(57)【要約】  本発明は、ＩｇＧ４関連疾患の病原物質を明らかにし、それを利用して、ＩｇＧ４関連疾患の検査方法等を提供することを目的とする。  本発明は、ＩｇＧ４関連疾患の指標として、検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び／又は、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程を含むＩｇＧ４関連疾患の検査方法を提供する。本発明はまた、ラミニンを含む、ＩｇＧ４関連疾患を検査するための検査試薬、及び、インテグリンを含む、ＩｇＧ４関連疾患を検査するための検査試薬を提供する。
2018016607.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧ４関連疾患の検査方法であって、
ＩｇＧ４関連疾患の指標として、検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び／又は
ＩｇＧ４関連疾患の指標として、検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法。
【請求項２】
前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
抗ラミニン抗体検出工程における前記抗体が、ラミニン−５１１と免疫学的に反応する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
抗インテグリン抗体検出工程における前記抗体が、インテグリンα６β１と免疫学的に反応する抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩｇＧ４関連疾患が、ＩｇＧ４関連腎疾患であり、
抗ラミニン抗体検出工程における前記抗体が、ラミニン−５２１と免疫学的に反応する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗ラミニン抗体検出工程が、ラミニンを抗原として用いて前記抗体を検出することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
自己免疫性膵炎の検査方法であって、
自己免疫性膵炎の指標として、検体の血液試料中の、ラミニン−５１１と免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び
自己免疫性膵炎の指標として、検体の血液試料中の、インテグリンα６β１と免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法。
【請求項７】
ラミニンを含む、ＩｇＧ４関連疾患を検査するための検査試薬。
【請求項８】
前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
前記ラミニンが、ラミニン−５１１である、請求項７に記載の検査試薬。
【請求項９】
前記ＩｇＧ４関連疾患が、ＩｇＧ４関連腎疾患であり、
前記ラミニンが、ラミニン−５２１である、請求項７に記載の検査試薬。
【請求項１０】
前記ラミニンを、固相に固定された形態で含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の検査試薬。
【請求項１１】
インテグリンを含む、ＩｇＧ４関連疾患を検査するための検査試薬。
【請求項１２】
ラミニン−５１１とインテグリンα６β１とを固相に固定された形態で含む、自己免疫性膵炎の検査試薬。
【請求項１３】
ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価する方法であって、
ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び／又は、
ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法。
【請求項１４】
ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
試験物質を作用させた動物から得た検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程と、
前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記抗体が減少した場合に、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜する選抜工程と
を含む方法。
【請求項１５】
ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法であって、
非ヒト動物に、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を投与する抗ラミニン抗体投与工程、及び
非ヒト動物を、ラミニンを抗原として免疫するラミニン免疫工程
のうち少なくとも一方を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＧ４関連疾患の検査方法、ＩｇＧ４関連疾患を検査するための検査試薬、ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価する方法、及び、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＧ４関連疾患とは、血清ＩｇＧ４高値とＩｇＧ４陽性形質細胞の組織浸潤または腫瘤形成を特徴とする疾患群である。【０００３】
ＩｇＧ４関連疾患は比較的新しい疾患概念であり、これまでのところ原因は不明である。罹患臓器としては膵臓、胆管、涙腺・唾液腺、中枢神経系、甲状腺、肺、肝臓、消化管、腎臓、前立腺、後腹膜、動脈、リンパ節、皮膚、乳腺等が知られている。病変が複数臓器におよび全身疾患としての特徴を有することが多いが、単一臓器病変の場合もある。【０００４】
自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）、ＩｇＧ４関連腎疾患、ＩｇＧ４関連涙腺唾液腺炎等がＩｇＧ４関連疾患に分類される疾患として知られている。【０００５】
ＩｇＧ４関連疾患の原因は従来知られておらず、ＩｇＧ４関連疾患の指標となるマーカー物質も知られていない。このため従来ＩｇＧ４関連疾患であると診断することは容易ではなかった。例えば、ＡＩＰは膵臓での組織浸潤を特徴とするが、組織の観察像からは膵癌との判別が難しく、ＡＩＰが誤って膵癌と診断される可能性もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２９４０４０号公報
【特許文献２】特開２００８−２７５５２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまでに自己免疫性膵炎の検査方法として、ＨＳＰ１０と免疫学的に反応する抗体を検出する方法（特許文献１）や、アミラーゼα２−Ａと免疫学的に反応する抗体を検出する方法（特許文献２）が知られている。しかしながら、これらの方法は、自己免疫性膵炎の検査方法として必ずしも満足できるものではない。【０００８】
ＩｇＧ４関連疾患の病原物質が特定できれば、病原物質を指標としてＩｇＧ４関連疾患を検査すること、病原物質を用いてＩｇＧ４関連疾患のモデル動物を作製すること、病原物質を標的として新たな治療薬を開発すること、等が可能になる。しかし、これまでのところＩｇＧ４関連疾患の病原物質は解明されていない。【０００９】
ＩｇＧ４関連疾患の病原物質を明らかにし、それを利用して、ＩｇＧ４関連疾患の検査方法、ＩｇＧ４関連疾患を検査するための検査試薬、ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価する方法、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法として有効な手段を提供することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは驚くべきことに、ＩｇＧ４関連疾患の病原物質が、ラミニンに対する自己抗体であること、及び、血清中における抗ラミニン抗体及び抗インテグリン抗体がＩｇＧ４関連疾患の指標となることを解明し、この知見に基づいて以下の発明を完成するに至った。
（１）ＩｇＧ４関連疾患の検査方法であって、
ＩｇＧ４関連疾患の指標として、検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び／又は
ＩｇＧ４関連疾患の指標として、検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法。
（２）前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
抗ラミニン抗体検出工程における前記抗体が、ラミニン−５１１と免疫学的に反応する抗体である、（１）に記載の方法。
（３）前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
抗インテグリン抗体検出工程における前記抗体が、インテグリンα６β１と免疫学的に反応する抗体である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記ＩｇＧ４関連疾患が、ＩｇＧ４関連腎疾患であり、
抗ラミニン抗体検出工程における前記抗体が、ラミニン−５２１と免疫学的に反応する抗体である、（１）に記載の方法。
（５）前記抗ラミニン抗体検出工程が、ラミニンを抗原として用いて前記抗体を検出することを含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記抗インテグリン抗体検出工程が、インテグリンを抗原として用いて前記抗体を検出することを含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記検体が血液試料である、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（７’）自己免疫性膵炎の検査方法であって、
自己免疫性膵炎の指標として、検体の血液試料中の、ラミニン−５１１と免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び
自己免疫性膵炎の指標として、検体の血液試料中の、インテグリンα６β１と免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法。
（８）ラミニンを含む、ＩｇＧ４関連疾患を検査するための検査試薬。
（９）前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
前記ラミニンが、ラミニン−５１１である、（８）に記載の検査試薬。
（１０）前記ＩｇＧ４関連疾患が、ＩｇＧ４関連腎疾患であり、
前記ラミニンが、ラミニン−５２１である、（８）に記載の検査試薬。
（１１）前記ラミニンを、固相に固定された形態で含む、（８）〜（１０）のいずれかに記載の検査試薬。
（１２）インテグリンを含む、ＩｇＧ４関連疾患を検査するための検査試薬。
（１３）前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
前記インテグリンが、インテグリンα６β１である、（１２）に記載の検査試薬。
（１４）前記インテグリンを、固相に固定された形態で含む、（１２）又は（１３）に記載の検査試薬。
（１４’）ラミニン−５１１とインテグリンα６β１とを固相に固定された形態で含む、自己免疫性膵炎の検査試薬。
（１５）ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価する方法であって、
ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び／又は、
ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法。
（１６）ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
試験物質を作用させた動物から得た検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程と、
前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記抗体が減少した場合に、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜する選抜工程と
を含む方法。
（１７）ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
試験物質を作用させた動物から得た検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程と、
前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記抗体が減少した場合に、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜する選抜工程と
を含む方法。
（１８）ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法であって、
非ヒト動物に、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を投与する抗ラミニン抗体投与工程、及び
非ヒト動物を、ラミニンを抗原として免疫するラミニン免疫工程
のうち少なくとも一方を含む方法。
（１９）ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法であって、
非ヒト動物に、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を投与する抗インテグリン抗体投与工程、及び
非ヒト動物を、インテグリンを抗原として免疫するインテグリン免疫工程
のうち少なくとも一方を含む方法。
（２０）ＩｇＧ４関連疾患の指標を取得する方法であって、
検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び／又は
検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法。
（２１）前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
抗ラミニン抗体検出工程における前記抗体が、ラミニン−５１１と免疫学的に反応する抗体である、（２０）に記載の方法。
（２２）前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
抗インテグリン抗体検出工程における前記抗体が、インテグリンα６β１と免疫学的に反応する抗体である、（２０）又は（２１）に記載の方法。
（２３）前記ＩｇＧ４関連疾患が、ＩｇＧ４関連腎疾患であり、
抗ラミニン抗体検出工程における前記抗体が、ラミニン−５２１と免疫学的に反応する抗体である、（２０）に記載の方法。
（２４）前記抗ラミニン抗体検出工程が、ラミニンを抗原として用いて前記抗体を検出することを含む、（２０）〜（２３）のいずれかに記載の方法。
（２５）前記抗インテグリン抗体検出工程が、インテグリンを抗原として用いて前記抗体を検出することを含む、（２０）〜（２４）のいずれかに記載の方法。
（２６）前記検体が、被検動物から分離された血液試料である、（２０）〜（２５）のいずれかに記載の方法。
（２６’）自己免疫性膵炎の指標を取得する方法であって、
検体中の、ラミニン−５１１と免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び
検体中の、インテグリンα６β１と免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法。
（２７）ＩｇＧ４関連疾患を検査するための検査試薬の製造における、ラミニンの使用。
（２８）前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
前記ラミニンが、ラミニン−５１１である、（２７）に記載の使用。
（２９）前記ＩｇＧ４関連疾患が、ＩｇＧ４関連腎疾患であり、
前記ラミニンが、ラミニン−５２１である、（２７）に記載の使用。
（３０）前記ラミニンが、ラミニンが固定された固相の形態である、（２７）〜（２９）のいずれかに記載の使用。
（３１）ＩｇＧ４関連疾患を検査するための検査試薬の製造における、インテグリンの使用。
（３２）前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
前記インテグリンが、インテグリンα６β１である、（３１）に記載の使用。
（３３）前記インテグリンが、インテグリンが固定された固相の形態である、（３１）又は（３２）に記載の使用。
（３３’）自己免疫性膵炎の検査試薬の製造における、固相に固定された形態の、ラミニン−５１１及びインテグリンα６β１の使用。
（３４）ＩｇＧ４関連疾患の検査に使用するためのラミニン。
（３５）前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
前記ラミニンが、ラミニン−５１１である、（３４）に記載のラミニン。
（３６）前記ＩｇＧ４関連疾患が、ＩｇＧ４関連腎疾患であり、
前記ラミニンが、ラミニン−５２１である、（３４）に記載のラミニン。
（３７）前記ラミニンが、ラミニンが固定された固相の形態である、（３４）〜（３６）のいずれかに記載の使用。
（３８）ＩｇＧ４関連疾患を検査に使用するためのインテグリン。
（３９）前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
前記インテグリンが、インテグリンα６β１である、（３８）に記載のインテグリン。
（４０）前記インテグリンが、インテグリンが固定された固相の形態である、（３８）又は（３９）に記載のインテグリン。
（４０’）自己免疫性膵炎の検査に使用するための、固相に固定された形態の、ラミニン−５１１及びインテグリンα６β１の組み合わせ。
（４１）ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法に使用するための、ラミニンと免疫学的に反応する抗体。
（４２）ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法に使用するための、ラミニン。
（４３）ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法に使用するための、インテグリンと免疫学的に反応する抗体。
（４４）ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法に使用するための、インテグリン。
（４５）ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物を作製するための試薬の製造における、ラミニンと免疫学的に反応する抗体の使用。
（４６）ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物を作製するための試薬の製造における、ラミニンの使用。
（４７）ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物を作製するための試薬の製造における、インテグリンと免疫学的に反応する抗体の使用。
（４８）ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物を作製するための試薬の製造における、インテグリンの使用。【００１１】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１６−１４２７０１号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の１つ以上の実施形態によれば、ＩｇＧ４関連疾患の検査方法、ＩｇＧ４関連疾患を検査するための検査試薬、ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価する方法、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法として有効な手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、実験１での、対照ＩｇＧ投与マウス（左列）と、患者ＩｇＧ投与マウス（右列）の、ＩｇＧ投与から１２時間後の膵臓のＨ＆Ｅ染色（上段）と、Ｇｒ１の染色（下段）の結果を示す。観察像中のスケールバーは上段では５０μｍ、下段では２０μｍを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実験１での、対照ＩｇＧ（三角）及び患者ＩｇＧ（丸）の投与量と、浮腫面積との相関関係を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、実験１での、対照ＩｇＧ投与マウス（左）と、患者ＩｇＧ投与マウス（右）の、ＩｇＧ投与から１２時間後の膵臓の壊死又は出血の病理組織的グレードと、Ｇｒ１陽性細胞数を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５：ｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔｅｓｔによる）。
【図２Ａ】図２Ａは、実験１での、対照ＩｇＧ投与マウス（左列）と、患者ＩｇＧ投与マウス（右列）の、ＩｇＧ投与から１２時間後の膵臓でのＩｇＧ（上段）、ＩｇＧ１（中段）、ＩｇＧ４（下段）の免疫組織化学的染色の結果を示す。観察像中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実験１での、対照ＩｇＧ投与マウスと患者ＩｇＧ投与マウスの、膵臓組織の免疫蛍光染色の結果を示す。観察像中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図３Ａ】図３Ａの上段の「対照１」は、１０名の対照のうち特定の１名（対照１）から得た対照ＩｇＧ１及び対照ＩｇＧ４の一方又は両方を投与したマウスの投与１２時間後の膵臓のＨ＆Ｅ染色の観察像である。観察像中のスケールバーは２０μｍを示す。図３Ａの中段及び下段「患者９」は、１０名のＩｇＧ４関連疾患患者のうち特定の１名（患者９）から得た患者ＩｇＧ１及び患者ＩｇＧ４の一方又は両方を投与したマウスの投与１２時間後の膵臓の、Ｈ＆Ｅ染色の観察像（中段）、及び、Ｇｒ１の免疫組織化学的染色の観察像（下段）である。観察像中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、対照ＩｇＧ１及び対照ＩｇＧ４の一方又は両方を投与したマウス（左）と、患者ＩｇＧ１及び患者ＩｇＧ４の一方又は両方を投与したマウス（右）の、投与から１２時間後の膵臓の壊死又は出血の病理組織的グレードと、Ｇｒ１陽性細胞数を示す（＊ｐ＜０．０５：ｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔｅｓｔによる）。
【図３Ｃ】図３Ｃは、１０名のＩｇＧ４関連疾患患者のうち特定の１名（患者１）から得た患者ＩｇＧ１及び患者ＩｇＧ４の一方又は両方を投与したマウスの投与１２時間後の膵臓の、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４の免疫組織化学的染色の観察像である。観察像中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図４Ａ】図４Ａ上段左は、ＡＩＰ病変のある部位（左側）と、病変のない部位（右側）との境界部分から採取した、ＡＩＰ患者の膵臓組織切片をＨ＆Ｅ染色した観察像を示す。図４Ａ上段右は、同様の膵臓組織切片の、ＩｇＧ４に対する免疫組織化学的染色の観察像を示す。スケールバーは２００μｍを示す。図４Ａ下段左は、図４Ａ上段右の観察像のうち、病変のある腺房の部分を拡大した観察像である。図４Ａ下段中は、図４Ａ上段右の観察像のうち、病変のある小葉間隙の部分を拡大した観察像である。図４Ａ下段右は、図４Ａ上段右の観察像のうち、病変のない正常な腺房の部分を拡大した観察像である。図４Ａ下段の各観察像においてスケールバーは２０μｍを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂの各像は、ＡＩＰ患者の膵臓での病変のある腺房を免疫蛍光染色した観察像を示す。図４Ｂの各像ではスケールバーは２０μｍを示す。図４Ｂ上段左は、ＡＩＰ患者の膵臓での病変のある腺房の、免疫蛍光染色されたＩｇＧ４の観察像を示す。図４Ｂ上段中は、図４Ｂ上段左と同じ観察領域の、免疫蛍光染色されたアミラーゼの観察像を示す。図４Ｂ上段右は、図４Ｂ上段左のＩｇＧ４の観察像と、図４Ｂ上段中のアミラーゼの観察像とを重ね合わせた像である。図４Ｂ下段左は、ＡＩＰ患者の膵臓での病変のある腺房の、免疫蛍光染色されたＩｇＧ４の観察像を示す。図４Ｂ下段中は、図４Ｂ下段左と同じ観察領域の、免疫蛍光染色されたコラーゲンＩＶの観察像を示す。図４Ｂ下段右は、図４Ｂ下段左のＩｇＧ４の観察像と、図４Ｂ下段中のコラーゲンＩＶの観察像とを重ね合わせた像である。
【図４Ｃ】図４Ｃの各像は、ＡＩＰ患者の膵臓での病変のある小葉間隙を免疫蛍光染色した観察像を示す。図４Ｃの各像ではスケールバーは２０μｍを示す。図４Ｃ左は、ＡＩＰ患者の膵臓での病変のある小葉間隙の、免疫蛍光染色されたＩｇＧ４の観察像を示す。図４Ｃ中は、図４Ｃ左と同じ観察領域の、免疫蛍光染色されたコラーゲンＩＶの観察像を示す。図４Ｃ右は、図４Ｃ左のＩｇＧ４の観察像と、図４Ｃ中のコラーゲンＩＶの観察像とを重ね合わせた像である。
【図５Ａ】ＡＩＰ患者血清及び対照血清中の抗ヒトラミニン−５１１活性断片抗体の濃度を示す。
【図５Ｂ】ＡＩＰ患者血清及び対照血清中の抗ヒトコラーゲンＩＶ抗体の濃度を示す。
【図５Ｃ】ＡＩＰ患者血清及び対照血清中の抗ヒトフィブロネクチン抗体の濃度を示す。
【図５Ｄ】ＡＩＰ患者血清及び対照血清中の抗ＧＦＰ抗体の濃度を示す。
【図６】図６は、Ｈ＆Ｅ染色により染色した膵臓の組織切片の観察像を示す。図６左が対照群の膵臓の観察像、図６右がラミニン−５１１により免疫した試験群の膵臓の観察像である。
【図７】ＡＩＰ患者血清及び対照血清中の抗ヒトラミニン−５２１抗体の濃度を示す。
【図８】図８左側にＩｇＧ４関連腎疾患患者ＩｇＧを皮下投与したマウスの腎臓の観察像を示し、図８右側に対照ＩｇＧを皮下投与したマウスの腎臓のヒトＩｇＧ４染色観察像を示す。上段は、腎臓全体のヒトＩｇＧ４染色観察像を示し、下段は糸状体のヒトＩｇＧ４染色観察像を示す。
【図９Ａ】実験８における、トレーニング群である１０名のＡＩＰ患者及び１０名の対照からの血清試料の、抗ヒトラミニン−５１１−Ｅ８  ＩｇＧ抗体レベルの測定結果を示す。
【図９Ｂ】実験８における、バリデーション群である４１名のＡＩＰ患者及び１０２名の対照（健常者２０名、ＡＩＰ以外の疾患患者８２名）からの血清試料の、抗ヒトラミニン−５１１−Ｅ８  ＩｇＧ抗体レベルの測定結果を示す。
【図１０】実験９における、２６名の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陽性ＡＩＰ患者、２５名の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陰性ＡＩＰ患者、及び、１１２名の対照からの血清試料での、抗インテグリンα６β１  ＩｇＧ抗体レベルの測定結果を示す。
【図１１】実験９における、２６名の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陽性ＡＩＰ患者、２５名の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陰性ＡＩＰ患者、及び、１１２名の対照からの血清試料での、抗インテグリンα３β１  ＩｇＧ抗体レベルの測定結果を示す。
【図１２】図１２上段は、抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陽性ＡＩＰ患者の造影ＣＴによる膵画像である。図１２下段は、抗インテグリンα６β１抗体陽性ＡＩＰ患者の造影ＣＴによる膵画像である。各画像中の矢印は病変箇所を指す。
【図１３】抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陽性ＡＩＰ患者５名の、ステロイド（プレドニゾン）を用いた治療の前後での、血清中の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体レベルの測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜１．ＩｇＧ４関連疾患＞
本発明においてＩｇＧ４関連疾患とは、血清ＩｇＧ４高値とＩｇＧ４陽性形質細胞の組織浸潤または腫瘤形成を特徴とする疾患群であり、具体的には、自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）、ＩｇＧ４関連腎疾患、ＩｇＧ４関連涙腺唾液腺炎、ＩｇＧ４関連硬化性胆管炎、ＩｇＧ４関連眼疾患、ＩｇＧ４関連動脈周囲炎、ＩｇＧ４関連下垂体炎、ＩｇＧ４関連肺疾患、ＩｇＧ４関連後腹膜線維症が例示できる。
＜２．ＩｇＧ４関連疾患の検査方法＞
本発明は第一に、
ＩｇＧ４関連疾患の検査方法であって、
ＩｇＧ４関連疾患の指標として、検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び／又は
ＩｇＧ４関連疾患の指標として、検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法に関する。
【００１５】
本発明の検査方法の１つ以上の実施形態は、ラミニンに対する抗体（自己抗体）が、ＩｇＧ４関連疾患の病原物質であり、被検動物から取得した検体中の前記抗体が、ＩｇＧ４関連疾患に罹患していることの指標となるという驚くべき知見に基づき完成された。
【００１６】
また、本発明の検査方法の１つ以上の実施形態は、ラミニンとインテグリンとの結合が、ＩｇＧ４関連疾患の病原物質のターゲットであり、被検動物から取得した検体中の抗ラミニン抗体及び／又は抗インテグリン抗体が、ＩｇＧ４関連疾患に罹患していることの指標となるという驚くべき知見に基づき完成された。
【００１７】
本発明の検査方法が対象とする被検動物は特に限定されずヒトであってもよいし、他の非ヒト哺乳動物であってもよいが、好ましくはヒトである。
【００１８】
本発明の検査方法に用いる検体としては、被検動物から採取される体液が挙げられる。具体的には、血清、血漿、全血等の血液試料のほか、唾液、髄液、尿などの血液以外の体液試料であってもよい。また、体液に限らず、被検動物から採取される組織、例えば、検査しようとするＩｇＧ４関連疾患の疾患部位（例えば膵臓、腎臓、唾液腺等）から採取される組織も、検体として用いることができる。検体は、被検動物から分離された形態で本発明の検査方法に用いる。
【００１９】
ラミニンは、天然型では、α鎖、β鎖およびγ鎖の３本のサブユニット鎖からなる巨大なヘテロ３量体分子である。α鎖としてα１〜α５、β鎖としてβ１〜β３、γ鎖としてγ１〜γ３が知られており、それらの組み合わせで１２種類以上のアイソフォームが存在する（表１参照）。本発明においてラミニンのアイソフォームは限定されない。すなわち検出しようとする抗体が免疫学的に反応するラミニンは、α１〜α５から選択される１種のα鎖、β１〜β３から選択される１種のβ鎖、γ１〜γ３から選択される１種のγ鎖からなるものであることができ、具体的には、表１に記載の１２種類のいずれか、或いは他のアイソフォームであることができ、好ましくはα鎖がα５、β鎖がβ１、γ鎖がγ１である「ラミニン−５１１」、及び、α鎖がα５、β鎖がβ２、γ鎖がγ１である「ラミニン−５２１」である。
【００２０】
【表１】
2018016607.tif 000003
【００２１】
本発明において、検出しようとする抗体が免疫学的に反応するラミニンの起源は特に限定されないが、ＩｇＧ４関連疾患は通常は自己免疫疾患であることから、被検動物と同じ種のラミニンであることが好ましく、特にヒトが好ましい。ヒト等の哺乳動物の種のラミニンのα鎖、β鎖、γ鎖をコードする遺伝子の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。表２に、ヒトを含む主な哺乳類について、ラミニンを構成する各鎖のアクセッション番号を示す。表２に示すアミノ酸配列を有するラミニンの各鎖が、更に翻訳後修飾を受けたものが、ラミニンを形成してもよい。これら以外の各種哺乳動物のラミニン構成鎖の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報も同様に公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。
【００２２】
【表２】
2018016607.tif 000004
【００２３】
本発明においてラミニン、ラミニン−５１１、ラミニン−５２１という各用語は、特に限定しない場合は、α鎖、β鎖及びγ鎖がそれぞれ全長からなる天然型の形態には限定されず、それぞれ、ラミニンの断片、ラミニン−５１１の断片、ラミニン−５２１の断片や、天然型のラミニン、天然型のラミニン−５１１、天然型のラミニン−５２１と等価な形態のものを包含する。従って、検出しようとする抗体は、ラミニンの断片と免疫学的に反応するものであってもよい。ラミニンの断片としては、天然型のラミニンの３量体を構成するα鎖、β鎖、γ鎖のうち少なくとも１つが全長よりも短いものが挙げられる。ラミニンの断片は、３量体を形成していることが好ましく、インテグリン結合活性を有していることがより好ましい。ラミニンの断片が３量体を形成していることは、ラミニンの断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、バンドの数を検出すること等により確認できる。ラミニンの断片がインテグリン結合活性を有していることは、ＥＬＩＳＡ法等により確認することができる。
【００２４】
３量体を形成し、且つ、インテグリン結合活性を有するラミニンの断片としては、天然型のラミニンをエラスターゼ等のタンパク質分解酵素で消化して得られる断片が挙げられ、特に好ましくはＥ８フラグメントである。ラミニンのＥ８フラグメントは、α鎖のＣ末端断片から、Ｃ末端の球状（Ｇ）ドメイン４および５が除かれた断片（α鎖Ｅ８）、β鎖のＣ末端断片（β鎖Ｅ８）およびγ鎖のＣ末端断片（γ鎖Ｅ８）が３量体を形成したフラグメントである（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007）。ラミニンのＥ８フラグメントは、全長ラミニンを膵エラスターゼにより酵素的に消化して得ることができる。市販のラミニンのＥ８フラグメントとしては、ヒトラミニン−５１１−Ｅ８（８９２０１２，株式会社ニッピ製）が例示できる。
【００２５】
インテグリンは、天然型では、α鎖及びβ鎖の２本のサブユニット鎖からなるヘテロ２量体分子である。α鎖としてα１〜α１１、αＶ、αＸ、αＭ、αＬ、αＤ、αＥ、αＩＩｂ、β鎖としてβ１〜β８が知られており、それらの組み合わせが異なる複数のアイソフォームが存在する。ラミニンのリガンドとなり得るインテグリンのアイソフォームとしては、インテグリンα６β１、インテグリンα３β１、インテグリンα６β４が知られている。本発明においてインテグリンのアイソフォームは限定されないが、好ましくはα鎖がα６、β鎖がβ１である「インテグリンα６β１」である。
【００２６】
本発明において、検出しようとする抗体が免疫学的に反応するインテグリンの起源は特に限定されないが、ＩｇＧ４関連疾患は通常は自己免疫疾患であることから、被検動物と同じ種のインテグリンであることが好ましく、特にヒトが好ましい。ヒト等の哺乳動物の種のインテグリンのα鎖、β鎖をコードする遺伝子の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。表３に、ヒトインテグリンを構成する各鎖のアミノ酸配列及び塩基配列のアクセッション番号を示す。ヒトインテグリンのα６鎖及びβ１鎖には、それぞれ、３つのスプライシングバリアントが知られている。表３に示すアミノ酸配列を有するヒトインテグリンのα鎖、β鎖が、更に翻訳後修飾を受けたものが、ヒトインテグリンを形成してもよい。これら以外の各種哺乳動物のインテグリン構成鎖の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報も同様に公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。
【００２７】
【表３】
2018016607.tif 000005
【００２８】
本発明においてインテグリン、インテグリンα６β１、インテグリンα３β１という各用語は、特に限定しない場合は、α鎖及びβ鎖がそれぞれ全長からなる形態には限定されず、それぞれ、インテグリンの断片、インテグリンα６β１の断片、インテグリンα３β１の断片や、天然型のインテグリン、天然型のインテグリンα６β１、天然型のインテグリンα３β１と等価な形態のものを包含する。従って、検出しようとする抗体は、インテグリンの断片と免疫学的に反応するものであってもよい。インテグリンの断片としては、インテグリンの２量体を構成するα鎖、β鎖のうち少なくとも１つが全長よりも短いものが挙げられる。インテグリンの断片は、２量体を形成していることが好ましく、ラミニン結合活性を有していることがより好ましい。インテグリンの断片が２量体を形成していることは、インテグリンの断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、バンドの数を検出すること等により確認できる。インテグリンの断片がラミニン結合活性を有していることは、ＥＬＩＳＡ法等により確認することができる。市販のインテグリンとしては、リコンビナントヒトインテグリンα６β１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州、製品番号７８０９−Ａ６）、リコンビナントヒトインテグリンα３β１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州、製品番号２８４０−Ａ３）が例示できる。
【００２９】
インテグリンの断片としては、市販されているヒトインテグリンα６β１の断片であるＨｕｍａｎ  ＩＴＧＡ６  ＆  ＩＴＧＢ１（中国北京、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、製品番号ＣＴ０１３−Ｈ２５０８Ｈ−２０）が例示できる。
【００３０】
抗ラミニン抗体検出工程は、検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する工程である。抗インテグリン抗体検出工程は、検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する工程である。各工程において「検出」とは、検体中に、ラミニン又はインテグリンと免疫学的に反応する抗体が存在するか否かを確認することのほか、検体中における該抗体の含有量を測定すること、すなわち「定量」すること、も包含する概念である。
【００３１】
抗ラミニン抗体検出工程及び抗インテグリン抗体検出工程は、検体中の前記抗体を定量的又は定性的に検出可能な方法であればよく、具体的な態様は特に限定されない。例えば、免疫学的手法を用いることができ、例えば、抗体酵素法（ＥＬＩＳＡ法）、免疫沈降法（ＩＰＰ法）、免疫ブロット法（ＩＢ法）、ラテックス凝集法、免疫クロマトグラフィー法、間接蛍光抗体法（ＩＦ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）などの手法を挙げることができる。多くの検体を処理し得るＥＬＩＳＡ法が特に好ましい。ＥＬＩＳＡ法では、具体的には、前記抗体の抗原である、上記で詳述したようなラミニン又はインテグリンを固相に固定し、該固相に固定した抗原に検体を接触させ、抗原と、検体中に含有される可能性のある前記抗体との免疫複合体を検出することで、前記抗体を検出することができる。ＥＬＩＳＡ法の実施に伴う非特異反応の抑制方法や、検出の際に使用し得る標識物質、測定機器などは、特に限定されない。抗原を固定するための固相としては、プレート、ビーズ、チューブなどの任意の形状の固相を用いることができる。
【００３２】
抗ラミニン抗体検出工程におけるラミニンと免疫学的に反応する抗体の量、及び、抗インテグリン抗体検出工程におけるインテグリンと免疫学的に反応する抗体の量は、前記抗体と前記抗原との免疫複合体の標識の測定値として求めることができる。既知濃度の前記抗体を含む標準試料により検量線を作成し、検量線を用いて標識の測定値から前記抗体の量を算出することもできる。
【００３３】
抗ラミニン抗体検出工程におけるラミニンと免疫学的に反応する抗体が存在するか否かの判定（陽性／陰性の判定）、及び、抗インテグリン抗体検出工程におけるインテグリンと免疫学的に反応する抗体が存在するか否かの判定（陽性／陰性の判定）は、それぞれ、被検動物個体（例えば、ＩｇＧ４関連疾患の罹患が疑われるヒト）から得た検体中の前記抗体の測定値を、ＩｇＧ４関連疾患を罹患していない動物個体（例えば健常者）から得た検体中の前記抗体の測定値と比較することによって行うことができる。ここで、ＩｇＧ４関連疾患を罹患していない個体から得た検体中の前記抗体の測定値は、同時に測定して得た値であってもよいし、予め測定して得た値であってもよい。被検動物個体から得た検体中の前記抗体の測定値が、ＩｇＧ４関連疾患を罹患していない動物個体から得た検体中の前記抗体の測定値よりも有意に大きい場合に、陽性と判断することができる。
【００３４】
抗ラミニン抗体検出工程におけるラミニンと免疫学的に反応する抗体、及び、抗インテグリン抗体検出工程におけるインテグリンと免疫学的に反応する抗体のクラスは特に限定されないが、好ましくはＩｇＧ抗体である。ＩｇＧ抗体のなかのサブクラスは特に限定されないが、例えばＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ４抗体を検出することができる。本発明者らは、ＩｇＧ４関連疾患では、ラミニンと免疫学的に反応するＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ４抗体が病原物質であることを見出していることから、これらはＩｇＧ４関連疾患の指標として特に有用である。
【００３５】
検査するＩｇＧ４関連疾患の種類と、ラミニンと免疫学的に反応する抗体の種類、又は、インテグリンと免疫学的に反応する抗体の種類との組み合わせは特に限定されない。
【００３６】
例えば、自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）の指標としては、ラミニン−５１１と免疫学的に反応する抗体（実験４参照）及びインテグリンα６β１と免疫学的に反応する抗体（実験９参照）が有用である。ラミニン−５１１と免疫学的に反応する抗体は、ラミニン−５１１の断片（特に、インテグリン結合活性を有する３量体断片）を抗原として用いた検出法により前記抗体を検出することが特に好ましい。インテグリンα６β１と免疫学的に反応する抗体は、インテグリンα６β１を抗原として用いた検出法により前記抗体を検出することが特に好ましい。
【００３７】
一方、ＩｇＧ４関連腎疾患の指標としては、ラミニン−５２１と免疫学的に反応する抗体が有用である（実験６参照）。この場合、ラミニン−５２１を抗原として用いた検出法により前記抗体を検出することが特に好ましい。
【００３８】
本発明のＩｇＧ４関連疾患の検査方法の、抗ラミニン抗体検出工程を含む実施形態により、検体中の、ラミニン、特にラミニン−５１１、特にラミニン−５１１−Ｅ８と免疫学的に反応する抗体が検出された場合、検出結果に基づき、検体が由来する被験動物が、ＩｇＧ４関連疾患、特に自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）に罹患していると判断することができる。ラミニン、特にラミニン−５１１、特にラミニン−５１１−Ｅ８と免疫学的に反応する抗体は、膵癌患者の検体からは検出されないことから、本発明のＩｇＧ４関連疾患の検査方法の、抗ラミニン抗体検出工程を含む実施形態は、ＡＩＰと膵癌とを判別する指標を得ることができ、特に有用である。
【００３９】
また、本発明のＩｇＧ４関連疾患の検査方法の、抗ラミニン抗体検出工程を含む実施形態により、検体中の、ラミニン、特にラミニン−５１１、特にラミニン−５１１−Ｅ８と免疫学的に反応する抗体が検出された場合、検出結果に基づき、検体が由来する被験動物が、ＩｇＧ４関連疾患、特にＡＩＰに、悪性腫瘍を合併するリスクが低いと判断することができる。
【００４０】
本発明のＩｇＧ４関連疾患の検査方法の、抗インテグリン抗体検出工程を含む実施形態により、検体中の、インテグリン、特にインテグリンα６β１と免疫学的に反応する抗体が検出された場合、検出結果に基づき、検体が由来する被験動物が、ＩｇＧ４関連疾患、特にＡＩＰに罹患していると判断することができる。
【００４１】
膵癌を罹患する被験動物と、ＡＩＰを罹患する、抗インテグリン抗体陽性の被験動物とでは、膵画像が類似しており、膵画像所見のみによる区別は難しい。ところが、インテグリン、特にインテグリンα６β１と免疫学的に反応する抗体は、膵癌患者の検体からは検出されないことから、本発明のＩｇＧ４関連疾患の検査方法の、抗インテグリン抗体検出工程を含む実施形態は、ＡＩＰと膵癌とを判別する指標を得ることができるため特に有用である。
【００４２】
また、本発明のＩｇＧ４関連疾患の検査方法の、抗インテグリン抗体検出工程を含む実施形態により、検体中に、インテグリン、特にインテグリンα６β１と免疫学的に反応する抗体が検出された場合、検出結果に基づき、検体が由来する被験動物が、ＩｇＧ４関連疾患、特にＡＩＰに、悪性腫瘍を合併するリスクが高いと判断することができる。悪性腫瘍を合併するリスクが高いと判断された被験動物に対しては、全身における悪性腫瘍のスクリーニングを実施する必要性が高いと判断することが可能である。
【００４３】
本発明のＩｇＧ４関連疾患の検査方法は、抗ラミニン抗体検出工程と抗インテグリン抗体検出工程の少なくとも一方を含んでいればよいが、より好ましくは、抗ラミニン抗体検出工程と抗インテグリン抗体検出工程の両方を含む。抗ラミニン抗体陰性の検体であっても、抗インテグリン抗体陽性である場合があり、抗インテグリン抗体陰性の検体であっても、抗ラミニン抗体陽性である場合があるため、検体中において両方の抗体を検出することにより、ＩｇＧ４関連疾患、特にＡＩＰ、に罹患している被験動物の検体の検出漏れの可能性を低減することができる。
＜３．ＩｇＧ４関連疾患の検査試薬＞
本発明は第二に、
ラミニンを含む、ＩｇＧ４関連疾患を検査するための検査試薬、
インテグリンを含む、ＩｇＧ４関連疾患を検査するための検査試薬、或いは、
ラミニン及びインテグリンを含む、ＩｇＧ４関連疾患を検査するための検査試薬
に関する。
【００４４】
ここで、ＩｇＧ４関連疾患、ラミニン、及び、インテグリンについては、本発明の検査方法に関して既述の通りである。
【００４５】
本発明の検査試薬の、ラミニンを含む実施形態は、上記の本発明の検査方法の、抗ラミニン抗体検出工程を含む実施形態に使用することができる。
【００４６】
本発明の検査試薬の、インテグリンを含む実施形態は、上記の本発明の検査方法の、抗インテグリン抗体検出工程を含む実施形態に使用することができる。
【００４７】
本発明の検査試薬の１以上の実施形態は、免疫学的測定に必要な試薬類、例えば、緩衝液等を必要に応じて含んでよく、複数の成分からなるキットとして提供されてもよい。
【００４８】
本発明の検査試薬の、ラミニンを含む実施形態において、ラミニンの形態は特に限定されず、溶液状態であってもよいし、乾燥状態であってもよいし、固相に固定された形態であってもよい。ラミニンが乾燥状態である場合、使用前に溶液状態にするための緩衝液や溶媒を本発明の検査試薬に含めてもよい。
【００４９】
本発明の検査試薬の、インテグリンを含む実施形態において、インテグリンの形態は特に限定されず、溶液状態であってもよいし、乾燥状態であってもよいし、固相に固定された形態であってもよい。インテグリンが乾燥状態である場合、使用前に溶液状態にするための緩衝液や溶媒を本発明の検査試薬に含めてもよい。
【００５０】
固相に固定された形態のラミニンを含む本発明の検査試薬の実施形態は、ＥＬＩＳＡ法によりＩｇＧ４関連疾患を検査するためのキットの形態とすることができる。固相に固定された形態のインテグリンを含む本発明の検査試薬の実施形態もまた、ＥＬＩＳＡ法によりＩｇＧ４関連疾患を検査するためのキットの形態とすることができる。固相に固定された形態のラミニン及びインテグリンを含む本発明の検査試薬の実施形態もまた、ＥＬＩＳＡ法によりＩｇＧ４関連疾患を検査するためのキットの形態とすることができる。各実施形態において、固相の形態としては、プレート、ビーズ、チューブなどの任意の形態であってよい。ＥＬＩＳＡ法によりＩｇＧ４関連疾患を検査するためのキットは、前記固相以外に、ブロッキング液、洗浄液、検体希釈液、酵素標識した二次抗体、基質液等を含むことができる。
＜４．ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価する方法＞
本発明は第三に、
ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価する方法であって、
ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び／又は、
ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法に関する。
【００５１】
上記の「ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価する方法」は、「ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価するための指標を取得する方法」と表現してもよい。
【００５２】
本発明の検査方法に関して既述の通り、検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体、及び、インテグリンと免疫学的に反応する抗体は、ＩｇＧ４関連疾患の指標として有用である。このため、ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の前記抗体は、治療が有効で治癒している場合は低下し、治療が十分に効果を発揮していない場合は治療開始前から変化しない又は上昇する。そこで、ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の。ラミニンと免疫学的に反応する抗体、及び／又は、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出することで、治療の効果を評価することが可能となる。
【００５３】
被検動物としては、ＩｇＧ４関連疾患の治療を受けたヒトや非ヒト動物が例示できる。
【００５４】
ＩｇＧ４関連疾患の治療としては、ステロイド投与等の、ＩｇＧ４関連疾患の治療が挙げられる。
【００５５】
本発明の治療効果の評価方法における、検体、ラミニン、インテグリン、抗体、抗ラミニン抗体検出工程、抗インテグリン抗体検出工程などの具体的態様は、本発明の検査方法に関して説明したのと同様である。
【００５６】
本発明の治療効果の評価方法における抗ラミニン抗体検出工程及び／又は抗インテグリン抗体検出工程で得た、ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中のラミニンと免疫学的に反応する抗体及び／又はインテグリンと免疫学的に反応する抗体の定量結果を、例えば、前記治療を開始する前の同一動物個体から得た検体中のラミニンと免疫学的に反応する抗体及び／又はインテグリンと免疫学的に反応する抗体の定量結果と比較して、前者が後者よりも小さい場合には、治療が有効であると評価することができる。一方、前者が後者と同程度或いは後者よりも大きい場合には、治療が有効でない又は十分でないと評価することができる。この評価結果に基づいて、治療を更に継続する、治療方針を変更する、治療を中止するなどの判断が可能である。
【００５７】
また、本発明の治療効果の評価方法における抗ラミニン抗体検出工程及び／又は抗インテグリン抗体検出工程で得た、ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中のラミニンと免疫学的に反応する抗体及び／又はインテグリンと免疫学的に反応する抗体の定量結果を、例えば、同一動物種の健常個体から得た検体中のラミニンと免疫学的に反応する抗体及び／又はインテグリンと免疫学的に反応する抗体の定量結果と比較して、前者が後者と同程度である又はより小さい場合には、治療が有効であると評価することができる。一方、前者が後者よりも大きい場合には、治療が有効でない又は十分でないと評価することができる。この評価結果に基づいて、治療を更に継続する、治療方針を変更する、治療を中止するなどの判断が可能である。
＜５．ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法１＞
本発明は第四に、
ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
試験物質を作用させた動物から得た検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程と、
前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記抗体が減少した場合に、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜する選抜工程と
を含む方法に関する。
【００５８】
本発明の検査方法の抗ラミニン抗体検出工程を含む実施形態に関して既述の通り、検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体は、ＩｇＧ４関連疾患の指標として有用である。このため、試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記抗体が減少した場合に、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜することが可能となる。
【００５９】
本発明のスクリーニング方法の抗ラミニン抗体検出工程を含む実施形態における、検体、ラミニン、抗体、抗ラミニン抗体検出工程などの具体的態様は、本発明の検査方法の抗ラミニン抗体検出工程を含む実施形態に関して説明したのと同様である。
【００６０】
本発明のスクリーニング方法の抗ラミニン抗体検出工程を含む実施形態において、試験物質としては、新規医薬の候補となる可能性のある試験物質であり特に限定されない。試験物質を作用させる動物は、典型的には、ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物等の、健常個体と比較して、ラミニンと免疫学的に反応する抗体の検体中での量が大きい動物である。
【００６１】
本発明のスクリーニング方法の抗ラミニン抗体検出工程を含む実施形態における選抜工程では、抗ラミニン抗体検出工程で得た、試験物質を作用させた動物から得た検体中の前記抗体の定量結果を、例えば、前記試験物質を作用させる前の同一動物個体から得た検体中の前記抗体の定量結果と比較して、前者が後者よりも小さい場合には、前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記抗体が減少したと判断し、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜することができる。
【００６２】
また、本発明のスクリーニング方法の抗ラミニン抗体検出工程を含む実施形態における選抜工程では、抗ラミニン抗体検出工程で得た、試験物質を作用させた動物から得た検体中の前記抗体の定量結果を、例えば、同一動物種の健常個体から得た検体中の前記抗体の定量結果と比較して、前者が後者と同程度である又はより小さい場合には、前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記抗体が減少したと判断し、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜することができる。
＜６．ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法２＞
本発明は第五に、
ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
試験物質を作用させた動物から得た検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程と、
前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記抗体が減少した場合に、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜する選抜工程と
を含む方法に関する。
【００６３】
本発明の検査方法の抗インテグリン抗体検出工程を含む実施形態に関して既述の通り、検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体は、ＩｇＧ４関連疾患の指標として有用である。このため、試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記抗体が減少した場合に、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜することが可能となる。
【００６４】
本発明のスクリーニング方法の抗インテグリン抗体検出工程を含む実施形態における、検体、インテグリン、抗体、抗インテグリン抗体検出工程などの具体的態様は、本発明の検査方法の抗インテグリン抗体検出工程を含む実施形態に関して説明したのと同様である。
【００６５】
本発明のスクリーニング方法の抗インテグリン抗体検出工程を含む実施形態において、試験物質としては、新規医薬の候補となる可能性のある試験物質であり特に限定されない。試験物質を作用させる動物は、典型的には、ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物等の、健常個体と比較して、インテグリンと免疫学的に反応する抗体の検体中での量が大きい動物である。
【００６６】
本発明のスクリーニング方法の抗インテグリン抗体検出工程を含む実施形態における選抜工程では、抗インテグリン抗体検出工程で得た、試験物質を作用させた動物から得た検体中の前記抗体の定量結果を、例えば、前記試験物質を作用させる前の同一動物個体から得た検体中の前記抗体の定量結果と比較して、前者が後者よりも小さい場合には、前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記抗体が減少したと判断し、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜することができる。
【００６７】
また、本発明のスクリーニング方法の抗インテグリン抗体検出工程を含む実施形態における選抜工程では、抗インテグリン抗体検出工程で得た、試験物質を作用させた動物から得た検体中の前記抗体の定量結果を、例えば、同一動物種の健常個体から得た検体中の前記抗体の定量結果と比較して、前者が後者と同程度である又はより小さい場合には、前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記抗体が減少したと判断し、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜することができる。
＜７．ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法１＞
本発明は第六に、
ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法であって、
非ヒト動物に、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を投与する抗ラミニン抗体投与工程、及び
非ヒト動物を、ラミニンを抗原として免疫するラミニン免疫工程
のうち少なくとも一方を含む方法に関する。
【００６８】
本発明の非ヒトモデル動物の作製方法の抗ラミニン抗体投与工程又はラミニン免疫工程を含む実施形態での、ラミニン、抗体等の具体的形態は、本発明の検査方法の抗ラミニン抗体検出工程を含む実施形態におけるものと同様である。
【００６９】
本明細書に記載の実験１及び実験２では、ＩｇＧ４関連疾患患者から得た血清又は該血清から精製した抗体をマウスに投与したとき、マウスはＩｇＧ４関連疾患を発症することが確認されている。そして、実験４では、ＩｇＧ４関連疾患患者から得た血清が、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を含むことが確認されている。このことから、非ヒト動物に、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を投与する抗ラミニン抗体投与工程により、ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物の作製が可能であると言える。
【００７０】
抗ラミニン抗体投与工程における非ヒト動物としては、例えばＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｂ６マウス等のマウス、その他の非ヒト動物が例示できる。
【００７１】
抗ラミニン抗体投与工程における、ラミニンと免疫学的に反応する抗体の投与経路は特に限定されないが、例えば、皮下投与、腹腔内投与、静脈投与等が例示できる。ラミニンと免疫学的に反応する抗体は、精製された抗体として非ヒト動物に投与される必要はなく、例えば、抗体を含む血清として非ヒト動物に投与されてもよい。
【００７２】
抗ラミニン抗体投与工程において、ラミニンと免疫学的に反応する抗体は、投与を受ける非ヒト動物が有するラミニンと免疫学的に反応できるように選択する。例えば、ヒト由来抗ヒトラミニン抗体は、マウスが有するラミニンと免疫学的に反応することができ、マウスにおいてＩｇＧ４関連疾患の病変を惹起することができる。
【００７３】
一方、本明細書に記載の実験５では、ヒトラミニン−５１１−Ｅ８フラグメントを抗原としマウスを免疫したとき、該抗原に対する抗体が形成され、該マウスはＩｇＧ４関連疾患を発症することが確認されている。このことから、非ヒト動物を、ラミニンを抗原として免疫するラミニン免疫工程により、ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物の作製が可能であると言える。
【００７４】
ラミニン免疫工程における非ヒト動物としては、例えばＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｂ６マウス等のマウス、その他の非ヒト動物が例示できる。
【００７５】
ラミニン免疫工程における方法は特に限定されない。ラミニンを、完全フロイントアジュバント等の適当なアジュバントとともに、非ヒト動物に皮下投与、静脈内投与、或いは腹腔内投与等の経路で投与することで、非ヒト動物を免疫することができる。
【００７６】
ラミニン免疫工程において、抗原として投与するラミニンは、それに対する抗体が、免疫される非ヒト動物が有するラミニンに自己免疫により免疫学的に反応できるように選択する。例えば、ヒトラミニン−５１１は、それに対するマウス抗体が、マウスが有するラミニンと自己免疫により免疫学的に反応することができ、マウスにおいてＩｇＧ４関連疾患の病変を惹起することができる。
＜８．ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法２＞
本発明は第七に、
ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法であって、
非ヒト動物に、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を投与する抗インテグリン抗体投与工程、及び
非ヒト動物を、インテグリンを抗原として免疫するインテグリン免疫工程
のうち少なくとも一方を含む方法に関する。
【００７７】
本発明の非ヒトモデル動物の作製方法の抗インテグリン抗体投与工程又はインテグリン免疫工程を含む実施形態での、インテグリン、抗体等の具体的形態は、本発明の検査方法の抗インテグリン抗体検出工程を含む実施形態におけるものと同様である。
【００７８】
抗インテグリン抗体投与工程における非ヒト動物としては、例えばＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｂ６マウス等のマウス、その他の非ヒト動物が例示できる。
【００７９】
抗インテグリン抗体投与工程における、インテグリンと免疫学的に反応する抗体の投与経路は特に限定されないが、例えば、皮下投与、腹腔内投与、静脈投与等が例示できる。インテグリンと免疫学的に反応する抗体は、精製された抗体として非ヒト動物に投与される必要はなく、例えば、抗体を含む血清として非ヒト動物に投与されてもよい。
【００８０】
抗インテグリン抗体投与工程において、インテグリンと免疫学的に反応する抗体は、投与を受ける非ヒト動物が有するインテグリンと免疫学的に反応できるように選択する。例えば、ヒト由来抗ヒトインテグリン抗体（特に、ヒト由来抗ヒトインテグリンα６β１抗体）は、マウスが有するインテグリンと免疫学的に反応することができ、マウスにおいてＩｇＧ４関連疾患の病変を惹起することができる。
【００８１】
インテグリン免疫工程における非ヒト動物としては、例えばＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｂ６マウス等のマウス、その他の非ヒト動物が例示できる。
【００８２】
インテグリン免疫工程における方法は特に限定されない。インテグリンを、完全フロイントアジュバント等の適当なアジュバントとともに、非ヒト動物に皮下投与、静脈内投与、或いは腹腔内投与等の経路で投与することで、非ヒト動物を免疫することができる。
【００８３】
インテグリン免疫工程において、抗原として投与するインテグリンは、それに対する抗体が、免疫される非ヒト動物が有するインテグリンに自己免疫により免疫学的に反応できるように選択する。例えば、ヒトインテグリン（特にヒトインテグリンα６β１）は、それに対するマウス抗体が、マウスが有するインテグリンと自己免疫により免疫学的に反応することができ、マウスにおいてＩｇＧ４関連疾患の病変を惹起することができる。
【実施例】
【００８４】
＜１．実験１：ＩｇＧ４関連疾患患者のＩｇＧのマウスへの投与＞
実験１では、ＩｇＧ４関連疾患患者の血清から精製したＩｇＧを健常マウス新生仔に投与し、投与後の膵臓への影響を観察した。その結果、ＩｇＧ４関連疾患患者の血清から精製したＩｇＧは、膵臓に対して病原性を示すことが明らかとなった。
１．１．血清
ＩｇＧ４関連疾患と診断された１０名の患者から血清試料を取得した。【００８５】
対照血清試料として、５名の健常者からの血清試料と、５名の疾患患者（３名の膵癌患者、２名の原発性硬化性胆管炎患者）からの血清試料を取得した。対照血清試料は、ＩｇＧ４関連疾患患者血清試料と、年齢（±５歳）、性別を揃えた。
１．２．ヒトＩｇＧの調製
上記の血清試料から、Ａｂ−Ｒａｐｉｄ  ＰｕＲｅ  Ｅｘ（Ｐ−０１５，Ｐｏｒｔｅ  Ｎｏｖａ製）を用い、製品の指示書に沿った手順により、ヒトＩｇＧを調製した。ＩｇＧはｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により透析し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（ＵＦＣ８０５０２４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を用いた限外濾過により濃縮し、使用時まで−２０℃で保存した。精製されたＩｇＧの濃度は、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ＥＩＡ  Ｋｉｔ（ＭＫ１３６，Ｔａｋａｒａ製）を用いて測定した。ＩｇＧ画分の純度を、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｅ８８−１０２，  Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｒｅｓ製）、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＭ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｅ８８−１００，  Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｒｅｓ製）、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｅ８８−１０８，  Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｒｅｓ製）、及び、クーマシーブリリアントブルー染色をそれぞれ用いてＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びタンパク質の混入を求め、確認した。【００８６】
ＩｇＧ４関連疾患患者の血清試料から得られたＩｇＧを「患者ＩｇＧ」とした。対照血清試料から得られたＩｇＧを「対照ＩｇＧ」とした。
１．３．動物試験
マウスとしてＢＡＬＢ／ｃマウスの雄の新生仔を用いた。【００８７】
各血清試料から調製されたＩｇＧをマウスに皮下投与した。１０〜２０ｍｇのヒトＩｇＧをマウス体重１ｇに対して投与した。
１．４．結果と考察１（図１Ａ〜図１Ｃ）
患者ＩｇＧ又は対照ＩｇＧの皮下投与から１２時間後に、マウスの膵臓の組織切片を採取し、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン＆エオシン）染色及び免疫組織化学的染色により染色し、観察した。免疫組織化学的染色では、骨髄細胞分化抗原Ｇｒ１に対する抗体を一次抗体として用い、Ｇｒ１陽性細胞を染色した。【００８８】
また、皮下投与から１２時間後に、マウスの血清中のヒトＩｇＧ濃度を測定した。【００８９】
結果を図１Ａ〜図１Ｃに示す。【００９０】
図１Ａは、対照ＩｇＧ投与マウス（左列）と、患者ＩｇＧ投与マウス（右列）の、ＩｇＧ投与から１２時間後の膵臓のＨ＆Ｅ染色（上段）と、Ｇｒ１の染色（下段）の結果を示す。観察像中のスケールバーは上段では５０μｍ、下段では２０μｍを示す。【００９１】
図１Ｂは、対照ＩｇＧ（三角）及び患者ＩｇＧ（丸）の投与量と、浮腫面積との相関関係を示す。図中のカットオフ値（２１．１％）は、対照ＩｇＧ又はＰＢＳ投与マウスでの浮腫面積の平均値に、標準偏差（ＳＤ）の２倍の値を加えた値である。【００９２】
図１Ｃは、対照ＩｇＧ投与マウス（左）と、患者ＩｇＧ投与マウス（右）の、ＩｇＧ投与から１２時間後の膵臓の壊死又は出血の病理組織的グレードと、Ｇｒ１陽性細胞数を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５：ｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔｅｓｔによる）。【００９３】
図１Ｂに示す通り、患者ＩｇＧ投与マウスと、対照ＩｇＧ投与マウスとで、血清中のヒトＩｇＧ濃度に有意な差はなかった（１９．４ｍｇ／ｍｌと２１．４ｍｇ／ｍｌ）。一方で、患者ＩｇＧのマウスへの投与により膵臓が損傷し、図１Ａに示す通り、投与後１２時間で損傷が最大となった。対照ＩｇＧのマウスへの投与では、図１Ａに示す通り、投与後１２時間で膵臓の損傷は生じなかった。【００９４】
組織学的観察では、腺房壊死、出血及びＧｒ１陽性多形核白血球の浸潤が、患者ＩｇＧを投与したマウスの膵臓で観察された（図１Ａ）。【００９５】
浮腫の面積を定量したところ、患者ＩｇＧ投与マウスでは浮腫形成が認められたが、対照ＩｇＧ投与マウスでは浮腫形成は認められなかった（図１Ｂ）。【００９６】
膵臓における壊死、出血、及びＧｒ１陽性細胞の浸潤は、患者ＩｇＧ投与マウスにおいて、対照ＩｇＧ投与マウスよりも有意に大きかった（図１Ｃ）。
１．５．結果と考察２（図２Ａ及び図２Ｂ）
図２Ａ及びＢに結果を示す試験は、患者ＩｇＧの病原性が、膵臓組織への直接的な結合により生じるのか否かを確認する試験である。【００９７】
患者ＩｇＧ又は対照ＩｇＧの皮下投与から１２時間後に、マウスの膵臓の組織切片を採取し、免疫組織化学的染色により染色し、観察した。免疫組織化学的染色では、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＧ１抗体又は抗ヒトＩｇＧ４抗体を一次抗体として用い、常法により、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４を染色した。【００９８】
また、前記の、マウスの膵臓の組織切片を免疫蛍光染色により染色し、蛍光顕微鏡により観察した。免疫蛍光染色では、フルオロセインイソシアネートがコンジュゲートされたウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体、ウサギ抗アミラーゼ抗体又はウサギ抗コラーゲンＩＶ抗体を抗体として、常法により、ヒトＩｇＧ、アミラーゼ又はコラーゲンＩＶを染色した。【００９９】
図２Ａは、対照ＩｇＧ投与マウス（左列）と、患者ＩｇＧ投与マウス（右列）の、ＩｇＧ投与から１２時間後の膵臓でのＩｇＧ（上段）、ＩｇＧ１（中段）、ＩｇＧ４（下段）の免疫組織化学的染色の結果を示す。観察像中のスケールバーは２０μｍを示す。【０１００】
図２Ｂは、対照ＩｇＧ投与マウスと患者ＩｇＧ投与マウスの、膵臓組織の免疫蛍光染色の結果を示す。観察像中のスケールバーは２０μｍを示す。【０１０１】
図２Ｂの上段の左端は、対照ＩｇＧ投与マウスの膵臓組織での、免疫蛍光染色されたヒトＩｇＧの観察像を示す。ヒトＩｇＧはマウスの膵臓では観察されなかった。【０１０２】
図２Ｂの上段の左から２つ目は、患者ＩｇＧ投与マウスの膵臓組織での、免疫蛍光染色されたヒトＩｇＧの観察像を示す。図２Ｂの上段の左から３つ目は、患者ＩｇＧ投与マウスの膵臓組織での、図２Ｂの上段の左から２つ目と同じ観察領域における、免疫蛍光染色されたアミラーゼの観察像を示す。図２Ｂの上段の右端は、上記のヒトＩｇＧの観察像と、上記のアミラーゼの観察像とを重ね合わせた像である。【０１０３】
図２Ｂの下段の左から１つ目は、患者ＩｇＧ投与マウスの膵臓組織での、免疫蛍光染色されたヒトＩｇＧの観察像を示す。図２Ｂの下段の左から２つ目は、患者ＩｇＧ投与マウスの膵臓組織での、図２Ｂの下段の左から１つ目と同じ観察領域における、免疫蛍光染色されたコラーゲンＩＶの観察像を示す。図２Ｂの下段の右端は、上記のヒトＩｇＧの観察像と、上記のコラーゲンＩＶの観察像とを重ね合わせた像である。【０１０４】
図２Ａに示すように、患者ＩｇＧ投与マウスの全てにおいて、膵臓の腺房の基部及び膵臓組織の小葉間隙においてＩｇＧ及びＩｇＧ４が蓄積していることが観察されたが、対照ＩｇＧ投与マウスの膵臓ではＩｇＧ及びＩｇＧ４は観察されなかった。また、患者ＩｇＧ投与マウスでは１０匹中６匹においてＩｇＧ１が観察されたが、対照ＩｇＧ投与マウスではＩｇＧ１は観察されなかった。【０１０５】
図２Ｂの上段に示す通り、患者ＩｇＧ投与マウスにおいて、ヒトＩｇＧと、膵臓の腺房で発現するアミラーゼとは共存していないことが確認された。また、図２Ｂの下段に示す通り、患者ＩｇＧ投与マウスにおいて、ヒトＩｇＧの大部分と、基底膜又は細胞外マトリクスで発現するコラーゲンＩＶと共存することが確認された。【０１０６】
以上の結果から、患者ＩｇＧの抗原は、基底膜又は細胞外マトリクスに含まれる成分であると推定される。
＜２．実験２：ＩｇＧ４関連疾患のＩｇＧ１、ＩｇＧ４のマウスへの投与＞
実験２では、ＩｇＧ４関連疾患患者の血清からＩｇＧのサブクラスＩｇＧ１とＩｇＧ４を精製し、健常マウス新生仔に投与し、投与後の膵臓への影響を観察した。その結果、ＩｇＧ４関連疾患患者の血清から精製したＩｇＧ１とＩｇＧ４はどちらも膵臓に対して病原性を示すこと、ＩｇＧ１の病原性はＩｇＧ４の病原性よりも大きいこと、ＩｇＧ１とＩｇＧ４を併用して投与するとＩｇＧ１の病原性は抑制されることが確認された。
２．１．ヒトＩｇＧの調製
上記１．１．得たＩｇＧ４関連疾患の患者の血清試料及び対照血清試料から、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４を精製した。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の精製は、それぞれ、Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＩｇＧ１（Ｈｕ）  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｒｉｃｓ（１９１３０３００５，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、及び、Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＩｇＧ４（Ｈｕ）  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｒｉｃｓ（２９０００５，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用い、製品の指示書に沿った手順により行った。手順の概要は、ヒト血清試料を前記製品のカラムに負荷し、ＰＢＳで洗浄した。目的とするサブクラス（ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）の画分を０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．８）により溶出させ、１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）により中和した。溶出したサブクラス（ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）の画分を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）により十分に洗浄しながら、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（ＵＦＣ８０５０２４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を用いた限外濾過により濃縮した。精製されたＩｇＧサブクラスの濃度を、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＥＬＩＳＡ（ＢＭＳ２０９２，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＥＬＩＳＡ（ＢＭＳ２０９３，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ３  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＥＬＩＳＡ（ＢＭＳ２０９４，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ４  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＥＬＩＳＡ（ＢＭＳ２０９５，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）を製品の指示書に従って用い、定量した。サブクラスの純度を、上記と同様の手順によりＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、他のＩｇＧサブクラス及びタンパク質の混入を求め、確認した。      【０１０７】
ＩｇＧ４関連疾患の患者の血清試料から得られたＩｇＧ１、ＩｇＧ４をそれぞれ「患者ＩｇＧ１」、「患者ＩｇＧ４」とした。対照血清試料から得られたＩｇＧ１、ＩｇＧ４をそれぞれ「対照ＩｇＧ１」、「対照ＩｇＧ４」とした。
２．２．動物試験
マウスとしてＢＡＬＢ／ｃマウスの雄の新生仔を用いた。【０１０８】
各血清試料から調製されたＩｇＧ１及びＩｇＧ４の一方又は両方、をマウスに皮下投与した。マウスへの投与量は、ＩｇＧ１のみを投与する場合はＩｇＧ１を１０ｍｇ／マウス体重１ｇの量で投与し、ＩｇＧ４のみを投与する場合はＩｇＧ４を１ｍｇ／マウス体重１ｇの量で投与し、ＩｇＧ１とＩｇＧ４とを投与する場合はＩｇＧ１を１０ｍｇ／マウス体重１ｇで投与しＩｇＧ４は１ｍｇ／マウス体重１ｇの量で投与した。
２．３．結果と考察（図３Ａ〜図３Ｃ）
患者ＩｇＧ１及び患者ＩｇＧ４の一方又は両方、或いは、対照ＩｇＧ１及び対照ＩｇＧ４の一方又は両方の皮下投与から１２時間後に、マウスの膵臓の組織切片を採取し、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン＆エオシン）染色及び免疫組織化学的染色により染色し、観察した。免疫組織化学的染色では、骨髄細胞分化抗原Ｇｒ１に対する抗体を一次抗体として用い、Ｇｒ１陽性細胞を染色した。免疫組織化学的染色ではまた、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４に対する抗体を一次抗体として用い、マウス膵臓組織中のヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４を染色した。【０１０９】
結果を図３Ａ〜図３Ｃに示す。【０１１０】
図３Ａの上段の「対照１」は、１０名の対照のうち特定の１名（対照１）から得た対照ＩｇＧ１及び対照ＩｇＧ４の一方又は両方を投与したマウスの投与１２時間後の膵臓のＨ＆Ｅ染色の観察像である。観察像中のスケールバーは２０μｍを示す。【０１１１】
図３Ａの中段及び下段の「患者９」は、１０名のＩｇＧ４関連疾患患者のうち特定の１名（患者９）から得た患者ＩｇＧ１及び患者ＩｇＧ４の一方又は両方を投与したマウスの投与１２時間後の膵臓の、Ｈ＆Ｅ染色の観察像（中段）、及び、Ｇｒ１の免疫組織化学的染色の観察像（下段）である。観察像中のスケールバーは２０μｍを示す。【０１１２】
図３Ｂは、対照ＩｇＧ１及び対照ＩｇＧ４の一方又は両方を投与したマウス（左）と、患者ＩｇＧ１及び患者ＩｇＧ４の一方又は両方を投与したマウス（右）の、投与から１２時間後の膵臓の壊死又は出血の病理組織的グレードと、Ｇｒ１陽性細胞数を示す（＊ｐ＜０．０５：ｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔｅｓｔによる）。この結果、患者ＩｇＧ１及び患者ＩｇＧ４はどちらも膵臓に対して病原性を示すこと、患者ＩｇＧ１の病原性は患者ＩｇＧ４の病原性よりも大きいこと、患者ＩｇＧ１と患者ＩｇＧ４を併用して投与すると患者ＩｇＧ１の病原性は抑制されることが確認された。【０１１３】
図３Ｃは、１０名のＩｇＧ４関連疾患患者のうち特定の１名（患者１）から得た患者ＩｇＧ１及び患者ＩｇＧ４の一方又は両方を投与したマウスの投与１２時間後の膵臓の、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４の免疫組織化学的染色の観察像である。観察像中のスケールバーは２０μｍを示す。患者ＩｇＧ１及び患者ＩｇＧ４の両方を投与したマウスでの膵臓のヒトＩｇＧ１染色強度（図３Ｃ上右）は、患者ＩｇＧ１のみを投与したマウスでの膵臓のヒトＩｇＧ１染色強度（図３Ｃ上左）よりも小さいことが確認された。一方、患者ＩｇＧ１及び患者ＩｇＧ４の両方を投与したマウスでの膵臓のヒトＩｇＧ４染色強度（図３Ｃ下右）は、患者ＩｇＧ４のみを投与したマウスでの膵臓のヒトＩｇＧ４染色強度（図３Ｃ上中）と同程度であった。【０１１４】
図３Ａ及び図３Ｂからわかるように、患者ＩｇＧ１及び患者ＩｇＧ４の一方又は両方を投与したマウスでは、膵臓において、浮腫形成、腺房壊死、出血及びＧｒ１陽性多形核白血球の浸潤が観察されたのに対して、対照ＩｇＧ１及び対照ＩｇＧ４の一方又は両方を投与したマウスでは膵臓に異常は見られなかった。【０１１５】
ＩｇＧ１及びＩｇＧ４はともに病原性を有し、ＩｇＧ１はＩｇＧ４よりも顕著な病原性を有する。しかし、ＩｇＧ１の病原性は、ＩｇＧ４を同時に投与すると顕著に抑制されたことから、ＩｇＧ４はＩｇＧ１の働きを阻害することが示唆される（図３Ｂ）。実際に、ＩｇＧ１のみを投与したマウスでのＩｇＧ１の染色量は、ＩｇＧ１とＩｇＧ４とを併用して投与した場合よりも顕著に多い（図３Ｃ）。一方、ＩｇＧ４のみを投与したマウスでのＩｇＧ４の染色量は、ＩｇＧ１とＩｇＧ４とを併用して投与した場合と同程度であった（図３Ｃ）。このことから、ＩｇＧ１とＩｇＧ４とは膵臓組織へ競合的に結合すること、及び、ＩｇＧ４の膵臓組織への結合親和性は、ＩｇＧ１よりも高いことが分かる。
＜３．実験３：ＡＩＰ患者の膵臓の観察＞
上記の実験１及び２から、ＩｇＧ４関連疾患の患者のＩｇＧ１及びＩｇＧ４が、膵臓組織に結合して病原性を示すことが判明した。そこで実験３では、自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）患者の膵臓において、ＩｇＧ４が蓄積しているかどうかを観察した。観察では、Ｈ＆Ｅ染色によりヒト膵臓組織を染色し、病変がある部分と、病変のない部分を判別した、また、免疫組織化学的染色及び免疫蛍光染色によりヒト膵臓組織中のＩｇＧ４、コラーゲンＩＶ、アミラーゼを可視化した。免疫組織化学的染色及び免疫蛍光染色の手順は実験２と同様である。【０１１６】
図４Ａ上段左は、ＡＩＰ病変のある部位（左側）と、病変のない部位（右側）との境界部分から採取した、ＡＩＰ患者の膵臓組織切片をＨ＆Ｅ染色した観察像を示す。図４Ａ上段右は、同様の膵臓組織切片の、ＩｇＧ４に対する免疫組織化学的染色の観察像を示す。スケールバーは２００μｍを示す。【０１１７】
図４Ａ下段左は、図４Ａ上段右の観察像のうち、病変のある腺房の部分を拡大した観察像である。図４Ａ下段中は、図４Ａ上段右の観察像のうち、病変のある小葉間隙の部分を拡大した観察像である。図４Ａ下段右は、図４Ａ上段右の観察像のうち、病変のない正常な腺房の部分を拡大した観察像である。図４Ａ下段の各観察像においてスケールバーは２０μｍを示す。病変のある膵臓組織では、ＩｇＧ４陽性形質細胞が染色されていることに加えて、腺房の基部及び小葉間隙において、ＩｇＧ４が線状に染色された。一方、病変のない膵臓組織では、このような染色は見られなかった。【０１１８】
図４Ｂの各像は、ＡＩＰ患者の膵臓での病変のある腺房を免疫蛍光染色した観察像を示す。図４Ｂの各像ではスケールバーは２０μｍを示す。【０１１９】
図４Ｂ上段左は、ＡＩＰ患者の膵臓での病変のある腺房の、免疫蛍光染色されたＩｇＧ４の観察像を示す。図４Ｂ上段中は、図４Ｂ上段左と同じ観察領域の、免疫蛍光染色されたアミラーゼの観察像を示す。図４Ｂ上段右は、図４Ｂ上段左のＩｇＧ４の観察像と、図４Ｂ上段中のアミラーゼの観察像とを重ね合わせた像である。この結果から、ＩｇＧ４はアミラーゼとは共存せず異なる部位に存在することが分かる。【０１２０】
図４Ｂ下段左は、ＡＩＰ患者の膵臓での病変のある腺房の、免疫蛍光染色されたＩｇＧ４の観察像を示す。図４Ｂ下段中は、図４Ｂ下段左と同じ観察領域の、免疫蛍光染色されたコラーゲンＩＶの観察像を示す。図４Ｂ下段右は、図４Ｂ下段左のＩｇＧ４の観察像と、図４Ｂ下段中のコラーゲンＩＶの観察像とを重ね合わせた像である。図４Ｂ下段右では、赤色のＩｇＧ４と、緑色のコラーゲンＩＶとが重複した部分が、黄色で示される。この結果から、ＩｇＧ４はコラーゲンＩＶと共に腺房の基部に存在することが分かる。【０１２１】
図４Ｃの各像は、ＡＩＰ患者の膵臓での病変のある小葉間隙を免疫蛍光染色した観察像を示す。図４Ｃの各像ではスケールバーは２０μｍを示す。【０１２２】
図４Ｃ左は、ＡＩＰ患者の膵臓での病変のある小葉間隙の、免疫蛍光染色されたＩｇＧ４の観察像を示す。図４Ｃ中は、図４Ｃ左と同じ観察領域の、免疫蛍光染色されたコラーゲンＩＶの観察像を示す。図４Ｃ右は、図４Ｃ左のＩｇＧ４の観察像と、図４Ｃ中のコラーゲンＩＶの観察像とを重ね合わせた像である。図４Ｃ右では、赤色のＩｇＧ４と、緑色のコラーゲンＩＶとが重複した部分が、黄色で示される。この結果から、ＩｇＧ４は、コラーゲンＩＶを発現する細胞外マトリクスに存在することが分かる。【０１２３】
データは示さないが、観察した全てのＡＩＰ患者からの膵臓組織が同様の傾向を示した。【０１２４】
一方、データは示さないが、健常者の膵臓及び慢性膵炎患者の膵臓ではＩｇＧ４は染色されなかった。
＜４．実験４：ＡＩＰ患者が有する抗体の、抗原の特定＞
上記実験１〜３から、ＡＩＰ患者では、膵臓組織での細胞外マトリクスに特異的に結合するＩｇＧ１及びＩｇＧ４が増加し、それが膵臓の病変を誘導していることが推定された。【０１２５】
そこで本発明者らは、ＡＩＰ患者の血清に含まれる抗体は、膵臓で発現している細胞外マトリクスタンパク質を抗原として認識していると推測した。本発明者らは、抗原を特定するために、文献から既知の、膵臓で発現している細胞外マトリクスタンパク質を、抗原候補として、個別に固相に固定し、ＡＩＰ患者の血清中に、前記細胞外マトリクスタンパク質に結合する抗体が含まれるか否かを、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法により確認した。ＥＬＩＳＡ法では、ＡＩＰ患者の血清中に含まれ得る、固相に固定された抗原候補と結合するヒトＩｇＧを一次抗体とし、ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）により標識されたウサギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体を二次抗体とした。
４．１．抗原の候補
抗原候補として、膵臓で発現している細胞外マトリクスタンパク質として既知の以下のタンパク質を試験した。【０１２６】
ヒトラミニン−５１１−Ｅ８（８９２０１２，株式会社ニッピ製）（ラミニン−５１１活性断片）
ヒトコラーゲンＩＶ（ａｂ７５３６，ａｂｃａｍ）
ヒトフィブロネクチン
ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）（ＭＢ−０７５２、ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）
ヒトＮｏｔｃｈ１（ａｂ６８５８０，ａｂｃａｍ）
ヒトＡｎｎｅｘｉｎ  Ａ２（ａｂ９３００５，ａｂｃａｍ）
ヒトＳＤＦ２Ｌ１（ＴＰ３１３１０２，ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）  ヒトＢｉｌｅ  ｓａｌｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｉｐａｓｅ（ａｂ１６７９６３、ａｂｃａｍ）
４．２．血清試料
ＡＩＰと診断された９名の患者から血清試料を取得した。【０１２７】
対照血清試料として、５名の健常者からの血清試料と、５名の疾患患者（３名の膵癌患者、２名の原発性硬化性胆管炎患者）からの血清試料を取得した。
４．３．手順
以下の試験では、特に明示しない場合は、ＥＬＩＳＡ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  Ｋｉｔ（Ｅ１０１，Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。【０１２８】
ＥＬＩＳＡ用コーティングバッファー（ＥＬＩＳＡ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）、ＥＬＩＳＡ用洗浄溶液（ＥＬＩＳＡ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ＥＬＩＳＡ用ブロッキングバッファー（ＥＬＩＳＡ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）、コンジュゲート希釈剤（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ）は全て前記キットの指示書に従い調製した。【０１２９】
全ての工程は室温で行った。
４．３．１．抗原候補によるコーティング
（１）上記の抗原候補の１つを前記キットのＥＬＩＳＡ用コーティングバッファーに希釈して２μｇ／ｍｌ濃度溶液とした。この溶液を、前記キットのマイクロウェルプレートに、１つのウェルあたり１００μｌとなるように加えた。【０１３０】
（２）上記のマイクロウェルプレートを６０分間インキュベートした。【０１３１】
（３）インキュベート後に各ウェルから溶液を吸引除去した。【０１３２】
（４）各ウェルを前記キットのＥＬＩＳＡ用洗浄溶液により洗浄した。具体的には、各ウェルに前記ＥＬＩＳＡ用洗浄溶液を満たし、次いで、前記ＥＬＩＳＡ用洗浄溶液を吸引除去する洗浄操作を３回行った。
４．３．２．ブロッキング
（１）前記キットのＥＬＩＳＡ用ブロッキングバッファー２００μｌを各ウェルに添加した。【０１３３】
（２）３０分間インキュベートした。【０１３４】
（３）インキュベート後、前記ＥＬＩＳＡ用ブロッキングバッファーを除去した後、各ウェルを３回洗浄した。
４．３．３．一次抗体
（１）前記ＡＩＰ患者血清試料（ｎ＝９）又は前記対照血清試料（ｎ＝１０）を、前記キットのコンジュゲート希釈剤（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ）により１：５０の割合で希釈した。【０１３５】
（２）前記希釈により得られた血清（一次抗体）希釈液を、ブロッキング後のマイクロウェルプレートの各ウェルに１００μｌ加えた。【０１３６】
（３）６０分間インキュベートした。【０１３７】
（４）インキュベート後、前記血清希釈液を除去し、各ウェルを３回洗浄した。
４．３．４．ＨＲＰコンジュゲート二次抗体
（１）ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）とコンジュゲートされた二次抗体（ａｂｃａｍ６７５９，ウサギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ），ポリクローナル）を、前記キットのコンジュゲート希釈剤（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ）により１：２０００の割合で希釈した。【０１３８】
（２）前記希釈により得られた二次抗体希釈液を、血清（一次抗体）を接触させたマイクロウェルプレートの各ウェルに１００μｌ加えた。【０１３９】
（３）６０分間インキュベートした。【０１４０】
（４）インキュベート後、前記二次抗体希釈液を除去し、各ウェルを５回洗浄した。
４．３．５．酵素基質反応
（１）製造元の推奨条件に従ってＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を調製した。【０１４１】
（２）前記ＴＭＢ溶液を、二次抗体を接触させたマイクロウェルプレートの各ウェルに１００μｌ加えた。【０１４２】
（３）５分間〜３０分間インキュベートし、ＨＲＰによるＴＭＢの酸化反応を行った。【０１４３】
（４）前記酸化反応後に、０．１８Ｍ  Ｈ２ＳＯ４１００μｌを、各ウェルに加えた。【０１４４】
（５）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの波長にて、前記酸化反応の生成物による呈色を測定した。
４．４．結果と考察
結果を図５Ａ（抗ヒトラミニン−５１１活性断片抗体）、図５Ｂ（抗ヒトコラーゲンＩＶ抗体）、図５Ｃ（抗ヒトフィブロネクチン抗体）、図５Ｄ（抗ＧＦＰ抗体）に示す。ヒトラミニン−５１１活性断片を抗原とした試験では、試験するＡＩＰ患者血清試料及び対照血清試料の母数を更に増やし、図５Ａに示すように、ＡＩＰ患者血清試料ではｎ＝４０、対照血清試料ではｎ＝４０とした。同様に、ヒトコラーゲンＩＶを抗原とした試験では、試験するＡＩＰ患者血清試料及び対照血清試料の母数を更に増やし、図５Ｂに示すように、ＡＩＰ患者血清試料ではｎ＝４０、対照血清試料ではｎ＝４０とした。【０１４５】
図５Ａ〜図５Ｄにおいて縦軸は、各抗原候補に対する抗体の血清中濃度に比例する４５０ｎｍでの吸光度の相対値を示す。カットオフ値は、前記対照血清試料の、各抗原候補に対する抗体の血清中濃度の平均値に、標準偏差（ＳＤ）の２倍の値を加えた値である。抗原候補に対する抗体の血清中濃度が、前記カットオフ値よりも高い場合に、抗原候補に対する抗体に関し陽性であると判断することができる。【０１４６】
図５Ａに示すように、抗ヒトラミニン−５１１抗体に関して、ＡＩＰ患者血清では４０例中２０例で陽性であったのに対し、対照血清では４０例中に陽性例はなかった。このことから、抗ヒトラミニン−５１１抗体の血清中濃度を指標として、ＡＩＰに罹患していることを検出できることが裏付けられた。また、抗ヒトラミニン−５１１抗体が陽性のＡＩＰ患者血清のうち１例では、血中ＩｇＧ濃度及び血中ＩｇＧ４濃度については、対照血清と実質的な差が無く正常値であったことから、抗ヒトラミニン−５１１抗体の血清中濃度を指標としてＡＩＰを判別する方法は、血中ＩｇＧ濃度及び血中ＩｇＧ４濃度を指標とする方法よりも高感度でＡＩＰを判別することができる可能性がある。【０１４７】
一方、図５Ｂ、５Ｃ及び５Ｄに示す結果から、抗ヒトコラーゲンＩＶ抗体、抗ヒトフィブロネクチン抗体、及び、抗ＧＦＰ抗体に関しては、ＡＩＰ患者血清と対照血清とで血清中濃度に差異は認められず、ＡＩＰの判別指標として有用でないことが判明した。【０１４８】
図示しないが、抗ヒトＮｏｔｃｈ１抗体、抗ヒトＡｎｎｅｘｉｎ  Ａ２抗体、抗ヒトＳＤＦ２Ｌ１抗体、抗ヒトＢｉｌｅ  ｓａｌｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｉｐａｓｅ抗体に関しても、ＡＩＰ患者血清と対照血清とで血清中濃度に明確な差異は認められなかった。
＜５．実験５：ラミニン−５１１によるマウスの免疫＞
上記の実験４の結果は、ヒトラミニン−５１１に対する抗体がＡＩＰの原因物質であると推定される。そこでこの推定を裏付けるべく、実験５では、ヒトラミニン−５１１によりマウスを免疫し、マウスの膵臓での病変の有無を確認した。
５．１．手順
８週齢の雄マウス（Ｂ６マウス、及び、ＢＡＬＢ／ｃマウス）を麻酔した。ＰＢＳと完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（２６３８１０，Ｄｉｆｃｏ製）との等量混合液１００μｌ中で乳化させた、１２０μｇのラミニン−５１１−Ｅ８（ヒトラミニン−５１１活性断片）（８９２０１２，株式会社ニッピ製）で、実験を開始した日（第０日）に、麻酔された前記マウスの両方の後足蹠に皮下投与により投与して免疫し、第２８日及び第５６日に、第０日の免疫に用いたのと同じ量の、ＣＦＡ中のラミニン−５１１−Ｅ８によりブーストを行った。【０１４９】
対照群では、同じ体積の、ＣＦＡにより乳化させた１２０μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）を、ラミニン−５１１−Ｅ８の前記乳化液に代えて用いる以外は同様の手順及びスケジュールでマウスを処理した。【０１５０】
３回目の免疫から２８日後に試験を終了した。試料血清は、最初の投与の前にマウスから採取した血液の血清（免疫前血清）と、屠殺後に採取した血液の血清である。試料血清は分析まで−８０℃に保存した。また、３回目の免疫から２８日後にマウスの膵臓の組織切片を採取し、Ｈ＆Ｅ染色により染色し観察した。【０１５１】
上記の操作を、ヒトラミニン−５１１活性断片を投与した試験群、及び、対照群のそれぞれについてｎ＝３となるよう実施した。
５．２．結果と考察
Ｈ＆Ｅ染色により染色した膵臓の組織切片の観察像を図６に示す。図６左が対照群の観察像、図６右がヒトラミニン−５１１活性断片（ｉ５１１ラミニン）により免疫した試験群の観察像である。ヒトラミニン−５１１活性断片により免疫した試験群のマウスでは膵臓に細胞浸潤の病変が形成されたのに対して、対照群のマウスでは膵臓に異常は見られなかった。ヒトラミニン−５１１活性断片により免疫した試験群のマウスでも、膵臓以外の部位には異常は見られなかった。図６に示す観察像を得たマウス個体以外のマウス個体においても、同様の傾向であった。
＜６．実験６：ＩｇＧ４関連腎疾患の患者が有する抗ラミニン抗体の分析＞
実験４に記載のＡＩＰ患者からの血清試料又は対照血清試料を用い、抗原候補としてヒトラミニン−５２１を用いて、実験４に記載の手順により抗ヒトラミニン−５２１抗体の血清中濃度を求めた。【０１５２】
ヒトラミニン−５２１としてＨｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｌａｍｉｎｉｎ  ５２１（ＢＬＡ−ＬＮ５２１−０２、Ｂｉｏ  Ｌａｍｉｎａ）を用いた。【０１５３】
結果を図７に示す。【０１５４】
９例のＡＩＰ患者のうち、ＩｇＧ４関連腎疾患を持つのは１例のみであった。この１例のＩｇＧ４関連腎疾患を持つＡＩＰ患者からの血清試料のみが、抗ヒトラミニン−５２１抗体を有意に高濃度で含んでいた。【０１５５】
この結果から、ＩｇＧ４関連腎疾患に関しては、抗ヒトラミニン−５２１抗体の血清中濃度が判別の指標として有効である可能性が示唆された。
＜７．実験７：ＩｇＧ４関連腎疾患患者ＩｇＧのマウスへの投与＞
実験６において抗ヒトラミニン−５２１抗体陽性であることが確認されたＩｇＧ４関連腎疾患患者の血清から、実験１と同様の手順でＩｇＧを調製した。このＩｇＧを「ＩｇＧ４関連腎疾患患者ＩｇＧ」とした。【０１５６】
一方、実験１で調製した対照ＩｇＧを用意した。【０１５７】
また、腎疾患を有していないＩｇＧ４関連疾患患者の血清から、実験１と同様の手順でＩｇＧを調製した。このＩｇＧを「腎疾患のないＩｇＧ４関連疾患患者ＩｇＧ」とした。【０１５８】
上記のＩｇＧ４関連腎疾患患者ＩｇＧ、対照ＩｇＧ、及び、腎疾患のないＩｇＧ４関連疾患患者ＩｇＧを、それぞれ、実験１と同様の手順でＢＡＬＢ／ｃマウスの雄の新生仔に皮下投与した。【０１５９】
投与から１２時間後に、実験１と同様の手順で、マウスの腎臓を採取し免疫組織化学的染色によりヒトＩｇＧ４を染色し観察した。【０１６０】
結果を図８に示す。【０１６１】
図８左側にＩｇＧ４関連腎疾患患者ＩｇＧを皮下投与したマウスの腎臓の観察像を示し、図８右側に対照ＩｇＧを皮下投与したマウスの腎臓のヒトＩｇＧ４染色観察像を示す。上段は、腎臓全体のヒトＩｇＧ４染色観察像を示し、下段は糸状体のヒトＩｇＧ４染色観察像を示す。図示しないが、腎疾患のないＩｇＧ４関連疾患患者ＩｇＧを皮下投与した場合の腎臓の観察像は、対照ＩｇＧと同様であった。【０１６２】
図８の結果から、ＩｇＧ４関連腎疾患患者ＩｇＧをマウスに投与した場合、腎臓の糸状体の間質にヒトＩｇＧ４が結合するのに対して、対照ＩｇＧをマウスに投与した場合にはそのような状態は生じないことが分かる。【０１６３】
一方、ラミニンβ２鎖の遺伝子異常によりＰｉｅｒｓｏｎ症候群が生じることが知られている。Ｐｉｅｒｓｏｎ症候群は、腎不全（メザンギウム増殖性糸状球腎炎）、神経障害（筋力低下）、縮瞳を含む。上記のＩｇＧ４関連腎疾患患者ＩｇＧを取得した、抗ヒトラミニン−５２１抗体陽性のＩｇＧ４関連腎疾患患者は、腎生検からメザンギウム増殖性糸状球腎炎であることが確認されており、筋力低下も確認されていることから、Ｐｉｅｒｓｏｎ症候群と症状、病理が合致する。従って、このＩｇＧ４関連腎疾患患者は、ラミニンβ２鎖に対する自己抗体を有しており、それが原因でＩｇＧ４関連腎疾患の症状が現れていると推測される。
＜８．実験８：ＡＩＰ患者の血清中の抗ラミニン５１１−Ｅ８自己抗体の測定＞
８．１．試料
ＩｇＧ４−ＲＤ  ２０１１の診断基準又はＡＩＰの診断基準を満たす５１名の治療中のＡＩＰ患者からの血清試料を取得した。２５名の健常者及び８６名の疾患患者（４９名の、組織学的に確認された癌患者、及び、３９名の、癌以外の疾患患者）から、対照の血清試料を取得した。ＡＩＰ患者５１名のうち１０名からの血清試料と、対照者１１２名のうち１０名からの血清試料をそれぞれトレーニング群として用い、残りをバリデーション群として用いた。全ての血清試料は−８０℃にて保存した。
８．２．ＥＬＩＳＡの手順
抗原の候補物質であるヒトラミニン５１１−Ｅ８として、ヒト由来リコンビナントラミニン−５１１−Ｅ８（８９２０１２，株式会社ニッピ製）を用いた。ラミニン５１１−Ｅ８は、ラミニンのα鎖、β鎖及びγ鎖のＣ末端領域がヘテロ三量体を形成した活性フラグメントであり、インテグリンへの結合能力を有する。ヒトラミニン−５１１−Ｅ８に対する血清抗体を、ＥＬＩＳＡ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  Ｋｉｔ（Ｅ１０１，Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を該キットの指示の通り用いるＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）により定量した。定量方法の概要は以下の通りである。【０１６４】
ヒトラミニン−５１１−Ｅ８を前記キットのＥＬＩＳＡ用コーティングバッファーに希釈して２μｇ／ｍｌ濃度溶液とし、この溶液を、前記キットのマイクロタイタープレートに、１つのウェルあたり１００μｌとなるように加え、室温で１時間インキュベートしてコーティングした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（洗浄液）で前記プレートを５回洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン含有Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水で前記プレートをコーティングし、１００μＬの、１：２０希釈血清で室温にて３０分間インキュベートした。前記洗浄液で５回洗浄した後、前記プレートを、１００μＬの、ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）とコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（１：４０００；ａｂ６７５９，Ａｂｃａｍ）と、室温にて１時間インキュベートした。前記洗浄液で３回洗浄した後、前記プレートをＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）により３分間インキュベートし、４５０ｎｍでの吸光度を測定して結合物量を定量した。ヒトラミニン−５１１−Ｅ８でコーティングしていない対照ウェルを、各血清試料についてのＥＬＩＳＡにおけるネガティブコントロールとして用いた。各アッセイはｎ＝３で行い、ヒトラミニン−５１１−Ｅ８でコーティングしたウェルでの吸光度の平均値から、対照ウェルでの吸光度の平均値を引いた値を、血清抗体のヒトラミニン−５１１−Ｅ８への特異的結合量、すなわち、血清中の抗ヒトラミニン−５１１−Ｅ８  ＩｇＧ抗体レベルとした。
８．３．結果
トレーニング群である１０名のＡＩＰ患者、及び、１０名の対照（膵臓癌患者３名、原発性硬化性胆管炎患者２名、健常者５名）からの血清試料の、抗ヒトラミニン−５１１−Ｅ８  ＩｇＧ抗体レベルの測定結果を図９Ａに示す。カットオフ値（光学密度単位［ＯＤ］）は、前記対照からの血清試料での抗ヒトラミニン−５１１−Ｅ８  ＩｇＧ抗体レベルの平均値に、標準偏差（ＳＤ）の３倍の値を加えた値である。１０名のＡＩＰ患者のうち６名からの血清試料が、ヒトラミニン−５１１−Ｅ８に対するＩｇＧ抗体が陽性であったのに対して、１０名の対照者の全員がヒトラミニン−５１１−Ｅ８に対するＩｇＧ抗体が陰性であった。【０１６５】
バリデーション群の４１名のＡＩＰ患者、及び、１０２名の対照（健常者２０名、ＡＩＰ以外の疾患患者８２名）からの血清試料の、抗ヒトラミニン−５１１−Ｅ８  ＩｇＧ抗体レベルの測定結果を図９Ｂに示す。カットオフ値（光学密度単位［ＯＤ］）は、前記対照からの血清試料での抗ヒトラミニン−５１１−Ｅ８  ＩｇＧ抗体レベルの平均値に、標準偏差（ＳＤ）の３倍の値を加えた値である。４１名のＡＩＰ患者のうち２０名からの血清試料が、抗ヒトラミニン−５１１−Ｅ８  ＩｇＧ抗体を有していた（陽性であった）のに対して、１０２名の対照者のうち２名のみが、抗ヒトラミニン−５１１−Ｅ８  ＩｇＧ抗体陽性であった。【０１６６】
上記のトレーニング群及びバリデーション群の測定結果をまとめると、ヒトラミニン−５１１−Ｅ８に対するＩｇＧ抗体陽性は、ＡＩＰ患者血清では２６／５１（５１．０％）であったのに対して、対照血清では２／１１２（１．８％）であった（Ｐ＜０．００１）。【０１６７】
５１名のＡＩＰ患者の血清試料の測定結果、及び、被験者の臨床像を下記の表４にまとめた。【０１６８】
【表４】
2018016607.tif 000006
【０１６９】
抗ヒトラミニン−５１１−Ｅ８抗体陽性のＡＩＰ患者では、陰性のＡＩＰ患者と比較して、悪性腫瘍及びアレルギー疾患の頻度が有意に低いことが判明した。【０１７０】
抗ヒトラミニン−５１１−Ｅ８抗体陽性のＡＩＰ患者２６名の全員が悪性腫瘍を合併していなかったのに対して、陰性のＡＩＰ患者２５名中８名が悪性腫瘍を合併していた。【０１７１】
抗ヒトラミニン−５１１−Ｅ８抗体陽性のＡＩＰ患者２６名中３名のみがアレルギー疾患を合併していたのに対して、陰性のＡＩＰ患者２５名中１２名がアレルギー疾患を合併していた。【０１７２】
また、造影ＣＴによる膵画像の比較から、抗ヒトラミニン−５１１−Ｅ８抗体陽性のＡＩＰ患者では、膵臓の頭部病変を示す患者の割合が、陰性のＡＩＰ患者と比較して有意に低いことが判明した。
＜９．実験９：抗ラミニン５１１−Ｅ８自己抗体陰性のＡＩＰ患者における抗インテグリン自己抗体の測定＞
膵臓においてラミニン５１１は、インテグリンα６β１又はインテグリンα３β１と結合することが知られている。本発明者らは、ＡＩＰ患者では、インテグリンα６β１又はインテグリンα３β１も自己抗原となるという仮説を立てた。
９．１．試料
実験８と同じ、５１名のＡＩＰ患者及び１１２名の対照からの血清試料を用いた。
９．２．ＥＬＩＳＡ
抗原候補物質としてインテグリンα６β１又はインテグリンα３β１を用いた以外は、実験８と同じ手順で、ＥＬＩＳＡにより、血清試料中の抗インテグリンα６β１抗体及び抗インテグリンα３β１抗体を定量した。【０１７３】
インテグリンα６β１として、リコンビナントヒトインテグリンα６β１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州、製品番号７８０９−Ａ６）を用いた。【０１７４】
インテグリンα３β１として、リコンビナントヒトインテグリンα３β１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州、製品番号２８４０−Ａ３）を用いた。
９．３．結果
２６名の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陽性ＡＩＰ患者、２５名の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陰性ＡＩＰ患者、及び、１１２名の対照からの血清試料での、抗インテグリンα６β１  ＩｇＧ抗体レベルの測定結果を図１０に、抗インテグリンα３β１  ＩｇＧ抗体レベルの測定結果を図１１に、それぞれ示す。カットオフ値（光学密度単位［ＯＤ］）は、前記対照からの血清試料での抗インテグリンα６β１  ＩｇＧ抗体レベル又は抗インテグリンα３β１  ＩｇＧ抗体レベルの平均値に、標準偏差（ＳＤ）の３倍の値を加えた値である。【０１７５】
図１０に示す通り、２６名の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陽性ＡＩＰ患者、及び、１１２名の対照は、全員が、抗インテグリンα６β１  ＩｇＧ抗体陰性であった。２５名の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陰性ＡＩＰ患者のうち４名が、抗インテグリンα６β１  ＩｇＧ抗体陽性であった。【０１７６】
図１１に示す通り、５１名のＡＩＰ患者及び１１２名の対照は、全て、抗インテグリンα３β１  ＩｇＧ抗体陰性であった。【０１７７】
以上の結果は、ラミニン５１１に加えてインテグリンα６β１が、一部のＡＩＰ患者において自己抗原であることを示す。このことは、ラミニン５１１とインテグリンα６β１との結合が、ＡＩＰでの自己抗体の標的であることを示唆する。【０１７８】
５１名のＡＩＰ患者を、２６名の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陽性ＡＩＰ患者（抗インテグリンα６β１抗体は陰性）と、４名の抗インテグリンα６β１抗体陽性ＡＩＰ患者（抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体は陰性）と、２１名の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陰性抗インテグリンα６β１抗体陰性ＡＩＰ患者に分類し、各群のＡＩＰ患者の臨床像を下記の表５にまとめた。なお、抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体と抗インテグリンα６β１抗体が両方とも陽性の被験者はいなかった。【０１７９】
【表５】
2018016607.tif 000007
【０１８０】
２６名の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陽性ＡＩＰ患者は、悪性腫瘍を合併している者が皆無であった。一方、４名の抗インテグリンα６β１抗体陰性ＡＩＰ患者のうち２名（５０％）が悪性腫瘍を合併していた。また、２１名の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陰性抗インテグリンα６β１抗体陰性ＡＩＰ患者のうち６名（２９％）が悪性腫瘍を合併していた。このことから、ＡＩＰ患者において、血清中の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体レベル及び抗インテグリンα６β１抗体レベルを指標として、悪性腫瘍の発症の可能性を予測することが可能である。例えば、抗インテグリンα６β１抗体陽性のＡＩＰ患者は、悪性腫瘍を合併する可能性が高いため、全身をスクリーニングする必要性が高いと言える。
＜１０．実験１０：膵画像の比較＞
図１２上段は、抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陽性ＡＩＰ患者の造影ＣＴによる膵画像である。図１２下段は、抗インテグリンα６β１抗体陽性ＡＩＰ患者の造影ＣＴによる膵画像である。各画像中の矢印は病変箇所を指す。【０１８１】
図１２上段に示すように、抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陽性ＡＩＰ患者の膵画像では、膵臓の体部及び尾部に病変が認められた。図１２下段に示すように、抗インテグリンα６β１抗体陽性ＡＩＰ患者の膵画像では、膵臓の体部に病変が認められ、これは膵癌患者の膵画像と類似しており、抗インテグリンα６β１抗体陰性ＡＩＰ患者４７例では同様の膵画像は皆無であった。
＜１１．実験１１：抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体力価の治療による低減＞
１１．１．手順
実験８で抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陽性であった２６名のＡＩＰ患者のうち５名について、ステロイドを用いたＡＩＰ治療の前後での、血清中の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体レベルを調べた。抗体レベルの測定は実験８と同様の方法で行った。【０１８２】
各患者はＡＩＰと診断された後、ステロイドの１種であるプレドニゾンの経口投与による治療を６〜８カ月間にわたり受けた。
１１．２．結果
５名の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体陽性ＡＩＰ患者の、ステロイド治療前後での、血清中の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体レベルを図１３に示す。ステロイド治療により各ＡＩＰ患者の血清中の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体力価はカットオフ値未満に低減された。また、図示しないが、各ＡＩＰ患者の血清中の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体力価の低減に伴い膵画像所見も改善した。このことは、血清中の抗ラミニン５１１−Ｅ８抗体は、ＡＩＰ治療の効果の指標としても有用であることを裏付ける。【０１８３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１Ａ】
2018016607.tif 000008
【図１Ｂ】
2018016607.tif 000009
【図１Ｃ】
2018016607.tif 000010
【図２Ａ】
2018016607.tif 000011
【図２Ｂ】
2018016607.tif 000012
【図３Ａ】
2018016607.tif 000013
【図３Ｂ】
2018016607.tif 000014
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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