【手続補正書】
【提出日】平成31年4月22日(2019.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又は複数の生体細胞を培養するマイクロ流体デバイスであって、
第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、
分離領域及び接続領域を含む少なくとも１つの成長室であって、前記分離領域は前記接続領域に流体接続され、前記接続領域は前記フロー領域への基端開口部を含む、少なくとも１つの成長室と
を含み、
前記分離領域は、当該マイクロ流体デバイスの非掃引領域であり、
前記少なくとも１つの成長室は、そこに共有結合された結合基を含む少なくとも１つの調整された表面を含み、前記結合基は、当該マイクロ流体デバイス内での細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に結合される、
マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記結合基は、シロキシ結合基である、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
前記少なくとも１つの調整された表面は、アルキル又はフルオロアルキル部分を含む、請求項１又は２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
前記アルキル又はフルオロアルキル部分は、１０炭素を超える骨格鎖長を有する、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
前記結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された前記部分にリンカーを介して間接的に結合される、請求項１から４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
前記少なくとも１つの調整された表面は、サッカリド部分、アルキレンエーテル部分、アミノ酸部分、又はそれらの任意の組合わせを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
前記少なくとも１つの調整された表面は、ＲＧＤ含有ペプチドを含む、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
前記調整された表面は、開裂可能部分を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項９】
前記マイクロ流体デバイスは、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を有する基板を更に含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
前記ＤＥＰ構成は、光学的に作動される、請求項９に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの成長室の前記接続領域は、前記フロー領域への基端開口部と前記分離領域への先端開口部を含み、
前記基端開口部での前記接続領域の幅Ｗｃｏｎは、約２０ミクロンから約１００ミクロンであり、
前記基端開口部から前記先端開口部への前記接続領域の長さＬｃｏｎは、前記基端開口部での前記接続領域の幅Ｗｃｏｎの少なくとも１．０倍である、
請求項１から１０のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
前記接続領域の長さＬｃｏｎは、前記基端開口部での前記接続領域の幅Ｗｃｏｎの少なくとも１．５倍である、請求項１１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
前記接続領域の長さＬｃｏｎは、前記基端開口部での前記接続領域の幅Ｗｃｏｎの少なくとも２．０倍である、請求項１１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
前記基端開口部での前記接続領域の幅Ｗｃｏｎは、約２０ミクロンから約６０ミクロンである、請求項１１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１５】
前記接続領域の長さＬｃｏｎは、約２０ミクロンから約５００ミクロンである、請求項１１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１６】
前記基端開口部での前記接続領域のマイクロ流体チャネルの幅は、約５０ミクロンから約５００ミクロンである、請求項１１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１７】
前記基端開口部での前記接続領域のマイクロ流体チャネルの高さは、約２０ミクロンから約１００ミクロンである、請求項１１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１８】
前記分離領域の容積は、２×１０４から２×１０６立方ミクロンである、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１９】
生体細胞を培養するキットであって、
マイクロ流体デバイスを含み、
前記マイクロ流体デバイスは、
第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、
分離領域及び接続領域を含む少なくとも１つの成長室であって、前記分離領域は前記接続領域に流体接続され、前記分離領域は前記マイクロ流体デバイスの非掃引領域であり、前記接続領域は前記フロー領域への基端開口部を含む、少なくとも１つの成長室と、
表面調整試剤、培養培地添加剤、前記マイクロ流体デバイスの調整された表面の開裂可能部分を開裂させるように構成された試剤、及び生体細胞又は生体細胞の集団の状態を検出する試剤の少なくとも一つと、
を含む、キット。
【請求項２０】
前記マイクロ流体デバイスは、請求項１から１８のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスである、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
表面調整試剤を更に含み、
前記表面調整試剤は、アルキレンエーテル部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、ホスホン酸部分、アミノ酸部分、核酸部分、又はサッカリド部分の少なくとも１つを含むポリマーを含む、
請求項１９又は２０に記載のキット。
【請求項２２】
第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、少なくとも１つの成長室とを有するマイクロ流体デバイスにおいて少なくとも１つの生体細胞を培養する方法であって、
前記マイクロ流体デバイスは、分離領域及び接続領域を含み、前記分離領域は前記接続領域に流体接続され、前記分離領域は前記マイクロ流体デバイスの非掃引領域であり、前記接続領域は前記フロー領域への基端開口部を含み、
当該方法は、
前記少なくとも１つの生体細胞を前記少なくとも１つの成長室に導入するステップであって、前記少なくとも１つの成長室は、そこに共有結合された結合基を含む少なくとも１つの調整された表面を含み、前記結合基は、そこでの細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に結合される、ステップと、
少なくとも、生体細胞のコロニーを生成するように前記少なくとも１つの生体細胞を増殖させるのに十分に長い時間にわたり、前記少なくとも１つの生体細胞を培養するステップと、
を含む方法。
【請求項２３】
前記マイクロ流体デバイスは、請求項１から１８のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの成長室の少なくとも１つの表面を調整することを更に含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
調整することは、ポリマーを含む調整試剤、哺乳類血清の１つ又は複数の成分、又は少なくとも１つの細胞接着ブロック分子を用いて前記少なくとも１つの成長室の少なくとも表面を処理することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの生体細胞を前記少なくとも１つの成長室に導入することは、前記少なくとも１つの生体細胞を移動させるのに十分な強度を有する誘電泳動（ＤＥＰ）力を使用することを含む、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＥＰ力は、光学的に作動される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記培養するステップ中に前記第１の流体培地をかん流させることを更に含み、前記第１の流体培地は、前記マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの流入口を介して導入され、且つ前記マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの流出口を介して搬出され、前記第１の流体培地は、搬出されると任意選択的に第２の流体培地からの成分を含む、請求項２２から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記培養するステップ後に、前記調整された表面の１つ又は複数の開裂可能部分を開裂させ、それにより、前記成長室又はその分離領域から前記フロー領域への前記１つ又は複数の生体細胞の搬出を促進するステップを更に含む、請求項２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記成長室又はその前記分離領域から前記フロー領域に前記１つ又は複数の生体細胞を搬出するステップを更に含む、請求項２２から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの生体細胞は、哺乳類細胞である、請求項２２から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの生体細胞は、免疫細胞である、請求項２２から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、又は樹状細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの生体細胞は、接着細胞である、請求項２２から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの生体細胞は、ハイブリドーマ細胞である、請求項２２から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの生体細胞を前記少なくとも１つの成長室に導入することは、単一の細胞を前記成長室に導入することを含み、前記培養するステップによって生成された生体細胞の前記コロニーは、クローンコロニーである、請求項２２から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの生体細胞は植物細胞である、請求項２２から３０のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１５】
幾つかの実施形態では、少なくとも１つの生体細胞は、マイクロ流体デバイスのフロー領域（例えば、フローチャネル）への流入口１２４を通してマイクロ流体デバイスに導入される。フローチャネル内の培地のフローは、細胞を成長室の開口部に近い位置に運ぶことができる。成長室の開口部に近い位置となった後、生体細胞は、次に、誘電泳動又は重力を含め、本明細書に記載される任意の原動力を使用して成長室内に移動し得る。誘電泳動力は、電気的に作動される力又は光学的に作動される力を含むことができ、ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）により更に提供され得る。少なくとも１つの生体細胞は、フローチャネルを通って少なくとも１つの成長室の接続領域の基端開口部に移動し得、接続領域はフローチャネル／領域に直接開口し、フローチャネル／領域に流体接続される。少なくとも１つの成長室の接続領域は、少なくとも１つの成長室の分離領域にも流体接続される。少なくとも１つの生体細胞は、接続領域を通って少なくとも１つの成長室の分離領域内に更に移動し得る。少なくとも１つの成長室の分離領域は、細胞増殖を支持するのに十分な寸法を有し得る。しかし、通常、成長室の寸法は、そのような増殖を培養での約１×１０３個以下、約５×１０２個以下、約４×１０２個以下、約３×１０２個以下、約２×１０２個以下、約１×１０２個以下、約５０個以下、約２５個以下、約１５個以下、又はわずか１０個以下に制限する。幾つかの実施形態では、分離領域は、培養での約１×１０２個以下、約５０個以下、約２５個以下、約１５個以下、又は約１０個以下の細胞への細胞増殖を支持するのに十分な寸法を有し得る。驚くべきことに、約１×１０２個の細胞までの細胞培養及び／又は増殖が、約１．０×１０７立方μｍ以下、約６×１０６立方μｍ以下、約２×１０６立方μｍ以下、約１．５×１０６立方μｍ以下、又は約１．０×１０６立方μｍ以下の容積を有する分離領域で良好に実行され得ることが分かっている。幾つかの他の実施形態では、約１×１０２個の細胞までの細胞培養及び／又は増殖は、約４×１０５立方μｍ以下の容積を有する分離領域で良好に実行され得る。細胞のタイプに応じて、生体細胞のサイズは、直径約１μｍ及び容積約１立方μｍ３を有するバクテリアから、直径約７〜８μｍ及び容積約１００立方μｍを有する赤血球細胞等の小さいヒトの細胞、直径約４０μｍ（非融合性）及び容積約２０００立方μｍを有するＨｅＬａ等の免疫細胞株、直径約２５μｍから最大で約６０μｍ及び容積約４７００立方μｍ〜約１００，０００立方μｍを有する巨核球、又は直径約１２０μｍ及び容積約９００，０００立方μｍを有するヒトの卵母細胞まで大きく異なり得る。したがって、容積約４×１０５立方μｍを有する成長室では、大きい種類（容積約１×１０５立方μｍ）の巨核球細胞はごく少数の増殖、例えば、合計で５個未満までの細胞の増殖を可能にする。代替的に、同じ小さい成長室（容積約４×１０５立方μｍ）で、バクテリア細胞（容積約１立方μｍ）を最高で約４００，０００個のバクテリア細胞まで増殖させることができる。