(57)【要約】  この出願は、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子の発現を抑制する核酸を有効性成分として含むことを特徴とする、該遺伝子を発現する腫瘍を有する被験体を治療または予防するための医薬組成物、ならびに、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子の発現を抑制する抗腫瘍性核酸を提供する。
2018003988.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＩＮＣ００４６１遺伝子の発現を抑制する核酸を有効性成分として含むことを特徴とする、該遺伝子を発現する腫瘍を有する被験体を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項２】
前記核酸が、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子の転写体ＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、もしくはその修飾ＲＮＡ、またはアンチセンスＤＮＡ、あるいは、該ｓｉＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡをコードするＤＮＡまたは該アンチセンスＤＮＡを含むベクターであることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記核酸が、配列番号３７の前記転写体ＲＮＡ配列の１位と１５０位の間の塩基配列、７００位と１６２０位の間の塩基配列、または３０５０位と３５６０位の間の塩基配列を標的とすることを特徴とする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記核酸が標的とする塩基配列が、配列番号２５〜３４からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記核酸が、下記のｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ：
（ａ）配列番号５のアンチセンス鎖配列と配列番号６のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｂ）配列番号７のアンチセンス鎖配列と配列番号８のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｃ）配列番号９のアンチセンス鎖配列と配列番号１０のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｄ）配列番号１１のアンチセンス鎖配列と配列番号１２のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｅ）配列番号１３のアンチセンス鎖配列と配列番号１４のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｆ）配列番号１５のアンチセンス鎖配列と配列番号１６のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｇ）配列番号１７のアンチセンス鎖配列と配列番号１８のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｈ）配列番号１９のアンチセンス鎖配列と配列番号２０のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｉ）配列番号２１のアンチセンス鎖配列と配列番号２２のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、ならびに、
（ｊ）配列番号２３のアンチセンス鎖配列と配列番号２４のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
からなる群から選択される１つのｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡあるいは２つ以上のｓｉＲＮＡおよび／またはその修飾ＲＮＡの組み合わせであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記修飾ＲＮＡが、２'−Ｏ、４'−Ｃメチレンブリッジを有するロックされたＬＮＡ修飾ヌクレオチド、２'−メトキシヌクレオチド、２'−メトキシエトキシヌクレオチド、あるいはそれらの組み合わせからなる、少なくとも２つの修飾ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記腫瘍が、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、白血病、子宮頸癌およびリンパ腫からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記脳腫瘍が、膠芽腫であることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記腫瘍が早期癌であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記核酸が、ドラッグデリバリー材料に含まれることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
下記の核酸：
（ａ）配列番号５のアンチセンス鎖配列と配列番号６のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｂ）配列番号７のアンチセンス鎖配列と配列番号８のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｃ）配列番号９のアンチセンス鎖配列と配列番号１０のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｄ）配列番号１１のアンチセンス鎖配列と配列番号１２のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｅ）配列番号１３のアンチセンス鎖配列と配列番号１４のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｆ）配列番号１５のアンチセンス鎖配列と配列番号１６のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｇ）配列番号１７のアンチセンス鎖配列と配列番号１８のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｈ）配列番号１９のアンチセンス鎖配列と配列番号２０のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｉ）配列番号２１のアンチセンス鎖配列と配列番号２２のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、ならびに、
（ｊ）配列番号２３のアンチセンス鎖配列と配列番号２４のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
からなる群から選択される抗腫瘍性核酸。
【請求項１２】
前記修飾ＲＮＡが、２'−Ｏ、４'−Ｃメチレンブリッジを有するロックされたＬＮＡ修飾ヌクレオチド、２'−メトキシヌクレオチド、２'−メトキシエトキシヌクレオチド、あるいはそれらの組み合わせからなる、少なくとも２つの修飾ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の抗腫瘍性核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳腫瘍（例、膠芽腫）を含む腫瘍の治療用核酸、ならびに該核酸を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
膠芽腫は最も予後不良な悪性脳腫瘍のひとつである。膠芽腫は遺伝子変異などのゲノム異常に加えて非翻訳ＲＮＡ、ヒストン修飾、ＤＮＡメチル化などのエピゲノム異常を有しており、これらエピゲノム異常が膠芽腫の発がんや悪性化に寄与していることが示唆されている。非翻訳ＲＮＡのひとつであるｌｏｎｇ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ  （ｌｎｃＲＮＡ）による遺伝子発現の制御は細胞の分化や増殖などの様々な生命現象に深く関わっており、近年ではがんへの関与も報告されている。【０００３】
本発明者らは、生物種を越えて進化学的に遺伝子配列が保存されたｌｎｃＲＮＡは少ないが、それらのなかには重要な機能をもつ可能性が高いものが存在することに着目してきた。ｌｎｃＲＮＡは、非翻訳ＲＮＡのなかで主要なものであり２００塩基を超える長さを有しており、広範な機能、例えば転写抑制、タンパク相互作用調節などの機能を有することが知られている。【０００４】
後述するように、本発明者らは今回、ヒト神経幹細胞に比べてヒト膠芽腫細胞で高発現する、ｌｎｃＲＮＡの１種であるＬＩＮＣ００４６１を同定した。ＬＩＮＣ００４６１（別称：Ｖｉｓｃ−２、等）のノックアウトマウスでは脳の構造や機能異常を認めないことが判明しているが（非特許文献１）、脳内におけるＬＩＮＣ００４６１の機能は不明である。さらにまた、脳以外の組織については、特許文献１において、ＬＩＮＣ００４６１は関節炎の診断マーカーになりうることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＵＳ  ２０１３／０１２９６６８  Ａ１
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐ．  Ｌ．  Ｏｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ，  ２５：  ３５７２−３５８５，  ２０１５
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ある特定のｌｎｃＲＮＡ、すなわちＬＩＮＣ００４６１遺伝子、を標的として膠芽腫等の腫瘍の増殖を抑制する核酸、ならびに該核酸を含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明者らは今回、神経膠腫形成マウスモデルを用いた解析によってＣ１３００７１Ｃ０３Ｒｉｋ遺伝子（ＬＩＮＣ００４６１のオルソログ）は発癌早期より発現が上昇し、腫瘍形成期にさらに発現が上昇すること、ならびに、ヒト膠芽腫検体においてもＬＩＮＣ００４６１遺伝子は高発現していることを見出した。本発明者らは今回さらに、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子の発現を抑制する核酸の使用により腫瘍細胞の増殖が有意に抑制されること、したがってＬＩＮＣ００４６１遺伝子を標的とした核酸が膠芽腫等の腫瘍の治療に有効であることを見出した。
【０００９】
本発明は、以下の特徴を包含する。
【００１０】
（１）ＬＩＮＣ００４６１遺伝子の発現を抑制する核酸を有効性成分として含むことを特徴とする、該遺伝子を発現する腫瘍を有する被験体を治療または予防するための医薬組成物。
【００１１】
（２）前記核酸が、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子の転写体ＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、もしくはその修飾ＲＮＡ、またはアンチセンスＤＮＡ、あるいは、該ｓｉＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡをコードするＤＮＡまたは該アンチセンスＤＮＡを含むベクターであることを特徴とする、（１）に記載の医薬組成物。
【００１２】
（３）前記核酸が、配列番号３７の前記転写体ＲＮＡ配列の１位と１５０位の間の塩基配列、７００位と１６２０位の間の塩基配列、または３０５０位と３５６０位の間の塩基配列を標的とすることを特徴とする、（１）または（２）に記載の医薬組成物。
【００１３】
（４）前記核酸が標的とする塩基配列が、配列番号２５〜３４からなる群から選択されることを特徴とする、（３）に記載の医薬組成物。
【００１４】
（５）前記核酸が、下記のｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ：
（ａ）配列番号５のアンチセンス鎖配列と配列番号６のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｂ）配列番号７のアンチセンス鎖配列と配列番号８のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｃ）配列番号９のアンチセンス鎖配列と配列番号１０のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｄ）配列番号１１のアンチセンス鎖配列と配列番号１２のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｅ）配列番号１３のアンチセンス鎖配列と配列番号１４のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｆ）配列番号１５のアンチセンス鎖配列と配列番号１６のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｇ）配列番号１７のアンチセンス鎖配列と配列番号１８のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｈ）配列番号１９のアンチセンス鎖配列と配列番号２０のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｉ）配列番号２１のアンチセンス鎖配列と配列番号２２のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、ならびに、
（ｊ）配列番号２３のアンチセンス鎖配列と配列番号２４のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
からなる群から選択される１つのｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡあるいは２つ以上のｓｉＲＮＡおよび／またはその修飾ＲＮＡの組み合わせであることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
【００１５】
（６）前記修飾ＲＮＡが、２'−Ｏ、４'−Ｃメチレンブリッジを有するロックされたＬＮＡ修飾ヌクレオチド、２'−メトキシヌクレオチド、２'−メトキシエトキシヌクレオチド、あるいはそれらの組み合わせからなる、少なくとも２つの修飾ヌクレオチドを含むことを特徴とする、（２）〜（５）のいずれかに記載の医薬組成物。
【００１６】
（７）前記腫瘍が、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、白血病、子宮頸癌およびリンパ腫からなる群から選択されることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれかに記載の医薬組成物。
【００１７】
（８）前記脳腫瘍が、膠芽腫であることを特徴とする、（７）に記載の医薬組成物。
【００１８】
（９）前記腫瘍が早期癌であることを特徴とする、（１）〜（８）のいずれかに記載の医薬組成物。
【００１９】
（１０）前記核酸が、ドラッグデリバリー材料に含まれることを特徴とする、（１）〜（９）のいずれかに記載の医薬組成物。
【００２０】
（１１）下記の核酸：
（ａ）配列番号５のアンチセンス鎖配列と配列番号６のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｂ）配列番号７のアンチセンス鎖配列と配列番号８のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｃ）配列番号９のアンチセンス鎖配列と配列番号１０のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｄ）配列番号１１のアンチセンス鎖配列と配列番号１２のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｅ）配列番号１３のアンチセンス鎖配列と配列番号１４のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｆ）配列番号１５のアンチセンス鎖配列と配列番号１６のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｇ）配列番号１７のアンチセンス鎖配列と配列番号１８のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｈ）配列番号１９のアンチセンス鎖配列と配列番号２０のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
（ｉ）配列番号２１のアンチセンス鎖配列と配列番号２２のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、ならびに、
（ｊ）配列番号２３のアンチセンス鎖配列と配列番号２４のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、
からなる群から選択される抗腫瘍性核酸。
【００２１】
（１２）前記修飾ＲＮＡが、２'−Ｏ、４'−Ｃメチレンブリッジを有するロックされたＬＮＡ修飾ヌクレオチド、２'−メトキシヌクレオチド、２'−メトキシエトキシヌクレオチド、あるいはそれらの組み合わせからなる、少なくとも２つの修飾ヌクレオチドを含むことを特徴とする、（１１）に記載の抗腫瘍性核酸。
【００２２】
本発明により、膠芽腫等の腫瘍の増殖を有意に抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】この図は、神経膠腫形成マウスモデル（生後２０日齢、６０日齢、９０日齢、および１２０日齢）における経時的なＣ１３００７１Ｃ０３Ｒｉｋ（ＬＩＮＣ００４６１のオルソログ）の相対発現量を示す。縦軸は、Ｇａｐｄｈ遺伝子を内部標準としたときのＣ１３００７１Ｃ０３Ｒｉｋの発現量を示す。黒色の棒グラフは、ｐ５３−／−，Ｎｆ１−／−の遺伝子変異をもつ腫瘍細胞の発現量を、灰色の棒グラフは、遺伝子変異が野生型の正常脳細胞の発現量をそれぞれ示す。横軸は生後からの日数を示す。＊：ｐ＜０．０５、エラーバー：標準偏差。
【図２】この図は、公表されたＴＣＧＡ（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）のｅｘｏｍｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（正常大脳４症例、膠芽腫１５１症例）の結果を用いて、ＬＩＮＣ００４６１の発現量を解析した結果を示す。縦軸は相対発現量（ＲＰＫＭ値）を示す。＊：ｐ＜０．０５。
【図３】この図は、ｓｉＲＮＡであるｓｉ−ＬＩＮＣ００４６１＃１、ｓｉ−ＬＩＮＣ００４６１＃２およびｓｉ−ＬＩＮＣ００４６１＃３（後述の表１）による膠芽腫細胞株（Ｕ８７およびＵ２５１）でのＬＩＮＣ００４６１の発現抑制効果の評価（Ａ：Ｕ８７、Ｂ：Ｕ２５１）を示す。各ｓｉＲＮＡ導入４８時間後におけるＬＩＮＣ００４６１の発現量をコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＮＣ）導入時におけるＬＩＮＣ００４６１の発現量（「１」とする。）に対する相対値として示す。＊：ｐ＜０．０５、エラーバー：標準偏差。
【図４】この図は、膠芽腫細胞株Ｕ８７およびＵ２５１に対するｓｉ−ＬＩＮＣ００４６１＃１、ｓｉ−ＬＩＮＣ００４６１＃２およびｓｉ−ＬＩＮＣ００４６１＃３（後述の表１）による抗増殖効果の評価（Ａ：Ｕ８７、Ｂ：Ｕ２５１）を示す。各ｓｉＲＮＡ導入時から２４時間毎における生きた腫瘍細胞数をｓｉＲＮＡ導入時における生きた腫瘍細胞数（「１」とする。）に対する相対値（相対腫瘍細胞数）として示す。＊：ｐ＜０．０５、エラーバー：標準偏差。
【図５】この図は、脳腫瘍同所移植マウスモデルにＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマーを内包するドラッグデリバリー製剤（核酸として２５μｇ／マウス）を静脈内投与したときの、投与前（Ａ）、投与直後（Ｂ）、投与３時間後（Ｃ）、および投与２４時間後（Ｄ）、該ドラッグデリバリー製剤が脳腫瘍組織に特異的に集積することを示す。各時間のパネルにおいて、左３個体は、Ａｌｅｘａ−６４７標識したＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマー単体が投与されたマウスであり、右３個体は、Ａｌｅｘａ−６４７標識したＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマーを内包するドラッグデリバリー製剤が投与されたマウスにおける結果である。
【図６】図６Ａは、脳腫瘍同所移植マウスモデルにＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマーを内包するドラッグデリバリー製剤（核酸として２５μｇ／マウス）を３日ごとに１回の頻度で５回静脈内投与したのちのマウス脳組織をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色した結果を示す。左３個体は、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子（ｆｉｒｅｆｌｙ  ＧＬ３  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）に対するＬＮＡオリゴマーを内包したドラッグデリバリー製剤（対照）を投与したマウス脳組織であり、右３個体は、  ＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマーを内包するドラッグデリバリー製剤（本発明）を投与したマウス脳組織である。点線は腫瘍領域を示し、スケールバーは１ｍｍを示す。各脳腫瘍の体積を図６Ｂに示す。＊は、統計的有意（ｎ＝３，  ｐ＜０．０１）を示す。
【図７】この図は、脳腫瘍同所移植マウスモデルにＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマーを内包するドラッグデリバリー製剤（核酸として２５μｇ／マウス）を３日ごとに１回の頻度で５回静脈内投与したのちのマウス脳腫瘍組織におけるＬＩＮＣ００４６１の発現量を示す。ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子（ｆｉｒｅｆｌｙ  ＧＬ３  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）に対するＬＮＡオリゴマーを内包したドラッグデリバリー製剤（対照）を投与したマウス脳腫瘍組織におけるＬＩＮＣ００４６１の発現量（「１」とする。）に対する相対値として示す。＊は、統計的有意（ｎ＝３，ｐ＜０．０１）を示す。
【００２４】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１６−１３１０７３号の開示内容を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明をさらに詳細に説明する。
１．ＬＩＮＣ００４６１遺伝子の発現を抑制する核酸
本発明の有効成分は、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子の発現を抑制する核酸である。以下に説明するように、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子を発現する腫瘍に対して、上記核酸は、該遺伝子の発現を抑制し、それによって該腫瘍の増殖を抑制する効果を有する。また、本発明に関わる核酸はすべて、文献等で公知の核酸オリゴマー合成技術（例、ホスホロアミダイト法、固相合成法など）を用いて作製できる。
【００２６】
本明細書で使用する「ＬＩＮＣ００４６１遺伝子」または「ＬＩＮＣ００４６１」は、その転写後にｌｎｃＲＮＡ（ｌｏｎｇ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）となる非翻訳ＲＮＡの一種であり、ヒトでは１〜３種の変異型（ｖａｒｉａｎｔ  １，ｖａｒｉａｎｔ  ２，ｖａｒｉａｎｔ  ３）が知られており、例えばＮＣＢＩ（米国）情報によると、登録番号ＮＲ＿０２４３８４（ｖａｒｉａｎｔ  １；ｌｎｃＲＮＡの場合、配列番号３７の塩基配列）、ＮＲ＿０２４３８３（ｖａｒｉａｎｔ  ２；ｌｎｃＲＮＡの場合、配列番号３８の塩基配列）として記載される塩基配列などが報告されている。本明細書では、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子は、上記の塩基配列、或いは、これらの各塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入を含む塩基配列、或いは、上記の各塩基配列と７０％以上、８０％以上または９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上もしくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる天然バリアントである。ＬＩＮＣ００４６１はまた、ＥｙｅＬｉｎ１、Ｖｉｓｃ−１ａ、Ｖｉｓｃ−１ｂ、Ｖｉｓｃ−２などとも称されており、この遺伝子はヒト５番染色体のヌクレオチド番号８８６６６８５３．．．８８６６６９３９に存在している（ＮＣＢＩ；ＮＣ＿０００００５．１０）。前述の通り、該遺伝子の機能については、これまで十分な知見が得られていなかった。
【００２７】
本明細書中で使用される「数個」とは、２〜１０の整数、好ましくは２〜５の整数をいう。また、配列同一性は、塩基配列等の配列アラインメントをとるための公知のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ、を使用して決定されうる。
【００２８】
本発明において、腫瘍細胞内でＬＩＮＣ００４６１遺伝子の発現を抑制する核酸は、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を有する、ｓｉＲＮＡ若しくはその前駆体ＲＮＡ、またはそれらの修飾ＲＮＡ、或いは、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡまたはその前駆体ＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを包含する。上記核酸の他の例は、アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ、該アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ若しくは該アンチセンスＤＮＡを含むベクター、またはその修飾核酸である。
【００２９】
本発明における核酸は、腫瘍細胞においてＬＩＮＣ００４６１遺伝子の発現を抑制する、かつ、腫瘍の増殖を抑制するかぎり核酸の種類や核酸の配列は特定のものに限定されないが、上記被験体のＬＩＮＣ００４６１遺伝子の転写体ＲＮＡの塩基配列内の領域、例えばヒトＬＩＮＣ００４６１遺伝子の転写体ＲＮＡの塩基配列である、例えば配列番号３７の塩基配列においてヌクレオチド番号１〜１５０、７００〜１６２０または３２００〜３５６０の領域内の、あるいは配列番号３８の塩基配列においてヌクレオチド番号５００〜１４２０または３０５０〜３３６０の領域内の、連続する１８〜３０ヌクレオチド、好ましくは２０〜２５ヌクレオチド、さらに好ましくは２１〜２３ヌクレオチドからなる配列を標的（ｔａｒｇｅｔ）とすることが好ましい。さらに具体的な標的配列は、例えば、配列番号２５（配列番号３７のヌクレオチド番号８６２〜８８４または配列番号３８のヌクレオチド番号６６４〜６８６）、配列番号２６（配列番号３７の塩基番号１５９５〜１６１７または配列番号３８のヌクレオチド番号１３９３〜１４１５）、配列番号２７（配列番号３７のヌクレオチド番号７０６〜７２８または配列番号３８のヌクレオチド番号５０４〜５２６）、配列番号２８（配列番号３７のヌクレオチド番号４６〜６８）、配列番号２９（配列番号３７のヌクレオチド番号１１４〜１３６）、配列番号３０（配列番号３７のヌクレオチド番号１４２６〜１４４８または配列番号３８のヌクレオチド番号１２３４〜１２５６）、配列番号３１（配列番号３７のヌクレオチド番号３２６９〜３２９１または配列番号３８のヌクレオチド番号３０６７〜３０８９）、配列番号３２（配列番号３７のヌクレオチド番号３４１５〜３４３７または配列番号３８のヌクレオチド番号３２０３〜３２２５）、配列番号３３（配列番号３７のヌクレオチド番号３４５０〜３４７２または配列番号３８のヌクレオチド番号３２４８〜３２７０）、配列番号３４（配列番号３７のヌクレオチド番号３５３４〜３５５６または配列番号３８のヌクレオチド番号３３３２〜３３５４）などの塩基配列を含む配列であるが、これらに限定されない。
【００３０】
ＬＩＮＣ００４６１に対しＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）作用を有するｓｉＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡについて、ｓｉＲＮＡは、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子の転写体ＲＮＡの一部に相補的な１８〜２５ヌクレオチド、好ましくは２０〜２４ヌクレオチド、さらに好ましくは２１〜２３ヌクレオチドからなる、かつＲＮＡｉ作用を有する、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡである。センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの各３'末端には、２〜５ヌクレオチド、好ましくは２ヌクレオチドの突出末端（ｏｖｅｒｈａｎｇ）、例えばＵＵ、ＣＵ、ＡＣ、ＵＣ、ＧＣ（ＤＮＡの場合、ＵはＴである。）など、を有していてもよい。突出末端は、ＲＩＳＣと相互作用する可能性が指摘されている（Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒａｐｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１０  Ａｕｇ；３８（１４）：４７８８−４７９７）。
【００３１】
ＲＮＡｉ作用は、当業界で一般的に使用される意味を有しており、短い二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）がその塩基配列特異的に標的転写体ＲＮＡを分解し、その遺伝子発現を抑制する現象である。
【００３２】
上記前駆体ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡのｐｒｉＲＮＡ、ｐｒｅＲＮＡ、ｓｈＲＮＡのいずれかである。ｐｒｉＲＮＡは、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子に対する転写体ＲＮＡ配列を有する。ｐｒｅＲＮＡは、ｐｒｉＲＮＡの酵素的プロセシングにより産生されるｐｒｅｓｈＲＮＡである。ｓｈＲＮＡは、ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡの略称であり、ｐｒｅｓｈＲＮＡから酵素的に産生された、ｓｉＲＮＡと同じ配列のセンス鎖とアンチセンス鎖とのステム、ならびにヘアピンループからなる。ｓｈＲＮＡのヘアピン構造は細胞機構によってｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合し、この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列をもつ転写体ＲＮＡに結合し、それを切断する。
【００３３】
本発明の核酸は、例えば、配列番号５のアンチセンス鎖配列と配列番号６のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、配列番号７のアンチセンス鎖配列と配列番号８のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、配列番号９のアンチセンス鎖配列と配列番号１０のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、配列番号１１のアンチセンス鎖配列と配列番号１２のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、配列番号１３のアンチセンス鎖配列と配列番号１４のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、配列番号１５のアンチセンス鎖配列と配列番号１６のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、配列番号１７のアンチセンス鎖配列と配列番号１８のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、配列番号１９のアンチセンス鎖配列と配列番号２０のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、配列番号２１のアンチセンス鎖配列と配列番号２２のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡ、ならびに、配列番号２３のアンチセンス鎖配列と配列番号２４のセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡからなる群から選択されるいずれか１つのｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡあるいは２つ以上のｓｉＲＮＡおよび／またはその修飾ＲＮＡの組み合わせである（ただし、上記の配列番号５〜２４の塩基配列の各３'末端の２つのヌクレオチドはＤＮＡである。）。本発明は、これらの特定の配列を有するｓｉＲＮＡまたはその修飾ＲＮＡからなる抗腫瘍性核酸も提供する。
【００３４】
或いは、本発明の核酸は、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子の転写体ＲＮＡに対する、上記ｓｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、またはアンチセンスＤＮＡ、を含むベクターである。好ましい前駆体ＲＮＡはｓｈＲＮＡである。
【００３５】
上記ベクターは、細胞内に導入されたとき上記ＤＮＡを発現可能にする調節配列を含む、例えば、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、或いは、プラスミド、人工染色体（例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ），酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、またはマウス人工染色体（ＭＡＣ））などの非ウイルスベクターのいずれかである。好ましいベクターは、安全性の面からプラスミド、センダイウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどである。プラスミドは、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞で使用可能であり、かつ安全性が証明されているプラスミドが好ましい。具体的には、プラスミドベクターとしては、例えば特表２０１４−５０８５１５号公報に記載されるようなベクター、例えばｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬ、ｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ、ｐＴＤＴ１などの非ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されないものとする。
【００３６】
上記調節配列は、プロモーター、転写開始点、ターミネーターなどを含み、必要に応じてエンハンサー、選択マーカー配列などを含むことができる。プロモーターは、特定の宿主細胞内で上記ＤＮＡの転写開始を促進するかぎり任意の内因性若しくは外因性プロモーターを使用できるが、例えばＵ６もしくはＨ１プロモーターであり、これにより、細胞内に導入後にベクターは恒常的に発現されるし、また、娘細胞に受け継がれ、遺伝子サイレンシングの効果も受け継がれる。
【００３７】
一般にＲＮＡは、生体内で、例えば血中等でリボヌクレアーゼにより分解されやすいためにかなり不安定である。これを解消するため、本発明では、好ましくはセンス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの修飾が行われる。修飾は、少なくとも１つの、好ましくは複数のヌクレオチドの修飾、例えば、塩基の修飾、糖の修飾、リン酸ジエステル部の修飾、またはそれらの組み合わせ、並びに／或いは、環状構造（二本鎖のステムと２つのループとからなる構造）、ＤＮＡを含むキメラ構造などを含むことができる。修飾は、非限定的に以下のものが挙げられる。
【００３８】
ＲＮＡもＤＮＡもともに糖、塩基およびホスホジエステル結合からなるヌクレオチドの連鎖によって構成される核酸であり、それらの核酸の構造上の違いは、ヌクレオチド中の糖にあり、すなわち、ＲＮＡの糖はリボースであり、一方ＤＮＡの糖は２'位の水酸基が水素で置換された２'−デオキシリボースであり、またさらなる違いは塩基、すなわち、ＲＮＡの塩基はアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）から構成され、一方ＤＮＡの塩基は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）から構成されることにある。
【００３９】
バックボーンであるリン酸ジエステル部の修飾には、ホスホジエステル結合に代えて例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホロアミデート結合とする修飾による置換が含まれる。
【００４０】
上記ＲＮＡおよびＤＮＡの塩基および糖の修飾には、特表２００７−５２５１９２号公報に例示されるような、２’−デオキシ−２’−ハロ（例えばフルオロ、クロロまたはブロモ）ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−ハロ（例えばフルオロ、クロロまたはブロモ）ピリミジンヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−ハロ（例えばフルオロ、クロロまたはブロモ）シチジンヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−ハロ（例えばフルオロ、クロロまたはブロモ）ウリジンヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−ハロ（例えばフルオロ、クロロまたはブロモ）グアノシンヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド、２'−デオキシリボヌクレオチド、ロックド核酸ヌクレオチド（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）；例えば２'−Ｏ，４'−Ｃメチレンブリッジ（−Ｏ−ＣＨ２−）修飾ヌクレオチド、２'−Ｏ，４'−Ｃエチレンブリッジ（−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−）修飾ヌクレオチド、等）、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−メトキシエトキシ（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’−メトキシ（２’−ＯＭｅ）ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチドなどが挙げられる。ここで、２'−Ｏ−基は、２'−Ｓ−基で置換されてもよい。また、２'−修飾ヌクレオチドについて、上記例示に加えて、例えば特表２０１０−５０７５７９号公報に記載されるような、糖の２'位を、例えば、ハロゲン、アリル、アミノ、アジド、アセトキシ、アルキル、アルコキシ、カルボキシ、アシル、カルボニルオキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、アリール、アルケニル、アルキニル、シアノ、ＯＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｎ（Ｒｍ）−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ（Ｒｍ）−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ（Ｒｍ）−アルキニル、Ｏ−アルキレニル−Ｏ−アルキル、アルキルアリール、アラルキル、Ｏ−アルキルアリール、Ｏ−アラルキル、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）によって置換しうる。ここで、各ＲｍとＲｎは、独立的に、Ｈ、アミノ保護基、または置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである。
【００４１】
ＬＮＡ修飾ヌクレオチドは、今西武（Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｉｍａｎｉｓｈｉ）らによって開発された人工核酸（Ｍ．Ａｂｄｕｒ  Ｒａｈｍａｎ，Ｓａｙｏｒｉ  Ｓｅｋｉ，Ｓａｔｏｓｈｉ  Ｏｂｉｋａ，Ｈａｒｕｈｉｓａ  Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｋａｚｕｙｕｋｉ  Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｉｍａｎｉｓｈｉ：「Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ２'，４'−ＢＮＡ：Ａ  ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅ」Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０．４８８６−４８９６（２００８））であり、本発明のｓｉＲＮＡの塩基配列中の糖部にＬＮＡ（「ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）」とも称する。）を導入したヌクレオチドは、著しくヌクレアーゼ耐性を有するものとなる。
【００４２】
本発明の核酸はまた、ｓｉＲＮＡの塩基配列中の一部にデオキシリボヌクレオチド配列を含むＲＮＡ／ＤＮＡキメラ構造を有することができる。デオキシリボヌクレオチド配列を含むことによってリボヌクレオチド配列のみと比べてよりヌクレアーゼ耐性とすることが可能になる（例えば特許第３８０３３１８号公報）。デオキシリボヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡの塩基配列のアンチセンス鎖またはセンス鎖の全ヌクレオチド数あたり３０％以下、好ましくは２０％以下の割合で含むことができる。デオキシリボヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖およびセンス鎖の両方に含まれていてもよいし、或いはセンス鎖のみに含まれていてもよい。また、ｓｉＲＮＡの塩基配列中のデオキシリボヌクレオチドは３'側に存在することが好ましく、例えば３'末端に突出末端として２〜４つのデオキシリボヌクレオチドが連続する配列で存在してもよい。
【００４３】
上記環状構造（すなわち、二本鎖のステムと２つのループとからなる構造）を有する核酸は、いわゆるダンベル型の一本鎖ＲＮＡである。ステムは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列の互いに相補的な配列から構成される。ループは、ステムの各末端部に連結された例えば１ループあたり非相補的な約２〜約１５ヌクレオチドから構成される（例えば米国特許第５，１６８，０５３号明細書、米国特許第５，１９０，９３１号明細書、米国特許第５，１３５，９１７号明細書、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｃｌｕｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：３４０５−３４１１、および米国特許第５，０８７，６１７号明細書）。
【００４４】
上記核酸の他の例として、上記のアンチセンスＲＮＡ（若しくはアンチセンスＤＮＡ）、またはその修飾核酸などを挙げることができる。
【００４５】
アンチセンスＲＮＡ（若しくはアンチセンスＤＮＡ）は、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子の転写産物であるｌｎｃＲＮＡを標的とする一本鎖核酸である。該ｌｎｃＲＮＡを標的とする上記ｓｉＲＮＡはｌｎｃＲＮＡを分解するのに対し、アンチセンスＲＮＡ（若しくはアンチセンスＤＮＡ）は上記のｌｎｃＲＮＡ機能を抑制若しくは阻害する。生体内での安定性を高めるために、アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡは、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ構造、および／または、１若しくは複数の上記の修飾ヌクレオチドを含む修飾誘導体が好ましい。修飾ヌクレオチドの具体例は上に記載したものであり、さらに好ましい例は、ホスホロチオエート修飾と、２’−ＭＯＥヌクレオチド、２’−ＯＭｅヌクレオチドまたはＬＮＡ修飾ヌクレオチドとの組み合わせである。アンチセンスＲＮＡ（若しくはアンチセンスＤＮＡ）またはその修飾誘導体の塩基長は、通常１２〜１００ヌクレオチド、好ましくは１５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは、２０〜３０ヌクレオチドである。塩基長として１００ヌクレオチドを超える長さとすることも可能であるが、特に製造コストの面で不利となるので、上記の範囲が適当である。アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡの配列は、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子の転写体ｌｎｃＲＮＡまたはそれをコードするＤＮＡの塩基配列、例えば配列番号３７または３８のヒトＬＩＮＣ００４６１由来の配列、あるいは、これらの各塩基配列と７０％以上、８０％以上または９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上もしくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる天然バリアントであるＬＩＮＣ００４６１の塩基配列から、上記サイズの連続する塩基配列を選択し、この配列に相補的な塩基配列またはその修飾塩基配列とすることができる。標的として、上記のとおり、ヒトＬＩＮＣ００４６１遺伝子の転写体ＲＮＡの塩基配列である例えば配列番号３７の塩基配列においてヌクレオチド番号１〜１５０、７００〜１６２０または３２００〜３５６０の領域内の、あるいは配列番号３８の塩基配列においてヌクレオチド番号５００〜１４２０または３０５０〜３３６０の領域内の連続する１９〜３０ヌクレオチド、好ましくは２０〜２５ヌクレオチド、さらに好ましくは２１〜２３ヌクレオチドからなる配列を標的とすることが好ましい。具体的な標的配列は、上記のとおり、配列番号２５〜３４のいずれかのヌクレオチド配列を含む配列である。
【００４６】
２．腫瘍の治療または予防のための医薬組成物
本発明の医薬組成物は、腫瘍細胞において上記ＬＩＮＣ００４６１遺伝子の発現を抑制する、それによって腫瘍の増殖を抑制する核酸を有効成分として含むことを特徴とする。本発明の組成物は腫瘍細胞を標的とするため、腫瘍の増殖は抑制され、腫瘍は退縮されうるし、また場合により、腫瘍の転移も抑制されうる。本発明では、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子の発現はステージ１〜２の早期癌において認められる（図１）ため、早期癌に対しても有効である。このため、本発明の医薬組成物またはその有効成分である核酸を、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子を発現する腫瘍もしくは癌を有するまたは有することが疑われる被験体（例、ヒト）に投与することを含む、該腫瘍もしくは癌の治療または予防のための方法も提供される。さらにまた、本発明の有効成分である核酸を、本発明の医薬組成物の製造に使用することができる。
【００４７】
上記核酸は、それ自体を担体等とともに混合して含む組成物の形態に製剤化されてもよいし、或いは、該核酸をデリバリーシステムに組み入れるように製剤化されてもよい。
【００４８】
上記核酸の用量は、非限定的に、ヒトの場合、１回あたり、かつ成人１ｋｇ体重あたり例えば約０．０１ｍｇ〜約１，０００ｍｇであるが、一般に用量または投与量は、被験体の性別、年齢、体重、症状、重症度、副作用などを考慮して選択されるべきである。また、投与は、例えば１週間、２週間、３週間、または４週間間隔、或いは、必要であれば１か月を超える間隔で行うことができる。
【００４９】
製剤化において、核酸有効成分の他に、担体または希釈剤、並びに添加剤を混合して医薬組成物の形態としうる。必要に応じて、該医薬組成物と、他の抗癌剤（例えば化学療法剤、抗体医薬、等）および／または他の治療関連薬剤とを組み合わせた、いわゆる医薬キットとすることもできる。
【００５０】
担体または希釈剤は、製剤の形態、すなわち通常、固体製剤、半固体製剤または液体（若しくは、溶液）製剤、或いは剤型（若しくは、投与形態）、に応じて変化しうる。剤型として、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、ゲル剤等の経口投与製剤、または、注射剤、点滴剤、経粘膜投与剤（例えば、経鼻投与剤等）、経皮投与剤、リポソーム剤、経直腸投与剤（若しくは坐剤）、吸入剤、軟膏剤、ローション剤等による非経口投与剤を挙げることができる。
【００５１】
液体製剤用の希釈剤には、水性溶媒の場合には、例えば、蒸留水、滅菌水、リンゲル液、生理食塩水などが含まれる。必要に応じて、エタノールを適量混合することができる。リポソーム製剤、難水性製剤等の場合には、有機溶媒単独でまたは有機溶媒／水混合液が担体または賦形剤として使用されうる。有機溶媒の例には、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アセトニトリル、アセトン、ケトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール、カカオ脂や大豆油などの油脂、並びにこれらの組み合わせが含まれる。
【００５２】
固体製剤用の担体または賦形剤の例は、マルトース、ラクトース、スクロース、デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、等を含む。
【００５３】
添加剤には、製薬上許容されうる、例えば、賦形剤、増量剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、乳化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、等が挙げられる。
【００５４】
投与経路は、例えば、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、経肺投与、組織内投与、経皮投与、経粘膜投与、直腸内投与、腹腔内投与、脳内投与などを挙げることができる。それらの中で、特に静脈内投与、経皮投与、経粘膜投与が好ましい。
【００５５】
本発明の核酸を生体内のヌクレアーゼから保護するために、例えばリポソーム内に該核酸を封入することができる。リポソームは、通常、カチオン性リポソームが使用される（Ｙ．ＴＡＫＡＨＡＳＨＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ  １２７（１０）１５２５―１５３１（２００７））。カチオン性リポソームは陽性に荷電しており、陰性に荷電した細胞膜と静電気的に結合しやすく、受動的に細胞膜に結合したリポソーム複合体は、エンドサイトーシスを介して細胞質内に取り込まれ、エンドゾームから抜け出して細胞質内に放出されると考えられている。また、ナノサイズのポリマーミセルタイプドラッグデリバリー材料などの非リポソームドラッグデリバリー材料に本発明の核酸を含有若しくは内包させてもよい（再表２００７／０９９６６０、再表２００７／０９９６６１、再表２００９／１１３６４５、ＷＯ２０１３／１６２０４１、再表２０１０／０９３０３６、再表２０１２／００５３７６）。
【００５６】
本発明はさらに、抗癌剤としての上記組成物を被験体に投与することを含む、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子を正常組織と比べてより高発現する腫瘍を有する被験体を治療するための方法を提供する。
【００５７】
本明細書で使用される「被験体」は、ヒト、ペット動物（イヌ、ネコなど）、動物園で飼育される動物などを含む哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【００５８】
本発明によって治療しうる上記腫瘍は、ＬＩＮＣ００４６１遺伝子を発現する悪性腫瘍、例えば、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、白血病、子宮頸癌およびリンパ腫など、好ましくは脳腫瘍（例えば膠芽腫）であるが、これらの腫瘍に限定されない。
【００５９】
例えば膠芽腫などの脳腫瘍の細胞での上記核酸の使用により優れた細胞増殖抑制効果が確認されたことから、本発明の核酸を有効成分とする組成物は、腫瘍細胞を標的とする抗癌剤としても優れたものであることが判明した。
【００６０】
組成物、被験体、投与量、投与経路、投与回数などは、上で記載したとおりである。
【００６１】
本発明の組成物は、化学療法剤、医薬抗体、免疫チェックポイント阻害剤などの他の癌治療剤の投与と組み合わせて被験体に投与することができる。該組成物の投与は、化学療法剤、医薬抗体、免疫チェックポイント阻害剤などの他の癌治療剤の投与の前に、同時に、または後に行うことができる。
【００６２】
化学療法剤の例は、非限定的に、特表２０１４−５０８５１５号公報に記載されるような抗癌剤、例えば、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、ランプトテシン、トポテカン、テニポシド、マイトキサントロン、等）、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、シスプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、コランブシル、ブスルファン、チオテパ、カルムスチン、ロムスチン、カルボプラチン、ダカルバジン、プロカルバジン、等）、ＤＮＡ鎖切断誘発剤（例えば、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、等）、微小管阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、等）、抗代謝剤（例えば、シタラビン、メトトレキセート、ヒドロキシウレア、５−フルオロウラシル、フロックスウリジン、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、フルダラビン、ペントスタチン、クロロデオキシアデノシン、等）、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、エピポフィロトキシン、テモゾロマイドなどである。
【００６３】
医薬抗体の例は、非限定的に、トラスツズマブ、ベバシツズマブ、パニツムマブ、セツキマブ、リツキマブ、モガムリズマブを含む種々の市販抗体および開発・上市される抗体である。
【００６４】
免疫チェックポイント阻害剤は、癌細胞が免疫細胞からの攻撃を回避することを抑制することによって癌細胞に対する免疫細胞の本来の攻撃力を回復するための薬剤であり、例えばＰＤ−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ−１）やＰＤ−Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ  １）に対する抗体（例えばニボルマブ、ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、等 ）などを包含する。
【００６５】
上記薬剤の投与量は、被験体の性別、年齢、体重、症状、重症度、副作用などを考慮して選択されるか、或いは、臨床現場で実際に使用される範囲の用量である。
【実施例】
【００６６】
以下の実施例を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は該実施例によって制限されないものとする。【００６７】
［実施例１］
＜神経膠腫形成マウスモデルにおけるＣ１３００７１Ｃ０３Ｒｉｋ発現の継時的変化＞
公共のデータベース（ＧＥＮＣＯＤＥ）に登録されている１５，８７６のｌｎｃＲＮＡからヒトとマウスで保存された塩基配列（相同性，＞８０％、塩基長，＞２００ｂｐ）を有する１３４のｌｎｃＲＮＡを同定した。さらにヒト膠芽腫細胞とヒト神経幹細胞のＲＮＡシークエンシングの結果を照らし合わせて、膠芽腫細胞で高発現するＬＩＮＣ００４６１を同定した。なお、Ｃ１３００７１Ｃ０３Ｒｉｋは、マウス由来の、ＬＩＮＣ００４６１（ヒト）のオーソログである。【００６８】
次に、本発明者らは、神経膠腫を自然発生する遺伝子改変マウスモデル（ｐ５３−／−，Ｎｆ１−／−）を用いて以下の実験を行った（Ｚｏｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ，  ２０１１,  １４６：  ２０９−２２１）。【００６９】
神経膠腫マウスモデルは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより購入した３系統の遺伝子変異マウス（＃１７５３０，（ＳＴＯＣＫ  Ｉｉｓ２ｔｍ１（ＡＣＴＢ−ｔｄＴｏｍａｔｏ，−ＥＧＦＰ）ＬｕｏＴｒｐ５３ｔｍ１ＴｙｊＮｆ１ｔｍ１Ｐａｒ／Ｊ）、＃４６００，（ＦＶＢ−Ｔｇ（ＧＦＡＰ−ｃｒｅ）２５ＭｅｓＪ）、＃１３７４９，（ＳＴＯＣＫ  Ｉｉｓ２ｔｍ１（ＡＣＴＢ−ＥＧＦＰ，−ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｌｕｏ／Ｊ）を交配し、作製した。【００７０】
生後２０日、６０日、９０日、１２０日に神経膠腫形成マウスモデルの大脳を摘出した。１個体の大脳に対してＥａｒｌｅ’ｓ  １０×ＢＳＳ１ｍｌ、ＥＤＴＡ（０．５Ｍ）１０μｌ、ＨＥＰＥＳ１００μｌ、ＮａＨＣＯ３（１．０Ｍ）２６０μｌ、Ｄ（＋）ｇｌｕｃｏｓｅ（×２０）５００μｌ、Ｌ−システイン（１６ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ、ＰＡＰＡＩＮ１５０μｌ、ＤＮａｓｅ（５０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌの混合液を用いて個々の細胞に分離した。その後、セルソーター（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩ）を用いてＧＦＰ陽性細胞（腫瘍細胞）のみ選別し、回収した。【００７１】
Ｔｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ  ｂｙ  ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ＃１５５９６０１８）を用いて、回収した腫瘍細胞からＲＮＡを抽出し、さらにＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ社（京都、日本国）；製品コードＲＲ０３６Ａ）を用い、添付プロトコールに従って、ｃＤＮＡを作製した。【００７２】
以下のプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＴＭ、  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を行い、Ｇａｐｄｈ遺伝子とＣ１３００７１Ｃ０３Ｒｉｋ遺伝子の発現量を計測した。
Ｇａｐｄｈプライマー配列：
Gapdh-Forward    CGTCCCGTAGACAAAATGGT（配列番号１）
Gapdh-Reverse    GAATTTGCCGTGAGTGGAGT（配列番号２）
Ｃ１３００７１Ｃ０３Ｒｉｋプライマー配列：
C130071C03Rik-Forward    TGACACTTCAAAGAAGCATAAAATG（配列番号３）
C130071C03Rik-Reverse    TGTGAATGTTTTAAGGGAGATCCT（配列番号４）【００７３】
ｐ５３，  Ｎｆ１に遺伝子変異のない野生型のマウスでは大脳を摘出後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社；Ｃａｔ  Ｎｏ．／ＩＤ：７４１０４）を用いて添付プロトコールに従ってＲＮＡを抽出した。【００７４】
Ｇａｐｄｈ遺伝子を内部標準とし、ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて経時的なＣ１３００７１Ｃ０３Ｒｉｋの発現量を計測した結果、Ｃ１３００７１Ｃ０３Ｒｉｋは発がん早期より発現が上昇しており、特に腫瘍形成期（生後９０日）には正常の１０倍以上の発現上昇が認められた（図１）。【００７５】
［実施例２］
＜ヒト膠芽腫患者大脳におけるＬＩＮＣ００４６１発現量の解析＞
ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）データベースから膠芽腫１５１例と正常大脳４例におけるＬＩＮＣ００４６１のデータを入手し、ＬＩＮＣ００４６１の発現について解析した。【００７６】
その結果、ヒト膠芽腫検体においてもＬＩＮＣ００４６１が高発現していることを確認した（図２）。また、ＬＩＮＣ００４６１は膠芽腫形成に関わる可能性が推定された。【００７７】
［実施例３］
＜ＬＩＮＣ００４６１の発現を抑制するｓｉＲＮＡ＞
本発明者らは、ＬＩＮＣ００４６１の発現を抑制するｓｉＲＮＡを３種類作製した。ｓｉＲＮＡの作製にはｓｉＤｉｒｅｃｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  （ｈｔｔｐ：／／ｓｉｄｉｒｅｃｔ２．ｒｎａｉ．ｊｐ／）を用いた。ＬＩＮＣ００４６１のＲＮＡ配列（ＲｅｆＳｅｑ  ＮＲ＿０２４３８４）に対する標的配列の検索を行い、３種類のｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＬＩＮＣ００４６１  ＃１〜＃１０；北海道システムサイエンス社（札幌、日本国）に委託）を作製した。ｓｉＲＮＡの配列を表１に示す。すべてのｓｉＲＮＡについて３'末端の２塩基をＤＮＡとして合成した。
【表１】
2018003988.tif 000003
【００７８】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（ライフテクノロジーズ社）を用いて添付プロトコールに従い、各ｓｉＲＮＡ（終濃度５０ｎＭ）を膠芽腫細胞株（Ｕ８７、Ｕ２５１、各初期細胞数５×１０４）へ導入した。コントロールｓｉＲＮＡはＳｉｌｅｎｃｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃１  ｓｉＲＮＡ（ライフテクノロジーズ社；カタログ番号４３９０８４３）を用いた。ｓｉＲＮＡ導入４８時間後にＧＡＰＤＨ遺伝子を内部標準とし、コントロールｓｉＲＮＡに対するＬＩＮＣ００４６１の発現量をｑＲＴ−ＰＣＲにて定量し、３種類のｓｉＲＮＡのＬＩＮＣ００４６１に対する発現抑制効果を確認した（図３）。【００７９】
Ｈｕｍａｎ  ＧＡＰＤ  （ＧＡＰＤＨ）  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌプライマー（カタログ番号４３５２９３４Ｅ）はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより購入し、また、ＬＩＮＣ００４６１の発現量を定量するためのプライマーとして以下のものを使用した。
プライマー配列：
LINC00461-Forward    CGTGCTGTGACTTTGGATCT（配列番号35）
LINC00461-Reverse    TGCTTCTTTGCAGTCTCATTTG（配列番号36）【００８０】
[実施例４]
＜Ｕ８７およびＵ２５１に対するｓｉＲＮＡによる抗増殖効果の評価＞
９６ウエルプレート上の膠芽腫細胞株（Ｕ８７、Ｕ２５１；各初期細胞数５×１０３）にｓｉＲＮＡ（終濃度５０ｎＭ）を導入した。導入後、２４、４８、７２時間後にそれぞれｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（同仁化学研究所（熊本、日本国）；製品コードＣＫ０４）を各ウェルに１０μｌずつ添加し、２時間後にマイクロプレートリーダー（ｖｅｒｓａＭＡＸ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。【００８１】
その結果、膠芽腫細胞内のＬＩＮＣ００４６１の発現抑制によって有意に膠芽腫細胞の増殖が悪化することが確認された（図４）。【００８２】
［実施例５］
＜脳腫瘍同所移植マウスモデルに対するＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマーを含むドラッグデリバリー製剤による抗腫瘍効果＞
脳腫瘍同所移植マウスモデルとして免疫不全マウス（ＢＬＡＢ／ｃ  ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕ；日本エスエルシー株式会社（静岡、日本国））の脳に膠芽腫細胞株Ｕ８７を同所移植し、移植１４日後の脳腫瘍が生着したマウスを作製した。【００８３】
マウス個体レベルで脳へのＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマーの集積を確認するため、ドラッグデリバリー材料（ナノサイズのポリマーミセルタイプ（ポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロックコポリマー）；Ｋ．  Ｏｓａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  （２００９）  ６，  Ｓ３２５−Ｓ３３９; Ｍｉｕｒａ，  Ｙ． ｅｔ  ａｌ． Ｃｙｃｌｉｃ  ＲＧＤ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｌａｔｉｎｕｍ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇｓ  ｔｏ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｂａｒｒｉｅｒ． ＡＣＳ  ｎａｎｏ ７，  ８５８３-８５９２  （２０１３））に内包するＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマー（５'側のＡＧＴおよび３'側のＣＴＴがロックド核酸であるアンチセンスＤＮＡ；5’-AGTTTATTCCGAACTTTTCTT-3’（配列番号３９））を蛍光物質（Ａｌｅｘａ−６４７）で標識した。なお比較解析としてＡｌｅｘａ−６４７標識したＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマー単体を用いた。【００８４】
ＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマーを内包するドラッグデリバリー製剤及びＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマー単体を脳腫瘍同所移植マウス（２５μｇ／マウス）に静脈内投与後、蛍光強度をＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）によって測定した結果、  ＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマーを内包したドラッグデリバリー製剤が脳腫瘍部に特異的に集積していることを確認した（図５）。【００８５】
次に、上記脳腫瘍同所移植マウス（膠芽腫細胞株Ｕ８７を移植１４日後のマウス）に対して、ＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマーを内包するドラッグデリバリー製剤を継続的に静脈内投与し（３日ごとに一度投与（２５μｇ／マウス））、抗腫瘍効果を評価した。なお比較解析としてＦｉｒｅｆｌｙ  ＧＬ３  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子に対するＬＮＡオリゴマー（５'側のＴＣＧおよび３'側のＧＴＴがロックド核酸であるアンチセンスＤＮＡ；5’-TCGAAGTACTCAGCGTAAGTT-3’（配列番号４０））を内包したドラッグデリバリー製剤を投与したマウスを用いた。投与開始から１５日後（この間に合計５回の投与を行った。）にマウス脳を摘出し、脳組織をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色によって観察した結果、ＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマーを内包したドラッグデリバリー製剤の投与により腫瘍の著しい縮小を認めた（図６）。また、マウス脳腫瘍組織よりＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲにてＬＩＮＣ００４６１の発現量を定量し、ＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマーを内包するドラッグデリバリー製剤に対する発現抑制効果を確認した（図７）。【００８６】
以上の結果より、ＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマーを内包するドラッグデリバリー製剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏで脳腫瘍に特異的に集積し、強い抗腫瘍作用を示すことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明により、ｓｉＲＮＡを用いて腫瘍細胞内のＬＩＮＣ００４６１の発現を抑制することによって膠芽腫等の腫瘍の増殖抑制効果が認められたことから、ＬＩＮＣ００４６１を標的とする核酸創薬が膠芽腫等の腫瘍の治療または予防のために有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００８８】
配列番号１〜４：プライマー
配列番号５〜２４：ヒトＬＩＮＣ００４６１のｓｉＲＮＡ
配列番号３５〜３６：プライマー
配列番号３９：ＬＩＮＣ００４６１−ＬＮＡオリゴマー
配列番号４０：Ｆｉｒｅｆｌｙ  ＧＬ３  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子に対するＬＮＡオリゴマー【００８９】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2018003988.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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