(57)【要約】  本願発明は、ヒト被検者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の特定のメチル化可変領域中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程を有し、前記基準値が、各メチル化可変領域のメチル化率に対してそれぞれ設定された、孤発性大腸癌患者と非孤発性大腸癌患者を識別するための値であり、前記多変量判別式が、特定のメチル化可変領域のうちの１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、孤発性大腸癌発症可能性の判定方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、
ヒト被検者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、表１〜７に記載のメチル化可変領域番号１〜１２１で表される各メチル化可変領域中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程
を有し、
前記メチル化可変領域の平均メチル化率が、当該メチル化可変領域中のＣｐＧサイトのうち、前記測定工程においてメチル化率が測定された全てのＣｐＧサイトのメチル化率の平均値であり、
前記基準値が、各メチル化可変領域の平均メチル化率に対してそれぞれ設定された、孤発性大腸癌患者と非孤発性大腸癌患者を識別するための値であり、
前記多変量判別式が、前記メチル化可変領域番号１〜１２１で表されるメチル化可変領域のうちの１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、
孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【表１】
2018062361.tif 000033
【表２】
2018062361.tif 000034
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
2018062361.tif 000039
【請求項２】
前記測定工程において、メチル化可変領域番号８〜１５、３５〜５２、及び１１１〜１２１で表されるメチル化可変領域のうち１か所以上が、平均メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、メチル化可変領域番号１〜７、１６〜３４、及び５３〜１１０で表されるメチル化可変領域のうち１か所以上が、平均メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項１に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項３】
前記測定工程において、前記多変量判別式がその平均メチル化率を変数として含むメチル化可変領域中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項１に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項４】
前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１〜１２１で表されるメチル化可変領域から選択される２か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、請求項３に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項５】
前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１〜１２１で表されるメチル化可変領域から選択される３か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、請求項３に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項６】
前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１〜５２で表されるメチル化可変領域からなる群より選択される１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、請求項３に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項７】
前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１〜１５で表されるメチル化可変領域からなる群より選択される１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、請求項３に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項８】
孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、
ヒト被検者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、配列番号１〜９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたメチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程
を有し、
前記基準値が、各ＣｐＧサイトのメチル化率に対してそれぞれ設定された、孤発性大腸癌患者と非孤発性大腸癌患者を識別するための値であり、
前記多変量判別式が、前記配列番号１〜９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む、
孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項９】
前記測定工程において、２〜１０個のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する、請求項８に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１０】
前記判定工程において、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７〜２０、２３〜２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１〜４８、５０〜５４、５９、６５〜６８、７０〜７７、７９〜８６、９０、及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７〜９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、４９、５５〜５８、６０〜６４、６９、７８、８７〜８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８又は９に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１１】
前記測定工程において、配列番号１〜５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７〜２０、２３〜２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１〜４８、及び５０〜５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７〜９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、及び４９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１２】
前記判定工程において、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７〜２０、２３〜２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１〜４８、及び５０〜５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号２、３、５、７〜９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、及び４９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が３以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１３】
前記測定工程において、配列番号１〜８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号１、４、及び６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７、及び８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１４】
前記判定工程において、配列番号１、４、及び６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号２、３、５、７、及び８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が３以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１０、及び１３のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１５】
前記測定工程において、配列番号５５〜８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号５９、６５〜６８、７０〜７７、及び７９〜８６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号５５〜５８、６０〜６４、６９、７８、及び８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１６】
前記判定工程において、配列番号５９、６５〜６８、７０〜７７、及び７９〜８６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号５５〜５８、６０〜６４、６９、７８、及び８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１０、及び１５のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１７】
前記測定工程において、配列番号８８〜９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号９０及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号８８、８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１８】
前記判定工程において、配列番号９０及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号８８、８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１０、及び１７のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１９】
前記和が５以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項１２、１４、１６、又は１８に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２０】
前記多変量判別式が、配列番号５５〜８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含み、
前記測定工程において、前記多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８又は９に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２１】
前記多変量判別式が、配列番号８８〜９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含み、
前記測定工程において、前記多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８又は９に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２２】
前記多変量判別式が、ロジスティック回帰式、線形判別式、ナイーブベイズ分類器で作成された式、又はサポートベクターマシンで作成された式である、請求項８〜２１のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２３】
前記生体試料が、腸管組織である、請求項８〜２２のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２４】
前記生体試料が、直腸粘膜組織である、請求項８〜２３のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２５】
前記直腸粘膜組織が、
採取具と、採取補助具とを備え、
前記採取具は、一対の板状体である第１の挟持片と第２の挟持片とからなり、
前記第１の挟持片と前記第２の挟持片は、それぞれ、挟持部と把持部とバネ部と固定部とから構成されており、
前記採取補助具は、
側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
棒状の把持部と、
を有し、
前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい方の辺縁部近傍に連結しており、
前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい方の辺縁部から外径が大きい方の辺縁部に向かって設けられており、
前記スリットの幅が、前記第１の挟持片と前記第２の挟持片が挟持部側の端部同士で接着した状態の幅よりも広く、
前記採取具導入部の大きい方の外径が３０〜７０ｍｍであり、回転軸方向の長さが５０〜１５０ｍｍである、大腸粘膜採取用キットによって採取されたものである、請求項２４に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２６】
前記第１の挟持片の挟持部のうち第２の挟持片と対向する面の端部と、前記第２の挟持片の挟持部のうち第１の挟持片と対向する面の端部と、の少なくとも一方に窪み部が設けられている、請求項２５に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２７】
採取具と、採取補助具とを備える大腸粘膜採取用キットであり、
前記採取具は、
一対の板状体である第１の挟持片と第２の挟持片とからなり、
前記第１の挟持片と前記第２の挟持片は、それぞれ、挟持部と把持部とバネ部と固定部とから構成されており、
前記採取補助具は、
側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
棒状の把持部と、
を有し、
前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい方の辺縁部近傍に連結しており、
前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい方の辺縁部から外径が大きい方の辺縁部に向かって設けられており、
前記スリットの幅が、前記第１の挟持片と前記第２の挟持片が挟持部側の端部同士で接着した状態の幅よりも広く、
前記採取具導入部の大きい方の外径が３０〜７０ｍｍであり、回転軸方向の長さが５０〜１５０ｍｍである、大腸粘膜採取用キット。
【請求項２８】
前記第１の挟持片の挟持部のうち第２の挟持片と対向する面の端部と、前記第２の挟持片の挟持部のうち第１の挟持片と対向する面の端部と、の少なくとも一方に窪み部が設けられている、請求項２７に記載の大腸粘膜採取用キット。
【請求項２９】
配列番号１〜９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトを含む部分塩基配列を有するＤＮＡ断片からなり、ヒト被検者の孤発性大腸癌発症可能性を判定するために用いられる、ＤＮＡメチル化率分析用マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸疾患の自覚症状のないヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する方法に関する。
本願は、２０１６年９月２９日に出願されたＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０７８８１０および２０１７年３月３１に日本に出願された特願２０１７−０７２６７４に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌は、初期に適切な治療を行うことにより治癒率が高い癌である。しかし、初期には自覚症状がない場合が多く、このため、健康診断等で定期的に検査し、早期に発見できることが好ましい。大腸癌検診としては、便潜血検査が広く行われている。便潜血検査は、便をサンプルとするため、非侵襲的である点で、スクリーニング検査としては優れている。しかし、細菌性やウイルス性腸炎、憩室出血、肛門疾患（痔核、痔瘻、裂肛）のように、便中に血液が混じる他の疾患と区別することができないという問題がある。【０００３】
大腸癌を便潜血検査で陽性となる他の疾患と区別してより精度よく調べる検査としては、内視鏡検査がある。しかしながら、早期の大腸癌を視認により検出することは、手技者の技量によるところが大きく、一般的に困難である。また、内視鏡検査は侵襲性が高く、被検者の負担も大きいという問題もある。【０００４】
内視鏡検査よりも非侵襲的に潰瘍性大腸炎を背景とした大腸粘膜に発生した大腸癌を早期に発見する方法として、ＤＮＡのメチル化をバイオマーカーとする方法がある。例えば、特許文献１には、潰瘍性大腸炎患者において、腫瘍性組織におけるｍｉＲ−１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１３７、及びｍｉＲ−３４ｂ／cの５種のｍｉＲＮＡ遺伝子のメチル化率は、非腫瘍性潰瘍性大腸炎組織に比べて有意に高いこと、また非癌部である直腸粘膜から採取された生体試料中の前記５種のｍｉＲＮＡ遺伝子のメチル化率は、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症のマーカーとし得ることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１５１５５１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、大腸疾患の自覚症状のないヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を、内視鏡検査よりも侵襲性が低く、より被検者の負担が小さい方法で判定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、大腸疾患の自覚症状のないヒト被検者のゲノムＤＮＡ中のＣｐＧサイト（シトシン−ホスホジエステル結合−グアニン）のメチル化率を網羅的に調べたところ、大腸癌を発症した患者と孤発性大腸癌を発症していないヒト被検者においてメチル化率に顕著な差がある９３種のＣｐＧサイトを見出し、を見出し、また、別に１２１のメチル化可変領域（differentially methylated region、「ＤＭＲ」ということがある。）を見出し、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［２９］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法、ＤＮＡメチル化率分析用マーカー、及び大腸粘膜採取用キットを提供する。
［１］  孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、
ヒト被検者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、表１〜７に記載のメチル化可変領域番号１〜１２１で表される各メチル化可変領域中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程
を有し、
前記メチル化可変領域の平均メチル化率が、当該メチル化可変領域中のＣｐＧサイトのうち、前記測定工程においてメチル化率が測定された全てのＣｐＧサイトのメチル化率の平均値であり、
前記基準値が、各メチル化可変領域の平均メチル化率に対してそれぞれ設定された、孤発性大腸癌患者と非孤発性大腸癌患者を識別するための値であり、
前記多変量判別式が、前記メチル化可変領域番号１〜１２１で表されるメチル化可変領域のうちの１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、
孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。【０００９】
【表１】
2018062361.tif 000002
【００１０】
【表２】
2018062361.tif 000003
【００１１】
【表３】
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【００１２】
【表４】
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【００１３】
【表５】
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【００１４】
【表６】
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【００１５】
【表７】
2018062361.tif 000008
【００１６】
［２］  前記測定工程において、メチル化可変領域番号８〜１５、３５〜５２、及び１１１〜１２１で表されるメチル化可変領域のうち１か所以上が、平均メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、メチル化可変領域番号１〜７、１６〜３４、及び５３〜１１０で表されるメチル化可変領域のうち１か所以上が、平均メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［１］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［３］  前記測定工程において、前記多変量判別式がその平均メチル化率を変数として含むメチル化可変領域中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［１］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［４］  前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１〜１２１で表されるメチル化可変領域から選択される２か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記［３］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［５］  前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１〜１２１で表されるメチル化可変領域から選択される３か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記［３］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［６］  前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１〜５２で表されるメチル化可変領域からなる群より選択される１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記［３］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［７］  前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１〜１５で表されるメチル化可変領域からなる群より選択される１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記［３］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。  【００１７】
［８］  孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、
ヒト被検者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、配列番号１〜９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたメチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程
を有し、
前記基準値が、各ＣｐＧサイトのメチル化率に対してそれぞれ設定された、孤発性大腸癌患者と非孤発性大腸癌患者を識別するための値であり、
前記多変量判別式が、前記配列番号１〜９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む、孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［９］  前記測定工程において、２〜１０個のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する、前記［８］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１０］  前記判定工程において、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７〜２０、２３〜２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１〜４８、５０〜５４、５９、６５〜６８、７０〜７７、７９〜８６、９０、及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７〜９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、４９、５５〜５８、６０〜６４、６９、７８、８７〜８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］又は［９］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１１］  前記測定工程において、配列番号１〜５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７〜２０、２３〜２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１〜４８、及び５０〜５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７〜９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、及び４９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１０］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１２］  前記判定工程において、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７〜２０、２３〜２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１〜４８、及び５０〜５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号２、３、５、７〜９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、及び４９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が３以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１１］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１３］  前記測定工程において、配列番号１〜８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号１、４、及び６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７、及び８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１０］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１４］  前記判定工程において、配列番号１、４、及び６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号２、３、５、７、及び８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が３以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１０］、及び［１３］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１５］  前記測定工程において、配列番号５５〜８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号５９、６５〜６８、７０〜７７、及び７９〜８６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号５５〜５８、６０〜６４、６９、７８、及び８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１０］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１６］  前記判定工程において、配列番号５９、６５〜６８、７０〜７７、及び７９〜８６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号５５〜５８、６０〜６４、６９、７８、及び８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１０］、及び［１５］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１７］  前記測定工程において、配列番号８８〜９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号９０及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号８８、８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１０］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１８］  前記判定工程において、配列番号９０及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号８８、８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１０］、及び［１７］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１９］  前記和が５以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［１２］、［１４］、［１６］、又は［１８］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［２０］  前記多変量判別式が、配列番号５５〜８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含み、  前記測定工程において、前記多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］又は［９］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［２１］  前記多変量判別式が、配列番号８８〜９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含み、  前記測定工程において、前記多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］又は［９］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［２２］  前記多変量判別式が、ロジスティック回帰式、線形判別式、ナイーブベイズ分類器で作成された式、又はサポートベクターマシンで作成された式である、前記［８］〜［２１］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［２３］  前記生体試料が、腸管組織である、前記［８］〜［２２］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［２４］  前記生体試料が、直腸粘膜組織である、前記［８］〜［２３］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。【００１８】
［２５］  前記直腸粘膜組織が、
採取具と、採取補助具とを備え、
前記採取具は、一対の板状体である第１の挟持片と第２の挟持片とからなり、
前記第１の挟持片と前記第２の挟持片は、それぞれ、挟持部と把持部とバネ部と固定部とから構成されており、
前記採取補助具は、
側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
棒状の把持部と、
を有し、
前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい方の辺縁部近傍に連結しており、
前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい方の辺縁部から外径が大きい方の辺縁部に向かって設けられており、
前記スリットの幅が、前記第１の挟持片と前記第２の挟持片が挟持部側の端部同士で接着した状態の幅よりも広く、
前記採取具導入部の大きい方の外径が３０〜７０ｍｍであり、回転軸方向の長さが５０〜１５０ｍｍである、大腸粘膜採取用キットによって採取されたものである、前記［２４］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［２６］  前記第１の挟持片の挟持部のうち第２の挟持片と対向する面の端部と、前記第２の挟持片の挟持部のうち第１の挟持片と対向する面の端部と、の少なくとも一方に窪み部が設けられている、前記［２５］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［２７］  採取具と、採取補助具とを備える大腸粘膜採取用キットであり、
前記採取具は、
一対の板状体である第１の挟持片と第２の挟持片とからなり、
前記第１の挟持片と前記第２の挟持片は、それぞれ、挟持部と把持部とバネ部と固定部とから構成されており、
前記採取補助具は、
側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
棒状の把持部と、
を有し、
前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい方の辺縁部近傍に連結しており、
前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい方の辺縁部から外径が大きい方の辺縁部に向かって設けられており、
前記スリットの幅が、前記第１の挟持片と前記第２の挟持片が挟持部側の端部同士で接着した状態の幅よりも広く、
前記採取具導入部の大きい方の外径が３０〜７０ｍｍであり、回転軸方向の長さが５０〜１５０ｍｍである、大腸粘膜採取用キット。
［２８］  前記第１の挟持片の挟持部のうち第２の挟持片と対向する面の端部と、前記第２の挟持片の挟持部のうち第１の挟持片と対向する面の端部と、の少なくとも一方に窪み部が設けられている、前記［２７］の大腸粘膜採取用キット。
［２９］  配列番号１〜９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトを含む部分塩基配列を有するＤＮＡ断片からなり、ヒト被検者の孤発性大腸癌発症可能性を判定するために用いられる、ＤＮＡメチル化率分析用マーカー。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る孤発性大腸癌発症可能性の判定方法により、ヒト被検者、特に大腸疾患の自覚症状のないヒト被検者から採取された生体試料について、ゲノムＤＮＡ中の特定のＣｐＧサイトのメチル化率又は特定のＤＭＲの平均メチル化率を調べることによって、孤発性大腸癌発症の可能性を判定することができる。
また、本発明に係る直腸粘膜採取用キットにより、患者の肛門から比較的安全かつ簡便に直腸粘膜を採取することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、採取具２の一実施態様の説明図である。
【図２】図２は、採取補助具１１の一実施態様の説明図である。
【図３】図３は、直腸粘膜採取用キットの使用態様の説明図である。
【図４】図４は、実施例１において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された５４ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づくクラスター解析である。
【図５】図５は、実施例１において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された８ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づくクラスター解析である。
【図６】図６は、実施例１において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された５４ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づく主成分分析である。
【図７】図７は、実施例１において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された８ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づく主成分分析である。
【図８】図８は、実施例２において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された３３ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づくクラスター解析である。
【図９】図９は、実施例２において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された３３ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づく主成分分析である。
【図１０】図１０は、実施例２において、配列番号５７で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ０１１０５４０３）、配列番号６３で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ０６８２９６８６）、及び配列番号７７で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ１４６２９３９７）の３個のＣｐＧサイトのメチル化率をマーカーとした場合の、孤発性大腸癌発症の有無の検査のＲＯＣ曲線である。
【図１１】図１１は、実施例３において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された６ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づくクラスター解析である。
【図１２】図１２は、実施例３において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された６ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づく主成分分析である。
【図１３】図１３は、実施例４において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜されたＤＭＲ１２１か所（１２１ＤＭＲセット）のメチル化率に基づくクラスター解析の結果である。
【図１４】図１４は、実施例４において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された１２１ＤＭＲセットのメチル化率に基づく主成分分析の結果である。
【図１５】図１５は、実施例４において、ＤＭＲ番号１１で表されるＤＭＲ、ＤＭＲ番号２４で表されるＤＭＲ、及びＤＭＲ番号４２で表されるＤＭＲの３個のＤＭＲの平均メチル化率をマーカーとした場合の、孤発性大腸炎患者の大腸癌発症の有無の検査のＲＯＣ曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ゲノムＤＮＡ中のＣｐＧサイトのシトシン塩基は、５位の炭素がメチル化修飾を受け得る。本発明及び本願明細書において、ＣｐＧサイトのメチル化率とは、一つの生物個体から採取された生体試料中のＣｐＧサイトのうち、メチル化されているシトシン塩基（メチル化シトシン）量とメチル化されていないシトシン塩基（非メチル化シトシン）量とを測定し、両者の和に対するメチル化シトシン量の割合（％）を意味する。また、本発明及び本願明細書において、ＤＭＲの平均メチル化率とは、ＤＭＲに存在する複数のＣｐＧサイトのメチル化率の相加平均値（算術平均値）又は相乗平均値（幾何平均値）を意味するが、これ以外の平均値でもよい。
【００２２】
本発明及び本願明細書において、「孤発性大腸癌」とは、その背景に明らかな原因疾患を認めず、家族歴や遺伝子検査から明確な遺伝性大腸癌も認めない個人に対して、加齢や食事、生活様式等の環境因子により偶発的な遺伝子変異が蓄積することによって発症する大腸癌であり、散発性と呼ばれることもある大腸癌である。すなわち、孤発性大腸癌には、明らかな原因疾患から発症する大腸癌及び遺伝性大腸癌を除く全ての大腸癌が含まれる。例えば、潰瘍性大腸炎等の他の大腸の炎症性疾患が進行して発症する大腸癌は、孤発性大腸癌には含まれない（Cellular and Molecular Life Sciences，2014，vol.71(18)，p.3523-3535；Cancer Letters，2014，vol.345，p.235-241）。また、家族性大腸腺腫症（familial adenomatous polyposis: FAP）やリンチ症候群（Lynch syndrome）等の遺伝性大腸癌も孤発性大腸癌には含まれない（Cancer，2015, 9:520）。
【００２３】
＜孤発性大腸癌発症可能性の判定方法＞
本発明に係る孤発性大腸癌発症可能性の判定方法（以下、「本発明に係る判定方法」ということがある。）は、ヒト被検者の孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、ゲノムＤＮＡ中のＣｐＧサイト又はＤＭＲのうち、メチル化率が、大腸癌を発症しておらず、かつ他の大腸疾患の自覚症状もない健常者群と、孤発性大腸癌を発症した大腸癌患者群とで差があるものをマーカーとすることを特徴とする。これらのマーカーとなるＣｐＧサイトのメチル化率又はＤＭＲの平均メチル化率を指標として、ヒト被検者が大腸癌を発症している可能性の高低を判定する。特定のＣｐＧサイトのメチル化率又は特定のＤＭＲの平均メチル化率を、ヒト被検者の孤発性大腸癌発症可能性を判定するために用いられるマーカーとすることにより、視認判別が非常に困難である早期孤発性大腸癌をより客観的かつ感度よく検出することができ、早期発見が期待できる。
【００２４】
本発明に係る判定方法においてマーカーとして用いられるＣｐＧサイト又はＤＭＲの平均メチル化率は、健常者と孤発性大腸癌の発症者とを区別し得る。このため、本発明に係る判定方法は、大腸疾患の自覚症状のないヒトの孤発性大腸癌の発症の可能性の判定に好適である。また、本発明に係る判定方法は、内視鏡検査よりも非侵襲的であり、かつ便潜血検査よりも精度よく孤発性大腸癌の発症の可能性を判定し得るため、特に大腸検診のような大腸癌のスクリーニング検査に有用である。例えば、便潜血検査において陽性であった被検者に対し、本発明に係る判定方法を行うことができる。
【００２５】
マーカーとするＣｐＧサイトのメチル化率に基づく孤発性大腸癌発症可能性の判定は、測定されたＣｐＧサイトのメチル化率の値自体に基づいて行ってもよく、マーカーとするＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む多変量判別式を用い、この多変量判別式から求められる判別値に基づいて行ってもよい。
【００２６】
マーカーとするＤＭＲの平均メチル化率に基づく孤発性大腸癌発症可能性の判定は、ＤＭＲ中の２以上のＣｐＧサイトのメチル化率から算出されたＤＭＲの平均メチル化率の値自体に基づいて行ってもよく、マーカーとするＤＭＲの平均メチル化率を変数として含む多変量判別式を用い、この多変量判別式から求められる判別値に基づいて行ってもよい。
【００２７】
本発明においてマーカーとされるＣｐＧサイト及びＤＭＲとしては、メチル化率が非大腸癌発症者群と孤発性大腸癌（以下、単に「大腸癌」ということがある。）患者群とで大きく相違するものが好ましい。両群の差が大きいほど、孤発性大腸癌の発症の有無をより確実に検出することができる。本発明においてマーカーとされるＣｐＧサイト及びＤＭＲは、大腸癌患者のメチル化率が非大腸癌発症者よりも有意に高い、すなわち、大腸癌の発症によりメチル化率が高くなるものであってもよく、大腸癌患者のメチル化率が非大腸癌発症者よりも有意に低い、すなわち、孤発性大腸癌の発症によりメチル化率が低くなるものであってもよい。
【００２８】
本発明においてマーカーとされるＣｐＧサイト及びＤＭＲとしては、同一の大腸癌患者において、大腸の非癌部位と癌部位とのメチル化率の差が小さいものがより好ましい。このようなＣｐＧサイトのメチル化率又はＤＭＲの平均メチル化率を指標とすることにより、大腸癌患者の非癌部位から採取された生体試料が用いられた場合であっても、癌部位から採取された生体試料を用いた場合と同様に、高感度に孤発性大腸癌の発症の有無を判定することができる。例えば、大腸深部の粘膜は内視鏡等を用いて採取する必要があり、ヒト被検者の負担が大きいが、肛門付近の直腸粘膜は比較的容易に採取できる。大腸の非癌部位と癌部位とのメチル化率の差が小さいＣｐＧサイト又はＤＭＲをマーカーとすることにより、癌部位が形成される位置にかかわらず、肛門付近の直腸粘膜を生体試料として孤発性大腸癌を発症したヒト被検者を漏れなく検出することができる。
【００２９】
本発明に係る判定方法のうち、測定されたＣｐＧサイトのメチル化率の値自体に基づいて判定を行う方法は、ヒト被検者の孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、ヒト被検者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、本発明においてマーカーとする特定の複数のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、前記測定工程において測定されたメチル化率と、各ＣｐＧサイトに対して予めそれぞれ設定された基準値に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程を有する。
【００３０】
本発明においてマーカーとされるＣｐＧサイトは、具体的には、配列番号１〜９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトである。各塩基配列を表８〜１６に示す。表の塩基配列中、括弧内のＣＧは、実施例１〜３で示す網羅的ＤＮＡメチル化解析で検出されるＣｐＧサイトである。これらのＣｐＧサイトを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片は、ヒト被検者の孤発性大腸癌発症可能性を判定するためのＤＮＡメチル化率分析用マーカーとして用いることができる。
【００３１】
【表８】
2018062361.tif 000009
【００３２】
【表９】
2018062361.tif 000010
【００３３】
【表１０】
2018062361.tif 000011
【００３４】
【表１１】
2018062361.tif 000012
【００３５】
【表１２】
2018062361.tif 000013
【００３６】
配列番号１〜５４で表される塩基配列中の括弧内の５４個のＣｐＧサイト（以下、まとめて「５４ＣｐＧセット」ということがある。）は、後記実施例１における網羅的ＤＮＡメチル化解析において、メチル化率が非大腸癌発症者群と大腸癌患者群とで大きく相違するものである。このうち、大腸癌患者のメチル化率が非大腸癌発症者よりもかなり低いものが、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７〜２０、２３〜２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１〜４８、及び５０〜５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトであり（表中、「−」）、大腸癌患者のメチル化率が非大腸癌発症者よりもかなり高いものが、配列番号２、３、５、７〜９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、及び４９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトである（表中、「＋」）。マーカーとされるＣｐＧサイトは、これら５４個のＣｐＧサイトに限定されるものではなく、配列番号１〜５４で表される塩基配列中の他のＣｐＧサイトも含まれる。
【００３７】
本発明においてマーカーとされるＣｐＧサイトとしては、配列番号１〜８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのみを用いてもよい。これらの８個のＣｐＧサイト（以下、まとめて「８ＣｐＧセット」ということがある。）は、５４ＣｐＧセットのうち、大腸癌患者の大腸の非癌部位と癌部位とのメチル化率の差が小さいものである。
【００３８】
【表１３】
2018062361.tif 000014
【００３９】
【表１４】
2018062361.tif 000015
【００４０】
【表１５】
2018062361.tif 000016
【００４１】
配列番号５５〜８７で表される塩基配列中の括弧内の３３個のＣｐＧサイト（以下、まとめて「３３ＣｐＧセット」ということがある。）は、後記実施例２における網羅的ＤＮＡメチル化解析において、メチル化率が非大腸癌発症者群と大腸癌患者群とで大きく相違するものである。このうち、大腸癌患者のメチル化率が非大腸癌発症者よりもかなり低いものが、配列番号５９、６５〜６８、７０〜７７、７９〜８６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトであり（表中、「−」）、大腸癌患者のメチル化率が非大腸癌発症者よりもかなり高いものが、配列番号５５〜５８、６０〜６４、６９、７８、及び８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトである（表中、「＋」）。マーカーとされるＣｐＧサイトは、これら３３個のＣｐＧサイトに限定されるものではなく、配列番号５５〜８７で表される塩基配列中の他のＣｐＧサイトも含まれる。
【００４２】
【表１６】
2018062361.tif 000017
【００４３】
配列番号８８〜９３で表される塩基配列中の括弧内の６個のＣｐＧサイト（以下、まとめて「６ＣｐＧセット」ということがある。）は、後記実施例３における網羅的ＤＮＡメチル化解析において、メチル化率が非大腸癌発症者群と大腸癌患者群とで大きく相違するものである。このうち、大腸癌患者のメチル化率が非大腸癌発症者よりもかなり低いものが、配列番号９０及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトであり（表中、「−」）、大腸癌患者のメチル化率が非大腸癌発症者よりもかなり高いものが、配列番号８８、８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトである（表中、「＋」）。マーカーとされるＣｐＧサイトは、これら６個のＣｐＧサイトに限定されるものではなく、配列番号８８〜９３で表される塩基配列中の他のＣｐＧサイトも含まれる。
【００４４】
各ＣｐＧサイトについては、予め、大腸癌患者と非大腸癌発症者を識別するための基準値を設定しておく。５４ＣｐＧセットのうち表８〜１２で「＋」と記されているＣｐＧサイト、３３ＣｐＧセットのうち表１３〜１５で「＋」と記されているＣｐＧサイト、及び６ＣｐＧセットのうち表１６で「＋」と記されているＣｐＧサイトの場合には、測定されたメチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高い、と判定する。５４ＣｐＧセットのうち表８〜１２で「−」と記されているＣｐＧサイト、３３ＣｐＧセットのうち表１３〜１５で「−」と記されているＣｐＧサイト、及び６ＣｐＧセットのうち表１６で「−」と記されているＣｐＧサイトの場合には、測定されたメチル化率が予め設定された基準値以下である場合に、ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高い、と判定する。
【００４５】
各ＣｐＧサイトの基準値は、大腸癌患者群と非大腸癌発症者群の当該ＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、両群を区別することができる閾値として実験的に求めることができる。具体的には、任意のＣｐＧサイトのメチル化の基準値は、一般的な統計学的手法によって求められる。下記にその例を示すが、本発明における基準値の決め方はこれらに限定されるものではない。
【００４６】
基準値の求め方の一例としては、例えば、まず、任意のＣｐＧサイトについて、ヒト被検者のうち内視鏡検査での生検組織による病理検査により大腸癌と診断されなかった患者（非大腸癌発症者）の直腸粘膜のＤＮＡメチル化を測定する。複数のヒト被検者について測定した後に、その平均値又は中央値などによりこれらのヒト被検者群のメチル化を代表する数値を算出し、これを基準値とすることができる。
【００４７】
その他、複数の非大腸癌発症者と複数の大腸癌患者に対して、それぞれ直腸粘膜のＤＮＡメチル化を測定し、平均値又は中央値などにより大腸癌患者群と非大腸癌発症者群のメチル化を代表する数値とばらつきをそれぞれ算出した後、ばらつきも考慮して両数値が区別されるような閾値を求め、これを基準値とすることができる。
【００４８】
前記判定工程においては、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７〜２０、２３〜２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１〜４８、５０〜５４、５９、６５〜６８、７０〜７７、７９〜８６、９０、及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７〜９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、４９、５５〜５８、６０〜６４、６９、７８、８７〜８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。本発明に係る判定方法においては、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７〜２０、２３〜２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１〜４８、５０〜５４、５９、６５〜６８、７０〜７７、７９〜８６、９０、及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号２、３、５、７〜９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、４９、５５〜５８、６０〜６４、６９、７８、８７〜８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上、好ましくは３以上、より好ましくは５以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定することにより、より精度よく判定を行うことができる。
【００４９】
前記５４ＣｐＧセットを本発明においてマーカーとする場合、すなわち、前記測定工程において前記５４ＣｐＧセットのメチル化率を測定する場合には、前記判定工程においては、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７〜２０、２３〜２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１〜４８、及び５０〜５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７〜９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、及び４９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。本発明に係る判定方法においては、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７〜２０、２３〜２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１〜４８、及び５０〜５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号２、３、５、７〜９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、及び４９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上、好ましくは３以上、より好ましくは５以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定することにより、より精度よく判定を行うことができる。
【００５０】
前記８ＣｐＧセットを本発明においてマーカーとする場合、すなわち、前記測定工程において前記８ＣｐＧセットのメチル化率を測定する場合には、前記判定工程においては、配列番号１、４、及び６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７、及び８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。本発明に係る判定方法においては、配列番号１、４、及び６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号２、３、５、７、及び８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上、好ましくは３以上、より好ましくは５以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定することにより、より精度よく判定を行うことができる。
【００５１】
前記３３ＣｐＧセットを本発明においてマーカーとする場合、すなわち、前記測定工程において前記３３ＣｐＧセットのメチル化率を測定する場合には、前記判定工程においては、配列番号５９、６５〜６８、７０〜７７、及び７９〜８６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号５５〜５８、６０〜６４、６９、７８、及び８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。本発明に係る判定方法においては、配列番号５９、６５〜６８、７０〜７７、及び７９〜８６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号５５〜５８、６０〜６４、６９、７８、及び８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上、好ましくは３以上、より好ましくは５以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定することにより、より精度よく判定を行うことができる。
【００５２】
前記６ＣｐＧセットを本発明においてマーカーとする場合、すなわち、前記測定工程において前記６ＣｐＧセットのメチル化率を測定する場合には、前記判定工程においては、配列番号９０及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号８８、８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。本発明に係る判定方法においては、配列番号９０及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号８８、８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上、好ましくは３以上、より好ましくは５以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定することにより、より精度よく判定を行うことができる。
【００５３】
本発明においては、配列番号１〜９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトをマーカーとして用いる。本発明においてマーカーとするＣｐＧサイトとしては、配列番号１〜９３で表される塩基配列中の括弧内の９３個のＣｐＧサイトの全て（以下、まとめて「９３ＣｐＧセット」ということがある。）であってもよく、前記５４ＣｐＧセットであってもよく、前記８ＣｐＧセットであってもよく、前記３３ＣｐＧセットであってもよく、前記６ＣｐＧセットであってもよい。前記５４ＣｐＧセットのＣｐＧサイト、前記８ＣｐＧセットのＣｐＧサイトは、いずれも、大腸癌患者群と非大腸癌発症者群のメチル化率の分散が小さく、大腸癌患者群と非大腸癌発症者群の識別能が高い点で優れている。一方で、前記３３ＣｐＧセット及び前記６ＣｐＧセットは、前記５４ＣｐＧセットのＣｐＧサイトや前記８ＣｐＧセットのＣｐＧサイトに比べて特異度はやや低くなるものの、感度が非常に高く、例えば、孤発性大腸癌の一次スクリーニング検査には非常に好適である。
【００５４】
本発明に係る判定方法のうち、特定のＤＭＲの平均メチル化率の値自体に基づいて判定を行う方法は、具体的には、孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、ヒト被検者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、本発明においてマーカーとする特定のＤＭＲ中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたＤＭＲの平均メチル化率と、各ＤＭＲの平均メチル化率に対して予めそれぞれ設定された基準値に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程を有する。なお、各ＤＭＲの平均メチル化率は、当該ＤＭＲ中のＣｐＧサイトのうち、前記測定工程においてメチル化率が測定された全てのＣｐＧサイトのメチル化率の平均値として算出する。
【００５５】
本発明においてマーカーとされるＤＭＲは、具体的には、ＤＭＲ番号１〜１２１で表されるＤＭＲからなる群より選択される１か所以上のＤＭＲである。各ＤＭＲの染色体上の位置及び対応する遺伝子を表１７〜２３に示す。表中のＤＭＲの開始点と終点の塩基位置は、ヒトゲノム配列のデータセット「ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９」に基づく。これらのＤＭＲ中に存在するＣｐＧサイトを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片は、孤発性大腸癌発症可能性を判定するためのＤＮＡメチル化率分析用マーカーとして用いることができる。
【００５６】
【表１７】
2018062361.tif 000018
【００５７】
【表１８】
2018062361.tif 000019
【００５８】
【表１９】
2018062361.tif 000020
【００５９】
【表２０】
2018062361.tif 000021
【００６０】
【表２１】
2018062361.tif 000022
【００６１】
【表２２】
2018062361.tif 000023
【００６２】
【表２３】
2018062361.tif 000024
【００６３】
ＤＭＲ番号１〜１２１で表されるＤＭＲ（以下、まとめて「１２１ＤＭＲセット」ということがある。）は、各領域中に含まれる複数のＣｐＧサイトのメチル化率が、非大腸癌発症者群と大腸癌患者群とで大きく相違するものである。このうち、大腸癌患者のＤＭＲの平均メチル化率（ＤＭＲ中に存在している複数のＣｐＧサイトのメチル化率の平均値）が非大腸癌発症者よりもかなり低いものが、ＤＭＲ番号８〜１５、３５〜５２、及び１１１〜１２１で表されるＤＭＲであり（表中、「−」）、大腸癌患者のＤＭＲの平均メチル化率が非大腸癌発症者よりもかなり高いものが、ＤＭＲ番号１〜７、１６〜３４、及び５３〜１１０で表されるＤＭＲである（表中、「＋」）。
【００６４】
本発明において、ＤＭＲの平均メチル化率をマーカーとする場合には、ＤＭＲ番号１〜１２１で表されるＤＭＲのうちの１か所をマーカーとしてもよく、ＤＭＲ番号１〜１２１で表されるＤＭＲからなる群より選択される任意の２か所以上をマーカーとしてもよく、ＤＭＲ番号１〜１２１で表されるＤＭＲの全てをマーカーとしてもよい。本発明においては、判定精度をより高められることから、ＤＭＲ番号１〜１２１で表されるＤＭＲからなる群のうちマーカーとして用いるＤＭＲは、２か所以上であることが好ましく、３か所以上であることがより好ましく、４か所以上であることがさらに好ましく、５か所以上であることがよりさらに好ましい。
【００６５】
より高い判定精度が得られることから、本発明においてそのメチル化率がマーカーとして用いられるＤＭＲは、ＤＭＲ番号１〜５２で表されるＤＭＲ（以下、まとめて「５２ＤＭＲセット」ということがある。）からなる群より選択される１か所以上であることが好ましく、５２ＤＭＲセットから選択される２か所以上であることがより好ましく、５２ＤＭＲセットから選択される３か所以上であることがさらに好ましく、５２ＤＭＲセットから選択される４か所以上であることがよりさらに好ましく、５２ＤＭＲセットから選択される５か所以上であることが特に好ましい。なかでも、ＤＭＲ番号１〜１５で表されるＤＭＲ（以下、まとめて「１５ＤＭＲセット」ということがある。）からなる群より選択される１か所以上であることが好ましく、１５ＤＭＲセットから選択される２か所以上であることがより好ましく、１５ＤＭＲセットから選択される３か所以上であることがさらに好ましく、１５ＤＭＲセットから選択される４か所以上であることがよりさらに好ましく、１５ＤＭＲセットから選択される５か所以上であることが特に好ましい。
【００６６】
各ＤＭＲの平均メチル化率は、それぞれのＤＭＲ中に含まれる全てのＣｐＧサイトのメチル化率の平均値としてもよく、それぞれのＤＭＲ中に含まれる全てのＣｐＧサイトから少なくとも１個のＣｐＧサイトを任意に選出し、この選出されたＣｐＧサイトのメチル化率の平均値としてもよい。各ＣｐＧサイトのメチル化率は、表８〜１６中の配列番号１等で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率の測定と同様にして測定することができる。
【００６７】
各ＤＭＲの平均メチル化率については、予め、大腸癌患者と非大腸癌発症者を識別するための基準値を設定しておく。前記１２１ＤＭＲセットのうち表１７〜２３で「＋」と記されているＤＭＲの場合には、測定されたＤＭＲの平均メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高い、と判定する。１２１ＤＭＲセットのうち表１７〜２３で「−」と記されているＤＭＲの場合には、測定されたＤＭＲの平均メチル化率が予め設定された基準値以下である場合に、ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高い、と判定する。
【００６８】
各ＤＭＲの平均メチル化率の基準値は、大腸癌発症者群と非大腸癌患者群の当該ＤＭＲの平均メチル化率を測定し、両群を区別することができる閾値として実験的に求めることができる。具体的には、ＤＭＲの平均メチル化率の基準値は、一般的な統計学的手法によって求められる。
【００６９】
前記９３ＣｐＧセット等のＣｐＧサイトのメチル化率をマーカーとする場合には、本発明に係る判定方法は、前記判定工程を、前記測定工程において測定されたメチル化率と、予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被験者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定することができる。当該多変量判別式は、前記配列番号１〜９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む。
【００７０】
前記１２１ＤＭＲセットからなる群より選択される１か所以上のＤＭＲの平均メチル化率をマーカーとする場合には、本発明に係る判定方法は、前記判定工程を、前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたＤＭＲの平均メチル化率と、予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被験者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定することができる。当該多変量判別式は、前記１２１ＤＭＲセット中のＣｐＧサイトのうち１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む。
【００７１】
本発明において用いられる多変量判別式は、２群を判別するために用いられる一般的な手法により求めることができる。当該多変量判別式としては、例えば、ロジスティック回帰式、線形判別式、ナイーブベイズ分類器で作成された式、又はサポートベクターマシンで作成された式が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの多変量判別式は、例えば、大腸癌患者群と非大腸癌発症者群について、前記配列番号１〜９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所又は２か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、得られたメチル化率を変数として、常法により作成することができる。また、大腸癌発症者群と非大腸癌患者群について、前記１２１ＤＭＲセット中のＤＭＲのうち１か所又は２か所以上のＤＭＲの平均メチル化率を測定し、得られたメチル化率を変数として、常法により作成することができる。
【００７２】
本発明において用いられる多変量判別式には、予め、大腸癌患者と非大腸癌発症者を識別するための基準判別値を設定しておく。基準判別値は、大腸癌患者群と非大腸癌発症者群について、使用する多変量判別式の値である判別値を求め、大腸癌患者群の判別値と非大腸癌発症者群の判別値とを比較し、両群を区別することができる閾値として実験的に求めることができる。
【００７３】
多変量判別式を用いて判定を行う場合、具体的には、前記測定工程において、使用する多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むＣｐＧサイトのメチル化率又はＤＭＲの平均メチル化率を測定し、前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、この判別値と予め設定した基準判別値とに基づいて、ＣｐＧサイトのメチル化率又はＤＭＲの平均メチル化率が測定されたヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性の高低を判定する。当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、当該ヒト被検者が、孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。
【００７４】
本発明において用いられる多変量判別式としては、前記３３ＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む式が好ましく、前記３３ＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がより好ましく、前記３３ＣｐＧサイトからなる群より任意に選択される２〜１０か所のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がさらに好ましく、前記３３ＣｐＧサイトからなる群より任意に選択される２〜５か所のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がよりさらに好ましい。
【００７５】
本発明において用いられる多変量判別式としては、前記６ＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む式が好ましく、前記６ＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がより好ましく、前記６ＣｐＧサイトからなる群より任意に選択される２〜６か所のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がさらに好ましく、前記６ＣｐＧサイトからなる群より任意に選択される２〜５か所のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がよりさらに好ましい。
【００７６】
前記３３ＣｐＧセット及び前記６ＣｐＧセットを構成するＣｐＧサイトは、これらのセットから任意で２〜１０個（６ＣｐＧセットの場合、２〜６個）、好ましくは２〜５個のＣｐＧサイトを選択し、この選択されたＣｐＧサイトのみを用いた場合でも、充分な感度及び特異度で、孤発性大腸癌の発症可能性を判定することができる。例えば、後記実施例２に示す通り、前記３３ＣｐＧセットのうち、配列番号５７で表される塩基配列中のＣｐＧサイト、配列番号６３で表される塩基配列中のＣｐＧサイト、及び配列番号７７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトの３個のＣｐＧサイトをマーカーとして用い、これらの３個のＣｐＧサイトのメチル化率を変数としてロジスティック回帰により作成された多変量判別式を用いた場合には、感度約９５％、特異度約９６％で孤発性大腸癌の発症可能性を判定することができる。臨床検査等において、メチル化率を測定するＣｐＧサイトの数が多いと、労力とコストが過大となるおそれがある。マーカーとするＣｐＧサイトを前記３３ＣｐＧセット及び前記６ＣｐＧセットを構成するＣｐＧサイトから選抜することにより、１又は２〜１０個という、臨床検査において測定可能な妥当な数のＣｐＧサイトで、精度よく孤発性大腸癌の発症可能性を判定することができる。
【００７７】
本発明において用いられる多変量判別式としては、前記１２１ＤＭＲセットからなる群より選択される１か所以上のＤＭＲの平均メチル化率を変数として含む式が好ましく、前記１２１ＤＭＲセットからなる群より選択される２か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がより好ましく、前記１２１ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される３か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がさらに好ましく、前記１２１ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される４か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がよりさらに好ましく、前記１２１ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される５か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式が特に好ましい。中でも、前記５２ＤＭＲセットからなる群より選択される１か所以上のＤＭＲの平均メチル化率を変数として含む式が好ましく、前記５２ＤＭＲセットからなる群より選択される２か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がより好ましく、前記５２ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される２〜１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がさらに好ましく、前記５２ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される３〜１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がよりさらに好ましく、前記５２ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される５〜１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式が特に好ましい。より好ましくは、前記１５ＤＭＲセットからなる群より選択される１か所以上のＤＭＲの平均メチル化率を変数として含む式が好ましく、前記１５ＤＭＲセットからなる群より選択される２か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がより好ましく、前記１５ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される２〜１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がさらに好ましく、前記１５ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される３〜１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がよりさらに好ましく、前記１５ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される５〜１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式が特に好ましい。
【００７８】
本発明に係る判定方法に供される生体試料は、ヒト被検者から採取された生体試料であって、当該被検者のゲノムＤＮＡが含まれているものであれば特に限定されるものではなく、血液、血漿、血清、涙液、唾液等であってもよく、消化管粘膜や、肝臓等のその他の組織から採取された組織片であってもよい。本発明に係る判定方法に供される生体試料としては、大腸の状態をより強く反映していることから、大腸粘膜であることが好ましく、比較的低侵襲に採取可能であることから直腸粘膜であることがより好ましい。前記血液などの体液、前記組織片、大腸粘膜又は直腸粘膜から生体試料を採取する場合、それぞれの生体試料に応じた採取具を用いて採取すればよい。
【００７９】
また、当該生体試料は、ＤＮＡが抽出可能な状態であればよく、各種前処理が施されているものであってもよい。例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織であってもよい。生体試料からのＤＮＡの抽出は常法により行うことができ、各種市販のＤＮＡ抽出・精製キットを使用することもできる。
【００８０】
ＣｐＧサイトのメチル化率を測定する方法としては、特定のＣｐＧサイトについてメチル化シトシン塩基とメチル化されていないシトシン塩基を区別して定量可能な方法であれば、特に限定されるものではない。当該技術分野において公知の方法をそのまま又は必要に応じて適宜改変することによりＣｐＧサイトのメチル化率を測定できる。ＣｐＧサイトのメチル化率の測定方法としては、例えば、バイサルファイトシーケンス法、ＣＯＢＲＡ（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）法、ｑＡＭＰ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）法等が挙げられる。その他、ＭＩＡＭ（Ｉ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｉｓｏｓｃｈｉｚｏｍｅｒｓ）法を用いて行ってもよい。
【００８１】
＜大腸粘膜採取用キット＞
本発明に係る大腸粘膜採取用キットは、直腸粘膜を挟んで採取するための採取具と、肛門を拡張し、当該採取具を肛門から大腸粘膜表面へ到達させるための採取補助具とを備える。以下、図１〜３を参照しながら、本発明に係る大腸粘膜採取用キットについて説明する。
【００８２】
図１（Ａ）〜図１（Ｃ）は大腸粘膜採取用キット１の採取具２の一実施態様の説明図である。図１（Ａ）は、採取具２の第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂが加力されていない状態の正面図であり、図１（Ｂ）は、採取具２の第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂが加力されていない状態の平面図であり、図１（Ｃ）は、採取具２の第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂが加力されていない状態の斜視図である。図１に示すように、採取具２は、一対の弾性板状体である第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂとからなる。第１の挟持片３ａは、挟持部３１ａと把持部３２ａとバネ部３３ａと固定部３４ａとから構成されており、第２の挟持片３ｂは、挟持部３１ｂと把持部３２ｂとバネ部３３ｂと固定部３４ｂとから構成されている。第１の挟持片３ａ及び第２の挟持片３ｂの形状は、板状の他、棒状であってもよく、直腸粘膜を挟んで採取するための一定の長さを有するように形成されていれば形状にこだわらない。また、素材も弾性体であれば特に限定されるものではなく、ステンレス等の金属であってもよく、樹脂であってもよい。採取具２としては、加力状態で第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂの重なりが安定し、大腸粘膜の採取がより容易であることから、金属であることが好ましい。
【００８３】
第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂは、固定部３４ａと固定部３４ｂにおいて、互いに対向した状態で連結固定されている。連結固定する方法は特に限定されるものではなく、例えば、第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂが互いに重なるように、固定部３４ａと固定部３４ｂの端部を溶接することにより、両者を連結固定することができる。
【００８４】
固定部３４ａと固定部３４ｂの長さは、特に限定されるものではないが、２０〜５０ｍｍが好ましく、３０〜４０ｍｍがより好ましい。固定部の長さが前記範囲内であることにより、両挟持片の連結固着が容易であり、かつ加力に対する充分な強度を付与できる。
【００８５】
第１の挟持片３ａには、把持部３２ａと固定部３４ａとの間に、弾性を備えるバネ部３３ａが設けられている。第２の挟持片３ｂには、把持部３２ｂと固定部３４ｂとの間に、弾性を備えるバネ部３３ｂが設けられている。バネ部３３ａとバネ部３３ｂにより、第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂを互いに接近するように加力した場合に、挟持部３１ａの端部と挟持部３１ｂの端部を接着させることができる。
【００８６】
バネ部３３ａとバネ部３３ｂの長さは、特に限定されるものではないが、２〜１０ｍｍが好ましく、３〜７ｍｍがより好ましい。バネ部の長さが前記範囲内であることにより、両挟持片へ充分な弾性を容易に付与できる。
【００８７】
第１の挟持片３ａにおいて、挟持部３１ａとバネ部３３ａの間が把持部３２ａであり、第２の挟持片３ｂにおいて、挟持部３１ｂとバネ部３３ｂの間が把持部３２ｂである。把持部３２ａの把持部３２ｂと対抗する面と、把持部３２ｂの把持部３２ａと対抗する面の裏面（大腸粘膜の採取者が把持する面）には、ヒト（大腸粘膜の採取者）が把持した際に滑りにくいよう、滑り止め加工がなされていてもよい。滑り止め加工としては、特に限定されないが、例えば、金属状の把持部に別途樹脂状の滑り止め部を貼付してもよく、把持部をギザギザ模様、楔状模様、又は紙ヤスリのヤスリ部のようなザラザラ模様等を施すことが挙げられる。滑り止め加工としては、図１（Ａ）に示すように、ギザギザ模様となるように、突起部や窪み部を幅方向にむかって略平行に複数設ける加工が好ましい。
【００８８】
把持部３２ａと把持部３２ｂの長さは、２０〜５０ｍｍが好ましく、３０〜４０ｍｍがより好ましい。把持部の長さが前記範囲内であることにより、把持や両挟持片への加力がより容易になる。
【００８９】
第１の挟持片３ａは、挟持部３１ａのうち第２の挟持片３ｂと対向する面の端部に、大腸粘膜を挟持する挟持面３５ａが形成されている。第２の挟持片３ｂは、挟持部３１ｂのうち第１の挟持片３ａと対向する面の端部に、大腸粘膜を挟持する挟持面３５ｂが形成されている。挟持面３５ａと挟持面３５ｂは、第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂに加力して挟持部３１ａの端部と挟持部３１ｂの端部が接着させた状態で、挟持面３５ａと挟持面３５ｂが少なくとも辺縁部において互いに密着するように設ける。
【００９０】
第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂへの加力により、両者は互いに近接する。このため、採取具２の挟持面３５ａと挟持面３５ｂを大腸粘膜に接触させた状態で、第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂに加力することによって、挟持面３５ａと挟持面３５ｂにより大腸粘膜を挟持することができる。より詳細には、挟持面３５ａの辺縁部と挟持面３５ｂの辺縁部が大腸粘膜を挟んだ状態で接する。この状態で採取具２を大腸粘膜から離すことにより、挟持面３５ａと挟持面３５ｂに挟持された大腸粘膜が引きちぎられて採取される。
【００９１】
大腸粘膜を比較的組織の破損が少ない状態で採取するために、挟持面３５ａと挟持面３５ｂの少なくとも一方には窪み部が設けられていることが好ましい。両者の少なくとも一方がカップ形状の場合であるため、挟持面３５ａの辺縁部と挟持面３５ｂの辺縁部が接した場合に、内部に空間が形成される。挟持面３５ａと挟持面３５ｂに挟持された大腸粘膜のうち、当該空間内に収容された部分は、大腸粘膜を引きちぎる際に負荷があまりかからず、よって組織の破壊を抑制できる。窪み部の形状は特に限定されるものではなく、例えば、カップ形状（半球状）にすることができる。大腸粘膜の採取がより容易であり、かつ組織の破壊を抑制できることから、挟持面３５ａと挟持面３５ｂの両方に窪み部が形成されていることがより好ましい。
【００９２】
挟持面３５ａと挟持面３５ｂに窪み部が形成されている場合、窪み部の内径は、必要な量の大腸粘膜が採取できる大きさに設定すればよい。本発明に係る判定方法に供される大腸粘膜の場合、少量の粘膜が採取できれば十分である。例えば、挟持面３５ａと挟持面３５ｂの窪み部の内径を、１〜５ｍｍ、好ましくは２〜３ｍｍとすることにより、大腸粘膜を過度に傷つけることなく、充分量の大腸粘膜を採取することができる。
【００９３】
挟持面３５ａの辺縁部と挟持面３５ｂの辺縁部は、互いに密接することが可能であればよく、平坦であってもよく、鋸歯状であってもよい。鋸歯状の場合には、挟持面３５ａの辺縁部と挟持面３５ｂの辺縁部により挟持することによって比較的弱い力で大腸粘膜を切断し採取することができる。
【００９４】
第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂの幅は、把持しやすいように、把持部から固定部までの部分の幅は、５〜１５ｍｍが好ましく、６〜１０ｍｍがより好ましい。一方で、第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂのうち挟持部の幅は、より小さい力で大腸粘膜を採取できることから、挟持面が設けられている端部に向かって細くなっていることが好ましい。第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂの端部の幅は、前述の窪み部よりも大きくなるようにしつつ、例えば、２〜６ｍｍ、好ましくは３〜４ｍｍとすることができる。
【００９５】
挟持部３１ａと挟持部３１ｂの長さは、２０〜６０ｍｍが好ましく、３０〜５０ｍｍがより好ましい。挟持部の長さが前記範囲内であることにより、採取補助具１１のスリット１３を貫通した状態での粘膜採取がより容易になる。
【００９６】
図２は、採取補助具１１の一実施態様の説明図である。図２（Ａ）は採取補助具１１の上側からみた斜視図であり、図２（Ｂ）は下側からみた斜視図である。また、図２（Ｃ）〜図２（Ｇ）は、それぞれ、採取補助具１１の正面図、平面図、底面図、左側面図、及び右側面図である。図２に示すように、採取補助具１１は、採取具導入部１２と、スリット１３と、把持部１４と、を有する。
【００９７】
採取具導入部１２は、側壁にスリット１３を有する円錐台形状の部材である。採取具導入部１２は、外径が小さい先端辺縁部１５から肛門に挿入し、外径が大きい手元辺縁部１６から採取具２を挿入する。採取具導入部１２は、回転軸方向に貫通孔を有していてもよい。肛門への挿入のしやすさの点から、手元辺縁部１６の外径は３０〜７０ｍｍが好ましく、４０〜６０ｍｍがより好ましい。また、採取具２の大腸粘膜表面への導入しやすさの点から、先端辺縁部１５の外径は１０〜３０ｍｍが好ましく、１５〜２５ｍｍがより好ましい。同様に、採取具導入部１２の回転軸方向の長さは５０〜１５０ｍｍが好ましく、７０〜１３０ｍｍがより好ましく、８０〜１２０ｍｍがさらに好ましい。
【００９８】
スリット１３は、採取具導入部１２の先端辺縁部１５から手元辺縁部１６に向かって設けられている。採取具導入部１２の側壁の一部分に先端辺縁部１５に達するスリット１３があることにより、腸管内における採取具２の先端部の動きの自由度が高まり、内部構造が複雑な直腸内において、大腸粘膜をより容易に採取することができる。スリット１３は、採取具導入部１２のいずれの位置に設定されていてもよい。例えば、スリット１３は、図２（Ｂ）に示すように、把持部１４に近い側にあることが好ましい。また、採取具導入部１２に設けられるスリット１３の数は、１つであってもよく、２以上であってもよい。
【００９９】
スリット１３を貫通して採取具２は大腸粘膜表面に達するため、スリット１３の幅は、挟持面３５ａと挟持面３５ｂが接した状態における、採取具２の第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂの端部の幅よりも広く設計される。例えば、挟持面３５ａと挟持面３５ｂとが接した状態における、採取具２の第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂの端部の幅Ｌ１が２〜５ｍｍの場合、スリット１３の先端辺縁部１５側の幅Ｌ２は７〜２５ｍｍが好ましく、１５〜２０ｍｍが好ましい。また、スリット１３の幅は、一定であってもよく、いずれかの方向に向けて狭くなっていてもよい。なお、スリットは、採取具導入部１２の壁面に２以上形成されていてもよい。
【０１００】
把持部１４は、その一端が、採取具導入部１２の手元辺縁部１６近傍に、採取具導入部１２から遠ざかる方向に連結している。把持部１４は、下方が開口した中空の棒状であって、リブで補強されているものであってもよい。把持部１４の長さは、手による握りやすさ等から、５０〜１５０ｍｍが好ましく、７０〜１３０ｍｍがより好ましい。また、手による握りやすさ等から、把持部１４の幅は、５〜２０ｍｍが好ましく、８〜１３ｍｍがより好ましく、把持部１４の厚みは、１０〜３０ｍｍが好ましく、１５〜２５ｍｍがより好ましい。把持部１４の形状は、握りやすい形状であればどのような形状であってもよく、例えば、板状であってもよく、棒状であってもよく、その他の形状であってもよい。
【０１０１】
把持部１４は、採取具導入部１２の手元辺縁部１６近傍において、採取具導入部１２の円錐台形状の中心軸に対して、垂直に連結されていてもよいが、より大腸粘膜への採取具２の到達が容易になるため、採取具導入部１２の回転軸方向と採取具導入部１２の中心軸方向の角度θ１（図２（Ｃ）参照。）が９０°超、１２０°以下が好ましく、９５〜１１０°がより好ましく、９５〜１０５°がさらに好ましい。
【０１０２】
図３は、本発明に係る大腸粘膜採取用キット１の使用の態様を示す説明図である。まず、大腸粘膜を採取される被検者の肛門に、採取補助具１１を先端辺縁部１５から挿入する。把持部１４を片手で持ち安定させた状態で、手元辺縁部１６側の開口部から採取具２を導入する。導入された採取具２は、先端部からスリット１３を貫通して大腸粘膜表面に達する。採取具２の挟持面３５ａと挟持面３５ｂとで大腸粘膜を挟持した状態で、採取具２をスリット１３から引き出すことにより、大腸粘膜が採取できる。
【実施例】
【０１０３】
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【０１０４】
［実施例１］
健常者８名（男性５名、女性３名）と、内視鏡検査での生検組織による病理診断により、潰瘍性大腸炎等の他の大腸の炎症性疾患は発症していないが、孤発性大腸癌と診断された大腸癌患者６名（男性３名、女性３名）とから採取された大腸粘膜中のＤＮＡに対して、ＣｐＧサイトのメチル化率を網羅的に解析した。【０１０５】
＜ＣｐＧサイトのメチル化レベルの網羅的解析＞
（１）生検及びＤＮＡ抽出
同一被検者の大腸３か所から粘膜組織を採取し、−８０℃で冷凍保存した。採取部位は、大腸癌患者は盲腸、横行結腸、直腸、及び癌部とし、健常者は盲腸、横行結腸、及び直腸とした。採取した組織を細断し、QIAmp DNA kit（Qiagen社製）を使用してＤＮＡを抽出した。【０１０６】
（２）ＤＮＡサンプルの品質評価
得られたＤＮＡの濃度は次のようにして求めた。すなわち、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Life Technologies社製）を用いて各サンプルの蛍光強度を測定し、キット付属のλ−ＤＮＡの検量線を用いて濃度を算出した。
次に、各サンプルをＴＥ（ｐＨ８．０）にて１ｎｇ／μＬに希釈し、Illumina FFPE QC Kit（Illumina社製）及びFast SYBR Green Master Mix（Life Technologies社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｔ値を求めた。サンプルとポジティブコントロールとのＣｔ値の差（以下、ΔＣｔ値）をサンプルごとに算出し、品質を評価した。ΔＣｔ値が５未満のサンプルは品質良好と判断し、以降のステップに進めた。【０１０７】
（３）バイサルファイト処理
EZ DNA Methylation Kit（ZYMO RESEARCH社製）を使用して、ＤＮＡサンプルに対してバイサルファイト処理を実施した。その後、Infinium HD FFPE Restore Kit（Illumina社製）を使用して、分解ＤＮＡを修復した。【０１０８】
（４）全ゲノム増幅
ＤＮＡをアルカリ変性した後、中和させ、HumanMethylation450 DNA Analysis Kit（Illumina社製）の全ゲノム増幅用の酵素とプライマーを添加し、３７℃のIncubation Oven（Illumina社製）で２０時間以上、等温で反応させることによって、全ゲノムを増幅させた。【０１０９】
（５）全ゲノム増幅したＤＮＡの断片化と精製
全ゲノム増幅したＤＮＡに、HumanMethylation450 DNA Analysis Kit（Illumina社製）の断片化用の酵素を添加し、Microsample Incubator（SciGene）で３７℃、１時間反応させた。断片化したＤＮＡに、共沈剤と２−プロパノールを加えて遠心分離処理し、ＤＮＡを沈澱させた。【０１１０】
（６）ハイブリダイゼーション
沈澱させたＤＮＡに、Hybridization bufferを加え、４８℃のHybridization Oven（Illumina社製）で１時間反応させ、ＤＮＡを溶解させた。溶解させたＤＮＡを９５℃のMicrosample Incubator（SciGene社製）で２０分間インキュベートして１本鎖に変性させた後、HumanMethylation450 DNA Analysis Kit（Illumina社製）のBeadChip上に分注した。４８℃のHybridization Ovenで１６時間以上反応させ、BeadChip上のプローブと１本鎖ＤＮＡをハイブリダイズした。【０１１１】
（７）標識反応及びスキャニング
ハイブリダイゼーション後のBeadChip上のプローブを伸長反応させ、蛍光色素を結合させた。次いで、当該BeadChipをiSCANシステム（Illumina社製）でスキャンし、メチル化蛍光強度及び非メチル化蛍光強度を測定した。実験終了時に、スキャンデータが全て揃っていること、及びスキャンが正常に行われたことを確認した。【０１１２】
（８）ＤＮＡメチル化レベルの定量及び比較解析
ＤＮＡメチル化解析ソフトウェアGenomeStudio（Version：V2011.1）を用いてスキャンデータを解析した。ＤＮＡメチル化レベル（β値）は、次の式により算出した。【０１１３】
［β値］＝
［メチル化蛍光強度］÷ (［メチル化蛍光強度］＋［非メチル化蛍光強度］＋100)【０１１４】
メチル化レベルが高い場合、β値は１に近づき、メチル化レベルが低い場合、β値は０に近づく。健常者直腸サンプル群（ｎ＝８）に対する大腸癌患者直腸サンプル群（ｎ＝６）のＤＮＡメチル化レベルの比較解析には、GenomeStudioにより算出されるDiffScoreを用いた。両者のＤＮＡメチル化レベルが近い場合、DiffScoreは０に近づき、大腸癌患者でのレベルが高い場合は正の値を示し、低い場合は負の値を示す。両群のメチル化レベルの差異が大きいほど、DiffScoreの絶対値は大きくなる。また、大腸癌患者直腸サンプル群（ｎ＝６）の平均β値から健常者直腸サンプル群（ｎ＝８）の平均β値を差し引いた値（Δβ値）も比較解析に用いた。【０１１５】
なお、ＤＮＡメチル化定量とＤＮＡメチル化レベル比較解析には、GenomeStudioとソフトウェアMethylation Module（Version:1.9.0）を用いた。GenomeStudioの設定条件は、下記の通りである。【０１１６】
ＤＮＡメチル化定量；
Normalization：  有り（Ｃｏｎｔｒｏｌｓ）
Subtract Background：  有り
Content Descriptor：       HumanMethylation450_15017482_v.1.2.bpm【０１１７】
ＤＮＡメチル化レベル比較解析；
Normalization：  有り(Controls)
Subtract Background：  有り
Content Descriptor：  HumanMethylation450_15017482_v.1.2.bpm
Ref Group：  比較解析4. Group-3
Error Model：  Illumina custom
Compute False Discovery Rate：  無し【０１１８】
（９）多変量解析
ＤＮＡメチル化レベルの定量及び比較解析の結果を用いて、統計解析ソフトウェアＲ（Version: 3.0.1、64bit、Windows（登録商標））を用いて、DiffScoreの算出、クラスター解析及び主成分分析を実施した。【０１１９】
クラスター解析のＲスクリプト：
> data.dist<-as.dist(1-cor(data.frame,use="pairwise.complete.obs",method="p"))> hclust(data.dist,method="complete")
# data.frame: CpG（行）x サンプル（列）から成るデータフレーム
# 1-ピアソン相関係数を距離として定義し、complete linkage法により実施【０１２０】
主成分分析のＲスクリプト：
> prcomp(t(data.frame),scale=T)
# data.frame: CpG（行）x サンプル（列）から成るデータフレーム【０１２１】
＜ＣｐＧバイオマーカーの選択＞
（１）ＣｐＧバイオマーカー候補の抽出
網羅的ＤＮＡメチル化解析データからＣｐＧバイオマーカー候補を選定する手段として、DiffScore及びΔβ値に基づいた絞り込みが報告されている（BMC Med genomics vol.4, p.50, 2011; Sex Dev vol.5, p.70, 2011）。前者の報告ではDiffScoreの絶対値が３０超、及びΔβ値の絶対値が０．２超に設定し、後者の報告ではDiffScoreの絶対値が３０超、及びΔβ値の絶対値が０．３超に設定して、バイオマーカー候補を抽出している。これらの方法に準じて、BeadChipに搭載されている４８５，５７７個のＣｐＧサイトからバイオマーカー候補を抽出した。【０１２２】
具体的には、まず、４８５，５７７個のＣｐＧサイトから、DiffScoreの絶対値が３０超かつΔβ値の絶対値が０．３超である５４個のＣｐＧサイトを抽出した。以下、この５４個のＣｐＧサイトをまとめて「５４ＣｐＧセット」という。さらに、孤発性大腸癌を発症した癌患者を取りこぼしなく判別することを目的に、癌患者サンプル内でＤＮＡメチル化レベルの変動が少ないものを絞り込んだ。すなわち、癌患者２３サンプル（４部位×各部位６又は７サンプル）のβ値の不偏分散ｖａｒを求め、不偏分散ｖａｒの値が０．０２より小さい８個のＣｐＧサイトを絞り込んだ。以下、この８個のＣｐＧサイトをまとめて「８ＣｐＧセット」という。【０１２３】
５４ＣｐＧセットの各ＣｐＧサイトの結果を表２４及び２５に示す。表中、「８ＣｐＧ」欄に＃があるＣｐＧサイトは８ＣｐＧセットに含まれるものを示す。【０１２４】
【表２４】
2018062361.tif 000025
【０１２５】
【表２５】
2018062361.tif 000026
【０１２６】
（２）ＣｐＧバイオマーカー候補を用いた臨床サンプルの多変量解析
前記５４ＣｐＧセット又は８ＣｐＧセットを用いて、全２３サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行ったところ、図４及び５に示すように、いずれのＣｐＧセットでも、クラスター解析では、全ての大腸癌患者サンプルが同一クラスター（図中、枠内）に集積した。また、図６及び７に示すように、主成分分析（縦軸は第２主成分）では、大腸癌患者サンプル（黒丸は非癌部から採取したサンプル、黒四角は癌部から採取したサンプル）と健常者（非癌）サンプル（黒三角）が第１主成分（横軸）方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。すなわち、いずれのＣｐＧセットでも、大腸癌患者サンプルと健常者サンプルを明確に区別することができた。これらの結果から、表２４及び２５に記載の５４ＣｐＧは、ヒト被検者における孤発性大腸癌の発症のバイオマーカーとして極めて有用であり、これらを用いることにより、ヒト被検者の孤発性大腸癌の発症の有無、特に大腸疾患の自覚症状のないヒト被検者の孤発性大腸癌の発症の有無を高い感度と特異度によって判定できることが明らかである。【０１２７】
［実施例２］
健常者２８名と、内視鏡検査での生検組織による病理診断により、潰瘍性大腸炎等の他の大腸の炎症性疾患は発症していないが、孤発性大腸癌と診断された大腸癌患者２０名とから採取された直腸粘膜中のＤＮＡに対して、ＣｐＧサイトのメチル化率を網羅的に解析した。【０１２８】
ＣｐＧサイトのメチル化率の解析に供したＤＮＡは、各被験者の直腸の粘膜組織から実施例１と同様にしてＤＮＡを抽出し、全ゲノム増幅し、ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルの定量及び比較解析を行い、その結果を用いてDiffScoreの算出、クラスター解析及び主成分分析を実施した。なお、BeadChipはInfinium Methylation EPIC BeadChip（Illumina社製）を使用した。また、GenomeStudioの設定条件は、「Content Descriptor」を「MethylationEPIC_v-1-0_B2.bpm」とした以外は、実施例１と同一の条件とした。【０１２９】
（１）ＣｐＧバイオマーカー候補の抽出
次いで、網羅的ＤＮＡメチル化解析データからＣｐＧバイオマーカー候補を抽出した。  具体的には、まず、８６６，８９５個のＣｐＧサイトから、Δβ値の絶対値が０．１５超である１４２個のＣｐＧサイトを抽出した。【０１３０】
次に、下記の２種類のロジスティック回帰モデルを作成した。［モデル１］１４２個のＣｐＧサイトから選んだ２個のＣｐＧの全ての組み合わせに基づく、１０，０１１個のロジスティック回帰モデル。
［モデル２］１４２個のＣｐＧサイトから選んだ３個のＣｐＧの全ての組み合わせに基づく、４６７，１８０個のロジスティック回帰モデル。
【０１３１】
両ロジスティック回帰モデルの判別式について、下記の２つの基準について、それぞれ充足するＣｐＧサイトを選定した。また、［モデル２］については、出現するＣｐＧサイトの頻度も算出し、頻度が３以上のものを選定した。【０１３２】
［基準１］感度が９０％超、特異度が９０％超、判別式の係数ｐ値が０．０５未満、かつＡＩＣ（赤池の情報量基準）が３０未満。［基準２］感度が９５％超、特異度が８５％超、判別式の係数ｐ値が０．０５未満、かつＡＩＣ（赤池の情報量基準）が３０未満。
【０１３３】
２つの基準のそれぞれについて、判別式に出現するＣｐＧサイトを選択したところ、表１３〜１５に記載の３３個のＣｐＧサイト（３３ＣｐＧセット）が選抜された。各ＣｐＧサイトの結果を表２６に示す。【０１３４】
【表２６】
2018062361.tif 000027
【０１３５】
（２）ＣｐＧバイオマーカー候補を用いた臨床サンプルの多変量解析
前記３３ＣｐＧセットのメチル化レベルに基づき、全４８サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行った。この結果、クラスター解析（図８）では、大腸癌患者サンプルの殆どが同一クラスター（図中、枠内）に集積した。また、主成分分析（図９、縦軸は第２主成分）では、大腸癌患者サンプル（●）と健常者サンプル（▲）が第１主成分（横軸）方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。すなわち、３３ＣｐＧセットを用いて大腸癌患者２０サンプルと健常者２８サンプルを明確に区別することができた。【０１３６】
（３）ＣｐＧバイオマーカー候補を用いた臨床サンプルの孤発性大腸癌の発症可能性の評価
前記３３ＣｐＧセットのうち、配列番号５７で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ０１１０５４０３）、配列番号６３で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ０６８２９６８６）、及び配列番号７７で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ１４６２９３９７）の３個のＣｐＧサイトのメチル化率をマーカーとした場合の、孤発性大腸癌発症の有無の判定の精度を調べた。【０１３７】
具体的には、２０名の孤発性大腸癌と診断された大腸癌患者及び２８名の健常者の直腸から採取された検体の前記３つのＣｐＧサイトのメチル化レベルの数値（β値）を用いてロジスティック回帰モデルに基づく判別式を作成して大腸癌患者と健常者の判別を行った。この結果、感度（大腸癌患者の中で、陽性と評価された割合）が９５．０％、特異度（健常者の中で、陰性と評価された割合）が９６．４％、陽性的中率（陽性と評価された中で、大腸癌患者の割合）が９５．０％、陰性的中率（陰性と評価された中で、健常者の割合）が９６．４％であり、いずれも９０％以上と高かった。また、図１０にＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を示す。ＡＵＣ（ＲＯＣ曲線下面積）は０．９８９であった。これらの結果から、前記３３ＣｐＧセットから選択された２〜５個のＣｐＧサイトのメチル化率に基づいて、高感度かつ高特異度で、孤発性大腸癌発症の可能性を評価できることが確認された。【０１３８】
［実施例３］
実施例１及び実施例２において求めた直腸粘膜サンプルのＤＮＡメチル化レベル（β値）から、ＣｐＧバイオマーカー候補を抽出した。【０１３９】
（１）ＣｐＧバイオマーカー候補の抽出
具体的には、まず、８６６，８９５個のＣｐＧサイトから、孤発性大腸癌と診断された大腸癌患者２６サンプル及び健常者３６サンプルのΔβの絶対値が０．１５超である４２個のＣｐＧサイトを抽出した。【０１４０】
次に、下記の２種類のロジスティック回帰モデルを作成した。［モデル１］４２個のＣｐＧサイトから選んだ２個のＣｐＧの全ての組み合わせに基づく、８６１個のロジスティック回帰モデル。
［モデル２］４２個のＣｐＧサイトから選んだ３個のＣｐＧの全ての組み合わせに基づく、１１，４８０個のロジスティック回帰モデル。
【０１４１】
両ロジスティック回帰モデルの判別式について、下記の２つの基準について、それぞれ充足するＣｐＧサイトを選定した。［基準１］感度が９０％超、特異度が９０％超、判別式の係数ｐ値が０．０５未満、かつＡＩＣ（赤池の情報量基準）が３０未満。
［基準２］感度が９５％超、特異度が８５％超、判別式の係数ｐ値が０．０５未満、かつＡＩＣ（赤池の情報量基準）が３０未満。
【０１４２】
２つの基準のそれぞれについて、判別式に出現するＣｐＧサイトを選択した。選択されたＣｐＧサイトから実施例２で選抜されたＣｐＧを除くと、表１６に記載の６個のＣｐＧサイト（６ＣｐＧセット）が選抜された。各ＣｐＧサイトの結果を表２７に示す。【０１４３】
【表２７】
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【０１４４】
（２）ＣｐＧバイオマーカー候補を用いた臨床サンプルの多変量解析
前記６ＣｐＧセットのメチル化レベルに基づき、全６２サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行った。この結果、クラスター解析（図１１）では、大腸癌患者サンプルの多くは数個のクラスター（図中、枠内）に集積した。また、主成分分析（図１２、縦軸は第２主成分）では、大腸癌患者サンプル（●）と健常者サンプル（▲）は、第１主成分（横軸）方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。すなわち、主成分分析では６ＣｐＧセットを用いて大腸癌患者２０サンプルと健常者２８サンプルを明確に区別することができた。【０１４５】
［実施例４］
実施例２において取得した大腸癌患者２０名及び健常者２８名の直腸から採取した検体の各ＤＭＲの平均メチル化率（平均β値；各ＤＭＲ中に存在するＣｐＧサイトのメチル化レベル（β値）の相加平均値）から、ＤＭＲバイオマーカー候補を抽出した。【０１４６】
（１）ＤＭＲバイオマーカー候補の抽出
具体的には、まず、８６６，８９５個のＣｐＧサイトのメチル化データ（ＩＤＡＴ形式）を、ＣｈＡＭＰパイプライン（Bioinformatics、30、428、2014；http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ChAMP.html）に入力し、大腸癌患者と健常者の２群間で有意と判定されたＤＭＲ４，２３２か所を抽出した。この中でΔβ値（［平均β値（癌直腸）］−［平均β値（非癌直腸）］）の絶対値が０．０５超である１２１か所（ＤＭＲ番号１〜１２１）をＤＭＲバイオマーカー候補とした。この１２１か所のＤＭＲ（１２１ＤＭＲセット）の結果を表２８〜３１に示す。【０１４７】
【表２８】
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【０１４８】
【表２９】
2018062361.tif 000030
【０１４９】
【表３０】
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【０１５０】
【表３１】
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【０１５１】
次に、Ｒソフトウェアのｇｌｍ関数を用いて前記１２１ＤＭＲセットから選んだ３か所のＤＭＲ全ての組み合わせに基づく２８７，９８０個のロジスティック回帰モデルを作成した。得られた判別式について、感度が９５％より大きく、かつ、４個の係数のうちｐ値が０．０５より小さいものが３個以上である判別式４７個を選択したところ、この中に出現するＤＭＲは５２か所であった（表中、５２ＤＭＲ）。さらに、判別式４７個に出現するＤＭＲの頻度を求めたところ、３回以上出現するものは１５か所であった（表中、１５ＤＭＲ）。【０１５２】
（２）ＤＭＲバイオマーカー候補を用いた臨床サンプルの多変量解析
前記１２１ＤＭＲセットのメチル化率に基づき、実施例２の全４８サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行った。この結果、クラスター解析では、大多数の大腸癌患者サンプルが同一クラスター（図１３中、枠内）に集積した。また、主成分分析（図１４）では、大腸癌患者サンプル（●）と健常者サンプル（▲）が第１主成分方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。【０１５３】
（３）ＤＭＲバイオマーカー候補を用いて臨床サンプルの孤発性大腸癌発症可能性の評価  前記１２１ＤＭＲセットのうち、ＤＭＲ番号１１、２４、及び４２の領域のメチル化率をマーカーとした場合の、孤発性大腸癌発症の有無の判定の精度を調べた。
【０１５４】
具体的には、２０名の大腸癌患者及び２８名の健常者の直腸から採取された検体の前記３か所のＤＭＲのメチル化レベルの数値（β値）を用いてロジスティック回帰モデルに基づく判別式を作成して大腸癌患者と健常者の判別を行った。この結果、感度（大腸癌患者のうち、陽性と評価された患者の割合）が１００％、特異度（健常者のうち、陰性と評価された者の割合）が９２．９％、陽性的中率（陽性と評価された者のうち、大腸癌患者の割合）が９０．９％、陰性的中率（陰性と評価された者のうち、健常者の割合）が１００％であり、いずれも９０％以上と高かった。また、図１５にＲＯＣ曲線を示す。この結果、ＡＵＣ（ＲＯＣ曲線下面積）は０．９６８であった。これらの結果から、前記１２１ＤＭＲセットから選択された数か所のＤＭＲの平均メチル化率に基づいて、高感度かつ高特異度で、孤発性大腸癌発症の可能性を評価できることが確認された。
【符号の説明】
【０１５５】
１…大腸粘膜採取用キット、２…採取具、３ａ…第１の挟持片、３ｂ…第２の挟持片、３１、３１ａ、３１ｂ…挟持部、３２、３２ａ、３２ｂ…把持部、３３、３３ａ、３３ｂ…バネ部、３４、３４ａ、３４ｂ…固定部、３５、３５ａ、３５ｂ…挟持面、１１…採取補助具、１２…採取具導入部、１３…スリット、１４…把持部、１５…先端辺縁部、１６…手元辺縁部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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