(57)【要約】ヒト多能性幹細胞からライディッヒ様細胞への作製方法を提供する。さらには、ヒト多能性幹細胞由来のライディッヒ様細胞を提供する。ヒト多能性幹細胞にNR5A1遺伝子を過剰発現させることで、ライディッヒ様細胞を作製することができる。本発明のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞は、１）ヒト多能性幹細胞にNR5A1遺伝子を導入する工程、及び２）ヒト多能性幹細胞にNR5A1を発現させる工程含む方法で作製することができる。本発明の方法で作製されたヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞はテストステロン産生能を有し、INSL3、17βHSD3及びLHCGRからなるいずれかが発現する。
2018088240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法：
１）ヒト多能性幹細胞にNR5A1遺伝子を導入する工程；
２）ヒト多能性幹細胞にNR5A1を発現させる工程。
【請求項２】
前項２の工程において、ヒト多能性幹細胞にNR5A1を発現させる工程が、胚様体を形成したヒト多能性幹細胞にNR5A1を発現させる工程である、請求項１に記載のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法。
【請求項３】
ヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞が、ヒト多能性幹細胞由来テストステロン産生細胞である、請求項１又は２に記載のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法。
【請求項４】
ヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞が、INSL3、17βHSD3及びLHCGRから選択される少なくとも１種以上のマーカーを発現している細胞である、請求項１又は２に記載のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法。
【請求項５】
前記ヒト多能性幹細胞が胚様体を形成した後にcAMPで処理する工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法。
【請求項６】
cAMPで処理する工程とフォルスコリンで処理する工程を含む、請求項５に記載のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法により作製されたヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法により作製されたヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞を有効成分として含む、LOH症候群の治療剤及び／又は改善剤。
【請求項９】
免疫隔離処理されたヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞を含む、請求項８に記載のLOH症候群の治療剤及び／又は改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法及びヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２０１６−２１９５８０号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
近年、加齢に伴う男性ホルモンの低下に起因し、様々な症状を認める加齢性男性性腺機能低下症候群（LOH症候群）が注目されている。これに対し、テストステロン（testosterone）のホルモン補充療法が行われている。しかしながら、ホルモンの補充療法は生理的な分泌パターンと異なったホルモン値を呈し、作用時間も短いため、反復投与が必要であり、患者の負担が大きい。このような反復投与を必要とせず、通院の時間、手間、注射に伴う痛み等が改善された、生活の質（quality of life： QOL）の向上につながる新たな治療方法の開発が望まれている。【０００４】
視床下部はゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）を産生する。下垂体前葉はGnRHの産生に反応して、黄体形成ホルモン（LH）と卵胞刺激ホルモン（FSH）を産生する。精巣のライディッヒ細胞（Leydig cell）はLHに反応して5〜10mg/日の テストステロンを産生するといわれている。テストステロンはコレステロールから、デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）とアンドロステンジオンといった数種類の中間化合物を経て合成される。【０００５】
自己複製能と多分化能を有する多能性幹細胞を用いた各種細胞への分化誘導法の開発が試みられている。多能性幹細胞のなかでも、胚性幹細胞（embryonic stem cells：ES細胞）及び人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells：iPS細胞）を用いた手法に注目が集まっている。様々な間葉系幹細胞に転写因子であるSF-1（Steroidogenic factor）を安定導入し、培地にcAMPを添加することで精巣や副腎のステロイドホルモン産生細胞に分化させることについて様々な試みがなされている。SF-1は、細胞内転写因子の核内受容体ファミリーのメンバーであり、ステロイドホルモンの代謝酵素をはじめステロイド産生に関連する遺伝子のプロモーター領域にその結合配列が存在しており、これらの転写に重要であることが明らかになっている。さらにSF-1のノックアウトマウスでは副腎・性腺が形成されないことから、SF-1はステロイド産生のみならず副腎や性腺の発生・分化に必須であることも明らかになっている。SF-1は、細胞内転写因子の核内受容体ファミリーのメンバーであり、NR5A1（nuclear receptor subfamily 5, group A, member 1）遺伝子によってコードされる。【０００６】
２種のヒトES細胞（H9株、KhES1株）及び１種のヒトiPS 細胞株（201B7株）について、SF-1を導入し、ステロイドホルモン産生細胞を分化誘導する方法について報告がある。ここでは、各ヒトES細胞やヒトiPS 細胞についてBIOやGSK-3阻害剤を用いて中胚葉系細胞に分化誘導し、フローサイトメトリーを用いて中胚葉系細胞をソーティングし、次にSF-1発現用pCMFlag-hsNR5A1搭載プラスミドを用いて当該中胚葉系細胞にSF-1を導入し、発現させている。さらに8-Bromo-cAMP（8-Br-cAMP）を含む培地中で培養してステロイドホルモン産生細胞に分化させている。しかしながら、プロゲストロンやコルチゾールの産生には言及しているもののテストステロンの産生については報告なく、ライディッヒ細胞の選択的な指標となるマーカー（INSL3, 17βHSD3, LHCGR等）の発現についても示されていない（非特許文献１：Endocrinology, 153(9): 4336-4345 (2012)）。【０００７】
マウス由来の多能性幹細胞（ES細胞）から間葉系幹細胞に分化誘導した後に、コンディショナルにSF-1を発現させてステロイドホルモン産生細胞を分化させる方法が開示されている（特許文献１：特開2011-15630）。しかしながら、テストステロンやコルチゾール等のホルモンの産生についての報告はなく、ライディッヒ細胞の指標となるマーカー発現についても示されていない。【０００８】
マウスES細胞（OriCellStrain C57BL/6 mESCs）にレンチウイルスベクターを用いてマウスSF-1を導入してSF-1+ESC株（ESC-SF-1）を作製し、さらに8-Br-cAMP及びフォルスコリン（forskolin：FSK）を含む培地中で培養して前駆ライディッヒ細胞（PLCs）に分化誘導したことを示す報告がある。ここでは、8-Br-cAMP単独処理に比べて8-Br-cAMP及びフォルスコリンでESC-SF-1を処理する方が、効果的にPLCsに分化誘導したことが示されている。そして、得られたPLCsをライディッヒ様細胞としてラットに移植し、血清中試料等からライディッヒ細胞の指標となるマーカー等を測定したことが報告されている（非特許文献２：STEM CELLS AND DEVELOPMENT, V24; 4, 460-470, 2015）。【０００９】
しかしながら、ヒト多能性幹細胞からテストステロン産生能を有するライディッヒ様細胞を作製したとの報告はまだない。マウス多能性幹細胞及びヒト多能性幹細胞では、例えば転写因子ネットワーク、エピジェネティクス、細胞外因子への反応性等で相違があることが既に報告されており（STEM CELLS 2010; 28: p.419-430、実験医学 2012; 30, No.10: p.1544-1548、医学のあゆみ 2011; 239, No.14: p.1247-1251）、ヒトにおいてもマウスの系と同様にライディッヒ細胞の指標となるマーカーが発現しテストステロンを産生する細胞が得られるかについては全く不明である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Endocrinology, 153(9): 4336-4345 (2012)
【非特許文献２】STEM CELLS AND DEVELOPMENT, 24(4): 460-470 (2015)
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開2011-15630号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法及びヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ヒト多能性幹細胞にNR5A1遺伝子を過剰発現させることで、ライディッヒ様細胞を作製することができる。本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、１）ヒト多能性幹細胞にNR5A1遺伝子を導入する工程、及び２）ヒト多能性幹細胞にNR5A1を発現させる工程含む方法で、テストステロン産生能を有し、INSL3、17βHSD3及びLHCGRからなるいずれかのマーカーを発現しうるライディッヒ様細胞が得られることを見出し、本発明を完成した。【００１４】
即ち、本発明は以下よりなる。
１．以下の工程を含む、ヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法：
１）ヒト多能性幹細胞にNR5A1遺伝子を導入する工程；
２）ヒト多能性幹細胞にNR5A1を発現させる工程。
２．前項２の工程において、ヒト多能性幹細胞にNR5A1を発現させる工程が、胚様体（embryoid body：EB）を形成したヒト多能性幹細胞にNR5A1を発現させる工程である、前項１に記載のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法。
３．ヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞が、ヒト多能性幹細胞由来テストステロン産生細胞である、前項１又は２に記載のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法。
４．ヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞が、INSL3、17βHSD3及びLHCGRから選択される少なくとも１種以上のマーカーを発現している細胞である、前項１又は２に記載のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法。
５．前記ヒト多能性幹細胞がEBを形成した後にcAMPで処理する工程を含む、前項１〜４のいずれかに記載のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法。
６．cAMPで処理する工程とフォルスコリンで処理する工程を含む、前項５に記載のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法。
７．前項１〜６のいずれかに記載の方法により作製されたヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞。
８．前項１〜６のいずれかに記載の方法により作製されたヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞を有効成分として含む、LOH症候群の治療剤及び／又は改善剤。
９．免疫隔離処理されたヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞を含む、前項８に記載のLOH症候群の治療剤及び／又は改善剤。【００１５】
Ａ．前項１〜６のいずれかに記載の方法により作製されたヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞を投与することによる、LOH症候群の治療及び／又は改善方法。
Ｂ．前項Ａのヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞を投与が、ヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の移植である、LOH症候群の治療及び／又は改善方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法によれば、INSL3、17βHSD3及びLHCGRから選択される少なくとも１種以上のマーカーを発現するライディッヒ様細胞を作製することができる。また、INSL3、17βHSD3及びLHCGRから選択される少なくとも１種以上のマーカーを発現する細胞によれば、テストステロンを産生しうる細胞となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明のライディッヒ様細胞の作製方法を示す図である。（実施例１）
【図２】本発明の作製方法で作製したライディッヒ様細胞の培養上清中のテストステロン濃度を確認した結果を示す図である。（実験例１）
【図３】本発明の作製方法で作製したライディッヒ様細胞のテストステロン産生マーカーの発現を確認した結果を示す図である。（実験例１）
【図４】NR5A1遺伝子の発現時期及び8-Br-cAMPの添加時期を変えた各条件でのライディッヒ様細胞の作製プロトコールを示す図である。（実験例２）
【図５】NR5A1遺伝子の発現時期及び8-Br-cAMPの添加時期を変えた各条件で作製したライディッヒ様細胞のテストステロン産生マーカーの発現を確認した結果を示す図である。（実験例２）
【図６】NR5A1遺伝子発現時期及びフォルスコリン添加濃度を変えた各条件でのライディッヒ様細胞の作製プロトコールを示す図である。（実験例３）
【図７】NR5A1遺伝子の発現時期及びフォルスコリン添加濃度を変えた各条件で作製したライディッヒ様細胞のテストステロン産生量を確認した結果を示す図である。（実験例３）
【図８】NR5A1遺伝子発現時期並びに8-Br-cAMP及びフォルスコリン添加の有無による各条件でのライディッヒ様細胞の作製プロトコールを示す図である。（実験例４）
【図９】NR5A1遺伝子発現時期並びに8-Br-cAMP及びフォルスコリン添加の有無による各条件で作製したライディッヒ様細胞のテストステロン産生マーカーの発現を確認した結果を示す図である。（実験例４）
【図１０】NR5A1遺伝子の発現時期及び胚様体（EB）形成時間を変えた各条件でのライディッヒ様細胞の作製プロトコールを示す図である。（実験例５）
【図１１】EB形成時間６日、総培養時間１４日で、各条件で作製したライディッヒ様細胞のテストステロン産生マーカーの発現を確認した結果を示す図である。（実験例５）
【図１２】ライディッヒ様細胞に対する黄体形成ホルモン（LH）添加の効果を検討する実験方法を示す図である。（実験例６）
【図１３】黄体形成ホルモン（LH）を添加したライディッヒ様細胞におけるテストステロン産生量を確認した結果を示す図である。（実験例６）
【図１４】8-Br-cAMPの添加濃度を換え、8-Br-cAMPとフォルスコリンの添加時期を変えたときのライディッヒ様細胞の作製プロトコールを示す図である。（実験例７）
【図１５】作製したライディッヒ様細胞のテストステロン産生量を確認した結果を示す図である。（実験例７）
【図１６】EB形成後細胞を単一（single cell）化したときのライディッヒ様細胞の作製プロトコールを示す図である。（実験例８）
【図１７】作製したライディッヒ様細胞のテストステロン産生量を確認した結果を示す図である。（実験例８）
【図１８】作製したライディッヒ様細胞をモデル動物に移植したときのテストステロン値の改善効果を確認した結果を示す図である。（実験例８）
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明はヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法及びヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞に関する。本発明のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞は、以下の１）及び２）工程を含むことで作製することができる。
１）ヒト多能性幹細胞にNR5A1遺伝子を導入する工程；
２）ヒト多能性幹細胞にNR5A1を発現させる工程。
【００１９】
本明細書において、「ライディッヒ様細胞」とは、多能性幹細胞を分化誘導処理して得られる細胞をいい、天然に存在する「ライディッヒ細胞」とは区別して用いられる。本発明の「ヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞」は、ヒト多能性幹細胞を分化誘導処理して得られる細胞であって、テストステロン産生能を有する細胞、及び／又はINSL3、17βHSD3及びLHCGRから選択される少なくとも１種以上のマーカーを発現している細胞をいう。そして、特にテストステロンの産生能が認められる細胞を、本明細書において「テストステロン産生細胞」ともいう。
【００２０】
１）ヒト多能性幹細胞にNR5A1遺伝子を導入する工程
本明細書において「多能性幹細胞」とは、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞であればよい。例えば、ES細胞（Embryonic Stem Cell）、人工多能性幹細胞（iPS細胞：Induced Pluripotent Stem Cells）等が挙げられる。本発明の方法では、ヒト多能性幹細胞を使用する。ヒトiPS細胞はヒトES細胞と性質が酷似するが、マウスES細胞とは、例えば転写因子ネットワーク、エピジェネティクス、細胞外因子への反応性等で相違点が見出されていることが報告されている（STEM CELLS 2010; 28: p.419-430、実験医学 2012; 30, No.10: p.1544-1548、医学のあゆみ 2011; 239, No.14: p.1247-1251）。これにより、本明細書において、ヒト多能性幹細胞とヒト以外の動物多能性幹細胞とは区別して考えられる。
【００２１】
本明細書においてES細胞とは、一般的には胚盤胞期胚の内部にある内部細胞塊（inner cell mass）と呼ばれる細胞集塊をin vitroでの培養に移し、未分化幹細胞集団として単離した多能性幹細胞である。ヒトES細胞について、既に多くの株が樹立されており、ES Cell International社、Wisconsin Alumni Research Foundation、National Stem Cell Bank (NSCB)等から入手することが可能である。ES細胞は、一般に初期胚を培養することにより樹立されるが、体細胞の核を核移植した初期胚からもES細胞を作製することもできる。本発明で使用されるES細胞は、自体公知の方法により作製されたES細胞、又は今後開発される新たな方法で作製されるES細胞であってもよい。
【００２２】
本明細書においてiPS細胞とは、体細胞へ数種類の遺伝子を導入することにより、卵子、胚やES細胞を利用せずに分化細胞の初期化を誘導し、ES細胞と同様な多能性や増殖能を有する誘導多能性幹細胞をいう。本発明で使用されるiPS細胞は、自体公知の方法により作製されたiPS細胞、又は今後開発される新たな方法により作製されるiPS細胞であってもよい。具体的には、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製されるES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されていてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子は、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3又はGlis1等が例示される。これらの初期化因子は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。初期化因子の組み合わせについては、既に多くの報告がなされており、自体公知の組み合わせ、又は今後開発される新たな組み合わせを適用することができる。
【００２３】
ES細胞又はiPS細胞等の多能性幹細胞の培養方法や培養に用いられる培地は特に限定されず、自体公知又は今後開発される培地や技術によることができる。必要に応じて、例えば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等のフィーダー細胞上で培養することができる。フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067又はWO2010/137746）、あるいは細胞外基質（例えば、Laminin（WO2009/123349）及びマトリゲル（BD社））等を用いてもよい。
【００２４】
ES細胞又はiPS細胞等の未分化性及び多能性を維持可能な培地や分化誘導に適した培地として、例えばDMEM及び／又はDMEM/F12などの市販のほ乳類細胞用基礎培地に、血清又は血清置換液（KnockOutTM Serum Replacement：KSR、ThermoFisher, SCIENTIFIC）、並びにbFGFなどを加えたもの、市販の霊長類ES細胞用培地、霊長類ES細胞増殖用基礎培地hESF-GRO、霊長類ES細胞分化誘導用基礎培地hESF-DIF、霊長類ES細胞増殖培地CSTI-7等を用いることができる。また、培地には、ES細胞又はiPS細胞等の多能性幹細胞の培養に適する自体公知の添加物、例えば、N2サプリメント、B27サプリメント、インシュリン、bFGF、アクチビンA、ヘパリン、ROCK（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）インヒビターやGSK-3インヒビターなどの各種インヒビター等から選択される１種又は複数種の添加物を適当な濃度で添加することができる。この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）等を利用することもできる。培地及びその添加物は、使用する細胞、分化状態等により適宜選択し、使用することができる。具体的には、例えば細胞の維持培養にはStemFitR（リプロセル）を使用することができる。培養方法の例としては、例えば37℃、5％CO2存在下にて、培地中で約１〜２０日間培養することができる。
【００２５】
本明細書においてNR5A1遺伝子は、例えばGenBank Accession No.NM_004959（配列番号１）で特定することができる。
【００２６】
ヒト多能性幹細胞にNR5A1遺伝子を導入する方法及びヒト多能性幹細胞にNR5A1を発現させる方法は、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。NR5A1のcDNAは、自体公知の方法により宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入することができる。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例えばpA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neoなど）を使用することができる。
【００２７】
発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、自体公知又は今後開発されるあらゆるプロモーター例えばEF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
【００２８】
発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点などを含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２９】
NR5A1のcDNAは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターとして、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター等を用い、該cDNAを含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat-E細胞）や相補細胞株（例、293細胞）等に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターをヒト多能性幹細胞に感染させ、NR5A1遺伝子を導入することができる。一方、非ウイルスベクターであるプラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターをヒト多能性幹細胞に導入することができる。ベクターとしてプラスミドを用いる具体的手段は、例えばScience, 322, 949-953 (2008) 等に記載されている方法を適用することができる。
【００３０】
２）ヒト多能性幹細胞にNR5A1を発現させる工程。
本発明は、上記NR5A1遺伝子を導入したヒト多能性幹細胞について、導入遺伝子を発現させる工程を含む。遺伝子は、自体公知又は今後開発されるあらゆる遺伝子発現システムを用いて遺伝子を発現させることができる。遺伝子発現のタイミングは、自体公知の方法又は今後開発される、遺伝子発現のあらゆる制御する方法を利用することができる。例えば、Tet-On/OffTMAdvanced発現誘導システム（Clontech）により遺伝子の発現を制御することができる。周知の方法に従ってクローニングしたNR5A1遺伝子を、GatewayTMシステム（ThermoFisher, SCIENTIFIC）を用いてpiggyBacベクター（System Biosciences）であるエントリーベクターに導入しPB-TAC-ERN-NR5A1を作製することができる。このneo耐性遺伝子を含む発現ベクター（PB-TAC-ERN-NR5A1）をFuGENE HD（Promega）を用いてヒト多能性幹細胞に導入し、形質転換細胞のセレクション用試薬、例えばG418を含む培地中で選別し強制発現系を作製する。培養培地にドキシサイクリン（Doxycycline：Dox）を添加することで、蛍光タンパク質であるmCherryが発現し、NR5A1遺伝子の安定的発現を確認することができる。
【００３１】
本発明の方法において、NR5A1遺伝子をヒト多能性幹細胞に導入した後、EBを形成させ、ヒト中胚葉細胞（mesoderm）に分化誘導する工程を含むことができる。EB形成時においてNR5A1遺伝子は発現していてもよい。その後のヒト多能性幹細胞からヒト中胚葉細胞への分化誘導は、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。具体的には、ゲラチン及び／又はコラーゲンコートしたシャーレでヒト多能性幹細胞を培養することでヒト中胚葉細胞へ分化誘導させることができる。ヒト中胚葉細胞への分化誘導方法は、例えば、特許5896360号に記載の中間中胚葉への分化誘導方法を適用することもできる。EB形成は、ヒト多能性幹細胞の培養開始後６〜１０日、好ましくは６〜８日、より好ましくは６日である。
【００３２】
本発明の方法において、NR5A1遺伝子を発現したヒト多能性幹細胞に、さらにcAMPで刺激し、処理する工程を含むことができる。cAMPとして、8-Br-cAMPを使用する場合は、0.01〜4mM、好ましくは0.1〜1mMで培地に添加することができる。さらにフォルスコリンで刺激するのが好ましい。フォルスコリンは0.1〜100μM、好ましくは2〜100μMであり、より好ましくは5〜100μMで培地に添加することができる。cAMP及びフォルスコリンは、NR5A1遺伝子を発現したヒト多能性幹細胞の培養当初から添加してもよいし、EB形成後に添加してもよいが、特に好適にはEB形成後である。
【００３３】
本発明のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法において、１）ヒト多能性幹細胞にNR5A1遺伝子を導入する工程と、２）ヒト多能性幹細胞にNR5A1を発現させる工程は、同一の細胞培養容器内で行なってもよいし、異なる容器内で行ってもよいが、好適には同一容器内で行うことができる。さらに、cAMPやフォルスコリンを用いて細胞を刺激する場合についても、遺伝子を発現させたときと同一の細胞培養容器内で行なってもよいし、異なる容器内で行ってもよいが、好適には異なる培養容器を用いて処理することができる。cAMPやフォルスコリンを用いて細胞を刺激する場合は、細胞を分離して単一細胞化（single cell化）処理するのが好適である。単一細胞化処理には、例えばAccutase等の細胞分離酵素を用いて処理するのが好適である。さらには、Y27632等のROCKインヒビターを用いて処理するのが好適である。EB形成後にそのまま細胞を培養プレートに播種するより、単一細胞化した後に播種するとライディッヒ様細胞に分化誘導後のテストステロン産生量は増加する。
【００３４】
本発明は、本発明の方法によって作製されたライディッヒ様細胞にも及ぶ。さらに本発明は、本発明の方法で作製したヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞を有効成分として含む、LOH症候群の治療剤及び／又は改善剤にも及ぶ。LOH症候群の治療剤及び／又は改善剤には、作製されたライディッヒ様細胞の他、薬学的に許容される担体を含むことができる。担体としては、例えば当該ライディッヒ様細胞作製のために細胞を培養したときの培養液等が挙げられる。また、ヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞を免疫隔離処理していてもよい。LOH症候群の治療としての有効成分としてのヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞は器官の形成の必要は無く、血中テストステロン値の改善が目的である。免疫隔離処理は、水、栄養分やホルモンは通過するが、免疫細胞や移植細胞が通過しないのが好適である。免疫隔離処理は、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。例えばアルギン酸ゲルやアガロース等のビーズに細胞を包埋することができる。かかる免疫隔離処理により、細胞移植に伴う免疫拒絶反応や細胞の拡散、浸潤等の問題を回避することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明の理解を深めるために実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。【００３６】
（実施例１）ライディッヒ様細胞の作製方法
本実施例では、ライディッヒ様細胞の作製方法を説明する。本発明のライディッヒ細胞は、（Ａ）ヒト多能性幹細胞にNR5A1遺伝子を導入する工程と、（Ｂ）ヒト多能性幹細胞にNR5A1を発現させる工程を含む方法により作製される。本実施例におけるライディッヒ様細胞の作製方法は以下である（図１参照）。【００３７】
１．使用細胞
本実施例では、iPS細胞（FFPB3AB4）を用いて分化誘導処理を行った。【００３８】
２．NR5A1遺伝子
GenBank Accession NM_004959（配列番号１）で特定されるNR5A1遺伝子の発現確認用のプライマーセット（配列番号２、３）を用いてPCR法にて核酸を増幅し、精巣mRNAでの発現を確認した。次に発現が確認されたmRNAについてクローニング用のプライマーセット（配列番号４、５）を用いてPCR法にて増幅し、配列番号１で特定されるNR5A1遺伝子全長（cDNA）をクローニングした。
・NR5A1遺伝子発現確認用プライマーセット
NR5A1 F ：AGG AGT ACC TGT ACC ACA AGC  （配列番号２）
NR5A1 R ：TGC AGC ATT TCG ATG AGC AG   （配列番号３）
・mRNAについてクローニング用のプライマーセット
NR5A1 cloning F ：CAC CAT GGA CTA TTC GTA CGA GGA CCT GGA C  （配列番号４）
NR5A1 cloning R ：TCA AGT CTG CTT GGC TTG CAG CAT TTC G   （配列番号５）【００３９】
３．NR5A1遺伝子発現プラスミドの作製
上記クローニングしたNR5A1 cDNAをTOPOTM反応にてプラスミド（TOP10）へ導入し、エントリークローンpENTR-NR5A1を作製した。pENTR-NR5A1の塩基配列を確認し、NR5A1のクローニングを確認した。Tanaka.A. et al., PLoS One. 2013; 8(4)に記載の手法にしたがって、GatewayTMシステム（ThermoFisher, SCIENTIFIC）を用いてpENTR-NR5A1をエントリーベクターであるPiggyBacTMベクターに導入し、PB-TAC-ERN-NR5A1を作製した。Tet-onTMシステム（タカラバイオ）により、ドキシサイクリン（Doxycycline：Dox）依存的にNR5A1を強制発現できるようなPB-TAC-ERN-NR5A1を作製した（図１参照）。【００４０】
４．NR5A1遺伝子の導入（Ａ）及び発現（Ｂ）
（Ａ）neo耐性遺伝子を含むPB-TAC-ERN-NR5A1をヒトiPS細胞（FFPB3AB4）にトランスフェクション試薬（FuGENE(R) HD、プロメガ社）を用いて導入し、G418（ジェネティシン）を用いて形質導入された細胞（PB-TAC-ERN-NR5A1-3AB4）を選択した。
（Ｂ）ドキシサイクリンを添加してTet-onTMシステムでNR5A1を強制発現させた。【００４１】
５．ライディッヒ様細胞への分化誘導
Tet-onTMシステムでNR5A1遺伝子を強制発現させたヒトiPS細胞（PB-TAC-ERN-NR5A1-3AB4）を、3×104個／ウェルとなるように96ウェル培養プレートに播種し、分化誘導培地を用いて６日間培養し、PB-TAC-ERN-NR5A1-3AB4から胚様体（EB）を形成させた。EBを形成したPB-TAC-ERN-NR5A1-3AB4をゲラチンコートした24ウェルプレート上で８日間培養し、ライディッヒ様細胞へ分化誘導処理した。以下の各実験例において、8-Br-cAMP及びフォルスコリンの添加濃度、添加時期を確認した。また、ドキシサイクリンの添加（Tet-on：Dox添加）、非添加（Tet-off：Dox非添加）によりNR5A1遺伝子の強制発現を調節し、各種検討を行った。【００４２】
６．細胞の培養方法
本発明で使用するiPS細胞（FFPB3AB4）は継代後１日間のみ10μMのROCKインヒビター（Y27632）を含むStemFitR（リプロセル）を用いて培養した。分化誘導培地として、15％KSR（ThermoFisher, SCIENTIFIC）を含むDMEM培地（Invitrogen）を用い、その後も同培地にて維持培養した。【００４３】
以下の各実験例で、PB-TAC-ERN-NR5A1-3AB4の分化誘導処理条件について各種検討を行い、作製されたライディッヒ様細胞の性状を確認した。【００４４】
（実験例１）ライディッヒ様細胞のテストステロン産生量及び細胞内マーカーの確認
本実験例では、実施例１で作製方法に従い遺伝子導入して作製したPB-TAC-ERN-NR5A1-3AB4について、Tet-onTMシステムでNR5A1遺伝子を強制発現させ（Tet-on：Dox添加）、15％KBS及び10μMのY27632含有DMEM培地で６日間培養し、EBを形成させた。当該EBを形成したPB-TAC-ERN-NR5A1-3AB4をゲラチンコートした24ウェルプレート上に播種し、1mMの8-Br-cAMP、10μMのY27632及び100μMのフォルスコリンを含む10％FBS含有DMEM培地でさらに８日間培養し、計１４日間培養した。培養して得られたライディッヒ様細胞について、培養上清中のテストステロン濃度及び細胞内マーカーの発現を確認した。テストステロン濃度は、ラジオイムノアッセイ（RIA）により確認した。細胞内マーカーは、作製された細胞の全RNAを得、PCR反応にてCYP11A1、HSD3β2、CYP17A1、17βHSD3、INSL3、LHCGRの発現を確認した。【００４５】
その結果、培養上清中にテストステロンの産生を認め（図２）、CYP11A1、HSD3β2、CYP17A1、17βHSD3、INSL3、LHCGRのいずれについても発現が認められた（図３）。【００４６】
（実験例２）NR5A1遺伝子発現時期及び8-Br-cAMPの添加時期の検討
本実験例では、ライディッヒ様細胞作製の工程における、NR5A1遺伝子の発現時期及び8-Br-cAMPの添加時期を検討した。PB-TAC-ERN-NR5A1-3AB4について、図４に示すプロトコールに従ってTet-onTMシステムでNR5A1遺伝子を強制発現させた系（Tet-on：Dox添加）及び強制発現していない系（Tet-off：Dox非添加）を作製し、各々について培養開始時期又は培養６日目に1mMの8-Br-cAMPを添加して、実験例１と同様に１４日間培養し、ライディッヒ様細胞を作製した。本実験例ではフォルスコリンは添加していない。【００４７】
各条件で作製されたライディッヒ様細胞について実験例１と同手法により細胞内マーカーの発現を確認した。その結果、培養開始時よりNR5A1遺伝子を強制発現させ、培養６日目に8-Br-cAMPを添加した系で、CYP11B1及び17βHSD3の発現が確認された（図５）。【００４８】
（実験例３）NR5A1遺伝子発現時期及びフォルスコリン添加濃度の検討
本実験例では、ライディッヒ様細胞作製の工程における、NR5A1遺伝子の発現時期及びフォルスコリン添加濃度を検討した。PB-TAC-ERN-NR5A1-3AB4について、図６に示すプロトコールに従ってTet-onTMシステムでNR5A1遺伝子を強制発現させた系（Tet-on：Dox添加）及び強制発現していない系（Tet-off：Dox非添加）を作製し、各々について培養６日目に1mMの8-Br-cAMP及び各濃度のフォルスコリンを添加して、実験例１と同様に１４日間培養し、ライディッヒ様細胞を作製した。【００４９】
各条件で作製されたライディッヒ様細胞について実験例１と同手法によりテストステロン濃度を確認した。その結果、NR5A1遺伝子を強制発現していない系（Tet-off）、及び8-Br-cAMPを添加していない系ではテストステロンを産生しないことが確認された。フォルスコリン添加では、100μMまで濃度依存性にテストステロン産生量が増加した（図７）。【００５０】
（実験例４）NR5A1遺伝子発現時期並びに8-Br-cAMP及びフォルスコリン添加の検討
本実験例では、ライディッヒ様細胞作製の工程における、NR5A1遺伝子の発現時期8-Br-cAMP、フォルスコリン添加の有無による細胞内マーカー発現を確認した。PB-TAC-ERN-NR5A1-3AB4について、図８に示すプロトコールに従って、培養６日目に1mMの8-Br-cAMP及び100μMのフォルスコリンを各々含む系及び含まない系を作製し、実験例１と同様に１４日間培養し、ライディッヒ様細胞を作製した。【００５１】
各条件で作製されたライディッヒ様細胞について実験例１と同手法によりPCR反応にて細胞内マーカーを確認した（図９）。17βHSD3、INSL3、LHCGR の発現は、8-Br-cAMP及びフォルスコリンを添加したTet-onの系で強かった。【００５２】
（実験例５）NR5A1遺伝子発現時期及びEB形成期間の検討
本実験例では、ライディッヒ様細胞作製の工程における、NR5A1遺伝子の発現時期及びEB形成期間について検討した。PB-TAC-ERN-NR5A1-3AB4について、図１０に示すプロトコールに従ってTet-onTMシステムでNR5A1遺伝子を強制発現させた系又は強制発現していない系を作製し、培養６日目又は１０日目に100μMのフォルスコリン及び1mMの8-Br-cAMPを各々添加し、実験例１と同手法により１４日又は１８日間培養し、ライディッヒ様細胞を作製した。【００５３】
各条件で作製されたライディッヒ様細胞について、実験例１と同手法によりPCR反応にて細胞内マーカーを確認した。その結果、NR5A1遺伝子を強制発現し、フォルスコリン及び8-Br-cAMPを添加した系でCYP21A2、CYP11B1、CYP11B2、INSL3及び17βHSD3の発現が確認された（図１１）。【００５４】
（実験例６）黄体形成ホルモン（LH）の添加検討
本実験例では、作製したライディッヒ様細胞にテストステロンの上位ホルモンである黄体形成ホルモン（LH）添加し、テストステロンの産生量を確認した。PB-TAC-ERN-NR5A1-3AB4について、図１２に示すプロトコールに従って、Tet-onTMシステムでNR5A1遺伝子を強制発現させた系（Tet-on：Dox添加）及び強制発現していない系（Tet-off：Dox非添加）で１４日間培養して、ライディッヒ様細胞を作製した。その後各々についてLHとして市販のhGC（ゴナトロピン）を2IU/ml含む培地で培養を継続し、ライディッヒ様細胞のテストステロン産生量を確認した。【００５５】
テストステロン産生量は、ラジオイムノアッセイ（RIA）により確認した。その結果、Tet-onでhGCを含む培地で培養した系で、経時的にテストステロンの産生量が増加したことが確認された（図１３）。【００５６】
（実験例７）8-Br-cAMP及びフォルスコリンの添加時期の検討
本実験例では、ライディッヒ様細胞作製の工程における、8-Br-cAMP及びフォルスコリンの添加濃度及び添加時期を検討した。PB-TAC-ERN-NR5A1-3AB4について、Tet-onTMシステムでNR5A1遺伝子を強制発現させた系を作製し、図１４に示すプロトコールに従って8-Br-cAMP及びフォルスコリンを培養開始日又は培養６日目（EB形成後）に各々添加した。8-Br-cAMPは、0、0.3、1又は3mM、フォルスコリンは100μM添加した。１４日間又は２０日間培養し、ライディッヒ様細胞を作製した。【００５７】
各条件で作製されたライディッヒ様細胞について実験例４と同手法によりテストステロンの産生量を確認した。その結果、8-Br-cAMPの至適濃度は、0.3mM及び1mMであり、培養６日目後に8-Br-cAMP及びフォルスコリンを添加したほうがテストステロンの産生量が高かった。また、8-Br-cAMPの添加濃度が0.3mM及び1mMの場合、培養２０日目でテストステロンの産生量が増加した（図１５）。【００５８】
（実験例８）細胞の播種方法の検討
本実験例では、ライディッヒ様細胞作製の工程におけるEB形成後、細胞を分離して単一細胞化（single cell化）による影響を確認した。PB-TAC-ERN-NR5A1-3AB4について、Tet-onTMシステムでNR5A1遺伝子を強制発現させた系（Tet-on：Dox添加）又は強制発現していない系（Tet-off：Dox非添加）を作製し、図１６に示すプロトコールに従って培養６日目（EB形成後）に細胞分離酵素（Accutase）を含む系、Accutaseと10μMのROCKインヒビター（Y27632）を含む系、及びAccutaseもY27632も含まない系で細胞を培養し、ライディッヒ様細胞を作製した。【００５９】
各条件で作製されたライディッヒ様細胞について実験例４と同手法によりテストステロンの産生能を確認した。その結果、AccutaseとY27632を含む系で単一細胞（single cell）化して培養した場合に、培養１４日目でテストステロンの産生認められ、２０日目でテストステロンの産生量がさらに増加した（図１７）。即ち、EB形成後にそのまま細胞を培養プレートに播種するより、単一細胞化した後に播種するとライディッヒ様細胞に分化誘導後のテストステロン産生量は増加する。【００６０】
（実施例２）ライディッヒ様細胞の作製及び移植によるテストステロン値の改善効果
本実施例では、作製したヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞をモデル動物に移植することで、血清テストステロン値が改善するかについて検討した。【００６１】
１．ヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製
実施例１の１〜６に示す方法と同手法によりiPS細胞（FFPB3AB4）を用いて分化誘導処理を行い、ライディッヒ様細胞を作製した。移植用に、ヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞を免疫隔離処理（アルギン酸ビーズに包埋）した。【００６２】
２．ライディッヒ様細胞移植実験
モデル動物としてSDラット（８週齢、雄）を用い、去勢のみ、去勢＋細胞移植、及び去勢を行わなかった各ラット（各n=1）について、去勢前、去勢後移植前、細胞移植後２０日目での血清テストステロン値を測定した。ラットの両側精巣を摘出し、去勢した。去勢後７日目に、免疫隔離処理したヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞塊４８個をラット体内に移植した。ラット血清におけるテストステロン値はラジオイムノアッセイ（RIA）法により測定した。【００６３】
３．ライディッヒ様細胞移植実験結果
上記の結果、モデル動物の去勢後移植前ではテストステロン値は0.03ng/ml未満であったが、細胞移植後２０日目ではテストステロン値の改善が認められた（図１８）。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
以上詳述したように、ヒト多能性幹細胞にNR5A1遺伝子を過剰発現させることで、ライディッヒ様細胞を作製することができる。本発明のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞は、１）ヒト多能性幹細胞にNR5A1遺伝子を導入する工程、及び２）ヒト多能性幹細胞にNR5A1を発現させる工程含む方法で作製することができる。本発明の方法で作製されたヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞はテストステロン産生能を有し、INSL3、17βHSD3及びLHCGRからなるいずれかが発現する。本発明の方法で作製したライディッヒ様細胞は、LOH症候群の患者に対して有効な治療剤として利用できると考えられる。特に、LOH症候群の治療使用するヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞は、器官の形成の必要がないので、免疫隔離処理した細胞を移植することで水分、栄養分やホルモンは通過するが、免疫細胞や移植細胞が通過しないので、細胞移植に伴う拒絶反応や細胞の拡散・浸潤を防ぐことができ有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月16日(2018.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法：
１）ヒト多能性幹細胞にＮＲ５Ａ１遺伝子を導入する工程：
２）ヒト多能性幹細胞にＮＲ５Ａ１を発現させる工程。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
ヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞が、ヒト多能性幹細胞由来テストステロン産生細胞である、請求項１に記載のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法。
【請求項４】
ヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞が、ＩＮＳＬ３、１７βＨＳＤ３及びＬＨＣＧＲから選択される少なくとも１種以上のマーカーを発現している細胞である、請求項１に記載のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法。
【請求項５】
前記ヒト多能性幹細胞が胚様体を形成した後にｃＡＭＰで処理する工程を含む、請求項１、３〜４のいずれかに記載のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法。
【請求項６】
ｃＡＭＰで処理する工程とフォルスコリンで処理する工程を含む、請求項５に記載のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法。
【請求項７】
請求項１、３〜６のいずれかに記載の方法により作製されたヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞。
【請求項８】
請求項１、３〜６のいずれかに記載の方法により作製されたヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞を有効成分として含む、ＬＯＨ症候群の治療剤及び／又は改善剤。
【請求項９】
免疫隔離処理されたヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞を含む、請求項８に記載のＬＯＨ症候群の治療剤及び／又は改善剤。
【請求項１０】
ヒト多能性幹細胞が胚葉体を形成した後、ｃ−ＡＭＰで処理する工程の前に、単一細胞化処理する工程を含む、請求項５又は６に記載のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法。
【請求項１１】
ＩＮＳＬ３、１７βＨＳＤ３及びＬＨＣＧＲから選択される少なくとも１種以上のマーカーが、ＩＮＳＬ３と、さらに１７βＨＳＤ３及びＬＨＣＧＲから選択される少なくとも１種以上のマーカーである、請求項４に記載のヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞の作製方法。
【請求項１２】
ＩＮＳＬ３を発現し、さらに１７βＨＳＤ３及びＬＨＣＧＲから選択される少なくとも１種以上のマーカーを発現していることを特徴とする、ヒト多能性幹細胞由来ライディッヒ様細胞。
【国際調査報告】
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