(57)【要約】  新たな敗血症の診断に有用なバイオマーカーを開発し、診断薬及び診断手法の提供。  敗血症診断の目的で、血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα−２−グリコプロテインから選ばれる成分の測定法。
2018088455.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
敗血症診断の目的で、血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα−２−グリコプロテインから選ばれる成分の測定法。
【請求項２】
血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα−２−グリコプロテインから選ばれる成分の濃度又は活性が、健常者又は非敗血症腎傷害患者に比べて有意に高い場合に敗血症と診断する請求項１記載の測定法。
【請求項３】
急性腎傷害患者における敗血症診断の目的である請求項１又は２記載の測定法。
【請求項４】
血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα−２−グリコプロテインから選ばれる成分を測定することを特徴とする敗血症の診断方法。
【請求項５】
血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα−２−グリコプロテインから選ばれる成分の濃度又は活性が、健常者又は非敗血症腎傷害患者に比べて有意に高い場合に敗血症と診断する請求項４記載の診断方法。
【請求項６】
急性腎傷害患者における敗血症の診断である請求項４又は５記載の診断方法。
【請求項７】
血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα−２−グリコプロテインから選ばれる成分の測定試薬を含有する敗血症診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、敗血症の診断方法及び診断試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症は、感染に対する宿主生体反応の調節不全により、生命を脅かす臓器機能障害(organ dysfunction)を呈する疾患であり、その死亡率は依然として高い。感染に起因するもしくは宿主に起因する産物が刺激となり、自然免疫応答から様々なｈｕｍｏｒａｌ  ｍｅｄｉａｔｅｒが放出され敗血症を引き起こすと言われている。そこで、ｍｅｄｉａｔｅｒ吸着能を有する膜素材を用いた血液浄化法が敗血症に施行され、臨床的効果を発揮してきた（非特許文献１〜４）。【０００３】
今まで、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８などのサイトカインが血液浄化膜通過後に濃度低下することは報告されてきた（非特許文献１〜４）。しかしそれらは、特定の物質に限定されており、膜へ吸着した物質の解析も、血液浄化膜前後の血中濃度差を測定した間接的なものであり十分ではなかった。【０００４】
また、急性腎傷害（Acute kidney injury, AKI）の中でも、敗血症性腎傷害は早期診断・早期治療が重要であるにも関わらず、敗血症性腎傷害を診断するバイオマーカーは報告がない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ther Apher 2001, 5(4): 306-314
【非特許文献２】Transfus Apher Sci 2006, 35(3): 253-264
【非特許文献３】Blood Purif 2011,31(1-3): 18-25
【非特許文献４】Blood Purif 2012, 34(2): 164-170
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、新たな敗血症の診断に有用なバイオマーカーを開発し、診断薬及び診断手法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、血液浄化法を施行した敗血症患者と非敗血症性急性腎傷害患者において、血液浄化膜に吸着した物質を溶出分離し、プロテオミクスの手法により解析を行った。その結果、従来、敗血症との関連性が全く知られていなかった２種の物質が、敗血症患者の血液中に有意に高濃度で存在し、敗血症の診断マーカーとして有用であることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔７〕を提供するものである。【０００９】
〔１〕敗血症診断の目的で、血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα−２−グリコプロテインから選ばれる成分の測定法。
〔２〕血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα−２−グリコプロテインから選ばれる成分の濃度又は活性が、健常者又は非敗血症腎傷害患者に比べて有意に高い場合に敗血症と診断する〔１〕記載の測定法。
〔３〕急性腎傷害患者における敗血症診断の目的である〔１〕又は〔２〕記載の測定法。
〔４〕血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα−２−グリコプロテインから選ばれる成分を測定することを特徴とする敗血症の診断方法。
〔５〕血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα−２−グリコプロテインから選ばれる成分の濃度又は活性が、健常者又は非敗血症腎傷害患者に比べて有意に高い場合に敗血症と診断する〔４〕記載の診断方法。
〔６〕急性腎傷害患者における敗血症の診断である〔４〕又は〔５〕記載の診断方法。
〔７〕血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα−２−グリコプロテインから選ばれる成分の測定試薬を含有する敗血症診断薬。
【発明の効果】
【００１０】
血液試料中のカルボニックアンテヒドラーゼ１又はロイシンリッチα−２−グリコプロテインの濃度又は活性が高い患者は敗血症であると診断できる。また、腎傷害患者のうち、カルボニックアンヒドラーゼ１又はロイシンリッチα−２−グリコプロテインの濃度又は活性が高い患者は敗血症であると診断できる。敗血症であることが早期に診断できれば、適確な治療指針の策定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】敗血症患者（Ｓｅｐｓｉｓ）及び非敗血症患者（Ｎｏｎ−Ｓｅｐｓｉｓ）のカルボニックアンヒドラーゼ１（ＣＡ１）、ロイシンリッチα−２−グリコプロテイン（ＬＲＧ１）、及びシスタチンＣ（Ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ）の濃度差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の敗血症診断マーカーは、カルボニックアンヒドラーゼ１（ＣＡ１）及びロイシンリッチα−２−グリコプロテイン（ＬＲＧ）から選ばれる成分である。
ＣＡ１は、生体中で、二酸化炭素と炭酸水素イオンとを相互交換することで、血液や他の組織の酸−塩基平衡を維持し、組織から二酸化炭素を運び出す補助をする酵素である。ＣＡ１活性や濃度は、鉄欠乏性貧血、ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、甲状腺機能亢進症・低下症等のマーカーとして有用であることが知られているが、敗血症との関係については知られていない。
ＬＲＧは、特発性正常圧水頭症、糖尿病、膵がんなどで上昇することは知られているが、敗血症との関係については知られていない。
【００１３】
本発明においては、血液試料中のＣＡ１又はＬＲＧの濃度又は活性を測定する。
【００１４】
血液試料としては、被検者から採取した血液試料であればよいが、血清、血漿を用いるのが簡便性の点で好ましい。また、腎傷害患者を対象とする場合には、血液浄化法施行後の血液浄化膜に吸着した成分を測定対象とすることができる。ここで、血液浄化法としては、血液透析、血液濾過透析、腹膜透析、血漿交換等が挙げられるが、これらのいずれも使用できる。
【００１５】
血液試料中のＣＡ１又はＬＲＧの測定手段としては、プロテオミクス解析手段による質量分析が挙げられるが、それぞれの成分の特異的測定手段を用いてもよい。例えば、ＣＡ１の場合には、キャピラリー電気泳動・質量分析、液体クロマトグラフィー・質量分析の他、炭酸脱水素活性測定法、加水分解酵素活性測定法（ＷＯ２００５／０９８０２６等）、免疫学的測定法（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなど）等が挙げられる。また、ＬＲＧの場合には、キャピラリー電気泳動・質量分析、液体クロマトグラフィー・質量分析の他、ＥＬＩＳＡ、ラテックス凝集法等の免疫学的測定法が挙げられる。
【００１６】
血液試料中のＣＡ１又はＬＲＧの活性又は濃度は、敗血症患者において健常者に比べて有意に高い値を示す。また、腎傷害患者のうち、非敗血症性腎傷害患者に比べて、敗血症性腎傷害患者において有意に高い値を示す。従って、ＣＡ１又はＬＲＧは、敗血症の診断マーカー、腎傷害患者における敗血症性腎傷害の診断マーカーとして有用である。例えば、敗血症診断の目的で、血液試料中のＣＡ１又はＬＲＧの活性又は濃度を、敗血症性腎傷害患者及び健常者または非敗血症性腎傷害患者における活性または濃度に基づいて決定した閾値と比較することができる。上記閾値は、定法、例えば、敗血症性腎傷害患者のデータや、健常者または非敗血症性腎傷害患者のデータを基に、統計解析ソフトウェアを用いたＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を用いて算出することができる。
【００１７】
本発明の敗血症診断薬は、血液試料中のＣＡ１又はＬＲＧの測定試薬を含有する。ＣＡ１又はＬＲＧの測定試薬としては、例えばキャピラリー電気泳動・質量分析、液体クロマトグラフィー・質量分析に用いる試薬、炭酸脱水素活性測定試薬、加水分解酵素活性測定試薬、免疫学的測定試薬（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ラテックス凝集等）が挙げられる。また、これらの測定試薬には、前記測定試薬の他、各マーカーの標準品、測定用プロトコールを含めることができ、測定キットとして供給することもできる。
【実施例】
【００１８】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。【００１９】
実施例１
Ａ．方法
（１）患者
この研究は千葉大学医学部付属病院で行われた。本研究では、２０１２年６月から２０１４年３月の間にＩＣＵ入室した持続的腎代替療法を受けた急性腎傷害（Acute kidney injury, AKI）２０人の患者を研究対象とした。２０人の患者のうち、１０人は、敗血症（ＡＣＣＰ／ＳＣＣＭ基準による）患者であり、残り１０人は非敗血症患者であった。千葉大学大学院治験審査委員会は、この研究を承認した。書面によるインフォームドコンセントは患者やその法定代理人から入手した。【００２０】
（２）検体採取
ポリメタクリレート血液浄化膜は、（Ｈｅｍｏｆｅｅｌ  ＣＨ−１．０，Ｔｏｒａｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）は、上記の１０人の患者（敗血症のｎ＝５、非敗血症のｎ＝５）から血液浄化法を施行した最初の日に収集した（施行条件は血流量１２０ｍＬ／分、濾過流量を５００ｍＬ／ｈ、透析液流量１０００ｍＬ／ｈ）。使用後の血液浄化膜は、生理食塩水１Ｌで洗浄した。そして筐体を切断し、中空糸膜を取り出した。中空糸膜は一定の大きさに切断し（長さ５ｃｍ、厚さ１ｃｍ）、水分除去の為、５０ｍＬチューブで遠心分離（５分間、２０００ｒｐｍ）し、−８０℃で保存した。ＩＣＵ入院時の血清検体は、２０人の患者から採取し、−８０℃で保存した。【００２１】
（３）血液浄化膜からの溶出及び単離
マイクロチューブに、冷凍保存した膜検体とサンプルバッファー（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２％ＳＤＳ，２０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．０１％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ，ｐＨ６．８／ＢＩＯＲＡＤ社）１ｍＬ入れ、９７℃、５分間加熱し、その抽出液を採取した。その抽出液を、５μＬずつｗｅｌｌに注入し、１５０Ｖ、９０ｍｉｎで電気泳動し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ行った。使用するゲルは２〜１００ＫＤａをより詳細に分離出来る低分子用ゲル（ＤＲＣ  Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＮＴ  Ｇｅｌ  ＮＴＨ−７Ｇ６ＨＰ）を用いた。泳動後のゲルはＣＢＢ染色を行い可視化した。【００２２】
（４）消化及び蛋白質同定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、可視領域および可視化されていない部位を、ゲル内トリプシン消化のために１ｍｍ2切片に切断した。Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００５，５（４）：１１１３−１１２４の記載に従ってゲル内トリプシン消化を行った。プロテオーム解析に先立ち、消化されたペプチドを脱塩し、選択的にＣ１８−ＳｔａｇｅＴｉｐｓ（Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２００７，２（８）：１８９６−１９０６）で強化した。濃縮されたサンプルは、Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００（ＤＩＯＮＥＸ、ＣＡ、ＵＳＡ）に取り付けた、トラップカラム（Ｃ１８、０．３×５ｍｍ、ＤＩＯＮＥＸ、ＣＡ、ＵＳＡ）、および分析カラム（Ｃ１８、０．０７５×１２０ｍｍ、Ｎｉｋｋｙｏテクノス、東京、日本）に注入した。移動相の流量は、３００ｎＬ／分とした。移動相の溶媒組成物は、１２０分サイクルで以下の様にプログラムされたものである。【００２３】
１２０−ｍｉｎ  ｃｙｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｍｉｘｉｎｇ  ｒａｔｉｏｓ  ｏｆ  ｓｏｌｖｅｎｔ  Ａ（２％ｖ／ｖ  ＣＨ3ＣＮ  ａｎｄ  ０．１％ｖ／ｖ  ＨＣＯＯＨ）ｔｏ  ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂ（９０％ｖ／ｖ  ＣＨ3ＣＮ  ａｎｄ  ０．１％ｖ／ｖ  ＨＣＯＯＨ）：５−１０％  Ｂ５ｍｉｎ，１０−１３．５％  Ｂ３５ｍｉｎ，１３．５−３５％  Ｂ６５ｍｉｎ，３５−９０％  Ｂ４ｍｉｎ，９０％  Ｂ０．５ｍｉｎ，９０−５％  Ｂ０．５ｍｉｎ，５％  Ｂ１０ｍｉｎ．【００２４】
精製されたペプチドはハイブリッドイオン−トラップフーリエ変換質量分析計であるＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）にＨＰＬＣから取り込まれた。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ  ｓｅａｒｃｈ  ｅｎｇｉｎｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２．６，Ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）は、ペプチドの質量及びタンデム質量スペクトルからタンパク質を同定するために使用した。ペプチド質量データは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ２０１４，２０２６８  ｅｎｔｒｉｅｓ）で検索した。データベースの検索パラメータは以下の通りであった。ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，２ｐｐｍ；ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，０．６Ｄａ；ｅｎｚｙｍｅ  ｗａｓ  ｓｅｔ  ｔｏ  ｔｒｙｐｓｉｎ，ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｕｐ  ｔｏ  ｏｎｅ  ｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ；ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．【００２５】
（５）ウエスタンブロット分析
プロテオーム解析で同定された３タンパク質（カルボニックアンヒドラーゼ［ＣＡ１］、ロイシンリッチα−２−グリコプロテイン［ＬＲＧ１］、シスタチンＣ［ＣｙｓＣ］）の血中濃度を、ＡＫＩ患者で測定した。測定はＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法で行った。この実験はｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅで行った。【００２６】
（６）統計学的分析
タンパク質同定の基準は、ａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ（ＦＤＲ）＜１％と設定した。ＦＤＲは、Ｔｈｅ  ＦＤＲ  ｗａｓ  ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｕｐｐｌｉｅｄ  ｂｙ  Ｍａｔｒｉｘ  ＳｃｉｅｎｃｅのＭａｓｃｏｔ  Ｐｅｒｌ  ｐｒｏｇｒａｍによって作成されたｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｄｅｃｏｙ  ｄａｔａｂａｓｅで推定した。ベースライン特性と結果の違いは、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔとＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔにて解析した。敗血症群と非敗血症群の機能分類は、ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ  ｔｅｓｔにて解析した。敗血症および非敗血症群とのＣＡ１、ＬＲＧ１及びＣｙｓの血中濃度の差は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔにて解析した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。解析はＳＰＳＳ（ＳＰＳＳ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２０，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）統計ソフトウェアを使用した。【００２７】
Ｂ．結果
敗血症患者５例の膜検体と、非敗血症患者５例の膜検体を前述の方法で溶出分離・質量解析した。敗血症群では４２９種類、非敗血症群では３５７種類のタンパク質を同定した。
敗血症群と非敗血症群で同定されたタンパク質の機能分析の比較した（表１）。敗血症群において「免疫系システム経路」及び「生物学的接着」を有意に認めた（Ｐ＜０．０５）。「代謝経路」と「刺激に対する反応」は両群ともに認めた。【００２８】
【表１】
2018088455.tif 000003
【００２９】
４２９種類のタンパク質のうち１９７種類が、敗血症群のみで同定された。さらに１９７種類のうち、９種類のタンパク質が、全ての検体（５敗血症患者）において同定された。９種類のタンパク質のうち、６種は既に敗血症との関連が報告されていた（表２）。
一方で、ＣＡ１、ＬＲＧ１、ＣｙｓＣの３種類のタンパク質は敗血症との関連が報告されていなかった（表３）。【００３０】
【表２】
2018088455.tif 000004
【００３１】
【表３】
2018088455.tif 000005
【００３２】
そこでこれらの３つのタンパク質に着目し、ウェスタンブロット法を使用して、敗血症群と非敗血症群の血中濃度について解析した（図１）。図１よりＣＡ１及びＬＲＧ１は、両群間に有意差を認めた（ＬＲＧ１；Ｐ＝０．００４０，ＣＡ１；Ｐ＝０．０１５）。ＣｙｓＣは、両群間に有意差は認めなかった（ＣｙｓＣ；Ｐ＝０．３５）。
以上の結果から、ＣＡ１及びＬＲＧ１は、敗血症の診断マーカーとして有用であることが判明した。これらの２成分は、特に急性腎傷害の原因としての敗血症の早期診断、治療に有効なバイオマーカーであると考えられた。
【図１】
2018088455.tif 000006
【国際調査報告】
2018088455.tif 000007
2018088455.tif 000008
2018088455.tif 000009
2018088455.tif 000010
2018088455.tif 000011
2018088455.tif 000012