(57)【要約】  本発明の課題は、活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の予防又は治療に効果的な、活性化されたＴ細胞及び／又はＢ細胞選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤を提供することにある。  ２５−ヒドロキシコレステロール又はその類縁体コレステロールを有効成分として含有してなる、活性化されたＴ細胞及び／又はＢ細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
2017209270.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２５−ヒドロキシコレステロール又はその類縁体コレステロールを有効成分として含有してなる、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
【請求項２】
２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールが、２０α−ヒドロキシコレステロール、又は２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールである、請求項１に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
【請求項３】
活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の予防又は治療用である、請求項１又は２に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
【請求項４】
活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、皮膚筋炎、多発性筋炎、動脈炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、接触皮膚炎、気管支喘息、強皮症、ＩｇＧ４関連疾患、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、円板状エリテマトーデス、モルフィア、混合性結合組織病、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、中毒性表皮壊死症、スティーヴンス・ジョンソン症候群、多形紅斑、薬疹、固定薬疹、扁平苔癬、移植片対宿主病、特発性間質性肺炎、閉塞性汎細気管支炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、自己免疫性肝炎、虫刺症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、ベーチェット病、シェーグレン症候群、自己免疫性膵炎、I型糖尿病、円形脱毛症、尋常性白斑、原田病、天疱瘡、類天疱瘡、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、甲状腺機能亢進症、慢性甲状腺炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性胃炎、グッドパスチャー症候群、悪性貧血、及び自己免疫性溶血性貧血から選択されるものである、請求項３に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
【請求項５】
活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患が、乾癬、接触皮膚炎、中毒性表皮壊死症、スティーヴンス・ジョンソン症候群、多形紅斑、薬疹、固定薬疹、扁平苔癬、移植片対宿主病、特発性間質性肺炎、閉塞性汎細気管支炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、自己免疫性肝炎、虫刺症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、ベーチェット病、シェーグレン症候群、自己免疫性膵炎、I型糖尿病、円形脱毛症、尋常性白斑、及び原田病から選択されるものであって、Ｔ細胞の活性化が関与する疾患である、請求項３又は４に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
【請求項６】
活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患が、乾癬、及び接触皮膚炎から選択されるものである、請求項３乃至５のいずれか一項に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
【請求項７】
活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患が、天疱瘡、及び類天疱瘡から選択されるものである、請求項３又は４に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
【請求項８】
天疱瘡又は類天疱瘡における皮膚のびらんを予防するものである、請求項７に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
【請求項９】
移植片に対する拒絶反応の予防又は治療用である、請求項１又は２に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
【請求項１０】
免疫抑制剤と組み合わせて使用されるものである、請求項９に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤であって、当該免疫抑制剤は２５−ヒドロキシコレステロールまたは２０α−ヒドロキシコレステロール、及び２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールからなる群から選択される２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールを有効成分とするものでない、細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
【請求項１１】
経口投与剤である、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
【請求項１２】
非経口投与剤である、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
【請求項１３】
経皮吸収剤又は注射剤である、請求項１２に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
【請求項１４】
２５−ヒドロキシコレステロール−７α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ｂ１）阻害剤をさらに含有するものである、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
【請求項１５】
２５−ヒドロキシコレステロール−７α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ｂ１）阻害剤がＣｌｏｔｒｉｍａｚｏｌｅである、請求項１４に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
【請求項１６】
Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞を選択的に失わせる方法であって、前記細胞を含む試料に対して２５−ヒドロキシコレステロール又は２５−ヒドロキシコレステロールを含む組成物を投与することを特徴とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの方法。
【請求項１７】
Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に対して選択的に細胞死を誘導又は促進する方法であって、前記細胞を含む試料に対して２５−ヒドロキシコレステロール又は２５−ヒドロキシコレステロールを含む組成物を投与することを特徴とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの方法。
【請求項１８】
試料が生体由来の体液である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
体液が末梢血である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＹＰ７Ｂ１阻害剤の投与を同時又は別工程で行うものである、請求項１６乃至１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＹＰ７Ｂ１阻害剤がＣｌｏｔｒｉｍａｚｏｌｅである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導活性又は細胞死促進活性を有する化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対して被検化合物を投与する工程を含み、２５−ヒドロキシコレステロール合成活性を指標とした選抜を行うものである、方法。
【請求項２３】
２５−ヒドロキシコレステロール合成活性を２５−ヒドロキシコレステロールの含有量により評価するものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
２５−ヒドロキシコレステロール合成活性をコレステロール  ２５−ヒドロキシラーゼ蛋白質蓄積量により評価するものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
２５−ヒドロキシコレステロール合成活性をコレステロール  ２５−ヒドロキシラーゼ遺伝子のｍＲＮＡ蓄積量により評価するものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
被検化合物に代えてＩＬ−２７を投与する試験をポジティブコントロールとして同時又は並行して行うものである、請求項２２乃至２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
選抜において、
［１］被検化合物添加の効果を無添加コントロールと比較する工程であって、被検化合物添加時の２５−ヒドロキシコレステロール合成活性が無添加コントロールの場合と比して１０以上、１５以上、又は２０以上を示した被検化合物を選抜する工程、
［２］被検化合物添加の効果をポジティブコントロールの効果と比較する工程であって、１０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲から予め選択された所定濃度（最終濃度）のＩＬ−２７を投与した場合の２５−ヒドロキシコレステロール合成活性を１とした場合に、１．０以上、１．５以上、又は２．０以上の値を示した被検化合物を選抜する工程、又は［３］  上記［１］及び［２］の選抜工程
のいずれかの工程を含むものである、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に対して選択的に作用して当該細胞の細胞死を誘導し、活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の予防又は治療に効果的な医薬に関する。具体的には、本発明は、活性化したＴ細胞及び／又は活性化したＢ細胞が関連する免疫機能の亢進又は異常を示す疾患を対象とした２５−ヒドロキシコレステロール（２５ＯＨＣ）又はその類縁体コレステロールを有効成分として含有する、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤に関する。さらには、Ｔ細胞を使用した２５ＯＨＣ産生誘導性物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体には、自らの構成成分とは異なる物質、例えば細菌、ウイルス、花粉などが体内に侵入又は接触すると、これを異物として認識して排除する仕組み、すなわち免疫機能が備わっている。異物に対して反応する際に自らを傷つけてしまう場合をアレルギー反応、自己物質を異物として認識してこれを排除しようとする反応を自己免疫反応と言い、これらも免疫反応に含まれる。
免疫反応の減弱若しくは亢進、自己免疫反応、又はアレルギー反応を病態とする疾患は極めて多岐にわたっており、そのそれぞれが治療の対象となっている。移植片に対する宿主の免疫反応もまた治療の対象となる。例えば、免疫反応の重要な機能を司る細胞であるＴ細胞やＢ細胞の機能に関連する疾患は多く知られている。具体的には、活性化したＴ細胞及び活性化したＢ細胞が関連する疾患として、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、皮膚筋炎、多発性筋炎、動脈炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、気管支喘息、強皮症、ＩｇＧ４関連疾患、及び原発性胆汁性肝硬変等を挙げることができる。また、活性化したＴ細胞が関連する疾患として、乾癬、接触皮膚炎、中毒性表皮壊死症、スティーヴンス・ジョンソン症候群、多形紅斑、固定薬疹、扁平苔癬、移植片対宿主病、特発性間質性肺炎、閉塞性汎細気管支炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、及び自己免疫性肝炎等、活性化したＢ細胞が関連する疾患として天疱瘡、類天疱瘡、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、甲状腺機能亢進症、慢性甲状腺炎、及び抗リン脂質抗体症候群等を挙げることができる。
免疫反応の異常又はアレルギー反応を病態とする疾患は、その種類が多いばかりでなく、それに罹患した患者数が極めて膨大であることもその大きな特徴である。上記に挙げた一疾患であるアトピー性皮膚炎に限っても、患者数は日本国内だけで約35万人、世界中では約2000万人と推定されている。これらの疾患の有病者数は極めて多く、その対策が強く望まれることは言うまでもない。しかし、治療においては異物を排除するという生体にとって必須の機能（反応）を適切に維持しつつ、疾患の原因となる異常又は不要な反応を除去又は減弱させることが必要となるが、このような条件を満たしてそれぞれの疾患を治療することは容易でなかった。【０００３】
コレステロールは、哺乳動物細胞内で最も豊富に存在する脂質分子種の一つであり、原形質膜脂質の約２５％を占めると共に、全ステロール類の大多数の源となっている。また、哺乳動物体内の恒常性の維持において鍵となる役割を担っている。オキシコレステロール類は、代謝され易いコレステロールの酸化型誘導体であり、組織内又は組織間におけるコレステロール輸送、胆汁の合成、核ホルモン受容体の活性化、ステロイドホルモン生合成、及びコレステロール生合成に関与する遺伝子群の制御などにおいて生理的な働きを示すと報告されている。また、オキシコレステロール類は、炎症の制御に関するシグナル伝達系に関与すること、アルツハイマー病や動脈硬化症のような慢性疾患の病態形成にも関与すると報告されている。しかしながら、生体内においては、オキシコレステロール類として２６−ヒドロキシコレステロール（２７−ヒドロキシコレステロールと同義）、２４−ヒドロキシコレステロール、７α−ヒドロキシコレステロールをはじめ、２５ＯＨＣ、７β−ヒドロキシコレステロールなど様々な分子種の存在が同定されているものの、各分子種の機能分担に関しては十分な解明がなされていない（非特許文献１）。例えば、２５ＯＨＣについて、コレステロール生合成のフィードバック制御に関わるという報告があるが、２５ＯＨＣを大部分欠損するマウスが正常なコレステロール代謝や恒常性を示すことから、当該分子種のコレステロール合成に対する寄与は明確でない（非特許文献２）。また、２５ＯＨＣは自然免疫機能に関与し、ウイルス感染に対する抵抗性の向上に働くという報告（特許文献１）があるが、それと正反対にウイルス感染性を上昇させるという報告（非特許文献３）もあるので、免疫機能にどのように働くのかも明確でない。この他にも２５ＯＨＣの生理的機能に関する示唆は種々の実験から得られていたが、実験は１０μＭなどμＭオーダーの濃度で２５ＯＨＣ投与が行われたものが大多数であり、これは生理的な濃度をはるかに上回る条件であったため、２５ＯＨＣの本来の生理的機能を解き明かすには十分なものと言えなかった。例えば、総説である非特許文献１の第403頁Table 1によれば、ヒト血漿（又は血清）中の２５ＯＨＣ濃度は０．００２〜０．０２６μＭと報告されている。したがって、２５ＯＨＣが生体の免疫反応やアレルギー反応にどのような機能を果たすのか、また、免疫反応の減弱若しくは亢進、自己免疫反応、又はアレルギー反応を病態とする疾患を予防又は治療に有効であるのかという問題は、いずれも未解決の問題として残されていた。また、２５ＯＨＣ以外の種々のコレステロール分子種に関しても、同様に、その機能や治療上の有用性は十分に解明されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／１６６５０３Ａ１
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Schroepfer, G J Jr, Physiiol. Rev. (2000) vol. 80, pp. 361-554
【非特許文献２】Bjorkhem I, J. Lipid Res. (2009) vol. 50, pp. S213-S218
【非特許文献３】Gold E S et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2014) vol. 111, pp. 10666-10671
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に対して選択的に作用して当該細胞に細胞死を誘導し、活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の予防又は治療に効果的な医薬を提供することにある。前記予防又は治療の対象となる疾患として、本発明は、免疫反応の亢進、自己免疫反応、又はアレルギー反応を病態とする各種疾患を意図している。これに加え、移植片に対する宿主の免疫反応を抑制することによる拒絶反応の予防又は治療も本発明は意図している。さらに、本発明は、当該予防又は治療に有用な物質の生産に寄与する化合物のスクリーニング方法の提供をもう一つの課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、異物を排除するという生体にとって必須の機能（反応）を適切に維持しつつ、疾患の原因となる異常又は不要な反応を除去又は減弱させるという治療方法はなかったという実情に鑑み、鋭意研究した結果、生体内コレステロール類の一種である２５ＯＨＣがＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に対して選択的に作用し、当該細胞の細胞死を誘導することを見い出した。また、２５ＯＨＣ直接の代謝物である７α，２５−ジヒドロキシコレステロールでは前記の２５ＯＨＣの活性が認められなかったものの、２５ＯＨＣ以外のある種のコレステロール分子種には、２５ＯＨＣと同様にＴ細胞の細胞死を誘導する活性があることを見い出した。さらに、２５ＯＨＣ生産酵素をコードするコレステロール  ２５−ヒドロキシラーゼ遺伝子がＴ細胞で発現し、かつ当該発現がＩＬ−２７投与によって顕著に誘導又は活性化されることを見い出し、これらの知見に基づいて本発明を完成させた。【０００８】
本発明は、２５ＯＨＣを有効成分として含有してなる、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤に関する。また、本発明は、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞を選択的に失わせる方法、又はＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に対して細胞死を選択的に誘導又は促進する方法であって、前記細胞を含む試料に対して２５ＯＨＣ又は２５ＯＨＣを含む組成物を投与することを特徴とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの方法に関する。これらの発明において、場合により、２５ＯＨＣに代えて、又は２５ＯＨＣと共に２５ＯＨＣの類縁体コレステロールを用いることもできる。本発明で意図される２５ＯＨＣの類縁体コレステロールは、細胞集団から活性化されたＴ細胞を選択的に失わせる活性、活性化されたＴ細胞に対して細胞死を選択的に誘導する活性、及び活性化されたＴ細胞の細胞死を誘導する活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有するものであり、当該活性を有する点において２５ＯＨＣと性質を共有するものである。本発明で使用される好ましい２５ＯＨＣの類縁体コレステロールとして、２０α−ヒドロキシコレステロール、及び２４（Ｒ／Ｓ），２５−エポキシコレステロールが挙げられる。さらに、本発明はＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導活性又は細胞死促進活性を有する化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対して被検化合物を投与する工程を含み、２５ＯＨＣ合成活性を指標とした選抜を行う方法に関する。【０００９】
より詳細には、本発明は、以下の（１）〜（６７）に関する。
（１）２５−ヒドロキシコレステロール又はその類縁体コレステロールを有効成分として含有してなる、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
（２）２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールが、２０α−ヒドロキシコレステロール、又は２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールである、（１）に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
（３）活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の予防又は治療用である、（１）又は（２）に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
（４）活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、皮膚筋炎、多発性筋炎、動脈炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、接触皮膚炎、気管支喘息、強皮症、ＩｇＧ４関連疾患、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、円板状エリテマトーデス、モルフィア、混合性結合組織病、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、中毒性表皮壊死症、スティーヴンス・ジョンソン症候群、多形紅斑、薬疹、固定薬疹、扁平苔癬、移植片対宿主病、特発性間質性肺炎、閉塞性汎細気管支炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、自己免疫性肝炎、虫刺症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、ベーチェット病、シェーグレン症候群、自己免疫性膵炎、I型糖尿病、円形脱毛症、尋常性白斑、原田病、天疱瘡、類天疱瘡、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、甲状腺機能亢進症、慢性甲状腺炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性胃炎、グッドパスチャー症候群、悪性貧血、及び自己免疫性溶血性貧血から選択されるものである、（３）に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
（５）活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、皮膚筋炎、多発性筋炎、動脈炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、気管支喘息、強皮症、ＩｇＧ４関連疾患、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、円板状エリテマトーデス、モルフィア、混合性結合組織病、及び急速進行性糸球体腎炎から選択されるものであって、Ｔ細胞及びＢ細胞の活性化が関与する疾患である、（３）又は（４）に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
（６）活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患が、乾癬、接触皮膚炎、中毒性表皮壊死症、スティーヴンス・ジョンソン症候群、多形紅斑、薬疹、固定薬疹、扁平苔癬、移植片対宿主病、特発性間質性肺炎、閉塞性汎細気管支炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、自己免疫性肝炎、虫刺症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、ベーチェット病、シェーグレン症候群、自己免疫性膵炎、I型糖尿病、円形脱毛症、尋常性白斑、及び原田病から選択されるものであって、Ｔ細胞の活性化が関与する疾患である、（３）又は（４）に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
（７）活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患が、乾癬、及び接触皮膚炎から選択されるものである、（３）、（４）及び（６）のいずれかに記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
（８）活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患が、天疱瘡、類天疱瘡、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、甲状腺機能亢進症、慢性甲状腺炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性胃炎、グッドパスチャー症候群、悪性貧血、及び自己免疫性溶血性貧血から選択されるものであって、Ｂ細胞の活性化が関与する疾患である、（３）又は（４）に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
（９）活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患が、天疱瘡、及び類天疱瘡から選択されるものである、（８）に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
（１０）天疱瘡又は類天疱瘡における皮膚のびらんを予防するものである、（９）に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
（１１）移植片に対する拒絶反応の予防又は治療用である、（１）又は（２）に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
（１２）免疫抑制剤と組み合わせて使用されるものである、（１１）に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤であって、当該免疫抑制剤は２５−ヒドロキシコレステロールまたは２０α−ヒドロキシコレステロール、及び２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールからなる群から選択される２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールを有効成分とするものでない、細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
（１３）経口投与剤である、（１）乃至（１２）のいずれかに記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
（１４）非経口投与剤である、（１）乃至（１２）のいずれかに記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
（１５）経皮吸収剤又は注射剤である、（１４）に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
（１６）２５−ヒドロキシコレステロール−７α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ｂ１）阻害剤をさらに含有するものである、（１）乃至（１５）のいずれかに記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。
（１７）ＣＹＰ７Ｂ１阻害剤がＣｌｏｔｒｉｍａｚｏｌｅである、（１６）に記載の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤。【００１０】
（１８）Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞を選択的に失わせる方法であって、前記細胞を含む試料に対して２５−ヒドロキシコレステロール又は２５−ヒドロキシコレステロールを含む組成物を投与することを特徴とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの方法。
（１９）Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞を選択的に失わせる方法であって、前記細胞を含む試料に対して２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロール又は２５−ヒドロキシコレステロール類縁体コレステロールを含む組成物を投与することを特徴とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの方法。
（２０）Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に対して選択的に細胞死を誘導又は促進する方法であって、前記細胞を含む試料に対して２５−ヒドロキシコレステロール又は２５−ヒドロキシコレステロールを含む組成物を投与することを特徴とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの方法。
（２１）Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に対して選択的に細胞死を誘導又は促進する方法であって、前記細胞を含む試料に対して２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロール又は２５−ヒドロキシコレステロール類縁体コレステロールを含む組成物を投与することを特徴とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの方法。
（２２）２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールが、２０α−ヒドロキシコレステロール、又は２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールである、（１９）又は（２１）に記載の方法。
（２３）試料が生体由来の体液である、（１８）乃至（２２）のいずれかに記載の方法。
（２４）体液が末梢血である、（２３）に記載の方法。
（２５）ＣＹＰ７Ｂ１阻害剤を同時又は別工程として投与する工程を含むものである、（１８）乃至（２４）のいずれかに記載の方法。
（２６）ＣＹＰ７Ｂ１阻害剤がＣｌｏｔｒｉｍａｚｏｌｅである、（２５）に記載の方法。【００１１】
（２７）Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導活性又は細胞死促進活性を有する化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対して被検化合物を投与する工程を含み、２５−ヒドロキシコレステロール合成活性を指標とした選抜を行うものである、方法。
（２８）２５−ヒドロキシコレステロール合成活性を２５−ヒドロキシコレステロールの含有量により評価するものである、（２７）に記載の方法。
（２９）２５−ヒドロキシコレステロール合成活性をコレステロール  ２５−ヒドロキシラーゼ蛋白質の蓄積量により評価するものである、（２７）に記載の方法。
（３０）２５−ヒドロキシコレステロール合成活性をコレステロール  ２５−ヒドロキシラーゼ遺伝子のｍＲＮＡ蓄積量により評価するものである、（２７）に記載の方法。
（３１）被検化合物に代えてＩＬ−２７を投与する試験をポジティブコントロールとして同時又は並行して行うものである、（２７）乃至（３０）のいずれかに記載の方法。
（３２）選抜において
［１］被検化合物添加の効果を無添加コントロールと比較する工程であって、被検化合物添加時の２５−ヒドロキシコレステロール合成活性が無添加コントロールの場合と比して１０以上、１５以上、又は２０以上を示した被検化合物を選抜する工程、
［２］被検化合物添加の効果をポジティブコントロールの効果と比較する工程であって、１０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲から予め選択された所定濃度（最終濃度）のＩＬ−２７を投与した場合の２５−ヒドロキシコレステロール合成活性を１とした場合に、１．０以上、１．５以上、又は２．０以上の値を示した被検化合物を選抜する工程、又は［３］  上記［１］及び［２］の選抜工程
のいずれかの工程を含むものである、（３１）に記載の方法。【００１２】
（３３）２５−ヒドロキシコレステロール又は２５−ヒドロキシコレステロールを含む組成物を投与することを特徴とする、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導方法又は細胞死促進方法。
（３４）２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロール又は２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールを含む組成物を投与することを特徴とする、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導方法又は細胞死促進方法。
（３５）２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールが、２０α−ヒドロキシコレステロール、又は２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールである、（３４）に記載の細胞死誘導方法又は細胞死促進方法。
（３６）２５−ヒドロキシコレステロール又は２５−ヒドロキシコレステロールを含む組成物を投与することを特徴とする、活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の予防又は治療方法。
（３７）２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロール又は２５−ヒドロキシコレステロール類縁体コレステロールを含む組成物を投与することを特徴とする、活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の予防又は治療方法。
（３８）２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールが、２０α−ヒドロキシコレステロール、又は２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールである、（３７）に記載の活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の予防又は治療方法。
（３９）２５−ヒドロキシコレステロール又は２５−ヒドロキシコレステロールを含む組成物を投与することを特徴とする、移植片に対する拒絶反応の予防又は治療方法。
（４０）２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロール又は２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールを含む組成物を投与することを特徴とする、移植片に対する拒絶反応の予防又は治療方法。
（４１）２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールが、２０α−ヒドロキシコレステロール、又は２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールである、（４０）に記載の、移植片に対する拒絶反応の予防又は治療方法。
（４２）組織移植又は臓器移植を受けた対象に対して実施するものである、（３６）乃至（４１）のいずれかに記載の方法。
（４３）他の免疫抑制剤を同時又は独立の工程として投与するものである、（３６）乃至（４２）のいずれかに記載の方法であって、前記他の免疫抑制剤は２５−ヒドロキシコレステロールまたは２０α−ヒドロキシコレステロール、及び２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールからなる群から選択される２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールを有効成分とするものでない、方法。
（４４）ＣＹＰ７Ｂ１阻害剤を同時又は別に投与する工程を含むことを特徴とする、（３３）乃至（４３）のいずれかに記載の方法。【００１３】
（４５）Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤の製造のための、２５−ヒドロキシコレステロールの使用。
（４６）Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤の製造のための、２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロール使用。
（４７）２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールが、２０α−ヒドロキシコレステロール、又は２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールである、（４６）に記載の使用。
（４８）活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の予防又は治療用組成物の製造のための、２５−ヒドロキシコレステロールの使用。
（４９）活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の予防又は治療用組成物の製造のための、２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロール使用。
（５０）２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールが、２０α−ヒドロキシコレステロール、又は２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールである、（４９）に記載の使用。
（５１）移植片に対する拒絶反応の予防又は治療用組成物の製造のための、２５−ヒドロキシコレステロールの使用。
（５２）移植片に対する拒絶反応の予防又は治療用組成物の製造のための、２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールの使用。
（５３）２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールが、２０α−ヒドロキシコレステロール、又は２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールである、（５２）に記載の使用。
（５４）前記移植片に対する拒絶反応の予防又は治療用組成物が、他の免疫抑制剤と同時又は独立して併用投与するためのものであって、前記他の免疫抑制剤は２５−ヒドロキシコレステロールまたは２０α−ヒドロキシコレステロール、及び２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールからなる群から選択される２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールを有効成分とするものでない、（５１）乃至（５３）のいずれかに記載の使用。
（５５）前記細胞死誘導剤又は細胞死促進剤がＣＹＰ７Ｂ１阻害剤と組合せて投与されるものである、（４５）乃至（４７）のいずれかに記載の使用。
（５６）前記予防又は治療用組成物がＣＹＰ７Ｂ１阻害剤と組合せて投与されるものである、（４８）乃至（５４）のいずれかに記載の使用。【００１４】
（５７）Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導方法又は細胞死促進方法における使用のための、２５−ヒドロキシコレステロール。
（５８）Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導方法又は細胞死促進方法における使用のための、２０α−ヒドロキシコレステロール、及び２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールからなる群から選択される２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロール。
（５９）活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の予防又は治療方法における使用のための、２５−ヒドロキシコレステロール。
（６０）活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の予防又は治療方法における使用のための、２０α−ヒドロキシコレステロール、及び２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールからなる群から選択される２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロール。
（６１）移植片に対する拒絶反応の予防方法又は治療方法における使用のための、２５−ヒドロキシコレステロール。
（６２）移植片に対する拒絶反応の予防方法又は治療方法における使用のための、２０α−ヒドロキシコレステロール、及び２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールからなる群から選択される２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロール。
（６３）他の免疫抑制剤と同時又は独立して使用するための、（６１）に記載の２５−ヒドロキシコレステロールであって、前記他の免疫抑制剤は２５−ヒドロキシコレステロールまたは２０α−ヒドロキシコレステロール、及び２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールからなる群から選択される２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールを有効成分とするものでない、２５−ヒドロキシコレステロール。
（６４）他の免疫抑制剤と同時又は独立して使用するための、（６２）に記載の２５−ヒドロキシコレステロール類縁体コレステロールであって、前記他の免疫抑制剤は２５−ヒドロキシコレステロールまたは２０α−ヒドロキシコレステロール、及び２４（Ｒ／Ｓ）, ２５−エポキシコレステロールからなる群から選択される２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロールを有効成分とするものでない、２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロール。
（６５）ＣＹＰ７Ｂ１阻害剤と組合せて使用するための、（５７）、（５９）、（６１）及び（６３）いずれかに記載の２５−ヒドロキシコレステロール。
（６６）ＣＹＰ７Ｂ１阻害剤と組合せて使用するための、（５８）、（６０）、（６２）及び（６４）いずれかに記載の２５−ヒドロキシコレステロールの類縁体コレステロール。【００１５】
（６７）被検化合物添加の効果を無添加コントロールと比較する工程であって、被検化合物添加時の２５−ヒドロキシコレステロール合成活性が無添加コントロールの場合と比して１０以上、１５以上、又は２０以上を示した被検化合物を選抜する工程を含むものである、（２７）乃至（３０）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の２５ＯＨＣ及び／又はその類縁体コレステロールを有効成分として含むＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤により、活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の予防又は治療を効果的に行うことができる。すなわち、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、皮膚筋炎、多発性筋炎、動脈炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、接触皮膚炎、気管支喘息、強皮症、ＩｇＧ４関連疾患、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、円板状エリテマトーデス、モルフィア、混合性結合組織病、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、中毒性表皮壊死症、スティーヴンス・ジョンソン症候群、多形紅斑、薬疹、固定薬疹、扁平苔癬、移植片対宿主病、特発性間質性肺炎、閉塞性汎細気管支炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、自己免疫性肝炎、虫刺症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、ベーチェット病、シェーグレン症候群、自己免疫性膵炎、I型糖尿病、円形脱毛症、尋常性白斑、原田病、天疱瘡、類天疱瘡、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、甲状腺機能亢進症、慢性甲状腺炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性胃炎、グッドパスチャー症候群、悪性貧血、又は自己免疫性溶血性貧血といった活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の予防又は治療をすることができる。また、本発明の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤により、移植片に対する拒絶反応を予防又は治療することができる。Ｔ細胞及び／又はＢ細胞の機能を抑制する免疫抑制剤は知られているものの、副作用がなく持続的な効果を有する医薬はいまだ提供されていないところ、活性化された細胞に選択的な作用を示す本発明の剤は副作用の低減及び効果の持続性の観点から技術的意義が大きい。さらに、本発明のスクリーニング方法によれば、上記細胞死誘導剤又は細胞死促進剤の有効成分である２５ＯＨＣの産生をＴ細胞において誘導又は促進する化合物が選抜可能となり、２５ＯＨＣと共に、又は２５ＯＨＣに代えて投与する医薬開発の道が開かれる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、マウスから単離したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で共刺激する培養系において、２５ＯＨＣ、コレステロール、若しくは７α,２５−ジヒドロキシコレステロール（７α,２５ＯＨＣ）添加時、又はコレステロール類無添加（Ｎｏｎｅ）の場合における、培養３日目の生細胞の割合を示す図である。バーの高さでＴ細胞の生存率の平均値を示し、併せて標準誤差も示す。図中、*はコレステロール類無添加（Ｎｏｎｅ）の場合と比して、２５ＯＨＣ添加の場合に有意な生存率の低下が認められたことを示す（ｐ＜０．０００１）。一方、ＮＳはコレステロール類無添加（Ｎｏｎｅ）の場合と比して、コレステロール又は７α,２５ＯＨＣ添加の場合に生存率に有意差が認められなかったことを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、生体中でのコレステロールから７α,２５ＯＨＣに至る代謝経路を示す図である。コレステロールは、コレステロール  ２５−ヒドロキシラーゼ（Ｃｈ２５ｈ）の触媒作用で２５ＯＨＣへと代謝され、さらに２５−ヒドロキシコレステロール−７α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ｂ１）の触媒作用によって７α,２５ＯＨＣへと代謝される。
【図２】図２は、マウスから単離したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で共刺激する培養系（左図）、又は刺激しない培養系（右図）において、２５ＯＨＣ（１０００ｎＭ）添加時、又は無添加の場合における、培養２日目の生細胞の割合を示す図である。バーの高さでＴ細胞の生存率を示す。
【図３】図３は、マウスから単離したＣＤ８陽性Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で共刺激する培養系（左図）、又は刺激しない培養系（右図）において、２５ＯＨＣ（３００ｎＭ）添加時、又は無添加の場合における、培養３日目の生細胞の割合を示す図である。バーの高さでＴ細胞の生存率を示す。
【図４】図４は、マウスから単離したＢ２２０陽性Ｂ細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）で刺激する培養系（左図）、又は刺激しない培養系（右図）において、２５ＯＨＣ（３００ｎＭ）添加時、又は無添加の場合における、培養３日目の生細胞の割合を示す図である。バーの高さでＢ細胞の生存率を示す。
【図５】図５は、マウスから単離したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で共刺激する培養系において、２５ＯＨＣを２、２０、１００、２００又は１０００ｎＭの終濃度で添加時、又無添加の場合における培養３日目の細胞集団をフローサイトメトリー解析した結果を示す。各パネルにおいて、横軸は前方散乱光（ＦＳＣ）、縦軸は７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）染色による測定シグナルの強度をそれぞれ示す。各パネルにおいてゲートされた生細胞を囲み、当該囲われた内部の細胞の割合（％）をパネル中に示す。
【図６】図６は、マウスから単離したＣＤ８陽性Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で共刺激する培養系（上段）、又はマウスから単離したＢ２２０陽性Ｂ細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）で刺激する培養系（下段）において、２５ＯＨＣを１、１０、１００、又は１０００ｎＭの終濃度で添加時、又無添加の場合における培養３日目の細胞集団をフローサイトメトリー解析した結果を示す。各パネルにおいて、横軸はＦＳＣ、縦軸は７−ＡＡＤ染色による測定シグナルの強度をそれぞれ示す。各パネルにおいてゲートされた生細胞を囲み、当該囲われた内部の細胞の割合（％）をパネル中に示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ハプテンによる接触皮膚炎モデルをＣｈ２５ｈノックアウトマウス（Ｃｈ２５ｈＫＯ）、又は野生型マウス（ＷＴ）に惹起した場合の、皮膚炎が生じた耳の厚みの経時的変化を示す図である。横軸を惹起後の時間（ｈｏｕｒ）、縦軸を耳の厚み（ｍｍ）として、Ｃｈ２５ｈＫＯにおける測定結果の平均値を●でプロットし、併せて標準誤差を示す。また、プロット間を黒線で結んで示す。他方、ＷＴにおける測定結果の平均値を○でプロットし、併せて標準誤差を示す。また、プロット間を灰色線で結んで示す。図中、*はＣｈ２５ｈＫＯとＷＴとの間でｐ＜０．００１の有意差があることを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７ＡのＡＵＣ値をＣｈ２５ｈＫＯ及びＷＴのそれぞれについて算出して示す図である。バーの高さでカーブ下の総面積（平均値）を示し、併せて標準誤差を示す。図中、*はＣｈ２５ｈＫＯとＷＴとの間でＡＵＣ値にｐ＝０．００２５の有意差があることを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ハプテンにより惹起した接触皮膚炎モデルマウス（ＷＴ）における、皮膚炎が生じた耳の厚みの経時的変化を示す図である。マウスに対して腹部にハプテン（ＤＮＦＢ）を塗布して感作し、５日後に片方の耳介へＤＮＦＢを塗布（チャレンジ）して接触皮膚炎を惹起させた。２５ＯＨＣ（２５ＯＨＣｉ．ｐ．）又は溶媒であるＤＭＳＯ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）が感作を行った日（Ｄａｙ  −５）より腹腔内へ連日投与された。横軸を惹起後の時間（ｈｏｕｒ）、縦軸を耳の厚み（ｍｍ）として、２５ＯＨＣｉ．ｐ．における測定結果の平均値を■でプロットし、併せて標準誤差を示す。また、プロット間を灰色線で結んで示す。他方、Ｃｏｎｔｒｏｌにおける測定結果の平均値を●でプロットし、併せて標準誤差を示す。また、プロット間を黒線で結んで示す。なお、ここで耳の厚み（ｍｍ）とは、測定時におけるチャレンジした側の耳介とチャレンジしていない側の耳介との厚みの差分を意味する。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａに示す結果のうち、惹起後９６時間における耳の厚みの測定結果を示す図である。バーの高さで（平均値）を示し、併せて標準誤差を示す。図中、ｐ＜０．００５は２５ＯＨＣｉ．ｐ．がＣｏｎｔｒｏｌに対してｐ＜０．００５の有意差があることを示す。
【図９】図９は、マウスから単離したナイーブＣＤ４Ｔ＋細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で共刺激する培養系において、ＴＧＦ−β（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２７（２０ｎｇ／ｍＬ）添加時、又はいずれも無添加（Ｎｏ）の場合における、培養２日目のＣｈ２５ｈのｍＲＮＡ発現量を示す図である。ｍＲＮＡの発現量は、ＲＴ−ｑＰＣＲで測定した相対的な発現量として示す。図中、相対発現量は標準誤差と共にバーの高さで示される。**は、ＴＧＦ−β添加時とＩＬ−２７添加時との間でｐ＜０．０００１の有意差があることを示す。
【図１０】図１０は、イミキモドクリームにより惹起した乾癬モデルマウスにおける、乾癬が生じた耳の厚みを示す図である。マウスに対して片耳（左耳）の背側面にイミキモド含有クリーム（ベセルナクリーム５％；持田製薬社製）２５０ｍｇ（イミキモド１２．５ｍｇ）を１日置きに３回（Ｄａｙ  ０，２，４）塗布して乾癬モデルとなる炎症を惹起させた。２５ＯＨＣ（２５ＯＨＣｉ．ｐ．）又は溶媒であるＤＭＳＯ（ＤＭＳＯｉ．ｐ．）がＤａｙ  ０からＤａｙ  ５まで、腹腔内へ連日投与された。図は、Ｄａｙ  ５における耳の厚みをＤａｙ  ０における耳の厚みと比較した耳の厚みの変化量（ｍｍ）の測定結果を示す。バーの高さで（平均値）を示し、併せて標準誤差を示す。図中、ｐ＝０．０４は２５ＯＨＣｉ．ｐ．が対照（ＤＭＳＯｉ．ｐ．）に対してｐ＝０．０４の有意差があることを示す。なお、ここで耳の厚みとは、測定時における乾癬を惹起した側の耳介（左耳）と、惹起していない側の耳介（右耳）との厚みの差分を意味する。
【図１１Ａ】図１１Ａは、マウスから単離したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で共刺激する培養系において、２０α−ヒドロキシコレステロールを１、１０、１００、又は１０００ｎＭの終濃度で添加時、又無添加の場合における培養３日目の細胞集団をフローサイトメトリー解析した結果を示す。各パネルにおいて、横軸は前方散乱光（ＦＳＣ）、縦軸は７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）染色による測定シグナルの強度をそれぞれ示す。各パネルにおいてゲートされた生細胞を囲み、当該囲われた内部の細胞の割合（％）をパネル中に示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、マウスから単離したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で共刺激する培養系において、２４（Ｒ／Ｓ），２５−エポキシコレステロールを１、１０、１００、又は１０００ｎＭの終濃度で添加時、又無添加の場合における培養３日目の細胞集団をフローサイトメトリー解析した結果を示す。各パネルにおいて、横軸は前方散乱光（ＦＳＣ）、縦軸は７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）染色による測定シグナルの強度をそれぞれ示す。各パネルにおいてゲートされた生細胞を囲み、当該囲われた内部の細胞の割合（％）をパネル中に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（１）２５−ヒドロキシコレステロール（２５ＯＨＣ）の入手、調製
２５ＯＨＣ（別名：5-Cholestene-3beta,25-diol; Cholest-5-ene-3beta,25-diol; 25-Hydroxy-5-cholestene-3β-ol）は、ＣＡＳ登録番号２１４０−４６−７、分子式Ｃ２７Ｈ４６Ｏ２で示される公知物質であり、適宜入手可能な物質である。例えば、Sigma-Aldrich社やSanta Cruz Biotechnology社から販売される製品を購入することで入手できる。
また、コレステロール  ２５−ヒドロキシラーゼを用いてコレステロールから生化学的に製造することもできる。その他、２５ＯＨＣの調製は、ＥＰ００２１２３５Ａ１、特開平９−２４９６９１号公報、特開昭６１−１８９２９４号公報、特開平７−２０６８９３号公報、特開昭４９−１０２６６１号公報、ＵＳ３８４６４５５Ａ、ＵＳ３８５６７８０Ａ、ＵＳ４１８３８５２Ａ、又はＵＳ３８２２２５４Ａに記載の方法などを参考にして調製することもできる。２５ＯＨＣはエタノール、クロロホルム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の有機溶媒にまず溶解させ、次いで水、緩衝液、生理食塩水、培地等で希釈して所望の濃度に調製し使用することができる。また、２５ＯＨＣの水性溶媒中に可溶な塩を調製するなどして、これを有機溶媒に溶解させることなく、直接水や緩衝液などの水性溶媒に直接溶解させて調製しても良い。また、シクロデキストリン類に包接させてから水性溶媒に直接溶解させても良い。
２５−ヒドロキシコレステロールは、分子内に８個の不斉炭素原子を含み、複数の立体異性体が存在する。いずれの立体異性体も、立体異性体の単独か混合物かにかかわらず、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導又は細胞死促進という効果を有する点で本発明で意図される範囲内である。生体内から得られる天然の２５−ヒドロキシコレステロール分子種である (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(2R)-6-hydroxy-6-methylheptan-2-yl]-10,13-dimethyl-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol が好ましく使用される。当該分子種は構造式で次のように示されるものである。
【００１９】
【化１】
2017209270.tif 000003
以下の実施例の項において２５ＯＨＣと記載する場合、この天然型分子種の使用を意味するものであるが、当該記載はその他の立体異性体の使用を妨げるものではない。
なお、本発明では、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤の有効成分として２５ＯＨＣを使用するものであるが、２５ＯＨＣの代替物として２５ＯＨＣの３位のヒドロキシル基がエステル化又はエーテル化により修飾された誘導体も用いることもできる。また、後記の２５ＯＨＣの類縁体コレステロールを、２５ＯＨＣに代えて、又は２５ＯＨＣの補助成分として使用することができる。
【００２０】
（２）Ｔ細胞、Ｂ細胞の調製
Ｔ細胞及びＢ細胞は、生体から採取した末梢血を使用して、各種マーカーの発現を指標として抗体やフローサイトメーター等を利用して公知の手法により単離することができる。また、マウスやラットについては、脾臓やリンパ節から採取した細胞を使用して単離をすることができる。
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性であること、及び、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４４ｌｏｗなど、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４４に関する発現レベルを単独又は組み合わせた指標により単離をすることができる。
ＣＤ８陽性Ｔ細胞はＣＤ８＋を指標に、Ｂ２２０陽性Ｂ細胞はＢ２２０＋を指標に、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の単離における材料や手法と同様の材料や手法を適用して単離することができる。
【００２１】
（３）Ｔ細胞及びＢ細胞の活性化
生体から単離したナイーブＴ細胞は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、及び／又は抗ＣＤ２８モノクローナル抗体で刺激することにより活性化させることができる。また、これらの抗体に代えてコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で処理することによっても活性化させることができる。前記抗体による刺激は、前記抗体で被覆した培養プレートに単離したナイーブＴ細胞を播種し、一定期間培養することで実施できる。培養プレートや培地は通常の細胞培養に適用される種類のものであれば任意に選択し、使用することができる。
抗ＣＤ３モノクローナル抗体、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体、ＣｏｎＡはいずれも市販されており、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社、Ｓｉｇｍａ社等が提供する商品を適宜選択して使用できる。
生体から単離したＢ細胞は、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）で処理することによって活性化させることができる。ＬＰＳによる刺激は、単離したＢ細胞をＬＰＳを含む培地に懸濁し、培養プレートで一定期間培養することで実施できる。Ｔ細胞の活性化の場合と同様、培養プレートや培地は通常の細胞培養に適用される種類のものであれば任意に選択し、使用することができる。
【００２２】
（４）活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞に選択的な細胞死誘導、又は選択的な細胞死促進効果の確認
本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤の有効成分である２５ＯＨＣの活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞に選択的な細胞死誘導、又は選択的な細胞死促進効果は、インビトロの実験により確認することができる。
Ｔ細胞及びＢ細胞は、上記の手順に沿って単離し、さらに上記の手段により活性化刺激を与えられながら培養することができる。培養期間中、経時的に生存細胞数が減少してくる。ここで、該活性化細胞の培養用培地に本発明の有効成分である２５ＯＨＣを添加すると、生存細胞数の減少が加速化し、２５ＯＨＣ無添加の対照と比較して、有意な生存細胞数の減少が認められる。代表的なものとして、下記の実施例１乃至３及び５に開示される具体的な手法が例示される。
Ｔ細胞やＢ細胞に細胞死を誘導する２５ＯＨＣの作用が活性化されたＴ細胞やＢ細胞に対して選択的であることは、活性化されていないＴ細胞又はＢ細胞を用いた実験を行うことにより確認することができる。
前記の実験において、Ｔ細胞又はＢ細胞に対する活性化刺激を与えないことでのみ条件が相違するインビトロの実験系を構築する。単離されたＴ細胞やＢ細胞の生存細胞数は、細胞培養を通じて経時的に減少する。このような条件の細胞培養において、本発明の有効成分である２５ＯＨＣが添加された場合、無添加の対照と比較しても、生存細胞数に有意な差異は認められない。代表的なものとして、下記の実施例２に開示される具体的な手法が例示される。
【００２３】
（５）本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤の調製
本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤において有効成分である２５ＯＨＣは、２５ＯＨＣそれ自体はもちろんのこと、その塩若しくは溶媒和物の形態の化合物を用いることもできる。塩及び溶媒和物形態の化合物は常法により製造することができる。
前記の塩としては、薬学的に許容できるものであれば特に制限はないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、トリアルキルアミン塩等の有機塩基塩；塩酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩；酢酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。
前記の溶媒和物としては、水和物、アルコール和物（例えば、エタノール和物）等が挙げられる。
本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤は、注射剤、座剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤等の剤型とすることができる。これらの製剤は、公知の方法で製造することができる。例えば、経口投与用製剤とする場合には、トラガントガム、アラビアガム、ショ糖脂肪酸エステル、レシチン、オリーブ油、大豆油、ＰＥＧ４００等の溶解剤；澱粉、マンニトール、乳糖等の賦形剤；メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤；結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤；タルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、軽質無水ケイ酸等の流動性向上剤等を適宜組み合わせて処方することにより製造することができる。また、注射用の製剤とする場合は、例えば、無菌的に保存した２５ＯＨＣの乾燥物又は保存溶液を、静脈注射用の生理食塩水又は緩衝液によって溶解又は希釈して調製することができる。２５ＯＨＣは水性溶媒への溶解度が低いので、水や生理食塩水など水性溶媒中へ直接溶解させたい場合は、予め水性溶媒中へ可溶な塩を調製することが望ましい。あるいは、２５ＯＨＣをシクロデキストリン類に包接させることにより水溶性を高めることも可能である。また、貼付剤のような皮膚外用剤として調製する場合には、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系など任意の形態で調製できる。前記のとおり２５ＯＨＣは水溶性が低いので、調製において油層に溶解させるか、油層に溶解させてから乳化することで好ましく配合させることができるが、調製方法はこれに限定されない。皮膚外用剤は、本発明の効果を損なわない範囲で通常の医薬組成物に配合される成分、例えばアルコール、油分、界面活性剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、防腐剤、無機粉末、有機粉末、香料等を任意に配合することができる。また、軟膏のような皮膚外用剤として調製する場合には、親油性、水溶性又はエマルジョンタイプの基剤に２５ＯＨＣを溶解又は分散させることにより調製できる。基剤としては、ワセリン、ラノリン、及びポリエチレングリコールを例として挙げられるが、特に限定されない。
【００２４】
（６）本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤の成分であるコレステロール類
前記のとおり、本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤の有効成分は２５ＯＨＣである。ここで、細胞死誘導剤又は細胞死促進剤としての組成物において、２５ＯＨＣ以外にもコレステロール類を含んでいても良い。例えば、（１）で記載されるように、２５ＯＨＣの立体異性体や、２５−ヒドロキシコレステロールの３位のヒドロキシル基がエステル化又はエーテル化により修飾された誘導体を用いることができる。これらは、２５ＯＨＣに代えて、又は２５ＯＨＣと共に使用することができる。また、コレステロール、又は２５ＯＨＣ以外の酸化コレステロール（好ましい例としては、下記（７）の２５ＯＨＣの類縁体コレステロール）を、第二、第三のコレステロール類成分として２５ＯＨＣと共に使用することができる。しかしながら、本発明において、コレステロール類としては唯一の成分として２５ＯＨＣを含有する組成物が最も好ましい例として挙げられる。
【００２５】
（７）本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤において、２５ＯＨＣに代えて使用することのできる有効成分（２５ＯＨＣの類縁体コレステロール）
前記のとおり、本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤の有効成分は２５ＯＨＣである。ここで、本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤を移植片に対する拒絶反応を予防又は治療する目的で使用する場合において、２５ＯＨＣの代替成分として、２５ＯＨＣの類縁体であるコレステロール分子種を用いることができる。この場合、使用する２５ＯＨＣ類縁体コレステロールとは、細胞集団から活性化されたＴ細胞を選択的に失わせる活性、活性化されたＴ細胞に対して細胞死を選択的に誘導する活性、及び活性化されたＴ細胞の細胞死を誘導する活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有するものであり、当該活性を有する点において２５ＯＨＣと性質を共有するものである。そして、安全性の観点からヒトの生体内に天然に存在する化合物が望ましい。望ましい２５ＯＨＣ類縁体コレステロールとして、２０α−ヒドロキシコレステロール、及び２４（Ｒ／Ｓ），２５−エポキシコレステロールを挙げることができる。これらの２５ＯＨＣ類縁体コレステロールを２５ＯＨＣと共に使用する場合は、２５ＯＨＣを含む剤と同時に投与するものでも、独立して投与するものでも良い。また、同時投与を意図する場合、２５ＯＨＣと２５ＯＨＣ類縁体コレステロールとを共に含む剤として調製して使用することもできる。２４（Ｒ／Ｓ），２５−エポキシコレステロールはラセミ体であるが、当該ラセミ体化合物を使用することに代えて、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロールなど、当該ラセミ体化合物に対応するいずれか一の光学異性体を使用しても良い。
【００２６】
（８）２０α−ヒドロキシコレステロールの入手、調製
２０α−ヒドロキシコレステロール（別名：5-Cholestene-3beta,20alpha-diol; (20S)-Cholest-5-ene-3beta,20-diol）は、ＣＡＳ登録番号５１６−７２−３、分子式Ｃ２７Ｈ４６Ｏ２で示される公知物質であり、適宜入手可能な物質である。例えば、Sigma-Aldrich社、Avanti Polar Lipids, Inc.社やSanta Cruz Biotechnology社から販売される製品を購入することで入手できる。
【００２７】
（９）２４（Ｒ／Ｓ），２５−エポキシコレステロールの入手、調製
２４（Ｒ／Ｓ），２５−エポキシコレステロールは、ＣＡＳ登録番号７２５４２−４９−５、分子式Ｃ２７Ｈ４４Ｏ２で示される公知物質であり、適宜入手可能な物質である。例えば、Santa Cruz Biotechnology社やAvanti Polar Lipids, Inc.社から販売される製品を購入することで入手できる。
【００２８】
（１０）本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤の第二の有効成分
前記のとおり、本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤の有効成分は２５ＯＨＣである。生体内などにおいて、２５ＯＨＣは、ＣＹＰ７Ｂ１の触媒作用によって７α,２５ＯＨＣへと代謝される。当該代謝が行われた場合、有効成分である２５ＯＨＣの生体内での濃度が低下することになる。それゆえ、２５ＯＨＣの効果を維持させる目的で、ＣＹＰ７Ｂ１阻害剤を第二の有効成分として用いることができる。ＣＹＰ７Ｂ１阻害剤の具体的な例としてはＣｌｏｔｒｉｍａｚｏｌｅ、Ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ、Ｂｉｆｏｎａｚｏｌｅ、Ｍｉｃｏｎａｚｏｌｅ、Ｖｏｒｉｃｏｎａｚｏｌｅ、Ｅｃｏｎａｚｏｌｅ、Ｔｉｏｃｏｎａｚｏｌｅ、Ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ、及びＭｅｔｙｒａｐｏｎｅなどが挙げられるが、これに限定されない。
また、本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤を移植片に対する拒絶反応を予防又は治療する目的で使用する場合は、２５−ヒドロキシコレステロールを有効成分とするものでない他の免疫抑制剤と組み合わせて使用することができる。この場合、前記他の免疫抑制剤は本発明の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤と同時に投与するものでも、独立して投与するものでも良い。また、同時投与を意図する場合、前記他の免疫抑制剤と本発明の細胞死誘導剤又は細胞死促進剤との合剤を調製して使用することもできる。前記他の免疫抑制剤は、公知の免疫抑制剤から任意に選択することができる。
【００２９】
（１１）本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤の用途［１］
本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤は、活性化したＴ細胞及び／又は活性化したＢ細胞が関連する免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の予防又は治療に使用することができる。ここで治療とは、対象疾患を完全に治癒させることのみならず、対象疾患の症状を緩和させることや、対象疾患の症状や病態の進展を抑制することも包含している。それゆえ、本発明において治療という用語は、対象疾患の症状の改善を広く意図したものと解釈されるべきである。
活性化したＴ細胞及び／又は活性化したＢ細胞が関連する免疫機能の亢進又は異常を示す疾患であって、本発明が予防又は治療の対象として意図する疾患は、次のように例示することができる。
全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、皮膚筋炎、多発性筋炎、動脈炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、接触皮膚炎、気管支喘息、強皮症、ＩｇＧ４関連疾患、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、円板状エリテマトーデス、モルフィア、混合性結合組織病、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、中毒性表皮壊死症、スティーヴンス・ジョンソン症候群、多形紅斑、薬疹、固定薬疹、扁平苔癬、移植片対宿主病、特発性間質性肺炎、閉塞性汎細気管支炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、自己免疫性肝炎、虫刺症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、ベーチェット病、シェーグレン症候群、自己免疫性膵炎、I型糖尿病、円形脱毛症、尋常性白斑、原田病、天疱瘡、類天疱瘡、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、甲状腺機能亢進症、慢性甲状腺炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性胃炎、グッドパスチャー症候群、悪性貧血、及び自己免疫性溶血性貧血。
これらのうち、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、皮膚筋炎、多発性筋炎、動脈炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、気管支喘息、強皮症、ＩｇＧ４関連疾患、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、円板状エリテマトーデス、モルフィア、混合性結合組織病、及び急速進行性糸球体腎炎は、活性化したＴ細胞及び活性化したＢ細胞が関連する免疫機能の亢進又は異常を示す疾患として例示することができる。
また、乾癬、接触皮膚炎、中毒性表皮壊死症、スティーヴンス・ジョンソン症候群、多形紅斑、薬疹、固定薬疹、扁平苔癬、移植片対宿主病、特発性間質性肺炎、閉塞性汎細気管支炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、自己免疫性肝炎、虫刺症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、ベーチェット病、シェーグレン症候群、自己免疫性膵炎、I型糖尿病、円形脱毛症、尋常性白斑、及び原田病は、主として活性化したＴ細胞が関連する免疫機能の亢進又は異常を示す疾患として例示することができる。
とりわけ、乾癬、薬疹、潰瘍性大腸炎、及びクローン病は、本発明における予防又は治療対象疾患として好ましく例示される。
また、天疱瘡、類天疱瘡、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、甲状腺機能亢進症、慢性甲状腺炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性胃炎、グッドパスチャー症候群、悪性貧血、及び自己免疫性溶血性貧血は、主として活性化したＢ細胞が関連する免疫機能の亢進又は異常を示す疾患として例示することができる。
とりわけ、天疱瘡及び類天疱瘡は、本発明における予防又は治療対象疾患として好ましく例示される。
さらに、本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤は、移植片に対する拒絶反応を予防又は治療に使用することができる。投与対象としては、他者由来の組織又は臓器の移植を受けた患者を挙げることができる。
【００３０】
（１２）本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤の投与形態
本発明の活性化したＴ細胞及び／又は活性化したＢ細胞が関連する免疫機能の亢進又は異常を示す疾患を対象としたＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤としての有効成分となる２５ＯＨＣの有効投与量は、患者の状態、症状など諸事情により適宜変更される。経口又は非経口の経路で全身投与される場合の１日分の投与量として、１ｍｇ〜１００００ｍｇの投与量が例示される。より好ましい例として、１０ｍｇ〜１０００ｍｇの投与量が挙げられる。経口投与する場合における２５ＯＨＣの１日分の投与量は、これを１日１回投与するか、又は数回に分けて投与することができる。逆に数日分の用量を１回に投与することにより２日以上毎に１度の投与ペースとすることもできる。注射剤として全身投与する場合における２５ＯＨＣの投与量も、１日１回投与するか、又は１日分を数回に分けて投与することができる。逆に数日分の用量を１回に注射することにより２日以上毎の投与ペースとすることもできる。また、点滴等により継続的に投与することでも良い。皮膚へ局所投与をする場合も、外用薬としての医薬組成物中の２５ＯＨＣの配合量、局所投与の頻度、及び塗布範囲などは適宜調整できる。例えば、外用薬は、有効成分である２５ＯＨＣが外用薬全量中の０．００１〜２０重量％配合されたものを利用することができる。いずれの場合も、投与は必ずしも継続的又は定期的に行う必要はなく、症状の変化などに応じて適宜間隔を空けて行うことが可能である。もちろん、単回の投与で治癒又は寛解すれば、複数回投与を行う必要はない。症状が再発乃至増悪した場合に投与を再開することでも良い。
本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤の投与方法としては、特に限定されるものではなく、経口投与、非経口投与のいずれもが好適に用いられる。投与量や投与ペースの目安は前記と同様である。非経口の投与方法としては皮下注射、筋肉注射、又は静脈投与等の注射や経皮吸収剤（貼付剤）や軟膏、ローション、ペースト、ゼリー又はスプレーなどの皮膚外用剤による経皮投与が好ましいが、これに限定されるものでは無い。経皮吸収剤や皮膚外用剤は、有効成分である２５ＯＨＣが皮膚外用剤全量中の０．００１〜２０重量％配合された剤を利用することができる。皮膚に病変部を有する疾患を治療対象とする場合には、皮膚外用剤を当該病変部へ塗布等することにより、有効成分である２５ＯＨＣを局所的に投与することが可能である。例えば、皮膚表面積１ｃｍ２当たり、１日に１０μｇ〜１００ｍｇの２５ＯＨＣが適用されるよう、経皮吸収剤や皮膚外用剤が使用され得る。また、本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤は、前記した投与形態に応じて、公知の各種の手法により製剤化方法を最適化することができる。
上記の投与形態は、２５ＯＨＣを投与する場合のみならず、前記の２５ＯＨＣ異性体、２５ＯＨＣ誘導体、及び２５ＯＨＣの類縁体コレステロールを投与する場合にも、２５ＯＨＣの場合と同様に適用することができる。
投与期間は、患者の病状に応じて適宜調整できる。投与期間中の投与用量は適宜調整できるが、継続的に一定量を投与するか、又は投与当初のみ比較的高用量で投与した後により少ない維持量の一定投与に移行する投与形態とすることが好ましい。
【００３１】
（１３）本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤の用途［２］
本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤は、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞を選択的に失わせる方法であって、前記細胞を含む試料に対して２５ＯＨＣ又は２５ＯＨＣを含む組成物を投与することを特徴とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの方法に用いることができる。ここで、活性化された細胞を選択的に失わせる方法とは、細胞集団中の活性化された生細胞の数を減少させることを意味し、集団内での活性化された細胞の生存率が低下することによって活性化された細胞が選択的に失われることになる。
また、本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤は、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に対して選択的に細胞死を誘導又は促進する方法であって、前記細胞を含む試料に対して２５ＯＨＣ又は２５ＯＨＣを含む組成物を投与することを特徴とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの方法に用いることができる。
これらいずれかの方法によって、生体外の環境において、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導又は細胞死促進を引き起こすことが可能となる。結果として、当該方法の実施前と比較して、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞の割合が特異的に低減した組成を有する細胞群を得ることができる。
活性化したＴ細胞及び／又は活性化したＢ細胞が関連する免疫機能の亢進又は異常を示す疾患を有する患者から末梢血等の体液を採取し、当該方法をｅｘ  ｖｉｖｏの方法として実施した場合、処理後の末梢血を生体へと還元することを通じて活性化したＴ細胞及び／又は活性化したＢ細胞が関連する免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の治療を行うことも可能である。他者由来の組織又は臓器の移植を受けた患者であって、移植片に対する拒絶反応を示す患者又は拒絶反応が懸念される患者から末梢血等の体液を採取し、当該方法をｅｘ  ｖｉｖｏの方法として実施した場合、処理後の末梢血を生体へと還元することを通じて拒絶反応の予防又は治療を行うことも可能である。これらｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの方法において、有効成分である２５ＯＨＣは、終濃度として３０ｎＭ〜１００μＭ、より好ましくは１００ｎＭ〜１０μＭの濃度で使用することができる。
【００３２】
前記二つのいずれの用途においても、２５ＯＨＣに代えて上記の２５ＯＨＣ類縁体コレステロールを用いることができる。
また、必要に応じて、２５ＯＨＣの効果を維持させる目的で、ＣＹＰ７Ｂ１阻害剤を第二の有効成分として用いることができる。また、ＣＹＰ７Ｂ１阻害剤の投与は、第二の有効成分として２５ＯＨＣと同時に投与することによる場合のみならず、２５ＯＨＣとは別工程での投与によってなされても良い。
ＣＹＰ７Ｂ１阻害剤の具体的な例としてはＣｌｏｔｒｉｍａｚｏｌｅが挙げられるが、これに限定されない。
第二又は第三のの有効成分として、２５ＯＨＣとは別異の免疫抑制性物質を用いることもできる。前記のＣＹＰ７Ｂ１阻害剤と同様の態様で使用することができる。免疫抑制性物質は、公知の免疫抑制剤の有効成分から適宜選択することができる。
必要に応じて、２５ＯＨＣの細胞死誘導又は細胞死促進効果を維持及び／又は増強させる目的で、２５ＯＨＣの類縁体であるコレステロールを補助的な有効成分として用いることができる。また、前記類縁体コレステロールの投与は、第二、第三又は第四の有効成分として２５ＯＨＣと同時に投与することによる場合のみならず、２５ＯＨＣとは別工程での投与によってなされても良い。
前記類縁体コレステロールの具体的な例として、２０α−ヒドロキシコレステロール、及び２４（Ｒ／Ｓ），２５−エポキシコレステロールが挙げられるが、これに限定されない。
【００３３】
（１４）本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、２５ＯＨＣの産生をＴ細胞において誘導又は促進する化合物の探索を目指すものである。
ヒト又は非ヒト動物の体液から単離したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を本方法において使用する。ヒトＴ細胞において２５ＯＨＣの産生を効率的に誘導又は促進する化合物を見出すことが最先の目的であるので、本方法において使用するナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞はヒト由来の単離細胞であることが好ましい。また、非ヒト動物は任意の動物種が利用できるが、哺乳動物が好ましく、入手の容易性や取り扱い技術の蓄積を考慮するとマウスやラットなどの齧歯目動物がより好ましく、特にマウスが好ましい。体液はＴ細胞を含むものであれば任意のものが利用できるが、血液が好ましく、脾臓、リンパ節、又は血管から採取した末梢血がより好ましい。採取したＴ細胞を含む体液から公知の方法でナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離する。例えば、フローサイトメーターを用いてマウスのＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４４ｌｏｗのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離することができる。単離したＣＤ４陽性のＴ細胞は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体でコーティングした培養プレートに播種し、細胞培養を通じて活性化させる。プレートは任意の種類が利用できる。以下は代表的な例として、９６穴平底プレートを使用するものとして実施態様を記載する。播種する細胞密度は任意であるが、好ましくは５ｘ１０３／ウェル〜５ｘ１０５／ウェル、より好ましく１ｘ１０４／ウェル〜１ｘ１０５／ウェル、さらに好ましくは２ｘ１０４／ウェル〜５ｘ１０４／ウェル、最も好ましくは５ｘ１０４／ウェルである。培養において試料は複数の群に分け、少なくとも一つの群は被検化合物を添加しない無添加コントロール、又は被検化合物無添加かつＩＬ−２７を添加したポジティブコントロールとする。ＩＬ−２７の添加量は１０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ（いずれも最終濃度）である。残りの群には培養液に被検化合物を添加する。被検化合物、及びＩＬ−２７は培養開始から一定時間後に添加しても良いが、好ましくは培養開始時から添加する。培養期間は任意であるが、短すぎると２５ＯＨＣ産生誘導が十分に起こらず、誘導活性を検出しにくくなる恐れがあり、一方長すぎると細胞の生存能が低下して２５ＯＨＣの産生能が低下する恐れがあるので、０．５日〜５日、好ましくは１日〜３日とする。所定の期間の培養後、サンプリングを行う。サンプリングした試料における２５ＯＨＣ産生能は２５ＯＨＣ自体の濃度の測定、２５ＯＨＣ合成酵素であるＣｈ２５ｈの蛋白質蓄積量の測定、又はＣｈ２５ｈのｍＲＮＡ蓄積量の測定を通じて評価を行う。ガスクロマトグラフ法、ウエスタンブロット法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法など、いずれの測定も当該技術分野で周知の技術が適用でき、当業者は適宜実施をすることができる。例えば、Ｃｈ２５ｈ遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ蓄積量）は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により測定できる。
また、Ｃｈ２５ｈ遺伝子プロモーターにレポーター遺伝子を機能的に連結させたキメラ遺伝子を有する形質転換細胞（又は当該形質転換細胞を含む形質転換動物や組織）を利用することによって、Ｃｈ２５ｈの蛋白質蓄積量の測定、又はＣｈ２５ｈのｍＲＮＡ蓄積量の測定を、レポーター遺伝子産物の蓄積量の測定やレポーター遺伝子のｍＲＮＡ蓄積量の測定に代替することができる。レポーター遺伝子を利用することは、当該方法の好ましい実施態様の一つとして挙げられる。レポーターとしては、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質など当業者に公知のものであれば、任意に用いることができる。また、形質転換細胞や形質転換動物は、周知慣用の手法によって当業者であれば適宜調製することができる。レポーター遺伝子を本方法で採用した場合、レポーター遺伝子産物の物理化学的な性質や生化学的な性質などを利用することにより、レポーター遺伝子の発現量の定量的な測定を化学発光や蛍光などの測定を通じて行うことも可能である。
そして、２５ＯＨＣ自体の濃度の測定、２５ＯＨＣ合成酵素であるＣｈ２５ｈの蛋白質蓄積量の測定、若しくはＣｈ２５ｈのｍＲＮＡ蓄積量の測定、又はＣｈ２５ｈ遺伝子プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子の発現の定量的な測定を通じて評価される被検化合物のＴ細胞における２５ＯＨＣ産生の誘導能又は促進能を、被検化合物を使用しない無添加コントロール時及び／又は被検化合物無添加かつＩＬ−２７添加時（ポジティブコントロール時）の２５ＯＨＣ産生の誘導能又は促進能と比較することにより所望の化合物の候補が選抜される。選抜の閾値は適宜決定することができるが、例えば無添加コントロールの誘導能／促進能を１とした場合に５以上、より好ましくは１０以上、さらにより好ましくは１５以上、最も好ましくは２０以上の値を示した被検化合物を候補化合物として選抜する。別の例では、ＩＬ−２７を添加したポジティブコントロールの誘導能／促進能を１とした場合に、０．５以上、より好ましくは１．０以上、さらにより好ましくは１．５以上、最も好ましくは２．０以上の値を示した被検化合物を候補化合物として選抜する。前記２つの例の選抜を両方行い、被検化合物の選抜を行っても良い。
選抜において閾値を変化させ、より高次の選抜段階でより厳しい閾値の設定を行うことにより、その選抜を多段階で行うこともできる。
当該選抜を行うことで、より２５ＯＨＣの生産誘導又は促進のためにより効果的な化合物を入手ことができる。
なお、ＩＬ−２７をポジティブコントロール用に使用する例で記載したが、ＩＬ−２７の使用は必須の要件ではない。ＩＬ−２７のポジティブコントロールを使用しないことも可能であるし、ＩＬ−２７に代えてＩＬ−２７受容体アゴニストをポジティブコントロール用に使用して同様のスクリーニング方法を構築することもできる。このような実施態様による物質の探索もまた本願の目的とするところであり、その探索は実施可能である。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例により何ら限定されるものではない。【００３５】
実施例１  単離されたＴ細胞の細胞培養中の細胞死に対するコレステロール類の影響
８週齢のＣ５７ＢＬ／６野生型マウス（三共ラボから購入）を使用して、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４４ｌｏｗ）を単離した。Ｔ細胞の活性化のために、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（クローン２Ｃ１１：Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社）及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（クローン３７．５１：Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社）それぞれ３μｇ／ｍＬでコーティングした培養プレート（９６ウェル平底プレート）を調製した。当該プレートに単離したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を５ｘ１０４Ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し、３日間培養した。培養液にはペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、ピルビン酸（Ｇｉｂｃｏ）、ＦＢＳ（ＢＯＶＯＧＥＮ）、ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、２−ＭＥ（シグマ)を添加したＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ）を使用した。培養は、２５ＯＨＣ（Ｓｉｇｍａ）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ）、若しくは７α,２５−ジヒドロキシコレステロール（７α,２５ＯＨＣ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，  Ｉｎｃ．）の添加（いずれも終濃度２００ｎＭ）、又はコレステロール類無添加（Ｎｏｎｅ）で行った。培養後の細胞は、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ：ＢＤ社）で染色し、フローサイトメーター（ＣａｎｔｏＩＩ：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて解析した。７−ＡＡＤのシグナル強度とＦＳＣのシグナル強度とに基づいてゲーティングし、生細胞数を測定すると共に、各培養系における生細胞の割合を算出した（ｎ＝３）。生細胞の割合は、２５ＯＨＣ添加では５．６±１．４％、コレステロール添加では５６．４±１．９％、７α,２５ＯＨＣ添加では５５．２±１．５％、コレステロール類無添加では５７．８±２．１％だった（図１Ａ）。コレステロール類無添加（Ｎｏｎｅ）の場合と比して、２５ＯＨＣ添加の場合に有意な生存率の低下が認められた（ｐ＜０．０００１）。一方、コレステロール又は７α,２５ＯＨＣ添加の場合にコレステロール類無添加（Ｎｏｎｅ）の場合と比して、有意差が認められなかった。
図１Ｂに示されるように、生体内において２５ＯＨＣはコレステロールからＣｈ２５ｈの触媒作用により生成し、ＣＹＰ７Ｂ１の触媒作用により７α,２５ＯＨＣへと代謝される。図１Ａに示されるように、活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養中の生存率は２５ＯＨＣにより顕著に低下し、２５ＯＨＣには活性化Ｔ細胞の細胞死誘導又は細胞死促進機能が備わることが認められる。一方、２５ＯＨＣと代謝経路中で前後するコレステロールや７α,２５ＯＨＣには活性化Ｔ細胞の細胞死誘導又は細胞死促進機能が認められなかった。【００３６】
実施例２  単離されたＴ細胞の細胞培養中の細胞死に対する活性化刺激の影響（１）
２５ＯＨＣによる細胞培養中のＴ細胞の生存率の低下がＴ細胞に対する活性化刺激の有無に影響を受けるかどうか、試験を行った。
実施例１と同様にナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。実施例１と同じく抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングした培養プレートを用いる場合を「刺激あり」とし、一方、前記両抗体でのコーティングのない培養プレートを用いる場合を「刺激なし」とした。両条件とも培養液中に２５ＯＨＣを含む（終濃度１０００ｎＭ）条件及び含まない条件を用意し、３日間の培養を行った。培養１日目、２日目及び３日目のそれぞれで一部の培養液をサンプリングし、実施例１と同様の方法で生細胞を測定し、Ｔ細胞の生存率を算出した。
「刺激あり」で２５ＯＨＣ無添加の場合、Ｔ細胞の生存率は、培養１日目、２日目及び３日目でそれぞれ６１．８％、５１．９％、及び４５．３％だった。
「刺激あり」で２５ＯＨＣ添加の場合、Ｔ細胞の生存率は、培養１日目、２日目及び３日目でそれぞれ４９．６％、１４．０％、及び６．９３％だった。
「刺激なし」で２５ＯＨＣ無添加の場合、Ｔ細胞の生存率は、培養１日目、及び２日目でそれぞれ５３．０％、及び２６．４％だった。
「刺激あり」で２５ＯＨＣ添加の場合、Ｔ細胞の生存率は、培養１日目、及び２日目でそれぞれ５５．７％、及び３０．４％だった。
なお、培養開始前（０日目）の生存率は９７．５％だった。
上記の結果について、培養２日目の生存率を棒グラフで示した（図２）。図２の左図は「刺激あり」、右図は「刺激なし」における結果をそれぞれ示す。
「刺激あり」の場合のＴ細胞の生存率は２５ＯＨＣの添加によって顕著に低下していることが認められる。一方、「刺激なし」の場合は２５ＯＨＣの有無でＴ細胞の生存率に明確な相違が認められなかった。この結果から、２５ＯＨＣによるＴ細胞に対する細胞死誘導又は細胞死促進機能はＴ細胞受容体刺激依存的であって、Ｔ細胞のうち活性化された細胞に対してのみ発揮される機能であることが示された。【００３７】
実施例３  単離されたＣＤ８陽性Ｔ細胞、及びＢ２２０陽性Ｂ細胞の細胞培養中の細胞死に対する２５ＯＨＣの影響（１）
２５ＯＨＣによる細胞死誘導又は細胞死促進作用について、ＣＤ８陽性Ｔ細胞及びＢ２２０陽性Ｂ細胞を使用して試験した。
２５ＯＨＣによる細胞培養中のＴ細胞の生存率の低下がＴ細胞又はＢ細胞に対する活性化刺激の有無に影響を受けるかどうか、試験を行った。
実施例１と同様、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスを使用した。野生型マウスからＣＤ８陽性Ｔ細胞及びＢ２２０陽性Ｂ細胞を単離し、細胞培養に供した（ただし、本実施例において単離された細胞は８ｘ１０４Ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で播種された。）。
ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、実施例１でＣＤ４陽性Ｔ細胞を扱った場合と同様の手法で、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、及び抗ＣＤ２８抗体によりコーティングした培養プレートを用いる場合を「刺激あり」とし、一方、前記両抗体でのコーティングのない培養プレートを用いる場合を「刺激なし」とした。両条件とも培養液中に２５ＯＨＣを含む（終濃度３００ｎＭ）条件及び含まない条件を用意し、３日間の培養を行った。培養１日目、２日目及び３日目のそれぞれで一部の培養液をサンプリングし、実施例１と同様の方法で生細胞を測定し、Ｔ細胞の生存率を算出した。
「刺激あり」で２５ＯＨＣ無添加の場合、Ｔ細胞の生存率は、培養３日目で５７．４％だった。
「刺激あり」で２５ＯＨＣ添加の場合、Ｔ細胞の生存率は、培養３日目で７．９％だった。
「刺激なし」で２５ＯＨＣ無添加の場合、Ｔ細胞の生存率は、培養３日目で１３．４％だった。
「刺激なし」で２５ＯＨＣ添加の場合、Ｔ細胞の生存率は、培養３日目１４．３％だった。
上記の結果について、培養３日目の生存率を棒グラフで示した（図３）。図３の左図は「刺激あり」、右図は「刺激なし」における結果をそれぞれ示す。
「刺激あり」の場合のＴ細胞の生存率は２５ＯＨＣの添加によって顕著に低下していることが認められる。一方、「刺激なし」の場合は２５ＯＨＣの有無でＴ細胞の生存率に明確な相違が認められなかった。この結果から、２５ＯＨＣによるＴ細胞に対する細胞死誘導又は細胞死促進機能はＴ細胞受容体刺激依存的であって、Ｔ細胞のうち活性化された細胞に対してのみ発揮される機能であることが示された。
Ｂ２２０陽性Ｂ細胞は、１μｇ／ｍＬのＬＰＳ刺激で活性化させた場合を「刺激あり」とし、一方、ＬＰＳによる活性化を行わなかった場合を「刺激なし」とした。両条件とも培養液中に２５ＯＨＣを含む（終濃度３００ｎＭ）条件及び含まない条件を用意し、３日間の培養を行った。培養１日目、２日目及び３日目のそれぞれで一部の培養液をサンプリングし、実施例１と同様の方法で生細胞を測定し、Ｂ細胞の生存率を算出した。
「刺激あり」で２５ＯＨＣ無添加の場合、Ｂ細胞の生存率は、培養３日目で７６．４％だった。
「刺激あり」で２５ＯＨＣ添加の場合、Ｂ細胞の生存率は、培養３日目で３７．３％だった。
「刺激なし」で２５ＯＨＣ無添加の場合、Ｂ細胞の生存率は、培養３日目で１３．３％だった。
「刺激なし」で２５ＯＨＣ添加の場合、Ｂ細胞の生存率は、培養３日目１４．０％だった。
上記の結果について、培養３日目の生存率を棒グラフで示した（図４）。図４の左図は「刺激あり」、右図は「刺激なし」における結果をそれぞれ示す。
「刺激あり」の場合のＢ細胞の生存率は２５ＯＨＣの添加によって顕著に低下していることが認められる。一方、「刺激なし」の場合は２５ＯＨＣの有無でＢ細胞の生存率に明確な相違が認められなかった。この結果から、２５ＯＨＣによるＢ細胞に対する細胞死誘導又は細胞死促進機能はＢ細胞受容体刺激依存的であって、Ｂ細胞のうち活性化された細胞に対してのみ発揮される機能であることが示された。【００３８】
実施例４  単離されたＴ細胞の細胞培養中の細胞死に対する活性化刺激の影響（２）
２５ＯＨＣによる細胞培養中のＴ細胞の生存率の低下が２５ＯＨＣ添加量に対して濃度依存的な応答を示すか、試験を行った。また、前記試験においてＴ細胞の生存率の低下がＴ細胞に対する活性化刺激の程度に影響を受けるかどうか、併せて試験を行った。
実施例１と同様にナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。実施例１と同じく抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングした培養プレートを用意し、２５ＯＨＣを２ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ又は１０００ｎＭの終濃度で添加した培地、又無添加の培地を加え、単離したＴ細胞を実施例１と同じ条件で播種して培養した。３日間の培養後、実施例１と同様の方法で生細胞を測定し、Ｔ細胞の生存率を算出した（ｎ＝２）。
また、同様の培養系において、さらに中和抗体である抗ＩＬ−２モノクローナル抗体（クローンＳ４Ｂ６：ＢＤ社）を添加した場合のＴ細胞の生存細胞数も調べ、前記と同様の手法でＴ細胞の生細胞を測定し、Ｔ細胞の生存率（％）を算出した。
その結果、２５ＯＨＣ無添加では５６．１％の生存率だったのに対し、２ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ及び１０００ｎＭの２５ＯＨＣ添加時に、それぞれ５９．９％、５７．１％、２３．８％、１１．１％及び５．１９％の生存率を示し（図５）、１００ｎＭ以上の２５ＯＨＣ添加の場合においてＴ細胞の生存率に顕著な低下が認められた。この生存率の低下は２５ＯＨＣの濃度に依存的して著しくなった。
一方、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によりＴ細胞を刺激しても、添加された抗ＩＬ−２抗体の中和活性によりＴ細胞の活性化が不十分となった場合には、２５ＯＨＣによるＴ細胞の生存数の減少（相対的な生存率の低下）は２ｎＭから１０００ｎＭのいずれの濃度でも認められなかった（データは示さず）。
本実施例の結果からも、２５ＯＨＣによるＴ細胞に対する細胞死誘導又は細胞死促進機能はＴ細胞受容体刺激依存的であって、Ｔ細胞のうち活性化された細胞に対してのみ発揮される機能であることが示された。【００３９】
実施例５  単離されたＣＤ８陽性Ｔ細胞、及びＢ２２０陽性Ｂ細胞の細胞培養中の細胞死に対する２５ＯＨＣの影響（２）
２５ＯＨＣによる細胞死誘導又は細胞死促進作用について、ＣＤ８陽性Ｔ細胞及びＢ２２０陽性Ｂ細胞を使用して試験した。
実施例１と同様、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスを使用した。野生型マウスからＣＤ８陽性Ｔ細胞及びＢ２２０陽性Ｂ細胞を単離し、細胞培養に供した。ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、実施例１でＣＤ４陽性Ｔ細胞を扱った場合と同様の手法で、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、及び抗ＣＤ２８抗体による共刺激で活性化させた。２５ＯＨＣを１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ若しくは１０００ｎＭの終濃度で添加した培養、又は無添加の培養とした。細胞培養は３日間行い、３日後の培養細胞について実施例１と同様に生細胞の測定、及び生存率の算出を行った。その結果、２５ＯＨＣ無添加では４１％の生存率だったのに対し、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ及び１０００ｎＭの２５ＯＨＣ添加時に、それぞれ４２．７％、４６．４％、７．０６％、及び１．２９％の生存率を示した（図６  上パネル）。
活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞の場合と同様、活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞でも２５ＯＨＣによる細胞死誘導又は細胞死促進機能が認められた。実施例４と同様、２５ＯＨＣによるＴ細胞の生存細胞数の減少が濃度依存的に認められた。１ｎＭ又は１０ｎＭの２５ＯＨＣ添加時には有意な生存細胞数の減少が認められないが、１００ｎＭ又はそれ以上の添加で生存細胞数は顕著に減少し、濃度上昇に伴って生存細胞数の減少はより著しくなった。
Ｂ２２０陽性Ｂ細胞は、１μｇ／ｍＬのＬＰＳ刺激で活性化させた。２５ＯＨＣを１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ若しくは１０００ｎＭの終濃度で添加した培養、又は無添加の培養とした。細胞培養は３日間行い、３日後の培養細胞について実施例１と同様に生細胞の測定、及び生存率の算出を行った。その結果、２５ＯＨＣ無添加では６３．２％の生存率だったのに対し、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ及び１０００ｎＭの２５ＯＨＣ添加時に、それぞれ５５．３％、４４．５％、１５．３％、及び１．５４％の生存率を示した（図６  下パネル）。
活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞の場合と同様、活性化Ｂ細胞でも２５ＯＨＣによる細胞死誘導又は細胞死促進機能が認められた。また、２５ＯＨＣによるＢ細胞の生存細胞数の減少は濃度依存的に見られた。１ｎＭ又は１０ｎＭの２５ＯＨＣ添加時には有意な生存細胞数の減少が認められないが、１００ｎＭ又はそれ以上の添加で生存細胞数は顕著に減少し、濃度上昇に伴って生存細胞数の減少はより著しくなった。
上記のとおり、活性化Ｔ細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞）のみならず、活性化Ｂ細胞においても２５ＯＨＣによる細胞死誘導又は細胞死促進機能が認められたことから、活性化Ｔ細胞及び活性化Ｂ細胞の共存する環境下において、２５ＯＨＣ又は２５ＯＨＣを含む組成物を投与することにより、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞の生存率を選択的に低下させる（活性化された細胞を選択的に失わせる）ことができ、亢進した免疫機能を抑制できることが強く示唆された。
なお、単離されたＢ２２０陽性Ｂ細胞をＬＰＳによる活性化刺激無しに培養した対照実験においては、２５ＯＨＣ添加（１０００ｎＭ）条件と無添加条件との間でＢ細胞の生存細胞数に実質的な差異は認められなかった（データは示さず）。
２５ＯＨＣの生理的機能（例えば、コレステロール生合成阻害作用）は種々検討されてきているが、その大部分では１０μＭなど、μＭオーダーの終濃度で添加した場合に機能が確認されている。一方、本発明で注目するＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導又は細胞死促進作用は１００ｎＭなど、ｎＭオーダーという比較的低濃度で効果を発揮している。したがって、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導又は細胞死促進作用を利用した本発明による疾患の予防や治療は、コレステロール合成阻害など従来公知の作用を発現させるための方法とは異質な低用量の投与により実現可能となるものである。【００４０】
実施例６  アレルギー性接触皮膚炎モデル動物の表現型（１）
ハプテン（ジニトロフルオロベンゼン；ＤＮＦＢ）の反復塗布により、モデル動物において接触皮膚炎を惹起することができる。接触皮膚炎の炎症には活性化Ｔ細胞やＢ細胞が関与することが知られている。
Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス（ＷＴ）、又はＣｈ２５ｈ遺伝子ノックアウトマウス（Ｃｈ２５ｈＫＯ）に対して、それぞれＤＮＦＢ反復塗布による接触皮膚炎を惹起した（ｎ＝4）。皮膚炎（炎症）が生じた耳の厚みを継続的に測定し、その経時的な変化を図７Ａとして示した。横軸を接触皮膚炎惹起後の時間（ｈｏｕｒ）、縦軸を耳の厚み（ｍｍ）として、Ｃｈ２５ｈＫＯにおける測定結果の平均値を●印でプロットした。また、プロット間を黒線で結んで示した。他方、ＷＴにおける測定結果の平均値を○印でプロットした。また、プロット間を灰色線で結んで示した。図中、*はＣｈ２５ｈＫＯとＷＴとの間でｐ＜０．００１の有意差があることを示す。さらに、図７Ａのカーブ下の総面積（ＡＵＣ値）を算出し、Ｃｈ２５ｈＫＯ及びＷＴのそれぞれについて図７Ｂの棒グラフに示した。図中、*はＣｈ２５ｈＫＯとＷＴとの間でＡＵＣ値にｐ＝０．００２５の有意差があることを示す。
図７Ａによって、Ｃｈ２５ｈ遺伝子を欠損すると接触皮膚炎の炎症が増悪し、野生型と比して炎症のスムーズな収束が損なわれることが示された。図１Ｂに示されるように、Ｃｈ２５ｈは２５ＯＨＣ生合成経路においてコレステロールから２５ＯＨＣを生成する反応を触媒する。Ｃｈ２５ｈＫＯマウスでは２５ＯＨＣ生合成の直前のステップの酵素が失われるので、２５ＯＨＣの供給とその機能に重大な欠損が生じる蓋然性が高い。よって、接触皮膚炎における活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞の機能亢進又は異常による炎症が２５ＯＨＣの投与により治療又は改善できる。【００４１】
実施例７  アレルギー性接触皮膚炎モデル動物の表現型（２）
Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスの腹部に対して、０．５％のＤＮＦＢ溶液を２５μＬ塗布することで感作し（Ｄａｙ  −５）、感作開始５日後のマウスの片耳に０．１５％のＤＮＦＢ溶液を２０μＬ塗布（チャレンジ）することで接触皮膚炎を惹起した（Ｄａｙ  ０）。２５ＯＨＣの効果を調べる目的で、２５ＯＨＣｉ．ｐ．群のマウス（ｎ＝５）には、Ｄａｙ  −５から連日、１μｍｏｌ（０．３３ｍＭの２５ＯＨＣ溶液を３ｍＬ）の２５ＯＨＣが腹腔内へ投与された。一方、対照となるＣｏｎｔｒｏｌ群のマウス（ｎ＝３）には、溶媒であるＤＭＳＯが３ｍＬ、Ｄａｙ  −５から連日腹腔内へ投与された。
皮膚炎（炎症）が生じた耳の厚みを継続的に測定し、その経時的な変化を図８Ａとして示した。横軸を惹起後の時間（ｈｏｕｒ）、縦軸を耳の厚み（ｍｍ）として、２５ＯＨＣｉ．ｐ．群における測定結果の平均値を■でプロットし、併せて標準誤差を示した。また、プロット間を灰色線で結んで示した。他方、Ｃｏｎｔｒｏｌ群における測定結果の平均値を●でプロットし、併せて標準誤差を示した。また、プロット間を黒線で結んで示した。
なお、ここで耳の厚み（ｍｍ）とは、測定時におけるチャレンジした側の耳介とチャレンジしていない側の耳介との厚みの差分を意味する。図中、Ｐ＜０．０００１（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）は、２５ＯＨＣｉ．ｐ．群とＣｏｎｔｒｏｌ群との間でｐ＜０．００１の有意差があることを示す。さらに、図８Ａに示す結果のうち、惹起後９６時間における耳の厚みの測定結果を図８Ｂとして示した。バーの高さで（平均値）を示し、併せて標準誤差を示す。図中、ｐ＜０．００５は２５ＯＨＣｉ．ｐ．群がＣｏｎｔｒｏｌ群に対してｐ＜０．００５の有意差があることを示す。
図８Ａによって、２５ＯＨＣ投与群では対照と比較して、接触皮膚炎の有意な早期改善効果が認められた。また、投与開始後９６時間後の時点では、２５ＯＨＣ投与群の炎症（耳の厚みを指標とする）は、同時点での対照と比して約６割程度にまで改善していることが認められた（図８Ｂ）。よって、接触皮膚炎における炎症が２５ＯＨＣの投与により治療又は改善できる。【００４２】
実施例８  Ｃｈ２５ｈ遺伝子発現する細胞、及び発現誘導性物質
生体内において、樹状細胞やマクロファージがＣｈ２５ｈ遺伝子を発現し、２５ＯＨＣを生産すると報告されている。また、当該発現はＩＦＮ−α又はＩＦＮ−βによって誘導又は活性化されることが知られている。
２５ＯＨＣの効率的な生産のために、Ｃｈ２５ｈ遺伝子の発現細胞や、発現誘導物質について検討した。その結果、全く意外なことに、活性化Ｔ細胞においてＩＬ−２７投与によってＣｈ２５ｈ遺伝子発現が顕著に活性化することが見いだされた。
実施例１と同様、マウスから単離したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（２Ｃ１１）及び１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（３７．５１）で共刺激する培養系を構築した（培養プレートは９６ウェル平底）。ただし、播種する細胞密度は５ｘ１０４／ウェル、１ｘ１０５／ウェル、又は２ｘ１０５／ウェルとした。ＴＧＦ−β（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２７（２０ｎｇ／ｍＬ）添加時、又はいずれも無添加（Ｎｏ）の場合における、培養２日目のＣｈ２５ｈのｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ｑＰＣＲで測定した相対的な発現量として評価した。Ｃｈ２５ｈの増幅に用いたプライマーセット、及びコントロールに使用したβ−アクチンの増幅に用いたプライマーセットの配列は、それぞれ次のとおりである。
Ch25h
FW 5'- GCGACGCTACAAGATCCA  （配列番号１）
RV 5'- CACGAACACCAGGTGCTG  （配列番号２）
beta-actin 
FW 5'- CGATGCCCTGAGGCTCTTT  （配列番号３）
RV 5'- TGGATGCCACAGGATTCCA  （配列番号４）
単離したナイーブＣＤ４＋細胞を５ｘ１０４／ウェルで播種した場合の結果を図９に示す（ｎ＝２）。図中、相対発現量は標準誤差と共にバーの高さで示される。**は、ＴＧＦ−β添加時とＩＬ−２７添加時との間でｐ＜０．０００１の有意差があることを示す。
活性化Ｔ細胞においては、ＩＬ−２７によるＣｈ２５ｈ遺伝子発現の顕著な増強が認められたが、ＴＧＦ−βによる増強はほとんど認められなかった。ＣＤ４陽性の活性化Ｔ細胞では、ＩＦＮ−αやＩＦＮ−βではなくＩＬ−２７が２５ＯＨＣ生産の調節を担い、２５ＯＨＣの供給を通じて活性化Ｔ細胞や活性化Ｂ細胞の生存能を制御することが示された。【００４３】
実施例９  乾癬モデル動物の表現型
Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスの片耳の背側面（左耳）にイミキモド含有クリーム（ベセルナクリーム５％；持田製薬社製）２５０ｍｇ（イミキモド１２．５ｍｇ）を１日置きに３回（Ｄａｙ  ０，２，４）塗布して乾癬モデルとなる炎症を惹起した。２５ＯＨＣの効果を調べる目的で、２５ＯＨＣｉ．ｐ．群のマウス（ｎ＝３）には、Ｄａｙ  ０からＤａｙ  ５まで連日、１μｍｏｌ（０．３３ｍＭの２５ＯＨＣ溶液を３ｍＬ）の２５ＯＨＣを腹腔内へ投与した。一方、対照となるＤＭＳＯｉ．ｐ．群のマウス（ｎ＝４）には、溶媒であるＤＭＳＯが３ｍＬ、腹腔内に連日投与された。
Ｄａｙ  ０及びＤａｙ  ５において、左耳（イミキモドクリーム塗布側）及び右耳（非塗布側）の耳の厚みを測定した。そして、左右耳の厚さの差を炎症の指標とし、Ｄａｙ  ０からＤａｙ  ５までの変化量を各群で統計的に解析した。
図１０は、Ｄａｙ  ５における耳の厚みをＤａｙ  ０における耳の厚みと比較した耳の厚みの変化量（ｍｍ）の測定結果を示している。バーの高さで耳の厚みの変化量（ｍｍ）を示し、併せて標準誤差を示している。図中、ｐ＝０．０４は２５ＯＨＣｉ．ｐ．が対照（ＤＭＳＯｉ．ｐ．）に対してｐ＝０．０４の有意差があることを示す。
なお、ここで耳の厚み（ｍｍ）とは、測定時における乾癬を惹起した側の耳介と、惹起していない側の耳介との厚みの差分を意味する。
２５ＯＨＣ投与群では対照と比較して、乾癬による炎症の有意な改善効果が認められた。また、Ｄａｙ  ５の時点では、２５ＯＨＣ投与群の炎症（耳の厚みを指標とする）は、同時点での対照と比して約５割程度にまで改善していることが認められた（図１０）。よって、乾癬における炎症が２５ＯＨＣの投与により治療又は改善できる。【００４４】
実施例１０  単離されたＴ細胞の細胞培養中の細胞死に対する２５ＯＨＣの類縁体コレステロールの作用
細胞培養中の活性化Ｔ細胞の２５ＯＨＣによる濃度依存的な生存率の低下が、コレステロールや７α，２５−ジヒドロキシコレステロールとは異なるコレステロール分子種によっても引き起こされるか調べる目的で試験を行った。
実施例１と同様にナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。実施例１と同じく抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングした培養プレートを用意した。当該培養プレートに、２５ＯＨＣの類縁体コレステロールを１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、又は１０００ｎＭの終濃度で添加した培地、又無添加の培地を加え、単離したＴ細胞を実施例１と同じ条件で培養した（ただし、９６ウェル平底プレートに単離したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を８ｘ１０４Ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種した。）。２５ＯＨＣの類縁体コレステロールとして、である２０α−ヒドロキシコレステロール（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，  Ｉｎｃ．）、又は２４（Ｒ／Ｓ），２５−エポキシコレステロール（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，  Ｉｎｃ．）を使用した結果が以下に示される。３日間の培養後、実施例１と同様の方法で生細胞を測定し、Ｔ細胞の生存率を算出した（それぞれ、ｎ＝３）。
その結果、２０α−ヒドロキシコレステロール無添加では６１．３％の生存率だったのに対し、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、及び１０００ｎＭの２０α−ヒドロキシコレステロール添加時に、それぞれ６１．９％、５９．６％、５３．３％及び１．６％の生存率を示し（図１１Ａ）、１０００ｎＭの２０α−ヒドロキシコレステロール添加の場合においてＴ細胞の生存率に顕著な低下が認められた。
また、２４（Ｒ／Ｓ），２５−エポキシコレステロール無添加では６０．０％の生存率だったのに対し、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、及び１０００ｎＭの２４（Ｒ／Ｓ），２５−エポキシコレステロール添加時に、それぞれ５８．３％、５８．２％、１１．３％及び１．４％の生存率を示し（図１１Ｂ）、１００ｎＭ以上の２４（Ｒ／Ｓ），２５−エポキシコレステロール添加の場合においてＴ細胞の生存率に顕著な低下が認められた。
本実施例の結果から、少なくとも２０α−ヒドロキシコレステロール、及び２４（Ｒ／Ｓ），２５−エポキシコレステロールからなる群から選択される２５ＯＨＣ類縁体コレステロールには、２５ＯＨＣと同様に、活性化Ｔ細胞に対して濃度依存的な生存率の低下をもたらす作用があることが示された。
一方、上記と同様の手法で試験したところ、７α−ヒドロキシコレステロール、７β−ヒドロキシコレステロール、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２２（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、及び７−ケトコレステロールの各コレステロール分子種においては、２５ＯＨＣと同様の有意な活性は認められなかった。
これらの結果を総合すると、活性化Ｔ細胞に対して濃度依存的な生存率の低下をもたらす作用を有するコレステロール分子種について、構造上の共通性を見い出すことはできなかった。【００４５】
実施例１１  ２５ＯＨＣの産生をＴ細胞において誘導又は促進する化合物のスクリーニング方法
動物の体液から単離したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を使用する。動物は任意の動物種が利用できるが、入手の容易性や取り扱い技術の蓄積を考慮するとマウスやラットなどの齧歯目動物、特にマウスが好ましい。体液はＴ細胞を含むものであれば任意のものが利用できるが、血液が好ましく、脾臓、リンパ節、又は血管から採取した末梢血がより好ましい。
採取したＴ細胞を含む体液から公知の方法でナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離する。例えば、フローサイトメーターを用いて実施例１のようにＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４４ｌｏｗのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離することができる。単離したＣＤ４陽性のＴ細胞は、実施例６と同様、抗ＣＤ３モノクローナル抗体及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体でコーティングした培養プレートに播種し、細胞培養を通じて活性化させる。プレートは任意の種類が利用できる。以下は代表的な例として、９６穴平底プレートを使用するものとして実施態様を記載する。播種する細胞密度は任意であるが、好ましくは５ｘ１０３／ウェル〜５ｘ１０５／ウェル、より好ましく１ｘ１０４／ウェル〜１ｘ１０５／ウェル、さらに好ましくは２ｘ１０４／ウェル〜５ｘ１０４／ウェル、最も好ましくは５ｘ１０４／ウェルである。培養において試料は複数の群に分け、一つはポジティブコントロール用にＩＬ−２７を添加する。添加量は５ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬである。残りの群には培養液に被検化合物を添加する。被検化合物、及びＩＬ−２７は培養開始から一定時間後に添加しても良いが、好ましくは培養開始時から添加する。培養期間は任意であるが、短すぎると２５ＯＨＣ産生誘導が十分に起こらず、誘導活性を検出しにくくなる恐れがあり、一方長すぎると細胞の生存能が低下して２５ＯＨＣの産生能が低下する恐れがあるので、０．５日〜５日、好ましくは１日〜３日とする。所定の期間の培養後、サンプリングを行う。サンプリングした試料における２５ＯＨＣ産生能は２５ＯＨＣ自体の濃度の測定、２５ＯＨＣ合成酵素であるＣｈ２５ｈの蛋白質蓄積量の測定、又はＣｈ２５ｈのｍＲＮＡ蓄積量の測定を通じて評価を行う。ガスクロマトグラフ法、ウエスタンブロット法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法など、いずれの測定も当該技術分野で周知の技術が適用でき、当業者は適宜実施をすることができる。例えば、Ｃｈ２５ｈ遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ蓄積量）は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により測定できる。
また、Ｃｈ２５ｈ遺伝子プロモーターにレポーター遺伝子を機能的に連結させたキメラ遺伝子を有する形質転換細胞（又は当該形質転換細胞を含む形質転換動物や組織）を利用することによって、Ｃｈ２５ｈの蛋白質蓄積量の測定、又はＣｈ２５ｈのｍＲＮＡ蓄積量の測定を、レポーター遺伝子産物の蓄積量の測定やレポーター遺伝子のｍＲＮＡ蓄積量の測定に代替することができる。
そして、被検化合物の示す２５ＯＨＣの誘導能又は促進能（ここで、当該誘導能又は促進能は、前記レポーター遺伝子の発現量の定量的な測定を通じて評価されたものでも良い）を、無添加時と比較することによって所望の化合物の候補が選抜される。選抜の閾値は適宜設定することができるが、例えば無添加時と比較して１０倍以上、１５倍以上、又は２０倍以上となる能力を示したものを候補化合物として選抜する。あるいは、被検化合物の示す誘導能又は促進能をＩＬ−２７添加時の誘導能又は促進能と比較することにより所望の化合物の候補が選抜される。選抜の閾値は適宜決定することができるが、例えばＩＬ−２７を添加したポジティブコントロールの誘導能／促進能を１とした場合に、１．０以上、１．５以上、又は２．０以上のものを候補化合物として選抜する。前記２通りの選抜を組み合わせて行っても良い。
選抜において閾値を変化させ、より高次の選抜段階でより厳しい閾値の設定を行うことにより、その選抜を多段階で行うこともできる。
当該選抜を行うことで、より２５ＯＨＣの生産誘導又は促進のためにより効果的な化合物を入手ことができる。
なお、本実施例はＩＬ−２７をポジティブコントロール用に使用しているが、ＩＬ−２７に代えてＩＬ−２７アゴニストを使用して同様のスクリーニング方法を構築することもできる。このような物質の探索もまた本願の目的とするところであり、当該実施例の手法に沿ってその探索は実施可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のＴ細胞及び／又はＢ細胞のうち活性化された細胞に選択的な細胞死誘導剤又は細胞死促進剤は、活性化Ｔ細胞及び／又は活性化Ｂ細胞による免疫機能の亢進又は異常を示す疾患の予防又は治療に有用であり、また、移植片に対する拒絶反応の予防又は治療に有用であることから、産業上利用可能性を有している。また、本発明のスクリーニング方法は、上記細胞死誘導剤又は細胞死促進剤の有効成分である２５ＯＨＣの産生をＴ細胞において誘導又は促進する化合物を探索するものであるから、産業上利用可能性を有している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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