【手続補正書】
【提出日】平成31年1月15日(2019.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内へのタンパク質及び核酸の送達方法であって、
懸濁液中の細胞を準備すること；
細胞変形狭窄部を含むマイクロ流体チャネルに前記懸濁液を通過させ、前記タンパク質及び前記核酸が通過するのに十分大きな前記細胞の摂動を誘導すること；ならびに
前記細胞が前記狭窄部を通過する前、その最中、及び／またはその後に、前記細胞を前記タンパク質及び前記核酸と接触させること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記タンパク質及び前記核酸が、タンパク質−核酸複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質及び前記核酸が、前記タンパク質−核酸複合体のコンポーネントであるが、前記細胞への送達時には複合体化していない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質及び前記核酸が、前記細胞内への送達後にタンパク質−核酸複合体を形成する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質及び前記核酸が、前記細胞内への送達前にタンパク質−核酸複合体を形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質及び前記核酸が、遺伝子編集コンポーネントを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質−核酸複合体が、
（ａ）リボ核タンパク質（ＲＮＰ）;または
（ｂ）第１ＲＮＰ及び第２ＲＮＰ；
を含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）前記タンパク質が、Ｃａｓタンパク質またはＣｐｆ１タンパク質であり；
（ｂ）前記核酸が、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランスアクチベーティングｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）である；
請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質及び前記核酸が、Ｃａｓタンパク質またはＣｐｆ１タンパク質及びｓｇＲＮＡを含むＲＮＰを含むタンパク質−核酸複合体を形成し、前記Ｃａｓタンパク質または前記Ｃｐｆ１タンパク質及び前記ｓｇＲＮＡが、約１：１０〜約１０：１のモル比で複合体化させた、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１ＲＮＰ及び前記第２ＲＮＰが、両方ともニッカーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１ＲＮＰが、前記第２ＲＮＰの標的配列とは異なる標的配列にニックを入れる、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質及び前記核酸が、タンパク質−核酸複合体を形成し、前記タンパク質−核酸複合体が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、静電引力を介してタンパク質と複合体化している核酸分子、タンパク質に巻きついた核酸分子、ＤＮＡ及びヒストン、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、リボソーム、酵素テロメラーゼ、ヴォールトリボ核タンパク質、ＲＮａｓｅ  Ｐ、ｈｎＲＮＰ、もしくは核内低分子ＲＮＰ（ｓｎＲＮＰ）、またはタンパク質を含む染色体を含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸が、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記懸濁液が、ドナーＤＮＡをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が前記狭窄部を通過する前、その最中、及び／またはその後に、前記懸濁液が、ドナーＤＮＡをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記狭窄部の直径が、前記細胞の直径の２０〜９９％である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記狭窄部の直径が、前記細胞の直径の２０〜６０％である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が複数の細胞の１つであり、前記複数の細胞の各細胞を複数の並列マイクロ流体チャネルのうちの１つに通過させ、
前記複数の並列マイクロ流体チャネルの各マイクロ流体チャネルが、細胞変形狭窄部を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）前記狭窄部の直径が、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２〜１０μｍ、もしくは１０〜２０μｍであり；
（ｂ）前記狭窄部の長さが、約１０、１５、２０、２４、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、もしくは１０〜１００μｍであり；
（ｃ）前記マイクロ流体チャネルに前記懸濁液を通過させるために約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００もしくは１０〜１００ｐｓｉの圧力を用い；
（ｄ）前記細胞が、約３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１００〜３００、２００〜７００、２５０〜４００、１００〜１０００ｍｍ／ｓ、１〜１０００ｍｍ／ｓ、１ｍ／ｓ、２ｍ／ｓ、３ｍ／ｓ、４ｍ／ｓ、５ｍ／ｓ、６ｍ／ｓ、７ｍ／ｓ、８ｍ／ｓ、９ｍ／ｓ、１０ｍ／ｓ、０．０１〜５ｍ／ｓ、５〜１０ｍ／ｓ、もしくは０．０１〜１０ｍ／ｓの速度で前記マイクロ流体チャネルを通過し；
（ｅ）前記マイクロ流体チャネルが、複数の細胞変形狭窄部を含み；
（ｆ）前記マイクロ流体チャネルが、単一の細胞変形狭窄部を含み；
（ｇ）前記細胞の前記摂動が、約１〜２０、１〜６００、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、もしくは６００ｎｍの最大直径を含み； 
（ｈ）約１〜２０、１〜６００、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、もしくは６００ｎｍの最大直径を有する前記細胞の摂動が、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０分間前記細胞上で持続する；及び／または
（ｉ）前記複数の並列マイクロ流体チャネルが、少なくとも約２、５、１０、２０、２５、３０、４０、４５、５０、７５、１００、５００、１０００、または２〜１０００のマイクロ流体チャネルを含む；
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞に前記タンパク質及び前記核酸を送達した後、
（ａ）前記細胞における標的遺伝子の発現が、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％もしくはこれより多く減少する；または
（ｂ）前記細胞が複数の細胞であり、前記複数の細胞における標的遺伝子の発現が、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％もしくはこれより多く減少する；
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞に前記タンパク質及び前記核酸を送達した後、
（ａ）前記細胞における標的遺伝子の発現が、少なくとも約５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００％もしくはこれより多く増加する；または
（ｂ）前記細胞が複数の細胞であり、前記複数の細胞における標的遺伝子の発現が、少なくとも約５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００％もしくはこれより多く増加する；
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含む、細胞にタンパク質−核酸複合体を送達するためのデバイスであって、前記マイクロ流体チャネルが、前記細胞の直径の２０〜９９％である直径を有する狭窄部幅を備える、前記デバイス。