(57)【要約】  モグロール配糖体およびモグロールの新たな製造方法が求められていた。本発明は、モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を切断する工程を含む、モグロール配糖体および／またはモグロールの製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質と、モグロール配糖体を反応させて、モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含む、モグロールおよび/またはモグロール配糖体の製造方法。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１の製造方法において、タンパク質と反応させるモグロール配糖体が、モグロシドＶ、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、１１−オキソモグロシド、モグロシドには、モグロシドＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＢ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記モグロール配糖体が、モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、シアメノシドＩからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記モグロール配糖体がモグロシドＶである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのグルコシド結合が、モグロール３位に付加されたゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、モグロール３位に付加されたグルコースとアグリコンであるモグロールとの間のグルコシド結合、モグロール２４位に付加された分岐三糖のβ１，６−グルコシド結合、モグロール２４位に付加されたゲンチオビオースのβ−１，６‐グルコシド結合、モグロール２４位に付加されたソホロースのβ−１，２−グルコシド結合、および／またはモグロール２４位に付加されたグルコースとアグリコンであるモグロールとの間のグルコシド結合のいずれかである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、前記モグロール配糖体と接触させて、前記モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含む、モグロールおよび／またはモグロール配糖体の製造方法。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ前記モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記形質転換細胞が、形質転換麹菌、形質転換酵母、形質転換細菌または形質転換植物である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素剤と接触させるモグロール配糖体が、モグロシドＶ、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、１１−オキソモグロシド、モグロシドには、モグロシドＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＢ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記モグロール配糖体が、モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、シアメノシドＩからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのグルコシド結合が、モグロール３位に付加されたゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、モグロール３位に付加されたグルコースとアグリコンであるモグロールとの間のグルコシド結合、モグロール２４位に付加された分岐三糖のβ１，６−グルコシド結合、モグロール２４位に付加されたゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、モグロール２４位に付加されたソホロースのβ−１，２−グルコシド結合、および／またはモグロール２４位に付加されたグルコースとアグリコンであるモグロールとの間のグルコシド結合のいずれかである、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、モグロールおよび／またはモグロール配糖体の生産方法。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ前記モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記形質転換体が、形質転換麹菌、形質転換酵母、形質転換細菌または形質転換植物である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのグルコシド結合が、モグロール３位に付加されたゲンチオビオースのβ‐１，６‐グルコシド結合、モグロール３位に付加されたグルコースとアグリコンであるモグロールとの間のグルコシド結合、モグロール２４位に付加された分岐三糖のβ−１，６−グルコシド結合、モグロール２４位に付加されたゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、モグロール２４位に付加されたソホロースのβ−１，２−グルコシド結合、および／またはモグロール２４位に付加されたグルコースとアグリコンであるモグロールとの間のグルコシド結合のいずれかである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モグロールまたはモグロール配糖体の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラカンカ（Siraitia grosvenorii）は、中国広西チワン族自治区を原産地とするウリ科の植物である。ラカンカの果実は、強い甘味を呈し、その抽出物は、天然甘味料として利用されている。また、ラカンカの果実を乾燥したものは、漢方の生薬としても利用されている。
ラカンカの果実は、甘味成分として、モグロール配糖体を含むことが知られている。モグロール配糖体は、アグリコンであるモグロールにグルコースが結合した配糖体である。モグロール配糖体は、グルコースの結合位置や数の違いで各種モグロール配糖体に分類される。ラカンカの果実に含まれるモグロール配糖体は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩおよび１１−オキソモグロシドである。この他、モグロール配糖体には、モグロシドＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＢ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１などがあることが知られている。
アグリコンであるモグロールには生理活性作用として、抗ガン作用があることが知られている（非特許文献１）。【０００３】
モグロール配糖体からモグロールを調製する方法はいくつか知られており、例えば、モグロール配糖体を０．５Ｎ  ＨＣｌ中で９５−１００℃で１０時間加熱し、酸加水分解する方法が開示されている（非特許文献１）。【０００４】
その他に、モグロール配糖体を酵素で加水分解する方法が知られている（特許文献１）。この方法では、具体的には、Aspergillus niger由来のペクチナーゼを加えて５０℃、４８時間反応させる。しかしながら、この活性を担っている酵素タンパク質やそれをコードする遺伝子についいては明らかになっていない。【０００５】
酵母（Saccharomyces cerevisiae）にモグロシドＶをモグロシドＩＩＩＥに変換する活性があること、また、その活性を担う酵素の遺伝子がＥＸＧ１（ＧＨ５ファミリー、β−１，３グルカナーゼ）であることが開示されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／０７６５７７
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Am. J. Cancer Res., 5(4), 1308-1318, 2015
【非特許文献２】J. Agric. Food Chem., 61(29), 7127-7134, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のような状況の下、モグロールおよび／またはモグロール配糖体の新たな生産方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、麹菌由来のグリコシドヒドロラーゼであるＡＯＢＧＬ１１ｐが、モグロシドＶを加水分解しモグロールおよびモグロール配糖体を生成する活性を有することなどを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質と、モグロール配糖体を反応させて、モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含む、モグロールおよび／またはモグロール配糖体の製造方法。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質
（２）
前記（１）の製造方法において、タンパク質と反応させるモグロール配糖体が、モグロシドＶ、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、１１−オキソモグロシド、モグロシドには、モグロシドＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＢ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１からなる群より選択される少なくとも１つである、前記（１）に記載の方法。
（３）
前記モグロール配糖体が、モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、シアメノシドＩからなる群より選択される少なくとも１つである、前記（１）または（２）に記載の方法。
（４）
前記モグロール配糖体がモグロールＶである、前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）
前記少なくとも１つのグルコシド結合が、モグロール３位に付加されたゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、モグロール３位に付加されたグルコースとアグリコンであるモグロールとの間のグルコシド結合、モグロール２４位に付加された分岐三糖のβ−１，６−グルコシド結合、モグロール２４位に付加されたゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、モグロール２４位に付加されたソホロースのβ−１，２−グルコシド結合、および／またはモグロール２４位に付加されたグルコースとアグリコンであるモグロールとの間のグルコシド結合のいずれかである、前記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法。
（６）
宿主細胞に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、前記モグロール配糖体と接触させて、前記モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含む、モグロールおよび／またはモグロール配糖体の製造方法。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ前記モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（７）
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記（６）に記載の方法。
（８）
前記形質転換細胞が、形質転換麹菌、形質転換酵母、形質転換細菌または形質転換植物である、前記（６）または（７）に記載の方法。
（９）
前記酵素剤と接触させるモグロール配糖体が、モグロシドＶ、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、１１−オキソモグロシド、モグロシドには、モグロシドＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＢ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１からなる群より選択される少なくとも１つである、前記（６）〜（８）のいずれか１つに記載の方法。
（１０）
前記モグロール配糖体が、モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、シアメノシドＩからなる群より選択される少なくとも１つである、前記（６）〜（９）のいずれか１つに記載の方法。
（１１）
前記少なくとも１つのグルコシド結合が、モグロール３位に付加されたゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、モグロール３位に付加されたグルコースとアグリコンであるモグロールとの間のグルコシド結合、モグロール２４位に付加された分岐三糖のβ−１，６−グルコシド結合、モグロール２４位に付加されたゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、モグロール２４位に付加されたソホロースのβ−１，２−グルコシド結合、および／またはモグロール２４位に付加されたグルコースとアグリコンであるモグロールとの間のグルコシド結合のいずれかである、前記（６）〜（１０）のいずれか１つに記載の方法。
（１２）
以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、モグロールおよび／またはモグロール配糖体の生産方法。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ前記モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（１３）
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記（１０）に記載の方法。
（１４）
前記形質転換体が、形質転換麹菌、形質転換酵母、形質転換細菌または形質転換植物である、前記（１２）または（１３）に記載の方法。
（１５）
前記少なくとも１つのグルコシド結合が、モグロール３位に付加されたゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、モグロール２４位に付加された分岐三糖のβ−１，６−グルコシド結合、および／またはモグロール２４位に付加された分岐三糖のβ−１，２−グルコシド結合のいずれかである、前記（１２）〜（１４）のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法により、モグロールおよびモグロール配糖体の新たな製造方法が提供される。【００１２】
また、反応条件を選択することで、各種モグロール配糖体を製造することができる。本願発明の一実施形態では、酵素濃度等の反応条件を選択することで、モグロールおよび／またはモグロール配糖体の生成量を増加させることができる。また、本願発明の一実施形態により、シアメノシドＩなどのモグロール四糖配糖体、モグロシドＩＩＩＥなどのモグロール三糖配糖体、モグロール二糖配糖体などの生成量を選択的に増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列。
【図１Ｂ】ＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列。
【図２】Ａ：ｐＮＰ−β−Ｇｌｃを基質とした、ＡＯＢＧＬ１１ｐの至適温度。Ｂ：ｐＮＰ−β−Ｇｌｃを基質とした、ＡＯＢＧＬ１１ｐの至適ｐＨ。Ｃ：ｐＮＰ−β−Ｇｌｃを基質とした、ＡＯＢＧＬ１１ｐの熱安定性。Ｄ：ｐＮＰ−β−Ｇｌｃを基質とした、ＡＯＢＧＬ１１ｐのｐＨ安定性。
【図３Ａ】ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡ配列とｃＤＮＡ配列の比較。
【図３Ｂ】ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡ配列とｃＤＮＡ配列の比較。
【図４】ＢＧＬ１１−１粗酵素液とモグロシドＶの反応。Ａ：基質なし、ＢＧＬ１１−１粗酵素液希釈なし。Ｂ：基質としてモグロシドＶを添加、ＢＧＬ１１−１粗酵素液の希釈倍率は１００倍。Ｃ：基質としてモグロシドＶを添加、ＢＧＬ１１−１粗酵素液の希釈倍率は１０倍。Ｄ：基質としてモグロシドＶを添加、ＢＧＬ１１−１粗酵素液は希釈なし。
【図５】Ｃ−１粗酵素とモグロシドＶの反応。Ａ：基質なし、Ｂ：基質としてモグロシドＶを添加。Ｃ−１粗酵素液はいずれも希釈なしで用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１６年７月１９日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１６−１４１６８５号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００１５】
以下において基質としてのモグロール配糖体を「基質モグロール配糖体」と呼び、生成物としてのモグロール配糖体を「生成モグロール配糖体」と呼ぶこともある。また、両者を「モグロール配糖体」と総称することもある。
「ＡＯＢＧＬ１１ｐ」は麹菌由来のβ-グルコシダーゼであり、そのｃＤＮＡ配列は配列番号１に、アミノ酸配列は配列番号２に、そしてゲノムＤＮＡ配列は配列番号３に示される。
【００１６】
１．モグロールおよび／またはモグロール配糖体の製造方法
本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」という）と、モグロール配糖体を反応させて、少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含む、モグロールおよび／またはモグロール配糖体の製造方法を提供する。一実施形態において、本発明は、モグロール配糖体のすべてのグルコシド結合を切断する工程を含むモグロールの製造方法を提供する。別の実施態様では、本発明はモグロール配糖体の特定の結合、例えば、モグロール３位に付加されたゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、および/または、モグロール２４位に付加された分岐三糖のβ−１，６−グルコシド結合を優先して切断する工程を含む、モグロールおよび／またはモグロール配糖体の製造方法を提供する。この場合、β−１，６−グルコシド結合の切断に加えて、分岐三糖のβ−１，２−グルコシド結合を切断する工程を含んでもよい。
【００１７】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質
【００１８】
上記（ｂ）または（ｃ）に記載のタンパク質は、代表的には、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体であるが、例えば、”Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol.4,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012”、”Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997”、”Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、”Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、”Gene, 34, 315 (1985)”、”Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、”Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
【００１９】
「配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質」としては、配列番号２のアミノ酸配列において、例えば、１〜８３個、１〜８０個、１〜７５個、１〜７０個、１〜６５個、１〜６０個、１〜５５個、１〜５０個、１〜４９個、１〜４８個、１〜４７個、１〜４６個、１〜４５個、１〜４４個、１〜４３個、１〜４２個、１〜４１個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個（１〜数個）、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
【００２０】
また、このようなタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００２１】
ここで、「モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合」とは、モグロールに糖が結合した配糖体であるモグロール配糖体において、アグリコンであるモグロールと側鎖との間のグルコシド結合、および側鎖内のグルコシド結合を意味する。また、「モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性」とは、モグロールに糖が結合した配糖体であるモグロール配糖体において、アグリコンであるモグロールと側鎖との間のグルコシド結合、および側鎖内のグルコシド結合のうち少なくとも１つを切断（加水分解）する活性を意味する。側鎖内のグルコシド結合の例としては、モグロール３位に付加されたゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、モグロール２４位の分岐三糖のβ−１，６−グルコシド結合、モグロール２４位の分岐三糖のβ−１，２−グルコシド結合、モグロール２４位に付加されたゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、および/または、モグロール２４位に付加されたソホロースのβ−１，２−グルコシド結合が挙げられる。ある実施形態において、すべてのグルコシド結合が加水分解され、モグロール配糖体からモグロールを生じる。別の実施形態では、モグロール３位に付加されたゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、および/または、モグロール２４位の分岐三糖のβ−１，６−グルコシド結合が優先して加水分解される。このようにして、一部の糖のみ切断されたモグロール配糖体が生じる。
【００２２】
モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性は、本発明のタンパク質と、たとえばモグロシドＶ、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、１１−オキソモグロシド、モグロシドＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＢ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１からなる群より選択される少なくとも１つのモグロール配糖体を反応させて、得られた反応生成物（モグロールおよび／またはモグロール配糖体）を精製し、精製したものを液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＬＣ）等の公知の手法により分析することで確認することができる。
【００２３】
「配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加された」とは、同一配列中の任意かつ１〜８３個のアミノ酸配列中の位置において、１〜８３個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
【００２４】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
【００２５】
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
【００２６】
本発明のタンパク質は、これをコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を適切な宿主細胞内で発現させることなどにより得ることができるが、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、ＡＡＰＰＴｅｃ  ＬＬＣ製、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．製、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．製、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００２７】
本発明において、「モグロール配糖体」とは、モグロールに糖が結合した配糖体である。モグロールおよびモグロール配糖体の例は、下記一般式（Ｉ）で示される。なお、モグロール３位およびモグロール２４位を式中に示した。本発明において、「分岐三糖」とは、下記一般式（Ｉ）においてＲ２の部分に付加されるもののうち三糖を構成するものをいう。
【化１】
2018016483.tif 000002
【表１】
2018016483.tif 000003
【００２８】
モグロール配糖体の例としては、モグロシドＶ、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、１１−オキソモグロシド、モグロシドＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＢ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明の一実施形態では本発明の酵素は配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質および／またはその変異体からなるタンパク質を用いる。別の実施形態では、基質としてモグロール配糖体が利用可能である。ここで、モグロール配糖体の例は前述のとおりである。本発明の一実施形態では、本発明の酵素を用いて、反応に添加する酵素量を調節したり、反応液中に有機溶媒を添加したり、反応温度を調節したりすることで反応条件を調節することにより、ラカンカ果実にもっとも多く含まれるモグロール配糖体であるモグロシドＶを基質として、モグロシドＩＩＩＥやモグロシドＩＩ（モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＢ、モグロシドＩＩＥ）といった希少なモグロール配糖体を生成することも可能である。
【００３０】
本発明において、モグロール配糖体を基質とした反応の酵素量、基質／酵素比、温度、ｐＨ、溶媒の有無、反応時間等は、当業者が適宜調整でき、これらを調整することによりモグロール配糖体に結合している糖をどこまで切断するか分解度合を制御することが可能である。
【００３１】
本発明に係るモグロールおよび／またはモグロール配糖体の製造方法によって、モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合が加水分解される。
【００３２】
本発明のモグロールおよび／またはモグロール配糖体の製造方法において、出発物質となるモグロール配糖体は、ラカンカ（Siraitia grosvenorii）から適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルやその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、超高性能液体クロマトグラフィー  （Ｕｌｔｒａ  （Ｈｉｇｈ）  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＰＬＣ）  等の公知の方法によって抽出し、精製することによって入手することができる。あるいは、出発物質となるモグロール配糖体は、市販のものでもよい。本発明の出発物質となるモグロール配糖体としては、モグロシドＶ、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、１１−オキソモグロシド、モグロシドＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＢ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１の他、β−１，６−グルコシド結合または、β−１，２−グルコシド結合の切断により種々のモグロール配糖体、例えばシアメノシドＩ、モグロシドＩＩＩE、モグロール二糖配糖体等を得ることができるものを含む。
【００３３】
本発明に係るモグロールおよび／またはモグロール配糖体の製造方法は、本発明のタンパク質と、モグロール配糖体を反応させて、モグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含む。本発明の方法は、さらに、前記工程で生成した本発明のモグロールおよび／またはモグロール配糖体を精製する工程を含んでいてもよい。
本発明のモグロールおよび／またはモグロール配糖体は、適切な溶媒（水等の水性溶媒、またはアルコール、エーテル、アセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルやその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ  （Ｈｉｇｈ）  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＰＬＣ）等の公知の方法によって精製することができる。
【００３４】
本発明に係るモグロール配糖体および／またはモグロールの製造方法は、基質を含む反応液に有機溶媒を添加した条件下で行うことができる。有機溶媒は、反応液全量に対し１％〜２０％の範囲とすることができ、好ましくは５％〜１５％、６〜１２％、より好ましくは８％である。有機溶媒は、一般的に入手可能なものでよく、好ましくは水と任意の割合で混合するものがよく、アセトニトリル等を用いることができる。有機溶媒は、反応液に予め添加してもよく、また反応の途中段階で添加してもよい。
【００３５】
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
【００３６】
配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３７】
「配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質」としては、前述のものが挙げられる。
【００３８】
「配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質」としては、前述のものが挙げられる。
【００３９】
本明細書中、「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、”Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Ｖol. 4, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2012”、”Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997”などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書中、「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６２℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００４０】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５〜６０℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。あるいは、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列、または配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列の全部または一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００４１】
上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＢＬＡＳＴの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１の塩基配列のＤＮＡ、または配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと６０％以上、６１％以上、６２％以上、６３％以上、６４％以上、６５％以上、６６％以上、６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００４２】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90:5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００４３】
上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法または公知の合成手法によって取得することが可能である。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドは、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの５’末端に含まれる。分泌シグナルペプチドおよびそれをコードする塩基配列からポリヌクレオチドは、前記と同様である。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。
【００４６】
適切な発現ベクターは、通常、
（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
【００４７】
発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージまたはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００４８】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００４９】
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーターおよび／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターの例としては、ｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ（ＭＭＴＶ）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネインプロモーター及びヒートショックプロテインプロモーター等が挙げられる。
【００５０】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ｕｒａ５、ｎｉａＤ）、薬剤耐性マーカー（ハイグロマイシン、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 337, 1984）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，  ＰＤＲ４）（それぞれ、猪腰淳嗣ら，生化学，vol. 64, p. 660, 1992; Hussain et al., Gene, vol. 101, p. 149, 1991）などが利用可能である。
【００５１】
本発明の形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。形質転換の対象となる細胞または生物としては、従来公知の各種細胞または生物を好適に用いることができる。形質転換の対象となる細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、糸状菌（麹菌Aspergillus oryzae、Aspergillus sojae）、植物細胞、ヒトを除く動物細胞等が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も、特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物または植物またはヒトを除く動物が挙げられる。形質転換体は、好ましくは、糸状菌、酵母または植物である。
形質転換で用いられる宿主として、モグロール配糖体のいずれかを生成するものを用いることもできる。ラカンカのように、元来少なくとも１つのモグロール配糖体を生成する植物だけではなく、本来モグロール配糖体を生成しない細胞または生物に少なくとも１つのモグロール配糖体の生成に必要な遺伝子を導入したものを宿主として用いることができる。「モグロール配糖体の生成に必要な遺伝子」は、例えば、ＷＯ２０１６／０５０８９０などに記載のモグロール配糖体合成活性を有する遺伝子が挙げられる。
【００５２】
宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, p. 4655-4661, 2000）、パーティクルデリバリー法（特開２００５−２８７４０３「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 75, p. 1929, 1978）、酢酸リチウム法（J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983）、Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。また、植物、もしくは植物に由来する組織や細胞への遺伝子導入の際には、例えばアグロバクテリウム法（Plant Molecular Biology Manual, Gelvin, S. B. et al., Academic Press Publishers）、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポーレーション法などを適宜選択して用いることができる。
【００５３】
形質転換体が、酵母または麹菌である場合、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された酵母または麹菌は、野生型と比べて本発明のタンパク質を多く発現する。このため、発現した本発明のタンパク質が、酵母または麹菌で生成されたモグロール配糖体と反応し、モグロールおよび／またはモグロール配糖体が酵母または麹菌の細胞内または培養液中、好ましくは、培養液中に生成される。
【００５４】
形質転換体が、植物である場合、本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。本発明のポリヌクレオチドが植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物（以下、「本発明の植物」）は、その野生型と比べて本発明のタンパク質を多く含む。このため、本発明のタンパク質が、本発明の植物で生成されたモグロール配糖体と反応し、モグロールが植物中に生成する。また、植物体のなかの環境が加水分解反応に最適でない場合は、モグロール配糖体のグルコシド結合の加水分解反応は抑制され、グルコシド結合が切断されずに維持されたモグロール配糖体やグルコシド結合の一部のみが切断されたモグロール配糖体が生成する。
【００５５】
そこで、本発明は別の実施態様として、本発明のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、モグロールおよび／またはモグロール配糖体の生産方法を提供する。
【００５６】
本発明のいくつかの態様の形質転換体またはその培養液は、その野生型と比べて本発明のモグロールおよび／またはモグロール配糖体の含有量が高く、その抽出物または培養液には、本発明のモグロールおよび／またはモグロール配糖体が高濃度で含まれる。本発明の形質転換体の抽出物は、形質転換体をガラスビーズ、ホモジェナイザーまたはソニケーター等を用いて破砕し、当該破砕物を遠心処理し、その上清を回収することにより、得ることができる。本発明のモグロールおよび／またはモグロール配糖体が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により形質転換体と培養上清とを分離することにより、本発明のモグロールおよび／またはモグロール配糖体を含む培養上清を得ることができる。
【００５７】
このようにして得られた抽出液もしくは培養上清は、さらに精製工程に供してもよい。本発明のモグロールおよび／またはモグロール配糖体の精製は、通常の分離および精製方法に従って行うことができる。具体的な方法は、前記と同様である。
【００５８】
非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を用いた本発明のモグロール配糖体および／またはモグロールの製造方法
本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させ、細胞を破砕することにより本発明のタンパク質を得ることができる。本発明のタンパク質を作用させることで、本発明のモグロール配糖体および／またはモグロールを生成することもできる。
具体的には、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤を、グルコシド結合を少なくとも１つを有するモグロール配糖体と接触させることによりモグロールを生成することができる。本発明のタンパク質は、酵母で発現させた場合にも麹菌で発現させた場合と同等の活性を示すことが実施例においても確認されている。  「形質転換細胞に由来する酵素剤」は、形質転換細胞を用いて調製され、本発明のタンパク質を含むものであれば限定されないが、例えば、形質転換細胞自体、形質転換細胞の粉砕物自体、形質転換細胞の培養上清自体、およびこれらの精製物である。そこで、本発明は、宿主細胞に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、グルコシド結合を少なくとも１つを有するモグロール配糖体と接触させて、少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含むモグロールおよび／またはモグロール配糖体の製造方法を提供する。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつモグロール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００５９】
上記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドであり、前記と同様である。
【００６０】
「接触」とは、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤とグルコシド結合を少なくとも１つを有するモグロール配糖体とを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤を含む容器に少なくとも１つのグルコシド結合を有するモグロール配糖体を添加すること、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤と少なくとも１つのグルコシド結合を有するモグロール配糖体とを混合すること、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤を少なくとも１つのグルコシド結合を有するモグロール配糖体を含む容器に添加することが含まれる。
【００６１】
「モグロール配糖体」、「少なくとも１つのグルコシド結合を有するモグロール配糖体」、及び「少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性」は、前記と同様である。
【００６２】
その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、“Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Ｖol. 4, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012”、“Methods in Yeast Genetics, A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）”等を参照することができる。
【００６３】
このようにして得られた本発明のモグロールおよび/またはモグロール配糖体は、常法に従って、例えば、食品、甘味料、香料、医薬品、工業原料（化粧料、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。
【００６４】
食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、老人用食品等が挙げられる。本明細書中、食品は、固体、流動体、および液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称である。
【００６５】
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。【００６７】
[実施例１]
麹菌のβ−グルコシダーゼ遺伝子の探索
麹菌ゲノムデータ（PRJNA28175）より、β−グルコシダーゼホモログを探索し、菌体内β−グルコシダーゼのホモログであるＡＯ０９０７０１０００２４４（ＣＤＳ配列：配列番号１、推定アミノ酸配列：配列番号２、ＯＲＦ配列：配列番号３、ゲノムＤＮＡ配列：配列番号４）を見出した。これをＡＯＢＧＬ１１としてクローン化することにした。ＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列を図１に示す。【００６８】
ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡのクローニング
ＡＯＢＧＬ１１をクローニングするために、以下のプライマーを設計した。
ＡＯＢＧＬ１１−Ｆ：
５´‐ＡＴＧＣＣＴＣＧＴＣＴＡＧＡＣＧＴＣＧＡＧＡＡ‐３´（配列番号４）
ＡＯＢＧＬ１１−Ｒ：
５´‐ＴＣＡＣＡＧＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＡＧＣＧＡ‐３´（配列番号５）【００６９】
麹菌  Aspergillus oryzae var. Brunneus（ＩＦＯ３０１０２）の分生子を液体培地（１Ｌあたり、グルコース  ２０ｇ、バクトトリプトン  １ｇ、酵母エキス  ５ｇ、ＮａＮＯ３  １ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ）１０ｍｌに植菌し、３０℃で１日間培養した。ろ過により菌体を集め、液体窒素中ですりつぶしたあと、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ゲノムＤＮＡを調製した。
ゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＡＯＢＧＬ１１−ＦとＡＯＢＧＬ１１−Ｒを用いて、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡）でＰＣＲを行った。得られた約２．５７ｋｂｐのＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン）を使ってクローン化し、プラスミドｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ１１ｇを得た。【００７０】
[実施例２]
麹菌によるＡＯＢＧＬ１１ｐの生産
麹菌発現用ベクターの構築
麹菌用ベクターｐＵＮＡ（酒類総合研究所）を制限酵素ＳｍａＩで消化して得られたＤＮＡ断片と、プラスミドｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ１１ｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し末端をＢｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）によって平滑化して得られた約２．５７ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＵＮＡ−ＡＯＢＧＬ１１ｇを得た。【００７１】
麹菌の形質転換
麹菌の形質転換は以下のとおり実施した。
宿主として、Aspergillus oryzae niaD300株（酒類総合研究所）を使用した。宿主株をＰＤＡプレートに植菌し、３０℃でおよそ１週間培養した。分生子懸濁液を得るために、０．１％  ｔｗｅｅｎ８０，  ０．８％  ＮａＣｌを加え、分生子を懸濁した。ミラクロスでろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、０．１％  ｔｗｅｅｎ８０，  ０．８％  ＮａＣｌで洗浄し、滅菌水に懸濁した。
分生子をＣＤプレート（１Ｌあたり、ＮａＮＯ３  ６ｇ、ＫＣｌ  ０．５２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １．５２ｇ、グルコース  １０ｇ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  ２ｍｌ、Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１Ｌあたり、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ８．８ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．４ｇ、ＮａＢ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ  ０．０５ｇ  ）  １ｍｌ、アガー  ２０ｇ（ｐＨ６．５））に塗布し、パーティクルデリバリー法により、ＤＮＡの導入を行った。ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（バイオラッド）を使って、パーティクル：タングステンＭ−１０、ラプチャーディスク：１１００ｐｓｉ、距離：３ｃｍとした。形質転換株として、ＣＤプレートで生育するものを選抜した。プラスミドｐＵＮＡ−ＡＯＢＧＬ１１ｇにより形質転換して得られた形質転換株をＢＧＬ１１−１株、コントロールベクターｐＵＮＡにより形質転換して得られた形質転換株をＣ−１株とした。【００７２】
麹菌によるＡＯＢＧＬ１１ｐの発現
ＢＧＬ１１−１株またはＣ−１株をＣＤプレートに植菌し、３０℃で７日間培養し、分生子を形成させた。分生子懸濁液を得るために、０．１％  ｔｗｅｅｎ８０，  ０．８％  ＮａＣｌを加え、分生子を懸濁した。ミラクロス（登録商標）でろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、０．１％  ｔｗｅｅｎ８０，  ０．８％  ＮａＣｌで洗浄し、滅菌水に懸濁し、分生子懸濁液としたこの分生子懸濁液を酵素生産用液体培地（１Ｌあたり、マルトース  １００ｇ、バクトトリプトン  １ｇ、酵母エキス  ５ｇ、ＮａＮＯ３  １ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ）  に植菌し、３０℃で２日間振とう培養を行った。ミラクロス（登録商標）によりろ過して菌体を集めた。得られた湿菌体  約４ｇを液体窒素で凍結し、乳鉢ですりつぶした。すりつぶした菌体を５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、よく混合した後、遠心分離した。得られた上清を、アミコン（登録商標）ウルトラ−１５  ５０ｋ（メルク）で、限外ろ過により濃縮し、０．１％  ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０（バッファーＡ）で置換することにより、約１ｍｌの粗酵素液を得た。【００７３】
タンパク質濃度の測定
粗酵素液のタンパク質濃度は、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（５倍濃縮）（ナカライテスク）を用いて定量した。その結果、ＢＧＬ１１−１粗酵素液  ６．４６ｍｇ／ｍｌ、Ｃ−１粗酵素液４ｍｇ／ｍｌであった。【００７４】
[実施例３]
ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ分解活性
ｐＮＰ−β−Ｇｌｃの分解活性を検討した。粗酵素液１０μＬ、０．２Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）５０μＬ、２０ｍＭ  ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ水溶液  ５０μＬ、水を加えてトータル２００μＬとし、３７℃で反応させた。なお、ＢＧＬ１１−１粗酵素液は活性が高かったため、粗酵素液を０．１％  ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）バッファーで１００倍に希釈したものを用いた。ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ  が加水分解して遊離したｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）に基づく１分間あたりの４０５ｎｍの吸光度変化（Δ４０５）は、ＢＧＬ１１−１粗酵素液で０．２４４、Ｃ−１粗酵素液で０．０００であった。
以上のことからも、ＡＯＢＧＬ１１ｐがβ−グルコシダーゼ活性を担っていることが示唆された。【００７５】
ｐＮＰ−β−Ｇｌｃを基質として、ＡＯＢＧＬ１１ｐの至適温度、至適ｐＨおよび熱安定性、ｐＨ安定性を調べた（図２（図２Ａ−図２Ｄ））。
なお、ＢＧＬ１１−１粗酵素液はバッファーＡで５０００倍希釈したもの（タンパク質濃度  １．３μｇ／ｍｌ）を使用した。【００７６】
至適温度：
反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）  ２０μｌ、０．２Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）  １００μｌ、２０ｍＭ  ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ、水を加えてトータル４００μｌとし、反応開始から１５分、３０分、４５分に１００μｌをサンプリングして１００μｌ  ０．２Ｍ  炭酸ナトリウム溶液と混合してから、４０５ｎｍの吸光度を測定し、Δ４０５を求めた。Δ４０５が最大となった４５℃を１として、各温度で反応させたときのΔ４０５の比率を図２Ａに示した。これにより、４５−５０℃が反応至適温度であることが分かった。【００７７】
至適ｐＨ：
反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）  ２０μｌ、０．２Ｍ  バッファー  １００μｌ、２０ｍＭ  ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ、水を加えてトータル４００μｌとした。バッファーは、ｐＨ４．０−６．０のとき酢酸ナトリウムバッファーを、ｐＨ６．０−８．０のときリン酸ナトリウムバッファーを用いた。上記と同様にサンプリング、測定を行い、Δ４０５の最大値に対する各ｐＨで反応させたときのΔ４０５の比率を図２Ｂに示した。これにより、ｐＨ６．０−７．０が反応至適ｐＨであることが分かった。【００７８】
熱安定性：
５０００倍希釈した粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）を３０℃、３７℃、４５℃、５０℃でそれぞれ１０分間保持したあと氷冷した。反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）  ５μｌ、０．２Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）  １００μｌ、２０ｍＭ  ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ、水を加えてトータル１００μｌとし、３７℃で４５分間反応させたあと、０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液  １００μｌを添加し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。熱処理しなかった酵素液による４５分後の４０５ｎｍの吸光度に対する各温度で処理したときの比率を求め、図２Ｃに示した。ＡＯＢＧＬ１１ｐは、１０分間の処理では３７℃まで安定であるが、４５℃での処理で約半分にまで失活し、５０℃の処理では、活性がほぼ失われることが分かった。【００７９】
ｐＨ安定性：
粗酵素液を、ｐＨ４．５、５．０、５．５、６．０（０．２Ｍ酢酸バッファー）、ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０（０．２Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー）の各バッファーで５０００倍希釈し、３７℃で１時間保持したあと氷冷した。反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）  ５μｌ、０．２Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）  １００μｌ、２０ｍＭ  ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ、水を加えてトータル１００μｌとし、３７℃で４５分間反応させたあと、０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液  １００μｌを添加し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。活性のもっとも高かったｐＨ６．５で保持したときの吸光度に対する各ｐＨで保持したときの吸光度の比率を求め、図２Ｄに示した。ＡＯＢＧＬ１１ｐは、ｐＨ６．５付近で最も安定であることがわかった。【００８０】
[実施例４]
ＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡのクローニング
ＢＧＬ１１−１株を酵素生産用培地１０ｍｌで培養し、ろ過により菌体を集めた。菌体を液体窒素で凍結し、乳鉢で菌体をすりつぶしてから、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ）でトータルＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ）により、ｃＤＮＡを合成した。これを鋳型として、プライマーＡＯＢＧＬ１１−ＦとＡＯＢＧＬ１１−Ｒを用いて、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡）でＰＣＲを行った。得られた約２．５２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン）を使ってＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡをクローン化し、プラスミドｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ１１ｃＤＮＡを得た。塩基配列を確認したところ、配列番号１の通りであった。ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡ配列とｃＤＮＡ配列を比較したものを図３に示す。【００８１】
[実施例５]
酵母でのＡＯＢＧＬ１１ｐの生産
酵母用発現ベクターの構築と酵母の形質転換
プラスミドｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ１１  ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して得られた約２．５２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、酵母発現ベクターｐＹＥ２２ｍ（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995）のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ＡＯＢＧＬ１１がベクターｐＹＥ２２ｍのＧＡＰＤＨプロモーターから発現する向きに挿入されたものを選抜し、ｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ３ｃとした。形質転換の親株として、S. cerevisiaeのＥＨ１３−１５株（ｔｒｐ１，ＭＡＴα）（Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989）を用いた。
プラスミドｐＹＥ２２ｍ（コントロール）、ｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ１１（ＡＯＢＧＬ１１発現用）をそれぞれ用いて酢酸リチウム法により、ＥＨ１３−１５株を形質転換した。形質転換株は、ＳＣ−Ｔｒｐ（１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、およびアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇを含む）寒天培地（２％アガー）上で生育するものを選抜した。【００８２】
プラスミドｐＹＥ２２ｍで形質転換して得られた株をＣ−Ｙ株、プラスミドｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ１１で形質転換して得られた株をＡＯＢＧＬ１１−Ｙ株とした。
選抜したＣ−Ｙ株とＡＯＢＧＬ１１−Ｙ株を、１Ｍリン酸カリウムバッファーを１／１０量添加したＳＣ−Ｔｒｐ液体培地１０ｍＬに１白金耳植菌し、３０℃、１２５ｒｐｍで２日間振とう培養した。得られた培養物を遠心分離により、培養上清と菌体に分けた。培養上清は、アミコン(登録商標)ウルトラ−１５  ５０ｋ（メルク）で限界ろ過に濃縮して０．１％  ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）でバッファー置換し、約１ｍｌの培養上清濃縮液を得た。
菌体は、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．１％ＣＨＡＰＳ溶液  １ｍｌに懸濁して、ガラスビーズにて菌体を破砕し、遠心分離して得られた上清を菌体破砕液とした。
培養上清濃縮液または菌体破砕液を２０μｌとり、２％  Ｘ‐β‐Ｇｌｃ／ＤＭＦ溶液を１μｌ添加し、室温で５分間反応させたところ、ＡＯＢＧＬ１１−Ｙ株由来の菌体破砕液のみ青色を呈し、Ｘ−β−Ｇｌｃ活性を有することが示唆された。【００８３】
ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ活性測定
ｐＮＰ−β−Ｇｌｃの分解活性を検討した。粗酵素液１０μＬ、０．２Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）５０μＬ、２０ｍＭ  ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ水溶液  ５０μＬ、水を加えてトータル２００μＬとし、３７℃で反応させた。なお、ＢＧＬ１１−１粗酵素液は活性が高かったため、粗酵素液を０．１％  ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）バッファーで１００倍に希釈したものを用いた。ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ  が加水分解して遊離したｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）に基づく１分間あたりの４０５ｎｍの吸光度変化（Δ４０５）は、ＡＯＢＧＬ１１−Ｙ粗酵素液で０．０６８、Ｃ−Ｙ粗酵素液で０．０００であった。【００８４】
[実施例６]
麹菌で生産したＡＯＢＧＬ１１ｐのモグロール配糖体加水分解活性
基質としてはモグロシドＶを用いた。モグロシドＶを５０μｇ／ｍＬ、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、上記ＢＧＬ１１−１粗酵素液またはその希釈液２０μＬで、全量１００μＬとし、３７℃で、１時間反応させた。コントロールとして、上記Ｃ−１粗酵素液も同様に反応させた。反応液を、メタノールで洗浄し水で平衡化したＳｅｐＰａｋＣ１８  ５００ｍｇ（Ｗａｔｅｒｓ）に供した。４０％メタノールで洗浄後、８０％メタノールで溶出し、スピードバックで乾固した。１００μＬの水に溶解し、ＨＰＬＣに供した。【００８５】
ＨＰＬＣの分析条件は以下の通りである。
カラム：コスモシール５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ  ４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５０ｍｍ（ナカライテスク）
移動相：Ａ；アセトニトリル、Ｂ；水
Ｂ  ｃｏｎｃ．９０％→３０％  ６０分  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ
流速：１ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：ＵＶ  ２０３ｎｍ【００８６】
結果を図４に示す。【００８７】
１００倍希釈したＢＧＬ１１−１粗酵素液と反応させた場合、基質のモグロシドＶの一部が加水分解され、４糖のモグロール配糖体が生成している。この４糖のモグロール配糖体は、保持時間からモグロシドＶのモグロール３位に付加されたゲンチオビオースのβ−１，６結合が加水分解されたシアメノシドＩであると考えられた。
１０倍希釈した酵素液と反応させた場合は、さらに加水分解が進み、４糖、３糖（保持時間よりモグロシドIIIＥ）、２糖のモグロール配糖体が生成した。
さらに、酵素液を希釈せずに反応させた場合には、基質として添加したモグロシドＶをはじめ配糖体は検出されず、アグリコンであるモグロールが検出された。
すなわち、ＢＧＬ１１−１粗酵素液によるモグロシドＶの加水分解反応は、グルコースが１つずつ順番に切断され、最終的にアグリコンであるモグロールにまで加水分解する様式で進行することが明らかになった。また、酵素液の濃度を調整することにより、モグロール配糖体の加水分解の進行を制御することが可能であることが示される。また、Ｃ−１粗酵素液とモグロシドＶとの反応の結果は図５に示され、この結果により、Ｃ−１粗酵素液はモグロシドＶの加水分解を進行させないことが示される。
[実施例７]【００８８】
酵母で生産したＡＯＢＧＬ１１ｐによるモグロール配糖体の加水分解活性
Ｃ−Ｙ株とＡＯＢＧＬ１１−Ｙ株の菌体破砕液が有するモグロール配糖体の加水分解活性を試験した。
基質  ５０μｇ／ｍｌ、酵素液  ２０μｌ、  ５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）を混合して、全量を１００μｌとし、３７℃で１時間反応させた。反応液を精製した後、ＨＰＬＣ分析に供した。なお、反応液の精製方法、ＨＰＬＣの条件は上述のとおりである。【００８９】
Ｃ−Ｙ株由来の菌体破砕液で反応した場合、いずれのモグロール配糖体でも生成物を検出することはできなかった。一方、ＡＯＢＧＬ１１−Ｙ株由来の菌体破砕液に基質としてモグロシドＶを用いた場合、生成物として、シアメノシドＩ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロール二糖配糖体、モグロールが生成する。このように、ＡＯＢＧＬ１１は酵母で発現させた場合にも麹菌で発現させた場合と同等の活性を示すことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本願発明は、麹菌由来のグルコシドヒドラーゼであるＡＯＢＧＬ１１ｐを用いて、モグロシドＶを加水分解し、モグロールおよび／またはモグロール配糖体を生産する方法を提供する。
【図１Ａ】
2018016483.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2018016483000001.app
【国際調査報告】
2018016483.tif 000011
2018016483.tif 000012
2018016483.tif 000013
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