(57)【要約】  小児急性リンパ性白血病（小児ALL）の血液学的病期の判定を補助するための方法、及びそれに使用できる体外診断用医薬品を提供する。  小児ALLの血液学的病期の判定を補助する方法であって、（1）被験者の末梢血及び骨髄液のいずれか少なくとも一方の生体試料中のウイルムス腫瘍−１遺伝子（WT1）のmRNA量を入手するステップ（2）前記同試料中のGAPDH mRNA量を入手するステップ、及び（3）前記(1)及び(2)のステップでそれぞれ入手したWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量との比に基づいて判定補助に必要な指標値を算出するステップを含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（1）〜（3）のステップを含む小児急性リンパ性白血病の血液学的病期の判定を補助する方法：
（1）被験者の生体試料中のウイルムス腫瘍−１遺伝子（WT1）のmRNA量を入手するステップ
（2）前記同生体試料中のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（GAPDH）の mRNA量を入手するステップ、及び
（3）前記(1)及び(2)のステップでそれぞれ入手したWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量との比に基づいて上記判定補助に必要な指標値を算出するステップ。
【請求項２】
前記（1）のステップが、RT-PCR法を用いてWT1 mRNA量を測定するか、またはRT-PCR法を用いて測定されたWT1 mRNA量の提供を受けるステップである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記（2）のステップが、RT-PCR法を用いてGAPDH mRNA量を測定するか、またはRT-PCR法を用いて測定されたGAPDH mRNA量の提供を受けるステップである、請求項１または２に記
載する方法。
【請求項４】
前記（3）のステップで得られる指標値が、(1)及び(2)のステップでそれぞれ入手されたWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量との比（WT1 mRNA量／GAPDH mRNA量）を正規化して得られる値である、請求項１乃至３のいずれかに記載する方法。
【請求項５】
上記正規化が、WT1 mRNA量とGAPDH mRNA量との比（WT1 mRNA量／GAPDH mRNA量）に健康成人1μgRNA中に含まれるGAPDH mRNA量の平均値である2.7x107 copies/μgRNA を乗ずることで行われる、請求項４に記載する方法。
【請求項６】
さらに下記のステップを有する請求項１乃至５のいずれかに記載する方法：
（4）前記（3）のステップで得られた指標値を予め設定されたカットオフ値と対比し、その大小に基づいて、被験者の血液学的病期を示すステップ。
【請求項７】
前記カットオフ値が、前記指標値の検出下限値よりも高い、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
小児急性リンパ性白血病の血液学的病期の判定が非寛解期と寛解期の別を判定することであって、
前記カットオフ値が、非寛解期にある小児ALL患者（非寛解期群）と寛解期にある小児ALL患者（寛解期群）の両群をそれぞれ対象として統計学的解析により求めた値である、請求項６又は７に記載する方法。
【請求項９】
前記カットオフ値が、生体試料のうち末梢血については220 copies/μgRNA、骨髄液については1,820 copies/μgRNAである、請求項８に記載する方法。
【請求項１０】
前記RT-PCR法が、2ステップRT-PCR法、または、1ステップRT-PCR法である、請求項２乃至９のいずれかに記載する方法。
【請求項１１】
前記RT-PCR法が、１ステップRT-PCR法である、請求項２乃至９のいずれかに記載する方法。
【請求項１２】
前記（1）及び（2）のステップにおける１ステップRT-PCR法が、WT1 mRNAおよびGAPDH mRNAの逆転写反応および伸長反応を、被験者の生体試料において同時かつ同一容器内で連続して進行させる方法である、請求項１１に記載する方法。
【請求項１３】
前記（1）のステップの１ステップRT-PCR法において、WT1 mRNA量の測定に
（a）配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードPCRプライマーと配列番号３に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、または
（b）配列番号５に示す塩基配列からなるフォワードPCRプライマーと配列番号６に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、
を用いる、請求項１１または１２に記載する方法。
【請求項１４】
前記（1）のステップの１ステップRT-PCR法において、WT1 mRNA量の測定に
（a’）配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードPCRプライマーと配列番号３に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、および標識された配列番号４に示す塩基配列からなるプローブ、または
（b’）配列番号５に示す塩基配列からなるフォワードPCRプライマーと配列番号６に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、および標識された配列番号７に示す塩基配列からなるプローブ
を用いる、請求項１１または１２に記載する方法。
【請求項１５】
前記（2）のステップの１ステップRT-PCR法において、GAPDH mRNA量の測定に
（c）配列番号９に示す塩基配列からなるフォワードPCRプライマーと配列番号１０若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセットを用いる、請求項１１〜１４のいずれかに記載する方法。
【請求項１６】
前記（2）のステップの１ステップRT-PCR法において、GAPDH mRNA量の測定に
（c’）配列番号９に示す塩基配列からなるフォワードPCRプライマーと配列番号１０若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号１１に示す塩基配列からなるプローブ
を用いる、請求項１１〜１４のいずれかに記載する方法。
【請求項１７】
（a）配列番号２に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号３に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、または
（b）配列番号５に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号６に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット
を含む急性リンパ性白血病の被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キット。
【請求項１８】
（a’）配列番号２に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号３に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、および標識された配列番号４に示す塩基配列からなるプローブ、または
（b’）配列番号５に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号６に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、および標識された配列番号７に示す塩基配列からなるプローブ
を含む急性リンパ性白血病の被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キット。
【請求項１９】
さらに（c）配列番号９に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号１０若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、
を含む請求項１７または１８に記載する急性リンパ性白血病の被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キット。
【請求項２０】
さらに（c’）配列番号９に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号１０若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号１１に示す塩基配列からなるプローブを含む、
請求項１７または１８に記載する急性リンパ性白血病の被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キット。
【請求項２１】
前記リアルタイムPCR用キットが、小児用である、請求項１７乃至２０のいずれかに記載する急性リンパ性白血病の被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キット。
【請求項２２】
請求項１７乃至２１のいずれかに記載する急性リンパ性白血病の被験者のWT1mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キット及び当該キットに関する説明書を含む商業パッケージであって、当該説明書及び／又は商業パッケージに下記のいずれか少なくとも一方の記載またはその内容が記載されている商業パッケージ：
（i）当該キットが急性リンパ性白血病の血液学的病期の判定の補助に使用できること
（ii）急性リンパ性白血病の血液学的病期の判定補助のためのカットオフ値。
【請求項２３】
上記急性リンパ性白血病が小児急性リンパ性白血病であって、（ii）急性リンパ性白血病の血液学的病期の判定補助のためのカットオフ値が、生体試料のうち末梢血については220 copies/μgRNA、骨髄液については1,820 copies/μgRNAである、請求項２２に記載する商業パッケージ。
【請求項２４】
請求項１乃至１４のいずれかに記載の急性リンパ性白血病の血液学的病期の判定を補助する方法を用いて、小児急性リンパ性白血病の血液学的病期を経時的に追跡する方法。
【請求項２５】
上記小児急性リンパ性白血病の血液学的病期の追跡が、非寛解期から寛解期への移行、および／または、寛解期から非寛解期への移行を追跡するものである、請求項２４に記載する方法。
【請求項２６】
下記（I）及び（II）のステップをコンピュータによって実行させるコンピュータプログラム：
（I）被験者の生体試料中のウイルムス腫瘍−１遺伝子（WT1）のmRNA 量、及び前記同生体試料中のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（GAPDH）の mRNA 量の入力を受けるステップ、及び
（II）前記(I)のステップで入力を受けたWT1 mRNA 量とGAPDH mRNA 量との比に基づいて、小児急性リンパ性白血病の血液学的病期の判定を補助するために必要な指標値を算出するステップ。
【請求項２７】
さらに下記（III）のステップをコンピュータによって実行させるプログラムを有する請求項２６に記載するコンピュータプログラム：
（III）前記(II)のステップで得られた指標値に基づいて、被験者について、小児急性リンパ性白血病の血液学的病期を決定するステップ。
【請求項２８】
小児急性リンパ性白血病の血液学的病期の判定に用いられるコンピュータシステムであって、
プロセッサと、メモリとを含むコンピュータを備え、
前記メモリには、
（I）被験者の生体試料中のウイルムス腫瘍−１遺伝子（WT1）のmRNA 量、及び前記同生体試料中のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（GAPDH）の mRNA 量の入力を受けるステップと
（II）前記(I)のステップで入力を受けたWT1 mRNA 量とGAPDH mRNA 量との比に基づいて、小児急性リンパ性白血病の血液学的病期の判定を補助するために必要な指標値を算出するステップとを、
前記コンピュータに実行させるコンピュータプログラムが記録されているコンピュータシステム。
【請求項２９】
前記メモリに記録されているコンピュータプログラムが、さらに、
（III）前記(II)のステップで得られた指標値に基づいて、被験者について、小児急性リンパ性白血病の血液学的病期を決定するステップを、コンピュータに実行させるコンピュータプログラムである、
請求項２８に記載するコンピュータシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小児急性リンパ性白血病の血液学的病期の判定を補助するための方法に関する。具体的には、急性リンパ性白血病に罹患しているか、または罹患が疑われる小児被験者について、当該被験者が急性リンパ性白血病の非寛解期であるか寛解期であるかの別を判定するために使用される方法に関する。また本発明は、上記急性リンパ性白血病の血液学的病期の判定補助、特に非寛解期から寛解期移行の判定補助、並びに寛解期から非寛解期移行の判定補助の実施に、または急性リンパ性白血病の血液学的病期のモニタリングに有効に使用される、体外診断用医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト末梢血または骨髄液を被験試料としてWT1 mRNA量を測定するキット（WT1 mRNA測定キット）は、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia：以下「AML」とも称する）患者における微小残存病変（minimal residual disease：以下「MRD」とも称する）のモニタリングマーカー、又は骨髄異形成症候群（myelodysplastic syndrome：以下「MDS」とも称する）患者における診断補助及び進行度モニタリングマーカーとしての使用が承認され、体外診断用医薬品として保険適用となっている（非特許文献１、特許文献１等参照）。【０００３】
また、WT1 mRNAは、急性リンパ性白血病（acute lymphoblastic leukemia：以下「ALL」とも称する）でも発現することが報告されている（非特許文献２〜８参照）。ここでALLは幼若リンパ球系細胞の腫瘍性変化と骨髄浸潤を特徴とする造血器腫瘍である。WHO分類第4版では、芽球の起源を重視して、血液系の腫瘍が大きく骨髄系腫瘍とリンパ系腫瘍との２つに分けられており、リンパ系腫瘍はさらにB細胞性とT細胞性とに分けられている。ALLはそのうち未熟なリンパ系腫瘍と位置づけられており、表１に示すように3つのグループに分類されている（非特許文献９参照）。【０００４】
【表１】
2018016474.tif 000002
非特許文献２〜８の諸家らの試験成績から、AMLと同様にALLの成人患者の骨髄液や末梢血中のWT1 mRNAは、成人ALL患者のMRDの有用なモニタリングマーカーになるものと考えられる。【０００５】
ALL患者におけるMRDの評価・測定法としては、キメラ遺伝子定量、免疫受容体（Immunoglobulin/ T cell receptor，Ig/TCR）遺伝子再構成を用いたMRD解析、及びフローサイトメトリー（flow cytometry、以下「FCM」とも称する）によるMRD解析等を挙げることができる。しかしながら、キメラ遺伝子は、発現頻度が最も高いとされるminor BCR/ABLでも、その発現頻度は成人ALLで25%、小児ALLで3%程度と低く、他のキメラ遺伝子を合わせてもキメラ遺伝子がMRDモニタリングマーカーとして使用できる症例は限られている。また、Ig/TCR遺伝子再構成を用いたMRD解析法及びFCMによるMRD解析法はコストが高く、また専門技術と経験が要求される測定法であるため、一部の医療（研究）機関で実施されるに留まっている。【０００６】
一方、近年、治療開始後のMRD量の重要性が認められている。例えば非特許文献１０によると、WT1 mRNAは多くの白血病で高発現していることが報告されており、成人白血病では、そのWT1 mRNA定量が予後予測因子やMRDの追跡に有用であることが示されている。しかし、小児白血病の予後予測因子やMRDの追跡におけるWT1 mRNA定量の有用性については結論が得られていない。また、非特許文献１１によると、上記WT1 mRNAは、成人AML患者のMRDのモニタリングマーカーとして十分であるが、小児ALL患者のMRDモニタリングマーカーとしては不十分であると指摘されている。その理由は明らかでないものの、成人ALL患者と小児ALL患者には、頻度を異にする様々な遺伝子異常があることや、両者は予後も異なっていることなどから（非特許文献１２〜１３）、成人のALLと小児のALLとは異なる疾病であると考えられる。また小児ALL患者においては、好中球機能を高めるためにG-CSF（顆粒球コロニー刺激因子：granulocyte-colony stimulation factor）の投与や末梢血中の幼若細胞出現等によりWT1を発現する非腫瘍性細胞が多く存在していることも理由として考えられる（非特許文献１０）。【０００７】
このため、小児ALLの診断には成人ALLの診断とは異なる指標及び／又は基準が求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ウイルムス腫瘍−１遺伝子（WT1）mRNAキット「WT1 mRNA測定キットII『オーツカ』」添付文書  （大塚製薬株式会社）（2015年7月改訂（第３版））
【非特許文献２】Chiusa L, di Celle PF, Campisi P, Ceretto C, Marmont F, Pich A. Prognostic value of quantitative analysis of WT1 gene transcripts in adult acute lymphoblastic leukemia Haematologica. 2006; 91: 270-1.
【非特許文献３】Boublikova L, Kalinova M, Ryan J, Quinn F, O’Marcaigh A, Smith O, et al. Wilms' tumor gene 1 (WT1) expression in childhood acute lymphoblastic leukemia: a wide range of WT1 expression levels, its impact on prognosis and minimal residual disease monitoring. Leukemia 2006; 20: 254-63.
【非特許文献４】Shabani M, Asgarian-Omran H, Vossough P, Vossough P, Sharifian RA, Faranoush M, et al. Expression profile of orphan receptor tyrosine kinase (ROR1) and Wilms' tumor gene 1 (WT1) in different subsets of B-cell acute lymphoblastic leukemia. Leuk Lymphoma 2008; 49(7): 1360-7.
【非特許文献５】Chen JS, Hsiao CC, Sheen JM, Cheng CN. Comparison of minimal residual disease (MRD) estimated by flow cytometry and by real-time quantitative PCR of Wilms tumor gene 1 (WT1) transcript expression in children with acute lymphoblastic leukemia. Leukemia Research 2007; 31: 1351-7.
【非特許文献６】Busse A, Gokbuget N, Siehl JM, Hoelzer D, Schwartz S, Rietz A, et al. Wilms' tumor gene 1 (WT1) expression in  subtypes of acute lymphoblastic leukemia (ALL) of adults and impact on clinical outcome. Ann Hematol 2009; 88: 1199-205.
【非特許文献７】Hu SY, Gu WY, Chen ZX, Wang XL, Cen JN, He HL, et al. The significance of detecting WT1 expression in childhood acute leukemias. Pediatric Hematology and Oncology. 2010; 27: 581-91.
【非特許文献８】Xu B, Song X, Yip NC, Xiao P, Zhang Y, Wang W, et al. Simultaneous detection of MDR1 and WT1 gene expression to predict the prognosis of adult acute lymphoblastic leukemia. Hematology.2010; 15(2): 74-80.
【非特許文献９】Borowitz MJ, Chan JKC. Precusor Lymphoid Neoplasms, overview. In: Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al. eds. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Fourth Edition, Lyon, IARC Press 2008; 168-78.
【非特許文献１０】中尾朋平, Non-malignant elevation of Wilms tumor gene (WT１) expression is frequently observed in the blood and bone marrow of childhood acute leukemia in remission and in benign blood diseases. 筑波大学博士（医学）学位論文（甲第5112号）. 2009: 638-640.
【非特許文献１１】R. Zhang, et al., Comparison of minimal residual disease (MRD) monitoring by WT1 quantification between childfood acute myeloid leukemia and acute leukemia. Euroepean Review for Medical and Pharmacological Sciences 2015;19: 2679-2688.
【非特許文献１２】Pui CH, Relling MV, James R, Downing JR. Acute Lymphoblastic Leukemia. N Engl J Med. 2004; 350: 1535-8.
【非特許文献１３】薄井紀子, 臨床血液. 2009; 50: 230-43
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開公報 WO 2014/115779 A1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記課題に鑑みて、ALLのうち小児ALLを対象とし、当該小児ALL患者または小児ALL罹患が疑われる患者について、MRDのモニタリングマーカーとしてWT1mRNAを用いて、小児ALLの血液学的病期、特に寛解期と非寛解期との別を判定するための補助方法を提供することを目的とする。特に本発明は、当該方法として、従来法と比較して、できるだけ簡便且つ平易に、また精度高く判断するための方法を提供することを目的とする。また本発明は、当該方法の実施に有効に使用される、ALLの血液学的病期、特に寛解期を検出するための体外診断用医薬品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべき、鋭意検討を重ねていたところ、従来、小児ALLのMRDのモニタリングマーカーとしては不十分であるとされていたWT1 mRNA量を用い、それと補正遺伝子として使用したGAPDH mRNA量との比（WT1 mRNA量／GAPDH mRNA量）に基づいて算出した指標値を用いることで、思いがけずも、寛解期にある小児ALL患者と非寛解期にある小児ALL患者とが明確に区別でき、小児ALLの血液学的病期、特に寛解期と非寛解期との別を区別（診断）できることを見出した。【００１２】
本発明はかかる知見に基づいてさらに研究を重ねて完成したものであって、下記の実施態様を包含するものである。【００１３】
（Ｉ）小児ALLの血液学的病期の判定を補助する方法
（Ｉ−１）下記の（1）〜（3）のステップを有する小児急性リンパ性白血病（小児ALL）の血液学的病期の判定を補助する方法：
（1）被験者の生体試料中のウイルムス腫瘍−１遺伝子（WT1）のmRNA量を入手するステップ
（2）前記同生体試料中のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（GAPDH）の mRNA量を入手するステップ、及び
（3）前記(1)及び(2)のステップでそれぞれ入手されたWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量との比に基づいて上記の判定補助に必要な指標値を算出するステップ。【００１４】
なお、小児ALLの血液学的病期は大きく非寛解期（未治療期、治療後再発期、及び治療不応期を含む）と寛解期の２つに分けることができる。上記本発明は、寛解導入治療及び寛解後療法を受けている小児ALL患者を対象とした場合、「小児ALL患者について非寛解期と寛解期との鑑別判定を補助する方法」と言い換えることができる。また小児ALLが疑われる患者を対象とした場合は、「小児ALLが疑われる患者について小児ALL罹患の有無、つまり小児ALLの未治療期（罹患）であるか否か（非罹患）の判定を補助する方法」と言い換えることもできる。【００１５】
（Ｉ−２）前記（1）のステップが、RT-PCR法を用いてWT1 mRNA量を測定するか、またはRT-PCR法を用いて測定されたWT1 mRNA量の提供を受けるステップである、（Ｉ−１）記載の方法。【００１６】
（Ｉ−３）前記（2）のステップが、RT-PCR法を用いてGAPDH mRNA量を測定するか、またはRT-PCR法を用いて測定されたGAPDH mRNA量の提供を受けるステップである、（Ｉ−１）または（Ｉ−２）に記載する方法。【００１７】
（Ｉ−４）前記（1）及び（2）のステップにおける１ステップRT-PCR法が、WT1 mRNAおよびGAPDH mRNAの逆転写反応および伸長反応を、被験者の生体試料において同時かつ同一容器内で連続して進行させる方法である、（Ｉ−３）に記載する方法。【００１８】
（Ｉ−５）前記RT-PCR法が、2ステップRT-PCR法、または、1ステップRT-PCR法である、（Ｉ−２）乃至（Ｉ−４）のいずれかに記載する方法。【００１９】
（Ｉ−６）前記RT-PCR法が、１ステップRT-PCR法である、（Ｉ−２）乃至（Ｉ−４）のいずれかに記載する方法。【００２０】
（Ｉ−７）前記（3）のステップで得られる指標値が、(1)及び(2)のステップでそれぞれ入手されたWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量との比（WT1 mRNA量／GAPDH mRNA量）を正規化して得られる値である、（Ｉ−１）乃至（Ｉ−６）のいずれかに記載する方法。【００２１】
（Ｉ−８）上記正規化が、WT1 mRNA量とGAPDH mRNA量との比（WT1 mRNA量／GAPDH mRNA量）に健康成人1μgRNA中に含まれるGAPDH mRNA量の平均値を乗ずることで行われる、（Ｉ−７）に記載する方法。【００２２】
（Ｉ−９）上記健康成人1μgRNA中に含まれるGAPDH mRNA量の平均値が、2.7x107copies/μgRNA である、（Ｉ−８）に記載する方法。【００２３】
（Ｉ−１０）さらに下記のステップを有する（Ｉ−１）乃至（Ｉ−９）のいずれかに記載する方法：
（4）前記（3）のステップで得られた指標値を予め設定されたカットオフ値（参考基準値）と対比し、その大小に基づいて、被験者の血液学的病期を示すステップ。【００２４】
（Ｉ−１１）上記（4）のステップが、前記（3）のステップで得られる指標値が予め設定されたカットオフ値より小さい場合に被験者が寛解期にあると示すか、または上記カットオフ値以上である場合に被験者が非寛解期（未治療期、治療後再発期、または治療不応期）にあると示すステップである、（Ｉ−１０）記載の方法。【００２５】
（Ｉ−１２）上記非寛解期が未治療期である（Ｉ−１１）記載の方法。【００２６】
（Ｉ−１３）上記カットオフ値が、小児ALL患者または疑小児ALL患者の生体試料について求められるWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量との比に基づいて得られる指標値と小児ALLの血液学的病期との関係から作成されるROC曲線（Receiver operating characteristic curve）に基づいて求められる値である、（Ｉ−１０）〜（Ｉ−１２）のいずれかに記載する方法。【００２７】
（Ｉ−１４）小児ALLの血液学的病期の判定が、小児ALLの非寛解期（未治療期、治療後再発期、または治療不応期）と寛解期の別を判定することであって、
前記カットオフ値が、非寛解期にある小児ALL患者（非寛解期群）と寛解期にある小児ALL患者（寛解期群）の両群をそれぞれ対象として統計学的解析により求めた値である、（Ｉ−１０）〜（Ｉ−１３）のいずれかに記載する方法。【００２８】
（Ｉ−１５）上記統計学的解析が、ROC解析、判別分析、または単変量解析、である（Ｉ−１４）に記載する方法。【００２９】
（Ｉ−１６）被験者の生体試料が血液（好ましくは末梢血）、または骨髄液である（Ｉ−１）乃至（Ｉ−１５）のいずれかに記載する方法。【００３０】
（Ｉ−１７）前記カットオフ値が、前記指標値の検出限界の最低値（検出下限値）よりも高い、（Ｉ−１０）乃至（Ｉ−１６）のいずれかに記載する方法。【００３１】
（Ｉ−１８）上記カットオフ値が、50copies/μgRNAより大きい値である、（Ｉ−１０）乃至（Ｉ−１７）に記載する方法。【００３２】
（Ｉ−１９）上記カットオフ値が、生体試料のうち末梢血については220 copies/μgRNA、骨髄液については1,820 copies/μgRNAである、（Ｉ−１０）乃至（Ｉ−１８）のいずれかに記載する方法。【００３３】
（Ｉ−２０）前記（1）のステップの１ステップRT-PCR法において、WT1 mRNA量の測定に（a）配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードPCRプライマーと配列番号３に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、または
（b）配列番号５に示す塩基配列からなるフォワードPCRプライマーと配列番号６に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、を用いる、（Ｉ−２）乃至（Ｉ−１９）のいずれかに記載する方法。【００３４】
（Ｉ−２１）前記（1）の１ステップのRT-PCR法において、WT1 mRNA量の測定に
（a’）配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードPCRプライマーと配列番号３に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、および標識された配列番号４に示す塩基配列からなるプローブ、または
（b’）配列番号５に示す塩基配列からなるフォワードPCRプライマーと配列番号６に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、および標識された配列番号７に示す塩基配列からなるプローブ
を用いる、（Ｉ−２）乃至（Ｉ−１９）のいずれかに記載する方法。【００３５】
（Ｉ−２２）前記（2）のステップの１ステップRT-PCR法において、GAPDH mRNA量の測定に
（c）配列番号９に示す塩基配列からなるフォワードPCRプライマーと配列番号１０若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセットを用いる、（Ｉ−３）乃至（Ｉ−２１）のいずれかに記載する方法。【００３６】
（Ｉ−２３）前記（2）のステップの１ステップRT-PCR法において、GAPDH mRNA量の測定に
（c’）配列番号９に示す塩基配列からなるフォワードPCRプライマーと配列番号１０若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号１１に示す塩基配列からなるプローブを用いる、（Ｉ−３）乃至（Ｉ−２１）のいずれかに記載する方法。【００３７】
（Ｉ−２４）前記（1）のステップの１ステップRT-PCR法において、WT1 mRNA量の測定に、（a’）配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードPCRプライマーと配列番号３に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、および標識された配列番号４に示す塩基配列からなるプローブ、または
（b’）配列番号５に示す塩基配列からなるフォワードPCRプライマーと配列番号６に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、および標識された配列番号７に示す塩基配列からなるプローブを用い、
前記（2）のステップの１ステップRT-PCR法において、GAPDH mRNA量の測定に
（c’）配列番号９に示す塩基配列からなるフォワードPCRプライマーと配列番号１０若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号１１に示す塩基配列からなるプローブを用いる、（Ｉ−３）乃至（Ｉ−２３）のいずれかに記載する方法。【００３８】
（Ｉ−２５）WT1 mRNA量が末梢血白血球または骨髄液有核細胞より抽出したRNA中のWT1 mRNA量である、（Ｉ−１）乃至（Ｉ−２４）のいずれかに記載する方法。【００３９】
（Ｉ−２６）生体試料中のWT1 mRNA量が、それぞれ小児ALLにおける微小残存病変のモニタリングマーカーである（Ｉ−１）乃至（Ｉ−２５）のいずれかに記載する方法。【００４０】
（Ｉ−２７）被験者が、小児ALL患者または小児ALL罹患が疑われる小児である（Ｉ−１）乃至（Ｉ−２６）のいずれかに記載する方法。
（Ｉ−２８）生体試料が末梢血、好ましくは末梢血白血球であるか、または骨髄液、好ましくは骨髄液有核細胞である（Ｉ−１）乃至（Ｉ−２７）のいずれかに記載する方法。【００４１】
（II）急性リンパ性白血病（ALL）の被験者のWT1mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用試薬キット（体外診断用医薬品）
（II−１）（a）配列番号２に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号３に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、または
（b）配列番号５に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号６に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット
を含むALLの被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キット。【００４２】
（II−２）（a’）配列番号２に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号３に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、および標識された配列番号４に示す塩基配列からなるプローブ、または
（b’）配列番号５に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号６に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、および標識された配列番号７に示す塩基配列からなるプローブ
を含むALLの被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キット。【００４３】
（II−３）さらに（c）配列番号９に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号１０若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、
を含む、（II−１）または（II−２）に記載するALLの被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キット。【００４４】
（II−４）さらに（c’）配列番号９に示す塩基配列からなるフォーワードPCRプライマーと配列番号１０若しくは１２に示す塩基配列からなるリバースPCRプライマーとからなるプライマーセット、及び標識された配列番号１１に示す塩基配列からなるプローブを含む、（II−１）または（II−２）に記載するALLの被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キット。【００４５】
（II−５）小児用のリアルタイムPCR用キットである、（II−１）乃至（II−４）のいずれかに記載するALLの被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キット。【００４６】
（II−６）（II−１）乃至（II−５）のいずれかに記載するALLの被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キット及び当該キットに関する説明書を含む商業パッケージであって、当該説明書及び／又は商業パッケージに下記のいずれか少なくとも一方の記載またはそれに関する記載が記載されている商業パッケージ：
（i）当該キットがALLの血液学的病期の判定の補助に使用できること
（ii）ALLの血液学的病期判定補助のためのカットオフ値（参考基準値）。
（II−７）上記カットオフ値が、50 copies/μgRNAより大きい値である、（II−６）に記載する商業パッケージ。【００４７】
（II−８）前記カットオフ値が、小児ALL患者または疑小児ALL患者の生体試料について求められるWT1 mRNA量とGAPDH mRNAとの比に基づいて得られる指標値と小児ALLの血液学的病期との関係から作成されるROC曲線（Receiver operating characteristic curve）に基づいて求められる値である、（II−６）または（II―７）に記載する商業パッケージ。【００４８】
（II−９）小児ALL患者の上記カットオフ値が、末梢血については220 copies/μgRNA、骨髄液については1,820 copies/μgRNAである、（II−６）乃至（II−８）のいずれかに記載する商業パッケージ。【００４９】
（III）急性リンパ性白血病（ALL）の血液学的病期の経時的追跡方法（モニタリング方法）
（III−１）（Ｉ−１）乃至（Ｉ−２８）のいずれかに記載の小児ALLの血液学的病期の判定を補助する方法を用いて、小児ALLの血液学的病期を経時的に追跡する方法（モニタリング方法）。【００５０】
（III−２）上記小児ALLの血液学的病期の追跡が、非寛解期（未治療期、または治療後再発期、または治療不応期）から寛解期への移行、および／または、寛解期から非寛解期（未治療期、治療後再発期、または治療不応期）への移行を追跡するものである、（III−１）に記載する方法。【００５１】
（IV）コンピュータプログラム
（IV−１）下記（I）及び（II）のステップをコンピュータによって実行させるコンピュータプログラム：
（I）被験者の生体試料中のWT1 mRNA 量、及び前記同生体試料中のGAPDH mRNA 量の入力を受けるステップ、及び
（II）前記(I)のステップで入力を受けたWT1 mRNA 量とGAPDH mRNA 量との比に基づいて、小児ALLの血液学的病期の判定を補助するために必要な指標値を算出するステップ。【００５２】
（IV−２）さらに下記（III）のステップをコンピュータによって実行させるプログラムを有する（IV−１）に記載するコンピュータプログラム：
（III）前記(II)のステップで得られた指標値に基づいて、被験者について、小児ALLの血液学的病期を決定するステップ。【００５３】
（V）コンピュータプログラムシステム
（V−１）小児ALLの血液学的病期の判定に用いられるコンピュータシステムであって、
当該コンピュータシステムはプロセッサと、メモリとを含むコンピュータを備え、
前記メモリには、
（I）被験者の生体試料中のWT1 mRNA 量、及び前記同生体試料中のGAPDH mRNA 量の入力を受けるステップと
（II）前記(I)のステップで入力を受けたWT1 mRNA 量とGAPDH mRNA 量との比に基づいて、小児ALLの血液学的病期の判定を補助するために必要な指標値を算出するステップとを、前記コンピュータに実行させるコンピュータプログラムが記録されている。【００５４】
（V−２）前記メモリに記録されているコンピュータプログラムが、さらに、
（III）前記(II)のステップで得られた指標値に基づいて、被験者について、小児ALLの血液学的病期を決定するステップを、コンピュータに実行させるコンピュータプログラムである、（V−１）に記載するコンピュータシステム。
【発明の効果】
【００５５】
本発明の小児ALLの血液学的病期の判定補助方法及びALLの被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キット（体外診断用医薬品）によれば、小児ALL患者またはALL罹患が疑われる小児患者について、小児ALLの血液学的病期（寛解期と非寛解期[未治療期、治療後再発期、または治療不応期]との別、特に寛解期と未治療期との別）または小児ALL罹患の有無を簡便に検出することができる。また、本発明のリアルタイムPCR用キットは、成人ALL患者に対しても同様に検出することができる。また、本発明の方法で得られた結果は、血液像、骨髄像、及び染色体異常などの他の関連する検査結果や臨床症状などに基づいてALL罹患の有無並びにALL罹患の血液学的病期、特に未治療期から寛解期への移行を確定判定するうえでの判断材料の一つとして有効に利用することが出来る。【００５６】
特にALLの確定診断には、従来より胸骨または腸骨に細い針を刺して骨髄液を吸引する方法による骨髄穿刺が必須であるのに対して、被験試料として末梢血を使用する本発明の方法は、身体及び精神に与える負担が少ない低侵襲的な方法であるため、ALLを確定診断する前の予備的判定方法として有効に利用することができる。【００５７】
また本発明のモニタリング方法によれば、小児ALL患者についてALLの血液学的病期を経時的に追跡することができる。その結果は、小児ALL患者の適切な治療に反映され、医療費の軽減、小児ALL患者の身体的な負担の軽減を可能にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の小児ALLの血液学的病期の判定補助方法に用いる判定補助装置の一例を示した概略図である。
【図２】判定補助装置のソフトウェアの機能構成を示すブロック図である。
【図３】判定補助装置のハードウェアの構成を示すブロック図である。
【図４】判定補助装置の動作を示すフローチャートの一例である。
【図５】WT1 mRNAの検査スケジュールを示す。
【図６】経過観察症例48例での末梢血及び骨髄液中のWT1 mRNA 発現量の推移を示す。各グラフにおいて縦軸はWT1 mRNA 発現量（copy/μg RNA）の常用対数値を、横軸は治療開始から経過観察期間（月）を示す（下記の図７も同じ。）
【図７Ａ】Ａ群（7例）（表８）での末梢血及び骨髄液中のWT1 mRNA発現量の推移を示す。
【図７Ｂ】Ｂ群（14例）（表８）での末梢血及び骨髄液中のWT1 mRNA発現量の推移を示す。
【図７Ｃ】Ｃ群（13例）（表８）での末梢血及び骨髄液中のWT1 mRNA発現量の推移を示す。
【図７Ｄ】Ｄ群（11例）（表８）での末梢血及び骨髄液中のWT1 mRNA発現量の推移を示す。
【図７Ｅ】Ｅ群（3例）（表８）での末梢血及び骨髄液中のWT1 mRNA発現量の推移を示す。
【図８】血液学的病期における末梢血及び骨髄液中のWT1 mRNA発現量を示す。縦軸はWT1 mRNA 発現量（copy/μg RNA）の常用対数値を示す。
【図９】寛解期と未治療期における末梢血及び骨髄液中のWT1 mRNA発現量のROC解析結果を示す。縦軸は感度を、横軸は特異度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
（Ｉ）小児ALLについて
小児ALLは、白血球の中のB細胞やT細胞などからなるリンパ球が幼若な段階で悪性化し、主に骨髄で異常に増加し、急速に進行する疾患であり、一般に「血液のがん」といわれる白血病の１つである。小児ALLの症状（貧血症状、倦怠感、めまい、ふらつき、動悸、息切れ、むくみ（浮腫等）、感染に伴う発熱、鼻血、歯肉出血や皮下出血、リンパ節腫脹、肝脾腫等）は、主に白血病細胞（がん細胞）が骨髄および末梢血中で異常に増殖し、正常な血液細胞（白血球、赤血球、血小板）が圧迫されて減少することにより引き起こされる。上記のような症状を認めた場合、小児ALLの罹患が疑われるものの、その確定診断には骨髄穿刺が不可欠とされており、骨髄穿刺によって得られた骨髄液標本によってエステラーゼ染色陰性およびペルオキシダーゼ染色陰性（陰性の基準は3%未満とする）のリンパ芽球が全有核細胞の25％以上で認められる場合に小児ALLに罹患していると判断される。なお、小児ALLは、長期生存率が30〜40％に満たない成人ALLとは異なり、概ね80％以上が治療によって治癒するといわれている。これは、成人発症例と比べて、フィラデルフィア染色体の変異やT細胞性の急性リンパ性白血病の頻度が少ないためであると考えられている。この意味で小児ALLは、治療方法も含めて、成人ALLとは異なる疾患として位置づけられている。
【００６０】
骨髄穿刺によって得られる情報（骨髄有核細胞数、及びその形態、細胞の表面抗原解析（白血病細胞の種類）、染色体検査、遺伝子解析、病理学的検査）に基づいて、予想される予後および適切な治療方法が選定される。
【００６１】
小児ALLの治療は、病期に応じて、大きく寛解導入療法と寛解後療法とに分けられ、寛解後療法は、さらに強化療法および維持療法とからなる。寛解導入療法には通常１ヶ月程度の治療期間を要し、寛解状態になると、引き続き寛解後療法に移り、残存する白血病細胞をさらに減少させて寛解を維持するとともに再発を予防する治療が施される。このため、いつの段階で寛解状態になったかどうか、つまり病期が寛解期に移行したか否かの見極めが、治療進行上極めて重要となる。
【００６２】
なお、小児ALLにおける「寛解」の定義は、下記の条件を満たす状態とされている：
(1)G-CSF投与なしで好中球が500/μL以上、
(2)血小板が8万/μL以上、
(3)輸血非依存性、
(4)末梢血に白血病細胞を認めない、
(5)白血病による臨床症状及び臨床所見が消失、並びに
(6)骨髄血において芽球が5％未満で明らかな白血病細胞の形態が認められない状態。
【００６３】
（II）小児ALLの血液学的病期の判定補助方法
本発明は、小児ALLの血液学的病期の判定を補助する方法に関する。
【００６４】
ここで小児ALLの血液学的病期としては、小児ALLに対する寛解導入療法がまだ行われていない状態にある「未治療期（初発期）」、上記寛解状態に移行した「寛解期」、及び寛解状態から再び白血病細胞が増加した状態になった「治療後再発期」、及び治療が奏功しなかった状態である「治療不応期」を挙げることができる。本発明は、小児ALLにおいて、上記血液学的病期のうち寛解期と非寛解期（未治療期、治療後再発期、及び治療不応期が含まれる）とを鑑別するための補助方法に関する。特に好ましくは本発明は、小児ALLにおいて、上記血液学的病期のうち非寛解期である未治療期（初発期）から寛解期への移行を判定する補助方法に関する。つまり、本発明は、寛解導入療法及び寛解後療法を行った小児ALL患者を対象として、当該患者が寛解状態に至ったか否かを、確定診断前に判断するために使用される補助的な判定方法に関する。
【００６５】
本発明の方法は、少なくとも下記（1）−（3）のステップを行うことによって実施することができる。
（1）被験者の生体試料中のWT-1のmRNA量を入手するステップ（WT1 mRNA量入手ステップ）
（2）前記同生体試料中のGAPDH mRNA量を入手するステップ（GAPDH mRNA量入手ステップ）、及び
（3）前記(1)及び(2)のステップでそれぞれ入手したWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量との比に基づいて判定補助に必要な指標値を算出するステップ（指標値算出ステップ）。
【００６６】
なお、本発明において、指標値算出ステップで得られた「指標値」を、「WT1mRNA発現量」とする場合がある。
【００６７】
以下これらのステップについて説明する。
【００６８】
（1）WT1 mRNA量入手ステップ
当該ステップは被験者の生体試料中に発現しているWT1 mRNA量を入手する工程である。
当該WT1 mRNA量の入手手段や入手方法は、このステップを実施した結果、WT1 mRNA量（情報）が得られた状態になればよく、その限りにおいて特に制限されるものではない。具体的には、自ら、被験者の生体試料を材料としてWT1 mRNA量を測定することで入手してもよいし、また第三者が測定したWT1 mRNA量について、直接または間接的にその提供を受けることで入手してもよい。
【００６９】
本発明が対象とする被験者は、小児急性リンパ性白血病（小児ALL）に罹患した小児ALL患者または小児ALL罹患が疑われる小児（以下、「疑小児ALL患者」ともいう）である。好ましくは小児ALL患者であり、さらに好ましくは小児ALLに対する寛解導入療法が開始されている小児ALL患者である。本発明において小児とは１〜19歳の男女を意味する。
【００７０】
また小児ALL患者とは、例えば理化学的所見、血液検査、及び骨髄穿刺などの所定の検査方法によって小児ALLに罹患していると確定診断された小児患者をいう。
【００７１】
また小児ALL罹患が疑われる小児（疑小児ALL患者）とは、それまで小児ALL罹患の既往歴がなく、臨床所見（血液一般検査、血液生化学検査等）及び臨床症状等からALLが疑われる者をいう。
【００７２】
本発明の方法で測定対象とする生体試料は、WT1 mRNAを含む小児（小児ALL患者、疑小児ALL患者）由来の生体試料を挙げることができ、例えば細胞、組織、血液、骨髄液、唾液、喀痰、糞便、及び尿を挙げることができる。好ましくは血液及び骨髄液である。また血液としては好適には末梢血を挙げることができる。より好ましくは末梢血の中でも末梢血白血球、骨髄液の中でも骨髄液有核細胞を挙げることができる。また当該生体試料として、WT1 mRNAを含有する可能性のある試料から公知の方法で処理することで得られる全RNA、あるいはmRNAを富化したRNA試料等を使用することもできる。RNA試料は、商業的に入手できるRNA抽出キットを用いて調製することができる。好ましくは血液（好ましくは末梢血）中の白血球成分または骨髄液中の有核細胞より市販のRNA抽出キットを用いて調製したものを例示することができる。なお、RNA試料は水溶液、あるいは適切な固相に吸着又は固定化した状態で用いることができる。mRNA量としては反応液100μｌ当り0.01ng〜1μｇとなるように調製することもできる。
【００７３】
本発明が測定の対象とするWT1遺伝子は、前述するように小児ウイルムス腫瘍の原因遺伝子として同定された3037bpからなる遺伝子であり、「Homo sapiens Wilms tumor 1 (WT1), transcript variant D, mRNA」として、NCBIに登録されている（NM_024426.4）。その塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００７４】
生体試料中のWT1 mRNA量の測定方法は、WT1遺伝子の転写物であるmRNAの量が測定できる方法であればよく、RT-PCR法（2ステップRT-PCR法、1ステップRT-PCR法）、in situ RT-PCR法、次世代シークエンサー等、当業界で広く知られた方法を例示することができる。好ましくは、2ステップRT-PCR法、または1ステップRT-PCR法、である。より好ましくは逆転写反応とPCR反応（伸長及び増幅反応）を同一容器内で連続して行う１ステップRT-PCR法による測定方法である。
【００７５】
本発明において用いることができる１ステップRT-PCR法に使用される反応緩衝液としては、逆転写活性を有する酵素が活性を示すのに適した水溶性緩衝液であればよく、例えばｐＨ７〜１０、好ましくはｐＨ８〜９の緩衝液、例えばトリス緩衝液を挙げることができる。更にこの緩衝液の中には逆転写活性を有する酵素またはDNAポリメラーゼの活性に必要な種々のイオンを含むことができる。中でもNaイオンやKイオンは塩の形で5〜50mMの濃度で添加することができる。またMgイオンやMnイオンは塩の形で1〜10mMの濃度で添加することができる。その他、必要に応じて界面活性剤、ウシ血清アルブミン（BSA）、ゼラチン等、逆転写活性を有する酵素またはDNAポリメラーゼの活性を促進または安定化する薬剤を配合することもできる。また、試料中のRNA及びRNA競合物の分解を抑制するためにリボヌクレアーゼ阻害剤が添加されていてもよい。
【００７６】
逆転写活性を有する酵素としては、トリ骨芽球症ウイルス由来逆転写酵素（AMV）、ラウス関連ウイルス由来逆転写酵素（RAV2）、モロニー・ネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（MMLV）、サーマス・サーモフィルス（Thermusthermophilus）由来DNAポリメラーゼ（Tth）、バチルス・カルドテナクス（Bacillus cardotenax ）由来DNAポリメラーゼ（Bca）、並びにそれらの誘導体が挙げられるが、中でもTthが最も本発明に適している。Tthとして、具体的にはThermus species Z05に由来するThermostable enzymeのDNAポリメラーゼを例示することができる。なお、これらの酵素はその本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換え蛋白質のいずれであってもよい。
【００７７】
反応液にはcDNA合成並びにPCRにおいて基質となる４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP；本明細書ではこの４種を総称して「dNTP」ともいう記載）が添加される。また、dNTPはそのすべて又は一部が、プライマーから合成されるDNA鎖の伸長を可能とする範囲で修飾及び／又は標識されたdNTPに置き換えることもできる。
【００７８】
本発明において標的RNAからのcDNA合成（逆転写反応及び伸長反応）に用いられるプライマーとしては、少なくとも標的RNAの塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、採用される反応条件において標的RNAにアニールするものである必要がある。オリゴヌクレオチドの長さとしては6〜100ヌクレオチド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの長さを例示することができる。また修飾及び／又は標識されたプライマーも使用できる。該プライマーは、例えば公知方法により化学的に合成することができる。また、PCRにおいて使用されるプライマーは、少なくとも標的RNA由来のcDNAを鋳型としたDNAの増幅が可能である必要がある。このためには、少なくとも鋳型cDNAの塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、採用される反応条件において当該cDNAにアニールするものである必要がある。好ましくは、上記の標的RNAからcDNAの合成（逆転写反応及び伸長反応）にプライマーとして機能するとともに、cDNAを鋳型としたDNAにもプライマーとして機能するオリゴヌクレオチドである。
【００７９】
本発明の目的遺伝子であるヒトWT1 mRNAをcDNAに逆転写し伸長、増幅するために好適に使用されるプライマーセットとしては、下記表２に記載する（A1）Forwardプライマー及び（A2）ReverseプライマーからなるプライマーセットＡ、並びに表３に記載する（B1）Forwardプライマー及び（B2）ReverseプライマーからなるプライマーセットＢを挙げることができる。なお、表２及び３には、これらのプライマーセットで増幅されたヒトWT1遺伝子増幅物を検出するために使用される配列特異的結合プローブ（（A3）Probe、（B3）Probe）も併せて示す。なお、かかるプローブは、増幅物の検出を容易にするために標識されていることが好ましい。
【００８０】
【表２】
2018016474.tif 000003
【００８１】
【表３】
2018016474.tif 000004
プローブの標識法には、RI法と非RI法とがあるが、非RI法を用いることが好ましい。非RI法には蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法が好適に使用される。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば特に限定されないが、例えばシアニン色素（Cy DyeTMシリーズのCy3やCy5等）、ローダミン6G試薬、FAM (6-カルボキシフルオレセイン)、及びHEX (6-ヘキサクロロフルオレセイン)などを用いることが出来る。またプローブは、消光色素で標識されていてもよい。なお、消光色素としては、消光色素としての機能を有し、且つ上記と同様に核酸の塩基部分と結合できるものであれば特に限定されず、例えばATTO-540Q（ATTO-TEC GmbH社）を挙げることができる。
【００８２】
本発明において使用されるRNA標準品（標的RNA）は公知の方法で作製することができる。例えば、「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）, 第87巻, 第2725〜2729頁（1990）」、「Clinical Chemistry（Clin. Chem. ）, 第41巻, 第819〜825頁（1995）」、「Blood，第82巻，第1929〜1936頁（1993）」等の記載を参照して作製することができる。
【００８３】
具体的には以下の通りである。増幅対象の2本鎖DNA配列に、RNA合成酵素，例えばT7 RNAポリメラーゼ等の反応基点となるプロモーター配列を付加して、RNA合成の鋳型となるDNA配列を作成する。反応容器内に、RNAポリメラーゼと、RNAプロモーター配列を含む2本鎖DNA、ヌクレオシド三リン酸を加え、37℃で30分〜2時間反応することにより、RNAプロモーター下流の鋳型DNAに相補的な一本鎖RNA（標的RNA）を合成する。
【００８４】
本発明で使用することができる１ステップRT-PCR法の反応操作及び反応条件としては、制限されないものの、下記を例示することができる。
【００８５】
反応容器内に、例えばcNTP、Mg塩やMn塩等の金属イオン、リボヌクレアーゼ阻害剤、逆転写活性を有する酵素、プライマー等を含む反応液を加え、反応開始までは４℃以下で保冷しておく。これに測定しようとするヒトWT1 mRNAを含み得る被験試料を添加し50〜70℃、好ましくは55〜65℃で2〜30分、好ましくは2〜10分程度、複数回反応させcDNA合成を行う（逆転写反応）。引き続き90〜99℃で10秒〜2分間程度加熱し、RNA-cDNA複合体を変性させる（熱変性）。更に90〜99℃での熱変性、45〜65℃のアニーリング反応、及び60〜80℃のDNA伸長反応からなる温度サイクル反応を2〜50サイクル行って標的RNA由来のDNA断片を増幅する。更に感度及び／又は特異性を向上するためにネステッドPCRを行う場合には、１段階目、２段階目のPCRに使用するプライマーを共に最初から反応容器内に添加しておき、２段階のPCRを連続して行うこともできる。この場合１段階目のPCR用プライマー量は２段階目のPCR用プライマー量より少なくすることが必要で、好ましくは２段階目のPCR用プライマー量の100倍以下の量が適している。
【００８６】
以上説明する方法によれば、ヒトWT1 mRNA量を、同一容器内における１ステップ反応により簡便に測定することができる。また当該方法は、商業的に入手できるリアルタイムRT-PCR用キット、及び／又は、リアルタイムPCR装置を用いることでより簡便に実施することができる。
【００８７】
但し、当該WT1 mRNA量の入手ステップは、当該方法に限らず、前述するように、被験者（例えば、小児ALL患者、疑小児ALL患者）の生体試料におけるWT1 mRNA量が、少なくとも情報として得られる方法であれよく、上記のごとく自ら被験者の生体試料を材料としてWT1 mRNA量を測定することで入手してもよいし、また第三者が測定したWT1 mRNA量を当該第三者または別の者からデータ（情報）として入手することで行うこともできる。
【００８８】
本発明において、前記の通り、2ステップRT-PCR法、または1ステップRT-PCR法を好ましく用いることができる。2ステップRT-PCR法としては、例えば、WT1 mRNA測定キット「オーツカ」が挙げられ、そして、このキットの添付文書（2013年3月改訂（第6版））に記載の方法を用いることができる。ここで、下記実施例は１ステップRT-PCR法を用いているが、文献（K.Kitamura,et al. Clinical usefulness of WT1 mRNA expression in bone marrow detected by a new WT1mRNA assay kid for monitoring acute myeloid leukemia: a comparison with expression of WT1 mRNA in peripheral blood. Int J Hematol (2016) 103:53-62.）には、1ステップRT-PCR法を用いた場合と、2ステップRT-PCR法を用いた場合とで、得られるWT1 mRNA量（定量値）に相関関係があることが示されている。  
【００８９】
（2）GAPDH mRNA量入手ステップ
当該ステップは、上記（1）のステップで対象とした被験者の生体試料を対象として、同生体試料中に発現しているGAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）のmRNA量を入手する工程である。
【００９０】
当該GAPDH mRNAの量の入手手段や入手方法は、このステップを実施した結果、GAPDH mRNA量（情報）が得られた状態になればよく、その限りにおいて特に制限されるものではない。具体的には、自ら、被験者の上記同生体試料を材料としてGAPDH mRNAの量を測定することで入手してもよいし、また同生体試料について第三者が測定したGAPDH mRNAの量について、直接または間接的にその提供を受けることで入手してもよい。
【００９１】
対象とする生体試料は、前述するWT1 mRNA量を測定した小児（小児ALL患者、疑小児ALL患者）由来の生体試料と同じ生体試料である。従って、生体試料としては、前述の通り、例えば細胞、組織、血液、骨髄液、唾液、喀痰、糞便、及び尿を挙げることができる。好ましくは血液及び骨髄液である。また血液としては好適には末梢血を挙げることができる。より好ましくは末梢血の中でも末梢血白血球、骨髄液の中でも骨髄液有核細胞を挙げることができる。
【００９２】
GAPDHは「Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), mRNA」としてNCBIに登録されている遺伝子である（NM_002046.3）。当該遺伝子は、細胞の分化に関係なく、どの細胞にも常に発現し存在し、特殊な機能は果たさないが、それらの生存に必須な役割を持つ遺伝子である。特に、当該遺伝子は、測定目的であるヒトWT1遺伝子と塩基配列の相同性が低く、このためRT-PCRによる増幅が競合しないため、ハウスキーピング遺伝子として好適に使用することができる。その塩基配列を配列表の配列番号８に示す。
【００９３】
被験者の生体試料におけるGAPDH mRNA量の測定方法は、GAPDH遺伝子の転写物であるmRNAの量を測定できる方法であればよく、RT-PCR法（2ステップRT-PCR法、1ステップRT-PCR法）、in situ RT-PCR法、次世代シークエンサー等、当業界で広く知られた方法を用いて測定することができる。好ましくは、2ステップRT-PCR法、または1ステップRT-PCR法である。より好ましくは逆転写反応とPCR反応（伸長及び増幅反応）を同一容器内で連続して行う１ステップRT-PCR法による測定方法である。本発明で用いることができる１ステップRT-PCR法に使用される反応緩衝液、当該反応緩衝液に配合する各種成分、逆転写活性を有する酵素、及びその他の成分としては、前記「(1)WT1 mRNA量入手ステップ」に記載したものを同様に挙げることができる。
【００９４】
GAPDH mRNAをcDNAに逆転写し伸長、増幅するために好適に使用されるプライマーセットとしては、下記表４に記載する（a1）Forwardプライマー及び（a2）Reverseプライマーからなるプライマーセットａ、並びに表５に記載する（b1）Forwardプライマー及び（b2）Reverseプライマーからなるプライマーセットｂを挙げることができる。なお、表４及び５には、これらのプライマーセットで増幅されたヒトGAPDH遺伝子増幅物を検出するために使用される配列特異的結合プローブ（（a3）Probe、（b3）Probe）も併せて示す。なお、かかるプローブは、増幅物の検出を容易にするために標識されていることが好ましい。プローブの標識法としては、前記「(1)WT1 mRNA量入手ステップ」に記載する方法を同様に挙げることができる。 
【００９５】
【表４】
2018016474.tif 000005
【００９６】
【表５】
2018016474.tif 000006
１ステップRT-PCRの反応操作及び反応条件としては、制限されないものの、前記「(1)WT1 mRNA量入手ステップ」に記載する方法及び条件を同様に挙げることができる。当該方法は、商業的に入手できるリアルタイムRT-PCRキット、及び／又はリアルタイムPCR装置を用いることでより簡便に実施することができる。斯くして、ヒトGAPDH mRNA量を、同一容器内における１ステップ反応により簡便に測定することができる。
【００９７】
但し、GAPDH mRNA量の入手ステップは、当該方法に限らず、前述するように、被験者（小児ALL患者、疑小児ALL患者）の生体試料におけるGAPDH mRNA量が得られる方法であればよく、上記のごとく自ら被験者の生体試料を材料としてGAPDH mRNA量を測定することで入手してもよいし、また第三者が測定したGAPDH mRNA量をデータ情報として収集することで行うこともできる。
【００９８】
上記（2）GAPDH mRNA量入手ステップは、前述する（1）WT1 mRNA量入手ステップと別個に行うこともできるが、(1)WT1 mRNA量入手ステップと同時に行うことが好ましい。より好ましくは（1）WT1 mRNA量入手ステップと（2）GAPDH mRNA量入手ステップはいずれも１ステップRT-PCR法により被験者の生体試料中のmRNA量を測定し、これを入手するステップであり、当該(1)および(2)における１ステップRT-PCR法が、WT1 mRNAおよびGAPDH mRNAそれぞれの逆転写反応および二本鎖cDNAの合成を含むPCR反応を、同時かつ同一の容器内で連続して進行させて行う方法である（マルチプレックス・１ステップ定量リアルタイムRT-PCR）。
【００９９】
この方法は、同一の反応容器内に、WT1遺伝子増幅用のフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセット、及びその増幅産物を検出するためのプローブ、並びにGAPDH遺伝子増幅用のフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセット、及びその増幅産物を検出するためのプローブに加えて、cNTP、Mg塩やMn塩等の金属イオン、リボヌクレアーゼ阻害剤、逆転写活性を有する酵素等を含む反応液を加え、前述する反応操作及び反応条件を用いて１ステップRT-PCRを行うことで実施することができる。
【０１００】
かかる反応容器内では下記の２つの反応が生じており、被験者の生体試料中に存在するWT1 mRNA由来のcDNAの増加、及びGAPDH mRNA由来のcDNAの増加の両方を同時にリアルタイムで測定することができる。
【０１０１】
本発明において、前記の通り、2ステップRT-PCR法、または1ステップRT-PCR法、を好ましく用いることができる。2ステップRT-PCR法としては、例えば、WT1 mRNA測定キット「オーツカ」が挙げられ、このキットの添付文書（2013年3月改訂（第6版））に記載の方法を用いることができる。ここで、本願の実施例は１ステップRT-PCR法を用いているが、文献（K.Kitamura,et al. Clinical usefulness of WT1 mRNA expression in bone marrow detected by a new WT1 mRNA assay kid for monitoring acute myeloid leukemia: a comparison with expression of WT1 mRNA in peripheral blood. Int J Hematol(2016)103:53-62.）には、1ステップRT-PCR法を用いた場合と、2ステップRT-PCR法を用いた場合とで、得られるWT1 mRNA量（定量値）に相関関係があることが示されている。 
【０１０２】
［反応容器内で生じている反応］
以下は、１ステップRT-PCR法を用いる場合について説明をする。
【０１０３】
WT mRNAに関して、まず測定試料に含まれるWT1 mRNAに相補的な配列を有するWT1リバースプライマーが結合する。このWT1リバースプライマーを起点として、逆転写活性を有するDNAポリメラーゼによってWT1 mRNAに特異的な第１鎖cDNAが合成される。次いで第１鎖cDNAに相補的な配列を有するWT1フォワードプライマーを起点として２本鎖cDNAが合成される。合成された２本鎖cDNAを鋳型とするPCRを繰り返し行うことで、WT1mRNA由来のcDNAが増幅される。この増幅過程において、２本鎖cDNAの片方に結合したWT1プローブ（標識WT1プローブ）が、DNAポリメラーゼの5’-3’エキソヌクレアーゼ活性により分解され、標識WT1プローブから標識物が遊離して、当該標識物に由来するシグナル（例えば、蛍光シグナルなど）を発する。このシグナルを、増幅サイクル毎に測定することにより、WT1 mRNA由来のcDNAの増加をリアルタイムに測定することができる。また並行して、GAPDH mRNAについても同様に連続した反応が起こっているので、上記と同様に、標識GAPDHプローブから遊離した標識物に由来するシグナルを、増幅サイクル毎に測定することにより、GAPDH mRNA由来のcDNAの増加をリアルタイムに測定することができる。この場合、WT1プローブ及びGAPDHプローブは、それぞれ異なる標識物（例えば蛍光物質）で標識されていることが好ましい。
【０１０４】
（3）指標値算出ステップ
当該ステップは、前記(1)及び(2)のステップでそれぞれ入手したWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量との比に基づいて判定補助に必要な指標値を算出するステップである。
【０１０５】
WT1 mRNA量とGAPDH mRNA量との比は、前記(1)のステップで入手したWT1 mRNA量（マーカー遺伝子の量）を(2)のステップで入手したGAPDH mRNA量（ハウスキーピング遺伝子の量）で除することで「WT1 mRNA量／GAPDH mRNA量」の値として得ることができ、GAPDH mRNA１コピーあたりのWT1 mRNAのコピー数を意味する。ここで「１コピー」とは１個のGAPDH mRNA若しくはWT1 mRNA、１分子のGAPDH mRNA若しくはWT1 mRNAを意味する。具体的には「GAPDH mRNA１コピーあたりのWT1 mRNAのコピー数」とは「GAPDH mRNA１個あたりのWT1 mRNAの個数」または「GAPDH mRNA１分子あたりのWT1 mRNAの分子数」と言い換えることができる。
【０１０６】
本発明の判定補助に必要な指標値は、上記で得られるWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量との比（WT1 mRNA量／GAPDH mRNA量）をさらに正規化（ノーマライゼーション）することで算出することができる。
【０１０７】
ここで正規化は、上記で得られる「WT1 mRNA量／GAPDH mRNA量」に、健康成人の１μg RNAあたりの平均GAPDH mRNA測定値（GAPDH mRNA量：copies/μg RNA）を乗ずることで行うことができる。なお、ここで健康成人とは、血液一般検査及び血液生化学検査、肝機能及び腎機能一般検査の検査結果が当業界の技術常識に基づいて正常と判断された20歳以上のヒト（男女の別を問わない）を意味する。
【０１０８】
具体的には、一例として、正規化は、上記で得られる「WT1 mRNA量／GAPDH mRNA量」に、健康成人の１μg RNAあたりの平均GAPDH mRNA測定値に相当する「2.7×107 copies/μgRNA」を乗ずることで行うことができ、斯くして得られる値を、指標値として判定補助に使用することができる。
【０１０９】
本発明において、指標値算出ステップで得られた指標値を、WT1 mRNA発現量、とする場合がある。
【０１１０】
（4）血液学的病期の判定補助ステップ
本発明の方法は、さらに下記のステップを含むことができる。
（4）前記（3）のステップで得られた指標値を予め設定されたカットオフ値と対比し、その大小に基づいて、被験者の小児ALLの血液学的病期を示すステップ。
【０１１１】
被験者が小児ALL患者である場合、当該ステップ(4)は、上記のステップ（3）で得られた指標値が所定のカットオフ値より小さい場合は当該被験者が寛解期にあると示し、一方、上記ステップ(3)で得られた指標値が上記所定のカットオフ値以上である場合は当該被験者が非寛解期にあると示すステップとすることができる。ここで非寛解期には、未治療期、治療後再発期、及び治療不応期が含まれる。このため、寛解期と鑑別する目的の非寛解期に従って、未治療期、治療後再発期、及び治療不応期の中からいずれか少なくとも１つの病期が選択され、それに応じたカットオフ値を使用することができる。なお、本発明において「カットオフ値」は血液学的病期の判定を補助するための「参考基準値」を意味し、本明細書に記載する「カットオフ値」は「参考基準値」と言い換えることができる。
【０１１２】
また被験者が疑小児ALL患者である場合、当該ステップ(4)は、上記のステップ（3）で得られた指標値が所定のカットオフ値より小さい場合は当該被験者が非罹患であると示し、一方、上記ステップ(3)で得られた指標値が上記所定のカットオフ値以上である場合は当該被験者が罹患（小児ALLの血液学的病期の分類において「非寛解期」）であると示すステップとすることができる。
【０１１３】
当該ステップで使用されるカットオフ値（小児ALL血液学的病期判定補助用カットオフ値）は、被験者が小児ALL患者である場合（好ましくは寛解導入療法を受けている小児ALL患者）、当該被験者が小児ALLの寛解期にあるか否かを補助判定するために使用される指標値に対する参考基準値である。言い換えれば、当該カットオフ値は、被験者が寛解期にあるか、それとも非寛解期（未治療期、治療後再発期、または治療不応期）にあるかの別を補助判定するために使用される指標値に対する参考基準値である。
【０１１４】
また当該ステップで使用されるカットオフ値は、被験者が疑小児ALL患者である場合、当該被験者が小児ALLに罹患しているか否かを補助判定するために使用される指標値に対する参考基準値である。当該罹患状態は、小児ALL患者の未治療期に該当する状態であり、非罹患状態は小児ALL患者の寛解期に該当する状態である。
【０１１５】
カットオフ値は、対象とする被験者の生体試料の種類、鑑別対象病期及び判定目的等に応じて個々に設定され、これらに応じて複数の値が存在する。具体的には、例えば被験者が寛解導入療法を受けている小児ALL患者である場合、当該被験者が非寛解期にあるかまたは寛解期に至っているかの別を補助判定するためのカットオフ値；被験者が寛解後療法を受けている小児ALL患者である場合、当該被験者が寛解期にあるかまたは治療後再発期にあるかの別を補助判定するためのカットオフ値；被験者が寛解導入療法または寛解後療法を受けている小児ALL患者である場合、当該被験者が治療不応期にあるかまたは寛解期にあるかの別を補助判定するためのカットオフ値；被験者が疑小児ALL患者である場合、当該被験者が未治療期であるか否か、つまり小児ALLに罹患しているか否かの別を補助判定するためのカットオフ値などを挙げることができる。なお、「小児ALLに罹患しているか否か」の「否」の場合とは、小児ALLに罹患していないものの、小児ALL以外の血液の病気に罹患している場合、及び小児ALLのみならず小児ALL以外の血液の病気にも罹患していない場合が含まれる。
【０１１６】
またこれらのカットオフ値は対象とする被験者の生体試料によっても相違し、具体的には例えば末梢血と骨髄液などの生体試料の種類に応じて個別のカットオフ値を設定することができる。
【０１１７】
例えば、被験者が小児ALL患者である場合、当該カットオフ値は、小児ALL患者の生体試料中のWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量との比（WT1 mRNA量／GAPDH mRNA量）に基づいて得られる指標値と、小児ALL患者における小児ALLの血液学的病期との関係から求めることができる。ここで指標値は、上記「（3）指標値算出ステップ」で説明した方法で求めることができる。
【０１１８】
具体的には、まず、慣用の診断方法によって小児ALLの血液学的病期（未治療期、治療後再発期、治療不応期、及び寛解期）が確定診断された複数の小児ALL患者を対象として、血液学的病期毎に、生体試料（例えば末梢血、骨髄液）中のWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量の比（WT1 mRNA量／GAPDH mRNA量）に基づく指標値の分布または平均値を求める。次いで、得られた病期毎の指標値の分布または平均値（平均指標値）に基づいて、寛解期に属する群（寛解期群）と各非寛解期に属する群（非寛解期群）とを識別（分離）することが可能な値を任意に設定し、これをカットオフ値とすることができる。上記非寛解期群には、未治療期群、治療後再発期群、及び治療不応期群が含まれる。つまり、未治療期群と寛解期群とを分離可能な値を設定すれば、これが未治療期群と寛解期群とを鑑別するためのカットオフ値になり、以下同様に、寛解期群と治療後再発期群とを分離可能な値、並びに寛解期群と治療不応期群とを分離可能な値を設定することで、当該設定値がそれぞれのカットオフ値になる。
【０１１９】
また疑小児ALL患者を対象とする場合、まず、慣用の診断方法によって小児ALL罹患（未治療期）であると確定診断された複数の小児ALL患者と複数の非ALL罹患小児を対象として、小児ALL罹患の有無別に、生体試料（例えば末梢血、骨髄液）中のWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量の比（WT1 mRNA量／GAPDH mRNA量）に基づく指標値の分布または平均値を求める。次いで、得られた罹患有無別の指標値の分布またはその平均値（平均指標値）に基づいて、小児ALL罹患者群と非ALL罹患小児群とを識別（分離）することが可能な値を任意に設定することで、これを小児ALL罹患の有無を補助判定するためのカットオフ値とすることができる。なお、非ALL罹患小児としては、ALLには罹患していないもののALL以外の血液の病気に罹患している小児、及びALLのみならずALL以外の血液の病気にも罹患していない小児を挙げることができる。特にALLに類似の症状を呈するALL以外の血液の病気に罹患した小児である。
【０１２０】
本発明において、これらの両群を識別（分離）することが可能なカットオフ値は、統計学的解析によって、求めることができる。統計学的解析としては、種々の解析方法を用いることができる。例えば、具体的には、ROC解析、判別分析、及び単変量解析などが挙げられる。
【０１２１】
判別分析は、例えば、あるデータから2群を識別するのに用いられる手法で、ある値以上と当該値未満とでグループを分ける分析である。
【０１２２】
単変量解析は、例えば、反応変数（Y=a+ｂXのYにあたるもの）が連続データの場合に、高血圧患者の血圧を１０下げるときのある薬剤の用量を考えるとすると、その１０をどのような基準で決めたかということに用いる解析である。
【０１２３】
本発明では、ROC解析を用いることが好ましい。ROC(Receiver operation character)解析を用いカットオフ値の求め方について記載する。非寛解期と寛解期について、これらの両群を識別（分離）することが可能なカットオフ値は、一例として、両群で求められる指標値（WT1 mRNA量とGAPDH mRNA量との比を正規化した値）について、感度（sensitivity）と特異度（100%-specificity）の２軸によるROC曲線（Receiver operating characteristic curve）を作成することで求めることができる。ROC曲線をもとにしたカットオフ値の求め方は、例えば「生物試料分析」2005年、28巻、pp.133-139及び Perkins NJ, Am J Epidemiol. 2006; 163: 670-675.に記載する方法に従って設定することができる。
【０１２４】
ROC曲線におけるカットオフ値の求め方としては、(1)ROC曲線を記載したグラフにおいて左上隅からの距離を利用する方法と（2）Youden indexを用いた方法の２つを挙げることができる。（1）の方法は、感度と特異度の優れた独立変数のROC曲線は、左上隅に近づいていくという事実から、この左上隅との距離が最小となる点をカットオフ値にする方法である。一方（2）の方法は、予測能及び診断能が低い独立変数のROC曲線、すなわちAUC＝0.500となる線から最も離れたポイントをカットオフ値にする方法である。具体的には、「感度＋特異度−１」を計算して、その最大値となるポイント（Youden index）をカットオフ値にする方法である。
【０１２５】
斯くして、各群（寛解期群と未治療期群、寛解期群と治療後再発期群、寛解期群と治療不応期群、罹患群と非罹患群）との鑑別を補助判定するためのカットオフ値を設定することができる。
【０１２６】
本発明において、カットオフ値は前記指標値の検出下限値よりも高い。
「指標値の検出下限値」とは、指標値が検出できる最小量（値）を意味する。具体的にはRT-PCR法を用いて測定した場合における検出最小量を意味する。より好ましくは本発明のリアルタイムPCR用キットを用いて測定した場合においてキットの性能上、測定できる検出下限の値である。
【０１２７】
後述する本実施例では、一例として、ROC曲線（Youden index法）により、これらのカットオフ値のうち、未治療期と寛解期との別を補助判定するためのカットオフ値（Youden index）を設定している。具体的には、生体試料として骨髄液を用いた場合、好適なカットオフ値は1,820copies/μg RNA（感度58.1％、特異度98.0％、AUC 0.794）であり、生体試料として末梢血を用いた場合、好適なカットオフ値は220copies/μg RNA（感度68.8％、特異度98.0％、AUC 0.894）である。
【０１２８】
従って、未治療の小児ALL患者及び寛解導入療法を施している小児ALL患者に対して、当該カットオフ値に基づいて未治療期と寛解期との別を補助判定することができる。具体的には、小児ALL患者について、末梢血及び／または骨髄液を被験試料として算出された指標値がそれぞれ220copies/μg RNA未満及び／または1,820copies/μg RNA未満であれば、当該小児ALL患者は寛解期に至っていると判断（予備的判断）することができ、逆に220copies/μg RNA以上及び／または1,820copies/μg RNA以上であれば、当該小児ALL患者は未だ未治療期にあると判断（予備的判断）することができる。
【０１２９】
以上説明する急性リンパ性白血病の血液学的病気の判定を補助する方法を用いることで、小児ALL患者についてその血液学的病期を経時的に追跡することが可能になる。このため、本発明は、上記方法を実施することによる小児ALLの血液学的病期の経時的追跡方法に関するものでもある。なお、上記小児ALLの血液学的病期の追跡には、非寛解期から寛解期への移行の追跡、および、寛解期から非寛解期への移行を追跡が含まれる。
【０１３０】
（III）急性リンパ性白血病の被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キット（体外診断用医薬品）
本発明のALL被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キットは、ヒトWT1 mRNAをRT-PCR法に供するためのプライマーセットと、ハウスキーピング遺伝子としてのGAPDH mRNAをRT-PCR法に供するためのプライマーセットの両方を包含することを特徴とする。また当該キットには、RT-PCR法で増幅されたヒトWT1 mRNAの増幅産物、及びハウスキーピング遺伝子（GAPDH mRNA）の増幅産物を検出するために使用されるプローブを含めることができる。
【０１３１】
キットの一例として、ヒトWT1 mRNAをRT-PCR法に供するためのプライマーセットとして表２に示す「（A1）Forwardプライマー（配列番号２）」及び「（A2）Reverseプライマー（配列番号３）」からなるプライマーセットＡ、並びにこれらのプライマーセットで増幅されたヒトWT1遺伝子増幅物を検出するために使用される配列特異的結合プローブとして表２に示す「（A3）Probe（配列番号４）」を含み、且つ、ハウスキーピング遺伝子として使用されるヒトGAPDH mRNAをRT-PCR法に供するためのプライマーセットとして表４に示す「（a1）Forwardプライマー（配列番号９）」及び「（a2）Reverseプライマー（配列番号１０）」からなるプライマーセットａ、並びにこれらのプライマーセットで増幅されたヒトGAPDH遺伝子増幅産物を検出するために使用される配列特異的結合プローブとして表４に示す「（a3）Probe（配列番号１１）」を含むものを挙げることができる。
【０１３２】
なお、プローブは、増幅物の検出を容易にするために標識されていることが好ましい。
【０１３３】
プローブの標識法には、RI法と非RI法とがあるが、非RI法を用いることが好ましい。非RI法には蛍光標識法、酵素、ビオチン標識法、発色団、化学発光標識法等が挙げられるが、蛍光標識法が好適に使用される。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば特に限定されないが、シアニン色素（Cy DyeTMシリーズのCy3やCy5等）、ローダミン6G試薬、FAM (6-カルボキシフルオレセイン)、及びHEX (6-ヘキサクロロフルオレセイン)などを用いることが出来る。またプローブは、消光色素で標識されていてもよい。なお、消光色素としては、消光色素としての機能を有し、且つ上記と同様に核酸の塩基部分と結合できるものであれば特に限定されず、例えばATTO-540Q（ATTO-TEC GmbH社）を挙げることができる。
【０１３４】
キットの他の一例として、ヒトWT1 mRNAをRT-PCR法に供するためのプライマーセットとして表３に示す「（B1）Forwardプライマー（配列番号５）」及び「（B2）Reverseプライマー（配列番号６）」からなるプライマーセットＢ、並びにこれらのプライマーセットで増幅されたヒトWT1遺伝子増幅物を検出するために使用される配列特異的結合プローブとして表３に示す「（B3）Probe（配列番号７）」を含み、且つ、ハウスキーピング遺伝子として使用されるヒトGAPDH mRNAをRT-PCR法に供するためのプライマーセットとして表５に示す「（b1）Forwardプライマー（配列番号９）」及び「（b2）Reverseプライマー（配列番号１２）」からなるプライマーセットｂ、並びにこれらのプライマーセットで増幅されたヒトGAPDH遺伝子増幅産物を検出するために使用される配列特異的結合プローブとして表５に示す「（b3）Probe（配列番号１１）」を含むものを挙げることができる。
【０１３５】
本発明の急性リンパ性白血病の被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キットは、上記成分のほか、逆転写反応とPCRの２つの反応に必要な各種成分（dNTP、金属イオン、ｐＨ調整のための緩衝成分等）、逆転写活性等を有する酵素や酵素補助因子などを含むことができる。なお、金属イオンとしては制限されないが、酢酸マンガンやマグネシウム塩等、二価の金属イオンを生じる塩を例示することができる。また、当該キットの各種成分は、更に酵素を安定化するような成分やリボヌクレアーゼ阻害剤等が添加されたものであってもよい。また当該キットには、WT1 RNA及び／又はGAPDH RNAを所定濃度含む標準液、並びに必要に応じて当該標準液を希釈するための緩衝液を含むことができる。
【０１３６】
本発明の急性リンパ性白血病の被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キットは、反応液をいれるための容器（反応容器）または被験試料を維持または保存するための容器（例えば、末梢血または骨髄液を採取し保存するための容器）をさらに含むことができる。あらかじめ反応液の１回分の必要量が分注された反応容器を準備しておくと、測定しようとする被験試料を添加するだけで反応を開始することができるため、ヒトWT1 mRNA量の定量を簡便に行うことができる。特に、多数の被験試料についてヒトWT1 mRNA量を定量する場合に有用である。またキットは被験試料の調製を容易するための他の成分を任意に含むことができる。また、ピペット、シリンジ、及びピンセット等、その他、被験試料採取を補助するための１以上の器具を含むこともできる。
【０１３７】
本発明の急性リンパ性白血病の被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キットは、単独で包装されるか、または必要に応じて当該キットに関する説明書とともに包装されて、商業的に流通することができる。当該説明書は書面、またはコンピューターに読み取り可能な媒体（ディスク、CD、DVD等）であることができる。当該説明書の記載としては、制限されないものの、本発明のリアルタイムPCR用キットについて、キットの構成、使用目的、測定原理、操作方法（用法・用量）、測定結果の判定法、及び臨床的意義からなる群から選択される少なくとも１つの事項を挙げることができる。
【０１３８】
本発明の急性リンパ性白血病の被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キットは、末梢血（白血球）または骨髄液（有核細胞）より抽出したRNA中のWT1 mRNAを定量リアルタイムRT-PCRにて測定することができるキットを包含するものであり、当該キットの使用目的または臨床的意義としては、ALL患者またはALL罹患が疑われる患者を対象として、ALLの血液学的病期（寛解期、非寛解期［未治療期、寛解後再発期、治療不応期］）の判定の補助（ALL患者における診断補助）に使用できることを挙げることができる。また当該リアルタイムPCR用キットは、ALL患者についてALL進行または再発のモニタリング、または治療を受けているALL患者について治療効果のモニタリングに使用することができる。また当該ALL診断用キットは、疑小児ALL患者について、小児ALLの罹患の有無の判定の補助（小児ALLの罹患診断の補助）に使用することができる。
【０１３９】
本発明の急性リンパ性白血病の被験者のWT1 mRNA量を測定するためのリアルタイムPCR用キットは、使用年齢を特に限定されず、大人用としても、小児用として、用いることができる。
【０１４０】
（IV）コンピュータプログラム製品
本発明には、小児ALLの血液学的病期の判定をコンピュータに実施させるためのコンピュータプログラム製品も含まれる。コンピュータプログラム製品には、インターネット等を介してダウンロード可能なコンピュータプログラムや、当該プログラムを記録した媒体（ディスク、CD、DVDなど）が例示される。
【０１４１】
例えば、以下のステップをコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが例示される。
（I）被験者の生体試料中のWT1 mRNA 量、及び前記同生体試料中のGAPDH mRNA 量の入力を受けるステップ、及び
（II）前記(I)のステップで入力を受けたWT1 mRNA 量とGAPDH mRNA 量との比に基づいて、小児ALLの血液学的病期の判定を補助するために必要な指標値を算出するステップ。なお、上記（I）のステップはWT1 mRNA 量とGAPDH mRNA 量の入力を同時に受けるものであっても、別々に受けるものであってもよい。
【０１４２】
また前記プログラムには、上記（I）及び（II）に加えて、さらに下記（III）のステップをコンピュータに実行させるためのプログラムであってもよい：
（III）前記(II)のステップで得られた指標値に基づいて、被験者について、小児ALLの血液学的病期を決定するステップ。
【０１４３】
［小児ALLの血液学的病期の判定補助装置］
以下に、当該コンピュータプログラムを実行させるために好適な装置（コンピュータ装置）の一形態を図面を参照して説明する。但し、本発明は当該実施形態に限定されるものではない。図１は被験者の血液学的病期の判定補助に用いる装置（以下、単に「判定補助装置」とも称する）の一例を示した概略図である。図１に示される判定補助装置１は、測定装置２と、当該測定装置２と接続されたコンピュータシステム３を含んでいる。この実施形態において、測定装置２は、被験者の生体試料におけるWT1 mRNA量及び／またはGAPDH mRNA量を測定する装置である。この測定装置２は、被験者の生体試料におけるWT1 mRNA量及び／またはGAPDH mRNA量そのもの、またはRT-PCR法等により増幅された各遺伝子増幅物に起因するの蛍光若しくは発光強度等のWT1 mRNA量及び／またはGAPDH RNA量に関係する情報を取得する。具体的には、被験者から採取された生体試料を測定装置２にセットすると、測定装置２は、当該生体試料におけるWT1 mRNA量及び／またはGAPDH RNA量に関連する情報を取得し、得られた情報をコンピュータシステム３に送信する。但し、本発明の判定補助装置において、上記の測定装置２は任意であり、本発明の判定補助装置はコンピュータシステム３からなるものであってもよい。
【０１４４】
コンピュータシステム３は、コンピュータ本体３ａと、キーボードやマウスからなる入力部３ｂと、被験者や被験試料等の情報や判定結果などを表示する表示部３ｃとを含む。コンピュータシステム３は、被験試料におけるWT1 mRNA量及び／またはGAPDH mRNA量に関する情報の入力を受ける。そして、コンピュータシステム３は、これらの情報に基づいて、被験者の小児ALLの血液学的病期を判定するプログラムを実行する。
【０１４５】
図２は、判定補助装置１のコンピュータ本体３ａのソフトウエアを機能ブロックで示すブロック図である。図２に示すように、コンピュータ本体３ａは、受信部３０１と、記憶部３０２と、算出部３０３と、判定部３０４と、出力部３０５とを備える。
【０１４６】
受信部３０１は、入力部３ｂを介して、小児ALLの血液学的病期判定の実施に必要な情報、具体的には、被験者や被験試料等の情報、または被験者の生体試料におけるWT1 mRNA量及び／またはGAPDH mRNA量等に関する情報を受信することができる。また受信部３０１は、任意の装置である前記測定装置２と、ネットワークを介して通信可能に接続することができ、測定装置２から送信された情報（例えば被験者や被験試料等の情報、または被験者の生体試料におけるWT1 mRNA量及び／またはGAPDH mRNA量等に関する情報等）を受信することができる。
【０１４７】
記憶部３０２は、判定に必要な基準値（正規化に必要な情報［例えば、健康成人の１μｇRNAあたりの平均GAPDH mRNA測定値］やカットオフ値など）及びWT1遺伝子の発現量を算出するための式や処理プログラムなど、本発明をコンピュータシステムで実行させるためのコンピュータプログラムを記憶する。算出部３０３は、受信部３０１で取得された情報を用い、記憶された式に従って、WT1 mRNA量とGAPDH mRNA量との比（WT1 mRNA量／GAPDH mRNA量）や指標値（WT1 mRNA発現量）等を算出する。判定部３０４は、受信部３０１によって取得されたか、または算出部３０３によって算出された指標値（WT1 mRNA発現量）が、記憶部３０２に記憶された基準値（カットオフ値）以上であるか、それ未満であるかを判定する。出力部３０５は、判定部３０４による判定結果を、被験者の小児ALLの血液学的病期の判定結果として表示部３ｃに出力する。なお、表示部３ｃは、制限されないものの、ブラウン管（CRT）、液晶ディスプレイ（LCD）、プラズマディスプレイ（PDP）、有機ELディスプレイ（OLED）からなるものであってもよい。
【０１４８】
図３は、図２に示すコンピュータ本体３ａのハードウェア構成を示すブロック図である。図３に示されるように、コンピュータ本体３ａは、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３０と、ＲＯＭ(Read Only Memory)３１と、ＲＡＭ３２と、補助記憶部３３と、入出力インターフェイス３４と、メディアインターフェイス３５と、通信インターフェイス３６と、画像出力インターフェイス３７とを備えている。ＣＰＵ３０、ＲＯＭ３１、ＲＡＭ(Random Access Memory)３２、補助記憶部３３、入出力インターフェイス３４、メディアインターフェイス３５、通信インターフェイス３６および画像出力インターフェイス３７は、バス３８によってデータ通信可能に接続されている。
【０１４９】
ＣＰＵ３０は、ＲＯＭ３１に記憶されているコンピュータプログラムおよびＲＡＭ３２にロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３０がコンピュータプログラムを実行し、取得されるデータの処理をすることにより、図２に示す各機能が実行される。これにより、コンピュータシステム３が、被験者について小児ALLの血液学的病期を判定するための装置として機能する。
【０１５０】
ＲＯＭ３１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３１には、前述のようにＣＰＵ３０によって実行されるコンピュータプログラムおよびこれに用いるデータが記録されている。
【０１５１】
ＲＡＭ３２は、ＳＲＡＭまたはＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ３２は、ＲＯＭ３１および補助記憶部３３に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ３２はまた、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３０の作業領域として利用される。
【０１５２】
補助記憶部３３は、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスクなどによって構成される。補助記憶部３３は、ＣＰＵ３０に実行させるためのオペレーティングシステムやアプリケーションプログラム等のコンピュータプログラム、および当該コンピュータプログラムの実行に用いる各種設定データが記憶されている。
【０１５３】
メディアインターフェイス３５は、記録媒体４０に記録されたコンピュータプログラム、データ、アプリケーションプログラムを読み出すことができる。読み出されたアプリケーションプログラム等は、ＲＡＭ３２又は補助記憶部３３に記憶される。またメディアインターフェイス３５は、ＣＰＵ３０が生成した情報を記録媒体４０に書き込む。メディアインターフェイス３５は、ＣＰＵ３０が生成し、補助記憶部３３に記憶された情報を記録媒体４０に書き込む。
【０１５４】
記録媒体４０は、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、またはＤＶＤ−ＲＯＭ等の可搬型記録媒体で構成されている。記録媒体４０は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、またはＤＶＤ−ＲＯＭドライブ等の読出装置によって、前記メディアインターフェイス３５と接続される。記録媒体４０にはコンピュータがオペレーションを実行するためのアプリケーションプログラム等が格納されていてもよい。
【０１５５】
入出力インターフェイス３４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３４には、タッチパネル、ペンタブレット、キーボード、マウス、マイクなどの入力部３ｂが接続されている。操作者は、当該入力部３ｂにより、コンピュータ本体３ａに各種の指令を入力することが可能である。また入出力インターフェイス３４は、ディスプレイやプリンタなどの出力部３０５に接続されており、ＣＰＵ３０が生成した情報、またはＣＰＵ３０が生成し、補助記憶部３３に記憶した情報を出力部３０５に出力する。
【０１５６】
通信インターフェイス３６は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイス、ネットワークインターフェースコントローラ等から構成されている。通信インターフェイス３６は、ＣＰＵ３０の制御下で、測定装置２又は他の外部機器からのデータを受信し、必要に応じてデータ処理部が保存又は生成する情報を、測定装置２または外部に送信又は表示する。通信インターフェイス３６は、ネットワークを介して測定装置２または他の外部機器と通信を行うこともできる。コンピュータ本体３ａは、通信インターフェイス３６により、プリンタなどへの印刷データの送信も可能である。
【０１５７】
画像出力インターフェイス３７は、前記表示部３ｃに接続されている。これにより、表示部３ｃは、ＣＰＵ３０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力することができる。表示部３ｃは、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
【０１５８】
［小児ALLの血液学的病期を判定するための判定補助装置の動作］
図４に記載するフローチャートを用いて、判定補助装置１による、被験者の小児ALLの血液学的病期判定の手順を説明する。ここでは、被験者由来の生体試料を用いて得られたWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量から指標値（WT1 mRNA発現量）を算出し、得られた指標値が基準値（カットオフ値）以上であるか否かの判断を行う場合を例として挙げて説明する。しかし、本発明は、この実施形態のみに限定されるものではない。
【０１５９】
ステップＳ１−１において、判定補助装置１の受信部３０１は、測定装置２から被験者の生体試料におけるWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量を取得する。またこのステップＳ１−１は、判定補助装置１の入力部３ｂから、被験者の生体試料におけるWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量の入力を受けることで、WT1 mRNA量とGAPDH mRNA量を取得してもよい。なお、受信部３０１へのWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量の入力は、同時に受けてもよいし、また別々に受けてもよい。
【０１６０】
次に、ステップＳ１−２において、算出部３０３は、上記ステップ１−１で取得した情報（WT1 mRNA量とGAPDH mRNA量）からWT1 mRNA量とGAPDH mRNA量との比（WT1 mRNA量／GAPDH mRNA量）を算出し、必要に応じて記憶部３０２に送信する。そして、ステップＳ１−３において、算出部３０３は、上記ステップＳ１−２で算出されたWT1 mRNA量／GAPDH mRNA量、並びに記憶部３０２に記憶されている健常成人の１μg  RNAあたりの平均GAPDH mRNA測定値に基づいて、判定補助に必要な指標値を算出する。
【０１６１】
その後、ステップＳ１−４において、判定部３０４は、記憶部３０２に記憶されている各種のカットオフ値（寛解期と未治療期との別を判定するためのカットオフ値、寛解期と治療後再発期との別を判定するためのカットオフ値、寛解期と治療不応期との別を判定するためのカットオフ値）の中から目的に応じて所望の（対象とする）カットオフ値を読み出し、これらとステップＳ１−３において取得した生体試料の指標値と対比して、当該指標値が前記カットオフ値以上であるか、それとも前記カットオフ値未満であるかを算出する。
【０１６２】
ステップＳ１−５〜Ｓ１−６において、前記ステップＳ１−４での算出結果に基づいて、被験者の血液学的病期について寛解期（非罹患）と非寛解期（未治療期、治療後再発期、治療不応期、罹患）の別が判定される。具体的には、被験者が小児ALL患者である場合、その患者の生体試料の指標値と、寛解期と未治療期との別を判定するためのカットオフ値とを対比して、当該指標値が前記カットオフ値以上である場合は未治療期であると判定され、カットオフ値未満である場合は寛解期であると判定される。また被験者が小児ALL患者である場合、その患者の生体試料の指標値と、寛解期と治療後再発期との別を判定するためのカットオフ値とを対比して、当該指標値が前記カットオフ値以上である場合は治療後再発期であると判定され、カットオフ値未満である場合は寛解期であると判定される。さらに被験者が小児ALL患者である場合、その患者の生体試料の指標値と、寛解期と治療不応期との別を判定するためのカットオフ値とを対比して、当該指標値が前記カットオフ値以上である場合は治療不応期であると判定され、カットオフ値未満である場合は寛解期であると判定される。また、被験者が疑小児ALL患者である場合、その患者の生体試料の指標値と、寛解期と未治療期との別を判定するためのカットオフ値とを対比して、当該指標値が前記カットオフ値以上である場合は、当該疑小児ALL患者は小児ALLに罹患していると判定され、カットオフ値未満である場合は小児ALLに罹患していないと判定される。
【０１６３】
ステップＳ１−７において、出力部３０５は、被験者の小児ALLの血液学的病期の判定結果を出力し、表示部３ｃに表示させる。これにより、判定補助装置１は、被験者が小児ALL患者である場合は、その小児ALLの血液学的病期が寛解期であるか非寛解期（未治療期、治療後再発期、治療不応期）であるかの別が、また被験者が疑小児ALL患者である場合は、その小児ALLに罹患しているか否か（罹患または非罹患）の別について判定することができ、その結果を、小児ALLの血液学病期の判定補助情報として医師などに提供することができる。
【０１６４】
（IV）コンピュータシステム
本発明には、被験者の小児ALLの血液学的病期判定の実施に適したコンピュータシステムも含まれる。当該システムは、プロセッサと、メモリ（記憶部３０２）とを含むコンピュータを備え、前記メモリには、以下のステップをコンピュータシステムで実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている。
（I）被験者の生体試料中のWT1 mRNA 量、及び前記同生体試料中のGAPDH mRNA 量の入力を受けるステップと
（II）前記(I)のステップで入力を受けたWT1 mRNA 量とGAPDH mRNA 量との比に基づいて、小児ALLの血液学的病期の判定を補助するために必要な指標値を算出するステップ。なお、上記（I）のステップはWT1 mRNA 量とGAPDH mRNA 量の入力を同時に受けるものであっても、別々に受けるものであってもよい。
【０１６５】
また前記コンピュータプログラムには、さらに下記（III）のステップを実行させるためのプログラムが記録されていてもよい：
（III）前記(II)のステップで得られた指標値に基づいて、被験者について、小児ALLの血液学的病期を決定するステップ。
【０１６６】
本実施形態によれば、上記（II）または（III）のステップで得られた結果に基づいて、被験者について小児ALLの血液学的病期を判定することができる。例えば、生体試料を提供した被験者が小児ALL患者である場合は、当該被験者の小児ALLの血液学的病期が、寛解期または未治療期であるかの鑑別、寛解期または治療後再発期であるかの鑑別、寛解期または治療不応期であるかの鑑別の判定結果を提供することができる。また生体試料を提供した被験者が疑小児ALL患者である場合は、当該被験者が小児ALLに罹患しているかまたは罹患していないかの判定結果を提供することができる。これらの判定結果を医師等に提供することによって、小児ALLの血液学病期についての医師等による診断を補助することができる。
【実施例】
【０１６７】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。但し、本発明はかかる実施例に特に制限されるものではない。【０１６８】
実施例１
ウイルムス腫瘍−１遺伝子（WT1）mRNAキットである「WT1 mRNA測定キットII『オーツカ』」（大塚製薬株式会社製）を用いて、小児ALL患者及びALLの疑いのある小児を対象として、末梢白血球及び骨髄液有核細胞より抽出したRNA中のWT1 mRNA量を測定した。当該キットは、RT-PCR用ミックス液、金属イオン溶液（酢酸マンガンなど）、WT1及びGAPDH混合溶液RNA標準液（WT1 RNA、GAPDH RNAなど）、及び標準液希釈液（緩衝剤等）等から構成されている。またRT-PCR用ミックス液には、表５に示すWT1フォワードプライマー、WT1リバースプライマー、WT1プローブ、GAPDHフォワードプライマー、GAPDH リバースプライマー、及びGAPDHプローブが含まれている。WT1プローブは5’末端がHEX（6-ヘキサクロロフルオレセイン）で標識されており、GAPDHプローブは5’末端がFAM（6-カルボキシフルオレセイン）で標識されている。またそれぞれのプローブの3’末端は消光色素であるATTO-540Q（ATTO-TEC GmbH社）で標識されている。【０１６９】
【表６】
2018016474.tif 000007
なお、RNAの抽出方法、抽出したRNA中のWT1 mRNAの量の測定及びその算出方法は、「WT1 mRNA測定キットII『オーツカ』」（大塚製薬株式会社製）の説明書（添付文書）の記載に従って行った。【０１７０】
（１）試験対象者
2014年12月から2015年12月末までに全国14の医療機関で実施された初発未治療の小児ALL患者及び小児ALLが疑われる小児患者のうち、本試験に対して同意が取得できた計49例を対象とした。但し、対象症例のうち、1例は、寛解導入療法終了前に他院に転院したため、寛解導入療法終了後及び早期強化療法終了後の2タイムポイントにおける検体が採取できなかった。なお、ALLが疑われる患者（疑ALL患者）で、後日、ALL以外の疾患とされた
ときは、治療開始前の1ポイントで試験を終了した。【０１７１】
（２）試験方法（フォローアップ試験：６ヶ月間）
治療開始から4〜6ヶ月間を観察期間として、下記のタイムポイントで骨髄液1mL及び末梢血7mLを採取し、これらの被験試料中のWT1 mRNAを測定した（図５参照）
（a）治療開始前（TP 0）
（b）寛解導入療法終了後（TP 1）
（c）早期強化療法終了後（TP 2）
（d）早期強化療法終了以降の骨髄検査時（診療目的で骨髄検査をする場合に限る）
解析対象症例49例のうち、解析対象とした検体の内訳を下記表７に示す。【０１７２】
【表７】
2018016474.tif 000008
（３）試験結果
（３−１）経過観察時のWT1 mRNA 発現量（指標値）の推移
対象とする49例のうち、試験途中で転院した１例を除く48例について、治療開始後４〜６ヶ月間に亘り１ヶ月毎に経過観察を行った。その結果、48例の全ての症例において、治療開始前（TP0）以外の経過観察ポイントは、すべて血液学的病期は寛解期であった。【０１７３】
48症例全ての経過観察期間中の末梢血及び骨髄液のWT1 mRNA 発現量の推移を図６に示す。【０１７４】
なお、末梢血及び骨髄液のWT1 mRNA 発現量は、下式に示すように、WT1 mRNA測定値（WT1 mRNA量）をGAPDH mRNA測定値（GAPDHmRNA量）で除した値（GAPDH mRNA１コピーあたりのWT1 mRNAコピー数）に、健康成人の１μgRNAあたりの平均GAPDH mRNAコピー数（GAPDH mRNA量＝GAPDH mRNA測定値）を乗じて算出した。なお、WT1 mRNAの測定は株式会社ビー・エム・エルに依頼した。【０１７５】
【数１】
2018016474.tif 000009
これまでに実施した成人ALL臨床性能試験によれば、寛解時のWT1 mRNA発現量は末梢血及び骨髄液のいずれも50copies/μgRNA未満であったが（カットオフ値：50copies/μgRNA）、小児ALL患者の場合、図２に示すように、寛解期であるにも関わらず、WT1 mRNA発現量は末梢血及び骨髄液のいずれも50copies/μgRNA未満にならない場合が多く（特に骨髄液のWT1 mRNA発現量）、成人ALL患者のカットオフ値とは異なる、少なくとも50copies/μgRNAより大きい値の新たなカットオフ値を設定する必要があることがわかった。【０１７６】
次に末梢血WT1 mRNA発現量の変動パターンに基づき、48症例を表８のようにＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの５群に分類した。 【０１７７】
【表８】
2018016474.tif 000010
また上記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの５群について、末梢血WT1 mRNA発現量及び骨髄液WT1 mRNA発現量の推移を図７のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥに示す。【０１７８】
５群のうち、Ａ，Ｂ及びＣの３群では、治療開始前に50 copies/μgRNA以上であった末梢血WT1 mRNA発現量が、経過観察のいずれかの時点で50 copies/μgRNA未満まで低下していた。この３群の合計症例数は34例であることから、全体の70.9％（34/48）の症例で寛解に伴い、治療開始前に50 copies/μgRNA以上であった末梢血WT1 mRNA発現量が50 copies/μgRNA未満まで低下することが示された。【０１７９】
（３−２）血液学的病期（未治療期及び寛解期）におけるWT1 mRNA発現量
小児ALL患者49例の解析対象検体である末梢血検体149検体及び骨髄液検体142検体を、それぞれ未治療期及び寛解期の２群に分け、WT1 mRNA 発現量を比較した。結果を図８及び表９に示す。【０１８０】
【表９】
2018016474.tif 000011
図８及び表９に示すように、小児ALL患者において、WT1 mRNA 発現量は末梢血及び骨髄液ともに寛解期は未治療期に比べ有意に低値を示していた（Student’s t-test，p<0.01）。しかしながら、両群のWT1 mRNA発現量の分布には重なりがあることから、寛解を判定する目安となるWT1 mRNA発現量のカットオフ値を、両群を対象としたROC（Receiver operationg character）解析により検討した。【０１８１】
ROC曲線の作成は定法に従って行い、特異度、感度ともに最も良い値をカットオフ値とした。ROC解析の結果を図９に示す。図９に示すように、ROC解析の結果、寛解判定のカットオフ値として、末梢血では220 copies/μgRNA、骨髄液では1,820 copies/μgRNAという値が求められた。末梢血でWT1 mRNA発現量220 copies/μgRNAをカットオフ値としたとき、感度は68.8%（33/48）であり、特異度は98.0%（99/101）であった。すなわち、寛解期の末梢血検体のうち、98.0%の検体が220 copies/μgRNA未満を示していた。同様に、骨髄液でWT1 mRNA発現量1,820 copies/μgRNAをカットオフ値としたとき、感度は58.1%（25/43）であり、特異度は98.0%（97/99）であった。すなわち、寛解期の骨髄液検体のうち、98.0%の検体が1,820 copies/μgRNA未満を示していた。【０１８２】
これまでに実施した成人ALL臨床性能試験試験において、成人については寛解時のWT1 mRNA発現量は50 copies/μgRNA未満であったが、上記の実験結果から、小児の場合は50 copies/μgRNA未満にならなくても寛解と判定することができる。【０１８３】
以上のことから、小児ALL患者について、寛解と判定できるWT1 mRNA発現量は、末梢血については220 copies/μgRNA未満、骨髄液については1,820 copies/μgRNA未満であり、いずれか少なくとも一方を充足する場合に寛解期に入ったと判断することができる。
【符号の説明】
【０１８４】
１      判定補助装置
２      測定装置
３      コンピュータシステム
３ａ    コンピュータ本体
３ｂ    入力部
３ｃ    表示部
３０    ＣＰＵ
３１    ＲＯＭ
３２    ＲＡＭ
３３    補助記憶部
３４    入出力インターフェイス
３５    メディアインターフェイス
３６    通信インターフェイス
３７    画像出力インターフェイス
３８    バス
４０    記録媒体
３０１  受信部
３０２  記憶部
３０３  算出部
３０４  判定部
３０５  出力部
【図１】
2018016474.tif 000012
【図２】
2018016474.tif 000013
【図３】
2018016474.tif 000014
【図４】
2018016474.tif 000015
【図５】
2018016474.tif 000016
【図６】
2018016474.tif 000017
【図７Ａ】
2018016474.tif 000018
【図７Ｂ】
2018016474.tif 000019
【図７Ｃ】
2018016474.tif 000020
【図７Ｄ】
2018016474.tif 000021
【図７Ｅ】
2018016474.tif 000022
【図８】
2018016474.tif 000023
【図９】
2018016474.tif 000024
【配列表】
2018016474000001.app
【国際調査報告】
2018016474.tif 000025
2018016474.tif 000026
2018016474.tif 000027
2018016474.tif 000028