(57)【要約】下記の構造式（Ｉ）で表され、酸化還元酵素Ｅと、フェナジン誘導体と、酸化還元酵素Ｅとフェナジン誘導体とを連結するリンカー部位Ｌとを有する電子メディエーター修飾酵素が開示されている。また、2018062542.tif 000016構造式（Ｉ）中、Ｙは炭素数１〜５の置換基を有してもよい直鎖又は分岐鎖アルキル基を表し、Ｒ１〜Ｒ８は、互いに独立して、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基若しくはアルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基又は置換基を有してもよいアミノ基を表し、うち少なくとも１つは、リンカー部位Ｌである。また、該電子メディエーター修飾酵素を用いた酵素電極、分光学的分析キット及び酵素試験紙が開示されている。
2018062542.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式（Ｉ）で表され、
酸化還元酵素Ｅと、
フェナジン誘導体と、
前記酸化還元酵素Ｅと前記フェナジン誘導体とを連結するリンカー部位Ｌとを有することを特徴とする電子メディエーター修飾酵素。
【化１】
2018062542.tif 000013
構造式（Ｉ）中、
Ｘは陰イオンを表し、
Ｙは炭素数１〜５の置換基を有してもよい直鎖又は分岐鎖アルキル基を表し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、互いに独立して、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基若しくはアルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基又は置換基を有してもよいアミノ基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８のうち少なくとも１つは、前記リンカー部位Ｌである。
【請求項２】
下記の構造式（II）で表されることを特徴とする請求項１に記載の電子メディエーター修飾酵素。
【化２】
2018062542.tif 000014
構造式（II）中、
Ｙはメチル基又はエチル基を表す。
【請求項３】
下記の構造式（III）で表されることを特徴とする請求項１に記載の電子メディエーター修飾酵素。
【化３】
2018062542.tif 000015
構造式（III）中、
Ｙはメチル基又はエチル基を表す。
【請求項４】
前記酸化還元酵素Ｅが、ＦＡＤ又はＦＭＮを補酵素とする酸化還元酵素であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の電子メディエーター修飾酵素。
【請求項５】
前記酸化還元酵素Ｅが、ＮＡＤ又はＮＡＤＰを補酵素とする酸化還元酵素であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の電子メディエーター修飾酵素。
【請求項６】
前記酸化還元酵素Ｅが、ＰＱＱを補酵素とする酸化還元酵素であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の電子メディエーター修飾酵素。
【請求項７】
前記酸化還元酵素Ｅが、グルコースを基質とすることを特徴とする請求項４に記載の電子メディエーター修飾酵素。
【請求項８】
前記酸化還元酵素Ｅが、ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素であることを特徴とする請求項７に記載の電子メディエーター修飾酵素。
【請求項９】
前記酸化還元酵素Ｅが、乳酸、フルクトシルアミノ酸、コレステロール及び１，５−アンヒドログルシトールのいずれかを基質とすることを特徴とする請求項４に記載の電子メディエーター修飾酵素。
【請求項１０】
前記酸化還元酵素Ｅが、乳酸酸化酵素（ＬＯｘ）、フルクトシルアミノ酸酸化酵素（ＦＡＯｘ）、コレステロール酸化酵素（ＣｈＯｘ）及びピラノース酸化酵素（ＰｙＯｘ）のいずれかである請求項４に記載の電子メディエーター修飾酵素。
【請求項１１】
基材と、作用電極と、対極とを有し、
前記作用電極の表面に、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の電子メディエーター修飾酵素が少なくとも１種固定されている酵素電極。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の電子メディエーター修飾酵素の少なくとも１種と、酸化還元指示薬とを含む分光学的分析キット。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の電子メディエーター修飾酵素の少なくとも１種と、酸化還元指示薬とを含む酵素試験紙。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電子伝達効率に優れ、高感度かつ高精度での生体関連物質の計測を可能にする新規な電子メディエーター修飾酵素、並びに該電子メディエーター修飾酵素を用いた酵素電極、分光学的分析キット及び酵素試験紙に関する。
【背景技術】
【０００２】
電気化学バイオセンサーは、酸化還元酵素反応と電極反応とを共役させることにより、酵素反応の有する高い基質選択性と、簡便かつ高感度での測定が可能であるという電気化学計測の特性を併せ持つデバイスである。電気化学バイオセンサーの高感度化のためには、酸化還元酵素と電極との間の電子伝達速度を向上させることが重要である。そのために、電子メディエーターと呼ばれる、酸化還元酵素（補酵素）と電極との電子伝達を媒介する低分子量の有機化合物や金属錯体等が用いられることがある。【０００３】
例えば、特許文献１には、絶縁性基板、前記基板上に配置された作用極及び対極を有する電極系、及び、前記電極系上に配置された試薬層を備え、前記試薬層が、アスペルギルス・オリゼ型ＦＡＤ−ＧＤＨ、ルテニウム化合物、及び、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）を含むグルコースセンサーが開示されている。【０００４】
また、特許文献２には、ブドウ糖酸化還元酵素と、フラビン・ヌクレオシド及びニコチンアミド・ヌクレオチドから選択された補酵素と、９−（ジメチルアミノ）ベンゾフェノキサジン−７−イウム＝クロリド、Ｎ−（９Ｈ−ベンゾフェノキサジン−９−イリデン）−Ｎ−メチルメタンアミニウム＝クロリド、８−ジメチルアミノ−２，３−ベンゾフェノキサジン＝ヘミ（塩化亜鉛）塩、７−ジメチルアミノ−１，２−ベンゾフェノキサジン、又は８−ジメチルアミノ−２，３−ベンゾフェノキサジンから単独で選択された少なくとも１つの電気活性有機分子、及び、オスミウム又はルテニウムの各錯体から単独で選択される少なくとも１つの配位錯体を含んで構成される伝達物質剤とを含んで構成される検体の検出用試薬及び当該試薬を含んで構成された電気化学的検出装置のストリップが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５５８４７４０号公報
【特許文献２】特許第５４５３３１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１及び２に記載の電気化学グルコースセンサーは、電子メディエーターとして、フェナジンメトサルフェートやベンゾフェノキサジン等の電気活性有機分子と、高価なルテニウム等の遷移金属錯体とを組み合わせて用いているため、高価であると共に、酸化還元酵素からの電子移動効率を確保するためには、過剰量の電子メディエーターを用いる必要がある。【０００７】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、安価で電子伝達効率に優れ、高感度かつ高精度での生体関連物質の計測を可能にする電子メディエーター修飾酵素、並びに該電子メディエーター修飾酵素を用いた酵素電極、分光学的分析キット及び酵素試験紙を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的に沿う本発明の第１の態様は、下記の構造式（Ｉ）で表され、
酸化還元酵素Ｅと、
フェナジン誘導体と、
前記酸化還元酵素Ｅと前記フェナジン誘導体とを連結するリンカー部位Ｌとを有することを特徴とする電子メディエーター修飾酵素を提供することにより上記課題を解決するものである。【０００９】
【化１】
2018062542.tif 000003
【００１０】
構造式（Ｉ）中、
Ｘは陰イオンを表し、
Ｙは炭素数１〜５の置換基を有してもよい直鎖又は分岐鎖アルキル基を表し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、互いに独立して、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基若しくはアルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基又は置換基を有してもよいアミノ基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８のうち少なくとも１つは、前記リンカー部位Ｌである。【００１１】
本発明の第１の態様に係る電子メディエーター修飾酵素は、下記の構造式（II）で表されるものであってもよい。【００１２】
【化２】
2018062542.tif 000004
【００１３】
構造式（II）中、Ｙはメチル基又はエチル基を表す。【００１４】
本発明の第１の態様に係る電子メディエーター修飾酵素は、下記の構造式（III）で表されるものであってもよい。【００１５】
【化３】
2018062542.tif 000005
【００１６】
構造式（III）中、Ｙはメチル基又はエチル基を表す。【００１７】
本発明の第１の態様に係る電子メディエーター修飾酵素において、前記酸化還元酵素Ｅが、ＦＡＤ又はＦＭＮを補酵素とする酸化還元酵素であってもよい。【００１８】
本発明の第１の態様に係る電子メディエーター修飾酵素において、前記酸化還元酵素Ｅが、ＮＡＤ又はＮＡＤＰを補酵素とする酸化還元酵素であってもよい。【００１９】
本発明の第１の態様に係る電子メディエーター修飾酵素において、前記酸化還元酵素Ｅが、ＰＱＱを補酵素とする酸化還元酵素であってもよい。【００２０】
本発明の第１の態様に係る電子メディエーター修飾酵素において、ＦＡＤ又はＦＭＮを補酵素とする前記酸化還元酵素Ｅが、グルコースを基質とするものであってもよく、前記酸化還元酵素Ｅが、ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素であってもよい。【００２１】
本発明の第１の態様に係る電子メディエーター修飾酵素において、前記酸化還元酵素Ｅが、乳酸、フルクトシルアミノ酸、コレステロール及び１，５−アンヒドログルシトールのいずれかを基質とするものであってもよい。【００２２】
本発明の第１の態様に係る電子メディエーター修飾酵素において、前記酸化還元酵素Ｅが、乳酸酸化酵素（ＬＯｘ）、フルクトシルアミノ酸酸化酵素（ＦＡＯｘ）、コレステロール酸化酵素（ＣｈＯｘ）及びピラノース酸化酵素（ＰｙＯｘ）のいずれかであってもよい。【００２３】
本発明の第２の態様は、基材と、作用電極と、対極とを有し、
前記作用電極の表面に、本発明の第１の態様に係る電子メディエーター修飾酵素が少なくとも１種固定されている酵素電極を提供することにより上記課題を解決するものである。【００２４】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様に係る電子メディエーター修飾酵素の少なくとも１種と、酸化還元指示薬とを含む分光学的分析キットを提供することにより上記課題を解決するものである。【００２５】
本発明の第４の態様は、本発明の第１の態様に係る電子メディエーター修飾酵素の少なくとも１種と、酸化還元指示薬とを含む酵素試験紙を提供することにより上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により提供される電子メディエーター修飾酵素は、リンカー部位を介して、電子メディエーターとして機能するフェナジン誘導体が酸化還元酵素に結合された構造を有している。それにより、フェナジン誘導体は常に酸化還元酵素の近傍に配置されるため、酸化還元酵素とフェナジン誘導体との間での電子の授受は、高価なルテニウム錯体等の遷移金属錯体を用いなくても効率的に行われる。したがって、本発明によると、安価で電子伝達効率に優れ、高感度かつ高精度での生体関連物質の計測を可能にする電子メディエーター修飾酵素、並びに該電子メディエーター修飾酵素を用いた酵素電極、分光学的分析キット及び酵素試験紙が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例２で作製したグルコース応答性酵素電極のグルコース濃度と電流との関係を示すグラフである。
【図２】実施例３で作製したグルコース応答性酵素電極のＣＡ測定結果を示すグラフである。
【図３】実施例３で作製したグルコース応答性酵素電極のグルコース濃度と電流との関係を示すグラフである。
【図４】実施例６で作製したグルコース応答性酵素電極のグルコース濃度と電流との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
続いて、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
【００２９】
［電子メディエーター修飾酵素］
本発明の第１の実施の形態に係る電子メディエーター修飾酵素（以下「電子メディエーター修飾酵素」と略称する場合がある。）は、下記の構造式（Ｉ）で表され、酸化還元酵素Ｅと、フェナジン誘導体と、酸化還元酵素Ｅと前記フェナジン誘導体とを連結するリンカー部位Ｌとを有している。
【００３０】
【化４】
2018062542.tif 000006
【００３１】
構造式（Ｉ）中、Ｘは陰イオンを表し、Ｙは炭素数１〜５の置換基を有してもよい直鎖又は分岐鎖アルキル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、互いに独立して、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基若しくはアルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基又は置換基を有してもよいアミノ基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８のうち少なくとも１つは、リンカー部位Ｌである。
【００３２】
陰イオンＸ
フェナジン誘導体の対イオンである陰イオンＸとしては、電子伝達特性等に影響を与えない限りにおいて、任意の有機又は無機陰イオンを特に制限なく用いることができる。陰イオンＸの具体例としては、塩化物イオン、臭化物イオン等のハロゲン化物イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオン、乳酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオン、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸等のアルキルスルホン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン等のアリールスルホン酸イオン等の有機酸イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、メチル硫酸イオン、エチル硫酸イオン、リン酸イオン等の無機酸イオン等が挙げられる。好ましい陰イオンの具体例としては、メチル硫酸イオン又はエチル硫酸イオンが挙げられる。
【００３３】
アルキル基Ｙ
フェナジン環の窒素原子上のアルキル基Ｙは、炭素数１〜５の直鎖又は分岐鎖アルキル基のうち任意のものである。好ましいアルキル基Ｙの具体例としては、メチル基及びエチル基が挙げられる。
【００３４】
置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８
フェナジン環上の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、互いに独立して、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基若しくはアルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基又は置換基を有してもよいアミノ基である。隣接する置換基同士が結合して、飽和又は不飽和の環を形成していてもよい。アルキル基及びアルコキシ基は、酵素活性及び電子伝達特性等に影響を与えない限りにおいて、任意の炭素数の直鎖又は分岐鎖アルキル基又はアルコキシ基であってもよい。アルキル基及びアルコキシ基上の置換基も、酵素活性及び電子伝達特性等に影響を与えない限りにおいて任意のものであってよいが、リンカー部位Ｌとして、酸化還元酵素Ｅとフェナジン誘導体とを連結する機能を果たすものは、酸化還元酵素Ｅ上の水酸基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基等の官能基と、カルボキシル基、イソシアネート基、アミノ基、チオール基等の反応性官能基との反応により形成された、エステル基、アミド基、ウレタン基、尿素基、ジスルフィド基等の官能基を有していてもよい。官能基は、反応性の官能基であってもよく、発色団、電子輸送機能等の機能を有するものであってもよい。
【００３５】
リンカー部位Ｌ
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８のうち少なくとも１つは、酸化還元酵素Ｅと、電子メディエーターとして作用するフェナジン誘導体を連結するリンカー部位（Ｌ）である。リンカー部位Ｌとしては、酵素活性及び電子伝達特性等に影響を与えない限りにおいて、任意の原子団を制限なく用いることができる。リンカー部位Ｌの具体例としては、Ｃ−Ｃ結合間又は側鎖に、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、エステル、アミド、ウレタン、尿素、シクロアルキレン基、アリール基、ヘテロアリール基等を有していてもよく、分岐を有していてもよいアルキレン基が挙げられる。
【００３６】
電子メディエーター修飾酵素の好ましい一例は、下記の構造式（II）又は（III）で表されるものである。
【００３７】
【化５】
2018062542.tif 000007
【００３８】
【化６】
2018062542.tif 000008
【００３９】
構造式（II）及び（III)中、Ｘはメチル硫酸イオン又はエチル硫酸イオンであり、Ｙはメチル基又はエチル基である。
【００４０】
酸化還元酵素Ｅ
電子メディエーター修飾酵素において、用いられる酸化還元酵素Ｅとしては、使用目的、計測対象となる生体関連物質等に応じて、所望の基質特異性を有する任意の起源の脱水素酵素、酸化酵素、還元酵素、酸素添加酵素、水素転移酵素等を適宜選択して用いることができる。酸化還元酵素の具体例としては、下記のものが挙げられる。
（１）ＦＡＤ又はＦＭＮを補酵素とするもの：ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素等
（２）ＮＡＤ又はＮＡＤＰを補酵素とするもの：アルコール脱水素酵素等
（３）ＰＱＱを補酵素とするもの：細菌由来グルコース脱水素酵素等
（４）その他のもの：フルクトシルアミノ酸酸化酵素（ＦＡＯｘ）、ピラノース酸化酵素（ＰｙＯｘ）、乳酸酸化酵素（ＬＯｘ）、コレステロール酸化酵素（ＣｈＯｘ）。この中でＦＡＯｘは糖化ヘモグロビンや糖化アルブミンといった糖化蛋白質を加水分解して生じる糖化アミノ酸を基質とする酸化酵素であり、この酵素を用いることで糖尿病の中長期の血糖管理の指標である糖化蛋白質の計測を行うことができる。またＰｙＯｘは糖尿病の短・中期の血糖管理の指標である１，５−アンヒドログルシトールの酵素分析法に用いられている酵素である。ＰｙＯｘは基質特異性が広く、本酵素の活性の有無を検出するためには同酵素のグルコースの活性を確認できれば、１，５−アンヒドログルシトールにも同様の活性を示すことは自明である。
【００４１】
電子メディエーター修飾酵素の合成は、反応後にリンカー部位Ｌとなるフェナジン誘導体上の置換基が有する反応性の官能基と、酸化還元酵素Ｅ上の官能基とを反応させることにより行われる。酸化還元酵素Ｅの変性や失活を避けるため、合成は、好ましくは、水系溶媒中温和な条件下で進行する反応により行われる。例えば、後述するカルボン酸とアミンの反応によるアミドの形成においては、カルボン酸の活性エステルとして、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）を用いてもよい。
【００４２】
反応後にリンカー部位Ｌとなるフェナジン誘導体上の反応性の官能基と酸化還元酵素Ｅ上の官能基の組み合わせの具体例としては、（１）カルボン酸とアミン：アミド、（２）カルボン酸と水酸基：エステル、（３）イソシアネートとアミン：尿素、（４）イソシアネートと水酸基：ウレタン、（５）チオール基：ジスルフィド等が挙げられる。或いは、化学修飾が必要となるが、アジドとアルキンのフイスゲン環化（いわゆる「クリックケミストリー」）、マレイミドとチオール基の反応によるチオコハク酸イミドの生成等により、フェナジン誘導体と酸化還元酵素Ｅとを結合させてもよい。
【００４３】
［酵素電極］
本発明の第２の実施の形態に係る酵素電極（以下、「酵素電極」と略称する場合がある。）は、少なくとも、絶縁性の基材と、作用電極と、対極とを有し、作用電極の表面には、本発明の第１の実施の形態に係る電子メディエーター修飾酵素が固定されている。酵素電極は、必要に応じて、参照極を有してもよい。酵素電極は、電子メディエーター修飾酵素に触媒される酵素反応に伴う電子移動を、電流値の変化として読み出すことができ、サンプル中の基質濃度の定量等に用いることができる。
【００４４】
作用電極及び対極は、任意の材質及び形状のものであってよい。例えば、作用電極及び対極として、カーボン電極を用いてもよいし、白金、金、銀、ニッケル、パラジウム等の金属電極を用いてもよい。参照極としては、特に限定されるものではなく、電気化学実験において一般的なものを特に制限なく用いることができるが、その具体例としては、飽和カロメル電極、銀−塩化銀電極等が挙げられる。
【００４５】
絶縁性の基材上に電極を形成する方法としては、フォトリゾグラフィ法や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷等の印刷法等が挙げられる。また、絶縁性基材の材料としては、任意の公知のものを特に制限なく用いることができ、その具体例としては、シリコン、ガラス、ガラスエポキシ、セラミック、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリプロピレン、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル及びポリイミド等が挙げられる。
【００４６】
電子メディエーター修飾酵素の作用電極表面への固定には、任意の公知の方法を特に制限なく用いることができ、その具体例としては、（１）水素結合、分子間力、疎水性相互作用等を介して作用電極の表面に電子メディエーター修飾酵素を吸着させる物理吸着法、（２）作用電極の表面に、表面官能基と架橋分子との反応等を利用して反応性の高い官能基を導入し、これを電子メディエーター修飾酵素の官能基と反応させ、形成された共有結合を介して電子メディエーター修飾酵素を作用電極の表面に固定する共有結合法、（３）架橋剤により電子メディエーター修飾酵素同士を架橋し不溶化させる架橋化法、（４）高分子等のマトリックスに電子メディエーター修飾酵素を包括させる包括法等が挙げられ、これらのうち複数の方法を組み合わせて用いることもできる。安定性等の観点からは、（２）の共有結合法が好ましく、インクジェット法等による印刷法が適用可能な点で、（４）の包括法も好ましい。
【００４７】
本発明の第３の実施の形態に係る分光学的分析キット（以下、「分光学的分析キット」と略称する場合がある。）は、本発明の第１の実施の形態に係る電子メディエーター修飾酵素と、酸化還元指示薬とを含み、溶液中で電子メディエーター修飾酵素に触媒される基質の酸化還元反応に伴う電子移動を、酸化還元指示薬の色（特定波長における吸光度）の変化として読み出すために用いられる。分光学的分析キットは、電子メディエーター修飾酵素及び酸化還元指示薬を、同一の容器中に収容された状態で含んでいてもよく、それぞれ個別の容器に収容された状態で含んでいてもよい。容器は、電子メディエーター修飾酵素及び酸化還元指示薬を安定に保存できる任意のものを用いることができる。容器の具体例としては、ガラス又は合成樹脂製ボトル、バイアル、アンプル等が挙げられる。電子メディエーター修飾酵素及び酸化還元指示薬は、結晶、粉末等の状態で容器中に収容されていてもよく、適当な溶媒又は分散媒中に溶解又は分散された状態で収容されていてもよい。
【００４８】
酸化還元指示薬は、電子メディエーター修飾酵素に用いられる電子メディエーターの酸化還元電位等に応じて、電子メディエーターとの間で電子の授受が可能なものを適宜選択して用いることができる。
【００４９】
分光学的分析キットは、必要に応じて、取扱説明書等と共に、溶媒、分散媒、希釈液等を、包装容器に同梱された状態で含んでいてもよい。
【００５０】
本発明の第４の実施の形態に係る酵素試験紙（以下、「酵素試験紙」と略称する場合がある。）は、発明の第１の実施の形態に係る電子メディエーター修飾酵素と、酸化還元指示薬とを、紙等のシート状の基材に含浸された状態で含んでおり、電子メディエーター修飾酵素に触媒される、酵素試験紙上に滴下された基質の酸化還元反応に伴う電子移動を、酸化還元指示薬の色（特定波長における吸光度）の変化として読み出すために用いられる。
【００５１】
酵素試験紙に用いられる電子メディエーター修飾酵素及び酸化還元指示薬は、前述の分光学的分析キットの場合と同様であるので、詳しい説明を省略する。酵素試験紙に用いられる基材としては、電子メディエーター修飾酵素及び酸化還元指示薬を含浸された状態で保持することが可能であり、吸水性を有し、試験紙として用いられる紙、不織布等のシート状のものを特に制限なく用いることができる。
【実施例】
【００５２】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
実施例１：ＰＥＳ修飾ＦＡＤＧＤＨの調製
カビ由来ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素（ＦＡＤＧＤＨ）水溶液（３６．２ｍｇ／ｍＬ、蒸留水）８．５μＬに対して、１−（３−カルボキシルプロパン）オキシ−５−エチルフェナジニウムエタンスルホン酸塩のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ａｒＰＥＳ）５０ｍＭ水溶液５又は８μＬ（終濃度２．５又は４．０ｍＭ）、及び５０ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ＝８．３）４０μＬを添加して、蒸留水を加え１００μＬとした。また、この混合反応溶液を、２５℃において２時間振盪した（１２００ｒｐｍ）。反応終了後、未反応のａｒＰＥＳを除くため、限外ろ過カラム（ａｍｉｃｏｎ（登録商標）  ｕｌｔｒａ  ３０ｋ、Ｍｅｒｃｋ）、２０ｍＭ  Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ＝７．０）を用いて緩衝液の交換を行った。【００５３】
以上の様に調製したＰＥＳ修飾ＦＡＤＧＤＨ（構造式（II））の酵素活性を、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）系、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）／ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロインドフェノール）系又はＤＣＩＰ系により測定した。ＭＴＴ系では、１ｍＭ  ＭＴＴ、０．０４％  Ｔｒｉｔｏｎ、２０ｍＭ  Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ＝７．０）中で、１００ｍＭグルコースを添加した時の５７０ｎｍの吸光度の増加を測定した。ＰＭＳ／ＤＣＩＰ系では、０．６ｍＭ  ＰＭＳ、０．０６ｍＭ  ＤＣＩＰ、２０ｍＭ  Ｐ．Ｐ．Ｂ．（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ＝７．０）中で、１００ｍＭグルコースを添加した時の６００ｎｍの吸光度の減少を測定した。【００５４】
【化７】
2018062542.tif 000009
【００５５】
酵素のＰＥＳ修飾時の、酵素：ａｒＰＥＳ混合比を１：５０又は１：８０として、修飾反応を行った。反応中の酵素及びａｒＰＥＳ混合溶液を３倍に希釈した場合の検討も併せて行った。修飾反応では、希釈なしの場合に凝集が見られたが、酵素・ａｒＰＥＳ混合溶液を３倍に希釈した反応溶液では、目視で凝集は見られなかった。ただ、蒸留水への交換、濃縮過程において凝集が見られた。回収された酵素量は希釈した反応液の方が多かった。調製した各修飾酵素の酵素活性測定（１ｍＭ  ＭＴＴ又は０．６ｍＭ  ＰＭＳ／０．０６ｍＭ  ＤＣＩＰ、グルコース濃度１００  ｍＭ）の結果を表１に示す。【００５６】
【表１】
2018062542.tif 000010
【００５７】
ＭＴＴ活性に関しては、混合比１：５０で調製した酵素では、希釈なしの場合に１４．３Ｕ／ｍｇ、希釈反応液の場合に１０．９Ｕ／ｍｇであり、希釈によってＰＥＳ修飾効率が低下していると考えられた。一方、混合比１：８０では、希釈なしの場合１５．７Ｕ／ｍｇ、希釈反応液の場合１７．７Ｕ／ｍｇであり、希釈してもＰＥＳ修飾効率の低下が見られなかった。修飾反応に用いるａｒＰＥＳの凍結融解の影響を検討するため、復水してそのまま使用する場合と、復水、凍結融解後のａｒＰＥＳを使用した場合での修飾効率の差をＭＴＴ活性で評価した。その結果、凍結融解後のａｒＰＥＳを使用した場合でのＭＴＴ活性は１１．８Ｕ／ｍｇと、８０％程度の活性の低下が観察された。この結果を元に、以後の実験では、ａｒＰＥＳを凍結融解せずに用いることとした。【００５８】
実施例２：ＰＥＳ修飾ＦＡＤＧＤＨを用いた酵素電極の調製（１）
カーボン印刷電極；１０ｍＭ  Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ＝７．０）中で、最終濃度が、それぞれ０．５％、５ｍＭ、５．１６ｍｇ／ｍＬ、１．２％となるよう、トレハロース、ａｒＰＥＳ、カビ由来ＦＡＤＧＤＨ、ケッチェンブラックを混合し、これをＰＥＳ修飾酵素インクとした。調製した酵素インクは、カーボン電極上に１６０ｎＬ／ｍｍ２で塗布（１６０ｎＬ×１）した。電極チップの作用電極上にＰＥＳ修飾酵素インクを塗布後、室温、低湿度下（ＭｃＤｒｙ：相対湿度１％）にて２時間乾燥した。乾燥した電極チップを、２５℃にてグルタルアルデヒド蒸気に１時間曝露し、これをＰＥＳ修飾酵素電極チップとして使用した。併せて、ＰＥＳ修飾していないカビ由来ＦＡＤＧＤＨを用いる以外は同様の手順を用いて調製したＰＥＳ非修飾酵素インクを用いて、ＰＥＳ非修飾酵素電極チップを作製した。各電極チップは、低湿度下（ＭｃＤｒｙ：相対湿度１％）にて測定まで保存した。【００５９】
２０ｍＭ  Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ＝７．０）中、０〜６００ｍｇ／ｄＬに調製したグルコース溶液を用い、ＰＥＳ修飾酵素電極チップの検量線の作成を行った。また、同濃度のグルコース溶液及び更に０．３６ｍＭの１−メトキシＰＥＳ（ｍＰＥＳ）を含む同濃度のグルコース溶液を用いて、ＰＥＳ修飾していないＦＡＤＧＤＨを用いて、ＰＥＳ非修飾酵素電極チップの検量線の作成を行った。測定にはクロノアンペロメトリー（ＣＡ）法を用い、検体添加後５秒後に電位を印加する（待ち時間５秒）方法により行った。印加電位は＋１００ｍＶ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ、電位印加時間は４５秒とした。【００６０】
測定結果を図１に示す。ＰＥＳ修飾酵素電極チップでは、グルコース溶液にｍＰＥＳを添加しなくても、６００ｍｇ／ｄＬまで基質濃度依存的応答を示した。一方、ＰＥＳ非修飾酵素電極チップでは、グルコース溶液にｍＰＥＳを添加しない場合にはグルコース濃度依存的な電流応答が観測されず、グルコース溶液にｍＰＥＳを添加した場合には、電流応答が高基質濃度で飽和した。ＰＥＳ修飾酵素電極チップを用いた場合、ＰＥＳ非修飾酵素電極チップを用い、グルコース溶液にｍＰＥＳを添加した場合に比べ、より幅広いグルコース濃度にわたって、グルコース濃度依存的な電流応答が確認できた。【００６１】
実施例３：ＰＥＳ修飾ＦＡＤＧＤＨを用いた酵素電極の調製（２）
１０ｍＭ  Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ＝７．０）中で最終濃度が、それぞれ０．５％、０．５、２．５又は５ｍＭ、５．０ｍｇ／ｍＬ、１．２％となるよう、トレハロース、ａｒＰＥＳ、カビ由来ＦＡＤＧＤＨ、ケッチェンブラックを混合し、これをＰＥＳ修飾酵素インクとした。調製した３種類のＰＥＳ修飾酵素インクを、ＤＥＰチップの円型カーボン電極上に２００ｎＬずつ２回積層塗布した。乾燥後、１０％ＢＳＡ溶液を更に２００ｎＬ塗布し、室温、低湿度下（ＭｃＤｒｙ：相対湿度１％）で２時間乾燥した。乾燥した各チップは、２５℃でグルタルアルデヒド蒸気に１時間曝露した。作製した各電極チップは、低湿度下（ＭｃＤｒｙ：相対湿度１％）で測定まで保存した。【００６２】
このようにして作製したチップをポテンショスタットと接続し、バッチセルに浸漬し、印加電位＋１００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）、攪拌速度２５０ｒｐｍにてＣＡ測定を行った。測定溶液は１００ｍＭ  Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ＝７．０）とし、同緩衝液で調製したグルコース溶液を５、１０、２５、５０、１００、３００、６００ｍｇ／ｄＬとなるように順次添加した。検量線の作製後、同緩衝液、同条件で、引き続き２０時間の連続測定を行った。【００６３】
異なる濃度のＰＥＳ修飾酵素インクを調製して３種類のグルコース応答性電極チップの作製を行い、その電流応答を比較した。ＣＡ測定では、いずれのグルコース応答性電極チップも基質濃度依存的応答を示したが（図２参照）、観測された応答電流値は、混合したａｒＰＥＳ量が多いほど高いという結果が得られた。ＣＡ測定から作製した検量線は、ａｒＰＥＳの濃度が５ｍＭの場合と２．５ｍＭの場合では直線性に大きな差は観測されなかったが、ａｒＰＥＳ濃度が０．５ｍＭの場合、より低濃度のグルコース濃度で応答が飽和した（図３参照）。【００６４】
実施例４：ＰＥＳ修飾ＬＯｘ及びＰＥＳ修飾ＣｈＯｘの調製
乳酸菌由来乳酸酸化酵素（ＬＯｘ）３００μｇに５０ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ＝８．３）２０μＬ、５０ｍＭ ａｒＰＥＳ水溶液５μＬを加え、蒸留水を加え１２０μＬとした。この混合反応溶液を、２０℃において２時間振盪した（１２００ｒｐｍ）。反応終了後、未反応のａｒＰＥＳを除くため、限外ろ過カラム（ａｍｉｃｏｎ（登録商標）  ｕｌｔｒａ  ３０ｋ、Ｍｅｒｃｋ）、２０ｍＭ  Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ＝７．０）を用いて緩衝液の交換を行った。ストレプトマイセス属由来のコレステロール酸化酵素（ＣｈＯｘ）に関しても同様にＰＥＳ修飾を行った。【００６５】
以上のように調製したＰＥＳ修飾ＬＯｘ及びＰＥＳ修飾ＣｈＯｘの酵素活性を、ＭＴＴ系及びＰＭＳ／ＭＴＴ系により測定した。ＭＴＴ系では、１ｍＭ  ＭＴＴ、０．０４％  Ｔｒｉｔｏｎ、２０ｍＭ  Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ＝７．０）中で、ＰＭＳ／ＭＴＴ系では、０．６ｍＭ  ＰＭＳ、１ｍＭ  ＭＴＴ、０．０４％  Ｔｒｉｔｏｎ、２０ｍＭ  Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ＝７．０）中で、１ｍＭの乳酸または１００μＭのコレステロールを添加した時の５７０ｎｍの吸光度の増加を測定した。結果を表２に示す。【００６６】
【表２】
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【００６７】
電子メディエーターを添加しない場合、ＬＯｘやＣｈＯｘにおいて、ＭＴＴの発色は全く観察されなかった。これに対して、これらの酵素をＰＥＳ修飾することで、電子メディエーターを添加していないＭＴＴ系は、電子メディエーターを添加したＰＭＳ／ＭＴＴ系の１０％前後の発色を示した。以上の結果からＰＥＳ修飾ＬＯｘおよびＰＥＳ修飾ＣｈＯｘを用いることで、他の電子メディエーターを加えることなく、乳酸あるいはコレステロールのそれぞれを計測できることが示された。【００６８】
実施例５：ＰＥＳ修飾ＰｙＯｘの調製
カワラタケ属由来ピラノース酸化酵素（ＰｙＯｘ）１ｍｇに５０ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ＝８．３）４０μＬ、５０ｍＭ ａｒＰＥＳ水溶液５μＬを加え、蒸留水を加え１００μＬとした。この混合反応溶液を、２０℃において２時間振盪した（１２００ｒｐｍ）。反応終了後、未反応のａｒＰＥＳを除くため、限外ろ過カラム（ａｍｉｃｏｎ（登録商標）  ｕｌｔｒａ  ３０ｋ、Ｍｅｒｃｋ）、２０ｍＭ  Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ＝７．０）を用いて緩衝液の交換を行った。【００６９】
以上のように調製したＰＥＳ修飾ＰｙＯｘの酵素活性を、ＭＴＴ系及びＰＭＳ／ＭＴＴ系により測定した。ＭＴＴ系では、１ｍＭ  ＭＴＴ、０．０４％  Ｔｒｉｔｏｎ、２０ｍＭ  Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ＝７．０）中で、ＰＭＳ／ＭＴＴ系では、０．６ｍＭ  ＰＭＳ、１ｍＭ  ＭＴＴ、０．０４％  Ｔｒｉｔｏｎ、２０ｍＭ  Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ＝７．０）中で、１ｍＭの乳酸または１００μＭのコレステロールを添加した時の５７０ｎｍの吸光度の増加を測定した。結果を表３に示す。【００７０】
【表３】
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【００７１】
電子メディエーターを添加しない場合、ＰＥＳ修飾によりＭＴＴ系の活性は１５倍以上に向上し、電子メディエーターを添加したＰＭＳ／ＭＴＴ系と比較すると、７％程度の発色を示した。ＰｙＯｘは糖尿病の短・中期の血糖管理の指標である１，５−アンヒドログルシトールの酵素分析法に用いられている酵素である。ＰｙＯｘは基質特異性が広く、本酵素の活性の有無を検出するためには同酵素のグルコースの活性を確認できれば、１，５−アンヒドログルシトールにも同様の活性を示すことは自明である。したがって、ＰＥＳ修飾ＰｙＯｘを用いて、他のメディエーターを加えることなく、ＭＴＴの発色が観察されたことから、１，５−アンヒドログルシトールの計測が行えることをこれらの結果は示している。【００７２】
実施例６：ＰＥＳ修飾ＰｙＯｘを用いた酵素電極の調製
５ｍＭ  Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ＝７．０）中で最終濃度が、それぞれ０．２５％、２．５ｍｇ／ｍＬ、１．２％、０．６％となるよう、トレハロース、ＰＥＳ修飾ＰｙＯｘ、ＢＳＡ、ケッチェンブラックを混合し、これをＰＥＳ修飾酵素インクとした。調製したＰＥＳ修飾酵素インクを、ＤＥＰチップの円型カーボン電極上に２００ｎＬずつ２回積層塗布した。室温、低湿度下（ＭｃＤｒｙ：相対湿度１％）で２時間乾燥した。乾燥したチップは、２５℃でグルタルアルデヒド蒸気に１時間曝露した。作製した酵素電極チップは、低湿度下（ＭｃＤｒｙ：相対湿度１％）で測定まで保存した。【００７３】
このようにして作製したチップをポテンショスタットと接続し、バッチセルに浸漬し、印加電位＋５０ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）、攪拌速度２５０ｒｐｍにてＣＡ測定を行った。測定溶液は１００ｍＭ  Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ＝７．０）とし、同緩衝液で調製したグルコース溶液を５、１０、２５、５０、１００、３００、６００ｍｇ／ｄＬとなるように順次添加した。【００７４】
ＣＡ測定では、グルコース濃度依存的応答を示し（図４参照）、ＰＥＳ修飾ＰｙＯｘを用いたグルコースが計測できることが示された。ＰｙＯｘは糖尿病の短・中期の血糖管理の指標である１，５−アンヒドログルシトールの酵素分析法に用いられている酵素である。ＰｙＯｘは基質特異性が広く、本酵素の活性の有無を検出するためには同酵素のグルコースの計測が可能であれば、１，５−アンヒドログルシトールの計測も同様に可能であることは自明である。したがって、ＰＥＳ修飾ＰｙＯｘを用いて、他のメディエーターを加えることなく、１，５−アンヒドログルシトールの計測が行えることをこれらの結果は示している。【００７５】
フルクトシルアミノ酸酸化酵素(ＦＡＯｘ)をｄＨ２Ｏで復水し、限外ろ過カラム（ａｍｉｃｏｎ（登録商標）  ｕｌｔｒａ  ３０ｋ，Ｍｅｒｃｋ）を用いてｄＨ２Ｏに交換・濃縮した。酵素約６００μｇに対して、５０ｍＭ  ａｒ−ＰＥＳ  ２．５μＬ、５０ｍＭ  ＴＡＰＳ（ｐＨ８．３）緩衝液を４０μＬ添加して、ｄＨ２Ｏで１００μＬにメスアップして混合した後、２５℃において２時間振盪した（１２００ｒｐｍ）。反応後未反応のａｒＰＥＳを除くため、限外ろ過カラム（ａｍｉｃｏｎ（登録商標）  ｕｌｔｒａ  ３０ｋ，Ｍｅｒｃｋ）、ｄＨ２Ｏを用いて緩衝液の交換を行った。以上のように調製したＰＥＳ修飾酵素の活性をＭＴＴ、もしくはＰＭＳ／ＭＴＴ系により測定した。１ｍＭ  ＭＴＴ、０又は０．６ｍＭ  ＰＭＳ、０．０４％  Ｔｒｉｔｏｎ，２０ｍＭ  Ｐ．Ｐ．Ｂ．（ｐＨ７．０）中で、基質を添加した時の５７０ｎｍの吸光度の増加を測定した。測定時の基質濃度は、１ｍＭフルクトシルバリンとした。【００７６】
ＰＥＳ修飾ＦＡＯｘに対して、ＭＴＴを用いた酵素活性測定を行った。調製したＰＥＳ修飾ＦＡＯｘのＭＴＴを用いた酵素活性測定の結果、ＭＴＴ活性は０．３１Ｕ／ｍｇであった。ＰＭＳをメディエーターとして用いた際のＭＴＴ活性は２５Ｕ／ｍｇであった。一方、未修飾のＦＡＯＤのＭＴＴ活性は０．１２Ｕ／ｍｇ，ＰＭＳ／ＭＴＴ系での活性は２３Ｕ／ｍｇであったことから、ＦＡＯｘをａｒＰＥＳで修飾することによりＭＴＴを発色試薬とする活性が３倍程度に上昇した。ＦＡＯｘは糖化ヘモグロビンや糖化アルブミンといった糖化蛋白質を加水分解して生じる糖化アミノ酸を基質とする酸化酵素であり、この酵素を用いることで糖尿病の中長期の血糖管理の指標である糖化蛋白質の計測を行うことができる。したがって、これらの結果はＰＥＳ修飾ＦＡＯｘを用いることで、他の電子メディエーターを加えることなく糖化タンパク質を計測できることを示している。【００７７】
なお、本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。【００７８】
本出願は、２０１６年９月３０日に出願された日本国特許出願２０１６−１９２７３０号に基づくものであり、その明細書、特許請求の範囲、図面および要約書を含むものである。上記日本国特許出願における開示は、その全体が本明細書中に参照として含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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