(57)【要約】本発明は、プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）を活性化することができるＰＩＭＴ活性化用組成物、皮膚の復元又は修復活性を評価するための新しい指標及び皮膚の抗老化活性を評価するための新しい指標、並びに、この指標を用いた皮膚の復元又は修復活性の評価方法及び皮膚の抗老化活性の評価方法等の提供を目的とする。本発明のプロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）活性化用組成物は、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物を含む、プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）活性化用組成物。
【請求項２】
皮膚に存在するＰＩＭＴ活性化用組成物である、請求項１に記載のＰＩＭＴ活性化用組成物。
【請求項３】
前記植物の抽出物が、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ホップ、ラベンダー、セージ、エンメイソウ、ユズ、シソ、ショウブ、アルニカ及びモモからなる群より選択される１種以上の植物の抽出物である請求項１又は２に記載のＰＩＭＴ活性化用組成物。
【請求項４】
前記植物の抽出物が、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ラベンダー、セージ及びエンメイソウからなる群より選択される１種以上の植物の抽出物である請求項１〜３のいずれに記載のＰＩＭＴ活性化用組成物。
【請求項５】
皮膚外用剤である請求項１〜４のいずれかに記載のＰＩＭＴ活性化用組成物。
【請求項６】
化粧料である請求項１〜５のいずれかに記載のＰＩＭＴ活性化用組成物。
【請求項７】
飲食品である請求項１〜４のいずれかに記載のＰＩＭＴ活性化用組成物。
【請求項８】
カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物を含む、異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物。
【請求項９】
皮膚における異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物である、請求項８に記載のタンパク質の復元又は修復促進用組成物。
【請求項１０】
前記植物の抽出物が、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ホップ、ラベンダー、セージ、エンメイソウ、ユズ、シソ、ショウブ、アルニカ及びモモからなる群より選択される１種以上の植物の抽出物である請求項８又は９に記載のタンパク質の復元又は修復促進用組成物。
【請求項１１】
前記植物の抽出物が、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ラベンダー、セージ及びエンメイソウからなる群より選択される１種以上の植物の抽出物である請求項８〜１０のいずれかに記載のタンパク質の復元又は修復促進用組成物。
【請求項１２】
皮膚外用剤である請求項８〜１１のいずれかに記載のタンパク質の復元又は修復促進用組成物。
【請求項１３】
化粧料である請求項８〜１２のいずれかに記載のタンパク質の復元又は修復促進用組成物。
【請求項１４】
飲食品である請求項８〜１１のいずれかに記載のタンパク質の復元又は修復促進用組成物。
【請求項１５】
カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物を動物に適用する、プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）の活性化方法。
【請求項１６】
カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物を動物に適用する、異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進方法。
【請求項１７】
ヒトの皮膚に存在するプロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）を活性化する、皮膚における異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進方法。
【請求項１８】
皮膚細胞におけるプロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）の発現量又は活性を指標とする、皮膚の復元又は修復活性の評価方法。
【請求項１９】
前記皮膚細胞が、表皮細胞及び／又は真皮細胞である請求項１８に記載の評価方法。
【請求項２０】
前記皮膚の復元又は修復活性が、紫外線及び／又は加齢による皮膚の老化に対する皮膚の復元又は修復活性である請求項１８又は１９に記載の評価方法。
【請求項２１】
皮膚細胞におけるプロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）の発現量又は活性を指標とする、皮膚の抗老化活性の評価方法。
【請求項２２】
前記抗老化活性が、紫外線及び／又は加齢による皮膚の老化に対する抗老化活性である請求項２１に記載の評価方法。
【請求項２３】
皮膚細胞におけるプロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）の発現量又は活性を指標とする、皮膚に存在するＰＩＭＴの活性化、皮膚の復元若しくは修復促進、又は、皮膚の抗老化のための有効成分のスクリーニング方法。
【請求項２４】
前記皮膚細胞に被験物質を接触させて、前記皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を測定する工程、及び、
前記被験物質を接触させた皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性が、前記被験物質を接触させなかった皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性と比較して大きい場合に、前記被験物質を有効成分として選択する工程を含む請求項２３に記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
前記皮膚細胞が、培養皮膚細胞である請求項２３又は２４に記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
皮膚細胞におけるプロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）の発現量又は活性の、皮膚の復元若しくは修復活性又は皮膚の抗老化活性の指標としての使用。
【請求項２７】
プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）を活性化するための、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物の使用。
【請求項２８】
異性化したアミノ酸を含むタンパク質を復元又は修復促進するための、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）活性化用組成物に関する。本発明はまた、異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物に関する。本発明はさらに、ＰＩＭＴの活性化方法、及び、異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進方法に関する。本発明はまた、皮膚の復元又は修復活性の評価方法、皮膚の抗老化活性の評価方法、及び、皮膚に存在するＰＩＭＴの活性化等のための有効成分のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚を健康で若々しい状態に保つことは、多くの人にとって関心の高い問題である。しかしながら、加齢に伴う皮膚の諸機能の低下等の内的要因と、紫外線曝露等の外的要因とによって、シワ、たるみ、ハリ不足、くすみ、皮膚の粗さ等の皮膚の老化現象が引き起こされる。特に、外的要因である紫外線による皮膚ダメージは蓄積性であり、加齢による皮膚老化の進行を加速させる、老化をより深刻な状態にするなど、皮膚に大きな影響を及ぼす。【０００３】
タンパク質中のＬ型のアスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）残基、アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）残基は異性化を起こしやすく、その結果Ｄ型のアスパラギン酸（Ｄ−Ａｓｐ）残基や、Ｄ型又はＬ型のイソアスパラギン酸（Ｄ−又はＬ−ｉｓｏＡｓｐ）残基が生じることが知られている。このタンパク質中のアミノ酸の異性化によりタンパク質の機能が損なわれ、アルツハイマー病等の疾患発症や、様々な老化現象の要因となる可能性が示唆されている。非特許文献１には、高齢者の皮膚、眼の水晶体、骨、歯等の組織からＤ−Ａｓｐが検出されること、皮膚組織では紫外線露光部からＤ−Ａｓｐが検出されることが記載されている。【０００４】
動物の脳組織、赤血球細胞等で、プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ−ｉｓｏａｓｐａｒｔｙｌ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が見出されている。ＰＩＭＴは、Ｌ−ｉｓｏＡｓｐの遊離のα−カルボキシル基又はＤ−Ａｓｐの遊離のβ−カルボキシル基を特異的に認識し、補酵素であるＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）からのメチル基転移反応を触媒する酵素であり、タンパク質中のＬ−ｉｓｏＡｓｐ及びＤ−Ａｓｐから、Ｌ−Ａｓｐへの変換を促進する。ＰＩＭＴノックアウトマウスでは、脳、心臓、肝臓及び赤血球に異性化アスパラギン酸残基含有タンパク質が増加することが報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Fujii N. Biol Pharm Bull 28(9): 1585-1589 (2005)
【非特許文献２】Kim E.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 94, 6132-6137 (1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
加齢及び紫外線曝露により体内でＤ−Ａｓｐ、Ｌ−ｉｓｏＡｓｐ（Ｌ−β−Ａｓｐ）等の異性化したアスパラギン酸（異性化Ａｓｐ）を含むタンパク質（異性化タンパク質）が増加すること、該アミノ酸の異性化によりタンパク質の立体構造が変化し、本来の機能が損なわれることから、タンパク質中のアミノ酸の異性化が皮膚等の老化とも関連することが考えられる。例えば、皮膚タンパク質中の異性化したアミノ酸残基から通常のＬ−アミノ酸への変換を促進することができれば、該異性化により変性したタンパク質の機能を回復させることができ、ひいては、該異性化により損なわれた皮膚の諸機能等を回復させることができると考えられる。【０００７】
しかしながら、皮膚における異性化タンパク質の修復機構は明らかにされていない。また、皮膚において該異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復を促進する作用を有する物質も報告されていない。【０００８】
本発明は、プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）を活性化することができる、ＰＩＭＴ活性化用組成物を提供することを目的とする。【０００９】
本発明の他の目的は、皮膚の復元又は修復活性を評価するための新しい指標及び皮膚の抗老化活性を評価するための新しい指標、並びに、この指標を用いた、皮膚の復元又は修復活性の評価方法、及び、皮膚の抗老化活性の評価方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究したところ、ヒトの皮膚の細胞において異性化タンパク質の復元又は修復を促進する酵素であるプロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（以下、ＰＩＭＴともいう）が発現し、皮膚での異性化タンパク質修復機構に寄与していることを明らかにした。皮膚の細胞にＰＩＭＴが発現していることは、本発明者により初めて見いだされた知見である。また本発明者は、皮膚由来のタンパク質に紫外線を照射すると、該タンパク質中のＡｓｐの異性化が誘導され、異性化タンパク質が増加することも見出した。さらに本発明者は、加齢、紫外線曝露等の要因により皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現が低下することを見出した。これらの知見から、加齢、紫外線等の皮膚老化をもたらす要因により皮膚におけるＰＩＭＴの活性が低下することを明らかにし、皮膚に存在するＰＩＭＴを活性化することにより、アミノ酸の異性化により変性した皮膚タンパク質の復元又は修復を促進することができることに想到した。これらの知見に基づき、ＰＩＭＴの活性を高める物質について研究を行い、特定の植物の抽出物が、該ＰＩＭＴの活性化に有効であることを見出した。【００１１】
本発明者はまた、皮膚におけるＰＩＭＴの発現量又はその活性を指標として、皮膚の復元又は修復活性、及び、皮膚の抗老化活性を評価できることに想到した。さらに、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を指標とすることにより、皮膚に存在するＰＩＭＴ活性化、皮膚の復元又は修復、及び、皮膚の抗老化に有効な物質をスクリーニングできることに想到した。【００１２】
すなわち本発明は、以下のＰＩＭＴ活性化用組成物、皮膚の復元又は修復活性の評価方法などを包含する。
本発明のプロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）活性化用組成物は、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物を含む。
上記植物の抽出物は、ＰＩＭＴを活性化する作用を有する。
本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物は、皮膚に存在するＰＩＭＴ活性化用組成物であることが好ましい。上記植物の抽出物は、皮膚に存在する（皮膚中の）ＰＩＭＴ活性化のために有用である。
上記植物の抽出物は、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ホップ、ラベンダー、セージ、エンメイソウ、ユズ、シソ、ショウブ、アルニカ及びモモからなる群より選択される１種以上の植物の抽出物であることが好ましい。これらの植物の抽出物は、ＰＩＭＴを活性化する作用が高いため好ましい。ＰＩＭＴを活性化する作用が特に高いことから、上記植物の抽出物は、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ラベンダー、セージ及びエンメイソウからなる群より選択される１種以上の植物の抽出物であることがより好ましい。【００１３】
本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物は、皮膚外用剤であることが好ましく、化粧料であることがより好ましい。また、本発明における別の好ましい態様の一例として、ＰＩＭＴ活性化用組成物が飲食品であることも好ましい。【００１４】
本発明の異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物は、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物を含む。
本発明の異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物は、皮膚における異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物であることが好ましい。
上記植物の抽出物としては、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ホップ、ラベンダー、セージ、エンメイソウ、ユズ、シソ、ショウブ、アルニカ及びモモからなる群より選択される１種以上の植物の抽出物が好ましく、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ラベンダー、セージ及びエンメイソウからなる群より選択される１種以上の植物の抽出物がより好ましい。これらの植物の抽出物は、ＰＩＭＴを活性化する作用が高いことから、異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進作用が高い。
本発明のタンパク質の復元又は修復促進用組成物は、皮膚外用剤であることが好ましく、化粧料であることがより好ましい。
また、本発明における別の好ましい態様の一例として、本発明のタンパク質の復元又は修復促進用組成物が飲食品であることも好ましい。【００１５】
本発明は、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物を動物に適用する、プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）の活性化方法も包含する。【００１６】
本発明は、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物を動物に適用する、異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進方法も包含する。【００１７】
本発明は、ヒトの皮膚に存在するプロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）を活性化する、皮膚における異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進方法も包含する。【００１８】
本発明の皮膚の復元又は修復活性の評価方法は、皮膚細胞におけるプロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）の発現量又は活性を指標とする。
本発明の皮膚の復元又は修復活性の評価方法においては、上記皮膚細胞が、表皮細胞及び／又は真皮細胞であることが好ましい。
上記皮膚の復元又は修復活性として、紫外線及び／又は加齢による皮膚の老化に対する皮膚の復元又は修復活性が挙げられる。本発明の評価方法は、紫外線及び／又は加齢によるアミノ酸の異性化に対する皮膚の復元又は修復活性を評価するために好適に使用される。【００１９】
本発明の皮膚の抗老化活性の評価方法は、皮膚細胞におけるプロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）の発現量又は活性を指標とする。
本発明の皮膚の抗老化活性の評価方法においては、上記抗老化活性が、紫外線及び／又は加齢による皮膚の老化に対する抗老化活性であることが好ましい。本発明の皮膚の抗老化活性の評価方法は、紫外線及び／又は加齢による皮膚の老化に対する抗老化活性を評価するために好適に使用される。【００２０】
本発明は、皮膚細胞におけるプロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）の発現量又は活性を指標とする、皮膚に存在するＰＩＭＴの活性化、皮膚の復元若しくは修復促進、又は、皮膚の抗老化のための有効成分のスクリーニング方法も包含する。
本発明のスクリーニング方法は、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を指標とすることにより、皮膚に存在するＰＩＭＴの活性化作用を有する物質、皮膚の復元若しくは修復促進作用を有する物質、又は、皮膚の抗老化作用を有する物質をスクリーニングすることができる。【００２１】
本発明のスクリーニング方法は、上記皮膚細胞に被験物質を接触させて、上記皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を測定する工程、及び、
上記被験物質を接触させた皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性が、上記被験物質を接触させなかった皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性と比較して大きい場合に、上記被験物質を有効成分として選択する工程を含むことが好ましい。
上記皮膚細胞は、培養皮膚細胞であることが好ましい。【００２２】
皮膚細胞におけるプロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）の発現量又は活性の、皮膚の復元若しくは修復活性又は皮膚の抗老化活性の指標としての使用も本発明の１つである。皮膚におけるＰＩＭＴの発現量又は活性は、皮膚の復元又は修復活性の指標、及び、皮膚の抗老化活性の指標として有用である。【００２３】
本発明は、以下の使用も包含する。
プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）を活性化するための、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物の使用。
異性化したアミノ酸を含むタンパク質を復元又は修復促進するための、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物の使用。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、ＰＩＭＴを活性化することができる、ＰＩＭＴ活性化用組成物を提供することができる。本発明により皮膚に存在するＰＩＭＴを活性化することにより、皮膚において異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復を促進することができる。【００２５】
また、本発明によれば、皮膚の復元又は修復活性を評価するための新しい指標、及び、皮膚の抗老化活性を評価するための新しい指標を提供することができる。本発明によれば、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を指標として、皮膚の復元又は修復活性を評価することができる方法、皮膚の抗老化活性を評価することができる方法を提供することができる。本発明により、皮膚の復元若しくは修復活性、又は、皮膚の抗老化活性を客観的に評価することが可能となり、皮膚の老化に関連する症状等に対する適切な処置を選択することにも寄与し得る。また、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を指標として用いることにより、皮膚に存在するＰＩＭＴの活性化作用を有する物質、皮膚の復元又は修復促進作用を有する物質及び皮膚の抗老化作用を有する物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、皮膚細胞におけるＰＩＭＴ発現量を示すグラフである。
【図２】図２は、紫外線Ｂ波（ＵＶＢ）照射によるタンパク質量あたりのＳＡＨ生成量を示すグラフである。
【図３】図３は、継代数の異なる皮膚線維芽細胞におけるＰＩＭＴ発現量を示すグラフである。
【図４】図４は、ストレス負荷による皮膚線維芽細胞のＰＩＭＴ発現量の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書中、異性化したアミノ酸（異性化アミノ酸ともいう）とは、Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）やＬ−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）が異性化して生成するＬ−アスパラギン酸の異性体（異性化アスパラギン酸）を意味する。
異性化アスパラギン酸（異性化Ａｓｐ）とは、より具体的には、Ｄ−アスパラギン酸（Ｄ−Ａｓｐ）、Ｄ型又はＬ型のイソアスパラギン酸（Ｄ−又はＬ−ｉｓｏＡｓｐ）であり、好ましくはＤ−Ａｓｐ、Ｌ−ｉｓｏＡｓｐである。Ｄ−ｉｓｏＡｓｐ及びＬ−ｉｓｏＡｓｐは、それぞれＤ−β−Ａｓｐ及びＬ−β−Ａｓｐとも呼ばれる。
【００２８】
本明細書において、アミノ酸の異性化とは、Ｌ−Ａｓｐ又はＬ−Ａｓｎが異性化アスパラギン酸になることをいう。異性化したアミノ酸（アミノ酸残基）を含むタンパク質を、異性化タンパク質ともいう。異性化タンパク質中の異性化アミノ酸（異性化アミノ酸残基）は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。
【００２９】
タンパク質中のアミノ酸が異性化すると、該タンパク質の立体構造が変化し、本来の機能が損なわれる。このため異性化タンパク質は、アミノ酸の異性化により変性したタンパク質ともいえる。このタンパク質中のアミノ酸の異性化は、様々な老化現象等と関連していると考えられている。異性化タンパク質中の異性化アミノ酸をＬ−Ａｓｐに変換（復元又は修復）することにより、異性化により変性したタンパク質を、本来の状態（異性化前の状態、変性前の状態）に復元、又は、該本来の状態に近い状態に修復することができる。本発明における異性化タンパク質の復元又は修復は、異性化タンパク質中の異性化ＡｓｐをＬ−Ａｓｐに変換すること、又は、これによりアミノ酸の異性化により変性したタンパク質を本来の状態（異性化前の状態、変性前の状態）に復元、又は、該本来の状態に近い状態に修復することを指す。また、異性化タンパク質中の異性化ＡｓｐのＬ−Ａｓｐへの変換は、異性化タンパク質中の異性化Ａｓｐの少なくとも一部をＬ−Ａｓｐに変換することを意味し、全ての異性化ＡｓｐをＬ−Ａｓｐに変換することに限られない。
【００３０】
ＰＩＭＴは、タンパク質中の異性化アミノ酸から通常のＬ−アミノ酸への変換（復元又は修復）を促進する作用を有する。より具体的には、ＰＩＭＴは、異性化ＡｓｐであるＬ−ｉｓｏＡｓｐ及びＤ−Ａｓｐから、Ｌ−Ａｓｐへの変換を促進する作用を有する。従ってＰＩＭＴを活性化することにより、異性化タンパク質の復元又は修復を促進することができる。例えば皮膚に存在するＰＩＭＴを活性化することにより、皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復を促進することができる。これにより、Ｌ−Ａｓｐ及び／又はＬ−Ａｓｎの異性化により損なわれる皮膚タンパク質の機能を、本来の状態又は該本来の状態に近い状態に回復することができ、ひいては、該アミノ酸の異性化による皮膚の諸機能の低下を抑制又は低下した皮膚の機能を回復することができると考えられる。
ＰＩＭＴの活性化は、ＰＩＭＴの発現増強、ＰＩＭＴの発現促進、ＰＩＭＴの発現低下抑制、ＰＩＭＴの発現回復等、ＰＩＭＴの作用を増強又は促進する任意の作用、該作用の低下を抑制する任意の作用を包含する。
【００３１】
＜ＰＩＭＴ活性化用組成物、及び、異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物＞
本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物は、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物を含む。
上記植物の抽出物は、ＰＩＭＴを活性化する作用を有する。従ってこれらの植物の抽出物は、ＰＩＭＴ活性化用組成物の有効成分として好適に使用される。また、上記植物の抽出物は、異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進のためにも有効であり、該異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物の有効成分としても好適に使用される。
上記１種以上の植物の抽出物を含む、異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物（以下、異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物ともいう）も、本発明の１つである。本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物及び異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物は、通常、上記植物の抽出物を有効成分として含むものである。
ＰＩＭＴ活性化用組成物は、皮膚に存在するＰＩＭＴ活性化用組成物として好適である。異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物は、皮膚における異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物として好適である。
【００３２】
本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物及び異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物においては、上記の１種又は２種以上の植物の抽出物を使用することができる。本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物及び異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物が２種以上の植物の抽出物を含む場合、それらは同じ属に属する植物であってもよく、異なる属に属する植物であってもよい。
カバノキ科カバノキ属（Betulaceae Betula）植物としては、例えば、シラカバ（Betula pendula又はBetula alba）が挙げられる。
ブドウ科ブドウ属（Vitaceae Vitis）植物としては、例えば、ブドウ（Vitis spp.）が挙げられる。ブドウの品種は特に限定されないが、例えば、カベルネ・ソーヴィニヨン、コンコード、メルロー、マスカットベリーＡ等の黒ブドウ；シャルドネ、甲州等の白ブドウ等が挙げられる。中でも、黒ブドウが好ましく、カベルネ・ソーヴィニヨン、メルロー等がより好ましい。
【００３３】
マメ科ダイズ属（Fabaceae Glycine）植物としては、ダイズ（Glycine max）が挙げられる。
アサ科カラハナソウ属（Cannabaceae Humulus）植物としては、ホップ（Humulus lupulus）が挙げられる。
シソ科（Lamiaceae）植物としては、ラベンダー（Lavandula angustifolia）等のラヴァンドラ属（Lavandula）；セージ（Salvia officinalis）等のアキギリ属（Salvia）；エンメイソウ（Rabdosia japonica (Isodon japonicus)又はRabdosia trichocarpa (Isodon trichocarpus)）等のヤマハッカ属（Isodon）；シソ（Perilla frutescens var. Crispa）等のシソ属（Perilla）の植物が挙げられる。
ミカン科ミカン属（Rutaceae Citrus）植物としては、ユズ（Citrus junos）が挙げられる。
ショウブ科ショウブ属（Acoraceae Acorus）植物としては、ショウブ（Acorus calamus）が挙げられる。
キク科アルニカ属（Asteroideae Arnica）植物としては、アルニカ（Arnica montana）が挙げられる。
バラ科モモ属（Rosaceae Amygdalus）植物としては、モモ（Amygdalus persica）が挙げられる。
【００３４】
本発明における植物抽出物として、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物（好ましくはラヴァンドラ属、アキギリ属又はヤマハッカ属に属する植物）、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、バラ科モモ属植物の１種以上の植物の抽出物が好ましく、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物の抽出物がより好ましく、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、シソ科植物の抽出物がさらに好ましい。
中でも、皮膚等に存在するＰＩＭＴを活性化する作用が高いことから、上記シラカバ、ブドウ、ダイズ、ホップ、ラベンダー、セージ、エンメイソウ、ユズ、シソ、ショウブ、アルニカ、モモの抽出物が好ましく、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ホップ、ラベンダー、セージ、エンメイソウ、ショウブの抽出物がより好ましく、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ホップ、ラベンダー、セージ、エンメイソウの抽出物がさらに好ましく、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ラベンダー、セージ、エンメイソウの抽出物がさらに好ましく、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ラベンダーの抽出物がさらにより好ましい。中でも、植物抽出物として、シラカバ抽出物、ブドウ抽出物及びダイズの抽出物が特に好ましく、シラカバ抽出物及びブドウ抽出物が最も好ましい。これらの１種又は２種以上の植物の抽出物を用いることが好ましい。
【００３５】
植物の抽出物の調製には、上記植物の任意の部位、例えば、根、根茎、茎、葉、枝、樹皮、花、種子（種皮、胚芽、胚乳、胚軸、子葉等を含む）、果実（果肉、果皮を含む）、又はこれらの複数の組み合わせを使用することができる。この植物の任意の部位を溶媒で抽出することにより植物抽出物を製造することができる。
植物の抽出物を作製するのに好ましい部位として、例えば、以下の部位が挙げられる。本発明における植物抽出物としては、植物の下記部位の抽出物が好ましい。
カバノキ科カバノキ属のシラカバは、樹皮が好ましい。
ブドウ科ブドウ属のブドウは、果実、種皮及び／又は種子が好ましく、果皮及び種子がより好ましい。
マメ科ダイズ属のダイズは、種子を用いることが好ましく、胚芽（ダイズ芽）がより好ましい。アサ科カラハナソウ属のホップは、花（より好ましくは雌花穂）が好ましい。
シソ科植物であれば、ラヴァンドラ属のラベンダーは花を、アキギリ属のセージ及びシソ属のシソは葉を、ヤマハッカ属のエンメイソウは葉及び／又は茎を、それぞれ用いるのが好ましい。
ミカン科ミカン属のユズは、果実を用いることが好ましい。ショウブ科ショウブ属のショウブは、根を用いることが好ましい。キク科アルニカ属のアルニカは、花を用いるのが好ましい。バラ科モモ属のモモは、種子を用いるのが好ましい。
上記植物の部位は、そのまま抽出工程に付されてもよく、粉砕、切断又は乾燥された後に抽出工程に付されてもよい。
【００３６】
植物の抽出方法は特に限定されず、植物成分の抽出に用いられる通常の抽出方法により得ることができる。抽出方法は適宜設定することができ、抽出条件も特に限定されない。例えば、上記植物の各部位を常温又は加温下にて抽出することにより得ることが好ましい。抽出の際には、適宜攪拌等の操作を行ってもよい。
【００３７】
植物の抽出に用いる溶媒（抽出溶媒）は適宜選択することができ、植物成分の抽出に通常用いられるものを使用することができる。抽出溶媒として、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール等の炭素数１〜５の低級１価アルコール；エチレングリコール、プロピレングリコール、１，２−ブチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，４−ブチレングリコール、２，３−ブチレングリコール等の多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル；ポリエチレングリコール等のポリエーテル；スクワラン等が挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせた混合溶媒を用いてもよい。低級１価アルコールは炭素数１〜４の１価アルコールが好ましく、炭素数２〜４のものがより好ましく、エタノール等がさらに好ましい。多価アルコールは、例えば、２価又は３価のアルコールが好ましく、２価のアルコールがより好ましい。また、多価アルコールは、例えば、炭素数２〜４の多価アルコールが好ましく、１，３−ブチレングリコール等がより好ましい。中でも、抽出溶媒として、水、低級１価アルコール、多価アルコール、スクワラン、これらの２種以上の混合溶媒が好ましく、水、低級１価アルコール、多価アルコール、これらの２種以上の混合溶媒がより好ましい。一実施形態においては、抽出溶媒として、例えば、水、低級１価アルコール又はその水溶液、多価アルコール又はその水溶液、スクワラン等がより好ましく、水、エタノール、エタノール水溶液、１，３−ブチレングリコール、１，３−ブチレングリコール水溶液、スクワラン等がさらに好ましい。例えば、低級１価アルコール水溶液（好ましくはエタノール水溶液等）及び多価アルコール水溶液は、アルコールの濃度が１０〜９８体積％が好ましく、３０〜９５体積％がより好ましく、５０〜９５体積％がさらに好ましい。本発明における植物の抽出物として、上記の溶媒抽出物が好ましい。
一実施態様において、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物（好ましくはラヴァンドラ属、アキギリ属又はヤマハッカ属に属する植物）、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、バラ科モモ属植物の抽出物は、低級１価アルコール水溶液の抽出物が好ましい。マメ科ダイズ属植物の抽出物は、水抽出物が好ましい。シソ科シソ属植物は、多価アルコール水溶液の抽出物が好ましい。
抽出に際して酸又はアルカリを添加し、抽出溶媒のｐＨを調整してもよい。
抽出後には、植物残渣（抽出後の植物体又はその部分）を抽出液から除去することが好ましい。植物残渣を抽出液から除去する方法は特に限定されず、ろ過、遠心分離等の公知の分離手段が挙げられる。
【００３８】
植物の抽出方法の一例として、例えば以下の方法が使用できる。植物原体又は乾燥物を細砕し、抽出溶媒を質量で５〜２０倍量加え、常圧下、室温で好ましくは１０分〜１５日、より好ましくは３０分〜１０日、さらに好ましくは１時間〜７日抽出するか、又は、抽出溶媒の沸点付近で好ましくは１０分〜１日（より好ましくは１０分〜２時間）程抽出してからろ過してろ液を得る。抽出の際は、静置してもよく、適宜攪拌を行ってもよい。また、得られたろ液（植物抽出液）をそのまま植物の抽出物としてもよく、必要に応じ濃縮又は乾燥してもよい。
【００３９】
本発明においては、抽出により得られた植物抽出液をそのまま植物の抽出物として用いることができる。また、植物抽出液を適宜な溶媒で希釈して植物の抽出物としてもよく、濃縮又は乾燥工程を行って、濃縮物や乾燥粉末としてもよく、ペースト状として用いてもよい。濃縮方法、乾燥方法も特に限定されず、凍結乾燥、噴霧乾燥等の公知の方法を使用できる。また、乾燥粉末を、溶媒に溶解させて又は懸濁させて用いることもできる。
さらに、上記の植物抽出液、その濃縮物や乾燥粉末について、本発明の効果を損なわない範囲で、必要に応じて、さらに脱臭、脱色等の精製を行ってもよい。このような精製方法は、通常の手段を任意に選択して行えばよく、例えば、ろ過；イオン交換樹脂、合成吸着樹脂、活性炭等の担体を用いるカラムクロマト等の各種クロマトグラフィー等を用いる方法が挙げられる。クロマトグラフィーに使用する担体の一例として、例えば、ダイヤイオンＨＰ−２０  １５Ｌ（製品名、三菱化学（株）製）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（製品名、ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられる。
本発明における植物の抽出物は、上記のような抽出方法で得られた各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮物又はその乾燥粉末、これらの精製物を含む。
また、上記植物の抽出物として、市販品を使用することもできる。
【００４０】
ＰＩＭＴを活性化することにより、異性化タンパク質の復元又は修復が促進される。上記植物の抽出物は、ＰＩＭＴの活性化、異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進のために使用することができる。例えば、上記植物の抽出物は、ＰＩＭＴの活性化、異性化タンパク質の復元又は修復促進のために使用される、化粧料（化粧料組成物）、医薬品（医薬品組成物）、医薬部外品（医薬部外品組成物）、飲食品（飲食品組成物）等を製造するために好適に使用される。上記植物の抽出物は、化粧料、医薬品、医薬部外品、飲食品等に配合され、ＰＩＭＴの活性化、異性化タンパク質の復元又は修復促進のための有効成分であり得る。上記ＰＩＭＴの活性化は、好ましくは皮膚に存在するＰＩＭＴの活性化である。異性化タンパク質の復元又は修復は、好ましくは皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復である。
【００４１】
上記植物の抽出物を用いると、該植物抽出物を用いない場合と比較して、ＰＩＭＴを活性化することができる。例えば、上記植物の抽出物を用いると、皮膚におけるＰＩＭＴの発現量を増加させることができる。また、例えば、紫外線曝露等の要因による皮膚のＰＩＭＴの発現低下を抑制することができる。上記の植物抽出物は、紫外線曝露等の要因により低下した皮膚におけるＰＩＭＴの発現を回復させることができる。本発明の一態様において、上記植物抽出物は、皮膚におけるＰＩＭＴの発現促進のため、皮膚におけるＰＩＭＴの発現低下（例えば紫外線曝露又は加齢に起因する発現低下）抑制のため、皮膚における低下したＰＩＭＴの発現回復のための有効成分として使用され得る。
上述したように皮膚由来のタンパク質に紫外線を照射すると、異性化タンパク質が増加する。一方、加齢、紫外線等の要因で皮膚におけるＰＩＭＴ発現量が低下する。これらの知見から、加齢、紫外線等の要因により、皮膚中の異性化タンパク質の蓄積が促進されると推定される。アミノ酸の異性化による皮膚タンパク質の変性は、皮膚の老化とも関連すると考えられる。
皮膚に存在するＰＩＭＴの活性化は、皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復を促進することから、例えば、老化した皮膚（皮膚状態又は皮膚機能）の回復促進、皮膚老化の予防又は改善等に有効であると考えられる。老化は、加齢による老化（加齢に伴う生理的老化）及び紫外線による老化（紫外線曝露による光老化）の何れか又は両方を包含する。予防は、症状の発症の防止、遅延を包含する。改善は、症状の軽快、症状の進行抑制及び完快を包含する。
上記植物抽出物を含む本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物及び異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物は、皮膚に存在するＰＩＭＴの活性化、皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復促進に有効である。上記植物抽出物は、例えば、皮膚の老化が気になる人や、皮膚老化症状の予防又は改善を希望する人等に適用して、皮膚の回復促進、皮膚老化の予防又は改善等のために好適に使用することができる。
上記目的のための上記植物の抽出物の使用は、治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念である。
【００４２】
本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物及び異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物の形態は特に限定されず、粉末状、顆粒状、ペースト状、固形状等であってもよく、液状であってもよく、適宜選択することができる。例えば、上記植物の抽出物を単独でＰＩＭＴ活性化用組成物（ＰＩＭＴ活性化剤ということもできる）、異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物（異性化タンパク質の復元又は修復促進剤ということもできる）として用いてもよい。また、本発明の効果を損なわない限り、上記植物の抽出物に加えて、その他の成分を配合してＰＩＭＴ活性化用組成物、異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物としてもよい。その他の成分としては、例えば、後述する医薬品、医薬部外品、化粧料、飲食品等に使用し得る成分が挙げられる。このような医薬品、医薬部外品、化粧料、飲食品は、配合成分に応じて常法により製造することができる。
本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物及び異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物は、一例として、剤の形態で提供することができるが、本形態に限定されるものではない。当該剤をそのまま組成物として、又は、当該剤を含む組成物として提供することもできる。
【００４３】
本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物及び異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物は、医薬品、医薬部外品、化粧料、飲食品など様々な用途に使用することができる。本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物及び異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物は、それ自体が、ＰＩＭＴの活性化、異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進のための医薬品、医薬部外品、化粧料又は飲食品であってもよく、又は、該医薬品、医薬部外品、化粧料又は飲食品等に配合して使用される素材又は製剤等であってもよい。
【００４４】
本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物及び異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物は、例えば、皮膚外用剤として好適に使用される。皮膚外用剤は、医薬品、医薬部外品、化粧料（化粧品）を含み、好ましくは化粧料である。一実施態様において、皮膚におけるＰＩＭＴ活性化のため、又は、皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復促進のために使用する場合は、ＰＩＭＴ活性化用組成物及び異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物を、皮膚外用剤とすることが好ましく、化粧料がより好ましい。上記植物の抽出物を含む皮膚外用剤は、皮膚に存在するＰＩＭＴ活性化用の皮膚外用剤；皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復促進用の皮膚外用剤として好適に使用される。
本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物、異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物は、皮膚外用剤以外の医薬品又は医薬部外品として使用することもできる。
別の実施態様においては、ＰＩＭＴ活性化用組成物及び異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物を飲食品とすることも好ましい。上記植物の抽出物を含む飲食品は、例えば、皮膚におけるＰＩＭＴ活性化のため、又は、皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復促進のために好適に使用される。上記植物の抽出物を含む飲食品は、皮膚に存在するＰＩＭＴ活性化用の飲食品、皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復促進用の飲食品として使用され得る。
【００４５】
本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物、異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物を医薬品、医薬部外品、化粧料等の皮膚外用剤、飲食品等とする場合について以下に説明する。
【００４６】
本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物、異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物を皮膚外用剤（ＰＩＭＴ活性化用皮膚外用剤、異性化タンパク質の復元又は修復促進用皮膚外用剤）とする場合、剤形等は特に限定されず、例えば溶液、乳液、クリーム、ゲル、粉末、エアゾール、ミスト、カプセル及びシート等任意の形態とすることができる。皮膚外用剤は、好ましくは化粧料である。化粧料の製品形態も特に限定されず、例えば、洗顔料、メーク落とし、化粧水、美容液、パック、乳液、クリーム、日焼け止め等のスキンケア化粧料；ファンデーション、化粧下地、口紅、アイシャドー、アイライナー、マスカラ、アイブロー、頬紅、ネイルエナメル等のメイクアップ化粧料；ヘアシャンプー、ヘアリンス、整髪料、染毛料、育毛剤等の毛髪化粧料；石けん、ボディソープ等の洗浄料；入浴剤等が挙げられる。
【００４７】
上記化粧料には、上記植物の抽出物を単独で使用してもよい。また、このような化粧料には、本発明の効果を損なわない範囲で、化粧料に許容される担体、添加剤等の成分、例えば、水、アルコール類、油剤、界面活性剤、増粘剤、金属セッケン、ゲル化剤、粉体、キレート剤、水溶性高分子、皮膜形成剤、樹脂、包接化合物、抗菌剤、消臭剤、塩類、ｐＨ調整剤、紫外線吸収剤、上記以外の動植物・微生物由来の抽出物、角質溶解剤、酵素、ホルモン類、他のビタミン類、保湿剤、殺菌剤、抗炎症剤、香料等の１又は２以上を適宜含有させることができる。化粧料は、一般的な製造法により製造することができる。例えば、上記植物の抽出物と、上記の化粧料に使用し得る成分１又は２以上とを混合した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。
【００４８】
皮膚外用剤を医薬品又は医薬部外品とする場合、上記植物の抽出物を単独で使用してもよく、該植物の抽出物と、医薬品又は医薬部外品に許容される担体、添加剤等の成分と組み合わせて使用してもよい。そのような成分として、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤等の１又は２以上が挙げられ、これらは必要に応じて使用できる。医薬品、医薬部外品は、一般的な製造法により製造することができる。例えば、上記植物の抽出物と、医薬品又は医薬部外品において使用し得る成分の１又は２以上とを混合した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。
【００４９】
化粧料等の皮膚外用剤中の上記植物の抽出物の含有量は特に限定されず、例えば、該抽出物の乾燥物換算の質量として、皮膚外用剤中に０．００００００１〜１００質量％が好ましく、０．０００００１〜１００質量％がより好ましく、０．００００１〜９９．９質量％がさらに好ましく、０．００００１〜１０質量％が特に好ましい。
【００５０】
本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物、異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物は、上述した皮膚外用剤以外の医薬品、医薬部外品とすることもできる。このような医薬品又は医薬部外品は、経口投与されてもよく、非経口投与されてもよい。医薬品又は医薬部外品は経口投与製剤（内服剤）又は非経口投与製剤の形態とすることができる。経口投与製剤の剤形としては、液剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、糖衣錠、カプセル剤、懸濁液、乳剤、チュアブル剤等が挙げられる。非経口投与製剤の剤形としては、注射剤、輸液剤等が挙げられる。このような医薬品又は医薬部外品には、上記植物の抽出物を単独で使用してもよく、該植物の抽出物と、医薬品又は医薬部外品に許容される担体、添加剤等の成分と組み合わせて使用してもよい。そのような成分として、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤等の１又は２以上が挙げられ、これらは必要に応じて使用できる。医薬品、医薬部外品は、一般的な製造法により製造することができる。例えば、上記植物の抽出物と、医薬品又は医薬部外品において使用し得る成分の１又は２以上とを混合した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。
【００５１】
皮膚外用剤以外の医薬品又は医薬部外品中の上記植物の抽出物の含有量は特に限定されず、例えば、該抽出物の乾燥物換算の質量として、医薬品又は医薬部外品中に０．００００００１〜１００質量％が好ましく、０．０００００１〜１００質量％がより好ましく、０．００００１〜９９．９質量％がさらに好ましく、０．００００１〜１０質量％が特に好ましい。
【００５２】
本発明のＰＩＭＴ活性化用組成物、異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物を飲食品とする場合、飲食品は特に限定されず、例えば、一般的な飲食品、健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品等が挙げられる。飲食品の形態も特に限定されない。上記健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品は、例えば、液剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、糖衣錠、カプセル剤、懸濁液、乳剤、チュアブル剤、流動食等の各種製剤形態とすることもできる。
【００５３】
上記飲食品には、上記植物の抽出物を単独で使用してもよく、飲食品に許容される成分、例えば、他の飲食品材料、飲食品に配合される添加剤等を配合して、ＰＩＭＴ活性化用の飲食品（ＰＩＭＴ活性化用飲食品組成物）、異性化タンパク質の復元又は修復促進用の飲食品（異性化タンパク質の復元又は修復促進用飲食品組成物）としてもよい。このような飲食品は、一般的な製造法により製造することができる。例えば、飲食品の製造において、飲食品材料等に上記植物の抽出物を配合すればよい。
【００５４】
飲食品中の上記植物の抽出物の含有量は特に限定されず、例えば、該抽出物の乾燥物換算の質量として、飲食品中に０．００００００１〜１００質量％が好ましく、０．０００００１〜１００質量％がより好ましく、０．００００１〜９９．９質量％がさらに好ましく、０．００００１〜１０質量％が特に好ましい。
【００５５】
上記医薬品、医薬部外品、化粧料又は飲食品の使用量は、特に限定されず、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って適宜設定することができる。化粧料等の皮膚外用剤であれば、例えば、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日当たり、上記植物の抽出物（乾燥物換算）として、例えば、０．０１〜５００ｍｇとするのが好ましい。医薬品又は医薬部外品を経口投与する場合の投与量は、例えば、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日当たり、植物の抽出物（乾燥物換算）として、例えば、０．０１〜５００ｍｇとするのが好ましい。飲食品であれば、その摂取量は、例えば、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日当たり、上記植物の抽出物（乾燥物換算）として、例えば、０．０１〜５００ｍｇとするのが好ましい。上記量の植物の抽出物を、単回又は複数回に分けて適用、摂取又は投与することができる。上記植物の抽出物を含む皮膚外用剤を皮膚に適用するタイミング、飲食品、医薬品又は医薬部外品を摂取又は投与するタイミングは特に限定されない。
【００５６】
上記医薬品、医薬部外品、化粧料又は飲食品の適用対象者としては、特に限定されず、ヒト又は非ヒト哺乳動物等に適用することができるが、ヒト（人）が好ましい。適用対象者としては、例えば、ＰＩＭＴの活性化（好ましくは皮膚におけるＰＩＭＴの活性化）を希望する又は必要とする人、異性化タンパク質の復元又は修復促進（好ましくは皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復促進）を希望する又は必要とする人が好ましい。また、一実施態様においては、例えば、皮膚の老化が気になる人、皮膚老化症状の予防又は改善を希望する人又は必要とする人、老化した皮膚の回復、皮膚の老化の予防又は改善を希望する人又は必要とする人が好ましい。また、化粧料等の皮膚外用剤を適用する身体の部位は特に限定されないが、上記目的で使用する場合は、例えば、老化が気になる部位の皮膚、老化症状の予防又は改善を希望する部位の皮膚、老化症状の予防又は改善が必要な部位の皮膚に適用することが好ましい。
【００５７】
＜ＰＩＭＴの活性化方法、及び、異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進方法＞
ヒト皮膚に存在するＰＩＭＴを活性化することにより、皮膚における異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復を促進する方法も、本発明に包含される。
異性化タンパク質が復元又は修復されると、異性化により損なわれたタンパク質の機能を回復させることができる。従って本発明の方法は、例えば、老化した皮膚（皮膚状態又は皮膚機能）の回復促進、皮膚老化の予防又は改善等に有効である。
ヒト皮膚に存在するＰＩＭＴを活性化する方法として、ヒトに上記の植物抽出物を適用する方法が挙げられる。より具体的には、例えば、上記植物抽出物をヒト皮膚に適用する方法、上記植物抽出物をヒトに投与又は摂取させて適用する方法等が挙げられる。好ましくは植物抽出物をヒト皮膚に適用する。植物抽出物は、上記のＰＩＭＴ活性化用組成物に記載した通りである。植物抽出物は、上述した皮膚外用剤、医薬品、医薬部外品、飲食品等の形態で適用することができる。皮膚に存在するＰＩＭＴを活性化することにより、皮膚における異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復を促進することができる。
【００５８】
カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物を動物に適用する、ＰＩＭＴの活性化方法；上記の１種以上の植物の抽出物を動物に適用する、異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進方法も本発明に包含される。
動物は、上述したヒト又は非ヒト哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。
上記ＰＩＭＴの活性化方法は、好ましくは、皮膚に存在するＰＩＭＴの活性化方法である。異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進方法は、好ましくは皮膚における異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進方法である。皮膚におけるＰＩＭＴの活性化及び異性化タンパク質の復元又は修復促進においては、上記植物抽出物を、皮膚に接触させることが好ましい。本発明の好ましい態様においては、上記植物の抽出物を動物の皮膚に適用する。例えば、上記植物抽出物を含む皮膚外用剤をヒト等の動物の皮膚に適用することにより、上記植物の抽出物をその皮膚細胞に接触させることができる。植物の抽出物及びその好ましい態様、好ましい使用量等は上述した通りである。皮膚外用剤も上述した通りである。一態様において、上記方法は非治療的な方法（医療行為を含まない方法）であることが好ましい。
【００５９】
＜皮膚の復元又は修復活性の評価方法、及び、皮膚の抗老化活性の評価方法＞
皮膚に存在するＰＩＭＴの発現量又は活性を指標として、皮膚の復元又は修復活性、皮膚の抗老化活性を評価することができる。
本発明の皮膚の復元又は修復活性の評価方法は、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を指標とする。本発明の皮膚の抗老化活性の評価方法は、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を指標とする。
本明細書中、本発明の皮膚の復元又は修復活性の評価方法、及び、本発明の皮膚の抗老化活性の評価方法を、本発明の評価方法ともいう。
【００６０】
本発明における皮膚の復元又は修復活性は、通常、皮膚のタンパク質中のアミノ酸（具体的には、Ｌ−ＡｓｐやＬ−Ａｓｎ）が異性化（Ｌ−ｉｓｏＡｓｐやＤ−Ａｓｐに変換）することにより変性したタンパク質（異性化タンパク質）を復元又は修復する活性、該皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復を促進する活性を指す。皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復を促進する活性は、紫外線、加齢等の要因による皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復活性の低下を抑制する活性を包含する。ＰＩＭＴは異性化タンパク質の復元又は修復を促進する作用を有することから、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性は、上記皮膚の復元又は修復活性を評価するための指標として有用である。皮膚の復元又は修復活性は、皮膚の復元又は修復力、皮膚の復元又は修復作用と言い換えることもできる。皮膚の復元又は修復活性は、皮膚の回復にも寄与し得る。
また、上述したように、アミノ酸の異性化による皮膚タンパク質の変性は、皮膚の老化とも関連すると考えられる。皮膚中の異性化タンパク質が復元又は修復されることにより、例えば、老化した皮膚の機能等が回復すると考えられる。従って皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性は、皮膚の抗老化活性の指標としても有用である。本発明における抗老化は、老化、好ましくは皮膚の老化の予防又は改善である。老化は、加齢による老化及び紫外線による老化の何れか又は両方を包含する。
また、例えば、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現は、紫外線及び／又は加齢により低下するが、紫外線及び／又は加齢によるＰＩＭＴの発現低下が少ない皮膚では、紫外線及び／又は加齢による皮膚のタンパク質の異性化を復元又は修復する活性が高い。皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を指標とすると、このような紫外線及び／又は加齢による皮膚の復元又は修復活性の低下を抑制する、紫外線及び／又は加齢による皮膚の老化に対する皮膚の復元又は修復活性を評価することもできる。
本発明の皮膚の復元又は修復活性の評価方法は、紫外線及び／又は加齢による皮膚の老化に対する皮膚の復元又は修復活性の評価方法として使用され得る。本発明の皮膚の抗老化活性の評価方法は、紫外線及び／又は加齢による皮膚の老化に対する抗老化活性の評価方法として使用され得る。
【００６１】
本発明の評価方法においては、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を指標として用いる。より具体的には、ＰＩＭＴの発現量又は活性の程度を指標として、皮膚の復元又は修復活性の程度若しくは変化、皮膚の抗老化活性の程度若しくは変化を評価する。
例えば、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性が高いと、タンパク質中の異性化ＡｓｐをＬ−Ａｓｐに変換する活性が高い。つまり、異性化タンパク質を復元又は修復する活性が高い。また、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性が高いと、アミノ酸の異性化による皮膚の諸機能の低下等を抑制する活性が高い。このため皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性が高いと、皮膚を復元又は修復する活性（作用）が高く、皮膚の老化を予防又は改善する活性（作用）が高いといえる。
【００６２】
ＰＩＭＴの発現量又は活性が高い皮膚は、異性化タンパク質の復元又は修復活性が高いことから、皮膚の復元又は修復活性、及び、皮膚の抗老化活性が高いといえる。また、ＰＩＭＴの発現量又は活性が高い皮膚は、皮膚細胞の老化の程度が低い（老化が進行していない）ともいえる。逆にＰＩＭＴの発現量又は活性が低い皮膚は、皮膚の復元又は修復活性、及び、皮膚の抗老化活性が低いといえる。また、ＰＩＭＴの発現又は活性が低い場合は、老化が進行した皮膚であるともいえる。
従って、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を指標として用いることにより、皮膚の復元又は修復活性、及び、皮膚の抗老化活性を客観的に評価することができる。また、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性は、皮膚の老化の進行度の評価の指標としても使用できる。
【００６３】
皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を指標とすることにより、被験者の皮膚の復元若しくは修復活性、又は、皮膚の抗老化活性を、例えば標準的な皮膚の該活性と比較したり、スキンケアによる皮膚の復元若しくは修復活性、又は、皮膚の抗老化活性の変化を評価したりすることもできる。このため、上記の評価に基づき、例えば、皮膚の老化に関連する症状に対する適切な処置を選択することができる。
【００６４】
本発明の評価方法に使用される皮膚細胞は、該評価が必要とされる被験者又は該評価を希望する被験者の皮膚細胞であればよく、ヒト又は非ヒト哺乳動物の皮膚細胞が挙げられ、ヒトの皮膚細胞が好ましい。皮膚細胞は、通常、被験者から採取された皮膚細胞である。皮膚細胞としては、表皮細胞及び／又は真皮細胞が好ましい。表皮細胞及び／又は真皮細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性は、皮膚の復元又は修復活性、及び、皮膚の抗老化活性の評価の指標として好ましい。中でも、真皮細胞がより好ましい。真皮組織は、加齢、紫外線等によるダメージが蓄積されるため、真皮細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を指標とすると、被験者の皮膚の復元又は修復活性、及び、皮膚の抗老化活性をより適切に評価することができる。また、採取が容易である点からは、表皮細胞が好ましい。
【００６５】
皮膚細胞の採取方法は特に限定されない。表皮細胞は、例えば、テープストリッピング法により採取することができる。真皮細胞は、注射針等により採取することができる。また、例えば再生医療等を目的として皮膚を一部採取した場合や、脂肪切除の際に余分となる皮膚からの細胞を使用することもできる。
【００６６】
皮膚の部位は特に限定されず、例えば、皮膚の復元又は修復活性、又は、皮膚の抗老化活性の評価が必要とされる部位又は希望される部位が好ましい。例えば、顔面（額、頬、目の周り、口の周り、顎）、耳の後ろ、頸部、腕、手、足、臀部等の皮膚が挙げられる。一態様において、好ましくは、露光部（紫外線露光部）の皮膚細胞であり、露光部の皮膚として、顔面（特に頬部等）、頸部、上腕部、手の甲等が挙げられる。露光部の皮膚細胞は、紫外線による皮膚の老化に対する皮膚の復元又は修復活性の評価、及び、紫外線による皮膚の老化に対する抗老化活性の評価に好適に用いられる。本発明においては、皮膚の復元又は修復活性、及び、抗老化活性の評価が重要と考えられる顔面の皮膚細胞を用いて評価することが好ましい。
【００６７】
本発明の評価方法は、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又はＰＩＭＴの活性を測定する工程を含むことが好ましい。
ＰＩＭＴの発現量は、皮膚細胞のＰＩＭＴ量（タンパク質量）又はＰＩＭＴをコードするｍＲＮＡ量を測定することにより測定することができる。操作が簡便であることから、ＰＩＭＴの発現量として、ＰＩＭＴ量を測定することが好ましい。
ＰＩＭＴ量を測定する場合は、採取した皮膚細胞からタンパク質を抽出してサンプルを調製し、該サンプル中のＰＩＭＴ量を測定すればよい。タンパク質の抽出方法及びＰＩＭＴ量の測定方法は特に限定されない。例えば、市販のタンパク質抽出溶媒（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ社製のＭ−ＰＥＲ（登録商標）  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ＲｅａｇｅｎｔやＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製の製品名Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ等）を用いて、皮膚細胞から抽出溶媒に可溶性のタンパク質を抽出し、ＰＩＭＴ測定用のサンプルとすることができる。また、皮膚細胞からのタンパク質の抽出には、浸透圧ショック法、凍結融解法、超音波処理法、ホモジナイズ等の方法を採用することもできる。
ＰＩＭＴ量は、ＰＩＭＴに特異的な抗体を利用する免疫測定方法（例えば、酵素反応を利用したＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法）等の公知の方法により測定することができる。ＥＬＩＳＡ法は、例えば、市販のキット（ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ−Ｉｓｏａｓｐａｒｔａｔｅ−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＣＭＴ１）、ＣＬＯＵＤ−ＣＬＯＮＥ社製）を使用することができる。
ｍＲＮＡの抽出、その量の測定方法は、公知の方法により行えばよい。ｍＲＮＡの測定は、例えば、ＰＣＲ法等の方法により実施することができる。ヒトＰＩＭＴのＤＮＡ配列は知られている（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００５３８９）。当業者であれば、ＰＩＭＴをコードするｍＲＮＡ量を測定するためのプライマーの設計や合成、ＤＮＡの増幅等を容易に行うことができる。また、ヒトＰＩＭＴ遺伝子の定量に使用可能なプライマーは市販されている（ＯｒｉＧｅｎｅ社、製品番号ＨＫ２５４５４、ＨＫ２０５４５３など）。このような市販のプライマーを入手してＰＩＭＴをコードするｍＲＮＡ量を測定することもできる。
【００６８】
皮膚細胞におけるＰＩＭＴの活性の測定は、ＰＩＭＴの酵素活性を測定できる任意の方法に従い、定量的又は定性的に実施することができる。具体的には、皮膚細胞からタンパク質を抽出し、ＰＩＭＴの反応によりＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）から生じるＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）の量をＨＰＬＣにより測定する方法、基質となるｉｓｏＡｓｐ含有ペプチドをニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）で蛍光ラベル化し、これをＰＩＭＴと反応させメチル化したのちＨＰＬＣで分離測定する方法（古地ら「ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ」  １２７巻第１２号  １９２７―１９３６項（２００７））等により、ＰＩＭＴの活性を測定することができる。
ＰＩＭＴの発現量及びＰＩＭＴの活性の測定値は、測定法に応じて使用しやすい値を用いればよい。例えば、ＰＩＭＴの発現量としてＰＩＭＴ量（タンパク質量）を使用する場合、ＰＩＭＴ発現量の測定値は、タンパク質量あたりのＰＩＭＴ量に換算したものを使用することができる。
ＰＩＭＴの発現量又はＰＩＭＴの活性の測定値を用いて、皮膚の復元又は修復活性の程度、皮膚の抗老化活性の程度、該活性の変化を評価することができる。
【００６９】
皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を指標として、皮膚の復元又は修復活性を評価する方法、皮膚の抗老化活性を評価する方法は特に限定されない。
例えば、実施態様の一例として、被験者の皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を測定する工程、該被験者の皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を、あらかじめ測定しておいた集団（例えば、同世代の集団）の皮膚細胞における発現量又は活性の分布と比較する工程を行うことができる。例えば、被験者の皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性が、あらかじめ測定しておいた集団の皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性の分布と比較して高い場合は、その被験者は皮膚の復元又は修復活性、及び、皮膚の抗老化活性が高いと評価（判定）される。
【００７０】
また、皮膚の復元又は修復活性、及び、皮膚の抗老化活性は、個人差があると考えられることから、例えば、同一の被験者において、露光部及び非露光部の皮膚細胞のＰＩＭＴの発現量又は活性を比較して、上記活性を評価することもできる。このような評価方法の一例として、同一被験者の露光部及び非露光部の皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を測定する工程、及び、上記露光部及び非露光部の皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を比較する工程を含む評価方法が挙げられる。紫外線により皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現又は活性は減少する。また、紫外線によるダメージは蓄積することから、同一の被験者において、通常、露光部の皮膚では、非露光部の皮膚と比較してＰＩＭＴの発現又は活性が低いと考えられる。このため露光部及び非露光部の皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を比較して、その差が小さいと、被験者の皮膚の復元又は修復活性、及び、皮膚の抗老化活性が高いと評価される。露光部の皮膚として、上述した顔面等の皮膚が挙げられる。非露光部としては特に限定されないが、例えば、臀部等が挙げられる。
【００７１】
同一の被験者における露光部及び非露光部のＰＩＭＴの発現量又は活性を比較することは、紫外線による皮膚の老化に対する皮膚の復元又は修復活性の評価、及び、紫外線による皮膚の老化に対する抗老化活性を評価する際に適している。非露光部の皮膚細胞におけるＰＩＭＴ発現量又は活性と、露光部の皮膚細胞におけるＰＩＭＴ発現量又は活性の差が小さいほど、紫外線による皮膚の老化に対する皮膚の復元又は修復活性、及び、紫外線による皮膚の老化に対する抗老化活性が高いと評価される。
【００７２】
また、皮膚細胞に紫外線を照射し、照射前後におけるＰＩＭＴ発現量又は活性を比較することもできる。この場合は、例えば、被験者の皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を測定する工程、該被験者の皮膚細胞に紫外線を照射する工程、紫外線照射後の被験者の皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を測定する工程、及び、紫外線照射前後におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を比較する工程を含むことが好ましい。
紫外線照射前後におけるＰＩＭＴ発現量又は活性を比較することは、紫外線による皮膚の老化に対する皮膚の復元又は修復活性の評価、及び、紫外線による皮膚の老化に対する抗老化活性を評価する際に適している。紫外線照射前と比較して、照射後のＰＩＭＴ発現量又は活性の低下が小さいほど、紫外線による皮膚の老化に対する皮膚の復元又は修復活性、及び、紫外線による皮膚の老化に対する抗老化活性が高いと評価される。
【００７３】
また、別の実施態様の一例として、皮膚に所定のスキンケアを行った場合の皮膚細胞におけるＰＩＭＴ発現量又は活性を、そのスキンケアを行わない場合のＰＩＭＴ発現量又は活性と比較することもできる。この比較は、スキンケアの前後におけるＰＩＭＴ発現量又は活性の比較であってもよい。これにより、スキンケアによる皮膚の復元若しくは修復活性の変化、又は、皮膚の抗老化活性の変化を評価することができる。例えば、あるスキンケアにより、該ケアを行わない場合と比較してＰＩＭＴの発現量又は活性が増加した場合に、該スキンケアにより、皮膚の復元若しくは修復活性、及び、皮膚の抗老化活性が高められたと評価することができる。
【００７４】
さらに、ある食品又は成分を摂取した場合の皮膚細胞におけるＰＩＭＴ発現量又は活性を、該食品又は成分を摂取しない場合のＰＩＭＴ発現量又は活性と比較することもできる。これにより、その食品又は成分による、皮膚の復元若しくは修復活性の変化、又は、皮膚の抗老化活性の変化を評価することができる。例えば、ある食品又は成分の摂取により、該食品又は成分を摂取しない場合と比較してＰＩＭＴの発現量又は活性が増加した場合に、該食品又は成分の摂取により、皮膚の復元又は修復活性、及び、皮膚の抗老化活性が高められたと評価することができる。
【００７５】
皮膚に存在するＰＩＭＴの活性化作用を有する物質、皮膚の復元又は修復促進作用を有する物質、及び、皮膚の抗老化作用を有する物質は、後述する方法によりスクリーニングすることができる。
【００７６】
＜皮膚に存在するＰＩＭＴの活性化、皮膚の復元若しくは修復促進、又は、皮膚の抗老化のための有効成分のスクリーニング方法＞
本発明のスクリーニング方法は、皮膚に存在するＰＩＭＴの活性化、皮膚の復元若しくは修復促進、又は、皮膚の抗老化のための有効成分をスクリーニングする方法である。本発明のスクリーニング方法では、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を指標とする。
皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を指標として、皮膚に存在するＰＩＭＴの活性化、皮膚の復元若しくは修復促進、又は、皮膚の抗老化のための有効成分、換言すると、皮膚に存在するＰＩＭＴの活性化作用を有する物質、皮膚の復元若しくは修復促進作用を有する物質、又は、皮膚の抗老化作用を有する物質をスクリーニングすることができる。
本発明のスクリーニング方法は、通常、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で行われる方法（インビトロでのスクリーニング方法）である。
【００７７】
本発明のスクリーニング方法で用いられる皮膚細胞として、ヒト又は非ヒト哺乳動物の皮膚細胞が挙げられる。皮膚細胞は、上述した被験者から採取した細胞であってもよいが、好ましくは、培養皮膚細胞を用いる。例えば、ヒト表皮角化細胞、ヒト真皮線維芽細胞等の培養皮膚細胞を用いることができる。使用する皮膚細胞は、コンフルエントになるまで増殖させたものが好ましい。細胞を増殖させる際の培養条件は特に限定されず、細胞に応じて公知の条件を採用すればよい。
【００７８】
本発明のスクリーニング方法は、上記皮膚細胞に被験物質を接触させて、上記皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を測定する工程、及び、
上記被験物質を接触させた皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性が、上記被験物質を接触させなかった皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性と比較して大きい場合に、上記被験物質を有効成分として選択する工程を含むことが好ましい。
【００７９】
被検物質は特に限定されず、例えば、植物抽出液、細胞抽出液、発酵生産物、タンパク質、ペプチド、ビタミン類、合成化合物などが挙げられる。これらは既知物質であってもよく、新規物質であってもよい。
皮膚細胞に被験物質を接触させる方法は、被験物質が該細胞に接触することができればよく、特に限定されない。例えば培養皮膚細胞であれば、被験物質を、該皮膚細胞を培養するための培地に添加すればよい。この際には、被験物質を添加した培地中で皮膚細胞を所定時間培養後、該細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を測定することが好ましい。培地、培養条件等は、細胞の種類等に応じて適宜設定することができる。培養時間は特に限定されず、培養条件等により適宜設定すればよい。例えば、被験物質を添加した培地中で、皮膚細胞を好ましくは５〜７２時間、より好ましくは１２〜４８時間培養すればよい。例えば培地の一例として、α−ＭＥＭ培地が挙げられる。培地には、血清（例えば、牛胎児血清）を添加してもよい。培地は、市販品を使用してもよい。
皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性の測定は、上述した方法により行うことができる。
また、上述したように、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性は紫外線により減少することから、例えば、皮膚細胞に被験物質を接触させる前又は後に、該皮膚細胞に紫外線を照射してもよい。紫外線を照射した場合に、被験物質を接触させた皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性が、上記被験物質を接触させなかった皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性と比較して大きいと、該被験物質は、皮膚に存在するＰＩＭＴ活性化作用が高いといえる。また、該被験物質は、紫外線による皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復活性の低下を抑制する作用、つまり紫外線による皮膚の老化に対する皮膚の復元又は修復作用が高いと考えられる。また、該被験物質は、紫外線による皮膚の老化に対する抗老化作用が高いと考えられる。
【００８０】
被験物質を接触させなかった皮膚細胞は、コントロールである。コントロールとして、被験物質の代わりに既知の抗老化剤の有効成分等を接触させた皮膚細胞を使用することもできる。コントロールとして既知の抗老化剤の有効成分等を接触させた皮膚細胞を使用すると、該既知の有効成分よりも皮膚に存在するＰＩＭＴ活性化作用が高い被験物質、皮膚の復元若しくは修復作用が高い被験物質、又は、皮膚の抗老化作用が高い被験物質を選択することができる。
【００８１】
本発明のスクリーニング方法により得られる有効成分は、皮膚に存在するＰＩＭＴを活性化することができる。これにより皮膚の復元又は修復を促進することができる。また、本発明のスクリーニング方法により得られる有効成分は、上記の皮膚の老化を予防又は改善することができる。より具体的には、皮膚細胞における異性化したＡｓｐからＬ−Ａｓｐへの変換を促進する活性に基づき、皮膚の老化を予防又は改善することができる。
【００８２】
本発明は、皮膚細胞におけるプロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）の発現量又は活性の、皮膚の復元若しくは修復活性又は皮膚の抗老化活性の指標としての使用も包含する。より具体的には、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性の程度を、上記活性の程度の指標として使用することができる。皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性は、皮膚の復元又は修復活性の指標として好適に使用される。また、皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性は、皮膚の抗老化活性の指標として好適に使用される。
【００８３】
本発明は、以下の使用等も包含する。
プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）を活性化するための、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物の使用。
異性化したアミノ酸を含むタンパク質を復元又は修復促進するための、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される１種以上の植物の抽出物の使用。
上記の使用は、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物における使用である。使用は、治療的使用であってもよく、非治療的使用であってもよい。上記使用は、非治療的な美容目的のための使用であり得る。植物抽出物の好ましい態様等は、上述した通りである。植物抽出物は、そのまま使用してもよく、植物抽出物を含有する組成物として使用してもよい。植物抽出物は上述した皮膚外用剤、飲食品等の形態で使用することができる。
本発明は、ＰＩＭＴ活性化用組成物を製造するための、上記植物抽出物の使用；異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物を製造するための、上記植物抽出物の使用も包含する。植物抽出物の好ましい態様等は、上述した通りである。
【実施例】
【００８４】
以下、本発明をより具体的に説明する実施例を示す。なお、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。【００８５】
以下の実験で使用したタンパク質抽出試薬は、Ｔｈｅｒｍｏ社製、製品名Ｍ−ＰＥＲ（登録商標）  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔである。試験例において、有意差の検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定により行った。【００８６】
＜試験例１＞
皮膚細胞におけるＰＩＭＴ発現量の測定
成人由来正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ−ＡＤ：クラボウ株式会社より購入）、成人由来正常ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ−ＡＤ：クラボウ株式会社より購入及びＮＨＤＦ−Ａｄ：Ｌｏｎｚａ社より購入）及び新生児由来ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−ＮＢ：クラボウ株式会社より購入及びＮＨＤＦ−Ｎｅｏ：Ｌｏｎｚａ社より購入）を用いて、ヒト皮膚におけるプロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）のタンパク質発現量について評価した。各細胞を懸濁した培地を１００ｍｍの培養ディッシュに播種し、３７℃、二酸化炭素濃度５ｖｏｌ％中にてコンフルエントになるまで培養した。タンパク質抽出試薬を用いてコンフルエントに達した細胞から該抽出試薬に可溶性のタンパク質を回収し、タンパク質量あたりのＰＩＭＴ量を測定した。このタンパク質量あたりのＰＩＭＴ量を、ＰＩＭＴ発現量とした。ＰＩＭＴ量はＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ−Ｉｓｏａｓｐａｒｔａｔｅ−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＣＭＴ１）（ＣＬＯＵＤ−ＣＬＯＮＥ社製）を用い、添付された説明書に従って測定を行った。また、発現量の指標としてＰＩＭＴが発現していることが既に報告されている胎児由来ヒト腎臓由来細胞（ＨＥＫ２９３）の細胞溶解液（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）を陽性対照に用いた。【００８７】
結果を図１に示す。図１は、皮膚細胞におけるＰＩＭＴ発現量（タンパク質量あたりのＰＩＭＴ量）を示すグラフである。
皮膚由来のＮＨＥＫ細胞及びＮＨＤＦ細胞全てにおいて、ＨＥＫ２９３細胞に比較すると低いものの、ＰＩＭＴが発現していることが示された。【００８８】
以下の試験例２〜８で使用した新生児由来正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−ＮＢ）は、試験例１で使用したＮＨＤＦ−ＮＢと同じである。細胞の培養は、特に断らない場合は、３７℃、二酸化炭素濃度５ｖｏｌ％中で行った。【００８９】
＜試験例２＞
紫外線Ｂ波（ＵＶＢ）照射により生成される皮膚タンパク質中の異性化アスパラギン酸のＰＩＭＴによる修復作用の検討
ＵＶＢ照射によりアスパラギン酸の異性化を誘導した新生児由来正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−ＮＢ）のタンパク質を用いて、ＰＩＭＴが皮膚タンパク質中の異性化アスパラギン酸に対しても修復作用を有するかについて検証した。具体的には、ＮＨＤＦ−ＮＢ細胞を懸濁した培地を培養ディッシュに播種し、３７℃、二酸化炭素濃度５ｖｏｌ％中にてコンフルエントになるまで培養した。タンパク質抽出試薬を用いてコンフルエントに達した細胞からタンパク質を回収後、該タンパク質にＵＶＢを一定時間照射し、異性化アスパラギン酸としてＬ−β−Ａｓｐ量をＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）  Ｉｓｏａｓｐａｒｔａｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付された説明書に従って定量した。本キットは、タンパク質又はペプチド中のイソアスパラギン酸にＰＩＭＴが作用するときに、補酵素Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ（ＳＡＭ）のメチル基をイソアスパラギン酸のα−カルボキシル基に転移し、ＳＡＭの脱メチル化物Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ  ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎ（ＳＡＨ）が生成することを利用し、ＳＡＨを定量することでイソアスパラギン酸残基を間接的に定量する方法である。また、１分子中に１箇所イソアスパラギン酸を含むことがわかっているデルタ睡眠誘発ペプチド（ＤＳＩＰ）を陽性対照として用いた。陽性対照の結果から、上記反応が起こり、生成したＳＡＨが検出できていることが確認された。なお、定量結果は各試験サンプルのタンパク質量あたりのＳＡＨ量として算出した。【００９０】
結果を図２に示す。図２は、ＵＶＢ照射によるタンパク質量あたりのＳＡＨ生成量を示すグラフである。図２のデータは、平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示した。図２中、＊は、ＵＶＢ照射時間０分に対する有意差である（＊：ｐ＜０．０５）。ＳＡＨ生成量が多いほど、異性化アスパラギン酸生成量が多いことを意味する。
ＵＶＢ未照射のＮＨＤＦ−ＮＢ細胞由来タンパク質からも一定量のＳＡＨが検出されたが、ＵＶＢ照射時間（４０分、６０分）に依存してＳＡＨ量が増加した。ＮＨＤＦ−ＮＢは真皮線維芽細胞である。この結果から、真皮線維芽細胞由来のタンパク質において、ＵＶＢの照射によりアスパラギン酸の異性化が誘導されることが示された、また、異性化した皮膚タンパク質中のアスパラギン酸に対してＰＩＭＴが作用することが示された。【００９１】
＜試験例３＞
継代数の異なる真皮線維芽細胞におけるＰＩＭＴ発現量の評価
細胞を繰り返し継代して培養すると、細胞は老化が進み、最終的には分裂機能を失うことが知られている。このため継代培養を繰り返した新生児由来正常ヒト皮膚線維芽細胞（真皮線維芽細胞）を、老化モデルとして使用した。
ＰＩＭＴの発現量が老化によりどのように変動するかを検証するため、継代を繰り返した新生児由来正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−ＮＢ、クラボウ株式会社より購入）を用いてＰＩＭＴのタンパク質発現量の変化を検証した。継代培養を繰り返したＮＨＤＦ−ＮＢ細胞（継代数（Ｐ）：３、６、１０、１２、１５及び１７）を播種し、３７℃、二酸化炭素濃度５ｖｏｌ％中にてコンフルエントになるまで培養した。コンフルエントに達した細胞からタンパク質抽出試薬を用いて、該抽出試薬に可溶性のタンパク質を回収し、タンパク質量あたりのＰＩＭＴ量を測定した。ＰＩＭＴ量の測定は、試験例１と同じ方法で行った。【００９２】
図３は、継代数の異なる皮膚線維芽細胞におけるＰＩＭＴ発現量（タンパク質量あたりのＰＩＭＴ量）を示すグラフである。継代培養を６回以上繰り返したＮＨＤＦ−ＮＢ細胞において、タンパク質量あたりのＰＩＭＴ発現量が低下する傾向が確認された。老化した皮膚組織では異性化アスパラギン酸が蓄積していることが確認されているが、老化が進んだ細胞ではタンパク質中の異性化アスパラギン酸を修復しうるＰＩＭＴの発現が低下することで、異性化アスパラギン酸の蓄積が増加すると想定される。【００９３】
＜試験例４＞
種々のストレス負荷におけるＰＩＭＴ発現量の変化
ＰＩＭＴの発現量が外的環境に影響されるかを調べるため、新生児由来正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−ＮＢ）にＵＶＢ照射や炎症惹起、栄養の枯渇、活性酸素などの刺激を与え、ＰＩＭＴのタンパク質発現量の変化を検証した。１００ｍｍの培養ディッシュに細胞を播種し、３７℃、二酸化炭素濃度５ｖｏｌ％中にて培養した。培養には１０％ウシ血清（ＦＢＳ）含有α−ＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。コンフルエントに達した細胞に以下の通り各種刺激を負荷した。
（１）活性酸素種（過酸化水素（Ｈ２Ｏ２））曝露によるＰＩＭＴ発現量への影響検証
培養上清を除去し、過酸化水素水（ナカライテスク社製）を最終濃度１０μＭとなるように添加した新鮮なＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地へ交換した。
（２）ＵＶＢ曝露によるＰＩＭＴ発現量への影響検証
培養上清を除去し、ハンクス平衡塩溶液（ナカライテスク社製）へ交換後、ＵＶＢ（積算光量約５．７ｍＪ／ｃｍ２）を照射した。照射後、新鮮なＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地へ交換した。
（３）低栄養状態におけるＰＩＭＴ発現量への影響検証
１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地を、ＦＢＳ無添加α−ＭＥＭ培地へ交換した。【００９４】
上記（１）〜（３）の方法により刺激を加えた後、４８時間培養した細胞からタンパク質抽出試薬に可溶性のタンパク質を回収し、タンパク質量あたりのＰＩＭＴ量を測定した。上記ＰＩＭＴ量の測定は、試験例１と同じ方法で行った。また、コントロールとして、上記（１）〜（３）の刺激を負荷せずに、１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地へ交換した細胞を用いた。【００９５】
図４は、ストレス負荷による皮膚線維芽細胞のＰＩＭＴ発現量（タンパク質量あたりのＰＩＭＴ量）の変化を示すグラフである。
図４のデータは、平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示した。＊は、コントロールに対する有意差である（＊：ｐ＜０．０５）。過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）曝露、ＵＶＢ曝露、低栄養下いずれにおいてもコントロールの細胞に比べＰＩＭＴ発現量が顕著に低下した。これらのことから、紫外線に曝露している皮膚や、活性酸素種などに曝露している皮膚、加齢に伴い栄養状態が低下している皮膚ではＰＩＭＴの発現が低下することで、異性化アスパラギン酸の蓄積が増加すると想定される。【００９６】
＜調製例１＞植物由来の抽出物の調製
抽出に用いた植物及びその部位は以下の通りである。
（１）エンメイソウ（Isodon japonicus）：茎及び葉
（２）シソ（Perilla frutescens var. Crispa）：葉
（３）シラカバ（Betula pendula）：樹皮
（４）ユズ（Citrus junos）：果実
（５）セージ（Salvia officinalis）：葉
（６）ダイズ（Glycine max）：胚芽（ダイズ芽）
（７）アルニカ（Arnica montana）：花
（８）アンズ（Prunus armeniaca）：種子
（９）ショウブ（Acorus calamus）：根
（１０）ラベンダー（Lavandula angustifolia）：花
（１１）モモ（Amygdalus persica）：種子
（１２）ホップ（Humulus lupulus）：雌花穂
（１３）ブドウ（Vitis spp.）（カベルネ・ソーヴィニヨン）：果皮及び種子【００９７】
上記（１）、（３）〜（５）及び（７）〜（１３）の植物の破砕物それぞれを、質量の１０倍量の３０〜９０ｖｏｌ％エタノール水溶液に浸し、室温下、１日１回攪拌操作を加えて１０分〜７日間抽出した。その後、濾過により残渣を除去し、抽出液を得た。当該抽出液を濃縮後、凍結乾燥することにより各植物の抽出物（エタノール抽出物）を粉末として得た。当該粉末状の植物抽出物を試験例５〜８の評価に用いた。【００９８】
（２）シソについては、エタノール水溶液の代わりに１，３−ブチレングリコール水溶液を使用し、上記方法で抽出した。抽出後、濾過により残渣を除去して抽出液（シソのブチレングリコール抽出液）を得た。当該抽出液を濃縮後、凍結乾燥することによりシソ抽出物（ブチレングリコール抽出物）を粉末として得た。当該粉末状のシソ抽出物を試験例５〜６の評価に用いた。【００９９】
上記（６）のダイズについては、ダイズの胚芽を粉砕し、質量の１０倍量の熱水で抽出した。その後、濾過により残渣を除去し、抽出液（ダイズ水抽出液）を得た。この抽出液を濃縮後、凍結乾燥することにより、ダイズ抽出物（水抽出物）を粉末として得た。この粉末状のダイズ抽出物を試験例５〜６の評価に用いた。【０１００】
＜試験例５＞
植物抽出物添加による皮膚細胞におけるＰＩＭＴ発現量の変化
新生児由来ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ−ＮＢ：クラボウ株式会社より購入）を用いて、調製例１で調製した植物抽出物を添加したときのヒト皮膚におけるＰＩＭＴのタンパク質発現量について評価した。
１００ｍｍの培養ディッシュに細胞を播種し、３７℃、二酸化炭素濃度５ｖｏｌ％中にてコンフルエントになるまで培養した。その後、得られた細胞に表１又は表２に記載の各植物抽出物を１０μｇ／ｍＬの濃度で添加し２４時間培養した。尚、培地は、ＦＢＳ無添加のα−ＭＥＭ培地を用い、植物抽出物はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、培地中のＤＭＳＯの最終濃度が０．１質量％となるように添加した。またコントロールには０．１質量％ＤＭＳＯを含む培地を用いた。【０１０１】
植物抽出物添加２４時間後、培養上清を除去し、ハンクス平衡塩溶液（ナカライテスク社製）へ交換し、ＵＶＢ（積算光量約５．７ｍＪ／ｃｍ２）を照射した。照射後、上記植物抽出物のＤＭＳＯ溶液を添加した新鮮な１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地（植物抽出物の最終濃度は１０μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯの最終濃度は０．１質量％）へ交換し、さらに４８時間培養した。この培養後、細胞からタンパク質抽出試薬に可溶性のタンパク質を回収したものをサンプルとし、タンパク質量あたりのＰＩＭＴ量（ＰＩＭＴ質量／タンパク質の質量）を測定した。ＰＩＭＴ量はＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ−Ｉｓｏａｓｐａｒｔａｔｅ−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＣＭＴ１）（ＣＬＯＵＤ−ＣＬＯＮＥ社製）を用い、添付された説明書にしたがって測定を行った。
本実験では、上記手順で各植物抽出物につきｎ＝３でサンプルを調製した。上記ＰＩＭＴ量の測定は、各サンプルにつき２回ずつ行い、その平均値を測定値とした。各植物抽出物について、この各サンプルの測定値（ｎ＝３）の平均値をＰＩＭＴ量の定量結果とした。【０１０２】
結果を表１及び表２に示す。表１に示す（１）〜（６）の植物抽出物、表２に示す（７）〜（１２）の植物抽出物は、それぞれ同じ試験系で試験を行った。
表１及び表２中、「コントロール」は、ＵＶＢを照射していないコントロールであり、「コントロール（＋ＵＶ）」は、ＵＶＢを照射したコントロールである。表１及び表２において、ＵＶ照射の「−」は、ＵＶＢを照射しなかったことを意味し、「＋」はＵＶ照射したことを意味する。表中、「＊」及び「＊＊」は、「コントロール（＋ＵＶ）」に対する有意差を示す（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。【０１０３】
ＰＩＭＴの定量結果は、ＵＶＢ照射したコントロール（コントロール（＋ＵＶ））のタンパク質量あたりのＰＩＭＴ量（ＰＩＭＴ発現量）を１００％とする相対値（％）（ＰＩＭＴ発現量（％））として示した。また、ＵＶＢ照射によるＰＩＭＴ発現量の低下に対して、植物抽出物がどれだけ回復作用を示すかを、「回復率（％）」として示した。回復率（％）は、ＵＶ照射なしのコントロールのＰＩＭＴ発現量（Ｃ０）、ＵＶ照射したコントロールのＰＩＭＴ発現量（Ｃ１）及び各植物抽出物を添加した細胞のＰＩＭＴ発現量（Ｓ）から、以下の計算により求めた。
回復率（％）＝１００×（（Ｓ）−（Ｃ１））／（（Ｃ０）−（Ｃ１））【０１０４】
植物抽出物を添加せずＵＶＢ照射を行った細胞（コントロール（＋ＵＶ））では、顕著にＰＩＭＴ発現量が低下した。また、エンメイソウ、シソ、シラカバ、ユズ、セージ、ダイズ、アルニカ、ショウブ、ラベンダー、モモ、ホップの各抽出物を添加した細胞では、これらの植物抽出物を添加せず、ＵＶＢ照射を行った細胞についての結果と比較し、ＰＩＭＴ発現量が多かった。特にシラカバ、ダイズ、ショウブ、ラベンダー、モモ、ホップ、セージ、エンメイソウから得られた抽出物はその作用が顕著であった。シラカバ、ダイズ、エンメイソウ、セージ、ラベンダーの抽出物は、コントロール（＋ＵＶ）に対する有意差が認められた。【０１０５】
【表１】
2018124002.tif 000002
【０１０６】
【表２】
2018124002.tif 000003
【０１０７】
＜試験例６＞
植物抽出物添加による皮膚細胞におけるＰＩＭＴ発現量の変化
調製例１で調製したシラカバ抽出物、セージ抽出物、ダイズ抽出物、エンメイソウ抽出物、ラベンダー抽出物を用いて、以下の評価を行った。
試験例５と同じ方法で、新生児由来ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ−ＮＢ：クラボウ株式会社より購入）をコンフルエントになるまで培養した。
その後、得られた細胞に各植物抽出物を１０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４時間培養した。尚、培地は、ＦＢＳ無添加のα−ＭＥＭ培地を用い、植物抽出物はＤＭＳＯに溶解し、培地中のＤＭＳＯの最終濃度が０．１質量％となるように添加した。コントロールには０．１質量％ＤＭＳＯを含む培地を用いた。
植物抽出物添加２４時間後、培養上清を除去し、上記植物抽出物のＤＭＳＯ溶液を添加した新鮮な１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地（植物抽出物の最終濃度は１０μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯの最終濃度は０．１質量％）へ交換し、さらに２４時間培養した。この培養後、細胞からタンパク質抽出試薬に可溶性のタンパク質を回収したものをサンプルとし、試験例５と同じ方法で、タンパク質量あたりのＰＩＭＴ量（ＰＩＭＴ質量／タンパク質の質量）を測定した。
本実験では、上記手順で各植物抽出物につきｎ＝３又はｎ＝４でサンプルを調製した。ＰＩＭＴ量の測定は、各サンプルにつき２回ずつ行い、その平均値を各サンプルの測定値とした。各植物抽出物について、この各サンプルの測定値（ｎ＝３又はｎ＝４）の平均値をＰＩＭＴ量の定量結果とした。【０１０８】
結果を表３に示す。表３は、各植物抽出物を添加した場合の、コントロールのＰＩＭＴ発現量を１００％とする相対値（％）（ＰＩＭＴ発現量（％））を示した。表３中、「＊」は、コントロールに対する有意差を示す（＊：ｐ＜０．０５）。【０１０９】
【表３】
2018124002.tif 000004
【０１１０】
表３に示すように、皮膚細胞にシラカバ、セージ、ダイズ、エンメイソウ及びラベンダーの各抽出物を添加すると、コントロールと比較して、ＰＩＭＴの発現量が増加した。この結果は、これらの植物の抽出物が、皮膚におけるＰＩＭＴの活性化作用を有することを示す。シラカバ抽出物は、コントロールに対する有意差が認められた。【０１１１】
＜試験例７＞
植物抽出物添加による皮膚細胞におけるＰＩＭＴ発現量の変化
新生児由来ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ−ＮＢ：クラボウ株式会社より購入）に調製例１で調製したブドウ抽出物を添加したときの、ヒト皮膚におけるＰＩＭＴのタンパク質発現量について評価した。【０１１２】
試験例５と同じ方法で、細胞をコンフルエントになるまで培養した。その後、得られた細胞にブドウ抽出物を２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬの濃度で添加し２４時間培養した。尚、培地は、ＦＢＳ無添加のα−ＭＥＭ培地を用い、ブドウ抽出物はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、培地中のＤＭＳＯの最終濃度が０．１質量％となるように添加した。コントロールには０．１質量％ＤＭＳＯを含む培地を用いた。【０１１３】
ブドウ抽出物添加２４時間後、培養上清を除去し、ハンクス平衡塩溶液（ナカライテスク社製）へ交換し、ＵＶＢ（積算光量約５．７ｍＪ／ｃｍ２）を照射した。照射後、ブドウ抽出物のＤＭＳＯ溶液を添加した新鮮な１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地（ブドウ抽出物の最終濃度は２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯの最終濃度は０．１質量％）へ交換し、さらに４８時間培養した。この培養後、細胞からタンパク質抽出試薬に可溶性のタンパク質を回収したものをサンプルとし、試験例５と同じ方法で、タンパク質量あたりのＰＩＭＴ量（ＰＩＭＴ質量／タンパク質の質量）を測定した。
本実験では、上記手順で各植物抽出物につきｎ＝４でサンプルを調製した。ＰＩＭＴ量の測定は、各サンプルにつき２回ずつ行い、その平均値を各サンプルの測定値とした。各植物抽出物について、この各サンプルの測定値（ｎ＝４）の平均値をＰＩＭＴ量の定量結果とした。【０１１４】
表４に結果を示す。表４中、「コントロール」は、ＵＶＢを照射していないコントロールであり、「コントロール（＋ＵＶ）」は、ＵＶＢを照射したコントロールである。表４において、ＵＶ照射の「−」は、ＵＶＢを照射しなかったことを意味し、「＋」はＵＶ照射したことを意味する。「＊＊」は、「コントロール（＋ＵＶ）」に対する有意差を示す（＊＊：ｐ＜０．０１）。【０１１５】
ＰＩＭＴの定量結果は、ＵＶＢ照射したコントロール（コントロール（＋ＵＶ））のタンパク質量あたりのＰＩＭＴ量（ＰＩＭＴ発現量）を１００％とする相対値（％）（ＰＩＭＴ発現量（％））として示した。また、ＵＶＢ照射によるＰＩＭＴ発現量の低下に対して、ブドウ抽出物がどれだけ回復作用を示すかを、「回復率（％）」として示した。回復率（％）は、試験例５と同じ方法で求めた。【０１１６】
【表４】
2018124002.tif 000005
【０１１７】
ブドウ抽出物を添加した細胞では、該抽出物を添加せず、ＵＶＢ照射を行った細胞と比較し、ＰＩＭＴ発現量が多かった。ブドウ抽出物が、ＵＶＢ照射によるＰＩＭＴ発現量の低下を抑制することが示された。【０１１８】
＜試験例８＞
試験例５と同じ方法で、新生児由来ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ−ＮＢ：クラボウ株式会社より購入）をコンフルエントになるまで培養した。
その後、得られた細胞に調製例１で調製したブドウ抽出物を２．５μｇ／ｍＬ又は５μｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４時間培養した。尚、培地は、ＦＢＳ無添加のα−ＭＥＭ培地を用い、ブドウ抽出物はＤＭＳＯに溶解し、培地中のＤＭＳＯの最終濃度が０．１質量％となるように添加した。コントロールには０．１質量％ＤＭＳＯを含む培地を用いた。
ブドウ抽出物添加２４時間後、培養上清を除去し、ブドウ抽出物のＤＭＳＯ溶液を添加した新鮮な１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地（ブドウ抽出物の最終濃度は２．５μｇ／ｍＬ又は５μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯの最終濃度は０．１質量％）へ交換し、さらに２４時間培養した。この培養後、細胞からタンパク質抽出試薬に可溶性のタンパク質を回収したものをサンプルとし、試験例５と同じ方法で、タンパク質量あたりのＰＩＭＴ量（ＰＩＭＴ質量／タンパク質の質量）を測定した。
本実験では、上記手順で各濃度のブドウ抽出物につきｎ＝５でサンプルを調製した。ＰＩＭＴ量の測定は、各サンプルにつき２回ずつ行い、その平均値を各サンプルの測定値とした。この各サンプルの測定値（ｎ＝５）の平均値をＰＩＭＴ量の定量結果とした。【０１１９】
結果を表５に示す。表５は、ブドウ抽出物を添加した場合の、コントロールのＰＩＭＴ発現量を１００％とする相対値（％）（ＰＩＭＴ発現量（％））で示した。表５中、「＊」は、コントロールに対する有意差を示す（＊：ｐ＜０．０５）。皮膚細胞にブドウ抽出物を添加すると、コントロールと比較して、ＰＩＭＴの発現量が有意に増加した。【０１２０】
【表５】
2018124002.tif 000006
【０１２１】
シラカバ、ブドウ、ダイズ、ホップ、ラベンダー、セージ、エンメイソウ、ユズ、シソ、ショウブ、アルニカ及びモモの各植物の抽出物を配合した化粧料、飲食品の製造例を以下に示す。これらの化粧料、飲食品は、ＰＩＭＴ活性化用の化粧料又は飲食品として使用可能であり、特に、皮膚に存在するＰＩＭＴ活性化用の化粧料又は飲食品として好適である。また、これらの化粧料、飲食品は、異性化タンパク質の復元又は修復促進用化粧料又は飲食品としても使用可能であり、皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復促進用化粧料又は飲食品としても好適に使用することができる。【０１２２】
製造例１〜３で使用した植物抽出物は、調製例１で得た各植物（シラカバ、ブドウ、ホップ、ラベンダー、セージ、エンメイソウ、ユズ、ショウブ、アルニカ又はモモ）のエタノール抽出液、シソのブチレングリコール抽出液又はダイズ水抽出液を、それぞれ固形分濃度０．１２質量／体積％に濃縮したものである。製造例４の植物抽出物には、調製例１で得た各植物抽出物（上記各植物のエタノール抽出液、シソのブチレングリコール抽出液又はダイズ水抽出液を凍結乾燥した粉末）をそれぞれ使用した。製造例１〜４では、植物抽出物として、シラカバ、ブドウ、ホップ、ラベンダー、セージ、エンメイソウ、ユズ、シソ、ショウブ、アルニカ、モモ及びダイズの各抽出物を使用したが、これらの２以上の植物の抽出物を組み合わせて使用することも可能である。【０１２３】
＜製造例１＞
化粧水
表６に記載の原料を均一に撹拌して、ＰＩＭＴ活性化用化粧水を調製した。【０１２４】
【表６】
2018124002.tif 000007
【０１２５】
＜製造例２＞
乳液
表７に記載の原料を均一に撹拌して、ＰＩＭＴ活性化用乳液を調製した。【０１２６】
【表７】
2018124002.tif 000008
【０１２７】
＜製造例３＞
クリーム
表８に記載の原料を均一に撹拌して、ＰＩＭＴ活性化用クリームを調製した。【０１２８】
【表８】
2018124002.tif 000009
【０１２９】
＜製造例４＞
用時溶解用粉末
表９に記載の原料を均一に撹拌して、ＰＩＭＴ活性化用粉末を調製した。用時溶解用粉末は、例えば、水、コーヒー、紅茶、ジュース等の飲料に溶解させて、又は、ヨーグルト等の食品に混ぜて使用することができる。【０１３０】
【表９】
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【０１３１】
＜試験例９＞
皮膚細胞におけるＰＩＭＴの発現量又は活性を指標として、皮膚に存在するＰＩＭＴの活性化作用を有する物質、皮膚の復元若しくは修復促進作用を有する物質、又は、皮膚の抗老化作用を有する物質をスクリーニングすることができる。
試験例５〜８のいずれかに記載の評価方法において、植物抽出物の代わりに任意の被験物質を使用して、該被験物質を添加したときの皮膚細胞におけるＰＩＭＴ発現量について評価する。
被験物質を添加して培養した細胞のＰＩＭＴ発現量（タンパク質量あたりのＰＩＭＴ量）が、被験物質を添加せずに培養した細胞（コントロール）のＰＩＭＴ発現量と比較して多い場合に、該被験物質を有効成分として選択する。有効成分として選択された被験物質は、皮膚に存在するＰＩＭＴの活性化、皮膚の復元若しくは修復促進、又は、皮膚の抗老化のための有効成分として使用することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明は、医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品等の分野において有用である。
【図１】
2018124002.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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