【手続補正書】
【提出日】平成30年12月21日(2018.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列と検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列とを含む少なくとも１つの非天然の核酸分子を含む、前記少なくとも１つの非天然の核酸分子を含む形質転換体を得るための完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株であって、前記藻類株の細胞が、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを同じレベルで発現し、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼであり、任意でＣａｓ９ヌクレアーゼである、完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株。
【請求項２】
少なくとも１つのガイドＲＮＡまたは少なくとも１つのガイドＲＮＡを発現するための少なくとも１つのコンストラクトを含み、前記ガイドＲＮＡが、前記細胞のゲノム内の部位を標的とし、ｇＲＮＡと、選択可能マーカーを含むドナーフラグメントとを用いたときの、前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株の標的変異率が、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％である、請求項１に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株。
【請求項３】
前記藻類株の属が、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）属、アンフィプローラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）属、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）属、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属、ボエケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）属、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）属、ボロジネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）属、フウセンモ（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）属、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）属、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）属、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）属、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）属、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリコスフェラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、デスモデスムス（Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）属、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属、エリプソイドン（Ｅｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）属、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）属、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）属、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）属、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属、ユースチグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）属、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）属、フラジラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）属、フラジラリオプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）属、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）属、ヒメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）属、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）属、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）属、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）属、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）属、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）属、サヤミドロ（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）属、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）属、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、パリエトクロリス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）属、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）属、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）属、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属、ファガス（Ｐｈａｇｕｓ）属、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）属、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）属、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）属、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、シュードスタウラストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）属、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）属、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、シゾクラミデラ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ）属、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）属、スピロギラ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）属、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）属、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）属、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）属、ヴィシェリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）属、及びボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属からなる群より選択される、請求項１に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株。
【請求項４】
前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株が、外因性の選択可能マーカー遺伝子を含まず、任意で、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株が、部位特異的リコンビナーゼをコードする外因性遺伝子を含み、任意で、前記部位特異的リコンビナーゼが、ｃｒｅ、ｆｒｔ、またはｄｒｅであり、任意で、部位特異的リコンビナーゼをコードする前記外因性遺伝子が、宿主生物における発現用にコドン最適化されており、任意で、部位特異的リコンビナーゼをコードする前記外因性遺伝子が、誘導性プロモーターに機能的に連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株。
【請求項５】
形質転換した藻類株を、前記ゲノム内の前記標的部位の改変についてスクリーニングする、請求項２に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株。
【請求項６】
少なくとも１つの形質転換体を培養すること；ならびに
少なくとも１つの形質転換体の培養物についてフローサイトメトリーを行って、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現コンストラクトに関して完全浸透性の細胞株を同定すること；
によって得られる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株。
【請求項７】
前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、キメラガイドＲＮＡであるか、またはｃｒＲＮＡであり、任意で、前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現株が、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするコンストラクトを更に含み、任意で、前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株。
【請求項８】
前記スクリーニングが、ＰＣＲを行って、前記標的部位における変異を検出することを含む、または、前記スクリーニングが、表現型スクリーニングを用いることを含む、請求項５に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株。
【請求項９】
前記標的部位への挿入のための外因性ドナーＤＮＡを更に含み、任意で、前記ドナーＤＮＡ分子が、前記標的部位への組み換えのための１つ以上の相同領域を含み、任意で、前記ドナーＤＮＡ分子が、選択可能マーカーを含み、任意で、前記ゲノム内の前記標的部位の改変についてスクリーニングすることが、前記ドナーＤＮＡ分子の前記選択可能マーカーを発現する形質転換体を同定することを含み、任意で、前記ドナーＤＮＡ分子が、前記標的部位への組み換えのための相同領域を含まない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、タイプＩＩまたはタイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼであり、任意で、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｂｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｐｆ１、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、これらのホモログ、及びこれらの改変型からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株。
【請求項１１】
前記藻類株が、検出可能マーカーを含み、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの完全浸透度での発現を同定するために、フローサイトメトリーを用いて、培養物において、前記検出可能マーカーを完全浸透度で発現する少なくとも１つの形質転換藻類株を同定する、請求項６に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株。
【請求項１２】
前記非天然の核酸分子が、選択可能マーカー遺伝子を更に含み、任意で、前記選択可能マーカー遺伝子が、抗生物質耐性を付与し、任意で、前記非天然の核酸分子を含む１つ以上の形質転換藻類株を得ることが、選択培地上の形質転換コロニーを選択することによる、請求項１１に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株。
【請求項１３】
目的の遺伝子をコードする前記遺伝子および前記検出可能マーカー遺伝子が、別々のプロモーターに機能的に連結している、ならびに／または目的の遺伝子をコードする前記遺伝子および前記選択可能マーカー遺伝子が、別々のプロモーターに機能的に連結している、請求項１２に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現藻類株。
【請求項１４】
前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、前記藻類細胞株において安定に発現する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の藻類株。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明では、導入遺伝子の完全浸透度に関する、組み換え細胞株のスクリーニング方法も提供する。この導入遺伝子は、機能的なＲＮＡまたはポリペプチドをコードできる。本明細書における実施例に開示されているように、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及び部位特異的リコンビナーゼの完全浸透度での発現に関するスクリーニングに加えて、１つの蛍光ピークを有する細胞株であって、その蛍光ピークが、非形質転換細胞で見られるピークの蛍光強度よりも高い細胞株を同定するために、フローサイトメトリーによって形質転換体をスクリーニングする方法を用いて、ＲＮＡｉ分子などの機能的なＲＮＡと、酵素などのポリペプチドとをコードする遺伝子を完全浸透度で発現する細胞株を単離できる。更に、様々な形質転換細胞株の蛍光強度レベルの比較により、全体的に発現レベルが高いかまたは低い方の細胞株を選択可能にできる。このように培養物全体にわたるスクリーニングは、発現タンパク質のレベルを割り出すなどの他の方法よりも信頼性が高いことができる。
[本発明1001]
以下の工程を含む、目的の外因性遺伝子を完全浸透度で発現する細胞株の生成方法：
目的の遺伝子および検出可能マーカー遺伝子を含む非天然の核酸分子を宿主細胞の集団に導入して、前記非天然の核酸分子を含む1つ以上の形質転換細胞株を得る工程；
前記1つ以上の形質転換細胞株の少なくとも1つを培養して、少なくとも1つの形質転換細胞株の培養物をもたらす工程；ならびに
前記目的の外因性遺伝子の完全浸透度での発現を同定するために、フローサイトメトリーを用いて、培養物において、前記検出可能マーカーを完全浸透度で発現する少なくとも1つの形質転換細胞株を同定する工程。
[本発明1002]
前記検出可能マーカーを完全浸透度で発現する形質転換細胞株を同定する工程が、前記少なくとも1つの形質転換細胞株の培養物のフローサイトメトリーの波形を、前記検出可能マーカーを発現しない対照培養物のフローサイトメトリーの波形と比較することを含み、形質転換細胞株の培養物のフローサイトメトリーの波形が、前記対照培養物の前記フローサイトメトリーの波形よりも高い蛍光レベルにシフトしている単一のピークを示すことによって、前記目的の遺伝子を完全浸透度で発現する形質転換細胞株が同定される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記非天然の核酸分子が、選択可能マーカー遺伝子を更に含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記選択可能マーカー遺伝子が、抗生物質耐性を付与する、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記非天然の核酸分子を含む1つ以上の形質転換細胞株を得る工程が、選択培地上の形質転換コロニーを選択することによる、本発明1003の方法。
[本発明1006]
目的の遺伝子をコードする前記遺伝子および前記検出可能マーカー遺伝子が、別々のプロモーターに機能的に連結している、本発明1001の方法。
[本発明1007]
目的の遺伝子をコードする前記遺伝子および前記選択可能マーカー遺伝子が、別々のプロモーターに機能的に連結している、本発明1001の方法。
[本発明1008]
目的の遺伝子が、機能的なＲＮＡまたはポリペプチドをコードする、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
目的の遺伝子が、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、シングルガイドＲＮＡ、キメラガイドＲＮＡ、ＲＮＡｉコンストラクト、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ配列、リボザイム、またはマイクロＲＮＡからなる群より選択される機能的なＲＮＡをコードする、本発明1008の方法。
[本発明1010]
目的の遺伝子が、酵素、リボソームタンパク質、構造タンパク質、分泌系の成分、トランスポーター、ポーリン、膜レセプター、ＤＮＡ結合タンパク質、リコンビナーゼ、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、転写因子、または細胞シグナル伝達タンパク質からなる群より選択されるポリペプチドをコードする、本発明1008の方法。
[本発明1011]
前記検出可能マーカーが、蛍光タンパク質である、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記検出可能マーカー遺伝子が、部位特異的リコンビナーゼによって認識される部位に隣接している、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記選択可能マーカー遺伝子が、部位特異的リコンビナーゼによって認識される部位に隣接している、本発明1002の方法。
[本発明1014]
前記選択可能マーカー遺伝子および前記検出可能マーカー遺伝子を含む配列が、部位特異的リコンビナーゼによって認識される部位に隣接している、本発明1002の方法。
[本発明1015]
前記非天然の核酸分子が、目的の遺伝子を2つ以上含む、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
目的の遺伝子を3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、またはそれより多く含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
少なくとも1つの目的の遺伝子が、部位特異的リコンビナーゼをコードする、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記部位特異的リコンビナーゼが、誘導性プロモーターに機能的に連結している、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記部位特異的リコンビナーゼが、ｃｒｅ、ｆｌｐ、またはＤｒｅである、本発明1017または1018の方法。
[本発明1020]
前記検出可能マーカー遺伝子が、部位特異的リコンビナーゼによって認識される部位に隣接している、本発明1017〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記部位特異的リコンビナーゼの発現を誘発する工程を更に含み、それによって、前記検出可能マーカー遺伝子を前記核酸分子から切除する、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記核酸分子が選択可能マーカー遺伝子を含み、更に、前記選択可能マーカー遺伝子が、部位特異的リコンビナーゼによって認識される部位に隣接している、本発明1017〜1019のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記部位特異的リコンビナーゼの発現を誘発する工程を更に含み、それによって、前記選択可能マーカー遺伝子を前記核酸分子から組み換え切除する、本発明1018の方法。
[本発明1024]
前記核酸分子が選択可能マーカー遺伝子を含み、前記検出可能マーカー遺伝子および前記選択可能マーカー遺伝子を含む前記核酸配列が、部位特異的リコンビナーゼによって認識される部位に隣接している、本発明1017〜1019のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記リコンビナーゼの発現を誘発する工程を更に含み、それによって、前記検出可能マーカー遺伝子および前記選択可能マーカー遺伝子を前記核酸分子から切除する、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記宿主細胞が真核宿主細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1027]
前記宿主細胞が、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、クモ形類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞、両生動物細胞、鳥類細胞、甲殻類細胞、または原生動物細胞である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記宿主細胞が、真菌細胞、任意で、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、プルラリア（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、及びヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属からなる群より選択される属の細胞である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記宿主細胞が、メソミセトゾア細胞、不等毛類細胞、または藻類細胞である、本発明1027の方法。
[本発明1030]
前記宿主細胞が藻類細胞である、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記藻類細胞が、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）属、アンフィプローラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）属、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）属、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属、ボエケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）属、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）属、ボロジネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）属、フウセンモ（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）属、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）属、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）属、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）属、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）属、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリコスフェラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、デスモデスムス（Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）属、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属、エリプソイドン（Ｅｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）属、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）属、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）属、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）属、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属、ユースチグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）属、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）属、フラジラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）属、フラジラリオプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）属、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）属、ヒメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）属、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）属、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）属、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）属、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）属、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）属、サヤミドロ（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）属、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）属、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、パリエトクロリス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）属、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）属、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）属、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属、ファガス（Ｐｈａｇｕｓ）属、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）属、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）属、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）属、シュードクロレラ（ＰｓｅｕｄｏＣｈｌｏｒｅｌｌａ）属、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、シュードスタウラストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）属、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）属、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、シゾクラミデラ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ）属、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）属、スピロギラ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）属、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）属、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）属、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）属、ヴィシェリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）属、及びボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属からなる群より選択される属の細胞である、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記藻類細胞が、珪藻類細胞、任意で、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）属、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）属、アンフィプローラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）属、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、フラジラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）属、フラジラリオプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ）属、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）属、及びタラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属からなる群より選択される属の細胞である、本発明1030の方法。
[本発明1033]
前記藻類細胞が、ユースティグマトファイト細胞、任意で、エリプソイジオン（Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｉｏｎ）属、ユースチグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）属、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、シュードスタウラストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）属、及びヴィシェリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）属からなる群より選択される属の細胞である、本発明1031の方法。
[本発明1034]
前記宿主細胞が、ラビリンチュラ類細胞、任意で、ラビリンチュラ（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌａ）属、ラビリンチュロイデス（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アウランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）属、及びウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属からなる群より選択される属の細胞である、本発明1029の方法。
[本発明1035]
以下の工程を含む、高効率ゲノム編集用細胞株の生成方法：
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列と、検出可能マーカーをコードする核酸配列とを含む非天然の核酸分子を宿主細胞の集団に導入して、前記非天然の核酸分子を含む1つ以上のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ形質転換細胞株を得る工程；
前記1つ以上のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ形質転換細胞株の少なくとも1つを培養して、少なくとも1つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ形質転換細胞株の培養物をもたらす工程；
フローサイトメトリーを用いて、前記少なくとも1つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ形質転換細胞株の培養物を、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ形質転換細胞株の培養物の細胞における前記検出可能マーカーの発現について評価する工程；ならびに
高効率ゲノム編集用細胞株を同定するために、前記細胞株の培養物において前記検出可能マーカーを完全浸透度で発現するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ形質転換細胞株を同定する工程。
[本発明1036]
前記検出可能マーカーを完全浸透度で発現する形質転換細胞株を同定する工程が、前記検出可能マーカーを発現しない対照培養物のフローサイトメトリーの波形を、前記少なくとも1つの形質転換細胞株の培養物のフローサイトメトリーの波形と比較することを含み、形質転換細胞株の培養物のフローサイトメトリーの波形が、前記対照培養物の前記フローサイトメトリーの波形よりも高い蛍光レベルにシフトしている単一のピークを示すことによって、前記目的の遺伝子を完全浸透度で発現する形質転換細胞株が同定される、本発明1035の方法。
[本発明1037]
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、前記宿主細胞に対して異種である、本発明1035の方法。
[本発明1038]
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質である、本発明1035の方法。
[本発明1039]
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、タイプＩＩまたはタイプＶ Ｃａｓタンパク質である、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ1、Ｃａｓ1Ｂ、Ｃａｓ2、Ｃａｓ3、Ｃａｓ4、Ｃａｓ5、Ｃａｓ6、Ｃａｓ7、Ｃａｓ8、Ｃａｓ9、Ｃａｓ10、Ｃｂｆ1、Ｃｓｙ1、Ｃｓｙ2、Ｃｓｙ3、Ｃｓｅ1、Ｃｓｅ2、Ｃｓｃ1、Ｃｓｃ2、Ｃｓａ5、Ｃｓｎ2、Ｃｓｍ2、Ｃｓｍ3、Ｃｓｍ4、Ｃｓｍ5、Ｃｓｍ6、Ｃｍｒ1、Ｃｍｒ3、Ｃｍｒ4、Ｃｍｒ5、Ｃｍｒ6、Ｃｐｆ1、Ｃｓｂ1、Ｃｓｂ2、Ｃｓｂ3、Ｃｓｘ17、Ｃｓｘ14、Ｃｓｘ10、Ｃｓｘ16、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ3、Ｃｓｘ1、Ｃｓｘ15、Ｃｓｆ1、Ｃｓｆ2、Ｃｓｆ3、Ｃｓｆ4、Ｃ2ｃ1、Ｃ2ｃ2、Ｃ2ｃ3、これらのホモログ、及びこれらの改変型からなる群より選択されている、本発明1035の方法。
[本発明1041]
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ9、Ｃｐｆ1、Ｃ2ｃ1、Ｃ2ｃ2、またはＣ2ｃ3である、本発明1039の方法。
[本発明1042]
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ9である、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記Ｃａｓ9タンパク質が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、またはナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ9タンパク質である、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記Ｃａｓ9タンパク質が、野生型Ｃａｓ9タンパク質に対して少なくとも1つの変異を含む、本発明1042の方法。
[本発明1045]
少なくとも1つの変異が、Ｄ10Ａ、Ｈ840Ａ、Ｎ854Ａ、及びＮ863Ａからなる群より選択されている、本発明1044の方法。
[本発明1046]
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする前記核酸配列が、前記宿主菌株における発現用にコドン最適化されている、本発明1035の方法。
[本発明1047]
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、少なくとも1つの核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、本発明1035の方法。
[本発明1048]
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、少なくともエピトープタグを含む、本発明1035の方法。
[本発明1049]
前記エピトープタグが、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、またはＭｙｃタグである、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記非天然の核酸分子が、選択可能マーカーを更に含む、本発明1035の方法。
[本発明1051]
前記選択可能マーカーが、抗生物質または毒素に対する耐性を付与する、本発明1050の方法。
[本発明1052]
前記検出可能マーカーをコードする前記核酸配列が、前記微生物株における発現用にコドン最適化されている、本発明1051の方法。
[本発明1053]
前記検出可能マーカーが、蛍光タンパク質である、本発明1035の方法。
[本発明1054]
前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、Ｃｈｅｒｒｙ、Ｔｏｍａｔｏ、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、またはこれらのうちいずれかのバリアントであり、前記バリアントとしては、単量体バリアントが挙げられるが、これに限らない、本発明1053の方法。
[本発明1055]
前記検出可能マーカーおよび前記Ｃａｓ9タンパク質が、別々のタンパク質として産生される、本発明1054の方法。
[本発明1056]
前記選択可能マーカーをコードする前記遺伝子、および前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする前記遺伝子が、異なるプロモーターに機能的に連結されている、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記宿主細胞が、原核生物の宿主細胞である、本発明1035の方法。
[本発明1058]
前記宿主細胞が、古細菌、シアノバクテリア、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、もしくは紅色非硫黄細菌の群のいずれか；または、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリア（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）属、デスルフォビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、ジェオトガリコッカス（Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ）属、キネオコッカス（Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ）属、ロドミクロビウム（Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、もしくはザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属のいずれか；に属する種の細胞である、本発明1057の方法。
[本発明1059]
前記宿主細胞が、真核宿主細胞である、本発明1035の方法。
[本発明1060]
前記宿主細胞が、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、クモ形類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞、両生動物細胞、鳥類細胞、甲殻類細胞、または原生動物細胞である、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｖｌ細胞、ＭＤＣＫ細胞、293細胞、3Ｔ3細胞、またはＰＣ12細胞である、本発明1059の方法。
[本発明1062]
前記宿主細胞が、真菌細胞、任意で、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、プルラリア（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、及びヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属からなる群より選択される属の細胞である、本発明1059の方法。
[本発明1063]
前記宿主細胞が、メソミセトゾア細胞、不等毛類細胞、または藻類細胞である、本発明1059の方法。
[本発明1064]
前記宿主細胞が、藻類細胞、任意で、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）属、アンフィプローラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）属、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）属、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属、ボエケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）属、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）属、ボロジネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）属、フウセンモ（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）属、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）属、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）属、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）属、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）属、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリコスフェラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、デスモデスムス（Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）属、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属、エリプソイドン（Ｅｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）属、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）属、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）属、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）属、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属、ユースチグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）属、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）属、フラジラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）属、フラジラリオプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）属、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）属、ヒメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）属、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）属、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）属、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）属、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）属、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）属、サヤミドロ（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）属、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）属、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、パリエトクロリス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）属、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）属、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）属、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属、ファガス（Ｐｈａｇｕｓ）属、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）属、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）属、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）属、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、シュードスタウラストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）属、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）属、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、シゾクラミデラ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ）属、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）属、スピロギラ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）属、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）属、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）属、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）属、ヴィシェリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）属、及びボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属からなる群より選択される属の細胞である、本発明1063の方法。
[本発明1065]
前記宿主細胞が、不等毛類細胞、任意で、ラビリンチュラ（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌａ）属、ラビリンチュロイデス（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アウランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）属、及びウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属からなる群より選択される属の細胞である、本発明1063の方法。
[本発明1066]
完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1067]
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼである、本発明1066の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1068]
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ9ヌクレアーゼである、本発明1067の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1069]
ｇＲＮＡと、選択可能マーカーを含むドナーフラグメントとを用いたときの、前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株の標的変異率が、少なくとも10％である、本発明1066〜1068のいずれかの完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1070]
ｇＲＮＡと、選択可能マーカーを含むドナーフラグメントとを用いたときの、前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株の標的変異率が、少なくとも25％である、本発明1069の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1071]
ｇＲＮＡと、選択可能マーカーを含むドナーフラグメントとを用いたときの、前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株の標的変異率が、約50％以上である、本発明1070の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1072]
ｇＲＮＡと、選択可能マーカーを含むドナーフラグメントとを用いたときの、前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株の標的変異率が、約80％以上である、本発明1071の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1073]
ｇＲＮＡと、選択可能マーカーを含むドナーフラグメントとを用いたときの、前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株の標的変異率が、約90％以上である、本発明1072の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1074]
微生物株である、本発明1066〜1073のいずれかの完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1075]
前記微生物株が、真菌、メソミセトゾア、不等毛類、または藻類である、本発明1074の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1076]
前記微生物株が、真菌株、任意で、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、プルラリア（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、及びヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属からなる群より選択される属の株である、本発明1074の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1077]
前記微生物株が、藻類株、任意で、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）属、アンフィプローラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）属、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）属、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属、ボエケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）属、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）属、ボロジネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）属、フウセンモ（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）属、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）属、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）属、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）属、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）属、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリコスフェラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、デスモデスムス（Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）属、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属、エリプソイドン（Ｅｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）属、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）属、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）属、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）属、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属、ユースチグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）属、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）属、フラジラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）属、フラジラリオプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）属、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）属、ヒメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）属、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）属、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）属、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）属、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）属、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）属、サヤミドロ（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）属、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）属、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、パリエトクロリス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）属、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）属、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）属、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属、ファガス（Ｐｈａｇｕｓ）属、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）属、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）属、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）属、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、シュードスタウラストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）属、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）属、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、シゾクラミデラ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ）属、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）属、スピロギラ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）属、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）属、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）属、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）属、ヴィシェリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）属、及びボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属からなる群より選択される属の株である、本発明1074の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1078]
前記微生物株が、不等毛類株、任意で、ラビリンチュラ（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌａ）属、ラビリンチュロイデス（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アウランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）属、及びウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属からなる群より選択される属の株である、本発明1074の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1079]
外因性の選択可能マーカー遺伝子を含まない、本発明1066〜1078のいずれかの完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1080]
外因性の検出可能マーカー遺伝子を含まない、本発明1066〜1079のいずれかの完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1081]
部位特異的リコンビナーゼをコードする外因性遺伝子を含む、本発明1079または1080の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1082]
前記部位特異的リコンビナーゼが、ｃｒｅ、ｆｒｔ、またはｄｒｅである、本発明1079または1080の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1083]
前記部位特異的リコンビナーゼがｃｒｅである、本発明1079または1080の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1084]
部位特異的リコンビナーゼをコードする前記外因性遺伝子が、宿主生物における発現用にコドン最適化されている、本発明1079または1080の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1085]
部位特異的リコンビナーゼをコードする前記外因性遺伝子が、誘導性プロモーターに機能的に連結されている、本発明1079または1080の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
[本発明1086]
以下の工程を含む、細胞のゲノムのインビボ改変方法：
少なくとも1つのガイドＲＮＡまたは少なくとも1つのガイドＲＮＡを発現させるための少なくとも1つのコンストラクトを、完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株に導入する工程であって、前記ガイドＲＮＡが、前記細胞のゲノム内の部位を標的とする、工程；および
前記ガイドＲＮＡで形質転換した細胞を、前記ゲノム内の前記標的部位の改変についてスクリーニングする工程。
[本発明1088]
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列と、検出可能マーカーをコードする少なくとも1つの核酸配列とを含む少なくとも1つの非天然の核酸分子を細胞に導入して、前記少なくとも1つの非天然の核酸分子を含む形質転換体を得ること；
少なくとも1つの形質転換体を培養すること；ならびに
少なくとも1つの形質転換体の培養物についてフローサイトメトリーを行って、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現コンストラクトに関して完全浸透性の細胞株を同定すること；
によって、前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現株を得る、本発明1086の方法。
[本発明1089]
前記少なくとも1つのガイドＲＮＡが、キメラガイドＲＮＡである、本発明1086または1087の方法。
[本発明1090]
前記少なくとも1つのガイドＲＮＡが、ｃｒＲＮＡである、本発明1086または1087の方法。
[本発明1091]
前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現株が、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするコンストラクトを更に含む、本発明1086の方法。
[本発明1092]
ｔｒａｃｒＲＮＡを前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現株に導入する工程を更に含む、本発明1086の方法。
[本発明1093]
前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、少なくとも1つの化学修飾を含む、本発明1091の方法。
[本発明1094]
前記スクリーニングする工程が、ＰＣＲを行って、前記標的部位における変異を検出することを含む、本発明1086〜1092のいずれかの方法。
[本発明1095]
前記スクリーニングする工程が、表現型スクリーニングを用いることを含む、本発明1086〜1092のいずれかの方法。
[本発明1096]
前記標的部位への挿入のために、ドナーＤＮＡを前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現株に形質転換する工程を更に含む、本発明1086〜1043のいずれかの方法。
[本発明1097]
前記ドナーＤＮＡ分子が、選択可能マーカーを含む、本発明1095の方法。
[本発明1098]
前記ドナーＤＮＡ分子が、前記標的部位への組み換えのための1つ以上の相同領域を含む、本発明1095の方法。
[本発明1099]
前記ドナーＤＮＡ分子が、前記標的部位への組み換えのための相同領域を含まない、本発明1095の方法。
[本発明1100]
前記ゲノム内の前記標的部位の改変についてスクリーニングする工程が、前記ドナーＤＮＡ分子の前記選択可能マーカーを発現する形質転換体を同定することを含む、本発明1095の方法。
[本発明1101]
ｔｒａｃｒＲＮＡと前記ｃｒＲＮＡを前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現株に導入する前に、前記ｔｒａｃｒＲＮＡと前記ｃｒＲＮＡをアニーリングさせる、本発明1091または1092の方法。
[本発明1102]
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、本発明1086〜1100のいずれかの方法。
[本発明1103]
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、タイプＩＩまたはタイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、本発明1101の方法。
[本発明1104]
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ1、Ｃａｓ1Ｂ、Ｃａｓ2、Ｃａｓ3、Ｃａｓ4、Ｃａｓ5、Ｃａｓ6、Ｃａｓ7、Ｃａｓ8、Ｃａｓ9、Ｃａｓ10、Ｃｂｆ1、Ｃｓｙ1、Ｃｓｙ2、Ｃｓｙ3、Ｃｓｅ1、Ｃｓｅ2、Ｃｓｃ1、Ｃｓｃ2、Ｃｓａ5、Ｃｓｎ2、Ｃｓｍ2、Ｃｓｍ3、Ｃｓｍ4、Ｃｓｍ5、Ｃｓｍ6、Ｃｍｒ1、Ｃｍｒ3、Ｃｍｒ4、Ｃｍｒ5、Ｃｍｒ6、Ｃｐｆ1、Ｃｓｂ1、Ｃｓｂ2、Ｃｓｂ3、Ｃｓｘ17、Ｃｓｘ14、Ｃｓｘ10、Ｃｓｘ16、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ3、Ｃｓｘ1、Ｃｓｘ15、Ｃｓｆ1、Ｃｓｆ2、Ｃｓｆ3、Ｃｓｆ4、Ｃ2ｃ1、Ｃ2ｃ2、Ｃ2ｃ3、これらのホモログ、及びこれらの改変型からなる群より選択されている、本発明1102のいずれかの方法。
[本発明1105]
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ9 ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである、本発明1103の方法。
[本発明1106]
前記細胞が、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、クモ形類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞、両生動物細胞、鳥類細胞、甲殻類細胞、または原生動物細胞である、本発明1086〜1104のいずれかの方法。
[本発明1107]
前記細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｖｌ細胞、ＭＤＣＫ細胞、293細胞、3Ｔ3細胞、またはＰＣ12細胞である、本発明1105の方法。
[本発明1108]
前記細胞が、真菌細胞、任意で、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、プルラリア（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、及びヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属からなる群より選択される属の細胞である、本発明1105の方法。
[本発明1109]
前記細胞が、メソミセトゾア細胞、不等毛類細胞、または藻類細胞である、本発明1105の方法。
[本発明1110]
前記細胞が、藻類細胞、任意で、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）属、アンフィプローラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）属、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）属、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属、ボエケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）属、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）属、ボロジネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）属、フウセンモ（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）属、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）属、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）属、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）属、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）属、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリコスフェラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、デスモデスムス（Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）属、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属、エリプソイドン（Ｅｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）属、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）属、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）属、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）属、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属、ユースチグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）属、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）属、フラジラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）属、フラジラリオプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）属、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）属、ヒメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）属、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）属、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）属、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）属、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）属、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）属、サヤミドロ（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）属、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）属、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、パリエトクロリス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）属、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）属、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）属、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属、ファガス（Ｐｈａｇｕｓ）属、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）属、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）属、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）属、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、シュードスタウラストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）属、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）属、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、シゾクラミデラ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ）属、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）属、スピロギラ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）属、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）属、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）属、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）属、ヴィシェリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）属、及びボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属からなる群より選択される属の細胞である、本発明1108の方法。
[本発明1111]
前記細胞が、不等毛類細胞、任意で、ラビリンチュラ（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌａ）属、ラビリンチュロイデス（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アウランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）属、及びウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属からなる群より選択される属の細胞である、本発明1108の方法。