(57)【要約】本開示は、電気信号またはカルシウム信号が環状心筋細胞塊内を循環して進行している環状心筋細胞塊を提供する。また、多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を、内側底部に凸部を有する培養容器中で培養する工程を含む、当該環状心筋細胞塊の製造方法を提供する。さらに、内側底部に凸部を有する培養容器を提供する。また、当該環状心筋細胞塊を使用して、医薬候補物質の心毒性を評価する方法および心疾患の処置剤をスクリーニングする方法、並びに、当該環状心筋細胞塊を含むそのためのキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を含む環状心筋細胞塊であって、少なくとも１つの電気信号またはカルシウム信号が環状心筋細胞塊内を循環して進行している、環状心筋細胞塊。
【請求項２】
多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、請求項１に記載の環状心筋細胞塊。
【請求項３】
心筋細胞の少なくとも一部がカルシウムセンサータンパク質の遺伝子を発現する、請求項１または請求項２に記載の環状心筋細胞塊。
【請求項４】
環状心筋細胞塊におけるβ−ＭＨＣの発現量が成体の正常心筋細胞の約１０％以上である、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
【請求項５】
内径が約０.１ｍｍ〜約７ｍｍである、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
【請求項６】
多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を、内側底部に凸部を有する培養容器中で培養する工程を含む、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の環状心筋細胞塊の製造方法。
【請求項７】
凸部の寸法１ｍｍにつき、約０.５×１０５個〜２.０×１０５個の心筋細胞を培養する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
心筋細胞に電気的または機械的刺激を与えないことを特徴とする、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの電気信号またはカルシウム信号が環状心筋細胞塊内を循環して進行している環状心筋細胞塊を選択する工程をさらに含む、請求項６ないし請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
内側底部に凸部を有する、多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を培養するための培養容器。
【請求項１１】
医薬候補物質の心毒性を評価する方法であって、
（１）請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の環状心筋細胞塊を、候補物質と接触させること、
（２）候補物質と接触させた環状心筋細胞塊の電気信号またはカルシウム信号を検出すること、および、
（３）段階（２）で検出された電気信号またはカルシウム信号を、対照の電気信号またはカルシウム信号と比較すること、
の各段階を含む、方法。
【請求項１２】
心疾患の処置剤をスクリーニングする方法であって、
（１）請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の環状心筋細胞塊を、候補物質と接触させること、
（２）候補物質と接触させた環状心筋細胞塊の電気信号またはカルシウム信号を検出すること、および、
（３）段階（２）で検出された電気信号またはカルシウム信号を、対照の電気信号またはカルシウム信号と比較すること、
の各段階を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の環状心筋細胞塊を含む、医薬候補物質の心毒性を評価するためのキット。
【請求項１４】
請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の環状心筋細胞塊を含む、心疾患の処置剤をスクリーニングするためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、日本国特許出願第２０１６−２５５２５８号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本願は、環状心筋細胞塊、その製造方法および当該方法に用いる培養容器を提供する。本願はさらに、当該環状心筋細胞塊を使用して、医薬候補物質の心毒性を評価する方法および心疾患の処置剤をスクリーニングする方法、並びに、そのためのキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多能性幹細胞（例えば、胚性多能性幹細胞（ＥＳ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ））の研究が進められており、再生医療、創薬研究、薬物安全性試験などの様々な用途への応用が期待されている。【０００３】
例えば、全ての領域の医薬品について心毒性に関する非臨床実験の実施を求める指針があり、ｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞からヒトの心筋細胞を誘導し、これを培養して得られる心筋組織片を薬物の毒性評価や動態評価に使用することに対する産業界の需要は高い。【０００４】
多能性幹細胞から心筋細胞を誘導する方法は種々提案されており、例えば、新規低分子化合物を用いた安定で高効率な臨床グレードの心筋分化誘導法が提案されている（特許文献１および２、非特許文献１）。また、本願発明者らは、配向性ファイバーシート上で心筋細胞を培養することにより、生体内の心筋組織に近い構造を有する心筋細胞片を得る方法を報告した（特許文献３）。【０００５】
心筋細胞の成熟を促進する方法としては、機械的刺激による方法が知られており（非特許文献２）、FLEXCELL社により製品化されている（Stage Flexer（登録商標））。しかしながら、この方法では、心筋細胞を機械的に刺激するために、複雑な装置が必要である。また、細胞にダメージを与えずに細胞培養しながらその機能を測定する方法として、細胞外電位活動を測定する多電極技術があるが、心筋細胞を機械的に刺激しながら多電極システムを使用するのは困難である。【０００６】
電気刺激により心筋細胞の成熟を促進する方法も知られている（非特許文献３および４）。しかしながら、これらの方法では、長時間にわたり、定期的、定量的に細胞に電気刺激をかけるため、細胞に損傷を与える。また、電気刺激を直接的に受ける細胞にしか効果がない。【０００７】
このように、多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を成熟させる技術は開発途上であり、さらなる改善が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際出願公開第２０１３／１１１８７５号公報
【特許文献２】国際出願公開第２０１５／１８２７６５号公報
【特許文献３】国際出願公開第２０１６／０６０２６０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Minami I, et al., Cell Rep. 2012 Nov 29; 2(5): 1448-60
【非特許文献２】A. Michic et al., Biomaterials, 35 2798-2808, 2014
【非特許文献３】S. S. Nunes et al., Nature Methods, 10. 781-787, 2013
【非特許文献４】F. G. Amandine et al., Biomaterials, 60. 82-91, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本願の目的は、心筋細胞の成熟に関連する特徴を有する環状心筋細胞塊、その製造方法または当該方法に用いる培養容器を提供することである。本願の別の目的は、医薬候補物質の心毒性を評価する方法もしくは心疾患の処置剤をスクリーニングする方法、または、そのためのキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ある態様では、本願は、多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を含む環状心筋細胞塊であって、少なくとも１つの電気信号またはカルシウム信号が環状心筋細胞塊内を循環して進行している、環状心筋細胞塊を提供する。【００１２】
ある態様では、本願は、多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を、内側底部に凸部を有する培養容器中で培養する工程を含む、上記の環状心筋細胞塊の製造方法を提供する。【００１３】
ある態様では、本願は、内側底部に凸部を有する、多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を培養するための培養容器を提供する。【００１４】
ある態様では、本願は、医薬候補物質の心毒性を評価する方法であって、
（１）上記の環状心筋細胞塊を、候補物質と接触させること、
（２）候補物質と接触させた環状心筋細胞塊の電気信号またはカルシウム信号を検出すること、および、
（３）段階（２）で検出された電気信号またはカルシウム信号を、対照の電気信号またはカルシウム信号と比較すること、
の各段階を含む、方法を提供する。【００１５】
ある態様では、本願は、心疾患の処置剤をスクリーニングする方法であって、
（１）上記の環状心筋細胞塊を、候補物質と接触させること、
（２）候補物質と接触させた環状心筋細胞塊の電気信号またはカルシウム信号を検出すること、および、
（３）段階（２）で検出された電気信号またはカルシウム信号を、対照の電気信号またはカルシウム信号と比較すること、
の各段階を含む、方法を提供する。【００１６】
ある態様では、本願は、上記の環状心筋細胞塊を含む、医薬候補物質の心毒性を評価するためのキットを提供する。
ある態様では、本願は、上記の環状心筋細胞塊を含む、心疾患の処置剤をスクリーニングするためのキットを提供する。
【発明の効果】
【００１７】
心筋細胞の成熟に関連する特徴を有する環状心筋細胞塊が提供される。当該環状心筋細胞塊は、医薬候補物質の心毒性評価や心疾患の処置剤のスクリーニングなどに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、例示的な培養容器の上面図および側面図である。
【図２】図２は、実施例において環状心筋細胞塊の製造に用いた培養容器の写真と模式図である。
【図３】図３は、培養開始時から１４日後までの心筋細胞の光学顕微鏡像（Ａ）と、環状心筋細胞塊の幅（Ｂ）を示す。
【図４】図４は、０〜２波の進行波が観察される環状心筋細胞塊におけるカルシウム信号の伝達速度を示す。
【図５】図５は、０〜２波の進行波が観察される環状心筋細胞塊における、心筋細胞の蛍光強度の変化を示す。
【図６】図６は、０〜２波の進行波が観察される環状心筋細胞塊における、培養７日後と１４日後のカルシウム信号の伝達速度を示す。
【図７】図７は、培養６日後および１４日後の環状心筋細胞塊における進行波の数を示す。
【図８】図８は、直径１ｍｍ、３ｍｍ、５ｍｍのピラーを用いて作製した環状心筋細胞塊における、進行波の発生率（Ａ）および心筋拍動数（Ｂ）を示す（Ｎ＝サンプル数）。
【図９】図９は、０〜２波の進行波が観察される環状心筋細胞塊の光学顕微鏡写真である。スケールバー：２００μｍ（上段）および５０.０μｍ（下段）
【図１０】図１０は、０〜２波の進行波が観察される環状心筋細胞塊における、心筋特異的マーカー（β−ＭＨＣ、ＴｎＴ２、α−アクチニン）の免疫染色およびＤＡＰＩ染色の結果を示す。図中、粒状の構造はＤＡＰＩ染色された核であり、線状の構造は免疫染色された心筋特異的マーカーである。
【図１１】図１１は、β−ＭＨＣについて免疫染色した環状心筋細胞塊（１進行波）の全体像を示す。
【図１２】図１２は、０〜２波の進行波が観察される環状心筋細胞塊における心筋特異的遺伝子の発現レベルを、定量的ＰＣＲにより測定した結果を示す。
【図１３】図１３は、０〜１波の進行波が観察される環状心筋細胞塊および従来法で培養した心筋細胞におけるβ−ＭＨＣの発現レベルを、定量的ＰＣＲにより測定した結果を示す。
【図１４】図１４は、１波の進行波が観察される環状心筋細胞塊における電気信号とカルシウム信号の変化を示す。
【図１５】図１５は、１波の進行波が観察される環状心筋細胞塊を様々な濃度のＥ−４０３１の存在下で培養したときの電気信号を示す。
【図１６】図１６は、１波の進行波が観察される環状心筋細胞塊を様々な濃度のＥ−４０３１の存在下で培養したときのカルシウム信号を示す。
【図１７】図１７は、１波の進行波が観察される環状心筋細胞塊における、Ｅ−４０３１による進行波の伝達速度の変化を示す。
【図１８】図１８は、１波の進行波が観察される環状心筋細胞塊における、Ｅ−４０３１による進行波の伝達速度の変化を示す。
【図１９】図１９は、１波の進行波が観察される環状心筋細胞塊における、イソプロテレノールおよびプロプラノロールによる進行波の伝達速度の変化を示す。
【図２０】図２０は、１波の進行波が観察される環状心筋細胞塊における、イソプロテレノールおよびプロプラノロールによる進行波の伝達速度の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
【００２０】
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「２０±１０％〜３０±１０％」を含むものとする。
【００２１】
「多能性幹細胞」とは、成体を構成する全ての細胞に分化することができる多分化能（pluripotency）と、細胞分裂を経てもその多分化能を維持することができる自己複製能を有する細胞を意味する。「多能性幹細胞」には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が含まれる。「多能性幹細胞」の生物種は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは齧歯類または霊長類、さらにより好ましくは霊長類である。サルまたはヒト多能性幹細胞、特にサルまたはヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を好適に用い得る。ある実施態様では、多能性幹細胞はヒトｉＰＳ細胞である。
【００２２】
多能性幹細胞から心筋細胞を誘導する方法は種々知られており、例えば特許文献１および２、並びに非特許文献１に記載の方法が例示される。また、多能性幹細胞から誘導された心筋細胞は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞由来の心筋細胞として市販されている細胞（例えば、iCell）であってもよい。
【００２３】
ある実施態様では、特許文献２に記載の方法により多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を使用する。簡潔に述べると、（１）多能性幹細胞をＷＮＴシグナル活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を含む培地中で培養する工程、および；（２）工程（１）で得られた細胞をＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養する工程を含む方法により、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導することができる。
【００２４】
「ＷＮＴシグナル活性化剤」とは、ＷＮＴシグナル経路を活性化する物質を意味する。ＷＮＴシグナル活性化剤としては、ＢＩＯおよびＣＨＩＲ９９０２１、ＴＷＳ１１９などのＧＳＫ３β阻害剤が例示される。「ＷＮＴシグナル阻害剤」とは、ＷＮＴシグナル経路を阻害する物質を意味する。ＷＮＴシグナル阻害剤には、例えば、国際公開第２０１２／０２６４９１号パンフレットに記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩、ＩＷＰ２、ＩＷＰ４、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１などの化合物が含まれる。
【００２５】
「ＰＫＣ活性化剤」は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）またはその下流のシグナル伝達経路を活性化する物質を意味する。ＰＫＣ活性化剤としては、ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（Phorbol 12-myristate 13-acetate）（ＰＭＡ）、プロストラチン、ブリオスタチン１（Bryostatin 1）、ブリオスタチン２（Bryostatin 2）、ＦＲ２３６９２４、（−）−インドラクタムＶ（(-)-Indolactam V）、ＰＥＰ００５、ホルボール１２，１３−ジブチラート（Phorbol 12,13-dibutyrate）、ＳＣ−９、ＳＣ−１０、１−オレオイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロール（1-Oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol）、１−Ｏ−ヘキサデシル−２−Ｏ−アラキドニル−ｓｎ−グリセロール（1-O-Hexadecyl-2-O-arachidonyl-sn-glycerol）、１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール（1,2-Dioctanoyl-sn-glycerol）、ＰＩＰ２、レシニフェラトキシン（Resiniferatoxin）、ホルボール１２，１３−ジヘキサノアート（Phorbol 12,13-Dihexanoate）、メゼレイン（Mezerein）、インゲノール３−アンゲラート（Ingenol 3-Angelate）、ＲＨＣ−８０２６７、ＤＣＰ−ＬＡ、リポキシンＡ４（Lipoxin A4）などが例示される。
【００２６】
「Ｓｒｃ阻害剤」は、チロシンキナーゼであるＳｒｃまたはその下流のシグナル伝達経路を阻害する物質を意味する。Ｓｒｃ阻害剤としては、Ａ４１９２５９、ＳＵ６６５６、ＰＰ１、１−ナフチルＰＰ１（1-Naphthyl PP1）、ＰＰ２、インジルビン−３’−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−オキシムエーテル（Indirubin-3'-(2,3-dihydroxypropyl)-oximether）、ＴＸ−１１２３、Src Kinase Inhibitor I（CAS 179248-59-0）、ＡＺＭ４７５２７１、ボスチニブ（Bosutinib）、ハービマイシンＡ（Herbimycin A）、ＫＢ  ＳＲＣ  ４、ＭＮＳ、ＰＤ１６６２８５、ＴＣ−Ｓ７００３などが例示される。
【００２７】
「ＥＧＦ受容体阻害剤」（ＥＧＦＲ阻害剤とも記載する）は、ＥＧＦ受容体からのシグナル伝達を阻害する物質を意味する。ＥＧＦ受容体阻害剤としては、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ（Gefitinib）、アファチニブ（Afatinib）、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＳＴ１３０６、ＡＺＤ８９３１、ＢＩＢＵ１３６１、ＢＩＢＸ１３８２、ＢＰＤＱ、ＢＰＩＱ−Ｉ、ＢＰＩＱ−ＩＩ、カネルチニブ（Canertinib）、ＣＬ−３８７，７８５、ＣＵＤＣ１０１、ダコミチニブ（Dacomitinib）、バンデタニブ（Vandetanib）、EGFR Inhibitor III（Ｎ−（４−（（３，４−ジクロロ−６−フルオロフェニル）アミノ）−キナゾリン−６−イル）−２−クロロアセトアミド、CAS 733009-42-2）、EGFR/ErbB-2 Inhibitor（４−（４−ベンジルオキシアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン、CAS 179248-61-4）、エルロチニブ（Erlotinib）、ＧＷ５８３３４０、ＧＷ２９７４、ＨＤＳ０２９、ラパチニブ（Lapatinib）、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＯＳＩ−４２０、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ１６８３９３、ＰＤ１７４２６５、ペリチニブ（Pelitinib）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ５６、ＸＬ６５７、ＰＰ３、ＡＧ−４９０、ＡＧ５５５、チロホスチン（Tyrphostin）Ｂ４２、チロホスチンＢ４４、ＡＧ５５６、ＡＧ４９４、ＡＧ８２５、ＲＧ−１３０２２、ＤＡＰＨ、EGFR Inhibitor（シクロプロパンカルボン酸−（３−（６−（３−トリフルオロメチル−フェニルアミノ）−ピリミジン−４−イルアミノ）−フェニル）−アミド、CAS 879127-07-8）、エルブスタチンアナログ（Erbstatin Analog）（メチル  ２，５−ジヒドロキシシナマート、CAS 63177-57-1）、ＪＮＪ２８８７１０６３、チロホスチン４７、ラベンダスチン（Lavendustin）Ａ、ラベンダスチンＣ、ラベンダスチンＣメチルエステル、ＬＦＭ−Ａ１２、ＴＡＫ１６５、ＴＡＫ２８５、チロホスチン５１、チロホスチンＡＧ１８３、チロホスチンＡＧ５２８、チロホスチンＡＧ９９、チロホスチンＲＧ１４６２０、ＷＺ３１４６、ＷＺ４００２、ＷＺ８０４０、ブテイン、チロホスチンＡＧ１１２などが例示される。ある態様において、ＥＧＦ受容体阻害剤は、キナゾリン系骨格を有するＥＧＦ受容体阻害剤、例えばＡＧ１４７８、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＳＴ１３０６、ＡＺＤ８９３１、ＢＩＢＵ１３６１、ＢＩＢＸ１３８２、ＢＰＤＱ、ＢＰＩＱ−Ｉ、ＢＰＩＱ−ＩＩ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７，７８５、ＣＵＤＣ１０１、ダコミチニブ、バンデタニブ、EGFR Inhibitor III（CAS 733009-42-2）、EGFR/ErbB-2 Inhibitor（CAS 179248-61-4）、エルロチニブ、ＧＷ５８３３４０、ＧＷ２９７４、ＨＤＳ０２９、ラパチニブ、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＯＳＩ−４２０、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ１６８３９３、ＰＤ１７４２６５、ペリチニブ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ５６、もしくはＸＬ６５７である。ＥＧＦ受容体阻害剤は、Santa Cruz Biotechなどから入手可能である。
【００２８】
ある実施態様では、ＷＮＴシグナル阻害剤は、以下の式（Ｉ）の化合物またはその塩である：
式（Ｉ）：
【化１】
2018124210.tif 000002
［式中、
Ｒ１−Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖または分岐アルコキシ基；非置換またはハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基；または基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、または非置換またはハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１−Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖または分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルコキシ基（Ａは、非置換または炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換またはハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基；または基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、または非置換またはハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ１０−Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；または炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である、
Ｘは、−ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖または分岐アルコキシ基、非置換またはハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；または基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基、または炭素数１〜５の直鎖または分岐アシル基である）である、および
ｎは、０から６の整数である］。
【００２９】
ある実施態様では、式（Ｉ）中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１は水素原子であり、
Ｒ２及びＲ３は、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、またはプロポキシ基であり、
Ｒ７はハロゲン原子であり、
Ｘは、硫黄原子であり、そして、
ｎは、０から４の整数、特に、ｎは１から４の整数である。
【００３０】
ある実施態様では、ＷＮＴシグナル阻害剤は、
ＫＹ０２１１１
【化２】
2018124210.tif 000003
ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）
【化３】
2018124210.tif 000004
ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）
【化４】
2018124210.tif 000005
または、ＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）
【化５】
2018124210.tif 000006
から選択される化合物、特にＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）である。
【００３１】
ある実施態様では、工程（２）の培地が２種以上のＷＮＴシグナル阻害剤を含み、前記２種以上のＷＮＴシグナル阻害剤の１つは上記の式（Ｉ）の化合物のいずれかまたはその塩であり、他のＷＮＴシグナル阻害剤はＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１から選択される１種以上の化合物、特にＸＡＶ９３９である。
【００３２】
ある実施態様では、ＷＮＴシグナル活性化剤はＢＩＯまたはＣＨＩＲ９９０２１、特にＣＨＩＲ９９０２１である。
ある実施態様では、ＰＫＣ活性化剤は、ＰＭＡまたはプロストラチン、特にＰＭＡである。
ある実施態様では、Ｓｒｃ阻害剤は、Ａ４１９２５９またはＳＵ６６５６、特にＡ４１９２５９である。
ある実施態様では、ＥＧＦ受容体阻害剤は、ＡＧ１４７８またはゲフィチニブ、特にＡＧ１４７８である。
【００３３】
ある実施態様では、ＷＮＴシグナル活性化剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＰＫＣ活性化剤はＰＭＡであり、ＷＮＴシグナル阻害剤は、ＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）、およびＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）から選択される化合物並びにＸＡＶ９３９、特にＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）およびＸＡＶ９３９であり、Ｓｒｃ阻害剤はＡ４１９２５９であり、そして、ＥＧＦ受容体阻害剤はＡＧ１４７８である。
【００３４】
ある実施態様では、工程（１）および（２）において細胞を浮遊培養により培養する。ある実施態様では、工程（１）を１〜３日間実施し、次いで、工程（２）を、工程（１）の終了直後または工程（１）の終了の１〜２日後から、２〜１３日間、好ましくは３〜１０日間、より好ましくは４〜１０日間、さらに好ましくは４〜８日間、実施する。
【００３５】
ある実施態様では、多能性幹細胞から誘導された心筋細胞の少なくとも一部は、カルシウムセンサータンパク質の遺伝子を発現するものである。「カルシウムセンサータンパク質」は、細胞内カルシウム濃度の変化に応じて発光等のシグナルを発するタンパク質であれば特に限定されず、例えば、エクオリン、エクオリン−ＧＦＰ融合タンパク質などの発光タンパク質、または、Cameleon、ＦＩＰ−ＣＢＳＭ、ＴＮ−Ｌ１５、ＹＣ６.１、Ｆ２Ｃ、Camgaroo、Ｇ−ＣａＭＰ、Pericamなどの蛍光タンパク質が含まれる。ある実施態様では、カルシウムセンサータンパク質は、緑色蛍光タンパク（ＥＧＦＰ）、カルモジュリン（ＣａＭ）、ミオシン軽鎖フラグメント（Ｍ１３）を遺伝子工学的に結合させたカルシウムセンサータンパク質であるＧ−ＣａＭＰまたはその改変体、例えば、Ｇ−ＣａＭＰ、ＧＣａＭＰ１.６、ＧＣａＭＰ２、ＧＣａＭＰ３、ＧＣａＭＰ６ｆ、ＧＣａＭＰ６ｍ、ＧＣａＭＰ６ｓ、特にＧＣａＭＰ３である。
【００３６】
多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を、内側底部に凸部を有する培養容器中で培養すると、細胞が凸部の周囲に集合して環状心筋細胞塊を形成する。ある態様では、本願は、多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を、内側底部に凸部を有する培養容器中で培養する工程を含む、環状心筋細胞塊の製造方法を提供する。
【００３７】
「環状」とは、棒状の構造（横断面における最長の長さよりも長手方向の長さが長い構造）の両端が連結した環の形状であることを意味する。環は円形であっても、円形でなくてもよい。ある実施態様では、環は円形である。「環状心筋細胞塊」は、環状に集合した、心筋細胞を含む細胞塊を意味する。環状心筋細胞塊は、そのままの形態で使用してもよく、酵素（トリプシン、TryoLE TM Express、コラゲナーゼ、ディスパーゼ等）処理等により心筋細胞を分離させ、分離した心筋細胞として使用してもよい。環状心筋細胞塊または心筋細胞は、内側底部に凸部を有する培養容器に入れられていてもよく、そこから取り出されて別のいかなる容器に入れられていてもよい。環状心筋細胞塊または心筋細胞は、当業者に公知の方法で冷凍されて提供されても、冷凍せずに提供されてもよい。
【００３８】
多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を培養するための内側底部に凸部を有する培養容器は、その内側底部に少なくとも１個の凸部（本明細書において、ピラー部分またはピラーとも称する）を有するものであれば、いかなる培養容器であってもよい。培養容器の内側底部とは、培養容器の内側底面をなす部分であって、心筋細胞を受けて培養する側の面をなす部分を意味する。使用可能な例示的な培養容器の上面図および側面図を図１に示す。図１中、底部１および側壁部３を含む本体部分５と、底部１の内側表面（内側底部）に存在する凸部７とを含む培養容器１０が例示されている。
【００３９】
培養容器の内側底部に存在する凸部は、本体部分と一体となっていてもよく、別個であってもよい。別個の場合、本体部分に接着されていてもよく、本体部分に接着されず、載置されていてもよい。接着には、凸部の材質として例示されるポリマーや、市販の生体適合性粘着剤、例えばシリコーン接着剤を使用できる。
【００４０】
培養容器の本体部分は、一般的に細胞培養に使用される容器であればよく、特に限定されない。本体部分の形状は、シャーレ、プレート、ボトル、チャンバー、マルチウェルプレート（例えば、６、１２、２４、４８、９６、または３８４ウェルプレート）等であり得る。本体部分の材質は、特に限定されない。具体的には、金属、ガラス、およびシリコーン等の無機材料、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリテトラフルオロエチレン４フッ化エチレン樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。本体部分は細胞培養容器として一般的に販売されているものであってよく、あるいは、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、プラスチック材料からなる本体部分を製造する場合には、慣用の成形法、例えば射出成形により製造することができる。ある実施態様では、本体部分は、プラスチック製のシャーレまたはマルチウェルプレートである。
【００４１】
凸部の材質は、細胞培養に悪影響を及ぼさない物質であれば特に限定されない。例えば、上記の本体部分と同様のものから選択され得、本体部分の材質と同じであっても異なっていてもよい。また、凸部の材質は、上記の本体部分の材質に加え、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアミド（ＰＡ）およびポリメチルグルタルイミド（ＰＭＧＩ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレン酢酸ビニル（ＰＥＶＡ）、ポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）等のポリマーから選択され得るが、これらに限定されない。ある実施態様では、凸部の材質はＰＤＭＳである。
【００４２】
本体部分の内表面は、細胞接着性であっても、非細胞接着性であってもよい。本体部分の少なくとも内表面部分が細胞接着性または非細胞接着性を有する物質で構成されていればよい。本体部分の材質が細胞接着性または非細胞接着性の物質であってよく、また、本体部分の少なくとも内表面部分に細胞接着性または非細胞接着性を有する物質によるコーティングが施されていてもよい。ある実施態様では、本体部分の内表面は非細胞接着性である。
【００４３】
凸部の表面は、細胞接着性であっても、非細胞接着性であってもよい。凸部の少なくとも表面部分が細胞接着性または非細胞接着性を有する物質で構成されていればよい。凸部の材質が細胞接着性または非細胞接着性の物質であってよく、また、凸部の少なくとも表面部分に細胞接着性または非細胞接着性を有する物質によるコーティングが施されていてもよい。ある実施態様では、凸部の表面は非細胞接着性である。
【００４４】
コーティング用の非細胞接着性を有する物質としては、例えば、ＭＰＣポリマー、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース類；ポリエチレンオキサイド；カルボキシビニルポリマー；ポリビニルピロリドン；ポリエチレングリコール；ポリアクリルアミド、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド等のポリアミド；キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、デンプン、ペクチン、カラギーナン、グアーガム、アラビアゴム、デキストラン等の多糖類；アルブミンおよびこれらの誘導体などが挙げられる。
【００４５】
コーティング用の細胞接着性を有する物質としては、例えば、ポリＬ−リジンおよびポリＬ−オルニチンなどの正電荷ポリマー、マトリゲル（商標）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびコラーゲンなどの細胞外基質が挙げられる。
【００４６】
凸部の形状は、培養容器の内側底部に隣接する周状部分に環状心筋細胞塊が形成され得るものであれば、特に限定されず、例えば、円柱、楕円柱、角柱、円錐、楕円錐、角錐、円錐台、楕円錘台、角錐台等の形状、およびこれらの表面に凹凸のある形状が挙げられる。ある実施態様では、凸部は実質的に円柱である。凸部の断面は、代表的には培養容器の内側底部と同一平面上にある断面を意味し（以下同様とする）、いかなる幾何学的形状であってもよく、例えば、円、楕円、多角形が挙げられる。ある実施態様では、凸部の断面は実質的に円である。凸部は、中実であっても中空であってもよい。
【００４７】
凸部の寸法は、培養容器の内側底部に隣接する周状部分に環状心筋細胞塊が形成され得るものであれば、特に限定されない。凸部の寸法は、凸部の断面の寸法を意味し、例えば、断面が円である場合、その直径であり、その他の幾何学的形状である場合は、その断面積（凸部が中空である場合は、それを中実と見なした場合の断面積）と同面積の円の直径に相当する。凸部の寸法は、例えば、約０.１ｍｍ〜約１４５ｍｍ、約０.１ｍｍ〜約８０ｍｍ、約０.１ｍｍ〜約３０ｍｍ、約０.１ｍｍ〜約１０ｍｍ、約０.１ｍｍ〜約７ｍｍ、約０.５ｍｍ〜約７ｍｍ、約１ｍｍ〜約７ｍｍ、約１ｍｍ〜約５ｍｍ、または約２ｍｍ〜約４ｍｍ、例えば、約３ｍｍである。
【００４８】
あるいは、凸部の寸法は、例えば、環の内径が約０.１ｍｍ〜約１４５ｍｍ、約０.１ｍｍ〜約８０ｍｍ、約０.１ｍｍ〜約３０ｍｍ、約０.１ｍｍ〜約１０ｍｍ、約０.１ｍｍ〜約７ｍｍ、約０.５ｍｍ〜約７ｍｍ、約１ｍｍ〜約７ｍｍ、約１ｍｍ〜約５ｍｍ、または約２ｍｍ〜約４ｍｍ、例えば約３ｍｍである環状心筋細胞塊が形成され得るものである。この場合、環状心筋細胞塊の環の外径は、内径よりも約０.０１ｍｍ〜約１ｍｍまたは約０.１ｍｍ〜約０.５ｍｍ、例えば約０.３ｍｍ大きいものとなり得る。環状心筋細胞塊の直径、外径、内径は、環状心筋細胞塊を円形とみなした場合の直径、外径、内径を意味する。
【００４９】
凸部の周囲に外枠が配置されていてもよい。その場合、凸部と外枠の間に心筋細胞を播種し、培養する。外枠の材質は、培養容器の本体部分および凸部に準じて選択でき、本体部分または凸部と同じであっても異なっていてもよい。外枠は本体部分と一体となっていてもよく、別個であってもよい。別個の場合、外枠は本体部分に接着されていてよい。接着には、凸部の材質として例示したポリマーや、市販の生体適合性粘着剤、例えばシリコーン接着剤を使用できる。
【００５０】
外枠の内側は、凸部の周囲に外枠が存在できるものであれば、いかなる形状であってもよい。外枠の内側の寸法は、凸部と外枠との間に環状心筋細胞塊が形成されるのに十分な面積があるように選択され得る。例えば、凸部と外枠の内壁との間に、約０.１ｍｍ〜約１０ｍｍ、約１ｍｍ〜約９ｍｍ、または約４ｍｍ〜約６ｍｍ、例えば、約５ｍｍの距離があるように構成され得る。外枠の外側の形状および寸法は、培養容器の本体部分に収まるものであれば、特に限定されない。外枠は、１個の培養容器にいくつ存在してもよい。ある実施態様では、１個の培養容器に１個の凸部および１個の外枠が存在する。ある実施態様では、１個の培養容器に複数の凸部が存在し、各凸部の周囲に各１個の外枠が存在する。
【００５１】
ある実施態様では、培養容器は外枠を含まない。その場合、培養容器の側壁部の形状と寸法は、凸部と側壁部との間に環状心筋細胞塊が形成されるのに十分な面積があるように選択され得る。例えば、凸部と側壁部との間に、約０.１ｍｍ〜約１０ｍｍ、約１ｍｍ〜約９ｍｍ、または約４ｍｍ〜約６ｍｍ、例えば、約５ｍｍの距離があるように構成され得る。
【００５２】
凸部の高さは、本体部分のサイズ等に応じて適宜定めればよく、例えば、約０.１ｍｍ〜約１０ｍｍ、０.１ｍｍ〜約５ｍｍ、約１ｍｍ〜約５ｍｍ、約３ｍｍ〜約５ｍｍ、例えば、約４ｍｍである。外枠の高さは、外枠の内部に培養液を満たすのに十分なものであればよく、本体部分のサイズ等に応じて適宜定められ、特に限定されない。外枠の高さは、凸部の高さと同じであっても異なっていてもよい。
【００５３】
ある態様では、内側底部に凸部を有する、多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を培養するための培養容器が提供される。この態様において、培養容器の詳細は上記の通りである。培養容器はさらに上記の外枠を含んでもよい。
【００５４】
環状心筋細胞塊の製造に用いる培養培地、培養方法および培養条件は、一般的に心筋細胞の培養に使用されるものであればよく、特に限定されない。上記の方法に用いる培地としては、例えば、ＩＭＤＭ、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１％ペニシリン・ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０.００１％２−メルカプトエタノール、０.００５Ｎ ＮａＯＨを含む培地が例示される。
【００５５】
培養方法としては、例えば、浮遊培養法、接着培養法、懸濁培養法等が挙げられる。ある実施態様において、浮遊培養法で心筋細胞を培養する。培養する心筋細胞の数は、培養方法、培養容器の本体部分および凸部の大きさ、細胞の種類等によって適宜決定され、例えば約１×１０２個〜約１×１０７個または約１×１０５個〜約１×１０６個であり得る。ある実施態様では、凸部の寸法１ｍｍにつき、約０.５×１０５個〜２.０×１０５個、約１.０×１０５個〜１.５×１０５個、例えば約１.３×１０５個の心筋細胞を培養し得る。例えば、凸部の寸法が１ｍｍである場合、約０.５×１０５個〜２.０×１０５個、約１.０×１０５個〜１.５×１０５個、例えば約１.３×１０５個の心筋細胞を培養し得、凸部の寸法が３ｍｍである場合、約１.５×１０５個〜約６.０×１０５個または約３.０×１０５個〜約４.５×１０５個、例えば４.０×１０５個の心筋細胞を培養し得、凸部の寸法が５ｍｍである場合、約２.５×１０５個〜１.０×１０６個、約５.０×１０５個〜７.５×１０５個、例えば約６.７×１０５個の心筋細胞を培養し得る。同様に、培養する心筋細胞の密度は、培養方法、培養容器の本体部分および凸部の大きさ、細胞の種類等によって適宜決定され、例えば約２×１０５個〜約２×１０７個／ｍｌ、約５×１０５個〜約８×１０６個／ｍｌであり得る。培地の交換は、例えば、１〜７日に１回、例えば４日、３日または２日に１回、行えばよい。培養の期間は、環状心筋細胞塊が形成されるのに十分な期間であればよく、例えば、０.５日間〜３ヵ月間、１日間〜２１日間、２日間〜１４日間、５日間〜１０日間、または６日間〜８日間であり得る。
【００５６】
上記の方法で形成される環状心筋細胞塊には、電気信号またはカルシウム信号が細胞塊内を循環して進行する現象（進行波）が見られることがある。「電気信号」とは、心筋細胞の膜電位の変化を意味する。「カルシウム信号」とは、心筋細胞のＣａ２＋振動を意味する。電気信号およびカルシウム信号は、環状心筋細胞塊内で一定の方向に進行することにより、細胞塊内を循環する。ある実施態様では、電気信号、カルシウム信号および心筋の拍動は、同様のパターンを示す。進行波は、１つの場合もあり（即ち、１つの電気信号またはカルシウム信号が環状心筋細胞塊内を循環して進行する）、２つ、３つまたはそれ以上の場合もあり、培養中にその数が変動（例えば、減少）することもある。理論により限定されないが、進行波が発生すると、環状心筋細胞塊に含まれる心筋細胞が生体の心臓において認められるものと類似した配向構造をとり、心筋細胞の成熟度が上昇する傾向が見られる。また、進行波の数が多いほど、心筋細胞の配向性と成熟度は高い傾向が見られる。従って、成熟度の高い心筋細胞を簡便な操作で得ることができる。
【００５７】
少なくとも１つの進行波が見られる環状心筋細胞塊を選択する。本願に関して、少なくとも１つの進行波が見られる環状心筋細胞塊には、少なくとも１つの進行波が見られる間に冷凍された環状心筋細胞塊が含まれる。
【００５８】
ある実施態様では、１つの進行波が見られる環状心筋細胞塊に含まれる心筋細胞では、心筋細胞の成熟度を示す心筋細胞特異的マーカーであるβ−ＭＨＣの発現量は、成体の正常心筋細胞の約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上または約３０％以上である。例えば、当該発現量は、成体の正常心筋細胞の約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上または約３０％以上であり、かつ、約６０％以下、約７０％以下、約８０％以下、約９０％以下または約１００％以下である。また、少なくとも１つの進行波が見られる環状心筋細胞塊の電位活動を多電極アレイで調べたところ、生体の心臓の電気活動を測定した心電図で見られるＱＴ波形に相当するＦＰＤ（Field Potential Duration）波形が確認され、従来法で培養された心筋細胞よりも不整脈の発生が少ないことが確認された。
【００５９】
心筋細胞の成熟度を高めるために電気的または機械的刺激を与えることが当分野で知られており、上記の方法でもそのような工程を実施してもよいが、実施する必要はない。ある実施態様では、心筋細胞または環状心筋細胞塊に生理的心拍数と同等の頻度で電気的または機械的刺激を与えない。ある実施態様では、心筋細胞または環状心筋細胞塊にいかなる電気的刺激も機械的刺激も与えない。
【００６０】
ある実施態様では、環状心筋細胞塊の電気信号を検出してもよい。電気信号を検出することにより、環状心筋細胞塊における心筋細胞の機能および成熟度を評価することができる。
【００６１】
電気信号は、例えば、環状心筋細胞塊を多電極アレイと接触させることにより、検出し得る。多電極アレイは、基板上に微小電極が多数、例えば１個〜３８４個、例えば６４個または９６個配された電極を意味する。培養細胞の細胞外電位を測定できる多電極アレイ（Multiple electrode array：MEA）システムとしては、例えばMulti-channel system MCS GmbH社（ドイツ）のマルチ電極アレイシステムやアルファメッドサイエンティフィック社のＭＥＤシステムなどが市販されている。多電極アレイシステムとは基板上に配した多数の微小電極により複数の細胞からの電気信号を同時に観測し、あるいは細胞や組織へ電気的に刺激を与えて刺激に対する細胞の応答を観測することができるシステムである。多電極アレイシステムを用いることにより、細胞に損傷を与えることなく、細胞の機能を評価することができる。具体的には、多電極アレイシステムによって、活動電位波形を測定し、電気信号を検出可能なチャネルの数、心拍数、電位振幅、ＦＰＤ、不整脈の有無などに基づいて心筋細胞の機能を評価することができる。
【００６２】
環状心筋細胞塊は、ピンセット等により容易に培養容器から取り出すことができ、多電極アレイと接触させることによって、電気信号を測定することができる。または、環状心筋細胞塊の少なくとも一部が多電極アレイ上に形成されるように多電極アレイと凸部を配置した培養容器で心筋細胞を培養することにより、環状心筋細胞塊の電気信号を測定してもよい。
【００６３】
ある実施態様では、環状心筋細胞塊のカルシウム信号を検出してもよい。カルシウム信号は、心筋細胞の細胞内カルシウム濃度の変化として検出できる。カルシウム信号を解析することにより、環状心筋細胞塊における心筋細胞の機能および成熟度を評価することができる。
【００６４】
Ｃａ２＋振動は、標準的な方法により、例えば、カルシウム感受性染料などのカルシウム検出試薬を用いて検出され得る。例えば、細胞内Ｃａ２＋イオン検出染料を含む培地で心筋細胞を培養し、細胞内カルシウムレベルの変化を測定する。細胞内Ｃａ２＋イオン検出染料の例には、ｆｕｒａ−２、ｂｉｓ−ｆｕｒａ２、ｉｎｄｏ−１、Ｑｕｉｎ−２、Ｑｕｉｎ−２ＡＭ、ベンゾチアザ−１、ベンゾチアザ−２、ｉｎｄｏ−５Ｆ、Ｆｕｒａ−ＦＦ、ＢＴＣ、Ｍａｇ−Ｆｕｒａ−２、Ｍａｇ−Ｆｕｒａ−５、Ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１、ｆｌｕｏ−３、ｒｈｏｄ−２、ｒｈｏｄ−３、ｆｕｒａ−４Ｆ、ｆｕｒａ−５Ｆ、ｆｕｒａ−６Ｆ、ｆｌｕｏ−４、ｆｌｕｏ−５Ｆ、ｆｌｕｏ−５Ｎ、オレゴングリーン４８８ ＢＡＰＴＡ、カルシウムグリーン、カルセイン、Ｆｕｒａ−Ｃ１８、カルシウムグリーン−Ｃ１８、カルシウムオレンジ、カルシウムクリムゾン、カルシウムグリーン−５Ｎ、マグネシウムグリーン、オレゴングリーン４８８ ＢＡＰＴＡ−１、オレゴングリーン４８８ ＢＡＰＴＡ−２、Ｘ−ｒｈｏｄ−１、Ｆｕｒａレッド、Ｒｈｏｄ−５Ｆ、Ｒｈｏｄ−５Ｎ、Ｘ−Ｒｈｏｄ−５Ｎ、Ｍａｇ−Ｒｈｏｄ−２、Ｍａｇ−Ｘ−Ｒｈｏｄ−１、Ｆｌｕｏ−５Ｎ、Ｆｌｕｏ−５Ｆ、Ｆｌｕｏ−４ＦＦ、Ｍａｇ−Ｆｌｕｏ−４、エクオリン、デキストラン抱合体、またはこれらの染料の誘導体が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、環状心筋細胞塊の少なくとも一部が上述のカルシウムセンサータンパク質の遺伝子を発現する場合は、細胞内Ｃａ２＋イオン検出染料を使用しなくても、Ｃａ２＋振動を検出し得る。ここで、環状心筋細胞塊は、カルシウムセンサータンパク質の遺伝子を発現する心筋細胞を、Ｃａ２＋振動を検出し得る数または割合で含み得る。
【００６５】
細胞内Ｃａ２＋イオン検出染料またはカルシウムセンサータンパク質の蛍光強度または発光量は、例えば、ＣＣＤカメラ、ルミノメーター、または、任意の他の好適な光学システムを使用して測定できる。利用可能な市販の光学システムとしては、例えば、Qimaging(Exiblue)などが挙げられる。Ｃａ２＋振動の解析には、ImageJ、Matlab等のソフトウェアを使用し得る。
【００６６】
ある実施態様では、心筋細胞の拍動、即ち、自発的収縮を検出してもよい。心筋細胞の拍動は、標準的な電気生理学的方法（例えばパッチクランプ）により検出し得る。
【００６７】
ある実施態様では、心筋細胞における心筋細胞特異的マーカーの発現を検出してもよい。マーカーの発現を解析することにより、心筋細胞の機能および成熟度を評価することができる。ある実施態様では、上記の方法は、心筋細胞特異的マーカーの発現が高い心筋細胞を含む環状心筋細胞塊を選択する工程をさらに含む。
【００６８】
心筋細胞特異的マーカーとしては、例えば、α−ＭＨＣ、β−ＭＨＣ、ＡＣＴＮ２、ＭＹＨ７、ＳＬＣ８Ａ１、ＭＹＬ２、ＴＮＮＩ３、ＣＫＭ、ＭＹＬ３、ＴＮＮＴ２、ＤＥＳ、ＭＹＬ７、ＮＡＴ１、ＧＡＴＡ４、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＮＰＰＡ、ＫＣＮＱ１、ＰＬＮ、ＭＢ、ＲＹＲ２およびＰＰＣが例示される。心筋細胞特異的マーカーの発現は、従来の生化学法または免疫化学法（例えば酵素結合免疫吸着測定法、免疫組織化学的アッセイ等）により検出され得る。あるいは、心筋細胞特異的マーカーをコードする核酸の発現が評価され得る。心筋細胞特異的マーカーをコードする核酸の発現は、ｍＲＮＡを増幅、検出、および分析するために、過去に一般的に使用されてきた分子生物学的方法（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）またはハイブリダイゼーション分析など）により確認され得る。心筋細胞特異的マーカーをコードする核酸配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋ等の公共のデータベースを通して利用可能であり、よって、プライマーまたはプローブとして使用されるマーカー特異的配列は容易に決定される。
【００６９】
ある態様では、本願は、医薬候補物質の心毒性を評価する方法を提供する。この方法は、以下の各段階を含む；
（１）上記の環状心筋細胞塊を、候補物質と接触させること、
（２）候補物質と接触させた環状心筋細胞塊の電気信号またはカルシウム信号を検出すること、および、
（３）段階（２）で検出された電気信号またはカルシウム信号を、対照の電気信号またはカルシウム信号と比較すること。
【００７０】
段階（１）では、例えば、環状心筋細胞塊の培養培地に候補物質を添加することにより、環状心筋細胞塊を候補物質と接触させる。候補物質には、全ての領域の医薬品の有効成分の候補物質が含まれる。段階（２）では、上記の電気信号またはカルシウム信号の検出方法により、候補物質と接触させた環状心筋細胞塊の電気信号またはカルシウム信号を検出する。段階（３）における対照は、候補物質と接触させる前の環状心筋細胞塊であってもよく、候補物質と接触させていない環状心筋細胞塊であってもよい。あるいは、対照は、心毒性がないことがわかっている物質、または、許容され得る心毒性を有する物質と接触させた環状心筋細胞塊であってもよい。段階（３）の結果、候補物質と接触させた環状心筋細胞塊の電気信号またはカルシウム信号が、対照の電気信号またはカルシウム信号と有意に異なる場合に、医薬候補物質は心毒性を有すると判定される。さらに、アッセイ系の有効性を裏付けるために、心筋拍動頻度を減少または増加させる物質またはＱＴ間隔を延長または短縮させる物質と接触させた環状心筋細胞塊を、正の対照として使用できる。
【００７１】
ある態様では、本願は、心疾患の処置剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、以下の各段階を含む；
（１）上記の環状心筋細胞塊を、候補物質と接触させること、
（２）候補物質と接触させた環状心筋細胞塊の電気信号またはカルシウム信号を検出すること、および、
（３）段階（２）で検出された電気信号またはカルシウム信号を、対照の電気信号またはカルシウム信号と比較すること。
【００７２】
本願に関して、「心疾患」とは、不整脈または不整脈を伴う循環器系の疾患を意味する。不整脈には、頻脈性不整脈および徐脈性不整脈が含まれる。段階（１）では、例えば、環状心筋細胞塊の培養培地に候補物質を添加することにより、環状心筋細胞塊を候補物質と接触させる。候補物質には、心疾患の処置効果を期待される物質、例えば、心筋拍動頻度またはＱＴ間隔を制御すると期待される物質が含まれる。工程（１）の前に心筋拍動頻度を減少または増加させる物質またはＱＴ間隔を延長または短縮させる物質と環状心筋細胞塊を接触させ、不整脈を生じさせる処理を行ってもよい。段階（２）では、上記の電気信号またはカルシウム信号の検出方法により、候補物質と接触させた環状心筋細胞塊の電気信号またはカルシウム信号を検出する。段階（３）における対照は、候補物質と接触させる前の環状心筋細胞塊であってもよく、候補物質と接触させていない環状心筋細胞塊であってもよい（負の対照）。あるいは、対照は、心筋拍動頻度を減少または増加させる物質またはＱＴ間隔を延長または短縮させる物質と接触させた環状心筋細胞塊であってもよい（正の対照）。必要であれば、対照の環状心筋細胞塊に、試験する環状心筋細胞塊と同様の不整脈を生じさせる処理を行ってもよい。
【００７３】
段階（３）の結果、候補物質と接触させた環状心筋細胞塊の電気信号またはカルシウム信号が、負の対照の電気信号またはカルシウム信号と有意に異なる場合に、あるいは、正の対照の電気信号またはカルシウム信号と同様の傾向を示す場合に、候補物質は心疾患の処置に使用し得ると判定される。
【００７４】
上記の医薬候補物質の心毒性を評価する方法または心疾患の処置剤をスクリーニングする方法において使用する、心筋拍動頻度を減少させる物質としては、例えば、イソプロテレノールなどのアドレナリン作動薬が挙げられる。心筋拍動頻度を増加させる物質としては、例えば、プロプラノロールなどのβ遮断薬が挙げられる。ＱＴ間隔を延長させる物質としては、Ｅ−４０３１などのＨＥＲＧチャネル阻害剤が挙げられる。
【００７５】
上記の医薬候補物質の心毒性を評価する方法または心疾患の処置剤をスクリーニングする方法のある実施態様では、カルシウムセンサータンパク質を発現する環状心筋細胞塊を使用して、カルシウム信号を検出する。この実施態様では、特別な検出試薬や電極を使用せずに上記の方法を実施できる。別の態様では、環状心筋細胞塊の電気信号を多電極アレイにより検出する。
【００７６】
本願は、また、上記の環状心筋細胞塊を含む、上記の医薬候補物質の心毒性を評価する方法または心疾患の処置剤をスクリーニングする方法を実施するためのキットを提供する。キットは、さらに、培養培地、対照物質、カルシウム検出試薬、多電極アレイ、キットの使用説明書等を含んでもよい。
【００７７】
例えば、本願は下記の実施態様を提供する。
［１］多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を含む環状心筋細胞塊であって、少なくとも１つの電気信号またはカルシウム信号が環状心筋細胞塊内を循環して進行している、環状心筋細胞塊。
［２］心筋細胞が、（１）多能性幹細胞をＷＮＴシグナル活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を含む培地中で培養する工程、および；（２）工程（１）で得られた細胞をＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養する工程を含む方法により、多能性幹細胞から誘導されたものである、第１項に記載の環状心筋細胞塊。
［３］ＷＮＴシグナル阻害剤が式（Ｉ）の化合物またはその塩であって、式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素原子であり、
Ｒ２及びＲ３が、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、またはプロポキシ基であり、
Ｒ７がハロゲン原子であり、
Ｘが、硫黄原子であり、そして、
ｎが、０から４の整数である、
第２項に記載の環状心筋細胞塊。
［４］ｎが１から４の整数である、第３項に記載の環状心筋細胞塊。
［５］ＷＮＴシグナル阻害剤が、ＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）、および、ＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）から選択される化合物である、第２項ないし第４項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［６］ＷＮＴシグナル阻害剤がＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）である、第２項ないし第５項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［７］工程（２）の培地が２種以上のＷＮＴシグナル阻害剤を含み、前記２種以上のＷＮＴシグナル阻害剤の１つが第３項ないし第６項のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩であり、他のＷＮＴシグナル阻害剤がＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１から選択される１種以上の化合物である、第２項ないし第６項のいずれかに記載の方法。
［８］２種以上のＷＮＴシグナル阻害剤が第３項ないし第６項のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物のいずれかまたはその塩およびＸＡＶ９３９である、第７項に記載の方法。
［９］ＷＮＴシグナル活性化剤がＢＩＯまたはＣＨＩＲ９９０２１である、第２項ないし第８項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［１０］ＷＮＴシグナル活性化剤がＣＨＩＲ９９０２１である、第２項ないし第９項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［１１］ＰＫＣ活性化剤がＰＭＡまたはプロストラチンである、第２項ないし第１０項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［１２］ＰＫＣ活性化剤がＰＭＡである、第２項ないし第１１項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［１３］Ｓｒｃ阻害剤がＡ４１９２５９またはＳＵ６６５６である、第２項ないし第１２項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［１４］Ｓｒｃ阻害剤がＡ４１９２５９である、第２項ないし第１３項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［１５］ＥＧＦ受容体阻害剤がＡＧ１４７８またはゲフィチニブである、第２項ないし第１４項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［１６］ＥＧＦ受容体阻害剤がＡＧ１４７８である、第２項ないし第１５項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［１７］ＷＮＴシグナル活性化剤がＣＨＩＲ９９０２１であり、ＰＫＣ活性化剤がＰＭＡであり、ＷＮＴシグナル阻害剤が、ＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）、およびＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）から選択される化合物並びにＸＡＶ９３９であり、Ｓｒｃ阻害剤がＡ４１９２５９であり、そして、ＥＧＦ受容体阻害剤がＡＧ１４７８である、第２項ないし第１６項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［１８］ＷＮＴシグナル阻害剤がＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）およびＸＡＶ９３９である、第１７項に記載の環状心筋細胞塊。
［１９］工程（１）および（２）において細胞を浮遊培養により培養する、第２項ないし第１８項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［２０］工程（１）が１〜３日間であり、工程（２）が２〜１３日間である、第２項ないし第１９項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
【００７８】
［２１］多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、第１項ないし第２０項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［２２］多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、第１項ないし第２１項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［２３］心筋細胞の少なくとも一部がカルシウムセンサータンパク質の遺伝子を発現する、第１項ないし第２２項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［２４］環状心筋細胞塊における心筋細胞特異的マーカーの発現が高い、第１項ないし第２３項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［２５］心筋細胞特異的マーカーがα−ＭＨＣ、β−ＭＨＣ、ＡＣＴＮ２、ＭＹＨ７、ＳＬＣ８Ａ１、ＭＹＬ２、ＴＮＮＩ３、ＣＫＭ、ＭＹＬ３、ＴＮＮＴ２、ＤＥＳ、ＭＹＬ７、ＮＡＴ１、ＧＡＴＡ４、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＮＰＰＡ、ＫＣＮＱ１、ＰＬＮ、ＭＢ、ＲＹＲ２およびＰＰＣからなる群から選択される、第２４項に記載の環状心筋細胞塊。
［２６］心筋細胞特異的マーカーがβ−ＭＨＣである、第２４項または第２５項に記載の環状心筋細胞塊。
［２７］環状心筋細胞塊におけるβ−ＭＨＣの発現量が、成体の正常心筋細胞の約１０％以上である、第１項ないし第２６項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［２８］環状心筋細胞塊におけるβ−ＭＨＣの発現量が、成体の正常心筋細胞の約３０％以上である、第１項ないし第２７項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［２９］内径が約０.１ｍｍ〜約１４５ｍｍである、第１項ないし第２８項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［３０］内径が約０.１ｍｍ〜約８０ｍｍである、第１項ないし第２９項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［３１］内径が約０.１ｍｍ〜約３０ｍｍである、第１項ないし第３０項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［３２］内径が約０.１ｍｍ〜約１０ｍｍである、第１項ないし第３１項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［３３］内径が約０.１ｍｍ〜約７ｍｍである、第１項ないし第３２項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［３４］内径が約０.５ｍｍ〜約７ｍｍである、第１項ないし第３３項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［３５］内径が約１ｍｍ〜約７ｍｍである、第１項ないし第３４項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［３６］内径が約１ｍｍ〜約５ｍｍである、第１項ないし第３５項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［３７］内径が約２ｍｍ〜約４ｍｍである、第１項ないし第３６項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［３８］内径が約３ｍｍである、第１項ないし第３７項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［３９］外径が内径よりも約０.０１ｍｍ〜約１ｍｍ大きい、第１項ないし第３８項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［４０］外径が内径よりも約０.１ｍｍ〜約０.５ｍｍ大きい、第１項ないし第３９項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［４１］外径が内径よりも約０.３ｍｍ大きい、第１項ないし第４０項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［４２］約１×１０２個〜約１×１０７個の心筋細胞を含む、第１項ないし第４１項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［４３］約１×１０５個〜約１×１０６個の心筋細胞を含む、第１項ないし第４２項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［４４］約３×１０５個〜約５×１０５個の心筋細胞を含む、第１項ないし第４３項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［４５］内径１ｍｍにつき、約０.５×１０５個〜２.０×１０５個の心筋細胞を含む、第１項ないし第４４項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［４６］内径１ｍｍにつき、約１.０×１０５個〜１.５×１０５個の心筋細胞を含む、第１項ないし第４５項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［４７］内径１ｍｍにつき、約１.３×１０５個の心筋細胞を含む、第１項ないし第４６項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［４８］冷凍されている、第１項ないし第４７項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［４９］冷凍されていない、第１項ないし第４７項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
［５０］多能性幹細胞がヒトの細胞である、第１項ないし第４９項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊。
【００７９】
［５１］多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を、内側底部に凸部を有する培養容器中で培養する工程を含む、第１項ないし第５０項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊の製造方法。
［５２］凸部の寸法１ｍｍにつき、約０.５×１０５個〜２.０×１０５個の心筋細胞を培養する、第５１項に記載の方法。
［５３］凸部の寸法１ｍｍにつき、約１.０×１０５個〜１.５×１０５個の心筋細胞を培養する、第５１項または第５２項に記載の方法。
［５４］凸部の寸法１ｍｍにつき、約１.３×１０５個の心筋細胞を培養する、第５１項ないし第５３項のいずれかに記載の方法。
［５５］約２×１０５個〜約２×１０７個／ｍｌの密度で心筋細胞を培養する、第５１項ないし第５４項のいずれかに記載の方法。
［５６］約５×１０５個〜約８×１０６個／ｍｌの密度で心筋細胞を培養する、第５１項ないし第５５項のいずれかに記載の方法。
［５７］心筋細胞を０.５日間〜３ヵ月間培養する、第５１項ないし第５６項のいずれかに記載の方法。
［５８］心筋細胞を１日間〜２１日間培養する、第５１項ないし第５７項のいずれかに記載の方法。
［５９］心筋細胞を２日間〜１４日間培養する、第５１項ないし第５８項のいずれかに記載の方法。
［６０］心筋細胞を５日間〜１０日間培養する、第５１項ないし第５９項のいずれかに記載の方法。
［６１］心筋細胞を６日間〜８日間培養する、第５１項ないし第６０項のいずれかに記載の方法。
［６２］心筋細胞に生理的心拍数と同等の頻度で電気的または機械的刺激を与えないことを特徴とする、第５１項ないし第６１項のいずれかに記載の方法。
［６３］心筋細胞に電気的または機械的刺激を与えないことを特徴とする、第５１項ないし第６２項のいずれかに記載の方法。
［６４］心筋細胞に電気的刺激を与えないことを特徴とする、第５１項ないし第６３項のいずれかに記載の方法。
［６５］環状心筋細胞塊の電気信号を検出する工程をさらに含む、第５１項ないし第６４項のいずれかに記載の方法。
［６６］環状心筋細胞塊のカルシウム信号を検出する工程をさらに含む、第５１項ないし第６５項のいずれかに記載の方法。
［６７］心筋細胞の自発的収縮を検出する工程をさらに含む、第５１項ないし第６６項のいずれかに記載の方法。
［６８］環状心筋細胞塊における心筋細胞特異的マーカーの発現を検出する工程をさらに含む、第５１項ないし第６７項のいずれかに記載の方法。
［６９］心筋細胞特異的マーカーの発現が高い環状心筋細胞塊を選択する工程をさらに含む、第６８項に記載の方法。
［７０］少なくとも１つの電気信号またはカルシウム信号が環状心筋細胞塊内を循環して進行している環状心筋細胞塊を選択する工程を含む、第５１項ないし第６９項のいずれかに記載の方法。
【００８０】
［７１］内側底部に凸部を有する、多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を培養するための培養容器。
［７２］凸部の寸法が約０.１ｍｍ〜約１４５ｍｍである、第５１項ないし第７１項のいずれかに記載の方法または培養容器。
［７３］凸部の寸法が約０.１ｍｍ〜約８０ｍｍである、第５１項ないし第７２項のいずれかに記載の方法または培養容器。
［７４］凸部の寸法が約０.１ｍｍ〜約３０ｍｍである、第５１項ないし第７３項のいずれかに記載の方法または培養容器。
［７５］凸部の寸法が約０.１ｍｍ〜約１０ｍｍである、第５１項ないし第７４項のいずれかに記載の方法または培養容器。
［７６］凸部の寸法が約０.１ｍｍ〜約７ｍｍである、第５１項ないし第７５項のいずれかに記載の方法または培養容器。
［７７］凸部の寸法が約０.５ｍｍ〜約７ｍｍである、第５１項ないし第７６項のいずれかに記載の方法または培養容器。
［７８］凸部の寸法が約１ｍｍ〜約７ｍｍである、第５１項ないし第７７項のいずれかに記載の方法または培養容器。
［７９］凸部の寸法が約１ｍｍ〜約５ｍｍである、第５１項ないし第７８項のいずれかに記載の方法または培養容器。
［８０］凸部の寸法が約２ｍｍ〜約４ｍｍである、第５１項ないし第７９項のいずれかに記載の方法または培養容器。
［８１］凸部の寸法が約３ｍｍである、第５１項ないし第８０項のいずれかに記載の方法または培養容器。
［８２］凸部の断面が実質的に円である、第５１項ないし第８１項のいずれかに記載の方法または培養容器。
［８３］凸部が実質的に円柱である、第５１項ないし第８２項のいずれかに記載の方法または培養容器。
［８４］培養容器の本体部分の内表面が非細胞接着性である、第５１項ないし第８３項のいずれかに記載の方法または培養容器。
［８５］凸部の表面が細胞非接着性である、第５１項ないし第８４項のいずれかに記載の方法または培養容器。
［８６］凸部の材質がＰＤＭＳである、第５１項ないし第８５項のいずれかに記載の方法または培養容器。
［８７］凸部の周囲に外枠が配置されている、第５１項ないし第８６項のいずれかに記載の方法または培養容器。
［８８］第５１項ないし第８７項のいずれかに記載の方法により製造された環状心筋細胞塊。
【００８１】
［８９］医薬候補物質の心毒性を評価する方法であって、
（１）第１項ないし第５０項および第８８項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊を、候補物質と接触させること、
（２）候補物質と接触させた環状心筋細胞塊の電気信号を検出すること、および、
（３）段階（２）で検出された電気信号を、対照の電気信号と比較すること、
の各段階を含む、方法。
［９０］対照が、候補物質と接触させる前の環状心筋細胞塊、候補物質と接触させていない環状心筋細胞塊、または、心毒性がないことがわかっている物質、もしくは、許容され得る心毒性を有する物質と接触させた環状心筋細胞塊である、第８９項に記載の方法。
［９１］候補物質と接触させた環状心筋細胞塊の電気信号が、対照の電気信号と有意に異なる場合に、医薬候補物質は心毒性を有すると判定することをさらに含む、第８９項または第９０項に記載の方法。
［９２］医薬候補物質の心毒性を評価する方法であって、
（１）第１項ないし第５０項および第８８項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊を、候補物質と接触させること、
（２）候補物質と接触させた環状心筋細胞塊のカルシウム信号を検出すること、および、
（３）段階（２）で検出されたカルシウム信号を、対照のカルシウム信号と比較すること、
の各段階を含む、方法。
［９３］対照が、候補物質と接触させる前の環状心筋細胞塊、候補物質と接触させていない環状心筋細胞塊、または、心毒性がないことがわかっている物質、もしくは、許容され得る心毒性を有する物質と接触させた環状心筋細胞塊である、第９２項に記載の方法。
［９４］候補物質と接触させた環状心筋細胞塊のカルシウム信号が、対照のカルシウム信号と有意に異なる場合に、医薬候補物質は心毒性を有すると判定することをさらに含む、第９２項または第９３項に記載の方法。
［９５］第１項ないし第５０項および第８８項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊を含む、医薬候補物質の心毒性を評価するためのキット。
【００８２】
［９６］心疾患の処置剤をスクリーニングする方法であって、
（１）第１項ないし第５０項および第８８項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊を、候補物質と接触させること、
（２）候補物質と接触させた環状心筋細胞塊の電気信号を検出すること、および、
（３）段階（２）で検出された電気信号を、対照の電気信号と比較すること、
の各段階を含む、方法。
［９７］対照が、候補物質と接触させる前の環状心筋細胞塊または候補物質と接触させていない環状心筋細胞塊である、第９６項に記載の方法。
［９８］候補物質と接触させた環状心筋細胞塊の電気信号が、対照の電気信号と有意に異なる場合に、候補物質は心疾患の処置に使用し得ると判定することをさらに含む、第９７項に記載の方法。
［９９］対照が、心筋拍動頻度を減少または増加させる物質またはＱＴ間隔を延長または短縮させる物質と接触させた環状心筋細胞塊である、第９６項に記載の方法。
［１００］候補物質と接触させた環状心筋細胞塊の電気信号が、対照の電気信号と同様の傾向を示す場合に、候補物質は心疾患の処置に使用し得ると判定することをさらに含む、第９９項に記載の方法。
［１０１］心疾患の処置剤をスクリーニングする方法であって、
（１）第１項ないし第５０項および第８８項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊を、候補物質と接触させること、
（２）候補物質と接触させた環状心筋細胞塊のカルシウム信号を検出すること、および、
（３）段階（２）で検出されたカルシウム信号を、対照のカルシウム信号と比較すること、
の各段階を含む、方法。
［１０２］対照が、候補物質と接触させる前の環状心筋細胞塊または候補物質と接触させていない環状心筋細胞塊である、第１０１項に記載の方法。
［１０３］候補物質と接触させた環状心筋細胞塊のカルシウム信号が、対照のカルシウム信号と有意に異なる場合に、候補物質は心疾患の処置に使用し得ると判定することをさらに含む、第１０２項に記載の方法。
［１０４］対照が、心筋拍動頻度を減少または増加させる物質またはＱＴ間隔を延長または短縮させる物質と接触させた環状心筋細胞塊である、第１０１項に記載の方法。
［１０５］候補物質と接触させた環状心筋細胞塊のカルシウム信号が、対照のカルシウム信号と同様の傾向を示す場合に、候補物質は心疾患の処置に使用し得ると判定することをさらに含む、第１０４項に記載の方法。
［１０６］第１項ないし第５０項および第８８項のいずれかに記載の環状心筋細胞塊を含む、心疾患の処置剤をスクリーニングするためのキット。
【００８３】
本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、発明を説明するためだけに供されるものである。
【実施例１】
【００８４】
培養容器の作製
厚さ４ｍｍのＰＤＭＳ（SYLGARD（登録商標） 184, Dow Corning）シートを、Tissue puncher（Fisher Scientific）を用いて直径３ｍｍの円形に切り抜き、ピラーを作製した。１０ｍｍ×１０ｍｍ×４ｍｍのＰＤＭＳシートに、Tissue puncherで直径８ｍｍの円形の穴を開け、外枠とした。ピラーの片面にシリコーン接着剤（一液縮合型ＲＶＴゴム（透明）（信越シリコーン））を付け、非細胞接着性培養シャーレ（Ultra-low attachment plate (Corning)）の中央に接着した。同様に、ピラーの周囲に外枠を接着した。一晩乾燥させた後、３０分間のＵＶ照射により滅菌した。この培養容器の写真と模式図を図２に示す。
【実施例２】
【００８５】
環状心筋細胞塊の形成
国際公開第２０１５／１８２７６５号（特許文献２）に記載の方法により、多能性幹細胞から心筋細胞を誘導した。簡潔に述べると、Ｃａ２＋センサー（ＧＣａＭＰ３強制発現）を持つｈｉＰＳＣ株（Y. Shiba et. al., Nature, 2012）の浮遊コロニー（Minami, I. et al., Cell reports 2, 1448-1460 (2012) および国際公開第２０１３／１１１８７５号パンフレットに記載の方法により調製）（これら文献は引用により本明細書に含まれる）を、心筋分化前期（ｄａｙ０−２）において、ＧＳＫ３β阻害剤（２μＭ ＣＨＩＲ９９０２１）とＰＫＣ活性剤（０.３μＭ ＰＭＡまたは３μＭプロストラチン）を添加したＰＦＣＤ培地（表１）により、浮遊培養条件下で培養した。次に、１日間（ｄａｙ２−３）化合物なしのＰＦＣＤ培地で培養した後、分化後期（ｄａｙ３−７）にＷＮＴシグナル阻害剤（３μＭ ＫＹ０３−Ｉおよび１μＭ ＸＡＶ９３９）とＥＧＦＲ阻害剤（１０μＭ ＡＧ１４７８）、Ｓｒｃ阻害剤（０.３μＭ Ａ４１９２５９）を添加したＰＦＣＤ培地中で、浮遊培養条件で、低接着ディッシュ（和光６４１−０７３９１またはコーニングＹＯ−０１８３５−２４）で、培養した。拍動心筋コロニーは通常ｄａｙ７〜９から観察された。【００８６】
表１に、ＰＦＣＤ培地の培地成分を示す。
【表１】
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【００８７】
心筋分化誘導培養開始３０〜６０日目の心筋コロニーを解離液（０.１％コラゲナーゼタイプＩ、０.２５％トリプシン、１Ｕ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、１１６ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１２.５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５.６ｍＭグルコース、５.４ｍＭ ＫＣｌおよび０.８ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ７.３５）で分離した。得られた心筋細胞４×１０５個を、血清を含む心筋培養液（IMDM（Sigma-Aldrich, I3390）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Sigma-Aldrich, M7145）、１％ペニシリン・ストレプトマイシン（GIBCO, 15140）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Sigma-Aldrich, G7513）、０.００１％２−メルカプトエタノール（GIBCO）、０.００５Ｎ ＮａＯＨ）を含む培地）２００μｌに分散し、実施例１で作製した培養容器のピラーの周囲に播いた。５時間後に、心筋培養液１ｍＬを添加した。２日後に血清を含まない心筋培養液に交換し、その後、４日に１回の頻度で培地を交換した。培養開始後に、心筋細胞はピラーの周囲にドーナツ状に集まって環状心筋細胞塊を形成し始めた。図３は、培養開始時から１４日後までの心筋細胞の顕微鏡像（図３Ａ）と、環状心筋細胞塊の幅の変化（図３Ｂ）を示す。環状心筋細胞塊の幅は、播種時に約２ｍｍであり、培養２日後に約０.４ｍｍに減少し、約６日後には約０.３ｍｍに減少し、その後は大きく変化せず、ほぼ一定であった。
【実施例３】
【００８８】
環状心筋細胞塊におけるカルシウム信号の伝達
実施例２の環状心筋細胞塊を蛍光顕微鏡で観察したところ、いくつかの環状心筋細胞塊において、心筋細胞の自発的Ｃａ２＋振動（カルシウム信号）を示す蛍光が、１〜３波の特異的な進行波として、環状心筋細胞塊内を循環していることが確認された。この現象が少なくとも培養８９日後まで継続する環状心筋細胞塊も存在した（培養８９日目で観察を中止した）。【００８９】
培養開始７日後の環状心筋細胞塊の拍動蛍光顕微鏡像を動画で撮影し、ImageJ により蛍光の変動を解析し、心筋特異的な興奮がそれぞれの心筋細胞の位置まで伝達されるのにかかる時間をマッピングすることにより、興奮伝達過程の地図（activation map）を作成し、進行波の伝達状況および伝達速度を可視化した（図４）。さらに、動画から情報を抽出し、蛍光強度の変化を比較したところ、進行波があると蛍光強度の変化が速く、さらに、進行波の数が多いほど、蛍光の変化はより速い傾向が見られた（図５）。また、培養開始７日後と１４日後で比較すると、進行波が１波でも２波でも、１４日後の方が伝達速度は速かった（図６）。図７は、培養開始６日後および１４日後の進行波の数を示す。進行波の数は、培養期間が延びるにつれ、減少する傾向が見られた。また、進行波が観察される環状心筋細胞塊の培地は、進行波が観察されない環状心筋細胞塊の培地よりも劣化が早く、進行波が発生すると心筋細胞の代謝が上昇することが示唆された。
【実施例４】
【００９０】
ピラーサイズの比較
実施例１と同様に、直径１ｍｍ、３ｍｍ、５ｍｍのピラーを作製し、各々４.０×１０５個の心筋細胞を用い、その他の条件は実施例１および２と同様にして、環状心筋細胞塊を作製した。環状心筋細胞塊を蛍光顕微鏡で観察し、進行波の発生率（図８Ａ）および心筋拍動数（図８Ｂ）を調べた。ピラーの直径が３ｍｍである場合、進行波の発生率は９０％以上であった。ピラーの直径が１ｍｍまたは５ｍｍである場合、進行波の発生率は各々約１１％および約７％であった。また、進行波が観察された環状心筋細胞塊における心筋拍動数は、ピラーの直径が１ｍｍ、３ｍｍおよび５ｍｍの場合で、各々、２.８３±０.２７回／秒、２.０３±０.０７回／秒、直径５ｍｍの場合１.８４±０.０４回／秒であり、ピラーが大きいほど、心筋拍動は遅くなる傾向が見られた。
【実施例５】
【００９１】
心筋細胞の組織化状態
実施例２の方法で心筋細胞を１４日間培養し、進行波なし、進行波１波および２波の環状心筋細胞塊を選択し、Hematoxylin-Eosin（ＨＥ）染色してから光学顕微鏡で観察した（図９）。進行波がない環状心筋細胞塊（０進行波）では、心筋細胞の組織化は進んでおらず、心筋組織構造は弛緩している。進行波がある環状心筋細胞塊（１進行波および２進行波）では、心筋組織は密集しており、コンパクトな構造を有した。これは、進行波の刺激を受けることによって、心筋細胞の組織化が進行することを示唆する。
【実施例６】
【００９２】
心筋細胞の成熟度
実施例２の方法で心筋細胞を１４日間培養し、進行波なし、進行波１波および２波の環状心筋細胞塊を選択し、それぞれ心筋特異的マーカー（β−ＭＨＣ、ＴｎＴ２、α−アクチニン）で免疫染色した（図１０）。その結果、進行波がない環状心筋細胞塊（０進行波）では、成熟心筋マーカーであるβ−ＭＨＣの発現が弱く、進行波がある環状心筋細胞塊（１進行波および２進行波）では、強いβ−ＭＨＣの発現が見られた。さらに、ＴｎＴ２およびα−アクチニンの染色では、進行波がある環状心筋細胞塊で筋線維分節構造が明確に観察され、トロポニン構造も配向していることが見られた。図１１は、β−ＭＨＣ染色した環状心筋細胞塊（１進行波）の全体像である。環状心筋細胞塊の全体がβ−ＭＨＣで強く染色された。
【実施例７】
【００９３】
心筋関連遺伝子の発現
実施例２の方法で心筋細胞を１４日間培養し、進行波なし、進行波１波および２波の環状心筋細胞塊を選択した。これらの環状心筋細胞塊を可溶化し、ｍＲＮＡを調整し、心筋特異的遺伝子であるＡＣＴＮ２、ＭＹＨ７、ＳＬＣ８Ａ１、ＭＹＬ２、ＴＮＮＩ３、ＣＫＭ、ＭＹＬ３、ＴＮＮＴ２、ＤＥＳ、ＭＹＬ７、ＮＡＴ１、ＧＡＴＡ４、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＮＰＰＡ、ＫＣＮＱ１、ＰＬＮ、ＭＢ、ＲＹＲ２およびＰＰＣの発現レベルを定量的ＰＣＲにより測定した（図１２）。進行波のある環状心筋細胞塊では、殆どの遺伝子の発現レベルが、進行波がない環状心筋細胞塊よりも高かった。進行波が２波の環状心筋細胞塊では、１波の環状心筋細胞塊よりも、発現レベルが高い傾向が見られた。
【実施例８】
【００９４】
成熟心筋マーカーの発現
実施例２の方法で心筋細胞を１４日間培養し、進行波のない環状心筋細胞塊および１波の進行波が観察される環状心筋細胞塊を選択した。実施例２の方法で、但し、ピラーを含まず、底面が平坦な培養容器中で、心筋細胞を１４日間培養した（Ｆｌａｔ）。これらの細胞集団および成人心筋サンプルを可溶化し、ｍＲＮＡを調整し、β−ＭＨＣの発現レベルを定量的ＰＣＲにより調べた（図１３）。進行波がある環状心筋細胞塊のβ−ＭＨＣの発現レベルは、成人心筋の３４.１％であり、従来の培養法（Ｆｌａｔ）で培養したサンプル（２％）および進行波のないサンプル（５％）より著しく高かった。
【実施例９】
【００９５】
環状心筋細胞塊の電気生理学的評価
実施例１の方法で、但し、非細胞接着性培養シャーレに多電極アレイ（Multi-channel system MCS GmbH社（ドイツ））を置き、環状心筋細胞塊が電極の上に形成されるようにピラーおよび外枠を接着して、環状心筋細胞塊デバイスを作製した。当該デバイスを用いて、実施例２の方法で心筋細胞を１４日間培養し、環状心筋細胞塊を作製した。１波の進行波が観察される環状心筋細胞塊の心筋拍動に伴う電気信号を測定した（図１４上段）。さらに、ＧＦＰ蛍光によりカルシウム信号を測定した（図１４下段）。両信号の変化は一致した。
【実施例１０】
【００９６】
環状心筋細胞塊を用いる心毒性評価
実施例９と同様に、ただし、心筋細胞を６日間培養し、多電極アレイ上に環状心筋細胞塊を作製した。１波の進行波が観察される環状心筋細胞塊を選択し、培養培地に様々な濃度のＥ−４０３１（代表的なＨＥＲＧチャネル阻害剤）を添加し、ＦＰＤを測定した（図１５）。Ｅ４０３１の濃度が高いほど、ＦＰＤは長かった。薬剤を洗い流すと、ＦＰＤは回復した。従来法で培養した心筋細胞の場合、５０ｎＭのＥ−４０３１により不整脈が起こることが知られているが、環状心筋細胞塊では１００ｎＭのＥ−４０３１を添加しても不整脈は起こらなかった。さらに、ＧＦＰ蛍光によりカルシウム信号を解析したところ、多電極アレイで測定した電気信号に対応する結果が得られた（図１６〜１８）。このことは、心毒性評価において、現行の多電極システムによる電気信号の解析の代替法として、カルシウム信号の解析を利用できることを示唆する。また、Ｅ−４０３１以外の心筋拍動頻度を制御する薬剤（拍動を加速するイソプロテレノールおよび拍動を減速するプロプラノロール）でも、同様の結果が得られた（図１９および２０）。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本願の環状心筋細胞塊は、従来の多能性幹細胞から誘導された心筋細胞にはない上記の特徴を有し、例えば、薬剤の効果または毒性の評価への応用が期待される。また、この環状心筋細胞塊は容易に製造でき、当該評価にかかるコストの削減に貢献し得る。
【符号の説明】
【００９８】
１…底部
３…側壁部
５…本体部分
７…凸部
１０…培養容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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