(57)【要約】  遺伝子発現量が少ない検体であっても感度よく神経芽腫の微小残存病変を検出することができる遺伝子マーカーの組み合わせを提供する。  本発明の試薬は、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨそれぞれの遺伝子マーカーを核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアを含み、神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられる。この試薬は、ＨＰＲＴ１遺伝子を核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアをさらに含んでよい。本発明の生体試料の分析方法は、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨそれぞれの遺伝子マーカーの生体試料中における発現量を、上記の試薬を用いて核酸増幅法により測定する工程を含む。核酸増幅法は好ましくはデジタルＰＣＲによって行われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨそれぞれの遺伝子マーカーを核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアを含み、神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられる試薬。
【請求項２】
レファレンス遺伝子としての、ＨＰＲＴ１、ＨＭＢＳ、ＧＵＳＢ、ＴＢＰおよびＢ２Ｍの少なくともいずれかを核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアをさらに含む、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
レファレンス遺伝子としての、ＨＰＲＴ１、ＨＭＢＳ、ＧＵＳＢおよびＴＢＰの少なくともいずれかを核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアをさらに含む、請求項１に記載の試薬。
【請求項４】
レファレンス遺伝子としてのＨＰＲＴ１を核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアをさらに含む、請求項１に記載の試薬。
【請求項５】
前記遺伝子マーカーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるプローブをさらに含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項６】
レファレンス遺伝子を核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアをさらに含む場合、前記レファレンス遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるプローブをさらに含む、請求項５に記載の試薬。
【請求項７】
ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨそれぞれの遺伝子マーカーの生体試料中における発現量を、請求項１から６のいずれか１項に記載の試薬を用いて核酸増幅法により測定する測定工程を含み、
前記発現量が神経芽腫の微小残存病変の発生レベルと相関する、生体試料の分析方法。
【請求項８】
前記遺伝子マーカーの１種以上の発現量が閾値以上か否かを評価する評価工程を含む、請求項７に記載の生体試料の分析方法。
【請求項９】
前記評価工程において、前記遺伝子マーカーの１種以上の発現量が閾値以上である場合に、前記生体試料の神経芽腫の微小残存病変を陽性と判定する、請求項８に記載の生体試料の分析方法。
【請求項１０】
前記測定工程における前記核酸増幅法がデジタルＰＣＲである、請求項７から９のいずれか１項に記載の生体試料の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経芽腫の微小残存病変を評価するための遺伝子マーカーおよびその使用に関する。より具体的には、本発明は、神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられる試薬、およびそれを用いた生体試料の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経芽腫は、神経堤細胞由来の難治性小児がんであり、小児がんの約１０％を占める。これは、脳腫瘍に次いで高い頻度である。また神経芽腫は、小児がん死亡原因の約１５％を占める。
神経芽腫は、５つの予後因子（病期、病理、年齢、ＭＹＣＮ増幅、ＤＮＡプロイディー）を用いて、低・中間・高リスク群に分類されるが、５０％を超える患者が高リスク群に分類される。そして、高リスク群患者の５０％超で再発する。【０００３】
したがって、神経芽腫の予後改善、特に高リスク群患者の予後改善には、再発の起源と考えられる微小残存病変（ＭＲＤ）を正しく評価することが不可欠である。腫瘍細胞にのみに検出される遺伝子が同定されていない神経芽腫では、正常細胞に比して腫瘍細胞で高発現するいくつかの遺伝子をマーカーとすることで、ＭＲＤの検出が試みられてきた。【０００４】
神経芽腫のＭＲＤの遺伝子マーカーとして、最初にＴＨが報告され（非特許文献１）、その後、ＰＨＯＸ２Ｂが報告された（非特許文献２）。さらに、非特許文献３では、ＣＨＧＡ、ＤＣＸ、ＤＤＣ、ＰＨＯＸ２Ｂ、およびＴＨの５種の遺伝子マーカーが報告されている。非特許文献４では、Ｂ４ＧＡＬＮＴ（GD2 synthase）、ＣＣＮＤ１、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂの４種の遺伝子マーカーが報告されている。非特許文献５では、ＣＨＲＮＡ３、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＰＨＯＸ２Ｂ、およびＴＨの５種の遺伝子マーカーが報告されている。【０００５】
一方、非特許文献６では、それまでの遺伝子マーカー探索において通常に用いられてきた接着培養したパレンタル神経芽腫細胞ではなく、生体内でＭＲＤを構成するがん幹細胞が濃縮されるように浮遊培養したスフェアー神経芽腫細胞を検証し、ＣＨＲＮＡ３、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＣＸ、ＤＤＣ、ＧＡＢＲＢ３、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＫＩＦ１Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、およびＴＨの１１種の遺伝子マーカーのうちいずれかが正常範囲を超えて発現している場合にＭＲＤ陽性とスコアするＭＲＤ検出プロトコールが提唱されている。非特許文献７では、２症例において、再発/再増殖の臨床診断よりも早期に、当該１１種の遺伝子マーカーによりＭＲＤ陽性と評価することが報告されている。上述の非特許文献６および非特許文献７では、遺伝子マーカーの測定にリアルタイムＰＣＲが用いられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】International Journal of Cancer (1994) 57: 671-675.
【非特許文献２】Journal of Clinical Oncology (2008) 26: 5443-5449.
【非特許文献３】Lancet Oncology (2013) 14: 999-1008.
【非特許文献４】Journal of Clinical Oncology (2015) 33:755-763.
【非特許文献５】European Journal of Cancer (2016) 54: 149-158.
【非特許文献６】Oncology Reports (2013) 29: 1629-1636.
【非特許文献７】Oncology Letters (2016) 12: 1119-1123.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、神経芽腫のＭＲＤマーカーとしては様々なものが報告されている。最初に神経芽腫のＭＲＤマーカーとして非特許文献１で報告されたＴＨでは、それ単独ではＴＨ陰性となりＭＲＤを検出できない例が多数報告され、次に、より陰性例の少ないＭＲＤマーカーとして非特許文献２で報告されたＰＨＯＸ２Ｂでもそれ単独では陰性例が散見された。これは、神経芽腫が、腫瘍の中でも多様性（ヘテロジェナイティー）が特に著しいという特有の課題を有していることを示している。このような神経芽腫特有の多様性に対応させるため、複数のＭＲＤマーカーを用いたＭＲＤの検出が試みられている。なお、非特許文献３〜５でそれぞれ報告された神経芽腫のＭＲＤマーカーでは、それまでとは異なるマーカーが組み合わされておりどの程度の偽陰性が生じるのか不明であるが、通常の接着培養した神経芽腫細胞株における発現に基づいて選択されたマーカーであることから、特異性の点で改善の余地があると考えられる。【０００８】
非特許文献６〜７で報告された神経芽腫のＭＲＤマーカーは、スフェアー神経芽腫細胞中で発現量の多いマーカーから選択されており、特異性が高い点で好ましい。また、神経芽腫特有の多様性に対応するためには、技術常識上、組み合わせるマーカーの数を増やすことでスクリーニング感度を上げる必要がある。スフェアー神経芽腫細胞中で発現量の多い１１個もの多数のマーカーが組み合わされていることは、偽陰性を低減する点でも好ましい。しかしながら、１１もの数のマーカーを分析対象とすることは検査効率が悪く、臨床への適用において非常に高い障壁となる。【０００９】
このように、神経芽腫のＭＲＤ検出においては、その特有の著しい多様性ゆえに、偽陰性の抑制と臨床適用性とを両立することが特に困難であった。そこで本発明の目的は、偽陰性を抑制しながらも臨床応用に適した少数の神経芽腫のＭＲＤマーカーの組み合わせを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は鋭意検討の結果、神経芽腫のＭＲＤの検出能力が特に高い特定の７種の遺伝子マーカーを見出した。本発明は、この知見に基づいて、さらに検討を重ねることにより完成したものである。
本発明は、神経芽腫の微小残存病変を評価するための試薬と、それを用いた生体試料の分析方法と、を含む。【００１１】
（１）
本発明の試薬は、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨそれぞれの遺伝子マーカーを核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアを含み、神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられる。【００１２】
上述のＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨとしてそれぞれ記載される遺伝子マーカーは、それぞれ、後述の配列番号１から配列番号７で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドと少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列からなり且つ当該ポリヌクレオチドと機能的に同等なものとを含む。【００１３】
本発明における遺伝子マーカーはわずか７個の組み合わせでありながら、それぞれの遺伝子マーカーが神経芽腫の微小残存病変における検出能力に特に優れるため、偽陰性を抑制するとともに臨床応用も容易となる。さらに、それぞれの遺伝子に対応するプライマーペア全てのアニーリング温度も揃い易いため、７種の遺伝子マーカーのいずれであっても同様に効率良く増幅させることができる。この点も、本発明における遺伝子マーカーセットの臨床応用を容易にする。【００１４】
（２）
上記（１）の試薬は、レファレンス遺伝子としての、ＨＰＲＴ１、ＨＭＢＳ、ＧＵＳＢ、ＴＢＰおよびＢ２Ｍの少なくともいずれかを核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアをさらに含んでよい。【００１５】
上述の（２）ならびに後述の（３）および（４）において、ＨＰＲＴ１、ＨＭＢＳ、ＧＵＳＢ、ＴＢＰおよびＢ２Ｍとしてそれぞれ記載されるレファレンス遺伝子は、後述の配列番号８から配列番号１２で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドと少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列からなり且つ当該ポリヌクレオチドと機能的に同等のものとを含む。【００１６】
このようなレファレンス遺伝子用のプライマーペアの併用により、神経芽腫の微小残存病変の発生をより正確に評価することができる。【００１７】
（３）
上記（１）の試薬は、レファレンス遺伝子としての、ＨＰＲＴ１、ＨＭＢＳ、ＧＵＳＢおよびＴＢＰの少なくともいずれかを核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアをさらに含んでよい。【００１８】
このような特定のレファレンス遺伝子は低発現量の遺伝子であるため、遺伝子発現量が少ない検体であってもより感度良く神経芽腫の微小残存病変を検出することができる。したがって、このような特定のレファレンス遺伝子用のプライマーペアの併用により、遺伝子マーカーの発現量が少なくても神経芽腫の微小残存病変の発生をより良好に評価することができる。【００１９】
（４）
上記（１）の試薬は、レファレンス遺伝子としてのＨＰＲＴ１を核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアをさらに含んでよい。【００２０】
レファレンス遺伝子ＨＰＲＴ１は低発現量の遺伝子であるため、遺伝子発現量が少ない検体であってもより感度良く神経芽腫の微小残存病変を検出することができる。それだけでなく、レファレンス遺伝子ＨＰＲＴ１は特に骨髄検体および末梢血検体の間における発現量の変動（ばらつき）が小さい。このため、骨髄検体であっても末梢血検体であっても、且つ、遺伝子発現量が少ない検体であっても、正しく神経芽腫の微小残存病変を検出することができる。【００２１】
（５）
上記（１）から（４）の試薬は、遺伝子マーカーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるプローブをさらに含んでよい。【００２２】
これによって、プローブをハイブリダイズさせることで遺伝子マーカーを検出することができる。【００２３】
（６）
上記（５）の試薬は、レファレンス遺伝子を核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアをさらに含む場合、当該レファレンス遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるプローブをさらに含んでよい。【００２４】
これによって、プローブをハイブリダイズさせることで遺伝子マーカーとともにレファレンス遺伝子を検出することができる。【００２５】
（７）
本発明の生体試料の分析方法は、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨそれぞれの遺伝子マーカーの生体試料中における発現量を、上記（１）から（６）のいずれかの試薬を用いて核酸増幅法により測定する測定工程を含む。遺伝子マーカーの発現量は、神経芽腫の微小残存病変の発生レベルと相関する。【００２６】
本発明における遺伝子マーカーはわずか７個の組み合わせでありながら、それぞれの遺伝子マーカーが神経芽腫の微小残存病変における検出能力に特に優れるため、偽陰性を抑制するとともに臨床応用も容易となる。さらに、それぞれの遺伝子に対応するプライマーペア全てのアニーリング温度が揃い易いため、７種の遺伝子マーカーのいずれであっても同様に効率良く増幅させることができる。この点も、本発明における遺伝子マーカーセットの臨床応用を容易にする。【００２７】
（８）
上記（７）の生体試料の分析方法は、遺伝子マーカーの１種以上の発現量が閾値以上か否かを評価する評価工程を含んでよい。【００２８】
本発明では７種の遺伝子マーカーのいずれであっても同様に効率良く増幅されるため、このように７種の遺伝子マーカーのうち１種以上の発現量が閾値以上であれば、神経芽腫の微小残存病変を陽性と判断することができる。【００２９】
（９）
上位（８）の生体試料の分析方法は、評価工程において、遺伝子マーカーの１種以上の発現量が閾値以上である場合に、生体試料の神経芽腫の微小残存病変を陽性と判定してよい。【００３０】
これによって、生体試料の由来元の患者における神経芽腫の微小残存病変を正しく診断することができる。【００３１】
（１０）
上記（７）から（９）のいずれかの生体試料の分析方法は、測定工程における核酸増幅法がデジタルＰＣＲであってよい。【００３２】
この場合、遺伝子発現量がより少ない検体であっても感度よく神経芽腫の微小残存病変を検出することができる。また、異なる分析主体、分析時期、分析機器、プロトコル（反応時間、反応温度等）等であっても測定結果のばらつきを少なくすることができ、正確に神経芽腫の微小残存病変を検出することができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によって、偽陰性を抑制しながらも臨床応用に適した好感度の神経芽腫のＭＲＤマーカーの組み合わせが提供されるため、より多くの患者において、神経芽腫の微小残存病変を正確に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例６において、本発明における７マーカー（ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨ）およびその他の４マーカー（ＤＣＸ、ＣＨＲＮＡ３、ＫＩＦ１Ａ、及びＧＡＢＲＢ３）を用いてＭＲＤの評価を行った２５２検体中の陽性検体数を示す。
【図２】図１の２５２検体において、当該７マーカー及びその他の４マーカーにおいて単一マーカー陽性となった検体数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
［１．神経芽腫の微小残存病変を評価するための試薬］
本発明の試薬は神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられるものであり、下記の７種の遺伝子マーカーを核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアとして用いられるポリヌクレオチド分子を含む。また、プライマーペアとして用いられるポリヌクレオチド分子に加えて、遺伝子マーカーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるプローブとして用いられるポリヌクレオチド分子をさらに含んでもよい。
なお、本明細書において、ポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい態様によれば、ポリヌクレオチド分子はＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００３６】
［１−１．遺伝子マーカー］
本発明における遺伝子マーカーは、ＣＲＭＰ１として記載される遺伝子、ＤＢＨとして記載される遺伝子、ＤＤＣとして記載される遺伝子、ＧＡＰ４３として記載される遺伝子、ＩＳＬ１として記載される遺伝子、ＰＨＯＸ２Ｂとして記載される遺伝子およびＴＨとして記載される遺伝子（以下、それぞれ単に、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨと記載する。）の７種を含む。これら遺伝子マーカーそれぞれは、神経芽腫の微小残存病変が存在する場合に発現量が増加する。
【００３７】
これら７種の遺伝子マーカーの組み合わせは、核酸増幅による神経芽腫の微小残存病変の検出感度が高く、神経芽腫の微小残存病変の偽陰性が少ない。このため、神経芽腫の微小残存病変の指標として有用である。したがって、これら７種の遺伝子マーカーの発現量を核酸増幅法で測定することにより、神経芽腫の微小残存病変を感度よく検出することができる。
【００３８】
これら７種の遺伝子マーカーは、それぞれが単一マーカーでも神経芽腫の微小残存病変を検出する性能を有し、わずか７個の組み合わせでありながら、神経芽腫特有の著しい多様性（ヘテロジェナイティー）に対応するスクリーニング感度を有する。この７個という遺伝子マーカー数は、レファレンス遺伝子の数を含めても、多くの核酸増幅装置において同時に遺伝子増幅できる数であるため、臨床への適用が容易である。
【００３９】
ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨの７種の遺伝子マーカーの組み合わせは、検出対象検体が末梢血検体であっても骨髄検体であっても有用である。この中でも、ＰＨＯＸ２Ｂは特に骨髄検体で検出感度が高く、ＣＲＭＰ１は特に末梢血検体で検出感度が高い傾向にある。
【００４０】
本発明における遺伝子マーカーそれぞれの配列情報の詳細は、公知のデータベースにおいて取得することができる。たとえば;
・ＣＲＭＰ１(collapsin response mediator protein 1)として、アメリカ合衆国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）のRefSeqデータベースにおけるアクセッション番号NM_001014809に相当するもの、
・ＤＢＨ(dopamine β-hydroxylase)として、同アクセッション番号NM_000787に相当するもの、
・ＤＤＣ(dopa decarboxylase)として、同アクセッション番号NM_000790に相当するもの、
・ＧＡＰ４３(growth-associated protein 43)として、同アクセッション番号NM_001130064に相当するもの、
・ＩＳＬ１(ISL LIM homeobox 1)として、同アクセッション番号NM_002202に相当するもの、
・ＰＨＯＸ２Ｂ(paired-like homeobox 2b)として、同アクセッション番号NM_003924に相当するもの、
・ＴＨ(tyrosine hydroxylase)として、同アクセッション番号NM_199292に相当するものが挙げられる。
【００４１】
本発明における遺伝子マーカーをコードする具体的なヌクレオチド配列としては、以下の配列が挙げられる。すなわち；
・ＣＲＭＰ１は配列番号１で表されるものであってよく、
・ＤＢＨは配列番号２で表されるものであってよく、
・ＤＤＣは配列番号３で表されるものであってよく、
・ＧＡＰ４３は配列番号４で表されるものであってよく、
・ＩＳＬ１は配列番号５で表されるものであってよく、
・ＰＨＯＸ２Ｂは配列番号６で表されるものであってよく、
・ＴＨは配列番号７で表されるものであってよい。
【００４２】
本発明における遺伝子マーカーをコードするヌクレオチド配列は、神経芽腫の微小残存病変の指標となる限り、上記の配列と相同性を有するものであってもよい。好ましくは、上述の配列番号１から配列番号７でそれぞれ表されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有し、かつ機能的に同等なポリヌクレオチドからなってよい。このようなポリヌクレオチドの配列相同性は、より好ましくは７５％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
【００４３】
なお、機能的に同等とは、上述の配列番号１から配列番号７でそれぞれ表されるヌクレオチド配列を有する特定のポリヌクレオチドと同等に、神経芽腫の微小残存病変が存在する場合に発現量が増加するものである。機能同等性は、たとえば、後述するプローブまたはプライマーを用い、ポリヌクレオチドの発現量を測定し、当該発現量と神経芽腫の微小残存病変との相関を公知の統計手法により決定し、上述の特定のポリヌクレオチドのそれと比較することにより容易に決定することができる。
【００４４】
また、上述のヌクレオチド配列の相同性は、公知の手法によって決定されるものである（以下においても同様）。このような手法の具体例としては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３−５８７７（１９９３）〕等が挙げられる。また、このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されており〔Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０）〕、本発明においても利用することができる。さらに、他の好ましい手法としては、遺伝情報処理ソフトウェア ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）を用いる手法が挙げられる。ＧＥＮＥＴＹＸを用いる場合には、ＢＬＡＳＴによる解析のほかにＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法によるホモロジー解析を行うことができ、本発明における相同性決定において有利に利用することができる。
【００４５】
上述の７種の遺伝子マーカーは、神経芽腫の微小残存病変の検出感度が高く、神経芽腫の微小残存病変のレベルが増加する場合に発現量が増加する。つまり、当該発現量と神経芽腫の微小残存病変の発生レベルとが相関する。したがって、後述するポリヌクレオチド分子を用い、これら７種の遺伝子マーカー全ての発現量を測定することで、得られた発現量から神経芽腫の微小残存病変を評価することができる。
【００４６】
［１−２．レファレンス遺伝子］
レファレンス遺伝子としては、たとえば、ＨＰＲＴ１として記載される遺伝子、ＨＭＢＳとして記載される遺伝子、ＧＵＳＢとして記載される遺伝子、ＴＢＰとして記載される遺伝子、およびＢ２Ｍとして記載される遺伝子（以下、それぞれ単に、ＨＰＲＴ１、ＨＭＢＳ、ＧＵＳＢ、ＴＢＰ、およびＢ２Ｍと記載する。）が挙げられる。これらの中から少なくとも１のレファレンス遺伝子を選択することができる。
【００４７】
これらの中でも、レファレンス遺伝子は、その発現量が適度に低度であることで遺伝子マーカー発現量が少ない検体であってもより感度よくＭＲＤを検出することができる点で、ＨＰＲＴ１遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＧＵＳＢ遺伝子、およびＴＢＰ遺伝子からなる群から選択されることが好ましい。さらにこの中でも、レファレンス遺伝子は、骨髄検体および末梢血検体における発現量の変動（ばらつき）が小さいことで骨髄に由来する生体試料に対しても末梢血に由来する生体試料に対しても有用性が高い点で、ＨＰＲＴ１遺伝子であることが最も好ましい。
【００４８】
レファレンス遺伝子の配列情報の詳細は、公知のデータベースにおいて取得することができる。たとえば；
・ＨＰＲＴ１(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1)として、アメリカ合衆国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）のRefSeqデータベースにおけるアクセッション番号NM_000194に相当するもの、
・ＨＭＢＳ（Hydroxymethylbilane synthase）として、同データベースにおけるアクセッション番号NM_000190に相当するもの、
・ＧＵＳＢ（Glucuronidase Beta）として、同データベースにおけるアクセッション番号NM_000181に相当するもの、
・ＴＢＰ（TATA-binding protein）として、同データベースにおけるアクセッション番号NM_003194に相当するもの、
・Ｂ２Ｍ（Beta-2-Microglobulin）として、同データベースにおけるアクセッション番号NM_004048に相当するもの、が挙げられる。
【００４９】
レファレンス遺伝子をコードする具体的なヌクレオチド配列としては、以下の配列が挙げられる。すなわち；
・ＨＰＲＴ１は配列番号８で表されるものであってよく、
・ＨＭＢＳは配列番号９で表されるものであってよく、
・ＧＵＳＢは配列番号１０で表されるものであってよく、
・ＴＢＰは配列番号１１で表されるものであってよく、
・Ｂ２Ｍは配列番号１２で表されるものであってよい。
【００５０】
レファレンス遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、内在性コントロールとなる限り、上記の配列と相同性を有するものであってもよい。好ましくは、上述のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有し、かつ上述の遺伝子それぞれと機能的に同等なポリヌクレオチドからなってよい。このようなポリヌクレオチドの配列相同性は、より好ましくは７５％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
【００５１】
なお、機能的に同等とは、ＨＰＲＴ１、ＨＭＢＳ、ＧＵＳＢ、ＴＢＰおよびＢ２Ｍにあっては、上述の配列番号８から配列番号１２で表されるヌクレオチド配列を有する特定のポリヌクレオチドと同等に検体間で測定値のばらつきが少ないものであり；ＨＰＲＴ１、ＨＭＢＳ、ＧＵＳＢおよびＴＢＰにあっては、さらに発現量が適度に低度であり、ＨＰＲＴ１にあっては、さらに骨髄検体および末梢血検体の間で測定値のばらつきが少ないものである。機能同等性は、たとえば、後述するプローブまたはプライマーを用い、ポリヌクレオチドの発現量を測定し、当該発現量、および、当該発現量と神経芽腫の微小残存病変との相関を公知の統計手法により決定し、上述の特定のポリヌクレオチドのそれらと比較することにより容易に決定することができる。
【００５２】
［１−３．プライマーペア］
本発明におけるプライマーペアは、上述の遺伝子マーカーをコードするヌクレオチド配列を増幅しうる一対のポリヌクレオチド分子である。本発明の試薬には７種の遺伝子マーカーＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨそれぞれに対する合計７対のプライマーペアが含まれる。
【００５３】
このようなプライマーペアは、上述の遺伝子マーカーをコードするヌクレオチド配列を増幅できるようにそれぞれ設計されたセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む。アンチセンスプライマーは、増幅対象のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子であり、センスプライマーは、増幅対象のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子である。具体的なプライマーペアの設計は、増幅対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜行うことができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００５４】
本発明では、上述の７種の遺伝子マーカーを選択することにより、７種の遺伝子マーカーそれぞれに対応するプライマーペア全てのアニーリング温度を良好に揃えることができる。このため、７種の遺伝子マーカーを同一熱源で同時測定する場合に増幅対象領域の増幅効率を良好に揃えることができる。７種の遺伝子マーカーのいずれであっても効率良く増幅されることで、遺伝子発現量が少ない検体であっても微小残存病変測定感度を向上させることができる。この点も、本発明における遺伝子マーカーセットの臨床応用を容易にする。
【００５５】
プライマーの長さおよび具体的配列は特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。たとえば、７種の遺伝子マーカーのうち複数、好ましくは全部の同時測定のために、アニーリング温度条件が揃うＴｍ値となるよう設計してよい。
【００５６】
プライマーの長さは、たとえば１８ヌクレオチド以上３０ヌクレオチド以下、好ましくは１８ヌクレオチド以上２６ヌクレオチド以下であってよい。
【００５７】
プライマーの具体的配列としては、たとえば以下が挙げられる。
・ＣＲＭＰ１に対するプライマー
5'-ccaatccctttatgctgacg-3' (sense)  （配列番号１３）
5'-ggaacgattaagttctctcctatttg-3' (antisense)  （配列番号１４）
・ＤＢＨに対するプライマー
5'-tggggacactgcctattttg-3' (sense)  （配列番号１５）
5'-ttctggggtcctctgcac-3' (antisense)  （配列番号１６）
・ＤＤＣに対するプライマー
5'-ctggagaagggggaggagt-3' (sense)  （配列番号１７）
5'-gccgatggatcactttggt-3' (antisense)  （配列番号１８）
・ＧＡＰ４３に対するプライマー
5'-gaggatgctgctgccaag-3' (sense)  （配列番号１９）
5'-ggcactttccttaggtttggt-3' (antisense)  （配列番号２０）
・ＩＳＬ１に対するプライマー
5'-aaggacaagaagcgaagcat-3' (sense)  （配列番号２１）
5'-ttcctgtcatcccctggata-3' (antisense)  （配列番号２２）
・ＰＨＯＸ２Ｂに対するプライマー
5'-ctaccccgacatctacactcg-3' (sense)  （配列番号２３）
5'-ctcctgcttgcgaaacttg-3' (antisense)  （配列番号２４）
・ＴＨに対するプライマー
5'-tcagtgacgccaaggaca-3' (sense)  （配列番号２５）
5'-gtacgggtcgaacttcacg-3' (antisense)  （配列番号２６）
【００５８】
本発明では、上述の７種の遺伝子マーカーを増幅しうるプライマーペアに加え、上述のレファレンス遺伝子を増幅しうるプライマーペアを含んでよい。
【００５９】
レファレンス遺伝子を増幅しうるプライマーの長さおよび具体的配列も特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。たとえば、７種の遺伝子マーカーのうち複数、好ましくは全部の同時測定のために、上記の７種の遺伝子マーカーとアニーリング温度条件が揃うＴｍ値となるよう設計してよい。
【００６０】
プライマーの長さは、たとえば１８ヌクレオチド以上３０ヌクレオチド以下、好ましくは１８ヌクレオチド以上２６ヌクレオチド以下であってよい。
【００６１】
レファレンス遺伝子用のプライマーの具体的配列としてはたとえば以下が挙げられる。
・ＨＰＲＴ１に対するプライマー
5'-tgaccttgatttattttgcatacc-3' (sense)  （配列番号２７）
5'-cgagcaagacgttcagtcct-3' (antisense)  （配列番号２８）
・ＨＭＢＳに対するプライマー
5'-ctgaaagggccttcctgag-3' (sense)  （配列番号２９）
5'-cagactcctccagtcaggtaca-3' (antisense)  （配列番号３０）
・ＧＵＳＢに対するプライマー
5'-cgccctgcctatctgtattc-3' (sense)  （配列番号３１）
5'-tccccacagggagtgtgtag-3' (antisense)  （配列番号３２）
・ＴＢＰに対するプライマー
5'-gaacatcatggatcagaacaaca-3' (sense)  （配列番号３３）
5'-atagggattccgggagtcat-3' (antisense)  （配列番号３４）
・Ｂ２Ｍに対するプライマー
5'-ttctggcctggaggctatc-3' (sense)  （配列番号３５）
5'-tcaggaaatttgactttccattc-3' (antisense)  （配列番号３６）
【００６２】
プライマーは、増幅対象の検出に適した付加的配列（具体的にはゲノムDNAと相補的でない配列）、例えばリンカー配列をさらに含んでいてもよい。
また、プライマーは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（たとえば、125I、131I、3H、14Cなど）、酵素（たとえば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、蛍光物質（たとえば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート、Cy3、Cy5など）、発光物質（たとえば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）などで標識されていてもよい。
さらに、プライマーは、各々別個に、または各々の機能を損なわなければ混合した状態で、水または適当な緩衝液（たとえば、TEバッファー、Tris-HClバッファーなど）中に適当な濃度（たとえば、2×以上20×以下の濃度で1μM以上50μM以下など）となるように溶解し、約-20℃で保存することができる。
【００６３】
［１−４．プローブ］
本発明の試薬に含まれてよいプローブは、本発明における遺伝子マーカーを指標として神経芽腫の微小残存病変を検出するための、上述の遺伝子マーカーをコードする配列またはその相補鎖配列を検出しうるポリヌクレオチド分子である。具体的には、プローブとして、上述の遺伝子マーカーを構成するポリヌクレオチドまたはその相補鎖なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズうるポリヌクレオチド分子を用いることができる。
【００６４】
本発明の試薬は、レファレンス遺伝子をコードする配列またはその相補鎖配列を検出しうるポリヌクレオチド分子をさらに含んでよい。具体的には、プローブとして、上述のレファレンス遺伝子を構成するポリヌクレオチドまたはその相補鎖なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズうるポリヌクレオチド分子を含んでよい。
【００６５】
相補的とは、２つのヌクレオチドがハイブリダイゼーション条件下において、対合しうるものであることを意味し、例えば、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）との関係、シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との関係をいう。
【００６６】
ハイブリダイズするとは、ポリヌクレオチド分子が通常のハイブリダイゼーション条件下（つまり通常のＰＣＲにおけるアニーリング条件下）、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で遺伝子マーカーまたはレファレンス遺伝子にハイブリダイズし、遺伝子マーカーまたはレファレンス遺伝子以外のポリヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。
【００６７】
ストリンジェントな条件とは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 6.3.1-6.3.6, 1999に記載される条件、例えば、6×ＳＳＣ（sodium chloride/sodium citrate）／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×ＳＳＣ／0.1％ＳＤＳ／50〜65℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。
【００６８】
また、本発明における遺伝子マーカーまたはレファレンス遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチド分子は、遺伝子特異的なハイブリダイズが可能であれば、その遺伝子マーカーまたはそのレファレンス遺伝子に対して完全に相補的である必要はないが、好ましくは、その遺伝子マーカーまたはそのレファレンス遺伝子に相補的なポリヌクレオチド分子の全部または一部の配列を含んで構成されるものとする。
【００６９】
本発明におけるプローブは、市販のオリゴヌクレオチド合成機等を用いて合成オリゴヌクレオチドとして作製してもよいし、あるいは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製してもよい。
【００７０】
本発明におけるプローブの鎖長は、たとえば１８ヌクレオチド以上３０ヌクレオチド以下、好ましくは１８ヌクレオチド以上２６ヌクレオチド以下であってよい。
【００７１】
本発明におけるプローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（たとえば、125I、131I、3H、14Cなど）、酵素（たとえば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、蛍光物質（たとえば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート、Cy3、Cy5など）、発光物質（たとえば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）などで標識されていてもよい。
あるいは、本発明におけるプローブは、蛍光物質（たとえば、FAM、VICなど）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（たとえば、MGB、TAMRAなど）がさらに結合されていてもよい。より具体的には、蛍光物質が５’末端に付され、クエンチャーが３’末端に付され、さらに３’末端がリン酸化されて構成されるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）として構成されてもよい。この場合、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
【００７２】
本発明の試薬は、上述のプライマーとして挙げた成分、またはプライマーおよびプローブとして挙げた成分に加え、核酸増幅に必要な他の成分をさらに含んでもよい。他の成分としては、核酸合成酵素、核酸合成基質、緩衝液、および標識（たとえばプライマーおよび/またはプローブが非標識の態様で含まれている場合）などから選ばれる１または複数の成分が挙げられる。本発明の試薬は、各成分がそれぞれ個装された状態のキットアイテムとして提供されてもよいし、任意の複数成分が混合された状態のキットアイテムとして提供されてもよい。
【００７３】
［２．神経芽腫の微小残存病変を評価するための生体試料の分析方法］
本発明における７種の遺伝子マーカーは、上述のとおり神経芽腫の微小残存病変の指標として有用である。したがって、本発明の生体試料の分析方法は、これら７種の遺伝子マーカーの生体試料中における発現量を核酸増幅法により測定する測定工程を含む。遺伝子マーカーの発現量は、神経芽腫の微小残存病変の発生レベルと相関（正の相関）する。
【００７４】
［２−１．生体試料］
生体試料は、神経芽腫患者に由来する試料であってよい。神経芽腫患者は、神経芽腫の任意の病期にある患者であってよい。具体的な病期としては、初発診断時、寛解導入療法終了後、手術後、幹細胞移植を含む持続療法終了後、放射線治療後、維持療法後の経過観察時、および再発診断時が挙げられる。本発明は特に、被験者が高リスク群患者である場合に有用である。
【００７５】
生体試料は、被験者のＲＮＡを含む試料であれば特に限定されず、使用する検出方法の種類に応じて適宜選択することができる。たとえば、生体試料は、被験者から採取された生体組織、具体的には、骨髄液または末梢血などから常法に従って調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの核酸試料であってよい。
【００７６】
［２−２．測定工程（核酸増幅）］
測定工程においては、核酸試料を鋳型として、上述のプライマーペアを用いて核酸増幅を行い、得られた増幅産物の発現量を測定する。
核酸増幅法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としては、通常のＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法等を用いることができる。好ましくは、核酸増幅法としてデジタルＰＣＲ法を用いることができる。神経芽腫の微小残存病変の正確な評価のより好ましい達成は、極めて微量な遺伝子マーカーの発現を検出することによってなされるが、デジタルＰＣＲを用いることは、遺伝子マーカーの発現量が少ない検体であっても感度よく検出することができる点で神経芽腫の微小残存病変の検出に特に適している。それだけでなく、デジタルＰＣＲは、分析主体、分析時期、分析機器、プロトコル（反応時間、反応温度等）等が異なっても測定結果のばらつきが少なく、正確に神経芽腫の微小残存病変を検出することもできる点でも好ましい。したがって、デジタルＰＣＲを用いることは、神経芽腫の微小残存病変の評価において汎用性の高さおよび信頼性の高さ等の点でも好ましい。
【００７７】
デジタルＰＣＲでは、まず、大きな容量の開始試料が複数のより小さな部分容量の試料（分割試料）に分割される。当該分割試料は、平均で単一コピーの標的を含むように調製される。このように分割試料中に存在するポリヌクレオチド分子が０分子（陰性）または１分子（陽性）となることにより、デジタル性が達成される。分割試料における陽性を計数することにより、開始試料中の標的の開始コピー数を推定することができる。つまり、増幅対象であった遺伝子マーカーの定量を行うことができる。したがって、生体試料中の標的が低い濃度であっても、標的の定量が可能となる。
分割試料をデジタル性が達成される適正濃度とするためには開始試料の複数連続希釈法を用いてよく、その容量は任意のＰＣＲ装置によって決定されてよい。
【００７８】
デジタルＰＣＲとしては、液滴ベースのデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いることが好ましい。ｄｄＰＣＲ法は、具体的には、デジタル希釈工程または液滴生成工程、ＰＣＲ増幅工程、検出工程、および分析工程を含む。液滴生成工程では、それぞれ核酸増幅に必要な試薬を含む複数の液滴を生成する。ＰＣＲ増幅工程ではそれらの液滴（または当該液滴が入っているより大きな反応体積試料）を標的の増幅に適切な熱サイクリング条件に付す。検出工程では、ＰＣＲ産物を含む液滴（または当該液滴が入っているより大きな反応体積試料）と含まない液滴（または当該液滴が入っているより大きな反応体積試料）との特定を行う。分析工程では、標的の濃度、絶対量（遺伝子マーカーの絶対量）または（レファレンス遺伝子に対する遺伝子マーカーの）相対量を導出する。
【００７９】
さらに本発明においては、上述のプローブを生体試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を含んでもよい。たとえば、増幅産物の検出を標識に基づいて行う場合に、上述の標識されたプローブを用いてよい。一例としてＴａｑＭａｎプローブを用いる場合、遺伝子マーカーにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの消光作用から開放されることで蛍光を発する。
【００８０】
［２−３．評価工程］
上述のように、本発明では７種の遺伝子マーカーそれぞれに対応するプライマーペア全てのアニーリング温度を良好に揃えることが容易であるため、７種の遺伝子マーカーのいずれであっても効率良く増幅することができる。このため、本発明では、測定された７種の遺伝子マーカーのうち１種以上の遺伝子マーカーの発現量が、神経芽腫の微小残存病変を有しない対照における当該遺伝子マーカーの発現量を参照して予め設定された閾値以上か否かを評価する評価工程を行うことができる。１種以上の遺伝子マーカーの発現量が閾値以上の場合、生体試料について神経芽腫の微小残存病変が陽性と判断することができる。したがって、１種以上の遺伝子マーカーの発現量が閾値以上の場合、生体試料の由来元となる患者について神経芽腫の微小残存病変が陽性と診断することができる。
【００８１】
遺伝子マーカーの発現量の閾値は、上述の手法により予め測定された遺伝子マーカーの定量値を参照して公知の統計手法により設定することができる。閾値の具体的な設定手法としては、たとえば、｛対照細胞における遺伝子マーカーの発現量の平均値±ｎ×標準偏差｝として導出する方法またはＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic)分析法などが挙げられる。具体的には、Journal Of Clinical Oncology 2008; 26: 5443-5449において設定された閾値を参考にすることができる。
【００８２】
本発明によると、偽陰性を抑制しながらも臨床応用に適した高感度の神経芽腫のＭＲＤマーカー７種の組み合わせを利用して神経芽腫の微小残存病変を検出することができる。７種のマーカーはそれぞれの遺伝子に対応するプライマーペア全てのアニーリング温度が揃うようにも選択されているため、遺伝子発現量が少ない検体であっても感度良く神経芽腫の微小残存病変を検出することができる。これまで安定的に検出することができなかった腫瘍量の検体であっても微小残存病変を発見することができるため、神経芽腫の微小残存病変のより詳細な検討が可能となる。たとえば、経時的に微小残存病変をモニタリングすると、微小残存病変の量的および質的検討が可能になる。また、７つの遺伝子マーカーのうちどの遺伝子マーカーが増減したかに着目すると、検体毎の腫瘍細胞の特徴（形質）を検討することができる。
これによって、測定した微小残存病変に基づいて高リスク群神経芽腫患者の層別化、および治療プロトコールの最適化を行うことができる。さらに、これまで発見出来なかった段階の再発であっても早期に発見し治療することができるため、特に高リスク群神経芽腫患者の予後改善を図ることできる。
【実施例】
【００８３】
以下に実施例を示し本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。以下の実施例では、ＭＲＤ遺伝子マーカーとして、ＣＲＭＰ１（配列番号１）、ＤＢＨ（配列番号２）、ＤＤＣ（配列番号３）、ＧＡＰ４３（配列番号４）、ＩＳＬ１（配列番号５）、ＰＨＯＸ２Ｂ（配列番号６）およびＴＨ（配列番号７）を用い、レファレンス遺伝子としてＨＰＲＴ１（配列番号８）を用いた。【００８４】
［実施例１］
神経芽腫患者（診断時）から骨髄検体を採取し、以下のようにして遺伝子マーカーＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨの測定を行った。
１）抗凝固剤（EDTAまたはヘパリン）を含む検体2 ml〜5 mlから、モノ・ポリ分離溶液（DSファーマバイオメディカル社製）を用いて有核細胞を遠心分離した。
２）得られた有核細胞から、TRIZOL PLUS RNA Purification kit（ライフテクノロジー社製）を用いてtotal RNAを抽出した。
３）抽出したTotal RNAの品質を、RNA 6000ナノキット（アジレントテクノロジー社製）を用いて評価した。
４）品質を評価したtotal RNA 1.0 μgからQuantiTect Reverse Transcription kit（キアジェン社製）を用いてcDNAを合成し、total 80μlとなるようにTE bufferで希釈した。【００８５】
５）QX200 Droplet Digital PCR System（バイオラッド社製）を用いて、７種の遺伝子マーカーを同時にddPCR（デジタルＰＣＲ）反応に供し、それぞれの遺伝子マーカーの発現量の解析を行った。
具体的には、各遺伝子マーカー（ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨ）およびレファレンス遺伝子（ＨＰＲＴ１）のプライマーとしては、それぞれ、配列番号１３から配列番号２６および配列番号２７から２８に示す配列を有するものを使用し、プローブとしては、 Universal Probe Library（ロッシュ社製）#65 (CRMP1マーカー用)、#3 (DBHマーカー用)、#49（DDCマーカー用）、 #26 (GAP43マーカー用)、#66 (ISL1マーカー用)、#17 (PHOX2Bマーカー用)、#42 (THマーカー用)、#73 (HPRT1マーカー用)を使用した。
鋳型cDNA 1.0 μl(total RNA 12.5 ng相当)、2 x ddPCR Supermix for Probes（バイオラッド）10μl、Sense primer (それぞれfinal 500 nM)、Antisense primer (それぞれfinal 500 nM)、Universal Probe Library（ロッシュ社製）(それぞれfinal 250 nM)を含むtotal 20 μlの反応液を調製した。
Droplet Generator (バイオラッド社製)を用いて反応液のドロップレットを作製し、PCR反応を行い、Droplet Reader (バイオラッド社製)を用いて測定を行った。PCR反応は、95℃10分の前反応の後、94℃30秒および58℃90秒を１サイクルとして40サイクル行い、最後に終了反応として98℃10分の条件で、サーマルサイクラーGene Amp PCR System 9700（アプライドバイオシステム社製）を用いて行った。【００８６】
６）得られた測定結果から、サンプルの各MRD遺伝子マーカーのコピー数(Copies per sample)を、MRD遺伝子マーカーのコピー数(copies per well)とレファレンス遺伝子のコピー数(copies per well)とから以下の式により算出した。
（MRD遺伝子マーカーのコピー数／レファレンス遺伝子のコピー数） X 10,000【００８７】
また、健常者10名の検体（PB:末梢血検体、BM:骨髄検体）におけるそれぞれの７種の遺伝子マーカーを測定して得られた平均値+3SD（SD:標準偏差）をカットオフ値（閾値）として下記のように設定し、当該カットオフ値未満である場合、陰性と判断することとした。【００８８】
【表１】
2018123764.tif 000002
【００８９】
神経芽腫患者の診断時骨髄検体の分析結果を以下に示す。【００９０】
【表２】
2018123764.tif 000003
【００９１】
上記表に示されるように、神経芽腫患者の診断時の骨髄検体では、ＤＢＨを除く６遺伝子マーカーのCopies per sample値がカットオフ値以上であった。したがって、この検体のＭＲＤは陽性と評価した。【００９２】
［実施例２］
検体として、神経芽腫患者の寛解時の骨髄検体を用いたことを除いて、実施例１と同様に各遺伝子マーカーを測定しＭＲＤの評価を行った。その結果を下記表に示す。【００９３】
【表３】
2018123764.tif 000004
【００９４】
上記表に示されるように、神経芽腫患者の寛解期の骨髄検体では、７遺伝子マーカーのCopies per sample値全てがカットオフ値未満であった。したがって、この検体のＭＲＤは陰性と評価した。【００９５】
［実施例３］
検体として、神経芽腫患者の診断時の末梢血検体を用いたことを除いて、実施例１と同様に各遺伝子マーカーを測定しＭＲＤの評価を行った。その結果を下記表に示す。【００９６】
【表４】
2018123764.tif 000005
【００９７】
上記表に示されるように、神経芽腫患者の診断時の末梢血検体では、ＣＲＭＰ１、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨマーカーのCopies per sample値がカットオフ値以上であった。したがって、この検体のＭＲＤは陽性と評価した。【００９８】
［実施例４］
検体として、神経芽腫患者の寛解期の末梢血検体を用いたことを除いて、実施例１を同様に各遺伝子マーカーを測定しＭＲＤの評価を行った。その結果を下記表に示す。【００９９】
【表５】
2018123764.tif 000006
【０１００】
上記表に示されるように、神経芽腫患者の寛解期の末梢血検体では、７遺伝子マーカーのCopies per sample値全てがカットオフ値未満であった。したがって、この検体のＭＲＤは陰性と評価した。【０１０１】
［実施例５］
高リスク神経芽腫患者の、寛解導入療法１コース終了後および寛解導入療法５コース終了後それぞれの骨髄検体（いずれも同患者由来）について、実施例１と同様に各遺伝子マーカーを測定しＭＲＤの評価を行った。その結果、寛解導入療法１コース終了後では７マーカー全てのCopies per sample値がカットオフ値以上であったが、寛解導入療法５コース終了後では７マーカー全てのCopies per sample値がカットオフ値未満であった。したがって、この患者は、寛解導入療法５コース終了後にＭＲＤが陰性となったと判断した。【０１０２】
また別途、高リスク神経芽腫患者の、初診時の骨髄検体および末梢血検体、ならびに寛解導入法５コース終了後の骨髄検体および末梢血検体（いずれも同患者由来）それぞれについて、実施例１と同様に各遺伝子マーカーを測定しＭＲＤの評価を行った。その結果、初診時の骨髄検体では６マーカー（具体的には、ＣＲＭＰ１、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、およびＴＨ）末梢血検体では５マーカー（具体的には、ＣＲＭＰ１、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、およびＴＨ）のCopies per sample値がカットオフ値以上であったが、寛解導入療法５コース終了後の骨髄検体および末梢血検体ではいずれも７マーカー全てのCopies per sample値がカットオフ値未満であった。したがって、この患者は、寛解導入療法５コース終了後にＭＲＤが陰性となったと判断した。【０１０３】
［実施例６］
上記の本発明における７マーカー（ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨ）に非特許文献６で報告されたその他の４マーカー（ＤＣＸ、ＣＨＲＮＡ３、ＫＩＦ１Ａ、およびＧＡＢＲＢ３）を加えた１１マーカーを用いて、骨髄検体２２９検体、末梢血検体２３検体の合計２５２検体のＭＲＤの評価を行った。【０１０４】
この２５２検体において、レファレンス遺伝子として非特許文献６で報告されたＢ２Ｍを選択し、反応装置としてサーマルサイクラーGene Amp PCR System 9700（アプライドバイオシステム社製）を用いてqPCR反応（リアルタイムＰＣＲ）を行い、１１マーカーの測定を行った。【０１０５】
この２５２検体のqPCR反応に用いたプライマー配列は、以下の通りである。
・Ｂ２Ｍに対するプライマー（配列番号３５、３６）
・ＣＲＭＰ１に対するプライマー（配列番号１３、１４）
・ＤＢＨに対するプライマー（配列番号１５、１６）
・ＤＤＣに対するプライマー（配列番号１７、１８）
・ＧＡＰ４８に対するプライマー（配列番号１９、２０）
・ＩＳＬ１に対するプライマー（配列番号２１、２２）
・ＰＨＯＸ２Ｂに対するプライマー（配列番号２３、２４）
・ＴＨに対するプライマー（配列番号２５、２６）
・ＤＣＸに対するプライマー
5'-catccccaacacctcagaag-3' (sense)
5'-ggaggttccgtttgctga-3' (antisense)
・ＣＨＲＮＡ３に対するプライマー
5'-tgaaatggaacccctctgac-3' (sense)
5'-ggaaatccccaacagcatt-3' (antisense)
・ＫＩＦ１Ａに対するプライマー
5'-cttggcgacatcactgacat-3' (sense)
5'-gctggacagggctgagag-3' (antisense)
・ＧＡＢＲＢ３に対するプライマー
5'-gggtgtccttctggatcaatta-3' (sense)
5'-ttgtcagcacagttgtgatcc-3' (antisense)【０１０６】
また、非特許文献６での報告と同様に、カットオフ値（閾値）を下記のように設定し、当該カットオフ値未満である場合、陰性と判断することとした。【０１０７】
【表６】
2018123764.tif 000007
【０１０８】
２５２検体において、本発明における７マーカー（ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨ）及び他の４マーカー（ＤＣＸ、ＣＨＲＮＡ３、ＫＩＦ１Ａ、及びＧＡＢＲＢ３）が陽性となった検体数を図１に示す。図１においては、たとえば１検体でＣＲＭＰ１とＤＣＸとの両方が検出された場合には、ＣＲＭＰ１について１陽性及びＤＣＸについて１陽性とカウントした。また、２５２検体において、本発明における７マーカー及び他の４マーカーが単独で陽性（単一マーカー陽性）となった検体数を図２に示す。【０１０９】
図１に示すように他の４マーカーは相当数検出されたにもかかわらず、図２に示すように、これら他の４マーカーのみ、単一マーカーとしての検出性能を持たなかった。これら４マーカーは、本発明における７マーカーとともに検出されるものであり、それら自体を測定しなくても偽陰性数に影響せず、スクリーニング感度に実質的に影響を与えなかった。従って、本発明における７マーカーが、偽陰性を抑制したまま臨床適用可能なマーカー数への削減を可能にしたことが示された。【０１１０】
［実施例７］
実施例１と同様にddPCRを用いて各遺伝子マーカーを測定し、神経芽腫患者の骨髄検体又は末梢血検体におけるＭＲＤの評価を行った。その結果を下記表に示す。【０１１１】
【表７】
2018123764.tif 000008
【０１１２】
【表８】
2018123764.tif 000009
【０１１３】
【表９】
2018123764.tif 000010
【０１１４】
【表１０】
2018123764.tif 000011
【０１１５】
【表１１】
2018123764.tif 000012
【０１１６】
【表１２】
2018123764.tif 000013
【０１１７】
【表１３】
2018123764.tif 000014
【０１１８】
上記表に示されるように、ddPCRを用いた場合も、本発明における７マーカー（ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨ）すべてが単一マーカーとしてＭＲＤ検出能があることが示された。【０１１９】
［実施例７］
BE(2)-C神経芽腫細胞株（American Type Culture Collection製）を正常骨髄細胞又は正常末梢血細胞で段階希釈し、実施例１と同様にddPCRを用いて各遺伝子マーカーを測定して検出限界を調べた。同様に、実施例６と同様にqPCRを用いて各遺伝子マーカーを測定して検出限界を調べた。それらの結果を表１４に示す。表中、BMは正常骨髄細胞で希釈した試料、PBは正常末梢血細胞で希釈した試料であり、数値は検出限界における希釈倍率を表し、カッコ書きの数値はqPCR（リアルタイムＰＣＲ）に対するddPCR（デジタルＰＣＲ）の感度を表す。表１４に示すように、ddPCRではより一層感度が高いため、より一層少ない検体であっても高感度でＭＲＤを検出することができる。【０１２０】
【表１４】
2018123764.tif 000015
【０１２１】
［試験例］
健常者１０名から採取した骨髄検体（BM）１０検体および末梢血検体（PB）１０検体において、レファレンス遺伝子ＧＵＳＢ、ＨＭＢＳ、ＨＰＲＴ１、及びＴＢＰを、実施例１と同様にddPCRを用いて増幅させた。これらレファレンス遺伝子マーカーのコピー数を表１５に示す。【０１２２】
【表１５】
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【０１２３】
表１５に示すように、これらレファレンス遺伝子の中でも、ＨＰＲＴ１のみが、検体間の発現量の変動も骨髄検体と末梢血検体との間の発現量の変動も小さく、安定的に発現していた。なお、実施例６においてqPCR（リアルタイムＰＣＲ）のレファレンス遺伝子として用いたＢ２Ｍが、ddPCR（デジタルＰＣＲ）アッセイ系に適用すると発現量過剰で飽和したことにより発現量の定量ができないことも確認した。つまり、ＨＰＲＴ１は、デジタルＰＣＲに適した低発現であるとともに、骨髄検体であっても末梢血検体であっても、デジタルＰＣＲによって正しく神経芽腫の微小残存病変を検出するのに特に適したレファレンス遺伝子であることが示された。【０１２４】
本発明の好ましい実施形態は上記の通りであるが、本発明は、上述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨から逸脱することのない様々な変形がなされる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２５】
配列番号１３から配列番号３６はプライマーである。
【図１】
2018123764.tif 000017
【図２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月18日(2018.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨからなる遺伝子マーカーを核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアを含み、神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられる試薬。
【請求項２】
レファレンス遺伝子としての、ＨＰＲＴ１、ＨＭＢＳ、ＧＵＳＢ、ＴＢＰおよびＢ２Ｍの少なくともいずれかを核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアをさらに含む、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
レファレンス遺伝子としての、ＨＰＲＴ１、ＨＭＢＳ、ＧＵＳＢおよびＴＢＰの少なくともいずれかを核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアをさらに含む、請求項１に記載の試薬。
【請求項４】
ＨＰＲＴ１からなるレファレンス遺伝子を核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアをさらに含む、請求項１に記載の試薬。
【請求項５】
骨髄検体に対して用いられる、請求項４に記載の試薬。
【請求項６】
前記遺伝子マーカーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるプローブをさらに含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項７】
レファレンス遺伝子を核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアをさらに含む場合、前記レファレンス遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるプローブをさらに含む、請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２ＢおよびＴＨからなる遺伝子マーカーの生体試料中における発現量を、請求項１から７のいずれか１項に記載の試薬を用いて核酸増幅法により測定する測定工程を含み、
前記発現量が神経芽腫の微小残存病変の発生レベルと相関する、生体試料の分析方法。
【請求項９】
前記遺伝子マーカーの１種以上の発現量が閾値以上か否かを評価する評価工程を含む、請求項８に記載の生体試料の分析方法。
【請求項１０】
前記評価工程において、前記遺伝子マーカーの１種以上の発現量が閾値以上である場合に、前記生体試料の神経芽腫の微小残存病変を陽性と判定する、請求項９に記載の生体試料の分析方法。
【請求項１１】
前記測定工程における前記核酸増幅法がデジタルＰＣＲである、請求項８から１０のいずれか１項に記載の生体試料の分析方法。
【請求項１２】
前記測定工程において、同一の核酸増幅装置を用いて前記遺伝子マーカーを同時に核酸増幅する、請求項１１に記載の生体試料の分析方法。
【国際調査報告】
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