(57)【要約】  本発明は、倒立顕微鏡による細胞観察に適した細胞培養容器であって、培養細胞への接着剤の影響がない細胞培養容器を提供する。本発明の細胞培養容器１０は、貫通孔１１２が設けられた底部１１０と、底部１１０から立ち上がる壁部１２０と、貫通孔１１２を覆うように底部１１０に溶着された薄膜部１３０と、を有する容器本体１００を含む。底部１１０および薄膜部１３０が、同種の合成樹脂を含み、薄膜部１３０の厚みが、１０μｍ以上１７０μｍ以下である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
貫通孔が設けられた底部と、該底部から立ち上がる壁部と、該貫通孔を覆うように該底部に溶着された薄膜部と、を有する容器本体を含み、
該底部および該薄膜部が、同種の合成樹脂を含み、
該薄膜部の厚みが、１０μｍ以上１７０μｍ以下である、細胞培養容器。
【請求項２】
前記同種の合成樹脂が、スチレン系樹脂である、請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
前記薄膜部が、スチレン系熱可塑性エラストマーをさらに含む、請求項２に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記スチレン系熱可塑性エラストマーが、スチレン−ブタジエン−スチレンブロック共重合体を含む、請求項３に記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記スチレン系樹脂と前記スチレン系熱可塑性エラストマーとの配合比（スチレン系樹脂：スチレン系熱可塑性エラストマー）が９５：５〜５０：５０である、請求項３または４に記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記底部が、その表面から前記貫通孔を囲むように突出する突起部を備え、
前記薄膜部が、該突起部を溶着部として前記底部に溶着されている、請求項１から５のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞培養容器の製造方法であって、
前記貫通孔および突起部が設けられた底部と前記壁部とを一体成形すること、および
薄膜部形成用樹脂膜を前記突起部に接触させた状態で、該薄膜部形成用樹脂膜を前記底部に溶着すること、
を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、イメージングサイトメーター、レーザー共焦点顕微鏡、二光子励起レーザー顕微鏡、超音波顕微鏡等の最新型顕微鏡を用いたライブセルイメージング技術（細胞を生きたまま連続して観察する技術）が普及してきている。ライブセルイメージングにおいて、例えば、細胞培養容器の底面に付着している細胞をそのまま観察する場合、容器の底面側から観察できる倒立顕微鏡が好ましく用いられる。倒立顕微鏡を用いた観察においては、解像度が高い画像を得る観点から、細胞培養容器の底面の厚みが薄いことが好ましい。【０００３】
通常の細胞培養容器は、１ｍｍ程度の厚みの底面を有するが、高解像度の観察を目的として、底面に貫通孔を設け、該貫通孔を覆うように薄い（例えば、厚み１７０μｍ以下）ガラス板または樹脂フィルムを取り付けた細胞培養容器（以下、それぞれを「ガラスボトムディッシュ」または「フィルムボトムディッシュ」と称する場合がある）が提案されている（特許文献１）。【０００４】
上記ガラスボトムディッシュまたはフィルムボトムディッシュによれば、高倍率かつ高解像度の観察が可能である一方で、ガラス板または樹脂フィルムの厚みが薄いことから容器全体を一体成形することが困難である。そのため、ガラス板または樹脂フィルムが接着剤を用いて貼着されており、培養細胞に対する接着剤の影響が懸念される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】実用新案登録第３１３９３５０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記従来の課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、倒立顕微鏡による細胞観察に適した細胞培養容器であって、培養細胞に対する接着剤の影響がない細胞培養容器を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明によれば、貫通孔が設けられた底部と、該底部から立ち上がる壁部と、該貫通孔を覆うように該底部に溶着された薄膜部と、を有する容器本体を含む細胞培養容器が提供される。該細胞培養容器においては、該底部および該薄膜部が、同種の合成樹脂を含み、該薄膜部の厚みが、１０μｍ以上１７０μｍ以下である。
１つの実施形態において、上記同種の合成樹脂が、スチレン系樹脂である。
１つの実施形態において、上記薄膜部が、スチレン系熱可塑性エラストマーをさらに含む。
１つの実施形態において、上記スチレン系熱可塑性エラストマーが、スチレン−ブタジエン−スチレンブロック共重合体を含む。
１つの実施形態において、上記スチレン系樹脂と上記スチレン系熱可塑性エラストマーとの配合比（スチレン系樹脂：スチレン系熱可塑性エラストマー）が９５：５〜５０：５０である。
１つの実施形態において、上記底部が、その表面から上記貫通孔を囲むように突出する突起部を備え、上記薄膜部が、該突起部を溶着部として上記底部に溶着されている。
本発明の別の局面によれば、上記細胞培養容器の製造方法が提供される。該製造方法は、上記貫通孔および突起部が設けられた底部と上記壁部とを一体成形すること、および、薄膜部形成用樹脂膜を上記突起部に接触させた状態で、該薄膜部形成用樹脂膜を上記底部に溶着すること、を含む。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、底部と薄膜部とが同種の合成樹脂を含むことから、薄膜部の厚みが非常に薄い場合であっても好適に溶着が行なわれ得る。その結果、倒立顕微鏡による細胞観察に適した細胞培養容器であって、培養細胞への接着剤の影響がない細胞培養容器が得られる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の１つの実施形態による細胞培養容器を開蓋状態で示す概略斜視図である。
【図２】図１に示す細胞培養容器の容器本体の概略平面図（ａ）と線Ａ−Ａに沿った概略断面図（ｂ）である。
【図３】本発明の１つの実施形態による細胞培養容器の製造方法を説明する概略図である。
【図４】実施例または参考例の細胞培養容器で培養された細胞を、倒立型顕微鏡を用いて観察した画像である。
【図５】実施例の細胞培養容器で培養された細胞を、倒立型顕微鏡を用いて観察した画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
Ａ．細胞培養容器
図１は、本発明の１つの実施形態における細胞培養容器１０を開蓋状態で示す概略斜視図であり、図２（ａ）は、図１に示される細胞培養容器１０の容器本体１００の概略平面図であり、図２（ｂ）は、その線Ａ−Ａに沿った概略断面図である。図１に示されるとおり、細胞培養容器１０は、容器本体１００と蓋体２００とからなる。
【００１１】
容器本体１００は、貫通孔１１２が設けられた底部１１０と、底部１１０から立ち上がる壁部１２０と、貫通孔１１２を覆うように底部１１０に溶着された薄膜部１３０と、を有する。より具体的には、底部１１０は、その表面から環状に、より具体的には貫通孔１１２を囲むように、下方に突出する突起部１１４ａおよび１１４ｂを備えており、該突起部１１４ａおよび１１４ｂを溶着部として、薄膜部１３０が底部１１０に溶着されている。
【００１２】
容器本体１００においては、底部１１０と、壁部１２０と、薄膜部１３０によって規定される空間が細胞培養区画１５０とされる。薄膜部１３０の貫通孔１１２に対応する領域が、倒立型顕微鏡による観察に好適な領域である。
【００１３】
容器本体１００は、壁部１２０の上端が開口とされており、蓋体２００が、容器本体１００の該開口を覆うことにより、細胞培養容器１０は閉蓋状態となる。蓋体２００は、天板部２１０と、天板部２１０の周縁から垂れ下がる周縁部２２０と、天板部２１０の周縁から立ち上がるスタッキング用凸部２３０とを有する。
【００１４】
壁部１２０は、薄肉部１２２と、厚肉部１２４とを有する。薄肉部１２２は、容器本体１００が蓋体２００で覆われた際に周縁部２２０と重なる部分であり、略一定の厚みで形成されている。厚肉部１２４はその最大外径が、蓋体２００の外径と略同径（例えば、±２ｍｍ）となるように上方に向かって徐々に厚みが大きくなるように形成されている。このような構成とすることにより、蓋体２００の内径と薄肉部１２２の外径との差を十分に確保しつつ、蓋体２００の外径と厚肉部１２４の最大外径との差を小さくできる。その結果、細胞培養容器を開閉する際の操作性と閉蓋状態の細胞培養容器を移動させる際の操作性とを両立し得る。また、厚肉部１２４には、切欠け部１２６が設けられている。切欠け部１２６を設けることにより、位置決めが容易となる。
【００１５】
底部１１０の周縁には、下方に突出する糸底部１４０が設けられている。糸底部１４０を設けることにより、薄膜部１３０が好適に保護され得る。
【００１６】
上記図示例において、容器本体は、平面視略円形に形成されているが、容器本体の形状は、特に限定されない。例えば、容器本体は、平面視矩形であってもよい。容器本体の内径は、目的に応じて適切に設定され得、一般に用いられている細胞培養皿と同様の内径（例えば、１０ｍｍ〜１００ｍｍ）とすることができる。
【００１７】
上記底部の形状および径は、上記容器本体の平面視形状および内径に応じて適切に設定される。
【００１８】
上記底部の厚み（厚みが一定でない場合は、その最小厚み）は、例えば０．５ｍｍ〜１．５ｍｍ、好ましくは０．６ｍｍ〜１．３ｍｍであり得る。当該厚み範囲であれば、細胞培養容器の底部としての強度を確保でき、また、溶着が好適に行われ得る。
【００１９】
上記底部に設けられる貫通孔の形状は、特に制限されず、円形、矩形等の任意の形状であり得る。該貫通孔の径は、薄膜部の厚みや所望の観察面積に応じて適切に設定され得る。貫通孔の面積は、底部の面積の３０％〜７０％程度とすることができ、その径は、例えば３ｍｍ〜７０ｍｍ、好ましくは５ｍｍ〜４０ｍｍであり得る。
【００２０】
上記底部の表面から突出する突起部の突出高さ（溶着前）は、例えば０．１ｍｍ〜０．４ｍｍ、好ましくは０．１５ｍｍ〜０．３ｍｍ、より好ましくは０．１８ｍｍ〜０．２２ｍｍであり得る。該突起部は、溶着の進行に伴って溶融し、押し潰される。溶着後の突起部の突出高さは、例えば０．０１ｍｍ〜０．３ｍｍ、好ましくは０．０５ｍｍ〜０．２５ｍｍであり得る。このような突出高さであれば、強固な溶着が可能となり、また、薄膜部が糸底部の末端部よりも内方に配置されることから、作業時に薄膜部が傷つくのを防止することができる。なお、突起部は、通常、底部の下方向に突出するように形成されるが、上方向に突出していてもよい。突起部が底部の上方向に突出する場合、薄膜部は、底部の上面に配置される。
【００２１】
上記突起部は、突出方向に向かって縮径するテーパー状に形成され得る。テーパー状とすることにより、超音波溶着の際に、超音波を突起部に集中させることができ、結果として、薄膜部の所望でない収縮や変性を防止し得る。テーパー角θは、好ましくは４０°〜８０°、より好ましくは５０°〜７０°である。
【００２２】
溶着された後の上記突起部の幅（溶着部の幅）は、好ましくは５μｍ〜４００μｍである。このような幅であれば、薄膜部が底部に強固に接合されるので液漏れ等が防止される。
【００２３】
上記突起部の数は、例えば１以上、好ましくは２〜３である。突起部を複数設けることにより、底部と薄膜部との溶着をより強固にすることができる。突起部を複数設ける場合、その間隔は、例えば１ｍｍ〜５ｍｍ、好ましくは１ｍｍ〜３ｍｍであり得る。
【００２４】
上記底部は、任意の適切な形成材料を用いて形成される。代表的には、底部の形成材料は、合成樹脂を含む。該合成樹脂としては、好ましくはスチレン系樹脂が用いられる。スチレン系樹脂は、透明性、硬度、成形性等に優れ得る。また、溶剤耐性にも優れるので油浸レンズを用いた観察にも適合し得る。
【００２５】
上記スチレン系樹脂は、スチレン系モノマーを含むモノマー成分を重合して得ることができる。スチレン系モノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、ｏ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン等の芳香族ビニル系モノマーを単独でまたは２種以上組み合わせて用いることができる。なかでも、スチレンが好ましく用いられる。スチレン系モノマー中におけるスチレンの含有割合は、好ましくは９０重量％以上、より好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは９８重量％〜１００重量％であり得る。
【００２６】
上記モノマー成分中における上記スチレン系モノマーの含有割合は、好ましくは８０重量％以上、より好ましくは９０重量％以上、さらに好ましくは９５重量％以上、さらにより好ましくは９８重量％以上であり得る。
【００２７】
上記モノマー成分は、必要に応じて、上記スチレン系モノマー以外の共重合モノマーを含み得る。該共重合モノマーとしては、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等のシアン化ビニルモノマー、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル等の（メタ）アクリル酸エステルモノマー、無水マレイン酸、無水イタコン酸等の無水物基含有モノマー、マレイミド、Ｎ−メチルマレイミド、Ｎ−フェニルマレイミド、Ｎ−シクロヘキシルマレイミド等のジカルボン酸イミド基含有モノマー、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、イタコン酸等のカルボキシル基含有モノマー等が挙げられる。
【００２８】
上記スチレン系樹脂の重合方法としては、塊状重合法、溶液重合法、懸濁重合法、乳化重合法等公知のスチレン重合方法が挙げられる。品質面や生産性の面では、塊状重合法、溶液重合法が好ましく、連続重合であることが好ましい。溶媒としては、例えばベンゼン、トルエン、エチルベンゼンおよびキシレン等のアルキルベンゼン類やアセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ヘキサン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素等が使用できる。また、重合時には、必要に応じて、重合開始剤および／または連鎖移動剤を使用することができる。
【００２９】
上記スチレン系樹脂の重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは１０，０００〜１，２００，０００、より好ましくは２０，０００〜１，０００，０００、さらに好ましくは５０，０００〜９００，０００である。重量平均分子量が１０，０００未満であると、得られる合成樹脂膜の強度が不十分となる場合がある。一方、重量平均分子量が１，２００，０００を超えると成形性または透明性が低下する場合がある。
【００３０】
上記スチレン系樹脂の多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は、好ましくは１．０〜３．０、より好ましくは１．０〜２．５、さらに好ましくは１．０〜２．０である。多分散度が当該範囲内であれば、成形性が向上し得る。
【００３１】
上記スチレン系樹脂の重量平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）は、重合反応の温度、時間、重合開始剤の種類および添加量、連鎖移動剤の種類および添加量、重合反応で使用する溶媒の種類および量等によって制御することができる。
【００３２】
上記スチレン系樹脂の重量平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）は、例えば、ゲルパーミエイションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて、次の条件で測定し、ポリスチレン換算の分子量として算出され得る。
ＧＰＣ機種：昭和電工株式会社製Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ−１０１
カラム：ポリマーラボラトリーズ社製  ＰＬｇｅｌ  １０μｍ  ＭＩＸＥＤ−Ｂ
移動相：テトラヒドロフラン
試料濃度：０．２質量％
温度：オーブン４０℃、注入口３５℃、検出器３５℃
検出器：示差屈折計
【００３３】
上記スチレン系樹脂は、曲げ弾性率が１，７００ＭＰａ〜３，５００ＭＰａであることが好ましい。曲げ弾性率は、好ましくは１，８００ＭＰａ〜３，４００ＭＰａである。曲げ弾性率が当該範囲であれば、破損が防止され得る。曲げ弾性率は、ＩＳＯ１７８に準拠して測定され得る。
【００３４】
１つの実施形態において、上記スチレン系樹脂として、市販のポリスチレン（ＧＰＰＳ）を用いることができる。市販のポリスチレンとしては、例えば、ＰＳジャパン社製、東洋スチレン社製等のＧＰＰＳが挙げられる。
【００３５】
上記底部の形成材料は、必要に応じて、上記合成樹脂に加えて、任意の適切な添加剤を含んでいてもよい。あるいは、上記底部の形成材料は、上記合成樹脂のみを含むものであってもよい。添加剤フリーとすることにより、添加剤による細胞への悪影響を回避し得る。
【００３６】
上記底部は、任意の適切な成形方法で作製される。該成形方法としては、射出成形が好ましく用いられる。
【００３７】
上記薄膜部の形状は、貫通孔を液密に覆う限りにおいて、特に限定されない。薄膜部の径は、底部への溶着代を確保する観点から、貫通孔の径を超え底部の径未満に設定される。薄膜部の径は、貫通孔の径の１１０％〜２００％程度であり、例えば、貫通孔の径よりも５ｍｍ〜２０ｍｍ程度大きく設定され得る。
【００３８】
上記薄膜部の厚みは、１７０μｍ以下であり、例えば１５０μｍ以下、また例えば１２０μｍ以下、また例えば１００μｍ以下、また例えば８０μｍ以下であり得る。一方、薄膜部の厚みは、１０μｍ以上であり、例えば２０μｍ以上、また例えば３０μｍ以上であり得る。当該厚み範囲であれば、細胞培養容器の底部としての強度を確保しつつ、高倍率の顕微鏡観察を好適に行うことができる。また、超音波顕微鏡を用いる場合には、超音波の伝導性の観点から、薄膜部の厚みは、５０μｍ程度であることが望ましい。なお、このように厚みの薄い薄膜部を備える細胞培養容器を、接着剤を用いることなく、実用可能な形態で提供することは、本発明の特徴の１つである。
【００３９】
上記薄膜部は、実質的には、上記底部に溶着された合成樹脂膜によって構成されている。該合成樹脂膜は、上記底部に含まれる合成樹脂と同種の合成樹脂を含む。底部と合成樹脂膜とが同種の樹脂を含むことにより、溶着強度が向上するので、合成樹脂膜（薄膜部）を底部に強固に接合することができる。また、比較的小さいエネルギーで溶着することができるので、薄い合成樹脂膜であっても意図しない収縮や変性を防止することができる。ここで、「同種の合成樹脂」とは、樹脂同士が全く同一である場合だけでなく、樹脂同士が互いに共通する基本骨格を有する場合を含む意味である。したがって、例えば、スチレン系モノマーを所定量以上（例えば、５０重量％以上）含むモノマー成分を重合して得られる樹脂（スチレン系樹脂）は、スチレン系モノマーの種類やモノマー成分の組成、分子量等が異なる場合であっても同種の樹脂の概念に含まれる。
【００４０】
好ましくは、上記合成樹脂膜および上記底部は、上記同種の合成樹脂として、スチレン系樹脂を含む。より具体的には、合成樹脂膜は、好ましくは上記底部とともにスチレン系樹脂を含み、より好ましくは該スチレン系樹脂とスチレン系熱可塑性エラストマーとのブレンドコポリマーを含む。スチレン系樹脂とスチレン系熱可塑性エラストマーとのブレンドコポリマーを含むことにより、合成樹脂膜に靱性を付与し得る。その結果、１７０μｍ以下の厚みであっても、細胞接着性、透明性、硬度、耐衝撃性、成形性等に優れる合成樹脂膜が得られ得る。
【００４１】
上記合成樹脂膜に含まれるスチレン系樹脂については、上記底部に含まれるスチレン系樹脂と同様の説明が適用され得る。合成樹脂膜に含まれるスチレン系樹脂および上底部に含まれるスチレン系樹脂は、好ましくはスチレン系モノマーを８０重量％以上含むモノマー成分を重合して得られる樹脂であり、より好ましくは同じスチレン系モノマーを５０重量％以上含むモノマー成分を重合して得られる樹脂であり、さらに好ましくは同じスチレン系モノマーを８０重量％以上含むモノマー成分を重合して得られる樹脂であり、さらにより好ましくは同じ組成のモノマー成分を重合して得られる樹脂である。
【００４２】
上記スチレン系熱可塑性エラストマーとしては、スチレン−ブタジエンブロック共重合体（ＳＢＲ）、スチレンーブタジエン−スチレンブロック共重合体（ＳＢＳ）、水素添加スチレン−ブタジエン−スチレンブロック共重合体（ＳＥＢＳ）、スチレン−イソプレンブロック−スチレンブロック共重合体（ＳＩＳ）、水素添加スチレン−イソプレンブロック−スチレンブロック共重合体（ＳＥＰＳ）等が挙げられる。これらは、単独でまたは２種以上組み合わせて用いられ得る。なかでも、スチレン系樹脂との相溶性に優れ、かつ、適度な靱性を付与し得ることから、ＳＢＳが好ましく用いられ得る。なお、スチレン系熱可塑性エラストマーは、ゴム弾性を有する点（より具体的には、ジエン単位を有している点）で上記スチレン系樹脂と区別される。
【００４３】
上記ＳＢＳにおけるスチレンとブタジエンとの質量比（スチレン／ブタジエン）は、好ましくは９５／５〜５／９５、より好ましくは９０／１０〜１０／９０である。また、上記ＳＢＳのメルトフローレート（ＩＳＯ  １１３３、ＭＦＲ：２００℃、荷重５．０ｋｇ）は、例えば０〜２５ｇ／１０分であり、好ましくは２〜２０ｇ／１０分であり得る。
【００４４】
１つの実施形態において、上記ＳＢＳとして、市販のＳＢＳを用いることができる。市販のＳＢＳとしては、旭化成ケミカルズ社製のタフプレン（登録商標）シリーズ、アサフレックス（登録商標）シリーズおよびアサプレン（登録商標）シリーズが挙げられる。
【００４５】
上記スチレン系樹脂とスチレン系熱可塑性エラストマーとの配合比（スチレン系樹脂：スチレン系熱可塑性エラストマー（固形分重量比））は、好ましくは９５：５〜５０：５０、より好ましくは９５：５〜８０：２０、さらに好ましくは９５：５〜９０：１０である。このような配合比とすることにより、細胞培養容器に所望される特性（透明性、細胞接着性、成形性、強度、耐衝撃性等）を充足する合成樹脂膜が得られ得る。
【００４６】
上記合成樹脂膜における合成樹脂の含有割合（ブレンドコポリマーを含む場合は、スチレン系樹脂とスチレン系熱可塑性エラストマーとの合計の含有割合）は、例えば９０重量％以上、好ましくは９５重量％〜１００重量％であり得る。
【００４７】
上記合成樹脂膜は、必要に応じて、任意の適切な添加剤を含んでいてもよい。あるいは、上記合成樹脂膜は、上記合成樹脂のみからなるものであってもよい。添加剤フリーとすることにより、添加剤による細胞への悪影響を回避し得る。
【００４８】
上記合成樹脂膜は、任意の適切な製造方法によって製造され得る。厚みが小さく、均一性に優れた合成樹脂膜を得る観点から、カレンダー成形法またはインフレーション成形法が好ましく用いられる。
【００４９】
上記薄膜部の細胞培養区画側表面には、必要に応じて、表面改質処理が施される。改質処理により、細胞接着性が最適化される、細胞が重層化する等の効果が得られ得る。改質処理後の表面の水接触角は、例えば６０°〜１００°であり得る。
【００５０】
上記改質処理の具体例としては、プラズマ処理（例えば、減圧プラズマ処理、大気圧プラズマ処理）、コロナ放電処理、エキシマ処理が挙げられる。好ましくはプラズマ処理である。プラズマ処理は、例えば、酸素、水素、窒素、大気、アルゴン、ヘリウム、アンモニア、一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、エタン、プロパンまたはこれらの混合ガスのプラズマを用いて行われる。なかでも、酸素、二酸化炭素またはこれらの混合ガスのプラズマを用いることが好ましい。プラズマ処理時の圧力は、通常、０．２Ｔｏｒｒ〜１．０Ｔｏｒｒである。
【００５１】
プラズマ処理を施すための装置としては、高周波、低周波等の発振器を備えた真空チャンバーを用いることが好ましい。なかでも、高周波による処理が好ましく、通常１３．５６ＭＨｚのものが用いられる。出力は、好ましくは１０Ｗ〜６０Ｗである。処理時間は、好ましくは３０秒〜５分である。
【００５２】
上記薄膜部は、透明性が高いことが好ましい。薄膜部のヘイズは、好ましくは３以下、より好ましくは２以下である。ヘイズは、ＪＩＳ  Ｋ  ７１３６、ＩＳＯ  １４７８２、ＩＳＯ  ５７２５−１，２，３に準拠して測定され得る。
【００５３】
上記壁部の高さ（底部の上面からの高さ）は、例えば５ｍｍ〜２５ｍｍであり得る。また、壁部の厚みとしては、任意の適切な厚みが採用され得る。例えば、薄肉部の厚みは、０．５ｍｍ〜１．５ｍｍであり得る。当該厚み範囲であれば、細胞培養容器の壁部としての強度を確保でき、また、成形が容易である。厚肉部の厚みは、蓋体の外径に応じて適切に設定され得る。
【００５４】
上記糸底部の厚みは、０．５ｍｍ〜１．５ｍｍであり得る。また、上記糸底部の高さは（底部の下面からの高さ）、例えば０．３ｍｍ〜３ｍｍであり得る。
【００５５】
上記壁部および糸底部の形成材料としては、底部の形成材料と同様の説明が適用できる。壁部および糸底部は、好ましくは底部の形成材料と同じ形成材料を用いて、底部と一体成形される。あるいは、壁部および糸底部は、底部の形成材料と異なる形成材料を用いて、底部と一体成形され得る。ここで一体成形とは、金型内で全体が成形され一つの成形品として射出成形されることを意味する。射出成形は、インサート成形または二色成形であってもよい。
【００５６】
上記蓋体の天板部の形状および径は、上記容器本体の平面視形状および外径に応じて適切に設定される。周縁部の高さは、例えば３ｍｍ〜２０ｍｍであり得る。また、スタッキング用凸部の高さは、例えば０．３ｍｍ〜２ｍｍであり得る。
【００５７】
上記天板部、周縁部およびスタッキング用凸部の形成材料としては、底部の形成材料と同様の説明が適用できる。これらは、好ましくは、底部の形成材料と同じ形成材料を用いて、一体成形される。あるいは、これらは、二種以上の異なる形成材料を用いて、一体成形（代表的には、インサート成形または二色成形）され得る。
【００５８】
以上、本発明の１つの実施形態による細胞培養容器を説明してきたが、本発明は該実施形態に限定されない。例えば、本発明の別の実施形態による細胞培養容器は、底部と、壁部と、薄膜部によって規定される細胞培養区画を複数備える、いわゆる「マルチウェル」型の細胞培養容器であり得る。この場合、ウェルの数は、例えば、４ウェル、６ウェル、９ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェルとすることができる。
【００５９】
Ｂ．細胞培養容器の製造方法
本発明の細胞培養容器は、任意の適切な方法によって製造され得る。１つの実施形態において、本発明の細胞培養容器の製造方法は、上記貫通孔および突起部が設けられた底部と上記壁部とを一体成形すること、および、薄膜部形成用樹脂膜を上記突起部に接触させた状態で、該薄膜部形成用樹脂膜を底部に溶着すること、を含む。
【００６０】
上記溶着方法としては、例えば超音波を印加する超音波溶着または熱を印加する熱溶着が好ましく挙げられる。薄膜部形成用樹脂膜の意図しない熱変性を防止しつつ強固に溶着する観点からは、超音波溶着がより好ましい。
【００６１】
図３は、超音波溶着を用いた本発明の細胞培養容器の製造方法の一例を説明する概略図である。まず、図３（ａ）に示すように、貫通孔１１２および突起部１１４ａ、１１４ｂが設けられた底部１１０と、底部１１０の周縁から立ち上がる壁部１２０とを、対応する形状の空洞部を有する金型を用いて射出成形することにより、一体成形する。あるいは、別途に作製した部材（底部または壁部）を金型内に配置し、該金型に他の部材の形成材料を注入してインサート成形することにより、底部と壁部とを一体成形してもよい。次いで、図３（ｂ）に示すように、作業台４００上に薄膜部形成用合成樹脂膜１３０’を載置し、その上に、突起部１１４ａ、１１４ｂが合成樹脂膜１３０’に接するように得られた成形品を載置する。次いで、図３（ｃ）に示すように、超音波溶着機の一部である超音波発振ホーン３００を底部１１０上に重ね、加圧および超音波の発振を行う。加圧状態で超音波を印加することにより、突起部１１４ａ、１１４ｂが溶融して、合成樹脂膜１３０’と溶着し、これにより、薄膜部１３０が形成される。
【００６２】
上記超音波溶着の条件は、合成樹脂膜の種類、膜厚等に応じて適切に設定され得る。超音波溶着は、例えば、１２５０Ｗの出力および２０ｋＨｚの周波数で約１秒間処理することにより行われ得る。
【００６３】
熱溶着を用いる場合、熱を印加する治具先端を突起部の形状に対応する形状（図示例では、環状）にすることにより、意図しない熱変性を防止することができる。熱溶着の加熱温度および加熱時間は、薄膜部形成用合成樹脂膜の種類、厚み等に応じて適切に設定され得る。加熱温度は、例えば１８０℃〜２４０℃、好ましくは１９０℃〜２３０℃であり得る。加熱時間は、例えば０．１秒〜３秒であり得る。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。【００６５】
［実施例１］
図３（ａ）〜（ｃ）に示す製造方法によって、図１および２に示すような細胞培養容器を得た。
具体的には、射出成形により、貫通孔（径：約２０ｍｍ）および２つの下向き円錐状の突起部（高さ：約０．２ｍｍ、断面形状のテーパー角６０°）が設けられた底部（内径：約３５ｍｍ、厚み：約１．２ｍｍ）と、底部の周縁から立ち上がる壁部（高さ：約１０ｍｍ、薄肉部の厚み：約１．５ｍｍ、厚肉部の最大厚み：約３．５ｍｍ）と、糸底部（高さ：約０．５ｍｍ）を、一体成形した。形成材料としては、ＧＰＰＳ（ＰＳジャパン社製、型番「６７９」）を用いた。
一方、ＧＰＰＳ（東洋スチレン社製、型番「ＨＲＭ１４」）とＳＢＳ（旭化成ケミカルズ社製、製品名「アサフレックス８１０」）とのブレンドコポリマーをインフレーション成形によって厚み５０μｍの樹脂膜に成形した。該ブレンドコポリマーにおける樹脂の配合比（固形分重量、ＧＰＰＳ：ＳＢＳ）は、１０：１あった。
得られた樹脂膜を円形（径：約３０ｍｍ）に切り抜き、作業台の上に配置し、その上に上記一体成型品を重ねた。このとき、一体成型品の底部に設けられた環状の突起部が樹脂膜に接触するように配置した。次いで、超音波溶着機（ブランソン社製、型番「２０００Ｘｄｔ」）の超音波発振ホーンを底部の上面に接触させて超音波溶着（出力：１２５０Ｗ、周波数：２０ｋＨｚ、時間：１秒）を行った。これにより、貫通孔を覆うように底部に溶着された薄膜部を有する容器本体を得た。次いで、底部等と同じ形成材料を用いた射出成形により蓋体を一体成形した。これにより、容器本体と蓋体とからなる細胞培養容器を得た。【００６６】
［実施例２］
ＧＰＰＳとＳＢＳとのブレンドコポリマーを厚み１７０μｍの樹脂膜に成形し、該樹脂膜を底部に溶着したこと以外は実施例１と同様にして、細胞培養容器を得た。【００６７】
［参考例１］
底部に貫通孔が設けられていない通常の細胞培養皿（ＢＤ社製、ポリスチレン製、底部の径：約３５ｍｍ、底部の厚み：約１．０ｍｍ）を用いた。【００６８】
［参考例２］
底面に貫通孔を設け、該貫通孔を覆うように該底面にガラス板を接着剤で貼着したガラスボトムディッシュ（エッペンドルフ社製、「Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｄｉｓｈｅｓ」、ガラス板部以外ポリスチレン製、底部の径：約３５ｍｍ、ガラス板の厚み：１７０μｍ）を用いた。【００６９】
≪細胞培養および顕微鏡観察≫
上記実施例および参考例の細胞培養容器を用いて、細胞培養を行った。具体的には、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）を約１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように増殖用細胞培養液（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に懸濁した。得られた懸濁液を各培養容器に播種し、炭酸ガスインキュベーター内（温度：３７±１℃、ＣＯ２濃度：５±０．１％）で１〜３日培養した。顕微鏡観察により、セミコンフルエントになっていることを確認後、培養液を分化用細胞培養液（ＤＭＥＭ＋２％ＨＳ）に置換した。その後、２〜３日に１回分化用細胞培養液を交換しながら、さらに５〜７日間培養した。
次いで、培養液を除去して、培養細胞をＰＢＳ  １．０ｍＬで洗浄し、４．０％ホルムアルデヒドをパスツールピペットで添加した。室温で１０分間放置した後、静かに溶液を除去した。培養細胞をＰＢＳ  １．０ｍＬで再度洗浄し、次いで、ＤＡＰＩを添加して室温で１０分間核染色処理を行った。
上記処理後の細胞を、倒立型レーザー共焦点顕微鏡を用いて培養容器の底面側から観察した。核染色によるＤＡＰＩの蛍光観察にはＵＶレーザーを用い、細胞の輪郭観察には微分干渉モード（ＤＩＣ）を用いた。用いた対物レンズの倍率は、１０倍（ドライ）、２０倍（ドライ）、４０倍（ドライ）、６３倍（油浸）または１００倍（油浸）であった。【００７０】
実施例および参考例の細胞培養容器で培養された細胞の観察画像をそれぞれ、図４および図５に示す。また、観察結果および観察画像に基づく細胞接着性の評価結果を表１に示す。
【表１】
2018042532.tif 000003
【００７１】
表１、図４および図５に示されるとおり、実施例１および２の細胞培養容器は、良好な細胞接着性を示し、かつ、４０倍の対物レンズを用いた場合であっても、解像度の高い画像が得られた。特に、実施例１の細胞培養容器は、６３倍および１００倍という高倍率の対物レンズを用いた場合であっても、解像度の高い画像が得られた。一方、参考例１の細胞培養容器によれば、２０倍以上の倍率の対物レンズを用いた場合には、十分な解像度を有する画像が得られなかった。また、参考例２の細胞培養容器では、細胞接着性が不十分であり、また、６３倍以上の倍率の対物レンズを用いた場合には、十分な解像度を有する画像が得られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の細胞培養容器は、細胞培養において好適に利用され得る。
【符号の説明】
【００７３】
１０          細胞培養容器
１００        容器本体
１１０        底部
１１２        貫通孔
１１４        突起部
１２０        壁部
１３０        薄膜部
２００        蓋体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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