(57)【要約】  ジアリルスルフィド（ALS）やジアリルジスルフィド（ALDS）等の香気成分の製造方法およびそれに関連する技術を提供する。Ｓ−アリルシステイン（ALC）やＳ−アリルシステインスルホキシド（ALCSO）等の香気成分前駆体にシスタチオニンリアーゼを作用させることによりジアリルスルフィド（ALS）やジアリルジスルフィド（ALDS）等の香気成分を生成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
香気成分前駆体とシスタチオニンリアーゼを含有し、
前記香気成分前駆体が、下記一般式（Ｉ）に示すシステイン誘導体および下記一般式（ＩＩ）に示すシステインスルホキシド誘導体から選択される１種またはそれ以上の成分である、組成物：
【化１】
2017213114.tif 000022
（式中、Ｒは、Ｃ１−６アルキル基またはＣ２−６アルケニル基を示す。）
【化２】
2017213114.tif 000023
（式中、Ｒは、Ｃ１−６アルキル基またはＣ２−６アルケニル基を示す。）
【請求項２】
前記一般式（Ｉ）のＲおよび前記一般式（ＩＩ）のＲが、それぞれ独立に、メチル、ｎ−プロピル、１−プロペニル、または２−プロペニルである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記香気成分前駆体が、Ｓ−アリルシステイン、Ｓ−アリルシステインスルホキシド、Ｓ−メチルシステインスルホキシド、Ｓ−プロピルシステインスルホキシド、およびＳ−（１−プロペニル）−システインスルホキシドから選択される１種またはそれ以上の成分である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記シスタチオニンリアーゼが、シスタチオニンγリアーゼおよび／またはシスタチオニンβリアーゼである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記シスタチオニンリアーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物：
（ａ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、シスタチオニンリアーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、シスタチオニンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
前記香気成分前駆体が、該香気成分前駆体を含有する酵母エキスである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記シスタチオニンリアーゼが、該シスタチオニンリアーゼを含有する酵母エキスである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
香気成分前駆体とシスタチオニンリアーゼを飲食品またはその原料に添加することを含み、
前記香気成分前駆体が、下記一般式（Ｉ）に示すシステイン誘導体および下記一般式（ＩＩ）に示すシステインスルホキシド誘導体から選択される１種またはそれ以上の成分である、飲食品の製造方法：
【化３】
2017213114.tif 000024
（式中、Ｒは、Ｃ１−６アルキル基またはＣ２−６アルケニル基を示す。）
【化４】
2017213114.tif 000025
（式中、Ｒは、Ｃ１−６アルキル基またはＣ２−６アルケニル基を示す。）
【請求項９】
前記一般式（Ｉ）のＲおよび前記一般式（ＩＩ）のＲが、それぞれ独立に、メチル、ｎ−プロピル、１−プロペニル、または２−プロペニルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記香気成分前駆体が、Ｓ−アリルシステイン、Ｓ−アリルシステインスルホキシド、Ｓ−メチルシステインスルホキシド、Ｓ−プロピルシステインスルホキシド、およびＳ−（１−プロペニル）−システインスルホキシドから選択される１種またはそれ以上の成分である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記シスタチオニンリアーゼが、シスタチオニンγリアーゼおよび／またはシスタチオニンβリアーゼである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記シスタチオニンリアーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法：
（ａ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、シスタチオニンリアーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、シスタチオニンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１３】
前記香気成分前駆体が、該香気成分前駆体を含有する酵母エキスである、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記シスタチオニンリアーゼが、該シスタチオニンリアーゼを含有する酵母エキスである、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
シスタチオニンリアーゼの活性が増大するように改変された酵母。
【請求項１６】
前記シスタチオニンリアーゼが、シスタチオニンγリアーゼおよび／またはシスタチオニンβリアーゼである、請求項１５に記載の酵母。
【請求項１７】
前記シスタチオニンリアーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１５または１６に記載の酵母：
（ａ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、シスタチオニンリアーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、シスタチオニンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１８】
シスタチオニンリアーゼをコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、シスタチオニンリアーゼの活性が増大した、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項１９】
前記遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、及び／又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによって上昇した、請求項１８に記載の酵母。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の酵母を原料として酵母エキスを製造することを含む、酵母エキスの製造方法。
【請求項２１】
シスタチオニンリアーゼを１５０Ｕ／ｇ以上の濃度で含有する酵母エキス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジアリルスルフィドやジアリルジスルフィド等の香気成分の製造方法およびそれに関連する技術に関する。香気成分は、例えば、食品分野において有用である。
【背景技術】
【０００２】
ニンニクフレーバーは、ニンニクを切ったりすりおろしたりした際に、アリイナーゼ（システインスルホキシドリアーゼ：EC 4.4.1.4）の作用によりニンニク中に存在するシステインスルホキシド誘導体（アリイン、メチイン、イソアリイン）がチオスルフィネート（アリシン（ジアリルチオスルフィネート）やその類縁体）に変換され（非特許文献１）、そのチオスルフィネートがさらにジアリルジスルフィド等の含硫有機化合物に変化することによって生成する（非特許文献２、３）ことが知られている。ジアリルジスルフィド等の含硫有機化合物は、ニンニクフレーバー、抗菌、大腸癌の予防、循環器疾患の予防等の種々の用途での利用が期待されているため、ニンニクからそれら含硫有機化合物の前駆体（アリイン等のシステインスルホキシド誘導体やアリシン等のチオスルフィネート）を工業的に製造する方法が検討されている（特許文献１、２）。しかしながら、ニンニク由来の原料を工業的に用いることは、製造コストや安定した生産の観点で改善の余地があった。また、アリイナーゼを利用してアリインからアリシン等のチオスルフィネートを製造する方法が検討されているが（特許文献３、非特許文献４）、製造コストやアリインの供給の観点で改善の余地があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭６２−２８９１９３
【特許文献２】特開２０１４−２３４４９号公報
【特許文献３】特開２００９−１００７７１号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Stoll, A. and Seebeck, E., Chemical investigations on alliin, the specific principle of garlic. Advan. Enzymol., 11,377-400 (1951)
【非特許文献２】Block, E., The organosulfur chemistry of the genus Allium-Implications for the organic chemistry of sulfur. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 31,1135-1178 (1992)
【非特許文献３】Roman Kubec, J. Agric. Food Chem. (1997) Vol.45,3580-3585
【非特許文献４】I. Krest, J. Agric. Food Chem. (2000) Vol.48,3753-3760
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ジアリルスルフィドやジアリルジスルフィド等の香気成分の製造方法およびそれに関連する技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、Ｓ−アリルシステイン（ALC）やＳ−アリルシステインスルホキシド（ALCSO）等の香気成分前駆体にシスタチオニンリアーゼを作用させることによりジアリルスルフィド（ALS）やジアリルジスルフィド（ALDS）等の香気成分が生成することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
香気成分前駆体とシスタチオニンリアーゼを含有し、
前記香気成分前駆体が、下記一般式（Ｉ）に示すシステイン誘導体および下記一般式（ＩＩ）に示すシステインスルホキシド誘導体から選択される１種またはそれ以上の成分である、組成物：
【化１】
2017213114.tif 000002
（式中、Ｒは、Ｃ１−６アルキル基またはＣ２−６アルケニル基を示す。）
【化２】
2017213114.tif 000003
（式中、Ｒは、Ｃ１−６アルキル基またはＣ２−６アルケニル基を示す。）
［２］
前記一般式（Ｉ）のＲおよび前記一般式（ＩＩ）のＲが、それぞれ独立に、メチル、ｎ−プロピル、１−プロペニル、または２−プロペニルである、［１］に記載の組成物。
［３］
前記香気成分前駆体が、Ｓ−アリルシステイン、Ｓ−アリルシステインスルホキシド、Ｓ−メチルシステインスルホキシド、Ｓ−プロピルシステインスルホキシド、およびＳ−（１−プロペニル）−システインスルホキシドから選択される１種またはそれ以上の成分である、［１］または［２］に記載の組成物。
［４］
前記シスタチオニンリアーゼが、シスタチオニンγリアーゼおよび／またはシスタチオニンβリアーゼである、［１］〜［３］のいずれかに記載の組成物。
［５］
前記シスタチオニンリアーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、［１］〜［４］のいずれかに記載の組成物：
（ａ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、シスタチオニンリアーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、シスタチオニンリアーゼ活性を有するタンパク質。
［６］
前記香気成分前駆体が、該香気成分前駆体を含有する酵母エキスである、［１］〜［５］のいずれかに記載の組成物。
［７］
前記シスタチオニンリアーゼが、該シスタチオニンリアーゼを含有する酵母エキスである、［１］〜［６］のいずれかに記載の組成物。
［８］
香気成分前駆体とシスタチオニンリアーゼを飲食品またはその原料に添加することを含み、
前記香気成分前駆体が、下記一般式（Ｉ）に示すシステイン誘導体および下記一般式（ＩＩ）に示すシステインスルホキシド誘導体から選択される１種またはそれ以上の成分である、飲食品の製造方法：
【化３】
2017213114.tif 000004
（式中、Ｒは、Ｃ１−６アルキル基またはＣ２−６アルケニル基を示す。）
【化４】
2017213114.tif 000005
（式中、Ｒは、Ｃ１−６アルキル基またはＣ２−６アルケニル基を示す。）
［９］
前記一般式（Ｉ）のＲおよび前記一般式（ＩＩ）のＲが、それぞれ独立に、メチル、ｎ−プロピル、１−プロペニル、または２−プロペニルである、［８］に記載の方法。
［１０］
前記香気成分前駆体が、Ｓ−アリルシステイン、Ｓ−アリルシステインスルホキシド、Ｓ−メチルシステインスルホキシド、Ｓ−プロピルシステインスルホキシド、およびＳ−（１−プロペニル）−システインスルホキシドから選択される１種またはそれ以上の成分である、［８］または［９］に記載の方法。
［１１］
前記シスタチオニンリアーゼが、シスタチオニンγリアーゼおよび／またはシスタチオニンβリアーゼである、［８］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］
前記シスタチオニンリアーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、［８］〜［１１］のいずれかに記載の方法：
（ａ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、シスタチオニンリアーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、シスタチオニンリアーゼ活性を有するタンパク質。
［１３］
前記香気成分前駆体が、該香気成分前駆体を含有する酵母エキスである、［８］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
前記シスタチオニンリアーゼが、該シスタチオニンリアーゼを含有する酵母エキスである、［８］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］
シスタチオニンリアーゼの活性が増大するように改変された酵母。
［１６］
前記シスタチオニンリアーゼが、シスタチオニンγリアーゼおよび／またはシスタチオニンβリアーゼである、［１５］に記載の酵母。
［１７］
前記シスタチオニンリアーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、［１５］または［１６］に記載の酵母：
（ａ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、シスタチオニンリアーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、シスタチオニンリアーゼ活性を有するタンパク質。
［１８］
シスタチオニンリアーゼをコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、シスタチオニンリアーゼの活性が増大した、［１５］〜［１７］のいずれかに記載の酵母。
［１９］
前記遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、及び／又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによって上昇した、［１８］に記載の酵母。
［２０］
［１５］〜［１９］のいずれかに記載の酵母を原料として酵母エキスを製造することを含む、酵母エキスの製造方法。
［２１］
シスタチオニンリアーゼを１５０Ｕ／ｇ以上の濃度で含有する酵母エキス。
［２２］
香気成分前駆体にシスタチオニンリアーゼを作用させることを含み、
前記香気成分前駆体が、下記一般式（Ｉ）に示すシステイン誘導体および下記一般式（ＩＩ）に示すシステインスルホキシド誘導体から選択される１種またはそれ以上の成分である、香気成分の製造方法：
【化５】
2017213114.tif 000006
（式中、Ｒは、Ｃ１−６アルキル基またはＣ２−６アルケニル基を示す。）
【化６】
2017213114.tif 000007
（式中、Ｒは、Ｃ１−６アルキル基またはＣ２−６アルケニル基を示す。）
［２３］
前記一般式（Ｉ）のＲおよび前記一般式（ＩＩ）のＲが、それぞれ独立に、メチル、ｎ−プロピル、１−プロペニル、または２−プロペニルである、［２２］に記載の方法。
［２４］
前記香気成分前駆体が、Ｓ−アリルシステイン、Ｓ−アリルシステインスルホキシド、Ｓ−メチルシステインスルホキシド、Ｓ−プロピルシステインスルホキシド、およびＳ−（１−プロペニル）−システインスルホキシドから選択される１種またはそれ以上の成分である、［２２］または［２３］に記載の方法。
［２５］
前記シスタチオニンリアーゼが、シスタチオニンγリアーゼおよび／またはシスタチオニンβリアーゼである、［２２］〜［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］
前記シスタチオニンリアーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、［２２］〜［２５］のいずれかに記載の方法：
（ａ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、シスタチオニンリアーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、シスタチオニンリアーゼ活性を有するタンパク質。
［２７］
前記香気成分が、ジアリルスルフィド、ジアリルジスルフィド、アリルメチルジスルフィド、ジメチルジスルフィド、ジメチルトリスルフィド、メチルプロピルトリスルフィド、ジプロピルトリスルフィド、３，４−ジメチルチオフェン、および２−メチル−２−ペンテナールから選択される１種またはそれ以上の成分である、［２２］〜［２６］のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】粗酵素液の調製フローを示す図。
【図２】野生株（Saccharomyces cerevisiae BY4742）またはCYS3遺伝子高発現株（Saccharomyces cerevisiae BY4742_CYS3↑）の粗酵素液とALCSOを120分反応させた際のALCSO残存率を示す図。
【図３】精製酵素の調製フローを示す図。
【図４】精製シスタチオニンβリアーゼまたは精製シスタチオニンγリアーゼとALCまたはALCSOを１時間反応させた際のALSおよびALDSの生成量を示す図。
【図５】粗酵素液の調製フローを示す図。
【図６】野生株（Saccharomyces cerevisiae BY4742）またはCYS3遺伝子高発現株（Saccharomyces cerevisiae BY4742_CYS3↑）の粗酵素液とALCSOを１時間反応させた際のALSの生成量を示す図。
【図７】野生株（Saccharomyces cerevisiae BY4742）またはCYS3遺伝子高発現株（Saccharomyces cerevisiae BY4742_CYS3↑）の粗酵素液とALCSOを１時間反応させた際のALDSの生成量を示す図。
【図８】精製シスタチオニンγリアーゼの濃度とALCSOの残存率の経時変化を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、香気成分前駆体にシスタチオニンリアーゼを作用させることを含む、香気成分の製造方法である。
【００１１】
＜１−１＞香気成分
香気成分は、香気成分前駆体からシスタチオニンリアーゼの作用を通じて生成するものであれば特に制限されない。香気成分として、具体的には、例えば、ジアリルスルフィド（Diallyl sulfide；ALS, 592-88-1）、ジアリルジスルフィド（Diallyl disulfide；ALDS, 2179-57-9）、アリルメチルジスルフィド（Allyl methyl disulfide；AMDS, 2179-58-0）、ジメチルジスルフィド（Dimethyl disulfide；DMDS, 624-92-0）、ジメチルトリスルフィド（Dimethyl trisulfide；DMTS, 3658-80-8）、メチルプロピルトリスルフィド（Methyl propyl trisulfide；MPTS, 17619-36-2）、ジプロピルトリスルフィド（Dipropyl trisulfide；DPTS, 6028-61-1）、３，４−ジメチルチオフェン（3,4-Dimethylthiophen；DMTP, 632-15-5）、２−メチル−２−ペンテナール（2-Methyl-2-pentenal, 623-36-9）、アリルメルカプタン（Allyl mercaptan, 870-23-5）、２，４−ジメチルチオフェン（2,4-Dimethylthiophene, 638-00-6）、プロピレンスルフィド（Propylene sulfide, 1072-43-1）、３−ビニル−３，４−ジヒドロ−１，２−ジチイン（3-Vinyl-3,4-dihydro-1,2-dithiine, 62488-53-3）、３−ビニル−３，６−ジヒドロ−１，２−ジチイン（3-Vinyl-3,6-dihydro-1,2-dithiine, 62488-52-2）２−ビニル−４Ｈ−１，３−ジチイン（2-Vinyl-4H-1,3-dithiin, 80028-57-5）、メチル（１−プロペニル）ペルスルフィド（Methyl(1-propenyl) persulfide, 5905-47-5）、２，３−ジメチルチオフェン（2,3-Dimethylthiophene, 632-16-6）、１，２，４，６−テトラチエパン（1,2,4,6-Tetrathiepane, 292-45-5）、アリルメチルトリスルフィド（Allyl methyl trisulfide, 34135-85-8）、ジプロピルジスルフィド（Dipropyl disulfide, 629-19-6）、ジプロペニルジスルフィド（Dipropenyl disulfide, 53925-82-9）、１，３−ジチアン（1,3-Dithiane, 505-23-7）、２−（２−エトキシエトキシ）エタノール（2-(2-Ethoxyethoxy)-ethanol, 111-90-0）、３，５−ジメチルイソチアゾール（3,5-Dimethylisothiazole, 24260-24-0）、イソチアゾール（Isothiazole, 288-16-4）、４−メチル−２−ヘプタノン（4-Methyl-2-heptanone, 6137-06-0）、１５−クラウン−５（15-Crown-5, 33100-27-5）、ノニルフェノール（Nonylphenol, 25154-52-3）、ｔｅｒｔ−ブチルジスルフィド（tert-Butyl disulfide, 110-06-5）、１−（２−クロロフェニル）−２−キノキサリン−２−イル−エテンアミン（1-Amino-1-ortho-chlorophenyl-2-(2-quinoxalinyl)ethane, 69737-10-6）、３，４−ジヒドロ−５−メチルナフタレン（3,4-Dihydro-1-methylnaphthalene, 4373-13-1）、３，３−ジヒドロ−５−メチルナフタレン（3,4-Dihydro-5-methylnaphthalene, 21564-78-3）、ヘキサメチルシクロトリシロキサン（Hexamethylcyclotrisiloxane, 541-05-9）、2-[(トリメチルシリル)オキシ]安息香酸トリメチルシリル（Trimethylsilyl 2-[(trimethylsilyl)oxy]benzoate, 3789-85-3）、２−メチル−ブタナール（2-Methyl-butanal, 590-86-3）、Ｎ−エチル−１，３−ジチオイソインドリン（N-ethyl-1,3-dithioisoindoline, 35373-06-9）、１−プロパナール（1-Propanal, 123-38-6）、２，４−ジメチルチオフェン（2,4-Dimethylthiophene, 638-00-6）、２，３−ジメチルチオフェン（2,3-Dimethylthiophene, 632-16-6）が挙げられる。括弧内には、ＣＡＳ番号を記載した。例えば、Ｓ−アリルシステイン（ALC）やＳ−アリルシステインスルホキシド（ALCSO）等の香気成分前駆体を用いた場合、ジアリルスルフィド（ALS）やジアリルジスルフィド（ALDS）等の香気成分が生成され得る。本発明においては、１種またはそれ以上の香気成分が製造されてよい。より具体的には、本発明においては、１種の香気成分が製造され��もよく、２種またはそれ以上の香気成分が製造されてもよい。すなわち、「香気成分」とは、特記しない限り、１種またはそれ以上の香気成分を意味してよい。
【００１２】
＜１−２＞シスタチオニンリアーゼとその製造
＜１−２−１＞シスタチオニンリアーゼ
「シスタチオニンリアーゼ」とは、シスタチオニンを分解する反応を触媒する酵素をいう。同反応を触媒する活性を「シスタチオニンリアーゼ活性」ともいう。すなわち、「シスタチオニンリアーゼ」とは、言い換えると、シスタチオニンリアーゼ活性を有するタンパク質である。また、シスタチオニンリアーゼをコードする遺伝子を「シスタチオニンリアーゼ遺伝子」ともいう。
【００１３】
シスタチオニンリアーゼとしては、選択した香気成分前駆体を基質とすることができ、香気成分の生成に関与するものを、特に制限されず用いることができる。シスタチオニンリアーゼとしては、シスタチオニンβリアーゼやシスタチオニンγリアーゼが挙げられる。「シスタチオニンβリアーゼ」とは、シスタチオニンと水からホモシステインとピルビン酸とアンモニアを生成する反応を触媒する酵素（EC 4.4.1.8）をいう。同反応を触媒する活性を「シスタチオニンβリアーゼ活性」ともいう。すなわち、「シスタチオニンβリアーゼ」とは、言い換えると、シスタチオニンβリアーゼ活性を有するタンパク質である。「シスタチオニンγリアーゼ」とは、シスタチオニンと水からシステインと２−オキソブタン酸とアンモニアを生成する反応とシステインと水からピルビン酸と硫化水素とアンモニアを生成する反応を触媒する酵素（EC 4.4.1.1）をいう。同反応を触媒する活性を「シスタチオニンγリアーゼ活性」ともいう。すなわち、「シスタチオニンγリアーゼ」とは、言い換えると、シスタチオニンγリアーゼ活性を有するタンパク質である。シスタチオニンリアーゼとしては、シスタチオニンγリアーゼが好ましい。シスタチオニンリアーゼとしては、１種またはそれ以上のシスタチオニンリアーゼを用いることができる。より具体的には、シスタチオニンリアーゼとしては、１種のシスタチオニンリアーゼを用いてもよく、２種またはそれ以上のシスタチオニンリアーゼを組み合わせて用いてもよい。すなわち、「シスタチオニンリアーゼ」とは、特記しない限り、１種またはそれ以上のシスタチオニンリアーゼを意味してよい。シスタチオニンリアーゼとしては、例えば、シスタチオニンβリアーゼとシスタチオニンγリアーゼのいずれか一方を用いてもよく、両方を用いてもよい。
【００１４】
シスタチオニンリアーゼの由来は特に制限されない。すなわち、シスタチオニンリアーゼとしては、細菌、酵母、高等動物等、いずれの由来のものを用いてもよい。シスタチオニンβリアーゼとしては、STR3遺伝子にコードされるStr3タンパク質が挙げられる。STR3遺伝子としては、サッカロミセス・セレビシエ等の酵母のSTR3遺伝子が挙げられる。サッカロミセス・セレビシエS288C株のSTR3遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするStr3タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および２に示す。シスタチオニンγリアーゼとしては、CYS3遺伝子にコードされるCys3タンパク質が挙げられる。CYS3遺伝子としては、サッカロミセス・セレビシエ等の酵母のCYS3遺伝子が挙げられる。サッカロミセス・セレビシエS288C株のCYS3遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするCys3タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３および４に示す。すなわち、シスタチオニンリアーゼ遺伝子は、例えば、上記例示したシスタチオニンリアーゼ遺伝子の塩基配列（例えば配列番号１または３に示す塩基配列）を有する遺伝子であってよい。また、シスタチオニンリアーゼは、例えば、上記例示したシスタチオニンリアーゼのアミノ酸配列（例えば配列番号２または４に示すアミノ酸配列）を有するタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」場合および当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合を包含する。
【００１５】
シスタチオニンリアーゼ遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したシスタチオニンリアーゼ遺伝子、例えば上記例示したSTR3遺伝子やCYS3遺伝子、のバリアントであってもよい。同様に、シスタチオニンリアーゼは、元の機能が維持されている限り、上記例示したシスタチオニンリアーゼ、例えば上記例示したStr3タンパク質やCys3タンパク質、のバリアントであってもよい。なお、そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。「STR3遺伝子」および「CYS3遺伝子」という用語は、それぞれ、上記例示したSTR3遺伝子およびCYS3遺伝子に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「Str3タンパク質」および「Cys3タンパク質」という用語は、それぞれ、上記例示したStr3タンパク質およびCys3タンパク質に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したシスタチオニンリアーゼ遺伝子やシスタチオニンリアーゼのホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【００１６】
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることをいう。シスタチオニンリアーゼ遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントがシスタチオニンリアーゼ活性を有するタンパク質をコードすることをいう。また、シスタチオニンリアーゼについての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントがシスタチオニンリアーゼ活性を有することをいう。
【００１７】
シスタチオニンβリアーゼやシスタチオニンγリアーゼ等のシスタチオニンリアーゼの活性は、例えば、公知の手法（Yamagata et al., Journal of Bacteriology, Aug. 1993, p.4800-4808）により測定することができる。すなわち、シスタチオニンリアーゼ活性は、例えば、シスタチオニンを基質として酵素反応を行い、シスタチオニンの減少量またはプロダクトの生成量を指標として、決定することができる。この場合、1 Uのシスタチオニンリアーゼ活性は、1分間に1μmolのシスタチオニンを減少させる酵素活性または1分間に1μmolのプロダクトを生成する酵素活性として定義される。
【００１８】
シスタチオニンβリアーゼ活性は、例えば、シスタチオニンを基質として酵素反応を行い、ホモシステインまたはピルビン酸の生成量を指標として、決定することができる。この場合、1 Uのシスタチオニンβリアーゼ活性は、1分間に1μmolのホモシステインまたはピルビン酸を生成する酵素活性として定義される。なお、ピルビン酸はシスタチオニンγリアーゼによっても生成され得るので、シスタチオニンγリアーゼ活性と区別するために、シスタチオニンβリアーゼ活性は、特に、ホモシステインの生成量を指標として決定してもよい。
【００１９】
シスタチオニンγリアーゼ活性は、例えば、シスタチオニンを基質として酵素反応を行い、システインまたは２−オキソブタン酸の生成量を指標として、決定することができる。この場合、1 Uのシスタチオニンγリアーゼ活性は、1分間に1μmolのシステインまたは２−オキソブタン酸を生成する酵素活性として定義される。なお、システインはシスタチオニンγリアーゼによりさらに分解され得るので、シスタチオニンγリアーゼ活性は、特に、２−オキソブタン酸の生成量を指標として決定してもよい。また、シスタチオニンγリアーゼ活性は、例えば、システインを基質として酵素反応を行い、ピルビン酸の生成量を指標として、決定することもできる。この場合、1 Uのシスタチオニンγリアーゼ活性は、1分間に1μmolのピルビン酸を生成する酵素活性として定義される。
【００２０】
酵素活性を測定する際の酵素反応は、酵素の種類等の諸条件に応じた適当な条件で実施することができる。酵素反応は、例えば、pH7.4、30℃で実施することができる。酵素反応は、具体的には、例えば、適当量の酵素（例えば、精製酵素として0.04〜0.2 mg/mL）、3 mM基質、100μM PLP（ピリドキサールリン酸）を含有する50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）を用いて30℃で実施することができる。
【００２１】
以下、保存的バリアントについて例示する。
【００２２】
シスタチオニンリアーゼ遺伝子のホモログまたはシスタチオニンリアーゼのホモログは、例えば、上記例示したシスタチオニンリアーゼ遺伝子の塩基配列または上記例示したシスタチオニンリアーゼのアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、シスタチオニンリアーゼ遺伝子のホモログは、例えば、各種生物の染色体を鋳型にして、これら公知のシスタチオニンリアーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。
【００２３】
シスタチオニンリアーゼ遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列（例えば配列番号２または４に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００２４】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００２５】
また、シスタチオニンリアーゼ遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を意味する。
【００２６】
また、シスタチオニンリアーゼ遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列（例えば配列番号１または３に示す塩基配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【００２７】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上述の遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００２８】
また、宿主によってコドンの縮重性が異なるので、シスタチオニンリアーゼ遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。すなわち、シスタチオニンリアーゼ遺伝子は、コドンの縮重による上記例示したシスタチオニンリアーゼ遺伝子のバリアントであってもよい。例えば、シスタチオニンリアーゼ遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
【００２９】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448の類似性を検索する方法、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載されているような、改良された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムが挙げられる。
【００３０】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331によく記載されている。
【００３１】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用できる。また、PSI-BLAST（BLAST 2.0）を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
【００３２】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
【００３３】
なお、上記の遺伝子やタンパク質の保存的バリアントに関する記載は、シスタチオニンβ−シンターゼ等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
【００３４】
＜１−２−２＞シスタチオニンリアーゼの製造
シスタチオニンリアーゼは、シスタチオニンリアーゼ遺伝子を有する宿主にシスタチオニンリアーゼ遺伝子を発現させることにより製造できる。なお、「シスタチオニンリアーゼ遺伝子を有する」ことを、「シスタチオニンリアーゼを有する」ともいう。すなわち、例えば、シスタチオニンリアーゼ遺伝子を有する宿主を、「シスタチオニンリアーゼを有する宿主」ともいう。また、シスタチオニンリアーゼ遺伝子の発現を、「シスタチオニンリアーゼの発現」ともいう。
【００３５】
また、シスタチオニンリアーゼは、シスタチオニンリアーゼ遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。
【００３６】
シスタチオニンリアーゼ遺伝子を有する宿主は、本来的にシスタチオニンリアーゼ遺伝子を有するものであってもよく、シスタチオニンリアーゼ遺伝子を有するように改変されたものであってもよい。
【００３７】
本来的にシスタチオニンリアーゼ遺伝子を有する宿主としては、上記のようなシスタチオニンリアーゼが由来する生物、例えば、サッカロミセス・セレビシエ等の酵母、が挙げられる。
【００３８】
シスタチオニンリアーゼ遺伝子を有するように改変された宿主としては、シスタチオニンリアーゼ遺伝子が導入された宿主が挙げられる。本来的にシスタチオニンリアーゼ遺伝子を有さない宿主にシスタチオニンリアーゼ遺伝子を導入することにより、同宿主のシスタチオニンリアーゼ活性を増大させる（同宿主にシスタチオニンリアーゼ活性を付与する）ことができる。
【００３９】
また、本来的にシスタチオニンリアーゼ遺伝子を有する宿主をシスタチオニンリアーゼ活性が増大するように改変して用いてもよい。
【００４０】
すなわち、シスタチオニンリアーゼ遺伝子を有する宿主は、例えば、シスタチオニンリアーゼ活性が増大するように改変された宿主であってよい。特に、シスタチオニンリアーゼ活性が増大するように改変された酵母を、「本発明の酵母」ともいう。本発明の酵母は、酵母の適当な菌株、例えば後述する菌株、をシスタチオニンリアーゼの活性が増大するように改変することで取得することができる。
【００４１】
宿主は、機能するシスタチオニンリアーゼを発現できるものであれば特に制限されない。宿主としては、例えば、細菌、真菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞が挙げられる。好ましい宿主としては、細菌や真菌等の微生物が挙げられる。
【００４２】
細菌としては、グラム陰性細菌やグラム陽性細菌が挙げられる。グラム陰性細菌としては、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌等の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌が挙げられる。グラム陽性細菌としては、バチルス（Bacillus）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌等のコリネ型細菌、放線菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。コリネ型細菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）やコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）が挙げられる。
【００４３】
真菌としては、酵母や糸状菌が挙げられる。好ましい真菌としては、酵母が挙げられる。酵母は、出芽酵母であってもよく、分裂酵母であってもよい。出芽酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロミセス属、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）等のキャンディダ属、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等のピヒア属、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）等のハンゼヌラ属等に属する酵母を例示することができる。分裂酵母としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロミセス属等に属する酵母を例示することができる。中でも、酵母エキスの生産によく用いられているサッカロミセス・セレビシエやキャンディダ・ユティリスが好ましい。酵母は、１倍体でもよいし、２倍性またはそれ以上の倍数性を有するものであってもよい。サッカロミセス・セレビシエとしては、例えば、サッカロミセス・セレビシエY006株（FERM BP-11299）が挙げられる。Y006株は、2010年8月18日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8  120号室）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11299が付与されている。また、サッカロミセス・セレビシエとしては、例えば、サッカロミセス・セレビシエBY4742株（ATCC 201389）、サッカロミセス・セレビシエBY4743株（ATCC 201390）、サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）も挙げられる。また、キャンディダ・ユティリスとしては、例えば、キャンディダ・ユティリスATCC 22023株が挙げられる。これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より入手できる。すなわち、各菌株に対応する登録番号を利用して分譲を受けることができる（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００４４】
酵母等の宿主の改変は、突然変異処理や遺伝子工学により実施できる。サッカロマイセス・セレビシエの遺伝子工学の具体的手法は、多くの書籍に記されている。また、キャンディダ・ユティリスについても、近年各種の方法が報告されており、それらを用いてよい。例えば、ケミカルエンジニアリング1999年6月号（23p-28p、三沢典彦）、FEMS Microbiology Letters（Luis Rodriguez et al., 165 (1998) 335-340）、WO98/07873、特開平8-173170、WO95/32289、Journal of Bacteriology（KEIJI KONDO et al., Vol.177 No.24 (1995) 7171-7177）、WO98/14600、特開2006-75122、特開2006-75123、特開2007-089441、特開2006-101867などの先行文献にその具体的な手法が記されているので適宜参考にすることができる。
【００４５】
以下に、シスタチオニンリアーゼ等のタンパク質の活性を増大させる手法（シスタチオニンリアーゼ遺伝子等の遺伝子を導入する方法も含む）について説明する。
【００４６】
「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して増大することを意味する。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して増大することを意味してよい。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が増大するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、各生物種の基準株（type strain）が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、宿主の説明において例示した株も挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、基準株（すなわち宿主が属する種の基準株）と比較して増大してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、サッカロミセス・セレビシエBY4742株と比較して増大してもよい。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。また、「タンパク質の活性が増大する」とは、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することを含む。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、宿主が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。
【００４７】
タンパク質の活性の増大の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して増大していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、非改変株が標的のタンパク質の活性を有していない場合は、同タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより同タンパク質が生成されていればよいが、例えば、同タンパク質はその活性が測定できる程度に生産されていてよい。
【００４８】
タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成できる。「遺伝子の発現が上昇する」とは、同遺伝子の発現が野生株や親株等の非改変株と比較して増大することを意味する。「遺伝子の発現が上昇する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して増大することを意味してよい。「遺伝子の発現が上昇する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が増大すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が増大することを意味してよい。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。
【００４９】
遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【００５０】
遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、酵母の場合、染色体中に多数のコピーが存在する配列としては、特有の短い繰り返し配列からなる自律複製配列（ARS）や、約150コピー存在するrDNA配列が挙げられる。ARSを含むプラスミドを用いて酵母の形質転換を行った例が、国際公開95/32289号パンフレットに記載されている。また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。
【００５１】
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
【００５２】
また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pCold TF DNA（タカラバイオ社）、pACYC系ベクター、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11；特開平10-215883号公報に記載のpVK7；特開平9-070291号公報に記載のpVC7が挙げられる。酵母細胞内で機能するベクターとしては、例えば、CEN4の複製開始点を持つプラスミドや2μm DNAの複製開始点を持つマルチコピー型プラスミドが挙げられる。酵母細胞内で機能するベクターとして、具体的には、例えば、pAUR123（タカラバイオ社製）やpYES2（インビトロジェン社）が挙げられる。
【００５３】
遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に宿主に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、宿主で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
【００５４】
遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、およびtrpAターミネーターが挙げられる。
【００５５】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【００５６】
また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に宿主に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合」としては、例えば、２またはそれ以上のタンパク質（例えば酵素）をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一のタンパク質複合体（例えば酵素複合体）を構成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００５７】
導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得した遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。すなわち、遺伝子を改変することにより、該遺伝子のバリアントを取得できる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質が特定の部位においてアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、遺伝子のバリアントを全合成してもよい。
【００５８】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、遺伝子の発現を上昇させることによりタンパク質の活性を増大させる場合、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強してもよく、一部の発現のみを増強してもよい。通常は、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強するのが好ましい。また、複合体を構成する各サブユニットは、複合体が目的のタンパク質の機能を有する限り、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、複数のサブユニットをコードする、同一の生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよく、それぞれ異なる生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよい。
【００５９】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、例えば、発現調節配列の改変により達成できる。「発現調節配列」とは、遺伝子の発現に影響する部位の総称である。発現調節配列としては、例えば、プロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域が挙げられる。発現調節配列は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節配列の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことができる。
【００６０】
遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるT7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、thrプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、msrAプロモーター、Bifidobacterium由来のPm1プロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型細菌で利用できるより強力なプロモーターとしては、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl.Microbiol.Biotechnolo., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf（EF-Tu）プロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、酵母で利用できるより強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターである、PGK1、PDC1、TDH3、TEF1、HXT7、ADH1等の遺伝子のプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【００６１】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5’-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
【００６２】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。すなわち、遺伝子の異種発現を行う場合等には、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。すなわち、導入される遺伝子は、例えば、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。
【００６３】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
【００６４】
上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【００６５】
また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の脱感作（desensitization to feedback inhibition）も含まれる。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処理し、ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強する手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
【００６６】
２倍体以上の倍数性を有する酵母を宿主として用いる場合であって、染色体の改変によりタンパク質の活性を増大させる場合には、同酵母は、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、タンパク質の活性が増大するように改変された染色体と野生型染色体とをヘテロで有していてもよく、タンパク質の活性が増大するように改変された染色体をホモで有していてもよい。
【００６７】
形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979.Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。あるいは、コリネ型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791）を利用することもできる。酵母の形質転換法としては、プロトプラスト法、ＫＵ法（H.Ito et al., J. Bateriol., 153-163 (1983)）、ＫＵＲ法（発酵と工業 vol.43, p.630-637 (1985)）、エレクトロポレーション法（Luis et al., FEMS Micro biology Letters 165 (1998) 335-340）、キャリアＤＮＡを用いる方法（Gietz R.D. and Schiestl R.H., Methods Mol.Cell. Biol. 5:255-269 (1995)）等、通常酵母の形質転換に用いられる方法を採用することができる。また、酵母の胞子形成、１倍体酵母の分離、等の操作については、「化学と生物 実験ライン３１ 酵母の実験技術」、初版、廣川書店；「バイオマニュアルシリーズ１０ 酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社等に記載されている。
【００６８】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【００６９】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。
【００７０】
遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、例えば、非改変株の、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【００７１】
タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、例えば、非改変株の、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【００７２】
上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、シスタチオニンリアーゼの活性増強やシスタチオニンリアーゼ遺伝子の導入に限られず、任意のタンパク質の活性増強や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現増強に利用できる。
【００７３】
シスタチオニンリアーゼ遺伝子を有する宿主を培養することにより、シスタチオニンリアーゼを発現させることができる。その際、必要に応じて、遺伝子の発現誘導を行う。宿主の培養条件や遺伝子の発現誘導の条件は、マーカーの種類、プロモーターの種類、および宿主の種類等の諸条件に応じて適宜選択すればよい。培養に用いる培地は、宿主が増殖でき、且つ、シスタチオニンリアーゼを発現できるものであれば特に制限されない。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン、及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。
【００７４】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜、でんぷんの加水分解物等の糖類、グリセロール、エタノール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類が挙げられる。
【００７５】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水が挙げられる。
【００７６】
イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる、
【００７７】
無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カリウムイオン、鉄イオン、リン酸イオンが挙げられる。
【００７８】
その他の有機成分としては、有機微量栄養源が挙げられる。有機微量栄養源としては、ビタミンB1などの要求物質や、それらを含む酵母エキス等が挙げられる。
【００７９】
培養温度は、例えば、20℃〜45℃、好ましくは24℃〜45℃、より好ましくは30℃〜37℃であってよい。培養は、通気培養が好ましい。その際の酸素濃度は、例えば、飽和濃度に対して5〜50%に、好ましくは10%程度に調節してよい。培養中のpHは、5〜9が好ましい。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等、を使用することができる。培養時間は、例えば、10時間〜120時間であってよい。培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。
【００８０】
上記のようにしてシスタチオニンリアーゼ遺伝子を有する宿主を培養することにより、シスタチオニンリアーゼを含む培養物が得られる。シスタチオニンリアーゼは、例えば、宿主の菌体内に蓄積し得る。「菌体」は、宿主の種類に応じて、適宜「細胞」と読み替えてよい。尚、使用する宿主及びシスタチオニンリアーゼ遺伝子の設計によっては、ペリプラズムにシスタチオニンリアーゼを蓄積させることや、菌体外にシスタチオニンリアーゼを分泌生産させることも可能である。
【００８１】
シスタチオニンリアーゼは、菌体等に含まれたまま使用してもよく、適宜、菌体等から分離精製し粗酵素画分又は精製酵素として使用してもよい。また、シスタチオニンリアーゼは、遊離の状態で利用されてもよいし、樹脂等の固相に固定化された固定化酵素の状態で利用されてもよい。
【００８２】
例えば、宿主の菌体内にシスタチオニンリアーゼが蓄積する場合、適宜、菌体を破砕、溶解、または抽出等し、シスタチオニンリアーゼを回収することができる。菌体は、遠心分離等により培養物から回収することができる。細胞の破砕、溶解、または抽出等は、公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、例えば、超音波破砕法、ダイノミル法、ビーズ破砕、フレンチプレス破砕、リゾチーム処理が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。また、例えば、培地にシスタチオニンリアーゼが蓄積する場合、遠心分離等により培養上清を取得し、培養上清からシスタチオニンリアーゼを回収することができる。
【００８３】
シスタチオニンリアーゼの精製は、酵素の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。シスタチオニンリアーゼの精製は、所望の程度に行うことができる。
【００８４】
精製されたシスタチオニンリアーゼは、本発明の方法における「シスタチオニンリアーゼ」として利用できる。
【００８５】
また、精製されたシスタチオニンリアーゼに限られず、シスタチオニンリアーゼを含有する任意の画分を本発明の方法における「シスタチオニンリアーゼ」として利用してもよい。すなわち、本発明の方法における「シスタチオニンリアーゼ」とは、そのような画分に含有されるものであってよい。シスタチオニンリアーゼを含有する画分は、シスタチオニンリアーゼが香気成分前駆体に作用できるように含有される限り特に制限されない。そのような画分としては、例えば、シスタチオニンリアーゼ遺伝子を有する宿主（シスタチオニンリアーゼを有する宿主）の培養物、同培養物から回収した菌体（培養菌体）、同菌体の破砕物、同菌体の溶解物、同菌体の抽出物（無細胞抽出液）、同菌体をアクリルアミドやカラギーナン等の担体で固定化した固定化菌体等の菌体処理物、同培養物から回収した培養上清、それらの部分精製物（粗精製物）、それらの組み合わせが挙げられる。特に、酵母を宿主として用いる場合、そのような画分としては、例えば、酵母エキスが挙げられる。これらの画分は、いずれも、単独で利用されてもよいし、精製されたシスタチオニンリアーゼと共に利用されてもよい。
【００８６】
酵母菌体からの酵母エキスの調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして実施することができる。酵母エキスの調製法としては、例えば、自己消化法、酵素分解法、酸分解法、アルカリ分解法、物理的破砕法、凍結融解法が挙げられる。酵母エキスは、例えば、酵母菌体を消化することにより調製したものでもよい。また、必要に応じて、得られた酵母エキスを濃縮してもよいし、乾燥してもよい。例えば、得られた酵母エキスを乾燥して粉末の形態にしてもよい。上記のようにして、シスタチオニンリアーゼ遺伝子を有する酵母の菌体からシスタチオニンリアーゼを含有する酵母エキス（シスタチオニンリアーゼ活性を有する酵母エキス）が得られる。
【００８７】
特に、本発明の酵母（シスタチオニンリアーゼ活性が増大するように改変された酵母）を原料として製造される酵母エキスを、「本発明の酵母エキス」ともいう。すなわち、本発明は、本発明の酵母を原料として用いて酵母エキスを調製することを含む、酵母エキスの製造方法を提供する。本発明の酵母エキスは、具体的には、シスタチオニンリアーゼを含有する酵母エキスであり、シスタチオニンリアーゼ活性を有する酵母エキスである。本発明の酵母エキスは、より具体的には、シスタチオニンリアーゼ含有量が高められた酵母エキスであってよく、シスタチオニンリアーゼ活性が高められた酵母エキスであってよい。本発明の酵母エキスは、例えば、シスタチオニンリアーゼ活性が増大するように改変されていない酵母を原料として製造される酵母エキスと比較して、シスタチオニンリアーゼ含有量が高められた酵母エキスであってよく、シスタチオニンリアーゼ活性が高められた酵母エキスであってよい。
【００８８】
本発明の酵母エキス等の酵母エキスにおけるシスタチオニンリアーゼの含有量（濃度）は、例えば、１５０Ｕ／ｇ以上、２００Ｕ／ｇ以上、５００Ｕ／ｇ以上、１０００Ｕ／ｇ以上、２０００Ｕ／ｇ以上、５０００Ｕ／ｇ以上、または１００００Ｕ／ｇ以上であってもよく、１０００００Ｕ／ｇ以下、１００００Ｕ／ｇ以下、５０００Ｕ／ｇ以下、２０００Ｕ／ｇ以下、１０００Ｕ／ｇ以下、または５００Ｕ／ｇ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。
【００８９】
＜１−３＞香気成分前駆体とその製造
＜１−３−１＞香気成分前駆体
香気成分前駆体としては、一般式（Ｉ）に示すシステイン誘導体（単に「システイン誘導体」ともいう）や一般式（ＩＩ）に示すシステインスルホキシド誘導体（単に「システインスルホキシド誘導体」ともいう）が挙げられる。
【００９０】
【化７】
2017213114.tif 000008
【００９１】
【化８】
2017213114.tif 000009
【００９２】
式中、「Ｒ」は、Ｃ１−６アルキル基またはＣ２−６アルケニル基を示す。
【００９３】
「Ｃ１−６アルキル基」とは、炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖のアルキル基を示す。Ｃ１−６アルキル基の炭素数は、１〜５、１〜４、または１〜３であってもよい。Ｃ１−６アルキル基として、具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルが挙げられる。Ｃ１−６アルキル基として、特に、メチルやｎ−プロピルが挙げられる。例えば、Ｒがメチルである場合、一般式（ＩＩ）に示すシステインスルホキシド誘導体はＳ−メチルシステインスルホキシド（MCSO）である。また、例えば、Ｒがｎ−プロピルである場合、一般式（ＩＩ）に示すシステインスルホキシド誘導体はＳ−プロピルシステインスルホキシド（PCSO）である。
【００９４】
「Ｃ２−６アルケニル基」とは、炭素数２〜６の直鎖または分岐鎖のアルケニル基を示す。Ｃ２−６アルケニル基の炭素数は、２〜５、２〜４、または２〜３であってもよい。Ｃ２−６アルケニル基は、１個の二重結合を有していてもよく、２個またはそれ以上の二重結合を有していてもよい。Ｃ２−６アルケニル基として、具体的には、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル、３−メチル−２−ブテニルが挙げられる。２−プロペニルを「アリル」ともいう。Ｃ２−６アルケニル基として、特に、１−プロペニルや２−プロペニル（アリル）が挙げられる。例えば、Ｒがアリルである場合、一般式（Ｉ）に示すシステイン誘導体はＳ−アリルシステイン（ALC）、一般式（ＩＩ）に示すシステインスルホキシド誘導体はＳ−アリルシステインスルホキシド（ALCSO；「アリイン」ともいう）である。また、例えば、Ｒが１−プロペニルである場合、一般式（ＩＩ）に示すシステインスルホキシド誘導体はＳ−（１−プロペニル）−システインスルホキシド（PeCSO）である。
【００９５】
香気成分前駆体としては、１種またはそれ以上の成分を用いることができる。より具体的には、香気成分前駆体としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。すなわち、「香気成分前駆体」とは、特記しない限り、１種またはそれ以上の香気成分前駆体を意味してよい。
【００９６】
＜１−３−２＞香気成分前駆体の製造
香気成分前駆体の製造方法は特に制限されない。香気成分前駆体は、例えば、化学合成、酵素反応、抽出法、またはその組み合わせにより製造することができる。システイン誘導体は、例えば、シスタチオニンβ−シンターゼを利用して、対応するチオール化合物（Ｒ−ＳＨ（Ｒは上述の通り））とＬ−セリンとを反応させることにより製造できる。また、システインスルホキシド誘導体は、例えば、オキシダーゼを利用して、対応するシステイン誘導体を酸化することにより製造できる。
【００９７】
＜１−３−２−１＞シスタチオニンβ−シンターゼおよびオキシダーゼとその製造
「シスタチオニンβ−シンターゼ」とは、ホモシステインとセリンからシスタチオニンを生成する反応を触媒する酵素（EC 4.2.1.22）をいう。同反応を触媒する活性を「シスタチオニンβ−シンターゼ活性」ともいう。すなわち、「シスタチオニンβ−シンターゼ」とは、言い換えると、シスタチオニンβ−シンターゼ活性を有するタンパク質である。また、シスタチオニンβ−シンターゼをコードする遺伝子を「シスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子」ともいう。シスタチオニンβ−シンターゼとしては、選択したチオール化合物から対応するシステイン誘導体を生成する反応を触媒できるものを、特に制限されず用いることができる。シスタチオニンβ−シンターゼの由来は特に制限されない。すなわち、シスタチオニンβ−シンターゼとしては、細菌、酵母、高等動物等、いずれの由来のものを用いてもよい。シスタチオニンβ−シンターゼとしては、CYS4遺伝子にコードされるCys4タンパク質が挙げられる。CYS4遺伝子としては、サッカロミセス・セレビシエ等の酵母のCYS4遺伝子が挙げられる。サッカロミセス・セレビシエS288C株のCYS4遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするCys4タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５および６に示す。
【００９８】
「オキシダーゼ」とは、酸化酵素の総称である。また、オキシダーゼをコードする遺伝子を「オキシダーゼ遺伝子」ともいう。オキシダーゼとしては、例えば、基質と反応して過酸化水素を生成する反応を触媒するものを用いることができる。オキシダーゼとして、具体的には、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼが挙げられる。オキシダーゼとしては、グルコースオキシダーゼが好ましい。オキシダーゼとしては、１種のオキシダーゼを用いてもよく、２種またはそれ以上のオキシダーゼを用いてもよい。「グルコースオキシダーゼ」とは、グルコースを基質として、酸素存在下、グルコノラクトン（グルコノラクトンは、非酵素的にグルコン酸へと加水分解される）と過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素（EC1.1.3.4）をいう。「ガラクトースオキシダーゼ」とは、Ｄ−ガラクトースを基質として、酸素存在下、Ｄ−ガラクト−ヘキソジアルドースと過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素（EC 1.1.3.9）をいう。「ウリカーゼ」とは、尿酸を基質として、酸素存在下、アラントインと過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素（EC 1.7.3.3）をいう。「コレステロールオキシダーゼ」とは、３β−ヒドロキシステロイドを基質として、酸素存在下、３−オキソステロイドと過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素（EC 1.1.3.6）をいう。「コリンオキシダーゼ」とは、コリンオキシダーゼは、コリンを基質として、酸素存在下、ベタインアルデヒドと過酸化水素を生成する反応（第一反応）と、ベタインアルデヒドを基質として、酸素存在下、ベタインと過酸化水素を生成する反応（第二反応）とを触媒する酵素（EC 1.1.3.17）をいう。「アシルＣｏＡオキシダーゼ」とは、アシルＣｏＡを基質として、酸素存在下、トランス−２、３−デヒドロアシルＣｏＡと過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素（EC 1.3.3.6）をいう。オキシダーゼの由来は特に制限されない。すなわち、オキシダーゼとしては、細菌、酵母、高等動物等、いずれの由来のものを用いてもよい。オキシダーゼとして、具体的には、例えば、「スミチームＰＧＯ」という商品名で新日本化学工業（株）より市販されている微生物由来のグルコースオキシダーゼが挙げられる。
【００９９】
シスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子やオキシダーゼ遺伝子等の遺伝子は、例えば、上記例示した遺伝子の塩基配列（例えば、シスタチオニンβ−シンターゼについて配列番号５に示す塩基配列）を有する遺伝子であってよい。また、シスタチオニンβ−シンターゼやオキシダーゼ等の酵素は、例えば、上記例示した酵素のアミノ酸配列（例えば、シスタチオニンβ−シンターゼについて配列番号６に示すアミノ酸配列）を有するタンパク質であってよい。また、シスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子やオキシダーゼ遺伝子等の遺伝子やシスタチオニンβ−シンターゼやオキシダーゼ等の酵素は、それぞれ、上記例示した遺伝子およびタンパク質等の公知の遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントであってもよい。遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントについては、上述したシスタチオニンリアーゼ遺伝子およびシスタチオニンリアーゼの保存的バリアントに関する記載を準用できる。
【０１００】
シスタチオニンβ−シンターゼやオキシダーゼ等の標的酵素は、シスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子やオキシダーゼ遺伝子等の標的遺伝子を有する宿主に該遺伝子を発現させることにより製造できる。標的遺伝子を有する宿主およびそれを利用した標的酵素の製造法については、シスタチオニンリアーゼ遺伝子を有する宿主およびそれを利用したシスタチオニンリアーゼの製造法についての記載を準用できる。例えば、シスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子を有する宿主は、シスタチオニンβ−シンターゼの活性が増大するように改変された宿主、例えば酵母、であってもよい。精製された標的酵素は、本発明の方法における「シスタチオニンβ−シンターゼ」または「オキシダーゼ」として利用できる。また、精製された標的酵素に限られず、標的酵素を含有する任意の画分を本発明の方法における「シスタチオニンβ−シンターゼ」または「オキシダーゼ」として利用してもよい。すなわち、本発明の方法における「シスタチオニンβ−シンターゼ」または「オキシダーゼ」とは、そのような画分に含有されるものであってよい。特に、酵母を宿主として用いる場合、そのような画分としては、例えば、酵母エキスが挙げられる。
【０１０１】
シスタチオニンβ−シンターゼ遺伝子やオキシダーゼ遺伝子等の標的遺伝子を有する宿主は、シスタチオニンリアーゼの活性が低下するように改変されていてもよい。シスタチオニンリアーゼについては上述の通りである。
【０１０２】
以下に、シスタチオニンリアーゼ等のタンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
【０１０３】
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して低下することを意味する。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して低下することを意味してよい。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が低下するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、各生物種の基準株（type strain）が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、宿主の説明において例示した株も挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、基準株（すなわち宿主が属する種の基準株）と比較して低下してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、サッカロミセス・セレビシエBY4742株と比較して低下してもよい。なお、「タンパク質の活性が低下する」ことには、同タンパク質の活性が完全に消失している場合も包含される。「タンパク質の活性が低下する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１０４】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の発現が非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１０５】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。遺伝子の転写効率の低下は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより弱いプロモーターに置換することにより達成できる。「より弱いプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも弱化するプロモーターを意味する。より弱いプロモーターとしては、例えば、誘導型のプロモーターが挙げられる。すなわち、誘導型のプロモーターは、非誘導条件下（例えば、誘導物質の非存在下）でより弱いプロモーターとして機能し得る。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
【０１０６】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が含まれる。
【０１０７】
遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
【０１０８】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【０１０９】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【０１１０】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子としては、遺伝子の全領域あるいは一部の領域を欠失した遺伝子、ミスセンス変異を導入した遺伝子ナンセンス変異を導入した遺伝子、フレームシフト変異を導入した遺伝子、トランスポゾンやマーカー遺伝子等の挿入配列を導入した遺伝子が挙げられる。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【０１１１】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【０１１２】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、タンパク質に複数のアイソザイムが存在する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、複数のアイソザイムの全ての活性を低下させてもよく、一部のみの活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。
【０１１３】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【０１１４】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【０１１５】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１１６】
タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１１７】
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【０１１８】
上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、シスタチオニンリアーゼの活性低下に加えて、任意のタンパク質の活性低下や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現低下に利用できる。
【０１１９】
＜１−３−２−２＞香気成分前駆体の製造
システイン誘導体は、シスタチオニンβ−シンターゼを利用して、チオール化合物とＬ−セリンとを反応させることにより生成することができる。具体的には、システイン誘導体は、シスタチオニンβ−シンターゼをチオール化合物とＬ−セリンに作用させることにより、生成することができる。Ｌ−セリン及びチオール化合物は、いずれも市販されており、容易に入手可能である。
【０１２０】
酵素反応（シスタチオニンβ−シンターゼを利用したシステイン誘導体の生成反応）は、酵素（シスタチオニンβ−シンターゼ）と基質（チオール化合物とＬ−セリン）を反応液中に共存させることにより達成できる。すなわち、酵素反応は、適当な反応液中で実施できる。酵素反応は、バッチ式で実施してもよく、カラム式で実施してもよい。バッチ式の場合は、反応容器内の反応液中で、酵素と基質を混合することにより、酵素反応を実施できる。酵素反応は、静置で実施してもよく、撹拌や振盪下で実施してもよい。カラム式の場合は、固定化菌体又は固定化酵素を充填したカラムに基質を含有する反応液を通液することにより、酵素反応を実施できる。反応液としては、例えば、必要な成分を含有する、水性溶媒を用いることができる。水性溶媒は、酵素反応を阻害しない限り特に限定されない。水性溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液が挙げられる。反応液は、例えば、酵素と基質を含有していてよい。また、反応液は、例えば、補酵素であるピリドキサールリン酸（「ピリドキサール-5'-リン酸」ともいう）を含有していてもよい。ピリドキサールリン酸は、特に、精製酵素等の、ピリドキサールリン酸の含有量が低い酵素源を用いる場合に反応液に添加するのが好ましい。また、酵素反応は、酵母エキス中で実施してもよい。すなわち、例えば、酵素を含有する酵母エキスを酵素源として用いる場合、該酵母エキスを液状やペースト状に調製して反応液とし、その中で酵素反応を実施してもよい。
【０１２１】
酵素反応の条件（反応液のpH、反応温度、反応時間、基質や酵素等の各種成分の濃度等）は、システイン誘導体が生成する限り特に制限されない。酵素反応の条件は、システイン誘導体の所望の合成量等の諸条件に応じて適宜設定できる。
【０１２２】
反応液中のＬ−セリンの濃度は、例えば、好ましくは１重量％〜２０重量％、特に好ましくは１重量％〜１０重量％であってよい。反応液中のチオール化合物の濃度は、例えば、酵素反応を阻害しない範囲に設定することができる。反応液中のチオール化合物の濃度は、例えば、好ましくは０．１重量％〜１０重量％であってよい。反応液中のピリドキサールリン酸の濃度は、例えば、０．１重量ｐｐｍ〜１００重量ｐｐｍであってよい。酵素反応に用いるシスタチオニンβ−シンターゼの量は、基質濃度、反応時間、その他の条件によって適宜調整し得る。基質や酵素等の各種成分は、適宜、反応液に追加で供給してもよい。反応液のｐＨは、例えば、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ７〜７．５であってよい。反応温度は、例えば、４℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは２５℃〜３５℃であってよい。反応時間は、例えば、０．５〜２４時間、好ましくは１〜１０時間、より好ましくは１〜５時間、特に好ましくは１〜３時間であってよい。このようにして酵素反応を実施することにより、システイン誘導体を含有する反応液が得られる。そのような反応液は、例えば、システイン誘導体を含有する酵母エキスであってもよい。すなわち、例えば、酵素反応を酵母エキス中で実施することにより、システイン誘導体を含有する酵母エキスが得られる。
【０１２３】
生成したシステイン誘導体は、適宜、反応液から回収することができる。すなわち、システイン誘導体は、反応液から回収してから、システインスルホキシド誘導体の製造や香気成分の製造に利用することができる。システイン誘導体の回収は、例えば、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿法、限外濾過濃縮法、硫安沈殿法（塩析）、有機溶媒（アセトン、エタノール、プロパノール、メタノール等）沈殿法、水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール、デキストラン等）沈殿法、酸性沈殿法、等電点沈殿法、イオン交換樹脂法、晶析法、電気透析法が挙げられる。これらの手法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。システイン誘導体は、所望の程度に精製されていてよい。また、システイン誘導体は、反応液に含まれたまま、システインスルホキシド誘導体の製造や香気成分の製造に利用することもできる。例えば、システイン誘導体を含有する反応液を、そのまま、あるいは適宜、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供してから、システインスルホキシド誘導体の製造や香気成分の製造に利用してもよい。これらの処理は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。すなわち、本発明の方法における「システイン誘導体」としては、精製品を用いてもよいし、システイン誘導体を含有する酵母エキス等の、システイン誘導体を含有する画分（素材）を用いてもよい。
【０１２４】
システインスルホキシド誘導体は、例えば、オキシダーゼを利用して、システイン誘導体を酸化することにより製造できる。具体的には、システインスルホキシド誘導体は、システイン誘導体の存在下、オキシダーゼをその基質に作用させることにより、生成することができる。以下、オキシダーゼがグルコースオキシダーゼである場合を例にシステインスルホキシド誘導体の製造法について詳述するが、他のオキシダーゼを利用する場合にも、オキシダーゼの種類に応じて適宜条件を設定できる。
【０１２５】
酵素反応（グルコースオキシダーゼを利用したシステイン誘導体の生成反応）は、酵素（グルコースオキシダーゼ）と基質（システイン誘導体とグルコース）を反応液中に共存させることにより達成できる。すなわち、酵素反応は、適当な反応液中で実施できる。酵素反応は、バッチ式で実施してもよく、カラム式で実施してもよい。反応液としては、例えば、必要な成分を含有する、水性溶媒を用いることができる。水性溶媒としては、酵素反応を阻害しない限り特に限定されない。水性溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液が挙げられる。反応液は、例えば、酵素と基質を含有していてよい。グルコースオキシダーゼによる酵素反応には酸素が利用される。よって、反応液は、例えば、酸素を含有していてもよい。例えば、反応容器中に空気を流通させることにより、反応液に酵素を供給することができる。また、酵素反応は、酵母エキス中で実施してもよい。すなわち、例えば、酵素を含有する酵母エキスを酵素源として用いる場合や、システイン誘導体を含有する酵母エキスをシステイン誘導体源として用いる場合は、該酵母エキスを液状やペースト状に調製して反応液とし、その中で酵素反応を実施してもよい。
【０１２６】
酵素反応の条件（反応液のpH、反応温度、反応時間、基質や酵素等の各種成分の濃度等）は、システインスルホキシド誘導体が生成する限り特に制限されない。酵素反応の条件は、システインスルホキシド誘導体の所望の合成量等の諸条件に応じて適宜設定できる。
【０１２７】
反応液中のグルコースの濃度は例えば、０．１重量％〜１０重量％、好ましくは０．１重量％〜１重量％であってよい。反応液中のシステイン誘導体の濃度は、例えば、酵素反応を阻害しない範囲に設定することができる。反応液中のシステイン誘導体の濃度は、例えば、０．１重量％〜１０重量％、好ましくは０．１重量％〜１重量％であってよい。酵素反応に用いるグルコースオキシダーゼの量は、基質濃度、反応時間、その他の条件によって適宜調整し得る。基質や酵素等の各種成分は、適宜、反応液に追加で供給してもよい。反応液のｐＨは、例えば、ｐＨ５〜７、好ましくは５．５〜６．５であってよい。反応温度は、例えば、４℃〜６０℃、好ましくは３０℃〜５０℃、より好ましくは３５〜４５℃であってよい。反応時間は、例えば、０．５〜２４時間、好ましくは１〜１０時間、より好ましくは１〜５時間であってよい。このようにして酵素反応を実施することにより、システインスルホキシド誘導体を含有する反応液が得られる。そのような反応液は、システインスルホキシド誘導体を含有する酵母エキスであってもよい。すなわち、例えば、酵素反応を酵母エキス中で実施することにより、システインスルホキシド誘導体を含有する酵母エキスが得られる。
【０１２８】
生成したシステインスルホキシド誘導体は、適宜、反応液から回収することができる。すなわち、システインスルホキシド誘導体は、反応液から回収してから、香気成分の製造に利用することができる。システインスルホキシド誘導体の回収は、例えば、システイン誘導体の回収と同様の手法により行うことができる。システインスルホキシド誘導体は、所望の程度に精製されていてよい。また、システインスルホキシド誘導体は、反応液に含まれたまま、香気成分の製造に利用することもできる。例えば、システインスルホキシド誘導体を含有する反応液を、そのまま、あるいは適宜、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供してから、香気成分の製造に利用してもよい。これらの処理は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。すなわち、本発明の方法における「システインスルホキシド誘導体」としては、精製品を用いてもよいし、システインスルホキシド誘導体を含有する酵母エキス等の、システインスルホキシド誘導体を含有する画分（素材）を用いてもよい。
【０１２９】
また、香気成分前駆体は、例えば、当該香気成分前駆体を含有する農林水産物から回収することができる。すなわち、システインスルホキシド誘導体は、そのような農林水産物から回収してから、香気成分の製造に利用することができる。そのような農林水産物としては、ニンニク、タマネギ、キャベツ等の野菜が挙げられる。これらの野菜は、香気成分前駆体を０．３％（ｗ／ｗ）〜３％（ｗ／ｗ）程度含有し得る。香気成分前駆体は、所望の程度に精製されていてよい。また、そのような農林水産物から得られる、香気成分前駆体を含有する画分（素材）を、香気成分の製造に利用してもよい。そのような画分として、具体的には、例えば、農林水産物の加工品が挙げられる。農林水産物の加工品としては、例えば、農林水産物を、細かい断片への分割（例えば、粉砕、刻み、潰し、すりおろし、等を含む）、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供して得られるものが挙げられる。これらの処理は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。すなわち、酵素反応により香気成分前駆体を製造する場合でも記載したように、本発明の方法における「香気成分前駆体」としては、精製品を用いてもよいし、当該香気成分前駆体を含有する画分（素材）を用いてもよい。
【０１３０】
＜１−４＞香気成分の製造
香気成分は、シスタチオニンリアーゼを利用して、香気成分前駆体から生成することができる。具体的には、香気成分は、シスタチオニンリアーゼを香気成分前駆体に作用させることにより生成することができる。
【０１３１】
酵素反応（シスタチオニンリアーゼを利用した香気成分の生成反応）は、酵素（シスタチオニンリアーゼ）と基質（香気成分前駆体）を反応液中に共存させることにより達成できる。すなわち、酵素反応は、適当な反応液中で実施できる。酵素反応は、バッチ式で実施してもよく、カラム式で実施してもよい。反応液としては、例えば、必要な成分を含有する、水性溶媒を用いることができる。水性溶媒は、酵素反応を阻害しない限り特に限定されない。水性溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液が挙げられる。反応液は、例えば、酵素と基質を含有していてよい。また、反応液は、例えば、補酵素であるピリドキサールリン酸を含有していてもよい。ピリドキサールリン酸は、特に、精製酵素等の、ピリドキサールリン酸の含有量が低い酵素源を用いる場合に反応液に添加するのが好ましい。また、酵素反応は、酵母エキス中で実施してもよい。すなわち、例えば、酵素を含有する酵母エキスを酵素源として用いる場合や、香気成分前駆体を含有する酵母エキスを香気成分前駆体源として用いる場合は、該酵母エキスを液状やペースト状に調製して反応液とし、その中で酵素反応を実施してもよい。
【０１３２】
酵素反応の条件（反応液のpH、反応温度、反応時間、基質や酵素等の各種成分の濃度等）は、システイン誘導体が生成する限り特に制限されない。酵素反応の条件は、香気成分の所望の合成量等の諸条件に応じて適宜設定できる。
【０１３３】
反応液中の香気成分前駆体の濃度は、例えば、酵素反応を阻害しない範囲に設定することができる。反応液中の香気成分前駆体の濃度は、例えば、好ましくは０．１重量％〜１０重量％であってよい。反応液中のピリドキサールリン酸の濃度は、例えば、０．１重量ｐｐｍ〜１００重量ｐｐｍであってよい。酵素反応に用いるシスタチオニンリアーゼの量は、基質濃度、反応時間、その他の条件によって適宜調整し得る。基質や酵素等の各種成分は、適宜、反応液に追加で供給してもよい。反応液のｐＨは、例えば、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ７〜７．５であってよい。反応温度は、例えば、４℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは２５℃〜３５℃であってよい。反応時間は、例えば、０．５〜２４時間、好ましくは１〜１０時間、より好ましくは１〜５時間、特に好ましくは１〜３時間であってよい。このようにして酵素反応を実施することにより、香気成分を含有する反応液が得られる。そのような反応液は、香気成分を含有する酵母エキスであってもよい。すなわち、例えば、酵素反応を酵母エキス中で実施することにより、香気成分を含有する酵母エキスが得られる。
【０１３４】
生成した香気成分は、適宜、反応液から回収することができる。すなわち、本発明の方法は、生成した香気成分を反応液から回収することを含んでいてもよい。香気成分の回収は、例えば、システイン誘導体の回収と同様の手法により行うことができる。香気成分は、所望の程度に精製されていてよい。香気成分は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上の純度に精製されてよい。
【０１３５】
＜２＞本発明の組成物
本発明の組成物は、シスタチオニンリアーゼと香気成分前駆体を含有する組成物である。シスタチオニンリアーゼと香気成分前駆体を総称して「有効成分」ともいう。有効成分については、本発明の方法で説明した通りである。有効成分の態様は、経口摂取可能なものであれば特に制限されない。シスタチオニンリアーゼは、精製品であってもよいし、シスタチオニンリアーゼを含有する酵母エキス等の、シスタチオニンリアーゼを含有する画分（素材）であってもよい。香気成分前駆体は、精製品であってもよいし、香気成分前駆体を含有する酵母エキスや香気成分前駆体を含有する農林水産物加工品等の、香気成分前駆体を含有する画分（素材）であってもよい。
【０１３６】
本発明の組成物は、例えば、飲食品に配合して利用できる。本発明の組成物は、具体的には、例えば、ニンニクフレーバー等の香気を所望のタイミングで飲食品に付与するために利用できる。すなわち、本発明の組成物が配合された飲食品においてシスタチオニンリアーゼを機能させることにより、香気を飲食品に付与することができる。具体的には、本発明の組成物が配合された飲食品においてシスタチオニンリアーゼを香気成分前駆体に作用させることにより、香気成分を生成し、以て、香気を飲食品に付与することができる。すなわち、本発明の組成物は、例えば、香気付与用の組成物であってよく、香気付与剤であってよい。このような香気を飲食品に付与する効果を「香気付与効果」ともいう。また、本発明の組成物は、調味料として構成されてもよい。
【０１３７】
本発明の組成物は、有効成分を含有する酵母エキスであってもよい。すなわち、例えば、シスタチオニンリアーゼを含有する酵母エキスをシスタチオニンリアーゼ源として用いる場合や、香気成分前駆体を含有する酵母エキスを香気成分前駆体源として用いる場合に、有効成分を含有する酵母エキスとして本発明の組成物が製造され得る。具体的には、例えば、シスタチオニンリアーゼを含有する酵母エキスと香気成分前駆体を含有する酵母エキスを混合することにより、有効成分を含有する酵母エキスが得られる。
【０１３８】
本発明の香料組成物は、有効成分からなるものであってもよく、そうでなくてもよい。
【０１３９】
「その他の成分」は、経口摂取可能なものであれば特に制限されない。「その他の成分」としては、例えば、調味料、飲食品、または医薬品に配合して利用されるものを利用できる。
【０１４０】
「その他の成分」として、具体的には、例えば、補酵素であるピリドキサールリン酸が挙げられる。ピリドキサールリン酸は、特に、ピリドキサールリン酸の含有量が低い有効成分源を用いる場合に配合するのが好ましい。また、「その他の成分」として、具体的には、例えば、砂糖、蜂蜜、メープルシロップ、スクロース、グルコース、フルクトース、異性化糖、オリゴ糖等の糖類；キシリトール、エリスリトール等の糖アルコール類；天然または人工甘味料；食塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；酢酸、クエン酸等の有機酸類およびその塩；グルタミン酸、グリシン等のアミノ酸類およびその塩；イノシン酸、グアニル酸、キサンチル酸等の核酸類およびその塩；食物繊維、ｐＨ緩衝剤、賦形剤、増量剤、香料、食用油、エタノール、水も挙げられる。
【０１４１】
「その他の成分」としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【０１４２】
本発明の組成物の形態は特に制限されない。本発明の組成物は、例えば、粉末状、顆粒状、液状、ペースト状、キューブ状等のいかなる形態であってもよい。
【０１４３】
本発明の組成物における各成分（すなわち、有効成分および任意でその他の成分）の濃度や含有比率は、香気付与効果が得られる限り特に制限されない。
【０１４４】
本発明の組成物における有効成分の濃度や含有比率は、有効成分の種類、飲食品の種類、香気の所望の発現量、本発明の組成物の使用量等の諸条件に応じて適宜設定することができる。
【０１４５】
本発明の組成物における有効成分の総濃度は、特に制限されないが、例えば、１００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、１０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、１％（ｗ／ｗ）以上、５％（ｗ／ｗ）以上、または１０％（ｗ／ｗ）以上であってもよく、１００％（ｗ／ｗ）以下、９９．９％（ｗ／ｗ）以下、７０％（ｗ／ｗ）以下、５０％（ｗ／ｗ）以下、３０％（ｗ／ｗ）以下、１０％（ｗ／ｗ）以下、５％（ｗ／ｗ）以下、または１％（ｗ／ｗ）以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。なお、「有効成分の総濃度」とは、シスタチオニンリアーゼの濃度と香気成分前駆体の濃度の合計を意味する。
【０１４６】
本発明の組成物におけるシスタチオニンリアーゼの含有量は、香気前駆体１ｍｇに対して、例えば、０．０１Ｕ以上、０．１Ｕ以上、０．２Ｕ以上、０．３Ｕ以上、０．４Ｕ以上、０．５Ｕ以上、０．７Ｕ以上、１Ｕ以上、５Ｕ以上、１０Ｕ以上、５０Ｕ以上、１００Ｕ以上、２００Ｕ以上、５００Ｕ以上、または１，０００Ｕ以上であってもよく、３，０００Ｕ以下、２，０００Ｕ以下、１，０００Ｕ以下、５００Ｕ以下、または３００Ｕ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。また、本発明の組成物におけるシスタチオニンリアーゼの含有量は、香気前駆体１ｍｇに対して、例えば、０．０００３３ｍｇ以上、０．００３３ｍｇ以上、０．００６７ｍｇ以上、０．０１ｍｇ以上、０．０１３ｍｇ以上、０．０１７ｍｇ以上、０．０２３ｍｇ以上、０．０３３ｍｇ以上、０．１７ｍｇ以上、０．３３ｍｇ以上、１．７ｍｇ以上、３．３ｍｇ以上、６．７ｍｇ以上、１７ｍｇ以上、または３３ｍｇ以上であってもよく、１００ｍｇ以下、６７ｍｇ以下、３３ｍｇ以下、１７ｍｇ以下、１０ｍｇ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。
【０１４７】
本発明の組成物におけるピリドキサールリン酸の含有量は、シスタチオニンリアーゼ１ｍｏｌに対して、例えば、０．１ｍｏｌ以上、０．５ｍｏｌ以上、１ｍｏｌ以上、１．５ｍｏｌ以上、または２ｍｏｌ以上であってもよく、１０ｍｏｌ以下、５ｍｏｌ以下、２ｍｏｌ以下、または１．５ｍｏｌ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。ピリドキサールリン酸の含有量は、シスタチオニンリアーゼ１ｍｏｌに対して、好ましくは１ｍｏｌ以上であってよい。
【０１４８】
本発明の組成物における各有効成分の濃度は、例えば、上記例示した有効成分の総濃度や含有比率を満たすように設定することができる。
【０１４９】
本発明の組成物における各成分（すなわち、有効成分および任意でその他の成分）の含有量（濃度）は、例えば、本発明の組成物を利用して飲食品を製造した際に、飲食品における各成分の濃度が所望の範囲となるような濃度であってよい。飲食品における各成分の濃度は、例えば、後述する範囲であってよい。
【０１５０】
なお、各成分の含有量（濃度）は、同成分を含有する素材を用いる場合にあっては、特記しない限り、当該素材中の同成分そのものの量に基づいて算出されるものとする。
【０１５１】
本発明の組成物に含まれる各成分は、互いに混合されて本発明の組成物に含まれていてもよく、それぞれ別個に、あるいは、任意の組み合わせで別個に、本発明の組成物に含まれていてもよい。本発明の組成物を添加して製造された飲食品中で有効成分が共存しており、且つ、該飲食品中でシスタチオニンリアーゼを機能させれば、香気付与効果が得られる。
【０１５２】
＜３＞本発明の飲食品
本発明の飲食品は、有効成分（すなわち、シスタチオニンリアーゼおよび香気成分前駆体）を含有する飲食品である。本発明の飲食品は、具体的には、有効成分が添加された飲食品である。なお、「添加」を「配合」ともいう。有効成分については、本発明の方法で説明した通りである。有効成分の態様は、経口摂取可能なものであれば特に制限されない。シスタチオニンリアーゼは、精製品であってもよいし、シスタチオニンリアーゼを含有する酵母エキス等の、シスタチオニンリアーゼを含有する画分（素材）であってもよい。香気成分前駆体は、精製品であってもよいし、香気成分前駆体を含有する酵母エキスや香気成分前駆体を含有する農林水産物加工品等の、香気成分前駆体を含有する画分（素材）であってもよい。
【０１５３】
本発明の飲食品は、有効成分を飲食品またはその原料に添加することにより製造できる。すなわち、本発明は、有効成分を飲食品またはその原料に添加することを含む、飲食品の製造方法を提供する。
【０１５４】
本発明においては、例えば、本発明の組成物を添加することにより有効成分を添加することができる。すなわち、上記飲食品の製造方法の一態様は、例えば、本発明の組成物を飲食品またはその原料に添加することを含む、飲食品の製造方法であってよい。
【０１５５】
飲食品としては、特に制限されず、あらゆる飲食品が包含される。飲食品には、調味料も包含される。飲食品としては、例えば、スープ等の飲料；ハム、ソーセージ、餃子、焼売、ハンバーグ、唐揚げ、とんかつ等の食肉加工食品；かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品；バター、発酵乳、粉乳、ホワイトソース、ヨーグルト、カスタード等の乳製品；チャーハン等の米飯加工食品；天然系調味料、風味調味料、メニュー用調味料、マヨネーズ、ドレッシング、ソース等の調味料；パン、麺類、グラタン、コロッケ等のその他の加工食品；冷凍食品等が挙げられる。スープとして、具体的には、例えば、コンソメスープ（チキン、ポーク、ビーフ等）、卵入りスープ、ワカメ入りスープ、ふかひれ入りスープ、中華風スープ、カレー風味スープ、お吸い物、味噌汁、ポタージュスープが挙げられる。「天然系調味料」とは、天然物を原料として、抽出、分解、加熱、発酵等の手法によって製造される調味料をいう。「風味調味料」とは、飲食品に風味原料の香気、風味、及び／又は味を付与するために用いられる調味料をいい、例えば、天然系調味料に砂糖や食塩等を加えて製造される。風味調味料として、具体的には、例えば、かつお風味、チキン風味、ポーク風味、ビーフ風味等の調味料が挙げられる。「メニュー用調味料」とは、特定のメニュー（中華メニュー等）の調理に適した調味料をいう。冷凍食品としては、上記例示したような飲食品の冷凍品が挙げられる。冷凍食品として、具体的には、例えば、餃子、焼売、チャーハン、ハンバーグ、唐揚げ、グラタン、とんかつ、コロッケ、ケーキ、ムースが挙げられる。飲食品の提供態様は特に制限されない。飲食品は、香気成分を生成してから（すなわち、ニンニクフレーバー等の香気を発現させてから）、喫食することができる。飲食品は、香気成分を生成してから喫食されること以外は、そのまま喫食できる態様で提供されてもよく、そうでなくてもよい。飲食品は、例えば、喫食前または喫食時に喫食に適した態様に調製されて喫食されてもよい。また、飲食品には、一般食品に限られず、栄養補助食品（サプリメント）、栄養機能食品、特定保健用食品等の、いわゆる健康食品や医療用食品も包含される。例えば、上記例示したような飲食品は、一般食品として提供されてもよいし、健康食品や医療用食品として提供されてもよい。
【０１５６】
本発明の飲食品は、本発明の組成物または有効成分を添加すること以外は、通常の飲食品と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。本発明の組成物または有効成分の添加は、飲食品の製造工程のいずれの段階で行われてもよい。すなわち、本発明の組成物または有効成分は、飲食品の原料に添加されてもよく、製造途中の飲食品に添加されてもよく、完成した飲食品に添加されてもよい。本発明の組成物または有効成分は、１回のみ添加されてもよく、２またはそれ以上の回数に分けて添加されてもよい。また、本発明の組成物を添加する場合、本発明の組成物が各有効成分をそれぞれ別個に、あるいは、任意の組み合わせで別個に含む場合には、各有効成分は同時に飲食品またはその原料に添加されてもよいし、それぞれ別個に、あるいは、任意の組み合わせで別個に、飲食品またはその原料に添加されてもよい。また、有効成分を添加する場合、各有効成分は同時に飲食品またはその原料に添加されてもよいし、それぞれ別個に、あるいは、任意の組み合わせで別個に、飲食品またはその原料に添加されてもよい。
【０１５７】
本発明の飲食品の製造方法は、さらに、その他の成分（有効成分以外の成分）を添加することを含んでいてもよい。ここでいう「その他の成分」については、上述した本発明の組成物における「その他の成分」についての記載を準用できる。「その他の成分」として、具体的には、例えば、補酵素であるピリドキサールリン酸が挙げられる。ピリドキサールリン酸は、特に、ピリドキサールリン酸の含有量が低い有効成分源を用いる場合に配合するのが好ましい。また、本発明の組成物を「その他の成分」とさらに併用してもよい。「その他の成分」を添加する場合、「その他の成分」の添加も、本発明の組成物または有効成分の添加と同様に行うことができる。例えば、「その他の成分」と本発明の組成物または有効成分とは、同時に飲食品またはその原料に添加されてもよいし、それぞれ別個に、あるいは、任意の組み合わせで別個に、飲食品またはその原料に添加されてもよい。
【０１５８】
本発明の飲食品の製造方法における各成分（すなわち、有効成分および任意でその他の成分）の添加量や添加比率は、香気付与効果が得られる限り特に制限されない。
【０１５９】
有効成分を添加する場合、有効成分の添加量や添加比率は、有効成分の種類、飲食品の種類、香気の所望の発現量等の諸条件に応じて適宜設定することができる。
【０１６０】
シスタチオニンリアーゼは、飲食品またはその原料に、例えば、飲食品におけるシスタチオニンリアーゼの濃度が所望の範囲となるように添加されてよい。飲食品におけるシスタチオニンリアーゼの濃度は、例えば、０．１Ｕ／ｇ以上、１Ｕ／ｇ以上、１０Ｕ／ｇ以上、１００Ｕ／ｇ以上、１０００Ｕ／ｇ以上、５０００Ｕ／ｇ以上、または１００００Ｕ／ｇ以上であってもよく、１０００００Ｕ／ｇ以下、または１００００Ｕ／ｇ以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。また、飲食品におけるシスタチオニンリアーゼの濃度は、例えば、０．１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、２ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、５ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、１０ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、５０ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、１００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、１０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、１％（ｗ／ｗ）以上、２％（ｗ／ｗ）以上、または５％（ｗ／ｗ）以上であってもよく、１０％（ｗ／ｗ）以下、または５％（ｗ／ｗ）以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。また、シスタチオニンリアーゼを含有する酵母エキスをシスタチオニンリアーゼ源として用いる場合、飲食品における該酵母エキスの濃度は、例えば、１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、５ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、１０ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、１００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、２００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、５００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、１０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、５０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、１％（ｗ／ｗ）以上、２％（ｗ／ｗ）以上、３％（ｗ／ｗ）以上、４％（ｗ／ｗ）以上、または５％（ｗ／ｗ）以上であってもよく、１０％（ｗ／ｗ）以下、または５％（ｗ／ｗ）以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。飲食品における該酵母エキスの濃度は、具体的には、例えば、１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）であってもよい。
【０１６１】
本発明の飲食品の製造方法におけるシスタチオニンリアーゼの添加量は、香気前駆体１ｍｇに対して、例えば、０．０１Ｕ以上、０．１Ｕ以上、０．２Ｕ以上、０．３Ｕ以上、０．４Ｕ以上、０．５Ｕ以上、０．７Ｕ以上、１Ｕ以上、５Ｕ以上、１０Ｕ以上、５０Ｕ以上、１００Ｕ以上、２００Ｕ以上、５００Ｕ以上、または１，０００Ｕ以上であってもよく、３，０００Ｕ以下、２，０００Ｕ以下、１，０００Ｕ以下、５００Ｕ以下、または３００Ｕ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。また、本発明の飲食品の製造方法におけるシスタチオニンリアーゼの添加量は、香気前駆体１ｍｇに対して、例えば、０．０００３３ｍｇ以上、０．００３３ｍｇ以上、０．００６７ｍｇ以上、０．０１ｍｇ以上、０．０１３ｍｇ以上、０．０１７ｍｇ以上、０．０２３ｍｇ以上、０．０３３ｍｇ以上、０．１７ｍｇ以上、０．３３ｍｇ以上、１．７ｍｇ以上、３．３ｍｇ以上、６．７ｍｇ以上、１７ｍｇ以上、または３３ｍｇ以上であってもよく、１００ｍｇ以下、６７ｍｇ以下、３３ｍｇ以下、１７ｍｇ以下、１０ｍｇ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。
【０１６２】
香気成分前駆体は、飲食品またはその原料に、例えば、飲食品における香気成分前駆体の濃度が所望の範囲となるように添加されてよい。飲食品における香気成分前駆体の濃度は、例えば、１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、１０ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、１００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、または５００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上であってもよく、５％（ｗ／ｗ）以下、１％（ｗ／ｗ）以下、または０．５％（ｗ／ｗ）以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。飲食品における香気成分前駆体の濃度は、具体的には、例えば、１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）であってもよい。また、香気成分前駆体を含有する酵母エキスを香気成分前駆体源として用いる場合、飲食品における該酵母エキスの濃度は、例えば、５ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、５０ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、５００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、２５００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、５０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以上、１％（ｗ／ｗ）以上、または２％（ｗ／ｗ）であってもよく、１０％（ｗ／ｗ）以下、５％（ｗ／ｗ）以下、または２％（ｗ／ｗ）以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。
【０１６３】
ピリドキサールリン酸は、飲食品またはその原料に、例えば、飲食品におけるピリドキサールリン酸の濃度が所望の範囲となるように添加されてよい。飲食品におけるピリドキサールリン酸の濃度は、例えば、０．００１ｍＭ以上、または０．０１ｍＭ以上であってもよく、０．５ｍＭ以下、または０．１ｍＭ以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。ピリドキサールリン酸の濃度は、具体的には、例えば、０．００１ｍＭ〜０．５ｍＭであってもよい。また、本発明の飲食品の製造方法におけるピリドキサールリン酸の添加量は、シスタチオニンリアーゼ１ｍｏｌに対して、例えば、０．１ｍｏｌ以上、０．５ｍｏｌ以上、１ｍｏｌ以上、１．５ｍｏｌ以上、または２ｍｏｌ以上であってもよく、１０ｍｏｌ以下、５ｍｏｌ以下、２ｍｏｌ以下、または１．５ｍｏｌ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。ピリドキサールリン酸の添加量は、シスタチオニンリアーゼ１ｍｏｌに対して、好ましくは１ｍｏｌ以上であってよい。
【０１６４】
上記例示した各成分の濃度は、飲食品の喫食態様に応じて、そのまま、あるいは適宜修正して、当該成分の添加量とすることができる。すなわち、濃縮または希釈されず喫食される（例えば、そのまま喫食される）飲食品を製造する場合、上記例示した各成分の濃度は、そのまま、当該成分の添加量と読み替えてよい。また、濃縮または希釈されて喫食される飲食品を製造する場合、上記例示した各成分の濃度と、濃縮または希釈の倍率とから、当該成分の添加量を設定することができる。例えば、１０倍希釈して喫食される飲食品を製造する場合、上記例示した各成分の濃度の１０倍を、当該成分の添加量として設定してよい。
【０１６５】
なお、各成分の添加量（濃度）は、同成分を含有する素材を用いる場合にあっては、特記しない限り、当該素材中の同成分そのものの量に基づいて算出されるものとする。
【０１６６】
本発明の組成物を添加する場合、その添加量は、香気付与効果が得られる限り特に制限されない。本発明の組成物の添加量は、有効成分の種類、本発明の組成物における有効成分の濃度、飲食品の種類、香気の所望の発現量等の諸条件に応じて適宜設定することができる。例えば、飲食品またはその原料に対して、本発明の組成物を、１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）〜５０％（ｗ／ｗ）添加してもよく、１０ｐｐｍ（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）添加してもよい。また、本発明の組成物は、例えば、各成分の飲食品における濃度が上記例示した各成分の濃度範囲内となるように、飲食品またはその原料に対して添加されてよい。
【０１６７】
また、本発明の飲食品においてシスタチオニンリアーゼを機能させることにより、ニンニクフレーバー等の香気を飲食品に付与することができる。具体的には、本発明の飲食品においてシスタチオニンリアーゼを香気成分前駆体に作用させることにより、香気成分を生成し、以て、香気を飲食品に付与することができる。すなわち、本発明は、本発明の飲食品においてシスタチオニンリアーゼを香気成分前駆体に作用させることを含む、飲食品に香気を付与する方法を提供する。また、本発明は、本発明の飲食品においてシスタチオニンリアーゼを香気成分前駆体に作用させることを含む、飲食品の製造方法を提供する。同方法により得られる飲食品は、具体的には、香気成分を含有する飲食品であってよく、香気が付与された飲食品であってよい。シスタチオニンリアーゼを機能させることは、例えば、酵素が機能する一般的な条件により実施できる。具体的には、例えば、水分の存在下で本発明の飲食品を加熱することにより、香気成分を生成することができる。すなわち、例えば、本発明の飲食品が粉末等の乾燥物として提供される場合には、本発明の飲食品に水分を添加して加熱することにより、香気成分を生成することができる。また、例えば、本発明の飲食品が十分な水分を含む形態で提供される場合には、そのまま加熱することにより、香気成分を生成することができる。香気成分を生成するタイミングは、特に制限されない。例えば、香気成分を生成させた飲食品を流通させてもよいし、調理時や喫食時に香気成分を生成させてもよい。なお、上記例示した飲食品における有効成分の濃度は、いずれも、香気成分の生成前の濃度を示す。
【実施例】
【０１６８】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。【０１６９】
本実施例で用いた試薬および菌株を表１に示す。【０１７０】
【表１】
2017213114.tif 000010
【０１７１】
実施例１：CYS3遺伝子高発現酵母変異株の粗酵素液を用いたＳ−アリルシステインスルホキシド（ALCSO）の分解
（１）CYS3遺伝子高発現株の作製
野生株として、実験室酵母であるSaccharomyces cerevisiae BY4742を用いた。CYS3遺伝子高発現株として、Saccharomyces cerevisiae BY4742においてCYS3遺伝子を高発現させた変異株（BY4742 CYS3↑）を用いた。CYS3遺伝子はシスタチオニンγリアーゼをコードする遺伝子である。【０１７２】
（１−１）CYS3遺伝子高発現用インテグレーションタイププラスミドの作製
CYS3遺伝子を高発現させるためのインテグレーションタイププラスミドは、まず構成高発現プロモーターであるTDH3遺伝子（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）プロモーター（TDH3p）からCYS3遺伝子を発現するマルチコピープラスミドを作製し、そのマルチコピープラスミドを鋳型として増幅したTDH3p-CYS3断片をpUC19プラスミド（インビトロジェン）にクローン化することにより作製した。用いたプライマーを表２に示す。【０１７３】
【表２】
2017213114.tif 000011
【０１７４】
（１−１−１）マルチコピープラスミドの作製
まず、SmaI制限酵素認識配列を有する配列番号７で示されるプライマーおよびXbaI制限酵素認識配列を有する配列番号８で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae S288C（ATCC 204508）のゲノムDNAを鋳型にPCRし、TDH3pを有するDNA断片を得た。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。次に、このDNA断片をpYES2（インビトロジェン）のSmaI-XbaI部位にクローン化し、プラスミドpYES2-TDH3pを得た。【０１７５】
続いて配列番号９で示されるプライマーおよび６コピーのヒスチジン（His-tag）をコードする配列を有する配列番号１０で示されるプライマーを用いてS288CのゲノムDNAを鋳型にPCRし、Ｃ末端にHis-tagが付加されたCys3をコードするCYS3遺伝子を有するDNA断片を得た。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。次に、このDNA断片を、制限酵素XbaIで消化して線状にしたpYES2-TDH3pにin-fusionクローニング法（Clontech社、In-Fusion(R) HD Cloning Kit）によりクローン化し、プラスミドpYES2-TDH3p-CYS3_6xHisを得た。【０１７６】
（１−１−２）インテグレーションタイププラスミドの作製
まず、SmaI制限酵素認識配列を有する配列番号１１で示されるプライマーおよびAatII制限酵素認識配列を有する配列番号１２で示されるプライマーを用い、S288CのゲノムDNAを鋳型にPCRし、URA3遺伝子を有するDNA断片（URA3断片）を得た。続いて、pUC19のSmaI-AatIIサイトにURA3断片をクローン化し、pUC19-URA3プラスミドを得た。別途、配列番号１３で示されるプライマーおよび配列番号１４で示されるプライマーを用いてpYES2-TDH3p-CYS3_6xHisプラスミドを鋳型にPCRし、TDH3p-CYS3_6xHisを有するDNA断片（TDH3p-CYS3_6xHis断片）を増幅した。TDH3p-CYS3_6xHis断片をpUC19-URA3のSphI-EcoRIサイトにin-fusionクローニング法により導入し、His-tagが付加されたCYS3遺伝子高発現用インテグレーションタイププラスミドpUC19-TDH3p-CYS3_6xHis-URA3を得た。【０１７７】
別途、配列番号１４で示されるプライマーの代わりに配列番号１５で示されるプライマーを用いて、同様の手順により、His-tagを有さないCYS3遺伝子高発現用インテグレーションタイププラスミドpUC19-TDH3p-CYS3-URA3を得た。【０１７８】
（１−２）CYS3遺伝子高発現株の作製
pUC19-TDH3p-CYS3_6xHis-URA3またはpUC19-TDH3p-CYS3-URA3をEcoRIで消化することにより線状化し、Saccharomyces cerevisiae BY4742由来のウラシル要求性株を形質転換することにより、CYS3遺伝子高発現株（以下、「変異株」ともいう）を作製した。形質転換は、Sofyanovichらの方法（Olga A. Sofyanovich et al: A New Method for Repeated “Self-Cloning” Promoter Replacement in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biotechnol., 48, 218-227 (2011)）に基づいて行い、ウラシルを含まない平板培地上で形質転換体を生育させることによりインテグレーションプラスミドが導入された株を選択した。【０１７９】
（２）粗酵素液の調製
野生株（BY4742）及び変異株（BY4742_CYS3↑）から、以下の手順により、粗酵素液を調製した。粗酵素液の調製フローを図１に示す。【０１８０】
（２−１）培養
野生株（BY4742）及び変異株（BY4742_CYS3↑）をそれぞれ１白金耳ずつ、5mLのYPD試験管培地に接種し、30℃、180rpmで24時間振盪培養した。得られた培養液の全量を100mLのYPDフラスコ培地に植菌し、さらに30℃、120rpmで72時間振盪培養した。得られた培養液を10分間遠心分離（4℃、9000rpm）して沈殿物を湿菌体として回収した。培地組成を表３に示す。【０１８１】
【表３】
2017213114.tif 000012
【０１８２】
（２−２）粗酵素液の調製
湿菌体にそれと等量の抽出用バッファーを加えて、破砕用湿菌体懸濁液を調製した。抽出用バッファー組成を表４に示す。【０１８３】
【表４】
2017213114.tif 000013
【０１８４】
破砕用湿菌体懸濁液（2ml）を105℃、１時間加熱して、破砕前の懸濁液中の固形分（DM）濃度を測定した。破砕用湿菌体懸濁液を安井器械株式会社製のマルチビーズショッカー(R)（型式：MB1001C(S)PAT., No:15073101）を用いてビーズ破砕（2700rpm、30sec ONと60sec OFFを12TIMES）し、得られた破砕液を10分間遠心分離（4℃、9000rpm）し、得られた上清液を粗酵素液とした。得られた上清液（2ml）を105℃、１時間加熱して、破砕後の上清液中の固形分濃度を測定した。結果を表５に示す。【０１８５】
【表５】
2017213114.tif 000014
【０１８６】
（３）粗酵素液によるALCSOの分解反応
野生株（BY4742）及び変異株（BY4742_CYS3↑）由来の粗酵素液を用いて、ALCSOの分解を測定した。【０１８７】
（３−１）野生株（BY4742）由来の上清液による反応
上清液（8,300ppm、1,783μl）、ALCSO溶液（20,000ppm、100μl）、ピリドキサールリン酸溶液（200ppm、20μl）、50mMリン酸カリウム緩衝液（97μl、pH7.4）を混合して反応液を調製し、30℃、30rpmで2時間振とうさせた。各溶液の調製には、50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）を用いた。60分反応後と120分反応後に反応液から100μlを取り、トリクロロ酢酸（10%、100μl）で沈殿させ、LC/MSによりALCSO残存量を定量し、ALCSO残存率を算出した。反応開始前のALCSO量は、上清を除く溶液にトリクロロ酢酸（10%、2000μl）を添加した後、上記の上清を添加した溶液より定量した。【０１８８】
（３−２）変異株（BY4742_CYS3↑）由来の上清液による反応
上清液（7,900ppm、1,873μl）、ALCSO溶液（20,000ppm、100μl）、ピリドキサールリン酸溶液（200ppm、20μl）、50mMリン酸カリウム緩衝液（7μl、pH7.4）を混合して反応液を調製し、30℃、30rpmで2時間振とうさせた。各溶液の調製には、50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）を用いた。60分反応後と120分反応後に反応液から100μlを取り、トリクロロ酢酸（10%、100μl）で沈殿させ、LC/MSによりALCSO残存量を定量し、ALCSO残存率を算出した。反応開始前のALCSO量は、上清を除く溶液にトリクロロ酢酸（10%、2000μl）を添加した後、上記の上清を添加した溶液より定量した。【０１８９】
（４）結果
120分反応後のALCSO残存率を図２に示す。変異株（BY4742_CYS3↑）では、野生株（BY4742）に比べて、ALCSOの分解量が増加して残存率が低くなった。この結果から、CYS3遺伝子がALCSO分解に関与する遺伝子であると考えられた。【０１９０】
実施例２：精製シスタチオニンβリアーゼおよび精製シスタチオニンγリアーゼによるジアリルスルフィド（ALS）およびジアリルジスルフィド（ALDS）の生成
（１）CYS3遺伝子またはSTR3遺伝子を高発現するE. coli株の作製
Saccharomyces cerevisiae S288C由来のCYS3遺伝子またはSTR3遺伝子をプラスミドpUC19にクローン化し、CYS3遺伝子またはSTR3遺伝子の発現プラスミドを得た。具体的には、配列番号１６および配列番号１７で示したプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae S288CのゲノムDNAを鋳型にPCRし、６コピーのヒスチジン（His-tag）をコードする塩基配列が付加されたCYS3遺伝子断片を得た。同様に、配列番号１８および配列番号１９で示したプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae S288CのゲノムDNAを鋳型にPCRし、６コピーのヒスチジン（His-tag）をコードする塩基配列が付加されたSTR3遺伝子断片を得た。続いて、プラスミドpUC19をEcoRIおよびHindIIIで消化し、それぞれの遺伝子断片をin-fusionクローニング法によりEcoRI-HindIIIサイトにクローン化した。得られた発現プラスミドでE. coli JM109を形質転換し、CYS3遺伝子またはSTR3遺伝子を高発現するE. coli株（JM109 CYS3↑およびJM109 STR3↑）を得た。【０１９１】
（２）精製酵素の調製
以下の手順により、シスタチオニンβリアーゼ（Str3タンパク質）およびシスタチオニンγリアーゼ（Cys3タンパク質）の精製酵素を調製した。精製酵素の調製フローを図３に示す。【０１９２】
LB培地（Hipolypepton 1g, Yeast extract 0.5g, NaCl 1g, in MilliQ水100ml）でJM109 CYS3↑およびJM109 STR3↑をそれぞれ培養後、IPTGでCYS3遺伝子およびSTR3遺伝子の発現を誘導し、さらに培養した。その後、超音波により菌体を破砕し、粗酵素液を得た。上記ホストで発現するCys3タンパク質およびStr3タンパク質にはそれぞれHis-tagを付加してあるため、His-tagと特異的に吸着するカラムに粗酵素液をアプライしてそれらのタンパク質を吸着後、Imidazoleの濃度を20mMから500mMに順次上昇させフラクションを回収した。各フラクションをSDSゲル電気泳動してCys3タンパク質の分子量48kD（4量体として194kDa）を有するフラクションおよびStr3タンパク質の分子量53kDaを有するフラクションを特定し、それぞれ精製シスタチオニンγリアーゼ（精製Cys3タンパク質）および精製シスタチオニンβリアーゼ（精製Str3タンパク質）とした。【０１９３】
（３）精製酵素によるALSおよびALDSの生成反応
精製Str3タンパク質および精製Cys3タンパク質をそれぞれ用いて酵素反応を行い、ALCまたはALCSOからのALSおよびALDSの生成を測定した。【０１９４】
（３−１）精製Str3タンパク質による反応
精製シスタチオニンβリアーゼ（精製Str3タンパク質；0.2mg/mL；375μL）、ALCSO溶液（1mg/1mL、187.5μL）またはALC溶液（1mg/1mL、187.5μL）、ピリドキサールリン酸溶液（2μg/1mL、0.75μL）、50mM TAPS-NaOH緩衝液（pH8.5、186.75μL）を混合して反応液を調製し、37℃で１時間反応させた。各溶液の調製には、50mM TAPS-NaOH緩衝液（pH8.5）を用いた。反応液（200μL）に10%TCA（300μL）を添加して反応を止め、生成したALSおよびALDSをLC/MSで定量した。【０１９５】
（３−２）精製Cys3タンパク質による反応
精製シスタチオニンγリアーゼ（精製Cys3タンパク質；0.5mg/mL；150μL）、ALCSO溶液（1mg/1mL、187.5μL）またはALC溶液（1mg/1mL、187.5μL）、ピリドキサールリン酸溶液（2μg/1mL、0.75μL）、50mM TAPS-NaOH緩衝液（pH8.0、411.75μL）を混合して反応液を調製し、30℃で１時間反応させた。各溶液の調製には、50mM TAPS-NaOH緩衝液（pH8.0）を用いた。反応液（200μL）に10%TCA（300μL）を添加して反応を止め、生成したALSおよびALDSをLC/MSで定量した。【０１９６】
（４）結果
１時間反応後の結果を図４に示す。精製シスタチオニンβリアーゼ（精製Str3タンパク質）および精製シスタチオニンγリアーゼ（精製Cys3タンパク質）により、ALCまたはALCSOからALSおよびALDSが生成されることが確認された。これらの結果から、CYS3遺伝子およびSTR3遺伝子がALCおよびALCSOの分解ならびにALSおよびALDS生成に関与する遺伝子であると考えられた。【０１９７】
実施例３：CYS3遺伝子高発現酵母変異株の粗酵素液を用いたALCSOからのALSおよびALDSの生成
（１）粗酵素液の調製
野生株（Saccharomyces cerevisiae BY4742）及び変異株（Saccharomyces cerevisiae BY4742_CYS3↑）から、以下の手順により、粗酵素液を調製した。粗酵素液の調製フローを図５に示す。【０１９８】
（１−１）培養
実施例１（２−１）と同様の手順で野生株（BY4742）および変異株（BY4742_CYS3↑）を培養した。【０１９９】
（１−２）粗酵素液の調製
湿菌体を適量のリン酸Ｋバッファー（表４）で懸濁した後、660nmの吸光度が1.2となるよう懸濁液をさらに抽出用バッファー（表４）にて希釈し、破砕用湿菌体懸濁液を得た。破砕用湿菌体懸濁液1mlをビーズ破砕（破砕1分間毎に氷上にて冷却するサイクルを4回実施）に供した。得られた破砕液を遠心分離し、得られた上清液を粗酵素液とした。【０２００】
（２）粗酵素液によるALSおよびALDSの生成反応
野生株（BY4742）及び変異株（BY4742_CYS3↑）由来の粗酵素液を用いて酵素反応を行い、ALCSOからのALSおよびALDSの生成を測定した。反応条件を表６に示す。ALSおよびALDSの生成量は、GC／MSにより測定した。【０２０１】
【表６】
2017213114.tif 000015
【０２０２】
（３）結果
結果を図６および７に示す。変異株（BY4742_CYS3↑）では、野生株（BY4742）に比べて、ALSおよびALDS生成量が有意に増加した。これらの結果から、CYS3遺伝子がALCSOの分解ならびにALSおよびALDS生成に関与する遺伝子であると考えられた。【０２０３】
実施例４：ALCSOと精製シスタチオニンγリアーゼの量比および濃度がALCSOの分解へ与える影響の評価
本実施例では、ALCSOと精製シスタチオニンγリアーゼの量比および濃度がALCSOの分解へ与える影響について評価した。【０２０４】
（１）精製シスタチオニンγリアーゼの調整
実施例２（２）と同様の手順で、Escherichia coli JM109 CYS3↑を培養し、精製シスタチオニンγリアーゼ（精製Cys3タンパク質）を調製した。【０２０５】
（２）精製シスタチオニンγリアーゼによるALCSOの分解反応
得られた精製シスタチオニンγリアーゼ（精製Cys3タンパク質）を用いて酵素反応を行い、ALCSOの分解を測定した。反応条件を表７に示す。酵素液（250〜2,000ppm）、ピリドキサールリン酸（2ppm）、ALCSO（10,000ppm）を含む反応液を1ml調製して30℃で反応させた。所定の時間に反応液100μlを採取して、100μlの10%TCAと混合して酵素反応を停止させた。反応停止後の反応液を10分間遠心分離（4℃、90000rpm）して、上清液に含まれるALCSOをLC/MSにより定量し、ALCSOの残存率を算出した。【０２０６】
【表７】
2017213114.tif 000016
【０２０７】
（３）結果
残存率の経時変化を図８に示す。これらの結果から、精製Cys3タンパク質の濃度依存的にALCSOの分解量が増加し、ALCSO 10,000ppm、酵素濃度 2,000ppmの条件で最もALCSOが消費された。また、専門パネル（１名）によって、反応後溶液の香りを鼻からの匂いかぎにて評価した。その結果、ALCSO 10,000ppmの条件で、いずれの酵素濃度でも、ALCSO残存率が８５〜８０％以下になったときにニンニクの香りを強く感じた。【０２０８】
実施例５：調理におけるニンニク香気の生成
フライパンを使った炒め料理において、ALCSOとシスタチオニンγリアーゼ（Cys3タンパク質）を用いてニンニクの香りを発現させることができるかを検証した。【０２０９】
（１）精製シスタチオニンγリアーゼの調整
実施例２（２）と同様の手順で、Escherichia coli JM109 CYS3↑を培養し、精製シスタチオニンγリアーゼ（精製Cys3タンパク質）を調製した。【０２１０】
（２）ニンニクの香りの発現
得られた精製シスタチオニンγリアーゼ（精製Cys3タンパク質）26mlを凍結乾燥機（-80℃、19.5時間、59Pa）を用いて凍結乾燥し、1.49gの精製Cys3タンパク質粉末を得た。表８に示す配合でＢ、Ｃ、Ｄ、およびＥを室温（20℃）で混合し、その直後に官能評価を実施して「加熱調理前」の評価結果を得た。混合物にさらにＡとＦを加えて表８に示す加熱条件で調理し、その直後に官能評価を実施して「加熱調理後」の評価結果を得た。官能評価は、専門パネル４名にて、対象物の香りを鼻からの匂いかぎにて実施した。表中、フライパンと生米の表面温度は、フライパンの中央から10cm離れた場所を赤外線非接触温度計で3点測定した平均値を示す。ニンニクのみじん切りは、2mm角の大きさにカットしたものを用いた。【０２１１】
【表８】
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【０２１２】
（３）結果【０２１３】
結果を表９に示す。試験区３では、加熱調理前後ともにニンニクの香りが感じられた。これらの結果より、フライパンを使った炒め料理において、シスタチオニンγリアーゼ（Cys3タンパク質）とALCSOを用いてニンニクの香りを発現させることができることを確認した。【０２１４】
【表９】
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【０２１５】
参考例：シスタチオニンγリアーゼ活性の測定
実施例１（２）で得られた粗酵素液および実施例２（２）で得られた精製酵素について、Ｌ−システインを基質として酵素活性の測定を行った。酵素活性の測定条件および測定結果を表１０に示す。【０２１６】
【表１０】
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【０２１７】
実施例５：CYS3遺伝子高発現酵母変異株の粗酵素液を用いた香気成分前駆体の分解と香気成分の生成
（１）粗酵素液の調製
実施例１と同様の方法で野生株（BY4742）及び変異株（BY4742_CYS3↑）の粗酵素液を調製した。【０２１８】
（２）粗酵素液による香気成分前駆体の分解反応
野生株（BY4742）及び変異株（BY4742_CYS3↑）由来の粗酵素液を用いて、香気成分前駆体の分解および香気成分の生成を測定した。香気成分前駆体としては、Ｓ−メチルシステインスルホキシド（MCSO）、Ｓ−プロピルシステインスルホキシド（PCSO）、Ｓ−（１−プロペニル）−システインスルホキシド（PeCSO）を用いた。香気成分としては、ジメチルジスルフィド（DMDS）、ジメチルトリスルフィド（DMTS）、ジプロピルトリスルフィド（DPTS）、３，４−ジメチルチオフェン（DMTP）を検出した。【０２１９】
（２−１）野生株（BY4742）由来の上清液による反応
上清液（8,300ppm、1,783μl）、香気成分前駆体溶液（20,000ppm、100μl）、ピリドキサールリン酸溶液（200ppm、20μl）、50mMリン酸カリウム緩衝液（97μl、pH7.4）を混合して反応液を調製し、30℃、30rpmで1時間振とうさせた。各溶液の調製には、50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）を用いた。60分反応後に反応液から100μlを取り、トリクロロ酢酸（10%、100μl）で沈殿させ、LC/MSにより香気成分前駆体残存量を定量し香気成分前駆体残存率を算出した。反応開始前の香気成分前駆体量は、上清を除く溶液にトリクロロ酢酸（10%、2000μl）を添加した後、上記の上清を添加した溶液より定量した。生成した香気成分をLC/MSで定量した。【０２２０】
（２−２）変異株（BY4742_CYS3↑）由来の上清液による反応
上清液（7,900ppm、1,873μl）、香気成分前駆体溶液（20,000ppm、100μl）、ピリドキサールリン酸溶液（200ppm、20μl）、50mMリン酸カリウム緩衝液（7μl、pH7.4）を混合して反応液を調製し、30℃、30rpmで2時間振とうさせた。各溶液の調製には、50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）を用いた。60分反応後と120分反応後に反応液から100μlを取り、トリクロロ酢酸（10%、100μl）で沈殿させ、LC/MSにより香気成分前駆体残存量を定量し、香気成分前駆体残存率を算出した。反応開始前の香気成分前駆体量は、上清を除く溶液にトリクロロ酢酸（10%、2000μl）を添加した後、上記の上清を添加した溶液より定量した。生成した香気成分をLC/MSで定量した。【０２２１】
（３）結果
60分反応後の香気成分前駆体残存率と香気成分の生成量を表１１に示す。変異株（BY4742_CYS3↑）では、野生株（BY4742）に比べて、MCSO、PCSO、およびPeCSOの残存率が低くなり、DMDS、DMTS、DPTSおよびDMTPの生成量が有意に増加した。これらの結果から、CYS3遺伝子が、MCSO、PCSO、およびPeCSO分解に関与する遺伝子であり、且つDMDS、DMTS、DPTS、およびDMTP生成に関与する遺伝子であると考えられた。【０２２２】
【表１１】
2017213114.tif 000020
【０２２３】
実施例６：精製Cys3タンパク質によるALCSOとMCSOの混合基質の分解と香気成分の生成
（１）精製酵素による香気成分前駆体の分解反応
精製システチオニンγリアーゼ（精製Cys3タンパク質）を用いて、Ｓ−アリルシステインスルホキシド（ALCSO）とＳ−メチルシステインスルホキシド（MCSO）の混合基質の分解および香気成分の生成を測定した。香気成分としては、ジアリルスルフィド（ALS）、ジアリルジスルフィド（ALDS）、ジメチルジスルフィド（DMDS）、アリルメチルジスルフィド（AMDS）を検出した。【０２２４】
精製システチオニンγリアーゼ（実施例２で得た精製Cys3タンパク質；2%、50μl）、ALCSO溶液（10%、100μl）、MCSO溶液（10%、100μl）、ピリドキサールリン酸溶液（10mM、10μl）、50mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.4、840μL）を混合して反応液を調製し、30℃で1時間反応させた。各溶液の調製には、50mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.4）を用いた。反応液（200μL）に10%TCA（300μL）を添加して反応を止め、反応前後の香気成分前駆体をLC/MSで、生成した香気成分をLC/MSおよびGC/MSで定量した。【０２２５】
（２）結果
1時間反応後の結果を表１２に示す。精製システチオニンγリアーゼ（精製Cys3タンパク質）により、ALCSOおよびMCSOが分解して、DMDS、AMDS、ALS、およびALDSが生成することを確認した。【０２２６】
【表１２】
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【産業上の利用可能性】
【０２２７】
本発明により、ジアリルスルフィドやジアリルジスルフィド等の香気成分を製造することができる。また、本発明により、ニンニクフレーバー等の香気を所望のタイミングで飲食品に付与することができる。【０２２８】
＜配列表の説明＞
配列番号１：Saccharomyces cerevisiae S288CのSTR3遺伝子の塩基配列
配列番号２：Saccharomyces cerevisiae S288CのStr3タンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：Saccharomyces cerevisiae S288CのCYS3遺伝子の塩基配列
配列番号４：Saccharomyces cerevisiae S288CのCys3タンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：Saccharomyces cerevisiae S288CのCYS4遺伝子の塩基配列
配列番号６：Saccharomyces cerevisiae S288CのCys4タンパク質のアミノ酸配列
配列番号７〜１９：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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