(57)【要約】多発性骨髄腫をはじめとする種々のがんに有用なフェニルフタルイミド修飾体として、下記の一般式で示されるフェニルフタルイミド修飾体を提供する。2018074563.tif 000034  式中、R1は4位又は5位に結合したPEGを含む基又はヒドロキシC1-5アルコキシ基であり、R2は6位のアミノ基であり、R3とR4は独立して、水素原子、アルキル基、アリール基、アラルキル基、又はアリールオキシ基である。
2018074563.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式で示されるフェニルフタルイミド修飾体。
【化１】
2018074563.tif 000033
式中、R1は4位又は5位に結合したPEGを含む基又はヒドロキシC1-5アルコキシ基であり、R2は6位のアミノ基であり、R3とR4は独立して、水素原子、アルキル基、アリール基、アラルキル基、又はアリールオキシ基である。
【請求項２】
R1が、PEGを含む基である請求項１に記載の修飾体。
【請求項３】
R1が、エステル結合を介してPEGをフタルイミド環に結合する基である請求項２に記載の修飾体。
【請求項４】
R1が、ヒドロキシC1-5アルコキシ基である請求項１に記載の修飾体。
【請求項５】
R1が、5位に結合する請求項１〜４のいずれか１項に記載の修飾体。
【請求項６】
R3及びR4が共にイソプロピル基であり、2'位及び6'位に存在する請求項１〜５のいずれか１項に記載の修飾体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の修飾体を含む医薬組成物。
【請求項８】
抗癌剤である、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
抗癌剤が多発性骨髄腫用である、請求項８記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なフェニルフタルイミド修飾体及びそれを有効成分とする医薬組成物に関する。より詳しくは、ポリエチレングリコール(PEG)又はヒドロキシアルコキシ基で修飾されたフェニルフタルイミド修飾体、その製造方法、及び該フェニルフタルイミド修飾体を含有する、抗癌剤などの医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液がんの約10%を占める多発性骨髄腫(Multiple Myeloma; 以下MM)は、予後不良の血液疾患の一つで、終末分化したBリンパ球(形質細胞)の単クローン性異常増殖を特徴とする造血器腫瘍である。MMは、骨融解病変、造血障害(特に貧血)、高カルシウム血症、腎障害、免疫不全、髄外性形質細胞腫等、特徴ある多様な症状を呈する。国内のMMの推定患者数は14,000人、毎年新たに診断される患者数は約4,000人で、年間死亡数は4,066人である。MMは高齢者に多く、今後わが国が超高齢化社会を迎えるに当たって患者数は着実に増加すると思われる。全世界では、MMの患者数は75万人にも上る。【０００３】
近年では造血器腫瘍のうち悪性リンパ腫や白血病の多くの症例が治癒に至るのに対し、MMや骨髄異形成症候群(MDS)は、高齢者に多い疾患であることもあって移植適応とならない症例も多く、いまだに治癒困難な疾患である。サリドマイドが奇形誘因原因物質として特定され、薬剤としては市場撤退を余儀なくされたが、MMに対しては有効であるというデータ報告とともに、厳しい使用制限下、臨床試験が行われ、その有効性が認められるに至った(非特許文献１; 非特許文献２)。最近、催奇形性因子としてサリドマイドに結合するタンパク質セレブロン（cereblon；CRBN）が同定された（非特許文献３）。更に、immunomodulatory  drugs(IMiDs)と呼ばれるサリドマイド類似の化合物（レナリドミド、ポマリドミド）の登場で、MMという難治性疾患に対する対策もされてきた（非特許文献４; 非特許文献５; 非特許文献６）。しかし、いずれの症例も数年先にはこれら新規薬剤にも耐性となり、大半の症例は致命的となる。とくに、第13番染色体欠失(del13)、t(4;14)転座あるいは第17番染色体欠失(del17)を有するハイリスク骨髄腫の予後は不良であり、特にTP53遺伝子が存在する第17番染色体の欠失(del17)を有する症例は新規薬剤を用いても絶対予後不良である(非特許文献７; 非特許文献８; 非特許文献９)。その後、プロテアソーム阻害剤のボルテゾミブ(非特許文献１０)やカルフィルゾミブ(非特許文献１１)も開発されてきている。更に、他の機序による薬剤（anti-CD38；daratumumab）の中には、単剤（非特許文献１２)あるいはレナリドミド併用により有効性が認められるものも存在する。また、抗CD38抗体（daratumumab）と抗PD-L1抗体（atezolizumab）の併用投与も実施されている。しかし、抗体医薬品は高価なうえに注射薬で経口服用ができないものであり、患者の利便性を考えると必ずしも最適とは言い切れない。【０００４】
かかる現状打破のために、ハイリスク染色体異常を有する症例に対しても有効な新規化合物を探索し、予後の改善を目指す必要がある。これまで本発明者らは、多数のフタルイミド誘導体を合成し、独自に樹立したハイリスク骨髄腫細胞株も含めた多くの骨髄腫細胞株パネルを用いて、それらの増殖抑制を指標に薬効の高い化合物TC11(2-(2,6-di-isopropylphenyl)-5-amino-1H-isoindole-1,3-dione; 図１)を見出した(非特許文献１３; 特許文献１)。TC11はフタルイミド環とジイソプロピルフェニル基を基本骨格とし、フタルイミド環の5位にアミノ基を有する(非特許文献１４; 非特許文献１５; 特許文献２)。一方で、TC11はサリドマイドやレナリドミド等のCRBN結合部位であるグルタルイミド環をもたない(非特許文献６)。TC11の標的タンパク質として細胞分裂期に中心体に局在し、中心体複製を制御する機能をもつnucleophosmin 1 (NPM1/B23.1) およびα-tubulinが同定された(非特許文献１１)。腫瘍細胞をTC11で処理すると、TC11が中心体のクラスター化を阻害し、その結果、分裂期細胞の多極化を引き起こし、さらに多核化を引き起こして、アポトーシスを誘導することがわかった(非特許文献１１)。同様なアポトーシス誘導現象は、HeLa細胞を用いたNPM1のsiRNAによるノックダウン実験によっても観察された。また、本発明者らはレナリドミド、サリドマイド耐性のMMに対してもTC11が有効であることを免疫不全マウスを用いたヒトMM xenograftモデルで明らかにした（非特許文献１６）。【０００５】
PEGは無毒性かつ非免疫原性の高分子であり、用途に応じてサイズや側鎖構造を変化することができるという特徴を有する。近年、この特徴を利用して、生体内での安定性が悪いタンパク質やペプチドの薬物動態特性や免疫特性の改善や、ターゲティング等の方法として、目的タンパク質やペプチドへのPEG修飾が注目され用いられている(非特許文献１７)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2010/061862A1
【特許文献２】JP 10-109975A
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Singhal, S. et al., N. Engl. J. Med., 341: 1565-1571, 1999
【非特許文献２】Hattori, Y. et al., Cancer Sci., 99,1243-1250, 2008
【非特許文献３】Ito, T. et al., Science, 327: 1345-1350, 2010
【非特許文献４】Dimopoulos, M. et al., N. Engl. J. Med., 357: 2123-2132, 2007
【非特許文献５】Weber, DM. et al., N. Engl. J. Med., 357: 2133-2142, 2007
【非特許文献６】Chamberlain, PP. et al., Nature Struct. Mol. Biol., 21: 803-809, 2014
【非特許文献７】Avet-Loiseau, H. et al., Blood, 109, 3489-3496, 2007
【非特許文献８】Avet-Loiseau, H. et al., Leukemia, 24, 623-628, 2010
【非特許文献９】Klein, U. et al., Cancer, 117, 2136-2144, 2011
【非特許文献１０】Jagannath, S. et al., Leukemia：21, 151-157, 2007
【非特許文献１１】Siegel, DS. et al., Blood, 120: 2817-2825, 2012
【非特許文献１２】Lokhorst, HM. et al., New Engl. J. Med., 373: 1207-1219, 2015
【非特許文献１３】Shiheido, H. et al., PLoS One, 7: e38878, 2012
【非特許文献１４】Shibata, Y. et al., Chem. Pharm. Bull., 44: 156-162, 1996
【非特許文献１５】Noguchi, T. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 15: 5509-5013, 2005
【非特許文献１６】Matsushita, M. et al., PLoS One, 10: e0116135, 2015
【非特許文献１７】Pasut, G., Veronese, FM., Adv.Drug Del. Rev., 61, 1177-1188, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新規フェニルフタルイミド修飾体を提供することを目的とする。本発明は、又、該新規修飾体を含有する医薬組成物を提供することを目的とする。本発明は、又、該新規修飾体を含有するMMをはじめとする種々のがんや免疫異常症の治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
TC11は、薬剤として開発するにあたっては、水溶性の低さが課題であった。腫瘍移植マウスモデルにおいて、TC11を腹腔内注射した際に大半が吸収されずに腹腔内に残存していることが観察されている。その結果、製剤化にあたり水溶性の向上が必要になった。まず、TC11の水溶性向上実験として、フタルイミド環についているアミノ基の塩酸やマレイン酸による塩形成を試みた。しかし、TC11の塩形成はほとんど認められなかった。それ故、PEG、ヒドロキシアルコキシ、糖類、糖質等による修飾により、TC11の水溶性の向上および血中動態と薬効の改善を目指した。【００１０】
これらの試行錯誤の結果、本発明者らは、合成が容易であり、水溶性と血中動態が格段に向上し、毒性が低く、催奇形性等の副作用もなく、ハイリスク染色体異常を有するMMをはじめとする種々のがんや免疫異常症にも薬効の高いフェニルフタルイミド修飾体を見出し、本発明を完成した。【００１１】
本発明は、下記の一般式で示されるフェニルフタルイミド修飾体を提供する。
【化１】
2018074563.tif 000003
式中、R1は4位又は5位に結合したPEGを含む基又はヒドロキシC1-5アルコキシ基であり、R2は6位のアミノ基であり、R3とR4は独立して、水素原子、アルキル基、アリール基、アラルキル基、又はアリールオキシ基である。【００１２】
R1は、PEGを含む基であることが好ましく、エステル結合を介してPEGをフタルイミド環に結合する基であることがさらに好ましい。R1は、ヒドロキシC1-5アルコキシ基であってもよい。また、R1は5位に結合することが好ましい。R3及びR4が共にイソプロピル基であり、2'位及び6'位に存在することが好ましい。【００１３】
また、本発明は、上記の修飾体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、好ましくは抗癌剤である。抗癌剤は多発性骨髄腫用であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の修飾体は、合成が容易であり、水溶性と血中動態が格段に向上し、毒性が低く、催奇形性等の副作用もなく、ハイリスク染色体異常を有するMMをはじめとする種々のがんや免疫異常症にも薬効が高く、医薬品として有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】TC11、HOEtO-TC11及びPEG11(E)-TC11の化学構造。
【図２】PEG11(E)-TC11(A)とPEG11(O)-TC11(B)のマウス血中での安定性。
【図３】PEG11(E)-TC11のマウス血漿中(A)および培地中(B)での安定性。
【図４】TC11とその修飾体PEG11(E)-TC11およびHOEtO-TC11のハイリスクMM細胞株(KMS21)に対するin vitro細胞増殖阻害活性の濃度依存性。
【図５】PEG11(E)-TC11(A)とレナリドミド(B)の種々のMM細胞に対するin vitro細胞増殖阻害活性。
【図６】PEG11(E)-TC11とTC11のハイリスクMM細胞(KMS34)と骨髄間質細胞由来の正常細胞(WT)に対するin vitro細胞増殖阻害活性。
【図７】TC11とPEG11(E)-TC11によるハイリスクMM細胞(MUM24)のアポトーシス誘導。
【図８】TC11とPEG11(E)-TC11の細胞周期に対する効果。
【図９Ａ】タンパク質セレブロン(CRBN)とサリドマイドおよびTC11との相互作用のプルダウン実験(A)（電気泳動写真）。
【図９Ｂ】CRBNとサリドマイドおよびレナリドミドとの相互作用の表面プラズモン共鳴バイオセンサーグラム(B)。
【図９Ｃ】CRBNとTC11およびその修飾体であるPEG11(E)-TC11、PEG11(O)-TC11、HOEtO-TC11との相互作用の表面プラズモン共鳴バイオセンサーグラム(C)。
【図１０】TC11(A)およびPEG11(E)-TC11(B)のマウス単回腹腔内投与時のマウス血中動態。
【図１１】KMS11担癌マウスに対するTC11、PEG11(E)-TC11、PEG11(O)-TC11の抗腫瘍効果。
【図１２】KMS11坦癌マウスに対するTC11、HOEtO-TC11、Lenalidomideの抗腫瘍    効果の比較。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
TC11は抗がん作用を有し、特に骨髄腫に対して薬効が高いことが知られている(非特許文献１３)。TC11の標的タンパク質として細胞分裂期に中心体に局在し、中心体複製を制御する機能をもつnucleophosmin 1 (NPM1/B23.1) およびα-tubulinが同定されている(非特許文献１３)。腫瘍細胞をTC11で処理すると、TC11が中心体のクラスター化を阻害し、その結果、分裂期細胞の多極化を引き起こし、さらに多核化を引き起こして、アポトーシスを誘導することがわかった(非特許文献１３)。同様なアポトーシス誘導現象は、HeLa細胞を用いたNPM1のsiRNAによるノックダウン実験によっても観察されている。さらに、TC11とNPM1のリン酸化との関連性についても研究され、TC11によりNPM1のSer4, Thr95, Thr199のリン酸化が経時的に亢進することが明らかにされている。NPM1のリン酸化酵素の１つにCyclin-dependent kinase 1 (CDK1)があるが、この阻害剤であるCGP74514A処理により、TC11によるNPM1のリン酸化亢進が抑制され、NPM1のリン酸化の亢進にはCDK1が関与することが判明した。
【００１７】
一方、Blue native PAGE法により、TC11はNPM1のoligomerizationを阻害することが判明した。NPM1はoligomer形成を通じて細胞生物学的機能を発揮すると考えられるが、TC11はその機能を抑制すると考えられる。また、TC11はα-tubulinの重合を阻害する。その結果、分裂期細胞死 (mitotic catastrophe)が誘導されると推測される。以上より、TC11は(1)NPM1のoligomerization阻害、(2)α-tubulinの重合を阻害、さらにCGP74514AはTC11によるアポトーシス誘導を抑制したことから(3) CDK1の過剰な活性化による細胞死の誘導等、多彩な機構により骨髄腫細胞のアポトーシスを誘導すると考えられる。
【００１８】
本発明者らはTC11がポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシアルコキシ、グルコース等の糖類、糖質等で修飾された種々の誘導体を合成し、それらのMMをはじめとする種々のがんの増殖抑制活性を鋭意探索した。具体的には、下記一般式で示されるフェニルフタルイミド誘導体について検討した。
【００１９】
【化２】
2018074563.tif 000004
式中、R1はPEG基がフタルイミド環の4位、5位、6位、7位のいずれかにエステル基若しくはエーテル基を介して結合するもの、R1はヒドロキシC1-5アルコキシ基がフタルイミド環の4位、5位、6位、7位のいずれかに結合するもの、又は、R1は単糖類、単糖類の誘導体、二糖類、多糖類、糖アルコールがフタルイミド環の4位、5位、6位、7位のいずれかに結合するものを表す。R2はアミノ基、水酸基、ニトロ基、O-アルキル基、S-アルキル基を表し、フタルイミド環の6位又は5位に位置するものを表す。R3とR4は同じでも異なっていてもよく、水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルキルチオ基、アラルキル基、アリールオキシ基を表す。
【００２０】
上記の一般式において、R2が6位のアミノ基であり、R1が4位又は5位に結合したPEGを含む基又はヒドロキシC1-5アルコキシ基であり、R3とR4は水素原子、アルキル基又はアリール基である修飾体が、in vitroのがん増殖抑制作用およびxenograft modelを用いたin vivo抗腫瘍活性を有することを見出した。また、PEGの結合様式により、特別な血中動態が観察されることを見出した。これらの化合物は今までに合成されておらず、全く新規なTC11修飾体である。
【００２１】
＜１＞本発明の修飾体
上記一般式中、R1は4位又は5位に結合したPEGを含む基又はヒドロキシC1-5アルコキシ基であり、R2は6位のアミノ基であり、R3とR4は独立して、水素原子、アルキル基、アリール基、アラルキル基、又はアリールオキシ基である。
【００２２】
R1はPEGを含む基であってよい。「PEG」とは、通常、構造式CH3O(CH2CH2O)nHにおいてnが5〜15(好ましくは6〜15、さらに好ましくは8〜13)のPEGを表す。PEGは、末端の酸素原子を介して直接にフタルイミド環に結合してもよいし（エーテル結合を介した結合）、２価の有機基を介してフタルイミド環に結合してもよい。このような有機基としては、修飾体の抗癌活性を妨げない限り、任意の有機基を使用することでき、通常には、途中の酸素原子がエステル基で置き換えられているポリオキシアルキレンを使用できる（エステル結合を介した結合）。アルキレンの炭素数は通常２〜４であり、重合度は通常２〜３である。例えば、ポリオキシエチレンの場合には、-CH2-CH2-C(O)-O-CH2-CH2-O-の構造が挙げられる。
【００２３】
PEGのフタルイミド環に結合する側でない末端は、OHでも、炭素数１〜３のアルキル基であってもよい。通常にはメチル基である。
【００２４】
R1は、途中の酸素原子がエステル基で置き換えられているポリオキシアルキレンを介して、すなわち、エステル結合を介してPEGをフタルイミド環に結合する基であることが好ましい。ヒドロキシアルコキシ-TC11はPEG11(E)-TC11が生体内のエステラーゼで加水分解されると生成する化合物である。したがって、エステル結合を介した結合の場合、生体内での加水分解により、より望ましい薬物動態を示し得ると考えられる。ヒドロキシアルコキシ誘導体も抗がん作用を示すため、R1は、ヒドロキシC1-5アルコキシ基であってもよい。ヒドロキシアルコキシ基の炭素数は、好ましくは１〜３であり、さらに好ましくは２である。
【００２５】
R1の具体例としては、CH3O(CH2CH2O)nCH2CH2O-、CH3O(CH2CH2O)nCH2CH2C(O)OCH2CH2O-が挙げられる。ｎは上述の通りである。
R1は5位に結合することが好ましい。
【００２６】
R2は、6位に結合するアミノ基である。修飾体が抗癌活性を示すには、フタルイミド環の6位にアミノ基が存在することが必要と考えられる。このアミノ基の効果を妨げないため、R1基は5位又は4位に結合させる。なお、フタルイミド環は対称であるため、6位と5位又は4位との関係は、5位と6位又は7位との関係と等価である。
【００２７】
R3とR4は独立して、水素原子、アルキル基、アリール基、アラルキル基、又はアリールオキシ基である。
【００２８】
アルキル基は、通常、炭素数1から6（好ましくは1〜3）のアルキル基である。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、t-ブチル基等が挙げられる。
【００２９】
アリール基は、通常、炭素数６〜１０のアリール基である。例えば、フェニル基が挙げられる。アリールは、アルキル基で置換されていてもよい。このアルキル基は上記アルキルと同様でよい。
【００３０】
アラルキル基は、アルキル部分が炭素数1から6（好ましくは1〜3）のアラルキル基である。アリール部分は、上記アリール基と同様でよい。例えば、ベンジル基、フェネチル基等が挙げられる。
【００３１】
アルキル基、アラルキル基におけるアルキル部分は、直鎖でも分岐してもよい。
アリールオキシ基は、上記アリール基及びアラルキル基に酸素原子が結合したものでよい。
【００３２】
R3及びR4の位置は特に限定されず、例えば、R3が2’若しくは6’位でフェニル基で置換されるもの、若しくは4’位でオキシフェニル基で置換されるものが挙げられる。R3及びR4が共にイソプロピル基であり、2'位及び6'位に存在することが好ましい。
【００３３】
修飾体が抗癌活性を示すには、フェニル環側の構造が疎水性であることが必要と考えられる。そのため、上記のR3及びR4の範囲で抗癌活性が発揮されると推測される。したがって、フェニル環側はPEG化しない方がよいと推測される。後記実施例１４で示されるように、フェニル環側の構造は、タンパク質セレブロンに結合しない構造でもある。
【００３４】
本発明の修飾体は、既知の合成手法を組み合わせることにより製造できる。以下、具体例を挙げて説明する。
【００３５】
本発明のTC11がエステル結合を介してPEGによって修飾された(PEG11(E)-TC11)（図１）の製造方法の例として、修飾反応基としてmPEG11-COOHの場合、次に示す方法を用いることにより製造することができる。
【００３６】
【化３】
2018074563.tif 000005
【００３７】
【化４】
2018074563.tif 000006
【００３８】
本発明の化合物であるPEGで修飾されたPEG11(E)-TC11は、例えば、4-ヒドロキシフタル酸を硝酸グアニジンによりニトロ化し、4-ヒドロキシフタル酸の5-ニトロ体と3-ニトロ体の混合物にし、その混合物を五酸化リンにより脱水反応を行い、5-ニトロ体と3-ニトロ体のヒドロキシフタル酸無水物の混合物にすることができる。この混合物に2,6-ジイソプロピルアニリンを反応させ、ジイソプロピルフェニルフタルイミド誘導体(1aと1b)にすることができる。この混合物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、1aと１bを分離することができる。1aにエチレンブロモヒドリンを反応させ、ヒドロキシエトキシ-1aにすることができる。このヒドロキシエトキシ-1aをmPEG11-COOHでエステル化して、PEG11(E)-1aにし、Pd/C触媒存在下で水素ガスで接触還元することにより、最終的にPEG11(E)-TC11を得ることができる。
【００３９】
本発明のTC11がエーテル結合を介してPEGによって修飾されたPEG11(O)-TC11の製造方法の例として、例えば、修飾反応基としてmPEG11の場合、次に示す方法を用いることにより製造することができる。
【００４０】
【化５】
2018074563.tif 000007
【００４１】
先に合成したヒドロキシエトキシ-1aを塩化トシル(TsCl)でトシル化することにより、トシルエトキシ-1aを合成し、これにmPEG11を反応させて、PEG(O)-1aを得、最終的にPd/C触媒存在下で水素ガスによって接触還元すると、PEG11(O)-TC11を得ることができる。
他の置換基を有する修飾体、例えばPEG5(E)-TC11も出発材料等を適宜置き換えることで同様に製造できる。
【００４２】
＜２＞本発明の医薬組成物
本発明は、上記の修飾体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、好ましくは抗癌剤である。抗癌剤は多発性骨髄腫用であることが好ましい。
【００４３】
有効成分であるフェニルフタルイミド修飾体は、医薬的に許容可能な担体を用いて製剤（医薬組成物）にすることができる。医薬的に許容可能な担体としては、賦形剤または基剤などが挙げられる。また、製剤は、通常に用いられる添加剤を含んでいてもよい。剤形は、投与経路に応じて適宜選択される。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの製剤にして、経口投与してもよいし、注射剤、坐剤などの製剤にして、腹腔内や静脈内や皮下への注射により非経口投与することもできる。製剤には、有効成分のフェニルフタルイミド修飾体と、他の抗癌剤と別個に包装して一体としたものも包含される。本発明の抗癌剤は、抗癌剤治療を受けているまたは受ける予定の患者に投与することができる。これらのフェニルフタルイミド修飾体は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、他の抗癌剤）と組み合わせて使用してもよい。
【００４４】
フェニルフタルイミド修飾体の投与量は、対象とする抗癌剤治療、患者の状態などにより適宜選択される。例えば、上記フェニルフタルイミド修飾体をヒトに投与する場合には、１日あたり約0.1〜20 mg/kg（体重）、好ましくは１日あたり約0.1〜0.5 mg/kg（体重）の投与量で、１回または数回に分けて経口投与および静脈内や皮下への非経口投与することができるが、その投与量や投与回数は、症状、年齢、投与方法などにより適宜変更しうる。
【００４５】
上記のフェニルフタルイミド修飾体は、特に、骨髄腫、悪性リンパ腫、白血病、骨髄異形成症候群などの造血器腫瘍や大腸癌、肺癌、腎細胞癌、乳癌、脳腫瘍、卵巣癌、メラノーマ、胃癌、前立腺癌などの固形癌などの癌の治療に利用することができる。特に、多発性骨髄腫に用いることが有利である。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例により本発明を詳細に説明する。これらは本発明の好ましい実施態様であり、これらの実施例によって限定されるものではない。【００４７】
実施例１
PEG11(E)-TC11の合成【００４８】
工程１
4-ヒドロキシフタル酸のニトロ化
300 ml三ツ口フラスコに４-ヒドロキシフタル酸（2.5 g, 13.73 mmol）を入れ、ガラス棒で塊をくだき出来るだけ細かい粉末にする。85%硫酸（10 mlのH2Oに96%硫酸を加えて88 mlにする。）を88 ml加え、超音波、撹拌、あるいは塊をガラス棒で砕き、室温で完全に溶解させる。氷中で撹拌しながらグアニジン硝酸塩（1.68 g, 13.76 mmol）を少しずつ加えた後、氷冷しながらさらに３時間撹拌する。反応液を氷冷したH2O（400 ml）に空け、フラスコを80 mlの氷冷したH2Oで洗う。全量で550 mlくらいになる。1Lの分液ロートに空け、酢酸エチルで2回（170 ml×2）抽出した後、酢酸エチル層を飽和食塩水で2回（70 ml×2）洗い、無水硫酸ナトリウムで脱水した後ろ過し、ろ液を蒸発乾固させる。【００４９】
【化６】
2018074563.tif 000008
【００５０】
以上の工程で淡黄色粉末のニトロ化物3.66 g（13.15 mmol, 収量95.8%）が得られた。重メタノール中での1H-NMR測定の結果、反応生成物は5-ニトロ-4-ヒドロキシフタル酸と3-ニトロ-4-ヒドロキシフタル酸のほぼ1：1の混合物であることが明らかになった。【００５１】
シリカゲルTLC(展開溶媒：クロロホルム/メタノール=1：1)のRf値：原料(4-ヒドロキシフタル酸)は0.77、生成物の5-ニトロ体は0.3、3-ニトロ体は0.07。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): 5-ニトロ体:δ8.56 (s, 1H), 7.27 (s, 1H); 3-ニトロ体: δ8.00 (d, J =8.8 Hz, 1H), 7.14 (d, J =8.8 Hz, 1H)。
5-ニトロ体と3-ニトロ体の生成比は、1H NMRの測定から1:1であった。【００５２】
工程２
5-ニトロおよび3-ニトロ-4-ヒドロキシフタル酸無水物の合成
500 ml三ツ口フラスコに5-ニトロおよび3-ニトロ-4-ヒドロキシフタル酸の混合物（1.22 g, 5.37 mmol）を加え、ガラス棒で塊を砕き、減圧下１時間乾燥させた後、脱水トルエン（150 ml）を加える。しかし、ほとんど溶けないので超音波により出来るだけ均一な懸濁液にする。シカペント（14.4 g、P2O5として：10.8 g, 76.08 mmol）をビーカーに秤量し、直ちに窒素ガス下、ロートとスパーテルを用いてフラスコ内に加える。シカペントは非常に吸湿性なので素早く加える。残りの脱水トルエン（33 ml）でロートを洗い、アルゴンガス下、100℃で一昼夜加熱還流する。室温まで冷却後、反応液をろ別してトルエンで洗浄した後、ろ液（僅かに濁りがある）を蒸発乾固する。【００５３】
【化７】
2018074563.tif 000009
【００５４】
以上の工程で淡黄色粉末の反応生成物 571.6 mg（2.73 mmol, 収量50.8%）が得られた。
シリカゲルTLC(展開溶媒：クロロホルム/メタノール=1：1)のRf値：原料(5-ニトロ-4-ヒドロキシフタル酸)は0.27、(3-ニトロ-4-ヒドロキシフタル酸)は0.1、5-ニトロ-4-ヒドロキシフタル酸無水物は0.9、3-ニトロ-4-ヒドロキシフタル酸無水物は0.77。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): 5-ニトロ体:δ8.82 (s, 1H), 7.81 (s, 1H); 3-ニトロ体: δ8.14 (d, J =8.8 Hz, 1H), 7.70 (d, J =8.8 Hz, 1H)。
5-ニトロ体と3-ニトロ体の生成比は、1H NMRの測定から1:0.6であった。【００５５】
工程３
2,6-ジイソプロピルアニリンの付加
50 ml二口ナス型フラスコに、2,6-ジイソプロピルアニリン（587mg, 3.31mmol）を秤量し、酢酸（2 ml）を加えて撹拌し、5-ニトロおよび3-ニトロ-4-ヒドロキシフタル酸無水物の混合物（571.6 mg, 2.73 mmol）を残りの酢酸（11.5 ml）に溶かして加え、140℃で一昼夜加熱還流する。室温まで冷却後、反応液を75 mlのH2O（酢酸の約5倍量）に空ける。直ちにベージュ色の細かい沈殿が析出する。緩やかに30分撹拌し、析出した沈殿をろ別し（注）、100 mlの5%酢酸で洗った後、ろ紙ごと乾燥させる。【００５６】
【化８】
2018074563.tif 000010
【００５７】
以上の工程で薄茶色粉末687 mgが得られた。濾紙に付着している粉末は、酢酸エチルで溶かした後蒸発乾固して、同様の薄茶色粉末273 mgを得た。合わせて、0.96 g (2.61 mmol,収量95.6%)の生成物が得られた。重クロロホルム中での1H-NMR測定の結果、5-ニトロ体と3-ニトロ体のそれぞれに2,6-ジイソプロピルアニリンが付加した混合物(化合物1aと化合物1b)であった。【００５８】
シリカゲルTLC(展開溶媒：クロロホルム/メタノール=10：1)のRf値：原料（5-ニトロ-4-ヒドロキシフタル酸無水物）は0.14、(3-ニトロ-4-ヒドロキシフタル酸無水物)は0.07、生成物の1aは0.34、1bは0.17。【００５９】
（注）析出する沈殿は細かいのでろ別の際にかなりの目詰まりを起こしやすい。その場合は、酢酸エチルでの抽出を行った。酢酸エチル層には1aと1b、未反応のアニリン、酢酸が含まれるが、蒸発乾固で酢酸をなるべく除き、アニリンは次のシリカゲルクロマトの行程で除くことが出来た。【００６０】
1aと1bの混合物（0.96 g）を1.8 mlのクロロホルムに溶解し、シリカゲルをまぶした後、ヘキサン：酢酸エチル（40:1）中で膨潤させたシリカゲルカラム(φ3.5 cm × 10.5 cm; 100.8 ml)の上部に注入する。ヘキサン：酢酸エチル（10:1）で混在するアニリンを溶出させた後、ヘキサン：酢酸エチル（4:1）で溶出する。【００６１】
【化９】
2018074563.tif 000011
【００６２】
以上の工程でシリカゲルTLC （クロロホルム/メタノール=10：1）でRf=0.34の黄色物質が得られた。精製物は重クロロホルム中での1H-NMR測定により、1aと同定された。また、上記TLC条件下で、1aの単一スポットのみが確認された。収量は628.8 mg（31.8%）であった。【００６３】
1H NMR (400 MHz, CDCl3): 5-ニトロ体:δ8.76 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.48 (t, 7.6 Hz, 1H), 7.29 (d, J =7.6 Hz, 2H), 2.61 (sep, J =7.2 Hz, 2H), 1.16 (d, J =7.2 Hz, 12H); 3-ニトロ体:δ8.11 (d, J =8.8 Hz, 1H), 7.59 (d, J =8.8 Hz,1H), 7.48 (t, J =7.6 Hz, 1H), 7.30 (d, J =7.6 Hz, 2H), 2.63 (sep, J =7.2 Hz, 2H), 1.16 (d, J =7.2 Hz, 12H) 5-ニトロ体と3-ニトロ体の生成比は、1H NMRの測定から1:0.7であった。
MS(EI):[M]+m/z 368【００６４】
工程４
1aへのヒドロキシエトキシ基の付加
5-ニトロ体の1a（628.8 mg, 1.71 mmol）を100 ml二口ナス型フラスコに秤量し、減圧下で１〜２時間乾燥させた後、脱水DMF（24 ml）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（583.4μl, 3.40 mmol）とエチレンブロモヒドリン(240.5μl, 3.41 mmol)を加え、110℃で一昼夜加熱還流する。室温に戻した後、300 ml分液ロートに移し、2 M HCl (60 ml)を加えて、ヘキサン：酢酸エチル（1：1）（60 ml×3）で抽出する。シリカゲルTLCの結果、ヘキサン：酢酸エチル層には、反応生成物が確認されたので、ヘキサン：酢酸エチル層を飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで脱水後、ろ過し減圧濃縮すると、残渣（濃褐色粘性液体）が701 mg得られた。得られた残渣には、反応生成物と未反応の原料が含まれていた。
得られた残渣を0.9 mlのクロロホルムに溶解し、シリカゲルをまぶして、ヘキサン：酢酸エチル（40:1）中で膨潤させたシリカゲルカラム（φ3.5 cm×7.2 cm; 69.1 ml）の上部に注入する。カラムをヘキサン：酢酸エチル（40:1）、（10:1）で順次洗った後、ヘキサン：酢酸エチル（4:1）で、未反応の1aを溶出させる。その後、ヘキサン：酢酸エチル（3:1）で、目的の反応生成物を溶出させる。【００６５】
【化１０】
2018074563.tif 000012
【００６６】
反応生成物の、重クロロホルム中での1H-NMR測定の結果から、ヒドロキシエトキシ-1aと同定された。ヒドロキシエトキシ-1aの収量は、567.2 mg（1.38 mmol, 80.7％）であった。【００６７】
シリカゲルTLC(展開溶媒：クロロホルム/酢酸エチル=1：1)のRf値：ヒドロキシエトキシ-1aは0.67、原料の1aは0.1。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ8.37 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.48 (t, J =7.8 Hz, 1H), 7.30 (d, J =7.8 Hz, 2H), 4.43 (t, J =4.3 Hz, 2H), 4.07 (m, 2H), 2.65 (sep, J =6.8 Hz, 2H), 1.17 (d, J =6.8 Hz, 12H)。
MS(EI):[M]+m/z 412【００６８】
工程５
ヒドロキシエトキシ-1aとmPEG11-COOHのエステル化
ヒドロキシエトキシ-1a（228.4 mg, 0.554 mmol）は20 mlナシ型フラスコに、mPEG11-COOH（401.5 mg、0.682 mmol）は10 mlナシ型フラスコに、それぞれ秤量した後、減圧下で約１時間乾燥させる。50 ml二口ナス型フラスコに脱水DMF 1.6 mlとトリエチルアミン(257μl, 1.85 mmol)を加え、さらに4-ジメチルアミノピリジン(6.96 mg, 0.057 mmol)と2-メチル-6-ニトロ無水安息香酸(235.1 mg, 0.683 mmol)を窒素ガス気流下で加える。予め乾燥させたmPEG11-COOHを脱水DMF 2.8 mlに溶解して加え、室温で15分撹拌する。その後、予め乾燥させたヒドロキシエトキシ-1aを脱水DMF 5.5 mlに溶解して加え、55℃で一昼夜加熱還流する。反応後、50 mlナス型フラスコに移し、55℃、10 mmHgでDMFを蒸発乾固させる。残渣（褐色粘性液体）を酢酸エチル（40 ml）に溶解して200 ml分液ロートに移し、飽和塩化アンモニウム（pH 4）40 mlを加えて抽出する。さらに酢酸エチル（40 ml）で2回抽出し、酢酸エチル層を飽和炭酸水素ナトリウム（pH 8）50 mlで中和後、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過、蒸発乾固させる。【００６９】
【化１１】
2018074563.tif 000013
【００７０】
最終的に、残渣546.8 mgが得られた。得られた残渣を0.5 mlのクロロホルムに溶解し、クロロホルム中で膨潤させたシリカゲルカラム(φ2.5 cm×10 cm; 49 ml)の上部に注入した。クロロホルム（100％）で未反応のヒドロキシエトキシ-1aを溶出した後、クロロホルム：メタノール（98：2）で目的の反応生成物を溶出させた。重クロロホルム中での1H-NMR測定の結果から、PEG11(E)-1a と確認された。シリカゲルTLC（クロロホルム/メタノール=10：1）の結果からは、PEG11(E)-1aのみのスポットが確認された。収量は365 mg（0.371 mmol, 67%）であった。【００７１】
シリカゲルTLC(展開溶媒：クロロホルム/メタノール=10：1)のRf値：原料のヒドロキシエトキシ-1aは0.53、生成物のPEG11(E)-1aは0.47。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ8.37 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.48 (t, J =7.6 Hz, 1H), 7.30 (d, J =7.6 Hz, 2H), 4.53 (m, 4H), 4.07 (m, 2H), 3.77 (t, J =6.4 Hz, 2H), 3.65 (br.s, 44H), 3.55 (dd, J =2.8, 4.0 Hz, 2H), 3.38 (s, 3H), 2.65 (sep, J =6.4 Hz, 2H), 1.16 (d, J =6.4 Hz,12H)。【００７２】
工程６
PEG11(E)-1aの水添反応によるPEG11(E)-TC11の合成
200 ml二口ナス型フラスコにPEG11(E)-1a（365 mg, 0.371 mmol）を加え、テトラヒドロフラン：エタノール（1:1）43 mlに溶解し、アルゴンガス気流下、5% Pd/C（172.5 mg）を加えた後、水素ガスで置換し、室温で一昼夜撹拌する。反応液はセライトを用いてろ過した後、ろ液を蒸発乾固させると、残渣（黄緑色粘性液体）402.1 mgが得られる。残渣をクロロホルム（0.6 ml）に溶解し、クロロホルム中で膨潤させたシリカゲルカラム（φ2.5 cm×9.5 cm; 46.6 ml)の上部に注入する。カラムを100%クロロホルム、次いでクロロホルム：メタノール(99:1)で洗った後、クロロホルム：メタノール(98:2)で、目的の反応生成物を溶出させると、蛍光性の淡黄色の油状物質が得られる。【００７３】
【化１２】
2018074563.tif 000014
【００７４】
得られた物質は、重クロロホルム中での1H-NMR測定の結果から、PEG11(E)-TC11と同定された。シリカゲルTLCの結果から、PEG11(E)-TC11のみの単一スポットが確認された。収量は386.8 mg（0.406 mmol）で、収率は出発物質のヒドロキシエトキシ-1aに対して73.3%であった。【００７５】
シリカゲルTLC(展開溶媒：クロロホルム/メタノール=10：1)のRf値(注)：原料のPEG(E)-1aは0.47、生成物のPEG11(E)-TC11は0.47。
(注)この条件のシリカゲルTLCでは、両者ほぼ同じRf値を示すが、PEG11(E)-TC11は365 nmの照射によって黄色の蛍光を発するが、PEG11(E)-1aは蛍光を発しない。また、1H-NMRの結果から、原料はすべて水添されPEG11(E)-TC11になっていた。【００７６】
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.25 (s, 1H), 7.16 (s, 1H), 7.42 (t, J =7.8 Hz, 1H), 7.26 (d, J =7.8 Hz, 2H), 4.56 (t, J =3.6 Hz, 2H), 4.33 (t, J =3.6 Hz, 2H), 3.78 (t, J =6.4 Hz, 2H), 3.64 (br.s, 44H), 3.55 (dd, J = 2.8, 6.0 Hz, 2H), 3.38 (s, 3H), 2.66 (sep, J =6.8 Hz, 2H), 1.14 (d, J =6.8 Hz,12H)。
HRMS(ESI): m/z [M+Na]+の計算値は975.50417、測定値は975.50454
HPLC: YMC-Pack C18カラム(250 mm × 4.6 mm、粒径5μm、流速0.7 ml/min、溶媒; CH3CN: H2O=1:1)で分析すると、11.8 minに溶出した。
UVmax= 270(s), 317(w), 404(w) nm (50% EtOH)【００７７】
実施例２
PEG5(E)-TC11の合成
PEG5(E)-TC11は前記のヒドロキシエトキシ-1aから下記の方法で合成した。
工程1
ヒドロキシエトキシ-１aとmPEG5-COOHのエステル化
【化１３】
2018074563.tif 000015
【００７８】
DMAP：50.0 mg (0.436 mmol)とトリエチルアミン：2.0 mL (14.53 mmol) をDMF：20 mLに溶解し、ヒドロキシエトキシ-1a： 1.8 g (4.36 mmol) および、mPEG5-COOH： 1.5 g (5.37 mmol) を加えた。続いて、MNBA：1.85 g (5.37 mmol)を加えた後、アルゴン雰囲気下、反応液を55℃まで加熱し、16時間攪拌した。HPLCにて反応完結を確認し、水を加え、酢酸エチルを用い抽出後、水層をさらに酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、減圧濃縮した。【００７９】
シリカゲルクロマトグラフィー（HiFlash 2L ヘプタン/酢酸エチル=5/1→0/1）にて精製し主留を減圧濃縮することでPEG5(E)-1a：2.86 gを無色油で得た(収率 97.3%)。【００８０】
工程2
PEG5(E)-1aの水添反応によるPEG5(E)-TC11の合成
【化１４】
2018074563.tif 000016
【００８１】
PEG5(E)-1a：2.86 g (4.23 mmol)のEtOH：56 mLとＴＨＦ：56 mL混合溶液中に、Pd/C (K-type)：450 mgを加えた後、水素雰囲気下、室温で2時間、撹拌した。
HPLCにて反応完結を確認後、反応液をろ過し、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（HiFlash  3L メタノール/クロロホルム =0/1→1/20）にて精製し主留を減圧濃縮することでPEG5(E)-TC11： 2.54 gを黄色油で得た(収率 93.0%)。【００８２】
HPLC: YMC-Pack Pro C18カラム(250mm × 4.6mm、粒径5μm、流速1.0 ml/min、溶媒; A: 0.1%のTFAを含むH20, B: 0.1% TFAを含むAcCN, Gradient: A/B= 100/30→50/50(10min)→15/75(15min)→0/100(20min)→100/30(25min)で分析すると、20.5minに溶出した。
MS(TOFMS):[M]+m/z 644.6
1H-NMR(400 MHz, d6-DMSO): δ7.44(t, J=7.6 Hz, 1H),7.35(s, 1H), 7.30(d, J=7.6 Hz, 2H), 7.09(s, 1H), 6.11(br.s, 2H), 4.44(br.t, 2H), 4.39(br.t, 2H), 3.65(t,J=6.4Hz), 3.48(m, 16H),3.23(s,3H),2.64(sep, J=7.2 Hz,2H),1.06(d, J=8.4 Hz,12H) 。【００８３】
実施例３
PEG11(O)-TC11の合成
工程１
ヒドロキシエトキシ-1aのトシル化
ヒドロキシエトキシ-1a（666.6 mg, 1.62 mmol）を100 mlナス型フラスコに秤量し、減圧下で約１時間乾燥させた後、脱水トルエン（43 ml）を加えて溶解させる。氷中にて撹拌しながら、窒素ガス気流下、塩化トシル（623.3 mg, 3.27 mmol）を加える。次いで、4-ジメチルアミノピリジン(400.2 mg, 3.28 mmol)を加えると沈殿を生じるが、そのまま室温に戻し、一昼夜撹拌する。反応後、セライトを用いて沈殿をろ別し、ろ液を蒸発乾固すると残渣818.6 mgを得る。シリカゲルTLC（ヘキサン：酢酸エチル=1：1）の結果から、トシルエトキシ-1aのスポット(Rf=0.75)、僅かな塩化トシルのスポット（Rf=0.82）と少量のヒドロキシエトキシ-1aのスポット（Rf=0.49）が確認された。【００８４】
【化１５】
2018074563.tif 000017
【００８５】
得られた残渣を1.5 mlのクロロホルムに溶解し、シリカゲルをまぶした後、ヘキサン中で膨潤させたシリカゲルカラム(φ3.5 cm×6.7 cm; 64.3 ml)の上部に注入する。ヘキサン：酢酸エチル（5：1）で塩化トシルを溶出した後、ヘキサン：酢酸エチル（4：1）で目的の反応生成物を溶出させる。未反応のヒドロキシエトキシ-1aは、ヘキサン：酢酸エチル（2：1）で回収する。重クロロホルム中の1H-NMR測定により、生成物はトシルエトキシ-1aと同定された。収量は503.7 mg（0.888 mmol, 55%）であった。未反応のヒドロキシエトキシ-1aは、144.4 mg（0.35 mmol, 22%）であった。【００８６】
シリカゲルTLC(展開溶媒：ヘキサン/酢酸エチル=1：1)のRf値：原料のヒドロキシエトキシ-1aは0.49、生成物のトシルエトキシ-1aは0.75、塩化トシルは0.82。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ8.30 (s, 1H), 7.82 (d, J =6.5 Hz, 2H), 7.60 (s, 1H), 7.48 (t, J =6.4 Hz, 1H), 7.39 (d, J =6.5 Hz, 2H), 7.30 (d, J =6.4 Hz, 2H), 4.50 (m, 2H), 4.45 (m, 2H), 2.63 (sep, J =5.2 Hz, 2H), 1.16 (d, J =5.2 Hz, 12H)。【００８７】
工程２
トシルエトキシ-1aとmPEG11のエーテル化
小ビーカーにモレキュラーシーブ3A（1.0 g）を秤量し、電子レンジで25秒加熱と減圧下20分での冷却を3回繰り返してモレキュラーシーブ3Aを活性化し、20 ml二口ナス型フラスコに窒素ガス気流下加える。mPEG11（307.6 mg, 0.595 mmol）は、20 mlナシ型フラスコに秤量し、1時間減圧した後、脱水DMF（2 ml）に溶解し、モレキュラーシーブ3Aのフラスコに加え、室温で30分〜1時間撹拌する。水素化ナトリウム（46.4 mg, 水素化ナトリウムとして27.8 mg, 1.16 mmol）は、10 ml二口ナス型フラスコに秤量し、付着するミネラルオイルを脱水ヘキサンで3回洗い、減圧下乾燥させた後、脱水DMF（2.9 ml）に懸濁させる。先のmPEG11のDMF溶液を氷中で撹拌して冷却させたところに、水素化ナトリウムの懸濁液をゆっくりと滴下した後、室温で1.5時間撹拌する。その後、氷中で撹拌しつつ、予め20 mlナシ型フラスコに秤量して、2〜3時間減圧下で乾燥した後、脱水DMF（1.4 ml）に溶解したトシルエトキシ-1a（157.9 mg, 0.278 mmol）を滴下する。氷中で7〜10分間撹拌する。その後、予め0.1 Mリン酸緩衝液pH7.0（5 ml）を加えておいた分液ロートに、反応液の上清を移し、反応フラスコとモレキュラーシーブをエーテル（12 ml）で洗った後、1回目の抽出を行う。さらに、水層に少量の飽和食塩水を加え、エーテル（12 ml）で2回抽出する。エーテル層を飽和食塩水で3回洗った後、無水硫酸ナトリウムで脱水させ、ろ過、蒸発乾固させる。【００８８】
【化１６】
2018074563.tif 000018
【００８９】
以上の工程で残渣（橙色粘性液体）193.9 mgが得られた。シリカゲルTLC（クロロホルム：メタノール=10：1）の結果から、Rf=0.42にUVをもつ目的のPEG11(O)-1aのスポット、Rf=0.94に弱いUVをもつスポットが確認された。【００９０】
残渣をクロロホルム（0.8 ml）に溶解し、クロロホルム中で膨潤させたシリカゲルカラム（φ1.3 cm×11 cm; 14.6 ml）の上部に注入する。カラムをクロロホルムで十分に洗った後、クロロホルム：メタノール（98:2）で、目的の生成物を溶出させる。重クロロホルム中での1H-NMR測定の結果から、生成物はPEG11(O)-1aと同定された。シリカゲルTLCの結果から、PEG11(O)-1aのみのスポット（UV吸収とその下辺にごくごく弱い青白い蛍光がある）が確認された。収量は165.5 mg（0.182 mmol, 65.5%）であった。【００９１】
シリカゲルTLC(展開溶媒：クロロホルム/メタノール=10：1)のRf値：原料のトシルエトキシ-1aは0.94、生成物のPEG11(O)-1aは0.42。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ8.30 (s, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.47 (t, J =6.2 Hz, 1H), 7.30 (d, J =6.2 Hz, 2H), 4.45 (t, J =3.7 Hz, 2H), 3.96 (t, J =3.7 Hz,2H), 3.64 (br.s, 44H), 3.34 (s, 3H), 2.65 (sep, J =5.6 Hz, 2H), 1.16 (d, J =5.6 Hz,12H)。【００９２】
工程３
PEG11(O)-1aの水添反応によるPEG11(O)-TC11の合成
200 ml二口ナス型フラスコにPEG11(O)-1a（165.5 mg, 0.182 mmol）を加え、テトラヒドロフラン：エタノール（1:1）40 mlに溶解し、アルゴンガス気流下、5% Pd/C（135.6 mg）を加えた後、水素ガスで置換し、室温で一昼夜撹拌する。反応液はセライトを用いてろ過した後、ろ液を蒸発乾固させる。【００９３】
【化１７】
2018074563.tif 000019
【００９４】
以上の工程で、残渣（黄緑色粘性液体）154.6 mgが得られた。シリカゲルTLC（クロロホルム：メタノール=10：1）の結果から、Rf=0.39に目的の生成物のPEG11(O)-TC11のスポット（黄色の蛍光）が確認されたが、そのスポットの上辺と下辺に弱い青白い蛍光が見られた。【００９５】
残渣をクロロホルム（0.7 ml）に溶解し、クロロホルムで膨潤させたシリカゲルカラム（φ1.3 cm×10 cm; 13.3 ml）の上部に注入する。カラムを100%クロロホルムとクロロホルム：メタノール（99:1）で順次洗った後（緑色と青白い蛍光物質が除かれる）、クロロホルム：メタノール（98:2）で、目的の反応生成物を溶出させると、蛍光性の黄色の油状物質が得られる。【００９６】
シリカゲルTLCの結果から、橙色のUVと黄色の蛍光を持ち、黄色に着色したPEG11(O)-TC11の単一のスポット（Rf=0.39）のみが確認された。重クロロホルム中で1H-NMRを測定した結果、PEG11(O)-TC11であると同定された。収量は145.9 mg（0.166 mmol）、収率は出発物質のヒドロキシエトキシ-1aに対して32.9%であった。【００９７】
シリカゲルTLC(展開溶媒：クロロホルム/メタノール=10：1)のRf値：原料のPEG11(O)-1a は0.42、生成物のPEG11(O)-TC11は0.39。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ8.11 (s, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.44 (t, J =6.2 Hz, 1H), 7.27 (d, J =6.2 Hz, 2H), 4.30 (t, J =4.6 Hz, 2H), 3.96 (t, J =4.6 Hz,2H), 3.64 (br.s, 44H), 3.35 (s, 3H), 2.66 (sep, J =5.6 Hz, 2H), 1.14 (d, J =5.6 Hz,12H)。
HRMS(ESI): m/z [M+Na]+の計算値は903.48304、測定値は903.48968
HPLC: YMC-Pack C18カラム(250 mm × 4.6 mm、粒径5μm、流速0.7 ml/min、溶媒; CH3CN: H2O=1:1)で分析すると、27.2 minに溶出した。
UVmax= 270(s), 318(w), 407(w) nm (50% EtOH)【００９８】
合成例１
Glu-TC11の合成
工程１
ヒドロキシエトキシ-1aのアセトグリコシル化
50 ml二口ナス型フラスコにヒドロキシエトキシ-1a（309.1 mg, 0.749 mmol）を秤量し、減圧下約１時間乾燥させた後、脱水アセトニトリル（4.5 ml）に溶解する。ジイソプロピルエチルアミン（256.6μl, 1.50 mmol）と、20 mlナシ型フラスコに秤量して、脱水アセトニトリル（5.5 ml）に溶解したアセトブロモ-α-D-グルコース（616.9 mg, 1.50 mmol）を加え、80℃で一昼夜加熱還流する。反応液を50 mlナスフラスコに移して蒸発乾固すると、残渣1.15 gを得る。残渣は2.5 mlのクロロホルムに溶解し、クロロホルム中で膨潤させたシリカゲルカラム（φ3.5×10.5 cm; 100.8 ml）の上部に注入する。クロロホルム：酢酸エチル（90:1）で洗浄した後、クロロホルム：酢酸エチル（80:1）で目的の反応生成物を分離する。【００９９】
【化１８】
2018074563.tif 000020
【０１００】
反応生成物は、1H -NMR（重クロロホルム）の結果から、グルコース由来とアセチル基のシグナルが確認され、回収した反応生成物は、Glu(OAc)-1aと確認されたが、TLCの結果から、グルコース由来と思われるものが混在していた。収量は739.5 mg（0.939 mmol, 約100%）であった。【０１０１】
シリカゲルTLC(展開溶媒：クロロホルム/酢酸エチル=5：1)のRf値：原料のヒドロキシエトキシ-1aは0.33、α-アセトブロモグルコースは0.63、生成物のGlu(OAc)-1aは0.50(糖鎖確認のためのp-アニスアルデヒド反応は陽性)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ8.29 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.48 (t, J =7.8 Hz, 1H), 7.30 (d, J =7.8Hz, 2H), 5.77 (d, J =5.2 Hz, 1H), 5.22 (t, J =7.4 Hz,1H), 4.93 (dd, J =2.4, 8.4 Hz, 1H), 4.40 (m, 1H), 4.39 (m, 2H), 4.21 (d, J =4.2 Hz, 2H), 3.95 (t, J =4.4 Hz, 2H), 3.93 (m, 1H), 2.65 (sep, J =6.8 Hz, 1H), 2.64 (sep, J =6.8 Hz, 1H), 2.22 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 1.77 (s, 3H), 1.15 (d, J =7.2 Hz, 12H)。【０１０２】
工程２
Glu(OAc)-TC11の合成（Glu(OAc)-1aの水添反応）
300 ml二口ナス型フラスコにGlu(OAc)-1a (739.5 mg, 0.939 mmol)を加え、テトラヒドロフラン：エタノール（1:1）100 mlに溶解し、アルゴンガス気流下、5% Pd/C（460.9 mg）を加えた後、水素ガスで置換し、室温で一昼夜撹拌する。反応液はセライトを用いてろ過した後、ろ液を蒸発乾固する。【０１０３】
【化１９】
2018074563.tif 000021
【０１０４】
以上の工程で、残渣679.5 mg（0.897 mmol, 95.5％）を得た。1H -NMR（重クロロホルム）の結果から、反応生成物はGlu(OAc)-TC11と確認された。TLCの結果から、Rf=0.40にGlu(OAc)-TC11と思われるスポットが確認された。また、Rf=0.52に青白のUVと蛍光を持ち、アニスに反応しないスポットが僅かにみられた。残渣は、そのまま脱アセチル化反応に用いた。【０１０５】
シリカゲルTLC(展開溶媒：クロロホルム/酢酸エチル=5：1)のRf値：Glu(OAc)-1aは0.50、生成物のGlu(OAc)-TC11は0.40。尚、糖鎖確認のためのp-アニスアルデヒド反応は両スポットとも陽性。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.29 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.42 (t, J =7.8 Hz, 1H), 7.26 (d, J =7.8Hz, 2H), 5.73 (d, J =5.2 Hz, 1H), 5.20 (t, J =2.8 Hz,1H), 4.91 (dd, J =2.4, 10.0 Hz, 1H), 4.35 (dd, J =2.8, 5.6Hz, 1H), 4.29 (m, 2H), 4.21 (d, J =4.0 Hz, 2H), 3.97 (m, 1H), 3.93 (t, J =4.6Hz, 2H), 2.75 (sep, J =6.8 Hz, 1H), 2.74 (sep, J =6.8 Hz, 1H), 2.10 (s, 9H), 1.79 (s, 3H), 1.15 (d, J =7.2 Hz, 12H)。【０１０６】
工程３
Glu(OAc)-TC11の脱アセチル化によるGlu-TC11の合成
100 ml二口ナス型フラスコにGlu(OAc)-TC11 (679.5 mg, 0.897 mmol)を加え、脱水メタノール（25 ml）に溶解した後、トリエチルアミン（5.6 ml, 40.2 mmol）を加えて室温で一昼夜撹拌する。反応液をメタノールに溶解し、100 mlナス型フラスコに移し蒸発乾固する。その後、トルエンを加えて（溶けない）２回蒸発乾固を繰り返してトリエチルアミンを除く。さらに、酢酸エチルで３回蒸発乾固を繰り返す。【０１０７】
【化２０】
2018074563.tif 000022
【０１０８】
以上の工程で、残渣566.4 mgを得た。1H -NMR（重クロロホルム）の結果から、アセチル基のシグナルが消失していることから、反応生成物はGlu-TC11と推測された。次に、反応生成物をシリカゲルカラムで精製した。【０１０９】
残渣を1.5 mlのクロロホルムに溶解し、クロロホルム中で膨潤させたシリカゲルカラム（φ2.7×11 cm; 62.7 ml）の上部に注入する。カラムをクロロホルムで洗浄した後、クロロホルム：メタノール（98：2）でRf=0.65に相当する化合物を溶出させる。さらに、クロロホルム：メタノール（97：3）を流した後、クロロホルム：メタノール（96：4）でRf=0.48に相当する反応生成物を溶出させ、溶媒を蒸発除去する。【０１１０】
以上の工程で黄色固体が得られた。重クロロホルムでの1H-NMRの測定結果から、Rf=0.48の化合物はGlu-TC11と同定された。Rf=0.65に相当する化合物はヒドロキシエトキシ-TC11と同定された。収量は384.4 mg（0.652 mmol）、収率は、出発物質のヒドロキシエトキシ-1aに対して87%であった。【０１１１】
シリカゲルTLC(展開溶媒：クロロホルム/酢酸エチル=5：1)のRf値：Glu(OAc)-TC11 は0.77、生成物のGlu-TC11は0.48。尚、糖鎖確認のためのp-アニスアルデヒド反応は両スポットとも陽性。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ7.35 (s, 1H), 7.45 (t, J =7.8 Hz, 1H), 7.29 (d, J =7.8Hz, 2H), 7.15 (s, 1H), 5.76 (d, J =5.2 Hz, 1H), 4.32 (t, J =4.4 Hz, 2H), 4.29 (t, J =4.8 Hz, 1H), 3.96 (dd, J =4.4, 7.6 Hz, 2H), 3.84 (t, J =4.6 Hz,1H), 3.80 (dd, J =2.4, 12.0 Hz, 1H), 3.68 (dd, J =5.6, 12.0 Hz,1H), 3.60 (ddd, J =2.4, 5.6, 8.8 Hz, 1H), 3.49 (dd, J =4.8, 9.6Hz, 1H), 2.72 (sep, J =6.9 Hz, 2H), 1.14 (d, J =6.9 Hz, 12H)。
HPLC: YMC-Pack C18カラム(250 mm × 4.6 mm、粒径5μm、流速0.7 ml/min、溶媒; CH3CN: H2O=1:1)で分析すると、12.8 minに溶出した。
UVmax= 268(s), 316(w), 400(w) nm (50% EtOH)【０１１２】
実施例４
ヒドロキシエトキシ-TC11(HOEtO-TC11)の合成
工程１
ヒドロキシエトキシ-1aの水添反応によるヒドロキシエトキシ-TC11の合成
200 ml二口ナス型フラスコにヒドロキシエトキシ-1a（220.9 mg, 0.536 mmol）を加え、テトラヒドロフラン：エタノール（1:1）30 mlに溶解し、アルゴンガス下、5% Pd/C（294.2 mg）を加えた後、水素ガスで置換し、室温で一昼夜撹拌する。反応液はセライトを用いてろ過した後、ろ液を蒸発乾固させると243.5 mgの深緑色粉末を得る。粉末は30 mlのクロロホルムに溶解し、クロロホルム中で膨潤させたシリカゲルカラム（φ3.5 cm×6 cm; 57.6 ml）の上部に注入する。クロロホルム：酢酸エチル（100）、（50:1）、（20:1）で順次洗浄した後、クロロホルム：酢酸エチル（5:1）で、目的の反応生成物を溶出させる。【０１１３】
【化２１】
2018074563.tif 000023
【０１１４】
反応生成物の、重クロロホルム中での1H-NMR測定の結果から、ヒドロキシエトキシ-TC11と同定された。シリカゲルTLCの結果から、ヒドロキシエトキシ-TC11のみのスポットが確認された。収量は199.2 mg（0.521 mmol, 97.2%）であった。【０１１５】
シリカゲルTLC(展開溶媒：クロロホルム/酢酸エチル=1：1)のRf値：原料のヒドロキシエトキシ-1aは0.63、ヒドロキシエトキシ-TC11は0.2。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.43 (t, J =7.8 Hz, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.27 (d, J =7.8 Hz, 2H),7.18 (s, 1H), 4.29 (t, J =4.3 Hz, 2H), 4.07 (m, 2H), 2.73 (sep, J =6.8 Hz, 2H), 1.16 (d, J =6.8 Hz, 12H)。
HPLC: YMC-Pack C18カラム(250 mm × 4.6 mm、粒径5μm、流速0.7 ml/min、溶媒; CH3CN: H2O=1:1)で分析すると、8.1 minに溶出した。
UVmax= 269(s), 321(s), 311(w), 414(w) nm (50% EtOH)【０１１６】
実施例５
薬剤の水に対する溶解度の評価
過剰量のTC11、PEG5(E)-TC11、HOEtO-TC11、Glu-TC11、PEG11(E)-TC11、PEG11(O)-TC11をそれぞれ100 mMのTris-HCl (pH 7.5)に加え、25℃で撹拌を行い、5時間おきに溶液の上清を回収し、高速液体クロマトグラフィー(YMC-Pack C18カラム(250 mm × 4.6 mm、粒径5μm)、流速0.7 ml/min、溶媒; CH3CN: H2O=1:1)を用いて濃度を測定した。濃度が一定になった点を飽和濃度とみなした。結果を表１に示す。【０１１７】
【表１】
2018074563.tif 000024
【０１１８】
表１の結果から、TC11に比べて、HOEtO-TC11は13.5倍、Glu-TC11は41倍、PEG11(E)-TC11は4,447倍、PEG11(O)-TC11は735倍も溶解度が向上することがわかった。その結果、溶解度がTC11に比べ4千倍以上も向上したPEG11(E)-TC11は、経口投与、静脈注射、皮下注射、筋肉注射等、TC11に比べ多様な投与方法が可能になった。【０１１９】
実施例６
PEG11(E)-TC11の安定性
まず、PEG11(E)-TC11(A)とPEG11(O)-TC11(B)のマウス血中での安定性について調べてみた。５週齢オスのICRマウス (CLEA Japan, Tokyo, Japan) にPEG11(E)-TC11とPEG11(O)-TC11をそれぞれTC11 20 mg/kgBWと当モル濃度になるようにそれぞれ59.1 mg/kgBW、54.6 mg/kgBWで腹腔内投与した。0、0.5、1、1.5、4、8、12、24時間後、26G針で尾静脈から出血させ、ヘパリン処理済みヘマトクリット毛細管 (Terumo, Tokyo, Japan) を用いて100μL程度採血した。採血後、血液を0.5 mLチューブに移し、4℃, 3,400 Gにて15分間遠心分離した。その後上清を回収し、-80℃で冷凍保存した。精度管理用血清のコンセーラ(登録商標) (Nissui pharmaceutical, Tokyo, Japan) を一ボトルあたり蒸留水(dH2O) 3 mLで溶解し、30分静置後、転倒混和し使用した。採取した血漿および尿10μLに対しコンセーラ190μLを混和しサンプルとした。また、PEG11(E)-TC11およびHOEtO-TC11をそれぞれ0、2、4、6、8、10μMとなるようdH2Oで希釈し、各濃度10μLとコンセーラ190μLを混和し検量線サンプルとした。Sep-Pak(登録商標) C18固相抽出カートリッジ (Waters Associates, Massachusetts, USA) を100% CH3CN 2 mLで洗浄後、dH2O 4 mLで平衡化を行った。各サンプルおよび検量線作成用サンプルをカートリッジに添加し、dH2O 200μLで洗い込みを行った。その後dH2O 2 mL、40%CH3CN 2 mL、100%CH3CN 250μLで洗浄し、100% CH3CN 1 mLで溶出した。溶出液を遠心エバポレーター CVE-2000 (TOKYO RIKAKIKAI CO, LTD, Tokyo, Japan) で減圧蒸発させ、100% EtOH 100μLで再溶解させ、0.45μm孔径クロマトディスク (GL sciences, Tokyo, Japan) でろ過した。高速液体クロマトグラフィー (High Performance Liquid Chromatography; HPLC)装置はJASCO製 (Tokyo, Japan)の下記のものを使用した。【０１２０】
インテリジェントHPLCポンプ  PU-2089
オートサンプラー            AS-2057
カラムオーブン              Co-2060
UV検出器                    UV-2075
蛍光検出器                    FP-2020
クロマトグラフィデータステーション  LC-NetII/ADC【０１２１】
HPLC測定は、固定相はInertsil(登録商標) ODS-3 250 nm×Φ4.6 mm、移動相はCH3CN：dH2O=50：50、流速は0.70 mL/min、UV検出波長は 267 nm、励起波長は380 nm、蛍光波長は530 nm、注入量は10μL、カラム温度は25℃にて行った。【０１２２】
TC11と異なり、PEG11(E)-TC11およびPEG11(O)-TC11の投与では薬剤の腹腔内残存は全く認められなかった。図2Aより、PEG11(E)-TC11投与時の検体では投与後0.5時間の時点でピークはPEG11(E)-TC11自体の保持時間 (tR) には検出されず、水溶性置換基のPEGの脱離した構造であるHOEtO-TC11と同じtRにのみ検出された。この結果は、PEG11(E)-TC11は血中ではエステラーゼにより速やかに加水分解され、HOEtO-TC11に変換されることを示唆している。一方、PEG11(O)-TC11投与時の検体では、投与後0.5時間の時点でPEG11(O)-TC11に対応する明確なピークが観察され、1.5時間後も同じ位置にピークが観察された(図2B)。この結果は、PEG11(O)-TC11は血中エステラーゼでは分解されず、他の化合物には変換していないことを示唆している。【０１２３】
次いで、PEG11(E)-TC11のマウス血漿中(A)および培地中(B)での安定性について調べてみた。図３Aに示すように、PEG11(E)-TC11はマウス血漿中では非常に速やかに血漿中のエステラーゼによって加水分解され、HOEtO-TC11に変換されることがわかった。また、図３Bに示すように、PEG11(E)-TC11は培地中でもゆっくりと分解されて、HOEtO-TC11に変換された。この分解は培地に含まれるFBS(ウシ胎児血清)中の少量のエステラーゼによるものと考えられる。【０１２４】
実施例７
TC11およびその修飾体のハイリスクMM細胞株に対するin vitro細胞増殖阻害活性
細胞増殖阻害活性の検討には、ハイリスクMM細胞株 (KMM1、KMS11、KMS21、KMS26、KMS28、KMS34)は川崎医科大学の大槻剛巳らにより樹立されたものを用いた(Otsuki, T. et al., Int. J. Oncol., 15: 1205-1212, 1999)。MM細胞株MUM24は本発明者の一人の服部 豊が独自にサリドマイド療法抵抗性患者より樹立したものである(Hattori, Y. et al., Blood Cancer J., 3: e115, 2013)。これらの細胞種の遺伝子異常、中でもp53遺伝子の欠失がFISH法(Chang, H. Blood, 105: 358-360, 2005) によって調べられている(WO2010/ 061862A1)。その結果、KMM1、KMS11、KMS26、KMS28、KMS34、MUM24は、片方のアレルではp53が欠失していて、KMS21はp53アレルの欠失がないことがわかっている。これらのハイリスクMM細胞株を任意の濃度のTC11、HOEtO-TC11、PEG11(E)-TC11、PEG11(O)-TC11等の薬剤で処理し、48時間後の細胞生存率をMTTアッセイ法(Mosman, T. J. Immunol. Methods, 65, 55-63, 1983)を用いて測定し、IC50値を算出した。詳しくは、各ハイリスクMM細胞株を2×105 cells/mlに調製し、1ウェルあたり50μl (1×104 cells) ずつ播種した。24時間後、任意の濃度のTC11, HOEtO-TC11, PEG11(E)-TC11, PEG11(O)-TC11等の薬剤を添加した。薬剤添加の48時間後にCell Proliferation Kit I [MTT] (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) 中のMTT labeling reagent を10μLずつ加え、37℃, 4時間で処理後、solution bufferを100μLずつ加え37℃で一晩静置した。マイクロプレートリーダーInfinitTM M1000 (Tecan, Maennedorf, Switzerland) を用い、波長570 nmで吸光度を測定した。細胞生存率は0μMの吸光度を100%とし、吸光度比から求めた。IC50はMicrosoft(登録商標) Excelを用い片対数グラフより算出した。【０１２５】
表２に示すように、TC11、HOEtO-TC11、PEG11(E)-TC11、PEG11(O)-TC11等の薬剤は多くのハイリスクMM細胞株に対して顕著な細胞増殖阻害活性を示し、中でも、PEG11(E)-TC11の薬効は高く、そのIC50値は1-7μMで、TC11のIC50値2-8μMとほぼ同程度であった。PEG11(O)-TC11も有意な細胞増殖阻害活性を示したが、その薬効(IC50値が5-60μM)は細胞株によってまちまちで、PEG11(E)-TC11に比べてIC50値は5〜10倍高く、薬効は低かった。HOEtO-TC11の薬効も高く(IC50値が1-8μM)、TC11やPEG11(E)-TC11のそれと同程度であった。これらの結果は、PEG11(E)-TC11は培地中および細胞内のエステラーゼによって加水分解され、分子サイズの小さいHOEtO-TC11になってから作用するので、細胞内で分解されない大きいサイズのPEG11(O)-TC11に比べて、分子運動性の観点から標的分子との反応性が高くなるため、薬効が高いと推測される。【０１２６】
さらに、TC11とその修飾体PEG11(E)-TC11およびHOEtO-TC11のハイリスクMM細胞株(KMS21)に対するin vitro細胞増殖阻害活性の濃度依存性を詳細に調べてみた(図4)。表2に示したTC11、HOEtO-TC11、PEG11(E)-TC11のIC50値近くの3μMでは、PEG11(E)-TC11とHOEtO-TC11のKMS21細胞に対する増殖阻害活性は、TC11に比べて3-4倍近くも高かった。このような現象は、他のハイリスクMM細胞株であるKMS11、KMS34、MUM24でも同様に観察された。このように、IC50値近くの3μMでPEG11(E)-TC11とHOEtO-TC11の増殖阻害活性がTC11に比べて非常に高くなった原因としては、(1)薬剤の水溶性が改善されたことにより、薬剤の細胞内への取り込み活性が向上した、(2)PEG11(E)-TC11は細胞内のカルボキシエステラーゼにより加水分解され、最終的にHOEtO-TC11になるが、HOEtO-TC11と薬剤ターゲットとの親和性がTC11に比べ高くなり、薬効が向上した可能性が考えられる。【０１２７】
【表２】
2018074563.tif 000025
【０１２８】
実施例８
実施例７と同様に、ハイリスクMM細胞株を任意の濃度のTC11、PEG5(E)-TC11の薬剤で処理し、48時間後の細胞生存率をWST-1アッセイ法(Cook, JA. & Mitchell, JB., Anal. Biochem., 179, 1-7, 1984)を用いて測定し、IC50値を算出した。詳しくは、各ハイリスクMM細胞株を5×105 cells/mlに調製し、1ウェルあたり50μl (2.5×104 cells) ずつ播種した。ウエルに任意の濃度のTC11、PEG5(E)-TC11等の薬剤を添加した。薬剤添加の48時間後にWST-1の試薬を加え、37℃、1時間CO2インキュベーター中で反応後、マイクロプレートリーダーを用い、波長450 nmで吸光度を測定した。細胞生存率は0μMの吸光度を100%とし、吸光度比から求めた。IC50はMicrosoft(登録商標) Excelを用い片対数グラフより算出した。【０１２９】
表３に示すように、TC11、PEG5(E)-TC11等の薬剤は  種々のハイリスクMM細胞株に対して顕著な細胞増殖阻害活性を示し、PEG5(E)-TC11の薬効(IC50値が1.3-4.6μM)は、TC11のIC50値とほぼ同程度であった。【０１３０】
【表３】
2018074563.tif 000026
【０１３１】
実施例９
PEG11(E)-TC11とレナリドミドの種々のハイリスクMM細胞に対するin vitro細胞増殖阻害活性
MM細胞株 (KMM1、KMS11、KMS21、KMS26、KMS27、KMS28、KMS34)は川崎医科大学の大槻剛巳らにより樹立されたものを用いた(Otsuki, T. et al., Int. J. Oncol., 15: 1205-1212, 1999)。MUM24は本発明者の一人の服部 豊が独自にサリドマイド療法抵抗性患者より樹立したものを用いた(Hattori, Y. et al., Blood Cancer J., 3: e115, 2013)。これらの細胞株を0-30μMのPEG11(E)-TC11および0-100μMのレナリドミドでそれぞれ処理し、48時間後の細胞生存率を実施例７と同様にMTTアッセイ法(Mosman, T. J. Immunol. Methods, 65, 55-63, 1983)を用いて算出した。【０１３２】
図５Aに示すように、PEG11(E)-TC11は種々のハイリスクMM細胞に対して顕著なin vitro細胞増殖阻害活性を示したが、レナリドミドは、図５Bに示すように、ハイリスクMM細胞KMS11、KMS28、KMS34を含む、KMS21やMUM24以外の骨髄腫細胞には全くin vitroでの細胞増殖阻害活性を示さなかった。これらの結果から、PEG11(E)-TC11はハイリスクMM細胞の増殖阻害に非常に有効であるが、レナリドミドはあまり有効でないことが確認できた。【０１３３】
実施例１０
PEG11(E)-TC11とPEG11(O)-TC11の種々の固形がん細胞に対するin vitro細胞増殖阻害活性
がん細胞は、KMS34(ヒト骨髄腫細胞)、HeLa(ヒト子宮頸がん細胞)、HCT116（ヒト大腸がん細胞; p53+/+）、KATOIII(ヒト胃がん細胞)、MDA-MB-231(ヒト乳がん細胞)、HT-29(ヒト結腸線がん細胞)、PANC-1(ヒト膵がん細胞)、Li-7(ヒト肝がん細胞)を用いた。WST-1法(Cook, JA. & Mitchell, JB., Anal. Biochem., 179, 1-7, 1984)による種々のがん細胞の増殖アッセイは以下のように行った。96穴マイクロプレートの各ウェルに目的の濃度に調製したPEG11(E)-TC11とPEG11(O)-TC11をそれぞれ1μlずつ入れる。そこへ培地を1ウェルあたり50μlずつ加え、プレートを軽く叩いて混和する。続いて、KMS34は5×105  cells/ml、それ以外の細胞は2×105 cells/mlに調製し、1ウェルあたり50μl (2.5×104 cells, 1×104 cells) ずつ播種し、CO2インキュベーター内 (37℃、5% CO2)で48時間培養する。培養した各ウェルに Cell proliferation reagent WST-1 (Roche)を10μlずつ加え、プレートを軽く叩いて混和し、CO2インキュベーター内で1時間反応させる。その後、プレートリーダーで1分間震盪し、450 nmの吸光度を測定する。このとき参照波長として595 nmも測定し、450 nmから差し引いたものを正味の値とする。【０１３４】
【表４】
2018074563.tif 000027
【０１３５】
表４の結果から、PEG11(E)-TC11とPEG11(O)-TC11は種々のがん細胞に対してin vitro細胞増殖阻害活性を示すことがわかった。PEG11(E)-TC11は、がん細胞の中でも、特にKMS34(骨髄腫細胞)に対して顕著な薬効(IC50値が0.67μM)を示し、次いで、HeLa(ヒト子宮頸がん細胞)、KATOIII(ヒト胃がん細胞)、HCT116（ヒト大腸がん細胞）にも強い細胞増殖阻害活性を示すことが確認できた。【０１３６】
実施例１１
PEG11(E)-TC11とTC11のハイリスクMM細胞(KMS34)と骨髄間質細胞由来の正常細胞に対するin vitro細胞増殖阻害活性
WST-1によるがん細胞と正常細胞の増殖アッセイは以下のように行った。96穴マイクロプレートの各ウェルに目的の濃度に調製したPEG11(E)-TC11とTC11をそれぞれ1μlずつ入れる。そこへ培地を1ウェルあたり50μlずつ加え、プレートを軽く叩いて混和する。続いて5×105cells/mlに調製したハイリスクMM細胞(KMS34)と2×105cells/mlに調製した骨髄間質細胞由来の正常細胞(WT)をそれぞれ1ウェルあたり50μl (2.5×104cells, 1×104cells) ずつ播種し、CO2インキュベーター内 (37℃、5% CO2)で48時間培養する。培養した各ウェルにCell proliferation reagent WST-1 (Roche)を10μlずつ加え、プレートを軽く叩いて混和し、CO2インキュベーター内で1時間反応させる。その後、プレートリーダーで1分間震盪し、450 nmの吸光度を測定する。このとき参照波長として595 nmも測定し、450 nmから差し引いたものを正味の値とする。【０１３７】
図６に示すように、PEG11(E)-TC11とTC11は、それぞれハイリスクMM細胞(KMS34)に対して、顕著な増殖阻害活性を示したが、骨髄間質細胞由来の正常細胞(WT)に対しては全く殖阻害活性を示さなかった。これらの結果から、PEG11(E)-TC11はMM細胞をはじめ種々のがん細胞に対して、がん特異的に細胞増殖阻害活性を示す薬剤であることが確認できた。【０１３８】
実施例１２
TC11とPEG11(E)-TC11によるハイリスクMM細胞(MUM24)のアポトーシス誘導
薬剤TC11やPEG11(E)-TC11によって引き起こされるアポトーシス誘導を観察するために、MM細胞の一種のMUM24細胞をTC11とPEG11(E)-TC11で処理し、Annexin V/PI染色を行い、フローサイトメーターを用いて解析を行った。より詳細には、MUM24を2.0×105個/mLになるよう調整し、1.95mLずつ6穴プレートに播いた。翌日から、TC11とPEG11(E)-TC11を最終濃度0, 10μMになるよう加え、37℃, 24, 48, 72時間で培養した。各細胞を1.5 mlずつ採取後、Phosphate Buffered Saline (PBS, Sigma-Aldrich) で2回洗浄を行った。その後、Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Bio Vision, California, USA) 中の1×Binding Buffer 500μLにAnnexin V-FITC 5μL, Propidium Iodide (PI) 5μLを加えた溶液に再懸濁させ暗所にて5分間静置した後、BDTM LSR II Flow Cytometer  (Becton, Dickinson and company, New Jersey, USA) を用いて蛍光強度を測定した。測定波長は励起波長を488 nmとし、Annexin V-FITCでは530±15 nm, PIでは610±10 nmを蛍光波長とした。【０１３９】
図７に示すように、TC11, PEG11(E)-TC11共に前期アポトーシス分画であるAnnexin V+/PI-の細胞、後期アポトーシス分画であるAnnexin V+/PI+の細胞の増加が確認された。その結果、TC11とPEG11(E)-TC11は明確にMM細胞にアポトーシスを引き起こすことが確認された。【０１４０】
実施例１３
TC11, PEG11(E)-TC11の細胞周期に対する効果
これまで、本発明者らはヒト子宮頸癌由来細胞株のHeLa細胞をTC11で処理すると、多極化と引き続いての多核化が生じることを報告している (Shiheido, H. et al., PLoS One, 7: e38878, 2012)。また、同論文でTC11の結合分子としてα-tubulinとNPM1を報告している。次に、TC11並びにその修飾体であるPEG11(E)-TC11の細胞周期への影響を検討するために、flow cytometryを用いて細胞内DNA含量の測定を行った。より詳細には、MUM24を4.0×105個/mLになるよう調整し、1.95mLずつ6穴プレートに播いた。翌日から、TC11とPEG11(E)-TC11を最終濃度0, 3μMになるよう加え、37℃、12、24、36時間で培養した。各細胞を採取後、PBSで洗浄し、460 mlの70% EtOHを加え、-30℃で一晩静置した。PBSで洗浄後、リン酸クエン酸緩衝液100 mlを加え、室温で30分静置させることで断片化したDNAを溶出させた。断片化DNAを溶出後100 ml PBS, 10 ml 1 mg/ml RNase A (heated) (Roche)を加え、室温で30分間反応させた。その後、200 ml PBS, 10 ml 1mg/ml PIを加え、暗所、室温で30分間反応させ、BD FACSCalibur(商標) (Becton, Dickinson and company, New Jersey, USA)を用いて蛍光強度を測定した。測定波長は励起波長を488 nmとし、610±10 nmを蛍光波長とした。【０１４１】
図８に示すように、TC11とPEG11(E)-TC11でそれぞれ処理したMUM24細胞は、コントロールと比較して、４倍体の細胞の割合が多くなっていた。したがって、TC11並びにPEG11(E)-TC11は、ハイリスクMM細胞(MUM24)をG2/M期で停止させることにより細胞死を誘導していることが確認できた。【０１４２】
実施例１４
プルダウン法および表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いたセレブロンタンパク質と
TC11およびその修飾体、並びにサリドマイドまたはレナリドミドとの相互作用の検証
最近、催奇形性因子としてサリドマイドに結合するタンパク質セレブロン（cereblon；CRBN）が同定された（Ito, T. et al., Science, 327: 1345-1350, 2010）。X線結晶構造解析の結果、サリドマイドはグルタルイミド環の部分でCRBNに結合することが確認された(Chamberlain, PP, et al., Nature Struct. Mol. Biol., 21: 803-810, 2014)。TC11はサリドマイドやレナリドミド等のCRBN結合部位であるグルタルイミド環をもたず、代わりにかさ高いジイソプロピルフェニル基を有するベンゼン環に置換されているので、CRBNに結合しにくいと推測される。ここでは、プルダウン法と表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いたCRBNとTC11およびその修飾体、並びにサリドマイドまたはレナリドミドとの相互作用の検証を試みた。【０１４３】
まず、CRBNとサリドマイドおよびTC11との相互作用をプルダウン法により検証した。CRBNの調製は、CRBN全長遺伝子の5’上流にT7タグ、3’下流にFLAGタグとヒスチジンタグを付加し、これをpcDNA3.3 (Invitrogen) 発現用ベクターに導入してプラスミドDNAを構築した。続いてKOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO) を用いてT7タグの5’上流にKozak配列を付加した。このプラスミドDNAを293T細胞にトランスフェクションし、37℃、5% CO2で4日間培養後、細胞をRIPA バッファー (Thermo) で抽出し、抽出画分をNi Sepharose excel (GEヘルスケア) を用いて精製した。精製した画分はイミダゾールが含まれるためTBS（ナカライテスク）にバッファー交換を行なった。ビオチンを付けた既存の医薬品のサリドマイドとTC11をそれぞれストレプトアビジンビースに結合させ、これに上記の方法で調製したリコンビナント全長CRBNを30℃、30 min反応させ、遠心分離によりFlow-through(F)画分とビーズ(B)画分に分け、SDS-PAGEによりCRBNに相当するタンパク質バンドを分離し、Western blotにより検出した。図９Aに示すように、CRBNはビーズに固定されたサリドマイドには結合したが、ビーズに固定されたTC11には結合しないことが明らかになった。因に、IはInput画分である。【０１４４】
次いで、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いたCRBNとTC11およびその修飾体であるPEG11(E)-TC11、PEG11(O)-TC11、HOEtO-TC11並びにサリドマイドまたはレナリドミドとの相互作用の検証を行なった。TC11 およびその修飾体であるPEG11(E)-TC11、 PEG11(O)-TC11、HOEtO-TC11並びにサリドマイドまたはレナリドミドとのCRBNに対するKDの見積もりはBIACORETM3000（表面プラズモン共鳴を原理としたバイオセンサー、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）による分子間相互作用の分析を行った。BIACOREのバイオセンサーのリガンド（センサーチップへ貼り付ける物質）は、上記の方法で調製したC末にヒスチジンタグの付いたCRBNとした。まず初めに、Sensor Chip NTAにCRBNを固定した。バッファーはTBS（ナカライテスク）を用い流速5μl/minで行った。フローセル２とフローセル４にCRBNを固定するためにバッファー交換を行なったCRBNを10μlインジェクションしたところ、それぞれ7800 RU(レスポンスユニット)結合した。一方、アナライト（流路系に流す物質）としてTC11およびその修飾体であるPEG11(E)-TC11、PEG11(O)-TC11、HOEtO-TC11並びにサリドマイドまたはレナリドミドはTBS（ナカライテスク）バッファーに溶解し、それぞれ１μM、２μM、10μMの濃度に調整した。BIACORE 3000による分子間相互作用の解析は、バッファーはTBSを用い流速20μl/minで行った。FLOWPATH 1,2あるいはFLOWPATH 3,4を使いKINJECTで各種アナライトを60μl インジェクションし300秒解離を測定した。TC11およびその修飾体であるPEG11(E)-TC11、PEG11(O)-TC11、HOEtO-TC11、並びにサリドマイドまたはレナリドミドは、TBSバッファーで１μM、２μM、10μMの濃度で測定した。解析はフローセル２のセンサーグラムからフローセル１のセンサーグラムを引き算あるいは、フローセル４のセンサーグラムからフローセル３のセンサーグラムを引き算したものを解析ソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｖｅｒ．４．１を用い、１：１結合モデルを用いて、反応速度論的解析を行い、解離定数（ＫD）を求めた。【０１４５】
図９BにCRBNとサリドマイドおよびレナリドミドとの相互作用の表面プラズモン共鳴バイオセンサーグラムを示した。グレーは実測データ、黒はフィッティングカーブを示す。本測定は両者とも良好なフィッティングカーブが得られた。サリドマイドはCRBNに対し5.66×10-7 MのKD値を示した。また、レナリドミドはCRBNに対し3.65×10-6 MのKD値を示した。図９CにCRBNとTC11 およびその修飾体であるHOEtO-TC11、PEG11(E)-TC11、PEG11(O)-TC11との相互作用の表面プラズモン共鳴バイオセンサーグラムを示す。いずれの化合物も１μM、２μM、10μMの濃度で測定を行った。図９Cから、TC11 およびその修飾体であるHOEtO-TC11、PEG11(E)-TC11、PEG11(O)-TC11は、CRBNとそれぞれ全く結合しないことが明らかになった。以上の結果を総合すると、TC11 およびその修飾体であるHOEtO-TC11、PEG11(E)-TC11、PEG11(O)-TC11は、サリドマイドやレナリドミドのような薬剤とは異なり、催奇形性に直接関与するCRBNには結合しないことから、催奇形性がほとんどない薬剤と考えられる。【０１４６】
実施例１５
TC11およびPEG11(E)-TC11の単回腹腔内投与時のマウス血中動態
TC11およびPEG11(E)-TC11の単回腹腔内投与時のマウスの血中動態を調べた。5週齢オスのICRマウス (CLEA Japan, Tokyo, Japan)６匹にTC11 60 mg/kgBWおよびそれと当モルのPEG11(E)-TC11 177.3 mg/kgBWを単回腹腔内投与した。0、0.25、0.5、1、1.5、4、8、12、24時間後に尾静脈よりヘパリン処理済みヘマトクリット毛細管(Terumo, Tokyo, Japan)を用いて100μL程度採血した。採血後、4℃, 3,400 G, 15分間遠心分離を行い、上清を10μl回収し、-80℃で冷凍保存した。その後の血清の処理とHPLCによるTC11とPEG11(E)-TC11およびHOEtO-TC11の分析は実施例７と同じ方法で行った。尚、実施例７で述べたように、PEG11(E)-TC11は血中ではエステラーゼにより速やかに加水分解され、HOEtO-TC11に変化するので、血中のHOEtO-TC11の量を測定した。【０１４７】
その結果、図１０Aに示すように、TC11 60 mg/kgBW単回腹腔内投与時の最高血中濃度到達時間 (tmax)、最高血中濃度 (Cmax)、血中半減期 (t1/2)は、それぞれ1.5時間、2.6μM、1.4時間であった。一方、図１０Bに示すように、PEG11(E)-TC11 177.3 mg/kgBW単回腹腔内投与時のtmax、Cmax、t1/2は、それぞれ1.0時間、24.4μM、2.2時間で、TC11に比べて最高血中濃度で９倍の上昇と、血中半減期の1.6倍の延長が確認出来た。【０１４８】
実施例１６
KMS11担癌マウスに対するTC11, PEG11(E)-TC11, PEG11(O)-TC11の抗腫瘍効果
KMS11 xenograft model mice  ６匹を用いて、in vivoにおけるTC11とその修飾体の抗腫瘍効果を検討した。6週令のICR/SCID miceにKMS11を3×107 cells/mouse皮下注射した。経時的に腫瘍体積を測定し、腫瘍体積が50 mm3を超えた日をDay 1として14日間観察を行った。TC11の１回の投与量は60 mg/kgBWで、PEG11(E)-TC11とPEG11(O)-TC11の腹腔内投与量はTC11と当モル量のそれぞれ177.3 mg/kgBW、163.8 mg/kgBWとした。TC11は生理食塩水(NaCl 0.9 w/v%)のみにはほとんど溶解しないので、DMSOに溶解した後、1.1% Tween 80/生理食塩水で希釈し、所定の濃度にした。溶媒の最終組成は、10% DMSO + 1% Tween 80/生理食塩水で、TC11はこの溶媒条件下でほぼ溶解していた。PEG11(E)-TC11とPEG11(O)-TC11は、それぞれ生理食塩水に完全溶解した。薬物の投与は3日のうち2日 (Day1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 12, 13)行い、Day14に屠殺し、腫瘍重量の測定と体内所見の確認を行った。【０１４９】
図１１に示すように、TC11、PEG11(E)-TC11、PEG11(O)-TC11それぞれの投与群において、コントロールと比較して腫瘍体積が顕著に減少している傾向が確認された。特に、PEG11(E)-TC11はTC11に比べても腫瘍体積が有意に減少し、中には腫瘍体積が投与開始時とほぼ同じ大きさの３個体や原発巣が完全に消失した１個体も見られた。また、各化合物投与群はコントロール群と比較して、体重の減少は見られず、腫瘍増殖を抑制する濃度において、毒性が少ないことが示唆された。【０１５０】
実施例１７
KMS11坦癌マウスに対するTC11、HOEtO-TC11、Lenalidomideの抗腫瘍効果の比較
実施例７において図４に示したように、TC11とHOEtO-TC11のハイリスクMM細胞株(KMS21)に対するin vitro細胞増殖阻害活性の濃度依存性を詳細に調べてみたところ、TC11とHOEtO-TC11のIC50値近くの3μMでは、HOEtO-TC11のKMS21細胞に対する増殖阻害活性は、TC11に比べて3-4倍近くも高かった。さらに、実施例９では、レナリドミドがハイリスクMM細胞KMS11、KMS28、KMS34を含む、KMS21やMUM24以外の骨髄腫細胞には全くin vitroでの細胞増殖阻害活性を示さなかった(図5B)。また、レナリドミドに対しては耐性を示す患者が約20％存在することも報告されている。それ故、HOEtO-TC11の薬効がTC11に比べてin vivoでも高いかどうか、レナリドミドはハイリスクMM細胞KMS11に対してin vivoでも抗腫瘍効果を示さないかどうか調べてみた。【０１５１】
実験はKMS11 xenograft model mice 5匹を用いて、in vivoにおけるTC11、HOEtO-TC11、Lenalidomideの抗腫瘍効果を検討した。５週令のICR/SCID miceにKMS11を2×107 cells/mouse皮下注射した。経時的に腫瘍体積を測定し、腫瘍体積が50 mm3を超えた日をDay 1として９日間観察を行った。TC11の１回の投与量は60 mg/kgBWで、HOEtO-TC11とLenalidomideの腹腔内投与量はTC11と当モル量のそれぞれ71.1 mg/kgBW、49.9 mg/kgBWとした。TC11、HOEtO-TC11、及びLenalidomideは、それぞれ60mg/mL（33％DMSO、66％Cremorphor）、71.1mg/mL（33％DMSO、66％Cremorphor）、及び49.9mg/mL（33％DMSO、66％Cremorphor）のストック溶液をあらかじめ調製し、4℃で保存しておき、投与日に生食水で、Vortexで撹拌しながら10倍希釈した後、腹腔内投与した。腫瘍体積は下記の式で算定した。
腫瘍体積(mm3)=長径×短径×短径×π/6=長径×短径×短径×0.5236【０１５２】
図１２に示すように、Day 9において、TC11およびHOEtO-TC11の投与により、KMS-11腫瘍増殖は、薬物非投与のコントロールの個体における増殖と比べて抑制され、明らかに有意差が出る結果であった。Day 9において、HOEtO-TC11の投与により、KMS-11腫瘍増殖は、コントロールのそれの1/3程度まで、TC11のそれの半分程度まで有意に抑制した。図中の＊印は、対照群１群との比較で、t検定（危険率5%）で有意であったことを示している。また、Lenalidomideのin vivo抗腫瘍作用は、HOEtO-TC11のそれよりも明らかに弱かった。【０１５３】
実施例１８
HOEtO-TC11の合成（別法）
工程１
【化２２】
2018074563.tif 000028
【０１５４】
4-ヒドロキシフタル酸：21.7 g (119.0 mmol) を95%濃硫酸：682 mLに溶解した。反応液を5℃まで冷却した後、アルゴン雰囲気下、グアニジン硝酸塩：14.6 g (119.0 mmol) を30分間かけてゆっくり加え、さらに１時間攪拌した。HPLCにて反応完結を確認し、反応液を冷却した氷水へゆっくり添加し、酢酸エチルを用い抽出後、水層をさらに酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、減圧濃縮することで、B + B’：16.8 gを茶色粉末として得た(収率62.1％)。
得られたBは、ニトロ基の位置異性体の混合物であり、その比は、B : B’ = 1 : 1.27であった。【０１５５】
工程２
【化２３】
2018074563.tif 000029
【０１５６】
BおよびB’の混合物：22.4 g (99.0 mmol) を無水酢酸：186 mLに溶解した。アルゴン雰囲気下、反応液を110℃まで加熱した後、3時間攪拌した。HPLCにて反応完結を確認し、反応液を、減圧濃縮することで、DおよびD’：24.8 gを黒色オイルとして得た(収率100％) 。
得られたDは、原料由来の位置異性体の混合物であり、その比は、D : D’= 1 : 1.27であった。【０１５７】
工程３
【化２４】
2018074563.tif 000030
【０１５８】
DおよびD’の混合物：24.8 g (99.0 mmol) を酢酸： 282 mLに溶解し、2,6-ジイソプロピルアニリン：24.0 mL (126.7 mmol) を加えた。反応液をアルゴン雰囲気下、120℃まで加熱した後、4時間攪拌した。その後、2,6-ジイソプロピルアニリン： 7.8 mL (41.58 mmol) を加え、さらに1時間攪拌した。HPLCにて反応完結を確認し、反応液を氷水へ入れ、酢酸エチルを用い抽出後、水層をさらに酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘプタン/酢酸エチル =20/1→4/1） にて精製し主留を減圧濃縮することで1a：15.0 gを薄黄色粉末として得た（収率B+B’の混合物より2工程、41.2%）。【０１５９】
工程４
【化２５】
2018074563.tif 000031
【０１６０】
1a： 13.5 g (36.6 mmol) をDMF：142 mLに溶解し、2-ブロモエタノール： 5.22 mL (73.3 mmol)とDIPEA：12.8 mL (73.3 mmol) を加えた。反応液をアルゴン雰囲気下、110℃まで加熱した後、18時間攪拌した。HPLCにて反応完結を確認し、水を加え、酢酸エチルを用い抽出後、水層をさらに酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘプタン/酢酸エチル =50/1→0/1）にて精製し主留を減圧濃縮した後、再度シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム/酢酸エチル =1/0→3/1）でヒドロキシエトキシ-1a：13.2 gを薄黄色粉末として得た（収率87.3%）。【０１６１】
工程５
【化２６】
2018074563.tif 000032
【０１６２】
ヒドロキシエトキシ-1a：7.0 g (16.97 mmol)のEtOH：200 mLとＴＨＦ：200 mL混合溶液中に、Pd/C (K-type)：2.3 gを加えた後、水素雰囲気下、室温で3時間、撹拌した。
HPLCにて反応完結を確認後、反応液をろ過し、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム/酢酸エチル =1/0→1/1）にて精製し主留を減圧濃縮することで、ヒドロキシエトキシ(HOEtO)-TC11：5.5 gを黄色粉末として得た（収率84.7%）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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