(57)【要約】  グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合する新たな核酸分子を提供する。  下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含む核酸分子を、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合する核酸分子とする。（ａ）配列番号１、８、もしくは１０の塩基配列または配列番号１、８、もしくは１０の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合するポリヌクレオチド
2018097220.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合する核酸分子。
（ａ）配列番号１、８、もしくは１０の塩基配列または配列番号１、８、もしくは１０の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合するポリヌクレオチド
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４（配列番号１）
GGTATGGAGGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTCAGCCAGACAGGGTTTATG
Ｇｌｉ９５＿３９５ＴＲ８ｍ１（配列番号８）
GGAAACGCCGCCTAGATCATTTGCGTCCTCCCTGGTGGGGATTGGCGAAAATTGACATCCTCAAGTTCCTGCGAAATG
Ｇｌｉ＿３９５ＢＲ８ｍ２（配列番号１０）
GGAAACGCCGCCTAGATCATTTGAAAACGTTGTTACCTCACCTATTATCTATTGACATCCTCAAGTTCCTGCGAAATG
【請求項２】
前記配列番号１、８、または１０の塩基配列の部分配列が、それぞれ、配列番号２〜７からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列、配列番号９の塩基配列、または配列番号１１の塩基配列である、請求項１記載の核酸分子。
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ５９Ａ（配列番号２）
GGTATGGAGGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTC
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ５１（配列番号３）
GGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTC
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ３８（配列番号４）
TCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTC
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ６７（配列番号５）
GGTATGGAGGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTCAGCCAGAC
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ５９Ｂ（配列番号６）
GGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTCAGCCAGAC
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ４６（配列番号７）
TCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTCAGCCAGAC
Ｇｌｉ９５＿３９５ＴＲ８ｍ１ｓ５０（配列番号９）
CGCCTAGATCATTTGCGTCCTCCCTGGTGGGGATTGGCGAAAATTGACAT
Ｇｌｉ＿３９５ＢＲ８ｍ２ｓ５１（配列番号１１）
GGAAACGCCGCCTAGATCATTTGAAAACGTTGTTACCTCACCTATTATCTA
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１個のチミンが、修飾塩基であり、前記チミンの修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である、請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドにおいて、チミンの全塩基数のうち、２０分の１以上が、修飾塩基であり、前記チミンの修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記各塩基配列における下線部で示されるチミンが、修飾塩基であり、前記チミンの修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１個のシトシンが、修飾塩基である、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドにおいて、シトシンの全塩基数のうち、２０分の１以上が、修飾塩基である、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記各塩基配列における下線部で示されるシトシンが、修飾塩基である、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
下記（ｅ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子。
（ｅ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、それぞれ、配列番号２〜７のいずれかの塩基配列、配列番号９の塩基配列、または配列番号１１の塩基配列を含む、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合するポリヌクレオチド
【請求項１１】
下記（ｆ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子。
（ｆ）配列番号１〜１１からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、それぞれ、式（Ｉ）〜（ＸＩ）で表される二次構造を形成可能である、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合するポリヌクレオチド
【化１】
2018097220.tif 000016
【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
2018097220.tif 000026
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、グルテンまたはグリアジンの検出試薬。
【請求項１３】
さらに、標識物質を有し、
前記標識物質が、前記核酸分子に結合されている、請求項１２記載の検出試薬。
【請求項１４】
前記標識物質が、酵素である、請求項１３記載の検出試薬。
【請求項１５】
前記酵素が、ルシフェラーゼである、請求項１４記載の検出試薬。
【請求項１６】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項１２から１５のいずれか一項に記載の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中のグルテンまたはグリアジンと、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、
前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする、グルテンまたはグリアジンの検出方法。
【請求項１７】
前記検出が、定性分析または定量分析である、請求項１６記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合する核酸分子およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
小麦は、日常的に頻繁に摂取される食品であるが、近年、小麦アレルギーの患者が増加しており、問題視されている。加工食品等は、小麦を使用するものが多く存在するため、加工食品やその製造ライン等においては、原料として小麦が混入しているか否かを分析することは、極めて重要である。【０００３】
アレルギーのアレルゲンは、一般的に、タンパク質やその分解物（ペプチド）であり、これらを抗原とする抗体を使用した分析方法が、主流である。小麦をはじめとする穀物に関しても、例えば、グルテン、および、グルテンを構成するタンパク質の１つであるグリアジンがアレルゲンとして知られている。グルテンに対する分析方法として、ＥＬＩＳＡ法を用いた方法が報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。【０００４】
しかし、抗体は、タンパク質であり、安定性に問題があるため、低コストで簡易な検査法に抗体を用いることが難しい。また、電気泳動やニトロセルロース膜へのブロッティング等が必要であり、操作が煩雑である。このため、近年、抗体に代えて、抗原と特異的に結合する核酸分子が注目されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】食衛誌  Vol.  45,  No.3,  pp128-134  (2004)
【非特許文献２】FEBS  Letters  Vol.  439    pp46-50  (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合する新たな核酸分子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の核酸分子は、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１、８、もしくは１０の塩基配列または配列番号１、８、もしくは１０の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合するポリヌクレオチド【０００８】
本発明のグルテンまたはグリアジンの検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。【０００９】
本発明のグルテンまたはグリアジンの検出方法は、前記本発明の核酸分子、または前記本発明の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中のグルテンまたはグリアジンと、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、
前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の核酸分子は、グルテンまたはグリアジンに結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、試料中のアレルゲンとの結合の有無によって、グルテンやグリアジンを検出できる。したがって、本発明の核酸分子は、例えば、食品製造、食品管理、食品の流通等の分野において、例えば、小麦等の穀物に由来するアレルゲンの検出に、極めて有用なツールといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の実施例１における、アプタマー１の推定二次構造である。
【図２】図２は、本発明の実施例１における、グリアジンおよびグルテンに対するアプタマー１の結合性を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例１における、グルテンに対するアプタマー１の結合性を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例１における、グリアジンに対するアプタマー１の結合性を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例２における、アプタマー２〜７の推定二次構造である。
【図６】図６は、本発明の実施例２における、グリアジンに対する各アプタマーの結合性を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例３における、発光量の測定結果を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例４における、アプタマー８〜１１の推定二次構造である。
【図９】図９は、本発明の実施例４における、グリアジンに対するアプタマー８および９の結合性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例４における、グリアジンに対するアプタマー１０および１１の結合性を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の実施例５における、加熱グリアジンに対するアプタマー８および９の結合性を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の実施例５における、加熱グリアジンに対するアプタマー１０および１１の結合性を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明の実施例６における、グルテンおよび加熱グルテンに対するアプタマー８〜１１の結合性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（１）核酸分子
本発明の核酸分子は、前述のように、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１、８、もしくは１０の塩基配列または配列番号１、８、もしくは１０の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合するポリヌクレオチド
【００１３】
本発明において、グルテンの由来は、特に制限されず、例えば、小麦、ライ麦、大麦、えん麦等の穀物があげられる。本発明の核酸について、例えば、結合能を確認するためのグルテンとして、市販のグルテンが使用でき、具体例として、小麦由来のグルテン（073-00575、和光純薬社製）が例示できる。グルテンは、例えば、加熱等による変性が生じていない未変性アレルゲンでもよいし、加熱等による変性が生じた変性アレルゲンでもよい。
【００１４】
本発明において、グリアジンの由来は、特に制限されず、例えば、前述したグルテンの由来と同様である。本発明の核酸について、例えば、結合能を確認するためのグリアジンとして、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ａ２７３１９に開示されたアミノ酸配列からなる、小麦由来のグリアジンタンパク質が例示できる。グリアジンは、例えば、加熱等による変性が生じていない未変性アレルゲンでもよいし、加熱等による変性が生じた変性アレルゲンでもよい。
【００１５】
本発明の核酸分子は、前述のように、グルテンまたはグリアジンに結合可能である。本発明において、「グルテンに結合する」とは、例えば、グルテンに対する結合性を有している、または、グルテンに対する結合活性を有しているともいい、「グリアジンに結合する」とは、例えば、グリアジンに対する結合性を有している、または、グリアジンに対する結合活性を有しているともいう。本発明の核酸分子とグルテンまたはグリアジンとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（商品名、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）が使用できる。本発明の核酸分子は、グルテンまたはグリアジンに結合することから、例えば、グルテンまたはグリアジンの検出に使用できる。
【００１６】
本発明の核酸分子は、グリアジンに対する結合力を示す解離定数が、例えば、５８１ｎｍｏｌ／Ｌ以下、１３２ｎｍｏｌ／Ｌ以下、１０２ｎｍｏｌ／Ｌ以下、２３ｎｍｏｌ／Ｌ以下、２０ｎｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００１７】
本発明の核酸分子は、ＤＮＡ分子、またはＤＮＡアプタマーともいう。本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
【００１８】
前記（ａ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記配列番号１、８、または１０の塩基配列を含むポリヌクレオチドでもよいし、前記配列番号１、８、または１０の塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよく、また、前記配列番号１、８、または１０の塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチドでもよいし、前記部分配列からなるポリヌクレオチドでもよい。前記配列番号１、８、および１０のポリヌクレオチドを以下に示す。
【００１９】
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４（配列番号１）
GGTATGGAGGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTCAGCCAGACAGGGTTTATG
Ｇｌｉ９５＿３９５ＴＲ８ｍ１（配列番号８）
GGAAACGCCGCCTAGATCATTTGCGTCCTCCCTGGTGGGGATTGGCGAAAATTGACATCCTCAAGTTCCTGCGAAATG
Ｇｌｉ＿３９５ＢＲ８ｍ２（配列番号１０）
GGAAACGCCGCCTAGATCATTTGAAAACGTTGTTACCTCACCTATTATCTATTGACATCCTCAAGTTCCTGCGAAATG
【００２０】
前記配列番号１の部分配列は、特に制限されないが、例えば、配列番号２〜７の塩基配列があげられる。
【００２１】
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ５９Ａ（配列番号２）
GGTATGGAGGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTC
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ５１（配列番号３）
GGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTC
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ３８（配列番号４）
TCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTC
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ６７（配列番号５）
GGTATGGAGGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTCAGCCAGAC
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ５９Ｂ（配列番号６）
GGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTCAGCCAGAC
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ４６（配列番号７）
TCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTCAGCCAGAC
【００２２】
前記配列番号８の部分配列は、特に制限されないが、例えば、配列番号９の塩基配列があげられる。
Ｇｌｉ９５＿３９５ＴＲ８ｍ１ｓ５０（配列番号９）
CGCCTAGATCATTTGCGTCCTCCCTGGTGGGGATTGGCGAAAATTGACAT
【００２３】
前記配列番号１０の部分配列は、特に制限されないが、例えば、配列番号１１の塩基配列があげられる。
Ｇｌｉ＿３９５ＢＲ８ｍ２ｓ５１（配列番号１１）
GGAAACGCCGCCTAGATCATTTGAAAACGTTGTTACCTCACCTATTATCTA
【００２４】
前記（ｂ）において、「同一性」は、特に制限されず、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００２５】
本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｃ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合するポリヌクレオチド
【００２６】
前記（ｃ）において、「ハイブリダイズするポリヌクレオチド」は、特に制限されず、例えば、前記（ａ）の塩基配列に対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【００２７】
前記（ｃ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
【００２８】
本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｄ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｄ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｄ）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合するポリヌクレオチド
【００２９】
前記（ｄ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｄ）のポリヌクレオチドが、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）の塩基配列において、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１または２個である。
【００３０】
本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｅ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｅ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｅ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、それぞれ、配列番号２〜７のいずれかの塩基配列、配列番号９の塩基配列、または配列番号１１の塩基配列を含む、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合するポリヌクレオチド
【００３１】
本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｆ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｆ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｆ）配列番号１〜１１からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、それぞれ、式（Ｉ）〜（ＸＩ）で表される二次構造を形成可能である、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合するポリヌクレオチド
【化１】
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【化２】
2018097220.tif 000004
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
2018097220.tif 000013
【００３２】
前記（ｆ）において、「二次構造を形成可能」とは、例えば、前記（ｆ）のポリヌクレオチドが、前記式におけるステム構造およびループ構造を形成可能であることをいう（以下、同様）。ステム構造およびループ構造については、後述する。
【００３３】
本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｇ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｇ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｇ）配列番号１、８、および１０からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、それぞれ、式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）のいずれか、式（ＩＸ）、および式（ＸＩ）で表される二次構造を形成可能である、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合するポリヌクレオチド
【００３４】
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｇ）のいずれかのポリヌクレオチドの配列を１つ含んでもよいし、前記ポリヌクレオチドの配列を複数含んでもよい。後者の場合、複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じでもよいし、異なってもよいが、好ましくは同じである。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上であり、好ましくは２〜１２であり、より好ましくは２〜６であり、さらに好ましくは２である。
【００３５】
前記リンカーは、例えば、ポリヌクレオチドがあげられ、その構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１〜２４塩基長であり、好ましくは１２〜２４塩基長であり、より好ましくは１６〜２４塩基長であり、さらに好ましくは２０〜２４塩基長である。
【００３６】
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
【００３７】
本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）〜（ｇ）のいずれかのポリヌクレオチドであり、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）〜（ｇ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）〜（ｇ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
【００３８】
本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
【００３９】
本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記核酸分子の長さは、特に制限されず、その下限は、例えば、１５塩基長であり、好ましくは７５塩基長または８０塩基長であり、その上限は、例えば、１０００塩基長であり、好ましくは２００塩基長、１００塩基長または９０塩基長である。
【００４０】
前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜３個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜３塩基」との記載は、「１、２、３塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００４１】
前記ポリヌクレオチドは、例えば、少なくとも１個の修飾塩基を含む。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、天然塩基（非人工塩基）が修飾された塩基があげられ、前記天然塩基と同様の機能を有することが好ましい。前記天然塩基は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等があげられる。前記塩基の修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられる。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられる。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「−ＣＨ３」または「−Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。
【００４２】
前記修飾塩基の修飾基は、特に制限されず、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基、下記式（１）のベンジルアミノカルボニル基（benzylaminocarbonyl）、下記式（２）のトリプタミノカルボニル基（tryptaminocarbonyl）およびイソブチルアミノカルボニル基（isobutylaminocarbonyl）等があげられる。
【化１２】
2018097220.tif 000014
【化１３】
2018097220.tif 000015
【００４３】
前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、アデニンが修飾された修飾アデニン、チミンが修飾された修飾チミン、グアニンが修飾された修飾グアニン、シトシンが修飾された修飾シトシンおよびウラシルが修飾された修飾ウラシル等があげられ、前記修飾チミン、前記修飾ウラシルおよび前記修飾シトシンが好ましい。
【００４４】
前記修飾アデニンの具体例としては、例えば、７’−デアザアデニン等があげられる。
【００４５】
前記修飾グアニンの具体例としては、例えば、７’−デアザグアニン等があげられる。
【００４６】
前記修飾シトシンの具体例としては、例えば、５’−メチルシトシン等があげられる。
【００４７】
前記修飾チミンの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルチミン、５’−トリプタミノカルボニルチミン、５’−イソブチルアミノカルボニルチミン等があげられる。
【００４８】
前記修飾ウラシルの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、５’−トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）および５’−イソブチルアミノカルボニルウラシル等があげられる。
【００４９】
前記ポリヌクレオチドは、特に制限されず、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の前記修飾塩基を含んでもよい。
【００５０】
前記修飾塩基の個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾塩基の個数は、例えば、１個以上である。前記修飾塩基は、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜８０個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜４０個、特に好ましくは１〜３０個、最も好ましくは１〜２０個であり、また、全ての塩基が、前記修飾塩基でもよい。前記修飾塩基の個数は、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基の個数であってもよいし、２種類以上の前記修飾塩基の個数の合計であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾塩基も、特に制限されず、例えば、１〜８０個、１〜５０個、１〜２０個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。
【００５１】
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾塩基の割合は、特に制限されない。前記修飾塩基の割合は、前記ポリヌクレオチドの全塩基数のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾塩基の割合も、特に制限されず、前述の範囲と同様である。ここで、前記全塩基数は、例えば、前記ポリヌクレオチドにおける天然塩基の個数と前記修飾塩基の個数の合計である。前記修飾塩基の割合を分数で示すが、これを満たす全塩基数と修飾塩基数とは、それぞれ正の整数である。
【００５２】
前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾チミンの場合、前記修飾チミンの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然チミンは、前記修飾チミンに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾チミンの個数は、例えば、１個以上である。前記修飾チミンは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜８０個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜４０個、特に好ましくは１〜３０個、最も好ましくは１〜２１個であり、また、全てのチミンが、前記修飾チミンでもよい。
【００５３】
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾チミンの割合は、特に制限されない。前記修飾チミンの割合は、前記天然チミンの個数と前記修飾チミンの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。
【００５４】
前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾ウラシルの場合、前記修飾ウラシルの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然チミンは、前記修飾ウラシルに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾ウラシルの個数は、例えば、１個以上である。前記修飾ウラシルは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜８０個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜４０個、特に好ましくは１〜３０個、最も好ましくは１〜２１個であり、また、全てのウラシルが、前記修飾ウラシルでもよい。
【００５５】
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾ウラシルの割合は、特に制限されない。前記修飾ウラシルの割合は、前記天然チミンの個数と前記修飾ウラシルの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。
【００５６】
前記修飾チミンと前記修飾ウラシルの個数の例示は、例えば、両者をあわせた個数であってもよい。
【００５７】
前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、前記各塩基配列における下線部で示されるチミンが、前記修飾チミンおよび前記修飾ウラシルの少なくとも一方でもよい。具体的には、例えば、配列番号１〜７、１０および１１のいずれかの塩基配列における下線部で示されるチミンが、５’−ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）でもよい。また、例えば、配列番号８および９のいずれかの塩基配列における下線部で示されるチミンが、５’−トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）でもよい。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記各塩基配列における下線部で示されるチミン以外のチミンは、例えば、天然塩基である。ただし、これには限定されず、前記各塩基配列における下線部で示されるチミン以外のチミンは、前記修飾塩基でもよい。
【００５８】
前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾シトシンの場合、前記修飾シトシンの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然シトシンは、前記修飾シトシンに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾シトシンの個数は、例えば、１個以上である。前記修飾シトシンは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜８０個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜４０個、特に好ましくは１〜３０個、最も好ましくは１〜２１個であり、であり、また、全てのシトシンが、前記修飾シトシンでもよい。
【００５９】
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾シトシンの割合は、特に制限されない。前記修飾シトシンの割合は、前記天然シトシンの個数と前記修飾シトシンの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。
【００６０】
前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、前記各塩基配列における下線部で示されるシトシンが、前記修飾シトシンでもよい。具体的には、例えば、配列番号１〜１１のいずれかの塩基配列における下線部で示されるシトシンが、５’−メチルシトシンでもよい。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記各塩基配列における下線部で示されるシトシン以外のシトシンは、例えば、天然塩基である。ただし、これには限定されず、前記各塩基配列における下線部で示されるシトシン以外のシトシンは、前記修飾塩基でもよい。
【００６１】
前記修飾塩基が、前記修飾アデニンまたは前記修飾グアニンの場合、前記修飾シトシンの個数および割合の説明において、「シトシン」および「修飾シトシン」を、それぞれ「アデニン」および「修飾アデニン」または「グアニン」および「修飾グアニン」に読み替えて援用できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然アデニンは、前記修飾アデニンに置換でき、例えば、天然グアニンは、前記修飾グアニンに置換できる。
【００６２】
本発明の核酸分子は、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖残基が修飾された修飾糖を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基および前記修飾糖を有するヌクレオチドでもよい。
【００６３】
前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。
【００６４】
前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基の２’位が修飾された、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
【００６５】
前記修飾ヌクレオチドの個数は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜８０個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜４０個、特に好ましくは１〜３０個、最も好ましくは１〜２１個である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾ヌクレオチドも、特に制限されず、例えば、１〜８０個、１〜５０個、１〜２０個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。
【００６６】
本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜８０個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜４０個、特に好ましくは１〜３０個、最も好ましくは１〜２１個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記人工核酸モノマー残基も、特に制限されず、例えば、１〜８０個、１〜５０個、１〜２０個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。
【００６７】
本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
【００６８】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長であり、好ましくは１〜５０塩基長であり、より好ましくは１〜２５塩基長、さらに好ましくは１８〜２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
【００６９】
本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することができる。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記担体に、例えば、前記付加配列を介して固定化する。前記担体は、例えば、ビーズ、プレート、フィルター、カラム、基板、容器等があげられる。
【００７０】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに標識物質を有してもよく、具体的には、前記核酸分子に前記標識物質が結合してもよい。前記標識物質が結合した前記核酸分子は、例えば、本発明の核酸センサということもできる。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合させてもよい。前記標識物質による標識化は、例えば、結合でもよいし、化学修飾でもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、酵素、蛍光物質、色素、同位体、薬物、毒素および抗生物質等があげられる。前記酵素は、例えば、ルシフェラーゼ、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子に直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、間接的に連結してもよい。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、ポリヌクレオチドのリンカー等である。
【００７１】
本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法、遺伝子工学的手法等の公知の方法等により合成できる。
【００７２】
本発明の核酸分子は、前述のように、グルテンに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、グルテンへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、グルテンに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
【００７３】
本発明の核酸分子によれば、グルテンを検出できる。グルテンの検出方法は、特に制限されず、グルテンと前記核酸分子との結合を検出することによって行える。
【００７４】
また、本発明の核酸分子は、前述のように、グリアジンに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子は、例えば、グリアジンへの結合性を利用する用途にも使用できる。本発明の核酸分子は、例えば、グリアジンに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
【００７５】
本発明の核酸分子によれば、例えば、グリアジンを検出できる。グリアジンの検出方法は、特に制限されず、グリアジンと前記核酸分子との結合を検出することによって行える。
【００７６】
（２）検出試薬およびキット
本発明の検出試薬は、前述のように、グルテンまたはグリアジンの検出試薬であって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出試薬を使用すれば、前述のように、例えば、グルテンまたはグリアジンの検出等を行うことができる。本発明の検出試薬は、例えば、グルテンへの結合剤またはグリアジンへの結合剤ともいえる。
【００７７】
本発明の検出試薬は、例えば、さらに、標識物質を有し、前記標識物質が、前記核酸分子に結合されてもよい。前記標識物質は、例えば、前記本発明の核酸分子における説明を援用できる。また、本発明の検出試薬は、例えば、担体を有し、前記担体に前記核酸分子が固定化されてもよい。前記担体は、例えば、前記本発明の核酸分子における説明を援用できる。
【００７８】
本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子または前記本発明の検出試薬を含む。本発明の検出キットは、例えば、さらに、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記試料を調製するための緩衝液、使用説明書等があげられる。また、後述する本発明の検出方法に示す、前記核酸分子に標識物質であるルシフェラーゼを結合させた核酸センサと、アレルゲン標識化担体とを用いる方法の場合、本発明の検出キットは、例えば、前記核酸センサと、アレルゲン標識化担体（グルテン標識化担体またはグリアジン標識化担体）を含むキットとすることができる。
【００７９】
本発明の検出試薬および検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の説明を援用でき、また、その使用方法についても、前記本発明の核酸分子および後述する前記本発明の検出方法を援用できる。
【００８０】
（３）検出方法
本発明のグルテンまたはグリアジンの検出方法は、前述のように、前記本発明の核酸分子、または前記本発明の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中のグルテンまたはグリアジンと、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子または前記検出試薬を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。以下、本発明の核酸分子の使用を例にあげて説明するが、本発明の核酸分子は、本発明の検出試薬と読み替え可能である。
【００８１】
本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、グルテンまたはグリアジンに特異的に結合することから、例えば、グルテンまたはグリアジンと、前記核酸分子または前記検出試薬との結合を検出することによって、試料中のグルテンまたはグリアジンを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のグルテンまたはグリアジンの量を分析可能であることから、定性分析または定量分析も可能といえる。
【００８２】
本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、食品、食品原料、食品添加物等があげられる。また、前記試料は、例えば、食品加工場または調理場等における付着物、洗浄後の洗浄液等があげられる。
【００８３】
前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記試料は、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体試料が好ましい。前記固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【００８４】
本発明の検出方法について、本発明の核酸分子として、標識物質で標識化された本発明の核酸センサを使用し、グルテンを検出する方法を例にあげて説明する。なお、グリアジンはグルテンの構成成分であることから、グルテンの検出は、グリアジンの検出として、読み替え可能である。なお、本発明は、これらの例示には制限されない。
【００８５】
前記検出工程は、例えば、さらに、前記複合体の検出結果に基づいて、前記試料中のグルテンの有無または量を分析する工程を含む。
【００８６】
前記複合体形成工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【００８７】
前記複合体形成工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは１８〜２５℃であり、接触時間は、例えば、１０〜１２０分であり、好ましくは３０〜６０分である。
【００８８】
前記複合体形成工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子（固相担体）でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前者の場合、前記担体は、特に制限されず、例えば、プレート、フィルター、カラム、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。
【００８９】
前記検出工程は、前述のように、前記試料中のグルテンと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のグルテンの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のグルテンの量を分析（定量）できる。
【００９０】
グルテンと前記核酸分子との結合の検出方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ等があげられる。
【００９１】
そして、グルテンと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にグルテンは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にグルテンが存在すると判断できる。また、予め、グルテンの濃度と結合量との相関関係を求めておき、前記相関関係に基づいて、前記結合量から、前記試料中のグルテンの濃度を分析することもできる。
【００９２】
グルテンと前記核酸分子との結合の検出について、一例として、前記核酸分子に標識物質であるルシフェラーゼを結合させた核酸センサと、グルテン標識化担体とを用いる方法を、以下に示す。
【００９３】
まず、前記核酸センサと前記試料とを混合する。これにより、前記試料中にグルテンが存在する場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、ターゲットであるグルテンと結合する。他方、前記試料中にグルテンが存在しない場合、前記核酸センサにおける核酸分子は、ターゲットと未結合の状態となる。
【００９４】
つぎに、前記混合物を、グルテン標識化担体に接触させた後、前記グルテン標識化担体を除去する。前記担体は、例えば、ビーズがあげられる。前記混合物において、前記核酸センサがグルテンと結合している場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、前記グルテン標識化担体におけるグルテンとは結合できない。このため、前記グルテン標識化担体を除去した画分に対して、ルシフェラーゼの基質を添加して発光反応を行った場合、前記核酸センサにおけるルシフェラーゼの触媒反応によって、発光が生じる。他方、前記混合物において、前記核酸センサがグルテンと結合していない場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、前記グルテン標識化担体におけるグルテンと結合する。このため、前記グルテン標識化担体の除去により、前記核酸センサも、前記グルテン標識化担体に結合した状態で除去されることになる。このため、前記グルテン標識化担体を除去した画分に対して、ルシフェラーゼの基質を添加して発光反応を行った場合、前記核酸センサが存在していないことから、ルシフェラーゼの触媒反応による発光は生じない。このため、発光の有無によって、試料中のグルテンの有無を分析（定性分析）することができる。また、試料中のグルテンの量と、前記グルテン標識化担体を除去した後の前記画分に残存する前記核酸センサの量とは、相関関係を有するため、発光の強弱によって、試料中のグルテンの量も分析（定量分析）することができる。
【００９５】
本発明によれば、前述のように、グルテンまたはグリアジンを検出できる。また、本発明によれば、グルテンまたはグリアジンの検出により、例えば、間接的に、小麦の有無を検出することも可能である。
【実施例】
【００９６】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。【００９７】
［実施例１］
本発明のアプタマーについて、グルテンおよびグリアジンに対する結合性を、ＳＰＲ解析により確認した。【００９８】
（１）アプタマー
下記ポリヌクレオチドのアプタマー１を、実施例のアプタマーとして合成した。下記配列番号１のポリヌクレオチドにおいて、下線部で示される「Ｔ」は、天然チミン（Ｔ）に代えて、チミンの５位が置換された５’−ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）を有するデオキシリボヌクレオチド残基とし、下線部で示される「Ｃ」は、天然シトシン（Ｃ）に代えて、シトシンの５位が置換された５’−メチルシトシンを有するデオキシリボヌクレオチド残基とした。
【００９９】
アプタマー１：Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４（配列番号１）
GGTATGGAGGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTCAGCCAGACAGGGTTTATG【０１００】
アプタマー１の推定二次構造を、図１に示す。ただし、これには限定されない。【０１０１】
前記アプタマーは、その３’末端に、２０塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。前記ポリｄＡ付加アプタマーは、９５℃、５分の条件で熱変性させたものを使用した。【０１０２】
（２）試料
小麦由来のグルテン（073-00575、和光純薬社製）を、ＳＢ１Ｔバッファーに懸濁し、一晩溶解させた後、遠心（１２，０００ｒｐｍ、１５分、室温）し分離した。前記分離した上清を、未変性グルテンを含む抽出液として得た。これをグルテン試料とした。また、小麦由来のグリアジン（cat#  101778、MP  Biomedicals社製）を使用し、同様にして、未変性グリアジンを含む抽出液を調製した。前記ＳＢ１Ｔバッファーの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨは、７．５とした。【０１０３】
以下の結合性試験において、前記アプタマーの交差反応の確認のため、以下に示す材料から、それぞれの試料を調製した。αカゼイン試料の調製は、前記グルテン試料の調製と同様にして行った。牛乳、卵、およびピーナッツは、フードプロセッサで破砕後、ＳＢ１Ｔバッファーに懸濁し、一晩溶解させた後、遠心（３０００ｇ、２０分、室温）し分離し、前記分離した上清を、０．８ｍｍのフィルターでろ過し、得られた抽出液を、試料として使用した。
鶏卵の卵白由来リゾチーム（120-02674、和光純薬社製）
鶏卵の全卵
牛乳由来αカゼイン（C6780-19、SIGMA社製）
牛乳（足柄乳業株式会社製）
生ピーナッツ（インドカレーの店アールティー社製）
ローストピーナッツ（KFVフルーツ社製）【０１０４】
（３）ＳＰＲによる結合性の解析
結合性の解析には、ProteON  XPR36（BioRad社）を、その使用説明書にしたがって使用した。【０１０５】
まず、前記ProteON専用のセンサーチップとして、ストレプトアビジンが固定化されたチップ（商品名  ProteOn  NLC  Sensor  Chip、BioRad社）を、前記ProteON  XPR36にセットした。前記センサーチップのフローセルに、超純水（ＤＤＷ）を用いて、１μｍｏｌ／Ｌのビオチン化ポリｄＴをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）が約９００ＲＵになるまで結合させた。前記ビオチン化ポリｄＴは、２０塩基長のデオキシチミジンの５’末端をビオチン化して調製した。そして、前記チップの前記フローセルに、ＳＢ１Ｔバッファーを用いて、１μｍｏｌ／Ｌの前記ポリｄＡ付加アプタマーを、流速２５μＬ／ｍｉｎで８０秒間インジェクションし、シグナル強度が約８００ＲＵになるまで結合させた。続いて、所定濃度（５００ｐｐｍまたは１００ｐｐｍ）の前記試料を、それぞれ、前記バッファーを用いて、流速２５μＬ／ｍｉｎで２４０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で、前記バッファーを流して、洗浄を行った。前記試料のインジェクション後、シグナル強度を測定し、前記試料のインジェクション開始を０秒として、２９５〜３１５秒におけるシグナル強度（ＲＵ）の平均値（ＲＵ２９５−３１５）を求めた。そして、前記ビオチン化ポリｄＴに前記ポリｄＡ付加アプタマーを結合させた時におけるＲＵ値（ＲＵｉｍｍｏｂ）とＲＵ２９５−３１５との比（ＲＵ２９５−３１５／ＲＵｉｍｍｏｂ）を算出した。【０１０６】
これらの結果を図２に示す。図２は、グリアジンおよびグルテンに対するアプタマー１の結合性を示すグラフであり、横軸は、各試料を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。横軸において、左から順に、グリアジン試料、グルテン試料、リゾチーム試料、卵試料、αカゼイン試料、牛乳試料、生ピーナッツ試料、およびローストピーナッツ試料を示す。各試料における濃度（ｐｐｍ）は、グリアジン試料、グルテン試料、リゾチーム試料、およびαカゼイン試料については、各タンパク質の濃度を示し、卵試料、牛乳試料、生ピーナッツ試料、およびローストピーナッツ試料については、各試料に含まれる全タンパク質の濃度を示す。図２に示すように、アプタマー１は、グリアジンおよびグルテンに対して、結合性を示した。一方、アプタマー１は、リゾチーム試料、卵試料、αカゼイン試料、牛乳試料、生ピーナッツ試料、およびローストピーナッツ試料に対しては、いずれも、シグナル強度が０．００以下であり、結合性を示さなかった。【０１０７】
つぎに、前記グルテン試料を使用し、前記試料におけるグルテンの濃度を、３．７、１１、３３、１００、および３００ｐｐｍとした以外は同様にして、結合性の解析を行った。【０１０８】
この結果を図３に示す。図３は、グルテンに対するアプタマー１の結合性を示すグラフであり、横軸は、グルテンの濃度（ｐｐｍ）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。図３に示すように、アプタマー１は、グルテンの濃度が増加するにつれて、シグナル強度が増加した。この結果から、本発明のアプタマーを用い、シグナル強度を測定することで、試料中のグルテン濃度を定量分析できることがわかった。【０１０９】
つぎに、前記グリアジン試料を使用し、前記試料におけるグリアジンの濃度を、０．２５、０．５、１、２、および４μｍｏｌ／Ｌとした以外は同様にして、結合性の解析を行い、前記試料のインジェクション開始後の所定時間におけるシグナル強度を求めた。【０１１０】
この結果を図４に示す。図４は、グリアジンに対するアプタマー１の結合性を示すグラフであり、横軸は、前記試料のインジェクション開始後の経過時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。図４に示すように、アプタマー１は、グリアジンの濃度が増加するにつれて、シグナル強度が増加した。【０１１１】
さらに、前記図４のＳＰＲ解析の結果から、動態パラメータを算出した。この結果、アプタマー１は、グリアジンに対する解離定数（ＫＤ）が、５．８１×１０−７ｍｏｌ／Ｌであり、優れた結合性であることがわかった。【０１１２】
［実施例２］
本発明の小型化アプタマーについて、グリアジンに対する結合性を、ＳＰＲ解析により確認した。【０１１３】
下記ポリヌクレオチドのアプタマー２〜７を、実施例の小型化アプタマーとして合成した。アプタマー２〜７は、前記実施例１のアプタマー１（配列番号１）を小型化したアプタマーである。下記ポリヌクレオチドにおいて、下線部で示される「Ｔ」は、天然チミン（Ｔ）に代えて、チミンの５位が置換された５’−ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）を有するデオキシリボヌクレオチド残基とし、下線部で示される「Ｃ」は、天然シトシン（Ｃ）に代えて、シトシンの５位が置換された５’−メチルシトシンを有するデオキシリボヌクレオチド残基とした。【０１１４】
アプタマー２：Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ５９Ａ（配列番号２）
GGTATGGAGGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTC
アプタマー３：Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ５１（配列番号３）
GGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTC
アプタマー４：Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ３８（配列番号４）
TCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTC
アプタマー５：Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ６７（配列番号５）
GGTATGGAGGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTCAGCCAGAC
アプタマー６：Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ５９Ｂ（配列番号６）
GGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTCAGCCAGAC
アプタマー７：Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ４６（配列番号７）
TCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTCAGCCAGAC【０１１５】
アプタマー２〜７の推定二次構造を、図５に示す。ただし、これには限定されない。【０１１６】
アプタマーとして、前記実施例１の前記アプタマー１と、前記小型化アプタマー２〜７を使用し、試料として、前記実施例１で調製したグリアジン試料（４μｍｏｌ／Ｌ）、リゾチーム試料（２５ｎｍｏｌ／Ｌまたは１００ｎｍｏｌ／Ｌ）、およびαカゼイン試料（１００ｎｍｏｌ／Ｌまたは４００ｎｍｏｌ／Ｌ）を使用した以外は、実施例１と同様にして、ＳＰＲによる結合性の解析を行った。【０１１７】
この結果を図６に示す。図６は、グリアジン（４μｍｏｌ／Ｌ）、リゾチーム（２５ｎｍｏｌ／Ｌまたは１００ｎｍｏｌ／Ｌ）、およびαカゼイン（１００ｎｍｏｌ／Ｌまたは４００ｎｍｏｌ／Ｌ）に対する各アプタマーの結合性を示すグラフであり、横軸は、各試料を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。各グラフは、左から順に、小型化アプタマー２、小型化アプタマー３、小型化アプタマー４、小型化アプタマー５、小型化アプタマー６、小型化アプタマー７、およびアプタマー１を示す。【０１１８】
図６に示すように、アプタマー１を小型化した小型化アプタマー２〜７は、いずれも、アプタマー１と比較して、グリアジンに対して、より高い結合性を示した。また、アプタマー１〜７は、リゾチームおよびαカゼインに対しては、いずれも、シグナル強度が０．００以下であり、結合性を示さなかった。これらの結果から、小型化アプタマー２〜７は、グリアジンに対して優れた特異性で結合することがわかった。【０１１９】
［実施例３］
本発明のアプタマーに標識物質ルシフェラーゼを結合させた核酸センサを作製し、前記核酸センサのグリアジンおよびグルテンに対する結合性を確認した。前記結合性の確認は、ターゲットであるグリアジンまたはグルテンが固相化されたターゲット固相化ビーズと、前記核酸センサとを用いて行った。【０１２０】
前述のように、反応液において、前記核酸センサが前記ターゲットと結合している場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、前記ターゲット固相化ビーズに固相化されたグリアジンまたはグルテンとは結合できない。このため、前記ターゲット固相化ビーズを除去した画分に対して発光反応を行った場合、前記核酸センサにおけるルシフェラーゼの触媒反応によって、発光が生じる。他方、前記反応液において、前記核酸センサが前記ターゲットと結合していない場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、前記ターゲット固相化ビーズに固相化されたグリアジンまたはグルテンと結合する。このため、前記ターゲット固相化ビーズの除去により、前記核酸センサも、前記ターゲット固相化ビーズに結合した状態で除去されることになる。このため、前記ターゲット固相化ビーズを除去した画分に対して、ルシフェラーゼの基質を添加して発光反応を行った場合、前記核酸センサが存在していないことから、ルシフェラーゼの触媒反応による発光は生じない。このため、前記核酸センサと前記ターゲット固相化ビーズとを用いて、ルシフェラーゼによる発光を検出することで、グリアジンまたはグルテンを検出することができる。【０１２１】
前記核酸センサは、蛍光物質ＮａｎｏＬｕｃ（商標）ルシフェラーゼ（Promega社製）を使用し、その使用説明書にしたがって、前記実施例１のアプタマー１（Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４）の５’末端を標識化することにより、調製した。【０１２２】
試料として、前記実施例１の前記グリアジン試料または前記グルテン試料を使用した。【０１２３】
前記ターゲット固相化ビーズは、ターゲットとして前記グリアジン試料または前記グルテン試料を使用し、NHS-activated  Sepharose  4  Fast  Flow  Lab  Packs（GE  Healthcare社製）を使用し、その使用説明書にしたがって調製した。【０１２４】
そして、前記核酸センサおよび前記ターゲット固相化ビーズを用い、前記核酸センサのグリアジンおよびグルテンに対する結合性を、以下に示すようにして確認した。まず、９６ウェルのＵ底プレートに、フィルタープレート（millipore社製、cat#MSGVN2250）をセットし、前記Ｕ底プレートの各ウェルに、５０μＬ／ウェルとなるように前記ターゲット固相化ビーズを加えた。前記各ウェルに、９０μＬの前記グリアジン試料または前記グルテン試料（終濃度  ０、０．４、１．２３５、３．７、１１．１、３３．３、１００ｐｐｍ）と、１０μＬの前記核酸センサ（２．５×１０６希釈）とを加え、１２００ｒｐｍ、５分、室温の条件で混合し、前記グリアジン試料または前記グルテン試料、前記ターゲット固相化ビーズ、および前記核酸センサを反応させた。その後、前記Ｕ底プレートを、３０００ｇ、２分、室温の条件で遠心分離し、前記ターゲット固相化ビーズを遠心除去した。前記遠心分離によって、前記フィルタープレートを通過した反応液を、前記各ウェルから回収し、発光量の測定に供した。前記発光量の測定には、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  Ｐｒｏ（ＴＥＣＡＮ社）を、その使用説明書にしたがって使用した。前記発光量の測定において、基質として、ＮａｎｏＧｌｏ（商標、Promega社製、cat#N2012）を使用した。また、交差反応の確認のため、前記グリアジン試料および前記グルテン試料に代えて、前述した卵、牛乳、および生ピーナッツを使用して、同様の測定を行った。【０１２５】
発光量の測定結果を図７に示す。図７は、グリアジン、グルテン、卵、牛乳、および生ピーナッツを試料とした場合における、発光量の測定結果を示すグラフである。図７において、横軸は、各試料の濃度を示し、縦軸は、発光量（ＲＬＵ）を示す。図７に示すように、グリアジン試料およびグルテン試料の場合、ルシフェラーゼの触媒反応による発光がみられた、前記グリアジン試料および前記グルテン試料のタンパク質濃度の増加に伴い、発光量が増加した。一方、前記卵試料、前記牛乳試料、および前記生ピーナッツ試料の場合は、いずれも、発光量は変化しなかった。【０１２６】
さらに、前記図７の測定結果から、３σ法により、前記核酸センサのグリアジンおよびグルテンに対する検出限界を算出した（ｎ＝３）。この結果、前記核酸センサのグリアジンおよびグルテンに対する検出限界（ＬＯＤ）は、それぞれ、１．２ｐｐｍであった。このことから、前記核酸センサは、微量のグリアジンおよびグルテンを検出可能であることがわかった。【０１２７】
［実施例４］
本発明のアプタマーについて、グリアジンに対する結合性を、ＳＰＲ解析により確認した。【０１２８】
下記ポリヌクレオチドのアプタマー８および９を、実施例１と同様にして、合成した。アプタマー９は、アプタマー８の小型化配列である。下記配列番号８および９のポリヌクレオチドにおいて、下線部で示される「Ｔ」は、天然チミン（Ｔ）に代えて、チミンの５位が置換された５’−トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）を有するデオキシリボヌクレオチド残基とし、下線部で示される「Ｃ」は、天然シトシン（Ｃ）に代えて、シトシンの５位が置換された５’−メチルシトシンを有するデオキシリボヌクレオチド残基とした。【０１２９】
アプタマー８：Ｇｌｉ９５＿３９５ＴＲ８ｍ１（配列番号８）
GGAAACGCCGCCTAGATCATTTGCGTCCTCCCTGGTGGGGATTGGCGAAAATTGACATCCTCAAGTTCCTGCGAAATG
アプタマー９：Ｇｌｉ９５＿３９５ＴＲ８ｍ１ｓ５０（配列番号９）
CGCCTAGATCATTTGCGTCCTCCCTGGTGGGGATTGGCGAAAATTGACAT【０１３０】
アプタマー８および９の推定二次構造を、図８（Ａ）に示す。ただし、これには限定されない。【０１３１】
アプタマー８および９を使用し、試料として、前記グリアジン試料を使用し、前記試料におけるグリアジンの濃度を、５０、１００、２００、および４００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は実施例１と同様にして、結合性の解析を行い、前記試料のインジェクション開始後の所定時間におけるシグナル強度を求めた。【０１３２】
この結果を図９に示す。図９（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、グリアジンに対するアプタマー８および９の結合性を示すグラフであり、横軸は、前記試料のインジェクション開始後の経過時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。図９（Ａ）および（Ｂ）に示すように、アプタマー８およびその小型化配列であるアプタマー９は、グリアジンの濃度が増加するにつれて、シグナル強度が増加した。【０１３３】
さらに、前記図９のＳＰＲ解析の結果から、動態パラメータを算出した。この結果、アプタマー８および９は、グリアジンに対する解離定数（ＫＤ）が、それぞれ、１９．４×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、および２２．７×１０−９ｍｏｌ／Ｌであり、優れた結合性であることがわかった。【０１３４】
つぎに、下記ポリヌクレオチドのアプタマー１０および１１を、実施例１と同様にして、合成した。アプタマー１１は、アプタマー１０の小型化配列である。下記配列番号１０および１１のポリヌクレオチドにおいて、下線部で示される「Ｔ」は、天然チミン（Ｔ）に代えて、チミンの５位が置換された５’−ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）を有するデオキシリボヌクレオチド残基とし、下線部で示される「Ｃ」は、天然シトシン（Ｃ）に代えて、シトシンの５位が置換された５’−メチルシトシンを有するデオキシリボヌクレオチド残基とした。【０１３５】
アプタマー１０：Ｇｌｉ＿３９５ＢＲ８ｍ２（配列番号１０）
GGAAACGCCGCCTAGATCATTTGAAAACGTTGTTACCTCACCTATTATCTATTGACATCCTCAAGTTCCTGCGAAATG
アプタマー１１：Ｇｌｉ＿３９５ＢＲ８ｍ２ｓ５１（配列番号１１）
GGAAACGCCGCCTAGATCATTTGAAAACGTTGTTACCTCACCTATTATCTA【０１３６】
アプタマー１０および１１の推定二次構造を、図８（Ｂ）に示す。ただし、これには限定されない。【０１３７】
アプタマー１０および１１を使用し、試料として、前記グリアジン試料を使用し、前記試料におけるグリアジンの濃度を、１００、２００、４００、および８００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は同様にして、結合性の解析を行い、前記試料のインジェクション開始後の所定時間におけるシグナル強度を求めた。【０１３８】
この結果を図１０に示す。図１０（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、グリアジンに対するアプタマー１０および１１の結合性を示すグラフであり、横軸は、前記試料のインジェクション開始後の経過時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。図１０（Ａ）および（Ｂ）に示すように、アプタマー１０およびその小型化配列であるアプタマー１１は、グリアジンの濃度が増加するにつれて、シグナル強度が増加した。【０１３９】
さらに、前記図１０のＳＰＲ解析の結果から、動態パラメータを算出した。この結果、アプタマー１０および１１は、グリアジンに対する解離定数（ＫＤ）が、それぞれ、１３２×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、および１０２×１０−９ｍｏｌ／Ｌであり、優れた結合性であることがわかった。【０１４０】
［実施例５］
本発明のアプタマーについて、加熱したグリアジンに対する結合性を、ＳＰＲ解析により確認した。【０１４１】
試料として、加熱グリアジン試料を使用した以外は実施例４と同様にして、結合性の解析を行い、前記試料のインジェクション開始後の所定時間におけるシグナル強度を求めた。前記加熱グリアジン試料は、前記グリアジン試料を、９５℃、１０分の条件で加熱処理し、１２０００×ｇで１０分遠心した後、上清を回収することにより調製した。【０１４２】
この結果を図１１および１２に示す。図１１（Ａ）および（Ｂ）は、加熱グリアジンに対するアプタマー８および９の結合性を示すグラフであり、横軸は、前記試料のインジェクション開始後の経過時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。図１１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、アプタマー８およびその小型化配列であるアプタマー９は、加熱グリアジンの濃度が増加するにつれて、シグナル強度が増加した。【０１４３】
図１２（Ａ）および（Ｂ）は、加熱グリアジンに対するアプタマー１０および１１の結合性を示すグラフであり、横軸は、前記試料のインジェクション開始後の経過時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。図１２（Ａ）および（Ｂ）に示すように、アプタマー１０およびその小型化配列であるアプタマー１１は、加熱グリアジンの濃度が増加するにつれて、シグナル強度が増加した。【０１４４】
さらに、前記図１１および１２のＳＰＲ解析の結果から、動態パラメータを算出した。この結果、アプタマー８〜１１は、加熱グリアジンに対する解離定数（ＫＤ）が、それぞれ、１９．７×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、２１．７×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、１３４×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、および９９．５×１０−９ｍｏｌ／Ｌであり、優れた結合性であることがわかった。【０１４５】
［実施例６］
本発明のアプタマーについて、グルテンおよび加熱グルテンに対する結合性を、ＳＰＲ解析により確認した。【０１４６】
アプタマーとして、アプタマー８〜１１を使用し、試料として、１００ｐｐｍの前記グルテン試料、および加熱グルテン試料を使用した以外は実施例１と同様にして、結合性の解析を行った。前記加熱グルテン試料は、前記グルテン試料を、９５℃、１０分の条件で加熱処理し、１２０００×ｇで１０分遠心した後、上清を回収することにより調製した。また、前記アプタマーの交差反応の確認のため、前記卵試料、前記牛乳試料、および前記生ピーナッツ試料を使用した以外は同様にして、結合性の解析を行った。【０１４７】
この結果を図１３に示す。図１３は、グルテンおよび加熱グルテンに対するアプタマー８〜１１の結合性を示すグラフであり、横軸は、アプタマーの種類を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。横軸において、左から順に、アプタマー８、アプタマー１０、アプタマー９、およびアプタマー１１を示す。各グラフは、左から順に、グルテン試料、加熱グルテン試料、卵試料、牛乳試料、および生ピーナッツ試料を示す。図１３に示すように、アプタマー８〜１１は、グルテンおよび加熱グルテンに対して、結合性を示した。一方、アプタマー８〜１１は、卵試料、牛乳試料、および生ピーナッツ試料に対しては、シグナル強度が０．０５以下であり、結合性を示さなかった。【０１４８】
以上の結果から、本発明のアプタマーは、グルテンおよび加熱グルテンに特異的に結合し、それを測定により検出できること、および、本発明のアプタマーによれば、発光の強弱によって、試料中のグルテンおよび加熱グルテンの量を分析できることがわかった。【０１４９】
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。【０１５０】
この出願は、２０１６年１１月２４に出願された日本出願特願２０１６−２２７８６５を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明の核酸分子は、グルテンまたはグリアジンに結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、試料中のアレルゲンとの結合の有無によって、グルテンやグリアジンを検出できる。このため、本発明の核酸分子は、例えば、食品製造、食品管理、食品の流通等の分野において、例えば、小麦等の穀物に由来するアレルゲンの検出に、極めて有用なツールといえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月14日(2019.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合する核酸分子。
（ａ）配列番号１、８、もしくは１０の塩基配列または配列番号１、８、もしくは１０の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合するポリヌクレオチド
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４（配列番号１）
GGTATGGAGGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTCAGCCAGACAGGGTTTATG
Ｇｌｉ９５＿３９５ＴＲ８ｍ１（配列番号８）
GGAAACGCCGCCTAGATCATTTGCGTCCTCCCTGGTGGGGATTGGCGAAAATTGACATCCTCAAGTTCCTGCGAAATG
Ｇｌｉ＿３９５ＢＲ８ｍ２（配列番号１０）
GGAAACGCCGCCTAGATCATTTGAAAACGTTGTTACCTCACCTATTATCTATTGACATCCTCAAGTTCCTGCGAAATG
【請求項２】
前記配列番号１、８、または１０の塩基配列の部分配列が、それぞれ、配列番号２〜７からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列、配列番号９の塩基配列、または配列番号１１の塩基配列である、請求項１記載の核酸分子。
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ５９Ａ（配列番号２）
GGTATGGAGGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTC
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ５１（配列番号３）
GGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTC
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ３８（配列番号４）
TCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTC
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ６７（配列番号５）
GGTATGGAGGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTCAGCCAGAC
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ５９Ｂ（配列番号６）
GGCAAGTCCCAATTCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTCAGCCAGAC
Ｇｌｕ３９２ＢＲ８ｍ４＿ｓ４６（配列番号７）
TCGTGCAGAGAAACGTGTCTGTATTTATTAATCGTTTCAGCCAGAC
Ｇｌｉ９５＿３９５ＴＲ８ｍ１ｓ５０（配列番号９）
CGCCTAGATCATTTGCGTCCTCCCTGGTGGGGATTGGCGAAAATTGACAT
Ｇｌｉ＿３９５ＢＲ８ｍ２ｓ５１（配列番号１１）
GGAAACGCCGCCTAGATCATTTGAAAACGTTGTTACCTCACCTATTATCTA
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１個のチミンが、修飾塩基であり、前記チミンの修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である、請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１個のシトシンが、修飾塩基である、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
下記（ｅ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸分子。
（ｅ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、それぞれ、配列番号２〜７のいずれかの塩基配列、配列番号９の塩基配列、または配列番号１１の塩基配列を含む、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合するポリヌクレオチド
【請求項７】
下記（ｆ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸分子。
（ｆ）配列番号１〜１１からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、それぞれ、式（Ｉ）〜（ＸＩ）で表される二次構造を形成可能である、グルテンおよびグリアジンの少なくとも一方に結合するポリヌクレオチド
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、グルテンまたはグリアジンの検出試薬。
【請求項９】
さらに、標識物質を有し、
前記標識物質が、前記核酸分子に結合されている、請求項８記載の検出試薬。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項８もしくは９記載の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中のグルテンまたはグリアジンと、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、
前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする、グルテンまたはグリアジンの検出方法。
【国際調査報告】
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