(57)【要約】本発明は、下記一般式（Ｉ）：2017188082.tif 000018で示される縮合多環式化合物またはその製薬学的に許容される塩を含有する動物細胞培養用培地添加剤、該化合物またはその製薬学的に許容される塩を含有する動物細胞培養用培地、及び該化合物またはその製薬学的に許容される塩を含有する培地中で動物細胞を培養することを含む動物細胞の培養方法等を提供する。
2017188082.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で示される縮合多環式化合物またはその製薬学的に許容される塩を含有する動物細胞培養用培地添加剤。
【化１】
2017188082.tif 000016
｛式中、Ａは芳香環基、複素環基、または脂肪族環基を示し、Ｂは置換基を有してもよい芳香環、置換基を有してもよい複素環、または置換基を有してもよい脂肪族環を示し、Ｃは置換基を有してもよい複素環基を示し、Tは基中の二つの炭素原子が二重結合、三重結合を有しても良く、また基中の炭素原子が−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−に一部が置換されても良い、置換基を有しても良い炭素数１〜７個からなるアルキレン基を示し、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、置換基を有してもよいアルケニル基、置換基を有してもよいアルキニル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいヘテロアリール基、置換基を有してもよいベンジルオキシ基、置換基を有してもよいアリールオキシ基、置換基を有してもよいヘテロアリールオキシ基、置換基を有してもよいアリールアミノ基、置換基を有してもよいアリールビニル基、または置換基を有してもよいアリールエチニル基を示し、−Ｘ−および−Ｚ−は、それぞれ独立して−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ6−（式中、Ｒ6は置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示す）、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ2−、−ＣＨ2−、−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、または−ＣＯ−を示し、−Ｗ−は−ＮＲ9−（式中、Ｒ9は水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基または置換基を有してもよいアリール基を示す）、−Ｏ−、または−ＣＲ7Ｒ8−（式中、Ｒ7、Ｒ8は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）を示し、Ｙは窒素原子またはＣＨを示し、ａ、ｂ及びｃはそれぞれの炭素原子の位置を示す。但し、ｉ）上記置換基は、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、アリール基、ヘテロアリール基からなる群から選ばれる。ii）Ｘが―ＣＨ2−、−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4およびＲ5は、前記と同義である）のとき、Ｙは窒素原子である。｝
【請求項２】
Ｂが置換基を有してもよい脂肪族環であり、Ｃが置換基を有してもよい複素環基であり、−Ｘ−が−ＮＨ−、または−ＮＲ6−（式中、Ｒ6は置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示す）であり、Ｙが窒素原子であり、−Ｚ−が−ＣＨ2−または−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）であり、−Ｗ−が−ＮＲ9−（式中、Ｒ9は水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基または置換基を有してもよいアリール基を示す）であり、−Ｔ−が、−ＣＲ11Ｒ12−（式中、Ｒ11及びＲ1２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、−ＣＲ13Ｒ14−ＣＲ15Ｒ16−（式中、Ｒ1３〜Ｒ1６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）または−ＣＲ17＝ＣＲ18−（式中Ｒ17およびＲ18はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）である請求項１記載の培地添加剤。
【請求項３】
Ｃの置換基を有してもよい複素環基が、置換基を有してもよいヘテロアリール基である請求項２記載の培地添加剤。
【請求項４】
Ａがフェニル基であり、Ｃの置換基を有してもよい複素環基が置換基を有してもよいフリル基、置換基を有してもよいチエニル基、置換基を有してもよいオキサゾリル基、置換基を有してもよいイソオキサゾリル基、置換基を有してもよいチアゾリル基、置換基を有してもよいオキサジアゾリル基、置換基を有してもよいチアジアゾリル基、置換基を有してもよいピリジル基、置換基を有してもよいピリドニル基、置換基を有してもよいピリダジニル基、置換基を有してもよいピリミジニル基、置換基を有してもよいイミダゾリル基、置換基を有してもよい４−オキソチアゾリジン−２−チオニル基のいずれかである請求項２記載の培地添加剤。
【請求項５】
Ｂが置換基を有してもよいシクロヘキサン環である請求項４記載の培地添加剤。
【請求項６】
一般式（Ｉ）の−Ｘ−が−ＮＨ−または−Ｎ（ＣＨ３）−であり、Ｙが窒素原子であり、−Ｚ−が−ＣＨ2−であり、−Ｗ−が−ＮＨ−であり、Ｂが置換基を有してもよいシクロヘキサン環であり、Cが置換基を有してもよいオキサゾリル基、置換基を有してもよいチアゾリル基、置換基を有してもよいピリジル基であり、−Ｔ−が、−ＣＲ11Ｒ12−（式中、Ｒ11及びＲ1２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、−ＣＲ13Ｒ14−ＣＲ15Ｒ16−（式中、Ｒ1３〜Ｒ1６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）または−ＣＲ17＝ＣＲ18−（式中、Ｒ17およびＲ18は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）である請求項５記載の培地添加剤。
【請求項７】
一般式（Ｉ）の−Ｘ−が−ＮＨ−または−Ｎ（ＣＨ３）−であり、Ｙが窒素原子であり、−Ｚ−が−ＣＨ2−または−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）であり、−Ｗ−が−ＮＨ−であり、Ａが複素環基であり、Ｂが置換基を有してもよいシクロヘキサン環であり、Cが置換基を有してもよいオキサゾリル基、置換基を有してもよいチアゾリル基、置換基を有してもよいピリジル基であり、−Ｔ−が、−ＣＲ11Ｒ12−（式中、Ｒ11及びＲ1２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、−ＣＲ13Ｒ14−ＣＲ15Ｒ16−（式中、Ｒ1３〜Ｒ1６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）または−ＣＲ17＝ＣＲ18−（式中、Ｒ17およびＲ18は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）である請求項２記載の培地添加剤。
【請求項８】
一般式（Ｉ）の−Ｚ−が−ＣＨ2−であり、Ａがヘテロアリール基である請求項７記載の培地添加剤。
【請求項９】
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3の少なくとも一つが、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、メトキシ基、エトキシ基、メチルチオ基、トリフルオロメチル基のいずれかで、残りが水素原子である請求項６記載の培地添加剤。
【請求項１０】
一般式（Ｉ）のａ、ｂおよびｃの炭素原子の絶対配置が、それぞれ独立してＲまたはＳである請求項６〜８のいずれか１項記載の培地添加剤。
【請求項１１】
一般式（Ｉ）のａおよびｂの炭素原子の絶対配置がともにＲであり、ｃの炭素原子の絶対配置がＲまたはＳである請求項１０記載の培地添加剤。
【請求項１２】
一般式（Ｉ）のａおよびｂの炭素原子の絶対配置がともにＳであり、ｃの炭素原子の絶対配置がＲまたはＳである請求項１０記載の培地添加剤。
【請求項１３】
細胞増殖用である、請求項１〜１２のいずれか１項記載の培地添加剤。
【請求項１４】
動物細胞が複能性幹細胞又は多能性幹細胞である、請求項１〜１３のいずれか１項記載の培地添加剤。
【請求項１５】
動物細胞が、神経幹細胞、神経前駆細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である請求項１〜１３のいずれか１項記載の培地添加剤。
【請求項１６】
下記一般式（Ｉ）で示される縮合多環式化合物またはその製薬学的に許容される塩を含有する動物細胞培養用培地。
【化２】
2017188082.tif 000017
｛式中、Ａは芳香環基、複素環基、または脂肪族環基を示し、Ｂは置換基を有してもよい芳香環、置換基を有してもよい複素環、または置換基を有してもよい脂肪族環を示し、Ｃは置換基を有してもよい複素環基を示し、Tは基中の二つの炭素原子が二重結合、三重結合を有しても良く、また基中の炭素原子が−Ｏ−、−Ｓ−，−ＮＨ−に一部が置換されても良い、置換基を有しても良い炭素数１〜７個からなるアルキレン基を示し、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、置換基を有してもよいアルケニル基、置換基を有してもよいアルキニル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいヘテロアリール基、置換基を有してもよいベンジルオキシ基、置換基を有してもよいアリールオキシ基、置換基を有してもよいヘテロアリールオキシ基、置換基を有してもよいアリールアミノ基、置換基を有してもよいアリールビニル基、または置換基を有してもよいアリールエチニル基を示し、−Ｘ−および−Ｚ−は、それぞれ独立して−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ6−（式中、Ｒ6は置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示す）、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ2−、−ＣＨ2−、−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、または−ＣＯ−を示し、−Ｗ−は−ＮＲ9−（式中、Ｒ9は水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基または置換基を有してもよいアリール基を示す）、−Ｏ−、または−ＣＲ7Ｒ8−（式中、Ｒ7、Ｒ8は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）を示し、Ｙは窒素原子またはＣＨを示し、ａ、ｂ及びｃはそれぞれの炭素原子の位置を示す。但し、ｉ）上記置換基は、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、アリール基、ヘテロアリール基からなる群から選ばれる。ii）Ｘが―ＣＨ2−、−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4およびＲ5は、前記と同義である）のとき、Ｙは窒素原子である。｝
【請求項１７】
Ｂが置換基を有してもよい脂肪族環であり、Ｃが置換基を有してもよい複素環基であり、−Ｘ−が−ＮＨ−、または−ＮＲ6−（式中、Ｒ6は置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示す）であり、Ｙが窒素原子であり、−Ｚ−が−ＣＨ2−または−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）であり、−Ｗ−が−ＮＲ9−（式中、Ｒ9は水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基または置換基を有してもよいアリール基を示す）であり、−Ｔ−が、−ＣＲ11Ｒ12−（式中、Ｒ11及びＲ1２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、−ＣＲ13Ｒ14−ＣＲ15Ｒ16−（式中、Ｒ1３〜Ｒ1６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）または−ＣＲ17＝ＣＲ18−（式中、Ｒ17およびＲ18は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）である請求項１６記載の培地。
【請求項１８】
Ｃの置換基を有してもよい複素環基が、置換基を有してもよいヘテロアリール基である請求項１７記載の培地。
【請求項１９】
Ａがフェニル基であり、Ｃの置換基を有してもよい複素環基が置換基を有してもよいフリル基、置換基を有してもよいチエニル基、置換基を有してもよいオキサゾリル基、置換基を有してもよいイソオキサゾリル基、置換基を有してもよいチアゾリル基、置換基を有してもよいオキサジアゾリル基、置換基を有してもよいチアジアゾリル基、置換基を有してもよいピリジル基、置換基を有してもよいピリドニル基、置換基を有してもよいピリダジニル基、置換基を有してもよいピリミジニル基、置換基を有してもよいイミダゾリル基、置換基を有してもよい４−オキソチアゾリジン−２−チオニル基のいずれかである請求項１７記載の培地。
【請求項２０】
Ｂが置換基を有してもよいシクロヘキサン環である請求項１９記載の培地。
【請求項２１】
一般式（Ｉ）の−Ｘ−が−ＮＨ−または−Ｎ（ＣＨ３）−であり、Ｙが窒素原子であり、−Ｚ−が−ＣＨ2−であり、−Ｗ−が−ＮＨ−であり、Ｂが置換基を有してもよいシクロヘキサン環であり、Cが置換基を有してもよいオキサゾリル基、置換基を有してもよいチアゾリル基、置換基を有してもよいピリジル基であり、−Ｔ−が、−ＣＲ11Ｒ12−（式中、Ｒ11及びＲ1２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、−ＣＲ13Ｒ14−ＣＲ15Ｒ16−（式中、Ｒ1３〜Ｒ1６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）または−ＣＲ17＝ＣＲ18−（式中、Ｒ17およびＲ18は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）である請求項２０記載の培地。
【請求項２２】
一般式（Ｉ）の−Ｘ−が−ＮＨ−または−Ｎ（ＣＨ３）−であり、Ｙが窒素原子であり、−Ｚ−が−ＣＨ2−または−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）であり、−Ｗ−が−ＮＨ−であり、Ａが複素環基であり、Ｂが置換基を有してもよいシクロヘキサン環であり、Cが置換基を有してもよいオキサゾリル基、置換基を有してもよいチアゾリル基、置換基を有してもよいピリジル基であり、−Ｔ−が、−ＣＲ11Ｒ12−（式中、Ｒ11及びＲ1２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、−ＣＲ13Ｒ14−ＣＲ15Ｒ16−（式中、Ｒ1３〜Ｒ1６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）または−ＣＲ17＝ＣＲ18−（式中、Ｒ17およびＲ18は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）である請求項１７記載の培地。
【請求項２３】
一般式（Ｉ）の−Ｚ−が−ＣＨ2−であり、Ａがヘテロアリール基である請求項２２記載の培地。
【請求項２４】
Ｒ1，Ｒ2およびＲ3の少なくとも一つが、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、メトキシ基、エトキシ基、メチルチオ基、トリフルオロメトキシ基のいずれかで、残りが−Ｈである請求項２１記載の培地。
【請求項２５】
一般式（Ｉ）のａ、ｂおよびｃの炭素原子の絶対配置が、それぞれ独立してＲまたはＳである請求項２１〜２３のいずれか１項記載の培地。
【請求項２６】
一般式（Ｉ）のａおよびｂの炭素原子の絶対配置がともにＲであり、ｃの炭素原子の絶対配置がＲまたはＳである請求項２５記載の培地。
【請求項２７】
一般式（Ｉ）のａおよびｂの炭素原子の絶対配置がともにＳであり、ｃの炭素原子の絶対配置がＲまたはＳである請求項２５記載の培地。
【請求項２８】
細胞増殖用である、請求項１６〜２７のいずれか１項記載の培地。
【請求項２９】
動物細胞が複能性幹細胞又は多能性幹細胞である、請求項１６〜２８のいずれか１項記載の培地。
【請求項３０】
動物細胞が、神経幹細胞、神経前駆細胞、ＥＳ細胞もしくはｉＰＳ細胞である請求項１６〜２８のいずれか１項記載の培地。
【請求項３１】
培地中の、縮合多環式化合物またはその製薬学的に許容される塩が、０．２５μＭ〜２００μＭである、請求項３０記載の培地。
【請求項３２】
請求項１６〜３１のいずれか１項記載の培地中で動物細胞を培養することを特徴とする、動物細胞の培養方法。
【請求項３３】
動物細胞が幹細胞である、請求項３２記載の培養方法。
【請求項３４】
培地中で細胞を１日以上培養することを特徴とする、請求項３２又は３３記載の培養方法。
【請求項３５】
請求項１６〜３１のいずれか１項記載の培地及び動物細胞を含む、動物細胞培養調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞の培養用の培地添加剤、培地及び培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞を研究、物質生産、医療などに応用するために、効率よく増殖させる培養方法が求められている。その際、細胞の増殖を促進するために動物血清成分やタンパク質性増殖因子を添加した培地を用いることが望ましい。上記用途で利用する培地は、未知の組成が含まれないこと、即ち既知成分のみで構成されることが望ましく、特に医療用途では異種由来の成分を含まないことが求められる。また、一般にタンパク質は溶液状態で不安定であることから、より安定に存在できる低分子化合物を代わりに用いることが望ましい。動物細胞培養用の培地には高い頻度でインスリンが添加される（非特許文献１及び２）。インスリンもタンパク質の一種であり、溶液状態では会合し、不均一になるなど不安定であるため、インスリンの機能を代替する低分子化合物を添加した培地が求められている。【０００３】
また、培地中でインスリン様作用を示す化合物として報告されているものに、化合物M（非特許文献３のＣｏｍｐｏｕｎｄ  ２）、Ｌ−７８３２８１（非特許文献４）、ＴＬＫ−１９７８１（非特許文献５及び６）、Ｎａ３ＶＯ４（非特許文献７）、ｅｒｔｉｐｒｏｔａｆｉｂ（特許文献３）等のＰＴＰ１Ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １Ｂ）阻害剤が報告されている。また、亜鉛（ｚｉｎｃ）がインスリン代替になるとの論文も報告されている（非特許文献８）。【０００４】
ところで、特許文献１には、下記一般式（Ｉ）で示される、複素環を有する縮合多環式化合物：【０００５】
【化１】
2017188082.tif 000003
【０００６】
が糖尿病治療効果を有することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００５／０４２５３６号
【特許文献２】国際公開第２００２／０４４１８０号
【特許文献３】国際公開第１９９９／０６１４３５号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Keenan J, et al., Cytotechnology. 2006 Mar;50(1-3):49-56.
【非特許文献２】Li G, et al., Endocrinology.2005 Nov;146(11):4690-6.
【非特許文献３】Qureshi SA, et al., J Biol Chem. 2000 Nov 24;275(47):36590-5.
【非特許文献４】Zhang B, et al., Science. 1999 May 7;284(5416):974-7
【非特許文献５】Cheng M, et al., J Cell Biochem. 2004 Aug 15;92(6):1234-45
【非特許文献６】Lum RT, et al., J Med Chem. 2008 Oct 9;51(19):6173-87.
【非特許文献７】Green A., Biochem J. 1986 Sep 15;238(3):663-9.
【非特許文献８】Wong VV, et al., Cytotechnology. 2004 Jul;45(3):107-15.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記状況のもとになされた。本発明の目的は、低分子化合物を用いることで、インスリンを含まない培地で効率良く動物細胞を培養するための培地添加剤、培地、及び培養方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の縮合多環式化合物がインスリンを含まない培地で効率良く動物細胞を培養させ得ることを見出した。本発明者らは更に研究を重ねた結果、驚くべきことに、糖取り込み促進活性を有することが報告されている（国際公開第２００５／０４２５３６号）下記一般式（Ｉ）で示される縮合多環式化合物：【００１１】
【化２】
2017188082.tif 000004
【００１２】
を培地に添加することにより、インスリンを実質的に含まない培地中であってもインスリン添加時と同程度以上に細胞の増殖を刺激し細胞死を抑制し得ることを見出した。さらに当該培地中で培養すると、多能性幹細胞の未分化能を保ったまま細胞を増殖させ得ることができることを見出した。本発明者らはこれらの知見に基づいて更に研究を重ね、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち、本発明は以下の通りのものである。
［１］  下記一般式（Ｉ）で示される縮合多環式化合物またはその製薬学的に許容される塩を含有する動物細胞培養用培地添加剤。
【化３】
2017188082.tif 000005
【００１４】
｛式中、Ａは芳香環基、複素環基、または脂肪族環基を示し、Ｂは置換基を有してもよい芳香環、置換基を有してもよい複素環、または置換基を有してもよい脂肪族環を示し、Ｃは置換基を有してもよい複素環基を示し、Tは基中の二つの炭素原子が二重結合、三重結合を有しても良く、また基中の炭素原子が−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−に一部が置換されても良い、置換基を有しても良い炭素数１〜７個からなるアルキレン基を示し、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、置換基を有してもよいアルケニル基、置換基を有してもよいアルキニル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいヘテロアリール基、置換基を有してもよいベンジルオキシ基、置換基を有してもよいアリールオキシ基、置換基を有してもよいヘテロアリールオキシ基、置換基を有してもよいアリールアミノ基、置換基を有してもよいアリールビニル基、または置換基を有してもよいアリールエチニル基を示し、−Ｘ−および−Ｚ−は、それぞれ独立して−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ6−（式中、Ｒ6は置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示す）、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ2−、−ＣＨ2−、−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、または−ＣＯ−を示し、−Ｗ−は−ＮＲ9−（式中、Ｒ9は水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基または置換基を有してもよいアリール基を示す）、−Ｏ−、または−ＣＲ7Ｒ8−（式中、Ｒ7、Ｒ8は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）を示し、Ｙは窒素原子またはＣＨを示し、ａ、ｂ及びｃはそれぞれの炭素原子の位置を示す。但し、ｉ）上記置換基は、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、アリール基、ヘテロアリール基からなる群から選ばれる。ii）Ｘが―ＣＨ2−、−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4およびＲ5は、前記と同義である）のとき、Ｙは窒素原子である。｝
［２］  Ｂが置換基を有してもよい脂肪族環であり、Ｃが置換基を有してもよい複素環基であり、−Ｘ−が−ＮＨ−、または−ＮＲ6−（式中、Ｒ6は置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示す）であり、Ｙが窒素原子であり、−Ｚ−が−ＣＨ2−または−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）であり、−Ｗ−が−ＮＲ9−（式中、Ｒ9は水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基または置換基を有してもよいアリール基を示す）であり、−Ｔ−が、−ＣＲ11Ｒ12−（式中、Ｒ11及びＲ1２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、−ＣＲ13Ｒ14−ＣＲ15Ｒ16−（式中、Ｒ1３〜Ｒ1６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）または−ＣＲ17＝ＣＲ18−（式中Ｒ17およびＲ18はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）である［１］記載の培地添加剤。
［３］  Ｃの置換基を有してもよい複素環基が、置換基を有してもよいヘテロアリール基である［２］記載の培地添加剤。
［４］  Ａがフェニル基であり、Ｃの置換基を有してもよい複素環基が置換基を有してもよいフリル基、置換基を有してもよいチエニル基、置換基を有してもよいオキサゾリル基、置換基を有してもよいイソオキサゾリル基、置換基を有してもよいチアゾリル基、置換基を有してもよいオキサジアゾリル基、置換基を有してもよいチアジアゾリル基、置換基を有してもよいピリジル基、置換基を有してもよいピリドニル基、置換基を有してもよいピリダジニル基、置換基を有してもよいピリミジニル基、置換基を有してもよいイミダゾリル基、置換基を有してもよい４−オキソチアゾリジン−２−チオニル基のいずれかである［２］記載の培地添加剤。
［５］  Ｂが置換基を有してもよいシクロヘキサン環である［４］記載の培地添加剤。
［６］  一般式（Ｉ）の−Ｘ−が−ＮＨ−または−Ｎ（ＣＨ３）−であり、Ｙが窒素原子であり、−Ｚ−が−ＣＨ2−であり、−Ｗ−が−ＮＨ−であり、Ｂが置換基を有してもよいシクロヘキサン環であり、Cが置換基を有してもよいオキサゾリル基、置換基を有してもよいチアゾリル基、置換基を有してもよいピリジル基であり、−Ｔ−が、−ＣＲ11Ｒ12−（式中、Ｒ11及びＲ1２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、−ＣＲ13Ｒ14−ＣＲ15Ｒ16−（式中、Ｒ1３〜Ｒ1６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）または−ＣＲ17＝ＣＲ18−（式中、Ｒ17およびＲ18は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）である［５］記載の培地添加剤。
［７］  一般式（Ｉ）の−Ｘ−が−ＮＨ−または−Ｎ（ＣＨ３）−であり、Ｙが窒素原子であり、−Ｚ−が−ＣＨ2−または−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）であり、−Ｗ−が−ＮＨ−であり、Ａが複素環基であり、Ｂが置換基を有してもよいシクロヘキサン環であり、Cが置換基を有してもよいオキサゾリル基、置換基を有してもよいチアゾリル基、置換基を有してもよいピリジル基であり、−Ｔ−が、−ＣＲ11Ｒ12−（式中、Ｒ11及びＲ1２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、−ＣＲ13Ｒ14−ＣＲ15Ｒ16−（式中、Ｒ1３〜Ｒ1６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）または−ＣＲ17＝ＣＲ18−（式中、Ｒ17およびＲ18は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）である［２］記載の培地添加剤。
［８］  一般式（Ｉ）の−Ｚ−が−ＣＨ2−であり、Ａがヘテロアリール基である［７］記載の培地添加剤。
［９］  Ｒ1、Ｒ2およびＲ3の少なくとも一つが、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、メトキシ基、エトキシ基、メチルチオ基、トリフルオロメチル基のいずれかで、残りが水素原子である［６］記載の培地添加剤。
［１０］  一般式（Ｉ）のａ、ｂおよびｃの炭素原子の絶対配置が、それぞれ独立してＲまたはＳである［６］〜［８］のいずれかに記載の培地添加剤。
［１１］  一般式（Ｉ）のａおよびｂの炭素原子の絶対配置がともにＲであり、ｃの炭素原子の絶対配置がＲまたはＳである［１０］記載の培地添加剤。
［１２］  一般式（Ｉ）のａおよびｂの炭素原子の絶対配置がともにＳであり、ｃの炭素原子の絶対配置がＲまたはＳである［１０］記載の培地添加剤。
［１３］  細胞増殖用である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の培地添加剤。
［１４］  動物細胞が複能性幹細胞又は多能性幹細胞である、［１］〜［１３］のいずれかに記載の培地添加剤。
［１５］  動物細胞が、神経幹細胞、神経前駆細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である［１］〜［１３］のいずれかに記載の培地添加剤。
［１６］  下記一般式（Ｉ）で示される縮合多環式化合物またはその製薬学的に許容される塩を含有する動物細胞培養用培地。
【化４】
2017188082.tif 000006
【００１５】
｛式中、Ａは芳香環基、複素環基、または脂肪族環基を示し、Ｂは置換基を有してもよい芳香環、置換基を有してもよい複素環、または置換基を有してもよい脂肪族環を示し、Ｃは置換基を有してもよい複素環基を示し、Tは基中の二つの炭素原子が二重結合、三重結合を有しても良く、また基中の炭素原子が−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−に一部が置換されても良い、置換基を有しても良い炭素数１〜７個からなるアルキレン基を示し、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、置換基を有してもよいアルケニル基、置換基を有してもよいアルキニル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいヘテロアリール基、置換基を有してもよいベンジルオキシ基、置換基を有してもよいアリールオキシ基、置換基を有してもよいヘテロアリールオキシ基、置換基を有してもよいアリールアミノ基、置換基を有してもよいアリールビニル基、または置換基を有してもよいアリールエチニル基を示し、−Ｘ−および−Ｚ−は、それぞれ独立して−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ6−（式中、Ｒ6は置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示す）、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ2−、−ＣＨ2−、−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、または−ＣＯ−を示し、−Ｗ−は−ＮＲ9−（式中、Ｒ9は水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基または置換基を有してもよいアリール基を示す）、−Ｏ−、または−ＣＲ7Ｒ8−（式中、Ｒ7、Ｒ8は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）を示し、Ｙは窒素原子またはＣＨを示し、ａ、ｂ及びｃはそれぞれの炭素原子の位置を示す。但し、ｉ）上記置換基は、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、アリール基、ヘテロアリール基からなる群から選ばれる。ii）Ｘが―ＣＨ2−、−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4およびＲ5は、前記と同義である）のとき、Ｙは窒素原子である。｝
［１７］  Ｂが置換基を有してもよい脂肪族環であり、Ｃが置換基を有してもよい複素環基であり、−Ｘ−が−ＮＨ−、または−ＮＲ6−（式中、Ｒ6は置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示す）であり、Ｙが窒素原子であり、−Ｚ−が−ＣＨ2−または−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4およびＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）であり、−Ｗ−が−ＮＲ9−（式中、Ｒ9は水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基または置換基を有してもよいアリール基を示す）であり、−Ｔ−が、−ＣＲ11Ｒ12−（式中、Ｒ11及びＲ1２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、−ＣＲ13Ｒ14−ＣＲ15Ｒ16−（式中、Ｒ1３〜Ｒ1６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）または−ＣＲ17＝ＣＲ18−（式中、Ｒ17およびＲ18は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）である［１６］記載の培地。
［１８］  Ｃの置換基を有してもよい複素環基が、置換基を有してもよいヘテロアリール基である［１７］記載の培地。
［１９］  Ａがフェニル基であり、Ｃの置換基を有してもよい複素環基が置換基を有してもよいフリル基、置換基を有してもよいチエニル基、置換基を有してもよいオキサゾリル基、置換基を有してもよいイソオキサゾリル基、置換基を有してもよいチアゾリル基、置換基を有してもよいオキサジアゾリル基、置換基を有してもよいチアジアゾリル基、置換基を有してもよいピリジル基、置換基を有してもよいピリドニル基、置換基を有してもよいピリダジニル基、置換基を有してもよいピリミジニル基、置換基を有してもよいイミダゾリル基、置換基を有してもよい４−オキソチアゾリジン−２−チオニル基のいずれかである［１７］記載の培地。
［２０］  Ｂが置換基を有してもよいシクロヘキサン環である［１９］記載の培地。
［２１］  一般式（Ｉ）の−Ｘ−が−ＮＨ−または−Ｎ（ＣＨ３）−であり、Ｙが窒素原子であり、−Ｚ−が−ＣＨ2−であり、−Ｗ−が−ＮＨ−であり、Ｂが置換基を有してもよいシクロヘキサン環であり、Cが置換基を有してもよいオキサゾリル基、置換基を有してもよいチアゾリル基、置換基を有してもよいピリジル基であり、−Ｔ−が、−ＣＲ11Ｒ12−（式中、Ｒ11及びＲ1２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、−ＣＲ13Ｒ14−ＣＲ15Ｒ16−（式中、Ｒ1３〜Ｒ1６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）または−ＣＲ17＝ＣＲ18−（式中、Ｒ17およびＲ18は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）である［２０］記載の培地。
［２２］  一般式（Ｉ）の−Ｘ−が−ＮＨ−または−Ｎ（ＣＨ３）−であり、Ｙが窒素原子であり、−Ｚ−が−ＣＨ2−または−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）であり、−Ｗ−が−ＮＨ−であり、Ａが複素環基であり、Ｂが置換基を有してもよいシクロヘキサン環であり、Cが置換基を有してもよいオキサゾリル基、置換基を有してもよいチアゾリル基、置換基を有してもよいピリジル基であり、−Ｔ−が、−ＣＲ11Ｒ12−（式中、Ｒ11及びＲ1２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、−ＣＲ13Ｒ14−ＣＲ15Ｒ16−（式中、Ｒ1３〜Ｒ1６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）または−ＣＲ17＝ＣＲ18−（式中、Ｒ17およびＲ18は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）である［１７］記載の培地。
［２３］  一般式（Ｉ）の−Ｚ−が−ＣＨ2−であり、Ａがヘテロアリール基である［２２］記載の培地。
［２４］  Ｒ1、Ｒ2およびＲ3の少なくとも一つが、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、メトキシ基、エトキシ基、メチルチオ基、トリフルオロメトキシ基のいずれかで、残りが−Ｈである請求項［２１］記載の培地。
［２５］  一般式（Ｉ）のａ、ｂおよびｃの炭素原子の絶対配置が、それぞれ独立してＲまたはＳである［２１］〜［２３］のいずれかに記載の培地。
［２６］  一般式（Ｉ）のａおよびｂの炭素原子の絶対配置がともにＲであり、ｃの炭素原子の絶対配置がＲまたはＳである［２５］記載の培地。
［２７］  一般式（Ｉ）のａおよびｂの炭素原子の絶対配置がともにＳであり、ｃの炭素原子の絶対配置がＲまたはＳである［２５］記載の培地。
［２８］  細胞増殖用である、［１６］〜［２７］のいずれかに記載の培地。
［２９］  動物細胞が複能性幹細胞又は多能性幹細胞である、［１６］〜［２８］のいずれかに記載の培地。
［３０］  動物細胞が、神経幹細胞、神経前駆細胞、ＥＳ細胞もしくはｉＰＳ細胞である［１６］〜［２８］のいずれかに記載の培地。
［３１］  培地中の、縮合多環式化合物またはその製薬学的に許容される塩が、０．２５μＭ〜２００μＭである、［３０］記載の培地。
［３２］  ［１６］〜［３１］のいずれかに記載の培地中で動物細胞を培養することを特徴とする、動物細胞の培養方法。
［３３］  動物細胞が幹細胞である、［３２］記載の培養方法。
［３４］  培地中で細胞を１日以上培養することを特徴とする、［３２］又は［３３］記載の培養方法。
［３５］  ［１６］〜［３１］のいずれかに記載の培地及び動物細胞を含む、動物細胞培養調製物。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、インスリンを含まない培地であっても、効率良く動物細胞を培養することができる。さらに、本発明化合物は、動物細胞の増殖刺激効果を有するため、動物細胞を効率よく増殖させることが可能となる。また、本発明化合物は、インスリンを含まない培地であっても、幹細胞の増殖を刺激し、幹細胞死を抑制し、その結果、幹細胞の生存率を向上させることができるため、複能性幹細胞及び多能性幹細胞等の幹細胞の培養に特に有用である。さらに、本発明化合物は、幹細胞の未分化性を損なわずに培養することができるため、複能性幹細胞及び多能性幹細胞等の幹細胞の維持培養においても有用である。さらに、本発明によれば、インスリンの代わりに本発明化合物を用いた培地を作製することで、培地中のタンパク成分の量を低減させることが可能となる。従って、本発明の培地中で培養された細胞を移植等の医療用途で用いる場合に、異種由来のタンパク質や組換えタンパク質の混入するリスクを低減させることが可能となり、より安全な治療方法の開発に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明化合物のhiPS細胞増殖刺激効果を示す図である。縦軸は細胞数、横軸は使用した培地を示す。
【図２】図２は、様々な低分子化合物のhiPS細胞増殖刺激効果を示す図である。縦軸は細胞数、横軸は培地中に含まれる各化合物の最終濃度（μＭ）を示す。
【図３】図３は、本発明化合物のhiPS細胞増殖刺激効果を示す図である。縦軸は細胞の累計増殖倍数、横軸は培養日数を示す。
【図４】図４は、本発明化合物又はインスリンを含有する培地中で培養したhiPS細胞の形態を示す図である。
【図５】図５は、本発明化合物又はインスリンを含有する培地中で培養したhiPS細胞における、Nanog及びOct3/4のmRNA発現量を示す図である。
【図６】図６は、本発明化合物又はインスリンを含有する培地中で培養したhiPS細胞における、Nanogタンパク質の免疫染色の結果を示す図である。
【図７】図７は、本発明化合物又はインスリンを含有する培地中で培養したhiPS細胞の分化多能性を示す図である。図中、矢印は各分化マーカーを発現する細胞を示す。
【図８】図８は、本発明化合物の神経幹細胞増殖刺激効果を示す図である。縦軸は細胞数を示す。
【図９】図９は、本発明化合物の神経幹細胞増殖刺激効果を示す図である。縦軸は細胞の累計増殖倍数、横軸は培養日数を示す。
【図１０】図１０は、本発明化合物又はインスリンを含有する培地中で培養した神経幹細胞の未分化状態を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明化合物のケラチノサイト増殖刺激効果を示す図である。縦軸は細胞数、横軸は使用した培地を示す。
【図１２】図１２は、インスリン受容体アゴニストとして知られる化合物Ｍと本発明化合物との増殖刺激効果の比較を示す図である。縦軸は細胞数、横軸は使用した培地を示す。
【図１３】図１３は、インスリン模倣剤として知られるＮａ３ＶＯ４と本発明化合物との増殖刺激効果の比較を示す図を示す図である。縦軸は細胞数、横軸は使用した培地を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常に用いられる意味を有する。
【００１９】
１  動物細胞培養用培地添加剤
本発明の動物細胞培養用培地添加剤（本明細書中、本発明の培地添加剤とも称する）は、下記一般式（Ｉ）で示される縮合多環式化合物（本明細書中、化合物（Ｉ）とも称する）またはその製薬学的に許容される塩を含有することを主たる特徴とする：
【００２０】
【化５】
2017188082.tif 000007
【００２１】
｛式中、Ａは芳香環基、複素環基、または脂肪族環基を示し、Ｂは置換基を有してもよい芳香環、置換基を有してもよい複素環、または置換基を有してもよい脂肪族環を示し、Ｃは置換基を有してもよい複素環基を示し、Tは基中の二つの炭素原子が二重結合、三重結合を有しても良く、また基中の炭素原子が−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−に一部が置換されても良い、置換基を有しても良い炭素数１〜７個からなるアルキレン基を示し、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、置換基を有してもよいアルケニル基、置換基を有してもよいアルキニル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいヘテロアリール基、置換基を有してもよいベンジルオキシ基、置換基を有してもよいアリールオキシ基、置換基を有してもよいヘテロアリールオキシ基、置換基を有してもよいアリールアミノ基、置換基を有してもよいアリールビニル基、または置換基を有してもよいアリールエチニル基を示し、−Ｘ−および−Ｚ−は、それぞれ独立して−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ6−（式中Ｒ6は置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示す）、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ2−、−ＣＨ2−、−ＣＲ4Ｒ5−（Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、または−ＣＯ−を示し、−Ｗ−は−ＮＲ9−（式中Ｒ9は水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基または置換基を有してもよいアリール基を示す）、−Ｏ−、または−ＣＲ7Ｒ8−（式中、Ｒ7、Ｒ8は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）を示し、Ｙは窒素原子またはＣＨを示し、ａ、ｂ及びｃはそれぞれの炭素原子の位置を示す。但し、
ｉ）上記置換基は、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、アリール基、ヘテロアリール基からなる群から選ばれる。
ii）Ｘが−ＣＨ2−、−ＣＲ4Ｒ5−のとき、Ｙは窒素原子である。｝。
【００２２】
以下に、本明細書において使用する用語を定義する。
【００２３】
「低級アルキル基」とは、炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルキル基を示し、具体的に例えばメチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、ｎ-ブチル基、ｎ-ペンチル基、ｎ-ヘキシル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ-ブチル基、ｔｅｒｔ-ブチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ-ペンチル基、ネオペンチル基、２-ペンチル基、３-ペンチル基、ｎ-ヘキシル基、２-ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などがあげられ、好ましくはメチル基、エチル基などがあげられる。
「アリール基」とは、炭素原子で構成される炭素数５〜１２の単環または２環よりなる芳香族置換基を示し、具体的に例えばフェニル基、インデニル基、ナフチル基、フルオレニル基などがあげられ、好ましくはフェニル基があげられる。
【００２４】
「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子があげられる。
「アルキル基」とは、炭素数１〜１８の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルキル基を示し、具体的に例えばメチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、ｎ-ブチル基、ｎ-ペンチル基、ｎ-ヘキシル基、ｎ-へプチル基、ｎ-オクチル基、ｎ-ノニル基、ｎ-デシル基、ｎ-ウンデシル基、ｎ-ドデシル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ-ブチル基、ｔｅｒｔ-ブチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ-ペンチル基、ネオペンチル基、２-ペンチル基、３-ペンチル基、ｎ-ヘキシル基、２-ヘキシル基、ｔｅｒｔ-オクチル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、１−アダマンチル基、などがあげられ、好ましくはｎ-ヘキシル基、ｎ-へプチル基、ｎ-オクチル基、ｎ-ノニル基、ｎ-デシル基、ｎ-ウンデシル基、ｎ-ドデシル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ-ブチル基、ｔｅｒｔ-ブチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ-ペンチル基、ネオペンチル基、２-ペンチル基、３-ペンチル基、ｎ-ヘキシル基、２-ヘキシル基、ｔｅｒｔ-オクチル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、１−アダマンチル基などがあげられ、より好ましくは、イソプロピル基、ｔｅｒｔ-ブチル基、ｔｅｒｔ-オクチル基、１−アダマンチル基などがあげられる。
【００２５】
「アルコキシ基」とは、炭素数１〜１８の直鎖または分岐鎖または環状のアルキル基を有するアルコキシ基を示し、具体的に例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ-プロポキシ基、ｎ-ブトキシ基、ｎ-ペンチルオキシ基、ｎ-ヘキシルオキシ基、ｎ-へプチルオキシ基、ｎ-オクチルオキシ基、ｎ-ノニルオキシ基、ｎ-デシルオキシ基、ｎ-ウンデシルオキシ基、ｎ-ドデシルオキシ基、イソプロポキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ-ブトキシ基、ｔｅｒｔ-ブトキシ基、シクロプロピルオキシ基、シクロブトキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロヘプチルオキシ基、２−シクロヘキシルエトキシ基、１−アダマンチルオキシ基、２−アダマンチルオキシ基、１−アダマンチルメチルオキシ基、２−（１−アダマンチル）エチルオキシ基、トリフルオロメトキシ基などがあげられ、好ましくはメトキシ基、エトキシ基、ｎ-プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ-ブトキシ基、ｔｅｒｔ-ブトキシ基、ｎ-ペンチルオキシ基、ｎ-ヘキシルオキシ基があげられる。
「アルキルチオ基」とは、炭素数１〜１２の直鎖または分岐鎖状または環状のアルキル基を有するアルキルチオ基を示し、具体的に例えばメチルチオ基、エチルチオ基、ｎ-プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ｎ-ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｓｅｃ-ブチルチオ基、ｔｅｒｔ-ブチルチオ基、シクロプロピルチオ基、シクロブチルチオ基、シクロペンチルチオ基、シクロブチルチオ基などがあげられる。
【００２６】
「アルキルスルホニル基」とは、炭素数１〜１２の直鎖または分岐鎖状または環状のアルキル基を有するアルキルスルホニル基を示し、具体的に例えばメタンスルホニル基、エタンスルホニル基、プロパンスルホニル基、ブタンスルホニル基、ペンタンスルホニル基、ヘキサンスルホニル基、ヘプタンスルホニル基、オクタンスルホニル基、ノナンスルホニル基、デカンスルホニル基、ウンデカンスルホニル基、ドデカンスルホニル基などがあげられる。
「アシル基」とは、ホルミル基、または炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルキル基を有するアシル基、または炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルケニル基を有するアシル基、または炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルキニル基を有するアシル基、または置換されていてもよいアリール基を有するアシル基であり、具体的に例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、イソクロトノイル基、ベンゾイル基、ナフトイル基などがあげられる。
「アシルオキシ基」とは、ホルミルオキシ基、または炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルキル基を有するアシルオキシ基、または置換されていてもよいアリール基を有するアシルオキシ基を示し、具体的に例えばホルミルオキシ基、アセチルオキシ基、プロピオニルオキシ基、ブチリルオキシ基、イソブチリルオキシ基、バレリルオキシ基、イソバレリルオキシ基、ピバロイルオキシ基、ヘキサノイルオキシ基、アクリロイルオキシ基、メタクリロイルオキシ基、クロトノイルオキシ基、イソクロトノイルオキシ基、ベンゾイルオキシ基、ナフトイルオキシ基などがあげられる。
【００２７】
「アルキルアミノ基」とは、アルキル基で一置換もしくは二置換されたアミノ基であり、そのアルキル基の例は前記「アルキル基」で示したものがあげられる。具体的に例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、メチルエチルアミノ基などがあげられる。
「アルコキシカルボニル基」とは、炭素数１〜８の直鎖または分岐鎖または環状のアルキル基を有するアルコキシカルボニル基を示し、具体的に例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ-ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｓｅｃ-ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ-ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基などがあげられる。
「カルバモイル基」とは、窒素上に炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖または環状のアルキル基を有してもよいカルバモイル基であり、具体的に例えばカルバモイル基、Ｎ−メチルカルバモイル基、Ｎ−エチルカルバモイル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル基、Ｎ−ピロリジルカルボニル基、Ｎ−ピペリジルカルボニル基、Ｎ−モルホリニルカルボニル基などがあげられる。
「スルホニル基」とは、硫黄原子上に炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖または環状のアルキル基を有してもよいスルホニル基であり、具体的に例えばメチルスルホニル基、エチルスルホニル基、プロピルスルホニル基、ブチルスルホニル基、などがあげられる。
【００２８】
「芳香環」とは、炭素原子で構成される単環または２つの環からなる芳香環をあらわし、具体的に例えばベンゼン環、ナフタレン環、インデン環、フルオレン環などがあげられ、好ましくはベンゼン環、ナフタレン環などがあげられる。
「複素環」とは、炭素および窒素、酸素、イオウなどで構成される５〜７員の１〜３つの環からなる複素環をあらわし、具体的に例えば、ピリジン環、ジヒドロピラン環、ピリダジン環、ピリミジン環、ピラジン環、ピロール環、フラン環、チオフェン環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、ピラゾール環、イミダゾール環、チアゾール環、イソチアゾール環、チアジアゾール環、ピロリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環、インドール環、イソインドール環、ベンゾフラン環、イソベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、ベンゾピラゾール環、ベンゾイミダゾール環、ベンゾオキサゾール環、ベンゾチアゾール環、プリン環、ピラゾロピリジン環、キノリン環、イソキノリン環、ナフチリジン環、キナゾリン環、ベンゾジアゼピン環、カルバゾール環、ジベンゾフラン環、などがあげられ、好ましくはピリジン環、ピリミジン環、ピリダジン環、ピリミジン環、フラン環、チオフェン環などがあげられる。
【００２９】
「芳香族環基」とは、置換基を有しない単環、二環、三環等の芳香族炭化水素基をあらわし、例えばフェニル基、ナフタリル基、アントラセニル基、フェナントレニル基等があげられる。
「複素環基」とは、環原子として、酸素原子、硫黄原子及び窒素原子から選択されるヘテロ原子を１〜４個含有する５〜８員の単環〜３環式の置換基を有しないへテロ環基を示す。
｛なお、環原子である任意の炭素原子がオキソ基で置換されていてもよく、硫黄原子又は窒素原子が酸化されオキシドを形成してもよい。また、ベンゼン環と縮環していてもよく、また、該へテロ環基は、架橋されていてもよく、また、スピロ環を形成しても良い。｝
例えば、ピリジル基、ピリダジニル基、ピリミジル基（＝ピリミジニル基）、ピラジニル基、フリル基、チエニル基、ピロリル基、イソオキサゾリル基、オキサゾリル基、イソチアゾリル基、チアゾリル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、オキサジアゾリル基、チアジアゾリル基、トリアゾイル基、テトラゾリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンズオキサゾリル基（＝ベンゾオキサゾリル基）、ベンゾチアゾリル基、ベンズイミダゾリル基（＝ベンゾイミダゾリル基）、インダゾリル基、ベンズイソキザゾリル基、ベンズイソチアゾリル基、ベンゾフラザニル基、ベンゾチアジアゾリル基、プリニル基、キノリル基（＝キノリニル基）、イソキノリル基、シンノリニル基、フタラジニル基、キナゾリニル基、キノキサリニル基、プテリジニル基、イミダゾオキサゾリル基、イミダゾチアゾリル基、イミダゾイミダゾリル基、ジベンゾフラニル基、ジベンゾチエニル基、カルバゾリル基、アクリジニル基、ピロリジニル基、ピラゾリジニル基、イミダゾリジニル基、ピロリニル基、ピラゾリニル基、イミダゾリニル基、テトラヒドロフラニル基、テトラヒドロチオフェニル基、チアゾリジニル基、ピペリジニル基（＝ピペリジル基）、ピペラジニル基、キヌクリジニル基、テトラヒドロピラニル基、モルホリニル基、チオモルホリニル基、ジオキソラニル基、ホモピペリジニル基（＝ホモピペリジル基）、ホモピペラジニル基、インドリニル基、イソインドリニル基、クロマニル基、イソクロマニル基、８−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−３−イル基、９−アザビシクロ[３．３．１]ノナン−３−イル基、３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−６−イル基、７−アザビシクロ[２．２．１]ペプタン−２−イル基、２−アザトリシクロ[３．３．１．１]デカン−４−イル基、１−アザビシクロ[２．２．２]オクタン−２−イル基、１−アザビシクロ[２．２．２]オクタン−３−イル基、１−アザビシクロ[２．２．２]オクタン−４−イル基、３−アザスピロ[５．５]ウンデカン−９−イル基、２−アザスピロ[４．５]デカン−８−イル基、２−アザスピロ[４．４]ノナン−７−イル基、８−アザスピロ[４．５]デカン−２−イル基等が挙げられる。
【００３０】
「脂肪族環基」とは、置換基を有しない炭素数３〜１０個の非芳香族炭化水素基を示し、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。
「脂肪族環」とは、炭素原子で構成される単環または２つの環からなる脂肪族環をあらわし、具体的に例えばシクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロヘプタン環、シクロオクタン環、デカリン環、ノルボルナン環などがあげられ、好ましくはシクロヘキサン環があげられる。
「ヘテロアリール基」とは、炭素および窒素、酸素、イオウなどで構成される５〜７員の１〜３つの環からなる芳香族複素環基をあらわし、具体的に例えば、ピリジル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、ピロリル基、フラニル基、チエニル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、チアジアゾリル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾフリル基、イソベンゾフリル基、ベンゾチエニル基、ベンゾピラゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾチアゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、ナフチリジニル基、キナゾリル基などがあげられ、好ましくは２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、１−ピラゾリル基などがあげられる。
【００３１】
「アリールオキシ基」とは、酸素原子上にアリール基を有するアリールオキシ基であり、そのアリール基の例は前記「アリール基」で示したものがあげられる。具体的に例えば、フェノキシ基、１−ナフチルオキシ基、２−ナフチルオキシ基などがあげられる。
「ヘテロアリールオキシ基」とは、酸素原子上にヘテロアリール基を有するヘテロアリールオキシ基であり、そのヘテロアリール基の例は前記「ヘテロアリール基」で示したものがあげられる。具体的に例えば、２−ピリジルオキシ基、３−ピリジルオキシ基、４−ピリジルオキシ基、２−ピリミジニルオキシ基などがあげられる。
「アリールアミノ基」とは、窒素原子上にアリール基で置換されたアリールアミノ基であり、そのアリール基の例は前記「アリール基」で示したものがあげられる。具体的に例えば、フェニルアミノ基、１−ナフチルアミノ基、２−ナフチルアミノ基などがあげられる。
「アリールビニル基」とは、アリール基で１位または２位が置換されたビニル基であり、そのアリール基の例は前記「アリール基」で示したものがあげられる。具体的に例えば、１−フェニルビニル基、２−フェニルビニル基などがあげられる。
「アリールエチニル基」とは、アリール基で２位が置換されたエチニル基であり、そのアリール基の例は前記「アリール基」で示したものがあげられる。具体的に例えば、フェニルエチニル基などがあげられる。
【００３２】
「置換基を有してもよい」とは、置換基を有し無い場合、及び置換基を有する場合には、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、アリール基、ヘテロアリール基からなる群から選ばれる置換基により、少なくとも１個以上置換されていることを示し、該置換基は同一または異なっていてもよく、また置換基の位置および数は任意であって、特に限定されるものではない。
【００３３】
以下、一般式（Ｉ）の各基について説明する。
【００３４】
一般式（Ｉ）におけるＡは、芳香環基、複素環基、または脂肪族環基である。Ａは、好ましくは芳香環基または複素環基であり、より好ましくはフェニル基、ピリジル基、ピリミジニル基、チエニル基、ベンゾチエニル基、インドリル基、キノリル基、ベンゾチアゾリル基が好ましく、フェニル基、チエニル基、ベンゾチエニル基、インドリル基、キノリル基、ベンゾチアゾリル基であり、特に好ましくはフェニル基およびベンゾチエニル基である。
【００３５】
一般式（Ｉ）におけるＢは、置換基を有してもよい芳香環、置換基を有してもよい複素環、または置換基を有してもよい脂肪族環である。Ｂは、好ましくは置換基を有してもよい芳香環または置換基を有してもよい脂肪族環であり、より好ましくは置換基を有してもよいベンゼン環または置換基を有してもよいシクロヘキサン環であり、特に好ましくは置換基を有してもよいシクロヘキサン環である。
【００３６】
一般式（Ｉ）におけるＣは、置換基を有してもよい複素環基である。Ｃは、好ましくは置換基を有してもよいフリル基、置換基を有してもよいチエニル基、置換基を有してもよいオキサゾリル基、置換基を有してもよいイソオキサゾリル基、置換基を有してもよいチアゾリル基、置換基を有してもよいオキサジアゾリル基、置換基を有してもよいチアジアゾリル基、置換基を有してもよいピリジル基、置換基を有してもよいピリドニル基、置換基を有してもよいピリダジニル基、置換基を有してもよいピリミジニル基、置換基を有してもよいイミダゾリル基、置換基を有してもよい４−オキソチアゾリジン−２−チオニル基であり、より好ましくは置換基を有してもよいオキサゾリル基、置換基を有してもよいチアゾリル基、置換基を有してもよいピリジル基である。
【００３７】
一般式（Ｉ）におけるＴは、基中の二つの炭素原子が二重結合、三重結合を有しても良く、また基中の炭素原子が−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−に一部が置換されても良い、置換基を有しても良い炭素数１〜７個からなるアルキレン基である。Ｔは、好ましくは原子数１〜２からなる結合であり、より好ましくは−ＣＨ２−、−ＣＲ１１Ｒ１２−（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、同一又は異なってもよくそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、−ＣＲ１３Ｒ１４−ＣＲ１５Ｒ１６−（式中、Ｒ１３〜Ｒ１６は、同一又は異なってもよくそれぞれ独立して、Ｒ１１と同義である）、−ＣＲ１７＝ＣＲ１８−（式中、Ｒ１７およびＲ１８は、同一又は異なってもよくそれぞれ独立して、Ｒ１１と同義である）であり、特に好ましくは−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−であり、最も好ましくは−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００３８】
一般式（Ｉ）におけるＲ1、Ｒ2およびＲ3は、同一または異なってもよく、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、置換基を有してもよいアルケニル基、置換基を有してもよいアルキニル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいヘテロアリール基、置換基を有してもよいベンジルオキシ基、置換基を有してもよいアリールオキシ基、置換基を有してもよいヘテロアリールオキシ基、置換基を有してもよいアリールアミノ基、置換基を有してもよいアリールビニル基、または置換基を有してもよいアリールエチニル基である。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいヘテロアリール基、ベンジルオキシ基、置換基を有してもよいアリールオキシ基、または置換基を有してもよいアリールエチニル基であり、より好ましくは水素原子、ハロゲン原子、水酸基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基であり、特に好ましくは水素原子、メトキシ基、エトキシ基、メチルチオ基である。
【００３９】
一般式（Ｉ）における−Ｘ−および−Ｚ−は、同一または異なってもよく、それぞれ独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ6−（式中、Ｒ6は、置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示す）、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ2−、−ＣＨ2−、−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4、Ｒ5は、同一又は異なってもよくそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、または−ＣＯ−である。
−Ｘ−は、好ましくは−ＮＨ−、−ＮＲ6−（式中、Ｒ6は低級アルキル基を示す）、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＣＨ2−であり、より好ましくは−ＮＨ−および−Ｎ（ＣＨ３）−であり、特に好ましくは−ＮＨ−である。
−Ｚ−は、好ましくは−ＮＨ−および−ＣＲ4Ｒ5−（式中、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立して、水素原子または置換基を有してもよい低級アルキル基を示す）であり、より好ましくは−ＣＨ2−である。
【００４０】
一般式（Ｉ）における−Ｗ−は、−ＣＲ7Ｒ8−（式中、Ｒ7及びＲ8は、同一又は異なってもよくそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基を示す）、−Ｏ−または−ＮＲ9−（式中、Ｒ9は、水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基または置換基を有してもよいアリール基を示す）である。−Ｗ−は、好ましくは−ＮＨ−、−ＮＲ9−（式中、Ｒ9は低級アルキル基を示す）、および−ＣＨ2−であり、より好ましくは−ＮＨ−及び−Ｎ（ＣＨ３）−であり、特に好ましくは−ＮＨ−である。Ｒ9は、好ましくは、水素原子、メチル基である。
【００４１】
一般式（Ｉ）におけるＹは、窒素原子またはＣＨである。但し、−Ｘ−が−ＣＨ2−又は−ＣＲ4Ｒ5−であるとき、Ｙは窒素原子である。Ｙは、好ましくは窒素原子である。
【００４２】
一般式（Ｉ）におけるａ、ｂ、ｃは、それぞれの炭素原子の位置を示す。Ｂが置換基を有してもよいシクロヘキサン環であるとき、ａおよびｂの炭素原子の絶対配置は、好ましくはＲまたはＳであり、より好ましくはＲである。
【００４３】
好適な化合物（Ｉ）としては、
Ａが、芳香環基、複素環基、または脂肪族環基であり、
Ｂが、置換基を有してもよいシクロヘキサン環であり、
Ｃが、置換基を有してもよい複素環基であり、
Ｔが、基中の二つの炭素原子が二重結合、三重結合を有しても良く、また基中の炭素原子が−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−に一部が置換されても良い、置換基を有しても良い炭素数１〜７個からなるアルキレン基であり、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、置換基を有してもよいアルケニル基、置換基を有してもよいアルキニル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいヘテロアリール基、置換基を有してもよいベンジルオキシ基、置換基を有してもよいアリールオキシ基、置換基を有してもよいヘテロアリールオキシ基、置換基を有してもよいアリールアミノ基、置換基を有してもよいアリールビニル基、または置換基を有してもよいアリールエチニル基であり、
−Ｘ−が、−ＮＨ−又は−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、低級アルキル基を表す）であり、
−Ｚ−が、−ＣＨ２−であり、
−Ｗ−が、−ＮＨ−であり、
Ｙが、窒素原子である、
化合物（Ｉ）である。
【００４４】
より好適な化合物（Ｉ）としては、
Ａが、フェニル基またはベンゾチエニル基であり、
Ｂが、置換基を有してもよいシクロヘキサン環であり、
Ｃが、置換基を有してもよいオキサゾリル基、置換基を有してもよいチアゾリル基または置換基を有してもよいピリジル基であり、
Ｔが、−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、それぞれ独立して、水素原子、メトキシ基、エトキシ基またはメチルチオ基であり、
−Ｘ−が、−ＮＨ−であり、
−Ｚ−が、−ＣＨ２−であり、
−Ｗ−が、−ＮＨ−であり、
Ｙが、窒素原子である、
化合物（Ｉ）である。
【００４５】
好適な化合物（Ｉ）の具体例は以下の通りである。
【００４６】
【化６】
2017188082.tif 000008
【００４７】
化合物（Ｉ）は、本発明の所望の効果を達成し得る限り、製薬学的に許容される塩の形であってもよい。製薬学的に許容される塩とは、具体的に例えば十分に酸性である化合物（Ｉ）についてはそのアンモニウム塩、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩などが例示され、これらが好ましい）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩などが例示され、これらが好ましい）、有機塩基の塩としてはたとえばジシクロヘキシルアミン塩、ベンザチン塩、Ｎ-メチル-Ｄ-グルカン塩、ヒドラミン塩、アルギニンまたはリジンのようなアミノ酸の塩などが挙げられる。さらに十分に塩基性である化合物（Ｉ）についてはその酸付加塩、例えば塩酸、硫酸、硝酸、りん酸などの無機酸塩、または酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、モノメチル硫酸等の有機酸塩などが挙げられるがこれらに限定されない。また、場合によっては含水物あるいは水和物であってもよい。
また化合物（Ｉ）は、全ての光学異性体及び幾何異性体などの異性体、水和物、溶媒和物もしくは結晶形を包含するものである。
【００４８】
化合物（Ｉ）及びその製薬学的に許容される塩（本明細書中、これらをまとめて「本発明化合物」とも称する）は、国際公開第２００５／０４２５３６号記載の方法またはそれに準ずる方法により合成できる。
なお、本発明化合物は、通常有機合成で用いられる、抽出、蒸留、結晶化、カラムクロマトグラフィー等の手法を用いて精製することができる。
【００４９】
本発明の培地添加剤は、１種類の本発明化合物を用いてもよく、複数種類の本発明化合物を組み合わせて用いてもよい。
【００５０】
本発明の培地添加剤における本発明化合物の含有量は、０．０１〜１００重量％である。
【００５１】
本発明の培地添加剤は、本発明化合物に加えて、培地添加剤に通常配合され得る各種成分を含有させることができるが、本発明化合物自体を単独で、本発明の培地添加剤として用いてもよい。
【００５２】
本発明の培地添加剤は、所望の効果を損なわない限り、本発明化合物に加え、使用の目的に応じて、血清代替物、培地添加物、脂肪酸をさらに含み得る。
血清代替物としては、例えば、血清アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＧｌｕｔａｍａｘＴＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｂ２７（登録商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，  ｍｉｎｕｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられるが、これらに限定されない。また、Ｎ２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等のインスリンを含む血清代替物の組成からインスリンを除去したものを作製して用いてもよい。
培地添加物としては、Ｙ−２７６３２などのＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤、ペニシリン−ストレプトマイシンなどの抗生物質、ビタミン類、Ｌ−アスコルビン酸、リン酸Ｌ−アスコルビルマグネシウム、ピルビン酸ナトリウム、２−アミノエタノール、グルコース、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、プロゲステロン、セレン化合物（例、亜セレン酸ナトリウム）、プトレシン等が挙げられるが、これらに限定されない。
脂肪酸としては、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、酪酸、酢酸、パルミトレイン酸、吉草酸（バレリアン酸）、カプロン酸、エナント酸（ヘプチル酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、クセン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、８，１１−エイコサジエン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の培地添加物に含まれる脂肪酸は飽和脂肪酸であってもよく、不飽和脂肪酸であってもよい。
本発明の培地添加剤が、本発明化合物に加え、血清代替物、培地添加物、脂肪酸をさらに含む場合、血清代替物、培地添加物、脂肪酸は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。本発明の培地添加剤は、所望の効果を損なわない限り、本発明化合物に加え、従来から細胞の培養に用いられてきた添加物などを適宜含むことができる。
【００５３】
本発明の培地添加剤は、所望の効果を損なわない限り、インスリンを含むものであってよい。本発明の培地添加剤がインスリンを含有する場合、本発明の培地添加剤におけるインスリンの含有量（物質量）は、本発明の培地添加剤中の本発明化合物の物質量に対して、好ましくは１／１００以下、より好ましくは１／１０００以下である。本発明の培地添加剤はインスリンを含有しないことが最も好ましい。
【００５４】
本発明の培地添加剤は、所望の効果を損なわない限り、本発明化合物に加え、さらに、任意の添加剤（例えば、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤等）を適当量含有してもよい。
【００５５】
本発明の培地添加剤は、所望の効果が得られる限り、いかなる剤形であってもよく、例えば、溶液、固形、粉末状等が挙げられる。本発明の培地添加剤の剤形が固形または粉末状である場合、適切な溶媒（例、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒及び緩衝液等）等を使用して所望の濃度になるように溶解し、使用することができる。
【００５６】
本発明の培地添加剤の剤形が溶液である場合、該溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８．５であり、より好ましくは約６〜約８である。本発明の培地添加剤の剤形が溶液である場合、該溶液は、メンブレンフィルター等を用いた濾過滅菌などの滅菌処理を行うことが好ましい。
【００５７】
本発明の培地添加剤は、動物細胞培養用培地に添加されることが好ましい。本発明の培地添加剤は、いずれの動物由来の細胞の培養にも好適に使用することができ、例えば、哺乳動物、鳥、魚、両生動物および爬虫類動物等由来の細胞の培養に用いることができる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明においては、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはマウス等のげっ歯類細胞又はヒト等の霊長類細胞、更に好ましくはヒト細胞が用いられる。
【００５８】
本発明において培養に付される細胞の種類としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹枝状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞、単核細胞等の分化した細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞、神経冠幹細胞、嗅粘膜幹細胞、内皮幹細胞、神経前駆細胞等の複能性幹細胞、肝細胞等の単能性幹細胞等が挙げられる。
本発明の培地添加剤は、好ましくは、ケラチノサイト、単能性幹細胞、複能性幹細胞又は多能性幹細胞の培養に用いられ、より好ましくは多能性幹細胞又は複能性幹細胞、さらに好ましくは胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、神経前駆細胞又は神経幹細胞の培養に用いられる。
【００５９】
本発明化合物は、誘導多能性幹細胞等の幹細胞の未分化状態及び多分化能（又は複分化能）を損なう効果を持たないため、特に、幹細胞の未分化状態及び多分化能（又は複分化能）を維持させながら、幹細胞を増殖させるのに、特に有用である。
本明細書中、「幹細胞」とは、自己複製能及び分化／増殖能を有する未熟な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、単能性幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、胎盤を除く生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
【００６０】
本明細書中、「多能性幹細胞」とは、自己複製能及び分化／増殖能を有する未熟な細胞を意味であって、胎盤を除く生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞の例としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００７  Ｎｏｖ  ３０；１３１（５）：８６１−７２）、精子幹細胞（ｍＧＳ細胞）（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ．２００７  Ｊａｎ；７６（１）：５５−６２）、胚性生殖細胞（Ｍａｔｓｕｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９２  Ｓｅｐ  ４；７０（５）：８４１−７）などが挙げられる。
【００６１】
多能性幹細胞は自体公知の方法により、入手できる。例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、哺乳動物の胚盤胞中の内部細胞塊を培養する方法（例えばＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１４  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載の方法）、体細胞核移植によって作製された初期胚を培養する方法（Ｗｉｌｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９７  Ｆｅｂ  ２７；３８５（６６１９）：８１０−３、Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９８  Ｊｕｌ  ２３；３９４（６６９１）：３６９−７４、Ｗａｋａｙａｍａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１  Ａｐｒ  ２７；２９２（５５１７）：７４０−３）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
さらに胚性幹細胞は所定の機関から入手することもできる。例えば、ヒトＥＳ細胞であるＫｈＥＳ−１細胞、ＫｈＥＳ−２細胞およびＫｈＥＳ−３細胞は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。
【００６３】
誘導多能性幹細胞の入手方法の例としては、核初期化物質（例えば、Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４等）を体細胞へ導入する方法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００６  Ａｕｇ  ２５；１２６（４）：６６３−７６、国際公開第２００７／０６９６６６号）が挙げられるが、これに限定されない。また、誘導多能性幹細胞は、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００７；２（１２）：３０８１−９、Ａｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８  Ａｕｇ  １；３２１（５８８９）：６９９−７０２、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００７  Ｎｏｖ  ３０；１３１（５）：８６１−７２、Ｙｕ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７  Ｄｅｃ  ２１；３１８（５８５８）：１９１７−２０、Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８  Ｊａｎ；２６（１）：１０１−６、などに記載の方法に準じて作製することができるが、これらに限定されない。
【００６４】
さらに誘導多能性幹細胞は所定の機関から入手することもできる。例えばヒトｉＰＳ細胞である２５３Ｇ１細胞、２０１Ｂ７細胞は、ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社から購入することができる。
【００６５】
胚性生殖細胞は、常法に従って始原生殖細胞を単離し、これをＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ）、ｂＦＧＦ（Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）およびＳＣＦ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）の存在下で培養することにより誘導することができる。また、ｍＧＳ細胞はＷＯ２００５／１００５４８に記載される方法に準じて、精巣細胞から作製することができる。
【００６６】
本発明において用いられる多能性幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞であり、より好ましくは誘導多能性幹細胞である。
【００６７】
本明細書中、「複能性幹細胞」とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。複能性幹細胞の例としては、神経幹細胞、神経前駆細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、骨髄幹細胞、生殖幹細胞等が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に用いられる複能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞等の多能性幹細胞由来のものであってもよく、生体組織から分離したものであってもよい。
本明細書中、「神経幹細胞」とは、神経系細胞（神経細胞及びグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど）、並びにそれらの前駆細胞）への複分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を維持し、自己複製能を有する未分化な細胞を意味する。具体的には、神経幹細胞とは、神経細胞及びグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど）を最終的に生み出す能力を有し、かつ、初期化などの特別な操作を加えない限りにおいて、表皮系細胞、血球系細胞、筋肉細胞等の神経系以外の細胞を実質的に生み出さない細胞である。実質的に生み出さないとは、神経幹細胞の生み出す細胞のうち、９０％以上が、神経細胞及びグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど）、並びにそれらの前駆細胞のいずれかである状態を指す。
【００６８】
本発明に用いられる神経幹細胞は、多能性幹細胞由来のもの（Ｂａｉｎ  Ｇら，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．１９９５  Ａｐｒ；１６８（２）：３４２−５７など）、生体組織から分離したもの、線維芽細胞などから多能性幹細胞を経由せずに直接分化誘導したもの（Ｍａｔｓｕｉ  Ｔら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２０１２  Ｊｕｎ；３０（６）：１１０９−１９）などが挙げられ、上記に記載の未分化性を維持し複分化能を維持する細胞であって神経細胞を生み出す能力を維持する限り、特に制限されない。
【００６９】
本明細書中、神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）とは、分裂能を有する未分化な細胞であって、１種以上の神経細胞に最終的に分化する能力を有する細胞を指す。神経前駆細胞は、神経細胞を最終的に生み出すよう運命決定され、かつ神経細胞及びその前駆細胞以外を実質的に生み出さない細胞を指す。
【００７０】
本発明において用いられる細胞は、一種類の細胞であってもよく、複数種類の細胞の混合物であってもよい。
【００７１】
本発明の培地添加剤は、動物細胞増殖用に好適に用いられる。本明細書中、細胞が「増殖」するとは、一定期間培養後に細胞分裂を経て細胞数が増加することを意味する。本明細書中、「動物細胞増殖用」であるとは、動物細胞の増殖刺激及び／又は細胞死の抑制等の動物細胞の増殖に有利な効果をもたらすことを意味する。動物細胞の増殖に有利な効果がもたらされたことは、動物細胞数の増加、動物細胞集団の倍化時間の短縮、動物細胞の増殖速度の上昇又は動物細胞の増殖に関与するマーカーの変化（例、リン酸化ヒストンＨ3陽性細胞の増加）等により確認することができる。
【００７２】
本発明化合物は、動物細胞の増殖を刺激し、動物細胞を増殖させる効果を有するので、一態様として、本発明の培地添加剤は、動物細胞の増殖刺激用に好適に用いられる。本発明の培地添加剤は、好ましくは哺乳動物細胞の増殖刺激用であり、より好ましくは複能性幹細胞及び多能性幹細胞等の幹細胞の増殖刺激用であり、さらに好ましくは多能性幹細胞及び／又は複能性幹細胞の増殖刺激用である。本明細書中、「増殖を刺激する」とは、細胞分裂（例、有糸分裂を介した細胞分裂）を誘発することを意味する。細胞増殖が刺激されたことは、動物細胞の増殖に関与するマーカーの変化（例、リン酸化ヒストンＨ3陽性細胞の増加）等により確認することができる。
【００７３】
本発明化合物は、インスリン低減培地で起こる動物細胞死を抑制する効果を有する。従って、一態様として、本発明の培地添加剤は、複能性幹細胞（好ましくは神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞）及び多能性幹細胞等の、インスリン低減培地での培養により細胞死を起こしやすい細胞の培養に好適に用いられる。本発明の培地添加剤は、複能性幹細胞（好ましくは神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞）及び多能性幹細胞等の、インスリン低減培地で起こる動物細胞死抑制用として特に好適に用いることができる。
【００７４】
本発明の一態様において、動物細胞は、分散細胞である。分散細胞とは、細胞分散を促進するために処理された細胞をいう。分散細胞としては、単一細胞、及び数個（典型的に約２〜５０、２〜２０、又は２〜１０個）の細胞からなる小さな細胞塊を形成している細胞が挙げられる。分散細胞は、浮遊（懸濁）細胞、又は接着細胞であり得る。細胞の分散は、自体公知の方法により行われ得る。このような方法としては、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、酵素（例、トリプシン、コラゲナーゼ）等による処理、機械的な分散（例、ピペッティング）などの操作が挙げられる。一態様において、動物細胞は、細胞分散を促進するために処理された幹細胞である。
【００７５】
本発明の培地添加剤は、生体から分離された細胞の培養（すなわちｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養）に好適に用いられる。また、本発明の培地添加剤は、生体から分離された組織の培養（すなわち、組織培養）に用いることもできる。
【００７６】
本発明の培地添加剤は、培地中のインスリンの作用を代替する効果を有するため、好ましい態様としては、本発明の培地添加剤は、インスリン低減培地に添加するために好適に用いられる。インスリン低減培地については、下記に詳述するとおりである。
【００７７】
２  動物細胞培養用培地
本発明の一実施形態として、本発明は、本発明化合物を含有する、動物細胞培養用の培地（本明細書中、本発明の培地ともいう）を提供する。本発明の培地を用いて動物細胞を培養することにより、動物細胞を効率的に培養させ得る。
【００７８】
本発明の培地中の、本発明化合物の濃度は、動物細胞の増殖刺激等の所望の効果を有する限り特に限定されず、培養に用いる動物細胞の種類、用いる本発明化合物の種類、培養に付す動物細胞のインスリン要求性の度合い等によって適宜設定することができる。当業者であれば例えば実施例に記載の方法にならい、最適な本発明化合物濃度を設定することができる。
【００７９】
本発明の培地中の、本発明化合物の濃度は、動物細胞の増殖刺激等の所望の効果を有する限り特に限定されないが、濃度が高すぎると細胞が死滅するため、通常１ｍＭ以下、好ましくは３００μＭ以下、より好ましくは２００μＭ以下、さらに好ましくは１５０μＭ以下、さらにより好ましくは１２０μＭ以下、特に好ましくは１００μＭ以下、特により好ましくは７０μＭ以下、尚更好ましくは５０μＭ以下、より一層好ましくは３０μＭ以下、さらにより一層好ましくは２５μＭ以下であり、濃度が低すぎても所望の効果が得られない傾向があるため、通常０．０１μＭ以上、好ましくは０．１μＭ以上、より好ましくは０．２μＭ以上、さらに好ましくは０．２５μＭ以上、さらにより好ましくは０．５μＭ以上、特に好ましくは０．８μＭ以上、特により好ましくは１μＭ以上、尚更好ましくは２μＭ以上、一層好ましくは２．５μＭ以上、より一層好ましくは４μＭ以上、さらに一層好ましくは５μＭ以上、特に一層好ましくは８μＭ以上、格別好ましくは１０μＭ以上である。本発明の培地中の、本発明化合物の濃度範囲は、例えば、０．０１μＭ〜１ｍＭ、好ましくは０．２μＭ〜２００μＭ、より好ましくは０．２５μＭ〜１００μＭ、更に好ましくは２．５μＭ〜５０μＭ、特に好ましくは５μＭ〜５０μＭ、さらに好ましくは５μＭ〜３０μＭ、とりわけ好ましくは８μＭ〜３０μＭ、一層好ましくは１０μＭ〜２５μＭである。
【００８０】
特に限定されるものではないが、例えば前記化合物１又はその塩を用いて誘導多能性幹細胞を培養する場合、前記化合物１又はその塩の濃度は、通常３００μＭ以下、より好ましくは２００μＭ以下、さらに好ましくは１５０μＭ以下、さらにより好ましくは１２０μＭ以下、特に好ましくは１００μＭ以下、特により好ましくは７０μＭ以下、尚更好ましくは５０μＭ以下、より一層好ましくは３０μＭ以下、さらにより一層好ましくは２５μＭ以下であり、通常０．０１μＭ以上、好ましくは０．１μＭ以上、より好ましくは０．２μＭ以上、さらに好ましくは０．２５μＭ以上、さらにより好ましくは０．５μＭ以上、特に好ましくは０．８μＭ以上、特により好ましくは１μＭ以上、尚更好ましくは２μＭ以上、一層好ましくは２．５μＭ以上、より一層好ましくは４μＭ以上、さらに一層好ましくは５μＭ以上、特に一層好ましくは８μＭ以上、格別好ましくは１０μＭ以上である。本発明の培地中の、前記化合物１又はその塩の濃度範囲は、例えば、０．０１μＭ〜３００μＭ、好ましくは０．２μＭ〜２００μＭ、より好ましくは０．２５μＭ〜１００μＭ、更に好ましくは２．５μＭ〜５０μＭ、特に好ましくは５μＭ〜５０μＭ、さらに好ましくは５μＭ〜３０μＭ、とりわけ好ましくは８μＭ〜３０μＭ、一層好ましくは１０μＭ〜２５μＭである。
【００８１】
特に限定されるものではないが、例えば前記化合物２又はその塩を用いて誘導多能性幹細胞を培養する場合、前記化合物２又はその塩の濃度範囲は、例えば、約０．２５μＭ〜約２００μＭ、好ましくは約５μＭ〜約５０μＭである。
特に限定されるものではないが、例えば前記化合物３又はその塩を用いて誘導多能性幹細胞を培養する場合、前記化合物３又はその塩の濃度範囲は、例えば、約０．２５μＭ〜約２５μＭ、好ましくは約５μＭ〜約２５μＭである。
特に限定されるものではないが、例えば前記化合物４又はその塩を用いて誘導多能性幹細胞を培養する場合、前記化合物４又はその塩の濃度範囲は、例えば、約０．２５μＭ〜約２００μＭ、好ましくは約５μＭ〜約５０μＭである。ここで、「約」とは±10%を許容する意味で用いる。
特に限定されるものではないが、例えば前記化合物５又はその塩を用いて誘導多能性幹細胞を培養する場合、前記化合物５又はその塩の濃度範囲は、例えば、約０．２５μＭ〜約２００μＭ、好ましくは約５μＭ〜約５０μＭである。
【００８２】
本発明の培地は、所望の効果を損なわない限り、本発明化合物に加え、さらに適当な濃度のインスリンを含んでもよい。
本発明の化合物に加えてインスリンを含む場合、培地中のインスリン濃度が高すぎると所望の効果を得られないため、本発明の培地は、動物細胞の増殖に寄与しない程度にインスリン濃度が低減された培地（本明細書中インスリン低減培地とも称する）であることが好ましい。用いる動物細胞の種類やインスリン要求度等によっても異なるが、インスリン低減培地中のインスリン濃度は、例えば、３００ｎＭ以下、好ましくは５０ｎＭ以下、更に好ましくは５ｎＭ以下であり、最も好ましくはインスリンを実質的に含まない。本発明の培地が「インスリンを実質的に含まない」とは、インスリンを全く含まない場合か、あるいはインスリンの濃度が、１００ｐＭ以下、好ましくは１０ｐＭ以下、更に好ましくは１ｐＭ以下である場合のいずれかであることを意味する。
【００８３】
本発明の培地に含まれる、本発明化合物以外の成分については、所望の効果を達成し得る限り特に限定されず、通常の動物細胞の培養に使用される組成を適宜採用し得る。
【００８４】
本発明の培地は、動物細胞の培養が可能な培地に本発明化合物を、上記濃度となるように添加することにより作製することができる。培地の作製には、１種類の本発明化合物を用いてもよく、複数種類の本発明化合物を組み合わせて用いてもよい。
【００８５】
本発明の培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製してもよい。基礎培地としては、動物細胞の増殖刺激等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、例えば、イーグル基礎培地（ＢＭＥ培地）、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ  ｍｅｄｉｕｍ）、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。
本発明の培地を多能性幹細胞の培養用として用いる場合、多能性幹細胞培養用として通常用いられる培地を基礎培地として調製してもよい。市販の幹細胞培養用の基礎培地としては、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴｅＳＲ２培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＲＨＢ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．）、ＴｅＳＲＴＭ−Ｅ６（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｈＥＳＦ−ＧＲＯ培地（ニプロ株式会社）、ＨＥＳＦ−ＤＩＦ培地（ニプロ株式会社）、ＣＳＴＩ−７（株式会社細胞科学研究所）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等が挙げられる。
上記基礎培地中に、あらかじめインスリンが含まれている場合には、上記の基礎培地の組成からインスリンを除いた組成の培地を調製し、基礎培地として用いてもよい。
【００８６】
本発明の培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、含有成分が化学的に決定された培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ；ＣＤＭ）である。本発明の培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、無血清培地であることが好ましい。本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２）などの増殖因子）を含む培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。
【００８７】
無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物の例としては、本発明の培地添加剤が含み得る血清代替物の例（上述）と同様のものが挙げられる。
【００８８】
通常、本発明の培地は、全ての必須アミノ酸（Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−バリン）を含む。
【００８９】
本発明の培地は、好ましくは、全ての非必須アミノ酸（Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、グリシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−プロリン）を含む。ここで、Ｌ−グルタミンに代えて、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを用いてもよい。
【００９０】
本発明の培地は、上述の２０種のアミノ酸に加えて、Ｌ−シスチン等の天然アミノ酸を含んでいてもよい。
【００９１】
本発明の培地は、さらに培地添加物を含有してもよい。培地添加物の例としては、本発明の培地添加剤が含み得る培地添加物の例（上述）と同様ものが挙げられる。添加物は自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。本発明の培地に含まれる好ましい培地添加物としては、トランスフェリン、セレン化合物（例、亜セレン酸ナトリウム）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
本発明の培地は、イノシトール、塩化コリン、葉酸、Ｄ−パントテン酸カルシウム、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、ナイアシンアミド、ビタミンＢ１２、リボフラビン（ビタミンＢ２）、Ｄ−ビオチン、Ｄ−グルコース、ピルビン酸ナトリウム、ヒポキサンチン、チミジン、リポ酸、プトレシン塩酸塩から成る群より選択される培地添加物を好ましくは１以上、より好ましくは２以上、さらに好ましくは３以上、さらにより好ましくは４以上含む。
【００９３】
本発明の培地は、脂肪酸を含んでもよい。本発明の培地に含まれる脂肪酸の例としては、本発明の培地添加剤が含み得る脂肪酸の例（上述）と同様ものが挙げられる。本発明の培地に含まれる脂肪酸は飽和脂肪酸であってもよく、不飽和脂肪酸であってもよい。
【００９４】
本発明の培地は、その使用目的に応じて、公知の細胞培養に使用される組成を適宜採用し得る。例えば、幹細胞の未分化性を維持させたまま増殖させることを目的とする場合、本発明の培地は、幹細胞の分化を促進させる効果を有する物質を含まないことが好ましく、幹細胞の分化を抑制する効果を有する物質を含むことが好ましい。幹細胞の分化を抑制する効果を有する物質としては、例えば、ヒト多能性幹細胞については、ＦＧＦ２等を、マウス多能性幹細胞については、白血病阻止因子（ＬＩＦ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００９５】
多能性幹細胞の未分化性を維持させたまま増殖させることを目的とする場合、本発明の培地の具体的な例とは、多能性幹細胞の未分化性を維持させたまま増殖させるための培地としては、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地にＬ−アスコルビン酸、セレン、トランスフェリン、ＮａＨＣＯ３、ＦＧＦ２及びＴＧＦ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）β１を添加した培地（Ｃｈｅｎ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１  Ｍａｙ；８（５）：４２４−４２９）に本発明化合物を添加した培地、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に非必須アミノ酸、Ｌグルタミン、βメルカプトエタノール、トランスフェリン、コレステロール、血清アルブミン、ピペコリン酸、塩化リチウム、ＦＧＦ２及びＴＧＦβ１を添加した培地（Ｌｕｄｗｉｇ  ＴＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６  Ａｕｇ；３（８）：６３７−４６）に本発明化合物を添加した培地、白血病抑制因子、ポリビニルアルコール、Ｌ−グルタミン、トランスフェリン、セレニウム、２−メルカプトエタノール及び抗生物質を添加したマウス胚性幹細胞維持用の無血清培地（特開２００７−２２８８１５号公報）に本発明化合物を添加した培地などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
例えば、本発明の培地を動物細胞の培養用に用いる場合、本発明の培地は、基礎培地に、本発明化合物、トランスフェリン、セレン化合物（例、亜セレン酸ナトリウム）を添加して調製することができるが、これに限定されない。本発明の培地を動物細胞の培養用に用いる場合、本発明の培地は、好ましくは、NaHCO3、L-アスコルビン酸、本発明化合物、トランスフェリン、セレン化合物（例、亜セレン酸ナトリウム）を含み、さらに好ましくはDMEM/F-12を基礎培地とし、NaHCO3、L-アスコルビン酸、本発明化合物、トランスフェリン、セレン化合物（例、亜セレン酸ナトリウム）を添加して調製することができるが、これに限定されない。
【００９７】
例えば、本発明の培地を多能性幹細胞の培養用に用いる場合、本発明の培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を基礎培地として、Ｌ−アスコルビン酸、セレン化合物（例、亜セレン酸ナトリウム）、トランスフェリン、ＦＧＦ２及びＴＧＦβ１に加え、本発明化合物を終濃度０．２５μＭ〜２００μＭとなるように添加して調製することができるが、これに限定されない。
例えば、本発明の培地を神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養用に用いる場合、本発明の培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を基礎培地として、プロゲステロン、プトレシン、セレン、トランスフェリン、ＦＧＦ２及びトランスフェリンに加え、本発明化合物を終濃度１μＭ〜５０μＭとなるように添加して調製することができるが、これに限定されない。
例えば、本発明の培地をケラチノサイトの培養用に用いる場合、本発明の培地は、ＨｕＭｅｄｉａ  ＫＧ２  ｂａｓａｌを基礎培地として、ヒト血清アルブミン、ハイドロコルチゾン、ヒトＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ゲンタマイシン、及びアンフォテリシンＡに加え、本発明化合物を終濃度１μＭ〜５０μＭとなるように添加して調製することができるがこれに限定されない。
例えば、本発明の培地を、多能性幹細胞及び複能性幹細胞などの幹細胞からの分化誘導のための培養用に用いる場合、本発明の培地は、幹細胞を所望の細胞に分化させるための公知の因子を含み得る。
上記に例示した培地の使用目的は、本発明の培地の使用の目的を何ら制限するものではない。
【００９８】
本発明の培地のｐＨは、約６．０〜約８．５であることが好ましく、より好ましくは約７．０〜約７．５に調整される。培地は、メンブレンフィルター等を用いた濾過滅菌などの滅菌処理を行うことが好ましい。
【００９９】
本発明の培地は、接着培養、浮遊培養、包埋培養、組織培養等のいずれの培養方法にも用いることができる。
【０１００】
本発明の培地は、動物細胞を培養するために用いられることが好ましい。本発明の培地を用いて培養し得る動物細胞の例としては、本発明の培地添加剤を用いることができる動物細胞の例（上述）と同様のものが挙げられ、その好適な態様も同様である。
【０１０１】
本発明の培地は、動物細胞の増殖を刺激する等の効果を有するため、本発明の培地は、動物細胞増殖用に用いることができる。本発明の培地は幹細胞の増殖を刺激し細胞死を抑制する効果を有するため、特に幹細胞の培養に有用である。一態様において、本発明の培地は、幹細胞の未分化状態を維持させながら、幹細胞を増殖維持するために用いられる。
【０１０２】
本発明の培地を、動物細胞増殖用に用いる場合、本発明の培地は、細胞増殖促進に働く濃度で本発明化合物を含有することが好ましい。本明細書中、「細胞増殖促進に働く濃度で」本発明化合物を含有するとは、本発明の培地中で動物細胞を培養した時に、本発明化合物を含有しないこと以外は組成が同一な対照培地中で培養した時と比較して、細胞増殖が促進されるのに十分な濃度で本発明化合物を含有することを意味する。
当該濃度は、本発明の培地中で一定数（例、５０００細胞）の動物細胞を一定期間（例、４日）培養した時に得られる細胞の数（Ｘ）と、上記対照培地中同一条件下で培養した時に得られる細胞の数（Ｙ）との比（Ｘ／Ｙ）が、好ましくは１．２以上、より好ましくは２以上、さらに好ましくは５以上であるか、若しくはＹが０でありＸが培養前の細胞数以上である程度、あるいはインスリン含有培地（例、インスリン３μＭを含む培地）で培養した場合と同等である程度に細胞増殖が促進されるのに十分な濃度である。
【０１０３】
３  動物細胞の培養方法
本発明は、本発明化合物を含む培地中で、動物細胞を培養することを含む、動物細胞の培養方法を提供する。「本発明化合物を含む培地」としては、上記本発明の培地が挙げられる。従って、本発明は、本発明の培地中で動物細胞を培養することを特徴とする、動物細胞の培養方法を提供する（本明細書中、これらの方法をまとめて「本発明の方法」とも称する）。本発明の方法に関連する各用語の定義及び態様は、上記に記載したものと同一である。
【０１０４】
本発明の方法において、動物細胞の培養は、本発明化合物を含む培地中に、動物細胞を播種することにより行ってもよく、動物細胞を含む培地中に本発明化合物を添加し、該動物細胞を培養することにより行ってもよい。本発明の方法において使用する培地の組成は、上記「本発明の培地」に記載された組成に準ずる。
【０１０５】
本発明の方法において用いられる本発明化合物は、１種類であってもよく、複数種類の本発明化合物を組み合わせて用いてもよい。
【０１０６】
本発明の方法により培養し得る動物細胞の例としては、本発明の培地添加剤を用いることができる動物細胞の例（上述）と同様ものが挙げられ、その好適な態様も同様である。
【０１０７】
本発明の方法における、培地中の動物細胞の濃度は、所望の効果を有する限り特に制限されないが、通常１０２〜１０６個／ｃｍ３、好ましくは、１０３〜１０６個／ｃｍ３、より好ましくは１０４〜１０５個／ｃｍ３である。
【０１０８】
本発明の方法における培養条件は、本発明化合物（又は本発明の培地添加剤）が用いられることを除いては、所望の効果を達成し得る限り特に限定されず、培養の目的に応じて通常の動物細胞の培養に用いられる培養条件を適宜採用し得る。
【０１０９】
例えば、多能性幹細胞の未分化性を維持させたまま培養する方法としては、実験医学別冊目的別で選べる細胞培養プロトコール（羊土社）などに記載の方法が挙げられる。多能性幹細胞の培養はマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）やマウス線維芽細胞株（ＳＴＯ）などのフィーダー細胞を用いてもよく、フィーダーフリー環境下で行ってもよい。
【０１１０】
本発明の方法において、細胞の培養に用いられる培養器は、細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルなどが挙げられる。
【０１１１】
細胞の培養に用いられる培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。
細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の任意の細胞支持用基質又はそれらの機能をミミックする人工物でコーティングされたものであり得る。細胞支持用基質は、幹細胞又はフィーダー細胞（用いられる場合）の接着を目的とする任意の物質であり得る。
【０１１２】
その他の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、細胞の増殖刺激等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。酸素濃度は、通常１〜４０％であるが、培養条件などにより適宜選択される。
【０１１３】
本発明の方法において、動物細胞は、接着培養、浮遊培養、組織培養などの自体公知の方法により培養可能である。
【０１１４】
本発明の方法における動物細胞を培養する期間は、所望の効果を達成し得る限り特に制限されるものではないが、好ましくは１日間以上、より好ましくは２日間以上、さらに好ましくは４日間以上であり、理論的には無限に培養を継続することができる。本発明の培地中で培養した動物細胞を回収し、その一部又は全部を本発明化合物を含む新鮮な培地（例、本発明の培地）中に継代し、引き続き培養を続けることにより、長期間に亘り増殖させることができる。
【０１１５】
本発明の方法によれば、動物細胞の増殖を刺激し細胞死を抑制することができるため、動物細胞を効率的に増殖させることが可能となる。特に、本発明の方法は、幹細胞を増殖を刺激し幹細胞死を抑制するため、幹細胞の培養に有用である。従って、本発明の方法は、好ましくは動物細胞を増殖させるための培養方法であり、より好ましくは幹細胞を増殖させるための培養方法である。一態様において、本発明の方法は、幹細胞の未分化状態を維持させながら、幹細胞を増殖させるための方法である。
【０１１６】
４  動物細胞培養組成物
本発明はさらに上記本発明の培地並びに動物細胞を含んでなる、培養組成物（本明細書中、本発明の培養組成物ともいう）を提供する。該培養組成物は、細胞を培養することにより得られる結果物を含む。本発明の培養組成物に関連する各用語の定義及び態様は、上記に記載したものと同一である。
【０１１７】
本発明の培養組成物における動物細胞は、生存し、増殖している細胞である。
【０１１８】
本発明の培養組成物において、動物細胞は、本発明の培地中に存在する。一態様において、本発明の培養組成物は、動物細胞の、本発明の培地中の懸濁液である。本発明の培養組成物は、適切な容器中に封入されていてもよい。
【０１１９】
一実施態様として、本発明の培養組成物は凍結保存させた状態で提供され得る。本発明の培養組成物は、凍結保存することが可能であり、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。凍結保存は、自体公知の細胞凍結保存方法を使用することができる。凍結保存の例としては、本発明の培養組成物にジメチルスルホキシドを加え、−８０〜−２００℃、好ましくは−１９６℃（液体窒素中）の条件で本発明の培養組成物を保存する。
【０１２０】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０１２１】
方法
培地の作製
ヒトiPS細胞（hiPS細胞）培養用培地として、E8培地（Chen et al., Nat Methods., 8,424-429, 2011 参照）の組成からインスリンを除去した、インスリン不含E8培地を作製した。表１に組成を示す。インスリン含有E8培地は、上記培地にヒトインスリン（最終濃度19.4 mg/L）を添加することで作製した。
Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ  ｎｅｕｒｏ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｌｉｋｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ（LtNES細胞）培養用培地として、インスリン不含N2B27培地を作製した。最終組成を表２に示す。インスリン不含N2サプリメントとして、既報のN2サプリメントの組成からインスリンを除去したものを作製した。インスリン不含B-27サプリメントは、市販のB-27 minus insulinサプリメント（Thermo Scientific）を用いた。これらのインスリン不含サプリメントとD-MEM/F12基礎培地を混合し、インスリン不含N2B27培地を作製した。インスリン含有N2B27培地は、上記培地にヒトインスリン（最終濃度4.5mg/L）を添加することで作製した。
ヒトケラチノサイト培養用培地として、インスリン不含ケラチノサイト培養用培地を作製した。最終組成を表３に示す。市販のHuMedia KG2培地（クラボウ）の基礎培地にリコンビナントヒト血清アルブミン（rHSA）、Hydrocortisone、hEGF（Epidermal growth factor）、Gentamycin、Amphotericin Aを添加することで、インスリン不含ケラチノサイト培養用培地を調製した。インスリン含有ケラチノサイト培養用培地は、ヒトインスリン（最終濃度10 mg/L）を添加することで作製した。【０１２２】
【表１】
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【０１２３】
【表２】
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【０１２４】
【表３】
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【０１２５】
細胞培養
未分化ヒトiPS細胞は、201B7株のhiPS細胞(Takahashi et al., Cell 131, 861-872. 2007参照)を用いた。培養基底膜マトリックスとしてiMatrix-511（ニッピ）をコートした12-wellもしくは48-wellのプレート（日本ベクトンディッキンソン）を用い、5% CO2/37 ℃の条件で既報の手法（Nakagawa et al., Scientific Reports 4, 3594, 2014参照）に従って維持培養した。細胞はY-27632（ナカライテスク）を10μM添加した培地にシングルセル播種し、翌日以降はY-27632を添加していない培地で培養した。細胞の剥離には、50%トリプルセレクト（Life Technologies）/EDTAを使用した。
ヒトLtNES細胞株は、既報の手法（Koch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 3225-3230, 2009 参照）で樹立したLtNES細胞株を用いた。培養基底膜マトリックスとしてPoly-ornithine/Mouse Laminin（Life Technologies）をコートした12-wellもしくは48-wellのプレートを用い、5% CO2/37 ℃の条件で行った。細胞の剥離には、トリプルセレクトを使用した。細胞は培地にシングルセル播種し2日ごとに培地交換を行った。
ヒトケラチノサイトは、クラボウより入手したHuman epidermal keratinocytes,adult (P1)を用いた。細胞培養は48-wellのプレートを用い、5% CO2/37 ℃の条件で行った。【０１２６】
hiPS細胞の三胚葉分化
インスリン含有E8培地又は不含E8培地で3継代培養したhiPS細胞を、24-wellプレートに15,000 細胞/wellの濃度で播種した。bFGFを含まない上記培地でそれぞれの細胞を14日間培養し、三胚葉への自発的な分化を誘導した。【０１２７】
細胞数の定量
細胞数の定量は、以下の2種類の方法で行った。12-wellプレートで培養を行った場合、細胞を50%トリプルセレクトにて剥離し、ピペッティングによりシングルセル化した後に生死細胞オートアナライザーCountess（Life Technologies）を用いて生細胞数を測定した。オートアナライザーにて測定された生細胞数を基に細胞増加倍率を算出した。48-wellプレートで培養を行った場合、10%(v/v)の WST-8試薬（Cell Counting Reagent SF、ナカライテスク社）を含む培地を150 μＬ加え、5% CO2/37 ℃で1-3時間インキュベートした。呈色した培地の450 nm （参照波長650 nm）における吸光度をマイクロプレートリーダーSH-9000（コロナ電気）で測定することにより、生細胞数の定量を行った。【０１２８】
リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析
各細胞のTotal RNAをMaxwell 16 LEV simplyRNA Purification Kits (Promega)を使用して抽出した。Total RNAは濃度測定を行った後、PrimeScript RT Master Mix（タカラバイオ）を用いて逆転写を行うことでcDNAを合成した。各cDNAと表４に示す各プライマーセット、Fast SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）を混合し、7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を用いてリアルタイムPCRを行った。各サンプルはN=2の平均値を採用し、β-Actinの発現量で標準化した後、相対定量を行った。【０１２９】
【表４】
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【０１３０】
免疫染色
各培養細胞を4% パラホルムアルデヒドりん酸緩衝液（ナカライテスク）を用いて室温で20分間固定化を行った。ブロッキング溶液（0.03% Triton-X 100, 5% BSA含有PBS）を添加して4 ℃で1時間インキュベートし、固定化した細胞のブロッキングを行った。表５に示す一次抗体を各希釈倍率で添加したブロッキング溶液を加え、抗原抗体反応を4 ℃で終夜行った。PBSで3回洗浄した後、表６に示す各倍率で希釈した二次抗体と1000倍希釈したHoechst33342（同人化学）を添加したブロッキング溶液を加え、4 ℃で1時間インキュベーションした。PBSで3回洗浄した後、蛍光顕微鏡EVOS FL Cell Imaging System（Life Technologies）を用いて観察および写真撮影を行った。【０１３１】
【表５】
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【０１３２】
【表６】
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【０１３３】
化合物
実施例において用いた化合物１〜５を下記表７に示す。【０１３４】
【表７】
2017188082.tif 000015
【０１３５】
実施例
実施例1. ヒトiPS細胞に対する本発明化合物のhiPS細胞増殖促進機能
インスリンを含まないE8培地 (Insulin−)に化合物1濃度を変えて添加することで、hiPS細胞増殖の本発明化合物に対する濃度依存性を評価した。48-wellプレートに201B7株hiPS細胞を5,000細胞播種し、インスリンを含まないE8培地（Insulin−）、インスリンを含むE8培地（Insulin）、インスリンを含まず化合物1を含む培地（Insulin−, 化合物1）で４日間培養した。生細胞数の定量結果を図1に示す。Insulin−培地で培養したhiPS細胞がほとんど死滅したのに対し、培地に化合物1を添加すると化合物1の濃度依存的にhiPS細胞が増殖した。また、細胞の最大増殖活性はインスリンと同程度であった。この結果より、化合物1がインスリンを代替してhiPS細胞の増殖を促進することが明らかになった（図１）。【０１３６】
実施例2．本発明化合物群のhiPS細胞増殖促進活性
本発明化合物群（化合物1, 化合物2, 化合物3, 化合物4, 化合物5）をInsulin−培地に添加し、それぞれの化合物のhiPS細胞増殖促進活性を評価した。48-wellプレートに201B7株hiPS細胞を5,000細胞播種し、各培地中で４日間培養した。生細胞数の定量結果を図2に示す。化合物1, 化合物2, 化合物3, 化合物4, 化合物5を添加した培地は明らかなhiPS細胞増殖活性(Absorbance値 > 0.05)を示した。これらの化合物は既報（国際公開第２００５／０４２５３６号）において糖取り込み促進活性のEC50値が0.1μg/mL以下であり、そのようなEC50値を持つ化合物についてインスリン代替能を有することが明らかになった。【０１３７】
実施例3. 本発明化合物を用いたhiPS細胞の未分化維持培養
実際のhiPS細胞培養で行われるような細胞の継代を行うことで、本発明化合物を用いた維持培養が可能かを調べた。インスリンもしくは20 μMの化合物1を含有するE8培地を用い、12-wellプレート上でhiPS細胞を継代培養した。細胞増殖の定量結果を図3に示す。化合物1含有E8培地を用いることで、インスリンを含有するE8培地と同様な効率でhiPS細胞を維持し、増殖できることが明らかになった。また、細胞の形態も両培地で大きく異なることはなかった（図4）。【０１３８】
また、3継代終了後のhiPS細胞の未分化マーカーの発現を評価した。NanogおよびOct3/4のmRNA発現量をリアルタイムPCRにより定量した結果を図5に示す。また、細胞内のNanogタンパク質を免疫染色した結果を図6に示す。化合物1含有E8培地で培養したhiPS細胞は、インスリンを含有するE8培地と同様にNanogやOct3/4を発現しており、未分化維持能が保たれていることが明らかになった。これらの結果より、本発明化合物を用いることで、インスリンを含まずともhiPS細胞の未分化維持培養が可能であり、未分化状態のhiPS細胞を効率よく増殖させることが可能であることが分かった。【０１３９】
実施例4. 本発明化合物を用いて培養したhiPS細胞の分化多能性評価
化合物1培地で維持培養したhiPS細胞が、三胚葉（外胚葉: Ectoderm、中胚葉: Mesoderm、内胚葉: Endoderm）の全てに分化する分化多能性を有するか評価を行った。bFGFを除いた培地でhiPS細胞を培養することで細胞が三胚葉へ自発的に分化することが知られている（Nakagawa et al., Scientific Reports 4, 3594, 2014参照）。我々はbFGFを含まないインスリン含有培地と20μMの化合物1を含有するE8培地を作製し、それぞれを用いて201B7株のhiPS細胞を2週間培養することで三胚葉へ分化させた。固定した細胞に対して三胚葉のバイオマーカー（外肺葉：Tuj1、中胚葉：α-SMA、内胚葉：AFPおよびSOX17）を免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察することでそれぞれの細胞に分化しているか確認した。
免疫染色結果を図7に示す。化合物1含有E8培地で維持培養し、分化させた細胞は三胚葉全ての分化マーカーを発現していることを確認した。この結果より、化合物1含有培地で培養した細胞が三胚葉の細胞に分化可能な多能性を有することが明らかになった。【０１４０】
実施例5. LtNES細胞に対する化合物1の細胞増殖促進機能
インスリンを含まないN2B27培地 (Insulin−)に化合物1濃度を変えて添加することで、LtNES細胞増殖の本発明化合物に対する濃度依存性を評価した。48-wellプレートにLtNES細胞を40,000細胞播種し、インスリンを含まないLtNES培地（Insulin−）、インスリンを含むLtNES培地（Insulin）、インスリンを含まず化合物1を含むLtNES培地（Insulin−, 化合物1）で7日間培養した。生細胞数の定量結果を図8に示す。Insulin−培地で培養したLtNES細胞がほとんど死滅したのに対し、培地に化合物1を添加すると化合物1の濃度依存的にhiPS細胞が増殖した。この結果より、化合物1がインスリンを代替してLtNES細胞の増殖を促進することが明らかになった。【０１４１】
実施例6. 本発明化合物を用いたLtNES細胞の維持培養
実際のLtNES細胞培養で行われるような細胞の継代を行うことで、本発明化合物を用いた維持培養が可能かを調べた。インスリンもしくは20 μMの化合物1を含有するN2B27培地を用い、12-wellプレート上でLtNES細胞を継代培養した。細胞増殖の定量結果を図9に示す。化合物1含有N2B27培地を用いることで、インスリンを含有するN2B27培地と同様な効率でhiPS細胞を維持し、増殖できることが明らかになった。
また、3継代終了後のLtNES細胞のマーカー（Nestin）を免疫染色した結果を図10に示す。化合物1含有N2B27培地で培養したLtNES細胞は、インスリンを含有するN2B27培地で培養したLtNES細胞と同様にNestinを発現しており、LtNES細胞としての未分化維持能が保たれていることが明らかになった。これらの結果より、本発明化合物を用いることで、インスリンを含まずともLtNES細胞を効率よく維持培養できることが分かった。【０１４２】
実施例7. ケラチノサイトに対する本発明化合物の細胞増殖促進機能
インスリンを含まないケラチノサイト培養用培地(Insulin−)に化合物1濃度を変えて添加することで、本発明化合物のケラチノサイトに対する細胞増殖促進能を評価した。48-wellプレートにヒトケラチノサイト7,500細胞播種し、インスリンを含まない培地（Insulin−）、インスリンを含む培地（Insulin）、インスリンを含まず化合物1を含む培地（Insulin−, 化合物1）で3日間培養した。生細胞数の定量結果を図11に示す。Insulin−培地で培養したケラチノサイトに対し、化合物1を添加した培地ではケラチノサイトの増殖効率が明らかに向上した。また、その増殖活性はインスリン含有培地と同程度であった。この結果より、化合物1がインスリンを代替してケラチノサイトの増殖を促進することが明らかになった。【０１４３】
実施例8. 他社インスリン受容体活性化化合物との比較
化合物1、化合物M（Sajjad et al., J. Biol. Chem., 275, 36590, 2000記載のCompound 2）もしくはNa3VO4（Green A., Biochem J., 238, 663-669, 1986参照）をInsulin−培地に添加し、それぞれの化合物のhiPS細胞増殖促進活性を評価した。48-wellプレートに201B7株hiPS細胞を5,000細胞播種し、各培地中で5日間培養した。生細胞数の定量結果を図12, 13に示す。化合物1を添加した培地は明らかなhiPS細胞増殖活性を示したのに対し、化合物MおよびNa3VO4は増殖促進活性を示さなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明によれば、インスリンを含まない培地であっても、効率良く動物細胞を培養することができる。さらに、本発明化合物は、動物細胞の増殖促進効果を有するため、動物細胞を効率よく増殖させることが可能となる。また、本発明化合物は、多能性幹細胞や複能性幹細胞等の未分化な細胞の未分化性を損なわずに培養できるため、本発明は特に幹細胞の培養に有用である。さらに、本発明によれば、インスリンの代わりに本発明化合物を用いた培地を作製することで、培地中のタンパク成分の量を低減させることが可能となる。従って、本発明の培地中で培養された細胞を移植等の医療用途で用いる場合に、異種由来のタンパク質や組換えタンパク質の混入するリスクを低減させることが可能となり、より安全な治療方法の開発に貢献することができる。【０１４５】
本出願は、日本で出願された特願２０１６−０８９８４３（出願日：２０１６年４月２７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2017188082.tif 000019
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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