【手続補正書】
【提出日】平成31年3月4日(2019.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、機能的なヒト組織をin vitroで作製する方法：
胚様体又はオルガノイドを組織構築物に埋め込む工程であって、前記組織構築物が第一の血管ネットワーク及び第二の血管ネットワークを含み、各血管ネットワークが1つ以上の相互接続血管チャネルを含む、前記埋め込み工程；
当該胚様体又はオルガノイドを、1つ以上の生物学的因子、生物学的因子勾配、圧、及び/又は酸素分圧勾配に暴露し、それによっては胚様体又はオルガノイドへ向かう及び/又は胚様体又はオルガノイドから出る毛細血管の脈管形成を誘導する工程；及び
当該胚様体又はオルガノイドが血管を新生し、当該毛細血管が第一の血管ネットワークを第二の血管ネットワークに接続し、それによって単一の血管ネットワーク及び灌流可能組織構造を作製する工程。
【請求項２】
1つ以上の生物学的因子が以下の1つ以上を含む、請求項1に記載の方法：
増殖因子、モルフォゲン、小分子、薬剤、ホルモン、DNA、shRNA、siRNA、ナノ粒子、mRNA、修飾mRNA。
【請求項３】
さらに、血管形成、脈管形成又は細管形成の少なくとも1つを含むことができる機械的製造プロセス又は生物学的発生プロセスによって1つ以上の相互接続血管チャネルを形成することを含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
1つ以上の生物学的因子、生物学的因子勾配、圧、及び/又は酸素分圧勾配がさらに胚様体又はオルガノイドの発生、分化、及び/又は機能発揮を指令する、請求項1−3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
第一の血管ネットワーク及び第二の血管ネットワークを別個に対処することができる、または、第一の血管ネットワーク及び第二の血管ネットワークが互いに接触しない、請求項1−4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
第一の血管ネットワークが動脈叢を含み、第二の血管ネットワークが静脈叢を含む、請求項1−5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
単一の血管ネットワークが、相互貫入血管ネットワーク及び/又は分枝した相互貫入血管ネットワークを含む、または、相互接続動脈及び静脈チャネルを含む、請求項1−６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
さらに、
多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株又は初代細胞の少なくとも1つを培養すること、または、
多能性若しくは多分化能性幹細胞を培養すること、
の少なくとも１つによって胚様体又はオルガノイドを作製する工程,
を含み、
前記培養が、ハンギングドロップ法、マイクロウェル内凝集、又はスピンニングバイオリアクターの使用によって低接着基質上で行われる、請求項1−7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
埋め込み前、埋め込み中及び/又は埋め込み後に、胚葉体又はオルガノイドをさらに、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株又は初代細胞の少なくとも1つを含む組織に分化させる、請求項1−8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
胚様体又はオルガノイドが、大脳オルガノイド、甲状腺オルガノイド、腸管又は消化管オルガノイド、肝オルガノイド、膵オルガノイド、胃オルガノイド、腎オルガノイド、網膜オルガノイド、心オルガノイド、骨オルガノイド、及び上皮オルガノイドから成る群から選択される、請求項1−9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
胚様体又はオルガノイドが、1つ以上の生物学的因子に暴露されるか、及び/又は以下による生物学的因子勾配に暴露される、請求項1−10のいずれか1項に記載の方法：
組織構築物内の1つ以上の生物学的因子の拡散、
組織構築物内での1つ以上の生物学的因子を積載した素材の局所的沈積、
局所的タンパク質翻訳による増殖因子の局所的de-novo生成、または、
１つ以上の生物学的因子による第一及び第二の血管ネットワークの一方又は両方の灌流。
【請求項１２】
第一及び第二の血管ネットワークの一方だけが1つ以上の生物学的因子を灌流させ、請求項1−11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
第一及び第二の血管ネットワークの両方が1つ以上の生物学的因子を灌流させ、第一の血管ネットワークの生物学的因子濃度が第二の血管ネットワークの生物学的因子濃度と相違する、または、
第一及び第二の血管ネットワークの両方が1つ以上の生物学的因子を灌流させ、第一の血管ネットワークの生物学的因子濃度が、第二の血管ネットワークの生物学的因子濃度と同じであり、
前記生物学的因子が、以下の増殖因子：血管内皮増殖因子（VEGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、スフィンゴシン1リン酸（S1P）、ホルボールミリステートアセテート（PMA）、肝細胞増殖因子（HGF）、単球走化性タンパク質1（MCP-1）、アンギオポイエチンANG-1、アンギオポイエチンANG-2、形質転換増殖因子ベータ（TGF-β）、表皮増殖因子（EGF）、ヒト成長因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）、及びヒスタミン、の1つ以上を含む、
請求項1−11のいずれか1項に記載の方法：。
【請求項１４】
酸素分圧勾配が、灌流中に第一及び第二の血管ネットワークの一方又は両方に導入される、または、酸素分圧勾配が、脱酸素媒体を第一及び第二の血管ネットワークの一方に導入し、さらに第一及び第二の血管ネットワークの他方に含酸素媒体を導入することによって形成される、請求項1−13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
灌流が約1マクロリットル/分から約1リットル/分の流速で実施される、請求項11−14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
第一及び第二の血管ネットワークの一方又は両方が灌流中に経壁圧を受ける、請求項11−15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
胚様体又はオルガノイドが、当該胚様体又はオルガノイドを組織構築物に埋め込む前に細胞外マトリックス素材中に被包化され、前記細胞外マトリックス素材がゲルを含む、請求項1−16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
胚様体又はオルガノイドが、
胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団及び胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団、または、
多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株、神経細胞、初代細胞又は前記の組み合わせの少なくとも2つ、
を含む、請求項1−17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
胚様体又はオルガノイドが、大脳オルガノイド、甲状腺オルガノイド、腸管又は消化管オルガノイド、肝オルガノイド、膵オルガノイド、胃オルガノイド、腎オルガノイド、網膜オルガノイド、心オルガノイド、骨オルガノイド、及び上皮オルガノイドから成る群から選択される、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
野生型細胞集団及び遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団を培地中で培養する工程；
遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団の胚葉体又はオルガノイド細胞の第一の集団への直進的分化及び/又はトランス分化を誘導する工程；
野生型細胞集団の胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団への分化を誘導する工程；及びそれによって少なくとも胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団及び胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団を含む胚様体又はオルガノイドを形成する工程、
によって胚様体又はオルガノイドを作製する工程、をさらに含み、
さらに構成的プロモーター、小分子誘導性プロモーター、細胞自律性プロモーター、細胞非自律性プロモーター、選別マーカー又は前記の組み合わせの少なくとも1つを含むDNAデリバリーエレメントを導入することによって前記遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団を作製すること、を含み、
前記胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団が、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、不死化細胞株又は初代細胞を含み、
前記胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団が神経前駆細胞を含み、
前記神経前駆細胞が、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、運動ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、痛覚受容体ニューロン、星状細胞、乏突起神経膠細胞前駆細胞、乏突起神経乏突起膠細胞の少なくとも1つを形成し、
前記遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団の直進的分化及び/又はトランス分化を誘導する工程が、転写因子、薬剤、小分子、増殖因子、モルフォゲン、ホルモン、DNA、shRNA、siRNA、ナノ粒子、mRNA、修飾mRNA、熱、光、及び機械的力から成る群から選択される少なくとも1つのキューを導入する工程を含み、
前記誘導される直進的分化及び/又はトランス分化が二次遺伝子誘導を伴い、
前記二次遺伝子誘導が、転写因子、薬剤、小分子、増殖因子、モルフォゲン、ホルモン、DNA、shRNA、siRNA、ナノ粒子、mRNA、修飾mRNA、熱、光、及び機械的力から成る群から選択される少なくとも1つのキューの提供を介し、
前記二次遺伝子誘導のために選択されるキューが、遺伝的に操作された誘導可能な細胞の集団の直進的分化及び/又はトランス分化を誘導する工程のために選択されるキューと同じである、
請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団が、二次遺伝子の誘導のために更なる発生を経る、請求項20に記載の方法であって、前記二次遺伝子の誘導が構成的に活性なPKCタンパク質の発現を誘導し、それによって胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団のスプラウト行動及び神経突起伸長の少なくとも1つを強化し、胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団が内皮細胞である、前記方法。
【請求項２２】
培養工程が、ハンギングドロップ法を介して、マイクロウェル内凝集を介して、又はスピンニングバイオリアクターの使用によって低接着基質上で行われる、請求項20−21のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
胚様体又はオルガノイド細胞の第一の集団対胚様体又はオルガノイド細胞の第二の集団の比が1：1である、請求項20−22のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
培養工程が分化培地で行われ、前記分化培地がドキシサイクリン（DOX）を含む、請求項20−23のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
さらに、血管形成、脈管形成又は細管形成の少なくとも1つを含むことができる機械的製造プロセス又生物学的発生プロセスによって1つ以上の相互接続血管チャネルを形成することを含む、請求項1−24のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
1つ以上の生物学的因子、生物学的因子勾配、圧、及び/又は酸素分圧勾配が、さらに当該胚様体又はオルガノイドの発生、分化、及び/又は機能発揮を指令する、請求項1−25のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
野生型細胞集団が、人工多能性幹細胞（iPSC）又はiPSCから誘導される特許固有の細胞株を含む、請求項20−26のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
胚様体又はオルガノイドを組織構築物へ埋め込む工程が
1つ以上の細胞搭載フィラメントを基質上に沈積させて1つ以上の組織パターンを形成する工程であって、前記フィラメントの各々は複数の生存細胞を含み、当該組織パターンの各々が1つ以上の予め定められた細胞タイプを含む、前記工程；
1つ以上のサクリファイスフィラメントを当該基質上に沈積させて、当該1つ以上の組織パターンに相互貫入する血管パターンを形成する工程であって、当該サクリファイスフィラメントの各々が一過性インクを含む、前記工程；
当該血管パターン内に胚様体又はオルガノイドを沈積させる工程；
当該1つ以上の組織パターン及び血管パターンを細胞外マトリックス組成物で少なくとも部分的に取り囲む工程；及び
当該一過性インクを除去し、それによって埋め込まれた胚様体又はオルガノイドを含む組織構築物を形成する工程、
を含み、
前記1つ以上の細胞搭載フィラメントの少なくとも一部が1つ以上の生物学的因子を含み、
前記第一及び第二の血管ネットワークの一方又は両方が微細流チャネルを含む、
請求項1−27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
複数の胚様体又はオルガノイドが組織構築物に埋め込まれる、請求項28に記載の方法であって、
前記胚様体又はオルガノイドが異なる表現型を含む、または、
胚様体又はオルガノイドが同じ表現型を含む、
前記方法。
【請求項３０】
さらに組織構築物のアレイを含み、埋め込み、暴露及び血管新生が各組織構築物で実施される、請求項1−29のいずれか1項に記載の方法。