(57)【要約】  本発明は、下記式（１）に示される構造を有するピロロキノリンキノンモノナトリウムを提供する。    【化１】2018003531.tif 000017
2018003531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）に示される構造を有するピロロキノリンキノンモノナトリウム。
【化１】
2018003531.tif 000015
【請求項２】
結晶であり、Ｃｕ  Ｋα放射線を用いた粉末Ｘ線回折で７．９、１０．９、１１．２、１８．４、２２．４、２５．７、２８．０、２８．８±０．４°に２θ角度のピークを示す請求項１に記載のピロロキノリンキノンモノナトリウム。
【請求項３】
下記式（２）に示される構造を有するジピロロキノリンキノンモノナトリウム。
【化２】
2018003531.tif 000016
【請求項４】
結晶であり、Ｃｕ  Ｋα放射線を用いた粉末Ｘ線回折で９．９、１６．１、１６．８、２８．１±０．４°に２θ角度のピークを示す請求項３に記載のジピロロキノリンキノンモノナトリウム。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のピロロキノリンキノンモノナトリウムの製造方法であって、
ピロロキノリンキノンジナトリウム及び／又はピロロキノリンキノントリナトリウムと酸とを接触させる工程を含むピロロキノリンキノンモノナトリウムの製造方法。
【請求項６】
前記工程を食塩存在下で行う請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記工程をエタノール濃度が１０〜９０質量％の水溶液の存在下で行う請求項５又は６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記工程でピロロキノリンキノンジナトリウムとピロロキノリンキノンモノナトリウムとの混合結晶を得る請求項５〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１又は２に記載のピロロキノリンキノンモノナトリウム或いは請求項３又は４に記載のジピロロキノリンキノンモノナトリウムのいずれかとピロロキノリンキノンジナトリウムとを共に含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピロロキノリンキノンモノナトリウム及びその製造方法、並びにそれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピロロキノリンキノン（以下、単に「ＰＱＱ」ということがある）は細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母に存在し、補酵素として重要な働きを行っており、近年までに細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギ−作用、逆転写酵素阻害作用、グリオキサラ−ゼＩ阻害作用−制癌作用などの多くの生理活性が明らかにされている。そのため、ＰＱＱは、医薬品、食品、及び化粧品分野で有用な物質として注目を集めている。例えば、医薬品分野では、ＰＱＱは、心臓、皮膚、神経等の治療薬としてその応用が期待されている。また、化粧品分野では、ＰＱＱは、美肌効果を有する物質として、その応用が期待されている。【０００３】
ピロロキノリンキノンは、培養で作られ、水溶液中で生成工程が行われるため、通常、アルカリ金属塩で得られる。ピロロキノリンキノンは水溶性であることが知られているが、フリー体構造のＰＱＱは低い水溶性を示し、実際にはＰＱＱのアルカリ金属塩にすることで水溶性が向上している。特にＰＱＱのナトリウム塩は毒性がないため使用しやすい。実際、ＰＱＱのジナトリウム塩が食品として認められて使用されている。ＰＱＱのジナトリウム塩の結晶は、含水結晶であるものが知られている（例えば、特許文献１、非特許文献１及び２参照）
下記構造式で示されるピロロキノリンキノンモノナトリウム塩はジナトリウム塩に比べ、溶解性が大きく異なっていることから、異なる使用目的で使用するのに適している。例えば、水への溶解をゆっくりとしたい場合に適している。
【化１】
2018003531.tif 000003
ピロロキノリンキノンのカルボン酸の１箇所の水素とナトリウムとが入れ替わった構造のモノナトリウム塩の合成方法としてテトラヒドロフランにＰＱＱを溶解させ、水溶液中の水酸化ナトリウムと反応させる方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１１／００７６３３号
【特許文献２】中国特許出願公開第１０１８８５７２５号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ishida, T. et al., “Molecular and crystal structure of PQQ (methoxatin), a novel coenzyme of quinoproteins: extensive stacking character and metal ion interaction”, Journal of American Chemical Society, 1998, Vol. 111, p. 6822-6828
【非特許文献２】Ikemoto, K. et al., Crystal structure and characterization of pyrroloquinoline quinone disodium trihydrate, Chemistry Central Journal 2012, 6:57  doi:10.1186/1752-153X-6-57
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、特許文献２に記載の方法で用いるテトラヒドロフランは引火性があり、食品に使用できる溶媒ではない。また、特許文献２に記載のナトリウム塩の製造方法においてピロロキノリンキノンを培養から製造する場合には、中性条件で培養したピロロキノリンキノン含有溶液は対イオンを有する構造である。そのため酸性条件にしてフリー体に変換して、さらに中和する必要がある。また、得られる物質は繊維状態構造で、嵩が高く、流動性に乏しい。そのため、同一体積での含量が低下する欠点がある。また、繊維状の結晶は固体状態では流動性に乏しく、取り扱いが困難である。【０００７】
ピロロキノリンキノンナトリウム塩は、ナトリウムの結合場所、結晶構造が異なることで安定性や取り扱い、色が変わることは知られている。取り扱いに関しては繊維状の固体になるとろ過をするとフィルム状になりやすく、粉体として取り扱う上で流動性に乏しく、使いにくい。これを改善するにはフィルム状に固まった状態を粉砕する操作が必要である。このような操作はこれまでに知られている結晶の作り方とは異なるため安定な結晶を得ることが比較的困難であり、安定な結晶及びその製造方法が求められている。安定な結晶を得るためには、特にかさ密度を上げることは重要である。これにより流動性の改善も図ることができる。
ＰＱＱの構造を有する化合物を食品や化粧品に応用する上では、ＰＱＱの構造を有する化合物には水溶性で色が変化しにくく結晶性が高いものが求められる。また、安全で迅速に製造できる方法が求められている。【０００８】
そこで、本発明は、有害な有機溶媒を使用せず、繊維状結晶を含まないかさ密度の高いピロロキノリンキノンモノナトリウムの製造方法及び新規な構造を有するピロロキノリンキノンモノナトリウムを提供することにある。さらに迅速なピロロキノリンキノンモノナトリウム結晶の製造方法及び新規な構造を有するピロロキノリンキノンモノナトリウム結晶を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、ＰＱＱジナトリウム又はＰＱＱトリナトリウムを特定条件下で調製することにより、新規な構造を有するＰＱＱモノナトリウム結晶が得られることを見出した。本発明者はまた、このＰＱＱモノナトリウム結晶は、変色しにくいことを見出した。本発明は、このような知見に基づく発明である。【００１０】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］
下記式（１）に示される構造を有するピロロキノリンキノンモノナトリウム。
【化２】
2018003531.tif 000004
［２］
結晶であり、Ｃｕ Ｋα放射線を用いた粉末Ｘ線回折で７．９、１０．９、１１．２、１８．４、２２．４、２５．７、２８．０、２８．８±０．４°に２θ角度のピークを示す［１］に記載のピロロキノリンキノンモノナトリウム。
［３］
下記式（２）に示される構造を有するジピロロキノリンキノンモノナトリウム。
【化３】
2018003531.tif 000005
［４］
結晶であり、Ｃｕ Ｋα放射線を用いた粉末Ｘ線回折で９．９、１６．１、１６．８、２８．１±０．４°に２θ角度のピークを示す［３］に記載のジピロロキノリンキノンモノナトリウム。
［５］
［１］に記載のピロロキノリンキノンモノナトリウムの製造方法であって、
ピロロキノリンキノンジナトリウム及び／又はピロロキノリンキノントリナトリウムと過剰の酸とを接触させる工程を含むピロロキノリンキノンモノナトリウムの製造方法。
［６］
前記工程を食塩存在下で行う［５］に記載の製造方法。
［７］
前記工程をエタノール濃度が１０〜９０質量％の水溶液の存在下で行う［５］又は［６］に記載の製造方法。
［８］
前記工程でピロロキノリンキノンジナトリウムとピロロキノリンキノンモノナトリウムとの混合結晶を得る［５］〜［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］
［１］又は［２］に記載のピロロキノリンキノンモノナトリウム或いは［３］又は［４］に記載のジピロロキノリンキノンモノナトリウムのいずれかとピロロキノリンキノンジナトリウムとを共に含む組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＰＱＱモノナトリウム結晶は、高い純度を有するだけでなく、溶解度と溶液中における分散性及び皮膚への浸透性が向上しており、化粧品、医薬品又は機能性食品の成分として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明のＰＱＱモノナトリウム結晶をボールアンドスティックで示した構造である。
【図２】側面から見た本発明のＰＱＱモノナトリウム結晶をボールアンドスティックで示した構造である。
【図３】実施例１のＰＱＱモノナトリウム結晶１の顕微鏡写真である。
【図４】実施例１のＰＱＱモノナトリウム結晶１の粉末Ｘ線回折である。
【図５】実施例２のＰＱＱモノナトリウム結晶をボールアンドスティックで示した構造である。
【図６】実施例２のＰＱＱモノナトリウム結晶１単結晶データから変換した粉末Ｘ線回折である。
【図７】実施例６のかさ密度の高いＰＱＱモノナトリウム結晶１の顕微鏡写真である。
【図８】実施例７のＰＱＱモノナトリウム結晶２の顕微鏡写真である。
【図９】実施例７のＰＱＱモノナトリウム結晶２の粉末Ｘ線回折である。
【図１０】実施例７のＰＱＱモノナトリウム結晶２をボールアンドスティックで示した構造である。
【図１１】比較例２のＰＱＱモノナトリウムの顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態（以下「本実施形態」とも記す。）について詳細に説明する。なお、以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明はその実施形態のみに限定されない。
【００１４】
本発明者はかさ密度の高い結晶を得るためにあるＰＱＱモノナトリウムの結晶構造を調べた結果、それがこれまで報告されていない結合を有する塩であることが判明した。従来のピロロキノリンキノンの塩は、カルボン酸の水素がはずれ、代わりにナトリウムが入った構造を有する。本発明では下記式（１）に示される構造を有するＰＱＱモノナトリウムである。
【００１５】
本実施形態のＰＱＱモノナトリウムは、例えば下記式（１）に示される構造を有する。これらの結合解析には単結晶構造解析が必要である。従来、ＰＱＱのカルボン酸の塩では酸性の水素原子が抜けたカルボン酸とナトリウムとが結合すると考えられている。ピロロキノリンキノンのこれまで報告された結晶でも同様の傾向がある。しかし、下記式（１）に示される構造を有するピロロキノリンキノンモノナトリウム（以下、「ＰＱＱモノナトリウム１」とも記す。）は、従来の考えからは予想外の構造を有している。本実施形態のＰＱＱモノナトリウムの構造は、キノリン構造に結合しており、水素が残っているカルボン酸と、キノリン構造中の窒素原子と、キノリン構造に結合している酸素原子とにナトリウムが結合し、キノリン構造に結合しており、ナトリウムが結合していないカルボン酸の水素が解離している。
図１及び図２は本実施形態のＰＱＱモノナトリウム１の結晶構造をボールアンドスティックで示したものである。本実施形態のＰＱＱモノナトリウム１の実際の結晶は下記式（１）に示される構造２つからなるユニットを有している。
【化４】
2018003531.tif 000006
【００１６】
本実施形態のＰＱＱモノナトリウムは、また例えば下記式（２）に示される構造を有する。下記式（２）に示される構造を有するジピロロキノリンキノンモノナトリウム（以下、「ＰＱＱモノナトリウム２」とも記し、ＰＱＱモノナトリウム１と区別しない場合には、単に「ＰＱＱモノナトリウム」と記す。）も、従来の考えからは予想外の構造を有している。本実施形態のＰＱＱモノナトリウム２の構造は、１分子のＰＱＱにおける、キノリン構造に結合しており、水素が残っているカルボン酸と、キノリン構造中の窒素原子と、キノリン構造に結合している酸素原子と、もう１分子のＰＱＱにおける、キノリン構造に結合しており、水素が残っていないカルボン酸と、ピロール構造に結合しているカルボン酸とにナトリウムが結合している。
【化５】
2018003531.tif 000007
【００１７】
本実施形態のＰＱＱモノナトリウムの結晶は、含水結晶であることが好ましい。含水結晶として、例えば結晶構造解析から導かれたあるＰＱＱモノナトリウムの結晶構造は２つのＰＱＱユニットと２つのナトリウムを有する構造である。本実施形態のＰＱＱモノナトリウムの結晶はこれまで報告されたナトリウム塩とは異なり、イオン化していないカルボン酸ＣＯＯＨのままナトリウムと結合を作っていることが特徴である。このような結合をもつピロロキノリンキノンは知られておらず、新規な結合をもつＰＱＱモノナトリウム結晶である。
【００１８】
単結晶によって構造決定された結晶はこのデータから粉末Ｘ線回折のデータに変換して同定可能である。そのためこの構造を有する結晶は単結晶構造解析だけでなく、確認は粉末Ｘ線回折で確認できる。本実施形態のＰＱＱモノナトリウム１の結晶（以下、「結晶１」とも記す。）は、Ｃｕ  Ｋα放射線を用いた粉末Ｘ線回折で、７．９、１０．９、１１．２、１８．４、２２．４、２５．７、２８．０、２８．８±０．４°に２θ角度のピークを示すＰＱＱモノナトリウム結晶である。このピークは、モノクロメータが装着された一般的な粉末Ｘ線回折装置で観測することができる。測定データには測定誤差も含まれることから、本実施形態で規定する結晶は、ピークの角度に関する合理的な同一性を有する結晶形である。この結晶１の結晶水は例えば９．２質量％である。実際には乾燥や湿度の影響によって水分量が変わり、１５〜１８質量％になることもある。この結晶形は四角柱である。この結晶形は繊維状でないことで粉末としての取り扱いが容易である。
【００１９】
本実施形態のＰＱＱモノナトリウム２の結晶（以下、「結晶２」とも記記し、結晶１と区別しない場合には、単に「結晶」と記す。）はＣｕ  Ｋα放射線を用いた粉末Ｘ線回折で、９．９、１６．１、１６．８、２８．１±０．４°に２θ角度のピークを示すＰＱＱモノナトリウム結晶である。この結晶は結晶形１をさらに安定化した結晶である。この結晶２は水分量が少ない。結晶２の水分量は例えば４〜７質量％である。低い水分量のピロロキノリンキノンモノナトリウムはより疎水的で油分との親和性向上メリットがある。実際の結晶では結晶１と結晶２とが混合した状態で得られることもある。
【００２０】
本実施形態のピロロキノリンキノンモノナトリウムの製造方法は、ピロロキノリンキノンジナトリウム及び／又はピロロキノリンキノントリナトリウムと酸とを接触させる工程を含む。酸は過剰の酸であることが好ましい。過剰の酸と接触させることにより迅速に製造を行うことができる。ここで過剰の酸とは、ピロロキノリンキノンジナトリウム及び／又はピロロキノリンキノントリナトリウムに対して酸が好ましくは２〜２００倍であり、より好ましくは３〜１００倍であり、さらに好ましくは５〜５０倍である。ここで、「接触させる」とは、ピロロキノリンキノンジナトリウム及び／又はピロロキノリンキノントリナトリウムと酸との少なくとも一部が接触していることを意味し、ピロロキノリンキノンジナトリウム及び／又はピロロキノリンキノントリナトリウムに酸を加えること、ピロロキノリンキノンジナトリウム及び／又はピロロキノリンキノントリナトリウムと酸とを混合することが含まれる。
【００２１】
本実施形態の製造方法で得られるＰＱＱモノナトリウムの結晶は、乾燥して使用されることが好ましい。具体的には、結晶の乾燥は、凍結乾燥、常圧乾燥や減圧乾燥により行うことができる。乾燥温度は、方法によって異なるが、例えば、−８０〜２５０℃、好ましくは、−６０〜２５０℃とすることができる。乾燥温度の下限は、凍結乾燥する際の出発温度であり、上限は結晶の分解が生じない温度である。例えば、乾燥温度は、凍結乾燥では、−８０〜０℃、好ましくは、−６０〜０℃とすることができ、常圧乾燥では、４０〜２５０℃とすることができ、減圧乾燥では、０〜２５０℃とすることができる。
【００２２】
本実施形態の製造方法はピロロキノリンキノンジナトリウムやピロロキノリンキノントリナトリウムからナトリウムイオンを除去することが特徴である。酸を加えることでナトリウムイオンは酸のナトリウム塩として除去される。過剰の酸を使用することで高速で結晶化させることが可能であるが、このときにはナトリウムイオンを共存させることが好ましい。具体的には塩酸の場合では塩化ナトリウム、硫酸では硫酸ナトリウムである。ピロロキノリンキノンモノナトリウムは溶解度が低く、除去されるナトリウム塩は溶解度が高いために分離される。
【００２３】
本実施形態のＰＱＱモノナトリウムの結晶１は、例えば、ＰＱＱジナトリウム又はＰＱＱトリナトリウムを水又はエタノール水に懸濁もしくは溶解させ、酸を添加して製造される。結晶１は、水又はエタノール水中でＰＱＱジナトリウム又はＰＱＱトリナトリウムを酸と反応する工程で製造される。ＰＱＱトリナトリウムを原料とする場合、本実施形態のＰＱＱモノナトリウムは、エタノール濃度０〜９０質量％の水溶液に、ＰＱＱトリナトリウムを添加し、次いで、酸を添加して、水溶液のｐＨを０〜２の範囲に調整することで結晶化させることができる。ＰＱＱジナトリウムを原料とする場合、本実施形態のＰＱＱモノナトリウムは、エタノール濃度０〜９０質量％の水溶液に、ＰＱＱジナトリウムを添加し、次いで、酸を添加して、水溶液のｐＨを０〜２の範囲に調整することで結晶化させることができる。より詳細に記載すると、ＰＱＱジナトリウムを原料とし、エタノール濃度２０〜８０質量％の水溶液を用いる場合、反応時間を１２時間より短くする必要がある。この場合、これより長時間（１２時間以上）反応を行うと結晶２が混入する。酸の添加量はＰＱＱジナトリウムの場合は等量、ＰＱＱトリナトリウム原料では２倍量のモルでＰＱＱモノナトリウムを製造できる。迅速に結晶を作るには過剰の酸を添加すればよく、このときにナトリウム塩、特に食塩を共存させることでＰＱＱモノナトリウムの結晶１を安定に取り出すことができる。本実施形態のＰＱＱモノナトリウムの結晶１はフリー体を形成する直前の準安定状態である。そのため、この条件では長時間反応させるとナトリウムを含まない結晶が析出するおそれがある。そのため、結晶作製には時間、温度を制御して適切な条件を選択することが好ましい。本実施形態で使用できる酸は塩酸、硫酸、硝酸の強酸が好ましいが、弱酸でも同様に反応を起こせる。使用できる弱酸は例えば酢酸、乳酸、蟻酸、クエン酸、リン酸である。使用する酸は限定されず、目的の結晶が得られる条件で行えばよい。
【００２４】
また、本実施形態のＰＱＱモノナトリウムの結晶１の製造方法は、過剰の酸を加える工程を食塩存在下で行うことが好ましい。
ここで食塩の量は、ピロロキノリンキノンジナトリウム及び／又はピロロキノリンキノントリナトリウムの質量に対して、好ましくは２〜２５０倍であり、より好ましくは５〜１００倍である。
【００２５】
本実施形態のＰＱＱモノナトリウムの結晶１は、例えば水溶液のｐＨを所定の値にしてから０．１〜１４０時間反応させることにより得ることができる。より好ましくは、反応時間は０．５〜９６時間とすることができる。また、反応温度は０〜９０℃、より好ましくは３〜６０℃で行うことができる。結晶化の条件は、できる結晶の品質に対する攪拌の有無や強弱の影響を勘案して、自由に選択できる。
【００２６】
本実施形態のＰＱＱモノナトリウムの結晶２は、例えばＰＱＱジナトリウムを原料としてエタノール水で反応させるか、いったん結晶化した結晶１をエタノール水中で再結晶することでできる。より作りやすい条件はエタノール濃度２０〜８０質量％の水溶液で結晶化させることで得ることができる。これらの結晶は製造した後、再結晶することもできる。本実施形態のＰＱＱモノナトリウムの結晶２は、例えば１２〜１４０時間反応させることにより得ることができる。より好ましくは、反応時間は１２〜９０時間とすることができる。また、反応温度は０〜９０℃、より好ましくは４０〜６０℃で行うことができる。
【００２７】
得られた結晶は、ろ過、遠心分離、デカンテーションで得ることができる。さらにこれをアルコール等で洗って提供することも可能である。
【００２８】
さらに、本実施形態のＰＱＱモノナトリウムの結晶２の製造方法は、酸を加える工程をエタノール濃度が１０〜９０質量％の水溶液の存在下で行うことがより好ましい。当該エタノール濃度は、１５〜８５質量％であることが好ましく、２０〜８０質量％であることがより好ましく、３０〜７０質量％であることがさらに好ましい。
【００２９】
本実施形態のＰＱＱモノナトリウムの結晶１及び２は、かさ密度が高く取り扱いやすい。また、本実施形態のＰＱＱモノナトリウムの結晶１及び２は、溶液に加えた場合もゲル化のような変化をしないために溶液調合が容易である。また、本実施形態のＰＱＱモノナトリウムの結晶２は、低水分含量結晶であり、かさ密度が高い。本実施形態のＰＱＱモノナトリウム結晶１及び２は、さらに、結晶であることから高純度であるという利点を有している。
さらに本実施形態のＰＱＱモノナトリウムの結晶は、溶解度、溶解速度、色の制御のためにジナトリウムと混合することができる。
本実施形態の組成物は、本実施形態のピロロキノリンキノンモノナトリウムとピロロキノリンキノンジナトリウムとを共に含む。
本実施形態の組成物において、ピロロキノリンキノンモノナトリウムとピロロキノリンキノンジナトリウムとの混合比率はピロロキノリンキノンモノナトリウムの結晶含量が好ましくは５〜９５質量％、より好ましくは５〜５０質量％である。本実施形態の組成物は結晶をそれぞれ混合して製造することもできるが、結晶化を部分的に行うことで製造することも可能である。すなわち上述したピロロキノリンキノンジナトリウム及び／又はピロロキノリンキノントリナトリウムに過剰の酸を加える工程でピロロキノリンキノンジナトリウムとピロロキノリンキノンモノナトリウムとの混合結晶を得ることができる。
【００３０】
従って、本実施形態のＰＱＱモノナトリウムの結晶１と２とは、ヒト用又は動物用として、食品、機能性食品、栄養剤、化粧品、医薬品又は医薬部外品として好適に使用することができる。ここでいう機能性食品とは、健康食品、栄養補助食品、栄養機能食品、栄養保健食品、及び特定保健用食品等、健康の維持あるいは食事にかわり栄養補給の目的で摂取する食品を意味している。食品、機能性食品、栄養剤、化粧品、医薬品又は医薬部外品の具体的な形態としては、カプセル剤（例えば、ゼラチンカプセル、ソフトカプセル）、タブレット、チュアブル、錠剤、ドリンク剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本実施形態のＰＱＱモノナトリウムの結晶１及び結晶２は、かさ密度が高いためにカプセルにつめるのに有利である。
本実施形態では、上述のＰＱＱモノナトリウムの結晶を含んでなる、医薬組成物、化粧組成物、機能性食品及び栄養剤が提供される。特に上述のＰＱＱモノナトリウムの結晶は皮膚に対する浸透性に優れることから、上述のＰＱＱモノナトリウムの結晶を含む本実施形態の医薬組成物は、経皮投与用の医薬組成物とすることができる。また、上述のＰＱＱモノナトリウムの結晶は油脂中における分散性に優れることから、オイル分散系の製剤への処方に適している。従って、上述のＰＱＱモノナトリウムの結晶を含む本実施形態の医薬組成物や化粧組成物は、好ましくは、乳剤や懸濁剤のような分散製剤の形態、軟膏剤やクリーム剤のような半固形製剤の形態あるいはソフトカプセルのような成形製剤の形態で提供されうる。
【００３１】
上述のＰＱＱモノナトリウムの結晶を機能性食品として製品化する場合には、添加剤として、例えば、甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防菌防黴剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等を用いることができる。また、上述のＰＱＱモノナトリウム結晶は、一般的には、通常の食品、例えば、味噌、醤油、インスタントみそ汁、ラーメン、焼きそば、カレー、コーンスープ、マーボードーフ、マーボーなす、パスタソース、プリン、ケーキ、パン等に加えることが可能である。また、上述のＰＱＱモノナトリウムの結晶を含む本実施形態の医薬組成物は、上述のＰＱＱモノナトリウムの結晶と少なくとも１つ以上の製剤用添加剤を含んでいてもよい。また、本実施形態の化粧組成物は、上述のＰＱＱモノナトリウムの結晶と少なくとも１以上の化粧品添加剤とを含んでいてもよい。製剤用添加剤や化粧品添加剤は、医薬組成物や化粧組成物の処方形態に従って、当業者であれば適宜選択することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、参考例、実施例及び比較例によって本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例にのみ限定されるものではない。【００３３】
粉末Ｘ線回折は、株式会社ＲＩＧＡＫＵ製ＲＩＮＴ２５００を使用し、
Ｘ線：Ｃｕ／管電圧４０ｋＶ／管電流１００ｍＡ
スキャンスピード：４．０００°／ｍｉｎ
サンプリング幅：０．０２０°
で行った。【００３４】
結晶の水分含量（質量％）の測定は、カールフィッシャー法により行った。
Ｎａ量の測定方法
ナトリウム電極はＨＯＲＩＢＡ  コンパクトイオンメーター  ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ  を使用した。
サンプル１ｍｇを０．５％コリン水酸化物水溶液１ｍＬに溶解する。この溶液を２００μＬナトリウム電極で測定した。検出下限１ｐｐｍ以下であった。【００３５】
参考例１：原料ＰＱＱトリナトリウム及びＰＱＱジナトリウム
ＰＱＱジナトリウムは三菱ガス化学株式会社製（商品名：ＢｉｏＰＱＱ）を使用した。ＰＱＱトリナトリウムはＢｉｏＰＱＱをｐＨ６−８で塩析することで得た。【００３６】
実施例１
結晶形１：ピロロキノリンキノンモノナトリウム（ＮａＣｌ  過剰、塩酸過剰）
ＰＱＱジナトリウム１．０ｇをＮａＣｌ  ２ｇ、濃塩酸７ｍＬ、水１Ｌに３７度で混合した。この時、ＰＱＱジナトリウムに対し、ＮａＣｌは１０倍以上、塩酸３０倍以上溶液に存在した。３時間攪拌して、その後、遠心分離、２‐プロパノール洗浄、乾燥して質量０．７２ｇの結晶を得た。得られた結晶は、Ｎａ量からＰＱＱモノナトリウムであることが判明した。得られたＰＱＱモノナトリウムの結晶の顕微鏡写真を図３に示す。さらに得られたＰＱＱモノナトリウムの結晶の粉末Ｘ線回折の結果を図４に示す。
得られたＰＱＱモノナトリウムの結晶は四角形であり、流動性のある粒子であった。この結晶はろ過を行ってもフィルム状にならず、分散性のよいものであった。短時間の処理時間で結晶化を行えた。【００３７】
粉末Ｘ線回折を行ったところ、得られた結晶は、７．９、１０．９、１１．２、１８．４、２２．４、２５．７、２８．０、２８．８±０．４°２θ角度のピークを示すＰＱＱモノナトリウム結晶であることが分かった（図４）。
得られたＰＱＱモノナトリウムの水分量は１６．１質量％であった。【００３８】
実施例２：単結晶構造解析
結晶の原子配置を決定するために単結晶構造解析を行った。粉末Ｘ線回折（XRD）では結晶のＸＹＺ軸のピークが混合して測定されるが単結晶構造解析ではこれらを分離して測定できるため、原子の位置決定が容易に行える。株式会社ＲＩＧＡＫＵ製Ｒ−ＡＸＩＳ  ＲＡＰＩＤ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒを使用して測定した。
人工胃液１５ｍＬに５０ｍｇのジナトリウム塩を加え、攪拌した。得られた溶液を０．２マイクロメートルのフィルターでろ過し、ろ液を４℃で１週間保存した。析出した濃赤色の結晶一粒の単結晶構造解析を行った。その結果、図５に示す構造のモノナトリウム塩であった。
この構造はピロロキノリンキノン２つとナトリウム２つとからなる構造を有し、結晶水を４つ含んでいた。一般に予想される構造とは異なりナトリウムの位置は式（１）で示される位置にあったが、このナトリウムと結合するカルボン酸の水素は解離せずに結合していた。
モノナトリウム塩のこの結晶構造を構造解析ソフトであるマーキュリーで粉末Ｘ線回折のデータに変換したピークを図６に示す。このピークは実施例１と一致しており、本発明で得られる結晶構造はすべて同一であることが確認できた。【００３９】
実施例３：結晶１  ピロロキノリンキノンジナトリウムの高濃度仕込み
水１Ｌに対しＮａＣｌ  ２ｇ、濃塩酸７ｍＬで混合した。この溶液４０ｍＬにＰＱＱジナトリウム０．６ｇを混合した。３７℃３時間攪拌し、遠心分離、２-プロパノール洗浄、乾燥して質量０．５６ｇの結晶を得た。得られた結晶は、Ｎａ量からＰＱＱモノナトリウムであることが判明した。得られたＰＱＱモノナトリウムの結晶の粉末Ｘ線解析も実施例１と同一のピークを有していた。【００４０】
実施例４  結晶１  高いＮａＣｌ濃度
ＰＱＱジナトリウム  ０．５０ｇをＮａＣｌ  ５０ｇ、水５００ｍＬ、濃塩酸３．５ｍＬと混合し、３７℃一晩反応させた。得られた反応液を、遠心分離、２-プロパノール洗浄、乾燥して質量０．４１ｇの結晶を得た。得られた結晶は、Ｎａ量からＰＱＱモノナトリウムであることが判明した。得られたＰＱＱモノナトリウムの結晶の粉末Ｘ線解析も実施例１と同一のピークを有していた。【００４１】
実施例５  結晶１  ピロロキノリンキノントリナトリウム原料
参考例１で得られたピロロキノリンキノントリナトリウムを使用した。ＰＱＱトリナトリウム  ０．５０gをＮａＣｌ  ５０ｇ、水５００ｍＬ、濃塩酸３．５ｍＬと混合し、３７℃一晩反応させた。得られた反応液を、遠心分離、２-プロパノール洗浄、乾燥して質量０．３２ｇの結晶を得た。得られた結晶は、Ｎａ量からＰＱＱモノナトリウムであることが判明した。得られたＰＱＱモノナトリウムの結晶の粉末Ｘ線解析も実施例１と同一のピークを有していた。【００４２】
実施例６  結晶１  かさ比重の大きいサンプル
ＰＱＱトリナトリウム２ｇ、エタノール２５ｍＬ、水２０ｍＬ、２Ｎ塩酸５ｍＬを室温で１時間攪拌した後、５０℃５日間反応させた。得られた反応液を、遠心分離、２-プロパノール洗浄、乾燥して質量１．４６ｇの結晶を得た。得られた結晶は、得られたＰＱＱモノナトリウムの結晶の粉末Ｘ線解析も実施例１と同一のピークを有していた。また、得られたＰＱＱモノナトリウムの水分量は１５．７質量％であった。
また、得られたＰＱＱモノナトリウムの顕微鏡写真を図７に示す。
結晶が大きくなることでかさ密度が高くなった。流動性も小さな結晶と比較して非常によかった。【００４３】
実施例７  結晶２
ピロロキノリンキノンジナトリウム２ｇをエタノール２５ｍＬ、水２２．５ｍＬの混合液に加えた。ここに２Ｎ塩酸２．５ｍＬ加え、室温で１時間攪拌した。この懸濁液を５０℃に加熱してサンプルを得た。５日後、サンプルをろ過したのち、減圧乾燥して質量１．７１ｇの結晶を得た。得られた結晶は、Ｎａ量からＰＱＱモノナトリウムであることが判明した。
また、得られたＰＱＱモノナトリウムの顕微鏡写真を図８に示す。得られたＰＱＱモノナトリウムの粉末Ｘ線解析の結果を図９に示す。
得られたＰＱＱモノナトリウムの水分量は５．０質量％であった。水分量の少ない結晶であった。
実施例２と同様に結晶２の単結晶構造解析を行った。その結果、図１０に示す構造のモノナトリウム塩であった。【００４４】
比較例１：ＰＱＱジナトリウムと塩酸のみの反応（食塩を含まない条件）
ＰＱＱジナトリウム１．０ｇを濃塩酸７ｍＬ、水１Ｌに３７度で混合した。この時、ＰＱＱジナトリウムに対し塩酸３０倍以上溶液に存在した。得られた溶液を、３時間攪拌、遠心分離、２-プロパノール洗浄、乾燥して質量０．７１ｇの結晶を得た。得られた結晶は、Ｎａ量が含まれていなかった。この条件では得られた結晶はＰＱＱフリー体であることが判明した。本発明の製造の特徴であるナトリウムイオンを過剰に入れないと結晶中からナトリウムが脱落してモノナトリウムを作ることができない場合があることがわかった。【００４５】
比較例２
中国公開公報（ＣＮ１０１８８５７２５Ａ）に記載される内容にもとづく実験
ピロロキノリンキノンジナトリウム塩２ｇを水１９８ｇに加えてジナトリウム塩水溶液を得た。得られた溶液はＮａＯＨでｐＨ９にあわせた。次に、この溶液に和光純薬製濃塩酸を水で５０％希釈した液７．７ｇを攪拌しながら添加してｐＨを０．９にした。得られた溶液を、３０分攪拌後、析出した固体をろ過し、水、イソプロパノールで洗った。これを減圧乾燥５０℃で一晩行った。回収した赤色結晶の質量は１．６ｇであった。Ｎａ分析によると、得られた結晶は、Ｎａ含有量０でナトリウムが含まれず、ＰＱＱフリー体であることがわかった。この方法で得られたＰＱＱフリー体を原料にした。ＰＱＱフリー体をテトラヒドロフランに溶かし、水酸化ナトリウム水溶液と混合した。
得られた結晶の顕微鏡写真を図１１に示す。
得られたモノナトリウム塩は実施例と異なり長細い繊維状の固体を含むものであった。さらに得られたモノナトリウム塩は、非常に小さく、ろ過固体はフィルム状になった。得られたモノナトリウム塩の水分量１６．６質量％であった。例えば特許文献２に記載されているモノナトリウム塩の構造は以下のとおりであった。
【化６】
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【００４６】
かさ密度測定
１０ｍＬメスフラスコを使用してかさ密度を測定した。
その結果を表１に示す。【００４７】
【表１】
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実施例の結晶のかさ比重は大きく、同一質量であればカプセルを小さくできる。小さなカプセルを使用できるのは飲み込みやすく、使用者の負担を減らせる利点がある。【００４８】
懸濁液流動性試験
結晶を１００ｇ／Ｌ濃度になるように水と混合した。室温で混合後４℃にして様子を観察した。【００４９】
【表２】
2018003531.tif 000010
実施例の結晶は濃厚な状態にしても流動性を有していることがわかった。これは溶液調合の際のプロセスで濃厚溶液として提供できる利点がある。比較例２の物質は流動性がなく、溶液で調製するプロセスで使用しにくい。【００５０】
実施例８〜１４
混合物の溶解性及び色
モノナトリウム結晶１として実施例１、モノナトリウム結晶２として実施例７で作ったものを使用した。表３に示す割合で粉末を混合して粉末の色を記録した。室温で結晶質量１０ｍｇに水１ｍＬ加えた。得られた水溶液を、超音波に５分かけ、７０度のお湯で１０分温めたら、室温の水３０分冷やした。冷却後の水溶液を、遠心分離して、上澄み液を取り出した。これをリン酸バッファーで希釈して３３０ｎｍの吸光度より溶解度を算出した。その結果を表３に示す。【００５１】
【表３】
2018003531.tif 000011
実施例の混合物によって色、溶解性を自由に設定できることがわかった。また、同じモノナトリウムで結晶形の異なるものを混合することでも色、溶解性を変えることができることがわかった。溶解性の制御は吸収性や食品成分との相互作用を変えることができるため、優れていることがわかった。色を重視する化粧品、食品用途に使用しやすいことがわかった。【００５２】
実施例１５  モノナトリウム結晶とジナトリウムの混合物製造
ＰＱＱジナトリウム２ｇをエタノール２５ｇと水２３ｇと混合した。ここに２Ｎ塩酸  ２ｍＬ加えた。これを室温で２時間攪拌し、５０度１８時間攪拌せずに置いた。これをろ過し、エタノールで洗い、減圧乾燥した。こげ茶色の固体を得た。得られた固体は、ナトリウムが１．５の割合になっていた。光学顕微鏡観察の結果、得られた固体は、ＰＱＱモノナトリウム結晶２が含まれた混合物であった。【００５３】
実施例１６：カプセル
グレートアングランド株式会社販売のヒドロキシプロピルメチルセルロース製カプセル♯０を使用した。カプセルに２０ｍｇの上記実施例及び比較例で得られた結晶のサンプルをつめた。
結晶１と結晶２とではそのまま、カプセルに入れることができた。比較例２の固体ではかさが高く直接入れられなかった。乳鉢ですりつぶすことでつめることができた。
実施例の結晶は固体をつぶす操作をいれずにカプセルに導入でき、ハードカプセルの使用に関して適した結晶であった。【００５４】
実施例１７  熱安定性試験（７０℃変色試験）
実施例１及び６並びに比較例２で得られた結晶１ｍｇを７０℃オーブンに入れ、２時間後の色の変化を観察した。
その結果を表４に示す。【００５５】
【表４】
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実施例の結晶１及び２は７０℃でも変色せず、安定であった。【００５６】
実施例１８  熱安定性試験（１８０℃１０分による溶解性変化）
熱処理による結晶の溶解性が変化するか試験した。
実施例１及び６並びに比較例２で得られた結晶１ｍｇをガラス製カバーガラスにはさんでホットプレートで１８０℃１０分加熱した。その後、結晶を水１０ｍＬに混合し、１５分間攪拌した。この時様子を記録した。攪拌後の水溶液を０．５μｍのフィルターで濾過し、１／１０に希釈して３３０ｎｍの吸光度を測定した。この測定より加熱処理前後の結晶の溶解性の変化を調べた。加熱前の結晶の溶解度を１００として加熱後の溶解度を表５に示す。【００５７】
【表５】
2018003531.tif 000013
実験に使用したすべての結晶は加熱処理前に水に溶けた。加熱処理を行うと溶けにくい成分が増えて変質した。結晶２は特に安定で溶解性の変化はなかった。結晶２は見た目には沈殿物は見えなかったが、吸光度は下がっており、微小な不溶結晶になっていると考えられる。繊維状に比べると変化は小さかった。比較例の繊維状は溶けない成分が現れ、沈殿物として見えた。また、吸光度からも不溶成分が多いことは明らかであった。
実施例の結晶１及び２は食品加工で使われる高温でも安定であった。従来のものでは沈殿物ができ、変質していた。【００５８】
実施例１９  抹茶との反応
抹茶２ｍｇと、実施例１及び６並びに比較例２で得られた結晶１ｍｇを混合した。混合粉末がぬれたモデルとして１００μＬの水を加えた。結晶２では茶葉は変色しなかった。しかし、結晶１及び繊維状（比較例２）ではオレンジ色に変色した。結晶２は非常に安定で粉末混合に優れていた。【００５９】
実施例２０  皮膚への浸透性試験
ブタの皮膚を水道水で洗浄し、水分を完全に拭き取った。このブタの皮膚に結晶を５ｍｇずつ接触させ、その後、ラップして皮膚に固定した。３７℃、８０分間後に、テープを剥がし、皮膚を水道水で洗浄して皮膚表面に付着した試験用組成物を除去した。試験用組成物をスキャナで取り込んで、画像ソフト（製品名：ペイント（ウィンドウズ（登録商標）ＸＰ付属ソフト）、マイクロソフト社製）を用いて皮膚の明るさの変化を測定することにより評価した。この際、皮膚の明るさの変化は
[[未処理の皮膚の明るさ−処理後の明るさ]/ [未処理の皮膚の明るさ]]×１００
により算出した。【００６０】
【表６】
2018003531.tif 000014
実施例の結晶は皮膚への浸透性が優れており、化粧品用途で使用するのに適していた。【００６１】
本出願は、２０１６年６月２９日に日本国特許庁へ出願された日本特許出願（特願２０１６−１２８９４１号）に基づくものであり、それらの内容はここに参照として取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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