【手続補正書】
【提出日】平成30年12月27日(2018.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織試料中の複数のマーカーを共発現解析するデジタル画像解析方法であって、
複数の単一マーカーチャネル画像（１２４）にアクセスするステップであって、前記複数の単一マーカーチャネル画像がそれぞれ、組織試料中のそれぞれの単一マーカーの量とピクセル強度値が相関するデジタル画像である、ステップと、
前記単一マーカーチャネル画像それぞれに対してマーカー発現のヒートマップを計算するステップと、
マーカー発現の各ヒートマップにおける１つ又は複数の関心領域（ＲＯＩ）候補（１２６）を特定するステップであって、前記１つ又は複数のＲＯＩ候補を特定する前記ステップが、前記ヒートマップにおける最高位の局所ピクセル強度最大を特定し、特定された局所強度最大のそれぞれ１つを取り囲む前記ヒートマップの所定数の部分領域を選択し、前記選択された部分領域を前記ヒートマップの前記ＲＯＩ候補として使用するため、局所極大フィルタをマーカー発現の各ヒートマップに適用するステップ（５２４）を含むものと、
マーカー発現の各ヒートマップから、前記特定された１つ又は複数のＲＯＩ候補を含むオーバーレイマスクを計算するステップであって、オーバーレイマスクが、前記オーバーレイマスクを導き出した前記ヒートマップの前記特定されたＲＯＩ候補のうち１つに属さない全てのピクセルをマスキングで除外する画像マスクである、ステップと、
前記オーバーレイマスクから１つ又は複数の共存ＲＯＩを、
前記ヒートマップの２つ以上における前記ＲＯＩ候補の共通部分面積及び／又は合併面積を特定すること、
前記特定された共通部分又は合併面積を、前記２つ以上のヒートマップに逆マッピングすること、及び、
前記逆マッピングされた共通部分又は合併面積に対応する前記ＲＯＩ候補又はその一部を、前記１つ又は複数の共存ＲＯＩとして使用すること、によって特定するステップと、
前記２つ以上のヒートマップに対応する前記マーカーが前記組織試料中で共発現しているかを決定するため、前記ヒートマップのうち２つ以上における前記共存ＲＯＩのピクセル強度を選択的に解析するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記１つ又は複数のＲＯＩ候補を特定する前記ステップが、マーカー発現の各ヒートマップに強度閾値を適用するステップ（５２１）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒートマップのいずれかにおける１つ又は複数の部分領域の前記ピクセルの前記強度値が、前記強度閾値を下回る場合（５２３）、前記ヒートマップの前記部分領域がＲＯＩ候補に特定され、前記ＲＯＩ候補が、前記マーカーが発現しないか又は所与の発現閾値よりも発現が少ない前記試料中の領域に対応する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒートマップのいずれかにおける１つ又は複数の部分領域の前記ピクセルの前記強度値が、前記強度閾値を上回る場合（５２２）、前記ヒートマップの前記部分領域がＲＯＩ候補に特定され、前記ＲＯＩ候補が、前記マーカーが前記所与の発現閾値よりも強く発現する前記試料中の領域に対応する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記選択された所定数の最高位の局所強度最大それぞれの周りでセット（Ｎ×Ｎ）のピクセルを有する視野（ＦＯＶ）を定め、前記定められたセット（Ｎ×Ｎ）のピクセルのＦＯＶを、前記ヒートマップの前記ＲＯＩ候補として使用される前記選択された部分領域として使用するステップ（５２６）を更に含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
共存ＲＯＩを決定する前記ステップが、
異なるマーカーに対応する１つ又は複数の少なくとも部分的に重なり合うＲＯＩ候補と、マーカー発現のそれぞれのマーカー特異的なヒートマップとを特定するステップと、
前記特定された少なくとも部分的に重なり合うＲＯＩ候補の共通部分面積を特定するステップと、
前記異なるマーカー特異的なヒートマップの前記特定された少なくとも部分的に重なり合うＲＯＩの合併面積を特定するステップと、
前記特定された共通部分面積と前記特定された合併面積との比を計算するステップと、
前記計算された比が重なり閾値を超えるか否かを評価するステップと、
を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記マーカー発現のヒートマップを計算する前記ステップが、ローパスフィルタを前記複数の単一マーカーチャネル画像それぞれに適用するステップを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
組織試料の多チャネル画像を、前記複数の単一マーカーチャネル画像それぞれへと分離するステップを更に含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の単一マーカーチャネル画像が一連の連続した組織部分から導き出され、前記方法が、前記特定されたＲＯＩ候補それぞれを共通座標系に見当合わせするステップを更に含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
非組織領域がマスキングされるように、前記複数の単一マーカーチャネル画像を前処理するステップを更に含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の単一マーカーチャネル画像の全てよりも少ない画像が、共存ＲＯＩを特定するために使用される、かつ／又は、
ＧＵＩが、共存ＲＯＩを特定するために使用される前記単一マーカーチャネル画像をユーザが選択することを可能にする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の単一マーカーチャネル画像の少なくともいくつかにおける少なくとも１つの特定された共存関心領域内の細胞を計数するステップと、任意選択で、２つ以上の異なるマーカーチャネル画像の共存領域の前記細胞計数を使用して免疫スコアを計算するステップとを更に含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
組織試料中の複数のマーカーを共発現解析する電子画像解析システムであって、１つ又は複数のプロセッサと少なくとも１つのメモリとを備え、前記少なくとも１つのメモリが、前記１つ又は複数のプロセッサによって実行され前記１つ又は複数のプロセッサに、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法を行わせる非一時的コンピュータ可読命令を記憶する、システム。
【請求項１４】
組織試料中の複数のマーカーを共発現解析するコンピュータシステムであって、１つ又は複数のプロセッサと少なくとも１つのメモリとを備え、前記少なくとも１つのメモリが非一時的コンピュータ可読命令を記憶し、当該非一時的コンピュータ可読命令が、前記１つ又は複数のプロセッサによって実行されることによって、前記１つ又は複数のプロセッサに、
複数の単一マーカーチャネル画像それぞれに対してマーカー発現のヒートマップを計算させ、前記複数の単一マーカーチャネル画像がそれぞれ単一のマーカーを含み、
マーカー発現の各ヒートマップにおける１つ又は複数の関心領域（ＲＯＩ）候補を特定させ、前記１つ又は複数のＲＯＩ候補を特定させることが、前記ヒートマップにおける最高位の局所ピクセル強度最大を特定し、特定された局所強度最大のそれぞれ１つを取り囲む前記ヒートマップの所定数の部分領域を選択し、前記選択された部分領域を前記ヒートマップの前記ＲＯＩ候補として使用するため、局所極大フィルタをマーカー発現の各ヒートマップに適用こと（５２４）を含み、
マーカー発現の各ヒートマップから、前記特定された１つ又は複数のＲＯＩ候補を含むオーバーレイマスクを計算させ、
前記オーバーレイマスクから、１つ又は複数の共存ＲＯＩを決定させ、
前記特定された１つ又は複数の共存ＲＯＩを前記複数の単一マーカーチャネル画像それぞれへと転送させる、
コンピュータシステム。
【請求項１５】
前記ヒートマップが、前記複数の単一マーカーチャネル画像それぞれにローパスフィルタを適用することによって計算される、請求項１４に記載のコンピュータシステム。