(57)【要約】ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的な反応を示す抗体が提供された。また、当該抗体によるジスルフィド型ＨＭＧＢ１を特異的に測定する方法および測定用キットまたは試薬が提供された。さらに、当該抗体およびジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体による全てのＨＭＧＢ１の測定方法および測定用キットまたは試薬が提供された。
2018079393.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体。
【請求項２】
ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の２３番目のシステイン（Ｃ２３）と４５番目のシステイン（Ｃ４５）によるジスルフィド結合を含む抗原決定基を認識する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＭＤ−２への結合活性を有するジスルフィド型ＨＭＧＢ１および／またはサイトカイン誘導能を持つジスルフィド型ＨＭＧＢ１に対する中和活性を有する、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１９で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１８６の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１９で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１８６の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体であって、
配列番号：２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
配列番号：２７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、
配列番号：２９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
配列番号：３１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、および
配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２を含む、
請求項１〜３のいずれかに記載の抗体。
【請求項５】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１９で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１８６の重鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１９で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１８６の軽鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体であって、配列番号：４７または７０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４９または７２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。
【請求項６】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１９で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１８６。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗体の低分子化抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗体の断片であって、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に対して特異的な結合活性を有する断片。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗体のキメラ抗体またはヒト化抗体。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗体のヒト抗体。
【請求項１１】
請求項１〜６に記載の抗体の可変領域をコードするDNAを定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込み、当該ベクターを宿主に導入し、抗体の可変領域および定常領域を産生させる工程を含む、請求項９に記載の抗体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜７、９および１０のいずれかに記載の抗体と試料とを接触させる工程を含む、該試料中のジスルフィド型ＨＭＧＢ１の測定または検出方法。
【請求項１３】
ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の測定または検出を免疫試験方法によって行うことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜７、９および１０のいずれかに記載の抗体を含む、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の測定または検出用キットまたは試薬。
【請求項１５】
免疫試験方法において使用するための、請求項１４に記載のキットまたは試薬。
【請求項１６】
以下（ａ）および（ｂ）に記載の抗体と試料とを接触させる工程を含む、該試料中の全てのＨＭＧＢ１の測定または検出方法： 
（ａ）請求項１〜７、９および１０のいずれかに記載の抗体、および
（ｂ）ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体。
【請求項１７】
全てのＨＭＧＢ１がジスルフィド型ＨＭＧＢ１、還元型ＨＭＧＢ１およびトロンビン分解ＨＭＧＢ１を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の２番目のグリシン（Ｇ２）と１７番目のアラニン（Ａ１７）の間のアミノ酸残基を含む抗原決定基を認識する抗体である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体であって、
配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号：５５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む抗体である、
請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の軽鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体であって、配列番号：６３または７４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体である、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６である、請求項１６〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
全てのＨＭＧＢ１の測定または検出を免疫試験方法によって行うことを特徴とする、請求項１６〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
以下（ａ）および（ｂ）に記載の抗体を含む、試料中の全てのＨＭＧＢ１の測定または検出用キットまたは試薬：
（ａ）請求項１〜７、９および１０のいずれかに記載の抗体、および
（ｂ）ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体。
【請求項２４】
全てのＨＭＧＢ１がジスルフィド型ＨＭＧＢ１、還元型ＨＭＧＢ１およびトロンビン分解ＨＭＧＢ１を含む、請求項２３に記載のキットまたは試薬。
【請求項２５】
ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の２番目のグリシン（Ｇ２）と１７番目のアラニン（Ａ１７）の間のアミノ酸残基を含む抗原決定基を認識する抗体である、請求項２３または２４に記載のキットまたは試薬。
【請求項２６】
ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体であって、
配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号：５５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む抗体である、
請求項２３〜２５のいずれかに記載のキットまたは試薬。
【請求項２７】
ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の軽鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体であって、配列番号：６３または７４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体である、請求項２３〜２６のいずれかに記載のキットまたは試薬。
【請求項２８】
ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６である、請求項２３〜２７のいずれかに記載のキットまたは試薬。
【請求項２９】
免疫試験方法において使用するための、請求項２３〜２８のいずれかに記載のキットまたは試薬。
【請求項３０】
ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体。
【請求項３１】
ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の２番目のグリシン（Ｇ２）と１７番目のアラニン（Ａ１７）の間のアミノ酸残基を含む抗原決定基を認識する、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３２】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体であって、
配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号：５５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、
請求項３０または３１に記載の抗体。
【請求項３３】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の軽鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体であって、配列番号：６３または７４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項３０〜３２のいずれかに記載の抗体。
【請求項３４】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６。
【請求項３５】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２１で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＣＰ１１−１。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症反応を惹起しTNFなどのサイトカインを放出するジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的な抗体、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の測定方法および測定試薬、ならびに、還元型ＨＭＧＢ１、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１、トロンビン分解ＨＭＧＢ１等の全てのＨＭＧＢ１を定量することが可能な測定方法および測定試薬等に関する。本発明は臨床検査、臨床病理学、免疫学、医学などの生命科学分野、とくに炎症や敗血症など重篤な病態の治療、診断、研究等の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈｉｇｈ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＯＸ１（以下「ＨＭＧＢ１」）は、クロマチン構造に含まれる非ヒストンタンパク質であり、多くの高等動植物に共通して含まれるタンパク質である。ＨＭＧＢ１は樹状細胞や単球などに作用し、成熟化・浸潤・サイトカインや炎症メディエーターの放出を誘導する。【０００３】
１９９９年、Ｗａｎｇら（非特許文献１）により、ＨＭＧＢ１が敗血症のマーカーとなり得ることが示され、ＨＭＧＢ１は敗血症性ショック時の晩期に発現するメディエーターとして注目されるようになった。また、ＨＭＧＢ１は、敗血症発症時に核外へと遊離され、重度の細胞障害性を示すことから、敗血症時の致死性に関与する可能性が指摘されている。【０００４】
敗血症とは、細菌感染などの外因性因子、pathogen-associated molecular patterns（病原体関連分子パターン：PAMPs）、生体内で生じた壊死細胞、障害を受けた組織由来の分子類（Damage Associated Molecular Patterns：DAMPs）等により、内因性炎症メディエーターであるサイトカインが血流へ放出され、全身症状を伴う急性炎症反応である。ＨＭＧＢ１はDAMPsの一種であると考えられている。【０００５】
一方、ＨＭＧＢ１は、複数の酸化還元状態で存在し、ＨＭＧＢ１のジスルフィド型のみが炎症を引き起こすことが知られている（非特許文献２）。Yangらは、ＨＭＧＢ１のジスルフィド型のみがin vitroにおいて高い親和性でMD-2に結合し、マウスマクロファージが、炎症性サイトカイン腫瘍壊死因子（TNF）を分泌するのを促進することを発見した（非特許文献３）。また、還元型のＨＭＧＢ１はケモカイン誘導能を持つことが知られている（非特許文献４）。【０００６】
また、ＷＯ２０１４/１４７８７３  Ａ１（特許文献１）では、ＨＭＧＢ１はトロンビンにより１０番目のアルギニン（Ｒ１０）と１１番目のグリシン（Ｇ１１）の間で切断され（全長ＨＭＧＢ１からＨＭＧＢ１のＮ末端側のアミノ酸Ｍ１−Ｒ１０が切断され）、新たに露呈したＮ末端アミノ酸残基「ＧＫＭＳＳ・・・」を有するＨＭＧＢ１の分解物が生じることが報告され、当該分解物がｄｅｓ−ＨＭＧＢ１と名付けられている。また、ＷＯ２０１４/１４７８７３  Ａ１では、ｄｅｓ−ＨＭＧＢ１は不活性化され、細胞障害性が低くなることが報告されている。【０００７】
敗血症等の重篤な患者の状態を把握し、必要に応じて血液浄化療法を行うなどの治療介入の為にはジスルフィド型ＨＭＧＢ１の測定が特に重要である。また、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に加え、分解されたｄｅｓ−ＨＭＧＢ１や還元型ＨＭＧＢ１などを含め、全ＨＭＧＢ１量とジスルフィド型ＨＭＧＢ１量の比などを検討する事で、患者の病態背景の正確な把握などが可能となる。しかしながら、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１のみを特異的に測定出来るキットや、様々な構造の異なるＨＭＧＢ１を測定出来るキットは未だ存在しなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２０１４/１４７８７３  Ａ１公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＳＣＩＥＮＣＥ、 ２８５、２４８〜２５１、１９９９
【非特許文献２】Journal of Leukocyte Biology, Volume 93, page 865-873, June 2013
【非特許文献３】The Journal of Experimental Medicine, Vol. 212, No. 1, 5-14, 2015
【非特許文献４】The Journal of Experimental Medicine, Vol. 209 No. 9 1519-1528, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
前述したように、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１のみを特異的に認識する抗体や、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１のみを特異的に測定出来るキット、様々な構造の異なるＨＭＧＢ１を測定出来るキットはこれまで存在しなかった。そのため、これまでは、サイトカイン誘導能のあるジスルフィド型ＨＭＧＢ１も、その他の生理活性が乏しい構造を持ったＨＭＧＢ１と同時に量り込まれていた可能性が有る。したがって、ＨＭＧＢ１の血中濃度と病態との関連性を正確に把握できていなかった可能性を否定できない。【００１１】
また、モノクローナル抗体などの作製の際ペプチド等を用いて免疫する事があるが、抗原が酸化されて期待しない構造をとってしまうことがあるため、通常、Cysが複数個入っている部分を免疫原として使用することは避けられる。また、抗体産生のためには抗原が細胞内でプロセシングされて、抗原提示細胞に提示される必要があるが、その際にも、抗原が酸化還元されて期待しない構造を取ることが考えられる。したがって、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１を含め、ジスルフィド結合を有する構造を認識する抗体は、一般的に作製が困難である。【００１２】
このように、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１を特異的に測定する手段の確立が求められている一方で、ジスルフィド結合を有するＨＭＧＢ１に対する抗体の作成は困難であった。また、患者の病態背景の正確な把握のためには、様々な構造の異なるＨＭＧＢ１を測定する必要がある。
本発明はこのような状況を鑑みてなされたものであり、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１特異的抗体、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の測定方法および測定試薬、ならびに、還元型ＨＭＧＢ１、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１、トロンビン分解ＨＭＧＢ１（ｄｅｓ−ＨＭＧＢ１）等の全てのＨＭＧＢ１を定量することが可能な測定方法および測定試薬等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を行った。その結果、本発明者らは、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的な反応を示す抗体を見出すとともに、当該抗体を使用してジスルフィド型ＨＭＧＢ１を特異的に測定する方法を確立した。また本発明者らは、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１特異的抗体と、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１および還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体等、複数の特徴的な抗体を組み合わせることで、全ＨＭＧＢ１を定量できる測定法を作製した。本発明はこのような知見に基づくものであり、以下〔１〕から〔３５〕に関する。【００１４】
〔１〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体。
〔２〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の２３番目のシステイン（Ｃ２３）と４５番目のシステイン（Ｃ４５）によるジスルフィド結合を含む抗原決定基を認識する、〔１〕に記載の抗体。
〔３〕ＭＤ−２への結合活性を有するジスルフィド型ＨＭＧＢ１および／またはサイトカイン誘導能を持つジスルフィド型ＨＭＧＢ１に対する中和活性を有する、〔１〕または〔２〕に記載の抗体。
〔４−１〕受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１９で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１８６の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１９で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１８６の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の抗体。
〔４−２〕配列番号：２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＣＤＲ１、配列番号：２７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＣＤＲ２、配列番号：２９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＣＤＲ３、配列番号：３１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖のＣＤＲ１、配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖のＣＤＲ２を含む、〔１〕〜〔４−１〕のいずれかに記載の抗体。
〔４−３〕配列番号：３５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＦＲ１、配列番号：３７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＦＲ２、配列番号：３９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＦＲ３、配列番号：４１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖のＦＲ１、配列番号：４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖のＦＲ２、配列番号：４５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖のＦＲ３を含む、〔１〕〜〔４−２〕のいずれかに記載の抗体。
〔５−１〕受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１９で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１８６の重鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１９で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１８６の軽鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、〔１〕〜〔４−３〕のいずれかに記載の抗体。
〔５−２〕配列番号：４７または７０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４９または７２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、〔１〕〜〔５−１〕のいずれかに記載の抗体。
〔６〕受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１９で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１８６。
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の抗体の低分子化抗体。
〔８〕〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の抗体の断片であって、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に対して特異的な結合活性を有する断片。
〔９〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の抗体のキメラ抗体またはヒト化抗体。
〔１０〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の抗体のヒト抗体。
〔１１〕〔１〕〜〔６〕に記載の抗体の可変領域をコードするDNAを定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込み、当該ベクターを宿主に導入し、抗体の可変領域および定常領域を産生させる工程を含む、〔９〕に記載の抗体の製造方法。
〔１２〕〔１〕〜〔７〕、〔９〕および〔１０〕のいずれかに記載の抗体と試料とを接触させる工程を含む、該試料中のジスルフィド型ＨＭＧＢ１の測定または検出方法。
〔１３〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の測定または検出を免疫試験方法によって行うことを特徴とする、〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕〔１〕〜〔７〕、〔９〕および〔１０〕のいずれかに記載の抗体を含む、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の測定または検出用キットまたは試薬。
〔１５〕免疫試験方法において使用するための、〔１４〕に記載のキットまたは試薬。
〔１６〕以下（ａ）および（ｂ）に記載の抗体と試料とを接触させる工程を含む、該試料中の全てのＨＭＧＢ１の測定または検出方法： 
（ａ）〔１〕〜〔７〕、〔９〕および〔１０〕のいずれかに記載の抗体、および
（ｂ）ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体。
〔１７〕全てのＨＭＧＢ１がジスルフィド型ＨＭＧＢ１、還元型ＨＭＧＢ１およびトロンビン分解ＨＭＧＢ１を含む、〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の２番目のグリシン（Ｇ２）と１７番目のアラニン（Ａ１７）の間のアミノ酸残基を含む抗原決定基を認識する抗体である、〔１６〕または〔１７〕に記載の方法。
〔１９−１〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体である、〔１６〕〜〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔１９−２〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＣＤＲ１、配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＣＤＲ２、配列番号：５５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＣＤＲ３を含む抗体である、〔１６〕〜〔１９−１〕のいずれかに記載の方法。
〔１９−３〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、配列番号：５７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＦＲ１、配列番号：５９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＦＲ２、配列番号：６１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＦＲ３を含む抗体である、〔１６〕〜〔１９−２〕のいずれかに記載の方法。
〔２０−１〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の軽鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体である、〔１６〕〜〔１９−３〕のいずれかに記載の方法。
〔２０−２〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、配列番号：６３または７４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体である、〔１６〕〜〔２０−１〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６である、〔１６〕〜〔２０−２〕のいずれかに記載の方法。
〔２２〕全てのＨＭＧＢ１の測定または検出を免疫試験方法によって行うことを特徴とする、〔１６〕〜〔２１〕のいずれかに記載の方法。
〔２３〕以下（ａ）および（ｂ）に記載の抗体を含む、試料中の全てのＨＭＧＢ１の測定または検出用キットまたは試薬：
（ａ）〔１〕〜〔７〕、〔９〕および〔１０〕のいずれかに記載の抗体、および
（ｂ）ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体。
〔２４〕全てのＨＭＧＢ１がジスルフィド型ＨＭＧＢ１、還元型ＨＭＧＢ１およびトロンビン分解ＨＭＧＢ１を含む、〔２３〕に記載のキットまたは試薬。
〔２５〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の２番目のグリシン（Ｇ２）と１７番目のアラニン（Ａ１７）の間のアミノ酸残基を含む抗原決定基を認識する抗体である、〔２３〕または〔２４〕に記載のキットまたは試薬。
〔２６−１〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体である、〔２３〕〜〔２５〕のいずれかに記載のキットまたは試薬。
〔２６−２〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＣＤＲ１、配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＣＤＲ２、配列番号：５５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＣＤＲ３を含む抗体である、〔２３〕〜〔２６−１〕のいずれかに記載のキットまたは試薬。
〔２６−３〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、配列番号：５７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＦＲ１、配列番号：５９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＦＲ２、配列番号：６１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＦＲ３を含む抗体である、〔２３〕〜〔２６−２〕のいずれかに記載の方法。
〔２７−１〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の軽鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体である、〔２３〕〜〔２６−３〕のいずれかに記載のキットまたは試薬。
〔２７−２〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、配列番号：６３または７４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体である、〔２３〕〜〔２７−１〕のいずれかに記載のキットまたは試薬。
〔２８〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６である、〔２３〕〜〔２７−２〕のいずれかに記載のキットまたは試薬。
〔２９〕免疫試験方法において使用するための、〔２３〕〜〔２８〕のいずれかに記載のキットまたは試薬。
〔３０〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体。
〔３１〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の２番目のグリシン（Ｇ２）と１７番目のアラニン（Ａ１７）の間のアミノ酸残基を含む抗原決定基を認識する、〔３０〕に記載の抗体。
〔３２−１〕受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む、〔３０〕または〔３１〕に記載の抗体。
〔３２−２〕配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＣＤＲ１、配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＣＤＲ２、配列番号：５５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＣＤＲ３を含む、〔３０〕〜〔３２−１〕のいずれかに記載の抗体。
〔３２−３〕ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体が、配列番号：５７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＦＲ１、配列番号：５９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＦＲ２、配列番号：６１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖のＦＲ３を含む、〔３０〕〜〔３２−２〕のいずれかに記載の抗体。
〔３３−１〕受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の軽鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、〔３０〕〜〔３２−３〕のいずれかに記載の抗体。
〔３３−２〕配列番号：６３または７４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、〔３０〕〜〔３３−１〕のいずれかに記載の抗体。
〔３４〕受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＨＭａ１６６。
〔３５〕受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２１で特定されるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体ＣＰ１１−１。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１特異的抗体、試料中のジスルフィド型ＨＭＧＢ１を特異的に測定または検出する方法および試料中のジスルフィド型ＨＭＧＢ１を特異的に測定または検出するためのキットが提供された。また本発明により、試料中の全ＨＭＧＢ１を測定または検出する方法および試料中の全ＨＭＧＢ１を測定または検出するためのキットが提供された。本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学、医学などの生命科学分野、とくに炎症や敗血症など重篤な病態の治療、診断、研究に有用である。特に、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１を特異的に測定または検出すること、および、還元型ＨＭＧＢ１、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１、トロンビン分解ＨＭＧＢ１（ｄｅｓ−ＨＭＧＢ１）の合計量を測定または検出することにより、これらＨＭＧＢ１と敗血症をはじめとするＨＭＧＢ１が関与する疾患の病態との関連性を詳細に診断および解析することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸配列（配列番号：９）を示す図である。
【図２】各抗体とＨＭＧＢ１ペプチドとの反応性を示すグラフである。
【図３】各抗体とＨＭＧＢ１−ＮＴペプチドとの反応性を示すグラフである。
【図４】ドットブロットによる各抗体の反応性を示す写真である。
【図５】ヒトＨＭＧＢ１ペプチドに対する各抗体の反応性の模式図を示す図である。
【図６】ＨＭＧＢ１の酸化還元状態の模式図を示す図である。
【図７】組換えヒトＨＭＧＢ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す写真である。
【図８】各抗体とジスルフィド型／還元型／アルキル化ｒｈＨＭＧＢ１の反応性を示すグラフである。
【図９】トロンビン消化ＨＭＧＢ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥとＮ末端アミノ酸配列(配列番号：８)の解析を示す写真である。
【図１０】トロンビン消化ｒｈＨＭＧＢ１（ｄｅｓ-ＨＭＧＢ１)に対するHMa166、HMa186抗体の反応性を示すグラフである。
【図１１】HMa186固相化によるジスルフィド型特異的ＨＭＧＢ１測定ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図１２】HMa186、HMa166両抗体固相化によるトータルＨＭＧＢ１測定ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図１３】トータルＨＭＧＢ１測定ＥＬＩＳＡの至適化の検討結果を示す図である。
【図１４】ＨＭａ１８６ＶＨ領域のＩＧＢＬＡＳＴ解析アライメントを示す図である。
【図１５】ＨＭａ１８６Ｖk領域のＩＧＢＬＡＳＴ解析アライメントを示す図である。
【図１６】ＨＭａ１６６ＶＨ領域のＩＧＢＬＡＳＴ解析アライメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。なお、以下に示す実施の形態はあくまでも一例であって、本発明は必ずしも以下の内容に限定されるものではない。
【００１８】
本発明は、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体に関する。本発明においてジスルフィド型ＨＭＧＢ１とは、ＨＭＧＢ１の２３番目のシステインと４５番目のシステインとの間でジスルフィドが形成されているＨＭＧＢ１をいう。したがって、本発明のジスルフィド型ＨＭＧＢ１特異的抗体は、これに限定されるものではないが、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の２３番目のシステイン（Ｃ２３）と４５番目のシステイン（Ｃ４５）により形成されるジスルフィド結合を含む抗原決定基を認識する抗体であることが好ましい。あるいは本発明のジスルフィド型ＨＭＧＢ１特異的抗体は、これに限定されるものではないが、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の２３番目のシステイン（Ｃ２３）から４５番目のシステイン（Ｃ４５）からなるアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体であることが好ましい。
【００１９】
また本発明は、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体であって、ＭＤ−２への結合活性を有するジスルフィド型ＨＭＧＢ１および／またはサイトカイン誘導能を持つジスルフィド型ＨＭＧＢ１に対する中和活性を有する抗体に関する。ジスルフィド型ＨＭＧＢ１は、in vitroにおいて高い親和性でＭＤ−２に結合し、マウスマクロファージによる炎症性サイトカイン腫瘍壊死因子（TNF）の分泌を促進することが知られている。また、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１は炎症を刺激（サイトカイン分泌等）することが知られている。本発明の抗体は、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１が有するこのような活性を中和することができる。ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に結合する抗体がジスルフィド型ＨＭＧＢ１活性を中和するか否かは、ビアコア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の生体分子相互作用解析機を用いて、センサーチップに固定化したＭＤ−２に結合したジスルフィド型ＨＭＧＢ１に対する抗体が当該活性を中和する現象を観察することによって判定することが出来る。もしくはマクロファージ等の免疫担当細胞やＲＡＷ２６４．７細胞などの樹立細胞株にジスルフィド型ＨＭＧＢ１を添加し、分泌されるＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１β、ＭＩＰ−２等のサイトカイン類の分泌を抗体が中和する現象を測定する事によって判定することができる。
【００２０】
また本発明は、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１を特異的に認識できるＨＭＧＢ１抗体の断片に関する。抗体断片は、例えば抗体を酵素で消化して生成させることができる。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが挙げられる。あるいは、これら抗体断片をコードするＤＮＡを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることもできる。
【００２１】
なお本発明のジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体は、ＨＭＧＢ１の２３番目のシステインと４５番目のシステインとの間でジスルフィドが形成されているＨＭＧＢ１を特異的に認識することができるものであれば特に限定されない。例えば、後述の、全長ＨＭＧＢ１からＨＭＧＢ１のＮ末端側のアミノ酸Ｍ１−Ｒ１０が切断されたアミノ酸配列を有するトロンビン分解ＨＭＧＢ１（ｄｅｓ−ＨＭＧＢ１）もまた、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と同様に、全長ＨＭＧＢ１における２３番目のシステイン（Ｃ２３）と４５番目のシステイン（Ｃ４５）により形成されるジスルフィド結合を含む。本発明のジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体は、このような、全長ＨＭＧＢ１からＨＭＧＢ１のＮ末端側のアミノ酸Ｍ１−Ｒ１０が切断されたアミノ酸配列を有するＨＭＧＢ１であって全長ＨＭＧＢ１における２３番目のシステインと４５番目のシステイン（全長ＨＭＧＢ１からＨＭＧＢ１のＮ末端側のアミノ酸Ｍ１−Ｒ１０が切断されたアミノ酸配列における１３番目のシステインと３５番目のシステイン）との間でジスルフィドが形成されているＨＭＧＢ１にも結合活性を有していてもよい。本発明のジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体は、ＨＭＧＢ１の２３番目のシステイン（Ｃ２３）と４５番目のシステイン（Ｃ４５）により形成されるジスルフィド結合を含む抗原決定基に特異的な抗体ということもできる。また本発明のジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体は、トロンビン分解ＨＭＧＢ１における１３番目のシステイン（Ｃ１３）と３５番目のシステイン（Ｃ３５）により形成されるジスルフィド結合を含む抗原決定基に特異的な抗体ということもできる。すなわち本発明のジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体は、ＨＭＧＢ１のジスルフィド結合を認識する。
【００２２】
また本発明は、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１を特異的に認識できるＨＭＧＢ１抗体の低分子化抗体に関する。本発明における低分子化抗体は、全長抗体の一部分（抗体断片）を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。本発明における低分子化抗体は、ＶＨ（重鎖可変領域）又はＶＬ（軽鎖可変領域）を含んでいることが好ましく、ＶＨおよびＶＬの両方を含むことが特に好ましい。本発明における低分子化抗体として、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、ダイアボディー（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ｓｃ（Ｆｖ）２（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  （Ｆｖ）２等）、これらの多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２３】
ｓｃＦｖは、抗体のＶＨとＶＬとを連結することにより得られる。ｓｃＦｖにおいて、ＶＨとＶＬは、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から２５残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。ダイアボディーは、２本のｓｃＦｖから構成されるダイマーである。ｓｃ（Ｆｖ）２は、２つのＶＨおよび２つのＶＬをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である。ｓｃ（Ｆｖ）２は、例えば、２つのｓｃＦｖをリンカーで結ぶことによって作製できる。
【００２４】
また本発明は、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１を特異的に認識できるＨＭＧＢ１抗体のキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体に関する。
【００２５】
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体である。キメラ抗体は、例えば、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１を特異的に認識できるＨＭＧＢ１抗体の重鎖、軽鎖の可変領域をコードするDNAを取得し、これらとヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込み、当該ベクターを宿主に導入し、抗体重鎖および軽鎖の可変領域と定常領域を産生させることにより得ることができる。定常領域としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫、牛、馬、豚、ヤギ、アカケザル、カニクイザル、チンパンジー、鶏、ゼブラフィッシュ等由来の定常領域を使用することができる。本発明のキメラ抗体は、抗体の産生の安定性の改善のために、アミノ酸の置換、欠失、付加などの改変がされていてもよい。
【００２６】
ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものである。ヒト化抗体は、例えば、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１を特異的に認識できるＨＭＧＢ１抗体の重鎖、軽鎖のCDRをコードするDNAとヒト抗体のフレームワーク領域（FR）とが連結するように設計したDNA配列を作製し、これを発現ベクターに組み込み、当該ベクターを宿主に導入し、当該DNAによりコードされるタンパク質を発現させることにより得ることができる。本発明のヒト化抗体は、抗体の産生の安定性の改善などのために、アミノ酸の置換、欠失、付加などの改変がされていてもよい。
【００２７】
アミノ酸を改変する場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、及び、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個（例えば２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個）のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1984)81:5662-6； Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res.(1982)10:6487-500; Wang, A. et al., Science(1984)224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1982)79:6409-13）。このような変異体は、アミノ酸改変前のアミノ酸配列と少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、そして、最も好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列の同一性を有する。本明細書において配列の同一性は、配列同一性が最大となるように必要に応じ配列を整列化し、適宜ギャップを導入した後、元となった重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列の残基と同一の残基の割合として定義される。
【００２８】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００２９】
ヒト抗体は、ヒト抗体を産生するマウスから調整した抗体である。ヒト抗体は、例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させて取得することができる。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することにより取得することができる。
【００３０】
また本発明は、モノクローナル抗体ＨＭａ１８６の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、および、モノクローナル抗体ＨＭａ１８６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体に関する。本発明の抗体は、さらにＦＲ領域および定常領域を有していてもよい。
モノクローナル抗体ＨＭａ１８６の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：２５、２７、２９に示す。
モノクローナル抗体ＨＭａ１８６の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の塩基配列をそれぞれ、配列番号：２４、２６、２８に示す。
モノクローナル抗体ＨＭａ１８６の重鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：３５、３７、３９に示す。
モノクローナル抗体ＨＭａ１８６の重鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３の塩基配列をそれぞれ、配列番号：３４、３６、３８に示す。
モノクローナル抗体ＨＭａ１８６の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：３１、３３に示す。
モノクローナル抗体ＨＭａ１８６の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２の塩基配列をそれぞれ、配列番号：３０、３２に示す。
モノクローナル抗体ＨＭａ１８６の軽鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：４１、４３、４５に示す。
モノクローナル抗体ＨＭａ１８６の軽鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３の塩基配列をそれぞれ、配列番号：４０、４２、４４に示す。
【００３１】
このような抗体は、例えば、次の方法により取得することができる。当業者公知の方法により、モノクローナル抗体ＨＭａ１８６を産生するハイブリドーマから、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３をコードするmRNAを単離する。そして、得られたmRNAから逆転写酵素を用いて重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を合成する。これを所望の抗体定常領域をコードするDNA、ＦＲ領域をコードするDNAと連結し、発現ベクターへ組み込む。当該発現ベクターを各種の発現細胞で発現させ、当業者に公知の方法により回収すればよい。
【００３２】
また本発明は、重鎖の可変領域としてモノクローナル抗体ＨＭａ１８６の重鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、軽鎖の可変領域としてモノクローナル抗体ＨＭａ１８６の軽鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体に関する。本発明の抗体は、さらに定常領域を有していてもよい。このような抗体もまた、上述のような当業者に周知の方法により取得することができる。
モノクローナル抗体ＨＭａ１８６の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：４７に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：４９に示す。
モノクローナル抗体ＨＭａ１８６の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号：４６に、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号：４８に示す。
なお本発明のモノクローナル抗体ＨＭａ１８６は、１または複数のアミノ酸(例えば、２０アミノ酸以内、１０、９、８、７、６、５、４、３、２アミノ酸以内など)が置換、欠失、付加および／または挿入されていてもよい。
【００３３】
本発明においては、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１を特異的に認識できるＨＭＧＢ１抗体として、モノクローナル抗体ＨＭａ１８６を挙げることができる。モノクローナル抗体ＨＭａ１８６は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されているハイブリドーマより産生される。以下に、寄託を特定する内容を示す。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構
（２）連絡先：〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（３）受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１９
（４）識別の表示：ＨＭａ１８６
（５）国内寄託日：２０１５年３月５日
（６）国際寄託への移管請求日：２０１６年１１月４日
【００３４】
また本発明は、本発明のジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体と試料とを接触させる工程を含む、該試料中のジスルフィド型ＨＭＧＢ１を特異的に測定または検出する方法に関する。
【００３５】
また本発明は、以下（ａ）および（ｂ）に記載の抗体と試料とを接触させる工程を含む、該試料中の全てのＨＭＧＢ１の測定または検出方法に関する。
（ａ）ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体
（ｂ）ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しトロンビン分解ＨＭＧＢ１（ｄｅｓ−ＨＭＧＢ１）に結合しない抗体
【００３６】
また本発明は、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しトロンビン分解ＨＭＧＢ１（ｄｅｓ−ＨＭＧＢ１）に結合しない抗体に関する。
なお本発明のジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体は、全長ＨＭＧＢ１のＮ末端側のアミノ酸Ｍ１−Ｒ１０が切断されたアミノ酸配列を有する、トロンビン分解ＨＭＧＢ１（ｄｅｓ−ＨＭＧＢ１）を認識することもできる。ジスルフィド型ＨＭＧＢ１がトロンビンで分解され、トロンビン分解ＨＭＧＢ１となってもまた、トロンビン分解ＨＭＧＢ１の１３番目のシステインと３５番目のシステイン（全長ＨＭＧＢ１の２３番目のシステインと４５番目のシステインに対応する）との間でジスルフィド結合が維持されているからである。
【００３７】
本発明における「全てのＨＭＧＢ１」は、ＨＭＧＢ１のアミノ酸配列が改変（付加、欠失、挿入、置換等）されたものや化学修飾されたもの、酵素処理物などを含む。より具体的には、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１、還元型ＨＭＧＢ１およびトロンビン分解ＨＭＧＢ１並びにこれらのアミノ酸が改変されたものや化学修飾されたもの、酵素処理物などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３８】
また本発明において還元型ＨＭＧＢ１とは、３つの全てのシステイン（Ｃ２３、Ｃ４５、Ｃ１０６）が還元されている状態のＨＭＧＢ１をいう。細胞核内で遺伝情報制御に関与するほか、細胞外ではケモタキシス（化学遊走誘導）活性を持つことが知られている。
トロンビン分解ＨＭＧＢ１（ｄｅｓ−ＨＭＧＢ１）とは、トロンビンまたはトロンビン・トロンボモジュリン複合体により、ＨＭＧＢ１の１０番目のアルギニン（Ｒ１０）―１１番目のグリシン（Ｇ１１）間が切断され、ＨＭＧＢ１のＮ末端の１０個のアミノ酸残基によるペプチド断片が分離して新たに生じたＮ末端「ＧＫＭＳＳ・・・」を有するＨＭＧＢ１の分解産物を指す。このＨＭＧＢ１の分解産物はＨＭＧＢ１に比べその生理活性が低いことが知られている。トロンビン分解ＨＭＧＢ１は、１３番目のシステインと３５番目のシステイン（全長ＨＭＧＢ１の２３番目のシステインと４５番目のシステインに対応する）との間にジスルフィド結合を有する。本発明においては、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１とジスルフィド結合を維持したトロンビン分解ＨＭＧＢ１をあわせて、非還元型ＨＭＧＢ１またはジスルフィド結合を有するＨＭＧＢ１と表現することもできる。また本発明においては、「ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体」を「非還元型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体」または「ジスルフィド結合を有するＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体」と表現することもできる。
【００３９】
本発明においては、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体は、例えば、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の２番目のグリシン（Ｇ２）と１７番目のアラニン（Ａ１７）の間のアミノ酸残基を含む抗原決定基を認識する抗体とすることができるが、これに限定されない。あるいは本発明において当該抗体は、例えば、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の２番目のグリシン（Ｇ２）と１７番目のアラニン（Ａ１７）の間のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列をエピトープとして認識する工程とすることができるが、これに限定されない。
【００４０】
また本発明においては、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体として、モノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、および、モノクローナル抗体ＨＭａ１６６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体を挙げることができるがこれに限定されない。このような抗体は、さらにＦＲ領域および定常領域を有していてもよい。
モノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：５１、５３、５５に示す。
モノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の塩基配列をそれぞれ、配列番号：５０、５２、５４に示す。
モノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：５７、５９、６１に示す。
モノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３の塩基配列をそれぞれ、配列番号：５６、５８、６０に示す。
【００４１】
また本発明においては、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体として、重鎖の可変領域としてモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する可変領域、軽鎖の可変領域としてモノクローナル抗体ＨＭａ１６６の軽鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を有する可変領域を有する抗体に関する。このような抗体は、さらに定常領域を有していてもよい。
モノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：６３に示す。
モノクローナル抗体ＨＭａ１６６の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号：６２に示す。
これら抗体は、上述のような当業者に周知の方法により取得することができる。
なお本発明のモノクローナル抗体ＨＭａ１６６は、１または複数のアミノ酸(例えば、２０アミノ酸以内、１０、９、８、７、６、５、４、３、２アミノ酸以内など)が置換、欠失、付加および／または挿入されていてもよい。
【００４２】
本発明におけるジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体として、モノクローナル抗体ＨＭａ１６６を挙げることができる。モノクローナル抗体ＨＭａ１６６は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されているハイブリドーマより産生される。以下に、寄託を特定する内容を示す。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構
（２）連絡先：〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（３）受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０
（４）識別の表示：ＨＭａ１６６
（５）国内寄託日：２０１５年３月５日
（６）国際寄託への移管請求日：２０１６年１１月４日
【００４３】
また本発明は、上記方法に使用するためのキットまたは試薬に関する。本発明のキットまたは試薬は、少なくとも以下（ａ）および（ｂ）に記載のジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体を含むキットまたは試薬であって、試料に含まれるジスルフィド型ＨＭＧＢ１を特異的に測定または検出するためのキットまたは試薬に関する。また本発明のキットまたは試薬は、少なくとも以下の（ａ）および（ｂ）に記載の抗体を含むキットまたは試薬であって、試料中の全てのＨＭＧＢ１の測定または検出用キットまたは試薬に関する。
（ａ）ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体
（ｂ）ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しトロンビン分解ＨＭＧＢ１（ｄｅｓ−ＨＭＧＢ１）に結合しない抗体
【００４４】
本発明においては、ＨＭＧＢ１抗体（例えば、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体など）の種類や由来などは限定されない。例えば、Ｍｏｕｓｅ、Ｒａｂｂｉｔ、Ｇｏａｔ等の種々の免疫動物から獲得される抗体が含まれる。また、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体からなる抗血清、モノクローナル抗体、またはこれらの抗体の断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'等）や低分子化抗体（例えば、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、ダイアボディー（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ｓｃ（Ｆｖ）２（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  （Ｆｖ）２等）、これらの多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も利用することができる。
【００４５】
例えば、ポリクローナル抗体は、精製したＨＭＧＢ１（例えば、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１、還元型ＨＭＧＢ１など）若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血ぺいを除去することにより調製することが可能である。またモノクローナル抗体は、ＨＭＧＢ１若しくはその一部のペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。
【００４６】
本発明においては、ＨＭＧＢ１の由来は限定されない。本発明においては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫、牛、馬、豚、ヤギ、アカケザル、カニクイザル、チンパンジー、鶏、ゼブラフィッシュ等由来のＨＭＧＢ１を測定または検出することができるが、これらに限定されない。
【００４７】
以下に、様々な動物由来のＨＭＧＢ１のアミノ酸配列のNCBI (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine) databaseにおけるアクセッション番号と、本願明細書における配列番号を示す。
・ヒト[Homo sapiens]  CAG33144.1／配列番号：９
・マウス[Mus musculus]  AAI10668.1／配列番号：１０
・ラット[Rattus norvegicus]  NP_037095.1／配列番号：１１
・ウサギ[Oryctolagus cuniculus]  NP_001164752.1／配列番号：１２
・イヌ[Canis lupus familiaris]  AAN11319.1／配列番号：１３
・ネコ[Felis catus]  XP_006927254.1／配列番号：１４
・ウシ[Bos taurus]  AAI02930.1／配列番号：１５
・ウマ[Equus caballus]  BAF33339.1／配列番号：１６
・ブタ[Sus scrofa]  NP_001004034.1／配列番号：１７
・ヤギ[Capra hircus]  XP_005687595.1／配列番号：１８
・アカケザル[Macaca mulatta]  AFJ72047.1／配列番号：１９
・カニクイザル[Macaca fascicularis]  NP_001270285.1／配列番号：２０
・チンパンジー[Pan troglodytes]  XP_509611.1／配列番号：２１
・ニワトリ[Gallus gallus]  NP_990233.1／配列番号：２２
・ゼブラフィッシュ[Danio rerio]  AAH67193.1／配列番号：２３
【００４８】
本発明において試料とは、ＨＭＧＢ１（例えば、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１、還元型ＨＭＧＢ１、トロンビン分解ＨＭＧＢ１など）が含まれるもしくは含まれると疑われる溶液を意味する。例えば、ヒトやその他の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫、牛、馬、豚、ヤギ、羊、サル（例えば、アカケザル、カニクイザル）、チンパンジー、鶏、ゼブラフィッシュなど）由来の血液、血清、血漿、尿、精液、ずい液、唾液、汗、涙、腹水、羊水など単離された生体試料、あるいはそれらを含む希釈液などを挙げることができるが、これらに限定されない。さらに、ＨＭＧＢ１が含まれるもしくは含まれると疑われる溶液を緩衝液などと混合して得られる溶液も、本発明の試料に含まれる。これらの試料の取得方法は当業者に周知である。混合あるいは希釈する溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。例えば、精製水、生理食塩水、またはトリス緩衝液、リン酸緩衝液もしくはリン酸緩衝液生理食塩水などの各種緩衝液を挙げることができるがこれらに限定されない。さらに、緩衝液のｐＨについても特に限定されず、適宜、好適なｐＨを選択することができる。一般的には、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることができるが、これに限定されない。また溶媒には、被測定物質の構造的な保護を目的として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼインなどのタンパク質、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等のうち１種または２種以上を適宜含有させてもよい。
【００４９】
ＨＭＧＢ１抗体（例えば、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体など）と試料を接触させる手段は、特に限定されない。即ち、試料の存在する容器にＨＭＧＢ１抗体が加えられてもよい。あるいは、ＨＭＧＢ１抗体の存在する容器に試料を加えてよい。
【００５０】
本発明においては、ＨＭＧＢ１（例えば、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１、全てのＨＭＧＢ１など）の測定または検出のために、公知の手法が利用できる。例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、免疫沈降法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法などの免疫試験方法を挙げることができるが、これらに限定されない。また、本発明における測定または検出は、用手法で行ってもよいし、分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【００５１】
例えば、酵素免疫測定法を用いる場合は、第一のＨＭＧＢ１抗体（例えば、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体など）が固相化されたマイクロプレートと、ＨＲＰ等の酵素が修飾された第二のＨＭＧＢ１抗体、洗浄緩衝液、及び発光／発色基質溶液、標準物質（ヒト組換え体ＨＭＧＢ１）、陽性コントロール（ヒト組換え体ＨＭＧＢ１）、検体希釈液、反応停止液などを用いて行うことができる。またＨＭＧＢ１の測定または検出は、第二のＨＭＧＢ１抗体に修飾されている酵素に、その至適条件下で前記酵素の基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法により測定することによって行うことができる。第二のＨＭＧＢ１抗体（検出抗体）は、第一のＨＭＧＢ１抗体（固相抗体）が認識するエピトープとは異なるエピトープを認識する抗体であることが好ましい。
【００５２】
また、蛍光免疫測定法を用いる場合には、第一のＨＭＧＢ１抗体が固相化された光導波路やマイクロプレートと、蛍光物質が修飾された第二のＨＭＧＢ１抗体、洗浄緩衝液を用いて行うことができる。ＨＭＧＢ１の測定または検出は、第二のＨＭＧＢ１抗体に修飾されている蛍光物質に励起光を照射し、その蛍光物質が発する蛍光強度を測定することにより行うことができる。さらに放射免疫測定法を用いる場合には、前述した方法と同様の操作により、放射性物質による放射線量を測定することによって、発光免疫測定法を用いる場合には、発光反応系による発光量を測定することによって、ＨＭＧＢ１を測定または検出することができる。
【００５３】
ウエスタンブロット法やドットブロット法を用いる場合は、電気泳動後の転写膜や直接サンプルをアプライしたメンブレンをBSAやスキムミルクでブロッキングした後、ＨＲＰ等の酵素が修飾されたＨＭＧＢ１抗体、洗浄緩衝液、及び発光／発色基質溶液等を用いて行うことができる。また、第一のＨＭＧＢ１抗体に対して、酵素や蛍光色素等で直接標識した二次抗体を反応させてもよい。
ＨＭＧＢ１の測定または検出は、ＨＭＧＢ１抗体や二次抗体に修飾されている酵素に、その至適条件下で前記の基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法により測定することにより行うことができる。
【００５４】
免疫沈降法を用いる場合は、サンプルとＨＭＧＢ１抗体等を反応させる際にBSAやスキムミルク等のブロッキング剤を添加しておくことができる。沈降はＨＭＧＢ１抗体に直接結合させた磁気ビーズやアガロース単体等を用いて行う、もしくはそれらのビーズ等を結合した二次抗体を用いて行うことができる。
【００５５】
また、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法などを用いる場合には、エンドポイント法またはレート法により透過光や散乱光を測定することによりＨＭＧＢ１を測定または検出することができる。そして、イムノクロマトグラフィー法を用いる場合には、テストライン上に現れる標識物質の色を目視的に確認することができる。なお、この目視的に確認する替わりに、分析装置等の機器を用いてもよい。
【００５６】
前記免疫測定方法に用いる固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス、または、磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック、メンブレン、または試験片等の形状の固相担体などを用いることができるが、これらに限定されない。
【００５７】
前記ＨＭＧＢ１抗体の固相化方法としては、公知の固相化方法が利用できる。例えば、物理吸着法としては、抗体と担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させる方法、また、緩衝液などに溶解した抗体と担体を接触させる方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
また、化学的結合法によりＨＭＧＢ１抗体を固相化する場合も公知の方法に従い調整することができる。例えば、抗体と担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステルまたはマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させて、抗体と担体双方のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、または水酸基等と反応させる方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
さらに、非特異的反応や、ＨＭＧＢ１抗体を固相化させた担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、公知の方法により処理することができる。例えば、抗体を固相化させた担体の表面または内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤または脱脂粉乳等を接触させ、被覆させる方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
前記第二のＨＭＧＢ１抗体への標識物質の修飾方法としては、公知の修飾方法が利用できる。物理吸着法としては、第二のＨＭＧＢ１抗体と標識物質を緩衝液などの溶液中で混合し接触させる方法、緩衝液などに溶解した抗体と標識物質を接触させる方法などが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、標識物質が金コロイドやラテックスである場合は物理吸着法が有効であり、抗体と金コロイドとを緩衝液中で混合し接触させることで、金コロイド標識を有する抗体を得ることができる。
【００６１】
また、化学的結合法により第二のＨＭＧＢ１抗体に標識物質を修飾させる場合には、公知の方法に従い調整することができる。例えば、抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステルまたはマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させて、抗体と標識物質双方のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、または水酸基等と反応させる方法などが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、標識物質が蛍光物質や酵素、または化学発光物質である場合、化学結合法が有効である。
【００６２】
また、非特異的反応や、標識物質を修飾させた抗体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、公知の方法により処理することができる。例えば、標識物質を結合させた抗体に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤または脱脂粉乳等を接触させ、被覆させる方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
また標識物質としては、酵素免疫測定法の場合、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、またはアミラーゼ等を用いることができるが、これらに限定されない。
【００６４】
また、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリアジンイソチオシアネート、シアニン、またはメロシアニン等を用いることができるが、これらに限定されない。
【００６５】
また、放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１等を用いることができるが、これらに限定されない。
【００６６】
また、発光免疫測定法の場合には、ルミノール系、ルシフェラーゼ系、アクリジニウムエステル系、またはジオキセタン化合物系等を用いることができるが、これらに限定されない。
【００６７】
また、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法の場合には、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン酸共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、金属コロイド、セラミックス、または磁性体等の材質よりなる微粒子を用いることができるが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明のキットや試薬は、ＨＭＧＢ１抗体と試料を接触させて使用することを特徴とする。本発明のキットや試薬は、試料中のＨＭＧＢ１（例えば、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１、還元型ＨＭＧＢ１、トロンビン分解ＨＭＧＢ１など）とＨＭＧＢ１抗体（例えば、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体など）の結合が起こるように構成される限り特に限定されない。
【００６９】
本発明のキットや試薬の構成においては、その他の試薬と組み合わせてもよいし、あるいは、固相にあらかじめ付着させておいてもよい。例えば、その他の試薬に組み合わせておく場合、組み合わせる試薬としては、試料中のＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ１抗体の結合に必要な緩衝液、試料希釈液、酵素などの標識物質を含有するＨＭＧＢ１抗体溶液、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、発色などのシグナルの生成に関与する物質を含有する試薬、較正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬などが挙げられる。また、前記固相の例としては、免疫試験キットに用いられる担体や試験紙、マイクロプレート、ガラス板、マイクロチューブ、ろ紙、ポリマー樹脂等を挙げることができる。
【００７０】
本発明におけるキットや試薬は、ＨＭＧＢ１の測定または検出に必要なものを含む。ＨＭＧＢ１の測定または検出に必要な種々のセットを含むキットや試薬、ＨＭＧＢ１の測定または検出に必要な種々の物質を充填した使いきりタイプのキットや試薬、複数の試料を同時に測定するためのマイクロプレートタイプの試験キットや試薬、内部に試薬等を含み目視による結果の判定が可能なイムノクロマトグラフィーや、試験紙も、本発明のキットや試薬に含まれる。
【００７１】
例えば、使いきりタイプのキットや試薬の形態の一例としては、第一のＨＭＧＢ１抗体が固相化された球状や棒状の担体、試薬希釈液、ＡＬＰ等の酵素が修飾された第二のＨＭＧＢ１抗体、洗浄液、および発光基質溶液、標準物質（ヒト組換え体ＨＭＧＢ１）、陽性コントロール（ヒト組換え体ＨＭＧＢ１）、検体希釈液、反応停止液などを、検査容器に充填する構成が考えられるがこれらに限定されない。
【００７２】
検査容器の形状は、試料中のＨＭＧＢ１の測定または検出を行うことができる限り特に限定されるものではない。例えば、反応槽や試薬格納槽が複数並んだ舟型の容器や、板状の基体に溝を設け、反応槽や格納槽を流路で繋いだ流路型の容器が挙げられるがこれらに限定されない。また、検査容器の大きさも特に限定されるものではないが、自動分析装置等に組み込んで用いるためには、１０センチメートル×１０センチメートル程度以下の小型であることが望ましい。さらに、反応槽への異物の混入や、試薬格納槽に充填しておいた試薬の蒸発・劣化を避けるために、各槽の上部をシールすることもできる。例えば、アルミニウム箔や高分子フィルム等を検査容器の反応槽と格納槽の上部に接着させる方法があげられる。特に、アルミニウム箔によるシールは、分析装置の穿孔機構や分注チップの先端で容易に開封できるので好ましい。検査容器の素材としては、被測定物質を測定するための反応を阻害しない限り特に限定されるものではない。例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７３】
また、マイクロプレートタイプのキットや試薬の形態としては、以下の構成が考えられる。例えば、第一のＨＭＧＢ１抗体が固相化されたマイクロプレートと共に、試料希釈液、ＨＲＰ等の酵素が修飾された第二のＨＭＧＢ１抗体、洗浄液、および発色基質溶液、標準物質（ヒト組換え体ＨＭＧＢ１）、陽性コントロール（ヒト組換え体ＨＭＧＢ１）、検体希釈液、反応停止液などを、それぞれ試薬ボトルとして付属する構成である。
【００７４】
イムノクロマトグラフィーの形態としては、ハウジングケース、サンプルパット、コンジュゲートパット、メンブレンフィルター、吸収パットから構成されるラテラルフローが好適である。また、ラテラルフローは以下の手順により作製される。まず、金コロイドや着色ビーズを標識した第一のＨＭＧＢ１抗体を作製し、これをコンジュゲーションパットに塗布・乾燥させる。一方で、第二のＨＭＧＢ１抗体をメンブレンフィルターのテストライン上に塗布・乾燥させる。さらに、前記第二のＨＭＧＢ１抗体を特異的に認識する第三の抗体をメンブレンフィルターのコントロールライン上に塗布・乾燥させる。最後に、このフィルターに前記コンジュゲーションパット、サンプルパット、吸収パットを貼りつけたものをラテラルフローとする。
【００７５】
本発明において、試薬の形状は特に限定されず、ＨＭＧＢ１抗体を含む溶液であってもよい。あるいは、それらのタブレット、粉末、容器に付着させた乾燥状態など、目的となる試験にあわせた容量、形状をとることができる。
【００７６】
本発明のキットまたは試薬は、本発明のジスルフィド型ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体と検出用標識抗体を含む、サンドイッチＥＬＩＳＡ用のキットまたは試薬とすることができる。特に、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１、還元型ＨＭＧＢ１、トロンビン分解ＨＭＧＢ１を含む全てのＨＭＧＢ１を測定または検出する場合、一実施態様として、固相抗体としてモノクローナル抗体ＨＭａ１６６およびモノクローナル抗体ＨＭａ１８６を、検出抗体としてモノクローナル抗体ＣＰ１１−１を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって行うことができる。モノクローナル抗体ＣＰ１１−１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されているハイブリドーマより産生される。以下に、寄託を特定する内容を示す。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構
（２）連絡先：〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（３）受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２１
（４）識別の表示：ＣＰ１１−１
（５）国内寄託日：２０１５年３月５日
（６）国際寄託への移管請求日：２０１６年１１月４日
【００７７】
また本発明は、本発明の測定または検出方法を使用して試料中のＨＭＧＢ１（ジスルフィド型ＨＭＧＢ１、または全てのＨＭＧＢ１）を測定または検出する工程を含む、敗血症、もしくは全身性炎症等の敗血症関連疾患の診断方法に関する。
また本発明は、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１特異的抗体、または、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１と還元型ＨＭＧＢ１の両方に結合しｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に結合しない抗体を含む、敗血症、もしくは全身性炎症等の敗血症関連疾患の診断用キットまたは試薬に関する。
【００７８】
本発明の診断方法および診断用キットまたは試薬においては、例えば、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１が検出された場合、被験者は敗血症もしくはその関連疾患に罹患していると判定される。本発明においては、ＨＭＧＢ１が検出された被験者に対し公知の敗血症もしくはその関連疾患の治療薬を投与するもしくは公知の治療法を施す工程を含むことができる。
【００７９】
敗血症やその関連疾患の重症度とＨＭＧＢ１の血中濃度の相関性について、今後のさらなる研究が必要であるが、敗血症患者ではＨＭＧＢ１の血中濃度が高い事が知られている（Ｗａｎｇ、ＳＣＩＥＮＣＥ、 ２８５、２４８〜２５１、１９９９）。また、ＨＭＧＢ１血中濃度と敗血症の診断基準の一つであるＳＯＦＡスコアやｌａｃｔａｔｅ値、ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ値などと、高い相関性が報告されている（Gibot、Intensive Care Medicine、３３、１３４７〜１３５３、２００７）。また、敗血症発症後、死亡しなかった患者では時間経過に伴ってジスルフィド型ＨＭＧＢ１の血中濃度が低下するが、予後が悪く、発症後死亡した患者では、ジスルフィド型ＨＭＧＢ１の血中濃度が時間経過に伴って高くなることが報告されている（Gibot、Intensive Care Medicine、３３、１３４７〜１３５３、２００７）。また、敗血症患者に血液浄化療法を行ったところ、高かったＨＭＧＢ１濃度が正常にまで回復し、最終的に退院した治療例も報告されている（Nakamura、Blood Purification、３２、１３９−１４２、２０１１）。このようにＨＭＧＢ１の血中濃度は様々な治療の開始や離脱に重要な情報となる。
【００８０】
以下に、モノクローナル抗体ＨＭａ１８６およびＨＭａ１６６の配列と配列表における該列番号の関係をまとめる。
モノクローナル抗体ＨＭａ１８６
重鎖ＣＤＲ１塩基配列  配列番号：２４
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列  配列番号：２５
重鎖ＣＤＲ２塩基配列  配列番号：２６
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列  配列番号：２７
重鎖ＣＤＲ３塩基配列  配列番号：２８
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列  配列番号：２９
軽鎖ＣＤＲ１塩基配列  配列番号：３０
軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列  配列番号：３１
軽鎖ＣＤＲ２塩基配列  配列番号：３２
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列  配列番号：３３
重鎖ＦＲ１塩基配列  配列番号：３４
重鎖ＦＲ１アミノ酸配列  配列番号：３５
重鎖ＦＲ２塩基配列  配列番号：３６
重鎖ＦＲ２アミノ酸配列  配列番号：３７
重鎖ＦＲ３塩基配列  配列番号：３８
重鎖ＦＲ３アミノ酸配列  配列番号：３９
軽鎖ＦＲ１塩基配列  配列番号：４０
軽鎖ＦＲ１アミノ酸配列  配列番号：４１
軽鎖ＦＲ２塩基配列  配列番号：４２
軽鎖ＦＲ２アミノ酸配列  配列番号：４３
軽鎖ＦＲ３塩基配列  配列番号：４４
軽鎖ＦＲ３アミノ酸配列  配列番号：４５
重鎖可変領域塩基配列  配列番号：４６
重鎖可変領域アミノ酸配列  配列番号：４７
軽鎖可変領域塩基配列  配列番号：４８
軽鎖可変領域アミノ酸配列  配列番号：４９
【００８１】
モノクローナル抗体ＨＭａ１６６
重鎖ＣＤＲ１塩基配列  配列番号：５０
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列  配列番号：５１
重鎖ＣＤＲ２塩基配列  配列番号：５２
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列  配列番号：５３
重鎖ＣＤＲ３塩基配列  配列番号：５４
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列  配列番号：５５
重鎖ＦＲ１塩基配列  配列番号：５６
重鎖ＦＲ１アミノ酸配列  配列番号：５７
重鎖ＦＲ２塩基配列  配列番号：５８
重鎖ＦＲ２アミノ酸配列  配列番号：５９
重鎖ＦＲ３塩基配列  配列番号：６０
重鎖ＦＲ３アミノ酸配列  配列番号：６１
重鎖可変領域塩基配列  配列番号：６２
重鎖可変領域アミノ酸配列  配列番号：６３
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に制限されるものではない。【００８３】
１．大腸菌組換えヒトＨＭＧＢ１の作製
大腸菌を用いた組換えヒトＨＭＧＢ１の作製方法を以下に示す。
GenBankに登録されたヒトＨＭＧＢ１遺伝子（GenBank：CR456863.1／配列番号：７）の配列を元に、クローニングの為の制限酵素サイトNdeIを上流に、BamHIを下流に付加した遺伝子を化学合成により作製した。Ｎ末側にヒスチジンタグを付加することができるpET15bプラスミドベクターに合成したヒトＨＭＧＢ１遺伝子をライゲーションし、シークエンスを確認した後、大腸菌BL21(DE3)にトランスフォームした。また、ヒトＨＭＧＢ１のＮ末端から８２番目のリジン（Ｍ１−Ｋ８２）までをコードする遺伝子ＨＭＧＢ１−ＮＴも同様に作製した。【００８４】
得られたヒトＨＭＧＢ１遺伝子を移入した大腸菌BL21(DE3)すなわち大腸菌BL21(DE3) (ＨＭＧＢ１/pET15b) および大腸菌BL21(DE3) (ＨＭＧＢ１−ＮＴ/pET15b)をそれぞれ2 L程度のサークルグロー（フナコシ）や2x YT（DIFCO）等の大腸菌培養培地で培養し、濁度（OD 600 nm）が0.5付近となった時に0.5 mM IPTGを加えて30℃で3時間誘導し、組換えヒトＨＭＧＢ１タンパクを発現させた。【００８５】
発現させた大腸菌BL21(DE3)(ＨＭＧＢ１/pET15b) および大腸菌BL21(DE3) (ＨＭＧＢ１―ＮＴ/pET15b)を遠心分離して菌体を回収し、-80℃で急速凍結させた後、20 mM Tris-HCl (pH7.5), 0.5 M NaCl, 1% Triton X-100を加え、懸濁した。懸濁液を氷上に移し、超音波破砕機を用いて菌体を破砕した。
その後、遠心分離を行い、破砕上清を0.22μmの濾過滅菌用フィルターで濾過滅菌した。【００８６】
濾過した破砕上清に50 mM Imidazoleを加え、ヒスチジンタグを用いた精製を行う為にHisTrap HP 5 mLカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、洗浄後、75 mM、100 mM、500 mMのImidazoleでステップワイズ溶出した。目的のタンパクが認められる分画を 10 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）にバッファー置換した後、ヒスチジンタグHiTrap Heparin HP 1mLカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、50-1100 mM NaClのリニアーグラジエントで溶出した。
目的のタンパクが認められる分画を 10 mM Hepesで5倍希釈し、Hitrap CMFFカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、0-180 mM NaClのリニアーグラジエントで溶出し、目的のタンパクが認められる分画を限外濾過膜で濃縮し、50 mM Hepes（pH8.0）、500 mM NaClにバッファー置換し、精製した。【００８７】
２．モノクローナル抗体の作製
（１）モノクローナル抗体ＣＰ１１−１作製法
ハプテンとしてヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸配列167〜180番のペプチドNo.5（KPDAAKKGVVKAEK／配列番号：６）のＣ末にシステイン（Ｃ）を付加し、システインのＳＨ基を用いて、キャリアーであるＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin）と結合させて作製したハプテン−キャリアータンパク質複合体抗原１００μｇをFreundの完全アジュバント（ＦＣＡ）と共にマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に初回免疫し、１４日後に追加免疫として初回免疫に用いたハプテン−キャリアータンパク質複合体５０μｇをFreundの不完全アジュバント（ＦＩＡ）と共に免疫した。以降１４日間隔で５０μｇのハプテン−キャリアータンパク質複合体をＦＩＡと共に計４回免疫を行った。最終免疫後、脾臓を取り出し、定法に従ってリンパ球を調整し、ミエローマSp2/0-Ag14 (ATCC：CRL-1581)と融合した。融合したハイブリドーマをＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹハイブリドーマクローニングキット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を用いて培養、クローニングを行った。得られたクローンをビアコア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてさらに詳細に検討し、ＣＰ１１−１を選択した。
なお、モノクローナル抗体ＣＰ１１−１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号「ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２１」として寄託されているハイブリドーマより産生される。【００８８】
（２）モノクローナル抗体ＨＭａ１６６、ＨＭａ１８６の作製法
ｒｈＨＭＧＢ１抗原１００μｇをFreundの完全アジュバント（ＦＣＡ）と共にマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に初回免疫した。１４日後に追加免疫として初ｒｈＨＭＧＢ１抗原５０μｇをFreundの不完全アジュバント（ＦＩＡ）と共に免疫した。以降１４日間隔で５０μｇのｒｈＨＭＧＢ１抗原をＦＩＡと共に計４回免疫を行った。最終免疫後、脾臓を取り出し、定法に従ってリンパ球を調整し、ミエローマSp2/0-Ag14 (ATCC：CRL-1581)と融合した。融合したハイブリドーマを定法に従い、限界希釈法により培養、クローニング、ＥＬＩＳＡによるスクリーニングを行い、１８個のクローンを得た。得られた１８クローンとＣＰ１１−１を合わせた１９クローンについて、それぞれをビアコア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のセンサーチップに抗マウスＩｇＧ抗体を介して固相化し、ｒＨＭＧＢ１を結合させた後、それぞれの抗体を加えて、ｒＨＭＧＢ１に対する結合性を詳細に検討し、エピトープの異なる抗体の組み合わせを選択した。結果、ＨＭａ１６６とＨＭａ１８６はどちらを固相に用いてもｒＨＭＧＢ１と強く反応し、かつ、それぞれの抗体とＨＭＧＢ１との結合に干渉しない事から、ＨＭａ１６６とＨＭａ１８６はエピトープが異なると考えられた（表１）。【００８９】
【表１】
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【００９０】
なお、モノクローナル抗体ＨＭａ１６６、ＨＭａ１８６は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号「ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２０」、「ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０１９」としてそれぞれ寄託されているハイブリドーマより産生される。【００９１】
（３）モノクローナル抗体作製の為のスクリーニング法
スクリーニングは各クローンの培養上清を５０μＬのｒｈＨＭＧＢ１（２μｇ/ｍＬ）を定法にて固相化し、精製水で５倍希釈したイムノブロック（DSファーマバイオメディカル）でブロッキングしたＥＬＩＳＡプレ−トに加え、２時間インキュベートした後洗浄し、続いて２次抗体としてＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧを加え、２時間インキュベートした後洗浄し、定法に従って発色基質TMBZ（KPL）を加え、リン酸で反応を終了させ、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸収を測定した。【００９２】
３．HMa166、HMa186モノクローナル抗体のエピトープ解析
ＨＭａ１６６とＨＭａ１８６モノクローナル抗体のエピトープについて、ＨＭＧＢ１の各種ペプチドと抗体との結合をビアコアで解析し、検討を行った。コントロールとして、ペプチドpeptide No.5（KPDAAKKGVVKAEK／配列番号：６）を免疫して得られたモノクローナル抗体ＣＰ１１−１を用いて同様の検討を行った。
結果、ＨＭａ１６６にpeptide No. 1（Ｇ２−Ａ１７）（GKGDPKKPRGKMSSYA/配列番号：１）は結合し、かつ洗浄後の結合量を示す抗原抗体複合体安定性も見られた。peptide No.3（Ｋ６５−Ｙ７８）(KADKARYEREMKTY/配列番号：３)もＨＭａ１６６に結合しているが、複合体安定性が低いため、これは非特異的吸着であると思われた（図２Ａ）。
また、ＨＭａ１８６はNo.1、No.2、No.3、No.4、No.5のどのpeptideとも結合性は見られなかった(図２Ｂ)。
ＣＰ１１−１は免疫に用いたpeptide No.5（KPDAAKKGVVKAEK／配列番号：６）にのみ結合性、抗原抗体複合体安定性がみとめられた（図２Ｃ）。【００９３】
また、モノクローナル抗体ＨＭａ１６６とＨＭａ１８６について、ＨＭＧＢ１−ＮＴとの結合性をビアコアで解析し、検討を行った。コントロールとして組換えヒトＨＭＧＢ１を用いた。
結果、ＨＭＧＢ１−ＮＴ（Ｍ１−Ｋ８２）（MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHP-DASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPK/配列番号：４）はモノクローナル抗体ＨＭａ１６６とＨＭａ１８６のどちらにも結合性を示した（図３Ａ, Ｂ）。【００９４】
さらに、ＨＭＧＢ１−ＮＴ（Ｍ１−Ｋ８２）（MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKH-PDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPK/配列番号：４）と組換えヒトＨＭＧＢ１と各モノクローナル抗体との反応性をドットブロット法を用いて確認した。
各タンパクをPVDF膜に100 ngスポットし、２０％イムノブロック（DSファーマ）で２時間室温でブロッキングし、TBStで洗浄後、各抗体を1μｇ/mlとなるように10%イムノブロック含有ＰＢＳに加え、２時間室温でインキュベートした。洗浄後、10%イムノブロック含有ＰＢＳで１００００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ   ＃ＮＡ９３１Ｖ）を室温で１時間反応させた。洗浄後、ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＃ＲＰＭ２２３６)で発色させた。
結果、モノクローナル抗体ＨＭａ１６６とＨＭａ１８６はＨＭＧＢ１−ＮＴと組換えヒトＨＭＧＢ１に結合性を示した。ＣＰ１１−１は組換えヒトＨＭＧＢ１にのみ結合性を示した（図４）。【００９５】
ＨＭａ１６６とＨＭａ１８６はエピトープが異なると考えられ（表１）、なおかつ、peptide No.2（Ｃ２３−Ｆ３８）（CREEHKKKHPDASVNF/配列番号：２）とpeptide No.3（Ｋ６５−Ｙ７８）(KADKARYEREMKTY/配列番号：３)には反応しなかった為、ＨＭａ１８６は４５番目のシステイン（Ｃ４５）付近の構造もしくは２３番目のシステイン（Ｃ２３）と４５番目のシステイン（Ｃ４５）がジスルフィド結合した立体構造を認識している可能性が考えられた（図５）。【００９６】
４．大腸菌組換えヒトＨＭＧＢ１の酸化還元状態の確認
精製した組換えヒトＨＭＧＢ１の酸化還元状態は以下の方法で確認した。
サイトカイン誘導能を持つジスルフィド型ＨＭＧＢ１は23番目のシステインC23と45番目のシステインC45がジスルフィド結合を持っており、サイトカイン誘導能は無く、ケモタキシスに関与する還元型ＨＭＧＢ１はこのジスルフィド結合が還元されていることが報告されている。精製した組換えヒトＨＭＧＢ１がこれらのどのような酸化還元状態になっているかを簡易的に調べるため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、両者の分子量を比較した。【００９７】
精製した組換えヒトＨＭＧＢ１に酸化防止（ジスルフィド結合形成防止）の目的で10 mM glutathione、1 mM EDTAを加え、10% β-ME非存在下、存在下の2xサンプルバッファー（第一化学薬品）（0.125 M Tris-HCl [pH 6.8]、4.3% SDS、30% Glycerol、0.01% BPB）を加え、室温で10分インキュベートしたのち、4-15% のアクリルアミドグラジエントゲル（Bio-Rad）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。コントロールとして、市販ジスルフィド ＨＭＧＢ１（HMGBiotech）を用いて同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。【００９８】
結果、市販ジスルフィド HMGBをβ-ME非存在下の非還元状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥしたものはジスルフィド結合を保持している為、分子が折りたたまれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける計算上の分子量が23.3 kDaと低くなる（図７レーン４）。一方、市販ジスルフィド HMGBをβ-ME存在下の還元状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥした物はジスルフィド結合が切断され、分子の折りたたみ構造が解消されるためにＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける計算上の分子量が24.9 kDaと高くなる（図７レーン５）。【００９９】
組換えヒトＨＭＧＢ１の場合、N末端に発現ベクター由来の付加配列を持つため、市販のＨＭＧＢ１より高い分子量を示すが、非還元状態では26.7 kDaと低く（図７レーン２）、還元状態では27.4 kDaと高い値を示した（図７レーン３）。これらのことより、組換えヒトＨＭＧＢ１はジスルフィド型ＨＭＧＢ１と同様、ジスルフィド結合を保持していると考えられた。【０１００】
５．還元型ヒト組換えＨＭＧＢ１の作製
還元型ＨＭＧＢ１は以下の方法で作製した。精製した組換えヒトＨＭＧＢ１（1 mg/ml）に20 mMとなるようにDTTを加え、37℃で60分インキュベートした。その後、20 mM glutathioneを含むPBSで平衡化したバッファー交換用カラムNap-5（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてバッファー置換を行った。【０１０１】
６．アルキル化ヒト組換えＨＭＧＢ１の作製
アルキル化ＨＭＧＢ１は還元型ヒト組換えＨＭＧＢ１と同様、20 mMとなるようにDTTを加え、37℃で60分インキュベートし、還元した後、40 mMとなるようにヨードアセトアミド（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加え、30分室温でインキュベートした。その後、過剰なヨードアセトアミドを不活性化するため、10 mMとなるようにDTTを加えた。引き続き、20 mM glutathioneを含むPBSで平衡化したバッファー交換用カラムNap-5（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてバッファー置換を行った。
ジスルフィド型ＨＭＧＢ１は、20 mM glutathioneを含むPBSで平衡化したバッファー交換用カラムNap-5（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてバッファー置換を行った。
タンパク定量はBradford 色素結合法（Bio-Rad）で行った。【０１０２】
７．ジスルフィドヒト組換えＨＭＧＢ１特異的抗体
3種の抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体HMa116、HMa186、CP11-1についてジスルフィド型ヒト組換えＨＭＧＢ１、還元型ヒトＨＭＧＢ１、アルキル化ヒト組換えＨＭＧＢ１に対する反応性について、分子間相互作用測定装置、ビアコア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検討した。
センサーチップに抗マウスIgG抗体を共有結合で固定化し、マウスIgG（ロックランド社）でブロッキングした後、20μg/mlの各モノクローナル抗体をそれぞれ結合させた。洗浄後、20μg/mlのジスルフィド型ヒト組換えＨＭＧＢ１、還元型ヒト組換えＨＭＧＢ１、アルキル化ヒト組換えＨＭＧＢ１を結合させ、その結合量を測定した。【０１０３】
結果、モノクローナル抗体HMa166およびCP11-1にはジスルフィド型ヒト組換えＨＭＧＢ１、還元型ヒト組換えＨＭＧＢ１、アルキル化ヒト組換えＨＭＧＢ１の3種の構造のＨＭＧＢ１が結合した。一方、HMa186にはジスルフィド型ヒト組換えＨＭＧＢ１のみが結合し、還元型ヒト組換えＨＭＧＢ１、アルキル化ヒト組換えＨＭＧＢ１には結合しなかった（図８）。すなわち、HMa186モノクローナル抗体はサイトカイン誘導能を持つジスルフィド型ＨＭＧＢ１の23番目のシステインC23と45番目のシステインC45によるジスルフィド結合領域を特異的に認識する抗体であった。【０１０４】
８．トロンビン分解ＨＭＧＢ１の作製
ＷＯ２０１４/１４７８７３  Ａ１では、ＨＭＧＢ１はトロンビンにより１０番目のアルギニン（Ｒ１０）と１１番目のグリシン（Ｇ１１）の間で切断され（ＨＭＧＢ１のＮ末端Ｍ１−Ｒ１０が切断され）、新たに露呈したＮ末端アミノ酸残基として「ＧＫＭＳＳ・・・」を有するＨＭＧＢ１の分解物ｄｅｓ−ＨＭＧＢ１が生じることが報告されている。また、ＷＯ２０１４/１４７８７３  Ａ１では、ｄｅｓ−ＨＭＧＢ１は不活性化され、細胞障害性が低くなることが報告されている（ＷＯ２０１４/１４７８７３  Ａ１  Ｐ．３  １５−２２行目）。
そこで、各モノクローナル抗体のトロンビン分解ＨＭＧＢ１に対する反応性を調べた。
トロンビン分解はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＣｌｅａｎＣｌｅａｖｅキットを用いて取扱説明書に準じて行った。1 mg/mlのヒト組換えＨＭＧＢ１90μlに10μlの１０Ｘバッファーを加え、その後、洗浄したトロンビン−アガロースを加えて３７℃で３時間および２０時間インキュベートした。インキュベーション後、５００ ｘｇで遠心してトロンビン−アガロースを取り除き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、分子量の低下を確認した（図９）。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、トランスブロッター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＰＶＤＦ膜に定法により電気転写し、トロンビン分解ＨＭＧＢ１と思われるバンドを切り出し、プロテインシークエンサー（ＡＢＩ）を用いてＮ末端アミノ酸配列解析を行った。結果、Ｎ−ＧＫＭＳＳＹＡＦＦＶＱＴＸＸＥＥＨＫＫＫ―Ｃ（Ｘ：未知アミノ酸／配列番号：８）と配列決定でき、ｄｅｓ−ＨＭＧＢ１と同等の配列が確認できた（図９）。【０１０５】
９．ｄｅｓ−ＨＭＧＢ１に対する抗体の反応性
ビアコア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ）を用いてｄｅｓ−ＨＭＧＢ１と抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体ＨＭａ１６６、ＨＭａ１８６との結合性を検討した。
センサーチップに抗マウスIgG抗体を共有結合で固定化し、マウスIgG（ロックランド社）でブロッキングした後、20μg/mlの各モノクローナル抗体をそれぞれ結合させた。洗浄後、20μg/mlのｄｅｓ−ＨＭＧＢ１を結合させ、その結合量を測定した。
結果、ＨＭａ１６６はｄｅｓ−ＨＭＧＢ１とは反応しなくなったが、ＨＭａ１８６はｄｅｓ−ＨＭＧＢ１とも結合できた（図１０）。【０１０６】
１０．ジスルフィド型ＨＭＧＢ１を測定出来るＥＬＩＳＡの作製
96 well ＥＬＩＳＡ plate (Maxsorp, Nunc)に10μg/mLの抗ＨＭＧＢ１抗体HMa186を100μL加え、定法に従い、固相化し、イムノブロック（DSファーマバイオメディカル）を精製水で5倍希釈したものを200μL分注し、ブロッキングを行った。TBSt (10 mM Tris pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20)で洗浄した後、0-80 ng/mLとなるように組換えＨＭＧＢ１を加え、室温で２時間反応させ、TBStで洗浄後、HRP標識した抗ＨＭＧＢ１抗体CP11-1を加え、洗浄後、定法に従って発色基質TMBZ（KPL）を加え、リン酸で反応を終了させ、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸収を測定した。
結果、2.5-80 ng/mLの組換えＨＭＧＢ１で直線性が得られた（図１１）。【０１０７】
１１．全てのＨＭＧＢ１（トータル）を測定出来るＥＬＩＳＡの作製
病態の進行状態、経過等の正確な把握にはサイトカイン誘導能のあるジスルフィド型ＨＭＧＢ１のみならず、還元型ＨＭＧＢ１や、分解されたｄｅｓ−ＨＭＧＢ１の測定も重要である。そこで、ＨＭａ１６６、ＨＭａ１８６を併用することによりジスルフィド型ＨＭＧＢ１、還元型ＨＭＧＢ１、ｄｅｓ−ＨＭＧＢ１の全てのＨＭＧＢ１（トータルＨＭＧＢ１）を測定出来るＥＬＩＳＡを作製した。
96 well ＥＬＩＳＡ plate (Maxsorp, Nunc)に、10μg/mLとなるように混合したHMa166とHMa186を100μL加え、定法に従い、固相化し、イムノブロック（DSファーマバイオメディカル）を精製水で5倍希釈したものを200μL分注し、ブロッキングを行った。TBSt (50 mM Tris pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20)で洗浄した後、0-80 ng/mLとなるように組換えＨＭＧＢ１を加え、室温で２時間反応させ、TBStで洗浄後、HRP標識した抗ＨＭＧＢ１抗体CP11-1を加え、洗浄後、定法に従って発色基質TMBZ（KPL）を加え、リン酸で反応を終了させ、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸収を測定した。
結果、2.5-80 ng/mLの組換えＨＭＧＢ１で直線性が得られた（図１２）。【０１０８】
１２．トータルＨＭＧＢ１測定ＥＬＩＳＡの至適化
ＥＬＩＳＡ等の抗原抗体反応において、一部の抗体では一般的な抗原抗体反応で用いられる塩濃度やｐＨ範囲であっても、干渉をうけ、良く反応出来ないことがある。そこで、当該トータルＨＭＧＢ１測定ＥＬＩＳＡの反応バッファーについて至適塩濃度およびｐＨの検討を添加回収実験により行った。96 well ＥＬＩＳＡ plate (Maxsorp, Nunc)に、10μg/mLとなるように混合したHMa166とHMa186を100μL加え、定法に従い固相化し、100 mM Tris-HCl (pH8.8)、１％ＢＳＡを300μL分注し、ブロッキングを行った。TBSt (50 mM Tris-HCl (pH7.4)、150 mM NaCl、0.05% Tween-20)で洗浄した。ｐＨを7.0、7.5、8.0、8.5、9.0に調製した5% BSA、0.1% Tween-20含有100 mM Tris-HCl、100 mM NaCl緩衝液(総塩濃度200 mM)、5% BSA、0.1% Tween-20含有100 mM Tris-HCl、40 mM NaCl緩衝液(総塩濃度140 mM)、5% BSA、0.1% Tween-20含有20 mM Tris-HCl、100 mM NaCl緩衝液(総塩濃度120 mM)にてヒトプール血漿（コージンバイオ）を10倍希釈し、さらに20 ngの組換えＨＭＧＢ１を加え、37℃で２時間反応させた。TBStで洗浄した後、HRP Protector(CANDOR Bioscience GmbH)で2μg/mL となるように希釈したHRP標識抗ＨＭＧＢ１抗体CP11-1を加え、室温で1時間反応させ、洗浄後、定法に従って発色基質TMBZ（KPL）を加え、リン酸で反応を終了させ、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸収を測定した。回収率は実測のＨＭＧＢ１値から各条件で測定したプール血漿中のＨＭＧＢ１濃度を減算した数値を添加量20で除して算出した。【０１０９】
結果、ヒトプール血漿に添加回収したＨＭＧＢ１の添加回収率を比較した場合、100 mM Tris-HCl（pH7.0）、40 mM NaClの緩衝液を用いた時の121%を除いて、どの塩濃度の緩衝液を用いてもほぼ100%±10%の回収率に収まっており、大きな違いは認められなかった。当該ＥＬＩＳＡはＥＬＩＳＡ等で良く用いられる生理的塩濃度である150 mM前後では緩衝液の塩濃度の違いに影響がない事が分かった。また、pHについてもＥＬＩＳＡ等で良く用いられるpH7.0からpH9.0の間でも大きな影響がないことが分かった（図１３）。【０１１０】
１３．ＨＭａ１６６、ＨＭａ１８６のＣＤＲ領域のシークエンス
（１）ＲＮＡ抽出
ＨＭａ１６６、ＨＭａ１８６産生ハイブリドーマ（１ｘ１０７  ｃｅｌｌ）に０．７５ｍｌのＴｒｉｚｏｌ  ＬＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加え、上下にピペッティングし、直接細胞を溶解した。５分間室温でインキュベートした後、０．２ｍｌのクロロホルムを加え、１５秒間激しく震とう混和した。室温で１５分インキュベートした後、１２，０００ｇ、１５分、４℃で遠心した。遠心後、水層を回収し、０．５ｍｌのイソプロパノールを加え、１０分間室温でインキュベートし、１２，０００ｇ、１０分、４℃で遠心した。得られた沈殿に１ｍｌの８０％エタノールを加え、沈殿を洗浄し、乾燥させた後、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水に溶解し、ＲＮＡとした。【０１１１】
（２）ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡ合成は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて行った。２μｇのＲＮＡにｏｌｉｇｏ  ｄＴプライマー  ５μＭ、ｄＮＴＰ  １ｍＭ、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を加え１０μｌとし、６５℃で５分間インキュベートした。その後、５ｘＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｂｕｆｆｅｒ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ２０Ｕ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＲＴａｓｅ  ２００Ｕ、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を加えて２０μｌとした。混合液を４２℃で４５分間インキュベートした後、７２℃で１５分熱処理した。【０１１２】
（３）ＣＤＲ領域のＰＣＲ
ＣＤＲ領域のクローニングはＷａｎｇら（Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｍｅｔｈｏｄ  ２０００，２３３，１６７−１７７）の方法に従って行った。ＰＣＲ酵素はＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）を用いた。重鎖のＰＣＲにはそれぞれＩｇＧ１プライマー（５’−ＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＧＣ−３’／配列番号：６４）、５’ＭＨ１プライマー（５’−ＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣ−３’／配列番号：６５）のセット、軽鎖のＰＣＲには３’ＫＣプライマー（５’−ＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣ−３’／配列番号：６６）、５’ＭＫプライマー（５’−ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＳＡＣＭＣＡＲＷＣＴＭＣＡ−３’／配列番号：６７）のセットを用いた。
ｃＤＮＡ１μｌ、１０ｘ  ＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μｌ、ｄＮＴＰ  ３．２μｌ、各０．５ μＭのプライマーセット、１Ｕ  ＥｘＴａｑ、滅菌精製水を加えて４０μｌとした。混合液を９４℃３分の変性の後、９４℃３０秒−４８℃３０秒−７２℃３０秒を３０サイクル繰り返し、７２℃３分伸長反応を行った。【０１１３】
（４）ＣＤＲ領域のクローニング
得られたそれぞれの重鎖、軽鎖のＰＣＲ産物を精製し、ｐＴ７  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＴＡクローニングした。１６℃で一昼夜インキュベーションし、ライゲーションした産物を大腸菌ＪＭ１０９にトランスフォームし、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に植菌し、一晩培養した。生育したコロニーをピックアップし、ボイル法にて鋳型ＤＮＡを調整し、ＰＣＲに供した。【０１１４】
（５）ＣＤＲ領域のシークエンス
ＰＣＲ酵素はＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）を用いた。鋳型ＤＮＡ１μｌ、１０ｘ  ＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μｌ、ｄＮＴＰ  ３．２μｌ、各０．５ μＭのＭ１３Ｕプライマー（５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’／配列番号：６８）、Ｍ１３Ｒプライマー（５’−ＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’／配列番号：６９）、１Ｕ  ＥｘＴａｑ、滅菌精製水を加えて４０μｌとした。混合液を９４℃３分の変性の後、９４℃３０秒−５５℃３０秒−７２℃３０秒を３０サイクル繰り返し、７２℃３分伸長反応を行った。得られたＰＣＲ産物を精製し、それぞれＭ１３Ｕプライマー、Ｍ１３Ｒプライマーを用いて定法によりシークエンス反応を行い、ＡＢＩ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、シークエンスを行った。【０１１５】
（６）ＣＤＲ領域の配列解析
シークエンサーにより、得られた配列を確認し、ＩＧＢＬＡＳＴ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を用いてＣＤＲ領域の解析を行った。その結果を図１４〜１６に示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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