(57)【要約】【課題】抗体とリソソーム酵素との融合蛋白質を有効成分として含有してなる，市場に流通させることが可能な程度に安定な医薬組成物を提供すること。【解決手段】抗体とリソソーム酵素との融合蛋白質を有効成分として含有し，更に，中性塩，ニ糖類，非イオン性界面活性剤，及び緩衝剤を含有してなる，凍結乾燥製剤。かかる凍結乾燥製剤としては，例えば，抗トランスフェリン受容体抗体とヒトイズロン酸−２−スルファターゼとの融合蛋白質を有効成分として含有し，更に，中性塩として塩化ナトリウム，ニ糖類としてスクロース，非イオン性界面活性剤としてポロキサマー，及び緩衝剤としてリン酸緩衝剤を含有してなるものが挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体とリソソーム酵素との融合蛋白質を有効成分として含有してなる凍結乾燥製剤であって，中性塩，ニ糖類，非イオン性界面活性剤，及び緩衝剤を更に含有してなる，凍結乾燥製剤。
【請求項２】
該中性塩が塩化ナトリウムである，請求項１に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３】
該ニ糖類がトレハロース，スクロース，マルトース，及び乳糖からなる群から選択されるものである，請求項１又は２に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項４】
該非イオン性界面活性剤が，ポリソルベート又はポロキサマーである，請求項１乃至３の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
【請求項５】
該非イオン性界面活性剤が，ポリソルベート２０，ポリソルベート８０，及びポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールからなる群から選択されるものである，請求項１乃至３の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
【請求項６】
該緩衝剤がリン酸緩衝剤である，請求項１乃至５の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
【請求項７】
該ニ糖類がスクロースであり，該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールであり，及び該緩衝剤がリン酸緩衝剤である，請求項１又は２に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項８】
該中性塩，該ニ糖類，及び該イオン性界面活性剤の含量が，該融合蛋白質の含量に対して，それぞれ，０．０１５〜２．５（ｗ／ｗ），２．５〜２００（ｗ／ｗ），及び０．００５〜６（ｗ／ｗ）である，請求項１乃至７の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
【請求項９】
該中性塩，該ニ糖類，及び該イオン性界面活性剤の含量が，該融合蛋白質の含量に対して，それぞれ，０．０５〜０．５（ｗ／ｗ），５〜５０（ｗ／ｗ），及び０．０２〜０．２（ｗ／ｗ）である，請求項１乃至７の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１０】
該中性塩，該ニ糖類，及び該イオン性界面活性剤の含量が，該融合蛋白質の含量に対して，それぞれ，０．１〜０．２５（ｗ／ｗ），１０〜２５（ｗ／ｗ），及び０．０４〜０．１（ｗ／ｗ）である，請求項１乃至７の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１１】
純水で溶解したときのｐＨが５．５〜７．５である，請求項１乃至１０の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１２】
該融合蛋白質が，該ヒトリソソーム酵素が該抗体の軽鎖又は重鎖の何れか何れかのＣ末端側又はＮ末端側の何れかにペプチド結合により結合したものである，請求項１乃至１１の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１３】
該融合蛋白質が，該ヒトリソソーム酵素が該抗体の重鎖のＣ末端側にペプチド結合により結合したものである，請求項１乃至１１の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１４】
該融合蛋白質が，該ヒトリソソーム酵素が該抗体の軽鎖又は重鎖の何れかのＣ末端側又はＮ末端側の何れかに，少なくとも１個のアミノ酸よりなるリンカーを介して結合したものである，請求項１乃至１１の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１５】
該融合蛋白質が，該ヒトリソソーム酵素を該抗体の重鎖のＣ末端側に少なくとも１個のアミノ酸よりなるリンカーを介して結合したものである，請求項１乃至１１の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１６】
該リンカーが，（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）で示されるアミノ酸配列を有するものである，請求項１４又は１５に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１７】
該リソソーム酵素が，ヒトリソソーム酵素である，請求項１乃至１６の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１８】
該リソソーム酵素が，α−Ｌ−イズロニダーゼ，イズロン酸−２−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β−ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β−ヘキソサミニダーゼＡ，β−ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ−アセチルグルコサミン−１−フォスフォトランスフェラーゼ，α−マンノシダーゼ，β−マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリルスルファターゼＡ，α−Ｌ−フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−ガラクトシダーゼ，β−グルクロニダーゼ，ヘパランＮ−スルファターゼ，α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ−１，６−グルコシダーゼ，シアリダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ−１，トリペプチジルペプチダーゼ−１，ヒアルロニダーゼ−１，ＣＬＮ１，及びＣＬＮ２からなる群から選択されるものである，請求項１乃至１７の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１９】
該ヒトリソソーム酵素が，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼである，請求項１７に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２０】
該抗体が，ヒト抗体又はヒト化抗体である，請求項１乃至１９の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２１】
該抗体が，血管内皮細胞の表面に存在する分子を抗原として認識するものである，請求項１乃至２０の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２２】
該血管内皮細胞が，ヒトの血管内皮細胞である，請求項２１に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２３】
該血管内皮細胞が，脳血管内皮細胞である，請求項２１又は２２に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２４】
該脳血管内皮細胞の表面に存在する分子が，トランスフェリン受容体（ＴｆＲ），インスリン受容体，レプチン受容体，リポ蛋白質受容体，ＩＧＦ受容体，ＯＡＴＰ−Ｆ，有機アニオントランスポーター，ＭＣＴ−８及びモノカルボン酸トランスポーターからなる群から選択されるものである，請求項２３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２５】
該抗体が，ヒト化抗ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）抗体である，請求項２０に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２６】
該抗体がヒト化抗ｈＴｆＲ抗体であり，該ヒトリソソーム酵素がヒトイズロン酸−２−スルファターゼであり，該融合蛋白質がヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とヒトイズロン酸−２−スルファターゼとの融合蛋白質であるものであり，該融合蛋白質が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるものである，請求項２０に記載の凍結乾燥製剤：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，
配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼがリンカー配列を介して結合したものとからなる，
融合蛋白質；
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，
配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼがリンカー配列を介して結合したものとからなる，
融合蛋白質；
（ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，
配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼがリンカー配列を介して結合したものとからなる，
融合蛋白質。
【請求項２７】
該抗体がヒト化抗ｈＴｆＲ抗体であり，該ヒトリソソーム酵素がヒトイズロン酸−２−スルファターゼであり，該融合蛋白質がヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とヒトイズロン酸−２−スルファターゼとの融合蛋白質であるものであり，該融合蛋白質が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるものである，請求項２０に記載の凍結乾燥製剤：
（ａ）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するものであり，
該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）で示されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼと結合し，それにより配列番号１３で示されるアミノ酸配列を形成しているものである，
融合蛋白質；
（ｂ）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するものであり，
該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）で示されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼと結合し，それにより配列番号１５で示されるアミノ酸配列を形成しているものである，
融合蛋白質；
（ｃ）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するものであり，
該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）で示されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼと結合し，それにより配列番号１７で示されるアミノ酸配列を形成しているものである，
融合蛋白質。
【請求項２８】
ほう珪酸ガラス又は疎水性樹脂により形成された容器に封入されたものである，請求項１乃至２７の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２９】
該容器が，シクロオレフィンコポリマー，シクロオレフィン類開環重合体，又はシクロオレフィン類開環重合体に水素添加したものを用いて形成されたものである，請求項２８に記載の凍結乾燥製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，抗体とリソソーム酵素とを結合させた蛋白質を有効成分とする医薬の，貯蔵安定な凍結乾燥製剤に関し，詳しくは，安定化剤として，スクロースと非イオン性界面活性剤を含有する凍結乾燥製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体とリソソーム酵素とを結合させた蛋白質として，抗インスリン受容体抗体とα−Ｌ−イデュロニダーゼの融合蛋白質（特許文献１），抗インスリン受容体抗体とイズロン酸−２−スルファターゼの融合蛋白質（特許文献２）が作製されたことが報告されている。このように人工的に構築された新規な蛋白質の製剤化において，如何なる形態がそれらの製剤処方として適切であるかは未知である。【０００３】
抗体の製剤化に関してみると，抗ＩＬ−１３抗体を有効性成分として含む凍結乾燥製剤（特許文献３），アルギニン，ヒスチジン，リジン等のアミノ酸又はその塩を含む抗体の凍結乾燥製剤（特許文献４），メグルミンを含む抗体の凍結乾燥製剤（特許文献５），ラクトビオン酸を含む抗ＥＧＦ受容体抗体の凍結乾燥製剤（特許文献６），クエン酸，ポリソルベート８０及びショ糖を含む抗ヒトＩＬ−２３ｐ１９抗体の凍結乾燥製剤（特許文献７）等，多くの報告がされている。つまり，抗体のみをとっても，その製剤化をするに当たっては，試行錯誤が必要とされているのが実情である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１０−５３４７２３号公報
【特許文献２】特表２０１２−５２１１９４号公報
【特許文献３】特表２０１６−５１９１２４号公報
【特許文献４】ＷＯ２００７／０７４８８０
【特許文献５】ＷＯ２００６／１３２３６３
【特許文献６】特表２００９−５４００１５号公報
【特許文献７】特表２０１２−５０１３３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は，安定化剤として，スクロースと非イオン性界面活性剤を含有してなり，市場に流通させることが可能な程度に安定な，抗体とリソソーム酵素とを結合させた蛋白質を有効成分として含有してなる凍結乾燥製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的に向けた研究において，本発明者らは，抗体とヒトリソソーム酵素の一種であるヒトイズロン酸−２−スルファターゼとを結合させた蛋白質が，スクロースと非イオン性界面活性剤とを賦形剤として含有する凍結乾燥製剤の形態とすることで安定に保存できることを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を含むものである。【０００７】
１．抗体とリソソーム酵素との融合蛋白質を有効成分として含有してなる凍結乾燥製剤であって，中性塩，ニ糖類，非イオン性界面活性剤，及び緩衝剤を更に含有してなる，凍結乾燥製剤。
２．該中性塩が塩化ナトリウムである，上記１に記載の凍結乾燥製剤。
３．該ニ糖類がトレハロース，スクロース，マルトース，及び乳糖からなる群から選択されるものである，上記１又は２に記載の凍結乾燥製剤。
４．該非イオン性界面活性剤が，ポリソルベート又はポロキサマーである，上記１乃至３の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
５．該非イオン性界面活性剤が，ポリソルベート２０，ポリソルベート８０，及びポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールからなる群から選択されるものである，上記１乃至３の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
６．該緩衝剤がリン酸緩衝剤である，上記１乃至５の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
７．該ニ糖類がスクロースであり，該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールであり，及び該緩衝剤がリン酸緩衝剤である，上記１又は２に記載の凍結乾燥製剤。
８．該中性塩，該ニ糖類，及び該イオン性界面活性剤の含量が，該融合蛋白質の含量に対して，それぞれ，０．０１５〜２．５（ｗ／ｗｗ／ｗ），２．５〜２００（ｗ／ｗｗ／ｗ），及び０．００５〜６（ｗ／ｗｗ／ｗ）である，上記１乃至７の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
９．該中性塩，該ニ糖類，及び該イオン性界面活性剤の含量が，該融合蛋白質の含量に対して，それぞれ，０．０５〜０．５（ｗ／ｗｗ／ｗ），５〜５０（ｗ／ｗｗ／ｗ），及び０．０２〜０．２（ｗ／ｗｗ／ｗ）である，上記１乃至７の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
１０．該中性塩，該ニ糖類，及び該イオン性界面活性剤の含量が，該融合蛋白質の含量に対して，それぞれ，０．１〜０．２５（ｗ／ｗｗ／ｗ），１０〜２５（ｗ／ｗｗ／ｗ），及び０．０４〜０．１（ｗ／ｗｗ／ｗ）である，上記１乃至７の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
１１．純水で溶解したときのｐＨが５．５〜７．５である，上記１乃至１０の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
１２．該融合蛋白質が，該ヒトリソソーム酵素が該抗体の軽鎖又は重鎖の何れかのＣ末端側又はＮ末端側の何れかにペプチド結合により結合したものである，上記１乃至１１の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
１３．該融合蛋白質が，該ヒトリソソーム酵素が該抗体の重鎖のＣ末端側にペプチド結合により結合したものである，上記１乃至１１の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
１４．該融合蛋白質が，該ヒトリソソーム酵素が該抗体の軽鎖又は重鎖の何れかのＣ末端側又はＮ末端側の何れかに，少なくとも１個のアミノ酸よりなるリンカーを介して結合したものである，上記１乃至１１の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
１５．該融合蛋白質が，該ヒトリソソーム酵素が該抗体の重鎖のＣ末端側に少なくとも１個のアミノ酸よりなるリンカーを介して結合したものである，上記１乃至１１の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
１６．該リンカーが，（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）で示されるアミノ酸配列を有するものである，上記１４又は１５に記載の凍結乾燥製剤。
１７．該リソソーム酵素が，ヒトリソソーム酵素である，上記１乃至１６の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
１８．該リソソーム酵素が，α−Ｌ−イズロニダーゼ，イズロン酸−２−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β−ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β−ヘキソサミニダーゼＡ，β−ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ−アセチルグルコサミン−１−フォスフォトランスフェラーゼ，α−マンノシダーゼ，β−マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリルスルファターゼＡ，α−Ｌ−フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−ガラクトシダーゼ，β−グルクロニダーゼ，ヘパランＮ−スルファターゼ，α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ−１，６−グルコシダーゼ，シアリダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ−１，トリペプチジルペプチダーゼ−１，ヒアルロニダーゼ−１，ＣＬＮ１，及びＣＬＮ２からなる群から選択されるものである，上記１乃至１７の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
１９．該ヒトリソソーム酵素が，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼである，上記１７に記載の凍結乾燥製剤。
２０．該抗体が，ヒト抗体又はヒト化抗体である，上記１乃至１９の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
２１．該抗体が，血管内皮細胞の表面に存在する分子を抗原として認識するものである，上記１乃至２０の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
２２．該血管内皮細胞が，ヒトの血管内皮細胞である，上記２１に記載の凍結乾燥製剤。
２３．該血管内皮細胞が，脳血管内皮細胞である，上記２１又は２２に記載の凍結乾燥製剤。
２４．該脳血管内皮細胞の表面に存在する分子が，トランスフェリン受容体（ＴｆＲ），インスリン受容体，レプチン受容体，リポ蛋白質受容体，ＩＧＦ受容体，ＯＡＴＰ−Ｆ，有機アニオントランスポーター，ＭＣＴ−８及びモノカルボン酸トランスポーターからなる群から選択されるものである，上記２３に記載の凍結乾燥製剤。
２５．該抗体が，ヒト化抗ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）抗体である，上記２０に記載の凍結乾燥製剤。
２６．該抗体がヒト化抗ｈＴｆＲ抗体であり，該ヒトリソソーム酵素がヒトイズロン酸−２−スルファターゼであり，該融合蛋白質がヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とヒトイズロン酸−２−スルファターゼとの融合蛋白質であるものであり，該融合蛋白質が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるものである，上記２０に記載の凍結乾燥製剤：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，
配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼがリンカー配列を介して結合したものとからなる，
融合蛋白質；
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，
配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼがリンカー配列を介して結合したものとからなる，
融合蛋白質；
（ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，
配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼがリンカー配列を介して結合したものとからなる，
融合蛋白質。
２７．該抗体がヒト化抗ｈＴｆＲ抗体であり，該ヒトリソソーム酵素がヒトイズロン酸−２−スルファターゼであり，該融合蛋白質がヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とヒトイズロン酸−２−スルファターゼとの融合蛋白質であるものであり，該融合蛋白質が，以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるものである，上記２０に記載の凍結乾燥製剤：
（ａ）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するものであり，
該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）で示されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼと結合し，それにより配列番号１３で示されるアミノ酸配列を形成しているものである，
融合蛋白質；
（ｂ）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するものであり，
該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）で示されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼと結合し，それにより配列番号１５で示されるアミノ酸配列を形成しているものである，
融合蛋白質；
（ｃ）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するものであり，
該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）で示されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼと結合し，それにより配列番号１７で示されるアミノ酸配列を形成しているものである，
融合蛋白質。
２８．ほう珪酸ガラス又は疎水性樹脂により形成された容器に封入されたものである，上記１乃至２７の何れかに記載の凍結乾燥製剤。
２９．
該容器が，シクロオレフィンコポリマー，シクロオレフィン類開環重合体，又はシクロオレフィン類開環重合体に水素添加したものを用いて形成されたものである，上記２８に記載の凍結乾燥製剤。    
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば，抗体とリソソーム酵素とを結合させた融合蛋白質を，市場に流通させることが可能な程度に，凍結乾燥製剤として安定化させることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は，抗体とリソソーム酵素とを結合させた蛋白質を有効成分とする医薬の，凍結乾燥状態で貯蔵安定な医薬組成物に関するものである。ここで，リソソーム酵素と結合される抗体は，好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体であるが，抗原に特異的に結合する性質を有するものである限り，抗体の動物種等に特に制限はない。例えば，抗体は，ヒト以外の哺乳動物の抗体であってもよく，またヒト抗体とヒト以外の他の哺乳動物の抗体のキメラ抗体であってもよい。
【００１０】
ヒト抗体は，その全体がヒト由来の遺伝子にコードされる抗体のことをいう。但し，遺伝子の発現効率を上昇させる等の目的で，元のヒトの遺伝子に変異を加えた遺伝子にコードされる抗体も，ヒト抗体である。また，ヒト抗体をコードする２つ以上の遺伝子を組み合わせて，ある一つのヒト抗体の一部を，他のヒト抗体の一部に置き換えた抗体も，ヒト抗体である。後述するヒト化抗体についても同様である。
【００１１】
ヒト抗体は，原則として，免疫グロブリン軽鎖の可変領域に３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の可変領域に３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。免疫グロブリン軽鎖の３箇所のＣＤＲは，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。免疫グロブリン重鎖の３箇所のＣＤＲは，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。ある一つのヒト抗体のＣＤＲを，その他のヒト抗体のＣＤＲに置き換えることにより，ヒト抗体の抗原特異性，親和性等を改変した抗体も，ヒト抗体である。後述するヒト化抗体についても同様である。
【００１２】
ヒト抗体の重鎖と軽鎖の可変領域はいずれも，原則として，４個のフレームワーク領域１〜４（ＦＲ１〜４）を含む。ＦＲ１は，ＣＤＲ１にそのＮ末端側で隣接する領域であり，重鎖及び軽鎖を構成する各ペプチドにおいて，そのＮ末端からＣＤＲ１のＮ末端に隣接するアミノ酸までのアミノ酸配列からなる。ＦＲ２は，重鎖及び軽鎖を構成する各ペプチドにおいて，ＣＤＲ１とＣＤＲ２との間のアミノ酸配列からなる。ＦＲ３は，重鎖及び軽鎖を構成する各ペプチドにおいて，ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間のアミノ酸配列からなる。ＦＲ４は，ＣＤＲ３のＣ末端に隣接するアミノ酸から可変領域のＣ末端までのアミノ酸配列からなる。但し，これに限らず，本発明においては，上記の各ＦＲ領域において，そのＮ末端側の１〜５個のアミノ酸及び／又はＣ末端側の１〜５個のアミノ酸を除いた領域を，フレームワーク領域とすることもできる。後述するヒト化抗体についても同様である。
【００１３】
本発明において，元のヒト抗体の遺伝子を改変することにより，元の抗体のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えた抗体も，ヒト抗体という。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜２０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜２０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，ヒト抗体である。アミノ酸を付加させる場合，元の抗体のアミノ酸配列中又はＮ末端側若しくはＣ末端側に，好ましくは１〜２０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，ヒト抗体である。変異を加えた抗体のアミノ酸配列は，元の抗体のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示すものである。つまり，本発明において「ヒト由来の遺伝子」というときは，ヒト由来の元の遺伝子に加えて，ヒト由来の元の遺伝子に改変を加えることにより得られる遺伝子も含まれる。後述するヒト化抗体についても同様である。
【００１４】
例えば，配列番号２で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖，配列番号４で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖，及び配列番号６で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖に変異を加える場合は，上記のルールが適用される。また，配列番号８で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖，配列番号９で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖，及び配列番号１０で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖に変異を加える場合にも，上記のルールが適用される。
【００１５】
元のヒト抗体の軽鎖の可変領域の全て又はその一部をコードする遺伝子に変異を加える場合にあっては，変異を加えた後の遺伝子は，元の遺伝子と，好ましくは８０％以上の相同性を有するものであり，より好ましくは９０％以上の相同性を有するものであるが，変異導入後の抗体が抗原に対する特異的親和性を有する限り，相同性に特に制限はない。軽鎖の可変領域のアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個であり，更により好ましくは１〜２個である。軽鎖の可変領域のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個であり，更により好ましくは１〜２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。軽鎖の可変領域にアミノ酸を付加させる場合，軽鎖の可変領域のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１〜１０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個，更により好ましくは１〜２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は，元の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。特に，ＣＤＲのアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜５個であり，より好ましくは１〜３個であり，更に好ましくは１〜２個である。ＣＤＲのアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜５個であり，より好ましくは１〜３個であり，更に好ましくは１〜２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。アミノ酸を付加させる場合，当該アミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１〜５個，より好ましくは１〜３個，更に好ましくは１〜２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた各ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸配列は，元の各ＣＤＲのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。後述するヒト化抗体についても同様である。
【００１６】
例えば，配列番号２３で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖の可変領域，配列番号２５で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖の可変領域，及び配列番号２７で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域に変異を加える場合は，上記のルールが適用される。
【００１７】
配列番号２３で示される軽鎖の可変領域はＣＤＲ１に配列番号２９又は３０のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号３１又は３２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ３に配列番号３３のアミノ酸配列を含む。配列番号２５で示される軽鎖の可変領域はＣＤＲ１に配列番号４０又は４１のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号４２又は４３のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ３に配列番号４４のアミノ酸配列を含む。配列番号２７で示される軽鎖の可変領域はＣＤＲ１に配列番号５１又は５２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号５３又は５４のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ３に配列番号５５のアミノ酸配列を含む。これらのＣＤＲに変異を加える場合は，上記のルールが適用される。
【００１８】
元のヒト抗体の重鎖の可変領域の全て又はその一部をコードする遺伝子に変異を加える場合にあっては，変異を加えた後の遺伝子は，元の遺伝子と，好ましくは８０％以上の相同性を有するものであり，より好ましくは９０％以上の相同性を有するものであるが，変異導入後の抗体が抗原に対する特異的親和性を有する限り，相同性に特に制限はない。重鎖の可変領域のアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個であり，更により好ましくは１〜２個である。重鎖の可変領域のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個であり，更により好ましくは１〜２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。重鎖の可変領域にアミノ酸を付加させる場合，重鎖の可変領域のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１〜１０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個，更により好ましくは１〜２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた重鎖の可変領域のアミノ酸配列は，元の重鎖の可変領域のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。特に，ＣＤＲのアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜５個であり，より好ましくは１〜３個であり，更に好ましくは１〜２個である。ＣＤＲのアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜５個であり，より好ましくは１〜３個であり，更に好ましくは１〜２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。アミノ酸を付加させる場合，当該アミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１〜５個，より好ましくは１〜３個，更に好ましくは１〜２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた各ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸配列は，元の各ＣＤＲのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。後述するヒト化抗体についても同様である。
【００１９】
例えば，配列番号２４で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖の可変領域，配列番号２６で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖の可変領域，及び配列番号２８で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域に変異を加える場合は，上記のルールが適用される。
【００２０】
配列番号２４で示される重鎖の可変領域はＣＤＲ１に配列番号３４又は３５のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号３６又は３７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ３に配列番号３８又は３９のアミノ酸配列を含む。配列番号２６で示される重鎖の可変領域はＣＤＲ１に配列番号４５又は４６のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号４７又は４８のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ３に配列番号４９又は５０のアミノ酸配列を含む。配列番号２８で示される重鎖の可変領域はＣＤＲ１に配列番号５６又は５７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号５８又は５９のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ３に配列番号６０又は６１のアミノ酸配列を含む。これらのＣＤＲに変異を加える場合は，上記のルールが適用される。
【００２１】
本発明において「相同性」とは，相動性計算アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列を比較した場合の，最適なアラインメントにおける，全アミノ酸残基に対する相同なアミノ酸残基の割合（％）を意味する。２つのアミノ酸配列をかかる割合で示される相同性で比較することは，本発明の技術的分野において周知であり，当業者にとって容易に理解されるものである。
【００２２】
なお，上記の抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列中のアミノ酸の他のアミノ酸による置換としては，例えば，芳香族アミノ酸（Phe, Trp, Tyr），脂肪族アミノ酸（Ala, Leu, Ile, Val），極性アミノ酸（Gln, Asn），塩基性アミノ酸（Lys, Arg, His），酸性アミノ酸（Glu, Asp），水酸基を有するアミノ酸（Ser, Thr）側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は，蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち，保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり，種々の文献に記載されている（例えば，Bowieら, Science, 247:1306-1310(1990)を参照）
【００２３】
なお，本発明において，元の蛋白質（抗体を含む）のアミノ酸配列と変異を加えた蛋白質のアミノ酸配列との相同性を算出するための相同性計算アルゴリズムとして，BLAST(Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990))，Pearson及びLipmanの類似性検索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988))，Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等が周知である。また，アメリカ国立衛生研究所がインターネット上で提供するBLASTプログラムの一つであるblastpは，２つのアミノ酸配列の相動性を算出するための手段として周知である。
【００２４】
本発明において，「ヒト化抗体」の語は，可変領域の一部（例えば，特にＣＤＲの全部又は一部）のアミノ酸配列がヒト以外の哺乳動物由来であり，それ以外の領域がヒト由来である抗体のことをいう。例えば，ヒト化抗体として，ヒト抗体を構成する免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を，他の哺乳動物のＣＤＲによって置き換えることにより作製された抗体が挙げられる。ヒト抗体の適切な位置に移植されるＣＤＲの由来となる他の哺乳動物の生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，又はヒト以外の霊長類であり，より好ましくはマウス及びラットであり，例えばマウスである。
【００２５】
本発明において，「キメラ抗体」の語は，２つ以上の異なる種に由来する，２つ以上の異なる抗体の断片が連結されてなる抗体のことをいう。
【００２６】
ヒト抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体とは，ヒト抗体の一部がヒト以外の哺乳動物の抗体の一部によって置き換えられた抗体である。抗体は，以下に説明するＦｃ領域，Ｆａｂ領域及びヒンジ部とからなる。このようなキメラ抗体の具体例として，Ｆｃ領域がヒト抗体に由来する一方でＦａｂ領域が他の哺乳動物の抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗体又は他の哺乳動物の抗体の何れかに由来する。逆に，Ｆｃ領域が他の哺乳動物に由来する一方でＦａｂ領域がヒト抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗体又は他の哺乳動物の抗体のいずれに由来してもよい。
【００２７】
また，抗体は，可変領域と定常領域とからなるということもできる。キメラ抗体の他の具体例として，重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（ＣＬ）がヒト抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）が他の哺乳動物の抗体に由来するもの，逆に，重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（ＣＬ）が他の哺乳動物の抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）がヒト抗体に由来するものも挙げられる。ここで，他の哺乳動物の生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，又はヒト以外の霊長類であり，より好ましくはマウスである。
【００２８】
ヒト抗体とマウス抗体のキメラ抗体は，特に，「ヒト／マウスキメラ抗体」という。ヒト／マウスキメラ抗体には，Ｆｃ領域がヒト抗体に由来する一方でＦａｂ領域がマウス抗体に由来するキメラ抗体や，逆に，Ｆｃ領域がマウス抗体に由来する一方でＦａｂ領域がヒト抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗体又はマウス抗体の何れかに由来する。ヒト／マウスキメラ抗体の他の具体例として，重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（ＣＬ）がヒト抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）がマウス抗体に由来するもの，逆に，重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（ＣＬ）がマウス抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）がヒト抗体に由来するものも挙げられる。
【００２９】
抗体は，本来，２本の免疫グロブリン軽鎖と２本の免疫グロブリン重鎖の計４本のポリペプチド鎖からなる基本構造を有する。但し，本発明において，「抗体」というときは，この基本構造を有するものに加え，
（１）１本の免疫グロブリン軽鎖と１本の免疫グロブリン重鎖の計２本のポリペプチド鎖からなるものや，以下に詳述するように，
（２）免疫グロブリン軽鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に免疫グロブリン重鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体，及び
（３）免疫グロブリン重鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に免疫グロブリン軽鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体も含まれる。また，
（４）本来の意味での抗体の基本構造からＦｃ領域が欠失したものであるＦａｂ領域からなるもの及びＦａｂ領域とヒンジ部の全部若しくは一部とからなるもの（Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２を含む）も，本発明における「抗体」に含まれる。更には，軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域をリンカー配列を介して結合させて一本鎖抗体としたｓｃＦｖも，本発明における抗体に含まれる。
【００３０】
ここでＦａｂとは，可変領域とＣＬ領域（軽鎖の定常領域）を含む１本の軽鎖と，可変領域とＣＨ１領域（重鎖の定常領域の部分１）を含む１本の重鎖が，それぞれに存在するシステイン残基同士でジスルフィド結合により結合した分子のことをいう。Ｆａｂにおいて，重鎖は，可変領域とＣＨ１領域（重鎖の定常領域の部分１）に加えて，更にヒンジ部の一部を含んでもよいが，この場合のヒンジ部は，ヒンジ部に存在して抗体の重鎖どうしを結合するシステイン残基を欠くものである。Ｆａｂにおいて，軽鎖と重鎖とは，軽鎖の定常領域（ＣＬ領域）に存在するシステイン残基と，重鎖の定常領域（ＣＨ１領域）又はヒンジ部に存在するシステイン残基との間で形成されるジスルフィド結合により結合する。Ｆａｂを形成する重鎖のことをＦａｂ重鎖という。Ｆａｂは，ヒンジ部に存在して抗体の重鎖どうしを結合するシステイン残基を欠いているので，１本の軽鎖と１本の重鎖とからなる。Ｆａｂを構成する軽鎖は，可変領域とＣＬ領域を含む。Ｆａｂを構成する重鎖は，可変領域とＣＨ１領域からなるものであってもよく，可変領域，ＣＨ１領域に加えてヒンジ部の一部を含むものであってもよい。但しこの場合，ヒンジ部で２本の重鎖の間でジスルフィド結合が形成されないように，ヒンジ部は重鎖間を結合するシステイン残基を含まないように選択される。Ｆ（ａｂ’）においては，その重鎖は可変領域とＣＨ１領域に加えて，重鎖どうしを結合するシステイン残基を含むヒンジ部の全部又は一部を含む。Ｆ（ａｂ’）２は２つのＦ（ａｂ’）が互いのヒンジ部に存在するシステイン残基どうしでジスルフィド結合により結合した分子のことをいう。Ｆ（ａｂ’）又はＦ（ａｂ’）２を形成する重鎖のことをＦａｂ’重鎖という。また，複数の抗体が直接又はリンカーを介して結合してなるニ量体，三量体等の重合体も，抗体である。更に，これらに限らず，免疫グロブリン分子の一部を含み，且つ，抗原に特異的に結合する性質を有するものは何れも，本発明でいう「抗体」に含まれる。即ち，本発明において免疫グロブリン軽鎖というときは，免疫グロブリン軽鎖に由来し，その可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有するものが含まれる。また，免疫グロブリン重鎖というときは，免疫グロブリン重鎖に由来し，その可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有するものが含まれる。従って，可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有する限り，例えば，Ｆｃ領域が欠失したものも，免疫グロブリン重鎖である。
【００３１】
また，ここでＦｃ又はＦｃ領域とは，抗体分子中の，ＣＨ２領域（重鎖の定常領域の部分２），及びＣＨ３領域（重鎖の定常領域の部分３）からなる断片を含む領域のことをいう。
【００３２】
更には，本発明において，「抗体」というときは，
（５）上記（４）で示したＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）又はＦ（ａｂ’）２を構成する軽鎖と重鎖を，リンカー配列を介して結合させて，それぞれ一本鎖抗体としたｓｃＦａｂ，ｓｃＦ（ａｂ’），及びｓｃＦ（ａｂ’）２も含まれる。ここで，ｓｃＦａｂ，ｓｃＦ（ａｂ’），及びｓｃＦ（ａｂ’）２にあっては，軽鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に重鎖を結合させてなるものでもよく，また，重鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に軽鎖を結合させてなるものでもよい。更には，軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域をリンカー配列を介して結合させて一本鎖抗体としたｓｃＦｖも，本発明における抗体に含まれる。ｓｃＦｖにあっては，軽鎖の可変領域のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に重鎖の可変領域を結合させてなるものでもよく，また，重鎖の可変領域のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に軽鎖の可変領域を結合させてなるものでもよい。
【００３３】
本発明において，「一本鎖抗体」というときは，免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合してなり，特定の抗原に特異的に結合することのできる蛋白質をいう。例えば，上記（２），（３）及び（５）に示されるものは一本鎖抗体に含まれる。また，免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合してなり，特定の抗原に特異的に結合することのできる蛋白質も，本発明における「一本鎖抗体」である。免疫グロブリン重鎖のＣ末端側にリンカー配列を介して免疫グロブリン軽鎖が結合した一本鎖抗体にあっては，通常，免疫グロブリン重鎖は，Ｆｃ領域が欠失している。免疫グロブリン軽鎖の可変領域は，抗体の抗原特異性に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）を３つ有している。同様に，免疫グロブリン重鎖の可変領域も，ＣＤＲを３つ有している。これらのＣＤＲは，抗体の抗原特異性を決定する主たる領域である。従って，一本鎖抗体には，免疫グロブリン重鎖の３つのＣＤＲが全てと，免疫グロブリン軽鎖の３つのＣＤＲの全てとが含まれることが好ましい。但し，抗体の抗原特異的な親和性が維持される限り，ＣＤＲの１個又は複数個を欠失させた一本鎖抗体とすることもできる。
【００３４】
一本鎖抗体において，免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の間に配置されるリンカー配列は，好ましくは２〜５０個，より好ましくは８〜５０個，更に好ましくは１０〜３０個，更により好ましくは１２〜１８個又は１５〜２５個，例えば１５個若しくは２５個のアミノ酸残基から構成されるペプチド鎖である。そのようなリンカー配列は，これにより両鎖が連結されてなる抗ｈＴｆＲ抗体がｈＴｆＲに対する親和性を保持する限り，そのアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンのみ又はグリシンとセリンから構成されるものであり，例えば，アミノ酸配列Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Gly，アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号１９），アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号２０），アミノ酸配列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号２１），又はこれらのアミノ酸配列が２〜１０回，あるいは２〜５回繰り返された配列を有するものである。例えば，免疫グロブリン重鎖の可変領域の全領域からなるアミノ酸配列のＣ末端側に，リンカー配列を介して免疫グロブリン軽鎖の可変領域を結合させてＳｃＦｖとする場合，アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号１９）の３個が連続したものに相当する計１５個のアミノ酸からなるリンカー配列が好適である。
【００３５】
本発明において，抗体が特異的に認識する抗原は，例えば，血管内皮細胞の表面に存在する分子（表面抗原）である。かかる表面抗原としては，トランスフェリン受容体（ＴｆＲ），インスリン受容体，レプチン受容体，リポ蛋白質受容体，ＩＧＦ受容体，ＯＡＴＰ−Ｆ等の有機アニオントランスポーター，ＭＣＴ−８等のモノカルボン酸トランスポーター，Ｆｃ受容体が挙げられるが，これらに限定されるものではない。抗原は，好ましくはヒト血管内皮細胞の表面に存在するこれら分子（表面抗原）である。
【００３６】
上記の表面抗原の中でも，トランスフェリン受容体（ＴｆＲ），インスリン受容体，レプチン受容体，リポ蛋白質受容体，ＩＧＦ受容体，ＯＡＴＰ−Ｆ等の有機アニオントランスポーター，ＭＣＴ−８等のモノカルボン酸トランスポーターは，血液脳関門（Blood Brain Barrier）を形成する脳毛細血管内皮細胞の表面に存在するものである。これら抗原を認識できる抗体は，抗原を介して脳毛細血管内皮細胞（脳血管内皮細胞）に結合できる。そして脳毛細血管内皮細胞に結合した抗体は，血液脳関門を通過して中枢神経系に到達することができる。従って，目的の蛋白質を，このような抗体と結合させることにより，中枢神経系にまで到達させることができる。目的の蛋白質としては，中枢神経系で薬効を発揮すべき機能を有する蛋白質が挙げられる。例えば，中枢神経障害を伴うリソソーム病患者において欠損しているか又は機能不全であるリソソーム酵素が，目的の蛋白質として挙げられる。かかるリソソーム酵素は，そのままでは中枢神経系に到達することができず，患者の中枢神経障害に対して薬効を示すことがないが，これらの抗体と結合させることにより血液脳関門を通過できるようになるので，リソソーム病患者において見られる中枢神経障害を改善することができる。
【００３７】
本発明において，「ヒトトランスフェリン受容体」又は「ｈＴｆＲ」の語は，配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する膜蛋白質をいう。本発明の抗ｈＴｆＲ抗体は，その一実施態様において，配列番号２２で示されるアミノ酸配列中Ｎ末端側から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの部分（ｈＴｆＲの細胞外領域）に対して特異的に結合するものであるが，これに限定されない。
【００３８】
抗体の作製方法をｈＴｆＲに対する抗体を例にとって以下に説明する。ｈＴｆＲに対する抗体の作製方法としては，ｈＴｆＲ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した細胞を用いて，組換えヒトトランスフェリン受容体（ｒｈＴｆＲ）を作製し，このｒｈＴｆＲを用いてマウス等の動物を用いて免疫して得る方法が一般的である。免疫後の動物からｈＴｆＲに対する抗体産生細胞を取り出し，これとミエローマ細胞とを癒合させることにより，ｈＴｆＲに対する抗体産生能を有するハイブリドーマ細胞を作製することができる。
【００３９】
また，マウス等の動物より得た免疫系細胞を体外免疫法によりｒｈＴｆＲで免疫することによってもｈＴｆＲに対する抗体を産生する細胞を取得できる。体外免疫法により免疫する場合，その免疫系細胞が由来する動物種に特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，モルモット，イヌ，ネコ，ウマ及びヒトを含む霊長類であり，より好ましくは，マウス，ラット及びヒトであり，更に好ましくはマウス及びヒトである。マウスの免疫系細胞としては，例えば，マウスの脾臓から調製した脾細胞を用いることができる。ヒトの免疫系細胞としては，ヒトの末梢血，骨髄，脾臓等から調製した細胞を用いることができる。ヒトの免疫系細胞を体外免疫法により免疫した場合，ｈＴｆＲに対するヒト抗体を得ることができる。
【００４０】
本発明において，抗体と結合させるべきヒトリソソーム酵素に特に限定はないが，α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ），イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ又はＩ２Ｓ），グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ），β−ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β−ヘキソサミニダーゼＡ，β−ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ−アセチルグルコサミン−１−フォスフォトランスフェラーゼ，α−マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ），β−マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ），サポシンＣ，アリルスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ），α−Ｌ−フコシダーゼ（ＦＵＣＡ１），アスパルチルグルコサミニダーゼ，α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ），α−ガラクトシダーゼ，β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ），ヘパランＮ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ），α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ），アセチルＣｏＡα−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ（ＡＣ），アミロ−１，６−グルコシダーゼ，シアリダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ−１（ＰＰＴ−１），トリペプチジルペプチダーゼ−１（ＴＰＰ−１），ヒアルロニダーゼ−１，酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ），ＣＬＮ１，及びＣＬＮ２等のリソソーム酵素，が挙げられる。
【００４１】
抗体が血管内皮細胞の表面に存在する分子（表面抗原）を特異的に認識するものである場合，抗体と結合させたヒトリソソーム酵素はそれぞれ，α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）はハーラー症候群又はハーラー・シャイエ症候群における中枢神経障害治療剤として，イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）はハンター症候群における中枢神経障害治療剤として，グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）はゴーシェ病における中枢神経障害治療剤として，βガラクトシダーゼはＧＭ１−ガングリオシドーシス１〜３型における中枢神経障害治療剤として，ＧＭ２活性化蛋白質はＧＭ２−ガングリオシドーシスＡＢ異型における中枢神経障害治療剤として，β−ヘキソサミニダーゼＡはサンドホフ病及びティサックス病における中枢神経障害治療剤として，β−ヘキソサミニダーゼＢはサンドホフ病における中枢神経障害治療剤として，Ｎ−アセチルグルコサミン−１−フォスフォトランスフェラーゼはＩ−細胞病における中枢神経障害治療剤として，α−マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）はα−マンノシドーシスにおける中枢神経障害治療剤として，β−マンノシダーゼはβ−マンノシドーシスにおける中枢神経障害治療剤として，ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）はクラッベ病における中枢神経障害治療剤として，サポシンＣはゴーシェ病様蓄積症における中枢神経障害治療剤として，アリルスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）は異染性白質変性症（異染性白質ジストロフィー）における中枢神経障害治療剤として，α−Ｌ−フコシダーゼ（ＦＵＣＡ１）はフコシドーシスにおける中枢神経障害治療剤として，アスパルチルグルコサミニダーゼはアスパルチルグルコサミン尿症における中枢神経障害治療剤として，α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼはシンドラー病及び川崎病における中枢神経障害治療剤として，酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）はニーマン・ピック病における中枢神経障害治療剤として，α−ガラクトシダーゼはファブリー病における中枢神経障害治療剤として，β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）はスライ症候群における中枢神経障害治療剤として，ヘパランＮ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ），α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ），アセチルＣｏＡα−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼはサンフィリッポ症候群における中枢神経障害治療剤として，酸性セラミダーゼ（ＡＣ）はファーバー病における中枢神経障害治療剤として，アミロ−１，６−グルコシダーゼはコリ病（フォーブス・コリ病）における中枢神経障害治療剤として，シアリダーゼはシアリダーゼ欠損症における中枢神経障害治療剤として，アスパルチルグルコサミニダーゼはアスパルチルグルコサミン尿症における中枢神経障害治療剤として，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ−１（ＰＰＴ−１）は，神経セロイドリポフスチン症又はＳａｎｔａｖｕｏｒｉ−Ｈａｌｔｉａ病における中枢神経障害治療剤として，トリペプチジルペプチダーゼ−１（ＴＰＰ−１）は，神経セロイドリポフスチン症又はＪａｎｓｋｙ−Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ病における中枢神経障害治療剤として，ヒアルロニダーゼ−１はヒアルロニダーゼ欠損症における中枢��経障害治療剤として，酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）はポンペ病における中枢神経障害治療剤として，ＣＬＮ１及びＣＬＮ２はバッテン病における中枢神経障害治療剤として使用できる。
【００４２】
抗体が血管内皮細胞の表面に存在する分子（表面抗原）を特異的に認識するものである場合に，抗体と結合させるべきリソソーム酵素として好適なものとして，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩ２Ｓ）を挙げることができる。Ｉ２Ｓは，ヘパラン硫酸やデルマタン硫酸のようなグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）分子内に存在する硫酸エステル結合を加水分解する活性を有するライソソーム酵素の一種である。ハンター症候群はこの酵素が先天的に欠失する遺伝子疾患である。ハンター症候群の患者は，ヘパラン硫酸，デルマタン硫酸が組織内に蓄積する結果，角膜混濁，精神発達遅滞等の諸症状を示す。但し，軽症の場合は精神発達遅延は観察されないこともある。従って，当該抗体とｈＩ２Ｓとの融合蛋白質は，ＢＢＢを通過することにより脳組織内に蓄積したＧＡＧを分解することができるので，精神発達遅滞を示すハンター症候群の患者に投与することにより，中枢神経障害治療剤として使用することができる。更には，精神発達遅滞を示さないハンター症候群の患者に，予防的に投与することもできる。
【００４３】
本発明において，「ヒトＩ２Ｓ」又は「ｈＩ２Ｓ」の語は，特に野生型のｈＩ２Ｓと同一のアミノ酸配列を有するｈＩ２Ｓのことをいう。野生型のｈＩ２Ｓは，配列番号１で示される５２５個のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列を有する。但し，これに限らず，Ｉ２Ｓ活性を有するものである限り，野生型のｈＩ２Ｓのアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えたものもｈＩ２Ｓに含まれる。ｈＩ２Ｓのアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個であり，更により好ましくは１〜２個である。ｈＩ２Ｓのアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個であり，更により好ましくは１〜２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。ｈＩ２Ｓにアミノ酸を付加させる場合，ｈＩ２Ｓのアミノ酸配列中又はＮ末端側若しくはＣ末端側に，好ましくは１〜１０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個，更により好ましくは１〜２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えたｈＩ２Ｓのアミノ酸配列は，元のｈＩ２Ｓのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。
【００４４】
なお本発明において，ｈＩ２ＳがＩ２Ｓ活性を有するというときは，ｈＩ２Ｓを抗体と融合させて融合蛋白質としたときに，天然型のｈＩ２Ｓが本来有する活性に対して，３％以上の活性を有していることをいう。但し，その活性は，天然型のｈＩ２Ｓが本来有する活性に対して，１０％以上であることが好ましく，２０％以上であることがより好ましく，５０％以上であることが更に好ましく，８０％以上であることが更により好ましい。抗体と融合させたｈＩ２Ｓが変異を加えたものである場合も同様である。抗体は，例えば抗ｈＴｆＲ抗体である。
【００４５】
本発明において「融合蛋白質」というときは，抗体とヒトリソソーム酵素とを，非ペプチドリンカー若しくはペプチドリンカーを介して，又は直接に結合させた物質のことをいう。抗体とヒトリソソーム酵素とを結合させる方法は，以下に詳述する。
【００４６】
抗体とヒトリソソーム酵素とを結合させる方法としては，非ペプチドリンカー又はペプチドリンカーを介して結合させる方法がある。非ペプチドリンカーとしては，ビオチン−ストレプトアビジン，ポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコール，エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体，ポリオキシエチル化ポリオール，ポリビニルアルコール，多糖類，デキストラン，ポリビニルエーテル，生分解性高分子，脂質重合体，キチン類，及びヒアルロン酸，又はこれらの誘導体，若しくはこれらを組み合わせたものを用いることができる。ペプチドリンカーは，ペプチド結合した１〜５０個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖若しくはその誘導体であって，そのＮ末端とＣ末端が，それぞれ抗体又はヒトリソソーム酵素の何れかと共有結合を形成することにより，抗体とヒトリソソーム酵素とを結合させるものである。
【００４７】
非ペプチドリンカーとしてビオチン−ストレプトアビジンを用いる場合，抗体がビオチンを結合させたものであり，ヒトリソソーム酵素がストレプトアビジンを結合させたものであり，このビオチンとストレプトアビジンとの結合を介して，抗体とヒトリソソーム酵素とを結合させてもよく，逆に，抗体がストレプトアビジンを結合させたものであり，ヒトリソソーム酵素がビオチンを結合させたものであり，このビオチンとストレプトアビジンとの結合を介して，抗体とヒトリソソーム酵素とを結合させてもよい。ビオチン及びストレプトアビジンは，周知の手法により蛋白質に結合させることができる。
【００４８】
非ペプチドリンカーとしてＰＥＧを用いて本発明の抗体とヒトリソソーム酵素とを結合させたものは，特に，抗体−ＰＥＧ−ヒトリソソーム酵素という。抗体−ＰＥＧ−ヒトリソソーム酵素は，抗体とＰＥＧとを結合させて抗体−ＰＥＧを作製し，次いで抗体−ＰＥＧとヒトリソソーム酵素とを結合させることにより製造することができる。又は，抗体−ＰＥＧ−ヒトリソソーム酵素は，ヒトリソソーム酵素とＰＥＧとを結合させてヒトリソソーム酵素−ＰＥＧを作製し，次いでヒトリソソーム酵素−ＰＥＧと抗体とを結合させることによっても製造することができる。ＰＥＧを抗体及びヒトリソソーム酵素と結合させる際には，カーボネート，カルボニルイミダゾール，カルボン酸の活性エステル，アズラクトン，環状イミドチオン，イソシアネート，イソチオシアネート，イミデート，又はアルデヒド等の官能基で修飾されたＰＥＧが用いられる。これらＰＥＧに導入された官能基が，主に抗体及びヒトリソソーム酵素分子内のアミノ基と反応することにより，ＰＥＧと抗体及びヒトリソソーム酵素が共有結合する。このとき用いられるＰＥＧの分子量及び形状に特に限定はないが，その平均分子量（ＭＷ）は，好ましくはＭＷ＝３００〜６００００であり，より好ましくはＭＷ＝５００〜２００００である。例えば，平均分子量が約３００，約５００，約１０００，約２０００，約４０００，約１００００，約２００００等であるＰＥＧは，非ペプチドリンカーとして好適に使用することができる。
【００４９】
例えば，抗体−ＰＥＧは，抗体とアルデヒド基を官能基として有するポリエチレングリコール（ＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ）とを，該抗体に対するＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤのモル比が１１，１２．５，１５，１１０，１２０等になるように混合し，これにＮａＣＮＢＨ３等の還元剤を添加して反応させることにより得られる。次いで，抗体−ＰＥＧを，ＮａＣＮＢＨ３等の還元剤の存在下で，ヒトリソソーム酵素と反応させることにより，抗体−ＰＥＧ−ヒトリソソーム酵素が得られる。逆に，先にヒトリソソーム酵素とＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤとを結合させてヒトリソソーム酵素−ＰＥＧを作製し，次いでヒトリソソーム酵素−ＰＥＧと抗体を結合させることによっても，抗体−ＰＥＧ−ヒトリソソーム酵素を得ることができる。
【００５０】
抗体とヒトリソソーム酵素とは，抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端側又はＮ末端側に，リンカー配列を介して又は直接に，それぞれヒトリソソーム酵素のＮ末端又はＣ末端をペプチド結合により結合させることもできる。このように抗体とヒトリソソーム酵素とを結合させてなる融合蛋白質は，抗体の重鎖又は軽鎖をコードするｃＤＮＡの３’末端側又は５’末端側に，直接又はリンカー配列をコードするＤＮＡ断片を挟んで，ヒトリソソーム酵素をコードするｃＤＮＡがインフレームで配置されたＤＮＡ断片を，哺乳動物細胞，酵母等の真核生物用の発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを導入した哺乳動物細胞を培養することにより，得ることができる。この哺乳動物細胞には，ヒトリソソーム酵素をコードするＤＮＡ断片を重鎖と結合させる場合にあっては，抗体の軽鎖をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用の発現ベクターも，同じホスト細胞に導入され，また，ヒトリソソーム酵素をコードするＤＮＡ断片を軽鎖と結合させる場合にあっては，抗体の重鎖をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用の発現ベクターも，同じホスト細胞に導入される。抗体が一本鎖抗体である場合，抗体とヒトリソソーム酵素とを結合させた融合蛋白質は，ヒトリソソーム酵素をコードするｃＤＮＡの５’末端側又は３’末端側に，直接，又はリンカー配列をコードするＤＮＡ断片を挟んで，１本鎖抗体をコードするｃＤＮＡを連結したＤＮＡ断片を，哺乳動物細胞，酵母等の真核生物用の発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを導入したこれらの細胞中で発現させることにより，得ることができる。
【００５１】
抗体の軽鎖のＣ末端側にヒトリソソーム酵素を結合させたタイプの融合蛋白質は，抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ヒトリソソーム酵素が，この抗体の軽鎖のＣ末端側に結合したものである。ここで抗体の軽鎖とヒトリソソーム酵素とは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。
【００５２】
抗体の重鎖のＣ末端側にヒトリソソーム酵素を結合させたタイプの融合蛋白質は，抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ヒトリソソーム酵素が，この抗体の重鎖のＣ末端側に結合したものである。ここで抗体の重鎖とヒトリソソーム酵素とは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。
【００５３】
抗体の軽鎖のＮ末端側にヒトリソソーム酵素を結合させたタイプの融合蛋白質は，抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ヒトリソソーム酵素が，この抗体の軽鎖のＮ末端側に結合したものである。ここで抗体の軽鎖とヒトリソソーム酵素とは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。
【００５４】
抗体の重鎖のＮ末端側にヒトリソソーム酵素を結合させたタイプの融合蛋白質は，抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ヒトリソソーム酵素が，この抗体の重鎖のＮ末端側に結合したものである。ここで抗体の重鎖とヒトリソソーム酵素とは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。
【００５５】
このとき抗体とヒトリソソーム酵素との間にリンカー配列を配置する場合，その配列は，好ましくは１〜５０個，より好ましくは１〜１７個，更に好ましくは１〜１０個，更により好ましくは１〜５個のアミノ酸から構成されるものであるが，抗体に結合させるべきヒトリソソーム酵素によって，リンカー配列を構成するアミノ酸の個数は，１個，２個，３個，１〜１７個，１〜１０個，１０〜４０個，２０〜３４個，２３〜３１個，２５〜２９個等と適宜調整できる。そのようなリンカー配列は，これにより連結された抗体がｈＴｆＲとの親和性を保持し，且つ当該リンカー配列により連結されたヒトリソソーム酵素が，生理的条件下で当該蛋白質の生理活性を発揮できる限り，そのアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンとセリンから構成されるものであり，例えば，グリシン又はセリンの何れか１個のアミノ酸からなるもの，アミノ酸配列Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号１９），アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号２０），アミノ酸配列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号２１），又はこれらのアミノ酸配列が１〜１０個，あるいは２〜５個連続してなる１〜５０個のアミノ酸からなる配列，２〜１７個，２〜１０個，１０〜４０個，２０〜３４個，２３〜３１個，２５〜２９個のアミノ酸からなる配列等を有するものである。例えば，アミノ酸配列Gly-Serを有するものはリンカー配列として好適に用いることができる。抗体が１本鎖抗体であっても同様である。
【００５６】
なお，本発明において，１つのペプチド鎖に複数のリンカー配列が含まれる場合，便宜上，各リンカー配列はＮ末端側から順に，第１のリンカー配列，第２のリンカー配列というように命名する。
【００５７】
抗体がヒト化抗体であり且つ抗ヒトトランスフェリン受容体抗体である場合の，抗体の好ましい形態として，以下の（ｘ）〜（ｚ）が挙げられる。すなわち，
（ｘ）軽鎖が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するものであり，重鎖が配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するもの；
（ｙ）軽鎖が配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するものであり，重鎖が配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するもの；
（ｚ）軽鎖が配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するものであり，重鎖が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するもの，の何れかである。
なお，ここで，（ｘ），（ｙ）及び（ｚ）は，実施例中に示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２，及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３にそれぞれ相当する。
【００５８】
但し，抗体がヒト化抗体であり且つ抗ヒトトランスフェリン受容体抗体である場合の，抗体の好ましい形態は，上記の（ｘ）〜（ｚ）に限られるものではない。例えば，抗体の軽鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）〜（ｚ）におけるそれぞれの軽鎖のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するものであり，該抗体の重鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）〜（ｚ）におけるそれぞれの重鎖のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するものである抗体も，ｈＴｆＲに対して親和性を有する限り，本発明において用いることができる。また，抗体の軽鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）〜（ｚ）におけるそれぞれの軽鎖のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するものであり，該抗体の重鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）〜（ｚ）におけるそれぞれの重鎖のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するものである抗体も，ｈＴｆＲに対して親和性を有する限り，本発明において用いることができる。また，抗体の軽鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）〜（ｚ）におけるそれぞれの軽鎖のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するものであり，該抗体の重鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）〜（ｚ）におけるそれぞれの重鎖のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するものである抗体も，ｈＴｆＲに対して親和性を有する限り，本発明における抗体として用いることができる。
【００５９】
また，軽鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）〜（ｚ）におけるそれぞれの軽鎖のアミノ酸配列を構成するアミノ酸配列中１〜１０個が置換，欠失又は付加をしたものであり，及び／又は重鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）〜（ｚ）におけるそれぞれの重鎖のアミノ酸配列を構成するアミノ酸配列中１〜１０個が置換，欠失又は付加をした抗体も，ｈＴｆＲに対して親和性を有する限り，本発明における抗体として用いることができる。また，軽鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）〜（ｚ）におけるそれぞれの軽鎖のアミノ酸配列を構成するアミノ酸配列中１〜５個が置換，欠失又は付加をしたものであり，及び／又は重鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）〜（ｚ）におけるそれぞれの重鎖のアミノ酸配列を構成するアミノ酸配列中１〜５個が置換，欠失又は付加をした抗体も，ｈＴｆＲに対して親和性を有する限り，本発明における抗体として用いることができる。更には，軽鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）〜（ｚ）におけるそれぞれの軽鎖のアミノ酸配列を構成するアミノ酸配列中１〜３個が置換，欠失又は付加をしたものであり，及び／又は重鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）〜（ｚ）におけるそれぞれの重鎖のアミノ酸配列を構成するアミノ酸配列中１〜３個が置換，欠失又は付加をした抗体も，ｈＴｆＲに対して親和性を有する限り，本発明における抗体として用いることができる。
【００６０】
上記の抗体の好ましい形態の（ｘ）において，配列番号２で示される軽鎖のアミノ酸配列中，配列番号２３で示されるアミノ酸配列が可変領域であり，配列番号８で示される重鎖のアミノ酸配列中，配列番号２４で示されるアミノ酸配列が可変領域である。また，上記の抗体の好ましい形態の（ｙ）において，配列番号４で示される軽鎖のアミノ酸配列中，配列番号２５で示されるアミノ酸配列が可変領域であり，配列番号９で示される重鎖のアミノ酸配列中，配列番号２６で示されるアミノ酸配列が可変領域である。また，上記の抗体の好ましい形態の（ｚ）において，配列番号６で示される軽鎖のアミノ酸配列中，配列番号２７で示されるアミノ酸配列が可変領域であり，配列番号１０で示される重鎖のアミノ酸配列中，配列番号２８で示されるアミノ酸配列が可変領域である。これら抗体の好ましい形態の（ｘ）〜（ｚ）において，重鎖又は／及び軽鎖のアミノ酸配列を構成するアミノ酸配列中への置換，欠失又は付加は，特に，これらの可変領域に導入される。
【００６１】
本発明における，抗体とヒトリソソーム酵素との融合蛋白質の好ましい一形態として，ヒト化抗ヒトトランスフェリン受容体抗体（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体）とヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩ２Ｓ）との融合蛋白質が挙げられる。この融合蛋白質において，ヒトトランスフェリン受容体に対する親和性と，ヒトリソソーム酵素の酵素活性のいずれをも保持させることができる限り，ｈＩ２Ｓは，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体を構成する重鎖と軽鎖のいずれに融合させてもよい。また，ｈＩ２Ｓを重鎖に結合させる場合において，重鎖のＮ末端側のＣ末端側のいずれにｈＩ２Ｓを融合させてもよく，ｈＩ２Ｓを軽鎖に結合させる場合において，軽鎖のＮ末端側のＣ末端側のいずれにｈＩ２Ｓを融合させてもよい。
【００６２】
かかるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とｈＩ２Ｓとの融合蛋白質の好ましい一形態として，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側にヒト化抗ｈＴｆＲ抗体を結合させた融合蛋白質が挙げられる。かかる融合蛋白質の好適なものとして以下の（１）〜（３）に示されるものが例示できる。
（１）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，
配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼがリンカー配列を介して結合したものと，
からなる融合蛋白質。
（２）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，
配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼがリンカー配列を介して結合したものと，
からなる融合蛋白質。
（３）配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，
配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼがリンカー配列を介して結合したものと，
からなる融合蛋白質。
これら（１）〜（３）の融合蛋白質において，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼは，好ましくは配列番号１で示されるアミノ酸を有するものであり，リンカー配列は，好ましくは（Gly-Ser）で示されるアミノ酸配列を有するものである。またこれらの融合蛋白質は，通常，２本の軽鎖と２本のヒトイズロン酸−２−スルファターゼと結合した重鎖とから構成される。
【００６３】
また，かかるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とｈＩ２Ｓとの融合蛋白質の好ましい一形態として，
（１）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するものであり，
該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，（Gly-Ser）で示されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼと結合しており，全体として配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するものである融合蛋白質，
（２）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するものであり，
該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，（Gly-Ser）で示されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼと結合しており，全体として配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するものである融合蛋白質，
（３）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するものであり，
該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，（Gly-Ser）で示されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼと結合しており，全体として配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有するものである融合蛋白質，が挙げられる。
これらの融合蛋白質は，通常，２本の軽鎖と２本のヒトイズロン酸−２−スルファターゼと結合した重鎖とから構成される。
【００６４】
本発明における凍結乾燥製剤は，有効成分として抗体とヒトリソソーム酵素との融合蛋白質を含有し，更に，中性塩，ニ糖類，非イオン性界面活性剤，及び緩衝剤を含有してなるものである。
【００６５】
凍結乾燥製剤に含まれる中性塩には，薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが，かかる中性塩としては，塩化ナトリウム，塩化マグネシウムが好適であり，特に塩化ナトリウムが好適である。
【００６６】
凍結乾燥製剤における中性塩の含量は，融合蛋白質の含量に対して，好ましくは０．０１５〜２．５（ｗ／ｗｗ／ｗ），より好ましくは０．０５〜０．５（ｗ／ｗｗ／ｗ），更に好ましくは０．１〜０．２５（ｗ／ｗｗ／ｗ）であり，例えば，０．１６（ｗ／ｗｗ／ｗ）である。
【００６７】
凍結乾燥製剤に含まれるニ糖類には，薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが，かかるニ糖類としては，トレハロース，スクロース，マルトース，乳糖又はこれらを組み合わせたものが好適であり，特にスクロースが好適である。
【００６８】
凍結乾燥製剤におけるニ糖類の含量は，融合蛋白質の含量に対して，好ましくは２．５〜２００（ｗ／ｗｗ／ｗ），より好ましくは５〜５０（ｗ／ｗｗ／ｗ），更に好ましくは１０〜２５（ｗ／ｗｗ／ｗ）であり，例えば，１５（ｗ／ｗｗ／ｗ）である。
【００６９】
凍結乾燥製剤に含まれる非イオン性界面活性剤には，薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが，かかる非イオン性界面活性剤として，ポリソルベート又はポロキサマーが好適である。例えば，ポリソルベート２０，ポリソルベート８０，及びポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールは，非イオン性界面活性剤として好適である。特に，ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールが好適である。ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールはポロキサマー１８８と同義である。
【００７０】
凍結乾燥製剤における非イオン性界面活性剤の含量は，融合蛋白質の含量に対して，好ましくは０．００５〜６（ｗ／ｗｗ／ｗ）であり，より好ましくは０．０２〜０．２（ｗ／ｗｗ／ｗ）であり，更に好ましくは０．０４〜０．１（ｗ／ｗｗ／ｗ）であり，例えば，０．０６５（ｗ／ｗｗ／ｗ）である。
【００７１】
凍結乾燥製剤に含まれる緩衝剤には，医薬品の賦形剤として用いることができるものである限り特に限定はないが，好ましくはリン酸緩衝剤である。リン酸緩衝剤は，凍結乾燥製剤を純水で溶解したときに，好ましくはｐＨが５．５〜７．５となるように，より好ましくはｐＨが６．０〜７．０となるように，例えばｐＨ６．５となるように凍結乾燥製剤に添加される。
【００７２】
本発明の凍結乾燥製剤の好適な組成の例として，
（Ａ）抗体とヒトリソソーム酵素との融合蛋白質の含量が０．５〜２０ｍｇであり，融合蛋白質の含量に対する中性塩，ニ糖類，及びイオン性界面活性剤の含量が，それぞれ，０．０１５〜２．５（ｗ／ｗｗ／ｗ），２．５〜２００（ｗ／ｗｗ／ｗ），及び０．００５〜６（ｗ／ｗｗ／ｗ）であるもの，
（Ｂ）抗体とヒトリソソーム酵素との融合蛋白質の含量が０．５〜２０ｍｇであり，融合蛋白質の含量に対する中性塩，ニ糖類，及びイオン性界面活性剤の含量が，それぞれ，０．０５〜０．５（ｗ／ｗ），５〜５０（ｗ／ｗ），及び０．０２〜０．２（ｗ／ｗ）であるもの，
（Ｃ）抗体とヒトリソソーム酵素との融合蛋白質の含量が０．５〜２０ｍｇであり，融合蛋白質の含量に対する中性塩，ニ糖類，及びイオン性界面活性剤の含量が，それぞれ，０．１〜０．２５（ｗ／ｗ），１０〜２５（ｗ／ｗ），及び０．０４〜０．１（ｗ／ｗ）であるもの，が挙げられる。
【００７３】
上記（Ａ）〜（Ｃ）において，リン酸緩衝剤は，凍結乾燥製剤を純水で溶解したときに，ｐＨが５．５〜７．５又は６．０〜７．０となるように，例えばｐＨ６．５となるように凍結乾燥製剤に添加される。
【００７４】
本発明の凍結乾燥製剤のより好適な組成の例として，
（Ｄ）抗体とヒトリソソーム酵素との融合蛋白質の含量が０．５〜２０ｍｇであり，融合蛋白質の含量に対する塩化ナトリウム，スクロース，及びポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの含量が，それぞれ，０．０１５〜２．５（ｗ／ｗ），２．５〜２００（ｗ／ｗ），及び０．００５〜６（ｗ／ｗ）であるもの，
（Ｅ）抗体とヒトリソソーム酵素との融合蛋白質の含量が０．５〜２０ｍｇであり，融合蛋白質の含量に対する塩化ナトリウム，スクロース，及びポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの含量が，それぞれ，０．０５〜０．５（ｗ／ｗ），５〜５０（ｗ／ｗ），及び０．０２〜０．２（ｗ／ｗ）であるもの，
（Ｆ）抗体とヒトリソソーム酵素との融合蛋白質の含量が０．５〜２０ｍｇであり，融合蛋白質の含量に対する塩化ナトリウム，スクロース，及びポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの含量が，それぞれ，０．１〜０．２５（ｗ／ｗ），１０〜２５（ｗ／ｗ），及び０．０４〜０．１（ｗ／ｗ）であるもの，が挙げられる。
【００７５】
上記（Ｄ）〜（Ｆ）において，リン酸緩衝剤は，凍結乾燥製剤を純水で溶解したときに，ｐＨが５．５〜７．５又は６．０〜７．０となるように，特にｐＨが６．５となるように添加される。
【００７６】
本発明の凍結乾燥製剤の更に具体的な組成の例として，
（Ｇ）抗体とヒトリソソーム酵素との融合蛋白質の含量が１０ｍｇであり，融合蛋白質の含量に対する塩化ナトリウム，スクロース，及びポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの含量が，それぞれ，０．１６（ｗ／ｗ），１５（ｗ／ｗ），及び０．６５（ｗ／ｗ）であり，純水で溶解したときにｐＨが６．０〜７．０となるようにリン酸緩衝剤が添加されたものが挙げられる。
【００７７】
上記（Ａ）〜（Ｇ）で示される凍結乾燥製剤において，抗体とヒトリソソーム酵素との融合蛋白質は，例えば，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とｈＩ２Ｓとの融合蛋白質である。かかるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とｈＩ２Ｓとの融合蛋白質の好ましい形態として，
（１）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するものであって，重鎖のＣ末端側に，リンカー配列を介して，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼが結合したものである融合蛋白質，
（２）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するものであって，重鎖のＣ末端側に，リンカー配列を介して，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼが結合したものである融合蛋白質，
（３）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するものであって，重鎖のＣ末端側に，リンカー配列を介して，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼが結合したものである融合蛋白質，が挙げられる。
上記（１）〜（３）の融合蛋白質において，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼは，好ましくは配列番号１で示されるアミノ酸を有するものであり，リンカー配列は，好ましくは（Gly-Ser）で示されるアミノ酸配列を有するものである。またこれら融合蛋白質は，通常，２本の軽鎖と２本のヒトイズロン酸−２−スルファターゼと結合した重鎖とから構成される。
【００７８】
上記（Ａ）〜（Ｇ）で示される凍結乾燥製剤における，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とｈＩ２Ｓとの融合蛋白質の更なる好ましい形態として，
（４）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するものであり，
該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，（Gly-Ser）で示されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼと結合しており，配列番号１３で示されるアミノ酸配列を形成しているもの，
（５）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するものであり，
該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，（Gly-Ser）で示されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼと結合しており，配列番号１５で示されるアミノ酸配列を形成しているもの，
（６）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するものであり，
該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，（Gly-Ser）で示されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼと結合しており，配列番号１７で示されるアミノ酸配列を形成しているもの，が挙げられる。
【００７９】
上記（Ａ）又は（Ｆ）で示される凍結乾燥製剤において，抗体とヒトリソソーム酵素との融合蛋白質が上記（１）〜（６）で示されるものである場合において，当該融合蛋白質の含量は，好ましくは０．５〜２０ｍｇであり，例えば，２．０〜１０ｍｇ，２．０〜６．０ｍｇ等であり，適宜，２．５ｍｇ，５．０ｍｇ等に調整される。当該融合蛋白質の好適な凍結乾燥製剤の組成の例として，
（Ｈ）当該融合蛋白質の含量が０．５〜２０ｍｇであり，融合蛋白質の含量に対する塩化ナトリウム，スクロース，及びポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの含量が，それぞれ，０．０１５〜２．５（ｗ／ｗ），２．５〜２００（ｗ／ｗ），及び０．００５〜６（ｗ／ｗ）であるもの，
（Ｉ）当該融合蛋白質の含量が０．５〜２０ｍｇであり，融合蛋白質の含量に対する塩化ナトリウム，スクロース，及びポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの含量が，それぞれ，０．０５〜０．５（ｗ／ｗ），５〜５０（ｗ／ｗ），及び０．０２〜０．２（ｗ／ｗ）であるもの，
（Ｊ）当該融合蛋白質の含量が０．５〜２０ｍｇであり，融合蛋白質の含量に対する塩化ナトリウム，スクロース，及びポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの含量が，それぞれ，０．１〜０．２５（ｗ／ｗ），１０〜２５（ｗ／ｗ），及び０．０４〜０．１（ｗ／ｗ）であるもの，が挙げられる。
【００８０】
より具体的には，
（Ｋ）当該融合蛋白質の含量が１０ｍｇであり，融合蛋白質の含量に対する塩化ナトリウム，スクロース，及びポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの含量が，それぞれ，０．１６（ｗ／ｗ），１５（ｗ／ｗ），及び０．６５（ｗ／ｗ）であり，純水で溶解したときにｐＨが６．０〜７．０となるようにリン酸緩衝剤が添加されたものがある。
【００８１】
抗体とヒトリソソーム酵素との融合蛋白質を有効成分とする本発明の凍結乾燥製剤は，例えば，ダブルチャンバータイプのシリンジ又はバイアル等の容器に封入，充填等された形態で供給することができる。また，本発明の凍結乾燥製剤は，これを溶解するための専用の溶液と共にキットとして供給することもできる。凍結乾燥製剤は，例えば，使用前に専用の溶液，純水，リンゲル液等で溶解した後に，生理食塩水で希釈して輸注液とし，この輸注液を点滴静注する。その他，凍結乾燥製剤は，患者の筋肉内，腹腔内又は皮下等に投与することもできる。凍結乾燥製剤を封入，充填等するためのシリンジ及びバイアル等の容器の材質に特に限定はないが，ほう珪酸ガラス製のものが好適であり，この他，環状オレフィンとオレフィンの共重合体であるシクロオレフィンコポリマー，シクロオレフィン類開環重合体又は，シクロオレフィン類開環重合体に水素添加したもの等の疎水性樹脂製のものも好適である。
【実施例】
【００８２】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。【００８３】
〔実施例１〕ｈＩ２Ｓ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質発現用ベクターの構築
ｈＩ２Ｓ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質発現用ベクターは，配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖からなるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１，配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖からなるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２，配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖からなるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，３種類のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体（番号１〜３）をコードする遺伝子を用いて構築した。【００８４】
pEF/myc/nucベクター（Invitrogen社）を，KpnIとNcoIで消化し，EF-1αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域を切り出し，これをT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。pCI-neo（Invitrogen社）を，BglII及びEcoRIで消化して，CMVのエンハンサー／プロモーター及びイントロンを含む領域を切除した後に，T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに，上記のEF-1αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域を挿入して，pE-neoベクターを構築した。pE-neoベクターを，SfiI及びBstXIで消化し，ネオマイシン耐性遺伝子を含む約1 kbpの領域を切除した。pcDNA3.1/Hygro(+)（Invitrogen社）を鋳型にしてプライマーHyg-Sfi5’（配列番号１１）及びプライマーHyg-BstX3’（配列番号１２）を用いて，ＰＣＲ反応によりハイグロマイシン遺伝子を増幅した。増幅したハイグロマイシン遺伝子を，SfiI及びBstXIで消化し，上記のネオマイシン耐性遺伝子を切除したpE-neoベクターに挿入して，pE-hygrベクターを構築した。【００８５】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖の全長をコードする遺伝子を含むDNA断片（配列番号３）を合成した。このDNA断片の5’側にはMluI配列を，3’側にはNotI配列を導入した。このDNA断片をMluIとNotIで消化し，pE-neoベクターのMluI-NotI間に組み込んだ。得られたベクターをヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖発現用ベクターであるpE-hygr(LC1)とした。【００８６】
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖の全長をコードする遺伝子を含むDNA断片（配列番号５）を合成した。このDNA断片の5’側にはMluI配列を，3’側にはNotI配列を導入した。このDNA断片をMluIとNotIで消化し，pE-neoベクターのMluI-NotI間に組み込んだ。得られたベクターを，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖発現用ベクターであるpE-hygr(LC2)とした。【００８７】
配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の全長をコードする遺伝子を含むDNA断片（配列番号７）を合成した。このDNA断片の5’側にはMluI配列を，3’側にはNotI配列を導入した。このDNA断片をMluIとNotIで消化し，pE-neoベクターのMluI-NotI間に組み込んだ。得られたベクターを，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖発現用ベクターであるpE-hygr(LC3)とした。【００８８】
配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖のＣ末端側に（Gly-Ser）のアミノ酸配列を有するリンカーを介して配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するｈＩ２Ｓを結合させた蛋白質をコードする遺伝子を含む，配列番号１４で示される塩基配列を有するDNA断片を人工的に合成した。このDNA断片は，配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖とｈＩ２Ｓを結合させた蛋白質をコードする。このDNA断片をMluIとNotIで消化し，pE-neoベクターのMluIとNotIの間に組み込み，pE-neo(HC-I2S-1)を構築した。【００８９】
配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖のＣ末端側に（Gly-Ser）のアミノ酸配列を有するリンカーを介して配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するｈＩ２Ｓを結合させた蛋白質をコードする遺伝子を含む，配列番号１６で示される塩基配列を有するDNA断片を人工的に合成した。このDNA断片は，配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖とｈＩ２Ｓを結合させた蛋白質をコードする。このDNA断片をMluIとNotIで消化し，pE-neoベクターのMluIとNotIの間に組み込み，pE-neo(HC-I2S-2)を構築した。【００９０】
配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖のＣ末端側に（Gly-Ser）のアミノ酸配列を有するリンカーを介して配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するｈＩ２Ｓを結合させた蛋白質をコードする遺伝子を含む，配列番号１８で示される塩基配列を有するDNA断片を人工的に合成した。このDNA断片は，配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖とｈＩ２Ｓを結合させた蛋白質をコードする。このDNA断片をMluIとNotIで消化し，pE-neoベクターのMluIとNotIの間に組み込み，pE-neo(HC-I2S-3)を構築した。【００９１】
〔実施例２〕ｈＩ２Ｓ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の高発現細胞株の作製
ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｋ１：American Type Culture Collectionから入手）を，下記の方法により，GenePulser（Bio-Rad社）を用いて，実施例１で構築したpE-hygr(LC1)とpE-neo(HC-I2S-1)との組み合わせ，実施例１で構築したpE-hygr(LC2)とpE-neo(HC-I2S-2)との組み合わせ，及び実施例１で構築したpE-hygr(LC3)とpE-neo(HC-I2S-3)との組み合わせで，それぞれ形質転換した。細胞の形質転換は概ね以下の方法で行った。【００９２】
5X105 個のＣＨＯ−Ｋ１細胞をCD OptiCHOTM培地（Thermo Fisher Scientific社）を添加した3.5 cm培養ディッシュに播種し，37℃，5% CO2の条件下で一晩培養した。培養後，細胞を5X106 個/mLの密度となるようにOpti-MEMTMI培地（Thermo Fisher Scientific社）で懸濁した。細胞懸濁液100 μLを採取し，これにCD OptiCHOTM培地で100 μg/mLに希釈したpE-hygr(LC1)及びpE-neo(HC-I2S-1)プラスミドDNA溶液を5 μLずつ添加した。GenePulser（Bio-Rad社）を用いて，エレクトロポレーションを実施し，細胞にプラスミドを導入した。37℃，5% CO2の条件下で一晩培養した後，細胞を，0.5 mg/mLのハイグロマイシン及び0.8 mg/mLのG418を含有するCD OptiCHOTM培地で選択培養した。pE-hygr(LC2)及びpE-neo(HC-I2S-2)の組み合わせ，pE-hygr(LC2)及びpE-neo(HC-I2S-3)の組み合わせでも同様にして細胞を形質転換させた。【００９３】
次いで，限界希釈法により，1ウェルあたり1個以下の細胞が播種されるように，96ウェルプレート上に選択培養で選択された細胞を播種し，各細胞が単クローンコロニーを形成するように約10日間培養した。単クローンコロニーが形成されたウェルの培養上清を採取し，ヒト化抗体含量をELISA法にて調べ，ｈＩ２Ｓ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の高発現細胞株を選択した。【００９４】
このときのELISA法は概ね以下の方法で実施した。96ウェルマイクロタイタープレート（Nunc社）の各ウェルに，ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体溶液を0.05 M 炭酸水素塩緩衝液(pH 9.6)で4 μg/mLに希釈したものを100 μLずつ加え，室温で少なくとも1時間静置して抗体をプレートに吸着させた。次いで，リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)に0.05% Tween20を添加したもの（PBS-T）で各ウェルを3回洗浄後，Starting Block(PBS)Blocking Buffer（Thermo Fisher Scientific社）を各ウェルに200 μLずつ加えてプレートを室温で30分静置した。次いで，各ウェルをPBS-Tで3回洗浄した後，リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)に0.5% BSA及び0.05% Tween20を添加したもの（PBS-BT）で適当な濃度に希釈した培養上清又はヒトIgG標準品を，各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも1時間静置した。次いで，プレートをPBS-Tで3回洗浄した後，PBS-BTで希釈したHRP標識抗ヒトＩｇＧポリクロ−ナル抗体溶液を，各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも1時間静置した。PBS-Tで各ウェルを3回洗浄後，0.4 mg/mL o-フェニレンジアミンを含むリン酸−クエン酸緩衝液(pH 5.0)を100 μLずつ各ウェルに加え，室温で8〜20分間静置した。次いで，1 mol/L 硫酸を100 μLずつ各ウェルに加えて反応を停止させ，96ウェルプレートリーダーを用いて，各ウェルにつき490 nmでの吸光度を測定した。高い測定値を示したウェルに対応する細胞を，ｈＩ２Ｓ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の高発現細胞株として選択した。【００９５】
pE-hygr(LC1)とpE-neo(HC-I2S-1)の組み合わせで形質転換させて得られたｈＩ２Ｓ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の高発現細胞株を，ｈＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株１とした。この細胞株が発現するｈＩ２Ｓとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質をＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体１とした。【００９６】
pE-hygr(LC2)とpE-neo(HC-I2S-2)の組み合わせで形質転換させて得られたｈＩ２Ｓ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の高発現細胞株を，ｈＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株２とした。この細胞株が発現するｈＩ２Ｓとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質をＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体２とした。【００９７】
pE-hygr(LC3)とpE-neo(HC-I2S-3)の組み合わせで形質転換させて得られたｈＩ２Ｓ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の高発現細胞株を，ｈＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株３とした。この細胞株が発現するｈＩ２Ｓとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質をＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体３とした。【００９８】
Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体１，Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体２及びＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体３に含まれる，ヒト化抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列，それら軽鎖及び重鎖に含まれる可変領域のアミノ酸配列，及び，それら可変領域に含まれるＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列の配列番号を，表１にまとめて示す。【００９９】
【表１】
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【０１００】
〔実施例３〕ｈＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株の培養
Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体を，以下の方法で製造した。実施例２で得たｈＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株３を，細胞密度が約2Ｘ105 個/mLとなるように，4 mM L-アラニル-L-グルタミン，100 μmol/L ヒポキサンチン及び16 μmol/L チミジンを含有する，約200 Lの無血清培地（EX-CELL Advanced CHO Fed-batch Medium，Sigma Aldrich社）に懸濁させた。この細胞懸濁液の140 Lを培養槽に移した。培地をインペラ―で89 rpmの速度で撹拌し，培地の溶存酸素濃度を約40%に保持し，34〜37℃の温度範囲で，約11日間細胞を培養した。培養期間中，細胞数，細胞の生存率，培地のグルコース濃度及び乳酸濃度を監視した。培地のグルコース濃度が15 mmol/L未満となった場合には，直ちにグルコース濃度が37.89 mmol/Lとなるように，グルコース溶液を培地に添加した。培養終了後に培地を回収した。回収した培地を，Millistak+HC Pod Filter grade D0HC（Merck社)でろ過し，更にMillistak+ HCgrade X0HC (Merck社)でろ過して，Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体３を含む培養上清を得た。この培養上清を，PelliconTM 3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(孔径：30 kDa, 膜面積：1.14 m2，Merck社)を用いて限外ろ過し，液量が約17分の1となるまで濃縮した。次いで，この濃縮液をOpticap XL600(0.22 μm, Merck社)を用いてろ過した。得られた液を濃縮培養上清とした。【０１０１】
〔実施例４〕ウイルスの不活化
実施例３で得た濃縮培養上清に，トリｎ−ブチルリン酸（TNBP）及びポリソルベート80を，終濃度がそれぞれ0.3% (v/v)及び1% (w/v)となるように添加し，室温で4時間穏やかに撹拌した。この工程は培養上清中に混入するウイルスを不活化させるためのものである。但し，生物由来の成分を含まない無血清培地を用いて細胞をする限り，ウイルスの不活化工程がなくとも培養上清中に人体に有害なウイルスが混入する可能性はほとんどない。【０１０２】
〔実施例５〕ｈＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体の精製
ウイルス不活化後の濃縮培養上清を，0.5倍容の140 mM NaClを含有する20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)を添加した後に，Millipak-200 Filter Unit(孔径：0.22 μm, Merck社)でろ過した。このろ過後の溶液を，カラム体積の4倍容の140 mM NaClを含有する20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)で平衡化した，プロテインＡアフィニティーカラムであるMabSelect SuRe LXカラム (カラム体積:約3.2 L, ベッド高:約20cm, GE Healthcare社)に，200 cm/時の一定流速で負荷し，Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体３をプロテインＡに吸着させた。【０１０３】
次いで，カラム体積の5倍容の500 mM NaCl及び450 mM アルギニンを含有する10 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)を同流速で供給してカラムを洗浄した。次いでカラム体積の2.5倍容の140 mM NaClを含有する20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)を同流速で供給してカラムを更に洗浄した。次いで，カラム体積の5倍容の140 mM NaClを含有する100 mM グリシン緩衝液(pH 3.5)で，プロテインＡに吸着したＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体３を溶出させた。溶出液は，予め1 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)の入れておいた容器に受けて，直ちに中和した。【０１０４】
上記のプロテインＡアフィニティーカラムからの溶出液に，200 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)と，4 M NaCl及び2 mM リン酸緩衝液を含有する10 mM MES緩衝液(pH 7.3)と，1 M Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)とを順次添加し，溶出液に含まれるリン酸ナトリウム及びNaClの濃度を，それぞれ2 mM及び215 mMに調整するとともに，溶出液のpHを7.3に調整した。次いで，この溶出液を，Opticap XL600(孔径：0.22 μm, Merck社)でろ過した。このろ過後の溶液を，カラム体積の4倍容の215 mM NaCl及び2 mM リン酸ナトリウムを含有する10 mM MES緩衝液(pH 7.3)で平衡化した，ハイドロキシアパタイトカラムであるCHT TypeII 40 μmカラム(カラム体積:約3.2 L，ベッド高:約20 cm，Bio-Rad社)に，200 cm/時の一定流速で負荷し，Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体３をハイドロキシアパタイトに吸着させた。【０１０５】
次いで，カラム体積の5倍容の同緩衝液を同流速で供給してカラムを洗浄した。次いで，カラム体積の5倍容の215 mM NaClを含有する35mM リン酸緩衝液(pH 7.3)で，ハイドロキシアパタイトに吸着したＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体３を溶出させた。なお，ハイドロキシアパタイトカラムでの精製は，プロテインＡアフィニティーカラムからの溶出液を半量ずつ用いて，2回に分けて実施した。【０１０６】
上記のハイドロキシアパタイトカラムからの溶出液に，希塩酸を加えてpHを6.5に調整した。次いで，PelliconTM 3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(孔径：30kDa, 膜面積：1.14 m2，Merck社)を用いて限外ろ過し，溶液中のＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体３の濃度が約2 mg/mLとなるまで濃縮した。次いで，この濃縮液をOpticap XL600 (0.22 μm, Merck社)を用いてろ過した。【０１０７】
上記の濃縮液を，カラム体積の5倍容の0.8 mg/mL NaCl及び75 mg/mL スクロースを含有する20 mM リン酸緩衝液(pH 6.5)で平衡化した，サイズ排除カラムであるSuperdex 200カラム(カラム体積:約12.6 L, ベッド高:40 cm, GE Healthcare社)に，19 cm/時の一定流速で負荷し，更に，同緩衝液を同じ流速で供給した。このとき，サイズ排除カラムからの溶出液の流路に，溶出液の吸光度を連続的に測定するための吸光光度計を配置して，280 nmの吸光度をモニターし，28 0nmで吸収ピークを示した画分を，Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体３を含む画分として回収し，これをＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体精製品とした。なお，サイズ排除カラムでの精製は，ハイドロキシアパタイトカラムからの溶出液を半量ずつ用いて，2回に分けて実施した。【０１０８】
〔実施例６〕Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体を含有する凍結乾燥品の製造
実施例５で得たＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体精製品を用いて，表２に示す組成の水溶液を調製した。この水溶液をVacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm（Corning社）を用いて除菌ろ過した。ろ過後の溶液を試験薬とした。試験薬のpHが約6.5となるように，必要に応じて水酸化ナトリウム溶液又は希塩酸を添加した。【０１０９】
【表２】
2018124277.tif 000003
【０１１０】
試験薬を2.5 mLずつ，ほう珪酸ガラス製バイアルに充填し，ゴム栓（塩素化ブチル製）を半打栓して凍結乾燥した。凍結乾燥工程において，バイアル内の気相を窒素に置換してからゴム栓を全打栓して，バイアルを密封した。得られた凍結乾燥品は，バイアル中で白色の塊を形成した。【０１１１】
〔実施例７〕Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体を含有する凍結乾燥製剤の安定性の検討
実施例６で製造した凍結乾燥品を，暗所，5℃又は25℃の環境下で6ヶ月間静置した。静置開始時，1ヶ月後，3ヶ月後，及び6ヶ月後に，バイアル中の凍結乾燥品を2.5 mLの純水で溶解し，これをサンプル溶液とした。各サンプル溶液のpHを測定するとともに，白色光源のもと，2000〜3750 lxの明るさで目視により異物の有無を検査した。また，各サンプル溶液中に含まれる1〜100 μmの粒径の微粒子数を，実施例８に示す方法で測定した。また，各サンプル溶液におけるＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体の重合体の比率を，実施例９に示す方法で測定した。更に，各サンプル溶液に含まれるＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲとの親和性を実施例１０に示す方法で測定した。更にまた，各サンプル溶液に含まれるＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体の酵素活性を実施例１１に示す方法で測定した。【０１１２】
暗所，5℃の環境下で6ヶ月間静置したときのＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体を含有する凍結乾燥製剤の安定性の測定結果を表３に示す。表３に示されるように，サンプル溶液のpHは，凍結乾燥品を6ヶ月静置した期間中，ほぼpH 6.5に保たれた。また，同期間中のサンプル溶液中に目視により明らかに認められる不溶性異物はなかった。また，同期間中のサンプル溶液中に含まれるＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体に占める重合体比率はほぼ一定であった。また，サンプル溶液中に含まれる1〜100 μmの粒径の微粒子の数も，同期間中に顕著に増加することはなかった。静置後6ヶ月のサンプル溶液で微粒子数の増加が観察されたが，それは，凍結乾燥製剤の保存期間を冷所で2年間と設定したときに，許容できる範囲のものであった。また，サンプル溶液中に含まれるＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体の酵素活性は，同期間中ほぼ一定に保たれた。また，サンプル溶液中に含まれるＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲに対する親和性が，同期間中に顕著に低下することもなかった（データは示さない）。【０１１３】
【表３】
2018124277.tif 000004
【０１１４】
暗所，25℃の環境下で6ヶ月間静置したときのＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体を含有する凍結乾燥製剤の安定性の測定結果を表４に示す。表４に示されるように，サンプル溶液のpHは凍結乾燥品を6ヶ月静置した期間中，ほぼpH 6.5に保たれた。また，同期間中に目視により明らかに認められる不溶性異物は生じなかった。また，同期間中の重合体比率はほぼ一定であった。また，サンプル溶液に含まれる1〜100 μmの粒径の微粒子の数も，同期間中に顕著に増加することはなかった。6ヶ月後に微粒子数の増加が観察されたが，それは，凍結乾燥製剤の保存期間を冷所で2年間と設定したときに，許容できる範囲のものであった。また，サンプル溶液中に含まれるＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体の酵素活性は，同期間中ほぼ一定に保たれた。また，サンプル溶液中に含まれるＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲに対する親和性が，同期間中に顕著に低下することもなかった（データは示さない）。【０１１５】
【表４】
2018124277.tif 000005
【０１１６】
以上の結果は，流通過程及び保管庫において，薬剤が冷所下に置かれることを前提にして，Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体を有効成分として含有してなる薬剤を，表２に示される組成の凍結乾燥製剤とすることで，薬理学的に安定な状態で市場に提供できることを示すものである。【０１１７】
〔実施例８〕サンプル溶液中に含まれる粒子数（粒径：1〜100 μm）の測定
サンプル溶液中に含まれる粒子数の測定は，フローイメージング粒子解析装置であるFlowCAMTM（フルイド・イメージング・テクノロジーズ社）を用いて行った。フローイメージング粒子解析装置は，サンプル溶液をシリンジポンプによって光学系と直交するフローセルに引き込み，フローセル中を通過する粒子をリアルタイムで撮影することにより，サンプル溶液中に含まれる粒子数を測定することのできる装置である。測定は，検出すべき粒子サイズを1〜100 μmに設定して行った。【０１１８】
〔実施例９〕サンプル溶液中に含まれるＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体の重合体の含有率の測定
島津HPLCシステムLC-20A（島津製作所）に，サイズ排除カラムクロマトグラフィーカラムであるTSKgel UltraSW Aggregate 3 μmカラム（7.8 mm径X30 cm長，TOSOH社）をセットした。また，カラムの下流に吸光光度計を設置し，カラムからの流出液の吸光度（測定波長215 nm）を連続して測定できるようにした。0.2 M リン酸ナトリウム緩衝水溶液を0.5 mL/分の流速で流してカラムを平衡化させた後，3〜20 μgのＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体を含有するサンプル溶液をカラムに負荷し，更に0.2 M リン酸ナトリウム緩衝水溶液を同流速で流した。この間，カラムからの流出液の吸光度（測定波長215 nm）を測定することにより，溶出プロフィールを得た。得られた溶出プロフィールから，Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体の単量体のピーク面積（単量体ピーク面積）と，この単量体ピークより先に現れるＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体の重合体のピーク面積（重合体ピーク面積）を求めた。重合体の含有率（%）を次式で求めた。
重合体の含有率（%）＝｛重合体ピーク面積／（単量体ピーク面積＋重合体ピーク面積）｝Ｘ１００【０１１９】
〔実施例１０〕サンプル溶液中に含まれるＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲへの親和性の測定
Ｉ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲへの親和性の測定は，バイオレイヤー干渉法（BioLayer Interferometry：BLI）を用いた生体分子相互作用解析システムであるOctetRED96（ForteBio社,a division of Pall Corporation）を用いて実施した。バイオレイヤー干渉法の基本原理について，簡単に説明する。センサーチップ表面に固定された生体分子の層（レイヤー）に特定波長の光を投射したとき，生体分子のレイヤーと内部の参照となるレイヤーの二つの表面から光が反射され，光の干渉波が生じる。測定試料中の分子がセンサーチップ表面の生体分子に結合することにより，センサー先端のレイヤーの厚みが増加し，干渉波に波長シフトが生じる。この波長シフトの変化を測定することにより，センサーチップ表面に固定された生体分子に結合する分子数の定量及び速度論的解析をリアルタイムで行うことができる。測定は，概ねOctetRED96に添付の操作マニュアルに従って実施した。ヒトＴｆＲとしては，Ｎ末端にヒスチジンタグが付加した，配列番号１に示されるアミノ酸配列の中でＮ末端側から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの，ｈＴｆＲの細胞外領域のアミノ酸配列を有する組換えヒトＴｆＲ（ｒヒトＴｆＲ：Sino Biological社）を用いた。【０１２０】
実施例６で調製したサンプル溶液を，それぞれHBS-P+（150 mM NaCl, 50 μM EDTA及び0.05% Surfactant P20を含む10 mM HEPES）で２段階希釈し，0.78125〜50 nM（0.117〜7.5 μg/mL）の７段階の濃度のサンプル溶液希釈液を調製した。ｒヒトＴｆＲを，ＨＢＳ−Ｐ＋で希釈し，25 μg/mLの溶液を調製し，ｒヒトＴｆＲ−ＥＣＤ（Histag）溶液とした。【０１２１】
上記２段階希釈して調製したサンプル溶液希釈液を，96 well plate, black（greiner bio-one社）に200 μL/ウェルずつ添加した。また，上記調製したｒヒトＴｆＲ−ＥＣＤ（Histag）溶液を，所定のウェルにそれぞれ200 μL/ウェルずつ添加した。ベースライン，解離用及び洗浄用のウェルには，HBS-P+を200 μL/ウェルずつ添加した。再生用のウェルには，10 mM Glycine-HCl（pH 1.7）を200 μL／ウェルずつ添加した。活性化用のウェルには，0.5 mM NiCl2溶液を200 μL/ウェルずつ添加した。このプレートと，バイオセンサー（Biosensor/Ni-NTA：ForteBio社，a division of Pall Corporation）を，OctetRED96の所定の位置に設置した。【０１２２】
OctetRED96を下記の表５に示す条件で作動させてデータを取得後，OctetRED96付属の解析ソフトウェアを用いて，結合反応曲線を１：１結合モデルあるいは２：１結合モデルにフィッティングし，抗ｈＴｆＲ抗体のｒヒトＴｆＲに対する会合速度定数（kon）及び解離速度定数（koff）を測定し，解離定数（KD）算出した。なお，測定は25〜30℃の温度下で実施した。【０１２３】
【表５】
2018124277.tif 000006
【０１２４】
〔実施例１１〕サンプル溶液中に含まれるＩ２Ｓ−抗ｈＴｆＲ抗体の酵素活性測定
サンプル溶液を，垂直ポリエーテルスルホン膜（VIVASPIN2 5,000 MWCO PES，ザルトリウス社）を限外濾過膜として用いた膜濾過により脱塩し，次いで，脱塩された試料を反応緩衝液（5 mM 酢酸ナトリウム，0.5 mg/L BSA，0.1% Triton X-100，pH 4.45）で約100 ng/mLに希釈した。96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェル（FluoroNunc Plate, Nunc社）に希釈したサンプル溶液を10 μLずつ添加し，37℃で15分間プレインキュベートした。基質溶液は，基質緩衝液（0.5 mg/mL BSAを含む5 mM 酢酸ナトリウム，pH 4.45）を用いて4-メチルウンベリフェリルサルフェート（SIGMA社）を最終濃度1.5 mg/mLになるように溶解することより調製した。基質溶液を，希釈したサンプル溶液を含んだ各ウェルに100 μLずつ添加し，プレートを暗所に37℃で1時間静置した。インキュベーション後，停止緩衝液（0.33 M グリシン，0.21 M 炭酸ナトリウム緩衝液, pH 10.7）を190 μLずつ，サンプルを含む各ウェルに加えた。対照として，150 μLの0.4 μmol/L 4-メチルウンベリフェロン（4-MUF，Sigma社）溶液と150 μLの停止緩衝液とを，ウェルに加えた。次いで，励起波長330 nm，蛍光検出波長440 nmでプレートを測定した。【０１２５】
種々の濃度の4-MUF溶液の蛍光強度を測定することにより標準曲線を作成した。各試料の蛍光強度を標準曲線に外挿した。なお，結果は，37℃で1分当たりに1 μモルの4-MUFが生成されるのと等しい活性を1単位 (Unit)とし，Unit/mg蛋白質量で表される活性として計算した。公開された米国特許出願（公開番号2004-0229250）は，この測定を実施する上で参照された。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明によれば，抗体とリソソーム酵素とを結合させた蛋白質を有効成分として含有してなる凍結乾燥製剤を，薬理学的に安定な状態で市場に提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２７】
配列番号２：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖をコードする塩基配列を含む塩基配列，合成配列
配列番号４：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号５：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖をコードする塩基配列を含む塩基配列，合成配列
配列番号６：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号７：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖をコードする塩基配列を含む塩基配列，合成配列
配列番号８：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖のアミノ酸配列
配列番号９：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖のアミノ酸配列
配列番号１０：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖のアミノ酸配列
配列番号１１：プライマーＨｙｇ−Ｓｆｉ５’，合成配列
配列番号１２：プライマーＨｙｇ−ＢｓｔＸ３’，合成配列
配列番号１３：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖とＩ２Ｓの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号１４：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖とＩ２Ｓの融合蛋白質をコードする塩基配列，合成配列
配列番号１５：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖とＩ２Ｓの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号１６：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖とＩ２Ｓの融合蛋白質をコードする塩基配列，合成配列
配列番号１７：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖とｈＩ２Ｓの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号１８：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖とｈＩ２Ｓの融合蛋白質をコードする塩基配列，合成配列
配列番号１９：リンカーのアミノ酸配列の例１
配列番号２０：リンカーのアミノ酸配列の例２
配列番号２１：リンカーのアミノ酸配列の例３
配列番号２３：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２４：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２５：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２６：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２７：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２８：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２９：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号３０：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号３１：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号３２：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号３３：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３４：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号３５：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号３６：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号３７：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号３８：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号３９：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号４０：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号４１：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号４２：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号４３：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号４４：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４５：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号４６：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号４７：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号４８：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号４９：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号５０：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号５１：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号５２：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号５３：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号５４：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号５５：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号５６：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号５７：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号５８：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号５９：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号６０：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号６１：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
【配列表】
2018124277000001.app
【国際調査報告】
2018124277.tif 000007
2018124277.tif 000008
2018124277.tif 000009
2018124277.tif 000010