(57)【要約】容器内の各観察領域の撮影画像が、メニスカスの影響を受けてコントラストが低い画像であったとしても、より正確かつ、信頼性の高い評価を行うことができる細胞画像評価装置および方法並びにプログラムを提供する。細胞が収容された容器内を撮影した撮影画像が、容器内のメニスカス領域を撮影した画像であるか非メニスカス領域を撮影した画像であるかを判別する領域判別部（２１）と、撮影画像に含まれる細胞の状態を評価する画像評価部（２２）とを備え、画像評価部（２２）が、メニスカス領域の画像と非メニスカス領域の画像とで異なる評価方法で評価する。
2018180813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が収容された容器内を撮影した撮影画像が、前記容器内のメニスカス領域を撮影した画像であるか非メニスカス領域を撮影した画像であるかを判別する領域判別部と、
前記撮影画像に含まれる細胞の状態を評価する画像評価部とを備え、
前記画像評価部が、前記メニスカス領域の画像と前記非メニスカス領域の画像とで異なる評価方法で評価する細胞画像評価装置。
【請求項２】
前記領域判別部が、前記撮影画像の特徴量に基づいて、前記メニスカス領域の画像であるか前記非メニスカス領域の画像であるかを判別する請求項１記載の細胞画像評価装置。
【請求項３】
前記領域判別部が、予め設定された前記容器内における位置情報に基づいて、前記メニスカス領域の画像であるか前記非メニスカス領域の画像であるかを判別する請求項１記載の細胞画像評価装置。
【請求項４】
前記領域判別部が、前記撮影画像の特徴量および予め設定された前記容器内における位置情報に基づいて、前記メニスカス領域の画像であるか前記非メニスカス領域の画像であるかを判別する請求項１記載の細胞画像評価装置。
【請求項５】
前記画像評価部が、前記非メニスカス領域の画像については、前記撮影画像に含まれる細胞の状態を示す特徴量を用いて評価し、前記メニスカス領域の画像については、画像特徴量を用いて評価する請求項１から４いずれか１項記載の細胞画像評価装置。
【請求項６】
前記細胞の状態を示す特徴量が、個々の細胞の状態の特徴量、細胞内に含まれる核小体の特徴量、白すじの特徴量、細胞内に含まれる核の特徴量および細胞のＮＣ比（Nucleocytoplasmic ratio）の少なくとも１つを含む請求項５記載の細胞画像評価装置。
【請求項７】
前記画像評価部が、前記容器内の前記メニスカス領域の画像の評価結果と前記非メニスカス領域の画像の評価結果とを統合して前記容器に対する評価結果を算出する請求項１から６いずれか１項記載の細胞画像評価装置。
【請求項８】
前記画像評価部が、前記容器に対する評価結果を算出する際、前記メニスカス領域の画像の評価結果と前記非メニスカス領域の画像の評価結果とに重み付けを付加する請求項７記載の細胞画像評価装置。
【請求項９】
前記非メニスカス領域の画像の評価結果に付加される重み付けが、前記メニスカス領域画像の評価結果に付加される重み付けよりも大きい請求項８記載の細胞画像評価装置。
【請求項１０】
前記撮影画像が、前記容器が設置されるステージおよび前記容器内の細胞の像を結像する結像光学系の少なくとも一方を移動させることによって、前記容器内の各観察領域を撮影した画像であり、
前記領域判別部が、前記観察領域毎の撮影画像について、前記メニスカス領域の画像であるか前記非メニスカス領域の画像であるかを判別する請求項１から９いずれか１項記載の細胞画像評価装置。
【請求項１１】
前記領域判別部が、前記撮影画像が、前記容器内の液体の波打ち領域を撮影した画像であるか否かを判別し、
前記画像評価部が、前記波打ち領域を撮影した画像を、前記メニスカス領域の画像を評価する評価方法と同じ評価方法で評価する請求項１から１０いずれか１項記載の細胞画像評価装置。
【請求項１２】
細胞が収容された容器内を撮影した撮影画像が、前記容器内のメニスカス領域を撮影した画像であるか非メニスカス領域を撮影した画像であるかを判別し、
前記撮影画像に含まれる細胞の状態を評価する際、前記メニスカス領域の画像と前記非メニスカス領域の画像とで異なる評価方法で評価する細胞画像評価方法。
【請求項１３】
コンピュータを、
細胞が収容された容器内を撮影した撮影画像が、前記容器内のメニスカス領域を撮影した画像であるか非メニスカス領域を撮影した画像であるかを判別する領域判別部と、
前記撮影画像に含まれる細胞の状態を評価する画像評価部として機能させる細胞画像評価プログラムであって、
前記画像評価部が、前記メニスカス領域の画像と前記非メニスカス領域の画像とで異なる評価方法で評価する細胞画像評価プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を撮影した撮影画像を用いて、撮影画像に含まれる細胞の状態を評価する細胞画像評価装置および方法並びにプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＳ（Embryonic Stem）細胞およびｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞などの多能性幹細胞は、種々の組織の細胞に分化する能力を備え、再生医療、薬の開発、および病気の解明などにおいて応用が可能なものとして注目されている。【０００３】
そして、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞や分化誘導された細胞などを顕微鏡などで撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の分化状態などを評価する方法が提案されている。【０００４】
一方、上述したように細胞を顕微鏡で撮像する際、高倍率な広視野画像を取得するため、いわゆるタイリング撮影を行うことが提案されている。具体的には、たとえばウェルプレートなどが設置されたステージを、結像光学系に対して移動させることによってウェル内の各観察領域を走査し、観察領域毎の画像を撮影した後、その観察領域毎の画像を繋ぎ合わせる方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１６−１２７３４２号公報
【特許文献２】特開２０１３−５７５９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ここで、上述したウェルプレートなどを用いて細胞を培養する際、ウェル内には細胞とともに、培養液などの液体が収容されるが、その液体の表面にはメニスカスが形成されることが知られている。【０００７】
そして、特に、位相差顕微鏡装置を用いて細胞の画像を撮影する場合には、撮影画像に対するメニスカスの影響が大きく、メニスカスが形成されていない非メニスカス領域の撮影画像と比較するとコントラストが低い画像となってしまう。【０００８】
したがって、メニスカス領域を撮影した撮影画像については、個々の細胞の画像を高精度に抽出することができないため、たとえば個々の細胞の状態を示す特徴量を用いて評価を行うようにしたのでは、評価結果の精度が低くなり、信頼性も低い評価結果となる場合がある。すなわち、非メニスカス領域の画像とメニスカス領域の画像とを同じように評価したのでは正確な評価結果を得ることができない場合がある。【０００９】
なお、特許文献１では、メニスカスを考慮してオートフォーカス制御を行うことが提案されており、特許文献２では、ウェルの側面の影の影響を考慮して濃度補正を施すことが提案されているが、メニスカス領域のコントラストが低い画像の評価方法については、何も提案されていない。【００１０】
本発明は、上記の問題に鑑み、容器内の各観察領域の撮影画像が、メニスカスの影響を受けてコントラストが低い画像であったとしても、より正確かつ、信頼性の高い評価を行うことができる細胞画像評価装置および方法並びにプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様による細胞画像評価装置は、細胞が収容された容器内を撮影した撮影画像が、容器内のメニスカス領域を撮影した画像であるか非メニスカス領域を撮影した画像であるかを判別する領域判別部と、撮影画像に含まれる細胞の状態を評価する画像評価部とを備え、画像評価部が、メニスカス領域の画像と非メニスカス領域の画像とで異なる評価方法で評価する。【００１２】
また、上記本発明の一態様による細胞画像評価装置において、領域判別部は、撮影画像の特徴量に基づいて、メニスカス領域の画像であるか非メニスカス領域の画像であるかを判別してもよい。【００１３】
また、上記本発明の一態様による細胞画像評価装置において、領域判別部は、予め設定された容器内における位置情報に基づいて、メニスカス領域の画像であるか非メニスカス領域の画像であるかを判別してもよい。【００１４】
また、上記本発明の一態様による細胞画像評価装置において、領域判別部は、撮影画像の特徴量および予め設定された容器内における位置情報に基づいて、メニスカス領域の画像であるか非メニスカス領域の画像であるかを判別してもよい。【００１５】
また、上記本発明の一態様による細胞画像評価装置において、画像評価部は、非メニスカス領域の画像については、撮影画像に含まれる細胞の状態を示す特徴量を用いて評価し、メニスカス領域の画像については、画像特徴量を用いて評価してもよい。【００１６】
また、上記本発明の一態様による細胞画像評価装置において、細胞の状態を示す特徴量は、個々の細胞の状態の特徴量、細胞内に含まれる核小体の特徴量、白すじの特徴量、細胞内に含まれる核の特徴量および細胞のＮＣ比（Nucleocytoplasmic ratio）の少なくとも１つを含んでもよい。【００１７】
また、上記本発明の一態様による細胞画像評価装置において、画像評価部は、容器内のメニスカス領域の画像の評価結果と非メニスカス領域の画像の評価結果とを統合して容器に対する評価結果を算出してもよい。【００１８】
また、上記本発明の一態様による細胞画像評価装置において、画像評価部は、容器に対する評価結果を算出する際、メニスカス領域の画像の評価結果と非メニスカス領域の画像の評価結果とに重み付けを付加してもよい。【００１９】
また、上記本発明の一態様による細胞画像評価装置において、非メニスカス領域の画像の評価結果に付加される重み付けは、メニスカス領域画像の評価結果に付加される重み付けよりも大きくすることが好ましい。【００２０】
また、上記本発明の一態様による細胞画像評価装置において、撮影画像は、容器が設置されるステージおよび容器内の細胞の像を結像する結像光学系の少なくとも一方を移動させることによって、容器内の各観察領域を撮影した画像とし、領域判別部は、観察領域毎の撮影画像について、メニスカス領域の画像であるか非メニスカス領域の画像であるかを判別してもよい。【００２１】
また、上記本発明の一態様による細胞画像評価装置において、領域判別部は、撮影画像が、容器内の液体の波打ち領域を撮影した画像であるか否かを判別することができ、画像評価部は、波打ち領域を撮影した画像を、メニスカス領域の画像を評価する評価方法と同じ評価方法で評価してもよい。【００２２】
本発明の一態様による細胞画像評価方法は、細胞が収容された容器内を撮影した撮影画像が、容器内のメニスカス領域を撮影した画像であるか非メニスカス領域を撮影した画像であるかを判別し、撮影画像に含まれる細胞の状態を評価する際、メニスカス領域の画像と非メニスカス領域の画像とで異なる評価方法で評価する。【００２３】
本発明の一態様による細胞画像評価プログラムは、コンピュータを、細胞が収容された容器内を撮影した撮影画像が、容器内のメニスカス領域を撮影した画像であるか非メニスカス領域を撮影した画像であるかを判別する領域判別部と、撮影画像に含まれる細胞の状態を評価する画像評価部として機能させる細胞画像評価プログラムであって、画像評価部が、メニスカス領域の画像と非メニスカス領域の画像とで異なる評価方法で評価する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の細胞画像評価装置および方法並びにプログラムによれば、細胞が収容された容器内を撮影した撮影画像が、容器内のメニスカス領域を撮影した画像であるか非メニスカス領域を撮影した画像であるかを判別し、撮影画像に含まれる細胞の状態を評価する際、メニスカス領域の画像と非メニスカス領域の画像とで異なる評価方法で評価する。これにより、メニスカス領域の画像が、メニスカスの影響を受けてコントラストが低い画像であったとしても、その画像に適した評価方法で評価することによって、より正確かつ、信頼性の高い評価を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の細胞画像評価装置の一実施形態を用いた細胞画像評価システムの概略構成を示すブロック図
【図２】ウェルプレートにおける各観察領域の走査軌跡を示す図
【図３】ウェルの側断面図および上面図を示す図
【図４】ウェル内の各観察領域の撮影画像の一例を示す図
【図５】ウェル単位で統合された評価結果の表示例を示す図
【図６】本発明の細胞画像評価装置の一実施形態を用いた細胞画像評価システムの作用を説明するためのフローチャート
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の細胞画像評価装置および方法並びにプログラムの一実施形態を用いた細胞画像評価システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本実施形態の細胞画像評価システムの概略構成を示すブロック図である。
【００２７】
本実施形態の細胞画像評価システムは、図１に示すように、顕微鏡装置１０と、細胞画像評価装置２０と、表示装置３０と、入力装置４０とを備えている。
【００２８】
顕微鏡装置１０は、培養容器内に収容された細胞を撮影し、撮影画像を出力する。本実施形態においては、具体的には、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどの撮像素子を備えた位相差顕微鏡装置を用いる。撮像素子としては、ＲＧＢ（Red Green Blue）のカラーフィルタが設けられた撮像素子を用いてもよいし、モノクロの撮像素子を用いるようにしてもよい。培養容器内に収容された細胞の位相差像が撮像素子に結像され、撮像素子から撮影画像として位相差画像が出力される。なお、顕微鏡装置１０としては、位相差顕微鏡装置に限らず、微分干渉顕微鏡装置および明視野顕微鏡装置などのその他の顕微鏡装置を用いるようにしてもよい。
【００２９】
撮影対象としては、複数の細胞が凝集した細胞コロニーでもよいし、分散して分布した複数の細胞でもよい。また、撮影対象の細胞としては、たとえばｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞といった多能性幹細胞、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋および肝臓の細胞、並びに人体から取り出された臓器の細胞およびがん細胞などがある。
【００３０】
また、本実施形態においては、培養容器として、複数のウェルを有するウェルプレートを用いる。なお、ウェルプレートを用いる場合、各ウェルが、本発明の容器に相当する。そして、顕微鏡装置１０は、ウェルプレートが設置されるステージを備えている。ステージは、水平面内において直交するＸ方向およびＹ方向に移動する。このステージの移動によって、ウェルプレートの各ウェル内における各観察領域が走査され、観察領域毎の撮影画像が撮影される。観察領域毎の撮影画像は細胞画像評価装置２０に出力される。
【００３１】
図２は、６つのウェル５１を有するウェルプレート５０を用いた場合における各観察領域の走査軌跡を実線Ｓｃで示した図である。図２に示すように、ウェルプレート５０内の各観察領域は、ステージのＸ方向およびＹ方向の移動によって走査開始点Ｓから走査終了点Ｅまでの実線Ｓｃに沿って走査される。
【００３２】
なお、本実施形態においては、ステージを移動させることによってウェル内の観察領域毎の撮影画像を撮影するようにしたが、これに限らず、細胞の位相差像を撮像素子に結像する結像光学系をステージに対して移動させることによって観察領域毎の撮影画像を撮影するようにしてもよい。または、ステージと結像光学系の両方を移動させるようにしてもよい。
【００３３】
また、本実施形態においては、ウェルプレートを用いるようにしたが、細胞が収容される容器としてはこれに限らず、たとえばシャーレまたはディッシュなどその他の容器を用いるようにしてもよい。
【００３４】
細胞画像評価装置２０は、図１に示すように、領域判別部２１と、画像評価部２２と、表示制御部２３とを備えている。細胞画像評価装置２０は、中央処理装置、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えたコンピュータから構成され、ハードディスクに本発明の細胞画像評価プログラムの一実施形態がインストールされている。そして、この細胞画像評価プログラムが中央処理装置によって実行されることによって、図１に示す領域判別部２１、画像評価部２２および表示制御部２３が機能する。なお、本実施形態においては、細胞画像評価プログラムによって、各部の機能を実行するようにしたが、これに限らず、たとえば複数のＩＣ（Integrated Circuit）、プロセッサ、ＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit）、ＦＰＧＡ（Field-Programmable Gate Array）、およびメモリなどを適宜組み合わせることによって各部の機能を実行するようにしてもよい。なお、細胞画像評価プログラムは、非一時的なコンピュータ読取り可能な記録媒体に格納され、細胞画像評価装置２０を構成するコンピュータに読み取られても良い。また、細胞画像評価プログラムは、ネットワークを介して配信されても良い。
【００３５】
領域判別部２１は、顕微鏡装置１０によって撮影された観察領域毎の撮影画像が、ウェル内のメニスカス領域を撮影した画像であるか非メニスカス領域を撮影した画像であるかを判別するものである。図３は、ウェル５１の側断面図および上面図を示した図である。また、図４は、ウェル内の各観察領域の撮影画像の一例を示す図である。図４において矩形領域で分割された各領域Ａが、各観察領域に相当する。
【００３６】
ウェル５１内には、細胞とともに、培養液などの液体が収容されるが、その液体の表面には、図３に示すようにメニスカスＭが形成される。そして、図３および図４に示すように、非メニスカス領域Ｒ１を撮影した画像はコントラストが高い画像となるが、メニスカス領域Ｒ２を撮影した画像はコントラストが低い画像となる。したがって、メニスカス領域Ｒ２の画像については、個々の細胞の画像を高精度に抽出することができないため、たとえば個々の細胞の状態を示す特徴量を用いて評価を行うようにしたのでは、評価結果の精度が低くなり、信頼性も低い評価結果となる場合がある。すなわち、非メニスカス領域の画像とメニスカス領域の画像とを同じ評価方法で評価したのでは正確な評価結果を得ることができない場合がある。なお、メニスカス領域の影響は、容器が小さいほど大きくなる。たとえば、６ウェルのウェルプレートの場合、各ウェルの中心から半径６０％以上の範囲がメニスカス領域となり、２４ウェルのウェルプレートの場合、ウェルの中心から半径２５％以上の範囲がメニスカス領域となる。
【００３７】
そこで、本実施形態の細胞画像評価システムにおいては、領域判別部２１において、観察領域毎の撮影画像が、メニスカス領域の画像であるか非メニスカス領域の画像であるかを判別し、その判別結果によって、評価方法を変えるようにする。
【００３８】
領域判別部２１は、具体的には、観察領域毎の撮影画像の特徴量を算出し、その特徴量に基づいて、撮影画像が、メニスカス領域の画像であるか非メニスカス領域の画像であるかを判別する。撮影画像の特徴量としては、たとえば撮影画像のコントラストおよび輝度などを用いることができる。撮影画像のコントラストを用いて判別する場合には、コントラストが閾値以上である撮影画像を非メニスカス領域の画像と判別し、閾値未満である撮影画像をメニスカス領域の画像と判別するようにすればよい。また、撮影画像の輝度を用いて判別する場合には、輝度が閾値未満である撮影画像を非メニスカス領域の画像と判別し、閾値以上である撮影画像をメニスカス領域の画像と判別するようにすればよい。なお、ここでいう輝度とは、撮影画像の輝度の平均値でもよいし、最大値または中央値などを用いてもよい。
【００３９】
画像評価部２２は、観察領域毎の撮影画像を取得し、その撮影画像に含まれる細胞の状態を評価する。細胞の状態を評価するとは、たとえば撮影画像に含まれる細胞が未分化細胞であるのか分化細胞であるのかを評価したり、共培養の際の細胞の種類ごとの細胞数をカウントしたり、撮影画像に含まれる未分化細胞と分化細胞の割合を評価したり、細胞または細胞コロニーの成長度を評価したり、または抗がん剤によるがん細胞の縮小率を評価したりすることをいう。ただし、細胞の状態の評価としては、これらに限らず、その他の評価でもよい。
【００４０】
そして、画像評価部２２は、メニスカス領域の画像と非メニスカス領域の画像とで異なる評価方法で細胞の状態を評価する。具体的には、画像評価部２２は、非メニスカス領域の画像については、その撮影画像に含まれる細胞の状態を示す特徴量を用いて評価し、メニスカス領域の画像については、画像特徴量を用いて評価する。細胞の状態を示す特徴量および画像特徴量については、後述する。
【００４１】
また、本実施形態の画像評価部２２は、ウェル内のメニスカス領域の画像の評価結果と非メニスカス領域の画像の評価結果とを統合して、そのウェルに対する評価結果を算出する。すなわちウェル単位での評価結果を算出する。このようにウェル単位（容器単位）での評価結果を算出することによって、継代または細胞の出荷の際などにおいてウェル単位で管理することができる。
【００４２】
具体的には、たとえばウェル内の各観察領域の撮影画像に含まれる分化細胞の割合と未分化細胞の割合の平均値をそれぞれ算出することによって、ウェル単位での分化細胞の割合と未分化細胞の割合を求めるようにしてもよい。
【００４３】
または、ウェル内の各観察領域の撮影画像について細胞または細胞コロニーの成長度を評価する場合には、その各観察領域の成長度の平均値をウェル単位の成長度として求めるようにしてもよい。また、ウェル内の全観察領域のうち、成長度が閾値以上である観察領域の数の割合を算出し、その割合をウェル単位の成長度として求めるようにしてもよい。もしくは、上記割合が閾値以上である場合には、ウェル単位での評価結果を「良い」とし、閾値未満である場合には、ウェル単位での評価結果を「悪い」としてもよい。または、成長度が閾値以上である観察領域の評価結果を「良い」とし、閾値未満である観察領域の評価結果を「悪い」とし、ウェル内に含まれる評価結果が「良い」の観察領域の数が、閾値以上である場合にウェル単位での評価結果を「良い」とし、閾値未満である場合にウェル単位での評価結果を「悪い」としてもよい。
【００４４】
表示制御部２３は、画像評価部２２による評価結果を表示装置３０に表示させる。具体的には、本実施形態においては、上述したように画像評価部２２においてウェル単位での評価結果が算出されるので、表示制御部２３は、そのウェル単位での評価結果を表示装置３０に表示させる。図５は、６ウェルのウェルプレートを用いた場合に、ウェル単位での分化細胞の割合と未分化細胞の割合とを算出し、統合された評価結果として表示した例である。図５の例において、上段左のウェルには、分化細胞が８０％存在し、未分化細胞が２０％存在する。上段中央のウェルには、分化細胞が７０％存在し、未分化細胞が３０％存在する。上段右のウェルには、分化細胞が６０％存在し、未分化細胞が４０％存在する。下段左のウェルには、分化細胞が６０％存在し、未分化細胞が４０％存在する。下段中央のウェルには、分化細胞が３０％存在し、未分化細胞が７０％存在する。下段右のウェルには、分化細胞が４０％存在し、未分化細胞が６０％存在する。
【００４５】
また、表示制御部２３は、観察領域毎の撮影画像を繋ぎ合わせることによって合成画像を生成し、その合成画像を表示装置３０に表示させる。
【００４６】
表示装置３０は、上述したように画像評価部２２による評価結果および表示制御部２３によって生成された合成画像を表示し、たとえば液晶ディスプレイなどを備える。また、表示装置３０をタッチパネルによって構成し、入力装置４０と兼用するようにしてもよい。
【００４７】
入力装置４０は、マウスやキーボードなどを備え、ユーザによる種々の設定入力を受け付ける。
【００４８】
次に、細胞の状態を示す特徴量および画像特徴量について説明する。細胞の状態を示す特徴量としては、個々の細胞の状態の特徴量、細胞内に含まれる核小体の特徴量、白すじの特徴量、細胞内に含まれる核の特徴量および細胞のＮＣ比の少なくとも１つを用いることができる。
【００４９】
個々の細胞の状態の特徴量としては、たとえば細胞の数、細胞の密度、細胞の増加率および細胞の円形度などがあるが、撮影画像に含まれる個々の細胞を認識し、その認識した細胞に基づいて算出される特徴量であればその他の特徴量でもよい。撮影画像に含まれる細胞の認識方法としては、たとえば細胞の画像のエッジを検出したり、パターンマッチン処理を用いて検出したり、機械学習によって生成された判別器を用いて検出したりする方法があるが、その他の公知な手法を用いることができる。なお、細胞の円形度については、未分化細胞は円形度が相対的に高くなるが、分化細胞は、たとえば細長い形状となり、円形度が相対的に低くなる。したがって、個々の細胞の円形度を算出することによって分化細胞であるか、または未分化細胞であるかを評価することができる。また、多能性幹細胞において、細胞が分化すると核内のクロマチン構造が変化し黒っぽくなるため、核を検出した後に核の輝度を評価することによって分化または未分化を評価することができる。ただし、分化細胞か未分化細胞かを評価する方法としては、これに限らず、その他の公知な手法を用いることができる。
【００５０】
また、細胞内に含まれる核または核小体の特徴量としては、たとえば核または核小体の数、核または核小体の密度および核または核小体の増加率などがあるが、撮影画像に含まれる核または核小体を認識し、その認識した核または核小体に基づいて算出される特徴量であればその他の特徴量でもよい。撮影画像に含まれる核または核小体の認識方法としては、細胞の認識方法と同様に、エッジ検出、パターンマッチングによる検出および判別器を用いた検出などを用いることができる。
【００５１】
また、白すじとは、細胞と背景間に発生する回折光による光のにじみ（ハロ）のことである。そして、白すじの特徴量としては、たとえば白すじの総面積、白すじの密度および白すじの分布状態などがあるが、撮影画像に含まれる白すじを認識し、その認識した白すじに基づいて算出される特徴量であればその他の特徴量でもよい。白すじの認識方法としては、たとえば撮影画像を２値化し、閾値処理によって白すじを抽出するようにしてもよい。または、白すじの認識方法として、パターンマッチン処理を用いて検出したり、機械学習によって生成された判別器を用いて検出したりしてもよいし、その他の公知な手法を用いてもよい。なお、白すじの特徴量については、たとえば細胞コロニー内に未分化細胞が多い状態では白すじは少ないが、分化が進み分化細胞が多くなると白すじの量が多くなる。したがって、白すじの特徴量に基づいて、細胞コロニーの分化度または未分化度、もしくは細胞コロニーの成長度などを評価することができる。
【００５２】
また、細胞のＮＣ比とは、核／細胞質面積比である。ＮＣ比については、細胞質と核のそれぞれの検出器を使用することで求めることができる。細胞質は、一般的にグレーかつフラットな見た目を有し、これに対し、核は比較的丸くかつ内部に核小体等の構造を含む。したがって、それぞれの検出器を機械学習により作成し、撮影画像に適用することによって細胞質領域と核領域とが得られる。このようにして得られた細胞質領域と核領域の面積の比を算出することによって、ＮＣ比を算出することができる。ＮＣ比は、細胞コロニー単位で算出してもよいし、予め指定された領域内でのＮＣ比を算出するようにしてもよい。
【００５３】
一方、メニスカス領域の画像を評価する際に用いられる画像特徴量とは、撮像画像自体の特徴量であって、具体的には、撮影画像の平均輝度、撮影画像の輝度の分散、撮影画像の輝度の最大値と最小値の差、撮影画像のコントラスト、撮影画像のエントロピー、撮影画像の空間周波数分布、撮影画像の方向性および撮影画像のゼルニケ特徴などを用いることができる。メニスカス領域の画像を評価する際に、画像特徴量を用いるのは、メニスカス領域の画像は、上述したようにコントラストが低いため、個々の細胞の画像または核小体の画像などの検出精度が低くなる。したがって、非メニスカス領域の画像のように個々の細胞の状態を示す特徴量を用いて評価するよりも、撮影画像自体の画像特徴量を用いて評価した方が、評価精度が向上するからである。
【００５４】
このような画像特徴量を用いて撮影画像に含まれる細胞の状態を評価する方法としては、たとえば画像特徴量とその画像特徴量に対応する評価結果との関係を予め実験などによって求めておき、撮影画像の画像特徴量と上記関係とに基づいて、評価結果を得るようにすればよい。また、画像特徴量とその画像特徴量に対応する評価結果との関係を、たとえば機械学習を用いて学習させて評価器を生成し、撮影画像の画像特徴量をその評価器に入力することによって評価結果を得るようにしてもよい。
【００５５】
次に、本実施形態の細胞画像評価システムの作用について、図６に示すフローチャートを参照しながら説明する。
【００５６】
まず、細胞および培養液が収容されたウェルプレートが顕微鏡装置１０のステージ上に設置される（Ｓ１０）。そして、ステージがＸ方向およびＹ方向に移動することによって、ウェルプレートの各ウェル内の観察領域が走査され、各観察領域の撮影画像が撮影される（Ｓ１２）。
【００５７】
そして、顕微鏡装置１０において撮影された観察領域毎の撮影画像は、細胞画像評価装置２０に順次出力され、領域判別部２１および表示制御部２３に順次入力される（Ｓ１２）。領域判別部２１は、入力された観察領域の撮影画像がメニスカス領域の画像であるか非メニスカス領域の画像であるかを判別する（Ｓ１４）。
【００５８】
そして、領域判別部２１によって、撮影画像がメニスカス領域の画像であると判別された場合には、画像評価部２２は、その撮影画像について、メニスカス領域の画像の評価方法を用いて評価する（Ｓ１６）。具体的には、その撮影画像について画像特徴量を算出し、その画像特徴量を用いて撮影画像に含まれる細胞の状態を評価する。
【００５９】
一方、領域判別部２１によって、撮影画像が非メニスカス領域の画像であると判別された場合には、画像評価部２２は、その撮影画像について、非メニスカス領域の画像の評価方法を用いて評価する（Ｓ１８）。具体的には、その撮影画像について、細胞の状態を示す特徴量を算出し、その特徴量を用いて撮影画像に含まれる細胞の状態を評価する。
【００６０】
そして、全ての観察領域が走査され、全ての観察領域の撮影画像の評価が終了するまでＳ１２〜Ｓ１８までの処理が繰り返される（Ｓ２０，ＮＯ）。
【００６１】
全ての観察領域の撮影画像の評価が終了した場合には（Ｓ２０，ＹＥＳ）、画像評価部２２は、各観察領域の撮影画像の評価結果をウェル単位で統合し、ウェル単位の評価結果を取得する（Ｓ２２）。
【００６２】
そして、表示制御部２３は、各観察画像の撮影画像を用いて合成画像を生成し、合成画像を表示装置３０に表示させ、かつウェル単位での統合評価結果を表示装置３０に表示させる（Ｓ２４）。
【００６３】
上記実施形態の細胞画像評価システムによれば、観察領域毎の撮影画像が、容器内のメニスカス領域を撮影した画像であるか非メニスカス領域を撮影した画像であるかを判別し、撮影画像に含まれる細胞の状態を評価する際、メニスカス領域の画像と非メニスカス領域の画像とで異なる評価方法で評価するようにしたので、メニスカス領域の画像が、メニスカスの影響を受けてコントラストが低い画像であったとしても、その画像に適した評価方法で評価することによって、より正確かつ、信頼性の高い評価を行うことができる。
【００６４】
なお、上記実施形態においては、画像評価部２２において、ウェル内のメニスカス領域の画像の評価結果と非メニスカス領域の画像の評価結果とを統合して、ウェル単位での評価結果を算出するようにしたが、このように統合された評価結果を算出する際、メニスカス領域の画像の評価結果と非メニスカス領域の画像の評価結果とに重み付けを付加するようにしてもよい。重み付けとしては、非メニスカス領域の画像の評価結果に付加される重み付けが、メニスカス領域画像の評価結果に付加される重み付けよりも大きくなるように設定することが好ましい。これは、非メニスカス領域の画像の方がメニスカスの影響が少なく、コントラストが高い画像であるので、評価結果の精度が高いと考えられるからである。
【００６５】
具体的には、たとえばウェル内の各観察領域の成長度の平均値をウェル単位の成長度として求める場合、メニスカス領域の観察領域の成長度に対して０．５よりも小さい重み付けを付加し、非メニスカス領域の観察領域の成長度に対して０．５以上の重み付けを付加するようにすればよい。
【００６６】
または、成長度が閾値以上である観察領域の評価結果を「良い」とし、閾値未満である観察領域の評価結果を「悪い」とする場合、メニスカス領域の観察領域の成長度に対して０．５よりも小さい重み付けを付加して「良い」または「悪い」を評価し、非メニスカス領域の観察領域の成長度に対して０．５以上の重み付けを付加して「良い」または「悪い」を評価するようにしてもよい。そして、上述したようにウェル内に含まれる評価結果が「良い」の観察領域の数が、閾値以上である場合にウェル単位での評価結果を「良い」とし、閾値未満である場合にウェル単位での評価結果を「悪い」としてもよい。
【００６７】
また、上記実施形態においては、撮影画像のコントラストなどの特徴量に基づいて、その撮影画像が、メニスカス領域の画像であるのか非メニスカス領域の画像であるのかを判別するようにしたが、判別方法としてはこれに限らず、予め設定されたウェル内における位置情報に基づいて、メニスカス領域の画像であるか非メニスカス領域の画像であるかを判別するようにしてもよい。
【００６８】
上述したようにウェル内に形成されるメニスカスの範囲は、ウェルの大きさなどによって予め分かる。したがって、撮像画像が撮影された観察領域のウェル内における位置がウェルの周辺部に該当するか否かによって、その撮像画像が、メニスカス領域の画像であるのか非メニスカス領域の画像であるのかを判別するようにしてもよい。または、上記実施形態のように撮影画像のコントラストなどの特徴量に基づいて、その撮影画像が、メニスカス領域の画像であるのか否かを判別し、メニスカス領域の画像であると判別され、かつその観察領域のウェル内における位置がウェルの周辺部に該当する場合に、メニスカス領域の画像であると判別するようにしてもよい。
【００６９】
具体的には、たとえばウェル内における観察領域の位置情報と、メニスカス領域であるか非メニスカス領域であるかを示す領域特定情報とを対応付けたテーブルなどを予め設定しておけばよい。そして、ウェル内における任意の観察領域の撮像画像を撮影した際に、上記テーブルを参照して、その観察領域の位置情報に対応付けられた領域特定情報を取得し、その領域特定情報と撮影画像とを紐づけして記憶するようにすればよい。そして、領域判別部２１によって判別を行う際には、撮影画像に紐づけされた領域特定情報を参照するようにすればよい。
【００７０】
なお、ウェル内における観察領域の位置情報については、たとえばステージの位置情報とウェル内における観察領域の位置情報との関係を予め設定しておき、ステージの位置情報に基づいて、観察領域の位置情報を取得するようにすればよい。または、ウェルプレート全体の画像を撮影し、その画像内におけるウェルの位置をエッジ検出などによって算出し、そのウェルの位置情報に基づいて、ウェル内における観察領域の位置情報を取得するようにしてもよい。
【００７１】
また、上述したように、ウェル内に形成されるメニスカスの範囲は、ウェルプレートのウェル数によって異なる。また、ウェルプレートだけでなく、その他の培養容器を用いる場合には、培養容器の種類によってメニスカスの範囲は異なる。
【００７２】
したがって、培養容器内における観察領域の位置情報と領域特定情報とを対応付けたテーブルを培養容器の種類毎に設定するようにしてもよい。そして、たとえばユーザが入力装置４０を用いて培養容器の種類の情報を設定入力し、その種類に応じたテーブルを使用するようにしてもよい。また、培養容器の種類の情報については、ユーザが設定入力するのではなく、培養容器に対してバーコードなどの識別情報を付与し、その識別情報を読み出して取得するようにしてもよい。
【００７３】
また、上述したようにウェル内における観察領域の位置情報に基づいて、メニスカス領域の画像であるのか非メニスカス領域の画像であるのかを判別し、さらに撮影画像のコントラストなどの特徴量に基づいて培養液の「波打ち」の領域を判別し、この波打ちの領域についても、メニスカス領域と同様の評価方法で評価するようにしてもよい。培養液の「波打ち」とは、培養液の表面に形成され、メニスカスとは別に、ウェル内における位置がウェルの周辺部以外の範囲である場合にも発生し得る。そして、光学的な現象としては、メニスカス領域と同様であるので、メニスカス領域と同様の評価方法で評価することによって、より適切な評価結果を得ることができる。
【符号の説明】
【００７４】
１０   顕微鏡装置
２０   細胞画像評価装置
２１   領域判別部
２２   画像評価部
２３   表示制御部
３０   表示装置
４０   入力装置
５０   ウェルプレート
５１   ウェル
Ａ     領域（観察領域）
Ｅ     走査終了点
Ｍ     メニスカス
Ｓｃ   走査軌跡を示す実線
Ｒ１   非メニスカス領域
Ｒ２   メニスカス領域
Ｓ     走査開始点
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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