【手続補正書】
【提出日】令和1年11月7日(2019.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）相対的な３Ｄ空間的関係を有する複数の核酸分子を三次元（３Ｄ）マトリックス内に含む生体試料を提供すること；
（ｂ）前記３Ｄマトリックスの内部に複数のアンプリコンを形成するのに十分な条件下で前記複数の核酸分子を核酸増幅に供すること、ここで、形成された後に、前記複数のアンプリコンは前記３Ｄマトリックスに結合させられ、前記相対的な３Ｄ空間的関係を有する；
（ｃ）前記複数のアンプリコンが前記３Ｄマトリックスに結合している間に前記複数のアンプリコンを核酸配列決定に供すること、ここで核酸配列決定は
（ｉ）前記複数のアンプリコンを検出可能な標識に順次接触させること、及び
（ｉｉ）検出器を使用して、前記検出可能な標識に対応する、前記３Ｄマトリックスからのシグナルを取得すること、
を含み、ここで前記シグナルは前記核酸配列決定の間に複数の平面から前記検出器によって取得される；並びに
（ｄ）（ｃ）で前記複数の平面から前記検出器によって取得された前記シグナルを使用して、前記複数のアンプリコンの３Ｄ立体画像を生成すること、ここで前記３Ｄ立体画像は前記複数のアンプリコンの前記相対的な３Ｄ空間的関係を特定する、
を含む、核酸分析の方法。
【請求項２】
（ｂ）が、前記複数のアンプリコンを前記３Ｄマトリックスに結合することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数のアンプリコンの各々が、形成された後に、前記３Ｄマトリックスに共有結合させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）より前に、（ｉ）前記生体試料中にマトリックス形成材料を導入すること、及び（ｉｉ）前記マトリックス形成材料を使用して前記３Ｄマトリックスを形成すること、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生体試料が細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記３Ｄマトリックスは細胞の中にあり、（ｃ）において前記シグナルは前記細胞の内部から取得される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記シグナルが蛍光シグナルである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生体試料が組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記検出器は、前記複数の平面から前記シグナルを、（ｉ）ホログラムとして、（ｉｉ）前記複数の平面から同時に、又は（ｉｉ）前記複数の平面の各平面から順次取得する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記３Ｄマトリックスがポリマー材料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記３Ｄマトリックスに対する共有結合を形成するために前記複数のアンプリコンの各々が官能化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記シグナルは、前記３Ｄマトリックス内部の複数の平面において同時に取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記シグナルは、前記複数のアンプリコンが前記検出可能な標識と接触している間に取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
（ｄ）は（ｃ）で取得された前記シグナルを使用して前記複数のアンプリコンの配列を決定することをさらに含み、前記複数のアンプリコンの前記３Ｄ立体画像は前記配列を特定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
（ｃ）は
（ｉ）各々がサブ配列を有する複数の検出プローブに、前記複数のアンプリコンを接触させること、
（ｉｉ）前記検出可能な標識を前記サブ配列の少なくともサブセットに順次結合させること、及び
（ｉｉｉ）前記サブ配列の配列を決定することによって前記複数のアンプリコンの少なくともサブセットの配列を決定すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体試料がステージの隣に配置され、前記配列決定の間に前記ステージに対する前記検出器の位置を調整して前記複数の平面から前記シグナルを取得する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数の平面が前記検出器の複数の焦点面である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
相対的な三次元（３Ｄ）空間的関係を有する複数の核酸分子を３Ｄマトリックス内に含む生体試料を保持するように構成された支持体；
前記生体試料からの一つ以上のシグナルを検出するように構成された検出器；及び
前記検出器に作動可能に接続されたコンピューター
を含み、前記コンピューターが
（ａ）前記３Ｄマトリックスの内部に複数のアンプリコンを形成するのに十分な条件下で前記複数の核酸分子を核酸増幅に供する、ここで、形成された後に、前記複数のアンプリコンは前記３Ｄマトリックスに結合させられ、前記相対的な３Ｄ空間的関係を有する；
（ｂ）前記複数のアンプリコンが前記３Ｄマトリックスに結合している間に前記複数のアンプリコンを核酸配列決定に供する、ここで核酸配列決定は
（ｉ）前記複数のアンプリコンを検出可能な標識に順次接触させること、及び
（ｉｉ）前記検出器を使用して、前記検出可能な標識に対応する、前記３Ｄマトリックスからのシグナルを取得すること、
を含み、ここでシグナルは前記核酸配列決定の間に複数の平面から前記検出器によって取得される；並びに
（ｃ）（ｂ）で前記複数の平面から前記検出器によって取得された前記シグナルを使用して、前記複数のアンプリコンの３Ｄ立体画像を生成する、ここで前記３Ｄ立体画像は前記複数のアンプリコンの前記相対的な３Ｄ空間的関係を特定する
ように構成されている、核酸分析用のシステム。
【請求項１９】
前記検出器を含み、前記核酸配列決定の間に前記複数の平面から前記シグナルを取得するために前記ステージに対する前記検出器の位置を調整するように構成された光学アセンブリをさらに含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記光学アセンブリが、前記支持体と光学的連結しているように構成された一つ以上の対物レンズを含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記核酸配列決定の間に前記検出器の焦点面の位置を調整するための軌道とエンコーダフィードバックを備えたモーターとをさらに含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２２】
前記生体試料が前記支持体に対して再現性よく配置されるように一つ以上の動作軸に関して前記支持体の表面をマッピングするように構成されたマッピングユニットをさらに含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２３】
前記マッピングユニットが、前記検出器と前記試料との間の一つ以上の距離測定値を取得するように構成されたオートフォーカスユニットを含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記マッピングユニットが、位置エンコーダーに対する、前記一つ以上の動作軸に沿った一つ以上のずれを計算するように構成されている、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２５】
前記支持体に作動可能に接続されており、前記核酸増幅を容易とするために前記複数の核酸分子を熱サイクリングに供するように構成された、加熱又は冷却ユニットをさらに含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２６】
プログラムされた量の試薬を前記生体試料に送達するように構成された流体ディスペンサーをさらに含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２７】
前記複数の平面が前記検出器の複数の焦点面である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２８】
前記複数の平面から前記シグナルを取得するために前記支持体に対する前記検出器の位置を調整可能である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２９】
前記コンピューターは、（ｂ）において取得された前記シグナルを使用して前記複数のアンプリコンの配列を特定するように構成されており、
前記複数のアンプリコンの前記３Ｄ立体画像は前記配列を特定する、
請求項１８に記載のシステム。
【請求項３０】
前記検出器は、前記複数の平面から前記シグナルを、（ｉ）ホログラムとして、（ｉｉ）前記複数の平面から同時に、又は（ｉｉ）前記複数の平面の各平面から順次取得するように構成されている、請求項１８に記載のシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
各参照文献は全ての目的のために全体が参照により本明細書に援用される。
Drmanac, R., Sparks, A.B., Callow, M.J., Halpern, A.L., Burns, N.L., Kermani, B.G., Carnevali, P., Nazarenko, I., Nilsen, G.B., Yeung, G., et al. (2010). Human genome sequencing using unchained base reads on self-assembling DNA nanoarrays. Science 327, 78-81.
Islam, S., Kjallquist, U., Moliner, A., Zajac, P., Fan, J.B., Lonnerberg, P., and Linnarsson, S. (2011). Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Res 21, 1160-1167.
Larsson, C., Grundberg, I., S[oe]derberg, O., and Nilsson, M. (2010). In situ detection and genotyping of individual mRNA molecules. Nature methods 7, 395-397.
Larsson, C., Koch, J., Nygren, A., Janssen, G., Raap, A.K., Landegren, U., and Nilsson, M. (2004). In situ genotyping individual DNA molecules by target-primed rolling-circle amplification of padlock probes. Nature methods 1, 227-232.
Shendure, J., Porreca, G.J., Reppas, N.B., Lin, X., McCutcheon, J.P., Rosenbaum, A.M., Wang, M.D., Zhang, K., Mitra, R.D., and Church, G.M. (2005). Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome. Science 309, 1728- 1732.
本発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞
三次元重合マトリックス内で複数の核酸を増幅してアンプリコンを作製すること、
前記アンプリコンを前記マトリックスに共有結合すること、
検出可能な標識で前記複数のアンプリコンが標識される光学的配列決定法を用いて、前記複数のアンプリコンを配列決定すること、及び
前記複数のアンプリコンを立体撮像して前記複数のアンプリコンの三次元撮像データを作成すること；ここで、光強度データは三次元立体画像に加工されること
を含む、三次元重合マトリックス内の複数の核酸を分析する方法。
＜２＞
前記複数の核酸が生体試料に含まれており、前記マトリックスを形成する材料が前記生体試料に導入される、＜１＞に記載の方法。
＜３＞
前記複数の核酸が細胞に含まれており、前記マトリックスを形成する材料が前記細胞に導入される、＜１＞に記載の方法。
＜４＞
前記複数の核酸が組織試料に含まれており、前記マトリックスを形成する材料が前記組織試料に導入される、＜１＞に記載の方法。
＜５＞
前記細胞内の前記複数のアンプリコンの相対的位置を前記三次元撮像データによって特定する、＜１＞に記載の方法。
＜６＞
蛍光in situ配列決定法を用いて前記複数のアンプリコンを配列決定する、＜１＞に記載の方法。
＜７＞
前記複数の核酸が、３Ｄ構造化照明法、選択的平面照明顕微鏡法、光シート顕微鏡法、放出光処理法、ピンホール共焦点顕微鏡法を用いる立体撮像、開口相関共焦点顕微鏡法を用いる立体撮像、スライスからの立体復元を用いる立体撮像、デコンボリューション顕微鏡法を用いる立体撮像、収差補正多焦点顕微鏡法を用いる立体撮像、及びデジタルホログラフィック顕微鏡法を用いる立体撮像のうちの１つ以上を用いて立体撮像される、＜１＞に記載の方法。
＜８＞
三次元核酸含有マトリックス用の試料ホルダーを含む、多軸ステージ又は位置決めシステム；
前記ステージに作動可能に接続されており、増幅及び配列決定のための熱サイクリングに有用な時間及び温度をプログラムすることができる、加熱又は冷却装置；
１種類以上の試薬を収容するための１つ以上のリザーバーと流体連結しており、プログラムされた量の液体試薬の前記試料ホルダーへの分注をプログラムすることができる、前記試料ホルダーに１種類以上の試薬を分注するために配置された流体ディスペンサー；
前記流体ディスペンサーに作動可能に接続されており、前記流体ディスペンサーを介して前記１つ以上のリザーバーから１種類以上の試薬を押し出す又は引き抜くポンプ；
１つ以上の光軸を含む光学アセンブリ；
受光できるように前記試料ホルダーに通じて配置されており、前記核酸試料の三次元立体画像へと加工される光強度シグナルを受光する、１つ以上の検出器；並びに
前記試料ホルダーへの試薬の導入、前記試料ホルダーの熱サイクリング、並びに画像の検出及び取得を、自動化し制御するための、ソフトウェアを備えた１つ以上のマイクロプロセッサ
を含む、自動配列決定及び立体撮像デバイス。