【手続補正書】
【提出日】令和1年11月5日(2019.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成分：
（ａ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミド；
（ｂ）目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミド；並びに
（ｃ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液
を含むプラスミド／ＰＥＩ混合物を含む組成物であって、
前記プラスミドが、１：０．０１〜１：１００のモル比範囲、又は１００：１〜１：０．０１のモル比範囲であり、前記成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の混合物が、任意選択で１０秒〜４時間の期間インキュベートされたものである、組成物。
【請求項２】
細胞をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞が、前記成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触している、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
遊離ＰＥＩをさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記細胞が、前記遊離ＰＥＩと接触している、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞が、前記成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の混合物と少なくとも４時間接触していたものである、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞が、前記成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の混合物並びに前記遊離ＰＥＩと少なくとも４時間接触していたものである、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記細胞が、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産するものである、請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、容器を含み、
前記容器が、任意選択でフラスコ、プレート、バッグ、若しくはバイオリアクターを含む、前記容器が、任意選択で無菌である、及び／又は前記容器が、任意選択で細胞の生存若しくは成長を維持するために適している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸を含むプラスミドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触している細胞並びにＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸を含む前記プラスミドをさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
遊離ＰＥＩをさらに含み、前記細胞が、前記遊離ＰＥＩと接触している、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記細胞が、前記成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の混合物、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸を含む前記プラスミド、並びに前記遊離ＰＥＩと少なくとも４時間接触していたものである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
（ａ）プラスミドを用意するステップ；
（ｂ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む溶液を用意するステップ；
（ｃ）（ａ）のプラスミドを（ｂ）のＰＥＩ溶液と混合して、プラスミド／ＰＥＩ混合物を生産し、任意選択で前記プラスミド／ＰＥＩ混合物を１０秒〜４時間の範囲の期間インキュベートするステップ；
（ｄ）細胞をステップ（ｃ）の前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
（ｅ）ステップ（ｄ）において生産した前記核酸／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）の前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも４時間インキュベートし、それにより、形質移入細胞を生産するステップ
を含む、形質移入細胞を生産する方法。
【請求項１５】
前記プラスミドが、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産する形質移入細胞を生産する方法であって、
（ａ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミドを用意するステップ；
（ｂ）目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドを用意するステップ；
（ｃ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む溶液を用意するステップ；
（ｄ）ステップ（ａ）及び（ｂ）のプラスミドをステップ（ｃ）のＰＥＩ溶液と混合して、プラスミド／ＰＥＩ混合物を生産し、任意選択で前記プラスミド／ＰＥＩ混合物を１０秒〜４時間の範囲の期間インキュベートするステップであって、前記プラスミドが、１：０．０１〜１：１００のモル比範囲又は１００：１〜１：０．０１のモル比範囲である、ステップ；
（ｅ）細胞をステップ（ｄ）の前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
（ｆ）ステップ（ｅ）で生産した前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；並びに
（ｇ）ステップ（ｆ）の前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも４時間インキュベートし、それにより、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産する形質移入細胞を生産するステップ
を含む、方法。
【請求項１７】
ステップ（ｆ）若しくは（ｇ）で生産した前記形質移入細胞及び／又はステップ（ｆ）若しくは（ｇ）で生産した前記形質移入細胞からの培養培地を収集して、細胞及び／又は培養培地収集物を生産するステップをさらに含む、請求項１４又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｇ）の前記細胞及び／又は培養培地収集物から組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製し、それにより、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産する方法であって、
（ａ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミドを用意するステップ；
（ｂ）目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドを用意するステップ；
（ｃ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む溶液を用意するステップ；
（ｄ）ステップ（ａ）及び（ｂ）の前記プラスミドをステップ（ｃ）の前記ＰＥＩ溶液と混合して、プラスミド／ＰＥＩ混合物を生産し、任意選択でプラスミド／ＰＥＩ混合物を１０秒〜４時間の範囲の期間インキュベートするステップであって、前記プラスミドが、１：０．０１〜１：１００のモル比範囲又は１００：１〜１：０．０１のモル比範囲である、ステップ；
（ｅ）細胞をステップ（ｄ）で生産した前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
（ｆ）ステップ（ｅ）で生産した前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
（ｇ）ステップ（ｅ）の前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物又はステップ（ｆ）の前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも４時間インキュベートして、形質移入細胞を生産するステップ；
（ｈ）ステップ（ｇ）で生産した前記形質移入細胞及び／又はステップ（ｇ）で生産した形質移入細胞からの培養培地を収集して、細胞及び／又は培養培地収集物を生産するステップ；並びに
（ｉ）ステップ（ｈ）で生産した前記細胞及び／又は培養培地収集物から組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製し、それにより、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産するステップ
を含む、方法。
【請求項２０】
目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産する形質移入細胞を生産する方法であって、
（ａ）成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）：
（ｉ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミド；
（ｉｉ）目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミド；並びに
（ｉｉｉ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液
の混合物を用意するステップ、
（ｂ）前記プラスミド（ｉ）及び（ｉｉ）が、１：０．０１〜１：１００のモル比範囲又は１００：１〜１：０．０１のモル比範囲となるように、前記プラスミドを前記ＰＥＩ溶液（ｉｉｉ）と混合して、プラスミド／ＰＥＩ混合物を生産し、任意選択で前記プラスミド／ＰＥＩ混合物を１０秒〜４時間の範囲の期間インキュベートするステップ；
（ｃ）細胞をステップ（ｂ）で生産した前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
（ｄ）ステップ（ｃ）で生産した前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
（ｅ）ステップ（ｃ）の前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物又はステップ（ｄ）の前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも４時間インキュベートして、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産する形質移入細胞を生産するステップ
を含む、方法。
【請求項２１】
ステップ（ｅ）で生産した形質移入細胞及び／若しくはステップ（ｅ）で生産した形質移入細胞からの培養培地を収集して、細胞及び／若しくは培養培地収集物を生産するステップ；並びに／又はステップ（ｅ）の細胞及び／若しくは培養培地収集物から組換えＡＡＶベクターを単離及び／若しくは精製し、それにより、目的のタンパク質をコードする若しくは目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産するステップをさらに含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産する方法であって、
（ａ）成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）：
（ｉ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミド；
（ｉｉ）目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミド；並びに
（ｉｉｉ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液
の混合物を用意するステップ、
（ｂ）前記プラスミド（ｉ）及び（ｉｉ）が、１：０．０１〜１：１００のモル比範囲又は１００：１〜１：０．０１のモル比範囲となるように、前記プラスミドを前記ＰＥＩ溶液（ｉｉｉ）と混合して、プラスミド／ＰＥＩ混合物を生産し、任意選択で前記プラスミド／ＰＥＩ混合物を１０秒〜４時間の期間インキュベートするステップ；
（ｃ）細胞をステップ（ｂ）で生産した前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
（ｄ）ステップ（ｃ）で生産した前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
（ｅ）ステップ（ｃ）の前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物又はステップ（ｄ）の前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも４時間インキュベートして、形質移入細胞を生産するステップ；
（ｆ）ステップ（ｅ）で生産した前記形質移入細胞及び／又はステップ（ｅ）で生産した形質移入細胞からの培養培地を収集して、細胞及び／又は培養培地収集物を生産するステップ；並びに
（ｇ）ステップ（ｆ）で生産した細胞及び／又は培養培地収集物から組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製し、それにより、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産するステップ
を含む、方法。
【請求項２３】
目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産する方法であって、
（ａ）成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）：
（ｉ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミド；
（ｉｉ）目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミド；並びに
（ｉｉｉ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液
の混合物を用意するステップであって、
前記プラスミド（ｉ）及び（ｉｉ）が、１：０．０１〜１：１００のモル比範囲又は１００：１〜１：０．０１のモル比範囲であり、成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の混合物が、任意選択で１０秒〜４時間の期間インキュベートされたものである、ステップ；
（ｂ）細胞を、ステップ（ａ）で生産した混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で生産した前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
（ｄ）ステップ（ｂ）の前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物又はステップ（ｃ）の前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも４時間インキュベートして、形質移入細胞を生産するステップ；
（ｅ）ステップ（ｄ）で生産した前記形質移入細胞及び／又はステップ（ｄ）で生産した形質移入細胞からの培養培地を収集して、細胞及び／又は培養培地収集物を生産するステップ；並びに
（ｆ）ステップ（ｅ）で生産した細胞及び／又は培養培地収集物から組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製し、それにより、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産するステップ
を含む、方法。
【請求項２４】
前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物、又は前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物、又は前記核酸／ＰＥＩ細胞培養物が、４時間〜１４０時間の範囲の期間インキュベートされる、請求項３〜２３のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項２５】
前記プラスミド／ＰＥＩ混合物が、０．１：１〜５：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有するか、５：１〜０．１：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有するか、前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物が、０．１：１〜５：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有するか、５：１〜０．１：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項２６】
前記プラスミド／ＰＥＩ混合物及び／又は遊離ＰＥＩのＰＥＩが、加水分解直鎖状ポリエチレンイミンを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項２７】
前記プラスミド／ＰＥＩ混合物及び／又は前記遊離ＰＥＩのＰＥＩが、４，０００〜１６０，０００の範囲の分子量及び／又は遊離塩基形態で２，５００〜２５０，０００の範囲の分子量を有する加水分解直鎖状ポリエチレンイミンを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項２８】
総ＰＥＩ中の窒素（Ｎ）とプラスミド中のリン酸（Ｐ）とのモル比が、前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物において１：１〜５０：１（Ｎ：Ｐ）の範囲である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項２９】
前記プラスミド／ＰＥＩ混合物が、３０秒〜４時間の範囲の期間インキュベートされる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項３０】
遊離ＰＥＩの量が、総ＰＥＩの１０％〜９０％の範囲である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項３１】
前記プラスミド／ＰＥＩ混合物が前記細胞と接触する前、同時、又は後に、前記遊離ＰＥＩが、前記細胞に添加される、請求項４、５及び７〜３０のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項３２】
前記細胞が、懸濁培養中である、請求項２〜３１のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項３３】
前記細胞が、無血清培養培地中で成長又は維持される、請求項２〜３１のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項３４】
前記プラスミド／ＰＥＩ混合物及び／又は前記遊離ＰＥＩと接触するときに、前記細胞が、細胞約１×１０５個／ｍＬ〜約１×１０８個／ｍＬの範囲の密度である、請求項２〜３３のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項３５】
前記プラスミド／ＰＥＩ混合物若しくは前記遊離ＰＥＩと接触するときに、前記細胞の生存率が、約６０％若しくは６０％超であるか、前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触するときに、前記細胞が、対数期成長中である、請求項２〜３４のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項３６】
コードされるＡＡＶパッケージングタンパク質が、ＡＡＶ  ｒｅｐ及び／又はＡＡＶ  ｃａｐを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項３７】
コードされるヘルパータンパク質が、アデノウイルスＥ２及び／若しくはＥ４、ＶＡＲＮＡタンパク質、並びに／又は非ＡＡＶヘルパータンパク質を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項３８】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２〜３７のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項３９】
前記細胞が、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞又はＨＥＫ２９３Ｆ細胞である、請求項２〜３７のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項４０】
目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミドとの合計量が、細胞１ｍＬあたり約０．１μｇ〜約１５μｇの範囲である、請求項２〜３９のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項４１】
目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミドとのモル比が、約１：５〜約１：１の範囲又は約１：１〜約５：１の範囲である、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項４２】
前記１種又は複数種のプラスミドが、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む第１のプラスミド及びヘルパータンパク質をコードする核酸を含む第２のプラスミドを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項４３】
目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む第１のプラスミドと、ヘルパータンパク質をコードする核酸を含む第２のプラスミドとのモル比が、約１〜５：１：１、又は１：１〜５：１、又は１：１：１〜５の範囲である、請求項４２に記載の組成物又は方法。
【請求項４４】
ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型又はＡＡＶ偽型を含み、前記ＡＡＶ偽型が、ＩＴＲ血清型と異なるＡＡＶカプシド血清型を含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項４５】
ＡＡＶベクターが、イントロン、発現制御エレメント、１つ若しくは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項４６】
発現制御エレメントが、構成的若しくは調節可能制御エレメント、又は組織特異的発現制御エレメント若しくはプロモーターを含む、請求項４５に記載の組成物又は方法。
【請求項４７】
発現制御エレメントが、肝臓における発現を付与するエレメントを含む、請求項４５に記載の組成物又は方法。
【請求項４８】
ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、若しくはＡＡＶ−２ｉ８のＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシドタンパク質のうちのいずれかと７５％以上の配列同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシドタンパク質を含むか、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ−２ｉ８のＡＡＶ血清型のうちのいずれかから選択される改変若しくはバリアントＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシドタンパク質を含む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項４９】
細胞が、前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触する前に、細胞約０．１×１０６個／ｍｌ〜約５．０×１０６個／ｍｌの範囲の細胞密度に継代培養される、請求項３〜４７のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項５０】
細胞が、継代培養の後に、前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と２日〜５日の間の期間接触する、請求項４９に記載の組成物又は方法。
【請求項５１】
生産した組換えＡＡＶベクターの量が、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加するステップのない状態と比較して、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加するステップのある状態で、少なくとも５０％以上である、請求項１６〜５０のいずれか一項に記載の方法。