(57)【要約】本発明は、免疫賦活化、特にＴ細胞免疫賦活化を引き起こし得るアジュバントを提供する。本発明は、特に抗原特異的な免疫賦活化、特にＴ細胞免疫賦活化を引き起こしうるアジュバントを提供する。
2017209274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、アジュバント組成物。
【請求項２】
グランザイムＡが、セリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡである、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項３】
セリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡが、配列番号３に示されるアミノ酸配列の１８４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がセリンから他のアミノ酸に置換されたグランザイムＡである、請求項１または２に記載のアジュバント組成物。
【請求項４】
Ｔ細胞性免疫またはＢ細胞性免疫を賦活化することに用いるための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
【請求項５】
樹状細胞を成熟化させることに用いるための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
【請求項６】
アジュバントとしての有効量のグランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質と、免疫原性物質とを含む、抗原特異的免疫活性化用組成物。
【請求項７】
アジュバントとしての有効量のグランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を、免疫原性物質とのコンジュゲートの形態で含む、請求項６に記載の抗原特異的免疫活性化用組成物。
【請求項８】
請求項６または７に記載の抗原特異的免疫活性化用組成物であって、免疫原性物質がポリペプチドであり、アジュバントとしての有効量のグランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を、前記免疫原性物質との融合タンパク質の形態で含む、抗原特異的免疫活性化用組成物。
【請求項９】
免疫原性物質が、がん抗原である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の抗原特異的免疫活性化用組成物。
【請求項１０】
ワクチンとして用いるための、請求項７〜９のいずれか一項に記載の抗原特異的免疫活性化用組成物。
【請求項１１】
グランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む、免疫を賦活化することに用いるための組成物。
【請求項１２】
請求項１１で定義された核酸と、ペプチド性の免疫原性物質をコードする核酸との組合せであって、前記ペプチド性の免疫原性物質に対する免疫を賦活化することに用いるための組合せ。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組合せが、１つのベクターまたは別々に含む２つ以上のベクターに含まれる、前記ペプチド性の免疫原性物質に対する免疫を賦活化することに用いるための組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物で形質転換され、グランザイムＡと前記免疫原性物質とを発現する、動物細胞。
【請求項１５】
ペプチド性の免疫原性物質とグランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質との融合タンパク質であって、免疫原性を有する融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１５に記載の融合タンパク質を有する動物細胞。
【請求項１７】
請求項１４または１６に記載の細胞を有効成分として含む、抗原特異的免疫活性化用組成物。
【請求項１８】
グランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を含む動物細胞と免疫原性物質との組合せであって、前記免疫原性物質に対する免疫を賦活化することに用いるための組合せ。
【請求項１９】
請求項１７に記載の組合せを含む、抗原特異的免疫活性化用組成物。
【請求項２０】
免疫原性物質取込み脾臓細胞と組み合わせて投与される、前記免疫原性物質に対する免疫を賦活化することに用いるための請求項１〜５のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活化、特にＴ細胞免疫賦活化を引き起こし得るアジュバントに関する。本発明は、特に抗原特異的な免疫賦活化、特にＴ細胞免疫賦活化を引き起こしうるアジュバントに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系を効率的に賦活化し，抗原特異的な記憶を成立させることは、感染症、癌などに対するワクチンの開発において重要な課題である。その為には至適条件の抗原とアジュバントを用いる必要がある。アジュバントは、ラテン語の補助を意味する“adjuvare”に由来した言葉で、ワクチンの際の抗原の内因性免疫原性を修飾するものを示す。
臨床では、アジュバントとして塩化アルミニウム、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩(alum)が利用され、癌ワクチンには不完全フロイントアジュバント(IFA)が使用されてきたが、これらの効果は抗原特異的な免疫賦活化を誘導する上で、未だ十分といえない。また、これらの作用機序は不明であり、かつ、副作用の問題点が指摘され始めている（非特許文献１）。【０００３】
グランザイムＡは、セリンプロテアーゼ活性を有するタンパク質であり、細胞傷害性Ｔリンパ球から見つかった（非特許文献２）。グランザイムＡの機能としては、アポトーシスの誘導が報告されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Gherardi et al., Brain, 124: 1821-1831, 2001
【非特許文献２】Gershenfeld et al, Science, 232 (4752): 854-858, 1996
【非特許文献３】Martinvalet et al, Cell, 133 (4): 681-692, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、免疫賦活化、特にＴ細胞免疫賦活化を引き起こし得るアジュバントを提供する。本発明は、特に抗原特異的な免疫賦活化、特にＴ細胞賦活化を引き起こしうるアジュバントを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、免疫賦活化、特にＴ細胞免疫賦活化を引き起こし得るアジュバントを提供する。本発明は、特に抗原特異的な免疫賦活化、特にＴ細胞賦活化を引き起こしうるアジュバントを提供する。【０００７】
本発明者らは、グランザイムＡが、セリンプロテアーゼ活性に非依存的に免疫賦活化することを明らかにした。本発明者らはまた、この免疫賦活化において抗原特異的な免疫の賦活化が生じていることも明らかにした。本発明者らはさらに、グランザイムＡは、抗原特異的なＴ細胞の誘導、樹状細胞の成熟（例えば、ＣＤ８陽性樹状細胞および／またはＣＤ８陰性樹状細胞の成熟）、インターフェロンγの産生を引き起こすことも明らかにした。本発明は、このような知見に基づく発明である。【０００８】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）グランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、アジュバント組成物。
（２）グランザイムＡが、セリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡである、上記（１）記載のアジュバント組成物。
（３）セリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡが、配列番号３に示されるアミノ酸配列の１８４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がセリンからアラニンに置換されたグランザイムＡである、上記（２）に記載のアジュバント組成物。
（４）Ｔ細胞性免疫またはＢ細胞性免疫を賦活化することに用いるための、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のアジュバント組成物。
（５）樹状細胞を成熟化させることに用いるための、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のアジュバント組成物。
（６）アジュバントとしての有効量のグランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質と、免疫原性物質とを含む、抗原特異的免疫活性化用組成物。
（７）アジュバントとしての有効量のグランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を、免疫原性物質とのコンジュゲートの形態で含む、上記（６）に記載の抗原特異的免疫活性化用組成物。
（８）上記（６）または（７）に記載の抗原特異的免疫活性化用組成物であって、免疫原性物質がポリペプチドであり、アジュバントとしての有効量のグランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を、前記免疫原性物質との融合タンパク質の形態で含む、抗原特異的免疫活性化用組成物。
（９）免疫原性物質が、がん抗原である、上記（６）〜（８）のいずれかに記載の抗原特異的免疫活性化用組成物。
（１０）ワクチンとして用いるための、上記（６）〜（９）のいずれかに記載の抗原特異的免疫活性化用組成物。
（１１）グランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む、免疫を賦活化することに用いるための組成物。
（１２）上記（１１）で定義された核酸と、ペプチド性の免疫原性物質をコードする核酸との組合せであって、前記ペプチド性の免疫原性物質に対する免疫を賦活化することに用いるための組合せ。
（１３）上記（１２）に記載の組合せが、１つのベクターまたは別々に含む２つ以上のベクターに含まれる、前記ペプチド性の免疫原性物質に対する免疫を賦活化することに用いるための組成物。
（１４）上記（１３）に記載の組成物で形質転換され、グランザイムＡと前記免疫原性物質とを発現する、動物細胞。
（１５）ペプチド性の免疫原性物質とグランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質との融合タンパク質であって、免疫原性を有する融合タンパク質。
（１６）上記（１５）に記載の融合タンパク質を有する動物細胞。
（１７）上記（１４）または（１６）に記載の細胞を有効成分として含む、抗原特異的免疫活性化用組成物。
（１８）グランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を含む動物細胞と免疫原性物質との組合せであって、前記免疫原性物質に対する免疫を賦活化することに用いるための組合せ。
（１９）上記（１８）に記載の組合せを含む、抗原特異的免疫活性化用組成物。
（２０）免疫原性物質取込み脾臓細胞と組み合わせて投与される、前記免疫原性物質に対する免疫を賦活化することに用いるための上記（１）〜（５）のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、抗原とグランザイムＡを発現する細胞が抗原特異的なＴ細胞を誘導することを示す図である。図１では、抗原は、オボアルブミンである。図中グランザイムＡは、ｇｒｍＡと略されていることがあり、以下の図でも同様である。
【図２】図２は、抗原特異的なＴ細胞誘導は、他のグランザイムよりもグランザイムＡにより強く引き起こされることを示す図である（図２Ａ参照）。図２はまた、グランザイムＡによる抗原特異的なＴ細胞誘導には、グランザイムのセリンプロテアーゼ活性がほとんど関与しないことを示す図である（図２Ｂ参照）。図中のＳ１８４Ａ  ｇｚｍＡは、グランザイムＡのセリンプロテアーゼ活性を実質的に喪失させた変異体である。
【図３】図３は、グランザイムＡが、リポポリサッカライド（以下、「ＬＰＳ」ともいう）と同等かそれよりも強く樹状細胞を成熟化させる作用を有することを示す図である。図中、ＤＣは樹状細胞を意味する。図中のＣＤ８６は、成熟した樹状細胞のマーカーである。
【図４】図４は、グランザイムＡが、リポポリサッカライド（以下、「ＬＰＳ」ともいう）と同等かそれよりも強くＣＤ８陽性樹状細胞およびＣＤ８陰性樹状細胞を成熟化させることを示す図である。
【図５】図５は、マウスに抗原とグランザイムＡを投与すると抗原特異的なＴ細胞が誘導されることを示す図である（図５Ａ参照）。図５はまた、マウスに抗原とグランザイムＡを投与するとインターフェロンγが産生されることを示す図である（図５Ｂ参照）。図中の「ｐｅｐ」は、ＯＶＡを意味する。
【図６】図６は、マウスにおいてグランザイムＡが抗原特異的にがんを抑制できることを示す図である。
【図７】図７は、抗原とグランザイムＡを投与したマウスでは、抗原特異的なＩｇＧ２抗体の産生量が増加し、抗原と水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）を投与したマウスでは、抗原特異的なＩｇＧ１抗体の産生量が増加することを示す図である。
【発明の具体的な説明】
【００１０】
本明細書では、「アジュバント組成物」とは、アジュバントとして用いる組成物を意味する。アジュバント組成物は、例えば、免疫原性物質と組み合わせて同時にまたは別々に投与すると、前記免疫原性物質に対する免疫を賦活化することができる。本明細書では、アジュバント組成物を、免疫賦活剤、免疫増強剤、または免疫賦活化することに用いるための組成物ということがある。本明細書では、アジュバント組成物は、抗原特異的なＴ細胞の誘導することに用いるため、特に抗原特異的なＣＤ８シングルポジティブ細胞を誘導することに用いるため、樹状細胞（例えば、ＣＤ８陽性樹状細胞およびＣＤ８陰性樹状細胞）を成熟化させることに用いるため、などの様々な目的に用いることができる。ＣＤ８シングルポジティブ細胞とは、ＣＤ８が陽性でありＣＤ４が陰性であるＴ細胞を意味し、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が挙げられる。
【００１１】
本明細書では、「免疫原性物質」とは、免疫原性を有する物質一般を意味する。免疫原性物質としては、投与対象において外因性の抗原となる物質（例えば、細菌トキソイドなどのトキソイド、ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、タンパク質複合体、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、抗原を表出した細胞、目的抗原ペプチドを表出した細胞および免疫刺激複合体及びこれらの断片）、及び投与対象において内因性の抗原となる物質（例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、Ｍａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−３、ｇｐ１００、チロシナーゼ，ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＣＡ−１２５、ｅｒｂ−２、Ｍｕｃ−１、Ｍｕｃ−２、ＴＡＧ−７２、ＡＥＳ、ＦＢＰ、Ｃ−レクチン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｇａｌｅｃｔｉｎ−４／ＮＹ−ＣＯ−２７、Ｐｅｃ６０、ＨＥＲ−２／ｅｒｂＢ−２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、Ｇ２５０、Ｈｓｐ１０５、点変異ｒａｓ癌遺伝子、点変異ｐ５３癌遺伝子、癌胎児性抗原、proteinase 3、ＷＴ−１、ｈＴＥＲＴ、ＰＲＡＭＥ、ＰＭＬ／ＲＡＲ−ａ、ＤＥＫ／ＣＡＮ、シクロフィリンＢ、ＴＥＬ−ＭＡＬ１、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＯＦＡ−ｉＬＲＰ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｓｐｅｒｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １７、ＳＰＡＮ−Ｘｂ、ＣＴ−２７、ＭＵＣ１などのがん抗原及びこれらの断片）が挙げられる。本明細書では、「ペプチド性の免疫原性物質」とは、翻訳後修飾等の修飾を有するペプチドまたは翻訳後修飾等の修飾を有しないペプチドであって、免疫原性を有するペプチドを意味する。
【００１２】
本明細書では、「核酸」とは、ヌクレオチドが連結した生体高分子を意味する。核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。
【００１３】
本明細書では、「動物」とは、免疫系、特に獲得免疫が備わった動物を意味し、脊椎動物、例えば、鳥類または哺乳動物、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類、特に、ヒトが挙げられる。本明細書では、動物は上述のようにヒトを含む意味で用いられ、ヒトを排除する場合には、非ヒト動物と記載する。
【００１４】
本明細書では、「ＡとＢとを組み合わせて投与する」またはこの類似表現は、ＡとＢとを組み合わせて投与する限り、ＡとＢとを混合して投与してもよいし、またはＡとＢとを別体として同時に若しくは逐次的に投与してもよいことを意味する。
【００１５】
本明細書では、「グランザイムＡ」とは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）により産生されるセリンプロテアーゼであり、細胞傷害性Ｔリンパ球関連セリンエステラーゼ３（ＣＴＬＡ３）、細胞傷害性Ｔリンパ球およびＮＫ細胞特異的トリプシン様セリンプロテアーゼ、またはＨＡＮＵＫＡＨ因子セリンプロテアーゼ（ＨＦＳＰ）とも呼ばれている。ヒトグランザイムＡとしては、例えば、NM_006144.3により登録されたｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が挙げられる。NM_006144.3により登録されたｍＲＮＡによりコードされるタンパク質（配列番号２のアミノ酸配列を有する）は、２６アミノ酸のシグナルペプチドをＮ末端に有するグランザイムＡ前駆体として産生され、配列番号２においてアミノ酸番号２９〜２５４番が成熟型グランザイムＡとなる。成熟型ヒトグランザイムＡのアミノ酸配列は、例えば、配列番号３であり得る。
【００１６】
本発明では、グランザイムＡは、抗原特異的な免疫賦活化することが示された。従って、本発明によれば、グランザイムＡを含む、免疫賦活化剤または免疫賦活化することに用いるための組成物が提供される。免疫賦活化は、抗原特異的なものであった。従って、本発明によれば、グランザイムＡを含む、抗原特異的な免疫賦活化剤または抗原特異的な免疫賦活化することに用いるための組成物が提供される。本発明の免疫賦活化剤または免疫賦活化することに用いるための組成物は、抗原としての免疫原性物質またはこれを含む組成物と組み合わせて対象に投与することができる。従って、ある態様では、本発明の免疫賦活化促進剤または免疫賦活化することに用いるための組成物は、抗原としての免疫原性物質またはこれを含む組成物と組み合わせて対象に投与される組成物であり得る。
【００１７】
本発明では、グランザイムＡは、抗原特異的なＴ細胞を誘導した。本発明ではまた、グランザイムＡは、抗原特異的なT細胞を誘導した。本発明ではさらに、グランザイムＡは、樹状細胞の成熟を引き起こした。特に本発明では、グランザイムＡは、ＣＤ８陽性樹状細胞も、ＣＤ８陰性樹状細胞も成熟化させた。特に、これらの抗原特異的なＴ細胞誘導、抗原特異的なＣＤ８シングルポジティブ細胞誘導、樹状細胞の成熟、ＣＤ８陽性樹状細胞の成熟、およびＣＤ８陰性樹状細胞の成熟は、インビボにおいて誘導された。従って、本発明によれば、グランザイムＡを含む、抗原特異的なＴ細胞の誘導剤、抗原特異的なＴ細胞の誘導することに用いるための組成物；グランザイムＡを含む、抗原特異的なＣＤ８シングルポジティブ細胞の誘導することに用いるための組成物；グランザイムＡを含む、樹状細胞を成熟化させることに用いる組成物；グランザイムＡを含む、ＣＤ８陽性樹状細胞を成熟化させること、および／または、ＣＤ８陰性樹状細胞を成熟化させることに用いるための組成物が提供され得、例えば、これらは生体に投与され得る。これらの誘導剤および組成物はいずれも、抗原としての免疫原性物質またはこれを含む組成物と組み合わせて対象に投与することができる。従って、ある態様では、上記のグランザイムＡを含む、抗原特異的なＴ細胞の誘導剤、抗原特異的なＴ細胞の誘導することに用いるための組成物；グランザイムＡを含む、抗原特異的なＴ細胞を誘導することに用いるための組成物；グランザイムＡを含む、樹状細胞を成熟化させることに用いる組成物；グランザイムＡを含む、ＣＤ８陽性樹状細胞を成熟化させること、および／または、ＣＤ８陰性樹状細胞を成熟化させることに用いるための組成物は、抗原としての免疫原性物質またはこれを含む組成物と組み合わせて対象に投与される誘導剤または組成物であり得る。
【００１８】
本発明では、グランザイムＡのアジュバント効果には、セリンプロテアーゼ活性は必要ではなかった。従って、ある態様では、グランザイムＡに代えて、セリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡ、例えば、セリンプロテアーゼ活性が実質的に喪失したグランザイムＡ、セリンプロテアーゼ活性を完全に喪失したグランザイムＡを用いることができる。セリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡとしては、配列番号３のアミノ酸配列の１８４番目のアミノ酸に対応するセリンが他のアミノ酸（例えば、アラニン）に置換されたグランザイムＡが挙げられ、本発明で用いることができる。セリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡを用いると、セリンプロテアーゼ活性に起因する副作用を低減できる点で有利であると考えられる。配列番号３のアミノ酸配列の１８４番目のアミノ酸に対応するセリンがアラニンに置換されたグランザイムＡは、セリンプロテアーゼ活性を実質的に有さず、本発明で好ましく用いられ得る。
【００１９】
本発明では、アジュバント効果の有効成分となるグランザイムＡを、グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞によって供給する細胞製剤の形態で用いられ得る。グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞は、同種同系、および同種異系のどちらであっても良いが、投与対象の体内で拒絶されずにグランザイムＡを供給できるという観点からは、同種同系が好ましい。
【００２０】
言い換えれば、グランザイムＡの代わりに、グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞を用いることができる。
従って、本発明によれば、本発明によれば、グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞を含む、免疫賦活化剤または免疫賦活化することに用いるための組成物が提供される。本発明によれば、グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞を含む、抗原特異的な免疫賦活化剤または抗原特異的な免疫賦活化することに用いるための組成物が提供される。
また、本発明によれば、グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞を含む、抗原特異的なＴ細胞の誘導剤、抗原特異的なＴ細胞の誘導することに用いるための組成物；グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞を含む、抗原特異的なＴ細胞の誘導することに用いるための組成物；グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞を含む、樹状細胞を成熟化させることに用いる組成物；グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞を含む、ＣＤ８陽性樹状細胞を成熟化させることおよび／またはＣＤ８陰性樹状細胞を成熟化させることに用いるための組成物が提供され得、例えば、これらは生体に投与され得る。
【００２１】
グランザイムＡが、グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞の形態で投与される上記態様において、免疫原性物質はクランザイムＡと共に細胞に取り込まれていてもよいし、細胞に発現させられていてもよい。
また、この態様では、グランザイムＡは、抗原としての免疫原性物質またはこれを含む組成物若しくはこれを有する細胞と組み合わせて対象に投与することができる。ある態様では、本発明の免疫賦活化剤または免疫賦活化することに用いるための組成物は、抗原としての免疫原性物質またはこれを含む組成物と組み合わせて対象に投与される組成物であり得る。投与の際、免疫原性物質は、前記細胞と一緒に、別々に投与することができる。免疫原性物質は、細胞内または細胞膜上に存在する形態で投与してもよい。
【００２２】
本発明では、グランザイムＡの代わりに、配列番号３のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、またはさらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質（例えば、配列番号３のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、またはさらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するグランザイムＡであってもよい）を用い得る。配列相同性は、例えば、Pearson and Lipman, PNAS, 85:2444-2448, 1988のＦＡＳＴＡプログラムにより、デフォルトパラメータで決定することができる。
【００２３】
本発明のある面では、免疫原性物質と、アジュバントとしての有効量のグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質とを含む、抗原特異的免疫活性化用組成物が提供される。本発明の上記組成物を生体に投与すると、免疫原性物質に特異的な免疫が賦活化され得る。
【００２４】
本発明のある面では、免疫原性物質とグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質とのコンジュゲートが提供される。上記コンジュゲートにおいては、免疫原性物質とグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質とは、リンカーを介して結合していてもよい。このようなコンジュゲートは、グランザイムＡのアジュバント能力を阻害しない限り許容され、分子内または分子間で相互作用して抗原特異的免疫活性化用組成物としての効果を発揮し得る。
【００２５】
ある態様では、本発明の抗原特異的免疫活性化用組成物は、アジュバントとしての有効量のグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を、免疫原性物質とのコンジュゲートの形態で含み得る。本発明のある態様では、免疫原性物質は、リンカーを介してグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質とコンジュゲートしていてもよい。
【００２６】
本発明のある面では、免疫原性物質がポリペプチドであり、アジュバントとしての有効量のグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を、前記免疫原性物質との融合タンパク質が提供される。ある態様では、免疫原性物質は、リンカーを介してグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質とコンジュゲートしていてもよい。このようなコンジュゲートは、グランザイムＡのアジュバント能力を阻害しない限り、分子内または分子間で相互作用して抗原特異的免疫活性化用組成物としての効果を発揮し得る。
【００２７】
本発明のある面では、本発明の上記融合タンパク質をコードする核酸が提供される。
【００２８】
本発明のある態様では、本発明の抗原特異的免疫活性化用組成物は、免疫原性物質がポリペプチドであり、アジュバントとしての有効量のグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を、前記免疫原性物質との融合タンパク質の形態で含み得る。免疫原性物質がポリペプチドである場合には、グランザイムＡと融合ペプチドとして供給され得る点で利点がある。この場合、融合はペプチド性リンカーを介してなされてもよい。
【００２９】
本発明によれば、グランザイムＡおよび免疫原性物質は、一緒に若しくは別々に、細胞内に発現させて（免疫原性物質は膜タンパク質であってもよく、この場合、細胞表面やＶＬＰに提示させて）、または細胞内に取り込ませた状態で、同時にまたは逐次的に投与することができる。細胞は、グランザイムＡおよび免疫原性物質を上記で説明したようにコンジュゲートとして有していてもよいし、グランザイムＡおよびペプチド性の免疫原性物質を上記で説明したように融合タンパク質として有していてもよい。ここで、「細胞がＸを有する」とは、細胞がＸを含んでいてもよいし、細胞表面に提示していてもよいことを意味する。
この態様において、動物細胞は、投与対象に対して自己細胞または非自己細胞とすることができ、非自己細胞としては、例えば、同種異系の動物細胞とすることができる。細胞の種類は、特に限定されないが例えば、体細胞、樹状細胞、血球細胞、リンパ球、脾臓細胞などとすることができる。
【００３０】
細胞内にグランザイム等のタンパク質を発現させる方法は、当業者に周知であり、例えば、ウイルスベクターを用いる方法、発現プラスミドベクターを用いる方法、ｍＲＮＡを導入する方法などを用いることができる。
【００３１】
細胞内にグランザイム等のタンパク質および免疫原性物質を取り込ませる方法は、当業者に周知であり、当業者であれば適宜実施することができる。例えば、本発明では、細胞として脾臓細胞を用い、免疫原性物質の存在下で高浸透圧条件下でインキュベートした後に低浸透圧条件下でアポトーシスを誘導することにより、免疫原性物質を細胞に取り込ませることができる（例えば、Iyoda et al., J. Exp. Med., 195 (10): 1289-1302を参照）。
【００３２】
本発明のある態様では、免疫原性物質は、がん抗原であり得る。
【００３３】
本発明のある態様では、本発明の全てのアジュバント組成物および抗原特異的免疫活性化用組成物は、脊椎動物、例えば、鳥類または哺乳動物、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類、特に、ヒトに投与され得る。
【００３４】
本発明の抗原特異的免疫活性化用組成物は、ワクチンとして用いてもよい。本発明の抗原特異的免疫活性化用組成物は、治療または予防を目的として、例えば、がんワクチンおよび感染症ワクチンなどのワクチンとして用いることができる。治療を目的としたワクチンとして用いる場合、本発明の抗原特異的免疫活性化用組成物は、これを必要とする対象、例えば、がんまたは感染症に罹患している対象または罹患していると判定された対象に対して投与される。予防を目的としたワクチンとして用いる場合、これを必要とする対象、本発明の抗原特異的免疫活性化用組成物は、がん若しくは感染症の罹患が疑われる対象または疑われると判定された対象、がんの再発を防ぐことが望ましい対象または望ましいと判定された対象、または感染症の罹患を未然に防ぐことが望ましい対象または望ましいと判定された対象に投与される。従って、本発明によれば、ワクチンとして用いるための、例えば、がんワクチンおよび感染症ワクチンなどのワクチンとして用いるための、グランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を含む、抗原特異的免疫活性化用組成物が提供される。がんワクチンにおいては、免疫原性物質はがん抗原とすることができ、がん抗原は細胞に提示された形態、ＶＬＰに提示された形態など、様々な形態で免疫原性組成物に含ませることができる。また、感染症ワクチンにおいては、免疫原性物質は、感染症の予防に用いられるワクチンとすることが好ましい。
【００３５】
本発明では、グランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質をコードする核酸と、ペプチド性の免疫原性物質をコードする核酸との組合せ（特に非天然の組合せ）が提供される。この態様において、グランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質をコードする核酸と、ペプチド性の免疫原性物質をコードする核酸とは、同一の核酸上に提供されてもよいし、別々の核酸として提供されてもよい。例えば、グランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質をコードする核酸と、ペプチド性の免疫原性物質をコードする核酸とは、同一のベクター上に提供されてもよいし、別々のベクター上に供給されてもよい。そして、同一のベクター上に提供される場合には、融合タンパク質として発現するようにインフレームで、リンカーを介してまたは介さずに連結されていてもよい。そして、上記核酸は、例えば、細胞内での発現を駆動することができるプロモーターに作動可能に連結され、細胞内で該核酸からのタンパク質の発現を可能とするように発現ベクターに組込まれ得る。本発明ではこれらのような発現ベクターも提供されうる。グランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質をコードする核酸と、ペプチド性の免疫原性物質をコードする核酸とが別の発現ベクター上に提供される場合には、本発明では、これらの発現ベクターの組合せが提供される。
【００３６】
本発明では、グランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質をコードする核酸と、ペプチド性の免疫原性物質をコードする核酸との組合せが発現可能に組込まれた１以上のベクターを含む動物細胞が提供される。これらの細胞は、投与する対象において同種同系または同種異系であってもよい。
【００３７】
本発明によれば、抗原ペプチドとグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質との組合せを含む、動物細胞が提供される。本発明ではまた、抗原ペプチドとグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質との組合せを含む動物細胞を含む、抗原特異的免疫活性化用組成物が提供される。
【００３８】
本発明では、免疫原性物質は細胞に取り込ませて投与してもよい。この際、グランザイムＡは同一の細胞内に供給されてもよいし、別の細胞内に供給されてもよいし、あるいは、ペプチドとして供給され、免疫原性物質を取り込んだ細胞と組み合わせて投与することができる。例えば、本発明では、抗原ペプチド取込み脾臓細胞と組み合わせて投与され、かつ、グランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を含む、前記抗原ペプチドに対する免疫を賦活化することに用いるための組成物が提供される。
【００３９】
本発明では、対象において抗原特異的な免疫を賦活化する、抗原特異的なＴ細胞（例えばＣＤ８ＳＰ細胞）による免疫を賦活化する、および／または、樹状細胞を成熟させる方法であって、グランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質と、抗原としての免疫原性物質を組み合わせて対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００４０】
本発明では、免疫賦活化剤または免疫賦活化することに用いるための組成物の製造におけるグランザイムＡの使用が提供される。本発明では、抗原特異的な免疫賦活化剤または抗原特異的な免疫賦活化することに用いるための組成物の製造におけるグランザイムＡの使用が提供される。本発明では、抗原特異的なＴ細胞の誘導剤、抗原特異的なＴ細胞の誘導することに用いるための組成物、抗原特異的なＴ細胞の誘導することに用いるための組成物、樹状細胞の成熟化に用いる組成物、ＣＤ８陽性樹状細胞を成熟化させること、および／または、ＣＤ８陰性樹状細胞を成熟化させることに用いるための組成物の製造におけるグランザイムＡの使用が提供される。
【００４１】
本発明の組成物は、賦形剤を含んでいてもよい。本発明の組成物は、例えば、非経口投与（例えば、腹腔内投与、静脈投与、皮下投与、腫瘍内投与など）で投与されうる。これらの非経口投与に適するように、調製され得る。
【００４２】
本発明の組成物は、グランザイムＡ以外のアジュバントを含んでいてもよい。そのようなアジュバントとしては、例えば、水酸化アルミニウムおよびフロイントアジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。グランザイムＡ以外のアジュバントを含む場合においても、抗原特異的なＴ細胞の誘導および／または樹状細胞の成熟化の効果は、グランザイムＡによってもたらされ得る。
【００４３】
グランザイムＡおよびペプチド性の免疫原性物質などのタンパク質およびペプチドは、当業者に周知の方法により調製することができる。例えば、グランザイムＡなどのタンパク質は、昆虫細胞、哺乳動物細胞などにグランザイムＡなどのタンパク質をコードする核酸を発現可能に導入することにより、細胞内で合成されたものを用いることができる。タンパク質を発現可能に細胞に導入するためには、当該タンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞内に導入すること、または当該タンパク質を発現するベクターを細胞内に導入することなどの方法により達成することができる。グランザイムＡなどのタンパク質はまた、例えば、無細胞タンパク質合成系を用いて合成することもできる。
【００４４】
発現ベクターは、選択された宿主細胞内でタンパク質を発現できるベクターを用いることができる。発現ベクターは、エピゾーマルベクターであってもよいし、細胞内に導入されると宿主細胞ゲノム内にインテグレートされるベクターであってもよい。発現ベクターとしては、プラスミドおよびウイルスベクターなどのベクターを用いることができる。このような発現ベクターは、当業者に周知の方法で設計され、かつ調製され得る。発現ベクター内では、発現させたい目的タンパク質は、通常、プロモーターに作動可能に連結される。プロモーターとしては、宿主細胞内でタンパク質を発現させることができるプロモーターを適宜用いることができる。発現ベクターは、当業者に周知の方法により細胞内に導入することができる。
【実施例】
【００４５】
実施例１：抗原特異的な免疫の誘導
本実施例では、グランザイムＡ（以下、「ｇｚｍＡ」と略す）がオボアルブミン（以下、「ＯＶＡ」という）に対する特異的免疫を引き起こすことを明らかにした。【００４６】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、ＯＶＡをコードするｍＲＮＡ（Accession番号：NM_205152
）と、グランザイムＡをコードするｍＲＮＡ（Accession番号：NM_006144.3）をエレクトロポレーションで導入し、病原菌フリーのＣ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈より静脈内投与した。投与７日後のマウスから脾臓を摘出し、セルストレイナーを用いて漉し、ACK lysing bufferで赤血球を溶血して洗浄し、脾臓由来単核球を得た。得られた脾臓由来単核球とＯＶＡ２５７-２６４ペプチドのテトラマー（ＯＶＡ−ｔｅｔ；MBL社製、製品番号：TS-5001-1C）およびFITC標識−抗ＣＤ８抗体（Biolegend社製、製造番号：100706）と反応させた。フローサイトメトリーでＯＶＡ特異的Ｔ細胞反応を検出した。対照としては、未処理ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた。結果は、図１に示される通りであった。【００４７】
図１に示されるように、グランザイムＡを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞では、ＯＶＡ特異的な免疫活性、特にＣＤ８陽性細胞が誘導された。【００４８】
次に、上記においてグランザイムＡに代えて他のグランザイムファミリー（グランザイムＢ、ＫおよびＭ）のｍＲＮＡを用いて、他のグランザイムファミリーが同様の免疫誘導活性を有するかを調べた。【００４９】
ＯＶＡのｍＲＮＡを単独でＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入して、上記と同様にマウス尾静脈に静脈投与した。７日後のマウスから得られたＣＤ８陽性細胞数を１として、ＯＶＡのｍＲＮＡに加えて、グランザイムＡ、グランザイムＢ（Accession番号：NM_013542）、グランザイムＫ（Accession番号：NM_008196）またはグランザイムＭ（Accession番号：NM_008504）のｍＲＮＡを導入した場合のＣＤ８陽性細胞数を相対値により比較した。結果は、図２に示される通りであった。【００５０】
図２左に示されるように、グランザイムＡは、ＯＶＡ特異的なＴ細胞を誘導したが、グランザイムＫおよびＭでは、ＯＶＡ特異的なＴ細胞誘導は確認されなかった。グランザイムＢでは、弱いＯＶＡ特異的なＴ細胞誘導が確認された。【００５１】
さらに、グランザイムＡがセリンプロテアーゼであることから、グランザイムＡが有する上記の免疫賦活活性にこの酵素活性が必要か否かを調べた。このために、グランザイムＡのアミノ酸配列（配列番号３のアミノ酸配列）の１８４番目のセリンをアラニンに置き換えたＳ１８４Ａ変異体を作製し、上記の実験系において、このｍＲＮＡをＯＶＡ  ｍＲＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入してＯＶＡ特異的なＴ細胞誘導を確認した。結果は、図２に示される通りであった。【００５２】
図２右に示されるように、グランザイムＡによる免疫賦活活性には、セリンプロテアーゼ活性は不要であることが示された。このことから、グランザイムＡの酵素活性を不活化した変異体を用いることにより、例えば、グランザイムＡ導入細胞を生体に導入した場合に、セリンプロテアーゼ活性に起因する副作用を低減できると考えられる。【００５３】
本実施例により、グランザイムＡは、抗原特異的な免疫賦活化を誘導できることが明らかとなった。特にグランザイムＡは、抗原特異的なＴ細胞の賦活化を誘導した。このことから、グランザイムＡは、アジュバントとして有用であることも明らかとなった。【００５４】
また、本実施例では、グランザイムＡは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の細胞内に発現していると考えられる。グランザイムＡは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞から放出されている訳ではなかったため、マウス体内の免疫細胞により破壊され、細胞の内容物として放出されることによりアジュバント効果を発揮することが示唆された。【００５５】
実施例２：骨髄由来樹状細胞への成熟化に対するグランザイムＡの効果
上記実施例では、グランザイムＡが免疫賦活化を誘導することを明らかにした。本実施例では、骨髄由来樹状細胞（以下「ＤＣ」と略す）への成熟に対するグランザイムＡの効果を調べた。【００５６】
昆虫細胞(sf9細胞)−バキュロウイルス発現系を用い、製造者マニュアルに従ってグランザイムＡのタンパク質を合成した。【００５７】
マウス骨髄細胞は、病原菌フリーのＣ５７ＢＬ／６マウスの末梢血から得た。具体的には、マウス大腿骨、頸骨より骨髄細胞を採取し、マウスFLT3L(ぺプロテック社 250-31L) 200ng/mlを添加し、樹状細胞を培養誘導した。【００５８】
培養誘導したＣＤ１１陽性樹状細胞の培養系に、合成されたグランザイムＡ（濃度：1000ng/mL）を添加し、２４時間後に細胞を回収して洗浄し、フローサイトメトリーによって抗ＣＤ８６抗体（BD社製、製品番号：553690）およびStreptavidin-PE(ebioscience社製  製品番号：12-4317-87)を用いてＣＤ８６発現強度により樹状細胞の成熟化について調べた。陽性対照としては、グランザイムＡの代わりにＬＰＳ（Invivogen社製、製品番号：tlrl-eklps）をＣＤ１１陽性単球の培養系に100ng/mlで添加した。陰性対照としては、グランザイムＡもＬＰＳも添加しないもの、および抗ＣＤ８６抗体の代わりにアイソタイプ抗体を用いたものとした。結果は、図３に示される通りであった。【００５９】
図３に示されるように、グランザイムＡとＬＰＳの双方においてＣＤ８６陽性細胞の増加が確認され、グランザイムＡはＬＰＳと同等に樹状細胞を成熟化することが確認された。【００６０】
このように、インビボの系においてグランザイムＡタンパク質は、骨髄由来樹状細胞を成熟化させる作用を有していた。次に、インビボにおけるグランザイムＡの効果を確認した。【００６１】
マウスに、合成したグランザイムＡ  ２０μｇを静脈投与した。投与１６時間後に脾臓を回収して、樹状細胞を十分量得るためにコラゲナーゼD (Roche社製、製品番号：11088882001)を用いて酵素処理を行った。次いで、脾臓の樹状細胞を抗CD11c抗体 (BD社製、製品番号550261)、抗CD8a抗体（Biolegend社製、製品番号：100706）で染色し、ＣＤ８陽性樹状細胞とＣＤ８陰性樹状細胞とに分けた。それぞれについて、上記の通りCD86発現強度により成熟化を検討した。結果は、図４に示される通りであった。【００６２】
図４に示されるように、グランザイムＡを投与したマウスでは、ＣＤ８陽性の樹状細胞およびＣＤ８陰性の樹状細胞のいずれも、ＬＰＳ投与マウスと同様に確認された。このことから、グランザイムＡは、生体内においても、ＬＰＳと同様に樹状細胞を成熟化させる効果を有することが明らかとなった。【００６３】
実施例３：生体内におけるグランザイムＡによる免疫誘導
実施例１では、グランザイムＡと抗原の両方を発現する細胞を生体に投与した。本実施例では、グランザイムＡをタンパク質として生体に投与した。【００６４】
Fujii S. et al., Journal of Experimental Medicine, 198(2): 267-279, 2003に記載の方法に従ってマウスにＯＶＡ抗原を免疫して、抗原特異的Ｔ細胞の有無について検討した。具体的には、病原菌フリーのＣ５７ＢＬ／６マウスの腹水より、脾細胞を回収した。得られた脾細胞を、ＯＶＡ抗原１０ｍｇ／ｍＬの存在下、高浸透圧培地（Hyper0.5M sucrose, 10%wt/vol polyethylene glycol1540, 10mM Hepes containing RPMI）に３７℃で１０分間インキュベートし、続けてアポトーシスを誘導するように低浸透圧溶液(DDW plus RPMI medium)で２分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄してＯＶＡ抗原取込み脾細胞を準備した。得られたＯＶＡ抗原取込み脾細胞を、無細胞タンパク質合成系により合成された２０μｇのグランザイムＡと共にマウスに投与し、脾臓を回収して、脾臓由来単核球を得た。得られた脾臓単核球とＯＶＡ２５７-２６４ペプチドのテトラマーと反応させ、フローサイトメーターでＯＶＡ特異的Ｔ細胞応答を検出した。陽性対照としては、２０μｇＬＰＳとＯＶＡ抗原取込み脾細胞を投与したものを用い、陰性対照としてはバッファーのみを投与したものを用いた。結果は、図５に記載される通りであった。【００６５】
図５に記載されるように、ＯＶＡ抗原取込み脾細胞とグランザイムＡを投与した群では、ＯＶＡ特異的なＴ細胞誘導が確認された（図５Ａ右）。一方で、ＯＶＡ抗原取込み脾細胞とＬＰＳを投与した群では、ＯＶＡ特異的なＴ細胞誘導は確認されなかった（図５Ａ真ん中）。【００６６】
次に、単離した単核球をＯＶＡペプチド（濃度 1 μM）の非存在下または存在下で６時間培養し、培養前後におけるインターフェロンγの産生量の変化（Ｔ細胞応答）を調べた。インターフェロンγは、細胞内染色法により測定した。結果は、図５に示される通りであった。【００６７】
図５に示されるように、ＬＰＳ投与群から得られた単核球ではＯＶＡペプチドの刺激による変化は見られなかったが、グランザイムＡ投与群から得られた単核球では、ＯＶＡペプチドによって刺激されてインターフェロンγが顕著に産生されることが確認された（図５Ｂ）。このことは、グランザイムＡは、従来のアジュバントでは困難であった抗原特異的Ｔ細胞の誘導および免疫応答を誘導し得ることを意味する。【００６８】
実施例４：がんワクチンとしての使用
上述の実施例により、グランザイムＡが抗原特異的な免疫応答を誘導できる、アジュバントとして利用できることを明らかにした。本実施例では、誘導した免疫応答によるがん細胞の抑制効果を調べた。【００６９】
実施例３と同じようにＯＶＡ抗原取込み脾臓細胞を調製した。２×１０７個のＯＶＡ抗原取込み脾臓細胞を２０μｇのグランザイムＡと共にマウスに静脈投与し、その７日後に１×１０５個のＭＯ４細胞を皮下投与して、ＭＯ４細胞の体内での増殖効果を確認した。ＭＯ４細胞は、ＯＶＡを強制発現したマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６細胞として知られている。対照としては、ＭＯ４細胞の投与のみを行ったマウスを用いた。結果は、図６に示される通りであった。【００７０】
図６に示されるように、ＯＶＡ抗原取込み脾臓細胞とグランザイムＡとを事前投与をしなかった対照群では、腫瘍サイズが急速に増大したのに対して、事前投与した群では、腫瘍サイズの増加が顕著に抑制された。このことから、グランザイムＡは、強いアジュバント効果を有し、がんワクチンとして有望であることが示された。【００７１】
実施例５：グランザイムＡにより誘導される免疫応答の解析
本実施例では、グランザイムＡにより誘導される免疫応答をより詳細に解析した。【００７２】
実施例４と同様に、マウスにＯＶＡ懸濁液100 μl (OVA蛋白100 μg)と２０μｇのグランザイムＡとを腹腔内投与した。対照として、グランザイムＡの代わりにOVA懸濁液と同量の水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）をアジュバントとする系、およびＯＶＡ抗原取込み脾臓細胞のみを投与する系を用いた。【００７３】
投与１４日後に、マウスから末梢血を回収した。回収された末梢血中のＩｇＧ１溝大量とＩｇＧ２抗体量とをそれぞれ常法を用いて測定した。結果は、図７に示される通りであった。【００７４】
図７に示されるように、Ａｌｕｍをアジュバントとして用いた場合には、ＩｇＧ１抗体の産生量が増大するのに対して、グランザイムＡをアジュバントとして用いた場合には、ＩｇＧ２抗体の産生量が増大した。このことからグランザイムＡはＴ細胞だけでなくＢ細胞免疫を賦活化することが明らかとなった。また、グランザイムＡによる免疫賦活化は、Ａｌｕｍなどとは異なる新しい機構により達成されることが明らかとなった。【００７５】
グランザイムＡは、生体のタンパク質であるので副作用の低減が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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