(57)【要約】  核酸を検出する方法であって、以下の工程：工程ａ）、カルボン酸および／またはその塩を含む溶液、酸化セリウムの担体および核酸を含む試料を混合し、酸化セリウムの担体に当該核酸を吸着させる工程、工程ｂ）、工程ａ）において混合した混合物から、前記核酸が吸着した酸化セリウムの担体を分離する工程、工程ｃ）、工程ｂ）において分離した核酸が吸着した酸化セリウムの担体に溶出液を加えて核酸を回収する工程、工程ｄ）、工程ｃ）において回収した核酸をハイブリダイゼーション反応または核酸の増幅反応によって検出する工程、を含む核酸の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を検出する方法であって、以下の工程：
工程ａ）、カルボン酸および／またはその塩を含む溶液、酸化セリウムの担体および核酸を含む試料を混合し、酸化セリウムの担体に当該核酸を吸着させる工程、
工程ｂ）、工程ａ）において混合した混合物から、前記核酸が吸着した酸化セリウムの担体を分離する工程、
工程ｃ）、工程ｂ）において分離した核酸が吸着した酸化セリウムの担体に溶出液を加えて核酸を回収する工程、
工程ｄ）、工程ｃ）において回収した核酸をハイブリダイゼーション反応または核酸の増幅反応によって検出する工程、
を含む核酸の検出方法。
【請求項２】
高次構造を有する核酸を検出する方法であって、以下の工程：
工程ａ）、カルボン酸および／またはその塩を含む溶液、酸化セリウムの担体および高次構造を有する核酸を含む試料を混合し、酸化セリウムの担体に前記核酸を吸着させる工程、
工程ｂ）、工程ａ）において混合した混合物から、前記核酸が吸着した酸化セリウムの担体を分離する工程、
工程ｃ）、工程ｂ）において分離した前記核酸が吸着した酸化セリウムの担体に溶出液を加えて核酸を回収する工程、
工程ｄ）、工程ｃ）において回収した核酸をハイブリダイゼーション反応または核酸の増幅反応によって検出する工程、
を含む核酸の検出方法。
【請求項３】
前記高次構造を有する核酸が、ＡとＴ（Ｕ）とが対をなし、ＧとＣとが対をなす塩基対形成以外の塩基対形成を基本構造とする高次構造、ＡとＴ（Ｕ）、ＧとＣとの塩基対非形成を基本構造とする高次構造、ＡとＴ（Ｕ）、ＧとＣとの塩基対形成を基本構造とする２重らせん構造にひずみが生じた結果形成される高次構造のうちいずれかの構造を有することを特徴とする請求項２に記載の核酸の検出方法。
【請求項４】
前記高次構造を有する核酸が、ミスマッチ構造、バルジ構造、ループ構造、ヘアピン構造、ダングリングエンド構造、シュードノット構造、ブランチ構造、四重らせん構造、八重らせん構造、三重らせん構造、環状構造のうちいずれかの構造を有することを特徴とする請求項２または３に記載の核酸の検出方法。
【請求項５】
前記カルボン酸が、酢酸、シュウ酸、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、請求項１から４のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【請求項６】
前記溶出液が緩衝液であることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を用いた実験技術の発展により、新規遺伝子探索や解析が行われるようになり、塩基配列情報と機能の関係が明らかになってきている。その結果、がんなどの疾患の特定や、外来の病原体の感染の特定など、医療現場においても核酸検出によるスクリーニング検査や臨床検査などが行われている。近年、様々な核酸の検出方法が検討され、核酸の検出感度は向上しているが、より高度な遺伝子の解析のために、更なる核酸の検出感度の向上が求められている。【０００３】
核酸の検出方法には、マイクロアレイやＰＣＲなどを用いて目的とする配列を検出する方法が挙げられる。このような核酸の検出方法は、プローブやプライマーを最適化させたり、反応条件を最適化させたりすることによって検出感度が向上することが知られているが、同時に検出対象となる核酸の純度や量によっても感度が変化することが知られている。つまり、核酸の回収から検出に至るまでの多くの工程が遺伝子の解析結果に影響することになる。【０００４】
ここで、代表的な核酸の回収方法としては、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿及びシリカへの核酸吸着などが挙げられる。中でも最も汎用的な方法は、特許文献１に記載されている、シリカを含む金属酸化物へ核酸を吸着、溶出させて回収するＢｏｏｍ法である。この方法は、遠心操作により核酸の吸着したシリカから核酸を回収すると同時に核酸の濃縮ができる特徴がある。しかしながら、このような方法は煩雑な操作や有機溶媒を使用する必要がある。核酸検出は医療現場においても利用されていることから、煩雑な操作や有機溶媒を使用せずに核酸を回収でき、核酸を効率よく検出する方法が好ましい。【０００５】
有機溶媒を使用せずに核酸回収から検出まで行える方法として、特許文献２には、酸化鉄などの磁性を有する無機成分を担体として用い、核酸を吸着させて回収する方法が記載されている。この方法では、核酸の回収液に無機成分が溶出してしまい、回収した核酸の純度が低下する課題があったため、無機成分の担体にポリマー、シリカ、チタニアやセリアなどの金属酸化物でコーティングする方法があわせて記載されている。この方法によって得られた核酸はそのままＰＣＲなどの酵素反応に直接用いることができると記載されている。【０００６】
また、有機溶媒を使用しない別の方法としてシリカゲルのイオン交換カラムを用いた方法がある。特許文献３では、イオン交換カラムに用いるシリカゲルの担体に、チタニア、セリア、ジルコニア、ハフニアなどの比重の大きい粒子を含有させて、カラムの密度を高め、核酸の回収量を向上させる方法が記載されている。しかしながら、特許文献３には、どの程度の感度で核酸を検出できるのか記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５２３４８０９号明細書
【特許文献２】特開２００７−６７２８号公報
【特許文献３】特表２００２−５１０７８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のように、核酸の回収方法とその後の検出方法が検討されている。しかし、特許文献２には実際にどのような様態の核酸を回収できるかは開示されていない。また、どの程度の感度で核酸が検出できるのかも記載されていない。そこで、後述する比較例１で特許文献２に記載される条件をできる限り再現し、ＰＣＲ法によって核酸の検出感度を評価した。しかしながら、特許文献２の方法では、ＰＣＲで核酸がほとんど検出できなかった。【０００９】
本発明者らは、特許文献２に記載の酸化セリウムの担体を利用して、核酸の検出感度を向上させることを目的として、鋭意検討し、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、核酸の検出感度を向上させるために、酸化セリウムを担体として用いる核酸の回収方法に着目した。酸化セリウムを担体とし、カルボン酸を含む条件で核酸を回収することによって、回収した核酸、特に高次構造を有する核酸の検出感度を向上させることができる。【００１１】
本発明は以下の通りである。
（１）核酸を検出する方法であって、以下の工程：
工程ａ）、カルボン酸および／またはその塩を含む溶液、酸化セリウムの担体および核酸を含む試料を混合し、酸化セリウムの担体に当該核酸を吸着させる工程、
工程ｂ）、工程ａ）において混合した混合物から、前記核酸が吸着した酸化セリウムの担体を分離する工程、
工程ｃ）、工程ｂ）において分離した核酸が吸着した酸化セリウムの担体に溶出液を加えて核酸を回収する工程、
工程ｄ）、工程ｃ）において回収した核酸をハイブリダイゼーション反応または核酸の増幅反応によって、検出する工程、
を含む核酸の検出方法。
（２)高次構造を有する核酸を検出する方法であって、以下の工程：
工程ａ）、カルボン酸および／またはその塩を含む溶液、酸化セリウムの担体および高次構造を有する核酸を含む試料を混合し、酸化セリウムの担体に当該核酸を吸着させる工程、
工程ｂ）、工程ａ）において混合した混合物から、前記核酸が吸着した酸化セリウムの担体を分離する工程、
工程ｃ）、工程ｂ）において分離した核酸が吸着した酸化セリウムの担体に溶出液を加えて核酸を回収する工程、
工程ｄ）、工程ｃ）において回収した核酸をハイブリダイゼーション反応または核酸の増幅反応によって、検出する工程、
を含む核酸の検出方法。
（３）前記高次構造を有する核酸が、ＡとＴ（Ｕ）とが対をなし、ＧとＣとが対をなす塩基対形成以外の塩基対形成を基本構造とする高次構造、ＡとＴ（Ｕ）、ＧとＣとの塩基対非形成を基本構造とする高次構造、ＡとＴ（Ｕ）、ＧとＣとの塩基対形成を基本構造とする２重らせん構造にひずみが生じた結果形成される高次構造のうちいずれかの構造を有することを特徴とする（２）に記載の核酸の検出方法。
（４）前記高次構造を有する核酸が、ミスマッチ構造、バルジ構造、ループ構造、ヘアピン構造、ダングリングエンド構造、シュードノット構造、ブランチ構造、四重らせん構造、八重らせん構造、三重らせん構造、環状構造のうちいずれかの構造を有することを特徴とする（２）または（３）に記載の核酸の検出方法。
（５）前記カルボン酸が、酢酸、シュウ酸、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である（１）から（４）のいずれかに記載の核酸の検出方法。
（６）前記溶出液が緩衝液であることを特徴とする（１）から（５）のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、生体試料などの試料に含まれる核酸、特に高次構造を有する核酸をハイブリダイゼーション反応または核酸の増幅反応によって検出する工程を含む核酸の検出方法において、その検出感度を向上させることが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明では、数十塩基程度のフラグメントから数万ｂｐ程度の長さの核酸、特に高次構造を有する核酸を回収し、高感度に検出することができる。
【００１４】
核酸は、溶媒に溶解させて、核酸の溶液として用いてもよい。核酸を溶解させる溶媒や、希釈する溶液は特に限定されないが、水やＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などの核酸を含む溶液に汎用される溶液を使用することが好ましい。
【００１５】
本発明で用いる核酸には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ（キメラ）及び人工核酸などが挙げられる。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ、マイクロＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡなどの核酸を用いることができる。また、ＲＮＡには、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡもしくはｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ、それらの前駆体又は合成ＲＮＡなどが挙げられる。合成ＤＮＡ及び合成ＲＮＡは、所定の塩基配列（天然型配列又は非天然型配列のいずれでもよい）に基づいて、例えば自動核酸合成機を用いて人工的に作製できる。
【００１６】
本発明では、核酸を含む任意の試料から核酸を回収し、検出することができる。核酸を含む任意の試料は、人工的に合成された核酸を含む試料を用いてもよいし、河川、海、土壌などに由来する核酸や環境ＤＮＡを含む試料を用いてもよいし、生体試料を用いてもよい。生体試料には、例えば、培養細胞、培養細胞の培養液、組織試料や標本などの細胞由来試料、細菌やウイルスなどの微生物由来試料、体液や便などのヒトを含む動物由来試料、核酸の他に、タンパク質、糖や脂質などの生物学的機能を有する化合物を含む溶液などを利用することができる。これらの生体試料が体液等の液体試料である場合には、採取後そのまま本発明を適用してもよいし、採取後に溶液を加えて希釈してもよい。生体試料が細胞ペレットや組織片等の固体試料である場合には、採取後に水や緩衝液で希釈してから本発明に用いてもよい。
【００１７】
また、生体試料を用いる場合には、以下のような処理をしてもよい。これは、核酸が細胞膜、細胞壁、小胞、リポソーム、ミセル、リボソーム、ヒストン、核膜、ミトコンドリア、ウイルスのキャプシド、エンベロープ、エンドソームまたはエキソソームのような化合物に内包されていたり、これらが相互作用していたりすることが多いためである。より収率よく核酸を回収するために、これらから核酸を遊離させることを目的とした処理を行ってもよい。
【００１８】
例えば、大腸菌が含まれている生体試料から核酸の回収効率を高めるために以下のような処理を行うことができる。大腸菌が含まれる生体試料に対して０．２Ｍの水酸化ナトリウムと１％のＳＤＳの混合液を加えることができ（アルカリ変性法）、また、１０％のサルコシル溶液を加えることもできる（サルコシルによる非変性法）。また、これらの溶液にリゾチームを添加しておいてもよい。また、プロテイナーゼＫにより３７℃で１時間処理を行うこともできる。他の方法として超音波処理を行うこともできる。
【００１９】
生体試料に対して、酵母が含まれている生体試料から核酸の回収効率を高めるために以下のような処理を行うことができる。例えば、生化学工業株式会社から市販されているザイモリエースで処理した後に１０％のＳＤＳを加えることもできる。
【００２０】
生体試料に対して、細胞が含まれている生体試料から核酸の回収効率を高めるために以下のような処理を行うことができる。例えば、１％のＳＤＳを加えることができる。他の方法として、４Ｍ以上の塩化グアニジニウム、グアニジンチオシアン酸塩、及び尿素などを加えることができる。この溶液に対して、サルコシルを０．５％以上になるよう加えてもよい。また、メルカプトエタノールを５０ｍＭ以上の濃度になるよう加えてもよい。
【００２１】
上記の操作において、生体試料に含まれる核酸の分解を抑制するために、核酸の分解酵素の阻害剤を添加してもよい。ＤＮＡ分解酵素の阻害剤として、ＥＤＴＡを１ｍＭ以下の濃度で添加することができる。また、ＲＮＡ分解酵素の阻害剤として市販されているＲＮａｓｉｎ  Ｐｌｕｓ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（プロメガ株式会社）、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ株式会社）、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡株式会社）などを使用することができる。
【００２２】
また、生体試料にＤＮＡとＲＮＡが混在しており、両者を分離したい場合には、フェノール・クロロホルム抽出によって分離することもできる。例えば、フェノール・クロロホルム抽出を酸性条件で行えばＲＮＡは水相、ＤＮＡはクロロホルム相に分離され、中性条件で行えばＲＮＡとＤＮＡは水相に分配される。この性質を利用して、取得したい核酸の種類に応じて条件を選択できる。上記のクロロホルムはｐ−ブロモアニソールに置換することもできる。
【００２３】
フェノール・クロロホルム抽出は、市販試薬であるＩＳＯＧＥＮ（登録商標：株式会社ニッポンジーン）、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標：ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＲＮＡｉｓｏ（タカラバイオ株式会社）、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標：東レ株式会社）  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｋｉｔ（東レ株式会社）を利用することもできる。以上の処理は、その一工程のみを行ってもよく、他の操作における工程と組み合わせることもできる。また、それに用いる溶液の濃度は、必要に応じて変えることもできる。
【００２４】
本発明では、核酸、特に高次構造を有する核酸を高い感度で検出することができる。
【００２５】
核酸の高次構造は、一般に、核酸の塩基配列に起因して形成される高次構造と、核酸とタンパク質との複合体が形成する高次構造に分類される。本発明では、どちらの高次構造を有する核酸も好ましく用いることができるが、核酸の塩基配列に起因して形成される高次構造を有する核酸をより好ましく用いることができる。
【００２６】
核酸の塩基配列に起因して形成される高次構造は、塩基対の形成において、ＡとＴ（Ｕ）とが対をなし、ＧとＣとが対をなす塩基対形成以外の塩基対形成を基本構造とする構造、ＡとＴ（Ｕ）、ＧとＣとの塩基対非形成を基本構造とする構造、ＡとＴ（Ｕ）、ＧとＣとの塩基対形成による２重らせん構造にひずみが生じた結果形成される構造に分類されるが、本発明では、いずれの構造を有する核酸であっても、好ましく用いることができる。
【００２７】
ＡとＴ（Ｕ）とが対をなし、ＧとＣとが対をなす塩基対形成以外の塩基対形成を基本構造とする高次構造としては、一塩基多型（ＳＮＰ）を含むミスマッチ構造（ターミナルミスマッチ構造、Ｇ・Ｔミスマッチ構造、Ｇ・Ａミスマッチ構造、Ｇ・Ｇミスマッチ構造、タンデムミスマッチ構造）が挙げられる。例えば、ミスマッチ構造は、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの前駆体、ゲノムＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、セルフリーＤＮＡに含まれている。
【００２８】
ＡとＴ（Ｕ）、ＧとＣとの塩基対非形成を基本構造とする高次構造には、バルジ構造、ヘアピン構造、ループ構造、ダングリングエンド構造、シュードノット構造、ブランチ構造、四重らせん構造（グアニン四重鎖、ｉモチーフ）などが挙げられる。
【００２９】
バルジ構造は、塩基対を形成している配列鎖中に結合しうる塩基がなく、塩基対を形成していない構造である。例えば、バルジ構造は、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの前駆体、ゲノムＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、セルフリーＤＮＡなどに含まれている。
【００３０】
ヘアピン構造は、一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡなどから成る塩基配列が一点を軸として対称に相補的な配列になるように並んでおり、これらのＲＮＡ、ＤＮＡが相補的な塩基同士結合した構造である。例えば、ヘアピン構造は、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの前駆体、ゲノムＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、セルフリーＤＮＡなどに含まれている。
【００３１】
ループ構造は、前記ヘアピン構造のうち、ＲＮＡ、ＤＮＡの一部の塩基配列が相補的になっておらず、その部分が塩基対を形成せずたるんだ構造である。例えば、ループ構造は、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの前駆体、ゲノムＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、セルフリーＤＮＡなどに含まれている。ダングリングエンド構造は、塩基対を形成した状態で３’末端もしくは５’末端のどちらか一方の末端が突出している構造である。例えば、ダングリングエンド構造は、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの前駆体、ゲノムＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、セルフリーＤＮＡなどに含まれている。
【００３２】
シュードノット構造は、上記ループ構造が塩基対形成部分を介して二つ以上の連続したループ構造である。例えば、シュードノット構造は、ウイルスのゲノムＤＮＡ、ウイルスのゲノムＲＮＡ、リボザイムなどに含まれている。
【００３３】
ブランチ構造は、一または複数の核酸鎖が部分的に上述の高次構造を形成した分岐鎖部分に生じる構造である。例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡなどに含まれている。
【００３４】
四重らせん構造（グアニン四重鎖、ｉモチーフ）および八重らせん構造は、一つの核酸配列鎖の中にＧまたはＣのどちらか一つの塩基が部分的に偏った配列を一つまたは複数箇所にもつ、１または複数の鎖から形成される構造である。例えば、四重らせん構造（グアニン四重鎖、ｉモチーフ）は、ゲノムＤＮＡに含まれており、特にポリグルタミン病やリピート病などを引き起こす原因遺伝子やテロメア領域に含まれている。
【００３５】
ＡとＴ（Ｕ）、ＧとＣとの塩基対形成を基本構造とする２重らせん構造にひずみが生じた結果形成される高次構造には、三重らせん構造、環状構造（クローズドサーキュラー、オープンサーキュラー、スーパーコイル）などが挙げられる。例えば、環状構造は、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミド、大腸菌または酵母などの微生物が有する環状ゲノム、ＨＰＶなどのウイルスゲノムなどに含まれている。
【００３６】
核酸とタンパク質との複合体が形成する高次構造は、例えば、修飾因子（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドカイネース、ヒストンなど）、転写因子（ＲＮＡポリメラーゼに分類させるものなど）、複製因子（ＤＮＡポリメラーゼに分類されるものなど）、逆転写因子（リバーストランスクリプターゼ、）、転移因子（トランスポダーゼ）、翻訳因子（リボソームの構成ユニットなど）、切断酵素（制限酵素など）、シグナル伝達因子、免疫応答に関わる因子などの高次構造が挙げられる。本発明では、これらタンパク質を含む核酸の高次構造も、高次構造を有する核酸として好ましく用いることができる。
【００３７】
上記の高次構造を有する核酸は、天然に存在する核酸でもよいし、人工的に合成された核酸や、遺伝子工学的に合成された核酸でもよい。また、メチル化や、リン酸化された核酸でもよい。
【００３８】
本発明で用いるカルボン酸は、少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸を指す。一つのカルボキシル基を有するカルボン酸として、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、ソルビン酸、安息香酸、サリチル酸、没食子酸、桂皮酸、乳酸などが挙げられる。二つのカルボキシル基を有するカルボン酸としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、フマル酸、マレイン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、リンゴ酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、タルトロン酸、酒石酸、シトラコン酸、メサコン酸、イタコン酸、シクロプロパンジカルボン酸、シクロブタンジカルボン酸、シクロペンタンジカルボン酸、シクロヘキサンジカルボン酸、イミノ二酢酸、αケトグルタル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸などが挙げられる。三つのカルボキシル基を有するカルボン酸としては、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸、プロパン−１，２，３−トリカルボン酸、ブタン−１，２，３，４−テトラカルボン酸、トリエチル−１，１，２−エタントリカルボン酸、シクロブタントリカルボン酸、シクロヘキサントリカルボン酸、ヘミメリト酸、トリメリト酸、トリメシン酸、ニトリロ三酢酸などが挙げられる。四つのカルボキシル基を有するカルボン酸としては、シクロヘキサンテトラカルボン酸、メロファン酸、プレニト酸、ピロメリト酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、（１８−クラウン−６）−２，３，１１，１２−テトラカルボン酸、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸が挙げられる。５つ以上のカルボキシル基を有するカルボン酸としては、ベンゼンペンタカルボン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−五酢酸、シクロヘキサンヘキサカルボン酸、メリト酸、ジエリスリトールのヘキサカルボン酸、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’，Ｎ”’−六酢酸、シクロオクタンジカルボン酸、トリエリスリトールの八酢酸などが挙げられる。これら中で特に好ましいカルボン酸は、酢酸、シュウ酸、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【００３９】
本発明で用いるカルボン酸として、上記で挙げたカルボン酸の塩を用いてもよい。カルボン酸の塩は、Ｌｉ塩、Ｎａ塩、Ｋ塩、Ｒｂ塩、Ｃｓ塩等を用いることができる。具体的には、酢酸の塩として、Ｌi塩、Ｎａ塩、Ｋ塩、Ｒｂ塩、Ｃｓ塩などが挙げられる。シュウ酸の塩としてＬｉ塩、２Ｌｉ塩、Ｎａ塩、２Ｎａ塩、Ｋ塩、２Ｋ塩、Ｒｂ塩、２Ｒｂ塩、Ｃｓ塩、２Ｃｓ塩などが挙げられる。クエン酸の塩として、Ｌｉ塩、２Ｌｉ塩、３Ｌｉ塩、Ｎａ塩、２Ｎａ塩、３Ｎａ塩、Ｋ塩、２Ｋ塩、３Ｋ塩、Ｒｂ塩、２Ｒｂ塩、３Ｒｂ塩、Ｃｓ塩、２Ｃｓ塩、３Ｃｓ塩などが挙げられる。ＥＤＴＡの塩として、Ｌｉ塩、２Ｌｉ塩、３Ｌｉ塩、４Ｌｉ塩、Ｎａ塩、２Ｎａ塩、３Ｎａ塩、４Ｎａ塩、Ｋ塩、２Ｋ塩、３Ｋ塩、４Ｋ塩、Ｒｂ塩、２Ｒｂ塩、３Ｒｂ塩、４Ｒｂ塩、Ｃｓ塩、２Ｃｓ塩、３Ｃｓ塩、４Ｃｓ塩ななどが挙げられる。また、アンモニウム塩、エチルアミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、エタノールアミン塩などのアミンを持つ有機塩なども挙げられる。これらの塩の中でも酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、シュウ酸二ナトリウム、シュウ酸二カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸二カリウム、クエン酸三カリウム、ＥＤＴＡ二ナトリウム、ＥＤＴＡ三ナトリウム、ＥＤＴＡ四ナトリウム、ＥＤＴＡ二カリウム、ＥＤＴＡ三カリウム、ＥＤＴＡ四カリウムが好ましい。
【００４０】
また、カルボン酸とカルボン酸の塩を混合して用いてもよいし、異なる種類のカルボン酸やカルボン酸の塩を混合して用いてもよい。
【００４１】
本発明におけるハイブリダイゼーション反応は、検出対象となる核酸とプローブとがお互いに水素結合を介して対を成す反応を指す。ハイブリダイゼーション反応は、互いに相補的な塩基配列または当該相補的な塩基配列に対して相同性の高い配列を有する核酸の分子間または分子内で起こり得る。
【００４２】
ハイブリダイゼーション反応で用いるプローブとは、検出対象となるＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列に対して、相補的な塩基配列または当該相補的な配列に対して相同性の高い塩基配列を有する核酸分子を指す。検出対象となる核酸の塩基配列は、センス鎖、アンチセンス鎖または両者でもよい。ハイブリダイゼーション反応を行うにあたって、プローブは１つだけ使用してもよく、複数個使用してもよい。プローブの長さは、特異的に検出するために、１６塩基以上の長さを有するものが好ましい。核酸分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ、モルフォリノ核酸、光応答性核酸、ヌクレオチドなどを利用できる。また、これらの核酸分子のうち、1種類だけを用いてもよいし、複数種類用いてもよい。またプローブの末端の核酸分子を蛍光色素や化学官能基で修飾してもよく、核酸分子の塩基を欠損させてもよい。
【００４３】
本発明で用いるハイブリダイゼーション反応は、例えば、核酸を含む溶液と、プローブを含む溶液を混合してハイブリダイゼーション反応を行うことにより核酸を検出する方法や、核酸またはプローブのどちらか一方を基板となる固体やゲルなどに固定して行うハイブリダイゼーション反応を行うことにより核酸を検出する方法が挙げられる。このような方法の具体例として、マイクロアレイ法、ノーザンブロティング法、サザンブロッティング法、サンドイッチハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＦＩＳＨ法などが挙げられる。
【００４４】
本発明で用いる核酸の増幅反応は、ポリメラーゼを用い、核酸を鋳型として、特定の配列を選択的に増幅する反応である。具体的にはＰＣＲ法や、ＬＣＲ法、ＬＡＭＰ法などが挙げられる。ＰＣＲ法には、さらに、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ―ＰＣＲ、競合的ＰＣＲ、アンカードＰＣＲ、ＴａｑＭａｎＰＣＲ、ランダムＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、シャトルＰＣＲ、ＰＣＲ／ＧＣ-ｃｌａｍｐ法、ストレッチＰＣＲ、Ａｌｕ  ＰＣＲ、メガプライマーＰＣＲ、Ｉｍｍｕｎｏ―ＰＣＲ、ＡＰ−ＰＣＲ、ＳＨＡＲＰ法、コンセンサスＰＣＲ、ＲＮＡ―ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ、ＬＡ―ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ、インバースＰＣＲ、リコンビネーションＰＣＲ、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ＰＣＲ、サイクリングプローブＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＳＤＡ法、コロニーＰＣＲ、ＤＮＡシーケンシング、ｉｎ  Ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、単一細胞ＰＣＲ、環境ＤＮＡのＰＣＲ、環境ＤＮＡのシーケンシング、ＤＮＡバーコーディング、ＤＮＡシャフリングなどの種類があるが、いずれのＰＣＲ法も好ましく用いることができる。
【００４５】
核酸を検出する工程における核酸の検出感度は、ハイブリダイゼーション反応の効率またはＰＣＲ効率を求めることにより、判断することができる。
【００４６】
ハイブリダイゼーション反応の効率は、電気泳動やＴｍ測定などによって判断できる。検出配列とプローブそれぞれの塩基長が十分に短いときには電気泳動、十分に長い場合にはＴｍ測定によって判断することが好ましい。
【００４７】
ハイブリダイゼーション反応の効率は、下記のとおり電気泳動によって求めることができる。まずは、検出配列を有する核酸溶液を同一濃度で３つ準備する。１つ目はそのまま電気泳動に用い、２つ目は検出に用いるプローブを１等量以上加え、１時間程度以上静置してから電気泳動に用いる。３つ目は、本発明の方法を用い、工程（ｃ）で回収された核酸に２つ目のサンプルと同等量のプローブを加え、２つ目のサンプルと同じ時間静置してから電気泳動に用いる。電気泳動により、１つ目のサンプルで検出されるバンドに加え、２つ目と３つ目のサンプルでは検出配列へプローブがハイブリダイゼーションしたことで新たなバンドが確認される。画像解析等のソフトウェアでバンドが見られないゲルの一部をバックグランドとし、バンドの強度からこの値と差を取ってバンドのシグナル強度とする。バンドのシグナル強度比を、２つ目のサンプルに対する３つ目のサンプルの比として算出し、１より大きい値であれば、ハイブリダイゼーション反応の効率が向上したと判断できる。
【００４８】
ハイブリダイゼーション反応の効率は、下記のとおりＴｍ測定によって求めることができる。Ｔｍ測定は、二重鎖の核酸の温度を上昇させて一本鎖に解離する過程にともなう２６０ｎｍにおける吸光度変化を測定する。横軸に温度、縦軸に吸光度をプロットした融解曲線を測定する。融解曲線において変曲点が観測され、これが５０％の二重鎖の核酸が融解する温度（Ｔｍ）となる。本測定をする上で、理論値または実測値のプローブのＴｍを予め測定しておく必要がある。
【００４９】
Ｔｍ測定の方法は、まず検出配列を有する核酸溶液を同一濃度で４つ準備する。１つ目はそのままＴｍ測定に用い、２つ目は検出に用いるプローブを１等量以上加え、１時間程度以上静置してからＴｍ測定に用いる。３つ目は、本発明の方法を用い、工程（ｃ）で回収された核酸をＴｍ測定に用いる。４つ目は、本発明における酸化セリウムの担体への吸着・溶出処理を行い、溶出液に２つ目のサンプルと同等量のプローブを加え、２つ目のサンプルと同じ時間静置してからＴｍ測定に用いる。続いて、ハイブリダイゼーション反応の効率を求めるにあたっては、融解曲線を使用する。プローブのＴｍでの吸光度を融解曲線から全てのサンプルに関して求める。２つ目のサンプルから１つ目のサンプルの差を、４つ目のサンプルから３つ目のサンプルの差をそれぞれ取り、前者を１として後者の比を算出し、ハイブリダイゼーション反応の効率が得られる。１より大きい値が得られると、ハイブリダイゼーション反応の効率が向上したと判断できる。高いハイブリダイゼーション反応の効率とは、この比率が１．１以上であればよく、好ましくは１．２以上、より好ましくは１．３以上である。Ｔｍ測定には紫外可視吸光光度計と温度調節ユニットを接続した装置を使用することができる。
【００５０】
ＰＣＲ効率は、下記のとおりリアルタイムＰＣＲ法によって求めることができる。リアルタイムＰＣＲ法によるＰＣＲ効率は、まず、検出配列を有する核酸溶液を同一つ濃度で２つ準備する。１つ目はそのままフォワードプライマーとリバースプライマーをプローブとして加え、２つ目は、本発明の方法を用いて、工程（ｃ）で回収された核酸に１つ目のサンプルと同等量のフォワードプライマーとリバースプライマーを加えてからリアルタイムＰＣＲ法に用いる。
【００５１】
リアルタイムＰＣＲ法では、横軸にサイクル数、縦軸に蛍光強度をプロットした増幅曲線が得られる。この増幅曲線において一定のシグナル強度に達したときのサイクル数（Ｃｑ値、Ｃｔ値）をそれぞれ求める。１つ目のサンプルのＣｑ値から２つ目のサンプルのＣｑ値の差をとる。この差について、２を底とした累乗の指数（べき指数）として値を算出し、ＰＣＲ効率とする。ＰＣＲ効率は、この値が１．４以上であればＰＣＲ効率が向上していると判断できる。この値は１．６以上がより好ましく、さらに好ましくは１．８以上である。
【００５２】
本発明で用いる酸化セリウムは、ＣｅＯ２を基本骨格に持つ両性酸化物であり、セリアとも呼ばれ、水に対して溶解性を有さない。酸化セリウムは、天然に産出するものを用いてもよいし、工業的に作製したものを用いてもよい。酸化セリウムを作製する方法としては、例えば、シュウ酸塩や炭酸塩の熱分解法や、硝酸塩などの溶液の中和によって得られる水酸化物沈殿を焼成することで酸化物を得る方法（中和法）、気相法などが挙げられる。工業的に作製した酸化セリウムは、試薬メーカーや、触媒化学メーカー、一般社団法人触媒学会の参照触媒部会などから入手することができる。
【００５３】
本発明で用いる酸化セリウムの担体は粒状のものがよい。粒径はそろっていても、異なる粒径を混合して担体に利用してもよい。粒径は、例えば、１００μｍ以下の酸化セリウム粒子を好ましく用いることができ、好ましくは５０μｍ以下の酸化セリウム粒子を用いることができ、より好ましくは１０μｍ以下の酸化セリウム粒子を用いることができる。
【００５４】
本発明においては、レーザー回折・散乱法に基づく粒度分布測定装置により求められる球相当径の頻度分布から算出される５０％径（Ｄ５０、メディアン径）を使用している。
【００５５】
本発明で用いる溶出液には、水や緩衝液を用いることができ、緩衝液が好ましい。
【００５６】
緩衝液は、リン酸とリン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液や、クエン酸とクエン酸ナトリウムを含むクエン酸緩衝液、トリスヒドロキシアミノメタンと塩酸を含むＴｒｉｓ−塩酸緩衝液にＥＤＴＡを添加したＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液などを好ましく用いることができる。これらのうち、クエン酸とクエン酸ナトリウムを含むクエン酸緩衝液、トリスヒドロキシアミノメタンと塩酸を含むＴｒｉｓ−塩酸緩衝液にＥＤＴＡを添加したＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液は、キレート作用を有する緩衝液であるため特に好ましい。緩衝液のｐＨはｐＨ４以上ｐＨ９以下が好ましく、ｐＨ５以上ｐＨ８以下がより好ましい。
【００５７】
緩衝液には、キレート剤を添加して、緩衝液にキレート作用を付与しても良い。キレート剤は、複数の配位座を持つ配位子を持っており、金属イオンへ結合し、錯体を形成する物質を用いることができる物質であり、キレート剤が含まれる緩衝液は、キレート作用を有する。
【００５８】
緩衝液に添加する具体的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ポリリン酸、メタリン酸及び／又はそれらの塩などが挙げられる。キレート剤の終濃度は、５０ｍＭ以上が好ましく、より好ましくは１００ｍＭ以上、さらに好ましくは５００ｍＭ以上である。
【００５９】
また、上記以外のキレート剤となる化合物として、陰イオン性のポリマーを挙げることができる。カルボン酸を側鎖に持つポリマーは金属イオンを配位するため、これらが緩衝液に含まれていてもよい。このような機能を有するポリマーとして、ポリビニルスルホン酸および／またはそれらの塩が挙げられる。その終濃度は特に限定されないが、１ｗｔ％以上であればよく、好ましくは１０ｗｔ％以上である。  本発明は、核酸、特に高次構造を有する核酸を検出するための方法であって、
工程ａ）カルボン酸を含む溶液、酸化セリウムの担体および核酸を含む試料を混合し、酸化セリウムの担体に前記核酸を吸着させる工程、
工程ｂ）工程ａ）において混合した混合物から、前記核酸が吸着した酸化セリウムの担体を分離する工程、
工程ｃ）工程ｂ）において分離した前記核酸が吸着した酸化セリウムの担体に溶出液を加えて核酸を回収する工程、
工程ｄ）工程ｃ）において回収した核酸ハイブリダイゼーション反応または核酸の増幅反応によって検出する工程、
を含む。以下、それぞれの工程について詳細に説明する。
【００６０】
工程ａ）は、カルボン酸および／またはその塩を含む溶液、酸化セリウムの担体および核酸を含む試料を混合し、酸化セリウムの担体に前記核酸を吸着させる工程である。カルボン酸と核酸を含む試料を予め混合しておき、酸化セリウムの担体と混合してもよいし、カルボン酸と酸化セリウムの担体を予め混合しておき、核酸を含む試料と混合してもよい。また、核酸を吸着させる前段階として、予め酸化セリウムの担体を水やエタノールなどの溶液で洗浄し、表面に吸着している不純物を除いておいてもよく、本洗浄操作を省略してもよい。
【００６１】
カルボン酸の濃度は、特に限定されないが、工程ａ）において混合した混合物の終濃度として、カルボキシル基を１〜２個有するカルボン酸を用いる場合は０．０１ｍＭ以上１００ｍＭ以下であればよく、カルボキシル基を３個以上有するカルボン酸を用いる場合は、０．０１ｍＭ以上１ｍＭ以下であればよい。酸化セリウムの担体と核酸を含む試料の混合方法は特に限定されないが、例えばピペッティングや転倒混合により行ってもよく、ミキサー、ボルテックスなどの装置を使用してもよい。混合時間は、特に限定されないが１分程度であればよく、それ以上の時間混合してもよい。また、本発明の担体をカラムに充填し、核酸を含む試料を通過させてもよい。
【００６２】
また、工程a）においてはカルボン酸および／またはその塩を含む溶液に、当該カルボン酸やカルボン酸の塩以外の化合物を添加してもよい。例えば、核酸回収の際に汎用されるような、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩などのタンパク質変性剤、塩化ナトリウム、塩化リチウムなどの塩、メルカプトエタノールなどの還元剤を添加することができる。
【００６３】
工程ｂ）は、工程ａ）において混合した混合物から、前記核酸が吸着した酸化セリウムの担体を分離する工程である。分離の方法としては、工程ａ）で得られる混合物を遠心分離し、核酸が吸着した酸化セリウムの担体を沈殿させ、上清を除く方法が挙げられる。核酸が吸着した酸化セリウムの担体の比重は水より重いため、遠心操作により容易に沈殿させることができる。遠心分離の条件は、例えば６０００Ｇ以上２００００Ｇ以下で１分間処理することが好ましく、１００００Ｇ以上２００００Ｇ以下で１分間処理することがより好ましい。他の分離方法としては、限外ろ過膜を用いる方法が挙げられる。核酸が吸着した酸化セリウムの担体の粒径より小さな孔径を持つ限外ろ過膜に対し、工程ａ）で得られた混合物を通過させ、核酸が吸着した酸化セリウムの担体を分離する。このような限外ろ過膜はキット化されており、メルク株式会社の「ウルトラフリー」（登録商標）やＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの「ナノセップ」（登録商標）に代表される遠心ろ過キットを入手して利用することができる。
【００６４】
また、工程ｂ）の操作の後に、必要に応じて以下のような処理をしてもよい。これは、工程ａ）の後に、酸化セリウムの担体の表面に目的となる核酸以外の生体試料由来物が吸着している可能性があるためである。例えば、より高純度に核酸を単離するため、洗浄や分解の処理を行うことができる。具体的には、非特異的に吸着した化合物を除去するために水で洗浄する、非特異的に吸着したタンパク質を除去するために界面活性剤で洗浄する、イオンや低分子化合物を除去するために界面活性剤を含む溶液で洗浄する、非特異的に吸着した疎水性化合物を除去するために有機溶媒で洗浄する、非特異的に吸着したタンパク質を分解するためにタンパク質分解酵素を添加する、ＤＮＡのみを単離するためにＲＮＡ分解酵素を添加する及びＲＮＡのみを単離するためにＤＮＡ分解酵素を添加する、などの様々な処理をすることができる。
【００６５】
工程ｃ）は、工程ｂ）において分離した前記核酸が吸着した酸化セリウムの担体に溶出液を加えて核酸を回収する工程である。核酸が吸着した酸化セリウムの担体に溶出液を加えて、吸着している核酸を溶出液中に溶出させ、核酸を回収する工程である。
【００６６】
上記溶出液を加えて核酸を回収するにあたって、酸化セリウムの担体と核酸を溶出させた溶液とを分離する方法としては、工程ｃ）において、核酸が吸着した担体に溶出液を加えて得られた混合物を遠心分離し、本発明の担体を沈殿させ、核酸が溶出している上清を取得する方法が挙げられる。本発明の担体の比重は水より重いため、遠心操作により容易に沈殿させることができる。遠心分離の条件は、例えば６０００Ｇ以上２００００Ｇ以下で１分間処理することが好ましく、１００００Ｇ以上２００００Ｇ以下で１分間処理することがより好ましい。
【００６７】
酸化セリウムの担体と核酸を溶出させた溶液とを分離する他の方法としては、限外ろ過膜を用いる方法が挙げられる。上記酸化セリウムの担体の粒径より小さな孔径を持つ限外ろ過膜に対し、工程ｃ）において得られた混合物を通過させ、酸化セリウムの担体を分離する。このような限外ろ過膜はキット化されており、メルク株式会社の「ウルトラフリー」（登録商標）やＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの「ナノセップ」（登録商標）に代表される遠心ろ過キットを入手して利用することができる。
【００６８】
回収された核酸は、必要に応じて、化学修飾を行うことができる。化学修飾には、核酸の末端に対する蛍光色素修飾、消光剤修飾、ビオチン修飾、アミノ化、カルボキシル化、マレインイミド化、スクシンイミド化、リン酸化及び脱リン酸化などが挙げられ、他にはインターカレーターやグルーブバインダーによる染色が挙げられる。これらの修飾は化学反応により導入されてもよく、酵素反応により導入されてもよい。これらの修飾基を導入し、回収された核酸自身を定量するのではなく、化学修飾を経て導入された修飾基を定量することで、間接的に核酸を定量することもできる。
【００６９】
工程ｄ）は、工程ｃ）において回収した核酸をハイブリダイゼーション反応または核酸の増幅反応によって検出する工程である。具体的には、ハイブリダイゼーション反応または核酸の増幅反応と同時に、または、ハイブリダイゼーション反応または核酸の増幅反応の後に、酵素反応、電気泳動、吸光度測定または蛍光検出などの通常の検出手段を用いて核酸を検出する。
【００７０】
上記ハイブリダイゼーション反応にあたって、ハイブリダイゼーション反応を促進する処理をすることもできる。例えば、加熱処理によってアニーリングする、マグネシウムや亜鉛等の金属イオンを添加する、光を照射して共有結合を形成させる、ホルマリン等の化学架橋剤を添加して共有結合を形成させることが挙げられる。
【実施例】
【００７１】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。【００７２】
＜材料と方法＞
担体に利用する酸化セリウム粒子は第一稀元素化学工業株式会社より入手し、そのまま実験に用いた。また、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＩＩはタカラバイオ株式会社より、ゲル染色用のＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄはインビトロジェン株式会社より購入し、特に精製することなくそのまま用いた。その他の試薬については、和光純薬株式会社、ナカライテスク株式会社、シグマーアルドリッチジャパン合同会社から購入し、特に精製することなくそのまま用いた。【００７３】
ミキサーは東京理化器械株式会社のＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を、ＰＣＲはバイオラッド株式会社のＣＦＸ９６を、Ｔｍ測定は島津製作所のＵＶ１６５０とＴＭＳＰＣ−８を、アクリルアミドゲル電気泳動はアトー株式会社のＷＳＥ−１１００を用いた。染色したアクリルアミドゲルはＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社のＦＬＡ  ９５００で画像取得し、その画像解析はＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社のＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬを用いた。【００７４】
配列番号１から１０で示される核酸は、ユーロフィンジェノミクス株式会社より購入し、特に精製することなくそのまま用いた。【００７５】
＜スーパーコイル構造を有する核酸：「ｐＵＣ１９」＞
スーパーコイル構造を有する核酸として、ｐＵＣ１９を以下のように調製して用いた。環状構造を有する核酸であるプラスミドＤＮＡ（２．７ｋｂｐ，  ｐＵＣ１９）をタカラバイオ社の大腸菌ＤＨ５α（ＴＫＲ９０５７）でクローニングし、プロメガ社のＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａ１４６０）で精製した。精製したｐＵＣ１９をアガロースゲルで電気泳動し、クローズドサーキュラー、オープンサーキュラー、リニア構造の３つの分画に分離して、クローズドサーキュラー構造を有する分画のみを、マッハライナーゲル社のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  （７４０６０９）で単離し、スーパーコイル構造を有する核酸（以下「ｐＵＣ１９」という。）として、以下の実験に用いた。【００７６】
ｐＵＣ１９をＰＣＲで検出するためのプライマーには、配列番号１で示される核酸（フォワードプライマー）、配列番号２で示される核酸（リバーズプライマー）を用いた。【００７７】
＜グアニン４重鎖構造を有する核酸：「Ｇ４」＞
高次構造を有する核酸として、グアニン４重鎖構造を有する核酸を、以下のように調製した。グアニン４重鎖構造を形成する配列が記載されている文献（Ｐ．  Ａｇｒａｗａｌ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０１３，４１，  １０５８４−１０５９２．）のＰｕ２２−Ｔ１２Ｔ１３の配列情報を元に、配列番号３と配列番号４の塩基配列で示される核酸を設計した。配列番号３で示される核酸のうち、５’末端より２３〜４４番目の塩基がグアニン４重鎖構造形成部位である。グアニン４重鎖構造は、グアニン４重鎖構造を形成する既知の配列に対し、カリウムを添加してアニールすることで作製できる。上記文献にしたがって、グアニン４重鎖構造を形成させた。簡潔には、終濃度が１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、７５ｍＭ  ＫＣｌ緩衝液（ｐＨ７）で１μＭになるよう配列番号３の核酸を溶解し、これを０．５℃／ｍｉｎの昇温速度で２０℃から９５℃まで加熱し、室温まで空冷するアニーリング操作を２回行い、実験に用いた。本処理を行った核酸を「Ｇ４」と記載する。【００７８】
Ｇ４を検出するための、ハイブリダイゼーション用プローブとして、配列番号４の塩基配列で示されるプローブ１を用いた。プローブ１は、５’−Ｃｙ５標識されており、配列番号３の塩基配列の５’末端より１〜２２番目の塩基とハイブリダイゼーションすることができる。【００７９】
＜バルジ構造、ループ構造、ヘアピン構造、ダングリングエンド構造、シュードノット構造の部分構造を有する核酸：「ループ１」＞
バルジ構造、ループ構造、ヘアピン構造、ダングリングエンド構造、シュードノット構造の部分構造を構成する核酸のモデルとして、配列番号５で示される塩基配列を有する核酸を設計した。配列番号５の塩基配列は５’末端より２０番目の塩基がバルジ構造、ループ構造、ヘアピン構造、シュードノット構造を構成する部位に相当し、５’末端より４０〜４５番目の塩基がダングリングエンド構造を構成する部位に相当する。配列番号５で示される核酸を、終濃度が１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７）で１μＭになるよう溶解し、これを０．５℃／ｍｉｎの昇温速度で２０℃から９５℃まで加熱し、室温まで空冷するアニーリング操作を２回行い、実験に用いた。本処理を行った核酸を「ループ１」と記載する。【００８０】
＜バルジ構造、ループ構造、ヘアピン構造、ダングリングエンド構造、シュードノット構造の部分構造を有する核酸：「ループ４）＞
バルジ構造、ループ構造、ヘアピン構造、ダングリングエンド構造、シュードノット構造の部分構造を構成する核酸のモデルとして、配列番号６で示される塩基配列を有する核酸を設計した。配列番号６の塩基配列は、５’末端より２０〜２３番目の塩基がバルジ構造、ループ構造、ヘアピン構造、ブランチ構造を構成する部位に相当し、５’末端より４３〜４８番目の塩基がダングリングエンド部位に相当する。配列番号６で示される核酸を、終濃度が１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７）で１μＭになるよう溶解し、これを０．５℃／ｍｉｎの昇温速度で２０℃から９５℃まで加熱し、室温まで空冷するアニーリング操作を２回行い、実験に用いた。本処理を行った核酸を「ループ４」と記載する。【００８１】
＜バルジ構造、ループ構造、ヘアピン構造、ダングリングエンド構造、シュードノット構造の部分構造を有する核酸：「ループ８」＞
バルジ構造、ループ構造、ヘアピン構造、ダングリングエンド構造、シュードノット構造の部分構造を構成する核酸のモデルとして、配列番号７で示される塩基配列を有する核酸を設計した。配列番号７の塩基配列は、５’末端より２０〜２７番目の塩基までがバルジ構造、ループ構造、ヘアピン構造、ブランチ構造を構成する部位に相当し、５’末端より４７〜５２番目の塩基がダングリングエンド部位に相当する。配列番号７で示される核酸を、終濃度が１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７）で１μＭになるよう溶解し、これを０．５℃／ｍｉｎの昇温速度で２０℃から９５℃まで加熱し、室温まで空冷するアニーリング操作を２回行い、実験に用いた。本処理を行った核酸を「ループ８」と記載する。【００８２】
＜高次構造を有さない核酸：配列番号９、１０で示される核酸＞
高次構造を有さない核酸として、ミスマッチ構造、バルジ構造、ループ構造、ヘアピン構造、ダングリングエンド構造、シュードノット構造、ブランチ構造、四重らせん構造、八重らせん構造、環状構造のいずれの構造も有さない配列番号９、１０で示される塩基配列を有する核酸を設計した。配列番号９，１０で示される核酸は、５’末端より１〜２５番目の塩基同士でハイブリダイゼーションする。配列番号９、１０で示される核酸は、それぞれ終濃度が１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７）で１μＭになるよう溶解し、両者を等量ずつ混合して調製した。これを０．５℃／ｍｉｎの昇温速度で２０℃から９５℃まで加熱し、室温まで空冷するアニーリング操作を２回行った。次に電気泳動をおこない、バンドが単一であることを確認して以降の実験に用いた。【００８３】
＜ループ１、ループ４、ループ８、高次構造を有さない核酸を検出するプローブ＞
ループ１、ループ４、ループ８、高次構造を有さない核酸として配列番号８，９で示される核酸を基に、上記で調製した核酸を検出するハイブリダイゼーション用プローブとして配列番号８で示されるプローブ２を用いた。プローブ２は、５’−Ｃｙ５標識されている。プローブ２は、ループ１（配列番号５）の５’末端より２１〜４５番目の塩基、ループ４（配列番号６）の５’末端より２４〜４８番目の塩基、ループ８（配列番号７）の５’末端より２８〜５２番目の塩基、配列番号９の５’末端より１〜２５番目の塩基とそれぞれハイブリダイゼーションすることができる。【００８４】
＜比較例１＞ｐＵＣ１９をカルボン酸および／またはカルボン酸の塩を含まない条件で回収し検出する方法
カルボン酸またはカルボン酸塩を含まない条件で、高次構造を有する核酸であるｐＵＣ１９を回収し、ＰＣＲ効率を求めた。【００８５】
特許文献２の実施例に記載の酸化セリウムを担体として用いた核酸の回収方法を検討した。その他、特許文献２に記載の内容と同様の条件にするため、核酸吸着液を水とｐＨ５〜９の間で緩衝作用を有する１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）とし、溶出液を水と０．５Ｍリン酸緩衝液とした。実験は以下のとおりである。【００８６】
最初に１．５ｍｌチューブ４本に、２．０ｍｇの酸化セリウム粒子を量り取った。それぞれに２００μｌのエタノールを加え、ボルテックスした後、遠心機で１分間遠心して上清を除いた。この操作を更に２回行って酸化セリウム粒子を洗浄し、酸化セリウムの担体として用いた。【００８７】
続いて、洗浄した酸化セリウムの担体に対し、１００ｎｇのｐＵＣ１９が溶解した水１００μｌまたは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）１００μｌを加え、５分間ミキサーで攪拌し、遠心（１００００Ｇ，  １ｍｉｎ）して上清を捨てた。残った担体に対し水を２００μｌ加え、ボルテックスした。この操作を更に２回行った。その後、１０μｌの水またはリン酸緩衝液（０．５Ｍ，  ｐＨ７）を加えて１５分間ミキサーで攪拌した。遠心機で遠心（１００００Ｇ，  １ｍｉｎ）して、上清を核酸溶液として回収した。【００８８】
ＰＣＲ効率は下記のように算出した。まず、１００ｎｇ／１０ｕｌとしたｐＵＣ１９をさらに水で５０倍希釈してテンプレートとして１μｌとり、プローブとして１０μＭのフォワードプライマーと１０μＭのリバースプライマーをそれぞれ１μｌずつ加えた。さらに水を９．５μｌ加えて、最後にＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＩＩを１２．５μｌ加えて混合し、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。同様に、上記酸化セリウムの担体を使って回収した核酸を含む溶出液を水で５０倍に希釈し、同様の組成で２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。両者を２ｓｔｅｐのシャトルプロトコル（ｓｔｅｐ１：  ９５℃，３０ｓｅｃ，ｓｔｅｐ２：９５℃，５ｓｅｃ，５６℃，３０ｓｅｃ，ｓｔｅｐ２を４０ｃｙｃｌｅ）にしたがってリアルタイムＰＣＲで検出し、Ｃｑ値を比較した。前者の酸化セリウムの担体による核酸回収工程を行わないサンプルのＣｑ値から、後者の特許文献２に従って酸化セリウムの担体による核酸回収工程を行ったサンプルのＣｑ値の差をとった。この差について、２を底とした累乗の指数（べき指数）としてＰＣＲ効率を算出した。結果を表１に示した。【００８９】
これらの結果は、後述のカルボン酸および／またはカルボン酸の塩を含む条件で回収した核酸を用いてＰＣＲ反応を行った実施例１、４〜７の結果と比べて低いＰＣＲ効率であった。【００９０】
【表１】
2018088502.tif 000002
【００９１】
＜実施例１＞ｐＵＣ１９をＥＤＴＡ二ナトリウム塩を含む条件で回収し、検出する方法
カルボン酸の塩としてＥＤＴＡ二ナトリウム塩を使用して、高次構造を有する核酸であるｐＵＣ１９を回収し、ＰＣＲ効率を求めた。【００９２】
終濃度が１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ  ＥＤＴＡとなるよう、ＥＤＴＡ二ナトリウムをＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液に加え、この溶液１００μｌに１００ｎｇのｐＵＣ１９をそれぞれ溶解し、酸化セリウムの担体と混合して吸着させた。また溶出液は０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）にした。その他の条件、操作は比較例１と同様に行い、リアルタイムＰＣＲによりＰＣＲ効率を算出した。結果を表１に示した。【００９３】
これらの結果から、カルボン酸の塩としてＥＤＴＡ二ナトリウム塩を用いて回収したｐＵＣ１９を検出することにより、ＰＣＲ効率が３．７倍以上となり、スーパーコイル構造を有する核酸をＰＣＲにより高感度に検出できることがわかった。【００９４】
＜実施例２＞ｐＵＣ１９をＥＤＴＡ二ナトリウムを含む条件で回収し、検出する方法
カルボン酸塩としてＥＤＴＡ二ナトリウムを使用して、高次構造を有する核酸であるｐＵＣ１９を回収し、ハイブリダイゼーション効率を求めた。【００９５】
終濃度が１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）、１ｍＭ  ＥＤＴＡとなるよう、ＥＤＴＡ二ナトリウムをＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液に加え、この溶液１００μｌに５００ｎｇのｐＵＣ１９をそれぞれ溶解し、酸化セリウムの担体と混合して吸着させた。また溶出液は１５μｌの０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）にした。その他の条件、操作は比較例１と同様に行い、酸化セリウムの担体による回収工程を行った。【００９６】
ハイブリダイゼーション反応の効率はサンプルを４つ用意し、Ｔｍ測定により下記のように算出した。１つ目のサンプルは、５００ｎｇ／１５ｕｌとしたｐＵＣ１９を７．５μｌ（２５０ｎｇ）とり、０．５Ｍリン酸緩衝液７．５μｌ、ホルムアミドを４μｌ加えて水で１００μｌにメスアップした。２つ目のサンプルは、１つ目のサンプルにさらにプローブとして１０μＭのフォワードプライマーと１０μＭのリバースプライマーをそれぞれ５μｌ加え、１００μｌにメスアップした。３つ目のサンプルは、上記酸化セリウムの担体による回収操作を行い、回収した核酸を含む溶出液を７．５μｌとり、ホルムアミドを４μｌ加えて水で１００μｌにメスアップした。４つ目のサンプルは、３つ目のサンプルにさらにプローブとして１０μＭのフォワードプライマーと１０μＭのリバースプライマーをそれぞれ５μｌ加え、１００μｌにメスアップした。それぞれのサンプルを使ってＴｍ測定を行い、融解曲線を取得した。使用したプローブのＴｍ（理論値）が６０℃であることから、６０℃における吸光度を融解曲線から全てのサンプルに関して求めた。２つ目のサンプルから１つ目のサンプルの差を、４つ目のサンプルから３つ目のサンプルの差をそれぞれ取り、前者を１として後者の比を算出し、ハイブリダイゼーション反応の効率を求めた。結果を表２に示した。【００９７】
これらの結果から、カルボン酸の塩としてＥＤＴＡ二ナトリムを用いて、回収したｐＵＣ１９を検出することにより、ｐＵＣ１９とプローブとのハイブリダイゼーション反応の効率が１．６倍向上した。【００９８】
【表２】
2018088502.tif 000003
【００９９】
＜実施例３＞Ｇ４をＥＤＴＡを含む条件で回収し、検出する方法
カルボン酸としてＥＤＴＡを使用して、高次構造を有する核酸であるＧ４を回収し、ハイブリダイゼーション効率を求めた。【０１００】
Ｇ４を含む溶液１０μｌに、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、７５ｍＭ  ＫＣｌ緩衝液（ｐＨ７）を９０μｌ加え、酸化セリウムの担体と混合して吸着させた。また溶出液には１０μｌの０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に７５ｍＭ  ＫＣｌを添加したものを用いた。その他の条件、操作は比較例１と同様に行い、酸化セリウムの担体による回収工程を行った。【０１０１】
ハイブリダイゼーション反応の効率は、サンプルを３つ用意し、電気泳動により下記のように算出した。１つ目のサンプルは、アニール後のＧ４（０．１μＭ、１μｌ）にローディング色素１μｌと水４μｌを加えた溶液である。２つ目のサンプルは、アニール後のＧ４（０．１μＭ、１μｌ）に検出用プローブ１（０．２μＭ、１μｌ）を加えて１時間静置し、その後ローディング色素１μｌと水３μｌを加えた溶液である。３つ目のサンプルは、上記酸化セリウムの担体による回収操作を行い、回収した核酸を含む溶出液を１μｌとり、検出用プローブ（０．２μＭ、１μｌ）加えて１時間静置し、その後ローディング色素１μｌと水３μｌを加えた溶液である。それぞれ１０ｗｔ％濃度のアクリルアミドゲル電気泳動を行い、検出用プローブの５’末端に修飾されたＣｙ５色素と、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで二重染色を行った。電気泳動により、１つ目のサンプルで検出されるバンドに加え、２つ目と３つ目のサンプルではＧ４へ検出用プローブ１がハイブリダイゼーションしたことで新たなバンドが確認された。このバンドの濃度比を、２つ目のサンプルに対する３つ目のサンプルの比として画像解析等で算出し、ハイブリダイゼーション反応の効率を求めた。結果を表２に示した。【０１０２】
これらの結果から、カルボン酸としてＥＤＴＡを用いて回収したＧ４を検出することにより、プローブとのハイブリダイゼーション反応の効率が２．３倍向上した。【０１０３】
＜実施例４＞ｐＵＣ１９をクエン酸三ナトリウムを含む条件で回収し、検出する方法
カルボン酸の塩としてクエン酸三ナトリウムを使用して、高次構造を有する核酸であるｐＵＣ１９を回収し、ＰＣＲ効率を求めた。【０１０４】
終濃度が１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭクエン酸となるようクエン酸三ナトリウムをＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液に加え、この溶液１００μｌに１００ｎｇのｐＵＣ１９をそれぞれ溶解し、酸化セリウムの担体と混合して吸着させた。また溶出液は０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）にした。その他の条件、操作は比較例１と同様に行い、リアルタイムＰＣＲによりＰＣＲ効率を算出した。結果を表３に示した。【０１０５】
これらの結果から、カルボン酸の塩としてクエン酸三ナトリウムを用いて回収したｐＵＣ１９を検出することにより、ＰＣＲ効率が３．４倍以上となり、高次構造をＰＣＲにより高感度に検出できることがわかった。【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
＜実施例５＞ｐＵＣ１９をシュウ酸二ナトリウムを含む条件で回収し、検出する方法
カルボン酸の塩としてシュウ酸二ナトリウムを使用して、高次構造を有する核酸であるｐＵＣ１９を回収し、ＰＣＲ効率を求めた。【０１０８】
終濃度が１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）、５０ｍＭ、２０ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭシュウ酸となるようシュウ酸二ナトリウムをＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液に加え、この溶液１００μｌに１００ｎｇのｐＵＣ１９をそれぞれ溶解し、酸化セリウムの担体と混合して吸着させた。また溶出液は０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）にした。その他の条件、操作は比較例１と同様に行い、リアルタイムＰＣＲによりＰＣＲ効率を算出した。結果を表４に示した。【０１０９】
これらの結果から、カルボン酸の塩としてシュウ酸二ナトリウムを用いて回収したｐＵＣ１９を検出することにより、ＰＣＲ効率が２．８倍以上となり、高次構造をＰＣＲにより高感度に検出できることがわかった。【０１１０】
【表４】
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【０１１１】
＜実施例６＞ｐＵＣ１９を酢酸ナトリウムを含む条件で回収し、検出する方法
カルボン酸の塩として酢酸ナトリウムを使用して、高次構造を有する核酸であるｐＵＣ１９を回収し、ＰＣＲ効率を求めた。【０１１２】
終濃度が１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）、１００ｍＭ、５０ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ酢酸となるよう酢酸ナトリウムをＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液に加え、この溶液１００μｌに１００ｎｇのｐＵＣ１９をそれぞれ溶解し、酸化セリウムの担体と混合して吸着させた。また溶出液を０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）にした。その他の条件、操作は比較例１と同様に行い、リアルタイムＰＣＲによりＰＣＲ効率を算出した。結果を表５に示した。【０１１３】
これらの結果から、これらの結果から、カルボン酸の塩と酢酸ナトリウムを用いて回収したｐＵＣ１９を検出することにより、ＰＣＲ効率が３．２倍以上となり、高次構造を有する核酸をＰＣＲにより高感度に検出できることがわかった。【０１１４】
【表５】
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【０１１５】
＜実施例７＞ＥＤＴＡと添加剤を含む条件でｐＵＣ１９を回収し、検出する方法
核酸回収の際に汎用されるタンパク質変性剤および還元剤を添加した条件で、核酸を回収し、核酸を検出した。タンパク質変性剤として、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩を用いた。還元剤として塩化ナトリウム、塩化リチウム、メルカプトエタノールを用いた。カルボン酸としてＥＤＴＡを使用して、高次構造を有する核酸であるｐＵＣ１９を回収し、ＰＣＲ効率を求めた。【０１１６】
グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、塩化ナトリウム、塩化リチウム、メルカプトエタノールを、カルボン酸を含む吸着溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７））にそれぞれ溶解し（終濃度：グアニジンチオシアン酸塩６Ｍ、グアニジン塩酸塩  ６Ｍ、塩化ナトリウム  ５Ｍ、塩化リチウム  ８Ｍ、メルカプトエタノール  １００ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭ）、この溶液１００μｌに１００ｎｇのｐＵＣ１９をそれぞれ加えて、酸化セリウムの担体と混合して吸着させた。また溶出液を０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）にした。その他の条件、操作は比較例１と同様に行い、リアルタイムＰＣＲによりＰＣＲ効率を算出した。結果を表６に示した。【０１１７】
これらの結果から、カルボン酸を含む溶液に上記の添加剤を加えても、ＰＣＲ効率が５．８倍以上となり、高次構造を有する核酸をＰＣＲにより高感度に検出できることがわかった。【０１１８】
【表６】
2018088502.tif 000007
【０１１９】
＜実施例８〜１０＞ループ１、ループ４、ループ８をＥＤＴＡを含む条件で回収し、検出する方法
カルボン酸としてＥＤＴＡを使用して、高次構造を有する核酸であるループ１、ループ４、ループ８をそれぞれ回収し、ハイブリダイゼーション効率を求めた。ループ１についての結果を実施例８、ループ４についての結果を実施例９、ループ８についての結果を実施例１０とする。【０１２０】
ループ１、ループ４、ループ８をそれぞれ含む溶液３μｌに、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７）を９７μｌ加え、酸化セリウムの担体と混合して吸着させた。また溶出液には１０μｌの０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いた。その他の条件、操作は比較例１と同様に行い、酸化セリウムの担体による核酸の回収を行った。【０１２１】
ハイブリダイゼーション反応は、ループ１（０．３μＭ、１μｌ）、ループ４（０．３μＭ、１μｌ）、ループ８（０．３μＭ、１μｌ）と検出用プローブ２（１μＭ、１μｌ）を用いた以外は実施例３と同様に行い、ハイブリダイゼーション効率を算出した。結果を表７に示した。【０１２２】
これらの結果から、カルボン酸としてＥＤＴＡを用いて回収したループ１、ループ４、ループ８を検出することにより、ハイブリダイゼーション反応の効率が、ループ１では３．７倍（実施例８）、ループ４では４．７倍（実施例９）、ループ８（実施例１０）では３．８倍にそれぞれ向上した。【０１２３】
本結果から各種の高次構造を有する核酸を高感度に検出できることがわかった。【０１２４】
【表７】
2018088502.tif 000008
【０１２５】
＜実施例１１＞高次構造を有さない核酸をＥＤＴＡを含む条件で回収し、検出する方法
カルボン酸としてＥＤＴＡを使用して、高次構造を有さない核酸である配列番号９、１０で示される核酸を回収し、ハイブリダイゼーション効率を求めた。【０１２６】
配列番号９、１０で示される核酸を含む溶液３μｌに、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、６Ｍグアニジンチオシアン酸塩を含む緩衝液（ｐＨ７）を９７μｌ加え、酸化セリウムの担体と混合して吸着させた。また溶出液には１０μｌの０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いた。その他の条件、操作は比較例１と同様に行い、酸化セリウムの担体による核酸の回収を行った。【０１２７】
ハイブリダイゼーション反応は、高次構造を有さない核酸と検出用プローブ２（１μＭ、１μｌ）を用いた以外は実施例３と同様に行い、ハイブリダイゼーション効率を算出した。結果を表８に示した。【０１２８】
これらの結果から、カルボン酸としてＥＤＴＡを用いて回収した核酸を検出することにより、高次構造を有さない核酸であってもハイブリダイゼーション反応の効率が１．４倍に向上した。【０１２９】
【表８】
2018088502.tif 000009
【配列表】
2018088502000001.app
【国際調査報告】
2018088502.tif 000010
2018088502.tif 000011
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