(57)【要約】  本発明は、ラクトバチルス・クンキーによって蜂蜜とカミツレ又はその処理物とを発酵して得られる発酵物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・クンキーによって蜂蜜とカミツレ又はその処理物とを発酵して得られる発酵物。
【請求項２】
前記カミツレ又はその処理物が、カミツレ花の乾燥粉末である、請求項１に記載の発酵物。
【請求項３】
前記蜂蜜と前記カミツレ又はその処理物との質量比が２６：１〜４：１である、請求項１又は２に記載の発酵物。
【請求項４】
皮膚バリア機能改善用、皮膚保湿用、皮膚の弾力改善用、皮膚のくすみ改善用、皮膚のシワ改善用、肌荒れ改善用、皮膚の老化防止用、肌の肌理改善用及び敏感肌改善用からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発酵物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の発酵物を含む、食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品。
【請求項６】
ラクトバチルス・クンキーによって蜂蜜とカミツレ又はその処理物とを発酵して発酵物を得る工程を含む、発酵物の製造方法。
【請求項７】
前記カミツレ又はその処理物が、カミツレ花の乾燥粉末である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記蜂蜜と前記カミツレ又はその処理物との質量比が２６：１〜４：１である、請求項６又は７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記発酵物が、皮膚バリア機能改善用、皮膚保湿用、皮膚の弾力改善用、皮膚のくすみ改善用、皮膚のシワ改善用、肌荒れ改善用、皮膚の老化防止用、肌の肌理改善用及び敏感肌改善用からなる群から選ばれる少なくとも一つである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の製造方法により得られた発酵物を添加する工程を含む、食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚、特に表皮は、バリア機能を有することが知られている。バリア機能とは、生体内からの過度な水分蒸散や、体外からの細菌等の異物の侵入を防ぐ機能である。表皮顆粒層に存在するタイトジャンクションは、皮膚のバリア機能に重要な役割を担うと考えられている。タイトジャンクションは、隣接する細胞同士を密着させるだけでなく、細胞と細胞との隙間をシールして物質の透過を制御する。タイトジャンクションを構成するのは、細胞膜タンパク質のクローディン、オクルディン及びタイトジャンクションタンパク質である。これらのタンパク質はタイトジャンクションストランドの骨格を構成し、タイトジャンクションのバリア機能を制御すると考えられている。特許文献１には、植物の抽出物を含有するクローディン産生促進剤及びオクルディン産生促進剤が記載されている。特許文献２には、サボテン科ウチワサボテン属に属する植物の果実から得られるカクタスフルーツ果実抽出物からなる皮膚バリア機能改善剤が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許５８６０５７７号公報
【特許文献２】特開２０１２−１２１８７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１には、カミツレ抽出物を用いてオクルディンの産生促進作用を調べたことが記載されている。しかし、特許文献１には、カミツレ抽出物にはオクルディン産生促進作用がほとんどなかったことが示されている。【０００５】
本発明は、優れた皮膚改善作用を有する新規な蜂蜜発酵物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ラクトバチルス・クンキーを用いて蜂蜜とカミツレ又はその処理物とを発酵して得られる発酵物に、優れた皮膚改善作用があることを新たに見出した。【０００７】
本発明は、ラクトバチルス・クンキーによって蜂蜜とカミツレ又はその処理物とを発酵して得られる発酵物を提供する。該発酵物は、優れた皮膚改善作用を有する。【０００８】
上記発酵物において、上記カミツレ又はその処理物が、カミツレ花の乾燥粉末であることが好ましい。カミツレ花の乾燥粉末を用いることによって、より高い皮膚改善作用を有する発酵物をより簡便に得ることができる。【０００９】
上記発酵物において、上記蜂蜜と上記カミツレ又はその処理物との質量比が２６：１〜４：１であることが好ましい。質量比が上記範囲であると、更に高い皮膚改善作用が得られる。【００１０】
上記発酵物は、皮膚バリア機能改善用、皮膚保湿用、皮膚の弾力改善用、皮膚のくすみ改善用、皮膚のシワ改善用、肌荒れ改善用、皮膚の老化防止用、肌の肌理改善用及び敏感肌改善用からなる群から選択される少なくとも一つとして好適である。【００１１】
本発明は、皮膚バリア機能改善、皮膚保湿、皮膚の弾力改善、皮膚のくすみ改善、皮膚のシワ改善、肌荒れ改善、皮膚の老化防止、肌の肌理改善及び敏感肌改善からなる群から選択される少なくとも一つに使用するための、ラクトバチルス・クンキーによって蜂蜜とカミツレ又はその処理物とを発酵して得られる発酵物と捉えることもできる。【００１２】
本発明は、ラクトバチルス・クンキーによって蜂蜜とカミツレ又はその処理物とを発酵して得られる発酵物を、それを必要とする対象に経口投与する工程、又当該対象の皮膚に適用する工程を含む、皮膚バリア機能改善方法、皮膚保湿方法、皮膚の弾力改善方法、皮膚のくすみ改善方法、皮膚のシワ改善方法、肌荒れ改善方法、皮膚の老化防止方法、肌の肌理改善方法及び敏感肌改善方法からなる群から選択される少なくとも一つと捉えることもできる。【００１３】
本発明は、皮膚バリア機能改善剤、皮膚保湿剤、皮膚の弾力改善剤、皮膚のくすみ改善剤、皮膚のシワ改善剤、肌荒れ改善剤、皮膚の老化防止剤、肌の肌理改善剤及び敏感肌改善剤からなる群から選択される少なくとも一つの製造における、ラクトバチルス・クンキーによって蜂蜜とカミツレ又はその処理物とを発酵して得られる発酵物の応用と捉えることもできる。【００１４】
本発明は、上記発酵物を含む、食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品を提供する。【００１５】
本発明はまた、ラクトバチルス・クンキーによって蜂蜜とカミツレ又はその処理物とを発酵して発酵物を得る工程を含む、発酵物の製造方法を提供する。該製造方法により得られる発酵物は、優れた皮膚改善作用を有する。【００１６】
上記製造方法において、カミツレ又はその処理物が、カミツレ花の乾燥粉末であることが好ましい。【００１７】
上記製造方法において、上記蜂蜜と上記カミツレ又はその処理物との質量比が２６：１〜４：１であることが好ましい。【００１８】
上記製造方法で得られる発酵物は、皮膚バリア機能改善用、皮膚保湿用、皮膚の弾力改善用、皮膚のくすみ改善用、皮膚のシワ改善用、肌荒れ改善用、皮膚の老化防止用、肌の肌理改善用及び敏感肌改善用からなる群から選択される少なくとも一つとして好適である。【００１９】
本発明はまた、上記製造方法により得られた発酵物を添加する工程を含む、食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の発酵物は、優れた皮膚改善作用を有する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。本明細書において「％」は特に言及しない限り「質量％」を意味する。
【００２２】
本実施形態に係る発酵物は、ラクトバチルス・クンキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ）によって、蜂蜜と、カミツレ又はその処理物（以下、「カミツレ原料」ともいう。）とを発酵して得られるものである。
【００２３】
蜂蜜は、ミツバチが、植物の花蜜、樹液、植物に寄生する虫の分泌液等から集めた蜜を主原料として作り出したものである。本実施形態において発酵に供される原料の蜂蜜の種類にはとくに制限がなく、例えば、マヌカ蜂蜜、アカシア蜂蜜、甘露蜂蜜、クローバー蜂蜜、オレンジ蜂蜜、レンゲ蜂蜜、ローズマリー蜂蜜、ヒマワリ蜂蜜、菜の花蜂蜜、コーヒー蜂蜜等を用いることができる。蜂蜜は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。蜂蜜を採取するために利用されるミツバチの種類、及び蜂蜜の産地は特に限定されない。
【００２４】
カミツレは、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）の植物であり、学名はＭａｔｒｉｃａｒｉａ  ｃｈａｍｏｍｉｌｌａ  Ｌ．である。使用するカミツレの部位としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、葉、茎、根、花、蕾、種子、果実、果皮、果核、地上部、全草、これらの混合物等が挙げられる。使用するカミツレの部位は花であることが好ましい。
【００２５】
発酵に供するカミツレ原料は、カミツレを採取して得たそのものであってもよく、カミツレの処理物であってもよい。カミツレ処理物としては、例えば、カミツレに、乾燥、粉砕、抽出等の処理を行って得られる処理物が挙げられる。これらの処理は１種を単独で行ってもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２６】
カミツレ処理物は、例えば、カミツレの乾燥物、粉砕物、破砕物、粉末、抽出物等であってよい。カミツレの乾燥は、例えば、天日乾燥、熱風乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等によって行うことができる。粉砕及び破砕はそれぞれ、例えば粉砕機、破砕機等を用いて行うことができる。カミツレ原料は、カミツレの乾燥粉末であることが好ましい。カミツレの乾燥粉末は、例えば、カミツレを乾燥し、更に粉砕することにより得ることができる。カミツレは、採取後直ちに乾燥し、粉砕したものであることが好ましい。カミツレ処理物としては、市販品を使用することができる。
【００２７】
カミツレの抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法によりカミツレから抽出して得ることができる。例えば、抽出溶媒を満たした処理槽に抽出原料であるカミツレの抽出部位を投入し、必要に応じて適宜攪拌しながら可溶性成分を溶出した後、濾過して抽出残渣を除くことにより抽出液を得ることができる。
【００２８】
カミツレの抽出物としては、カミツレから抽出して得られた抽出液をそのまま用いてもよく、例えば、さらに希釈、濃縮、乾燥、ろ過、精製等の処理を行ったものを用いてもよい。
【００２９】
抽出溶媒としては、例えば、水系溶媒、親水性有機溶媒等であってよい。水系溶媒としては、例えば、純水、精製水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等が挙げられる。親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられる。抽出溶媒は、これらの１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３０】
発酵は、ラクトバチルス・クンキーを用いて行うことができる。本実施形態に係る発酵物を得るために用いられるラクトバチルス・クンキーは、グルコース及びフルクトースに対する資化性を示すものであることが好ましく、グルコース、フルクトース、スクロース、トレハロース及びグルコン酸塩に対する資化性を示すものであることが好ましい。ラクトバチルス・クンキーは、ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ４０２であってもよい。ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ４０２は、２０１１年１０月３日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１７７として寄託されており、入手可能である。また、当該菌株は、現在国際寄託に移管されており、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３９である。
【００３１】
発酵に用いるラクトバチルス・クンキーの培養は、常法に従って行うことができる。培地は、当該菌が培養できるものであれば特に制限はなく、天然培地、合成培地、半合成培地等を用いることができる。培地としては、窒素源及び炭素源を含有するものを使用することができ、窒素源としては、肉エキス、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、グルテン、大豆粉、大豆加水分解物、アミノ酸等が挙げられ、炭素源としては、グルコース、ラクトース、フラクトース、イノシトール、ソルビトール、水飴、澱粉、麹汁、フスマ、バカス、糖蜜等が挙げられる。その他、無機質（例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、炭酸カルシウム、鉄、マンガン、モリブデン）、各種ビタミン類などを添加することができる。
【００３２】
培養温度は、例えば４〜４５℃であってよく、２５〜４０℃であることが好ましく、２８〜３３℃であることがより好ましい。培養時間は例えば８〜７２時間であってよい。培養は、通気振とう又は通気攪拌して行ってもよい。培地のｐＨは、例えば４．０〜９．０であってよく、６．０〜８．０であることが好ましい。培養方法としては、例えば、ＭＲＳ培地に菌体を植菌し、３０℃で４８時間培養することが挙げられる。
【００３３】
ラクトバチルス・クンキーを培養して得た菌液は、そのまま蜂蜜及びカミツレ原料を含む発酵培地に播種して発酵に用いてもよく、培地等で希釈して用いてもよい。
【００３４】
ラクトバチルス・クンキーによる蜂蜜及びカミツレ原料の発酵は、例えば、４〜４５℃で行うことができ、２５〜４０℃で行うことが好ましい。発酵時間は例えば１２〜６０時間であってよく、２４〜４８時間であることが好ましい。発酵開始時の蜂蜜含有物のｐＨは、例えば３〜８であってよく、４〜６であることが好ましい。発酵は、通気振とう又は通気攪拌して行ってもよい。
【００３５】
蜂蜜及びカミツレ原料の発酵は、蜂蜜及びカミツレ原料を含む発酵培地中でラクトバチルス・クンキーを培養することにより行うことができる。蜂蜜及びカミツレ原料を含む発酵培地は、ラクトバチルス・クンキーが発酵できる形態であればよく、例えば、液体、ペースト、ゲル等の形態であってよい。発酵培地は、例えば水等の溶媒に蜂蜜及びカミツレ原料を溶解又は懸濁させたものであってよい。
【００３６】
発酵開始時の発酵培地中の蜂蜜濃度は、発酵培地全量に対して、例えば０．１〜４０％であってよく、１〜３０％であってよく、８〜１３％であってもよい。また、発酵開始時の発酵培地中の蜂蜜濃度は、固形分として、発酵培地全量に対して、例えば０．０８〜３２％であってよく、０．８〜２４％であってよく、６．４〜１０．４％であってもよい。
【００３７】
発酵開始時の発酵培地中のカミツレ原料濃度は、固形分として、発酵培地全量に対して、例えば０．０１〜２０％であってよく、０．１〜５％であってよく、０．５〜２％であってもよい。発酵開始時の発酵培地中の蜂蜜（全量）とカミツレ原料（乾燥質量）との質量比は、例えば４０００：１〜１：２００であってよく、２６：１〜４：１であってよい。発酵培地は、さらに、例えばビタミン類、アミノ酸類、ミネラル類、塩類、界面活性剤、脂肪酸、金属類等の乳酸菌の培養に必要とされている公知の栄養素を含んでいてよい。発酵に用いる蜂蜜は加熱等により滅菌処理されていてもよい。
【００３８】
本実施形態に係る発酵物は、発酵により得られたものそのままであってもよく、加熱、ろ過、精製、濃縮、蒸発乾固、凍結乾燥、スプレードライ等の処理が施されたものであってもよい。本実施形態に係る発酵物は、ラクトバチルス・クンキーの生菌体及び／又は死菌体を含んでいてもよく、ろ過等により菌体が分離除去されていてもよい。本実施形態に係る発酵物は、発酵培地に蜂蜜を含むため、原料の蜂蜜よりもビタミン、アミノ酸等の成分が増加し、原料の蜂蜜に含まれていなかった有機酸が産生していること等が期待できる。
【００３９】
本実施形態に係る発酵物は、オクルディン、クローディン−１、クローディン−４、タイトジャンクションタンパク質−１、タイトジャンクションタンパク質−２、タイトジャンクションタンパク質−３、ＩＩＩ型コラーゲンα１鎖、ＩＶ型コラーゲン、アクアポリン３、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ２及びＴＩＭＰ（組織メタロプロテアーゼ阻害物質）２からなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質の産生促進作用を有する。したがって、本実施形態に係る発酵物は、オクルディン産生促進用、クローディン−１産生促進用、クローディン−４産生促進用、タイトジャンクションタンパク質−１産生促進用、タイトジャンクションタンパク質−２産生促進用、タイトジャンクションタンパク質−３産生促進用、ＩＩＩ型コラーゲンα１鎖産生促進用、ＩＶ型コラーゲン産生促進用、アクアポリン３産生促進用、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ２産生促進用及び／又はＴＩＭＰ２産生促進用としても好適である。また、上記発酵物は、これらのタンパク質をコードする各遺伝子の発現促進用としても好適である。
【００４０】
本実施形態に係る発酵物は、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、シクロオキシゲナーゼ２及びマトリックスメタロプロテアーゼ−９からなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質の産生抑制作用を有する。したがって、本実施形態に係る発酵物は、インターロイキン−１α産生抑制用、インターロイキン−１β産生抑制用、シクロオキシゲナーゼ２産生抑制用及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ−９産生抑制用として好適である。また、上記発酵物は、これらのタンパク質をコードする各遺伝子の発現抑制用としても好適である。
【００４１】
上記各種タンパク質については以下のことが知られている。オクルディン、クローディン−１、クローディン−４、タイトジャンクションタンパク質−１、タイトジャンクションタンパク質−２及びタイトジャンクションタンパク質−３は、タイトジャンクション構成タンパク質であり、バリア機能に関与するとされている。タイトジャンクションが脆弱になると、水分蒸散亢進、保湿成分及びカルシウムイオンの流出、角層水分量に関わるフィラグリン及び細胞間脂質の合成不良、角質肥厚等を引き起こし、乾燥肌、敏感肌、荒れ肌、肌の透明感のなさ、肌のくすみ等に繋がる。タイトジャンクションの強化により、乾燥肌、敏感肌、荒れ肌、及びくすみの予防、透明感の向上等の効果が期待できる。
【００４２】
ＩＩＩ型コラーゲンは、胎児の皮膚に多く含まれ、肌の弾力性を保つ役割を担っている。ＩＶ型コラーゲンは、表皮と真皮の間に存在する基底膜の主要な構成成分である。セリンパルミトイルトランスフェラーゼ２は、セラミドを合成する際の初発律速酵素である。ＴＩＭＰ２は、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）のインヒビターである。
【００４３】
インターロイキン−１α及びインターロイキン−１βは、免疫細胞の活性化を促し、炎症反応を引き起こすことが知られている。特にインターロイキン−１αは、角化細胞内に大量に存在している。シクロオキシゲナーゼ２は、炎症に関与するプロスタグランジンの合成酵素であり、紫外線等によって発現が上昇することが知られている。シクロオキシゲナーゼ２の産生低下は、メラノサイトに作用するプロスタグランジンの産生を抑制し、紫外線によるシミの産生を抑制する。
【００４４】
ＭＭＰ−９は、基底膜構成タンパク質を分解することが報告されており、紫外線で発現が上昇する。ＭＭＰ−９の増加を防ぐことにより、基底膜の破壊が抑制され、たるみ及びシワの形成が抑制される。また、基底膜の破壊を防ぐことにより、表皮で生成されたメラニンの真皮側への移行を防ぐことで、消えにくいシミの産生が抑制される。
【００４５】
したがって、本実施形態に係る発酵物は、皮膚改善作用、具体的には例えば、皮膚バリア機能改善作用、皮膚保湿作用、皮膚の弾力改善作用、皮膚のくすみ改善作用、皮膚のシワ改善作用、肌荒れ改善作用、皮膚の老化防止作用、肌の肌理改善作用及び敏感肌改善作用に優れる。そのため、本実施形態に係る発酵物は、例えば、皮膚バリア機能改善用、皮膚保湿用、皮膚の弾力改善用、皮膚のくすみ改善用、皮膚のシワ改善用、肌荒れ改善用、皮膚の老化防止用、肌の肌理改善用及び敏感肌改善用からなる群から選ばれる少なくとも一つとして好適である。皮膚の老化防止とは、例えば、皮膚のしわ、シミ、くすみ、たるみ、荒れ等の予防又は改善、肌理の改善などを含む。
【００４６】
本発明の一実施態様は、皮膚バリア機能改善、皮膚保湿、皮膚の弾力改善、皮膚のくすみ改善、皮膚のシワ改善、肌荒れ改善、皮膚の老化防止、肌の肌理改善及び敏感肌改善からなる群から選択される少なくとも一つに使用するための、ラクトバチルス・クンキーによって蜂蜜とカミツレ又はその処理物とを発酵して得られる発酵物である。
【００４７】
本発明の一実施態様は、ラクトバチルス・クンキーによって蜂蜜とカミツレ又はその処理物とを発酵して得られる発酵物を、それを必要とする対象に経口投与する工程、又当該対象の皮膚に適用する工程を含む、皮膚バリア機能改善方法、皮膚保湿方法、皮膚の弾力改善方法、皮膚のくすみ改善方法、皮膚のシワ改善方法、肌荒れ改善方法、皮膚の老化防止方法、肌の肌理改善方法及び敏感肌改善方法からなる群から選択される少なくとも一つである。
【００４８】
本発明の一実施態様は、皮膚バリア機能改善剤、皮膚保湿剤、皮膚の弾力改善剤、皮膚のくすみ改善剤、皮膚のシワ改善剤、肌荒れ改善剤、皮膚の老化防止剤、肌の肌理改善剤及び敏感肌改善剤からなる群から選択される少なくとも一つの製造における、ラクトバチルス・クンキーによって蜂蜜とカミツレ又はその処理物とを発酵して得られる発酵物の応用である。
【００４９】
本実施形態に係る発酵物は、そのまま化粧品、医薬品又は医薬部外品として用いてもよく、化粧品、医薬品又は医薬部外品の成分として用いてもよい。化粧品、医薬品又は医薬部外品は、例えば、溶液、乳液、軟膏、クリーム、ペースト、ゼリー、エアゾール、粉体、オイル、固形、フォーム等の形態であってよい。上記発酵物は、皮膚に直接、滴下、散布、塗布等により適用してもよく、経口投与されてもよい。本実施形態に係る発酵物は、皮膚外用剤であってよい。上記化粧品又は医薬部外品としては、例えば、化粧水、洗顔料、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス、美容液、パック、マスク、化粧油、軟膏等の基礎化粧品、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ、おしろい等のメークアップ化粧品、洗顔料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、シェービングクリーム、ボディソープ、ボディクリーム、石けん、シャンプー、リンス、へアートリートメント、日焼けローション、日焼け止めローション、日焼けクリーム、日焼け止めクリーム、日焼けジェル、日焼け止めジェル、整髪料、へアートニック剤、育毛剤、制汗剤、入浴剤、マウスリンス、マウスウォッシュ等が挙げられる。
【００５０】
本実施形態に係る発酵物を、化粧品、医薬品又は医薬部外品の成分として用いる場合、発酵物の含有量は、例えば化粧品、医薬品又は医薬部外品中の０．０１〜１００％であってよく、０．１〜５０％であることが好ましく、０．３〜３．０％であることがより好ましく、０．４〜１．５％であることが更に好ましい。
【００５１】
本実施形態に係る発酵物を、医薬品又は医薬部外品の成分として用いる場合、該医薬品又は医薬部外品は、他の成分として、例えば、薬学的に許容される成分（例えば、賦形剤、結合材、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤）を含んでいてもよい。
【００５２】
医薬品又は医薬部外品は、固体、液体、ペースト等のいずれの形状であってもよく、タブレット（素錠、糖衣錠、発泡錠、フィルムコート錠、チュアブル錠、トローチ剤等を含む）、カプセル剤、丸剤、粉末剤（散剤）、細粒剤、顆粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液、シロップ、ペースト、注射剤（使用時に、蒸留水又はアミノ酸輸液若しくは電解質輸液等の輸液に配合して液剤として調製する場合を含む）等の剤形であってもよい。これらの各種製剤は、例えば、有効成分である上記発酵物と、必要に応じて他の成分とを混合して上記剤形に成形することによって調製することができる。
【００５３】
本実施形態に係る発酵物は、そのまま食品として用いてもよく、食品に添加して用いてもよい。上記発酵物を摂取することにより、上述の皮膚改善が期待できる。食品としては、食品の３次機能（体調調節機能）が強調されたものであることが好ましい。食品の３次機能が強調された食品としては、例えば、健康食品、機能性食品、栄養組成物(nutritional composition)、栄養補助食品、サプリメント、保健用食品、特定保健用食品、栄養機能食品、又は機能性表示食品等が挙げられる。
【００５４】
上記発酵物を食品に添加して用いる場合、食品は食品として許容される成分を含んでいてもよい。食品として許容される成分としては、例えば、ミネラル類、ビタミン類、フラボノイド類、キノン類、ポリフェノール類、アミノ酸、核酸、必須脂肪酸、清涼剤、結合剤、甘味料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤等が挙げられる。
【００５５】
食品としては以下のようなものが挙げられ、これらの製造工程中の中間製品、又は最終製品に、上記発酵物を混合して、上記の目的に用いられる食品を得ることができる：コーヒー、ジュース及び茶飲料等の清涼飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料、並びに、日本酒、洋酒、果実酒及びハチミツ酒等の酒などの飲料；カスタードクリーム等のスプレッド；フルーツペースト等のペースト；チョコレート、ドーナツ、パイ、シュークリーム、ガム、ゼリー、キャンデー、クッキー、ケーキ及びプリン等の洋菓子；大福、餅、饅頭、カステラ、あんみつ及び羊羹等の和菓子；アイスクリーム、アイスキャンデー及びシャーベット等の氷菓；カレー、牛丼、雑炊、味噌汁、スープ、ミートソース、パスタ、漬物、ジャム等の調理済みの食品；ドレッシング、ふりかけ、旨味調味料及びスープの素等の調味料。
【００５６】
本実施形態に係る発酵物からなる食品、化粧品、医薬品若しくは医薬部外品、又は該発酵物を含む食品、化粧品、医薬品若しくは医薬部外品は、皮膚バリア機能改善用、皮膚保湿用、皮膚の弾力改善用、皮膚のくすみ改善用、皮膚のシワ改善用、肌荒れ改善用、皮膚の老化防止用、肌の肌理改善用及び敏感肌改善用からなる群から選択される少なくとも一つであってよい。また、当該食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品は、オクルディン産生促進用、クローディン−１産生促進用、クローディン−４産生促進用、タイトジャンクションタンパク質−１産生促進用、タイトジャンクションタンパク質−２産生促進用、タイトジャンクションタンパク質−３産生促進用、ＩＩＩ型コラーゲンα１鎖産生促進用、ＩＶ型コラーゲン産生促進用、アクアポリン３産生促進用、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ２産生促進用及び／又はＴＩＭＰ２産生促進用であってよく、これらのタンパク質をコードする遺伝子の発現促進用であってよい。また、上記食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品は、インターロイキン−１α産生抑制用、インターロイキン−１β産生抑制用、シクロオキシゲナーゼ２産生抑制用及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ−９産生抑制用であってよく、これらのタンパク質をコードする遺伝子の発現抑制用であってもよい。
【００５７】
本実施形態に係る発酵物からなる、又は該発酵物を含む食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品には、例えば、タイトジャンクションの改善；細胞間隙経路の透過性改善；美肌；皮膚の保湿；皮膚の弾力やハリの低下、皮膚の乾燥、肌荒れ、シワ、老化の防止；肌の引き締め；肌の肌理、くすみの改善；敏感肌の改善；光老化の防止；等の表示が付されていてもよい。なお、光老化防止とは、具体的には、紫外線等の光の影響によるシミ、シワ等の症状を予防又は改善することをいう。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００５９】
［蜂蜜及びカミツレ花末の発酵液の調製］
ルーマニア産アカシア蜂蜜（山田養蜂場社）を１０％（ｗ／ｗ）、カミツレ花末を１％（ｗ／ｗ）含む水溶液（ｐＨ５）を調製した。該水溶液を１１０℃で５分間処理して滅菌し、発酵前液を得た。【００６０】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＢＰＳ４０２をＭＲＳ寒天培地で３０℃、４８時間、静置培養した。形成したコロニーから、一白金耳を発酵前液５０ｍＬに植菌し、３０℃、２４時間振とう培養することで、前培養液を得た。【００６１】
上記発酵基質含有液１０００ｍＬに、上記前培養液を１ｍＬ播種し、至適温度にて２４時間振とう培養した。得られた発酵液を５分間１１０℃で処理して滅菌後、ろ過し、フェノキシエタノールを０．５％の濃度になるように添加して、試験用の蜂蜜及びカミツレ花末の発酵液を得た。【００６２】
［ＤＮＡマイクロアレイ試験］
ヒト皮膚三次元モデルキット（ＥＦＴ−４１２、クラボウ社製）を用いてＤＮＡマイクロアレイ試験を行った。プロトコールに従い、皮膚モデルを６ウエルプレートへ移し、アッセイ培地を用いて３７℃で一晩、５％ＣＯ２下で前培養を行った。前培養後、上記発酵液を角層側に２００μＬ添加し、真皮側にはアッセイ培地を２．５ｍｌ添加し、３日間培養を続けた。培養終了後、皮膚組織をＰＢＳ（−）にて洗浄し、デルマパンチ（直径８ｍｍ）を用いて組織を回収後、ＤＮＡマイクロアレイ解析を実施した。コントロールとしてフェノキシエタノール０．５％を添加した精製水を用い、同様に解析を行った。また、被検物質による皮膚三次元モデルに対する細胞毒性を、ＭＴＴ法により評価した。【００６３】
４２４５０個の遺伝子について網羅的解析を行った結果、コントロールと比較して、発酵液処理によって発現が１．５倍以上に上昇した遺伝子は３０１２遺伝子、２分の１以下に減少した遺伝子は２８２６遺伝子であった。この中から、皮膚機能に関する遺伝子として、表１のとおり１５のタンパク質をコードする遺伝子が抽出された。上記発酵液による細胞毒性は確認されなかった。【００６４】
【表１】
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【００６５】
表１に示したとおり、蜂蜜及びカミツレ花末発酵液では、タイトジャンクション構成タンパク質、コラーゲン、アクアポリン３、セラミド合成律速酵素等の、肌の水分保持又はバリア機能の向上に関与するタンパク質をコードする遺伝子において、精製水と比較して１．５倍以上の有意な発現上昇が確認された。一方、炎症反応に関与するインターロイキン１、紫外線で上昇することが報告されているシクロオキシゲナーゼ−２、及び皮膚基底膜構成タンパク質を分解するＭＭＰ−９をコードする各遺伝子については、蜂蜜及びカミツレ花粉末発酵液が発現を有意に抑制することが確認された。【００６６】
［タンパク質産生促進試験］
被験物質として、上記蜂蜜及びカミツレ花末発酵液、及び１０％蜂蜜水（ルーマニア産アカシア蜂蜜１０％、精製水９０％）を用いた。さらにこれらの被験物質の濃度を１．０％又は０．５％に調整した水溶液を以下の試験に用いた。【００６７】
＜オクルディン産生促進試験＞
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、ＫＧＭで溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞をプレートに固定させ細胞表面に発現したオクルディンの量を、ポリクローナル抗ヒトオクルディン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。オクルディン産生促進率の計算方法は以下のとおりである。結果を表２に示す。
オクルディン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験試料無添加時（コントロール）の波長４０５ｎｍにおける吸光度【００６８】
【表２】
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【００６９】
蜂蜜及びカミツレ花末発酵液に、０．５％及び１．０％の濃度で高いオクルディン産生促進作用が認められた。【００７０】
＜クローディン−４産生促進試験＞
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、ＫＧＭで溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞をプレートに固定させ細胞表面に発現したクローディン−４の量を、モノクローナル抗ヒトクローディン−４抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。クローディン−４産生促進率の計算方法は以下のとおりである。結果を表３に示す。
クローディン−４産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験試料無添加時（コントロール）の波長４０５ｎｍにおける吸光度【００７１】
【表３】
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【００７２】
蜂蜜及びカミツレ花末発酵液に、０．５％及び１．０％の濃度の濃度でクローディン−４産生促進作用が認められた。【００７３】
＜タイトジャンクションタンパク質−２産生促進試験＞
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、ＫＧＭで溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞をプレートに固定させ細胞表面に発現したＺＯ−２の量を、ポリクローナル抗ヒトＺＯ−２抗体を用いたＥＬＩＺＡ法により測定した。なお、タイトジャンクションタンパク質−２は、ＺＯ−２とも呼ばれている。ＺＯ−２産生促進率の計算方法は以下のとおりである。結果を表４に示す。
ＺＯ−２産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験試料無添加時（コントロール）の波長４０５ｎｍにおける吸光度【００７４】
【表４】
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【００７５】
蜂蜜及びカミツレ花末発酵液に、０．５％濃度でのＺＯ−２産生促進作用が認められた。【００７６】
上述のとおり、蜂蜜及びカミツレ花末発酵液では、オクルディン及びクローディン−４の産生促進作用は０．５％及び１．０％の濃度で認められ、ＺＯ−２は０．５％の濃度で産生促進作用が認められた。一方、１０％蜂蜜水は、１．０％の濃度でオクルディン産生を増加させたが、クローディン−４及びＺＯ−２の産生量には影響を与えなかった。
【国際調査報告】
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