(57)【要約】  本発明は、アレルギー性鼻炎発症の有無や、アレルギー性鼻炎の発症リスクを精度よく診断できるアレルギー性鼻炎の診断用マーカー等を提供することを課題とする。  ヒトＣＲＬＦ２（Cytokine receptor-like factor 2）遺伝子又はヒトＥＴＶ７（ets variant 7）遺伝子や、ヒトＣＲＬＦ２タンパク質又はヒトＥＴＶ７タンパク質をバイオマーカーとして用い、かかる遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現増加や、かかるタンパク質の発現増加を検出することにより、アレルギー性鼻炎、好ましくはスギ花粉症、又はダニアレルギー性鼻炎の有無や発症リスクを精度よく診断することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＲＬＦ２遺伝子及びＥＴＶ７遺伝子のいずれか一方又は両方のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現増加、或いは、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子及びＥＴＶ７遺伝子のいずれか一方又は両方がコードするタンパク質の発現増加を検出することを特徴とするアレルギー性鼻炎を診断するためのデータを収集する方法。
【請求項２】
アレルギー性鼻炎が、スギ花粉症又はダニアレルギー性鼻炎であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びタンパク質が、好塩基球由来のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びタンパク質であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、アレルゲン特異的ＩｇＥの発現増加を検出することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ヒトＣＲＬＦ２遺伝子及びＥＴＶ７遺伝子のいずれか一方又は両方のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とするアレルギー性鼻炎の診断用キット。
【請求項６】
ヒトＣＲＬＦ２遺伝子及びＥＴＶ７遺伝子のいずれか一方又は両方がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えることを特徴とするアレルギー性鼻炎の診断用キット。
【請求項７】
アレルギー性鼻炎が、スギ花粉症又はダニアレルギー性鼻炎であることを特徴とする請求項５又は６に記載のキット。
【請求項８】
ヒトＣＲＬＦ２遺伝子及びＥＴＶ７遺伝子のいずれか一方又は両方、或いは、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子及びＥＴＶ７遺伝子のいずれか一方又は両方がコードするタンパク質からなることを特徴とするアレルギー性鼻炎を診断するためのバイオマーカー。
【請求項９】
アレルギー性鼻炎が、スギ花粉症又はダニアレルギー性鼻炎であることを特徴とする請求項８に記載のバイオマーカー。
【請求項１０】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を備えたことを特徴とするアレルギー性鼻炎の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
（ａ）アレルギー性鼻炎非ヒト動物に被検薬剤又は被検物質を投与する工程；
（ｂ）前記非ヒト動物から採取された生体試料中の、ＣＲＬＦ２遺伝子及びＥＴＶ７遺伝子のいずれか一方又は両方のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現減少、或いは、ＣＲＬＦ２遺伝子及びＥＴＶ７遺伝子のいずれか一方又は両方がコードするタンパク質の発現減少を検出する工程；
【請求項１１】
アレルギー性鼻炎が、スギ花粉症又はダニアレルギー性鼻炎であることを特徴とする請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー性鼻炎を診断するためのデータを収集する方法や、アレルギー性鼻炎の診断用キットや、アレルギー性鼻炎を診断するためのバイオマーカーや、アレルギー性鼻炎の予防又は治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性鼻炎は、本来無害であるはずの外来抗原に対して、免疫系が過剰に反応することにより生じる、くしゃみ、鼻みず、鼻づまり等の鼻粘膜におけるアレルギー性疾患である。ここ数十年来、生活様式や生活環境の変化に伴い、アレルギー性鼻炎を罹患する患者が急増し、患者におけるＱＯＬ（Quality Of Life）の低下や医療費負担の増大が問題となっている。特にスギ花粉症等の花粉症患者は、カビ、ダニ等のハウスダストが原因で生じるアレルギー性鼻炎と同様に、年々増加の一途をたどっている。【０００３】
スギ花粉症の主因は、スギ花粉中の抗原性物質、すなわち、スギ抗原（アレルゲン）であると考えられている。大気中に飛散したスギ花粉がヒトの体内に侵入すると、Ｂ細胞によってスギ抗原に対するイムノグロブリンＥ抗体（ＩｇＥ）が産生される。このＩｇＥは、肥満細胞や好塩基球の細胞膜上に存在する高親和性ＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩに結合する。この状態を「感作」といい、さらに、スギ抗原が再び侵入して、これら細胞膜上のＩｇＥを架橋すると、ヒスタミンやロイコトリエン等のメディエータが放出され（脱顆粒反応）、アレルギー性鼻炎が発症する。【０００４】
アレルギー性鼻炎の治療は、主として抗ヒスタミン剤を代表とする抗アレルギー剤、吸入ステロイド薬等の薬物療法により行われている。また、花粉飛散前に抗アレルギー薬を投与する初期療法（季節前治療）が、飛散開始後又は症状増悪後より治療を開始するより所見、症状がよくなることが示唆されている。【０００５】
アレルギー性鼻炎の症状は、ウィルスや細菌等の感染においてもみられることから、適切なアレルギー性鼻炎の治療を行うためには、アレルギー性鼻炎を発症しているか否かを正確に判定することが重要である。一方、アレルギー性鼻炎の発症を予防するためには、アレルギー性鼻炎の発症の前段階である感作未発症状態を診断することにより、アレルギー性鼻炎の発症リスクを診断・予測する必要がある。しかしながら、未感作から感作、及び感作から発症に至るメカニズムはほとんど解明されていないこともあり、アレルギー性鼻炎の発症リスクを診断・予測する有効な手段がないのが現状である。【０００６】
近年、タンパク質の解析技術が著しく発展し、罹患者等の生体組織におけるタンパク質量（の変動）に関する情報を網羅的に得ることができるようになった。この技術を利用して、アレルギー性鼻炎の改善レベルを評価するためのバイオマーカーとして、フィラグリンやアポリポタンパク質Ａ−ＩＶが報告されている（特許文献１、２）。しかし、かかるバイオマーカーは、アレルギー性鼻炎発症の有無や、アレルギー性鼻炎の発症リスクを診断・予測するものではない。【０００７】
一方、ＣＲＬＦ２（Cytokine receptor-like factor 2）は、ＩＬ−７Ｒα鎖とヘテロ２量体を形成してＴＳＬＰ（Thymic Stromal Lymphopoietin）受容体（ＴＳＬＰＲ）として機能するタンパク質である。近年、ヒト末梢好塩基球において、ＴＳＬＰＲ（ＣＲＬＦ２）が発現することが報告されている（非特許文献１）。また、アレルギー喘息患者由来の好塩基球におけるＣＲＬＦ２の発現は、アレルゲン刺激により増加することが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、ＣＲＬＦ２の発現増加と、アレルギー性鼻炎発症の有無や、アレルギー性鼻炎の発症リスクとの関連性については知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１４−７６００９号公報
【特許文献２】特開２００９−２１０４２０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Giacomin, P.R. et al., J. Immunol. 2012, 189: 4371-4378
【非特許文献２】Agrawal, R. et al., Clin. Exp. Allergy 2014, 44: 1266-1273
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、アレルギー性鼻炎発症の有無や、アレルギー性鼻炎の発症リスクを精度よく診断できるアレルギー性鼻炎の診断用マーカー等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するため、アレルギー性鼻炎の感作陰性未発症者、感作陽性未発症、及び感作陽性発症者から採取された生体試料中の遺伝子発現量の変化を解析したところ、アレルギー性鼻炎発症の有無や、アレルギー性鼻炎の感作陽性発症と、アレルギー性鼻炎の感作陽性未発症とを精度よく分類することができるアレルギー性鼻炎の診断用マーカーを見いだし、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕ヒトＣＲＬＦ２遺伝子又はＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現増加、或いは、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子又はＥＴＶ７遺伝子がコードするタンパク質の発現増加を検出することを特徴とするアレルギー性鼻炎を診断するためのデータを収集する方法。
〔２〕ヒトＣＲＬＦ２遺伝子及びＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現増加、或いは、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子及びＥＴＶ７遺伝子がコードするタンパク質の発現増加を検出することを特徴とする上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕アレルギー性鼻炎が、スギ花粉症又はダニアレルギー性鼻炎であることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びタンパク質が、好塩基球由来のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びタンパク質であることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕さらに、アレルゲン特異的ＩｇＥの発現増加を検出することを特徴とする上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕ヒトＣＲＬＦ２遺伝子又はＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とするアレルギー性鼻炎の診断用キット。
〔７〕ヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー若しくはプローブ、又はそれらの標識物と、ヒトＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー若しくはプローブ、又はそれらの標識物とを備えることを特徴とする上記〔６〕に記載のキット。
〔８〕ヒトＣＲＬＦ２遺伝子又はＥＴＶ７遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えることを特徴とするアレルギー性鼻炎の診断用キット。
〔９〕ヒトＣＲＬＦ２遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物と、ヒトＥＴＶ７遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物とを備えることを特徴とする上記〔８〕に記載のキット。
〔１０〕アレルギー性鼻炎が、スギ花粉症又はダニアレルギー性鼻炎であることを特徴とする上記〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載のキット。
〔１１〕ヒトＣＲＬＦ２遺伝子又はＥＴＶ７遺伝子、或いは、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子又はＥＴＶ７遺伝子がコードするタンパク質からなることを特徴とするアレルギー性鼻炎を診断するためのバイオマーカー。
〔１２〕ヒトＣＲＬＦ２遺伝子と、ヒトＥＴＶ７遺伝子とからなる、或いは、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子がコードするタンパク質と、ヒトＥＴＶ７遺伝子がコードするタンパク質とからなることを特徴とする上記〔１１〕に記載のバイオマーカー。
〔１３〕アレルギー性鼻炎が、スギ花粉症又はダニアレルギー性鼻炎であることを特徴とする上記〔１１〕又は〔１２〕に記載のバイオマーカー。
〔１４〕以下の工程（ａ）及び（ｂ）を備えたことを特徴とするアレルギー性鼻炎の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
（ａ）アレルギー性鼻炎非ヒト動物に被検薬剤又は被検物質を投与する工程；
（ｂ）前記非ヒト動物から採取された生体試料中の、ＣＲＬＦ２遺伝子又はＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現減少、或いは、ＣＲＬＦ２遺伝子又はＥＴＶ７遺伝子がコードするタンパク質の発現減少を検出する工程；
〔１５〕工程（ｂ）において、ＣＲＬＦ２遺伝子及びＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現減少、或いは、ＣＲＬＦ２遺伝子及びＥＴＶ７遺伝子がコードするタンパク質の発現減少を検出することを特徴とする上記〔１４〕に記載のスクリーニング方法。
〔１６〕アレルギー性鼻炎が、スギ花粉症又はダニアレルギー性鼻炎であることを特徴とする上記〔１４〕又は〔１５〕に記載のスクリーニング方法。【００１３】
また本発明のスクリーニング方法のその他の態様としては、アレルギー性鼻炎の予防又は治療剤（薬）の有効性を判定する方法や、アレルギー性鼻炎の予防剤（薬）候補又は治療剤（薬）候補のスクリーニング方法を挙げることができる。【００１４】
また本発明の実施の他の形態として、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子又はＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現増加、或いは、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子又はＥＴＶ７遺伝子がコードするタンパク質の発現増加を検出することを特徴とするアレルギー性鼻炎の診断方法や、アレルギー性鼻炎の診断における使用のためのヒトＣＲＬＦ２遺伝子又はＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、或いは、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子又はＥＴＶ７遺伝子がコードするタンパク質を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の収集方法によると、アレルギー性鼻炎発症の有無や、アレルギー性鼻炎の感作陽性発症と、アレルギー性鼻炎の感作陽性未発症とを精度よく診断（分類）できるため、アレルギー性鼻炎発症前に、アレルギー性鼻炎の発症を予防したり、アレルギー性鼻炎の適切な治療を行うことができる。また、本発明のスクリーニング方法は、アレルギー性鼻炎の予防（保護）又は治療剤（薬）の開発に資するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、スギ花粉症に関する３群（健常群、感作未発症群、及び発症群）について、好塩基球におけるＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量（縦軸の「ＦＰＫＭ値」）を、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより解析した結果を示す図である。図１Ｂは、上記３群について、好塩基球におけるＣＲＬＦ２遺伝子のｃＤＮＡの発現量を、定量ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。縦軸の「ＲＱ」は、健常群の刺激「−」の発現量を１とした場合の発現量の相対値を示す。図中の刺激「−」及び「＋」は、それぞれスギ抗原の刺激無し及び有りを示す。また、図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、それぞれ統計学的に有意差（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）があることを示す。
【図２】図２Ａは、上記３群について、好塩基球におけるＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡの発現量（縦軸の「ＦＰＫＭ値」）を、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより解析した結果を示す図である。図２Ｂは、上記３群について、好塩基球におけるＥＴＶ７遺伝子のｃＤＮＡの発現量を、定量ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。縦軸の「ＲＱ」は、健常群の刺激「−」の発現量を１とした場合の発現量の相対値を示す。図中の刺激「−」及び「＋」は、それぞれスギ抗原の刺激無し及び有りを示す。図中の「＊」は、統計学的に有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。
【図３】上記３群について、好塩基球におけるＴＳＬＰＲの発現量を、フローサイトメーターにより解析した結果を示す図である。縦軸の「ＴＳＬＰＲ変動倍率」は、スギ抗原未刺激におけるＴＳＬＰＲの発現量に対する、スギ抗原刺激におけるＴＳＬＰＲの発現量の比率を示す。
【図４】スギ花粉症に関する２群（未発症群［健常群及び感作未発症群］及び発症群）について、スギ特異的ＩｇＥ抗体値を基に、両群を判定した結果（図４Ａ）と、好塩基球におけるＴＳＬＰＲの発現量を基に、両群を判定した結果（図４Ｂ）を示す図である。図中の実線は平均値を示し、点線は閾値を示す。図中の「＊」は、統計学的に有意差（Ｐ＜０．０００１）があることを示す。
【図５】スギ花粉症に関する２群（未発症群及び発症群）について、スギ特異的ＩｇＥ抗体値を基に、両群を判定する方法（図５Ａ）と、好塩基球におけるＴＳＬＰＲの発現量を基に、両群を判定する方法（図５Ｂ）とを組み合わせた結果を示す図である。図中の実線は平均値を示し、点線は閾値を示す。図中の「＊」は、統計学的に有意差（Ｐ＜０．０１）があることを示す。
【図６】ダニアレルギー性鼻炎に関する２群（未発症群［健常群及び感作未発症群］及び発症群）について、ダニ特異的ＩｇＥ抗体値を基に、両群を判定した結果（図６Ａ）と、好塩基球におけるＴＳＬＰＲの発現量を基に、両群を判定した結果（図６Ｂ）を示す図である。図中の実線は平均値を示し、点線は閾値を示す。図中の「＊」は、統計学的に有意差（Ｐ＜０．０００１）があることを示す。
【図７】ダニアレルギー性鼻炎に関する２群（未発症群及び発症群）について、ダニ特異的ＩｇＥ抗体値を基に、両群を判定する方法（図７Ａ）と、好塩基球におけるＴＳＬＰＲの発現量を基に、両群を判定する方法（図７Ｂ）とを組み合わせた結果を示す図である。図中の実線は平均値を示し、点線は閾値を示す。図中の「＊」は、統計学的に有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のアレルギー性鼻炎を診断するためのデータを収集する方法としては、被験者（提供者）から採取された生体試料中のヒトＣＲＬＦ２（Cytokine receptor-like factor 2）遺伝子のｍＲＮＡ又はその逆転写産物（ｃＤＮＡ）の発現増加や、前記生体試料中のヒトＥＴＶ７（ets variant 7）遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現増加や、前記生体試料中のヒトＣＲＬＦ２遺伝子がコードするタンパク質（ヒトＣＲＬＦ２タンパク質）の発現増加や、前記生体試料中のヒトＥＴＶ７遺伝子がコードするタンパク質（ヒトＥＴＶ７タンパク質）の発現増加を検出、及び必要に応じて定量する、アレルギー性鼻炎の診断用データを収集する方法（以下、「本件収集方法」という）であれば特に制限されない。
【００１８】
また、本発明のアレルギー性鼻炎の診断用キットとしては、上記生体試料中のヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現や、上記生体試料中のヒトＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備える、アレルギー性鼻炎の診断に用いるためのキット（以下、「本件診断用キット１」という）や、上記生体試料中のヒトＣＲＬＦ２タンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物や、上記生体試料中のヒトＥＴＶ７タンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備える、アレルギー性鼻炎の診断に用いるためのキット（以下、「本件診断用キット２」という）であれば特に制限されず、本件診断用キット１及び２は、アレルギー性鼻炎を診断するためのキットに関する用途発明であり、これらキットには、一般にこの種の診断キットに用いられる成分、例えば担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤の他、取扱説明書、アレルギー性鼻炎を診断するための説明書等の添付文書が通常含まれる。
【００１９】
また、本発明のアレルギー性鼻炎を診断するためのバイオマーカーとしては、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子やＥＴＶ７遺伝子、或いは、ヒトＣＲＬＦ２タンパク質やＥＴＶ７タンパク質からなる、被験者におけるアレルギー性鼻炎の診断用バイオマーカー（以下、「本件バイオマーカー」という）であれば特に制限されない。
【００２０】
また、本発明のアレルギー性鼻炎の予防又は治療剤のスクリーニング方法としては、アレルギー性鼻炎非ヒト動物に被検薬剤又は被検物質を投与する工程（ａ）；及び前記非ヒト動物から採取された生体試料中の、非ヒトＣＲＬＦ２遺伝子やＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現増加、或いは、非ヒトＣＲＬＦ２タンパク質やＥＴＶ７タンパク質の発現増加を検出する工程；を順次備えた方法（以下、「本件スクリーニング方法」という）であれば特に制限されない。
【００２１】
上記「アレルギー性鼻炎の診断」には、アレルギー性鼻炎発症の有無の判定、より具体的には、アレルギー性鼻炎の感作陽性発症と、アレルギー性鼻炎の感作陰性未発症又は感作陽性未発症との分類や、アレルギー性鼻炎発症リスクの判定、より具体的には、アレルギー性鼻炎の感作陽性発症と、アレルギー性鼻炎の感作陽性未発症との分類が含まれる。
【００２２】
本件収集方法としては、より精度の高い診断用データを提供する観点から、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現増加と、ヒトＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現増加とを、同時、逐次、又は個別に検出する方法や、ヒトＣＲＬＦ２タンパク質の発現増加と、ヒトＥＴＶ７タンパク質の発現増加とを、同時、逐次、又は個別に検出する方法が好ましい。
【００２３】
また、本件診断用キット１としては、より精度の高い診断用キットを提供する観点から、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー若しくはプローブ、又はそれらの標識物と、ヒトＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー若しくはプローブ、又はそれらの標識物とを備えるキットが好ましい。また、本件診断用キット２としては、より精度の高い診断用キットを提供する観点から、ヒトＣＲＬＦ２タンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物と、ヒトＥＴＶ７タンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物とを備えるキットが好ましい。
【００２４】
また、本件バイオマーカーとしては、より精度の高い診断用バイオマーカーを提供する観点から、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子とＥＴＶ７遺伝子とからなるもの、又は、ヒトＣＲＬＦ２タンパク質とＥＴＶ７タンパク質とからなるものが好ましい。
【００２５】
また、本件スクリーニング方法としては、より効果の高いアレルギー性鼻炎の予防又は治療剤をスクリーニングする観点から、上記工程（ｂ）において、非ヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現減少と、非ヒトＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現減少とを、同時、逐次、又は個別に検出する方法や、非ヒトＣＲＬＦ２タンパク質の発現減少と、非ヒトＥＴＶ７タンパク質の発現減少とを、同時、逐次、又は個別に検出する方法が好ましい。
【００２６】
本発明において「アレルギー性鼻炎」とは、ある種の外因性物質の摂取又は接触により生体内に抗体が作られ、同じ外因性物質（アレルゲン［抗原］）の再摂取又は再接触により抗原抗体反応が生じて、アレルギー性鼻炎の症状（鼻閉、発作性反復性のくしゃみ、及び／又は水性鼻漏）が現れる、鼻粘膜におけるＩ型アレルギー性（ＩｇＥ抗体によるアレルギー性）の炎症を意味する。
【００２７】
本発明において、「アレルギー性鼻炎の感作陰性未発症」とは、対象のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の増加が認められず、かつ、上記アレルギー性鼻炎の症状が認められない状態を意味し、「アレルギー性鼻炎の感作陽性未発症」とは、対象のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の増加が認められ、かつ、上記アレルギー性鼻炎の症状が認められない状態を意味し、「アレルギー性鼻炎の感作陽性発症」とは、対象のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の増加が認められ、かつ、上記アレルギー性鼻炎の症状が認められる状態を意味する。
【００２８】
上記アレルギー性鼻炎は、始発時期から通年性のアレルギー性鼻炎と、季節性のアレルギー性鼻炎とに分類される。かかる通年性のアレルギー性鼻炎は、ハウスダスト（例えば、カビ、真菌の胞子、織物の繊維、動物の鱗屑、ダニ、昆虫の死骸）等が原因で、年間を通じて発症し得るものである。一方、上記季節性のアレルギー性鼻炎は、花粉等が原因で、一年の特定の時期に発症し得るものである。
【００２９】
上記アレルギー性鼻炎としては、具体的に、上記ハウスダストにより生じるアレルギー性鼻炎や、スギ花粉症、ヒノキ花粉症、ブタクサ花粉症、イネ花粉症、ケヤキ花粉症、カモガヤ花粉症、シラカバ花粉症、コナラ花粉症、ハンノキ花粉症、マツ属花粉症を挙げることができ、これらの中でもスギ花粉症や、ダニが原因で発症するアレルギー性鼻炎（ダニアレルギー性鼻炎）が好ましい。
【００３０】
上記被験者としては、アレルギー性鼻炎の感作陽性未発症の被検者や、細菌性鼻炎やウィルス性鼻炎等の他の疾患に罹患している可能性がある被験者などのアレルギー性鼻炎かどうか不明な被験者を挙げることができる。かかるアレルギー性鼻炎かどうか不明な被験者には、過去にアレルギー性鼻炎に罹患したことがあり、被検時にアレルギー性鼻炎かどうか不明な被験者も含まれる。
【００３１】
上記生体試料としては、組織、細胞、器官等の非液性試料や、血液、尿、唾液等の液性試料や、血液から調製された好塩基球を含む試料を挙げることができ、これらの中でも血液、又は血液から調製された好塩基球を含む試料が好ましい。
【００３２】
被験者がアレルギー性鼻炎の感作陰性未発症者である場合、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量や、ヒトＣＲＬＦ２タンパク質の発現量は、通常、対象のアレルゲンで刺激されていない生体試料（以下、便宜上「未刺激試料」ということがある）と、対象のアレルゲンで刺激されている生体試料（以下、便宜上「刺激試料」ということがある）との間でほとんど変わらない。
【００３３】
したがって、本件収集方法において、被験者由来の「未刺激試料」と、「刺激試料」との間でヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量がほとんど変わらない場合、或いは、被験者由来の「未刺激試料」と、「刺激試料」との間でヒトＣＲＬＦ２タンパク質の発現量がほとんど変わらない場合、かかる被験者は、アレルギー性鼻炎の感作陰性未発症者である可能性が高いと診断するためのデータを収集することができる。
【００３４】
また、被験者がアレルギー性鼻炎の感作陽性未発症者である場合、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量や、ヒトＣＲＬＦ２タンパク質の発現量は、通常、「未刺激試料」と比べ、「刺激試料」の方が増加する。かかる感作陽性未発症者由来の「未刺激試料」に対する「刺激試料」の増加レベルの相対値（比率；以下、便宜上「感作未発症者におけるＣＲＬＦ２比率」ということがある）は、検出対象の生体試料、刺激するアレルゲンの濃度、検出方法等により異なるため、一概に特定することはできないが、好塩基球由来のヒトＣＲＬＦ２タンパク質を免疫学的測定法で検出する場合、通常１．０１〜１．４の範囲内であり、例えば、１．０１〜１．３５、１．０１〜１．３、１．０１〜１．２５、１．０１〜１．２、１．０１〜１．１５、１．０１〜１．１、１．０１〜１．０５、１．０５〜１．３５、１．０５〜１．３、１．０５〜１．２５、１．０５〜１．２、１．０５〜１．１５、１．０５〜１．１、１．１〜１．３５、１．１〜１．３、１．１〜１．２５、１．１〜１．２、１．１〜１．１５、１．１５〜１．３５、１．１５〜１．３、１．１５〜１．２５、１．１５〜１．２０、１．２〜１．３５、１．２〜１．３、１．２〜１．２５、１．２５〜１．３５、１．２５〜１．３、１．３〜１．３５、１．０５〜１．４、１．１〜１．４、１．１５〜１．４、１．２〜１．４、１．２５〜１．４、１．３〜１．４、１．３５〜１．４等を挙げることができる。
【００３５】
したがって、本件収集方法において、「未刺激試料」に対する「刺激試料」の、ＣＲＬＦ２タンパク質の発現量比率が、「感作未発症者におけるＣＲＬＦ２比率」の範囲内である場合、かかる被験者は、アレルギー性鼻炎の感作陽性未発症者である可能性が高いと診断するためのデータを収集することができる。
【００３６】
また、好塩基球由来のＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡの発現をＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）解析で検出する場合や、好塩基球由来のヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｃＤＮＡの発現を定量ＰＣＲ法で検出する場合、「感作未発症者におけるＣＲＬＦ２比率」は、通常１．２以上であり、例えば、１．３以上、１．６以上、１．７以上、２．０以上、２．３以上、２．６以上、３．０以上、３．３以上、３．６以上、４．０以上、４．３以上、４．６以上、５．０以上、５．３以上、５．６以上、６．０以上、６．３以上、６．６以上、７．０以上等を挙げることができる。
【００３７】
したがって、本件収集方法において、被験者由来の「未刺激試料」中のヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量に対する、前記被験者由来の「刺激試料」中のヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量の比率が、「感作未発症者におけるＣＲＬＦ２比率」以上である場合、かかる被験者は、アレルギー性鼻炎の感作陽性未発症者である可能性が高いと診断するためのデータを収集することができる。
【００３８】
また、被験者がアレルギー性鼻炎の発症者である場合、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量や、ヒトＣＲＬＦ２タンパク質の発現量は、通常、「未刺激試料」と比べ、「刺激試料」の方が増加する。かかる発症者由来の「未刺激試料」に対する「刺激試料」の増加レベルの相対値（比率；以下、便宜上「発症者におけるＣＲＬＦ２比率」ということがある）は、検出対象の生体試料、刺激するアレルゲンの濃度、検出方法等により異なるため、一概に特定することはできないが、好塩基球由来のヒトＣＲＬＦ２タンパク質を免疫学的測定法で検出する場合、通常１．０５以上であり、例えば、１．１以上、１．１５以上、１．２以上、１．２５以上、１．３以上、１．３５以上、１．４以上、１．４５以上、１．５以上、１．５５以上、１．６以上、１．６５以上、１．７以上、１．７５以上、１．８以上、１．８５以上、１．９以上、１．９５以上、２．０以上、２．０５以上、２．１以上、２．１５以上、２．２以上、２．２５以上、２．３以上、２．３５以上、２．４以上、２．４５以上、２．５以上等を挙げることができる。
【００３９】
したがって、本件収集方法において、被験者由来の「未刺激試料」中のヒトＣＲＬＦ２タンパク質の発現量に対する、前記被験者由来の「刺激試料」中のヒトＣＲＬＦ２タンパク質の発現量の比率が、「発症者におけるＣＲＬＦ２比率」以上である場合、かかる被験者は、アレルギー性鼻炎の感作陽性発症者である可能性が高いと診断するためのデータを収集することができる。
【００４０】
また、好塩基球由来のヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡの発現をＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）解析で検出する場合や、好塩基球由来のヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｃＤＮＡの発現を定量ＰＣＲ法で検出する場合、「発症者におけるＣＲＬＦ２比率」は、通常１．２以上であり、例えば、１．３以上、１．６以上、１．９以上、２．０以上、２．３以上、２．６以上、３．０以上、３．３以上、３．６以上、４．０以上、４．３以上、４．６以上、５．０以上、５．３以上、５．６以上、６．０以上、６．３以上、６．６以上、７．０以上等を挙げることができる。
【００４１】
したがって、本件収集方法において、被験者由来の「未刺激試料」中のヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量に対する、前記被験者由来の「刺激試料」中のヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量の比率が、「発症者におけるＣＲＬＦ２比率」以上である場合、かかる被験者は、アレルギー性鼻炎の感作陽性発症者である可能性が高いと診断するためのデータを収集することができる。
【００４２】
本件収集方法において、被験者由来の「未刺激試料」と、「刺激試料」との間でヒトＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量とがほとんど変わらない場合、或いは、被験者由来の「未刺激試料」と、「刺激試料」との間でヒトＥＴＶ７タンパク質の発現量がほとんど変わらない場合、かかる被験者は、アレルギー性鼻炎の感作陰性未発症者又は感作陽性未発症者である可能性が高いと診断するためのデータを収集することができる。
【００４３】
また、被験者がアレルギー性鼻炎の感作陽性発症者である場合、ヒトＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量や、ヒトＥＴＶ７タンパク質の発現量は、通常、「未刺激試料」と比べ、「刺激試料」の方が増加する。かかる感作陽性発症者由来の「未刺激試料」に対する「刺激試料」の増加レベルの相対値（比率；以下、便宜上「発症者におけるＥＴＶ７比率」ということがある）は、検出対象の生体試料、刺激するアレルゲンの濃度、検出方法等により異なるため、一概に特定することはできないが、好塩基球由来のヒトＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡの発現をＲＮＡ−Ｓｅｑ解析で検出する場合や、好塩基球由来のヒトＥＴＶ７遺伝子のｃＤＮＡの発現を定量ＰＣＲ法で検出する場合、通常１．２以上であり、例えば、１．５以上、２．０以上、２．５以上、３．０以上、３．５以上、４．０以上、４．５以上、５．０以上、５．５以上、６．０以上、６．５以上、７．０以上、７．５以上、８．０以上、８．５以上、９．０以上、９．５以上、１０以上等を挙げることができる。
【００４４】
したがって、本件収集方法において、被験者由来の「未刺激試料」中のヒトＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量に対する、前記被験者由来の「刺激試料」中のヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量の比率が、「発症者におけるＥＴＶ７比率」以上である場合、或いは、被験者由来の「未刺激試料」中のヒトＥＴＶ７タンパク質の発現量に対する、前記被験者由来の「刺激試料」中のヒトＥＴＶ７タンパク質の発現量の比率が、「発症者におけるＥＴＶ７比率」以上である場合、かかる被験者は、アレルギー性鼻炎の感作陽性発症者である可能性が高いと診断するためのデータを収集することができる。
【００４５】
本件収集方法において、被験者由来の「未刺激試料」と、「刺激試料」との間でヒトＣＲＬＦ２及びＥＴＶ７遺伝子の両方について、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量がほとんど変わらない場合、かかる被験者は、アレルギー性鼻炎の感作陰性未発症者である可能性が高いと診断するためのデータを収集することができる。
【００４６】
また、本件収集方法において、被験者由来の「未刺激試料」に対する「刺激試料」中のヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量が増加し、かつ、前記被験者由来の「未刺激試料」に対する「刺激試料」中のヒトＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量が増加しない場合、かかる被験者は、アレルギー性鼻炎の感作陽性未発症者である可能性が高いと診断するためのデータを収集することができる。
【００４７】
また、本件収集方法において、ヒトＣＲＬＦ２及びＥＴＶ７遺伝子の両方について、被験者由来の「未刺激試料」に対する「刺激試料」のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量が増加する場合、かかる被験者は、アレルギー性鼻炎の感作陽性発症者である可能性が高いと診断するためのデータを収集することができる。
【００４８】
本件収集方法において、「未刺激試料」に対する「刺激試料」の、ヒトＣＲＬＦ２遺伝子又はＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現量比率や、ＣＲＬＦ２タンパク質又はＥＴＶ７タンパク質の発現量比率が、閾値（カットオフ値）より高いか否かを指標として、これらｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、又はタンパク質の発現が増加しているか否かを判定することもできる。上記閾値は、定法、例えば、「感作未発症者におけるＣＲＬＦ２比率」のデータや、「発症者におけるＣＲＬＦ２比率」のデータを基に、統計解析ソフトウェアを用いたＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を用いて算出することができる。
【００４９】
上記「刺激試料」は、生体試料をアレルゲン存在下で培養することにより調製できる。生体試料の培養期間としては、特に制限されず、例えば１０分〜２日間、好ましくは１〜１２時間である。また、生体試料の培養に用いる培養液としては、特に制限されず、例えば、５〜２０％のウシ胎児血清（Fetal bovine serum；ＦＢＳ）を含む動物細胞培養用基礎培養液（ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９、ＡＩＭ−Ｖ等）を挙げることができる。また、培養液中のアレルゲンの濃度としては、特に制限されず、例えば０．０１〜１ｎｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは０．０５〜０．２ｎｇ／ｍＬである。培養温度は、通常３０〜４０℃の範囲内であり、好ましくは約３７℃である。培養時のＣＯ２濃度は、通常約１〜１０％の範囲内であり、好ましくは約５％である。また、培養時の湿度は、通常約７０〜１００％の範囲内であり、好ましくは約９５〜１００％の範囲内である。上記「未刺激試料」は、アレルゲン非存在下で「刺激試料」と同じ条件で調製することが好ましい。
【００５０】
上記ヒトＣＲＬＦ２遺伝子としては、具体的に以下の［Ａ群ポリヌクレオチド］から選択される１又は２種以上のポリヌクレオチドを挙げることができる。
［Ａ群ポリヌクレオチド］
（１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（ＣＲＬＦ２のアイソフォーム１をコードするｃＤＮＡ［NCBI Reference Sequence：NM_022148］）、或いは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するポリヌクレオチド；
（２）配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（ＣＲＬＦ２のアイソフォーム２をコードするｃＤＮＡ［NCBI Reference Sequence：NM_001012288］）
、或いは、配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するポリヌクレオチド；
【００５１】
上記ヒトＣＲＬＦ２タンパク質としては、具体的に以下の［Ａ群タンパク質］から選択される１又は２種以上のタンパク質を挙げることができる。
［Ａ群タンパク質］
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＣＲＬＦ２のアイソフォーム１［NCBI Reference Sequence：NP_071431］）、或いは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するタンパク質；
（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＣＲＬＦ２のアイソフォーム２［NCBI Reference Sequence：NP_001012288］）、或いは、配列番号４に示される
アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するタンパク質；
【００５２】
上記ヒトＥＴＶ７遺伝子としては、具体的に以下の［Ｂ群ポリヌクレオチド］から選択される１又は２種以上のポリヌクレオチドを挙げることができる。
［Ｂ群ポリヌクレオチド］
（１）配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（ＥＴＶ７のアイソフォーム１をコードするｃＤＮＡ［NCBI Reference Sequence：NM_016135］）、或いは、配列番号５に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するポリヌクレオチド；
（２）配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（ＥＴＶ７のアイソフォーム２をコードするｃＤＮＡ［NCBI Reference Sequence：NM_001207035］）、
或いは、配列番号７に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するポリヌクレオチド；
（３）配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（ＥＴＶ７のアイソフォーム３をコードするｃＤＮＡ［NCBI Reference Sequence：NM_001207036］）、
或いは、配列番号９に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するポリヌクレオチド；
（４）配列番号１１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（ＥＴＶ７のアイソフォーム４をコードするｃＤＮＡ［NCBI Reference Sequence：NM_001207037］）
、或いは、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するポリヌクレオチド；
（５）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（ＥＴＶ７のアイソフォーム５をコードするｃＤＮＡ［NCBI Reference Sequence：NM_001207038］）
、或いは、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するポリヌクレオチド；
（６）配列番号１５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（ＥＴＶ７のアイソフォーム６をコードするｃＤＮＡ［NCBI Reference Sequence：NM_001207039］）
、或いは、配列番号１５に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するポリヌクレオチド；
（７）配列番号１７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（ＥＴＶ７のアイソフォーム７をコードするｃＤＮＡ［NCBI Reference Sequence：NM_001207040］）
、或いは、配列番号１７に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するポリヌクレオチド；
（８）配列番号１９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（ＥＴＶ７のアイソフォーム８をコードするｃＤＮＡ［NCBI Reference Sequence：NM_001207041］）
、或いは、配列番号１９に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するポリヌクレオチド；
【００５３】
上記ヒトＥＴＶ７タンパク質としては、具体的に以下の［Ｂ群タンパク質］から選択される１又は２種以上のタンパク質を挙げることができる。
［Ｂ群タンパク質］
（１）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＥＴＶ７のアイソフォーム１［NCBI Reference Sequence：NP_057219］）、或いは、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するタンパク質；
（２）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＥＴＶ７のアイソフォーム２［NCBI Reference Sequence：NP_001193964］）、或いは、配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するタンパク質；
（３）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＥＴＶ７のアイソフォーム３［NCBI Reference Sequence：NP_001193965］）、或いは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するタンパク質；
（４）配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＥＴＶ７のアイソフォーム４［NCBI Reference Sequence：NP_001193966］）、或いは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するタンパク質；
（５）配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＥＴＶ７のアイソフォーム５［NCBI Reference Sequence：NP_001193967］）、或いは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するタンパク質；
（６）配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＥＴＶ７のアイソフォーム６［NCBI Reference Sequence：NP_001193968］）、或いは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するタンパク質；
（７）配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＥＴＶ７のアイソフォーム７［NCBI Reference Sequence：NP_001193969］）、或いは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するタンパク質；
（８）配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＥＴＶ７のアイソフォーム８［NCBI Reference Sequence：NP_001193970］）、或いは、配列番号２０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するタンパク質；
【００５４】
上記「１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列」とは、通常１〜１０個の範囲内、好ましくは１〜７個の範囲内、より好ましくは１〜６個の範囲内、さらに好ましくは１〜５個の範囲内、より好ましくは１〜４個の範囲内、さらに好ましくは１〜３個の範囲内、より好ましくは１〜２個の範囲内、最も好ましくは１個の数のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列を意味する。
【００５５】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、通常１〜１０個の範囲内、好ましくは１〜７個の範囲内、より好ましくは１〜６個の範囲内、さらに好ましくは１〜５個の範囲内、より好ましくは１〜４個の範囲内、さらに好ましくは１〜３個の範囲内、より好ましくは１〜２個の範囲内、最も好ましくは１個の数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。
【００５６】
本件収集方法や本件スクリーニング方法において、ＣＲＬＦ２又はＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現量を検出・定量する方法としては、ＣＲＬＦ２又はＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの一部又は全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、生体試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析する方法や、上記全ＲＮＡを、ＣＲＬＦ２又はＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたノーザンブロッティング法で検出する方法や、上記全ＲＮＡを、逆転写酵素を用いてＣＲＬＦ２又はＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡの逆転写産物（ｃＤＮＡ）を合成した後、かかる逆転写産物を特異的に増幅するプライマー対を用いた、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等の定量ＰＣＲ法で検出する方法や、上記ｃＤＮＡを、ＣＲＬＦ２又はＥＴＶ７遺伝子検出用プローブ（ビオチン、アビジン等の標識物質でラベルしたＣＲＬＦ２又はＥＴＶ７遺伝子のｃＤＮＡ）が、ガラス、シリコン、プラスチックなどのハイブリダイゼーションに使用可能な支持体上に固定化したものを用いたマイクロアレイで検出する方法等を挙げることができる。
【００５７】
本件収集方法や本件スクリーニング方法において、ＣＲＬＦ２又はＥＴＶ７タンパク質の発現量を検出・定量する方法としては、ＣＲＬＦ２又はＥＴＶ７タンパク質の一部又は全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、ＣＲＬＦ２又はＥＴＶ７タンパク質を構成するペプチドを検出する質量分析法や、ＣＲＬＦ２又はＥＴＶ７タンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法を挙げることができる。
【００５８】
上記免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロッティング法、フローサイトメトリー等を好適に例示することができる。フローサイトメトリーは、蛍光物質（アロフィコシアニン［ＡＰＣ］、フィコエリトリン［ＰＥ］、ＦＩＴＣ［fluorescein isothiocyanate］、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７等）で標識した、ＣＲＬＦ２又はＥＴＶ７タンパク質に特異的に結合する抗体を用いた蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により行うことができる。ＣＲＬＦ２タンパク質は細胞表面受容体であることから、好塩基球等の細胞中のＣＲＬＦ２タンパク質は、生細胞の状態で検出できる。このため、好塩基球等の細胞中のＣＲＬＦ２タンパク質の発現量を検出・定量する場合、簡便性を考慮すると、フローサイトメトリーを用いることが好ましい。
【００５９】
本件収集方法又は本件スクリーニング方法において、アレルギー性鼻炎を診断するためのデータの信頼性をより高めるために、さらに、アレルゲン特異的ＩｇＥの発現増加又は減少を、同時、逐次、又は個別に検出する方法が好ましい。かかるアレルゲン特異的ＩｇＥの発現増加又は減少を検出する方法は、特に、本件収集方法の前に実施することが好ましい。
【００６０】
本件収集方法又は本件スクリーニング方法において、アレルゲン特異的ＩｇＥの発現増加又は減少を検出する方法としては、生体試料中のアレルゲン特異的ＩｇＥの発現量を検出・定量できる方法であればよく、具体的には、かかる生体試料と、アレルゲン（抗原）とを接触させ、生体試料中のアレルゲン特異的ＩｇＥと、アレルゲンとの結合を検出するＣＡＰ（Capsulated Hydrophilic Carrier Polymer）−ＲＡＳＴ（Radioallergosorbent Test）法、マスト細胞又は好塩基球におけるＩｇＥ受容体と、アレルゲンとの結合により放出されるヒスタミンを検出するヒスタミン遊離試験（ＨＲＴ）、アレルゲン刺激による好塩基球細胞の表面の活性化マーカー（ＣＤ２０３等）の変化を、フローサイトメーターにより解析する好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）、アレルゲン特異的ＩｇＥ及び転写因子ＮＦ−ＡＴ（Nuclear Factor-Activated Tcell）により制御可能なプロモーター下流にレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、ＧＦＰ等）が挿入された遺伝子を用いたレポーターアッセイにより解析する方法などを挙げることができる。アレルゲン特異的ＩｇＥを検出する場合の生体試料は、通常、血液や、血液から調製された血清又は血漿である。
【００６１】
本件診断用キット１におけるプライマーとしては、ヒトＣＲＬＦ２又はＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの上流又は下流の配列の一部とアニーリングしうる相補的なプライマーセット（便宜上、それぞれ「フォワードプライマー及びリバースプライマー」という）であれば、プライマー配列の長さ、かかるｃＤＮＡとアニーリングする部位、増幅するｃＤＮＡの長さ等は、ｃＤＮＡの増幅効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。例えば、プライマー配列の長さとしては、通常１０〜１００塩基長であり、好ましくは１０〜４０塩基長であり、より好ましくは１０〜３０塩基長であり、さらに好ましくは１５〜３０塩基長である。
【００６２】
上記フォワードプライマー及びリバースプライマーは、通常、鋳型ＤＮＡである上記［Ａ群ポリヌクレオチド］及び［Ｂ群ポリヌクレオチド］から選択されるポリヌクレオチド由来の増幅産物が特異的に生成されるように選択される。すなわち、上記［Ａ群ポリヌクレオチド］及び［Ｂ群ポリヌクレオチド］のポリヌクレオチドにおいて、ヌクレオチド配列の１番目を上流とし、末尾を下流とした場合、フォワードプライマーの３’末端におけるヌクレオチドは、フォワードプライマーとリバースプライマーによる二本鎖ＤＮＡ形成（プライマーダイマー形成）による擬陽性を回避することも考慮すると、通常、リバースプライマーの３’末端におけるヌクレオチドよりも少なくとも上流にアニールするように選択される。
【００６３】
上記フォワードプライマー及びリバースプライマーは、その少なくとも一部が鋳型ＤＮＡ（上記［Ａ群ポリヌクレオチド］及び［Ｂ群ポリヌクレオチド］から選択されるポリヌクレオチド）の一部とアニール（ハイブリダイズ）し、かつ、ＰＣＲにより増幅産物を生成できるものであればよく、ここでフォワードプライマー又はリバースプライマーの「少なくとも一部」とは、通常、フォワードプライマー又はリバースプライマーのヌクレオチド配列に対して６０％以上を意味し、好ましくは６５％以上であり、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは７５％以上であり、さらにより好ましくは８０％以上であり、特に好ましくは８５％以上であり、最も好ましくは９０％以上を意味する。
【００６４】
本件診断用キット１におけるプローブとしては、ヒトＣＲＬＦ２又はＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの一部又は全部がハイブリダイゼーションするプローブであれば、プローブの長さ、ハイブリダイズする部位等は、ハイブリダイゼーションの効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。例えば、プローブの長さは、通常５０〜２０００塩基長であり、好ましくは１００〜１５００塩基長であり、より好ましくは２００〜１０００塩基長であり、さらに好ましくは３００〜８００塩基長である。
【００６５】
上記プローブは、通常、鋳型ＤＮＡである上記［Ａ群ポリヌクレオチド］及び［Ｂ群ポリヌクレオチド］から選択されるポリヌクレオチドにアニール（ハイブリダイズ）するように選択される。この場合、上記プローブは、その少なくとも一部が鋳型ＤＮＡ（上記［Ａ群ポリヌクレオチド］及び［Ｂ群ポリヌクレオチド］から選択されるポリヌクレオチド）の一部とアニール（ハイブリダイズ）できるものであればよく、ここでプローブの「少なくとも一部」とは、通常、プローブのヌクレオチド配列に対して６０％以上を意味し、好ましくは６５％以上であり、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは７５％以上であり、さらにより好ましくは８０％以上であり、特に好ましくは８５％以上であり、最も好ましくは９０％以上を意味する。
【００６６】
本件診断用キット２における抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの抗体であってもよく、また、この中には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）２などの抗体の一部からなる抗体断片も含まれる。
【００６７】
本件診断用キット１や２の標識物における標識物質としては、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescence Protein；ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（Cyan Fluorescence Protein；ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescence Protein；ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescence Protein；ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Red Fluorescence Protein；ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ（luciferase）等の蛍光タンパク質、３Ｈ 、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質を挙げることができる。
【００６８】
本件スクリーニング方法の工程（ａ）において、アレルギー性鼻炎非ヒト動物に被検薬剤又は被検物質を投与する方法としては、具体的に、非経口投与や経口投与を挙げることができる。かかる非経口投与としては、例えば、静脈内投与、小動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、心室内投与、頭蓋内投与、鼻腔内投与、結腸内投与、経皮的投与を挙げることができる。
【００６９】
本件スクリーニング方法の工程（ｂ）において、「刺激試料」における非ヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量が、被検薬剤又は被検物質の投与前後で減少する場合、或いは、「刺激試料」における非ヒトＣＲＬＦ２タンパク質の発現量が、被検薬剤又は被検物質の投与前後で減少する場合、かかる被検薬剤又は被検物質は、アレルギー性鼻炎の予防又は治療剤の候補薬剤又は物質として選択することができる。一方、「刺激試料」における非ヒトＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量が、被検薬剤又は被検物質の投与前後で減少しない場合、或いは、「刺激試料」における非ヒトＣＲＬＦ２タンパク質の発現量が、被検薬剤又は被検物質の投与前後で減少しない場合、かかる被検薬剤又は被検物質は、アレルギー性鼻炎の予防又は治療剤の候補薬剤又は物質として除外することができる。
【００７０】
また、本件スクリーニング方法の工程（ｂ）において、「刺激試料」における非ヒトＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量が、被検薬剤又は被検物質の投与前後で減少する場合、或いは、「刺激試料」における非ヒトＥＴＶ７タンパク質の発現量が、被検薬剤又は被検物質の投与前後で減少する場合、かかる被検薬剤又は被検物質は、アレルギー性鼻炎の予防又は治療剤の候補薬剤又は物質として選択することができる。一方、非ヒトＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現量が、被検薬剤又は被検物質の投与前後で減少しない場合、或いは、「刺激試料」における非ヒトＥＴＶ７タンパク質の発現量が、被検薬剤又は被検物質の投与前後で減少しない場合、かかる被検薬剤又は被検物質は、アレルギー性鼻炎の予防又は治療剤の候補薬剤又は物質として除外することができる。
【００７１】
本件スクリーニング方法におけるアレルギー性鼻炎非ヒト動物としては、アレルギー性鼻炎を自然に発症した非ヒト動物であってもよいし、文献「日本補完代替医療学会誌  第９巻  第２号  ２０１２年９月：１０７−１１３」に記載の方法にしたがって作製したアレルギー性鼻炎モデルラットや、文献「Haenuki, Y. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 2012, 130: 184-194e11」に記載の方法にしたがって作製したアレルギー性鼻炎モデルマウスや、特開２０１３−７０６５３号公報に記載の方法にしたがって作製したアレルギー性鼻炎モデル動物や、市販されているアレルギー性鼻炎モデル動物、例えば、卵アレルギーモデル OVA-IgEマウス（BALB/cA-Tg（IgE-H01-4）Rin Tg（IgE-kL01-4）Rin /Jcl）や、化学物質アレルギーモデルTNP-IgEマウス（BALB/cA-Tg（IgE-Hb4）Rin Tg（IgE-kLb4）Rin /Jcl）（すべて、日本クレア社製）であってもよい。上記非ヒト動物としては、マウスの他、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の非ヒト哺乳動物を例示することができる。
【００７２】
非ヒト動物のＣＲＬＦ２遺伝子又はタンパク質（ヒトＣＲＬＦ２遺伝子又はタンパク質のオーソログ）は、マウス（NCBI Gene ID: 57914）、ラット（NCBI Gene ID: 171499）、イヌ（NCBI Gene ID: 491709）、ウシ（NCBI Gene ID: 529792）、サル（NCBI Gene ID: 106995136）等において知られている。
また、非ヒト動物のＥＴＶ７遺伝子又はタンパク質（ヒトＥＴＶ７遺伝子又はタンパク質のオーソログ）は、チンパンジー（NCBI Gene ID: 747854）、イヌ（NCBI Gene ID: 481764）、ウシ（NCBI Gene ID: 529792）、サル（NCBI Gene ID: 719151）等において知られている。
【００７３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００７４】
１．好塩基球由来のＲＮＡの抽出
スギ花粉症の感作陽性未発症者６名（感作未発症群）、及びスギ花粉症の感作陽性発症者１１名（発症群）、並びにスギ花粉症の感作陰性未発症者５名（健常群）の計２２名（２７〜５０歳の男性１６名及び女性６名）から９０ｍＬ採血し、HetaSep（STEMCELL Technologies社製）を用いて赤血球を除去した後、EasySep Neg Human Basophil Kit（STEMCELL Technologies社製）を用いて好塩基球をネガティブ分離した。上記３群（感作未発症群、感作発症群、及び健常群）由来の好塩基球を、それぞれ０．１ｎｇ／ｍＬのスギ花粉抽出液（ＬＳＬ社製）存在下及び非存在下で４時間（３７℃）、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培養液中に培養した後、miRNeasy Mini kit（Qiagen社製）を用い、添付のプロトコールにしたがってトータルＲＮＡを精製した。【００７５】
２．ＲＮＡシーケンス解析及び統計解析
上記好塩基球由来のトータルＲＮＡを用いたＲＮＡ−Ｓｅｑ解析を、かずさＤＮＡ研究所に委託した。スギ抗原（スギ花粉）刺激あり又はなしの上記３群（感作未発症群、感作発症群、及び健常群）間におけるＲＮＡ遺伝子の発現量を、統計学的手法（多群検定［ＡＮＯＶＡ法］、下位多重検定［Ｔｕｋｅｙ法］、２群検定［paired t-test］）により解析した結果、ＣＲＬＦ２及びＥＴＶ７遺伝子を含む１２種の遺伝子が、アレルギー性鼻炎診断用バイオマーカーの候補として同定された。【００７６】
３．定量ＰＣＲ法
上記１２種の候補遺伝子のさらなるスクリーニングを定量ＰＣＲ法により行った。上記好塩基球由来のトータルＲＮＡを鋳型として、TaqMan Gene Expression Assays（Applied Biosystems社製）を用いた定量ＰＣＲを、製品添付のプロトコールにしたがって行った。
その結果、ＣＲＬＦ２及びＥＴＶ７遺伝子が、アレルギー性鼻炎診断用バイオマーカーとして同定された。なお、内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた。また、定量ＰＣＲに用いた各遺伝子検出用プライマー・プローブ溶液のAssay IDは、以下のとおりである。
ＣＲＬＦ２（Assay ID：Hs00845692_m1）
ＥＴＶ７（Assay ID：Hs00903229_m1）
Ｇａｐｄｈ（Assay ID：Hs99999905_m1）【００７７】
ＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、スギ花粉で刺激することにより、未刺激の場合と比べ、感作未発症群及び発症群の両方において、それぞれ２．４６±１．００（０．４５）及び２．３２±１．０９（０．３３）倍増加することが示された（図１Ａ、「平均値±標準偏差（標準誤差）」として示す）。また、ＣＲＬＦ２遺伝子のｃＤＮＡの発現量についても同様に、スギ花粉で刺激することにより、未刺激の場合と比べ、感作未発症群及び発症群の両方において、それぞれ１．７５±０．２１（０．０９）及び１．６２±０．５０（０．１５）倍増加することが示された（図１Ｂ）。一方、健常群由来のＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの発現量は、スギ花粉で刺激しても、未刺激の場合と比べ、ほとんど変わらなかった（図１Ａ及びＢ）。
この結果は、ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析や定量ＰＣＲ法等により、好塩基球由来のＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現を解析すると、アレルゲン刺激による発現量増加の有無を指標として、アレルギー性鼻炎の感作陰性未発症者と、感作陽性未発症及び感作陽性発症者とを分類できることを示している。【００７８】
また、ＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの発現量は、スギ花粉で刺激することにより、未刺激の場合と比べ、発症群でそれぞれ３．１２±３．０４（０．９６）及び４．０５±４．７６（１．８０）倍増加することが示された（図２Ａ及びＢ）。一方、健常群及び感作未発症群の両方においては、ＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの発現量は、スギ花粉で刺激しても、未刺激の場合と比べ、ほとんど変わらなかった（図２Ａ及びＢ）。
この結果は、ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析や定量ＰＣＲ法等により、好塩基球由来のＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現を解析すると、アレルゲン刺激による発現量増加の有無を指標として、アレルギー性鼻炎の感作陰性未発症者及び感作陽性未発症と、感作陽性発症者とを分類できることを示している。【００７９】
以上の結果を総合すると、ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析や定量ＰＣＲ法等により、好塩基球由来のＣＲＬＦ２及びＥＴＶ７遺伝子の両方の遺伝子について、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現を解析すると、アレルゲン刺激による発現量増加の有無を指標として、アレルギー性鼻炎の感作陰性未発症者、感作陽性未発症、及び感作陽性発症者を分類できることを示している。すなわち、アレルゲン刺激によりＣＲＬＦ２及びＥＴＶ７遺伝子の両方の遺伝子について、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現増加が認められない場合、アレルギー性鼻炎の感作陰性未発症者と判定することができ、アレルゲン刺激によりＣＲＬＦ２遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現増加が認められ、かつ、ＥＴＶ７遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現増加が認められない場合、アレルギー性鼻炎の感作陽性未発症者と判定することができ、アレルゲン刺激によりＣＲＬＦ２及びＥＴＶ７遺伝子の両方の遺伝子について、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現増加が認められる場合、アレルギー性鼻炎の感作陽性発症者と判定することができる。【００８０】
４．フローサイトメトリー解析（１）
好塩基球由来のＣＲＬＦ２タンパク質が構成するＴＳＬＰ受容体（ＴＳＬＰＲ）の発現をフローサイトメーターにより解析した。具体的には、スギ花粉症の感作陽性未発症者１１名（感作未発症群）、及びスギ花粉症の感作陽性発症者１３名（発症群）、並びにスギ花粉症の感作陰性未発症者９名（健常群）の計３３名から９０ｍＬ採血し、それぞれ０．１及び１ｎｇ／ｍＬのスギ花粉抽出液（ＬＳＬ社製）存在下及び非存在下で４時間（３７℃）、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培養液中に培養した後、標識物質で標識した抗ＴＳＬＰＲ抗体（BioLegend社製）の他、死細胞を除去するための７−ＡＡＤ（7-Amino-Actinomycin D）（BD Biosciences社製）、ネガティブセレクションのための標識物質で標識した抗ＣＤ３抗体（BioLegend社製）、及びポジティブセレクションのための標識物質で標識した抗ＣＲＴＨ２抗体を用いて３０分間、４℃条件下で抗原抗体反応を行った。その後、好塩基球のゲーティング、及び好塩基球由来のＴＳＬＰＲの発現解析は、フローサイトメーター（FACS Aria II［BD Biosciences社製］）を用いて行った（図３）。なお、陽性コントロールとして、上記３群（感作未発症群、感作発症群、及び健常群）由来の血液を、Ａｎｔｉ−ＩｇＥで刺激した場合の実験も行った。【００８１】
感作未発症群由来の好塩基球を、０．１及び１ｎｇ／ｍＬのスギ花粉で刺激すると、未刺激の場合と比べ、ＴＳＬＰＲの発現量はそれぞれ１．１８±０．２４及び１．２９±０．４６倍増加することが示された（図３、「平均値±標準偏差」として示す）。一方、発症群由来の好塩基球を、０．１及び１ｎｇ／ｍＬのスギ花粉で刺激すると、未刺激の場合と比べ、ＴＳＬＰＲの発現量はそれぞれ１．４３±０．３３及び１．４６±０．３１倍増加することが示された（図３）。
すなわち、感作未発症群及び発症群由来の好塩基球におけるＴＳＬＰＲは、アレルゲン刺激によりともに増加するものの、感作未発症群と比べ、発症群の方が増加レベルは高いことが示された。
一方、健常群由来の好塩基球をスギ花粉で刺激しても、未刺激の場合と比べ、ＴＳＬＰＲの発現量はほとんど変わらなかった（図３）。
以上の結果は、フローサイトメトリー等の免疫学的測定法により、好塩基球由来のＴＳＬＰＲの発現を解析すると、アレルゲン刺激による発現量増加の有無や、発現量増加レベルを指標として、アレルギー性鼻炎の感作陰性未発症者、感作陽性未発症、及び感作陽性発症者を分類できることを示している。【００８２】
５．フローサイトメトリー解析（２）
次に、スギ花粉症の未発症群（健常群及び感作未発症群）と発症群との判定を、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ法を用いて血清中のスギ特異的ＩｇＥ抗体値を検出する従来法に代えて、好塩基球由来のＴＳＬＰＲの発現量を検出する方法を行った場合に、判定精度が向上するか否かを解析した。具体的には、鼻誘発テストが陰性であるスギ花粉症未発症群（健常群９名及び感作未発症群１１名）２０名由来の好塩基球と、鼻誘発テストが陽性であるスギ花粉症発症群１２名由来の好塩基球とを、上記「４．フローサイトメトリー解析（１）」の項目に記載の方法に従って、０．１ｎｇ／ｍＬのスギ花粉抽出液（ＬＳＬ社製）で刺激し、ＴＳＬＰＲの発現量を測定し、スギ花粉未刺激におけるＴＳＬＰＲの発現量に対する比率（ＴＳＬＰＲ変動倍率）を算出した。なお、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ法や鼻誘発テストは、文献「鼻アレルギー診療ガイドライン−通年性鼻炎と花粉症-２０１６年版．鼻アレルギー診療ガイドライン作製委員会  編、ライフ・サイエンス社」に記載の方法に従って行った。【００８３】
その結果、ＴＳＬＰＲ変動倍率の閾値（カットオフ値）を１．５に設定すると、発症群の中で１．５以上となる真陽性患者の割合（感度）は、５８．３％（７／１２）であり、未発症群の中で１．５未満となる真陰性患者の割合（特異度）は、９５．０％（１９／２０）であり、発症群及び未発症群全体に対する上記真陽性患者及び真陰性患者の割合（正診率）は８１．３％と高かった（図４Ｂ）。
一方、スギ特異的ＩｇＥによる判定において、陽性の疑いがあるとされているクラス１（スギ特異的ＩｇＥ抗体価［ＵＡ／ｍＬ］が０．３５）を閾値に設定すると、発症群の中でクラス１以上（０．３５［ＵＡ／ｍＬ］以上）となる真陽性患者の割合（感度）は、１００％（１２／１２）であるものの、未発症群の中でクラス１未満（０．３５［ＵＡ／ｍＬ］未満）となる真陰性患者の割合（特異度）は４５％（９／２０）であり、発症群及び未発症群全体に対する上記真陽性患者及び真陰性患者の割合（正診率）は、６６．０％程度であった（図４Ａ）。
この結果は、スギ花粉症の未発症群と発症群とを判定する場合、好塩基球由来のＴＳＬＰＲの発現量を基にした本発明の方法の方が、従来のスギ特異的ＩｇＥ抗体値を基にした方法よりも、精度（特異度及び正診率）が優れていることを示している。【００８４】
次に、スギ花粉症の未発症群と発症群との判定を、従来法のスギ特異的ＩｇＥ抗体値を基にした方法と、好塩基球由来のＴＳＬＰＲの発現量を基にした本発明の方法とを組み合わせて行った。具体的には、図４Ａの結果において、さらに、クラス５（スギ特異的ＩｇＥ抗体価［ＵＡ／ｍＬ］が５０；図５Ａ中の上側点線）を閾値に設定し、クラス１〜５に該当する患者１７名（図５Ａ中の２つの点線の範囲内にある患者）の判定を保留し、それ以外の患者１５名について、クラス５以上（５０［ＵＡ／ｍＬ］以上）を陽性とし、クラス１未満（０．３５［ＵＡ／ｍＬ］未満）を陰性として判定した。その結果、発症群の中でクラス５以上となる真陽性患者の割合（感度）は１００％（５／５）であり、未発症群の中でクラス１未満となる真陰性患者の割合（特異度）は９０％（９／１０）であり、発症群及び未発症群全体に対する上記真陽性患者及び真陰性患者の割合（正診率）は９３．３％であった（図５Ａ）。判定を保留した患者１７名について、好塩基球由来のＴＳＬＰＲの発現量を基にした判定を、ＴＳＬＰＲ変動倍率の閾値を１．５に設定して行うと、発症群の中で１．５以上となる真陽性患者の割合（感度）は５７．１％（４／７）であり、未発症群の中で１．５未満となる真陰性患者の割合（特異度）は９０％（９／１０）であり、発症群及び未発症群全体に対する上記真陽性患者及び真陰性患者の割合（正診率）は７６．５％であった（図５Ｂ）。【００８５】
この結果は、従来法のスギ特異的ＩｇＥ抗体値を基にした１次判定法により、陰性である者は、スギ花粉症の感作陰性未発症者である可能性が高いと判定することができ、陽性である者は、スギ花粉症の感作陽性発症者である可能性が高いと判定することができ、陽性及び陰性のいずれか判断できなかった者については、好塩基球由来のＴＳＬＰＲの発現量を基にした２次判定法（本発明の方法）をさらに行い、かかる２次判定法において、陽性である者は、スギ花粉症の感作陽性発症者である可能性が高いと判定することができ、陰性である者は、スギ花粉症の感作陽性未発症者である可能性が高いと判定することができることを示している。
このように、従来法と本発明の方法を組み合わせることにより、従来法では、感作陽性未発症者、又は発症者のいずれか判断できなかったスギ花粉症患者を、本発明の方法により判定することができ、結果として、スギ花粉症の未発症群と発症群とを、高い精度（正診率：８４．４％、２７／３２）で判定することが可能となる。【００８６】
６．フローサイトメトリー解析（３）
次に、ダニアレルギー性鼻炎の未発症群（健常群及び感作未発症群）と発症群との判定を、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ法を用いて血清中のダニ特異的ＩｇＥ抗体値を検出する従来方法に代えて、好塩基球由来のＴＳＬＰＲの発現量を検出する方法を行った場合に、判定精度が向上するか否かを解析した。
鼻誘発テストが陰性であるダニアレルギー性鼻炎未発症群（健常群９名及び感作未発症群７名）１６名由来の好塩基球と、鼻誘発テストが陽性であるダニアレルギー性鼻炎発症群１１名由来の好塩基球とを、上記「４．フローサイトメトリー解析（１）」の項目に記載の方法に従って、０．１ｎｇ／ｍＬのダニ抗原（INDOOR biotechnologies社製）で刺激し、ＴＳＬＰＲの発現量を測定し、ダニ抗原未刺激におけるＴＳＬＰＲの発現量に対する比率（ＴＳＬＰＲ変動倍率）を算出した。なお、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ法や鼻誘発テストは、文献「鼻アレルギー診療ガイドライン−通年性鼻炎と花粉症-２０１６年版．鼻アレルギー診療ガイドライン作製委員会  編、ライフ・サイエンス社」に記載の方法に従って行った。【００８７】
その結果、ＴＳＬＰＲ変動倍率の閾値を１．５に設定すると、発症群の中で１．５以上となる真陽性患者の割合（感度）は８１．８％（９／１１）であり、未発症群の中で１．５未満となる真陰性患者の割合（特異度）は９３．８％（１５／１６）であり、発症群及び未発症群全体に対する上記真陽性患者及び真陰性患者の割合（正診率）は８８．９％と高かった（図６Ｂ）。
一方、ダニ特異的ＩｇＥによる判定において、陽性の疑いがあるとされているクラス１（ダニ特異的ＩｇＥ抗体価［ＵＡ／ｍＬ］が０．３５）を閾値に設定すると、発症群の中でクラス１以上（０．３５［ＵＡ／ｍＬ］以上）となる真陽性患者の割合（感度）は１００％（１１／１１）であるものの、未発症群の中でクラス１未満（０．３５［ＵＡ／ｍＬ］未満）となる真陰性患者の割合（特異度）は６２．５％（１０／１６）であり、発症群及び未発症群全体に対する上記真陽性患者及び真陰性患者の割合（正診率）は７７．８％程度であった（図６Ａ）。
この結果は、ダニアレルギー性鼻炎の未発症群と発症群とを判定する場合、好塩基球由来のＴＳＬＰＲの発現量を基にした本発明の方法の方が、従来のダニ特異的ＩｇＥ抗体値を基にした判定法よりも、精度（特異度及び正診率）が優れていることを示している。【００８８】
次に、ダニアレルギー性鼻炎の未発症群と発症群との判定を、従来法のダニ特異的ＩｇＥ抗体値を基にした方法と、好塩基球由来のＴＳＬＰＲの発現量を基にした本発明の方法とを組み合わせて行った。具体的には、図６Ａの結果において、さらに、クラス５（ダニ特異的ＩｇＥ抗体価［ＵＡ／ｍＬ］が５０；図７Ａ中の上側点線）を閾値に設定し、クラス１〜５に該当する患者１７名（図７Ａ中の２つの点線の範囲内にある患者）の判定を保留し、それ以外の患者１０名について、クラス５以上（５０［ＵＡ／ｍＬ］以上）を陽性とし、クラス１未満（０．３５［ＵＡ／ｍＬ］未満）を陰性として判定した。その結果、未発症群の中でクラス１未満となる真陰性患者の割合（特異度）は１００％（１０／１０）であり、未発症群全体に対する上記真陰性患者の割合（正診率）は１００％であった（図７Ａ）。判定を保留した患者１７名について、好塩基球由来のＴＳＬＰＲの発現量を基にした判定を、ＴＳＬＰＲ変動倍率の閾値を１．５に設定して行うと、発症群の中で１．５以上となる真陽性患者の割合（感度）は８１．８％（９／１１）であり、未発症群の中で１．５未満となる真陰性患者の割合（特異度）は８３．３％（５／６）であり、発症群及び未発症群全体に対する上記真陽性患者及び真陰性患者の割合（正診率）は８２．４％であった（図７Ｂ）。【００８９】
この結果は、従来法のダニ特異的ＩｇＥ抗体値を基にした１次判定法により、陰性である者は、ダニアレルギー性鼻炎の感作陰性未発症者である可能性が高いと判定することができ、陰性か判断できなかった者については、好塩基球由来のＴＳＬＰＲの発現量を基にした２次判定法（本発明の方法）をさらに行い、かかる２次判定法において、陽性である者は、ダニアレルギー性鼻炎の感作陽性発症者である可能性が高いと判定することができ、陰性である者は、ダニアレルギー性鼻炎の感作陽性未発症者である可能性が高いと判定することができることを示している。
このように、従来法と本発明の方法を組み合わせることにより、従来法では、感作陽性未発症者、又は発症者のいずれか判断できなかったダニアレルギー性鼻炎患者を、本発明の方法により判定することができ、結果として、ダニアレルギー性鼻炎の未発症群と発症群とを、高い精度（正診率：８８．９％、２４／２７）で判定することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明は、アレルギー性鼻炎発症の診断、予防、及び治療の他、アレルギー性鼻炎の予防又は治療剤の開発に資するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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