(57)【要約】  本発明は、マウスノロウイルス（ＭＮＶ）が、哺乳動物細胞内での宿主特性の壁を越えて増殖可能な遺伝子組換え培養細胞や遺伝子組み換え動物、さらにこれらを用いたスクリーニング方法の用途を提供して、ノロウイルスに関する研究停滞の問題を解決することを課題とする。本発明者は、マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子、及び／又は、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子、の全部若しくは一部が一種又は二種以上組み込まれている、遺伝子組換え哺乳動物培養細胞、これを自己の細胞として保有する哺乳動物において、ＭＮＶ感染が認められることを見出し、これを基にノロウイルスに関連する薬剤のスクリーニング方法等を提供することにより、上記課題の解決を行った。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子、及び／又は、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子、の全部若しくは一部が、一種又は二種以上組み込まれている、遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
【請求項２】
組み込まれるマウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子、及び／又は、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子、の全部又は一部として、細胞外領域の全部若しくは一部を含むことを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
【請求項３】
細胞外領域は、シグナルペプチド及び全てのベータコイル構造をコードする領域を含むことを特徴とする、請求項２に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
【請求項４】
組み込まれるマウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子、及び／又は、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子、の全部又は一部として、さらに膜貫通領域を含むことを特徴とする、請求項３に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
【請求項５】
組み込まれるマウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子、及び／又は、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子、の全部又は一部として、さらに細胞内領域のシグナル伝達機能を有する部分のコード領域を含むことを特徴とする、請求項３又は４に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
【請求項６】
マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子は、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｂ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｄ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３００ｇ、又は、ＣＤ３００ｈの遺伝子であることを特徴とする、請求項５に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
【請求項７】
マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子は、ＣＤ３００ｄ遺伝子、であることを特徴とする、請求項５に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
【請求項８】
組み込まれるマウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子、あるいは、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子は、そのコードするタンパク質のＮ末端から１５０アミノ酸残基分の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項５〜７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
【請求項９】
哺乳動物培養細胞は、株化培養細胞、生検サンプルから誘導されるオルガノイド、不死化誘導細胞、又は、ｉＰＳ細胞であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
【請求項１０】
哺乳動物培養細胞は、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ハムスター由来、モルモット由来、ウサギ由来、ネコ由来、イヌ由来、ブタ由来、又は、サル由来の哺乳動物培養細胞であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
【請求項１１】
哺乳動物培養細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト由来）、Ｃａｃｏ２細胞（ヒト由来）、Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ４０７細胞（ヒト由来）、マクロファージ系培養細胞１５３１０−ＬＮ細胞（ヒト由来）、ＮＡＬＭ−６（ヒト由来）、ＲＡＷ２６４．７細胞（マウス由来）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス由来）、Ｍ１細胞（マウス由来）、ＢＨＫ細胞（ハムスター由来）、ＣＨＯ細胞（ハムスター由来）、ＣＲＦＫ（ネコ由来）、ＭＤＣＫ（イヌ由来）、ＰＫ−１５（ブタ由来）、ＶＥＲＯ（サル由来）、又は、ＣＯＳ７（サル由来）であることを特徴とする、請求項１０に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え哺乳動物培養細胞を自己の細胞として保有する、遺伝子組み換え哺乳動物。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞、又は、請求項１２に記載の遺伝子組換え哺乳動物（ヒトを除く）に、マウスノロウイルスを感染させ、当該哺乳動物細胞、又は、哺乳動物（ヒトを除く）において当該マウスノロウイルスを増殖させる、ノロウイルスの生産方法。
【請求項１４】
哺乳動物細胞、あるいは、哺乳動物（ヒトを除く）に対して、マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子、又は、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子、の全部若しくは一部を、一種又は二種以上導入することにより、当該哺乳動物細胞、あるいは、哺乳動物（ヒトを除く）において、マウスノロウイルスに対する被感染能を付与する、哺乳動物細胞、あるいは、哺乳動物における被感染能の付与方法。
【請求項１５】
マウスノロウイルスを感染させた、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞、又は、請求項１２に記載の遺伝子組換え哺乳動物（ヒトを除く）に、ノロウイルスに対する作用についてのスクリーニング対象物質を接触させて、当該哺乳動物培養細胞、あるいは、哺乳動物（ヒトを除く）における当該ノロウイルスの増殖を検出することにより、当該スクリーニング対象物質の作用の情報を取得することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項１６】
スクリーニング対象作用が、ノロウイルスの不活化作用、又は、増殖の阻害作用であることを特徴とする、請求項１５に記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞、又は、請求項１２に記載の遺伝子組換え哺乳動物（ヒトを除く）に、スクリーニング対象物質とマウスノロウイルスを接触させて、当該哺乳動物培養細胞、あるいは、哺乳動物（ヒトを除く）に対するノロウイルスの侵入、又は、増殖を検出することにより、当該スクリーニング対象物質の作用の情報を取得することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項１８】
スクリーニング対象作用が、ノロウイルスの細胞侵入の阻害作用、又は、細胞内における増殖の阻害作用であることを特徴とする、請求項１７に記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え哺乳動物培養細胞、又は、請求項１２に記載の遺伝子組換え哺乳動物（ヒトを除く）に、スクリーニング対象ワクチンを免疫して、当該哺乳動物培養細胞、又は、哺乳動物（ヒトを除く）におけるマウスノロウイルスに対する防御作用を検出することにより、当該スクリーニング対象ワクチンの作用の情報を取得することを特徴とする、スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの増殖手段に関する発明であり、具体的にはノロウイルスの増殖手段に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
ノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）は、カリシウイルス科ノロウイルス属ノーウォークウイルス種に属するウイルスの総称として一般に広く使用されている用語である。本来は、ノーウォークウイルスと呼称されるべきであるが、ここではノロウイルスを使用する。ノロウイルスには、５つの遺伝子グループが存在し、遺伝子グループＩ〜Ｖ（ＧＩ〜ＧＶ）のうち、ＧＩ、ＧII、ＧIVがヒトに感染するノロウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ：ＨｕＮｏＶ）である。ＧIIIはウシに感染するノロウイルス、ＧＶはマウスに感染するノロウイルス（マウスノロウイルス：ＭＮＶ）である。【０００３】
ＨｕＮｏＶは、非細菌性急性胃腸炎を引き起こすウイルス属であり、約７５００塩基のＲＮＡをゲノムとするウイルスであり、エンベロープは伴わない。ノロウイルスは非常に強い感染力を有していることが知られており、乾燥状態でも４℃では８週間程度、２０℃でも３〜４週間程度は生存し、感染者の糞便や吐瀉物、又は、それらの乾燥物に由来する塵埃を介して経口感染する。感染者の便や吐瀉物に含まれるウイルスが、食べ物に付着することにより引き起こされる食中毒は、しばしば、一事件当たり１００人を超える大規模な食中毒事件となる他、下水処理上を経て河川から海に下り、二枚貝の中腸腺に濃縮されるため、二枚貝類の生食によっても食中毒を引き起こすことから、食中毒の原因ウイルスの一つとして知られている。【０００４】
ＨｕＮｏＶに感染した感染者は、ＨｕＮｏＶが、十二指腸から小腸上部で増殖し、感染性の胃腸炎症状を呈することが多い。この場合、死に至る場合は希であるが、突発的な激しい吐き気や嘔吐、下痢、腹痛、悪寒、発熱を伴い、苦痛が極めて大きく、特異的な治療法は確立していない。【０００５】
米国ＣＤＣの資料によるとＨｕＮｏＶの感染による集団食中毒は世界各地で頻繁に発生しており、全世界で発生する下痢症の２０％がＨｕＮｏＶによると推定されている。ＨｕＮｏＶには、試験管内でウイルスを増殖させるための感受性細胞株が樹立されておらず、薬剤の効果を判定できないため、効果的な消毒剤の開発が妨げられている。アルコールなどの一般的な消毒薬が効きにくいとされており、次亜塩素酸ナトリウム、加熱処理などを用いるしか消毒方法が無い。また、感染増殖機構が解明されていないこと、ＨｕＮｏＶの感染増殖が可能な小型実験動物が存在しない事などから、病原性発現機構も不明なままである。【０００６】
ノロウイルスは、ウイルスの接着、侵入、脱核のステップに強い種特異性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Francisco Borrego, Blood, 2013; 121(11): 1951-1960
【非特許文献２】Katayama K, Murakami K, Sharp TM, Guix S, Oka T, Takai-Todaka R, Nakanishi A, Crawford SE, Atmar RL, Estes MK.Plasmid-based human norovirus reverse genetics system produces reporter-tagged progeny virus containing infectious genomic RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. Sep 23；111(38); E4043-52, Epub Sep 5, 2014.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
通常、ウイルスについての詳細な研究を行うには、適切な動物培養細胞を選択して目的ウイルスを感染させてウイルスを増殖させることが必要である。この点において、ノロウイルスにおいては大きな障害が存在する。ノロウイルスについての詳細な研究が最も待たれているのは、ヒトに感染するノロウイルス（ＨｕＮｏＶ）であることは明らかであるが、残念ながら、現状においてＨｕＮｏＶを実験室的に効率良く増殖させる適切な方法が未だに見出されていない。また、仮にＨｕＮｏＶを実験室内で増殖させる方法が見つかったとしても、ＨｕＮｏＶが感染できる実験動物は存在しておらず、ＨｕＮｏＶが体内でどのように増殖し、どのように症状を引き起こすのか等を調べることは難しい。【０００９】
そこで、ノロウイルスの宿主特異性を利用して、ヒトに対して感染性を持たず、実験室マウスに対して感染力を持つマウスノロウイルス（ＭＮＶ）を用いた実験モデルを確立して、これを用いてノロウイルス感染症の治療に有効な薬剤等のスクリーニング等を行う方法を確立することは、非常に価値ある事柄である。ＭＮＶもＨｕＮｏＶも、細胞内に入ってしまえば、増殖して感染性ウイルスを産生できる。つまり、細胞内におけるノロウイルスの複製プロセスは、ノロウイルス同士でほぼ同一と考えられる。【００１０】
本発明は、ヒトや家畜に対する直接的な感染力を持たないＭＮＶの受容体を見出し、その受容体を利用して、宿主特性の壁を越えたＭＮＶが増殖可能な遺伝子組換え培養細胞や遺伝子組み換え動物、さらにこれらを用いたスクリーニング方法の用途を提供し、上述したノロウイルスに関する研究停滞の問題を解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、ＭＮＶの自然宿主の細胞に対する感染を司る細胞表面のレセプターが存在するのではないかと考え、これについての検討を行った。ＭＮＶとＲＡＷ２６４．７細胞を用いた実験の結果から、マウスの細胞表面に存在する「ＣＤ３００Ｆ」と呼ばれているレセプターが、まさに求めるレセプターであることを突き止めた。【００１２】
本発明は、第１に、マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子（別名：ＣＬＭ−１、ＤｉｇＲ２、ＬＭＩＲ−３、ＭＡＩＲ−Ｖ）、及び／又は、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子、の全部若しくは一部が、一種又は二種以上組み込まれている、遺伝子組換え哺乳動物培養細胞（以下、「本発明の組換え哺乳動物細胞」ともいう）である。また、本発明は、本発明の組換え哺乳細胞を自己の細胞として保有する、遺伝子組み換え哺乳動物（ヒトを除く）（以下、「本発明の組換え哺乳動物」ともいう）、を提供する。【００１３】
本明細書においては、対象物が遺伝子の場合には、原則として、当該対象物の名称の末尾に「遺伝子」の語を付した（例えば、「ＣＤ３００Ｆ遺伝子」等）。また、当該遺伝子に基づくｍＲＮＡから翻訳されたポリプロテインを「タンパク質」（例えば、「ＣＤ３００Ｆタンパク質」等）と記載し、当該タンパク質に対する分子修飾（糖鎖付加、シグナルペプチドの除去、ポリプロテインＮ末端のメチオニン残基の除去等）が、天然又は人工で行われたものを「分子」（例えば、「ＣＤ３００Ｆ分子」等）と記載した。また、当該対象物が現実に細胞内において発揮する機能を重要視する場合、あるいは、遺伝子、タンパク質、及び、分子を総称する場合には、遺伝子、タンパク質、又は、分子の語は付していない（例えば、「ＣＤ３００Ｆ」等）。【００１４】
マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の塩基配列は、配列番号１（アクセッション番号：ＡＢ２９２０６１）で表され、これにコードされるタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２で表される。【００１５】
図１に、マウスのＣＤ３００Ｆタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）と分子の立体構造の概略図を示した。本図面は、http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1ZOXから得たマウスＣＤ３００Ｆタンパク質の全長を示している。左端のＮ末端から１７アミノ酸（実線囲み部分）は、シグナルペプチド領域、１８１アミノ酸は細胞外領域、１４アミノ酸（灰色マーク部分）は細胞膜貫通領域、及び、１２４アミノ酸からなる細胞内領域（うすい文字の部分）、からなっている。下線部分は、β鎖構成領域であり、太字部分は、３／１０らせん領域である。【００１６】
本発明における遺伝子組換えにおいて、遺伝子の塩基配列は、対応するアミノ酸配列に基づいてコドン改変が可能である。また、後述するノロウイルスの結合部位以外は、ノロウイルスレセプターとしての性質を保つことが確認できれば既報のアミノ酸から別のアミノ酸への改変が可能である。【００１７】
マウスと、マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子が組み込まれる哺乳動物、又は、培養細胞が由来する動物種は、同一であっても良いが、異なる動物種とすることも可能である。例えば、マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子（ＣＤ３００ｌｆ遺伝子）を導入する培養細胞をヒト由来とすることにより、よりヒトに近いＭＮＶの感染細胞を作出することが可能であり、スクリーニング系として特に好適である。【００１８】
ＣＤ３００Ｆは、非特許文献１に詳しく記載されている通り、活性化レセプターの機能と抑制レセプターの機能が対をなすことによる免疫細胞過程の広範かつ多様な組合せを調節するＣＤ３００ファミリーの一つとして知られている。ＣＤ３００Ｆは、哺乳動物種毎に認められ、かつ、若干構造が異なっている。例えば、マウスのＣＤ３００Ｆは、「ＣＤ３００ｌｆ」（別名：ＣＬＭ−１、ＤｉｇＲ２、ＬＭＩＲ−３、ＭＡＩＲ−Ｖ）（非特許文献１の表２）として知られており、これをコードする遺伝子はマウス第１１番染色体に存在する（非特許文献１の図１Ｂ）。ＣＤ３００Ｆ分子は、２箇所のＳ−Ｓ結合を伴うＩｇＶ様の細胞外ドメインと長い抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭｓ）と種々のアダプター分子を伴う細胞内ドメインが、膜貫通ドメインで連続し、ヒトとマウスでは、特に細胞内ドメインが若干異なっている（非特許文献１の１９５１頁の右欄、１９５２頁右欄最下行から１９５４頁左欄第１２行目、同文献の図２等）。【００１９】
「マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子」について、ＣＤ３００ファミリーの分子は、非特許文献１や、上述した図１に示すように、（１）細胞外領域、（２）膜貫通領域、及び、（３）細胞内領域の３領域に分けることができる。さらに、図２にＣＤ３００ファミリーの分子の立体構造における細胞外領域、膜貫通領域、細胞内領域と細胞膜との関連を示す概略図を示した（http://first.lifesciencedb.jp/archives/6137 より引用）。【００２０】
上記の３種類の領域のうち、（１）細胞外領域は、ノロウイルスの細胞外導入と増殖に直接的に係わっており、当該領域がＣＤ３００Ｆ遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子も、導入対象の遺伝子として用いることができる。マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリーの名称は、ＣＤ３００ａ（当該遺伝子の別名として、ＬＭＩＲ−１、ＭＡＩＲ−１、ＣＬＭ−８が知られている）、ＣＤ３００ｂ（当該遺伝子の別名として、ＬＭＩＲ−５、ｍＩＲＥＭ３、ＣＬＭ−７が知られている）、ＣＤ３００ｃ（当該遺伝子の別名として、ＣＬＭ−６、ＣＭＲＦ−３５Ａが知られている）、ＣＤ３００ｄ（当該遺伝子の別名として、ＬＭＩＲ−４、ＭＡＩＲ−ＩＶ、ＣＬＭ−５が知られている）、ＣＤ３００ｅ（当該遺伝子の別名として、ＣＬＭ−２、ＩＲＥＭ−２が知られている）、ＣＤ３００ｇ（当該遺伝子の別名として、ｎｅｐｍｕｃｉｎ、ＣＬＭ−９が知られている）、又は、ＣＤ３００ｈ（当該遺伝子の別名として、ＬＭＩＲ−７、ＣＬＭ−３が知られている）であり、これらのマウスＣＤ３００ファミリーのタンパク質をコードする遺伝子を、導入対象の遺伝子として用いることができる。これらのマウスのＣＤ３００ファミリーの中でも、ＣＤ３００ｄが好ましい。【００２１】
マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子、又は、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子は、対応するＣＤ３００Ｆ又はＣＤ３００Ｆ類似ファミリー遺伝子の全部であってもよいが、一部であってもよい。「当該遺伝子の一部」である場合、上記した細胞外領域をコードする遺伝子の全部又は一部を含むことが好ましい。「当該細胞外領域の一部」は、シグナルペプチド及び全てのベータコイル構造の領域をコードする遺伝子を含むことが好ましい。そしてさらに、膜貫通領域をコードする遺伝子を含むことが特に好適であり、さらに細胞内領域のシグナル伝達機能を有する部分をコードする遺伝子を含むことが極めて好適である。マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子、又は、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子は、そのコードするタンパク質のＮ末端から１５０アミノ酸残基分の塩基配列を含むことが好適である。【００２２】
上述した「マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子の全部又は一部」と、これらの「マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子の全部又は一部」を併せた遺伝子群から、一種又は二種以上を選択して、後述する組み込み対象哺乳動物又は哺乳動物培養細胞への導入遺伝子とすることができる。【００２３】
次に、上記ＣＤ３００Ｆ遺伝子の全部若しくは一部、及び／又は、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子の全部若しくは一部の一種又は二種以上を、自己の遺伝子として保有する、本発明の組換え哺乳動物哺乳動物の動物種（ヒトを除く）は、特に限定されないが、ノロウイルスの感染モデルとして適切な哺乳動物種である。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、サル等が挙げられる。これらの哺乳動物に対する遺伝子組み込み法としては、例えば、ＣＤ３００Ｆ遺伝子又は対象となるＣＤ３００ファミリー遺伝子を組み込んだマウス白血病ウイルスベクター、レンチウイルスベクター等のレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスＩ型ベクター、ＨＶＪ−リポソーム等の改変ウイルス性ベクター、哺乳動物細胞内で機能するＣＭＶプロモーター、ＧＡＣプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーターを有するプラスミドベクターなどを用いて、所望のＣＤ３００Ｆ遺伝子又は対象となるＣＤ３００ファミリー遺伝子を対象哺乳動物に導入し、発現させることができる。【００２４】
さらに、上記ＣＤ３００Ｆ遺伝子の全部若しくは一部、及び／又は、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子の全部若しくは一部の、一種又は二種以上が組み込まれる哺乳動物培養細胞は特に限定されず、例えば、ヒト培養細胞であれば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｃａｃｏ２細胞、Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ４０７、マクロファージ系培養細胞１５３１０−ＬＮ細胞、ＮＡＬＭ−６細胞等が挙げられ、マウス培養細胞であれば、ＲＡＷ２６４．７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｍ１細胞等が挙げられる。その他、ＢＨＫ細胞（ハムスター由来）、ＣＨＯ細胞（ハムスター由来）、ＣＲＦＫ細胞（ネコ由来）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ由来）、ＰＫ−１５細胞（ブタ由来）、ＶＥＲＯ細胞（サル由来）、ＣＯＳ７細胞（サル由来）等が挙げられる。哺乳動物培養細胞としては、上記のような培養細胞株の他に、生検サンプルから誘導されるオルガノイド、不死化誘導細胞、ｉＰＳ細胞等を用いることも可能である。【００２５】
哺乳動物培養細胞への上記ＣＤ３００Ｆ遺伝子の全部若しくは一部、及び／又は、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子の全部若しくは一部の、一種又は二種以上の導入方法は、特に限定されず、常法に従って行われる。典型的には、上記の哺乳動物に対する遺伝子導入を行うためのベクター、すなわち、上記ＣＤ３００Ｆ遺伝子の全部若しくは一部、及び／又は、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子の全部若しくは一部の、一種又は二種以上を組み込んだマウス白血病ウイルスベクター、レンチウイルスベクター等のレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスＩ型ベクター、ＨＶＪ−リポソーム等の改変ウイルス性ベクター、哺乳動物細胞内で機能するＣＭＶプロモーター、ＧＡＣプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーターを有するプラスミドベクターなどを用いる導入方法が挙げられる。遺伝子の導入には、組換えウイルスの他、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、市販のトランスフェクション試薬、マイクロインジェクション法、スタンポレーション法、パーティクルガン法等を用いることもできる。【００２６】
なお、上記ＣＤ３００Ｆ遺伝子の全部若しくは一部、及び／又は、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子の全部若しくは一部の、一種又は二種以上は、常法により確保することがきる。すなわち、上記ＣＤ３００Ｆ遺伝子の全部若しくは一部、及び／又は、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子の全部若しくは一部の、一種又は二種以上の由来動物のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法により当該遺伝子領域を増幅することにより、容易に所望のＣＤ３００Ｆ遺伝子の全部又は一部を得ることができる。これを自家で行うことも可能であるが、外注して行うことも可能であり、さらに市販がなされている場合には市販品を用いることも可能である。【００２７】
本発明では、第２に、上記の本発明の組換え哺乳動物培養細胞、及び／又は、本発明の組換え哺乳動物に、マウスノロウイルス（ＭＮＶ）を感染させ、当該哺乳動物細胞、又は、哺乳動物において当該ＭＮＶを増殖させる、ノロウイルスの生産方法（以下、本発明の生産方法ともいう）が提供される。【００２８】
第３に、哺乳動物細胞、あるいは、哺乳動物（ヒトを除く）に対して、マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子、又は、当該遺伝子の細胞外領域の塩基配列が当該遺伝子に類似するＣＤ３００ファミリー遺伝子、の全部若しくは一部を、一種又は二種以上導入することにより、当該哺乳動物細胞、あるいは、哺乳動物（ヒトを除く）において、マウスノロウイルス（ＭＮＶ）に対する被感染能を付与する、哺乳動物細胞、あるいは、哺乳動物における被感染能の付与方法が提供される。【００２９】
第４に、マウスノロウイルス（ＭＮＶ）を感染させた、本発明の組換え哺乳動物培養細胞、又は、本発明の組換え哺乳動物に、ノロウイルスに対する作用についてのスクリーニング対象物質を接触させて、当該哺乳動物培養細胞、あるいは、哺乳動物における当該ノロウイルスの増殖を検出することにより、当該スクリーニング対象物質の作用の情報を取得することを特徴とする、スクリーニング方法が提供される。【００３０】
この場合、スクリーニング対象作用は、ノロウイルスの不活化作用、又は、増殖の阻害作用とすることは好適な態様である。【００３１】
第５に、本発明の組換え哺乳動物培養細胞、又は、本発明の組換え哺乳動物に、スクリーニング対象物質とマウスノロウイルス（ＭＮＶ）を接触させて、当該哺乳動物培養細胞、あるいは、哺乳動物に対するノロウイルスの侵入、又は、増殖を検出することにより、当該スクリーニング対象物質の作用の情報を取得することを特徴とする、スクリーニング方法が提供される。【００３２】
この場合、スクリーニング対象作用が、ノロウイルスの細胞侵入の阻害作用、又は、細胞内における増殖の阻害作用であることは好適な態様である。【００３３】
第６に、本発明の組換え哺乳動物培養細胞、又は、本発明の組換え哺乳動物に、スクリーニング対象ワクチンを免疫して、当該哺乳動物細胞、又は、哺乳動物におけるマウスノロウイルス（ＭＮＶ）に対する防御作用を検出することにより、当該スクリーニング対象ワクチンの作用の情報を取得することを特徴とする、スクリーニング方法が提供される。
【発明の効果】
【００３４】
本発明により、マウスノロウイルス（ＭＮＶ）の人工的な増殖手段が提供され、さらに、当該ＭＮＶの増殖系を用いる、ノロウイルスに対する薬剤やワクチンのスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】マウスのＣＤ３００Ｆタンパク質のアミノ酸配列と分子の立体構造の概略図である。
【図２】ＣＤ３００ファミリーの分子の立体構造と細胞膜との関連を示す概略図である。
【図３】各種のＲＡＷ細胞に対してＭＮＶを作用させた場合の光学顕微鏡写真像である。
【図４】各種のＲＡＷ細胞に対してＭＮＶを作用させた場合の細胞内部のＭＮＶ分子の発現、細胞表面のＣＤ３００Ｆ（ｌｆ）分子発現の有無、ＭＮＶ産生能力を測定した結果を示す図である。
【図５−１】マウスのＣＤ３００Ｆ遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の核酸配列とＲＡＷ２６４．７細胞のＣＤ３００Ｆ遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の核酸配列を比較した結果を示す図である。
【図５−２】マウスのＣＤ３００Ｆタンパク質のアミノ酸配列とＲＡＷ２６４．７細胞のＣＤ３００Ｆタンパク質のアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。
【図６】マウスのＣＤ３００Ｆタンパク質とＲＡＷ細胞のＣＤ３００Ｆタンパク質(ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆタンパク質とＣＤ３００ｄタンパク質)のアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。上段は全体のアミノ酸配列の比較であり、下段はＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子の立体構造を示している。
【図７−１】ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子をヒト腎臓由来細胞ＨＥＫ２９３Ｔに導入し、その発現の確認を、ＦＡＣＳを用いて行った図である。
【図７−２】ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子の発現細胞にＭＮＶが結合していることの確認を、ＦＡＣＳを用いて行った図である。
【図７−３】ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子の発現細胞における、ＭＮＶ分子発現の確認を、ウェスタンブロットにより行った図である。
【図７−４】ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子の発現細胞の培養上清におけるＭＮＶ数のカウントを行った図である。
【図８−１】ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆの欠損変異導入遺伝子等のアライメントを示した図である。
【図８−２】ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆの欠損変異導入遺伝子等がコードするアミノ酸配列のアライメントを示した図である。
【図９−１】作出したマウスＣＤ３００Ｆ分子の細胞外ドメインの変異分子の模式図である。
【図９−２】図９−１のマウスＣＤ３００Ｆ分子の細胞外ドメインの変異分子をコードする遺伝子を導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して蛍光標識したＭＮＶを作用させ、ＦＡＣＳで確認した結果を示す図である。
【図９−３】図９−２の各細胞にＭＮＶを感染させ、ウェスタンブロットで細胞内でのＭＮＶ-ＲｄＲｐの発現を調べた結果の図である。
【図９−４】ＭＮＶを感染させた図９−２の各細胞の培養上清におけるＭＮＶ数を測定した結果の図である。
【図１０】マウスＣＤ３００Ｆ分子の細胞外ドメインの変異遺伝子を導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳで確認した結果を示す図である。
【図１１】マウスの各種ＣＤ３００Ｆ分子のアミノ酸配列とウェスタンブロットの結果を示した図である。
【図１２−１】マウス以外の哺乳動物の培養細胞に対してＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子を導入して、各形質転換細胞の振る舞いをＦＡＣＳで検討した結果を示す図である。
【図１２−２】マウス以外の哺乳動物の培養細胞に対してＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子を導入した形質転換細胞に対して、ＭＮＶを感染させた場合のＭＮＶ分子の発現をウェスタンブロットで検討した結果を示す図である。
【図１２−３】マウス以外の哺乳動物の培養細胞に対してＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子を導入した形質転換細胞に対して、ＭＮＶを感染させた場合の培養上清におけるＭＮＶ数のカウント数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、本発明の実施例を開示することにより、本発明の実施の形態の一例を示す。
【００３７】
［１］ＭＮＶ特異的なレセプターの同定
ＲＡＷ細胞で増殖培養可能なＭＮＶを用いて、ＭＮＶ特異的なレセプターを同定した。図３に、これらのＲＡＷ細胞に対してＭＮＶを作用させた場合の光学顕微鏡写真（倍率１０倍）を示した。ＭＮＶ無感染で培養を行った状態のＲＡＷ細胞（図３Ａ）は、ＭＮＶの感染により死滅した（図３Ｂ）。また、Ｃａｓ９酵素をコードする遺伝子とＣａｓ９に認識されるガイドＲＮＡ配列を有する哺乳類細胞の遺伝子をランダムにノックアウト可能な核酸配列ライブラリーの組換えレンチウイルスをＲＡＷ細胞に感染させ、マウスＣＤ３００Ｆ遺伝子（ＣＤ３００ｌｆ遺伝子）をノックアウトした細胞に、ＭＮＶ−Ｓ７−ＰＰ３株を感染させて、生き残る細胞集団が得られた（図３Ｃ）。すなわち、当該生き残りの細胞は、ＭＮＶの感染にかかわらず生存可能な細胞である。
【００３８】
なお、上記のＭＮＶ−Ｓ７−ＰＰ３株は、非特許文献２においてＭＮＶのリバースジェネティックスシステムを構築した際に使用した、日本において実験室マウスの糞便からＲＡＷ細胞を用いて分離培養したＭＮＶであり、Ｓ７株と名付けられた。ＲＡＷ細胞で３代の継代を行ったのち全塩基配列が決定され、リバースジェネティックスシステム用のインフェクシャスクローンとして報告を行った。継代数を表す表現としてＭＮＶ−Ｓ７−ＰＰ３と表記している。
【００３９】
ここで得られた生き残りの細胞集団は、ＭＮＶ感染条件下で生存した細胞であるから、ＭＮＶに対する感受性を失った細胞集団である。この細胞集団に含まれる遺伝子のノックアウト部分を明らかにするため、ガイドＲＮＡ配列をターゲットとしたプライマーを設計し、ＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物には、ガイドＲＮＡに挟まれた状態でノックアウトされた遺伝子の部分配列が含まれている。次にＰＣＲ産物の全ての塩基配列情報を読み解くため、ＭｉＳｅｑ（イルミナ社）次世代シーケンサーを用い、全てのＰＣＲ増幅産物の塩基配列を決定した。ここまでの作業を２回繰り返し、２回の施行で共通して検出され、最も出現頻度が高い配列を調べたところ、ＣＤ３００Ｆ遺伝子であることが明らかになった。つまり、ＣＤ３００Ｆ分子の発現をノックアウトされたＲＡＷ細胞が、生き残った細胞集団の中に最も多く観察された細胞であることが明らかにされた。この結果は、ＣＤ３００Ｆ遺伝子から発現するＣＤ３００Ｆ分子がＭＮＶの感染増殖を司るレセプターであることを示していた。
【００４０】
［２］ＣＤ３００Ｆ遺伝子のＭＮＶ特異性の確認
図４は、各種のＲＡＷ細胞に対してＭＮＶを作用させた場合の細胞内部のＭＮＶ分子の発現（図４Ａ）、細胞表面のＣＤ３００Ｆ（ｌｆ）分子発現の有無（図４Ｂ）、ＭＮＶ産生能力を測定した結果（図４Ｃ）、を示す図である。
【００４１】
ＭｕＣＤ３００Ｆ遺伝子ノックアウトＲＡＷ細胞と、通常のＲＡＷ 細胞におけるＭｕＣＤ３００Ｆ分子の発現をウェスタンブロットで確認すると、通常のＲＡＷ細胞には抗ＭｕＣＤ３００Ｆ抗体に反応するバンドが確認できたのに対し、ＭｕＣＤ３００Ｆ遺伝子ノックアウト細胞には、抗ＣＤ３００Ｆ分子抗体に反応するバンドはわずかしか確認できなかった（図４Ａ）。なお、図４Ａにおける「ＲｄＲｐ」は、ＭＮＶのＲＮＡｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを意味するものであり、「ＶＰ１」は、ＭＮＶのＶＰ１タンパク質を意味するものである。次に、ＦＡＣＳ（フローサイトメトリー）でそれぞれの細胞のＭｕＣＤ３００Ｆ分子の発現を調べた（図４Ｂ）。これによれば、蛍光標識した抗ＭｕＣＤ３００Ｆ分子抗体は、ＭｕＣＤ３００Ｆ遺伝子ノックアウト細胞には結合せず、蛍光シグナルのプラス方向へわずかにシフトが確認された（図４Ｂ右図）。
【００４２】
以上から、発現して細胞表面に移動したＭｕＣＤ３００Ｆ分子が、ＭＮＶのレセプターとして機能していることが示唆された。
【００４３】
さらに、ＭＮＶがＭｕＣＤ３００ＦをＲＡＷへの感染のためにレセプターとして利用していることを確かめるため、ＲＡＷ細胞に発現しているＣＤ３００Ｆ（マウスＣＤ３００Ｆ：ＭｕＣＤ３００Ｆとする）をクローニングして、その遺伝子の塩基配列（配列番号３）と、コードするアミノ酸配列（配列番号４）を、それぞれ公知のマウスＣＤ３００Ｆ遺伝子（アクセッション番号：ＡＢ２９２０６１（配列番号１））と、コードするアミノ酸配列（配列番号２）との比較を行い、両マウスＣＤ３００Ｆが実質的に同一の配列（塩基配列：９７％、アミノ酸配列：９８％）であることを確認した（図５−１、−２：後述する）。細胞外に突出している部分（細胞外ドメイン：Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）を標的にして、以下の検討を実施した。（ｉ）ＭｕＣＤ３００Ｆ分子の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体「Ａｎｔｉ−ＣＤ３００Ｆ  ｅｘｃｄ  ＭｏＡｂ」、（ii）ヒトのＣＤ３００Ｆ分子に対するモノクローナル抗体「Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ３００Ｆ  ｅｘｃｄ  ＭｏＡｂ」を作用させた後、ＭＮＶの感染が阻害できるか否かを確認した。すなわち、（ａ）未処理の細胞、（ｂ）Ａｎｔｉ−ＣＤ３００Ｆ  ｅｘｃｄ  ＭｏＡｂをＭｕＣＤ３００Ｆ分子の細胞外ドメインに作用させ、ＭｕＣＤ３００Ｆの機能を抑えた細胞、（ｃ）未処理の細胞にＡｎｔｉ−ＨｕｍａｎＣＤ３００Ｆ  ｅｘｃｄ  ＭｏＡｂを作用させた細胞を準備し、これらにＭＮＶを感染させ、４８時間後に培養上清中のＭＮＶ数をＣＣＩＤ５０で測定した。その結果、（ａ）未処理の細胞、（ｃ）未処理の細胞にＡｎｔｉ−ＨｕＣＤ３００Ｆ  ｅｘｃｄ  ｃｅｌｌ  ＭｏＡｂを加えた細胞では、ＭＮＶが１０５／５０μＬ以上認められたのに対し、（ｂ）未処理の細胞にＡｎｔｉ−ＭｕＣＤ３００Ｆ  ｅｘｃｄ  ｃｅｌｌ  ＭｏＡｂを加えた細胞に対しては、ＭＮＶが１０３／５０μＬ程度の増殖しか認められなかった（図４Ｃ）。この結果は、ＭＮＶの感染はＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子の細胞外ドメインを抗体でブロックすることでＭＮＶの感染効率を１／１０００に抑えることが可能であったことを示している。つまり、ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子の細胞外ドメインが、ＭＮＶを結合し、ＭＮＶを細胞内に取り込むために重要な部分であることが明らかになった。
【００４４】
ＦＡＣＳでのＭｕＣＤ３００Ｆ分子発現細胞のシフトがわずかなのは、抗ＭｕＣＤ３００Ｆ分子抗体が、ＭｕＣＤ３００ｄ分子にも反応するため、細胞表面の蛍光強度の差がわずかになってしまったためとも考えられた。また、ウエスタンブロッティングでＭｕＣＤ３００Ｆ遺伝子ノックアウト細胞にわずかなＲｄＲｐとＶＰ１のバンドが認められたのは、ＲＡＷ細胞には貪食作用があり、ＭｕＣＤ３００Ｆ遺伝子ノックアウト後も貪食作用によるＭＮＶ感染が起きていることもその要因の一つと考えられる。さらに、ＭｕＣＤ３００ｄタンパク質が、ＭｕＣＤ３００Ｆタンパク質の細胞外ドメインの１４−１２０アミノ酸部分の配列が８０％以上の相同性を示すため、ＭｕＣＤ３００ｄ分子がＭｕＣＤ３００Ｆ分子の代替えとして機能する可能性も認められた（図６）。図６は、アミノ酸配列の相同性検索により、ＣＤ３００ファミリーの中で、ＣＤ３００ｄ（別名ＬＭＩＲ４）タンパク質とＭｕＣＤ３００Ｆタンパク質のアミノ酸配列全体のアライメントの結果を示している。図６上段が当該アライメントの結果を示している。図６上段一列目の配列は、前述した配列番号４の公知のＭｕＣＤ３００Ｆタンパク質のアミノ酸配列であり、二列目の配列は、前述した配列番号２のＲＡＷ細胞のＭｕＣＤ３００Ｆタンパク質のアミノ酸配列であり、三列目がこれらに対応させたＣＤ３００ｄタンパク質のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＡＢ２９２０６２：配列番号６（遺伝子の塩基配列は配列番号５））である。細胞外領域から細胞膜貫通領域まで（Ｎ−末端から１３０アミノ酸まで）の両配列が約８０％の相同性を示すことが明らかになった。マウスＣＤ３００ｄ分子の立体構造を検討しても、マウスＣＤ３００Ｆ分子とほぼ同様の立体構造が両者に認められ（図６下段）、ＣＤ３００ｄ分子もＭＮＶのレセプターとして機能することが予想される。なお、図６下段における構造の内容を示す下線や囲み等の意味は、上述した図１と図２と同様である。
【００４５】
以上をまとめると、ＭＮＶは、ＭｕＣＤ３００Ｆ分子をレセプターとして利用し、ＲＡＷ細胞に感染していること、ＭｕＣＤ３００Ｆ遺伝子をノックアウトした細胞では、ＭｕＣＤ３００ｄ分子もまた、それを補完する形でレセプターとして機能する可能性があることが明らかになった。また、ＭｕＣＤ３００Ｆ分子の代替えレセプターとしてＭｕＣＤ３００ｄ分子が機能するのであれば、アミノ酸配列の相同性が８０％以上を示す細胞外ドメインの１４−１２０の部分がＭＮＶレセプターとしてＭＮＶへの結合などに関係している可能性がある。
【００４６】
［３］細胞外ドメインについての検討
［３］−１：マウスＣＤ３００Ｆ同士の同一性の確認
次に、ＭｕＣＤ３００Ｆの遺伝子配列情報を、ＤＤＢＪ核酸データベースより入手（アクセッション番号ＡＢ２９２０６１）し、この配列に基づいてＲＡＷ細胞のＣＤ３００Ｆ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲで増幅して、当該遺伝子をクローニングした。上述のように、ＭｕＣＤ３００Ｆ遺伝子とＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子の塩基配列（配列番号１と配列番号３）とアミノ酸配列（配列番号２と配列番号４）を比較したところ、相同性はそれぞれ９７％（図５−１）、９８％（図５−２）であった。本文では、ＭｕＣＤ３００Ｆ分子とＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子を同義の分子と考えることとし、以下の検討は、ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆを用いて行った。
【００４７】
［３］−２：ヒト腎臓由来培養細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子導入と発現による検討
ＭｕＣＤ３００Ｆ分子により、ＭＮＶへの感受性が制御されているか否かを探るため、ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子を、ＭＮＶ非感受性のヒト腎臓由来培養細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入して、ＭＮＶの感受性を調べた。
【００４８】
ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子を組換えレンチウイルスによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞の遺伝子に挿入し、同時に挿入されたｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を利用して、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる選択培養をおこなうことで、ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を得た。ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子が正しく、ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子として発現していること、ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子が細胞表面に運ばれ、細胞外ドメインが出ていることを、ＭｕＣＤ３００ ｅｘｃｄ ＭｏＡｂを作用させた後、ＦＡＣＳで細胞集団のシフトを検討して確認した。
【００４９】
その結果、ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子導入細胞は、ＭｕＣＤ３００ ｅｘｃｄ ＭｏＡｂに反応し、蛍光シグナルが検出され、未処理のＨＥＫ２９３Ｔとは完全に別の細胞集団としてＦＡＣＳで検出された（図７−１）。従って、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子が正常に発現されていることが明らかになった。
【００５０】
次に、ＭｕＣＤ３００Ｆ分子発現細胞にＭＮＶが結合していることを確かめるために、ＭｕＣＤ３００Ｆ分子発現細胞と、未処理のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に蛍光標識したＭＮＶを加え、ＦＡＣＳで細胞集団の分離が可能かどうかを調べた。ＭｕＣＤ３００Ｆ分子発現細胞は、蛍光標識ＭＮＶが結合して蛍光標識が付加され、未処理のＨＥＫ２９３Ｔとは明らかに異なる細胞集団としてＦＡＣＳで分離された（図７−２の右上図と右下図）。
【００５１】
次に、ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＭＮＶを感染させ、４８時間後に細胞を回収して、ウェスタンブロットで、ＭＮＶのＶＰ１とＲＮＡｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＲｄＲｐ）の細胞内発現を確認したところ、未処理のＨＥＫ２９３Ｔ細胞にはＭＮＶ分子の発現が認められなかったが、ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子発現細胞にはＶＰ１とＲｄＲｐのバンドが確認された（図７−３）。
【００５２】
培養上清中のＭＮＶ粒子数を測定したところ、未処理細胞の上清にはＭＮＶ粒子が存在しなかったが、ＭｕＣＤ３００Ｆ分子発現細胞には１０６／５０μＬのＭＮＶ粒子が観察された（図７−４）。一方、ＭｕＣＤ３００Ｆ分子発現細胞にＭｕＣＤ３００  ｅｘｃｄ  ＭｏＡｂを作用させ、その後ＭＮＶを感染させた細胞では、培養上清中に１０１／５０μＬ以下のＭＮＶしか検出されず、ＭｕＣＤ３００Ｆ発現細胞の１／１０００００以下の産生量であった。
【００５３】
以上のことから、ＭｕＣＤ３００Ｆ遺伝子をＭＮＶ非感受性のヒト培養細胞株ＨＥＫ２９３Ｔに導入すると、ＭｕＣＤ３００Ｆ分子の発現によりＭＮＶ感受性細胞へと変化し、ＭＮＶを効率よく増殖させる細胞になることが明らかになった。また、その感受性獲得に重要なのは細胞外ドメインであることを示していた。
【００５４】
［３］−３：ＭｕＣＤ３００Ｆ分子の細胞外ドメインについての詳細な検討
ＭｕＣＤ３００Ｆ分子の細胞外ドメインのどの部分がＭＮＶとの結合に重要なのかを調べるため、（ａ）シグナルペプチド（１−１７アミノ酸；ａａ）下流から３４アミノ酸分の塩基配列１０２塩基を削った「ＭｕＲａｗ＿ｄ１０２」（遺伝子の配列番号７、アミノ酸配列の配列番号８）、（ｂ）同様に６８アミノ酸分の塩基配列２０４塩基を削った「ＭｕＲａｗ＿ｄ２０４」（遺伝子の配列番号９、アミノ酸配列の配列番号１０）、（ｃ）１３０番目のアミノ酸１から１７０番目のアミノ酸Ｄまで４０アミノ酸が欠損しており、１２９番目のＡがＧに、１７１，１７２のＮＧがＫＲに変異したＣＤ３００Ｆバリアント分子である「ＭｕＲＡＷ＃ｄ１２０ｖ」（遺伝子の配列番号１１、アミノ酸配列の配列番号１２）、（ｄ）細胞内ドメインを削った「ＭｕＲＡＷ＃ｄｃｐｄ」（６８５−６８７ｎｔ  ＴＣＡをストップコドンＴＡＡに変換し、細胞内ドメインのアミノ酸残基Ｓ；セリン以降翻訳されないようにした）、をコードする遺伝子（６８５−６８７塩基で翻訳が停止するようにした遺伝子の配列番号１３、当該翻訳が制限されたアミノ酸配列の配列番号１４を作製してＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。これらの遺伝子とそれらがコードするタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを図８−１にアミノ酸配列アライメント、図８−２に核酸配列アライメント、として示した。
【００５５】
最初に細胞外ドメインの３４アミノ酸を削った（核酸では１０２塩基）「ＭｕＲａｗ＿ｄ１０２」と細胞内ドメインを削った「ＭｕＲＡＷ＿ｄｃｐｄ」の遺伝子を導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図９−１に模式図を示した）に対して蛍光標識したＭＮＶを作用させ、ＦＡＣＳで確認した。
【００５６】
その結果、ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子導入細胞とＭｕＲＡＷ＿ｄｃｐｄ遺伝子導入細胞にコントロール細胞集団からのシフトが認められ、ＭＮＶが、発現したＣＤ３００Ｆ分子に結合していることが確認された。しかし、ＭｕＲａｗ＿ｄ１０２遺伝子導入細胞には、ＧＦＰラベルＭＮＶは反応せず、細胞集団のシフトは認められなかった（図９−２）。さらにＭｕＲａｗ＿ｄ２０４分子においてもＭｕＲａｗ＿ｄ１０２分子と同様にＭＮＶの結合が認められなかった（図示せず）。ここで細胞集団のシフトが認められなかった２例については、導入遺伝子が発現して細胞表面において発現しているにも拘わらず、当該細胞表面におけるＭＮＶの結合が認められなかったことが明らかになった。
【００５７】
次に、これらの細胞にＭＮＶを感染させ４８時間後に培養上清を回収し、ＣＣＩＤ５０を測定すると共に、ウェスタンブロットで細胞内でのＭＮＶ-ＲｄＲｐ分子の発現を調べた。ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子発現細胞（ＦＬ）、ＭｕＲａｗ＿ｄｃｐｄ分子発現細胞（ｄｃｙｔｏ）では、ＲｄＲｐの発現が認められ、ＭＮＶの感染が確認できたが、未処理の細胞では、ＲｄＲｐの発現が認められず、ＭＮＶの感染が確認できなかった（図９−３）。培養上清のＣＣＩＤ５０測定の結果、ＦＬ、ｄｃｙｔｏでは１０５／５０μＬ以上のＭＮＶ産生が認められ、ＭＮＶの増殖が確認できたが、未処理細胞とＭｕＲａｗ＿ｄ１０２分子発現細胞では、感染に用いたイノキュラム１０２／５０μＬ以下のＭＮＶが検出されただけであり、ＭＮＶの増殖を認めなかった（図９−４）。つまり、ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子は、細胞外ドメインの１８−１２０塩基にコードされるアミノ酸３４残基を失うと、レセプターとしての機能が無くなるため、この領域にＭＮＶとの結合など、レセプターとしての機能を発揮するために重要な部分が含まれていることが示唆された。
【００５８】
追加の試験で、（ａ）未処理ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、（ｂ）ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、（ｃ）ＭｕＲａｗ＃ｄ１０２遺伝子導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、（ｄ）ＭｕＲａｗ＿ｄ２０４遺伝子導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、（ｅ）ＭｕＲＡＷ＃ｄｃｐｄ遺伝子導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞について、これらの遺伝子がコードする分子の細胞外ドメインが細胞表面に発現しＭＮＶが結合できるか否かを検証した。
【００５９】
具体的には、上記ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子、ＭｕＲａｗ＿ｄ１０２分子、ＭｕＲａｗ＿ｄ２０４分子、ＭｕＲａｗ＿ｄｃｐｄ分子のそれぞれについて、これらをコードする遺伝子をプラスミドベクターのＣＭＶプロモーター下流にクローニングし、ＧＦＰプラスミドとコトランスフェクションして導入した。ＧＦＰ発現をトランスフェクションのモニターとして利用し、ＧＦＰ発現細胞をソートした。ソートした細胞に抗ＭｕＣＤ３００Ｆ分子抗体を作用させ、本抗体を特異的に認識可能な赤色蛍光ラベル二次抗体を作用させて、ＦＡＣＳを行った。ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子、ＭｕＲａｗ＿ｄ１０２分子、ＭｕＲａｗ＿ｄ２０４分子、ＭｕＲａｗ＿ｄｃｐｄ分子のそれぞれをコードする遺伝子をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、全て、未処理ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して蛍光シグナルが高い集団を形成し、ＦＡＣＳパターンのシフトが認められた（図１０）。
【００６０】
これらのことから、ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子、ＭｕＲａｗ＿ｄ１０２分子、ＭｕＲａｗ＿ｄ２０４分子、ＭｕＲａｗ＿ｄｃｐｄ分子のそれぞれをコードする遺伝子をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、全て、ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子の細胞外ドメインが、ＭｕＣＤ３００Ｆ分子は勿論のこと、ＭｕＲａｗ＿ｄ１０２分子、ＭｕＲａｗ＿ｄ２０４分子、ＭｕＲａｗ＿ｄｃｐｄ分子等の欠失変異分子であっても、細胞表面で発現していることが確認できた。
【００６１】
以上をまとめると、ＭＮＶ非感受性細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子を導入すると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞がＭＮＶ非感受性細胞から感受性細胞に変化することから、ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ分子はＭＮＶの感染に直接関与するレセプターであることが示された。また、当該遺伝子のシグナルペプチド（１−１７アミノ酸；ａａ）下流から３４アミノ酸分の塩基配列１０２塩基を削った「ＭｕＲａｗ＿ｄ１０２」遺伝子導入細胞ではレセプターとしての機能が発揮されないため、ＭＮＶ感受性に重要な部分は、ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆタンパク質のシグナルペプチド下流の１０２塩基にコードされるアミノ酸配列（３４アミノ酸）である可能性が高い。さらに、細胞内ドメインを削ったＭｕＲａｗ＿ｄｃｐｄ遺伝子導入細胞もＭＮＶに対する感受性を失わないことから、ＭＮＶ感受性には細胞外ドメインが重要な機能を有すると考えられる。
【００６２】
上記の結果をさらに明確にするため、１３０番目のアミノ酸「Ｉ」から１７０番目のアミノ酸「Ｄ」まで４０アミノ酸が欠損しており、１２９番目の「Ａ」が「Ｇ」に、１７１番目・１７２番目の「ＮＧ」が「ＫＲ」に変異したＣＤ３００Ｆバリアント分子である「ＭｕＲａｗ＿ｄ１２０ｖ」分子と、このＭｕＲａｗ＿ｄ１２０ｖ分子のＣ末端側を欠失させることで、膜貫通ドメインと細胞内ドメインを欠損させた「ＭｕＲａｗ＿ｄ１２０ｖＣ  ｔｅｒｍ」分子（配列番号１５、アミノ酸配列の配列番号１６）を用いて、上記と同様のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質転換を通じてＭＮＶ感受性に関与する領域の検討を行った。その結果、「ＭｕＲａｗ＿ｄ１２０ｖ」遺伝子の導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、完全長のＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子導入細胞と同様に感染が認められ、ウェスタンブロットで、ＭＮＶ−ＲｄＲｐとＶＰ１が検出された。これに対して、膜貫通ドメインと細胞内ドメインを欠損させ細胞外ドメインを細胞表面に発現させないようにした「ＭｕＲａｗ＿ｄ１２０ｖＣ  ｔｅｒｍ」遺伝子導入細胞には、ＭＮＶが感染せずＭＮＶ−ＲｄＲｐとＶＰ１がウェスタンブロットを行っても認められなかった（図１１）。
【００６３】
上記の結果は、マウスのＣＤ３００Ｆ分子の細胞外ドメインは、（ｉ）シグナルペプチド下流の３４アミノ酸を失うと、ＭＮＶに結合できなくなるが、それより下流の１３０番目の残基から１７０番目の残基、合計４０アミノ酸残基を失っても、ＭＮＶに結合できること、（ii）細胞内ドメインは、ＭＮＶのＣＤ３００Ｆ分子への結合、ＭＮＶの細胞への感染に影響を与えていないこと、（iii）ＣＤ３００Ｆ分子の細胞外ドメインは、発現後細胞外に運ばれ、細胞膜上に膜貫通領域をもって表出されていなければならないことが明らかになった。マウスのＣＤ３００Ｆ分子の細胞外ドメインの立体構造は、結晶構造解析によって解かれており（図１）、この３４アミノ酸には３つのβ鎖（ＶＴ、ＥＶＳＧＱ、ＬＴＶＱＣＲＹ）とヘリックス（ＳＧＷ）があり、これらのβ鎖は互いに近接した構造を形作っている。構造上のこの部分を失うとＭＮＶは細胞膜上のＣＤ３００Ｆ分子に結合できなくなることが示された。
【００６４】
さらに、この３４アミノ酸配列に相同性を示すタンパク質を検索すると、ＣＤ３００ファミリーの中で、ＣＤ３００ｄ（別名ＬＭＩＲ４）タンパク質におけるＮ−末端から１３０アミノ酸までの配列が約８０％の相同性を示すことが明らかになった（図５）。それに加え、ＣＤ３００ｄ分子の構造を検討しても、ＣＤ３００Ｆ分子とほぼ同様の立体構造が両者に認められた。このことから、ＣＤ３００ｄ分子もＭＮＶのレセプターとして機能する可能性が高いことがより一層明確になった。
【００６５】
［４］他の動物細胞へのＭＮＶ感受性付与についての検討
ＭｕＣＤ３００Ｆが、他の動物細胞のＭＮＶ感受性を変えることができるか否かについて調べるため、ＭｕＲａｗＣＤ３００Ｆ遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞の場合と同様に、マウスの細胞であるがＭＮＶ非感受性のＮＩＨ３Ｔ３細胞、動物種の異なる非感受性細胞でアフリカミドリザル由来のＣＯＳ７細胞、同様にハムスター由来のＣＨＯ細胞、ネコ由来のＣＲＦＫ細胞に導入した。これらの細胞はＨＥＫ２９３Ｔと同様にｐｕｒｏｍｙｃｉｎで選択し、ＭｕＣＤ３００Ｆ分子発現細胞集団として調製して、その振る舞いをＦＡＣＳで確認した（図１２−１）。
【００６６】
それぞれの細胞にＭＮＶを感染させ、ＭｕＣＤ３００Ｆ分子の発現、ＭＮＶ−ＲｄＲｐ、ＭＮＶ−ＶＰ１の発現を、それぞれウェスタンブロットで調べた（図１２−２）。
【００６７】
その結果、ＭｕＣＤ３００Ｆ分子の発現している細胞は、ＭＮＶ−ＲｄＲｐ，ＶＰ１の発現が確認された。さらに、ＭＮＶの新生ウイルス粒子の産生量を測定したところ、１０５−７ＣＣＩＤ５０／５０μＬの産生が認められ、ＭｕＣＤ３００Ｆがそれぞれの細胞形質をＭＮＶ非感受性から感受性に転換させたことが明らかになった（図１２−３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図４−１】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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