(57)【要約】  末梢の通常Ｔ細胞においてSatb1の発現を抑制するまたはSatb1の機能を抑制する工程を含む、制御性Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。末梢の通常T細胞においてSatb1の発現を抑制すると、当該T細胞においてFoxp３の安定な発現が誘導される。Foxp3発現細胞は安定な制御性T細胞へと分化する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢通常Ｔ細胞においてSatb1の発現を抑制するまたはSatb1の機能を抑制する工程を含む、制御性Ｔ細胞を誘導または製造する方法。
【請求項２】
Satb1の発現を抑制する、またはSatb1の機能を抑制する物質を対象に投与することを含む、対象において制御性T細胞を誘導する請求項1記載の方法。
【請求項３】
インビトロで末梢通常T細胞のSatb1の発現を抑制して、末梢通常T細胞にFoxp3の発現を誘導する工程を有する請求項１記載の方法。
【請求項４】
Satb1の発現が抑制された細胞をさらにT細胞活性化物質の存在下で培養する工程を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
末梢通常T細胞が、CD4陽性細胞またはCD8陽性細胞である、請求項１〜４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
Satb1の発現の抑制を、ゲノム編集技術用いて行う、請求項３〜５いずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項３〜６いずれかの方法により得られたFoxp3発現T細胞を対象に移入する工程を含む、制御性T細胞を誘導する方法。
【請求項８】
制御性T細胞を誘導することにより、自己免疫疾患の処置、免疫代謝疾患の処置、アレルギーの処置、臓器移植における拒絶反応の処置、臓器移植における移植片対宿主病の処置および胎児母胎免疫寛容の誘導からなる群から選択される処置を行う、請求項２または７に記載の方法。
【請求項９】
Satb1の発現を抑制する、またはSatb1の機能を抑制する物質を含む、制御性T細胞誘導剤。
【請求項１０】
Satb1の発現を抑制する、またはSatb1の機能を抑制する物質を含む、自己免疫疾患の処置、免疫代謝疾患の処置、アレルギーの処置、臓器移植における拒絶反応の処置、臓器移植における移植片対宿主病の処置および胎児母胎免疫寛容の誘導からなる群から選択される処置のための剤。
【請求項１１】
末梢通常T細胞のSatb1の発現または機能を抑制したT細胞を含有する、細胞培養物。
【請求項１２】
（１）Satb1を発現する細胞を制御性Ｔ細胞誘導剤候補物質で処理する工程、
（２）Satb1の発現またはSatb1の活性を測定する工程、および
（３）Satb1の発現またはSatb1の活性を抑制する物質を、制御性Ｔ細胞誘導剤として選択する工程
を含む、制御性T細胞誘導剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、末梢Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系に内在するCD25陽性CD4陽性制御性T細胞の重要な特徴として、転写因子Foxp3を特異的に発現しており、Foxp3の欠損あるいは突然変異により制御性T細胞の発生および分化、また、制御性T細胞の抑制機能が障害されることがある。正常なT細胞でもFoxp3を異所性に発現させることにより免疫抑制機能が発揮されるという実験結果から、Foxp3遺伝子は制御性T細胞の発生および機能におけるマスター遺伝子であると考えられている。またヒトにおいてFoxp3遺伝子に突然変異が生じるとその大半において制御性T細胞の発生が阻害され、その結果、自己抗原および非自己抗原に対する免疫応答の制御が異常をきたすことが報告されている。【０００３】
また、近年ではFoxp3を発現するCD8陽性細胞が、免疫応答の制御に大きな役割を果たしていることも報告されている。【０００４】
TGFβの存在下において抗原によってマウスのCD4陽性T細胞を刺激することにより、Foxp3の発現を誘導させて機能および表現型において内在性の制御性T細胞に類似した誘導性制御性T細胞を実験的に作製できる。しかし、誘導性制御性T細胞におけるFoxp3の発現は不安定であり、免疫抑制機能を安定的に維持できないため、誘導性制御性T細胞を臨床応用するのは難しい状況にある。【０００５】
近年の研究により、誘導性制御性T細胞におけるFoxp3発現の不安定性は、おもにFoxp3遺伝子のエピジェネティックな制御の違いに由来すると理解されている。エピジェネティクスとは、DNA塩基配列の変化をともなわず細胞分裂ののちも継承される遺伝子発現、あるいは表現型の変化と定義される。遺伝子発現のエピジェネティックな制御とは、DNAの配列は変化することなくDNAやクロマチンの修飾により遺伝子発現が制御されることである。近年、細胞系譜に特異的な遺伝子発現制御は、転写因子による制御とエピジェネティックな制御に依存することが明らかになってきている。制御性T細胞におけるエピジェネティックな制御として、Foxp3をはじめとする制御性T細胞に特異的なさまざまな機能タンパク質をコードする遺伝子の発現制御領域が制御性T細胞では特異的に脱メチル化していることが挙げられる。これまでの知見では、誘導性制御性T細胞では、制御性T細胞に特異的な脱メチル化領域がメチル化されたままであることに起因して、Foxp3遺伝子を含む制御性T細胞に特異的な遺伝子の発現が不安定であると考えられている。制御性T細胞に特異的なエピジェネティックな修飾を導入することにより、Foxp3の安定な発現のみならず、機能的に安定な制御性T細胞を作製する手法の開発が望まれる。【０００６】
非特許文献１には、インビトロでIL-2、TGF-β、レチノイン酸、ラパマイシン、酪酸の混合物により誘導されたFoxp3陽性細胞が免疫抑制活性を示すことが示されている。ただし、この実験系では誘導されるFoxp3の発現は不安定である。【０００７】
非特許文献２はインビトロで末梢T細胞からTGF-βとラパマイシンにより制御性T細胞を作製することを報告する。さらに、非特許文献２は、得られた制御性T細胞を生体内に移入して移植における移植片対宿主病（GVHD）を抑制あるいは治療することを提案している。【０００８】
非特許文献３は、末梢血由来T細胞を移入したヒト化マウスにラパマイシンを投与し続けると、制御性T細胞とアポトーシスによりT細胞分裂が抑制されることを報告する。この文献はまた、ラパマイシンの副作用についても説明する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Schmidt A, Eriksson M et al. Comparative analysis of protocols to induce human CD4+Foxp3+ Regulatory T cells by combinations of IL-2, TGF-beta, retinoic acid, rapamycin and butyrate. PloS One. 11(2): e0148474, 2016.
【非特許文献２】Hippen K L, Merkel S C et al. Generation and large-scale expansion of human inducible regulatory T cells that suppress graft-versus-host disease. Am J Transplant. 11(6): 1148-57, 2011.
【非特許文献３】Hester J, Schiopu A et al. Low-dose rapamycin treatment increases the ability of human regulatory T cells to inhibit transplant arteriosclerosis in vivo. Am J Transplant. 12(8): 2008-2016, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本願は、末梢Ｔ細胞から安定な制御性Ｔ細胞を誘導する方法を提供することを目的とする。本願は、自己免疫疾患、免疫代謝疾患、アレルギー、臓器移植の拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などの治療や予防、胎児母胎免疫寛容の誘導などに有用な制御性Ｔ細胞を誘導する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、末梢通常T細胞においてSatb1の発現を抑制することにより、制御性T細胞のマスター遺伝子であるFoxp3の発現が誘導されることを初めて見出した。Satb1抑制はFoxp3を誘導して制御性T細胞分化を促進すると同時に、炎症性サイトカインを産生するTh17細胞への分化を抑制することを確認した。一方でSatb1の発現の抑制はTh1細胞、Th2細胞への分化には影響を及ぼさなかった。本発明者らはSatb1抑制によりFoxp3の発現を誘導させたT細胞が安定した制御性T細胞へ変わりやすいこと、また、Satb1抑制によりFoxp3の発現を誘導させたT細胞が体内で制御性T細胞として自己免疫疾患の発症を抑制することを確認した。【００１２】
本発明者らはまた、末梢CD8陽性細胞においてSatb1の発現を抑制することにより、CD8陽性細胞においてFoxp3の発現が誘導されることを確認した。また。Satb1の発現を抑制した細胞をさらにT細胞活性化物質の存在下で培養すると、Foxp3発現細胞が特異的に増殖されることを確認した。【００１３】
上記の結果より、本発明者らは本願発明を完成させた。本願は下記を提供する：
［１］  末梢通常Ｔ細胞においてSatb1の発現を抑制するまたはSatb1の機能を抑制する工程を含む、制御性Ｔ細胞を誘導または製造する方法。
［２］  Satb1の発現を抑制する、またはSatb1の機能を抑制する物質を対象に投与することを含む、対象において制御性T細胞を誘導する［1］記載の方法。
［３］  インビトロで末梢通常T細胞のSatb1の発現を抑制して、末梢通常T細胞にFoxp3の発現を誘導する工程を有する［１］記載の方法。
［４］  Satb1の発現が抑制された細胞をさらにT細胞活性化物質の存在下で培養する工程を含む、［３］記載の方法。
［５］  末梢通常T細胞が、CD4陽性細胞またはCD8陽性細胞である、［１］〜［４］いずれかに記載の方法。
［６］  Satb1の発現の抑制を、ゲノム編集技術用いて行う、［３］〜［５］いずれかに記載の方法。
［７］  ［３］〜［６］いずれかの方法により得られたFoxp3発現T細胞を対象に移入する工程を含む、制御性T細胞を誘導する方法。
［８］  制御性T細胞を誘導することにより、自己免疫疾患の処置、免疫代謝疾患の処置、アレルギーの処置、臓器移植における拒絶反応の処置、臓器移植における移植片対宿主病の処置および胎児母胎免疫寛容の誘導からなる群から選択される処置を行う、［２］または［７］に記載の方法。
［９］  Satb1の発現を抑制する、またはSatb1の機能を抑制する物質を含む、制御性T細胞誘導剤。
［１０］  Satb1の発現を抑制する、またはSatb1の機能を抑制する物質を含む、自己免疫疾患の処置、免疫代謝疾患の処置、アレルギーの処置、臓器移植における拒絶反応の処置、臓器移植における移植片対宿主病の処置および胎児母胎免疫寛容の誘導からなる群から選択される処置のための剤。
［１１］  末梢通常T細胞のSatb1の発現または機能を抑制したT細胞を含有する、細胞培養物。
［１２］  （１）Satb1を発現する細胞を制御性Ｔ細胞誘導剤候補物質で処理する工程、
（２）Satb1の発現またはSatb1の活性を測定する工程、および
（３）Satb1の発現またはSatb1の活性を抑制する物質を、制御性Ｔ細胞誘導剤として選択する工程
を含む、制御性T細胞誘導剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１４】
本願の方法により、末梢のＴ細胞にFoxp3を安定に発現させることが可能となった。Foxp3を安定に発現するT細胞は、安定な制御性Ｔ細胞へと分化される。即ち、本願の方法により、安定な制御性T細胞を誘導することが可能となった。安定な制御性T細胞を誘導することによって、自己免疫疾患、免疫代謝疾患、アレルギー、臓器移植における拒絶反応、および臓器移植における移植片対宿主病に対する処置並びに胎児母胎免疫寛容の誘導等が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒト細胞293種においてSatb1を高発現する細胞上位100種について、Satb1の発現量を示す。
【図２】Satb1欠損マウス（Satb1fl/flThpokCre+）とコントロールマウス（Satb1fl/＋ThpokCre+）の胸腺及び脾臓のCD4陽性T細胞の、Foxp3およびCD25の発現についてのFACS分析結果。
【図３】Satb1欠損マウス（Satb1fl/flThpokCre+）と野性型マウス（Satb1fl/fl）のCD4+CD25-細胞に発現する遺伝子のスキャッタープロット。
【図４】Satb1欠損マウス（Satb1fl/flThpokCre+）とコントロールマウス（Satb1fl/＋ThpokCre+）の末梢CD4+T細胞の、HeliosおよびNrp1の発現についてのFACS分析結果。
【図５】図４のFACS分析結果をグラフにした。Satb1欠損マウスとコントロールマウス末梢より単離したCD4+CD25+T細胞のうち、左側がNrp1+Helios+Treg細胞、即ち胸腺由来の制御性T細胞、右側がNrp-Helios-Treg細胞、即ち末梢由来の制御性T細胞の割合を示す。
【図６】Satb1欠損マウスとコントロールマウス末梢より単離した各細胞画分のFoxp3遺伝子のCNS2領域内の脱メチル化の程度を示す。各ブロックはアンプリコン内のCpG残基を示す。
【図７】野性型マウス（Satb1fl/fl）と、Satb１欠損マウス（Satb1fl/flThpokCre+）の末梢CD4+CD25-CD44-細胞を取得し、Th1、Th2およびTh17をそれぞれ誘導する条件下で培養し、得られた細胞についてTh1、Th2およびTh17それぞれのマーカーについてのFACS分析結果。
【図８】図７のFACS分析結果をまとめたグラフ。
【図９】野性型T細胞（CD45.1+)とSatb1欠損マウス由来T細胞（CD45.2+)を混合してマウスへ移植する実験の概略図。
【図１０】野性型T細胞（CD45.1+)とSatb1欠損マウス由来T細胞（CD45.2+)を混合して生体内へ移植した１７日目のレシピエント腸間膜リンパ節から取得した、それぞれの動物由来のCD4+T細胞のFACS分析結果。
【図１１】移植17日目のレシピエント腸間膜リンパ節から取得した、それぞれの動物由来のCD4+T細胞における、Foxp3遺伝子のCNS2領域内の脱メチル化の程度を示す。
【図１２】移植0日と移植17日目のレシピエント腸間膜リンパ節から取得した、それぞれの動物由来のCD4+T細胞において、Foxp3遺伝子のCNS2領域内完全に脱メチル化されたアンプリコンの割合を示す。
【図１３】腸炎モデルマウスに対してSatb1欠損マウス（Satb1fl/flThpokCre+）または野性型マウス（Satb1fl/fl）末梢より単離したCD4+CD25-CD45RBhiT細胞を移植した場合の体重の変化を示す。
【図１４】腸炎モデルマウスに対してSatb1欠損マウス（Satb1fl/flThpokCre+）または野性型マウス（Satb1fl/fl）末梢より単離したCD4+CD25-CD45RBhiT細胞を移植して53日後の大腸の写真。
【図１５】腸炎モデルマウスに対してSatb1欠損マウス（Satb1fl/flThpokCre+）または野性型マウス（Satb1fl/fl）末梢より単離したCD4+CD25-CD45RBhiT細胞を移植して53日後の腸間膜リンパ節および脾臓から取得したCD4+T細胞のFoxp3およびCD25についてのFACS分析結果。
【図１６】腸炎モデルマウスに対してSatb1欠損マウス（Satb1fl/flThpokCre+）または野性型マウス（Satb1fl/fl）末梢より単離したCD4+CD25-CD45RBhiT細胞を移植して53日後の腸間膜リンパ節および脾臓から取得したCD4+T細胞のIL-17AおよびIFNｇについてのFACS分析結果。
【図１７】図１５および１６の結果をグラフ化した。
【図１８】T細胞特異的Satb1欠損マウスにおけるCD8陽性細胞からのFoxp3の誘導量を示すFACS分析結果。
【図１９】CD8陽性細胞中、Foxp3発現細胞の割合を示す。
【図２０】SATB1欠損T細胞からのFoxp3の誘導量を示すFACS分析結果。NaiveT細胞、CD25-エフェクターT細胞、CD25+エフェクターT細胞をT細胞活性化物質で刺激後のFoxp3発現細胞の割合を表す。
【図２１】CRISPR/CAS9システムを用いてSatb1欠損を誘導したマウスEL4細胞におけるFoxp3転写活性をLuciferase解析によって検討した結果。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本願においては、末梢通常Ｔ細胞におけるSatb1の発現を抑制する、またはSatb1の機能を抑制する。本願明細書および請求の範囲において「末梢通常Ｔ細胞」とは、末梢に存在する制御性Ｔ細胞以外のＴ細胞であり、例えばCD4+細胞、CD8+細胞を含む。本願においてSatb1発現を抑制する対象となる細胞として特に好ましくはCD4+CD25-細胞、例えばCD4+CD25-CD45RA+細胞（ナイーブTh細胞）、CD4+CD25-/lowCD45RA-細胞（エフェクターTh細胞）、並びにCD8+細胞が例示される。
【００１７】
Satb1（Special AT-rich binding protein 1）は多数の遺伝子をSatb1のもとに集合させ、さらにクロマチンリモデリングに関与する種々の酵素と相互作用しながら、クロマチン構造と遺伝子発現を制御するゲノムオーガナイザーである。ヒト細胞293種においてSatb1の発現を調べ、そのうちの高発現細胞上位100を図１にまとめた。Satb1は胸腺細胞で最も高い発現が見られ、胎児、新生児において胸腺の発生に係わっていると考えられる。一方、胸腺が退縮した成人においては、ナイーブT細胞でSatb1の発現が最も高いと考えられる。  
【００１８】
なお、本願明細書及び請求の範囲において「CD4陽性」あるいは「CD4+」という場合、特に断りがなければCD4陽性CD8陰性のCD4シングルポジティブ細胞をいい、「CD8陽性」あるいは「CD8+」という場合、特に断りがなければCD4陰性CD8陽性のCD8シングルポジティブ細胞をいうものとする。
【００１９】
Satb1の発現を抑制するには、インビボ、インビトロを問わず遺伝子の発現を制御するための公知の技術を用いればよく、特に制限されない。例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡなどのＲＮＡ分子を用いて発現を抑制する方法、CRISPR/Cas9やTALENなどのゲノム編集技術を用いて発現を抑制する方法が例示される。特にゲノム編集技術、例えばCRISPR/Cas9を用いてSatb1の発現を抑制する方法が好適に用いられる。
【００２０】
Satb1の機能を抑制する方法としては、末梢T細胞にSatb1タンパク質に対する中和抗体やそのフラグメントを作用させること、Satb1の活性を抑制する物質、例えば低分子物質を作用させることが例示されるが、これらに限定されない。
【００２１】
一の態様として本願は、Satb1の発現を抑制する、もしくはSatb１の機能を抑制する物質を対象へ投与することを含む、生体内で制御性T細胞を誘導する方法を提供する。本願はまた、Satb1の発現を抑制する、もしくはSatb1の機能を抑制する物質を含む、制御性T細胞の誘導剤を提供する。
【００２２】
別の態様として、インビトロにおいて末梢通常T細胞のSatb1の発現を抑制してFoxp3の発現を誘導する工程を含む方法が提供される。
【００２３】
末梢通常T細胞は、ヒトを含む動物の末梢血単核球からCD4+画分またはCD8+画分、好ましくはCD4+CD25-画分若しくはCD8+画分をFACSAria (BD Biosciences)などにより分取することによって得ることができる。所望の抗原特異性を有する末梢通常T細胞を選択して、または誘導して用いてもよい。あるいは末梢通常T細胞としては、ヒトを含む動物由来の多能性幹細胞、例えばES細胞やiPS細胞より誘導した通常T細胞であってもよい。多能性幹細胞からＴ細胞の誘導方法は公知である。多能性幹細胞から目的とする抗原特異性を有するT細胞を誘導する方法として、WO 2016/010148、WO 2016/010153、WO 2016/010154、WO 2016/010155、WO 2017/159087、WO 2017/159088、WO 2017/179720などが例示される。インビトロにおけるSatb1発現の抑制は、上記のいずれの方法を用いてもよい。
【００２４】
本願のインビトロにおいてFoxp3の発現を誘導する工程を含む方法においては、インビトロでSatb1の発現を抑制した細胞をさらに、T細胞活性化物質の存在下で培養する工程を有していてもよい。T細胞活性化物質は、インビトロにおいてT細胞の増殖及び活性化を誘導する物質であって、IL-2などのサイトカイン、抗CD3抗体および抗CD28抗体が例示される。さらにTGFβを加えてもよい。Satb1の発現が抑制された細胞をT細胞活性化物質の存在下で培養することにより、Foxp3を発現する細胞が特異的に増殖する。
【００２５】
インビボ、あるいはインビトロで末梢通常T細胞のSatb1の発現が抑制されると、当該細胞は制御性T細胞のマスター転写因子であるFoxp3を発現する。Foxp3を発現するCD4+CD25-細胞は、生体内で安定したFoxp3+CD4+CD25+細胞へと分化を促され、制御性T細胞として機能する。Foxp3を発現するCD8+細胞もまた、制御性T細胞として機能する細胞となる。
【００２６】
本願は末梢通常T細胞からインビトロで誘導されたFoxp3を発現する細胞を、制御性T細胞誘導を必要とする対象へ移入することを含む、対象において制御性T細胞を誘導する方法をさらに提供する。
【００２７】
本願によって、Foxp3遺伝子CNS2領域の脱メチル化の程度が50％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上であるFoxp3発現細胞を得ることができる。
【００２８】
本願において、生体内で制御性T細胞を誘導することにより、免疫寛容の導入を必要とする疾患や症状、例えば自己免疫疾患、免疫代謝疾患、アレルギー疾患、移植臓器への拒絶反応、骨髄移植後の移植片対宿主病（GVHD）および免疫代謝疾患に対する処置並びに胎児母胎免疫寛容の誘導が可能となる。従って、本願の方法はこれらの疾患や症状の処置のために有用である。
【００２９】
本願明細書並びに請求の範囲において「処置」には、疾患または症状の予防、治療、症状の軽減、症状の減弱、進行の阻害などのあらゆる疾患または症状の管理を含む。
【００３０】
本願の方法により、CD4陽性T細胞のみならずCD8陽性T細胞にもFoxp3の発現を誘導することができる。CD8陽性T細胞は抗原提示細胞に発現するクラスI主要組織適合抗原複合体（MHC）とそれに結合した抗原ペプチドを認識する。一方、CD4陽性T細胞は抗原提示細胞上のクラスII MHCとそれに結合する抗原ペプチドを認識する。即ちCD4陽性制御性T細胞とCD8陽性制御性T細胞は異なる抗原を認識するものであり、本願の方法によって広範な免疫応答の抗原特異的免疫抑制が達成される。  
【００３１】
インビトロで誘導したFoxp3を発現する細胞は、適当な媒体へ分散させて対象へ投与する。細胞を分散させるための媒体としては、例えば生理的食塩水やＰＢＳが例示される。患者への投与は経静脈的に行えばよい。投与量や投与回数、時期は制御性T細胞誘導の目的に応じて適宜設定すればよい。
【００３２】
いずれの態様においても、免疫寛容の誘導が望まれる時期に対象において制御性T細胞を誘導することが考えられる。例えば、自己免疫疾患の治療のためには持続的に制御性T細胞を誘導する必要があると考えられる。花粉症などの季節性のアレルギー性疾患の治療若しくは予防の場合は、対象となるアレルギー源の発生に合わせて誘導時期を決定すればよい。臓器移植や骨髄移植の場合は、移植と同時あるいは拒絶反応の認められた時など、免疫寛容の誘導が望まれる時期に誘導を行うことが考えられる。
【００３３】
本願はまた、制御性Ｔ細胞誘導剤のスクリーニング方法であって、下記工程：
（１）Satb1を発現する細胞を制御性Ｔ細胞誘導剤候補物質で処理する工程、
（２）Satb1の発現またはSatb1の活性を測定する工程、および
（３）Satb1の発現またはSatb1の活性を抑制する物質を、制御性Ｔ細胞誘導剤として選択する工程
を含む、制御性T細胞誘導剤のスクリーニング方法を提供する。
【００３４】
制御性T細胞誘導剤は自己免疫疾患、アレルギー、臓器移植、骨髄移植および免疫代謝疾患などの予防や治療ならびに胎児母胎免疫寛容の誘導に有用である。
【実施例】
【００３５】
本願発明は、以下に示す動物実験のデータにより支持される。【００３６】
実施例１  Satb1欠損マウスCD4＋T細胞におけるFoxp3の発現
Satb1をT細胞よりコンディショナルに欠損するマウスを作製した。先に報告された方法により調製されたSatb1fl/flマウス（Hao, B. Et al., J. Exp. Med. 212 809-824(2015)）とThpokCre+マウス（C57BL/6J）（Mucida, D. et al., Nat. Immunol. 14, 281-289(2013))を交配させてSatb1fl/flThpokCre+マウスを得た。対照として同様にしてSatb1fl/+ThpokCre+マウスを獲た。Foxp3の発現を調べるために、各マウスをFoxp3GFPマウスと交配した。【００３７】
Satb1fl/flThpokCre+マウスは、末梢の胸腺由来Treg、通常T細胞（Tconv)、末梢でTconvより分化したTreg (pTreg)においてSatb1の欠損が誘導されるが、胸腺中のTreg (tTreg)および胸腺中のTconvにおけるSatb1の発現には影響がない。以下Satb1fl/flThpokCre+マウスを「Satb1欠損マウス」と、Satb1fl/+ThpokCre+マウスを「コントロールマウス」と言う。【００３８】
各マウスの胸腺および脾臓を取り出し、CD4陽性細胞中のFoxp3およびCD25の発現を調べた。結果を図２に示す。胸腺においてはSatb1の発現は抑制されておらず、Foxp3の発現量はSatb1欠損マウスとコントロールマウスではさほど変化が無い。一方、脾臓中のCD4陽性細胞においては、コントロールマウスでは約10％しかFoxp3を発現していないが、Satb1欠損マウスでは50％以上のT細胞がFoxp3を発現した。【００３９】
Satb1欠損マウスと野性型マウスの末梢CD4+CD25-細胞について遺伝子発現量のプロファイルを確認した。各マウスの末梢CD4+CD25-細胞をFACS Aria IIによりソートし、１×105個の細胞からTRIzol Reagent (Thermo Fisher)を用いてRNAを抽出した。得られたRNAをmiRNeasy Micro Kit (Quiagen)を用いて精製し、RNAライブラリをIon Total RNA-Seq Kit v2 (Thermo Fisher)にて作製し、RNA配列をIon Protonにより確認した。得られた配列をTopHat2(v. 2.0.11)を用いてマウスゲノム（mmm9）にマッピングした。マッピングの結果を基にCuffnorm(v. 2.2.0)による正規発現量FPKMの算出、および発現差違遺伝子(FDR<0.05）をCuffdiff(v. 2.2.0)を用いて同定した。末梢の制御性T細胞（Treg）において、末梢の通常T細胞（Tconv)と比較して発現上昇している遺伝子(Treg up signature gene)あるいはTregで発現が減少している遺伝子（Treg down sgnature）を同定し、それぞれプロットした。結果を図３に示す。【００４０】
Tregにおいて発現が上昇する遺伝子のうち、Satb1欠損マウスにおいてFoxp3の発現が突出して増加していることが確認された。Satb1欠損マウス由来とコントロールマウス由来の末梢Foxp3+CD4+CD25+細胞において、末梢Treg細胞において発現が上昇する遺伝子、即ちCD25、GITR、CTLA4、HeliosおよびNrp1の発現量を比較したが、Satb1欠損マウスとコントロールマウス間で発現量に相違は無かった。【００４１】
Satb1欠損マウスおよびコントロールマウスより取得された末梢CD4+CD25+Foxp3+T細胞、即ち制御性T細胞について、HeliosとNrp1の発現をFACSにより調べた。Nrp1-Helios-Foxp3+細胞は末梢由来の、Nrp1+Helios+Foxp3+細胞は胸腺由来の制御性T細胞であることを示す。結果を図４および図５に示す。図５において、コントロールマウス（Satb1fl/+ThpokCre+）およびSatb1欠損マウス（Satb1fl/flThpokCre+）それぞれについて左側がNrp1+Helios+Treg細胞、即ち胸腺由来の制御性T細胞、右側がNrp-Helios-Treg細胞、即ち末梢由来の制御性T細胞のCD4陽性細胞中の割合を示す。Satb1欠損マウスにおいては、末梢由来制御性T細胞が増えることが確認された。即ち、Satb1の発現を抑制した場合、Foxp3誘導は末梢で生じることが確認された。【００４２】
また、Foxｐ３の安定的な発現はFoxp3遺伝子の脱メチル化によりもたらされる。そこで、各細胞画分のFoxp3遺伝子のCNS2領域のDNA脱メチル化を調べた。結果を図６に示す。Satb1欠損マウスの末梢由来の制御性T細胞（Nrp1-CD25+Foxp3+）では、50％以上の脱メチル化が観察された。これは、コントロールマウスの末梢由来制御性T細胞と同程度のDNA脱メチル化であった。この結果より、Satb1欠損マウスで誘導された末梢由来の制御性T細胞はFoxｐ３遺伝子の脱メチル化によって安定にFoxp3を発現していることが確認された。【００４３】
野性型マウス（Satb1fl/fl）と、Satb１欠損マウス（Satb1fl/flThpokCre+）の末梢CD4+CD25-CD44-細胞を取得し、Th1細胞、Th2細胞およびTh17細胞をそれぞれ誘導する条件下で培養した。得られた細胞について、Th1細胞、Th2細胞およびTh17細胞それぞれのマーカーを用いてフローサイトメトリーで検出した。結果を図７および８に示す。Satb1欠損マウスと野性型マウスでは、Th1細胞およびTh2細胞の量に大きな変化は無かったが、炎症性サイトカインを産生するTh17細胞への分化が抑制されていた。よって、末梢のSatb1の発現を抑制あるいはその機能を抑制することによって、制御性T細胞を誘導することによる免疫寛容の誘導のほか、Th17細胞の減少による炎症の抑制もまた期待できる。【００４４】
実施例２  Satb1欠損T細胞の生体移植試験
試験の概要を図９に示す。
CD4+CD25-CD45RBhiT細胞を、CD45.1+野性型マウスおよびCD45.2+Satb1欠損マウス（Satb1fl/flThpokCre+）のリンパ球細胞よりFACSにてソートした。それぞれ2.5×10５個の細胞を混合し、静脈内投与によりRag2-/-マウスに移入した。Rag2-/-マウスはT細胞およびB細胞の受容体の再構成ができず、T細胞、B細胞、NKT（natural killer T）細胞を完全に欠く免疫不全マウスである。【００４５】
移植１７日後に腸間膜リンパ節からリンパ球を単離し、FACSにて解析した。n=6で行った結果を図１０の下のグラフに示す。Satb1を欠損していない野性型マウス由来のCD45.1+CD4+細胞に比べて、Satb1欠損マウス由来のCD45.2+CD4+細胞では、Foxp3の発現が顕著に増加した。【００４６】
また、移植17日後のマウス腸間膜リンパ節より得たCD45.1+CD4+T細胞およびCD45.2+CD4+T細胞それぞれに発現するFoxp3遺伝子のCNS2領域内の6つのCpG残基のメチル化度を調べた。結果を図１１に示す。CNS2領域内のCpG残基を5'末端より順番に1-6と番号を振った(列）。アンプリコンは最も脱メチル化されている残基から順に並べた(行）。全脱メチル化を100％とした場合に0-50%脱メチル化分については、図から除いている(波線以下）。最も脱メチル化されたクローンから順番に上位3.75％分を拡大したのが下の図である。また、図１２に移植0日と移植17日における全脱メチルアンプリコンの割合を示す。Satb1欠損CD4+T細胞においては、Foxp3遺伝子のCNS2領域における脱メチル化が進み、Foxｐ３遺伝子が安定に発現されていることが確認された。【００４７】
実施例３  腸炎モデルマウスに対する、Satb1欠損T細胞の生体内移植の効果
腸炎モデルマウスとして、4週齢のRag2-/-マウスを用いた（Powrie et al., 1993, Int Immunology）。
CD4+CD25-CD45RBhiT細胞を、野性型マウス（Satb1fl/fl）およびSatb1欠損マウス（Satb1fl/flThpokCre+）のリンパ球細胞よりFACSにてソートした。各細胞（1x106個）を静脈内投与により4週齢のRag2-/-マウスに移植した。細胞移植後の体重の変化を53日目まで観察した。T細胞移植53日後に動物を安楽死させ、大腸を取り出した。Satb1欠損マウス３匹、野性型マウス3匹からのCD4+CD25-CD45RBhiT細胞をそれぞれ別のRag2-/-マウスに移植した。体重の変化を図１３に、取り出した大腸の写真を図１４に示す。【００４８】
Satb1欠損マウス由来のCD4+CD25-T細胞を移植したマウスにおいては、野性型T細胞を移植したマウスと比べて体重の有意な増加が認められた。また、移植53日後の肉眼的所見では、Satb1欠損マウス由来のT細胞を移植したマウスでは野性型T細胞を移植したマウス由来のものより大腸が長く、Satb1欠損マウスの移植により腸炎の発症が抑制されることが確認された。【００４９】
また、野性型マウスまたはSatb1欠損マウス(ドナー)のT細胞を移植した腸炎モデルマウス(レシピエント)の、移植53日後の腸間膜リンパ節および脾臓からCD4+T細胞を採取し、FACSにて分析した。結果を図１５及び１６に示す。また、これらの結果をまとめたグラフを図１７に示す。【００５０】
Satb1欠損マウスのT細胞を移植した腸炎モデルマウスにおいては、野性型と比べてFoxp3を発現する細胞が増加し、またFoxp3+CD4+CD25+細胞である調節性T細胞が増加した。一方、腸間膜リンパ節においてはTh1細胞の有意な減少が認められたが、Th17細胞数についてはほとんど変化が無かった。【００５１】
実施例４  Satb1欠損マウス由来CD8陽性T細胞におけるFoxp３発現の誘導
Satb1をCD4陽性T細胞よりコンディショナルに欠損するマウスを作製した。先に報告された方法により調製されたSatb1fl/flマウス（Hao, B. Et al., J. Exp. Med. 212 809-824(2015)）とCD4Cre+マウス（C57BL/6J）（Lee, PP etal., Immunity 15. 763-774 (2001))を交配させてSatb1fl/flCD4 Cre+マウスを得た。対照としてCD4-Cre+マウスを用いた。【００５２】
両方のマウスのリンパ節をそれぞれ回収し、すりガラスを用いて組織を破砕し、ナイロンメッシュで濾過して全リンパ球細胞懸濁液を調製した。前記調製した全リンパ球細胞を、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗Foxp3抗体、抗CTLA4抗体で染色し、FACSAriaIIを用いてCD8陽性細胞中のFoxp3発現およびCTLA4発現を解析した。FACS解析図を図１８に、CD8陽性細胞中のFoxp3発現細胞の割合を図１９に示す。【００５３】
胸腺においてすべてのT細胞はCD4+CD8+のDP状態を経由してそれぞれのSP細胞へ分化することから、Satb1fl/flCD4 Cre+マウス由来のCD8陽性細胞はSatb1が欠損する。Satb1欠損によるFoxp3の誘導は末梢にて生じることから、本実施例により、Satb1の抑制より、CD8陽性T細胞からFoxp3を発現するT細胞の誘導が可能であることが示される。【００５４】
実施例５  Satb1欠損マウス由来のエフェクターT細胞におけるFoxp3発現の誘導
実施例１と同様にして得たFoxp3-DTR-GFP KI/ThPOK-Cre/SATB1 fl/flマウスのリンパ節を回収し、すりガラスを用いて組織を破砕し、ナイロンメッシュで濾過して全リンパ球細胞懸濁液を調製した。前記調製した全リンパ球細胞を、抗CD4抗体、抗CD25抗体、抗CD44抗体、抗CD62L抗体で染色し、FACSAriaIIを用いて各種細胞分画を精製した。ナイーブTh細胞（CD25-CD44-CD62L+）、CD25-エフェクター（CD25-GFP-CD44+CD62L-）およびCD25+エフェクター（CD25＋GFP-CD44+CD62L-）細胞をDynabeads(R) T cell activator(抗CD3/CD28抗体）（Thermo Fisher Scientific, Inc.）およびIL-2の存在下で０〜１０ng/mLの濃度のTGFβと共に72時間培養し、刺激後の細胞におけるGFP陽性細胞割合をFACSにて解析した。結果を図２０に示す。
Satb1が欠損しているCD4＋CD25＋エフェクター細胞をT細胞活性化物質により刺激することにより、Foxp3のインビトロでの発現が促進されることが確認された。【００５５】
実施例６  CRISPR/CAS系を用いた、in vitro Satb1抑制誘導によるFoxp3発現促進
マウスTリンパ腫細胞株であるEL4細胞からCRISPR/CAS9システムを用いてSATB1欠損EL4細胞株を作製した。ガイドRNAをpSpCas9-T2A-GFP/sgRNA (オリジナルのベクターはFeng Zhang教授から譲り受けた）(pSpCas9n(BB)-2A-GFP (PX461), Addgene plasmid # 48140) に組み込んだ。 
用いたガイド配列sgSatb1:caccgCGCCGGGCGGCGGACTTCCC【００５６】
Cas9 および sgRNA 発現ベクターはNucleofector L system (Lonza)を用いて細胞に導入した。作成後の細胞にFoxp3プロモーター配列を含むLuciferase発現ベクターをNucleofector L systemによって導入し、Dynabeads(R) T cell activatorによって24時間刺激した。刺激後の細胞を溶解し、Luciferase活性を測定した。結果を図２１に示す。EL4はSatb1をノックアウトしていない細胞、KO#7およびKO#９はそれぞれSatb1をノックアウトした細胞を示す。pGL 4.10はFoxp3プロモーター配列を含まないネガティブコントロールを示す。【００５７】
インビトロでT細胞のSatb1発現を抑制することによって、Foxp3発現の誘導ができることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本願の方法により、安定な制御性T細胞を誘導することが可能となった。安定な制御性T細胞を誘導することにより、自己免疫疾患、免疫代謝疾患、アレルギー、臓器移植における拒絶反応、臓器移植における移植片対宿主病の処置や胎児母胎免疫寛容の誘導を達成することができる。
【図１】
2018117090.tif 000002
【図２】
2018117090.tif 000003
【図３】
2018117090.tif 000004
【図４】
2018117090.tif 000005
【図５】
2018117090.tif 000006
【図６】
2018117090.tif 000007
【図７】
2018117090.tif 000008
【図８】
2018117090.tif 000009
【図９】
2018117090.tif 000010
【図１０】
2018117090.tif 000011
【図１１】
2018117090.tif 000012
【図１２】
2018117090.tif 000013
【図１３】
2018117090.tif 000014
【図１４】
2018117090.tif 000015
【図１５】
2018117090.tif 000016
【図１６】
2018117090.tif 000017
【図１７】
2018117090.tif 000018
【図１８】
2018117090.tif 000019
【図１９】
2018117090.tif 000020
【図２０】
2018117090.tif 000021
【図２１】
2018117090.tif 000022
【国際調査報告】
2018117090.tif 000023
2018117090.tif 000024
2018117090.tif 000025
2018117090.tif 000026