(57)【要約】  本発明は免疫チェックポイント阻害剤とアジュバント組成物を組み合わせて含む、がん又は感染症を治療するための医薬に関する。より詳細には、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と、二本鎖ＲＮＡと一本鎖ＯＤＮから構成される核酸アジュバントを併用することを特徴とする、がん又は感染症の医薬に関する。
2018021400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫チェックポイント阻害剤、及びアジュバント組成物を組み合わせて含む、がん又は感染症を治療するための医薬であって、
前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含み、
前記アジュバント組成物が、二本鎖ＲＮＡと、ＣｐＧ ＯＤＮにおいてＣｐＧがＧｐＣ、ＴｐＣ、又はＣｐＣに置換された配列又はその５塩基長以上の部分配列からなる一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（一本鎖ＯＤＮ）から構成される核酸アジュバントを含む、前記医薬。
【請求項２】
免疫チェックポイント阻害剤とアジュバント組成物が併用されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
免疫チェックポイント阻害剤とアジュバント組成物が同時又は順次に投与されることを特徴とする、請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
二本鎖ＲＮＡと、ＣｐＧ ＯＤＮにおいてＣｐＧがＧｐＣ、ＴｐＣ、又はＣｐＣに置換された配列又はその５塩基長以上の部分配列からなる一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（一本鎖ＯＤＮ）から構成される核酸アジュバントを含むアジュバント組成物と併用することを特徴とする、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む免疫チェックポイント阻害剤を有効成分とするがん又は感染症を治療するための医薬。
【請求項５】
アジュバント組成物が、細菌抗原、ウイルス抗原、及びがん抗原から選ばれる抗原分子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項６】
核酸アジュバントを構成する核酸の末端がリン酸化されていない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項７】
二本鎖ＲＮＡが、配列番号１に示される塩基配列の連続した３０塩基以上の配列を含み、全長が８０〜１６０塩基長の塩基配列を有する核酸か、あるいは前記配列と８０％の配列同一性を有し、かつＴＬＲ３活性化能を有する核酸である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項８】
二本鎖ＲＮＡが配列番号２〜１１のいずれかに示される塩基配列を有する核酸か、その連続した１００塩基以上の塩基配列を有する核酸、あるいは前記配列と８０％の配列同一性を有し、かつＴＬＲ３活性化能を有する核酸である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項９】
二本鎖ＲＮＡが配列番号１１に示される塩基配列を有する核酸か、その連続した１００塩基以上の塩基配列を有する核酸、あるいは前記配列と８０％の配列同一性を有し、かつＴＬＲ３活性化能を有する核酸である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１０】
一本鎖ＯＤＮが配列番号１９〜３９のいずれかに示される塩基配列又はその５塩基以上の部分配列からなる核酸である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１１】
一本鎖ＯＤＮが配列番号１９〜２４のいずれかに示される塩基配列又はその５塩基以上の部分配列からなる核酸である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１２】
一本鎖ＯＤＮが１５〜２８塩基長である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１３】
一本鎖ＯＤＮを構成するヌクレオチドがフォスフォロチオエート修飾されている請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１４】
核酸アジュバントが、配列番号４０で示されるセンス鎖と配列番号４１で示されるアンチセンス鎖を含む核酸、配列番号４２で示されるセンス鎖と配列番号４３で示されるアンチセンス鎖を含む核酸、又は前記配列とそれぞれ８０％の配列同一性を有するセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、かつアジュバント活性を有する核酸である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１５】
核酸アジュバントが、
１）配列番号４０で示されるセンス鎖と配列番号４１で示されるアンチセンス鎖を含む、
２）配列番号４２で示されるセンス鎖と配列番号４３で示されるアンチセンス鎖を含む、
３）配列番号４４で示されるセンス鎖と配列番号４５で示されるアンチセンス鎖を含む、又は
４）配列番号４６で示されるセンス鎖と配列番号４７で示されるアンチセンス鎖を含む
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、日本特許出願２０１６−１４７６５７（２０１６年７月２７日出願）及び２０１７−０７９４４５（２０１７年４月１３日出願）に基づく優先権を主張しており、この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
［技術分野］
本発明は、免疫チェックポイント阻害剤とアジュバント組成物の併用に関する。より詳細には、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と、二本鎖ＲＮＡと一本鎖ＯＤＮから構成される核酸アジュバントを併用することを特徴とする、がん又は感染症の新規な治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体には、細胞ががん化したときや、体内に細菌やウイルスなどの病原体が侵入したときに、これを排除する自然の免疫防御システムが備わっており、その免疫防御システムを制御する分子を免疫チェックポイントと呼ぶ。がん細胞は、しばしば、「免疫チェックポイント」を発現増強することで、免疫防御システムの監視から巧妙に逃れていると考えられる。【０００３】
ＰＤ−１やＰＤ−Ｌ１は、代表的な免疫チェックポイント分子であり、この分子を標的とする抗体は、様々ながん種において、顕著な抗がん作用を示すことが確認され、現在医薬として開発されている。しかし、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体療法については、５０％以上の転移性メラノーマで寛解が見られたとの報告がある一方、固形がんでの寛解は２０〜３０％に留まり、その奏効率は十分なものとは言えない。また、ＰＤ−１抗体療法に応答する患者と応答しない患者が存在し、その鑑別や、応答しない患者に対する治療法の開発が求められている。【０００４】
抗がん免疫ワクチン療法は、手術、抗がん剤、放射線療法で治療できないがんに対する第４の治療法として、近年特に注目されている。抗がん創薬では副作用が問題になることが多いが、免疫ワクチン療法では、がん細胞特異的な抗原を用いてがん細胞を選択的に攻撃するため、侵襲や副作用が少ないという利点がある。免疫ワクチン療法では、しばしば抗原性を補強することで、ワクチンの効果を補助・増強させるアジュバントが使用される。【０００５】
Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）の活性化は、樹状細胞に自然免疫応答を引き起こし、サイトカイン産生や細胞性免疫の活性化を誘導する。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）などの２重鎖ＲＮＡはＴＬＲ３リガンドとなり、強い抗がん効果を示すため、ワクチンアジュバントとして有望視されてきたが、炎症、サイトカイン血症などの副作用のために臨床適用は断念されている。【０００６】
発明者らは、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のＴＬＲ３を介したＩＦＮ−β発現誘導を阻害するＧｐＣジヌクレオチド含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＧｐＣ ＯＤＮ）を見出し、このＧｐＣ ＯＤＮがＴＬＲ３を介して細胞内に取り込まれることを報告している（非特許文献１）。また、麻疹ウイルス由来のｄｉＲＮＡ（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）がアジュバント機能を有することを報告している（特許文献１）。【０００７】
さらに、発明者らは、上記ＧｐＣ ＯＤＮとｄｉＲＮＡに基づいて設計した核酸が、エンドソーム上のＴＬＲ３に到達して、強いアジュバント活性を有することを見出している（特許文献２）。このアジュバントは、過剰な炎症性サイトカイン産生を誘導することなく、マウス移植がんモデルにおいてＮＫ／ＣＴＬ依存的な抗がん活性を誘導することから（特許文献３及び非特許文献２）、副作用の少ない非炎症性の核酸免疫アジュバントとして抗がん免疫ワクチンへの適用が期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００８／０６５７５２
【特許文献２】ＷＯ２０１２／０１４９４５
【特許文献３】ＷＯ２０１６／０８８７８４
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Itoh et al., The Journal of Immunology, 2008, vol.181, No.8, pp5522-5529
【非特許文献２】Matsumoto et al., Nature Communications, 2015, 6:6280
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、安全性を維持しつつ、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効率を改善し、新たながん免疫療法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、抗ＰＤ−Ｌ１抗体単独では効果がない腫瘍に対し、二本鎖ＲＮＡと一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（一本鎖ＯＤＮ）から構成される核酸アジュバントを併用することで、ＣＴＬ依存性の顕著な腫瘍退縮を誘導できることを確認した。【００１２】
本発明は、上記の知見に基づいて完成されたもので、以下の（１）〜（１７）に関する。
（１）免疫チェックポイント阻害剤、及びアジュバント組成物を組み合わせて含む、がん又は感染症を治療するための医薬であって、前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含み、前記アジュバント組成物が、二本鎖ＲＮＡと、ＣｐＧ ＯＤＮにおいてＣｐＧがＧｐＣ、ＴｐＣ、又はＣｐＣに置換された配列又はその５塩基長以上の部分配列からなる一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（一本鎖ＯＤＮ）から構成される核酸アジュバントを含む、前記医薬（二本鎖ＲＮＡはＴＬＲ３リガンドとして機能し、一本鎖ＯＤＮはエンドソームへの送達分子として機能する）；
（２）免疫チェックポイント阻害剤とアジュバント組成物が併用されることを特徴とする、（１）に記載の医薬；
（３）免疫チェックポイント阻害剤とアジュバント組成物が同時又は順次に投与されることを特徴とする、（２）に記載の医薬；
（４）二本鎖ＲＮＡと、ＣｐＧ ＯＤＮにおいてＣｐＧがＧｐＣ、ＴｐＣ、又はＣｐＣに置換された配列又はその５塩基長以上の部分配列からなる一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（一本鎖ＯＤＮ）から構成される核酸アジュバントを含むアジュバント組成物と併用することを特徴とする、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む免疫チェックポイント阻害剤を有効成分とするがん又は感染症を治療するための医薬；
（５）アジュバント組成物が、細菌抗原、ウイルス抗原、及びがん抗原から選ばれる抗原分子を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の医薬；
（６）核酸アジュバントを構成する核酸の末端がリン酸化されていない、（１）〜（５）のいずれかに記載の医薬；
（７）二本鎖ＲＮＡが、配列番号１に示される塩基配列の連続した３０塩基以上、好ましくは４０塩基以上の塩基配列を有し、かつ、全長が１００〜１６０塩基長、好ましくは１１０〜１５０塩基長、より好ましくは１２０〜１４０塩基長の塩基配列を有する核酸か、あるいは前記配列と８０％の配列同一性を有し、かつＴＬＲ３活性化能を有する核酸である、（１）〜（６）のいずれかに記載の医薬；
上記核酸には、二本鎖ＲＮＡが、配列番号１に示される塩基配列の連続した３０〜８０塩基長の塩基配列を２〜４回繰り返し含む核酸、好ましくは配列番号１に示される塩基配列の連続した３０〜５０塩基長の塩基配列を３回繰り返し含む核酸が含まれる。
（８）二本鎖ＲＮＡが配列番号２〜１１のいずれかに示される塩基配列を有する核酸か、その連続した１００塩基以上、好ましくは１１０塩基以上、より好ましくは１２０塩基以上の塩基配列を有する核酸、あるいは前記配列と８０％の配列同一性を有し、かつＴＬＲ３活性化能を有する核酸である、（１）〜（７）のいずれかに記載の医薬；
（９）二本鎖ＲＮＡが配列番号１１に示される塩基配列を有する核酸か、その連続した１００塩基以上、好ましくは１１０塩基以上、より好ましくは１２０塩基以上の塩基配列を有する核酸、あるいは前記配列と８０％の配列同一性を有し、かつＴＬＲ３活性化能を有する核酸である、（１）〜（８）のいずれかに記載の医薬；
（１０）一本鎖ＯＤＮが配列番号１９〜３９のいずれかに示される塩基配列又はその５塩基以上の長さを有する部分配列からなる核酸である、（１）〜（９）のいずれかに記載の医薬；
（１１）一本鎖ＯＤＮが配列番号１９〜２４のいずれかに示される塩基配列又はその５塩基以上の長さを有する部分配列からなる核酸である、（１）〜（９）のいずれかに記載の医薬；
（１２）一本鎖ＯＤＮが１５〜２８塩基長である、（１）〜（１１）のいずれかに記載の医薬；
（１３）一本鎖ＯＤＮを構成するヌクレオチドがフォスフォロチオエート修飾されている（１）〜（１２）のいずれかに記載の医薬；
（１４）核酸アジュバントが、配列番号４０で示されるセンス鎖と配列番号４１で示されるアンチセンス鎖を含む核酸、配列番号４２で示されるセンス鎖と配列番号４３で示されるアンチセンス鎖を含む核酸、又は前記配列とそれぞれ８０％の配列同一性を有するセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、かつアジュバント活性を有する核酸である、（１）〜（１３）のいずれかに記載の医薬；
（１５）核酸アジュバントが、
１）配列番号４０で示されるセンス鎖と配列番号４１で示されるアンチセンス鎖を含む、
２）配列番号４２で示されるセンス鎖と配列番号４３で示されるアンチセンス鎖を含む、
３）配列番号４４で示されるセンス鎖と配列番号４５で示されるアンチセンス鎖を含む、又は
４）配列番号４６で示されるセンス鎖と配列番号４７で示されるアンチセンス鎖を含む
（１）〜（１４）のいずれかに記載の医薬。
（１６）二本鎖ＲＮＡと、ＣｐＧ ＯＤＮにおいてＣｐＧがＧｐＣ、ＴｐＣ、又はＣｐＣに置換された配列又はその５塩基長以上の部分配列からなる一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（一本鎖ＯＤＮ）から構成される核酸アジュバントを含むアジュバント組成物であって、
二本鎖ＲＮＡが、配列番号１に示される塩基配列の連続した３０〜８０塩基長の塩基配列を２〜４回繰り返して含む核酸、好ましくは配列番号１に示される塩基配列の連続した３０〜５０塩基長の塩基配列を３回繰り返し含む核酸である、アジュバント組成物。
（１７）（１６）に記載のアジュバント組成物を含む、がん又は感染症を治療するための医薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体療法の効果や奏効率を改善することができる。本発明のアジュバントは、樹状細胞に効率よく取り込まれ、全身性の炎症性サイトカイン産生を誘導することなく、ＴＬＲ３を特異的に活性化するとともに、ＮＫ・ＣＴＬを誘導する。したがって、他の免疫複合療法とは異なり、サイトカイン血症などの副作用を生じることなく、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体の効果を温和に向上させ、腫瘍退縮をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１ａ−ｂ】図１ａは、ＰＢＳ（対照）、ＯＶＡ、又ＯＶＡ＋ＡＲＮＡＸを皮下投与したマウス（野生型（ＷＴ）及び各種ノックアウト（ＫＯ）マウス）の脾臓及び膝下リンパ節における腫瘍特異的ＣＴＬの発現誘導（％）を示す。  図１ｂは、ＰＢＳ（対照）、ＯＶＡ、又ＯＶＡ＋ＡＲＮＡＸを皮下投与したマウス（野生型（ＷＴ）及び各種ノックアウト（ＫＯ）マウス）の脾臓細胞におけるＩＦＮ−γ産生（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【図１ｃ】図１ｃは、ＰＢＳ（対照）、ＯＶＡ、又ＯＶＡ＋ＡＲＮＡＸを皮下投与したマウス（野生型（ＷＴ）及び各種ノックアウト（ＫＯ）マウス）の脾臓由来の腫瘍特異的ＣＴＬをフローサイトメトリーで解析した結果を示す。
【図２】図２は、生食（対照）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、又ＡＲＮＡＸを皮下投与（ａ）及び静脈投与（ｂ）したときの、サイトカインの誘導を示す。
【図３ａ−ｃ】図３ａは、ＥＧ７細胞株のＰＤ−Ｌ１発現を示す。  図３ｂは、実施例３（ＡＲＮＡＸと抗原の投与による抗腫瘍効果）の実験プロトコルの概要を示す。  図３ｃは、Ｄａｙ０でＥＧ７細胞を皮下移植したマウスの腫瘍体積の経時変化を示す。Ｄａｙ７でＯＶＡ＋ＡＲＮＡＸを皮下投与したマウスでは顕著な腫瘍退縮が見られるが（−●−）、ＰＢＳを投与したマウス（対照）では腫瘍退縮は見られない（−■−）。
【図３ｄ−ｆ】図３ｄは、ＰＢＳ（対照）又はＯＶＡ＋ＡＲＮＡＸを皮下投与したマウスの腫瘍内におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞（左）、ＯＶＡ  ｔｅｔｒａｍｅｒ陽性／ＣＤ８陽性Ｔ細胞（中）、ＣＤ１１ｃ陽性／ＣＤ８陽性Ｔ細胞（右）の割合を示す。  図３ｅは、ＰＢＳ（対照）又はＯＶＡ＋ＡＲＮＡＸを皮下投与したマウスにおけるＧｚｍｂ、Ｉｆｎｇ、Ｐｒｆ１、Ｃｘｃｌ９、Ｃｘｃｌ１０、Ｃｘｃｌ１１の発現誘導の定量ＰＣＲによる解析結果を示す。  図３ｆは、ＰＢＳ（対照）又はＯＶＡ＋ＡＲＮＡＸを皮下投与したマウスの腫瘍組織におけるＤＡＰＩとＣＤ８αに対する免疫染色を示す。
【図４ａ−ｃ】図４ａは、ＰＤ−Ｌ１高発現ＥＧ７細胞株（実線）と通常株（破線）のＰＤ−Ｌ１発現を比較して示す。  図４ｂは、実施例４（ＡＲＮＡＸと抗αＰＤ−Ｌ１抗体の併用）の実験プロトコルの概要を示す。  図４ｃは、Ｄａｙ０でＥＧ７細胞を皮下移植し、day 7にPBS(対照)またはOVA+ARNAXの皮下投与後、抗マウスPD-L1 抗体またはアイソタイプ抗体を静脈投与したマウスの腫瘍体積の経時変化を示す。ＰＤ−Ｌ１抗体単独投与（−■−）では腫瘍退縮は見られないが、ＰＤ−Ｌ１抗体にＯＶＡ＋ＡＲＮＡＸを併用投与（-x-）することで顕著な腫瘍退縮が見られ、その効果はＯＶＡ＋ＡＲＮＡＸのみの投与（−▲−）よりも高い。
【図４ｄ】図４ｄは、ＰＢＳ（対照）又はＯＶＡ＋ＡＲＮＡＸの皮下投与後、抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体又はアイソタイプ抗体を静脈投与したマウスの脾臓及び腫瘍におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞（左）、ＯＶＡ  ｔｅｔｒａｍｅｒ陽性／ＣＤ８陽性Ｔ細胞（中左）、ＣＤ１１ｃ陽性／ＣＤ８陽性Ｔ細胞（中右）、ＰＤ−１陽性／ＣＤ８陽性Ｔ細胞（右）の割合を示す（上段は脾臓、下段は腫瘍内）。
【図４ｅ】図４ｅは、ＰＢＳ（対照）又はＯＶＡ＋ＡＲＮＡＸを皮下投与後、抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体又はアイソタイプ抗体を静脈投与したマウスの腫瘍におけるＧｚｍｂ、Ｉｆｎｇ、Ｐｒｆ１、Ｃｘｃｌ９、Ｃｘｃｌ１０、Ｃｘｃｌ１１の発現誘導のＲＴ−ＰＣＲによる解析結果を示す。
【図５】図５は、本発明に係るアジュバント核酸（ＡＲＮＡＸ）と抗ＰＤ−Ｌ１抗体の作用機序を示す。
【図６ａ−ｅ】図６ａは、ＭＯ５細胞株（実線）のＰＤ−Ｌ１発現を示す。  図６ｂは、実施例５（ＡＲＮＡＸと抗αＰＤ−Ｌ１抗体の併用）の実験プロトコルの概要を示す。  図６ｃは、Ｄａｙ０でＭＯ５細胞を皮下移植し、day 10にPBS(対照)またはOVA+ARNAXの皮下投与後、抗マウスPD-L1 抗体またはアイソタイプ抗体を静脈投与したマウスの腫瘍体積の経時変化を示す。ＰＤ−Ｌ１抗体単独投与（−■−）及びＯＶＡ＋ＡＲＮＡＸ投与（−▲−）に比べて、ＰＤ−Ｌ１抗体とＯＶＡ＋ＡＲＮＡＸ併用投与（-Ｘ-）では顕著に高い腫瘍退縮が見られる。  図６ｄは、ＰＢＳ（対照）又はＯＶＡ＋ＡＲＮＡＸの皮下投与後、抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体又はアイソタイプ抗体を静脈投与したマウスの脾臓及び腫瘍におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞（左）、ＯＶＡ  ｔｅｔｒａｍｅｒ陽性／ＣＤ８陽性Ｔ細胞（中左）、ＣＤ１１ｃ陽性／ＣＤ８陽性Ｔ細胞（中右）、ＰＤ−１陽性／ＣＤ８陽性Ｔ細胞（右）の割合を示す（上段は脾臓、下段は腫瘍内）。  図６ｅは、ＰＢＳ（対照）又はＯＶＡ＋ＡＲＮＡＸを皮下投与後、抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体又はアイソタイプ抗体を静脈投与したマウスの腫瘍におけるＧｚｍｂ、Ｉｆｎｇ、Ｐｒｆ１、Ｃｘｃｌ９、Ｃｘｃｌ１０の発現誘導のＲＴ−ＰＣＲによる解析結果を示す。
【図６ｆ】図６ｆは、腫瘍浸潤免疫細胞の割合を示す。ＣＤ４５陽性細胞でゲーティングした腫瘍浸潤リンパ球の割合（上）、ＣＤ４５陽性細胞でゲーティングした樹状細胞（ＤＣ）サブセットの割合、ＣＤ４５陽性細胞でゲーティングした腫瘍浸潤単球、ＣＤ１１ｂ陽性骨髄細胞サブセット及びマクロファージの割合。
【図７】図７は、ＡＲＮＡＸ１２０＃１、ＡＲＮＡＸ＃２、ＡＲＮＡＸ１３０、ＡＲＮＡＸ１４０の構造を示す。
【図８】図８は、ＡＲＮＡＸ１２０＃２のＴＬＲ３を介したＩＦＮ−βプロモーター活性化能を示す。
【図９】図９は、ＡＲＮＡＸ１２０＃１、ＡＲＮＡＸ１３０のＴＬＲ３を介したＩＦＮ−βプロモーター活性化能を示す。
【図１０】図１０は、ＡＲＮＡＸ１４０のｉｎ ｖｉｖｏクロスプライミング活性（用量を変量）を示す。
【図１１】図１１は、ＡＲＮＡＸ１２０＃２のｉｎ ｖｉｖｏクロスプライミング活性（用量を変量）を示す。
【図１２】図１２は、ＡＲＮＡＸ１２０＃１の抗腫瘍効果（ＥＧ７）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、免疫チェックポイント阻害剤（抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体）と、二本鎖ＲＮＡと一本鎖ＯＤＮから構成される核酸アジュバントを組み合わせて含む、がん又は感染症を治療するための医薬に関する。
【００１６】
１．免疫チェックポイント阻害剤
がん細胞、細菌やウイルスなどの病原体に対する自然の免疫防御システムを制御する分子を免疫チェックポイントと言い、たとえば、エフェクターＴ細胞表面に発現するＰＤ−１や、腫瘍細胞表面に発現するＰＤ−Ｌ１やＰＤ−Ｌ２、活性化Ｔ細胞あるいは抑制性Ｔ細胞Ｔｒｅｇの表面に発現するＣＴＬＡ−４、樹状細胞表面に発現するＣＤ８０やＣＤ８６が挙げられる。これらのうち、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ８０／ＣＤ８６は、感作されたＴ細胞がナイーブＴ細胞からＴＨ１、ＴＨ２、ＴＦＨ細胞等に分化するプライミングフェースで機能し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２は、エフェクター細胞が腫瘍細胞等を攻撃するエフェクターフェースで機能する。
【００１７】
「免疫チェックポイント阻害剤」とは、「免疫チェックポイント」を阻害し、自然の免疫防御システムを制御する物質・分子を意味する。例えば、上記免疫チェックポイントに特異的な抗体（抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体等）が「免疫チェックポイント阻害剤」の代表例として挙げられる。
【００１８】
本発明で使用される「免疫チェックポイント阻害剤」は、エフェクターフェースで機能する免疫チェックポイント阻害剤、すなわち、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２を阻害する物質・分子である。好ましくは、「免疫チェックポイント阻害剤」は抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【００１９】
「抗ＰＤ−１抗体」
本発明で使用される「抗ＰＤ−１抗体」は、ＰＤ−１に結合し、その免疫チェックポイントとしての機能を阻害できるものであれば特に限定されない。抗ＰＤ−１抗体としては、既に医薬として承認販売されているものや、開発中のものがあり、これらを好適に利用することができる。そのような「抗ＰＤ−１抗体」としては、ニボルマブ（オプジーボ（ＧＳＫ／小野薬品））、ヒト化ＩｇＧ４型抗体であるペムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５（Ｍｅｒｃｋ））、ジピリズマブ（ＣＴ−０１１（ＣｕｒｅＴｅｃｈ））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
「抗ＰＤ−Ｌ１抗体」
また、本発明で使用される「抗ＰＤ−Ｌ１抗体」は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、その免疫チェックポイントとしての機能を阻害できるものであれば特に限定されない。抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、既に医薬として承認（販売）されているものや、開発中のものがあり、これらを好適に利用することができる。そのような「抗ＰＤ−Ｌ１抗体」としては、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ／ＲＧ−７４４６（Ｒｏｃｈｅ／中外）、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ（ＭＥＤＩ４７３６（アストラゼネカ））、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ））、ＭＥＤ１０６８０／ＡＭＰ−５１４が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
抗体は、常法に基づいて作製してもよい。その場合、抗体は、ヒトに対する異種抗原性を低下させるために、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体であるか、あるいは完全ヒト抗体であることが好ましい。抗体は免疫チェックポイント阻害剤としての機能を有する限り、抗体断片でもよい。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖを挙げることができる。
【００２２】
本発明の「免疫チェックポイント阻害剤」は、薬理学上許容される担体や添加物を含むものであってもよい。そのような担体や添加物としては、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、抗酸化剤、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。
【００２３】
具体的には、水性担体としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、オリーブオイルなどの植物油、及びエチルオレイン酸などの有機エステルが含まれる。
【００２４】
非水性担体としては、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００２５】
抗酸化剤としては、水溶性抗酸化剤であるアスコルビン酸、システインハイドロクロライド、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、脂溶性抗酸化剤であるアスコルビルパルミテート、ブチル化ハイドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ハイドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、α−トコフェロール、及び金属キレート剤であるクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸が挙げられる。
【００２６】
本発明の「免疫チェックポイント阻害剤」の投与経路は特に限定されないが、非経口投与が好ましく、具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与としては、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射が例示できる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。
【００２７】
本発明の「免疫チェックポイント阻害剤」の投与量は、その使用目的、投与経路等によって適宜決定される。目的とする最適な応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整される。有効成分は抗体であるため、投与量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲である。例えば、投与量は、約０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重であるか又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。典型的な治療方法には、例えば、週１回投与、２週間おきに１回投与、３週おきに１回投与、４週おきに１回投与、月１回投与、３ヶ月おきに１回投与又は３〜６ヶ月おきに１回投与などである。例えば、静注投与の場合、１ｍｇ／ｋｇ体重又は３ｍｇ／ｋｇ体重である。投与回数は、症状に応じて適宜設定され、単回のボーラスで投与してもよいし、数回に分けて時間をかけて投与してもよい。例えば、投与６回を４週おきに、次に３週おきで投与する場合もあれば、３週おきに投与する場合もあれば、３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、次に３週おきに１ｍｇ／ｋｇ体重で投与される場合もある。
【００２８】
２．アジュバント組成物
２．１  核酸アジュバント
本発明にかかる「アジュバント組成物」は、二本鎖ＲＮＡとエンドソームに送達される一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（一本鎖ＯＤＮ）から構成される核酸（核酸アジュバント）を含む。
【００２９】
（１）「二本鎖ＲＮＡ」
微生物由来の二本鎖ＲＮＡは、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３（ＴＬＲ３）のリガンドとして自然免疫を活性化することが知られている。同様の現象は人工合成した二本鎖ＲＮＡでも見られる（Matsumoto M., and T. Seya. 2008. TLR3: Interferon induction by double-stranded RNA including poly(I:C). Adv. Drug Del. Rev. 60: 805-812.）。ＴＬＲは１型の膜タンパク質であり、ウイルスや細菌由来の成分を認識し生体防御の応答を誘起する。ＴＬＲ３は、ＴＬＲファミリーの１つであり、細胞外の二本鎖ＲＮＡをリガンドとして、ＴＩＣＡＭ−１を介して多彩な細胞応答を誘導する。ＴＬＲ３は骨髄系樹状細胞ではエンドソームに、上皮系細胞の一部やマクロファージでは細胞表面とエンドソームに局在しているが、いずれの細胞でもＴＬＲ３を介したシグナルはエンドソームから伝達されるため、二本鎖ＲＮＡが細胞内へと取り込まれることが必要となる。
【００３０】
微生物由来の二本鎖ＲＮＡは、ヒトの遺伝子には作用しないため、ＴＬＲ３リガンドとして、自然免疫を制御することで、ワクチンアジュバントとして利用する研究も進められている。本発明で使用される「二本鎖ＲＮＡ」は、そのような外因性（例えば、ウイルスや細菌由来）の二本鎖ＲＮＡであって、ヒトの内在性遺伝子に影響を与えることなく、ＴＬＲ３リガンドとして（ＴＬＲ３活性化能を有し）、自然免疫を活性化する。
【００３１】
本発明の「二本鎖ＲＮＡ」は、たとえば、ＲＮＡウイルス由来のｄｓＲＮＡを単離し、これを鋳型として合成することができる。対象となるＲＮＡウイルスは特に限定されず、マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルス、プラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルスのいずれであってもよい。具体的には、麻疹ウイルス、センダイウイルス、ＲＳウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルスなどが挙げられる。好ましくは、マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスの麻疹ウイルス、センダイウイルス及びＲＳウイルスであり、より好ましくは、麻疹ウイルス、センダイウイルス及びＲＳウイルスのワクチン株である。
【００３２】
馴化麻疹ウイルス株であるＥｄｍｏｎｓｔｏｎ（ＥＤ）株由来のｄｉＲＮＡ（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ：配列番号１）は従来よりワクチンに含まれ（Shingai ey al., J Immunol. 2007; 179: 6123-6133）、ヒトに対する安全性が確立している。発明者らは、このＥＤ株由来のｄｉＲＮＡがアジュバントの機能を有することを見出し（前掲 Itoh et al., The Journal of Immunology, 2008; Matsumoto et al. Nat. Commun. 2015）、これを基に作製した５９塩基長〜１４０塩基長の二本鎖ＲＮＡが、後述する一本鎖ＯＤＮと連結させることで、効率よくエンドソームに送達され、細胞内ＲＮＡセンサーＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５を活性化することなくＴＬＲ３のみを活性化させ、腫瘍退縮効果を有することを確認している（ＷＯ２０１２／０１４９４５及びＷＯ２０１６／０８８７８４）。このＥＤ株由来のｄｉＲＮＡに基づく「二本鎖ＲＮＡ」は、５’末端をキャップすることで他の免疫系（例えば、ＭＤＡ５／ＲＩＧ−１）を活性化することなく、ＴＬＲ３のみを特異的に活性化するため、全身性の炎症性サイトカインの誘導を引き起こす心配がなく、ワクチンアジュバントとして優れている。したがって、本発明で使用される「二本鎖ＲＮＡ」の好ましい一形態として、このＥＤ株由来のｄｉＲＮＡに基づく二本鎖ＲＮＡを挙げることができるが、他のウイルスや細菌由来の二本鎖ＲＮＡも、ＴＬＲ３リガンドとして、本発明の核酸アジュバントに利用することができる。
【００３３】
「二本鎖ＲＮＡ」の長さは特に限定されないが、ＴＬＲ３活性化能のためには約５０塩基対以上が好ましく、約６０塩基対以上がより好ましく、約９０塩基対以上、約１００塩基長以上、約１１０塩基以上がさらに好ましく、約１２０塩基長以上が特に好ましい。上限も特に限定されないが、合成の容易さから、約１６０塩基対までの長さにすることが好ましい。したがって、本発明の「二本鎖ＲＮＡ」の長さとしては、約５０〜１６０塩基対が好ましく、約９０〜１５０塩基対、約１００〜１５０塩基対、約１１０〜１４０塩基対がより好ましく、約１２０〜１４０塩基対が特に好ましい。
【００３４】
ＥＤ株由来のｄｉＲＮＡは配列番号１に示される塩基配列を有し、ループ構造を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｉＲＮＡ）を形成する（Shingai et al., J Immunol. 2007 Nov 1;179(9):6123-6133）。ＥＤ株由来のｄｉＲＮＡを基に「二本鎖ＲＮＡ」を設計する場合、配列番号１に示されるＥＤ株のｄｉＲＮＡのいずれの部分を、「二本鎖ＲＮＡ」として使用してもよいが、ＡＵ  Ｒｉｃｈな領域が合成効率の面からは好ましい。そのようなＡＵ  Ｒｉｃｈな領域としては、たとえば、センス鎖側配列としては、配列番号１の１７位〜７８位、１０１位〜１６４位、及び２１６位〜２６９位等が挙げられるが、いずれも合成効率の面から好ましい領域であって、ＴＬＲ３リガンドとしての機能はこれらの領域に限定されない。
【００３５】
前述した特許出願（ＷＯ２０１２／０１４９４５）では、配列番号１に示されるＥＤ株のｄｉＲＮＡにおいて、以下の塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡを調製し、その活性を確認している。
第１０１７位〜第１０７４位の塩基配列（配列番号２）、
第１０７７位〜第１１５２位の５’末端にシトシンを３個付加した塩基配列（配列番号３）
第１０１７位〜第１１５２位の５’末端にシトシンを３個付加した塩基配列（配列番号４）
第１０７７位〜第１１５２位の３’末端にシトシンを３個付加した塩基配列（配列番号５）
第１０１７位〜第１１５２位の３’末端にシトシンを３個付加した塩基配列（配列番号６）
第１０５７位〜第１１５２位の３’末端にシトシンを３個付加した塩基配列（配列番号７）
第１０４６位〜第１１５２位の３’末端にシトシンを３個付加した塩基配列（配列番号８）
第１０３７位〜第１１５２位の３’末端にシトシンを３個付加した塩基配列（配列番号９）
第１０１７位〜第１０８９位の塩基配列（配列番号１０）。
【００３６】
また、特許出願（ＷＯ２０１６／０８８７８４）では、配列番号１に示されるＥＤ株のｄｉＲＮＡにおいて、第１位〜第１４０位の塩基配列（配列番号１１）を有する二本鎖ＲＮＡを調製し、その活性を確認している。ｄｉＲＮＡがステムループを形成することを考慮すれば、配列番号１１に示される配列は、配列番号２〜９に示される配列と相補鎖をなす領域であることが理解できる。
【００３７】
したがって、本発明の「二本鎖ＲＮＡ」としては、配列番号１に示される塩基配列の連続した３０〜１６０塩基長の塩基配列を有する核酸（二本鎖ＲＮＡ）を使用できる。また、合成効率の点からは、配列番号１に示される塩基配列の１７位〜７８位、１０１位〜１６４位、及び２１６位〜２６９位中の連続した３０塩基以上、好ましくは４０塩基以上を含む（繰り返し含むものでもよい）、全長が１００〜１６０塩基長、好ましくは１１０〜１５０塩基長、より好ましくは１２０〜１４０塩基長の核酸（二本鎖ＲＮＡ）を好適に使用することができる。なお、「二本鎖ＲＮＡ」は、配列番号１の部分配列を２〜４回繰り返し含むものであってもよい。例えば、配列番号１の１７−１３６位の連続した１２０塩基長を含むもののほか（配列番号４２（センス）、配列番号４３（アンチセンス））、配列番号１の１７−５６位の連続した４０塩基長を３回繰り返して含むもの（配列番号４４（センス）、配列番号４５（アンチセンス））も使用することができる。
【００３８】
配列番号２〜１１のいずれかに示される塩基配列を有する核酸はその一例であり、このうち配列番号１１で示される塩基配列とその部分配列を有する核酸について、発明者らはｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍退縮効果を確認している。
【００３９】
本発明の「二本鎖ＲＮＡ」とＥＤ株由来のｄｉＲＮＡの機能・構造を考慮すれば、配列番号２〜１１に示される塩基配列を有する核酸（二本鎖ＲＮＡ）に限定されず、その連続した１００塩基以上、好ましくは１１０塩基以上、より好ましくは１２０塩基以上の塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡも使用できる。また、前記配列と８０％の配列同一性、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％の配列同一性を有する塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡも、ＴＬＲ３活性化能を有する限り、本発明の「二本鎖ＲＮＡ」として利用できる。なお、「二本鎖ＲＮＡ」が、部分配列を繰り返し含むものである場合、配列同一性は部分配列と当該部分配列に対応する配列とを比較した数値とする。
【００４０】
また、配列番号２〜１１に示される塩基配列、その連続した１００塩基以上、好ましくは１１０塩基以上、より好ましくは１２０塩基以上の塩基配列において、１〜１０個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜３個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡも、ＴＬＲ３活性化能を有する限り、本発明の「二本鎖ＲＮＡ」として利用できる。
【００４１】
ＴＬＲ３活性化能は、ＷＯ２０１２／０１４９４５の実施例２に記載されているように、ヒトＴＬＲ３発現プラスミドを、ＩＦＮ−βプロモーターを含むレポータープラスミドとともにトランスフェクトした細胞を作製し、その培養液中に二本鎖ＲＮＡを添加し、レポーター活性の上昇を見ることにより容易に確認することができる。したがって、配列番号２〜１１で示される「二本鎖ＲＮＡ」に限定されず、当業者であれば、配列番号１に示されるようなウイルスや細菌由来のｄｓＲＮＡの塩基配列と、ＷＯ２０１２／０１４９４５及びＷＯ２０１６／０８８７８４の記載、ならびに当該分野の技術常識から、本発明で使用される他の「二本鎖ＲＮＡ」を容易に取得できる。
【００４２】
（２）一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（一本鎖ＯＤＮ）
ＴＬＲ９はウイルスＤＮＡやバクテリアＤＮＡの非メチル化ＣｐＧモチーフを認識する。ＴＬＲ９を介したシグナリングは短い合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）により高効率に行われる。このＯＤＮには細菌やウイルスの遺伝子に特有のＣｐＧモチーフが含まれており、「ＣｐＧ ＯＤＮ」として当該分野で周知である。ＣｐＧ ＯＤＮは、樹状細胞のエンドソームに送達され、ＴＬＲ９リガンドとして機能するため、強いワクチンアジュバンドや抗体産生増強剤として有用であることが知られている。一方で、ＭｙＤ８８依存性のサイトカイン（特にＩＦＮ−γ）を強く誘導し、Ｔｈ２応答を引き起す。ＣｐＧ ＯＤＮは３つのタイプに分類され、ＡタイプはＩＦＮαを強力に誘導するＮＫ細胞のアクチベーターであり、ＢタイプはＩＦＮαの誘導は弱いＢ細胞のアクチベーターであり、ＣタイプはＢタイプの作用とＡタイプの作用を併せ持つ。本発明の「一本鎖ＯＤＮ」は、ＣｐＧのサイトカイン誘導活性を除去したＧｐＣ型とし、Ｂタイプ又はＣタイプのＧｐＣ ＯＤＮに基づくものが好ましい。
【００４３】
前述した特許出願（ＷＯ２０１２／０１４９４５）では、上記ＣｐＧ ＯＤＮにおいて、ＣｐＧをＧｐＣに変換したＯＤＮ（ＧｐＣ ＯＤＮ）や、前記ＧｐＣをＴｐＣ又はＣｐＣに変換したＯＤＮもエンドソームに送達されることが、本発明者らにより確認されている。さらに上記ＯＤＮの５塩基以上の長さを有する部分配列からなる核酸も、エンドソームに送達されることが、本発明者らにより確認されている。
【００４４】
ＣｐＧをＧｐＣ、ＴｃＰ、ＣＰＣに変換したＯＤＮは、樹状細胞のエンドソームに送達されるが、ＴＬＲ９アゴニスト活性を有さないため、不必要な免疫応答を誘導しない。すなわち、本発明で使用される「一本鎖ＯＤＮ」は、ＴＬＲ９アゴニスト活性を有しないエンドソームに送達される一本鎖ＯＤＮである。
【００４５】
ＣｐＧ ＯＤＮはＴＬＲ９アゴニストとして、ＧｐＣ ＯＤＮはそのＣｏｎｔｒｏｌ（ＴＬＲ９アゴニスト活性を有しないため）として、市販されており、本発明ではこれらのＯＤＮを好適に利用することができる。以下に、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから販売されているＣｐＧ ＯＤＮ（Ｂタイプ又はＣタイプ）及びそのＧｐＣ ＯＤＮ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とその配列を記載する（http://www.invivogen.com/tlr9-agonist）。
【００４６】
【表１】
2018021400.tif 000003
【００４７】
本発明の「一本鎖ＯＤＮ」は、ＣｐＧ ＯＤＮにおいてＣｐＧジヌクレオチドがＧｐＣ、ＴｐＣ又はＣｐＣジヌクレオチドに置換された塩基配列を有するＯＤＮ、あるいはエンドソーム送達機能を有するその部分配列を挙げることができる。
【００４８】
そのような「一本鎖ＯＤＮ」の具体例として、配列番号１９〜３９に示される塩基配列を有するＯＤＮ、又はその５塩基以上の長さを有する部分配列からなる核酸を挙げることができる。
【００４９】
なお、配列番号１９〜３９に示される配列において、１〜３個、好ましくは１又は２個、より好ましくは１個の欠失、置換、挿入もしくは付加を有する塩基配列を有するＯＤＮも、ＴＬＲ９アゴニスト活性を有さずエンドソームに送達される限り、本発明の「一本鎖ＯＤＮ」として利用できる。
【００５０】
本発明の「一本鎖ＯＤＮ」は、エンドソームへの送達機能の点から、１５塩基長以上であることが好ましく、１５〜２８塩基長であることがより好ましい。
【００５１】
エンドソームへの送達能力は、ＷＯ２０１２／０１４９４５の実施例５に記載されているように、ヒトＴＬＲ３を、ＩＦＮ−βプロモーターを含むレポータープラスミドとともにトランスフェクトした細胞を作製し、その培養液中に二本鎖ＲＮＡに一本鎖ＯＤＮを連結した核酸を添加し、レポーター活性をコントロールと比較することにより容易に確認することができる。したがって、配列番号１９〜３９で示される塩基配列を有する一本鎖ＯＤＮだけでなく、当業者であれば、市販のＣｐＧ ＯＤＮやＧｐＣ ＯＤＮ（ｃｏｎｔｒｏｌ）の塩基配列と、ＷＯ２０１２／０１４９４５及びＷＯ２０１６／０８８７８４の記載から、本発明で使用される他の「一本鎖ＯＤＮ」を容易に取得できる。
【００５２】
本発明の「ＧｐＣ ＯＤＮ」を構成する一本鎖ヌクレオチドは、安定性（ヌクレアーゼ耐性）の点から修飾されていることが好ましい。そのような修飾としては、フォスフォロチオエート修飾を挙げることができる。フォスフォロチオエート修飾されることで、一本鎖ＯＤＮはヌクレアーゼで分解されることなく、効率よく核酸をエンドソームに送達できる。
【００５３】
（３）アジュバント核酸の合成
本発明のアジュバント核酸は、上記した「二本鎖ＲＮＡ」と「一本鎖ＯＤＮ」から構成される。「二本鎖ＲＮＡ」と「一本鎖ＯＤＮ」の連結される順番や、連結様式は特に限定されず、「一本鎖ＯＤＮ」の３’側に「二本鎖ＲＮＡ」の５’側が結合しても、「一本鎖ＯＤＮ」の５’側に「二本鎖ＲＮＡ」の３’側が結合していてもよいが、「一本鎖ＯＤＮ」の３’側に「二本鎖ＲＮＡ」の５’側が結合していることが好ましく、「一本鎖ＯＤＮ」の３’末端が「二本鎖ＲＮＡ」のセンス鎖の５’末端と結合していることがさらに好ましい。
【００５４】
「二本鎖ＲＮＡ」と「一本鎖ＯＤＮ」は直接連結されてもよいし、適当なリンカーを介して連結されてもよい。リンカー配列の長さ（塩基数）は限定されない。リンカー配列以外に、いずれか一方の末端又は両末端に、さらに他の核酸を連結していてもよいが、この場合、ＲＮＡの３’側に他の核酸を連結していることが好ましい。
【００５５】
本発明の核酸を形成する各一本鎖核酸は、いずれの末端にもリン酸基が結合していないことが好ましい。５’末端にリン酸基が残っていると、生体内での大量投与により細胞質内ＲＩＧ−Ｉ経路を活性化し、大量のサイトカイン産生が誘導され副作用の原因となるからである（Robinson RA, DeVita VT, Levy HB, Baron S, Hubbard SP, Levine AS. A phase I-II trial of multiple-dose polyriboinosic-polyribocytidylic acid in patients with leukemia or solid tumors. J Natl Cancer Inst. 1976 Sep;57(3):599-602）。インビトロ転写により合成されたＲＮＡ鎖の５’末端には、３リン酸が付加されるが、本発明の核酸は化学合成により製造できるため、５’末端及び３’末端のいずれにもリン酸基が結合していない核酸として合成することができる。
【００５６】
「一本鎖ＯＤＮ」の３’末端が「二本鎖ＲＮＡ」のセンス鎖の５’末端と直接共有結合している場合、本発明の核酸アジュバントは、一本鎖核酸Ａ（「一本鎖ＯＤＮ」と「二本鎖ＲＮＡ」センス鎖とのキメラ核酸）と、一本鎖核酸Ｂ（「二本鎖ＲＮＡ」アンチセンス鎖）からなる核酸として合成することができる。
【００５７】
一例として、ＷＯ２０１６／０８８７８４には、配列番号４０で示されるセンス鎖（一本鎖核酸Ａ）と配列番号４１で示されるアンチセンス鎖（一本鎖核酸Ｂ）から構成される核酸とその合成方法が記載されている。この例では、「二本鎖ＲＮＡ」と「一本鎖ＯＤＮ」は直接連結されているが、核酸の安定性とアジュバント活性に負の影響を与えない限り、両者の間にリンカーが含まれていてもよい。本明細書においては、この配列番号４０で示されるセンス鎖と配列番号４１で示されるアンチセンス鎖から構成される核酸アジュバントを「ＡＲＮＡＸ」と呼ぶこともある。
【００５８】
本発明の核酸は、上記センス鎖とアンチセンス鎖に限定されるものではなく、前記配列とそれぞれ８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％の配列同一性を有するセンス鎖とアンチセンス鎖から構成される核酸も、それがアジュバント活性を有する限り、本発明の核酸として利用することができる。なお、前述したように、「二本鎖ＲＮＡ」が特定の部分配列を繰り返し含む場合には、上記配列同一性は、当該繰り返し部分に関しては、部分配列と当該部分配列に対応する配列とを比較した数値とする。
【００５９】
核酸のアジュバント活性は、ＷＯ２０１２／０１４９４５及びＷＯ２０１６／０８８７８４の実施例の記載にしたがい、たとえば、一次的にはヒトＴＬＲ３発現プラスミドを、ＩＦＮ−βプロモーターを含むレポータープラスミドとともにトランスフェクトした細胞を作製し、その培養液中に核酸アジュバントを添加し、レポーター活性の上昇を見ることにより、より厳密には、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍退縮効果等をみることにより確認することができる。
【００６０】
上記したセンス鎖とアンチセンス鎖からなる核酸は、たとえば、ＷＯ２０１６／０８８７８４の記載された方法にしたがい、部分配列を合成し、順次ライゲーションすることで合成することができる。もちろん、上記方法に限定されず、使用される二本鎖ＲＮＡと一本鎖ＯＤＮの長さや構造に応じて、常法にしたがい、合成方法は適宜最適化してよい。
【００６１】
腫瘍の微小環境では、腫瘍細胞以外に腫瘍に浸潤した骨髄系細胞による免疫抑制状態が生じている。腫瘍関連マクロファージ（Tumor-associated macrophage:ＴＡＭ）は腫瘍の増殖・維持・浸潤を強くサポートしており、腫瘍に都合の良い微小環境の形成に寄与し、myeloid-derived suppressor cell（ＭＤＳＣ）は抗原特異的Ｔ細胞の活性を抑制する。こうした抑制性マクロファージが腫瘍内に浸潤するマウス移植がんでｐｏｌｙ（Ｉ:Ｃ）治療を行うと、腫瘍が退縮する（Shime et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109(6): 2066-2071.2012）。腫瘍退縮の要因は、ｐｏｌｙ（Ｉ:Ｃ）に応答したＴＡＭからのＴＬＲ３−ＴＩＣＡＭ−１依存的なＴＮＦ−α産生による腫瘍の出血性壊死であるが、同時に、腫瘍内のマクロファージは抑制型のＭ２タイプからエフェクター型のＭ１タイプに変換しており、ＴＬＲ３シグナルでエピジェネティックな変化が誘導される。ＴＬＲ３特異的アジュバントである本発明のアジュバント組成物の投与により、腫瘍内のがん抑制細胞をがん攻撃型に転換し、腫瘍内微小環境を制御することで腫瘍の増殖を阻害できると考えられる。
【００６２】
本発明の核酸アジュバントは、１）樹状細胞に効率よく取り込まれる、２）ＴＬＲ３のみ活性化しＭＤＡ５/ＲＩＧ−１を活性化しない、３）全身的な炎症性サイトカイン／タイプＩ  ＩＦＮ産生を誘導しない、４）樹状細胞を活性化し、ＮＫ細胞、ＣＴＬを誘導する、５）強い抗腫瘍活性を示す、６）腫瘍内微小環境を制御することで腫瘍の増殖を阻害できる、７）ＧＭＰ基準による化学合成が可能である、という特徴を有する。したがって、がん免疫療法におけるアジュバントとして極めて有用である。
【００６３】
（４）製剤化
本発明の「アジュバント組成物」は、薬理学上許容される担体や添加物を含むものであってもよい。そのような担体や添加物としては、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、抗酸化剤、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。これらの具体例は、「免疫チェックポイント阻害剤」において記載したとおりである。
【００６４】
本発明の「アジュバント組成物」の投与経路は特に限定されないが、非経口投与が好ましく、具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与としては、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射が例示できる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。
【００６５】
本発明の「アジュバント組成物」の投与量は、その使用目的、投与経路等によって適宜決定される。ヒトに投与する場合は、例えば、一回の投与につき体重１ｋｇあたり０．００００１ｍｇから１０ｍｇの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり１〜１００ ｍｇ/ｂｏｄｙの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の「アジュバント組成物」の投与量は上記投与量に制限されるものではない。
【００６６】
２．２  抗原分子
本発明は、アジュバント組成物は、抗原分子を含んでいてもよい。がん患者や細菌感染者の体内には、内因性の抗原が存在するため、アジュバント核酸のみでも免疫効果は得られる。もっとも、アジュバント核酸のみで十分な効果が得られない場合には、治療対象とする疾患に応じて、抗原分子をアジュバントとともに投与することが好ましい。抗原分子としては、ウイルス抗原、細菌抗原、がん抗原、及びこれらの抗原性成分等が挙げられる。
【００６７】
ウイルス抗原としては、例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、ハンタウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、海綿状ウイルス、ＨＩＶ、ＣＭＶ、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘ウイルス、風疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス等のウイルス抗原又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６８】
細菌抗原としては、例えば、バチルス属、エスケリキア属、リステリア属、ナイセリア属、ノカルジア属、サルモネラ属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属等の細菌抗原又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６９】
がん抗原としては、例えば、白血病、リンパ腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、消化器系腫瘍、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、食道癌、直腸癌、大腸癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、喉頭癌、気管支癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発骨髄腫等のがん抗原又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００７０】
本発明のアジュバント組成物は、単独でも、がん又は感染症の治療効果を有し、本発明は、アジュバント組成物を含むがん又は感染症を治療するための医薬も提供する。
【００７１】
３．がん又は感染症を治療するための医薬
本発明は、上記した免疫チェックポイント阻害剤、及びアジュバント組成物を組み合わせて含む、がん又は感染症を治療するための医薬を提供する。
【００７２】
本発明の医薬は、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む免疫チェックポイント阻害剤に、アジュバント組成物を同時に、別々に、又は、順次に投与するために組み合わせた（併用投与する）医薬を意味する。
【００７３】
免疫チェックポイント阻害剤とアジュバント組成物は、別々に提供されてもよいし、免疫チェックポイント阻害剤とアジュバント組成物から構成されるキットとして提供されてもよい。
【００７４】
本発明の医薬の治療対象となる疾患としては、免疫チェックポイント阻害剤の対象となりうる疾患（癌、感染症等）である。癌としては、例えば、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頚部癌、メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管カルシノーマ、子宮内膜カルシノーマ、子宮頚部カルシノーマ、膣カルシノーマ、外陰部カルシノーマ、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、柔組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性白血病、急性白血病、小児固形癌、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎盂カルシノーマ、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍新脈管形成、脊椎腫瘍、脳幹グリオーム、下垂体アデノーマ、カポシ肉腫、扁平上皮癌、扁平細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発腫瘍等が挙げられる。とくに、ＰＤ−Ｌ１を発現する転移性癌に好適に適用することができる。
【００７５】
感染症としては、例えば、ＨＩＶ感染（ＡＩＤＳ）、肝炎、ヘルペス、マラリア、リューシュマニア症、インフルエンザ、赤痢、肺炎、結核、敗血症等を挙げることができる。とくに、重篤な免疫不全を生じるＨＩＶ感染に好適に適用することができる。
【００７６】
前述したように抗ＰＤ−１抗体や抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、免疫防御機構のエフェクターフェースで作用するのに対し、本発明の核酸アジュバントは、樹状細胞のエンドソームに送達され、ＴＬＲ３を活性化し、ＮＫ細胞、ＣＴＬを誘導するなどプライミングフェースで作用すると考えられる。したがって、本発明のアジュバント核酸を抗ＰＤ−１抗体や抗ＰＤ−Ｌ１抗体と併用することで、プライミングフェースとエフェクターフェースの両方を通じて免疫防御機構を活性化することができる（図５参照）。
【００７７】
上記した作用機序により、本発明の医薬は、アジュバント組成物と抗ＰＤ−１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を併用することで、抗ＰＤ−１抗体や抗ＰＤ−Ｌ１抗体が単独では奏功しない癌に対しても効果を奏し、かつ、より強力にＣＴＬ依存性の腫瘍退縮を誘導する。アジュバント組成物と抗ＰＤ−１抗体や抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、併用することにより、それぞれ単独で投与するよりも、相乗的に抗腫瘍効果が増大する。
【００７８】
さらに、アジュバント組成物と併用することにより、抗ＰＤ−１抗体やＰＤ−Ｌ１抗体単独では達成しえない抗体産生やＮＫ細胞活性化と言う効果、腫瘍微小環境の改善という効果も奏される。本発明の医薬は安全性が高く、高齢者にも安全に投与することができ、抗ＰＤ−１抗体や抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いた治療対象を広げ、その効果を高めることができる。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００８０】
実施例１：ＡＲＮＡＸと抗原の投与によるＣＴＬの誘導
１．材料及び方法
８-１１週齢の野生型(C57BL/6)及びB57BL/6バックグラウンドのノックアウト♂マウス（MAVS KO, MyD88 KO, TLR3 KO, TICAM-1 KO, IRF3 KO, IRF3/7 DKO）を実験に用いた。PBS、OVA(100 μg)、又はOVA(100 μg)＋ARNAX(60 μg)をday0, day7にマウス皮下投与し、day11に脾臓と膝下リンパ節を採取し、CD8+ T 細胞中のOVA特異的CD8+T細胞の割合をOVA-tetramer (MBL社製)で測定した。Tetramer assayは添付文書に従って行った。具体的には、脾臓及びリンパ節細胞(1x 107/ml)を50倍希釈のH2-Kb OVA tetramer(PE)で20分間染色し、洗浄後、anti-CD3e mAb（APC）、anti-CD8a mAb（FITC）で染色し、CD8+T細胞中のOVA 特異的CD8+T細胞の割合をFACS Aria(BD社)で解析した。また、脾細胞(1x 107/ml)を100 nMのOVA特異的ペプチド（SL８：SIINFEKL）あるいはコントロールWT1ペプチド(Db126: RMFPNAPYL)で３日間刺激し、培養上清中のIFN-γをCytokine bead assay(CBA; BD社)で測定した。【００８１】
２．結果
野生型マウスにおいてPBSあるいはOVA単独投与では、脾臓及び膝下リンパ節で、OVA特異的CTLは誘導されないが、OVA＋ARNAX投与で誘導された。RIG-I-like receptor(RLR)の下流のアダプター分子であるMAVSのノックアウトマウス、TLR3以外のTLRのアダプター分子であるMyD88ノックアウトマウスは野生型マウスと同様の結果であった。TLR3, TLR3のアダプター分子であるTICAM-1, Type I IFN誘導に必須の転写因子IRF3, IRF7のノックアウトマウスでは、OVA+ARNAXによるOVA特異的CTLは全く誘導されなかった（図１ａ，ｃ）。また、野生型マウスとMAVSノックアウトマウスの脾細胞では、OVA特異的ペプチド刺激で大量のIFN-γが産生されたが、TLR3, TICAM-1, IRF3, IRF3/7ノックアウトマウスでは全くIFN-γ産生は見られなかった（図１ｂ）。【００８２】
３．考察
抗原特異的CTLは、抗原単独では誘導されず、抗原＋ARNAX投与により誘導されることが明らかとなった。ノックアウトマウスの結果から、ARNAXによる抗原特異的CTL誘導はTLR3-TICAM-1-IRF3経路に依存し、RLR-MAVS経路やTLR3以外のTLR-MyD88経路は関与しないことが判明した。ARNAXのプライミングアジュバント活性はTLR3-TICAM-1シグナルとして定義できる。【００８３】
実施例２：投与経路によるＡＲＮＡＸのサイトカイン産生効果及び安全性の比較
１．材料及び方法
８週齢の野生型(C57BL/6)♀マウスの皮下にsaline, poly(I:C)(150 μg),ARNAX(150 μg)を、あるいは静脈中にsaline, poly(I:C)(50 μg), ARNAX(50 μg)を投与し、３時間及び６時間後の血中のサイトカイン量を測定した（図２）。IL-6, TNF-α, IL-12p40はCBAで、IFN-β, IP-10はELISAにて測定した。【００８４】
２．結果
ARNAX皮下投与において、血中の炎症性サイトカインIL-6, TNF-αはpoly(I:C)投与より少なく、IFN-γも非常に少なかった。一方、Th1型サイトカインであるIL-12p40はpoly(I:C)より多く産生誘導され、NK細胞、NKT細胞、T細胞を呼び寄せるケモカインのIP-10はpoly(I:C)と同等に誘導された。静脈内投与では、poly(I:C)はTNF-α, IL-6,IFN-βを強く誘導するが、ARNAXは殆ど誘導しなかった。【００８５】
３．考察
ARNAXは投与経路に拘らず、全身的な炎症性サイトカインやタイプI IFN産生を殆ど誘導しないことから、poly(I:C)で見られる副作用が軽減された非炎症性アジュバントといえる。一方、Th1型サイトカインのIL-12はpoly(I:C)より多く産生誘導される。抗原特異的CTL誘導では第３のシグナルとしてIL-12やtype I IFNなどのサイトカインが必要であるが、IL-12で誘導されたCTLはtype I IFNで誘導されたCTLより、腫瘍内でのPD-1の発現が低く、より長く生存するという報告もあり、ARNAXのIL-12high／IFN-βlowのサイトカインプロフィールは、腫瘍内での機能的な抗原特異的CD8＋T細胞の誘導に適している。【００８６】
実施例３：ＡＲＮＡＸと抗原の投与による抗腫瘍効果（胸腺腫）
１．材料及び方法
C67BL/6マウス (7週齢,♀)の腰背部にOVA発現腫瘍（胸腺腫）株であるEG7 (2x106 /200 μl PBS)を皮下移植し、day7にPBS(n=5)又はOVA(100 μg)+ARNAX(60 μg)(n=5)を皮下投与し、腫瘍の増殖を経時的に測定した(図３ｃ)。 Day14に腫瘍を採取し、腫瘍内のCD8+T 細胞の割合、CD8+ T細胞中のOVA特異的CD8+T細胞及びCD11c陽性CD8+T細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した（図３ｄ）。また、腫瘍組織切片を作成し、抗CD8α抗体で免疫染色して腫瘍内のCD8+T細胞の浸潤を共焦点顕微鏡でPBS群20視野、OVA+ARNAX群16視野を観察し数値化した（図３ｆ）。更に、腫瘍組織からRNAをTrizolを用いて精製し、Gzmb, Ifng, Perf1, Cxcl9, Cxcl10, Cxcl11の遺伝子発現を定量PCRで測定した（図３ｅ）。【００８７】
２．結果
OVA+ARNAX治療でEG7腫瘍内にCD8+T細胞が非常に多く浸潤していた（図３ｄ,ｆ）。CD8+T細胞中のOVA特異的CTLの割合も高く,活性化マーカーのCD11cも発現しており、エフェクターメモリーの腫瘍反応性CTLが誘導されたと考えられる。それに伴い腫瘍の退縮が誘導された（図３ｃ）。腫瘍内では、granzyme（Gzmb）, perforin（Prf1）, IFN-γ（Ifng）, Cxcl9,10,11などの遺伝子がOVA+ARNAXで発現上昇していた（図３ｅ）。【００８８】
３．考察
ARNAX＋がん抗原投与で、腫瘍特異的CTLを効率的に誘導し腫瘍内に浸潤させ、腫瘍退縮を導く事ができると考えられる。腫瘍内では、granzyme, perforin, IFN-γなど細胞傷害関連遺伝子やCxcl9,10,11といったCTLを誘導するケモカイン遺伝子の発現が上昇しており、ARNAXは腫瘍内にTh1型免疫応答を構築することができるアジュバントである。【００８９】
実施例４：ＡＲＮＡＸとＰＤ−Ｌ１抗体の併用投与（胸腺腫）
１．材料及び方法
C67BL/6マウス (7週齢,♀)の腰背部にPD-L1高発現EG7 （Kataoka et al., Nature 534:402,2016）(2x106 /200 μl PBS)を皮下移植し、day7にPBS （isotype Ab群） (n=4), PBS （anti-PD-L1 Ab群）(n=4),OVA(100 μg)+ARNAX(60 μg) （isotype Ab群）(n=6), OVA(100 μg)+ARNAX(60 μg) （anti-PD-L1 Ab群） (n=6)を皮下投与し、day7, 9, 11にisotype Abあるいはanti-PD-L1 Ab（200μg/head） を静脈内投与し腫瘍の増殖を経時的に測定した(図４ｃ)。 Day13に脾臓及び腫瘍を採取し、脾臓及び腫瘍内のCD8+T 細胞の割合、CD8+ T細胞中のOVA特異的CD8+T細胞、CD11c陽性CD8+T細胞、PD-１陽性CD8+T細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した（図４d）。更に、腫瘍組織からRNAをTrizolを用いて精製し、Gzmb, Ifng, Perf1, Cxcl9, Cxcl10, Cxcl11の遺伝子発現を定量PCRで測定した（図４ｅ）。【００９０】
２．結果
PD-L1高発現EG7において、PD-L1抗体単独治療では腫瘍増殖は抑制されなかったが、OVA+ARNAXで腫瘍の退縮が誘導された。更に、PD-L1抗体との併用でより効果的に腫瘍が退縮した（図４c）。OVA+ARNAXで腫瘍内にCD8+ T cellが浸潤しており、抗PD-L1抗体を併用すると更に多くのT細胞が浸潤していた。腫瘍内のOVA特異的CD8+T cell の割合はOVA+ARNAX, OVA+ARNAX+anti-PD-L1 Abいずれも高くなっていた（図４ｄ）。一方脾臓では、抗原特異的CD8+T cell の増殖はPD-L1抗体の併用で著しく増加しており、活性化マーカーのCD11c, PD-1陽性CD8+T細胞の割合も高く、エフェクターメモリーの腫瘍反応性CTLが誘導されていることが判明した。また、腫瘍内のGzmb, Ifng, Perf1, Cxcl9,の遺伝子発現もARNAX+OVAとanti-PD-L１抗体併用で上昇していた（図４ｅ）。【００９１】
３．考察
PD-L1抗体治療に抵抗性のPD-L1高発現のEG7腫瘍において、OVA+ARNAXで腫瘍の増殖はある程度抑制されるが、抗PD-L1抗体を併用することで効果的に腫瘍退縮を導くことができたことから、併用治療によりPD-1/PD-L1抵抗性を解除できると考えられる。
PD-1経路がブロックされたことにより、プライミング相において多くの腫瘍特異的CTLが誘導されて腫瘍内に浸潤し、エフェクター相での機能抑制解除により効果的にがん退縮を導いたと考えられ、抗PD-1/PD-L1抗体との併用はARNAXの作用強化に有用である（図５参照）。【００９２】
実施例５：ＡＲＮＡＸとＰＤ−Ｌ１抗体の併用投与（メラノーマ）
１．材料及び方法
C67BL/6マウス (7週齢,♀)の腰背部にOVA発現B16メラノーマ株であるMO5(2x106 /200 μl PBS)を皮下移植し、day10にPBS （isotype Ab群） (n=5), PBS （anti-PD-L1 Ab群）(n=4),OVA(100 μg)+ARNAX(60 μg)（isotype Ab群）(n=4), OVA(100 μg)+ARNAX(60 μg) （anti-PD-L1 Ab群）(n=4)を皮下投与し、day10, 12, 14、16にisotype Abあるいはanti-PD-L1 Ab（200μg/head） を静脈内投与し、腫瘍の増殖を経時的に測定した(図６ｃ)。 Day17に脾臓及び腫瘍を採取し、脾臓及び腫瘍内のCD8+T 細胞の割合、CD8+ T細胞中のOVA特異的CD8+T細胞及びCD11c陽性CD8+T細胞、PD-1陽性CD8+T細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した（図６ｄ）。また、腫瘍組織からRNAをTrizolを用いて精製し、granzyme（Gzmb）, perforin（Prf1）, IFN-γ（Ifng）, Cxcl10,の遺伝子発現を定量的PCRで測定した（図６ｅ）。さらに、腫瘍浸潤免疫細胞の割合を、リンパ球、樹状細胞、CD11b陽性骨髄細胞のそれぞれについて測定した（図６ｆ）。【００９３】
２．結果
PD-L1発現MO5において、OVA+ARNAXは、PD-L1抗体単独治療と同程度の腫瘍の退縮を誘導させた。更に、OVA+ARNAXはPD-L1抗体と併用することでより効果的に腫瘍を退縮させた（図６ｃ）。OVA+ARNAXでは腫瘍内にCD8+ T cellが浸潤しており、抗PD-L1抗体を併用すると更に多くのT細胞が浸潤していた。腫瘍内のOVA特異的CD8+T cell の割合はOVA+ARNAX, OVA+ARNAX+anti-PD-L1 Abいずれも高くなっていた（図６ｄ）。一方脾臓では、抗原特異的CD8+T cell の増殖はPD-L1抗体の併用で著しく増加しており、活性化マーカーのCD11c, PD-1陽性CD8+T細胞の割合も高く、エフェクターメモリーの腫瘍反応性CTLが誘導されていることが判明した。また、腫瘍内のGzmb, Ifng, Perf1, Cxcl9,の遺伝子発現もARNAX+OVAとanti-PD-L１抗体併用で上昇していた（図６ｅ）。【００９４】
３．考察
MO5腫瘍において、ARNAX+がん抗原治療は腫瘍増殖を抑制するが、PD-L1抗体と併用することでより効果的に腫瘍退縮を導くことができる。このことから、メラノーマについても、ARNAX＋がん抗原との併用治療によりPD-1/PD-L1免疫チェックポイント阻害剤は高い抗腫瘍効果を発揮できるものと考えられる。【００９５】
実施例６：ＡＲＮＡＸの構造とＴＬＲ３を介したＩＦＮβ活性化能
１．材料及び方法
以下の4種類の二本鎖RNAを合成した。
ARNAX140：配列番号１の1-140位の塩基配列を有する二本鎖RNA
ARNAX120#1：配列番号１の17-136位の塩基配列を有する二本鎖RNA
ARNAX120#2：配列番号１の17-56の塩基配列を3回連結した配列を有する二本鎖RNA
ARNAX130：配列番号１の1-130位の塩基配列を有する二本鎖RNA
配列番号１の17-56位はAUリッチな領域である（図７）。【００９６】
HEK293細胞に対照プラスミド(pEF/BOS)あるいはヒトTLR3発現プラスミドをIFN-β プロモーターレポータープラスミドと共にトランスフェクトし、24時間後に培地、poly(I:C)、ARNAX140又はARNAX120#2を2, 5, 10 μg/mlの濃度で加えた。6時間後に細胞中のルシフェラーゼ活性を測定した。pEF/BOS発現細胞に陰性対照として培地を加えたときのルシフェラーゼ活性を1として、foldで表した（図８）。【００９７】
同様の実験を、poly(I:C)、ARNAX140、ARNAX130又はARNAX120#1を2, 5, 10 μg/mlの濃度で加えて実施した（図９）。【００９８】
２．結果
ARNAX120のTLR3を介したIFN-βプロモーター活性化能はARNAX140の7-8割で、RNA配列の異なるARNAX120#1とARNAX120#2でTLR3活性化能に差は認められなかった。ARNAX130は、ARNAX140と同等のTLR3を介したIFN-βプロモーター活性化能を有することが確認された。【００９９】
実施例７：ＡＲＮＡＸ１２０のＣＴＬの誘導活性
１．材料及び方法
実施例１にしたがい、8週齢の野生型(C57BL/6)雌性マウスを用いて、PBS、OVA(100 μg)、OVA(100 μg)＋poly(I:C)(50 μg)、OVA(100 μg)＋ARNAX140 (10 μg)、OVA(100 μg)＋ARNAX140 (30 μg), OVA(100 μg)＋ARNAX140 (60 μg) の皮下投与による脾臓と膝下リンパ節におけるOVA特異的CD8+T細胞の割合を測定した。【０１００】
同様に、8週齢の野生型(C57BL/6)雌性マウスを用いて、PBS、OVA(100 μg)、OVA(100 μg)＋poly(I:C)(50 μg)、OVA(100 μg)＋ARNAX120#2 (10 μg)、OVA(100 μg)＋ARNAX120#2(30 μg) の皮下投与による脾臓におけるOVA特異的CD8+T細胞の割合を測定した。また、脾細胞(1x 107/ml)を100 nMのOVA特異的ペプチド（SL8：SIINFEKL）あるいはコントロールWT1ペプチド(Db126: RMFPNAPYL)で3日間刺激し、培養上清中のIFN-γをELISAで測定した。【０１０１】
２．結果
PBSあるいはOVA単独投与ではOVA特異的CTLは誘導されないが、OVA＋poly(I:C)、OVA+ARNAX140, OVA＋ARNAX120#2投与ではCTLが誘導され、in vivoでのクロスプライミング活性が確認された（図１０、図１１）。ARNAX140の投与量を変量した結果、10μg/headで充分CTL誘導活性があることが判明した（図１０）。ARNAX120はARNAX140と同等のCTL誘導活性（クロスプライミング活性）を有し、10μg/headの投与量で充分CTL誘導活性を示すことが確認された（図１１）。【０１０２】
実施例８：ＡＲＮＡＸ１２０の抗腫瘍活性
１．材料及び方法
実施例３に従い、C67BL/6マウス (7週齢,♀)の腰背部にEG7 (2x106 /200 μl PBS)を皮下移植し、day7にPBS(n=5)、ARNAX120#1 (10 μg)(n=4)又はOVA(100 μg)+ARNAX120#1(10 μg)(n=5)を皮下投与し、腫瘍の増殖を経時的に測定した。【０１０３】
２．結果
ARNAX120#1 10μg単独投与でEG7腫瘍の増殖抑制が見られるが、OVA抗原との同時投与で腫瘍を顕著に退縮させることが確認された（図１２）。以上の結果から、ARNAXは120塩基長あれば十分に効果を発揮できること、その配列には配列番号１に示される配列中の連続した少なくとも40塩基が含まれていればよいことが確認された。製造効率及びコスト面からは短い核酸のほうが好ましいことから、ARNAX120やARNAX130は実用面で有用なアジュバント候補となり得る。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明によれば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体療法の効果や奏効率を改善することができる。したがって、本発明は、がんや感染症など免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体）を用いた免疫療法が期待される医療分野において有用である。【０１０５】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０１０６】
配列番号12：合成DNA(ODN M362)
配列番号13：合成DNA(ODN 2006)
配列番号14：合成DNA(ODN 1668)
配列番号15：合成DNA(ODN 1826)
配列番号16：合成DNA(ODN 2007)
配列番号17：合成DNA(ODN BW006)
配列番号18：合成DNA(ODN 2395)
配列番号19：合成DNA(ODN M362 control)
配列番号20：合成DNA(ODN M362 control_TpC置換体)
配列番号21：合成DNA(ODN M362 control_CpC置換体)
配列番号22：合成DNA(ODN 2006 control)
配列番号23：合成DNA(ODN 2006 control_TpC置換体)
配列番号24：合成DNA(ODN 2006 control_CpC置換体)
配列番号25：合成DNA(ODN 2007 control)
配列番号26：合成DNA(ODN 2007 control_TpC置換体)
配列番号27：合成DNA(ODN 2007 control_CpC置換体)
配列番号28：合成DNA(ODN BW006 control)
配列番号29：合成DNA(ODN BW006 control_TpC置換体)
配列番号30：合成DNA(ODN BW006 control_CpC置換体)
配列番号31：合成DNA(ODN 2395 control)
配列番号32：合成DNA(ODN 2395 control_TpC置換体)
配列番号33：合成DNA(ODN 2395 control_CpC置換体)
配列番号34：合成DNA(ODN 1668 control)
配列番号35：合成DNA(ODN 1668 control_TpC置換体)
配列番号36：合成DNA(ODN 1668 control_CpC置換体)
配列番号37：合成DNA(ODN 1826 control)
配列番号38：合成DNA(ODN 1826 control_TpC置換体)
配列番号39：合成DNA(ODN 1826 control_CpC置換体)
配列番号40：センス鎖用DNA/RNAキメラ分子(ARNAX140)
配列番号41：アンチセンス鎖用合成RNA(ARNAX140)
配列番号42：センス鎖用DNA/RNAキメラ分子(ARNAX120#1)
配列番号43：アンチセンス鎖用合成RNA(ARNAX120#1)
配列番号44：センス鎖用DNA/RNAキメラ分子(ARNAX120#2)
配列番号45：アンチセンス鎖用合成RNA(ARNAX120#2)
配列番号46：センス鎖用DNA/RNAキメラ分子(ARNAX130)
配列番号47：アンチセンス鎖用合成RNA(ARNAX130)
【図１ａ−ｂ】
2018021400.tif 000004
【図１ｃ】
2018021400.tif 000005
【図２】
2018021400.tif 000006
【図３ａ−ｃ】
2018021400.tif 000007
【図３ｄ−ｆ】
2018021400.tif 000008
【図４ａ−ｃ】
2018021400.tif 000009
【図４ｄ】
2018021400.tif 000010
【図４ｅ】
2018021400.tif 000011
【図５】
2018021400.tif 000012
【図６ａ−ｅ】
2018021400.tif 000013
【図６ｆ】
2018021400.tif 000014
【図７】
2018021400.tif 000015
【図８】
2018021400.tif 000016
【図９】
2018021400.tif 000017
【図１０】
2018021400.tif 000018
【図１１】
2018021400.tif 000019
【図１２】
2018021400.tif 000020
【配列表】
2018021400000001.app
【国際調査報告】
2018021400.tif 000021
2018021400.tif 000022
2018021400.tif 000023
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