(57)【要約】  （ａ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号１）又は（ｂ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含有する骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療剤。本発明の剤は、経口摂取可能であり、また、骨形成機能を有し、骨折の予防及び／又は治癒促進効果を有することから、骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療に極めて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号１）又は（ｂ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含有する骨形成不全症の予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
（ａ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号１）又は（ｂ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含有する骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤。
【請求項３】
（ａ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号１）又は（ｂ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含有する変形性関節症の予防及び／又は治療剤。
【請求項４】
骨折の予防及び／又は治癒促進剤である請求項１〜３のいずれかに記載の剤。
【請求項５】
経口投与用である請求項１〜４のいずれかに記載の剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の剤を含有する骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療用医薬品。
【請求項７】
骨形成を促進することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の剤又は医薬品。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の剤または医薬品と他の骨形成不全症、骨粗鬆症及び/又は変形性関節症の予防及び/又は治療用医薬品との組み合わせ。
【請求項９】
（ｂ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする、請求項１〜３のいずれかに記載の剤。
【請求項１０】
骨折の予防及び／又は治癒促進用である、請求項９記載の剤。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドを含有し、破骨細胞阻害作用を有する化合物又はビスホスホネート製剤と同時または順次に投与されることを特徴とする、骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療用医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、破骨細胞阻害作用を有する化合物又はビスホスホネート製剤による治療を受けている患者用の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成不全症等の予防及び／又は治療剤に関する。より詳細には、骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨形成不全症は、骨の主要な成分であるコラーゲンの先天的な異常により、骨脆弱性を示す疾患であり、易骨折性や進行性骨変形などを主症状とする。発生頻度は約２万人に１人で、難病に指定されている。骨形成不全症患者は、乳児期から小児期において、頻回の長管骨骨折、持続的な脊椎圧迫骨折等の多発骨折や高度の骨変形によって歩行不能などをきたし、成人後も車椅子や介護が必要となる場合がある（非特許文献１）。わが国において内科的治療で効能・効果が承認されている治療薬は、唯一、骨吸収抑制作用を持つビスホスホネート製剤であり、周期的静脈投与により骨折予防の効果が認められている。その効果は、破骨細胞の活動を阻害し、骨吸収を抑制することに基づくと知られている。しかしながら、ビスホスホネート製剤は、骨折治癒の修復期において、骨折治癒に重要な働きをする破骨細胞の活動を抑制することから、すでに骨折している場合、その破骨細胞の機能の低下が骨折治癒を遅延させる恐れがあり、禁忌とされている。また、副作用として、低カルシウム血症や呼吸困難などを引き起こすことも問題とされている。従って、骨形成不全症の治療において効力と安全性に優れた新規の骨形成促進剤の開発が望まれている。【０００３】
さらに、実際に骨形成不全症において骨折治癒過程を観察した報告により、骨折線の消失にはビスホスホネート製剤を使った方が使わない場合よりも時間がかかることが知られている（非特許文献２）。また、骨には細かい骨折が起きていることが知られていて、古い骨には細かい骨折が蓄積しており、ビスホスホネート製剤の投与により、大理石骨病を発症して骨折がむしろ増えたと報告されている（非特許文献３）。さらには、ビスホスホネート製剤は、成長には影響しないことが知られているが、骨がその形を保ちながら大きくなるのは骨が更新されることによることから、ビスホスホネート製剤により、骨の更新が止まった状態が長く続くと骨の形成異常が起きる恐れがある（非特許文献４）。従って、骨形成不全症の治療薬には、破骨細胞の活動を抑えることなく、新しい作用機序により骨形成を促進し、骨折の予防ばかりでなく、骨折治癒も促進する新規骨形成促進剤が望まれている。また、骨形成不全症患者の多くが乳児から小児の患者であることから、その成長に異常を起こさず、摂取し易い形の経口投与可能な形態であることも新規骨形成促進剤の望ましい要件である。【０００４】
ここで、骨格の形成において、頭蓋と鎖骨を除くほとんどの骨は内軟骨性骨化の過程を経て形成される。すなわち、各骨は軟骨として形成される。その軟骨骨幹部中心に存在する軟骨細胞は肥大化し、アポトーシスに陥る。そこへ血管から侵入した骨芽細胞や破骨細胞によって骨組織へと置換され、骨が形成される（非特許文献５）。【０００５】
同様に、骨折治癒の修復過程においても、修復期に、膜性骨化による繊維性仮骨形成に先行して、骨折部近傍では間隙を埋めるように、間葉系幹細胞から分化した軟骨細胞から軟骨が形成される。その後、軟骨は肥大化し、血管侵入を受け石灰化する。その後、石灰化軟骨が破骨細胞によって吸収され、骨芽細胞によって形成された骨組織へと置換される（内軟骨性骨化）。骨折後、軟骨がすべて骨組織に置換され、繊維性仮骨が層板骨に置き換わることを経て骨癒合に至る（非特許文献６）。このように、骨形成及び骨折治癒のいずれの過程においても、間葉系幹細胞から分化した軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞などの種々の細胞群の役割が明らかにされつつある。【０００６】
一方で、特定のペプチドが前駆骨芽細胞増殖促進活性を有することが知られている（特許文献１）。しかしながら、このペプチドが骨形成不全症等の骨疾患に伴う骨形成や骨折治癒に与える影響については不明な点が多い。また、現在骨粗鬆症や変形性関節症に対する薬剤は存在するが決して満足できるものではない。そこで本発明は以下に詳述するように、骨形成不全症、骨粗鬆症及び変形性関節症に対する予防及び／又は治療薬剤を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１２９７２６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】骨形成不全症の診療ガイドライン（日本小児内分泌学会薬事委員会）日本小児科学会雑誌 2006; 110:1467-1471.
【非特許文献２】田中  弘之（清野  佳紀監修： 改訂版骨の病気と付き合うには、メディカルレビュー社：198-199、2010）
【非特許文献３】Mashiba T, Hirano T, Turner CH, et al.: Suppressed bone turnover by bisphosphonates increases microdamage accumulation and reduces some biomechanical properties in dog rib. J Bone Miner Res 15: 613-620, 2000
【非特許文献４】Whyte MP, Wenkert D, Clements KL, et al.: Bisphosphonate-induced osteopetrosis. N Engl J Med 349: 457-463, 2003
【非特許文献５】妻木範行、骨・軟骨の再生、実験医学、Vol.32、No.7（増刊）、177-184
【非特許文献６】中島新ら、骨折骨癒合研究の進歩、千葉医学、86：83-91、2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規で優れた骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意検討した結果、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが、軟骨前駆細胞増殖促進作用、前駆骨芽細胞増殖促進作用、並びに、ＩＧＦ−１（インシュリン様成長因子）産生促進作用を併せ持つことを明らかにした。また、これらの作用に関連して、成長期ラットにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドの経口投与は用量依存的に骨形成を促進し、また、肥大軟骨層や成長軟骨の増加を促進することを明らかにした。二次海綿骨においては、前駆骨芽細胞増殖、石灰化、骨量増加を促進することを明らかにした。さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドの経口投与は長軸骨の成長を促進させることも明らかとした。かかる作用は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドでも同様に確認されるものであった。【００１１】
また、次のことも本発明者らは明らかにした。即ち、経口投与された配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、胃液中では消化されにくく、腸液中で代謝され配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドとなり、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドは腸管粘膜から吸収される。また、経口投与された配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドも、胃や腸ではそれ以上分解を受けず、腸管粘膜から体内に吸収される。体内に吸収された配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、間葉系幹細胞から分化した軟骨細胞の増殖を促進し、内軟骨性骨化を経て、骨芽細胞の増殖を促進させることで、骨形成及び骨折治癒を促進する。また、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドは経口投与により肝臓でＩＧＦ−１の産生を促進し、産生されたＩＧＦ−１は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドと合わせて骨形成や骨折治癒を促進するばかりでなく、骨の成長を促進する。従って、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドの経口投与は、既存のビスホスホネート製剤のように破骨細胞の活動を抑えることなく、新しい作用機序により、骨形成不全症において骨折予防ばかりでなく骨折治癒も促進する新規薬剤として有用であることを見出した。特に、本発明は、世界初の「骨折治癒促進作用及び長軸骨成長作用を併せもつ骨形成不全症に対する経口製剤」として、効果的に骨形成不全症の治療に貢献できる。【００１２】
このように、前記特許文献１において、特定の配列を有する、ペンタペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ペンタデカンペプチドが好適態様として具体的に開示されているが、本発明の配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、骨形成不全症のみならず、骨折の治癒促進に予想外に顕著な効果を奏するものであり、中でも、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドは、前記特許文献１において具体的に開示されたものではないだけでなく、構造が簡単なため効率よく合成でき、かつ、吸収性にも優れるという優れた効果も奏するものである。また、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドに比べて、単位質量あたりの効果が高いものであり、投与サイズの縮小化も簡便に行えるものである。【００１３】
すなわち、本発明は、以下の各発明を包含する。
〔１〕（ａ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号１）又は（ｂ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含有する骨形成不全症の予防及び／又は治療剤。
〔２〕（ａ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号１）又は（ｂ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含有する骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤。
〔３〕（ａ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号１）又は（ｂ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含有する変形性関節症の予防及び／又は治療剤。
〔４〕骨折の予防及び／又は治癒促進剤である前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の剤。
〔５〕経口投与用である前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の剤。
〔６〕前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の剤を含有する骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療用医薬品。
〔７〕骨形成を促進することを特徴とする前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の剤又は医薬品。
〔８〕前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の剤または医薬品と他の骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療用医薬品との組み合わせ。【００１４】
また、本発明は、以下の態様も包含する。
〔９〕（ｂ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の剤。
〔１０〕骨折の予防及び／又は治癒促進用である、前記〔９〕記載の剤。
〔１１〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のペプチドを含有し、破骨細胞阻害作用を有する化合物又はビスホスホネート製剤と同時または順次に投与されることを特徴とする、骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療用医薬組成物。
〔１２〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、破骨細胞阻害作用を有する化合物又はビスホスホネート製剤による治療を受けている患者用の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、新規な骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療剤を提供することができる。当該剤は、経口摂取可能である。当該剤は、骨形成機能を有する。当該剤は、骨折の予防及び／又は治癒促進効果を有する。当該剤は、破骨細胞の活動を抑制しない点、低カルシウム血症等の副作用が少ない点等で特に優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】合成ペプチド（Ｎｏ．１）の分析結果を示すグラフである。
【図２】合成ペプチド（Ｎｏ．２）の分析結果を示すグラフである。
【図３】合成ペプチド（Ｎｏ．１）の前駆骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図４】合成ペプチド（Ｎｏ．２）の前駆骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図５】合成ペプチド（Ｎｏ．１）の軟骨前駆細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図６】合成ペプチド（Ｎｏ．２）の軟骨前駆細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図７】実施例３の実験プロトコールを示す図である。
【図８】合成ペプチド（Ｎｏ．１）投与群の、一日あたりの成長軟骨伸長速度（長軸方向）を測定した結果を示す図である。
【図９】合成ペプチド（Ｎｏ．１）投与群の、ラットの成長軟骨における肥大軟骨層の面積を測定した結果を示す図である。
【図１０】合成ペプチド（Ｎｏ．１）投与群の、ラット血清中インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）濃度を測定した結果を示す図である。
【図１１】実施例４の実験プロトコールを示す図である。
【図１２】合成ペプチド（Ｎｏ．１）投与群の、ラット一次海面骨の形成を蛍光顕微鏡で確認した結果を示す図である。
【図１３】実施例５の実験プロトコールを示す図である。
【図１４】合成ペプチド（Ｎｏ．１）投与群の、一日あたりの成長軟骨伸長速度（長軸方向）を測定した結果を示す図である。
【図１５】合成ペプチド（Ｎｏ．１）投与群の、ラットの二次海綿骨における骨量を測定した結果を示す図である。
【図１６】合成ペプチド（Ｎｏ．１）投与群の、骨芽細胞が局在する総骨面に対する面積割合を測定した結果を示す図である。
【図１７】合成ペプチド（Ｎｏ．１）投与群の、破骨細胞が局在する総骨面に対する面積割合を測定した結果を示す図である。
【図１８】合成ペプチド（Ｎｏ．１）投与群の、一日あたりのラット二次海綿骨石灰化速度を算出した結果を示す図である。
【図１９】合成ペプチド（Ｎｏ．１）投与群の、ラット二次海綿骨の骨量を測定した結果を示す図である。
【図２０】合成ペプチド（Ｎｏ．１）投与群の、骨芽細胞が局在する総骨面に対する面積割合を測定した結果を示す図である。
【図２１】合成ペプチド（Ｎｏ．１）投与群の、ラット骨組織面積あたりの骨芽細胞数を測定した結果を示す図である。
【図２２】合成ペプチド（Ｎｏ．１）投与群の、破骨細胞が局在する総骨面に対する面積割合を測定した結果を示す図である。
【図２３】合成ペプチド（Ｎｏ．１）投与群の、ラット骨組織面積あたりの破骨細胞数を測定した結果を示す図である。
【図２４】合成ペプチド（Ｎｏ．１）投与群の、ラット体重の経時変化を測定した結果を示す図である。
【図２５】実施例８の実験プロトコールを示す図である。
【図２６】合成ペプチド（Ｎｏ．１）単回投与群の、ラット血清中インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）濃度を継時的に測定した結果を示す図である。
【図２７】合成ペプチド（Ｎｏ．２）単回投与群の、ラット血清中インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）濃度を継時的に測定した結果を示す図である。
【図２８】合成ペプチド（Ｎｏ．１）単回投与群の、ラット血清中インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）濃度を測定した結果を示す図である。
【図２９】合成ペプチド（Ｎｏ．１）単回投与群の、ラット肝臓中インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）濃度を測定した結果を示す図である。
【図３０】合成ペプチド（Ｎｏ．２）単回投与群の、ラット血清中インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）濃度を測定した結果を示す図である。
【図３１】合成ペプチド（Ｎｏ．２）単回投与群の、ラット肝臓中インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）濃度を測定した結果を示す図である。
【図３２】合成ペプチド（Ｎｏ．２）、合成ペプチド（Ｎｏ．２）逆配列又は合成ペプチド（Ｎｏ．２）構成アミノ酸単回投与群の、ラット血清中インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）濃度を測定した結果を示す図である。
【図３３】合成ペプチド（Ｎｏ．２）、合成ペプチド（Ｎｏ．２）逆配列又は合成ペプチド（Ｎｏ．２）構成アミノ酸単回投与群の、ラット肝臓中インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）濃度を測定した結果を示す図である。
【図３４】合成ペプチド（Ｎｏ．１）単回投与群のラット血漿副甲状腺ホルモン濃度（ＰＴＨ）を継時的に測定した結果を示す図である。
【図３５】合成ペプチド（Ｎｏ．１）の人工胃液（0.2%NaCl、0.32%ペプシン、2.4%希塩酸、pH3.0に調整）を用いた消化試験を行った結果を示す図である。
【図３６】合成ペプチド（Ｎｏ．１）の人工腸液（0.34%KH2PO4、0.36%Na2HPO4、1%パンクレアチン、ｐＨ6.8に調整）を用いた消化試験を行った結果を示す図である。
【図３７】蛍光色素（Ｃｙ３）を用いて標識した合成ペプチド（Ｎｏ．１）単回投与群の、マウス生体内への吸収を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
〔ペプチド〕
本発明は、（ａ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号１）又は（ｂ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有する骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療剤を提供する。
【００１８】
本発明におけるペプチドは、（ａ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号１）又は（ｂ）Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、その誘導体又はその薬理学的に許容される塩を包含する。本明細書において、配列番号１、２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを、それぞれ、合成ペプチド（Ｎｏ．１）、合成ペプチド（Ｎｏ．２）と略称することもある。
【００１９】
本発明におけるペプチドの誘導体は、特定のアミノ酸配列で示されるペプチドのＣ末端が、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル若しくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基若しくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。アミド体としては、アミド、Ｃ１−６アルキル基の１つ又は２つで置換されたアミド、フェニル基で置換されたＣ１−６のアルキル基の１つ又は２つで置換されたアミド、２つの置換基が、それらが結合する窒素原子と一緒になってアミド基の窒素原子を含んでモルホリノ、ピペリジノ等の５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
【００２０】
本発明のペプチドの誘導体には、Ｎ末端のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているものも含まれる。
【００２１】
本発明におけるペプチドの誘導体を構成するアミノ酸は、側鎖が任意の置換基で修飾されていてもよい。置換基は特に限定されないが、例えば、フッ素原子、塩素原子、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アミノ基、リン酸基などが挙げられる。また、側鎖の置換基は、保護基で保護されていてもよい。当該技術分野では置換基、保護基などは従来十分に確立されているので、本発明においてもそれらに従ってよい。
【００２２】
本発明におけるペプチドは塩を形成していてもよく、その塩としては、生理学的に許容される塩が好ましい。生理学的に許容される塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属若しくはアルカリ土類金属の、又はアルミニウムの水酸化物又は炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどとの塩などが挙げられる。
【００２３】
本発明におけるペプチドは、元のペプチドの特性が保持される限り、Ｄ−アミノ酸を含んでもよく、非天然アミノ酸を含んでもよい。また、本発明におけるペプチド又はその誘導体は、元のペプチドの特性が保持される限り、ペプチドに他の物質を連結してもよい。ペプチドに連結可能な他の物質としては、例えば、他のペプチド、脂質、糖又は糖鎖、アセチル基、天然又は合成のポリマー等が挙げられる。また、本発明におけるペプチドは、元のペプチドの特性が保持される限り、ペプチドに、糖鎖付加、側鎖酸化、リン酸化等の修飾を行ってもよい。本発明におけるペプチドのセリンはリン酸化されていてもよい。
【００２４】
すなわち、本発明には配列番号１及び２の誘導体（又は修飾体）であって、配列番号１又は２の生理活性（後記する骨形成作用又は骨折治癒促進作用）を示す化合物が含まれる。
【００２５】
本発明におけるペプチドは、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）又は液相合成法により容易に製造することができる。また、本発明におけるペプチド、その誘導体又はその塩をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いて製造することができる。また、本発明におけるペプチド、その誘導体又はその塩を一部に含むペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いてペプチドを取得し、これを適当なプロテアーゼやペプチダーゼで切断することによって製造することができる。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳系を用いる方法により製造することができる。ペプチドの生理活性を保持するための誘導体又は修飾体は、従来数多く知られているので、本発明もそれらに従ってよい。
【００２６】
また、本発明におけるペプチドは、鶏の卵黄タンパク質の加水分解物から精製して取得することができる。卵黄タンパク質の加水分解物の調製方法、ペプチドの精製方法は特に限定されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、脱脂卵黄粉末を調製し、プロテアーゼ等の酵素を用いて加水分解物を調製し、限外濾過、ＨＰＬＣ等の各種クロマトグラフィーを用いて目的のペプチドを精製する方法などが挙げられる。
【００２７】
〔骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療用途〕
本発明におけるペプチドは、骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療効果を奏する。本発明において、骨形成不全症、骨粗鬆症及び変形性関節症の予防及び／又は治療効果は、共通のメカニズムで奏される。
【００２８】
骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療効果は、骨形成作用及び骨折治癒促進作用の有無を指標にして確認することができる。具体的には、例えば、長軸骨の成長促進、肥大軟骨層の面積、成長軟骨等の増加、二次海綿骨における石灰化、骨量の増加、前駆骨芽細胞増殖促進、軟骨前駆細胞増殖促進、ＩＧＦ−１産生促進等を指標にして確認することができる（実施例参照）。ここで、成長軟骨とは、例えば骨端にある骨の伸長部位のことをいう。二次海綿骨とは、例えば成熟した海綿骨をいう。特に本発明におけるペプチドは、長軸骨成長促進作用及び骨折治癒促進作用を併せもつ点で優れている。
【００２９】
本発明におけるペプチドは、破骨細胞の活動を抑制しない点、低カルシウム血症等の副作用が少ない点で優れていることは注目すべきである。
【００３０】
本発明におけるペプチドは、哺乳動物への経口投与により目的の効果を奏することが確認されているので、これらのペプチドを含有する剤は、経口投与用の剤として好適に実施することができる。また、本発明におけるペプチドは、安全性が高く、穏やかに作用するものであり長期間の摂取又は使用が可能である。
【００３１】
〔医薬〕
本発明は、本発明におけるペプチドを含有する医薬を包含する。本発明におけるペプチドは、骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療用医薬の有効成分として使用することができる。
【００３２】
本発明の医薬は、本発明におけるペプチドを有効成分とし、医薬製剤の製造法として公知の方法（例えば、日本薬局方に記載の方法等）に従って、薬学的に許容される担体又は添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には、例えば錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠、舌下錠、口腔内崩壊錠、バッカル錠等を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、マイクロカプセル剤を含む）、トローチ剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、放出制御製剤（例、速放性製剤、徐放性製剤、徐放性マイクロカプセル剤）、エアゾール剤、フィルム剤（例、口腔内崩壊フィルム、口腔粘膜貼付フィルム）、注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、経皮吸収型製剤、軟膏剤、ローション剤、貼付剤、坐剤（例、肛門坐剤、膣坐剤）、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点眼剤等の経口剤又は非経口剤が挙げられる。担体又は添加剤の配合割合については、医薬分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体又は添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性又は油性基剤等の各種担体、賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００３３】
錠剤、カプセル剤などに含有することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は通常の製剤業務（例えば有効成分を注射用水、天然植物油等の溶媒に溶解又は懸濁させる等）に従って調製することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０（登録商標）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
【００３４】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。投与対象は、乳児であってもよく、小児であってもよく、成人であってもよい。
【００３５】
本発明の医薬は、剤型、投与方法、担体等により異なるが、本発明におけるペプチドを製剤全量に対して通常０．０１〜１００％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．１〜９５％（ｗ／ｗ）の割合で添加することにより、常法に従って製造することができる。
【００３６】
投与量は、投与対象、症状、投与ルートなどにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、体重約６０ｋｇのヒトにおいては、１日当たり約０.０１〜１０００ｍｇ、好ましくは約０．１〜５００ｍｇ、より好ましくは約０．５〜１００ｍｇ、さらに好ましくは５〜８０ｍｇである。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
【００３７】
本発明の医薬は、他の医薬と組み合わせて使用することにより、相加的又は相乗的な効果の向上が認められる。他の医薬としては、例えば骨形成不全症薬、骨粗鬆症薬、変形性関節症薬が挙げられる。
【００３８】
他の医薬としては、例えば、カルシウム薬、カルシウム吸収促進薬、ヒト型抗ＲＡＮＫＬモノクローナル抗体、女性ホルモン製剤、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、カルシトニン製剤、ビスホストネート製剤、ヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨｒＰ誘導体、ビタミンＫ２製剤、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体、抗ＴＮＦα抗体、ＩＬ−１レセプターアゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター、抗スクレロスチン抗体、カテプシンＫ阻害剤、リコンビナントヒト繊維芽細胞増殖因子（ｒｈＦＧＦ−２）などが挙げられる。具体的には、カルシウム薬としては、例えば、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム（商品名：カルチコール注）、L-アスパラギン酸カルシウム水和物（商品名：アスパラＣＡ）などが挙げられるが、特に限定されない。カルシウム吸収促進薬としては、例えば、アルファカルシドール（商品名：アルファロール、ワンアルファ）、カルシトリオール（商品名：ロカルトロール）、ファレカルシトリオール（商品名：フルスタン）、エルデカルシトール（商品名：エディロール）などが挙げられるが、特に限定されない。ヒト型抗ＲＡＮＫＬモノクローナル抗体としては、例えば、デノスマブ（商品名：プラリア）が挙げられるが、特に限定されない。女性ホルモン製剤としては、例えば、エストリオール（商品名：ホーリン、エストリール）、結合型エストロゲン（プレマリン）、エストラジオール（商品名：エストラーナ）などが挙げられるが、特に限定されない。選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）としては、例えば、ラロキシフェン塩酸塩（商品名：エビスタ）、バゼドキシフェン酢酸塩（商品名：ビビアント）などが挙げられるが、特に限定されない。カルシトニン製剤としては、例えば、エルカトニン（商品名：エルシトニン）、サケカルシトニン（商品名：カルシトラン）などが挙げられるが、特に限定されない。ビスホストネート製剤としては、例えば、エチドロン酸二ナトリウム（商品名：ダイドロネル）、アレンドロン酸ナトリウム（商品名：ボナロン、フォサマック）、リセドロン酸ナトリウム（商品名：ベネット、アクトネル）、ミノドロン酸（商品名：リカルポン、ボノテオ）、イバンドロン酸ナトリウム水和物（商品名：ボンビバ注）、イバンドロン酸ナトリウム（商品名：ボンビバ錠）などが挙げられるが、特に限定されない。ヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）としては、例えば、テリパラチド（商品名：テリボン、フォルテオ）が挙げられるが、特に限定されない。ＰＴＨｒＰ誘導体としては、例えば、ａｂａｌｏｐａｒａｔｉｄｅが挙げられるが、特に限定されない。ビタミンＫ２製剤としては、例えば、メナテトレノン（商品名：ケイツー、グラケー）が挙げられるが、特に限定されない。抗スクレロスチン抗体としては、例えば、ロモソズマブ（商品名）が挙げられるが、特に限定されない。カテプシンＫ阻害剤としては、例えば、オダナカチブ（商品名）が挙げられるが、特に限定されない。
【００３９】
他の医薬としては、例えば、ビスホスホネート製剤が挙げられる。ビスホスホネート製剤としては、例えば、パミドロン酸二ナトリウム水和物（商品名：アレディア）が挙げられるが、特に限定されない。
【００４０】
他の医薬としては、例えば、非ステロイド系消炎鎮痛剤（NSAID）、トロポミオシン関連キナーゼ（Trk)A阻害剤、アデノシンA3受容体作動薬、グルココルチコイド受容体作動薬、ヒアルロン酸、繊維芽細胞増殖因子18阻害薬、抗GM‐CSF（顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子）抗体、抗NGF（神経成長因子）抗体などが挙げられる。非ステロイド系消炎鎮痛剤（NSAID）としては、例えば、（S)-フルルビプロフェンが挙げられるが、特に限定されない。アデノシンA3受容体作動としては、例えば、piclidenosonが挙げられるが、特に限定されない。グルココルチコイド受容体作動薬としては、例えば、トリアムシノロンアセトニドが挙げられるが、特に限定されない。ヒアルロン酸としては、例えば、精製ヒアルロン酸ナトリウム（商品名：アルツ、スベニール）などが挙げられるが、特に限定されない。繊維芽細胞増殖因子18阻害薬としては、例えば、spriferminが挙げられるが、特に限定されない。抗NGF（神経成長因子）抗体としては、例えば、フルラヌマブが挙げられるが、特に限定されない。
【００４１】
また、他の医薬としては、破骨細胞阻害作用を有する化合物又はビスホスホネート製剤が挙げられる。これらの医薬と組み合わせて使用しても、本発明の剤または医薬品が、破骨細胞に影響を及ぼすものではないことから、骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療に、なかでも、当該症状における骨形成の促進や、骨折の治癒促進などに好適に用いることができる。
【００４２】
（Ａ）本発明の剤または医薬品と（Ｂ）他の骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療用医薬品との組み合わせの実施態様としては、（Ａ）と（Ｂ）とを併用してもよく、（Ａ）と（Ｂ）とを予め混合しておいてもよい。
【００４３】
本発明において、（Ａ）と（Ｂ）とを併用する場合、（Ａ）と（Ｂ）とを使用するタイミングは特に限定されず、（Ａ）を前投与、同時投与又は後投与してもよく、またいずれかを組み合わせてもよい。ここで、（Ａ）を「前投与」とは、（Ｂ）を未投与状態の対象へ（Ａ）を一定時間投与することを意味する。また、（Ａ）を「同時投与」とは、（Ｂ）の投与開始時から投与停止時まで継続して、又は（Ｂ）の投与開始時から投与停止時までの間に一定時間、対象へ（Ａ）を投与することを意味する。（Ａ）を「後投与」とは、（Ｂ）の投与停止後から、対象へ（Ａ）を一定時間投与することを意味する。なお、（Ａ）及び（Ｂ）の投与時間は、特に限定されないが、例えば、１〜３０分程度であってもよく、１〜１２時間程度であってもよい。
【００４４】
本発明の医薬において、（Ａ）と（Ｂ）とを予め混合しておく場合、混合比率（Ａ）／（Ｂ）は特に限定されないが、例えば、１／（０．００１〜１０００）であってもよく、１／（０．０１〜１００）であってもよく、１／（０．１〜１０）であってもよく、１／（０．５〜２）であってもよい。
【００４５】
本発明は、骨形成を促進することを特徴とする本発明の剤又は医薬品を包含する。ここで骨形成を促進するとは、例えば、骨芽細胞を増殖する、軟骨細胞を増殖する、骨成長を促進する、骨石灰化速度を増加する等、さらに、これらの２以上の組み合わせ等をいう。本発明において骨として具体的には、例えば一次海面骨、二次海綿骨、骨髄、骨端、骨幹端、骨幹、予備石灰化層、成長板、肥大軟骨層、成長軟骨、長軸骨、大腿骨、膝蓋骨、腓骨、脛骨、皮質骨等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明は、さらに、以下の各発明を包含する。
（ａ）哺乳動物に対して本発明の剤又は当該ペプチド（配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。但し、上記した塩、エステル、誘導体、修飾体を含む。以下同じ。）の有効量を投与することを特徴とする骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療方法。
（ｂ）骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療において使用する本発明の剤又は当該ペプチド。
（ｃ）骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療のための、本発明の剤又は当該ペプチドの使用。
（ｄ）骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防及び／又は治療用医薬製造のための、本発明の剤又は当該ペプチドの使用。
（ｅ）哺乳動物に対して本発明の剤又は当該ペプチドの有効量を投与することを特徴とする骨折の予防及び／又は治癒促進方法。
（ｆ）骨折の予防及び／又は治癒促進において使用する本発明の剤又は当該ペプチド。
（ｇ）骨折の予防及び／又は治癒促進のための、本発明の剤又は当該ペプチドの使用。
（ｈ）骨折の予防及び／又は治癒促進用医薬製造のための、本発明の剤又は当該ペプチドの使用。
（ｉ）本発明の剤又は当該ペプチドを含有する飲食品、食品添加物、飼料、飼料添加物、化粧品。
【００４７】
〔飲食品〕
本発明の飲食品は、骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防用飲食品、骨折予防及び／又は治癒促進用飲食品等として好適である。
【００４８】
飲食品には、本発明の剤又は当該ペプチドを含有する健康食品、機能性食品、特定保健用食品、病者用食品、サプリメントが含まれる。飲食品の形態は特に限定されず、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤等の形態で提供することができる。本発明の飲食品として例えば茶飲料、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料、そば、うどん、中華麺、即席麺等の麺類、飴、キャンディー、ガム、チョコレート、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子及びパン類、かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品、加工乳、発酵乳等の乳製品、サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品、ソース、たれ等の調味料、カレー、シチュー、丼、お粥、雑炊等のレトルトパウチ食品、アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の冷菓などを挙げることができる。
【００４９】
〔食品添加物、飼料、飼料添加物〕
本発明の食品添加物は、骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防用食品添加物、骨折予防及び／又は治癒促進用食品添加物等として好適である。本発明の食品添加物の形態は特に限定されないが、例えば、液状、ペースト状、粉末状、フレーク状、顆粒状等が挙げられる。本発明の食品添加物は一般的な食品添加物の製造方法に従って製造することができる。
【００５０】
さらに、本発明におけるペプチドを含有する飼料又は飼料添加物としても実施することができる。
【００５１】
〔化粧品〕
本発明の化粧品は、骨形成不全症、骨粗鬆症及び／又は変形性関節症の予防用化粧品、骨折予防及び／又は治癒促進用化粧品として好適である。化粧品には、いわゆる薬用化粧品（医薬部外品）が含まれる。化粧品としては、例えば、洗浄剤、シャンプー、リンス、ヘアートニック、ヘアーローション、アフターシェーブローション、ボディーローション、化粧ローション、クレンジングクリーム、マッサージクリーム、エモリエントクリーム、エアゾール製品、消臭剤、芳香剤、脱臭剤又は入浴剤などを挙げることができる。本発明の化粧品は、本発明におけるペプチド以外に化粧品として一般に使用されている成分、例えば、界面活性剤、保湿剤、動植物由来油脂、シリコーン類、高級アルコール、低級アルコール、動植物由来抽出エキス、紫外線吸収剤、消炎剤、金属封鎖剤、ビタミン類、酸化防止剤、増粘剤、防腐剤、殺菌剤、ｐＨ調整剤、着色剤、各種香料などを目的に応じて適宜配合することができる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５３】
〔製造例：合成ペプチドＮｏ．１及びＮｏ．２の製造〕
合成ペプチドＮｏ．１及びＮｏ．２をペプチド自動合成装置Ｓｙｒｏ ＩＩ（バイオタージ・ジャパン株式会社製）を使用して化学合成した。図１または図２のグラフに示す単一のピークが、目的の合成ペプチドＮｏ．１またはＮｏ．２を示している。【００５４】
〔実施例１：合成ペプチドを用いた前駆骨芽細胞増殖促進活性の検討〕
マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ Ｓｕｂｃｌｏｎｅ−４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−２５９３）を、１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培養液を用いて、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下でサブコンフルエントになるまで培養した後、トリプシン処理により細胞を集めた。集めた細胞を、上記α−ＭＥＭ培養液に懸濁して細胞懸濁液（５×１０４個／ｍＬ）を調製した。この細胞懸濁液を９６穴プレートに１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で前培養した。翌日、サンプルを溶解した０．１％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培養液に交換し、さらに２４時間培養した。前駆骨芽細胞の増殖活性は、ＢｒｄＵ取り込み量にて評価した。サンプルの前駆骨芽細胞の増殖促進活性は、サンプル未添加の増殖値を１００とした時の相対値で表した。【００５５】
結果を図３及び４に示した。合成ペプチドＮｏ．１及びＮｏ．２ともに前駆骨芽細胞の増殖を促進した。また、合成ペプチドＮｏ．２の方が、合成ペプチドＮｏ．１に比べて高い活性であり、その効果は低濃度においても十分確認されるものであった。【００５６】
〔実施例２：合成ペプチドを用いた軟骨前駆細胞増殖促進活性の検討〕
マウス軟骨前駆細胞株ＡＴＤＣ５（ＲＣＢ０５６５）を５％ＦＢＳ、３×１０−８Ｍ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ、５μｇ／ｍＬ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培養液を用いて、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下でサブコンフルエントになるまで培養した後、トリプシン処理により細胞を集めた。集めた細胞を、上記ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に懸濁して細胞懸濁液（５×１０４個／ｍＬ）を調製した。この細胞懸濁液を９６穴プレートに１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で前培養した。翌日、サンプルを溶解した３×１０−８Ｍ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ、５μｇ／ｍＬ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培養液に交換し、さらに２４時間培養した。軟骨前駆細胞の増殖活性は、ＢｒｄＵ取り込み量にて評価した。サンプルの軟骨前駆細胞の増殖促進活性は、サンプル未添加の増殖値を１００とした時の相対値で表した。【００５７】
結果を図５及び６に示した。合成ペプチドＮｏ．１及びＮｏ．２ペプチドともに軟骨前駆細胞の増殖を促進した。【００５８】
〔実施例３：合成ペプチドによる成長期ラットにおける骨成長促進作用の検討〕
４週齢のＣｒｌｊ：ＷＩ雄性ラットに合成ペプチド（Ｎｏ．１）又は注射水（コントロール）を、それぞれ胃ゾンデを用いて１日１回７日間強制経口投与した（各群：ｎ＝１０）。合成ペプチドの用量は、１、１０、１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。また、陽性対照としてヒト成長ホルモン（ｈＧＨ；ノルディトロピン、日本標準商品分類番号８７２４１２）を５００μｇ／ｋｇ／ｄａｙとして、１日１回７日間皮下投与した。骨形成部位の蛍光標識として４日目の投与後にテトラサイクリン（２０ｍｇ／ｋｇ）、６日後にカルセイン（１０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ皮下投与した。７日目に検体を投与した後は絶食条件でラットを飼育した。２４時間後にラットを麻酔下で放血して安楽死させ、脛骨を採取した（図７を参照）。その後、脛骨近位部について非脱灰標本を作成し、蛍光顕微鏡（OLYMPUS社製BX-53）で画像を取得し、形態計測システム（Histometry RT digitizer、System Supply Co., Ltd.）を用いて骨形態計測を行った。成長軟骨における長軸方向の伸長率（Lo.G.R: Longitudinal Growth Rate）の計測において、成長率は、テトラサイクリン及びカルセインの標識幅を計測し、それらの蛍光標識の投与間隔（２日間）から一日あたりの成長幅を算出した。【００５９】
その結果、ｈＧＨ投与群及びＮｏ．１投与群はコントロール群と比較して有意に骨成長促進作用を示し、Ｎｏ．１の作用は濃度依存的であった（図８）。また肥大化軟骨層の面積を測定した結果、ｈＧＨ投与群及びＮｏ．１投与群（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）はコントロール群と比較して有意に高値となった（図９）。【００６０】
さらに、7日間検体を投与後、24時間絶食したのちに採血して作成した血清から、血清中インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）濃度をＥＬＩＳＡ（R&D社製 Mouse/Rat IGF-1 Quantikine ELISA Kit; Mg100）で測定した結果、Ｎｏ．１投与群（１、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）はコントロール群と比較して、血清ＩＧＦ−１濃度が上昇傾向を示した（図１０）。成長期において、骨形成や筋肉の発育に関与するＩＧＦ−１の増加は、上述した骨成長促進作用を来す一因であることを示す。【００６１】
これらの結果から、本発明のペプチドは経口投与により成長期における長軸方向の骨成長を促進することが確認された。【００６２】
〔実施例４：合成ペプチドによる一次海面骨における形成促進作用の検討〕
４週齢のＣｒｌｊ：ＷＩ雄性ラットに合成ペプチド（Ｎｏ．１）又は注射水（コントロール）を、それぞれ胃ゾンデを用いて１日１回７日間強制経口投与した（各群：ｎ＝３）。合成ペプチドの用量は、１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。また、陽性対照としてヒト成長ホルモン（ｈＧＨ；ノルディトロピン、日本標準商品分類番号８７２４１２）を５００μｇ／ｋｇ／ｄａｙとして、１日１回７日間皮下投与した。骨形成部位の蛍光標識として４日目の投与後にテトラサイクリン（２０ｍｇ／ｋｇ）、６日後にカルセイン（１０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ皮下投与した。７日目に検体を投与した後は絶食条件でラットを飼育した。２４時間後にラットを麻酔下で放血して安楽死させ、脛骨を採取した（図１１を参照）。その後、脛骨近位部について非脱灰標本を作成し、蛍光顕微鏡（OLYMPUS社製BX-53）で画像を取得し、形態計測システム（Histometry RT digitizer、System Supply Co., Ltd.）を用いて骨形態計測を行った。【００６３】
その結果、Ｎｏ．１投与群はコントロール及びｈＧＨ投与群に対して一次海面骨に取り込まれた蛍光標識が高頻度に検出され、成長期における海綿骨の形成を早期に誘導することが確認された（図１２；白色部位）。【００６４】
以上から、本発明のペプチドは、経口投与により一次海綿骨の形成を促進することが明らかとなった。【００６５】
〔実施例５：合成ペプチドによる成長軟骨及び二次海綿骨における骨形成促進作用の検討〕
４週齢のＣｒｌｊ：ＷＩ雄性ラットに合成ペプチド(Ｎｏ．１)又は注射水(コントロール)を、それぞれ胃ゾンデを用いて１日１回２１日間強制経口投与した。合成ペプチドの用量は、１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。また、陽性対照としてヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)を５００μｇ／ｋｇ／ｄａｙとして、１日１回２１日間皮下投与した。骨形成部位の蛍光標識として、１８日目の投与後にテトラサイクリン(２０ｍｇ／ｋｇ)、２０日目の投与後にカルセイン(１０ｍｇ／ｋｇ)をそれぞれ皮下投与した。２１日目に検体を投与した後は絶食条件でラット飼育した。２４時間後ラットを麻酔下で放血して安楽死させ、脛骨を採取した（図１３を参照）。その後、頸骨近位部について非脱灰標本を作成し、蛍光顕微鏡(OLYMPUS社製BX-53)で画像を取得し、形態計測システム(Histometry RT digitizer、System Supply Co., Ltd.)及び解析ソフト(CSS-840 cancellous bone morphometry version、System Supply Co., Ltd.)を用いて骨形態計測を行った。骨端軟骨における長軸方向の成長率(Lo.G.R; Longitudinal Growth Rate)を計測するにおいて、成長率は、テトラサイクリン及びカルセインの標識幅を計測し、それらの蛍光標識の投与間隔(２日間)から一日あたりの成長幅を算出した。【００６６】
その結果、ｈＧＨ投与群及びＮｏ．１投与群はコントロール群と比べて有意に骨成長が促進され、Ｎｏ．１投与群はｈＧＨ投与群に対しても有意な骨成長促進作用が示された(図１４)。このことから、本発明のペプチドがより長期の経口投与条件においても長軸方向の骨成長を促進することが示された。【００６７】
さらに、上述した解析システムにより二次海綿骨の骨量(BV;Bone volume/TV;Tissue volume)を解析した結果、コントロール群やｈＧＨ投与群に対してＮｏ．１投与群で高値となった(図１５)。また、Ｎｏ．１投与群において、総骨面に対して骨芽細胞が局在する骨面の割合(Ob.S;Osteoblast surface/BS;Bone surface)が高値となり(図１６)、破骨細胞の局在する骨面の割合(Oc.S;Osteoclast surface/BS;Bone surface)は低値となった（図１７）。【００６８】
これらの結果から、本発明のペプチドを経口投与することにより、形成優位の骨代謝が誘導されることにより骨量の増加が確認された。【００６９】
〔実施例６：合成ペプチドによる二次海綿骨における骨石灰化速度の増加作用の検討〕
４週齢のＣｒｌｊ：ＷＩ雄性ラットに合成ペプチド（Ｎｏ．１）又は注射水（コントロール）を、それぞれ胃ゾンデを用いて１日１回７日間強制経口投与した（各群：ｎ＝１０）。合成ペプチドの用量は、１、１０、１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。また、陽性対照としてヒト成長ホルモン（ｈＧＨ；ノルディトロピン、日本標準商品分類番号８７２４１２）を５００μｇ／ｋｇ／ｄａｙとして、１日１回７日間皮下投与した。骨形成部位の蛍光標識として４日目の投与後にテトラサイクリン（２０ｍｇ／ｋｇ）、６日後にカルセイン（１０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ皮下投与した。７日目に検体を投与した後は絶食条件でラットを飼育した。２４時間後にラットを麻酔下で放血して安楽死させ、脛骨を採取した（図７を参照）。その後、脛骨近位部について非脱灰標本を作成し、蛍光顕微鏡（OLYMPUS社製BX-53）で画像を取得し、形態計測システム（Histometry RT digitizer、System Supply Co., Ltd.）を用いて骨形態計測を行った。二次海綿骨におけるテトラサイクリン及びカルセインの標識幅を計測し、それらの蛍光標識の投与間隔(２日間)から一日あたりの石灰化速度を算出した。【００７０】
その結果、ｈＧＨ投与群及びＮｏ．１投与群はコントロール群と比べて有意に石灰化速度が増加した。さらに、Ｎｏ．１投与群において１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上では、ｈＧＨ投与群に対しても有意な石灰化速度の増加が示された(図１８)。また、二次海綿骨の骨量(BV;Bone volume/TV;Tissue volume)を解析した結果、ｈＧＨ投与群と比較して、Ｎｏ．１投与群（１０ｍｇ／ｋｇ）で有意に高値となった（図１９）。さらに、Ｎｏ．１投与群では、総骨面に対して骨芽細胞が局在する骨面の割合(Ob.S;Osteoblast surface/BS;Bone surface)、骨組織単位面積あたりの骨芽細胞数(N.Ob;Number of osteoblast/TV:Tissue volume)は高値となるものの（図２０、２１）、破骨細胞の局在する骨面の割合(Oc.S;Osteoclast surface/BS;Bone surface)、骨組織単位面積あたりの破骨細胞数(N.Oc;Number of osteoclast/TV:Tissue volume)はコントロールと同程度となり、破骨細胞には影響を及ぼさないことが分かった（図２２、２３）。Ｎｏ．１投与群に見られた二次海綿骨の石灰化速度、骨量の増加は、そのような骨芽細胞の増加に起因することが確認された。【００７１】
これらの結果から、本発明のペプチドを経口投与することによって二次海綿骨の石灰化が促進され、骨形成速度が増加することが示された。【００７２】
〔実施例７：合成ペプチドによる体重への影響検討〕
４週齢のＣｒｌｊ：ＷＩ雄性ラットに合成ペプチド（Ｎｏ．１）又は注射水（コントロール）を、それぞれ胃ゾンデを用いて１日１回７日間強制経口投与した（各群：ｎ＝１０）。合成ペプチドの用量は、１、１０、１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。また、陽性対照としてヒト成長ホルモン（ｈＧＨ；ノルディトロピン、日本標準商品分類番号８７２４１２）を５００μｇ／ｋｇ／ｄａｙとして、１日１回７日間皮下投与した。投与１、３、５、７日目に体重を測定した。その結果、投与期間中全ての群で体重の有意な変化は確認されなかった（図２４）。これらのことから、本発明ペプチドを７日間連続して経口摂取しても体重には影響を与えないことが示された。【００７３】
〔実施例８：合成ペプチドによるインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）産生促進作用の検討〕
４週齢のＷｉｓｔａｒ雄性ラットに合成ペプチド（Ｎｏ．１又はＮｏ．２）又は注射水（コントロール）を、それぞれ胃ゾンデを用いて単回経口投与した（各群：ｎ＝６）。合成ペプチドの用量は、Ｎｏ．１及びＮｏ．２ともに１０ｍｇ／ｋｇとした。投与前、投与３０、４５、６０、９０分後に尾部より採血し、血清を作成した。投与１２０分後に麻酔下で腹部大静脈より全採血し、安楽死させた（図２５を参照）。その後血清中のＩＧＦ−１濃度をＥＬＩＳＡ（R&D社製 Mouse/Rat IGF-1 Quantikine ELISA Kit; Mg100）を用いて測定した。【００７４】
その結果、合成ペプチドＮｏ．１投与群では投与４５、６０、９０分後にコントロールと比較して血清ＩＧＦ−１濃度が有意に高値を示し、Ｎｏ．２投与群では投与４５、６０分後にコントロールと比較して血清ＩＧＦ−１濃度が有意に高値を示した（図２６、２７）。【００７５】
次に、各合成ペプチドについて濃度依存性を検討した。先ず、合成ペプチドＮｏ．１を１、５、１０ｍｇ／ｋｇ単回経口投与し（各群：ｎ＝６）、６０分後に麻酔下で安楽死させた後、肝臓を摘出し、血清及び肝臓中のＩＧＦ−１濃度を測定した。なお、血清ＩＧＦ−１濃度については、投与前と投与後の前後差（Δ値）を評価した。その結果、Ｎｏ．１投与群では、コントロール群と比較して濃度依存的に血清及び肝臓中ＩＧＦ−１濃度が有意に上昇した（図２８、２９）。【００７６】
次に、合成ペプチドＮｏ．２は、０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇをラットに単回経口投与し（各群：ｎ＝６）、４５分後に麻酔下で安楽死させた後、肝臓を摘出し、血清及び肝臓中のＩＧＦ−１濃度を測定した。なお、血清ＩＧＦ−１濃度については、投与前と投与後の前後差（Δ値）を評価した。その結果、Ｎｏ．２投与群では、コントロール群と比較して濃度依存的に血清及び肝臓中ＩＧＦ−１濃度が有意に上昇した（図３０、３１）。【００７７】
ＩＧＦ−１は肝臓で産生され、骨の形成に関与することから、本発明のペプチドは、生体内のＩＧＦ−１産生を促進させることで骨形成を促進させることが明らかになった。【００７８】
これらの結果から、本発明のペプチドＮｏ．１及びＮｏ．２を経口投与することにより、生体内のＩＧＦ−１産生を促進することが確認された。【００７９】
〔実施例９：合成ペプチド投与によるＩＧＦ−１産生促進作用の検討〕
４週齢のＷｉｓｔａｒ雄性ラットに合成ペプチド（Ｎｏ．２）、Ｎｏ．２とは逆配列のペプチド（配列番号３；本願明細書等においてR-No.2とも示す）、合成ペプチドＮｏ．２の構成アミノ酸（本願明細書等においてＡＡとも示す）、又は注射水（コントロール）を、それぞれ胃ゾンデを用いて単回経口投与した（各群：ｎ＝６）。合成ペプチド、逆配列ペプチド及び構成アミノ酸の用量は、１０ｍｇ／ｋｇとした。投与４５分後に、麻酔下で安楽死させた後、肝臓を摘出し、血清及び肝臓中のＩＧＦ−１濃度をＥＬＩＳＡ（R&D社製 Mouse/Rat IGF-1 Quantikine ELISA Kit; Mg100）を用いて測定した。なお、血清ＩＧＦ−１濃度については、投与前と投与後の前後差（Δ値）を評価した。【００８０】
その結果、合成ペプチドＮｏ．２投与群のみ血清及び肝臓中のＩＧＦ−１濃度が有意に高値を示した（図３２、３３）。このことから、本発明の合成ペプチドＮｏ．２のＩＧＦ−１産生促進作用は、ペプチド配列特異的であることが確認された。【００８１】
〔実施例１０：合成ペプチド投与による副甲状腺ホルモン濃度への影響検討〕
４週齢のＷｉｓｔａｒ雄性ラットに合成ペプチド（Ｎｏ．１）又は注射水（コントロール）を、それぞれ胃ゾンデを用いて単回経口投与した（各群：ｎ＝６）。合成ペプチドの用量は、１０ｍｇ／ｋｇとした。投与前、投与３０、４５、６０、９０分後に尾部より採血し、血清を作成した。投与１２０分後に麻酔下で腹部大静脈より全採血し、安楽死させた。その後、血清中の副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone：PTH）濃度をELISA（Uscn Life Science Inc社製 Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit For Parathyroid Hormone(PTH)）を用いて測定した。【００８２】
その結果合成ペプチドＮｏ．１投与群とコントロール群で血清ＰＴＨ濃度に有意な変化は認められなかった（図３４）。ＰＴＨは骨代謝に関与していることが知られており、継続的にＰＴＨを投与した場合、骨吸収を促進するが、断続的に投与した場合、骨形成を促進する。既存薬であるＰＴＨ製剤はこの特徴を利用した骨形成促進剤である。本発明の合成ペプチドは血清中ＰＴＨ濃度を変化させなかったことから、既存薬とは異なるメカニズムで骨形成を促進させていることが示唆された。【００８３】
〔実施例１１：合成ペプチドの消化液への耐性検討〕
合成ペプチドＮｏ．１について人工胃液試験を行った。１０ｍｇの合成ペプチドＮｏ．１を１ｍＬの人工胃液（０．２％ＮａＣｌ、０．３２％ペプシン、２．４％希塩酸、ｐＨ３．０に調整）に溶解し、３７℃で振とう反応させた。反応前、反応６０、１２０分後にサンプルを回収し、ＨＰＬＣ〔カラム：（ODSカラム、サイズ：φ46mm×500mm、SHIMADZU）、移動相：（A）0.05％ TFA、（B）90％ Acetonitrile/0.05％ TFA、B 2％（0min）→20％（50min）→100％（50.1min）→100％（55min）Gradient、検出：UV215nm〕を用いて、合成ペプチドＮｏ．１が胃液に分解されるかどうか（耐性）を検討した。その結果、合成ペプチドＮｏ．１は人工胃液に６０、１２０分反応させても分解されず、高い耐性を示した（図３５）。【００８４】
次に、１０ｍｇの合成ペプチドＮｏ．１を１ｍＬの人工腸液（０．３４％ＫＨ２ＰＯ４、０．３６％Ｎａ２ＨＰＯ４、１％パンクレアチン、ｐＨ６．８に調整）に溶解し、３７℃で振とう反応させた。反応前、反応１２０分後、一晩経過後にそれぞれ反応させたサンプルを回収し、ＨＰＬＣ〔カラム：（ODSカラム、サイズ：φ46mm×500mm、SHIMADZU）、移動相：（A）0.05％ TFA、（B）90％ Acetonitrile/0.05％ TFA、B 2％（0min）→20％（50min）→100％（50.1min）→100％（55min）Gradient、検出：UV215nm〕を用いて、合成ペプチドＮｏ．１が腸液に分解されるかどうか（耐性）を検討した。その結果、合成ペプチドＮｏ．１は人工腸液で分解され、最終的に合成ペプチドＮｏ．２の配列を持つペプチドに集約した（図３６）。【００８５】
これらの結果から、本発明の合成ペプチドＮｏ．１を摂取すると、消化管内で合成ペプチドＮｏ．２に分解され得ることが明らかとなった。【００８６】
〔実施例１２：合成ペプチドの体内吸収検討〕
合成ペプチドＮｏ．１をＣｙａｎｉｎｅ３（ｃｙ３）ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ（Lumiprobe社製、Cat#：61020）を用いて標識した。２０ｍｇの合成ペプチドＮｏ．１を９．２ｍＬの０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）に溶解し、ペプチド溶解液９ｍＬをｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅで溶解したｃｙ３ ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬと混合した。混合溶液は室温、遮光下で４時間静置した後、Ｇ−１０ゲルろ過カラム（GEヘルスケ社製、Sephadex G-10）を用いて精製した。その後、凍結乾燥により溶媒を除去し、ｃｙ３標識合成ペプチドＮｏ．１を得た。得られたｃｙ３標識合成ペプチドＮｏ．１を７週齢ｄｄＹ雄性マウスに単回経口投与した。Ｃｙ３標識合成ペプチドＮｏ．１の用量は、１００ｍｇ／ｋｇとした。投与１５分後に麻酔下で門脈より採血し、安楽死させた後、胃、小腸、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳、大腿骨を摘出した。その後、各組織をホモジナイズし、門脈血より作成した血清とともにＨＰＬＣに供し〔カラム：（ODSカラム、サイズ：φ46mm×500mm、SHIMADZU）、移動相：（A）0.05％ TFA、（B）90％ Acetonitrile/0.05％ TFA、B 2％（0min）→20％（50min）→100％（50.1min）→100％（55min）Gradient、検出：UV215nm〕、ｃｙ３標識合成ペプチドＮｏ．１が生体内で検出されるか検討した。【００８７】
その結果、ｃｙ３標識合成ペプチドＮｏ．１は小腸で一部分解され、ｃｙ３標識合成ペプチドＮｏ．２の両方が検出され、門脈血及び肝臓ではｃｙ３標識合成ペプチドＮｏ．２のみが検出された（図３７）。これらの結果から、本発明の合成ペプチドＮｏ．１は小腸で合成ペプチドＮｏ．２の配列をもったペプチドに分解、吸収され、血液を介して肝臓に移行することが確認された。よって、合成ペプチドＮｏ．１や合成ペプチドＮｏ．２を経口摂取しても、合成ペプチドＮｏ．１は代謝されて合成ペプチドＮｏ．２になり、また、合成ペプチドＮｏ．２はそのままの形でいずれも消化管に到達し、合成ペプチドＮｏ．２は分子量が小さいため消化管からの吸収も速やかで効率も高いことから、いずれを経口摂取しても、これらのペプチドが有する効果がより効果的に奏されることが示唆される。【００８８】
なお本発明は上述した各実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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