(57)【要約】  本発明は、プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質を有効成分として含有する、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤を提供する。
2018101261.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質を有効成分として含有する、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
【請求項２】
上記物質が、Ｚｂｔｂ２０生成を抑制又は阻害する物質を含む、請求項１に記載の進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
【請求項３】
上記物質が、ドパミン受容体アゴニスト又はドパミン受容体部分アゴニストを含む、請求項１に記載の進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
【請求項４】
上記進行型免疫性脱髄疾患が二次進行型多発性硬化症である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
【請求項５】
プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質を対象に投与することを含む、進行型免疫性脱髄疾患への進行を予防又は抑制する方法。
【請求項６】
上記物質が、Ｚｂｔｂ２０生成を抑制又は阻害する物質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記物質が、ドパミン受容体アゴニスト又はドパミン受容体部分アゴニストを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
上記進行型免疫性脱髄疾患が二次進行型多発性硬化症である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤を製造するための、プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質の使用。
【請求項１０】
上記物質が、Ｚｂｔｂ２０生成を抑制又は阻害する物質を含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
上記物質が、ドパミン受容体アゴニスト又はドパミン受容体部分アゴニストを含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
上記進行型免疫性脱髄疾患が二次進行型多発性硬化症である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
ＣＸ３ＣＲ１受容体の活性化を抑制又は阻害する物質を有効成分として含有する、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
【請求項１４】
上記物質が、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体又はその抗原結合断片である、請求項１３に記載の進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
【請求項１５】
ヒト対象からミクログリアを採取し、ＩＬ−９、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β１の少なくとも１種の発現量を測定することを含む、進行型免疫性脱髄疾患への進行を診断するためのデータを収集する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＳ）とは、自己免疫疾患のひとつで、髄鞘及び神経軸索を標的とする多発性炎症が惹起され、広汎な脱髄に起因する神経伝導障害を引き起こす疾患である。多発性硬化症の病態が進行すると、運動障害や視覚障害などの重篤な神経症状が現れる。【０００３】
多発性硬化症は、急性増悪と寛解を繰り返す再発寛解型ＭＳ（ＲＲ−ＭＳ）と、進行型ＭＳがある。進行型ＭＳには、一次進行型ＭＳ（ＰＰ−ＭＳ）と、ＲＲ−ＭＳ病態が一定期間続いた後に進行性の病態へと移行する二次進行型ＭＳ（ＳＰ−ＭＳ）、及び再発を繰り返しながら進行する進行再発型ＭＳ（ＰＲ−ＭＳ）が知られている（非特許文献１〜３）。【０００４】
ＲＲ−ＭＳの疾患修飾性治療薬（ｄｉｓｅａｓｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｄｒｕｇｓ：ＤＭＤ）として、１型インターフェロン、抗炎症剤、免疫抑制剤等が知られている。一方、進行型ＭＳに対してＲＲ−ＭＳのＤＭＤを適用しても効果がなく、現在のところ進行型ＭＳに対する有効なＤＭＤは知られていない。進行型ＭＳの治療方針としては、バクロフェンの髄注、持続性４−アミノピリジン製剤の投与等の対症療法が重要な位置を占めている。【０００５】
これまでのところ、進行型ＭＳ病態の形成機序は、ＲＲ−ＭＳ病態の形成機序との異同を含めて明らかではない。一方、非特許文献４には、ＳＰ−ＭＳ患者の中枢神経系（ＣＮＳ）では、複数の細胞又は組織において障害が生じており、またその障害が白質だけでなく灰白質にもおよんでいることが報告されている。また非特許文献４は、多発性硬化症患者の脳内において、ＰＡＲ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）受容体ファミリーに属するＰＡＲ２受容体の発現量が変化しており、ＰＡＲ２受容体が神経の炎症症状に関与していることを報告している。【０００６】
本発明者らは、単相型の実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスでは、誘導初期に通常の四肢麻痺を伴うＥＡＥ病態が観察されない一方で、誘導後期（誘導後約２８日以降）にＥＡＥ病態（以下、「後期ＥＡＥ病態」ともいう。）が観察されること、及び後期ＥＡＥ病態が進行型ＭＳ病態のモデルになることを見出した（特許文献１）。また、本発明者らは、神経変性を含む後期ＥＡＥ病態が、刺激に伴うグランザイムＢの放出による持続的な神経細胞障害に起因するものと考え、ＰＡＲ１受容体アンタゴニスト等を用いてＰＡＲ１受容体を阻害することにより、後期ＥＡＥ病態が改善することを見出した（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１６／００２８２７号
【特許文献２】国際公開第２０１６／１１４３８６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２０１２，８，６４７−６５６．
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２０１３，９，４９６−５０３．
【非特許文献３】Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１３，１９：  １４２８−１４３６．
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １８０２（２０１０），６６−７９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、これらの事情に鑑みてなされたものであり、進行型免疫性脱髄疾患治療の予防、発症抑制又は治療剤の提供を主な目的とする。本発明はまた、進行型免疫性脱髄疾患への進行を予防又は抑制する方法の提供も目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＮＲ４Ａ２欠損マウスの後期ＥＡＥ病態において、ＣＮＳ由来の抗原提示細胞による刺激により、Ｔｈ細胞のＥｏｍｅｓ分子の発現が誘導されること、抗原提示細胞が産生するプロラクチンがＥｏｍｅｓ分子の発現誘導を促進することを新たに見出した。本発明は、これらの新規知見に基づくものである。なお、プロラクチンは、脳下垂体だけではなく、脳下垂体以外の脳組織、乳腺、乳頭組織、胎盤、子宮、免疫組織（例えば、リンパ球、胸腺、脾臓）等からも産生されることが知られている。これらのプロラクチンは、脳下垂体由来のプロラクチンと区別して、異所性プロラクチンとも呼ばれる。【００１１】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１５）を提供する。
（１）プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質を有効成分として含有する、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
（２）上記物質が、Ｚｂｔｂ２０生成を抑制又は阻害する物質を含む、（１）に記載の進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
（３）上記物質が、ドパミン受容体アゴニスト又はドパミン受容体部分アゴニストを含む、（１）に記載の進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
（４）上記進行型免疫性脱髄疾患が二次進行型多発性硬化症である、（１）〜（３）のいずれかに記載の進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
（５）プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質を対象に投与することを含む、進行型免疫性脱髄疾患への進行を予防又は抑制する方法。
（６）上記物質が、Ｚｂｔｂ２０生成を抑制又は阻害する物質を含む、（５）に記載の方法。
（７）上記物質が、ドパミン受容体アゴニスト又はドパミン受容体部分アゴニストを含む、（５）に記載の方法。
（８）上記進行型免疫性脱髄疾患が二次進行型多発性硬化症である、（５）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤を製造するための、プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質の使用。
（１０）上記物質が、Ｚｂｔｂ２０生成を抑制又は阻害する物質を含む、（９）に記載の使用。
（１１）上記物質が、ドパミン受容体アゴニスト又はドパミン受容体部分アゴニストを含む、（９）に記載の使用。
（１２）上記進行型免疫性脱髄疾患が二次進行型多発性硬化症である、（９）〜（１１）のいずれかに記載の使用。
（１３）ＣＸ３ＣＲ１受容体の活性化を抑制又は阻害する物質を有効成分として含有する、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
（１４）上記物質が、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体又はその抗原結合断片である、（１３）に記載の進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
（１５）ヒト対象からミクログリアを採取し、ＩＬ−９、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β１の少なくとも１種の発現量を測定することを含む、進行型免疫性脱髄疾患への進行を診断するためのデータを収集する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤の提供、および進行型免疫性脱髄疾患への進行を予防又は抑制する方法の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスのＣＮＳへ浸潤した抗原提示細胞（ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞）と共培養したＴｈ細胞におけるＣＤ１０７ａ及びＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラムである。
【図２】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスのＣＮＳへ浸潤した抗原提示細胞（ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞）と共培養したＴｈ細胞のＥｏｍｅｓ発現量を示すグラフである（図１のサマリーデータ）。
【図３】図３（ａ）は、各進行度のＥＡＥ病態における脳及び脊髄を採取した時期を示すグラフであり、３つの点線は、それぞれ初期ＥＡＥ病態、中期ＥＡＥ病態、後期ＥＡＥ病態に相当する採取時期を示す。図３（ｂ）は、各進行度のＥＡＥ病態におけるＴ細胞のサイトグラム及びＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示すグラフである。
【図４】各進行度のＥＡＥ病態におけるＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ１９−ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞のサイトグラム及び各細胞の割合を示すグラフである。
【図５】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスのＣＮＳへ浸潤した抗原提示細胞（ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞）におけるプロラクチン及び成長ホルモンの発現量を示すグラフである。
【図６】各進行度のＥＡＥ病態におけるＣＳＦ中のプロラクチン及び成長ホルモンの発現量を示すグラフである。
【図７】プロラクチン共存下培養によるＥｏｍｅｓ発現への影響を示すグラフである。
【図８】プロラクチン共存下培養によるＥｏｍｅｓ発現への影響を示すグラフである。
【図９】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスのＣＮＳへ浸潤した抗原提示細胞におけるプロラクチン及びＺｂｔｂ２０の遺伝子発現量を示すグラフである。
【図１０】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスのＣＮＳへ浸潤した抗原提示細胞におけるＺｂｔｂ２０のタンパク質発現を示すサイトグラムである。
【図１１】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスのＣＮＳへ浸潤した抗原提示細胞におけるＺｂｔｂ２０およびプロラクチンのタンパク質発現を示すグラフである。
【図１２】後期ＥＡＥ病態のマウスのＣＮＳから採取したＢ細胞におけるＩＬ−１０及びＺｂｔｂ２０の遺伝子発現レベルを示すサイトグラム及びグラフである。
【図１３】後期ＥＡＥ病態のマウスのＣＮＳから採取したｎｏｎ−Ｂ抗原提示細胞におけるＺｂｔｂ２０の遺伝子発現レベルを示すサイトグラム及びグラフである。
【図１４】脳下垂体におけるプロラクチン及び成長ホルモンの発現量を示すグラフである。
【図１５】プロラクチン存在下又は非存在下で培養した脾臓由来Ｔｈ細胞におけるＥｏｍｅｓ発現量を示すグラフである。
【図１６】プロラクチン存在下又は非存在下で培養した脾臓由来ＣＤ２２６＋Ｔｈ細胞でのＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラムである。
【図１７】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスに、ブロモクリプチンを投与したときのＥＡＥスコアを示すグラフである。
【図１８】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスに、ブロモクリプチンを投与したあとでＣＮＳへ浸潤したＴｈ細胞のＥｏｍｅｓ発現を示すグラフである。
【図１９】ブロモクリプチン投与後のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示すグラフである。
【図２０】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスにブロモクリプチンを投与したときの、ＣＮＳへ浸潤したＴｈ細胞におけるＣＤ１０７ａ及びＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラムである。
【図２１】ブロモクリプチン投与後のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合及びＣＤ１０７ａ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示すグラフである。
【図２２】ドパミン投与後のＥｏｍｅｓ遺伝子の発現を示すグラフである。
【図２３】Ｌ−ドパ投与後のＥＡＥ病態マウスの臨床スコアを示すグラフである。
【図２４】Ｌ−ドパ投与後のＥｏｍｅｓタンパク質及びＺｂｔｂ２０タンパク質の発現を示すグラフである。
【図２５】Ｌ−ドパ投与後のプロラクチン遺伝子の発現レベルを示すグラフである。
【図２６】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスに、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体を投与したときのＥＡＥスコアを示すグラフである。
【図２７】単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスに、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体を投与したときのＣＤ４＋Ｔｈ細胞に対するＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の割合を示すグラフである。
【図２８】Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与後のＥＡＥ病態マウスの臨床スコアを示すグラフである。
【図２９】Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与後のＥｏｍｅｓタンパク質及びＺｂｔｂ２０タンパク質の発現を示すグラフである。
【図３０】Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与後のプロラクチン遺伝子及びＺｂｔｂ２０遺伝子の発現を示すグラフである。
【図３１】図３１（ａ）及び（ｂ）は、抗ＣＤ２０抗体投与後のＥＡＥ病態マウスの臨床スコアを示すグラフである。図３１（ｃ）は、抗ＣＤ２０抗体投与後のＺｂｔｂ２０タンパク質の発現を示すグラフである。
【図３２】抗ＣＤ２０抗体投与後のＥｏｍｅｓタンパク質及びＺｂｔｂ２０タンパク質の発現を示すグラフである。
【図３３】各種サイトカイン存在下での培養におけるＺｂｔｂ２０タンパク質の発現を示すグラフである。
【図３４】各種サイトカイン存在下での培養におけるＺｂｔｂ２０遺伝子及びプロラクチン遺伝子の発現を示すグラフである。
【図３５】ＥＡＥ病態の進行に伴う各種サイトカイン発現の変化を示すグラフである。
【図３６】ＥＡＥ病態の進行に伴う各種サイトカイン発現の変化を示すグラフである。
【図３７】後期ＥＡＥ病態マウスから採取したミクログリア存在下での培養におけるプロラクチン遺伝子及びＺｂｔｂ２０遺伝子の発現を示すサイトグラム及びグラフである。
【図３８】ＥＡＥ病態の進行に伴う各種サイトカイン発現の変化を示すグラフである。
【図３９】ＥＡＥ病態の進行に伴う各種サイトカイン発現の変化を示すグラフである。
【図４０】ＥＡＥ病態の進行に伴う各種ケモカイン発現の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
〔定義〕
本明細書において、「進行型免疫性脱髄疾患」とは、免疫反応に起因する髄鞘の障害により生じる疾患であって、寛解することなく持続的に進行する疾患を意味する。進行型免疫性脱髄疾患は、好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患である。進行型免疫性脱髄疾患としては、例えば、ＰＰ−ＭＳ、ＳＰ−ＭＳ及びＰＲ−ＭＳ等の進行型多発性硬化症が挙げられる。
【００１５】
ＮＲ４Ａ２遺伝子は、Ｎｕｒｒ１遺伝子、ＮＯＴ遺伝子、又はＲＮＲ１遺伝子とも呼ばれ、オーファン核内受容体の１種である。ＮＲ４Ａ２遺伝子の主な発現部位は、中枢神経系であり、特に中脳腹側、脳幹、脊髄に強く発現している。また、ＮＲ４Ａ２は，プロスタグランジン、増殖因子、炎症性サイトカイン、Ｔ細胞受容体架橋に応答して発現が誘導され、リガンド依存性又はリガンド非依存性にＤＮＡと直接結合して転写を制御する。ヒトＮＲ４Ａ２遺伝子の転写産物のＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅのアクセッション番号は、ＮＭ＿００６１８６．３である。
【００１６】
Ｅｏｍｅｓ遺伝子は、Ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ又はＴｂｒ２とも呼ばれ、Ｔ−ｂｏｘ転写因子族の一種であり、脊椎動物の発生や分化に係るタンパク質である。Ｅｏｍｅｓ遺伝子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞障害性Ｔ細胞，ＣＴＬ）及びＮＫ細胞で発現していることが知られている。また、パーフォリン及びグランザイムＢの発現を直接誘導することが知られている。ヒトＥｏｍｅｓ遺伝子の転写産物のＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅのアクセッション番号は、ＮＭ＿００１２７８１８２．１（バリアント１）、ＮＭ＿００５４４２．３（バリアント２）、及びＮＭ＿００１２７８１８３．１（バリアント３）である。
【００１７】
Ｚｂｔｂ２０は、Ｃ２Ｈ２  Ｋｒｕｐｐｅｌ系ジンクフィンガータンパク及びＢＴＢ／ＰＯＺドメインを含むジンクフィンガータンパクのサブファミリの１つに属するタンパクである。また、Ｚｂｔｂ２０は、プロラクチン遺伝子のプロモーターに結合しており、プロラクチンの転写活性を促進させる。Ｚｂｔｂ２０は、下垂体前葉の全ての成熟内分泌細胞系に高発現している。Ｚｂｔｂ２０の欠損は、プロラクチンの発現及び分泌を顕著に減少させる。
【００１８】
〔進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤〕
本発明の第一の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤は、プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質を有効成分として含有する。
【００１９】
進行型免疫性脱髄疾患は、好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患であり、より好ましくは二次進行型多発性硬化症（ＳＰ−ＭＳ）である。
【００２０】
プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質としては、例えば、プロラクチン遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質、ドパミン受容体アゴニスト、ドパミン受容体部分アゴニスト、ドパミン再吸収阻害薬（Ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｒｅｕｐｔａｋｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ドパミン分解酵素阻害薬、ドパミン類似化合物、又は、Ｚｂｔｂ２０生成を抑制又は阻害する物質が挙げられる。ドパミン受容体アゴニスト又は部分アゴニストは、ドパミンＤ２受容体アゴニスト又は部分アゴニストであることが好ましい。
【００２１】
プロラクチン遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質は、プロラクチンがタンパク質として機能することを抑制できる物質であればよい。当該発現抑制物質としては、例えば、プロラクチン遺伝子を転写レベル又は翻訳レベルで発現抑制することができる物質、プロラクチンの機能性部位に結合して機能発現を抑制することができる物質が挙げられる。
【００２２】
プロラクチン遺伝子を転写レベル又は翻訳レベルで発現抑制することができる物質としては、例えば、プロラクチンの遺伝子発現を抑制する核酸、ペプチド、糖又は糖タンパク質、分子量１０００以下の低分子化合物等であってもよい。プロラクチンの遺伝子発現を抑制する核酸としては、例えば、プロラクチン遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
【００２３】
プロラクチンの機能性部位に結合して機能発現を抑制することができる物質としては、例えば、抗プロラクチン抗体又はその抗原結合性断片（例えば、中和抗体）等が挙げられる。
【００２４】
プロラクチンの発現を抑制する発現抑制物質は、プロラクチン遺伝子のゲノム配列、ｍＲＮＡ配列、タンパク質配列、タンパク質の立体構造等の情報に基づいて、本技術分野で公知の方法により設計及び製造することができる。
【００２５】
ドパミン受容体アゴニストとしては、例えば、ドパミン、アポモルヒネ、ブロモクリプチン、カベルゴリン、キラドパ（Ｃｉｌａｄｏｐａ）、ジヒドレキシジン（Ｄｉｈｙｄｒｅｘｉｄｉｎｅ）、ジナプソリン（Ｄｉｎａｐｓｏｌｉｎｅ）、ドキサントリン（Ｄｏｘａｎｔｈｒｉｎｅ）、エピクリプチン、リスリド（Ｌｉｓｕｒｉｄｅ）、ペルゴリド、ピリベジル（Ｐｉｒｉｂｅｄｉｌ）、プラミペキソール、プロピルアポモルヒネ、キナゴリド（Ｑｕｉｎａｇｏｌｉｄｅ）、タリペキソール、ロピニロール、ロチゴチン、ロキシンドール（Ｒｏｘｉｎｄｏｌｅ）、スマニロール（Ｓｕｍａｎｉｒｏｌｅ）が挙げられる。
【００２６】
ドパミン受容体部分アゴニストとしては、例えば、アリピプラゾール、ブレクスピプラゾール、フェンシクリジン、サルビノリンＡ、クインピロールが挙げられる。
【００２７】
ドパミン再吸収阻害薬としては、例えば、アルトロパン、アンフォネリック酸、アミネプチン、ＢＴＣＰ、ＤＢＬ−５８３、ジフルオロピン（Ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｉｎ）、ＧＢＲ−１２７８３、ＧＢＲ−１２９３５、ＧＢＲ−１３０６９、ＧＢＲ−１３０９８、ＧＹＫＩ−５２８９５、ロメトパン（ｌｏｍｅｔｏｐａｎｅ）、メチルフェニデート、ＲＴＩ−２２９、ヴァノキセリンが挙げられる。
【００２８】
ドパミン分解酵素阻害薬としては、例えば、セレギリン、ゾニサミド等のモノアミノキシダーゼＢ阻害薬、エンタカポン等のカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害薬が挙げられる。
【００２９】
ドパミン類似化合物としては、例えば、Ｌ−ドパ（レボドパ、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）、ドロキシドパ（Ｌ−トレオ−ジヒドロキシフェニルセリン）が挙げられる。
【００３０】
Ｚｂｔｂ２０遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質は、Ｚｂｔｂ２０がタンパク質として機能することを抑制できる物質であればよい。当該発現抑制物質としては、例えば、Ｚｂｔｂ２０遺伝子を転写レベル又は翻訳レベルで発現抑制することができる物質、Ｚｂｔｂ２０の機能性部位に結合して機能発現を抑制することができる物質が挙げられる。Ｚｂｔｂ２０遺伝子を転写レベル又は翻訳レベルで発現抑制することができる物質としては、例えば、Ｚｂｔｂ２０の遺伝子発現を抑制する核酸、ペプチド、糖又は糖タンパク質、分子量１０００以下の低分子化合物等であってもよい。Ｚｂｔｂ２０の遺伝子発現を抑制する核酸としては、例えば、Ｚｂｔｂ２０遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種が挙げられる。Ｚｂｔｂ２０の機能性部位に結合して機能発現を抑制することができる物質としては、例えば、Ｚｂｔｂ２０の機能性部位に結合して機能発現を抑制する核酸、ペプチド、糖又は糖タンパク質、分子量１０００以下の低分子化合物、抗Ｚｂｔｂ２０抗体（例えば、中和抗体）又はその抗原結合性断片等が挙げられる。
【００３１】
Ｚｂｔｂ２０の発現を抑制する発現抑制物質は、Ｚｂｔｂ２０遺伝子のゲノム配列、ｍＲＮＡ配列、タンパク質配列、タンパク質の立体構造等の情報に基づいて、本技術分野で公知の方法により設計及び製造することができる。Ｚｂｔｂ２０の発現を抑制する発現抑制物質としては、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ１２２／ＣＵＸ１／ｍｉｃｒｏＲＮＡ２１４／ＺＢＴＢ２０経路を阻害又は抑制する物質であってもよい。ｍｉｃｒｏＲＮＡ２１４又はｍｉｃｒｏＲＮＡ２１４を強制発現させると、Ｚｂｔｂ２０遺伝子の発現が抑制されることが知られている（Ｋｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２０１１，  ２：３３８，１−１０）。また、Ｚｂｔｂ２０の発現を抑制する発現抑制物質としては、例えば、ＬＭＰ２Ａ（Ｌａｔｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２Ａ）及び／又はＩＲＦ４（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ４）の発現を抑制する物質であってもよい。ＬＭＰ２Ａ発現Ｂ細胞では、Ｉｒｆ４及びＺｂｔｂ２０遺伝子の発現が亢進されており、Ｉｒｆ４によってコードされるタンパクＩＲＦ４はＺｂｔｂ２０プロモーターに結合し、Ｚｂｔｂ２０遺伝子の発現を亢進させることが知られている（Ｍｉｎａｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１５，１１２，３７，１１６１２−１１６１７）。
【００３２】
本実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤における上記有効成分（プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質）の含有量は、特に制限されるものではなく、例えば、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤全量を基準として、０．００１〜１００質量％であってよい。
【００３３】
進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤は、上記有効成分のみで構成されていてもよく、また上記有効成分以外に、多発性硬化症の予防、発症抑制又は治療において使用されうる他の薬剤、製剤技術分野において常用される賦形剤、緩衝剤、安定化剤、抗酸化剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤及び流動添加調節剤等の添加剤を含有していてもよい。また、上記他の薬剤は、プロラクチン受容体から始まるシグナル伝達の抑制又は阻害とは、異なるメカニズムで治療効果を発揮するものであることが好ましい。
【００３４】
他の薬剤としては、電位依存性ナトリウムチャネル阻害剤（例えば、ラモトリジン（Ｌａｍｏｔｒｉｇｉｎｅ））、カリウムチャネルブロッカー（例えば、ファムプリジン（Ｆａｍｐｒｉｄｉｎｅ））、電位依存性カルシウムチャネル抑制剤（例えば、ガバペンチン（Ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ））、シポニモド（ＢＡＦ３１２、Ｓｉｐｏｎｉｍｏｄ）、ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤（例えば、シンバスタチン（Ｓｉｍｂａｓｔａｔｉｎ）等のスタチン）、Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニスト（例えば、フィンゴリモド（Ｆｉｎｇｏｌｉｍｏｄ、ＦＴＹ７２０）、ｃ−ｋｉｔ受容体阻害剤（例えば、マシチニブ（Ｍａｓｉｔｉｎｉｂ））、ＭＩＳ４１６、トエルナ（Ｔｏｅｌｕｎａ）、カリウム保持性利尿薬（例えば、アミロリド（Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ））、リルゾール（Ｒｉｌｕｚｏｌｅ）、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、イブジラスト（Ｉｂｕｄｉｌａｓｔ、ＭＮ−１６６））、シクロフォスフォアミド、ステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、ミトキサントロン（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ））、ＥＬＮＤ００２、ＭＤ１００３、リタリン（Ｒｉｔａｌｉｎ）、フマル酸クエチアピン（Ｑｕｅｔｉａｐｉｎｅ  ｆｕｍａｒａｔｅ）、ＮＭＤＡ受容体阻害剤（例えば、メマンチン（Ｍｅｍａｎｔｉｎｅ））、タクロリムス（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）、テリフルノミド（Ｔｅｒｉｆｌｕｎｏｍｉｄｅ、ＨＭＲ１７２６）、ＢＨＴ−３００９−０１、サンフェノンＥＧＣＧ（サンフェノンエピガロカテキンガレート）、ＣＳ−０７７７、グラチラマー酢酸塩（Ｃｏｐｏｘｏｎｅ（登録商標））、ＯＮＯ−４６４１、プリン代謝拮抗剤（例えば、クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ））、リポ酸、イノシン、カンナビス、ナビキシモルス（Ｎａｂｉｘｉｍｏｌｓ、Ｓａｔｉｖｅｘ（登録商標））、エリスロポイエチン、インターフェロンβ−１ｂ、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、エストリオール、合成ミエリン塩基性タンパク部分ペプチド（例えば、ジルコチド（Ｄｉｒｕｃｏｔｉｄｅ、ＭＢＰ８２９８））、モノクローナル抗ヒトＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ））、ヒト化モノクローナル抗α４インテグリン抗体（例えば、ナタリツマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ、ＢＧ００００２））、モノクロ−ナル抗ＣＤ２５抗体（例えば、ダクリツマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ））、ヒト化モノクローナル抗ＩＬ−１２抗体、モノクローナル抗ＩＬ−１２／２３抗体（例えば、ＡＢＴ−８７４（Ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ））、ヒト化モノクローナルＮｏｇｏ−Ａ抗体（例えば、Ｏｚａｎｅｚｕｍａｂ、ＧＳＫ１２２３２４９）等が挙げられる。
【００３５】
第一の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤の剤形は、例えば、散剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、注射剤等のいずれの剤形であってもよい。
【００３６】
第一の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤は、経口投与されてもよく、非経口投与されてもよい。具体的な投与量の一例として、例えば、ヒト成人男子（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日当たりの進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤の投与量は、通常、有効成分量換算で、０．０００１μｇ〜１００００ｍｇ／日／人である。
【００３７】
上記第一の実施形態は、それを必要とするヒト対象にプロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質を投与するステップを含む、進行型免疫性脱髄疾患への進行を予防又は抑制する方法ということもできる。例えば、上記第一の実施形態に係る方法は、再発寛解型免疫性脱髄疾患から進行型免疫性脱髄疾患への進行を予防又は抑制する。
【００３８】
本発明の第二の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤は、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含有する。
【００３９】
進行型免疫性脱髄疾患は、好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患であり、より好ましくは二次進行型多発性硬化症（ＳＰ−ＭＳ）である。
【００４０】
抗ＣＸ３ＣＲ１抗体又はその抗原結合断片としては、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。抗ＣＸ３ＣＲ１抗体は、マウス抗体、ラット抗体、モルモット抗体、ハムスター抗体、ウサギ抗体、サル抗体、イヌ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体のいずれであってもよい。抗ＣＸ３ＣＲ１抗体は、血中滞留性等の物性を改善するために化学修飾を施したものであってもよい。また、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体は、治療効果を高めるために、放射性核種、毒素等が結合したものであってもよい。
【００４１】
抗ＣＸ３ＣＲ１抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体は、マウス抗体、ラット抗体、モルモット抗体、ハムスター抗体、ウサギ抗体、サル抗体、イヌ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体のいずれであってもよい。抗ＣＸ３ＣＲ１抗体は、血中滞留性等の物性を改善するために化学修飾を施したものであってもよい。また、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体は、治療効果を高めるために、放射性核種、毒素等が結合したものであってもよい。
【００４２】
抗原結合性断片としては、抗体の抗原結合部位を含む抗体断片であればよく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ等が挙げられる。
【００４３】
本実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤における上記有効成分（抗ＣＸ３ＣＲ１抗体又はその抗原結合断片）の含有量は、特に制限されるものではなく、例えば、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤全量を基準として、０．００１〜１００質量％であってよい。
【００４４】
進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤は、上記有効成分のみで構成されていてもよく、また上記有効成分以外に、多発性硬化症の予防、発症抑制又は治療において使用されうる他の薬剤、製剤技術分野において常用される賦形剤、緩衝剤、安定化剤、抗酸化剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤及び流動添加調節剤等の添加剤を含有していてもよい。また、上記他の薬剤は、ＣＸ３ＣＲ１受容体から始まるシグナル伝達の抑制又は阻害とは、異なるメカニズムで治療効果を発揮するものであることが好ましい。他の薬剤は、第一実施形態で示した薬剤と同一である。
【００４５】
第二の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤の剤形は、例えば、散剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、注射剤等のいずれの剤形であってもよい。
【００４６】
第二の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤は、経口投与されてもよく、非経口投与されてもよい。具体的な投与量の一例として、例えば、ヒト成人男子（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日当たりの進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤の投与量は、通常、有効成分量換算で、０．０００１μｇ〜１００００ｍｇ／日／人である。
【００４７】
上記第二の実施形態は、それを必要とするヒト対象に抗ＣＸ３ＣＲ１抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む、進行型免疫性脱髄疾患の治療方法、又は病態の進行抑制方法ということもできる。
【００４８】
上記第一又は第二の実施形態において、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制、病態の進行抑制効果は、Ｔｈ細胞表面のＥｏｍｅｓ発現量が増加量を解析することにより、判断することができる。Ｔｈ細胞表面のＥｏｍｅｓ発現量が増加量の解析方法としては、例えば、ヒト対象から採取された、リンパ球を含む体液中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出する方法が挙げられる。ヒト対象から採取された体液は、リンパ球を含む体液であればよい。ヒト対象から採取された体液としては、例えば、血液、脳脊髄液が挙げられる。血液は、末梢血であってよい。Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出は、本技術分野における常法に従って行うことができる。
【００４９】
Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出は、これに限定されるものではないが、例えば、ヒト対象から採取された、リンパ球を含む体液サンプルから常法に従いＰＢＭＣを分離するステップ、標識抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合性断片、標識抗ＣＤ４抗体又はその抗原結合性断片、及び標識抗Ｅｏｍｅｓ抗体又はその抗原結合性断片をＰＢＭＣと反応させ、フローサイトメーターでＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するステップを含む方法により実施することができる。
【００５０】
本発明はまた、ヒト対象からミクログリアを採取し、ＩＬ−９、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β１の少なくとも１種の発現量を測定することを含む、進行型免疫性脱髄疾患への進行を診断するためのデータを収集する方法も提供する。
【００５１】
図３６に示すように、ＥＡＥ病態の進行過程において、中期ＥＡＥ病態になるとミクログリア内のＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β１、ＩＬ−９の発現量が顕著に増加する。すなわち、ヒト対象のミクログリアにおいて、これらのサイトカインの発現量が顕著に増加することは、進行型免疫性脱髄疾患への進行を判断するためのデータを収集することができる。
【００５２】
サイトカインの増加は、進行型免疫性脱髄疾患への進行が疑われていないヒト対象又は健康成人のミクログリア内のサイトカインの発現量に基づいて定められた閾値よりも多いことを意味する。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００５４】
１．ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウスのＥＡＥ解析
（１）動物
使用したマウスはすべて６〜８週齢で、特定病原体不在条件下で飼育した。ｌｏｘｐ配列でＮＲ４Ａ２遺伝子を挟んだターゲッティングベクターを用いて、ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌマウスを樹立した。すなわち、ｌｏｘｐ配列に挟まれたＮＲ４Ａ２導入遺伝子をＣ５７ＢＬ／６胚性幹細胞にマイクロインジェクションにより導入した。樹立系統をＣ５７ＢＬ／６  ＦＬＰｅマウス（理研バイオリソースセンター）と交雑させてネオマイシンカセットを除去した系統同士を交配して、ホモ接合ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスを作製した。得られたマウスをＣ５７ＢＬ／６  ＣＤ４−Ｃｒｅマウス（タコニック社）と交配させることにより、ＣＤ４特異的ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６  Ｃｒｅ−ＣＤ４／ＮＲ４Ａ２ｆｌ＼ｆｌマウス）を樹立した。【００５５】
（２）ＥＡＥ誘導（単相型ＥＡＥ）
１００μｇのＭＯＧ３５−５５残基に相当するペプチド（東レリサーチセンター，日本，東京にて合成、以下、「ＭＯＧペプチド」ともいう。）と１ｍｇの結核菌Ｈ３７Ｒａ死菌（Ｄｉｆｃｏ，米国，カンザス州）を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化したものを等量混和し、ホモジナイザーを用いて乳化させ、ＭＯＧエマルジョンを調製した。得られたＭＯＧエマルジョンを、ＣＤ４特異的ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｒｅ−ＣＤ４／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）及び対照としてＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の背部皮下に１〜２か所注射し、免疫を付与した。さらに、免疫付与後０日目と２日目に、１匹あたり、２００ｎｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，米国）のＰＢＳ溶液２００μＬを、マウスの腹腔内に注射した。【００５６】
（３）中枢神経系へのＴ細胞の浸潤
上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）及びＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）から、誘導１０日後（初期ＥＡＥ病態に相当）、誘導１４日後（中期ＥＡＥ病態に相当）及び誘導１８日後（後期ＥＡＥ病態に相当）に脳及び脊髄を採取し、フローサイトメーターを用いて、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を分離した。具体的には、組織を小さい破片に切断した後、３７℃で４０分間、１．４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＨ及び１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含有したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）において更に分解した。得られた組織のホモジネートを７０μｍ細胞濾過器（ＧＥヘルスケアサイエンス社製）に通し、不連続パーコール密度勾配遠心分離法（３７％／８０％）を用いて、白血球細胞を濃縮した。次いで、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞をＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩ（ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで分離した。分離したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を、それぞれ脾臓由来のＣＤ２２６＋Ｔｈ細胞と８時間、共培養した。培養後、回収したＴｈ細胞のＥｏｍｅｓ及びＣＤ１０７ａの発現量の変化をフローサイトメーターで解析した。分離の際に使用した抗体は、抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ１０７ａ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いた。【００５７】
結果を図１及び図２に示す。図１によれば、誘導１８日後のＥＡＥ発症マウス（後期ＥＡＥ病態に相当）では、ＣＮＳ由来の抗原提示細胞が、Ｔｈ細胞に対する顕著なＥｏｍｅｓ発現誘導能を有することが認められた。【００５８】
（４）ＥＡＥ病態の各進行度におけるＥｏｍｅｓ発現
上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスから、誘導１０日後（初期ＥＡＥ病態）、１４日後（中期ＥＡＥ病態）、１８日後（後期ＥＡＥ病態）に脳及び脊髄を採取し、フローサイトメーターを用いて、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。なお、採取時期は、図３（ａ）のグラフにおける初期、中期、後期に相当する。具体的には、組織を小さい破片に切断した後、３７℃で４０分間、１．４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＨ及び１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含有したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）において更に分解した。得られた組織のホモジネートを７０μｍ細胞濾過器（ＧＥヘルスケアサイエンス社製）に通し、不連続パーコール密度勾配遠心分離法（３７％／８０％）を用いて、白血球細胞を濃縮した。次いで、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞をＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩ（ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで分離した。
分離したＣＤ４＋Ｔ細胞のＥｏｍｅｓ発現量の変化をフローサイトメーターで解析した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。【００５９】
次に、各ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して、細胞内染色を行い、Ｅｏｍｅｓ発現量を測定した。結果を図３（ｂ）に示す。図３（ｂ）のグラフは、病態の各進行度における、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＥｏｍｅｓ＋Ｔ細胞の割合（％）を示したものである。後期ＥＡＥ病態において、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が、顕著に増加していることが観測された。【００６０】
また、採取した脳及び脊髄から、フローサイトメーターを用いて、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ４５ｈｉ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ１９−Ｂ細胞を分離した。分離したＣＤ４５ｈｉ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ１９−Ｂ細胞をそれぞれＦＡＣＳソートで分離した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＴＣＲβ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＭＨＣｃｌａｓｓＩＩ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いた。【００６１】
結果を図４に示す。中期ＥＡＥ病態において、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ１９−ｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞のＣＮＳへの浸潤が顕著に増加し、後期ＥＡＥ病態では、これらの細胞が中期ＥＡＥ病態と比較して減少することが観測された。【００６２】
（５）ＥＡＥ病態におけるプロラクチン及び成長ホルモンの遺伝子発現量
上記１．（３）と同様に、ＥＡＥ発症マウスのＣＮＳから経時的にＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を抽出し、プロラクチン（Ｐｒｌ）及び成長ホルモン（Ｇｈ）の遺伝子発現量を定量ＰＣＲ法にて解析した。プロラクチン及び成長ホルモンのプライマーとして、それぞれＭｍ＿Ｐｒｌ＿１＿ＳＧ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ及びＭｍ＿Ｇｈ＿１＿ＳＧ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（いずれもＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。【００６３】
結果を図５に示す。図５中、「ＥＢ」は前期ＥＡＥ状態で抽出されたＣＤ１９＋Ｂ細胞を意味し、「ＥＤ」は前期ＥＡＥ状態で抽出されたｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を意味し、「ＭＢ」は中期ＥＡＥ状態で抽出されたＣＤ１９＋Ｂ細胞を意味し、「ＭＤ」は中期ＥＡＥ状態で抽出されたｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を意味し、「ＬＢ」は後期ＥＡＥ状態で抽出されたＣＤ１９＋Ｂ細胞を意味し、「ＬＤ」は後期ＥＡＥ状態で抽出されたｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を意味する。図５によれば、後期ＥＡＥ状態のＣＮＳ由来の抗原提示細胞において、プロラクチン及び成長ホルモンの発現量が顕著に増加していることが観測された。【００６４】
（６）ＥＡＥ病態の各進行度におけるＣＳＦ中のプロラクチン及び成長ホルモンの発現
三種混合麻酔薬（メデトミジン、ミダゾラム、ブトルファノール）を腹腔内投与（ｉｐ）することにより、マウスを麻酔した。マウスは、無処置マウス、早期ＥＡＥ病態のマウス、中期ＥＡＥ病態のマウス、後期ＥＡＥ病態のマウスを用いた。各マウスの後頭部の皮膚を矢尻状に切開し、皮下組織と筋肉を注意深く分離し、大槽を覆う硬膜の表面を露出させた。露出した硬膜にガラスキャピラリーを穿刺し、毛管現象を利用してＣＳＦを収集した。得られたＣＳＦを−８０℃の冷凍庫で保管した。
採取したＣＳＦ中のプロラクチン（ＰＲＬ）及び成長ホルモン（ＧＨ）のタンパク発現量を、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いて測定した。【００６５】
結果を図６に示す。中期ＥＡＥ病態では、成長ホルモンのタンパク発現量が増加し、後期ＥＡＥ病態では、プロラクチン及び成長ホルモンのタンパク発現量が増加していることが観測された。【００６６】
（７）プロラクチン共存下培養によるＥｏｍｅｓ発現への影響
未処置の野生型Ｂ６マウスから採取した脾臓由来ＣＤ２２６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、プロラクチンの非存在下又は特定量のプロラクチンの存在下において、４時間又は８時間培養した。培養後の各細胞のＥｏｍｅｓ発現量を、フローサイトメーター又は定量的リアルタイムＰＣＲを用いて測定した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。【００６７】
結果を図７に示す。培養時間にかかわらず、３０、１００ｎｇ／ｍＬのプロラクチン存在下で培養すると、ＣＤ４＋Ｅｏｍｅｓ＋Ｔ細胞の割合が顕著に増加していることが観測された。図８（ａ）は、図７に示す各フローサイトグラムに基づき、Ｅｏｍｅｓ＋細胞の割合をグラフにまとめたものである。図８（ｂ）は、各細胞のプロラクチンタンパクの相対発現量をグラフ化したものである。図８においても、３０ｎｇ／ｍＬのプロラクチン存在下で培養すると、プロラクチンタンパクの発現量が増加していることが観測された。【００６８】
（８）ＥＡＥ病態の進行に伴うプロラクチン及びＺｂｔｂ２０の遺伝子発現量の変化
上記１．（３）と同様に、ＥＡＥ発症マウスのＣＮＳから経時的にＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を抽出し、プロラクチン及びＺｂｔｂ２０の遺伝子発現量を定量ＰＣＲ法にて解析した。プロラクチン及びＺｂｔｂ２０のプライマーとして、それぞれＭｍ＿Ｐｒｌ＿１＿ＳＧ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ及びＭｍ＿Ｚｂｔｂ２０＿１＿ＳＧ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（いずれもＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。【００６９】
結果を図９に示す。図９中の「ＥＢ」、「ＭＢ」、「ＬＢ」、「ＥＤ」、「ＭＤ」及び「ＬＤ」はそれぞれ、図５における定義と同じである。図９によれば、後期ＥＡＥ状態のＣＮＳ由来の抗原提示細胞において、プロラクチン及びＺｂｔｂ２０の遺伝子発現量が増加していることが観測された。【００７０】
（９）ＥＡＥ病態の進行に伴うプロラクチン及びＺｂｔｂ２０のタンパク質発現量の変化
上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）及びＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）から、誘導９日後（初期ＥＡＥ病態に相当）及び誘導１９日後（後期ＥＡＥ病態に相当）に脳及び脊髄を採取し、フローサイトメーターを用いて、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を分離した。具体的には、組織を小さい破片に切断した後、３７℃で４０分間、１．４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＨ及び１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含有したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）において更に分解した。得られた組織のホモジネートを７０μｍ細胞濾過器（ＧＥヘルスケアサイエンス社製）に通し、不連続パーコール密度勾配遠心分離法（３７％／８０％）を用いて、白血球細胞を濃縮した。次いで、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞をＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯ  ＩＩ（ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて解析した。分離したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞のＺｂｔｂ２０の発現量の変化をフローサイトメーターで解析した。検出の際に使用した抗体は、抗Ｚｂｔｂ２０抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。【００７１】
結果を図１０及び図１１に示す。図１０によれば、後期ＥＡＥ病態では、Ｚｂｔｂ２０の発現量が有意に増加していることが観測された。また、図１１（ａ）は、Ｚｂｔｂ２０＋細胞の割合をグラフ化したものであり、後期ＥＡＥ病態では、Ｚｂｔｂ２０発現が顕著に増加していることが観測された。また、図１１（ｂ）に示すように、Ｂ細胞及びｎｏｎ−Ｂ抗原提示細胞におけるプロラクチン遺伝子（Ｐｒｌ）の発現量を測定したところ、後期ＥＡＥ病態では、プロラクチン遺伝子（Ｐｒｌ）の相対発現量が顕著に増加していることが観測された。【００７２】
また、後期ＥＡＥ病態のマウスのＣＮＳから採取したＢ細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）とＢＤ  ＧｏｌｇｉＰｌｕｇの存在下、６時間培養した。培養したＢ細胞を、ＣＤ１ｄ及びＣＤ５遺伝子の染色状態に基づき、図１２（ａ）に示すように４種の分画（Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３、Ｆｒ４）に分離した。各分画からのＩＬ−１０及びＺｂｔｂ２０の遺伝子発現レベルを、ＦＡＣＳプロットを用いて測定した。その結果を図１２（ｂ）に示す。【００７３】
さらに、後期ＥＡＥ病態のマウスのＣＮＳから採取したｎｏｎ−Ｂ抗原提示細胞を染色し、ＦＡＣＳ解析した。ｎｏｎ−Ｂ抗原提示細胞を、ＣＤ１１ｃ及びＰＤＣＡ−１遺伝子の染色状態に基づき、図１３（ａ）に示すように３種の分画（Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３）に分離した。各分画からのＺｂｔｂ２０の遺伝子発現レベルを、ＦＡＣＳプロットを用いて測定した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ１１ｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＰＤＣＡ−１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ｚｂｔｂ２０抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた。【００７４】
その結果を図１３（ａ）に示す。また、各分画におけるＺｂｔｂ２０＋細胞の割合を図１３（ｂ）に示した。【００７５】
（１０）脳下垂体におけるプロラクチン及び成長ホルモンの発現
無処置又は早期、中期もしくは後期ＥＡＥ病態のマウスから、脳下垂体を切り出し、総ＲＮＡを単離した後、プロラクチン遺伝子（Ｐｒｌ）の発現レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて測定した。その結果を図１４（ａ）に示す。【００７６】
また、マウスの血清を採取し、血清中のプロラクチン（ＰＲＬ）及び成長ホルモン（ＧＨ）のタンパクレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。その結果を図１４（ｂ）に示す。いずれの進行度のＥＡＥ病態においても、血清中のプロラクチン（ＰＲＬ）レベルは、無処置マウスのものよりも顕著に低いことが観測された。【００７７】
さらに、無処置又は早期、中期もしくは後期ＥＡＥ病態のマウスのＣＮＳから、ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡを用いて、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＰＤＣＡ−１＋ＣＤ１１ｃ＋形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、ＣＤ４５ｉｎｔＣＤ１１ｂ＋ミクログリア細胞を精製し、これらのプロラクチン遺伝子（Ｐｒｌ）及びｚｂｔｂ２０遺伝子の発現レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて測定した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＰＤＣＡ−１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ１１ｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ｚｂｔｂ２０抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた。ＰｒｌおよびＧＨの定量には、Ｍｏｕｓｅ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ  ｐａｎｅｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた。【００７８】
結果を図１４（ｃ）に示す。後期ＥＡＥ病態では、ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＰＤＣＡ−１＋Ｂ２２０＋ｐＤＣにおいて、プロラクチン遺伝子の発現レベルが顕著に増加していたことが観測された。また、ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ４５ｉｎｔＣＤ１１ｂ＋ミクログリア細胞において、ｚｂｔｂ２０遺伝子の発現レベルがＥＡＥ病態の進行に伴い、増加していたことが観測された。【００７９】
２．プロラクチンによる後期ＥＡＥ病態の変化
（１）プロラクチン添加とＥｏｍｅｓ遺伝子の発現増強１
未処理マウスの脾臓由来のＴｈ細胞を、リコンビナントプロラクチン非存在下又は存在下にて８時間培養した。培養後、Ｔｈ細胞から総ＲＮＡを抽出した。得られた総ＲＮＡから、ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（タカラ社製）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置で、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いた条件で、又はＡＢＩ  ７３００リアルタイムＰＣＲ装置で、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた条件で、市販のプライマー（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ，ＱＴ０１０７４３３２，Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して定量リアルタイムＰＣＲを行った。Ｅｏｍｅｓ遺伝子発現量は、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子の発現量に基づいて補正した。【００８０】
結果を図１５に示す。図１５中、１はプロラクチンを添加せずに培養したもの、２は低濃度のプロラクチン存在下で培養したもの、３は、高濃度のプロラクチン存在下で培養したものを意味する。図１５の縦軸は、ハウスキーピング遺伝子（β２ミクログロブリン）に対するＥｏｍｅｓの相対発現量を表したものであり、プロラクチンの濃度依存的にＥｏｍｅｓ発現量が増加した。【００８１】
（２）プロラクチン添加とＥｏｍｅｓタンパク質の発現増強２
脾臓由来のＣＤ２２６＋Ｔｈ細胞を、プロラクチン非存在下又は存在下にて８時間または４８時間培養した。培養後、ＣＤ２２６＋Ｔｈ細胞を抗ＣＤ２２６抗体、抗Ｅｏｍｅｓ抗体で染色し、ＣＤ２２６＋Ｅｏｍｅｓ＋Ｔ細胞、ＣＤ２２６＋Ｅｏｍｅｓ−Ｔ細胞とＣＤ２２６−Ｔ細胞をＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯ  ＩＩ（ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて解析した。解析の際に使用した抗体は、抗ＣＤ２２６抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、および抗Ｅｏｍｅｓ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）である。【００８２】
結果を図１６に示す。プロラクチン非存在下で培養した細胞に比べて、プロラクチン存在下で培養した細胞では、４８時間後のＥｏｍｅｓ発現量が顕著に増加した。【００８３】
（３）Ｄ２受容体アゴニストによる後期ＥＡＥ病態の抑制
上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＣＤ４−Ｃｒｅ／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌマウス及び対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に、誘導４日後からブロモクリプチンを隔日で腹腔内注射した。注射した後、以下に示すＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。
＜ＥＡＥ評価基準＞
０：臨床徴候なし
１：尾の部分的麻痺
２：弛緩した尾
３：後肢の部分的麻痺
４：全後肢の麻痺
５：後肢及び前肢の麻痺【００８４】
結果を図１７に示す。図１７中の矢印は、ブロモクリプチンを投与した日を示す。ブロモクリプチンを投与することにより、後期ＥＡＥ病態は有意に抑制された。【００８５】
（４）Ｄ２受容体アゴニスト（ブロモクリプチン）投与によるＥｏｍｅｓタンパク質の発現抑制１
上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＣＤ４−Ｃｒｅ／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌマウスにおいて、誘導４日後からブロモクリプチンを隔日で静脈内注射したマウス及び注射しなかったマウスから脳及び脊髄を採取し、フローサイトメーターを用いて、ＣＮＳへ浸潤したＴｈ細胞を分離した。具体的には、組織を小さい破片に切断した後、３７℃で４０分間、１．４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＨ及び１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含有したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）において更に分解した。得られた組織のホモジネートを７０μｍ細胞濾過器（ＧＥヘルスケアサイエンス社製）に通し、不連続パーコール密度勾配遠心分離法（３７％／８０％）を用いて、白血球細胞を濃縮した。次いで、ＣＮＳへ浸潤したＴｈ細胞をＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩ（ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで分離した。回収したＴｈ細胞のＥｏｍｅｓ及びＣＤ４の発現量の変化をフローサイトメーターで解析した。分離の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。【００８６】
結果を図１８及び図１９に示す。図１８に示すように、ブロモクリプチンを投与することにより、ＣＮＳ浸潤Ｔｈ細胞におけるＥｏｍｅｓタンパク質の発現量は有意に抑制された。図１９は、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合と実際の細胞数の変化を示すグラフである。【００８７】
（５）Ｄ２受容体アゴニスト（ブロモクリプチン）投与によるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現抑制２
上記１．（３）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＣＤ４−Ｃｒｅ／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌマウスにおいて、誘導４日後からブロモクリプチンを隔日で静脈内注射したマウス及び注射しなかったマウスから、誘導２７日後に脳及び脊髄を採取し、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞をＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩ（ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで分離した。分離したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を、それぞれ脾臓由来のＣＤ４＋Ｔｈ細胞と８時間、共培養した。培養後、回収したＴｈ細胞のＥｏｍｅｓ及びＣＤ１０７ａの発現量の変化をフローサイトメーターで解析した。検出の際に使用した抗体は、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ１０７ａ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いた。【００８８】
結果を図２０に示す。図２０によれば、ブロモクリプチンを投与することにより、ＣＮＳ由来の抗原提示細胞のＴｈ細胞に対するＥｏｍｅｓタンパク質発現およびＣＤ１０７ａ発現誘導能は有意に抑制された。【００８９】
（６）Ｄ２受容体アゴニスト（ブロモクリプチン）投与によるＥｏｍｅｓ遺伝子及びＣＤ１０７ａ遺伝子の発現
上記１．（３）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＣＤ４−Ｃｒｅ／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌマウスに、誘導４日後からブロモクリプチン又はプラセボ（ＤＭＳＯ及びＰＢＳ）を隔日で腹腔内注射した。誘導３２日後に脳及び脊髄を採取し、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ１９−ＣＤ４５ｈｉｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞をＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩ（ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで分離した。分離した細胞を、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１０７ａ抗体の存在下、類遺伝子系統の未処置マウス由来の脾臓からＦＡＣＳソートで分離したＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した。８時間共培養した後、各細胞を染色して、Ｅｏｍｅｓ発現を解析した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１０７ａ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いた。【００９０】
結果を図２１に示す。共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞表面のＥｏｍｅｓ遺伝子とＣＤ１０７ａ遺伝子の発現量は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ１９−ＣＤ４５ｈｉｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞のいずれと共培養した場合であっても、ブロモクリプチンの投与によって、減少していることが観測された。【００９１】
（７）Ｄ２受容体アゴニスト（ドパミン）投与によるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現抑制
後期ＥＡＥ病態マウスから、ＦＡＣＳソートにより、ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ１９−ＣＤ４５ｈｉｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞を精製した。精製された各細胞を、ドパミンの非存在下又は特定量のドパミンの存在下、２４、４８、９６時間培養した。培養後の細胞を回収し、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、プロラクチン遺伝子（Ｐｒｌ）及びＺｂｔｂ２０遺伝子の発現量を解析した。【００９２】
結果を図２２に示す。図２２（ａ）は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞における遺伝子発現量を示し、図２２（ｂ）は、ＣＤ１９−ＣＤ４５ｈｉｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞における遺伝子発現量を示す。いずれの場合にもドパミン共存かで培養することにより、プロラクチン及びＺｂｔｂ２０遺伝子の発現量は顕著に低下していることが観測された。【００９３】
（８）ドパミン前駆物質（Ｌ−ドパ）投与によるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現抑制
上記１．（３）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＣＤ４−Ｃｒｅ／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌマウスに、誘導４日後からＬ−ドパ又はプラセボ（ＤＭＳＯ及びＰＢＳ）を隔日で腹腔内注射した。【００９４】
各マウスのＥＡＥスコアを図２３に示す。Ｌ−ドパを反復投与することにより、ＥＡＥスコアが顕著に改善していることが観測された。図２３の右グラフにおいて、点線は９５％信頼区間を示す。累積ＥＡＥスコアの比較においても、Ｌ−ドパの反復投与によるＥＡＥスコアの改善が確認された。【００９５】
次に、誘導３２日後に各マウスから脳及び脊髄を採取し、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ１９−ＣＤ４５ｈｉｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞をＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩ（ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで分離した。分離した各細胞を染色して、Ｅｏｍｅｓ及びＺｂｔｂ２０遺伝子の発現を解析した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｚｂｔｂ２０抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた。【００９６】
結果を図２４に示す。図２４（ａ）に示すように、ＣＤ４＋Ｔ細胞において、Ｌ−ドパの反復投与により、ＣＤ４＋Ｅｏｍｅｓ＋Ｔ細胞の割合が顕著に減少していることが観測された。また、図２４（ｂ）及び（ｃ）に示すように、ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ１９−ＣＤ４５ｈｉｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞において、Ｌ−ドパの反復投与により、Ｚｂｔｂ２０＋細胞の割合も減少していることが観測された。【００９７】
次に、Ｌ−ドパ投与マウス及び非投与マウスのＣＮＳ及び脾臓からそれぞれ分離したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ１９−ＣＤ４５ｈｉｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞におけるプロラクチン遺伝子（Ｐｒｌ）の発現レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて解析した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いた。【００９８】
結果を図２５に示す。ＣＮＳ由来のＢ細胞及びｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞において、プロラクチン遺伝子の発現レベルが顕著に高く、Ｌ−ドパの反復投与によって、その発現レベルが低下していることが観測された。【００９９】
３．抗ＣＸ３ＣＲ１抗体投与によるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現抑制
上記１．（３）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスに誘導１０日後（後期ＥＡＥ病態に相当）に、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）又はそのアイソタイプ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を投与し、上述のＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。【０１００】
結果を図２６に示す。図２６に示すように、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体を投与することで（ＣＸ３ＣＲ１）、アイソタイプを投与した場合と比べて（Ｉｓｏｔｙｐｅ）、後期ＥＡＥ病態が有意に改善された。【０１０１】
また、誘導２２日後及び誘導２８日後に、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体又はそのアイソタイプを投与されたマウスのＣＮＳを採取し、ＣＤ４＋細胞を分離した。得られたＣＤ４＋細胞における、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋細胞及びＥｏｍｅｓ＋＋ＣＤ４＋細胞（Ｅｏｍｅｓ強陽性ＣＤ４陽性Ｔｈ細胞）のＣＤ４＋細胞に対する割合及び絶対量を測定した。【０１０２】
結果を図２７に示す。図２７に示すように、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋細胞及びＥｏｍｅｓ＋＋ＣＤ４＋細胞のいずれにおいても、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体投与により、後期ＥＡＥ病態におけるＥｏｍｅｓ陽性Ｔｈ細胞のＣＤ４＋細胞に対する割合及び絶対量は有意に減少した。【０１０３】
４．Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与によるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現抑制
（１）ＥＡＥ病態の臨床スコアの変化
上記１．（３）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスに誘導７日後（初期ＥＡＥ病態に相当）に、アテロコラーゲン基質で安定化されたＺｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ（（株）高研製）又は対照スクランブルｓｉＲＮＡ（（株）高研製）を静脈内注射により投与し、上述のＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。【０１０４】
その結果を図２８に示す。図２８の右グラフの縦軸は、累積臨床スコアを示す。対照スクランブルｓｉＲＮＡ投与マウスでは、未処置マウスと同等の臨床スコアであったのに対し、Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与マウスでは、顕著に臨床スコアの低下が観測された。図２８の右グラフの右グラフは累積臨床スコアをグラフ化したものであり、点線は９５％信頼区間を示す。【０１０５】
（２）Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与によるＥｏｍｅｓ及びＺｂｔｂ２０遺伝子の発現抑制
上記４．（１）と同様に処置した未処置マウス、Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与マウス及び対照スクランブルｓｉＲＮＡ投与マウスの脳及び脊髄を採取し、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＢ細胞を分離した。得られた各マウス群のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＢ細胞におけるＥｏｍｅｓ又はＺｂｔｂ２０遺伝子の発現を、フローサイトメーターを用いて解析した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｚｂｔｂ２０抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた。【０１０６】
結果を図２９に示す。図２９（ａ）に示すように、Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与マウスでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現、Ｂ細胞におけるＺｂｔｂ２０遺伝子の発現がともに顕著に抑制されていたことが観測された。図２９（ｂ）は、各マウス群のＥｏｍｅｓ及びＺｂｔｂ２０の発現細胞の割合を比較するためにグラフ化したものである。【０１０７】
（３）Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与によるプロラクチン遺伝子の発現抑制
上記４．（１）と同様に処置した未処置マウス、Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与マウス及び対照スクランブルｓｉＲＮＡ投与マウスを用いて、後期ＥＡＥ病態マウスのＣＮＳから抗原提示細胞を分離した。得られた抗原提示細胞から、ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩ（ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートでＣＤ１９−ＣＤ４５ｈｉｎｏｎ−Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞を精製した。精製した細胞にＺｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ又は対照スクランブルｓｉＲＮＡを形質導入し、ＬＰＳの存在下２４時間培養した後、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、Ｚｂｔｂ２０及びプロラクチン（Ｐｒｌ）の発現レベルを測定した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いた。【０１０８】
結果を図３０に示す。Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡの投与により、Ｚｂｔｂ２０遺伝子及びＰｒｌ遺伝子の発現レベルは顕著に低下していることが観測された。【０１０９】
５．抗ＣＤ２０抗体投与によるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現抑制
（１）ＥＡＥ病態の臨床スコアの変化
上記１．（３）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスにおいて、誘導７日前又は誘導１３日後（後期ＥＡＥ病態に相当）に、それぞれ抗ＣＤ２０抗体又は対照ＩｇＧを静脈内注射により投与し、上述のＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。【０１１０】
結果を図３１（ａ）及び（ｂ）に示す。図３１（ａ）及び（ｂ）中の矢印は、抗体を投与した日を示す。図３１（ａ）は、誘導７日前に抗体を投与した結果を示し、図３１（ｂ）は誘導１３日後に抗体を投与した結果を示す。図３１（ｂ）に示すように、誘導１３日後に抗ＣＤ２０抗体を投与することにより、顕著に臨床スコアが改善した。図３１（ｂ）の右グラフは累積臨床スコアをグラフ化したものであり、点線は９５％信頼区間を示す。【０１１１】
（２）抗ＣＤ２０抗体によるＥｏｍｅｓ及びＺｂｔｂ２０遺伝子の発現抑制
上記５．（１）と同様に処置した未処置マウス、抗ＣＤ２０抗体及び対照ＩｇＧ投与マウスの脳及び脊髄を採取し、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＢ細胞を分離した。得られた各マウス群のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＢ細胞におけるＥｏｍｅｓ又はＺｂｔｂ２０遺伝子の発現をフローサイトメーターを用いて解析した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ２０抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｚｂｔｂ２０抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた。【０１１２】
結果を図３１（ｃ）及び３２に示す。図３１（ｃ）に示すように、抗ＣＤ２０抗体投与マウスでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現、Ｂ細胞におけるＺｂｔｂ２０遺伝子の発現がともに顕著に抑制されていたことが観測された。図３２は、各マウス群のＥｏｍｅｓ及びＺｂｔｂ２０の発現細胞の割合を比較するためにグラフ化したものである。【０１１３】
６．各種サイトカインによるＺｂｔｂ２０遺伝子発現の変化
（１）各種サイトカインによるＺｂｔｂ２０遺伝子発現の変化
脾臓由来ＣＤ１９＋Ｂ細胞を単離し、ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩ（ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで精製した。精製したＢ細胞は、ＬＰＳの存在下、図３３（ａ）に示すサイトカインの共存下又は非共存下で２４時間培養した。培養後、各細胞におけるＺｂｔｂ２０遺伝子の発現レベルを測定した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｚｂｔｂ２０抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた。【０１１４】
結果を図３３及び３４に示す。図３３（ａ）では、サイトカイン非共存下で培養した細胞のＺｂｔｂ２０遺伝子の発現レベルをグレーのグラフで示し、各種サイトカイン共存下で培養した場合の発現レベルを黒線グラフで示した。表示したサイトカイン共存下で培養すると、Ｚｂｔｂ２０遺伝子の発現が増加していること、ＩＦＮα又はＩＦＮβ１の共存下で培養するとＺｂｔｂ２０遺伝子の発現増加が最も顕著であることが観測された。図３３（ｂ）は、各条件におけるＺｂｔｂ２０＋細胞の割合をグラフ化したものである。図３４は、ＦＡＣＳプロットにより、各種サイトカイン共存下で培養した場合にサイトカイン非共存下で培養した場合に対して、Ｚｂｔｂ２０＋細胞又はＰｒｌ＋細胞の割合が何倍に増加したかを示す。【０１１５】
（２）ＥＡＥ病態の進行に伴う各種サイトカイン発現の変化１
各進行度（初期ＥＡＥ病態、中期ＥＡＥ病態、後期ＥＡＥ病態）におけるマウスのＣＳＦ及び血漿を採取し、各種サイトカインの発現レベルをＬｕｍｉｎｅｘ  ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。また、同様にして、ＣＮＳ由来のＢ細胞、ｐＤＣ、ミクログリアにおける１型インターフェロン（ＩＦＮα２、ＩＦＮβ１）、ＩＬ−６、ＩＬ−９、Ｃｘｃｌ１３の発現レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて測定した。ＩＦＮαおよびＩＦＮβの検出には、ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ  Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮａ／ｂ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用い、他のサイトカインの検出には、ＢｉｏＰｌｅｘ  Ｐｒｏ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＧＩ  ２３−ｐｌｅｘ  ｐａｎｅｌおよびＢｉｏＰｌｅｘ  Ｐｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＧＩＩＩ  ＴＨ１７  ８−ｐｌｅｘ  Ｂ  ｐａｎｅｌ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いた。【０１１６】
結果を図３５、３６に示す。図３５は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＦＮ−γの発現レベルを示す。図３５（ａ）は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βの発現レベルを示す。図３５（ｂ）は、ＣＮＳ由来のＢ細胞、ｐＤＣ、ミクログリアにおけるＩＦＮα２又はＩＦＮβ１の発現量を示し、図３５（ｃ）は、ＣＮＳ由来のＢ細胞、ｐＤＣ、ミクログリアにおけるＩＬ−６、ＩＬ−９、Ｃｘｃｌ１３の発現量を示す。図３５（ｂ）及び（ｃ）に示すように、中期ＥＡＥ病態になると、ミクログリア内においてＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−β１、ＩＬ−９の発現量が顕著に増加していたことが観測された。【０１１７】
（３）後期ＥＡＥ病態マウス由来のミクログリアによるＺｂｔｂ２０発現への影響
類遺伝子系統の未処置マウスの脾臓からＦＡＣＳソートにより、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を分離し、未処置マウス又は後期ＥＡＥ病態マウス由来のミクログリア細胞とともに２４時間共培養した。培養後のＢ細胞におけるＺｂｔｂ２０遺伝子の発現量を、フローサイトメーターを用いて測定した。また、Ｂ細胞をＦＡＣＳソートで精製し、リアルタイムＰＣＲを用いてＺｂｔｂ２０及びＰｒｌのＲＮＡレベルを検出した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｚｂｔｂ２０抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。【０１１８】
結果を図３７に示す。図３７（ａ）に示すように、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を後期ＥＡＥ病態マウスのミクログリアと共培養すると、Ｚｂｔｂ２０遺伝子の発現が顕著に増強されていることが観測された。また、図３７（ｂ）に示すように、Ｚｂｔｂ２０及びＰｒｌのＲＮＡレベルも相対的に増加していたことが観測された。【０１１９】
（４）ＥＡＥ病態の進行に伴う各種サイトカイン発現の変化
未処置又は各進行度のＥＡＥ病態マウスからＣＳＦ及び血漿を採取し、各種サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、Ｅｏｔａｘｉｎ、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１ａ）のタンパクレベルをＬｕｍｉｎｅｘ  ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。検出には、ＢｉｏＰｌｅｘ  Ｐｒｏ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＧＩ  ２３−ｐｌｅｘ  ｐａｎｅｌおよびＢｉｏＰｌｅｘ  Ｐｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＧＩＩＩ  ＴＨ１７  ８−ｐｌｅｘ  Ｂ  ｐａｎｅｌ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いた。【０１２０】
結果を図３８〜４０に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【国際調査報告】
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