(57)【要約】  本発明は、ジカウイルスを高感度且つ迅速に検出できる方法を提供することを目的とし、具体的には、ジカウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、LAMP法によりジカウイルスに特異的な塩基配列を増幅することを含む、ジカウイルスの検出方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(d)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、ジカウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(a) 5'-TTGACCAGGTAGTTCTCCCAGTATGGCCAATGCCATTTGTTC-3'(配列番号１)
(b) 5'-AGGGAGAATGGATGACCACTGACTCCTCAATCCACACTCTGT-3'(配列番号２)
(c) 5'-CAGAAGGGACCTCCGACT-3'(配列番号３)
(d) 5'-CGTAACTGGGGTCTTGTCTT-3'(配列番号４)
【請求項２】
以下の(e)及び/又は(f)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項１記載のプライマーセット。
(e) 5'-TGGAACCCAGTCAACTG-3'(配列番号５)
(f) 5'-AGACATGCTTGTGGTGT-3'(配列番号６)
【請求項３】
以下の(g)及び/又は(h)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項１記載のプライマーセット。
(g) 5'-CCCAGTCAACTGGCACAG-3'(配列番号７)
(h) 5'-CATGCTTGTGGTGTG-3'(配列番号８)
【請求項４】
以下の(j)〜(m)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、ジカウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(j) 5'-TGGCCTTTCCAAATTCCCCTTGCTGAGAGGAGAGTGCCAGAG-3'(配列番号１０)
(k) 5'-TCTGGTATATGTGGCTAGGGGCCCCATCCAGTGATCCTCGTT-3'(配列番号１１)
(l) 5'-AGTGGACAAGGAAAGAGAGC-3'(配列番号１２)
(m) 5'-CACCACCTCCTGAGTTCTC-3'(配列番号１３)
【請求項５】
以下の(n)及び/又は(o)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項４記載のプライマーセット。
(n) 5'-AGATGGAGCTTGTTGAAGTG-3'(配列番号１４)
(o) 5'-CTCTCCAGGGGCGGGATGGA-3'(配列番号１５)
【請求項６】
以下の(q)〜(t)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、ジカウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(q) 5'-AGGGTTTCCACTCTTGTGTGTCCACATGCCCTCAGGTTCTT-3'(配列番号１７)
(r) 5'-AGTTCCGTTTTGCTCCCACCCACAATGGACCTCCCGTC-3'(配列番号１８)
(s) 5'-TTGCGTTGTGAAGCCAATT-3'(配列番号１９)
(t) 5'-CCGGCCAATCAGTTCATCT-3'(配列番号２０)
【請求項７】
以下の(u)及び/又は(v)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項６記載のプライマーセット。
(u) 5'-CTTTTTCCCATCATGTTGTACACAC-3'(配列番号２１)
(v) 5'-TAGAGTTCGAAGCCCTTGGATTCT-3'(配列番号２２)
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載のプライマーセットを含む、ジカウイルス検出又はジカウイルス感染症診断用キット。
【請求項９】
蛍光標識プローブをさらに含む、請求項８記載のキット。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(i)のオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、請求項９記載のキット。
(i) 5'-TGGAACCCAGTCAACTGGCACAGATGAAC-3'(配列番号９)
【請求項１１】
請求項４又は５記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(p)のオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、請求項９記載のキット。
(p) 5'-TAGATTTCTAGAGTTCGAAGCCCTTGGATTC-3'(配列番号１６)
【請求項１２】
請求項６又は７記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(w)のオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、請求項９記載のキット。
(w) 5'-CTTCCTAACTTTTCCCATATCATTCAAGAACC-3'(配列番号２３)
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項記載のプライマーセット又は請求項８〜１２のいずれか１項記載のキットを用いて、ジカウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行う工程を含む、ジカウイルスの検出方法。
【請求項１４】
ジカウイルスの標的核酸領域の増幅反応がLAMP法である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項記載のプライマーセット又は請求項８〜１２のいずれか１項記載のキットを用いて、ジカウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、ジカウイルス感染の有無を検査する工程を含む、ジカウイルス感染症の検査方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジカウイルスの検出方法に関し、さらに詳しくは遺伝子の、高感度且つ迅速な検出法を利用したジカウイルス感染症の診断方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ジカウイルスは、フラビウイルス科フラビウイルス属のウイルスであり、1本鎖RNA＋鎖をウイルスゲノムとして有するRNAウイルスである。ジカウイルスに感染したヒトは、例えば熱(ジカ熱)、頭痛、関節痛、筋痛症、倦怠感、食欲不振、発疹、無力症、後眼窩痛、浮腫、リンパ節症、下痢等といったインフルエンザ様の症状を発症する。また、ジカウイルス感染症自体は致死率の低い感染症であるが、妊婦が感染すると胎児や新生児の小頭症の発症の原因となることが報告されている。2016年リオデジャネイロオリンピックの開催地であるブラジルをはじめ、パラグアイ、コロンビア等の南米大陸、メキシコ、エルサルバドル等の中米で流行が確認されている。その地域を訪問した人が帰国した後に発症したケースが欧米など世界各地で確認されていることから世界的な流行が懸念されているため、ワクチンや効率的なジカウイルスの検出方法の開発が望まれている。【０００３】
非特許文献１及び２は、一段階(One-step)RT-PCRを用いてジカウイルスを検出する方法を開示する。しかしながら、さらに、ジカウイルスを高感度且つ迅速に検出できる検査法が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Faye O.ら, Journal of Clinical Virology, 2008年, Vol. 43, pp. 96-101
【非特許文献２】Balm M.N.D.ら, Journal of Medical Virology, 2012年, Vol. 84, pp. 1501-1505
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ジカウイルスを高感度且つ迅速に検出できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ジカウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)法によりジカウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、ジカウイルスを高感度且つ迅速に検出できることを見出し、本発明を完成した。【０００７】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）以下の(a)〜(d)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、ジカウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(a) 5'-TTGACCAGGTAGTTCTCCCAGTATGGCCAATGCCATTTGTTC-3'(配列番号１)
(b) 5'-AGGGAGAATGGATGACCACTGACTCCTCAATCCACACTCTGT-3'(配列番号２)
(c) 5'-CAGAAGGGACCTCCGACT-3'(配列番号３)
(d) 5'-CGTAACTGGGGTCTTGTCTT-3'(配列番号４)【０００８】
（２）以下の(e)及び/又は(f)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、（１）記載のプライマーセット。
(e) 5'-TGGAACCCAGTCAACTG-3'(配列番号５)
(f) 5'-AGACATGCTTGTGGTGT-3'(配列番号６)【０００９】
（３）以下の(g)及び/又は(h)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、（１）記載のプライマーセット。【００１０】
(g) 5'-CCCAGTCAACTGGCACAG-3'(配列番号７)
(h) 5'-CATGCTTGTGGTGTG-3'(配列番号８)【００１１】
（４）以下の(j)〜(m)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、ジカウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(j) 5'-TGGCCTTTCCAAATTCCCCTTGCTGAGAGGAGAGTGCCAGAG-3'(配列番号１０)
(k) 5'-TCTGGTATATGTGGCTAGGGGCCCCATCCAGTGATCCTCGTT-3'(配列番号１１)
(l) 5'-AGTGGACAAGGAAAGAGAGC-3'(配列番号１２)
(m) 5'-CACCACCTCCTGAGTTCTC-3'(配列番号１３)【００１２】
（５）以下の(n)及び/又は(o)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、（４）記載のプライマーセット。
(n) 5'-AGATGGAGCTTGTTGAAGTG-3'(配列番号１４)
(o) 5'-CTCTCCAGGGGCGGGATGGA-3'(配列番号１５)【００１３】
（６）以下の(q)〜(t)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、ジカウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(q) 5'-AGGGTTTCCACTCTTGTGTGTCCACATGCCCTCAGGTTCTT-3'(配列番号１７)
(r) 5'-AGTTCCGTTTTGCTCCCACCCACAATGGACCTCCCGTC-3'(配列番号１８)
(s) 5'-TTGCGTTGTGAAGCCAATT-3'(配列番号１９)
(t) 5'-CCGGCCAATCAGTTCATCT-3'(配列番号２０)【００１４】
（７）以下の(u)及び/又は(v)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、（６）記載のプライマーセット。
(u) 5'-CTTTTTCCCATCATGTTGTACACAC-3'(配列番号２１)
(v) 5'-TAGAGTTCGAAGCCCTTGGATTCT-3'(配列番号２２)【００１５】
（８）（１）〜（７）のいずれか１記載のプライマーセットを含む、ジカウイルス検出又はジカウイルス感染症診断用キット。【００１６】
（９）蛍光標識プローブをさらに含む、（８）記載のキット。【００１７】
（１０）（１）〜（３）のいずれか１記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(i)のオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、（９）記載のキット。
(i) 5'-TGGAACCCAGTCAACTGGCACAGATGAAC-3'(配列番号９)【００１８】
（１１）（４）又は（５）記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(p)のオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、（９）記載のキット。
(p) 5'-TAGATTTCTAGAGTTCGAAGCCCTTGGATTC-3'(配列番号１６)【００１９】
（１２）（６）又は（７）記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(w)のオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、（９）記載のキット。
(w) 5'-CTTCCTAACTTTTCCCATATCATTCAAGAACC-3'(配列番号２３)【００２０】
（１３）（１）〜（７）のいずれか１記載のプライマーセット又は（８）〜（１２）のいずれか１記載のキットを用いて、ジカウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行う工程を含む、ジカウイルスの検出方法。【００２１】
（１４）ジカウイルスの標的核酸領域の増幅反応がLAMP法である、（１３）記載の方法。【００２２】
（１５）（１）〜（７）のいずれか１記載のプライマーセット又は（８）〜（１２）のいずれか１記載のキットを用いて、ジカウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、ジカウイルス感染の有無を検査する工程を含む、ジカウイルス感染症の検査方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、ジカウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、LAMP法によりジカウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、ジカウイルスを高感度且つ迅速に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１におけるプライマーセット(1)を用いたPCR法のリアルタイム蛍光測定の増幅曲線を示す。
【図２】実施例１におけるプライマーセット(2)を用いたPCR法のリアルタイム蛍光測定の増幅曲線を示す。
【図３】実施例１におけるプライマーセット(3)を用いたPCR法のリアルタイム蛍光測定の増幅曲線を示す。
【図４】実施例１におけるプライマーセット(1)を用いたLAMP法のリアルタイム蛍光測定の増幅曲線を示す。
【図５】実施例１におけるプライマーセット(2)を用いたLAMP法のリアルタイム蛍光測定の増幅曲線を示す。
【図６】実施例１におけるプライマーセット(3)を用いたLAMP法のリアルタイム蛍光測定の増幅曲線を示す。
【図７】実施例１におけるプライマーセット(4)を用いたLAMP法のリアルタイム蛍光測定の増幅曲線を示す。
【図８】実施例１におけるプライマーセット(5)を用いたLAMP法のリアルタイム蛍光測定の増幅曲線を示す。
【図９】実施例１におけるプライマーセット(6)を用いたLAMP法のリアルタイム蛍光測定の増幅曲線を示す。
【図１０】実施例１におけるプライマーセット(7)を用いたLAMP法のリアルタイム蛍光測定の増幅曲線を示す。
【図１１】表１で示したリアルタイム蛍光検出の増幅物を用いて電気泳動法によるPCR法の検出感度と特異性を示す写真である。レーン1と11はマーカー(下から100bp、200bp、300bp、400bpと続き、色のバンドが濃いところが500bpである。)であり、レーン2はプライマーセット(1)の10000コピー/テストであり、レーン3はプライマーセット(1)の100コピー/テストであり、レーン4はプライマーセット(1)の0コピー/テストであり、レーン5はプライマーセット(2)の10000コピー/テストであり、レーン6はプライマーセット(2)の100コピー/テストであり、レーン7はプライマーセット(2)の0コピー/テストであり、レーン8はプライマーセット(3)の10000コピー/テストであり、レーン9はプライマーセット(3)の100コピー/テストであり、レーン10はプライマーセット(3)の0コピー/テストである。
【図１２】表２で示したリアルタイム蛍光検出の増幅物を用いて電気泳動法によるLAMP法の検出感度と特異性を示す写真である。レーン1と14はマーカー(下から100bp、200bp、300bp、400bpと続き、色のバンドが濃いところが500bpである。)であり、レーン2はプライマーセット(4)の10000コピー/テストであり、レーン3はプライマーセット(4)の100コピー/テストであり、レーン4はプライマーセット(4)の0コピー/テストであり、レーン5はプライマーセット(5)の10000コピー/テストであり、レーン6はプライマーセット(5)の1000コピー/テストであり、レーン7はプライマーセット(5)の0コピー/テストであり、レーン8はプライマーセット(6)の10000コピー/テストであり、レーン9はプライマーセット(6)の100コピー/テストであり、レーン10はプライマーセット(6)の0コピー/テストであり、レーン11はプライマーセット(7)の10000コピー/テストであり、レーン12はプライマーセット(7)の100コピー/テストであり、レーン13はプライマーセット(7)の0コピー/テストである。
【図１３】実施例２におけるプライマーセット(4)を用いたLAMP法のリアルタイム濁度測定の増幅曲線を示す。
【図１４】実施例２におけるプライマーセット(5)を用いたLAMP法のリアルタイム濁度測定の増幅曲線を示す。
【図１５】実施例２におけるプライマーセット(6)を用いたLAMP法のリアルタイム濁度測定の増幅曲線を示す。
【図１６】実施例２におけるプライマーセット(7)を用いたLAMP法のリアルタイム濁度測定の増幅曲線を示す。
【図１７】実施例３におけるプライマーセット(4)を用いたLAMP法のQProbeを用いたリアルタイム蛍光測定の消光曲線を示す。
【図１８】実施例３におけるプライマーセット(5)を用いたLAMP法のQProbeを用いたリアルタイム蛍光測定の消光曲線を示す。
【図１９】実施例３におけるプライマーセット(6)を用いたLAMP法のQProbeを用いたリアルタイム蛍光測定の消光曲線を示す。
【図２０】実施例３におけるプライマーセット(7)を用いたLAMP法のQProbeを用いたリアルタイム蛍光測定の消光曲線を示す。
【図２１】実施例４におけるプライマーセット(4)を用いたLAMP法のQProbeを用いたリアルタイム蛍光測定の消光曲線を示す。
【図２２】実施例４におけるプライマーセット(5)を用いたLAMP法のQProbeを用いたリアルタイム蛍光測定の消光曲線を示す。
【図２３】実施例４におけるプライマーセット(6)を用いたLAMP法のQProbeを用いたリアルタイム蛍光測定の消光曲線を示す。
【図２４】実施例４におけるプライマーセット(7)を用いたLAMP法のQProbeを用いたリアルタイム蛍光測定の消光曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２６】
本発明に係るプライマーセットは、ジカウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを含む、LAMP法によりジカウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットである。
【００２７】
本発明に係るプライマーセットによれば、被験体由来のサンプル中のジカウイルスを高感度且つ迅速に検出することができる。
【００２８】
本発明において使用されるサンプルとしては、ジカウイルス感染が疑われるヒト又は他の動物の生体由来のサンプル、例えば喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、唾液、血液、血清、血漿、髄液、尿、精液および羊水等の体液、糞便、組織等が挙げられる。また、感染実験等に用いられた細胞やその培養液、あるいは生体由来の検体や培養細胞等から分離したウイルスを含む検体等もサンプルとなりうる。これらのサンプルは分離、抽出、濃縮、精製等の前処理を行っても良い。
【００２９】
本発明における核酸増幅は、納富らが開発した、PCR法で不可欠とされる温度制御が不要な核酸増幅法：LAMP法と呼ばれるループ媒介等温増幅法(国際公開第00/28082号パンフレット)で達成することができる。当該方法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の3'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とすると共に、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、LAMP法では、プライマーの3'末端が常にサンプルに由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能するため、その結果として、高感度に且つ特異性の高い核酸増幅反応を可能としている。
【００３０】
LAMP反応で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の計6領域、すなわち3'末端側からF3c、F2c、F1cという領域と、5'末端側からB3、B2、B1という領域の塩基配列を認識する少なくとも4種類のプライマーであって、各々インナープライマーF(FIP)及びB(BIP)とアウタープライマーF(F3)及びB(B3)と呼ぶ。また、F1c、F2c、F3cの相補配列をそれぞれF1、F2、F3、またB1、B2、B3の相補鎖をB1c、B2c、B3cと呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、且つ合成起点を与える塩基配列を3'末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を5'末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「F2より選ばれた塩基配列」及び「F1cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーF(FIP)、そして「B2より選ばれた塩基配列」と「B1cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーB(BIP)と呼ぶ。一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の3'末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識し、且つ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「F3より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーF(F3)、「B3より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーB(B3)と呼ぶ。ここで、各プライマーにおけるFとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方、Bとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示である。ここで、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、10塩基以上、好ましくは15塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでも良く、各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。
【００３１】
LAMP法においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、さらにこれとは別のプライマー、すなわちループプライマー(Loop Primer)を用いることができる。ループプライマーLF及び/又はLBは、ダンベル構造の5'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いると、核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる(国際公開第02/24902号パンフレット)。ループプライマーの塩基配列は上述のダンベル構造の5'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的遺伝子の塩基配列又はその相補鎖から選ばれても良く、他の塩基配列でも良い。また、ループプライマーは1種類でも2種類でも良い。
【００３２】
ジカウイルスはRNAウイルスである。LAMP法は鋳型がRNAの場合には、鋳型がDNAの場合の反応液に逆転写酵素を添加することで、同様に核酸増幅反応を進めることができる(RT-LAMP法)。
【００３３】
ジカウイルスに特異的な塩基配列を迅速に増幅できるLAMP法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、ジカウイルスのNS5遺伝子(GenBank Accession Number: KU312312.1、配列番号２４)を標的配列として、以下の3組のプライマーセットを選定した。
プライマーセット１−２１：
(a) FIP：5'-TTGACCAGGTAGTTCTCCCAGTATGGCCAATGCCATTTGTTC-3'(配列番号１)
(b) BIP：5'-AGGGAGAATGGATGACCACTGACTCCTCAATCCACACTCTGT-3'(配列番号２)
(c) F3：5'-CAGAAGGGACCTCCGACT-3'(配列番号３)
(d) B3：5'-CGTAACTGGGGTCTTGTCTT-3'(配列番号４)
(e) LF1：5'-TGGAACCCAGTCAACTG-3'(配列番号５)
(f) LB1：5'-AGACATGCTTGTGGTGT-3'(配列番号６)
(g) LFM1：5'-CCCAGTCAACTGGCACAG-3'(配列番号７)
(h) LBM1：5'-CATGCTTGTGGTGTG-3'(配列番号８)
プライマーセット１−１：
(j) FIP：5'-TGGCCTTTCCAAATTCCCCTTGCTGAGAGGAGAGTGCCAGAG-3'(配列番号１０)
(k) BIP：5'-TCTGGTATATGTGGCTAGGGGCCCCATCCAGTGATCCTCGTT-3'(配列番号１１)
(l) F3：5'-AGTGGACAAGGAAAGAGAGC-3'(配列番号１２)
(m) B3：5'-CACCACCTCCTGAGTTCTC-3'(配列番号１３)
(n) LF11：5'-AGATGGAGCTTGTTGAAGTG-3'(配列番号１４)
(o) LB11：5'-CTCTCCAGGGGCGGGATGGA-3'(配列番号１５)
プライマーセット１−６：
(q) FIP：5'-AGGGTTTCCACTCTTGTGTGTCCACATGCCCTCAGGTTCTT-3'(配列番号１７)
(r) BIP：5'-AGTTCCGTTTTGCTCCCACCCACAATGGACCTCCCGTC-3'(配列番号１８)
(s) F3：5'-TTGCGTTGTGAAGCCAATT-3'(配列番号１９)
(t) B3：5'-CCGGCCAATCAGTTCATCT-3'(配列番号２０)
(u) LF15：5'-CTTTTTCCCATCATGTTGTACACAC-3'(配列番号２１)
(v) LB15：5'-TAGAGTTCGAAGCCCTTGGATTCT-3'(配列番号２２)
【００３４】
核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、例えばBst DNAポリメラーゼ(ラージフラグメント)、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、Csa DNAポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくはBst DNAポリメラーゼ(ラージフラグメント)が挙げられる。
【００３５】
RT-LAMP法に用いる逆転写酵素としては、RNAを鋳型としてDNAを合成する活性を有する酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、例えばAMV、Cloned AMV、MMLV、Recombinant HIVの逆転写酵素、SuperscriptII/III/IV、ReverTraAce、Thermoscript、Ominiscript、Sensiscript等が挙げられ、好ましくは、AMV又はCloned AMV逆転写酵素が挙げられる。またBca DNAポリメラーゼのように、逆転写酵素活性とDNAポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素を用いると、RT-LAMP反応を1つの酵素で行うことができる。
【００３６】
核酸合成で使用する酵素や逆転写酵素は、ウイルスや細菌等から精製されたものでも良く、遺伝子組み換え技術によって作製されたものでも良い。またこれらの酵素はフラグメント化やアミノ酸の置換等の改変をされたものでも良い。
【００３７】
LAMP反応後の核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーター法(特開2001-242169号公報)を用いたり、あるいは反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかけたりしても容易に検出できる。アガロースゲル電気泳動では、LAMP増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー(はしご)状に検出される。また、LAMP法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。従って、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば400nmの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認することで、核酸増幅反応を検出することも可能である(国際公開第01/83817号パンフレット)。
【００３８】
LAMP反応の核酸増幅産物の検出の一態様としては、蛍光標識プローブを用いる方法が挙げられる。例えば、蛍光消光プローブ(Quenching Probe：QProbe(登録商標))と称される3'末端または5'末端に蛍光標識されたプローブは、標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素がその発光を減少させることで、増幅産物を検出又は定量することができる(特開2001-286300号公報)。また末端部分において、ハイブリダイゼーションの塩基対がG（グアニン）とC（シトシン）のペアを形成するように設計されることを特徴としている。ここで使用される蛍光標識としては、例えば、BODIPY-FL、カルボキシローダミン6G（CR6G）、カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、Pacific Blue、フルオレセイン-4-イソチオシアネート（FITC）等が挙げられる。
【００３９】
本発明においては、上記3組のプライマーセットに合わせて、以下のQProbeを使用することができる。なお、各QProbeは、3'末端にBODIPY-FLで標識されている。
プライマーセット１−２１に対するQProbe：
(i) ZK-LF21QP3G：5'-TGGAACCCAGTCAACTGGCACAGATGAAC-3'(配列番号９)
プライマーセット１−１に対するQProbe：
(p) ZK-LB1QP3G：5'-TAGATTTCTAGAGTTCGAAGCCCTTGGATTC-3'(配列番号１６)
プライマーセット１−６に対するQProbe：
(w) ZK-LF6QP3G：5'-CTTCCTAACTTTTCCCATATCATTCAAGAACC-3'(配列番号２３)
【００４０】
本発明に係るプライマーセットを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてジカウイルス検出又はジカウイルス感染症診断用にキット化することができる。具体的には、本発明に係るプライマーセット、蛍光標識プローブ、核酸合成の基質となる4種類のdNTP、核酸合成を行うDNAポリメラーゼ、逆転写活性を持つ酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される。
【００４１】
以上に説明した本発明に係るプライマーセット又はキットを用いて、ジカウイルスの標的核酸領域の増幅反応(好ましくはLAMP法)を行い、ジカウイルスを検出又は定量することができる。換言すれば、当該検出又は定量により、ジカウイルス感染の有無を検査し、ジカウイルス感染症を検査又は評価することができる。本発明に係るプライマーセットを用いたLAMPの反応液には、例えば、反応液25μl当たり、本発明に係るプライマーセットに含まれる各プライマー2.5〜80pmol(好ましくは5〜40pmol)、検体用核酸0.02fg〜4μg(好ましくは8fg〜0.0004μg)、鎖置換型DNA合成酵素4〜64U(好ましくは8〜32U)、逆転写酵素0.1〜10U(好ましくは0.5〜4U)、最終濃度0.8〜2.4mM(好ましくは1.2〜1.8mM)のdNTPが含まれる。また、QProbeを使用する場合には、例えば、LAMPの反応液25μl当たり0.5〜20pmol(好ましくは1〜5pmol)のQProbeを含む。さらに、LAMPの増幅反応条件としては、例えば、温度60℃〜65℃(好ましくは63℃)で10〜60分(好ましくは15〜30分)が挙げられる。          
【００４２】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
〔実施例１〕検出感度の確認
LAMP法と、PCR法との検出感度の比較を行った。
１．試料及び試薬の調製
１）試料
ZIKAウイルスのNS5遺伝子配列より選ばれた配列番号２４のRNAを、10mM Tris buffer(WAKO製) pH8.0に溶解し、1テスト当たり10,000コピーから100コピーまでの10倍段階希釈液と、50、25コピーの2倍段階希釈液を作製し、試料溶液とした。また同Tris bufferを0コピーの試料溶液とした。【００４４】
２）PCR法に用いる試薬組成及び濃度
PCR法で使用するZIKAウイルス検出用プライマーとして、
(1)NS5遺伝子の219bpを増幅するプライマーセット１−１のF3(AGTGGACAAGGAAAGAGAGC：配列番号１２）及びB3(CACCACCTCCTGAGTTCTC：配列番号１３)で示される塩基配列から成るプライマーセット１；
(2)NS5遺伝子の220bpを増幅するプライマーセット１−６のF3(TTGCGTTGTGAAGCCAATT：配列番号１９)及びB3(CCGGCCAATCAGTTCATCT：配列番号２０)で示される塩基配列から成るプライマーセット２；
(3)NS5遺伝子の190bpを増幅するプライマーセット１−２１のF3(CAGAAGGGACCTCCGACT：配列番号３)及びB3(CGTAACTGGGGTCTTGTCTT：配列番号４)で示される塩基配列から成るプライマーセット３；
を使用した。【００４５】
反応には、1ステップリアルタイム定量RT-PCRキットであるQuantiTect Probe RT-PCR kit(QIAGEN)を使用した。
RT-PCR反応溶液組成：
・2×QuantiTect Probe RT-PCR MasterMix 12.5μL
・F3 primer(100pmol/μl) 0.15μL
・B3 primer(100pmol/μl) 0.15μL
・YO-PRO-1 160nM(Thermo Fisher Scientific)
・QuantiTect RT Mix 0.25μL
・RNase Inhibitor(20U/μl) 0.1μL
・RNase Free Water 6.35μL
・RNA Template 5μL【００４６】
３）LAMP法に用いる試薬組成及び濃度
LAMP法で使用するZIKAウイルス検出用プライマーとして、
(1)プライマーセット１−１からLF11/LB11を除くプライマーセット
(2)プライマーセット１−６からLF15/LB15を除くプライマーセット
(3)プライマーセット１−２１からLF1/LB1とLFM1/LBM1を除くプライマーセット
(4)プライマーセット１−１
(5)プライマーセット１−６
(6)プライマーセット１−２１からLFM1/LBM1を除くプライマーセット
(7)プライマーセット１−２１からLF1/LB1を除くプライマーセット
を使用した。
※(1)-(3)：インナープライマーとアウタープライマーのみ
※(4)-(7)：インナープライマーとアウタープライマーとループプライマー【００４７】
最終反応溶液25μL中の各試薬濃度が下記になるよう調製した。
反応溶液組成(濁度検出系)：
・20mM Trine pH8.6
・30mM KCl
・8mM MgSO4
・1.4mM dNTPs
・0.5％Tween20
・1.6mM DTT
・1.6μM FIP及びBIP
・0.2μM F3及びB3
・0.8μM LF及びLB
・AMV Reverse Transcriptase 1.0U(20U/μl、Roche)
・Bst DNApolymerase 22.8U(New England Biolabs)
・RNase Inhibitor(40U/μl) 1μL
・RNA Template 5μL【００４８】
反応溶液組成(インターカレーター系)：
上記濁度検出系の反応溶液組成に、更に以下の試薬を添加して調製した。
・PPase 20mU(New England Biolabs)
・YO-PRO-1 160nM(Thermo Fisher Scientific)【００４９】
反応溶液組成(probe系)：
上記濁度検出系の反応溶液組成に、更に以下の試薬を添加して調製した。
・PPase 20mU(New England Biolabs)
・QProbe 0.04μM(日鉄住金環境株式会社)【００５０】
QProbeは、LAMPプライマーセット(4)-(7)と組み合わせて使用した。
(8)(4)＋ZK-LB1QP3G
(9)(5)＋ZK-LF6QP3G
(10)(6)＋ZK-LF21QP3G
(11)(7)＋ZK-LF21QP3G【００５１】
反応組成(電気泳動)：
上記インターカレーター系の反応溶液組成で増幅後、その増幅産物5μLを2%アガロースゲルに供し、以下の試薬を含むbufferで染色した。
・0.1μg/mL EtBr(ニッポンジーン)を含むTBE buffer【００５２】
２．核酸増幅法による反応
１）PCR法による反応
PCR反応は、RNA溶液5μLを加え、最終反応溶液25μLとし、0.2mLの専用チューブ内でリアルタイム定量PCRシステムLightcycler480(Roche)を用い、逆転写50℃30分、熱変性95℃15分後、熱変性94℃15秒、PCR反応52℃75秒を1サイクルとして計45サイクル行った。所要時間は約100分だった。【００５３】
反応終了後の反応溶液5μLを2％アガロースゲルで電気泳動し、増幅産物を確認した。
２）LAMP法による反応
LAMP反応は、LAMP用試薬にRNA溶液5μLを加え、最終反応溶液25μLとし、0.2mLの専用チューブ内でリアルタイム定量PCRシステムMx3005P(Agilent Technologies)を用い、63℃で30分LAMP反応を行った。【００５４】
反応終了後の反応溶液5μLを2％アガロースゲルで電気泳動を行った。【００５５】
３．リアルタイム蛍光(インターカレーター系)測定による検出感度の比較結果
プライマーセット(1)-(3)を用いたPCR法のリアルタイム蛍光測定の反応時間の結果を表１に示す。具体的には、表１においては、プライマーセット(1)-(3)を用いたＰＣＲ法のリアルタイム蛍光測定の反応時間を示した。各コピー数について、2重測定を実施した。表の上から、10000c/t(コピー/テスト)、1000コピー/テスト、100コピー/テスト、50コピー/テスト、25コピー/テスト、NC(0コピー/テスト)を示す。また、増幅曲線の結果を図１〜３に示す。【００５６】
PCR法は、プライマーセット(1)は、25コピー以上が測定開始後約50分までに蛍光の増加を確認したが、0コピーも測定開始後約50分に蛍光の増加を確認した。このプライマーセットでは特異的増幅であるかは判断できなかった。【００５７】
プライマーセット(2)は、25コピー以上が測定開始後約75分までに蛍光の増加を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。【００５８】
プライマーセット(3)は、25コピー以上が測定開始後約73分までに蛍光の増加を確認したが、0コピーも測定開始後約80分に蛍光の増加を確認した。【００５９】
【表１】
2018042598.tif 000002
【００６０】
プライマーセット(1)-(7)を用いたLAMP法のリアルタイム蛍光測定の反応時間の結果を表２に示す。具体的に、表２においては、プライマーセット(1)-(7)を用いたLAMP法のリアルタイム蛍光測定の反応時間を示した。各コピー数について、2重測定を実施した。表の上から、10000c/t(コピー/テスト)、1000コピー/テスト、100コピー/テスト、50コピー/テスト、25コピー/テスト、NC(0コピー/テスト)を示す。プライマーセット(1)-(3)(ループプライマー無し)では、10000コピー/テストとNCのみを計測した。また、増幅曲線の結果を図４〜１０に示す。【００６１】
プライマーセット(1)は、10000コピーが測定時間約20分までに蛍光の増幅を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。【００６２】
プライマーセット(2)は、10000コピーが測定時間約22分までに蛍光の増幅を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。【００６３】
プライマーセット(3)は、10000コピーが測定時間約20分までに蛍光の増幅を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。【００６４】
プライマーセット(4)は、100コピー以上が測定時間約14分までに蛍光の増幅を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。プライマーセット(1)にループプライマーを添加することで、10000コピー/テストの反応時間が10分以上短縮された。【００６５】
プライマーセット(5)は、1000コピー以上が測定時間約20分までに蛍光の増幅を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。プライマーセット(2)にループプライマーを添加することで、10000コピー/テストの反応時間が8分以上短縮された。【００６６】
プライマーセット(6)は、50コピー以上が測定時間約30分までに蛍光の増幅を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。プライマーセット(6)はプライマーセット(3)にループプライマーを添加することで、10000コピー/テストの反応時間が10分以上短縮された。【００６７】
プライマーセット(7)は、1000コピー以上が測定時間約10分までに蛍光の増幅を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。プライマーセット(7)はプライマーセット(3)にループプライマーを添加することで、10000コピー/テストの反応時間が10分以上短縮された。【００６８】
【表２】
2018042598.tif 000003
【００６９】
４．電気泳動法による各増幅反応の検出感度と特異性の確認
PCR法の電気泳動の結果を図１１に、プライマーセット(4)-(7)を用いたLAMP法の電気泳動の結果を図１２に示す。【００７０】
PCR法では、プライマーセット(1)は219bpの特異的バンドが10000コピーで明瞭に認められ、100コピーは薄いバンド、0コピーは特異的バンドを認めなかった。【００７１】
プライマーセット(2)は220bpの特異的バンドが100コピーまで明瞭に認められ、0コピーは特異的バンドを認めなかった。【００７２】
プライマーセット(3)は190bpの特異的バンドが100コピーまで明瞭に認められ、0コピーは特異的バンドを認めなかった。【００７３】
これに対し、LAMP法では、
プライマーセット(4)は100コピーまで特異的増幅のラダー状のバンドが明瞭に認められ、0コピーは特異的バンドを認めなかった。【００７４】
プライマーセット(5)は1000コピーまで特異的増幅のラダー状のバンドが明瞭に認められ、0コピーは特異的バンドを認めなかった。【００７５】
プライマーセット(6)は100コピーまで特異的増幅のラダー状のバンドが明瞭に認められ、0コピーは特異的バンドを認めなかった。【００７６】
プライマーセット(7)は1000コピーまで特異的増幅のラダー状のバンドが明瞭に認められ、0コピーは特異的バンドを認めなかった。【００７７】
〔実施例２〕LAMP法のリアルタイム濁度測定法による検出時間と感度の検討
実施例１に記載のプライマーセット(4)-(7)を用いたLAMP法の検出時間及び感度の検討は、実施例１のLAMP法の反応溶液組成(濁度検出系)25μLを用い、リアルタイム濁度測定装置LoopampEXIA(測定波長 650nm、栄研化学)によって63℃で30分LAMP反応を行った。【００７８】
プライマーセット(4)-(7)を用いたLAMP法のその結果を表３に示す。具体的に、表３においては、プライマーセット(4)-(7)を用いたLAMP法のリアルタイム濁度測定の反応時間を示した。各コピー数について、2重測定を実施した。表の上から、10000コピー/テスト、1000コピー/テスト、100コピー/テスト、50コピー/テスト、25コピー/テスト、NC(0コピー/テスト)を示す。また、増幅曲線の結果を図１３〜１６に示す。【００７９】
プライマーセット(4)は、1000コピー以上が測定時間約18分までに濁度の増幅を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。リアルタイム蛍光測定法より10000コピー/テストの反応時間が約5分遅延した。【００８０】
プライマーセット(5)は、10000コピー以上が測定時間約18分までに濁度の増幅を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。リアルタイム蛍光測定法より10000コピー/テストの反応時間が約5分遅延した。【００８１】
プライマーセット(6)は、1000コピー以上が測定時間約19分までに濁度の増幅を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。リアルタイム蛍光測定法より10000コピー/テストの反応時間が約5分遅延した。【００８２】
プライマーセット(7)は、25コピー以上が測定時間約26分までに蛍光の濁度を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。リアルタイム蛍光測定法より10000コピー/テストの反応時間が約4分遅延した。【００８３】
【表３】
2018042598.tif 000004
【００８４】
〔実施例３〕LAMP法のQProbeを用いたリアルタイム蛍光測定法による検出時間と感度の検討
実施例１に記載のプライマーセット(4)-(7)を用いたLAMP法の検出時間及び感度の検討は、実施例１のLAMP法の反応溶液組成(probe系)25μLを用い、リアルタイム定量PCRシステムMx3005P(Agilent Technologies)によって63℃で30分LAMP反応を行った。【００８５】
プライマーセット(4)-(7)を用いたLAMP法のその結果を表４に示す。具体的には、表４においては、プライマーセット(4)-(7)のLAMP法のQProbeを用いたリアルタイム測定の反応時間を示した。各コピー数について、2重測定を実施した。表の上から、10000コピー/テスト、1000コピー/テスト、100コピー/テスト、50コピー/テスト、25コピー/テスト、NC(0コピー/テスト)を示す。また、消光曲線の結果を図１７〜２０に示す。【００８６】
プライマーセット(4)は、100コピー以上が測定時間約23分までに蛍光の消光を確認し、0コピーは測定時間中の消光が確認されなかった。リアルタイム蛍光測定法より10000コピー/テストの反応時間が約6分遅延した。【００８７】
プライマーセット(5)は、10000コピー以上が測定時間約26分までに蛍光の消光を確認し、0コピーは測定時間中の消光が確認されなかった。リアルタイム蛍光測定法より10000コピー/テストの反応時間が約5分遅延した。【００８８】
プライマーセット(6)は、100コピー以上が測定時間約26分までに蛍光の消光を確認し、0コピーは測定時間中の消光が確認されなかった。リアルタイム蛍光測定法より10000コピー/テストの反応時間が約3分遅延した。【００８９】
プライマーセット(7)は、50コピー以上が測定時間約28分までに蛍光の消光を確認し、0コピーは測定時間中の消光が確認されなかった。リアルタイム蛍光測定法より10000コピー/テストの反応時間が約2分遅延した。【００９０】
【表４】
2018042598.tif 000005
【００９１】
〔実施例４〕交差反応性の確認
LAMP法の交差反応性を確認した。
１．試料及び試薬の調製
１）試料
デングウイルス、ウエストナイルウイルス、チクングニアウイルスの抽出RNAを、100倍希釈になるように10mM Tris buffer(WAKO製) pH8.0に溶解し試料溶液とした。【００９２】
２）LAMP法に用いる試薬組成及び濃度
実施例１に記載のプライマーセット(4)-(7)と、反応組成(Probe系)を使用した。【００９３】
２．LAMP法のQProbeを用いたリアルタイム蛍光測定法による交差反応の確認
LAMP反応は、LAMP用試薬にRNA溶液5μLを加え、最終反応溶液25μLとし、0.2mLの専用チューブ内でリアルタイム定量PCRシステムMx3005P(Agilent Technologies)を用い、63℃で30分LAMP反応を行った。【００９４】
プライマーセット(4)-(7)を用いたLAMP法のその結果を表５に示す。具体的には、表５においては、プライマーセット(4)-(7)のLAMP法のQProbeを用いたリアルタイム測定の反応時間を示した。各項目について、1重測定を実施した。上から、D-1〜D-4はデング熱ウイルス血清型1〜4のRNAを示し、WNV99〜WNV Eg101はウエストナイルウイルスのRNAを示し、CHIKはチクングニアウイルスのRNAを示す。また、消光曲線の結果を図２１〜２４に示す。【００９５】
プライマーセット(4)-(7)は、10000コピー/テストを除き、いずれも測定時間中の消光は確認されなかった。【００９６】
【表５】
2018042598.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明によれば、ジカウイルスを高感度且つ迅速に検出することができ、ジカウイルス感染症を効率的に診断することができる。【００９８】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2018042598.tif 000007
【図２】
2018042598.tif 000008
【図３】
2018042598.tif 000009
【図４】
2018042598.tif 000010
【図５】
2018042598.tif 000011
【図６】
2018042598.tif 000012
【図７】
2018042598.tif 000013
【図８】
2018042598.tif 000014
【図９】
2018042598.tif 000015
【図１０】
2018042598.tif 000016
【図１１】
2018042598.tif 000017
【図１２】
2018042598.tif 000018
【図１３】
2018042598.tif 000019
【図１４】
2018042598.tif 000020
【図１５】
2018042598.tif 000021
【図１６】
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【図１７】
2018042598.tif 000023
【図１８】
2018042598.tif 000024
【図１９】
2018042598.tif 000025
【図２０】
2018042598.tif 000026
【図２１】
2018042598.tif 000027
【図２２】
2018042598.tif 000028
【図２３】
2018042598.tif 000029
【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018042598.tif 000032
2018042598.tif 000033
2018042598.tif 000034
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