(57)【要約】  顕微観察部（１０）において、移動部（１５）により光源部（１１）等を移動させつつ細胞培養プレート（１３）上の各測定位置のホログラムデータを取得する際に、測定時画像作成部（２４）は一つの測定位置についてのデータが得られる毎に原データ（光強度の２次元分布）に基づくホログラム画像を縮小したサムネイル画像を作成し、表示処理部（２５）は得られたサムネイル画像を貼り付けることで表示部（２７）に表示するプレート全体のホログラム画像を順次完成させる。測定実行中に測定者がホログラム画像を見て測定が適切でないと判断すると、測定停止ボタンを押して直ちに測定を中止させる。これにより、試料に異物が混入している等、測定の不具合がある場合に、全測定終了後にサーバでホログラムデータに基づく位相画像や強度画像が再構成されるよりも前に測定を中止させることができ、無駄な測定に時間を費やすことを回避することができる。
2018158947.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホログラフィック顕微鏡を利用した細胞観察装置であって、
a)コヒーレント光を出射する光源部と、
b)前記光源部からの出射光を細胞を含む試料に照射したときの物体波と参照波との干渉縞であるホログラムを取得する検出部と、
c)前記試料上の測定位置が移動するように前記光源部及び前記検出部と前記試料との一方又は両方を移動させる移動部と、
d)前記移動部により前記試料上の測定位置を移動させつつ所定の観察対象領域内の各測定位置におけるホログラムの取得を繰り返すように前記光源部、前記検出部、及び前記移動部を制御する測定制御部と、
e)前記測定制御部による制御の下で前記検出部で得られたホログラムデータに基づいて位相情報を算出するとともに該位相情報の２次元分布を示す画像を作成する再構成画像作成部と、
f)前記測定制御部による制御の下での測定実行中に、すでに測定が終了した測定位置について前記検出部で得られたホログラムデータに基づき前記観察対象領域の全体又はその一部の光強度分布を示すホログラム画像を作成する測定時画像作成部と、
g)前記測定時画像作成部で作成されたホログラム画像を表示部に表示する表示処理部と、
を備えることを特徴とする細胞観察装置。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞観察装置であって、
前記光源部は複数段階に波長を設定可能であり、
前記測定制御部は各測定位置において前記光源部の出射光の波長を複数段階に切り替えて各波長に対するホログラムを取得するように前記光源部、前記検出部、及び前記移動部を制御し、
前記再構成画像作成部は、同一測定位置に対して得られた互いに異なる複数の波長についてのホログラムデータを用いて位相情報を算出し、
前記測定時画像作成部は、各測定位置における任意の一つの波長についてのホログラムデータに基づき前記観察対象領域の全体又はその一部の光強度分布を示すホログラム画像を作成することを特徴とする細胞観察装置。
【請求項３】
請求項２に記載の細胞観察装置であって、
前記測定時画像作成部は、互いに異なる複数の波長のうち、最初に測定が実施される波長についてのホログラムデータに基づいてホログラム画像を作成することを特徴とする細胞観察装置。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞観察装置であって、
前記表示処理部は、前記測定時画像作成部で作成された前記観察対象領域の全体又はその一部のホログラム画像と、実行中である測定を停止する指示をユーザが行うための操作子と、を配置した画面を表示部に表示することを特徴とする細胞観察装置。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞観察装置であって、
前記測定制御部は、前記操作子が操作されたのに応じて、実行中である測定を中止することを特徴とする細胞観察装置。
【請求項６】
請求項１に記載の細胞観察装置であって、
前記表示部に表示するホログラム画像の範囲をユーザが指定する範囲指定部をさらに備え、
前記測定時画像作成部は、前記範囲指定部により指定された範囲についてのホログラム画像を作成することを特徴とする細胞観察装置。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞観察装置であって、
前記測定時画像作成部は、前記範囲指定部により指定された範囲の大きさに応じた観察倍率のホログラム画像を作成することを特徴とする細胞観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞の状態を観察する細胞観察装置に関し、さらに詳しくは、ホログラフィ顕微鏡により物体波と参照波との干渉縞を記録したホログラムを取得し、そのホログラムデータに基づいて位相情報や強度情報を算出したうえで位相画像や強度画像等を作成する細胞観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療分野では、近年、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞を用いた研究が盛んに行われている。一般に細胞は透明であって通常の光学顕微鏡では観察しにくいため、従来、細胞の観察には位相差顕微鏡が広く利用されている。しかしながら、位相差顕微鏡では顕微画像を撮影する際に焦点合わせを行う必要があるため、広い観察対象領域を細かく区画したそれぞれの小領域についての顕微画像を取得するような場合、測定に時間が掛かりすぎるという問題がある。これを解決するため、近年、デジタルホログラフィ技術を用いたデジタルホログラフィック顕微鏡が開発され実用に供されている（特許文献１、２等参照）。【０００３】
デジタルホログラフィック顕微鏡では、光源からの光が物体表面で反射又は透過してくる物体光と同一光源から直接到達する参照光とがイメージセンサ等の検出面で形成する干渉縞（ホログラム）を取得し、そのホログラムに基づいた光波の逆伝播演算処理等を実施することで位相情報や振幅（強度）情報を取得し、再構成画像として強度画像や位相画像を作成する。こうしたデジタルホログラフィック顕微鏡では、ホログラムを取得したあとの演算処理の段階で任意の距離における位相情報等を得ることができるため、撮影時にいちいち焦点合わせを行う必要がないという利点がある。【０００４】
デジタルホログラフィック顕微鏡には、インライン（in-line）型、オフアクシス（off-axis）型、位相シフト型などの方式がある。これら各方式では主として、ホログラムを取得するための光学系の構成が相違している。オフアクシス型では通常、レーザ光源から出射した光を参照光と物体に照射される照射光とに分割し、該照射光に対し物体を透過して来た物体光と参照光とを互いに異なる入射角で以てイメージセンサに入射させる。一方、インライン型では、レーザ光源から出射した光を分割せずに物体に照射し、物体を透過して来た物体光と物体を透過せずに該物体の近傍を通過した参照光とを共にイメージセンサに略垂直に入射させる。また、位相シフト型では、位相シフト干渉計を用い分割した参照光の光路長を複数段階に変化させることで、位相が複数段階に相違するホログラムを取得する。【０００５】
いずれの方式であってもデジタルホログラフィック顕微鏡では、取得したホログラムデータに基づいて光波の位相情報及び振幅情報を算出し、それを画像化する処理をコンピュータで行う必要がある。例えば特許文献１、非特許文献１等には、インライン型デジタルホログラフィック顕微鏡で取得される複数の波長光についてのホログラムに基づく光波伝播の反復計算による位相回復方法が提案されているが、こうした計算はかなり複雑で計算量も多い。【０００６】
培養中の生体細胞を観察するための細胞観察装置では、細胞培養プレート全体又は該プレートに形成されているウェル全体の広い範囲について各細胞が詳細に観察できる程度の高い解像度の画像を作成する必要がある。デジタルホログラフィック顕微鏡を用いた細胞観察装置で、こうした位相画像や強度画像を得るためには、観察対象領域（例えば細胞培養プレート全体）を細かく区切った多数の小領域についてそれぞれホログラムを取得し、そのホログラムに基づく演算処理を行って小領域毎の位相情報や振幅情報の２次元分布を求め、多数の小領域のそうした２次元分布を合成して観察対象領域についての画像を再構成する必要がある。【０００７】
上述したように、位相情報等の算出や画像の再構成処理の計算量はもともと多いため、多数の小領域毎にこうした計算を行う場合、その計算量はかなり膨大になる。そのため、或る程度性能の高いコンピュータを使用したとしても、測定を開始してから観察対象領域についての位相画像が再現されるまでには時間が掛かる。
本発明者らの検討によれば、例えば細胞培養プレート全体を８００個程度の小領域に分割し、各小領域についてそれぞれ高い解像度（例えば４０００×３０００画素／枚）で複数の波長についてのホログラムを取得する装置において、測定開始から位相画像の再構成処理が終了するまで１時間以上掛かる。即ち、測定開始時点から１時間以上の時間が経過したあとに、初めて観察対象である試料の位相画像や強度画像の観察が可能となる。【０００８】
観察対象である細胞培養プレート中に異物の混入などの不具合があったり、測定の失敗又は不手際があったりした場合、測定自体が無駄になるが、上述したようにそうした不具合が判明するのは測定開始時点からかなり時間が経過してからである。そのため、測定時間が無駄に費やされてしまうことになり、細胞の観察作業や解析作業の効率を低下させるという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際特許公開第２０１６／０８４４２０号
【特許文献２】特開平１０−２６８７４０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ペン・バオ（Peng Bao）、ほか３名、「レンズレス・フェーズ・マイクロスコピー・ユージング・フェーズ・リトライバル・ウィズ・マルチプル・イルミネーション・ウェーブレングス（Lensless phase microscopy using phase retrieval with multiple illumination wavelengths）」、アプライド・オプティクス（Applied Optics）、ジ・オプティカル・ソサイエティ・オブ・アメリカ（The Optical Society of America）、2012年、Vol. 51、No. 22、pp. 5486-5494
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、デジタルホログラフィック顕微鏡により取得されたホログラムに基づいて位相回復等の演算処理を行って細胞を含む試料についての位相画像や強度画像を再構成する細胞観察装置において、試料の不具合や測定の不手際などの発生をユーザが迅速に認識することで、不所望のデータの取得を回避することができる細胞観察装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために成された本発明は、デジタルホログラフィック顕微鏡を利用した細胞観察装置であって、
a)コヒーレント光を出射する光源部と、
b)前記光源部からの出射光を細胞を含む試料に照射したときの物体波と参照波との干渉縞であるホログラムを取得する検出部と、
c)前記試料上の測定位置が移動するように前記光源部及び前記検出部と前記試料との一方又は両方を移動させる移動部と、
d)前記移動部により前記試料上の測定位置を移動させつつ所定の観察対象領域内の各測定位置におけるホログラムの取得を繰り返すように前記光源部、前記検出部、及び前記移動部を制御する測定制御部と、
e)前記測定制御部による制御の下で前記検出部で得られたホログラムデータに基づいて位相情報を算出するとともに該位相情報の２次元分布を示す画像を作成する再構成画像作成部と、
f)前記測定制御部による制御の下での測定実行中に、すでに測定が終了した測定位置について前記検出部で得られたホログラムデータに基づき前記観察対象領域の全体又はその一部の光強度分布を示すホログラム画像を作成する測定時画像作成部と、
g)前記測定時画像作成部で作成されたホログラム画像を表示部に表示する表示処理部と、
を備えることを特徴としている。【００１３】
本発明に係る細胞観察装置では、典型的には、前記試料は細胞培養容器であり、前記ホログラフィック顕微鏡によるホログラムデータの取得が可能な最大の領域は前記細胞培養容器全体又はその一部の領域であるものとすることができる。上記細胞培養容器は、一又は複数のウェルが形成された細胞培養プレート、シャーレ、大量培養を目的とした培養フラスコなどである。したがって、本発明に係る細胞観察装置は、こうした細胞培養容器において培養中である生体細胞を観察するのに好適な装置である。【００１４】
本発明に係る細胞観察装置において、移動部は例えば、その位置が固定された細胞培養プレートに対して光源部及び検出部を一体に移動させることで、該細胞培養プレート上で光源部から出射したコヒーレント光が照射される測定位置が変化するものとすることができる。測定制御部は該移動部により例えば光源部及び検出部をステップ状に移動させつつ、細胞培養プレート内の一つの測定位置にコヒーレント光を照射し、それにより検出部の検出面上に形成されるホログラムによる光強度の２次元分布を示すデータ（ホログラムデータ）を取得する、という動作を繰り返す。【００１５】
再構成画像作成部は、検出部で得られたホログラムデータに基づいて位相情報を算出する演算を行うが、それとは別に、測定時画像作成部は、測定の実行中に、すでに測定が終了した測定位置について得られたホログラムデータに基づき、観察対象領域の全体又はその一部の領域の光強度分布を示すホログラム画像を作成する。測定の進行に伴って一つの測定位置についてのホログラムデータが新たに得られる毎に、測定時画像作成部は、観察対象領域の全体又はその一部の光強度分布を示すホログラム画像を更新する。即ち、このホログラム画像は測定の進行に伴ってほぼリアルタイムで更新される。【００１６】
測定時画像作成部で作成されるホログラム画像はホログラムに対応する光強度の２次元分布であるので、透明であって高さも低い生体細胞については十分に可視化されないが、或る程度の大きさの異物や大きな段差があるウェルの縁部などについては十分に識別可能な画像が得られる。そのため、ユーザ（測定者）は測定実行中に表示部に表示されるホログラム画像を確認することで、細胞以外の異物の混入や測定の不適切性などを把握することができる。それにより、測定の続行が不要であるとユーザが判断したときには、測定を途中で停止させて無駄な測定を実行することを回避することができる。【００１７】
本発明に係る細胞観察装置において、インライン型、オフアクシス型、位相シフト型などのデジタルホログラフィック顕微鏡の方式は問わないが、光学系の構成が簡素であって試料と光源部との距離を複数段階に変化させる必要がないために駆動機構も簡素になるという点で、複数の波長におけるホログラムを利用するインライン型の構成が望ましい。【００１８】
この場合、本発明に係る細胞観察装置において、好ましくは、
前記光源部は複数段階に波長を設定可能であり、
前記測定制御部は各測定位置において前記光源部の出射光の波長を複数段階に切り替えて各波長に対するホログラムを取得するように前記光源部、前記検出部、及び前記移動部を制御し、
前記再構成画像作成部は、同一測定位置に対して得られた互いに異なる複数の波長についてのホログラムデータを用いて位相情報を算出し、
前記測定時画像作成部は、各測定位置における任意の一つの波長についてのホログラムデータに基づき前記観察対象領域の全体又はその一部の光強度分布を示すホログラム画像を作成する構成とすることができる。【００１９】
この構成では、光源部の出射光の波長が複数段階に切り替えられるとき、その複数の波長のいずれについてのホログラムデータに基づいてホログラム画像を作成しても構わない。ただし、測定が終了した測定位置におけるホログラム画像を少しでも早く描出するという点からは、前記測定時画像作成部は、互いに異なる複数の波長のうち、最初に測定が実施される波長についてのホログラムデータに基づいてホログラム画像を作成するよい。【００２０】
一方、光源部での出射光の波長切替えの不具合をホログラム画像から把握するためには、互いに異なる複数の波長のうちの最初に測定が実施される波長についてのホログラムデータに基づいてホログラム画像を作成するのではなく、少なくとも１回以上切り替えられたあとの波長についてのホログラムデータに基づいてホログラム画像を作成するとよい。或いは、必ずしも各測定位置における同じ波長についてのホログラムデータに基づいて全体のホログラム画像を作成する必要はなく、測定位置毎に異なる波長についてのホログラムデータに基づいて全体のホログラム画像を作成してもよい。【００２１】
また本発明に係る細胞観察装置において、好ましくは、
前記表示処理部は、前記測定時画像作成部で作成された前記観察対象領域の全体又はその一部のホログラム画像と、実行中である測定を停止する指示をユーザが行うための操作子と、を配置した画面を表示部に表示する構成とするとよい。【００２２】
この構成の細胞観察装置では、前記測定制御部は、前記操作子が操作されたのに応じて、実行中である測定を中止する構成とするとよい。上記操作子としては例えばＧＵＩ部品の一つであるボタンを用いることができる。【００２３】
この構成では、ユーザ（測定者）は測定の実行中に表示部にほぼリアルタイムで表示されるホログラム画像を見ながら、例えば細胞以外の異物の混入がないか、或いは測定が適切に行われているか等を判断し、測定を中止したほうがよいと判断したならば、直ぐに操作子を操作して測定の中止を指示することができる。これにより、簡単な操作で迅速に測定を中止することができる。【００２４】
また本発明に係る細胞観察装置において、
前記表示部に表示するホログラム画像の範囲をユーザが指定する範囲指定部をさらに備え、
前記測定時画像作成部は、前記範囲指定部により指定された範囲についてのホログラム画像を作成する構成としてもよい。【００２５】
通常、或る一つの測定位置についてのホログラムを取得する際には最も高い解像度でデータの取得が行われるが、観察対象領域全体等のホログラム画像を作成して表示する際には、その画像の大きさや表示部の画面画素数などに応じて画像の解像度を落とす必要がある。この解像度を下げる処理は測定位置毎に行う必要があるため、表示部に表示するホログラム画像の範囲が狭いほど、つまりその範囲に含まれる測定位置が少ないほど、処理の負担が軽くなる。上記構成によれば、ユーザが範囲指定部により確認したい範囲を絞ることができるので、それによって測定時画像作成部は不要な処理を行う必要がなくなり、計算の負荷が軽減される。【００２６】
また、この場合、前記測定時画像作成部は、前記範囲指定部により指定された範囲の大きさに応じた観察倍率のホログラム画像を作成するようにしてもよい。【００２７】
これにより、ユーザは小さな異物等の存在も確認し易くなり、測定を中止すべきか否かの判断をより的確に行うことができる。【００２８】
なお、本発明に係る細胞観察装置において、再構成画像作成部と測定時画像作成部とは同じコンピュータや同一筐体に収容されたハードウェア回路でそれら機能を実現するように構成してもよいが、別々のコンピュータ又は全く別体であるハードウェア回路でそれぞれの機能を実現するように構成してもよい。具体的には例えば、複雑な計算が必要である再構成画像作成部の機能は、測定を担うデジタルホログラフィック顕微鏡本体を制御するパーソナルコンピュータと通信ネットワークを介して接続されるサーバ（高性能なコンピュータ）で実現するようにし、測定時画像作成部の機能はそのパーソナルコンピュータで実現するようにしてもよい。
【発明の効果】
【００２９】
本発明に係る細胞観察装置によれば、測定によって取得されたホログラムデータに基づく複雑な計算の結果作成される位相画像や強度画像が表示されるのを待つことなく、測定の実行中に、ユーザ（測定者）は試料の不具合や測定の不手際などの発生の有無をほぼリアルタイムで表示されるホログラム画像において確認することができる。それによって、そうした不具合が発生したときに迅速に測定を中止させ、測定時間が無駄に費やされることを回避することができる。その結果、効率のよい細胞観察の作業が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の一実施例である細胞観察装置の全体構成図。
【図２】本実施例の細胞観察装置における測定用端末の概略構成図。
【図３】本実施例の細胞観察装置における画像再構成処理を説明するための概念図。
【図４】本実施例の細胞観察装置における測定時の測定位置走査の説明図。
【図５】本実施例の細胞観察装置における測定時の波長切替えタイミングの説明図。
【図６】本実施例の細胞観察装置におけるリアルタイム画像表示画面の一例を示す模式図。
【図７】本実施例の細胞観察装置におけるリアルタイム画像表示画面の他の表示例を示す模式図。
【図８】本実施例の細胞観察装置においてリアルタイム画像表示画面に表示される表示画像の実例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明に係る細胞観察装置の一実施例について、添付図面を参照して説明する。
図１は本実施例の細胞観察装置の全体構成図、図２は本実施例の細胞観察装置における測定用端末の概略構成図である。
【００３２】
本実施例の細胞観察装置は、インターネット、イントラネットなどの通信ネットワーク７を介して接続された測定用端末１と、閲覧用端末３と、サーバ５と、を含む。図１には、測定用端末１及び閲覧用端末３をそれぞれ２台ずつ記載しているが、これらはそれぞれ適宜の数だけ設けることができる。
【００３３】
サーバ５は高性能なコンピュータであり、該コンピュータにインストールされている専用のソフトウェアにより具現化される機能ブロックとして、データ送受信部５１、測定データ記憶部５２、位相回復演算部５３、画像再構成部５４、画像データ記憶部５５等を備える。
【００３４】
測定用端末１は顕微観察部１０と制御・処理部２０とから成る。本実施例の細胞観察装置では、顕微観察部１０はインライン型デジタルホログラフィック顕微鏡であり、図２に示すように、レーザダイオード等を含む光源部１１とイメージセンサ１２とを備え、光源部１１とイメージセンサ１２との間に、観察対象物である細胞１４を含む細胞培養プレート１３が配置される。光源部１１及びイメージセンサ１２は例えばモータ等の駆動源を含む移動部１５により、互いに直交するＸ軸、Ｙ軸の二軸方向に一体に移動自在である。
【００３５】
なお、図２では図面が煩雑になるのを避けるために、光源部１１とイメージセンサ１２とを一つずつ、つまり一組しか記載していないが、実際には、光源部１１とイメージセンサ１２とは一枚の細胞培養プレート１３を挟んで四組設けられており、後述するように、その四組の光源部１１とイメージセンサ１２とにより一枚の細胞培養プレート１３の異なる測定位置についてのホログラムの取得が可能となっている。
【００３６】
制御・処理部２０の実体は顕微観察部１０の動作を制御するとともに顕微観察部１０で取得されたデータを処理するパーソナルコンピュータ（ＰＣ）であり、該ＰＣにインストールされた専用のソフトウェアにより具現化される機能ブロックとして、撮影制御部２１、測定データ記憶部２２、データ送受信部２３、測定時画像作成部２４、表示処理部２５等を備える。また、制御・処理部２０には、キーボードやマウス等のポインティングデバイスである入力部２６と、表示部２７と、が接続されている。
【００３７】
閲覧用端末３は測定用端末１における制御・処理部２０と同様に、その実体は一般的なＰＣである。そして、該ＰＣにインストールされた専用のソフトウェアにより、サーバ５からデータを受領し、該データに基づいて形成される適宜の画像（後述する位相画像や強度画像など）を表示することが可能である。
【００３８】
次に、本実施例の細胞解析装置におけるホログラムデータ取得の際の動作について図３〜図５を参照して説明する。
図３は本実施例の細胞観察装置における画像再構成処理を説明するための概念図、図４は本実施例の細胞観察装置における測定時の測定位置走査の説明図、図５は本実施例の細胞観察装置における出射光の波長切替えタイミングの説明図である。
【００３９】
図３（ａ）は本実施例の細胞観察装置において使用される細胞培養プレート１３の概略上面図である。細胞培養プレート１３には六個の上面視円形状のウェル１３ａが形成されており、その各ウェル１３ａ内で細胞が培養される。ここでは、この一つの細胞培養プレート１３全体、つまりは六個のウェル１３ａを含む矩形状の範囲全体が観察対象領域である。上述したように、顕微観察部１０は四組の光源部１１及びイメージセンサ１２を備えており、各組の光源部１１及びイメージセンサ１２はそれぞれ、細胞培養プレート１３全体を４等分した四つの４分割範囲８１のホログラムデータの収集を担う。つまり、四組の光源部１１及びイメージセンサ１２が細胞培養プレート１３全体に亘るホログラムデータの収集を分担している。
【００４０】
一組の光源部１１及びイメージセンサ１２が１回に測定可能である範囲は、図２（ｂ）及び（ｃ）に示すように、４分割範囲８１の中の１個のウェル１３ａを含む略正方形状の範囲８２をＸ軸方向に１０等分、Ｙ軸方向に１２等分して得られる一つの撮像単位８３に相当する範囲である。一つの４分割範囲８１は１５×１２＝１８０個の撮像単位８３を含む。この一つの撮像単位８３が本発明における「測定位置」である。四つの光源部１１と四つのイメージセンサ１２はそれぞれ光源部１１及びイメージセンサ１２を含むＸ−Ｙ面内で、４分割範囲８１と同じ大きさの矩形の四つの頂点付近にそれぞれ配置されおり、細胞培養プレート１３上の異なる四つの撮像単位８３についてのホログラムの取得を同時に行う。
【００４１】
細胞培養プレート１３についてのデータ収集に際し、観察者はまず、観察対象である細胞（多能性細胞）１４が培養されている細胞培養プレート１３を顕微観察部１０の所定位置にセットし、該細胞培養プレート１３を特定する識別番号や測定日時などの情報を入力部２６から入力したうえで測定実行を指示する。この測定指示を受けて撮影制御部２１は、顕微観察部１０の各部を制御して測定を開始する。
【００４２】
即ち、撮影制御部２１による制御の下で一つの光源部１１は、１０°程度の微小角度の広がりを持つコヒーレント光を細胞培養プレート１３の所定の領域（一つの撮像単位８３）に照射する。細胞培養プレート１３及び細胞１４を透過したコヒーレント光（物体光１７）は、細胞培養プレート１３上で細胞１４に近接する領域を透過した光（参照光１６）と干渉しつつイメージセンサ１２に到達する。物体光１７は細胞１４を透過する際に位相が変化した光であり、他方、参照光１６は細胞１４を透過しないので該細胞１４に起因する位相変化を受けない光である。したがって、イメージセンサ１２の検出面（像面）上には、細胞１４により位相が変化した物体光１７と位相が変化していない参照光１６との干渉像、つまりホログラムがそれぞれ形成され、このホログラムに対応する２次元的な光強度分布データ（ホログラムデータ）がイメージセンサ１２から出力される。
【００４３】
上述したように、四つの光源部１１からは略同時に細胞培養プレート１３に向けてコヒーレント光が出射され、四つのイメージセンサ１２では細胞培養プレート１３上の異なる撮像単位８３に対応する領域のホログラムデータが取得される。一つの測定位置での測定が終了する毎に、光源部１１及びイメージセンサ１２は移動部１５により、Ｘ−Ｙ面内で一つの撮像単位８３に相当する距離だけＸ軸方向、Ｙ軸方向にステップ状に移動される。例えば図４に示すように、一つの４分割範囲８１において一番目の撮像単位８３ａからＸ軸方向に順に測定位置が移動し、最終的には最後の撮像単位８３ｂでの測定が行われるように、或る一組の光源部１１及びイメージセンサ１２は細胞培養プレート１３に対して順次移動される。これにより、４分割範囲８１に含まれる１８０個の撮像単位８３での測定が実施され、四組の光源部１１及びイメージセンサ１２全体で細胞培養プレート１３全体の測定が実際されることになる。
【００４４】
また本実施例の細胞観察装置では、サーバ５で位相情報を復元する演算を行うために、同じ物体についてつまりは一つの撮像単位８３について、複数（ここでは四つ）の異なる波長の光についてのホログラムを取得する。そこで、細胞培養プレート１３上で一つの撮像単位８３に対応する領域についての測定を行う際に、光源部１１から出射されるコヒーレント光の波長を予め定めた四つの段階に順次切り替え、その各波長光に対してそれぞれホログラムデータを収集する。具体的には、図５に示すように、一つの測定位置において、出射光の波長をＡ→Ｂ→Ｃ→Ｄと順に切り替え、各波長についてそれぞれホログラムデータを取得したならば、移動部１５により次の測定位置まで光源部１１及びイメージセンサ１２を移動させる。
このようにして、顕微観察部１０では、細胞培養プレート１３上の７２０個の撮像単位８３に対応する領域について、それぞれ四つの波長（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）に関するホログラムデータを漏れなく得ることができる。
【００４５】
上述したように顕微観察部１０の四つのイメージセンサ１２で得られたホログラムデータは、制御・処理部２において測定データ記憶部２２に一旦格納される。データ送受信部２３は、測定データ記憶部２２に格納されたホログラムデータを測定日時等の属性情報とともに、逐次、通信ネットワーク７を介してサーバ５に転送する。複数の測定用端末１は同時に稼働可能であり、各測定用端末１で収集されたホログラムデータは通信ネットワーク７を介して１台のサーバ５に集約される。なお、各測定用端末１からサーバ５へは生の、つまりは加工されていないホログラムデータを送ればよいが、必要に応じて、各測定用端末１に固有の誤差要因を補正するような加工処理を施したホログラムデータをサーバ５へ送るようにしてもよい。
【００４６】
サーバ５においてデータ送受信部５１は各測定用端末１から送られて来たホログラムデータを受け取り、測定用端末１を特定するための識別情報、撮影時に入力された細胞培養プレートの識別情報や測定日時などの属性情報とともにホログラムデータを測定データ記憶部５２に蓄積する。このようにしてデータを収集しつつ又は収集したあと、位相回復演算部５３は測定データ記憶部５２からホログラムデータを適宜読み出し、光波の伝播計算処理を行うことで位相情報を復元するとともに振幅情報を求める。位相情報や振幅情報の空間分布は撮像単位８３毎に求まるから、全ての撮像単位８３の位相情報や振幅情報が得られたならば、画像再構成部５４は、その位相情報や振幅情報に基づいて、観察対象領域全体の位相画像や強度画像を形成する。
【００４７】
具体的に画像再構成部５４は、撮像単位８３毎に算出された位相情報の空間分布に基づき各撮像単位８３の位相画像を再構成し、その狭い範囲の位相画像を繋ぎ合わせるタイリング処理（図２（ｄ）参照）を行うことで、観察対象領域つまりは細胞培養プレート１３全体についての位相画像を形成する。もちろん、タイリング処理の際には撮像単位８３の境界での位相画像が滑らか繋がるように適宜の補正処理を行うとよい。なお、こうした位相情報の算出や画像の再構成の際には、特許文献１、２等の既知の文献に開示されているアルゴリズムを利用すればよい。また、通常の処理で得られる再構成画像は取得されたホログラムデータにより原理的に求まる最高解像度の画像であるが、それだけでなく、その最高解像度の位相画像を元に、ビニング処理等により解像度を落とした複数段階の解像度（倍率）の位相画像を作成するようにしてもよい。そして、こうして作成した位相画像を構成する画像データを画像データ記憶部５５に格納する。
【００４８】
サーバ５の性能にも依るが、位相回復演算部５３や画像再構成部５４における処理は複雑で時間が掛かる。そのため、たとえ測定用端末１側で全ての測定が終了しても、直ちにその測定結果に基づく位相画像や強度画像を閲覧することはできない。そのため、例えばウェル１３ａ中に異物が混入しているような場合に、そのことを位相画像や強度画像で測定者が把握するのは時間的にあとである。そこで、本実施例の細胞観察装置では、以下のようにして、測定実行中に異物の混入や測定の不具合を迅速に把握することができるようにしている。
【００４９】
測定実行前に測定者が入力部２６で所定の操作を行うと、表示処理部２５は、図６に示すようなリアルタイム画像表示画面１００を表示部２７に表示する。このリアルタイム画像表示画面１００には、画像表示欄１０１と情報表示欄１０２とが配置されており、さらに右下には、「停止」ボタンが配置されている。情報表示欄１０２には、測定中（又は測定しようとしている）細胞培養プレート１３の名称（プレート名）や識別番号（プレートＩＤ）などの属性情報が表示される。ただし、図６に示したのは測定実行中のリアルタイム画像表示画面１００であるため画像表示欄１０１に実質的な画像が表示されているが、測定の開始前には画像表示欄１０１には実質的な画像は何も表示されていない。
【００５０】
測定が開始されて上述したように細胞培養プレート１３上での各撮像単位８３に対応する領域についての複数波長のホログラムデータが得られると、該データは測定データ記憶部２２に格納されるが、測定時画像作成部２４はこれと並行して、一つの撮像単位８３に対応する領域についての最初の波長の、つまりは波長Ａに関するホログラムデータが得られると、そのデータに基づいて光強度の２次元分布を示すホログラム画像を作成する。このときに作成されるホログラム画像の大きさ、つまり解像度は画像表示欄１０１に表示される画像の範囲に依存する。図６に示した例は、画像表示欄１０１に細胞培養プレート１３全体のホログラム画像を表示する場合であり、このとき一つの撮像単位８３に対応するホログラム画像は最小になる。つまり、このとき、測定時画像作成部２４は、一つの撮像単位８３に対応する領域から得られるホログラムデータに基づいて、光強度の２次元分布を示す解像度が最低であるサムネイル画像を作成する。そして、表示処理部２５は作成されたホログラム画像のサムネイル画像を、リアルタイム画像表示画面１００中の画像表示欄１０１内の所定領域に貼り付けて表示する。
【００５１】
測定時画像作成部２４は、測定によって得られた光強度の２次元分布の解像度を落とす以外の画像処理を実質的に行うことなくホログラム画像を縮小したサムネイル画像を作成し、表示処理部２５はその画像をそのまま表示する。したがって、或る波長に関するホログラムデータが得られると、殆ど時間遅れなく（つまりはほぼリアルタイムで）そのデータに基づくホログラム画像が表示部２７に表示される。そして、次の撮像単位８３に相当する領域についての波長Ａに関するホログラムデータが新たに取得され、そのデータに基づくホログラム画像を縮小したサムネイル画像が作成されると、表示部２７の画面上ではそのサムネイル画像が表示上に追加される。図６では、こうしてすでに表示されているサムネイル画像を符号１０１ａで、測定中又は画像作成中であるサムネイル画像の位置を符号１０１ｂで、未だ測定が実施されていないサムネイル画像の位置を符号１０１ｃで示している。
【００５２】
図８はリアルタイム画像表示画面１００に表示される表示画像の実例を示す図である。この図から分かるように、画像表示欄１０１に表示されるホログラム画像はホログラムデータそのものであるものの、ウェル１３ａの縁部の段差や細胞に比べれば十分に高さがありしかも透明ではない異物などは明瞭に描出される。また、一部の光源部１１が出射光を発していない、一部のイメージセンサ１２の画素が損傷しているといった装置の不具合や測定上の不手際の多くも、それに起因する現象が画像に現れる。そこで、測定の実行中に測定者は画像表示欄１０１に表示されるホログラム画像を監視し、何らかの問題があると判断できる場合には、入力部２６で「停止」ボタン１０３をクリック操作する。すると、撮影制御部２１はこの操作を受けて測定を停止する。このように、測定に何らかの問題がある場合に測定を速やかに停止させることで、残りの無駄な測定に時間を費やすことを回避することができる。また、例えば異物の混入が疑われる場合に、測定者は速やかに細胞培養プレート１３を調べ、その原因を究明したり測定をやり直したりすることができる。
【００５３】
図６は、細胞培養プレート１３全体のホログラム画像を画像表示欄１０１に表示した例であるが、そのうちの一部を選択的に画像表示欄１０１に表示させることもできる。図７は一つの４分割範囲８１に対応するホログラム画像を画像表示欄１０１に表示させるようにした例である。このように、測定者が確認したい部分のみを拡大して表示させることで、例えば小さな異物なども見つけ易くなる。また、画像表示欄１０１上に表示すべき撮像単位８３に対応する領域の数が少なくて済むので、上述したようにホログラムデータに基づいて解像度を落としたサムネイル画像を作成する際に、その解像度を落とす画像処理を行う対象を減らすことができる。それによって、コンピュータのＣＰＵの負荷を減らすことができ、画像表示などの一層の迅速化を図ることができる。
【００５４】
なお、上記実施例において顕微観察部１０はインライン型デジタルホログラフィック顕微鏡であるが、顕微観察部１０は観察対象領域中の測定位置毎にホログラムを取得するものであればよいので、インライン型に限らず、オフアクシス型や位相シフト型のデジタルホログラフィック顕微鏡であってもよい。また、光源部１１からの出射光の波長を切り替えることで複数のホログラムを取得するものに限らず、例えば細胞培養プレートをＸ軸、Ｙ軸に共に直交するＺ軸方向に複数段階に移動させて複数のホログラムを取得するものにも本発明を適用することができる。
【００５５】
また、上記実施例では、測定用端末１と通信ネットワーク７を介して接続されたサーバ５において位相回復等の演算処理を実施していたが、スタンドアロン型の装置で全ての処理を実施する構成としてもよいことは当然である。
【００５６】
さらにまた、上記実施例及び上記記載の変形例はいずれも本発明の一例であり、本発明の趣旨の範囲でさらに適宜の変更、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００５７】
１…測定用端末
１０…顕微観察部
１１…光源部
１２…イメージセンサ
１３…細胞培養プレート
１３ａ…ウェル
１４…細胞
１５…移動部
１６…参照光
１７…物体光
２…制御・処理部
２０…制御・処理部
２１…撮影制御部
２２…測定データ記憶部
２３…データ送受信部
２４…測定時画像作成部
２５…表示処理部
２６…入力部
２７…表示部
３…閲覧用端末
５…サーバ
５１…データ送受信部
５２…測定データ記憶部
５３…位相回復演算部
５４…画像再構成部
５５…画像データ記憶部
７…通信ネットワーク
１００…リアルタイム画像表示画面
１０１…画像表示欄
１０２…情報表示欄
１０３…「停止」ボタン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月9日(2019.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホログラフィック顕微鏡を利用した細胞観察装置であって、
a)コヒーレント光を出射する光源部と、
b)前記光源部からの出射光を細胞を含む試料に照射したときの物体波と参照波との干渉縞であるホログラムを取得する検出部と、
c)前記試料上の測定位置が移動するように前記光源部及び前記検出部と前記試料との一方又は両方を移動させる移動部と、
d)前記移動部により前記試料上の測定位置を移動させつつ所定の観察対象領域内の各測定位置におけるホログラムの取得を繰り返すように前記光源部、前記検出部、及び前記移動部を制御する測定制御部と、
e)前記測定制御部による制御の下で前記検出部で得られたホログラムデータに基づいて位相情報を算出するとともに該位相情報の２次元分布を示す画像を作成する再構成画像作成部と、
f)前記測定制御部による制御の下での測定実行中に、すでに測定が終了した測定位置について前記検出部で得られたホログラムデータに基づき、後記範囲指定部により指定された範囲についての光強度分布を示すホログラム画像をリアルタイムに作成する測定時画像作成部と、
g)前記観察対象領域中で表示部に表示するホログラム画像の範囲をユーザに指定させる範囲指定部と、
h)前記測定制御部による制御の下での測定実行中に、前記測定時画像作成部でリアルタイムに作成されたホログラム画像を前記表示部に表示する表示処理部と、
を備えることを特徴とする細胞観察装置。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞観察装置であって、
前記光源部は複数段階に波長を設定可能であり、
前記測定制御部は各測定位置において前記光源部の出射光の波長を複数段階に切り替えて各波長に対するホログラムを取得するように前記光源部、前記検出部、及び前記移動部を制御し、
前記再構成画像作成部は、同一測定位置に対して得られた互いに異なる複数の波長についてのホログラムデータを用いて位相情報を算出し、
前記測定時画像作成部は、各測定位置における任意の一つの波長についてのホログラムデータに基づきホログラム画像を作成することを特徴とする細胞観察装置。
【請求項３】
請求項２に記載の細胞観察装置であって、
前記測定時画像作成部は、互いに異なる複数の波長のうち、最初に測定が実施される波長についてのホログラムデータに基づいてホログラム画像を作成することを特徴とする細胞観察装置。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞観察装置であって、
前記表示処理部は、前記測定時画像作成部で作成されたホログラム画像と、実行中である測定を停止する指示をユーザが行うための操作子と、を配置した画面を表示部に表示することを特徴とする細胞観察装置。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞観察装置であって、
前記測定制御部は、前記操作子が操作されたのに応じて、実行中である測定を中止することを特徴とする細胞観察装置。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞観察装置であって、
前記測定時画像作成部は、前記範囲指定部により指定された範囲の大きさに応じた観察倍率のホログラム画像を作成することを特徴とする細胞観察装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
上記課題を解決するために成された本発明は、ホログラフィック顕微鏡を利用した細胞観察装置であって、
a)コヒーレント光を出射する光源部と、
b)前記光源部からの出射光を細胞を含む試料に照射したときの物体波と参照波との干渉縞であるホログラムを取得する検出部と、
c)前記試料上の測定位置が移動するように前記光源部及び前記検出部と前記試料との一方又は両方を移動させる移動部と、
d)前記移動部により前記試料上の測定位置を移動させつつ所定の観察対象領域内の各測定位置におけるホログラムの取得を繰り返すように前記光源部、前記検出部、及び前記移動部を制御する測定制御部と、
e)前記測定制御部による制御の下で前記検出部で得られたホログラムデータに基づいて位相情報を算出するとともに該位相情報の２次元分布を示す画像を作成する再構成画像作成部と、
f)前記測定制御部による制御の下での測定実行中に、すでに測定が終了した測定位置について前記検出部で得られたホログラムデータに基づき、後記範囲指定部により指定された範囲についての光強度分布を示すホログラム画像をリアルタイムに作成する測定時画像作成部と、
g)前記観察対象領域中で表示部に表示するホログラム画像の範囲をユーザに指定させる範囲指定部と、
h)前記測定制御部による制御の下での測定実行中に、前記測定時画像作成部でリアルタイムに作成されたホログラム画像を前記表示部に表示する表示処理部と、
を備えることを特徴としている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
通常、或る一つの測定位置についてのホログラムを取得する際には最も高い解像度でデータの取得が行われるが、観察対象領域全体等のホログラム画像を作成して表示する際には、その画像の大きさや表示部の画面画素数などに応じて画像の解像度を落とす必要がある。この解像度を下げる処理は測定位置毎に行う必要があるため、表示部に表示するホログラム画像の範囲が狭いほど、つまりその範囲に含まれる測定位置が少ないほど、処理の負担が軽くなる。本発明に係る細胞観察装置によれば、ユーザが範囲指定部により確認したい範囲を絞ることができるので、それによって測定時画像作成部は不要な処理を行う必要がなくなり、計算の負荷が軽減される。
【国際調査報告】
2018158947.tif 000011
2018158947.tif 000012
2018158947.tif 000013
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