【手続補正書】
【提出日】平成30年12月28日(2018.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えウイルス粒子の調製物を特徴付ける方法であって、
ａ）該調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、
ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、および
ｃ）Ｃ（ｓ）分布での各ピーク下面積を積分して、各ピークの相対濃度を決定する工程であって、各ピークが組換えウイルスの組換えウイルス粒子の種に相当する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子のベクターゲノムの完全性を評価する方法であって、
ａ）該調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、
ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、および
ｃ）Ｓ値に対応するプロット上のピークの存在によって該調製物中の組換えウイルス粒子の種を同定する工程であって、組換えウイルスの組換えウイルス粒子の具体的な種のゲノムサイズは、該種のＳ値を、周知のヌクレオチドサイズを有するカプシド化されたウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子のＳ値によって作成された標準曲線と比較することによって算出される工程
を含み、
そして場合により、Ｃ（ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルスの組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程を含む、
前記方法。
【請求項３】
組換えウイルス粒子の調製物中の空のカプシドまたは変種のサイズの組換えウイルスゲノムを含むカプシド粒子の存在を決定するための方法であって、
ａ）該調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、ならびに
ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程であって、インタクトな組換えウイルスゲノムを含む完全カプシド粒子に対するピーク以外の１つまたはそれ以上のピークの存在は、変種のサイズのゲノムを含むカプシド粒子および／または空のカプシドの存在を表す工程
を含む、前記方法。
【請求項４】
組換えウイルス粒子の調製物中の空のカプシド相対量を測定する方法であって、
ａ）該調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、
ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、
ｃ）Ｃ（ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程、および
ｄ）空のカプシド粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量を、インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量または調製物中の組換えウイルス粒子の総量と比較する工程、
インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子に対応しないＳ値を有する組換えウイルス粒子の量を、インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量または調製物中の組換えウイルス粒子の総量と比較する工程、
インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子または空のカプシド粒子に対応しないＳ値を有する組換えウイルス粒子の量を、調製物中の組換えウイルス粒子の総量と比較する工程、または
インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量を、空のカプシド粒子、変種の組換えウイルスゲノムを含むカプシド粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量、および／または調製物中の組換えウイルス粒子の総量と比較する工程
を含む、前記方法。
【請求項５】
組換えウイルス粒子の調製物の精製の際に、空のカプシドおよび／または、変種の組換えウイルスゲノムを含むカプシド粒子の除去をモニターする方法であって、精製工程における１つまたはそれ以上の工程に続いて、調製物から組換えウイルス粒子サンプルを除去すること、ならびに請求項４に記載の方法により、空のカプシドおよび／または変種の組換えウイルスゲノムを含むカプシド粒子の相対量についてサンプルを分析することを含み、空のカプシドおよび／または変種のゲノムを含むカプシドの完全カプシドに対する相対量における減少は、組換えウイルス粒子の調製物からの空のカプシドの除去を示す、前記方法。
【請求項６】
空のカプシド粒子のＳ値に対応するピークの存在は、空のカプシド粒子の存在を示すか、または、インタクトな組換えウイルスゲノムを含む完全カプシド粒子もしくは空のカプシド粒子に対するピーク以外の１つまたはそれ以上のピークの存在は、変種のサイズのゲノムを含むカプシド粒子の存在を表し、
場合により、変種のサイズのゲノムを含むカプシド粒子は、切断型ゲノム、凝集体、組換え体および／またはＤＮＡ不純物を含む、
請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子の不均一性を決定する方法であって、
ａ）該調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、
ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプ
ロットする工程であって、インタクトなウイルスゲノムを含むカプシドに相当するピークに追加してピークが存在することは、調製物中の組換え粒子の不均一性を示す工程
を含み、
そして場合により、該方法は、Ｃ（ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程をさらに含む
前記方法。
【請求項８】
追加のピークの存在は、空のカプシド粒子および／または変種のゲノムを含む組換えウイルス粒子の存在を示し、
そして場合により、変種のゲノムは、切断型ウイルスゲノム、凝集体、組換え体および／またはＤＮＡ不純物である、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
組換えウイルス粒子の調製物の精製の際に組換えウイルス粒子の均一性をモニターする方法であって、精製工程における１つまたはそれ以上の工程に続いて、調製物から組換えウイルス粒子サンプルを除去すること、ならびに請求項７または８に記載の方法により、組換えウイルス粒子の不均一性を決定することを含み、インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子の相対量における増加は、組換えウイルス粒子の調製物中の全ウイルス粒子の均一性の増大を示す、前記方法。
【請求項１０】
組換えウイルス粒子の沈降は、吸光度、約２３０ｎｍ、２６０ｎｍもしくは２８０ｎｍにおける吸光度、干渉、およびレイリー干渉の１つまたはそれ以上によってモニターされ、ならびに／または、１０〜６０秒間ごとに、１０秒間ごとに、もしくは６０秒間ごとにモニターされる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
調製物は水溶液であり、該水溶液は、場合により、医薬製剤、緩衝液、生理学的ｐＨを有する緩衝液、生理学的浸透圧を有する緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびに、約７．２のｐＨおよび約３００ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有するＰＢＳの、１つまたはそれ以上を含む、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
モニターすることは、参照サンプルとの比較をさらに含み、参照サンプルは組換えウイルス粒子を含まない水溶液を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｃ（ｓ）値はラム方程式解を含むアルゴリズムによって決定され、
そして場合により、アルゴリズムはＳＥＤＦＩＴアルゴリズムであり、および／または、半径方向不変（ＲＩ）および時不変（ＴＩ）ノイズサブトラクションが適用される、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
沈降は、最低密度を有する組換えウイルス粒子が超遠心機のセクターの底に沈降する、組換えウイルス粒子が超遠心速度セルの底に沈降する、および、最低密度を有する組換えウイルス粒子が沈降し光学ウインドウが透明化する、の１つまたはそれ以上まで、モニターされる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも３０、約３０、約３０から約７５、約３０から約５０、または約５０から約７５スキャンが、組換えウイルス粒子の沈降をモニターするために使用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
正則化は、少なくとも約０．６８のＦ統計の信頼レベルでフィッティングレベルに適用され、
そして場合により、正則化は、二次微分正則化、最大エントロピー正則化、約０．６８から約０．９０のＦ統計の信頼レベルでフィッティングレベルに適用される、約０．６８から約０．９９のＦ統計の信頼レベルでフィッティングレベルに適用される、または、約０．６８のＦ統計の信頼レベルでフィッティングレベルに適用される、の１つまたはそれ以上である、
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
以下のＣ（ｓ）パラメーターは一定に保たれ：分解能は約２００Ｓから約５０００Ｓであり、Ｓｍｉｎは約１Ｓから約１００Ｓであり、Ｓｍａｘは約１００Ｓから約５０００Ｓであり、および摩擦比は約１．０であり、または遠心分離ソフトウェアによって決定された値に移行させ、
そして場合により、分解能は、約２００Ｓから約１０００Ｓもしくは約２００Ｓであり；Ｓｍｉｎは、約１Ｓであり：および／または、Ｓｍａｘは、約１００Ｓから約１０００Ｓ、約２００Ｓから約５０００Ｓ、もしくは約２００Ｓである、
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
境界沈降速度は、約３，０００ｒｐｍから約２０，０００ｒｐｍ、約３，０００ｒｐｍから約１０，０００ｒｐｍ、約１０，０００ｒｐｍから約２０，０００ｒｐｍ、約１５，０００ｒｐｍから約２０，０００ｒｐｍ、約４℃から約２０℃、約４℃の、１つまたはそれ以上で実行される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法を含む組換えウイルス粒子の産生のための工程を評価する方法であって、空のカプシド粒子の相対量と比較したインタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子、および／または組換えウイルス粒子の参照調製物と比較した変種の組換えウイルスゲノムを含む組換えウイルスカプシド粒子の相対量における増大が、組換えウイルス粒子の産生の改善を示す、前記方法。
【請求項２０】
組換えウイルス粒子は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、組換えアデノウイルス粒子、組換えレンチウイルス粒子または組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）粒子、場合によりＨＳＶ−１粒子またはＨＳＶ−２粒子である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ウイルス粒子はｒＡＡＶ粒子であり、
そして、該ｒＡＡＶ粒子は、
産生細胞株から；
ｉ）ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ｉｉ）ｒＡＡＶベクター配列、ならびにｉｉｉ）アデノウイルスヘルパー機能をコードする核酸の三重トランスフェクションによって；
ＡＡＶ／ＨＳＶハイブリッドによって；
昆虫細胞から；
ＡＡＶベクター配列、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐコード領域ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の好適な宿主細胞への一過性トランスフェクションによって；または、
ＡＡＶベクター配列、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐコード領域ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする１つまたはそれ以上の核酸の好適な宿主細胞への導入によって、
産生され、
該１つまたはそれ以上の核酸は組換えヘルパーウイルスを使用して細胞に導入され、場合により、該組換えヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
組換えウイルス粒子は、
アデノウイルスベクター配列ならびにアデノウイルス複製およびパッケージング配列をコードする核酸の好適な宿主細胞への一過性トランスフェクションによって；
レンチウイルスベクター配列ならびに／またはレンチウイルス複製およびパッケージング配列をコードする核酸の好適な宿主細胞への一過性トランスフェクションによって；または
ＨＳＶベクター配列ならびに／またはＨＳＶ複製およびパッケージング配列をコードする核酸の好適な宿主細胞への一過性トランスフェクションによって、
産生される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
空のカプシドが低減された組換えウイルス粒子および／または変種のゲノムを含む組換えウイルス粒子を調製するための方法であって、
ａ）組換えウイルス産生のために好適な条件下で宿主細胞を培養する工程であり、細胞は、
ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲを端に有する異種性導入遺伝子をコードする核酸、
ｉｉ）ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐコード領域を含む核酸であり、変異導入されたｐ５プロモーターを含み、ｐ５プロモーターからのｒｅｐ発現は野生型ｐ５プロモーターと比較して低減されている核酸、ならびに
ｉｉｉ）ＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸
を含む工程；
ｂ）組換えウイルス粒子を放出するように宿主細胞を溶解する工程；
ｃ）宿主細胞によって産生された組換えウイルス粒子を単離する工程；ならびに
ｄ）空のカプシドおよび／または変種のゲノムを有する組換えウイルス粒子の存在について請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法による分析超遠心分離法によって組換えウイルス粒子を分析する工程
を含み、
そして場合により、ｐ５プロモーターは、ｒｅｐおよび／もしくはｃａｐコード領域の３'に位置付けられている、ならびに／または、ＡＡＶヘルパーウイルス機能は、アデノウイルスＥ１Ａ機能、アデノウイルスＥ１Ｂ機能、アデノウイルスＥ２Ａ機能、アデノウイルスＶＡ機能およびアデノウイルスＥ４  ｏｒｆ６機能を含む、
前記方法。
【請求項２４】
組換えウイルス粒子は、１つまたはそれ以上の自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムを含み、該方法は、ｓｃＡＡＶゲノムの単量体形態またはｓｃＡＡＶゲノムの二量体形態を含む組換えウイルス粒子の存在を検出するために使用される、請求項１９、２１および２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
組換えウイルス粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶ２／２−７ｍ８カプシド、ＡＡＶ  ＤＪカプシド、ＡＡＶ２  Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２  Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２  Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ  Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシドまたはマウスＡＡＶカプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルスウイルス１）；およびＡＡＶ１  ＩＴＲ、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ＡＡＶ３  ＩＴＲ、ＡＡＶ４  ＩＴＲ、ＡＡＶ５  ＩＴＲ、ＡＡＶ６  ＩＴＲ、ＡＡＶ７  ＩＴＲ、ＡＡＶ８  ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８  ＩＴＲ、ＡＡＶ９  ＩＴＲ、ＡＡＶ１０  ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０  ＩＴＲ、ＡＡＶ１１  ＩＴＲ、ＡＡＶ１２  ＩＴＲ、ＡＡＶ  ＤＪ  ＩＴＲ、ヤギＡＡＶ  ＩＴＲ、ウシＡＡＶ  ＩＴＲまたはマウスＡＡＶ  ＩＴＲ；チロシン変異またはヘパリン結合変異を含むＡＡＶカプシド；
アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４〜３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型由来のカプシド；およびアデノウイルス血清型２カプシドの変種またはアデノウイルス血清型５カプシドの変種；
を含む、
または、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変種で偽型化される、
請求項２０または２３に記載の方法。