(57)【要約】  本発明は、Ｘ線マイクロＣＴを用いた皮膚組織の観察方法の提供を課題とする。前処理溶液としてアセトンを用い、染色液としてヨウ素含有溶液を用いて染色を行うことにより、皮膚組織における汗腺、皮脂腺、毛嚢などの付属器の識別が可能になる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ線画像撮影法による皮膚試料の観察方法であって、
皮膚試料とアセトン含有溶液とを接触させる工程；
皮膚試料とヨウ素含有溶液とを接触させる工程；
皮膚試料を、Ｘ線コンピュータ断層撮影装置により３次元画像を取得する工程
を含む、前記観察方法。
【請求項２】
前記観察方法が、皮膚試料中の付属器の観察を可能にする、請求項１に記載の観察方法。
【請求項３】
前記付属器が、皮脂腺、汗腺、毛器官からなる群から選ばれる、請求項２に記載の観察方法。
【請求項４】
ヨウ素含有溶液が、ヨウ化カリウム及びヨウ素の少なくとも１を含む、請求項１又は２に記載の観察方法。
【請求項５】
Ｘ線画像撮影のための皮膚試料の調製方法であって、
皮膚試料とアセトン含有溶液とを接触させる工程；
皮膚試料とヨウ素含有溶液とを接触させる工程；
を含む、前記調製方法。
【請求項６】
ヨウ素含有溶液が、ヨウ化カリウム及びヨウ素の少なくとも１を含む、請求項５に記載の調製方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の観察方法を用いて付属器の深度を測定することによる、皮膚空洞化の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚試料に対するＸ線画像撮影法の技術分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｘ線は透過性が高い一方で、物質に応じて透過性が異なる。そこでＸ線の透過性の差を利用して、医療分野や非破壊内部検査分野で用いられている。Ｘ線撮影をコンピュータで処理して３次元画像を取得する技術が開発されており、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）と呼ばれている。ＣＴは、放射線被曝の影響を考えなければ、解像度を極めて高くすることができ、顕微鏡レベル又はそれ以上の微細構造の３次元画像を取得することができる。このようなＣＴはＸ線マイクロＣＴと呼ばれており、生体に適用することは好ましくないものの、取得された組織の内部の３次元構造をより精緻に観察するのに適している。【０００３】
Ｘ線マイクロＣＴが開発されて以来、単離組織、樹脂成形品、小型電子部品等様々な物質の断面画像の取得及び解析が可能になってきている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Journal of Cell Science (2016), vol. 129,pp, 2483-2492
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らが、Ｘ線マイクロＣＴを用いて、ヒト皮膚組織試料について皮膚の３次元構造の解析を試みたところ、表皮層、真皮層、及び皮下脂肪層といった大まかな構造の差異を識別可能であった一方で、皮膚構造に含まれる付属器といった構造については識別ができなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者らが、Ｘ線マイクロＣＴ装置の設定、組織試料の調製について鋭意検討を行った。本発明者らが、アセトンにより皮膚組織試料を前処理し、ヨウ素含有溶液で染色し、Ｘ線マイクロＣＴ装置に供したところ、驚くべきことに、皮膚に含まれる微小器官である付属器を識別可能になり、本発明に至った。【０００７】
具体的に、本発明は、Ｘ線画像撮影法による皮膚試料の観察方法に関する。本発明の観察法では、以下の：
皮膚試料とアセトン含有溶液とを接触させる工程；
皮膚試料とヨウ素含有溶液とを接触させる工程；及び
皮膚試料を、Ｘ線コンピュータ断層撮影装置により３次元画像を取得する工程
を含むことを特徴とする。【０００８】
他の態様では、本発明は、Ｘ線画像撮影のための皮膚試料の調製方法にも関する。本発明の調製方法では、以下の：
皮膚試料とアセトン含有溶液とを接触させる工程；及び
皮膚試料とヨウ素含有溶液とを接触させる工程
を含むことを特徴とする。【０００９】
さらに別の態様では、本発明の観察方法を用いて、汗腺の最下部の深度を測定することによる、皮膚空洞化の検出方法にも関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の皮膚試料の調製方法により調製された皮膚試料を観察することで、皮膚に含まれる微細な組織である付属器の構造の観察が可能になる。また、付属器の一つである汗腺の深度を測定することにより皮膚空洞化を検出することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、前処理溶液−染色液の組合せとして、（１）ＰＦＡ−ヨウ素含有溶液（Lugol）、（２）ＰＦＡ−リンタングステン酸、（３）アセトン−ヨウ素含有溶液（Lugol）、及び（４）アセトン−リンタングステン酸を用いて処理を行い、Ｘ線マイクロＣＴで取得された３次元画像を示す。
【図２】図２は、アセトン−ヨウ素含有溶液の組合せで処理されて、Ｘ線マイクロＣＴで取得された３次元画像において、器官（毛（hair)、立毛筋（hair muscle, arrector pili)、汗腺（sweat gland)、及び皮脂腺（sebaceous gland)）並びに組織（表皮（epidermis)、真皮層（dermal layer））を表した図である。
【図３】図３Ａは、正常(normal)皮膚と、重篤なたるみ(severe sagging)のある皮膚における外観写真と、超音波による内部画像を示す。正常皮膚では、真皮層（dermal layer）と皮下脂肪（fat）との境界が平坦である一方で、重篤なたるみのある皮膚では、重篤な真皮の欠損（severe defect）が見られた。図３Ｂは、真皮空洞の大きさ(defect severity)と皮膚の弾力性(skin firmness)との関係を示すグラフである。真皮空洞が大きくなる（Large)ほど皮膚の弾力性が低下し、真皮空洞が小さくなるほど、皮膚の弾力性が高くなった（High)。相関計数は、ピアソンの相関係数（Pearson's correlation coefficient）により示した。
【図４】図４Ａは、Ｘ線マイクロＣＴで取得された汗腺（sweat gland）を含む部分の３次元画像を示す。汗腺の下側に空洞（cavity)が見られた。図４Ｂは、汗腺(sweat gland)、毛嚢(hair follicle)、及び皮脂腺(sebaceous gland)の組織切片染色写真を示す。汗腺では空洞が存在した（cavitation)一方で、毛嚢や皮脂腺には空洞が存在しなかった（no cavitation)。図４Ｃは、汗腺と真皮空洞との共局在（co-localized)の割合（ratio)を示すグラフである。共局在していない（none)場合は、およそ１０％程度であった。有意差はスチューデントのｔ検知（Student's t-test)により求めた。
【図５】図５は、３０代の若い（young)皮膚と６０代の年配の（old）皮膚における汗腺（sweat gland）部分の３次元画像を示す。年配の皮膚では、汗腺は表皮（epidermis)側へと上方に収縮していた（shrink upward）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、Ｘ線画像撮影法による皮膚試料の観察方法に関する。この観察法では、以下の：
皮膚試料とアセトン含有溶液とを接触させる工程；
皮膚試料とヨウ素含有溶液とを接触させる工程；及び
皮膚試料を、Ｘ線コンピュータ断層撮影装置により３次元画像を取得する工程
を含むことを特徴とする。
【００１３】
Ｘ線画像撮影方法は、任意の出力および解像度が選択されうる。３次元構造を観察することから、断層写真（ＣＴ像）が好ましい。また、付属器などの微小器官を観察する観点から、０．１μｍ以下の分解能を有する、いわゆるＸ線マイクロＣＴと呼ばれる撮影法が好ましい。Ｘ線マイクロＣＴの分解能は、より小さい組織を観察する観点から、０．１μｍ以下が好ましく、０．０１μｍ以下がさらに好ましく、０．０５μｍ以下がさらに好ましい。分解能の下限は特に限定されないが、Ｘ線ＣＴ装置の能力に左右され、例えば０．０００１μｍ以上、又は０．００１μｍ以上である。
【００１４】
皮膚試料とは、皮膚から取得された試料をいう。皮膚試料は、観察したい領域を含む形で取得されていればよい。皮膚試料は、表皮、真皮、及び皮下組織のいずれか１以上を含んでいればよい。皮膚切片を用いることもできるし、３次元培養皮膚モデルを用いることもできる。皮膚試料の取得元の動物種は限定されないが、例えばヒト、ブタ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ、ウマなどである。特にヒトの皮膚が好ましいが、ヒトの皮膚と近い構造を有するブタの皮膚も観察資料として好ましい。
【００１５】
表皮は、皮膚最外層に存在する皮膚組織である。表皮は、角層、顆粒層、有棘層、及び基底層から主に構成されている。基底層に存在する基底細胞が分裂し、外層へと移動する。この移動の過程で脱核が生じて扁平化し角層へと分化し、最終的に剥がれ落ちる。表皮には、ケラチノサイトの他、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞などが存在する。表皮と真皮との境界に基底膜が存在しており、基底膜は隆起して乳頭構造をとる。真皮は、乳頭層、乳頭下層、網状層から構成される。表皮から真皮にかけて、汗腺や皮脂腺などの分泌腺や毛器官が陥没して存在する。分泌線としては、エクリン汗腺、アポクリン汗腺、皮脂腺、毛脂腺が存在する。毛器官としては、毛嚢、毛、及び立毛筋が存在する。分泌線のうち、アポクリン汗腺、毛脂腺は毛器官に付随している。従来のＸ腺マイクロＣＴでは、これらの毛器官や分泌腺の識別は困難であったところ、本発明の試料調製方法により試料を調製し、観察方法により観察した場合には、これらの付属器の識別が可能になった。
【００１６】
取得された皮膚試料は、取得後に冷蔵又は冷凍で保存されていてもよいし、取得後すぐにアセトン含有溶液と接触されてもよい。アセトン含有溶液は、アセトンを含む溶液であれば任意の溶液である。アセトンの含有量は、５０％以上が好ましく、さらに好ましくは８０％以上であり、最も好ましくは１００％アセトンである。
【００１７】
アセトン含有溶液との接触時間は、皮膚試料の大きさに応じて任意に選択することができる。例えば５ｍｍの厚さの皮膚切片では、６時間以上、好ましくは１２時間以上、さらに好ましくは２４時間以上接触されうる。接触時間の上限は特に限定されないが、実験簡略化の観点から、４８時間以内、より好ましくは２４時間以内である。アセトン含有溶液との接触工程は、任意の温度で行われてよく、例えば室温や冷蔵下で行われうる。生体試料を扱う観点から、冷蔵下、例えば４℃で行われることが好ましい。
【００１８】
本発明において、ヨウ素含有溶液とは、ヨウ素又はヨウ化物が含有されていれば任意の溶液であってよい。ヨウ素はＸ線の吸収率が高いことから、ヨウ素の沈着度に応じてＸ線撮影により組織の識別が可能になると考えられる。したがって、ヨウ素含有溶液は、染色液と言うこともできる。ヨウ化物は、ヨウ素の溶解を助けるために用いられうる。本発明のヨウ素含有溶液に含まれうるヨウ化物としては、ヨウ化水素、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、四ヨウ化炭素など、任意のヨウ化物が挙げられる。ヨウ素とヨウ化カリウムの混合溶液であってもよく、例えばルゴール試薬であってもよい。ヨウ素含有溶液におけるヨウ化物及びヨウ素の濃度は、合計で０．１〜１０％の濃度を用いることができ、さらに好ましくは１〜５％の濃度を用いることができる。ヨウ化物とヨウ素の混合比としては、１：１０〜１０：１の間で任意に選択することができる。混合比としてはより好ましくは１：５〜５：１であり、更に好ましくは１：２〜２：１である。ルゴール試薬では、ヨウ化カリウムとヨウ素の合計量は３．７５％で使用され、その存在比は２：１である。
【００１９】
ヨウ素含有溶液との接触時間は、皮膚試料の大きさに応じて任意に選択することができる。例えば５ｍｍの厚さの皮膚切片では、１２時間以上、好ましくは２４時間以上、さらに好ましくは４８時間以上接触されうる。接触時間の上限は特に限定されないが、実験簡略化の観点から、９６時間以内、より好ましくは４８時間以内である。アセトン含有溶液との接触工程は、任意の温度で行われてよく、例えば室温や冷蔵下で行われうる。生体試料を扱う観点から、冷蔵下、例えば４℃で行われることが好ましい。
【００２０】
本発明において、各工程の前又は後において、各工程で用いた溶液を洗い流すために洗浄工程を行うことができる。洗浄工程は、任意の溶液で１〜複数回置換することで行われうる。使用する溶液としては、生体試料を扱う観点からリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が使用されてもよいし、次の工程で使用される溶液を用いてもよい。
【００２１】
ヨウ素含有溶液との接触工程の後に、３次元画像を取得するために、Ｘ線コンピュータ断層撮影装置により撮影が行われる。撮影は、任意のＸ線ＣＴ装置において、出力を適宜選択することにより行うことができる。使用される出力としては、分解能を高める観点から１０ｋＶ以上が好ましく、より好ましくは２５ｋＶ以上で撮影を行うことができる。１００ｋＶ以下が好ましく、より好ましくは５０ｋＶ以下で撮影が行われる。一例として、Comscan Techno社のμＣＴ装置（D200RSS270）において、出力を５０ｋＶ及びＸ線管電流２００μＡに設定して観察を行うことができる。
【００２２】
本発明の方法を用いて、皮膚試料をＸ腺マイクロＣＴにより可視化した際に、皮膚表面からの長さが縮んでいる汗腺があることを見いだした。このような汗腺を萎縮した汗腺ということにする。汗腺のなかでも特にエクリン汗腺が萎縮していた。萎縮した汗腺は主に高齢者の皮膚において多く観察された。汗腺の最深部は、通常真皮と皮下組織との境界に存在しているところ、萎縮した汗腺は、萎縮した分だけ皮膚表層側へと移動しており、その移動した領域は皮下組織に置き換わっていることが分かった（図３及び４）。このように皮下組織が真皮側へと隆起して形成される洞を真皮空洞と呼ぶこととする。真皮空洞の大きさは、おおよそ１０μｍ〜１０００μｍの直径を有する略球状であるが、その形状は一定ではない。真皮空洞内は皮下脂肪組織により充填されていることから、単に真皮洞ともいうことができる。真皮層中に含まれる細胞成分や間質成分が、真皮空洞内には含まれないことにより、皮膚の弾力が失われ、たるみが生じ、皮膚の老化に繋がると考えられる（PCT/JP2015/072140）。
【００２３】
したがって、汗腺が萎縮しているか否かを判定することで、皮膚のたるみを測定することができる。汗腺の萎縮を、皮膚表面からの汗腺の最下部までの深度に基づき決定することができる。また、萎縮度を、汗腺が存在しておらず皮下脂肪組織が隆起していない領域における皮膚表面から皮下脂肪組織までの距離（L1）と、汗腺が存在している領域の汗腺の最深部（又は皮下組織）までの距離（L2）とから求めることができる。例えば、以下の式：
【数１】
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で表すこともできる。深度が増加するにつれ、萎縮度が低下し、皮膚の空洞は少なくなる。一方で、深度が低下するにつれ、萎縮度が増加し、皮膚の空洞が大きくなる。
【００２４】
したがって、本発明の観察方法を用いて汗腺の萎縮度を測定することにより、皮膚空洞化の検出が可能となる。
【００２５】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【００２６】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例】
【００２７】
実施例１：
皮膚検体を4% PFAまたはアセトンで前処理後、ルゴール又はリンタングステン酸に浸しPBSで洗浄後、CTで撮影を行った。
形成外科手術を受けた１７名の女性被験者及び２０名の男性被験者から、余剰皮膚を取得し、５ｍｍ厚に切ることで皮膚試料とした。ＰＢＳで洗浄後、皮膚試料をアセトン中に入れ、２４時間４℃でインキュベートすることにより前処理を行った。比較として、４％ＰＦＡ水溶液を前処理溶液のアセトンの代わりに用いた。インキュベート後、皮膚試料をＰＢＳで洗浄した。次にルゴール試薬を希釈したヨウ素含有溶液（２．５％ヨウ化カリウム及び１．２５％ヨウ素水溶液）中に皮膚試料を入れ、２４時間４℃でインキュベートした。比較として、ヨウ素含有溶液の代わりに、リンタングステン酸含有溶液を用いた。リンタングステン酸含有溶液は、６．７％リンタングステン酸水溶液をストック溶液とし、ストック溶液１．５ｍｌに対し、１．５ｍｌの水及び１００％エタノール７ｍｌを添加して染色液とし、試料を染色した。染色後の皮膚試料をＰＢＳで洗浄し、μＣＴ（D200RSS270;Comscan Techno)により測定した。前処理溶液−染色液の組合せ：（１）ＰＦＡ−ヨウ素含有溶液（Lugol）、（２）ＰＦＡ−リンタングステン酸、（３）アセトン−ヨウ素含有溶液（Lugol）、及び（４）アセトン−リンタングステン酸についてのＸ線マイクロＣＴの取得画像を図１に示す。【００２８】
前処理−染色液として、（３）アセトン−ヨウ素含有溶液を用いて取得した３次元画像を示す（図２）。図２には、器官（毛（hair)、立毛筋（hair muscle, arrector pili)、汗腺（sweat gland)、及び皮脂腺（sebaceous gland)）並びに組織（表皮（epidermis)、真皮層（dermal layer））が表示される。【００２９】
実施例２：
３０代の同年齢の２名の女性の皮膚外観について写真をとり、また皮膚の内部を超音波造影装置で画像を取得した。１名の皮膚外観は正常であったが、もう１名の皮膚外観は皮膚のたるみを有していた。皮膚外観と、超音波画像を図３Ａ示す。同じ年齢の対象であっても、皮膚のたるみがある対象の皮膚では、超音波画像において真皮部分への脂肪組織の隆起（以下、真皮空洞という）が見られるのに対し、たるみのない正常対象の皮膚では、そのような空洞は見られなかった。次に皮膚における真皮空洞の大きさと、その部分の堅さとの関係について、被験者を変えて計測した。皮膚の弾力性（skin firmness）は、キュートメーターを用いてＵｒ／Ｕｆ値を測定することにより決定した。結果を図３Ｂに示す。【００３０】
本発明者らが、真皮空洞の原因を探るべく、実施例１で得られた３次元画像を解析していたところ、真皮空洞が存在する箇所に汗腺が存在していることを発見した（図４Ａ）。汗腺と真皮空洞との関連を調べるため、組織切片染色画像において、汗腺（sweat gland)、皮脂腺（Sebaceous gland）、及び毛嚢（Hair follicle)について観察したところ、汗腺において特異的に真皮空洞が存在することがわかった（図４Ｂ）。汗腺と真皮空洞との共局在率を計算した（図４Ｃ）。【００３１】
次に、３０代の皮膚における汗腺と、６０代の皮膚における汗腺を、３次元画像及び組織切片染色画像の両者で比較したところ、６０代の皮膚では、汗腺の位置が浅くなっていることが分かり、年齢と共に萎縮していることが分かった（図５）。そして汗腺が萎縮した領域に、真皮空洞として、脂肪組織が隆起していることが分かった。【００３２】
３０代及び６０代の皮膚における汗腺の深度を求めた。深度は、皮膚表面から、汗腺の最深部までの距離で表した。また、真皮空洞化の重篤度を、皮膚表面から空洞の最上部までの距離として表した。したがって、汗腺深度と年齢、汗腺深度と真皮空洞化の重篤度との相関を調べた。結果を下記の表に示す。
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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