(57)【要約】  本発明は、トリB細胞抗体ライブラリから抗体を取得する方法であって、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法である。（ａ）カルシニューリン阻害剤 およびトリ血清の存在下でトリB細胞抗体ライブラリと抗原とを接触させる工程、（ｂ）工程（ａ）において該抗原と結合したトリB細胞を選択する工程、（ｃ）工程（ｂ）で選択されたトリB細胞を、カルシニューリン阻害剤 およびトリ血清の存在下で培養する工程、および（ｄ）工程（ｃ）を経て得られたトリB細胞、および／または該トリB細胞が発現する抗体を取得する工程【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリB細胞抗体ライブラリから抗体を取得する方法であって、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法。
（ａ）カルシニューリン阻害剤およびトリ血清の存在下でトリB細胞抗体ライブラリと抗原とを接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）において該抗原と結合したトリB細胞を選択する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で選択されたトリB細胞を、カルシニューリン阻害剤およびトリ血清の存在下で培養する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）を経て得られたトリB細胞、および／または該トリB細胞が発現する抗体を取得する工程
【請求項２】
前記工程（ｄ）で取得したトリB細胞が発現する抗体の軽鎖および／または重鎖可変領域のアミノ酸配列を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記トリB細胞が、ニワトリB細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ニワトリB細胞がDT40細胞であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
解離定数が1×10-8M以下である抗体を取得することを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記カルシニューリン阻害剤がFK506および／またはシクロスポリンAであることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記トリB細胞が発現する抗体がIgMまたはIgGであることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記トリB細胞が発現する抗体がトリ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の取得方法に関する。より具体的には、高い親和性で抗原と結合する抗体を抗体ライブラリから取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
主成分である抗体は生体内において特定の抗原と結合し、様々な生体内防御反応を惹起する。抗体医薬とは抗体のこの特性を利用した治療薬であり、そのため治療用抗体は高い抗原特異性と標的抗原に対する高親和性を有することが求められる。
抗原に対する抗体の親和性は、解離定数KDで表されることが多い。一般的に普及している分析方法はSurface Plasmon Resonance（SPR）法であり、反応速度論的（カイネティクス）解析により結合速度定数（ka値又はkon値）と解離速度定数（kd値又はkoff値）を計測し、KDを算出する。医薬品の開発候補となるモノクローナル抗体においては、KD値は1×10-8 M以下が求められており、例えば、抗体医薬として利用されているHumira（登録商標）、 Lucentis（登録商標）はそれぞれ3.0×10-11 M、4.6×10-11 MのKDを持つ高親和性抗体である（非特許文献１、２）。【０００３】
抗体作製方法は、一般的に動物免疫を利用するものと、そうでないものに分類される。動物免疫を利用する方法としては、抗原を動物に免疫し、得られたB細胞とミエローマを融合するハイブリドーマ法が挙げられる。しかしながらこの方法では、動物を利用するため抗体取得まで時間と労力が掛かる、免疫寛容により抗体が得られないことがある、などの問題がある。動物免疫を利用しない方法としては、ファージディスプレイ法が挙げられる。ファージ粒子に抗体の可変領域からなる１本鎖抗体（single chain variable fragment, scFv）を提示し、標的抗原に結合するクローンを取得する方法であるが、ライブラリの質はscFvの多様性に依存することや、scFvから完全長抗体にする過程で特異性や親和性に変化が生じることが課題となっている。【０００４】
上記の抗体作製技術に加え、ニワトリB細胞由来細胞株DT40細胞を利用した抗体作製技術ADLib（登録商標）システムが開発され、さらに遺伝子導入によりヒト抗体を産生できるライブラリが利用できるようになった（特許文献１、２、３および非特許文献３）。抗原に特異的に結合する抗体を持つクローンをライブラリから選択できるため、免疫寛容を回避し、迅速に完全長抗体を得ることができる。加えて、トリにおいて抗体遺伝子配列の多様化は、主に相同組換え（Gene Conversion）により起こるため、ヒトやマウスの多様化とは異なるメカニズムによる抗体遺伝子配列の変化が期待できるという利点がある。【０００５】
高親和性抗体を取得するための工夫はすでにいくつか行われているが、課題も多い。動物免疫においては、複数回免疫と呼ばれる、同じ抗原を繰り返し免疫することで高親和性抗体を発現するB細胞を誘導する方法が取られているが、時間と労力が掛かる上に非特異的結合が増加する可能性もある。ファージディスプレイ法では、標的抗原に結合する抗体クローンの選択を繰り返し、親和性の高いクローンを濃縮する方法が取られているが、一本鎖抗体で親和性が高くても、完全長抗体にしたときに親和性が低下する恐れがある。また、各方法で取得された抗体可変領域の配列にランダムに変異を導入することで高親和性抗体を取得する手法も用いられているが、必ずしも親和性が向上するわけではなく、親和性が向上する一方で非特異的結合が上昇する可能性や、導入された変異により抗体として正しく発現・機能できなくなる可能性がある。
その他、配列の多様化を促進することで高親和性抗体を取得する方法も開発されている。例えば、通常の野生型マウスと比較して、胚中心B細胞の抗体可変領域に多くの体細胞突然変異が誘発されるGANPマウス（登録商標）を使用した動物免疫（特許文献４）や、XRCC3遺伝子を不活性化したトリB細胞（特許文献５）、AID遺伝子の発現を制御したトリB細胞（特許文献６）、または変異導入に関与するAIDの活性を高めた変異AIDを導入したDT40-SWΔC細胞株（非特許文献４）を利用する方法などが挙げられるが、いずれも親和性の向上に直結するとは限らない。【０００６】
以上のように、抗体医薬において、高親和性抗体の取得は非常に重要な課題であり、より簡便かつ高確率に高親和性抗体を取得する方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許4214234号
【特許文献２】WO2008/047480
【特許文献３】WO2015/167011
【特許文献４】特許4478577号
【特許文献５】特開2009-060850
【特許文献６】特許4487068号
【０００８】
【非特許文献１】Kaymakcalan et al., Clin. Immunol., Vol. 131, 308-316, 2009
【非特許文献２】Papadopoulos et al., Angiogenesis, Vol.15, 171-185, 2012
【非特許文献３】Seo et al., Nature Biotechnol., Vol. 23, 731-735, 2005
【非特許文献４】金広優一ら：日本生物工学会大会講演要旨集，p.109, 2008.
【非特許文献５】Sigal et al., Annu. Rev. Immunol. Vol. 10, 519-560, 1992
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記事情に鑑み、本発明の目的は、トリB細胞抗体ライブラリから抗体を取得する方法、より具体的には、トリB細胞抗体ライブラリから高親和性抗体を取得する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、標的抗原に対して高い親和性を有する抗体を取得するため、鋭意研究を行った結果、カルシニューリン阻害剤およびトリ血清の存在下でトリB細胞抗体ライブラリを標的抗原と反応させ、抗原特異的抗体を産生するB細胞を選択した後に、カルシニューリン阻害剤およびトリ血清と共に培養することにより、高親和性抗体を取得することに成功した。
カルシニューリン阻害剤は、免疫抑制剤として臓器移植や自己免疫疾患の治療に使われている。カルシニューリン阻害剤であるFK506とシクロスポリンAは、FKBPとシクロフィリンにそれぞれ特異的に結合して、カルシニューリンと複合体を形成することで、T細胞活性化を抑制することがわかっている。B細胞においては、カルシニューリンはB細胞の分化や増殖に関与していると言われているが（非特許文献５）、カルシニューリン阻害剤による効果はあまりよく知られていない。【００１１】
以上のような状況において、発明者らは、カルシニューリン阻害剤およびトリ血清の存在下でトリB細胞抗体ライブラリから標的抗原に特異的に結合する抗体を産生するB細胞を取得することで、抗原に対して高い親和性を示す抗体が得られることを見いだし、本発明を完成させるに至った。【００１２】
したがって、本発明は以下の（１）〜（８）である。
（１）トリB細胞抗体ライブラリから抗体を取得する方法であって、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法。
（ａ）カルシニューリン阻害剤およびトリ血清の存在下でトリB細胞抗体ライブラリと抗原とを接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）において該抗原と結合したトリB細胞を選択する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で選択されたトリB細胞を、カルシニューリン阻害剤およびトリ血清の存在下で培養する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）を経て得られたトリB細胞、および／または該トリB細胞が発現する抗体を取得する工程
（２）前記工程（ｄ）で取得したトリB細胞が発現する抗体の軽鎖および／または重鎖可変領域のアミノ酸配列を決定する工程をさらに含む、上記（１）に記載の方法。
（３）前記トリB細胞が、ニワトリB細胞であることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（４）前記ニワトリB細胞がDT40細胞であることを特徴とする上記（３）に記載の方法。
（５）解離定数が1×10-8M以下である抗体を取得することを特徴とする上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記カルシニューリン阻害剤がFK506および／またはシクロスポリンAであることを特徴とする上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記トリB細胞が発現する抗体がIgMまたはIgGであることを特徴とする上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記トリB細胞が発現する抗体がトリ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法により、標的抗原に対する高親和性抗体が簡便、かつ迅速に取得することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】シングルセルソーティングの結果。  トリ血清（CS）及びFK506を添加した培地（以下、CS/FK506培地）（ａ）およびCS及びFK506を含まない培地（以下、CS(-)培地）（ｂ）でのシングルセルソート時のサイトグラム。
【図２】抗原固相ELISAスクリーニング。  CS/FK506培地反応群（ａ）およびCS(-)培地反応群（ｂ）の培養上清を用いた抗原固相ELISAの結果例を示す。横軸はクローン番号。抗原はhVEGF-A、陰性抗原としてhTNF-alpha、 Lysozyme（リゾチーム）、Streptavidin（ストレプトアビジン、図面中ではSAと表記）を使用した。
【図３】CS/FK506群（10種）のSPRセンサーグラムの結果。センサーグラム右上にはクローン番号を示す。
【図４】CS(-)群（10種）のSPRセンサーグラムの結果。
【図５】共通（common）群（6種）のSPRセンサーグラムの結果。
【図６】抗原抗体間の結合速度定数（kon）、解離速度定数（koff）およびKD値。  CS(-)群またはCS/FK506群のクローンについて各パラメーターの平均値（（ａ）kon、（ｂ）koff、（ｃ）KD）を比較した。
【図７】抗原と抗体のBindingに対するStabilityの相関プロット。  CS(-)群、CS/FK506群および共通群でのBindingとStabilityのResponse unit (RU)をプロットした。実線、ドット線はそれぞれCS(-)群、CS/FK506群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の実施形態は、トリB細胞抗体ライブラリから抗体を取得する方法、特に、高親和性抗体を取得する方法であって、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法である。
（ａ）カルシリューリン阻害剤（例えば、FK506またはシクロスポリンAなど）およびトリ血清の存在下でトリB細胞抗体ライブラリと抗原とを接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）において該抗原と結合したトリB細胞を選択する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で選択されたトリB細胞を、カルシリューリン阻害剤（例えば、FK506またはシクロスポリンAなど）およびトリ血清の存在下で培養する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）を経て得られたトリB細胞、および／または該トリB細胞が発現する抗体を取得する工程
【００１６】
本明細書において「カルシニューリン阻害剤およびトリ血清の存在下」とは、培地または溶液中にカルシニューリン阻害剤およびトリ血清が存在している状態をいう。カルシニューリン阻害剤としては、カルシニューリンの活性阻害を可能とする化合物（低分子、中分子、高分子）、タンパク質、ペプチド、核酸などが挙げられ、またカルシニューリンの発現を低下または喪失させる化合物（低分子、中分子、高分子）、タンパク質、ペプチド、核酸などを用いても良い。カルシニューリン阻害剤としては、例えばシクロスポリンAまたはFK506が好ましく、シクロスポリンAの類似体またはFK506の類似体であっても良い。培地または溶液中の濃度は、特に限定はしないが、例えば、シクロスポリンAは5 nM以下、FK506は1μM以下を使用することが望ましい。
なお、カルシニューリンの阻害剤を添加する方法以外に、カルシニューリンの発現を低下または喪失させたトリB細胞を用いても良く、これにより、カルシニューリン阻害剤存在下と同等の効果を得ることも可能である。
使用するトリ血清は、好ましくはニワトリ血清であり、成鳥、雛のいずれの血清でも利用できる。使用濃度は、限定はしないが、例えば、10 %以下であり、さらに好ましくは5 %以下を使用することが望ましい。カルシニューリン阻害剤およびトリ血清は、（ａ）および（ｃ）の工程において添加することが望ましいが、（ｂ）および／または（ｄ）の工程においては添加しなくても添加しても良い。
【００１７】
本実施形態で使用する「トリB細胞抗体ライブラリ」は、多様な抗体を産生するトリB細胞の集団である。なお、本明細書において「トリB細胞抗体ライブラリ」はそれぞれ異なった抗体を産生するトリB細胞の集団のみならず、同一の抗体を産生するトリB細胞の集団も含む。ここでトリB細胞とは、特に限定はしないが、例えば、ニワトリB細胞由来細胞株であるDT40細胞、生体由来のニワトリB細胞である。また、当該トリB細胞には、多様な変異を導入する処理が施されたトリB細胞、例えば、XRCC3遺伝子を不活性化したトリB細胞（特開2009-060850）、AID遺伝子の発現を制御したトリB細胞（特開2006-109711）、TSA（Trichostatin A）を含むHDAC（Histone Deacetylase）阻害剤を用いて抗体配列を多様化したトリB細胞、外来性の遺伝子配列又はその一部を染色体上に導入したトリB細胞（例えば、任意の抗体遺伝子配列等を導入したトリB細胞）なども含まれる。
本実施形態で使用する「トリB細胞抗体ライブラリ」の培養条件等は、当業者において周知の方法によって容易に行うことができ、特に限定はしないが、例えば、トリB細胞がDT40細胞である場合は、IMDM培地（Invitrogen）などを用い、5 %程度のCO2存在下、39.5℃程度で培養してもよい。
また、上記「トリB細胞抗体ライブラリ」は、抗原と接触する前に、あらかじめ、カルシニューリン阻害剤（例えば、FK506など）およびトリ血清の存在下で培養してもよい。
【００１８】
本実施形態において「トリB細胞から産生される抗体」は、トリ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体などが挙げられる。本明細書においてキメラ抗体とは、互いに由来の異なる領域同士を連結させた抗体であり、例えば由来の異なる可変領域と定常領域とを連結させた抗体や、由来の異なるFab領域とFc領域とを連結させた抗体が含まれるが、これらに限定されない。例えば、トリ−マウスキメラ抗体は、トリ遺伝子由来の抗体のアミノ酸配列とマウス遺伝子由来の抗体のアミノ酸配列とを連結させた抗体のことである。それ以外にトリ遺伝子由来の抗体のアミノ酸配列とヒト遺伝子由来の抗体のアミノ酸配列とを連結させたトリ−ヒトキメラ抗体、トリ遺伝子由来の抗体のアミノ酸配列とウサギ遺伝子由来の抗体のアミノ酸配列とを連結させたトリ−ウサギキメラ抗体、トリ遺伝子由来の抗体のアミノ酸配列とヤギ遺伝子由来の抗体のアミノ酸配列とを連結させたトリ−ヤギキメラ抗体などが挙げられる。
ヒト化抗体とは、産生される抗体の重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のうち、一部がトリ遺伝子由来の配列であり、それ以外がヒト遺伝子由来の配列である抗体のことである。また、ヒト抗体とは、産生される抗体の重鎖または軽鎖のアミノ酸配列がすべてヒト遺伝子由来の配列である抗体のことである。
また、本実施形態において「トリB細胞から産生される抗体」には、トリ以外の動物種由来の抗体のアミノ酸配列の全てまたは一部を含む抗体も含まれる。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ウシまたはヤギなどから得られる抗体のアミノ酸配列の全てまたは一部を含む抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
本実施形態において「トリB細胞から産生される抗体」のアイソタイプは、特に限定はしないが、例えばIgM、IgG、IgAまたはIgYなどが挙げられる。
【００１９】
本実施形態において、「高親和性抗体」とは、抗原に対して高い結合親和性を有する抗体のことを言う。抗体結合親和性を表す指標として、解離定数（KD）が一般的である。特に限定しないが、好ましい結合親和性としては、例えば、1×10-5 M以下、1×10-6 M以下、1×10-7 M以下、1×10-8 M以下、1×10-9 M以下、1×10-10 M以下または1×10-11 M以下の解離定数を有する親和性が挙げられる。また、解離定数は、1×10-15 M以上、1×10-14 M以上、1×10-13 M以上、1×10-12 M以上、1×10-11 M以上、1×10-10 M以上または1×10-9 M以上であってもよい。親和性の測定は、当業者であれば周知の技術により実施することができ、一般的にSPR法が望ましく、その他、BLI法（bio-layer interferometry）を用いることもできる。また平衡法による親和性測定も可能であり、例えばFCM（Flow Cytometry；フローサイトメトリー）法、ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法を利用しても良い。
【００２０】
本実施形態で使用する「抗原」は、化合物（低分子、中分子、高分子）、タンパク質、ペプチド、脂質、核酸などが挙げられる。ここで「抗原」は、例えば、標識された化合物および、化合物とタンパク質の複合体、化合物と抗体の複合体、タンパク質と抗体の複合体などでも良い。タンパク質は、体液中に分泌されるタンパク質や細胞表面上に発現しているタンパク質、細菌、ウィルス、ウィルス様粒子やリポパーティクルに提示させたタンパク質、Nanodiscなどの膜タンパク質を再構築したものであっても良い。例えば、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、受容体などが使用できる。また、抗抗体を取得する場合は抗体を抗原として使用できる。抗原として抗体を用いる場合、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などが使用できる。抗体の形状としては、全長抗体、抗体断片（例えばF(ab’)2, Fab’, Fab, Fv, scFv, Fcなど）、および抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含むタンパク質などが使用できるが、これに限定されない。これら抗原は、翻訳後修飾などの化学修飾を受けたものであっても良く、例えば糖、リン酸、脂質による修飾が挙げられる。
【００２１】
本実施形態において、「トリB細胞抗体ライブラリと抗原とを接触させる」とは、当該ライブラリを構成する細胞（群）と抗原とが接触（相互作用）し得る状態にすること、あるいは、当該細胞（群）表面上に発現されている抗体もしくは該細胞から分泌される抗体と抗原とが接触（相互作用）し得る状態にすることである。例えば、限定はしないが、当該ライブラリの培地または溶液中に抗原を適量添加、適当な時間培養することによっても、実施することができる。
ここで使用する抗原は、標識抗原あるいはタグを付加した抗原が使用できる。標識抗原としては、Biotinや蛍光色素によって直接標識された抗原や抗体などを介して間接的に標識された抗原が使用できる。タグを付加した抗原としてはFLAG-tag、His-tag、Myc-tag、Strep-tag、GST（glutathione S-transferase）、MBP（maltose binding protein）またはGFP（green fluorescent protein）などのタグを付加した抗原が利用できる。
【００２２】
本実施形態の「抗原と結合したトリB細胞を選択する工程」において、好ましくは特異的な抗体やタンパク質、化合物を固定した磁気ビーズを用いて、標識抗原あるいはタグを付加した抗原に結合するトリB細胞を選択する方法が選択できる。例えばDynabeads（登録商標）（Thermo Fisher）、あるいは MACS マイクロビーズ （Miltenyi Biotec）を用いて、抗原と結合したトリB細胞を選択しても良いし、蛍光標識された抗タグ抗体などを用いて抗原と結合したトリB細胞を選択しても良い。
本実施形態の「選択されたトリB細胞を、カルシニューリン阻害剤およびトリ血清の存在下で培養する工程」において、カルシニューリン阻害剤およびトリ血清の存在下での培養時間は、特に限定はしないが、例えば、１〜１６８時間程度であってもよい。
【００２３】
本実施形態において、選択されたトリB細胞を、カルシニューリン阻害剤（例えば、FK506またはシクロスポリンAなど） およびトリ血清の存在下で培養した結果、得られたトリB細胞には、高親和性抗体を発現するものが含まれており、当該トリB細胞が分泌する抗体を高親和性抗体として取得することができ、当該トリB細胞が発現する抗体の重鎖および軽鎖の遺伝子配列を決定することによって高親和性抗体の遺伝子配列を得ることができる。
なお、トリB細胞を、カルシニューリン阻害剤およびトリ血清を含まない培地で培養した「コントロール群」と、カルシニューリン阻害剤およびトリ血清を含む培地で培養した「カルシニューリン阻害剤／トリ血清群」との、それぞれの細胞群が発現する抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域のアミノ酸配列を決定し、「コントロール群」とは異なるアミノ酸配列を有する抗体を発現する「カルシニューリン阻害剤／トリ血清群」由来のトリB細胞が発現する抗体を高親和性抗体候補として選択してもよい。
【００２４】
本明細書において引用されたすべての文献の開示内容は、全体として明細書に参照により組み込まれる。また、本明細書全体において、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものを含むものとする。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２５】
高親和性抗体セレクション
１．抗原発現ベクターの構築
ヒトVEGF-Aのアイソフォームの１つであるVEGF 165（27-191アミノ酸配列、UniProt# P15692-4、以下hVEGF-Aと表記）およびヒトTNF-alpha（77-233アミノ酸配列、UniProt# P01375、以下hTNF-alphaと表記）の遺伝子配列を合成し、PCRによりN末端にFLAGタグを付加した後に、pEF1 vector（V92020、Invitrogen）に挿入し、発現ベクターFLAG-hVEGF-A/pEF1およびFLAG-hTNF-alpha/pEF1を得た。【００２６】
２．遺伝子導入及び発現
遺伝子導入方法はNeoFection（N462、アステック社）のプロトコルに従った。NeoFectionを用いて発現ベクター（FLAG-hVEGF-A/pEF1およびFLAG-hTNF-alpha/pEF1）をトランスフェクションしたFreeStyle 293F細胞（R790-07、Life Technologies）（1.0x10６cells/mL）を、37℃、8 % CO2存在下で5日間、3 Lの培養液で振盪培養した（BioShaker CO2-BR-180LF、TAITEC）。培養にはFreeStyle 293 Expression Medium（12338-026、Life technologies）、1 % Penicillin-Streptomycin（15140-122、Life technologies）を使用した。【００２７】
３．抗原の精製
各培養上清3 Lを回収し、ANTI-FLAG M2 Affinity Gel（A2220-25ML、SIGMA）に吸着させ、D-PBS(-)（045-29795、Wako）で洗浄後、0.1 mg/mL FLAG peptide（F-3290、SIGMA）、 D-PBS(-)により溶出した。各フラクションおよび通過画分をSDS-PAGEおよびMonoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse（F3165-1MG、SIGMA）によるWestern Blotにより確認し、目的タンパク質が存在する画分を回収し、Amicon Ultra-15 10K（UFC901024、Millipore）により濃縮し、0.22μmフィルター（MILLEX-GV、SLGVJ13SL、Millipore）により濾過を行った。
濃縮を行ったFLAG精製サンプルをゲル濾過カラムHiLoad 16/600 Superdex 200pg（28-9893-35、GE Healthcare）120 mLを用いてD-PBS(-)により溶出した。各画分をSDS-PAGEにより確認し、目的タンパク質が精製されたことを確認した。
ゲル濾過精製後のサンプルをAmicon Ultra-15 10Kにより濃縮し、0.22μmフィルターにより濾過を行った。得られた精製抗原（hVEGF-AおよびhTNF-alpha）のタンパク質濃度は、NanoDrop Spectrophotometer ND-2000cにより算出した。【００２８】
４．ライブラリの培養
ニワトリB細胞由来細胞株であるDT40細胞を宿主とするヒトライブラリの培養方法は以下の方法で行った。39.5℃、5 % CO2存在下で培養し、培地はIMDM（12440-079、Life Technologies）を用い、10 % FBS（11824、Biosera）、1 % Penicillin-Streptomycinを加えて使用した。以下、特に断りが無い限り、CS(-)培地とは前記のものを指す。CS/FK506含有培地とは、CS(-)培地に5 %トリ血清（16110-082、Life Technologies）と1μM FK506（1007965、Cayman）を添加したものを指す。【００２９】
５．磁気ビーズを用いた特異的吸着ならびにフローサイトメーターによる連続セルソート
ライブラリはWO2015/167011に記載のヒトライブラリを使用した。ライブラリを2セット用意し、一方はCS/FK506含有培地で懸濁し、もう一方はCS(-)培地で懸濁した。培地で懸濁したライブラリに終濃度10 nMとなるようhVEGF-A抗原と1/500量のビオチン標識抗FLAG抗体（F9291-1MG、SIGMA）を添加し、4℃で30分間転倒混和しながら反応させた。反応終了後は各培地で2回洗浄し、各培地で再懸濁した。1/100量のAnti-Biotin MicroBeads UltraPure（130-105-637、Miltenyi Biotec）、1/10000量のGoat Anti-Human IgG-PE（2040-09、SouthernBiotech）、1/1000量のStreptavidin Alexa Fluor 647 Conjugate（S21374、Life Technologies）を添加し、4℃で10〜30分間転倒混和しながら反応させた。反応終了後、autoMACS Pro Separator （Miltenyi Biotec）でカラム濃縮を行い、カラムに吸着されなかったフラクション（ネガティブフラクション）をFACS Aria Fusion（BD）で測定してソート範囲の設定を行った。その後ポジティブフラクションサンプルを全量ロードし、それぞれの培地を分注した96 well plateに陽性細胞集団を1細胞/wellになるようソーティングを実施した（図１）。CS/FK506含有培地反応群については、シングルセルで170 well分をCS/FK506含有培地にソートした。CS(-)培地反応群については、シングルセルで255 well分をCS(-)培地にソートした。【００３０】
６．抗原固相ELISAによるスクリーニング
D-PBS(-)（14249-24、ナカライテスク）で2.5μg/mLに希釈したhVEGF-A抗原溶液および陰性対照抗原溶液20μLをMAXISORP 384 IMMUNO PLATE（464718、NUNC）に分注し、4℃で一晩反応させて固相化した。マイクロプレート専用小型遠心機（GYRO mini GM-01、MICRONIX）で遠心して溶液を除き、ブロッキング溶液（1 % BSA（A8022, SIGMA）を含むPBS）45μLを加えて室温で1時間反応させた。GYRO miniで遠心して溶液を除き、培養上清25μLを加えて室温で1時間反応させた。GYRO miniで遠心して溶液を除き、ブロッキング溶液で2000倍に希釈したGoat anti-Human IgG-Fc HRP-conjugated（A80-104P、BETHYL）を25μL加え、室温で45分間反応させた。洗浄溶液（0.05 % Tween20（167-11515、Wako）を含むPBS）で5回洗浄し、TMB（53-00-02、KPL）を25μL加えて5分30秒間反応させた。1 N 硫酸（192-04696、Wako）25μLを加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（infinite M1000、TECAN）を用いて450 nmの吸光度を測定した。陰性抗原として、調製したhTNF-alpha、Lysozyme（L6876、SIGMA）、Streptavidin（32243-24、ナカライテスク、図面中ではSAと表記）を使用した。ODには、得られた吸光度からバックグラウンドを引いた補正値を使用し、S/N比は、OD（hVEGF-A）/OD（hTNF-alpha）の式から得られた値を示す。【００３１】
CS/FK506含有培地反応群については、ソート後6日間培養した後に抗原固相ELISAを行った。ソート数170 wellに対し113 wellでコロニー形成が確認され、その内抗原特異的に反応するクローンが63個（OD>1, S/N比>10）確認された（表１、図２）。
CS(-)培地反応群については、ソート後7日間培養した後に抗原固相ELISAを行った。ソート数255 wellに対し148 wellでコロニー形成が確認され、その内抗原特異的に反応するクローンが43個（OD>1, S/N比>10）確認された（表１、図２）。
【表１】
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【００３２】
７．配列解析およびグルーピング
OD>1, S/N比>10の基準をクリアした陽性クローン全てについて可変領域の抗体配列を解析し、重鎖・軽鎖を含めて可変領域で同一アミノ酸配列をコードしているものを1つのグループとする方法でグルーピングを行った。最終的にグループはCS/FK506含有培地反応群で16種類、CS(-)培地反応群で16種類確認され、その内6種は両方の群で存在することが確認された（表２）。以降、両方の群で配列が共通であったグループを共通群とし、CS(-)培地反応群およびCS/FK506含有培地反応群から共通群を除いた配列グループをCS(-)群、CS/FK506群とした。
【表２】
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【００３３】
８．親和性スクリーニング
各配列グループの代表クローン26種について、培養上清を再調製し、SPR法（Biacore T200、GE Healthcare）を用いて、抗原との親和性を測定した。Human Antibody Capture Kit（BR100839、GE Healthcare）を用いてCM5センサーチップ（BR100530、GE Healthcare）にanti-human IgG(Fc)抗体を固定した後、培養上清中の抗体をキャプチャーした。100 nM hVEGF-Aを240秒反応させ、その後300秒解離させた。再生溶液として3 M MgCl2を30秒間反応させて、1サイクルを完了させた。バッファーはHBS-EP+（10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05 % (v/v) surfactant P20（pH 7.4）（BR100669、GE Healthcare））を使用し、流速は30μL/minで測定した。またいくつかのクローンに関しては、30 nM hVEGF-Aを用いて同じプロトコルにより再測定した。各配列グループの代表クローンから得た抗体の各SPRセンサーグラムを比較したところ、多くのクローンは大きい結合速度、解離速度を持つ箱型のセンサーグラムを示したが、いくつかのクローンで非常に遅い解離速度を示すものがあった（図３〜図５）。【００３４】
各SPRセンサーグラムに対しBiacore T200 Evaluation Software によるLangmuir 1:1 binding modelによるフィッティングを行い、結合速度定数kon, 解離速度定数koffを算出し、KD=koff/kon の式よりKD値を決定した。CS(-)群及びCS/FK506群のクローンにおける各パラメーターの平均値を比較した（図６）。その結果、CS(-)群と比較して、CS/FK506群においてkonが大きく、koffが小さくなっており、KD値は約4.7倍小さかった（表３）。
【表３】
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【００３５】
さらに抗体の解離速度を確認するため、得られたセンサーグラムにおける結合反応測定終了5秒前におけるResponse unit（RU）をBindingとし、解離反応測定終了5秒前におけるRUをStabilityとして、Bindingに対するStabilityの相関をプロットした（図７）。CS(-)群よりもCS/FK506群の方が、Stabilityの値が高い、すなわち解離速度が遅いクローンが多いことが明らかとなった。また線形回帰により各群の近似式から傾きを算出し、各群における抗体−抗原複合体の解離率を比較したところ、CS/FK506群においてCS(-)群よりも解離率が低かった（表４）。これによりCS/FK506群では解離反応開始後においても抗体が抗原に結合している確率が高いことが示唆される。
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、目的の抗原と高い親和性で結合する抗体を取得する方法に関するものである。従って、抗体医薬に関連する医薬、薬学の分野、あるいは、抗体を用いて研究用試薬として扱う分野において、本発明の利用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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