(57)【要約】  新たな蛍光タンパク質を提供する。  本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体は、第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質とを含み、前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが連結されており、前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質との組み合わせは、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とが、重複している組み合わせであることを特徴とする。
2018100803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質とを含み、
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが連結されており、
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質との組み合わせは、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とが、重複している組み合わせであることを特徴とする蛍光タンパク質複合体。
【請求項２】
前記第２蛍光タンパク質は、
前記第１蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ１）で前記第２蛍光タンパク質を励起した際の発光強度（Ｉ２Ｅ１）と、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）で前記第２蛍光タンパク質を励起した際の発光強度（Ｉ２Ｌ１）とが、Ｉ２Ｅ１＜Ｉ２Ｌ１の関係を満たすタンパク質である、請求項１記載の蛍光タンパク質複合体。
【請求項３】
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが、異なるタンパク質である、請求項１または２記載の蛍光タンパク質複合体。
【請求項４】
前記第１蛍光タンパク質の最大励起波長と前記第２蛍光タンパク質の最大励起波長とが異なる、請求項３記載の蛍光タンパク質複合体。
【請求項５】
前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とが、３５０〜６５０ｎｍの波長を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質複合体。
【請求項６】
前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）が、前記第２蛍光タンパク質の最大励起波長（Ｅ２ｍａｘ）を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質複合体。
【請求項７】
前記第２蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ２）が、４９０〜６５０ｎｍの範囲を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質複合体。
【請求項８】
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが、リンカーを介して連結されている、請求項１から７のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質複合体。
【請求項９】
前記リンカーが、ペプチドリンカーである、請求項８記載の蛍光タンパク質複合体。
【請求項１０】
前記ペプチドリンカーが、グリシンセリンリンカー領域を含む、請求項９記載の蛍光タンパク質複合体。
【請求項１１】
前記グリシンセリンリンカー領域が、配列番号４８（ＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列からなるペプチド単位を有する、請求項１０記載の蛍光タンパク質複合体。
【請求項１２】
前記グリシンセリンリンカー領域が、前記ペプチド単位が１〜３個連結されたリンカーである、請求項１１記載の蛍光タンパク質複合体。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質複合体に、前記蛍光タンパク質複合体における前記第１蛍光タンパク質の励起波長の光を照射する工程を含み、
前記第１蛍光タンパク質に、前記第１蛍光タンパク質の励起波長の光を照射することで、前記第１蛍光タンパク質を発光させ、
前記第１蛍光タンパク質の発光により、前記蛍光タンパク質複合体における前記第２蛍光タンパク質を励起して、前記第２蛍光タンパク質を発光させることを特徴とする蛍光タンパク質の発光方法。
【請求項１４】
さらに、前記第２蛍光タンパク質の発光の検出工程を含む、請求項１３記載の発光方法。
【請求項１５】
第１蛍光タンパク質をコードする第１核酸配列と、第２蛍光タンパク質をコードする第２核酸配列とを含み、
前記第１核酸配列と前記第２核酸配列とは、前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが連結された複合体として発現されるように、連結されており、
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質の組み合わせは、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とが、重複している組み合わせであることを特徴とする、蛍光タンパク質複合体をコードする遺伝子。
【請求項１６】
前記第１核酸配列と前記第２核酸配列とが、リンカーをコードする核酸配列を介して連結されている、請求項１５記載の遺伝子。
【請求項１７】
請求項１５または１６記載の蛍光タンパク質複合体をコードする遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１５または１６記載の蛍光タンパク質複合体をコードする遺伝子または請求項１７記載の発現ベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光タンパク質複合体、および蛍光タンパク質の発光方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光タンパク質として、ＧＦＰ（Green  Fluorescent  Protein）およびＹＦＰ（Yellow  Fluorescent  Protein）等が、一般的に用いられている（非特許文献１）。前記蛍光タンパク質は、研究等の様々な用途に使用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Chalfie M et al., “Green fluorescent protein as a marker for gene expression”, Science, February 1994, Vol.263, no.5148, p802-805.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、前記蛍光タンパク質は、それぞれ特有の励起波長および最大励起波長、ならびに蛍光波長および発光極大波長を有しているため、前記蛍光タンパク質を励起により発光させ、その発光を検出するには、それぞれの励起条件および発光検出条件により、光学的に使用が制限される場合がある。【０００５】
そこで、本発明は、例えば、蛍光タンパク質に依存する光学的な条件を広げることができる、新たな蛍光タンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の蛍光タンパク質複合体は、
第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質とを含み、
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが連結されており、
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質との組み合わせは、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とが、重複している組み合わせであることを特徴とする。【０００７】
本発明の蛍光タンパク質の発光方法は、
前記本発明の蛍光タンパク質複合体に、前記蛍光タンパク質複合体における前記第１蛍光タンパク質の励起波長の光を照射する工程を含み、
前記第１蛍光タンパク質に、前記第１蛍光タンパク質の励起波長の光を照射することで、前記第１蛍光タンパク質を発光させ、
前記第１蛍光タンパク質の発光により、前記蛍光タンパク質複合体における前記第２蛍光タンパク質を励起して、前記第２蛍光タンパク質を発光させることを特徴とする。【０００８】
本発明の蛍光タンパク質複合体をコードする遺伝子は、
第１蛍光タンパク質をコードする第１核酸配列と、第２蛍光タンパク質をコードする第２核酸配列とを含み、
前記第１核酸配列と前記第２核酸配列とは、前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが連結された複合体として発現されるように、連結されており、
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質の組み合わせは、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とが、重複している組み合わせであることを特徴とする。【０００９】
本発明の発現ベクターは、前記本発明の蛍光タンパク質複合体をコードする遺伝子を含むことを特徴とする。【００１０】
本発明の形質転換体は、前記本発明の蛍光タンパク質複合体をコードする遺伝子または前記発現ベクターを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、前記第１蛍光タンパク質と前記蛍光タンパク質とを前述の条件で組合せることにより、例えば、外部からの励起光が、前記第２蛍光タンパク質の励起条件とは異なる場合や最大励起波長から外れている場合であっても、前記第１蛍光タンパク質の発光による励起により、前記第２蛍光タンパク質を発光することができる。このため、本発明によれば、例えば、蛍光タンパク質を単独で使用する場合と比較して、より広い光学的条件の設定が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例２において、励起波長４００ｎｍおよび蛍光検出波長５１６ｎｍでの蛍光強度を示すグラフである。
【図２】図２（Ａ）は、実施例３において、励起波長４００ｎｍおよび所定の蛍光波長域における蛍光強度を示すグラフであり、図２（Ｂ）は、所定の蛍光波長域における最大蛍光強度を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例３において、励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。
【図４】図４（Ａ）は、実施例４において、励起波長４００ｎｍおよび所定の蛍光波長域における蛍光強度を示すグラフであり、図４（Ｂ）は、所定の蛍光波長域における最大蛍光強度を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例４において、励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の蛍光タンパク質複合体は、例えば、前記第２蛍光タンパク質が、前記第１蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ１）で前記第２蛍光タンパク質を励起した際の発光強度（Ｉ２Ｅ１）と、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）で前記第２蛍光タンパク質を励起した際の発光強度（Ｉ２Ｌ１）とが、Ｉ２Ｅ１＜Ｉ２Ｌ１の関係を満たすタンパク質である。
【００１４】
本発明の蛍光タンパク質複合体は、例えば、前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが、異なるタンパク質である。
【００１５】
本発明の蛍光タンパク質複合体は、例えば、前記第１蛍光タンパク質の最大励起波長と前記第２蛍光タンパク質の最大励起波長とが異なる。
【００１６】
本発明の蛍光タンパク質複合体は、例えば、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とが、３５０〜６５０ｎｍの波長を含む。
【００１７】
本発明の蛍光タンパク質複合体は、例えば、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）が、前記第２蛍光タンパク質の最大励起波長（Ｅ２ｍａｘ）を含む。
【００１８】
本発明の蛍光タンパク質複合体は、例えば、前記第２蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ２）が、４９０〜６５０ｎｍの範囲を含む。
【００１９】
本発明の蛍光タンパク質複合体は、例えば、前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが、リンカーを介して連結されている。
【００２０】
本発明の蛍光タンパク質複合体は、例えば、前記リンカーが、ペプチドリンカーである。
【００２１】
本発明の蛍光タンパク質複合体は、例えば、前記ペプチドリンカーが、グリシンセリンリンカー領域を含む。
【００２２】
本発明の蛍光タンパク質複合体は、例えば、前記グリシンセリンリンカー領域が、配列番号４８（ＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列からなるペプチド単位を有する。
【００２３】
本発明の蛍光タンパク質複合体は、例えば、前記グリシンセリンリンカー領域が、前記ペプチド単位が１〜３個連結されたリンカーである。
【００２４】
本発明の発光タンパク質の発光方法は、例えば、さらに、前記第２蛍光タンパク質の発光の検出工程を含む。
【００２５】
本発明の遺伝子は、例えば、前記第１核酸配列と前記第２核酸配列とが、リンカーをコードする核酸配列を介して連結されている。
【００２６】
＜蛍光タンパク質複合体＞
本発明の蛍光タンパク質複合体は、前述のように、
第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質とを含み、
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが連結されており、
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質との組み合わせは、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とが、重複している組み合わせであることを特徴とする。
【００２７】
本発明の蛍光タンパク質複合体は、後述するように、前記第１蛍光タンパク質の発光により、前記第２蛍光タンパク質を励起させることから、例えば、ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体ということもできる。なお、本発明は、いわゆる「ＦＲＥＴ（蛍光エネルギー移動）」の機能によって限定されるものではない。
【００２８】
本発明において、前記第１蛍光タンパク質および前記第２蛍光タンパク質は、前述のように、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とが、重複している組み合わせであればよく、その他の条件は、特に制限されない。
【００２９】
本発明において、「蛍光タンパク質の励起波長」とは、その蛍光タンパク質を発光できる励起光の波長をいい、「蛍光タンパク質の蛍光波長」とは、その蛍光タンパク質が励起によって発光した、前記蛍光の波長という。
【００３０】
本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体によれば、例えば、目的の蛍光タンパク質の発光を、その蛍光タンパク質に特有の励起光を外部から照射しなくても、間接的に前記蛍光タンパク質の発光を生じさせることができる。すなわち、本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体の場合、例えば、前記目的の蛍光タンパク質を前記第２蛍光タンパク質とし、前記第２蛍光タンパク質の励起波長と重複する蛍光波長の発光を示す蛍光タンパク質を前記第１蛍光タンパク質とする。このような構成とすることで、例えば、前記第２蛍光タンパク質の励起波長ではなく、前記第１蛍光タンパク質の励起波長を外部から照射することで、前記第１蛍光タンパク質を励起して発光させ、その発光により、前記第２蛍光タンパク質を間接的に励起させ、発光させることができる。
【００３１】
また、本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体によれば、例えば、前記第１蛍光タンパク質または前記第２蛍光タンパク質を単独で使用する場合よりも、より強い蛍光強度の発光を得ることもできる。
【００３２】
本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体において、前記第２蛍光タンパク質は、前記第１蛍光タンパク質の発光によって励起される。このため、前記第２蛍光タンパク質は、例えば、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長で励起されるタンパク質である。前記第２蛍光タンパク質は、前記第１蛍光タンパク質の発光によって励起され、発光できるタンパク質であればよく、例えば、前記第１蛍光タンパク質に照射される励起光によって、発光してもよいし、発光しなくてもよい。
【００３３】
本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体によれば、例えば、前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質を、それぞれ単独で励起して発光させる場合と比較して、より強い発光強度の発光を得ることもできる。
【００３４】
本発明において、前記第２蛍光タンパク質は、例えば、前記第１蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ１）で前記第２蛍光タンパク質を励起した際の発光強度（Ｉ２Ｅ１）と、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）で前記第２蛍光タンパク質を励起した際の発光強度（Ｉ２Ｌ１）とが、Ｉ２Ｅ１＜Ｉ２Ｌ１の関係を満たすタンパク質があげられる。このような第２蛍光タンパク質であれば、本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体は、例えば、前記第１タンパク質の励起波長（Ｅ１）で前記第２蛍光タンパク質を励起する場合よりも、前記第１蛍光タンパク質が発光した蛍光波長（Ｌ１）によって、間接的に前記第２蛍光タンパク質が励起され、より強い発光を示すことができる。
【００３５】
前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とは、前述のように、重複する波長を含んでいればよい。前記重複する波長は、特に制限されず、前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質の種類に応じて、適宜設定できる。
【００３６】
前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）は、例えば、前記第２蛍光タンパク質の最大励起波長（Ｅ２ｍａｘ）を含んでもよい。この場合、本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体において、前記第１蛍光タンパク質の発光による、前記第２蛍光タンパク質の励起で、例えば、前記第２蛍光タンパク質を、より効率よく、強い強度で発光させることができる。
【００３７】
前記第１蛍光タンパク質の蛍光極大波長（Ｌ１ｍａｘ）は、例えば、５１１〜５１９ｎｍである。
【００３８】
前記第２蛍光タンパク質の最大励起波長（Ｅ２ｍａｘ）は、例えば、５０１〜５０９ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍである。前記第２蛍光タンパク質の蛍光極大波長（Ｌ２ｍａｘ）は、例えば、５１１〜５１９ｎｍ、５１６〜５２４ｎｍである。
【００３９】
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とは、例えば、同じタンパク質でもよいし、異なるタンパク質でもよい。前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが、同じ励起波長域の場合、例えば、前記励起波長域に含まれる所定の励起波長（Ｅ１）で前記第１蛍光タンパク質を励起し、前記第１蛍光タンパク質を発光させ、前記励起波長域に含まれる前記蛍光波長（Ｌ１）で前記第２蛍光タンパク質（前記第１蛍光タンパク質と同一）を励起し、発光させることができる。
【００４０】
前記第１蛍光タンパク質の最大励起波長（Ｅ１ｍａｘ）と前記第２蛍光タンパク質の最大励起波長（Ｅ２ｍａｘ）との差は、特に制限されない。
【００４１】
前記第１蛍光タンパク質の最大励起波長（Ｅ１ｍａｘ）は、特に制限されず、例えば、３９６〜４０４ｎｍ、４０１〜４０９ｎｍの範囲である。前記第１蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ１）は、特に制限されず、例えば、３５０〜６５０ｎｍの範囲を含む。
【００４２】
前記第２蛍光タンパク質の最大励起波長（Ｅ２ｍａｘ）は、特に制限されず、例えば、前述の通りである。前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）は、特に制限されない。
【００４３】
前記第１蛍光タンパク質および前記第２蛍光タンパク質は、それぞれ、例えば、励起波長の変移により得られる蛍光のピークが、１つでもよいし、２つ以上でもよい。後者の場合、例えば、励起波長は、所望のピークを含む蛍光波長の発光を生じる範囲に設定することができる。
【００４４】
本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体は、例えば、前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが、直接的に連結してもよいし、間接的に連結してもよい。後者の場合、前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とは、例えば、リンカーを介して連結されている。
【００４５】
前記リンカーは、特に制限されず、例えば、前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが、それぞれ独立して性質を維持できればよい。前記リンカーは、例えば、ペプチドリンカーである。
【００４６】
前記ペプチドリンカーは、特に制限されず、例えば、グリシンセリンリンカー領域を含むペプチドリンカーがあげられる。グリシンセリンリンカーは、グリシン残基とセリン残基とを含むペプチドである。前記ペプチドリンカーは、例えば、前記グリシンセリンリンカー領域のみからなる形態でもよいし、前記グリシンセリンリンカー領域を含む形態でもよい。前記グリシンセリンリンカーは、以下、「ＧＳリンカー」、前記グリシンセリンリンカー領域は、以下、「ＧＳリンカー領域」ともいう。
【００４７】
前記グリシンセリンリンカー領域は、例えば、配列番号４８（ＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列からなるペプチド単位を有する。前記グリシンセリンリンカー領域において、前記ペプチド単位の個数（ｎ）は、特に制限されず、ｎは、正の整数であり、例えば、１〜３であり、１〜２である。前記ペプチド単位を２個以上有する場合、前記グリシンセリンリンカー領域は、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎで表される。
【００４８】
前記ペプチドリンカーは、前述のように、前記グリシンセリンリンカー領域を含む形態でもよく、この場合、前記グリシンセリンリンカー領域以外の領域は、特に制限されない。本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体を、例えば、遺伝子工学的に調製する場合、後述する本発明の発現ベクター等を用いて合成できる。前記発現ベクターは、例えば、前記第１蛍光タンパク質をコードする核酸配列と、前記第２蛍光タンパク質をコードする核酸配列と、任意で前記グリシンセリンリンカー領域をコードする核酸配列とを、制限酵素部位を利用して、骨格となるベクターに連結することで構築することができる。このため、前記ペプチドリンカーにおける前記その他の領域は、例えば、前記核酸配列を連結するための制限酵素部位に由来するペプチド領域であってもよい。前記ペプチドリンカーにおいて、前記グリシンセリンリンカー領域以外のその他の領域は、特に制限されず、例えば、その長さ（アミノ酸残基数）は、１〜３、１〜２である。また、前記ペプチドリンカーにおいて、前記その他の領域の位置は、特に制限されず、例えば、前記グリシンセリンリンカーのＣ末端側でもよいし、Ｎ末端側でもよいし、Ｃ末端側とＮ末端側の両方であってもよい。
【００４９】
前記ペプチドリンカーの長さ（アミノ酸残基数）は、特に制限されず、その下限は、例えば、１、５、８、１０、１３であり、その上限は、例えば、１８、１５、１３、１０、８である。
【００５０】
本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体は、例えば、前記第１蛍光タンパク質の上流側に、さらに、ペプチド付加領域を有してもよい。本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体を、例えば、遺伝子工学的に調製する場合、後述する本発明の発現ベクター等を用いて合成できる。前記発現ベクターは、例えば、前記第１蛍光タンパク質をコードする核酸配列と、前記第２蛍光タンパク質をコードする核酸配列と、任意で前記グリシンセリンリンカー領域をコードする核酸配列とを、制限酵素部位を利用して、骨格となるベクターに連結することで構築することができる。このため、例えば、前記発現ベクターに連結するための制限酵素部位に由来するペプチド領域が、前記ペプチド付加領域として付加されてもよい。前記ペプチド付加領域の長さ（アミノ酸残基数）は、特に制限されず、例えば、１〜４であり、１〜３であり、１〜２である。
【００５１】
本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体について、以下に具体例をあげるが、本発明は、これらの例には何ら制限されない。
【００５２】
本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体は、前述のように、前記第１蛍光タンパク質の発光によって、前記第２蛍光タンパク質を励起し、前記第２蛍光タンパク質を発光させることができる。このため、前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質との組合せとしては、ブラックライトで励起されるタンパク質を前記第２蛍光タンパク質とし、ＵＶライトで励起され且つブラックライトの波長域の発光を生じるタンパク質を前記第１蛍光タンパク質とする組合せが例示できる。ブラックライトで蛍光タンパク質を励起する場合、例えば、励起により発光する蛍光波長がブラックライトの波長と重複すると、発光を視覚化するために、光学フィルタを介した発光の視認が必要になる場合がある。他方、ＵＶライトの場合、例えば、ブラックライト時のような光学フィルタを介した発光の視認を回避することができる。このため、前記第１蛍光タンパク質として、ＵＶライトで励起され且つ励起によりブラックライト波長域に含まれる蛍光波長の発光を生じる蛍光タンパク質を第１蛍光タンパク質として使用すれば、前記第１蛍光タンパク質をＵＶライトで励起することにより、前記第１蛍光タンパク質を発光させることができる。そして、その発光は、ブラックライト波長域に含まれる蛍光波長であるため、この発光によって、ブラックライトを使用することなく、前記第２蛍光タンパク質を励起し、発光させることが可能となる。
【００５３】
このような第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質との組合せとしては、例えば、以下のような組合せが例示できる。
【００５４】
【表１】
2018100803.tif 000003
【００５５】
【表２】
2018100803.tif 000004
【００５６】
【表３】
2018100803.tif 000005
【００５７】
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質は、直接的または間接的に連結されて、前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体の構成要件として存在する。このため、例えば、前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体を遺伝子工学的に発現させる場合、前記複合体の開始コドンは、前記第１蛍光タンパク質の１番目のメチオニン残基をコードするため、前記第２蛍光タンパク質の１番目のメチオニン残基は、欠失してもよい。
【００５８】
また、前記第１蛍光タンパク質、前記ペプチドリンカーにおけるグリシンセリンリンカー領域、および前記第２蛍光タンパク質の組合せとしては、例えば、以下のような組合せが例示できる。
【００５９】
【表４】
2018100803.tif 000006
【００６０】
前記表４において、前記ペプチドリンカーにおけるＧＳリンカー領域（ＧＧＧＧＳ）ｎの繰り返し単位の数ｎは、特に制限されず、例えば、１〜３であり、また、前記ペプチドリンカーにおけるその他の領域Ｎｍのアミノ酸残基Ｎは、特に制限されず、任意のアミノ酸（Ｘａａ）であり、例えば、全てが同じであっても異なってもよく、繰り返し単位の数ｍは、特に制限されず、前記ペプチド付加領域と同様である。
【００６１】
前記表４に示す組合せのＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体は、例えば、以下の配列で表すことができる。
【００６２】
【表５】
2018100803.tif 000007
【００６３】
前記第１蛍光タンパク質および前記第２蛍光タンパク質は、例えば、前述の他に、以下に示す蛍光タンパク質を、組合せて使用することもできる。
【００６４】
（Ｆ１）  配列番号１のアミノ酸配列からなり、前記配列番号１のアミノ酸配列において、５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２が、任意のアミノ酸であり、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３が、任意のアミノ酸であり、１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４が、任意のアミノ酸であるタンパク質
（Ｆ２）  前記（Ｆ１）の５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３、および１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４以外のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質
（Ｆ３）  前記（Ｆ１）の５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３、および１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４以外のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質
【００６５】
前記配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質において、５２番目、１３３番目、および１５４番目のアミノ酸は、例えば、前記タンパク質の発色団と相互作用すると推定される。前記タンパク質は、例えば、５２番目、１３３番目、および１５４番目のアミノ酸を任意のアミノ酸とすることにより、前記タンパク質の蛍光活性を調整でき、例えば、相対的に低い波長の励起光（例えば、紫外線（以下同様））においても、より強い蛍光を発するタンパク質や、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発するタンパク質を得られる。
【００６６】
前記（Ｆ１）における配列番号１のアミノ酸配列は、以下の通りである。以下のアミノ酸配列において、３箇所の四角で囲んだアミノ酸（Ｘ）は、１箇所目のアミノ酸が、Ｘａａ５２、２箇所目のアミノ酸が、Ｘａａ１３３、３箇所目のアミノ酸が、Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸である。また、２箇所の下線を引いたアミノ酸（Ｘ）は、１箇所目のアミノ酸が、Ｘａａ１９８、２箇所目のアミノ酸が、Ｘａａ２０５に対応するアミノ酸である。
【００６７】
（Ｆ１）
2018100803.tif 000008
【００６８】
前記（Ｆ１）において、Ｘａａ５２は、任意のアミノ酸である。前記任意のアミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、好ましくは、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｃ、Ｍ、またはＴである。また、前記（Ｆ１）において、Ｘａａ５２は、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｈである。
【００６９】
前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１３３は、任意のアミノ酸である。前記任意のアミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、好ましくは、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴである。また、前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１３３は、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｔである。
【００７０】
前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１５４は、任意のアミノ酸である。前記任意のアミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、好ましくは、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹであり、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＹである。また、前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１５４は、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｋである。
【００７１】
前記（Ｆ１）において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せは、特に制限されず、例えば、
Ｘａａ５２は、例えば、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘａａ１３３は、例えば、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘａａ１５４は、例えば、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹである。
【００７２】
前記（Ｆ１）において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せは、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、好ましくは、
Ｘａａ５２は、例えば、Ｃ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘａａ１３３は、例えば、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘａａ１５４は、例えば、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＹである。
以下、前記（Ｆ１）がこのようなＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せを有する場合、前記（Ｆ１）を、（Ｂ１）ともいい、前記（Ｆ２）および（Ｆ３）において、前記（Ｆ１）が（Ｂ１）の場合、前記（Ｆ２）および（Ｆ３）を、それぞれ、（Ｂ２）および（Ｂ３）ともいう。また、以下の説明において、前記（Ｂ２）および（Ｂ３）は、例えば、前記（Ｆ２）および（Ｆ３）の説明において、（Ｆ１）を（Ｂ１）に、（Ｆ２）を（Ｂ２）に、（Ｆ３）を（Ｂ３）に、それぞれ読み替えて、その説明を援用できる。
【００７３】
前記タンパク質において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せは、例えば、下記（ａａ１）〜（ａａ１１）および（ａａ１２）のいずれか１つの組合せである。また、前記タンパク質において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せは、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、下記（ａａ１）、（ａａ３）、（ａａ６）、（ａａ９）、（ａａ１０）、または（ａａ１２）が好ましく、下記（ａａ１）、または（ａａ９）の組合せがより好ましい。また、前記タンパク質において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せは、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、下記（ａａ２）の組合せが好ましい。前記タンパク質は、例えば、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、それぞれ、Ｈ、ＳおよびＲの組合せ、ならびにＤ、ＳおよびＲの組合せのタンパク質を除く。
【００７４】
【表６】
2018100803.tif 000009
【００７５】
前記タンパク質において、Ｘａａ２０５は、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、Ｉに置換されていることが好ましい。また、前記タンパク質において、Ｘａａ１９８は、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、ＬまたはＨに置換されていることが好ましい。前記新規タンパク質において、１９８番目および２０５番目のアミノ酸は、例えば、それぞれが、前記タンパク質の発色団と相互作用すると推定される。このため、１９８番目および２０５番目のアミノ酸の少なくとも一方について、上述の置換を行なうことにより、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発するタンパク質を得られると推定される。前記新規タンパク質において、Ｘａａ１９８およびＸａａ２０５は、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、さらに強い蛍光を発することから、ＬおよびＩの組合せ、またはＨおよびＩの組合せに、それぞれ置換されていることがより好ましい。
【００７６】
前記（Ｆ１）のタンパク質は、例えば、配列番号２〜４７からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。前記（Ｆ１）が配列番号２〜４７のアミノ酸配列からなるタンパク質である場合、前記（Ｆ１）は、それぞれ、（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４６）ともいい、前記（Ｆ２）は、それぞれ、（Ｆ２−１）〜（Ｆ２−４６）ともいい、前記（Ｆ３）は、それぞれ、（Ｆ３−１）〜（Ｆ３−４６）ともいう。
【００７７】
前記（Ｂ１）のタンパク質は、例えば、配列番号２、４、７、１０、１１、１３、および１４〜４７からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。前記（Ｂ１）における各配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質の説明は、前記（Ｆ１）における各配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質の説明を援用できる。
【００７８】
前記（Ｆ１）における配列番号２〜４７のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記配列番号２〜１３のアミノ酸配列は、前記配列番号１のアミノ酸配列において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、それぞれ、前記（ａａ１）〜（ａａ１２）の組合せの場合に対応する。前記配列番号１４〜２８のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、前記（ａａ１）の組合せの場合に対応する。前記配列番号２９〜４７のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、前記（ａａ９）の組合せの場合に対応する。
【００７９】
（Ｆ１−１）
2018100803.tif 000010
【００８０】
（Ｆ１−２）
2018100803.tif 000011
【００８１】
（Ｆ１−３）
2018100803.tif 000012
【００８２】
（Ｆ１−４）
2018100803.tif 000013
【００８３】
（Ｆ１−５）
2018100803.tif 000014
【００８４】
（Ｆ１−６）
2018100803.tif 000015
【００８５】
（Ｆ１−７）
2018100803.tif 000016
【００８６】
（Ｆ１−８）
2018100803.tif 000017
【００８７】
（Ｆ１−９）
2018100803.tif 000018
【００８８】
（Ｆ１−１０）
2018100803.tif 000019
【００８９】
（Ｆ１−１１）
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【００９０】
（Ｆ１−１２）
2018100803.tif 000021
【００９１】
（Ｆ１−１３）
2018100803.tif 000022
【００９２】
（Ｆ１−１４）
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【００９３】
（Ｆ１−１５）
2018100803.tif 000024
【００９４】
（Ｆ１−１６）
2018100803.tif 000025
【００９５】
（Ｆ１−１７）
2018100803.tif 000026
【００９６】
（Ｆ１−１８）
2018100803.tif 000027
【００９７】
（Ｆ１−１９）
2018100803.tif 000028
【００９８】
（Ｆ１−２０）
2018100803.tif 000029
【００９９】
（Ｆ１−２１）
2018100803.tif 000030
【０１００】
（Ｆ１−２２）
2018100803.tif 000031
【０１０１】
（Ｆ１−２３）
2018100803.tif 000032
【０１０２】
（Ｆ１−２４）
2018100803.tif 000033
【０１０３】
（Ｆ１−２５）
2018100803.tif 000034
【０１０４】
（Ｆ１−２６）
2018100803.tif 000035
【０１０５】
（Ｆ１−２７）
2018100803.tif 000036
【０１０６】
（Ｆ１−２８）
2018100803.tif 000037
【０１０７】
（Ｆ１−２９）
2018100803.tif 000038
【０１０８】
（Ｆ１−３０）
2018100803.tif 000039
【０１０９】
（Ｆ１−３１）
2018100803.tif 000040
【０１１０】
（Ｆ１−３２）
2018100803.tif 000041
【０１１１】
（Ｆ１−３３）
2018100803.tif 000042
【０１１２】
（Ｆ１−３４）
2018100803.tif 000043
【０１１３】
（Ｆ１−３５）
2018100803.tif 000044
【０１１４】
（Ｆ１−３６）
2018100803.tif 000045
【０１１５】
（Ｆ１−３７）
2018100803.tif 000046
【０１１６】
（Ｆ１−３８）
2018100803.tif 000047
【０１１７】
（Ｆ１−３９）
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【０１１８】
（Ｆ１−４０）
2018100803.tif 000049
【０１１９】
（Ｆ１−４１）
2018100803.tif 000050
【０１２０】
（Ｆ１−４２）
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【０１２１】
（Ｆ１−４３）
2018100803.tif 000052
【０１２２】
（Ｆ１−４４）
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【０１２３】
（Ｆ１−４５）
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【０１２４】
（Ｆ１−４６）
2018100803.tif 000055
【０１２５】
前記（Ｆ２）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質ということもできる。前記（Ｆ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｆ２）が、前記蛍光活性を有する範囲であればよい。前記（Ｆ２）のアミノ酸配列において、「１もしくは数個」は、例えば、１〜４３個、１〜３３個、１〜２２個、１〜１１個、１〜９個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。本発明において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜５個」との記載は、「１、２、３、４、５個」の全ての開示を意味する（以下、同様）。前記（Ｆ１）において、Ｘａａ２０５が、Ｉに置換されている場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ２０５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、およびＸａａ２０５が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。また、前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１９８が、ＬまたはＨに置換されている場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ１９８が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、およびＸａａ１９８が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１９８およびＸａａ２０５が、ＬおよびＩの組合せ、またはＨおよびＩの組合せに、それぞれ置換されている場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ１９８およびＸａａ２０５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、Ｘａａ１９８、およびＸａａ２０５が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。前記「１もしくは数個」は、例えば、前述の説明を援用できる。
【０１２６】
前記（Ｆ３）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質ということもできる。前記（Ｆ３）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｆ３）が、前記蛍光活性を有する範囲であればよい。前記（Ｆ３）のアミノ酸配列において、「同一性」は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記「同一性」は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。前記（Ｆ１）において、Ｘａａ２０５が、Ｉに置換されている場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ２０５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、およびＸａａ２０５が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。また、前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１９８が、ＬまたはＨに置換されている場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ１９８が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、およびＸａａ１９８が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１９８およびＸａａ２０５が、ＬおよびＩの組合せ、またはＨおよびＩの組合せに、それぞれ置換されている場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ１９８およびＸａａ２０５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、Ｘａａ１９８、およびＸａａ２０５が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。前記「同一性」は、例えば、前述の説明を援用できる。
【０１２７】
前記蛍光タンパク質は、例えば、以下のような化学的特性を有する。なお、以下で示す励起波長、励起極大波長、蛍光波長および蛍光極大波長は、例えば、３５０〜６５０ｎｍの波長の範囲における化学的特性である。
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３８６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５０６〜５２４ｎｍ
【０１２８】
前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４６）のタンパク質は、例えば、それぞれ、以下のような化学的特性を有する。なお、前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４６）の励起波長または蛍光波長において、複数の蛍光強度の極大値が存在する場合、複数の励起極大波長および蛍光極大波長を示している。
【０１２９】
（Ｆ１−１）
励起波長：３５０〜５６０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１３０】
（Ｆ１−２）
励起波長：３５０〜６００ｎｍ
励起極大波長：５０１〜５０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１３１】
（Ｆ１−３）
励起波長：３５０〜６２０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１６〜５２４ｎｍ
【０１３２】
（Ｆ１−４）
励起波長：３５０〜６２５ｎｍ
励起極大波長：４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１３３】
（Ｆ１−５）
励起波長：３５０〜６１５ｎｍ
励起極大波長：５０１〜５０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１３４】
（Ｆ１−６）
励起波長：３５０〜６２５ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１６〜５２４ｎｍ
【０１３５】
（Ｆ１−７）
励起波長：３５０〜６２５ｎｍ
励起極大波長：４７６〜４８４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５０６〜５１４ｎｍ
【０１３６】
（Ｆ１−８）
励起波長：３５０〜６０５ｎｍ
励起極大波長：４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１３７】
（Ｆ１−９）
励起波長：３５０〜６１５ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１３８】
（Ｆ１−１０）
励起波長：３５０〜５９０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１６〜５２４ｎｍ
【０１３９】
（Ｆ１−１１）
励起波長：３５０〜５７５ｎｍ
励起極大波長：４７６〜４８４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５０６〜５１４ｎｍ
【０１４０】
（Ｆ１−１２）
励起波長：３５０〜５９５ｎｍ
励起極大波長：３８６〜３９４ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１６〜５２４ｎｍ
【０１４１】
（Ｆ１−１３）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１４２】
（Ｆ１−１４）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１４３】
（Ｆ１−１５）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１４４】
（Ｆ１−１６）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１４５】
（Ｆ１−１７）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１４６】
（Ｆ１−１８）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１４７】
（Ｆ１−１９）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１４８】
（Ｆ１−２０）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１４９】
（Ｆ１−２１）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１５０】
（Ｆ１−２２）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ  
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１５１】
（Ｆ１−２３）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１５２】
（Ｆ１−２４）
励起波長：３５０〜６４５ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１５３】
（Ｆ１−２５）
励起波長：３５０〜５８０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１５４】
（Ｆ１−２６）
励起波長：３５０〜５６０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１５５】
（Ｆ１−２７）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１５６】
（Ｆ１−２８）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１５７】
（Ｆ１−２９）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１５８】
（Ｆ１−３０）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１５９】
（Ｆ１−３１）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１６０】
（Ｆ１−３２）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１６１】
（Ｆ１−３３）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１６２】
（Ｆ１−３４）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１６３】
（Ｆ１−３５）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０６〜４１４ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１６４】
（Ｆ１−３６）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、５０１〜５０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１６５】
（Ｆ１−３７）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１６６】
（Ｆ１−３８）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１６７】
（Ｆ１−３９）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４１６〜４２４ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１６８】
（Ｆ１−４０）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１６９】
（Ｆ１−４１）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１７０】
（Ｆ１−４２）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４１６〜４２４ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１７１】
（Ｆ１−４３）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４２１〜４２９ｎｍ、５０１〜５０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１７２】
（Ｆ１−４４）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１７３】
（Ｆ１−４５）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１７４】
（Ｆ１−４６）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１７５】
前記励起波長、前記励起極大波長、前記蛍光波長、および前記蛍光極大波長の測定方法は、特に制限されず、例えば、ＪＩＳ  Ｋ０１２０に基づいて行うことができる。
【０１７６】
＜蛍光タンパク質の発光方法＞
本発明の蛍光タンパク質の発光方法は、前述のように、前記本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体に、前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体における前記第１蛍光タンパク質の励起波長の光を照射する工程を含み、
前記第１蛍光タンパク質に、前記第１蛍光タンパク質の励起波長の光を照射することで、前記第１蛍光タンパク質を発光させ、
前記第１蛍光タンパク質の発光により、前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体における前記第２蛍光タンパク質を励起して、前記第２蛍光タンパク質を発光させることを特徴とする。
【０１７７】
本発明の発光方法は、前記本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体を使用し、前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体における前記第１蛍光タンパク質に対して、前記第１蛍光タンパク質が発光する条件の励起光を照射し、前記第１蛍光タンパク質の発光により、前記第２蛍光タンパク質を発光させればよく、その他の構成は、何ら制限されない。
【０１７８】
前記照射工程において、前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体に照射する光の波長は、特に制限されず、前記第１蛍光タンパク質の励起波長であり、且つ、励起による前記第１蛍光タンパク質の発光が、前記第２蛍光タンパク質の励起波長を含む条件であればよい。前記第１蛍光タンパク質の励起波長および蛍光波長、ならびに前記第２蛍光タンパク質の励起波長および蛍光波長は、例えば、本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体の記載を援用できる。
【０１７９】
本発明の発光方法は、例えば、さらに、前記第２蛍光タンパク質の発光を検出する検出工程を含んでもよい。この場合、本発明の発光方法は、例えば、本発明の発光の検出方法ということもできる。
【０１８０】
本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体において例示した前記表１、表２、表３、および表５の組合せの場合、例えば、以下のような、励起と蛍光検出が可能となる。なお、本発明は、これには制限されない。
【０１８１】
前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体の場合、前記第１蛍光タンパク質は、例えば、ＵＶライトの波長域の照射光により励起が可能である。そして、前記照射光の励起による前記第１蛍光タンパク質の発光は、前記第２蛍光タンパク質の励起波長を含むため、これにより前記第２蛍光タンパク質を発光させ、前記発光を検出することができる。前記第２蛍光タンパク質を単体で使用する場合、例示した前記第２蛍光タンパク質の励起波長がブラックライトの波長域であると、例えば、ブラックライトの照射光が照射される。しかし、前記第２蛍光タンパク質の発光が、前記ブラックライトの波長と重複すると、前記第２蛍光タンパク質の発光を、直接視認することができず、発光以外の光をカットする光学フィルタ（例えば、商品名ＳＣ−５２、富士フィルム社製）を介して、視認する必要がある。しかしながら、前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体の場合、外部からの励起光は、前記第１蛍光タンパク質に応じて設定でき、前記第２蛍光タンパク質は、前記第１蛍光タンパク質の発光により励起されるため、前述のような前記ブラックライトの使用による問題も解消できる。また、前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体の場合、前記第２蛍光タンパク質を単独で使用する場合よりも、例えば、より強い蛍光強度の発光を得ることもできる。
【０１８２】
＜遺伝子＞
本発明の遺伝子は、前述のように、ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体をコードする遺伝子であり、第１蛍光タンパク質をコードする第１核酸配列と、第２蛍光タンパク質をコードする第２核酸配列とを含み、前記第１核酸配列と前記第２核酸配列とは、前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが連結された複合体として発現されるように、連結されており、前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質の組み合わせは、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とが、重複している組み合わせであることを特徴とする。本発明の遺伝子によれば、例えば、これを発現させることで、前記本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体を容易に製造できる。
【０１８３】
本発明の遺伝子は、例えば、前記第１核酸配列と前記第２蛍光タンパク質とが、リンカーをコードする核酸配列を介して連結されている。
【０１８４】
本発明の遺伝子は、前記本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体をコードすればよく、その他の構成等は何ら制限されない。本発明の遺伝子は、例えば、前記第１蛍光タンパク質、前記第２蛍光タンパク質、および任意の前記リンカーのアミノ酸配列に応じて、適宜、それらをコードするコドンからなる核酸配列に置き換えることで設計できる。
【０１８５】
本発明の遺伝子を構成するポリヌクレオチドは、例えば、公知の遺伝子工学的手法または合成手法によって製造できる。
【０１８６】
＜発現ベクター＞
本発明の発現ベクターは、前述のように、前記本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体をコードする遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターによれば、例えば、前記発現ベクターを宿主に導入することで、前記本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体を容易に製造できる。本発明の発現ベクターは、例えば、前記本発明の遺伝子の説明等を援用できる。
【０１８７】
前記発現ベクターは、例えば、前記本発明の遺伝子がコードする前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体を発現可能なように、機能的に、前記遺伝子を構成するポリヌクレオチドを含んでいればよく、その他の構成は、特に制限されない。
【０１８８】
前記発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう。）に、前記ポリヌクレオチドを挿入することで作製できる。前記ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記ベクターは、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターがあげられる。前記ベクターは、例えば、バイナリーベクターが好ましい。植物に形質転換を行う場合、前記ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリーベクターが好ましい。アグロバクテリウムを使用する方法により、植物に形質転換を行う場合、前記ベクターは、例えば、ｐＢＩ１２１ベクター、ｐＰＺＰ２０２ベクター、ｐＢＩＮＰＬＵＳベクター、ｐＢＩＮ１９ベクター、ｐＢＩＧ２１１３Ｎ、ｐＢＩＧ２１１３ＳＦ、ｐＲＩ１０１ＤＮＡベクター（ＴａＫａＲａ社製）、ｐＲＩ２０１ＤＮＡベクター（ＴａＫａＲａ社製）、ｐＲＩ９０９ＤＮＡベクター（ＴａＫａＲａ社製）、ｐＲＩ９１０ＤＮＡベクター（ＴａＫａＲａ社製）等があげられる。大腸菌等の微生物に形質転換を行う場合、前記ベクターは、例えば、ｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（ノバジェン社）、ｐＱＥ−８０Ｌベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫベクター、ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５−ＧＷ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＥＧＦＰベクター、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（−）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等があげられる。
【０１８９】
前記発現ベクターは、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現および前記ポリヌクレオチドがコードする前記本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体の発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は特に制限されない。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現およびこれがコードする前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
【０１９０】
前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
【０１９１】
＜ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体の製造方法＞
本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体の製造方法は、特に制限されず、例えば、遺伝子工学的手法により製造してもよいし、公知の合成方法により製造してもよい。前者の場合、本発明の製造方法は、前記本発明の遺伝子を発現させる発現工程を含む。これにより、本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体の製造方法は、例えば、前記本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体を容易に製造できる。
【０１９２】
前記本発明の遺伝子の発現は、例えば、前記遺伝子を構成するポリヌクレオチドの発現であり、前記本発明の発現ベクターを使用して行ってもよい。
【０１９３】
前記ポリヌクレオチドを発現させる方法は、特に制限されず、公知の方法が採用でき、例えば、無細胞タンパク質合成系を使用してもよいし、宿主を使用してもよい。
【０１９４】
前者の場合、無細胞タンパク質合成系において前記ポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。この場合、前記ポリヌクレオチドの発現には、発現ベクターを使用してもよい。前記無細胞タンパク質合成系は、例えば、細胞抽出液と、各種成分を含むバッファーと、目的のポリヌクレオチドが導入された発現ベクターとを用いて、公知の方法により行うことができ、例えば、市販の試薬キットが使用できる。
【０１９５】
後者の場合、例えば、前記ポリヌクレオチドが導入された前記宿主を使用し、前記宿主の培養により、前記宿主において前記ポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。このように、例えば、前記ポリヌクレオチドを宿主に導入することで、本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体を合成する形質転換体を製造でき、また、前記形質転換体の培養により、本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体を合成できる。
【０１９６】
前記宿主は、例えば、微生物、植物、動物、昆虫またはこれらの培養細胞等の非ヒト宿主、単離したヒト細胞またはその培養細胞等があげられ、好ましくは、植物である。前記宿主が植物の場合、前記植物は、例えば、植物体またはその部分であってもよい。前記植物体の部分は、例えば、器官、組織、細胞または栄養繁殖体等があげられる。前記器官は、例えば、花弁、花冠、花、葉、種子、果実、茎、根等があげられる。前記組織は、例えば、前記器官の部分である。前記細胞は、例えば、前記植物体またはその組織から採取した細胞、前記細胞の培養細胞、プロトプラスト、カルス等があげられる。前記植物の由来は、特に制限されず、例えば、アブラナ科、ナス科、イネ科、マメ科、バラ科、ナデシコ科、キク科、リンドウ科、ゴマノハグサ科、クマツヅラ科、サクラソウ科、サボテン科、ラン科等があげられる。前記アブラナ科は、例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）等のシロイヌナズナ属等があげられる。前記ナス科は、例えば、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）等のタバコ属、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ×ｈｙｂｒｉｄａ）等のツクバネアサガオ属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ニーレンベルギア（Ｎｉｅｒｅｍｂｅｒｇｉａ ｈｉｐｐｏａｍａｎｉｃａ）等のアマモドキ属、カリブラコア（Ｃａｌｉｂｒａｃｈｏａ ｈｙｂｒｉｄ Ｃｕｌｔｉｖａｒ）等のカリブラコア属等があげられる。前記イネ科は、例えば、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）等のトウモロコシ属、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）等のイネ属等があげられる。前記マメ科は、例えば、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）等のダイズ属等があげられる。前記バラ科は、例えば、バラ（Ｒｏｓａ）等のバラ属があげられる。前記ナデシコ科は、例えば、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）等のナデシコ属等があげられる。前記キク科は、例えば、栽培ギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）等のキク属、ガーベラ（Ｇｅｒｂｅｒａ ｃｖｓ．）等のガーベラ（オオセンボンヤリ）属等があげられる。前記リンドウ科は、例えば、トルコキキョウ（Ｅｕｓｔｏｍａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）等のユーストマ属等があげられる。前記ゴマノハグサ科は、例えば、トレニア（Ｔｏｒｅｎｉａ ｆｏｕｒｎｉｅｒｉ）等のトレニア属等があげられる。前記クマツヅラ科は、例えば、バーベナ（Ｇａｒｄｅｎ ｖｅｒｂｅｎａ）等のバーベナ属等があげられる。前記サクラソウ科は、例えば、シクラメン（Ｃｙｃｌａｍｅｎ ｐｅｒｓｉｃｕｍ）等のシクラメン属等があげられる。前記サボテン科は、例えば、アウストロキリンドロプンティア属、アストロフィツム属、エキノカクツス属、エキノセレウス属、エキノプシス属、エピフィラム属、オプンティア属、カニバサボテン属、カマエセレウス属、キリンドロプンティア属、ギムノカリキウム属、シャコバサボテン属、セレニセレウス属、テフロカクツス属、ネオブクスバウミア属、ネオライモンディア属、ノパレア属、フェロカクツス属、マミラリア属、メロカクツス属、リプサリス属、ロセオカクツス属、ロフォフォラ属等があげられる。前記ラン科は、例えば、ファレノプシス（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｃｖｓ．）等のファレノプシス（コチョウラン）属、シンビジウム（Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｃｖｓ．）等のシンビジウム（シュンラン）属、デンドロビウムのノビル系（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｎｏｂｉｌｅ ｈｙｂｒｉｄｓ）、デンドロビウムのデンファレ系（Ｄ． ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｈｙｂｒｉｄｓ）等のデンドロビウム（セッコク）属、オンシジウム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｃｖｓ．）等のオンシジウム属、カトレア（Ｃａｔｔｌｅｙａ ｃｖｓ．）等のカトレア属等があげられる。前記微生物は、例えば、真核生物、原核生物等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等があげられる。
【０１９７】
前記ポリヌクレオチドを前記宿主に導入する方法、すわなち、前記宿主の形質転換の方法は、特に制限されず、例えば、前記発現ベクターを用いて導入する方法でもよいし、前記発現ベクターを用いずに導入する公知の方法でもよい。後者の場合、前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。前記導入方法は、例えば、ヒートショック法、酢酸リチウム法、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。前記宿主が植物の場合、前記導入方法は、アグロバクテリウムを介する方法が好ましい。前記本発明の遺伝子を構成するポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明の発現ベクターにより前記宿主に導入してもよい。
【０１９８】
前記宿主の培養の方法は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜設定できる。前記宿主の培養に使用する培地は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜決定できる。
【０１９９】
前記宿主の培養に使用する培地の形態は、特に制限されず、例えば、固体培地、液体培地、寒天培地等、従来公知の培地を適宜使用できる。前記培地に含まれる成分は、特に制限されない。前記培地は、例えば、市販の培地を含んでもよい。前記宿主が植物である場合、前記植物の市販培地は、特に制限されず、例えば、Murashige-Skoog（ＭＳ）培地等があげられる。前記宿主が植物細胞である場合、前記植物細胞の市販培地は、特に制限されず、例えば、ハイポネックス培地、ＭＳ培地、Gamborg  B5（Ｂ５）培地、White培地等があげられる。前記宿主が微生物である場合、前記微生物の市販培地は、特に制限されず、例えば、ＬＢ培地、スーパーブロス培地、Ｍ９培地等があげられる。前記培地は、例えば、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。前記培地のｐＨは、特に制限されず、例えば、ｐＨ６〜８の範囲、ｐＨ６．５〜７．５の範囲である。
【０２００】
前記宿主の培養方法は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記宿主が植物の場合、前記培養方法は、例えば、前記植物を土壌栽培、水性栽培する方法等があげられる。前記植物が植物細胞の場合、前記培養方法は、例えば、カルス培養、根の培養、胚珠培養、胚培養等があげられる。
【０２０１】
前記宿主の培養時の培養温度は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記宿主が植物の場合、前記培養温度は、例えば、植物の生育可能温度、生育最適温度等があげられる。具体的には、前記培養温度は、例えば、１５〜４０℃の範囲、３０〜３７℃の範囲等で行うことができる。前記宿主が植物細胞の場合、前記培養温度は、例えば、植物細胞の生育可能温度、生育最適温度等があげられる。具体的には、前記培養温度は、例えば、１５〜４０℃の範囲、３０〜３７℃の範囲等で行うことができる。
【０２０２】
前記宿主は、例えば、好気的条件下で培養してもよく、嫌気的条件下で培養してもよい。前記好気的条件または嫌気的条件は、特に制限されず、従来公知の方法を用いて設定できる。
【０２０３】
＜形質転換体＞
本発明の形質転換体は、前記本発明の遺伝子または前記発現ベクターを含むことを特徴とする。本発明の形質転換体は、前記本発明の遺伝子または前記発現ベクターを含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の形質転換体は、前記本発明の遺伝子または前記発現ベクターを含むため、例えば、蛍光活性を有する。本発明の形質転換体は、例えば、前記本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体等の説明を援用できる。
【０２０４】
本発明において、前記形質転換体は、特に制限されず、動物、植物等があげられるが、植物が好ましい。前記形質転換体が動物である場合、前記形質転換体としては、例えば、ヒト大腸がん細胞等のがん細胞があげられる。前記形質転換体が植物である場合、前記植物および植物の由来は、特に制限されず、例えば、前述の説明を援用できる。具体的に、前記植物は、例えば、植物体またはその部分であってもよい。前記植物体の部分は、例えば、器官、組織、細胞または栄養繁殖体等があげられる。前記器官は、例えば、花弁、花冠、花、葉、種子、果実、茎、根等があげられる。前記組織は、例えば、前記器官の部分である。前記細胞は、例えば、前記植物体またはその組織から採取した細胞、前記細胞の培養細胞、プロトプラスト、カルス等があげられる。
【０２０５】
本発明において、前記形質転換体が植物の場合、本発明の形質転換体は、例えば、さらに繁殖させることができる。この際、本発明の形質転換体は、前記繁殖材料として使用できる。前記繁殖材料は、特に制限されず、例えば、前記形質転換体の全体でもよいし、部分でもよい。前記形質転換体が、前記植物体またはその部分の場合、前記繁殖材料は、例えば、種子、果実、シュート、塊茎等の茎、塊根等の根、株、プロトプラスト、カルス等があげられる。
【０２０６】
本発明の形質転換体の繁殖方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記繁殖方法は、例えば、有性生殖および無性生殖のいずれでもよく、好ましくは無性生殖である。前記無性生殖による繁殖は、例えば、栄養繁殖（vegetative  propagation）があげられ、栄養生殖（vegetative  reproduction）ともいう。前記栄養繁殖の方法は、特に制限されず、前記植物体またはその部分の場合、例えば、挿し芽、挿し木による繁殖、器官からの植物個体への細分化、カルスによる増殖等があげられる。前記器官は、例えば、前述したような葉、茎、根等が利用できる。
【０２０７】
前記形質転換体を栄養繁殖することにより得られる繁殖体を、以下、本発明の栄養繁殖体という。本発明の栄養繁殖体は、前記本発明の形質転換体と同一の性質を有することが好ましい。本発明の栄養繁殖体は、前記形質転換体と同様に、特に制限されず、例えば、植物体またはその部分があげられる。
【０２０８】
また、前記形質転換体を有性生殖した場合、例えば、種子、これから生育した生育体等の子孫が得られる。本発明の子孫は、前記本発明の形質転換体と同一の性質を得ることが好ましい。本発明の子孫は、例えば、前記形質転換体と同様に、例えば、植物体またはその部分のいずれでもよい。
【０２０９】
本発明の形質転換体は、例えば、さらに加工してもよい。加工する前記形質転換体の種類は、特に制限されず、例えば、花、葉、枝等があげられる。前記形質転換体の加工品は、特に制限されず、例えば、花、葉、枝等を乾燥させたポプリ、押し花、ドライフラワー、プリザーブドフラワー、樹脂密封品等があげられる。また、本発明の加工品は、例えば、前記形質転換体の栄養繁殖体、器官、組織または細胞の加工品でもよい。
【０２１０】
＜形質転換体の製造方法＞
本発明の形質転換体の製造方法は、宿主に、本発明の遺伝子または前記発現ベクターを導入する導入工程を含むことを特徴とする。本発明の形質転換体の製造方法は、宿主に、本発明の遺伝子または前記発現ベクターを導入する導入工程を含むことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の形質転換体の製造方法によれば、例えば、前記本発明の形質転換体を容易に製造できる。
【０２１１】
本発明の形質転換体の製造方法は、さらに、前記宿主に、前記遺伝子を発現させる発現工程を含んでいてもよい。
【０２１２】
前記導入工程において、本発明の遺伝子または前記発現ベクターを前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、例えば、前記本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体の製造方法における前記ポリヌクレオチドを前記宿主に導入する方法の説明を援用できる。本発明の製造方法において、前記宿主は、植物が好ましい。
【０２１３】
前記発現工程は、例えば、宿主内で、本発明の遺伝子から本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体を発現させる工程である。前記発現工程において、前記宿主は、例えば、本発明の遺伝子または前記発現ベクターが導入された形質転換体であることが好ましく、前記形質転換体の培養により、前記宿主において本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体を発現させることが好ましい。
【０２１４】
前記宿主が植物の場合、本発明の形質転換体の製造方法は、さらに、前記導入工程により得られた形質転換体を繁殖する繁殖工程を含んでもよい。前記繁殖工程における繁殖方法は、例えば、前述の説明を援用できる。また、本発明の形質転換体の製造方法は、繁殖した形質転換体から採種する採種工程を含んでもよく、さらに、前記採種工程で得られた種子から生育体を生育する生育工程を含んでもよい。
【実施例】
【０２１５】
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。【０２１６】
［実施例１］
本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体を調製した。【０２１７】
（１）発現ベクターの構築
前記表５に示す組合せ１および２について、それぞれ、下記表７および８に示すアミノ酸配列からなる蛍光タンパク質複合体６種類を設計した。また、組合せ３として、下記表９に示すアミノ酸配列からなる蛍光タンパク質複合体３種類を設計した。前記蛍光タンパク質複合体は、それぞれ、ＧＳリンカー領域の繰り返し単位の数を１、２および３に変化させた。また、前記蛍光タンパク質複合体には、Ｎ末端側に下線部に示す領域を付加した。下記アミノ酸配列において、前記下線部の領域は、開始コドンに該当するメチオニン残基、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６タグ）およびＧＳリンカーから構成される。また、下記アミノ酸配列において、四角で囲んだリンカー領域中のＡＡＡは、後述する発現ベクターの構築における制限酵素部位に由来するアミノ酸配列である。前記組合せ１および２は、ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体であり、前記組合せ３は、非ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体である。【０２１８】
【表７】
2018100803.tif 000056
【表８】
2018100803.tif 000057
【表９】
2018100803.tif 000058
【０２１９】
前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体の各領域をコードするポリヌクレオチドを調製し、制限酵素で処理し、pEGFPベクター（clontech）のマルチクローニングサイト間に、EGFP領域に代えて、前記各ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体をコードするポリヌクレオチドを挿入した。これを、前記各ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体を発現する発現ベクターとした。前記各発現ベクターに挿入された、前記表７〜９のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を、下記表１０〜１２に示す。【０２２０】
【表１０】
2018100803.tif 000059
2018100803.tif 000060
【表１１】
2018100803.tif 000061
2018100803.tif 000062
【表１２】
2018100803.tif 000063
2018100803.tif 000064
【０２２１】
なお、ネガティブコントロールとして、ＢＫ１５のみを導入した発現ベクター、ＢＬのみを導入した発現ベクターを、同様にして構築した。下記表に、前記ＢＫ１５単独または前記ＢＬ単独の発現ベクターにより発現されるタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。なお、下記アミノ酸配列において、下線部は、前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体と同様である。【０２２２】
【表１３】
2018100803.tif 000065
【０２２３】
【表１４】
2018100803.tif 000066
【０２２４】
（２）大腸菌への導入
大腸菌ＤＨ５α株に、前記各発現ベクターを、それぞれ単独で、ヒートショック法により形質導入した。得られた形質転換体を、抗生物質（アンピシリン）１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地を用いて、３７℃で１６〜１８時間培養した。そして、培養した菌体を集菌し、得られたペレットを、プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、ロシュ社製）１錠を含むＰＢＳ溶液４０ｍＬを用いて、２回洗浄した。前記洗浄後のペレットを、前記プロテアーゼ阻害剤を含むＰＢＳ溶液１．５ｍＬに懸濁した。つぎに、得られた懸濁液を、超音波ホモジナイザー（ＱＳＯＮＩＣＡ、ワケンビーテック株式会社製）を用いて、Ａｍｐ２５％、１分間の条件で、２回超音波処理した。そして、前記処理後の懸濁液を、１３００ｒｐｍ、４℃の条件で、１０分間遠心し、得られた上清を回収した。各発現ベクターを導入した形質転換体から得られた上清を、前記表７〜９に示すＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体サンプルとした。前記各上清中のタンパク質濃度は、前記各上清に、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）を添加後、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）  Ｍ１０００Ｐｒｏ、ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。【０２２５】
［実施例２］
本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体の蛍光活性を確認した。【０２２６】
前記実施例１で調製した、ＢＫ１５−ｇｓ１−ＢＬ、ＢＫ１５−ｇｓ１−Ｗｔの上清サンプルを、２μｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。これら希釈サンプル５０μＬについて、前記マイクロプレートリーダーを用い、下記測定条件で蛍光強度（ＦＩ）を測定した。また、ネガティブコントロールであるＢＫ１５の上清サンプルについても、同様に測定した。プレートは、HTS  384well  C-Flat  Fluorescence  Black  Plate (#781076、greiner bio-one)を使用した。【０２２７】
（測定条件）
励起波長：４００ｎｍ（バンド幅：５ｎｍ）
蛍光（検出）波長：５１６ｎｍ（バンド幅：５ｎｍ）
レーザー強度（Ｇａｉｎ）：１０５【０２２８】
励起波長（Ｅｘ）４００ｎｍ、蛍光波長（Ｅｍ）５１６ｎｍに固定した結果を、図１に示す。図１は、各ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体について、上記条件での蛍光強度（ＦＩ）を示すグラフである。図１に示すように、ＢＫ１５単独と比較して、ＢＫ１５と、ＢＬまたはＷｔとを連結したＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体は、より強い蛍光強度の発光を示した。前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体において前記第２蛍光タンパク質に該当するＢＬおよびＷｔは、外部からの励起波長４００ｎｍよりも、前記複合体内のＢＫ１５の蛍光波長５１２ｎｍにおいて、より強い蛍光強度を示す。このため、ＢＫ１５とＢＬまたはＷｔとを連結したＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体とすることで、前記複合体内の励起によって、ＢＫ１５単独よりも強い発光強度を実現できる。また、ＢＬまたはＷｔ単独の場合、それらを発光させるには、例えば、励起波長５０７〜５０８ｎｍの照射が必要であるが、その場合、得られる発光の波長５１６〜５１７ｎｍであるため、発光の視認には、他の光をカットする光学フィルムの使用が必要になる。しかしながら、前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体は、ＢＬまたはＷｔに適した励起波長（５０７〜５０８ｎｍ）の光ではなく、ＢＫ１５を発光させる励起波長（４００ｎｍ）の光の照射が可能であり、さらにＢＫ１５の発光により、ＢＬまたはＷｔを励起して発光させることができる。このため、前述のような光学フィルムも不要である。【０２２９】
［実施例３］
本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体の蛍光活性を確認した。【０２３０】
前記実施例１で調製した、ＢＫ１５−ｇｓ２−ＢＬ、ＢＫ１５−ｇｓ２−ＷｔおよびＢＫ１５−ｇｓ２−ＢＫ１５の上清サンプルを、２μｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。これら希釈サンプル５０μＬについて、前記マイクロプレートリーダーを用い、下記測定条件で、前記実施例２と同様にして、蛍光強度（ＦＩ）を測定した。また、ネガティブコントロールであるＢＫ１５の上清サンプルおよびＢＬの上清サンプルについても、同様に測定した。【０２３１】
（測定条件）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ（バンド幅：５ｎｍ）
蛍光（検出）波長：３５０〜６５０ｎｍ（バンド幅：５ｎｍ）
レーザー強度（Ｇａｉｎ）：１０５【０２３２】
励起波長（Ｅｘ）が４００ｎｍであり、蛍光検出波長（Ｅｍ）が４００〜６００ｎｍの場合の結果を、図２（Ａ）に示し、前記図２（Ａ）における最も高い蛍光強度の結果を、図２（Ｂ）に示す。また、表１５に、最大の蛍光強度および前記蛍光強度を示した蛍光検出波長を示す。【０２３３】
図２（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ＢＫ単独およびＢＬ単独の場合と比較して、各ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体によれば、蛍光強度が有意に増加し、具体的には、蛍光極大波長における蛍光強度が有意に増加した。また、図２（Ａ）および表１５に示すように、前記第１蛍光タンパク質としてＢＫ１５を使用し、前記第２蛍光タンパク質として前記第１蛍光タンパク質とは別の蛍光タンパク質であるＢＬまたはＷｔを使用したＢＫ１５−ｇｓ２−ＢＬおよびＢＫ１５−ｇｓ２−Ｗｔは、最も高い蛍光強度を示す波長が、ＢＫ単独よりも長波長側にシフトした。これらの結果から、前記第１蛍光タンパク質であるＢＫ１５が４００ｎｍの励起光で励起され、それにより得られる発光により、前記第２蛍光タンパク質（ＢＬ、Ｗｔ）がさらに励起され、発光したことがわかる。なお、図示していないが、Ｗｔ単独の結果は、ＢＬと同様である。【０２３４】
【表１５】
2018100803.tif 000067
【０２３５】
また、励起波長の全範囲および蛍光波長の全範囲の測定結果を、図３に示す。図３の各図は、Ｘ軸方向が、励起波長を示し、Ｙ軸方向が、蛍光波長を示し、Ｚ軸方向が、蛍光強度を示す。また、表１６に、発光ピークの発光強度、最大励起波長、発光極大波長を示す。【０２３６】
図３に示すように、ＢＫ１５単独は、４００ｎｍ等の低波長域では、発光ピークを示すものの、その強度ＦＩは、１５，０００程度であった。他方、ＢＬ単独は、４００ｎｍを含む低波長域では発光ピークは示さないが、高波長域の強度ＦＩは、ＢＫ１５よりも一桁大きい１５０，０００を示した。これに対して、前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体は、いずれも、４００ｎｍ等の低波長域のピークの他に、高波長域においてもピークが確認できた。この結果からも、前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体は、前記図２で述べたように、４００ｎｍで励起した場合、第１蛍光タンパク質のＢＫ１５が励起され発光し、この発光によって、さらに第２蛍光タンパク質であるＢＬ、Ｗｔが励起され発光していることがわかる。【０２３７】
【表１６】
2018100803.tif 000068
【０２３８】
［実施例４］
本発明のＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体の蛍光活性を確認した。【０２３９】
前記実施例１で調製した、ＢＫ１５−ｇｓ３−ＢＬ、ＢＫ１５−ｇｓ３−ＷｔおよびＢＫ１５−ｇｓ３−ＢＫ１５の上清サンプルを、２μｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。これら希釈サンプル５０μＬについて、前記マイクロプレートリーダーを用い、下記測定条件で、前記実施例２と同様にして、蛍光強度（ＦＩ）を測定した。また、ネガティブコントロールであるＢＫ１５の上清サンプルおよびＢＬの上清サンプルについても、同様に測定した。【０２４０】
（測定条件）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ（バンド幅：５ｎｍ）
蛍光（検出）波長：３５０〜６５０ｎｍ（バンド幅：５ｎｍ）
レーザー強度（Ｇａｉｎ）：１０５【０２４１】
励起波長（Ｅｘ）が４００ｎｍであり、蛍光検出波長（Ｅｍ）が４００〜６００ｎｍの場合の結果を、図４（Ａ）に示し、前記図４（Ａ）における最も高い蛍光強度の結果を、図４（Ｂ）に示す。また、表１７に、最大の蛍光強度および前記蛍光強度を示した蛍光検出波長を示す。【０２４２】
図４（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ＢＫ単独およびＢＬ単独の場合と比較して、各ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体によれば、蛍光強度が有意に増加し、具体的には、蛍光極大波長における蛍光強度が有意に増加した。また、図４（Ａ）および表１７に示すように、前記第１蛍光タンパク質としてＢＫ１５を使用し、前記第２蛍光タンパク質として前記第１蛍光タンパク質とは別の蛍光タンパク質であるＢＬまたはＷｔを使用したＢＫ１５−ｇｓ３−ＢＬおよびＢＫ１５−ｇｓ３−Ｗｔは、最も高い蛍光強度を示す波長が、ＢＫ単独よりも長波長側にシフトした。これらの結果から、前記第１蛍光タンパク質であるＢＫ１５が４００ｎｍの励起光で励起され、それにより得られる発光により、前記第２蛍光タンパク質（ＢＬ、Ｗｔ）がさらに励起され、発光したことがわかる。なお、図示していないが、Ｗｔ単独の結果は、ＢＬと同様である。【０２４３】
【表１７】
2018100803.tif 000069
【０２４４】
また、励起波長の全範囲および蛍光波長の全範囲の測定結果を、図５に示す。図５の各図は、図４と同様に、Ｘ軸方向が、励起波長を示し、Ｙ軸方向が、蛍光波長を示し、Ｚ軸方向が、蛍光強度を示す。また、表１８に、最大の蛍光強度および前記蛍光強度を示した蛍光検出波長を示す。前述のように、ＢＫ１５単独は、４００ｎｍ等の低波長域では、発光ピークを示すものの、その強度ＦＩは、１５，０００程度であった。他方、ＢＬ単独は、４００ｎｍを含む低波長域では発光ピークは示さないが、高波長域の強度ＦＩは、ＢＫ１５よりも一桁大きい１５０，０００を示した。これに対して、図５に示すように、前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体は、いずれも、４００ｎｍ等の低波長域のピークの他に、高波長域においてもピークが確認できた。この結果からも、前記ＦＲＥＴ型蛍光タンパク質複合体は、前記図４で述べたように、４００ｎｍで励起した場合、第１蛍光タンパク質のＢＫ１５が励起され発光し、この発光によって、さらに第２蛍光タンパク質であるＢＬ、Ｗｔが励起され発光していることがわかる。【０２４５】
【表１８】
2018100803.tif 000070
【０２４６】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。【０２４７】
この出願は、２０１６年１１月３０日に出願された日本出願特願２０１６−２３２７４６を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。【０２４８】
＜付記＞
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
（付記１）
第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質とを含み、
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが連結されており、
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質との組み合わせは、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とが、重複している組み合わせであることを特徴とする蛍光タンパク質複合体。
（付記２）
前記第２蛍光タンパク質は、
前記第１蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ１）で前記第２蛍光タンパク質を励起した際の発光強度（Ｉ２Ｅ１）と、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）で前記第２蛍光タンパク質を励起した際の発光強度（Ｉ２Ｌ１）とが、Ｉ２Ｅ１＜Ｉ２Ｌ１の関係を満たすタンパク質である、付記１記載の蛍光タンパク質複合体。
（付記３）
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが、異なるタンパク質である、付記１または２記載の蛍光タンパク質複合体。
（付記４）
前記第１蛍光タンパク質の最大励起波長と前記第２蛍光タンパク質の最大励起波長とが異なる、付記３記載の蛍光タンパク質複合体。
（付記５）
前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とが、３５０〜６５０ｎｍの波長を含む、付記１から４のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質複合体。
（付記６）
前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）が、前記第２蛍光タンパク質の最大励起波長（Ｅ２ｍａｘ）を含む、付記１から５のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質複合体。
（付記７）
前記第２蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ２）が、４９０〜６５０ｎｍの範囲を含む、付記１から６のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質複合体。
（付記８）
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが、リンカーを介して連結されている、付記１から７のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質複合体。
（付記９）
前記リンカーが、ペプチドリンカーである、付記８記載の蛍光タンパク質複合体。
（付記１０）
前記ペプチドリンカーが、グリシンセリンリンカー領域を含む、付記９記載の蛍光タンパク質複合体。
（付記１１）
前記グリシンセリンリンカー領域が、配列番号４８（ＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列からなるペプチド単位を有する、付記１０記載の蛍光タンパク質複合体。
（付記１２）
前記グリシンセリンリンカー領域が、前記ペプチド単位が１〜３個連結されたリンカーである、付記１１記載の蛍光タンパク質複合体。
（付記１３）
付記１から１２のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質複合体に、前記蛍光タンパク質複合体における前記第１蛍光タンパク質の励起波長の光を照射する工程を含み、
前記第１蛍光タンパク質に、前記第１蛍光タンパク質の励起波長の光を照射することで、前記第１蛍光タンパク質を発光させ、
前記第１蛍光タンパク質の発光により、前記蛍光タンパク質複合体における前記第２蛍光タンパク質を励起して、前記第２蛍光タンパク質を発光させることを特徴とする蛍光タンパク質の発光方法。
（付記１４）
さらに、前記第２蛍光タンパク質の発光の検出工程を含む、付記１３記載の発光方法。
（付記１５）
第１蛍光タンパク質をコードする第１核酸配列と、第２蛍光タンパク質をコードする第２核酸配列とを含み、
前記第１核酸配列と前記第２核酸配列とは、前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが連結された複合体として発現されるように、連結されており、
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質の組み合わせは、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とが、重複している組み合わせであることを特徴とする、蛍光タンパク質複合体をコードする遺伝子。
（付記１６）
前記第１核酸配列と前記第２核酸配列とが、リンカーをコードする核酸配列を介して連結されている、付記１５記載の遺伝子。
（付記１７）
付記１５または１６記載の蛍光タンパク質複合体をコードする遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクター。
（付記１８）
付記１５または１６記載の蛍光タンパク質複合体をコードする遺伝子または付記１７記載の発現ベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
【産業上の利用可能性】
【０２４９】
本発明によれば、前記第１蛍光タンパク質と前記蛍光タンパク質とを前述の条件で組合せることにより、例えば、外部からの励起光が、前記第２蛍光タンパク質の励起条件とは異なる場合や最大励起波長から外れている場合であっても、前記第１蛍光タンパク質の発光による励起により、前記第２蛍光タンパク質を発光することができる。このため、本発明によれば、例えば、蛍光タンパク質を単独で使用する場合と比較して、より広い光学的条件の設定が可能になる。
【図１】
2018100803.tif 000071
【図２】
2018100803.tif 000072
【図３】
2018100803.tif 000073
【図４】
2018100803.tif 000074
【図５】
2018100803.tif 000075
【配列表】
2018100803000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月15日(2019.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１蛍光タンパク質と第２蛍光タンパク質とを含み、
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが連結されており、
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質との組み合わせは、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とが、重複している組み合わせであることを特徴とする蛍光タンパク質複合体。
【請求項２】
前記第２蛍光タンパク質は、
前記第１蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ１）で前記第２蛍光タンパク質を励起した際の発光強度（Ｉ２Ｅ１）と、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）で前記第２蛍光タンパク質を励起した際の発光強度（Ｉ２Ｌ１）とが、Ｉ２Ｅ１＜Ｉ２Ｌ１の関係を満たすタンパク質である、請求項１記載の蛍光タンパク質複合体。
【請求項３】
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが、異なるタンパク質である、請求項１または２記載の蛍光タンパク質複合体。
【請求項４】
前記第１蛍光タンパク質の最大励起波長と前記第２蛍光タンパク質の最大励起波長とが異なる、請求項３記載の蛍光タンパク質複合体。
【請求項５】
前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とが、３５０〜６５０ｎｍの波長を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質複合体。
【請求項６】
前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）が、前記第２蛍光タンパク質の最大励起波長（Ｅ２ｍａｘ）を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質複合体。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質複合体に、前記蛍光タンパク質複合体における前記第１蛍光タンパク質の励起波長の光を照射する工程を含み、
前記第１蛍光タンパク質に、前記第１蛍光タンパク質の励起波長の光を照射することで、前記第１蛍光タンパク質を発光させ、
前記第１蛍光タンパク質の発光により、前記蛍光タンパク質複合体における前記第２蛍光タンパク質を励起して、前記第２蛍光タンパク質を発光させることを特徴とする蛍光タンパク質の発光方法。
【請求項８】
第１蛍光タンパク質をコードする第１核酸配列と、第２蛍光タンパク質をコードする第２核酸配列とを含み、
前記第１核酸配列と前記第２核酸配列とは、前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質とが連結された複合体として発現されるように、連結されており、
前記第１蛍光タンパク質と前記第２蛍光タンパク質の組み合わせは、前記第１蛍光タンパク質の蛍光波長（Ｌ１）と、前記第２蛍光タンパク質の励起波長（Ｅ２）とが、重複している組み合わせであることを特徴とする、蛍光タンパク質複合体をコードする遺伝子。
【請求項９】
請求項８記載の蛍光タンパク質複合体をコードする遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８記載の蛍光タンパク質複合体をコードする遺伝子または請求項９記載の発現ベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
【国際調査報告】
2018100803.tif 000076
2018100803.tif 000077
2018100803.tif 000078