【手続補正書】
【提出日】令和1年6月18日(2019.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、単一分子を分析するための方法であって：
（ａ）少なくとも１つの個別の試料域をその上に含む担持体を、提供するステップ、ここで、前記試料域が、少なくとも部分的には導電性材料でできている、
（ｂ）前記担持体を、分析対象である少なくとも１つの単一分子を含む液体媒体と接触させるステップ、これによって、前記試料域上の液体媒体の反応空間を形成する、
（ｃ）前記反応空間に電場を直流電圧で印加するステップ、これによって、分析対象である前記少なくとも１つの単一分子の、前記試料域での濃縮を達成する、および
（ｄ）前記少なくとも１つの単一分子を、個別に分析するステップ、
ここで、個別の試料域の前記単一分子は、照射体積要素を提供する光源によって照射され、前記体積要素は全反射によって生成されるエバネセント場である、
方法。
【請求項２】
以下の工程を含む、複数の単一分子を分析するための方法であって：
（ａ）複数の個別の試料域をその上に含む担持体を、提供するステップ、ここで前記試料域が、少なくとも部分的には導電性材料でできている、
（ｂ）前記担持体を、分析対象である複数の単一分子を含む液体媒体と接触させるステップ、これによって、前記試料域上の少なくとも１つの反応空間を形成する、
（ｃ）前記反応空間に電場を直流電圧で印加するステップ、これによって、分析対象である前記単一分子の、前記試料域での濃縮を達成する、および
（ｄ）前記単一分子を、個別に分析するステップ、
ここで、複数の個別の試料域の前記複数の単一分子は、照射体積要素を提供する光源によって照射され、前記体積要素は全反射によって生成されるエバネセント場である、
方法。
【請求項３】
単一の核酸分子、特に複数の単一の核酸分子の配列を決定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
試料域が、約１〜２０ｎｍの範囲の直径を有し、個別の試料域と試料域との間の距離が、前記試料域の直径の少なくとも約２倍、好ましくは約３〜５００倍である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記担持体は、平坦な表面または構造化された表面を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記担持体は、個別の試料域と試料域と間の領域に導電性の表面を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記試料域の表面は、金属、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｒ、Ｎｉ、またはＡｌ、特にＡｕである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料域の表面には、核酸合成酵素および／または核酸分解酵素が結合している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記電場は、約１〜５０００Ｖ／ｃｍ、特に約１０〜２０００Ｖ／ｃｍ、より特に約２０〜２００Ｖ／ｃｍの電場強度を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記電場は、前記担持体表面とさらなる電極との間に印加され、前記電極は光学測定装置の導電性構造または導電性のマイクロウェル壁であってもよい、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法の、配列集団の部分配列の頻度および／または分布の決定のための使用。
【請求項１２】
前記集団は、少なくとも１０２個、少なくとも１０３個、または少なくとも１０４個の個別の構成要素を含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
（ｉ）少なくとも１つの個別の試料域をその上に含む担持体、ここで、前記試料域が、少なくとも部分的には導電性材料でできている、
（ｉｉ）前記担持体を、分析対象である少なくとも１つの単一分子を含む液体媒体と、接触させるのに適した手段、
（ｉｉｉ）前記担持体を前記液体媒体に接触させる際に形成される反応空間に、電場を直流電圧で印加するのに適した手段、これによって、分析対象である前記少なくとも１つの単一分子の、前記試料域での濃縮を達成する、
（ｉｖ）個別の試料域の単一分子を、個別に照射するための光源であって、少なくとも１つの照射された個別の体積要素を、前記担持体表面の１つの試料域に提供する光源、および
（ｖ）個別の試料域で単一分子から発せられる光を、個別に検出する光検出器
を含む、少なくとも１つの個別の単一分子を分析する装置であって、例えば、少なくとも１つの単一の核酸分子の配列を決定し、
ここで、前記少なくとも1つの照射された個別の体積要素は全反射によって生成されるエバネセント場である、
装置。
【請求項１４】
（ｉ）複数の個別の試料域をその上に含む担持体、ここで、前記試料域が少なくとも部分的には導電性材料でできている、
（ｉｉ）前記担持体を、分析対象である複数の単一分子を含む液体媒体と、接触させるのに適した手段、
（ｉｉｉ）前記担持体を前記液体媒体と接触させる際に形成される反応空間に、電場を直流電圧で印加するのに適した手段、これによって、分析対象である前記単一分子の、前記試料域での濃縮を達成する、
（ｉｖ）個別の試料域の単一分子を、個別に照射するための光源であって、少なくとも１つの照射された個別の体積要素を、前記担持体表面の１つの試料域に提供する光源、および
（ｖ）個別の試料域で複数の単一分子から発せられた光を、個別に並行して検出する光検出器
を含む、複数の個別の単一分子を並行分析する装置であって、例えば、複数の単一の核酸分子の配列を並行して決定し、
ここで、前記少なくとも1つの照射された個別の体積要素は全反射によって生成されるエバネセント場である、
装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
単一分子の配列決定により、ある種内の微生物集団、あるいはある微生物内の細胞集団の個別の配列の分布を決定してもよい。例えば、微生物集団（例えば、バクテリアまたはウイルス）あるいは細胞集団（例えば、精子）は、それらのゲノムの特定の配列に同一の遺伝子情報を含まない。そうではなくて、所定の長さに渡って１個または数個（例えば、２、３、または４個）の異なるヌクレオチドを有する示差的な個別の配列（いわゆる準種または亜種(sub-species)に一致）が存在する。本発明は、単一分子の配列を決定することで、特に、個別の変異体の単一分子の配列決定サイクルを繰り返すことで、個別の変異体の配列を正確に決定することができる。これにより、微生物（例えば、ウイルスまたはバクテリア）集団内、あるいは細胞（例えば、精子）集団内の、個別の部分配列（sub-sequences）の頻度および分布を決定してもよい。この情報により、所与の微生物集団内または細胞集団内の亜種の分布を、正確に決定してもよい。これにより、病原性微生物（例えば、バクテリアまたはウイルス）の場合、例えば、薬物耐性変異の有無を検出することで、診断および治療を向上させることができる。精子などの細胞の場合、例えば、特定の遺伝型の有無を検出することで、改善された遺伝子分析を行ってもよい。
さらに、本発明は以下の各項目に記載の態様を含むものである。
［項目１］
以下のステップを含む、単一分子を分析するための方法：
（ａ）少なくとも１つの個別の試料域をその上に含む担持体を、提供するステップ、ここで、前記試料域が、少なくとも部分的には導電性材料でできている、
（ｂ）前記担持体を、分析対象である少なくとも１つの単一分子を含む液体媒体と接触させるステップ、これによって、前記試料域上の液体媒体の反応空間を形成する、
（ｃ）前記反応空間に電場を印加するステップ、これによって、分析対象である前記少なくとも１つの単一分子の、前記試料域での濃縮を達成する、および
（ｄ）前記少なくとも１つの単一分子を、個別に分析するステップ。
［項目２］
以下の工程を含む、複数の単一分子を分析するための方法：
（ａ）複数の個別の試料域をその上に含む担持体を、提供するステップ、ここで前記試料域が、少なくとも部分的には導電性材料でできている、
（ｂ）前記担持体を、分析対象である複数の単一分子を含む液体媒体と接触させるステップ、これによって、前記試料域上の少なくとも１つの反応空間を形成する、
（ｃ）前記反応空間に電場を印加するステップ、これによって、分析対象である前記単一分子の、前記試料域での濃縮を達成する、および
（ｄ）前記単一分子を、個別に分析するステップ。
［項目３］
単一の核酸分子、特に複数の単一の核酸分子の配列を決定する、項目１または２に記載の方法。
［項目４］
試料域が、約１〜２０ｎｍの範囲の直径を有し、個別の試料域と試料域との間の距離が、前記試料域の直径の少なくとも約２倍、好ましくは約３〜５００倍である、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
［項目５］
前記担持体は、平坦な表面または構造化された表面を有する、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
［項目６］
前記担持体は、個別の試料域と試料域と間の領域に導電性の表面を有する、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
［項目７］
前記試料域の表面は、金属、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｒ、Ｎｉ、またはＡｌ、特にＡｕである、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
［項目８］
前記試料域の表面には、核酸合成酵素および／または核酸分解酵素が結合している、項目１〜７のいずれかに記載の方法。
［項目９］
前記電場は、約１〜５０００Ｖ／ｃｍ、特に約１０〜２０００Ｖ／ｃｍ、より特に約２０〜２００Ｖ／ｃｍの電場強度を有する、項目１〜８のいずれかに記載の方法。
［項目１０］
前記電場は、前記担持体表面とさらなる電極との間に印加され、前記電極は光学測定装置の導電性構造または導電性のマイクロウェル壁であってもよい、項目１〜９のいずれかに記載の方法。
［項目１１］
項目１〜１０のいずれかに記載の方法の、配列集団の部分配列の頻度および／または分布の決定のための使用。
［項目１２］
前記集団は、少なくとも１０２個、少なくとも１０３個、または少なくとも１０４個の個別の構成要素を含む、項目１１に記載の使用。
［項目１３］
（ｉ）少なくとも１つの個別の試料域をその上に含む担持体、ここで、前記試料域が、少なくとも部分的には導電性材料でできている、
（ｉｉ）前記担持体を、分析対象である少なくとも１つの単一分子を含む液体媒体と、接触させるのに適した手段、
（ｉｉｉ）前記担持体を前記液体媒体に接触させる際に形成される反応空間に、電場を印加するのに適した手段、
（ｉｖ）個別の試料域の単一分子を、個別に照射するための光源であって、少なくとも１つの照射された個別の体積要素を、前記担持体表面の１つの試料域に提供する光源、および
（ｖ）個別の試料域で単一分子から発せられる光を、個別に検出する光検出器
を含む、少なくとも１つの個別の単一分子を分析する装置であって、例えば、少なくとも１つの単一の核酸分子の配列を決定する、装置。
［項目１４］
（ｉ）複数の個別の試料域をその上に含む担持体、ここで、前記試料域が少なくとも部分的には導電性材料でできている、
（ｉｉ）前記担持体を、分析対象である複数の単一分子を含む液体媒体と、接触させるのに適した手段、
（ｉｉｉ）前記担持体を前記液体媒体と接触させる際に形成される反応空間に、電場を印加するのに適した手段、
（ｉｖ）個別の試料域の単一分子を、個別に照射するための光源であって、少なくとも１つの照射された個別の体積要素を、前記担持体表面の１つの試料域に提供する光源、および
（ｖ）個別の試料域で複数の単一分子から発せられた光を、個別に並行して検出する光検出器
を含む、複数の個別の単一分子を並行分析する装置であって、例えば、複数の単一の核酸分子の配列を並行して決定する、装置。
さらに、以下の図は本発明を例示するものである。