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　特願２００３−５４５６９１「化学的に修飾されたヒト成長ホルモンコンジュゲート」拒絶査定不服審判事件〔平成１５年　５月３０日国際公開、ＷＯ０３／４４０５６、平成１７年　８月２５日国内公表、特表２００５−５２５３０２〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１．手続の経緯 ・本願発明
　本願は、２００２年１１月２０日（パリ条約による優先権主張外国庁受理２００１年１１月２０日、米国）を国際出願日とする出願であって、平成１９年５月１５日付手続補正書により補正された明細書の記載からみて、その請求項１に係る発明は、以下のとおりのものである。
「一つのポリ（エチレングリコール）分子が、生物学的に活性なヒト成長ホルモンポリペプチドのアミノ末端α−アミノ基に選択的に共有結合したものを含むコンジュゲートであって、ポリ（エチレングリコール）分子が式：ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨＯのアルデヒドからなる官能基を有し、ポリ（エチレングリコール）が２０ｋＤａ又は３０ｋＤａの分子量を有する、前記コンジュゲート。」（以下、「本願発明」という。）
第２．当審の拒絶の理由の概要
　一方、当審が平成１８年１１月１４日付けで通知した拒絶理由において、平成１８年７月１４日付手続補正を同日付で補正却下するとともに、平成１８年１月４日付手続補正書により補正された請求項１〜１４に係る発明について、該請求項に係る発明は、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない旨通知した。
第３．引用例 
（ａ）当審の拒絶理由で引用例２として引用された本願優先日前の２００１年１０月１８日に頒布された刊行物である国際公開第０１／７６６３９号パンフレットには、
(ａ１)「本発明は、ミエロポエチン（MPOs）の化学的修飾に関するものであって、MPOは、組換えタンパク質のファミリーであって、ヒトインターロイキン−３（IL-3）及びタンパク質の造血成長因子受容体の多機能性アゴニストであって、G-CSFを含むがそれに限定されないものである。ＰＥＧ化MPOsは低下したクリアランス速度、改善された安定性、低下した抗原性またはそれらの組み合わせを有するであろう。」（第１頁１行〜２０行）、
(ａ２)「ＰＥＧ化と表現される結合反応は、歴史的にモル過剰ポリマーで、ポリマーが蛋白質のどこに結合するかにかかわりなく、溶液中で行われた。しかし、そのような一般的な技術は十分な生理活性を保持しながら非抗原性ポリマーに生理活性蛋白質を結合するためには概して不適切であることが証明されている。MPOの生理活性を維持するための一つの方法は、ポリマーカップリング過程において、受容体結合部位に関連したそれらのMPOの反応基の結合を実質的に避けることである。本発明の別の側面は、高レベルの保持活性を維持するMPOにポリエチレングリコールを結合させる方法を提供することである。」（第１３頁下から２行〜第１４頁１２行）、 
(ａ３)「実施例１　直鎖 30,000MW　PEG-ALD　MPO 
 　／＼／＼／＼／＼／＼／＼／＼ＯＣＨ２CH２CHO 
 M-PEG-アルデヒド5,000、20,000及び30,000MW 
　本実施例は、還元アルキル化による実質的に均質なＮ-末端モノＰＥＧ化MPOの作製のための方法を示す。Ｎ-末端の第１アミンの相対的ｐＫａ値対リジン残基のε-アミノ基の第１アミンのｐＫａ値の差を利用して、約30,000MWのメトキシ-直鎖PEG-プロピオンアルデヒド試薬（Shearwater Polymers Inc.）を還元アミノ化により、MPOのＮ-末端に選択的に結合した。pH4.5の10〜20mM　酢酸ナトリウムに溶かして4.5mg/mLとしたMPO蛋白質を、固体のメトキシ-PEG-プロピオンアルデヒド（M-PEG-ALD）の添加によりM-PEG-ALDと反応させ、１アミンにつき6.5：１の相対的PEG：MPOモル比を得た。反応は、保存した１MのNaCNBH4をH2Oに溶かして最終濃度20mMとしたものを添加することにより触媒した。反応は、４℃で、18〜96時間行った。反応は、0.1M酢酸でｐHを4.0まで低下させるか、又は、５倍モル過剰のTris HClを添加することにより停止させた。」（第２６頁２１行〜第２７頁１５行）、　
(ａ４)「トリプシン消化マップのプロファイル（第5図）は、ＰＥＧ化MPO（20,000及び30,000PEG-ALD MPO種共に）の〜９０％がＮ-末端アラニン残基のα-NH2基がＰＥＧ化されたことを示すのに利用できる。」（第３６頁１行〜５行）、と記載され、 
(ａ５) そして、このようにして20,000及び30,000PEGでモノＰＥＧ化したＭＰＯは、血漿中のクリアランス速度が低下したこと（表３）及びＭＰＯ活性を有し、臨床上の効き目が向上したこと（表４）が、記載されている。
 　 
（ｂ）同じく引用例１２として引用された本願優先日前の１９９９年１１月９日に頒布された刊行物である特開平１１−３１０６００号公報には、
（ｂ１）「【発明が解決しようとする課題】
　しかし、特定のタンパク質に関する技術の現在の一般的な技術水準では、Ｇ−ＣＳＦのようなタンパク質のＮ末端に水溶性ポリマーを選択的に結合させることはできない。むしろ、現在の方法では、例えばリシン側基のような反応性基ンパク質内のどこに位置しているかにかかわらず）またはＮ末端に非選択的に結合する。そのため不均一な混合物が生成する。例えば、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子の場合、いくつかの分子は、他の分子と異なる数のポリエチレングリコール部分を有している。例えば、５個のリシン残基を有するタンパク質分子が上記の方法で反応させると、ある分子は６個のポリエチレングリコール部分を有し、またある分子は５個、またある分子は４個、またある分子は３個、またある分子は２個、またある分子は１個のＰＥＧ部分を有し、またある分子はＰＥＧ部分をもっていない。そして、いくつかのポリエチレングリコール部分を有する分子において、そのポリエチレングリコール部分は、異なる分子と同じ位置に結合していないこともある。
　このことは、治療用のＰＥＧ化タンパク質製品を開発する場合不利である。このような開発を行う場合、生物活性を予知できることが重要である。例えば、スーパーオキシドジスムターゼとポリエチレングリコールの非選択的結合の場合、得られる修飾酵素のいくつかの画分は全く不活性であったと報告されている（Ｐ．ＭｃＧｏｆｆら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３６巻、３０７９〜３０９１頁、１９８８年）。治療用のタンパク質がロット毎に組成が異なる場合、上記の予知を得ることができない。ポリエチレングリコール部分のいくつかは、ある位置では他の位置の場合と同様に安定に結合できないので、このようなＰＥＧ部分はタンパク質から解離することになる。勿論、このようなＰＥＧ部分がランダムに結合し、したがってランダムに解離する場合、治療用タンパク質の薬物動態を正確に予知することはできない。消費者からみれば、その循環時間はロット毎に変動するので投与量が不正確になる。メーカーから見ると、治療用タンパク質を販売するための法律上の承認を得るのに複雑さが加わる。その上に、上記の方法は、（タンパク質とポリマーの間に）結合部分なしでは選択的Ｎ末端化学修飾を行えない。結合部分を用いると、抗原性があるかもしれないので不利である。
　したがって、選択的にＮ末端が化学修飾されたタンパク質とその類似体が得られる方法が要望されている。そのタンパク質としてはＧ−ＣＳＦや共働性インターフェロンなどがあるがこれら２種の化学修飾されたタンパク質を以下に例示する。本発明はこの要望をいくつかの態様で検討するものである。
【課題を解決するための手段】
　本発明は、Ｎ末端化学修飾タンパク質の実質的に均質な製剤とその製造方法に関する。予想外のことであったが、Ｇ−ＣＳＦのＮ末端を化学修飾すると、この分子の別の位置に一つの化学修飾がなされている他のＧ−ＣＳＦ種にはみられない、安定性の利点を示した。またも予想外であったが、Ｎ末端を化学修飾されたＧ−ＣＳＦを製造する本発明の方法で、還元的アルキル化反応を用いて、Ｎ末端を選択的に修飾する条件を提供することができ、かつこの方法はＧ−ＣＳＦのみならず他のタンパク質（またはその類似体）に広く適用できることが見出されたのである。また驚くべきことであるが、還元的アルキル化反応を用いると、最終生成物（水溶性ポリマーとのアミン結合を有するタンパク質）が、アミド結合を有する同じポリマー／タンパク質結合体よりはるかに安定であることが見出された。このように修飾された他の一つのタンパク質（下記実施例で説明する）は共働性インターフェロンである。したがって、一層詳細に以下に説明するように、本発明には、特定のタンパク質の特定の修飾のみならずタンパク質（またはその類似体）の化学修飾に関するいくつかの態様がある。」（第３頁第４欄４３行〜第４頁第６欄１１行）」、
（ｂ２）「水溶性ポリマーは上記した種類のものであってよく、そして、蛋白にカップリングするための単一の反応性アルデヒドを有するものでなければならない。ポリエチレングリコールについては、Ｇ−ＣＳＦへのカップリングにはＰＥＧ　６０００、コンセンサスインターフェロンに対してはＰＥＧ　１２０００の使用を以下に記載している。ただし、Ｇ−ＣＳＦの場合は、ＰＥＧ　１２０００、２００００および２５０００も本発明の方法で良好に使用される。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（例えば米国特許第５，２５２，７１４号参照）は水中の安定性の点で好都合である。
　前記したとおり、本発明の方法はＮ末端α−アミノ基を有するいかなる蛋白またはその類似体にも広範に適用できる。」（第７頁第１２欄３６行〜４９行）、と記載され、
（ｂ３）そして、実施例２及び３には、メトキシポリエチレングリコールアルデヒドによりＮ末端モノＰＥＧ化させたＧ−ＣＳＦ及びコンセンサスインターフェロンが、生物学的活性を有することが、記載されている。 　
(ｃ）同じく引用例８として引用された本願優先日前に頒布された刊行物であるJournal of Biological Chemistry（1996）Vol.271，p.21969-21977は、「ポリエチレングリコールとの複合により作製された長期間作用する成長ホルモン」という題の文献であって、
（ｃ１）「第１級アミンと選択的に結合する5kDa試薬である、5kDaのポリエチレングリコール-5000（PEG5000）N-ヒドロキシスクシニミジルエステルと反応させて、サイズの増加したヒト成長ホルモン（hGH）誘導体が製造された。反応条件と精製方法を調整して、PEG部分を７個まで含むhGH誘導体を単離することができ、この誘導体はストークス半径が変わり、非修飾ホルモンの有効分子量２２kDaから３００kDaになった。幸いなことに、最も反応性があるアミンは、受容体との結合に重要な２つの部位のどちらにもない。にもかかわらず、PEG修飾のレベルが増えるに従って線形的に、その受容体への親和性は減少し、細胞を基礎とする試験のＥＣ５０は1,500倍まで増加した。親和性の減少のほとんどは、受容体への結合速度が遅くなる結果であった。ラットにおけるhGHのクリアランス速度は、逆に有効分子量に比例し、ろ過モデルにぴったりと一致した。これら類似体の効能を、下垂体切除ラットに毎日あるいは６日毎に注射し、身体あるいは組織成長に係る効果を決めることによりテストした。これら類似体の効き目は、５等量のPEG5000が結合したhGHで最高であって、効能は、非修飾hGHに比べて約１０倍に増加した。このようなPEG化hGH誘導体は、hGHの毎日の注射に代わる長期作用物として有望である。より一般的には、これらの研究は、受容体結合親和性を犠牲にしてでも、ホルモンのクリアランス特性を改良することが、ホルモンの効き目にめざましい増加をもたらすことを示すものである。」（第２１９６９頁要約１行〜３０行）、と記載され、
（ｃ２）また、hGHには、PEG5000-NHSと理論的に反応することができる第１級アミンとして、１位のPheのα-アミノ基と９個のLys側鎖のε-アミノ基の合わせて１０個が存在し（第２１９７１頁左欄下から１７行〜同欄下から１５行）、そのうち最も反応性が高いアミノ基は、１位のPheのα-アミノ基と140位のLysのε-アミノ基であって（第２１９７２頁右欄２０行〜２１行）、このことは、質量スペクトル分析を用いたトリプシン消化マップにより解析されたPEG修飾の部位（第２１９７２頁、図５参照）から明らかにされたことである（第２１９７２頁右欄１０行〜２０行）こと、
（ｃ３）そして、第２１９７３頁、図６には、hGHの立体構造とともに、１位のα-アミノ基と９個のLys側鎖のε-アミノ基がその反応性で色分けして示され、この９つのLysのうち、Lys-41,Lys-168,Lys-172,Lys-115はある程度中に埋もれていて、PEG5000-NHSとの反応性が低いか、あるいは反応しない（第２１０７２頁３１行〜３５行）こと、
（ｃ４）さらに、結合したPEGの数によって、PEG-hGHの種類を分離することが可能であり、クロマトグラフによる型の多くは、同じ数のPEG基が付加したものであるが、修飾されたアミンの間で不均一性が生じることがとてもよくあることであって、例えば、PEGが５個結合したhGHが単独で単離される一方で、他の型では、PEGが４個結合したhGH又はPEGが6個結合したhGHが混合したままとなるが（第１Ａ、１Ｂ図）、その理由は修飾された位置の不均一性にあると考えられること（第２１９７５頁左欄下から６行〜同頁右欄３行）、が記載されている。 
 　 
（ｄ）同じく引用例１として引用された本願優先日前の１９９９年１０月２６日に頒布された刊行物である特表平１１−５１２２９８号公報は、ヒト成長ホルモンの作用剤または拮抗剤としての使用のための特定の成長ホルモン変異体及びそれらのＰＥＧ化形態に関するものであって（第５頁８行〜９行）、ヒト成長ホルモンは、サイト１及びサイト２と呼ばれる部位で２つの受容体と結合するものであり（第６頁下から７行〜同頁下から６行）、サイト１での受容体に対する結合アフィニティーが増大したものは、hGH作用剤として機能し、サイト２結合を破壊する修飾である120位のアミノ酸の置換を含むhGH変異体は、hGH拮抗剤として機能すること（第１０頁１１〜１５行）、hGHのＰＥＧ化が比較的高い程度では、ＰＥＧ化hGH変異体の半減期が増大するが、サイト1アフィニティーは減少すること、サイト1結合は作用剤及び拮抗剤hGH変異体において本質的なものであるため、増大したＰＥＧ化は両タイプのhGH変異体の有効性を減少するものであって、当業者は、望ましい増大した半減期をもち、未だin vivoでの効力のある充分な有効性を維持した接合物を生産するためにhGH変異体に対するＰＥＧ化の適した程度を容易に決定し得ること（第４１頁５行〜同頁下から７行）、が記載されている。 
  
第４．対比・判断 
　上記引用例２記載事項（ａ３）〜（a５）によると、引用例２には、２０kDaまたは３０kDaの分子量を有するポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」という。）を有するメトキシＰＥＧプロピオンアルデヒド分子を、ミエロポエチン（以下、「ＭＰＯ」という。）のアミノ末端α−アミノ基に１分子結合させたＮ末端モノＰＥＧ化ＭＰＯが記載されており、本願発明と引用例２に記載された事項を比較すると、両者は、「一つのＰＥＧ分子が、生物学的に活性なポリペプチドのアミノ末端α−アミノ基に選択的に共有結合したものを含むコンジュゲートであって、ＰＥＧ分子が式：ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨＯのアルデヒドからなる官能基を有し、ＰＥＧが２０ｋＤａ又は３０ｋＤａの分子量を有するコンジュゲートポリペプチドのアミノ末端α−アミノ基に選択的に共有結合したものを含むコンジュゲート」である点で共通するが、両者は、生物学的に活性なポリペプチドが、前者ではヒト成長ホルモン（以下、「hGH」という。）であるのに対し、後者ではＭＰＯである点で相違する。 
　しかしながら、一般に生理活性を有するポリペプチドにおいて、分子量を増加させることで生体内でのクリアランス速度を減少させ、半減期を延長させ、または、抗原性を減少させることを目的としてＰＥＧを結合させることは、本願優先日前既にＰＥＧ化といわれ、常套手段であったといえ、その際、引用例１２記載事項（b１）にも記載のように、生物活性を予知でき、かつ治療用タンパク質製品としての安定性を向上させるために、比較的分子量の高いＰＥＧを１つだけ、タンパク質のＮ末端に結合させることは、Ｎ末端モノＰＥＧ化といわれ、引用例２や引用例１２に記載のように、本願優先日当時既に開発されていた技術であった。
　一方、引用例８記載事項（ｃ２）及び引用例１記載事項（ｄ）にもあるように、本願優先日時点において、ｈＧＨはそのアミノ酸配列はもちろん、その立体構造も詳しく解析されているホルモンであって、ＰＥＧと結合可能な１０個のアミノ基のうち、Ｎ-末端α-アミノ基が最も反応性が高い反応基２つのうちの１つであることが周知であった。さらに、引用例８記載事項（c１）にあるように、引用例８には、５つの分子量5,000のＰＥＧを結合させたｈＧＨの生体での効能が、非修飾ｈＧＨに比べて約１０倍増加したこと、及びホルモンの受容体結合親和性を多少犠牲にしても、ホルモンのクリアランス特性を改良することが、ホルモンの効き目にめざましい増加をもたらすことが記載されている。　　
　このような技術水準の下で、引用例２に記載されたＮ末端モノＰＥＧ化技術を、引用例８に記載の、ＰＥＧ化が有効であるｈＧＨに適用しようとすることは、引用例８のｈＧＨに結合した５つの分子量5,000ＰＥＧのうち、１つはｈＧＨのＮ末端に結合しているであろうこと、及びＮ-末端が受容体との結合部位から離れた位置に存在するという周知事項をたとえ考慮しなくとも、当業者であれば極めて容易に想到し得ることである。 　
　そして、そのようにして得られたＮ末端モノＰＥＧ化ｈＧＨの生体での効能は、本願明細書、表３のマウス体重増加を示した結果において、本願発明のものを週１回投与した場合（表３、３行目、７行目）の７３％、９４％（ｈＧＨ毎日投与による体重増加との比較）に対して、例えば引用例８に記載の５kDaＰＥＧを複数結合させたものに相当するものの場合（表３、下から３行目、下から２行目）が１２４％、１３４％であり、引用例２記載のＮ末端モノＰＥＧ化をｈＧＨに適用した場合に予測できないほど格別なものではなく、その他の本願発明によって奏される効果も、上記引用例２、１２、８、及び１の記載から予測できない格別なものとは認められない。　
　したがって、本願発明は、引用例２、８、１２、及び１の記載から当業者が容易に発明をすることができたものである。 
 
第５．審判請求人の主張
　審判請求人は、平成１９年５月１５日付けで提出した意見書で、
(1)ＧＨのクリアランスについては二つのメカニズムが知られており、第一のメカニズムは腎糸球体での濾過作用（腎クリアランス）によるものであり（参考資料１、２）、第二のメカニズムはＧＨ受容体自身による取り込みを介するものであり（参考資料３、４）、後者は、治療的濃度におけるｈＧＨクリアランスの大部分を占めていて、このメカニズムによるクリアランス速度は受容体親和性に依存する。このように、ＰＥＧ化ｈＧＨの受容体親和性についての拒絶理由通知における指摘は生体内での実際の現象をあまりにも単純化しすぎた認識に基くものである旨、及び
(2)ｈＧＨの受容体結合部位に関する拒絶理由通知における、Ｎ末端のα−アミノ基はｈＧＨの受容体との結合部位と離れた位置にあるため受容体との親和性に影響を与えない旨の指摘は、優先日当時の技術水準の正しい理解に基くものではなく、参考資料５−１０はｈＧＨ分子または類似のウシＧＨ分子のＮ末端が受容体結合に関与する可能性を示すものであり、上記指摘とは相反する事実も知られていた旨、主張している。
　しかしながら、審判請求人が提出した参考資料１〜１０は、すべて本願優先日から７年〜２０年も前の文献であり、本願優先日当時の技術水準を適切に表すものとはいえない。
　すなわち、上記(2)の主張の根拠として提出された参考資料５〜１０は、いずれも１９８９年から１９９３年の文献であるのに対して、ｈＧＨの受容体結合部位に関する記載のある引用例８及び引用例１は、それぞれ１９９６年、１９９９年の文献であるから、技術の進歩からみて、後者の方が本願優先日当時の技術水準をより適切に反映したものといえる。
　また、上記(1)の主張についても同じであるばかりか、さらに、クリアランスのメカニズムに対する認識は違っていても、結果として受容体親和性が低い方が有利であるということになるのであるから、この認識の相違は、ｈＧＨをＮ末端ＰＥＧ化しようとする阻害事由になるものではなく、むしろ、20k又は30kDaのような大きな分子量のPEGを結合させることの動機付けとさえなるものである。 
 したがって、請求人の上記主張は採用できない。 
 　 
 第６．むすび
　以上のとおりであるから、本願請求項１に係る発明は、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから、他の請求項に係る発明については検討するまでもなく、本願は拒絶をすべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。