(57)【要約】  植物細胞をプラズマで処理した後、物質を接触させることにより、当該細胞に、その由来とする植物及び組織の種類を問わず、また障害をもたらすことなく、簡便かつ高効率にて物質を導入できることを見出した。
2018016217.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞に物質を導入する方法であって、該細胞をプラズマで処理した後、当該細胞に物質を接触させる、方法。
【請求項２】
前記物質がタンパク質又は核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プラズマが常温大気圧プラズマである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記プラズマが、二酸化炭素プラズマ、窒素プラズマ、酸素プラズマ、水素及びアルゴン混合プラズマ、並びに空気プラズマからなる群から選択される少なくとも一つのプラズマである、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記プラズマが、二酸化炭素プラズマ及び窒素プラズマからなる群から選択される少なくとも一つのプラズマである、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラズマを用いて植物細胞内に、タンパク質、核酸等の物質を導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、核酸等の物質を、細胞内に導入することは、基礎研究のみならず、様々な産業用途においても非常に意義のあることである。【０００３】
哺乳動物細胞への物質導入に関しては、細胞のエンドサイトーシスや微生物の細胞内侵入に関与する細胞透過性因子等を利用した方法が既に確立し、広く用いられている。また様々なトランスフェクション試薬が市販され、それらを適宜選択して用いることにより、前記物質を哺乳動物細胞に導入することができる。【０００４】
一方、植物細胞に関しては、このようなトランスフェクション法はあまり有効ではなく、前記物質を導入することは困難である。これは、植物細胞はセルロースを含む強固な細胞壁に包まれているため、この細胞壁が物質導入の妨げになっている故のことと考えられている。【０００５】
このような、植物細胞への物質導入に関し、予めセルラーゼ等の酵素によって細胞壁を処理する方法（プロトプラスト法）、微細なシリンジを用いて細胞内に物質を導入する方法（マイクロインジェクション法）、金属微粒子を物質で覆って、それを細胞内に撃ち込む方法（パーティクルガン法）、電気的に細胞膜に孔を開け、物質を細胞内に流入させる方法（エレクトロポレーション法）が試みられている。【０００６】
しかしながら、これら方法で導入を行うには、植物の種毎に適切な条件を検討することが必要であり、導入条件が確立していない植物種も多い。さらに、これら方法による導入は、煩雑で手間のかかる操作であり時間を要する。また導入効率の面でも乏しく、さらには導入対象である植物細胞にダメージ（障害）をもたらすものである。また、プロトプラスト法においては、プロトプラストの単離が難しく、さらにその培養やそれからの個体への再分化が困難であるケースが多い。そのため、かかる問題点を鑑み、植物細胞に、その由来とする植物及び組織の種類を問わず、また障害をもたらすことなく、簡便かつ高効率にて物質を導入することが可能となる方法が希求されているが、未だそのような方法は確立されていないのが現状である。【０００７】
ところで、プラズマ処理、特に大気圧非熱プラズマ処理は、様々な分野、例えば、製造業、製薬業、環境制御において注目を集めている。実際、本発明者らは、かかるプラズマ処理が、ポリイミドフィルム表面の親水処理に有効であることを明らかにしている。また、麻酔ガス及び有毒化学薬品を、大気圧プラズマによって分解できるということも報告している。さらに、生物に対する効果に関しては、大気圧非熱プラズマによって、細菌や生体分子が不活性化されることも明らかにしている。【０００８】
また、プラズマ処理を用いた細胞への物質導入に関しては、物質の存在下にて哺乳動物細胞にプラズマを照射することによって、当該物質がその細胞内に導入されたことが報告されている（特許文献１及び２）。なお、特許文献２においては、かかるプラズマ処理は通常細胞に障害をもたらすものであり、例えば照射後の細胞生存数は半分以下になることも同文献において示されている（特許文献２の［００７６］欄の記載参照のほど）。また同文献においては、プラズマ処理による哺乳動物細胞へのタンパク質導入において、ＣＰＰの存在下ではその導入効率が促進されることも示されている（特許文献２の［００８２］欄の記載参照のほど）。【０００９】
しかしながら、植物細胞に関しては、上述のとおり、その由来とする植物及び組織の種類を問わず、また障害をもたらすことなく、簡便かつ高効率にて、植物細胞に、物質を導入する方法は未だ確立されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開２００２／０６４７６７号
【特許文献２】国際公開２０１１／１４８９９６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、植物細胞に、その由来とする植物及び組織の種類を問わず、また障害をもたらすことなく、簡便かつ高効率にて物質を導入する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、プラズマ処理した植物組織に、タンパク質、核酸等の物質を接触させることにより、該物質はその植物細胞内に導入されることを明らかにした。特許文献１及び２においては細胞を物質存在下でプラズマ処理しているが、驚くべきことに、植物細胞においては、プラズマ処理を施してから時間をおいて物質を接触させても、当該物質を細胞に導入することができた。また、植物細胞は細胞壁を備えているため、一般に哺乳動物細胞より物質導入が困難であるが、かかる方法によれば、細胞透過性ぺプチド（ＣＰＰ）等を用いることなく、植物細胞に物質を導入することが可能であった。また、物質を導入し得る植物及び組織の種類に制限はなく、さらにプラズマ処理によって植物細胞に障害がもたらされないことをも見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち、本発明は、プラズマを用いて植物細胞内に、タンパク質、核酸等の物質を導入する方法に関し、より詳しくは、以下を提供するものである。
＜１＞  植物細胞に物質を導入する方法であって、該細胞をプラズマで処理した後、当該細胞に物質を接触させる、方法。
＜２＞  前記物質がタンパク質又は核酸である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞  前記プラズマが常温大気圧プラズマである、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞  前記プラズマが、二酸化炭素プラズマ、窒素プラズマ、酸素プラズマ、水素及びアルゴン混合プラズマ、並びに空気プラズマからなる群から選択される少なくとも一つのプラズマである、＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一つに記載の方法。
＜５＞  前記プラズマが、二酸化炭素プラズマ及び窒素プラズマからなる群から選択される少なくとも一つのプラズマである、＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一つに記載の方法。【００１４】
なお、本発明においては、「二酸化炭素プラズマ」、「窒素プラズマ」等とは、各プラズマを生成するために用いられるガスの種類（二酸化炭素、窒素等）に基づく名称である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、植物細胞に、その由来とする植物及び組織の種類を問わず、また障害をもたらすことなく、簡便かつ高効率にて物質を導入することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例で用いた、本発明に係るプラズマ処理の一実施形態を示す、概略図である。すなわち、プラズマ発生装置１の内部にガス供給部２からプラズマ生成用ガスを流入させると共に、当該ガスをガス冷却装置４により冷却させた後、プラズマ発生装置内の内部電極に電力供給部３より電圧を印加することにより、プラズマ５を試料６（植物細胞。例えば、タバコの葉片）に照射することを示す、図である。
【図２】大腸菌において発現させニッケルアフィニティークロマトグラフィー担体を用いて精製したＨｉｓタグ融合タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開し、ＣＢＢ染色及びイムノブロットにて解析した結果を示す写真である。図中、「１」はＨｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡタンパク質をＣＢＢ染色にて解析した結果を示し、「２」はＨｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡタンパク質を抗ＧＦＰ抗体を用いたイムノブロットにて解析した結果を示し、「３」はＨｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡ−Ｒ８タンパク質をＣＢＢ染色にて解析した結果を示し、「４」はＨｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡ−Ｒ８タンパク質を抗ＧＦＰ抗体を用いたイムノブロットにて解析した結果を示す。なお、これら分析に供したタンパク質量は、ＣＢＢ染色においては１μｇであり、イムノブロットにおいては５０ｎｇである。
【図３】二酸化炭素プラズマ、酸素プラズマ、水素及びアルゴン混合ガスプラズマ又は窒素プラズマを照射した後、Ｈｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡ−Ｒ８タンパク質を接触させたタバコの葉片を、共焦点顕微鏡にて観察した結果を示す、写真である。
【図４】水素及びアルゴン混合ガスプラズマ、二酸化炭素プラズマ、窒素プラズマ、又は酸素プラズマを照射した後、Ｈｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡ−Ｒ８タンパク質を接触させたタバコの葉片における、ｃＡＭＰ産生量を測定した結果を示すグラフである。なお図中、各条件につき独立して試験した２つの葉片の結果を示す。また図中、「Ｎｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ」は単にＰＢＳ溶液（タンパク質非含有）を接触させた結果を示し、「Ｎｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」はプラズマ処理を施していない結果を示す。
【図５】二酸化炭素プラズマ又は窒素プラズマを照射してから６日後のタバコの葉片の外観を示す写真である。図中「２ｓｅｃ」及び「５ｓｅｃ」はプラズマの照射時間を示す。図中のスケールバーは１ｃｍを示す。
【図６】二酸化炭素プラズマ又は窒素プラズマを照射した後、Ｈｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡタンパク質を接触させたタバコの葉片を、共焦点顕微鏡にて観察した結果を示す、写真である。
【図７】二酸化炭素プラズマ又は窒素プラズマを照射した後、Ｈｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡタンパク質を接触させたタバコの葉片における、ｃＡＭＰ産生量を測定した結果を示すグラフである。
【図８】Ａｉｒプラズマを照射した後、Ｈｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡタンパク質を接触させたタバコの葉片を、共焦点顕微鏡にて観察した結果を示す、写真である。
【図９】二酸化炭素プラズマ又は窒素プラズマを照射した後、Ｈｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡタンパク質を接触させた、シロイヌナズナの葉又はイネの根を、共焦点顕微鏡にて観察した結果を示す、写真である。
【図１０】二酸化炭素プラズマを照射した後、ｓＧＦＰタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡの溶液に接触させたタバコの葉片を、共焦点顕微鏡にて観察した結果を示す、写真である。図中のスケールバーは５０μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（植物細胞への物質導入方法）
本発明の植物細胞に物質を導入する方法は、該細胞をプラズマで処理した後、当該細胞に物質を接触させる、方法である。
【００１８】
本発明において「植物」とは特に制限はなく、例えば、双子葉植物（タバコ、シロイヌナズナ等）及び単子葉植物（イネ等）を含む被子植物、裸子植物、コケ植物、シダ植物、草本植物、並びに木本植物が挙げられる。
【００１９】
「植物細胞」としては、任意の組織中に存在する植物細胞又は任意の組織に由来する植物細胞を本発明においては対象とすることができ特に制限されない。このような組織としては、例えば、葉、根、根端、葯、花、種子、さや、茎、茎頂、胚、花粉が挙げられる。また、本発明の方法においては、人為的に処理された植物細胞（例えば、カルス、懸濁培養細胞）も対象とすることができる。
【００２０】
前述の植物細胞に導入される「物質」としては特に制限はなく、例えば、ヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド、糖、脂質等の生体高分子が挙げられる。ここで、ヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド及び核酸が含まれ、ペプチドには、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質が含まれ、糖には、オリゴ糖及び糖鎖が含まれる。また、本発明に係る「物質」には、天然に存在する生体高分子のみならず、それらの誘導体（例えば、架橋型ヌクレオチド、非天然型アミノ酸）も含まれ、さらにそれらの複合体（例えば、糖タンパク質、糖脂質、ＲＮＡ−タンパク質複合体）も含まれる。
【００２１】
本発明において、「プラズマ」とは、気体を構成する分子が、電離により正（陽イオン）と負（電子）とに分かれている荷電粒子群を含み、全体として電気的にほぼ中性である粒子の集団（電離気体）を意味する。植物細胞を処理する「プラズマ」としては特に制限はなく、大気圧下で発生させるもの（大気圧プラズマ）であってもよく、また大気圧より低い圧力下で発生させるもの（低圧プラズマ）であっても良いが、発生させるために真空系を要することなく、また植物の生存環境に近いという観点から、大気圧プラズマであることが好ましい。なお、本発明において、大気圧とは、厳密に１０１３ｈＰａである必要はなく、その近傍の圧力（７００〜１３００ｈＰａ）の範囲であればよい。
【００２２】
大気圧プラズマを発生させる方法としては特に制限はなく、当業者であれば適宜公知の方法を用いて行うことができる。かかる公知の方法としては、例えば、誘電体バリア放電、誘導結合プラズマ放電（ＩＣＰ）、容量結合プラズマ放電（ＣＣＰ）、ホローカソード放電、コロナ放電、ストリーマ放電、グロー放電、アーク放電が挙げられる。これらの中では、比較的高いプラズマ・電子・ラジカル密度を得ることができ、かつプラズマガス温度を低く保ちやすいという観点から、グロー放電、ホロカソード放電が好ましい。
【００２３】
また、放電を生じさせるための電流は、その放電の種類、その放電（ひいてはプラズマ）を発生させるための装置の大きさ及び形状、放電を生じさせるために電圧を印加する電極の大きさ及び形状等により一概には言えないが、直流であっても交流であってもよい。
【００２４】
また、上述の植物細胞を処理する「プラズマ」の温度としては特に制限はなく、通常−９０〜２００℃であり、好ましくは０〜５０℃であり、より好ましくは２０〜３０℃（常温）である。このような温度制御は、例えば、Ｏｓｈｉｔａ  Ｔ，Ｋａｗａｎｏ  Ｈ，Ｔａｋａｍａｔｓｕ  Ｔ，Ｍｉｙａｈａｒａ  Ｈ，Ｏｋｉｎｏ  Ａ  （２０１５）「温度制御可能な大気プラズマ源」ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ  Ｓｃｉ４３：１９８７−１９９２、特開２０１０−０６１９３８号公報等に記載の方法にて達成することができる。より具体的には、当該方法によれば、後述のプラズマを生成するために用いられるガスを、液体窒素等を用いたガス冷却装置によって低温（例えば、−１９５℃）迄冷却した後、ヒーターによって所望の温度に加熱し、プラズマ化し、更にその生成されたプラズマのガス温度をヒーターにフィードバックすることで、プラズマの温度を所望の値に１℃単位で制御することができる。
【００２５】
プラズマを生成するために電圧を印加されるガスの種類としては特に制限はないが、物質の導入効率の観点から、二酸化炭素、窒素、酸素、水素及びアルゴンから選択される少なくとも１のガスが好ましく、より好ましくは、二酸化炭素、窒素がより好ましい。また、後述の実施例に示すとおり、水素及びアルゴンからなる混合ガス（体積百分率として、好ましくは０．０１〜５０％水素及び９９．９９〜５０％アルゴン）、窒素及び酸素からなる混合ガス（所謂、空気。体積着分率として、好ましくは９０〜７０％窒素及び３０〜１０％酸素）も好適に用いられる。
【００２６】
また、プラズマ発生装置に供給される前記ガスの流量は、当該装置の大きさ及び形状等、さらには試料（植物細胞）がプラズマの気流により吹き飛ぶのを避けつつ、プラズマの発生を安定させることを考慮し、当業者であれば適宜調整され得るものであり、例えば、３〜５Ｌ／分が挙げられる。
【００２７】
このようなプラズマを発生させる装置としては特に制限はないが、例えば、図１に示すような構成が提示される。より具体的には、プラズマを発生させることができるプラズマ発生装置１の他、プラズマを生成するために用いられるガスを該装置に供給するための装置（ガス供給部２）、前記ガスを電離させるための電力を供給する装置（電力供給部３）とを、本発明の植物細胞に物質を導入するための装置は少なくとも備えていることが好ましく、更にプラズマの温度を制御するためのガス冷却装置４及び／又は試料６（植物細胞）を載せるための台（載置台）を備えていることがより好ましい。また、図１には示していないが、ガス供給部２とプラズマ発生装置１との間に、ガス冷却装置４の代わりに、ガス冷却及びガス加温システム（ガス温度調整システム）を設けることがさらに好ましく。さらにまた、図１には示していないが、外部からの熱の流入を避けるため、ガス冷却装置４の代わりに断熱材を備えるものであってもよい。なお、プラズマ発生装置としても特に制限はなく、公知の装置を適宜用いれば良い。例えば、特開２０１５−０７２９１３号公報、特開２０１４−２１２８３９号公報、特開２０１３−２２５４２１号公報、特開２０１３−０９４４６８号公報、特開２０１２−２５６５０１号公報、特開２００８−０４１４２９号公報、特開２００９−０８２７９６号公報、特開２０１０−０６１９３８号公報において開示されている装置は、本発明において好適に用いられる。
【００２８】
以上のとおりにして発生させたプラズマによる植物細胞の処理は、通常、プラズマ照射口の下に当該細胞を置きプラズマを照射することにより達成される。かかる場合、照射時間としては特に制限はなく、用いるプラズマ及び植物細胞の種類等により適宜調整され得るが、植物細胞への障害を抑えつつ、物質の導入効率をより高めるという観点から、好ましくは０．０１〜３分であり、より好ましくは１〜３０秒であり、さらに好ましくは１〜１０秒であり、特に好ましくは２〜５秒である。
【００２９】
さらに、プラズマ照射口から植物細胞までの距離としても特に制限はないが、プラズマはプラズマ発生部から離れた直後から失活を始めるので、プラズマ照射口からの距離は可能な限り短くすることが望ましい。一方、プラズマは、ガス流として排気される必要があり、また植物細胞が吹き飛ぶのを抑えつつ、それにまんべんなく照射することも望ましい。そして、当業者であれば、用いるプラズマ装置及びそのガス流、並びに植物細胞の種類及び大きさ等を考慮し、上記観点を両立すべく適宜調整し得、例えば、プラズマ照射口から植物細胞までの距離として５〜７ｍｍ程度が挙げられる。
【００３０】
また、このようにしてプラズマ処理した植物細胞と、該細胞に導入する物質との接触開始時間としては、特に制限はないが、プラズマ処理による物質導入効率をより高めるという観点から、前記プラズマでの処理後０．０１〜３０分の間であることが好ましく、０．０１〜５分の間であることがより好ましい。さらに、植物細胞と物質との接触時間についても特に制限はないが、物質の導入効率と植物細胞のその後の正常な生育の観点から、１分〜３０時間であることが好ましい。
【００３１】
プラズマ処理した植物細胞に物質を接触させる方法は、特に制限はなく、物質自体をそのまま植物細胞のプラズマ接触部に添加してもよいが、その物質の性状に応じて、導入を促進するための担体に担持、付加、混合又は含有させて添加してもよい。かかる担体としては、例えば、リポソーム等のリン脂質組成物、金属（金、タングステン等）、無機物（シリコン化合物等）から成る粒子やウイスカー、アルギン酸ビーズ、ウイルス性物質（例えばコートタンパク質）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）が挙げられる。
【００３２】
さらに、植物細胞と物質との接触は、物質（又は前記物質と担体との混合物等）を含有する溶液に添加若しくは当溶液中に植物細胞を浸漬することでも行える。このような溶液としては、植物細胞を生存させたまま維持できるものであれば特に制限はなく、例えば、緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リン酸緩衝液（ＮａＰＯ４及びＫＰＯ４）、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液等）、培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地等）が挙げられる。また、溶液中の物質の濃度としては、各物質の種類、導入する植物及びその組織の種類等により適宜調整され得るが、物質がタンパク質である場合、通常１〜１００μｇ／ｍｌであり、ＤＮＡである場合には通常１〜１００μｇ／ｍｌである。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、後述の実験は、以下に示す材料及び方法を用いて行った。【００３４】
（植物）
本発明のプラズマ処理等に供する植物組織は以下のとおりに調製した。【００３５】
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ）は、その種子を土に播種し、２５℃、明１６時間／暗８時間サイクル下で栽培し、後述のプラズマ処理には、播種後４〜８週間の葉（成熟葉）を、約１．５〜２ｃｍの四角片になるようペーパータオル上で切断して供した。また、葉片の維持培養には、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）の１／２塩濃度の平板培地を用いた。【００３６】
イネ（日本晴）は、２７℃、明１６時間／暗８時間サイクル下で水道水を使って水耕栽培し、後述のプラズマ処理には、播種後２〜３週間の根を、約０．５〜３ｃｍの長さになるようスライド上で切断して供した。【００３７】
シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０）は、その種子を土に播種し、２２℃、明１２時間／暗１２時間サイクル下で栽培し、後述のプラズマ処理には、播種後４〜８週間の葉（成熟葉）を切り取ったものをそのまま供した。【００３８】
（ｓＧＦＰ−ＣｙａＡ融合タンパク質の調製）
本発明のプラズマ処理によって前記植物組織に導入されるタンパク質は、以下のとおりに調製した。【００３９】
すなわち先ず、アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）と、スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質（ｓＧＦＰ）と、Ｈｉｓタグとを融合させてなるタンパク質（Ｈｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡタンパク質）を調製した。より具体的にはｓＧＦＰをコードするＤＮＡ断片（配列番号：１）を、ｐＧＷＢ５（Ｎａｋａｇａｗａ  Ｔら、（２００７）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０４，３４−４１．参照のほど）を鋳型として、ＢａｍＨＩ−ｓＧＦＰ−Ｆプライマー（５’−ＴＡＧＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧ−３’、配列番号：２）及びＥｃｏＲＩ−ｓＧＦＰ−Ｒプライマー（５’−ＴＡＧＡＡＴＴＣＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ−３’、配列番号：３）を用いたＰＣＲにより増幅した。また、ｐＥＮＴＲ３Ｃ−ｓＧＦＰベクターを調製するため、前記にて増幅して得られた断片をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにて処理した上で、ｐＥＮＴＲ３Ｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した。次に、ＣｙａＡのオープンリーデングフレーム（ＯＲＦ、配列番号４）において、そのＮ末端４００アミノ酸をコードする部分を、ｐＨＭＣｙＡ（Ｆｕｒｕｔａｎｉ  Ａら、Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．（２００９）Ｊａｎ；２２（１）：９６−１０６．参照のほど）を鋳型として、ＥｃｏＲＩ−Ｃｙａ−Ｆプライマー（５’−ＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＡＴＣＡＧＧＣ−３’、配列番号：５）及びＸｈｏＩ−ｓｔｏｐ−Ｃｙａ１２００Ｒプライマー（５’−ＴＣＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＴＧＧＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＣＧＣＣＣ−３’、配列番号：６）を用いたＰＣＲにより増幅した。このようにして増幅した断片をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて処理し、ｐＥＮＴＲ３Ｃ−ｓＧＦＰに挿入することにより、ｐＥＮＴＲ３Ｃ−ｓＧＦＰ−ＣｙａＡを調製した。次いで、該プラスミドをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩによって処理し、ｓＧＦＰ−ＣｙａＡのＮ末に６×ヒスチジン（Ｈｉｓタグ）を融合させるため、その処理断片（ｓＧＦＰ−ＣｙａＡ断片）をｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、ｐＥＴ２８ａ−ｓＧＦＰ−ＣｙａＡプラスミドを調製した。【００４０】
また、さらに細胞透過性ペプチド  アルギニン８アミノ酸（Ｒ８、配列番号：７）を融合させた、Ｈｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡ−Ｒ８タンパク質を調製するため、Ｒ８をコードするＤＮＡ断片を、１本鎖ＤＮＡ  ＥｃｏＲＩ−Ｒ８−ｓｔｏｐ−ＸｈｏＩ−ＦとＸｈｏＩ−ｓｔｏｐ−Ｒ８−ＥｃｏＲＩ−Ｒとをアニーリングさせることにより調製し、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩによって処理したｐＥＮＴＲ３Ｃ−ｓＧＦＰに挿入した。ＣｙａＡのＮ末端４００アミノ酸をコードするＯＲＦを、ｐＨＭＣｙＡを鋳型として、ＥｃｏＲＩ−Ｃｙａ−Ｆプライマー及びＥｃｏＲＩ−Ｃｙａ１２００Ｒプライマー（５’−ＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＣＧＣＣＣ−３’、配列番号：８）を用いたＰＣＲにより増幅した。このようにして増幅した断片をＥｃｏＲＩによって処理し、ＥｃｏＲＩにて処理したｐＥＮＴＲ３Ｃ−ｓＧＦＰ−Ｒ８に挿入した。次に、このようにして得られたプラスミドを更にＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩによって処理することにより、ｓＧＦＰ−ＣｙａＡ−Ｒ８断片を切り出し、それをｐＥＴ２８ａベクターに入れ換え、ｐＥＴ２８ｓ−ｓＧＦＰ−ＣｙａＡ−Ｒ８プラスミドを調製した。【００４１】
以上のとおりにして調製したプラスミド  ｐＥＴ２８ａ−ｓＧＦＰ−ＣｙａＡ及びｐＥＴ２８ａ−ｓＧＦＰ−ＣｙａＡ−Ｒ８を、大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。そして、これら大腸菌を培養することにより、これらプラスミドがコードする融合タンパク質  Ｈｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡ及びＨｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡ−Ｒ８を各々発現させ、Ｈｉｓタグタンパク質精製用クロマトグラフィー担体（ＧＥヘルスケア社製、製品名：Ｎｉセファロースハイパフォーマンス）を用い、その説明書に記載の方法により、精製した。【００４２】
なお、これら精製タンパク質が、所望の融合タンパク質であることは、ＣＢＢ染色及び抗ＧＦＰ抗体（Ａｂｃａｍ社製）を用いたイムノブロットにより、確認している（図２  参照）。【００４３】
（プラズマ処理）
プラズマ処理は、Ｔａｋａｍａｔｓｕ  Ｔ，Ｈｉｒａｉ  Ｈ，Ｓａｓａｋｉ  Ｒ，Ｍｉｙａｈａｒａ  Ｈ，Ｏｋｉｎｏ  Ａ  （２０１３）「大気ダメージフリーマルチガスプラズマジェット源を用いた、ポリイミドフィルムの表面親水化」ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｐｌａｓｍａ  Ｓｃｉ  ４１：１１９−１２５、及び、Ｏｓｈｉｔａ  Ｔ，Ｋａｗａｎｏ  Ｈ，Ｔａｋａｍａｔｓｕ  Ｔ，Ｍｉｙａｈａｒａ  Ｈ，Ｏｋｉｎｏ  Ａ  （２０１５）「温度制御可能な大気プラズマ源」ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ  Ｓｃｉ４３：１９８７−１９９２に記載の方法に沿って行った。【００４４】
より具体的には、図１に示すとおり、プラズマ発生装置（株式会社プラズマコンセプト東京社製、ダメージフリーマルチガスプラズマジェット（ダメージフリープラズマ（日本登録商標第５４０９０７３号）、マルチガスプラズマ（（日本登録商標５４３２５８５号）、製品番号：ＰＣＴ−ＤＦＭＪ０２））の装置本体を接地し、装置本体より、所定の高電圧をプラズマ発生部の内部高圧電極を供給した。所定の高電圧とは、１０〜３０ｋＨｚ及び最大９ｋＶの変調された交流電圧であり、こうした電力がプラズマ発生部に供給され、グロー放電を発生させ、さらにアルゴン、水素、二酸化炭素、窒素、酸素、空気（Ａｉｒ）、及びそれらの混合気体等をガス種として、５Ｌ／分の流速にて１ｍｍ穴に通すことにより、安定した大気圧プラズマを生成した。【００４５】
なお、このようにして生成されたプラズマの温度（プラズマ照射口から５ｍｍの所の温度）は、熱電対測定の結果、５０℃以下であった。より低温（約２０〜３０℃）のプラズマを生成するため、液体窒素を用いた気体冷却装置により気体を冷却した。【００４６】
そして、上記のとおりにして調製した植物組織の直上５ｍｍの所に照射口を設置し、プラズマ処理を施した。その後、前記精製融合タンパク質を含む又は含まないＰＢＳ溶液を、当該植物組織に接触させた。【００４７】
（ｃＡＭＰ酵素免疫アッセイ）
ＣｙａＡタンパク質は、細胞質に存在するカルモジュリンタンパク質及びＡＴＰ依存的に、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の産生を触媒する酵素である。そのため、ＣｙａＡを含む融合タンパク質を細胞内に導入した場合、その細胞のｃＡＭＰ量を測定することにより、導入された該タンパク質量を評価することができる。【００４８】
そこで、前記プラズマ処理によって植物組織に導入された融合タンパク質を定量的に解析するため、ｃＡＭＰ量を、ｃＡＭＰバイオトラック酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）システム（アマシャム社製）を用い、その添付の説明書の方法に従って測定した。【００４９】
より具体的には、本発明の方法によりタバコの葉を処理した後、当該葉から直径１３ｍｍのリーフディスクを調製し、それを液体窒素と共に乳棒と乳鉢にてすり潰し、さらに、得られた粉末を、６％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸  ３２０μＬにて処理した。次いで、２００μＬのホモジネートを４℃、２０００ｇにて、１５分間遠心した。得られた上清は、水で飽和した５倍量のジエチルエーテルにて４回洗浄した。次に、残った水抽出物を、５５℃にて真空乾燥機により乾燥させた。そして、乾燥抽出物を、キット付属の２００μＬアッセイ用バッファーに溶解させ、各溶解抽出物の４０μＬをｃＡＭＰ酵素免疫アッセイに供した。【００５０】
（共焦点顕微鏡）
植物組織に導入された融合タンパク質を解析するため、当該タンパク質に含まれるＧＦＰが発する蛍光を検出した。具体的には、共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ−３００及びフルオビューソフトウェア（共にオリンパス社製）を用いて、ＧＦＰ画像、内在蛍光及び明視野像を取得した。【００５１】
（実施例１）
プラズマ処理による、タバコの葉へのタンパク質導入
低温（２０〜３０℃）マルチガスプラズマジェットを用いてプラズマ処理（照射時間：２〜３０秒）したタバコ葉を、その照射を施してから１〜５秒後にＨｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡ−Ｒ８タンパク質含有ＰＢＳ溶液に浮かべ、インキュベーションした（インキュベーション時間：１２〜２４時間、タンパク質溶液の濃度：５０μｇ／ｍｌ、溶液量：４００μｌ）。そして、当該インキュベーションしてから１２〜２４分後に共焦点顕微鏡によりＧＦＰタンパク質由来の蛍光シグナルを検出した。なお、マルチガスプラズマジェットのガス源としては、ＣＯ２、Ｏ２、Ｈ２とＡｒとの混合ガス（体積百分率：５％Ｈ２及び９５％Ａｒ）、Ｎ２を用いた。【００５２】
その結果、図３に示すとおり、いずれのガス源を用いてもプラズマ処理を行うことによって、タバコの葉にタンパク質を導入できることが明らかになった。特に驚くべきことは、特許文献１及び２において開示されているように細胞を物質存在下でプラズマ処理せずとも、植物細胞においては、プラズマ処理を施してから時間をおいて物質を接触させても、当該物質が細胞に導入されることが明らかになった。【００５３】
次に、導入効率の良いガス源を更に選択するため、前記同様、ＣＯ２、Ｏ２、Ｈ２とＡｒとの混合ガス、Ｎ２をガス源として用い発生させたプラズマによりタバコの葉を処理し、当該葉における、ｃＡＭＰ量を定量的に解析した。【００５４】
その結果、図４に示すとおり、図３同様に、いずれのガス源を用いてもプラズマ処理を行うことによって、タバコの葉にタンパク質が導入されていることが確認された。特に、ＣＯ２又はＮ２から発生させたプラズマにより処理することによって、その処理時間を問わず、ｃＡＭＰ量は、それらガス処理によるｃＡＭＰ量（コントロール）と比較して、有意に増加した。Ｏ２、Ｈ２とＡｒとの混合ガスに関しては、発生させたプラズマにより２０秒又は３０秒処理することによってｃＡＭＰ量の増加が認められたが、５秒又は１０秒の処理時間ではコントロールとの差が認められ難い傾向にあった。【００５５】
（実施例２）
プラズマ処理による植物細胞への影響についての検証
ＣＯ２又はＮ２から発生させたプラズマは、微生物を不活化する能力があることが明らかになっている（Ｔａｋａｍａｔｓｕ  Ｔ，Ｕｅｈａｒａ  Ｋ，Ｓａｓａｋｉ  Ｙ，Ｈｉｄｅｋａｚｕ  Ｍ，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  Ｙ，Ｉｗａｓａｗａ  Ａ，Ｉｔｏ  Ｎ，Ｋｏｈｎｏ  Ｍ，Ａｚｕｍａ  Ｔ，Ｏｋｉｎｏ  Ａ（２０１５）「マルチガスプラズマジェットによって誘導される、液相における微生物不活性化」ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０：ｅ０１３５５４６．参照のほど）。【００５６】
また、物質の存在下にて哺乳動物細胞にプラズマを照射することによって、当該物質がその細胞内に導入されたことが報告されているものの、プラズマ処理は通常細胞に障害をもたらすものであり、例えば照射後の細胞の生存率は半分以下であることが示されている（特許文献２の［００７６］欄の記載参照のほど）。そこで、これらプラズマが植物組織にダメージを与えるか否かについて調べた。具体的には、ＣＯ２プラズマ又はＮ２プラズマによって２秒又は５秒、タバコの葉を処理し、その後６日間当該葉における形態を観察した。【００５７】
その結果、図５に示すとおり、プラズマ処理を施してから６日間経過しても、タバコの葉において有意なダメージは観察されなかった。したがって、かかるプラズマ処理は植物組織に障害をもたらさないことが明らかになった。【００５８】
（実施例３）
ＣＰＰを用いない、プラズマ処理によるタバコの葉へのタンパク質導入
本願出願前において、植物細胞への物質導入に関してはタンパク質導入が特に難しく、ｆｌｏｒｉｇｅｎタンパク質等と細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）との懸濁液に、植物の茎頂分裂組織等を曝露することによって、当該タンパク質をこれら組織の細胞に導入できたことが報告されている（国際公開２０１３／１１８８６３号  参照のほど）。さらに、シリンジを用いたインフィルトレーションによって、ポリカチオン配列を含むＣＰＰとタンパク質等との複合体を植物細胞に導入できたことも報告されている（Ｎｇ  ＫＫら、（２０１６）、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １１：ｅ０１５４０８１．、国際公開２０１３／１２９６９８号  参照のほど）。また、プラズマ処理による哺乳動物細胞への物質導入において、ＣＰＰがその導入効率を促進することも示されている（特許文献２の［００８２］欄の記載参照のほど）。【００５９】
そこで、プラズマ処理による植物細胞へのタンパク質導入において、ＣＰＰが必要であるか否かについて調べるため、ＣＯ２プラズマ又はＮ２プラズマによりタバコの葉片を処理した後、上記Ｈｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡ−Ｒ８タンパク質含有ＰＢＳ溶液の代わりに、Ｈｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡタンパク質含有ＰＢＳ溶液に浮かべ、インキュベーションし、当該融合タンパク質導入の有無について検出した。【００６０】
図６に示した結果から明らかなとおり、ＣＯ２プラズマ又はＮ２プラズマによって処理した細胞のいずれにおいてもＧＦＰ由来の蛍光が検出された。さらに、図７に示すとおり、ＣＯ２プラズマ処理によって、そのガスにより処理した場合に比べて約４．０倍ｃＡＭＰ量は有意に増加した。またＮ２プラズマ処理によって、そのガスにより処理した場合に比べて約１．３倍とｃＡＭＰ量は有意に増加した。【００６１】
なお、プラズマ処理によるＨｉｓ−ｓＧＦＰ−ＣｙａＡ導入によって本当にｃＡＭＰ量が増加していることを確認するため、プラズマ処理後タンパク質を添加しない葉片において、ｃＡＭＰ量を測定した。その結果、予期したとおり、プラズマ処理と未処理との間に有意な差は認められなかった（図７のＣ  参照）。【００６２】
以上の結果から、プラズマ処理による植物細胞へのタンパク質導入において、ＣＰＰは必要でないことが明らかになった。特に驚くべきことは、植物細胞は細胞壁を備えているため、哺乳動物細胞より物質導入が困難であるにも関わらず、かかる方法によれば、ＣＰＰを用いることなく、植物細胞に物質を導入できることが明らかになった。【００６３】
また、ガス種をＣＯ２及びＮ２からＡｉｒ（体積百分率：８０％Ｎ２及び２０％Ｏ２）に代え、同様にプラズマ処理したタバコの葉におけるＨｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡタンパク質の導入の有無を解析した。その結果、図８に示すとおり、Ａｉｒプラズマ処理（２秒）によっても、ＣＰＰを要することなく、タンパク質を植物細胞内に導入できることが明らかになった。【００６４】
（実施例４）
プラズマ処理による、イネの根及びシロイヌナズナの葉へのタンパク質導入
上述のタバコの葉同様に、他の植物、他の組織に対しても、プラズマ処理によってタンパク質を導入できることを確認すべく、イネの根及びシロイヌナズナの葉をプラズマ処理（処理時間：２〜５秒）することにより、タンパク質導入を試みた。なお、導入を試みたタンパク質は、Ｈｉｓタグ融合ｓＧＦＰ−ＣｙａＡタンパク質である。【００６５】
その結果、図９に示した結果から明らかなとおり、いずれの植物及び組織においてもＧＦＰ由来の蛍光が検出されたことから、本発明の方法は、植物及びその組織の種類を問わず、タンパク質を導入できることが確認された。【００６６】
（実施例５）
プラズマ処理による、植物細胞へのＤＮＡ導入
上述のタンパク質同様、本発明の方法によりＤＮＡも植物細胞に導入されることを、以下の記載のとおり確認する。【００６７】
具体的には、植物細胞に導入されるＤＮＡとしては、レポーター遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡを用いる。なお、レポーター遺伝子として、より具体的には、緑色蛍光タンパク質（ｓＧＦＰ）をコードするＰ３５Ｓ−ｓＧＦＰ−ＴＮＯＳ、βグルクローニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするＰ３５Ｓ−ＧＵＳ−ＴＮＯＳ、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）をコードするＰ３５Ｓ−ＬＵＣ−ＴＮＯＳプラスミドＤＮＡが用いられる。また、ここで、Ｐ３５Ｓは、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター配列を意味し、ＴＮＯＳはアグロバクテリウムのノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーター配列を意味する。【００６８】
そして、上述のタンパク質同様に、タバコの葉、イネの根、シロイヌナズナの葉について各切片を調製し、当該切片にＮ２プラズマ又はＣＯ２プラズマを２〜５秒照射する。次いで、前記プラスミドＤＮＡを１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で含むＰＢＳ溶液に前記切片を浸す。その後、当該切片を寒天培地上に置き、２７℃で１〜５日間維持する。【００６９】
プラスミドＤＮＡの導入は、細胞内へ導入されたレポーター遺伝子が核内へと移行し、転写翻訳されてレポーター遺伝子によってコードされるタンパク質が細胞内で発現することを指標として確認する。ｓＧＦＰタンパク質の発現は、２７℃で維持した切片を共焦点顕微鏡で観察することで検出する。ＧＵＳタンパク質の発現は、２７℃で維持した切片を発色基質であるＸ−ＧＬＵＣで処理し、青色の発色として実体顕微鏡で観察する。ＬＵＣタンパク質の発現は、２７℃で維持した切片をＬＵＣの基質であるルシフェリンで処理し、高感度ＣＣＤカメラ（ＬＡＳ−３０００）等で化学発光を検出する。【００７０】
実際、上述のタンパク質同様に、タバコの葉について切片を調製し、当該切片にＣＯ２プラズマを５秒照射した。次いで、後述のプラスミドＤＮＡ（ｐＵＧＷ２−ｓＧＦＰ）を２０μｇ／ｍｌの濃度で含む１／４ｘＰＢＳ溶液に前記切片を浸した。その３〜８時間後に、当該切片をカルス形成培地［１ｘムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）、１ｘＭＳビタミン（０．１μｇ／ｍｌ  塩酸チアミン，０．５μｇ／ｍｌ  塩酸ピリドキシン，０．５μｇ／ｍｌ  ニコチン酸，２μｇ／ｍｌ  グリシン，１００μｇ／ｍｌ  ミオイノシトール），０．１μｇ／ｍｌ  α−ナフタレン酢酸，１μｇ／ｍｌ  ６−ベンジルアミノプリン，３０ｇ／Ｌ  スクロース，２００μｇ／ｍｌ  セフォタックス，８．５ｇ／Ｌアガー，ｐＨ５．８］上に置き、室温で一晩おいた。その後、２８℃、明１６時間／暗８時間サイクル下に移してさらに１日間生育させ、前記切片におけるｓＧＦＰタンパク質の発現を、共焦点顕微鏡で観察することによって、検出を試みた。また、対照群として、前記ＣＯ２プラズマ処理の代わりにＣＯ２ガス処理を施したもの、及びＣＯ２プラズマ処理後、下記プラスミドＤＮＡ（ｐＵＧＷ２−ｓＧＦＰ）を接触させなかったものも用意し、これら切片においてもｓＧＦＰタンパク質の発現の検出を試みた。得られた結果を図１０に示す。【００７１】
なお、導入したプラスミドＤＮＡ（ｐＵＧＷ２−ｓＧＦＰ）は、以下のようにして調製した。ｓＧＦＰをコードするＤＮＡ断片（配列番号：１）を、上記ｐＧＷＢ５を鋳型として、ＥｃｏＲＩ−ｓＧＦＰ−Ｆプライマー（５’−ＴＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧ−３’、配列番号：９）及びＸｈｏＩ−ｓＧＦＰ−Ｒプライマー（５’−ＡＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ−３’、配列番号：１０）を用いたＰＣＲにより増幅した。次いで、増幅した断片をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて処理し、ｐＥＮＴＲ３Ｃ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）のＥｃｏＲＩとＸｈｏＩサイトに挿入し、ｐＥＮＴＲ−ｓＧＦＰエントリークローンを作製した。さらに、ＧａｔｅｗａｙのＬＲクロナーゼ反応で、ｐＵＧＷ２デスティネーションベクター（Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ（２００７）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０４，３４−４１．参照のほど）にｓＧＦＰを挿入することにより、ｐＵＧＷ２−ｓＧＦＰを調製した。【００７２】
図１０に示した結果から明らかなとおり、プラズマ処理を施したタバコの葉においてＧＦＰ由来の蛍光が検出されたことから、本発明の方法によれば、タンパク質のみならずＤＮＡも、ＣＰＰ等を特段用いることなく、植物細胞に導入できることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
以上説明したように、本発明によれば、植物細胞に、その由来とする植物及び組織の種類を問わず、また障害をもたらすことなく、簡便かつ高効率にて物質を導入することが可能となる。【００７４】
したがって、本発明の方法によれば、植物細胞等の表現型の変化により、導入した物質（遺伝子、タンパク質等）の機能を解析できるため、基礎研究において非常に有用である。また、このような物質導入により新たな機能が付加された植物細胞は、バイオマス、機能性食材、医薬品材料等の生産・開発の場としても非常に有用であるため、本発明は、様々な産業用途においても多大な貢献をもたらすものである。
【符号の説明】
【００７５】
１…プラズマ発生装置、２…ガス供給部、３…電力供給部、４…ガス冷却装置、５…プラズマ、６…試料。
【配列表フリーテキスト】
【００７６】
配列番号：１
＜２２３＞  スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質の遺伝子配列
配列番号：２
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマー（ＢａｍＨ１−ｓＧＦＰ−Ｆ）の配列
配列番号：３
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマー（ＥｃｏＲ１−ｓＧＦＰ−Ｒ）の配列
配列番号：４
＜２２３＞  アデニル酸シクラーゼ
配列番号：５
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマー（ＥｃｏＲ１−Ｃｙａ−Ｆ）の配列
配列番号：６
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマー（Ｘｈｏ１−Ｓｔｏｐ−Ｃｙａ１２００Ｒ）の配列
配列番号：７
＜２２３＞  細胞透過性ペプチド  アルギニン８アミノ酸の配列
配列番号：８
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマー（ＥｃｏＲ１−Ｃｙａ１２００Ｒ）の配列
配列番号：９
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマー（ＥｃｏＲＩ−ｓＧＦＰ−Ｆ）の配列
配列番号：１０
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマー（ＸｈｏＩ−ｓＧＦＰ−Ｒ）の配列
【図１】
2018016217.tif 000003
【図２】
2018016217.tif 000004
【図３】
2018016217.tif 000005
【図４】
2018016217.tif 000006
【図５】
2018016217.tif 000007
【図６】
2018016217.tif 000008
【図７】
2018016217.tif 000009
【図８】
2018016217.tif 000010
【図９】
2018016217.tif 000011
【図１０】
2018016217.tif 000012
【配列表】
2018016217000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月26日(2017.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁を備えた植物細胞に物質を導入する方法であって、該細胞をプラズマで処理した後、当該細胞に物質を接触させる、方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
前記細胞壁を備えた植物細胞が植物組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記物質がタンパク質又は核酸である、請求項１又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記物質がタンパク質である、請求項１又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記プラズマが常温大気圧プラズマである、請求項１及び６〜８のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記プラズマが、グロー放電及びホロカソード放電からなる群から選択される少なくとも一つの放電によって発生されるプラズマである、請求項１及び６〜９のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プラズマが、二酸化炭素プラズマ、窒素プラズマ、酸素プラズマ、水素及びアルゴン混合プラズマ、並びに空気プラズマからなる群から選択される少なくとも一つのプラズマである、請求項１及び６〜１０のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プラズマが、二酸化炭素プラズマ及び窒素プラズマからなる群から選択される少なくとも一つのプラズマである、請求項１及び６〜１０のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
植物組織にタンパク質を導入する方法であって、該組織をプラズマで処理した後、当該組織にタンパク質を接触させる方法であり、かつ前記プラズマは、二酸化炭素及び窒素からなる群から選択される少なくとも一つのガスに電圧を印加し、グロー放電及びホロカソード放電からなる群から選択される少なくとも一つの放電によって発生される、常温大気圧プラズマである、方法。
【手続補正書】
【提出日】平成30年6月8日(2018.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁を備えた植物細胞に物質を導入する方法であって、該細胞をプラズマで処理した後、当該細胞に物質を接触させ、かつ前記プラズマが、グロー放電及びホロカソード放電からなる群から選択される少なくとも一つの放電によって発生されるプラズマである、方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
前記細胞壁を備えた植物細胞が植物組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記物質がタンパク質又は核酸である、請求項１又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記物質がタンパク質である、請求項１又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記プラズマが常温大気圧プラズマである、請求項１及び６〜８のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
前記プラズマが、二酸化炭素プラズマ、窒素プラズマ、酸素プラズマ、水素及びアルゴン混合プラズマ、並びに空気プラズマからなる群から選択される少なくとも一つのプラズマである、請求項１及び６〜９のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プラズマが、二酸化炭素プラズマ及び窒素プラズマからなる群から選択される少なくとも一つのプラズマである、請求項１及び６〜９のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
前記細胞の前記プラズマによる処理が、前記プラズマの前記細胞への直接照射である、請求項１、６〜９、１１及び１２のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
植物組織にタンパク質を導入する方法であって、該組織にプラズマを直接照射した後、当該組織にタンパク質を接触させる方法であり、かつ前記プラズマは、二酸化炭素及び窒素からなる群から選択される少なくとも一つのガスに電圧を印加し、グロー放電及びホロカソード放電からなる群から選択される少なくとも一つの放電によって発生される、常温大気圧プラズマである、方法。
【国際調査報告】
2018016217.tif 000013
2018016217.tif 000014
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