【手続補正書】
【提出日】平成31年4月5日(2019.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
初代細胞において標的核酸の遺伝子調節を誘導するための方法であって、
（ａ）標的核酸に相補的な第１のヌクレオチド配列、およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含む修飾型単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、前記第１のヌクレオチド配列および／または前記第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの１個または複数が修飾型ヌクレオチドである、修飾型単一ガイドＲＮＡ；ならびに
（ｂ）Ｃａｓポリペプチド、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、および／またはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター
を初代細胞へ導入するステップ
を含み、
前記修飾型ｓｇＲＮＡが前記Ｃａｓポリペプチドを標的核酸へ導き、
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡと比較して増強した活性で標的核酸の遺伝子調節を誘導する、方法。
【請求項２】
前記増強した活性が、前記修飾型ｓｇＲＮＡの増加した安定性および／または前記修飾型ｓｇＲＮＡの標的核酸に対する増加した特異性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸が標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子調節が前記標的ＤＮＡのゲノム編集を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲノム編集が、標的ＤＮＡの相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
組換えドナー修復鋳型を前記初代細胞へ導入するステップをさらに含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記組換えドナー修復鋳型が、前記標的ＤＮＡの２つの重複しない相同部分を含む２つのヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、ゲノム編集を受ける前記標的ＤＮＡに対応するヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に位置する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組換えドナー修復鋳型が、一塩基多型（ＳＮＰ）を正すための変異をコードするヌクレオチド配列を含む合成の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）鋳型、および標的ＤＮＡの２つの重複しない相同部分を含む２つのヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、変異をコードするヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に位置する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子調節が、エンドヌクレアーゼ欠損Ｃａｓポリペプチドを用いた、前記標的ＤＮＡまたは前記標的ＲＮＡの遺伝子発現の阻害または活性化を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記修飾型ｓｇＲＮＡおよび前記Ｃａｓポリペプチドを前記初代細胞へ導入する前に、前記初代細胞が多細胞生物体から単離される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記多細胞生物体が、植物、多細胞原生生物、多細胞真菌、または動物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記初代細胞が、幹細胞、免疫細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記幹細胞が、造血幹細胞・造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）、間葉幹細胞、神経幹細胞、臓器幹細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記修飾型ｓｇＲＮＡおよび前記Ｃａｓポリペプチドを前記初代細胞へ導入した後に、前記初代細胞またはその子孫が前記多細胞生物体へ戻される、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記初代細胞が初代細胞集団を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記初代細胞集団の少なくとも約３０％において前記標的核酸の遺伝子調節を誘導する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記初代細胞集団の少なくとも約４０％において前記標的核酸の遺伝子調節を誘導する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記初代細胞集団の少なくとも約５０％において前記標的核酸の遺伝子調節を誘導する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記初代細胞集団の少なくとも約６０％において前記標的核酸の遺伝子調節を誘導する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記修飾型ヌクレオチドが、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組合せにおける修飾を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記リボース基における修飾が、前記リボース基の２’位における修飾を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リボース基の２’位における修飾が、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−デオキシ、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記リン酸基における修飾が、ホスホロチオエート修飾を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記修飾型ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル３’−ホスホロチオエート（ＭＳ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル３’−チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）ヌクレオチド、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１のヌクレオチド配列が約２０ヌクレオチド長である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上が、修飾型ヌクレオチドである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記修飾型ヌクレオチドが、前記第１のヌクレオチド配列の５’末端に、もしくは５’末端の近くに、および／または前記第１のヌクレオチド配列内の内部の位置に位置する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの約１０％から約３０％までが修飾型ヌクレオチドである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２のヌクレオチド配列が約８０ヌクレオチド長である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上が、修飾型ヌクレオチドである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記修飾型ヌクレオチドが、前記第２のヌクレオチド配列の３’末端に、もしくは３’末端の近くに、および／または前記第２のヌクレオチド配列内の内部の位置に位置する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの約１％から約１０％までが修飾型ヌクレオチドである、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記第１のヌクレオチド配列の５’末端、または５’末端の近くにおける１個、２個、または３個の連続した、または非連続の修飾型ヌクレオチド、および前記第２のヌクレオチド配列の３’末端、または３’末端の近くにおける１個、２個、または３個の連続した、または非連続の修飾型ヌクレオチドを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記第１のヌクレオチド配列の５’末端における３個の連続した修飾型ヌクレオチド、および前記第２のヌクレオチド配列の３’末端における３個の連続した修飾型ヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記修飾型ｓｇＲＮＡが化学合成される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記修飾型ｓｇＲＮＡが少なくとも２個の異なる修飾型ｓｇＲＮＡを含み、各修飾型ｓｇＲＮＡが、異なる標的核酸へ方向づけられている、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｃａｓポリペプチドが、前記ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９ポリペプチド、そのバリアント、またはその断片である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記初代細胞へ導入するステップが、前記初代細胞をエレクトロポレーションすることを含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８６】
前述の発明は、理解を明りょうにするために、例証および例としてかなり詳細に記載されているが、当業者は、ある特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲内で実施され得ることを認識しているだろう。加えて、本明細書に提供された各参考文献は、各参考文献を個々に引用することにより本明細書の一部をなすものとするのと同じ程度でその全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
なお、出願時の特許請求の範囲は、以下のとおりである。
［請求項１］
初代細胞において標的核酸の遺伝子調節を誘導するための方法であって、
（ａ）標的核酸に相補的な第１のヌクレオチド配列、およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含む修飾型単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、前記第１のヌクレオチド配列および／または前記第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの１個または複数が修飾型ヌクレオチドである、修飾型単一ガイドＲＮＡ；ならびに
（ｂ）Ｃａｓポリペプチド、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、および／またはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター
を初代細胞へ導入するステップ
を含み、
前記修飾型ｓｇＲＮＡが前記Ｃａｓポリペプチドを標的核酸へ導き、
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡと比較して増強した活性で標的核酸の遺伝子調節を誘導する、方法。
［請求項２］
前記増強した活性が、前記修飾型ｓｇＲＮＡの増加した安定性および／または前記修飾型ｓｇＲＮＡの標的核酸に対する増加した特異性を含む、請求項１に記載の方法。
［請求項３］
前記標的核酸が標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡを含む、請求項１または２に記載の方法。
［請求項４］
前記遺伝子調節が前記標的ＤＮＡのゲノム編集を含む、請求項３に記載の方法。
［請求項５］
前記ゲノム編集が、標的ＤＮＡの相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含む、請求項４に記載の方法。
［請求項６］
組換えドナー修復鋳型を前記初代細胞へ導入するステップをさらに含む、請求項４または５に記載の方法。
［請求項７］
前記組換えドナー修復鋳型が、前記標的ＤＮＡの２つの重複しない相同部分を含む２つのヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、ゲノム編集を受ける前記標的ＤＮＡに対応するヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に位置する、請求項６に記載の方法。
［請求項８］
前記組換えドナー修復鋳型が、一塩基多型（ＳＮＰ）を正すための変異をコードするヌクレオチド配列を含む合成の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）鋳型、および標的ＤＮＡの２つの重複しない相同部分を含む２つのヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、変異をコードするヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に位置する、請求項６に記載の方法。
［請求項９］
前記遺伝子調節が、エンドヌクレアーゼ欠損Ｃａｓポリペプチドを用いた、前記標的ＤＮＡまたは前記標的ＲＮＡの遺伝子発現の阻害または活性化を含む、請求項３に記載の方法。
［請求項１０］
前記修飾型ｓｇＲＮＡおよび前記Ｃａｓポリペプチドを前記初代細胞へ導入する前に、前記初代細胞が多細胞生物体から単離される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１１］
前記多細胞生物体が、植物、多細胞原生生物、多細胞真菌、または動物である、請求項１０に記載の方法。
［請求項１２］
前記初代細胞が、幹細胞、免疫細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１３］
前記幹細胞が、造血幹細胞・造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）、間葉幹細胞、神経幹細胞、臓器幹細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
［請求項１４］
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
［請求項１５］
前記修飾型ｓｇＲＮＡおよび前記Ｃａｓポリペプチドを前記初代細胞へ導入した後に、前記初代細胞またはその子孫が前記多細胞生物体へ戻される、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１６］
前記初代細胞が初代細胞集団を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１７］
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記初代細胞集団の少なくとも約３０％において前記標的核酸の遺伝子調節を誘導する、請求項１６に記載の方法。
［請求項１８］
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記初代細胞集団の少なくとも約４０％において前記標的核酸の遺伝子調節を誘導する、請求項１６に記載の方法。
［請求項１９］
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記初代細胞集団の少なくとも約５０％において前記標的核酸の遺伝子調節を誘導する、請求項１６に記載の方法。
［請求項２０］
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記初代細胞集団の少なくとも約６０％において前記標的核酸の遺伝子調節を誘導する、請求項１６に記載の方法。
［請求項２１］
前記修飾型ヌクレオチドが、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組合せにおける修飾を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２２］
前記リボース基における修飾が、前記リボース基の２’位における修飾を含む、請求項２１に記載の方法。
［請求項２３］
前記リボース基の２’位における修飾が、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−デオキシ、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
［請求項２４］
前記リン酸基における修飾が、ホスホロチオエート修飾を含む、請求項２１に記載の方法。
［請求項２５］
前記修飾型ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル３’−ホスホロチオエート（ＭＳ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル３’−チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）ヌクレオチド、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２６］
前記第１のヌクレオチド配列が約２０ヌクレオチド長である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２７］
前記第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上が、修飾型ヌクレオチドである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２８］
前記修飾型ヌクレオチドが、前記第１のヌクレオチド配列の５’末端に、もしくは５’末端の近くに、および／または前記第１のヌクレオチド配列内の内部の位置に位置する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２９］
前記第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの約１０％から約３０％までが修飾型ヌクレオチドである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
［請求項３０］
前記第２のヌクレオチド配列が約８０ヌクレオチド長である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
［請求項３１］
前記第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上が、修飾型ヌクレオチドである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
［請求項３２］
前記修飾型ヌクレオチドが、前記第２のヌクレオチド配列の３’末端に、もしくは３’末端の近くに、および／または前記第２のヌクレオチド配列内の内部の位置に位置する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
［請求項３３］
前記第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの約１％から約１０％までが修飾型ヌクレオチドである、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
［請求項３４］
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記第１のヌクレオチド配列の５’末端、または５’末端の近くにおける１個、２個、または３個の連続した、または非連続の修飾型ヌクレオチド、および前記第２のヌクレオチド配列の３’末端、または３’末端の近くにおける１個、２個、または３個の連続した、または非連続の修飾型ヌクレオチドを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
［請求項３５］
前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記第１のヌクレオチド配列の５’末端における３個の連続した修飾型ヌクレオチド、および前記第２のヌクレオチド配列の３’末端における３個の連続した修飾型ヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の方法。
［請求項３６］
前記修飾型ｓｇＲＮＡが化学合成される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
［請求項３７］
前記修飾型ｓｇＲＮＡが少なくとも２個の異なる修飾型ｓｇＲＮＡを含み、各修飾型ｓｇＲＮＡが、異なる標的核酸へ方向づけられている、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
［請求項３８］
前記Ｃａｓポリペプチドが、前記ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
［請求項３９］
前記Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９ポリペプチド、そのバリアント、またはその断片である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
［請求項４０］
前記初代細胞へ導入するステップが、前記初代細胞をエレクトロポレーションすることを含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
［請求項４１］
対象において遺伝的疾患を予防または処置するための方法であって、
前記遺伝的疾患に関連した標的遺伝子における変異を正すのに十分な量で修飾型単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を前記対象に投与するステップであって、前記修飾型ｓｇＲＮＡが、前記標的遺伝子に相補的な第１のヌクレオチド配列、およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含み、かつ前記第１のヌクレオチド配列および／または前記第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの１個または複数が修飾型ヌクレオチドである、ステップ
を含む、方法。
［請求項４２］
前記遺伝的疾患が、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症、鎌状赤血球貧血、サラセミア、血友病、腫瘍症、癌、ＨＩＶ感染症、加齢黄斑変性、統合失調症、トリヌクレオチドリピート障害、脆弱Ｘ症候群、プリオン関連障害、筋萎縮性側索硬化症、薬物依存、自閉症、アルツハイマー病、パーキンソン病、嚢胞性線維症、血液凝固性疾患または障害、炎症、免疫関連疾患または障害、代謝性疾患、肝臓疾患および障害、腎臓疾患および障害、筋肉／骨格疾患および障害、神経学的および神経細胞の疾患および障害、心血管疾患および障害、肺疾患および障害、ならびに眼疾患および障害からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
［請求項４３］
Ｃａｓポリペプチド、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、および／またはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを対象に投与するステップをさらに含む、請求項４１または４２に記載の方法。
［請求項４４］
前記Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９ポリペプチド、そのバリアント、またはその断片である、請求項４３に記載の方法。
［請求項４５］
組換えドナー修復鋳型を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
［請求項４６］
前記修飾型ｓｇＲＮＡの投与が、対応する非修飾型ｓｇＲＮＡの投与と比較して、前記標的遺伝子において前記変異を正す前記Ｃａｓポリペプチドの効果を増強する、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
［請求項４７］
前記修飾型ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓポリペプチド、および／または組換えドナー修復鋳型が、薬学的に許容される担体と共に前記対象に投与される、請求項４５または４６に記載の方法。
［請求項４８］
前記修飾型ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓポリペプチド、および／または組換えドナー修復鋳型が、ナノ粒子、リポソーム、ミセル、ビロソーム、核酸複合体、およびそれらの組合せからなる群から選択される送達系によって前記対象へ投与される、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
［請求項４９］
前記核酸複合体が、前記Ｃａｓポリペプチドと複合体化した前記修飾型ｓｇＲＮＡを含む、請求項４８に記載の方法。
［請求項５０］
前記修飾型ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓポリペプチド、および／または組換えドナー修復鋳型が、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、皮下、細動脈内、脳室内、頭蓋内、病巣内、髄腔内、局所的、経粘膜、鼻腔内、およびそれらの組合せからなる群から選択される送達経路によって対象へ投与される、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の方法。