(57)【要約】  精製ネコエリスロポエチン（ｆＥＰＯ）を製造するための改善された手段を提供することを目的とする。  本発明の精製ｆＥＰＯの製造方法は、ｆＥＰＯを含むタンパク質液のｐＨを４以上、７以下の範囲に調整するｐＨ調整工程と、ｐＨ調整工程においてｐＨ調整されたタンパク質液を、陽イオン交換基を備えた担体に接触させてｆＥＰＯを吸着させ、次いでｆＥＰＯを前記担体から溶出させることを含む精製工程とを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製されたネコ由来エリスロポエチンの製造方法であって、
ネコ由来エリスロポエチンを含むタンパク質液のｐＨを４以上、７以下の範囲に調整するｐＨ調整工程と、
ｐＨ調整工程においてｐＨ調整されたタンパク質液を、陽イオン交換基を備えた担体に接触させてネコ由来エリスロポエチンを吸着させ、次いで吸着されたネコ由来エリスロポエチンを前記担体から溶出させることを含む精製工程と
を含む方法。
【請求項２】
精製工程の前に、ｐＨ調整工程においてｐＨ調整されたタンパク質液から析出物を除去する析出物除去工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐＨ調整工程において前記タンパク質液のｐＨを４．７以上の範囲に調整する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ｐＨ調整工程において、前記タンパク質液と、酸性領域で緩衝作用を有する成分を１Ｍ以下の濃度で含む、酸性領域で緩衝作用を有する緩衝液とを混合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ｐＨ調整工程において、前記タンパク質液と、前記タンパク質液１容量部に対して１．５容量部以上の、酸性領域で緩衝作用を有する緩衝液とを混合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ｐＨ調整工程において用いる前記タンパク質液が、ネコ由来エリスロポエチンをコードする外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類の卵を用いて調製されたタンパク質液である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により、精製されたネコ由来エリスロポエチンを製造する工程と、
前記精製されたネコ由来エリスロポエチンを水溶性長鎖分子で化学修飾して水溶性長鎖分子付加ネコ由来エリスロポエチンを得る水溶性長鎖分子付加工程と
を含む、水溶性長鎖分子付加ネコ由来エリスロポエチンの製造方法。
【請求項８】
水溶性長鎖分子付加工程において得られた水溶性長鎖分子付加ネコ由来エリスロポエチンをフィルターに通してウイルスを除去するウイルス除去工程を更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
水溶性長鎖分子付加工程において得られた水溶性長鎖分子付加ネコ由来エリスロポエチンを含み、哺乳動物の体液の浸透圧及びｐＨと同じ浸透圧及びｐＨを有する液状組成物を調製する製剤化工程を更に含む、請求項７又は８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物用医薬の有効成分として利用することができる、精製されたネコ由来エリスロポエチンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ネコはペットとして昔から人間に愛着のある動物であるが、最近では「伴侶、仲間、相棒としての動物」として人間社会の一員としての地位が確立しつつある。一方、医学、薬学、獣医学、心理学などで従来から実験動物として使用されており、最近では医薬品の安全性試験、効果検定にも使用されるようになってきている。このようにネコの社会的重要性が高まっている状況の中では、ネコの疾病や伝染病に対する関心が高く、その有効な治療法が望まれている。近年ネコの疾病治療においても医薬用タンパク質が注目されており、主としてヒト用の医薬用タンパク質が転用されている。しかし、ヒト用の医薬用タンパク質はネコが本来持つ生体内タンパク質とアミノ酸配列が異なるため、生体内での効果が異なる可能性がある。また、アミノ酸配列の差異により、アレルギーを起こす可能性もあり、悪くすればアナフィラキシー様症状を引き起こす。よって、高頻度の投与には耐えないため、ネコが本来もつ医薬用タンパク質の開発が求められている。【０００３】
そこで本出願人は、ネコ由来医薬用タンパク質として、腎性貧血等の疾患の治療に用いることができるネコ由来エリスロポエチンを、トランスジェニック鳥類を用いて生産する技術を開発している（特許文献１、２）。【０００４】
特許文献１及び２では、ネコ由来エリスロポエチンを発現するよう遺伝子組み換えしたトランスジェニック鳥類の卵の卵白からネコ由来エリスロポエチンを取得する方法を開示している。特許文献１及び２では、トランスジェニック鳥類の卵白からネコ由来エリスロポエチンを精製し回収するためには、塩析法、吸着カラムクロマトグラフ法（ブルーセファロースクロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー等）、イオン交換カラムクロマトグラフ法、ゲルろ過カラムクロマトグラフ法、抗体カラム法を単独、もしくは組み合わせて精製することが開示されている。【０００５】
特許文献１の実施例９では、卵白を水で希釈してｐＨを５．０に調整して１５分間以上撹拌したのち遠心分離し、上清をｐＨ７．０に調整する前処理を行うこと、並びに、前処理後の卵白液に対して、ブルーセファロースクロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー、脱塩カラム、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーをこの順で行ってネコ由来エリスロポエチンを精製することが開示されている。【０００６】
特許文献２の段落００２６では、卵白を前処理としてバッファーで希釈してｐＨ調整したのちにブルーセファロースカラムに供し、透析後、陽イオン交換カラム（ＳＰカラム）で目的物を分画し、限外濃縮したのちに脱塩カラム処理後、陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥセファロースカラム）精製で純度９９％以上のネコエリスロポエチンを取得することが開示されている。【０００７】
特許文献３では、アミノ酸配列が改変されたネコ由来エリスロポエチンのバリアントを、ＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣）細胞等の細胞を用いて発現させ、該細胞の培地または細胞溶解液から精製する方法が開示されている。精製のための手法として、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー等が例示されている。特許文献３の実施例８ではネコ由来エリスロポエチンのバリアントを発現する細胞の培養上清をｐＨ８．５に調整し、フェニルボロネートクロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーをこの順で行い、ネコ由来エリスロポエチンのバリアントを精製することが開示されている。【０００８】
一方、特許文献４の実施例２４では、ヒト由来エリスロポエチンを生産するトランスジェニックニワトリの卵の卵白を、３倍量のｐＨ４．６の５０ｍＭ酢酸ナトリウムで希釈し、混合した後、ろ過して、セファロース陽イオン交換カラムを用いてヒト由来エリスロポエチンを精製することが開示されている。特許文献５では、ヒト由来エリスロポエチン産生哺乳類細胞を培養し、培養上清からヒト由来エリスロポエチンを精製し回収する方法として、色素アフィニティークロマトグラフィーにより精製する第一ステップと、ハイドロキシアパタイトカラムにより精製する第二ステップと、陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製する第三ステップとを行う方法が開示されている。【０００９】
特許文献６では、卵白をクロマトグラフィー処理のために前処理する方法として、卵白のプールに、卵白に対して約０．５重量％〜約５重量％の酸性緩衝液を添加し、ｐＨが約５〜６．５の混合卵白が形成されるように前記卵白と前記酸性緩衝液を混合する方法が開示されている。特許文献６では前記酸性緩衝液として、約５Ｍ〜約６Ｍの酢酸ナトリウムを含む緩衝液が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−８９５７８号公報
【特許文献２】特開２０１０−１１１５９５号公報
【特許文献３】特表２０１２−５０４１３６号公報
【特許文献４】特表２０１０−５０９３２７号公報
【特許文献５】特表２０１０−５１１３７８号公報
【特許文献６】国際公開ＷＯ２０１５／１６４３２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、特許文献１及び２において具体的に開示されている精製方法は、ブルーセファロースクロマトグラフィーを使用するものである。ブルーセファロースクロマトグラフィーで用いるカラムは、担体に色素の分子が固定されたものであるが、これらの分子がネコ由来エリスロポエチンの精製物に混入するリスクは皆無ではない。【００１２】
また、特許文献４及び５では、ネコ由来エリスロポエチンを生産し精製することは一切記載されていない。さらに特許文献４では、陽イオン交換クロマトグラフィーの処理の前に酸性領域内にタンパク質溶液をｐＨ調整すること及びカラムにロードする際に酸性領域において緩衝作用を有する緩衝液を使用することについて開示されていない。また特許文献５の方法では、色素アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製を行うため、特許文献１、２と同様に、色素分子がエリスロポエチンの精製物に混入するリスクが皆無ではない。【００１３】
また、特許文献６には、ネコ由来エリスロポエチンを生産し精製することは一切記載されていない。当然ながら特許文献６は、ネコ由来エリスロポエチンを精製して回収するために適した手段を開示していない。【００１４】
上述より、タンパク質液からネコ由来エリスロポエチンを精製して回収する方法として、従来公知である色素アフィニティークロマトグラフィーを利用する方法（特許文献１、２等）は必ずしも満足できるものではない。また、特許文献３ではアフィニティークロマトグラフィーを利用するタンパク質精製方法だけでなく、それを利用しないタンパク質精製方法も記載されているが、アフィニティークロマトグラフィーを利用しない場合は、一般に精製倍率を上げるために多段階のクロマトグラフィーを要するという問題があり、改善の余地がある。【００１５】
したがって、本発明は、精製されたネコ由来エリスロポエチンを製造するために最適化された手段を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決するための手段として本明細書では以下の発明を開示する。
（１）精製されたネコ由来エリスロポエチンの製造方法であって、
ネコ由来エリスロポエチンを含むタンパク質液のｐＨを４以上、７以下の範囲に調整するｐＨ調整工程と、
ｐＨ調整工程においてｐＨ調整されたタンパク質液を、陽イオン交換基を備えた担体に接触させてネコ由来エリスロポエチンを吸着させ、次いで吸着されたネコ由来エリスロポエチンを前記担体から溶出させることを含む精製工程と
を含む方法。
（２）精製工程の前に、ｐＨ調整工程においてｐＨ調整されたタンパク質液から析出物を除去する析出物除去工程を更に含む、（１）に記載の方法。
（３）ｐＨ調整工程において前記タンパク質液のｐＨを４．７以上の範囲に調整する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ｐＨ調整工程において、前記タンパク質液と、酸性領域で緩衝作用を有する成分を１Ｍ以下の濃度で含む、酸性領域で緩衝作用を有する緩衝液とを混合する、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）ｐＨ調整工程において、前記タンパク質液と、前記タンパク質液１容量部に対して１．５容量部以上の、酸性領域で緩衝作用を有する緩衝液とを混合する、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）ｐＨ調整工程において用いる前記タンパク質液が、ネコ由来エリスロポエチンをコードする外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類の卵を用いて調製されたタンパク質液である（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の方法により、精製されたネコ由来エリスロポエチンを製造する工程と、
前記精製されたネコ由来エリスロポエチンを水溶性長鎖分子で化学修飾して水溶性長鎖分子付加ネコ由来エリスロポエチンを得る水溶性長鎖分子付加工程と
を含む、水溶性長鎖分子付加ネコ由来エリスロポエチンの製造方法。
（８）水溶性長鎖分子付加工程において得られた水溶性長鎖分子付加ネコ由来エリスロポエチンをフィルターに通してウイルスを除去するウイルス除去工程を更に含む、（７）に記載の方法。
（９）水溶性長鎖分子付加工程において得られた水溶性長鎖分子付加ネコ由来エリスロポエチンを含み、哺乳動物の体液の浸透圧及びｐＨと同じ浸透圧及びｐＨを有する液状組成物を調製する製剤化工程を更に含む、（７）又は（８）に記載の方法。【００１７】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１６−０７２８１５号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、精製されたネコ由来エリスロポエチンを製造するための改善された手段が提供される。【００１９】
本発明では、ｐＨ調整工程と、陽イオン交換基を備えた担体を用いる精製工程とを併用することで、ネコ由来エリスロポエチンを効率的に精製することができる。【００２０】
また、ｐＨ調整工程によりタンパク質液から不溶性成分を析出物として析出させてから精製工程を行う本発明の実施形態によれば、ネコ由来エリスロポエチンを効率的に精製することができる。【００２１】
更に、精製工程において、酸性領域で緩衝作用を有する緩衝液中で、陽イオン交換基を備えた担体に接触させてネコ由来エリスロポエチンを吸着させる本発明の実施形態によれば、ネコ由来エリスロポエチンを更に効率的に精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実験２において、卵白溶液をｐＨ調整し静置して１時間経過後の写真を示す。サンプル番号とｐＨ条件との対応関係は表１に記載の通り。
【図２】実験４における、各ｐＨ条件での陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによる精製の溶出チャートを示す。実線は総タンパク質量を、点線はｆＥＰＯ回収率をそれぞれ示す。総タンパク質量の大部分はＯＴＦ（オボトランスフェリン）である。横軸は溶出液量をカラム体積（ＣＶ）で示す。
【図３】実験４において、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによる精製をｐＨ４．８にて行った際の、分子量マーカーＭ、精製前の前処理後卵白原料Ｐ、非吸着画分Ｆ、洗浄画分Ｗ、溶出画分Ｅ、全溶出画分ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。分子量マーカーＭの数字の単位はキロダルトン（ｋＤa）である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
＜ネコ由来エリスロポエチン＞
以下、エリスロポエチンを「ＥＰＯ」と記載する場合がある。またネコ由来エリスロポエチンを「ｆＥＰＯ」と記載する場合がある。
【００２４】
ｆＥＰＯをコードするＤＮＡ塩基配列を配列番号１に示す。配列番号１に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列は配列番号２に示す通りであり、このうち第１〜第２６アミノ酸残基はシグナル配列であるため、ｆＥＰＯプレタンパク質ともいう。そして、前記ｆＥＰＯプレタンパク質のシグナル配列が除かれ、且つ第１９２アミノ酸基が欠失したアミノ酸配列が成熟ｆＥＰＯであり、成熟ｆＥＰＯのアミノ酸配列は配列番号３に示す通りである。ｆＥＰＯとしてはまた、配列番号２のｆＥＰＯプレタンパク質のアミノ酸配列を一部に含むポリペプチドや、配列番号３の成熟ｆＥＰＯのアミノ酸配列を一部に含むポリペプチドであってもよい。
【００２５】
ｆＥＰＯとしてはまた、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるｆＥＰＯプレタンパク質及び配列番号３に示すアミノ酸配列からなる成熟ｆＥＰＯに限らず、その活性変異体も使用できる。活性変異体は、好ましくは、本願明細書の実施例に示す活性測定条件において、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるｆＥＰＯプレタンパク質、或いは、配列番号３に示すアミノ酸配列からなる成熟ｆＥＰＯを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、更に好ましくは８０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体には、例えば、配列番号２又は３に示すアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、より好ましくは配列番号２又は３に示すアミノ酸配列においてそのＮ末端及び／又はＣ末端に、合計で１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドや、配列番号２又は３に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。配列番号２に示すアミノ酸配列からなるｆＥＰＯプレタンパク質の活性変異体は、より好ましくは、配列番号２のＮ末端、Ｃ末端、第１〜第２６残基の部分及び第１９２残基から選択される少なくとも一か所において上記で挙げたような変異を含む。配列番号３に示すアミノ酸配列からなる成熟ｆＥＰＯは、Ｎ末端に開始コドンがコードするメチオニン残基が付加されていてもよい。本明細書において「複数個」とは、例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上であり、また、５０個以下、４５個以下、４０個以下、３５個以下、３０個以下、２９個以下、２８個以下、２７個以下、２６個以下、２５個以下、２４個以下、２３個以下、２２個以下、２１個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下をいう。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号２又は３に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。アミノ酸同一性は、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質の検索システムを用いて算出することができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：  ５８７３−５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：  ４０３−４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５：  ２４４４−２４４８）。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似するアミノ酸間の置換をいう。性質の類似するアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（���ルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）等に分類することができる。
【００２６】
ｆＥＰＯとしては、一般的に入手可能な動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）、植物細胞、原核生物、酵母を宿主としｆＥＰＯをコードする外来遺伝子が導入されｆＥＰＯを発現するように遺伝子組み換えされたトランスジェニック細胞で製造されたものや、ｆＥＰＯをコードする外来遺伝子が導入されｆＥＰＯを発現するように遺伝子組み換えされたトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物で製造されたもの、無細胞タンパク質合成系を用いて製造されたもの等が利用できるが、これらに限定されるものではない。前記トランスジェニック動物としては鳥類が挙げられ、鳥類としてはニワトリ、ウズラ、七面鳥、カモ、アヒル、ダチョウ、ガチョウ、オナガドリ、ハト、エミュー、キジ、ホロホロチョウ等の家禽鳥類が好ましく、特にニワトリが好ましい。トランスジェニック鳥類は、卵中にｆＥＰＯを蓄積するものが好ましい。卵中にｆＥＰＯを発現するトランスジェニック鳥類を作出し、その卵からｆＥＰＯを取得する方法は特許文献１等に記載の通りである。前記トランスジェニック植物としては特に限定されず、単子葉植物であっても双子葉植物よく、単子葉植物としては、例えばイネ科（イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、ヒエ等）、ユリ科（アスパラガス、ユリ、タマネギ、ニラ、カタクリ等）、ショウガ科（ショウガ、ミョウガ、ウコン等）に属する植物が挙げられ、双子葉植物としては、例えばアブラナ科（シロイヌナズナ、キャベツ、ナタネ、カリフラワー、ブロッコリー、ダイコン等）、ナス科（トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ等）、マメ科（ダイズ、エンドウ、インゲン、アルファルファ等）、ウリ科（キュウリ、メロン、カボチャ等）、セリ科（ニンジン、セロリ、ミツバ等）、キク科（レタス等）、アオイ科（ワタ、オクラ等）、アカザ科（シュガービート、ホウレンソウ等）、フトモモ科（ユーカリ、クローブ等）、ヤナギ科（ポプラ等）に属する植物が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００２７】
ｆＥＰＯのポリペプチドは１つ以上の糖鎖や、その他の基により修飾されていてもよい。ｆＥＰＯを修飾する糖鎖の種類と数は特に限定されず、使用する発現系（すなわちトランスジェニック細胞、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、無細胞タンパク質合成系等）に応じた種類と数の糖鎖により修飾されることが一般的である。例えば、使用する発現系がニワトリであった場合の糖鎖修飾は、主に、トリマンノシルコアにβ-Ｎ-アセチルグルコサミン残基を含む糖鎖が更に２〜５本結合した糖鎖による修飾である。
【００２８】
＜精製されたネコ由来エリスロポエチン＞
本発明において「精製された」ネコ由来エリスロポエチン（ｆＥＰＯ）とは、タンパク質量あたりのｆＥＰＯ濃度が、精製前の原料となるタンパク質液中よりも高められた状態で存在するｆＥＰＯを意味し、精製の程度は問わず粗精製物であってもよい。例えば、陽イオン交換体による精製工程を１回経たｆＥＰＯも本発明での精製されたｆＥＰＯに含まれる。
【００２９】
＜タンパク質液＞
本発明の方法において原料として用いるタンパク質液は、ｆＥＰＯを含有する液状物であれば特に限定されず、ｆＥＰＯが水中に溶解した形態であってもよい。このようなタンパク質液としては上記のようなｆＥＰＯを発現するトランスジェニック細胞、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、無細胞タンパク質合成系等のｆＥＰＯ生産系に由来するｆＥＰＯ含有タンパク質液を使用することができる。
【００３０】
原料として用いるタンパク質液の第１の好適な形態は、ｆＥＰＯをコードする外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類の卵を用いて調製されたタンパク質液である。当該卵は、割卵して得られる全卵や、全卵から分離された卵白、卵黄等の各種形態であることができ、好ましくは卵白である。前記卵は凍結したのち解凍したものであってもよい。前記卵を用いて調製されたタンパク質液としては、前記卵自体であってもよいし、前記卵を水又は水溶液で希釈して得た溶液であってもよい。前記卵を用いて調製されたタンパク質液は、好ましくはせん断処理を施して十分に均一化したものである。より好ましくは、前記卵を用いて調製されたタンパク質液は、せん断処理が施された、前記卵自体、又は、前記卵と前記卵１容量部に対して例えば３容量部以下、好ましくは２容量部以下、より好ましくは１容量部以下の水との混合液である。
【００３１】
原料として用いるタンパク質液の第２の好適な形態は、ｆＥＰＯをコードする外来性遺伝子を有するトランスジェニック細胞（例えばＣＨＯ細胞）を培地中で培養して形成される培養混合物から調製されたタンパク質液である。当該第２の好適な形態に係るタンパク質液としては、好ましくは、前記培養混合物自体、前記培養混合物の上清液、前記培養混合物において前記細胞を破砕した破砕液、前記破砕液の上清液、或いは、これらの液のうちの１つを濃縮した液、水又は水溶液で希釈した液が例示できる。
【００３２】
＜ｐＨ＞
本発明においてｐＨ値は、特に限定しない限り、測定時の液温を２２．５±０．５℃としてｐＨ計を用いて測定された値を指す。ｐＨ計は市販の標準試薬を用いてｐＨ４及びｐＨ７での２点校正をしたうえで使用することが好ましい。
【００３３】
＜ｐＨ調整工程＞
本発明でのｐＨ調整工程は、ｆＥＰＯを含むタンパク質液のｐＨを４以上、７以下の範囲に調整する工程である。
【００３４】
ｆＥＰＯを含むタンパク質液のｐＨを４以上、７以下の範囲に調整することにより、驚くべきことに、タンパク質液に含まれる成分のうち、ｆＥＰＯ以外の一部の成分が不溶化して析出することが顕著に促進される。この結果、ｐＨ調整工程を経たタンパク質液中では、溶解成分におけるｆＥＰＯの割合が高まる。このため、ｐＨ調整工程を経たタンパク質液を後述する精製工程に供することで、ｆＥＰＯを効率的に精製することが可能である。一方、ｆＥＰＯを含むタンパク質液のｐＨを４未満又は７を上回る範囲とした場合、ｆＥＰＯ以外の成分による析出物は形成され難く、ｆＥＰＯの精製効率を高める効果は得られない。
【００３５】
ｐＨ調整工程におけるｐＨの前記範囲は、析出物の形成を促進する観点から、より好ましくは、４．１以上、４．２以上、４．３以上、４．４以上、４．５以上、４．６以上、４．７以上、４．８以上、４．９以上、５．０以上であり、また、６．５以下、６．４以下、６．３以下、６．２以下、６．１以下、６．０２以下、６．０以下、５．９以下、５．８以下、５．７以下、５．６以下、５．５以下、５．４以下、５．３以下、５．２以下、５．１以下である。特に、ｐＨを４．７以上、４．８以上、４．９以上又は５．０以上とした場合、及び／又は、ｐＨを６．１以下、６．０２以下、６．０以下、５．９以下、５．８以下、５．７以下、５．６以下、５．５以下、５．４以下、５．３以下、５．２以下、５．１以下とした場合に、タンパク質液からの析出物の形成が特に促進されるため好ましい。
【００３６】
更に、ｐＨ調整工程においてタンパク質液のｐＨを前記範囲に調整することは、後述する精製工程において陽イオン交換基を含む担体を用いて精製する場合にｆＥＰＯを高収率で得ることができるという観点からも好ましい。この観点からは、ｐＨ調整工程におけるｐＨの前記範囲は特に４．４以上、４．５以上、４．６以上、４．７以上、４．８以上、４．９以上、５．０以上とすることが好ましい。収率の観点からｐＨ調整工程におけるｐＨの上限は特に限定されないが、好ましくは６．５以下、６．４以下、６．３以下、６．２以下、６．１以下、６．０以下、５．９以下、５．８以下、５．７以下、５．６以下、５．５以下、５．４以下、５．３以下、５．２以下である。
【００３７】
更にまた、ｐＨ調整工程においてタンパク質液のｐＨを前記範囲に調整することは、ｆＥＰＯの活性を保持する観点からも好ましい。この観点からは、ｐＨ調整工程におけるｐＨの前記範囲は特に４．１以上、４．２以上、４．３以上、４．４以上、４．５以上、４．６以上、４．７以上、４．８以上、４．９以上、５．０以上とすることが好ましい。活性の観点からｐＨ調整工程におけるｐＨの上限は特に限定されないが、好ましくは６．５以下、６．４以下、６．３以下、６．２以下、６．１以下、６．０以下である。
【００３８】
このように本発明の一実施形態では、ｐＨ調整工程を行うことにより、析出物の形成の促進と、陽イオン交換基を含む担体を用いたｆＥＰＯの精製の収率の向上と、ｆＥＰＯの活性保持において有利な効果を奏することができる。すなわち、ｐＨ調整工程とその後のｆＥＰＯの精製工程とを一貫したｐＨ条件で行うことにより、ｆＥＰＯの活性を保持できるとともに、精製効率を向上させることができる。このような効果は、特許文献４、６等の従来技術からは示唆されない予想外の有利な効果である。
【００３９】
ｐＨ調整工程による上記の効果は、原料タンパク質液として上記の第１の好適な形態、すなわち、ｆＥＰＯをコードする外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類の卵を用いて調製されたタンパク質液を用いる場合に特に顕著である。トランスジェニック鳥類の卵にはオボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド等が主要タンパク質として含まれることが知られており、これらの主要タンパク質は等電点が酸性領域である（例えばオボアルブミンの等電点は４．６、オボトランスフェリンの等電点は６．１、オボムコイドの等電点は３．９〜４．５）ことが一般的であるのに対して、ｆＥＰＯは、配列番号３に示すアミノ酸配列から等電点が８．２と推測される。そこで、ｆＥＰＯをコードする外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類の卵を用いて調製されたタンパク質液のｐＨを４以上、７以下とすることにより、等電点がアルカリ性領域であるｆＥＰＯは溶解し、等電点が酸性領域のタンパク質が析出しているものと推定されるが、この推定機構には拘束されない。
【００４０】
ｐＨ調整工程は、後述する精製工程を行う前のタンパク質液に対して行う。先にｐＨ調整工程を行い、その後に精製工程を行うことにより、精製工程でのｆＥＰＯの精製効率を高める上記の効果が得られる。
【００４１】
ｐＨの調整は、十分量の緩衝液とタンパク質液とを混合し、必要に応じて酸又は塩基を混合して、混合物のｐＨを目的とする上記範囲のｐＨに調整することで行うことができる。より具体的には、十分量の緩衝液とタンパク質液とを混合した混合物のｐＨを測定し、ｐＨが上記範囲外の場合は、適量の酸又は塩基を混合することで、混合物のｐＨを上記範囲となるように調整することができる。十分量の緩衝液としては、タンパク質液１容量部に対して、例えば１．５容量部以上、好ましくは２容量部以上の緩衝液であり、上限は特に限定されないが典型的には１０容量部以下、より典型的には７重量部以下である。十分量の緩衝液を用いることにより、タンパク質液の粘度を十分に低減させることができ、そのまま精製工程において陽イオン交換基を含む担体を用いた精製に用いる場合の取扱いが容易であるため好ましい。また、ｐＨ調整工程において析出した析出物を除去する実施形態においても、タンパク質液の粘度を十分に低減させることにより析出物の除去が容易であるため好ましい。ｐＨ調整工程における十分量の緩衝液とタンパク質液との混合物の粘度としては、例えば１５℃においてＢ型粘度計（例えば、東機産業社製のＴＶＢ−１０型粘度計）で測定した時に２０ｃＰ以下、より好ましくは１０ｃＰ以下、さらに好ましくは５ｃＰ以下の粘度が好ましい。なお、特許文献６では、卵白のプールに、卵白に対して約０．５重量％〜約５重量％の酸性緩衝液を添加し、ｐＨが約５〜６．５の混合卵白が形成されるように前記卵白と前記酸性緩衝液を混合する方法が開示されており、このｐＨの範囲の酸性緩衝液を用いることで粘度が低減できると記載されている。しかしながら、特許文献６のように少量の酸性緩衝液を添加した卵白の粘度は非常に高く、析出物の除去やカラムクロマトグラフィーを行う際の取り扱いは容易でない。
【００４２】
前記緩衝液としては特に限定はしないが、例えば、グリシン、フタル酸、クエン酸、コハク酸、酢酸及びリン酸から選択される少なくとも１種以上を緩衝成分として含むものが使用できる。また、医薬品の製造に適した生体毒性の少ないものが好ましく、例えば酢酸緩衝液は使いやすく好ましい。また、ｆＥＰＯの等電点（配列番号３のアミノ酸配列からなるｆＥＰＯは、アミノ酸配列から、等電点が８．２と推測される）を鑑みると酸性領域において緩衝作用を有する緩衝液を好適に用いることができる。前記緩衝作用とは、酸や塩基が添加されたり、蒸発や希釈によって濃度が変化したりしても、ほとんどｐＨが変動しないという作用である。酸性領域としては、好ましくは、上記のｐＨの範囲が挙げられる。緩衝液の緩衝成分の濃度としては、１Ｍ以下が好ましく、５００ｍＭ以下がより好ましく、４００ｍＭ以下がより好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がより好ましく、１００ｍＭ以下がより好ましく、９０ｍＭ以下がより好ましく、８０ｍＭ以下がより好ましい。高濃度の緩衝成分がタンパク質に接触するとタンパク質が変性する場合がある。緩衝成分の濃度が上記のように比較的低い緩衝液は、タンパク質液と混合した際にｆＥＰＯを含むタンパク質に与えるダメージが小さいため好ましい。なお特許文献６では、約５Ｍ〜約６Ｍの酢酸ナトリウムを含む酸性緩衝液を卵白と混合することが記載されているが、このような高濃度の酸性ナトリウムを含む緩衝液は、卵白を変性させる可能性が高いと考えられる。なお本実施形態において緩衝液の緩衝成分の濃度の上限は特限定されないが、典型的には１ｍＭ以上であり、１０ｍＭ以上がより好ましく、２０ｍＭ以上がさらに好ましい。緩衝成分の濃度は、緩衝成分が塩の形態で含まれるか遊離体の形態として含まれるかに関わらず、全て遊離体の形態で存在するものとして換算した濃度である。
【００４３】
ｐＨ調整されたタンパク質液は、好ましくは、タンパク質を好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１００ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１５ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で含有する。また、ｐＨ調整されたタンパク質液は、ｆＥＰＯを好ましくは１２.３μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１６．６μｇ／ｍＬ以上、好ましくは６０．０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは４１．７μｇ／ｍＬ以下の濃度で含有する。タンパク質濃度又はｆＥＰＯの濃度は、原料タンパク質液として上記の第１の好適な形態、すなわち、ｆＥＰＯをコードする外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類の卵を用いて調製されたタンパク質液を用いる場合に特に好適である。ここで、前記のｆＥＰＯ濃度は、ｆＥＰＯを、配列番号３に示すアミノ酸配列からなり、水溶性長鎖分子等により化学修飾がされていない、成熟ｆＥＰＯのポリペプチドとして換算した重量に基づく濃度を指す。
【００４４】
タンパク質濃度の測定方法は、水をブランクとして、分光光度計を用いて光路長１ｃｍの石英セルを用いて２８０ｎｍの吸光度により求める。このとき、吸光度が分光光度計の分析感度の上限を超えないよう、分析試料は水で希釈して測定するともに、３２０ｎｍの吸光度の値を用いてバックグランド補正する。具体的には、（２８０ｎｍの吸光度-３２０ｎｍの吸光度）×希釈倍率×０.９５９としてタンパク質濃度（ｍｇ/ｍＬ）を算出する。
【００４５】
ｆＥＰＯ濃度（ｎｇ／ｍＬ）の測定方法は、ＥＰＯ-ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、前処理後卵白原料とｆＥＰＯ標準品（自社管理）を測定する。標準品から４．０〜１．１ｎｇ／ｍＬの検量線を作成し、次式を用いてタンパク質液中のエリスロポエチン濃度を算出する。式：濃度（ｎｇ／ｍＬ）＝（吸光度の平均値−切片）／傾き×希釈率として計算する。
【００４６】
＜析出物除去工程＞
ｐＨ調整工程によりｐＨ調整されたタンパク質液は、そのまま精製工程での処理に用いてもよいし、精製工程の前に、ｐＨ調整工程においてｐＨ調整されたタンパク質液から析出物を除去する析出物除去工程を行ってもよい。ｐＨ調整工程での析出物は、上記の通り、タンパク質成分と考えられる。
【００４７】
析出物除去工程は、ｐＨ調整後のタンパク質液からろ過、遠心処理等の任意の手段により析出物を除去し、析出物量が低減されたタンパク質液を回収する工程である。析出物除去工程を行うことにより、不要なタンパク質の量を低減して精製効率を高めることができるとともに、精製工程におけるタンパク質液の取り扱いが容易になる。
【００４８】
ろ過により析出物を分離する方法としては、好ましくは平均孔径０．５μｍ以上、２５μｍ以下、より好ましくは平均孔径０．２μｍ以上、５μｍ以下のフィルターを用いた濾過が挙げられる。遠心処理により析出物を分離する方法としては、５，０００×ｇ〜１０，０００×ｇの遠心分離をする方法が挙げられる。
【００４９】
＜精製工程＞
精製工程は、ｐＨ調整工程においてｐＨ調整されたタンパク質液を、必要に応じて析出物除去工程を行った後に、陽イオン交換基を備えた担体に接触させてｆＥＰＯを吸着させ、次いで吸着されたｆＥＰＯを前記担体から溶出させることを含む。
【００５０】
陽イオン交換基としてはスルホン酸基（−ＳＯ３−）を含む強い陽イオン交換基、カルボキシル基（−ＣＯＯ−）を含む弱い陽イオン交換基等が挙げられる。スルホン酸基を含む強い陽イオン交換基としては具体的にはスルホプロピル（ＳＰ）等が挙げられる。カルボキシル基を含む弱い陽イオン交換基としては具体的にはカルボキシメチル（ＣＭ）が挙げられる。
【００５１】
陽イオン交換基が連結される担体は、イオン交換クロマトグラフィーの分野で一般的に用いられる担体であれば特に限定されず、例えばスチレン系担体、アガロース系担体、セルロース系担体を用いることができる。スチレン系担体としてはスチレンとジビニルベンゼンとを共重合させた架橋高分子から構成される担体が挙げられ、市販品としてはＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社から市販されている商品名ＭｉｎｉＢｅａｄｓ、ＭｏｎｏＢｅａｄｓ、ＳＯＵＲＣＥ１５、ＳＯＵＲＣＥ３０が例示できる。アガロース系担体の市販品としてはＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社から市販されている商品名Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓ等のＳｅｐｈａｒｏｓｅシリーズの担体が挙げられる。セルロース系担体としてはＪＮＣ株式会社から市販されている商品名セルファインＭＡＸシリーズの担体が挙げられる。
【００５２】
陽イオン交換基を備えた担体（以下「陽イオン交換体」という）に接触させるタンパク質液として、上記のｐＨ調整工程によりｐＨが４以上、７以下に調整されているタンパク質液を用いることで、陽イオン交換体での精製でのｆＥＰＯの収率を高めることができるため好ましい。この観点からは、陽イオン交換体に接触させるタンパク質液のｐＨは特に４．１以上、４．２以上、４．３以上、４．４以上、４．５以上、４．６以上、４．７以上、４．８以上、４．９以上、５．０以上とすることが好ましく、これらの範囲のなかでも特に４．４以上又はより高いｐＨ値の範囲であることが好ましい。この収率の観点から陽イオン交換体に接触させるタンパク質液のｐＨの上限は特に限定されないが、好ましくは６．５以下、６．４以下、６．３以下、６．２以下、６．１以下、６．０以下、５．９以下、５．８以下、５．７以下、５．６以下、５．５以下、５．４以下、５．３以下、５．２以下である。
【００５３】
また、陽イオン交換体に接触させるタンパク質液として、上記のｐＨ調整工程によりｐＨが４以上、７以下に調整されているタンパク質液を用いることは、ｆＥＰＯの活性を保持する観点からも好ましい。この観点からは、陽イオン交換体に接触させるタンパク質液のｐＨは特に４．１以上、４．２以上、４．３以上、４．４以上、４．５以上、４．６以上、４．７以上、４．８以上、４．９以上、５．０以上とすることが好ましく、これらの範囲のなかでも特に４．８以上又はより高いｐＨ値の範囲であることが好ましい。この活性の観点から陽イオン交換体に接触させるタンパク質液のｐＨの上限は特に限定されないが、好ましくは６．５以下、６．４以下、６．３以下、６．２以下、６．１以下、６．０以下である。
【００５４】
このように、ｐＨ調整工程において所定のｐＨ範囲に調整したタンパク質液を陽イオン交換体と接触させることにより、陽イオン交換基を含む担体を用いたｆＥＰＯの精製の収率の向上と、ｆＥＰＯの活性保持において有利な効果を奏することができる。ｐＨ調整工程により、析出物の形成を促進することができることは既述の通りである。このように、ｐＨ調整工程とその後のｆＥＰＯの精製工程とを一貫したｐＨ条件で行うことにより、ｆＥＰＯの活性を保持できるとともに精製効率を向上させることができる。
【００５５】
ｐＨ調整されたタンパク質液を、陽イオン交換体に接触させる際は、まず、陽イオン交換体をカラム等に充填して形成したベッドを、ｆＥＰＯの等電点よりも低いｐＨに調整された吸着用緩衝液で満たして平衡化することが好ましい。吸着用緩衝液は、ｐＨ調整工程で用いる緩衝液と実質的に同じ緩衝液（緩衝液の緩衝成分の濃度も実質的に同じである方が好ましい）、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等であるが、ｆＥＰＯの等電点を鑑みると酸性領域において緩衝作用を有する吸着用緩衝液を好適に用いることができる。前記酸性領域のｐＨ値としては、陽イオン交換体に接触させるタンパク質液の上記のｐＨ値と同様の範囲から選択することができ、好ましくは、陽イオン交換体に接触させるタンパク質液と実質的に同じｐＨ値とすることができる。前記緩衝作用とは、酸や塩基が添加されたり、蒸発や希釈によって濃度が変化したりしても、ほとんどｐＨが変動しないという作用である。ｆＥＰＯは、配列番号３に示すアミノ酸配列から等電点が８．２と推測され、酸性ｐＨ条件では正に荷電すると考えられる。このため、酸性領域において緩衝作用を有する前記吸着用緩衝液中で陽イオン交換体に前記タンパク質液を接触させると、ｆＥＰＯは前記陽イオン交換体に高確率で吸着することができ、ｆＥＰＯを精製することができる。この効果は、原料タンパク質液として上記の第１の好適な形態、すなわち、ｆＥＰＯをコードする外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類の卵を用いて調製されたタンパク質液を用いる場合に特に顕著である。既述の通り、トランスジェニック鳥類の卵に含まれる主要タンパク質の多くは酸性領域に等電点を有しており酸性条件下では陽イオン交換体に吸着しにくいことから、酸性領域に緩衝作用を有する前記吸着用緩衝液中では、前記主要タンパク質と混在しているｆＥＰＯを選択的に前記陽イオン交換体に吸着することができると考えられる。
【００５６】
ｐＨ調整されたタンパク質液を平衡化された陽イオン交換体のベッドに負荷して、ｆＥＰＯを陽イオン交換体に吸着させ、必要に応じてベッドを洗浄する。その後、前記吸着用緩衝液に塩類を加えて段階的に又は連続的にイオン強度を高めた溶出用緩衝液を、ｆＥＰＯが吸着された陽イオン交換体のベッドを通過させて、ｆＥＰＯを溶出させ、ｆＥＰＯ含有液として回収する。溶出用緩衝液のイオン強度は１００ｍＭ以上、３００ｍＭ以下が好ましい。陽イオン交換体を用いた精製は２０℃以上、２５℃以下の温度の範囲内で行うことが好ましい。洗浄に用いる洗浄用緩衝液及び前記吸着用緩衝液のｐＨは、陽イオン交換体に接触させるタンパク質液と実質的に同じｐＨ値とすることができる。
【００５７】
陽イオン交換体を用いた精製は、前記析出物除去工程以外のｆＥＰＯの精製工程としては最初に行うことが好ましい。その理由は、原料として用いるタンパク質液にアルブミンが大量に含まれる場合に、それを最初に除くことで、精製倍率を上げることができるためである。
【００５８】
本発明の精製工程では、陽イオン交換体を用いた精製以外に、更なるタンパク質精製処理によりｆＥＰＯを精製する工程を組み合わせてもよい。他の精製処理としては、塩析、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、抗体カラム法等を単独で、もしくは組み合わせて使用することができる。また例示されていない他のタンパク質精製処理を行ってもよい。吸着クロマトグラフィーとしては、色素アフィニティークロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィー、金属イオンアフィニティクロマトグラフィー等が挙げられる。色素アフィニティークロマトグラフィーとしてはＣｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  ３Ｇ等のトリアジン色素が連結した固相担体を利用したものが挙げられる。ただし、本発明の方法は、より好ましくは色素アフィニティークロマトグラフィーにより精製する工程を含まない。色素アフィニティークロマトグラフィーにより精製する工程を含まないことにより、色素が目的とする精製ｆＥＰＯに混入することを回避することができるためである。イオン交換クロマトグラフィーとしては上述の陽イオン交換クロマトグラフィーのほかに、陰イオン交換クロマトグラフィーも利用することができる。
【００５９】
複数の精製処理を行う場合、必要に応じて、処理間でｆＥＰＯを含むタンパク質を溶解する緩衝液を交換することができる。緩衝液の交換は限外ろ過や透析を利用する通常の方法により行うことができる。
【００６０】
＜水溶性長鎖分子付加工程＞
本発明では、より好ましくは、精製工程において精製されたｆＥＰＯを水溶性長鎖分子で化学修飾して水溶性長鎖分子付加ｆＥＰＯを得る水溶性長鎖分子付加工程を更に含む。
【００６１】
水溶性長鎖分子としては特に限定されないが、例えばＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ポリアミノ酸、ポリプロピレングリコール等が使用できる。これらは反応前駆体を作製し、合成反応によりタンパク質に付加することができる。このうち、ＰＥＧは抗原性がなく無毒であるため、修飾タンパク質の抗原性を低下させ、副作用としての抗タンパク質抗体の発現を抑える点からも有効である。
【００６２】
ｆＥＰＯをマウス、ラット等のげっ歯類に投与し造血効果を確認すると、血中単回投与後４日目に網状赤血球の増加が最大となり、７日目に効果がなくなることが報告されているが、ＰＥＧを付加すると肝臓での代謝が阻害され、血中寿命が延びることにより薬効持続期間が延長され、ラット造血実験では２倍の１４日間効果が持続することが知られている。
【００６３】
付加されるＰＥＧ等の水溶性長鎖分子の分子量の増大に伴い、水溶性長鎖分子−ｆＥＰＯ複合体の血中寿命は増大する。しかし、極めて高分子の水溶性長鎖分子を付加することはｆＥＰＯの造血活性を阻害するため（ＷＯ０２／０３２９５７）、水溶性長鎖分子の重量平均分子量は、５ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以下がインビボ造血効果を最大にする上で好ましく、より好ましくは１０ｋＤａ以上であり、より好ましくは３０ｋＤａ以下である。更に好ましくは２０ｋＤａである。
【００６４】
ｆＥＰＯには少なくとも３個所の水溶性長鎖分子の結合可能部位があり、ひとつのｆＥＰＯポリペプチドに結合する水溶性長鎖分子は１（モノ）、２（ジ）、３（トリ）分子が可能であるが、複数箇所にＰＥＧが結合することでＥＰＯのレセプター結合能が阻害されインビボ活性を低下させることから、モノ体又はジ体が好ましく、ジ体が特に好ましい。
【００６５】
本発明において「化学修飾」とは、特定の官能基を化学的に変化させて、活性や反応性などの機能を変化させることを指し、ｆＥＰＯをＰＥＧ等の水溶性長鎖分子で化学修飾するとは、ｆＥＰＯを構成するポリペプチドが有する官能基（例えば１級アミノ基）と、水溶性長鎖分子が有する官能基とを反応させて共有結合を形成し、ｆＥＰＯを構成するポリペプチドに水溶性長鎖分子を付加することを指す。
【００６６】
ｆＥＰＯを水溶性長鎖分子で化学修飾する方法としては、ｆＥＰＯと水溶性長鎖分子をモル比で約１：１〜１０となる割合で混合後、４〜３７℃で混和しながら３０〜１８０分間反応させ、反応停止剤として１００ｍＭグリシン溶液を約１／１０量加え、４〜３７℃で１時間混和しながら反応を停止させる手法などが挙げられる。
【００６７】
水溶性長鎖分子修飾ｆＥＰＯは、水溶性長鎖分子の付加数が１又は２以上であって、水溶性長鎖分子修飾された１分子のゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより測定した水系溶媒中における見かけの分子量が１００ｋＤａから９００ｋＤａであるものが好ましく、水溶性長鎖分子の付加数が１であって、上記見かけの分子量が１００ｋＤａから５００ｋＤａであるもの、又は、水溶性長鎖分子の付加数が２であって、上記見かけの分子量が１００ｋＤａから５００ｋＤａであるものがより好ましい。上記ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる見かけの分子量の測定は、低圧クロマト装置ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００（アマシャム社製）及びゲルろ過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００（アマシャム社製）を用いて行う。
【００６８】
一般に、水溶性長鎖分子をタンパク質に共有結合させる方法としては、タンパク質、又は糖鎖の酸化活性可能な官能基であるポリオール、ラクトール、アミン、カルボン酸又はカルボン酸誘導体との化学反応がある。またスルホネートエステル活性化ポリマー、例えばスルホネートエステル活性化ＰＥＧを用いる方法などがある。ＥＰＯに付加する場合にもこれらの方法で付加することができる。
【００６９】
以下、水溶性長鎖高分子がＰＥＧである場合の好ましい形態について説明する。
【００７０】
ＰＥＧをタンパク質に共有結合させるために用いるＰＥＧ化反応前駆体としては、長鎖分子の片末端をメトキシ化したものが使用できる。さらにメトキシ化されていない末端を、ｆＥＰＯが有するアミノ基等の求核性基による求核反応を受けて共有結合を形成し得る基に改変した（例えば、スクシンイミジル脂肪酸エステル化した）ＰＥＧが開発されており、なかでも次式：
ＣＨ３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｘ−Ｙ
（式中、
Ｙはスクシンイミジルオキシ基等の脱離基を表し、
Ｘは
−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）−
で表される基であり、
ｍは１以上、８以下、より好ましくは４以上、より好ましくは６以下、最も好ましくは５の整数であり、
ｎは重合度を示す整数である）
で表されるものが反応性の点から好ましい。前記式で表されるＰＥＧ化反応前駆体をヒトＥＰＯと反応させると、Ｎ末端又はリジン残基のアミノ基に選択的に付加することが知られている。ＥＰＯには複数のリジン残基が存在するため、反応が進むにつれＰＥＧの付加数は増え、付加数の異なる異性体混合物となる。配列番号２からなるｆＥＰＯにおいてはアラニン２７、リジン７１及び／又はリジン７８が、配列番号３からなる成熟ｆＥＰＯにおいてはアラニン１、リジン４５及び／又はリジン５２が、それぞれＰＥＧ化されることが好ましい。
【００７１】
＜ウイルス除去工程＞
本発明の方法は、上記水溶性長鎖分子付加工程を行う場合、より好ましくは、水溶性長鎖分子付加工程において得られた水溶性長鎖分子付加ｆＥＰＯを、フィルターに通してウイルスを除去するウイルス除去工程を更に含む。上記水溶性長鎖分子付加工程では、水溶性長鎖分子付加ｆＥＰＯが溶解した液状組成物として得られ、該液状組成物を前記フィルターに通液することによりウイルス除去工程を行うことができる。
【００７２】
ここでフィルターとしては不織布、中空糸膜、多孔フィルム等により構成されるフィルターを用いることができる。該フィルターは１〜１，０００ｎｍの範囲の幅の細孔を有するものが好ましい。
【００７３】
ウイルス除去工程により除去されるウイルスとしてはヒトパルボウイルス、マウス微小ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなどが挙げられる。
【００７４】
＜製剤化工程＞
本発明の方法は、上記水溶性長鎖分子付加工程を行う場合、より好ましくは、水溶性長鎖分子付加工程において得られた水溶性長鎖分子付加ｆＥＰＯを含み、哺乳動物の体液の浸透圧及びｐＨと同じ浸透圧及びｐＨを有する液状組成物を調製する製剤化工程を更に含む。ここで「同じ」とは「実質的に同じ」を包含する。
【００７５】
哺乳動物はネコ、イヌ等の、ｆＥＰＯの投与の対象となる哺乳動物を指す。対象とする哺乳動物の体液の浸透圧及びｐＨと同じ浸透圧及びｐＨを有するｆＥＰＯ含有液状組成物は、対象とする哺乳動物に皮下投与した際に痛みを引き起こしにくいため好ましい。例えば浸透圧が約２８０ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏであり、ｐＨが約７．４である体液を有する哺乳動物に投与するのに適した液状組成物を製造する場合には、製剤化工程において調製される前記液状組成物は、浸透圧が好ましくは２００ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏ以上、４００ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏ以下、より好ましくは２５０ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏ以上、より好ましくは３００ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏ以下であり、ｐＨが好ましくは７．０以上、８．０以下、より好ましくは７．３以上、より好ましくは７．７以下である。また、哺乳動物の体液の浸透圧をＸｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏとしたとき、前記液状組成物の浸透圧は好ましくは（Ｘ±１００）ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏ、より好ましくは（Ｘ±５０）ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏとすることもできる。哺乳動物の体液のｐＨをＹとしたとき、前記液状組成物のｐＨは好ましくは（Ｙ±０．５）、より好ましくは（Ｙ±０．１）とすることもできる。ここで浸透圧とｐＨは２０〜２５℃において測定した値を指す。
【００７６】
＜ネコ由来エリスロポエチンの形態＞
本発明の方法で製造される精製されたｆＥＰＯ、水溶性長鎖分子付加ｆＥＰＯ及び前記液状組成物は、どのような形態で提供されてもよく、例えば非ヒト動物を対象とした薬剤組成物の形態であってもよいし、例えば水中にｆＥＰＯを含むｆＥＰＯ溶液等の、ｆＥＰＯ含有薬剤組成物の製造のための中間品の形態であってもよい。
【００７７】
本発明の方法で製造される精製されたｆＥＰＯ、水溶性長鎖分子付加ｆＥＰＯ及び前記液状組成物は、精製されたｆＥＰＯ又は水溶性長鎖分子付加ｆＥＰＯ以外に水等の溶媒、賦形剤、崩壊剤、結合剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、浸透圧調節剤及び界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種の成分が組み合わされたものであってよく、該成分は好ましくは、投与対象となる非ヒト動物に対して薬理学的に許容される成分である。本発明の方法で製造される精製されたｆＥＰＯ、水溶性長鎖分子付加ｆＥＰＯ及び前記液状組成物は、精製されたｆＥＰＯ又は水溶性長鎖分子付加ｆＥＰＯに他の添加物が組み合わされたものであってよく、該添加物としては例えば、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、健康食品素材、栄養補助食品素材、ビタミン、香料、甘味剤、防腐剤、保存剤及び抗酸化剤からなる群から選択される少なくとも１種の添加物を使用することができる。該添加物は好ましくは、投与対象となる非ヒト動物に対して薬理学的に許容される添加物である。
【００７８】
本発明の方法では、精製されたｆＥＰＯ又は水溶性長鎖分子付加ｆＥＰＯを含む溶液、ゲル又は粉末を調整した後、各種製剤の形態にする工程を更に含むことができる。ここで、前記製剤の形態としては、例えば、注射剤、点滴剤、注入剤、外用液剤、貼付剤、塗布剤（クリーム剤、軟膏剤等）、吸入剤、噴霧剤、坐剤、レクタルカプセル剤、皮下埋め込み型徐放製剤、ミセル製剤、ゲル化製剤、リポソーム製剤、及び、膣内投与のためのペッサリー等の非経口投与用の製剤の形態や、経口投与用の製剤の形態が挙げられる。注射剤、点滴剤の適用としては、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、臓器内、鼻腔内、点眼、脳内、腹腔内、病巣などが挙げられる。注射剤はプレフィルドシリンジ製剤の形態であってもよい。注入剤の適用としては、直腸内、膣内などが挙げられる。経口投与用の各種製剤としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等の固形剤や、エキス剤、エリキシル剤、シロップ剤、チンキ剤、リモナーデ剤等の液剤が挙げられる。これらの形態の薬剤のうち、ｆＥＰＯが液中に溶解した製剤は上記の「ｆＥＰＯ含有液状組成物」に包含される。
【実施例】
【００７９】
以下実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。商品名を記載している場合は特に記述のない限り添付の説明書の指示に従った。【００８０】
＜実験１＞
トランスジェニックニワトリによるｆＥＰＯ含有卵白の調製は特開２００７−８９５７８に記載の方法を基礎とし改変を加えた方法により行ったが、その工程の要点を以下に記載する。【００８１】
下記の試験においてｆＥＰＯの量は、いずれも、配列番号３に示すアミノ酸配からなるポリペプチド（成熟ｆＥＰＯ）として換算した重量に基づく量である。卵白中に生成されるｆＥＰＯは、配列番号３に示すアミノ酸配からなるポリペプチド（成熟ｆＥＰＯ）である。【００８２】
１．トランスジェニックニワトリを用いたネコ由来ＥＰＯを含有する卵白の調製
１．１．ニワトリ胚へのレトロウイルスベクターのマイクロインジェクションと人工孵化
ｆＥＰＯ発現用レトロウイルスベクターを、ニワトリ胚へマイクロインジェクションし、ｆＥＰＯを発現するトランスジェニックニワトリを作製した。マイクロインジェクションと人工孵化は無菌条件下で行った。【００８３】
ｆＥＰＯ（プレタンパク質の全長）をコードするＤＮＡ塩基配列を配列番号１に示す。【００８４】
特開２００７−８９５７８の実施例５の方法で調製された、ｆＥＰＯ発現用レトロウイルスベクターを含む溶液を用いた。この溶液のウイルス力価は１．６×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。ウイルス力価の測定法は特開２００７−８９５７８の実施例３に記載の通りである。【００８５】
ニワトリ受精卵（城山種鶏場製）の外側を消毒液（株式会社昭和フランキ製）及びエタノールで除菌した。孵卵機Ｐ−００８（Ｂ）型（株式会社昭和フランキ製）を３８℃、湿度５０〜６０％の環境になるようセットし、電源を入れた時刻を孵卵開始時刻（０時間）とし、以後１５分毎に９０°転卵しながら孵卵を行った。【００８６】
孵卵開始から約５５時間経過後孵卵器から卵を取り出し、鈍端部に１ｍｍ程度の穴を開けた。つづいて卵の側面の中央よりやや上部に直径７〜１０ｍｍ程度の穴をあけた。実体顕微鏡システムＳＺＸ１２（オリンパス社製）下で、フェムトチップＩＩ（エッペンドルフ社製）に特開２００７−８９５７８の実施例５に記載の手順で調製したウイルス液約２μｌを注入し、フェムトジェット（エッペンドルフ社製）を用いて前記穴からニワトリ胚の心臓に注入した。【００８７】
ウイルス液を注入後スコッチテープＢＫ−１５（住友スリーエム社製）で穴をふさぎ、孵卵器に戻して孵卵を続けた。孵卵器の転卵を３０分毎に３０°転卵に変更した。孵卵開始から１週間後に孵卵器に６０ｃｃ／ｍｉｎで酸素を供給し孵卵を行った。孵卵開始から１９日目に転卵をとめ、自然に孵化するのを待った。自然に孵化し誕生した雛を飼育して成長させて、トランスジェニックニワトリの雌性成体を得た。飼料として、幼雛ＳＸセーフティー及びネオセーフティー１７（豊橋飼料株式会社製）を用いた。トランスジェニックニワトリが産卵した卵白中におけるｆＥＰＯの発現を、後述のＢａＦ／ＥＰＯＲによる細胞増殖アッセイにより確認した。卵白中のｆＥＰＯ活性は１．４×１０4  Ｕ／ｍＬであることが確認された。【００８８】
卵白中にｆＥＰＯ活性が確認されたニワトリ個体の卵を回収し、ダイアモンドカッター型割卵機（ミタカ電機社製）を用いて割卵し、卵白分離スリット（ミタカ電機社製）を用いて卵白と卵黄を分離し、卵白のみを回収した。回収した卵白は１ｍｍ口径の卵白ストレーナー（三共技研社製）を通液することでせん断した。せん断した卵白１０〜２０Ｌを、２０Ｌ容量のタンクへ回収した後、撹拌機を用いて７５０ｒｐｍ、５分間攪拌して混合した。攪拌後の卵白を容器に小分けした後、−８０℃のフリーザー（日本フリーザー社製  ＣＬＮ−５０ＣＤ１）を用いて凍結保管した。【００８９】
以上の操作を複数回行い、下記の精製処理に必要な量のｆＥＰＯ含有卵白を調製し凍結した。【００９０】
１．２．ネコ由来エリスロポエチンの活性測定
卵白中のｆＥＰＯの活性は、ＥＰＯ依存性細胞株であるＢａＦ／ＥＰＯＲによる細胞増殖アッセイ（特開平１０−９４３９３）により行った。細胞増殖アッセイはエポジン（中外製薬株式会社製）を標準エリスロポエチンとして、増殖の検量線を描きそれを元に未知サンプルのエリスロポエチン活性を測った。ＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞用培地として５％の牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）と５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０リキッド培地（日水製薬株式会社製）を用いた。通常のＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞の培養の際には終濃度１  ＩＵ／ｍｌとなるようにエポジンを加えた。細胞増殖アッセイには対数増殖期にある細胞を用いた。【００９１】
ＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞で細胞増殖アッセイを行うため、まず培地中のエポジンを除去した。培養したＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を取り除き、沈殿にエポジンを含まない培地を１０ｍｌ加え懸濁した。同様の操作を３度行い培地中のエポジンを除去した。細胞を計数し、エポジンを含まない培地で５５５５５Ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように希釈した。９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに９０μｌずつ播種した。これに、培地で２５、１６、１０、６．４、４．０、２．５、１．６、１．０  ＩＵ／ｍｌとなるよう希釈したエポジンを１０μｌずつ加え、一様になるよう懸濁した（エリスロポエチンの終濃度はそれぞれ２．５、１．６、１．０、０．６４、０．４、０．２５、０．１６、０．１  ＩＵ／ｍｌとなる）。【００９２】
アッセイに用いるサンプルは培地で２〜４倍程度ずつ段階希釈し、検量線の測定範囲内に入るようにし、播種した細胞中に１０μｌずつ加え、一様になるよう懸濁した。標準サンプル、未知サンプル共に同じものを３点測った。２日間培養し、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同人化学研究所社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。１〜４時間呈色反応を行った後、０．１ｍｏｌ／ｌの塩酸を１０μｌ加え反応を停止し、マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定した。標準サンプルの測定結果を対数近似し、近似式を求めた。求めた近似式より未知サンプルの活性を換算した。ｆＥＰＯの、エポジンの１ ＩＵに相当する活性を、１ Ｕとする。【００９３】
活性測定に用いる卵白は、超音波や物理的手法により全体を一様となるように調製した。調製したサンプルは活性測定時まで−８０℃で凍結保存した。【００９４】
２．卵白の前処理
上記１の手順で得られた、ｆＥＰＯを含有する卵白からｆＥＰＯを精製するための前処理として、前記卵白に対して以下の処理を行った。【００９５】
２．１．解凍
上記１で得られ−８０℃のフリーザー内に保管された凍結卵白を容器ごと取り出し、解凍機を用い１５℃の温度において１４時間かけて解凍し、以降の処理に用いた【００９６】
２．２．せん断
解凍後の卵白のせん断処理を次の手順で行った。【００９７】
回収した卵白を１００Ｌ容量のタンクへ４０．８ｋｇ秤量した後、１ｍｍ口径の卵白ストレーナー（三共技研社製）へ通液することでせん断し、１００Ｌ容量のタンクへ回収した。さらにストレーナー内へ精製水を通液して洗浄し、洗浄液も含めて合計約７２Ｌ（約７２Ｋｇ）の卵白液を回収した。【００９８】
２．３．ｐＨ調整
ｐＨ調整用緩衝液として、下記の手順で５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を調整した。【００９９】
５Ｌ容量のジョッキ中で、約２Ｌ精製水を加え、該水中に、１１４９．６ｇの酢酸ナトリウム３水和物（メルク株式会社）と、１８７．２ｇの氷酢酸（メルク株式会社）とを加えて十分に撹拌し、４Ｌにメスアップしたものを、濃縮緩衝液として調製した。【０１００】
５００Ｌ容量のタンクに１３６Ｌの精製水を加え、該水中に前記濃縮緩衝液を４Ｌ加え、精製水を用いて総量が１５８Ｋｇとなるようにメスアップし十分に撹拌した。【０１０１】
５００Ｌ容量のタンクに、１５８Ｋｇの前記緩衝液を加え１９０ｒｐｍで撹拌しながら上記実験１の２．２．のせん断処理により得られた約７２Ｋｇの卵白液を添加し、次いで精製水を添加して総量が２４０．０ｋｇとなるように調整した。そして、氷酢酸を添加してｐＨを５．１に調整して混合液を得た（以下、ｐＨ調整済卵白液という）。なお、ｐＨ調整済卵白液には酢酸緩衝液と卵白との混合直後から白濁が生じた。【０１０２】
ｐＨ測定は、ナカライテスク製校正液を使用してｐＨ４及びｐＨ７での２点校正をしたｐＨ計（堀場製作所）を用いて実施した。測定時の溶液温度は２２．５±０．５℃とした。特に断りのない限り、本明細書におけるｐＨ値は全てこの条件のもとで測定された値である。【０１０３】
２．４．膜ろ過
白濁が生じたｐＨ調整済卵白液の膜ろ過を次の手順で行った。【０１０４】
前記２．３．で調製したｐＨ調整済卵白液をポンプで送液し、メッシュ径１００〜３００μｍのステンレス製金網を通すことにより、大きな凝集物を除いた。その後、そのろ過液について、精密ろ過膜（孔径０．２〜５μｍのデプスフィルター、メルクミリポア社製）を用い、およそ２０〜３０ＬＭＨの流速でフィルターろ過し、ろ過後の液をタンクに回収した。精密ろ過膜に残った液を、押し出し用緩衝液１６０ｋｇを流して回収した。【０１０５】
タンクに回収されたろ液を攪拌し均一化した後、０．２μｍ（メルクミリポア社製）のフィルターを通して、無菌的にバッグに充填した。【０１０６】
上記で用いる押し出し用の緩衝液として、下記の手順で酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．１）を調整した。１Ｌ容量のビーカー中に１０００ｇの精製水を加え、該水中に、３８３．２ｇの酢酸ナトリウム３水和物（メルク株式会社）と、６３．６８ｇの氷酢酸（メルク株式会社）とを加え十分に撹拌した。粉末が完全に溶解したことを目視で確認した後に撹拌を停止し、精製水７９.０ｋｇと混合して、ｐＨを測定してｐＨ５．１０±０．０５であることを確認した。この操作を繰り返して合計１６０ｋｇの押し出し用緩衝液を作製した。【０１０７】
膜ろ過後の卵白処理液（以下「前処理後卵白原料」とする）のタンパク質濃度は７．４ｍｇ／ｍＬ、ｆＥＰＯ濃度は１５．９μｇ／ｍＬ以上、ｐＨ値は５．１２であった。【０１０８】
タンパク質濃度の測定方法：前処理後卵白原料を精製水で希釈し遠心分離またはフィルターろ過により沈殿物を除去する。これを分光光度計と光路長１ｃｍの石英セルを用いて波長２８０ｎｍと３２０ｎｍの吸光度を測定し次式からタンパク質量を算出する。式：タンパク質量（ｍｇ/ｍＬ）＝（Ａｂｓ２８０-Ａｂｓ３２０）×０．９５９×希釈倍率
ｆＥＰＯ濃度の測定方法：ＥＰＯ-ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、前処理後卵白原料と、ＰＥＧ化されていない成熟ｆＥＰＯ標準品（自社管理）を測定する。標準品から４．０〜１．１ｎｇ／ｍＬの検量線を作成し、次式を用いて前処理後卵白原料中のエリスロポエチン濃度を算出する。式：濃度（ｎｇ／ｍＬ）＝（吸光度の平均値−切片）／傾き×希釈率【０１０９】
＜実験２＞
ニワトリ卵白溶液におけるｐＨと沈殿物量との関係について調べた。
１．方法
実験１の「１．１．トランスジェニックニワトリを用いたネコ由来ＥＰＯを含有する卵白の調製」に記載の手順で調製したｆＥＰＯ含有ニワトリ卵白を−２０℃で凍結保存したのち、１５℃のインキュベータにて一晩インキュベートして解凍した。【０１１０】
解凍した卵白を実験１の「２．２．せん断」と同様にストレーナーにてせん断した。【０１１１】
５３ｍＭの酢酸ナトリウム水溶液を１５００ｍｌ作成した。３０６ｇのせん断した卵白（卵白の比重１．０２）に、前記５３ｍＭ酢酸ナトリウム溶液１５００ｍｌを加え（最終濃度４４ｍＭ）、スターラにより攪拌して卵白溶液とした。【０１１２】
卵白溶液１００ｍｌを分注し、必要に応じて氷酢酸を添加して、ｐＨを下記の表１又は表２に示す各値に調整した。【０１１３】
ｐＨ調整後に再度懸濁してＯ．Ｄ６００を測定した。【０１１４】
Ｏ．Ｄ６００を測定後、別のガラス容器に移した。【０１１５】
全てのサンプルを個別にガラス容器に移した後、同時に転倒混和により均一化させた。均一化後、１時間静置した後に写真撮影を行った。【０１１６】
２．結果
各サンプルにおける卵白溶液の濁度（Ｏ．Ｄ６００）の測定結果を下記の表１に示す。
【表１】
2017169978.tif 000002
【０１１７】
また、均一化し１時間静置後の各サンプル（サンプル番号は表１参照）の写真を図１に示す。【０１１８】
上記の結果から、ｐＨ４．００とｐＨ４．９１との間で沈殿生成量が変化することが推定された。そこで別のロットの卵白を用い、卵白溶液のｐＨを４．００、４．４０、４．７９とした以外はサンプル１〜８と同様の手順で卵白溶液の濁度（Ｏ．Ｄ６００）を測定した。結果を表２に示す。
【表２】
2017169978.tif 000003
【０１１９】
以上の結果から、ｐＨ４〜７において、卵白から沈殿物が効率よく生じることが明らかとなった。ｐＨ５付近でＯ．Ｄ６００の値が最大になることから、沈殿物を取り除くにはｐＨ５．１前後が最適といえる。また、ｐＨ４．４〜６．１の範囲内、特にｐＨ４．７〜６．０２の範囲内で沈殿物が効率よく生じることが明らかとなった。【０１２０】
＜実験３＞
ニワトリ卵白中には主要なタンパク質としてオボアルブミン、オボムコイド等が含まれる。オボアルブミンの等電点（ｐＩ）は４．６であり、オボムコイドのｐＩは３．９〜４．５であることが知られている（生化学辞典第４版、東京化学同人）。一方、配列番号３のアミノ酸配列からなるｆＥＰＯは、アミノ酸配列から、ｐＩが８．２と推測される。個々のタンパク質は、溶液のｐＨにより荷電状態が異なり、ｐＩより高いｐＨ条件下では負に荷電し、ｐＩより低いｐＨ条件下では正に荷電する。上記の通り、ニワトリ卵白中に含まれる主要なタンパク質とｆＥＰＯとでｐＩが異なることから、イオン交換クロマトグラフィーにより、オボアルブミンやオボムコイド等の卵白中の主要タンパク質とｆＥＰＯとを分離できると考えられる。【０１２１】
そこで、ｆＥＰＯが陽イオン交換体に結合する条件およびオボアルブミンを除去できる条件をバッチ法により検討した。【０１２２】
１．方法
１．１．卵白溶液のｐＨ調整
ｐＨ３．５、４．４、５．０、５．６の５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液を作製して、実験２に記載の方法と同様の手法で解凍・せん断した卵白と混合して、ｐＨが３．５、４．４、５．０、５．６の各ｐＨ調整済卵白液を作製した。ｐＨ調整済卵白液は遠心分離して沈殿物を除去してから実験に供した。【０１２３】
１．２．陽イオン交換カラム担体への吸着と回収
本欄に記載の５０ｍＭ酢酸緩衝液はｐＨ調整済卵白液と同じｐＨのものを使用した。エタノールに懸濁されている陽イオン交換カラム担体（ＳＰ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗ，ＧＥヘルスケア）５００μｌを遠心分離（１０００ｇ，３分）し、上清を捨てた。１ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌを加え懸濁後遠心分離（１０００ｇ，３分）し、上清を捨てた。１ｍｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液を加え、懸濁後遠心分離（１０００ｇ，３分）し、上清を捨てた。再び、１ｍｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液を加え、懸濁後遠心分離（１０００ｇ，３分）し、上清を捨てた。沈殿に、５００μｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液と、前記１．１．欄で調製したｐＨ調整済卵白液２５０μｌとを加え懸濁後１時間室温で振とうした。振とう後、遠心分離（１０００ｇ，３分）を行った。沈殿に１ｍｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液を加え、１時間室温で振とうした。１ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌを加え１時間室温で振とうした。振とう後遠心分離（１０００ｇ，３分）し、上清を「吸着画分」として回収した。回収した各画分のｆＥＰＯ測定はＢａＦ／ＥＰＯＲによる細胞増殖アッセイ（実験１の「１．２．ネコ由来エリスロポエチンの活性測定」の欄参照）を行った。【０１２４】
オボアルブミンが除去されているか否かを以下の手順で評価した：各サンプリング液と１０ｍＭ ＤＴＴ含サンプルローディングバッファーを等量混和し、約９８℃で５分間加熱処理をする。これを１２．５％濃度ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後に、銀染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて銀染色して、オボアルブミンバンドの有無を判定した。【０１２５】
２．結果
結果を表３に示す。【０１２６】
吸着画分についての○はｆＥＰＯが検出され、かつ、前処理後卵白原料中のｆＥＰＯ量を１００％としたとき５０％以上のｆＥＰＯ量が含まれていたことを表す。【０１２７】
オボアルブミン除去に関して、×は吸着画分においてオボアルブミンが全く除去できていないこと指し、△はある程度除去されていることを指し、○は概ね除去できていることを指す。
【表３】
2017169978.tif 000004
【０１２８】
陽イオン交換カラム担体はｐＨ３．５においてｆＥＰＯだけでなくオボアルブミンを吸着してしまうのに対して、より高いｐＨ条件ではｆＥＰＯを吸着しオボアルブミンを除去できることが明らかとなった。ｆＥＰＯの吸着量には差が無かったが、オボアルブミンを除去するという目的を達成するには、ｐＨ４．４以上が好ましい。【０１２９】
＜実験４＞
ＡＫＴＡクロマトシステムを用いて、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにおける、ｆＥＰＯの回収率へのｐＨ条件の影響について、実験３より狭い範囲で確認した。【０１３０】
実験１の「２．３．ｐＨ調整」欄に記載した５０ｍＭ酢酸緩衝液として、ｐＨが５．１の代わりに４．８、４．９、５．０、５．２のものを用いて、前処理後卵白原料を作製した。よって、取得された前処理後卵白原料のｐＨは、それぞれ４．８、４．９、５．０、５．２に調整されている。陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによる精製は全て２０℃の温度条件で行った。【０１３１】
ＸＫ２６カラム（ＧＥヘルスケア社製）にＳＰ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＳＰＦＦ：ＧＥヘルスケア）をベッド高１５ｃｍ、圧縮率１１３％で充填した。【０１３２】
以下の緩衝液をｐＨ４．８、４．９、５．０、５．２にて作製して、前処理後卵白原料と同じｐＨの緩衝液を用いて実験を行った。
Ａ液：５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液
Ｂ液：５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液／７０ｍＭ塩化ナトリウム
Ｃ液：５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液／１５０ｍＭ塩化ナトリウム
Ｄ液：５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液／１Ｍ塩化ナトリウム【０１３３】
Ａ液を通液して平衡化した後に、担体体積１ｍｌに対して、総タンパク質量として８８ｍｇの前処理後卵白原料を負荷した。負荷の際の線流速は３０ｃｍ／ｈとした。担体に非吸着及び弱く結合しているタンパク質を洗い流すため、Ｂ液を３ＣＶ通液した。５ＣＶのＣ液で主画分の溶出を行い、１ＣＶずつ回収した。回収後は泡立たないように混合し、サンプリングした。３ＣＶのＤ液でカラムに残留している残タンパク質成分の溶出を行った。【０１３４】
卵白添加時に非吸着の画分（フロースルー）、洗浄画分、溶出画分、全溶出の画分について、下記の分析を実施した。【０１３５】
＜分析＞
タンパク質量：上記実験１の「２．４．膜ろ過」で説明したのと同様の手順でタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度×回収液量を総タンパク質量とした。【０１３６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：各サンプリング液と１０ｍＭ ＤＴＴ含サンプルローディングバッファーを等量混和し、約９８℃で５分間加熱処理をする。これを１２．５％濃度ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後に、銀染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて銀染色して、ＯＶＡの有無を確認した。【０１３７】
ＥＬＩＳＡ：上記実験１の「２．４．膜ろ過」で説明したのと同様の手順で負荷液と溶出画分のｆＥＰＯ濃度を測定した。ｆＥＰＯ回収率は、溶出画分に含まれるｆＥＰＯ濃度×回収液量を負荷した卵白原料に含まれるｆＥＰＯ量で除して算出した。【０１３８】
図２に、溶出チャートを示す。実線は総タンパク質量を、点線はｆＥＰＯ回収率をそれぞれ示す。総タンパク質量の大部分はＯＴＦ（オボトランスフェリン）などの不純物タンパク質であり、相対的なｆＥＰＯ量は３％程度である。【０１３９】
図３に、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによる精製をｐＨ４．８にて行った際の、分子量マーカーＭ、精製前の前処理後卵白原料Ｐ、非吸着画分Ｆ、洗浄画分Ｗ、溶出画分Ｅ、全溶出画分ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。【０１４０】
吸着時のｐＨ条件ごとのｆＥＰＯ収率を次表に示す。
【表４】
2017169978.tif 000005
【０１４１】
図３に示されるように、ｐＨ４．８の条件でも、主要な不純物であるオボアルブミン（ＯＶＡ）は、非吸着画分Ｆ及び洗浄画分Ｗに含まれ、溶出画分Ｅには混入しないことが確認された。また、ｐＨ４．８〜５．２でｆＥＰＯの回収率は７４％以上と高く、ｐＨ４．９〜５．２では７８％以上となりより高いｆＥＰＯの回収率となった。【０１４２】
＜実験５＞
上記実験１の２．１．の解凍処理を経て得られた卵白液と、上記実験１の２．４．の膜ろ過処理を経て得られた前処理後卵白原料２ロット分について、東機産業社製のＴＶＢ−１０型粘度計を用いて１５℃での粘度を測定した。
卵白液の粘度：４９．２ｃＰ（１５℃）
前処理後卵白原料の粘度：３．１ｃＰ、２．９ｃＰ（１５℃）【０１４３】
この結果は、ｐＨ調整及び膜ろ過の工程を経ていない卵白液は粘度が非常に高く、ｐＨ調整及び膜ろ過の工程により粘度が低減することを示す。【０１４４】
＜実験６＞
ｆＥＰＯ活性のｐＨによる影響を以下の手順で調べた。【０１４５】
精製ｆＥＰＯ溶液として、ＰＥＧ化されていない成熟ｆＥＰＯ換算で、６１．５μｇ／ｍＬのｆＥＰＯを含むものを用いた。この精製ｆＥＰＯ溶液は、下記の実験７の「３．更なる精製」の工程で得られたＰＥＧ化されていない精製ｆＥＰＯ溶液である。【０１４６】
ｐＨ制御のための緩衝液として以下の緩衝液を用意した。【０１４７】
ｐＨ４．０用緩衝液：５０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液に酢酸を加えてｐＨ４．０とした。【０１４８】
ｐＨ５．０用緩衝液：５０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液に酢酸を加えてｐＨ４．０とした。【０１４９】
ｐＨ６．０用緩衝液：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１Ｎ塩酸を加えてｐＨ６．０とした。【０１５０】
精製ｆＥＰＯ溶液をｐＨ４．０用緩衝液で２００倍希釈し、ｐＨ５．０用緩衝液及びｐＨ６．０用緩衝液でそれぞれ４００倍希釈した希釈液を調製した。【０１５１】
希釈液を室温で３日間静置し、３日後に実験１の１．２．欄に記載のＢａＦ／ＥＰＯＲによる細胞増殖アッセイにより希釈液のエリスロポエチン活性を測定した。活性は、希釈前の精製ｆＥＰＯ溶液１ｍＬあたりの、エポジンとしてのエリスロポエチン活性（Ｕ）として表した。各ｐＨ条件において３回の測定を行いその平均値を次表に示す。
【表５】
2017169978.tif 000006
【０１５２】
この結果は、ｐＨが５以上の場合に、ｆＥＰＯの活性は保持され易く、ｐＨが５.０付近であればｆＥＰＯは失活しにくいためである。【０１５３】
そして、上記表３〜５から、精製工程におけるクロマトグラフィーをロードする際のタンパク質液のｐＨが４．４〜６．０であれば、オボアルブミンを除去し、ｆＥＰＯの回収率が高くなることが明らかとなった。また、ｐＨが４．８〜５．２であれば、活性を保持しつつ、回収率をより向上させることを見出した。【０１５４】
＜実験７＞
上記の実験の結果から、卵白をｐＨ５．１にｐＨ調整して膜ろ過を行い、その後にｐＨ５．１で陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことが、卵白からｆＥＰＯを精製する条件として好ましいと本発明者らは推定した。そこで以下の実験７では、実験１の２．４．欄で調製した前処理後卵白原料（卵白をｐＨ５．１に調整した後に膜ろ過した卵白原料）をｐＨ５．１での陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、更にＰＥＧ化してＰＥＧ化ｆＥＰＯ製剤を調製した。【０１５５】
１．陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
＜工程概要＞
本工程では、実験１の２．４．欄で調製した前処理後卵白原料を陽イオン交換クロマトグラフィー担体に負荷し、ｆＥＰＯを吸着させた。不純物を洗浄した後、ｆＥＰＯを溶出させることでｆＥＰＯの粗精製を行った。該工程の目標は主不純物であるオボアルブミン（以下ＯＶＡと記載する）の除去である。【０１５６】
＜主要機器＞
・クロマトグラフィーシステム：ＡＫＴＡクロマトシステム（ＧＥヘルスケア社製）
付帯装備：Ａ，Ｂポンプ、サンプルポンプ、電気伝導度計、吸光度モニター（２８０ｎｍおよび２１５ｎｍ）、温度計、圧力計
・精製カラム：ＢＰＧ３００カラム（ＧＥヘルスケア社製）【０１５７】
＜精製用担体＞
・ＳＰ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＳＰＦＦ：ＧＥヘルスケア）
ベッド高１５ｃｍ、圧縮率１１３％【０１５８】
＜担体のカラムへのパッキング手法＞
パッキング時のカラムへの通液は、カラムの上から下の方向（以下Ｄｏｗｎ  Ｆｌｏｗと記載する）で行った。パッキング作業は室温（以下、室温の範囲は、２０．０〜２５．０℃とする）で実施し、カラムの評価およびカラム保管条件も２０〜２５℃とした。
パッキング液：水
担体圧縮率（自然沈降体積／充填体積）：１．１３
最終ベッド高：１５ｃｍ【０１５９】
＜緩衝液＞
以下の緩衝液を用いた。
Ａ液：５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．１０）
Ｂ液：５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．１０）／７０ｍＭ塩化ナトリウム
Ｃ液：５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．１０）／１５０ｍＭ塩化ナトリウム
Ｄ液：５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．１０）／１Ｍ塩化ナトリウム【０１６０】
調製した各緩衝液は、０．２μｍフィルター濾過を実施後、７２時間以内に使用した。【０１６１】
ｐＨ測定は、ナカライ社製校正液を使用し、ｐＨ＝４、ｐＨ＝７の２点校正を実施した。ｐＨ測定時の溶液温度は２２．５±０．５℃とした。【０１６２】
＜試薬＞
以下の試薬を使用した。
酢酸ナトリウム・３水和物（メルク株式会社）
氷酢酸（メルク株式会社）
塩化ナトリウム（メルク株式会社）【０１６３】
＜調製方法＞
Ａ液：水１００．００ｋｇに対して、酢酸ナトリウム４７９．００ｇ、酢酸を７９．６００ｇ添加、溶解、混合し、ｐＨおよび電気伝導度での確認を行った。
Ｂ液：水１００．００ｋｇに対して、酢酸ナトリウム４７９．００ｇ、塩化ナトリウム４０９．２０ｇを溶解し、酢酸６９．９７０ｇを添加し、混合後、ｐＨおよび電気伝導度での確認を行った。
Ｃ液：水１５０．００ｋｇに対して、酢酸ナトリウム７１８．５０ｇを溶解後、塩化ナトリウム１３１５．５０ｇを溶解し、酢酸９７．６５０ｇを添加し、混合後、ｐＨおよび電気伝導動での確認を行った。
Ｄ液：水２００．００ｋｇに対して、酢酸ナトリウム９５８．００ｇを溶解後、塩化ナトリウム１１６８８．０ｇを溶解し、酢酸８８．４８０ｇを添加し、混合後、ｐＨおよび電気伝導度での確認を行った。【０１６４】
＜工程モニタリング＞
クロマトシステムに内蔵されている、流速、液量、電気伝導度、吸光度（２８０ｎｍ）、圧力（充填圧以下とする）、温度をモニタリングした。【０１６５】
流速については、サンプルポンプ、システムポンプともに出口流量の実測により確認した。温度については、クロマト開始前に使用緩衝液およびサンプルが２０−２５℃になっていることを確認した。【０１６６】
＜操作手順＞
精製時の温度は２０−２５℃とした。線流速は、前処理後卵白原料の負荷時３０ｃｍ／ｈ、分画時は６０ｃｍ／ｈとした。凝集物の発生によるカラム目詰まり防止を目的とし、前処理後卵白原料は０．２μｍ濾過を実施し、さらにカラムの直前に０．２μｍフィルターを設置した。【０１６７】
１）平衡化
カラム中の保存液を置換するため、１カラム体積（以下、ＣＶと表記する）の水を通液後に下記の操作を行った。【０１６８】
Ｄ液を通液後（３ＣＶ以上）、Ａ液を通液（３ＣＶ以上）し、それぞれ電気伝導度が安定することを確認した。【０１６９】
２）前処理後卵白原料の負荷
担体体積（※）１ｍｌに対して、総タンパク質量として８８ｍｇの前処理後卵白原料を負荷した。カラムの目詰まり防止のため、前処理後卵白原料は、０．２μフィルター濾過を実施した。前処理後卵白原料は４℃で保管されているが、カラムに添加する前に２０−２５℃に戻した。線流速を３０ｃｍ／ｈとし、前処理後卵白原料を負荷した。尚、分画時（洗浄・溶出・全溶出）の線流速は６０ｃｍ／ｈとした。
※担体体積とは、圧縮・充填後の担体体積であり、カラム断面積×ベッド高とする。【０１７０】
３）洗浄
前処理後卵白原料の負荷後、担体に非吸着及び弱く結合しているタンパク質を洗い流すため、Ｂ液を３ＣＶ通液した。【０１７１】
４）溶出
５ＣＶのＣ液で主画分の溶出を行い、まとめて回収した。回収後は泡立たないように混合し、サンプリングし、下記の工程管理試験を実施した。残りは使用するまで４℃で保管した。【０１７２】
５）全溶出
３ＣＶのＤ液でカラムに残留している残タンパク質成分の溶出を行った。【０１７３】
＜サンプリング＞
卵白添加時に非吸着の画分（フロースルー）、洗浄画分、溶出画分、全溶出の画分について、液をよくかき混ぜた上、サンプリングを行い、下記の工程管理試験を実施した。【０１７４】
＜工程管理試験＞
下記項目について工程管理試験を実施した。工程管理試験はクロマトグラフィー終了後、次工程である限外濾過を実施する前に実施した。【０１７５】
本工程で得られた溶出画分を、「ＳＰＦＦ溶出画分」とした。【０１７６】
タンパク質量：上記実験１の「２．４．膜ろ過」で説明したのと同様の手順でタンパク質濃度を測定する。溶出画分のタンパク質量は２．４ｍｇ／ｍＬであった。【０１７７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：各サンプリング液と１０ｍＭ ＤＴＴ含サンプルローディングバッファーを等量混和し、約９８℃で５分間加熱処理をする。これを１２．５％濃度ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後に、銀染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて銀染色する。その結果、負荷サンプルにあったＯＶＡは溶出画分には無かった。【０１７８】
ＥＬＩＳＡ：上記実験１の「２．４．膜ろ過」で説明したのと同様の手順で負荷液と溶出画分のｆＥＰＯ濃度を測定する。これらの濃度と負荷重量または溶出画分重量を積算し、負荷量に対する溶出画分のｆＥＰＯ量の相対値を求める。結果、溶出画分のｆＥＰＯ量は、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに負荷したｆＥＰＯ量の９１％以上であった。【０１７９】
２．限外濾過による濃縮・塩交換工程
上記１．により得られた陽イオン交換クロマトグラフィー溶出液（ＳＰＦＦ溶出画分）に対し、限外濾過膜による濃縮及び塩交換を実施した。【０１８０】
限外濾過膜として、限外濾過膜（再生セルロース  分画分子量５ｋ）  メルク社製  ペリコン限外濾過膜、Ｖスクリーン膜を用いた。処理液１１．６Ｌあたり、０．４ｍ２以上の限外濾過膜を使用した。【０１８１】
限外濾過用緩衝液として、４．９５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．７５）、２０ｐｐｍＣａＣｌ２を用い、塩交換した。【０１８２】
濃縮及び塩交換後の回収液（限外濾過後回収液）のタンパク質濃度は、２回の試験でそれぞれ、９．７４ｍｇ／ｍＬ及び９．０７ｍｇ／ｍＬであった。総タンパク質量は、上記実験１の「２．４．膜ろ過」で説明したのと同様の手順でタンパク質濃度を測定した。【０１８３】
３．更なる精製
上記２．で得られた限外濾過後回収液から複数の公知の精製工程を経て精製ｆＥＰＯ画分（以下、精製ＥＰＯ画分）を得た。【０１８４】
精製ＥＰＯ画分は緩衝液として５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．３５）を含む。【０１８５】
精製ＥＰＯ画分はｐＨ８．３５の、無色透明で不溶性物質を含まないものであった。【０１８６】
ｆＥＰＯ濃度：精製ＥＰＯ画分をリン酸緩衝液で希釈して分光光度計と光路長１ｃｍの石英セルを用いて波長２８０ｎｍと３２０ｎｍの吸光度を測定し、次式からｆＥＰＯ濃度を算出する。式：ｆＥＰＯ濃度（ｍｇ/ｍＬ）＝（Ａｂｓ２８０-Ａｂｓ３２０）×０．９５９×希釈倍率【０１８７】
その結果、ｆＥＰＯ濃度は２．３ｍｇ／ｍＬであった。上記の算式により求められるｆＥＰＯ濃度は、配列番号３に示すアミノ酸配列からなり、水溶性長鎖分子等により化学修飾がされていないポリペプチドとして換算した重量に基づく濃度である。【０１８８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＷＢ：精製ＥＰＯ画分を１０ｍＭ ＤＴＴ含サンプルローディングバッファーと混和し、約９８℃で５分間加熱処理をする。これを１２．５％濃度ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、転写用電気泳動槽を用いてＰＶＤＦ膜に転写する。抗ｆＥＰＯモノクローナル抗体、各試験用液（ＴＯＹＯＢＯ社製）および検出用試薬（ＧＥ社製）を用いてタンパク質を検出した結果、約３０ｋＤａの位置にバンドを確認した。【０１８９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）：精製ＥＰＯ画分を１０ｍＭ ＤＴＴ含サンプルローディングバッファーと混和し、約９８℃で５分間加熱処理をする。これを１５％濃度ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後にＣＢＢ染色を行う。この結果、単一なバンドを確認した。【０１９０】
ＨＰＬＣ−ＲＰ：ＨＰＬＣと逆相用カラム（ＧＲＡＣＥ社製）を用いて、移動相Ａ（超純水／トリフルオロ酢酸＝１０００／１）と移動相Ｂ（超純水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸＝１００／９００／１）のグラジエントで０．７５ｍＬ／分で７０分間分析する。精製ＥＰＯ画分のチャートと対照（リン酸緩衝液）のそれとを比較して目視でピークを検出し、手動でピーク演算を行う。ｆＥＰＯのピーク面積に対するそれ以外のピーク面積を求めた結果、０．５％以上のピークを認めなかった。【０１９１】
ＨＰＬＣ−ＳＥＣ：ＨＰＬＣとサイズ排除用カラム（東ソー社製）を用いて、移動相（０．０５％ポリソルベート／リン酸緩衝液）０．５ｍＬ／分で７０分間分析する。精製ＥＰＯ画分のチャートと対照（リン酸緩衝液）のそれとを比較して目視でピークを検出し、手動でピーク演算を行う。ｆＥＰＯのピーク面積に対するそれ以外のピーク面積を求めた結果、２．０％以上のピークを認めなかった。【０１９２】
生物活性測定：上記実験１の１．２．欄に記載のネコ由来エリスロポエチンの活性測定に記載の方法に従って生物学的活性を求めた。精製ＥＰＯ画分を希釈（１００００００倍〜３３７５０００倍）して培養液に加えた。２日間３７℃５％ＣＯ２雰囲気下で培養した後に、セルカウンティングキット８（同仁化学）を加えて、細胞数を測定した。標準曲線を作成して、活性を読み取り、製剤の比活性を算出した結果、２．８×１０５  Ｕ／ｍｇだった。【０１９３】
ＥＬＩＳＡ：ＯＶＡ測定キット（森永生科学社製）、オボトランスフェリン測定キット（ＩＣＬ社製）およびリゾチーム測定キット（ＣＵＳＡＢＩＯ社製）を用いて、ＯＶＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を標準品として用いる以外は各キットの手順に従い精製ＥＰＯ画分中の各物質量を定量する。その結果ｆＥＰＯ量に対して、ＯＶＡは３６９ｐｐｍ、オボトランスフェリンは１ｐｐｍ、リゾチームは６２ｐｐｍであった。【０１９４】
４．ｆＥＰＯのＰＥＧ化
上記３．で得られた精製ＥＰＯ画分に以下のＰＥＧ化剤を添加した。
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＨＳ（平均分子量２０Ｋの直鎖ＰＥＧのＰＥＧ化剤、日油株式会社製）【０１９５】
ｆＥＰＯとＰＥＧ化剤とがモル比で１：５となる割合で精製ＥＰＯ画分とＰＥＧ化剤を混合後、４℃で混和しながら２時間反応させた。２時間反応後、反応停止剤として１００ｍＭグリシン溶液を１／１０量加え、４℃で１時間混和しながら反応を停止させた。【０１９６】
５．ＰＥＧ化ｆＥＰＯの分離精製
上記４．で得られたＰＥＧ化反応液を１０倍量の５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で希釈し、０．２μｍフィルターろ過後、モノＰＥＧ体、ジＰＥＧ体、オリゴＰＥＧ体および未反応ＰＥＧ、未反応ＥＰＯを分離回収するため、陽イオン交換カラムにより分離精製を行った。【０１９７】
以下の操作は２０−２５℃にて行った。【０１９８】
前記希釈液を陽イオン交換カラム（ＭａｃｒｏＣａｐＳＰ：ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）に負荷した。負荷後のカラムを５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）により洗浄し、次いで、５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ４．５）でステップ溶出を行い、溶出画分を回収した。回収された溶出画分を均質に撹拌し「ＭＣＳＰ溶出画分」とした。次いで、５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ４．５）により残タンパク質の溶出を行った。【０１９９】
「ＭＣＳＰ溶出画分」はモノＰＥＧ体及びジＰＥＧ体のピークを回収した画分に相当する。【０２００】
＜サンプリング＞
ＰＥＧ化反応液と溶出画分について、液をよくかき混ぜた上、サンプリングを行い、工程管理試験を実施した。【０２０１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：各サンプリング液と１０ｍＭ ＤＴＴ含サンプルローディングバッファーを等量混和し、約９８℃で５分間加熱処理をする。これを４〜２０％濃度のポリアクリルアミドグラジエントゲルで電気泳動した後に、銀染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて銀染色する。その結果、６０ｋＤａと１２０ｋＤａにバンドを認めた。【０２０２】
６．原薬調製
表６に示す各成分のうちＰＥＧ化ｆＥＰＯ及びＴｗｅｅｎ８０を含まない以外は同様の成分を水中に含みｐＨ調整した緩衝液を原薬緩衝液とした。上記５．で得たＭＣＳＰ溶出画分を限外濾過によって原薬緩衝液に塩交換するとともに、タンパク質濃度を０．２７ｍｇ／ｍＬに調整した。【０２０３】
上記の限外濾過後の溶液を平均孔径２０ｎｍの中空糸膜を通過させることによりウイルス除去を行った。【０２０４】
上記のウイルス除去後の溶液に０．２μｍフィルターろ過を行い、無菌的にバッグに充填したものを原薬とした。【０２０５】
７．製剤化
上記６．において調製された原薬を用いて下記組成の液状組成物を製造した。【０２０６】
０．５ｇのＴｗｅｅｎ８０をメスフラスコに加えた後に、合計１００ｍＬになるように原薬緩衝液を加えて、よく撹拌したものをＴｗｅｅｎ８０液とした。原薬４６８．９ｍＬを正確に量り取り、２Ｌメスシリンダーに投入した。Ｔｗｅｅｎ８０液１３ｍＬを正確に量り取り同じ２Ｌメスシリンダーに投入した後に、原薬緩衝液を加えて１３００ｍＬにメスアップした。こうして得られたＰＥＧ化ｆＥＰＯ溶液製剤の組成を表６に示す。ミリパック２０（メルク社製）を用いて濾過し、ガラスバイアルに１．１ｍＬずつ充填した。ゴム栓とアルミキャップを用いて打栓して密閉した。【０２０７】
ｆＥＰＯ濃度：上記３．で説明したのと同様の手順で測定したｆＥＰＯ濃度は０．１１ｍｇ／ｍＬであった。【０２０８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）：上記３．で説明したのと同様の手順でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）を行った。その結果、６０ｋＤａと１２０ｋＤａにバンドを確認した。【０２０９】
ＨＰＬＣ−ＲＰ：上記３．で説明したのと同様の手順でＨＰＬＣ−ＲＰを行った。ＰＥＧ体のピーク面積に対するそれ以外のピーク面積を求めた結果、０．５％以上のピークを認めなかった。【０２１０】
ＨＰＬＣ−ＳＥＣ：上記３．で説明したのと同様の手順でＨＰＬＣ−ＳＥＣを行った。凝集体、トリＰＥＧ体、モノＰＥＧ体およびジＰＥＧ体のピーク面積から相対値を求めた結果、凝集体の割合は２．０％より小さかった。【０２１１】
生物活性測定：上記実験１の１．２．欄に記載のネコ由来エリスロポエチンの活性測定に記載の方法に従って生物学的活性を求めた。製剤の比活性を算出した結果、１．８×１０４  Ｕ／ｍｇだった。
【表６】
2017169978.tif 000007
【０２１２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2017169978.tif 000008
【図２】
2017169978.tif 000009
【図３】
2017169978.tif 000010
【配列表】
2017169978000001.app
【国際調査報告】
2017169978.tif 000011
2017169978.tif 000012
2017169978.tif 000013
2017169978.tif 000014
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