(57)【要約】  明細書に記載の化合物Ａ〜Ｄからなる群から選択される化合物又はその塩を含有する、エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための抗腫瘍剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミドｌ；
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）アクリルアミド；
（Ｓ，Ｅ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）−３−クロロアクリルアミド；及び
（Ｒ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）−Ｎ−メチルアクリルアミドからなる群から選択される化合物又はその塩を含有する、エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための抗腫瘍剤。
【請求項２】
化合物が、（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミドである、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者は、肺癌、乳癌、頭頸部癌、脳腫瘍、子宮癌、造血器腫瘍、又は皮膚癌の患者である、請求項１又は２に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者は、肺癌患者である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
エクソン２０挿入変異が、エクソン２０領域に１つ以上のアミノ酸が挿入された変異である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】
エクソン２０挿入変異が、エクソン２０領域に１〜７つのアミノ酸が挿入された変異である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項７】
エクソン２０挿入変異が、エクソン２０領域に１〜４つのアミノ酸が挿入された変異である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項８】
エクソン２０挿入変異が、Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ、Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＮＰＨ、Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＰＨである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項９】
エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者に有効量の
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド；
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）アクリルアミド；
（Ｓ，Ｅ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）−３−クロロアクリルアミド；及び
（Ｒ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）−Ｎ−メチルアクリルアミド
からなる群から選択される化合物又はその塩を投与する工程を含む、悪性腫瘍患者の治療方法。
【請求項１０】
エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための、
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド；
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）アクリルアミド；
（Ｓ，Ｅ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）−３−クロロアクリルアミド；及び
（Ｒ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）−Ｎ−メチルアクリルアミド
からなる群から選択される化合物又はその塩。
【請求項１１】
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド；
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）アクリルアミド；
（Ｓ，Ｅ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）−３−クロロアクリルアミド；及び
（Ｒ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）−Ｎ−メチルアクリルアミド
からなる群から選択される化合物又はその塩の、エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための医薬を製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエクソン２０挿入変異型上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、「ＥＧＦＲ」とも称する）を有する癌に対する抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＧＦＲは受容体チロシンキナーゼであり、正常組織においてはリガンドである上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、以下「ＥＧＦ」とも称する）と結合することで生理機能を発揮し、上皮組織において増殖及びアポトーシス阻害に寄与している（非特許文献１）。また、ＥＧＦＲ遺伝子の体細胞変異は癌の原因遺伝子として知られており、例えばＥＧＦＲのエクソン１９領域の７４６〜７５０番アミノ酸が欠失したもの（以下、「エクソン１９欠失変異」とも称する）及びエクソン２１領域の８５８番アミノ酸がロイシンからアルギニンへ変異したもの（以下、「Ｌ８５８Ｒ変異」とも称する）はＥＧＦ非依存的なキナーゼ活性を恒常的に誘導し、癌細胞の増殖及び生存に寄与する（非特許文献２）。これらの変異は、東アジアにおいては、例えば非小細胞肺癌の３０〜５０％で認められ、また、欧米においても非小細胞肺癌のおよそ１０％で認められると報告されており、癌の原因因子の1つとして考えられている（非特許文献３）。【０００３】
そのため、ＥＧＦＲ阻害剤の抗腫瘍剤としての研究開発は従来から活発に行われており、ＥＧＦＲ変異陽性肺癌の治療に導入されている。例えばゲフィチニブ、エルロチニブ、及びアファチニブは、治療用量において、野生型ＥＧＦＲの阻害に起因すると広く考えられている皮膚の異常及び消化管障害が副作用として発現する一方、エクソン１９欠失変異型及びＬ８５８Ｒ変異型ＥＧＦＲ陽性肺癌に対して高い抗腫瘍効果を示す。これらの治療効果は、ＥＧＦＲ阻害剤が野生型ＥＧＦＲに比し変異型ＥＧＦＲを選択的に阻害することに起因すると考えられている（非特許文献４）。【０００４】
しかし近年、癌の中にはエクソン２０領域に１つ以上のアミノ酸が挿入された変異（以下、「エクソン２０挿入変異」とも称する）を持つＥＧＦＲを有するものが存在し、これらの癌は従来のＥＧＦＲ阻害剤に低感受性であることが明らかとなってきた。例えばアファチニブのＥＧＦＲ変異陽性肺癌に対する臨床の抗腫瘍効果は、エクソン１９欠失変異及びＬ８５８Ｒ変異に比しエクソン２０挿入変異では著しく低いことが報告されている（非特許文献５）。そのためこれらの患者には化学療法が汎用されているが、治療法の選択肢が限定されること及び十分な治療効果が得られていないことから、更に治療効果の高い抗腫瘍剤が必要とされている。【０００５】
特許文献１には、エクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲに特徴付けられる疾患の治療に用いることができる化合物が記載されている。しかし当該文献１に記載の化合物は、本発明に係る化合物と構造が大きく異なる上、野生型ＥＧＦＲとの比較による選択性及びｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける有効性は開示されていない。【０００６】
また、特許文献２には、キノリン置換化合物が記載されているが、エクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲに対する阻害活性は記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１５／１７５６３２Ａ１
【特許文献２】ＷＯ２０１５／０２５９３６Ａ１
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．６，ｐｐ８０３−８１２（２００６）
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１９，ｐｐ１３８９−１４００（２０１３）
【非特許文献３】Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．７，ｐｐ１６９−１８１（２００７）
【非特許文献４】Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．ｖｏｌ．１３，ｅ２３−３１（２０１２）
【非特許文献５】Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．ｖｏｌ．１６，ｐｐ８３０−８３８（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、従来のＥＧＦＲ阻害剤で治療効果が十分ではない、エクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲへの選択性が高い阻害剤であり、かつ、野生型ＥＧＦＲを阻害することによる副作用が低減した抗腫瘍剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、エクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲが癌の治療標的として妥当であることと併せて、従来治療に導入されているＥＧＦＲ阻害剤が、野生型ＥＧＦＲとエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲ間の選択性に乏しいことを見出した。また、特定の化合物が、エクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲに対する選択性及び腫瘍増殖抑制効果を示し、代表的なＥＧＦＲ変異陽性癌治療薬であるアファチニブより優れたものであることを確認し、本発明を完成するに至った。【００１１】
従って、本発明は、以下の態様を包含する。【００１２】
項１．（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド（以下、「化合物Ａ」とも称する）;
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）アクリルアミド（以下、「化合物Ｂ」とも称する）;
（Ｓ，Ｅ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）−３−クロロアクリルアミド（以下、「化合物Ｃ」とも称する）;及び
（Ｒ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）−Ｎ−メチルアクリルアミド（以下、「化合物Ｄ」とも称する）からなる群から選択される化合物又はその塩を含有する、エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための抗腫瘍剤。【００１３】
項２．化合物が、（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミドである、項１に記載の抗腫瘍剤。【００１４】
項３．エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者は、肺癌、乳癌、頭頸部癌、脳腫瘍、子宮癌、造血器腫瘍、又は皮膚癌の患者である、項１又は２に記載の抗腫瘍剤。【００１５】
項４．エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者は、肺癌患者である、項１〜３のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。【００１６】
項５．エクソン２０挿入変異が、エクソン２０領域に１つ以上のアミノ酸が挿入された変異である、項１〜４のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。【００１７】
項６.エクソン２０挿入変異が、エクソン２０領域に１〜７つのアミノ酸が挿入された変異である、項１〜５のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。【００１８】
項７．エクソン２０挿入変異が、エクソン２０領域に１〜４つのアミノ酸が挿入された変異である、項１〜６のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。【００１９】
項８．エクソン２０挿入変異が、Ａ７６３＿Ｙ７６４ｉｎｓＦＱＥＡ、Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＮＰＧ、Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ、Ｄ７７０＞ＧＹ、Ｎ７７１＿Ｐ７７２ｉｎｓＮ、Ｐ７７２＿Ｒ７７３ｉｎｓＰＲ、Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＮＰＨ、Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＰＨ、Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＡＨ、Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＨ、Ｖ７７４＿Ｃ７７４ｉｎｓＨＶ、又はＡ７６１＿Ｅ７６２ｉｎｓＥＡＦＱである、項１〜７のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。【００２０】
項９．エクソン２０挿入変異が、Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ、Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＮＰＨ、Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＰＨである、項１〜８のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。【００２１】
項１０．エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者に有効量の
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド；
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）アクリルアミド；
（Ｓ，Ｅ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）−３−クロロアクリルアミド；及び
（Ｒ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）−Ｎ−メチルアクリルアミド
からなる群から選択される化合物又はその塩を含む抗腫瘍剤を投与する工程を含む、悪性腫瘍患者の治療方法。【００２２】
項１１．エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための、
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド；
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）アクリルアミド；
（Ｓ，Ｅ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）−３−クロロアクリルアミド；及び
（Ｒ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）−Ｎ−メチルアクリルアミド
からなる群から選択される化合物又はその塩。【００２３】
項１２．エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための抗腫瘍剤を製造するための、
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド；
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）アクリルアミド；
（Ｓ，Ｅ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）−３−クロロアクリルアミド；及び
（Ｒ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）−Ｎ−メチルアクリルアミド
からなる群から選択される化合物又はその塩の使用。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係る抗腫瘍剤は、野生型ＥＧＦＲを阻害せずに、エクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲへの高い選択性を示す。したがって、野生型ＥＧＦＲを阻害することによる副作用を低減しつつ、従来のＥＧＦＲ阻害剤で治療効果が十分ではない、エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者に対する優れた治療効果を発揮する抗腫瘍剤を提供するものとして有用である。【００２５】
従来のＥＧＦＲ阻害剤は、野生型ＥＧＦＲに比べてエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲへの選択性が低いため、抗腫瘍効果を発揮する投与量と野生型ＥＧＦＲに起因する副作用（皮膚の異常、消化管障害など）が生じる投与量との乖離が小さく、十分な治療効果を発揮することが困難であった。一方、本発明に係る抗腫瘍剤は、エクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲへの選択性が高いため、野生型ＥＧＦＲに起因する副作用を生じさせずに投与量を増加させること可能であり、エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者に対して優れた治療効果を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】野生型及び変異型ＥＧＦＲ発現細胞株に対する化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、並びに、比較化合物、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びアファチニブの細胞増殖抑制に関する試験結果から算出した、野生型ＥＧＦＲとエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲとのＩＣ５０比を示す。
【図２】野生型及び変異型ＥＧＦＲ発現ヒト細胞株に対する化合物Ａ、比較化合物、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びアファチニブの細胞増殖抑制に関する試験結果から算出した、野生型ＥＧＦＲとエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲとのＧＩ５０比を示す。
【図３】化合物Ａの抗腫瘍効果を測定するための変異型ＥＧＦＲ発現細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲｉｎｓＡＳＶ細胞）皮下移植モデルマウスにおける相対的腫瘍体積（以下、「ＲＴＶ」ともいう。）を示す。
【図４】化合物Ａの毒性を測定するための変異型ＥＧＦＲ発現細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲｉｎｓＡＳＶ細胞）皮下移植モデルマウスの腫瘍の群分け後における体重を示す。
【図５】化合物Ａの抗腫瘍効果を測定するための変異型ＥＧＦＲ発現細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ細胞）皮下移植モデルマウスにおける相対的腫瘍体積を示す。
【図６】化合物Ａの毒性を測定するための変異型ＥＧＦＲ発現細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ細胞）皮下移植モデルマウスの腫瘍の群分け後における体重を示す。
【図７】化合物Ａの抗腫瘍効果を測定するための変異型ＥＧＦＲ発現細胞株（Ｈ１９７５−ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ細胞）皮下移植モデルマウスにおける相対的腫瘍体積を示す。
【図８】化合物Ａの毒性を測定するための変異型ＥＧＦＲ発現細胞株（Ｈ１９７５−ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ細胞）皮下移植モデルマウスの腫瘍の群分け後における体重を示す。
【図９】化合物Ａの毒性を測定するための変異型ＥＧＦＲ発現細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３―ＥＧＦＲｉｎｓＮＰＨ）皮下移植モデルマウスにおける腫瘍体積を示す。
【図１０】化合物Ａの毒性を測定するための変異型ＥＧＦＲ発現細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３―ＥＧＦＲｉｎｓＮＰＨ）皮下移植モデルマウスの腫瘍の群分け後における体重を示す。
【図１１】化合物Ａの抗腫瘍効果を測定するための変異型ＥＧＦＲ発現細胞株（Ｈ１９７５−ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ細胞）皮下移植モデルラットおける腫瘍体積を示す。
【図１２】化合物Ａの毒性を測定するための変異型ＥＧＦＲ発現細胞株（Ｈ１９７５−ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ細胞）皮下移植モデルラットの腫瘍の群分け後における体重を示す。
【図１３】化合物Ａの毒性を測定するためのＶ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ変異型ＥＧＦＲ陽性肺癌患者由来腫瘍皮下移植モデルマウスにおける腫瘍体積を示す。
【図１４】本発明化合物Ａの毒性を測定するためのＶ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ変異型ＥＧＦＲ陽性肺癌患者由来腫瘍皮下移植モデルマウスの腫瘍の群分け後における体重を示す。
【図１５】野生型ＥＧＦＲ（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ＥＧＦＲ）のアミノ酸配列を示す（配列番号１）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
明細書の上記又は下記記載において、本発明範囲に含まれる様々な定義の好適例を、下記で詳細に説明する。
【００２８】
本明細書において「ＥＧＦＲ」とは、ヒト上皮成長因子受容体タンパク質を示し、ＥｒｂＢ−１又はＨＥＲ１とも呼ばれている。
【００２９】
本明細書において「野生型ＥＧＦＲ」とは、体細胞変異を有していないＥＧＦＲを示し、具体的には配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００５２１９．２）。
【００３０】
本明細書において「エクソン２０挿入変異」とは、ＥＧＦＲのエクソン２０領域（配列番号１における７６１〜８２３番のアミノ酸配列）に１つ以上（好ましくは１〜７つ、より好ましくは１〜４つ）のアミノ酸が挿入された変異を示し、好ましくは、エクソン２０領域の７６３番アラニンから７６４番チロシンの間にアミノ酸配列ＦＱＥＡ（Ｎ末側から順番にフェニルアラニン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン）が挿入された変異（Ａ７６３＿Ｙ７６４ｉｎｓＦＱＥＡ）、エクソン２０領域の７６９番バリンから７７０番アスパラギン酸の間にアミノ酸配列ＡＳＶ（Ｎ末側から順番にアラニン、セリン、バリン）が挿入された変異（Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ）、エクソン２０領域の７７０番アスパラギン酸から７７１番アスパラギンの間にアミノ酸配列ＳＶＤ（Ｎ末側から順番にセリン、バリン、アスパラギン酸）が挿入された変異（Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤ）、エクソン２０領域の７７０番アスパラギン酸から７７１番アスパラギンの間にアミノ酸配列ＮＰＧ（Ｎ末側から順番にアスパラギン、プロリン、グリシン）が挿入された変異（Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＮＰＧ）、エクソン２０領域の７７０番アスパラギン酸から７７１番アスパラギンの間にアミノ酸Ｇ（グリシン）が挿入された変異（Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ）、エクソン２０領域の７７０番アスパラギン酸が欠失し替わりにアミノ酸配列ＧＹ（Ｎ末側から順にグリシン、チロシン）が挿入された変異（Ｄ７７０＞ＧＹ）、エクソン２０領域の７７１番アスパラギンから７７２番プロリンの間にアミノ酸Ｎ（アスパラギン）が挿入された変異（Ｎ７７１＿Ｐ７７２ｉｎｓＮ）、エクソン２０領域の７７２番プロリンから７７３番ヒスチジンの間にアミノ酸配列ＰＲ（Ｎ末側から順にプロリン、アルギニン）が挿入された変異（Ｐ７７２＿Ｒ７７３ｉｎｓＰＲ）、エクソン２０領域の７７３番ヒスチジンから７７４番バリンの間にアミノ酸配列ＮＰＨ（Ｎ末側から順番にアスパラギン、プロリン、ヒスチジン）が挿入された変異（Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＮＰＨ）、エクソン２０領域の７７３番ヒスチジンから７７４番バリンの間にアミノ酸配列ＰＨ（Ｎ末側から順番にプロリン、ヒスチジン）が挿入された変異（Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＰＨ）、エクソン２０領域の７７３番ヒスチジンから７７４番バリンの間にアミノ酸配列ＡＨ（Ｎ末側から順番にアラニン、ヒスチジン）が挿入された変異（Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＡＨ）、エクソン２０領域の７７３番ヒスチジンから７７４番バリンの間にアミノ酸Ｈ（ヒスチジン）が挿入された変異（Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＨ）、エクソン２０領域の７７４番バリンから７７５番システインの間にアミノ酸配列ＨＶ（Ｎ末側から順番にヒスチジン、バリン）が挿入された変異（Ｖ７７４＿Ｃ７７４ｉｎｓＨＶ）、エクソン２０領域の７６１番アラニンから７６２番グルタミン酸の間にアミノ酸配列ＥＡＦＱ（Ｎ末側から順番にグルタミン酸、アラニン、フェニルアラニン、グルタミン）が挿入された変異（Ａ７６１＿Ｅ７６２ｉｎｓＥＡＦＱ）等が挙げられる。より好ましくはエクソン２０領域の７６９番バリンから７７０番アスパラギン酸の間にアミノ酸配列ＡＳＶ（Ｎ末側から順番にアラニン、セリン、バリン）が挿入された変異（Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ）、エクソン２０領域の７７０番アスパラギン酸から７７１番アスパラギンの間にアミノ酸配列ＳＶＤ（Ｎ末側から順番にセリン、バリン、アスパラギン酸）が挿入された変異（Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤ）、エクソン２０領域の７７０番アスパラギン酸から７７１番アスパラギンの間にアミノ酸Ｇ（グリシン）が挿入された変異（Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ）、エクソン２０領域の７７３番ヒスチジンから７７４番バリンの間にアミノ酸配列ＮＰＨ（Ｎ末側から順番にアスパラギン、プロリン、ヒスチジン）が挿入された変異（Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＮＰＨ）、エクソン２０領域の７７３番ヒスチジンから７７４番バリンの間にアミノ酸配列ＰＨ（Ｎ末側から順番にプロリン、ヒスチジン）が挿入された変異（Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＰＨ）が挙げられる。特に好ましくはエクソン２０領域の７７０番アスパラギン酸から７７１番アスパラギンの間にアミノ酸配列ＳＶＤ（Ｎ末側から順番にセリン、バリン、アスパラギン酸）が挿入された変異（Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤ）、エクソン２０領域の７７０番アスパラギン酸から７７１番アスパラギンの間にアミノ酸Ｇ（グリシン）が挿入された変異（Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ）が挙げられる。
【００３１】
本明細書において「エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者」とは、ＥＧＦＲのエクソン２０領域の少なくとも１箇所にエクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を示し、当該ＥＧＦＲは異なった２箇所以上にエクソン２０挿入変異を有してもよいが、好ましくは１箇所にエクソン２０挿入変異を有するものである。また、当該ＥＧＦＲはエクソン２０挿入変異以外の変異（例えば、エクソン１９欠失変異、Ｌ８５８Ｒ変異、Ｌ７９０Ｍ変異など）を有することもできる。
【００３２】
本発明において、悪性腫瘍患者が発現しているＥＧＦＲがエクソン２０挿入変異を有することの検出方法は、当該変異が検出できれば特に制限されず、公知の検出方法を使用することができる。エクソン２０挿入変異の検出においては、ＥＧＦＲ遺伝子のゲノム配列、ＥＧＦＲ遺伝子の転写産物、又はＥＧＦＲタンパク質のいずれをも検出対象とすることができる。
【００３３】
エクソン２０挿入変異の検出に供する試料としては、悪性腫瘍患者由来の生体試料、特に悪性腫瘍患者から採取したものであり悪性腫瘍細胞を含む試料であれば特に限定されない。生体試料としては、例えば体液（血液、尿等）、組織、その抽出物及び採取した組織の培養物などが例示できる。また、生体試料の採取方法は、生体試料の種類に応じ適宜選択することができる。
【００３４】
生体試料は、検出方法に応じて、適切な処理をされることにより調製される。また、検出に用いられる試薬（例えば、プライマー又はプローブを含む試薬）は、検出方法に応じて、慣用される方法により調整することができる。
【００３５】
本発明の1つの態様において、抗腫瘍剤の悪性腫瘍患者への投与の前に、悪性腫瘍患者が発現しているＥＧＦＲがエクソン２０挿入変異を有することの検出する工程を行うことができる。
【００３６】
次に、化合物Ａ〜Ｄ（化合物Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）（本明細書において、「本発明化合物」、「本発明に係る化合物」と総称する場合がある）及びその製造法について説明する。
【００３７】
化合物Ａ（（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド）は、下記化学式で表される。
【００３８】
【化１】
2018079310.tif 000002
【００３９】
化合物Ｂ（（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）アクリルアミド）は、下記化学式で表される。
【００４０】
【化２】
2018079310.tif 000003
【００４１】
化合物Ｃ（（Ｓ，Ｅ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）−３−クロロアクリルアミド）は、下記化学式で表される。
【００４２】
【化３】
2018079310.tif 000004
【００４３】
化合物Ｄ（（Ｒ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）−Ｎ−メチルアクリルアミド）は、下記化学式で表される。
【００４４】
【化４】
2018079310.tif 000005
【００４５】
上記化合物Ａ〜Ｄは、例えば、ＷＯ２０１５／０２５９３６Ａ１に記載された製造法又は実施例に示す方法等により製造することができる。ただし、化合物Ａ〜Ｄの製造法はこれら反応例に限定されるものではない。
【００４６】
上記化合物Ａ〜Ｄが、光学異性体、立体異性体、回転異性体、互変異性体等の異性体を有する場合には、特に明記しない限り、いずれの異性体も混合物も本発明化合物に包含される。例えば、化合物Ａ〜Ｄに光学異性体が存在する場合には、特に明記しない限り、ラセミ体及びラセミ体から分割された光学異性体も本発明化合物に包含される。
【００４７】
上記化合物Ａ〜Ｄの塩とは、薬学的に許容される塩を意味し、塩基付加塩又は酸付加塩を挙げることができる。
【００４８】
該塩基付加塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；例えばアンモニウム塩；例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、プロカイン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機アミン塩等が挙げられる。
【００４９】
該酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；例えば酢酸塩、ギ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、トリフルオロ酢酸塩等の有機酸塩；例えばメタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩等が挙げられる。
【００５０】
上記化合物Ａ〜Ｄ又はその塩には、そのプロドラッグも含まれる。プロドラッグは、生体内における生理条件下で酵素、胃酸等による反応により化合物Ａ〜Ｄ又はその塩に変換する化合物、即ち酵素的に酸化、還元、加水分解等を起こして本発明化合物又はその塩に変化する化合物、胃酸等により加水分解等を起こして化合物Ａ〜Ｄ又はその塩に変化する化合物をいう。また、広川書店１９９０年刊「医薬品の開発」第７巻分子設計１６３頁から１９８頁に記載されているような生理的条件で化合物Ａ〜Ｄ又はその塩に変化するものとすることもできる。
【００５１】
［疾患の記載］
本発明の対象となる腫瘍は特に制限はされないが、例えば、頭頚部癌、消化器癌（食道癌、胃癌、十二指腸癌、肝臓癌、胆道癌（胆嚢・胆管癌等）、膵臓癌、結腸直腸癌（結腸癌、直腸癌等）等）、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌、中皮腫等）、乳癌、生殖器癌（卵巣癌、子宮癌（子宮頚癌、子宮体癌等）等）、泌尿器癌（腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍等）、造血器腫瘍（白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫等）、骨・軟部腫瘍、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられる。好ましくは、肺癌、乳癌、頭頸部癌、脳腫瘍、子宮癌、造血器腫瘍、又は皮膚癌である。
【００５２】
上記化合物Ａ〜Ｄ又はその塩を医薬として用いるにあたっては、必要に応じて薬学的担体を配合し、予防又は治療目的に応じて各種の投与形態を採用可能である。該形態としては、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等のいずれでもよく、好ましくは、経口剤が採用される。これらの投与形態は、各々当業者に公知慣用の製剤方法により製造できる。
【００５３】
薬学的担体としては、製剤素材として慣用の各種有機或いは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として配合される。また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、安定化剤等の製剤添加物を用いることもできる。
【００５４】
経口用固形製剤を調製する場合は、化合物Ａ〜Ｄに賦形剤、必要に応じてさらに結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。
【００５５】
賦形剤としては、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、無水ケイ酸等が挙げられる。結合剤としては、水、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、α−デンプン液、ゼラチン液、Ｄ−マンニトール、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。滑沢剤としては、精製タルク、ステアリン酸塩ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。着色剤としては、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。矯味・矯臭剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
【００５６】
経口用液体製剤を調製する場合は、化合物Ａ〜Ｄに矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。
【００５７】
矯味・矯臭剤としては、前記に挙げられたものを用いることができる。緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。安定剤としては、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。必要により、腸溶性コーティング又は、効果の持続を目的として、経口製剤に公知の方法により、コーティングを施すこともできる。このようなコーティング剤にはヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）等が挙げられる。
【００５８】
注射剤を調製する場合は、化合物Ａ〜ＤにｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。
【００５９】
ｐＨ調節剤及び緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としては、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、グリセリン等が挙げられる。
【００６０】
坐剤を調製する場合は、化合物Ａ〜Ｄに当業者において公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセリド等を、更に必要に応じてＴｗｅｅｎ８０（商標）のような界面活性剤等を加えた後、常法により製造することができる。
【００６１】
軟膏剤を調製する場合は、化合物Ａ〜Ｄに通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化することができる。
【００６２】
基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。
【００６３】
保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
【００６４】
貼付剤を調製する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布することにより製造することができる。
【００６５】
支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布若しくは不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム或いは発泡体シートが挙げられる。
【００６６】
上記の各投与単位形態中に配合されるべき上記化合物Ａ〜Ｄの量は、これを適用すべき患者の症状により、或いはその剤形等により一定ではないが、一般に投与単位形態あたり、経口剤では０．０５〜１０００ｍｇ、注射剤では０．０１〜５００ｍｇ、坐剤では１〜１０００ｍｇとするのが望ましい。
【００６７】
また、上記投与形態を有する薬剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、有効成分の化合物Ａ〜Ｄとして通常成人（体重５０ｋｇ）１日あたり０．０５〜５０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１０００ｍｇとすることができ、これを１日１回又は２〜３回程度に分けて投与するのが好ましい。
【００６８】
本発明はまた、エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者に有効量の化合物Ａ〜Ｄからなる群から選択される化合物又はその塩を含む抗腫瘍剤を投与する工程を含む、悪性腫瘍患者の治療方法を提供する。
【００６９】
本発明はまた、エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための、化合物Ａ〜Ｄからなる群から選択される化合物又はその塩を提供する。
【００７０】
本発明はまた、エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための、化合物Ａ〜Ｄからなる群から選択される化合物又はその塩の使用を提供する。
【００７１】
本発明はまた、エクソン２０挿入変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための抗腫瘍剤を製造するための、化合物Ａ〜Ｄからなる群から選択される化合物又はその塩の使用を提供する。
【００７２】
本発明はまた、下記工程（１）〜（２）を含む、悪性腫瘍患者における化合物Ａ〜Ｄからなる群から選択される化合物又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法の治療効果を予測する方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を検出する工程、及び
（２）上記工程（１）における検出の結果、ＥＧＦＲ遺伝子がエクソン２０挿入変異を有している場合、当該患者に対する当該化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
【００７３】
本発明はまた、下記工程（１）〜（３）を含む、悪性腫瘍患者の治療方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を検出する工程、及び
（２）上記工程（１）における検出の結果、ＥＧＦＲ遺伝子がエクソン２０挿入変異を有している場合、当該患者に対す化合物Ａ〜Ｄからなる群から選択される化合物又はその塩を含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程、及び
（３）上記工程（２）で当該化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された患者に、当該抗腫瘍剤を投与する工程。
【００７４】
ＥＧＦＲ遺伝子の塩基配列は公知である。ｃＤＮＡの塩基配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、ＮＭ＿００５２２８．４である。
【００７５】
なお、「治療効果」は、腫瘍縮小効果、再発抑制効果、延命効果などにより評価することができ、再発抑制効果は無再発生存期間の延長及び／又は再発率の改善の程度、延命効果は全生存期間及び／又は無増悪生存期間の中央値の延長の程度などにより表すことができる。化合物Ａ又はその塩を有効成分として含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が「十分な治療効果を示す」とは、化合物Ａ又はその塩を有効成分として含有する抗腫瘍剤を投与することにより、非投与の場合と比較して、生存期間を顕著に延長させたり、再発を顕著に抑制させたりする程度の優れた治療効果をいう。
【実施例】
【００７６】
以下に試験例を示し、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例(試験例)に制限されるものではない。【００７７】
試験例１
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  薬効試験
野生型及び変異型ＥＧＦＲ発現細胞株に対する細胞増殖抑制効果の評価（１）
化合物の野生型ＥＧＦＲ及び変異型ＥＧＦＲに対する阻害活性は、ヒトＥＧＦＲ遺伝子を導入したマウスＢリンパ球前駆細胞株であるＢａ／Ｆ３細胞を用いて行った。Ｂａ／Ｆ３細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン／１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック）及び１ｎｇ／ｍＬ  マウスインターロイキン−３（ｍＩＬ−３）（ＣＳＴ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）にて維持し、ヒトＥＧＦＲ遺伝子（野生型（ＷＴ）、Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ（ｉｎｓＡＳＶ）、Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤ（ｉｎｓＳＶＤ）、Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ（ｉｎｓＧ）、Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＮＰＨ（ｉｎｓＮＰＨ）、Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＰＨ（ｉｎｓＰＨ））をコードしたＰＢ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ＧＦＰ＋ＰｕｒｏベクターもしくはＰＢ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ＲＦＰ＋ＰｕｒｏベクターをＳｕｐｅｒ  ＰｉｇｇｙＢａｃＴｒａｎｓｐｏｓａｓｅ発現ベクターと共にＡｍａｘａ（商標）  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  （商標）  Ｋｉｔ  Ｖによる電気穿孔法により導入した後ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ）にて選択した。野生型ＥＧＦＲを発現したＢａ／Ｆ３細胞（以下、「Ｂａ／Ｆ３―ＥＧＦＲ＿ＷＴ」とも称する）は５０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ）存在下でｍＩＬ−３非依存的な増殖を示し、又エクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲを発現したＢａ／Ｆ３細胞（以下、「Ｂａ／Ｆ３−ＥＧＦＲｉｎｓＡＳＶ」、「Ｂａ／Ｆ３−ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ」、「Ｂａ／Ｆ３−ＥＧＦＲｉｎｓＧ」、「Ｂａ／Ｆ３−ＥＧＦＲｉｎｓＮＰＨ」、「Ｂａ／Ｆ３−ＥＧＦＲｉｎｓＰＨ」とも称する）はＥＧＦ非存在下でｍＩＬ−３非依存的な増殖を示した。【００７８】
細胞増殖抑制効果の評価に際し、Ｂａ／Ｆ３―ＥＧＦＲ＿ＷＴ細胞を１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン及び５０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦを含むＲＰＭＩ−１６４０培地にて懸濁し、細胞懸濁液を９６ウェル平底マイクロプレートの各ウェルに１ウェルあたりの細胞数が３０，０００個になるよう播種した。一方、エクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲを発現したＢａ／Ｆ３細胞は１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地にて懸濁し、細胞懸濁液を９６ウェル平底マイクロプレートの各ウェルに１ウェルあたりの細胞数が１５，０００個になるように播種した。次に特許文献２に記載の製造方法に従って得られた（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド（化合物Ａ）、（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）アクリルアミド（化合物Ｂ）、（Ｓ，Ｅ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチレン−５−（キノリン−３−イル）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ピロリジン−７−イル）−３−クロロアクリルアミド（化合物Ｃ）、（Ｒ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）−Ｎ−メチルアクリルアミド（化合物Ｄ）及びＷＯ２０１３／１２５７０９Ａ１に記載の製造方法に従って得られた（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−５−（キノリン−３−イル）−６，７，８，９−テトラヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド（ＷＯ２０１３／１２５７０９Ａ１の実施例１の化合物）（以下、「比較化合物」とも称する）をＤＭＳＯに溶解し、ＤＭＳＯもしくは各細胞の懸濁に用いた培地を用いて希釈し、これを細胞の培養プレートの各ウェルに加え、５％炭酸ガス含有の培養器中３７℃で３日培養した。培養後の細胞数の計測はＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（プロメガ）を用いて、メーカーの推奨するプロトコールに基づき行った。以下の式より増殖阻害率を算出し、５０％阻害する被検化合物の濃度（ＩＣ５０（μＭ））を求めた。【００７９】
増殖阻害率（％）＝Ｔ  ／  Ｃ  ×１００
Ｔ：被検化合物を添加したウェルの発光強度
Ｃ：被検化合物を添加しなかったウェルの発光強度。【００８０】
また、以下の式より野生型ＥＧＦＲとエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲとのＩＣ５０の比を算出した。結果を図１に示す。【００８１】
ＩＣ５０  ｒａｔｉｏ＝ＩＣ５０（ＷＴ）  ／  ＩＣ５０（ｅｘ２０ｉｎｓ）
ＩＣ５０（ＷＴ）：野生型ＥＧＦＲに対するＩＣ５０
ＩＣ５０（ｅｘ２０ｉｎｓ）：エクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲに対するＩＣ５０。【００８２】
図1から明らかなとおり、化合物Ａ〜Ｄはエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲを発現した細胞株に対して細胞増殖抑制効果を示し、変異選択性は比較化合物、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びアファチニブに比して高かった。【００８３】
試験例２
野生型及び変異型ＥＧＦＲ発現ヒト細胞株に対する細胞増殖抑制効果（２）
化合物の野生型ＥＧＦＲ及び変異型ＥＧＦＲに対する阻害活性を評価するために、遺伝子改変によりＤ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤ変異型ＥＧＦＲを発現させたヒト肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞（以下、「Ｈ１９７５−ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ」とも称する）、野生型ＥＧＦＲを発現しているヒト類上皮癌細胞株であるＡ４３１細胞を使用した。Ｈ１９７５−ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ細胞は、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞にＤ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤ（ｉｎｓＳＶＤ）をコードしたＰＢ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ＲＦＰ＋ＰｕｒｏベクターをＳｕｐｅｒ  ＰｉｇｇｙＢａｃＴｒａｎｓｐｏｓａｓｅ発現ベクターと共にＡｍａｘａ（商標）  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）  Ｋｉｔ  Ｒによる電気穿孔法により導入した後ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ）にて選択した後、ＸＴＮ（商標）  ＴＡＬＥＮｓ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ）をＡｍａｘａ（商標）  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）  Ｋｉｔ  Ｒによる電気穿孔法により導入し、内在性ＥＧＦＲ（Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ）がノックアウトされた細胞をシーケンスにより選択した。【００８４】
細胞増殖抑制効果の評価に際し、それぞれの細胞をＡＴＣＣにより推奨されている培地中に懸濁させた。細胞懸濁液を９６ウェル平底プレートの各ウェルに１ウェルあたりの細胞数が３，０００個になるよう播種し、５％炭酸ガス含有の培養器中３７℃で１日培養した。化合物Ａ、比較化合物、ゲフィチニブ、エルロチニブ及びアファチニブをＤＭＳＯに溶解し、ＤＭＳＯを用いて被検化合物を終濃度の２００倍の濃度になるように希釈した。被検化合物のＤＭＳＯ溶液を各細胞の懸濁に用いた培地で希釈し、これを細胞の培養プレートの各ウェルにＤＭＳＯの最終濃度が０．５％になるように加え、５％炭酸ガス含有の培養器中３７℃で３日培養した。培養開始時（ｄａｙ０）及び培養後（ｄａｙ３）の細胞数の計測はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（プロメガ）を用いて、メーカーの推奨するプロトコールに基づき行った。以下の式より増殖阻害率を算出し、５０％阻害する被検化合物の濃度（ＧＩ５０（μＭ））を求めた。結果を表１に示す。【００８５】
１）Ｔｄａｙ３≧Ｃｄａｙ０の場合
増殖率（％）＝（Ｔｄａｙ３−Ｃｄａｙ０）／（Ｃｄａｙ３−Ｃｄａｙ０）×１００
Ｔ：被検化合物を添加したウェルの発光強度
Ｃ：被験化合物を添加しなかったウェルの発光強度
ｄａｙ０：被験化合物を添加する日
ｄａｙ３：評価日。【００８６】
２）Ｔｄａｙ３＜Ｃｄａｙ０の場合
増殖率（％）＝（Ｔｄａｙ３−Ｃｄａｙ０）／（Ｃｄａｙ０）×１００
Ｔ：被検化合物を添加したウェルの発光強度
Ｃ：被験化合物を添加しなかったウェルの発光強度
ｄａｙ０：被験化合物を添加する日
ｄａｙ３：評価日。【００８７】
【表１】
2018079310.tif 000006
【００８８】
また、以下の式より野生型ＥＧＦＲとエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲのＧＩ５０値の比を算出した。結果を図２に示す。【００８９】
ＧＩ５０  ｒａｔｉｏ＝ＧＩ５０（Ａ４３１）  ／  ＧＩ５０（Ｈ１９７５  ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ）
ＧＩ５０（Ａ４３１）：野生型ＥＧＦＲに対するＧＩ５０
ＧＩ５０（Ｈ１９７５  ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ）：エクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲに対するＧＩ５０。【００９０】
表１及び図２から明らかなとおり、化合物Ａはエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲを発現した細胞株に対して細胞増殖抑制効果を示し、変異選択性は比較化合物、ゲフェチニブ、エルロチニブ、アファチニブ及びオシメルチニブに比して高かった。【００９１】
試験例３
野生型及び変異型ＥＧＦＲ発現細胞株に対するリン酸化ＥＧＦＲ阻害活性の評価（１）
野生型ＥＧＦＲを過剰発現しているヒト類上皮癌細胞株であるＡ４３１細胞、遺伝子改変によりＤ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤ変異型ＥＧＦＲを発現しているヒト肺腺癌細胞株であるＨ１９７５−ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ細胞をそれぞれ培地中に懸濁させた。細胞懸濁液をそれぞれ６０ ｍｍ ディッシュに播種し，５％炭酸ガス含有の培養器中３７℃で１日培養した。化合物ＡをＤＭＳＯに溶解し、ＤＭＳＯを用いて被検化合物を終濃度の１０００倍の濃度になるように希釈した。被検化合物のＤＭＳＯ溶液を各細胞の懸濁に用いた培地で希釈し、これを細胞の培養ディッシュにＤＭＳＯの最終濃度が０．１％になるように加え、５％炭酸ガス含有の培養器中３７℃で６時間培養した。培養後、細胞を回収し、ペレットの状態で使用時まで−８０℃で保管した。ペレットにプロテアーゼインヒビターカクテル（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を加えたＲＩＰＡ  バッファー（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を添加し細胞内のタンパク質を抽出後、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてタンパク質濃度を測定し、各サンプルをリン酸化ＥＧＦＲ発現測定に適したタンパク質濃度にそれぞれ調整した。リン酸化ＥＧＦＲ発現測定はＳｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）アッセイシステム（プロテインシンプル）を用いて、メーカー推奨のプロトコールに基づき行った。１次抗体はＰｈｏｓｐｈｏ−ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｔｙｒ１０６８）＃３７７７（ＣＳＴ）を５０分の１に希釈し、測定に用いた。【００９２】
細胞ごとにタンパク質濃度（ｘ軸）とリン酸化ＥＧＦＲ発現量（ｙ軸）の検量線を作成し、その検量線を基に各サンプルのリン酸化ＥＧＦＲ発現量をタンパク質濃度に換算した。以下の式よりリン酸化ＥＧＦＲ阻害率を算出し、リン酸化ＥＧＦＲを５０％阻害することのできる被検化合物の濃度（ＩＣ５０（μＭ））を求めた。【００９３】
リン酸化ＥＧＦＲ阻害率（％）＝Ｔ  ／  Ｃ  ×１００
Ｔ：被検化合物を添加したサンプルのタンパク質濃度相当量
Ｃ：被検化合物を添加しなかったサンプルのタンパク質濃度相当量。【００９４】
また、以下の式より野生型ＥＧＦＲとエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲとの選択性を算出した。結果を表２に示す。【００９５】
ＩＣ５０比＝ＩＣ５０（Ａ４３１）  ／  ＩＣ５０（Ｈ１９７５  ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ）
ＩＣ５０（Ａ４３１）：野生型ＥＧＦＲに対するＩＣ５０
ＩＣ５０（Ｈ１９７５  ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ）：エクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲに対するＩＣ５０。【００９６】
【表２】
2018079310.tif 000007
【００９７】
表２から明らかなとおり、化合物Ａは、エクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲに対する選択的阻害活性を示した。【００９８】
試験例４
野生型及び変異型ＥＧＦＲ発現細胞株に対するリン酸化ＥＧＦＲ阻害活性の評価（２）
化合物の野生型ＥＧＦＲ及び変異型ＥＧＦＲの自己リン酸化阻害活性は、ヒトＥＧＦＲ遺伝子を導入したマウス線維芽細胞株であるＮＩＨ−３Ｔ３細胞を用いて行った。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は１０％ウシ新生児血清（ＮＢＣＳ）、１，５００ｍｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン／１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地（和光純薬）にて維持し、ヒトＥＧＦＲ遺伝子（ＷＴ，ｉｎｓＡＳＶ、ｉｎｓＳＶＤ、ｉｎｓＧ、ｉｎｓＮＰＨ、ｉｎｓＰＨ）をコードしたＰＢ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ＲＦＰ＋ＰｕｒｏベクターをＳｕｐｅｒ  ＰｉｇｇｙＢａｃＴｒａｎｓｐｏｓａｓｅ発現ベクターと共にＡｍａｘａ（商標）  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）  Ｋｉｔ  Ｒによる電気穿孔法により導入した後ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ）にて選択した。野生型ＥＧＦＲを発現したＮＩＨ−３Ｔ３細胞（以下、「ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲ＿ＷＴ」とも称する）は１％ＮＢＣＳ条件下かつ５０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ）存在下で増殖を示し、又エクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲを発現したＮＩＨ−３Ｔ３細胞（以下、「ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲｉｎｓＡＳＶ」、「ＮＩＨ３Ｔ３―ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ」、「ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲｉｎｓＧ」、「ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲｉｎｓＮＰＨ」、「ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲｉｎｓＰＨ」とも称する）は１％ＮＢＣＳ条件下かつＥＧＦ非存在下で増殖を示した。【００９９】
ＥＧＦＲ自己リン酸化阻害活性評価に際し、ヒトＥＧＦＲを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞をそれぞれ培地中に懸濁させた。細胞懸濁液をそれぞれ６０ mm ディッシュ又は６ウェル平底プレートに播種し，５％炭酸ガス含有の培養器中３７℃で１日培養した。化合物ＡをＤＭＳＯに溶解し、ＤＭＳＯを用いて被検化合物を終濃度の４００倍の濃度になるように希釈した。被検化合物のＤＭＳＯ溶液を各細胞の懸濁に用いた培地で希釈し、これを細胞の培養ディッシュにＤＭＳＯの最終濃度が０．２５％になるように加えた。更にＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲ＿ＷＴ細胞の培養ディッシュにはＥＧＦを終濃度５０ ｎｇ／ｍＬとなるよう加えた。全ての培養ディッシュを５％炭酸ガス含有の培養器中３７℃で６時間培養した。培養後、細胞を回収し、ペレットの状態で使用時まで−８０℃で保管した。ペレットにプロテアーゼインヒビターカクテル（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を加えたＲＩＰＡ  バッファー（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を添加し細胞内のタンパク質を抽出後、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてタンパク質濃度を測定し、各サンプルをリン酸化ＥＧＦＲ発現測定に適したタンパク質濃度にそれぞれ調整した。リン酸化ＥＧＦＲ発現測定はＳｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）  アッセイシステム（プロテインシンプル）を用いて、メーカー推奨のプロトコールに基づき行った。１次抗体はＰｈｏｓｐｈｏ−ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｔｙｒ１０６８）＃３７７７（ＣＳＴ）を５０分の１に希釈し、測定に用いた。【０１００】
細胞ごとにタンパク質濃度（ｘ軸）及びリン酸化ＥＧＦＲ発現量（ｙ軸）の検量線を作成し、その検量線を基に各サンプルのリン酸化ＥＧＦＲ発現量をタンパク質濃度に換算した。以下の式よりリン酸化ＥＧＦＲ阻害率を算出し、リン酸化ＥＧＦＲを５０％阻害することのできる被検化合物の濃度（ＩＣ５０（μＭ））を求めた。【０１０１】
リン酸化ＥＧＦＲ阻害率（％）＝Ｔ  ／  Ｃ  ×１００
Ｔ：被検化合物を添加したサンプルのタンパク質濃度相当量
Ｃ：被検化合物を添加しなかったサンプルのタンパク質濃度相当量。【０１０２】
また、以下の式より野生型ＥＧＦＲとエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲとの選択性を算出した。結果を表３に示す。【０１０３】
ＩＣ５０比＝ＩＣ５０（ＷＴ）  ／  ＩＣ５０（エクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲ）【０１０４】
【表３】
2018079310.tif 000008
【０１０５】
表３から明らかなとおり、化合物Ａは、種々のエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲに対する選択的阻害活性を示した。【０１０６】
上記試験例１から４の結果から明らかなように、化合物Ａ〜Ｄはエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲを発現した細胞株に対してＥＧＦＲ阻害効果を伴った細胞増殖抑制効果を示し、その効果及び変異選択性は比較化合物、ゲフェチニブ、エルロチニブアファチニブ及びオシメルチニブに比して高かった。【０１０７】
試験例５
Ｉｎ  ｖｉｖｏ薬効試験
変異型ＥＧＦＲ発現細胞株皮下移植モデルを用いた抗腫瘍効果の評価
ヒト変異型ＥＧＦＲを導入したＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲｉｎｓＡＳＶ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ細胞もしくはＨ１９７５−ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ細胞をヌードマウスの皮下に移植し、腫瘍が生着したヌードマウスの腫瘍体積が１００−２００ｍｍ３程度になった時点で、各群の腫瘍体積の平均が均一になるよう無作為層別化により１群５−６匹を割付、化合物Ａ及びアファチニブを１４日間、１日１回連日経口投与した。
投与用量は、アファチニブでは本試験の投与期間である１４日間での最大耐薬用量（投与期間中の体重減少が２０％未満となる最大投与用量）の２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを、化合物Ａでは２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（最大耐薬用量）を使用した。なお、最大耐薬用量は、アメリカ国立がん研究所（ＮＣＩ）による「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  Ｐｒｏｐｏｓａｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｒａｔｓ」に従って人道的観点から設定した。【０１０８】
各被験化合物投与における腫瘍の経時的増殖推移を比較するため、腫瘍の増殖割合として群分け時の腫瘍体積を１とした相対腫瘍体積（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｗｅｉｇｈｔ、以下、「ＲＴＶ」とも称する）を以下の式に従って算出した。また毒性の指標として経時的に体重を測定して群分け日に対する平均体重変化率（Ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｈａｎｇｅ，以下、「ＢＷＣ（％）」とも称する）を以下の式に従って算出した。各個体のＲＴＶ及びＢＷＣの平均値の推移を図３−８に示す。【０１０９】
ＲＴＶ＝（腫瘍体積計測日の腫瘍体積）／（群分け時の腫瘍体積）
ＢＷＣ（％）＝（体重測定日の体重）／（群分け時の体重）。【０１１０】
最終評価日の化合物Ａ投与群の平均ＲＴＶ値が、アファチニブの投与群の平均ＲＴＶ値より小さく、かつ統計的有意差（Ｓｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定、ｐ＜０．０５）を示した場合に、化合物Ａは、アファチニブよりも有意に有効であると判定し、図中に＊印で示す。なお、最終評価日のＴ／Ｃ（％）を以下の式に従って算出した。結果を表４に示す。【０１１１】
【表４】
2018079310.tif 000009
【０１１２】
図３−８及び表４に示す結果から明らかなように、化合物Ａはヌードマウスの皮下に移植したエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲ発現細胞株に対して顕著な抗腫瘍効果を示した。またその効果はアファチニブに比して高かく、その際にマウスでの重篤な体重減少、便異常、皮膚異常の症状は認められなかった。【０１１３】
試験例６
Ｉｎ  ｖｉｖｏ薬効試験
変異型ＥＧＦＲ発現細胞株皮下移植モデルを用いた抗腫瘍効果の評価
ヒト変異型ＥＧＦＲを導入したＮＩＨ３Ｔ３―ＥＧＦＲｉｎｓＮＰＨ細胞をヌードマウスの皮下に移植した。腫瘍が生着したヌードマウスの腫瘍体積が１００−２００ｍｍ３程度になった時点で、各群の腫瘍体積の平均が均一になるよう無作為層別化により１群６匹を割付、化合物Ａ及びアファチニブを１０日間１日１回連日経口投与した。【０１１４】
投与用量は、アファチニブでは最大耐薬用量（投与期間中の体重減少が２０％未満となる最大投与用量）の２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを、化合物Ａでは１００及び２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを使用した。なお、最大耐薬用量は、アメリカ国立がん研究所（ＮＣＩ）による「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  Ｐｒｏｐｏｓａｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｒａｔｓ」に従って人道的観点から設定した。【０１１５】
各被験化合物投与における腫瘍の経時的増殖推移の比較のため、各個体の腫瘍体積（以下、「ＴＶ」とも称する）を以下の式に従って算出した。また毒性の指標として経時的に体重を測定して群分け日に対する体重変化率（Ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｈａｎｇｅ，以下、「ＢＷＣ（％）」とも称する）を以下の式に従って算出した。各個体のＴＶ及びＢＷＣの平均値の推移を図９−１０に示す。【０１１６】
ＴＶ（ｍｍ３）＝（長径×短径２）／２
ＢＷＣ（％）＝（体重測定日の体重）／（群分け時の体重）。【０１１７】
抗腫瘍効果について、化合物Ａ投与群の最終投与翌日の平均ＴＶ値が、コントロール群の平均ＴＶ値より小さく、かつ統計的有意差（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定、ｐ＜０．０５）を示した場合に、化合物Ａは有効であると判定し、図中に＊印で示す。なお、最終評価日のＴ／Ｃ（％）を以下の式に従って算出した。結果を表５に示す。【０１１８】
Ｔ／Ｃ（％）＝（被験化合物投与群の腫瘍体積）／（コントロール群の腫瘍体積）。【０１１９】
【表５】
2018079310.tif 000010
【０１２０】
図９−１０及び表５から明らかなように、本発明化合物Ａはヌードマウス皮下に移植したエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲ発現細胞株に対して腫瘍増殖抑制又は腫瘍退縮を伴う顕著な抗腫瘍効果を示し、その際に評価動物での重篤な体重減少は認められなかった。【０１２１】
試験例７
変異型ＥＧＦＲ発現細胞株ラット皮下移植モデルを用いた抗腫瘍効果の評価
ヒト変異型ＥＧＦＲを導入したＨ１９７５―ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ細胞をヌードラットの皮下に移植した。腫瘍が生着したヌードラットの腫瘍体積が２００−５００ｍｍ３程度になった時点で、各群の腫瘍体積の平均が均一になるよう無作為層別化により１群６匹を割付、化合物Ａを１４日間１日１回連日経口投与した。【０１２２】
投与用量は本試験の投与期間である１４日間での最大耐薬用量（投与期間中の体重減少が２０％未満となる最大投与用量）未満の２０及び４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを使用した。なお、最大耐薬用量は、アメリカ国立がん研究所（ＮＣＩ）による「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  Ｐｒｏｐｏｓａｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｒａｔｓ」に従って人道的観点から設定した。
各被験化合物投与における腫瘍の経時的増殖推移の比較のため、各個体の腫瘍体積（以下、「ＴＶ」とも称する）を以下の式に従って算出した。また毒性の指標として経時的に体重を測定して群分け日に対する体重変化率（Ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｈａｎｇｅ，以下、「ＢＷＣ（％）」とも称する）を以下の式に従って算出した。各個体のＴＶ及びＢＷＣの平均値の推移を図１１−１２に示す。【０１２３】
ＴＶ（ｍｍ３）＝（長径×短径２）／２
ＢＷＣ（％）＝（体重測定日の体重）／（群分け時の体重）。【０１２４】
抗腫瘍効果について、化合物Ａ投与群の最終評価日の平均ＴＶ値が、コントロール群の平均ＴＶ値より小さく、かつ統計的有意差（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定、ｐ＜０．０５）を示した場合に、化合物Ａは有効であると判定し、図中に＊印で示す。なお、最終評価日のＴ／Ｃ（％）を以下の式に従って算出した。結果を表６に示す。【０１２５】
Ｔ／Ｃ（％）＝（被験化合物投与群の腫瘍体積）／（コントロール群の腫瘍体積）。【０１２６】
【表６】
2018079310.tif 000011
【０１２７】
図１１−１２及び表６から明らかなように、化合物Ａはヌードラット皮下に移植したエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲ発現細胞株に対して腫瘍増殖抑制又は腫瘍退縮を伴う顕著な抗腫瘍効果を示し、その際に評価動物での重篤な体重減少は認められなかった。【０１２８】
試験例８
変異型ＥＧＦＲ陽性肺癌患者由来腫瘍のマウス皮下移植モデルを用いた抗腫瘍効果の評価
Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ変異型ＥＧＦＲ陽性ヒト肺癌患者由来腫瘍であるＬＸＦ  ２４７８をヌードマウスの皮下に移植した。腫瘍が生着したヌードマウスの腫瘍体積が１００−２００ｍｍ３程度になった時点で、各群の腫瘍体積の平均が均一になるよう無作為層別化により１群８匹を割付、化合物Ａ及びアファチニブを２８日間１日１回連日経口投与した後、２週間の観察期間を設けた。【０１２９】
投与用量は、アファチニブでは最大耐薬用量（投与期間中の体重減少が２０％未満となる最大投与用量）の２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを、化合物Ａでは１００及び２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを使用した。なお、最大耐薬用量は、アメリカ国立がん研究所（ＮＣＩ）による「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  Ｐｒｏｐｏｓａｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｒａｔｓ」に従って人道的観点から設定した。【０１３０】
各被験化合物投与における腫瘍の経時的増殖推移の比較のため、腫瘍の増殖割合として群分け時の腫瘍体積を１とした相対腫瘍体積（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｗｅｉｇｈｔ、以下、「ＲＴＶ」とも称する）を以下の式に従って算出した。また毒性の指標として経時的に体重を測定して群分け日に対する体重変化率（Ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｈａｎｇｅ，以下、「ＢＷＣ（％）」とも称する）を以下の式に従って算出した。各個体のＲＴＶ及びＢＷＣの平均値の推移を図１３−１４に示す。【０１３１】
ＲＴＶ＝（腫瘍体積計測日の腫瘍体積）／（群分け時の腫瘍体積）
ＢＷＣ（％）＝（体重測定日の体重）／（群分け時の体重）。【０１３２】
投与最終日翌日（Ｄａｙ２８）の化合物Ａ投与群の平均ＲＴＶ値が、コントロール群の平均ＲＴＶ値より小さく、かつ統計的有意差（Dunnett検定、ｐ＜０．０５）を示した場合に、化合物Ａは有効であると判定し、図中に＊印で示す。なお、最終投与日翌日（Ｄａｙ２８）のＴ／Ｃ（％）を以下の式に従って算出した。結果を表７に示す。【０１３３】
Ｔ／Ｃ（％）＝（被験化合物投与群のＲＴＶ）／（コントロール群のＲＴＶ）。【０１３４】
【表７】
2018079310.tif 000012
【０１３５】
図１３−１４及び表７から明らかなように、化合物Ａはヌードマウスの皮下に移植したエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲ陽性肺癌患者由来腫瘍に対して腫瘍退縮を伴う顕著な抗腫瘍効果を示し、観察期間中もその効果は持続した。その際に評価動物での重篤な体重減少は認められなかった。【０１３６】
試験例９
変異型ＥＧＦＲ発現細胞株肺移植モデルを用いた延命効果の評価
ヒト変異型ＥＧＦＲ導入細胞株であるＨ１９７５−ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを導入したＨ１９７５―ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ―Ｌｕｃ株を樹立した。Ｈ１９７５―ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ―Ｌｕｃ細胞は、ＮＣＩ−Ｈ１９７５―ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ細胞にＬｕｃｉｆｅｒａｓｅをコードしたｐＪＴＩ（商標）ＦＡＳＴ  ＤＥＳＴベクターをｐＪＴＩ（商標）ＰｈｉＣ３１  Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ発現ベクターと共にＡｍａｘａ（商標）  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）  Ｋｉｔ  Ｒによる電気穿孔法により導入した後、ハイグロマイシンＢ（ナカライテスク株式会社）にて選択した。【０１３７】
延命効果の評価に際し、培養したＨ１９７５−ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ−Ｌｕｃ細胞の懸濁液にＭａｔｒｉｇｅｌを等量加えて細胞浮遊液を調製した後、ヌードマウスの右肺に移植した。移植後６日の時点で生存している全てのマウスにＬｕｃｉｆｅｒｉｎを尾静脈内投与し、各群の発光強度の平均値が均一になるよう無作為層別化により１群９匹を割付、化合物Ａ及びアファチニブを１日１回連日経口投与した。投与用量は、アファチニブでは最大耐薬用量（投与期間中の体重減少が２０％未満となる最大投与用量）の２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを、化合物Ａでは１００及び２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを使用した。なお、最大耐薬用量は、アメリカ国立がん研究所（ＮＣＩ）による「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  Ｐｒｏｐｏｓａｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｒａｔｓ」に従って人道的観点から設定した。【０１３８】
延命効果の評価として、移植後生存期間を観察し、個々のマウスについて生存日数を求めた。求めた生存日数から各群の生存日数中央値（Ｍｅｄｉａｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｔｉｍｅ、以下「ＭＳＴ」とも称す）を算出し、コントロール群と被験化合物投与群のＭＳＴを用いて以下の計算式により生存期間延長効果（Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｌｉｆｅ  ｓｐａｎ、以下「Ｉ．Ｌ．Ｓ．（％）」とも称す）を算出した。また毒性の指標として経時的に体重を測定して群分け日に対する体重変化率（Ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｈａｎｇｅ，以下、「ＢＷＣ（％）」とも称する）を以下の式に従って算出した。【０１３９】
Ｉ．Ｌ．Ｓ．（％）＝（Ｔ／Ｃ−１）×１００
Ｔ：被験化合物投与群のＭＳＴ
Ｃ：コントロール群のＭＳＴ。【０１４０】
ＢＷＣ（％）＝（体重測定日の体重）／（群分け時の体重）。【０１４１】
延命効果の判定として、被験化合物投与群のＭＳＴが、コントロール群のＭＳＴより大きく、かつ統計的有意差（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定、ｐ＜０．０５）を示した場合に、化合物Ａは有効であると判定し、結果を表８に示す。【０１４２】
【表８】
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【０１４３】
表８から明らかなように、化合物Ａはエクソン２０挿入変異型ＥＧＦＲ発現細胞株をヌードマウスの肺同所に移植したモデルにおいて顕著な延命作用を示した。一方、アファチニブには本モデルにおける延命作用は認められなかった。また、化合物Ａの投与による動物の重篤な体重減少は認められなかった。【０１４４】
試験例１０
移植腫瘍及びマウス皮膚組織におけるリン酸化ＥＧＦＲ阻害活性の評価
ヒト変異型ＥＧＦＲを導入したＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲｉｎｓＳＶＤ細胞をヌードマウスの皮下に移植し、腫瘍が生着したヌードマウスの腫瘍体積が２５０−５００ｍｍ３程度になった時点で、各群の腫瘍体積の平均が均一になるよう無作為層別化により１群３匹を割付け、化合物Ａ及びアファチニブを単回経口投与した。投与後、化合物Ａ及びアファチニブそれぞれの最高血中濃度到達時間付近である１時間及び３時間の時点で腫瘍並びに皮膚組織を採取した。採取した組織は液体窒素を用いて瞬間凍結し、使用時まで−８０℃で保管した。腫瘍及び皮膚組織はプロテアーゼインヒビターカクテル（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を加えたＲＩＰＡ  バッファー（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を添加した状態でホモジナイズして細胞内のタンパク質を抽出した後、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてタンパク質濃度を測定し、各サンプルをリン酸化ＥＧＦＲ発現測定に適したタンパク質濃度にそれぞれ調整した。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離してＰＤＶＦメンブレンに転写した。ブロッキングした後、一次抗体であるＰｈｏｓｐｈｏ−ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｔｙｒ１０６８）＃２２３４（ＣＳＴ）を０．１％  ＴＢＳ−Ｔバッファーで１０００分の１に希釈し、４℃で一晩反応させた。その後二次抗体であるＨＲＰ標識抗ラビット抗体＃ＮＡ９３４０Ｖ（ＧＥヘルスケア）を０．１％  ＴＢＳ−Ｔバッファーで調製した５％スキムミルク溶液に２５００分の１に希釈し、室温で４０分反応させた。ＥＣＬ−Ｐｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア）で反応させた後、ＬＡＳ−３０００（ＧＥヘルスケア）で検出した。【０１４５】
上記試験の結果から、化合物Ａは皮膚の野生型ＥＧＦＲに比し腫瘍の変異型ＥＧＦＲを選択的に阻害することが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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