(57)【要約】  本発明は、抗原結合活性を有するものとして簡便に製造できるものであって、大腸菌発現系で得られるものであっても、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）よりもそれ自体及び抗原分子との複合体の結晶化能が高い、フラグメント抗体の提供を課題とする  本発明は、抗体の重鎖ドメイン（ＶＨ領域）のＣ末端にＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチドであって、ＶＨ領域がＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１１２のアミノ酸残基をシステインに変異させたペプチド（ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ）と、抗体の軽鎖ドメイン（ＶＬ領域）のＣ末端にＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチドであって、ＳＡＲＡＨドメインがＣ末端から１３番目のアミノ酸残基をシステインに変異させたものであるペプチド（ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ））との複合体からなるフラグメント抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）抗体の重鎖ドメイン（ＶＨ領域）のＣ末端にＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチドであって、ＶＨ領域がＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１１２のアミノ酸残基をシステインに変異させたペプチド（ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ）と、
（ｂ）抗体の軽鎖ドメイン（ＶＬ領域）のＣ末端にＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチドであって、ＳＡＲＡＨドメインがＣ末端から１３番目のアミノ酸残基をシステインに変異させたペプチド（ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ））との複合体からなるフラグメント抗体であって、
（ｃ）ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨとＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）が、上記２つのシステイン間のジスルフィド結合により結合しているフラグメント抗体。
【請求項２】
前記ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨにおけるＳＡＲＡＨドメインが、配列番号１〜８で示されるものであり、前記ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）におけるＳＡＲＡＨドメインが、配列番号９〜１６で示されるものである、請求項１に記載のフラグメント抗体。
【請求項３】
前記ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨにおけるＳＡＲＡＨドメインが、配列番号１〜２で示されるものであり、前記ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）におけるＳＡＲＡＨドメインが、配列番号９〜１０で示されるものである、請求項１に記載のフラグメント抗体。
【請求項４】
（ａ）抗体の重鎖ドメイン（ＶＨ領域）のＣ末端にＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチドであって、ＶＨ領域がＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１１２のアミノ酸残基をシステインに変異させたペプチド（ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ）と、
（ｂ）抗体の軽鎖ドメイン（ＶＬ領域）のＣ末端にＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチドであって、ＳＡＲＡＨドメインがＣ末端から１３番目のアミノ酸残基をシステインに変異させたペプチド（ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ））との複合体からなるタンパク質結晶化促進用フラグメント抗体であって、
（ｃ）ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨとＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）が、上記２つのシステイン間のジスルフィド結合により結合しているタンパク質結晶化促進用フラグメント抗体。
【請求項５】
前記ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨにおけるＳＡＲＡＨドメインが、配列番号１〜８で示されるものであり、前記ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）におけるＳＡＲＡＨドメインが、配列番号９〜１６で示されるものである、請求項４に記載のタンパク質結晶化促進用フラグメント抗体。
【請求項６】
前記ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨにおけるＳＡＲＡＨドメインが、配列番号１〜２で示されるものであり、前記ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）におけるＳＡＲＡＨドメインが、配列番号９〜１０で示されるものである、請求項４に記載のタンパク質結晶化促進用フラグメント抗体。
【請求項７】
前記請求項１〜３で示されるフラグメント抗体を用いる、タンパク質の結晶化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラグメント抗体、及び当該フラグメント抗体を用いるタンパク質の結晶化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＧをはじめとする抗体分子は、抗原分子に結合する性質から、研究や治療、診断の分野において今や欠かせないツールとなっている。抗体分子は一般に分子量が大きいマルチドメインの糖タンパク質であり、分子内に複数のジスルフィド結合（以下、Ｓ−Ｓ結合と略記する場合がある）があるため、動物細胞を用いて発現させる必要がある。しかし、動物細胞を用いたタンパク質の生産は、バクテリアを用いた生産に比べて一般にコストがかかる上に、リコンビナントの抗体分子は発現が悪いことが多い為、生産性が低いという問題がある。【０００３】
上記の抗体分子の生産における問題点を補うべく、分子量が小さいフラグメント抗体の使用が考案されている。フラグメント抗体は、組織浸潤性が高い等のメリットがある。【０００４】
代表的なフラグメント抗体としては、ｖａｒｉａｂｌｅドメイン（ＶＨ領域およびＶＬ領域）とｃｏｎｓｔａｎｔドメイン（ＣＨ１領域およびＣＬ領域）から構成されるＦａｂが挙げられる。しかし、Ｆａｂは一般に全長抗体を精製後、それを酵素処理したのちさらなる精製を経て得るのが通例である為、生産コストが高いという問題がある。また、他のフラグメント抗体としては、ＶＨ領域またはＶＬ領域のＣ末端ともう一方のＮ末端を長くフレキシブルなペプチドリンカーで結合させたｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ（以下、ｓｃＦｖと略記する場合がある）が知られている（非特許文献１）。しかし、長くフレキシブルなペプチドリンカーがあることにより、ｓｃＦｖ同士の凝集が生じることがあった。また、抗体としての活性が低下したり、不安定化したりする等の問題もあった。【０００５】
そこで、本発明者らは従来のフラグメント抗体が有する問題点を解決すべく、ＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端同士を、逆平行のコイルドコイルを形成するヒトＭａｍｍａｌｉａｎ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ２０−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １（Ｍｓｔ１）のＳＡＲＡＨドメインのダイマーを介して結合させた新たなフラグメント抗体（以下、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ第１世代、またはＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）と略記する場合がある）を開発した（非特許文献２）。【０００６】
このＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）は、（ａ）抗体の重鎖ドメイン（ＶＨ領域）のＣ末端にヒトＭｓｔ１のＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチドであって、当該ヒトＭｓｔ１のＳＡＲＡＨドメインのＮ末端から３５番目のアミノ酸残基をシステインに変異させたペプチドと、（ｂ）抗体の軽鎖ドメイン（ＶＬ領域）のＣ末端にヒトＭｓｔ１のＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチドであって、当該ヒトＭｓｔ１のＳＡＲＡＨドメインのＮ末端から２４番目のアミノ酸残基をシステインに変異させたペプチドとの複合体からなるフラグメント抗体であって、（ｃ）２つのＳＡＲＡＨドメインが、変異させたシステイン間のジスルフィド結合により結合しているフラグメント抗体である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ．  Ｂｉｒｄ、  １９８８、  Ｓｃｉｅｎｃｅ、  Ｊａｍｅｓ  Ｓ．  Ｈｕｓｔｏｎ、  １９８８、  ＰＮＡＳ
【非特許文献２】有森貴夫、町田栞、藤井勇樹、北郷悠、高木淳一、新規フラグメント抗体フォーマット“Ｆｖ−ｃｌａｓｐ”のデザインとその構造解析、第１５回日本蛋白質科学会年会、平成２７年６月２５日
【非特許文献３】Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、  Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ、  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、  １９６、  ９０１−９１７  （１９８７）
【非特許文献４】Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ，  Ｂ．，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．  ＆  Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．  （１９９７）．Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７３，  ９２７−９４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、種々の目的抗原分子に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）について、動物細胞又は大腸菌を用いた遺伝子組換による発現、精製、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）の結晶化およびＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）と目的抗原分子との複合体の結晶化を試みた。その結果、特に大腸菌発現系で得られるＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）において、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）と目的抗原分子との複合体の結晶が得られない場合や、分解能が低い結晶しか得られない場合があることが判った。【０００９】
そこで、本発明は、抗原結合活性を有するものとして簡便に製造でき、大腸菌発現系で得られるものであっても、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）よりも、それ自体及び抗原分子との複合体の結晶化能が高い、フラグメント抗体の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決するため、（ａ）抗体の重鎖ドメイン（ＶＨ領域）のＣ末端にヒトＭｓｔ１のＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチド（以下、ＶＨ−ＳＡＲＡＨと略記する場合がある）中のＶＨ領域にシステインの変異を入れたペプチドと、（ｂ）抗体の軽鎖ドメイン（ＶＬ領域）のＣ末端にヒトＭｓｔ１のＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチド（以下、ＶＬ−ＳＡＲＡＨと略記する場合がある）中のＳＡＲＡＨドメインにシステインの変異を入れたペプチドとの複合体からなる複数のフラグメント抗体について、当該フラグメント抗体と抗原分子との複合体の結晶化を鋭意研究した。
その結果、（ａ）抗体の重鎖ドメイン（ＶＨ領域）のＣ末端にＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチドであって、ＶＨ領域がＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１１２のアミノ酸残基をシステインに変異させたペプチド（以下、ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨと略記する場合がある）と、（ｂ）抗体の軽鎖ドメイン（ＶＬ領域）のＣ末端にＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチドであって、ＳＡＲＡＨドメインのＣ末端から１３番目のアミノ酸残基をシステインに変異させたペプチド（以下、ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）と略記する場合がある）との複合体からなるフラグメント抗体であって、（ｃ）ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨとＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）が、上記２つのシステイン間のジスルフィド結合により結合しているフラグメント抗体（以下、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ第２世代、またはＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と略記する場合がある）を用いると、大腸菌発現系で得られたＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）であっても、それ自体やＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と抗原分子との複合体についての結晶化能を有することを見出した。
加えて、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、結晶化条件の最適化を行う前のスクリーニング段階から、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と抗原分子の複合体について高分解能の結晶を得ることができることも見出した。また、難結晶化タンパク質の結晶化が促進されたことから、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）はタンパク質結晶化促進用フラグメント抗体として働くことも見出した。さらに、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）やｓｃＦｖと比べて熱安定性が高いことを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１１】
本発明は、以下のフラグメント抗体、及び当該フラグメント抗体を用いるタンパク質の結晶化方法に関する。
［１］（ａ）抗体の重鎖ドメイン（ＶＨ領域）のＣ末端にＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチドであって、ＶＨ領域がＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１１２のアミノ酸残基をシステインに変異させたペプチド（ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ）と、（ｂ）抗体の軽鎖ドメイン（ＶＬ領域）のＣ末端にＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチドであって、ＳＡＲＡＨドメインがＣ末端から１３番目のアミノ酸残基をシステインに変異させたペプチド（ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ））との複合体からなるフラグメント抗体であって、（ｃ）ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨとＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）が、上記２つのシステイン間のジスルフィド結合により結合しているフラグメント抗体。
［２］前記ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨにおけるＳＡＲＡＨドメインが、配列番号１〜８で示されるものから選ばれるもの（配列番号１〜８で示されるもの）であり、前記ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）におけるＳＡＲＡＨドメインが、配列番号９〜１６で示されるものである、［１］に記載のフラグメント抗体。
［３］前記ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨにおけるＳＡＲＡＨドメインが、配列番号１〜２で示されるものであり、前記ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）におけるＳＡＲＡＨドメインが、配列番号９〜１０で示されるものである、［１］に記載のフラグメント抗体。
［４］（ａ）抗体の重鎖ドメイン（ＶＨ領域）のＣ末端にＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチドであって、ＶＨ領域がＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１１２のアミノ酸残基をシステインに変異させたペプチド（ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ）と、（ｂ）抗体の軽鎖ドメイン（ＶＬ領域）のＣ末端にＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチドであって、ＳＡＲＡＨドメインがＣ末端から１３番目のアミノ酸残基をシステインに変異させたペプチド（ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ））との複合体からなるタンパク質結晶化促進用フラグメント抗体であって、（ｃ）ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨとＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）が、上記２つのシステイン間のジスルフィド結合により結合しているタンパク質結晶化促進用フラグメント抗体。
［５］前記ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨにおけるＳＡＲＡＨドメインが、配列番号１〜８で示されるものであり、前記ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）におけるＳＡＲＡＨドメインが、配列番号９〜１６で示されるものである、［４］に記載のタンパク質結晶化促進用フラグメント抗体。
［６］前記ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨにおけるＳＡＲＡＨドメインが、配列番号１〜２で示されるものであり、前記ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）におけるＳＡＲＡＨドメインが、配列番号９〜１０で示されるものである、［４］に記載のタンパク質結晶化促進用フラグメント抗体。
［７］前記［１］〜［３］で示されるフラグメント抗体を用いる、タンパク質の結晶化方法。
【発明の効果】
【００１２】
［１］本発明のフラグメント抗体は、簡便に製造することができ、且つ、抗原結合活性を有する。
［２］本発明のフラグメント抗体は、大腸菌発現系で得られるものであっても、それ自体及び抗原分子との複合体の結晶化能が高い。これにより、本発明のフラグメント抗体は、従来のフラグメント抗体や抗体では困難であった抗原決定部位の立体構造解析が容易にできる。
［３］さらに、本発明のフラグメント抗体は、タンパク質、特に、難結晶化タンパク質との複合体の結晶化を促進し、タンパク質結晶化促進用フラグメント抗体として働く。また、本発明のフラグメント抗体によれば、タンパク質との複合体との結晶が短期間で再現性よく得られる。
［４］本発明のフラグメント抗体は、従来の抗体やフラグメント抗体よりも耐熱性が高く、より安定なフラグメント抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、比較例１でＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）が得られたことを確認した図である。
【図２】図２は、比較例２でＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）が得られたことを確認した図である。
【図３】図３は、比較例３でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）が得られたことを確認した図である。
【図４】図４は、比較例５で行ったＰ２０．１抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＣ８ペプチドとの複合体のＸ線結晶構造解析の結果である。
【図５】図５は、比較例６で行った１２ＣＡ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＨＡペプチドとの複合体のＸ線結晶構造解析の結果である。
【図６】図６は、実験例１において、比較例７−９及び実施例１で得た、２Ｈ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（Ｓ−Ｓなし）、２Ｈ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’）、２Ｈ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’’）、及び２Ｈ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）のＳ−Ｓ結合形成能をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した図である。
【図７】図７は、実施例２でＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）が得られたことを確認した図である。
【図８】図８は、実施例３−１０でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各種Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）が得られたことを確認した図である。
【図９】図９は、実験例２でゲルろ過クロマトグラフィーにより各種Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）が抗原結合活性を有することを確認した図である。
【図１０】図１０は、実験例２でバイオレイヤー干渉法により各種Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）が抗原結合活性を有することを確認した図である。
【図１１】図１１（Ａ）は、実施例１１でＴＳ２／１６抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）について得られた結晶の顕微鏡写真である。図１１（Ｂ）は、実施例１１で行ったＴＳ２／１６抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）のＸ線結晶構造解析の結果である。
【図１２】図１２（Ａ）は、実施例１２でＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と抗原分子の複合体について得られた結晶の顕微鏡写真である。図１２（Ｂ）は、実施例１２で行ったＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と抗原分子の複合体のＸ線結晶構造解析の結果である。
【図１３】図１３（Ａ）は、実施例１３で１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と抗原分子の複合体について得られた結晶の顕微鏡写真である。図１３（Ｂ）は、実施例１３で行った１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と抗原分子の複合体のＸ線結晶構造解析の結果である。
【図１４】図１４（Ａ）は、実施例１４でＮＺ−１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と抗原分子の複合体について得られた結晶の顕微鏡写真である。図１４（Ｂ）は、実施例１４で行ったＮＺ−１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と抗原分子の複合体のＸ線結晶構造解析の結果である。
【図１５】図１５（Ａ）及び（Ｂ）は、実施例１５で９３２０１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とＶｐｓ１０ｐの複合体について得られた結晶の顕微鏡写真である。図１５（Ｃ）は、実施例１５で行った９３２０１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とＶｐｓ１０ｐの複合体のＸ線結晶構造解析の結果である。
【図１６】図１６（Ａ）及び（Ｂ）は、実施例１６でＴＳ２／１６抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とインテグリンα６β１の複合体について得られた結晶の顕微鏡写真である。図１６（Ｃ）は、実施例１６で行ったＴＳ２／１６抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とインテグリンα６β１の複合体のＸ線結晶構造解析の結果である。
【図１７】図１７（Ａ）は、実施例１７でｔ１Ｅ４抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とＨＧＦの複合体について得られた結晶の顕微鏡写真である。図１７（Ｂ）は、実施例１７で行ったｔ１Ｅ４抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とＨＧＦの複合体のＸ線結晶構造解析の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のフラグメント抗体は、
（ａ）抗体の重鎖ドメイン（ＶＨ領域）のＣ末端にＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチドであって、ＶＨ領域においてＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１１２のアミノ酸残基をシステインに変異させたペプチド（ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ）と、
（ｂ）抗体の軽鎖ドメイン（ＶＬ領域）のＣ末端にＳＡＲＡＨドメインのＮ末端が結合したペプチドであって、ＳＡＲＡＨドメインのＣ末端から１３番目のアミノ酸残基をシステインに変異させたペプチド（ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ））との複合体からなるフラグメント抗体であって、
（ｃ）ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨとＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）が、上記２つのシステイン間のジスルフィド結合により結合しているフラグメント抗体である。
なお、非特許文献３及び４は、Ｃｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号の決定法に関する文献である。
【００１５】
［ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ］
ＳＡＲＡＨドメインは、Ｎ末端側の短いヘリックス（ｈ１）とＣ末端側の長いヘリックス（ｈ２）により構成される通常４２〜５４個、好ましくは４３〜４９個、より好ましくは４７〜４９個、特に好ましくは４９個のアミノ酸残基からなるドメイン（ペプチド）であって、他のＳＡＲＡＨドメインと、それぞれのｈ２間で逆平行コイルドコイルを形成するという性質を有するものである。尚、ｈ１は好ましくは５〜７個、ｈ２は好ましくは３８〜４２個のアミノ酸残基からなる。
ここで用いられるＳＡＲＡＨドメインとしては、上記した如き性質を有するものであればよく、なかでも２つのＳＡＲＡＨドメインがｈ２間で逆平行コイルドコイルを形成する際に、２つのＳＡＲＡＨドメインの（２つのｈ１の）両Ｎ末端の間の距離が３５Å〜４５Åとなるものが好ましく、３９Å〜４１Åとなるものがより好ましく、４０Åとなるものが特に好ましい。
このようなＳＡＲＡＨドメインとしては、具体的には、例えば、ヒトＭａｍｍａｌｉａｎ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ２０−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １（Ｍｓｔ１）のＳＡＲＡＨドメイン、ヒトＭａｍｍａｌｉａｎ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ２０−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  ２（Ｍｓｔ２）のＳＡＲＡＨドメイン、ショウジョウバエのＨｉｐｐｏのＳＡＲＡＨドメイン、ショウジョウバエＲＡＳＳＦのＳＡＲＡＨドメイン、ヒトＲＡＳＳＦ５のＳＡＲＡＨドメイン、ヒトＲＡＳＳＦ１のＳＡＲＡＨドメイン、ヒトＷＷ４５のＳＡＲＡＨドメイン、ショウジョウバエＳａｖのＳＡＲＡＨドメイン等が挙げられ、更にこれらのうちの一つ（好ましくはヒトＭｓｔ１のＳＡＲＡＨドメイン）と通常８５％以上の配列相同性、好ましくは９０％以上の配列相同性、より好ましくは９５％以上の配列相同性を有するもの等が挙げられる。
より具体的には、例えば、配列番号１で示されるもの（Ｍｓｔ１のＳＡＲＡＨドメイン）、配列番号２で示されるもの（Ｍｓｔ２のＳＡＲＡＨドメイン）、配列番号３で示されるもの（ＨｉｐｐｏのＳＡＲＡＨドメイン）、配列番号４で示されるもの（ＲＡＳＳＦのＳＡＲＡＨドメイン）、配列番号５で示されるもの（ＲＡＳＳＦ５のＳＡＲＡＨドメイン）、配列番号６で示されるもの（ＲＡＳＳＦ１のＳＡＲＡＨドメイン）、配列番号７で示されるもの（ＷＷ４５のＳＡＲＡＨドメイン）、配列番号８で示されるもの（ＳａｖのＳＡＲＡＨドメイン）等が好ましく、配列番号１〜２で示されるものがより好ましく、配列番号１で示されるものが特に好ましい。なお、上記した性質を有するものであれば、配列番号１〜８で示されるものは、その配列中の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものであってもよい。ここで、数個とは５個以下、好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下の自然数を表す。このようなものとしては、例えば配列番号１〜８において、Ｃ末端から２６番目のアミノ酸残基がシステインに置換（変異）しているもの等が挙げられる。
上記ＳＡＲＡＨドメインは、天然に存在するタンパク質に由来するＳＡＲＡＨドメインであっても、天然に存在するタンパク質に由来するＳＡＲＡＨドメインをもとに人工的にデザインしたものであっても何れでもよい。
天然に存在するタンパク質に由来するＳＡＲＡＨドメインは、通常、当該タンパク質を有する生物種を問わないが、本発明のフラグメント抗体を医薬として用いる場合には、抗原性の面から、実際の利用に際して投与することになる動物と同一の生物種に由来するものが好ましい。
【００１６】
ここで用いられるＶＨ領域としては、少なくとも特定の抗原を認識して特異的な親和結合性を有するのに十分な部位を有し、且つＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１１２のアミノ酸残基がシステインであるものである。
なお、上記システインの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａ法により決定される位置であるが、当該アミノ酸残基と同じ位置であれば、Ｃｈｏｔｈｉａ法以外の方法、例えばＫａｂａｔ法、ＩＭＧＴ法により定義したものも含まれる。
本発明におけるＶＨ領域は、具体的には、目的とする抗原分子に対する抗体の重鎖における３つのＣＤＲ１〜３とＣｈｏｔｈｉａ法により決定される抗体残基番号１１２のアミノ酸残基がシステインであるフレームワーク領域（ＦＲ）４を少なくとも含むものであり、好ましくは、目的とする抗原分子に対する抗体の重鎖における３つのＣＤＲ１〜３とＦＲ１〜３およびＣｈｏｔｈｉａ法により決定される抗体残基番号１１２のアミノ酸残基がシステインであるＦＲ４を少なくとも含むものである。
なかでも、Ｃｈｏｔｈｉａ法により決定される抗体残基番号１〜１１２のアミノ酸配列又は抗体残基番号１〜１１３のアミノ酸配列からなるものであって、抗体残基番号１１２のアミノ酸残基がシステインであるものがより好ましく、Ｃｈｏｔｈｉａ法により決定される抗体残基番号１〜１１３のアミノ酸配列からなるものであって、抗体残基番号１１２のアミノ酸残基がシステインであるものが特に好ましい。
なお、ＣＤＲ１〜３は、Ｃｈｏｔｈｉａ法、Ｋａｂａｔ法、ＩＭＧＴ法またはその他の方法に従い、あるいはこれらを総合的に考慮して決定すればよい。
【００１７】
本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨは、上記のＶＨ領域のＣ末端と上記のＳＡＲＡＨドメインのＮ末端とが結合したものである。ＶＨ領域とＳＡＲＡＨドメインとは、直接結合していても、リンカー配列を介して結合していてもよいが、ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨの発現効率やリフォールドの効率が高いことから、リンカー配列を介するほうが好ましい。リンカー配列の長さとしては、通常１〜４アミノ酸残基、好ましくは２アミノ酸残基である。リンカー配列としては、本発明のフラグメント抗体の性質に悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されないが、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ等が挙げられる。
【００１８】
以下に本発明のＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨを模式的に示す。
2018088403.tif 000002
（Ｘはアミノ酸残基、ｍは０〜４の整数、−［Ｘ］ｍ−はリンカー配列をそれぞれ表す。）
【００１９】
［ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）］
ここで用いられるＳＡＲＡＨドメインは、Ｎ末端側の短いヘリックス（ｈ１）とＣ末端側の長いヘリックス（ｈ２）により構成される通常４２〜５４個、好ましくは４３〜４９個、より好ましくは４７〜４９個、特に好ましくは４９個のアミノ酸残基からなるドメイン（ペプチド）であって、他のＳＡＲＡＨドメインと、それぞれのｈ２間で逆平行コイルドコイルを形成するという性質を有するものであって、且つＣ末端から１３番目のアミノ酸残基がシステインであるものである。尚、ｈ１は好ましくは５〜７個、ｈ２は好ましくは３８〜４２個のアミノ酸残基からなる。なかでも２つのＳＡＲＡＨドメインがｈ２間で逆平行コイルドコイルを形成する際に、２つのＳＡＲＡＨドメインの（２つのｈ１の）両Ｎ末端の間の距離が３５Å〜４５Åとなるものが好ましく、３９Å〜４１Åとなるものがより好ましく、４０Åとなるものが特に好ましい
このようなＳＡＲＡＨドメインとしては、上記の本発明のＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨにおけるＳＡＲＡＨドメインのＣ末端から１３番目のアミノ酸残基がシステインに置換（変異）したものが挙げられる。
具体的には例えばヒトＭａｍｍａｌｉａｎ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ２０−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １（Ｍｓｔ１）のＳＡＲＡＨドメイン、ヒトＭａｍｍａｌｉａｎ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ２０−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  ２（Ｍｓｔ２）のＳＡＲＡＨドメイン、ショウジョウバエのＨｉｐｐｏのＳＡＲＡＨドメイン、ショウジョウバエＲＡＳＳＦのＳＡＲＡＨドメイン、ヒトＲＡＳＳＦ５のＳＡＲＡＨドメイン、ヒトＲＡＳＳＦ１のＳＡＲＡＨドメイン、ヒトＷＷ４５のＳＡＲＡＨドメイン、ショウジョウバエＳａｖのＳＡＲＡＨドメイン等が挙げられ、更にこれらのうちの一つ（好ましくはヒトＭｓｔ１のＳＡＲＡＨドメイン）と通常８５％以上の配列相同性、好ましくは９０％以上の配列相同性、より好ましくは９５％以上の配列相同性を有するものであって、且つそのＣ末端から１３番目のアミノ酸残基がシステインに置換（変異）したもの等が挙げられる。
より具体的には、例えば、配列番号９で示されるもの（Ｍｓｔ１のＳＡＲＡＨドメインのＣ末端から１３番目のアミノ酸残基がシステインに置換（変異）したもの）、配列番号１０で示されるもの（Ｍｓｔ２のＳＡＲＡＨドメインのＣ末端から１３番目のアミノ酸残基がシステインに置換（変異）したもの）、配列番号１１で示されるもの（ＨｉｐｐｏのＳＡＲＡＨドメインのＣ末端から１３番目のアミノ酸残基がシステインに置換（変異）したもの）、配列番号１２で示されるもの（ＲＡＳＳＦのＳＡＲＡＨドメインのＣ末端から１３番目のアミノ酸残基がシステインに置換（変異）したもの）、配列番号１３で示されるもの（ＲＡＳＳＦ５のＳＡＲＡＨドメインのＣ末端から１３番目のアミノ酸残基がシステインに置換（変異）したもの）、配列番号１４で示されるもの（ＲＡＳＳＦ１のＳＡＲＡＨドメインのＣ末端から１３番目のアミノ酸残基がシステインに置換（変異）したもの）、配列番号１５で示されるもの（ＷＷ４５のＳＡＲＡＨドメインのＣ末端から１３番目のアミノ酸残基がシステインに置換（変異）したもの）、配列番号１６で示されるもの（ＳａｖのＳＡＲＡＨドメインのＣ末端から１３番目のアミノ酸残基がシステインに置換（変異）したもの）等が好ましく、配列番号９〜１０で示されるものがより好ましく、配列番号９で示されるものが特に好ましい。なお、上記の性質を有するものであれば、配列番号９〜１６で示されるものは、その配列中の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものであってもよい。ここで、数個とは５個以下、好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下の自然数を表す。このようなものとしては、例えば配列番号９〜１６において、Ｃ末端から２６番目のアミノ酸残基がシステインに置換（変異）しているもの等が挙げられる。
【００２０】
また、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）におけるＳＡＲＡＨドメインは、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨにおけるＳＡＲＡＨドメインと同じＳＡＲＡＨドメインに由来するものであっても、異なるＳＡＲＡＨドメインに由来するものであってもよく、逆平行コイルドコイルを形成しやすいものであれば、その同一性は問わない。
本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨにおけるＳＡＲＡＨドメインと本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）におけるＳＡＲＡＨドメインとの具体的な好ましい組み合わせとしては、配列番号１で示されるものと配列番号１３で示されるものとの組み合わせ、配列番号５で示されるものと配列番号９で示されるものとの組み合わせ、配列番号１で示されるものと配列番号９で示されるものとの組み合わせ、配列番号２で示されるものと配列番号１０で示されるものとの組み合わせ、配列番号３で示されるものと配列番号１１で示されるものとの組み合わせ、配列番号４で示されるものと配列番号１２で示されるものとの組み合わせ、配列番号５で示されるものと配列番号１３で示されるものとの組み合わせ、配列番号６で示されるものと配列番号１４で示されるものとの組み合わせ、配列番号７で示されるものと配列番号１５で示されるものとの組み合わせ、配列番号８で示されるものと配列番号１６で示されるものとの組み合わせが好ましく、配列番号１で示されるものと配列番号９で示されるものとの組み合わせ、配列番号２で示されるものと配列番号１０で示されるものとの組み合わせ、配列番号１で示されるものと配列番号１３で示されるもの、配列番号５で示されるものと配列番号９で示されるものとの組み合わせがより好ましい。上記配列番号１〜１６で示されるものは、その配列中の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものであってもよい。ここで、数個とは５個以下、好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下の自然数を表す。
本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）におけるＳＡＲＡＨドメインは、天然に存在するタンパク質に由来するＳＡＲＡＨドメインであっても、天然に存在するタンパク質に由来するＳＡＲＡＨドメインをもとに人工的にデザインしたものであっても何れでもよい。
天然に存在するタンパク質に由来するＳＡＲＡＨドメインは、通常、当該タンパク質を有する生物種を問わないが、本発明のフラグメント抗体を医薬として用いる場合には、抗原性の面から、実際の利用に際して投与することになる動物と同一の生物種に由来するものが好ましい。
【００２１】
本発明におけるＶＬ領域としては、少なくとも特定領域の抗原を認識して特異的な親和性を有するのに十分な部位を含んでいればよく、例えば、目的とする抗原分子に対する抗体の軽鎖における３つのＣＤＲ１〜３を少なくとも含むもの、好ましくは目的とする抗原分子に対する抗体の軽鎖における３つのＣＤＲ１〜３とＦＲ１〜４を少なくとも含むものが挙げられる。
なかでも、Ｃｈｏｔｈｉａ法により決定される抗体残基番号１〜１０７のアミノ酸配列からなるものがより好ましい。
なお、ＣＤＲ１〜３は、Ｃｈｏｔｈｉａ法、Ｋａｂａｔ法、ＩＭＧＴ法またはその他の方法に従い、あるいはこれらを総合的に考慮して決定すればよい。
【００２２】
本発明のＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）は、上記のＶＬ領域のＣ末端と上記のＳＡＲＡＨドメインのＮ末端とが結合したものである。ＶＬ領域とＳＡＲＡＨドメインとは、直接結合していても、リンカー配列を介して結合していてもよいが、ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）の発現効率やリフォールドの効率が高いことから、リンカー配列を介して結合しているほうが好ましい。リンカー配列の長さとしては、通常１〜４アミノ酸残基、好ましくは２アミノ酸残基である。リンカー配列としては、本発明のフラグメント抗体の性質に悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されないが、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ等が挙げられる。
【００２３】
以下に本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）を模式的に示す。
2018088403.tif 000003
（Ｙはアミノ酸残基、ｌは０〜４の整数、−［Ｙ］ｌ−はリンカー配列をそれぞれ表す。）
【００２４】
［フラグメント抗体］
本発明のフラグメント抗体は、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨと本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）との複合体からなるものである。
より具体的には、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨにおけるＳＡＲＡＨドメインのｈ２と本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）におけるＳＡＲＡＨドメインのｈ２とが、逆平行のコイルドコイルを形成することによって結合しており、更に、ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨにおけるＶＨ領域のＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１１２のシステイン残基とＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）におけるＳＡＲＡＨドメインのＣ末端から１３番目のシステイン残基とがジスルフィド結合により結合しているものである。
本発明のフラグメント抗体は、このような特殊な結合様式により結合しているため、抗原結合活性を有しているだけでなく、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）よりも耐熱性が高く安定であり、また、大腸菌発現系で得られるものであっても、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）よりも、それ自体及び抗原分子との複合体の結晶化能が高い。これにより、本発明のフラグメント抗体は、従来のフラグメント抗体や抗体では困難であった抗原決定部位の立体構造解析を容易に行うことができる。
さらに、本発明のフラグメント抗体は、当該特殊な結合様式により結合しているため、タンパク質、特に、難結晶化タンパク質との複合体の結晶化を促進する働きを有しており、タンパク質結晶化促進用フラグメント抗体として特に有用である。
なお、本明細書において「結晶化能が高い」とは、本発明のフラグメント抗体を用いてそれ自体又は抗原分子との複合体の結晶化を行った場合において、高分解能の結晶が得られる、又は／及び所謂スクリーニング段階においてより多くの結晶が得られることを意味する。
【００２５】
以下に本発明のフラグメント抗体を模式的に示す。
2018088403.tif 000004
（図中、Ｘ、Ｙ、ｌ、及びｍは前記と同じ）
【００２６】
［本発明のフラグメント抗体の調製方法］
本発明のフラグメント抗体は、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学的製法により製造することができる。例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル法（Ｆｍｏｃ法）、ｔ−ブチルオキシカルボニル法（ｔＢｏｃ法）等の通常の化学的製法（化学合成法）により、本発明のフラグメント抗体を得ることができる。また、市販のペプチド合成機を用いて化学合成することもできる。
【００２７】
さらに、本発明のフラグメント抗体は、本発明のフラグメント抗体をコードする核酸分子を適当なプラスミドやファージなどの発現ベクターに組み込み、宿主細胞を組換え発現ベクターを用いて形質転換（又は形質導入）させ、得られた宿主細胞を増幅させて、細胞内又は細胞外に分泌させる、という遺伝子組み換え技術を用いた周知の方法でも得ることができる。
【００２８】
本発明のフラグメント抗体の調製方法について、遺伝子組換技術により調製する場合、例えば以下の工程に従って調製する方法が挙げられる。
（１）遺伝子組換・発現工程
（２）精製工程
要すれば、（１）遺伝子組換・発現工程の後、可溶化工程、リフォールディング工程、濃縮工程等を行ってもよい。
【００２９】
［（１）遺伝子組換・発現工程］
（１）遺伝子組換・発現工程は、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列を有するベクター（以下、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ発現用組換ベクターと略記する場合がある）、又は本発明に係る上記ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）をコードする核酸配列を有するベクター（以下、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）発現用組換ベクターと略記する場合がある）を宿主に遺伝子導入し、遺伝子導入を行った宿主を培養することにより、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）又は本発明のフラグメント抗体を含む、粗抽出液、培養液（培養上清）又は沈殿を調製する工程である。
【００３０】
本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列は、少なくとも上記ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨにおけるＶＨ領域をコードする核酸配列の３’末端と上記ＳＡＲＡＨドメインをコードする核酸配列の５’末端とが結合した核酸配列を有していればよく、スタートコドン、ストップコドン、リンカー配列をコードする核酸配列、及びタグをコードする配列等遺伝子工学の分野においてタンパク質の調製のために用いられる核酸配列等を含んでいてもよい。
上記ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨにおけるＶＨ領域をコードする核酸配列と上記ＳＡＲＡＨドメインをコードする核酸配列とは、直接結合していても、リンカー配列を介して結合していてもよいが、ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨの発現効率やリフォールドの効率が高いことから、リンカー配列を介して結合しているほうが好ましい。
リンカー配列をコードする核酸配列の長さとしては、通常３〜１２塩基、好ましくは６塩基である。リンカー配列をコードする核酸配列としては、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ及び本発明のフラグメント抗体の性質に悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されないが、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒをコードする核酸配列、Ｇｌｙ−Ｇｌｙをコードする核酸配列、Ｓｅｒ−Ｓｅｒをコードする核酸配列等が挙げられ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒをコードする核酸配列が好ましい。
【００３１】
本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）をコードする核酸配列は、少なくとも上記ＶＬ領域をコードする核酸配列の３’末端と上記ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）におけるＳＡＲＡＨドメインをコードする核酸配列の５’末端とが結合した核酸配列を有していればよく、スタートコドン、ストップコドン、リンカー配列をコードする核酸配列、及びタグをコードする配列等遺伝子工学の分野においてタンパク質の調製のために用いられる核酸配列等を含んでいてもよい。
上記ＶＬ領域をコードする核酸配列と上記ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）における上記ＳＡＲＡＨドメインをコードする核酸配列とは、直接結合していても、リンカー配列を介して結合していてもよいが、ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）の発現効率やリフォールドの効率が高いことから、リンカー配列を介して結合するほうが好ましい。
リンカー配列をコードする核酸配列の長さとしては、通常３〜１２塩基、好ましくは６塩基である。リンカー配列をコードする核酸配列としては、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）及び本発明のフラグメント抗体の性質に悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されないが、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒをコードする核酸配列、Ｇｌｙ−Ｇｌｙをコードする核酸配列、Ｓｅｒ−Ｓｅｒをコードする核酸配列等が挙げられ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒをコードする核酸配列が好ましい。
【００３２】
上記本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ発現用組換ベクター、又は本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）発現用組換ベクター（以下、当該２つの発現用組換ベクターをあわせて、本発明に係る発現用組換ベクターと略記する場合がある）は、少なくとも本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列を有するベクター、又は本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）をコードする核酸配列を有するベクターであって、宿主中で本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、又は本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）を発現し、生産する機能を有するものであれば特に制限されない。
【００３３】
本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ発現用組換ベクターとしては、例えば、常法のクローニング技術に従い、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、及び配列番号５２等の本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列を、例えば、ｐＥＴ１６ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ｐＣＡＧ−Ｎｅｏベクター（和光純薬工業（株）製）等の発現ベクターに組み込んだベクターが挙げられる。
本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）発現用組換ベクターとしては、例えば、常法のクローニング技術に従い、配列番号４２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、及び配列番号６０等の本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列を、例えば、ｐＥＴ１６ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ｐＣＡＧ−Ｎｅｏベクター（和光純薬工業（株）製）等の発現ベクターに組み込んだベクターが挙げられる。
【００３４】
本発明に係る発現用組換ベクターの調製方法としては、最終的に、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、又は本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）をコードする核酸配列を有するベクターが得られる方法であれば、遺伝子組換による発現用組換ベクターの調製方法に関する公知の方法に準じて行えばよく、特に制限されない。
例えば、発現ベクターに本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列、又は本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）をコードする核酸配列を遺伝子導入する方法が挙げられる。
当該本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列、又は本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）をコードする核酸配列は、当該核酸配列の全長を一度に発現ベクターに遺伝子導入しても、複数回に分けて遺伝子導入してもよい。
即ち、本発明に係る発現用組換ベクターは、予め本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列の部分配列、又は本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）をコードする核酸配列の部分配列を導入した発現用組換ベクターに、さらに本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列の残りの部分配列、又は本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）をコードする核酸配列の残りの部分配列を導入することにより得てもよい。
【００３５】
本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列の部分配列、又は本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）をコードする核酸配列の部分配列と、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列の残りの部分配列、又は本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）をコードする核酸配列の残りの部分配列とは、最終的に本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ又は本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）を発現し、生産する機能を有するベクターが得られれば、元となる本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列、又は本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）をコードする核酸配列のいずれの箇所で分けてもよい。
【００３６】
本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列の部分配列と本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列の残りの部分配列との組み合わせとしては、例えば、［本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ中のＶＨ領域をコードする核酸配列と、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ中のＳＡＲＡＨドメインをコードする配列］の組み合わせ、［本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ中のＶＨ領域及びリンカーをコードする配列と、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ中のＳＡＲＡＨドメインをコードする核酸配列の組み合わせ］、［本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ中のＶＨ領域をコードする核酸配列と、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ中のＳＡＲＡＨドメイン及びリンカーをコードする配列］の組み合わせ等が挙げられる。
本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）をコードする核酸配列の部分配列と本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）をコードする核酸配列の残りの部分配列との組み合わせとしては、例えば、［本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）中のＶＬ領域をコードする核酸配列と本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）中のＳＡＲＡＨドメインをコードする核酸配列］の組み合わせ、［本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）中のＶＬ領域をコードする核酸配列と本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）中のＳＡＲＡＨドメイン及びリンカーをコードする核酸配列］の組み合わせ、［本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）中のＶＬ領域及びリンカーをコードする核酸配列と本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）中のＳＡＲＡＨドメインをコードする核酸配列の組み合わせ］等が挙げられる。
即ち、本発明に係る発現用組換ベクターの調製においては、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列の部分配列、又は本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）をコードする核酸配列の部分配列を有するベクター（以下、中間体ベクターと略記する場合がある）を得てもよく、例えば、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ中のＳＡＲＡＨドメインをコードする核酸配列を有するベクター、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ中のＳＡＲＡＨドメイン及びリンカーをコードする核酸配列を有するベクター、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）中のＳＡＲＡＨドメインをコードする核酸配列を有するベクター、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）中のＳＡＲＡＨドメイン及びリンカーをコードする核酸配列を有するベクター等が挙げられる。これらの中間体ベクターは、リンカーをコードする核酸配列又は本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ中のＳＡＲＡＨドメインをコードする核酸配列の上流にＮｄｅＩ、ＮｃｏＩ等の制限酵素配列を含んでいてもよい。
【００３７】
発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。具体的には、例えば、ｐＥＴ１６ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＥＴ２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ｐＣＡＧ−Ｎｅｏベクター（和光純薬工業（株）製）、ｐＴｒｃＨｉｓ２ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、Ｐｑｅ−ｔｒｉ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＡＬ等のプラスミドベクター、ｐＭＥＩ−５  ＤＮＡ（宝酒造社製）、ｐＬＶＳＩ−ＣＭＶ  ＮＥＯ  Ｖｅｃｔｏｒ（宝酒造社製）等のウイルスベクターが挙げられる。また、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３、ｐＥＴ３ａ）の他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ／Ｎｅｏ、ｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４、ｐＣＡＴ３、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＭＶ等も挙げられ、中でもｐＥＴ１６ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＥＴ２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、及びｐｃＤＮＡ３．１ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が好ましい。
【００３８】
例えば、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ発現用組換ベクターを調製する場合、上記した如き発現ベクターに、当該本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列中のＳＡＲＡＨドメインをコードする核酸配列、要すればＳＡＲＡＨドメインをコードする核酸配列の上流にリンカーをコードする核酸配列を導入し、中間体ベクターを得る。得られた中間体ベクターにおいて、導入したＳＡＲＡＨドメインをコードする核酸配列、又はリンカーをコードする核酸配列の上流に、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列中のＶＨ領域（例えば、目的とする抗原分子に対する抗体の重鎖における３つのＣＤＲ１〜３、ＦＲ１〜３、及びＣｈｏｔｈｉａ法により決定される抗体残基番号１１２のアミノ酸残基がシステインであるＦＲ４）をコードする核酸配列を導入することにより、各種抗原分子に対するＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ発現用組換ベクターを容易に調製することができる。
より具体的には、リンカー核酸配列（例えばＧｌｙ−Ｓｅｒ）およびＳＡＲＡＨドメインをコードする核酸配列を導入した上記した如き発現ベクター（中間体ベクター）を調製しておけば、当該発現ベクターのリンカー核酸配列およびＳＡＲＡＨドメインをコードする核酸配列の上流に、所望のＶＨ領域部分（例えば、目的とする抗原分子に対する抗体の重鎖における３つのＣＤＲ１〜３とＦＲ１〜３およびＣｈｏｔｈｉａ法により決定される抗体残基番号１１２のアミノ酸残基がシステインであるＦＲ４が挙げられる）を導入することにより、各種抗原分子に対するＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ発現用組換ベクターを容易に調製することができる。
なお、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）発現用組換ベクターは、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ発現用組換ベクターと同様に調製できる。
【００３９】
本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ又は／及び本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）は、タグペプチドや他のタンパク質との融合蛋白として発現させても良い。融合させるタグペプチドとしてはＦＬＡＧタグ、３Ｘ  ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ（Ｈｉｓ  ｔａｇ、例えば６×Ｈｉｓタグ）等が挙げられる。
【００４０】
次いで、発現用組換ベクターを用いて、適当な宿主細胞を形質転換（形質導入）することにより、形質転換体を調製する。
宿主細胞としては、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ又は／及び本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）を発現し、生産する機能を有するものであればいずれでもよく、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．）やバチルス属菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、  Ｂ．  ｂｒｅｖｉｓ、  Ｂ．  ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｉｓ）等の原核生物、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞等が挙げられ、大腸菌、動物細胞が好ましく、大腸菌、哺乳類細胞がより好ましく、大腸菌が特に好ましい。哺乳類細胞としては、例えば、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞等が挙げられる。大腸菌としては、例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）、  Ｋ−１２、  ＤＨ１、  ＤＨ５、ＤＨ５α、  Ｍ１５、ＨＢ１０１、  Ｃ６００、  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ、  ＪＭ１０９、  ＪＭ１０５、  ＪＭ１２７、  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、  ＶＣＳ２５７、  ＴＯＰ１０等が挙げられる。
また、プラスミドやファージＤＮＡの導入効率のより高い、コンピテントセル（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ）を用いても良い。コンピテントセルとしては、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）等が挙げられる。
【００４１】
上記の通り、宿主細胞として大腸菌を用いた場合（以下、大腸菌発現系と略記する場合がある）により得られるＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）は、抗原分子との複合体の結晶化能を有さないものがあり、また、当該結晶化能を有する場合であっても、結晶化条件の最適化を行う前の所謂スクリーニング段階では、低分解能の結晶しか得られない。
他方、本発明のフラグメント抗体は、大腸菌発現系で調製した場合であっても、本発明のフラグメント抗体自体や特定の抗原との複合体の結晶化能を有するものが得られる。
【００４２】
本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ発現用組換ベクター、及び本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）発現用組換ベクターは、共発現させても、別々の宿主細胞に発現させてもいずれでもよいが、宿主細胞として大腸菌を用いる場合には、別々の宿主細胞に発現させるのが好ましく、また、宿主細胞として動物細胞を用いる場合には、共発現させるのが好ましい。
なお、動物細胞で共発現させる場合には、本発明のフラグメント抗体（本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨと本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）の複合体）として発現されるため後述するリフォールディング工程は不要であるが、別々の宿主細胞に発現させる場合には、発現した本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨと本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）を混合後、後述するリフォールディング工程を行う必要がある。
【００４３】
本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ発現用組換ベクター又は本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）発現用組換ベクターを宿主細胞に遺伝子導入する方法としては、例えば、「目的別で選べるタンパク質発現プロトコール、第３章タンパク質発現プロトコール、ＩＳＢＮ９７８−４−７５８１−０１７５−２、羊土社」等に記載の公知の方法に準じて行えばよい。
【００４４】
次いで、形質転換体を、栄養培地中で培養して、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ又は本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）を生成させる。培養は公知の方法により行われ、温度、培地のｐＨ及び培養時間も適宜設定されればよい。
宿主細胞が大腸菌である形質転換体を培養する場合は、大腸菌を培養する常法の条件で、通常用いられる液体培地で行えばよく、また、宿主細胞が動物細胞である形質転換体を培養する場合は、動物細胞を培養する常法の条件で、通常用いられる液体培地で行えばよい。また、必要により例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えてもよい。
【００４５】
本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）又は本発明のフラグメント抗体を含有する、培養液（培養上清）粗抽出液又は沈殿は、上記培養により得られる培養物から、以下のようにして取得できる。
すなわち、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）又は本発明のフラグメント抗体が、形質転換体の培養液中に分泌される場合には、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）又は本発明のフラグメント抗体を含有する培養液（培養上清）を得る。
本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）又は本発明のフラグメント抗体が、形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、濾過または遠心分離などの方法によって培養物から菌体あるいは細胞を回収し、適当な緩衝液に再懸濁する。そして、例えば界面活性剤処理、超音波処理、リゾチーム処理、凍結融解などの方法で、回収された細胞等の細胞壁及び／又は細胞膜を破壊した後、遠心分離や濾過などの方法で、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）又は本発明のフラグメント抗体を含有する粗抽出液を得る。
本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）又は本発明のフラグメント抗体が、封入体として発現する場合には、濾過または遠心分離などの方法によって培養物から菌体あるいは細胞を回収し、適当な緩衝液に再懸濁する。そして、例えば界面活性剤処理、超音波処理、リゾチーム処理、凍結融解などの方法で、回収された細胞等の細胞壁及び／又は細胞膜を破壊した後、遠心分離などの方法によって、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）又は本発明のフラグメント抗体を含有する沈殿を得る。この場合、後述する可溶化工程を行う必要がある。
【００４６】
本発明のフラグメント抗体の調製方法においては、上記（１）遺伝子組換・発現工程の後、要すれば、可溶化工程、リフォールディング工程、濃縮工程等を行う。
【００４７】
［可溶化工程］
可溶化工程は、上記（１）遺伝子組換・発現工程で、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）又は本発明のフラグメント抗体が封入体として発現した場合に、回収した本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）又は本発明のフラグメント抗体を含有する沈殿から本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）又は本発明のフラグメント抗体を可溶化方法に付し、これらを含有する可溶化済溶液を得る工程である。
【００４８】
可溶化方法は、公知の方法に従えばよく、特に制限はない。
具体的には、上記（１）遺伝子組換・発現工程で回収した本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）又は本発明のフラグメント抗体を含有する沈殿に、可溶化溶液を添加し、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）又は本発明のフラグメント抗体を含有する可溶化済溶液を得ればよい。
【００４９】
可溶化溶液としては、工程（１）で得られた封入体の沈殿を可溶化するものであれば特に制限されず、例えば、６Ｍ  塩酸グアニジンや８Ｍ  尿素等を含む公知の可溶化溶液が挙げられ、より具体的には、６Ｍ  塩酸グアニジン可溶化溶液［６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ］、８Ｍ  尿素可溶化溶液［８  Ｍ  Ｕｒｅａ、  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）、  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ］等が挙げられる。
【００５０】
［リフォールディング工程］
リフォールディング工程は、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、及び本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）を別々の宿主に発現させる場合に、上記可溶化工程で得られた本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨの可溶化溶液、上記（１）遺伝子組換・発現工程で得られた本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨの粗抽出液、又は上記（１）遺伝子組換・発現工程で得られた本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨの培養液（培養上清）中の本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨと、
上記可溶化工程で得られた本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）の可溶化溶液、上記（１）遺伝子組換・発現工程で得られた本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）の粗抽出液、又は上記（１）遺伝子組換・発現工程で得られた本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）の培養液（培養上清）中の本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）との複合体を、リフォールディング方法により形成させる方法である。
【００５１】
リフォールディング方法は、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨと本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）との複合体を形成させることができれば、公知の方法に従えばよく、特に制限はない。
具体的には、上記可溶化工程で得られた本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨの可溶化溶液、上記（１）遺伝子組換・発現工程で得られた本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨの粗抽出液、又は上記（１）遺伝子組換・発現工程で得られた本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨの培養液（培養上清）と、
上記可溶化工程で得られた本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）の可溶化溶液、上記（１）遺伝子組換工程で得られた本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）の粗抽出液、又は上記（１）遺伝子組換・発現工程で得られた本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）の培養液（培養上清）を混合し、得られた混合液に１又は複数種のリフォールディング溶液を添加して、本発明のフラグメント抗体（本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨと本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）複合体）を形成させ、本発明のフラグメント抗体を含有するリフォールディング済溶液を得ればよい。
【００５２】
リフォールディング溶液としては、例えば、リフォールディング溶液Ａ［４Ｍ  Ｕｒｅａ、０．４Ｍ  Ｌ−Ａｒｇ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３７５μＭ  酸化型グルタチオン］、及びリフォールディング溶液Ｂ［０．４Ｍ  Ｌ−Ａｒｇ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３７５μＭ  酸化型グルタチオン］等が挙げられる。
【００５３】
［濃縮工程］
濃縮工程は、上記リフォールディング工程で得られたリフォールディング済溶液を濃縮し、濃縮液を得る工程である。濃縮工程は、上記リフォールディング工程等によりタンパク質が希釈された場合等に行い、これによりその後の精製工程を容易に行うことができる。
【００５４】
濃縮方法としては、上記リフォールディング工程で得られたリフォールディング済溶液を濃縮することができる方法であれば制限されず、例えば、塩析法、限外ろ過法等の公知の濃縮方法が挙げられる。
【００５５】
［（２）精製工程］
精製工程は、上記（１）遺伝子組換・発現工程で得られた培養液（培養上清）又は粗抽出液、或いは濃縮工程で得られた濃縮液から、本発明のフラグメント抗体を単離、精製する工程である。
【００５６】
本発明のフラグメント抗体の単離、精製方法としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法、塩析、溶媒沈殿法等の溶解度を利用する方法、ゲル濾過など分子量の差を利用する方法、などが挙げられる。
【００５７】
精製された本発明のフラグメント抗体は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ等により確認することができる。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で分子量を確認することにより、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨと本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）がヘテロダイマーを形成し正しい立体構造をとっているか、即ち、本発明に係るＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ中のＶＨ領域におけるＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１１２のシステイン残基と、本発明に係るＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）中のＳＡＲＡＨドメインのＣ末端から１３番目のシステイン残基がＳ−Ｓ結合を形成しているかを確認することができる。
【００５８】
［タンパク質の結晶化方法］
本発明のタンパク質の結晶化方法は、本発明のフラグメント抗体の存在下、タンパク質（以下、目的タンパク質とする場合がある）を結晶化する方法である。目的タンパク質は、本発明のフラグメント抗体が特異的に認識するタンパク質（抗原）である。
【００５９】
即ち、本発明のタンパク質の結晶化方法は、本発明のフラグメント抗体の存在下、公知の結晶化方法を行えばよく、目的タンパク質の結晶が得られる方法であれば、特に制限はない。
具体的な結晶化方法としては、例えば、バッチ法、蒸気拡散法、透析法、自由界面拡散法、濃縮法、光照射法、振動法、撹拌法等が挙げられ、蒸気拡散法がより好ましい。蒸気拡散法としては、シッティングドロップ法、ハンギングドロップ法、サンドイッチドロップ法等が挙げられ、シッティングドロップ法がより好ましい。
【００６０】
より具体的には、本発明のタンパク質の結晶化方法は、以下の工程を含む。
（１）目的タンパク質を含有する溶液と本発明のフラグメント抗体を含有する溶液とを混合し、目的タンパク質と本発明のフラグメント抗体との複合体を形成させる工程（以下、複合体形成工程と略記する場合がある）
（２）目的タンパク質と本発明のフラグメント抗体との複合体の結晶を得る工程（以下、結晶化工程）
【００６１】
［複合体形成工程］
複合体形成工程は、目的タンパク質を含有する溶液と本発明のフラグメント抗体を含有する溶液を混合し、目的タンパク質と本発明のフラグメント抗体との複合体を形成させることにより行われる。
【００６２】
目的タンパク質を含有させる溶媒としては、一般にタンパク質の結晶化において用いられるものであれば特に制限はなく、例えば、純水、緩衝液、沈殿剤溶液、界面活性剤溶液、アルコール溶液、有機溶媒、キレート剤溶液、還元剤溶液、クライオプロテクタント溶液、イオン液体及びこれらの混合溶液が挙げられ、純水、及び緩衝液が好ましい。緩衝液のｐＨは、通常限定されないが、例えばｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ５〜８である。具体的には、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、グッド緩衝液、等が挙げられる。また、これらの緩衝液の緩衝剤濃度としては、通常５〜１００ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭの範囲から適宜選択される。
本発明のフラグメント抗体を含有させる溶媒としては、上記目的タンパク質を含有させる溶媒と同様であり、好ましい具体例も同様である。
【００６３】
目的タンパク質を含有する溶液における目的タンパク質の量、および本発明のフラグメント抗体を含有する溶液における本発明のフラグメント抗体の量は、目的タンパク質を含有する溶液と本発明のフラグメント抗体を含有する溶液の混合液において、目的タンパク質のモル当量が本発明のフラグメント抗体のモル当量と同等以上であって、かつ、当該混合液における目的タンパク質と本発明のフラグメント抗体の複合体の濃度が、通常２ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬとなる量を用いればよい。
【００６４】
目的タンパク質を含有する溶液および本発明のフラグメント抗体を含有する溶液の混合液（以下、結晶化試料と略記する場合がある）は、要すれば、限外ろ過装置などの公知の方法で濃縮してもよい。
【００６５】
［結晶化工程］
結晶化工程は、自体公知の結晶化方法、例えば上記した如き具体的な結晶化方法により、複合体形成工程で形成させた目的タンパク質と本発明のフラグメント抗体との複合体の結晶を得る工程である。
【００６６】
結晶化工程は、具体的には、例えば以下のように行えばよい。
複合体形成工程で得られた目的タンパク質と本発明のフラグメント抗体との複合体を含有する混合液（結晶化試料）を１条件あたり通常０．０５μＬ〜２μＬ、好ましくは０．１μＬ〜０．５μＬと、スクリーニングキットに付属するスクリーニングキット溶液をこれと等量混合してドロップを作成し、結晶化試料と同じ組成のリザーバ（沈殿剤溶液）通常５０μＬ〜１０００μＬ、好ましくは８０μＬ〜１５０μＬの存在下、シッティングドロップ法により結晶化を行い、目的タンパク質と本発明のフラグメント抗体との複合体の結晶を得る。
【００６７】
なお、要すれば、結晶化工程により得られた目的タンパク質と本発明のフラグメント抗体との複合体の結晶を、検出する工程、Ｘ線回折装置により分析する工程等公知の手法に付すことで、目的タンパク質と本発明のフラグメント抗体との複合体の立体構造を解析することができる。
【００６８】
本発明のタンパク質の結晶化方法によれば、本発明のフラグメント抗体を用いることにより、高分解能の結晶が得られ、また、所謂スクリーニング段階においてより多くの結晶が得られる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のフラグメント抗体は、動物細胞系よりも取扱が容易な大腸菌発現系で調製した場合であっても、抗原結合活性、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）よりも高い結晶化能、タンパク質の結晶化を促進する性質等を有することから、簡便に製造することができる当該性質を有するフラグメント抗体として、創薬等タンパク質の結晶化が行われる分野において有用である。また、本発明のフラグメント抗体は、熱耐性を有しており、安定性が高いことから、抗体医薬の分野において有用である。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例および比較例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されない。【００７１】
＜比較例１  大腸菌発現系を用いたＰ２０．１抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）の調製＞
以下の方法により、配列番号１７で示されるＰ２０．１抗体に対するＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）（以下、Ｐ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）と略記する場合がある。）、および配列番号１８で示されるＰ２０．１抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）（以下、Ｐ２０．１抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）と略記する場合がある。）を、（１）遺伝子組換・発現工程および可溶化工程、（２）リフォールディング工程、（３）濃縮工程、並びに（４）精製工程に付し、Ｐ２０．１抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）（以下、Ｐ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）と略記する場合がある）を得た。
なお、得られたＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）は、Ｐ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）のＳＡＲＡＨドメイン中のＮ末端から３５番目のシステイン残基と、Ｐ２０．１抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）のＳＡＲＡＨドメイン中のＮ末端から２４番目のシステイン残基とがＳ−Ｓ結合を形成するようにデザインしたものである。
（１）遺伝子組換・発現工程および可溶化工程
（１）−１：Ｐ２０．１抗体に対するＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）の調製
配列番号１９で示される、Ｐ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）をコードする核酸配列を、常法に従い、ｐＥＴ２８ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトに導入し、Ｐ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）発現用組換ベクターを調製した。得られたＰ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）発現用組換ベクターを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に導入した。Ｐ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）発現用組換ベクターを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、１ＬのＬＢ培地を用いて３７℃で培養した。ＯＤ＝０．６付近で、終濃度が０．４ｍＭとなるようにＩＰＴＧを培地に添加し誘導を行った。培養開始から４時間後に、Ｐ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）発現用組換ベクターを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（菌体）を回収した。
回収した菌体のうち、培地０．５Ｌでの培養で得られた分の当該菌体を、２０ｍＬのＴＢＳ（２０ｍＬ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁し、懸濁液を得た。得られた懸濁液に、菌体破砕用試薬［Ｐｅｐｔｓｔａｔｉｎ（終濃度が１μＭ）、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（終濃度が１０μＭ）、ＰＭＳＦ（終濃度が２５０μＭ）およびＴｕｒｂｏＮｕｃｌｅａｓｅ（Ａｃｃｅｌａｇｅｎ社製、３μＬ）］を添加して混合し、超音波発生機（ＴＯＭＹ社製）を用いて菌体を破砕した後、遠心分離処理（２５０００ｘｇ、４℃、２０ｍｉｎ）し、上清を除去して沈殿を得た。得られた沈殿に、６ｍＬの可溶化溶液［６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）］を添加し、時折ピペッティングをしながら、３７℃で２時間インキュベートを行った。次いで、遠心分離処理（２５０００ｘｇ、４℃、２０  ｍｉｎ）を行い、Ｐ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）を含む上清を回収した。
（１）−２：Ｐ２０．１抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）の調製
配列番号２０で示される、Ｐ２０．１抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）をコードする核酸配列を、常法に従い、ｐＥＴ１６ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ制限酵素サイトに導入し、Ｐ２０．１抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）発現用組換ベクターを調製した。得られたＰ２０．１抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）発現用組換ベクターを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に導入した。
発現ベクターの大腸菌への導入以降は、上記（１）−１と同様の方法により、Ｐ２０．１抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）を調製し、Ｐ２０．１抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）を含む上清を回収した。
（２）リフォールディング工程
上記（１）−１で回収したＰ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）を含む上清と、上記（１）−２で回収したＰ２０．１抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）を含む上清とを混合し、混合液を得た。得られた混合液を０．４５μｍのフィルターでろ過し、得られたろ液が２５倍希釈となるように、リフォールディング溶液Ａ［４Ｍ  Ｕｒｅａ、０．４Ｍ  Ｌ−Ａｒｇ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３７５μＭ  酸化型グルタチオン］を、攪拌しながら、ろ液に添加した後、４℃で４時間インキュベートした。得られたインキュベート後の混合液が２倍希釈となるように、リフォールディング溶液Ｂ［０．４Ｍ  Ｌ−Ａｒｇ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３７５μＭ  酸化型グルタチオン］を、攪拌しながら、ろ液に添加した後、４℃で一晩（Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔで）インキュベートし、リフォールディング済み抗体溶液を得た。
（３）濃縮工程
上記（２）で得られたリフォールディング済み抗体溶液に、８０％飽和となるようにすりつぶした硫安を少しずつ添加して硫安沈殿を行った後、４℃で３時間攪拌をしながらインキュベートした。得られたインキュベート後の溶液を、遠心分離処理（１２０００ｘｇ、４℃、６０ｍｉｎ）し、上清を除去して沈殿を得た。得られた沈殿に、リフォールディング溶液［上記リフォールディング溶液Ａと上記リフォールディング溶液Ｂとを１：１で混合した溶液］を添加して懸濁し、懸濁液を得た。得られた懸濁液を、常法に従い、１Ｌの透析溶液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）、  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ］を用いて、１回あたり４−１６時間で、合計３回透析した。透析後の懸濁液を回収後、遠心分離処理（２５０００ｘｇ、４℃、２０ｍｉｎ）し、上清を回収した。得られた上清を、常法に従い、限外濾過により濃縮し、濃縮液を得た。
（４）精製工程
上記（３）で得られた濃縮液を、常法に従い、ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ（ＧＥ社製）、及びゲルろ過精製用溶出バッファー［５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）、  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ］を用いて、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎでゲルろ過精製を行った。分子量マーカーからＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）と見積もられる位置に単分散のピークが得られたことから、当該ピークの溶出液を回収した。
次いで、ゲルろ過精製で回収した溶出液を、常法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果、Ｐ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）のバンドに加え、不純物のバンドも確認された。
そこで、ゲルろ過精製で回収した溶出液から不純物を取り除くため、配列番号２１で示される当該フラグメント抗体の抗原分子であるＣ８ペプチド（ＰＲＧＹＰＧＱＶ）を固定化したＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ社製）、平衡化バッファー［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．５）、  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ］、溶出バッファー［０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｃ８、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．５）、  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ］を用いて精製し、溶出液を回収した。
回収した溶出液について、常法に従い、還元条件下又は非還元条件下でそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
結果を図１に示す。図中、左のレーンが還元条件下での電気泳動図、右側のレーンが非還元条件下での電気泳動図である。還元条件下では、１８ｋＤａ付近にＰ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）、１６ｋＤａ付近にＰ２０．１抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）のバンドが得られた。また、非還元条件下では、３５ｋＤａ付近にバンドが得られた。Ｐ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）とＰ２０．１抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）は、両者が正しくヘテロダイマーを形成したときにのみＳ−Ｓ結合が形成されるようにＣｙｓ残基の導入位置をデザインしている為、これらの結果から、鎖間のＳ−Ｓ結合が正しく形成されたヘテロダイマーであるＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）が得られたことが判った。【００７２】
＜比較例２  動物細胞発現系を用いたＰ２０．１抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）の調製＞
以下の方法により、配列番号２２で示されるＰ２０．１抗体に対するＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）（Ｎ末端にマウスナイトジェンのシグナル配列を含む）、および配列番号２４で示されるＰ２０．１抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）（Ｎ末端にマウスナイトジェンのシグナル配列を含む）を、（１）遺伝子組換工程、（２）動物細胞発現系を用いた組換タンパク質発現工程、および（３）精製工程に付し、Ｐ２０．１抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）（以下、Ｐ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）と略記する場合がある。）を得た。
（１）遺伝子組換工程
配列番号２３で示されるＰ２０．１抗体に対するＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）をコードする核酸配列（Ｎ末端にマウスナイトジェンのシグナル配列をコードする配列を含む）を、常法に従い、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｍｅＩ制限酵素サイトに導入し、Ｐ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）発現用組換ベクターを調製した。また、配列番号２３で示される核酸配列の代わりに、配列番号２５で示されるＰ２０．１抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）をコードする核酸配列（Ｎ末端にマウスナイトジェンのシグナル配列をコードする配列を含む）を使用し、Ｐ２０．１抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）発現用組換ベクターを調製した。
（２）動物細胞発現系を用いた組換タンパク質発現工程
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を、６００ｍＬのＥｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、細胞が３ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように播種した。その後、常法に従い、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３  Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、各４００μｇのＰ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）発現用組換ベクターおよびＰ２０．１抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）発現用組換ベクターを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞へ遺伝子導入した。遺伝子導入後、３７℃、８％ＣＯ２条件下、１２５ｒｐｍで遺伝子導入したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を１８時間振盪培養した。その後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  １およびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）をそれぞれ３ｍＬ、３０ｍＬ添加し、３７℃、８％ＣＯ２条件下、１２５ｒｐｍで３日間振盪培養し、培養上清を回収した。
（３）精製工程
（２）で回収した培養上清を、比較例１と同様の手法でＣ８ペプチドを固定化したＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ社製）を用いて精製した。次いで、その溶出画分を、常法に従い、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ社製）、及びゲルろ過精製用溶出バッファー［２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．５）、  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ］を用いて、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎでゲルろ過精製を行った。分子量マーカーからＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）と見積もられる位置に単分散のピークが得られたことから、当該ピークの溶出液を回収した。
回収した溶出液について、常法に従い、還元条件下又は非還元条件下でそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
結果を図２に示す。図中、左のレーンが還元条件下での電気泳動図、右側のレーンが非還元条件下での電気泳動図である。還元条件下では、１８ｋＤａ付近にＰ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）、１６ｋＤａ付近にＰ２０．１抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）のバンドが得られた。また、非還元条件下では、３５ｋＤａ付近にバンドが得られた。Ｐ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）とＰ２０．１抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）は、両者が正しくヘテロダイマーを形成したときにのみＳ−Ｓ結合が形成されるようにＣｙｓ残基の導入位置をデザインしている為、これらの結果から、鎖間のＳ−Ｓ結合が正しく形成されたヘテロダイマーであるＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）が得られたことが判った。【００７３】
＜比較例３  大腸菌発現系を用いた１２ＣＡ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）の調製＞
配列番号１９で示される、Ｐ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）コードする核酸配列の代わりに、配列番号２６で示される、１２ＣＡ５抗体に対するＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）をコードする核酸配列を使用し、また、配列番号２０で示されるＰ２０．１抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）をコードする核酸配列の代わりに、配列番号２７で示される、１２ＣＡ５抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）をコードする核酸配列を使用した以外は、比較例１と同様の方法により、配列番号２８で示される、１２ＣＡ５抗体に対するＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）（以下、１２ＣＡ５抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）と略記する場合がある）および配列番号２９で示される、１２ＣＡ５抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）（以下、１２ＣＡ５抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）と略記する場合がある）を、（１）遺伝子組換・発現工程および可溶化工程、（２）リフォールディング工程、および（３）濃縮工程に付し、さらに、以下に示す（４）精製工程により、１２ＣＡ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）（以下、１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）と略記する場合がある。）を得た。
以下に、（４）精製工程の結果について示す。
（３）の濃縮工程で得られた濃縮液を、比較例１と同様の方法によりゲルろ過精製を行った結果、分子量マーカーから１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）と見積もられる位置に単分散のピークが得られたことから、当該ピークの溶出液を回収した。
次いで、回収した溶出液を、常法に従い、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果、３７ｋＤａ付近の１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）のバンドに加え、１５−１８ｋＤａ付近に不純物のバンドも確認された。１２ＣＡ５抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）と１２ＣＡ５抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）は、両者が正しくヘテロダイマーを形成したときにのみＳ−Ｓ結合が形成されるようにＣｙｓ残基の導入位置をデザインした為、これらの不純物のバンドは、それぞれのホモダイマーあるいは、部分的に不完全なリフォールディングによる未酸化状態のヘテロダイマーと考えられた。
そこで、ゲルろ過精製で回収した溶出液から不純物を取り除くため、常法に従い、Ｍｏｎｏ  Ｑ  ５／５０（ＧＥ社製）、イオン交換クロマトグラフィー用溶出バッファー［５０  ｍＭ  ｔｏ  ３００  ｍＭ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｏｆ  ＮａＣｌ  ｉｎ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、  ｐＨ  ７．５］を用いて、流速１ｍＬ／ｍｉｎで、２０ｍＬかけてグラジエントをかけ、イオン交換クロマトグラフィーを行った。
その結果、最も大きなピーク（以下、ピークＡと略記する場合がある）の後に、小さなピークが２つ（以下、ピークＢ、Ｃと略記する場合がある）得られた。
回収したピークＡ〜Ｃの溶出液について、常法に従い、非還元条件下と還元条件下でそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
結果を図３に示す。図中、左側のゲルが還元条件下での電気泳動、右側のゲルが非還元条件下での電気泳動図である。Ａ〜Ｃのレーン名はそれぞれゲルろ過精製で回収したピークＡ〜Ｃの各溶出液の名称に対応する。
非還元条件下での電気泳動の結果、Ａは３５ｋＤａ付近に１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）のバンド、Ｂは１８ｋＤａ付近に１２ＣＡ５抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）のバンドと１６ｋＤａ付近に１２ＣＡ５抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）のバンド、Ｃは１６ｋＤａ付近に１２ＣＡ５抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）のバンドがそれぞれ得られた。
これらの結果から、ピークＡに、鎖間のＳ−Ｓ結合が正しく形成されたヘテロダイマーである１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）が得られたことが判った。なお、ピークＢは未酸化状態のヘテロダイマー分子、ピークＣはホモダイマー分子とそれぞれ考えられた。【００７４】
＜比較例４  大腸菌発現系で得られたＰ２０．１抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＣ８ペプチドとの複合体の結晶構造解析＞
以下の方法により、比較例１で大腸菌発現系により得られたＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）を用いて、Ｐ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）と当該フラグメント抗体の抗原分子であるＣ８ペプチドとの複合体の結晶化を行った。Ｐ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＣ８ペプチドの終濃度がそれぞれ７ｍｇ／ｍＬ、１ｍＭとなるように両者を混合し、結晶化試料とした。自動結晶化装置ｍｏｓｕｑｕｉｔｏ（ＴＴＰ  ＬａｂＴｅｃｈ社製）、各種スクリーニングキット［Ｃｌａｓｓｉｃｓ  Ｎｅｏ  Ｓｕｉｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）（９６条件）、Ｗｉｚａｒｄ  Ｃｌａｓｓｉｃ  １  ＆  ２（Ｒｉｇａｋｕ社製）（９６条件）、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ  Ｓｙｎｅｒｇｙ（Ｒｉｇａｋｕ社製）（１９２条件）、ＳａｌｔＲｘ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）（９６条件）］、ビオラモタンパク質結晶化プレート（９６ウェル、アズワン社製）を用いて、１条件当たり０．１μＬの結晶化試料と０．１μＬのスクリーニングキット溶液（結晶化試薬）を混合してドロップを作製し、リザーバには８０μＬの結晶化試薬を用い、シッティングドロップ蒸気拡散法により結晶化のスクリーニングを行った。
上記の様に、４種類のキットを用いて合計４８０のスクリーニング条件を検討したが、全く結晶を得ることはできなかった。大腸菌発現系で得られたＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）は、当該フラグメント抗体と抗原分子との複合体において、結晶化能を有さないものがあることが判った。【００７５】
＜比較例５  動物細胞発現系で得られたＰ２０．１抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＣ８ペプチドとの複合体の結晶構造解析＞
比較例２で動物細胞発現系により得られたＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）を用いて、比較例４と同様の方法により、Ｐ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）と当該フラグメント抗体の抗原分子であるＣ８ペプチドとの複合体の結晶化を行った。ただし、スクリーニングキットは、Ｉｎｄｅｘ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）およびＷｉｚａｒｄ  Ｃｌａｓｓｉｃ  １  ＆  ２（Ｒｉｇａｋｕ社製）を用いた。
その結果、スクリーニング段階におけるＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＣ８ペプチドとの複合体は、１９２条件中７条件（３．６％）で結晶が得られた。これらのうちの１条件についてさらに条件を最適化して得られた結晶（Ｃｒｙｓｔａｌ−１）と、スクリーニングにおいてＣｒｙｓｔａｌ−１とは異なる条件で得られた結晶（Ｃｒｙｓｔａｌ−２）について、放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８にてＸ線回折実験を実施した。その結果、Ｃｒｙｓｔａｌ−１は１．３１Å分解能、Ｃｒｙｓｔａｌ−２は１．７５Å分解能でそれぞれＸ線回折データを得た。得られたＸ線回折データを用い、Ｐ２０．１Ｆａｂの結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＺＰＫ）およびＭｓｔ１のＳＡＲＡＨドメインの結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：４ＮＲ２）をサーチモデルとし、分子置換プログラムＰＨＡＳＥＲ［ＭｃＣｏｙ、  Ａ．  Ｊ．、  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｓｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｏｆｔｗａｒｅ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  ４０、  ６５８−６７４  （２００７）］を使用した分子置換法により位相を決定した。その後、ＲＥＦＭＡＣ５［Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ、  Ｇ．  Ｎ．、  ｅｔ  ａｌ．  ＲＥＦＭＡＣ  ５  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  ６７、  ３５５−３６７  （２０１１）］およびＰＨＥＮＩＸ［Ａｄａｍｓ、Ｐ．、  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＨＥＮＩＸ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ．  Ｒａｄｉａｔ．、  １１、  ５３-５５．  （２００４）］を用いて構造の精密化を行った。得られたＰ２０．１抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＣ８ペプチドとの複合体（Ｃｒｙｓｔａｌ−１）のＸ線結晶構造解析の結果を図４に示す。【００７６】
＜比較例６  大腸菌発現系で得られた１２ＣＡ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＨＡペプチドとの複合体の結晶構造解析＞
比較例３で大腸菌発現系により得られた１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）を用いて、比較例４と同様の方法により、１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）と配列番号３０で示される抗原分子であるＨＡペプチド（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）との複合体の結晶化を行った。ただし、１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＨＡペプチドの終濃度がそれぞれ７ｍｇ／ｍＬ、１ｍＭとなるように両者を混合したものを結晶化試料とし、スクリーニングキットは、Ｃｌａｓｓｉｃｓ  Ｎｅｏ  Ｓｕｉｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）（９６条件）、Ｃｌａｓｓｉｃｓ  ＩＩ  Ｓｕｉｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）（９６条件）、Ｗｉｚａｒｄ  Ｃｌａｓｓｉｃ  １  ＆  ２（Ｒｉｇａｋｕ社製）（９６条件）を用いた。
その結果、スクリーニング段階における１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）と抗原分子であるＨＡペプチドとの複合体は、上記の３種類のキットを用いた合計２８８条件中、５１条件（１７．７％）で結晶が得られた。
得られた複合体の結晶のうち、１０種類の結晶について、比較例５と同様の方法により、Ｘ線回折実験を実施したところ、概ね４〜９Åという低い回折能を示した。そこで、これらのうちの１種類について結晶化条件の検討、Ｘ線回折実験を繰り返し、結晶化条件を最適化した結果、２．２Åでのデータ収集に成功した。このデータについて、比較例５と同様の方法により、立体構造を決定した（ただし、Ｆｖ領域に対する分子置換のサーチモデルはＰＤＢ  ＩＤ：１ＨＩＬを使用した）。得られた１２ＣＡ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＨＡペプチドとの複合体の構造を図５に示す。
大腸菌発現系で得られたＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）は、スクリーニング段階において結晶化能を有していても、後述するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）よりも、結晶が得られるスクリーニング条件の数は少なく、また、スクリーニングで得られる結晶では回折能が低い（結晶化能が低い）傾向にあることが判った。【００７７】
以下の比較例７−９及び実施例１は、比較例５で得られたＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）の構造をもとに、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）を改良するため、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）の変異体（後述するＦｖ−ｃｌａｓｐ（Ｓ−Ｓなし）、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’）、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’’）、およびＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）を作成したものである。
各変異体におけるＳ−Ｓ結合の位置を、下記表１に示す。【００７８】
【表１】
2018088403.tif 000005
【００７９】
＜比較例７  動物細胞発現系を用いた２Ｈ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（Ｓ−Ｓなし）の調製＞
以下の方法により、配列番号３１で示される２Ｈ５抗体に対するＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｎ末端に２Ｈ５重鎖のシグナル配列、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列を含む。以下、２Ｈ５抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨと略記する場合がある）、および配列番号３２で示される２Ｈ５抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｎ末端に２Ｈ５軽鎖のシグナル配列、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列を含む。以下、２Ｈ５抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨと略記する場合がある）を、（１）遺伝子組換工程、（２）動物細胞発現系を用いた組換タンパク質発現工程、及び（３）精製工程に付し、２Ｈ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（Ｓ−Ｓなし）（以下、２Ｈ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（Ｓ−Ｓなし）と略記する場合がある。）を含む培養上清を得た。
（１）遺伝子組換工程
配列番号２３で示されるＰ２０．１抗体に対するＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）をコードする核酸配列（Ｎ末端にマウスナイトジェンのシグナル配列をコードする配列を含む）の代わりに、配列番号３３で示される２Ｈ５抗体に対するＶＨ−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列（Ｎ末端に２Ｈ５重鎖のシグナル配列、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列をコードする配列を含む）を使用し、また、配列番号２５で示されるＰ２０．１抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）をコードする核酸配列（Ｎ末端にマウスナイトジェンのシグナル配列をコードする配列を含む）の代わりに、配列番号３４で示される２Ｈ５抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列（Ｎ末端に２Ｈ５軽鎖のシグナル配列、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列をコードする配列を含む）を使用した以外は、比較例２と同様の方法により、２Ｈ５抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨおよび２Ｈ５抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨの発現用組換ベクターを調製した。
（２）動物細胞発現系を用いた組換タンパク質発現工程
Ｐ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）発現用組換ベクターの代わりに２Ｈ５抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ発現用組換ベクターを使用し、またＰ２０．１抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）発現用組換ベクターの代わりに２Ｈ５抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨの発現用組換ベクターを使用した以外は、比較例２と同様の方法により、２Ｈ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（Ｓ−Ｓなし）を含む培養上清を回収した。
（３）精製工程
回収した培養上清１ｍＬから、配列番号８９で示される２Ｈ５の抗原分子であるｅＴＥＶペプチド（ＲＥＮＬＹＦＱＧＫＤＧ）を固定化したＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ社製）２０μＬを用いて、アフィニティークロマトグラフィー法により沈降反応を行い、担体に結合したタンパク質を溶出させ、溶出液（以下、Ｓ−Ｓなし溶出液と略記する場合がある）を得た。
なお、得られた２Ｈ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（Ｓ−Ｓなし）は２Ｈ５抗体のＦｖ領域およびそれに融合したＳＡＲＡＨドメイン配列中に新たなシステイン残基を持たず、分子間でＳ−Ｓ結合を形成しないようにデザインしたものである。【００８０】
＜比較例８  動物細胞発現系を用いた２Ｈ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’）の調製＞
比較例７と同様の方法により、配列番号３５で示される２Ｈ５抗体に対するＶＨ（１１Ｃ）−ＳＡＲＡＨ（Ｎ末端に２Ｈ５重鎖のシグナル配列、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列を含む。以下、２Ｈ５抗体−ＶＨ（１１Ｃ）−ＳＡＲＡＨと略記する場合がある）、および配列番号３６で示される２Ｈ５抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３３Ｃ）（Ｎ末端に２Ｈ５軽鎖のシグナル配列、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列を含む。以下、２Ｈ５抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３３Ｃ）と略記する場合がある）を、（１）遺伝子組換工程、（２）動物細胞発現系を用いた組換タンパク質発現工程、及び（３）精製工程に付し、２Ｈ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’）（以下、２Ｈ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’）と略記する場合がある。）を含む溶出液（以下、ｖ１’溶出液と略記する場合がある）を得た。
なお、得られた２Ｈ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’）は、２Ｈ５抗体に対するＶＨ（１１Ｃ）−ＳＡＲＡＨのＶＨ領域中のＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１１のシステイン残基と、２Ｈ５抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３３Ｃ）のＳＡＲＡＨドメイン中のＣ末端から１７番目（Ｎ末端から３３番目）のシステイン残基とがＳ−Ｓ結合を形成するようにデザインしたものである。【００８１】
＜比較例９  動物細胞発現系を用いた２Ｈ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’’）の調製＞
比較例７と同様の方法により、配列番号３７で示される２Ｈ５抗体に対するＶＨ（１０８Ｃ）−ＳＡＲＡＨ（Ｎ末端に２Ｈ５重鎖のシグナル配列、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列を含む。以下、２Ｈ５抗体−ＶＨ（１０８Ｃ）−ＳＡＲＡＨと略記する場合がある）、および配列番号３８で示される２Ｈ５抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３０Ｃ）（Ｎ末端に２Ｈ５軽鎖のシグナル配列、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列を含む。以下、２Ｈ５抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３０Ｃ）と略記する場合がある）を、（１）遺伝子組換工程、（２）動物細胞発現系を用いた組換タンパク質発現工程、及び（３）精製工程に付し、２Ｈ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’’）（以下、２Ｈ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’’）と略記する場合がある。）を含む溶出液（以下、ｖ１’’溶出液と略記する場合がある）を得た。
なお、得られた２Ｈ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’’）は、２Ｈ５抗体に対するＶＨ（１０８Ｃ）−ＳＡＲＡＨのＶＨ領域中のＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１０８のシステイン残基と、２Ｈ５抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３０Ｃ）のＳＡＲＡＨドメイン中のＣ末端から２０番目（Ｎ末端から３０番目）のシステイン残基とがＳ−Ｓ結合を形成するようにデザインしたものである。【００８２】
＜実施例１  動物細胞発現系を用いた２Ｈ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）の調製＞
比較例７と同様の方法により、配列番号３９で示される２Ｈ５抗体に対するＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ（Ｎ末端に２Ｈ５重鎖のシグナル配列、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列を含む。以下、２Ｈ５抗体−ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨと略記する場合がある）、および配列番号４０で示される２Ｈ５抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）（Ｎ末端に２Ｈ５軽鎖のシグナル配列、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列を含む。以下、２Ｈ５抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）と略記する場合がある）を、（１）遺伝子組換工程、（２）動物細胞発現系を用いた組換タンパク質発現工程、及び（３）精製工程に付し、２Ｈ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）（以下、２Ｈ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と略記する場合がある。）を含む溶出液（以下、ｖ２溶出液と略記する場合がある）を得た。
なお、得られた２Ｈ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、２Ｈ５抗体に対するＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨのＶＨ領域中のＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１１２のシステイン残基と、２Ｈ５抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）のＳＡＲＡＨドメイン中のＣ末端から１３番目（Ｎ末端から３７番目）のシステイン残基とがＳ−Ｓ結合を形成するようにデザインしたものである。【００８３】
＜実験例１  ２Ｈ５抗体の各種Ｆｖ−ｃｌａｓｐバージョンのＳ−Ｓ結合形成能＞
比較例７−９及び実施例１で得た各溶出液について、常法に従い、還元条件下又は非還元条件下でそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
結果を図６に示す。図中、中央のマーカーのレーンを挟んでゲルの左側（レーン１〜４）が還元条件下での電気泳動図、ゲルの右側（レーン５〜８）が非還元条件下での電気泳動図である。レーン１は還元条件下における比較例７で得られたＳ−Ｓなし溶出液、レーン２は還元条件下における比較例８で得られたｖ１’溶出液、レーン３は還元条件下における比較例９で得られたｖ１’’溶出液、レーン４は還元条件下における実施例１で得られたｖ２溶出液、レーン５は非還元条件下における比較例７で得られたＳ−Ｓなし溶出液、レーン６は非還元条件下における比較例８で得られたｖ１’溶出液、レーン７は非還元条件下における比較例９で得られたｖ１’’溶出液、レーン８は非還元条件下における実施例１で得られたｖ２溶出液の電気泳動の結果をそれぞれ示す。
還元条件下において、Ｓ−Ｓなし溶出液（レーン１）、ｖ１’溶出液（レーン２）、及びｖ２溶出液は、それぞれ２２ｋＤａ付近に２Ｈ５抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ、又は２Ｈ５抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨにシステイン残基を導入した変異体のバンドが得られ、また、それぞれ１８ｋＤａ付近に２Ｈ５抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ、又は２Ｈ５抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨにシステイン残基を導入した変異体のバンドが得られた。一方、ｖ１’’溶出液（レーン３）は、２Ｈ５抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨにシステイン残基を導入した変異体や２Ｈ５抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨにシステイン残基を導入した変異体に対応するバンドは得られなかった。
また、非還元条件下において、Ｓ−Ｓなし溶出液（レーン５）は、３５−３７ｋＤａ付近に予想される２Ｈ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ二量体のバンドが得られず、ｖ１’溶出液（レーン６）は、Ｓ−Ｓ結合を形成した２Ｈ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’）のバンド（３５ｋＤａ付近）の他に、１７ｋＤａ付近にＳ−Ｓ結合を形成出来ていない単独の２Ｈ５抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨのバンドおよび２Ｈ５抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨのバンドが得られたが、ｖ２溶出液（レーン８）は、Ｓ−Ｓ結合を形成した２Ｈ５抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）のバンド（３７ｋＤａ）のみが得られた。
還元条件下での電気泳動の結果から、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（Ｓ−Ｓなし）（比較例７）、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’）（比較例８）、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）（比較例１０）は、宿主からそれぞれ発現し分泌されており、また、抗原分子への結合活性が保たれていることが判った。一方、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’’）（比較例９）は発現分泌がされなかったか、あるいは発現したものの抗原結合能を失ったことが判った。
さらに、非還元条件下での電気泳動の結果から、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’）は分子間でＳ−Ｓ結合を形成しないダイマー、もしくはホモダイマーのような不純物が生じる一方、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）のみが分子間Ｓ−Ｓ結合を１００％形成する能力を持つことが判った。【００８４】
比較例５−６に示したＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）の構造解析の結果から、ＶＨ−ＳＡＲＡＨとＶＬ−ＳＡＲＡＨがより安定なヘテロダイマーを構成するように、本発明者らはＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’）、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’’）、およびＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）の３つの異なる変異体を考案した。
即ち、ＶＨ−ＳＡＲＡＨとＶＬ−ＳＡＲＡＨに導入するシステイン残基の位置の組み合わせとして、上記表１に記載の３つの新たな組み合わせ｛［ＶＨ（１１Ｃ）−ＳＡＲＡＨのＶＨ領域中のＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１１のシステイン残基と、ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３３Ｃ）のＳＡＲＡＨドメイン中のＣ末端から１７番目（Ｎ末端から３３番目）のシステイン残基（Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’）］の組み合わせ、［ＶＨ（１０８Ｃ）−ＳＡＲＡＨのＶＨ領域中のＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１０８のシステイン残基と、ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３０Ｃ）のＳＡＲＡＨドメイン中のＣ末端から２０番目（Ｎ末端から３０番目）のシステイン残基（Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’’）］の組み合わせ、［ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨのＶＨ領域中のＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１１２のシステイン残基と、ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）のＳＡＲＡＨドメイン中のＣ末端から１３番目（Ｎ末端から３７番目）のシステイン残基（Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）］の組み合わせ｝を考案し、それらについて、Ｓ−Ｓ結合形成能を実験例１で検討した。
しかし、実験例１に示すように、意外なことにこれらの変異体のうちＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’）は分子間で安定なＳ−Ｓ結合を形成せず、また、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１’’）は良好な発現量と抗原結合能を保てなかったことが判った。
すなわち、Ｆｖ−ｃｌａｓｐにおいて分子内可動性を抑えてヘテロダイマーを安定化するとともに結晶化能を改善するためには、導入するヘテロダイマー間Ｓ−Ｓ結合の位置は、ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨのＶＨ領域中のＣｈｏｔｈｉａ法による抗体残基番号１１２のアミノ酸残基とＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）のＳＡＲＡＨドメイン中のＣ末端から１３番目（Ｎ末端から３７番目）のアミノ酸残基を選ぶ必要があることが判った。【００８５】
＜実施例２  大腸菌発現系を用いたＰ２０．１抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）の調製＞
配列番号１９で示される、Ｐ２０．１抗体−ＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）をコードする核酸配列の代わりに、配列番号４１で示される、Ｐ２０．１抗体に対するＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨをコードする核酸配列を使用し、また、配列番号２０で示されるＰ２０．１抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）をコードする核酸配列の代わりに、配列番号４２で示される、Ｐ２０．１抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）をコードする核酸配列を使用した以外は、比較例１と同様の方法により、大腸菌発現系を用いて、配列番号４３で示される、Ｐ２０．１抗体に対するＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ（以下、Ｐ２０．１抗体−ＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨと略記する場合がある）、および配列番号４４で示される、Ｐ２０．１抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）（以下、Ｐ２０．１抗体−ＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）と略記する場合がある）を、（１）遺伝子組換・発現工程および可溶化工程、（２）リフォールディング工程、（３）濃縮工程、および（４）精製工程に付し、Ｐ２０．１抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）（以下、Ｐ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と略記する場合がある）を得た。
結果を図７に示す。図中、左側のレーンが還元条件下での電気泳動図、右側のレーンが非還元条件下での電気泳動図である。還元条件下、Ｐ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、Ｐ２０．１抗体に対するＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨおよびＰ２０．１抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）のバンドが１８ｋＤａ付近に重なって得られ、非還元条件下、３５ｋＤａ付近にＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）の一本のバンドが得られた。Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、大腸菌発現系でもＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨとＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）の間で正しくヘテロダイマーを形成しＳ−Ｓ結合を形成した組換えタンパク質が非常に高純度で得られることが判った。
また、得られたＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、上記精製の過程で抗原分子であるＣ８ペプチドを固定化したレジンで精製しているので、抗Ｃ８ペプチド抗体としての活性を有していることは明らかである。
すなわち、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、発現させる宿主細胞の種類によらず、簡便に製造できることができ、且つ、抗原結合活性を有することが判った（実施例１、２）。【００８６】
＜実施例３−１０  大腸菌発現系を用いたＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）の調製＞
実施例２と同様の方法により、Ｐ２０．１抗体に対するＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨの代わりに、９３２０１抗体、ＴＳ２／１６抗体、ＳＧ／１９抗体、ｔ８Ｅ４抗体、９Ｅ１０抗体、１２ＣＡ５抗体、ｔ１Ｅ４抗体、およびＮＺ−１抗体に対するＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ、並びに、Ｐ２０．１抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）の代わりに、９３２０１抗体、ＴＳ２／１６抗体、ＳＧ／１９抗体、ｔ８Ｅ４抗体、９Ｅ１０抗体、１２ＣＡ５抗体、ｔ１Ｅ４抗体、およびＮＺ−１抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）を、それぞれ（１）遺伝子組換・発現工程および可溶化工程、（２）リフォールディング工程、（３）濃縮工程、及び（４）精製工程に付し、各抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）（以下、各抗体の名称−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と略記する場合がある）を調製した。
使用した核酸の配列および調製したタンパク質の配列を下記表２及び表３にそれぞれ示す。【００８７】
【表２】
2018088403.tif 000006
【００８８】
【表３】
2018088403.tif 000007
結果を図８に示す。図中、左側のレーンが還元条件下での電気泳動図、右側のレーンが非還元条件下での電気泳動図である。８種類の抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）のすべてにおいて、実施例２で得られたＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と同様に、還元条件下では各抗体に対するＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨ及びＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）に相当するバンドが１８−２０ｋＤａ付近に得られ、また、非還元条件下では３５−３７ｋＤａ付近に各抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）のバンドが一本得られた。
すなわち、大腸菌発現系で調製したこれら８種の抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、いずれもＶＨ（１１２Ｃ）−ＳＡＲＡＨとＶＬ−ＳＡＲＡＨ（３７Ｃ）の間で正しくヘテロダイマーを形成してＳ−Ｓ結合を形成し、高い純度で精製できることが判った。【００８９】
＜実験例２  Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）の抗原結合活性の確認＞
実施例３−１０で得られた各種抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）が抗原結合活性を有することを、ゲルろ過クロマトグラフィーのピークシフト又はバイオレイヤー干渉法によりそれぞれ確認した。
９３２０１抗体、ＴＳ２／１６抗体、ＳＧ／１９抗体及びｔ８Ｅ４抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）については、それぞれの抗原分子［９３２０１抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）については配列番号７７で示されるＳＯＲＬＡ  Ｖｐｓ１０ｐドメイン、ＴＳ２／１６抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とＳＧ／１９抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）については配列番号７８で示されるα６鎖と配列番号７９で示されるβ１鎖からなるインテグリンα６β１、ｔ８Ｅ４抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）ついては配列番号８０で示されるＨＧＦ］と安定な複合体を形成することを、ゲルろ過クロマトグラフィーのピークシフトによって確認した。
結果を図９に示す。いずれの抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）も、抗原タンパク質と結合することによりピークがシフトしたことから、各種抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、抗原結合活性を有することが判った。
また、９Ｅ１０抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と１２ＣＡ５抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）については、それぞれの抗原分子である配列番号８１で示されるＭｙｃタグを付加したＴ４Ｌタンパク質、又は配列番号８２で示されるＨＡタグを付加したＴ４Ｌタンパク質に対する結合を、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６（プライムテック社）を用いたバイオレイヤー干渉法によってリアルタイム解析し、オリジナルの抗体（９Ｅ１０抗体及び１２ＣＡ５抗体）の抗原分子に対する結合能と比較した。
結果を図１０に示す。いずれの抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）も、オリジナルの抗体と同程度の抗原結合活性（抗原親和性）を持つことが判った。
なお、ＮＺ−１抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）及びｔ１Ｅ４抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）については、後述する実施例１４及び実施例１７において、それぞれの抗原との複合体の状態で結晶構造解析し、結晶中で抗原と１：１の複合体を形成していることを直接確認した。これらの結果から、各種抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、抗原結合活性を有することが判った。【００９０】
＜実施例１１  ＴＳ２／１６抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）の結晶構造解析＞
実施例４で調製したＴＳ２／１６抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）（以下、ＴＳ２／１６抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と略記する場合がある）を用いて、比較例４と同様の方法により、ＴＳ２／１６抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）の結晶化を行った。
ただし、４．９ｍｇ／ｍＬのＴＳ２／１６抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）溶液を結晶化試料とし、スクリーニングキットは、Ｃｌａｓｓｉｃｓ  Ｎｅｏ  Ｓｕｉｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）（９６条件）、Ｗｉｚａｒｄ  Ｃｌａｓｓｉｃ  １  ＆  ２（Ｒｉｇａｋｕ社製）（９６条件）を用いた。
その結果、スクリーニング段階において、１９２条件中、１条件（０．５％）で結晶が得られた。得られた結晶について、比較例５と同様の方法により、Ｘ線回折データを測定し、２．０４Å分解能でデータが得られ、構造を決定することができた。
結果を図１１に示す。Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、結晶化能を有することが判った。一般に、全長の抗体では通常結晶は得られず、また従来のフラグメント抗体（Ｆａｂフラグメントや単鎖抗体（ｓｃＦｖ）フラグメント）では結晶が得られないことも多いため、抗原決定部位の立体構造解析が不明な抗体が存在している。Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、結晶化能を有しており、また、結晶化が容易であることから、抗体の抗原決定部位の立体構造解析において、特に有用であることが判った。【００９１】
＜実施例１２−１４  各種Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と抗原との複合体の結晶構造解析＞
実施例２で調製したＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と配列番号２１で示されるＰ２０．１抗体の抗原分子であるＣ８ペプチドとの複合体（実施例１２）、実施例８で調製した１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と配列番号３０で示される１２ＣＡ５抗体の抗原分子であるＨＡペプチドとの複合体（実施例１３）、実施例１０で調製したＮＺ−１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と配列番号８３で示されるＮＺ−１抗体の抗原分子であるＰＡペプチドとの複合体（実施例１４）について、比較例４と同様の方法により結晶化を行った。
ただし、Ｐ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とＣ８ペプチドの複合体については、それぞれの終濃度が１１ｍｇ／ｍＬ、２ｍＭとなるように両者を混合したものを結晶化試料とし、スクリーニングキットは、Ｃｌａｓｓｉｃｓ  Ｎｅｏ  Ｓｕｉｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）（９６条件）、Ｃｌａｓｓｉｃｓ  ＩＩ  Ｓｕｉｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）（９６条件）、Ｗｉｚａｒｄ  Ｃｌａｓｓｉｃ  １  ＆  ２（Ｒｉｇａｋｕ社製）（９６条件）、ＪＣＳＧ＋（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ社製）（９６条件）を用いた。１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とＨＡペプチドの複合体については、それぞれの終濃度が７ｍｇ／ｍＬ、１ｍＭとなるように両者を混合したものを結晶化試料とし、スクリーニングキットは、Ｃｌａｓｓｉｃｓ  Ｎｅｏ  Ｓｕｉｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）（９６条件）、Ｃｌａｓｓｉｃｓ  ＩＩ  Ｓｕｉｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）（９６条件）、Ｗｉｚａｒｄ  Ｃｌａｓｓｉｃ  １  ＆  ２（Ｒｉｇａｋｕ社製）（９６条件）を用いた。ＮＺ−１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とＰＡペプチドの複合体については、それぞれの終濃度が３．８ｍｇ／ｍＬ、１ｍＭとなるように両者を混合したものを結晶化試料とし、スクリーニングキットは、Ｃｌａｓｓｉｃｓ  Ｎｅｏ  Ｓｕｉｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）（９６条件）、Ｗｉｚａｒｄ  Ｃｌａｓｓｉｃ  １  ＆  ２（Ｒｉｇａｋｕ社製）（９６条件）を用いた。
その結果、スクリーニング段階で、Ｐ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とＣ８ペプチドとの複合体については、３８４条件中３５条件（９．１％）、１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とＨＡペプチドとの複合体については、２８８条件中７４条件（２５．７％）、ＮＺ−１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とＰＡペプチドとの複合体については、１９２条件中６条件（３．１％）でそれぞれ結晶が得られた。
１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とＨＡペプチドとの複合体およびＮＺ−１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とＰＡペプチドとの複合体については、スクリーニングで得られた結晶を用い、比較例５と同様の方法により、Ｘ線回折データを測定し、それぞれ２．４５Å分解能、２．１５Å分解能でデータが得られた。また、Ｐ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とＣ８ペプチドとの複合体については、スクリーニングで得られた結晶の条件を元に結晶化条件の最適化を行い、その結果得られた結晶を用いてＸ線回折データの測定を行い、１．１７Å分解能のデータが得られた。得られたＸ線回折データを用い、比較例５と同様の手法により構造を決定した。ただし、Ｆｖ領域に対する分子置換のサーチモデルは、Ｐ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）についてはＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＣ８ペプチドとの複合体の構造、１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）については１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＨＡペプチドとの複合体の構造、ＮＺ−１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）についてはＮＺ−１Ｆａｂの構造（ＰＤＢ  ＩＤ：４ＹＯ０）を使用した。
結果を図１２〜図１４に示す。【００９２】
Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）について、以下に比較して考察する。
比較例４の結果、大腸菌発現系で得られたＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＣ８ペプチドとの複合体は、４８０条件を検討したものの、全く結晶を得ることはできず、動物細胞発現系で調製して初めて３．６％の確率で結晶が得られたのに対し、実施例１２の結果、Ｐ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とＣ８ペプチドとの複合体は、大腸菌発現系で得られたものでも３８４条件中３５条件（９．１％）で結晶が得られ、結晶化条件を最適化した結晶からは１．１７Å分解能の非常に高分解能なデータが得られた。
また、比較例６の結果、スクリーニング段階における１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＨＡペプチドとの複合体は、２８８条件中５１条件（１７．７％）で結晶が得られ、当該結晶からは概ね４Å分解能〜９Å分解能の低分解能のデータしか得られなかったのに対し、１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＨＡペプチドとの複合体と全く同じ条件（タンパク質濃度、抗原濃度、使用したスクリーニングキットの種類）でスクリーニングを実施したにも関わらず、実施例１３の結果、スクリーニング段階における１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）とＨＡペプチドとの複合体は、２８８条件中７４条件（２５．７％）で結晶が得られ、当該結晶からは２．４５Å分解能の高分解能のデータが得られた。
これらの結果から、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）は大腸菌発現系で得られたものは結晶化能を有さない場合があるが、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は発現時の宿主によらずに結晶化能を有するものが得られることが判った。大腸菌は動物細胞に比べ取扱が容易であることから、特に大腸菌発現系で結晶化能を有するものが得られる点において、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）はＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）よりも有用である。
また、例え大腸菌発現系で得られたＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）が結晶化能を有する場合であっても、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）に比べ、結晶化能が高く（結晶化されやすく）、高分解能の結晶を得られることが判った。【００９３】
＜実施例１５−１７  各種Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）と難結晶性抗原との複合体の結晶構造解析＞
難結晶性タンパク質であるＳＯＲＬＡ（ｎｅｕｒｏｒａｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のＶｐｓ１０ｐドメイン、インテグリンα６β１、及びＨＧＦ（肝細胞増殖因子）について、配列番号７７で示されるＶｐｓ１０ｐと実施例３で調製した９３２０１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）との複合体（実施例１５）、配列番号７８および配列番号７９で示されるインテグリンα６β１と実施例４で調製したＴＳ２／１６抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）との複合体（実施例１６）、配列番号８０で示されるＨＧＦと実施例９で調製したｔ１Ｅ４抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）との複合体（実施例１７）について、比較例４と同様の方法により結晶化を行った。
ただし、Ｖｐｓ１０ｐと９３２０１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）との複合体については、濃度を３ｍｇ／ｍＬおよび１．５ｍｇ／ｍＬにしたものを結晶化試料とし、スクリーニングキットは、前者についてはＣｌａｓｓｉｃｓ  Ｎｅｏ  Ｓｕｉｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）（９６条件）、後者についてはＣｌａｓｓｉｃｓ  Ｎｅｏ  Ｓｕｉｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）（９６条件）およびＷｉｚａｒｄ  Ｃｌａｓｓｉｃ  １  ＆  ２（Ｒｉｇａｋｕ社製）（９６条件）を用いた。インテグリンα６β１とＴＳ２／１６抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）との複合体については、濃度を９．２ｍｇ／ｍＬにしたものを結晶化試料とし、スクリーニングキットは、Ｃｌａｓｓｉｃｓ  Ｎｅｏ  Ｓｕｉｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）（９６条件）、Ｗｉｚａｒｄ  Ｃｌａｓｓｉｃ  １  ＆  ２（Ｒｉｇａｋｕ社製）（９６条件）、ＰｒｏＰｌｅｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ社製）（９６条件）を用いた。ＨＧＦとｔ１Ｅ４抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）との複合体については、濃度を９．７ｍｇ／ｍＬにしたものを結晶化試料とし、スクリーニングキットは、Ｃｌａｓｓｉｃｓ  Ｎｅｏ  Ｓｕｉｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）（９６条件）、Ｃｌａｓｓｉｃｓ  ＩＩ  Ｓｕｉｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）（９６条件）、Ｗｉｚａｒｄ  Ｃｌａｓｓｉｃ  １  ＆  ２（Ｒｉｇａｋｕ社製）（９６条件）、ＰｒｏＰｌｅｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ社製）（９６条件）、ＪＣＳＧ＋（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ社製）（９６条件）を用いた。
その結果、スクリーニング段階で、Ｖｐｓ１０ｐと９３２０１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）との複合体については、２８８条件中１１条件（３．８％）、インテグリンα６β１とＴＳ２／１６抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）との複合体については、２８８条件中２条件（０．７％）、ＨＧＦとｔ１Ｅ４抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）との複合体については、４８０条件中１条件（０．２％）でそれぞれ結晶が得られた。
得られた各複合体の結晶について、比較例５と同様の方法により、Ｘ線回折データを測定し、当該複合体のＸ線結晶構造解析を行った。
結果を図１５−図１７に示す。スクリーニング段階において、Ｖｐｓ１０ｐと９３２０１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）との複合体については３．２Å分解能、インテグリンα６β１とＴＳ２／１６抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）との複合体については３．３７Å分解能、ＨＧＦとｔ１Ｅ４抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）との複合体については４．１Å分解能でデータが得られ、結晶構造を決定することができた。
さらに、結晶化条件の最適化を行ったところ、Ｖｐｓ１０ｐと９３２０１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）との複合体については２．５９Å分解能、インテグリンα６β１とＴＳ２／１６抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）との複合体については、最終的に３．０５Å分解能でデータが得られ、結晶構造を決定することができた。【００９４】
以下に、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）の結晶化を促進する働きについて考察する。
インテグリンはマルチドメインの糖タンパク質であり、細胞外ドメインはシグナル伝達に連動して非常に大きな構造変化をおこすことが知られており、単独での結晶化は困難であると考えられていた。そこで本発明者らは、これまでにＴＳ２／１６を含む複数の抗体のＦａｂを使用して結晶化を試みたが、全く結晶は得られていなかった。しかし、上記の通り、ＴＳ２／１６抗体のＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）との複合体を用いることで、スクリーニング段階においても３．３７Å分解能でデータが得られ、結晶構造を決定することができた。
また、本願発明者らは、過去にＨＧＦとｔ１Ｅ４抗体のＦａｂの結晶構造解析を試みたが、最高で９Å程度の回折能を有した結晶しか得られなかった。しかし、上記の通り、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）を用いることで、スクリーニング段階においても４．１Å分解能で結晶構造を決定することができた。
これらの結果から、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、タンパク質、特に、難結晶性タンパク質と複合体を形成させた時に、その結晶化を促進する働きがあることが明らかとなり、結晶化促進用フラグメント抗体として有用であることが判った。
また、本願発明者らは、過去にＶｐｓ１０ｐとプロペプチドとの複合体の結晶構造を行った（Ｋｉｔａｇｏ、Ｙ．、ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｏｒＬＡ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２、１９９−２０６．（２０１５））が、当該複合体の結晶は析出に１〜２ヶ月程度かかる上、解析に耐える品質の結晶が得られる頻度が非常に低かった。しかし、上記の通り、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）を用いることで、スクリーニング段階においても、３．２Å分解能、結晶化条件の最適化後は２．５９Å分解能で結晶構造を決定することができ、しかもこれらの結晶はわずか１日で再現性よく得ることができた。
すなわち、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、再現性よく、また短時間で、タンパク質、特に、難結晶性タンパク質の結晶化を促進する働きがあることが明らかとなり、結晶化促進用フラグメント抗体として有用であることが判った。【００９５】
＜実験例３  Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）の熱安定性＞
従来の単鎖抗体であるｓｃＦｖ及びＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）とＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）の熱安定性を以下の方法により比較した。
従来のフラグメント抗体であるＰ２０．１抗体のｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、特許第５２５７９９７号に記載の方法により、大腸菌発現および巻き戻し法で調製した。ＮＺ−１抗体のｓｃＦｖは、配列番号８４で示される配列を用いた以外は、Ｐ２０．１抗体の単鎖抗体（ｓｃＦｖ）と同様の方法により調製した。
また、ＮＺ−１抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）及びＳＧ／１９抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）は、比較例３と同様の方法により、配列番号８５で示される、ＮＺ−１抗体に対するＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）及び配列番号８６で示される、ＮＺ−１抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）、並びに配列番号８７で示される、ＳＧ／１９抗体に対するＶＨ−ＳＡＲＡＨ（Ｙ３５Ｃ）及び配列番号８８で示される、ＳＧ／１９抗体に対するＶＬ−ＳＡＲＡＨ（Ｍ２４Ｃ）をそれぞれ（１）遺伝子組換・発現工程および可溶化工程、（２）リフォールディング工程、（３）濃縮工程及び（４）精製工程に付し、調製した。
調製したＰ２０．１抗体のｓｃＦｖ、ＮＺ−１抗体のｓｃＦｖ、ＮＺ−１抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）、ＳＧ／１９抗体に対するＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）、比較例１で得られたＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）、比較例３で得られた１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）、実施例２で調製したＰ２０．１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）、実施例５で調製したＳＧ／１９抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）、実施例８で調製した１２ＣＡ５抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）、及び実施例１０で調製したＮＺ−１抗体−Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）を用いてサーマルシフトアッセイを行い、それぞれのＴｍ値を求めた。
サーマルシフトアッセイでは、各試料にＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を添加し、２５℃から８５℃まで温度を上昇させたときの蛍光値の変化をリアルタイムで測定することでタンパク質の変性状態をモニターし、得られた変性曲線からＴｍ値［℃］を算出した。結果を下記表４に示す。表中の単位は全て［℃］である。【００９６】
【表４】
2018088403.tif 000008
これらの実験結果から、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、従来のフラグメント抗体であるｓｃＦｖやＦｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ１）に比べＴｍ値が高く、その差は６−１１℃にも達することが判った。すなわち、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、従来のフラグメント抗体よりもはるかに熱安定が高い為、冷蔵あるいは室温での保存安定性も高い。この性質により、Ｆｖ−ｃｌａｓｐ（ｖ２）は、フラグメント抗体、及びタンパク質結晶化促進用フラグメント抗体としてはもちろん、それ以外の用途でも極めて有利な性質を有することが期待される。
【図１】
2018088403.tif 000009
【図２】
2018088403.tif 000010
【図３】
2018088403.tif 000011
【図４】
2018088403.tif 000012
【図５】
2018088403.tif 000013
【図６】
2018088403.tif 000014
【図７】
2018088403.tif 000015
【図８】
2018088403.tif 000016
【図９】
2018088403.tif 000017
【図１０】
2018088403.tif 000018
【図１１】
2018088403.tif 000019
【図１２】
2018088403.tif 000020
【図１３】
2018088403.tif 000021
【図１４】
2018088403.tif 000022
【図１５】
2018088403.tif 000023
【図１６】
2018088403.tif 000024
【図１７】
2018088403.tif 000025
【配列表】
2018088403000001.app
【国際調査報告】
2018088403.tif 000026
2018088403.tif 000027
2018088403.tif 000028
2018088403.tif 000029