(57)【要約】３ＨＨ単位をより高い組成比率で含有する共重合ＰＨＡを生産する形質転換体、及び、当該形質転換体を用いた共重合ＰＨＡの製造方法を提供する。３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する原核微生物に対し、トランス−２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性と（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が導入されてなる、３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを生産する形質転換体。当該形質転換体を培養する工程を含む、３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する原核微生物に対し、トランス−２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性と（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が導入されてなる、３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを生産する形質転換体。
【請求項２】
さらに、クロトニル−ＣｏＡ還元酵素（ＣＣＲ）をコードする遺伝子が導入されてなる請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
さらに、エチルマロニル−ＣｏＡ脱炭酸酵素をコードする遺伝子が導入されてなる請求項２に記載の形質転換体。
【請求項４】
前記トランス−２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性と（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、ヤロウィア・リポリティカに由来する遺伝子である請求項１〜３いずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項５】
前記トランス−２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性と（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、ドロソフィラ・メラノガスターに由来する遺伝子である請求項１〜３いずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項６】
前記原核微生物がバクテリアである請求項１〜５いずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項７】
前記原核微生物がカプリアビダス属に属するバクテリアである請求項１〜６いずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項８】
前記原核微生物がカプリアビダス・ネカトールである請求項１〜７いずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか１項に記載の形質転換体を培養する工程を含む、３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡの製造方法。
【請求項１０】
前記共重合ＰＨＡがＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である請求項９に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを生産する形質転換体、及び、当該ＰＨＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと記すこともある）は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機ポリマーである。ＰＨＡは生分解性を有する熱可塑性高分子であり、再生可能資源を原料として産生することができる。これらのことから、ＰＨＡを環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている。【０００３】
現在までに、数多くの微生物がエネルギー貯蔵物質としてＰＨＡを菌体内に蓄積することが知られている。ＰＨＡの代表例としては、３−ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢと記すこともある）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と記すこともある）が挙げられる。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に分解されることから、環境に優しいプラスチックとして注目されている。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いために硬くて脆い性質を持っており、実用的には応用範囲が限られている。応用範囲を広げるためには、Ｐ（３ＨＢ）に柔軟性を付与することが必要であった。【０００４】
そこで、３ＨＢと３−ヒドロキシ吉草酸（以下、３ＨＶと記す）とからなる共重合ＰＨＡ（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）と記す）とその製造方法が開発された（例えば特許文献１及び特許文献２を参照）。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は、Ｐ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際にはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）中の３ＨＶモル分率を増加させてもそれに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルムやシート、軟質系包装容器等へ加工するために要求される程には柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取手等、硬質成型体の限られた分野にしか利用されていない。【０００５】
さらにＰＨＡの柔軟性を高めるために、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと記すこともある）からなる共重合ＰＨＡ（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と記すこともある）及びその製造方法について研究が行われている（特許文献３及び特許文献４を参照）。これらの報告においてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）の野生株を用い、オレイン酸、パルミチン酸等の脂肪酸を炭素源として発酵生産されている。【０００６】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の物性に関する研究も行われている（非特許文献１を参照）。この報告では、炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてＡ．ｃａｖｉａｅを培養して、様々な３ＨＨ組成比を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成比の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の様な硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、３ＨＨ組成比がより高くなるとＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。すなわち、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成比を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで応用可能な幅広い物性を持たせることができるため、幅広い分野への応用が期待できる。【０００７】
また、カプリアビダス・ネカトール（Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ）を宿主とし、プラスミドｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ  ３７５３３）にポリエステル合成酵素遺伝子やＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子等を導入したｐＪＲＤＥＥ３２やｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３等のＰＨＡ合成酵素発現プラスミドによって形質転換された形質転換体のＰＨＡ生産性が調べられている（特許文献５及び非特許文献２を参照）。該菌株の培養後の菌体量はもともと４ｇ／Ｌと低かったが、植物油脂を炭素源とした同菌株の培養条件の改善により菌体量は４５ｇ／Ｌ、ポリマー含量は６２．５％までポリマー生産性が向上し、また、３ＨＨ組成比は８．１ｍｏｌ％まで向上することが分かった。このように、培養条件によってＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成比やポリマー生産性を改善する試みがなされている（特許文献６を参照）。【０００８】
Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒの染色体ＤＮＡに組み込むことで３ＨＨ組成比を向上させた報告もなされている（特許文献７及び非特許文献３を参照）。この報告では、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒのｐｈａ合成酵素遺伝子を含むｐｈａオペロン領域にＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を複数挿入することで、植物油脂を原料として生産されるＰＨＢＨの３ＨＨ組成比を１０．５ｍｏｌ％まで向上させている。【０００９】
これらのようにＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産は植物油脂を原料として行われる例が多い。一方で、糖質原料からＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する研究も行われている（非特許文献４を参照）。この報告では、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒに、ストレプトマイセス・シンナモネンシス由来のクロトニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子を導入することで、フルクトースを原料として、少量の３ＨＨ単位を含むＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産している。【００１０】
また近年、クロトニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子に加えて、エチルマロニル−ＣｏＡ脱炭酸酵素遺伝子を導入することで、３ＨＨ組成比が向上することが報告されている（非特許文献５を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開昭５７−１５０３９３号公報
【特許文献２】特開昭５９−２２０１９２号公報
【特許文献３】特開平５−９３０４９号公報
【特許文献４】特開平７−２６５０６５号公報
【特許文献５】特開平１０−１０８６８２号公報
【特許文献６】特開２００１−３４００７８号公報
【特許文献７】国際公開第２０１１／１０５３７９号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｙ．Ｄｏｉ，Ｓ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２８，ｐｐ．４８２２−４８２３（１９９５）
【非特許文献２】Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７９，１５，ｐｐ．４８２１−４８３０（１９９７）
【非特許文献３】Ｙ．Ｋａｗａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７８，ｐｐ．４９３−５０２（２０１２）
【非特許文献４】Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３，ｐｐ．６１８−６２４（２００２）
【非特許文献５】Ｃ．Ｉｎｓｏｍｐｈｕｎ，Ｈ．Ｘｉｅ，Ｊ．Ｍｉｆｕｎｅ，Ｙ．Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．Ｏｒｉｔａ，Ｓ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２７，ｐｐ．３８−４５（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、３ＨＨ単位をより高い組成比率で含有する共重合ＰＨＡを生産する形質転換体、及び、当該形質転換体を用いた共重合ＰＨＡの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、原核生物は通常保持しておらず、真核生物のみが保持するトランス−２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性と（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性の両方を有する酵素をコードする遺伝子を、３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する原核微生物に導入することで、３ＨＨ単位をより高い組成比率で含有する共重合ＰＨＡの発酵生産が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１５】
すなわち、本発明は、３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する原核微生物に対し、トランス−２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性と（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が導入されてなる、３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを生産する形質転換体に関する。【００１６】
前記形質転換体は、さらに、クロトニル−ＣｏＡ還元酵素（ＣＣＲ）をコードする遺伝子が導入されてなることが好ましく、また、さらに、エチルマロニル−ＣｏＡ脱炭酸酵素をコードする遺伝子が導入されてなることが好ましい。【００１７】
前記トランス−２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性と（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子は、ヤロウィア・リポリティカに由来する遺伝子、または、ドロソフィラ・メラノガスターに由来する遺伝子であることが好ましい。【００１８】
前記原核微生物は、バクテリアであることが好ましく、カプリアビダス属に属するバクテリアであることがより好ましく、カプリアビダス・ネカトールであることがさらに好ましい。【００１９】
第二の本発明は、前記形質転換体を培養する工程を含む、３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡの製造方法に関する。前記共重合ＰＨＡはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、３ＨＨ単位をより高い組成比率で含有する共重合ＰＨＡを生産する形質転換体を提供することができる。また、当該形質転換体を培養することで、３ＨＨ単位をより高い組成比率で含有する共重合ＰＨＡを発酵生産することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。
【００２２】
１．３ＨＨ単位含有共重合ＰＨＡを生産する形質転換体
本発明では、３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する原核微生物に対し、トランス−２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性と（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を導入することによって、３ＨＨ単位をより高い組成比率で含有する共重合ＰＨＡを生産する形質転換体を提供する。
【００２３】
本発明において、前記酵素をコードする遺伝子が導入される元株となる原核微生物は、３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する原核微生物である限り特に限定されない。このような原核微生物としては、前記ＰＨＡ合成酵素遺伝子を本来的に有する野生株だけではなく、そのような野生株を人工的に突然変異処理して得られる変異株や、遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子及び／又はＰＨＡ生産関連酵素遺伝子が導入された組み換え原核微生物株であってもよい。
【００２４】
ＰＨＡ合成酵素遺伝子が３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを合成可能であるとは、あらゆる培養条件で３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを合成可能であることを意味するものではなく、特定の培養条件で３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを合成できるものであれば足りる。例えば、後述する比較例２に記載の菌株は、グルコースを単一炭素源とする培養条件では、３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを合成しないが、炭素源として油脂を含む培養条件では、３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを合成できるので、「３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する原核微生物」に該当する。
【００２５】
そのような原核微生物として、具体的には、細菌、放線菌、藍藻、古細菌などが例示され、好ましくは、細菌（バクテリア）である。当該細菌としては、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する細菌が好ましい例として挙げられる。安全性及び生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、アエロモナス属、ワウテルシア属に属する細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス属又はアエロモナス属に属する細菌であり、さらにより好ましくはカプリアビダス属に属する細菌であり、特に好ましくはカプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）である。
【００２６】
３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する原核微生物が、遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された組み換え原核微生物株である場合、前記外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子としては、３ＨＨを取り込んで、３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡを生産する機能を有する遺伝子である限り特に限定されない。そのようなＰＨＡ合成酵素遺伝子としては、例えば、配列番号１に記載するアミノ酸配列を有する酵素をコードする、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子、又は、該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つ、３ＨＨ単位含有共重合ＰＨＡ合成活性を有するポリペプチドをコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。なお、上記配列同一性は好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。これらの中でも、３ＨＨ単位含有共重合ＰＨＡとしてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子が好ましく、なかでも、例えば配列番号２に記載するアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子がより好ましい。
【００２７】
本発明において、元株となる原核微生物としては、カプリアビダス・ネカトールにアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入されてなる組み換え原核微生物株が最も好適である。
【００２８】
本発明では、上記原核微生物に、トランス−２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性と（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子（以下、導入遺伝子と略記する場合がある）を導入する。
【００２９】
前記導入遺伝子は、通常、原核生物が保持しておらず、真核生物に由来する遺伝子である。従って、本発明では、真核生物に由来する遺伝子を原核微生物に導入する。当該導入遺伝子を、前記ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する原核微生物に導入することにより得られる形質転換体は、３ＨＨ単位をより高い組成比率で含有する共重合ＰＨＡを生産できるようになる。
【００３０】
通常、原核微生物内のβ酸化はトランス−２−エノイル−ＣｏＡから（Ｓ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを経由する反応であり、このβ酸化の経路では、３ＨＨ単位含有共重合ＰＨＡのモノマーとなるＲ体の３ＨＨモノマーが生成しない。しかし、本発明により前記導入遺伝子を原核微生物に導入することで、油脂を炭素源とする場合において、原核微生物内で、トランス−２−エノイル−ＣｏＡから（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを経由する代謝経路が構築され、この経路により炭素数６の（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡが合成されるようになるため、その結果、Ｒ体の３ＨＨモノマーが生成し、最終合成物の共重合ＰＨＡにおける３ＨＨ単位の組成比率が高まるものと推測される。
【００３１】
一方、糖を炭素源とする培養において３ＨＨ単位含有共重合ＰＨＡを生産しようとする場合は、通常のβ酸化とは逆向きの反応で、炭素数２のアセチル−ＣｏＡから、炭素数６の（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを合成する必要があると考えられる。この場合においても、前記導入遺伝子を原核微生物に導入することによって、（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを経由する代謝経路が構築されることで、Ｒ体の３ＨＨモノマーが効率的に生成し、最終合成物の共重合ＰＨＡにおける３ＨＨ単位の組成比率が高まるものと推測される。
【００３２】
前記導入遺伝子としては、トランス−２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性と（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子である限り特に限定されないが、通常、酵素ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｙｐｅ  ２（ＭＦＥ−２）をコードするＭＦＥ２遺伝子として知られている遺伝子が挙げられる。具体例として、ヤロウィア・リポリティカに由来するＭＦＥ２遺伝子（通称ＭＦＥ−１遺伝子）、ドロソフィラ・メラノガスター等に由来するＭＦＥ２遺伝子、サッカロマイセス・セレビシエに由来するＭＦＥ２遺伝子（通称ＦＯＸ２遺伝子）等が挙げられる。
【００３３】
前記導入遺伝子は真核生物に由来する遺伝子であるため、一般的にイントロンと呼ばれる非翻訳領域を含む場合がある。このような場合、イントロンにあたる塩基配列を除去した状態の導入遺伝子を原核微生物に導入してもよい。また、前記導入遺伝子中のコドンは宿主に応じて適宜改変してもよい。
【００３４】
前記導入遺伝子としては、ＭＦＥ−２をコードするＭＦＥ２遺伝子が好ましい。具体的には、例えば、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードするヤロウィア・リポリティカ由来のＭＦＥ２遺伝子や、配列番号４で示されるアミノ酸配列をコードするドロソフィラ・メラノガスター由来のＭＦＥ２遺伝子、又はこれらのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、且つトランス−２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性と（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチドをコードする遺伝子等が挙げられる。なお、上記配列同一性はより好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上である
また、非特許文献５において、３ＨＨモノマーを取り込み可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入したカプリアビダス・ネカトールに、クロトニル−ＣｏＡ還元酵素（ＣＣＲ）遺伝子及びエチルマロニル−ＣｏＡ脱炭酸酵素（ＥＭＤ）遺伝子を導入することで、糖を炭素源としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産できることが報告されている。本発明の形質転換体においても、前記導入遺伝子に加えて、ＣＣＲ遺伝子及び／又はＥＭＤ遺伝子が導入されていても良い。ＣＣＲ遺伝子及び／又はＥＭＤ遺伝子の導入により、糖を炭素源とする場合において、上述した炭素数６の（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの合成経路が強化又は効率化され、生産される共重合ＰＨＡにおける３ＨＨ単位の組成比率が向上することになる。
【００３５】
本願明細書におけるＣＣＲとは、脂肪酸β−酸化経路の中間体である炭素数４のクロトニル−ＣｏＡを還元し、ブチリル−ＣｏＡを生成する酵素である。本発明において使用され得るＣＣＲ遺伝子の由来は、翻訳後の該還元酵素が上記のクロトニル−ＣｏＡ還元酵素活性を有する限り特に限定されないが、例えば、放線菌Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ由来のクロトニル−ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１７８６７３）や、メタノール資化性菌Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ由来のクロトニル−ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：７９９０２０８）等が挙げられる。好ましくは配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するクロトニル−ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、且つクロトニル−ＣｏＡ還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする遺伝子である。
【００３６】
本願明細書におけるＥＭＤとは、クロトニル−ＣｏＡ還元酵素やプロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼなどによる副反応で生じたエチルマロニル−ＣｏＡのブチリル−ＣｏＡへの脱炭酸反応を触媒する酵素を意味する。この活性を有する限りにおいては、ＥＭＤの由来は特に限定されないが、例えば、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するマウス由来のエチルマロニル−ＣｏＡ脱炭酸酵素が挙げられる。該アミノ酸配列をコードする遺伝子塩基配列としては、例えば、配列番号７に記載の塩基配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３７】
上記導入遺伝子が導入された原核微生物のグルコース資化能が低い、あるいはグルコース資化能を持たない場合、遺伝子変異、遺伝子破壊、遺伝子発現の強化、外来遺伝子の導入等の方法によって、本発明の形質転換体にグルコース資化能を付与または強化することができる。例えば、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株はグルコース取り込み系の遺伝子を持たないため、グルコースを資化することができない。Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株にグルコース資化能を付与する方法としては特に限定されないが、一例として、Ｎ−アセチルグルコサミンの取り込み遺伝子であるｎａｇＥの７９３番目の塩基であるＧをＣに置換し、さらに転写制御因子をコードする遺伝子であるｎａｇＲを破壊することで、グルコース資化能を付与する方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ.１１３，６３（２０１２））が挙げられる。また、グルコーストランスポーターをコードする外来遺伝子を導入することで、グルコース資化能を付与する方法（特開２００９−２２５６６２号公報）も挙げられる。さらに、グルコースリン酸化酵素遺伝子を導入する方法が有効な場合もある。
【００３８】
本発明の形質転換体において、導入された前記導入遺伝子又はその他の遺伝子は、宿主となる原核微生物が保有する染色体、プラスミド、メガプラスミドなどのＤＮＡ上に存在しても良いし、プラスミドベクター上や人工染色体上など人為的に形質転換体内に組み込まれたＤＮＡ上に存在しても良い。しかし、導入された遺伝子の保持という観点から、原核微生物が保有する染色体あるいはメガプラスミド上に存在するのが好ましく、原核微生物が保有する染色体上に存在するのがより好ましい。また、宿主となる原核微生物がこれらの遺伝子を元々保有している場合には、導入に代えて、元々保有する遺伝子の上流の塩基配列を置換、欠失または付加すること等により、遺伝子の発現量を増加させてもよい。
【００３９】
微生物が保有するＤＮＡ上に任意のＤＮＡを部位特異的に置換又は挿入する方法は当業者に周知であり、本発明の形質転換体を製造する際に使用できる。特に限定されないが、代表的な方法としては、トランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ｏｈｍａｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１６２：ｐ．１０６８（１９８５））、相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Ｎｏｔｉ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．１５４，ｐ．１９７（１９８７））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース添加培地耐性株として容易に単離する方法（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．６，ｐ．１１９５（１９９２）；Ｌｅｎｚ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１７６，ｐ．４３８５（１９９４））等が挙げられる。また、細胞へのベクターの導入方法としても特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
【００４０】
なお、遺伝子クローニングや遺伝子組み換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９又は２００１）などに記載される技術を利用することができる。
【００４１】
上記の各種遺伝子を発現させるためのプロモーターは特に限定されない。カプリアビダス・ネカトールのｐｈａＣ１遺伝子のプロモーター、ｐｈａＰ１遺伝子のプロモーター、大腸菌に由来するｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｉｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、あるいは人工的に作成された配列番号８で示される塩基配列を有するＰｏｅ１プロモーター等が使用可能である。
【００４２】
２．ＰＨＡの製造方法
本発明の形質転換体を培養することで、ＰＨＡを生産させ、得られたＰＨＡを回収することでＰＨＡを製造することができる。
【００４３】
本発明によるＰＨＡの生産においては、炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地において、前記形質転換体を培養することが好ましい。
【００４４】
炭素源としては、本発明の形質転換体が資化可能であればどんな炭素源でも使用可能であるが、好ましくは、グルコース、フルクトース、スクロースなどの糖類；パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類；ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体等が挙げられる。
【００４５】
窒素源としては、例えば、アンモニア；塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。そのほかの有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
【００４６】
本発明の形質転換体を培養する際の、培養温度、培養時間、培養時ｐＨ、培地等の条件は、宿主の原核微生物、例えばラルストニア属、カプリアビダス属、ワウテルシア属、アエロモナス属、エシェリキア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属等の細菌類の培養で通常使用されるような条件でよい。
【００４７】
本発明において生産されるＰＨＡの種類としては、３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡであれば特に限定されないが、炭素数４〜１６の２−ヒドロキシアルカン酸、３−ヒドロキシアルカン酸（３ＨＨを除く）および４−ヒドロキシアルカン酸から選択される１種以上のモノマーと３ＨＨとを重合して得られる共重合ＰＨＡが好ましく、より好ましくは、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸との共重合体であるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である。なお、生産されるＰＨＡの種類は、目的に応じて、使用する原核微生物の保有するあるいは別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。
【００４８】
本発明において、形質転換体を培養した後、菌体からのＰＨＡの回収は、特に限定されないが、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収する。
【００４９】
得られたＰＨＡの重量平均分子量（Ｍｗ）や３ＨＨ等のモノマー組成（ｍｏｌ％）の分析は、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィーやガスクロマトグラフ法、核磁気共鳴法等により行うことができる。
【実施例】
【００５０】
以下に実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。【００５１】
以下の製造例、実施例、及び比較例で使用されるＫＮＫ００５株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上にアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子（配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子）が導入された形質転換体である。また、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株は、ＫＮＫ００５株において、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ１，２，６遺伝子が欠失した形質転換体である。これらの形質転換体は、米国特許第７３８４７６６号明細書および国際公開第２０１４／０６５２５３号に記載の方法に準じて作成することができる。【００５２】
（製造例１）ＭＦＥ２ｙｌ発現用プラスミドの作製
この製造例では、ＭＦＥ２ｙｌ発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。【００５３】
合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ヤロウィア・リポリティカに由来するＭＦＥ２（ＭＦＥ２ｙｌ）遺伝子配列を有するＤＮＡ断片（配列番号９）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、国際公開２００７／０４９７１６号に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結して、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＭＦＥ２ｙｌを得た。【００５４】
さらに、合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｔｒｃプロモーターを有するＤＮＡ断片（配列番号１０）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＭｕｎＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＭＦＥ２ｙｌをＭｕｎＩで切断したものと連結した。得られたプラスミドベクターから、ＭＦＥ２ｙｌ配列がｔｒｃプロモーター配列の下流側に位置する向きでｔｒｃプロモーター配列が連結されたプラスミドベクターを選別し、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌとした。【００５５】
（実施例１）ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌ／ＫＮＫ００５株の作製
この実施例では、製造例１で得たプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌをＫＮＫ００５株に導入して、形質転換体ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌ／ＫＮＫ００５株を得た。【００５６】
プラスミドベクターの細胞への導入は以下のように電気導入によって行った。遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現ベクター２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、生育してきた形質転換体ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌ／ＫＮＫ００５株を取得した。【００５７】
（製造例２）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／Ｚ２，Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株の作製
まず、染色体置換用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。【００５８】
合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｎａｇＥ遺伝子の一部の配列を含むＤＮＡ断片（配列番号１１）を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基より上流および下流の塩基配列を有し、且つｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基がＧからＣに置換された塩基配列を含む染色体置換用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｎａｇＥＧ７９３Ｃを作製した。【００５９】
次に、染色体置換用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｎａｇＥＧ７９３Ｃを用いて、以下のようにして染色体置換株ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ株の作製を行った。【００６０】
染色体置換用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｎａｇＥＧ７９３Ｃで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、得た形質転換体を、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。【００６１】
得られた培養液を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＤＮＡシーケンサーによる解析により染色体上のｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換された菌株１株を単離した。この変異導入株をＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ株と命名した。得られたＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、さらにｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換された株である。【００６２】
さらに、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。【００６３】
合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｎａｇＲ構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１２）を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｎａｇＲ構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｎａｇＲＵＤを作製した。【００６４】
次に、遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｎａｇＲＵＤを用いて、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ株を親株として、上記と同様の方法で、遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株の作製を行った。【００６５】
ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、さらにｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。【００６６】
さらに、染色体導入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株のｐｈａＺ２遺伝子の上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１３）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ２ＵＤＭＳを得た。次に、人工遺伝子合成および合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ｐｏｅ１プロモーター、ＣＣＲ遺伝子、及びＥＭＤ遺伝子を有するＤＮＡ断片（配列番号１４）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化したｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ２ＵＤＭＳとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、染色体導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ２：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄを得た。【００６７】
さらに、染色体導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ２：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄを用いて、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株を親株として、上記と同様の方法で、遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／Ｚ２：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株の作製を行った。【００６８】
ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／Ｚ２：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、さらにｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらに染色体上にＣＣＲ遺伝子およびＥＭＤ遺伝子が１コピーずつ導入された株である。【００６９】
さらに、合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株のｐｈａＺ６遺伝子の上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１５）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ６ＵＤＭＳを得た。次に、上記のＰｏｅ１プロモーター、ＣＣＲ遺伝子、及びＥＭＤ遺伝子を有するＤＮＡ断片（配列番号１４）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化したベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ６ＵＤＭＳとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、染色体導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄを得た。【００７０】
さらに、染色体導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄを用いて、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／Ｚ２：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株を親株として、上記と同様の方法で、遺伝子導入株ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／Ｚ２，Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株の作製を行った。【００７１】
ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／Ｚ２，Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらに染色体上にＣＣＲ遺伝子およびＥＭＤ遺伝子が２コピーずつ導入された株である。【００７２】
（実施例２）ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌ／ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／Ｚ２，Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株の作製
製造例１で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌを、実施例１に記載の電気導入によって、製造例２に記載のＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／Ｚ２，Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株に導入し、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌ／ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／Ｚ２，Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株を取得した。【００７３】
（製造例３）ＫＮＫ１４３Ｓ／Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株の作製
まず、特開２０１３−９６２７号公報に記載の染色体導入用プラスミドベクターｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いて、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株を親株として、製造例２に記載の方法でプロモーターおよびＳＤ配列挿入株ＡＣＰ−ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株の作製を行った。【００７４】
ＡＣＰ−ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｂｋｔＢ（βケトチオラーゼ）遺伝子の開始コドン直前にＡ．ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株である。【００７５】
次に、国際公開第２０１５／１１５６１９号に記載のプロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂを用いて、ＡＣＰ−ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株を親株として、製造例２に記載の方法でプロモーターおよびＳＤ配列挿入株ＡＣＰ−ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ株の作製を行った。【００７６】
ＡＣＰ−ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にＡ．ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、さらにｐｈａＪ４ｂ遺伝子の開始コドン直前にｔｒｃプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株である。【００７７】
さらに、特開２００８−２９２１８号公報に記載の染色体置換用ベクターｐＢｌｕｅＡＳＲＵを用いて、ＡＣＰ−ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ株を親株として、製造例２に記載の方法でＫＮＫ１４４Ｓ株を作製した。【００７８】
ＫＮＫ１４４Ｓ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にＡ．ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の開始コドン直前にｔｒｃプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、さらにｐｈａＡ構造遺伝子配列中に終止コドンと制限酵素ＮｈｅＩ切断部位が生成した株である。【００７９】
次に、プロモーター、リボソーム結合配列及び遺伝子挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。【００８０】
人工遺伝子合成および合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、リボソーム結合配列、ＣＣＲ遺伝子、及びＥＭＤ遺伝子を含む、配列番号１６で示される塩基配列が導入されたＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ２ＵＤＭＳをＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結し、プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ２Ｕ−ｃｃｒ−ｅｍｄ−Ｚ２Ｄを得た。【００８１】
次に、合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｔｒｃプロモーターを有するＤＮＡ断片（配列番号１７）を得た。このＤＮＡ断片を、ＭｕｎＩで消化し、上記のプラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ２Ｕ−ｃｃｒ−ｅｍｄ−Ｚ２ＤをＭｕｎＩで切断したものと連結した。得られたプラスミドの中から、ｃｃｒおよびｅｍｄがｔｒｃプロモーター配列の下流側に位置する向きでｔｒｃプロモーター配列が連結されたプラスミドをＰＣＲによって選別し、プロモーター、リボソーム結合配列及び遺伝子挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ２Ｕ−ｔｒｃ−ｃｃｒ−ｅｍｄ−Ｚ２Ｄを得た。【００８２】
次に、プロモーター、リボソーム結合配列及び遺伝子挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ２Ｕ−ｔｒｃ−ｃｃｒ−ｅｍｄ−Ｚ２Ｄを用いて、ＫＮＫ１４４Ｓ株を親株として、製造例２に記載の方法で、ＫＮＫ１４３Ｓ株を作製した。【００８３】
ＫＮＫ１４３Ｓ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にＡ．ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の開始コドン直前にｔｒｃプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、ｐｈａＡ構造遺伝子配列中に終止コドンと制限酵素ＮｈｅＩ切断部位が生成し、さらに元々はｐｈａＺ２遺伝子があった位置にｔｒｃプロモーター、リボソーム結合配列、ＣＣＲ遺伝子及びＥＭＤ遺伝子が挿入された株である。【００８４】
さらに、製造例２に記載の染色体導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄを用いて、ＫＮＫ１４３Ｓ株を親株として、製造例２と同様の方法で、遺伝子導入株ＫＮＫ１４３Ｓ／Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株の作製を行った。【００８５】
ＫＮＫ１４３Ｓ／Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にＡ．ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の開始コドン直前にｔｒｃプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、ｐｈａＡ構造遺伝子配列中に終止コドンと制限酵素ＮｈｅＩ切断部位が生成し、さらに染色体上にＣＣＲ遺伝子およびＥＭＤ遺伝子が２コピーずつ導入された株である。【００８６】
（実施例３）ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌ／ＫＮＫ１４３Ｓ／Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株の作製
製造例１で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌを、実施例１に記載の電気導入によって、製造例３に記載のＫＮＫ１４３Ｓ／Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株に導入し、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌ／ＫＮＫ１４３Ｓ／Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株を取得した。【００８７】
（比較例１）ＫＮＫ００５株によるＰＨＡ生産
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％  Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％  Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％  Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４とした。【００８８】
ＰＨＡ生産に使用した生産培地の組成は１．１ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、０．１３ｗ／ｖ％  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）とした。炭素源は、パーム核油を１．５ｗ／ｖ％となるように培地に添加した。【００８９】
ＫＮＫ００５株のグリセロールストック（５０μＬ）を種母培地（５ｍＬ）に接種して培養温度３０℃で２４時間振とう培養し、得られた培養液を種母とした。【００９０】
ＰＨＡ生産培養は、５０ｍＬの生産培地を入れた坂口フラスコに前記種母を１．０ｖ／ｖ％接種し、培養温度３０℃で振とう培養を行った。７２時間培養後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。【００９１】
ＰＨＡ生産量は以下のように算出した。得られた乾燥菌体１ｇあたり１００ｍＬのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が１／３になるまで濃縮後、濃縮液量の３倍量のヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、ＰＨＡ生産量を算出した。結果を表１に示した。【００９２】
生産されたＰＨＡの３ＨＨ組成比率は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥ＰＨＡの約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することでＰＨＡ分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のＰＨＡ分解物のモノマー単位組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μｌを注入した。温度条件は、初発温度１００〜２００℃まで８℃／分の速度で昇温し、さらに２００〜２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、得られたＰＨＡの３ＨＨ組成比率を表１に示した。【００９３】
本比較例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ単位を２．９ｍｏｌ％含有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。【００９４】
（実施例４）ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌ／ＫＮＫ００５株によるＰＨＡ生産
種母培地の組成は比較例１に記載のものと同様とした。種母培地でプラスミドベクター導入株を培養する場合には、カナマイシンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように種母培地に添加した。【００９５】
ＰＨＡ生産に使用した生産培地の組成および炭素源は比較例１に記載のものと同様とした。【００９６】
実施例１で作製したｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌ／ＫＮＫ００５株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【００９７】
本実施例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が６．３ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。すなわち、ＭＦＥ２遺伝子の導入により、比較例１で生産された共重合ＰＨＡよりも多くの３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡが生産された。【００９８】
（比較例２）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／Ｚ２，Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株によるＰＨＡ生産
種母培地の組成は比較例１に記載のものと同様とした。ＰＨＡ生産に使用した生産培地の組成は比較例１に記載のものと同様とし、炭素源としてはパーム核油ではなく、４０ｗ／ｖ％グルコース水溶液を単一炭素源として用い、グルコースが２．０ｗ／ｖ％となるように生産培地に添加した。【００９９】
製造例２で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／Ｚ２，Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１００】
本比較例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ単位を含有せず、ＰＨＢであった。【０１０１】
（実施例５）ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌ／ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／Ｚ２，Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株によるＰＨＡ生産
種母培地の組成は比較例１に記載のものと同様とした。種母培地でプラスミドベクター導入株を培養する場合には、カナマイシンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように種母培地に添加した。【０１０２】
ＰＨＡ生産に使用した生産培地の組成は比較例１に記載のものと同様とし、炭素源としてはパーム核油ではなく、４０ｗ／ｖ％グルコース水溶液を単一炭素源として用い、グルコースが２．０ｗ／ｖ％となるように生産培地に添加した。【０１０３】
実施例２で作製したｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌ／ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／Ｚ２，Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１０４】
本実施例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ単位を１．４ｍｏｌ％含有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。比較例２では３ＨＨ単位を含有しない単独重合ＰＨＡが生産されたのに対し、本実施例では、ＭＦＥ２遺伝子の導入により、３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡが生産された。【０１０５】
（比較例３）ＫＮＫ１４３Ｓ／Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株によるＰＨＡ生産
種母培地の組成は比較例１に記載のものと同様とした。ＰＨＡ生産に使用した生産培地の組成は比較例１に記載のものと同様とし、炭素源としてはパーム核油ではなく、４０ｗ／ｖ％グルコース水溶液を単一炭素源として用い、グルコースが２．０ｗ／ｖ％となるように生産培地に添加した。【０１０６】
製造例３で作製したＫＮＫ１４３Ｓ／Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１０７】
本比較例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ単位を１．１ｍｏｌ％含有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。【０１０８】
（実施例６）ｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌ／ＫＮＫ１４３Ｓ／Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株によるＰＨＡ生産
種母培地の組成は比較例１に記載のものと同様とした。ＰＨＡ生産に使用した生産培地の組成は比較例１に記載のものと同様とし、炭素源としてはパーム核油ではなく、４０ｗ／ｖ％グルコース水溶液を単一炭素源として用い、グルコースが２．０ｗ／ｖ％となるように生産培地に添加した。【０１０９】
実施例３で作製したｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ＭＦＥ２ｙｌ／ＫＮＫ１４３Ｓ／Ｚ６：：Ｐｏｅ１−ｃｃｒ−ｅｍｄ株を比較例１と同様の方法で培養し、ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１１０】
本実施例で生産されたＰＨＡは、３ＨＨ単位を４．７ｍｏｌ％含有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。すなわち、ＭＦＥ２遺伝子の導入により、比較例３で生産された共重合ＰＨＡよりも多くの３ＨＨ単位を含有する共重合ＰＨＡが生産された。【０１１１】
【表１】
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【配列表】
2018021046000001.app
【国際調査報告】
2018021046.tif 000003
2018021046.tif 000004
2018021046.tif 000005
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