(57)【要約】  個々の細胞の活性を定量的に評価する方法、及びそれに用いる装置を提供する。  細胞導入部と、細胞配置部と、観察部と、解析部とを備え、前記細胞導入部は、前記細胞配置部に１個又は複数個の細胞を導入し、前記細胞配置部は、導入された前記１個又は複数個の細胞を配置し、前記観察部は、前記細胞配置部における細胞接触による経時的な事象を観察し、前記解析部は、前記細胞接触による経時的な事象を解析する、細胞観察装置である。
2017169267.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞導入部と、細胞配置部と、観察部と、解析部とを備え、
前記細胞導入部は、前記細胞配置部に１個又は複数個の細胞を導入し、
前記細胞配置部は、導入された前記１個又は複数個の細胞を配置し、
前記観察部は、前記細胞配置部における細胞接触による経時的な事象を観察し、
前記解析部は、前記細胞接触による経時的な事象を解析する、
細胞観察装置。
【請求項２】
前記細胞導入部及び／又は前記細胞配置部に薬剤を添加する薬剤添加部を備える、請求項１に記載の細胞観察装置。
【請求項３】
前記細胞接触による経時的な事象は、細胞の移動、細胞の移動スピードの変化、細胞の形態変化、細胞の分泌物放出、細胞の捕食、細胞死、細胞増殖、細胞から発する蛍光強度の変化、細胞間の距離の変化、細胞内顆粒の生成及び細胞内顆粒の局在化からなる群から選択される、請求項１に記載の細胞観察装置。
【請求項４】
前記細胞接触による経時的な事象は明視野像、位相差像、蛍光像、屈折率像からなる群から選択される像を用いて観察される、請求項１に記載の細胞観察装置。
【請求項５】
前記細胞は免疫細胞及び／又はがん細胞である、請求項１に記載の細胞観察装置。
【請求項６】
前記細胞配置部は複数のウェルを有し、各ウェルに前記免疫細胞が１個又は複数個配置される、請求項５に記載の細胞観察装置。
【請求項７】
前記ウェルに、前記がん細胞が１個又は複数個配置される、請求項６に記載の細胞観察装置。
【請求項８】
単一免疫細胞に複数のがん細胞を接触させ、
前記単一免疫細胞が既定の時間内に致死させたがん細胞の数を調べることを含む、
免疫細胞の活性度の評価方法。
【請求項９】
単一免疫細胞に複数のがん細胞を接触させ、
前記単一免疫細胞が致死させたがん細胞の数を調べ、
前記単一免疫細胞が、既定の時間内に、既定の数未満のがん細胞を致死させた場合又は既定の数を超えたがん細胞を致死させた場合、該単一免疫細胞を排除する、
免疫細胞の品質管理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞観察装置、免疫細胞の活性度の評価方法及び免疫細胞の品質管理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、複数の種類の細胞が関わる細胞傷害アッセイでは、放射性同位元素用いた手法（Cr51 release assay）が用いられていたが、操作面で制約があるとともに、煩雑な作業を必要としていた。また、傷害する細胞に一度Cr51を取り込ませる必要があり、その程度が細胞の種類によって異なるため、測定精度のバラツキの要因となっていた。【０００３】
放射性同位体を用いない手法であるLactate Dehydrogenase (LDH) Assayでは、細胞から放出された乳酸脱水素酵素（LDH）を測定することにより細胞への傷害を測定することができる。しかし、この手法では、ターゲット細胞とエフェクター細胞のどちらの傷害を測定できているかを区別することはできず、バックグラウンドノイズが高いという問題があった。また、バルクのシグナル変化を測定するのみであり、個々のエフェクター細胞がいくつのターゲット細胞を傷害しているかを測定することはできなかった。【０００４】
ところで、近年、がんを治療する免疫療法が確立されつつあり、増殖された質の良い免疫細胞が求められている。免疫細胞は、がん細胞を傷害または捕食するが、その傷害性については、定性的に評価されるのみである（非特許文献１）。【０００５】
また、免疫細胞とがん細胞とを接触させてがん細胞を傷害し、蛍光によって評価する細胞接触アッセイも行われているが（非特許文献２）、１個の免疫細胞が何個のがん細胞を傷害するかを具体的に特定するアッセイは、開示されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Immunity. 2015 May 19, 42(5):864-76
【非特許文献２】Bioinformatics. 2015 Oct 1;31(19):3189-97
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明者らは、鋭意研究の結果、細胞をバルクではなく、細胞個々についての活性を定量的に評価する方法、及びそれに用いる装置を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本技術は、
細胞導入部と、細胞配置部と、観察部と、解析部とを備え、
前記細胞導入部は、前記細胞配置部に１個又は複数個の細胞を導入し、
前記細胞配置部は、導入された前記１個又は複数個の細胞を配置し、
前記観察部は、前記細胞配置部における細胞接触による経時的な事象を観察し、
前記解析部は、前記細胞接触による経時的な事象を解析する、
細胞観察装置を提供する。
また、前記細胞観察装置は、前記細胞導入部及び／又は前記細胞配置部に薬剤を添加する薬剤添加部を備えてもよい。
前記細胞接触による経時的な事象は、細胞の移動、細胞の移動スピードの変化、細胞の形態変化、細胞の分泌物放出、細胞の捕食、細胞死、細胞増殖、細胞から発する蛍光強度の変化、細胞間の距離の変化、細胞内顆粒の生成及び細胞内顆粒の局在化からなる群から選択される。
また、前記細胞接触による経時的な事象は明視野像、位相差像、蛍光像及び屈折率像からなる群から選択される像を用いて観察される。
更に、前記細胞は免疫細胞及び／又はがん細胞である。
前記細胞配置部は複数のウェルを有し、各ウェルに前記免疫細胞が１個又は複数個配置され、また、前記ウェルに、前記がん細胞が１個又は複数個配置されてもよい。【０００９】
本技術は、単一免疫細胞に複数のがん細胞を接触させ、
前記単一免疫細胞が既定の時間内に致死させたがん細胞の数を調べることを含む、
免疫細胞の活性度の評価方法も提供する。【００１０】
更に、本技術は、
単一免疫細胞に複数のがん細胞を接触させ、
前記単一免疫細胞が致死させたがん細胞の数を調べ、
前記単一免疫細胞が、既定の時間内に、既定の数未満のがん細胞を致死させた場合又は既定の数を超えたがん細胞を致死させた場合、該単一免疫細胞を排除する、
免疫細胞の品質管理方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本技術によれば、単一細胞による細胞傷害や捕食等を観察でき、該単一細胞の活性を定量的に評価でき、またその評価に基づいて用途に適切な細胞を選択することができる。
なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本技術に係る細胞観察装置の模式図である。
【図２】本技術に係る細胞観察及び解析の例を示す概略図である。
【図３】本技術に係る細胞観察及び解析の例を示すフローチャートである。
【図４】本技術に係る細胞観察装置の観察部の動作を示すフローチャートである。
【図５】がん細胞死率を時間経過で追った模擬的なグラフである。
【図６】細胞傷害性T細胞の動きの変化の活発さを示す模擬的なグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．細胞観察装置
１−１．装置の構成
１−２．細胞観察及び解析の例
１−３．データ解析
２．免疫細胞の活性度の評価方法
２−１．細胞傷害アッセイによる評価
２−２．分泌物放出アッセイによる評価
２−３．抗体依存性細胞傷害による評価
２−４．応用例１
２−５．応用例２
３．免疫細胞の品質管理方法
【００１４】
＜１．細胞観察装置＞
１−１．装置の構成
本技術の細胞観察装置の一例を模式的に図１に示す。
本技術の細胞観察装置は、少なくとも細胞導入部１０２と、細胞配置部１０３と、観察部１０４と、解析部１０５とを備える。これに、好ましくは薬剤添加部１１４を備え、細胞観察装置１０００の主要部１００（太線で囲んだ部分）とする。
【００１５】
細胞導入部１０２の上流に、細胞分集部１０１を備えることができる。
細胞分集部１０１は、該部に入れた細胞を１つ又は複数のパラメーターによって区別して、あらかじめ設定された細胞のタイプを分けて集める。
前記パラメーターとして、例えば、細胞の蛍光強度、サイズ、形態、電気特性が挙げられる。
細胞分集部１０１に用いる具体的な装置として、例えば、FACS、フィルターが挙げられる。
なお、細胞分集部１０１の設置は任意であり、細胞のタイプごとに予め分けて細胞を次に細胞導入部１０２に導入することも可能である。
【００１６】
細胞導入部１０２は、前記細胞分集部１０１で準備した細胞を、細胞配置部１０３へ導入する流路を持つ。
細胞導入部１０２には薬剤を添加することもでき、各細胞種類ごとに別の薬剤を添加するようにしてもよい。
細胞導入部１０２の細胞導入方法は、例えば、下流の細胞配置部１０３側からの細胞の吸引による。
また、前記薬剤の例としては、分子標的薬や免疫チェックポイント阻害剤（抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体等）等の抗がん剤、インターロイキン（IL-2等）、インターフェロン（IFN-γ等）が挙げられる。
【００１７】
細胞配置部１０３は、ウェルが備えられており、導入された１種類又は複数種類の細胞を混ぜてウェルに配置する。ウェルの数は特に限定されないが、数十個〜数万個以上と幅広く設定できる。ウェルの具体例として、例えば吸引ウェル、沈降ウェルが挙げられる。
細胞配置部１０３には、前記薬剤を導入することができ、細胞導入部１０１を介さずに細胞配置部１０３に直接薬剤を導入してもよい。
ウェルに入れる細胞数は、１個又は複数個でもよい。
また、細胞配置部は、後述の細胞環境制御部１１３により、酸素、温度、pH等の細胞環境が制御されるようにしてもよい。
【００１８】
細胞配置部１０３の各ウェルに入れられた複数の細胞は、細胞同士の接触が起こり、何らかの事象が生じる。事象は、例えば細胞の移動、細胞の移動スピードの変化、細胞の形態変化、細胞の分泌物放出、細胞の捕食、細胞死、細胞増殖、細胞から発する蛍光強度の変化、細胞間の距離の変化、細胞内顆粒の生成及び細胞内顆粒の局在化等が挙げられる。
例えば、各ウェルに免疫細胞とがん細胞と入れると、免疫細胞ががん細胞に接触して細胞傷害を起こし、がん細胞を死に至らしめる。
免疫細胞としては、例えば、ナチュラルキラー（NK）細胞、T細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、キラーT細胞等が挙げられる。これらのうち１種類を選択してもよいし、複数選択してもよい。
【００１９】
観察部１０４は、細胞配置部１０３に配置された細胞を経時的に観察する。この観察では、前記細胞接触による事象を追跡することができる。
観察方法は特に限定されないが、例えば明視野像、位相差像、蛍光像、屈折率像を利用して行う。蛍光染色を利用した場合、例えば、がん細胞に予めGFP等の蛍光タンパク質が発現されるように遺伝子組み換えしておき、がん細胞が免疫細胞に傷害または捕食され死に至る過程を蛍光で追跡することができる。観察は、例えば数分〜数日間、連続して行う。
また、観察部１０３に用いる具体的な装置として、顕微鏡、CMOS等のイメージセンサーが挙げられる。
【００２０】
解析部１０５は、観察部で取得しているデータ、例えば画像データを解析する。データは、前記細胞の移動、接触、形態変化、分泌物放出、捕食、死及び増殖を表す画像等であり、これらを数値化、グラフ化することができる。
解析部１０５に用いる具体的な装置として、例えばパーソナルコンピュータ及び解析のためのプログラムが挙げられる。
また、解析は、観察される事象をリアルタイムで行ってもよいし、観察される事象を取得しデータとして保存してから解析してもよい。
解析例については後述する。
【００２１】
また、本技術の細胞観察装置は、データ保存部１０７を備えてもよい。
データ保存部１０７は、前記観察データ及び前記解析データを保存する。
データ保存部１０７に用いる具体的な装置として、サーバーやメモリーディスク等が挙げられる。
更に、データ保存部１０７の下流にデータベース１１５を備え、各種データを蓄積して、過去のデータの検索、抽出等を行えるようにしてもよい。
【００２２】
あるいは、本技術の細胞観察装置は、解析部１０５の下流に比較部１１６を有してもよい。比較部１１６は、例えば解析部１０５のデータと、コーントロールデータ又は過去の解析データとを比較することができる。
比較部１１６に用いる具体的な装置として、例えばデータベース参照パーソナルコンピュータ及びプログラムが挙げられる。
【００２３】
また、表示部１０６を備えることもできる。
表示部１０６は、前記観察データ及び前記解析データを表示する。
表示部１０６に用いる具体的な装置として、PCモニター等が挙げられる。
【００２４】
細胞接触の観察が終わると、細胞配置部１０３のウェル内の細胞を取り出すことができる。例えば、細胞取り出し部１０８を備え、前記解析で特定した細胞を取り出す。
細胞取り出し部１０８に用いる具体的な装置として、ピペット等が挙げられる。
【００２５】
取り出した細胞は、細胞保持部１０９で保持する。細胞保持部１０９は、例えば細胞の種類に応じて複数あってもよい。細胞保持部１０９は、細胞に応じて、細胞環境制御部１１３により、酸素、温度、pH等について制御される。
また、細胞保持部１０９は、薬剤添加部１１４から試薬が添加されるようにすることもできる。
あるいは、下流の遺伝子解析部１１０での遺伝子解析のための前処理を行うこともできる。
細胞保持部１０９に用いる具体的な装置として、９６穴プレート等が挙げられる。
【００２６】
遺伝子解析部１１０は、前記細胞保持部１０９で保持されている細胞を遺伝子解析する。
遺伝子解析部１１０に用いる具体的な装置として、例えば、DNAシークエンサー、RNAシークエンサーが挙げられる。
【００２７】
また、本技術の細胞観察装置には、流路プライミング部１１１、及びチップ設置部１１２を備えてもよい。
流路プライミング部１１１は、流路チップを準備する。流路プライミング部１１１は、例えば、気泡をなくすための動作や塗れ性改善動作（例：エタノールを流してから水やバッファーで洗浄する）を行うことができる。
チップ設置部１１２は、流路プライミング部１１１で洗浄した流路チップを、細胞配置部に細胞が配置されるよう、正しく取り付ける。
【００２８】
更に、前述のように、細胞環境制御部１１３を備えてもよい。細胞環境制御部１１３は、細胞配置部１０３及び細胞保持部１０９に入っている細胞の環境を調整、制御する。
細胞環境制御部１１３に用いる具体的な装置として、例えばCO2・O2レグレター、温調装置、培地交換装置が挙げられる。
【００２９】
また、薬剤添加部１１４は、細胞導入部１０２、細胞配置部１０３、細胞保持部１０９にそれぞれ別の薬剤又は試薬を入れることができる。同じ部に複数の薬剤又は試薬を入れてもよい。
薬剤添加部１１４に用いる具体的な装置として、例えばサンプラー（ピペット）、マイクロ流路が挙げられる。
薬剤又は試薬の具体例としては、サイトカイン等の細胞活性化剤、免疫細胞に傷害又は捕食されるがん細胞、がん抗原、がん細胞への有効性を調べる薬剤、抗がん剤、染色試薬、細胞分散試薬、あるいは、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、アレルゲン等が挙げられる。
【００３０】
１−２．細胞観察及び解析の例
サンプルから目的細胞を分取し、本技術の細胞観察装置にて観察・解析するまでの一連の流れの例を図２に示す。
【００３１】
サンプルには複数種の細胞、例えば調節性T細胞（Treg）２０１、骨髄由来抑制細胞（MDSC）２０２、樹状細胞（DC）２０３、細胞傷害性T細胞（CTL）２０４、がん細胞２０５が含まれる。
該サンプルをフローサイトメーター２０００によりソーティングし、細胞の種類ごとに分取する（例えば細胞傷害性T細胞２０４、がん細胞２０５）。ここで、がん細胞は、がん細胞の種類に特異的な抗体２０６を用いて、がん細胞の種類を特定してもよい。
【００３２】
分取された細胞傷害性T細胞２０４とがん細胞２０５を、前記細胞導入部１０２から、細胞配置部１０３のウェル１０３１に配置する。
その後、経時的な観察を行うが、観察はウェル１０３１ごとに行ってもよいし、細胞配置部１０３全体で行ってもよい。あるいは、細胞配置部１０３をいくつかのパートに区切って、パートごとに異なる種類の細胞を導入して観察することもできる。
【００３３】
ウェル１０３１内では、細胞傷害性T細胞２０４のがん細胞２０５に対する攻撃、及びがん細胞死が生じる。この一連の事象をCMOS等で観察し、データを記録する。
【００３４】
図３に、本技術に係る細胞分集から細胞反応解析までのフローチャートを示す。
まず、細胞サンプル（S301）をフローサイトメーターにかけ、細胞の種類ごとに細胞分集する（S302）。
一方の細胞は、そのまま本技術に係る細胞観察装置１０００の細胞導入部１０２に導入される（S303）。
他方の細胞は、細胞観察装置１０００の薬剤添加部１１４から供給される薬剤で処理され(S304)、細胞導入部１０２に導入される（S305）。
【００３５】
細胞は、細胞導入部１０２から細胞配置部１０３の各ウェルに、所望の数が配置される(S306)。
細胞配置部１０３に配置された細胞は、細胞接触による反応、分泌物放出、捕食、細胞死等を起こし、これらの事象が観察部１０４で経時的に観察される。例えば、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、CCD、CMOS等で観察され（S307）、データとして記録することができる。
【００３６】
１−３．データ解析
例えば、細胞接触による反応から得られたデータは、解析部１０５で解析される（S308）。
解析部１０５の動作の例を図４に示す。
蛍光画像データを解析する場合（S401）、データの画像処理を行う（S402）。画像処理は、例えば、コントラスト調整、画像閾値セグメンテーション、ノイズ処理、ボーダー排除等である。
【００３７】
次に、細胞識別処理を行う（S403）。細胞識別処理では、細胞の種類の違いを識別し、種類ごとに分ける。例えば、色や大きさ、質感等のテクスチャ等で識別し、分けることができる。細胞識別処理により、該処理が終わる際、検出された細胞について、それまでの時間の一定間隔ごと及び種類ごとに位置情報を求めることもでき(S404)、データの１つとなり得る。
【００３８】
次に、事象検出処理を行う（S405）。事象検出処理は、細胞の相互作用によって生じる事象を検出する。事象としては、例えば、細胞の色の変化（Apoptosis反応試薬）、細胞の形態変化（Apoptosis形態変化）、又は２種類の細胞のco-localization（免疫細胞が緑色に発色しているとすると、免疫細胞の緑色の中にがん細胞から発色する赤色が一定の割合入っている）、接触（免疫細胞とがん細胞の境界が一定以下の距離になっている）等が挙げられる。これらの事象を一定の時間ごとに検出する。これらの事象は経時的に観察されるため、事象の定義や判定は、ある程度、曖昧になったり、判定時が異なる事象間で重複することもあり得る。
また、これら事象は、細胞ごとに検出、算出してもよいし、細胞配置部１０３のウェルに導入された細胞をまとめて検出、算出してもよい（S406）。例えば、図５（模擬グラフ）に示すように、全ウェルでのがん細胞死率を時間経過で追った累積のグラフ（207）で表すことができる。
【００３９】
事象が検出されると（S407）、次に、事象が検出された細胞について、画像データから更に分析したい部分を抜き出すため、蛍光を定量するため等のことから、Region of interests（ROI）機能を有する画像解析装置でROIを作成する（S408）。ROI作成の際は細胞の大きさに合致させて作成してもよいし、細胞のサイズに対して任意の大きさで作成してもよい。また、ROIの形は特に限定されない。
【００４０】
次に、作成されたROI内での細胞の動きを、その事象の前後に解析し、動きの指標を算出し、評価する（S409）。細胞の動きの指標として、ROIフレーム間の移動累積距離、自動多変量画像解析（MVA）による動き評価等が挙げられる。例えば、図６（模擬グラフ）に示すように、各ウェルにおける細胞傷害性T細胞の動きの変化（S410）の活発さを指標で表してグラフ化（208）することができる。
【００４１】
その他のデータの表示例としては、例えば、特定の事象が起こる前後の細胞の動きの分布情報、細胞ごとの動きの追跡の画像表示、免疫細胞あたりの致死したがん細胞数、特定の事象の経過時間の表示等が挙げられる。
【００４２】
＜２．免疫細胞の活性度の評価方法＞
２−１．細胞傷害アッセイによる評価
本技術の細胞観察装置を用いて、前述のように、免疫細胞（NK細胞、T細胞、マクロファージ、樹状細胞等）をがん細胞に接触させ、がん細胞への傷害を生じさせ、そのときの免疫細胞の活性評価、免疫細胞とがん細胞の傷害相性の評価等を行うことができる。
【００４３】
具体的には、例えば、以下の計算方法で評価することができる。
がん細胞生存割合の算出：細胞接触後の生存がん細胞数／全がん細胞数
がん細胞死割合の算出：  細胞接触後の致死がん細胞数／全がん細胞数
免疫細胞生存割合の算出：細胞接触後の生存免疫細胞数／全免疫細胞数
免疫細胞死割合の算出：  細胞接触後の致死免疫細胞数／全免疫細胞数
更に、
接触細胞数／非接触細胞数、又は接触細胞数／全細胞数
で、細胞接触アッセイの効率を表すことができる。
【００４４】
前記計算方法の場合、バックグラウンドとして、ネガティブコントロールを取ることが好ましい。
ここで、ネガティブコントロールは、
がん細胞生死判定の場合：免疫細胞を含まない又はネガティブとなる細胞
免疫細胞生死判定の場合：がん細胞を含まない又はネガティブとなる細胞
抗がん剤評価の場合：    抗がん剤を含まない又は反応を起こさない分子
である。
なお、細胞接触による反応開始前時点での細胞数を、１００％生存しているものとする。
また、
細胞接触によるがん細胞死の割合の算出：細胞接触後の致死がん細胞数/細胞接触をした全がん細胞数
細胞接触後のがん細胞生存の割合の算出：細胞接触後の生存がん細胞数/細胞接触をした全がん細胞数
で、細胞接触を起こしたがん細胞に限定して、生死割合を算出することができる。この場合、バックグランドを取らずに、免疫細胞によるがん細胞の生死を算出することができる。
【００４５】
免疫細胞とがん細胞の識別は、例えば、形態、大きさ、蛍光等による染色、動きで行うことができる。
また、細胞接触の判定は、例えば、接触時間、細胞の動きの停止（移動スピード）、顆粒の局在化、異なる蛍光色素をもつ細胞同士の隣接化（蛍光染色）で行うことができる。
細胞死の判定は、例えば、細胞の形態変化、細胞死判定色素のシグナル増強（蛍光染色）で行うことができる。
なお、当該評価は、リアルタイムで細胞を観察、解析して行うことも可能である。
【００４６】
２−２．分泌物放出アッセイによる評価
分泌物放出アッセイでは、細胞接触に伴う細胞からの分泌物放出有無の評価を行う。
細胞接触の判定については、前述のとおりである。
分泌物放出の判定は、例えば、細胞形態変化、顆粒生成、分泌物のイムノアッセイ、カルシウム等の既存アッセイで行うことができる。
【００４７】
２−３．抗体依存性細胞傷害による評価
Antibody-Dependent-Cellular-Cytotoxicity(ADCC)を適用して免疫細胞の活性度を評価することができる。
例えば、抗体を介した免疫細胞（NK細胞、T細胞、マクロファージ、樹状細胞等）による、がん細胞への傷害を観察する。
抗体依存性細胞傷害による評価は、例えば、がん細胞と抗体の結合評価、抗体と免疫細胞の結合評価及び活性化評価、免疫細胞によるがん細胞への傷害評価等を行って判断することができる。
【００４８】
また、がん細胞の死だけではなく、抗体を介した免疫細胞とがん細胞のインタラクションの軌跡を見てもよい。
例えば、抗がん剤の有効性の機序について調べることができる。
具体的には、NK細胞とがん細胞との接触時間を測定、観察し、抗体のFc部分とNK細胞に発現しているFcγIIIの親和性をみればよい。
また、NK細胞の細胞質にあるパーフォリンやグランザイム等のタンパク質の発現誘導、顆粒の生成についてみればよい。
更に、パーフォリン等のタンパク質の標的細胞への侵入をみてもよい。
また更に、がん細胞の細胞死誘導、アポトーシスの非誘導を調べてもよい。
【００４９】
２−４．応用例１
本技術を応用して、創薬時の抗がん剤評価をすることもできる。
例えば、ウェルに配置されたがん細胞に候補の抗がん剤を投与し、同じウェルに免疫細胞（例えばNK細胞、細胞傷害性T細胞）を導入する。それにより生じる事象を本技術により観察、解析し、がん細胞の生死判断を行う。
また、免疫療法の場合は、免疫細胞を増殖し、がん細胞に増殖した免疫細胞を投与し、がん細胞の変化を観察して効果を確認することができる。更に、がん免疫チェックポイント阻害剤に本技術を適用してもよい。
【００５０】
２−５．応用例２
本技術を応用して、がん細胞と腫瘍内浸潤リンパ球（Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL)）の反応によるT細胞受容体（TCR）の選択をすることもできる。
まず、がん細胞からTILを単離するか、血液からT細胞を単離する。
次に、単離したTIL又はT細胞を、IL-2やIFN-γ等で処理する。
一方、がん細胞を免疫チェックポイント阻害剤（例えば、オプジーボ（登録商標））で処理する。
処理したTIL又はT細胞と、処理したがん細胞とを接触させ、本技術により観察、解析して、がん細胞のがん抗原に対して特異的な反応を示すTIL又はT細胞の個体を識別する。
識別された細胞を単離し、その細胞が有するDNA、RNA等の配列解析を行い、TCRを特定する。
【００５１】
本技術を応用することにより、TILやT細胞等の免疫細胞の数が少なくても前記応用例等を行うことができ、かつ使用する薬剤や試薬も少量で済む。
【００５２】
＜３．免疫細胞の品質管理方法＞
近年、がんの免疫療法が注目され、免疫細胞を生体外で増殖し、活性化後、体内へ投与する過程が必要とされている。
本技術は、増殖した免疫細胞を、バルクではなく、単一細胞ごとに品質評価、管理することにも適用できる。
具体的には、本技術の免疫細胞の品質管理方法は、
単一免疫細胞に複数のがん細胞を接触させ、
前記単一免疫細胞が傷害又は捕食したがん細胞の数を調べ、
前記単一免疫細胞が、既定の時間内に、既定の数未満のがん細胞を捕食した場合又は既定の数を超えたがん細胞を傷害又は捕食した場合、該単一免疫細胞を排除する、
ことで行うことができる。
【００５３】
ここで、生体から単離した免疫細胞の活性度の評価を、本技術を用いて行うとどのようなデータが出るかの模擬例を示す。
生体由来の免疫細胞の活性度を評価する場合、様々な種類の免疫細胞を含む多様な細胞群となる。その場合、個々の免疫細胞とターゲット細胞との相性に依存して、細胞傷害数が異なってくる。
そこで、例えば、免疫細胞１個ごとにID番号を付し、ウェルに免疫細胞１個を配置し、更にがん細胞を１０個程度配置したときに、その免疫細胞ががん細胞を何個傷害するかを、本技術を用いて観察、解析した場合、以下の表１に示すデータが想定される。
【００５４】
【表１】
2017169267.tif 000003
【００５５】
免疫細胞の品質管理を行う際、免疫細胞の活性が強すぎても、弱すぎても好ましくない。活性が強すぎる免疫細胞は、免疫細胞を被験者に投与したときに、例えば自己免疫疾患のような症状を起こすことがあるからである。また、活性が弱すぎる免疫細胞は、免疫細胞を被験者に投与しても、免疫細胞としての機能が十分に発揮されないからである。
【００５６】
前記表１の模擬例では、例えば、細胞傷害数の範囲４以上６以下を示す単一免疫細胞を選択することができる。
従来の品質管理は、バルクでおこなわれていたため、表１に示すように、細胞傷害数の範囲が４以上６以下の免疫細胞が存在しても、それを排除することはできなかった。つまり、バルク全体として良好な活性を示していても、個々の免疫細胞でみると、活性の高い免疫細胞も活性の低い免疫細胞も混在していた。
【００５７】
本技術は、免疫細胞の製造中の品質管理にも適用することができる。
免疫細胞の製造において、保存状態等を適切に管理し、製造された全体としての細胞の品質が高いことを確認する必要がある。
その一方で、免疫細胞の製造過程において細胞の活性化が不均一な場合も起こり得るので、個々の細胞としても、品質が高いことを確認する必要がある。
本技術によれば、単一細胞レベルで細胞評価をすることで、細胞の品質管理を行うことができる。
【００５８】
ここで、免疫細胞製造中の品質管理のための免疫細胞の活性度の評価を、本技術を用いて行うとどのようなデータが出るかの模擬例を表２に示す。
【００５９】
【表２】
2017169267.tif 000004
【００６０】
前述したように、従来のバルクでの品質管理では、極めて活性が高い（極高）と極めて活性が低い（極低）が混在した免疫細胞を排除できないが、本技術によれば、細胞傷害数の範囲４以上６以下のサンプルを選択することができる。
なお、免疫細胞を患者に投与する直前の品質管理も同様に行うことができる。
【００６１】
なお、本技術は、以下のような構成も採ることができる。
〔１〕細胞導入部と、細胞配置部と、観察部と、解析部とを備え、
前記細胞導入部は、前記細胞配置部に１個又は複数個の細胞を導入し、
前記細胞配置部は、導入された前記１個又は複数個の細胞を配置し、
前記観察部は、前記細胞配置部における細胞接触による経時的な事象を観察し、
前記解析部は、前記細胞接触による経時的な事象を解析する、
細胞観察装置。
〔２〕前記細胞導入部及び／又は前記細胞配置部に薬剤を添加する薬剤添加部を備える、〔１〕に記載の細胞観察装置。
〔３〕前記細胞接触による経時的な事象は、細胞の移動、細胞の移動スピードの変化、細胞の形態変化、細胞の分泌物放出、細胞の捕食、細胞死、細胞増殖、細胞から発する蛍光強度の変化、細胞間の距離の変化、細胞内顆粒の生成及び細胞内顆粒の局在化からなる群から選択される、〔１〕又は〔２〕に記載の細胞観察装置。
〔４〕前記細胞接触による経時的な事象は蛍光色素を用いて観察される、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の細胞観察装置。
〔５〕前記細胞は免疫細胞及び／又はがん細胞である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の細胞観察装置。
〔６〕前記細胞配置部は複数のウェルを有し、各ウェルに前記免疫細胞が１個又は複数個配置される、〔５〕に記載の細胞観察装置。
〔７〕前記ウェルに、前記がん細胞が１個又は複数個配置される、〔６〕に記載の細胞観察装置。
〔８〕単一免疫細胞に複数のがん細胞を接触させ、
前記単一免疫細胞が既定の時間内に致死させたがん細胞の数を調べることを含む、
免疫細胞の活性度の評価方法。
〔９〕単一免疫細胞に複数のがん細胞を接触させ、
前記単一免疫細胞が致死させたがん細胞の数を調べ、
前記単一免疫細胞が、既定の時間内に、既定の数未満のがん細胞を致死させた場合又は既定の数を超えたがん細胞を致死させた場合、該単一免疫細胞を排除する、
免疫細胞の品質管理方法。
【符号の説明】
【００６２】
１００        主要部
１０１        細胞分集部
１０２        細胞導入部
１０３        細胞配置部
１０４        観察部
１０５        解析部
１０６        表示部
１０７        データ保存部
１０８        細胞取り出し部
１０９        細胞保持部
１１０        遺伝子解析部
１１１        流路プライミング部
１１２        チップ設置部
１１３        細胞環境制御部
１１４        薬剤添加部
１１５        データベース
２０１        調節性T細胞
２０２        骨髄由来抑制細胞
２０３        樹状細胞
２０４        細胞傷害性T細胞
２０５        がん細胞
２０６        抗体
２０７        がん細胞死率を時間経過で追った累積のグラフ
２０８        細胞傷害性T細胞の動きの変化のグラフ
１０００      細胞観察装置
１０３１      ウェル
２０００      フローサイトメーター
【図１】
2017169267.tif 000005
【図２】
2017169267.tif 000006
【図３】
2017169267.tif 000007
【図４】
2017169267.tif 000008
【図５】
2017169267.tif 000009
【図６】
2017169267.tif 000010
【国際調査報告】
2017169267.tif 000011
2017169267.tif 000012
2017169267.tif 000013
2017169267.tif 000014