(57)【要約】  ＤＮＡ分子に結合したＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍に所望の塩基配列のＤＮＡ断片を挿入する方法であって、前記ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質を利用して、トランスポザーゼ結合配列と前記所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片と、前記結合領域とを近接させる工程と、前記トランスポザーゼ結合配列にトランスポザーゼを結合させる工程と、前記トランスポザーゼを活性化し、その結果、前記所望の塩基配列のＤＮＡ断片が前記結合領域の近傍に挿入される工程と、を備える方法。
2018042776.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ分子に結合したＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍に所望の塩基配列のＤＮＡ断片を挿入する方法であって、
前記ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質を利用して、トランスポザーゼ結合配列と前記所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片と、前記結合領域とを近接させる工程と、
前記トランスポザーゼ結合配列にトランスポザーゼを結合させる工程と、
前記トランスポザーゼを活性化し、その結果、前記所望の塩基配列のＤＮＡ断片が前記結合領域の近傍に挿入される工程と、
を備える方法。
【請求項２】
前記所望の塩基配列を起点として前記ＤＮＡ分子を遺伝子増幅し、増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物の塩基配列を解析する工程と、
を更に備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記所望の塩基配列がプロモーター配列を含み、
前記遺伝子増幅が、前記プロモーター配列にＲＮＡポリメラーゼを接触させて前記プロモーター配列の下流のＤＮＡを転写してＲＮＡを生成することにより行われる、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記所望の塩基配列が前記プロモーター配列の下流に識別配列を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
トランスポザーゼ結合配列と所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片と、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質又は前記特異的結合物質に対する特異的結合物質との結合体。
【請求項６】
前記所望の塩基配列がプロモーター配列を含む、請求項５に記載の結合体。
【請求項７】
前記所望の塩基配列が前記プロモーター配列の下流に識別配列を更に含む、請求項６に記載の結合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍に所望のＤＮＡ断片を挿入する方法に関する。本願は、２０１６年８月３０日に、日本に出願された特願２０１６−１６７９６７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質と特定のゲノム領域との結合、あるいはゲノム領域同士の相互作用を検出する方法として、クロマチン免疫沈降（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ、ＣｈＩＰ）解析、ＣｈＩＰ−ｃｈｉｐ解析、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ（３Ｃ、Ｈｉ−Ｃ）等が広く利用されている（例えば、非特許文献１を参照）。【０００３】
これらの方法は、概ね次のようにして行われる。まず、ＵＶ照射、ホルムアルデヒド処理等によりＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質とをクロスリンクした後、超音波処理、制限酵素処理等によりＤＮＡを断片化する。続いて、免疫沈降によりＤＮＡ結合タンパク質が結合したＤＮＡ断片を回収する。続いて、回収したＤＮＡ断片をプロテアーゼ処理してＤＮＡ結合タンパク質を除去し、ＤＮＡ断片の塩基配列を、放射線標識プローブを用いたドットブロットハイブリダイゼーション又はサザンハイブリダイゼーション、ＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーション（ＣｈＩＰ−ｃｈｉｐ解析）、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、次世代シークエンサーを用いた塩基配列解析（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析）等により解析する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Carey M. F., et al., Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), Cold Spring Harbor Protocols, 4 (9), pdb.prot5279, 2009.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、例えば、不溶性タンパク質は免疫沈降することができない。また、試料が少数細胞である場合等には、反応時に担体の使用を必要とするため夾雑物の混入や標的の損失が避けられない。このため、免疫沈降を必須の工程とする従来の方法では、不溶性タンパク質のＤＮＡへの結合を解析することや組織等の少数細胞からの解析が困難な場合があった。そこで、本発明は、免疫沈降を行うことなく、タンパク質と特定のゲノム領域との結合を解析することができる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
（１）ＤＮＡ分子に結合したＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍に所望の塩基配列のＤＮＡ断片を挿入する方法であって、前記ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質を利用して、トランスポザーゼ結合配列と前記所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片と、前記結合領域とを近接させる工程と、前記トランスポザーゼ結合配列にトランスポザーゼを結合させる工程と、前記トランスポザーゼを活性化し、その結果、前記所望の塩基配列のＤＮＡ断片が前記結合領域の近傍に挿入される工程と、を備える方法。
（２）前記所望の塩基配列を起点として前記ＤＮＡ分子を遺伝子増幅し、増幅産物を得る工程と、前記増幅産物の塩基配列を解析する工程と、を更に備える、（１）に記載の方法。
（３）前記所望の塩基配列がプロモーター配列を含み、前記遺伝子増幅が、前記プロモーター配列にＲＮＡポリメラーゼを接触させて前記プロモーター配列の下流のＤＮＡを転写してＲＮＡを生成することにより行われる、（２）に記載の方法。
（４）前記所望の塩基配列が前記プロモーター配列の下流に識別配列を更に含む、（３）に記載の方法。
（５）トランスポザーゼ結合配列と所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片と、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質又は前記特異的結合物質に対する特異的結合物質との結合体。
（６）前記所望の塩基配列がプロモーター配列を含む、（５）に記載の結合体。
（７）前記所望の塩基配列が前記プロモーター配列の下流に識別配列を更に含む、（６）に記載の結合体。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、免疫沈降を行うことなく、タンパク質と特定のゲノム領域との結合を解析することができる技術を提供することができる。したがって、例えば不溶性タンパク質等の、免疫沈降を行うことが困難なタンパク質のＤＮＡへの結合を解析することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣｈＩＬＴ）法を説明する模式図である。
【図１Ｂ】ＣｈＩＬＴ法を説明する模式図である。
【図１Ｃ】ＣｈＩＬＴ法を説明する模式図である。
【図２】ＣｈＩＬＴ法を説明する模式図である。
【図３】ＣｈＩＬＴ法を説明する模式図である。
【図４】ＣｈＩＬＴ法を説明する模式図である。
【図５】（ａ）〜（ｃ）は、ＣｈＩＬＴ法を説明する模式図である。
【図６】（ａ）及び（ｂ）は、ＣｈＩＬＴ法を説明する模式図である。
【図７】（ａ）〜（ｄ）は、実験例１及び２の結果を示すグラフである。
【図８Ａ】実験例３の結果を示すグラフである。
【図８Ｂ】実験例３の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。また、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
【００１０】
［ＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍に所望のＤＮＡ断片を挿入する方法］
１実施形態において、本発明は、ＤＮＡ分子に結合したＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍に所望の塩基配列のＤＮＡ断片を挿入する方法であって、前記ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質を利用して、トランスポザーゼ結合配列と前記所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片と、前記結合領域とを近接させる工程（ａ）と、前記トランスポザーゼ結合配列にトランスポザーゼを結合させる工程（ｂ）と、前記トランスポザーゼを活性化し、その結果、前記所望の塩基配列のＤＮＡ断片が前記結合領域の近傍に挿入される工程（ｃ）と、を備える方法を提供する。以下、本実施形態の方法をＣｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣｈＩＬＴ）法という場合がある。
【００１１】
上述したように、不溶性タンパク質は免疫沈降することができない。また、例えば固定した組織や細胞の免疫染色では広範なタンパク質を染色することが可能であるのに対し、免疫沈降で回収することができる抗原は限られており、免疫染色可能な抗原の約１０％程度しか免疫沈降できないといわれている。また、少数細胞を試料とした免疫沈降では、担体を使用する必要があるため、夾雑物の混入や標的の損失が問題となる。これに対し、ＣｈＩＬＴ法によれば、免疫沈降を行うことなく、タンパク質と特定のゲノム領域との結合を解析することが可能になる。
【００１２】
したがって、ＣｈＩＬＴ法によれば、免疫沈降を必須の工程とする従来技術では解析が困難であったＤＮＡ結合タンパク質について、ＤＮＡとの結合を解析することが可能になる。また、従来技術では、１細胞レベルでＤＮＡ結合タンパク質の解析を行うことは困難であった。これに対し、ＣｈＩＬＴ法によれば、後述するように、１細胞レベルでＤＮＡ結合タンパク質の解析を行うことも可能である。
【００１３】
解析対象となるＤＮＡ結合タンパク質は、特に制限されず、例えば、ヒストン、転写因子、リン酸化ポリメラーゼ等が挙げられる。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質として、特定のリン酸化状態のＲＮＡポリメラーゼＩＩを解析することにより、遺伝子の転写状態を解析することが可能である。
【００１４】
以下、図１Ａ〜図５を参照しながらＣｈＩＬＴ法について説明する。図１Ａ〜図５は、ＣｈＩＬＴ法を説明する模式図である。図１Ａは、パラホルムアルデヒド固定された細胞標本を示す図である。図１Ｂは、図１Ａのスライドガラス上に固定された細胞標本Ｓを拡大した図である。図１Ｃは、細胞標本Ｓに対しＣｈＩＬＴ法を実施した場合に、細胞標本Ｓの核内で生じる反応を説明する図である。図１Ｃは、ゲノムＤＮＡ１０がヒストン２０に巻きついてクロマチン構造を形成した状態を示す。図１Ｃの例では、ＤＮＡ結合タンパク質はヒストン２０である。
【００１５】
図１Ｃの例では、特異的結合物質３０は、ヒストン２０を認識する抗体である。特異的結合物質３０には、リンカー４４を介してＤＮＡ断片４０が結合されている。ＤＮＡ断片４０は、トランスポザーゼ結合配列４１と、所望の塩基配列とを含む塩基配列を有している。図１の例では、所望の塩基配列は、Ｔ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が連結した塩基配列である。図１Ｃ〜図６において、Ｔ７プロモーター配列４２の矢印は、Ｔ７ポリメラーゼによる転写の向きを示す。
【００１６】
リンカー４４は、ＤＮＡ断片４０をヒストン２０の結合領域１１に近接させるためのつなぎひも（ｔｅｔｈｅｒ、テザー）の役割を有している。図１Ｃの例では、リンカー４４はＤＮＡ断片であり、例えば５０〜７０塩基の長さを有している。しかしながら、リンカー４４は、テザーとして機能するものであれば特に制限されず、例えばポリエチレングリコール等のポリマーで構成されていてもよい。
【００１７】
（工程（ａ））
図１Ｃの例では、パラホルムアルデヒド固定された細胞標本Ｓを試料としてＣｈＩＬＴ法を実施している。まず、ヒストン２０に対する特異的結合物質３０を利用して、ＤＮＡ断片４０と結合領域１１とを近接させる。ここで、特異的結合物質３０を利用して近接させるとは、図１Ｃの例のようにＤＮＡ断片４０が結合した特異的結合物質３０を、その抗原であるヒストン２０に結合させることにより、ＤＮＡ断片４０と結合領域１１とを近接させることであってもよい。あるいは、特異的結合物質３０が、例えばヒストン２０に対するマウスＩｇＧ抗体であり、このマウスＩｇＧ抗体を１次抗体としてヒストン２０に結合させ、続いて、ＤＮＡ断片４０が結合した抗マウスＩｇＧ抗体を２次抗体として上記の１次抗体に結合させることにより、ＤＮＡ断片４０と結合領域１１とを近接させることであってもよい。
【００１８】
ヒストン２０に対する特異的結合物質３０を利用して、ＤＮＡ断片４０と結合領域１１とを近接させる工程は、図１Ｃの例のように、パラホルムアルデヒド固定された組織切片中の細胞内で実施することができる。この工程は、免疫染色と同様に、複数の抗体を同時に使用することも可能である。したがって、ＣｈＩＬＴ法によれば、複数のＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍にそれぞれ異なる所望の塩基配列のＤＮＡ断片を挿入することもできる。ここで、識別配列４３として、ＤＮＡ結合タンパク質ごとに区別可能な配列を使用することにより、複数のＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡへの結合を区別して検出することもできる。
【００１９】
（工程（ｂ））
続いて、トランスポザーゼ結合配列４１にトランスポザーゼ５０を結合させる。図２は、試料にトランスポザーゼ５０を添加して、トランスポザーゼ結合配列４１にトランスポザーゼ５０を結合させた状態をを示す。
【００２０】
トランスポザーゼとしては、核内に入りやすい観点から、大きさが小さなものが好ましい。例えば、分子量が５０ＫＤａ以下のトランスポザーゼが好ましい。また、認識する配列の配列特異性が高いものが好ましい。また、ＤＮＡ型トランスポザーゼが好ましい。また、活性を制御できるトランスポザーゼが好ましく、例えば、２価の金属イオン等のカチオンをバッファー中に添加すると活性化されるトランスポザーゼが挙げられる。好ましいトランスポザーゼとしては、例えば、ＴＮ５トランスポザーゼ、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ（ＳＢ１０）、ＴＮ１０等が挙げられる。トランスポザーゼ結合配列４１は、使用するトランスポザーゼに応じて決定すればよい。
【００２１】
（工程（ｃ））
続いて、上記のトランスポザーゼ５０を活性化する。トランスポザーゼ５０の活性化は、例えば、２価の金属イオンをバッファー中に添加すること等により実施することができる。
【００２２】
また、トランスポザーゼ５０の種類によっては、ＤＮＡ断片を転移させる活性を発揮するためにダイマーを形成する必要がある場合がある。また、トランスポザーゼ５０がダイマーを形成するために、トランスポザーゼ５０がトランスポザーゼ結合配列４１に結合している必要がある場合がある。例えば、上述したＴＮ５、ＳＢ１０、ＴＮ１０等はこのようなトランスポザーゼである。このような場合には、トランスポザーゼ５０のダイマーを形成させることによってもトランスポザーゼ５０を活性化することができる。
【００２３】
また、トランスポザーゼ５０の種類によっては、トランスポザーゼ５０を活性化するために、トランスポザーゼ５０のダイマーを形成させ、且つ２価の金属イオンをバッファー中に添加することが必要な場合がある。
【００２４】
図３は、トランスポザーゼ５０のダイマーを形成させた状態を示す。図３では、試料に、トランスポザーゼ結合配列４１を有する遊離のＤＮＡ断片を添加して、当該ＤＮＡ断片にトランスポザーゼ５０を結合させている。図３に示すように、上記のＤＮＡ断片と結合したトランスポザーゼ５０は、ＤＮＡ断片４０を構成するトランスポザーゼ結合配列４１に結合したトランスポザーゼ５０とダイマーを形成する。
【００２５】
トランスポザーゼ５０を活性化した結果、ＤＮＡ断片４０中の所望の塩基配列（図３の例ではＴ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が連結した塩基配列）のＤＮＡ断片が結合領域１１の近傍に挿入される。ここで、近傍とは、空間的に近い領域であればよく、例えば結合領域１１から５００塩基以下であってもよく、例えば１００塩基以下であってもよく、例えば５０塩基以下であってもよい。
【００２６】
あるいは、近傍とは、空間的に近い領域であればよいため、ゲノムＤＮＡ１０の塩基配列上は結合領域１１から非常に離れた領域であって、ゲノム領域同士の相互作用により近接した領域であってもよい。すなわち、染色体構造上近接した領域であってもよい。
【００２７】
本工程において、トランスポザーゼ５０によるＤＮＡ断片の挿入反応が不完全に終了する場合がある。具体的には、例えば、挿入されたＤＮＡ断片が部分的に１本鎖ＤＮＡとなっている場合、挿入されたＤＮＡ断片が断片化している場合等が挙げられる。そこで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼＩ等を用いたｆｉｌｌ  ｉｎ反応等により、トランスポザーゼ５０によるＤＮＡ断片の挿入反応を完全に終了させる工程を更に実施してもよい。
【００２８】
図４は、所望の塩基配列のＤＮＡ断片が結合領域１１の近傍に挿入された状態の一例を示す模式図である。図４に示すように、この例では、結合領域１１の近傍に所望の塩基配列（Ｔ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が連結した塩基配列）のＤＮＡ断片が挿入されている。図４の例では、所望の塩基配列だけでなく、２つのトランスポザーゼ結合配列４１、及びリンカー４４の一部に由来する塩基配列４４’もゲノムＤＮＡ１０に挿入されている。
【００２９】
図５（ａ）〜（ｃ）は、上述した図３の状態からトランスポザーゼ５０が活性化した結果、ＤＮＡ断片がゲノムＤＮＡ１０に挿入された場合の例を示す模式図である。図５（ａ）は、上述した図４の状態を示す。図５（ｂ）は、上述した図４とは逆向きに所望の塩基配列が挿入された状態を示す。図５（ｃ）は、トランスポザーゼ結合配列４１を有する遊離のＤＮＡ断片に結合したトランスポザーゼ５０同士がダイマーを形成した場合に、ゲノムＤＮＡ１０に挿入されうる塩基配列を示す。
【００３０】
図５（ｃ）においてゲノムＤＮＡ１０に挿入された塩基配列は、２つのトランスポザーゼ結合配列４１を含み、それらの間に、任意の塩基配列４５を含む場合がある。塩基配列４５は、上述したｆｉｌｌ  ｉｎ反応により形成されたものである。
【００３１】
図５（ｃ）に示す塩基配列は、目的外の副産物であり、結合領域１１の近傍に限らず、ゲノムＤＮＡ１０上のあらゆる部分に挿入され得る。しかしながら、図５（ｃ）に示す塩基配列は、所望の塩基配列（この例ではＴ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が連結した塩基配列）を有していない。このため、目的とする解析における影響を排除することができる。
【００３２】
以上の工程により、ＤＮＡ分子に結合したＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍に所望の塩基配列のＤＮＡ断片を挿入することができる。
【００３３】
（特異的結合物質）
ＣｈＩＬＴ法において、特異的結合物質としては、抗体の他にも、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に標的物質又はその断片を抗原として免疫することによって作製することができる。あるいは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。
【００３４】
アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的物質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的物質に特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００３５】
（所望の塩基配列）
また、図１Ｃ〜図５の例では、ゲノムＤＮＡ１０に挿入する所望の塩基配列は、Ｔ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が連結した塩基配列であったが、所望の塩基配列はこれに限定されない。例えば、所望の塩基配列として、Ｔ７プロモーター配列４２の代わりにＳＰ６プロモーター配列等の別のプロモーター配列を用いてもよい。あるいは、所望の塩基配列は、プロモーター配列のみから構成されていてもよい。あるいは、所望の塩基配列は、識別配列のみから構成されていてもよい。また、識別配列としては、確率的に出現頻度が低い塩基配列であれば特に制限されず、例えば約４〜２０塩基程度の任意の塩基配列を用いることができる。
【００３６】
ゲノムＤＮＡ１０に挿入する所望の塩基配列の長さは、例えば２０〜５００塩基であってもよく、例えば２０〜２００塩基であってもよく、例えば２０〜１００塩基であってもよい。
【００３７】
また、図１Ｃ〜図５の例では、ＤＮＡ断片４０を構成する各要素（Ｔ７プロモーター配列４２、識別配列４３及びトランスポザーゼ結合配列４１）は隣接しているが、各要素の間には任意の塩基配列のスペーサーが存在していてもよい。また、各要素の順序は図１Ｃ〜図５の例に示したものに限定されず、必要に応じて適宜入れ換えてもよいし、追加の要素を付加してもよい。
【００３８】
また、ＤＮＡ断片４０は、１本鎖であってもよく、２本鎖であってもよい。但し、使用するトランスポザーゼの特性により、トランスポザーゼ結合配列４１が２本鎖ＤＮＡである必要がある場合には、少なくともトランスポザーゼ結合配列４１は２本鎖である必要がある。
【００３９】
上述した反応により、固定された細胞標本を試料として、ＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍に所望の塩基配列のＤＮＡ断片を挿入した後、レーザーマイクロダイセクション等により細胞を切り出して回収し、１細胞レベルで後述する解析を行うこともできる。
【００４０】
（ＣｈＩＬＴ法により挿入したＤＮＡ断片を利用した解析）
ＣｈＩＬＴ法は、前記所望の塩基配列（図１Ｃ〜図５の例ではＴ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が連結した塩基配列）を起点としてＤＮＡ１０を遺伝子増幅し、増幅産物を得る工程と、前記増幅産物の塩基配列を解析する工程と、を更に備えていてもよい。これにより、所望のＤＮＡ断片が挿入されたゲノム上の位置を解析することができる。
【００４１】
（遺伝子増幅）
遺伝子増幅としては、例えば、挿入した塩基配列に相補的なプライマーとランダムプライマーとを組み合わせたＰＣＲ、ポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ等）を用いた転写等が挙げられる。本明細書において、「所望の塩基配列を起点として遺伝子増幅する」とは、結合領域１１の近傍に挿入された所望の塩基配列の一部又は全部を利用してゲノムＤＮＡ１０を遺伝子増幅することを意味する。
【００４２】
例えば、図１Ｃ〜図５の例では、ゲノムＤＮＡ１０に挿入した塩基配列にＴ７プロモーター配列４２が含まれている。そこで、「所望の塩基配列を起点として遺伝子増幅する」とは、上記のゲノムＤＮＡ１０にＴ７ポリメラーゼを作用させて転写することにより、Ｔ７プロモーター配列４２の下流のゲノムＤＮＡ１０をＲＮＡに転写することであってもよい。
【００４３】
あるいは、「所望の塩基配列を起点として遺伝子増幅する」とは、上記のゲノムＤＮＡ１０を鋳型として、挿入した塩基配列の一部又は全部に相補的な塩基配列を有するプライマーと、ランダムプライマーとを組み合わせたＰＣＲを行うこと等により、結合領域１１の近傍のゲノムＤＮＡ１０の塩基配列を遺伝子増幅することであってもよい。
【００４４】
すなわち、ＣｈＩＬＴ法では、挿入した塩基配列がプロモーター配列を含んでおり、遺伝子増幅が、プロモーター配列にＲＮＡポリメラーゼを接触させてプロモーター配列の下流のＤＮＡを転写してＲＮＡを生成することにより遺伝子増幅してもよい。なお、上述したように、図５（ｃ）に示す塩基配列は、Ｔ７プロモーター配列４２を有していないため、Ｔ７ポリメラーゼを作用させても遺伝子増幅（転写）されることはない。
【００４５】
あるいは、挿入した所望の塩基配列を利用したＰＣＲ等により遺伝子増幅してもよい。なお、上述したように、図５（ｃ）に示す塩基配列は、所望の塩基配列（Ｔ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が結合した塩基配列）を有していないため、塩基配列を利用したＰＣＲ反応を行っても遺伝子増幅されることはない。
【００４６】
（識別配列）
図６（ａ）は、図４又は図５（ａ）に示すＤＮＡ１０にＴ７ポリメラーゼを作用させて、Ｔ７プロモーター配列４２の下流のＤＮＡ１０をＲＮＡ６０に転写した状態を示す図である。また、図６（ｂ）は、図５（ｂ）に示すＤＮＡ１０にＴ７ポリメラーゼを作用させて、Ｔ７プロモーター配列４２の下流のＤＮＡ１０をＲＮＡ６０に転写した状態を示す図である。
【００４７】
図６（ａ）、（ｂ）の例では、Ｔ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が導入されている。すなわち、ＣｈＩＬＴ法では、所望の塩基配列は、プロモーター配列の下流に識別配列を更に含んでいてもよい。
【００４８】
図６（ａ）、（ｂ）の例では、Ｔ７プロモーター配列４２の下流に識別配列４３が導入されているため、ＲＮＡ６０は、識別配列４３の相補鎖４３’及び識別配列４３の下流のＤＮＡ１０の相補鎖１０’を含んでいる。
【００４９】
ゲノムＤＮＡにＴ７ＲＮＡポリメラーゼを作用させると、上記の反応により挿入したＴ７プロモーター配列４２以外の領域からＲＮＡが転写されてしまう場合がある。これに対し、識別配列４３が存在することにより、挿入したＴ７プロモーター配列４２を起点として転写されたＲＮＡとそれ以外のＲＮＡとを識別することが可能になる。すなわち、識別配列４３の相補鎖４３’を有するＲＮＡ６０は、挿入したＴ７プロモーター配列４２を起点として転写されたＲＮＡであると判断することができる。
【００５０】
また、上述したように、ＣｈＩＬＴ法では、同時に複数のＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質を用いた解析を行うことができる。ここで、各特異的結合物質を利用してＤＮＡ１０に挿入されるＤＮＡ断片４０に、それぞれ異なる識別配列４３を導入しておくことにより、いずれのＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍から転写されたＲＮＡであるかを識別することも可能になる。
【００５１】
続いて、転写されたＲＮＡ６０の塩基配列を解析することにより、ＤＮＡ結合タンパク質が結合したゲノム上の位置を特定することができる。ＲＮＡ６０の塩基配列の解析は、例えば、次世代シークエンサーにより行ってもよいし、ＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーションにより行ってもよい。
【００５２】
上述した図６（ａ）、（ｂ）の例では、ＲＮＡ６０に転写される領域が互いに異なっているが、いずれの例においても、ＲＮＡ６０は結合領域１１の近傍から転写されるＲＮＡである。したがって、ＲＮＡ６０の塩基配列を解析することにより、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質（図１〜６の例ではヒストン２０）の結合領域のゲノム上の位置を特定することができる。すなわち、所望の塩基配列が挿入される向きは、解析結果に影響しない。
【００５３】
［結合体］
１実施形態において、本発明は、トランスポザーゼ結合配列と所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片と、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質又は前記特異的結合物質に対する特異的結合物質との結合体を提供する。
【００５４】
本実施形態の結合体は、ＤＮＡ分子に結合したＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍への、所望の塩基配列の挿入用であるということができる。
【００５５】
本実施形態の結合体において、トランスポザーゼ結合配列、所望の塩基配列、特異的結合物質については、上述したものと同様である。すなわち、所望の塩基配列はプロモーター配列を含んでいてもよい。また、所望の塩基配列はプロモーター配列の下流に識別配列を更に含んでいてもよい。
【００５６】
本実施形態の結合体において、ＤＮＡ断片は、リンカーを介してＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質又は前記特異的結合物質に対する特異的結合物質と結合していることが好ましい。リンカーについては上述したものと同様である。
【００５７】
本実施形態の結合体において、「上記のＤＮＡ断片と、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質との結合体」とは、例えば、１次抗体に上記のＤＮＡ断片が結合した結合体を意味する。すなわち、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質に直接上記のＤＮＡ断片が結合した結合体を意味する。
【００５８】
また、本実施形態の結合体において、「上記のＤＮＡ断片と、ＤＮＡ結合タンパク質に対する前記特異的結合物質に対する特異的結合物質との結合体」とは、例えば、２次抗体にＤＮＡ断片が結合した結合体を意味する。すなわち、本実施形態では、上記のＤＮＡ断片は、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質には結合しておらず、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質に結合する特異的結合物質に結合している。より具体的には、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質がマウスＩｇＧであった場合、上記のＤＮＡ断片と抗マウスＩｇＧ抗体との結合体等が挙げられる。
【００５９】
特異的結合物質１分子あたりの上記のＤＮＡ断片の数は特に制限されず、例えば１〜１０個であってもよい。
【００６０】
特異的結合物質にＤＮＡ断片を結合する方法は特に制限されず、例えば、スクシンイミド基、マレイミド基等を有する化学架橋剤を用いて結合してもよい。例えば、ＤＮＡ断片の５’末端にアミノ基を結合させておき、当該アミノ基と特異的結合物質に存在するアミノ基、カルボキシ基等の官能基を適宜の化学架橋剤で共有結合することが挙げられる。あるいは、例えば、アビジンとビオチンの結合等を利用して特異的結合物質にＤＮＡ断片を結合させてもよい。
【実施例】
【００６１】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６２】
［実験例１］
従来法であるＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析により、約１０００個のマウス骨格筋芽細胞を用いて、ＤＮＡ結合タンパク質である、リジン４トリメチル化修飾されたヒストンＨ３（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）の、ゲノムＤＮＡ上の結合位置を解析した。【００６３】
（可溶性クロマチン分画の調製）
マウス骨格筋芽細胞１０００個を１ｍＬの培地に懸濁し、１．５ｍＬシリコナイズチューブに入れた。続いて、１００μＬの固定溶液（３７％ホルムアルデヒド）を添加し、５分間、室温で静置し、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質とをクロスリンクした。【００６４】
続いて、１００μＬの１Ｍグリシン水溶液を添加し、５分間室温で撹拌した。これにより、グリシンと残存したホルムアルデヒドとを反応させて、クロスリンク反応を停止させた。続いて、３０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心し、上清を除去し、更にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で細胞を２回洗浄した。【００６５】
続いて、２ｍＬのＣｈＩＰバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２００ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．５％ＮＰ４０，ＰＭＳＦ，アプロチニン、ロイぺプチン）を添加して細胞を懸濁し、氷上で１０分間静置した。【００６６】
続いて、超音波細胞破砕装置を用いて、氷水で冷却しながら超音波処理を行い、ＤＮＡを断片化した。【００６７】
続いて、マイクロコッカルヌクレアーゼを加え、４０分間、３７℃で酵素処理を行った。続いて、終濃度１０ｍＭとなるようにＥＤＴＡを加えて反応を停止させた。続いて、１５，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心し、上清を２ｍＬシリコナイズチューブに回収した。続いて、ＣｈＩＰバッファーを加えて希釈し、可溶性クロマチン分画を得た。【００６８】
（免疫沈降）
上記の可溶性クロマチン分画に、２μｇのウサギ抗マウスＩｇＧ抗体と２μｇのマウス抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体とを予め反応させた抗体複合体溶液と、２０μＬのヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体が結合した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０）とを添加し、ローテーターで一晩、４℃で撹拌した。【００６９】
続いて、マグネティックスタンドに反応溶液をセットして１分間静置し、磁性粒子を回収した。続いて、回収した磁性粒子を、ＣｈＩＰバッファーで３回、洗浄バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５００ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．５％ＮＰ４０）で３回、１×ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））で３回洗浄した。【００７０】
（ＤＮＡの精製）
１００μＬのＣｈＩＰ溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ）を上記の磁性粒子に加え、ボルテックスミキサーで懸濁し、更に５Ｍ  ＮａＣｌ  ５μＬを添加した。続いて、６５℃で４時間以上加熱し、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質のクロスリンクをはずした。【００７１】
続いて、０．５μＬの１０ｍｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅＡを添加し、ボルテックスミキサーで撹拌し、３７℃で３０分インキュベートした。続いて、１μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを添加し、ボルテックスミキサーで撹拌し、５０℃で１時間インキュベートした。続いて、ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてＤＮＡを精製した。【００７２】
（塩基配列の解析）
続いて、次世代シークエンサーにより回収されたＤＮＡの塩基配列を解析した。【００７３】
（結果）
図７（ａ）は、従来法であるＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析により、約１０００個の細胞を用いてＥｅｆ１ａ１遺伝子座へのＨ３Ｋ４ｍｅ３の結合をマッピングした結果を示すグラフである。【００７４】
［実験例２］
マウス骨格筋芽細胞を用いて、ＣｈＩＬＴ法により、ＤＮＡ結合タンパク質である、リジン４トリメチル化修飾されたヒストンＨ３（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）の、ゲノムＤＮＡ上の結合位置を１細胞レベルで解析した。【００７５】
（細胞の固定）
まず、スライドガラスにマウス骨格筋芽細胞を播種した。続いて、１６時間培養後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した。続いて、１％パラホルムアルデヒド溶液を添加して室温で５分間静置し、細胞を固定後、ＰＢＳで洗浄した。【００７６】
（ＤＮＡ断片のＨ３Ｋ４ｍｅ３結合領域への近接）
続いて、固定した細胞試料にブロッキング剤（商品名「Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ−Ｐ」、ナカライテスク社）を加え室温で１０分間静置後、ＰＢＳで洗浄した。続いて、０．１×Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ−Ｐで希釈した抗体複合体（２μｇ／ｍＬ抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体及び核酸標識２次抗体を予め反応させたもの）を添加し、３７℃で２時間反応させた後、ＰＢＳで洗浄した。この結果、核酸標識２次抗体に標識したＤＮＡ断片とゲノムＤＮＡ上のＨ３Ｋ４ｍｅ３結合領域とが近接した。【００７７】
ここで、核酸標識２次抗体に標識したＤＮＡ断片は、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片と、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片とをアニーリングさせたものであった。【００７８】
配列番号１に記載の塩基配列において、第４９〜６７番目の塩基配列はＴＮ５トランスポザーゼの結合配列であり、第７〜２６番目の塩基配列はＴ７プロモーター配列であり、第２７〜３４番目の塩基配列は識別配列であり、第１〜６塩基はリンカーの一部の塩基配列であった。【００７９】
また、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片は、配列番号１に記載の塩基配列における第４９〜６７番目の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ断片であり、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片とアニールすることにより、２本鎖ＤＮＡであるＴＮ５トランスポザーゼの結合配列を形成した。【００８０】
（トランスポザーゼの結合）
続いて、試料にＴＮ５トランスポザーゼを８５μｇ／ｍＬずつ添加し、室温で１０分間放置した。これにより、核酸標識２次抗体に標識されたＤＮＡ断片中のトランスポザーゼ結合配列にトランスポザーゼが結合した。【００８１】
（トランスポザーゼの活性化及び所望の塩基配列の挿入）
続いて、試料に、トランスポザーゼ結合配列を有する遊離のＤＮＡ断片（以下、「ｏｌｉｇｏ３−４」という。）を添加し、室温で１時間反応させた後、ＰＢＳで洗浄した。ｏｌｉｇｏ３−４は、配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片と、配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片とをアニーリングさせたものであった。ｏｌｉｇｏ３−４の２本鎖ＤＮＡ領域は、ＴＮ５トランスポザーゼの結合配列であった。【００８２】
続いて、試料を１×ＴＮ５透析バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．２），０．１Ｍ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１０％グリセロール）で洗浄した。【００８３】
続いて、試料に１×ＴＡＰＳ−ＤＭＦバッファー（１０ｍＭ  ＴＡＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．５），５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）を添加し、３７℃で１時間静置した。これにより、核酸標識２次抗体に標識されたＤＮＡ断片に結合したトランスポザーゼが活性化し、核酸標識２次抗体に標識されたＤＮＡ断片がゲノムＤＮＡ上のＨ３Ｋ４ｍｅ３結合領域の近傍に挿入された。【００８４】
続いて、１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を添加し、室温で１０分間静置したのち、ＰＢＳで洗浄した。これにより、トランスポザーゼを失活させて除去した。【００８５】
続いて、１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応バッファーで洗浄し、ｆｉｌｌ  ｉｎ反応溶液（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘ，Ｔ４ＤＮＡリガーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼＩ）を加え室温で３０分間反応させた。これにより、核酸標識２次抗体に標識されたＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡ上のＨ３Ｋ４ｍｅ３結合領域の近傍に確実に挿入させた。【００８６】
続いて、１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を添加し、室温で１０分間静置したのち、ＰＢＳで洗浄した。これにより、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼＩを失活させて除去した。【００８７】
（１細胞の切り出し）
続いて、レーザーマイクロダイセクションにより、対象細胞を１個ずつ切り出し、それぞれマイクロチューブに回収した。【００８８】
（遺伝子増幅）
ここでは、遺伝子増幅として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写を行った。まず、切り出した各細胞を１×Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼバッファーで洗浄した。続いて、インビトロ転写溶液（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼバッファー，ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ，ＵＴＰ，ＲＮａｓｅインヒビター，Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）を加え、３７℃で１６時間反応させた。これにより、挿入したＤＮＡ断片に含まれていたＴ７ＲＮＡプロモーター配列を起点として、ゲノムＤＮＡが転写された。【００８９】
続いて、ＤＮａｓｅＩを加え３７℃で３０分間反応させた。これにより、回収した細胞中に含まれていたＤＮＡが分解された。続いて、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社）により転写されたＲＮＡを精製した。【００９０】
（回収したＲＮＡの塩基配列解析）
続いて、精製したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを調製し、次世代シークエンサーを用いて塩基配列を解析し、ゲノム上にマッピングした。【００９１】
（結果）
図７（ｂ）〜（ｄ）は、それぞれ、Ｅｅｆ１ａ１遺伝子座へのＨ３Ｋ４ｍｅ３の結合を、ＣｈＩＬＴ法により１細胞レベルで解析してマッピングした代表的な結果を示すグラフである。【００９２】
その結果、図７（ｂ）〜（ｄ）に示すように、個々の細胞によって、Ｅｅｆ１ａ１遺伝子座へのＨ３Ｋ４ｍｅ３の結合に差があることが明らかとなった。このような結果は、図７（ａ）の１０００個の細胞を用いたＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析では検出することができず、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との結合を１細胞レベルで解析してはじめて検出することができたものである。【００９３】
［実験例３］
ＣｈＩＬＴ法により、様々なＤＮＡ結合タンパク質のゲノムＤＮＡ上の結合を１細胞レベルで解析した。細胞としてマウス骨格筋芽細胞を用いた。また、１次抗体として、下記表１に示す抗ＤＮＡ結合タンパク質抗体を使用した。また、２次抗体として、実験例２で用いたものと同様のＤＮＡ断片で標識した、抗マウスＩｇＧ抗体又は抗ウサギＩｇＧ抗体を使用した。【００９４】
【表１】
2018042776.tif 000003
【００９５】
（細胞の固定）
実験例２と同様にして、スライドガラス上でマウス骨格筋芽細胞を培養して固定し、ＰＢＳで洗浄した。【００９６】
（抗体複合体の反応）
続いて、実験例２と同様にして、固定した細胞試料にブロッキング剤（商品名「Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ−Ｐ」、ナカライテスク社）を加え室温で１０分間静置後、ＰＢＳで洗浄した。続いて、０．１×Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ−Ｐで希釈した抗体複合体（１次抗体及び核酸標識２次抗体を予め反応させたもの）を添加し、３７℃で２時間反応させた後、ＰＢＳで洗浄した。【００９７】
抗体複合体は、１次抗体がマウス抗体である場合には２次抗体に核酸標識マウス抗体を反応させて調製した。また、１次抗体がウサギ抗体である場合には２次抗体に核酸標識ウサギ抗体を反応させて調製した。【００９８】
また、陰性対照として、核酸標識抗マウスＩｇＧ抗体のみ、又は核酸標識抗ウサギＩｇＧ抗体のみを反応させたサンプルも調製した。すなわち、１次抗体を反応させなかったサンプルを陰性対照として調製した。その後、トランスポザーゼの結合、トランスポザーゼの活性化及び所望の塩基配列の挿入を実験例２と同様にして行った。【００９９】
（１細胞の切り出し）
続いて、レーザーマイクロダイセクションにより、対象細胞を１個ずつ切り出し、それぞれマイクロチューブに回収した。【０１００】
（遺伝子増幅及び塩基配列解析）
回収した各細胞について、実験例２と同様にしてＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写を行い、転写されたＲＮＡを精製した。続いて、精製したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを調製し、次世代シークエンサーを用いて塩基配列を解析し、ゲノム上にマッピングした。【０１０１】
（結果）
図８Ａは、表１に示す様々な１次抗体を用いたＣｈＩＬＴ法により、ＤＮＡ結合タンパク質の結合を１細胞レベルで解析してマッピングした結果を示すグラフである。各抗体複合体につき２細胞ずつ解析を行った。【０１０２】
図８Ａ中、グラフの横軸は次世代シークエンサーにより得られたリード数を表す。また、「Ｖａｌｉｄ」はゲノム上に有効にマッピングされたリードを表し、「Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ」はゲノム上の同一位置にマッピングされたリードが２個存在したリードを表し、「Ｍｕｌｔｉ」はゲノム上の同一位置にマッピングされたリードが３個以上存在したリードを表し、「Ｕｎｍａｐｐｅｄ」はゲノム上にマッピングされなかったリードを表し、「Ｎｅｘｔｅｒａ」は塩基配列解析に使用したライブラリーに由来するリードを表す。【０１０３】
図８Ａ中、例えば「ｒＨ３Ｋ２７ｍｅ３」はｒＨ３Ｋ２７ｍｅ３抗体と核酸標識抗ウサギＩｇＧ抗体との複合体を反応させた結果であることを表し、以下同様である。また、例えば「ｍＨ３Ｋ４ｍｅ３−ｒＨ３Ｋ２７ｍｅ３」はｍＨ３Ｋ４ｍｅ３抗体と核酸標識抗マウスＩｇＧ抗体との複合体、及びｒＨ３Ｋ２７ｍｅ３抗体と核酸標識抗ウサギＩｇＧ抗体との複合体を同時に反応させた結果であることを表し、以下同様である。また、「＃１」、「＃２」は、それぞれ、解析した２細胞のうちの第１の細胞の結果及び第２の細胞の結果であることを表す。【０１０４】
その結果、１次抗体を使用しなかった陰性対照ではほとんどリードが得られておらず、１次抗体の反応依存的にリードが得られたことが確認された。また、細胞内に存在するヒストン修飾や転写因子の量に応じたリードが得られたことが確認された。【０１０５】
図８Ｂは、図８Ａのグラフの横軸を、「Ｖａｌｉｄ」、「Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ」、「Ｍｕｌｔｉ」、「Ｕｎｍａｐｐｅｄ」、「Ｎｅｘｔｅｒａ」の各リードの存在割合に変更したグラフである。その結果、核酸標識抗マウスＩｇＧ抗体、又は核酸標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用いたＣｈＩＬＴ法により、約５０〜８５％の有効リードを得ることができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明によれば、免疫沈降を行うことなく、タンパク質と特定のゲノム領域との結合を解析することができる技術を提供することができる。したがって、例えば不溶性タンパク質等の、免疫沈降を行うことが困難なタンパク質のＤＮＡへの結合を解析することが可能になる。また、少数細胞等を試料とした解析も容易になる。
【符号の説明】
【０１０７】
１０…ゲノムＤＮＡ、１０’…ゲノムＤＮＡ１０の相補鎖、１１…結合領域、２０…ヒストン、３０…特異的結合物質、４０…ＤＮＡ断片、４１…トランスポザーゼ結合配列、４１’…トランスポザーゼ結合配列４１の相補鎖、４２…Ｔ７プロモーター配列、４３…識別配列、４３’…識別配列４３の相補鎖、４４…リンカー、４４’…リンカー４４の一部に由来する塩基配列、４５…任意配列、５０…トランスポザーゼ、６０…ＲＮＡ、Ｓ…細胞標本。
【図１Ａ】
2018042776.tif 000004
【図１Ｂ】
2018042776.tif 000005
【図１Ｃ】
2018042776.tif 000006
【図２】
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【図３】
2018042776.tif 000008
【図４】
2018042776.tif 000009
【図５】
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【図６】
2018042776.tif 000011
【図７】
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【図８Ａ】
2018042776.tif 000013
【図８Ｂ】
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【配列表】
2018042776000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月6日(2018.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定した細胞のＤＮＡ分子に結合したＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍に所望の塩基配列のＤＮＡ断片を挿入する方法であって、
前記ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質を利用して、トランスポザーゼ結合配列と前記所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片と、前記結合領域とを近接させる工程と、
前記トランスポザーゼ結合配列にトランスポザーゼを結合させる工程と、
前記トランスポザーゼを活性化し、その結果、前記所望の塩基配列のＤＮＡ断片が前記結合領域の近傍に挿入される工程と、
を備える方法。
【請求項２】
前記所望の塩基配列を起点として前記ＤＮＡ分子を遺伝子増幅し、増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物の塩基配列を解析する工程と、
を更に備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記所望の塩基配列がプロモーター配列を含み、
前記遺伝子増幅が、前記プロモーター配列にＲＮＡポリメラーゼを接触させて前記プロモーター配列の下流のＤＮＡを転写してＲＮＡを生成することにより行われる、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記所望の塩基配列が前記プロモーター配列の下流に識別配列を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
トランスポザーゼ結合配列と所望の塩基配列とを含む塩基配列を有する第１のＤＮＡ断片と、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質又は前記特異的結合物質に対する特異的結合物質との結合体であって、前記第１のＤＮＡ断片の前記トランスポザーゼ結合配列には第１のトランスポザーゼが結合しており、前記第１のトランスポザーゼには第２のトランスポザーゼが結合してダイマーを形成しており、前記第２のトランスポザーゼにはトランスポザーゼ結合配列を有する第２のＤＮＡ断片が結合している、結合体。
【請求項６】
前記所望の塩基配列がプロモーター配列を含む、請求項５に記載の結合体。
【請求項７】
前記所望の塩基配列が前記プロモーター配列の下流に識別配列を更に含む、請求項６に記載の結合体。
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月9日(2018.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラホルムアルデヒド又はホルムアルデヒドで固定した細胞のＤＮＡ分子に結合したＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍に所望の塩基配列のＤＮＡ断片を挿入する方法であって、
前記ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質を利用して、トランスポザーゼ結合配列と前記所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片と、前記結合領域とを、ｉｎ  ｓｉｔｕで近接させる工程と、
前記トランスポザーゼ結合配列にトランスポザーゼを結合させる工程と、
前記トランスポザーゼを活性化し、その結果、前記所望の塩基配列のＤＮＡ断片が前記結合領域の近傍に挿入される工程と、
を備える方法。
【請求項２】
前記所望の塩基配列を起点として前記ＤＮＡ分子を遺伝子増幅し、増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物の塩基配列を解析する工程と、
を更に備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記所望の塩基配列がプロモーター配列を含み、
前記遺伝子増幅が、前記プロモーター配列にＲＮＡポリメラーゼを接触させて前記プロモーター配列の下流のＤＮＡを転写してＲＮＡを生成することにより行われる、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記所望の塩基配列が前記プロモーター配列の下流に識別配列を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
パラホルムアルデヒド又はホルムアルデヒドで固定した細胞のＤＮＡ分子に結合したＤＮＡ結合タンパク質の結合領域の近傍に所望の塩基配列のＤＮＡ断片をｉｎ  ｓｉｔｕで挿入するための組成物であって、
前記組成物は、結合体及び緩衝液を含み、前記結合体は、トランスポザーゼ結合配列と前記所望の塩基配列とを含む塩基配列を有する第１のＤＮＡ断片と、ＤＮＡ結合タンパク質に対する特異的結合物質又は前記特異的結合物質に対する特異的結合物質とが共有結合で結合した結合体であって、前記第１のＤＮＡ断片の前記トランスポザーゼ結合配列には第１のトランスポザーゼが結合しており、前記第１のトランスポザーゼには第２のトランスポザーゼが結合してダイマーを形成しており、前記第２のトランスポザーゼにはトランスポザーゼ結合配列を有する第２のＤＮＡ断片が結合している、組成物。
【請求項６】
前記所望の塩基配列がプロモーター配列を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記所望の塩基配列が前記プロモーター配列の下流に識別配列を更に含む、請求項６に記載の組成物。
【国際調査報告】
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