(57)【要約】【解決課題】  細胞質に集積する新規な近赤外蛍光プローブを提供すること。【解決手段】  以下の一般式（Ｉ）：2018101456.tif 000073で表される化合物又はその塩。
2018101456.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）：
2018101456.tif 000069
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１〜４個の同一又は異なる一価の置換基を示し、Ｒ１は、同一であっても異なっていてもよく；
Ｒ２は、アニオン性官能基、炭素数１〜１０のアルキル基又は炭素数１〜１０のアルコキシ基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｘは、ＳｉＲ１１Ｒ１２、ＧｅＲ１１Ｒ１２、ＳｎＲ１１Ｒ１２、ＣＲ１１Ｒ１２、ＳＯ２、又はＰＯＲ１３であり、
Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示し、
Ｒ１３は、炭素数１〜６のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基を示し；
Ｒ７は、炭素数１〜６個のアルキレン基を示し；
Ｒ８は、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ８は、Ｒ５と一緒になって、Ｒ８が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ９又はＲ１０、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ４、Ｒ６と一緒になって、Ｒ９、Ｒ１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｙは、存在する場合は、スペーサーを示し：
Ｌは、測定対象物質に対する捕捉基として作用する置換基を示す）
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｒ２のアニオン性官能基は、水酸基、カルボキシ基、スルホ基、炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基、カルボキシ基を有する炭素数１〜１０のアルキル基、又はカルボキシ基を有する炭素数１〜１０のアルコキシ基から選択される、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
前記捕捉基が、プロトン、金属イオン、低酸素環境、活性酸素種、一酸化窒素、過酸化水素、一重項酸素又はｐＨ環境を捕捉するための捕捉基である、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
前記金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン又はカルシウムイオンから選択される、請求項３に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
前記捕捉基が、カルシウムイオンを捕捉するための捕捉基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
Ｙは、アミド、エステル又はチオウレアである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項７】
Ｌが以下の一般式（１）で表されるカルシウムイオンを捕捉するための捕捉基である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
2018101456.tif 000070
（式中、Ｒ２０１、Ｒ２０２、Ｒ２０３及びＲ２０４は、それぞれ独立に、カルボキシ基、カルボキシ基を有するアルキル基、エステル基、置換されていてもよいアルキルエステル基、又はこれらの塩を示し；
Ｒ２０５、Ｒ２０６及びＲ２０７は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、メトキシ基又はニトロ基を示し；
Ｒ２０８は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す。）
【請求項８】
Ｌが以下の式（２）： 
2018101456.tif 000071
（式中、Ｒは、水素又は−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ３であり、各Ｒは同一あっても異なっていてもよく：
Ｒ’は、メチル基、メトキシ基又はフッ素原子である）
で表されるカルシウムイオンを捕捉するための捕捉基である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項９】
Ｒ２は、カルボキシ基である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項１０】
Ｒ７は、メチレン基又はエチレン基から選択され、Ｒ８は、メチル基又はエチル基から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項１１】
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項１２】
Ｒ７は、メチレン基であり、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はいずれもメチル基である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項１３】
Ｒ１は何れも水素原子である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項１４】
以下の式（３）で表される化合物又はその塩。
2018101456.tif 000072
（式中、Ｒは、水素又は−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ３であり、各Ｒは同一であっても異なっていてもよく：
Ｒ’は、メチル基、メトキシ基又はフッ素原子であり、Ｒ１は一般式（Ｉ）で定義した通りである。）
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
【請求項１６】
測定対象物質の測定方法であって、下記の工程：
（ａ）請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩と測定対象物質とを接触させる工程、及び
（ｂ）上記工程（ａ）で生成した測定対象物質の捕捉後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。
【請求項１７】
前記測定対象物質がカルシウムイオンである、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な蛍光プローブに関するものであり、より具体的には、新規な深赤色蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
カルシウムイオン（Ｃａ２＋）は生体内におけるセカンドメッセンジャーとして重要な役割を担っている（非特許文献１）。生理的条件下において細胞質のＣａ２＋濃度は〜１００ｎＭの低濃度に保たれているが、刺激に応じて細胞外もしくは小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリアなどのＣａ２＋ストアから細胞質へＣａ２＋が流入し、カルモジュリンをはじめとするＣａ２＋結合タンパク質と相互作用することで様々な生体応答を惹起する。特に細胞質におけるＣａ２＋の濃度変動は心筋、骨格筋などの筋肉の収縮、神経伝達に伴う自然発火、膵臓における酵素分泌など多岐に渡る生命現象の調節機構に関与しており、細胞質におけるカルシウム濃度変動を追跡するツールは生物研究において非常に重要である。【０００３】
これまでに時間依存的に生じるカルシウムの濃度変動を追跡する手法として、Ｃａ２＋蛍光イメージングプローブによる可視化観察がなされてきた。汎用されているキサンテン系色素を母核とした蛍光プローブを図１に挙げる（非特許文献２、３）。
Ｃａ２＋蛍光プローブは、蛍光団部位とＣａ２＋と配位結合するＢＡＰＴＡ（１，２−ｂｉｓ（ｏ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｘｙ）ｅｔｈａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）と呼ばれるキレーター部位からなっている。Ｒｈｏｄ−２を除き、蛍光母核にはフルオレセイン誘導体を用いられている。これらプローブは細胞質に集積する特徴があり、細胞内の生理機能に関与するＣａ２＋を感度良く検出するために適した特徴であるといえる。
一方、ローダミンを母核にしているＲｈｏｄ−２はフルオレセインを母核にしたものより長い波長を持つ。しかしながら、このプローブは他のローダミン類の例にもれずミトコンドリアへの局在性を示すため、ミトコンドリアのＣａ２＋濃度を測定するために使用されている。【０００４】
近年、本発明者等により、キサンテン環１０位のＯ原子をＳｉ原子に置換した色素を母核としたＣａ２＋プローブＣａＴＭ−２（非特許文献４）及びＣａＳｉＲ−１（非特許文献５）が開発された。フルオレセイン類縁体を蛍光団に持つＣａＴＭ−２は赤色蛍光を有し、細胞質へと集積する。一方、Ｓｉ−ローダミンを蛍光団に持つＣａＳｉＲ−１は近赤外光領域に蛍光を有する一方でリソソームへの局在性を示す。【０００５】
以上のように、様々な生理的イベントの引き金となる細胞質のカルシウム濃度変動を可視化するためには、現状フルオレセイン類縁体を蛍光母核としたプローブを用いる必要があり、ローダミン類を母核としたプローブは各種オルガネラ内のカルシウム濃度変動を観察するために用いられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Clapham D.E., Cell, 2007, 131, 1047-1058.
【非特許文献２】Minta A., Kao J.P.Y., Tsein R.Y., J. Biol. Chem., 1989, 264, 8171.
【非特許文献３】Johnson I., Spence M.T.Z., Ed. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11th Ed. Molecular Probes, Inc. 2010.
【非特許文献４】Egawa T., Hirabayashi K., Koide Y., Kobayashi C., Takahashi N., Mineno T., Terai T., Ueno T., Komatsu T., Ikegaya Y., Matsuki N., Nagano T., Hanaoka K., Angew. Chem. Int. Ed., 2013, 52, 3874-3877.
【非特許文献５】Egawa T., Hanaoka K., Koide Y., Ujita S., Takahashi N., Ikegaya Y., Matsuki N., Terai T., Ueno T., Komatsu T., Nagano T., J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 14157-14159.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細胞質に集積する新規な近赤外蛍光プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ローダミン類はその波長の長さが特長であり、フルオレセイン類縁体では到達できない、近赤外領域で蛍光を有するプローブの開発が可能であり、マルチカラーイメージングにおける新たなカラーウインドウを提供することができる。
そこで本発明者らは、ローダミン類を蛍光母核としてＣａＳｉＲ−１のように近赤外領域に蛍光を有し、細胞質に集積して、カルシウムイオン等の生体内の金属イオン等の濃度変動を可視化することができる、実用的な蛍光プローブを開発する検討を行った。【０００９】
ローダミン類を蛍光母核としたＣａ２＋プローブは、キサンテン環が有するカチオン性によりミトコンドリアやリソソームへの集積を示してしまい、細胞内のＣａ２＋等の生体内の金属イオン濃度が大きく変動する細胞質へと集積させることができない。そこで、本発明者等は、分子デザインとして蛍光色素分子全体の電荷を０にすることにより、カチオン性に由来していたミトコンドリアのような特定の細胞内小器官への集積を抑制し、より細胞質に留まるＳｉ等のローダミン類が開発可能であると考え、ベンゼン環部位にカルボン酸等のアニオン性官能基の導入を行った。【００１０】
更に、本発明者等は、Ｃａ２＋キレーターとして知られるＢＡＰＴＡ構造のカルボン酸をアセトキシメチル基（ＡＭ基）で保護した構造をローダミンと結合させることで、細胞質集積性を示すＣａ２＋プローブを開発できるのではと考え、ローダミン色素とＢＡＰＴＡ構造を結合させた種々の化合物を合成した結果、キサンテン環の窒素原子から伸長させたリンカーを介して結合させた化合物が高いＳ／Ｎ比を示すことを見出し、本発明を完成した。【００１１】
即ち、本発明は、
［１］以下の一般式（Ｉ）：
2018101456.tif 000003
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１〜４個の同一又は異なる一価の置換基を示し、Ｒ１は、同一であっても異なっていてもよく；
Ｒ２は、アニオン性官能基、炭素数１〜１０のアルキル基又は炭素数１〜１０のアルコキシ基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｘは、ＳｉＲ１１Ｒ１２、ＧｅＲ１１Ｒ１２、ＳｎＲ１１Ｒ１２、ＣＲ１１Ｒ１２、ＳＯ２、又はＰＯＲ１３であり、
Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示し、
Ｒ１３は、炭素数１〜６のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基を示し；
Ｒ７は、炭素数１〜６個のアルキレン基を示し；
Ｒ８は、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ８は、Ｒ５と一緒になって、Ｒ８が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ９又はＲ１０、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ４、Ｒ６と一緒になって、Ｒ９、Ｒ１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｙは、存在する場合は、スペーサーを示し：
Ｌは、測定対象物質に対する捕捉基として作用する置換基を示す）
で表される化合物又はその塩。
［２］Ｒ２のアニオン性官能基は、水酸基、カルボキシ基、スルホ基、炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基、カルボキシ基を有する炭素数１〜１０のアルキル基、又はカルボキシ基を有する炭素数１〜１０のアルコキシ基から選択される、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］前記捕捉基が、プロトン、金属イオン、低酸素環境、活性酸素種、一酸化窒素、過酸化水素、一重項酸素又はｐＨ環境を捕捉するための捕捉基である、［１］又は［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］前記金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン又はカルシウムイオンから選択される、［３］に記載の化合物又はその塩。
［５］前記捕捉基が、カルシウムイオンを捕捉するための捕捉基である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［６］Ｙは、アミド、エステル又はチオウレアである、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［７］Ｌが以下の一般式（１）で表されるカルシウムイオンを捕捉するための捕捉基である、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
2018101456.tif 000004
（式中、Ｒ２０１、Ｒ２０２、Ｒ２０３及びＲ２０４は、それぞれ独立に、カルボキシ基、カルボキシ基を有するアルキル基、エステル基、置換されていてもよいアルキルエステル基、又はこれらの塩を示し；
Ｒ２０５、Ｒ２０６及びＲ２０７は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、メトキシ基又はニトロ基を示し；
Ｒ２０８は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す。）
［８］Ｌが以下の式（２）： 
2018101456.tif 000005
（式中、Ｒは、水素又は−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ３であり、各Ｒは同一あっても異なっていてもよく：
Ｒ’は、メチル基、メトキシ基又はフッ素原子である）
で表されるカルシウムイオンを捕捉するための捕捉基である、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［９］Ｒ２は、カルボキシ基である、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［１０］Ｒ７は、メチレン基又はエチレン基から選択され、Ｒ８は、メチル基又はエチル基から選択される、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［１１］Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基から選択される、［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［１２］Ｒ７は、メチレン基であり、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はいずれもメチル基である、［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［１３］Ｒ１は何れも水素原子である、［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［１４］以下の式（３）で表される化合物又はその塩。
2018101456.tif 000006
（式中、Ｒは、水素又は−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ３であり、各Ｒは同一であっても異なっていてもよく：
Ｒ’は、メチル基、メトキシ基又はフッ素原子であり、Ｒ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りである。）
［１５］［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
［１６］測定対象物質の測定方法であって、下記の工程：
（ａ）［１］〜［１５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩と測定対象物質とを接触させる工程、及び
（ｂ）上記工程（ａ）で生成した測定対象物質の捕捉後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。
［１７］前記測定対象物質がカルシウムイオンである、［１６］に記載の方法。
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、細胞質に集積する近赤外蛍光プローブを提供することが可能である。
また、本発明により、Ｃａ２＋キレーターのＢＡＰＴＡ構造のカルボン酸をアセトキシメチル基（ＡＭ基）で保護した構造を、ローダミン色素のキサンテン環の窒素原子から伸長させたリンカーを介して結合させることで、生細胞イメージングにおいても、細胞質集積性が高く、高いＳ／Ｎ比を示すカルシウム蛍光プローブを提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】従来のキサンテン系色素を母核とした蛍光プローブ
【図２】種々のＳｉ−ローダミン類を用いた蛍光イメージングの結果
【図３】カルボン酸を有するＳｉ−ローダミンのＸ線結晶構造解析の結果
【図４】サイトゾルに局在化したＳｉ−ローダミンの模式図.
【図５】ベンゼン環部位２位がメチル基に置換されたＳｉ−ローダミンを用いた蛍光イメージングの結果
【図６】光励起電子移動（ＰｅＴ）によるＣａＳｉＲ−１ の蛍光制御の原理
【図７】化合物Ａ〜ＣのＣａ２＋プローブとしての評価結果
【図８】ＣａＳｉＲ−２ＡＭを用いたＨｅＬａ細胞における蛍光イメージングの結果
【図９】ＣａＳｉＲ−２ＡＭを利用したＨｅＬａ細胞におけるｈｉｓｔａｍｉｎｅまたはＡＴＰの視覚化、及び誘発カルシウムオシレーションの結果。
【図１０】ＣａＳｉＲ−１ＡＭを利用したＨｅＬａ細胞におけるｈｉｓｔａｍｉｎｅまたはＡＴＰの視覚化、及び誘発カルシウムオシレーションの結果。
【図１１】ＣａＳｉＲ−２ＡＭ及びＣａＳｉＲ−１ＡＭのラット脳スライスにおけるＣａ２＋イメージングの結果。
【図１２】ＣａＳｉＲ−１のラット脳スライスにおける共染色による蛍光イメージングの結果。
【図１３】ＣａＳｉＲ−１で培養したラット脳スライスのサイトゾル、リソソーム及び全細胞の蛍光トレース。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個、更に好ましくは炭素数１〜３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。
【００１５】
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
【００１６】
本発明の１つの実施態様は、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
2018101456.tif 000007
【００１７】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１〜４個の同一又は異なる一価の置換基を示す。Ｒ１は、同一であっても異なっていてもよい。
Ｒ１がベンゼン環上に存在する一価の置換基を示す場合には、ベンゼン環上に同一又は異なる置換基が１ないし２個程度存在していることが好ましい。
Ｒ１が１個又は２個以上の一価の置換基を示す場合には、該置換基はベンゼン環上の任意の位置に置換することができる。好ましくは、Ｒ１の全てが水素原子であるか、Ｒ１の１つが一価の置換基であり、それ以外のＲ１は水素原子である。
【００１８】
Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、アミノ基及び測定対象物質に対する捕捉基として作用する置換基からなる群から選択される。
Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
Ｒ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基又はアミノアルキル基などであってもよい。
Ｒ１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよく、Ｒ１が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基（例えば、４−カルボキシブトキシ基又は４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基など）であってもよい。
【００１９】
Ｒ１の捕捉基の測定対象物質の種類は特に限定されず、例えば、プロトン、金属イオン（例えば、ナトリウムイオンやリチウムイオンなどのアルカリ金属イオン、カルシウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオンなど）、非金属イオン（炭酸イオンや水酸イオンなど）、低酸素環境、活性酸素種（例えば、ヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸、過酸化水素など）、一酸化窒素、過酸化水素、一重項酸素、ｐＨ環境又は酵素などのいずれであってもよい。
Ｒ１の捕捉基は、好ましくは、プロトン、金属イオン、低酸素環境、活性酸素種、一酸化窒素、過酸化水素、一重項酸素又はｐＨ環境を捕捉するための捕捉基である。
ここで、金属イオンとしては、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン又はカルシウムイオンから選択される。好ましくは、金属イオンは、カルシウムイオンである。
【００２０】
Ｒ１の捕捉基の具体的な種類は、後述する、Ｌの測定対象物質に対する捕捉基として作用する置換基と同様である。
Ｒ１の捕捉基は、Ｌの捕捉基と同じであっても異なっていてもよい。また、Ｒ１の捕捉基が作用する測定対象物質は、Ｌの捕捉基が作用する測定対象物質と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００２１】
本発明の１つの側面においては、Ｒ１の捕捉基はカルシウムイオンの捕捉基である。また、本発明の１つの側面においては、Ｒ１の捕捉基は、後述する式（１）又は（２）で表されるカルシウムイオンの捕捉基である。
また、本発明の１つの側面においては、Ｒ１及びＬの捕捉基はカルシウムイオンの捕捉基である。また、本発明の１つの側面においては、Ｒ１及びＬの捕捉基は、後述する式（１）又は（２）で表されるカルシウムイオンの捕捉基である。
【００２２】
一つの好ましい側面において、Ｒ１が炭素数１〜６個のアルキル基などの一価の置換基であり、該置換基はベンゼン環上の３位から６位に存在する。
【００２３】
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｒ１は何れも水素原子である。
【００２４】
本発明において、一般式（Ｉ）において、Ｒ２は、アニオン性官能基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基であり、好ましくは、アニオン性官能基である。
理論に拘束されることを意図するものではないが、キサンテン骨格のベンゼン環にアニオン性官能基を導入することによりローダミンのカチオン性を解消することで、カチオン性に由来していたミトコンドリアのような特定の細胞内小器官への集積を抑制し、より細胞質に留まることが可能となる。
また、一般的に分子骨格内に水溶性官能基であるカルボン酸のようなアニオン性官能基を導入すると、細胞膜への透過性を低下させるが、キサンテン骨格のベンゼン環２位にカルボキシ基等のアニオン性官能基導入したローダミンは特定のオルガネラに強く保持されることなく、高い細胞膜透過性を示すことが可能となる。
【００２５】
Ｒ２のアニオン性官能基は、水酸基、カルボキシ基、炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基、カルボキシ基を有する炭素数１〜１０のアルキル基、又はカルボキシ基を有する炭素数１〜１０のアルコキシ基から選択される。
アニオン性官能基として、好ましくは、水酸基、カルボキシ基、スルホ基、カルボキシ基を有する炭素数１〜１０のアルキル基であり、更に好ましくは、カルボキシル基である。
【００２６】
Ｒ２の炭素数１〜１０のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基等が挙げられ、炭素数１〜１０のアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基等が挙げられる。
【００２７】
一般式（Ｉ）において、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。
Ｒ３又はＲ４がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ３又はＲ４が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ３及びＲ４がともに水素原子である場合、又はＲ３及びＲ４がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
【００２８】
一般式（Ｉ）において、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示すが、Ｒ３及びＲ４について説明したものと同様である。Ｒ５及びＲ６が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又は共にフッ素原子であることが好ましい。
【００２９】
一般式（Ｉ）において、Ｘは、ＳｉＲ１１Ｒ１２、ＧｅＲ１１Ｒ１２、ＳｎＲ１１Ｒ１２、ＣＲ１１Ｒ１２、ＳＯ２、又はＰＯＲ１３である。Ｘは、好ましくはＳｉＲ１１Ｒ１２又はＧｅＲ１１Ｒ１２であり、更に好ましくは、ＳｉＲ１１Ｒ１２ある。
【００３０】
Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示す。Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、炭素数１〜３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ１１及びＲ１２がともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ１１及びＲ１２が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１１又はＲ１２が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ１１又はＲ１２がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
【００３１】
Ｒ１３は、炭素数１〜６のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基を示す。フェニル基の置換基としては、メチル基、ヒドロキシ基、メトキシ基などが挙げられる。
合成上のし易さの点から、Ｒ１３は、好ましくはメチル基又はフェニル基である。また、Ｒ１３がメチル基である方が水溶性が高いため、より好ましい。
【００３２】
一般式（Ｉ）において、Ｒ８は、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す。
また、Ｒ８は、Ｒ５と一緒になって、Ｒ８が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基（ベンジル基、フェネチル基等）、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｒ８は、メチル基又はエチル基から選択される。
【００３４】
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す。
【００３５】
また、Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。ヘテロシクリルとしては、アゼチジン、ピロリジン等があげられ、これらヘテロシクリルは炭素数１〜６個のアルキル等の置換基で置換されていてもよい。
【００３６】
また、Ｒ９又はＲ１０、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ４、Ｒ６と一緒になって、Ｒ９、Ｒ１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基（ベンジル基、フェネチル基等）、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基から選択される。
【００３８】
本発明においては、一般式（Ｉ）において、測定対象物質に対する捕捉基として作用する置換基（捕捉基）であるＬが、キサンテン環の窒素原子を介して伸長させたリンカー（Ｒ７−Ｙ）を介して結合した構造を有することが重要である。
理論に拘束されることを意図するものではないが、捕捉基は、キサンテン環に結合したベンゼン環に導入することも可能ではあるが、例えば、Ｃａ２＋プローブの捕捉基に好適に用いられるＢＡＰＴＡ部位とキサンテン環の距離が短い（ＢＡＰＴＡ構造とキサンテン環との間の結合数が少ない）ほど、Ｃａ２＋非存在下においてＰｅＴ（光誘起電子移動）によりよく消光することで、高いＳ／Ｎ比を示すことが可能である。
【００３９】
一般式（Ｉ）において、Ｒ７は、炭素数１〜６個のアルキレン基を示し、アルキレン基は置換基（例えば、ヒドロキシ基、メトキシ基）を有していてもよい。Ｒ７は、好ましくはメチレン基又はエチレン基である。
【００４０】
一般式（Ｉ）において、Ｙは、存在する場合は、Ｌとベンゼン環とを結合するスペーサーを示す。スペーサーとしては、アミド（−ＣＯ−ＮＨ−）、エステル（−ＣＯＯ−）、チオウレア等を用いることができるが、アミド又はエステルが好ましく、アミドがより好ましい。
【００４１】
一般式（Ｉ）において、Ｌは、測定対象物質に対する捕捉基として作用する置換基を示す。
測定対象物質の種類は特に限定されず、例えば、プロトン、金属イオン（例えば、ナトリウムイオンやリチウムイオンなどのアルカリ金属イオン、カルシウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオンなど）、非金属イオン（炭酸イオンや水酸イオンなど）、低酸素環境、活性酸素種（例えば、ヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸、過酸化水素など）、一酸化窒素、過酸化水素、一重項酸素、ｐＨ環境又は酵素などのいずれであってもよいが、本発明においては、好ましくは、プロトン、金属イオン、低酸素環境、活性酸素種、一酸化窒素、過酸化水素、一重項酸素又はｐＨ環境であり、更に好ましくは、金属イオンである。
【００４２】
金属イオンとしては、好ましくは、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン又はカルシウムイオンから選択され、更に好ましくは、カルシウムイオンである。
【００４３】
測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉基は種々提案されており、測定対象物質の種類に応じて適宜選択可能である。例えば、特開平１０−２２６６８８号公報、国際公開ＷＯ９９／５１５８６、特開２０００−２３９２７２号公報、国際公開ＷＯ０１／６２７５５などのほか、モレキュラープローブス社のカタログ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ １１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）の第１０章（酵素基質と分析）、第１７章シグナル伝達プローブ）、第１８章（一酸化窒素を含む活性酸素種プローブ）、第１９章（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、及び他の金属イオンインディケーター）、第２０章（ｐＨインディケーター）、及び第２１章（ナトリウムイオン、カリウムイオン、塩素イオン、及び他のイオン）に記載された捕捉基を用いることもできる。もっとも、捕捉基は上記刊行物に記載されたものに限定されることはない。
【００４４】
本明細書において「捕捉」という用語は、捕捉基が実質的に化学変化を起こさずに金属イオンなどをキレート化などにより捕捉する場合のほか、測定対象物質との化学反応により化学構造が変化する場合、酵素との接触によって捕捉基が切断されて脱離する場合を含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【００４５】
捕捉基としては、例えば、下記の（Ａ）から（Ｋ）で表される捕捉基が挙げられるが、本発明において使用可能な捕捉基はこれらに限定されることはない。
【００４６】
（Ａ）亜鉛イオンの捕捉基
（Ａ−１）
2018101456.tif 000008
（式中、Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、及びＲ１０４はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、２−ピリジルメチル基、２−ピリジルエチル基、２−メチル−６−ピリジルメチル基、又は２−メチル−６−ピリジルエチル基を示すが、Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、及びＲ１０４からなる群から選ばれる基のうち少なくとも１つは２−ピリジルメチル基、２−ピリジルエチル基、２−メチル−６−ピリジルメチル基、及び２−メチル−６−ピリジルエチル基からなる群から選ばれる基を示し；Ｒ１０５は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し；ｍ及びｎはそれぞれ独立に０又は１を示すが、ｍ及びｎが同時に０となることはない）で表される捕捉基。
上記の捕捉基は特許４４０２１９１号公報及びＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７，ｐｐ．１０１９７−１０２０４，２００５に開示されている。
上記の捕捉基の好適な例としては、以下の式で表される捕捉基が挙げられる。
2018101456.tif 000009
【００４７】
また、これらの捕捉基は、後述するように、例えば−ＣＯ−ＮＨ−などのスペーサーを介してベンゼン環に結合していてもよい。例えば、式（a-1-1)の捕捉基が−ＣＯ−ＮＨ−のスペーサーを介してベンゼン環に結合する場合は以下の式で表される。
2018101456.tif 000010
【００４８】
（Ａ−２）
2018101456.tif 000011
（式中、Ｒ１１１、Ｒ１１２及びＲ１３３はそれぞれ独立にカルボキシ基及びその塩を示し、Ｒ１１４は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基はＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４，ｐｐ．７７６−７７８，２００２に開示されている。
【００４９】
（Ａ−３）
2018101456.tif 000012
（式中、Ｒ１１５は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基は米国特許第５６４８２７０号明細書に記載されている。
【００５０】
（Ａ−４）
2018101456.tif 000013
（式中、Ｒ１２１及びＲ１２２はそれぞれ独立にカルボキシ基及びその塩を示し；
Ｒ１２３はＣ１−６アルキル基を示し；Ｒ１２４はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる水素原子を含む一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基はＣｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ，３１，ｐｐ．２４５−２５１，２００２に開示されている。
【００５１】
（Ａ−５）
2018101456.tif 000014
（式中、Ｒ１２５は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる水素原子を含む一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基は特開２０００−２３９２７２号公報に開示されている。
【００５２】
（Ｂ）一酸化窒素の捕捉基
2018101456.tif 000015
（式中、Ｒ１３１及びＲ１３２はベンゼン環上の隣接した位置に置換する置換基を示し、それぞれ独立にアミノ基又はＣ１−６アルキルモノ置換アミノ基を示すが、Ｒ１３１及びＲ１３２が同時にＣ１−６アルキルモノ置換アミノ基を示すことはなく；Ｒ１３３は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基は特許第３２０００２４号公報、米国特許第６４４１１９７号明細書、米国特許第６７５６２３号明細書、及び特許第３９６７９４３号公報に開示されている。
【００５３】
（Ｃ）活性酸素種の捕捉基
2018101456.tif 000016
（式中、Ｒ１４１はアミノ基又はヒドロキシ基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基は国際公開ＷＯ２００１／０６４６６４号公報に開示されている。
【００５４】
（Ｄ）低酸素環境の捕捉基
（Ｄ−１）
2018101456.tif 000017
［式中、Ｒ１５１及びＲ１５２はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数１ないし６個のアルキル基を示し、Ｒ１５１及びＲ１５２は互いに結合して炭素数２ないし６個のアルキレン基となってもよく；Ｙ１は炭素数１ないし６個のアルキレン基を示し；Ｘ１は単結合、−ＣＯ−、又は−ＳＯ２−を示し；Ｘ２は−Ｏ−Ｙ２−Ｎ（Ｒ１５４）−（式中、Ｙ２は炭素数１ないし６個のアルキレン基を示し、Ｒ１５４は水素原子又は炭素数１ないし６個のアルキル基を示す）を示し；ｒは０又は１を示し；ｐ−Ｃ６Ｈ４−はｐ−フェニレン基を示し；Ａｒはアリールジイル基を示し；Ｒ１５３はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基を示す］
で表される捕捉基。
上記の捕捉基は国際公開ＷＯ２０１０／０２６７４３に開示されている。
【００５５】
（Ｄ−２）
2018101456.tif 000018
上記の捕捉基は特開２００９−２７５００６号公報に開示されている。
【００５６】
（Ｅ）過酸化水素の捕捉基
2018101456.tif 000019
（式中、Ｒ１６１はベンゼン環上に存在する１個又は２個以上の電子吸引性置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基は国際公開ＷＯ２００９／１１０４８７号公報に開示されている。
【００５７】
（Ｆ）一重項酸素の捕捉基
2018101456.tif 000020
（式中、Ｒ１７１及びＲ１７２それぞれ独立にＣ１−４アルキル基又はアリール基を示し；Ｒ１７３は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基は特許第４３７３６０８号公報及び国際公開ＷＯ２００２／０１８３６２に開示されている。
【００５８】
（Ｇ）ｐＨ環境の捕捉基
2018101456.tif 000021
（式中、Ｒ１８１、Ｒ１８２、Ｒ１８３はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基、若しくは置換基を有していてもよいアリール基であるか、又はＲ１８１とＲ１８２とが結合してＣ１−３アルキレン基を示すか、若しくはＲ１８１とＲ１８３とが結合してＣ１−３アルキレン基を示し；Ａは置換基を有していてもよいＣ１−３アルキレン基を示し；Ｒ１８４は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基は国際公開ＷＯ２００８／０９９９１４号公報及び国際公開
ＷＯ２００８０５９９１０号公報に開示されている。
【００５９】
（Ｈ）マグネシウムイオンの捕捉基
2018101456.tif 000022
（式中、Ｒ１９１、Ｒ１９２及びＲ１９３はそれぞれ独立にカルボキシ基及びその塩を示し；Ｒ１９４は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２５６，Ｃ５４０−５４８，１９８９に開示されている。
【００６０】
（Ｉ）ナトリウムイオン及びカリウムイオンの捕捉基
2018101456.tif 000023
（式中、Ｒ１９５は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す）で表される捕捉基。
上記の捕捉基はＢｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１５，ｐｐ．１８５１−１８５５，２００５に開示されている。
【００６１】
（Ｊ）カルシウムイオンの捕捉基
2018101456.tif 000024
【００６２】
式（１）中、Ｒ２０１、Ｒ２０２、Ｒ２０３及びＲ２０４は、それぞれ独立に、カルボキシ基、カルボキシ基を有するアルキル基、エステル基、置換されていてもよいアルキルエステル基、又はこれらの塩を示す。
Ｒ２０５、Ｒ２０６及びＲ２０７は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子及び臭素原子）、炭素数１〜６のアルキル基、メトキシ基又はニトロ基を示す。
Ｒ２０８は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す。
【００６３】
本発明の好ましい態様においては、一般式（Ｉ）において、Ｌは、上記式（１）で表されるカルシウムイオンの捕捉基である。
【００６４】
カルシウムイオンの捕捉基のＬとしては、ＢＡＰＴＡ（１，２−ｂｉｓ（ｏ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｘｙ)ｅｔｈａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）の構造を有することが好ましい。
また、
また、カルシウムイオンの捕捉基のＬとしては、以下の式（２）で表される補足基が好ましい。
2018101456.tif 000025
【００６５】
式（２）中、Ｒは、水素又は−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ３であり、各Ｒは同一あっても異なっていてもよい。  Ｒ’は、メチル基、メトキシ基又はフッ素原子である。
【００６６】
（Ｋ）酵素の捕捉基
酵素としては、例えば、還元酵素、酸化酵素、加水分解酵素などを挙げることができる。例えば、β−ラクタマーゼ、チトクロームＰ４５０酸化酵素、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、ラクターゼ、アルカリホスファターゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ、及びグルタミルトランスフェラーゼなど、感染症やがんなどの診断対象として有用な酵素を挙げることができるが、これらに限定されることはない。酵素のうち、特に加水分解酵素が好ましい。加水分解酵素の典型例として、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、アルカリフォスファターゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ、及びグルタミルトランスフェラーゼなどを挙げることができるが、加水分解酵素は上記のものに限定されるわけではない。
【００６７】
測定対象物質として加水分解酵素を用いる場合には、該酵素の特異的基質となる化合物や官能基を選択して、該酵素による加水分解を受けてＬ（及びＲ１）が水素原子である化合物を与えるように一般式（Ｉ）の化合物を設計することができる。例えば、糖加水分解酵素を測定対象物質として用いる場合にはＬ１（及びＲ１）としてその酵素の基質となる糖化合物の残基を用いることができる。糖化合物が有する水酸基やアミノ基などの官能基は必要に応じて適宜の保護基で保護されていてもよい。このような保護基を有する化合物もすべて本発明の範囲に包含される。
【００６８】
酵素と接触することで切断される一価の置換基の例としては、測定対象物質としてペプチダーゼ、プロテアーゼを用いる場合は、本明細書中の式（ａ）〜（ｇ）及びＧＧＴの蛍光プローブとして記載した置換基や国際公開ＷＯ２０１０／０９５４５０の１２頁の［化４］に記載されている（１）から（７）の化合物に置換したアミノ酸残基（アミノ酸残基とは、アミノ酸のアミノ基又はカルボキシ基から水素原子が一つ外れた基を示す）を含むたんぱく質を構成する２０種類のＬ−アミノ酸に由来するアシル残基（以上のアミノ酸残基は、本明細書の一般式（Ｉ）のＬが結合しているＹ又はＲ７に結合してもよい）が挙げられる。また、測定対象物質として、ラクタマーゼを用いる場合は本明細書中の式（ｈ）に記載した置換基が、糖加水分解酵素を用いる場合はガラクトシル基、グルコシル基、グルクロノシル基が、グルクロン酸転移酵素を用いる場合は水酸基、アミノ基、カルボキシ基、チオール基が酵素と接触することで切断される一価の置換基の例として挙げられる。
【００６９】
測定対象物質としてグルタチオンを用いる場合は、測定対象物質と接触することで切断される一価の置換基としては、本明細書中の式（ｉ）に記載した置換基などを挙げることができる。 
【００７０】
測定対象物質としては、酵素（ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ラクタマーゼ、糖加水分解酵素、転移酵素、酸化還元酵素など）、グルタチオンがあげられる。例えば、酵素としてはぺプチダーゼ、プロテアーゼ、又はラクタマーゼであることが好ましい。
【００７１】
ぺプチダーゼ又はプロテアーゼの種類は、Ｌ（及びＲ１）がアシル基である上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物において、該アシル基を加水分解できるものであればその種類は特に限定されず、ぺプチダーゼはエンドペプチダーゼ又はエキソペプチダーゼのいずれであってもよく、プロテアーゼはエンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼのいずれであってもよい。例えば、特定のアミノ酸又はペプチドを基質とするペプチダーゼ又はプロテアーゼを測定するために、Ｌ（及びＲ１）に該アミノ酸又はペプチドに由来するアシル残基を用いることができ、このように設計された化合物を用いることによって、特定のペプチダーゼ又はプロテアーゼを特異的に測定することができる（アミノ酸又はペプチドに由来するアシル残基は、アミノ酸のカルボキシ基から水酸基を除去した残りの部分構造を示す）。このような観点から、ペプチダーゼ又はプロテアーゼに対する蛍光プローブとしては、Ｌ及び（Ｒ１は）としてペプチダーゼ又はプロテアーゼにより加水分解可能なアミノ酸由来又はペプチド由来のアシル残基を用いることが好ましく、例えば、たんぱく質を構成する２０種類のＬ−アミノ酸に由来するアシル残基や、セレノシステイン、ピロリシン、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、Ｏ−ホスホセリン、デスモシン、β−アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γアミノ酪酸、又はオパインなどに由来するアシル残基を用いることができる。
【００７２】
ペプチダーゼがＬＡＰ(leucine aminopeptidase：ロイシンアミノペプチダーゼ）である場合における好適なＲ１１（Ｒ９、Ｒ１０又はＲ１３）の例として、以下の置換基が挙げられる。
2018101456.tif 000026
【００７３】
ペプチダーゼがＧＧＴ（γ-glutamyl transpeptidase：γ-グルタミルトランスペプチターゼ）である場合における好適なＲ１１の例として、以下の置換基が挙げられる。例えば、Ｒ１１として下記の置換基を有する化合物を国際公開ＷＯ２０１１／０８７０００に記載の方法に従ってγＧｌｕ−ＲｈｏＨＭの代わりに用いれば、がん細胞やがん組織を特異的に測定することが可能であり、がん診断薬として利用することができる。
【００７４】
2018101456.tif 000027
【００７５】
プロテアーゼがＣａｓｐａｓｅ−３である場合における好適なＬ（及びＲ１）の例として、以下の置換基が挙げられる。
2018101456.tif 000028
【００７６】
プロテアーゼがＣａｌｐａｉｎである場合における好適なＬ（Ｒ１）の例として、以下の置換基が挙げられる。
2018101456.tif 000029
【００７７】
ラクタマーゼがβ-Ｌａｃｔａｍａｓｅ（β-ラクタマーゼ）である場合における好適なＬ（及びＲ１）の例として、以下の置換基が挙げられる。
2018101456.tif 000030
【００７８】
接触により切断する測定対象物質がグルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）である場合における好適なＬ（Ｒ１）の例として、以下の置換基が挙げられる。
2018101456.tif 000031
【００７９】
本発明の１つの好ましい態様においては、一般式（Ｉ）において、Ｒ２は、カルボキシ基である。
【００８０】
本発明の１つの好ましい態様においては、一般式（Ｉ）において、Ｒ２は、カルボキシ基であり、Ｒ７は、メチレン基又はエチレン基から選択され、Ｒ８は、メチル基又はエチル基から選択される。
【００８１】
本発明の１つの好ましい態様においては、一般式（Ｉ）において、Ｒ２は、カルボキシ基であり、Ｒ７は、メチレン基又はエチレン基から選択され、Ｒ８は、メチル基又はエチル基から選択され、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基から選択される。
【００８２】
本発明の１つの好ましい態様においては、一般式（Ｉ）において、Ｒ２は、カルボキシ基であり、Ｒ７は、メチレン基であり、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はいずれもメチル基である。
【００８３】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物の非限定的な例としては以下の化合物が挙げられる。
2018101456.tif 000032
式（３）において、Ｒは、水素又は−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ３であり、各Ｒは同一であっても異なっていてもよい。また、Ｒ’は、メチル基又はフッ素原子であり、Ｒ１は、一般式（Ｉ）で定義した通りである。
【００８４】
式（３）の化合物の一つの好ましい側面においては、Ｒ１が炭素数１〜６個のアルキル基などの一価の置換基であり、該置換基はベンゼン環上の３位から６位に存在する。
【００８５】
式（３）の化合物の一つの好ましい側面においては、Ｒ１は何れも水素原子である。
【００８６】
本発明の一般式（Ｉ）及び（３）の化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質も本発明の範囲内である。
【００８７】
本発明の一般式（Ｉ）及び（３）の化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
【００８８】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物を製造することができる。
【００８９】
本発明のもう１つの態様は、一般式（Ｉ）のいずれかの化合物又はその塩を含む蛍光プローブである。
【００９０】
また、本発明のもう１つの態様は、測定対象物質の測定方法であって、下記の工程：（ａ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と測定対象物質とを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成した測定対象物質の捕捉後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法である。
本発明の方法において、測定対象物質は好ましくはカルシウムイオンである。
【実施例】
【００９１】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００９２】
１．細胞質に集積するローダミン類の開発
一般的にローダミン色素はそのキサンテン環の持つカチオンによりミトコンドリアなどのオルガネラへの局在性を示す。そこで初めに、この局在性を構造修飾によって制御することで、細胞質に集積し、近赤外蛍光を有するローダミン類の開発が可能であるか検討を行った。
ローダミンの持つカチオン性を解消し、Ｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅを０にするような分子修飾として、構造中にカルボン酸のようなアニオン性官能基を導入する方法が考えられた。このようなアニオン性官能基の導入によりローダミンのカチオン性を解消することで、カチオン性に由来していたミトコンドリアのような特定の細胞内小器官への集積を抑制し、より細胞質に留まるＳｉ等のローダミン類が開発可能であると考えられる。しかしその一方で、一般的に分子骨格内に水溶性官能基であるカルボン酸のようなアニオン性官能基を導入することは、細胞膜への透過性を低下させることが知られている。
そこで、ベンゼン環部位のカルボン酸とその細胞膜透過性について考察するために、ベンゼン環部位の異なる位置にカルボン酸を導入したＳｉ−ローダミン類を合成することで、より詳細な検討を行った。具体的には、Ｓｉ−ローダミン類のベンゼン環部位２位、３位、または４位にカルボン酸を導入した誘導体を合成した。さらに、合成したＳｉ−ローダミン類をＨｅＬａ細胞へと応用することで、蛍光イメージングを行った。細胞外の余剰な色素を洗い流すことなく撮影した蛍光画像を図２に示す。
測定条件は、１μＭのカルボキシ基を有するＳｉ−ローダミンでＨｅLａ細胞をインキュベーションし、Ｅｘは６３３ｎｍ、Ｅｍは６７０〜７５０ｎｍで、図２のスケールバーは３０μｍである。
図２で示されるように、ベンゼン環の３位及び４位にカルボキシ基を有するＳｉ−ローダミン類は細胞内からの蛍光がほとんど観察されなかったのに対して（図２の中央と右側の写真）、２位にカルボキシ基を持つＳｉ−ローダミンは細胞内から強い蛍光が観察された（図２の左側の写真）。また、２位にカルボキシ基を持つＳｉ−ローダミンはｗａｓｈ  ｏｕｔを行うことで細胞内からの蛍光強度が大きく減弱した。
以上の結果から、ベンゼン環２位にカルボキシ基を持つＳｉ−ローダミンは特定のオルガネラに強く保持されることなく、高い細胞膜透過性を示すことが明らかとなった。【００９３】
上記の結果は以下のように考察される。Ｓｉ−ローダミンのベンゼン環部位３位、または４位にカルボン酸が導入された色素は、アニオン性官能基を有する多くの色素に観察されるように、細胞膜透過性が下がり、細胞内からの蛍光が観察されなかった。一方、ベンゼン環２位にカルボン酸が導入されたＳｉ−ローダミンはこれら２つの色素と異なり、高い膜透過性によって細胞内へと集積し、細胞内からの強い蛍光が観察された。このような２位にカルボキシ基を持つＳｉ−ローダミンに特徴的な挙動は、この色素が分子内においてベンゼン環部位２位のカルボン酸がキサンテン環９位へと求核攻撃し、分子内スピロ環化状態を形成することによるものと推測された。つまり、脂溶性環境である細胞膜を透過するにあたり、開環状態に比して脂溶性の高い分子内スピロ環化状態を形成することで細胞膜を通過し、再び細胞内にて開環状態を形成することによって細胞内からの蛍光が観察されたものと考えられる。【００９４】
さらに、上記の挙動をサポートするデータとしてベンゼン環部位２位にカルボン酸を有するＳｉ−ローダミンのＸ線結晶構造解析を行い、実際にＳｉ−ローダミンが分子内スピロ環化状態を形成することを確認した（図３）。即ち、図３の非対称ユニットは２つの結晶学的に独立な分子を含んでおり、２−ＣＯＯＨＳｉＲ６５０は分子内スピロ環化構造を有する。【００９５】
以上の結果を受けて、本発明のプローブ開発の前段階として、まず、細胞質に集積するＳｉ−ローダミンの分子デザインを行った。上記の検討結果からベンゼン環２位にカルボキシ基を有するＳｉ−ローダミンを蛍光団として用い、さらに細胞内滞留性の向上のため、アセトキシメチル基（ＡＭ基）で保護したイミノ二酢酸部位を導入した。
ＡＭ基によって保護された色素は細胞内へと導入された後、細胞内エステラーゼによりＡＭ基が切断され、細胞外への漏出性が低下し細胞内に滞留することが知られている。ＡＭ基が切断される前はＮｅｔ  ｃｈａｒｇｅが０であるため、ミトコンドリアなどのオルガネラへの局在は抑えられると考えた（図４参照）。それに加えて、コントロール色素として、分子内スピロ環化状態を形成することのできない、ベンゼン環部位２位がメチル基に置換されたＳｉ−ローダミンを合成し、検討に用いることとした。【００９６】
デザイン、合成した化合物をＨｅＬａ細胞へと応用し、蛍光イメージングを行った（図５）。測定条件は、１μＭの色素（７５ｎＭのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ又は７５ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ）で１時間インキュベーションしたＨｅLａ細胞を用いた。Ｅｘは６５０ｎｍ、Ｅｍは６７０−７５０ｎｍで、図５のスケールバーは２０μｍである。
余剰分の色素を洗い流してから撮像したところ、ベンゼン環２位にカルボキシ基を導入したローダミン類は細胞質への集積を示した。その一方、ベンゼン環部位２位にメチル基を有する色素は異なる局在を示し、共染色実験の結果、主にリソソームへの局在を示すことが分かった。したがって、ベンゼン環部位へのカルボキシ基の導入はローダミンの細胞内局在に大きな影響を及ぼしていることが明らかとなった。【００９７】
２．細胞質集積性ローダミンを基礎としたＣａ２＋蛍光プローブの分子デザイン
上記の検討で、ベンゼン環２位にカルボン酸を有するローダミン類にＡＭ基で保護したイミノ二酢酸構造を導入することによってローダミンを細胞質に集積させることに成功した。次に、上記の実験によって得られた知見を活かしたＣａ２＋蛍光プローブの分子デザインを以下のように行った。
Ｃａ２＋を検出する際の蛍光制御原理については、既存のＣａ２＋プローブにも適用されているｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＰｅＴ）を用いることとした。ＰｅＴは、蛍光プローブが励起光によって蛍光団部位が励起された際に、励起された蛍光団が基底状態に戻り蛍光を発するより早く蛍光団近傍の電子密度が高い構造からの電子移動によって蛍光が消光する現象を指す。つまり、ＰｅＴにおいては、蛍光団励起時に蛍光団近傍の電子密度が高い構造が電子供与体、蛍光団が電子受容体となる。化学反応等により電子供与体である構造の電子密度が低下することでＰｅＴが生じなくなり蛍光性が回復するため、様々な生理活性物質を捕捉する蛍光プローブの蛍光制御原理として用いられている。ＣａＳｉＲ−１のようなローダミンを蛍光団に用いたＣａ２＋プローブの場合、キサンテン環部位が電子受容体、ＢＡＰＴＡ構造のアミノフェノール部位が電子受供与体となるが、Ｃａ２＋非存在下ではＰｅＴが生じることで蛍光プローブはほぼ無蛍光性となる。一方でカルシウム存在下においては、ＢＡＰＴＡ構造にＣａ２＋イオンが配位することによりＢＡＰＴＡ構造のアミノフェノール部位の電子密度が低下して電子移動が起こらなくなるため、プローブの蛍光性が回復する（図６）。【００９８】
ＰｅＴによる蛍光制御は、Ｒｅｈｍ−Ｗｅｌｌｅｒ式（文献３：Johnson I., Spence M.T.Z., Ed. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11th Ed. Molecular Probes, Inc. 2010.）によって示される電子移動過程の自由エネルギー変化量ΔＧｅＴおよびＭａｒｃｕｓ式（文献９：Marcus R. A., Annu. Rev. Phys. Chem., 1964, 15, 155-196.；文献１０：Marcus R. A., Sutin, N., Biochim. biophys. Acta, 1985, 811, 265-322.；文献１１：Marcus R. A., Angew. Chem. Int. Ed., 1993, 32, 1111-1121.；文献１２：De Silva A.P., Gunaratne H.Q., Gunnlaugsson T., Huxley A. J. M., McCoy C. P., Rademacher J. T., Rice T.E., Chem. Rev., 1997, 97, 1515-1566.）によって記述される電子移動速度定数ｋｅＴにより評価することができる。【００９９】
・Ｒｅｈｍ−Ｗｅｌｌｅｒ式
2018101456.tif 000033
Eox:電子供与体の一電子酸化電位, Ered:電子受容体の一電子還元電位, ΔE0,0:励起エネルギー, C:励起によって生じたラシ゛カル種をクーロン引力圏外に引き離すために要するエネルギー【０１００】
・Ｍａｒｃｕｓ式
2018101456.tif 000034
V：軌道間相互作用, λ：再配向エネルギー, kB：ボルツマン定数, h：プランク定数, T：温度【０１０１】
上記パラメータの中には電子移動過程における電子供与体と電子受容体との距離に関与するものが存在する。まず、Vは電子供与体と電子受容体との電子軌道の相互作用に関与するパラメータであり、両者の距離が近くなると大きな値をとる。また、λは電子移動に伴う周囲の反応環境の再配向エネルギーであり、電荷分離状態において電子供与体と電子受容体との間に水などの他の分子種がどれほど入り込むかを評価する。さらにCも電子受容体と電子供与体が隣接していると大きな値をとるパラメータである。【０１０２】
そこで、新たに近赤外蛍光を有するＣａ２＋プローブを開発するにあたり、次のようなＢＡＰＴＡ部位とキサンテン環との距離の異なるプローブをデザイン、合成を行った。以下に示した化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物ＣはＢＡＰＴＡ構造とキサンテン環との間の結合数がそれぞれ、７、６、５と異なっており、結合数が少ないほどＣａ２＋非存在下においてＰｅＴによりよく消光するものと考えた。【０１０３】
2018101456.tif 000035
【０１０４】
［合成実施例１］
ＢＡＰＴＡの合成
以下のスキーム１により、化合物Ａ〜Ｃを合成するのに用いる合成中間体ＢＡＰＴＡを合成した。【０１０５】
スキーム１：ＢＡＰＴＡの構造の合成
2018101456.tif 000036
【０１０６】
（１）１−（２−ブロモエトキシ）−２−ニトロベンゼンの合成
2018101456.tif 000037
文献１（Dong X., Yang Y., Sun J., Liu Z., Liu B.F., Chem. Commun., 2009, 26, 3883.）に従って合成した。【０１０７】
（２）４−メチル−１−ニトロ−２−［２−（２−ニトロフェノキシ）エトキシ］−ベンゼンの合成
2018101456.tif 000038
上記文献１に従って合成した。【０１０８】
（３）２−［２−（２−アミノフェニル）エトキシ］−４−メチルーベンゼンアミンの合成
2018101456.tif 000039
上記文献１に従って合成した。【０１０９】
（４）５−メチルＢＡＴＰＡテトラメチルエステルの合成
2018101456.tif 000040
【０１１０】
２−［２−（２−アミノフェニル）エトキシ］−４−メチルベンゼンアミン（７２４ｍｇ、２．８１ｍｍｏｌ）、メチルブロモアセテート（１．５４ｍＬ、１６．７ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（５．８ｍＬ、３３．３ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（２０ｍＬ）に溶解させ、８０°Ｃで夜通し攪拌した。ＡｃＯＥｔ（２０ｍＬ）を加え、ろ過で塩を除いた後、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し（ＥｔＯＡｃ／ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝１／２）、５−メチルＢＡＴＰＡテトラメチルエステルを得た（３６２ｍｇ、０．６６２ｍｍｏｌ、収率２３％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.26 (s, 3H), 3.56 (s, 6H), 3.58 (s, 6H), 4.12 (s, 4H), 4.16 (s, 4H), 4.27 (s, 4H), 6.67 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 6.74 (dd, J = 4.9 Hz, 3.4 Hz, 1H), 6.81-6.83 (m, 1H), 6.85-6.89 (m, 2H), 6.90-6.93 (m, 1H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 20.9, 51.5, 51.6, 53.3, 53.4, 67.0, 67.1, 113.2, 114.1, 119.0, 119.2, 121.5, 121.7, 122.2, 132.1, 136.8, 139.2, 150.3, 150.4, 172.0, 172.0.【０１１１】
（５）５−メチル−５’−ニトロＢＡＰＴＡテトラメチルエステルの合成
2018101456.tif 000041
【０１１２】
文献２（Egawa T., Hanaoka K., Koide Y., Ujita S., Takahashi N., Ikegaya Y., Matsuki N., Terai T., Ueno T., Komatsu T., Nagano T., J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 14157-14159.）に従って合成した。【０１１３】
（６）５−アミノ−５’−メチルＢＡＰＴＡテトラメチルエステルの合成
2018101456.tif 000042
【０１１４】
上記文献２に従って合成した。【０１１５】
［合成実施例２（参考例）］
以下のスキーム２により、化合物Ａを合成した。【０１１６】
スキーム２：化合物Ａの合成
2018101456.tif 000043
【０１１７】
（１）４−ブロモ−１，３−ベンゼンジカルボン酸１，３−ビス［（３−メチル−３−オキセタニル）メチル］エステルの合成
2018101456.tif 000044
【０１１８】
４−ブロモテレフタル酸（５．０４ｇ、２０．５３ｍｍｏｌ）、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（８．４６ｇ、４４．３２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（７１８ｍｇ、５．８８ｍｍｏｌ）、３−メチル−３−オキセタンメタノール（５．０２ｍＬ、５１．１８ｍｍｏｌ）を脱水ＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、室温で夜通し攪拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水と飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し（ＥｔＯＡｃ／ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝１／１）、２−ブロモ−１，４−ベンゼンジカルボン酸１，４−ビス［（３−メチル−３−オキセタニル）メチル］エステルを得た（４．０３ｇ、収率４７％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.42 (s, 3H), 1.44 (s, 3H), 4.44 (s, 2H), 4.47 (s, 4H), 4.48 (s, 2H), 4.61 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 4.63 (d, J = 1.2 Hz, 2H) 7.78 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 8.4 Hz, 1.5 Hz, 2H), 8.31 (d, J = 1.5 Hz, 1H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 21.0, 21.2, 39.1, 39.2, 69.9, 70.1, 79.3, 79.4, 121.3, 128.1, 131.1, 133.5, 135.1, 136.2, 164.3, 165.6.【０１１９】
（２）１，１’−（２−ブロモ−１，４−フェニレン）ビス（４−メチル−２，６，７−トリオキサビシクロ［２．２．２］オクタン）の合成
2018101456.tif 000045
【０１２０】
文献３（Grimm J.B., Klein T., Kopek B.G., Shtengel G., Hess H.F., Sauer M., Lavis L.D., Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 1723.）に従って合成した。【０１２１】
（３）２，４−ｄｉＣＯＯＨＳｉＲの合成
2018101456.tif 000046
【０１２２】
１，１’−（２−ブロモ−１，４−フェニレン）ビス（４−メチル−２，６，７−トリオキサビシクロ［２．２．２］オキセタン）（４７６ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）と脱水ＴＨＦ（１０ｍＬ）を加熱乾燥したフラスコに加えアルゴン置換した後に、−７８℃まで冷却し１Ｍｓｅｃ−ＢｕＬｉ（１．１５ｍｍｏｌ）を加え１時間攪拌した。これにＳｉＸ−１（４９．０ｍｇ、０．１４２ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解させた溶液をゆっくり加え、室温で３．５時間攪拌した。酢酸（５ｍＬ）を加えた後に、溶媒を減圧除去した。残渣を６Ｎの塩酸に溶かした後に夜通し加熱還流した。室温に冷却し、溶媒を減圧除去した後に、残渣をＨＰＬＣにより精製し２，４−ｄｉＣＯＯＨＳｉＲを得た（２５．５ｍｇ、収率３２％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.15 (s, 3H), 0.22 (s, 3H), 2.85 (s, 12H), 6.31 (dd, J = 7.5 Hz, 2.1 Hz, 2H), 6.49 (d, J = 9.8 Hz, 2H), 6.74  (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.93  (dd, J = 8.0 Hz, 1.7 Hz, 3H), 8.36-8.38 (m, 1H). HRMS (ESI+): Calcd for [M]+ 483.1896., Found, 473.1877 (-2.0 mmu).【０１２３】
（４）化合物Ａの合成
2018101456.tif 000047
【０１２４】
２，４−ｄｉＣＯＯＨＳｉＲ（２５．５ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）、５−アミノ−５’−メチルＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（２０．０ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（８６．０ｍｇ、０．２２６ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（４８．０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３．０ｍＬ）に溶解させ夜通し攪拌した。溶媒を減圧除去した後、残渣に２Ｎ塩酸を加えＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣を２ＮＮａＯＨ水溶液／ＭｅＯＨ（１．５ｍＬ／１．５ｍＬ）に溶解させ、室温で５時間攪拌し、ＨＰＬＣにより精製し、化合物Ａを得た（３．１ｍｇ、３．２μｍｏｌ、収率９％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.57 (s, 3H), 0.65 (s, 3H), 2.27 (s, 3H), 3.30 (s, 12H), 3.82 (s, 4H), 3.90 (s, 4H), 4.38-4.41 (m, 4H), 6.66 (dd, J = 9.0 Hz, 2.7 Hz, 3H), 6.74 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 6.88 (dd, J = 8.3 Hz, 4.9 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 7.37-7.42 (m, 2H), 8.31 (dd, J = 8.3 Hz, 1.5 Hz, 1H) 8.51 (d, J = 1.0 Hz, 1H).
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+ 960.3487., Found, 960.3461 (-2.7 mmu). HPLC analysis: eluent: A/B = 80/20 to 0/100, 20 min, liner gradient; solvent A: H2O, 0.1 % TFA; solvent B: acetonitrile/H2O = 80/20, 0.1 % TFA; flow rate, 1.0 mL/min; detection wavelength 650 nm. 
2018101456.tif 000048
【０１２５】
［合成実施例３（参考例）］
以下のスキーム３により、化合物Ｂを合成した。【０１２６】
スキーム３：化合物Ｂの合成
2018101456.tif 000049
【０１２７】
（１）化合物Ｂの合成
化合物Ｂ
2018101456.tif 000050
【０１２８】
化合物Ａと同様に、８．３ｍｇの２．５−ｄｉＣＯＯＨＳｉＲと２３．３ｍｇの５−アミノ−５’−メチルＢＡＰＴＡテトラメチルエステルから合成し、化合物Ｂを得た（１．２ｍｇ、収率９％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.53 (s, 3H), 0.64 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 2.94 (s, 12H), 3.79 (s, 4H), 3.92 (s, 4H), 4.29-4.30 (m, 4H), 6.61-6.64 (m, 3H), 6.72 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.79-6.83 (m, 2H), 6.86 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 2.7 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.33 (dd, J = 8.7 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.79 (s, 1H), 8.03 (d, J = 8.2 Hz, 1H) 8.16 (dd, J = 8.2 Hz, 1.4 Hz, 1H). HRMS (ESI+): Calcd for [M]+ 960.3487., Found, 960.3507 (2.0 mmu). HPLC analysis: eluent: A/B = 80/20 to 0/100, 20 min, liner gradient; solvent A: H2O, 0.1 % TFA; solvent B: acetonitrile/H2O = 80/20, 0.1 % TFA; flow rate, 1.0 mL/min; detection wavelength 650 nm.
2018101456.tif 000051
【０１２９】
［合成実施例４］
以下のスキーム４により、本発明の化合物Ｃを合成した。【０１３０】
スキーム４：化合物Ｃ（ＣａＳｉＲ−２）の合成
2018101456.tif 000052
【０１３１】
（１）Ｎ−メチル−３−ブロモアニリンの合成
2018101456.tif 000053
【０１３２】
３−ブロモアニリン（５．００ｇ、２９．１ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（９０ｍＬ）に溶解させ、ＮａＯＭｅ（１１．２５ｇ、２０８ｍｍｏｌ）とパラホルムアルデヒド（１３．１ｇ、４３７ｍｍｏｌ）を加え室温で夜通し攪拌した。０℃に冷却しＮａＢＨ４をゆっくり加えた後、８０℃で２時間攪拌した。室温に冷却し、２ＮＮａＯＨ水溶液を加えた後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し（ＥｔＯＡｃ／ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝１／４）、Ｎ−メチル−３−ブロモアニリンを得た（２．２７ｇ、１２．４ｍｏｌ、収率４２％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 2.81 (s, 3H), 3.78 (br, 1H), 6.51 (dd, J = 8.1, 2.2 Hz, 1H), 6.73-6.74 (m, 1H), 6.80 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.99-7.04 (m, 1H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 30.5, 111.2, 114.7, 119.9, 123.3, 130.4, 150.5.【０１３３】
（２）Ｎ−アリル−Ｎ−メチル−３−ブロモアニリンの合成
2018101456.tif 000054
【０１３４】
Ｎ−メチル−３−ブロモアニリン（２．２７ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（４．２０ｇ、３０．４ｍｏｌ）及び臭化アリル（４．００ｇ、３３．１ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（５０ｍＬ）に溶解させ、８０℃で夜通し攪拌した。室温に冷却し、ろ過した後に、ろ液の溶媒を減圧除去した。残った油滴をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し（ＣＨ２Ｃｌ２／ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝１／２）、Ｎ−アリル−Ｎ−メチル−３−ブロモアニリンを得た（２．０２ｇ、８．９４ｍｏｌ、収率７３％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 2.93 (s, 3H), 3.89-3.91 (m, 2H), 5.10-5.18 (m, 2H), 5.74-5.87 (m, 1H), 6.60 (dd, J = 8.4 Hz, 2.6 Hz, 1H), 6.78-6.81 (m, 2H), 7.05 (m, 1H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 38.1, 55.1,110.9, 115.0, 116.5, 119.1, 123.5, 130.4, 133.1, 150.7.【０１３５】
（３）Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ブロモ−４−ヒドロキシメチルアニリン
2018101456.tif 000055
【０１３６】
ＤＭＦ（２ｍＬ、２５．８ｍｏｌ）とＰＯＣｌ３（２．６ｍＬ、２８．０ｍｍｏｌ）を１００℃で攪拌し、そこにＮ，Ｎ−ジメチル−３−ブロモアニリン（５．０２ｇ、２５．１ｍｍｏｌ）をトルエン（１３０ｍＬ）に溶解させたものを加え、１００℃で夜通し攪拌した。室温に冷却し、２ＮＮａＯＨ水溶液を加え２時間攪拌した。それをＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をＭｅＯＨ（１００ｍＬ）に溶解させ、ＮａＢＨ４を０℃でゆっくり加え、５．５時間攪拌した。Ｈ２Ｏを加えて反応を止め、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し（ＡｃＯＥｔ／ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝１／４）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ブロモ−４−ヒドロキシメチルアニリンを得た（３．２０ｇ、１３．９ｍｏｌ、収率５５％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.87 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.94 (s, 6H), 4.64 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 6.63 (dd, J = 8.4, 2.6 Hz), 6.88 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.25 (d, J = 8.8 Hz, 1H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 40.3, 65.1, 111.4, 116.0, 124.4, 127.0 130.4, 151.1.【０１３７】
（４）（２−ブロモ−４−Ｎ，Ｎ−ジメチル）（２−ブロモ−４−Ｎ’−アリル−Ｎ’−メチル）メタンの合成
2018101456.tif 000056
【０１３８】
Ｎ−アリル−Ｎ−メチル−３−ブロモアニリン（９５８ｍｇ、４．２４ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジメチル−３−ブロモ−４−ヒドロキシメチルアニリン（６５０ｍｇ、２．８３ｍｍｏｌ）、及びＢＦ３・ＯＥｔ２（４５２μｍｏｌ、４２３ｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解させ、室温で夜通し攪拌した。Ｈ２Ｏを加えて反応を止め、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し（ＣＨ２Ｃｌ２／ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝１／３）、（２−ブロモ−４−Ｎ，Ｎ−ジメチル）（２−ブロモ−４−Ｎ’−アリル−Ｎ’−メチル）メタンを得た（８７６ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ、収率６９％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 2.88 (s, 9H), 3.83-3.85 (m, 2H), 3.98 (s, 2H), 5.10-5.15 (m, 2H), 5.74-5.83 (m, 1H), 6.52-6.58 (m, 2H), 6.80-6.85 (m, 2H), 6.90-6.93 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 38.1, 39.9, 40.6, 55.2, 111.8, 111.9, 116.1, 116.3, 116.5, 125.7, 127.0, 127.2, 130.9, 133.4, 149.0, 150.1.【０１３９】
（５）Ｎ−アリル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリメチル−Ｓｉ−キサントン（ＳｉＸ−２）の合成
2018101456.tif 000057
【０１４０】
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルジアミノ−Ｓｉ−キサントンと同様に、文献２の通りに、（２−ブロモ−４−Ｎ，Ｎ−ジメチル）（２−ブロモ−４−Ｎ’−アリル−Ｎ’−メチル）メタン（１．１７ｇ）からＮ−アリル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリメチル−Ｓｉ−キサントンを得た（１８７ｍｇ、収率２０％）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 0.45 (s, 6H), 3.08 (s, 3H), 3.09 (s, 6H), 4.03-4.05 (m, 2H), 5.15-5.21 (m, 2H), 5.80-5.92 (m, 1H), 6.78-6.85 (m, 4H), 8.37 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 8.40 (d, J =4.5 Hz, 1H)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ = -1.1, 38.0, 40.0, 54.6, 113.1, 113.2, 114.2, 114.4, 116.5, 129.6, 131.5, 131.6, 132.7, 140.4, 140.5, 150.6, 151.4, 185.2.【０１４１】
（６）２−ＣＯＯＨＳｉＲ６３０の合成
2018101456.tif 000058
【０１４２】
ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブロモベンゾエート（３９５ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）と脱水ＴＨＦ（３ｍＬ）を加熱乾燥したフラスコに加え、アルゴン置換した後、−７８℃まで冷却し、１Ｍｓｅｃ−ＢｕＬｉ（１．３ｍｍｏｌ）を加え４分間攪拌した。ＳｉＸ−２（９４．０ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ（４ｍＬ）に溶解させたものをゆっくり加え、室温で２時間攪拌した後、２ＮＨＣｌａｑ．（５ｍＬ）を加え３０分攪拌した。それをＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧除去した。残渣をＴＦＡ（５ｍＬ）に溶解させ３時間攪拌した。ＴＦＡを除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって軽く精製し、中間体（ＥＳＩ−ＭＳ（＋）：４５５）を含むフラクションを回収し、溶媒を減圧除去した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）に溶解させ、１，３−ジメチルバルビツール酸（１４４ｍｇ、０．９２３ｍｍｏｌ）とＰｄ（ＰＰｈ３）４（９９ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）を加え、３５°Ｃで夜通し攪拌した。減圧除去した後に、ＨＰＬＣで精製し、２−ＣＯＯＨＳｉＲ６３０三フッ化酢酸塩を得た（６０．６ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ、収率４３％）。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ = 0.56 (s, 3H), 0.61 (s, 3H), 3.03(s, 3H), 3.28 (s, 6H), 6.61 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 6.74 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 6.97-7.00 (m, 2H), 7.20-7.32 (m, 3H), 7.67 (m, 2H), 8.23 (d, J = 7.3 Hz, 1H). HRMS (ESI+): Calcd for [M]+ 415.1842., Found, 415.1843 (+0.1 mmu).【０１４３】
（７）２−ＣＯＯＨＳｉＲ６５０−ＣＯＯＨの合成
2018101456.tif 000059
【０１４４】
２−ＣＯＯＨＳｉＲ６３０三フッ化酢酸塩（２２．０ｍｇ、４１．６μｍｏｌ）をｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート（１３．８μＬ、１０２μｍｏｌ）に溶解させ、ＤＩＥＡ（１４．２μＬ、８２．５μｍｏｌ）を加え、３５℃で夜通し攪拌した。減圧除去した後、残渣をＴＦＡ（５ｍＬ）に溶解させ、室温で１．５時間攪拌した。ＴＦＡを除去した後、残渣を軽くＨＰＬＣで精製しｃｒｕｄｅの２−ＣＯＯＨ６５０−ＣＯＯＨ（１０．３ｍｇ）を得た。この化合物をそのまま次の反応に用いた。【０１４５】
（８）化合物Ｃ（ＣａＳｉＲ−２）の合成
2018101456.tif 000060
【０１４６】
化合物Ａと同様に、２−ＣＯＯＨ６５０−ＣＯＯＨ（３．７ｍｇ）と５−アミノ−５’−メチルＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（６．０ｍｇ）から合成し、化合物Ｃを得た（０．１ｍｇ、収率２％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.50 (s, 3H), 0.57 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 2.90 (s, 6H), 3.08 (s, 3H), 3.46 (s, 4H), 3.50 (s, 4H), 4.09 (s, 2H), 4.22-4.26 (m, 4H), 6.57 (dd, J = 9.1 Hz, 3.2 Hz, 1H), 6.61-6.62 (m, 2H), 6.65 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.73 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.98 (dd, J = 1.4 Hz, 1.4 Hz, 2H), 7.02 (dd, J = 9.4 Hz, 2.5 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.25 (q, J = 7.8 Hz, 1H), 7.59 (ddd, J = 7.5 Hz, 7.5 Hz, 1.2 Hz 1H), 7.71 (ddd, J = 7.5 Hz, 7.5 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.49 (br, 1H).
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+ 960.3487., Found, 960.3453 (-3.6 mmu). HPLC analysis: eluent: A/B = 80/20 to 0/100, 20 min, liner gradient; solvent A: H2O, 0.1 % TFA; solvent B: acetonitrile/H2O = 80/20, 0.1 % TFA; flow rate, 1.0 mL/min; detection wavelength 650 nm.
2018101456.tif 000061
【０１４７】
［実施例１］
化合物Ａ〜ＣのＣａ２＋プローブとしての評価
合成した化合物Ａ、Ｂ、ＣがＣａ２＋センサーとして機能しうるかどうかを調べるために、様々なＣａ２＋濃度の溶液の下で吸収・蛍光スペクトルを測定した。結果を図７に示す。
図７は、１００ｎＭのＫＣｌ及び１０ｎＭのエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）を含有し、ｐＨ７．２の３０ｍＭの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパン硫酸（ＭＯＰＳ）中で種々の濃度（０、０．０１７、０．０３８、０．０６５、０．１００、０．１５０、０．２２５、０．３５１、０．６０２、１．３５、３９ｍＭ）の遊離Ｃａ２＋の存在下での１μＭの化合物Ａ、Ｂ、Ｃの吸収スペクトル（左側）、発光スペクトル（中央）を表す。励起波長は、６４６ｎｍ（Ａ）、６４８ｎｍ（Ｂ）、６３５ｎｍ（Ｃ）であった。
図７の右側は、１００ｎＭのＫＣｌ及び１０ｎＭのＥＧＴＡを含有し、ｐＨ７．２の３０ｍＭのＭＯＰＳ中で種々の濃度の遊離Ｃａ２＋の存在下での１μＭの化合物Ａ、Ｂ、Ｃの蛍光強度のプロットを示す。
また、化合物Ａ、Ｂ、Ｃの光物理特性を表１に示す。【０１４８】
【表１】
2018101456.tif 000062
【０１４９】
合成した化合物Ａ、Ｂ、Ｃは全てＣａ２＋濃度の上昇に伴って蛍光強度が上昇し、Ｃａ２＋プローブとして機能することが分かった。しかしながら、Ｃａ２＋非存在下における蛍光量子収率とアクティベーションレシオには大きな違いが見られ、化合物Ａではφfl ＝０．１０、アクティベーションレシオ２．５倍となったのに対し、化合物Ｃではφfl ＝０．０１、アクティベーションレシオ２６倍となった。この結果は仮説通り、電子供与体であるＢＡＰＴＡ構造と電子受容体であるキサンテン環との距離を反映した結果であると考えられ、化合物Ｃは両者間の結合数が最も小さく距離が最も近いため、ＰｅＴにより大きく消光したと考えられた。以下においては、この化合物ＣをＣａＳｉＲ−２と称し、更に検討を行った。【０１５０】
［実施例２］
新規Ｃａ２＋蛍光プローブの生細胞応用
次に、ＣａＳｉＲ−２が細胞内環境で特定のオルガネラに集積せず細胞質に留まるか確かめるため、ＨｅＬａ細胞への応用を行った。生細胞応用をするにあたり、ＣａＳｉＲ−２に細胞膜透過性を付与するため、ＢＡＰＴＡ構造のカルボン酸をＡＭ基で保護したプローブＣａＳｉＲ−２ＡＭの合成を行った。【０１５１】
［合成実施例５］
以下のスキーム５により、ＣａＳｉＲ−２ＡＭ（化合物Ｄ）を合成した。【０１５２】
スキーム５：化合物Ｄ（ＣａＳｉＲ−２ＡＭ）の合成
2018101456.tif 000063
【０１５３】
（１）５−メチル−５’−ニトロＢＡＰＴＡの合成
2018101456.tif 000064
【０１５４】
５−ニトロＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（２５９ｍｇ、０．４３８ｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解させ、２ＮＮａＯＨａｑ．（８ｍＬ）を加え、室温で夜通し攪拌した。２ＮＨＣｌで中和し、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣによって精製し、５−メチル−５’−ニトロＢＡＰＴＡを得た（１７０ｍｇ、０．３１８ｍｍｏｌ、収率７２％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ =2.27 (s, 3H), 4.12 (s, 4H), 4.24-4.34 (m, 8H), 6.67-6.71 (m, 3H), 6.77 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.83 (dd, J = 8.8, 2.9 Hz, 1H). 13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ = 21.0, 68.1, 69.3, 109.5, 115.7, 116.5, 119.2, 120.8, 122.8, 134.5, 137.1, 141.7, 147.0, 149.8, 151,9, 174.4, 175.3. HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 558.1336, Found, 558.1340 (+0.4 mmu).【０１５５】
（２）５−メチル−５’−ニトロＢＡＰＴＡテトラアセトキシメチルエステルの合成
2018101456.tif 000065
【０１５６】
５−メチル−５’−ニトロＢＡＰＴＡ（１４７．８ｍｇ、０．２７６ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（５ｍＬ）に溶解させ、ＤＩＥＡ（４２０μＬ、２．４１ｍｍｏｌ）とブロモメチルアセテート（１２０μＬ、１．２ｍｍｏｌ）を加え、夜通し攪拌した。酢酸を加えて酸性にした後、ＨＰＬＣによって精製し、５−メチル−５’−ニトロＢＡＰＴＡテトラアセトキシメチルエステルを得た（１５８ｍｇ、０．１９２ｍｍｏｌ、収率７０％）。
1H NMR (300 MHz, CD2Cl2): δ =2.03 (s, 6H), 2.05 (s, 6H), 2.27 (s, 3H), 4.13 (s, 4H), 4.28-4.31 (m, 6H), 4.36-4.39 (m, 2H), 5.58 (s, 4H), 5.61 (s, 4H), 6.70-6.75(m, 3H), 6.80 (d, J = 8.1 Hz), 7.76 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.81 (dd, J = 9.2, 2.6 Hz, 1H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 20.5, 20.8, 53.3, 53.4, 66.7, 67.7, 79.0, 79.4, 108.2, 114.9, 116.4, 118.0, 120.4, 122.3, 133.0, 136.2, 141.3, 144.6, 148.7, 150.3, 169.1, 169.3, 169.3, 169.9. HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 846.2181, Found, 846.2173 (-0.8 mmu).【０１５７】
（３）５−メチル−５’−アミノＢＡＰＴＡテトラアセトキシメチルエステルの合成
2018101456.tif 000066
【０１５８】
５−メチル−５’−ニトロＢＡＰＴＡテトラアセトキシメチルエステル（１４７．９ｍｇ、０．１７９ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（５ｍＬ）とＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０％）を加え、水素下、室温で３時間攪拌した。Ｐｄ／Ｃをろ過によって除去し、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣによって軽く精製し、ｃｒｕｄｅの５−メチル−５’−アミノＢＡＰＴＡテトラアセトキシメチルエステルを得た（７７．０ｍｇ）。【０１５９】
（４）ＣａＳｉＲ−２ＡＭの合成
2018101456.tif 000067
【０１６０】
２−ＣＯＯＨ６５０−ＣＯＯＨ（４．１ｍｇ、７．０μｍｏｌ）、５−アミノ−５’−メチルＢＡＰＴＡテトラアセトキシメチルエステル（３５．０ｍｇ、４１μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１５．７ｍｇ、４１．３μｍｏｌ）とＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（３．６ｍｇ、２３．５μｍｏｌ）をＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解させ、室温で夜通し攪拌した。酢酸を加えて中和した後、ＨＰＬＣによって精製し、ＣａＳｉＲ−２ＡＭを得た（４．０ｍｇ、３．０６μｍｏｌ、収率４３％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.55 (s, 3H), 0.62 (s, 3H), 2.00 (s, 6H), 2.03 (s, 6H), 2.28 (s, 3H), 2.98 (s, 6H), 3.17 (s, 3H), 4.13-4.17 (m, 10H), 4.26 (s, 4H), 5.58 (s, 4H), 5.60 (s, 4H), 6.63-6.84 (m, 8H), 7.01-7.08 (m, 3H), 7.29-7.33 (m, 2H), 7.64-7.68 (m, 1H), 7.75-7.78 (m, 1H), 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H). HRMS (ESI+): Calcd for [M]+ 1248.4332., Found, 1248.4289 (-4.3 mmu). HPLC analysis: eluent: A/B = 80/20 to 0/100, 20 min, liner gradient; solvent A: H2O, 0.1 % TFA; solvent B: acetonitrile/H2O = 80/20, 0.1 % TFA; flow rate, 1.0 mL/min; detection wavelength 650 nm.
2018101456.tif 000068
【０１６１】
合成したＣａＳｉＲ−２  ＡＭを用いてＨｅＬａ細胞におけるイメージング実験を行った。
実験条件として、ＨｅＬａ細胞を、３７℃、０．３％ＤＭＳＯを含有するＨＢＳＳ中３μＭＣａＳｉＲ−２ＡＭと共に３０分間インキュベートし、その後、色素を３回洗い流し、イメージングを開始した。
その結果、細胞内からわずかに点状に局在した蛍光が見えるものの、大部分のプローブは期待通り細胞質に分布することが分かった（図８及び図９）。また、細胞内に見える局在については、その点状の局在からリソソームへ局在していると考えられる。
続いて、細胞外部からの刺激によって細胞内に生じるＣａ２＋濃度変動をＣａＳｉＲ−２ＡＭで捉えることができるか検討した（図８）。具体的にはＨｅＬａ細胞にＣａＳｉＲ−２ＡＭをロード後、細胞外液にｈｉｓｔａｍｉｎｅまたはＡＴＰを添加して細胞内でカルシウムオシレーションを生じさせ、それを蛍光強度の変化として捉えることができるか検討した。また、最後にカルシウムイオノフォアであるｉｏｎｏｍｙｃｉｎを添加して、細胞内のＣａ２＋濃度上昇が見られるか検討した。【０１６２】
ヒスタミンはＨｅＬａ細胞の細胞膜上のＨ１受容体を介してホスホリパーゼＣを活性化し、ホスホリパーゼＣはＰＩＰ２を加水分解してＩＰ３を産生する（文献１３：Hill S.J., Ganellin C.R., Timmerman H., Schwartz J.C., Shankley N.P., Young J.M., Schunack W., Levi R., Haas H.L., Pharmacol Rev., 1997, 49, 253-278.）。ＩＰ３は小胞体上のＩＰ３受容体に結合し、小胞体上のＣａ２＋チャネルが開口しＣａ２＋が放出される（文献１４：R. Y. Tsien., Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 1983, 12, 91-116）。ヒスタミン刺激によるカルシウムオシレーションは、主にこのＨ１受容体を介した経路で生じる（文献１５：Zhu D.M., Tekle E., Huang C.Y., Chock P.B., J. Biol. Chem., 2000, 275, 6063-6066.）。一方、ＡＴＰはヒト骨髄由来幹細胞（文献１６：Kawano S., Otsu K., Kuruma A., Shoji S., Yanagida E., Muto Y., Yoshikawa F., Hirayama Y., Mikoshiba K., Furuichi T., Cell Calcium, 2006, 39, 313-324.）や放射状グリア（文献１７：Barrack D.S., Thul R., Owen M.R.., J. Theor. Biol., 2014, 347, 17-32.）において細胞膜上のＰ２Ｙ１受容体を介してホスホリパーゼＣを活性化し、以下ヒスタミンと同様の経路で細胞内のＣａ２＋濃度を上昇させることが知られている。【０１６３】
蛍光観察開始後９０秒後にｈｉｓｔａｍｉｎｅ（１μＭ）やＡＴＰ（１００μＭ）を添加したところ、細胞内の蛍光強度が変化する様子が観察された。また、蛍光観察開始後２１０秒でｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（５μＭ）を添加したところ、細胞内の蛍光上昇が観察された。以上の結果から、ＣａＳｉＲ−２ＡＭによって細胞外刺激による細胞内のＣａ２＋濃度変動の観察に成功した。すなわち、ＣａＳｉＲ−２ＡＭは細胞質におけるカルシウムオシレーションを捉えることが可能な近赤外蛍光Ｃａ２＋センサーであることが示された。
なお、図８において、１から５までの個々の細胞のＲＯＩの蛍光変化を示し、励起および発光波長６５０ｎｍ／６７０−７５０ｎｍで画像を捕捉した。【０１６４】
続いてＣａＳｉＲ−２ＡＭを、既存の近赤外蛍光プローブＣａＳｉＲ−１ＡＭと比較した。ＣａＳｉＲ−１ＡＭはＣａ２＋非存在下では蛍光が極めて低く抑えられており（φ＜０．００１）、非常に大きいａｃｔｉｖａｔｉｏｎを示すプローブである一方、リソソームへの局在が示唆されている（文献５：Egawa T., Hanaoka K., Koide Y., Ujita S., Takahashi N., Ikegaya Y., Matsuki N., Terai T., Ueno T., Komatsu T., Nagano T., J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 14157-14159.）。
ＣａＳｉＲ−２ＡＭとＣａＳｉＲ−１ＡＭのオルガネラごとにＲＯＩを囲って蛍光シグナルのトレースをとった結果を図９及び図１０に示す。本実験においては、刺激を加える前の蛍光強度を把握するために、解析結果では縦軸は蛍光変化率ではなく蛍光強度を採用している。【０１６５】
図９の左側の図は、ＣａＳｉＲ−２ＡＭを利用したＨｅＬａ細胞におけるｈｉｓｔａｍｉｎｅ（ａ）またはＡＴＰ（ｃ）の視覚化を示し、右側の図は、誘発カルシウムオシレーションを示す。ＨｅＬａ細胞を、３７℃、３０分間、０．４５％ＤＭＳＯを含むＨＢＳＳ中の３μＭＣａＳｉＲ−２ＡＭおよび０．０３％Ｐｌｕｒｏｎｉｃと共に培養し、次いで、色素を３回洗い流し、イメージングを開始した。
ｈｉｓｔａｍｉｎｅ又はＡＴＰ、ｉｏｎｏｍｙｃｉｎの添加条件は図８と同様である。図９において、１から７までの個々の細胞のＲＯＩの蛍光変化（＃１〜＃３：核；＃４−＃６：細胞質；＃７：バックグラウンド）を示す。また、励起および発光波長６５０ｎｍ／６７０−７５０ｎｍで画像を捕捉した。【０１６６】
図１０の左側の図は、ＣａＳｉＲ−１ＡＭを利用したＨｅＬａ細胞におけるｈｉｓｔａｍｉｎｅ（ａ）またはＡＴＰ（ｃ）の視覚化を示し、右側の図は、誘発カルシウムオシレーションを示す。ＨｅＬａ細胞を、３７℃、３０分間、０．４５％ＤＭＳＯを含むＨＢＳＳ中の３μＭＣａＳｉＲ−１ＡＭおよび０．０３％Ｐｌｕｒｏｎｉｃと共に培養し、次いで、色素を３回洗い流し、イメージングを開始した。
ｈｉｓｔａｍｉｎｅ又はＡＴＰ、ｉｏｎｏｍｙｃｉｎの添加条件は図８と同様である。図１０において、１から１０までの個々の細胞のＲＯＩの蛍光変化（＃１〜＃３：核；＃４−＃６：サイトゾル；＃７−＃９：リソソーム；＃１０：バックグラウンド）を示す。また、励起および発光波長６５０ｎｍ／６７０−７５０ｎｍで画像を捕捉した。【０１６７】
ＣａＳｉＲ−２ＡＭおよびＣａＳｉＲ−１ＡＭの両者において核（＃１−＃３）および細胞質（＃４−＃６）においで最大で刺激前の２倍程度となる蛍光強度のカルシウムオシレーションが観測されたが、ＣａＳｉＲ−１  ＡＭにおいては色素が最も多く集積し蛍光強度が高いリソソーム（＃７−＃９）でのカルシウムオシレーションは核・細胞質ほどには観測されないことが分かった。すなわち、リソソームに集積したプローブに由来する高いバックグラウンド蛍光のために、ＣａＳｉＲ−１は細胞内カルシウムオシレーションを捉える際に感度高く測定できないことが分かった。
ＣａＳｉＲ−１ＡＭがリソソーム内で蛍光を発している理由については、先行研究（文献１８：Lloyd-Evans E., Morgan A.J., He X., Smith D.A., Elliot-Smith E., Sillence D.J., Churchill G.C., Schuchman E.H., Galione A., Platt F.M., Nat. Med., 2008, 14, 1247-1255.）により説明がつけられる。すなわち、リソソームには初めからＣａＳｉＲ−１ＡＭの蛍光が振り切れる数１００μＭの濃度のＣａ２＋が存在するからである。したがって、ＣａＳｉＲ−１ＡＭはリソソームのカルシウム濃度を観察する場合には、有用なプローブである可能性があるが、カルシウムシグナリングにおいて重要となる細胞内カルシウムイオンの濃度変動を高感度に捉えるためには、細胞質に集積する性質を持つＣａＳｉＲ−２ＡＭの方が適していることが明らかとなった。【０１６８】
［実施例３］
ＣａＳｉＲ−２ＡＭのラット脳スライスにおけるＣａ２＋イメージングへの応用
神経科学の分野においては、脳機能を解明するために複数の神経細胞の活動を同時に追跡することが必要であり、その基盤技術としてＣａ２＋イメージング法は極めて重要である（文献１９：Grienberger C., Konnerth A., Neuron, 2012, 73, 862-885.；文献２０： Takahashi N., Sasaki T., Usami A., Matsuki N., Ikegaya Y., Neurosi. Res., 2007, 58, 219-225.；文献２１：21. Losonczy A., Makara J.K., Magree J.C., Nature, 2008, 452, 436-441.）。
従来は、神経活動に伴う活動電位は電極を用いることで測定されてきた。しかし、このような電気生理学的手法によって測定可能なニューロンは数が限られている上に、実際の神経活動は複数のニューロンによって構成される巨大な神経ネットワークの上に成り立っているため、実際の神経活動を観察する手法として、複数のニューロンを１細胞レベルで時空間分解能よく観察できる機能的多ニューロン同時画像法（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｕｌｔｉｎｅｕｒｏｎ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｍａｇｉｎｇ；  ｆＭＣＩ）が用いられるようになった（文献２２：Mizunuma M., Ikegaya Y., Folia Pharmacol. Jpn., 2009, 134, 17-21.）。
脳を構成する神経細胞は自発的な神経活動を行っており、これは自然発火と呼ばれている。そして、脳神経細胞は発火に伴い、電位依存性のＣａ２＋チャネルが開口し、細胞内へＣａ２＋が流入する。すなわち、ｆＭＣＩを用いて神経細胞にＣａ２＋プローブを導入して蛍光観察を行うことで、視野内の複数の神経細胞の活動をプローブの蛍光変化に置き換えることによって同時に観察することができ、どの神経細胞がどのタイミングで活動を行っているかを視覚的に観察することができる。そこで、本発明の化合物ＣａＳｉＲ−２ＡＭによって神経細胞における自然発火現象を観察することができるか検討を行った。
ＣａＳｉＲ−２ＡＭを添加した人工脳脊髄液にラット脳スライスを浸すという簡便な手法でプローブをロードし、蛍光イメージングを行い、ＣａＳｉＲ−２ＡＭが神経細胞内に取り込まれるか、そして神経細胞の自然発火が１細胞レベルで観察できるかをＣａＳｉＲ−１ＡＭと比較することで確かめた（図１１）。【０１６９】
図１１の左側の図を比較すると、ＣａＳｉＲ−２ＡＭとＣａＳｉＲ−１ＡＭとでは細胞内の局在が異なっており、ＣａＳｉＲ−２ＡＭでは細胞全体に色素が分布し、細胞質が染色されている様子が観察できるが、ＣａＳｉＲ−１ＡＭでは細胞内の一部のオルガネラに局在している様子が観察された。これは、培養細胞における実験結果を反映しているものと考えられた。また、神経細胞におけるカルシウム濃度変動に関しては、ＣａＳｉＲ−２ＡＭでは各々の神経細胞のカルシウム応答が高いＳ／Ｎ比で捉えられているのに対し、ＣａＳｉＲ−１ＡＭではシグナルの立ち上がりが鈍く、ベースラインが安定しないためにＳ／Ｎ比の高いイメージングができないことが分かった。
プローブの局在が異なることによりカルシウム応答の様子が著しく変化することは非常に興味深い現象であり、ＣａＳｉＲ−１ＡＭでシグナルが鋭くならなかった原因しては、色素が局在するオルガネラのカルシウム変動を同時に捉えているためと考えられた。本実験結果により、神経細胞における自然発火を捉えるためにはＣａ２＋プローブを細胞質に集積させることが重要であることが改めて示された。【０１７０】
次に、ＣａＳｉＲ−１が、実際にどのオルガネラに局在しているのかを確かめるため、ラット脳スライスへのプローブロードと同時に、リソソーム染色試薬であるＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（７５ｎＭ）又はミトコンドリア染色試薬であるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（２００ｎＭ）を加えて共染色を行った（図１２）。
蛍光イメージングの結果から、神経細胞内のＣａＳｉＲ−１ＡＭの局在に対してはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒよりもＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの方がより良くｍｅｒｇｅしている様子が観察された。従って、ラット脳スライスにおける実験でＣａＳｉＲ−１ＡＭは培養細胞と同様にリソソームへ局在することが分かった。【０１７１】
また、ＣａＳｉＲ−１ＡＭについては、部位ごとのトレースを比べてみると、細胞全体のトレースはリソソームと思われる構造と細胞質のものとの足し算になることが分かった（図１３）。すなわち、マウスの脳スライスを用いて神経発火を観察する場合、ＣａＳｉＲ−１ＡＭでは神経細胞の細胞質でのカルシウム濃度変動の他に、主にリソソームでのカルシウム変動も併せて捉えてしまうため、ベースラインが高くなり感度良く神経発火を捉えることができなかったと考えられる。ＣａＳｉＲ−２ＡＭがマウス脳スライスの系において感度高く神経発火を捉えることができる理由としては、細胞質に集積させることで神経発火に伴う細胞質内のカルシウム濃度変動のみを捕らえているからと実験から明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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