(57)【要約】  本発明はアジュバントの新たな分類手法を提供する。一つの実施形態では、本発明は、アジュバントの器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法であって、該方法は：(A)２つ以上のアジュバントを用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得る工程；（B)該発現データについて、該アジュバントをクラスタリングする工程；および（C)該クラスタリングに基づいて、該アジュバントの該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成する工程を包含する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスクリプトームクラスタリングに基づいて、医薬成分を分類する工程を包含する医薬成分分類方法。
【請求項２】
前記分類する工程は、ａ）前記トランスクリプトームクラスタリングに基づいて基準成分を生成する工程と、ｂ）該基準成分に基づいて候補医薬成分を分類する工程とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記医薬成分は、有効成分、添加成分およびアジュバントからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記医薬成分は、アジュバントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記分類は、宿主応答に基づく分類、メカニズムに基づく分類、細胞（肝臓、リンパ節、脾臓）、メカニズムに基づく用途別の分類、およびモジュール分類からなる群より選択される少なくとも１つの特徴による分類をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記分類は、Ｇ１〜Ｇ６：
（１）Ｇ１（インターフェロンシグナリング）；
（２）Ｇ２（脂質およびリポタンパク質代謝性）；
（３）Ｇ３（ストレス応答性）；
（４）Ｇ４（創傷応答性）；
（５）Ｇ５（リン酸含有化合物代謝プロセス性）；および
（６）Ｇ６（ファゴソーム性）：
からなる群より選択される少なくとも１つの分類を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記医薬成分はアジュバントであり、前記Ｇ１〜Ｇ６の分類は、基準医薬成分のトランスクリプトームクラスタリングとの比較で行われ、
Ｇ１の基準医薬成分は、ＳＴＩＮＧリガンドであり、
Ｇ２の基準医薬成分は、シクロデキストリン類であり、
Ｇ３の基準医薬成分は、免疫反応性ペプチド類であり、
Ｇ４の基準アジュバントは、ＴＬＲ２リガンドであり、
Ｇ５の基準医薬成分は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、および／または
Ｇ６の基準医薬成分は、スクアレン水中油型エマルジョンアジュバントである、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｇ１〜Ｇ６の分類は、基準医薬成分のトランスクリプトームクラスタリングとの比較で行われ、
Ｇ１の基準成分は、ｃｄｉＧＭＰ、ｃＧＡＭＰ、ＤＭＸＡＡ、ＰｏｌｙＩＣおよびＲ８４８からなる群より選択され、
Ｇ２の基準医薬成分は、ｂＣＤ（βシクロデキストリン）であり、
Ｇ３の基準医薬成分は、ＦＫ５６５であり、
Ｇ４の基準医薬成分は、ＭＡＬＰ２ｓであり、
Ｇ５の基準医薬成分は、Ｄ３５，Ｋ３およびＫ３ＳＰＧからなる群より選択され、および／または
Ｇ６の基準医薬成分は、ＡｄｄａＶａｘである、
請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｇ１〜Ｇ６の分類は、トランスクリプトーム分析において発現に有意差がある遺伝子（識別マーカー遺伝子；ＤＥＧ）の発現プロファイルに基づいて行われ、
前記G1のＤＥＧは、Gm14446、Pml、H2-T22、Ifit1、Irf7、Isg15、Stat1、Fcgr1、Oas1a、Oas2、Trim12a、Trim12c、Uba7およびUbe2l6からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
前記G2のDEGは、Elovl6、Gpam、Hsd3b7、Acer2、Acox1、Tbl1xr1、Alox5apおよびGgt5からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
前記G3のDEGは、Bbc3、Pdk4、Cd55、Cd93、Clec4e、Coro1a、およびTraf3、Trem3、C5ar1、Clec4n、Ier3、Il1r1、Plek、Tbx3、およびTrem1からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
前記G4のDEGは、Ccl3、Myof、Papss2、Slc7a11、およびTnfrsf1bからなる群より選択される少なくとも1つを含み、
前記G5のDEGは、Ak3、Insm1、Nek1、Pik3r2、およびTtnからなる群より選択される少なくとも1つを含み、
前記G６のDEGは、Atp6v0d2、Atp6v1c1、およびClec7aからなる群より選択される少なくとも1つを含む、
請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
医薬成分を分類する方法であって、該方法は：
（ａ）候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）基準医薬成分セットを提供する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、該基準医薬成分セットの少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、
を包含する方法。
【請求項１１】
医薬成分を分類する方法であって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）請求項６〜８のいずれか一項に記載のＧ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準医薬成分セットを提供する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、
を包含する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
所望の機能を有する組成物の製造方法であって、
（Ａ）候補医薬成分を提供する工程、
（Ｂ）所望の機能に対応するトランスクリプトーム発現パターンを有する候補医薬成分を選択する工程、および
（Ｃ）選択された候補医薬成分を用いて組成物を製造する工程を包含する、組成物の製造方法。
【請求項１３】
所望の機能を有する組成物のスクリーニング方法であって、
（Ａ）候補医薬成分を提供する工程、および
（Ｂ）所望の機能に対応するトランスクリプトーム発現パターンを有する候補医薬成分を選択する工程を包含する、組成物の製造方法。
【請求項１４】
前記所望の機能は、請求項６〜８のいずれか一項に記載のＧ１〜Ｇ６のいずれか１つまたは複数を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
所望の機能を発揮するための組成物であって、該所望の機能を発揮する医薬成分を含み、該所望の機能は、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によって特定される分類の１つまたは複数を含む、組成物。
【請求項１６】
所望の機能を発揮するための組成物であって、該所望の機能を発揮する医薬成分を含み、該所望の機能は、請求項６〜８のいずれか一項に記載のＧ１〜Ｇ６のいずれか１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか一項一項に記載の方法を用いて、医薬成分の品質管理を行う方法。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか一項一項に記載の方法を用いて、医薬成分の安全性を試験する方法。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか一項一項に記載の方法を用いて、毒性ボトルネック遺伝子の候補を特定する工程と、
該毒性遺伝子を他の動物種において欠損させてノックアウト動物を作製する工程と、
該ノックアウト動物において毒性が減少または消失するかを決定し、減少または消失があった遺伝子を毒性ボトルネット遺伝子として選択する工程と
を含む、毒性ボトルネック遺伝子を提供する方法。
【請求項２０】
アジュバント等の候補医薬成分について、毒性ボトルネック遺伝子のうち少なくとも１つについて遺伝子発現の活性化が観察されるかを決定する工程と、
該活性化が観察された候補医薬成分を毒性有として判断する工程とを
含む、薬剤の毒性判定方法。
【請求項２１】
請求項１〜１１のいずれ一項一項に記載の方法を用いて、医薬成分の効果を判定する方法。
【請求項２２】
請求項１〜１１のいずれか一項一項に記載の方法を用いて、有効性判定遺伝子を特定する工程と、
該毒性遺伝子を他の動物種において欠損させてノックアウト動物を作製する工程と、
該ノックアウト動物において有効性が減少または消失するかを決定し、減少または消失があった遺伝子を有効性ボトルネット遺伝子として選択する工程と
を含む、有効性ボトルネック遺伝子を提供する方法。
【請求項２３】
アジュバント等の候補医薬成分について、有効性ボトルネック遺伝子のうち少なくとも１つについて遺伝子発現の活性化が観察されるかを決定する工程と、
該活性化が観察された候補薬剤を有効性有として判断する工程とを
含む、薬剤の有効性判定方法。
【請求項２４】
トランスクリプトームクラスタリングに基づいて、医薬成分を分類する工程を包含する医薬成分分類方法をコンピュータに実装させるプログラム。
【請求項２５】
トランスクリプトームクラスタリングに基づいて、医薬成分を分類する工程を包含する医薬成分分類方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納した記録媒体。
【請求項２６】
トランスクリプトームクラスタリングに基づいて、医薬成分を分類する分類部を包含する医薬成分分類するためのシステム。
【請求項２７】
医薬成分を分類する方法をコンピュータに実装させるプログラムであって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）基準医薬成分セットを計算する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、基準医薬成分セットの少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、
を包含するプログラム。
【請求項２８】
医薬成分を分類する方法をコンピュータに実装させるプログラムであって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）請求項６〜８のいずれか一項に記載のＧ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準医薬成分セットを提供する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、
を包含する請求項２７に記載のプログラム。
【請求項２９】
医薬成分を分類する方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納した記録媒体であって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）基準医薬成分セットを計算する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、基準医薬成分セットの少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、
を包含する、記録媒体。
【請求項３０】
医薬成分を分類する方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納した記録媒体であって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）請求項６〜８のいずれか一項に記載のＧ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準医薬成分セットを提供する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、
を包含する、請求項２９に記載の記録媒体。
【請求項３１】
医薬成分を分類するシステムであって、該システムは：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する候補医薬成分提供部；
（ｂ）基準医薬成分セットを計算する基準医薬成分計算部；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングするトランスクリプトームクラスタリング分析部；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、基準医薬成分セットの少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する判定部、
を包含するシステム。
【請求項３２】
医薬成分を分類するシステムであって、該システムは：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する候補医薬成分提供部；
（ｂ）請求項６〜８のいずれか一項に記載のＧ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準医薬成分セットを提供する基準医薬成分格納部；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングするトランスクリプトームクラスタリング分析部；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する判定部、
を包含する請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
医薬成分を、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法で特定される分類に使用するための遺伝子分析パネル。
【請求項３４】
アジュバントを請求項６〜８のいずれか一項に記載のＧ１〜Ｇ６またはそれ以外への分類に使用するための遺伝子分析パネルであって、該遺伝子分析パネルは、Ｇ１のＤＥＧ，Ｇ２のＤＥＧ、Ｇ３のＤＥＧ、Ｇ４のＤＥＧ、Ｇ５のＤＥＧおよびＧ６のＤＥＧからなる群より選択される少なくとも１つのＤＥＧを検出する手段を含み、
該G1のＤＥＧは、Gm14446、Pml、H2-T22、Ifit1、Irf7、Isg15、Stat1、Fcgr1、Oas1a、Oas2、Trim12a、Trim12c、Uba7およびUbe2l6からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
該G2のDEGは、Elovl6、Gpam、Hsd3b7、Acer2、Acox1、Tbl1xr1、Alox5apおよびGgt5からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
該G3のDEGは、Bbc3、Pdk4、Cd55、Cd93、Clec4e、Coro1a、およびTraf3、Trem3、C5ar1、Clec4n、Ier3、Il1r1、Plek、Tbx3、およびTrem1からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
該G4のDEGは、Ccl3、Myof、Papss2、Slc7a11、およびTnfrsf1bからなる群より選択される少なくとも1つを含み、
該G5のDEGは、Ak3、Insm1、Nek1、Pik3r2、およびTtnからなる群より選択される少なくとも1つを含み、
該G６のDEGは、Atp6v0d2,Atp6v1c1,およびClec7aからなる群より選択される少なくとも1つを含む、
遺伝子分析パネル。
【請求項３５】
前記遺伝子分析パネルは、少なくともＧ１のＤＥＧの検出手段、少なくともＧ２のＤＥＧの検出手段、少なくともＧ３のＤＥＧの検出手段、少なくともＧ４のＤＥＧの検出手段、少なくともＧ５のＤＥＧの検出手段および少なくともＧ６のＤＥＧの検出手段を含む、請求項３４に記載の遺伝子分析パネル。
【請求項３６】
医薬成分の器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法であって、該方法は：
２つ以上の医薬成分を用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得る工程；
該発現データについて、該医薬成分をクラスタリングする工程；および
該クラスタリングに基づいて、該医薬成分の該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成する工程
を包含する方法。
【請求項３７】
前記トランスクリプトーム分析は、前記医薬成分を前記対象生物に投与し、投与後一定時間で前記器官におけるトランスクリプトームを該医薬成分の投与前の該器官におけるトランスクリプトームと比較する工程、および該比較の結果発現が変動した遺伝子（ＤＥＧ）のセットを特定する工程を包含する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＤＥＧのセットを２つ以上の医薬成分において統合し、共通して変動するＤＥＧのセットを生成する工程を包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記比較の結果、前記共通して変動するＤＥＧのうち、発現が所定の閾値を超えて変動したＤＥＧを選択し、有意ＤＥＧのセットを生成する工程を包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記所定の閾値は、所定の倍数の相違および所定の統計学的有意（ｐ値）で特定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも２つ以上の器官について、前記トランスクリプトーム分析を行い、特定の器官でのみ発現が変動した遺伝子（ＤＥＧ）のセットを特定し、該セットを該器官特異的ＤＥＧセットとする工程を包含する、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記トランスクリプトーム分析は、肝臓、脾臓およびリンパ節からなる群より選択される少なくとも１つの器官におけるトランスクリプトームに対してなされる、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記医薬成分医薬成分の種類の数は、統計学的に有意なクラスタリング分析を可能とする数である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記プロファイルのうち、特定の医薬成分または医薬成分クラスターおよび特定の器官に特有の遺伝子マーカーの１または複数を医薬成分評価マーカーとして提供する工程を包含する、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記医薬成分について、生物学的指標を分析し、クラスターと相関づける工程をさらに包含する、請求項３６〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記生物学的指標は、創傷、細胞死、アポトーシス、NFκBシグナル経路、炎症応答、TNFシグナル経路、サイトカイン類、遊走、ケモカイン、化学走性、ストレス、防御応答、免疫応答、生来免疫応答、適合性免疫応答、インターフェロン類およびインターロイキン類からなる群より選択される少なくとも１つの指標を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記生物学的指標は、血液学的指標を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記血液学的指標は、白血球（ＷＢＣ）、リンパ球（ＬＹＭ）、単球（ＭＯＮ）、顆粒球（ＧＲＡ）、リンパ球の相対含有率％（ＬＹ％）、単球の相対含有率％（ＭＯ％）、顆粒球の相対含有率％（ＧＲ％）、赤血球（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（Ｈｂ、ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、赤血球分布幅（ＲＤＷ）、血小板（ＰＬＴ）、血小板濃度（ＰＣＴ）、平均血小板容積（ＭＰＶ）および血小板分布幅（ＰＤＷ）からなる群より選択される少なくとも1つを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記生物学的指標は、サイトカインプロファイルを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
医薬成分の器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法をコンピュータに実装するプログラムであって、該方法は：
（A）２つ以上の医薬成分を用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得る工程；
（B）該発現データについて、該医薬成分医薬成分をクラスタリングする工程；
（C）該クラスタリングに基づいて、該医薬成分医薬成分の該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成する工程
を包含する、プログラム。
【請求項５１】
医薬成分の器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法をコンピュータに実装するプログラムを格納した記録媒体であって、該方法は：
（A）２つ以上の医薬成分を用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得る工程；
（B）該発現データについて、該医薬成分をクラスタリングする工程；
（C）該クラスタリングに基づいて、該医薬成分の該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成する工程
を包含する、記録媒体。
【請求項５２】
医薬成分の器官トランスクリプトームプロファイルを生成するためのシステムであって、該システムは：
（A）２つ以上の医薬成分を用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得るまたは入力する発現データ獲得部；
（B）該発現データについて、該医薬成分をクラスタリングするクラスタリング演算部；
（C）該クラスタリングに基づいて、該医薬成分の該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成するプロファイリング部
を包含する、システム。
【請求項５３】
医薬成分の特徴情報を提供する方法であって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）機能が既知の基準医薬成分セットを提供する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；
（ｄ）該候補医薬成分が属するのと同一のクラスターに属する該基準医薬成分セットのメンバーの特徴を、該候補医薬成分の特徴として提供する工程、
を包含する方法。
【請求項５４】
請求項３６〜４９のいずれか一項に記載の特徴をさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
医薬成分の特徴情報を提供する方法をコンピュータに実装させるプログラムであって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）機能が既知の基準医薬成分セットを提供する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；
（ｄ）該候補医薬成分が属するのと同一のクラスターに属する該基準医薬成分セットのメンバーの特徴を、該候補医薬成分の特徴として提供する工程、
を包含する、プログラム。
【請求項５６】
医薬成分の特徴情報を提供する方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納する記録媒体であって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）機能が既知の基準医薬成分セットを提供する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；
（ｄ）該候補医薬成分が属するのと同一のクラスターに属する該基準医薬成分セットのメンバーの特徴を、該候補医薬成分の特徴として提供する工程、
を包含する、記録媒体。
【請求項５７】
医薬成分の特徴情報を提供するシステムであって、該システムは：
（ａ）候補医薬成分を提供する候補医薬成分提供部；
（ｂ）機能が既知の基準医薬成分セットを提供する基準医薬成分提供部；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングするトランスクリプトームクラスタリング解析部；
（ｄ）該候補医薬成分が属するのと同一のクラスターに属する該基準医薬成分セットのメンバーの特徴を、該候補医薬成分の特徴として提供する特徴分析部、
を包含する、システム。
【請求項５８】
請求項３６〜４９または請求項５３に記載の方法を用いて、医薬成分の品質管理を行う方法。
【請求項５９】
請求項３６〜４９または請求項５３に記載の方法を用いて、医薬成分の安全性を試験する方法。
【請求項６０】
請求項３６〜４９または請求項５３に記載の方法を用いて、医薬成分の効果を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬に用いられる成分（以下、特に断らない限り「医薬成分」といい、有効成分、添加成分、アジュバント等の成分をいう。）の特徴分析法および分類に関する。より特定すると、本発明はアジュバント等の医薬成分のトランスクリプトーム分析に基づく分類および特徴解析手法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬成分（たとえば、有効成分、添加成分、アジュバント等）または医薬自体の有効性および安全性（毒性）の評価は、その医薬に承認を与え、市場に流通させるかどうかを決めるのに重要な役割を果たす。【０００３】
有効成分については、原薬の段階から積極的に有効性、安全性について非臨床試験がなされている。しかしながら、追加の成分（添加成分）やアジュバントについては、積極的に試験がなされているというものではなく、現在では、経験ベースに基づき体系だった安全性・有効性の試験がなされているとはいえない。【０００４】
特に、アジュバント(Adjuvant)は、それ自体の薬効に注目が集まるというより、補助的な成分として認識されてきた。アジュバントとは、ラテン語の「助ける」という意味をもつ'adjuvare'という言葉を語源に持ち、ワクチンなどの主剤と一緒に投与して、その効果（例えば、免疫原性）を増強する目的で使用される物質（因子）の総称である。古典的なアジュバント（すなわち、免疫アジュバント）の開発研究の歴史は古く90年程度の歴史があるが、アジュバント自体のメカニズム等の研究は最近まであまり盛んではなかった。最近では、免疫学、微生物学の研究、自然免疫、樹状細胞の研究が起爆剤となり、研究開発が盛んに行われており、経験的に行われていたアジュバントの開発は、最近は分子から生体のレベルにいたるまで科学的なアプローチが可能となりつつある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、トランスクリプトーム分析の結果を、複数の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）についてクラスタリングすることで、各クラスターがその成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特徴ごとにクラスタリングされ、系統的に分類することができることを見出すことで完成した。また、既知の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）で典型的な基準医薬成分（有効成分の場合は基準有効成分、添加成分の場合は基準添加成分、アジュバントの場合は基準アジュバント）が存在することを見出し、新規物質または特定の作用効果もしくは機能（例えば、有効成分の有する薬効、添加成分の有する補助機能、アジュバント機能）未知の物質を別々の（例えば、６種類）カテゴリーに属するかまたはそれ以外のものであるかを特定できる技術も提供する。【０００６】
したがって、本発明は以下を提供する。
（項目ａ１）アジュバントの器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法であって、該方法は：（A)２つ以上のアジュバントを用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得る工程；（B)該発現データについて、該アジュバントをクラスタリングする工程；（C)該クラスタリングに基づいて、該アジュバントの該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成する工程を包含する方法。
（項目ａ２）前記トランスクリプトーム分析は、前記アジュバントを前記対象生物に投与し、投与後一定時間で前記器官におけるトランスクリプトームを該アジュバントの投与前の該器官におけるトランスクリプトームと比較する工程、および該比較の結果発現が変動した遺伝子（ＤＥＧ）のセットを特定する工程を包含する、項目ａ１に記載の方法。
（項目ａ３）前記ＤＥＧのセットを２つ以上のアジュバントにおいて統合し、共通して変動する遺伝子（ＤＥＧ）のセットを生成する工程を包含する、項目ａ２に記載の方法。
（項目ａ４）前記比較の結果、発現が所定の閾値を超えて変動した遺伝子を特定し、特定された遺伝子のうち前記共通して変動する遺伝子を選択し有意ＤＥＧのセットを生成する工程を包含する、項目ａ３に記載の方法。
（項目ａ５）前記所定の閾値は、所定の倍数の相違および所定の統計学的有意（ｐ値）で特定される、項目ａ４に記載の方法。
（項目ａ６）少なくとも２つ以上の器官について、前記トランスクリプトーム分析を行い、特定の器官でのみ発現が変動する遺伝子のセットを特定し、該セットを該器官特異的遺伝子セットとする工程を包含する、項目ａ２〜５のいずれか1項に記載の方法。
（項目ａ７）前記トランスクリプトーム分析は、肝臓、脾臓およびリンパ節からなる群より選択される少なくとも１つの器官におけるトランスクリプトームに対してなされる、項目ａ１〜６のいずれか1項に記載の方法。
（項目ａ８）前記アジュバントの数は、統計学的に有意なクラスタリング分析を可能とする数である、項目ａ1〜７のいずれか1項に記載の方法。
（項目ａ９）前記プロファイルのうち、特定のアジュバントまたはアジュバントクラスターおよび特定の器官に特有の遺伝子マーカーの１または複数をアジュバント評価マーカーとして提供する工程を包含する、項目ａ１〜８のいずれか1項に記載の方法。
（項目ａ１０）前記アジュバントについて、生物学的指標を分析し、クラスターと相関づける工程をさらに包含する、項目ａ１〜９のいずれか1項に記載の方法。
（項目ａ１１）前記生物学的指標は、創傷、細胞死、アポトーシス、NFκBシグナル経路、炎症応答、TNFシグナル経路、サイトカイン類、遊走、ケモカイン、化学走性、ストレス、防御応答、免疫応答、生来免疫応答、適合性免疫応答、インターフェロン類およびインターロイキン類からなる群より選択される少なくとも１つの指標を含む、項目ａ１０に記載の方法。
（項目ａ１２）前記生物学的指標は、血液学的指標を含む、項目ａ１０に記載の方法。
（項目ａ１３）前記血液学的指標は、白血球（ＷＢＣ）、リンパ球（ＬＹＭ）、単球（ＭＯＮ）、顆粒球（ＧＲＡ）、リンパ球の相対含有率％（ＬＹ％）、単球の相対含有率％（ＭＯ％）、顆粒球の相対含有率％（ＧＲ％）、赤血球（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（Ｈｂ、ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、赤血球分布幅（ＲＤＷ）、血小板（ＰＬＴ）、血小板濃度（ＰＣＴ）、平均血小板容積（ＭＰＶ）および血小板分布幅（ＰＤＷ）からなる群より選択される少なくとも1つを含む、項目ａ１２に記載の方法。
（項目ａ１４）前記生物学的指標は、サイトカインプロファイルを含む、項目ａ１０に記載の方法。
（項目ａ１５）アジュバントの器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法をコンピュータに実装するプログラムであって、該方法は：（A）２つ以上のアジュバントを用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得る工程；（B）該発現データについて、該アジュバントをクラスタリングする工程；（C）該クラスタリングに基づいて、該アジュバントの該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成する工程を包含する、プログラム。
（項目ａ１５Ａ）項目ａ１〜１４のいずれか一項に記載の特徴をさらに含む、項目ａ１５に記載のプログラム。
（項目ａ１６）アジュバントの器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法をコンピュータに実装するプログラムを格納した記録媒体であって、該方法は：（A）２つ以上のアジュバントを用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得る工程；（B）該発現データについて、該アジュバントをクラスタリングする工程；（C）該クラスタリングに基づいて、該アジュバントの該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成する工程を包含する、記録媒体。
（項目ａ１６Ａ）項目ａ１〜１４のいずれか一項に記載の特徴をさらに含む、項目ａ１６に記載の記録媒体。
（項目ａ１７）アジュバントの器官トランスクリプトームプロファイルを生成するためのシステムであって、該システムは：（A）２つ以上のアジュバントを用いて対象生物の少な
くとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得るまたは入力する発現データ獲得部；（B）該発現データについて、該アジュバントをクラスタリングするクラスタリング演算部；（C）該クラスタリングに基づいて、該アジュバントの該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成するプロファイリング部を包含する、システム。
（項目ａ１７Ａ）項目ａ１〜項目ａ１４のいずれか一項に記載の特徴をさらに含む、項目ａ１７に記載のシステム。
（項目ａ１８）アジュバントの特徴情報を提供する方法であって、該方法は：（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補アジュバントを提供する工程；（ｂ）機能が既知の基準アジュバントセットを提供する工程；（ｃ）該候補アジュバントおよび該基準アジュバントセットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；（ｄ）該候補アジュバントが属するのと同一のクラスターに属する該基準アジュバントセットのメンバーの特徴を、該候補アジュバントの特徴として提供する工程、を包含する方法。
（項目ａ１９）項目ａ１〜項目ａ１４のいずれか一項に記載の特徴をさらに含む、項目ａ１８に記載の方法。
（項目ａ２０）アジュバントの特徴情報を提供する方法をコンピュータに実装させるプログラムであって、該方法は：（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補アジュバントを提供する工程；（ｂ）機能が既知の基準アジュバントセットを提供する工程；（ｃ）該候補アジュバントおよび該基準アジュバントセットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；（ｄ）該候補アジュバントが属するのと同一のクラスターに属する該基準アジュバントセットのメンバーの特徴を、該候補アジュバントの特徴として提供する工程、を包含する、プログラム。
（項目ａ２０Ａ）項目ａ１〜項目ａ１４のいずれか一項に記載の特徴をさらに含む、項目ａ１９に記載のプログラム。
（項目ａ２１）アジュバントの特徴情報を提供する方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納する記録媒体であって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補アジュバントを提供する工程；（ｂ）機能が既知の基準アジュバントセットを提供する工程；（ｃ）該候補アジュバントおよび該基準アジュバントセットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；（ｄ）該候補アジュバントが属するのと同一のクラスターに属する該基準アジュバントセットのメンバーの特徴を、該候補アジュバントの特徴として提供する工程、を包含する、記録媒体。
（項目ａ２１Ａ）項目ａ１〜項目ａ１４のいずれか一項に記載の特徴をさらに含む、項目ａ２０に記載の記録媒体。
（項目ａ２２）アジュバントの特徴情報を提供するシステムであって、該システムは：（ａ）候補アジュバントを提供する候補アジュバント提供部；（ｂ）機能が既知の基準アジュバントセットを提供する基準アジュバント提供部；（ｃ）該候補アジュバントおよび該基準アジュバントセットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングするトランスクリプトームクラスタリング解析部；（ｄ）該候補アジュバントが属するのと同一のクラスターに属する該基準アジュバントセットのメンバーの特徴を、該候補アジュバントの特徴として提供する特徴分析部、を包含する、システム。
（項目ａ２２Ａ）項目ａ１〜項目ａ１４のいずれか一項に記載の特徴をさらに含む、項目ａ２２に記載のシステム。
（項目ａ２３）項目ａ１〜項目ａ１４または項目ａ１８もしくは項目ａ１９に記載の方法、項目ａ１５、１５Ａ、項目ａ２０または項目ａ２０Ａに記載のプログラム、項目ａ１６、項目ａ１６Ａ、項目ａ２１または項目ａ２１Ａに記載の記録媒体、あるいは項目ａ項目ａ１７、項目ａ１７Ａ、項目ａ２２または項目ａ２２Ａに記載のシステムを用いて、アジュバントの品質管理を行う方法。
（項目ａ２４）項目ａ１〜項目ａ１４または項目ａ１８もしくは項目ａ１９に記載の方法、項目ａ１５、１５Ａ、項目ａ２０または項目ａ２０Ａに記載のプログラム、項目ａ１６、項目ａ１６Ａ、項目ａ２１または項目ａ２１Ａに記載の記録媒体、あるいは項目ａ項目ａ１７、項目ａ１７Ａ、項目ａ２２または項目ａ２２Ａに記載のシステムを用いて、アジュバントの安全性を試験する方法。
（項目ａ２５）項目ａ１〜項目ａ１４または項目ａ１８もしくは項目ａ１９に記載の方法、項目ａ１５、１５Ａ、項目ａ２０または項目ａ２０Ａに記載のプログラム、項目ａ１６、項目ａ１６Ａ、項目ａ２１または項目ａ２１Ａに記載の記録媒体、あるいは項目ａ項目ａ１７、項目ａ１７Ａ、項目ａ２２または項目ａ２２Ａに記載のシステムを用いて、アジュバントの効果を判定する方法。
＜分類法＞
（項目ｂ１）
トランスクリプトームクラスタリングに基づいて、アジュバントを分類する工程を包含するアジュバント分類方法。
（項目ｂ２）
前記分類は、宿主応答に基づく分類、メカニズムに基づく分類、細胞（肝臓、リンパ節、脾臓）、メカニズムに基づく用途別の分類、およびモジュール分類からなる群より選択される少なくとも１つの特徴による分類をさらに含む、項目ｂ１に記載の方法。
（項目ｂ３）
前記分類は、Ｇ１〜Ｇ６：
（１）Ｇ１（インターフェロンシグナリング）；
（２）Ｇ２（脂質およびリポタンパク質代謝性）；
（３）Ｇ３（ストレス応答性）；
（４）Ｇ４（創傷応答性）；
（５）Ｇ５（リン酸含有化合物代謝プロセス性）；および
（６）Ｇ６（ファゴソーム性）：  
からなる群より選択される少なくとも１つの分類を含む、項目ｂ１または２に記載の方法。
（項目ｂ４）
前記Ｇ１〜Ｇ６の分類は、基準アジュバントのトランスクリプトームクラスタリングとの比較で行われ、
Ｇ１の基準アジュバントは、ＳＴＩＮＧリガンドであり、
Ｇ２の基準アジュバントは、シクロデキストリン類であり、
Ｇ３の基準アジュバントは、免疫反応性ペプチド類であり、
Ｇ４の基準アジュバントは、ＴＬＲ２リガンドであり、
Ｇ５の基準アジュバントは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、および／または
Ｇ６の基準アジュバントは、スクアレン水中油型エマルジョンアジュバントである、
項目ｂ３に記載の方法。
（項目ｂ５）
前記Ｇ１〜Ｇ６の分類は、基準アジュバントのトランスクリプトームクラスタリングとの比較で行われ、
Ｇ１の基準アジュバントは、ｃｄｉＧＭＰ、ｃＧＡＭＰ、ＤＭＸＡＡ、ＰｏｌｙＩＣおよびＲ８４８からなる群より選択され、
Ｇ２の基準アジュバントは、ｂＣＤ（βシクロデキストリン）であり、
Ｇ３の基準アジュバントは、ＦＫ５６５であり、
Ｇ４の基準アジュバントは、ＭＡＬＰ２ｓであり、
Ｇ５の基準アジュバントは、Ｄ３５，Ｋ３およびＫ３ＳＰＧからなる群より選択され、および／または
Ｇ６の基準アジュバントは、ＡｄｄａＶａｘである、
項目ｂ３または４に記載の方法。
（項目ｂ６）
前記Ｇ１〜Ｇ６の分類は、トランスクリプトーム分析において発現に有意差がある遺伝子（識別マーカー遺伝子；ＤＥＧ）の発現プロファイルに基づいて行われ、
前記G1のＤＥＧは、Gm14446、Pml、H2-T22、Ifit1、Irf7、Isg15、Stat1、Fcgr1、Oas1a、Oas2、Trim12a、Trim12c、Uba7およびUbe2l6からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
前記G2のDEGは、Elovl6、Gpam、Hsd3b7、Acer2、Acox1、Tbl1xr1、Alox5apおよびGgt5からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
前記G3のDEGは、Bbc3、Pdk4、Cd55、Cd93、Clec4e、Coro1a、およびTraf3、Trem3、C5ar1、Clec4n、Ier3、Il1r1、Plek、Tbx3、およびTrem1からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
前記G4のDEGは、Ccl3、Myof、Papss2、Slc7a11、およびTnfrsf1bからなる群より選択される少なくとも1つを含み、
前記G5のDEGは、Ak3、Insm1、Nek1、Pik3r2、およびTtnからなる群より選択される少なくとも1つを含み、
前記G６のDEGは、Atp6v0d2、Atp6v1c1、およびClec7aからなる群より選択される少なくとも1つを含む、
項目ｂ３〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目ｂ７）
アジュバントを分類する方法であって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補アジュバントを提供する工程；
（ｂ）項目ｂ３〜６のいずれか１項に記載のＧ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準アジュバントセットを提供する工程；
（ｃ）該候補アジュバントおよび該基準アジュバントセットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および
（ｄ）該候補アジュバントが属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補アジュバントを同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、
を包含する方法。
（項目ｂ８）
所望の機能を有するアジュバント組成物の製造方法であって、
（Ａ）アジュバント候補を提供する工程、
（Ｂ）所望の機能に対応するトランスクリプトーム発現パターンを有するアジュバント候補を選択する工程、および
（Ｃ）選択されたアジュバント候補を用いてアジュバント組成物を製造する工程を包含する、アジュバント組成物の製造方法。
（項目ｂ９）
前記所望の機能は、項目ｂ３〜６のいずれか１項に記載のＧ１〜Ｇ６のいずれか１つまたは複数を含む、項目ｂ８に記載の方法。
（項目ｂ１０）
所望の機能を有する発揮するためのアジュバント組成物であって、該所望の機能を発揮するアジュバントを含み、該所望の機能は、項目ｂ３〜６のいずれか１項に記載のＧ１〜Ｇ６のいずれか１つまたは複数を含む、組成物。
（項目ｂ１１）
項目ｂ１〜７のいずれか1項に記載の方法を用いて、アジュバントの品質管理を行う方法。
（項目ｂ１２）
項目ｂ１〜７のいずれか1項に記載の方法を用いて、アジュバントの安全性を試験する方法。
（項目ｂ１３）
項目ｂ１〜７のいずれか1項に記載の方法を用いて、アジュバントの効果を判定する方法。
（項目ｂ１４）
トランスクリプトームクラスタリングに基づいて、アジュバントを分類する工程を包含するアジュバント分類方法をコンピュータに実装させるプログラム。
（項目ｂ１４Ａ）
前記トランスクリプトームクラスタリングは、項目ｂ２〜７のいずれか1項に記載の１または複数の特徴をさらに含む、項目ｂ１４に記載のプログラム。
（項目ｂ１５）
トランスクリプトームクラスタリングに基づいて、アジュバントを分類する工程を包含するアジュバント分類方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納した記録媒体。
（項目ｂ１５Ａ）
前記トランスクリプトームクラスタリングは、項目ｂ２〜７のいずれか1項に記載の１または複数の特徴をさらに含む、項目ｂ１５に記載の記録媒体。
（項目ｂ１６）
トランスクリプトームクラスタリングに基づいて、アジュバントを分類する分類部を包含するアジュバント分類するためのシステム。
（項目ｂ１６Ａ）
前記トランスクリプトームクラスタリングは、項目ｂ２〜７のいずれか1項に記載の１または複数の特徴をさらに含む、項目ｂ１６に記載のシステム。
（項目ｂ１７）
アジュバントを分類するアジュバントを分類する方法をコンピュータに実装させるプログラムであって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補アジュバントを提供する工程；
（ｂ）項目ｂ３〜６のいずれか１項に記載のＧ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準アジュバントセットを提供する工程；
（ｃ）該候補アジュバントおよび該基準アジュバントセットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および
（ｄ）該候補アジュバントが属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補アジュバントを同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、
を包含するプログラム。
（項目ｂ１７Ａ）
項目ｂ２〜７のいずれか1項に記載の１または複数の特徴をさらに含む、項目ｂ１７に記載のプログラム。
（項目ｂ１８）
アジュバントを分類する方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納した記録媒体であって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補アジュバントを提供する工程；
（ｂ）項目ｂ３〜６のいずれか１項に記載のＧ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準アジュバントセットを提供する工程；
（ｃ）該候補アジュバントおよび該基準アジュバントセットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および
（ｄ）該候補アジュバントが属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補アジュバントを同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、
を包含する、記録媒体。
（項目ｂ１８Ａ）
項目ｂ２〜７のいずれか1項に記載の１または複数の特徴をさらに含む、項目ｂ１８に記載の記録媒体。
（項目ｂ１９）
アジュバントを分類するシステムであって、該システムは：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補アジュバントを提供する候補アジュバント提供部；
（ｂ）項目ｂ３〜６のいずれか１項に記載のＧ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準アジュバントセットを提供する基準アジュバント格納部；
（ｃ）該候補アジュバントおよび該基準アジュバントセットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングするトランスクリプトームクラスタリング分析部；および
（ｄ）該候補アジュバントが属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補アジュバントを同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する判定部、
を包含するシステム。
（項目ｂ１９Ａ）
項目ｂ２〜７のいずれか1項に記載の１または複数の特徴をさらに含む、項目ｂ１９に記載のシステム。
（項目ｂ２０）
アジュバントを項目ｂ３〜６のいずれか１項に記載のG1〜G6および／またはそれ以外への分類に使用するための遺伝子分析パネルであって、該遺伝子分析パネルは、Ｇ１のＤＥＧ、Ｇ２のＤＥＧ、Ｇ３のＤＥＧ、Ｇ４のＤＥＧ、Ｇ５のＤＥＧおよびＧ６のＤＥＧからなる群より選択される少なくとも１つのＤＥＧを検出する手段を含み、
該G1のＤＥＧは、Gm14446、Pml、H2-T22、Ifit1、Irf7、Isg15、Stat1、Fcgr1、Oas1a、Oas2、Trim12a、Trim12c、Uba7およびUbe2l6からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
該G2のDEGは、Elovl6、Gpam、Hsd3b7、Acer2、Acox1、Tbl1xr1、Alox5apおよびGgt5からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
該G3のDEGは、Bbc3、Pdk4、Cd55、Cd93、Clec4e、Coro1a、およびTraf3、Trem3、C5ar1、Clec4n、Ier3、Il1r1、Plek、Tbx3、およびTrem1からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
該G4のDEGは、Ccl3、Myof、Papss2、Slc7a11、およびTnfrsf1bからなる群より選択される少なくとも1つを含み、
該G5のDEGは、Ak3、Insm1、Nek1、Pik3r2、およびTtnからなる群より選択される少なくとも1つを含み、
該G６のDEGは、Atp6v0d2、Atp6v1c1、およびClec7aからなる群より選択される少なくとも1つを含む、
遺伝子分析パネル。
（項目ｂ２１）
前記遺伝子分析パネルは、少なくともＧ１のＤＥＧの検出手段、少なくともＧ２のＤＥＧの検出手段、少なくともＧ３のＤＥＧの検出手段、少なくともＧ４のＤＥＧの検出手段、少なくともＧ５のＤＥＧの検出手段および少なくともＧ６のＤＥＧの検出手段を含む、項目ｂ２０に記載の遺伝子分析パネル。
＜「アジュバント」のアジュバント＞
（項目ｂＸ１）
δイヌリン（β−Ｄ−［２→１］ポリ（フルクト−フラノシル）α−Ｄ−グルコース）またはその機能等価物を含む、抗原のアジュバント性を惹起または増強するための組成物。
（項目ｂＸ２）
前記等価物は、δイヌリンと等価のトランスクリプト―ム発現プロファイルを有する、項目ｂＸ１に記載の組成物。
＜樹状細胞活性化＞
（項目ｂＡ１）
δイヌリンまたはその機能等価物を含む、樹状細胞を活性化するための組成物。
（項目ｂＡ２）
前記活性化は、マクロファージの存在下でなされる、項目ｂＡ１に記載の組成物。
（項目ｂＡ３）
δイヌリンまたはその機能等価物を含む、前記組成物は、マクロファージの増強剤とともに投与されることを特徴とする、項目ｂＡ１またはＡ２に記載の組成物。
＜Th指向性＞
（項目ｂＢ１）
δイヌリンまたはその機能等価物を含む、Ｔｈ１型抗原のＴｈ１応答を増強し、かつ、Ｔｈ２型抗原のＴｈ２応答を増強するための組成物。
＜ＴＮＦα＞
（項目ｂＣ１）
δイヌリンまたはその機能等価物を含む、アジュバント組成物であって、該組成物はＴＮＦαが正常または増強された状態で投与されることを特徴とする、組成物。
＜同様のアジュバント・アジュバントの判定法＋製造法＞
（項目ｂＤ１）
候補アジュバントが抗原のアジュバント性を惹起または増強するかどうかを判定する方法であって、該方法は：（ａ）候補アジュバントを提供する工程；（ｂ）δイヌリンまたはその機能等価物を評価基準アジュバントとして提供する工程；（ｃ）該候補アジュバントおよび該評価基準アジュバントのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および（ｄ）該候補アジュバントが該評価基準アジュバントと同一のクラスターに属すると判定された場合、該候補アジュバントを抗原のアジュバント性を惹起または増強するものであると判定する工程、を包含する方法。
（項目ｂＥ１）
抗原のアジュバント性を惹起または増強するアジュバントを含む組成物を製造する方法であって、該方法は：（ａ）１または複数の候補アジュバントを提供する工程；（ｂ）δイヌリンまたはその機能等価物を評価基準アジュバントとして提供する工程；（ｃ）該候補アジュバントおよび該評価基準アジュバントのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；（ｄ）該候補アジュバントのうち、該評価基準アジュバントと同一のクラスターに属するアジュバントが存在する場合該アジュバントを抗原のアジュバント性を惹起または増強するアジュバントとして選択し、存在しない場合は（ａ）〜（ｃ）を繰り返す工程；および（ｅ）（ｄ）で得られた抗原のアジュバント性を惹起または増強するアジュバントを含む組成物を製造する工程を包含する、方法。【０００７】
（項目ｃ１）
トランスクリプトームクラスタリングに基づいて、医薬成分を分類する工程を包含する医薬成分分類方法。
（項目ｃ２）
前記分類する工程は、ａ）前記トランスクリプトームクラスタリングに基づいて基準成分を生成する工程と、ｂ）該基準成分に基づいて候補医薬成分を分類する工程とを含む、項目ｃ１に記載の方法。
（項目ｃ３）
前記医薬成分は、有効成分、添加成分およびアジュバントからなる群より選択される、項目ｃ１または２に記載の方法。
（項目ｃ４）
前記医薬成分は、アジュバントである、項目ｃ１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目ｃ５）
前記分類は、宿主応答に基づく分類、メカニズムに基づく分類、細胞（肝臓、リンパ節、脾臓）、メカニズムに基づく用途別の分類、およびモジュール分類からなる群より選択される少なくとも１つの特徴による分類をさらに含む、項目ｃ１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目ｃ６）
前記分類は、Ｇ１〜Ｇ６：
（１）Ｇ１（インターフェロンシグナリング）；
（２）Ｇ２（脂質およびリポタンパク質代謝性）；
（３）Ｇ３（ストレス応答性）；
（４）Ｇ４（創傷応答性）；
（５）Ｇ５（リン酸含有化合物代謝プロセス性）；および
（６）Ｇ６（ファゴソーム性）：
からなる群より選択される少なくとも１つの分類を含む、項目ｃ１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目ｃ７）
前記医薬成分はアジュバントであり、前記Ｇ１〜Ｇ６の分類は、基準医薬成分のトランスクリプトームクラスタリングとの比較で行われ、
Ｇ１の基準医薬成分は、ＳＴＩＮＧリガンドであり、
Ｇ２の基準医薬成分は、シクロデキストリン類であり、
Ｇ３の基準医薬成分は、免疫反応性ペプチド類であり、
Ｇ４の基準アジュバントは、ＴＬＲ２リガンドであり、
Ｇ５の基準医薬成分は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、および／または
Ｇ６の基準医薬成分は、スクアレン水中油型エマルジョンアジュバントである、
項目ｃ６に記載の方法。
（項目ｃ８）
前記Ｇ１〜Ｇ６の分類は、基準医薬成分のトランスクリプトームクラスタリングとの比較で行われ、
Ｇ１の基準成分は、ｃｄｉＧＭＰ、ｃＧＡＭＰ、ＤＭＸＡＡ、ＰｏｌｙＩＣおよびＲ８４８からなる群より選択され、
Ｇ２の基準医薬成分は、ｂＣＤ（βシクロデキストリン）であり、
Ｇ３の基準医薬成分は、ＦＫ５６５であり、
Ｇ４の基準医薬成分は、ＭＡＬＰ２ｓであり、
Ｇ５の基準医薬成分は、Ｄ３５，Ｋ３およびＫ３ＳＰＧからなる群より選択され、および／または
Ｇ６の基準医薬成分は、ＡｄｄａＶａｘである、
項目ｃ６または７に記載の方法。
（項目ｃ９）
前記Ｇ１〜Ｇ６の分類は、トランスクリプトーム分析において発現に有意差がある遺伝子（識別マーカー遺伝子；ＤＥＧ）の発現プロファイルに基づいて行われ、
前記G1のＤＥＧは、Gm14446、Pml、H2-T22、Ifit1、Irf7、Isg15、Stat1、Fcgr1、Oas1a、Oas2、Trim12a、Trim12c、Uba7およびUbe2l6からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
前記G2のDEGは、Elovl6、Gpam、Hsd3b7、Acer2、Acox1、Tbl1xr1、Alox5apおよびGgt5からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
前記G3のDEGは、Bbc3、Pdk4、Cd55、Cd93、Clec4e、Coro1a、およびTraf3、Trem3、C5ar1、Clec4n、Ier3、Il1r1、Plek、Tbx3、およびTrem1からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
前記G4のDEGは、Ccl3、Myof、Papss2、Slc7a11、およびTnfrsf1bからなる群より選択される少なくとも1つを含み、
前記G5のDEGは、Ak3、Insm1、Nek1、Pik3r2、およびTtnからなる群より選択される少なくとも1つを含み、
前記G６のDEGは、Atp6v0d2、Atp6v1c1、およびClec7aからなる群より選択される少なくとも1つを含む、
項目ｃ６〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目ｃ１０）
医薬成分を分類する方法であって、該方法は：
（ａ）候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）基準医薬成分セットを提供する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、該基準医薬成分セットの少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、
を包含する方法。
（項目ｃ１１）
医薬成分を分類する方法であって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）項目ｃ６〜８のいずれか一項に記載のＧ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準医薬成分セットを提供する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、
を包含する項目ｃ１０に記載の方法。
（項目ｃ１２）
所望の機能を有する組成物の製造方法であって、
（Ａ）候補医薬成分を提供する工程、
（Ｂ）所望の機能に対応するトランスクリプトーム発現パターンを有する候補医薬成分を選択する工程、および
（Ｃ）選択された候補医薬成分を用いて組成物を製造する工程を包含する、組成物の製造方法。
（項目ｃ１３）
所望の機能を有する組成物のスクリーニング方法であって、
（Ａ）候補医薬成分を提供する工程、および
（Ｂ）所望の機能に対応するトランスクリプトーム発現パターンを有する候補医薬成分を選択する工程を包含する、組成物の製造方法。
（項目ｃ１４）
前記所望の機能は、項目ｃ６〜８のいずれか一項に記載のＧ１〜Ｇ６のいずれか１つまたは複数を含む、項目ｃ１２または１３に記載の方法。
（項目ｃ１５）
所望の機能を発揮するための組成物であって、該所望の機能を発揮する医薬成分を含み、該所望の機能は、項目ｃ１〜１１のいずれか一項に記載の方法によって特定される分類の１つまたは複数を含む、組成物。
（項目ｃ１６）
所望の機能を発揮するための組成物であって、該所望の機能を発揮する医薬成分を含み、該所望の機能は、項目ｃ６〜８のいずれか一項に記載のＧ１〜Ｇ６のいずれか１つまたは複数を含む、項目ｃ１５に記載の組成物。
（項目ｃ１７）
項目ｃ１〜１１のいずれか一項一項に記載の方法を用いて、医薬成分の品質管理を行う方法。
（項目ｃ１８）
項目ｃ１〜１１のいずれか一項一項に記載の方法を用いて、医薬成分の安全性を試験する方法。
（項目ｃ１９）
項目ｃ１〜１１のいずれか一項一項に記載の方法を用いて、毒性ボトルネック遺伝子の候補を特定する工程と、
該毒性遺伝子を他の動物種において欠損させてノックアウト動物を作製する工程と、
該ノックアウト動物において毒性が減少または消失するかを決定し、減少または消失があった遺伝子を毒性ボトルネット遺伝子として選択する工程と
を含む、毒性ボトルネック遺伝子を提供する方法。
（項目ｃ２０）
アジュバント等の候補医薬成分について、毒性ボトルネック遺伝子のうち少なくとも１つについて遺伝子発現の活性化が観察されるかを決定する工程と、
該活性化が観察された候補医薬成分を毒性有として判断する工程とを
含む、薬剤の毒性判定方法。
（項目ｃ２１）
項目ｃ１〜１１のいずれ一項一項に記載の方法を用いて、医薬成分の効果を判定する方法。
（項目ｃ２２）
項目ｃ１〜１１のいずれか一項一項に記載の方法を用いて、有効性判定遺伝子を特定する工程と、
該毒性遺伝子を他の動物種において欠損させてノックアウト動物を作製する工程と、
該ノックアウト動物において有効性が減少または消失するかを決定し、減少または消失があった遺伝子を有効性ボトルネット遺伝子として選択する工程と
を含む、有効性ボトルネック遺伝子を提供する方法。
（項目ｃ２３）
アジュバント等の候補医薬成分について、有効性ボトルネック遺伝子のうち少なくとも１つについて遺伝子発現の活性化が観察されるかを決定する工程と、
該活性化が観察された候補薬剤を有効性有として判断する工程とを
含む、薬剤の有効性判定方法。
（項目ｃ２４）
トランスクリプトームクラスタリングに基づいて、医薬成分を分類する工程を包含する医薬成分分類方法をコンピュータに実装させるプログラム。
（項目ｃ２５）
トランスクリプトームクラスタリングに基づいて、医薬成分を分類する工程を包含する医薬成分分類方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納した記録媒体。
（項目ｃ２６）
トランスクリプトームクラスタリングに基づいて、医薬成分を分類する分類部を包含する医薬成分分類するためのシステム。
（項目ｃ２７）
医薬成分を分類する方法をコンピュータに実装させるプログラムであって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）基準医薬成分セットを計算する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、基準医薬成分セットの少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、
を包含するプログラム。
（項目ｃ２８）
医薬成分を分類する方法をコンピュータに実装させるプログラムであって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）項目ｃ６〜８のいずれか一項に記載のＧ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準医薬成分セットを提供する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、
を包含する項目ｃ２７に記載のプログラム。
（項目ｃ２９）
医薬成分を分類する方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納した記録媒体であって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）基準医薬成分セットを計算する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、基準医薬成分セットの少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、
を包含する、記録媒体。
（項目ｃ３０）
医薬成分を分類する方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納した記録媒体であって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）項目ｃ６〜８のいずれか一項に記載のＧ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準医薬成分セットを提供する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、
を包含する、項目ｃ２９に記載の記録媒体。
（項目ｃ３１）
医薬成分を分類するシステムであって、該システムは：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する候補医薬成分提供部；
（ｂ）基準医薬成分セットを計算する基準医薬成分計算部；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングするトランスクリプトームクラスタリング分析部；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、基準医薬成分セットの少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する判定部、
を包含するシステム。
（項目ｃ３２）
医薬成分を分類するシステムであって、該システムは：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する候補医薬成分提供部；
（ｂ）項目ｃ６〜８のいずれか一項に記載のＧ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準医薬成分セットを提供する基準医薬成分格納部；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングするトランスクリプトームクラスタリング分析部；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する判定部、
を包含する項目ｃ３１に記載のシステム。
（項目ｃ３３）
医薬成分を、項目ｃ１〜１１のいずれか一項に記載の方法で特定される分類に使用するための遺伝子分析パネル。
（項目ｃ３４）
アジュバントを項目ｃ６〜８のいずれか一項に記載のＧ１〜Ｇ６またはそれ以外への分類に使用するための遺伝子分析パネルであって、該遺伝子分析パネルは、Ｇ１のＤＥＧ，Ｇ２のＤＥＧ、Ｇ３のＤＥＧ、Ｇ４のＤＥＧ、Ｇ５のＤＥＧおよびＧ６のＤＥＧからなる群より選択される少なくとも１つのＤＥＧを検出する手段を含み、
該G1のＤＥＧは、Gm14446、Pml、H2-T22、Ifit1、Irf7、Isg15、Stat1、Fcgr1、Oas1a、Oas2、Trim12a、Trim12c、Uba7およびUbe2l6からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
該G2のDEGは、Elovl6、Gpam、Hsd3b7、Acer2、Acox1、Tbl1xr1、Alox5apおよびGgt5からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
該G3のDEGは、Bbc3、Pdk4、Cd55、Cd93、Clec4e、Coro1a、およびTraf3、Trem3、C5ar1、Clec4n、Ier3、Il1r1、Plek、Tbx3、およびTrem1からなる群より選択される少なくとも1つを含み、
該G4のDEGは、Ccl3、Myof、Papss2、Slc7a11、およびTnfrsf1bからなる群より選択される少なくとも1つを含み、
該G5のDEGは、Ak3、Insm1、Nek1、Pik3r2、およびTtnからなる群より選択される少なくとも1つを含み、
該G６のDEGは、Atp6v0d2,Atp6v1c1,およびClec7aからなる群より選択される少なくとも1つを含む、
遺伝子分析パネル。
（項目ｃ３５）
前記遺伝子分析パネルは、少なくともＧ１のＤＥＧの検出手段、少なくともＧ２のＤＥＧの検出手段、少なくともＧ３のＤＥＧの検出手段、少なくともＧ４のＤＥＧの検出手段、少なくともＧ５のＤＥＧの検出手段および少なくともＧ６のＤＥＧの検出手段を含む、項目ｃ３４に記載の遺伝子分析パネル。
（項目ｃ３６）
医薬成分の器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法であって、該方法は：
２つ以上の医薬成分を用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得る工程；
該発現データについて、該医薬成分をクラスタリングする工程；および
該クラスタリングに基づいて、該医薬成分の該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成する工程
を包含する方法。
（項目ｃ３７）
前記トランスクリプトーム分析は、前記医薬成分を前記対象生物に投与し、投与後一定時間で前記器官におけるトランスクリプトームを該医薬成分の投与前の該器官におけるトランスクリプトームと比較する工程、および該比較の結果発現が変動した遺伝子（ＤＥＧ）のセットを特定する工程を包含する、項目ｃ３６に記載の方法。
（項目ｃ３８）
前記ＤＥＧのセットを２つ以上の医薬成分において統合し、共通して変動するＤＥＧのセットを生成する工程を包含する、項目ｃ３７に記載の方法。
（項目ｃ３９）
前記比較の結果、前記共通して変動するＤＥＧのうち、発現が所定の閾値を超えて変動したＤＥＧを選択し、有意ＤＥＧのセットを生成する工程を包含する、項目ｃ３７または３８に記載の方法。
（項目ｃ４０）
前記所定の閾値は、所定の倍数の相違および所定の統計学的有意（ｐ値）で特定される、項目ｃ３９に記載の方法。
（項目ｃ４１）
少なくとも２つ以上の器官について、前記トランスクリプトーム分析を行い、特定の器官でのみ発現が変動した遺伝子（ＤＥＧ）のセットを特定し、該セットを該器官特異的ＤＥＧセットとする工程を包含する、項目ｃ３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目ｃ４２）
前記トランスクリプトーム分析は、肝臓、脾臓およびリンパ節からなる群より選択される少なくとも１つの器官におけるトランスクリプトームに対してなされる、項目ｃ３６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目ｃ４３）
前記医薬成分医薬成分の種類の数は、統計学的に有意なクラスタリング分析を可能とする数である、項目ｃ３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目ｃ４４）
前記プロファイルのうち、特定の医薬成分または医薬成分クラスターおよび特定の器官に特有の遺伝子マーカーの１または複数を医薬成分評価マーカーとして提供する工程を包含する、項目ｃ３６〜４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目ｃ４５）
前記医薬成分について、生物学的指標を分析し、クラスターと相関づける工程をさらに包含する、項目ｃ３６〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目ｃ４６）
前記生物学的指標は、創傷、細胞死、アポトーシス、NFκBシグナル経路、炎症応答、TNFシグナル経路、サイトカイン類、遊走、ケモカイン、化学走性、ストレス、防御応答、免疫応答、生来免疫応答、適合性免疫応答、インターフェロン類およびインターロイキン類からなる群より選択される少なくとも１つの指標を含む、項目ｃ４５に記載の方法。
（項目ｃ４７）
前記生物学的指標は、血液学的指標を含む、項目ｃ４６に記載の方法。
（項目ｃ４８）
前記血液学的指標は、白血球（ＷＢＣ）、リンパ球（ＬＹＭ）、単球（ＭＯＮ）、顆粒球（ＧＲＡ）、リンパ球の相対含有率％（ＬＹ％）、単球の相対含有率％（ＭＯ％）、顆粒球の相対含有率％（ＧＲ％）、赤血球（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（Ｈｂ、ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、赤血球分布幅（ＲＤＷ）、血小板（ＰＬＴ）、血小板濃度（ＰＣＴ）、平均血小板容積（ＭＰＶ）および血小板分布幅（ＰＤＷ）からなる群より選択される少なくとも1つを含む、項目ｃ４７に記載の方法。
（項目ｃ４９）
前記生物学的指標は、サイトカインプロファイルを含む、項目ｃ４５に記載の方法。
（項目ｃ５０）
医薬成分の器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法をコンピュータに実装するプログラムであって、該方法は：
（A）２つ以上の医薬成分を用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得る工程；
（B）該発現データについて、該医薬成分医薬成分をクラスタリングする工程；
（C）該クラスタリングに基づいて、該医薬成分医薬成分の該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成する工程
を包含する、プログラム。
（項目ｃ５１）
医薬成分の器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法をコンピュータに実装するプログラムを格納した記録媒体であって、該方法は：
（A）２つ以上の医薬成分を用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得る工程；
（B）該発現データについて、該医薬成分をクラスタリングする工程；
（C）該クラスタリングに基づいて、該医薬成分の該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成する工程
を包含する、記録媒体。
（項目ｃ５２）
医薬成分の器官トランスクリプトームプロファイルを生成するためのシステムであって、該システムは：
（A）２つ以上の医薬成分を用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得るまたは入力する発現データ獲得部；
（B）該発現データについて、該医薬成分をクラスタリングするクラスタリング演算部；
（C）該クラスタリングに基づいて、該医薬成分の該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成するプロファイリング部
を包含する、システム。
（項目ｃ５３）
医薬成分の特徴情報を提供する方法であって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）機能が既知の基準医薬成分セットを提供する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；
（ｄ）該候補医薬成分が属するのと同一のクラスターに属する該基準医薬成分セットのメンバーの特徴を、該候補医薬成分の特徴として提供する工程、
を包含する方法。
（項目ｃ５４）
項目ｃ３６〜４９のいずれか一項に記載の特徴をさらに含む、項目ｃ５３に記載の方法。
（項目ｃ５５）
医薬成分の特徴情報を提供する方法をコンピュータに実装させるプログラムであって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）機能が既知の基準医薬成分セットを提供する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；
（ｄ）該候補医薬成分が属するのと同一のクラスターに属する該基準医薬成分セットのメンバーの特徴を、該候補医薬成分の特徴として提供する工程、
を包含する、プログラム。
（項目ｃ５６）
医薬成分の特徴情報を提供する方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納する記録媒体であって、該方法は：
（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）機能が既知の基準医薬成分セットを提供する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；
（ｄ）該候補医薬成分が属するのと同一のクラスターに属する該基準医薬成分セットのメンバーの特徴を、該候補医薬成分の特徴として提供する工程、
を包含する、記録媒体。
（項目ｃ５７）
医薬成分の特徴情報を提供するシステムであって、該システムは：
（ａ）候補医薬成分を提供する候補医薬成分提供部；
（ｂ）機能が既知の基準医薬成分セットを提供する基準医薬成分提供部；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングするトランスクリプトームクラスタリング解析部；
（ｄ）該候補医薬成分が属するのと同一のクラスターに属する該基準医薬成分セットのメンバーの特徴を、該候補医薬成分の特徴として提供する特徴分析部、
を包含する、システム。
（項目ｃ５８）
項目ｃ３６〜４９または項目ｃ５３に記載の方法を用いて、医薬成分の品質管理を行う方法。
（項目ｃ５９）
項目ｃ３６〜４９または項目ｃ５３に記載の方法を用いて、医薬成分の安全性を試験する方法。
（項目ｃ６０）
項目ｃ３６〜４９または項目ｃ５３に記載の方法を用いて、医薬成分の効果を判定する方法。【０００８】
本発明において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、医薬成分（有効成分、添加成分、アジュバントなど）を系統的に分類し、そして未知の機能の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）でも、詳細な実験を行うことなくその機能（例えば、有効成分、添加成分、アジュバントの詳細な性質、安全性、有効性等）を分析し正確に予測することができる技術を提供する。また、本発明は、医薬成分（有効成分、添加成分、アジュバントなど）を系統的に分類し、そして未知の機能の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）でも、既存の基準医薬成分（例えば、本明細書に例示されるアジュバントのＧ１〜Ｇ６の基準アジュバント）いずれかと同じであるかまたはそれ以外のものであるかについて、その機能を分析することができる技術を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図1はそれぞれの器官からの有意に差示的に発現された遺伝子(sDEG)を構成するアジュバント遺伝子空間を示す。それぞれの遺伝子についてのsDEGをベン図で表示している。リンパ節(LN)、肝臓(LV)および脾臓(SP)における固有のセットを、p値とともにTargetMine経路アノテーションを使用して解析した。同様に、３つの器官(LV、SPおよびLN)全てに共有される遺伝子セットをp値とともに経路解析によってアノテーションした。
【図１Ｂ】図1はそれぞれの器官からの有意に差示的に発現された遺伝子(sDEG)を構成するアジュバント遺伝子空間を示す。それぞれの遺伝子についてのsDEGをベン図で表示している。リンパ節(LN)、肝臓(LV)および脾臓(SP)における固有のセットを、p値とともにTargetMine経路アノテーションを使用して解析した。同様に、３つの器官(LV、SPおよびLN)全てに共有される遺伝子セットをp値とともに経路解析によってアノテーションした。
【図２Ａ】図2Ａは３つの器官の間で一貫したアジュバントを示す。ＲのWard  D2法によって決定した場合の肝臓(LV、上)、脾臓(SP、左)およびリンパ節(LN、右)におけるアジュバントクラスター。クラスターの詳細については、図１４参照。参照アジュバントは、色付きのフォントで示す。バッチ効果および弱いアジュバント(バッチ効果を超えるが、基準ラインよりは下)を灰色で示す。３つの器官の間のアジュバントクラスター関係性を線で示す。
【図２Ｂ】図2Ｂは３つの器官の間で一貫したアジュバントを示す。ＲのWard  D2法によって決定した場合の肝臓(LV)におけるアジュバントクラスター。参照アジュバントは、色付きのフォントで示す。バッチ効果および弱いアジュバント(バッチ効果を超えるが、基準ラインよりは下)を灰色で示す。
【図２Ｃ】図2Ｃは３つの器官の間で一貫したアジュバントを示す。ＲのWard  D2法によって決定した場合の脾臓(SP)におけるアジュバントクラスター。参照アジュバントは、色付きのフォントで示す。バッチ効果および弱いアジュバント(バッチ効果を超えるが、基準ラインよりは下)を灰色で示す。
【図２Ｄ】図2Ｄは３つの器官の間で一貫したアジュバントを示す。ＲのWard  D2法によって決定した場合のリンパ節(LN)におけるアジュバントクラスター。参照アジュバントは、色付きのフォントで示す。バッチ効果および弱いアジュバント(バッチ効果を超えるが、基準ラインよりは下)を灰色で示す。
【図２Ｅ】図２Ｂのマウス肝臓(LV)のクラスターの左側の拡大図である。
【図２Ｆ】図２Ｂのマウス肝臓(LV)のクラスターの右側の拡大図である。
【図２Ｇ】図２Ｃのマウス脾臓(SP)のクラスターの左側の拡大図である。
【図２Ｈ】図２Ｃのマウス脾臓(SP)のクラスターの右側の拡大図である。
【図２Ｉ】図２Ｄのマウスリンパ節(LN)のクラスターの左側の拡大図である。
【図２Ｊ】図２Ｄのマウスリンパ節(LN)のクラスターの右側の拡大図である。
【図２Ｋ】図２Ｋは、ラットにおいて３つの器官の間で一貫したアジュバントを示す。マウスと同様の傾向が観察された。図２Ａと同様、ＲのWard  D2法によって決定した場合の肝臓(上)、脾臓(右)および肺（左)におけるアジュバントクラスター。
【図２Ｌ】図２Ｅのラットの肝臓クラスターの拡大図である。
【図２Ｍ】図２Ｅのラットの脾臓クラスターの拡大図である。
【図２Ｎ】図２Ｅのラットの肺クラスターの拡大図である。
【図２Ｏ】図２Ｌのラット肝臓クラスターの左側の拡大図である。
【図２Ｐ】図２Ｌのラット肝臓クラスターの右側の拡大図である。
【図２Ｑ】図２Ｍのラット脾臓クラスターの左側の拡大図である。
【図２Ｒ】図２Ｍのラット脾臓クラスターの右側の拡大図である。
【図２Ｓ】図２Ｎのラット肺クラスターの左側の拡大図である。
【図２Ｔ】図２Ｎのラット肺クラスターの右側の拡大図である。
【図３Ａ】図3はアジュバントグループの生物学的アノテーションおよびサイトカインアノテーションを示す。zスコア(表１７)を使用して選択したアジュバントグループ関連遺伝子を、TargetMineを用いて生物学的プロセスにアノテーションした(a)、またはIPAを用いた上流解析でサイトカインアノテーションを推測した(b)。代表的なアノテーション、遺伝子(表１８)およびIPA上流解析(表１９)を表示する。
【図３Ｂ】図3はアジュバントグループの生物学的アノテーションおよびサイトカインアノテーションを示す。zスコア(表１７)を使用して選択したアジュバントグループ関連遺伝子を、TargetMineを用いて生物学的プロセスにアノテーションした(a)、またはIPAを用いた上流解析でサイトカインアノテーションを推測した(b)。代表的なアノテーション、遺伝子(表１８)およびIPA上流解析(表１９)を表示する。
【図４Ａ】図4はリンパ節において同じ受容体を標的とするアジュバントの相対比較を示す。35/K3/K3SPG(表２０)またはcdiGMP/cGAMP/DMXAA(表２１)などの同じ受容体を標的とするアジュバント間の倍数変化の値をｚスコア化することで優先的に誘導される遺伝子を選択した。ベン図(a,d)、優先的にアップレギュレーションされた上位10遺伝子(b,e)および選択した遺伝子の40モジュールに対するマッピング(c,f)を示す。
【図４Ｂ】図4はリンパ節において同じ受容体を標的とするアジュバントの相対比較を示す。35/K3/K3SPG(表２０)またはcdiGMP/cGAMP/DMXAA(表２１)などの同じ受容体を標的とするアジュバント間の倍数変化の値をｚスコア化することで優先的に誘導される遺伝子を選択した。ベン図(a,d)、優先的にアップレギュレーションされた上位10遺伝子(b,e)および選択した遺伝子の40モジュールに対するマッピング(c,f)を示す。図４Ｂのｂのグラフでは、左欄上段、中欄中段および右欄下段が、アジュバントと優先的にアップレギュレーションされた上位10遺伝子との関係に対応する。
【図４Ｃ】図4はリンパ節において同じ受容体を標的とするアジュバントの相対比較を示す。35/K3/K3SPG(表２０)またはcdiGMP/cGAMP/DMXAA(表２１)などの同じ受容体を標的とするアジュバント間の倍数変化の値をｚスコア化することで優先的に誘導される遺伝子を選択した。ベン図(a,d)、優先的にアップレギュレーションされた上位10遺伝子(b,e)および選択した遺伝子の40モジュールに対するマッピング(c,f)を示す。
【図４Ｄ】図4はリンパ節において同じ受容体を標的とするアジュバントの相対比較を示す。35/K3/K3SPG(表２０)またはcdiGMP/cGAMP/DMXAA(表２１)などの同じ受容体を標的とするアジュバント間の倍数変化の値をｚスコア化することで優先的に誘導される遺伝子を選択した。ベン図(a,d)、優先的にアップレギュレーションされた上位10遺伝子(b,e)および選択した遺伝子の40モジュールに対するマッピング(c,f)を示す。図４Ｂのｅのグラフでは、左欄上段、中欄中段および右欄下段が、アジュバントと優先的にアップレギュレーションされた上位10遺伝子との関係に対応する。
【図５Ａ】図5はアジュバント誘導性血液学的変化を示す。アジュバント注射後の末梢血の血液学的変化(a)。黒の実線、その外側の２つの灰色の破線、さらにその外側の２つの赤色の破線は、それぞれ、バッファー対照で処置したマウスの平均ならびに、1SDの標準偏差（ＳＤ）レベルおよび2SDのＳＤレベルを示す。1SDを超えるパラメータ変化を赤色のバーで示し(1SD、薄い赤色;2SD、濃い赤色)、その他のパラメータ変化を黒色のバーで示す。相関する遺伝子の数およびその代表的なリストを示す(b)。血液中の白血球(WBC)数と、肝臓（ＬＶ）におけるCXCL9発現レベルとに関する相関プロット（c)。赤色の傾いた線は線形フィッティングの線を示す。WBC数を１ＳＤより大きく変化させたアジュバントを赤色（薄い色）のフォントで示す。Exp5(bCD_ID、D35_ID、K3SPG_ID)およびExp10(DMXAA_ID、MALP2s_ID、MPLA_ID、R848_ID)からの試料についての血液学的データは、独立の実験によって取得したことに留意されたい。そのため、それらは、器官の遺伝子発現データ(プロットにおいて黒の×で示す)と物理的な関連はないが、依然として良好な相関を示した(図７を参照)。
【図５Ｂ】図5はアジュバント誘導性血液学的変化を示す。アジュバント注射後の末梢血の血液学的変化(a)。黒の実線、その外側の２つの灰色の破線、さらにその外側の２つの赤色の破線は、それぞれ、バッファー対照で処置したマウスの平均ならびに、1SDの標準偏差（ＳＤ）レベルおよび2SDのＳＤレベルを示す。1SDを超えるパラメータ変化を赤色のバーで示し(1SD、薄い赤色;2SD、濃い赤色)、その他のパラメータ変化を黒色のバーで示す。相関する遺伝子の数およびその代表的なリストを示す(b)。血液中の白血球(WBC)数と、肝臓（ＬＶ）におけるCXCL9発現レベルとに関する相関プロット（c)。赤色の傾いた線は線形フィッティングの線を示す。WBC数を１ＳＤより大きく変化させたアジュバントを赤色（薄い色）のフォントで示す。Exp5(bCD_ID、D35_ID、K3SPG_ID)およびExp10(DMXAA_ID、MALP2s_ID、MPLA_ID、R848_ID)からの試料についての血液学的データは、独立の実験によって取得したことに留意されたい。そのため、それらは、器官の遺伝子発現データ(プロットにおいて黒の×で示す)と物理的な関連はないが、依然として良好な相関を示した(図７を参照)。
【図６】図６は、本発明のシステムを実施するための構成を示した模式図である。
【図７】試料のVolcanoプロット。遺伝子プローブ発現の倍数変化（ＦＣ）のLog2（横軸）と、対応のあるｔ検定の結果（縦軸）とを試料（アジュバント、投与経路、器官）ごとのVolcanoプロットで示す。有意な変化を示したもの（（FC>1.5またはFC<0.667）かつ（ｐ値<0.01）かつ（カスタマイズＰＡコール＝１））を赤（アップレギュレート）または青（ダウンレギュレート）のドットで示す。赤矢印で示したMPLA_ID_LNおよびPam3CSK4_ID_LNでは、多数のプローブがアップレギュレートされた（平均的に）が、MPLAまたはPam3CSK4で処置したマウスのＬＮにおける遺伝子発現はばらついたので、p値は<0.01に達しなかった。
【図８】個々のマウスでアップレギュレートされた遺伝子プローブのベン図を示し、マウスはそれぞれ示したアジュバントによって処置されたマウスである。円の相対的な大きさは、それぞれのアジュバントが個々のマウスにおいてどの程度遺伝子プローブをアップレギュレートさせたかを示す。円の重なる部分は、マウス間で共通してアップレギュレートされた遺伝子プローブを示す。MPLA_ID_LNおよびPam3CSK4_ID_LNには下線を付しているが、これら２種類のアジュバント処置による３試料のうちの１つ（緑、右上）は、他の２つの試料と比較してほとんど応答を示さなかったか、僅かな応答しか示さなかった。MPLA_ID_LNおよびPam3CSK4_ID_LNに関しては、その中の１つの試料のデータが解析に適さないと考えられたので（詳細は標準手順３を参照のこと）、２つの試料についての結果のみを示している。この解析においてベン図の重なりが大きいことは、同じアジュバント処置群において個々のマウス間の遺伝子応答が一貫していることを示す。
【図９】アップレギュレートされた遺伝子プローブの数と、アジュバント処置マウス間の一貫性（ベン図における重なり合う部分）との間の相関。横軸は、重複を除いた遺伝子プローブの合計数のうちの重なり合った部分に存在するプローブ（一部のアジュバントについては２つの試料間の重なり）の百分率を示す（図８を参照）。縦軸は、アップレギュレートされた（平均ＦＣ＞２）遺伝子プローブの数を示す。赤線（傾いた線）は線形フィッティングを示す。灰色の領域は、９９％信頼領域を示す。９９％信頼領域の外に現れたアジュバントはその名称を示した。この解析は、各器官においてアジュバントで誘導される強力な遺伝子応答が個々のマウス間の遺伝子応答の一貫性と正に相関することを示す。
【図１０Ａ】各アジュバントについての生物学的プロセスアノテーションを示す。それぞれの器官（ＬＶ、ａ；ＳＰ、ｂ；ＬＮ、ｃ）について、各アジュバントについてＦＣ＞２の遺伝子プローブセットを、TargetMineによってその生物学アノテーションにしたがってアノテーションした。得られたアノテーション（アノテーションｐ値＜０．０５、選択したキーワード（例えば、創傷、死、サイトカイン）を含む）を、キーワードを含むアノテーションのＬｏｇＰ値を合計することによって統合した（詳細は表１２を参照のこと）。ヒートマップ（赤と緑のグラデーション）は−ＬｏｇＰを示す。赤が濃くなる（最も濃い領域よりは薄いが、その他の領域の中では比較的に濃い）とスコアが高いことを示す。緑（最も濃い領域）は、ｐ値が＜０．０５に達したアノテーションがなかったことを示す。鼻内経路を使用したので、ＬＮにおけるＥＮＤＣＮのデータ（ｃ）は空欄である。
【図１０Ｂ】各アジュバントについての生物学的プロセスアノテーションを示す。それぞれの器官（ＬＶ、ａ；ＳＰ、ｂ；ＬＮ、ｃ）について、各アジュバントについてＦＣ＞２の遺伝子プローブセットを、TargetMineによってその生物学アノテーションにしたがってアノテーションした。得られたアノテーション（アノテーションｐ値＜０．０５、選択したキーワード（例えば、創傷、死、サイトカイン）を含む）を、キーワードを含むアノテーションのＬｏｇＰ値を合計することによって統合した（詳細は表１２を参照のこと）。ヒートマップ（赤と緑のグラデーション）は−ＬｏｇＰを示す。赤が濃くなる（最も濃い領域よりは薄いが、その他の領域の中では比較的に濃い）とスコアが高いことを示す。緑（最も濃い領域）は、ｐ値が＜０．０５に達したアノテーションがなかったことを示す。鼻内経路を使用したので、ＬＮにおけるＥＮＤＣＮのデータ（ｃ）は空欄である。
【図１０Ｃ】各アジュバントについての生物学的プロセスアノテーションを示す。それぞれの器官（ＬＶ、ａ；ＳＰ、ｂ；ＬＮ、ｃ）について、各アジュバントについてＦＣ＞２の遺伝子プローブセットを、TargetMineによってその生物学アノテーションにしたがってアノテーションした。得られたアノテーション（アノテーションｐ値＜０．０５、選択したキーワード（例えば、創傷、死、サイトカイン）を含む）を、キーワードを含むアノテーションのＬｏｇＰ値を合計することによって統合した（詳細は表１２を参照のこと）。ヒートマップ（赤と緑のグラデーション）は−ＬｏｇＰを示す。赤が濃くなる（最も濃い領域よりは薄いが、その他の領域の中では比較的に濃い）とスコアが高いことを示す。緑（最も濃い領域）は、ｐ値が＜０．０５に達したアノテーションがなかったことを示す。鼻内経路を使用したので、ＬＮにおけるＥＮＤＣＮのデータ（ｃ）は空欄である。
【図１１Ａ】遺伝子プローブおよびアジュバントの階層的クラスタリングを示す。有意に差示的に発現された遺伝子を、ＬＶ（ａ）、ＳＰ（ｂ）およびＬＮ（ｃ）においてアジュバント（横軸）および遺伝子プローブ（縦軸）について逐次的にクラスタリングした。各遺伝子プローブの倍数変化発現値を、図に示す色の尺度でヒートマップとして示す。遺伝子プローブは、示した最も高いスコアで関連付けられたアノテーションで４０個のモジュールに分割した。TargetMineによる各モジュールのアノテーション、プローブ数およびｐ値を、右側に示す。
【図１１Ｂ】遺伝子プローブおよびアジュバントの階層的クラスタリングを示す。有意に差示的に発現された遺伝子を、ＬＶ（ａ）、ＳＰ（ｂ）およびＬＮ（ｃ）においてアジュバント（横軸）および遺伝子プローブ（縦軸）について逐次的にクラスタリングした。各遺伝子プローブの倍数変化発現値を、図に示す色の尺度でヒートマップとして示す。遺伝子プローブは、示した最も高いスコアで関連付けられたアノテーションで４０個のモジュールに分割した。TargetMineによる各モジュールのアノテーション、プローブ数およびｐ値を、右側に示す。
【図１１Ｃ】遺伝子プローブおよびアジュバントの階層的クラスタリングを示す。有意に差示的に発現された遺伝子を、ＬＶ（ａ）、ＳＰ（ｂ）およびＬＮ（ｃ）においてアジュバント（横軸）および遺伝子プローブ（縦軸）について逐次的にクラスタリングした。各遺伝子プローブの倍数変化発現値を、図に示す色の尺度でヒートマップとして示す。遺伝子プローブは、示した最も高いスコアで関連付けられたアノテーションで４０個のモジュールに分割した。TargetMineによる各モジュールのアノテーション、プローブ数およびｐ値を、右側に示す。
【図１２Ａ】それぞれの器官におけるアジュバントに応答した細胞集団の解析。それぞれの器官におけるアジュバントに応答した細胞集団を、個々のアジュバントについて平均ＦＣ＞２を満たす遺伝子プローブによって予測した。プローブのＩＤおよびそのＦＣ発現値を、ImmGenデータベースに基づく１０種類の免疫細胞タイプの予測マトリックスを使用して処理した。細胞タイプスコアおよび試料を縦横両軸でクラスタリングし、ｚスコアのヒートマップとして示す。
【図１２Ｂ】それぞれの器官におけるアジュバントに応答した細胞集団の解析。それぞれの器官におけるアジュバントに応答した細胞集団を、個々のアジュバントについて平均ＦＣ＞２を満たす遺伝子プローブによって予測した。プローブのＩＤおよびそのＦＣ発現値を、ImmGenデータベースに基づく１０種類の免疫細胞タイプの予測マトリックスを使用して処理した。細胞タイプスコアおよび試料を縦横両軸でクラスタリングし、ｚスコアのヒートマップとして示す。
【図１２Ｃ】それぞれの器官におけるアジュバントに応答した細胞集団の解析。それぞれの器官におけるアジュバントに応答した細胞集団を、個々のアジュバントについて平均ＦＣ＞２を満たす遺伝子プローブによって予測した。プローブのＩＤおよびそのＦＣ発現値を、ImmGenデータベースに基づく１０種類の免疫細胞タイプの予測マトリックスを使用して処理した。細胞タイプスコアおよび試料を縦横両軸でクラスタリングし、ｚスコアのヒートマップとして示す。
【図１３Ａ】それぞれの器官における４０モジュールの免疫細胞タイプ解析。それぞれの器官（ＬＶ、ａ；ＳＰ、ｂ；ＬＮ、ｃ）における４０モジュールを、その応答性の免疫細胞集団についてImmGenデータベースを参照として使用して解析した。モジュールに関連付けられた細胞集団をヒートマップとして示す。
【図１３Ｂ】それぞれの器官における４０モジュールの免疫細胞タイプ解析。それぞれの器官（ＬＶ、ａ；ＳＰ、ｂ；ＬＮ、ｃ）における４０モジュールを、その応答性の免疫細胞集団についてImmGenデータベースを参照として使用して解析した。モジュールに関連付けられた細胞集団をヒートマップとして示す。
【図１３Ｃ】それぞれの器官における４０モジュールの免疫細胞タイプ解析。それぞれの器官（ＬＶ、ａ；ＳＰ、ｂ；ＬＮ、ｃ）における４０モジュールを、その応答性の免疫細胞集団についてImmGenデータベースを参照として使用して解析した。モジュールに関連付けられた細胞集団をヒートマップとして示す。
【図１４Ａ】アジュバントのクラスター解析。アジュバント投与マウス由来の各試料を、ＲのＷａｒｄ  Ｄ２法によって、それぞれの器官（ＬＶ、ａ；ＳＰ、ｂ；ＬＮ、ｃ）について個別にクラスタリングした。ＬＶおよびＳＰについては高さ閾値１．０で、ＬＮについては高さ閾値１．５でアジュバントをグルーピングし、閾値線を赤で示す。３つの器官の間で一貫したアジュバントのグループメンバーは色を付けて示す。バッチ効果および弱いアジュバント（バッチ効果は上回るが、閾値線を下回る）のグループを、灰色で示す。D35_ID_x2およびK3_ID_x3（非常に強い遺伝子応答を示した２つの試料）は、ALM、bCD、ENDCNおよびFCAなどの他のＤＡＭＰ関連アジュバントと一緒にG2LVにクラスタリングされた。
【図１４Ｂ】アジュバントのクラスター解析。アジュバント投与マウス由来の各試料を、ＲのＷａｒｄ  Ｄ２法によって、それぞれの器官（ＬＶ、ａ；ＳＰ、ｂ；ＬＮ、ｃ）について個別にクラスタリングした。ＬＶおよびＳＰについては高さ閾値１．０で、ＬＮについては高さ閾値１．５でアジュバントをグルーピングし、閾値線を赤で示す。３つの器官の間で一貫したアジュバントのグループメンバーは色を付けて示す。バッチ効果および弱いアジュバント（バッチ効果は上回るが、閾値線を下回る）のグループを、灰色で示す。D35_ID_x2およびK3_ID_x3（非常に強い遺伝子応答を示した２つの試料）は、ALM、bCD、ENDCNおよびFCAなどの他のＤＡＭＰ関連アジュバントと一緒にG2LVにクラスタリングされた。
【図１４Ｃ】アジュバントのクラスター解析。アジュバント投与マウス由来の各試料を、ＲのＷａｒｄ  Ｄ２法によって、それぞれの器官（ＬＶ、ａ；ＳＰ、ｂ；ＬＮ、ｃ）について個別にクラスタリングした。ＬＶおよびＳＰについては高さ閾値１．０で、ＬＮについては高さ閾値１．５でアジュバントをグルーピングし、閾値線を赤で示す。３つの器官の間で一貫したアジュバントのグループメンバーは色を付けて示す。バッチ効果および弱いアジュバント（バッチ効果は上回るが、閾値線を下回る）のグループを、灰色で示す。D35_ID_x2およびK3_ID_x3（非常に強い遺伝子応答を示した２つの試料）は、ALM、bCD、ENDCNおよびFCAなどの他のＤＡＭＰ関連アジュバントと一緒にG2LVにクラスタリングされた。
【図１４Ｄ】図１４ＡのＬＶクラスターの左側の拡大図である。
【図１４Ｅ】図１４ＡのＬＶクラスターの右側の拡大図である。
【図１４Ｆ】図１４ＢのＳＰクラスターの左側の拡大図である。
【図１４Ｇ】図１４ＢのＳＰクラスターの右側の拡大図である。
【図１４Ｈ】図１４ＣのＬＮクラスターの左側の拡大図である。
【図１４Ｉ】図１４ＣのＬＮクラスターの右側の拡大図である。
【図１５Ａ】アジュバントで関連付けられたグループ内の上位１０遺伝子。アジュバントグループ関連遺伝子のｚスコアヒートマップ。アジュバントグループ関連遺伝子をｚスコアから選択した。上位３０遺伝子のリストをまずこのｚスコアにしたがって選択し、その後上位１０遺伝子を実際の遺伝子発現値にしたがって選択した。
【図１５Ｂ】アジュバントで関連付けられたグループ内の上位１０遺伝子。アジュバントグループ関連遺伝子のｚスコアヒートマップ。アジュバントグループ関連遺伝子をｚスコアから選択した。上位３０遺伝子のリストをまずこのｚスコアにしたがって選択し、その後上位１０遺伝子を実際の遺伝子発現値にしたがって選択した。
【図１５Ｃ】アジュバントで関連付けられたグループ内の上位１０遺伝子。アジュバントグループ関連遺伝子のｚスコアヒートマップ。アジュバントグループ関連遺伝子をｚスコアから選択した。上位３０遺伝子のリストをまずこのｚスコアにしたがって選択し、その後上位１０遺伝子を実際の遺伝子発現値にしたがって選択した。
【図１６Ａ】アジュバントグループ関連遺伝子間の異なる関係性および共通の関係性ならびにそれぞれの器官からの４０モジュール。アジュバントグループ関連のアップレギュレートされた遺伝子を、遺伝子発現値のｚスコアに基づいて選択した（表１７）。選択したプローブを、それぞれの器官についての４０モジュール内の分布について解析した。Ｇ１関連遺伝子は、単一のインターフェロン関連モジュールに分布した（表１７および表１８）。他のグループ関連の遺伝子は、それぞれの器官についていくつかのモジュールに広く異なって分布した。ＬＮにおけるＧ１（アジュバント５種類）は、５種類のアジュバント（cdiGMP、cGAMP、DMXAA、PolyICおよびR848）に関連する遺伝子の分布の結果を示す。バーおよび数字は、各グループ内の遺伝子プローブの百分率を示す。ＬＶにおけるＧ４ならびにＬＮにおけるＧ３およびＧ６は、それぞれ、１種類のアジュバントのみを含む（それぞれ、MALP2s、FK565およびAddaVax）。これらの結果は、利用できるデータが限定的であるので、解釈には注意を要する。
【図１６Ｂ】アジュバントグループ関連遺伝子間の異なる関係性および共通の関係性ならびにそれぞれの器官からの４０モジュール。アジュバントグループ関連のアップレギュレートされた遺伝子を、遺伝子発現値のｚスコアに基づいて選択した（表１７）。選択したプローブを、それぞれの器官についての４０モジュール内の分布について解析した。Ｇ１関連遺伝子は、単一のインターフェロン関連モジュールに分布した（表１７および表１８）。他のグループ関連の遺伝子は、それぞれの器官についていくつかのモジュールに広く異なって分布した。ＬＮにおけるＧ１（アジュバント５種類）は、５種類のアジュバント（cdiGMP、cGAMP、DMXAA、PolyICおよびR848）に関連する遺伝子の分布の結果を示す。バーおよび数字は、各グループ内の遺伝子プローブの百分率を示す。ＬＶにおけるＧ４ならびにＬＮにおけるＧ３およびＧ６は、それぞれ、１種類のアジュバントのみを含む（それぞれ、MALP2s、FK565およびAddaVax）。これらの結果は、利用できるデータが限定的であるので、解釈には注意を要する。
【図１６Ｃ】アジュバントグループ関連遺伝子間の異なる関係性および共通の関係性ならびにそれぞれの器官からの４０モジュール。アジュバントグループ関連のアップレギュレートされた遺伝子を、遺伝子発現値のｚスコアに基づいて選択した（表１７）。選択したプローブを、それぞれの器官についての４０モジュール内の分布について解析した。Ｇ１関連遺伝子は、単一のインターフェロン関連モジュールに分布した（表１７および表１８）。他のグループ関連の遺伝子は、それぞれの器官についていくつかのモジュールに広く異なって分布した。ＬＮにおけるＧ１（アジュバント５種類）は、５種類のアジュバント（cdiGMP、cGAMP、DMXAA、PolyICおよびR848）に関連する遺伝子の分布の結果を示す。バーおよび数字は、各グループ内の遺伝子プローブの百分率を示す。ＬＶにおけるＧ４ならびにＬＮにおけるＧ３およびＧ６は、それぞれ、１種類のアジュバントのみを含む（それぞれ、MALP2s、FK565およびAddaVax）。これらの結果は、利用できるデータが限定的であるので、解釈には注意を要する。
【図１７】CpGアジュバントによって有意にアップレギュレートされた遺伝子のベン図およびアノテーション解析。有意に差示的に発現された遺伝子をベン図で解析し、示した遺伝子セットを、TargetMineによる生物学的アノテーションのためにさらに解析した。D35_K3_K3SPGの共通遺伝子（７５の遺伝子プローブを含む）はインターフェロン関連の生物学的プロセスに強く関連付けられた。
【図１８】stingリガンドアジュバントによって有意にアップレギュレートされた遺伝子のベン図およびアノテーション解析。有意に差示的に発現された遺伝子をベン図で解析し、示した遺伝子セットを、TargetMineによる生物学的アノテーションのためにさらに解析した。cdiGMP_cGAMP_DMXAAの共通遺伝子（１４９１の遺伝子プローブを含む）はインターフェロン関連の生物学的プロセスに強く関連付けられた。
【図１９Ａ】血液学的データと遺伝子発現との代表的な相関プロット。示した器官におけるCxcl(a)、Il7(b)およびS1pr5(c)についての血液学的データと遺伝子発現との代表的な相関プロットを示す。上のパネルは白血球（ＷＢＣ）のデータを示す。下のパネルはリンパ球（ＬＹＭ）を示す。(a)ＬＶのWBC_Cxcl9において高い相関が観察された。ＬＮでは、Cxcl9は、cdiGMP、cGAMPおよびDMXAAによって誘導されたが、これら３種類のアジュバントは白血病を引き起こさなかった。(b)ＳＰにおけるIl7の低減は、アジュバント誘導性のリンパ球欠乏症と強度に相関した。(c)ＳＰにおけるS1pr5の低減もまた、リンパ球欠乏症と強度に相関した。興味深いことに、S1pr5とＬＹＭとの相関はＳＰにおいてのみ観察された。
【図１９Ｂ】血液学的データと遺伝子発現との代表的な相関プロット。示した器官におけるCxcl(a)、Il7(b)およびS1pr5(c)についての血液学的データと遺伝子発現との代表的な相関プロットを示す。上のパネルは白血球（ＷＢＣ）のデータを示す。下のパネルはリンパ球（ＬＹＭ）を示す。(a)ＬＶのWBC_Cxcl9において高い相関が観察された。ＬＮでは、Cxcl9は、cdiGMP、cGAMPおよびDMXAAによって誘導されたが、これら３種類のアジュバントは白血病を引き起こさなかった。(b)ＳＰにおけるIl7の低減は、アジュバント誘導性のリンパ球欠乏症と強度に相関した。(c)ＳＰにおけるS1pr5の低減もまた、リンパ球欠乏症と強度に相関した。興味深いことに、S1pr5とＬＹＭとの相関はＳＰにおいてのみ観察された。
【図１９Ｃ】血液学的データと遺伝子発現との代表的な相関プロット。示した器官におけるCxcl(a)、Il7(b)およびS1pr5(c)についての血液学的データと遺伝子発現との代表的な相関プロットを示す。上のパネルは白血球（ＷＢＣ）のデータを示す。下のパネルはリンパ球（ＬＹＭ）を示す。(a)ＬＶのWBC_Cxcl9において高い相関が観察された。ＬＮでは、Cxcl9は、cdiGMP、cGAMPおよびDMXAAによって誘導されたが、これら３種類のアジュバントは白血病を引き起こさなかった。(b)ＳＰにおけるIl7の低減は、アジュバント誘導性のリンパ球欠乏症と強度に相関した。(c)ＳＰにおけるS1pr5の低減もまた、リンパ球欠乏症と強度に相関した。興味深いことに、S1pr5とＬＹＭとの相関はＳＰにおいてのみ観察された。
【図２０Ａ】ＡＳ０４のクラスター解析。ＡＳ０４およびalum（ALM_gsk）対照試料についてのデータを、それぞれの器官（ＬＶ、ａ；ＳＰ、ｂ；ＬＮ、ｃ）について処理して解析した。全体として、クラスター構造は、図２および図１４に示されるものと同様となった。対照のalum(ALM_gsk)はバッチ効果閾値を下回り、これはLVおよびSPにおけるALMでも同様であった。LNにおけるALM_gskのうちの１つの試料は、バッチ効果の閾値を上回り、ＬＮにおいてＧ２に分類された。
【図２０Ｂ】ＡＳ０４のクラスター解析。ＡＳ０４およびalum（ALM_gsk）対照試料についてのデータを、それぞれの器官（ＬＶ、ａ；ＳＰ、ｂ；ＬＮ、ｃ）について処理して解析した。全体として、クラスター構造は、図２および図１４に示されるものと同様となった。対照のalum(ALM_gsk)はバッチ効果閾値を下回り、これはLVおよびSPにおけるALMでも同様であった。LNにおけるALM_gskのうちの１つの試料は、バッチ効果の閾値を上回り、ＬＮにおいてＧ２に分類された。
【図２０Ｃ】ＡＳ０４のクラスター解析。ＡＳ０４およびalum（ALM_gsk）対照試料についてのデータを、それぞれの器官（ＬＶ、ａ；ＳＰ、ｂ；ＬＮ、ｃ）について処理して解析した。全体として、クラスター構造は、図２および図１４に示されるものと同様となった。対照のalum(ALM_gsk)はバッチ効果閾値を下回り、これはLVおよびSPにおけるALMでも同様であった。LNにおけるALM_gskのうちの１つの試料は、バッチ効果の閾値を上回り、ＬＮにおいてＧ２に分類された。
【図２０Ｄ】図２０ＡのＬＶクラスターの左側の拡大図である。
【図２０Ｅ】図２０ＡのＬＶクラスターの右側の拡大図である。
【図２０Ｆ】図２０ＢのＳＰクラスターの左側の拡大図である。
【図２０Ｇ】図２０ＢのＳＰクラスターの右側の拡大図である。
【図２０Ｈ】図２０ＣのＬＮクラスターの左側の拡大図である。
【図２０Ｉ】図２０ＣのＬＮクラスターの右側の拡大図である。
【図２１】図２１は複数の器官のクラスター解析によって決定した場合のアジュバントのグループ化を示す。図２、図１４および図２０に示されるデータを一つの表にまとめた。ＡＳ０４はＬＮにおいてＧ１であり、ＬＶにおいてＧ２であった。ＳＰにおいてＧ２は固有のグループとなった。ＡＳ０４のデータを追加しても、図２および図１４に示されるアジュバントクラスター構造は全体として変化しなかった。
【図２２Ａ】図２２では、Ａｄｖａｘ（商標）が、Ｔｈ２型抗原と組み合わせた場合にはＴｈ２応答を誘導することを示す。（Ａ〜Ｄ）０日目および１４日目に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）にＳＶおよびアジュバントをｉ．ｍ．投与することで免疫化した。血清中の抗原特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃならびに全ＩｇＥを１４日目および２８日目にＥＬＩＳＡで測定した。（Ｅ−Ｇ）２８日目に、脾細胞を、１５μｇのＳＶおよびアジュバントで免疫化したマウスから調製し、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩの核タンパク質エピトープペプチドで刺激した。刺激後、上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−１３およびＩＬ−１７をＥＬＩＳＡで測定した。結果は３つの別個の実験を表す。中央値およびＳＥＭをそれぞれの群について示している。統計的有意を、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定における＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、†Ｐ＜０．０５、†††Ｐ＜０．００１で示す。
【図２２Ｂ】図２２では、Ａｄｖａｘ（商標）が、Ｔｈ２型抗原と組み合わせた場合にはＴｈ２応答を誘導することを示す。（Ａ〜Ｄ）０日目および１４日目に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）にＳＶおよびアジュバントをｉ．ｍ．投与することで免疫化した。血清中の抗原特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃならびに全ＩｇＥを１４日目および２８日目にＥＬＩＳＡで測定した。（Ｅ−Ｇ）２８日目に、脾細胞を、１５μｇのＳＶおよびアジュバントで免疫化したマウスから調製し、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩの核タンパク質エピトープペプチドで刺激した。刺激後、上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−１３およびＩＬ−１７をＥＬＩＳＡで測定した。結果は３つの別個の実験を表す。中央値およびＳＥＭをそれぞれの群について示している。統計的有意を、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定における＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、†Ｐ＜０．０５、†††Ｐ＜０．００１で示す。
【図２２Ｃ】図２２では、Ａｄｖａｘ（商標）が、Ｔｈ２型抗原と組み合わせた場合にはＴｈ２応答を誘導することを示す。（Ａ〜Ｄ）０日目および１４日目に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）にＳＶおよびアジュバントをｉ．ｍ．投与することで免疫化した。血清中の抗原特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃならびに全ＩｇＥを１４日目および２８日目にＥＬＩＳＡで測定した。（Ｅ−Ｇ）２８日目に、脾細胞を、１５μｇのＳＶおよびアジュバントで免疫化したマウスから調製し、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩの核タンパク質エピトープペプチドで刺激した。刺激後、上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−１３およびＩＬ−１７をＥＬＩＳＡで測定した。結果は３つの別個の実験を表す。中央値およびＳＥＭをそれぞれの群について示している。統計的有意を、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定における＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、†Ｐ＜０．０５、†††Ｐ＜０．００１で示す。
【図２３Ａ】図２３では、Ａｄｖａｘ（商標）が、Ｔｈ１型抗原と組み合わせた場合にはＴｈ１応答を呈することを示す。（Ａ−Ｄ）０日目および１４日目に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）に、ＷＶおよびアジュバントをｉ．ｍ．投与することで免疫化した。１５μｇのＳＶを、アラムとともに用いて０日目および１４日目に免疫化した。血清中の抗原特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃならびに全ＩｇＥ力価を１４日目および２８日目にＥＬＩＳＡで測定した。（Ｅ−Ｇ）２８日目に、脾細胞を、１５μｇのＷＶおよびアジュバントで免疫化したマウスから調製し、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ特異的な核タンパク質ペプチドで刺激した。刺激後、上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−１３およびＩＬ−１７をＥＬＩＳＡで測定した。結果は３つの別個の実験を表す。中央値およびＳＥＭをそれぞれの群について示している。統計的有意を、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定における＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、†Ｐ＜０．０５で示す。
【図２３Ｂ】図２３では、Ａｄｖａｘ（商標）が、Ｔｈ１型抗原と組み合わせた場合にはＴｈ１応答を呈することを示す。（Ａ−Ｄ）０日目および１４日目に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）に、ＷＶおよびアジュバントをｉ．ｍ．投与することで免疫化した。１５μｇのＳＶを、アラムとともに用いて０日目および１４日目に免疫化した。血清中の抗原特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃならびに全ＩｇＥ力価を１４日目および２８日目にＥＬＩＳＡで測定した。（Ｅ−Ｇ）２８日目に、脾細胞を、１５μｇのＷＶおよびアジュバントで免疫化したマウスから調製し、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ特異的な核タンパク質ペプチドで刺激した。刺激後、上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−１３およびＩＬ−１７をＥＬＩＳＡで測定した。結果は３つの別個の実験を表す。中央値およびＳＥＭをそれぞれの群について示している。統計的有意を、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定における＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、†Ｐ＜０．０５で示す。
【図２３Ｃ】図２３では、Ａｄｖａｘ（商標）が、Ｔｈ１型抗原と組み合わせた場合にはＴｈ１応答を呈することを示す。（Ａ−Ｄ）０日目および１４日目に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）に、ＷＶおよびアジュバントをｉ．ｍ．投与することで免疫化した。１５μｇのＳＶを、アラムとともに用いて０日目および１４日目に免疫化した。血清中の抗原特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃならびに全ＩｇＥ力価を１４日目および２８日目にＥＬＩＳＡで測定した。（Ｅ−Ｇ）２８日目に、脾細胞を、１５μｇのＷＶおよびアジュバントで免疫化したマウスから調製し、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ特異的な核タンパク質ペプチドで刺激した。刺激後、上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−１３およびＩＬ−１７をＥＬＩＳＡで測定した。結果は３つの別個の実験を表す。中央値およびＳＥＭをそれぞれの群について示している。統計的有意を、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定における＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、†Ｐ＜０．０５で示す。
【図２４】図２４では、Ａｄｖａｘ（商標）が、Ｔｈ０型抗原と組み合わせた場合またはＴｌｒ７−／−マウスにおいては免疫応答を誘導しないことを示す。０日目および１４日目に、（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝４または５）または（Ｂ）Ｔｌｒ７−／−マウス（ｎ＝５）に、それぞれ、１００μｇのＯＶＡおよびアジュバント、または１．５μｇのＷＶ単独もしくは１．５μｇのＷＶおよびアジュバントをｉ．ｍ．投与することで免疫化した。血清中の抗原特異的全ＩｇＧ力価を１４日目および２８日目にＥＬＩＳＡで測定した。結果は３つの別個の実験を表す。中央値およびＳＥＭをそれぞれの群について示している。統計的有意を、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定における＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１で示す。
【図２５】図２５では、Ａｄｖａｘ（商標）がインビボでＤＣを活性化するが、インビトロでは活性化しないことを示す。（Ａ〜Ｃ）骨髄由来ＤＣを、インビトロで２４時間１ｍｇ／ｍｌアラム、１ｍｇ／ｍｌＡｄｖａｘ（商標）または５０ｎｇ／ｍｌＬＰＳで刺激し、その後、ｐＤＣ上のＣＤ４０発現を評価した。（Ｄ−Ｆ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの尾基底に０．６７ｍｇアラム、１ｍｇ  Ａｄｖａｘ（商標）または５０ｎｇ  ＬＰＳを注射した。注射の２４時間後に、鼠径部リンパ節を採取し、ＤＮａｓｅＩおよびコラゲナーゼで処理した。その後、細胞を染色し、ＦＡＣＳによって分析した。結果は３つの別個の実験を表す。生理食塩水の結果を線とともに灰色の領域で示し、アジュバントの結果をさらなる塗りつぶしを行わず線のみで示す。
【図２６Ａ】図２６では、マクロファージがＡｄｖａｘ（商標）のアジュバント効果に必要とされることを示す。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１標識Ａｄｖａｘデルタイヌリン粒子のｉ．ｄ．投与の（Ａ−Ｃ）１時間後および（Ｄ−Ｆ）２４時間後のリンパ節の２光子励起顕微鏡分析。Ａｄｖａｘ（商標）投与の３０分前に抗ＣＤ１６９−ＦＩＴＣおよび抗ＭＡＲＣＯ−フィコエリトリン抗体をｉ．ｄ．注射することでＣＤ１６９＋およびＭＡＲＣＯ＋  マクロファージを染色した。（Ａ，Ｄ）青（左）はＡｄｖａｘ（商標）を示し、（Ｂ，Ｅ）緑（中央）はＣＤ１６９＋マクロファージを示し、（Ｃ，Ｆ）赤（右）はＭＡＲＣＯ＋  マクロファージを示す。（Ｇ，Ｈ）リンパ節における貪食細胞を、示した日（−２日目および−７日目）にクロドロン酸リポソーム注射することで枯渇させ、その後ＷＶ＋Ａｄｖａｘ（商標）を０日目にｉ．ｄ．投与することで免疫化した。血清中の抗原−特異的全ＩｇＧまたはＩｇＧ２ｃ力価を１４日目および２８日目にＥＬＩＳＡで測定した。結果は３つの別個の実験を表す。中央値およびＳＥＭをそれぞれの群について示している。統計的有意を、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定における＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１で示す。
【図２６Ｂ】図２６では、マクロファージがＡｄｖａｘ（商標）のアジュバント効果に必要とされることを示す。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１標識Ａｄｖａｘデルタイヌリン粒子のｉ．ｄ．投与の（Ａ−Ｃ）１時間後および（Ｄ−Ｆ）２４時間後のリンパ節の２光子励起顕微鏡分析。Ａｄｖａｘ（商標）投与の３０分前に抗ＣＤ１６９−ＦＩＴＣおよび抗ＭＡＲＣＯ−フィコエリトリン抗体をｉ．ｄ．注射することでＣＤ１６９＋およびＭＡＲＣＯ＋  マクロファージを染色した。（Ａ，Ｄ）青（左）はＡｄｖａｘ（商標）を示し、（Ｂ，Ｅ）緑（中央）はＣＤ１６９＋マクロファージを示し、（Ｃ，Ｆ）赤（右）はＭＡＲＣＯ＋マクロファージを示す。（Ｇ，Ｈ）リンパ節における貪食細胞を、示した日（−２日目および−７日目）にクロドロン酸リポソーム注射することで枯渇させ、その後ＷＶ＋Ａｄｖａｘ（商標）を０日目にｉ．ｄ．投与することで免疫化した。血清中の抗原−特異的全ＩｇＧまたはＩｇＧ２ｃ力価を１４日目および２８日目にＥＬＩＳＡで測定した。結果は３つの別個の実験を表す。中央値およびＳＥＭをそれぞれの群について示している。統計的有意を、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定における＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１で示す。
【図２７Ａ】図２７では、Ａｄｖａｘ（商標）が、ＩＬ−１β、ＣＬＲおよびＴＮＦ−αシグナル伝達経路の遺伝子発現を変化させることを示す。Ａｄｖａｘ（商標）単独投与（ｉ．ｄ．またはｉ．ｐ．）６時間後の全器官（肺；ＬＧ、肝臓；ＬＶ、脾臓；ＳＰ、腎臓；ＫＤ、リンパ節；ＬＮ）のトランスクリプトームをＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ（ｎ＝３）によって取得した。（Ａ）選択した遺伝子プローブ（ＦＣ＞２かつＰＡ＝１）のみを示す。（Ｂ）Ａｄｖａｘ（商標）応答細胞集団解析を行った。図の左半分は、１０種の免疫細胞型を示し、右半分は試料を示す。内側の円内のｒｉｂｂｏｎは、それぞれの試料の細胞型スコアを表す。中間層の環の色は細胞型または試料を表す。最外層の環は、合計寄与のうちの、対抗する因子から見たときのそれぞれの因子（細胞型または試料）についての％を表す。例えば、ＳＰ．ｉｐにおいて、好中球は、その細胞集団の約３０％を占める。（Ｃ）ＳＰにおいてＡｄｖａｘ（商標）誘導性遺伝子のＩＰＡ上流レギュレーター解析を行った。
【図２７Ｂ】図２７では、Ａｄｖａｘ（商標）が、ＩＬ−１β、ＣＬＲおよびＴＮＦ−αシグナル伝達経路の遺伝子発現を変化させることを示す。Ａｄｖａｘ（商標）単独投与（ｉ．ｄ．またはｉ．ｐ．）６時間後の全器官（肺；ＬＧ、肝臓；ＬＶ、脾臓；ＳＰ、腎臓；ＫＤ、リンパ節；ＬＮ）のトランスクリプトームをＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ（ｎ＝３）によって取得した。（Ａ）選択した遺伝子プローブ（ＦＣ＞２かつＰＡ＝１）のみを示す。（Ｂ）Ａｄｖａｘ（商標）応答細胞集団解析を行った。図の左半分は、１０種の免疫細胞型を示し、右半分は試料を示す。内側の円内のｒｉｂｂｏｎは、それぞれの試料の細胞型スコアを表す。中間層の環の色は細胞型または試料を表す。最外層の環は、合計寄与のうちの、対抗する因子から見たときのそれぞれの因子（細胞型または試料）についての％を表す。例えば、ＳＰ．ｉｐにおいて、好中球は、その細胞集団の約３０％を占める。（Ｃ）ＳＰにおいてＡｄｖａｘ（商標）誘導性遺伝子のＩＰＡ上流レギュレーター解析を行った。
【図２７Ｃ】図２７では、Ａｄｖａｘ（商標）が、ＩＬ−１β、ＣＬＲおよびＴＮＦ−αシグナル伝達経路の遺伝子発現を変化させることを示す。Ａｄｖａｘ（商標）単独投与（ｉ．ｄ．またはｉ．ｐ．）６時間後の全器官（肺；ＬＧ、肝臓；ＬＶ、脾臓；ＳＰ、腎臓；ＫＤ、リンパ節；ＬＮ）のトランスクリプトームをＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ（ｎ＝３）によって取得した。（Ａ）選択した遺伝子プローブ（ＦＣ＞２かつＰＡ＝１）のみを示す。（Ｂ）Ａｄｖａｘ（商標）応答細胞集団解析を行った。図の左半分は、１０種の免疫細胞型を示し、右半分は試料を示す。内側の円内のｒｉｂｂｏｎは、それぞれの試料の細胞型スコアを表す。中間層の環の色は細胞型または試料を表す。最外層の環は、合計寄与のうちの、対抗する因子から見たときのそれぞれの因子（細胞型または試料）についての％を表す。例えば、ＳＰ．ｉｐにおいて、好中球は、その細胞集団の約３０％を占める。（Ｃ）ＳＰにおいてＡｄｖａｘ（商標）誘導性遺伝子のＩＰＡ上流レギュレーター解析を行った。
【図２７Ｄ】図２７ＣのＳＰにおけるＡｄｖａｘ（商標）誘導性遺伝子のＩＰＡ上流レギュレーター解析の符号の説明の拡大図である。
【図２７Ｅ】図２７ＣのＳＰにおけるＡｄｖａｘ（商標）誘導性遺伝子のＩＰＡ上流レギュレーター解析による相関図の拡大図である。
【図２８Ａ】図２８では、ＴＮＦ−αが、Ａｄｖａｘ（商標）のアジュバント効果に必要とされることを示す。（Ａ）腹腔マクロファージをＡｄｖａｘ（商標）またはアラムで８時間刺激し、上清中のＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）１ｍｇ  Ａｄｖａｘ（商標）または０．６７ｍｇアラムをｉ．ｐ．注射した１時間後に、血清および腹腔洗浄液を収集し、血清および洗浄液中のＴＮＦ−αレベルをＥＬＩＳＡで測定した。（Ｃ−Ｅ）０日目および１４日目に、ヘテロ接合またはＴｎｆａ−／−マウス（ｎ＝５）に、１．５μｇのＷＶおよびアジュバントをｉ．ｍ．投与することで免疫化した。血清中の抗原特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ力価を、１４日目および２８日目にＥＬＩＳＡで測定した。結果は３つの別個の実験を表す。中央値およびＳＥＭをそれぞれの群について示している。統計的有意を、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定またはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定における＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１で示す。
【図２８Ｂ】図２８では、ＴＮＦ−αが、Ａｄｖａｘ（商標）のアジュバント効果に必要とされることを示す。（Ａ）腹腔マクロファージをＡｄｖａｘ（商標）またはアラムで８時間刺激し、上清中のＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）１ｍｇ  Ａｄｖａｘ（商標）または０．６７ｍｇアラムをｉ．ｐ．注射した１時間後に、血清および腹腔洗浄液を収集し、血清および洗浄液中のＴＮＦ−αレベルをＥＬＩＳＡで測定した。（Ｃ−Ｅ）０日目および１４日目に、ヘテロ接合またはＴｎｆａ−／−マウス（ｎ＝５）に、１．５μｇのＷＶおよびアジュバントをｉ．ｍ．投与することで免疫化した。血清中の抗原特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ力価を、１４日目および２８日目にＥＬＩＳＡで測定した。結果は３つの別個の実験を表す。中央値およびＳＥＭをそれぞれの群について示している。統計的有意を、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定またはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定における＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１で示す。
【図２９】毒性ゲノム学データベースに基づく「毒性」群および「非毒性」群の作成の概略図を示す。
【図３０Ａ】ネクローシス予測モデルのために選択したプローブ（遺伝子）について、免疫応答（１）および代謝（４）に関連する５つの経路に濃縮されたことを示す。
【図３０Ｂ】各アジュバント投与の６時間および２４時間後時点の遺伝子変動パターンを、毒性ゲノム学データベースの６時間および２４時間後時点の「毒性」遺伝子パターンおよび「非毒性」遺伝子パターンと比較してそれぞれのアジュバントについての「毒性」スコアを計算した。上は、６時間後（左）または２４時間後（右）の比較結果において高い毒性スコアを示したアジュバントを示す。下は、２４時間後の比較結果における各アジュバントの毒性スコアを示す。
【図３１】実際に各アジュバントを投与して６時間後（上）および２４時間後（下）時点のＡＬＴの活性を示す。
【図３２】マウスにＦＫ５６５を腹腔内投与した１日目、２日目、３日目および５日目に収集した肝臓をヘマトキシリン・エオジン染色し、組織学的解析を行った結果を示す。矢印は、肝損傷を示す。スケールバーは１００μｍを示す。
【図３３】マウスにＦＫ５６５を腹腔内投与した後に収集した肝臓をＴＵＮＥＬ染色し、アポトーシスを確認した結果を示す。左は対称のＰＢＳ投与の結果を示し、右はＦＫ５６５投与の結果を示す。
【図３４】マウスにＰＢＳ、ＦＫ５６５（１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇまたは１００μｇ／ｋｇ）またはＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した３時間後、１日目および２日目に血液を収集した。これらの血液を使用してアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の血清レベルについて、生化学的解析を行った結果を示す。
【図３５】データベースを解析した結果得られたＯｓｍｒを中心とした遺伝子クラスターを示す。
【図３６】上段は、各アジュバントをラットに投与した６時間後の肝臓における遺伝子Ｙの発現変化（倍数変化）を示す。下段は、ＦＫ５６５を野生型（左）またはＯｓｍｒ欠失（右）マウスに投与して収集した肝臓をＴＵＮＥＬ染色した結果を示す。
【図３７】野生型またはＯｓｍｒ欠失マウスにＰＢＳ、ＦＫ５６５（１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇまたは１００μｇ／ｋｇ）またはＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した１日後に血液を収集した。これらの血液を使用してアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の血清レベルについて、生化学的解析を行った結果を示す。
【図３８】アジュバント性予測モデルの作成の概略図を示す。
【図３９】アジュバント性予測モデルのために選択したプローブ（遺伝子）は、細胞死（４）、免疫応答（２）および代謝（３６）に関連する４２の経路に濃縮されたことを示す（左）。細胞死（４）および免疫応答（２）に関する経路を構成する遺伝子のベン図を示す（右）。
【図４０】アジュバント性予測モデルによって計算された、薬物、免疫刺激剤、ＬＰＳおよびＴＮＦのスコアを示す（上）。ＰＯ；経口投与、ＩＶ；静脈内投与、ＩＰ；腹腔内投与をそれぞれ示す。アジュバント性予測モデルのＲＯＣ曲線を示す（下）。
【図４１】マウスに、オボアルブミンとともにａｌｕｍ、ＣｐＧｋ３または５種類の薬物（ＡＣＡＰ、ＢＯＲ、ＣＨＸ、ＣＯＬ、ＰＨＡ）を２〜３種類の用量で０日目および１４日目に皮内投与し、２１日目に血液および脾臓を収集した。抗オボアルブミン（ｏｖａ）抗体価（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２および全ＩｇＧ）を２１日目に測定した結果を示す。Ｙ軸は、log10の尺度で抗体価の増大を示す。括弧内の数は投与用量（μｇ／１回／マウス）を示す。オボアルブミンは１０μｇ／１回／マウスで投与した。
【図４２】脾臓細胞に対して、インビトロで、各薬物に加えて、オボアルブミン（ｏｖａ）２５７〜２６４ペプチド（ＯＶＡ−ＭＨＣ１）、ｏｖａ  ３２３〜３３９ペプチド（ＯＶＡ−ＭＨＣ２）またはｏｖａタンパク質（ＯＶＡ−ｗｈｏｌｅ）を添加して刺激するか、または追加の刺激なしで処理して上清を収集した。上清におけるＴｈ１型（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）のサイトカインをＥＬＩＳＡで測定した結果を示す。括弧内の数は投与用量（μｇ／１回／マウス）を示す。オボアルブミンは１０μｇ／１回／マウスで投与した。
【図４３】脾臓細胞に対して、インビトロで、各薬物に加えて、オボアルブミン（ｏｖａ）２５７〜２６４ペプチド（ＯＶＡ−ＭＨＣ１）、ｏｖａ  ３２３〜３３９ペプチド（ＯＶＡ−ＭＨＣ２）またはｏｖａタンパク質（ＯＶＡ−ｗｈｏｌｅ）を添加して刺激するか、または追加の刺激なしで処理して上清を収集した。上清におけるＴｈ２型（ＩＬ−４およびＩＬ−５）のサイトカインをＥＬＩＳＡで測定した結果を示す。括弧内の数は投与用量（μｇ／１回／マウス）を示す。オボアルブミンは１０μｇ／１回／マウスで投与した。
【図４４】マウスに、オボアルブミンとともにａｌｕｍ、ＣｐＧｋ３または５種類の薬物（ＡＣＡＰ、ＢＯＲ、ＣＨＸ、ＣＯＬ、ＰＨＡ）を投与し、３時間後（０日目）に血液を収集し、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の血清レベルについて生化学的解析を行った結果を示す。括弧内の数は投与用量（μｇ／１回／マウス）を示す。オボアルブミンは１０μｇ／１回／マウスで投与した。
【図４５】マウスに各薬物を腹腔内投与して６時間および２４時間後に血液を収集し、循環血液中のｍｉＲＮＡを分析した結果を示す。縦軸は−ｌｏｇ１０（ｐ値）を示し、横軸は−ｌｏｇ２（ｍｉＲＮＡ量）を示す。
【図４６】マウスにＡｌｕｍおよびＡＳ０４を投与した６時間および２４時間後の循環血液中のｍｉＲＮＡを分析した結果を示す。縦軸は−ｌｏｇ１０（ｐ値）を示し、横軸は−ｌｏｇ２（ｍｉＲＮＡ量）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１２】
（医薬成分の分類）
医薬成分は、作用効果が分かっているものであっても、系統立てて分類されていないものも多い。例えば、免疫アジュバントはワクチンの効力の向上に重要な働きをする。広範な物質が免疫アジュバントとして機能することが報告されているが、その作用様式および安全性プロファイルは完全には理解されているというものではない。本発明は、多数の（実施例では、21種類）の異なる医薬成分（例えば、アジュバント）を用いた動物（例えば、マウス）における臓器・器官全体のトランスクリプトーム分析を行い、これらの医薬成分誘導性応答（アジュバントの場合、アジュバント誘導性応答）の統合データを作成し、医薬成分（例えば、アジュバント）の詳細な特徴を解明し（抽出し）、その作用メカニズムおよび潜在的な安全性プロファイルを予測し分類することができることを見出し、具体的にグループ分けができること、およびその各々に標準的な医薬成分（例えば、アジュバント）を設定することができることを見出した。本発明は、任意の医薬成分（例えば、アジュバント）を網羅的かつ体系的に評価するための柔軟性のある標準化する方法およびその枠組み（分類方法）を提供する。本発明では、例えば、少なくともＧ１〜Ｇ６と命名された特徴のあるアジュバント群またはそれ以外の群に各アジュバントに分類することができることが示された。このような分類には、医薬成分の機能（例えば、アジュバント機能）が未知の物質または新規物質などの対象物質のトランスクリプトーム分析を行い、機能が確認された基準医薬成分（例えば、基準アジュバント）のトランスクリプトーム分析データを含めてクラスタリング分析を行い、対象物質がどの基準医薬成分と同様のクラスターに分類されるかを判断することで、対象物質の属性を特定または特定の予測をすることができる。本発明は、任意の医薬成分（有効成分、添加成分、アジュバントなど）を網羅的かつ体系的に評価するための柔軟性のある標準化する方法およびその枠組みを提供する。
【００１３】
本発明の例示的な分類対象であるアジュバントは、伝統的には、ワクチンにおける添加剤として使用されてきた。種々の物質、例えば、油エマルジョン、アルミニウム塩またはナノ粒子としてしばしば製剤化される小分子、脂質および核酸が、多くのワクチン抗原とともにアジュバントとして機能することが知られている（Coffman,R.L.,Sher,A.  &  Seder,  R.A.  Immunity  33,492-503(2010)；Reed,  S.G.,  Orr,  M.T.  &  Fox,  C.B.  Nat  Med  19,  1597-1608(2013)およびDesmet,C.J.  &  Ishii,  K.J.  Nature  reviews.  Immunology  12,  479-491(2012)）。アジュバントの作用様式は、経験的に２つのクラス（免疫刺激剤および抗原送達システム）にカテゴリー化されているが、体系的な分類はなされていない。免疫刺激剤は、その外因性起源または内因性起源にしたがって、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰs）（Janeway,C.A.,  Jr.  Cold  Spring  Harbor  symposia  on  quantitative  biology  54  Pt  1,  1-13(1989)）または傷害関連分子パターン(DAMPs)（Matzinger,  P.  Annu  Rev  Immunol  12,  991-1045(1994)）にさらに分類することが提唱されており、生殖系列コード化パターン認識受容体によって認識され、これによってインターフェロンおよび炎症促進性サイトカインの分泌が誘導される（Kawai,T.  &  Akira,  S.  Nature  immunology  11,  373-384(2010)；Matzinger,  P.  Annu  RevImmunol  12,  991-1045(1994)）。しかし、多くのアジュバントは、レシピエントにおける複数のシグナル伝達経路に影響を及ぼすと考えられていたため、それぞれのアジュバントがインビボで免疫応答を増強するまたは方向付ける根底にあるメカニズムは従来の技術では分類不明であったが、本発明では、これらの分類が可能となった。本発明は、宿主応答について、全てのアジュバントをカテゴリー化することができる。
【００１４】
新しい医薬成分を使用するためには、適切な製剤化、ＧＭＰ生産法をクリアすることが必要である。例えば、新しいアジュバントを臨床用のワクチンに使用するためには、適切な製剤化、ＧＭＰ生産法をクリアすることが必要であり、そしてより重要なことは、そのアジュバントの使用によるリスクおよびベネフィット（安全性および有効性）の確立を含め複数のステップをクリアする必要がある（Shoenfeld,  Y.  &  Agmon-Levin,  N.  Journal  of  autoimmunity  36,  4-8(2011)；Batista-Duharte,  A.,  Lindblad,  E.B.  &  Oviedo-Orta,  E.  Toxicologyletters  203,  97-105(2011)；Zaitseva,  M.  et  al.  Vaccine  30,  4859-4865(2012).；Stassijns,J.,  Bollaerts,  K.,  Baay,  M.  &  Verstraeten,  T.  Vaccine  34,  714-722(2016)）。動物実験の結果は、ある程度ヒトに外挿することができることから、前臨床動物研究がワクチンの開発のために必要とされている（Batista-Duharte,A.,  Lindblad,  E.B.  &  Oviedo-Orta,  Toxicology  letters  203,  97-105(2011)；Sun,Y.,  Gruber,  M.  &  Matsumoto,M.  Journal  of  pharmacological  and  toxicologicalmethods  65,  49-57(2012)）。実際、新しいアジュバント化ワクチンの開発のためには、動物における生物学的影響および免疫病理学的影響の慎重な評価が必須となる（Mastelic,B.  et  al.  Biologicals  41,  115-124(2013)）。現在承認されているアジュバント化ワクチンは、ヒトに使用する前に前臨床毒性評価をクリアしており、市販後その安全性が市販後調査等の副作用調査モニタリングによって追跡調査されている。しかし、大きく異なる物理化学的性質を備えた種々の物質がアジュバントとして機能することの合理的な説明はこれまでなされておらず、ワクチンアジュバントの作用様式および安全性リスクについて動物モデルで評価するための単純かつ直截な方法は存在していなかったが、本発明の手法を用いることによりこれが可能となった。
【００１５】
システムワクチン学の手法（Pulendran,  B.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A  111,  12300-12306(2014)）は、保護作用の相関関係を特定することによってワクチン科学の研究手法であり、（特にヒトワクチンについて）比較的新しい手法である（Ravindran,R.  et  al.  Science  343,  313-317(2014)；Tsang,  J.S.  et  al.  Cell  157,  499-513(2014)；Nakaya,  H.I.  et  al.  Immunity  43,  1186-1198(2015)；Sobolev,  O.  et  al.Nature  immunology  17,  204-213(2016)）。ワクチン接種後の早期に誘導される遺伝子発現プロファイルを調査することによって、これらの手法は、その後の適応免疫応答を予測することができる。
【００１６】
本発明は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）に対して、体系的で網羅的な研究手法を提供するものである。例えば、アジュバント分野では、種々の分析方法がワクチンアジュバントについて研究されており、分子シグネチャが報告されているが、体系的な解決には至っておらず、むしろ、種々の既知の分類方法では、分類ができないと報告されている（Olafsdottir,  T.,  Lindqvist,  M.  &  Harandi,  A.M.  Vaccine  33,5302-5307(2015)）。したがって、本発明は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を体系的網羅的に分類し、新規医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の有効性および安全性について信頼性のおける予測手段を提供するものである。さらに、本発明は、医薬成分の機能（例えば、有効成分の薬効、添加成分の補助機能、アジュバント機能）が未知または未確定の物質について、その機能の特定について信頼性のおける予測手段を提供するものであり、さらに、また、機能が既知のものでも、その品質管理に役立てることができ、安全性管理の一環として活用することもできる。また、新規医薬成分（例えば、アジュバント）の有効性および安全性の確認の一環として利用することができる。
【００１７】
本発明者らは、広範な異なるアジュバントの投与後に、マウスの肝臓（ＬＶ）、脾臓（ＳＰ）および流入領域鼠径リンパ節（ＬＮ）からおよそ３３０のマイクロアレイの遺伝子発現データを取得した。データを統合することで、アジュバント誘導遺伝子（トランスクプトーム）パネルを規定することができた。本明細書ではこれを「アジュバント遺伝子空間（スペース）」とも称する。この空間内のアジュバント誘導遺伝子の発現データ（トランスクプトーム）を解析することで、インビボにおけるそれぞれのアジュバントの性質を明らかにした。この手法を使用して、２つの比較的新しいアジュバントについてその未知の作用メカニズムを予測した。この予測の１つは、独立して研究された結果と一致しており、本発明の手法が正しい予測結果を与えることが確認された（Hayashi,  M.  et  al..  Scientific  Reports  6:  29165.doi:10.1038/srep29165.）。そして、この考え方は、アジュバントに限られることなく、有効成分、添加成分などの医薬成分一般に適用し得ることが想定される。すなわち、本発明者らは、広範な異なる医薬成分の投与後に、遺伝子発現データを取得し、データを統合することで、医薬成分誘導遺伝子（トランスクプトーム）パネルを規定することができる。本明細書ではこれを「医薬成分遺伝子空間（スペース）」とも称する。この空間内の医薬成分誘導遺伝子の発現データ（トランスクプトーム）を解析することで、インビボにおけるそれぞれの医薬成分の性質を明らかにすることができる。このような方法は、機械学習などを活用した人工知能（ＡＩ）を利用して実施することができる。
【００１８】
（定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【００１９】
本明細書において「医薬成分」とは、医薬を構成し得る任意の成分を意味し、例えば、有効成分（それ自体が薬効を示すもの）、添加成分（それ自体は、薬効を期待されていないが、医薬として含まれる場合一定の役割（例えば、賦形剤、滑沢剤、界面活性剤等）を果たすことが期待される成分）、アジュバント（主薬（例えば、ワクチンなどの場合抗原）の薬効（例えば免疫応答惹起能力）を増強するもの）等を例示することができる。医薬成分としては、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤、緩衝剤、結合剤、爆破剤、希釈剤、香味料、潤滑剤などを例示することができる。医薬成分は、単独の物質であってもよく、複数の物質や剤の組合せであってもよい。有効成分と添加成分との組み合わせ、アジュバントと有効成分との組み合わせなどの任意の組合せも含まれ得る。
【００２０】
本明細書では、「有効成分」は、意図される薬効を発揮する成分をいい、単独または複数の成分が該当し得る。
【００２１】
本明細書において「添加成分」とは、薬効を期待されていないが、医薬として含まれる場合一定の役割を果たす任意の成分をいい、例えば、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤、緩衝剤、結合剤、爆破剤、希釈剤、香味料、潤滑剤を挙げることがができる。本明細書では、βシクロデキストリンなども添加成分として包含されるところ、このような成分はアジュバントとしても有効であると判明することがある。この場合、目的によりアジュバントというか添加成分というかを当業者が決定する。
【００２２】
本明細書において「アジュバント」とは、本明細書で使用される場合、抗原（ワクチンなどが例示される。）と共同して投与される場合に、その抗原に対する被験体の免疫応答を増強する化合物をいう。免疫応答のアジュバント媒介性の増強は、代表的に、（ｉ）上記抗原単独での免疫に応じて生成された抗体の数に対して、上記アジュバント／抗原組み合わせでの免疫に応じて生成された抗体の数の増加；（ｉｉ）上記抗原もしくは上記アジュバントを認識するＴ細胞の数の増加；（ｉｉｉ）１種以上のＩ型サイトカインのレベルの増加；ならびに（ｉｖ）生のチャレンジ後のインビボ防御のうちの１つ以上が挙げられるが、それらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法によって評価され得る。
【００２３】
本明細書において「トランスクリプトーム」とは、特定の状況下において細胞（１個の細胞または細胞の集団）中に存在する全ての転写産物（例えば、ｍＲＮＡまたは一次転写産物（ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび他の非コードＲＮＡを含む、すべてのＲＮＡ分子のセット）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）の総体を指す呼称である。本発明に関連してトランスクリプトームは、特定の時点で所与の個体の１個の細胞、細胞の集団、好ましくは癌細胞の集団、またはすべての細胞において産生されるすべてのＲＮＡ分子のセットを意味する。
【００２４】
本明細書において「エクソーム」とは、ヒトゲノム中の全エクソンの集合体をいい、発現される遺伝子のコード部分であるエクソンによって形成される生物のゲノムの部分の全体をいう。エクソームは、タンパク質および他の機能的遺伝子産物の合成において使用される遺伝的青写真を提供する。これは、ゲノムの機能的に最も重要な部分であり、それゆえ、生物の表現型に寄与する可能性が最も高いとされてきた。
【００２５】
本明細書において「トランスクリプトーム分析」のために、任意の適切な配列決定法を本発明に従って使用することができる。次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術が好ましい。本明細書において「次世代シークエンシング」または「ＮＧＳ」という用語は、サンガー化学として公知の「従来の」シークエンシング法に対して、ゲノム全体を小片に分割することによって核酸鋳型をゲノム全体に沿って並行してランダムに読み取る、すべての新規ハイスループットシークエンシング技術を意味する。ＮＧＳ技術（超並列シークエンシング技術とも称する）は、全ゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム（ゲノムのすべての転写配列）またはメチローム（ゲノムのすべてのメチル化配列）の核酸配列情報を非常に短期間、例えば１〜２週間以内、好ましくは１〜７日間以内、または最も好ましくは２４時間未満内に送達することができ、原理上は、単一細胞シークエンシングアプローチを可能にする。市販されているかまたは文献中で言及されている任意のＮＧＳプラットフォームを本発明の実施のために使用することができる。本明細書において「トランスクリプト―ム発現プロファイル」とは、ある因子についてトランスクリプトーム分析を行った際の各遺伝子の発現状況のプロファイルをいう。
【００２６】
本明細書において「…と等価のトランスクリプト―ム発現プロファイル」は、「トランスクリプト―ム発現プロファイル」が実質的に同一または同一であるか、ある目的のために実質的に類似していることをいい、発現プロファイルの同一性は、医薬成分（例えば、アジュバント）等の分子またはその一部について、発現プロファイルが類似しているかどうかで判定することができる。ここで、類似するかどうかは、本明細書中で定義されるｓＤＥＧなどの遺伝子発現の程度によって規定され得、発現の程度、量、活性量などに基づいて決定することができる。理論に束縛されることを望まないが、本発明の一部の実施形態では、この類似度に基づいて医薬成分（例えば、アジュバント）の分類することによって、同一のクラスターに属する医薬成分（例えば、アジュバント）は、同一のカテゴリーに入る医薬成分（例えば、アジュバント）と同様の特徴を有すると理解される。従って、本発明の手法を用いて同じ医薬成分クラスター（例えば、アジュバントクラスター）に属するかどうかを調べることによって、新規医薬成分（例えば、アジュバント）または未知の機能の医薬成分（例えば、アジュバント）の特徴分析を行うことができる。本明細書において類似度を調査するために、「類似性スコア」を使用することがありうる。この「類似性スコア」とは、類似度を示す具体的な数値をいい、例えば、トランスクリプトームの発現パターン等を計算した場合に使用される技法に応じて、適宜適切なスコアが採用されうる。類似性スコアは、例えば、回帰的な手法、ニューラルネットワーク法や、サポートベクトルマシン、ランダムフォレストといった機械学習アルゴリズムなどを用いて算出することができる。
【００２７】
本明細書において「クラスタリング」または「クラスター分析」あるいは「クラスタリング分析」とは、交換可能に用いられ、異なる性質のものが混在している集団（対象）の中から互いに類似するものを集めて集落（クラスター）を作り（分割し）、対象を分類する方法をいい、分割後の各部分集合はクラスターという。分割の方法にも幾つかの種類があり，全ての分類対象が各々、一つずつのクラスターの要素となる場合（ハード，または，クリスプなクラスターという。）、および一つのクラスターが複数のクラスターに同時に部分的に所属する場合（ソフト，または，ファジィなクラスターという。）がある。本明細書では、通常ハードなクラスター分析を利用する。代表的なクラスター分析としては、階層クラスター分析、非階層クラスター分析等がある。通常階層クラスター分析が使用されるがそれに限定されない。本明細書において「トランスクリプトームクラスタリング」とは、トランスクリプトーム分析の結果に基づいてクラスタリングを行うことをいう。
【００２８】
本明細書において「クラスター」とは、概して、ある集団の要素（例えば、医薬成分（例えば、アジュバント））を，外的基準や群の数の指定なしに，多次元空間における要素の分布から，類似したものを集めたものをいい、本明細書では、医薬成分（例えば、アジュバント）の「クラスター」という場合、多数の医薬成分（例えば、アジュバント）のうち類似したものを集めたものをいう。同一のクラスターに属する医薬成分（例えば、アジュバント）は、同様の（すなわち、同一または類似の）作用効果（例えば、アジュバント機能（例えば、サイトカイン刺激等））を有する。多変量解析によって分類することができ、種々のクラスター分析手法を用いてクラスターを構成することができる。本発明が提供する医薬成分（例えば、アジュバント）のクラスターは、そのクラスターへ属していることを示すことにより、医薬成分（例えば、アジュバント）の機能により分類を行うことが可能である。また、分類された後の同一クラスターに属する医薬成分（例えば、アジュバント）は、そのクラスターに特徴的な特性を有すると、精度よく、合理的な確率を以て予測することができる。合理的な確率は、クラスター分析に用いるパラメータによって、例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％。８５％、８０％、７５％、７０％等に適切に設定することができる。
【００２９】
本明細書において機能が「同一」または「類似する」とは、クラスター分析後の結果について用いられ、ある性質について、実質的に同程度の活性を有する場合同一といい、ある性質について質的には同じ活性であるが、量が異なる場合に「類似する」という。このような類似する程度は、例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％。８５％、８０％、７５％、７０％等に適宜決定することができる。本明細書において「同一のクラスター」とは、クラスター分析に同じクラスターに入ることをいう。同じクラスターに入れるかどうかは、類似度によって決定することができる。
【００３０】
本明細書において「類似度」とは、有効成分、添加成分、アジュバント等の医薬成分などの分子またはその一部について、発現プロファイルが類似している度合いをいう。類似度は、本明細書中で定義されるｓＤＥＧなどの遺伝子発現の程度によって規定され得、発現の程度、量、活性量などに基づいて決定することができる。理論に束縛されることを望まないが、本発明の一部の実施形態では、この類似度に基づいて医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を分類することによって、同一のクラスターに属する医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）は、同一のカテゴリーに入る医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）と同様の特徴を有すると理解される。従って、本発明の手法を用いて同じ医薬成分クラスター（例えば、アジュバントクラスター）に属するかどうかを調べることによって、新規医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）または未知の機能の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）医薬成分の特徴分析を行うことができる。本明細書において類似度を調査するために、「類似性スコア」を使用することがありうる。この「類似性スコア」とは、類似度を示す具体的な数値をいい、例えば、トランスクリプトームの発現パターン等を計算した場合に使用される技法に応じて、適宜適切なスコアが採用されうる。類似性スコアは、例えば、回帰的な手法、ニューラルネットワーク法や、サポートベクトルマシン、ランダムフォレストといった機械学習アルゴリズムなどの人工知能（ＡＩ）で用いられる技術を用いて算出することができる。クラスター分析を行った例は図２０にも例示されている。
【００３１】
重要な指標として、機能が同一または類似していることが知られる医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）同士の発現パターンとよく合うように閾値を決めるのが適切であるが、統計学的有意性を重視する場合、他の閾値を採用することもあり得、当業者は状況に応じて本明細書の記載を参考に適宜閾値を設定することができる。例えば、階層的クラスタリング手法（例えば、群平均法(average  linkage  clustering)、最短距離法（ＮＮ法）、Ｋ−ＮＮ法、Ｗａｒｄ法、再長距離法、重心法）を用いてクラスタリング分析をした場合に求められる最大距離が特定の値未満のものを同一クラスターとみなすことができる。このような値としては、１未満、０．９５未満、０．９未満、０．８５未満、０．８未満、０．７５未満、０．７未満、０．６５未満、０．６未満、０．５５未満、０．５未満、０．４５未満、０．４未満、０．３５未満、０．３未満、０．２５未満、０．２未満、０．１５未満、０．１未満、０．０５未満などを挙げることができるがこれらに限定されない。クラスタリング手法としては階層的手法（例えば、最短距離法）に限られず、非階層的手法（例えば、k-means法）を用いてもよい。階層的クラスタリングが好ましくありうる。
【００３２】
クラスタリングにおいて、分類される要素間の距離（類似度）を当業者は適宜設定することができる。一般的に用いられる要素間の距離としては、ユークリッド距離、マハラノビス距離、またはコサイン類似度（距離）等を挙げることができる。
【００３３】
階層的クラスタリングを行うソフトウェアとしては、限定されるものではないが、例えば、Java（登録商標）-based  free  software,  Clustering  Calculator(Brzustowski,  J.)（http://www2.biology.ualberta.ca/jbrzusto/cluster.php/）が挙げられる。
【００３４】
このようなソフトウェアに、ベクトルのデータを入力して、以下のような出力：
Treeの結合位置の高さ(arbitrary  unit)
Treeのトポロジー
Treeの各ノード間の距離(arbitrary  unit)
各結合のブートストラップの値（例えば、1000回試行）
を得ることができる。それ以外にも、任意選択での出力を得ることもできる。
【００３５】
このような出力データから、適切なソフトウェアを利用して樹形図を描くことができる（Phylip/DRAWTREE  formatや、(hierarchical  trees)  using  Tree  Explorer  software、Tamura,  K.,  available  at  http://www.evolgen.biol.が挙げられるが限定されるものではない）。
【００３６】
ブートストラップ値（bootstrap値、bpとも称される）のほかに、p-value  of  multiscale  bootstrap（Au）といった値を出力することができる。これらの値は、クラスタリングの数学的な安定性を示す値である。AUは、配列解析などで用いられることが多く、系統樹の安定性を示すのに適した場合があるパラメータである。
【００３７】
階層的クラスタリングは、分枝型（ｄｉｖｉｓｉｖｅ）と凝集型（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｖｅ）に分類される。代表的に用いられる凝集型では、Ｎ個の対象からなるデータが与えられたとき、まず、１個の対象だけを含むＮ個のクラスターがある初期状態を作成する。この状態から始めて，対象ｘ１とｘ２の間の距離ｄ（ｘ１，ｘ２）（非類似度）からクラスター間の距離ｄ（Ｃ１，Ｃ２）を計算し，最もこの距離の近い二つのクラスターを逐次的に併合していく。そして、この併合を、全ての対象が一つのクラスターに併合されるまで繰り返すことで階層構造を獲得する。この階層構造はデンドログラム（樹状図）によって表示される。デンドログラムとは、各終端ノードが各対象を表し、併合されてできたクラスターを非終端ノードで表した二分木である。非終端ノードの横軸は併合されたときのクラスター間の距離を表す。クラスターC1とC2の距離関数d(C1,C2)の違いによりいくつか手法があり、最短距離法(nearest  neighbor  method)または単連結法(single  linkage  method)；最長距離法(furthest  neighbor  method)または完全連結法(complete  linkage  method)；群平均法(group  average  method)；ウォード法(Ward’s  method)（Ward法は、各対象から、その対象を含むクラスターのセントロイドまでの距離の二乗の総和を最小化する）などを挙げることができる。最短距離法、最長距離法、及び、群平均法は任意の対象間の距離d(xi,xj)が与えられている場合に適用でき、クラスターを併合した後の距離の更新はLance-Williamsの更新式（G.N.Lance  and  W.T.Williams,  The  Computer  Journal,  vol.9,  pp.373-380(1967)）により定数時間で可能である。対象が数値ベクトルで記述されている場合は、ベクトル間のユークリッド距離などを求めて適用することができる。Ward法は対象が数値ベクトルで与えられている場合には所定の式が直接適用でき、対象間の距離のみが与えられている場合ではLance-Williamsの更新式を使って距離の更新することによって適用することができる。Lance-Williamsの更新式で定数時間で距離の更新が可能な一般の場合の計算量はO(N2logN)で求められるが、上記の距離更新手法には可約性(reducibility)という性質があり、再近隣グラフの性質を活用することでO(N2)の時間で計算可能なアルゴリズム（F.Murtagh,  The  Computer  Journal,  vol.26,pp.354-359(1983)）が知られている。また、カラー・並列計算機上での計算量についてはOlson文献（C.F.Olson:  Parallel  Computing,  Vol.21,  pp.1313-1325(1995)）等の公知の情報を用いて実施することができる。本発明の階層型クラスタリングの分析例は実施例に例示されており、例えば図１４において例示されている。
【００３８】
階層型クラスタリングは、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）ごとにおよび遺伝子プローブごとに各器官において行うことができる（図１１）。この分析では、医薬成分（例えば、アジュバント）に応答する細胞集団の割合も分析することができる（図１２）。細胞については、免疫細胞のタイプ別の分析を行うこともできる（図１３）。
【００３９】
本明細書において、本発明の１つの実施形態では、トランスクリプトーム分析は、対象となる医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を対象生物に投与し、投与後一定時間で対象となる器官（臓器）におけるトランスクリプトームをその医薬成分（例えば、アジュバント）の投与前の同一のまたは対応する器官におけるトランスクリプトームと比較する工程、およびこの比較の結果発現が変動した遺伝子（ＤＥＧ）のセットを特定することによって実施することができる。
【００４０】
本明細書において、「差次的に発現される遺伝子」または「発現が変動した遺伝子（ＤＥＧ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｅｎｔｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｇｅｎｅ）」とは、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を前記対象生物に投与し、投与後一定時間で前記器官におけるトランスクリプトームを該医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の投与前の該器官におけるトランスクリプトームと比較する工程、および該比較の結果、発現が変動（例えば、増加、減少、発生または消失）する遺伝子をいう。そして、その変動が「有意」である場合、「有意ＤＥＧ」または「ｓＤＥＧ」と称する。ここで、有意に変動とは、通常、統計学的に有意な変動をいうが、これに限定されず、本発明の目的において適切であれば、適宜の基準を用いて有意性を判断することができる。ＤＥＧの判定方法は、実施例において例示されており、代表的には以下のとおりである：以下の条件を全て満たす統計的に有意な変化（アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）として定義することができる：有意ＤＥＧを設定する場合の所定の閾値は、所定の倍数の相違および所定の統計学的有意（ｐ値）での特定；代表的には、平均倍数変化（ＦＣ）が＞１．５または＜０．６６７であること、関連付けられたｔ検定のｐ値が多重検定補正無しで＜０．０１であること、およびカスタマイズＰＡコールが１であることが挙げられるが、これに限定されず、他の特定方法を用いてもよい。好ましい実施形態では、比較の結果、発現が所定の閾値を超えて変動した遺伝子を特定し、特定された遺伝子のうち前記共通して変動する遺伝子を選択し有意ＤＥＧのセットを生成する。ＤＥＧの分析は、差次的発現を分析し得る任意の手法を用いることができる。実施例で使用されるＶｏｌｃａｎｏプロットは、すべての個体/特性マトリックスで、統計的効果をy軸に、生物学的効果をx軸に配した散布図である。唯一の制約は、2水準の質的説明変数の水準間の差を検討することだけが実行できる。Ｖｏｌｃａｎｏプロットでは、通常、y軸の座標は、図を読みやすくするために-log10(p値)で尺度化され、高い値は最も有意な効果を反映しており、一方、低い値はほとんど有意でない効果に対応する。統計的に有意な効果が、生物学的な尺度で興味深いとは限らないため、Ｖｏｌｃａｎｏプロット用いると、多数の反復によるとても正確な測定が関与する実験は、生物学的にとても弱い差で関連づけられる低いp値を提供するかもしれないというリスクを低減することができ、したがって、p値のみならず、生物学的効果に注目した解析を行うことができる。
【００４１】
ＤＥＧを解析する際に、複数のサンプルを処理することが通常であり、これらの複数のサンプルにおいて応答が異なることがありうる。このような場合、反応の様子をベン図として表し（例えば、図８）、これの重複が多いことは、一貫して発現がなされていると判断できるものであり、普遍性が高いと判断することができる。ベン図の重複割合は、アップレギュレートする遺伝子プローブ数と相関関係にあることが本発明において見出されている。このようなプロットを行うと、医薬成分誘導性（例えば、有効成分の薬効、添加成分の補助機能、アジュバント誘導性）の強力な遺伝子応答は、ベン図分析を行うことで判断することができる。ＣｐＧアジュバントで有意にアップレギュレートされた遺伝子のベン図およびアノテーション分析を行った例が図１７に例示されている。同様にｃｄｉＧＭＰについて行ったものが図１８に例示されている。
【００４２】
明細書において、医薬成分およびそれぞれの器官についての全てのｓＤＥＧの集合を、「医薬成分遺伝子空間（スペース）」と称する。本明細書において、アジュバントおよびそれぞれの器官についての全てのｓＤＥＧの集合を、「アジュバント遺伝子空間（スペース）」と称する。同様に有効成分の場合は「有効成分遺伝子空間（スペース）」、添加成分の場合は「添加成分遺伝子空間（スペース）」と称され得る。
【００４３】
本明細書において、ＤＥＧのセットを２つ以上の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）において統合し、共通して変動する遺伝子（ＤＥＧ）のセットを生成することを、共通ＤＥＧセット生成ということがある。ここでは、１つの実施形態では、少なくとも２つ以上の器官について、前記トランスクリプトーム分析を行い、特定の器官（例えば、肝臓、脾臓およびリンパ節）でのみ発現が変動する遺伝子のセットを特定し、該セットを該器官特異的遺伝子セットとすることができる。したがって、本明細書では「器官特異的遺伝子セット」とは、ある器官に特異的に発現が変動する遺伝子のセットのことをいう。
【００４４】
本明細書において使用され得る「器官」とは「臓器」とも称し、生物のうち、動物や植物などの多細胞生物の体を構成する単位で、形態的に周囲と区別され、それ全体としてひとまとまりの機能を担うもののことをいう。例えば、代表的には、肝臓、脾臓およびリンパ節が挙げられ、このほか、腎臓、肺、副腎、膵臓、心臓等の他の臓器などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００４５】
本明細書において「統計学的に有意なクラスタリング分析を可能とする数」とは、アジュバントに関する数であり、クラスタリング分析を行った際に、統計学的に有意差が検出できる標本数をいう。検出力などを適宜設定し、統計学分野の慣用技術に基づいて当業者は適宜設定することができる。
【００４６】
本明細書において「遺伝子マーカー」、ある対象物の状態又は作用の評価の指標となるものであって、ここではある遺伝子の発現量と相関するときの遺伝子関連物質をいう。本明細書において特に断らない限り、「遺伝子マーカー」は「マーカー」と称することがある。
【００４７】
医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）に関連する遺伝子（マーカー）群は、ｚスコアヒートマップ手法を用いて表すことができるがこれに限定されない（図１５）。
【００４８】
本明細書において「医薬成分評価マーカー」とは、特定の医薬成分または医薬成分クラスターおよび特定の器官に特有の、または特異的な遺伝子マーカーをいう。医薬成分評価マーカーは複数の器官または医薬成分もしくは医薬成分クラスターに特有または特異的であってもよいが、その場合、他のマーカーと組み合わせて使用することによって、特定の器官または医薬成分もしくは医薬成分クラスターを同定することができる。このような関係性に関連して、医薬成分関連遺伝子中で共有される顕著な関係を有する遺伝子を選択する。アップレギュレートされた遺伝子の医薬成分群は、その発現のｚスコアに基づいて選択することができる（図１６参照）。
【００４９】
医薬成分が、アジュバントの場合、医薬成分評価マーカーは「アジュバント評価マーカー」とも呼ばれる。すなわち、本明細書において「アジュバント評価マーカー」とは、特定のアジュバントまたはアジュバントクラスターおよび特定の器官に特有の、または特異的な遺伝子マーカーをいう。アジュバント評価マーカーは複数の器官またはアジュバントもしくはアジュバントクラスターに特有または特異的であってもよいが、その場合、他のマーカーと組み合わせて使用することによって、特定の器官またはアジュバントもしくはアジュバントクラスターを同定することができる。このような関係性に関連して、アジュバント関連遺伝子中で共有される顕著な関係を有する遺伝子を選択する。アップレギュレートされた遺伝子のアジュバント群は、その発現のｚスコアに基づいて選択することができる（図１６参照）。医薬成分が有効成分の場合は「有効成分評価マーカー」と称され得、添加成分の場合は「添加成分評価マーカー」と称され得る。
【００５０】
トランスクリプトームプロファイルデータを分析することによって、生物学的プロセスのアノテーションを行うことができる。このようなアノテーションは、TargetMineなどのソフトウェアを用いることで実行することができる。アノテーションは、キーワードで表すことができ、創傷、細胞死、アポトーシス、NFκBシグナル経路、炎症応答、TNFシグナル経路、サイトカイン類、遊走、ケモカイン、化学走性、ストレス、防御応答、免疫応答、生来免疫応答、適合性免疫応答、インターフェロン類、インターロイキン類などを宛がうことができる。これは器官ごと、投与経路ごとなどに分けることができる（図１０参照）。創傷のアノテーションとしては、regulation  of  response  to  wounding；response  to  wounding；positive  regulation  of  response  to  wounding；を挙げることができる。；細胞死のアノテーションとしては、cell  death；death；programmed  cell  death；regulation  of  cell  death；regulation  of  programmed  cell  death；positive  regulation  of  programmed  cell  death；positive  regulation  of  cell  death；negative  regulation  of  cell  death；negative  regulation  of  programmed  cell  deathを挙げることができる。アポトーシスのアノテーションとしては、apoptotic  process；regulation  of  apoptotic  process；apoptotic  signaling  pathway；intrinsic  apoptotic  signaling  pathway；positive  regulation  of  apoptotic  process；regulation  of  apoptotic  signaling  pathway；negative  regulation  of  apoptotic  process；regulation  of  intrinsic  apoptotic  signaling  pathwayを挙げることができる。NFκBシグナル経路のアノテーションとしては、NF-kappa  B  signaling  pathway；I-kappa  B  kinase/NF-kappa  B  signaling；positive  regulation  of  I-kappa  B  kinase/NF-kappa  B  signaling；regulation  of  I-kappa  B  kinase/NF-kappa  B  signalingを挙げることができる。炎症応答のアノテーションとしては、inflammatory  response；regulation  of  inflammatory  response；positive  regulation  of  inflammatory  response；acute  inflammatory  response；leukocyte  migration  involved  in  inflammatory  responseを挙げることができる。TNFシグナル経路のアノテーションとしては、TNF  signaling  pathwayを挙げることができる。サイトカイン類のアノテーションとしては、response  to  cytokine；Cytokine-cytokine  receptor  interaction|Endocytosis；cellular  response  to  cytokine  stimulus；Cytokine-cytokine  receptor  interaction；cytokine  production；regulation  of  cytokine  production；cytokine-mediated  signaling  pathway；cytokine  biosynthetic  process；cytokine  metabolic  process；positive  regulation  of  cytokine  production；negative  regulation  of  cytokine  production；regulation  of  cytokine  biosynthetic  process；regulation  of  tumor  necrosis  factor  superfamily  cytokine  production；tumor  necrosis  factor  superfamily  cytokine  production；positive  regulation  of  cytokine  biosynthetic  process；cytokine  secretion；positive  regulation  of  tumor  necrosis  factor  superfamily  cytokine  productionを挙げることができる。遊走のアノテーションとしては、positive  regulation  of  leukocyte  migration；cell  migration；leukocyte  migration；regulation  of  leukocyte  migration；neutrophil  migration；positive  regulation  of  cell  migration；granulocyte  migration；myeloid  leukocyte  migration；regulation  of  cell  migration；lymphocyte  migrationを挙げることができる。ケモカインのアノテーションとしては、chemokine-mediated  signaling  pathway；chemokine  production；regulation  of  chemokine  production；positive  regulation  of  chemokine  productionを挙げることができる。化学走性のアノテーションとして��、cell  chemotaxis；chemotaxis；leukocyte  chemotaxis；positive  regulation  of  leukocyte  chemotaxis；taxis；granulocyte  chemotaxis；neutrophil  chemotaxis；positive  regulation  of  chemotaxis；regulation  of  leukocyte  chemotaxis；regulation  of  chemotaxis；lymphocyte  chemotaxisを挙げることができる。ストレスのアノテーションとしては、response  to  stress；regulation  of  response  to  stress；cellular  response  to  stressを挙げることができる。防御応答のアノテーションとしては、defense  response；regulation  of  defense  response；positive  regulation  of  defense  response；defense  response  to  other  organism；defense  response  to  bacterium；defense  response  to  Gram-positive  bacterium；defense  response  to  protozoan；defense  response  to  virus；regulation  of  defense  response  to  virus；regulation  of  defense  response  to  virus  by  host；negative  regulation  of  defense  responseを挙げることができる。免疫応答のアノテーションとしては、immune  response；positive  regulation  of  immune  response；regulation  of  immune  response；activation  of  immune  response；immune  response-activating  signal  transduction；immune  response-regulating  signaling  pathway；negative  regulation  of  immune  response；production  of  molecular  mediator  of  immune  responseを挙げることができる。生来免疫応答のアノテーションとしては、innate  immune  response；regulation  of  innate  immune  response；positive  regulation  of  innate  immune  response；activation  of  innate  immune  response；innate  immune  response-activating  signal  transduction；negative  regulation  of  innate  immune  responseを挙げることができる。適合性免疫応答のアノテーションとしては、adaptive  immune  response  based  on  somatic  recombination  of  immune  receptors  built  from  immunoglobulin  superfamily  domains；adaptive  immune  response；positive  regulation  of  adaptive  immune  response；regulation  of  adaptive  immune  response；regulation  of  adaptive  immune  response  based  on  somatic  recombination  of  immune  receptors  built  from  immunoglobulin  superfamily  domainsを挙げることができる。インターフェロン類のアノテーションとしては、response  to  interferon-alpha；interferon-alpha  production；cellular  response  to  interferon-alpha；positive  regulation  of  interferon-alpha  production；regulation  of  interferon-alpha  production；cellular  response  to  interferon-beta；response  to  interferon-beta；positive  regulation  of  interferon-beta  production；regulation  ofinterferon-beta  production；interferon-beta  production；response  to  interferon-gamma；cellular  response  to  interferon-gamma；interferon-gamma  production；regulation  of  interferon-gamma  productionを挙げることができる。；インターロイキン類のアノテーションとしては、interleukin-6  production；regulation  of  interleukin-6  production；positive  regulation  of  interleukin-6  production；interleukin-12  production；regulation  of  interleukin-12  production；positive  regulation  of  interleukin-12  productionを挙げることができる。生物学的指標としては、サイトカインプロファイルも挙げられる。サイトカインプロファイルは、IFNA2；IFNB1；IFNG；IFNL1；IFNA1/IFNA13；IL15；IL4；IL1RN；IFNK；IFNA4；IL1B；IL12B；TNFSF10；TNF；IFNA10；IFNA21；IFNA5；IFNA7；IFNA14；IFNA6；IFNE；IFNA8；IFNA16；CD40LG；IL6；IL2；IL12A；IL27；OSM；IFNA17；EBI3；IL10；IFNW1；TNFSF11；IL7などを含むがこれらに限定されない。
【００５１】
分析項目としては、例えば、血液学的指標と遺伝子発現のプロットを応用することもできる（図１９）。ここで、血液学的指標は、白血球（ＷＢＣ）、リンパ球（ＬＹＭ）、単球（ＭＯＮ）、顆粒球（ＧＲＡ）、リンパ球の相対含有率％（ＬＹ％）、単球の相対含有率％（ＭＯ％）、顆粒球の相対含有率％（ＧＲ％）、赤血球（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（Ｈｂ、ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、赤血球分布幅（ＲＤＷ）、血小板（ＰＬＴ）、血小板濃度（ＰＣＴ）、平均血小板容積（ＭＰＶ）、血小板分布幅（ＰＤＷ）などを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００５２】
本発明を用いると、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）は、クラスター分析を行うことによってグループ分けすることができる（図２１）。
【００５３】
生物学的活性は例えば、抗原抗体反応の結合定数や解離定数、結合アッセイ等の２つ以上の抗体を用いたときの各々の抗体の抗原に対する結合定数や解離定数を用いたデータや、ＥＬＩＳＡ等のデータの場合は吸光度の絶対値または相対値等で表すこともできる。
【００５４】
本発明の分析において使用される検出剤または検出手段は、遺伝子またはその発現を検出することができる限りどのような手段であってもよい。
【００５５】
本発明の検出剤または検出手段は、検出可能とする部分（例えば、抗体等）に他の物質（例えば、標識等）を結合させた複合体または複合分子であってもよい。本明細書において使用される場合、「複合体」または「複合分子」とは、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。２以上の部分がポリペプチドの場合は、キメラポリペプチドとも称しうる。従って、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を含む。
【００５６】
本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、マーカー検出剤への結合または相互作用を含む、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得るが、本発明では、PCR産物の量をもって測定することができる。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、免疫沈降法（ＩＰ）、免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Nat  Genet．2002  Dec；32  Suppl：526-32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、RT−PCR、RACE法、SSCP法、免疫沈降法、two−hybridシステム、in  vitro翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【００５７】
本明細書において「手段」とは、ある目的（例えば、検出、診断、治療）を達成する任意の道具となり得るものをいい、特に、本明細書では、「選択的に認識（検出）する手段」とは、ある対象を他のものとは異なって認識（検出）することができる手段をいう。
【００５８】
本明細書において「（核酸）プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段として使用され得る。
【００５９】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子（例えば、本発明のマーカー）の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、LASERGENE，PrimerSelect，DNAStar）を用いて行ってもよい。
【００６０】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチド、特異的抗体またはそのフラグメントなどが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー検出手段として用いられる。
【００６１】
本明細書において、医薬成分がアジュバントである場合、そのアジュバントの分類は、例えば、Ｇ１（インターフェロンシグナリング）；Ｇ２（脂質およびリポタンパク質代謝性）；Ｇ３（ストレス応答性）；Ｇ４（創傷応答性）；Ｇ５（リン酸含有化合物代謝プロセス性）；およびＧ６（ファゴソーム性）などを挙げることができるがこれらに限定されない（図２、図１４、図２１参照）。このような分類は、本発明の医薬成分（例えば、アジュバント）の器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法を実行することによってはじめて見いだされたものである。
【００６２】
本発明を用いることによって、医薬成分分類のための基準医薬製品（標準医薬成分ともいう）を定めることができ、これは本明細書において例示されている。医薬成分がアジュバントである場合、アジュバント分類の基準アジュバント（標準アジュバント）を同定することができ、例えば、上記Ｇ１〜Ｇ６についていえば、Ｇ１の基準アジュバント（標準アジュバント）は、ｃｄｉＧＭＰ、ｃＧＡＭＰ、ＤＭＸＡＡ、ＰｏｌｙＩＣおよびＲ８４８からなる群より選択され、Ｇ２の基準アジュバント（標準アジュバント）は、ｂＣＤであり、Ｇ３の基準アジュバント（標準アジュバント）は、ＦＫ５６５であり、Ｇ４の基準アジュバント（標準アジュバント）は、ＭＡＬＰ２ｓであり、Ｇ５の基準アジュバント（標準アジュバント）は、Ｄ３５，Ｋ３およびＫ３ＳＰＧからなる群より選択され、および／またはＧ６の基準アジュバント（標準アジュバント）は、ＡｄｄａＶａｘである。ｃｄｉＧＭＰ、ｃＧＡＭＰ、ＤＭＸＡＡ、ＰｏｌｙＩＣおよびＲ８４８は、ＲＮＡ関連アジュバント（ＳＴＩＮＧリガンド）であり、ｃｄｉＧＭＰはＴｈ１応答、ＤＭＸＡＡはＴｈ２応答を惹起するとされる。Ｇ１は、生物機能：インターフェロン応答（タイプＩ，タイプＩＩ）、ストレス系の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）ということができる。Ｇ２は、脂質およびリポタンパク質代謝性であり、ｂＣＤが代表医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）であるが、ＡＬＭも似た作用を有し、生物機能としては、炎症サイトカイン、脂質代謝、ＤＡＭＰ（宿主由来ｄｓＤＮＡとの作用）の作用を挙げることができる。Ｇ３は、ストレス応答性のクラスターであり、代表医薬成分（例えば、アジュバント）としてはＦＫ５６５が挙げられ、生物機能としては、Ｔ細胞サイトカイン、ＮＫ細胞サイトカイン、ストレス応答、創傷応答、ＰＡＭＰなどを挙げることができる。Ｇ４は、創傷応答性であり、代表医薬成分（例えば、アジュバント）としては、ＭＡＬＰ２ｓを挙げることができ、生物機能としては、ＴＮＦ応答、ストレス応答、創傷応答、ＰＡＭＰを挙げることができる。Ｇ５は、リン酸含有化合物代謝プロセス性であり、ＣｐＧ（Ｄ３５、Ｋ３、Ｋ３ＳＰＧ）が代表医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）であり、ＴＬＲ９リガンドなども代表例であり、生物機能としては、核酸代謝、リン酸含有化合物代謝を挙げることができる。Ｇ６は、ファゴソーム性であり、ＡｄｄａＶａｘ（ＭＦ５９）が代表医薬成分（例えば、アジュバント）であり、生物機能としては、ファゴソーム（食作用）、ＡＴＰなどを挙げることができる。医薬成分が有効成分の場合、上記用語は代表有効成分、基準（標準）有効成分などと称され得、添加成分の場合は、上記用語は代表添加成分、基準（標準）添加成分などと称され得る。
【００６３】
Ｇ１（インターフェロンシグナリング性）は、代表的にＳＴＩＮＧリガンドが基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）、代表的な例としてはｃｄｉＧＭＰ、ｃＧＡＭＰ、ＤＭＸＡＡ、ＰｏｌｙＩＣおよびＲ８４８、はＲＮＡ関連アジュバント（ＳＴＩＮＧリガンド）を含み、ｃｄｉＧＭＰはＴｈ１応答、ＤＭＸＡＡはＴｈ２応答を惹起するとされる。Ｇ１は、生物機能：インターフェロン応答（タイプＩ，タイプＩＩ）、ストレス系の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）ということができる。「ＳＴＩＮＧ」（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ）とは、小胞体に局在する膜タンパク質として同定されたものであり、ｄｓＤＮＡの刺激によりＴＢＫ１とＩＲＦ３を活性化しＩ型インターフェロンの発現を誘導するアダプタータンパク質である。ＳＴＩＮＧリガンドとは、ＳＴＩＮＧに対するリガンドであり、ＳＴＩＮＧの刺激によりインターフェロンが分泌される。ＳＴＩＮＧとしては、例えば、ｃｄｉＧＭＰ、ｃＧＡＭＰ、ＤＭＸＡＡ、ＰｏｌｙＩＣ、Ｒ８４８、2’３’−ｃＧＡＭＰなどを挙げることができる。ｃｄｉＧＭＰはサイクリックジＧＭＰである。ｃＧＡＭＰはサイクリックＡＭＰ−ＡＭＰである。ＤＭＸＡＡは、５，６−ジメチルキサンテノンー４−酢酸である。ＰｏｌｙＩＣはPoly  I:Cとも称する。Ｒ８４８はレシキモド（resiquimod）である。
【００６４】
Ｇ１のトランスクリプトーム分析において発現に有意差がある遺伝子（有意ＤＥＧ）は、Gm14446、Pml、H2-T22、Ifit1、Irf7、Isg15、Stat1、Fcgr1,Oas1a、Oas2、Trim12a、Trim12c、Uba7およびUbe2l6からなる群より選択される少なくとも1つを含む。
【００６５】
Ｇ２（脂質およびリポタンパク質代謝性）は、脂質およびリポタンパク質代謝性であり、βシクロデキストリン（ｂＣＤ）が代表医薬成分（例えば、代表有効成分、代表添加成分、代表アジュバント）であり基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）であるが、ＡＬＭ（Ｄ３５、Ｋ３（ＬＶ）も似た作用を有し、生物機能としては、炎症サイトカイン、脂質代謝、ＤＡＭＰ（宿主由来ｄｓＤＮＡとの作用）の作用を挙げることができる。ｂＣＤとは、βシクロデキストリンの略称であり、アジュバントとして用いられる代表例である。
【００６６】
Ｇ２のトランスクリプトーム分析において発現に有意差がある遺伝子（有意ＤＥＧ）は、Elovl6、Gpam、Hsd3b7、Acer2、Acox1、Tbl1xr1、Alox5apおよびGgt5からなる群より選択される少なくとも1つを含む。
【００６７】
Ｇ３（ストレス応答性）は、ストレス応答性のクラスターであり、代表アジュバントとしてはＦＫ５６５（ヘプタノイル−γ−Ｄ−グルタミル−（Ｌ）−メソ−ジアミノピメリル−（Ｄ）−アラニン）が挙げられ、これは、免疫反応性ペプチドであり、生物機能としては、Ｔ細胞サイトカイン、ＮＫ細胞サイトカイン、ストレス応答、創傷応答、ＰＡＭＰなどを挙げることができる。
【００６８】
Ｇ３のトランスクリプトーム分析において発現に有意差がある遺伝子（有意ＤＥＧ）は、Bbc3、Pdk4、Cd55、Cd93、Clec4e、Coro1a,およびTraf3、Trem3、C5ar1、Clec4n、Ier3、Il1r1、Plek、Tbx3,およびTrem1からなる群より選択される少なくとも1つを含む。
【００６９】
Ｇ４（創傷応答性）は、創傷応答性の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）であり、Ｔｏｌｌ様リガンド（ＴＬＲ）２リガンドと表現することができ、代表医薬成分（例えば、アジュバント）としては、ＭＡＬＰ２ｓ（マクロファージ活性化リポペプチド２または）を挙げることができ、生物機能としては、ＴＮＦ応答、ストレス応答、創傷応答、ＰＡＭＰを挙げることができる。
【００７０】
Ｇ４のトランスクリプトーム分析において発現に有意差がある遺伝子（有意ＤＥＧ）は、Ccl3、Myof、Papss2、Slc7a11、およびTnfrsf1bからなる群より選択される少なくとも1つを含む。
【００７１】
Ｇ５（リン酸含有化合物代謝プロセス性）は、リン酸含有化合物代謝プロセス性の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）、ＣｐＧ（Ｄ３５，Ｋ３，Ｋ３ＳＰＧ等）が代表医薬成分（例えば、代表アジュバント）であり基準医薬成分（例えば、基準アジュバント）であり、ＴＬＲ９リガンドなども代表例であり、生物機能としては、核酸代謝、リン酸含有化合物代謝を挙げることができる。
【００７２】
Ｇ５のトランスクリプトーム分析において発現に有意差がある遺伝子（有意ＤＥＧ）は、Ak3、Insm1、Nek1、Pik3r2、およびTtnからなる群より選択される少なくとも1つを含む。
【００７３】
Ｇ６（ファゴソーム性）は、ファゴソーム性のアジュバントであり、スクアレン水中油型エマルジョン、例えば、ＡｄｄａＶａｘおよびＭＦ５９が代表医薬成分（例えば、代表有効成分、代表添加成分、代表アジュバント）、基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）であり、生物機能としては、ファゴソーム（食作用）、ＡＴＰなどを挙げることができる。
【００７４】
Ｇ６のトランスクリプトーム分析において発現に有意差がある遺伝子（有意ＤＥＧ）は、Atp6v0d2、Atp6v1c1、およびClec7aからなる群より選択される少なくとも1つを含む。
【００７５】
上述した医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）は、略称で示している場合もあるが、（存在する場合）そのフルネーム、代表的入手先、物理的性質、（存在する場合）受容体、参考論文等をまとめた表を以下に示す。
【表１−１】
2018124293.tif 000002
【表１−２】
2018124293.tif 000003
【００７６】
ｂＣＤとは、βシクロデキストリンの略称であり、アジュバントとして用いられる代表例である。ｂＣＤは添加成分でもありうる。
【００７７】
ＦＫ５６５とは、免疫反応性ペプチドの一種であり、化学名はヘプタノイル−γ−Ｄ−グルタミル−（Ｌ）−メソ−ジアミノピメリル−（Ｄ）−アラニン（heptanoyl-gamma-D-glutamyl-(L)-meso-diaminopimelyl-(D)-alanine）であり、J  Antibiot(Tokyo).  1983  Aug;36(8):1045-50に詳説されている。
【００７８】
ＭＡＬＰ２ｓとは、マクロファージ活性化リポペプチド２（Macrophage-activating  lipopeptide-2）の略であり、ＢＣＧ−ＣＷＳに類似したＴｏｌｌ様リガンド（ＴＬＲ）２リガンドであり、詳細には、［Ｓ−（２，３）−ビスパルミトイルオキシプロピルＣｙｓ（Ｐ２Ｃ）−GNNDESNISFKEKで表され、Akazawa  T.  et  al.,  CancerSci  2010;  101:1596-1603等に詳述されている。
【００７９】
本明細書中で使用される「ＣｐＧモチーフ」とは、シトシンヌクレオチドと、それに続くグアノシンヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのメチル化されていないジヌクレオチド部分をいい、アジュバントの代表例として用いられる。本発明の解析結果、Ｇ５すなわち核酸代謝、リン酸含有化合物代謝に属することが判明した。５−メチルシトシンもまた、シトシンの代わりに使用され得る。ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）は、免疫賦活性のＣｐＧモチーフを含有する、短い（約２０塩基対）、一本鎖の合成ＤＮＡ断片であって、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）の強力なアゴニストであり、樹状細胞（ＤＣｓ）およびＢ細胞を活性化して、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮｓ）および炎症性サイトカインを産生させ（Hemmi，  H．，  et  al．  Nature  408，  740-745（2000）;Krieg，  A.M．  Nature  reviews．  Drug  discovery  5，  471-484（2006））、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を含む、Ｔｈ１型の液性および細胞性免疫反応のアジュバントとして作用する（Brazolot  Millan，  C.L．，  Weeratna，  R．，  Krieg，  A.M．，  Siegrist，  C.A.  ＆  Davis，  H．L．  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America  95，  15553-15558（1998）．;Chu，  R．S.，  Targoni，  O．S.，  Krieg，  A.M．，  Lehmann，  P．V．  ＆  Harding，  C.V．  The  Journal  of  experimental  medicine  186，  1623-1631（1997））。そこで、ＣｐＧ  ＯＤＮは、感染症、癌、喘息および花粉症に対して可能性のある免疫療法剤とみなされてきた（Krieg，  A.M．  Nature  reviews．  Drug  discovery  5，  471-484（2006）;Klinman，  D．M．  Nature  reviews．  Immunology  4，  249-258（2004））。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）は、免疫賦活性の非メチル化ＣｐＧモチーフを含有する一本鎖ＤＮＡであり、ＴＬＲ９のアゴニストである。ＣｐＧ  ＯＤＮには、骨格配列及び免疫賦活特性がそれぞれ異なる、Ｋ型（Ｂ型とも呼ばれる）、Ｄ型（Ａ型とも呼ばれる）、Ｃ型及びＰ型の４つの型がある（Advanced  drug  delivery  reviews  61，  195-204（2009））。
【００８０】
免疫賦活化ＣｐＧ  ＯＤＮの４種類の異なるタイプ（Ａ／Ｄ、Ｂ／Ｋ、ＣおよびＰタイプ）が報告されている。Ａ／Ｄタイプは、５’および３’末端にホスホロチオエート（ＰＳ）結合を、およびホスホジエステル（ＰＯ）のパリンドローム（回文構造）ＣｐＧ含有配列を中心に有するポリＧモチーフを特徴とするオリゴヌクレオチドであり、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）からの高いインターフェロン（ＩＦＮ）−α産生によって特徴付けられる。Ａ／Ｄタイプ以外はＰＳ骨格からなる。Ｂ／Ｋタイプは、典型的には非回文構造の、複数の非メチル化ＣｐＧモチーフを含有し、主に、インターロイキン（ＩＬ）−６やＩＬ−１２などの炎症性サイトカインを誘導するが、ＩＦＮ−αの産生は低い。Ｂ／ＫタイプのＯＤＮは、生理食塩水を用いて容易に製剤化され、その一部は臨床試験中である。Ｄ３５−ｄＡｓ４０およびＤ３５ｃｏｒｅ−ｄＡｓ４０を含む２つの修飾ＯＤＮは、本発明者らが見出したものであり、ヒトのＰＢＭＣにおいて元のＤ３５と同様に免疫賦活性であり、用量依存性の様式で高いＩＦＮ−α分泌をもたらすものである。ＣタイプおよびＰタイプのＣｐＧ  ＯＤＮはそれぞれ１つおよび２つの回文構造ＣｐＧ配列を含有する。双方ともＫ型の様にＢ細胞を活性化させ、Ｄ型の様にｐＤＣｓを活性化させることができるが、Ｐ型ＣｐＧ  ＯＤＮと比較して、Ｃ型ＣｐＧ  ＯＤＮは、ＩＦＮ−α産生をより弱く誘導する（Hartmann，  G．，  et  al．  European  journal  of  immunology  33，  1633-1641（2003）;Marshall，  J．D．，  et  al．  Journal  of  leukocyte  biology  73，  781-792（2003）．;およびSamulowitz，  U．，  et  al．  Oligonucleotides  20，  93-101(2010)）。
【００８１】
ＡｄｄａＶａｘとは、スクワレンベースの水中油アジュバントを指す。ＭＦ５９も類似した構造を示す。本明細書において「スクワレンベース水中油アジュバント」とは、スクワレンを含む水中油型の構造をしているエマルジョンであるアジュバントを言う。
【００８２】
本明細書において、使用される医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）は単離されたものまたは精製されたものでありうる。本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、遺伝子マーカー等の核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質は、好ましくは「精製された」物質である。本明細書において「単離」されたとは、天然に存在する状態で付随する任意のものを少なくとも１つ除去したものをいい、例えば、ゲノム配列からその特定の遺伝子配列を取り出した場合も単離といいうる。従って、本明細書において使用される遺伝子は、単離されたものでありうる。
【００８３】
本明細書において「被験体（者）」とは、本発明の診断または検出、あるいは治療等の対象となる対象（例えば、ヒト等の生物または生物から取り出した細胞、血液、血清等）をいう。
【００８４】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではagentに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、cDNA、ゲノムDNAのようなDNA、mRNAのようなRNAを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８５】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害（例えば、がん、アレルギー）について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいい、患者の疾患、もしくは疾患に伴う1つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。事前に診断を行って適切な治療を行うことは「コンパニオン治療」といい、そのための診断薬を「コンパニオン診断薬」ということがある。
【００８６】
本明細書において「治療薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、がん、アレルギー等の疾患など）を治療できるあらゆる薬剤をいう。本発明の一実施形態において「治療薬」は、有効成分と、薬理学的に許容される1つもしくはそれ以上の担体とを含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、例えば有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また治療薬は、治療のために用いられる物であれば使用形態は限定されず、有効成分単独であってもよいし、有効成分と任意の成分との混合物であってもよい。また上記担体の形状は特に限定されず、例えば、固体または液体（例えば、緩衝液）であってもよい。なおがん、アレルギー等の治療薬は、がん、アレルギー等の予防のために用いられる薬物（予防薬）、またはがん、アレルギー等の抑制剤を含む。
【００８７】
本明細書において「予防」とは、ある疾患または障害（例えば、がん、アレルギー等の疾患など）について、そのような状態になる前に、そのような状態にならないようにすることをいう。本発明の薬剤を用いて、診断を行い、必要に応じて本発明の薬剤を用いて例えば、アレルギー等の予防をするか、あるいは予防のための対策を講じることができる。
【００８８】
本明細書において「予防薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、がん、アレルギー等の疾患など）を予防できるあらゆる薬剤をいう。
【００８９】
本明細書において「キット」とは、通常2つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、抗体、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、検査薬、診断薬、治療薬、抗体等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
【００９０】
本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、経口、食道への投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（FDA）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（package  insert）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【００９１】
本明細書において「診断」とは、被験体における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「早期診断」、「予測診断」、「事前診断」等を含む。本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。
【００９２】
本発明の医薬等としての処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量を決定することができる。
【００９３】
本明細書において「プログラム」は、当該分野で使用される通常の意味で用いられ、コンピュータが行うべき処理を順序立てて記述したものであり、法律上「物」として扱われるものである。すべてのコンピュータはプログラムに従って動作している。現代のコンピュータではプログラムはデータとして表現され、記録媒体または記憶装置に格納される。
【００９４】
本明細書において「記録媒体」は、本発明を実行させるプログラムを格納した記録媒体であり、記録媒体は、プログラムを記録できる限り、どのようなものであってもよい。例えば、内部に格納され得るＲＯＭやＨＤＤ、磁気ディスク、ＵＳＢメモリ等のフラッシュメモリなどの外部記憶装置でありうるがこれらに限定されない。
【００９５】
本明細書において「システム」とは、本発明の方法またはプログラムを実行する構成をいい、本来的には、目的を遂行するための体系や組織を意味し、複数の要素が体系的に構成され、相互に影響するものであり、コンピュータの分野では、ハードウェア、ソフトウェア、OS、ネットワークなどの、全体の構成をいう。
【００９６】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
【００９７】
＜医薬成分のトランスクリプトーム分析＞
本発明は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法を提供する。この方法は：（Ａ）２つ以上の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得る工程；（Ｂ）該発現データについて、該医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）をクラスタリングする工程；（Ｃ）該クラスタリングに基づいて、該医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成する工程を包含する。
【００９８】
本発明の方法で用いられるトランスクリプトーム分析は、どのような手法を用いても実現することができる。トランスクリプトーム分析は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を投与せずに対象生物の器官のトランスクリプトーム分析を行い、コントロールトランスクリプトームを入手し、候補となる医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を投与した後に対象生物の同じ器官のトランスクリプトーム分析を行い、コントロールトランスクリプトームを用いて必要に応じて正規化して、その医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の器官のトランスクリプトーム分析とすることができる。同様の手順を第二以降の別の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）に対しても行うことができる。２つ以上の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）についてトランスクリプトーム分析を行って得られた発現データを用いて、各医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）のクラスタリング分析を行うことができる。クラスタリング分析された結果である遺伝子発現データに基づいて得られた医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）のクラスター情報に基づいて、各医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を分析することができる。特に、標準医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）または基準医薬成分（本明細書において基準医薬成分と標準医薬成分は同じものをさす。）と同じクラスターに属している医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）は、その基準医薬成分（標準医薬成分）と同様の機能を有していると推定することができる。該クラスタリングに基づいて、該アジュバントの該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成することは、当該分野で公知の任意の手法を用いて実現することができる。プロファイルは、例えば、図２のようなデンドログラムを用いてもよく、Excel（登録商標）などの表計算ソフトを用いて表現してもよいが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
（医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の機能分類）
１つの局面において、本発明は、トランスクリプトームクラスタリングに基づいて、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を分類する工程を包含するアジュバント分類方法を提供する。本発明において、トランスクリプトームクラスタリングに基づく分類は、対象となる医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を基準医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）のトランスクリプトームクラスタリングの結果に基づいて分類する工程を含みうる。医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の分類は、種々挙げられるが、例えば、分類は、宿主応答に基づく分類、メカニズムに基づく分類、細胞（肝臓、リンパ節、脾臓）、メカニズムに基づく用途別の分類、およびモジュール分類からなる群より選択される少なくとも１つの特徴による分類を含みうる。
【０１００】
代表的な実施形態では、本発明が提供する医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の分類は、（１）Ｇ１（インターフェロンシグナリング）；（２）Ｇ２（脂質およびリポタンパク質代謝性）；（３）Ｇ３（ストレス応答性）；（４）Ｇ４（創傷応答性）；（５）Ｇ５（リン酸含有化合物代謝プロセス性）；および（６）Ｇ６（ファゴソーム性）からなる群より選択される少なくとも１つの分類を含む。なお、Ｇ１〜Ｇ６については、アジュバントについていえばその相当部分を分類することができるが、少数ではあるものの、これらに分類されないものがある。これらは、Ｇ１〜Ｇ６に分類されないものとして扱うことができる。必要に応じて、さらにトランスクリプトーム分析を行って、さらなる分類を行うことができる。
【０１０１】
本発明の好ましい実施形態では、分類がまだの対象物質について分類する場合、Ｇ１〜Ｇ６の各基準医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を用いてトランスクリプトーム分析の結果をクラスタリングし、これらを比較することで分類を実施することができる。ここで、Ｇ１の基準医薬成分は、ｃｄｉＧＭＰ、ｃＧＡＭＰ、ＤＭＸＡＡ、ＰｏｌｙＩＣおよびＲ８４８からなる群より選択され、Ｇ２の基準医薬成分は、ｂＣＤであり、Ｇ３の基準医薬成分は、ＦＫ５６５であり、Ｇ４の基準医薬成分は、ＭＡＬＰ２ｓであり、Ｇ５の基準医薬成分は、Ｄ３５，Ｋ３およびＫ３ＳＰＧからなる群より選択され、および／またはＧ６の基準医薬成分は、ＡｄｄａＶａｘである。これらの基準医薬成分は、代表的なものであり、Ｇ１〜Ｇ６に属すると判断された他の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を代替的に使用することができる。
【０１０２】
１つの実施形態では、Ｇ１〜Ｇ６の分類は、トランスクリプトーム分析において発現に有意差がある遺伝子（識別マーカー遺伝子；ＤＥＧ）の発現プロファイルに基づいて行われ、前記Ｇ１のＤＥＧは、Gm14446、Pml、H2-T22、Ifit1、Irf7、Isg15、Stat1、Fcgr1,Oas1a、Oas2、Trim12a、Trim12c、Uba7およびUbe2l6からなる群より選択される少なくとも1つを含み、前記Ｇ２のDEGは、Elovl6、Gpam、Hsd3b7、Acer2、Acox1、Tbl1xr1、Alox5apおよびGgt5からなる群より選択される少なくとも1つを含み、前記Ｇ３のDEGは、Bbc3、Pdk4、Cd55、Cd93、Clec4e、Coro1a,およびTraf3、Trem3、C5ar1、Clec4n、Ier3、Il1r1、Plek,Tbx3,およびTrem1からなる群より選択される少なくとも1つを含み、前記Ｇ４のDEGは、Ccl3、Myof、Papss2、Slc7a11、およびTnfrsf1bからなる群より選択される少なくとも1つを含み、前記Ｇ５のDEGは、Ak3、Insm1、Nek1、Pik3r2、およびTtnからなる群より選択される少なくとも1つを含み、前記Ｇ６のDEGは、Atp6v0d2、Atp6v1c1、およびClec7aからなる群より選択される少なくとも1つを含む。
【０１０３】
これらのＤＥＧは、基準医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の代替を特定する際にも利用することができ、上記ＤＥＧのパターンが実質的に同一の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を基準医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）として用いることができる。
【０１０４】
したがって、ある局面では、本発明は、アジュバントをＧ１〜Ｇ６またはそれ以外への分類に使用するための遺伝子分析パネルを提供する。この遺伝子分析パネルは、Ｇ１のＤＥＧ、Ｇ２のＤＥＧ、Ｇ３のＤＥＧ、Ｇ４のＤＥＧ、Ｇ５のＤＥＧおよびＧ６のＤＥＧからなる群より選択される少なくとも１つのＤＥＧの検出剤または検出手段を含み、該Ｇ１のＤＥＧは、Gm14446、Pml、H2-T22、Ifit1、Irf7、Isg15、Stat1、Fcgr1,Oas1a、Oas2、Trim12a、Trim12c、Uba7およびUbe2l6からなる群より選択される少なくとも1つを含み、該Ｇ２のDEGは、Elovl6、Gpam、Hsd3b7、Acer2、Acox1、Tbl1xr1、Alox5apおよびGgt5からなる群より選択される少なくとも1つを含み、該Ｇ３のDEGは、Bbc3、Pdk4、Cd55、Cd93、Clec4e、Coro1a,およびTraf3、Trem3、C5ar1、Clec4n、Ier3、Il1r1、Plek、Tbx3およびTrem1からなる群より選択される少なくとも1つを含み、該Ｇ４のDEGは、Ccl3、Myof、Papss2、Slc7a11、およびTnfrsf1bからなる群より選択される少なくとも1つを含み、該Ｇ５のDEGは、Ak3、Insm1、Nek1、Pik3r2、およびTtnからなる群より選択される少なくとも1つを含み、該Ｇ６のDEGは、Atp6v0d2、Atp6v1c1、およびClec7aからなる群より選択される少なくとも1つを含む。
【０１０５】
好ましくは、本発明の遺伝子分析パネルは、少なくともＧ１のＤＥＧの検出剤または検出手段、少なくともＧ２のＤＥＧの検出剤または検出手段、少なくともＧ３のＤＥＧの検出剤または検出手段、少なくともＧ４のＤＥＧの検出剤または検出手段、少なくともＧ５のＤＥＧの検出剤または検出手段および少なくともＧ６のＤＥＧの検出剤または検出手段を含む。
【０１０６】
本発明の遺伝子分析パネルに含まれる検出剤または検出手段は、遺伝子を検出することができる限りどのような手段であってもよい。
【０１０７】
１つの局面において、本発明は、医薬成分を分類する方法であって、該方法は：
（ａ）候補医薬成分を提供する工程；
（ｂ）基準医薬成分セットを提供する工程；
（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および
（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、該基準医薬成分セットの少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補アジュバントを同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、
を包含する方法を提供する。医薬成分は、例えば、有効成分、添加成分、アジュバントなどであり得る。
【０１０８】
１つの実施形態では、本発明は、アジュバントを分類する方法を提供する。この方法は：（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分（候補アジュバント）を提供する工程；（ｂ）Ｇ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準医薬成分（基準アジュバント）セットを提供する工程；（ｃ）該候補医薬成分（候補アジュバント）および該基準医薬成分（基準アジュバント）セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および（ｄ）該候補医薬成分（候補アジュバント）が属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分（候補アジュバント）を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、を包含する。
【０１０９】
本発明において、（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分（例えば、候補アジュバント）を提供する工程は、任意の手法で、実行することができる。例えば、新規物質を入手または合成してもよいし、すでに市販されている物質を入手し、候補医薬成分（例えば、候補アジュバント）として提供してもよい。候補医薬成分（例えば、候補アジュバント）としては、例えば、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、リポソーム、水中油分子、油中水分子、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品あるいは添加成分として利用され得る低分子など）、これらの複合分子、が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１０】
本発明において、（ｂ）基準医薬成分セット（例えば、Ｇ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準アジュバントセット）を提供する工程は、任意の手法で、実行することができる。ここで、例示されるＧ１〜Ｇ６の特徴については、本明細書の他の箇所に記載されたとおりであり、その基準医薬成分（基準アジュバントなど）としては、任意のものを利用することができるが、代表的には、Ｇ１の基準医薬成分（例えば、基準アジュバント）は、ｃｄｉＧＭＰ、ｃＧＡＭＰ、ＤＭＸＡＡ、ＰｏｌｙＩＣおよびＲ８４８からなる群より選択され、Ｇ２の基準医薬成分（例えば、基準アジュバント）は、ｂＣＤであり、Ｇ３の基準医薬成分（例えば、基準アジュバント）は、ＦＫ５６５であり、Ｇ４の基準医薬成分（例えば、基準アジュバント）は、ＭＡＬＰ２ｓであり、Ｇ５の基準医薬成分（例えば、基準アジュバント）は、Ｄ３５，Ｋ３およびＫ３ＳＰＧからなる群より選択され、および／またはＧ６の基準医薬成分（例えば、基準アジュバント）は、ＡｄｄａＶａｘである。これらの医薬成分（例えば、基準アジュバント）は、市販されているものを利用してもよく、新たに合成または製造してもよい。
【０１１１】
本発明において、（ｃ）該候補医薬成分（例えば、候補アジュバント）および該基準医薬成分（例えば、基準アジュバント）セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程は、任意の手法で、実行することができる。トランスクリプトーム分析およびクラスタリングは当該分野で公知の手法を適宜組み合わせて実施することができる。
【０１１２】
１つの実施形態では、本発明で実施されるトランスクリプトーム分析は、医薬成分（例えば、アジュバント）を前記対象生物に投与し、投与後一定時間で前記器官におけるトランスクリプトームを該医薬成分（例えば、アジュバント）の投与前の該器官におけるトランスクリプトームと比較し、その比較の結果発現が変動した遺伝子（ＤＥＧ）（好ましくは統計学的に有意に変動する遺伝子、すなわち有意ＤＥＧ）のセットを特定する。これらの一連の操作は標準化されたものであってもよく、このような標準化手続は、例えば、http://sysimg.ifrec.osaka-u.ac.jp/adjvdb/に記載されたものでもよい。医薬成分（例えば、アジュバント）の投与および器官の採取、RNA抽出およびGeneChipデータ取得は、このようにして、当該分野で公知の技術を適宜応用することができることが理解される。また、当局の規制および倫理的基準を満たすために、法令およびガイドラインに適合し、適宜施設内の基準を満たし、施設の適宜の委員会によって承認されたものであって良い。
【０１１３】
医薬成分（例えば、アジュバント）の投与は、例えば、尾基底等の刺激の少ない部位への投与が例示されるが、それらに限定されない。投与方法は、尾基底への皮内投与（ｉｄ）の他、例えば、腹腔内（ｉｐ）、ｉ．ｎ．（鼻内）投与、経口投与などであってもよい。医薬成分（例えば、アジュバント）の投与量は、当該分野での公知の情報または実施例の情報を参酌しながら、対象動物において重篤な反応原性なく良好な作用効果（例えば、アジュバント機能）を誘起するような用量を選択する。医薬成分（例えば、アジュバント）の投与群の他、適切なバッファー対象群を用いてネガティブコントロール実験を行う。
【０１１４】
また、必要に応じて、予備実験を行い医薬成分（例えば、アジュバント）の投与後に器官において発現が変動する遺伝子を調べておき、大幅に変動するものや適宜の時間経過後に正常に戻るものなどを調べることができる。実施例で例示されるように投与後6時間での遺伝子発現を見ることが好ましい一例であることが判明し、24時間後には正常に戻るものが多いことから、遺伝子発現の変動は、例えば、投与後１〜20時間後、好ましくは３〜１２時間後、例えば、４〜８時間後、約6時間後の任意の時点での投与を行うことが好ましくありうる。遺伝子発現は、ここに調べてもよく遺伝子チップ（例えば、Affimetrix  Gene  Chipマイクロアレイシステム(Affymetrix)）などを用いて調べてもよい。遺伝子チップでの試験用のサンプルの調製は、例えば、適宜のキットでＴｏｔａｌ  ＲＮＡを調製することで行うことができる。
【０１１５】
発現の解析は、当該分野で公知の任意の手法を用いて行うことができる。例えば、Affimetrix  GeneChipマイクロアレイシステム(Affymetrix)などのシステムに付属するソフトウェアを用いてもよく、自作してもよく、インターネット等で入手可能な他のプログラムを用いてもよい。
【０１１６】
１つの実施形態では、本発明において、トランスクリプトーム分析について、本発明の方法は、前記ＤＥＧのセットを２つ以上の医薬成分（例えば、アジュバント）において統合し、共通して変動する遺伝子（ＤＥＧ）のセットを生成する工程を包含する。ここで、ＤＥＧは好ましくは有意ＤＥＧでありうる。有意ＤＥＧは任意の閾値の設定により抽出し得るが、具体的な実施形態では、本発明において利用される所定の閾値は、所定の倍数の相違および所定の統計学的有意（ｐ値）で特定されうる。例えば、以下の条件を全て満たす統計的に有意な変化(アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション)として定義することができる：平均倍数変化（ＦＣ）が＞１．５または＜０．６６７であること、関連付けられたｔ検定のｐ値が多重検定補正無しで＜０．０１であること、およびカスタマイズＰＡコールが１であること。ここで、ＦＣは、他の値を設定することもでき、１倍より多く１０倍以下（他方はその逆数）であればよい。例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍（および他方はその逆数）などであってもよい。この値の組は通常逆数の関係にあるが、逆数の関係にない組み合わせを用いてもよい。ｐ値もまた、＜０．０１以外の基準を用いることもできる。例えば、＜０．０５、＜０．０４、＜０．０３、＜０．０２などであってもよく、＜０．００９、＜０．００８、＜０．００７、＜０．００６、＜０．００５、＜０．００４、＜０．００３、＜０．００２、＜０．００１などであってもよい。
【０１１７】
１つの実施形態では、本発明の方法は、医薬成分（例えば、アジュバント）の投与前後での比較の結果、発現が所定の閾値を超えて変動した遺伝子を特定し、特定された遺伝子のうち共通して変動する遺伝子を選択し有意ＤＥＧのセットを生成する工程を包含する。ここで利用される所定の閾値は、本明細書において他の箇所に説明される任意の閾値を用いることができる。本発明において共通して変動するとして選択された遺伝子は、有意ＤＥＧのセットとして使用される。このような有意ＤＥＧのセットは、医薬成分（例えば、アジュバント）の分類に利用することができる。
【０１１８】
１つの実施形態では、本発明の方法は、少なくとも２つ以上の器官について、トランスクリプトーム分析を行い、特定の器官でのみ発現が変動する遺伝子のセットを特定し、該セットを該器官特異的遺伝子セットとする工程を包含する。このような器官特異的遺伝子セットを用いれば、特定の器官におけるトランスクリプトーム分析を行うだけで医薬成分（例えば、アジュバント）を分類することが可能である。医薬成分（例えば、アジュバント）の分類は、基準医薬成分（例えば、基準アジュバント）または標準医薬成分（例えば、標準アジュバント）との比較等を利用して行うことができる。
【０１１９】
別の実施形態では、本発明で実施されるトランスクリプトーム分析は、多数の器官に対してなされ、好ましくは、例えば、肝臓、脾臓およびリンパ節からなる群より選択される少なくとも１つの器官におけるトランスクリプトームに対してなされる。理論に束縛されることを望まないが、これらの器官では、実施例で示されるように、アジュバントの性質の特定をより明確に可能にする結果を示しているからであるが、これに限定されず、アジュバント以外の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分など）、他の器官（例えば、腎臓、肺、副腎、膵臓、心臓等）も選択することができる。
【０１２０】
１つの実施形態では、本発明が分析する医薬成分（例えば、アジュバント）の数は、統計学的に有意なクラスタリング分析を可能とする数である。このような数は統計学に関する技術常識を用いて特定することができ、数を特定することは本発明の本質ではない。
【０１２１】
1つの実施形態では、本発明の方法は、決定したプロファイルのうち、特定の医薬成分（例えば、アジュバント）および特定の器官に特有の遺伝子マーカーの１または複数を医薬成分（例えば、アジュバント）評価マーカーとして提供する工程を包含する。本発明の医薬成分（例えば、アジュバント）評価マーカーを用いることにより、従来では達成することができなかったアッセイ、例えば、未知の医薬成分（例えば、アジュバント）または既知の医薬成分（例えば、アジュバント）であっても解析が進んでいない医薬成分（例えば、アジュバント）について、多数の実験をしなくても評価することができる。本発明において、（ｄ）該候補医薬成分（例えば、候補アジュバント）が属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分（例えば、候補アジュバント）を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程もまた、当該分野で（ｃ）で説明したクラスターを分析して判定することができる。理論に束縛されることを望まないが、実施例で実証されているように、本発明により特定された特定の医薬成分（例えば、アジュバント）および特定の器官に特有の遺伝子は、クラスター分析に利用することができ、その結果、基準医薬成分（例えば、基準アジュバント）または標準医薬成分（例えば、標準アジュバント）と対比するなどして医薬成分（例えば、アジュバント）を評価することができる。
【０１２２】
１つの実施形態では、本発明の方法は、医薬成分（例えば、アジュバント）について、生物学的指標を分析し、クラスターと相関づける工程をさらに包含する。分析される生物学的指標は、分析ができるものであれば、どのようなものでも利用することができる。生物学的指標は、正常なプロセスや病的プロセス、あるいは治療に対する薬理学的な反応の指標として客観的に測定・評価される項目であり、バイオマーカーなどで測定することができる。生物学的指標としては、代表的には、例えば、創傷、細胞死、アポトーシス、NFκBシグナル経路、炎症応答、TNFシグナル経路、サイトカイン類、遊走、ケモカイン、化学走性、ストレス、防御応答、免疫応答、生来免疫応答、適合性免疫応答、インターフェロン類およびインターロイキン類からなる群より選択される少なくとも１つの指標などを含むがこれらに限定されない。疾患の状態や変化、治癒の程度を特徴づけるバイオマーカーは、新薬の臨床試験での有効性を確認するためのサロゲートマーカー（代用マーカー）として使われる。血糖値やコレステロール値などは、生活習慣病の指標として代表的なバイオマーカーである。尿や血液中に含まれる生体由来の物質だけでなく、心電図、血圧、ＰＥＴ画像、骨密度、肺機能、ＳＮＰｓも含まれる。またゲノム解析やプロテオーム解析が進んできたことによって、ＤＮＡやＲＮＡ、生体タンパク質等に関連したさまざまなバイオマーカーが見出されている。
【０１２３】
１つの代表的な実施形態では、前記生物学的指標は、血液学的指標を含む。
【０１２４】
このような血液学的指標としては、白血球（ＷＢＣ）、リンパ球（ＬＹＭ）、単球（ＭＯＮ）、顆粒球（ＧＲＡ）、リンパ球の相対含有率％（ＬＹ％）、単球の相対含有率％（ＭＯ％）、顆粒球の相対含有率％（ＧＲ％）、赤血球（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（Ｈｂ、ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、赤血球分布幅（ＲＤＷ）、血小板（ＰＬＴ）、血小板濃度（ＰＣＴ）、平均血小板容積（ＭＰＶ）および血小板分布幅（ＰＤＷ）などを挙げることができるがこれらに限定されない。血液学的指標は、これらの１つまたは複数、あるいはすべてを測定してもよい。
【０１２５】
１つの実施形態では、本発明に置いて分析される生物学的指標は、サイトカインプロファイルを含む。「サイトカインプロファイル」という用語は、ある時刻に、患者の中で産生されたサイトカインの種類および各種サイトカインの量を意味する。サイトカインは白血球によって放出され、免疫効果を有するタンパク質である。サイトカインの例には、（γ−インターフェロンのような）インターフェロン、腫瘍壌死因子、インターロイキン（ＩＬ）１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０が含まれるが、これらには限定されない。サイトカインの例には、（γ−インターフェロンのような）インターフェロン、腫瘍壌死因子、インターロイキン（ＩＬ）１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０が含まれるが、これらには限定されない。例えば、心臓循環器系のサイトカインとしては、、ＣＣＬ２  （ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）、ＣＲＰ、ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１６、Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）、ＦＧＦ、Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ  （ＣＸＣ３Ｌ１）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、Ｍ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＲＡＮＴＥＳ  （ＣＣＬ５）、ＴＮＦα、ＶＥＧＦなどを挙げることができるがそれらに限定されない。別の局面では、本発明は、医薬成分（例えば、アジュバント）の器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法をコンピュータに実装するプログラムを提供する。このプログラムが実装する法は：（A）２つ以上の医薬成分（例えば、アジュバント）を用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得る工程；（B）該発現データについて、該医薬成分（例えば、アジュバント）をクラスタリングする工程；（C）該クラスタリングに基づいて、該医薬成分（例えば、アジュバント）の該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成する工程を包含する。ここで使用される各工程は、本発明の方法で採用され得る任意の実施形態またはその組み合わせで実施することができる。
【０１２６】
別の局面において、本発明は、所望の機能を有する組成物の製造方法を提供する。この方法は、（Ａ）候補医薬成分を提供する工程、（Ｂ）所望の機能に対応するトランスクリプトーム発現パターンを有する候補医薬成分を選択する工程、および（Ｃ）選択された候補医薬成分を用いて組成物を製造する工程を包含する。ここで、（Ａ）および（Ｂ）は、本明細書において上述した本発明の医薬成分（例えば、アジュバント）を分類する方法における医薬成分（例えば、アジュバント）の候補の提供、トランスクリプトーム分析およびクラスタリングなどの任意の特徴を採用することができる。
【０１２７】
本発明において、（Ｃ）選択された医薬成分（例えば、候補アジュバント）を用いて組成物を製造する工程もまた、当該分野で公知の任意の手法を用いて実施することができる。このような組成物の製造は、好ましくは薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤等および／または有効成分（アジュバント、ワクチンの場合抗原等）を、選択された候補医薬成分（例えば、候補アジュバント）を混合することによって達成することができる。賦形剤としては、緩衝剤、結合剤、爆破剤、希釈剤、香味料、潤滑剤などを含み得る。
【０１２８】
具体的な実施形態では、本発明の所望の機能に対応するトランスクリプトーム発現パターンを有する候補医薬成分（例えば、候補アジュバント）を選択する工程において、所望の機能は、Ｇ１〜Ｇ６のいずれか１つまたは複数を含む。
【０１２９】
別の局面において、本発明は、所望の機能を発揮するための組成物であって、該所望の機能を発揮する医薬成分（例えば、アジュバント）を含み、好ましくは、該所望の機能は、Ｇ１〜Ｇ６のいずれか１つまたは複数を含む、組成物を提供する。本発明の組成物に含まれる医薬成分（例えば、アジュバント）に含まれる所望の機能を発揮する医薬成分（例えば、アジュバント）は、本発明の方法で特定されたものでありうる。好ましくは、本発明の組成物に含まれる医薬成分（例えば、アジュバント）に含まれる所望の機能を発揮する医薬成分（例えば、アジュバント）は、基準医薬成分（例えば、基準アジュバント）ではなく、新たにその機能（Ｇ１〜Ｇ６またはそれ以外）が同定されたものでありうる。
【０１３０】
本発明はまた、本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の分類方法を用いて、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の品質管理を行う方法を提供する。品質管理は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の分類方法で用いられるトランスクリプトームクラスタリングの分析結果を見て、基準となる動物等において、基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）と同様の遺伝子発現パターンがみられるかどうかを判定することによって判断することができる。対象となる医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）が属するグループの基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）またはその代替物と実質的に同様の遺伝子発現パターンが見られれば、その対象医薬成分（例えば、対象有効成分、対象添加成分、対象アジュバント）は品質が良いものとして判断することができ、遺伝子発現パターンの相違が見られれば、その程度に従って、品質のレベルを特定することができる。
【０１３１】
本発明はまた、本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の分類方法を用いて、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の安全性を試験する方法を提供する。安全性試験は、本明細書に記載される医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の分類方法で用いられるトランスクリプトームクラスタリングの分析結果を見て、基準となる動物等において、基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）と同様の遺伝子発現パターンがみられるかどうかを判定することによって判断することができる。対象となる医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）が属するグループの基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）またはその代替物と実質的に同様の遺伝子発現パターンが見られれば、その対象医薬成分（例えば、対象有効成分、対象添加成分、対象アジュバント）は安全性が高いものとして判断することができ、遺伝子発現パターンの相違が見られれば、その程度に従って、安全性のレベルを特定することができる。
【０１３２】
本発明はまた、本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の分類方法を用いて、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の効果（有効性）を試験する方法を提供する。効果試験（有効性試験）は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の分類方法で用いられるトランスクリプトームクラスタリングの分析結果を見て、基準となる動物等において、基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）と同様の遺伝子発現パターンがみられるかどうかを判定することによって判断することができる。対象となる医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）が属するグループの基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）またはその代替物と実質的に同様の遺伝子発現パターンが見られれば、その対象医薬成分（例えば、対象有効成分、対象添加成分、対象アジュバント）は効果がその医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）と同程度に高いものとして判断することができ、遺伝子発現パターンの相違が見られれば、その程度に従って、効果のレベルを特定することができる。
【０１３３】
１つの局面では、本発明は、有効性または毒性（安全性）についてのボトルネック遺伝子を特定し得ることを特徴とする。
【０１３４】
本明細書において「ボトルネック遺伝子」とは、ある現象（例えば、有効性がみられること、あるいは毒性がみられること）について、その現象の帰趨に本質的な影響を与える遺伝子をいう。
【０１３５】
例えば、その現象が安全性または毒性の場合、毒性ボトルネック遺伝子が特定され得る。毒性ボトルネック遺伝子は、その遺伝子の発現に変動がみられる（例えば、発現が無から有になる、有から無になる、あるいは増加するまたは減少する）場合、対象（例えば、医薬成分）に毒性があるあるいはないと判断し得るものをいう。代表的には、毒性ボトルネック遺伝子は、対象が投与された後に検査され、その遺伝子の発現がみられるあるいは増加すると、その対象は毒性があると判断され得るものである。
【０１３６】
本発明の手法を用いると、毒性ボトルネック遺伝子を特定することができる。例えば、本発明の方法を用いて、毒性があるとわかっている物質について、トランスクリプトーム分析を行って、そのパターンを特定し、対象物質について少なくとも一部同様のパターンを取る遺伝子を特定し、毒性ボトルネック遺伝子の候補遺伝子とすることができる。その候補遺伝子に関し他の動物種において相当する遺伝子を当該他の動物種において欠損させてノックアウト動物を作製し、該ノックアウト動物において、ノックアウトしていない動物に比較して毒性が減少または消失するかを決定し、減少または消失があった遺伝子を毒性ボトルネット遺伝子として選択することができる。減少または消失は、統計学的に有意であることが好ましい。本発明は、このような毒性ボトルネック遺伝子を提供または同定する方法をも提供する。
【０１３７】
１つの局面において、本発明は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の毒性判定方法を提供する。この方法は、候補アジュバント等の候補医薬成分について、毒性ボトルネック遺伝子のうち少なくとも１つについて遺伝子発現の変動（例えば、活性化）が観察されるかを決定する工程と、該変動（例えば、活性化）が観察された候補医薬成分を毒性有として判断する工程とを
含む。毒性の判定において、医薬成分個々の成分について試験することのほか、複数の成分の組合せあるいは最終の製剤における組み合わせについても試験することができる。場合によっては、最終の組合せでの毒性試験が重要であり得る。
【０１３８】
別の例では、対象となる現象が有効性の場合、有効性ボトルネック遺伝子が特定され得る。有効性ボトルネック遺伝子は、その遺伝子の発現に変動がみられる（例えば、発現が無から有になる、有から無になる、あるいは増加するまたは減少する）場合、対象（例えば、医薬成分）に有効性があるあるいはないと判断し得るものをいう。代表的には、有効性ボトルネック遺伝子は、対象が投与された後に検査され、その遺伝子の発現がみられるあるいは増加すると、その対象は有効性があると判断され得るものである。有効性ボトルネック遺伝子は少なくとも１つ特定され得るが、セットで提供されることもある。
【０１３９】
本発明の手法を用いると、有効性ボトルネック遺伝子を特定することができる。例えば、本発明の方法を用いて、有効性があるとわかっている物質について、トランスクリプトーム分析を行って、そのパターンを特定し、対象物質について少なくとも一部同様のパターンを取る遺伝子を特定し、有効性ボトルネック遺伝子の候補遺伝子とすることができる。その候補遺伝子に関し他の動物種において相当する遺伝子を当該他の動物種において欠損させてノックアウト動物を作製し、該ノックアウト動物において、ノックアウトしていない動物に比較して有効性が増加または発現するかを決定し、増加または発現があった遺伝子を有効性ボトルネット遺伝子として選択することができる。増加または発現は、統計学的に有意であることが好ましい。本発明は、このような有効性ボトルネック遺伝子を提供または同定する方法をも提供する。
【０１４０】
１つの局面において、本発明は、医薬成分（例えば、有効成分、アジュバント）の有効性判定方法を提供する。この方法は、候補アジュバント等の候補医薬成分について、有効性ボトルネック遺伝子のうち少なくとも１つについて遺伝子発現の変動（例えば、活性化）が観察されるかを決定する工程と、該変動（例えば、活性化）が観察された候補医薬成分を有効性有として判断する工程とを含む。添加成分についても有効性を定義することができる場合は、同様に有効性ボトルネック遺伝子を用いた有効性の判定を行うことができる。アジュバントの場合は、主薬（例えば、ワクチンの場合の抗原）とともに試験することが想定される。
【０１４１】
（コンピュータプログラム、システム、記録媒体）
さらに別の局面では、本発明は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法をコンピュータに実装するプログラムを格納した記録媒体を提供する。この記録媒体に格納されるプログラムが実行する方法は：（A）２つ以上の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得る工程；（B）該発現データについて、該医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）をクラスタリングする工程；（C）該クラスタリングに基づいて、該医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成する工程を包含する。ここで使用される各工程は、本発明の方法で採用され得る任意の実施形態またはその組み合わせで実施することができる。
【０１４２】
さらに別の局面では、本発明は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の器官トランスクリプトームプロファイルを生成するためのシステムを提供する。このシステムは：（A）２つ以上の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得るまたは入力する発現データ獲得部；（B）該発現データについて、該医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）をクラスタリングするクラスタリング演算部；（C）該クラスタリングに基づいて、該医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の該器官のトランスクリプトームプロファイルを生成するプロファイリング部を包含する本発明のシステムの各部（発現データ獲得部、クラスタリング演算部、プロファイリング部等）は、本発明の方法で採用され得る任意の実施形態またはその組み合わせを実現する任意の構成を採用することができ、任意の実施形態で実施することができる。
【０１４３】
ここで、本発明のシステムの発現データ獲得部では、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を用いたトランスクリプトーム分析を行ってデータを生成するか、行った結果を入手することができるように構成される。
【０１４４】
１つの局面において、本発明は、トランスクリプトームクラスタリングに基づいて、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を分類する工程を包含する医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の分類方法をコンピュータに実装させるプログラムを提供する。ここで使用される各工程は、本明細書に記載されている、本発明の方法で採用され得る任意の実施形態またはその組み合わせで実施することができる。
【０１４５】
別の局面において、本発明は、トランスクリプトームクラスタリングに基づいて、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を分類する工程を包含する医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の分類方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納した記録媒体を提供する。ここで使用される各工程は、本明細書に記載されている、本発明の方法で採用され得る任意の実施形態またはその組み合わせで実施することができる。
【０１４６】
別の局面において、本発明は、トランスクリプトームクラスタリングに基づいて、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を分類する分類部を包含する医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を分類するためのシステムを提供する。本発明のシステムの各部（分類部等）は、本明細書に記載されている、本発明の方法で採用され得る任意の実施形態またはその組み合わせを実現する任意の構成を採用することができ、任意の実施形態で実施することができる。
【０１４７】
ここで、本発明のシステムの分類部では、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を用いたトランスクリプトーム分析を行ってデータを生成するか、行った結果を入手することができるように構成される。
【０１４８】
次に、図６の機能ブロック図を参照して、本発明のシステムの構成を説明する。なお、本図においては、単一のシステムで実現した場合を示しているが、複数のシステムで実現される場合も本発明の範囲に包含されることが理解される。このシステムで実現される方法は、プログラム（例えば、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の分類をコンピュータに実装するためのプログラム）として記載することができる。このようなプログラムは記録媒体に記録することができ、方法として実現することができる。
【０１４９】
本発明のシステム１０００は、コンピュータシステムに内蔵されたＣＰＵ１００１にシステムバス１０２０を介してＲＡＭ１００３、ＲＯＭ、ＳＳＤやＨＤＤ、磁気ディスク、ＵＳＢメモリ等のフラッシュメモリなどの外部記憶装置１００５及び入出力インターフェース（Ｉ／Ｆ）１０２５が接続されて構成される。入出力Ｉ／Ｆ１０２５には、キーボードやマウスなどの入力装置１００９、ディスプレイなどの出力装置１００７、及びモデムなどの通信デバイス１０１１がそれぞれ接続されている。外部記憶装置１００５は、情報データベース格納部１０３０とプログラム格納部１０４０とを備えている。何れも、外部記憶装置１００５内に確保された一定の記憶領域である。
【０１５０】
このようなハードウェア構成において、入力装置１００９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介してコマンドを受信することで、この記憶装置１００５にインストールされたソフトウェアプログラムがＣＰＵ１００１によってＲＡＭ１００３上に呼び出されて展開され実行されることで、ＯＳ（オペレーションシステム）と協働して本発明の機能を奏するようになっている。もちろん、このような協働する場合以外の仕組みでも本発明を実装することは可能である。
【０１５１】
本発明の実装において、トランスクリプトームクラスタリングとして用いるためのデータ、例えば、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）に関する対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析の結果、このトランスクリプトーム分析を行って得られた発現データまたはこれと同等の情報（例えば、シミュレーションを行って得られたデータ）は、入力装置１００９を介して入力され、あるいは、通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介して入力されるか、あるいは、データベース格納部１０３０に格納されたものであってもよい。２つ以上の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を用いて対象生物の少なくとも１つの器官のトランスクリプトーム分析を行って発現データを得るステップおよび／または分類のためのトランスクリプトームクラスタリングの実施は、プログラム格納部１０４０に格納されたプログラム、または、入力装置１００９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介してコマンドを受信することで、この外部記憶装置１００５にインストールされたソフトウェアプログラムによって実行することができる。このようなトランスクリプトーム分析を行うソフトウェアは、実施例に例示されるものを使用してよいが、これに限定されず、当該分野で公知の任意のソフトウェアを利用することができる。分析が行われたデータは、出力装置１００７を通じて出力されるかまたは情報データベース格納部１０３０等の外部記憶装置１００５に格納されてもよい。発現データについて、該医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）をクラスタリングするステップもまた、プログラム格納部１０４０に格納されたプログラム、または、入力装置１００９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介してコマンドを受信することで、この記憶装置１００５にインストールされたソフトウェアプログラムによって実行することができる。作成されたクラスタリング分析のデータは、出力装置１００７を通じて出力されるかまたは情報データベース格納部１０３０等の外部記憶装置１００５に格納されてもよい。クラスタリングに基づいて、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の器官のトランスクリプトームプロファイルを生成するステップもまた、プログラム格納部１０４０に格納されたプログラム、または、入力装置１００９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介してコマンドを受信することで、この記憶装置１００５にインストールされたソフトウェアプログラムによって実行することができる。作成されたトランスクリプトームプロファイルデータは、出力装置１００７を通じて出力されるかまたは情報データベース格納部１０３０等の外部記憶装置１００５に格納されてもよい。トランスクリプトームプロファイルデータについて種々の特徴に関するデータ処理や格納もまた、プログラム格納部１０４０に格納されたプログラム、または、入力装置１００９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介してコマンドを受信することで、この記憶装置１００５にインストールされたソフトウェアプログラムによって実行することができる。プロファイルの特徴や情報は、出力装置１００７を通じて出力されるかまたは情報データベース格納部１０３０等の外部記憶装置１００５に格納されてもよい。
【０１５２】
データベース格納部１０３０には、これらのデータや計算結果、もしくは通信デバイス１０１１等を介して取得した情報が随時書き込まれ、更新される。各入力配列セット中の各々の配列、参照データベースの各遺伝子情報ＩＤ等の情報を各マスタテーブルで管理することにより、蓄積対象となるサンプルに帰属する情報を、各マスタテーブルにおいて定義されたＩＤにより管理することが可能となる。
【０１５３】
データベース格納部１０３０には、上記計算結果は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の各種情報、生体情報等の既知の情報と関連付けて格納されてもよい。このような関連付けは、ネットワーク（インターネット、イントラネット等）を通じて入手可能なデータをそのまままたはネットワークのリンクとしてなされてもよい。
【０１５４】
また、プログラム格納部１０４０に格納されるコンピュータプログラムは、コンピュータを、上記した処理システム、例えば、データ提供、トランスクリプトーム分析、発現データ分析、クラスタリング、プロファイリング、その他の処理等を行う処理を実施するシステムとして構成するものである。これらの各機能は、それぞれが独立したコンピュータプログラムやそのモジュール、ルーチンなどであり、上記ＣＰＵ１００１によって実行されることでコンピュータを各システムや装置として構成させるものである。なお、以下においては、それぞれのシステムにおける各機能が協働してそれぞれのシステムを構成しているものとする。
【０１５５】
＜機能未知医薬成分の解析方法＞
別の局面において、本発明は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特徴情報を提供する方法を提供する。この方法は：（ａ）候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）を提供する工程；（ｂ）機能が既知の基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットを提供する工程；（ｃ）該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）および該基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；（ｄ）該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）が属するのと同一のクラスターに属する該基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのメンバーの特徴を、該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）の特徴として提供する工程、を包含する。本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特徴情報の提供は、本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）のトランスクリプトーム分析技術を用いるものであり、本明細書に記載される＜医薬成分のトランスクリプトーム分析＞の任意の特徴を１つまたはそれらを組み合わせて含みうる。
【０１５６】
ここで、候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）は、新規物質でもよく、既知物質でもよい。従来医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）としての性質が公知であっても未知のものであってもよい。候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）は、対象生物の少なくとも１つの器官に提供されることが意図される。このような器官としては、肝臓、脾臓およびリンパ節などを挙げることができるが、それらに限定されない。
【０１５７】
機能が既知の基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットの提供は、＜医薬成分のトランスクリプトーム分析＞で言及した具体的なＧ１〜Ｇ６に属する任意のアジュバントを用いてもよく、＜医薬成分のトランスクリプトーム分析＞で記載される手法を用いて別途同定された医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）またはそのセットを用いてもよい。
【０１５８】
候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）および基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得ることは、当該分野で公知の任意の手法を用いることができ、基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットについては、すでに分析されたデータを用いることもできるし、新たにデータを取り直してもよい。すでに分析されたデータを用いる場合は、好ましくは候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）のトランスクリプトーム分析は、このすでに分析されたデータで利用された条件（例えば、投与形態、用法用量等）でトランスクリプトーム分析を行うことが好ましくありうるが、必ずしもこれに限定されない。遺伝子発現データが得られたら、クラスタリングする。クラスタリングは、任意の手法を用いることができ、本明細書に記載される＜医薬成分のトランスクリプトーム分析＞で言及した方法を利用することができる。
【０１５９】
トランスクリプトーム分析後、遺伝子発現データのクラスタリング分析結果が得られたら、候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）がどの医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）クラスター（グループ）に属するかを判定し、候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）が属するのと同一のクラスターに属する該基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのメンバーの特徴を、該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）の特徴として提供することができる。このような特徴情報の提供方法により提供された情報は、候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）が実際に有する特徴である蓋然性が高く、新規物質もしくは医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）としての機能が未知の既知物質の特性を予測する極めて有用性の高い方法であるといえる。
【０１６０】
１つの局面において、本発明は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特徴情報を提供する方法をコンピュータに実装させるプログラムを提供する。このプログラムが実装する方法は：（ａ）候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）を提供する工程；（ｂ）機能が既知の基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットを提供する工程；（ｃ）該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）および該基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバントセット）のトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；（ｄ）該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）が属するのと同一のクラスターに属する該基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのメンバーの特徴を、該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）の特徴として提供する工程、を包含する。本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特徴情報の提供は、本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）のトランスクリプトーム分析技術を用いるものであり、本明細書に記載される＜医薬成分のトランスクリプトーム分析＞の任意の特徴を１つまたはそれらを組み合わせて含みうる。
【０１６１】
１つの局面において、本発明は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特徴情報を提供する方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納する記録媒体を提供する。この記録媒体が格納するプログラムが実行する方法は：（ａ）候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）を提供する工程；（ｂ）機能が既知の基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットを提供する工程；（ｃ）該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）および該基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；（ｄ）該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）が属するのと同一のクラスターに属する該基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのメンバーの特徴を、該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）の特徴として提供する工程、を包含する。本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特徴情報の提供は、本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）のトランスクリプトーム分析技術を用いるものであり、本明細書に記載される＜医薬成分のトランスクリプトーム分析＞の任意の特徴を１つまたはそれらを組み合わせて含みうる。
【０１６２】
１つの局面において、本発明は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特徴情報を提供するシステムを提供する。このシステムは：（ａ）候補医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を提供する候補医薬成分提供部；（ｂ）機能が既知の基準医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）セットを提供する基準医薬成分提供部；（ｃ）該候補医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）および該基準医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングするトランスクリプトームクラスタリング解析部；（ｄ）該候補医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）が属するのと同一のクラスターに属する該基準医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）セットのメンバーの特徴を、該候補医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特徴として提供する特徴分析部、を包含する。本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特徴情報の提供は、本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）のトランスクリプトーム分析技術を用いるものであり、本明細書に記載される＜医薬成分のトランスクリプトーム分析＞の任意の特徴を１つまたはそれらを組み合わせて含みうる。本発明のシステムの各部（候補医薬成分提供部、基準医薬成分提供部、トランスクリプトームクラスタリング解析部、特徴分析部等）は、本発明の方法で採用され得る任意の実施形態またはその組み合わせを実現する任意の構成を採用することができ、任意の実施形態で実施することができる。
【０１６３】
１つの実施形態では、候補医薬成分提供部は、候補医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を提供する機能及び配置を有する限り、どのような構成をとっていてもよい。解析部やプロファイリング部とは同一または異なる構造物として提供され得る。候補医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）は、対象生物の少なくとも１つの器官に提供されることが意図される。
【０１６４】
１つの実施形態では、基準医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）提供部は、機能が既知の基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットを提供する。基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）提供部では、基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）があらかじめ格納されていてもよく、あるいは別途基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）が外部より提供され受け入れられるような構成となっていてもよい。候補医薬成分提供部と基準医薬成分提供部とは、異なっていても同一であってもよい。同一である場合は候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）と基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）が混入しないような構成または機能が付与され得る。
【０１６５】
１つの実施形態では、トランスクリプトームクラスタリング解析部は、候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）および基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする。候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）および基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのトランスクリプトーム分析は、トランスクリプトームクラスタリング解析部自体がその機能のすべてを備えていてもよいし、外部で遺伝子発現データを入手し、そのデータが入力され、トランスクリプトームクラスタリング解析部がその結果をトランスクリプトーム分析する機能を有するように構成されていてもよい。
【０１６６】
１つの実施形態では、特徴分析部は、該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）が属するのと同一のクラスターに属する該基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのメンバーの特徴を、該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）の特徴として提供する。
【０１６７】
次に、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特徴情報を提供するシステムについても、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の器官トランスクリプトームプロファイルを生成するためのシステムと同様の処理が可能であり（図６の機能ブロック図を参照のこと）。
【０１６８】
別の局面において、本発明は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を分類する方法をコンピュータに実装させるプログラムを提供する。該方法は：（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する工程；（ｂ）基準医薬成分セットを計算する工程；（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、基準医薬成分セットの少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、を包含する。この方法において、医薬成分は、有効成分、添加成分、アジュバント、またはその組み合わせなどであり得る。別の局面において、本発明は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を分類する上記方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納した記録媒体を提供する。
【０１６９】
１つの実施形態では、本発明は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を分類する方法をコンピュータに実装させるプログラムであって、該方法は：（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）を提供する工程；（ｂ）Ｇ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準アジュバントセットを提供する工程；（ｃ）該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）および該基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および（ｄ）該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）が属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、を包含するプログラムを提供する。ここで使用される各工程は、本発明の方法で採用され得る任意の実施形態またはその組み合わせで実施することができる。別の局面において、本発明は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を分類する上記方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納した記録媒体を提供する。
【０１７０】
別の実施形態において、本発明は、アジュバントを分類する方法をコンピュータに実装させるプログラムおよび該プログラムを格納した記録媒体を提供する。ここで、該方法は：（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補アジュバントを提供する工程；（ｂ）Ｇ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準アジュバントセットを提供する工程；（ｃ）該候補アジュバントおよび該基準アジュバントセットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および（ｄ）該候補アジュバントが属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補アジュバントを同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程、を包含する。ここで使用される各工程は、本発明の方法で採用され得る任意の実施形態またはその組み合わせで実施することができる。
【０１７１】
さらなる局面において、本発明は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を分類するシステムを提供する。このシステムは：（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する候補医薬成分提供部；（ｂ）基準医薬成分セットを計算する基準医薬成分計算部；（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングするトランスクリプトームクラスタリング分析部；および（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、基準医薬成分セットの少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する判定部、を包含する。このシステムにおいて、医薬成分は、有効成分、添加成分、アジュバント、またはその組み合わせなどであり得る。
【０１７２】
１つの実施形態において、本発明は、医薬成分を分類するシステムを提供する。このシステムは：（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分を提供する候補医薬成分提供部；（ｂ）本発明のＧ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準医薬成分セットを提供する基準医薬成分格納部；（ｃ）該候補医薬成分および該基準医薬成分セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングするトランスクリプトームクラスタリング分析部；および（ｄ）該候補医薬成分が属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する判定部、を包含する。
【０１７３】
別の実施形態において、本発明は、アジュバントを分類するシステムであって、該システムは：（ａ）対象生物の少なくとも１つの器官において候補アジュバントを提供する候補アジュバント提供部；（ｂ）Ｇ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準アジュバントセットを提供する基準アジュバント格納部；（ｃ）該候補アジュバントおよび該基準アジュバントセットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングするトランスクリプトームクラスタリング分析部；および（ｄ）該候補アジュバントが属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補アジュバントを同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する判定部、を包含するシステムを提供する。本発明のシステムの各部（候補アジュバント提供部、基準アジュバント格納部、トランスクリプトームクラスタリング分析部、判定部等）は、本発明の方法で採用され得る任意の実施形態またはその組み合わせを実現する任意の構成を採用することができ、任意の実施形態で実施することができる。
【０１７４】
ここで、本発明のシステムの分類部では、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）を用いたトランスクリプトーム分析を行ってデータを生成するか、行った結果を入手することができるように構成される。
【０１７５】
次に、図６の機能ブロック図を参照して、本発明のシステムの構成を説明する。なお、本図においては、単一のシステムで実現した場合を示しているが、複数のシステムで実現される場合も本発明の範囲に包含されることが理解される。このシステムで実現される方法は、プログラムとして記載することができる。このようなプログラムは記録媒体に記録することができ、方法として実現することができる。
【０１７６】
本発明のシステム１０００は、コンピュータシステムに内蔵されたＣＰＵ１００１にシステムバス１０２０を介してＲＡＭ１００３、ＲＯＭ、ＳＳＤやＨＤＤ、磁気ディスク、ＵＳＢメモリ等のフラッシュメモリなどの外部記憶装置１００５及び入出力インターフェース（Ｉ／Ｆ）１０２５が接続されて構成される。入出力Ｉ／Ｆ１０２５には、キーボードやマウスなどの入力装置１００９、ディスプレイなどの出力装置１００７、及びモデムなどの通信デバイス１０１１がそれぞれ接続されている。外部記憶装置１００５は、情報データベース格納部１０３０とプログラム格納部１０４０とを備えている。何れも、外部記憶装置１００５内に確保された一定の記憶領域である。
【０１７７】
このようなハードウェア構成において、入力装置１００９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介してコマンドを受信することで、この記憶装置１００５にインストールされたソフトウェアプログラムがＣＰＵ１００１によってＲＡＭ１００３上に呼び出されて展開され実行されることで、ＯＳ（オペレーションシステム）と協働して本発明の機能を奏するようになっている。もちろん、このような協働する場合以外の仕組みでも本発明を実装することは可能である。
【０１７８】
本発明の実装において、候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）および機能が既知の基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得た場合、このトランスクリプトーム分析を行って得られた発現データまたはこれと同等の情報（例えば、シミュレーションを行って得られたデータ）は、入力装置１００９を介して入力され、あるいは、通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介して入力されるか、あるいは、データベース格納部１０３０に格納されたものであってもよい。該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）および該基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングするステップは、プログラム格納部１０４０に格納されたプログラム、または、入力装置１００９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介してコマンドを受信することで、この外部記憶装置１００５にインストールされたソフトウェアプログラムによって実行することができる。このようなトランスクリプトーム分析や発現分析を行うソフトウェアは、実施例に例示されるものを使用してよいが、これに限定されず、当該分野で公知の任意のソフトウェアを利用することができる。分析が行われたデータは、出力装置１００７を通じて出力されるかまたは情報データベース格納部１０３０等の外部記憶装置１００５に格納されてもよい。該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）が属するのと同一のクラスターに属する該基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのメンバーの特徴を、該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）の特徴として提供するステップもまた、プログラム格納部１０４０に格納されたプログラム、または、入力装置１００９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介してコマンドを受信することで、この記憶装置１００５にインストールされたソフトウェアプログラムによって実行することができる。作成された候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）の特徴のデータは、出力装置１００７を通じて出力されるかまたは情報データベース格納部１０３０等の外部記憶装置１００５に格納されてもよい。トランスクリプトームプロファイルデータについて種々の特徴に関するデータ処理や格納もまた、プログラム格納部１０４０に格納されたプログラム、または、入力装置１００９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介してコマンドを受信することで、この記憶装置１００５にインストールされたソフトウェアプログラムによって実行することができる。プロファイルの特徴や情報は、出力装置１００７を通じて出力されるかまたは情報データベース格納部１０３０等の外部記憶装置１００５に格納されてもよい。
【０１７９】
また、本発明の別の実装において、対象生物の少なくとも１つの器官において候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）を提供する工程によって提供される候補アジュバントに関するデータは、入力装置１００９を介して入力され、あるいは、通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介して入力されるか、あるいは、データベース格納部１０３０に格納されたものであってもよい。Ｇ１〜Ｇ６からなる群より選択される少なくとも１つに分類される基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットを提供する工程によって提供される基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのデータもまた、同様に格納または入力され得る。あるいは基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのデータは、データベース格納部１０３０からまたは通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介してデータを呼び出して利用してもよい。該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）および該基準医薬成分（例えば、基準有効成分、基準添加成分、基準アジュバント）セットのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程は、プログラム格納部１０４０に格納されたプログラム、または、入力装置１００９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介してコマンドを受信することで、この外部記憶装置１００５にインストールされたソフトウェアプログラムによって実行することができる。このようなトランスクリプトーム分析および／またはクラスタリングを行うソフトウェアは、実施例に例示されるものを使用してよいが、これに限定されず、当該分野で公知の任意のソフトウェアを利用することができる。分析が行われたデータは、出力装置１００７を通じて出力されるかまたは情報データベース格納部１０３０等の外部記憶装置１００５に格納されてもよい。該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）が属するクラスターが、グループＧ１〜Ｇ６の少なくとも１つと同じクラスターに分類される場合、該候補医薬成分（例えば、候補有効成分、候補添加成分、候補アジュバント）を同一のグループに属すると判定し、どこにも属しない場合、分類不能と判定する工程もまた、プログラム格納部１０４０に格納されたプログラム、または、入力装置１００９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介してコマンドを受信することで、この記憶装置１００５にインストールされたソフトウェアプログラムによって実行することができる。判定データは、出力装置１００７を通じて出力されるかまたは情報データベース格納部１０３０等の外部記憶装置１００５に格納されてもよい。
【０１８０】
データベース格納部１０３０には、これらのデータや計算結果、もしくは通信デバイス１０１１等を介して取得した情報が随時書き込まれ、更新される。各入力配列セット中の各々の配列、参照データベースの各遺伝子情報ＩＤ等の情報を各マスタテーブルで管理することにより、蓄積対象となるサンプルに帰属する情報を、各マスタテーブルにおいて定義されたＩＤにより管理することが可能となる。
【０１８１】
データベース格納部１０３０には、上記計算結果は、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の各種情報、生体情報等の既知の情報と関連付けて格納されてもよい。このような関連付けは、ネットワーク（インターネット、イントラネット等）を通じて入手可能なデータをそのまままたはネットワークのリンクとしてなされてもよい。
【０１８２】
また、プログラム格納部１０４０に格納されるコンピュータプログラムは、コンピュータを、上記した処理システム、例えば、データ提供、トランスクリプトーム分析、発現データ分析、クラスタリング、プロファイリング、その他の処理等を行う処理を実施するシステムとして構成するものである。これらの各機能は、それぞれが独立したコンピュータプログラムやそのモジュール、ルーチンなどであり、上記ＣＰＵ１００１によって実行されることでコンピュータを各システムや装置として構成させるものである。なお、以下においては、それぞれのシステムにおける各機能が協働してそれぞれのシステムを構成しているものとする。
【０１８３】
＜品質管理、安全性試験、効果判定応用＞
１つの局面において、本発明は、本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法および／または本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特徴情報を提供する方法を用いて、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の品質管理を行う方法を提供する。医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の品質管理は、特に医薬品として出荷される際の、各ロットの医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の品質が適切なものかをあらかじめ試験することによって品質を一定のレベル以上に保つものである。医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の器官トランスクリプトームプロファイルは、種々の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特性を有意DEGを用いて分析することができるため、実際に複雑な試験を行わなくても品質を一定程度に保つことができる。
【０１８４】
品質管理の具体的手法としては、例えば、品質管理の対象となる医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）について、上記分析を行い、その器官トランスクリプトームプロファイルを得る。その医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）について想定される標準的な器官トランスクリプトームプロファイル（基準トランスクリプトームプロファイルともいう。）と品質管理の対象となる医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の器官トランスクリプトームプロファイルとを比較して、有意な相違がなければ、想定された品質が保持されていると判定することなどが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、有意な相違がある場合に品質基準を満たしていないとして判定し、有意な相違がみられない場合に品質基準を満たすかどうかをさらなる試験することで決定してもよい。
【０１８５】
別の局面において、本発明は、本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法および／または本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特徴情報を提供する方法を用いて、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の安全性を試験する方法を提供する。新規医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）自体は毒性評価が必要であり、アジュバントの場合は、新規アジュバントと抗原とを含む製剤での毒性評価も必要であり、さらに既存の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）、抗原であってもその組み合わせによっては、毒性評価が必要である。このような毒性評価の一部または全部として、このような器官トランスクリプトームプロファイルまたは医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特徴情報を活用することができる。ヒト摂取後の安全性を外挿するために有用である。
【０１８６】
安全性の判断の具体的手法としては、例えば、安全性判断の対象となる医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）について、上記分析を行い、その器官トランスクリプトームプロファイルを得る。その医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）について想定される標準的な器官トランスクリプトームプロファイル（基準トランスクリプトームプロファイルともいう。）と安全性判断の対象となる医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の器官トランスクリプトームプロファイルとを比較して、有意な相違がなければ、想定された安全性が保持されていると判定することなどが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、有意な相違がある場合に安全性基準を満たしていないとして判定し、有意な相違がみられない場合に安全性基準を満たすかどうかをさらなる試験することで決定してもよい。
【０１８７】
別の局面において、本発明は、本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の器官トランスクリプトームプロファイルを生成する方法および／または本発明の医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特徴情報を提供する方法を用いて、医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の効果を判定する方法を提供する。新規医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）自体は有効性評価が必要であり、アジュバントの場合、新規アジュバントと抗原とを含む製剤での有効性評価も必要であり、さらに既存のアジュバント、抗原であってもその組み合わせによっては、有効性評価が必要である。このような有効性評価の一部または全部として、このような器官トランスクリプトームプロファイルまたは医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の特徴情報を活用することができる。ヒト摂取後の有効性評価を外挿するために有用である。
【０１８８】
有効性評価の判断の具体的手法としては、例えば、有効性判断の対象となる医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）について、上記トランスクリプトーム分析を行い、その器官トランスクリプトームプロファイルを得る。その医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）について想定される標準的な器官トランスクリプトームプロファイル（基準トランスクリプトームプロファイルともいう。）と有効性判断の対象となる医薬成分（例えば、有効成分、添加成分、アジュバント）の器官トランスクリプトームプロファイルとを比較して、有意な相違がなければ、想定された有効性が達成されていると判定することなどが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、有意な相違がある場合に有効性の基準を満たしていないとして判定し、有意な相違がみられない場合に有効性の基準を満たすかどうかをさらなる試験することで決定してもよい。
【０１８９】
本発明では、アジュバントデータベースに加えて毒性ゲノムデータベース（ゲート）等を用いて、データベース間分析を行うことができる。例えば、アジュバントデータベースはヒト、サル、マウス、ラットなどで実証されており、使用し得ることが実証されているほか、このほかの動物でも同様に利用可能であることが理解される。また毒性ゲノムデータベースは、ヒトやラットで公開されており、これ以外に入手可能なデータベースを用いてデータベース間分析を行うことができる。これらは、単剤投与で６時間および２４時間のデータがあり、遺伝子発現プロファイル（肝臓、腎臓、リンパ節および脾臓など）、血液学（白血球、赤血球、血小板など）、生化学試験（アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、などのほか、血清ｍｉＲＮＡプロファイルなどを試験することができ、これらのデータベースも入手可能である。
【０１９０】
本発明では、トランスクリプトームベースで毒性予測および有効性予測が可能であるが、その際機械学習（例えば、サポートベクターマシン）を用いて予測モデルを生成し予測することも可能である。
【０１９１】
例えば、公開の毒性ゲノムゲート（１５０）について、毒性グループ（１０）および非毒性グループ（１０）について、例えば、４回の投与の間に病理的知見が得られたグループと毒性関連の特徴が観察されていないものとを特定する。毒性グループについて、これと似た発現パターンなどを示したサンプルについては、毒性と予測することができ、非毒性グループに類似したパターンを示したサンプルは非毒性と判定することができる。この場合、機械学習によって予測モデルを生成することができ、これらのモデルおよびモデルに基づく予測方法もまた本発明の範囲内にある。
【０１９２】
アジュバントデータベースなどの有効性に関連するアジュバントデータベースを用いると有効性を判定することができる。粒子、エマルジョン、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＴＬＲリガンドなどのデータベースを利用することができる。
【０１９３】
本発明は、機械学習を利用した人工知能（ＡＩ）を用いて実施することができる。本明細書において「機械学習」とは、明示的にプログラミングすることなく、コンピュータに学ぶ能力を与えるような技術をいう。機能単位が新しい知識・技能を獲得すること,又は既存の知識・技能を再構成することによって、自身の性能を向上させる過程である。経験から学ぶように計算機をプログラミングすることで、細部をプログラミングするのに必要になる手間の多くは減らせ、機械学習分野では、経験から自動的に改善を図れるようなコンピュータプログラムを構築する方法について議論している。データ分析・機械学習の役割としては、アルゴリズム分野と並んで知的処理の基盤になる要素技術であり、通常他の技術と連携して利用され、連携する分野の知識（ドメイン知識；例えば、医学分野）が必要である。その応用範囲としては、予測（データを集め，これから起こることを予測する）、探索（集めたデータの中から，何か目立つ特徴を見つける）、検定・記述（データの中のいろいろな要素の関係を調べる）などの役割がある。機械学習は，実世界の目標の達成度を示す指標に基づくものであり、機械学習の利用者が、実世界での目標を把握していなければならない。そして、目的が達成されたときに，良くなるような指標を定式化する必要がある。機械学習としては、線形回帰、ロジスティック回帰、サポートベクターマシンなどが用いられ得、および交差検証（交差検定、交差確認ともいう。Cross  Validation）を行うことで、各モデルの判別精度を算出することができる。ランキングした後、１つずつ特徴量を増やして機械学習（線形回帰、ロジスティック回帰、サポートベクターマシンなど）と交差検証を行い、各モデルの判別精度を算出することができる。それにより、最も高い精度のモデルを選択することができる。本発明において、機械学習は、任意のものを使用することができ、教師付き機械学習として、線形、ロジスティック、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）などを利用することができる。
【０１９４】
機械学習では論理的推論を行う。論理的推論にはおおまかに３種類あり、演繹（ｄｅｄｕｃｔｉｏｎ）、帰納（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）、アブダクション（ａｂｄｕｃｔｉｏｎ）がある。演繹は、ソクラテスは人間、すべての人間は死ぬとの仮説があったときにソクラテスは死ぬとの結論を導き出すもので特殊な結論といえる。帰納は、ソクラテスは死ぬ、ソクラテスは人間との仮説があったときにすべての人間は死ぬとの結論を導き出すもので一般的な規則を導くものである。アブダクションは、ソクラテスは死ぬ、すべての人間は死ぬとの仮定があった時にソクラテスは人間であると導き出すものであり、仮説・説明にあたる。とはいえ、帰納にしてもどう一般化するかは前提によるため、客観的であるとは言えない可能性があることに留意する。
【０１９５】
不可能性には、不可能、非常に困難、未解決の３種類の基本原理がある。また、不可能性には、汎化誤差、ノ―フリーランチ定理、醜いアヒルの子定理があり、真のモデルの観測は不可能なので検証できないという不良設定問題に留意する必要がある。
【０１９６】
機械学習において、特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）・属性（ａｔｔｒｉｂｕｔｅ）とは、予測対象をある側面で見たときに，どのような状態にあるのかを表すものである。特徴ベクトル・属性ベクトルとは、予測対象を記述する特徴（属性）をベクトルの形式にまとめたものである。
【０１９７】
本明細書において、「モデル（ｍｏｄｅｌ）」または「仮説（ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）」とは、同義に用いられ、入力される予測対象から，予測結果への対象対応を記述する写像，もしくはそれらの候補集合で、数学的な関数か論理式を用いて表現する。機械学習での学習では、訓練データを参照して、モデル集合から真のモデルを最もよく近似すると思われるモデルが選択される。
【０１９８】
モデルとしては、生成モデル、識別モデル、関数モデルなどが挙げられる。入力（予測対象）ｘと出力（予測結果）ｙとの写像関係の分類モデル表現する方針の違いを示すものである。生成モデルは、入力ｘが与えられたときの出力ｙの条件付分布を表現する。識別モデルは、入力ｘと出力ｙの同時分布を表現する。識別モデルと生成モデルは写像関係が確率的である。関数モデルは、写像関係が確定的なもので、入力ｘと出力ｙの確定的な関数関係を表現する。識別モデルと生成モデルでは識別の方がやや高精度といわれることもあるが，ノーフリーランチ定理により基本的には優劣はない。
【０１９９】
機械学習での学習では、訓練データを参照して、モデル集合から真のモデルを最もよく近似すると思われるモデルを選択する。どのような「近似」をするかで、いろいろな学習方法がある。代表的には、最尤推定があり、確率的なモデル集合の中から、訓練データが発生する確率が最も高いモデルを選択する学習の基準である。最尤推定で、真のモデルを最も近似するモデルが選択できる。ＫＬダイバージェンスは、尤度が大きくなると真の分布へのＫＬダイバージェンスは小さくなる。推定の種類は種々あり、推定した予測値やパラメータを求める形式の種類によって異なる。点推定は、最も確実性の高い値を一つだけ求めるもので、最尤推定やＭＡＰ推定など、分布や関数の最頻値を使うもので、最もよく利用される。他方、区間推定では、推定値が存在する範囲を求めるこの範囲に推定値が存在する確率が９５％といった形で統計分野でよく利用される。分布推定では、推定値が存在する分布を求める事前分布を導入した生成モデルと組み合わせてベイズ推定などで利用される。
【０２００】
（アジュバントのアジュバント）
ワクチンアジュバントは、多くのワクチンの免疫原性、そしてその効力を開始させ、最大化し、延長させるのに非常に重要である。80年以上にわたって、アルミニウム塩(アラム、alum)が、ヒトに慣用的に使用される唯一のアジュバントであった。近年、アラムをモノホスホリルリピドAおよびスクアレンオイルエマルジョンと組み合わせたものなど、限定的であるがさらなるアジュバントが、ヒトへの使用について承認されている。適当なアジュバントは、理想的には、免疫応答の型を含め、最良の病原体保護を提供するようなワクチン特性に基づいて選択されるべきである。残念ながら、現在ヒトに使用することが承認されているアジュバントの種類が不足しているため、免疫応答の誘導の精密な調整には制限がかかり、異なるタイプのアジュバントの開発が急がれている。
【０２０１】
最もよく知られたアジュバントは、病原体認識受容体(PRR)、例えば、TLR、NODまたはインフラマソーム受容体を標的とし、炎症性サイトカインおよびI型インターフェロン(IFN)の産生および抗原提示細胞(APC)上での共刺激分子のアップレギュレーションを引き起こす(Olive,  2012,  Expert  review  of  vaccines  11,  237-256)。ワクチンに含まれる病原体関連分子パターン(PAMPs)、例えば、微生物の核酸、糖脂質またはタンパク質は、内因性の元々備わったアジュバントとして機能し、先天性免疫応答を惹起し、その後、特異的抗原によって誘導される適応免疫応答が起こる(Desmet,  C.J.,  and  Ishii,  K.J.  (2012).  Nature  reviews  Immunology  12,  479-491)。例えば、インフルエンザWVワクチン中のウイルスＲＮＡは、TLR7を活性化し、そうすることでWV  抗原に対してTh1にバイアスした応答を誘導する(Koyama,  S.,  Aoshi,  T.,  Tanimoto,  T.,  Kumagai,  Y.,  Kobiyama,  K.,  Tougan,  T.,  Sakurai,  K.,  Coban,  C.,  Horii,  T.,  Akira,  S.,  et  al.(2010).  Science  translational  medicine  2,  25ra24.)。
【０２０２】
しかしながら、アジュバント活性を誘発または増強するメカニズムは何ら知られていない。
【０２０３】
したがって、別の局面において、本発明はワクチン用アジュバントとして開発されているイヌリンから誘導した微粒子であるデルタイヌリンであるＡｄｖａｘ（商標）の免疫学的特徴および作用機構を研究した成果に基づくものである。ここで、デルタイヌリンは、Ｔｈ２型抗原であるインフルエンザスプリットワクチンと組み合わせた場合には２型アジュバントとなるが、Ｔｈ１型抗原であるインフルエンザ不活化全ビリオン（ＷＶ）と組み合わせた場合には１型アジュバントとして挙動することを示す。さらに、ＷＶの元々備わったＲＮＡアジュバント効果が発揮されないＴＬＲ７欠損マウスにおいて、デルタイヌリンのＷＶに対するアジュバント効果は失われ、中立的な（neutral）Ｔｈ０型抗原であるオボアルブミンに対するアジュバント効果は示されなかった。したがって、他のアジュバントとは異なり、デルタイヌリンは共投与した抗原の本来の特性を強化し、そのアジュバント機能には、樹状細胞だけでなく貪食マクロファージおよびＴＮＦ−αも必ず必要である。これらの結果から、デルタイヌリンは、いまだに完全には解明されていない固有の作用機構を介してワクチンの内因性のアジュバント効果を強化することができる固有のクラスのアジュバントであることが示された。新規アジュバントの性質の解析の結果から、アジュバントのアジュバント活性が見いだされ、これに基づく種々の医療応用が企図される。
【０２０４】
本明細書において用いられるとき、「イヌリン」という用語は、直鎖状にフルクトースが側鎖なく結合し末端に１つのグルコースが結合したβ−Ｄ−（２→１）ポリフルクトフラノシルα−Ｄ−グルコースファミリーから成る単純で不活性な多糖類であり、イヌリン、β−Ｄ−［２→１］−ポリフルクトフラノシルα−Ｄ−グルコースだけでなく、例えばこの末端のグルコースを除くことが可能であるインベルターゼまたはイヌラーゼ酵素を用いて、イヌリンからの末端グルコースの酵素的除去によって得られる可能性があるβ−Ｄ−［２→１］ポリフルクトースを含む、イヌリンの誘導体も含む（場合によって機能的等価物に含まれる。）と理解されるべきである。この用語または機能的等価物の範囲内に含まれる他の誘導体は、例えば公知の方法によるアルキル、アリール、またはアシル基での化学的置換によって、遊離の水酸基がエーテル化またはエステル化されたイヌリンの誘導体である。イヌリン組成物は、単純で中性の多糖から成る公知の組成であるが、分子量は多様であり１６キロダルトン（ｋＤ）以下またはそれを超える範囲に及ぶ。イヌリンは、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）の貯蔵炭水化物であり、ダリアの球根から安価に得られる。イヌリンは比較的疎水性のポリオキシエチレン様の骨格を有し、この珍しい構造に加えてイオン化されない性質が、再結晶による容易に、非常に純粋なイヌリンの調製を可能にしている。自然界ではイヌリンは重合度（ＤＰ）６０程度あるいはそれ以上のフルクトースから成り、様々な溶解度や特性等を持つ。
【０２０５】
イヌリンの分子組成は周知であるが、報告されている溶解性は様々である。現在、イヌリンは少なくとも５種類知られており、アルファイヌリン（ａＩＮ；Ｐｈｅｌｐｓ，ＣＦ．Ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｎｕｌｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ９５：４１−４７（１９６５）参照）、ベータイヌリン（ｂＩＮ；Ｐｈｅｌｐｓ，ＣＦ．Ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｎｕｌｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ９５：４１−４７（１９６５）参照）、ガンマイヌリン（ｇＩＮ）、デルタイヌリン（ｄＩＮ、デルティンとも称される。）、エプシロンイヌリン（ｅＩＮ）が知られている。ａＩＮ〜ｄＩＮは、２３℃で急速に溶解する形態(ベータイヌリン；β２３°イヌリン）から、３７℃で８分の半減期で可溶性の形態（アルファイヌリン；α３７８イヌリン）を経て、３７℃で実質的に不溶性の形態（ガンマイヌリン）さらに５０℃で実質的に不溶性の形態（デルタイヌリン）という水性媒体における異なった溶解率によって特徴付けられる（ガンマイヌリンについては、ＷＯ８７／０２６７９およびＣｏｏｐｅｒ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ  Ｃａｒｔｅｒ，Ｍ．，１９８６およびＣｏｏｐｅｒ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓｔｅｅｌｅ，Ｅ．Ｊ．，１９８８）を参照。）。ｅＩＮは後述するようにａＩＮ〜ｄＩＮとは異なる性質を有するとして同定されたものである。デルタイヌリンは、Ａｄｖａｘ（商標）として販売されるアジュバント製品が知られている。デルタイヌリンは５０℃で水に不溶性であり、ＷＯ２００６／０２４１００において開示されており、その内容は本明細書において参考として援用される。デルタイヌリンは、濃縮された溶液（例えば５０ｍｇ／ｍｌ）において、７０−８０℃に加熱された場合にのみ可溶性であり、薄い溶液の５０％ＯＤ７００熱転移点が５３−５８℃である。デルタイヌリンは、濃縮されたガンマイヌリン溶液を５５℃以上に加熱することにより容易に調製される。アルファイヌリン(ａＩＮ)は水からの沈殿によって得られ、ベータイヌリンはエタノールからの沈殿によって得られる。エプシロンイヌリンは、希薄懸濁液（＜０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０％ＯＤ７００熱転移点が好ましくは、約５８℃から約８０℃の範囲にあり、５９℃以下では水溶媒に溶解度が低く、より好ましくは、７５℃以下で水溶媒に溶解度が低い。ｅＩＮ粒子の単一分子は、約５から約５０キロダルトン（ｋＤ）の範囲の分子量を持つ。ｅＩＮ粒子の単一分子の重合度（ＤＰ）は、多くの場合高い（即ちフルクトースの重合度２５以上、好ましくはフルクトースの重合度３５以上）。ｅＩＮはジメチルスルホキシド（水素結合を中和する事が知られている溶媒）に対しａＩＮ、ｂＩＮ、ｇＩＮおよびｄＩＮのそれぞれと比較してより低い溶解度示す。
【０２０６】
ガンマイヌリンは、３７℃で水に実質的に不溶性であるが、濃縮された溶液（例えば５０ｍｇ／ｍｌ）において、４５℃以上の温度でのみ、αおよびβ多形形態のように可溶性である。デルタイヌリンは、粒子状であり、５０％ＯＤ７００熱転移点（薄い溶液の溶解相転移）が４７±１℃というシャープな溶解点を持つ。デルタイヌリンは、５０℃で水に不溶性でありＷＯ２００６／０２４１００号にあるように、濃縮された溶液（例えば５０ｍｇ／ｍｌ）において、７０−８０℃に加熱された場合にのみ可溶性である。ｄＩＮは、薄い溶液の５０％ＯＤ７００熱転移点が５３−５８℃ということで特徴づけられる。ｄＩＮは、濃縮されたｇＩＮ溶液を５５℃以上に加熱することにより簡便に調製することができる。デルタイヌリン（ｄＩＮ）およびガンマイヌリン（ｇＩＮ）は、３７℃で不溶性であり、もしこの温度を持つ人間のような生物体に導入されてもそれぞれの粒子形態を維持でき、免疫学的に活性であり、単独あるいは水酸化アルミニウムのような抗原結合担体材料と共に、特にワクチンのアジュバントとして有効であることがすでに解っている（Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ  ａｎｄ  ＥＪ  Ｓｔｅｅｌｅ，１９９１，Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１ａ，Ｃｏｏｐｅｒ，ＰＤ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１ｂ．ＷＯ９０／０１９４９およびＷＯ２００６／０２４１００）。エプシロンイヌリンもまた免疫学的に活性であり、また、ガンマイヌリンおよびデルタイヌリンに匹敵するかまたはより高い免疫活性を有し得る。エプシロンイヌリンは、５つのイヌリンの多形形態の中で最も熱安定的であり、その粒子の懸濁液が他の多形形態が溶解する温度においても不溶性のままである。エプシロンイヌリンは８５℃に加熱しても最も熱安定的に有利であるとされており、熱安定性が要求されるアジュバントとして用いられる場合、エプシロンイヌリン粒子が高い温度でも安定でありうる。
【０２０７】
本明細書において「δイヌリン（β−Ｄ−［２→１］ポリ（フルクト−フラノシル）α−Ｄ−グルコース）」とは、アジュバントを構成する物質であり、これに構成される微粒子からなるアジュバントは、代表的には、Ａｄｖａｘ（商標）として知られるアジュバント製品として入手可能である。デルタイヌリン型アジュバントであるＡｄｖａｘ（商標）は、微粒子アジュバントであり、その微粒子はポリフルクトフラノシル−ｄ−グルコース（デルタイヌリン）の微粒子に由来する。これによって、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、日本脳炎、ウエストナイルウイルス、ＨＩＶ、炭疽菌およびリステリアに対するワクチンを含め様々なワクチンの免疫原性および効力が改善されることが示されている  （Ｄｏｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｆｅｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｈｏｎｄａ−Ｏｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｌａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｐｅｔｒｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｄｅｌ  Ｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｓａａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。Ｂ型肝炎、インフルエンザおよび虫刺されによるアレルギーのワクチンなどのＡｄｖａｘ（商標）アジュバントを含む  ワクチンが、ヒト臨床試験において評価されている（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｈｅｄｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０２０８】
これらの臨床試験によって優れた免疫原性および優れた忍容性が示されているが、Ａｄｖａｘ（商標）の作用機構はいまだに知られていない。本発明において、デルタイヌリンのアジュバント効果を様々なタイプのワクチン抗原を用いて試験した。予想外に、デルタイヌリンは、ＴＬＲアゴニストとは異なり、共投与された抗原に対して免疫応答のバイアスをかけなかった。代わりに、興味深いことに、デルタイヌリンは、ワクチン抗原自体の免疫バイアスを増強した。このことから、デルタイヌリンが、「アジュバントのアジュバント」という新しい様式で機能し、抗原それ自体が備える元々備わったアジュバント活性を増幅させる作用があることが示唆される。
【０２０９】
本明細書において「抗原のアジュバント性を惹起または増強する」とは、ある抗原について抗原自体が持つアジュバント性を惹起（すなわち、ないところから発生させる）または増強（すなわち、すでに存在している活性を増大させる）ことを意味する。
【０２１０】
本明細書において「樹状細胞を活性化する」とは、樹状細胞がその本来の機能を発揮し得る状態になるか、その状態の度合いが増すことを言い、例えば、補助シグナル分子の発現等が上昇し、まだ一度も抗原に出会ったことのないナイーブT細胞へと抗原を提示し、ナイーブT細胞を活性化する機能を有するまたは増強されることなどが挙げられる。外来異物と遭遇したことのない樹状細胞は未熟樹状細胞と呼ばれ、活性化された樹状細胞とは細胞表面分子の発現なども含めて大きく異なる。未熟樹状細胞は貪食能は高いが、ＭＨＣクラスＩＩ分子やＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０などの補助シグナル分子の発現レベルは低い。樹状細胞は感染などが生じていない状況でも抗原を取り込んでいるが、ＭＨＣクラスＩＩや補助シグナル分子の発現が低いことから、ナイーブＴ細胞を活性化することはできない。細菌やウイルス等の感染が生じると、樹状細胞に劇的な変化が誘導される。感染に伴う様々な刺激により活性化され成熟した樹状細胞は、細菌やウイルス由来の抗原ペプチドを提示したＭＨＣクラスＩＩを大量に発現するようになり、また補助シグナル分子の発現が上昇し、ケモカイン受容体であるＣＣＲ７依存性にリンパ管を通り所属リンパ節のＴ細胞領域へと移動する。リンパ節のＴ細胞領域でナイーブＴ細胞に抗原を提示し、同時に様々なサイトカインを放出することで、ナイーブT細胞からエフェクターT細胞への分化を誘導する。感染にともなう樹状細胞の活性化には以下の３種類のシグナルが関与していると考えられる。一番目は感染局所に浸潤してきた好中球やマクロファージなどの放出するTNFαなどのサイトカイン、２番目は感染に伴い死んだ好中球やマクロファージ等由来の死細胞由来成分、３番目が細菌やウイルス由来の成分（例えばグラム陰性菌由来のリポポリサッカライドなど）を認識するToll様受容体(TLR)（詳細は第7回のマクロファージの項参照）からの活性化シグナルである。樹状細胞は感染が起こった局所に数時間とどまり十分に抗原を取り込み活性化され、その後にリンパ管を伝わって所属リンパ節に移行し、そこでナイーブT細胞を活性化し、約１週間で寿命を終える。樹状細胞が移動していなくなった感染局所には骨髄から新たな樹状細胞が供給され、感染が継続する限り、感染巣における樹状細胞の活性化→所属リンパ節への移行というステップを繰り返す。
【０２１１】
本明細書において「マクロファージの存在下」とは、生来のまたは外来のマクロファージが存在する任意の環境をいう。
【０２１２】
本明細書において「マクロファージの増強剤」とは、マクロファージの機能または活性を付与または増強する任意の薬剤を言う。マクロファージの増強剤としては、例えば、ピコリン酸、結晶シリカ、アルミニウム塩等の従来型アジュバント、などを挙げることができる。
【０２１３】
本明細書において「Ｔｈ１型抗原」とはＴｈ１細胞に関連する抗原をいい、好ましくはＴｈ１免疫応答を惹起または増強する任意の抗原をいう。下記に説明するように特に、細胞性免疫（病原体の菌体を貪食する）が強化されるものをいう。
【０２１４】
本明細書において「Ｔｈ２型抗原」とはＴｈ２細胞に関連する抗原をいい、好ましくはＴｈ２免疫応答を惹起または増強する任意の抗原をいう。下記に説明するように特に、液性免疫（病原体の毒素を中和する）が強化されるものをいう。
【０２１５】
Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞については当該分野で公知の任意の性質や機能を有することを前提に本発明が説明されるべきであるが、本明細書においてＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞について特に言及すべき性質や機能について以下にさらに説明する。リンパ球には、Ｔ細胞と、抗体（免疫グロブリン）を産生するＢ細胞とがあり、Ｔ細胞には、さらに、単球・マクロファージから抗原を提示され、免疫反応を調節する、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４抗原陽性）と、ウイルス感染細胞などを傷害する、キラーＴ細胞（ＣＤ８抗原陽性）があり、ヘルパーＴ細胞には、Ｔｈ１細胞（Ｔヘルパー１細胞）とＴｈ２細胞（Ｔヘルパー２細胞）とがある。抗原提示細胞が、インターロイキン（ＩＬ）−１２を産生するか、またはプロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ２を産生するかが、Ｔｈ１細胞（細胞性免疫を担う）と、Ｔｈ２細胞（液性免疫を担う）のどちらが優位になるのかを決定する。
【０２１６】
抗原提示細胞であるマクロファージが、抗原をＴ細胞に提示する際に分泌するＩＬ−１２は、Ｔｈ０細胞（ナイーブＴｈ細胞）を、Ｔｈ１細胞に分化させる。Ｔｈ１細胞は、ＩＬ−２、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ（ＩｇＥ抗体の産生を抑制する）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、ＴＮＦ−β、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３を産生し、Ｔ細胞や、単球など貪食細胞の活性を高め、細胞性免疫（ツベルクリン反応等）に関与する。Ｔｈ１細胞が産生するＩＦＮ−γは、Ｔｈ０細胞のＴｈ１細胞への分化を、促進させる。マクロファージが、抗原をＴ細胞に提示する際に分泌するＰＧＥ２は、Ｔｈ０細胞を、Ｔｈ２細胞に分化させる。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−３、ＩＬ−４（免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｅ抗体の産生を増加させるサイトカインで、肥満細胞や、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞からも産生される）、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３を産生し、液性免疫（抗体産生等）に関与する。ＩＬ−１０は、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ−γの産生、ＩＬ−１２の産生を抑制する。Ｔｈ２細胞が産生するＩＬ−４や、ＩＬ−６は、Ｔｈ０細胞のＴｈ２細胞への分化を、促進させる。Ｔｈ０細胞が、Ｔｈ２細胞に分化するには、ＩＬ−４より、アラキドン酸から生成されるＰＧＥ２の方が、重要と考えられている。Ｔｈ２細胞は、抗原提示細胞として、Ｂ細胞（ＩＬ−１２を産生しない）から抗原刺激を受けても増殖する。
【０２１７】
Ｔｈ１細胞による免疫応答では、細胞性免疫が働いて、リンパ球やマクロファージなど単核細胞中心の炎症反応が起る。例えば、真菌であるクリプトコッカスに対する免疫応答では、Ｔｈ１細胞が優位に働くと、強固な肉芽腫が形成され、感染が局所に封じ込められる。他方、Ｔｈ２細胞が優位に働くと、炎症性細胞浸潤が極めて乏しい。例えば、液性免疫では、クリプトコッカスなどの細胞内寄生菌を殺傷しない。その為、肺胞腔にクリプトコッカスが充満して、感染が、容易に血行性に広がって、髄膜炎などを発症する。Ｔｈ１細胞より、Ｔｈ２細胞が優位に働いている状態では、ＩｇＥ抗体産生が増加し、アレルギー体質に陥りやすいと考えられる。
【０２１８】
菌体成分（Ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ：ＰＡＭＰ）は、樹状細胞に作用し、Ｔｈ０細胞のＴｈ１細胞への分化を促進し、Ｔｈ１細胞優位の状態にし、アレルギー体質を改善する。いわゆる衛生仮説では、納豆、ヨーグルトなどの食材を摂取すると、アレルギー体質が改善されるとされる根拠となる。ウイルス感染では、１型インターフェロン（ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β）が産生される。１型インターフェロンは、Ｔ細胞に作用し、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−１０を産生させる。
【０２１９】
細菌感染では、２型インターフェロンであるＩＦＮ−γが産生され、Ｔｈ１細胞が誘導される。細胞内寄生性細菌（結核菌、サルモネラ菌、リステリア菌など）による感染症では、主に、Ｔｈ１細胞が誘導され、Ｔｈ１細胞から産生されるＩＦＮ−αにより食細胞（マクロファージ）が活性化され、また、Ｔｈ１細胞から産生されるＩＬ−２によりＣＤ８陽性キラーＴ細胞が活性化され、殺菌等が行われる。
【０２２０】
細胞外で増殖する細菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ等のグラム陽性球菌等）による感染症では、主に、Ｔｈ２細胞が誘導され、Ｔｈ２細胞から産生されるサイトカインにより、抗体が産生され、殺菌等が行われる。Ｔｈ１細胞は、ＩＬ−２を産生し、キラーＴ細胞やＮＫ細胞などを活性化させ、細胞性免疫を活性化させる。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４を産生し、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ、ｇｐ３９）を介して、Ｂ細胞を活性化させ、Ｉ型アレルギーを引き起こすＩｇＥ抗体の産生を促進させ、液性免疫を活性化させる。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γも産生するが、ＩＦＮ−γは、Ｔｈ２細胞のＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）発現を抑制し、ＩｇＥ抗体産生を抑制する。また、Ｔｈ２細胞の産生するＩＬ−４や、ＩＬ−１０は、Ｔｈ１細胞の反応を抑制する。
【０２２１】
抗原提示細胞（樹状細胞）は、表面のＴＬＲｓにより、生体に侵入したのが、病原体なのか（細菌なのか、ウイルスなのか）、毒素なのかなどを識別し、それに応じて、炎症性サイトカイン、インターフェロン等を産生する。その結果、Ｔｈ０細胞は、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞に分化することになる。
【０２２２】
細胞性免疫では、Ｔｈ１細胞が産生するＩＦＮ−γにより、マクロファージが活性化され、細胞内寄生菌が、殺菌される。また、Ｔｈ１細胞が産生するＩＬ−２により、キラーＴ細胞が活性化され、ウイルス感染細胞が、障害される。
【０２２３】
液性免疫では、Ｔｈ２細胞が産生するＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３により、Ｂ細胞が分化・増殖し、抗体（免疫グロブリン）が、産生される。抗体は、病原体が産生する菌体外毒素を中和し、細胞外寄生菌をオプソニン化しマクロファージなどによる貪食を促進し、補体系を活性化し溶菌する。
【０２２４】
本明細書において「Ｔｈ１応答」とは、上述したようなＴｈ１細胞による免疫応答をいい、Ｔｈ１細胞による免疫応答では、上記に詳述するように、細胞性免疫が働いて、リンパ球やマクロファージなど単核細胞中心の炎症反応が起る。真菌のクリプトコッカスに対する免疫応答では、Ｔｈ１細胞が優位に働くと、強固な肉芽腫が形成され、感染が局所に封じ込められる。本明細書において「Ｔｈ２応答」とは、Ｔｈ２細胞が優位に働く場合を言い、上記に詳述するように、炎症性細胞浸潤が極めて乏しい。例えば、液性免疫では、クリプトコッカスなどの細胞内寄生菌を、殺せない。その為、肺胞腔にクリプトコッカスが充満して、感染が、容易に血行性に広がって、髄膜炎などを発症する。
【０２２５】
本明細書において「ＴＮＦαが正常または増強された状態」とは、生体内で腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）が正常レベルで維持されているか、または生体内での正常レベルのＴＮＦαが再現された状態をいい、「増強」とは、生体内で通常存在するＴＮＦαよりも多いレベルのＴＮＦαが存在するか、または生体内での正常レベルより高いＴＮＦαが再現された状態をいう。
【０２２６】
本明細書では「アジュバントのアジュバント」とは、すでにアジュバントであることが判明している化合物のアジュバント活性を増強する活性を含むほか、他の物質についてアジュバントかどうか不明であるか保有していない物質について、その物質にアジュバント活性を付与することも包含する概念であることが理解される。
【０２２７】
本明細書において「候補アジュバント」とは、候補医薬成分の一種であり、アジュバントとして考慮される任意の物質またはその組み合わせを言う。候補アジュバントとしては、以下のような、ＴＬＲ非依存的アジュバント、ＴＬＲ依存的アジュバントなどのアジュバントであることができるが、これら以外のアジュバントとしての機能や特性が未知の化合物や他の物質、それらの組合せを用いることもできる。ＴＬＲ非依存的アジュバントとしては、以下を挙げることができるがこれらに限定されない：ミョウバン（リン酸アルミニウム／水酸化アルミニウム；様々な適応を示す無機塩）；ＡＳ０３（ＧＳＫ；スクアレン）（１０．６８ｍｇ）、ＤＬ−α−トコフェロール（１１．８６ｍｇ）、およびポリソルベート８０（４．８５ｍｇ）、パンデミックインフルエンザに使用される水中油型エマルジョン）；ＭＦ５９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ；４〜５％（ｗ／ｖ）スクアレン、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．５％Ｓｐａｎ  ８５、任意で可変量のムラムルトリペプチドホスファチジル−エタノールアミン（ＭＴＰ−ＰＥ））、インフルエンザに使用される水中油型エマルジョン）：プロバックス（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ；スクアレン＋プルロニックＬ１２１）、水中油型エマルジョン）；モンタニド（Ｓｅｐｐｉｃ  ＳＡ；Ｂｉｏｖｅｎ；Ｃａｎｃｅｒｖａｘ；オレイン酸マンニドおよび鉱油）、マラリアおよび癌の治療において使用される油中水型エマルジョン）；ＴｉｔｅｒＭａｘ（ＣｙｔＲｘ；スクアレン＋ＣＲＬ−８９４１）、油中水型エマルジョンで）；ＱＳ２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ；Ｑｕｉｌ  Ａの画分）、黒色腫、マラリア、ＨＩＶ、およびインフルエンザの治療において使用される植物由来組成物）；Ｑｕｉｌ  Ａ（Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；キラヤの精製画分）、様々な治療において使用される植物由来組成物）；ＩＳＣＯＭ（ＣＳＬ；Ｉｓｃｏｎｏｖａ；サポニン＋ステロール＋場合により、リン脂質）、インフルエンザをはじめとする様々な治療において使用される植物由来組成物）；リポソーム（Ｃｒｕｃｅｌｌ；Ｎａｓｖａｘ；脂質からなる合成リン脂質球）は様々な疾患の治療において使用される）など。
【０２２８】
ＴＬＲ依存的アジュバントとしては、以下のようなアジュバントを挙げることができるがこれらに限定されない：Ａｍｐｌｉｇｅｎ（Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｘ；規則的に現われるミスマッチ領域を含む特異的に構成された合成二本鎖ＲＮＡ）、ＴＬＲ３の活性化により作用し、パンデミックインフルエンザに対するワクチンとして使用される）；ＡＳ０１（ＧＳＫ；ＭＰＬ、リポソーム、およびＱＳ−２１）、ＴＬＲ４のＭＰＬ活性化により作用し、リポソームは、ＡＰＣへの抗原送達の促進をもたらし、ＱＳ−２１は、ＡＰＣへの抗原提示の増強および細胞傷害性Ｔ細胞の誘導をもたらし、また、これは、マラリアおよび結核に対するワクチンとして使用される。）；ＡＳ０２（ＧＳＫ；ＭＰＬ、ｏ／ｗエマルジョン、およびＱＳ−２１）は、ＴＬＲ４のＭＰＬ活性化により作用し、ｏ／ｗエマルジョンは、自然炎症応答、ＡＰＣの動員および活性化、注射部位における抗原持続の増強、免疫適格細胞への提示、様々なパターンのサイトカインの誘発をもたらし、ＱＳ−２１は、ＡＰＣへの抗原提示の増強および細胞傷害性Ｔ細胞の誘導をもたらし、また、これは、マラリア、結核、ＨＢＶ、およびＨＩＶに対するワクチンとして使用される。）；ＡＳ０４（ＧＳＫ；ＭＰＬ、水酸化アルミニウム／リン酸アルミニウム）は、ＴＬＲ４のＭＰＬ活性化により作用し、ミョウバンは、デポ効果、局所炎症、およびＡＰＣによる抗原取込みの増加をもたらし、また、これは、ＨＢＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ、ＲＳＶ、およびＥＢＶに対するワクチンとして使用される。）；ＭＰＬ  ＲＣ−５２９（Ｄｙｎａｖａｘ；ＭＰＬ）は、ＴＬＲ４の活性化により作用し、ＨＢＶに対するワクチンとして使用される。）；Ｅ６０２０（Ｅｉｓａ／Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ；合成リン脂質二量体）は、ＴＬＲ４の活性化により作用する。）；ＴＬＲ−テクノロジー（Ｖａｘｉｎｎａｔｅ；抗原およびフラジェリン、ＴＬＲ５の活性化により作用し、インフルエンザに対するワクチンにおいて使用される。）；ＰＦ−３５１２６７６（ＣｐＧ  ７９０９）（Ｃｏｌｅｙ／Ｐｆｉｚｅｒ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ；免疫調節合成オリゴヌクレオチド）、ＴＬＲ９の活性化により作用し、ＨＢＶ、インフルエンザ、マラリア、および炭疽菌に対するワクチンにおいて使用される。）；ＩＳＳ（Ｄｙｎａｖａｘ；短いＤＮＡ配列）、ＴＬＲ９の活性化により作用し、ＨＢＶおよびインフルエンザに対するワクチンにおいて使用される。）；ＩＣ３１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ；ペプチドおよびオリゴヌクレオチド）、ＴＬＲ９の活性化、注射部位でのデポの形成、およびＡＰＣへの抗原取込みの増強により作用し、インフルエンザ、結核、マラリア、髄膜炎、アレルギー、および癌適応症に対するワクチンとして使用される。）など。
【０２２９】
本明細書において「評価基準アジュバント」とは、「基準アジュバント」または「標準アジュバント」とも呼ばれ、基準医薬成分の一つであり、機能が既知のアジュバントをいう。このようなアジュバントは、当該分野で公知の方法でその性質や機能が決定されている。例示的に、本発明では、δイヌリン（β−Ｄ−［２→１］ポリ（フルクト−フラノシル）α−Ｄ−グルコース）またはその機能等価物について、そのアジュバントとしての機能が判明しているため、それを基準とすることができる。
本明細書において「遺伝子発現データ」とは、各種遺伝子の任意の発現データを言う。
【０２３０】
＜「アジュバント」のアジュバントであるδイヌリン類＞
１つの局面において、本発明はδイヌリン（β−Ｄ−［２→１］ポリ（フルクト−フラノシル）α−Ｄ−グルコース）またはその機能等価物を含む、抗原のアジュバント性を惹起または増強するための組成物を提供する。ここで、δイヌリン（β−Ｄ−［２→１］ポリ（フルクト−フラノシル）α−Ｄ−グルコース）またはその機能等価物のＡｄｖａｘ（商標）として知られるアジュバント製品を挙げることができるがそれに限定されない。
【０２３１】
１つの実施形態では、本発明において使用されるδイヌリンの等価物は、δイヌリンと等価のトランスクリプト―ム発現プロファイルを有する。このようなトランスクリプト―ム発現プロファイルは、トランスクリプトーム分析を行って、遺伝子の発現プロファイルの分析を行うことによって実施することができる。トランスクリプトーム分析は、本明細書に記載される任意の手法によって実施することができる。
【０２３２】
＜樹状細胞活性化＞
別の局面では、本発明はδイヌリンまたはその機能等価物を含む、樹状細胞を活性化するための組成物を提供する。ここで、例えば、活性化は、マクロファージの存在下でなされてもよい。あるいは、δイヌリンまたはその機能等価物を含む、前記組成物は、マクロファージの増強剤とともに投与されてもよい。マクロファージが正常又は強化されている状態下でδイヌリンまたはその機能等価物が樹状細胞を活性化することを本発明で見出したことによるものである。したがって、本発明はアジュバントとしてδイヌリンまたはその機能等価物を利用する場合の一つの指標または活性化の根拠とすることができる。ここで利用されるδイヌリンまたはその機能等価物は、＜「アジュバント」のアジュバント＞の項で説明される任意の物質またはその組み合わせを利用することができる。また、＜「アジュバント」のアジュバント＞または＜同様のアジュバント・アジュバントの判定法および製造法＞で説明されるトランスクリプトーム分析を用いて、δイヌリンまたはその機能等価物と同様の樹状細胞活性化を有するアジュバントを同定することができる。
【０２３３】
＜Ｔｈ指向性＞
別の局面において、本発明は、δイヌリンまたはその機能等価物を含む、Ｔｈ１型抗原のＴｈ１応答を増強し、かつ、Ｔｈ２型抗原のＴｈ２応答を増強するための組成物を提供する。ここで利用されるδイヌリンまたはその機能等価物は、＜「アジュバント」のアジュバント＞の項で説明される任意の物質またはその組み合わせを利用することができる。また、＜「アジュバント」のアジュバント＞または＜同様のアジュバント・アジュバントの判定法および製造法＞で説明されるトランスクリプトーム分析を用いて、δイヌリンまたはその機能等価物と同様のＴｈ指向性を有するアジュバントを同定することができる。
【０２３４】
＜ＴＮＦαKOマウスに基づく技術＞
さらなる局面において、本発明は、δイヌリンまたはその機能等価物を含む、アジュバント組成物であって、該組成物はＴＮＦαが正常または増強された状態で投与されることを特徴とする、組成物を提供する。ここで利用されるδイヌリンまたはその機能等価物は、＜「アジュバント」のアジュバント＞の項で説明される任意の物質またはその組み合わせを利用することができる。また、＜「アジュバント」のアジュバント＞または＜同様のアジュバント・アジュバントの判定法および製造法＞で説明されるトランスクリプトーム分析を用いて、δイヌリンまたはその機能等価物と同様のＴＮＦαが正常または増強された状態での特質を有するアジュバントを同定することができる。
【０２３５】
＜同様のアジュバント・アジュバントの判定法および製造法＞
１つの局面において、本発明は、候補アジュバントが抗原のアジュバント性を惹起または増強するかどうかを判定する方法を提供する。この方法は、（ａ）候補アジュバントを提供する工程；（ｂ）δイヌリンまたはその機能等価物を評価基準アジュバントとして提供する工程；（ｃ）該候補アジュバントおよび該評価基準アジュバントのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；および（ｄ）該候補アジュバントが該評価基準アジュバントと同一のクラスターに属すると判定された場合、該候補アジュバントを抗原のアジュバント性を惹起または増強するものであると判定する工程、を包含する。ここで利用されるδイヌリンまたはその機能等価物は、＜「アジュバント」のアジュバント＞の項で説明される任意の物質またはその組み合わせを利用することができる。
【０２３６】
本発明の方法において、候補アジュバントの提供は任意の形態で実施することができる。δイヌリンまたはその機能等価物の評価基準アジュバントとしての提供も任意の形態で実施することができる。例えば、Ａｄｖａｘ（商標）などのデルタイヌリンを評価基準アジュバントとして用いてもよい。Ａｄｖａｘ（商標）はイヌリンの名の結晶粒子であり、Ｂ型肝炎（予防的および治療的）、インフルエンザ、炭疽菌、赤痢菌、日本脳炎、狂犬病、ハチ毒、アレルギーに対するワクチン、および癌免疫療法において使用される生体ポリマーである（Ｖａｘｉｎｅ  Ｐｔｙから販売されている。）。
【０２３７】
別の局面において、本発明は、抗原のアジュバント性を惹起または増強するアジュバントを含む組成物を製造する方法を提供する。この方法は、（ａ）１または複数の候補アジュバントを提供する工程；（ｂ）δイヌリンまたはその機能等価物を評価基準アジュバントとして提供する工程；（ｃ）該候補アジュバントおよび該評価基準アジュバントのトランスクリプトーム分析を行って遺伝子発現データを得て、該遺伝子発現データをクラスタリングする工程；（ｄ）該候補アジュバントのうち、該評価基準アジュバントと同一のクラスターに属するアジュバントが存在する場合該アジュバントを抗原のアジュバント性を惹起または増強するアジュバントとして選択し、存在しない場合は（ａ）〜（ｃ）を繰り返す工程；および（ｅ）（ｄ）で得られた抗原のアジュバント性を惹起または増強するアジュバントを含む組成物を製造する工程を包含する。ここで利用されるδイヌリンまたはその機能等価物は、＜「アジュバント」のアジュバント＞の項で説明される任意の物質またはその組み合わせを利用することができる。
【０２３８】
＜アジュバントのアジュバントを用いた医薬＞
本発明で使用されるアジュバントまたは「アジュバントのアジュバント」は、医薬品または医薬組成物として提供される。
【０２３９】
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に、注射剤あるいは経口、経腸、経膣、経皮または経眼剤として調製され得る。組成物はまた、活性成分が例えばワクチン抗原（遺伝子組換え抗原を含む）、抗原ペプチドまたは抗イディオタイプ抗体を含むものとも成り得る。追加的または代替的に活性成分は、リンフォカイン、サイトカイン、胸腺細胞刺激因子、マクロファージ刺激因子、エンドトキシン、ポリヌクレチド分子（例えばワクチン抗原をコードしているもの）あるいは組換えウイルスベクター、微生物（例えば微生物の抽出物）またはウイルス（例えば不活化または弱毒化されたウイルス）でもあり得る。実際、本発明の組成物は、不活化または弱毒化されたウイルスが活性成分である場合に使用される事に特に適している。
【０２４０】
本発明がアジュバント組成物として用いられる場合、対象となる好ましいワクチン抗原は、細菌、ウイルス、酵母菌、カビ、原虫および他の微生物の抗原の一部またはすべて、あるいはヒト、動物または植物由来の病原体および花粉やその他のアレルゲン、特に毒素（例えばミツバチやスズメバチの毒）およびハウスダストダニや犬猫のフケのような喘息を引き起こすアレルゲンを含む。
【０２４１】
特に好ましいワクチン抗原は、インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白（例えば不活化された季節性インフルエンザウイルスおよび季節性のＨ１、Ｈ３、Ｂ株またはパンデミックＨ５株の組換えＨＡ抗原）、インフルエンザ核蛋白、ロタウイルスの外層カプシド蛋白、ｇｐ１２０のごときヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）表面抗原、ヒトパピローマウイルスＥ７抗原、単純ヘルペスウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原（例えばＨＢｓ抗原）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）表面抗原、不活化日本脳炎ウイルス、（狂犬病を引き起こす）リッサウイルス表面抗原等のウイルス抗原、および赤痢菌、ポルフィロモナス・ジンジバリス（例えばプロテアーゼおよびアドヘジン蛋白）、ヘリコバクター・ピロリ（例えばウレアーゼ）、リステリア・モノサイトゲネシス、結核菌（例えばＢＣＧ）、マイコバクテリア・アビウム（例えばｈｓｐ６５）、クラミジア・トラコマチス、カンジダ・アルビカンス（例えば外膜蛋白）、肺炎球菌、髄膜炎菌（例えばクラス１外膜蛋白）、炭疽菌（炭疽の原因菌）、コクシエラ・ブルネッティ（Ｑ熱の原因菌であるが自己免疫型糖尿病（即ち１型糖尿病）に対し長期にわたる防御反応を誘導できる）等の微生物由来の抗原およびマラリアを引き起こす原虫（特にプラスモディウム・ファルシパラムおよびプラスモディウム・バイバックス）である。他に特に好まれる抗原は、癌抗原（即ち一つあるいはそれ以上の癌に付随する抗原）例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン−１（ＭＵＣ−１）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ｐ５３およびｒａｓの異常産物およびメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）である。
【０２４２】
本発明の組成物がワクチン抗原である場合、その組成物は好ましくは抗原結合担体材料を含むものである。抗原結合担体材料は、例えばマグネシウム、カルシウム、またはアルミニウムのリン酸塩、硫酸塩、水酸化物（例えば水酸化アルミニウムおよび／または硫酸アルミニウム）の様な金属塩または沈殿物のうち一つまたはそれ以上、および／または蛋白質、脂質、硫酸化またはリン酸化多糖（例えばヘパリン、デキストラン、もしくはセルロース誘導体）を含む有機酸およびキチン（ポリＮ−アセチルグルコサミン）もしくはそれらの脱アセチル化誘導体、または塩基性セルロース誘導体のような有機塩基、および／または他の抗原のうち一つまたはそれ以上である。抗原結合担体材料は、溶解性の乏しい任意の材料（水酸化アルミニウム（アラム）ゲルまたはその水和塩複合体）の粒子でもよい。典型的には、抗原結合担体材料は凝集する傾向は無く、または凝集を避けるように処理される。最も好ましくは、抗原結合担体材料は、水酸化アルミニウム（アラム）ゲル、リン酸アルミニウムゲルまたはリン酸カルシウムゲルである。
【０２４３】
本発明はキットとして提供されることができる。本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、抗体、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、検査薬、診断薬、治療薬、抗体等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
【０２４４】
このように、本発明のさらなる局面では、本発明はキットに関するものであり、このキットは、(a)本発明の医薬組成物を溶液形状または凍結乾燥形状で包含する容器と、(b)選択的に、該凍結乾燥製剤用の希釈剤または再構成液を包含する第２の容器と、(c)選択的に、(i)該溶液の使用または(ii)該凍結乾燥製剤の再構成および／または使用に関する説明書とを有する。該キットは、1もしくはそれ以上の(iii)緩衝剤、(iv)希釈剤、(v)フィルター、(vi)針、または(v)シリンジをさらに有する。該容器は、好ましくは瓶、バイアル瓶、シリンジ、または試験管であり、多用途容器でよい。該医薬組成物は、好ましくは乾燥凍結される。
【０２４５】
本発明のキットは、好ましくは、本発明の乾燥凍結製剤およびその再構成および／または使用に関する説明書を、適切な容器内に有する。適切な容器として含まれるのは、例えば、瓶、バイアル瓶(例えばデュアルチャンババイアル)、シリンジ(デュアルチャンパシリンジなど)、および試験管である。該容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成することができる。好ましくは、該キットおよび／または容器は、該容器上にある、あるいは該容器に伴う、再構成および／または使用の方法を示す説明書を包含する。例えば、そのラベルは、該乾燥凍結製剤を再構成して上記のペプチド濃度にするという説明を示すことができる。該ラベルは、さらに、該製剤が皮下注射に有用であるもしくは皮下注射のためのものであるという説明を示すことができる。本発明のキットは、他の構成要素(例えば他の化合物またはこれら他の化合物の医薬組成物)と共に、もしくはそれらなしに、本発明の医薬組成物の製剤を包含する単一の容器を有すること、または各構成要素によって別の容器を有することができる。
【０２４６】
本発明の医薬組成物は、経口(経腸)、経鼻腔、経眼、皮下、皮内、筋内、静脈内、または経皮のような任意の許容される経路によって該ペプチドを投与するのに適したものである。好ましくは、該投与は皮下投与であり、最も好ましくは皮内投与である。投与は注入ポンプによって行うことができる。したがって、本発明の医薬は、治療法または予防法として提供することができる。このような疾患を治療または予防するための方法は、有効量の本発明の組成物、アジュバントまたは医薬を、有効量のワクチン抗原などとともに、治療または予防を必要とする被検体に投与する工程を包含する。
【０２４７】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。
【０２４８】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、バイオインフォマティクスは、当該分野において公知であり、周知でありまたは慣用される任意のものが使用され得る。
【０２４９】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０２５０】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０２５１】
以下に実施例を記載する。必要な場合、以下の実施例において、全ての実験は、大阪大学倫理委員会で承認されたガイドラインに従って実施した。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Sigma−Aldrich、和光純薬、ナカライ、R&D  Systems、USCN  Life  Science  INC等）の同等品でも代用可能である。対照試薬として用いたＰＢＳはナカライテスクから入手しＤＭＳＯもナカライテスクから入手した。また、Tris-HClは和光純薬から入手した。【０２５２】
（方法）
標準的な操作プロトコル
全ての手順は、以下のそれぞれの標準的な操作プロトコルに従った(標準手順)：アジュバント投与および器官の採取(標準手順1)、RNA抽出およびGeneChipデータ取得(標準手順2)、品質管理およびデータベースへの最終的なデータの編入(標準手順3)。これらのプロトコルの詳細情報は、以下にまとめる。全ての実験は、適切な法律、ガイドラインの下で行われ、国立研究開発法人医薬基盤・栄養・健康研究所によって承認された。【０２５３】
（標準手順１）
（アジュバント投与およびサンプリング）
C57BL/6マウス(雄性、５週齢、C57BL/6JJc1)は、CLEAJapanから購入し、少なくとも１週間順応させた（−７日目〜−１０日目）。１日目ＡＭ１０時：バッファーまたはアジュバント溶液の投与を開始する（３０分以内に投与を完了する）。
i.d.：合計１００μＬを尾基底に投与する（左側５０μＬ＋右側５０μＬ）。
＊ｂＣＤは合計２００μＬをi.d.投与した。
i.p.：合計２００μＬを腹部の下部４分の１の箇所に投与する。
i.n.：50μLのケタミン／キシラジン混合物（ケタミン９０mg/kgおよびキシラジン10mg/kg）を皮下注射して麻酔し、Ｐ２０ピペットマンで１０μＬ（それぞれの鼻孔に５μＬ）の溶液をゆっくり鼻に滴下する。ＰＭ４時：器官のサンプリングを開始する（３０分以内に全てのマウスのサンプリングを完了する）。【０２５４】
（血液採取）
血液学的試験のために約200μLの血液を非ヘパリン化キャピラリー管で後眼窩静脈叢から取得し、2μLの10%EDTA-2Kを含む1.5mLチューブに入れる。穏やかにタップして十分に混合する。血液学的試験まで室温で保存する。【０２５５】
（器官のサンプリング）
ＬＮ：鼠径部リンパ節（両側）を露出させ、取り出す。約１ｍＬのＲＮＡlaterを含む３５ｍｍディッシュ中、立体顕微鏡下で脂肪組織のコンタミネーションをできるだけ低減するために、脂肪組織を取り除く。クリーニング後、両側のリンパ節を、１ｍＬのＲＮＡlaterを入れた２．０ｍＬEppendorf  Protein  LoBindチューブに移す。
ＳＰ：脾臓を露出させ、取り出す。脂肪組織および膵臓組織をできるだけ取り除く。クリーニング後、かみそりで脾臓を３つの部分に分ける。それぞれの部分を、別々に１ｍＬのＲＮＡlaterを入れた２．０ｍＬEppendorf  Protein  LoBindチューブに移す（全部で３チューブ）。
ＬＮ：肝臓の左葉を露出させ、取り出す。生検パンチ(φ5mm)で３か所くり抜く。それぞれの部分を、別々に１ｍＬのＲＮＡlaterを入れた２．０ｍＬEppendorf  ProteinLoBindチューブに移す（全部で３チューブ）。採取した器官は、それぞれRNAlaterを含むチューブに入れ、このチューブを一晩４℃で維持し、その後使用するまで−８０℃で保存した。【０２５６】
（血液学的細胞カウント）
血液学的細胞カウントは、VetScan  HMII(Abaxis)を使用して実施した。50ulのEDTA-2K血液試料に、250ulの生理食塩水を添加することで希釈し、説明書に従ってVetScanHMIIで測定した。【０２５７】
（標準手順２）
（ＲＮＡ抽出およびGeneChipデータの取得）
このプロトコルは、Molecular  Toxicology,  Biological  Safety  Research  Center,  NationalInstitute  of  Health  Sciences  and  Toxicogenomics  informatics  project  (TGP2)、NationalInstitutes  of  Biomedical  Innovation,  Health  and  Nutrition  and  Division  of  Cellularが製造元のマニュアルを参照して確立したものである。【０２５８】
（1.動物組織のホモジネート）
・1.1.試薬および機器
・1.1.1.試薬
1)  RNeasy（登録商標）Mini  Kit(QIAGEN、カタログ番号74106)
2)  Buffer  RLT*
3)  2-メルカプトエタノール(β-ME)
1.1.2.  機器
1)  ジルコニウムビーズ(直径5mm、Tosoh、カタログ番号YTZ-5)
2)  電子はかり
3)アスピレーター
4)  Mixer  MillMM300(QIAGEN)
5)  マイクロ遠心分離機
・1.2.  試薬の調製
・1.2.1.  BufferRLT*
1)使用前に1mLのBufferRLTあたり10μＬの2-メルカプトエタノールを添加する。
・室温で最大1か月保存
・1.3.  動物組織をホモジネートする手順
1)室温で試料を溶解する。
結晶も沈殿物もRNAlater中に存在しないことを確認する。
・一般的に、これはその後のRNA精製に影響を及ぼさないが、稀に、RNAの不安定化を引き起こす場合がある。
2)器官の重量を測定する。
・試料の重量が約30〜100mgになるようにする。
・筋組織の重量は約30〜50mgになるようにする。筋肉試料は量が多すぎるとホモジネートの凝集が起こる。
3)アスピレーションでRNAlater試薬を除去する。形成された場合には、結晶はここで全て取り除く。
4)火炎滅菌したピンセットを使用してジルコニウムビーズをチューブに入れる(チューブあたり1ビーズ)。
5)400μＬのBufferRLTを添加する。
・筋肉試料の場合、ホモジネートの凝集を防ぐため、600μＬのBuffer  RLTを添加する。
6)Mixer  Millアダプターにチューブを載せる。TGP2研究室では、MixerMillアダプターの端の列にのみチューブを載せていた。Mixer  Millアダプターの中央にチューブを載せると破壊が不完全となる場合がある。
7)器官切片を最適な条件下でMixerMillにより破壊しホモジネートする。
・TGP2研究室では、破壊は、室温で3分間25Hzで行った。最初の破壊ステップの後、Mixer  Millアダプターを回転させ、各チューブが均等にホモジネートされるようにする。第２の破壊ステップも、室温で3分間25Hzで行った。
8)室温で1分間300xgで遠心分離することでホモジネート中に生じる泡を除去する。
9)ホモジネートを-80℃で保存する。【０２５９】
（2.動物組織からの全RNAの精製(TRI-easy法)）
この節では、動物組織からの全RNAの抽出および精製について記載する。「TRI-easy法」は、酸グアニジニン-フェノール-クロロホルム(AGPC)抽出とRNeasy技術とを組み合わせたものである。【０２６０】
・2.1.  試薬および機器
・2.1.1.  試薬
1)  TRIzol（登録商標）LS試薬(Invitrogen，カタログ番号10296-028)
2)  RNeasy（登録商標）MiniKit(QIAGEN，カタログ番号74106)
BufferRLT*
BufferRW1*
BufferRPE
RNase非含有水
RNeasyミニスピンカラム
収集チューブ(1.5mL)
収集チューブ(2mL)
3)  DNase(QIAGEN，カタログ番号79254)
DNase  I、RNase非含有(凍結乾燥)
BufferRDD
DNase-RNase非含有水
4)  2-メルカプトエタノール(β-ME)
5)  エタノール
6)  クロロホルム
7)  DEPC処理水(Ambion，カタログ番号9920)【０２６１】
・2.1.2.  機器
1)  電子はかり
2)  アスピレーター
3)  Mixer  Mill
4)マイクロ遠心分離機(2mlチューブ用のローター)
5)  Multiskan  Spectrum(Themo  Labsystems)
6)  Gene  Quantpro(Amersham  Pharmacia  Biotech)
・2.2.試薬の調製
・2.2.1.  BufferRLT*
1)使用前に1mLのBuffer  RLTあたり10μＬのβ-MEを添加する。
・室温で最大1か月保存する。
・2.2.2.  BufferRPE
1)初回に使用する前に、4体積分のエタノールを添加する。
・室温で保存する。
・2.2.3.  50%  エタノール
1)  1体積分のDEPC処理水をエタノールに添加する。
*漂白剤溶液または酸性溶液をBufferRLT、Buffer  RW1および試料調製廃棄液に直接加えないこと。【０２６２】
・2.2.4.  DNase
1)凍結乾燥DNase  I(1500  Kunitz単位)を560μＬのDNase-RNase非含有水に溶解する。
・融解したアリコートは最大６週間2〜8℃で保存できる。
・長期保存については、アリコート最大９か月間-20℃で保存できる。
・再構成したDNaseIはボルテックスしないこと。
・融解後はアリコートを再凍結させないこと。
2)  10μlのDNaseIストック溶液(上述)を70μＬのBuffer  RDDに添加する。チューブをゆっくりひっくり返して混合し、チューブの側面に残った液を短時間遠心分離することで回収する。
【表２】
2018124293.tif 000004
・DNase  Iは特に物理的変性を起こしやすい。混合は、チューブをゆっくりひっくり返すことで行わなければならない。ボルテックスしてはいけない。【０２６３】
・2.3.  （任意選択）スパイクRNAの体積を計算する
・2.4.全RNA精製の手順(TRI-easy法)
1)組織ホモジネートを室温で溶解する。
2)  RLT  Bufferで体積を150μＬに調整して適切な濃度の試料ホモジネートを収集チューブ(2mL)中で調製する。
3)  3体積分のTRIzolLS試薬(450μＬ)を添加し、ボルテックスで混合した後、室温で5分間インキュベートする。
4)  1体積分のクロロホルム(150μＬ)を添加し、30秒間手で激しく振り混ぜた後、室温で2〜15分間インキュベートする。
5)  室温において12000xg以下で15分間遠心分離する。
6)上層の水相を注意深く分離し、新しい1.5mLチューブに移す。
7)  1体積分の50%  エタノールを添加し、ピペッティングで混合する。
・50%  エタノール(70%エタノールの代わりとして)を使用すると、肝臓試料からのRNA回収量が増加し得る。
8)上清を、2mL収集チューブにセットしたRNeasyミニスピンカラムに移す。
9)蓋をゆっくり閉め、室温で15秒間8,000xg以下で遠心分離する。
10)フロースルーを捨て、カラムを再度セットする。
11)  350μＬのBufferRW1をRNeasyスピンカラムに添加してスピンカラムのメンブレンを洗浄する。
12)蓋をゆっくり閉め、室温で15秒間8,000xg以下で遠心分離する。
13)フロースルーを捨て、カラムを再度セットする。
14)（任意選択）80μＬのDNase溶液をカラムに添加し、室温で15分間インキュベートする。
15)  350μＬのBufferRW1をカラムに添加する。
16)  蓋をゆっくり閉め、室温で15秒間8,000xg以下で遠心分離してスピンカラムのメンブレンを洗浄する。
17)カラムを新しい収集チューブにセットする。
18)  500μＬのRPEをRNeasyスピンカラムに添加する。
19)  蓋をゆっくり閉め、室温で15秒間8,000xg以下で遠心分離する。
20)フロースルーを捨てカラムを再度セットする。
21)  500μＬのRPEをRNeasyスピンカラムに添加する。
22)  蓋をゆっくり閉め、室温で２分間8,000xg以下で遠心分離する。
23)  カラムを新しい収集チューブにセットする。
24)  蓋をゆっくり閉め、室温で1分間１５,000xg以下で遠心分離
25)  カラムを新しい1.5mL収集チューブにセットする。
26)  40μＬのDNase-RNase非含有水を溶出したRNAに添加する。
27)チューブを室温で3分間インキュベートする。
28)  蓋をゆっくり閉め、室温で1分間１５,000xg以下で遠心分離する。
29)高ＲＮＡ回収率のためにカラムに溶出物全量を添加してRNAを再溶出する。
30)チューブを室温で3分間インキュベートする。
31)  蓋をゆっくり閉め、室温で1分間１５,000xg以下で遠心分離する。
・溶出物のＲＮＡ濃度が必要な濃度に満たない場合ステップ29〜31を繰り返す。
32)溶出物のOD260、OD280、OD975、OD900をMultiskan  Spectrumで測定する。全RNAは500ng/μＬより高い濃度である必要がある。
33)  [QC]読み取ったOD値、変動およびOD260/OD280。
34)  [QC]電気泳動による28Sリボソームおよび18SリボソームRNA。【０２６４】
（3.  cDNAの合成）
・3.1.  試薬および機器
・3.1.1.  試薬
1)  One-Cycle  cDNASynthesis  Kit(Affymetrix，カタログ番号900431、-20℃保存)
T7-オリゴ(dT)プライマー、50μM
5X  1stStrand  Reaction  Mix
DTT,0.1M
dNTP,10mM
SuperScript  II,  200U/μＬ
5X  2ndStrand  Reaction  Mix
大腸菌DNAリガーゼ、10U/μＬ
大腸菌DNAポリメラーゼI、10U/μＬ
RNaseH,  2U/μＬ
T4  DNAポリメラーゼ、5U/μＬ
EDTA、0.5M(室温で保存)
RNase非含有水(室温で保存)
・Affymetrix  One-Cycle  Assaysで使用するためのOne-Cycle  cDNAキット用のSuperScriptおよび/またはInvitrogenからの同様のものを使用することができる。
2)  SampleCleanup  Module(Affymetrix、カタログ番号900371)
cDNABinding  Buffer
cDNAWash  Buffer、6mL濃縮物
cDNAElution  Buffer
3)  DEPC処理水(Ambion，カタログ番号9915G)
4)  0.5M  EDTA二ナトリウム塩(Sigma，カタログ番号E-7889)
5)  エタノール
・3.1.2.  機器
1)  SampleCleanup  Module(Affymetrix、カタログ番号900371)
cDNAクリーンアップスピンカラム
2mL収集チューブ
1.5mLマイクロチューブ、DNase/RNase/パイロジェン非含有
・蓋が稀に壊れるので、キット中の1.5mL収集チューブは使用しない。
2)ヒートブロック
3)マイクロ遠心分離機【０２６５】
・3.2.試薬の調製
・3.2.1.First-Strand  Master  Mix
1)十分量のFirst-StrandMaster  Mixを1.5mLチューブ中に調製する。以下の表を参照。
2)  チューブを振り混ぜ、溶解させた後、短時間遠心分離する。
3)  First-StrandMaster  Mixを使用直前に調製し、氷上に静置する。
【表３】
2018124293.tif 000005
【０２６６】
・3.2.2.  Second-StrandMaster  Mix
1)  十分量のSecond-StrandMaster  Mixを15mLチューブ中に調製する。以下の表を参照。
2)  チューブを振り混ぜ、溶解させた後、短時間遠心分離する。
3)  チューブをゆっくり十分に振り混ぜ、短時間遠心分離する。
4)Second-Strand  Master  Mixを使用直前に調製し、氷上に静置する。
【表４】
2018124293.tif 000006
・3.2.3.  cDNAWash  Buffer
1)  24mLのエタノールを添加して作業溶液を得て、混同を避けるためチェックボックスにチェックを入れる。
・室温で保存する。
・バッファー全量を１か月以内に使用しない場合には、必要量のバッファーをDNase/RNase非含有チューブ中に調製する。【０２６７】
・3.3.cDNA合成手順
・3.3.1.  第１鎖cDNAの合成
1)  5μｇ/10μＬのRNA試料を、RNase非含有水を使用して調製する。
2)  -80℃で保存していたＲＮＡ試料を溶解した後、チューブをゆっくり十分に振り混ぜ、短時間遠心分離する。
3)  2μＬの50μM  T7-オリゴ(dT)プライマーを添加する。チューブをゆっくり十分に振り混ぜ、短時間遠心分離する。
4)チューブを70℃で１０分間インキュベートする。
5)試料を4℃で2分間冷却し、短時間遠心分離する。
6)  7μＬのFirst-StrandMaster  Mixをそれぞれの反応混合物に添加して最終体積が19μＬになるようにする。チューブをよく振り混ぜ、短時間遠心分離して、チューブの底の反応混合物を回収する。
7)すぐにチューブを42℃で2分間インキュベートする。
8)１μＬのSuperScriptIIを反応混合物に添加する。チューブをよく振り混ぜ、短時間遠心分離する。
9)チューブを42℃で1時間インキュベートする。
10)試料を4℃で2分間冷却する。
11)  チューブを短時間(約5秒)遠心分離してチューブの底の反応混合物を回収し、すぐに次のステップに進む。【０２６８】
・3.3.2.  第２鎖cDNAの合成
1)  130μＬのSecond-StrandMaster  Mixを各第１鎖合成試料に添加し、チューブをよく振り混ぜ、短時間遠心分離する。
2)チューブを16℃で2時間インキュベートする。
3)  2μＬのT4  DNAポリメラーゼを添加する。チューブをよく振り混ぜ、短時間遠心分離する。
4)チューブを16℃で5分間インキュベートする。
5)  10μＬのEDTA、0.5Mを添加する。ボルテックスで十分に混合し、短時間遠心分離する。
・２本鎖cDNA試料は-20℃で保存することができる。【０２６９】
・3.3.3.二本鎖cDNAのクリーンアップ
・このプロトコルの全ステップは室温で行うこと。
2)  600μＬのcDNABinding  Bufferを２本鎖cDNA試料に添加する。３分間ボルテックスで
混合し、短時間遠心分離する。
・混合物の色が黄色であることを確認する(cDNA合成反応を起こしていない場合のcDNA  Binding  Bufferの色)。
・混合物の色がオレンジまたは紫である場合、10μＬの3M酢酸ナトリウム、pH  5.0を添加し、混合し、混合物の色が黄色であることを確認する。
3)  cDNAクリーンアップスピンカラムを2mL収集チューブにセットする。
4)試料の混同を防ぐためにスピンカラムの蓋に試料番号を記入する。
5)  500μＬの試料をcDNAクリーンアップスピンカラムに載せ、カラムの蓋を閉める。その後、室温で1分間8,000xg(10,500rpm)で遠心分離する。
6)遠心分離後、フロースルーを捨て、再度cDNAクリーンアップカラムを2mL  収集チューブにセットする。
7)スピンカラムに残りの混合物(262μＬ)を載せ、カラムの蓋を閉める。その後、室温で1分間8,000xg(10,500rpm)で遠心分離する。
8)遠心分離後、フロースルーおよび収集チューブを捨てる。
9)スピンカラムを新しい2mL収集チューブに移す。
10)  700μＬのcDNAWash  Bufferをスピンカラムに入れ、カラムの蓋を閉め、室温で1分間8,000xg(10,500rpm)で遠心分離する。
11)遠心分離後、フロースルーおよび収集チューブを捨て、スピンカラムを新しい2mL収集チューブに移す。
12)スピンカラムのキャップを開け、室温で5分間10,000xg(15,000rpm)で遠心分離する。13)遠心分離後、フロースルーおよび収集チューブを捨てる。
14)スピンカラムを1.5mL収集チューブに移す。
15)  14μＬのcDNAElution  Bufferをスピンカラムのメンブレン上に直接載せる。
16)室温で１分間インキュベートし、1分間10,000xg(15,000rpm)で遠心分離して溶出させる。
・  溶出物の平均体積は12μＬである。【０２７０】
（4.  cRNAの合成）
・4.1.  試薬および機器
・4.1.1.  試薬
1)  IVT  labeling  Kit(Affymetrix、カタログ番号900449、-20℃保存)
10X  IVTLabeling  Buffer
IVT  LabelingEnzyme  Mix
IVTLabeling  NTP  Mix
3'-標識対照(0.5μｇ/μＬ)
RNase非含有水
2)  GeneChipSample  Cleanup  Module(Affymetrix、カタログ番号900371)
IVTcRNA  Binding  Buffer
IVTcRNA  Wash  Buffer、5mL濃縮物
RNase非含有水
5XFragmentation  Buffer
cDNABinding  Buffer
cDNAWash  Buffer、6mL濃縮物
cDNAElution  Buffer
3)  DEPC処理水(Ambion、カタログ番号9920、室温で保存)
4)  エタノール
・4.1.2.  機器
1)  GeneChipSample  Cleanup  Module(Affymetrix、カタログ番号900371)
IVTcRNAクリーンアップスピンカラム
1.5mL収集チューブ(溶出用)
2mL収集チューブ
1.5mLマイクロチューブ、DNase/RNase/パイロジェン非含有
・cRNAクリーンアップスピンカラムをcDNAクリーンアップスピンカラムと混同しないように注意する。
2)  ヒートブロック
3)マイクロ遠心分離機【０２７１】
・4.2.試薬の調製
・4.2.1.  IVTReaction  Mix
1)  十分量のIVTReaction  Mixを1.5mLチューブ中に調製する。以下の表を参照。
2)  チューブを振り混ぜ、それぞれを溶解させた後、短時間遠心分離する。
・First-Strand  Master  Mixは使用直前に調製し氷上に静置する。
【表５】
2018124293.tif 000007
・4.2.2.  IVT  cRNAWash  Buffer(室温で保存)
1)20mLのエタノールを添加して作業溶液を得て、混同を避けるためにボトルラベルのチェックボックスにチェックを入れる。
・必要に応じて、30℃の水浴中で温めることで沈殿物を溶解させ、その後バッファーを室温に置く。
・4.2.3.  80%エタノール(室温で保存)
1)  RNase/DNase非含有チューブ中でエタノールおよびDEPC処理水を4:1の比率で混合する。【０２７２】
・4.3.  IVT反応の手順
・4.3.1.  IVT反応
1)  30μＬのIVTReaction  Mixを1.5mLチューブ中に調製する。
2)  10μＬの２本鎖cDNA試料を添加する。チューブを振り混ぜ、それぞれを溶解させた後、短時間遠心分離する。
3)チューブを300  rpmで混合しながら16時間37℃でインキュベートする。
4)すぐに精製しない場合、標識cRNAを-80℃で保存する。【０２７３】
・4.3.2.cRNAのクリーンアップ
1)  60μＬのRNase非含有水を試料(40μＬ)に添加して３秒間ボルテックスする。
2)  350μＬのIVTcRNA  Binding  Bufferを混合物に添加して３秒間ボルテックスする。
・コンタミネーションの可能性がある場合には、チップを交換する。
3)  250μＬの100%エタノールを混合物に添加し、ピペッティングによって十分に混合する。
・コンタミネーションの可能性がある場合には、チップを交換する。
4)混合物(700μＬ)を、2mL収集チューブにセットしたIVT  cRNAクリーンアップスピンカラムに載せる。
5)  15秒間8,000xg(10,500rpm)で遠心分離する。
6)フロースルーおよび収集チューブを捨てる。
7)スピンカラムを新しい2mL収集チューブに移す。
8)  500μＬのIVTcRNA  Wash  Bufferをスピンカラムに載せる。
・コンタミネーションの可能性がある場合には、チップを交換する。
9)  15秒間8,000xg(10,500rpm)で遠心分離し、フロースルーを捨てる。
10)  500μＬの80%(v/v)エタノールをスピンカラムに載せる。
・コンタミネーションの可能性がある場合には、チップを交換する。
11)  15秒間8,000xg(10,500rpm)で遠心分離し、フロースルーを捨てる。
12)キャップを開け、5分間8,000xg(10,500rpm)で遠心分離し、フロースルーおよび収集チューブを捨てる。
13)スピンカラムを新しい1.5mL収集チューブに移し、11μＬのRNase非含有水を直接スピンカラムのメンブレン上に載せる。
・コンタミネーションの可能性がある場合には、チップを交換する。
14)  キャップを閉め、1分間10,000xg(15,000rpm)で遠心分離して溶出させる。
15)  10μＬのRNase非含有水を直接スピンカラムのメンブレン上に載せる。
・コンタミネーションの可能性がある場合には、チップを交換する。
16)キャップを閉め、1分間10,000xg(15,000rpm)で遠心分離して溶出させる。
17)  O.D.を測定することでＲＮＡ濃度を決定する。【０２７４】
・4.3.3.cRNAの断片化
1)  cRNAおよびRNase非含有水の量を計算してcRNA濃度を20μｇ/μＬに調整する。
・  全血液試料の場合、cRNA濃度は10μｇ/μＬである。
・  TGPでは、全RNAのキャリーオーバーをなくすため、cRNAの量を以下の式にしたがって計算した。
［ｃＲＮＡ量］＝ＲＮＡｍ−全ＲＮＡｉ＊Ｙ
ＲＮＡｍ：ＩＶＴ反応後に測定したｃＲＮＡのみかけの量
全ＲＮＡｉ１）：出発試料の全ＲＮＡ量
Ｙ：［ＩＶＴ反応に使用したｃＤＮＡ溶液の量］２）／［ｃＤＮＡ溶液の量］３）
１）ＴＧＰ中５μｇ、２）ＴＧＰ中１０μＬ、３）ＴＧＰ中１２μＬ
2)  ステップ1)で計算したRNase非含有水およびcRNAを1.5mLマイクロチューブに分注する。
3)チューブの蓋に試料番号を記す。
・コンタミネーションの可能性がある場合には、チップを交換する。
・TGPでは、残りのcRNA試料はバーコードラベルを付けて-80℃で保存した。
4)  8μＬの5xfragmentation  bufferを添加する。
・コンタミネーションの可能性がある場合には、チップを交換する。
5)  チューブをタップして混合し、短時間遠心分離する。
6)  cRNAの定量のため(反応前)、1μＬのこれらの反応混合物を電気泳動用の8連PCR反応チューブに分注する。
7)  チューブを35分間94℃でインキュベートする。
8)  cRNAの定量のために(反応後)、1μＬのこれらの断片化した反応混合物を電気泳動用の8連PCR反応チューブに分注する。
9)  [QC]変性アガロースゲル上での電気泳動によるcRNAの断片化パターン。
・一般に、断片化cRNA試料は保存しない。必要であれば、-80℃で保存する。【０２７５】
・4.3.4.cRNAおよびその断片化の簡単な確認
1)  cRNAの品質確認のための基準
cRNA電気泳動パターンが全体に汚れがなく、1kbp付近のバンドが強く染色されること(レーン1)。
cRNA電気泳動パターンが全体に汚れがなく、1kbp付近のバンドが強く染色されないこと(レーン3)。
cRNAのサイズ分布が1kbp(レーン7)未満であること。これらの試料は、高いバックグランドを示すことになるので、その後の反応に不適切である。
2)  断片化cRNAの確認
・断片化cRNAのサイズ分布が35〜200bp（ゲル電気泳動の先端）を示す(レーン2、4)。【０２７６】
（5.  ハイブリダイゼーション）
・5.1.  試薬および機器
・5.1.1.  試薬
1)  GeneChipEukaryotic  Hybridization対照キット(Affymetrix、カタログ番号900454または900457)
20xEukaryotic  Hybridization対照
対照オリゴヌクレオチドB2
・対照オリゴヌクレオチドB2(150μＬ)は３つのチューブに分注し、-20℃で保存した。
2)  MES非含有酸一水和物(Sigma,カタログ番号M5287、250g、室温で保存)
3)  MESナトリウム塩  (Sigma,カタログ番号M5057、100g、室温で保存)
4)  5M  NaCl(Ambion、カタログ番号9760、100mL、室温で保存)
5)  0.5M  EDTA(Sigma、カタログ番号E7889、100mL、室温で保存)
6)  10%  Tween20(Surfact-Amps  20、PIERCE、カタログ番号9005-64-5、10mL、最大１年間室温で保存)
7)  10mg/mL  Herring  Sperm  DNA(Promega、カタログ番号D1811、最大１年間-20℃で保存または最大１か月間4℃で保存)
8)  50mg/mLウシ血清アルブミン(Invitrogen、カタログ番号15561-020、3mL、最大１年間-20℃で保存または最大１か月間4℃で保存)
9)  DEPC処理水(Ambion、カタログ番号9920、室温で保存)
10)  20x  SSPEBuffer(Invitrogen、カタログ番号15591-043、1L、室温で保存)
・5.1.2.  機器
1)  50mLチューブ、DNase/RNase/パイロジェン非含有
2)  15mLチューブ、DNase/RNase/パイロジェン非含有
3)  1.5mLマイクロチューブ、DNase/RNase/パイロジェン非含有
4)  Bottle  TopVacuum  Filter(Iwaki、カタログ番号8024-045)
5)  Storage  Bottle(Iwaki、カタログ番号8930-001)
6)  タフスポット(Toho、直径1/2インチ、白色、T-SPOTS-50)
7)  Gene  Chip  Hybridization  Oven  640(Affymetrix)
8)  クールインキュベータ(Mitsubishi  Electronic  Engineering、CN-25A)【０２７７】
・5.2.試薬の調製
・5.2.1.  12xMESストックバッファー(遮光、最大３か月間4℃で保存)
1)混合して体積を1,000mLに調製する。pHは6.5〜6.7になるようにする。
2)  0.22μｍフィルターを通す。
・この操作は、滅菌のためというより脱気およびダストの除去のためである。
・MESバッファーをオートクレーブしない。
・MESバッファーが黄色くなっている場合には使用しない。
【表６】
2018124293.tif 000008
【０２７８】
・5.2.2.  2xHybridization  Buffer(遮光、最大１か月間4℃で保存)
最終1x濃度のバッファーは100mM  MES、1M[Na+]、20mM  EDTA、0.01%Tween-20である。
1)  50mLチューブ中に調製し、ひっくり返しながら混合する。
【表７】
2018124293.tif 000009
【０２７９】
・5.2.3.  1xHybridization  Buffer(遮光、最大１か月間4℃で保存)
1)  50mLチューブ中に調製し、ひっくり返しながら混合する。
【表８】
2018124293.tif 000010
【０２８０】
・5.2.4.  Wash  Asolution(ストリンジェントでない洗浄バッファー、最大１か月間室温で保存)
1)メスシリンダーを使用してビーカー中に調製し、スターラーで十分に混合する。
2)調整したWash  Asolutionを清浄な専用容器に移す。
・この操作は、滅菌のためというより脱気およびダストの除去のためである。
【表９】
2018124293.tif 000011
【０２８１】
・4.1.  ハイブリダイゼーション
1)  結露およびゴムセプタムのひび割れを防ぐため使用３０分前にGeneChipを室温に平衡化する。
・GeneChipをチェックする(ガラス表面の疵など)。
2)  30μＬの各断片化標識cRNA試料を1.5mLマイクロチューブに移す。
3)  十分量のHybridization  Mixを15mLチューブ中に調製する。以下を参照。
【表１０】
2018124293.tif 000012
4)  270μＬのHybridization  Mixを断片化標識cRNA試料に添加し、チューブを振り混ぜ、短時間遠心分離する。
・コンタミネーションの可能性がある場合には、チップを交換する。
5)  ヒートブロックを使用してチューブを5分間99℃でインキュベートする。
6)  ヒートブロックを使用してチューブを5分間４５℃でインキュベートする。
7)  室温で5分間10,000xg(15,000rpm)で遠心分離してハイブリダイゼーションカクテル由来の全ての不溶性物質を収集する。
8)  ハイブリダイゼーションカクテルを遠心分離している間、アレイを200μＬの1xHybridization  Mixで濡らしておく。
・清浄な未使用のRAININピペットチップを挿入することでGeneChipのセプタムの右上に孔を開ける。
・清浄な未使用のRAININピペットチップでセプタムの左下から1xHybridization  Mix(事前ハイブリダイゼーションバッファー)を充填する。
9)  60rpmで回転させながらHybridization  Ovenを使用してGeneChipを10分間45℃でインキュベートする(事前ハイブリダイゼーション)。
10)  GeneChipからのバッファーの漏出をチェックする。
11)清浄な未使用のRAININピペットチップでアレイに孔を開け、1xHybridization  MixをGeneChipから取り除く。
12)  チューブの底に不溶性の物質が残るのを避けるため、清浄な未使用のRAININピペットチップで200μＬの清澄なハイブリダイゼーションカクテルを再充填する。
13)  漏出を防ぐために1/2インチのタフスポットをセプタムに貼る。
14)  上清(約100μＬのハイブリダイゼーションカクテルが残る)を取り出した後のマイクロチューブを-80℃で保存する。
・TGPでは、チューブに試料のIDバーコードを付した。
・GeneChipのガラス表面に触れないこと。
15)  GeneChipをHybridization  Ovenに入れ、60rpmで回転させながら18時間45℃でインキュベートする(ハイブリダイゼーション)。
・モーターに応力がかかるのを避けるために、軸を中心にバランスをとった配置でプローブアレイを設置する。
16)  ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションカクテルを清浄な未使用のRAININピペットチップでGeneChipから除去した。
・TGPでは、このカクテルを、残りのハイブリダイゼーションカクテルに加えて、再ハイブリダイゼーション用のハイブリダイゼーションカクテルとして-80℃で保存する。
17)  GeneChipを適切な体積のWash  Buffer  Aで完全に充填する(約260μＬ)。
・TGPでは、次のステップまでGeneChipをクールインキュベータに入れておいた。【０２８２】
（標準手順３）
（品質管理(QC)およびデータベースへの最終的なデータ編入）
アジュバントデータベースプロジェクトにおける全ての遺伝子発現は品質管理(QC)を合格したものである。データ取得は、インハウスのGeneChip（登録商標）Scanner  3000  7G(Affymetrix)において実施した。取得したデータを、バックグランドのシグナル、角のシグナル、存在/非存在コールの数およびハウスキーピング遺伝子の発現値についてさらに解析した。次に、グループ内またはグループ間の再現性をスキャッタープロット分析によって確認した。X軸およびY軸は、同じ(グループ間)または異なる(グループ間)アジュバント処置マウスグループにおける２つの異なる試料由来の各遺伝子についての遺伝子発現値を示す。赤色のドットは、高い相関係数(CV)を示す遺伝子を表す。【０２８３】
（代表的ＱＣ例）
以下は、本プロジェクトで観察された5種類の代表的なQC例である。【０２８４】
1)不明な理由で失敗したQCの例（スペアの試料で再度アッセイを行った）
【化１】
2018124293.tif 000013
DMXAA_ID_SP_x1(a-1)は、不明な理由によりスキャッタープロットが大きく歪んだ。sHz_ID_LV_x3(a-2)およびMBT_ID_LV_x3(a-3)は、同じ器官由来で同じアジュバントで処置した別の試料に対して、異常な曲がったスキャッタープロットを示した。他の(スペアの)組織断片（同じ試料から同時にサンプリングしたがスペアとして別々に保存していたもの）を使用して再アッセイを行った。スペア断片からのデータも歪んだスキャッタープロットを示した場合、その試料はその後の解析から除外した。これら３つのケースにおいて、DMXAA_ID_SP_x1、sHz_ID_LV_x3およびMBT_ID_LV_x3の再アッセイデータはQCに合格し、その後の解析に使用した。【０２８５】
2)他の組織が大きくコンタミネーションしたため失敗したQC試料（その後の解析から除外した）
ADX_ID_LN_c1とADX_ID_LN_c3との間のスキャッタープロットは、片側の偏りを示した。CV分析によって、このADX_ID_LN_c1試料には鼠径リンパ節の周辺の脂肪組織による重度のコンタミネーションが起こっていることが分かった。CVフィルターを適用した場合でも、脂肪組織由来の遺伝子の除外は達成できなかった(中心線から大きく広がった黒のドットで示される)。そのため、これらのコンタミネーションによる強力な影響を避けるため、これらの試料はその後の解析から完全に除外した。【０２８６】
3)他の組織による不可避的な弱いコンタミネーションがあるもののQCに合格したもの
ADX_IP_SP_c2(c-1)およびcdiGMP_ID_SP_c1(c-2)は、脾臓における正常なスキャッタープロット(e-2)に対して膵臓のコンタミネーションを示した。脾臓と膵臓とは近傍に位置するので、注意深くクリーニングを行っても脾臓から膵臓組織を完全に取り除くことは技術的に困難である。そのため、CVフィルターを適用して、データ処理法によりこれらのコンタミネーション由来の遺伝子（通常高いCVを示す）を取り除いた。【０２８７】
4)異なる大きさの宿主応答を示すもののQCに合格したもの
マウスの個体間の差により、広い分布を示した試料(d-1,2)も検出することができたが、これは、アジュバント投与後の宿主応答の大きさが異なることを反映している。【０２８８】
5)問題なくQCに合格したもの
（合成仮想対照）
実験3の試料の統計解析に少なくとも３つの対照試料を取得するために、「03PBS_LN_c1」合成仮想対照を「03PBS_LN_c1v」で置き換えた。合成仮想対照「03PBS_LN_c1v」は、合計10の実験からプールした対照試料の個々の遺伝子発現の平均を使用して作成した。それぞれのプローブセットについて、プールした対照試料の中の最高値のプローブおよび最低値のプローブを取り除いた後に平均値を計算した。【０２８９】
（QC後のデータセットのさらなる評価に基づく試料の除外）
他の２匹のマウスと比較して強すぎる遺伝子応答を示したので、さらに２つの試料、K3SPG_IP_LV_x2およびK3SPG_IP_SP_x2(両試料は、実験２の#2マウスから取得)を除外した(図は示さず)。ADX_ID_LN、K3SPG_IP_LVおよびK3SPG_IP_SPについては、２つの処置試料だけを後の解析に使用した。他の試料は、３つの試料で解析した。【０２９０】
（CVフィルタリング）
GeneChipデータのQC解析の間に、いくつかの試料には、他の組織由来の遺伝子のコンタミネーションが低レベルであるが、実質的なレベルで含まれていた(例えば、上記ＱＣ散乱図の赤)。注意深くクリーニングして器官を採取しても完全にマイクロコンタミネーション(QC例３)を除去することは技術的に困難であった。そのため、標的器官遺伝子解析からマイクロコンタミネーション由来の遺伝子を低減させるために変動係数(CV)フィルターを開発した。それぞれの遺伝子プローブのベースラインでの変動を、緩衝液を注射した合計33匹の対照マウスからのGeneChipデータを使用して計算した図は示さず)。それぞれの器官において大きなCVを示した遺伝子プローブについて、GeneExpression  Barcode  3.0(http://barcode.luhs.org/)データベースを使用してその起源をさらに解析した。Barcode  3.0による解析によって、これらのCVの大きな遺伝子プローブは、LVにおける神経組織(図は示さず)、SPにおける膵臓組織(図は示さず)そしてLNにおける脂肪組織(図は示さず)に主に由来することが明らかになった。これらのマイクロコンタミネーションの影響を取り除くため、CV値<1でデータをフィルタリングし、このフィルタリングしたデータ(45037プローブのうちの43200)をさらなる解析のために使用した。【０２９１】
（アジュバントの投与およびサンプリング）
本実施例で使用したアジュバントの詳細情報は別途記載する。C57BL/6マウス(雄性、５週齢、C57BL/6JJc1)は、CLEA  Japanから購入し、少なくとも１週間順応させた。それぞれのアジュバントを標準手順1に記載するように調製し、それぞれのアジュバントについて示した用量/体積(表１１)を、マウス(グループごとにn=3)の、主に尾基底に投与した(皮内、i.d.)。５種類のアジュバント(ADX、ALM、bCD、K3およびK3SPG)はi.p.投与した。ENDCNはi.n.（鼻内）投与した。予備実験において、筋内投与を行うと非常にばらつきが大きく再現性の低い遺伝子プロファイルが得られたので、本実施例では筋内投与を行っていないが、条件を調整すれば筋肉内注射も利用可能である。それぞれのアジュバントの用量は、本発明者らの実験(ALM、K3およびK3SPG、bCD、cdiGMPおよびcGAMP、D35、DMXAA、FK565、sHZ)、以前の報告(AddaVax、ADX、ENDCN、PolyIC、Pam3CSK4、MPLA、MALP2s、R848)または下記の共通プロトコル(FCAおよびISA51VGの1:1混合物)(詳細は別途記載する)に基づいて、マウスにおいて重篤な反応原性なく良好なアジュバント機能を誘起するような用量を選択した。【０２９２】
選択したMBTの用量は、FK565の用量と同じであったが、これに関しての実験は行っておらず、FK565および他のNODリガンドについての予備データ（データは示さず）に基づいて決定した。合計21種類の異なるアジュバントのうち、３〜５種類の異なるアジュバントを１つの実験において使用し、適切なバッファー対照グループを使用した(大部分のアジュバントについてはＰＢＳ、ENDCNについてはTris-HCl、そしてDMXAA、MALP2s、MPLAおよびR848については5%DM標準手順BS)。この研究において、合計で10の独立した実験を行った(標準手順1を参照、例えば表１１)。
【表１１】
2018124293.tif 000014
【０２９３】
予備実験において、ＦＣＡおよびＡＬＭについて７２時間までの異なる時点で試験したところ、試験した用量範囲では、遺伝子発現の変化は多くの場合６時間時点でピークに達し、２４時間時点では大部分の変化が収まっていた。予備実験によって、アジュバントの投与後に、器官における遺伝子発現の変化を、一定して投与後6時間の時点で調べ、24時間後にはマウスおよびラットにおいて概ね正常レベルに戻ったことが明らかになった。そのため、サンプリングには投与後６時間後の時点を選んだ。アジュバント投与６時間後に、LV、SPおよびLN（両側）を取り出し、その遺伝子発現をAffimetrixGeneChipマイクロアレイシステム(Affymetrix)を使用して調べた。採取した器官は、それぞれRNAlaterを含むチューブに入れ、このチューブを一晩４℃で維持し、その後使用するまで−８０℃で保存した。一般血液学的試験のため、アジュバント投与６時間後に採血も実施した。血液学的試験のために約200μLの血液を非ヘパリン化キャピラリー管で後眼窩静脈叢から取得し、2μLの10%EDTA-2Kを含む1.5mLチューブに入れた。血液学的細胞カウントは、VetScanHMII(Abaxis)を使用して実施した。50ulのEDTA-2K血液試料に、250ulの生理食塩水を添加することで希釈し、説明書に従ってVetScanHMIIで測定した。【０２９４】
（データ取得および品質管理）
マイクロアレイのデータ取得はIgarashiら（Igarashi,  Y.  et  al.  Open  TG-GATEs:  a  large-scaletoxicogenomics  database.  Nucleic  acids  research  43,  D921-927(2015)）に従った。簡潔に説明すると、RNAlaterに貯蔵された組織ブロックにRLTバッファー(QiagenGmbH.,  Germany)添加し、MixerMill  300(Qiagen,  Germany)上で20Hzにおいて5分間、5mm径のジルコニウムビーズ(ASONE  Corporation,  Japan)とともに振盪することによってホモジネートした。全RNAをTrizol  LS(LifeTechnologies,  CA)およびRNeasy  Mini  Kit(Qiagen)を製造元の指示に従って使用してLV、SPおよびLNから単離した。GeneChip（登録商標）3’IVT  Express  Reagent  KitまたはGeneChip（登録商標）3’IVT  PLUS  Reagent  Kitを使用して試料調製を行い、遺伝子発現プロファイルは、製造元の指示に従ってGeneChip（登録商標）Mouse  Genome  2.0  Array(Affymetrix,  CA)を使用して決定した。洗浄ステップおよび染色ステップは、GeneChip（登録商標）Hybridization,  Wash,  and  Stain  kiton  a  fluidics  station  450(Affymetrix)を使用して実施した。GeneChip（登録商標）アレイをGeneChip（登録商標）Scanner  3000  7G(Affymetrix)によってスキャンした。得られたデジタル画像ファイル(DATファイル)をAffymetrix（登録商標）GeneChip（登録商標）Command  Console（登録商標）ソフトウェアによってＣＥＬファイルに変換した(標準手順2)。【０２９５】
結局、別々に実施した１０の実験から330の(99は対照、231は処置群)  GeneChipデータファイルおよび血液学的パラメータを得た(表１１)。実験３における１つのPBS対照および１つのADX_ID処置LN試料は、大量の脂肪組織由来の遺伝子発現のために取り除かなければならなかったことに留意されたい(see標準手順3)。結果的に、実験3のデータセットのさらなる解析のために、このADX_ID処置LN試料のデータは除外し、このPBS対照試料は合成した仮想の対照データで置き換えた(標準手順3)。さらに、K3SPG_IP処置#2マウス由来のLV試料およびSP試料は、K3-SPGのi.p.注射が適切になされなかったために解析から除外した(標準手順3)。非標的組織のマイクロコンタミネーションを含む実験全体の条件依存的要因を低減するために、対照のバッファー処置マウスにおいて大きな変動係数を示した全ての遺伝子プローブもまた除外した(標準手順3)。【０２９６】
（遺伝子発現の存在または非存在の決定(カスタマイズPAコール)）
MAS5.0における存在または非存在(PA)コールを、以下のようにカスタマイズした。単一のアジュバントまたはその適切なベヒクル対照で処置した３匹のマウスの２つのグループのそれぞれから得た正規化したMAS5.0発現データを平均化し、それぞれのグループについて平均発現比を計算した。このプロセスにおいて、MAS5.0のPAコール(カスタマイズPAコール)も以下のように統合した。３つの対照試料からのPAコールが[「P」、「P」および「A」]である場合、優勢なPAコールとして「Ｐ］を選択した(半分より多くが「Ｐ」)。同じ戦略を３つのアジュバント処置試料に適用した。それぞれの遺伝子の発現比が>1.0であった場合、カスタマイズPAコールはその処置群の優勢なコールによって決定した。発現比が<  1.0であった場合、カスタマイズPAコールはベヒクル対照群の優勢なコールによって決定した。得られたカスタマイズPAコールは、「P」を「１」として、「A」を「０」として処理した。すなわち、発現比が１より大きく、処置試料のPAコールが「Ｐ］、「Ｐ］および「Ａ］であった場合、この遺伝子セットのカスタマイズPAコールは「１」であった。２つの試料を解析する場合(ADX_ID_LN、K3SPG_IP_LVおよびK3SPG_IP_SP)には、[「P」、「A」]は「A」として処理した。【０２９７】
（有意に差次的に発現される遺伝子(有意に発現が変動する遺伝子＝sDEGまたは有意SEG)）
sDEGを、以下の条件を全て満たす統計的に有意な変化(アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション)として定義した：平均倍数変化(FC)が>1.5または<0.667であること、関連付けられたt検定のp値が多重検定補正無しで<0.01であること、およびカスタマイズPAコールが1であること。【０２９８】
（TargetMineによる生物学的テーマ濃縮解析）
規定した遺伝子セットを特定の基準(例えば、FC、PAコール、閾値)にしたがって選択した。その後、その機能濃縮値を、APIインターフェースを使用してTargetMine（Chen,Y.A.,  Tripathi,  L.P.  &  Mizuguchi,  K.  PloS  one  6,  e17844(2011)）(http://targetmine.mizuguchilab.org/)から取得した。以下のリソース（GO、GOSlim、IntegratedPathway、KEGG、ReactomeおよびNCI  pathway）を、TargetMine  Interfaceによる解析全体を通して使用した。Holm-Bonferroni法を多重検定補正に使用した。【０２９９】
（全器官トランスクリプトームを使用した個々のアジュバントの生物学的アノテーション解析（図１０および表１２））
【表１２−１】
2018124293.tif 000015
【表１２−２】
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【表１２−３】
2018124293.tif 000017
【０３００】
各マウスから取得した各器官についての全器官トランスクリプトームデータを、以下のように分析して、各アジュバントを投与した３匹のマウス群から取得した個々の試料について生物学的テーマを取得した。特定の実験条件（例えば、DMXAA,  LV,  i.d.）について、eijはj番目の試料（j=1,  2,  3）におけるi番目の遺伝子の発現値であり、ei(c)は対応する対照試料の平均発現値である。eij/ei(c)>2.0の場合のPj遺伝子のセットを初めに定義した。その後、TargetMine(Chen,Y.A.  et  al.,  PloS  one  6,  e17844(2011))(http://targetmine.mizuguchilab.org/)を使用してPj内で濃縮された生物学的テーマを特定した。Tjは生物学的テーマの得られたリストを示し、関連のp値はFischerの正確性検定により取得した。【０３０１】
次に、グループ内の個々の試料全てによってコールされた生物学的テーマを以下のようにスコア付けした。所与の実験条件について３つのリスト(T1,  T2,  T3)が得られているので、テーマのコンセンサスリストTをT={(t1,  p1),  (t2,  p2),  ..}（tiは、T1、T2およびT3全てに出現する生物学的テーマであり、piは関連のp値の最小値である）として作成した。p値が<0.05であるテーマのみをTに含めた。【０３０２】
Tにおける生物学的テーマをさらにまとめるために、一般にアジュバント活性に関連すると考えられるタームのリストを別個に作成した。AT={at1,at2,  ..}（atiは、事前に選択したアジュバント関連タームである（例えば、「ストレス」や「サイトカイン」））を定義した。最後に、アジュバント関連タームatiについての濃縮スコアＳを、S(ati)=Σ-log(pj)（Tにおけるtjの名称は、部分文字列としてタームatiを含み、pjは関連のp値である）と定義した。【０３０３】
このスコアリングスキームによって、各器官における各アジュバントに応答する遺伝子における事前に選択したアジュバント関連タームの相対的濃縮をまとめた。【０３０４】
（階層的クラスタリング）
アジュバントおよびそれぞれの器官についての全てのsDEGの集合を、「アジュバント遺伝子空間」と定義した。アジュバントと、アジュバント遺伝子空間における遺伝子との階層的クラスタリングは、Rパッケージのhclust関数によって実施した（１−ピアソン相関係数を距離の尺度として用い、Ward  D2アルゴリズムを用いた）。得られた遺伝子クラスター（「遺伝子モジュール」と定義）(Mixと表し、ここでiはモジュール番号を表し、xは器官を表す)では、同じモジュール内の遺伝子は、所定のアジュバントを投与すると同様の挙動を示すと想定している。本明細書において使用した21種類のアジュバントについてもまた階層的クラスタリングを行い、Gjy（jはグループ番号を表し、yは器官を表す)としてグループ化した。【０３０５】
（ImmGenデータベースに基づく細胞集団のプロファイリング）
ImmGenデータベース(Heng,T.S.  et  al.,  Nature  immunology  9,  1091-1094(2008))(http://www.immgen.org/)は、定常状態における様々な免疫細胞タイプの遺伝子発現プロファイルを提供する。遺伝子がどの細胞タイプに由来するのかその起源を推測するためにこれらの発現プロファイルを使用した。最初に、ImmGen発現プロファイルから、１０種類全ての免疫細胞タイプ(j)におけるそれぞれの遺伝子(i)を重み付けした。
【数１】
2018124293.tif 000018
ここで、所与の遺伝子についての細胞タイプ(例えば、好中球)の重みは、その特定の細胞タイプにおけるその遺伝子の発現レベルのみに依存し、他の細胞タイプ(例えば、マクロファージ、B細胞)における発現レベルには依存しないと仮定した。その後、それぞれのアジュバントの発現プロファイルについて、倍数変化、p値カットオフおよびPAコール基準に基づいて遺伝子を選択した。細胞タイプ(j)についてのそれぞれの試料(k)における細胞タイプの寄与を以下のように計算した:
【数２】
2018124293.tif 000019
ここで、(s)は遺伝子の差示的発現を表し、Gは所与のカットオフを満たす遺伝子の総数を表す。【０３０６】
（Zスコアに基づく差示的遺伝子発現解析）
それぞれの試料のFC値を、それぞれの器官についてのデータセット全体を使用することによって遺伝子ベースでzスコアに変換した。目的の３回反復試料のZスコアをそれぞれのアジュバントについて合計した。例えば、cdiGMP投与後のＬＶ試料における３つの試料のzスコアを遺伝子ごとに合計して、その後、合計スコアが>3である遺伝子をcdiGMP投与後にＬＶにおいて比較的に優先的に発現する遺伝子として選択した。以下の基準を選択のために適用した。ＬＶにおいて、G1LV関連遺伝子は、cdiGMP(z>3)  &  cGAMP(z>3)  &  DMXAA(z>3)  &  PolyIC(z>3)  &  R848(z>3)で選択した。G2LV:ALM_IP(z>1)  &  bCD(z>1)  &  ENDCN(z>1)&  FCA(z>1)。G3LV:ADX(z>1)  &  Pam3CSK4(z>1)  &  FK565(z>1)。G4LV:MALP2s(z>3)。SPにおいて、G1SP:  cdiGMP(z>3)  &  cGAMP(z>3)  &DMXAA(z>3)  &  PolyIC(z>3)  &  R848(z>3)。G2SP:  ENDCN_x2+  ENDCN_x3(z>2)  &  ALM_IP(z>3)  &  bCD(z>3)。G3SP:FCA(z>3)  &  FK565(z>3)&  Pam3CSK4(z>3)。G4SP:ADX_ID_x2  +  ADX_ID_x3(z>2)  &  ADX_IP(z>3)  &  MALP2s(z>3)。LNにおいて、G1LN(5adj):cdiGMP(z>3)  &  cGAMP(z>3)  &  DMXAA(z>3)  &  PolyIC(z>3)&  R848(z>3)。G1LN(8adj):  cdiGMP(z>0)  &  cGAMP(z>0)  &DMXAA(z>0)  &PolyIC(z>0)  &  R848(z>0)  &  MALP2s(z>575  0)&  MPLA_x1  +  MPLA_x3(z>0)  &  Pam3CSK4_x2  +  Pam3CSK4_x3(z>0)。G2LN:bCD(z>3)  &  FCA(z>3)。G3LN:  FK565(z>3)。G5LN:K3(z>1.5)  &  K3SPG_x1  +  K3SPG_x2(z>1)  &  D35_x1  +  D35_x3(z>1)。G6LN:AddaVax(z>3)。【０３０７】
血液学的データおよび遺伝子発現相関の解析
ピアソン相関解析を、それぞれの器官における血液学的データおよび遺伝子発現変化に適用した。解析に使用したデータは、以下の基準を使用して選択した。遺伝子はcPA=1でなければならず、血液学的データはプールした対照の平均から1標準偏差(1  SD)より大きくなければならない。得られた血液学的パラメータのペアおよび遺伝子をWelchのt検定によってさらに選択した。p値が<0.05であり、かつ相関係数の絶対値が<0.8であり、かつ勾配（傾き）の絶対値が<  1.2であるペアを選択した。実験５および実験１０から得られた血液学的データおよび遺伝子データは、別々の実験から取得したので、これらの関連付けのないデータはこの分析に使用しなかった。重要なことに、これらの関連付けのない試料のデータをテスト試料としてプロットしたところ、これらのデータはまた相関直線に良好にフィッティングされた。【０３０８】
表１３  本実施例で使用したアジュバントまたはコントロール
【表１３】
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次に、本実施例で使用したアジュバントと用量を示す。【０３０９】
【表１４−１】
2018124293.tif 000021
【０３１０】
【表１４−２】
2018124293.tif 000022
【０３１１】
表１５  アジュバント投与後に統計的に有意に変化した遺伝子プローブの数。有意に変化した遺伝子は、「有意に差次的に発現される遺伝子」(sDEG)と記載され、以下の基準によって定義される:倍数変化>1.5(上方)または<0.667(下方)、かつp値が<0.01、かつカスタマイズPAコール=1。肝臓はLV、脾臓はSP、リンパ節はLNと表す。空欄は試料が試験されなかったことを表す。
【表１５】
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【０３１２】
表１６  本実施例で言及された遺伝子の識別情報
【表１６−１】
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【０３１３】
【表１６−２】
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【０３１４】
（結果）
アジュバント遺伝子空間−ｓＤＥＧの集合によってアジュバントに対する器官の応答を特徴付ける
合計２１種類のアジュバント（表１）を、マウスの尾基底（皮内、i.d.）、腹腔内（i.p.）または経鼻的（i.n.）に投与した。アジュバント投与の６時間後に、ＬＶ、ＳＰ（全身性の器官として）およびＬＮ（局所性のリンパ組織として）の器官全体のトランスクリプトームを取得し、それぞれの器官とアジュバントとのペアについての顕著に差示的に発現された遺伝子（ｓＤＥＧ）のセットを画定した（表１５）。次に、アジュバント誘導性遺伝子応答を、器官ごとに全てのｓＤＥＧを合わせることによって統合した。LV、SPおよびLNからのsDEGの集合は、それぞれ合計で8049、8449および9451の遺伝子プローブであった(図１)。アジュバント遺伝子空間には、インビボで試験した21種類の異なるアジュバントのうち少なくとも１種類を投与したことによって有意に発現が変化した遺伝子が含まれていた。全体としては、3874遺伝子(ＬＶ誘導遺伝子のうちの48%)、2331遺伝子(SP誘導遺伝子のうちの28%)および2991遺伝子(LN誘導遺伝子のうちの31%)がそれぞれの器官に固有であった。TargetMine(Chen,Y.A.  et  al.,  PloS  one  6,  e17844(2011))による経路解析によって、これらの固有の遺伝子が、LV、SPおよびLNについて、それぞれ、脂質代謝、転写および免疫系に関連していることが示された(図１)。これら３つの器官は2299遺伝子を共有しており、これらの遺伝子はインターフェロン、サイトカイン、NF−κBおよびTNFシグナル伝達に関する経路に濃縮されていた(図１)。【０３１５】
ボルカノプロットデータ（図Ｓ１）によって、アジュバントの半数（AddaVax、ADX、ALM、D35、ISA51VG、K3、K3SPG、MBT、MPLAおよびsHZ）は、局所的に投与した場合に穏和な応答（<100のsDEG）を誘導したが、これは、用量レベルを実際のワクチン接種の状況を模倣して選択したという事実と一貫している。bCD、ENDCNおよびPam3CSK4は中程度の応答（100〜200のsDEG）を誘導した。対照的に、cdiGMP、cGAMP、DMXAA、FCA、FK565、MALP2s、PolyICおよびR848は、少なくとも１つの器官において強い遺伝子応答(>500のsDEG)を誘導した。これらのアジュバントは直接流入ＬＮにおいてより大きな遺伝子応答を誘導し、全身性の器官（ＬＶおよびＳＰ）における応答は比較的に弱い傾向がみられた（表１５および図Ｓ１）。興味深いことに、ＦＫ５６５（合成ＮＯＤ１リガンド）は、i.d.投与後にＬＮよりもＬＶおよびＳＰにおいてより大きな応答を誘導した（表１５および図Ｓ１）。ＡＤＸおよびＡＬＭは、ＬＶおよびＳＰにおいて明白な遺伝子発現変化をもたらしたが、K3、K3SPGおよびbCDは比較的弱い応答を誘導した（表１５および図Ｓ１）。MPLA、Pam3CSK4およびその他の比較的穏和なアジュバント個々のマウスおよび器官の間で遺伝子応答がばらつく傾向があった（図８および図９）。【０３１６】
アジュバントの半数は、sDEGの数が限定的であったので、通常の遺伝子アノテーション解析で特徴付けることは困難であった。そのため、別の遺伝子選択基準（倍数変化>2）も試験して、それぞれのアジュバントについて意味のある生物学的アノテーションが抽出できるかどうかを調べた。実際、この分析によって、実践的なアジュバント用量（比較的少量）からでも十分な妥当なインビボの生物学的アノテーションが得られた（図１０）。大部分のアジュバントが、炎症、サイトカイン／ケモカイン応答、化学走性／移動およびストレス／防御／免疫応答を誘導し、i.d.投与後にＬＶおよびＳＰよりＬＮにおいて比較的に強力であった（図１０）。組織損傷に関するアノテーション（創傷、細胞死、アポトーシス、ＮＦκＢシグナル伝達経路）に関して、ADX、D35、K3、K3SPG、MBTおよびsHZはＬＮにおいて細胞死および創傷を誘導しなかったが、この知見は、ADXおよびsHZの良好な局所的耐容性プロファイルと一貫している。ＬＮにおいて大部分のアジュバント（AddaVax、ADX、ISA51VG、MBTおよびsHZ以外）に対してインターフェロンおよびインターロイキン応答もまた検出された（図１０）。ＬＮにおける比較的強力な炎症およびストレス応答にかかわらず（図１０）、ALM、K3SPGおよびMPLAは、ＬＶおよびＳＰにおいて限定的な応答しか示さなかった。これは、これらのアジュバント効果が局所に留まることを示唆している（図１０）。対照的に、ISA51VGおよびsHZを例外として、他のアジュバントは、i.d.局所的投与後であっても全身性の器官において検出可能なレベルの応答を誘導するようである（図１０）。興味深いことに、ＭＢＴ（ＮＯＤ２リガンド）i.d.投与後にＳＰおよびＬＮよりもＬＶにおいてより多くの遺伝子応答を誘導するようであり、FK565でも同様の結果であった（図１０）。ADX、ALMおよびK3SPGのi.p.投与によって、i.d.投与よりもＬＶおよびＳＰにおける炎症およびストレス関連応答が比較的強く誘導された（図１０）。これらの結果は、ｐ値による選択をしなくても本データセットはアジュバント誘導遺伝子応答についてかなりの情報を提供することを示し、これは、それぞれのアジュバントによって誘導されるインビボの生物学的応答を実質的な信頼性で引き出すのに十分なレベルである。したがって、本全器官トランスクリプトームのアプローチが支持される。【０３１７】
アジュバント遺伝子空間により、３つの器官におけるアジュバント誘導性宿主応答が明らかになるアジュバント遺伝子空間についてのより詳細な情報を得るために、遺伝子とアジュバントとの階層的クラスタリングを実施した(図１１;http://sysimg.ifrec.osaka-u.ac.jp/adjvdb/methodologies/adjv_space.htmlも参照)。この解析において、それぞれの器官についておよそ10,000の遺伝子プローブを合計40のクラスターに分ける(クラスターごとに数百遺伝子)と、TargetMineを使用してそれぞれのクラスターについての生物学的アノテーションを得るのに適切であることを見出した。ここから後では、遺伝子クラスターを後述のアジュバントクラスターと区別するために、それぞれの器官についてのこれら40のクラスターを「モジュール」と呼ぶ(図１１)。これらのモジュールについてGene  Ontology(GO)濃縮解析を行うことで、アジュバントの投与が、それぞれの器官において広範な生物学的プロセス、例えば、免疫関連プロセスおよびより基礎的な生物学的細胞プロセスを誘導することが明らかとなった(図１１)。また、その遺伝子発現プロファイルを、ImmGendatabase（Heng,  T.S.  et  al.,  Nature  immunology  9,  1091-1094(2008)）(https://www.immgen.org/)（方法に記載）から公衆的に利用可能な遺伝子発現プロファイルと比較することによってそれぞれのアジュバントに応答する細胞のタイプを同定した。この解析によって、LVおよびSPの応答は、好中球および間質細胞と顕著に関連付けられることが明らかになった(図１２)。LNにおいては、好中球および間質細胞に加えて、その応答はマクロファージとも関連付けられた(図１２)。興味深いことに、ＳＰにおける３分の１の遺伝子がモジュール14〜19にクラスタリングされ、これらは全てRNAプロセシングに関連しており(図１１b)、B細胞に強固に関連付けられた(図１３b)。他方、LVでは、T細胞との関連はほとんど観察されず、LVにはＴ細胞が比較的少ないという一般知識と一致する知見が得られた(図１３a)。LNでは、非常に多くの種類の免疫細胞のタイプがそれぞれのモジュールに関連付けられた。Pam3CSK4、K3、K3SPGおよびFCAによってアップレギュレーションされた、LNのモジュール１６における遺伝子(M16LN)はファゴソームに関連しており、対応してマクロファージ集団に関連付けられた(図１３c)。同じ「免疫系プロセス」のアノテーションが３回現れ、モジュール(M)15LN、M27LNおよびM40LNは異なる細胞タイプに関連付けられた。M15LN(ＡLMおよびK3によって弱く誘導された)は、Ｔ細胞に関連付けられ、M27LN(これらのアジュバントによって最もよく誘導された)は、強く好中球に関連付けられ、M40LN(cdiGMP、cGAMP、DMXAA、PolyICおよびR848によって強く誘導された)は、樹状細胞、マクロファージ、好中球および間質細胞を含めより広範な免疫細胞に関連付けられた(図１３c)。これらのデータは、アジュバント遺伝子空間の手法によって多層的な情報（それぞれのアジュバントの生物学的性質および異なる細胞タイプのアジュバントへの応答性を含む）を提供することができることを示す。【０３１８】
アジュバントをアジュバント遺伝子空間内の６つのグループに分類する
アジュバントを、その刺激特性(例えば、PAMPsまたはDAMPs)またはその物理化学的特性(例えば、溶質、粒子またはエマルジョン)にしたがってカテゴリー化した。これらの記述子では定性的な差異によって、バイアスなしでアジュバントをカテゴリー化することが困難になる。そのため、階層的クラスタリングを使用してアジュバントをカテゴリー化した。このクラスター解析によって、それぞれの器官についてのアジュバント遺伝子空間内で興味深く洞察にあふれたグループ化が示された。それぞれの器官は特徴的な遺伝子プロファイルを示すが(Fig1)、LV、SPおよびLN間でかなり一貫したアジュバントグループ化が観察された(図2（Ａ〜Ｄ）および図１４)。クラスターツリーにおいて、同じアジュバントの３つの反復試料の大部分は緊密に結びついており(第１および第２の系統樹ノードを形成している)、これは、同じアジュバントが投与されたそれぞれのマウスが同様の遺伝子発現変化を示したことを示す(図１４)。いくつかの興味深い例外は、ＬＮにおけるD35_ID_x2およびK3_ID_x3であった(図１４a)。より高レベルのクラスタリング閾値(カットオフ高さ=1.0)では、バッチ効果（Leek,  J.T.  et  al.,  Nat  Rev  Genet  11,  733-739(2010)）を除外して、４つの主要なグループがＬＶにおいて形成され(図１４a)、SPにおいても同様であった(図１４b)。LNでは、カットオフ高さ1.0で、10のグループが与えられ(図１４c)、LNは、それぞれのアジュバントに対してLVまたはSPよりも強く、多様に反応することを示す(図１４)。ＬＮについてカットオフ高さ1.5では、バッチ効果を除外して合計５グループが得られた(図１４c)。このカットオフの設定では、また、LVおよびSPにおいてより同等なグループ化がなされた(図１４)。【０３１９】
多くのクラスターは、器官の間で一貫していた。５種類のアジュバント(cdiGMP、cGAMP、DMXAA、PolyICおよびR848)は、LV、SPおよびLNにおいて単一のクラスターとして固定され、これをグループ(G)1と呼んだ(図2（Ａ〜Ｄ）および図１４)。同様にして、bCD、FK565およびMALP2sが、それぞれ、G2、G3およびG4についての参照として役立つことを見出した。なぜなら、これらは、別々のクラスターに一定して現れたからである(図2（Ａ〜Ｄ）および図１４)。LNでは、２つのさらなるグループG5およびG6が観察された(図2（Ａ〜Ｄ）および図１４c)。【０３２０】
なお、同様の、トランスクリプトーム解析をラットに対して行ったところ、図２Ｋ〜Ｎに示されるような結果が得られた。この結果は、マウスの結果である図２Ａ〜Ｄとほぼ同様のものであり、ラットにおいても同様に、アジュバントのグループ分けにトランスクリプトーム解析が有用であることが示されたといえる。【０３２１】
（特徴的な生物学的応答に関連付けられるそれぞれのアジュバント）
遺伝子レベルでそれぞれのアジュバントグループをさらに特徴付けるために、最初に、他のグループと比較して優先的にそれぞれのアジュバントグループ(G1〜G6)においてアップレギュレーションされる遺伝子を、その発現倍数変化をzスコアに変換することによって同定した(表１７（一部抜粋）および図１５)。
【表１７−１】
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【表１７−２】
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【表１７−３】
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【０３２２】
アジュバント遺伝子空間の40のモジュールにおいて、ＬＶおよびＳＰからのＧ１において高いzスコアをつけられた遺伝子はほとんど、それぞれ、モジュールM20LV(「生物的刺激への応答」とアノテーションされた)およびM23SP(「ウイルスに対する応答」とアノテーションされた)において見出された(図１５および図１６)。同様に、LNでは、G1の５種類の参照アジュバント(cdiGMP、cGAMP、DMXAA、PolyICおよびR848)において優先的にアップレギュレーションされた遺伝子は、M40LNモジュール(「免疫系プロセス」とアノテーションされた)において見出された(図１５および図１６)。他のグループ(G2、G3、G4、G5およびG6)由来の関連遺伝子は、いくつかのモジュールに分布しており、G1関連モジュールとは明らかに異なっていた(図１６)。TargetMine(表１８)およびIngenuity  Pathways  AnalysisTM(IPA)上流サイトカイン(表１９)解析によって、アジュバントグループに関連付けられる生物学的特徴の詳細を得た。
【表１８−１】
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【表１８−２】
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【表１８−３】
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【表１８−４】
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【表１８−５】
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【表１８−６】
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【表１８−７】
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【表１８−８】
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【表１８−９】
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【表１８−１０】
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【表１８−１１】
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【表１８−１２】
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【表１８−１３】
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【表１８−１４】
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【表１８−１５】
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【表１８−１６】
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【表１８−１７】
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【表１８−１８】
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【０３２３】
【表１９−１】
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【表１９−２】
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【表１９−３】
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【表１９−４】
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【表１９−５】
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【表１９−６】
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【０３２４】
予想されたように、G1アジュバントは、インターフェロン応答として特徴付けられた(図3aおよび図3b)。G2〜G6アジュバントは、IL6およびTNFなどの炎症性サイトカインに関連付けられた(図3b)。G2アジュバントは、脂質代謝との関連は弱く(図3a)、IPA解析によってオンコスタチンMおよびIL10との関連が示唆された(図3b)。G3〜G5アジュバントでは、アジュバントおよび器官の数が限られていたので(図3a)、これらのグループについて優先的な関連を引き出すことは困難であった。限られた条件で解析を実施したが、G3アジュバントはT細胞およびNK細胞サイトカイン、例えばIL2、IL4およびIL15に関連付けられ得ることが示唆された(図3b)。G4アジュバントは、他のアジュバントより広いプロファイルを有し、多くのサイトカインが含まれた。しかし、M32SPモジュールが優先的に関連付けられたことから、G4はTNF応答によって特徴づけられ得ることが示唆された(図１６b)。G5アジュバントは、代謝プロセスとともにリン酸含有化合物に関連付けられ、これはヌクレオチド代謝プロセスを示唆し、この知見は、G5がCpG核酸アジュバントグループであることと一貫している(図3a)。G6アジュバント、例えば、MF59と等価な油エマルジョンであるAddaVaxは、ファゴソームと関連付けられ(図3a)、IPA上流サイトカイン解析によってIL1AおよびIL33がそれらについてのサイトカインであると示唆された(図3b)。【０３２５】
（アジュバントグループ解析によってADX、bCDおよびENDCNの作用様式を予測する）
RNA関連アジュバントまたはSTINGリガンドであるG1アジュバント(cdiGMP、cGAMP、DMXAA、PolyICおよびR848)は、I型およびII型インターフェロン応答と強く関連付けられ、G2〜G6アジュバントとは明らかに異なる。G2〜G6アジュバントは、炎症応答に関連付けられるようである。G2には、ALMおよびbCDが含まれ、これらは両方ともDAMPsを介して機能すると予測されている(Marichal,T.  et  al.,  Nat  Med  17,  996-1002(2011)およびOnishi,  M.  et  al.,  Journal  ofimmunology  194,  2673-2682(2015))。興味深いことに、ＬＶにおいて強く応答したD35サンプルおよびK3サンプル、すなわち、D35_ID_x2およびK3_ID_x3（これらはクラスタリングの例外として上述、図１４aで赤字で説明)は、両方ともG2LVにクラスタリングされた。したがって、ある状況下では、D35およびK3は、DNAが傷害された細胞から放出されて宿主の免疫応答を誘導することを模倣することができる(Marichal,T.  et  al.,  Nat  Med  17,  996-1002(2011)およびOnishi,  M.  et  al.,  Journal  ofimmunology  194,  2673-2682(2015))。G3およびG4は、主に、細菌の細胞壁に由来するPAMPsから誘導されるアジュバントからなる。G5は、CpGアジュバントからなる。D35、K3およびK3SPGなどのＧ５アジュバントは、インビトロでは良好なインターフェロン誘導因子として認識されているが、本解析において、CpGアジュバントは、インビボでは典型的なG1型のTLRおよびRLRリガンドとは生物学的に異なることが示唆された。G6はAddaVax、すなわちMF59等価物からなる。MF59の作用メカニズムは、よく調べられており、筋肉から放出されたATP(別のDAMPs)がアジュバント効果のメディエーターとして働くことが示唆されている(Vono,M.et  al.,  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  Statesof  America  110,  21095-21100(2013))。G2およびG6は、LN由来の試料において関連するが別個のクラスターを形成したので(図１４c)、アジュバントクラスタリングの結果は、この解釈を支持する可能性がある。【０３２６】
まとめると、得られたデータは、試験したアジュバントが、その作用様式の共通の類似性によってグループ化されたことを強く示唆する。したがって、新しいアジュバントの作用様式を、そのグループ化を知ることによって予測することができる。この仮説を検証するために、２種類のアジュバントを選択し試験した。ENDCNは、新規の脂質を基礎とする経鼻アジュバントであり、現在インフルエンザワクチンの一部として臨床試験の第Ｉ相/第II相段階にある(Falkeborn,T.  et  al.,  PloS  one  8,  e70527(2013)およびMaltais,  A.K.  et  al.,  Vaccine  32,3307-3315(2014))。ENDCNは、G2（ＬＶおよびＳＰの両方において、bCDのグループ）にカテゴリー化された。bCDは、そのアジュバント機能が、DAMPsを介した宿主由来のdsDNAと関連付けられる可能性が高いことが以前に示されている(Onishi,M.  et  al.,  Journal  of  immunology  194,  2673-2682(2015))。ENDCNのＧ２へのカテゴリー化は、ENDCNがアジュバントとして機能するために宿主由来の因子を利用することを強く示唆する。この仮説はさらに検討され、ENDCNのインビボにおける詳細な免疫学的解析によって、宿主細胞が放出したRNAおよびTBK1がそのアジュバント機能に関与することが明らかにされた(Hayashi,M.  et  al.,  Scientific  Reports,  6,  Article  number:  29165(2016))。このことは、ENDCNがG2アジュバントであることをさらにサポートする。別の例はADX(Honda-Okubo,Y.  et  al.,  Vaccine  30,  5373-5381(2012)およびSaade,  F.  et  al.,  Vaccine  31,1999-2007(2013))であり、これは作用様式が未知であるイヌリンを基礎とする粒子状のアジュバントである。G2ではなくG3LV/G4SPにクラスタリングされたことで、ADXはDAMPsメディエーターではなく、特定されていないＰＡＭＰs受容体を介して作用することが示唆される(図2および図１４)。より詳細なADXの解析が現在進められている(Hayashi  et  al.  Scientific  Reports  6,  Article  number:  29165(2016))。【０３２７】
（アジュバント遺伝子空間解析は、同じ受容体を標的とするアジュバント間の差異を明らかにする）
D35、K3およびK3SPGは全てTLR9に作用し、cdiGMP、cGAMPおよびDMXAAはSTINGを標的とする(Gao,P.  et  al.,  Cell  154,  748-762(2013))。対応して、これらのアジュバントは、本発明の方法によって同じアジュバントグループにクラスタリングされ、全てのTLR9リガンドはG5に、全てのSTINGリガンドはG1にクラスタリングされた(図2および図１４)。D35およびK3は、重複する部分があるが、実質的に異なる生物学的応答を誘導することが公知である(Steinhagen,F.  et  al.,  Journal  of  Leukocyte  Biology  92,  775-785(2012))。STINGリガンドでは、直接的な比較は現在のところ報告されていないが、cdiGMPはTh1応答を誘導するようであり(Madhun,A.S.  et  al.,  Vaccine  29,  4973-4982(2011))、他方、DMXAAはTh2応答を誘導する(Tang,  C.K.  etal.,  PloS  one  8,  e60038(2013))。３種類のSTINGリガンド(cdiGMP、cGAMPおよびDMXAA)は類似の化学構造を共有するが、それぞれ、細菌、宿主細胞および合成化学物質から誘導されている(Gao,P.  et  al.,  Cell  154,  748-762(2013))。ＬＮにおけるCpG(図１７)およびSTINGリガンド(図１８)からのｓＤＥＧの単純なベン図による解析からは、これらのアジュバントがインターフェロン応答を誘導するという周知の事実が確認されただけで、それらの個々の差異を引き出すことは困難であった。しかし、アジュバント遺伝子空間において、ｚスコア(図１５)および40モジュールのマッピング(図１６)解析を使用すると、それらの間のより詳細な差異を同定することができた。本実験条件において、D35は、インビボでK3やK3SPGよりも比較的強力なインターフェロン誘導因子であった(図4a-cおよび表２０)。
【表２０】
2018124293.tif 000053
【０３２８】
K3は、D35またはK3SPGと比較して優先的にRNA生合成を誘導し、これはM26LNに濃縮された(図4c)。同様の解析(図4d-fおよび表２１)によって、cdiGMPは最も強力なインターフェロン誘導因子であることが明らかになり、cGAMPおよびDMXAAよりもM37LNおよびM40LNにおける遺伝子マッピングに優先的に関連付けられた(図4f)。
【表２１】
2018124293.tif 000054
【０３２９】
DMXAAは、cdiGMPやcGAMPよりも優先的にＲＮＡプロセシングおよび遺伝子発現応答を誘導した(図4f)。解析によって、cdiGMPは、インビボで他のstingリガンドよりもインターフェロン応答をよく誘導することが示唆された。これは、cdiGMPが病原菌によって生産されるという事実と関連し得る(Woodward,J.J.  et  al.,  Science  328,  1703-1705(2010)）。【０３３０】
（全身性の遺伝子応答はアジュバント誘導性の血液学的変化に関連付けられる）
多くのアジュバントは、種々の循環血細胞の数に影響を及ぼす。顆粒球増加は、２１種類のアジュバントのうちのいずれを投与した後でも最も一般的な事象であり(図5a)、この知見は、好中球がアジュバント投与に最も応答する細胞であるという事実と一貫している(図１２)。単球増加は次に一般的な事象であり、bCD、cdiGMP、cGAMP、MPLAおよびPam3CSK4によって明確に誘導された(図5a)。リンパ球減少はあまり一般的ではなかったが、FK565、MALP2s、PolyICおよびR848によって強く誘導され(図5a)、これらのアジュバントは、白血球減少もまた引き起こした(図5a)。興味深いことに、FK565は顆粒球増加(以前の研究で観察されたように(Tanaka,M.  et  al.,  Bioscience,  Biotechnology,  and  Biochemistry57,  1602-1603(1993))およびリンパ球減少を同時に引き起こした(図5a)。次に、線形モデルを使用して器官におけるこれらの血液学的パラメータと遺伝子発現変化との間の相関を調べた(スキームは、http://sysimg.ifrec.osaka324u.ac.jp/adjvdb/methodologies/hema.htmlを参照)。この手法によって、それぞれの器官におけるそれぞれの血液細胞タイプについて種々の遺伝子を取り出した(図5bおよび表２２)。相関する遺伝子の数に基づいて、LVは最も大きな血液学的変化を示した(図5b)。代表的な例として、ＬＶにおけるCxcl9のアップレギュレーション（インターフェロンによって強く誘導され、インフルエンザワクチンの安全性マーカーとして報告されている(Mizukami,T.  et  al.,  Vaccine  26,  2270-2283(2008)およびMizukami,  T.  et  al.,  PloS  one  9,e101835(2014))）は白血球減少と明らかに相関した(図１９a）。ダウンレギュレーションされた例として、ＳＰにおけるIl7およびS1pr5が挙げられ、これらはリンパ球減少にも相関した(図5bおよび図１９b,c)。対照的に、単球増加および顆粒球増加に関する遺伝子については、何ら相関が見出されず(図5bおよび表２２)、複数の遺伝子がこれらのプロセスに係ることが示唆された。これらの結果から、血液中の顆粒球、単球およびリンパ球の数は異なるメカニズムによって制御されていることが示唆され、全身性の器官における遺伝子変化によって、アジュバント誘導性の白血球減少およびリンパ球減少が、おそらくインターフェロン、Il7およびS1P関連のメカニズムによって引き起こされたと考えられる。【０３３１】
【表２２】
2018124293.tif 000055
【０３３２】
（アジュバント遺伝子空間におけるAS04の特徴付け）
最後に、別の試験アジュバントAS04(Didierlaurent,  A.M.  et  al.,  Journal  of  immunology  183,6186-6197(2009))を調べることによってアジュバント遺伝子空間の柔軟性を試験した。AS04はアルミニウムヒドロキシドおよび3-O-デスアシル-4’-モノホスホリルリピドAからなり、これはCervarix（ヒトパピローマウイルス16/18に対するワクチン）において使用されている。AS04、バッファー対照およびalumのみの対照をマウスにi.d.投与し、その血液学的パラメータおよび器官遺伝子発現を調べた(Experiment  11参照)。【０３３３】
実験11（Experiment  11）は、以下の通りである。
【表２３】
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【０３３４】
（血液学（図５ａに関連する））
いくつかの血液学的パラメータの変化について、アジュバント投与の影響を調べた。以下のパラメータを調べた：白血球（ＷＢＣ）、リンパ球（ＬＹＭ）、単球（ＭＯＮ）、顆粒球（ＧＲＡ）、リンパ球の相対含有率％（ＬＹ％）、単球の相対含有率％（ＭＯ％）、顆粒球の相対含有率％（ＧＲ％）、赤血球（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（Ｈｂ、ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、赤血球分布幅（ＲＤＷ）、血小板（ＰＬＴ）、血小板濃度（ＰＣＴ）、平均血小板容積（ＭＰＶ）、血小板分布幅（ＰＤＷ）。図５に示されるような項目のデータを得た。【０３３５】
Volcanoプロット（図７に関連する）：フォーマットについて説明すると、ｘ軸およびｙ軸は、それぞれLog（変化倍数）およびLog（ｐ値）に対応する。【０３３６】
３匹のマウス間のベン図（図８に関連する）：：フォーマットについて説明すると、３匹のそれぞれのマウスにおいてアップレギュレートされた遺伝子プローブを決定し、３匹それぞれの個体をx1、x2、x3と示す。sDEGを使用した解析（FC>1.5またはFC<0.67、p<0.01、cPA=1）
a.sDEGの数は以下のとおりである。
【表２４】
2018124293.tif 000057
b.sDEGの遺伝子群
遺伝子の差示的発現をlog2（倍数変化）で示す。０でない値を付けた遺伝子の数が上の表中の数に対応する。【０３３７】
c.sDEGによって得られた生物学的プロセスのリスト
機能的解析を、-log(p値)でスコアリングして行った。そのため、高スコアの機能は、低スコアの機能より有意であると表示される。【０３３８】
血液学的評価によって、AS04は血液中の単球および顆粒球のレベルを増大させることが示されたが、これはMPLAの血液学的プロファイルと同様である(図5a)。クラスター解析の結果、AS04からのそれぞれの試料は、bCD、ALM_IPおよびENDCNを含むグループであるG2LVにおけるＦＣＡ試料と密接に結びつけられた(図２０a)。SPでは、AS04は、G2（ここでも、bCD、ALM_IPおよびENDCNを含んだ）の近傍に新しいクラスターを形成した(図２０b)。AS04は、G1LN（CpGオリゴデオキシヌクレオチドからは外れてPAMPsリガンドの大部分を表すグループ）にカテゴリー化された。これらのデータから、AS04誘導性の局所応答はG1LNにカテゴリーされる多くのＰＡＭＰsリガンドと類似であることが示唆されるが、bCD、ALM_IPおよびENDCNを含むG2アジュバントと類似の比較的穏やかな全身性の応答が観察された(図２０)。このことは、AS04がアルミニウムヒドロキシドと3-O-デスアシル-4’-モノホスホリルリピドAとの組み合わせアジュバントであるという事実と一貫している。AS04を含めたアジュバントのグループ化は図２１にまとめられている。まとめると、これらの結果から、アジュバント遺伝子空間は、多くの異なるアジュバントについて、柔軟であるが、信頼でき洞察に富むプロファイルを提供することが示唆される。【０３３９】
（考察）
以上の結果をいかに考察する。本実施例ではマウスに投与した21種類の異なるアジュバントの網羅的な器官トランスクリプトーム解析について調べた。得られた結果から、アジュバント誘導性の遺伝子応答は、アジュバントのタイプ、投与経路および試験した器官を含め多くの要因の影響を受けることが示された。驚くべきことに、LVおよびSPのような、注射部位から離れた全身性の器官と考えられる器官もまた、所与のアジュバントの一般作用様式を特徴付けるのに有用な器官であった。LVおよびSPから収集したデータは、局所LNから得られた情報を増補するまたは補うものであった。現在、多くの臨床的なワクチンが、筋肉内または皮下投与されている。さらに、経鼻経路による粘膜投与も実践されている。非経口投与経路では、直接的に流入するリンパ様組織をサンプリングすることは困難な場合があり、このことはENDCN(Falkeborn,T.  et  al.,  PloS  one  8,  e70527(2013)およびMaltais,  A.K.  et  al.,  Vaccine  32,3307-3315(2014))で示された。それにもかかわらず、LVおよびSPのトランスクリプトームによって、ENDCNは潜在的なDAMPs放出アジュバントであることが明らかされた。ENDCNは、その作用様式に関してbCD25(Onishi,M.  et  al.,  Journal  of  immunology  194,  2673-2682(2015))といくらか類似している。さらに、離れた器官におけるトランスクリプトーム試験によって、インビボの「アジュバント効果」の生体内分布が提供された(図２１)。器官トランスクリプトームからは、アジュバント自体が器官に到達したのかどうかは分からないが、器官がアジュバントの投与に反応したことは確認される。結論としては、結果から、局所投与した多くのアジュバントが、注射部位から離れた全身性の器官における遺伝子発現変化を引き起こす可能性があることが示された。しかし、アジュバント投与後の離れた器官の遺伝子発現は必ずしも器官毒性を示すのではなく、マウスに使用した用量は、概して体重あたりの用量に基づくとヒトへの適用には過剰な用量であった。そのため、得られた結果をヒトに直接外挿するにはまた制限があり、これらの点については今後さらなる検討を要する。【０３４０】
本手法の別の重要な知見は、バッチ効果に関する。アレイまたは次世代シークエンサーを使用した多くの網羅的遺伝子解析法は、バッチ効果によって妨害され得ることが報告されている(Leek,  J.T.  et  al.,  Nat  Rev  Genet  11,  733-739(2010))。得られたデータにもバッチ効果が観察されたが、本手法の場合には、これは有益かつ有用な内部基準となった。バッチ効果によって、器官が、アジュバント投与に実質的に応答したか、それとも応答しなかったかが区別された。必要十分量のマイクロアレイデータが取得された場合には、バッチ効果によって、遺伝子発現のゆらぎなどの「背景ノイズ」を単純に低減することができる。しかし、本研究の３３０のマイクロアレイデータでも、依然としてバッチ効果シグネチャなしで背景ノイズレベルを決定するには十分でなかった。この意味で、１つの実験で３種類の異なるアジュバントを試験する本手法は、バッチ効果（遺伝子発現がアジュバント特異的であるかどうかを決定するための高感度な内部基準として機能した）をモニタリングするための単純で有効な方法である。試験したすべてのアジュバントの中で、ALMは、局所投与される場合には、最も弱く遺伝子応答を誘導するアジュバントの１つである。同様に、MPLA、D35、K3、K3SPGおよびAddaVaxは局所的なＬＮには作用したが、離れた全身性の器官には作用せず、その局所作用傾向が示唆される(図２１)。他のアジュバントは、ＬＶおよびＳＰにおいて検出可能なレベルの遺伝子応答を誘導した(図２１)が、上述のように、これは、器官毒性を直接意味するのではなく、その解釈にはさらなる研究が必要である。【０３４１】
アジュバント遺伝子空間を構築するために、厳しいデータ品質チェック(QC)プロトコルに従った(標準手順3)。この厳しいプロトコルによって、いくらかのデータは破棄され、QCを満たさない試料を置き換えるデータとして仮想対照を作製することが要求される。しかし、同時に、この厳しいデータ処理の方針によって、明確なバッチ効果を観察することができ、より重要なことに「自己組織化」アジュバントクラスター（タグ付けも主観的な指示も行っていない宿主応答に基づくクラスターおよびバッチ効果からなる）を観察することができた。さらに、データ解析に試験アジュバントとしてAS04を追加しても、アジュバントクラスター全体の構造は変化しなかったので、他のアジュバントとの相対比較が可能であり、本発明者らのデータベースが、新たな追加アジュバントを特徴付ける際に動的柔軟性を有することが確認された。【０３４２】
まとめると、結果的に、本手法は、前臨床アジュバントおよび臨床アジュバントを、網羅的かつ客観的な様式で評価するための有用なプラットフォームを提供することができる。将来、本手法の柔軟性によって、新たなアジュバント、さらなる投与のバリエーションについてデータセットを蓄積するだけで、または抗原のデータを含めることによってさらなる改良が可能になる。本研究において、21種類のアジュバントを、抗原を用いずに６時間後の時点だけで調べた。他の時点および抗原を使用する今後の研究、ならびに一般に利用可能なワクチンアジュバントに関連した免疫学的シグネチャ(Knudsen,N.P.  et  al.,  Scientific  reports  6,  19570(2016))をインシリコで組み込むことが、アジュバント化ワクチンのメカニズムをより詳細に理解するために必要である。並行して、本発明者らは、アジュバントの毒性学的特性を評価するためにラットにおいて類似のマイクロアレイデータを取得した（実施例4参照）。ラットのトランスクリプトームデータは、公開のTG-GATE(Igarashi,Y.  et  al.,  Nucleic  acids  research  43,  D921-927(2015))(これは同様にラットに関するものである)の遺伝毒性学的データセットに直接組み込むことができる。さらに、本発明者らは、ヒト臨床試料からのマイクロRNA発現プロファイルを取集した（実施例４参照）。上述の全てのデータセットを統合したところ、これらのデータベースによって、異なる実験条件下における異なる種のアジュバント誘導性遺伝子発現シグネチャについてのより統合的で網羅的な解析を実施することができることが証明された。【０３４３】
（実施例２）
本実施例では、アジュバント機能が不明の物質を本発明の方法を用いて、分類する方法を実施する。【０３４４】
物質としては、適宜の候補物質を提供する。【０３４５】
アジュバントの投与、遺伝子マーカーの発現分析、クラスタリング等のデータ解析等は、実施例１に準じて実施する。【０３４６】
候補物質と基準アジュバント（Ｇ１）ｄｃｉＧＭＰ、ｃＧＡＭＰ、ＤＭＸＡＡ、ＰｏｌｙＩＣ及びＲ８４８；（Ｇ２）ｂＣＤ；（Ｇ３）ＦＫ５６５；（Ｇ４）ＭＡＬＰ２ｓ；（Ｇ５）Ｄ３５，Ｋ３およびＫ３ＳＰＧ；および（Ｇ６）ＡｄｄａＶａｘ）とをクラスタリングする。【０３４７】
（結果）
マウス脾臓、肝臓等へ投与した際の、候補物質のトランスクリプトームとＧ１〜Ｇ６の基準アジュバントのトランスクリプトームとを比較し、同じクラスターに分類されたものは、それぞれＧ１〜Ｇ６に分類される。【０３４８】
（実施例３：アジュバントのアジュバント）
（材料および方法）
（マウス）
６週齢の雌性C57BL/6JマウスをCLEA  Japanから購入した。Tlr7-/-  または  Il-1r-/-マウスは、それぞれOriental  BioServiceおよびJackson  Laboratoryから購入した。Card9-/-(Hara  et  al.,  2007,  Nature  immunology  8,  619-629.)、Fcrg-/-(Arase  et  al.,  1997,  J  Exp  Med  186,  1957-1963.)またはDap12-/-(Takai  et  al.,  1994,  Cell  76,  519-529.)。マウスは、それぞれDr.Hara、Dr.SaitoまたはDr.Takaiから譲り受けた。Tnfa-/-マウスは以前に記載されている(Marichal  et  al.,  2011,  Nature  medicine  17,  996-1002.)。全ての動物実験は、Institutional  Animal  Care  and  Use  Committeeに承認され、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所の動物施設の施設ガイドラインに則って実施した。【０３４９】
（抗原、抗体、アジュバントおよびペプチド）
オボアルブミンは生化学工業から購入した。A/New  Caledonia/20/99株由来のSVおよび不活化WVは、微生物化学研究所（Institute  of  Microbial  Chemistry）(Osaka,  Japan)から寄贈された。CpG-ODN(5’-ATCGACTCTCGAGCGTTCTC-3’＝配列番号１)はGene  Design(Osaka,  Japan)による合成品であった。CpG-SPGは以前に報告された通りに調製した(Kobiyama  et  al.,  2014,  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America  111,  3086.)。アラムはSigmaから購入し、Advax（商標）、B型肝炎表面抗原(HB)はVaxine  Pty  Ltdから提供された。LPSはSigmaから購入した。核タンパク質のMHCクラスI(ASNENMETM＝配列番号２)およびMHCクラスII(ARSALILRGSVAHKSCLPACVYGP＝配列番号３)のエピトープペプチドはOperon  Biotechnologiesによる合成品であった。Cytokine  ELISA  kits  for  IFN-γ,  IL-13,  IL-17,  TNF-α  and  IL-1βは、R&D  Systemsから購入した。【０３５０】
（免疫化）
C57BL/6Jマウスを、２週間の間隔をおいて(0日目および14日目)、筋内(i.m.)またはi.d.のいずれかで２回免疫化した。抗原特異的ELISAのために、血液試料を14日目および28日目に採取した。ワクチン化および採血の間、マウスをケタミンで麻酔した。アラムアジュバント化抗原は、免疫化前に１時間より長く回転させた。Advax（商標）、アラムまたはCpG-SPGを、それぞれ、マウスごとに1mg、マウスごとに0.67mgまたはマウスごとに10μg使用して免疫化を行った。【０３５１】
（抗体力価）
ELISAのために、炭酸緩衝液(pH9.6)中、SVワクチン化群およびWVワクチン化群については1μg/mlのSVを用いて、OVAワクチン化群については10μg/mlのOVAを用いて、およびHBワクチン化群については1μg/mlのHBを用いて、96ウェルプレートをコーティングした。1%ウシ血清アルブミンを含むPBSでウェルをブロッキングして、免疫化マウス由来の希釈血清を、抗原をコーティングしたプレート上でインキュベートした。洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼとコンジュゲート化したヤギ抗マウス全IgG、IgG1またはIgG2c(Southern  Biotech)を添加し、室温で１時間インキュベートした。さらに洗浄した後、プレートを３０分間TMB基質とともにインキュベートし、反応を1N  H2SO4で停止させ、その後、吸収を測定した。抗体力価を計算した。０．２のODを陽性試料のカットオフとして設定した。血清中の全IgEの濃度を全IgE  ELISAキット(Bethyl)で測定した。【０３５２】
（抗原特異的サイトカイン応答の測定）
二回目の免疫化の２週間後、マウスから脾臓を採取し、1×106個の脾細胞を96ウェルプレートに播種し、核タンパク質のMHCクラスIまたはIIエピトープペプチドで刺激した。刺激の二日後に、上清中のIFN-γ、IL-13およびIL-17をELISAで測定した。【０３５３】
（サイトカイン産生プロファイル）
アジュバントのi.p.注射後のいくつかの時点において、マウスを屠殺し、腹腔洗浄液を収集した。洗浄液中のサイトカインをBio-plex(BioRad)で測定した。【０３５４】
（DCの活性化）
インビトロの実験に関して、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(NaclaiTesque)および100ng/mlのヒトfms様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt3L)(PeproTech)を補充したRPMI  1640中で骨髄細胞を7日間培養することによって骨髄由来DCを作製し、1mg/ml  アラム、1mg/ml  Advax（商標）または50ng/ml  LPS(Sigma)で15時間刺激し、その後、形質細胞様DC(pDC)上のCD40発現をFACSによって評価した。pDCはCD11c+/SiglecH+細胞と定義した。【０３５５】
インビボ実験は以前に記載された通りに実施した(Kobiyama  et  al.,  2014,  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America  111,  3086.)。簡潔に述べると、C57BL/6Jマウスの尾基底に0.67mgアラム、1mg  Advax（商標）または50ng  LPSを注射した。注射の２４時間後に、流入領域リンパ節を摘出し、DNaseIおよびコラゲナーゼで30分間処理し、その後、抗mCD11c(N418)抗体、抗mCD8α(56-6.7)抗体、抗mPDCA-1(JF05-1C2.4.1)抗体、抗mCD40(3/23)抗体および7AADで染色し、FACSで分析した。pDCはCD11c+/mPDCA-1+細胞と定義し、CD8α+DCはCD11c+/CD8α+細胞と定義し、CD8α-DCはCD11c+/CD8α-/mPDCA-1-細胞と定義した。【０３５６】
（マクロファージおよびGM-DCのインビトロ刺激）
マクロファージの調製のために、マウスに3mlの4%(w/v)チオグリコレート(Sigma)溶液をi.p.注射した。４日後、マクロファージを腹腔から収集し、96ウェルプレートに播種した。マクロファージを50ng/ml  LPSで18時間プライミングし、アジュバントで8時間刺激した。上清中のIL-1βをELISAで測定した。LPSによるプライミングを行わずに、Advax（商標）またはアラムで刺激した後に上清中のTNF-αをELISAで測定した。GM-DCの調製のために、マウス骨髄細胞を、10%  FBS、1%  ペニシリン/ストレプトマイシン溶液および20ng/mlマウスGM-CSF(PeproTech)を補充したRPMI  1640中で7日間培養した。【０３５７】
GM-DCを収集し、96ウェルプレートに播種し、50ng/ml  LPSで18時間プライミングし、アジュバントで8時間刺激した。上清中のIL-1βをELISAで測定した。【０３５８】
（2光子励起顕微鏡分析）
ビオチン化デルタイヌリン粒子(1mg)をBrilliant  Violet  421ストレプトアビジン(BioLegend)と事前に混合し、その後マウスの尾基底にi.d.投与した。鼠径部LN摘出の３０分前に、抗MARCO-フィコエリトリンまたは抗CD169-FITC抗体をマウスにi.d.投与した。鼠径部リンパ節中のAdvax（商標）粒子の分布を2光子励起顕微鏡(FV1000MPE;  Olympus,  Tokyo,  Japan)で調べた。【０３５９】
（クロドロン酸リポソーム注射）
クロドロン酸リポソーム(FormMax)を、免疫化の7日前または2日前にマウスの尾基底に投与した。0日目および14日目に、マウスの尾基底にWV(1.5μg)＋アジュバントを投与してマウスを免疫化した。-2日目におけるクロドロン酸処置によって、0日目においてマクロファージおよびDCは両方とも枯渇した。-7日目における処置によって、マクロファージは枯渇したが、DCは０日目にすでに回復していた。血液試料を14日目および28日目に採取し、血清抗体力価をELISAで測定した。【０３６０】
（マイクロアレイ分析）
アジュバント投与の６時間後に、脾臓、肺、腎臓および肝臓を摘出し(n=3)、全RNAを以前に記載された通りに抽出した(Onishi  et  al.,  2015,  Journal  of  immunology  194,2673-2682.)。全RNAを調製した後、遺伝子発現プロファイルを、3'  IVT  Express  KitおよびGene  Chip  Mouse  Genome  430  2.0  Array(Affymetrix)を使用して取得した。発現の値は、それぞれの遺伝子チップの中央値で基準化した。得られたデジタルイメージファイルは、Affymetrix  Microarray  Suite  version  5.0アルゴリズム(MAS5.0)を使用して事前処理した。差示的発現を、処置試料および対照試料の平均間の比率として計算した。MAS  5.0における存在または非存在(PA)コールを、以下のようにさらにカスタマイズした。比率が>1である場合には、PAコールは処置試料に依存する。比率が<1または=1である場合には、コールは対照ベヒクル試料に依存する。優勢なコール(半分を上回る)を試料セットに適用した(例えば、比率が<1かつ対照試料のPAコールが「P」、「P」および「A」である場合、このセットのカスタマイズPAコールは「1」である)。MAS5.0およびPAコール解析は、RのためのBioconductor  Affyパッケージ(http://www.bioconductor.org)を使用して実行した。差示的に発現した遺伝子の有意性についてのＰ値は、正規化した処置試料と正規化したベヒクル試料との間でt検定を使用することによって計算した。その後の解析については、対照と刺激試料との間の倍数変化が>2であったプローブのみを用いた。フラグのなかった、すなわち、PAコールが「0」であったプローブは除外した。【０３６１】
（細胞集団分析）
細胞集団分析を以下のように行った。ImmGen  database(http://www.immgen.org/)から直接、定常状態条件の種々の免疫細胞型の遺伝子発現プロファイルを取得した。これらの発現プロファイルを使用して遺伝子がどの細胞型を起源とするのかを推定した。まず、以下のように、１０種類の免疫細胞型(j)におけるそれぞれの遺伝子(i)を重み付けした:
【数３】
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所与の遺伝子の細胞タイプの重みは、その特定の細胞タイプにおけるその遺伝子の発現レベルのみに依存し、他の細胞タイプにおける発現レベルには依存しないと仮定した。それぞれのアジュバント試料の発現プロファイルについて、倍数変化(FC>2)およびPAコール閾値(PA=1)に基づいて遺伝子を決定した。最後に、細胞型(j)の試料(k)についての細胞型の寄与を以下のように算出した:
【数４】
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ここで、cは偽遺伝子を表す。図6bにおいて、このスコアはribbonの幅で表される。【０３６２】
（IPAにおける上流レギュレーター解析）
IPAレギュレーター効果特性を使用して上流解析を行った。主な目的は、上流の制御機構およびその下流機能への影響との関係性を解明することであった。この解析のために、倍数変化>2かつPAコール=1の遺伝子を選択した。最終的に報告したネットワークは、P値<0.001であった。【０３６３】
（統計解析）
群間の統計的有意(P<0.05)は、Dunnettの多重比較検定またはStudentのt検定によって決定した。【０３６４】
（結果）
（Advax（商標）アジュバントは、Th2型の抗原と組み合わせた場合にTh2応答を増強する）
Advax（商標）のアジュバント効果を理解するため、初めに、Advax（商標）を添加したインフルエンザスプリットワクチン(SV)によって免疫化したマウスにおける免疫応答を試験した。インフルエンザスプリットワクチンは、Th2免疫応答を惹起することが以前に示されている(Kistner  et  al.,  2010,  PloS  one  5,  e9349.)。SVによる免疫化単独で、IgG1産生が惹起され(Th2型IgGサブクラス)、より高い免疫化用量では、IL-13(Th2型サイトカイン)産生が誘導された。このことはSVがTh2誘導性抗原であることと一致する(図２２A-２２C)。Advax（商標）をSVに添加すると、IgG1抗体産生が増強されるが、IgG2c抗体産生は増強されず、これは、より低い抗原用量(0.015および0.15)において顕著である(図２２A-２２C)。典型的なTh2型アジュバントであるアラム（Alum）は、ヒトのワクチン接種において一般に使用されるが、これもまた、IgG1優勢な抗体応答を増強する。Advax（商標）は、アラムと同様に、SV抗原に対するTh2応答を誘導した。また、アラムは、ワクチンアレルギーのリスクを潜在的に増大させるIgE産生を誘導することが公知である(Nordvall,  1982,  Allergy  37,  259-264.)。そのため、Advax（商標）またはアラムのいずれかを用いてＳＶ免疫化した後に血清中のIgEレベルを測定した。アラムによって、IgE産生は有意に用量依存的に増加したが、Advax（商標）では、IgE産生は誘導されなかった(図２２D)。このことは、Advax（商標）がSV単独によって誘導される抗体サブタイプ応答を増幅するだけであるという観察と一致している。【０３６５】
インフルエンザウイルス核タンパク質由来のMHCクラスI(CD8  T細胞)またはＭＨＣクラスII(CD4  T細胞)ペプチドで免疫化したマウスから取得した脾細胞を刺激することによってT細胞応答を試験した。CD4  T細胞のIL-13産生は、SV＋Advax（商標）で免疫化したマウスと対照との間で有意な差はなかったが、Advax（商標）は、SVによるIgG1サブクラス抗体の産生能を増強した。その後、アラムは、IL-13産生の有意な増大を示した(図２２E-２２G)。これらの結果は、Advax（商標）は、SVと組み合わせるとTh2型アジュバントとして機能するが、Advax（商標）は、アラムと比べてIL-13およびIgEの産生を増大させないことを示す。【０３６６】
（Advax（商標）アジュバントは、Th1型の抗原と組み合わせた場合にTh1  応答を増強する）
次に、Advax（商標）またはアラムのいずれかを添加した不活化全ビリオンインフルエンザワクチン(WV)によって免疫化したマウスにおける免疫応答を調べた。このＷＶには、ウイルスRNAが含まれ、これによって、TLR7活性化が誘導され、そうすることでウイルスRNAはTh1応答を誘導する内因性のアジュバントとして働く(Koyama  et  al.,  2010,  Science  translational  medicine  2,  25ra24.)。Advax（商標）アジュバントは、IgG2c(Th1型のサブクラス)産生を増強しただけで、IgG1産生に対する影響は最小限であったが、アラム（alum）は、WV誘導性のIgG2c応答を抑制し、IgG1レベルを有意に増大させた(図２３A-２３D)。サイトカインレベルにおいて、Advax（商標）は、WV単独で免疫化したマウスと比較してCD4およびCD8  T細胞によるIFN-γ(Th1型のサイトカイン)産生を増強した。対照的に、アラムは、IFN-γ産生を抑制したが、CD4  T細胞によるIL-13産生を有意に増大させた(図２３E-２３Ｇ）。これらの結果は、Advax（商標）はＷＶと組み合わせるとTh1型アジュバントとして機能するが、アラムはＳＶおよびＷＶのどちらと組み合わせてもTh2型アジュバントとして機能することを示す。【０３６７】
（Advax（商標）のアジュバント効果はワクチン抗原中の内因性アジュバントによって形成される）
上記の知見から、Advax（商標）をTh2型抗原と組み合わせると、Th2免疫が増強されるが、Th1型抗原と組み合わせるとTh1免疫が増強されることが理解される。これをうけて、Advax（商標）のアジュバント効果は、それぞれの抗原に含まれる内在する固有のアジュバント特性を強化するように作用することで媒介されるという仮説を立てた。対照的に、他のアジュバントは固定の免疫バイアス効果を有し、それによって例えば、アラム（alum）は常にTh2応答のバイアスを示すが、CpG-ODNは常にTh1応答のバイアスを示し、これは共投与する抗原の本来の特性によらない。この仮説を検証するために、オボアルブミン(OVA)抗原（中立（ニュートラル）なTh0型の抗原と考えられている）に対するAdvax（商標）のアジュバント効果を試験した。Advax（商標）ではOVA特異的抗体応答の増強は起こらなかったが、予測通り、アラム（alum）ではIgG1産生の増強のみが起こった(図２４A)。【０３６８】
WVの元々備わった内因性のアジュバント効果はTlr7欠損マウスにおいて失われることを以前に示し、WVの免疫原性におけるTLR7シグナル伝達の重要性を確立した(Koyama  et  al.,  2010,  Science  translational  medicine  2,  25ra24.)。最後に、Tlr7欠損マウスにおけるＷＶに対するAdvax（商標）のアジュバント効果を試験した。特筆すべきことに、野生型マウスにおいてAdvax（商標）で見られたWV抗体応答の増強は、Tlr7欠損マウスにおいて見られなかったが、アラムによって誘導されたIgG1応答の増強はTlr7欠損マウスにおいても保存された(図２４B)。まとめると、これらの知見から、Advax（商標）が、新規の追加的なアジュバントのクラスに属し、固有の免疫極性化特性を変化させることなくワクチン抗原内に含まれる内因性の元々備わったアジュバントを増幅させるように機能することが示唆される。【０３６９】
（Advaxアジュバントは、樹状細胞をインビボで活性化するが、インビトロでは活性化しない）
樹状細胞(DC)は、アジュバント誘導性免疫応答において中心的な役割を果たすので、Advax（商標）がDCをインビトロおよびインビボで活性化できるかどうかを調べた。マウス骨髄由来DCを、Advax（商標）、アラム（alum）またはリポ多糖(LPS)によって15時間インビトロで刺激し、CD40（ＤＣの活性化マーカー）の発現を、フローサイトメトリーによって評価した。LPSは、予想通りインビトロでＤＣ上のCD40発現を増大させたが、Advax（商標）およびアラムはいずれもＤＣ上のCD40発現に影響を及ぼさなかった(図２５A-２５C)。次に、アジュバント投与後に流入領域リンパ節から取得したＤＣ上のCD40発現を測定することによって、Advax（商標）またはアラムがインビボでDC上のCD40発現を活性化することができるかどうかを調べた。インビトロの知見とは対照的に、Advax（商標）およびアラムは両方とも、インビボ投与時には、流入リンパ節における活性化DCの頻度を増大させた(図２５D-１２F)。アラムは、注射部位において死細胞からの細胞外DNA放出を誘導するので(Marichal  et  al.,  2011,  Nature  medicine  17,  996-1002.)、DAMP受容体への結合を介したこの細胞外DNAによって、アラムがなぜインビボではDCの活性化を誘導したのに、インビトロでは誘導しなかったのかが説明され得る。Advax（商標）も同様に、注射部位で細胞死を誘導して、DAMP受容体を介して間接的にＤＣを活性化するのかどうかを調べた。この可能性を検証するため、Advax（商標）またはアラムの注射部位における細胞傷害性および宿主DNA/RNA放出をインビボで評価した。Advax（商標）またはアラムを腹腔内(i.p.)投与した後、腹腔洗浄液を採取し、洗浄液中の死細胞の数およびDNA/RNA濃度を測定した。アラムは、予想通りに細胞死および核酸放出を誘導したが、Advax（商標）の注射は、細胞死も核酸放出も誘導しなかった。これは、DAMPシグナル伝達経路は、ＤC活性化およびCD40発現をインビボで誘導するAdvax（商標）の作用に関与しないことを示す。【０３７０】
（貪食マクロファージはAdvax（商標）のアジュバント効果を媒介する細胞である）
免疫複合体および不活化インフルエンザウイルスは、流入領域リンパ節(DLN)においてCD169+ (Siglec-1またはMOMA-1とも呼ばれる)マクロファージに捕捉されて、体液性免疫応答を誘導し(Gonzalez  et  al.,  2010,  Nature  immunology  11,  427-434.;  Suzuki  et  al.,  2009,  J  Exp  Med  206,  1485-1493.)、ある種の粒子状アジュバントは、MARCO+  マクロファージに効率よく取り込まれる(Aoshi  et  al.,  2009,  European  journal  of  immunology  39,  417-425.;  Kobiyama  et  al.,  2014,  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America  111,  3086.)。そのため、ＤＬＮにおけるAdvax（商標）の挙動を、蛍光標識Advax（商標）粒子を使用してインビボで解析した。皮内(i.d.)投与１時間後に、弱いAdvax（商標）シグナルが、ＤＬＮにおいてMARCO+マクロファージと共局在しており、この共局在シグナルは、24時間後においてさらに大きかった。Advax（商標）とCD169+マクロファージとの共局在はＤＬＮにおいてほとんど観察されなかった(図２６A-２６F)。このことは、i.d.投与したAdvax（商標）が、MARCO+マクロファージに取り込まれたことを示唆する。次に、アジュバント効果のためにAdvax（商標）がマクロファージに取り込まれることが必要かどうかを調べるために、クロドロン酸リポソーム注射後のマクロファージおよびDCの回復動態の差を利用した。クロドロン酸リポソームは、マクロファージおよびDCを両方とも２日目までに完全に枯渇させるが、その後、マクロファージは少なくとも７日間回復しないのに対して、DCの大部分はこの期間で回復する(Aoshi  et  al.,  2008,  Immunity  29,  476-486.;  Kobiyama  et  al.,  2014,  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America  111,  3086.)。興味深いことに、Advax（商標）のアジュバント効果は、試験した時点(2日目または7日目)によらず、クロドロン酸リポソーム処置によって有意に減少した(図２６Gおよび２６H)。これは、Advax（商標）のアジュバント機能がマクロファージの存在に依存することを示唆している。対照的に、CpG-SPGのアジュバント機能は、クロドロン酸処置後２日目には有意に減少したが、7日目には減少しなかった。これは、以前に報告されるように、CpG-SPGのアジュバント機能の大部分はDCに依存しており、マクロファージに依存しないことを示唆している(Kobiyama  et  al.,  2014,  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America  111,  3086.)。【０３７１】
（Advax（商標）はIL-1β-、C型レクチン受容体およびTNF-α関連のシグナル伝達経路の遺伝子発現を変化させる）
Advax（商標）の生物学的特性を理解するために、サイトカイン産生に対するその効果を調べた。Advax（商標）またはアラムをi.p.投与した後のいくつかの時点で、腹腔洗浄液を採取し、洗浄液中のサイトカインを分析した。アラムは、インターロイキン(IL)-5、IL-10、IL-12、腫瘍壊死因子(TNF)-αおよび顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)を含め様々なサイトカインの産生を誘導したが、Advax（商標）投与ではIL-10、G-CSFやマクロファージ炎症性タンパク質(MIP)-1などの限られたサイトカイン応答が観察された。【０３７２】
Advax（商標）のインビボにおける主要な生物学的効果をさらに調べるために、Advax（商標）の局所(i.d.)投与または全身性(i.p.)投与後の各組織における遺伝子発現プロファイルを試験した。Advax（商標）のi.d.投与では、遺伝子発現の変化は限定的であったが、i.p.投与では、いくつかの組織において遺伝子発現が変化した(図２７A)。i.p.投与では、急性期応答、炎症、ケモカイン、補体/血小板、およびC型レクチン受容体(CLR)関連の応答に関連する遺伝子が差示的に制御された。さらに、応答細胞集団を解析したところ、Advax（商標）が好中球およびマクロファージの応答をインビボで誘導したことが明らかになった(図２７B)。さらに、Ingenuity経路解析(IPA)における上流レギュレーター解析を行うと、４つの上流レギュレーター:NF-κB(複合体)、IL-1β、IFN-γおよびTNF-αがAdvax（商標）のi.p.投与による影響を受けることが示唆された。これは、貪食細胞接着、好中球の化学走性ならびに造血幹細胞およびナチュラルキラー細胞の移動を増強する遺伝子の発現を駆動する(図２７C)。【０３７３】
Advax（商標）のアジュバント機能にこれらの生物学的因子がどのように寄与しているのかを調べるために、まず、Advax（商標）がIL-1β産生を誘導することができるかどうかを試験した。腹腔マクロファージまたは顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)で誘導された骨髄由来DC(GM-DC)を、LPSによるプライミングの後Advax（商標）またはアラムで刺激し、その後、IL-1β産生を試験した。しかし、インビトロにおいてAdvax（商標）で刺激したこれらの細胞においてIL-1β産生は検出されなかった。他方、アラムはIL-1β産生を有意に誘導した。ある種の粒子状アジュバントはアジュバント機能を発揮するためにNLRP3インフラマソームの活性化およびその後のIL-1β産生を必要とするので(Eisenbarth  et  al.,  2008,  Nature  453,  1122-1126.;  Kuroda  et  al.,  2013,  Int  Rev  Immunol  32,  209-220.)、NLPR3インフラマソームの構成要素である、Nlrp3、Caspase1またはIL-1rの非存在条件がAdvax（商標）のアジュバント機能に及ぼす影響をインビボで試験した。これらのNLPR3インフラマソームが欠損したそれぞれのマウスにおいてAdvax（商標）は、有意なアジュバント効果を示した。これは、Advax（商標）のアジュバント効果が、NLPR3インフラマソーム/IL-1βシグナル伝達経路に依存しないことを示唆する。次に、Advax（商標）のアジュバント機能におけるCLR関連シグナル伝達経路の関与を調べるために、CLRシグナル伝達経路関連遺伝子（Fcrg-/-、Card9-/-またはDap12-/-）を欠失したマウスにおいてそのアジュバント効果を試験した。これらの遺伝子が存在しなくても、Advax（商標）が抗体応答を増強する能力に影響はなかった。これは、Advax（商標）のアジュバント効果が、これらのCLR関連シグナル伝達経路に依存しないことを示唆する。【０３７４】
（TNF-αはAdvax（商標）のアジュバント効果に必須である）
また、遺伝子発現解析によって、i.p.投与したAdvax（商標）がTNF-α関連シグナル伝達経路に影響を及ぼすことが示唆された(図２７C)。そのため、Advax（商標）がTNF-α産生を誘導できるかどうかを調べた。マクロファージをインビトロでAdvax（商標）で刺激し、培養上清中のTNF-αを測定した。Advax（商標）はTNF-α産生を誘導しなかったが、アラムによる刺激は、インビトロで有意にマクロファージのTNF-α産生を誘導した(図２８A)。しかし、i.p.注射したAdvax（商標）は、血清中のTNF-αレベルの有意な増大を引き起こした(図２８B)。他方、逆説的に、i.p.投与したアラムは血清中のTNF-αレベルに影響を及ぼさなかった。i.p.注射したAdvax（商標）は、肺や脾臓などの遠隔の組織においてTNF-α-シグナル伝達経路関連遺伝子を含む遺伝子発現に影響を及ぼしたため(図２７Aおよび２７B)、血清中のTNF-αはこれらの組織に由来するものと考えられる。最後に、Advax（商標）のアジュバント効果におけるTNF-αの役割を調べるため、Tnfa-/-マウスを、Advax（商標）アジュバント化したWVまたはB型肝炎表面抗原で免疫化し、得られる抗体応答を試験した(それぞれ図２８C-２８E)。Tnfaの欠失はAdvax（商標）の抗体応答に対するアジュバント効果を有意に低減させた。これは、完全なTNF-αシグナル伝達が、抗体応答に対するAdvax（商標）のアジュバント効果に重要であることを示唆している。【０３７５】
（実施例４：安全性および有効性のモデル構築）
次に、本実施例は、本発明を用いて安全性および有効性のデータベースおよびモデルを構築することができることを実証した。
実施例１−２で示されるようなアジュバントデータベースに加え、毒性ゲノム学データベース（ゲート）を用いると、機械学習などにより、トランスクリプトームベースの毒性および安全性の予測が可能となる。【０３７６】
（ラット肝臓トランスクリプトーム６時間および２４時間での毒性予測）
毒性ゲノム学データベースから、１０の化合物を含む「毒性」群および１０の化合物を含む「非毒性」群をそれぞれ作成した。「毒性」群の化合物は、４回の投与内で病理学的知見を示した化合物であった。「非毒性」群の化合物は、毒性に関連する特徴が観察されなかった化合物であった（図２９）。（これらのデータは、公開のTG-GATE(Igarashi,Y.  et  al.,  Nucleic  acids  research  43,  D921-927(2015))から入手可能である））。【０３７７】
これら「毒性」群の化合物および「非毒性」群の化合物を投与して６時間後および２４時間後のトランスクリプトーム解析結果に基づいて、「毒性」群の化合物の投与によって発現が変化した遺伝子のパターンと、「非毒性」群の化合物の投与によって発現が変化した遺伝子のパターンとを取得した。（これらのデータは、公開のTG-GATE(Igarashi,Y.  et  al.,  Nucleic  acids  research  43,  D921-927(2015))から入手可能である））。ネクローシス予測モデルのために選択したプローブ（遺伝子）は、免疫応答（１）および代謝（４）に関連する５つの経路に濃縮された（図３０Ａ）。【０３７８】
実施例１−２で示されるようなアジュバントデータベースにおける各アジュバント投与の６時間および２４時間後時点の遺伝子変動パターンを、これら公知の化合物についての投与の６時間および２４時間後時点の「毒性」遺伝子パターンおよび「非毒性」遺伝子パターンと比較して、それぞれのアジュバントがどの程度の「毒性」スコアとなるかを計算した（図３０Ｂ）。「毒性」スコア算出方法は例えば、Igarashi,Y.  et  al.,  Nucleic  acids  research  43,  D921-927(2015)およびUehara,T.  et  al.,  Toxicol  Appl  Pharmacol  2011  Sep  15;255(3):297-306を参照。【０３７９】
実際に各アジュバントを投与して６時間および２４時間後時点のＡＬＴの活性を測定した（図３１）。ＡＳＴおよびＡＬＴ活性測定は、当該分野で公知の手法（例えば、カイネティクスアッセイまたはエンドポイントアッセイによって比色測定）で行われ、このデータは、LSIメディエンス社に委託して測定した。【０３８０】
高い毒性が予測されたアジュバントＸ（ＦＫ５６５）の毒性を、実際にマウスで確認した。
マウスにＰＢＳ、ＦＫ５６５（１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇまたは１００μｇ／ｋｇ）またはＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、３時間／６時間後、１日目、２日目、３日目および５日目に血液および肝臓を収集した。収集した肝臓をヘマトキシリン・エオジン染色し、組織学的解析を行った（図３２）。また、肝臓をＴＵＮＥＬ染色し、アポトーシスを確認した（図３３）。また、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の血清レベルについて、生化学的解析を行った（図３４）。
ＲＯＣ曲線から毒性予測モデルの妥当性が示された。アジュバント性予測モデルについて選択されたプローブのＰＣＡ解析からも妥当性が示された（アジュバントデータベース＋毒性ゲノム学データベース（ゲート））。Ｏｓｍｒを中心とした経路のヒートマップが作成された（データ示さず）。【０３８１】
上記のデータベースの解析からＯｓｍｒを中心とした遺伝子クラスターが得られた（図３５）。この毒性と関連が深いと予測された遺伝子Ｙ（Ｏｓｍｒ）について調査した。各アジュバントをラットに投与した６時間後の肝臓における遺伝子Ｙの発現変化（倍数変化）を図３６の上段に示す。Ｏｓｍｒ欠失マウスは、Jackson Laboratoriesから入手したものをベースに用いた。【０３８２】
野生型およびＯｓｍｒ欠失マウスにＰＢＳ、ＦＫ５６５（１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇまたは１００μｇ／ｋｇ）またはＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、１日後に血液および肝臓を収集した。DRI-CHEM  7000V（富士フィルム、東京、日本）を使用してＡＳＴおよびＡＬＴの血清レベルを解析した（図３７）。また、肝臓をＴＵＮＥＬ染色し、アポトーシスを確認した（図３６の下段）。ＡＳＴおよびＡＬＴ活性測定は、当該分野で公知の手法（例えば、カイネティクスアッセイまたはエンドポイントアッセイによって比色測定）で行われ、【０３８３】
（マウスにおける肝臓毒性遺伝子の確認）
たとえば、下記表を参照して、ラットで毒性との関連が示唆された遺伝子をマウスにおいてノックアウトさせる候補として選択することができる（例えば、ＮＯＤ１リガンドに対するＮＯＤ１）。本実施例では、Ｏｓｍｒをノックアウトさせた。
【表２５】
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【０３８４】
（ラット肝臓モデルでのアジュバント特性の予測）
図３８に示すように、安全なアジュバントについてアジュバントデータベースから特徴を探索し、公開毒性ゲノム学データベースからアジュバントとして作用する化合物を探索する。【０３８５】
アジュバント性予測モデルによって、多くの薬物がアジュバントである可能性が示唆された。これをマウスを用いた実験によって確認した。【０３８６】
アジュバント性予測モデルのために選択したプローブ（遺伝子）は、細胞死（４）、免疫応答（２）および代謝（３６）に関連する４２の経路に濃縮された。細胞死（４）および免疫応答（２）に関する経路を構成する遺伝子のベン図では、７つの遺伝子が両者に共通した（図３９）。
アジュバント性予測モデルによって、多くの薬物、免疫刺激剤、ＬＰＳおよびＴＮＦが高いスコアとなり（図４０上）、色付きの文字で示した薬物を、購入し、次にマウスで試験した。ＲＯＣ曲線によりアジュバント性予測モデルの妥当性が確認された（図４０下）。【０３８７】
マウスに、オボアルブミンとともにａｌｕｍ、ＣｐＧｋ３または５種類の薬物（ＡＣＡＰ、ＢＯＲ、ＣＨＸ、ＣＯＬ、ＰＨＡ）を２〜３種類の用量で０日目および１４日目に皮内投与した。２１日目に血液および脾臓を収集した。抗オボアルブミン（ｏｖａ）抗体価（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２）を２１日目に測定した。薬物によってＩｇＧ１およびＩｇＧ２価の異なるアジュバント特性が観察された（図４１）。上記例で各薬物、オボアルブミンなどは日本生化学またはＷＡＫＯから入手したものを用いた。これらの薬物はこれらの供給先の他、他の供給先から得られるものも利用可能である。【０３８８】
さらに、脾臓細胞（免疫したマウスから採取した臓器に由来する細胞である）に対して、インビトロで、各薬物に加えて、オボアルブミン（ｏｖａ）２５７〜２６４ペプチド（ＯＶＡ−ＭＨＣ１）、ｏｖａ  ３２３〜３３９ペプチド（ＯＶＡ−ＭＨＣ２）またはｏｖａタンパク質（ＯＶＡ−ｗｈｏｌｅ）を添加して刺激するか、または追加の刺激なしでで処理して上清を収集した。上清におけるＴｈ１型（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）（図４２）およびＴｈ２型（ＩＬ−４およびＩＬ−５）（図４３）のサイトカインをＥＬＩＳＡで測定した。【０３８９】
マウスにオボアルブミンとともにａｌｕｍ、ＣｐＧｋ３または５種類の薬物（ＡＣＡＰ、ＢＯＲ、ＣＨＸ、ＣＯＬ、ＰＨＡ）を投与し、３時間後（０日目）に血液を収集し、DRI-CHEM  7000V（富士フィルム、東京、日本）を使用してアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の血清レベルについて生化学的解析を行った（図４４）。【０３９０】
マウスに各薬物を腹腔内投与して６時間および２４時間後に血液を収集し、循環血液中のｍｉＲＮＡを分析した（図４５）。ＡｌｕｍおよびＡＳ０４の投与６時間および２４時間後の循環血液中のｍｉＲＮＡを分析した結果を示す（図４６）。
（結果）【０３９１】
以上の結果から、本発明のトランスクリプトーム分析によって、アジュバントなどの医薬成分を分類することができる上に、有効性および安全性を試験することができることが理解される。【０３９２】
本実施例では、本発明者らは、アジュバントの毒性学的特性を評価するために、本実施例において、ラットに関して実施例１と同様のマイクロアレイデータを取得した。ラットのトランスクリプトームデータは、公開のTG-GATE(Igarashi,Y.  et  al.,  Nucleic  acids  research  43,  D921-927(2015))(これは同様にラットに関するものである)の遺伝毒性学的データセットに直接組み込むことができることから、これに基づき解析を実施したところ、毒性の解析を行うことができることが実証され、さらに、トランスクリプトーム解析で得られた知見に基づきマウスでノックアウト実験を行ったところ、毒性に関与する遺伝子であることが証明された。従って、本実施例での結果は種を超えて実証可能であることが証明され、動物モデルでの毒性実験の検証に本発明および本発明で得られた知見を利用することが可能であることが証明された。さらに、本発明者らは、ヒト臨床試料からのマイクロRNA発現プロファイルを取集し、これを用いてmiRNAの解析を行った。上述の全てのデータセットを統合したところ、これらのデータベースによって、異なる実験条件下における異なる種のアジュバント誘導性遺伝子発現シグネチャについてのより統合的で網羅的な解析を実施することができ、有効性についてもトランスクリプトーム解析で得られた知見に基づく試験を行うことができることが証明された。【０３９３】
毒性および有効性に関しては、アジュバントのみならず、原理的に、医薬成分一般において同様の分析が可能であることが当業者には理解される。特に毒性については、有効成分のみならず添加成分（賦形剤、キャリアなど）についても同様の試験を行うことができ、あるいは複数の同種または異種の医薬成分を混合した混合物や最終の製剤についても同様の試験を行うことができる。有効成分についても、同様に有効成分の指標をもとに同様のトランスクリプトーム解析の試験が可能であると当業者に理解される。【０３９４】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、日本国に2016年12月28日に出願された特願2016-256270および特願2016-256278に対して優先権主張を伴う出願である。その内容はその全体が、具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０３９５】
免疫関連の疾患について、アジュバントの分類を含む精確度が高い、臨床応用が可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０３９６】
配列番号１  CpG-ODN  (5’-ATCGACTCTCGAGCGTTCTC-3’）
配列番号２  MHCクラスI  (ASNENMETM）
配列番号３  MHCクラスII  (ARSALILRGSVAHKSCLPACVYGP）
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図２Ｎ】
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【図２Ｏ】
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【図２Ｐ】
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【図２Ｑ】
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【図２Ｒ】
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【図２Ｓ】
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【図２Ｔ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２０Ｈ】
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【図２０Ｉ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
2018124293.tif 000170
【図４５】
2018124293.tif 000171
【図４６】
2018124293.tif 000172
【配列表】
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【国際調査報告】
2018124293.tif 000173
2018124293.tif 000174
2018124293.tif 000175
2018124293.tif 000176
2018124293.tif 000177
2018124293.tif 000178
2018124293.tif 000179
2018124293.tif 000180