(57)【要約】  （ａ）酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相上に、露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する樹脂組成物の層（ＰＡＧ層）を形成する工程と、（ｂ）前記ＰＡＧ層の所望の位置を露光する工程と、（ｃ）前記の露光後のＰＡＧ層を除去する工程と、（ｄ）前記のＰＡＧ層を除去した固相を、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させる工程と、を含む核酸アレイの製造方法。
2018131593.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相上に、露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する樹脂組成物の層（ＰＡＧ層）を形成する工程と、
（ｂ）前記ＰＡＧ層の所望の位置を露光する工程と、
（ｃ）前記の露光後のＰＡＧ層を除去する工程と、
（ｄ）前記のＰＡＧ層を除去した固相を、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させる工程と、を含む
核酸アレイの製造方法。
【請求項２】
前記（ｃ）の工程が、前記の露光後のＰＡＧ層を、固相から剥離することによって行われる、請求項１に記載の核酸アレイの製造方法。
【請求項３】
前記（ｃ）の工程が、前記の露光後のＰＡＧ層を、溶剤を用いて溶解させることによって行われる、請求項１に記載の核酸アレイの製造方法。
【請求項４】
前記（ｃ）の工程が、前記の露光後のＰＡＧ層を除去する操作の後に、前記固相を洗浄する操作を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸アレイの製造方法。
【請求項５】
前記樹脂が、ポリウレタン樹脂を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸アレイの製造方法。
【請求項６】
前記ＰＡＧは、オニウム塩、ジアゾメタン、及びスルホン酸エステルからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸アレイの製造方法。
【請求項７】
前記酸分解性保護基は、アセチル基（Ａｃ）、ベンゾイル基（Ｂｚ）、トリチル基（Ｔｒ）、モノメトキシトリチル基（ＭＭＴ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）、トリメトキシトリチル基（ＴＭＴ）、β‐メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、メトキシメチルエーテル基（ＭＯＭ）、テトラヒドロピラニル基（ＴＨＰ）、及びｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＳ）からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸アレイの製造方法。
【請求項８】
前記（ａ）〜（ｄ）の工程を、任意の回数繰り返す、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸アレイの製造方法。
【請求項９】
酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相上に、露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する樹脂組成物の層（ＰＡＧ層）を形成する、ＰＡＧ層形成部と、
前記ＰＡＧ層の所望の位置を露光する露光部と、
前記の露光後のＰＡＧ層を除去する、ＰＡＧ層除去部と、
前記のＰＡＧ層を除去した固相を、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させるためのヌクレオチド誘導体反応部と、を含む
核酸アレイ製造装置。
【請求項１０】
前記固相を、前記ＰＡＧ層形成部、前記露光部、及び前記ＰＡＧ層除去部間を移動させる固相移動部と、前記固相移動部における前記固相の移動を制御する固相移動制御部と、をさらに含む請求項９に記載の核酸アレイ製造装置。
【請求項１１】
前記露光部は光源を含み、前記光源は、前記ＰＡＧ層形成部の上部に配置されており、前記ＰＡＧ層形成部の全部又は一部が、前記露光部を兼ねる、請求項１０に記載の核酸アレイ製造装置。
【請求項１２】
前記ＰＡＧ層形成部の全部又は一部が、前記ＰＡＧ層除去部を兼ねる、請求項９又は１１に記載の核酸アレイ製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸アレイの製造方法、及び核酸アレイ製造装置に関する。
本願は、２０１７年１月１２日に、日本に出願された特願２０１７−００３３１０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡマイクロアレイの作製方法には、アフィメトリクス社によって開発されたアフィメトリクス型と、スタンフォード大学で開発されたスタンフォード型とがある。アフィメトリクス型は、感光性塩基を用いたフォトリソグラフィープロセスにより、基板上でＤＮＡを合成する方法である。一方、スタンフォード型は、ロボットプリンティング技術により、基板上にＤＮＡをスポットする方法である。
アフィメトリクス型によれば、より集積度の高いマイクロアレイを作製することができる。しかし、非特許文献１によるとパターニングのための感光性塩基は特殊であり、量産性の観点からスループットに関わる光応答性も十分とは言えない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９９７，  １１９  （２２），  ５０８１―５０９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の一実施態様は、（ａ）酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相上に、露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する樹脂組成物の層（ＰＡＧ層）を形成する工程と、（ｂ）前記ＰＡＧ層の所望の位置を露光する工程と、（ｃ）前記の露光後のＰＡＧ層を除去する工程と、（ｄ）前記のＰＡＧ層を除去した固相を、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させる工程と、を含む核酸アレイの製造方法である。【０００５】
また、本発明の一実施態様は、酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相上に、露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する樹脂組成物の層（ＰＡＧ層）を形成する、ＰＡＧ層形成部と、前記ＰＡＧ層の所望の位置を露光する露光部と、前記の露光後のＰＡＧ層を除去する、ＰＡＧ層除去部と、前記のＰＡＧ層を除去した固相を、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させるためのヌクレオチド誘導体反応部と、を含む核酸アレイ製造装置である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本発明の１実施形態にかかる核酸アレイ製造方法の概略図である。
【図２】本発明の１実施形態にかかる核酸アレイ製造方法の概略図である。
【図３】本発明の１実施形態にかかる核酸アレイ製造装置の概略図である。
【図４】本発明の１実施形態にかかる核酸アレイ製造装置の概略図である。
【図５】飛行時間二次イオン質量分析計（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：ＴｏＦ−ＳＩＭＳ）を用いて、パターニング後の基板表面の有機化学構造の質量分布マッピング評価の結果である。酸による脱保護部分のＭＳスペクトルを示した。
【図６】ＴｏＦ−ＳＩＭＳを用いて、パターニング後の基板表面の有機化学構造の質量分布マッピング評価の結果である。酸による脱保護部分のＭＳスペクトルを示した。
【図７】パターニング後の基板におけるフラグメントイオンｍ／ｚ５９と保護基由来のｍ／ｚ３０３に由来する質量でのマッピング評価結果を示す。ＰＡＧ層の膜厚は８μｍとした。
【図８】パターニングによる露光部分における水酸基生成の模式図である。
【図９】パターニング後の基板におけるフラグメントイオンｍ／ｚ５９と保護基由来のｍ／ｚ３０３に由来する質量でのマッピング評価結果を示す。ＰＡＧ層の膜厚は６０ｎｍとした。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
≪核酸アレイの製造方法≫
１実施形態において、本発明は、核酸アレイの製造方法を提供する。本実施形態の核酸製造方法は、（ａ）酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相上に、露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する樹脂組成物の層（ＰＡＧ層）を形成する工程と、（ｂ）前記ＰＡＧ層の所望の位置を露光する工程と、（ｃ）前記の露光後のＰＡＧ層を除去する工程と、（ｄ）前記のＰＡＧ層を除去した固相を、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させる工程と、を含む。
【０００８】
図１（１）〜（７）に基づき、本実施形態の製造方法の概略を説明する。
まず、図１（１）に示すように、酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定された基板等の固相１を準備する。図１（１）の例では、酸分解性保護基で保護されている官能基は、水酸基（−ＯＨ）である。また、図中、「ＰＧ」は、酸分解性保護基である。次に、図１（２）に示すように、光酸発生剤（Ｐｈｏｔｏ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ：ＰＡＧ）を含有する樹脂組成物を用いてＰＡＧ層２を形成する。その後、図１（３）に示すように、ＰＡＧ層２に対してパターン露光を行う。これにより、露光された部分のＰＡＧ層中のＰＡＧが酸を発生し、図１（４）に示すように、露光された部分のＰＡＧ層２の下層の酸分解性保護基が脱保護される。次に、露光後のＰＡＧ層２を、固相１上から除去する。図１（５）の例では、ＰＡＧ層２は、剥離により除去されている。ＰＡＧ層２を除去した後、図１（６）に示すように、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体４を作用させる。なお、図１（６）の例では、ヌクレオチド誘導体４は、アデニンヌクレオチド誘導体である。ヌクレオチド誘導体４は、脱保護された官能基と反応し、図１（７）に示すように、前記官能基を介して固相１上に保持される。
以下、各工程の詳細を説明する。
【０００９】
［ＰＡＧ層形成工程］
工程（ａ）は、酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相上に、露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する樹脂組成物の層（ＰＡＧ層）を形成する工程である。
【００１０】
工程（ａ）では、まず、図１（１）に示されるように、酸分解性保護基（ＰＧ）で保護された官能基を有する分子が固定化された固相１を準備する。固相１としては、例えば、基板やビーズ等を用いることができる。基板を使用する場合、基板の材質としては、例えば、シリコン、ガラス、石英、ソーダ石灰ガラス、ポリアミド樹脂、プラスチックフィルム等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１１】
酸分解性保護基は、酸の作用により脱保護される基である。本実施形態において、酸分解性保護基は、特に限定されず、酸の作用により脱保護されるものであれば、特に制限なく使用することができる。酸分解性保護基としては、例えば、アセチル基（Ａｃ）；ベンゾイル基（Ｂｚ）；トリチル基（Ｔｒ）、モノメトキシトリチル基（ＭＭＴ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）、トリメトキシトリチル基（ＴＭＴ）などのエーテル系保護基；β‐メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、メトキシメチルエーテル基（ＭＯＭ）、テトラヒドロピラニル基（ＴＨＰ）などのアセタール系保護基；ｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＳ）などのシリルエーテル基等を挙げることができるが、これらに限定されない。これらの酸分解性保護基は、保護する官能基が水酸基である場合に用いられる。保護する官能基がアミノ基等である場合も、適宜好適な酸分解性保護基を選択して用いることができる。一例として、酸分解性保護基として、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を挙げることができる。
【００１２】
本実施形態においては、固相上に固定化された分子の官能基が、酸分解性保護基で保護されている。官能基は、特に限定されず、後述するヌクレオチド誘導体と結合できるものであればよい。一例として、官能基として、水酸基を挙げることができる。
【００１３】
酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相を準備する方法は特に限定されないが、例えば、固相表面に有機シラン化合物分子を固定し、該有機シラン化合物分子に酸分解性保護基を有する分子を結合させることによって行うことができる。
固相表面に有機シラン化合物を固定する方法としては、例えば、酸素ガス等で固相表面のプラズマ処理を行った後、水又はエタノール中で有機シラン化合物を反応させる。前記方法で用いる有機シラン化合物としては、例えば、ヒドロキシアルキルシラン、ヒドロキシアルキルアミドシラン、ヒドロキシグリコールシラン等を挙げることができる。例えば、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド）等を用いることができる。
例えば、固相をプラズマ処理した後、有機シラン化合物溶液に浸漬して、７０〜１２０℃程度で５〜４０分程度加熱した後、イソプロパノール等の有機溶媒に浸漬して洗浄する。なお、洗浄の際には、超音波処理を行ってもよい。洗浄後、固相を乾燥し、１００〜１４０℃程度で１〜１０分程度加熱することにより、有機シラン化合物分子を固相に固定することができる。
【００１４】
続いて、固相に固定化された有機シラン化合物分子に、酸分解性保護基を有する分子を反応させる。酸分解性保護基を有する分子としては、例えば、酸分解性保護基を有するホスホロアミダイトヌクレオチド、５’又は３’の水酸基を酸分解性保護基で保護したヌクレオチド等、核酸人工合成法として知られるホスホロアミダイト法やリン酸エステル法に適用可能な核酸モノマー等を挙げることができる。そのような分子としては、一例として、ＤＭＴ−ホスホロアミダイトヌクレオチドを挙げることができる。例えば、有機シラン化合物を固定化した固相を、酸分解性保護基を有するホスホロアミダイトヌクレオチド溶液に浸漬し、１〜１５分程度揺動することにより、酸分解性保護基を有する分子を固相表面に固定化することができる。当該反応は、禁水条件下で行ってもよい。反応後、適宜アセトニトリル等の有機溶媒で洗浄してもよい。
なお、上記の例では、有機シラン化合物分子に酸分解性保護基を有する分子を結合させたが、有機シラン化合物分子を直接酸分解性保護基で保護してもよい。
【００１５】
上記のように準備した固相上に、図１（２）に示されるように、ＰＡＧを含有する樹脂組成物を用いてＰＡＧ層２を形成する。
【００１６】
ＰＡＧは、露光により酸を発生する分子である。本実施形態の製造方法において、ＰＡＧは、特に限定されず、レジスト組成物などに一般的に用いられるものを使用することができる。ＰＡＧとしては、スルホニウム塩、ヨードニウム塩等のオニウム塩、ジアゾメタン、スルホン酸エステル等が挙げられる。ジアゾメタンやスルホン酸エステル等のノニオン系よりも、オニウム塩等のイオン系の方が、強い酸を生成することができる。一例として、ＰＡＧは、オニウム塩である。オニウム塩としては、トリフルオロメタンスルホン酸トリフェニルスルホニウムなどのスルホニウム塩、パーフルオロプロパンスルホン酸ジフェニルヨードニウムなどのヨードニウム塩等が挙げられる。そのようなオニウム塩から生成される酸としては、フルオロアンチモネート（ＨｓｂＦ６）、ＦＡＰ（フルオロアルキルフォスフェート）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＣＦ３ＳＯ３Ｈ：ＴｆＯＨ）、パーフルオロプロパンスルホン酸等が挙げられる。本実施形態の製造方法に用いるＰＡＧが生成する酸は、一例として、酸解離定数（ｐＫａ）が−３０〜５程度である。また、一例として、ｐＫａが−２５〜０である。さらに、ＰＡＧは、溶媒に対する溶解度が約１質量％以上のものを用いることができるが、溶解度がより高いものを用いてもよい。ＰＡＧとして、例えば、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）に対する溶解度が、３０質量％以上、４０質量％以上、又は５０質量％以上のものを用いてもよい。ＰＡＧは、レジスト用などに市販されているものを使用することもできる。一例として、サンアプロ社のＣＰＩ（登録商標）シリーズのＰＡＧを使用することができる。ＣＰＩ（登録商標）シリーズのＰＡＧとしては、ＣＰＩ−２１０Ｓを例示することができる。
【００１７】
ＰＡＧを含有する樹脂組成物は、ＰＡＧに加えて樹脂を含有する。樹脂は、ともに樹脂組成物に含有されるＰＡＧが酸を発生する波長の光を透過するものであれば、特に限定されない。前記光を透過する樹脂を用いることにより、樹脂組成物を露光した場合に樹脂組成物中のＰＡＧに前記波長の光が到達し、ＰＡＧが酸を発生する。ＰＡＧに酸を発生させる波長の光を透過する樹脂（以下、「光透過性樹脂」という。）は、ＰＡＧの種類に応じて、適宜選択すればよい。光透過性の高い透明な樹脂であれば、一般的なＰＡＧに酸を発生させる波長の光を透過するため、光透過性樹脂には、透明な樹脂を使用することができる。そのような樹脂としては、例えば、ポリウレタン樹脂；ポリメタクリル酸メチル樹脂などのアクリレート樹脂；イミド樹脂；アミド樹脂；スルホン樹脂；ビニル樹脂；シリコーン樹脂；ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン樹脂；ポリスチレン；ポリカーボネート；ポリエステルテレフタラートなどのポリエステル；エポキシ樹脂；多糖やポリオールなどの親水性樹脂；パーフルオロエーテルなどの撥水性樹脂等を挙げることができるが、これらに限定されない。成膜後の樹脂組成物中のＰＡＧが酸を生成するものであれば、ＰＡＧと光透過性樹脂とは相溶する組み合わせでも分散する組み合わせでもよい。
なお、光透過性樹脂として、剥離性の高い樹脂を用いれば、後の工程（ｃ）において、剥離によりＰＡＧ層を除去することができる。剥離性の高い樹脂としては、ポリウレタン樹脂、シリコーン樹脂、アクリレート樹脂等を例示することができるが、これらに限定されない。
光透過性樹脂は、市販のものを用いてもよい。例えば、ポリウレタン樹脂の市販品としては、ＲｕｓＰａｃｋ（株式会社オーデック）等を例示することができる。
光透過性樹脂は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用しもよい。
【００１８】
樹脂組成物は、ＰＡＧ及び光透過性樹脂以外の、他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、例えば、溶剤や、樹脂製品の調製に一般的に使用される添加剤等を例示することができる。樹脂内を塩基性〜中性に保つための塩基性物質や界面活性剤などを添加することもできる。ＰＡＧから発生する酸の熱拡散を抑制する目的で、塩基性物質を添加することもできる。塩基性物質として、例えば、アルキルアミンなどを添加してもよい。また、ＰＡＧから発生する酸の界面脱保護反応を抑制しなければ、樹脂組成物の離形性を高めるための添加剤を添加してもよい。例えば、シリコーン系離型剤を添加してもよい。
【００１９】
樹脂組成物は、例えば、ＰＡＧと光透過性樹脂とを溶剤に溶解し、適宜他の成分を添加して撹拌することにより調製することができる。溶剤は、ＰＡＧ及び光透過性樹脂の種類に応じて、適宜選択すればよい。溶剤は、一般的に使用される有機溶剤等を用いることができる。溶剤としては、例えば、エタノール、ブタノール、イソプロピルアルコール、イソブチルアルコール、ベンジルアルコールなどのアルコール系溶剤；プロピレングリコールモノエチルエーテル（ＰＧＭＥ）、ＰＧＭＥＡ等のエーテル系溶剤；アセトン、シクロヘキサンなどのケトン系溶剤；酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸イソプロピルなどのエステル系溶剤；トルエン、キシレン、シクロヘキサンなどの炭化水素系溶剤等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、溶剤は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上の混合溶剤であってもよい。
【００２０】
樹脂組成物において、ＰＡＧの含有量は特に限定されないが、例えば、光透過性樹脂１００質量部に対して、０．００５〜２０質量部、０．５〜１５質量部、１〜１０質量部等とすることができる。
また、樹脂組成物における光透過性樹脂の含有量は特に限定されないが、例えば、樹脂組成物１００質量％に対して、０．１〜７０質量％、０．５〜６０質量％、１〜５０質量％等とすることができる。樹脂組成物中の光透過性樹脂の含有量を少なくすると、膜厚の薄いＰＡＧ層を形成することができる。
【００２１】
樹脂組成物を用いたＰＡＧ層の形成は、レジスト膜の形成等に一般的に用いられる方法で行えばよい。ＰＡＧ層の形成には、例えば、スピンコート法、ディップコート法、スリットダイコート法、スプレーコート法等を用いることができる。前記のような方法で成膜した後、加熱等を行って膜を乾燥してもよい。
ＰＡＧ層の膜厚は特に限定されないが、例えば、１０〜２００００ｎｍ程度、３０〜１００００ｎｍ程度とすることができる。膜厚が薄くなるほど、より微細なアレイを製造することができる。一方、膜厚が厚くなると、剥離によりＰＡＧ層を除去することができる。剥離可能な膜厚は、光透過性樹脂の種類により異なるが、例えば１０００ｎｍ以上を挙げることができる。したがって、アレイの微細化の程度に応じて、適宜膜厚を選択すればよい。例えば、剥離によりＰＡＧ層を除去する場合には、１０００〜２００００ｎｍ程度、又は１０００〜１００００ｎｍ程度の膜厚とすることができる。
【００２２】
［露光工程］
工程（ｂ）は、上記工程（ａ）で形成したＰＡＧ層の所望の位置を露光する工程である。
図１（３）に示すように、ＰＡＧ層２に対してパターン露光を行うと、露光部分のＰＡＧ層２に含まれるＰＡＧから酸（Ｈ＋）が生成する。この酸により、ＰＡＧ層２の下層に存在する酸分解性保護基（ＰＧ）が脱保護され、酸分解性保護基で保護されていた官能基が露出する。なお、図１（４）は、露光後のＰＡＧ層を示している。図１（４）では、ＰＡＧ層２の露光部分３において酸が生成しており、その下層の酸分解性保護基が脱保護されて、官能基（−ＯＨ）が露出している。
【００２３】
工程（ｂ）における露光は、ＰＡＧの種類に応じて、ｇ線、ｈ線、ｉ線、ＡｒＦエキシマレーザー、ＫｒＦエキシマレーザー、ＥＵＶ、ＶＵＶ、ＥＢ、Ｘ線等を放射する適切な光源を用いて行うことができる。例えば、ＡｒＦ用ＰＡＧを用いた場合には、ＡｒＦエキシマレーザーを用いて露光することができる。また、ｉ線用ＰＡＧを用いた場合には、ｉ線を用いて露光することができる。
【００２４】
工程（ｂ）における露光において、露光量は特に限定されないが、例えば、１０〜６００ｍＪ／ｃｍ２、又は５０−２００ｍＪ／ｃｍ２とすることができる。アフィメトリクス型のＤＮＡマイクロアレイの作製方法では、感光性塩基の脱保護のために数Ｊ以上が必要であり、本実施形態の製造方法では、アフィメトリクス型の方法と比較して、少ない露光量で核酸アレイの製造を行うことができる。
【００２５】
露光は、後述する酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体との接触工程において、当該ヌクレオチド誘導体を結合させたい位置のＰＡＧ層に対してのみ行う。このようなパターン露光を行うことにより、ＰＡＧ層の露光した部分の下層に位置する酸分解性保護基のみが脱保護され、未露光部分の酸分解性保護基は脱保護されずに維持される。このようなパターン露光には、例えば、フォトマスク等を用いて行う方法、レンズやミラーなどの光学系を用いたプロジェクション露光、空間光変調素子、レーザービームなどを用いたマスクレス露光等の手段を用いることができる。
【００２６】
［ＰＡＧ層除去工程］
工程（ｃ）は、上記工程（ｂ）で露光した露光後のＰＡＧ層を除去する工程である。
図１（５）に示す例では、ＰＡＧ層２の除去は、ＰＡＧ層２を、固相１から剥離することによって行われている。
【００２７】
ＰＡＧ層の除去の方法は、特に限定されないが、ＰＡＧ層を固相から剥離する方法、ＰＡＧ層を溶剤を用いて溶解させる方法等を例示することができる。
【００２８】
ＰＡＧ層を固相から剥離する場合、剥離の方法は特に限定されない。例えば、ＰＡＧ層の一端を把持して剥離する方法や、粘着性基材をＰＡＧ層に接触させて剥離する方法等を挙げることができる。剥離方法の一例としては、ロールｔｏロール技術を用いた方法等が挙げられる。
【００２９】
ＰＡＧ層の剥離後は、固相上に残存するＰＡＧ層の残渣を除去するため、固相の洗浄を行ってもよい。洗浄は、有機溶剤等を用いて行えばよく、そのような溶剤としては、アセトン、イソプロピルアルコール等を例示することができる。また、洗浄効果を高めるために溶剤蒸気を用いたベーパー洗浄を行ってもよい。また、洗浄効果を高めるために、洗浄操作中に、固相に対して超音波照射を行ってもよい。
【００３０】
ＰＡＧ層を溶剤を用いて溶解する場合、樹脂組成物に含有される光透過性樹脂の種類に応じて、当該光透過性樹脂を溶解可能な溶剤を適宜選択して、ＰＡＧ層を溶解すればよい。溶剤としては、アセトン、イソプロピルアルコール等を例示できるが、これらに限定されない。また、溶解効果を高めるために、溶解操作中に、基板に対して超音波照射を行ってもよい。
【００３１】
ＰＡＧ層の溶解後は、固相上に残存するＰＡＧ層の残渣を除去するため、固相の洗浄を行ってもよい。洗浄は、適切な有機溶剤等を用いて行えばよく、そのような溶剤としては、アセトン、イソプロピルアルコール等を例示することができる。また、洗浄効果を高めるために溶剤蒸気を用いたベーパー洗浄を行ってもよい。また、洗浄効果を高めるために、洗浄操作中に、基板に対して超音波照射を行ってもよい。
【００３２】
［ヌクレオチド誘導体反応工程］
工程（ｄ）は、上記工程（ｃ）でＰＡＧ層を除去した固相を、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させる工程である。
図１（６）及び（７）に示されるように、酸分解性保護基（ＰＧ）を有するヌクレオチド誘導体４を、ＰＡＧ層２除去後の固相１に接触させると、脱保護により露出した官能基（−ＯＨ）とカップリングして結合する。これにより、固相１上の所望の位置において、所望の配列の核酸合成を行うことができる。
【００３３】
酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体は、一般的な核酸合成法に使用されるものを用いることができる。核酸合成法としては、一例として、ホスホロアミダイト法を挙げることができ、ヌクレオチド誘導体として、ホスホロアミダイト化されたヌクレオチド誘導体を用いることができる。また、酸分解性保護基は、酸の作用により脱保護されるものであれば、特に制限なく使用することができる。酸分解性保護基としては、例えば、上記「［ＰＡＧ層形成工程］」において記載したもの等を例示することができる。一例として、酸分解性保護基には、ＤＭＴを用いることができる。また、酸分解性保護基によって保護される官能基としては、リボース又はデオキシリボースの５位の炭素に結合する水酸基を挙げることができるが、これに限定されない。本工程で使用可能なヌクレオチド誘導体としては、例えば、ＤＭＴ−ｄＡホスホロアミダイト、ＤＭＴ−ｄＴホスホロアミダイト、ＤＭＴ−ｄＧホスホロアミダイト、ＤＭＴ−ｄＣホスホロアミダイト等を挙げることができるが、これらに限定されない。ヌクレオチド誘導体は、核酸合成用に市販されているものを用いてもよい。また、ヌクレオチド誘導体が由来するヌクレオチドは、ＲＮＡであってもよく、ＢＮＡ（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）やＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）等の人工核酸であってもよい。
【００３４】
ヌクレオチド誘導体として、ホスホロアミダイト化されたヌクレオチド誘導体を用いる場合、当該ヌクレオチド誘導体と固相上の官能基との反応は、一般的なホスホロアミダイト法で用いられる条件により行うことができる。例えば、ホスホロアミダイト法による核酸合成は、以下のような手順で行うことができる。
まず、ホスホロアミダイト化されたヌクレオチド誘導体をテトラゾール等により活性化し、当該ヌクレオチド誘導体を固相上の官能基とカップリングさせる。次に、未反応の官能基をアセチル化等によりキャッピングし、以降のサイクルに関与しないようにする。その後、固相上の官能基と前記ヌクレオチド誘導体との結合を、ヨードを用いて酸化し、３価のリンから５価のリン酸エステルに変換する。
これらの反応は公知であり、公知の条件で反応を行うことができる。また、これらの反応に用いる試薬は、市販のものを用いることができる。なお、上記の方法は、固相上の官能基とヌクレオチド誘導体との結合方法の一例であり、他の方法により結合反応を行ってもよい。
【００３５】
ヌクレオチド誘導体との反応を行う前に、固相は、乾燥させておいてもよい。乾燥には、例えば、乾燥アセトニトリルや窒素フロー等を使用することができる。また、固相上の官能基とヌクレオチド誘導体との結合反応は、禁水条件下で行ってもよい。
【００３６】
［核酸伸長］
本実施形態の製造方法は、工程（ａ）〜工程（ｄ）を任意の回数繰り返すことにより、固相上で核酸伸長を行い、所望の配列及び塩基長を有する核酸アレイを製造することができる。例えば、ＤＮＡアレイを製造する場合には、アデニン、チミン、シトシン、及びグアニンを塩基としてそれぞれ有する４種類のヌクレオチド誘導体を使用して、工程（ａ）〜工程（ｄ）を繰り返すことにより、任意の配列及び塩基長を有するＤＮＡを固相１上で合成し、ＤＮＡアレイを製造することができる。
以下、固相上でのＤＮＡの合成例について、図１（１）〜（１３）及び図２（１）〜（１２）を参照して説明する。
【００３７】
図１（１）〜（７）は、１巡目の工程（ａ）〜（ｄ）を示す。詳細は、上述したとおりである。図１（１）〜（７）では、ヌクレオチド誘導体４として、アデニンヌクレオチド誘導体を固相１上の官能基（−ＯＨ）に結合している。
【００３８】
図１（８）〜（１３）は、２巡目の工程（ａ）〜（ｄ）を示す。図１（８）では、１巡目の工程（ａ）〜（ｄ）でアデニンヌクレオチド誘導体が結合された固相１に対して、再度ＰＡＧ層２の形成を行っている（工程（ａ））。図１（９）では、ＰＡＧ層２に対して１巡目とは異なる位置に露光を行っており、これにより露光された部分のＰＡＧ層２中のＰＡＧが酸を発生し、図１（１０）に示すように、ＰＡＧ層２の露光された部分３の下層の酸分解性保護基（ＰＧ）が脱保護される（工程（ｂ））。次に、図１（１１）に示すように、露光後のＰＡＧ層２を除去する（工程（ｃ））。図１（１１）の例では、露光後のＰＡＧ層２が剥離により除去されている。そして、図１（１２）に示すように、ＰＡＧ層２を除去した固相１を酸分解性保護基（ＰＧ）を有するヌクレオチド誘導体４と接触させる（工程（ｄ））。図１（１２）の例では、ヌクレオチド誘導体４として、チミジンヌクレオチド誘導体を、固相１上の官能基（−ＯＨ）に作用させている。その結果、図１（１３）に示すように、固相１上の官能基（−ＯＨ）にチミジンヌクレオチド誘導体が結合する。
【００３９】
図２（１）〜（６）は、３巡目の工程（ａ）〜（ｄ）を示す。図２（１）では、１巡目でアデニンヌクレオチド誘導体、２巡目でチミジンヌクレオチドが結合された固相１に対して、再度ＰＡＧ層２の形成を行っている（工程（ａ））。図２（１）では、ＰＡＧ層２に対して１巡目及び２巡目とは異なる位置に露光を行っており、これにより露光された部分のＰＡＧ層２中のＰＡＧが酸を発生し、図２（３）に示すように、ＰＡＧ層２の露光された部分３の下層の酸分解性保護基（ＰＧ）が脱保護される（工程（ｂ））。次に、図２（４）に示すように、露光後のＰＡＧ層２を除去する（工程（ｃ））。図２（４）の例では、露光後のＰＡＧ層２が剥離により除去されている。そして、図２（５）に示すように、ＰＡＧ層２を除去した固相１を酸分解性保護基（ＰＧ）を有するヌクレオチド誘導体４と接触させる（工程（ｄ））。図２（５）の例では、ヌクレオチド誘導体４として、グアニンヌクレオチド誘導体を、固相１上の官能基（−ＯＨ）に作用させている。その結果、図２（６）に示すように、固相１上の官能基（−ＯＨ）にグアニンヌクレオチド誘導体が結合する。
【００４０】
図２（７）〜（１２）は、４巡目の工程（ａ）〜（ｄ）を示す。図２（７）では、１巡目でアデニンヌクレオチド誘導体、２巡目でチミジンヌクレオチド、３巡目でグアニンヌクレオチドが結合された固相１に対して、再度ＰＡＧ層２の形成を行っている（工程（ａ））。図２（８）では、ＰＡＧ層２に対して１巡目乃至３巡目とは異なる位置に露光を行っており、これにより露光された部分のＰＡＧ層２中のＰＡＧが酸を発生し、図２（９）に示すように、ＰＡＧ層２の露光された部分３の下層の酸分解性保護基（ＰＧ）が脱保護される（工程（ｂ））。次に、図２（１０）に示すように、露光後のＰＡＧ層２を除去する（工程（ｃ））。図２（１０）の例では、露光後のＰＡＧ層２が剥離により除去されている。そして、図２（１１）に示すように、ＰＡＧ層２を除去した固相１を酸分解性保護基（ＰＧ）を有するヌクレオチド誘導体４と接触させる（工程（ｄ））。図２（１１）の例では、ヌクレオチド誘導体４として、シトシンヌクレオチド誘導体を、固相１上の官能基（−ＯＨ）に作用させている。その結果、図２（１２）に示すように、固相１上の官能基（−ＯＨ）にシトシンヌクレオチド誘導体が結合する。
【００４１】
上記のようにして、図１及び図２の例では、工程（ａ）〜（ｄ）を４回繰り返すことにより、１段目のヌクレオチドを固相１に結合させている。同様にして、工程（ａ）〜（ｄ）をさらに４回繰り返すことにより、１段目のヌクレオチドに対して、２段目のヌクレオチドを結合させることができる。同様にして、工程（ａ）〜（ｄ）をさらに４回繰り返すことにより、２段目のヌクレオチドに対して、３段目のヌクレオチドを結合させることができる。このように、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンの各ヌクレオチド誘導体を各回で用いる４回の工程（ａ）〜（ｄ）を１セットとして、当該セットを所望の回数行うことにより、所望の塩基長の配列を固相１上に合成することができる。例えば、前記セットを１０回行うことにより、１０塩基のＤＮＡを固相１上に合成することができる。
【００４２】
このように、工程（ａ）〜（ｄ）を任意の回数繰り返すことにより、固相１上の所望の位置に、所望の配列を有する核酸を合成することができる。このようにして、固相１上に、例えば、任意の配列を有する１０〜１００塩基の核酸を合成し、核酸アレイを製造することができる。
【００４３】
なお、図１及び図２の例では、アデニン、チミン、グアニン、シトシンの順にヌクレオチド誘導体を反応させているが、ヌクレオチド誘導体を反応させる順序はこれに限定されず、これらのヌクレオチド誘導体を任意の順序で反応させることができる。また、ヌクレオチド誘導体を反応させる順序は、各セット間で同じである必要はなく、セット毎に異なる順序でヌクレオチド誘導体を反応させてもよい。
【００４４】
また、上記説明した例では、固相上で１段ずつヌクレオチドを伸長させているが、必ずしも１段ずつヌクレオチドを伸長させる必要はない。例えば、１巡目でアデニンヌクレオチド誘導体を用い、２巡目でチアミンヌクレオチド誘導体を用いる場合、１巡目と２巡目で一部重複する位置を露光し、１巡目と２巡目の露光が重複する位置に「Ａ−Ｔ」の配列を形成してもよい。
【００４５】
本実施形態の製造方法によれば、従来の方法よりも、少ない露光量で核酸アレイの製造を行うことができる。また、光透過性樹脂は、入手が容易で安価なものを使用できるため、核酸合成にかかる費用を削減することができる。また、光透過性樹脂の膜厚やパターン露光を制御することにより、アレイの微細化も可能である。
そのため、本実施形態の製造方法によれば、アレイの微細化が可能で、かつスループットの高い核酸アレイの製造方法が提供される。
【００４６】
≪核酸アレイ製造装置≫
１実施形態において、本発明は、上記実施形態の核酸アレイ製造方法を実現するための核酸アレイの製造装置を提供する。本実施形態の核酸アレイの製造装置は、酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相上に、露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する樹脂組成物の層（ＰＡＧ層）を形成する、ＰＡＧ層形成部と、前記ＰＡＧ層の所望の位置を露光する露光部と、前記の露光後のＰＡＧ層を除去する、ＰＡＧ層除去部と、前記のＰＡＧ層を除去した固相を、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させるためのヌクレオチド誘導体反応部と、を含む。
以下に、本実施形態の核酸アレイ製造装置の構成の一例について説明する。
【００４７】
図３は、本実施形態の核酸アレイ製造装置の構成の一例を示したものである。図３に示す装置の例では、核酸アレイ製造装置１００は、ＰＡＧ層形成部１０と、露光部２０と、ＰＡＧ層除去部３０と、ヌクレオチド誘導体反応部４０と、を備える。
【００４８】
ＰＡＧ層形成部１０は、酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相１上にＰＡＧ層２を形成する機構を備える。ＰＡＧ層形成部１０は、例えば、固相１を保持する固相保持部、樹脂組成物を固相１上に塗布する樹脂組成物塗布部、樹脂組成物を固相１上にスピンコートするスピンコート部、スピンコート等により成膜されたＰＡＧ層を乾燥する乾燥部等を備えることができる。樹脂組成物は、スピンコートに限らずディップコーター、スリットダイコーター、スプレーコーターなどで固相上に成膜することもできる。その場合、ＰＡＧ層形成部は、スピンコート部に代えて、ディップコート部、スリットダイコート部、スプレーコート部を備える。また、任意に、固相をプラズマ処理するプラズマ処理部、有機シラン化合物を固相表面に結合（シラン化）させるシラン化部等を備えていてもよい。
【００４９】
露光部２０は、ＰＡＧ層２の所望の位置を露光する機構を備える。露光部２０は、露光のための光源２１を備えることができる。また、ＰＡＧ層の所望の位置を露光するためのフォトマスクや露光パターンを記憶する露光パターン記憶部等を有していてもよい。また、フォトマスクに代えて、レンズやミラーなどの光学系を用いたプロジェクション露光、空間光変調素子、レーザービームなどを用いたマスクレス露光等の手段を備えていてもよい。
【００５０】
ＰＡＧ層除去部３０は、露光後のＰＡＧ層２を除去する機構を備える。ＰＡＧ層２の除去を剥離により行う場合、ＰＡＧ層除去部３０は、ＰＡＧ層の一端を把持して剥離するＰＡＧ層把持剥離部、固相１を保持する固相保持部等を備えることができる。また、ＰＡＧ層把持剥離部に替えて、接着性表面を有する基材を含むＰＡＧ層接着剥離部を備えていてもよい。ＰＡＧ層接着剥離部は、接着性表面を有する基材をＰＡＧ層２の表面に接触させることによりＰＡＧ層２を接着し、固相１からＰＡＧ層２を剥離する。接着性表面を有する基材を円筒状とし、ＰＡＧ層２の表面上に円筒状の接着性表面を転がすことによってＰＡＧ層２を剥離する構成としてもよい。
また、ＰＡＧ層２の除去を溶剤を用いた溶解により行う場合、ＰＡＧ層除去部３０は、溶剤に固相１を浸漬するための浸漬槽、浸漬槽の溶媒を入れ替えるための溶媒添加・排出部等を備えることができる。なお、ＰＡＧ層の溶解は固液界面で進行するため必要量の溶剤と固相１が接触していればよく、必ずしも浸漬する必要はない。そのため、浸漬槽に代えて、例えば、スリットダイコーターやスプレーコーター等で、ＰＡＧ層に溶剤の必要量を塗布する構成としてもよく、スピンコーターで微量の溶剤をＰＡＧ層全体に広げて塗布するなどした後、所定の時間保持する構成としてもよい。このような構成とした場合、浸漬法を行う場合と比較して溶剤のコストを大幅に低減できる。
また、ＰＡＧ層除去部３０は、任意に、ＰＡＧ層除去後の固相１を洗浄する洗浄部を備えていてもよい。ＰＡＧ層２の除去を溶剤を用いた溶解により行う場合には、ＰＡＧ層溶解のための浸漬槽を、洗浄のための洗浄槽に併用することもできる。洗浄槽としては蒸気洗浄槽を備えてもよい。浸漬槽での液体洗浄又は蒸気洗浄槽での蒸気洗浄を単独で行ってもよく、浸漬槽で洗浄後に蒸気洗浄槽を用いた洗浄を施してもよい。
【００５１】
ヌクレオチド誘導体反応部４０は、ＰＡＧ層除去後の固相を、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させる機構を備える。ヌクレオチド誘導体反応部４０は、ヌクレオチド誘導体を反応させるための反応槽、当該反応槽にヌクレオチド誘導体を添加するヌクレオチド誘導体添加部等を備えることができる。また、ヌクレオチド誘導体反応部４０は、乾燥雰囲気、不活性雰囲気などの雰囲気制御を行う雰囲気制御部を備えていてもよい。ヌクレオチド誘導体を固相１に導入後、通常の人工核酸合成法で行う酸化反応・キャッピング反応が可能な反応槽及びこれらの反応に必要な薬液を添加する薬液添加部などを備えることもできる。また、核酸合成をホスホロアミダイト法で行う場合には、ホスホロアミダイト法の各種操作を行うための操作部等を備えていてもよい。
【００５２】
核酸アレイ製造装置１００は、任意に、ヌクレオチド誘導体導入後の固相１を洗浄する洗浄部５０を備える。溶剤を用いた溶解により洗浄行う場合には、ヌクレオチド導入試薬や酸化反応・キャッピング反応で使用した試薬を除去するための浸漬洗浄槽を備えることもできる。洗浄層としては蒸気洗浄槽を備えてもよい。浸漬槽での液体洗浄又は蒸気洗浄槽での蒸気洗浄を単独で行う構成としてもよく、浸漬槽で洗浄後に蒸気洗浄槽を用いた洗浄を施す構成としてもよい。
ＰＡＧ層除去部３０が、ＰＡＧ層除去後の固相１を洗浄する洗浄部を有する場合、当該洗浄部の全部又は一部が洗浄部５０を兼ねていてもよい。
【００５３】
また、核酸アレイ製造装置１００は、固相１を、ＰＡＧ層形成部１０、露光部２０、ＰＡＧ層除去部３０へと移動させる固相移動部６０と、固相移動部６０の移動を制御する固相移動制御部６１を備えていてもよい。これにより、固相１を、ＰＡＧ層形成部１０、露光部２０、ＰＡＧ層除去部３０へと自動で移動させ、効率よく核酸アレイを製造することができる。また、固相移動部６０は、さらにヌクレオチド誘導体反応部４０へと固相１を移動させる構成としてもよい(例えば、図３)。ヌクレオチド誘導体反応部４０での反応終了後は、固相１をＰＡＧ層形成部１０に戻す構成としてもよい。なお、図３の例では、固相移動部６０は、各部を接続するベルト状の構成となっているが、固相移動部６０の構成はこれに限定されず、例えば、アーム等により固相１を移動させる構成としてもよい。
【００５４】
また、核酸アレイ製造装置１００は、ＰＡＧ層形成部１０の上部に露光部２０の光源２１が配置されていてもよい（例えば、図４）。例えば、スピンコーティングによりＰＡＧ層を形成する場合、スピンコーターの回転台の真上に露光部の光源が配置されていてもよい。このような構成により、固相１を移動させることなく、ＰＡＧ層形成工程と露光工程を連続的に行うことができる。この場合、ＰＡＧ層形成部１０の全部又は一部が、露光部２０を兼ねる構成となる。
【００５５】
さらに、核酸アレイ製造装置１００は、ＰＡＧ層形成部１０の全部又は一部が、ＰＡＧ層除去部３０を兼ねていてもよい（例えば、図４）。例えば、ＰＡＧ層把持剥離部やＰＡＧ層接着剥離部をＰＡＧ層形成部１０に設け、露光後のＰＡＧ層２の除去を行うようにすることもできる。また、ＰＡＧ層の除去を溶剤による溶解により行う場合、上述のとおり、必ずしも固相を溶剤に浸漬させる必要はなく、少量の溶剤を塗布することによって行うこともできる。そのため、例えば、ＰＡＧ層形成部１０に配置されたスピンコーター、スリットダイコーター、スプレーコーター等を、ＰＡＧ層に対する溶剤の塗布に用いてもよい。このような構成により、固相を移動させることなく、ＰＡＧ層形成工程、露光工程、ＰＡＧ層除去工程を連続的に行うことができる。
【００５６】
核酸アレイ製造装置１００は、上記各部の他、任意の構成として、上記各部の動作を制御する制御部７０、核酸アレイの各プローブの配列を記憶するアレイ配列記憶部７１等を備えることができる。
【００５７】
上記のような構成を備える核酸アレイ製造装置１００の動作の一例について説明する。
まず、ＰＡＧ層形成部１０において、固相１上にＰＡＧ層２の形成が行われる。また、必要に応じて、ＰＡＧ層２の形成前に、プラズマ処理部及びシラン化部により、固相のプラズマ処理及びシラン化が行われる。例えば、シラン化後、酸分解性保護基を有する分子を固相上の有機シラン化合物に結合させる方法等により、酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相が準備される。当該固相上に、樹脂組成物塗布部により樹脂組成物が塗布され、スピンコート部等により成膜され、乾燥部により乾燥されてＰＡＧ層２が形成される。ＰＡＧ層形成部１０でＰＡＧ層２が形成された後、固相１は、固相移動部６０により、露光部２０に搬送される。
【００５８】
露光部２０では、固相１上に形成されたＰＡＧ層２に対して、パターン露光が行われる。露光は、光源２１から光を照射することにより行われ、例えば、フォトマスク等を用いて、ＰＡＧ層２の所定位置を露光する。露光部２０における露光量は、例えば、１０〜６００ｍＪ／ｃｍ２となるように制御される。ＰＡＧ層２の露光された位置では、ＰＡＧが酸を発生し、ＰＡＧ層２の露光部分の下層に位置する酸分解性保護基が脱保護される。
露光部２０でＰＡＧ層２が露光された後、固相１は、固相移動部６０により、ＰＡＧ層除去部３０に搬送される。
【００５９】
ＰＡＧ層除去部３０では、露光後のＰＡＧ層２が固相１から除去される。ＰＡＧ層２の除去を剥離により行う場合、例えば、固相１を固相保持部により固定し、ＰＡＧ層把持剥離部でＰＡＧ層２の一端を把持して剥離する。あるいは、固相１を固相保持部により固定し、ＰＡＧ層接着剥離部によりＰＡＧ層２を接着剥離する。
また、ＰＡＧ層２の除去を溶剤を用いた溶解により行う場合、例えば、浸漬部において固相１を溶剤に浸漬して、ＰＡＧ層２を溶解する。
ＰＡＧ層２を除去した固相１は、任意に洗浄部により洗浄が行われる。
ＰＡＧ層除去部３０でＰＡＧ層２が除去された後、固相１は、固相移動部６０により、ヌクレオチド誘導体反応部４０に搬送される。
【００６０】
ヌクレオチド誘導体反応部４０では、ＰＡＧ層２が除去された固相１を、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させる。これにより、ヌクレオチド誘導体が固相１上の官能基と結合する。ヌクレオチド誘導体反応部４０では、例えば、反応槽において、固相１がヌクレオチド誘導体と接触させられ、ホスホロアミダイト法の各種操作が行われる。
【００６１】
ヌクレオチド誘導体反応部４０で、ヌクレオチド誘導体が結合された後、固相１は、再びＰＡＧ層形成部１０に搬送され、上記の工程が任意の回数繰り返される。このように、ＰＡＧ層形成、露光、ＰＡＧ層除去、及びヌクレオチド誘導体反応を任意回数繰り返すことにより、所望の配列を有する核酸アレイを製造することができる。
【００６２】
なお、上記の例では、固相移動部６０により固相１を各部に搬送することとしたが、例えば、固相１を一か所に保持して核酸アレイ製造装置１００の各部が固相１の固定位置へ移動し各工程を施してもよい。
【００６３】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６５】
≪実施例１≫
［基板上でのリンカー層の形成、及び酸分解性保護基の導入］
ビーカーに、シランカップリング剤（Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド、Ｇｅｌｅｓｔ社製）を１５０ｍｇ秤量し、９０℃に加温した１５０ｍＬのイオン交換水を加えた。９０℃で５分間撹拌した後、１．５ｍＬの酢酸を添加し、さらに３０分間加熱撹拌してシラン溶液を作成した。
次に、基板となる１５０ｎｍ熱酸化膜付３インチシリコンウエハーを大気圧酸素プラズマ装置（ＹＡＰ５１０；ヤマト科学社製）で４００Ｗ×３回処理し活性化させた後、反応容器に入れ、上記シラン溶液を加えて設定温度９０℃で２０分間加熱した。
加熱後、容器から基板を取り出し、イソプロパノール（ＩＰＡ）に浸漬して、２８ｋＨｚ超音波洗浄を５分間行った後、窒素フローで乾燥した。その後、１２０℃で３分間加熱することにより、シランを基板に定着させてリンカー層を形成させた。
なお、必要に応じて、プラズマ処理前の基板片面にマスキングテープ（Ｎ３８０，日東電工社製）を貼り付け、ＩＰＡ洗浄する前にマスキングテープを剥離することで片面のみにリンカー層を形成した。【００６６】
次に、酸素濃度０．０％、湿度３．３％以下の窒素雰囲気に制御したグローブボックス内にて、以下の作業を行った。
ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）−ｄＴホスホロアミダイト（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）１ｇに、テトラゾールのアセトニトリル溶液（４５０ｍＭ，  Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）を２０ｍＬ、乾燥アセトニトリル（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１０ｍＬ加えた。このようにしてＤＭＴ−ｄＴホスホロアミダイト  ４５ｍＭ溶液を３０ｍＬ調製した。
上記のようにリンカー層を形成した基板を乾燥アセトニトリルに浸漬し、窒素フローで乾燥した。乾燥後、反応容器に入れ、上記ＤＭＴ−ｄＴホスホロアミダイト溶液を加えて２分間揺動した。基板を容器から取り出し、搬送用の別容器に乾燥アセトニトリルを基板と共に入れ、グローブボックスから取り出した。
基板をアセトニトリル１００ｍＬが入った洗浄用容器に浸漬し、２８ｋＨｚ超音波洗浄を５分間行った。別の容器にアセトニトリル１００ｍＬを用意し、同様の洗浄をさらに２回、全３回行った。窒素フローで乾燥後、基板をグローブボックス内で保管した。【００６７】
［樹脂組成物の調製］
ポリウレタン濃度２０質量％のアルコール溶液（ＲｕｓＰａｃｋ、オーデック社製）に、１質量％（ポリウレタンに対し５質量％）となるようＰＡＧ（ＣＰＩ−２１０Ｓ、サンアプロ社製）を添加した。自公転式混練機を用いて撹拌し、さらに２８ｋＨｚ超音波を５分間照射して、ＰＡＧを完溶させた。【００６８】
［ＰＡＧ層の形成］
上記のように調製した基板に対し、上記樹脂組成物をスピン成膜し（１０００ｒｐｍ，３０秒）、ホットプレートを用いて９０℃で１分間加熱し乾燥した。ＰＡＧ層の膜厚は、８μｍとなるようにした。【００６９】
［パターニング及びＰＡＧ層の除去］
３６５ｎｍのＵＶ光でパターン露光を行った。パターン露光は、１００μｍ間隔毎に、露光部分及び未露光部分を交互に設けるようにして行った。露光後、基板から、ＰＡＧ層を剥離して除去した。【００７０】
［パターニングの評価］
飛行時間二次イオン質量分析計（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ
ｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：  ＴｏＦ−ＳＩＭＳ）を用いて基板上の有機化学構造の質量を分析・解析し、質量分布によるマッピング評価を行った。分析に際しては、基板をアセトンに浸漬して洗浄を行った。酸による脱保護部分のＭＳスペクトルを図５及び図６に示した。フラグメントイオンピークに相当するｍ／ｚ５９（図６）、分子イオンピークに相当するｍ／ｚ＝４８７（図５）が検出されており、脱保護構造の帰属が可能であった。
図７には本発明でパターニングした基板におけるフラグメントイオンｍ／ｚ５９でのマッピング評価結果を示した。露光量に応じて脱保護された構造が増えていること、また位置選択的な脱保護が起きていることが分かった。
図８に示すように、露光部分のみ水酸基を生成させることができたことから、本技術はホスホロアミダイト法などの人工ＤＮＡ合成法などを用いることで、光加工を用いたＤＮＡチップの作製を可能とするものと言える。【００７１】
≪実施例２≫
［基板上でのリンカー層の形成、及び酸分解性保護基の導入］
ビーカーに、シランカップリング剤（Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド、Ｇｅｌｅｓｔ社製）を１５０ｍｇ秤量し、９０℃に加温した１５０ｍＬのイオン交換水を加えた。９０℃で５分間撹拌した後、１．５ｍＬの酢酸を添加し、さらに３０分間加熱撹拌してシラン溶液を作成した。
次に、基板となる１５０ｎｍ熱酸化膜付３インチシリコンウエハーを大気圧酸素プラズマ装置（ＹＡＰ５１０；ヤマト科学社製）で４００Ｗ×３回処理し活性化させた後、反応容器に入れ、上記シラン溶液を加えて設定温度９０℃で２０分間加熱した。
加熱後、容器から基板を取り出し、イソプロパノール（ＩＰＡ）に浸漬して、２８ｋＨｚ超音波洗浄を５分間行った後、窒素フローで乾燥した。その後、１２０℃で３分間加熱することにより、シランを基板に定着させてリンカー層を形成させた。
なお、必要に応じて、プラズマ処理前の基板片面にマスキングテープ（Ｎ３８０，日東電工社製）を貼り付け、ＩＰＡ洗浄する前にマスキングテープを剥離することで片面のみにリンカー層を形成した。【００７２】
次に、酸素濃度０．０％、湿度３．３％以下の窒素雰囲気に制御したグローブボックス内にて、以下の作業を行った。
ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）−ｄＴホスホロアミダイト（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）１ｇに、テトラゾールのアセトニトリル溶液（４５０ｍＭ，  Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）を２０ｍＬ、乾燥アセトニトリル（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１０ｍＬ加えた。このようにしてＤＭＴ−ｄＴホスホロアミダイト  ４５ｍＭ溶液を３０ｍＬ調製した。
上記のようにリンカー層を形成した基板を乾燥アセトニトリルに浸漬し、窒素フローで乾燥した。乾燥後、反応容器に入れ、上記ＤＭＴ−ｄＴホスホロアミダイト溶液を加えて２分間揺動した。基板を容器から取り出し、搬送用の別容器に乾燥アセトニトリルを基板と共に入れ、グローブボックスから取り出した。
基板をアセトニトリル１００ｍＬが入った洗浄用容器に浸漬し、２８ｋＨｚ超音波洗浄を５分間行った。別の容器にアセトニトリル１００ｍＬを用意し、同様の洗浄をさらに２回、全３回行った。窒素フローで乾燥後、基板をグローブボックス内で保管した。【００７３】
［樹脂組成物の調製］
ポリウレタン濃度２０質量％のアルコール溶液（ＲｕｓＰａｃｋ、オーデック社製）に、１質量％（ポリウレタンに対し５質量％）となるようＰＡＧ（ＣＰＩ−２１０Ｓ、サンアプロ社製）を添加した。自公転式混練機を用いて撹拌し、さらに２８ｋＨｚ超音波を５分間照射して、ＰＡＧを完溶させた。これをＰＧＭＥで２０倍希釈して自公転式混練機を用いて撹拌した。【００７４】
［ＰＡＧ層の形成］
上記のように調製した基板に対し、上記樹脂組成物をスピン成膜し（１０００ｒｐｍ，３０秒）、ホットプレートを用いて９０℃で１分間加熱し乾燥した。ＰＡＧ層の膜厚は、６０ｎｍとなるようにした。【００７５】
［パターニング及びＰＡＧ層の除去］
３６５ｎｍのＵＶ光でパターン露光を行った。パターン露光は、５μｍ間隔毎に、露光部分及び未露光部分を交互に設けるようにして行った。露光後、基板から、ＰＡＧ層を剥離して除去した。【００７６】
［パターニングの評価］
図９には本発明でパターニングした基板におけるフラグメントイオンｍ／ｚ５９でのマッピング評価結果を示した。露光量に応じて脱保護された構造が増えていること、また位置選択的な脱保護が起きていることが分かった。
図８に示すように、露光部分のみ水酸基を生成させることができたことから、本技術はホスホロアミダイト法などの人工ＤＮＡ合成法などを用いることで、光加工を用いたＤＮＡチップの作製を可能とするものと言える。
【符号の説明】
【００７７】
１      固相
２      ＰＡＧ層
３      ＰＡＧ層の露光部分
４      ヌクレオチド誘導体
１０    ＰＡＧ層形成部
２０    露光部
３０    ＰＡＧ層除去部
４０    ヌクレオチド誘導体反応部
５０    洗浄部
６０    固相移動部
６１    固相移動制御部
７０    制御部
７１    アレイ配列記憶部
１００  核酸アレイ製造装置
【図１】
2018131593.tif 000003
【図２】
2018131593.tif 000004
【図３】
2018131593.tif 000005
【図４】
2018131593.tif 000006
【図５】
2018131593.tif 000007
【図６】
2018131593.tif 000008
【図７】
2018131593.tif 000009
【図８】
2018131593.tif 000010
【図９】
2018131593.tif 000011
【国際調査報告】
2018131593.tif 000012
2018131593.tif 000013
2018131593.tif 000014