(57)【要約】【課題】  本発明は、心不全の治療及び／又は予防の効果を長期にわたって維持することを可能とする、新たな移植用心筋幹細胞、当該細胞を製造する方法及び当該細胞を含む細胞製剤を提供することを目的とするものである。【解決手段】  本発明は、ミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤との複合体を心筋幹細胞に導入する工程を含む、心不全の治療及び／又は予防に用いるための心筋幹細胞の製造方法、当該製造方法により製造された細胞及びこれを含む細胞製剤、並びに当該細胞を製造するためのリポソームに関する。本発明によれば、細胞移植による治療及び／又は予防効果を長期にわたって維持することが可能な心筋幹細胞を提供することができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤との複合体を心筋幹細胞に導入する工程を含む、心不全の治療及び／又は予防に用いるための心筋幹細胞の製造方法。
【請求項２】
前記複合体が、ミトコンドリア活性化剤が封入されたミトコンドリア指向性リポソームである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記複合体が、ミトコンドリア活性化剤が封入された、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び／又はスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつミトコンドリア指向性分子を脂質膜表面に有するミトコンドリア指向性リポソームである、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
ミトコンドリア指向性分子が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
ミトコンドリア活性化剤がレスベラトロールである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
ミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤との複合体を心筋幹細胞に導入することにより製造される、心筋幹細胞。
【請求項７】
前記複合体が、ミトコンドリア活性化剤が封入されたミトコンドリア指向性リポソームである、請求項６に記載の心筋幹細胞。
【請求項８】
前記複合体が、ミトコンドリア活性化剤が封入された、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び／又はスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつミトコンドリア指向性分子を脂質膜表面に有するミトコンドリア指向性リポソームである、請求項６又は７に記載の心筋幹細胞。
【請求項９】
ミトコンドリア指向性分子が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項８に記載の心筋幹細胞。
【請求項１０】
ミトコンドリア活性化剤がレスベラトロールである、請求項６〜９のいずれか一項に記載の心筋幹細胞。
【請求項１１】
心筋幹細胞を含む細胞集団であって、蛍光色素ＪＣ−１で染色したときのＪＣ−１モノマーの蛍光強度に対するＪＣ−１ダイマーの蛍光強度の比の平均値が１〜４である、前記細胞集団。
【請求項１２】
請求項６〜１１のいずれか一項に記載の心筋幹細胞又は細胞集団を含む、心不全の治療及び／又は予防に用いるための細胞製剤。
【請求項１３】
ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び／又はスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつミトコンドリア指向性分子を脂質膜表面に有する、心筋幹細胞のミトコンドリアに被封入物を導入するためのリポソーム。
【請求項１４】
ミトコンドリア指向性分子が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１３に記載のリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心不全の治療及び／又は予防に利用される新たな心筋幹細胞の製造方法、ミトコンドリアが活性化された心筋幹細胞を含む細胞集団、該心筋幹細胞又は細胞集団を含む心不全の治療及び／又は予防のための細胞製剤、並びに該心筋幹細胞を製造するためのリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全は、心筋梗塞、心筋症若しくは狭心症等の心臓関連疾患、又は高血圧、腎臓病若しくは悪性腫瘍に対する化学療法の副作用等の心臓以外の疾患が原因となって、心臓の機能が低下して肺や全身に必要な量の血液を供給できなくなった症状を指す。心不全は、日本においてがんに次ぐ主要死因であり、その根本的な治療法としては心臓移植が挙げられる。しかしながら、心臓移植は、移植ドナーの慢性的な不足、移植臓器の耐用年数の限界、拒絶反応、生涯にわたる免疫抑制薬内服、頻回の入院カテーテル検査等、多岐にわたる問題点を有する。【０００３】
２０００年代後半に心不全に対する有望な治療法として細胞移植が提唱されて以来、ｉＰＳ細胞を含む様々な細胞を用いた細胞移植療法が検討されている。特に、心筋幹細胞移植は、自己体細胞を用いる移植のため免疫学的に安全である、侵襲性の低い方法で行うことができるなどの利点を有する。心筋幹細胞移植は、臨床試験で一定の効果が実証されている（例えば非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。【０００４】
心筋幹細胞移植の問題としては、例えば、ブタ虚血再灌流モデルでの心筋幹細胞移植実験において移植細胞生着効果が限定的であること（非特許文献４）、ラットドキソルビシン心筋症モデルでの心筋幹細胞移植実験において生存率改善効果が限定的であること（非特許文献５）などが挙げられる。すなわち、長期にわたる治療効果の維持が、心筋幹細胞移植における今後の課題の一つである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｏｌｌｉ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ２０１１，３７８，ｐｐ．１８４７−１８５７
【非特許文献２】Ｍａｋｋａｒ，Ｒ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ２０１２，３７９，ｐｐ．８９５−９０４
【非特許文献３】Ｉｓｈｉｇａｍｉ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１５，１１６，ｐｐ．６５３−６６４
【非特許文献４】Ｔａｋｅｈａｒａ，Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．  ２００８，５２，ｐｐ．１８５８−６５
【非特許文献５】Ｄｅ  Ａｎｇｅｌｉｓ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０１０，１２１，ｐｐ．２７６−２９２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、心不全の治療及び／又は予防の効果を長期にわたって維持することを可能とする、新たな移植用心筋幹細胞、当該細胞を製造する方法及び当該細胞を含む細胞製剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、心筋幹細胞のミトコンドリアにミトコンドリア活性化剤を送達することで、生着効果が高められ、治療効果が長期にわたって維持された移植用細胞を製造することができることを見出し、下記の各発明を完成させた。【０００８】
（１）ミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤との複合体を心筋幹細胞に導入する工程を含む、心不全の治療及び／又は予防に用いるための心筋幹細胞の製造方法。
（２）前記複合体が、ミトコンドリア活性化剤が封入されたミトコンドリア指向性リポソームである、（１）に記載の製造方法。
（３）前記複合体が、ミトコンドリア活性化剤が封入された、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び／又はスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつミトコンドリア指向性分子を脂質膜表面に有するミトコンドリア指向性リポソームである、（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）ミトコンドリア指向性分子が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、（３）に記載の製造方法。
（５）ミトコンドリア活性化剤がレスベラトロールである、（１）から（４）のいずれか一項に記載の製造方法。
（６）ミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤との複合体を心筋幹細胞に導入することにより製造される、心筋幹細胞。
（７）前記複合体が、ミトコンドリア活性化剤が封入されたミトコンドリア指向性リポソームである、（６）に記載の心筋幹細胞。
（８）前記複合体が、ミトコンドリア活性化剤が封入された、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び／又はスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつミトコンドリア指向性分子を脂質膜表面に有するミトコンドリア指向性リポソームである、（６）又は（７）に記載の心筋幹細胞。
（９）ミトコンドリア指向性分子が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、（８）に記載の心筋幹細胞。
（１０）ミトコンドリア活性化剤がレスベラトロールである、（６）から（９）のいずれか一項に記載の心筋幹細胞。
（１１）心筋幹細胞を含む細胞集団であって、蛍光色素ＪＣ−１で染色したときのＪＣ−１モノマーの蛍光強度に対するＪＣ−１ダイマーの蛍光強度の比の平均値が１〜４である、前記細胞集団。
（１２）（６）から（１１）のいずれか一項に記載の心筋幹細胞又は細胞集団を含む、心不全の治療及び／又は予防に用いるための細胞製剤。
（１３）ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び／又はスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつミトコンドリア指向性分子を脂質膜表面に有する、心筋幹細胞のミトコンドリアに被封入物を導入するためのリポソーム。
（１４）ミトコンドリア指向性分子が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、（１３）に記載のリポソーム。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞移植による治療及び／又は予防効果を長期にわたって維持することが可能な心筋幹細胞を提供することができる。かかる心筋幹細胞は、心筋傷害に対する治療及び／若しくは予防、心臓機能の回復、保護若しくは低下抑制、又は心不全の治療及び／若しくは予防などのために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】レスベラトロールを封入し、ＮＢＤで蛍光標識されたミトコンドリア指向性リポソームを導入した心筋幹細胞を示すフローサイトメトリーのヒストグラムである。横軸はＮＢＤの蛍光量を、縦軸は細胞数を表す。
【図２】レスベラトロールを封入し、ＮＢＤで蛍光標識されたミトコンドリア指向性リポソームを導入した心筋幹細胞を共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いて観察した写真である。図中、Ｂの写真はＮＢＤ（緑色）で染色されたＲＥＳ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒを、Ｃの写真はＭＴＤＲ（赤色）で染色されたミトコンドリアを、Ｄの写真はＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（青色）で染色された細胞核を、Ａの写真はＢ〜Ｄの写真を重ね合わせたものをそれぞれ示す。各図のスケールバーは２０μｍである。
【図３】心筋芽細胞と、レスベラトロールを封入したミトコンドリア指向性リポソームを導入した心筋幹細胞（ＭＡ−Ｃｅｌｌ）又は未処理の心筋幹細胞（ＣＰＣ）とを共培養したときの、ドキソルビシン（終濃度１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ）による細胞傷害下での細胞生存率を示すグラフである。図中、「共培養」は心筋芽細胞とＭＡ−Ｃｅｌｌとの共培養を、「ＣＰＣ単独」は心筋芽細胞とＣＰＣとの共培養を、「コントロール」は心筋芽細胞の単独培養を表す。
【図４】心筋芽細胞と、レスベラトロールを封入したミトコンドリア指向性リポソームを導入した心筋幹細胞（ＭＡ−Ｃｅｌｌ（＋ＲＥＳ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ））、空のＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒを導入した心筋幹細胞（ＣＰＣ（＋ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ））、レスベラトロールで直接処理した心筋幹細胞（ＣＰＣ（＋ＲＥＳ））又はＣＰＣとを共培養したときの、ドキソルビシン（終濃度１０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ）による細胞傷害下での細胞生存率を示す。
【図５】心筋芽細胞と、レスベラトロールを封入したミトコンドリア指向性リポソームを導入した心筋幹細胞（ＣＰＣ＋ＲＥＳ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ）、レスベラトロールで直接処理した心筋幹細胞（ＣＰＣ（＋ＲＥＳ））又はＣＰＣとを共培養したときの、ドキソルビシン（終濃度１０μｇ／ｍＬ）による細胞傷害下で４８時間経過後の細胞生存率を示す。
【図６】心筋芽細胞とＭＡ−Ｃｅｌｌとを共培養したときの、レスベラトロールの各用量におけるドキソルビシン（終濃度１０μｇ／ｍＬ）による細胞傷害下での細胞生存率を示すグラフである。
【図７】ＭＡ−Ｃｅｌｌ若しくはＣＰＣを移植した又は未処置のドキソルビシン心不全モデルマウス及び健常マウスに関するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を示すグラフである。
【図８】ＭＡ−Ｃｅｌｌ若しくはＣＰＣを移植した又は未処置のドキソルビシン心不全モデルマウス及び健常マウスの平均体重の変化を示すグラフである。
【図９】ＭＡ−Ｃｅｌｌ若しくはＣＰＣを移植した又は未処置のドキソルビシン心不全モデルマウス及び健常マウスの心臓組織におけるジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）陽性細胞率を示すグラフである。
【図１０】ＭＡ−Ｃｅｌｌ若しくはＣＰＣを移植した又は未処置のドキソルビシン心不全モデルマウス及び健常マウスの心臓組織におけるアポトーシス誘導率を示すグラフである。
【図１１】ＭＡ−Ｃｅｌｌを移植したドキソルビシン心不全モデルマウス及び健常マウスの左室短縮率を示すグラフである。
【図１２】ＭＡ−Ｃｅｌｌ若しくはＣＰＣを移植した又は未処置のドキソルビシン心不全モデルマウス及び健常マウスの心臓組織における、ＰＧＣ１α、ＥＳＲＲａ、ＳＤＨＡ、Ｃｏｘ１及びＡＴＰ１ａの各遺伝子の相対的発現量を示すグラフである。
【図１３】ＭＡ−Ｃｅｌｌ若しくはＣＰＣを移植した又は未処置のドキソルビシン心不全モデルマウス及び健常マウスの心臓組織におけるミトコンドリア呼吸鎖複合体の形成率を示すグラフである。
【図１４】移植後のマウス心臓におけるＭＡ−Ｃｅｌｌの定着を示す写真である。図中、左下の写真はＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８（緑色）で染色された心筋アクチニンを、右上の写真はＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（青色）で染色された細胞核を、右下の写真はＣｅｌｌＶｕｅ  Ｃｌａｒｅｔ（赤色）で染色されたＭＡ−Ｃｅｌｌを、左上の写真はこれらを重ね合わせたものをそれぞれ示す。
【図１５】蛍光色素ＪＣ−１を用いてＭＡ−Ｃｅｌｌ及びＣＰＣのミトコンドリア膜電位を検出した結果を示す写真である。図中、左列の写真はＣＰＣ、中央列の写真はＭＡ−Ｃｅｌｌ、右列の写真はＦＣＣＰを添加したＣＰＣであり、中段の写真は脱分極したミトコンドリアを示すＪＣ−１モノマーに対応する波長５２９ｎｍの緑色蛍光を、下段の写真は分極したミトコンドリアを示すＪＣ−１ダイマーに対応する波長５９０ｎｍの赤色蛍光を、上段の写真は中段の写真と下段の写真の重ね合わせたものを、それぞれ示す。
【図１６】蛍光色素ＪＣ−１を用いてＭＡ−Ｃｅｌｌ及びＣＰＣのミトコンドリア膜電位を検出した画像を基に、脱分極したミトコンドリアを示すＪＣ−１モノマー（緑色）及び分極したミトコンドリアを示すＪＣ−１ダイマー（赤色）の蛍光強度の比（Ｄｉｍｅｒ／Ｍｏｎｏｍｅｒ）を算出した結果を示すグラフである。図中、○は個々の細胞における値を、━は平均値（ｎ＝１９）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の第１の態様は、ミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤との複合体を心筋幹細胞に導入する工程を含む、心不全の治療及び／又は予防に用いるための心筋幹細胞の製造方法に関する。
【００１２】
心筋幹細胞（心筋前駆細胞（Ｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）ともいう。以下、ＣＰＣと表す）は、自己複製能及び心筋、血管内皮・平滑筋、脂肪、骨、軟骨等への分化能を有する幹細胞である。本発明で使用されるＣＰＣは、当業者に公知の方法により心臓組織から分離することができる。かかるＣＰＣの一例は、例えばＯｈら（ＰＮＡＳ．，２００３，１００，ｐｐ．１２３１３−１２３１８）の方法、Ｉｓｈｉｇａｍｉら（Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．，２０１５，１１６，ｐｐ．６５３−６６４）の方法等によって心臓組織から分離された細胞である。また、ｉＰＳ細胞から分化誘導されたＣＰＣ（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６，２０１６、１９１１１）、及び線維芽細胞や心筋細胞のリプログラミングにより得られるＣＰＣ（Ｉｅｄａ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２０１０，１４２，ｐｐ．３７５−３８６）も、本発明において使用することができる。上記各文献は参照により本明細書に取り込まれる。
【００１３】
ＣＰＣはいかなる動物由来のものであってもよいが、ヒトの心不全の治療又は予防に使用する目的においては、ヒトのＣＰＣを使用することが好ましい。本発明では、心不全を患っている者若しくは心不全のおそれがある者の心臓組織から自己体細胞を用いる移植を前提として分離されるＣＰＣを使用することが特に好ましい。
【００１４】
またＣＰＣは、Ｓｃａ−１等のＣＰＣ特異的マーカーの発現に基づいて単離精製されたものであってもよく、又は細胞集団、例えば心臓から分離した細胞のスフェロイド培養により得られるヘテロな細胞集団に含まれる状態のものであってもよい。後者の場合は、細胞集団ごと後述のミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤との複合体を導入する工程に供され、これによりミトコンドリアが活性化されたＣＰＣを含む細胞集団が製造される。
【００１５】
ＣＰＣは、その後の細胞移植に必要な細胞数を確保するため、その幹細胞性を維持するかぎりインビトロで継代培養して増殖させた後に使用してもよい。
【００１６】
本発明は、ミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤との複合体をＣＰＣに導入する工程を含む。
【００１７】
ミトコンドリア指向性キャリアは、細胞内に当該キャリアが導入されたときに、細胞内オルガネラの一つであるミトコンドリアに選択的に到達する機能を有するものをいう。ミトコンドリア指向性キャリアの例としては、Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ  ｃａｔｉｏｎ（ＴＰＰ）若しくはＲｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３などの脂溶性カチオン物質、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＭＴＳ）ペプチド（Ｋｏｎｇ，ＢＷ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ２００３，１６２５，ｐｐ．９８−１０８）若しくはＳ２ペプチド（Ｓｚｅｔｏ，Ｈ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．  ２０１１，２８，ｐｐ．２６６９−２６７９）などのポリペプチド、又はＤＱＡｓｏｍｅ（Ｗｅｉｓｓｉｇ，Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００１，７５，ｐｐ．４０１−４０８）、ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（Ｙａｍａｄａ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  ２００８，１７７８，ｐｐ．４２３−４３２）、ＤＦ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（Ｙａｍａｄａ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．  ２０１１，１９，ｐｐ．１４４９−１４５６）、Ｓ２ペプチドで修飾された改変型ＤＦ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ  ２０１３，１３，ｐｐ．６１０−６１４）などのミトコンドリア指向性リポソームを挙げることができる。上記各文献は、本発明における各キャリアの製造及び利用に関して、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１８】
本発明において好ましいミトコンドリア指向性キャリアはミトコンドリア指向性リポソームであり、特にＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ、ＤＦ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ又は改変型ＤＦ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒが好ましい。
【００１９】
ミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤との複合体とは、化学的な結合又は物理的封入などの様式に拘わらず、ミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤とが一体的に挙動する形態の物質をいう。例えば、脂溶性カチオン脂質又はポリペプチドがミトコンドリア指向性キャリアであるときは、例えば脂溶性カチオン脂質に関するＭｕｒｐｈｙらの方法（Ｇ．Ｆ．  Ｋｅｌｓｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６，ｐｐ．４５８８−４５９６）、Ｓｚｅｔｏペプチドに関する特表２００７−５０３４６１に記載された方法などに準じて、共有結合又はイオン結合などの化学的方法によってミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤とを結合させることで、ミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤との複合体を形成させることができる。
【００２０】
また、ミトコンドリア指向性キャリアがリポソームであるときは、リポソームの脂質膜表面にミトコンドリア活性化剤を化学的に結合させることで、又はリポソームの内部すなわち脂質膜で封鎖された内部空間にミトコンドリア活性化剤を物理的に封入することで、ミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤との複合体を形成させることができる。
【００２１】
ＣＰＣへの前記複合体の導入は、ミトコンドリア指向性キャリア毎に知られた細胞への導入方法によって行うことができる。例えば複合体を含む適当な培地でＣＰＣを培養することで細胞内に導入してもよく、また複合体とＣＰＣとを、リポフェクタミン、ポリエチレングリコールその他の細胞への物質の取込を促進することのできる公知の物質の存在下でインキュベーションすることで、細胞内に導入してもよい。
【００２２】
本発明の第１の態様におけるミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤との複合体をＣＰＣに導入する工程の好ましい例は、ミトコンドリア活性化剤が封入されたミトコンドリア指向性リポソームである複合体、特にＭＴＳペプチド又はＳ２ペプチドで表面修飾された、ミトコンドリア活性化剤が封入されたＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ又はＤＦ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒである複合体とＣＰＣとをインキュベーションすることで、複合体をＣＰＣに導入する工程である。
【００２３】
ミトコンドリア活性化剤は、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体（電子伝達系）を活性化させる、特にミトコンドリアの膜電位を分極した状態とすることのできる物質をいい、特にミトコンドリアを過分極状態とすることができるものの使用が好ましい。そのようなミトコンドリア活性化剤の例としては、レスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ、３，５，４’−トリヒドロキシ−ｔｒａｎｓ−スチルベン）、コエンザイムＱ１０、ビタミンＣ、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステイン、ＴＥＭＰＯ、ＳＯＤ、グルタチオンなどの抗酸化剤を挙げることができ、特にレスベラトロールが好ましい。
【００２４】
本発明で好ましく使用されるレスベラトロールは、植物から公知の方法で抽出されたものでもよく、また例えばＡｎｄｒｕｓら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ２００３，４４，ｐｐ．４８１９−４８２２）その他の公知の方法で化学合成されたものであってもよい。
【００２５】
本発明の第１の態様の方法により製造されるＣＰＣは、本発明のさらなる態様の１つであって、後の実施例に示すように、ドキソルビシンが投与されたマウスの生存率を大幅に向上させることができる。また、ドキソルビシンが投与されたマウスの心臓組織における酸化ストレスの低減、アポトーシスの抑制又はミトコンドリア機能の維持にも好適に関与する。
【００２６】
アントラサイクリン系薬剤の一種であるドキソルビシンの投与によって重度の心筋傷害がもたらされることは、臨床的に知られており、ドキソルビシンが投与されたマウスは心不全モデルマウスとして利用されている。したがって、本発明の第１の態様の方法により製造されるＣＰＣは、心筋傷害、特に重度の心筋傷害に対する治療及び／若しくは予防、心臓機能の回復、保護若しくは低下抑制、又は心不全の治療及び／若しくは予防などのために利用することができる。
【００２７】
本発明の別の態様は、心筋幹細胞を含む細胞集団であって、蛍光色素ＪＣ−１で染色したときのＪＣ−１モノマーの蛍光強度に対するＪＣ−１ダイマーの蛍光強度の比（ＪＣ−１ダイマーの蛍光強度／ＪＣ−１モノマーの蛍光強度）の平均値が１〜４である、前記細胞集団に関する。
【００２８】
ミトコンドリアは、その内部に存在する呼吸鎖複合体の働きにより膜内外にプロトン濃度勾配を生じ、膜電位を有した分極状態になる。分極したミトコンドリアは、アポトーシスや代謝ストレス等を受けると、膜電位が低下した脱分極状態に陥る。このようにミトコンドリアの分極状態はミトコンドリアの代謝活性を表すパラメーターであり、分極したミトコンドリアを多く有する細胞はミトコンドリアが活性化された細胞であると考えられる。
【００２９】
ミトコンドリア膜電位プローブである蛍光色素ＪＣ−１（５，５’，６，６’−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−１，１’，３，３’−ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｙｌｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｉｏｄｉｄｅ）は、脱分極したミトコンドリア内では緑色の蛍光を発するモノマーであるが、分極したミトコンドリア内では赤色の蛍光を発するダイマーを形成することが知られている。したがって、ＪＣ−１モノマーとダイマーとの蛍光強度の比は、ミトコンドリアの分極状態を表す指標となる。蛍光強度の比は、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、コスモバイオその他から市販されているＪＣ−１を用い、製造者のプロトコールに従って蛍光レシオ検出を行うことで測定することができる。
【００３０】
本態様にかかる細胞集団は、ミトコンドリアが活性化されたＣＰＣを含む細胞集団であり、該集団に含まれるＣＰＣのミトコンドリア活性化の程度は、細胞集団をＪＣ−１で染色したときのＪＣ−１モノマーの蛍光強度に対するＪＣ−１ダイマーの蛍光強度の比（ＪＣ−１ダイマーの蛍光強度／ＪＣ−１モノマーの蛍光強度）の平均値により表すことができる。
【００３１】
蛍光強度の比の平均値は、細胞集団に含まれる任意の個数、好ましくは十数個から数十個のＣＰＣそれぞれについてＪＣ−１モノマーの蛍光強度に対するＪＣ−１ダイマーの蛍光強度の比（ＪＣ−１ダイマーの蛍光強度／ＪＣ−１モノマーの蛍光強度）を測定し、それらの平均値として算出することができる。ミトコンドリアが活性化されたＣＰＣを含む細胞集団におけるＪＣ−１モノマーの蛍光強度に対するＪＣ−１ダイマーの蛍光強度の比の平均値は、１より大きく、好ましくは１〜４である。
【００３２】
なお、本態様の細胞集団は、主にＣＰＣからなる細胞集団であり、好ましくはＣＰＣ以外の細胞を実質的に含まない細胞集団である。かかる細胞集団は、典型的には前述の本発明の第１の態様である方法によって製造することができる。
【００３３】
上述のＣＰＣ及びＣＰＣを含む細胞集団は、いずれも心筋傷害に対する治療及び／若しくは予防、心臓機能の回復、保護若しくは低下抑制、又は心不全の治療及び／若しくは予防などのために利用することができる。したがって、処置を必要とする対象に対して有効量の前記ＣＰＣ又は細胞集団を投与する工程を含む、心筋傷害又は心不全を治療及び／若しくは予防する方法は、本発明のさらなる態様として提供される。さらに、処置を必要とする対象に対して有効量の前記ＣＰＣ又は細胞集団を投与する工程を含む、心臓機能を回復させる方法、心臓機能を保護する方法又は心臓機能の低下を抑制する方法も本発明のさらなる別の態様として提供される。
【００３４】
さらに、上述のＣＰＣ又はＣＰＣを含む細胞集団を有効成分とする細胞製剤、特に心筋傷害又は心不全の治療及び／又は予防のための細胞製剤、心臓機能の回復及び／又は保護のための細胞製剤、心臓機能の低下を抑制するための細胞製剤なども、本発明の異なる態様として提供される。
【００３５】
本発明の一態様である細胞製剤は、当業者に公知の方法で調製することが可能である。例えば、必要に応じて水又はそれ以外の薬学的に許容される緩衝液などに細胞を懸濁した懸濁液の形態として調製することができる。細胞製剤は、薬学的に許容される担体又は媒体、例えば植物油、乳化剤、懸濁化剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、防腐剤などの添加剤を含んでいてもよい。
【００３６】
本発明の一態様である細胞製剤は、有効量の上述のＣＰＣ又はＣＰＣを含む細胞集団を含む。本明細書中で用いられる「有効量」は、心筋傷害に対する治療及び／若しくは予防、心臓機能の回復、保護若しくは低下抑制、又は心不全の治療及び／若しくは予防などの効果を発揮するために必要なＣＰＣの量を意味する。有効量は、処置を必要とする対象の状況に依るが、一対象個体あたり、例えば１×１０３細胞〜１×１０９細胞、好ましくは１×１０６細胞〜１×１０９細胞、より好ましくは１×１０７細胞〜１×１０９細胞であり、これを１回又は適宜間隔を開けて複数回投与してもよい。
【００３７】
細胞製剤の投与方法に特に制限はなく、一般的に用いられる投与方法、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、局所投与等を挙げることができる。静脈内投与又は心臓への局所投与が好ましい。
【００３８】
本発明の別の態様は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とホスファチジン酸（ＰＡ）及び／又はスフィンゴミエリン（ＳＭ）とを脂質膜の構成脂質として含有し、かつミトコンドリア指向性分子を脂質膜表面に有する、ＣＰＣのミトコンドリアに被封入物を導入するためのリポソームも提供する。ミトコンドリア指向性分子が配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドすなわちＳ２ペプチドであるリポソームは、前述のｋａｗａｍｕｒａらに記載された方法によって製造することができる。本態様のリポソームは、Ｓ２ペプチドに加えて、さらに配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドすなわちオクタアルギニンペプチドを脂質膜表面に有してもよく、かかるリポソームは特許第５０６７７３３号に記載の方法によって製造することができる。好ましい被封入物は、本発明の第一の態様において説明したミトコンドリア活性化剤である。
【００３９】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１．レスベラトロールをミトコンドリアに送達したＣＰＣの調製
（１）マウスＣＰＣの精製
マウスＣＰＣを、Ｏｈら（ＰＮＡＳ．  ２００３，１００，ｐｐ．１２３１３−１２３１８）の方法に従い、下記のようにして単離・精製した。【００４１】
８週齢のｃ５７ＢＬ６／Ｊ雄マウスから心臓を摘出し、コラゲナーゼ処理及びパーコール密度勾配処理することでＣＰＣを含む細胞群を抽出した。得られた細胞群を初代培養した後に、ＭＡＣＳ  ｓｙｓｔｅｍによりソーティングを行って選択的に抽出したＳｃａ−１陽性ＣＰＣを継代培養することで、マウスＣＰＣを単離した。単離したＣＰＣについて、表面マーカータンパク質量をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で、並びに心筋転写因子及び構造タンパク質の遺伝子発現量をＰＣＲ法によりそれぞれ定量し、これらの値が既報のものと一致することを確認した（データは示さず）。【００４２】
（２）Ｓ２ペプチドで修飾されたＲＥＳ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒの調製
Ｓ２ペプチドで表面修飾され、かつレスベラトロールを封入したミトコンドリア指向性リポソーム（ＲＥＳ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ）を下記のように調製した。【００４３】
１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）の１ｍＭ脂質エタノール溶液（ＤＯＰＥ／ＳＭ＝９：２）１３７．５μＬとクロロホルム１１２．５μＬとの混合液を減圧乾燥処理することで、脂質膜フィルムを調製した。２．３ｍｇ／ｍＬレスベラトールを含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液２５０μＬを脂質膜フィルムに添加して水和させた（室温、１５分間）後、バスタイプソニケータ（ＡＵ−２５Ｃ；アイワ医科工業）を用いて超音波処理することで、リポソームを調製した。このリポソームにＳｔｅａｒｙｌ  Ｓ２溶液を総脂質量の１０％となるように添加し、室温で３０分間インキュベーションすることで、ＲＥＳ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒを調製した。【００４４】
調製されたＲＥＳ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒは、平均粒子径：１２１±７ｎｍ、ゼータ電位：４９±１ｍＶ、レスベラトロール封入率：８７±４％の、正電荷を有するナノ粒子であり、４℃での１カ月保存後も粒子物性は維持されることが確認された。【００４５】
（３）ＣＰＣへのＲＥＳ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒの導入
既報（Ａｂｅ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．  ２０１６，１０５，ｐｐ．７３４−７４０）の方法に従い、ＲＥＳ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒを緑色蛍光色素ＮＢＤ（7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazole）で標識し、ＣＰＣへの導入を評価した。総脂質量として５５０μＭのＮＢＤ蛍光標識ＲＥＳ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（レスベラトロール濃度は１００μＭ）を２００μＬ準備し、１×１０６個のＣＰＣ／ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地１０ｍＬに添加して１時間インキュベーションすることで、ＣＰＣにＲＥＳ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒを導入した。ＦＡＣＳを用いてＣＰＣに取り込まれたＮＢＤ蛍光標識キャリアを検出することで、ＲＥＳ−ＭＩＴＯ−ＰｏｒｔｅｒがＣＰＣに導入されたことを確認した（図１）。【００４６】
既報（Ａｂｅ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．  ２０１６，１０５，ｐｐ．７３４−７４０）の方法に従って、ＮＢＤ蛍光標識ＲＥＳ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒが導入されたＣＰＣのミトコンドリアをＭＴＤＲで染色した後に、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いて観察したところ、ＮＢＤの緑色とＭＴＤＲの赤色とが重なり合った黄色のドットが観察された。このことから、ＲＥＳ−ＭＩＴＯ−ＰｏｒｔｅｒはＣＰＣのミトコンドリアに集積する事が確認された（図２）。【００４７】
実施例２．レスベラトロールをミトコンドリアに送達したＣＰＣの心筋芽細胞保護効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験）
（１）ＣＰＣへのＲＥＳ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒの導入
ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に懸濁したＣＰＣを１×１０６個／ウェルとなるように６ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間培養した。各ウェルに実施例１の（２）で調製したＲＥＳ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒを添加して２時間インキュベーションすることでＲＥＳ−ＭＩＴＯ−ＰｏｒｔｅｒをＣＰＣに導入し、以後の実験に用いた。このＲＥＳ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒを導入したＣＰＣをＭＡ−Ｃｅｌｌと表す。【００４８】
（２）ドキソルビシンによる細胞傷害下での細胞生存率
ラット心筋芽細胞Ｈ９ｃ２細胞（ＡＴＣＣより購入）を３×１０４個／ウェルとなるように、及び（１）で調製したＭＡ−Ｃｅｌｌを１×１０４個／ウェルとなるようにＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で混合し、混合液を３７℃で２４時間共培養した。共培養液に終濃度１０μｇ／ｍＬ（低用量）又は５０μｇ／ｍＬ（高用量）となるようにドキソルビシンを添加して細胞傷害を誘起してさらに１６時間培養した後、ＷＳＴ−１試薬（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）を用いて細胞生存率を測定した。また、ＭＡ−Ｃｅｌｌに代えて培地のみを添加したＨ９ｃ２細胞（コントロール）、及びＭＡ−Ｃｅｌｌに代えてＣＰＣを添加したＨ９ｃ２細胞（ＣＰＣ単独）についても、上記と同様にして細胞傷害を誘起して、細胞生存率を測定した。ドキソルビシン未処理のＨ９ｃ２細胞の細胞生存率を１００％としたときの結果を図３に示す。【００４９】
ＭＡ−Ｃｅｌｌはドキソルビシンの細胞傷害作用による細胞生存率の減少を抑制することが確認された。また共培養におけるＨ９ｃ２細胞とＭＡ−Ｃｅｌｌとの混合比率を６：１としたときも、同様の結果が確認された（図４のＭＡ−Ｃｅｌｌ）。一方、ＭＡ−Ｃｅｌｌに代えてレスベラトロールで直接処理したＣＰＣをＨ９ｃ２細胞に添加したときの細胞生存率（図４のＣＰＣ（＋ＲＥＳ））の減少はＣＰＣ単独のそれ（図４のＣＰＣ）と同程度であり、レスベラトロールの添加による改善は確認されなかった。【００５０】
また、培地をＤＭＥＭ−Ｆ１２からＤＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）に変更し、Ｈ９ｃ２細胞と、ＭＡ−Ｃｅｌｌ、レスベラトロールで直接処理したＣＰＣ又はＣＰＣとの混合比率を６：１として３７℃で２４時間共培養した後、終濃度１０μｇ／ｍＬのドキソルビシンを添加して細胞傷害を誘起してさらに４８時間培養した後の細胞生存率を測定した。ドキソルビシン未処理のＨ９ｃ２細胞の細胞生存率を１００％としたときの結果を図５に示す。ＭＡ−Ｃｅｌｌによるドキソルビシンの細胞傷害作用による細胞生存率の減少抑制は、細胞傷害誘起後４８時間後も保たれていることが確認された。【００５１】
（３）レスベラトロール用量依存的な細胞生存率の変化
上記（１）と同様の操作を行って、レスベラトロール濃度０〜１０μМのＲＥＳ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒを用いて、レスベラトロールの送達量を変化させたＭＡ−Ｃｅｌｌを調製した。各ＭＡ−Ｃｅｌｌ及び終濃度１０μｇ／ｍＬのドキソルビシンを用いて上記（２）と同様の実験を行い、レスベラトロールの各用量における細胞生存率を測定した。ドキソルビシン未処理のＨ９ｃ２細胞の細胞生存率を１００％としたときの結果を図６に示す。【００５２】
ドキソルビシンの細胞傷害作用による細胞生存率の減少は、レスベラトロールの用量に依存して改善されることが確認された。【００５３】
実施例３．レスベラトロールをミトコンドリアに送達したＣＰＣの心筋傷害に対する保護効果（ｉｎ  ｖｉｖｏ実験）
（１）ドキソルビシン心筋傷害モデルマウスの作製及び各ＣＰＣの投与
健常マウス（６〜８週齢の雄Ｃ５７／ＢＬ６マウス）の心臓にＭＡ−Ｃｅｌｌ（１×１０６個）を細胞移植して、ＭＡ−Ｃｅｌｌ移植群（ｎ＝６）を用意した。移植から２４時間後に、Ｚｈａｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２，１８，ｐｐ．１６３９−１６４２）の方法を参考にして、２００μＬのドキソルビシン／ＰＢＳを２５ｍｇ／ｋｇとなるように１回のみ、マウスの腹腔内に投与して、心筋傷害を誘導した。細胞移植をしない群（未処置群）及びＭＡ−Ｃｅｌｌに代えてＣＰＣを移植した群（ＣＰＣ移植群）についても、上記と同様にして心筋傷害を誘導した。また、ドキソルビシンを投与しない群（健常群）を各群に対して用意した。【００５４】
（２）心筋傷害誘導後の生存率
心筋傷害誘導後の各群の生存率に関するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を作成し、ｌｏｇ−ｒａｎｋ解析による統計処理を行った。その結果を図７に示す。ＭＡ−Ｃｅｌｌ移植群の生存率は、未処置群及びＣＰＣ移植群のそれと比較して大きく改善されることが確認された。【００５５】
（３）平均体重
心筋傷害誘導から３日目及び７日目における各群のマウス平均体重を、図８に示す。ドキソルビシンを投与した全ての群で一時的に体重は減少するが、７日目にはＭＡ−Ｃｅｌｌ移植群において体重の回復傾向が認められた。【００５６】
（４）心臓組織における酸化ストレス状態
心筋傷害誘導から３日目に心臓を摘出し、Ｚｈａｎｇら（前出）の方法を参考にして心臓組織を速やかにジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）染色し、心臓組織中の赤色細胞（ＤＨＥ陽性細胞）をカウントして、心臓組織の酸化ストレス状態をＤＨＥ陽性細胞率として定量した。その結果を図９に示す。ＤＨＥは、生細胞中の活性酸素種と反応して赤色蛍光を発する蛍光プローブである。健常群のＤＨＥ陽性細胞率と比較して、未処置群群及びＣＰＣ移植群では有意に高いＤＨＥ陽性細胞率を示した。一方、ＭＡ−Ｃｅｌｌ移植群ではＤＨＥ陽性細胞の増加が抑制される傾向が確認された。【００５７】
（５）心臓組織におけるアポトーシス誘導
（４）で摘出した心臓を組織固定した後に、ＴＵＮＮＥＬ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ社）を用いたＴＵＮＥＬ法を行い、心臓組織中のアポトーシス陽性細胞をカウントして、アポトーシス誘導率を算出した。その結果を図１０に示す。未処置群及びＣＰＣ移植群ではアポトーシス誘導細胞が多数観察されたが、ＭＡ−Ｃｅｌｌ移植群では健常群と同程度のレベルまでアポトーシス誘導が抑制されている事が確認された。【００５８】
（６）心機能（左室短縮率）
心筋傷害誘導した５週間後の健常群及びＭＡ−Ｃｅｌｌ移植群の各マウスの心機能（左室短縮率）を断層心エコー法を行うことで測定した。その結果を図１１に示す。左室短縮率については、ＭＡ−Ｃｅｌｌ移植群と健常群との間には有意な差は認めらなかった。【００５９】
（７）ミトコンドリア機能
（４）で摘出した心臓組織から全ＲＮＡを抽出・精製し、逆転写反応後、内標準にＧＡＰＤＨを設定したリアルタイムＰＣＲ法を行うことで、ミトコンドリア新生に関連するＰＧＣ１α及びＥＳＲＲａ、ミトコンドリア呼吸鎖複合体に関連するＳＤＨＡ、Ｃｏｘ１及びＡＴＰ１ａの各遺伝子の発現量を定量した。健常群における各遺伝子の発現量を１としたときの各群における相対的発現量を、図１２に示す。未処置群及びＣＰＣ移植群では各遺伝子の発現レベルが大きく減少していたが、ＭＡ−Ｃｅｌｌ移植群では発現レベルの減少が抑制されている事が確認された。この結果から、ＭＡ−Ｃｅｌｌ移植群の心臓組織では、心筋傷害誘導後も、ミトコンドリア新生及びミトコンドリア酸化的リン酸化遺伝子群の発現が有意に維持されていることが確認された。【００６０】
（８）ミトコンドリア呼吸鎖複合体の構造保持
（４）で摘出した心臓組織からタンパク質を抽出し、Ｂｌｕｅ−Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ミトコンドリアＣｏｍｐｌｅｘＩ抗体（Ａｂｃａｍ）及びミトコンドリアＣｏｍｐｌｅｘＩＩ抗体（Ａｂｃａｍ）を用いたＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行い、電子伝達系Ｓｕｐｅｒ−ｃｏｍｐｌｅｘ帯（１，０００ｋＤａ）のバンドを定量した。ＣｏｍｐｌｅｘＩＩ抗体によるバンド定量値で補正することで算出したＳｕｐｅｒ−ｃｏｍｐｌｅｘの形成率を、図１３に示す。未処置群と比較すると、ＣＰＣ移植群及びＭＡ−Ｃｅｌｌ移植群ではミトコンドリア呼吸鎖複合体構造が保持されることが確認された。特に、ＭＡ−Ｃｅｌｌ移植群では、健常群と同程度のレベルでミトコンドリア呼吸鎖複合体の高次構造が保持される事が確認された。【００６１】
実施例４．ＭＡ−Ｃｅｌｌの心筋組織内での生着
ＣｅｌｌＶｕｅ  Ｃｌａｒｅｔ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ）を製造者のプロトコルに従って用いて、細胞膜表面を赤色に染色したＭＡ−Ｃｅｌｌ及びＣＰＣを調製した。これらの細胞を用いて実施例３と同様の細胞移植及び心筋傷害誘導を行い、傷害誘導から７日目に心臓を摘出した。摘出された心臓について、１次抗体に心筋アクチニン抗体（Ｍｓ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  α  ａｃｔｉｎｉｎ  Ａｂ（Ｓｉｇｍａ））、２次抗体にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｇｏａｔ  Ｆ（ａｂ’）２  ａｎｔｉ−Ｍｓ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて心筋を緑色に、またＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて細胞核を青色にそれぞれ染色し、顕微鏡観察を行った。ＭＡ−Ｃｅｌｌを移植したマウスに関する顕微鏡写真を図１４に示す。【００６２】
ＭＡ−Ｃｅｌｌを移植したマウスの心臓組織では、緑色の心筋組織上に赤色の移植細胞が存在することが確認された（図１４左上の重ね合わせ、白色矢印の位置）。一方、ＣＰＣ移植群では赤色の蛍光は観察されなかった（データは示さず）。【００６３】
実施例５．ＭＡ−Ｃｅｌｌのミトコンドリア膜電位
ＭＡ−Ｃｅｌｌ及び実施例１で調製したＣＰＣについて、蛍光色素ＪＣ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を製造者のプロトコルに従って用いてミトコンドリアの膜電位を調べた。ＪＣ−１は、分極したミトコンドリアに集積すると波長５９０ｎｍの赤色蛍光を発し、ミトコンドリアが脱分極する（膜電位が消失する）と細胞質中に拡散して波長５２９ｎｍの緑色の蛍光を発する。結果を図１５に示す。【００６４】
ＣＰＣでは、ミトコンドリアに局在した赤色蛍光が観察されると共に緑色の蛍光も観察された（図１５左、ＣＰＣ）。また、ミトコンドリア膜電位の脱共役剤であるＦＣＣＰでＣＰＣを処理したときは、赤色蛍光がほぼ消失し、緑色蛍光のみが観察された（図１５右、ＦＣＣＰ）。一方、ＭＡ−Ｃｅｌｌでは、ＣＰＣと比較して多量の赤色蛍光が観察された（図１５中、ＭＡ−Ｃｅｌｌ）。【００６５】
さらに、ＭＡ−Ｃｅｌｌ及びＣＰＣそれぞれについて１９個の細胞を対象として、脱分極したミトコンドリア（緑、Ｍｏｎｏｍｅｒ）の蛍光強度に対する分極したミトコンドリア（赤、Ｄｉｍｅｒ）の蛍光強度の比（Ｄｉｍｅｒ／Ｍｏｎｏｍｅｒ  ｒａｔｉｏ）を算出した（図１６）。その結果、ＭＡ−Ｃｅｌｌでは、比率は０．５〜４．５倍の範囲にあり、その平均値は１．９である一方、ＣＰＣでは比率は０〜１の範囲にあり、その平均値は０．４であることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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