(57)【要約】  本発明は、糖鎖リガンドがリンカーを介してオリゴヌクレオチドと結合した核酸複合体であって、糖鎖リガンドが、糖鎖リガンドの非還元末端にＯ結合マンノースを有する、核酸複合体、を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖リガンドがリンカーを介してオリゴヌクレオチドと結合した核酸複合体であって、糖鎖リガンドが、糖鎖リガンドの非還元末端にＯ結合マンノースを有する、核酸複合体。
【請求項２】
糖鎖リガンドが、ＣＤ２０９および／またはＣＤ２０６に結合親和性を示す構造を有する、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項３】
糖鎖リガンドが、Ｏ結合マンノースの１位でエーテル結合を介してシクロヘキサン骨格と結合している、請求項１または２に記載の核酸複合体。
【請求項４】
糖鎖リガンドが、下記構造を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【化１】
2018004004.tif 000172
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニル基、置換または非置換の炭素数３〜２０のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびＮＲ3からなる群から選択される基であり、
Ｒ3は、水素原子あるいは置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基である。）
【請求項５】
【化２】
2018004004.tif 000173
（式中、
Ｒ１’およびＲ２’は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニル基、置換または非置換の炭素数３〜２０のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Ｙ１’およびＹ２’は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびＮＲ3’からなる群から選択される基であり、
Ｒ3’は、水素原子あるいは置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基である。）
【請求項６】
Ｙ１およびＹ２またはＹ１’およびＹ２’がＮＨである、請求項４または５に記載の核酸複合体。
【請求項７】
Ｒ１およびＲ２またはＲ１’およびＲ２’が置換または非置換のアラルキル基である、請求項６に記載の核酸複合体。
【請求項８】
糖鎖リガンドが、下記構造で示される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【化３】
2018004004.tif 000174
（式中、
Ｒ１’’およびＲ２’’は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニル基、置換または非置換の炭素数３〜２０のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Ｙ１’’およびＹ２’’は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびＮＲ３’’からなる群から選択される基であり、
Ｒ３’’は、水素原子あるいは置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基である。）
【請求項９】
糖鎖リガンドが、下記構造で示される、請求項８に記載の核酸複合体。
【化４】
2018004004.tif 000175
（式中、
Ｒ１’’’およびＲ２’’’は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニル基、置換または非置換の炭素数３〜２０のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Ｙ１’ ’’およびＹ２’ ’’は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびＮＲ３’’からなる群から選択される基であり、
Ｒ３’ ’’は、水素原子あるいは置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基である。）
【請求項１０】
糖鎖リガンドを２〜８個有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【請求項１１】
リンカーが、下記構造のいずれかの構造を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【化５】
2018004004.tif 000176
（式中、
Ｘ１は、ＣＨまたは窒素原子である。
Ｘ２〜Ｘ４は、それぞれ独立して、ＣＨまたは窒素原子である。）
【請求項１２】
リンカーが、下記構造を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【化６】
2018004004.tif 000177
【請求項１３】
リンカーが、下記構造を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【化７】
2018004004.tif 000178
（式中、
ｎ１は、１〜１００の整数である。）
【請求項１４】
リンカーが、下記構造のいずれかの構造を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【化８】
2018004004.tif 000179
【化９】
2018004004.tif 000180
【化１０】
2018004004.tif 000181
【化１１】
2018004004.tif 000182
【化１２】
2018004004.tif 000183
【化１３】
2018004004.tif 000184
【化１４】
2018004004.tif 000185
【化１５】
2018004004.tif 000186
【化１６】
2018004004.tif 000187
【化１７】
2018004004.tif 000188
【化１８】
2018004004.tif 000189
【化１９】
2018004004.tif 000190
（式中、
ｎ２およびｎ３は、それぞれ独立して、１〜１００の整数である。）
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸複合体を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
細胞内に導入するための、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記細胞が樹状細胞またはマクロファージである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
静脈内投与または皮下投与される、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸複合体または請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療または予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸複合体および該核酸複合体を含む医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸医薬として、アンチセンス、デコイ核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびａｎｔｉｍｉＲＮＡなどが知られている。核酸医薬は、細胞内のあらゆる遺伝子を制御できる汎用性の高さから、今まで治療困難とされてきたさまざまな疾患への臨床応用が期待されている。
また、核酸医薬は、細胞内における標的選択性と活性の高さから抗体、低分子医薬に次ぐ、次世代医薬として期待されている。
しかしながら、核酸医薬は、標的組織への送達が困難であることが問題点として挙げられる。【０００３】
インビボにおける効果的な核酸医薬の送達法の１つとして、標的化化合物と核酸との核酸複合体（コンジュゲート核酸）を用いることが報告されている。標的化化合物としては、細胞外に発現する受容体に結合可能なリガンドが挙げられる。その中でも特に、肝細胞に極めて高発現しているアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合可能であるリガンドとしてＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等を利用した核酸複合体が複数報告されている。近年では、これらのリガンドとｓｉＲＮＡ類とを結合した核酸複合体が肝細胞に効率的に送達されることが報告されている（非特許文献１）。【０００４】
標的化化合物とオリゴヌクレオチドの複合体として、特許文献１および２には、例えば、以下に示す核酸複合体が開示されている。
【化１】
2018004004.tif 000002
（式中、Ａｃはアセチル基を表す。以下、本明細書において同様である。）
また、特許文献３には、特許文献１および２と同様の糖リガンド−テザーユニットを有する以下の構造を有する核酸複合体が開示されている。
【化２】
2018004004.tif 000003
また、特許文献４には、糖リガンド−テザーユニットとして、以下に示す構造を有する核酸複合体が開示されている。
【化３】
2018004004.tif 000004
【０００５】
特許文献１〜４に報告されているような従来の核酸複合体は、標的臓器としては肝臓がほとんどであり、その適用範囲は限定されている。したがって、肝臓以外の標的臓器として、細胞に効果を示す核酸複合体の開発が強く望まれている。
ＣＤ２０９（別名  ＤＣ−ＳＩＧＮ，  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−３−Ｇｒａｂｂｉｎｇ  Ｎｏｎｉｎｔｅｇｒｉｎ）およびＣＤ２０６（別名  ＭＲ１，  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｍａｎｎｏｓｅ  Ｒｃｅｐｔｏｒ  １）等のＣ型レクチンは、樹状細胞、マクロファージ、好中球等の免疫系細胞に発現しており、その機能の一つとしてウイルスや細菌等の外来異物の捕捉が報告されている。ＣＤ２０６は、マクロファージや樹状細胞の表面に発現し、ＣＤ２０９は皮膚や粘膜組織上の樹状細胞、扁桃、リンパ節、脾臓といったリンパ組織の樹状細胞の表面に発現しており、両者ともにＨＩＶ等のウイルスの補足に関与することが知られている（非特許文献２，３）。
ＣＤ２０６およびＣＤ２０９を利用した送達技術として、特許文献５には、マンノースやフコース等の糖分子と抗原のコンジュゲートを免疫誘導に利用することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００９／０７３８０９号
【特許文献２】国際公開第２０１３／０７５０３５号
【特許文献３】国際公開第２０１５／１０５０８３号
【特許文献４】国際公開第２０１４／１７９６２０号
【特許文献５】国際公開第２００６／０９３５２４号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ジャーナルオブアメリカンケミカルソサイエティー  （Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ），２０１４年，第１３６巻，ｐ１６９５８?１６９６１
【非特許文献２】ネイチャーレビューズイミュノロジー  （Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），２００９年，第９巻，ｐ４６５?４７９
【非特許文献３】ネイチャーレビューズイミュノロジー  （Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），２００３年，第３巻，ｐ６９７?７０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、新規核酸複合体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の（１）〜（２２）に関する。
（１）
糖鎖リガンドがリンカーを介してオリゴヌクレオチドと結合した核酸複合体であって、糖鎖リガンドが、糖鎖リガンドの非還元末端にＯ結合マンノースを有する、核酸複合体。
（２）
糖鎖リガンドが、ＣＤ２０９および／またはＣＤ２０６に結合親和性を示す構造を有する、（１）に記載の核酸複合体。
（３）
糖鎖リガンドが、Ｏ結合マンノースの１位でエーテル結合を介してシクロヘキサン骨格と結合している、（１）または（２）に記載の核酸複合体。
（４）
糖鎖リガンドが、下記構造を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の核酸複合体。
【化４】
2018004004.tif 000005
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニル基、置換または非置換の炭素数３〜２０のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびＮＲ3からなる群から選択される基であり、
Ｒ3は、水素原子あるいは置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基である。）
（５）
糖鎖リガンドが、下記構造で示される、（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸複合体。
【化５】
2018004004.tif 000006
（式中、
Ｒ１’およびＲ２’は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニル基、置換または非置換の炭素数３〜２０のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Ｙ１’およびＹ２’は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびＮＲ3’からなる群から選択される基であり、
Ｒ3’は、水素原子あるいは置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基である。）
（６）
Ｙ１およびＹ２またはＹ１’およびＹ２’がＮＨである、（４）または（５）に記載の核酸複合体。
（７）
Ｒ１およびＲ２、またはＲ１’およびＲ２’が置換または非置換のアラルキル基である、（６）に記載の核酸複合体。
（８）
糖鎖リガンドが、下記構造で示される、（１）〜（７）のいずれかに記載の核酸複合体。
【化６】
2018004004.tif 000007
（式中、
Ｒ１’’およびＲ２’’は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニル基、置換または非置換の炭素数３〜２０のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Ｙ１’’およびＹ２’’は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびＮＲ３’’からなる群から選択される基であり、
Ｒ３’’は、水素原子あるいは置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基である。）
（９）
糖鎖リガンドが、下記構造で示される、（８）に記載の核酸複合体。
【化７】
2018004004.tif 000008
（式中、
Ｒ１’’’およびＲ２’’’は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニル基、置換または非置換の炭素数３〜２０のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Ｙ１’ ’’およびＹ２’ ’’は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびＮＲ３’’からなる群から選択される基であり、
Ｒ３’ ’’は、水素原子あるいは置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基である。）
（１０）
糖鎖リガンドを２〜８個有する、（１）〜（９）のいずれかに記載の核酸複合体。
（１１）
リンカーが、下記構造のいずれかの構造を有する、（１）〜（１０）のいずれかに記載の核酸複合体。
【化８】
2018004004.tif 000009
（式中、
Ｘ１は、ＣＨまたは窒素原子である。
Ｘ２〜Ｘ４は、それぞれ独立して、ＣＨまたは窒素原子である。）
（１２）
リンカーが、下記構造を有する、（１）〜（１１）のいずれかに記載の核酸複合体。
【化９】
2018004004.tif 000010
（１３）
リンカーが、下記構造のいずれかの構造を有する、（１）〜（１２）のいずれかに記載の核酸複合体。
【化１０】
2018004004.tif 000011
（１４）
リンカーが、下記構造を有する、（１）〜（１３）のいずれかに記載の核酸複合体。
【化１１】
2018004004.tif 000012
（式中、
ｎ１は、１〜１００の整数である。）
（１５）
リンカーが、下記構造のいずれかの構造を有する、（１）〜（１３）のいずれかに記載の核酸複合体。
【化１２】
2018004004.tif 000013
【化１３】
2018004004.tif 000014
【化１４】
2018004004.tif 000015
【化１５】
2018004004.tif 000016
【化１６】
2018004004.tif 000017
【化１７】
2018004004.tif 000018
【化１８】
2018004004.tif 000019
【化１９】
2018004004.tif 000020
【化２０】
2018004004.tif 000021
【化２１】
2018004004.tif 000022
【化２２】
2018004004.tif 000023
【化２３】
2018004004.tif 000024
（式中、
ｎ２およびｎ３は、それぞれ独立して、１〜１００の整数である。）
（１６）
前記オリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、（１）〜（１５）のいずれかに記載の核酸複合体。
（１７）
（１）〜（１６）のいずれかに記載の核酸複合体を含む、医薬組成物。
（１８）
細胞内に導入するための、（１７）に記載の医薬組成物。
（１９）
前記細胞が樹状細胞またはマクロファージである、（１８）に記載の医薬組成物。
（２０）
静脈内投与または皮下投与される、（１７）〜（１９）のいずれかに記載の医薬組成物。
（２１）
（１）〜（１６）のいずれかに記載の核酸複合体または（１７）〜（２０）のいずれかに記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療または予防方法。
（２２）
前記患者が哺乳動物である、（２１）に記載の治療または予防方法。
【発明の効果】
【００１０】
例えば本発明の核酸複合体を含む医薬組成物を、哺乳動物に投与して、生体内において、各種関連疾患を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】試験例１のＣＤ４５  アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）によるヒト単球由来樹状細胞のｍＲＮＡノックダウン試験の結果を示す。
【図２】試験例２のＢｅｔａ−２  Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（Ｂ２Ｍ）に対するＡＳＯを用いたヒト単球由来樹状細胞のタンパク質ノックダウン試験の結果を示す。
【図３】試験例３のＢ２Ｍ−ｓｉＲＮＡを用いたヒト単球由来樹状細胞のタンパク質ノックダウン試験の結果を示す。
【図４】試験例４のＢ２Ｍ−ｓｉＲＮＡを用いたヒト単球由来樹状細胞のｍＲＮＡノックダウン試験の結果を示す。
【図５】試験例５のＢ２Ｍ−ｓｉＲＮＡを用いたヒト単球由来樹状細胞のタンパク質ノックダウン試験の結果を示す。
【図６】試験例６のＢ２Ｍ−ｓｉＲＮＡを用いたヒト単球由来樹状細胞のタンパク質ノックダウン試験の結果を示す。
【図７】試験例７のＢ２Ｍ−ｓｉＲＮＡを用いたヒト単球由来樹状細胞のタンパク質ノックダウン試験の結果を示す。
【図８】試験例８のＢ２Ｍ−ｓｉＲＮＡを用いたヒト単球由来樹状細胞のタンパク質ノックダウン試験の結果を示す。
【図９】試験例９のＢ２Ｍ−ｓｉＲＮＡを用いたヒト単球由来樹状細胞のタンパク質ノックダウン試験の結果を示す。
【図１０】試験例１０のＢ２Ｍ−ｓｉＲＮＡを用いたヒト単球由来樹状細胞のタンパク質ノックダウン試験の結果を示す。
【図１１】試験例１１のＢ２Ｍ−ｓｉＲＮＡを用いた成熟ヒト単球由来樹状細胞のタンパク質ノックダウン試験の結果を示す。
【図１２】試験例１２のＨＰＲＴ１−ｓｉＲＮＡを用いた成熟ヒト単球由来樹状細胞のタンパク質ノックダウン試験の結果を示す。
【図１３】試験例１３のＢ２Ｍ−ｓｉＲＮＡを用いたヒト単球由来マクロファージ細胞のタンパク質ノックダウン試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の核酸複合体は、糖鎖リガンドがリンカーを介してオリゴヌクレオチドと結合した核酸複合体であって、糖鎖リガンドが、糖鎖リガンドの非還元末端にＯ結合マンノースを有する、核酸複合体である。
核酸複合体は、糖鎖リガンドと、リンカーと、オリゴヌクレオチドとをその分子内構成要素として有し、糖鎖リガンドと、オリゴヌクレオチドとが、リンカーを介して結合することにより連結する。糖鎖リガンド又はオリゴヌクレオチドと、リンカーとの結合は、好ましくは共有結合である。
本発明の核酸複合体は、糖鎖リガンド―リンカー―オリゴヌクレオチドという構造を有する。
【００１３】
本発明においては、糖鎖リガンドが、非還元末端にＯ結合マンノースを有していれば、リンカー及びオリゴヌクレオチドは、公知の構造を採用することができる。
すなわち、糖鎖リガンド、リンカー及びオリゴヌクレオチドの各構造を有する従来公知の核酸複合体において、糖鎖リガンドを本発明における非還元末端にＯ結合マンノースを有する糖鎖リガンドとした核酸複合体は、本発明の範囲内となる。
【００１４】
本発明において、糖鎖リガンドは、非還元末端にＯ結合マンノースを有する。
Ｏ結合マンノースの構造としては、下記構造が挙げられる。
【化２４】
2018004004.tif 000025
マンノースのＯ結合は、α結合であってもよく、β結合であってもよいが、好ましくは、マンノースのＯ結合は、α結合である。
【００１５】
通常、糖鎖は、非還元末端と、還元末端を有し、本発明においては、非還元末端がＯ結合マンノースである。
非還元末端がＯ結合マンノースであるとは、糖鎖リガンドの最外部において、Ｏ結合マンノースを有し、他の構造をさらに有していないことを意味する。
【００１６】
糖鎖リガンドは、標的細胞に発現している受容体に結合可能な糖類（単糖、二糖、三糖および多糖など）に由来する基を意味し、非天然構造を含むものが挙げられる。
糖類のユニットである単糖としては、天然に存在するものとして、例えば、アロース、アルトース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリスルロース、フルクトース、フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、ガラクトサミニトール、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース−６−リン酸、グロース、グリセルアルデヒド、グリセロマンノ−ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース−６−リン酸、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロース、およびキシルロース等が挙げられ、これら単糖がグリコシド結合により結合し糖類として天然に存在している。
本発明においては、糖鎖リガンドは、非天然構造を含むものが好ましく、非天然構造として上記単糖以外の構造を含むことを意味する。
糖類における各単糖は、Ｄ体またはＬ体であってもよく、Ｄ体とＬ体の任意割合による混合物であってもよい。
糖類は、デオキシ糖（アルコールヒドロキシ基を水素原子に置換したもの）、アミノ糖（アルコールヒドロキシ基をアミノ基に置換したもの）、チオ糖（アルコールヒドロキシ基をチオールに置換したもの、またはＣ＝ＯをＣ＝Ｓに置換したもの、または環酸素を硫黄に置換したもの）、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖（環炭素を窒素に置換したもの）、イミノ糖（環酸素を窒素に置換したもの）、ホスファノ糖（環酸素をリンに置換したもの）、ホスファ糖（環炭素をリンに置換したもの）、Ｃ−置換単糖（非末端炭素原子における水素原子を炭素原子で置換したもの）、不飽和単糖、アルジトール（カルボニル基をＣＨＯＨ基で置換したもの）、アルドン酸（アルデヒド基をカルボキシ基に置換したもの）、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸などを含んでいてもよい。
アミノ糖としては、糖類におけるアミノ単糖として、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノボサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトースジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、フォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン（ｋａｎｓｏｓａｍｉｎｅ）、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン（ｐｕｒｐｕｒｏｓａｍｉｎｅ）、ロドサミンなどが挙げられる。また、アミノ糖のアミノ基は、アセチル基などで置換されていてもよい。
【００１７】
本発明において、糖鎖リガンドが、ＣＤ２０９および／またはＣＤ２０６に結合親和性を示す構造を有することが好ましい。
本発明においては、非還元末端がＯ結合マンノースであることにより、ＣＤ２０９および／またはＣＤ２０６に結合親和性を示すこととなる。
糖鎖リガンドが、ＣＤ２０９および／またはＣＤ２０６に結合親和性を示すことにより、樹状細胞またはマクロファージの細胞表面に発現する受容体に核酸複合体が結合し、当該細胞にオリゴヌクレオチドを核酸医薬として送達し得る。
【００１８】
糖鎖リガンドは、マンノースの１位でエーテル結合を介してシクロヘキサン骨格と結合した構造を有することが好ましい。
シクロヘキサン骨格は、糖鎖リガンドにおける非天然構造として存在し、マンノースの１位でエーテル結合を介してシクロヘキサン骨格と結合した構造としては、下記構造を有することが挙げられる。
【化２５】
2018004004.tif 000026
なお、シクロヘキサン環は、置換基を有していてもよく、マンノースのシクロヘキサンとのグリコシド結合は、α結合であってもよく、β結合であってもよい。
【００１９】
マンノースの１位でエーテル結合を介してシクロヘキサン骨格と結合した構造としては、例えば、下記構造が好ましい。
【化２６】
2018004004.tif 000027
式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニル基、置換または非置換の炭素数３〜２０のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびＮＲ3からなる群から選択される基であり、
Ｒ3は、水素原子または置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基である。
本明細書において、それぞれ独立してとは、各基が、同時に規定される他の基と独立して選択肢の中から選択される基であることを意味し、同一または異なっていてもよい。
【００２０】
置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、イソプロピル、ブチル、シクロブチル、イソブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ペンタデシル、イコシルが挙げられるが特に限定されない。
【００２１】
置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基における置換基としては、例えば、ヒドロキシ、ハロゲン、メルカプト、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルバモイル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３アルキルチオ、アミノ、Ｃ１−Ｃ３モノアルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ３ジアルキルアミノからなる群から選ばれる置換基が挙げられる。
置換基の数は、例えば、１〜３であり、複数の置換基を有する場合、複数の置換基は、同一または異なっていてもよい。
本明細書において、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニル基、置換または非置換の炭素数３〜２０のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、お置換または非置換のアラルキル基における置換基について、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基における置換基と同義である。
【００２２】
置換または非置換の炭素数２〜２０のアルケニル基としては、置換または非置換の炭素数２〜２０のアルキル基において１以上の２重結合を含む基であればよい。置換または非置換の炭素数３〜２０のアルキニル基としては、置換または非置換の炭素数３〜２０のアルキル基において１以上の３重結合を含む基であればよい。
置換または非置換のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基等の芳香環が挙げられるが、特に限定されない。
置換または非置換のヘテロアリール基としては、窒素原子、酸素原子または硫黄原子を環内に有する複素芳香環を意味し、例えば、１〜３個の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有する５〜６員の芳香環が挙げられる。
置換または非置換のヘテロ脂環基としては、窒素原子、酸素原子または硫黄原子を環内に有する複素脂肪族環を意味し、例えば、１〜３個の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有する５〜６員の脂肪族環が挙げられる。
置換または非置換のアラルキル基としては、置換または非置換のアルキル基が、置換または非置換のアリール基で置換された基であればよく、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基において置換基として１以上のアリール基を含む基が挙げられ、具体的には、置換または非置換のベンジル基もしくはフェネチル基等が挙げられる。
【００２３】
Ｙ１およびＹ２は酸素原子であることが好ましく、ＮＨであることも好ましい。
【００２４】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、置換または非置換の炭素数１〜２０のアルキル基であることが好ましく、中でも、Ｒ１およびＲ２がメチル基であることが好ましい。Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、置換または非置換のアラルキル基であることも好ましく、Ｙ１およびＹ２がＮＨであり、かつ、Ｒ１およびＲ２が置換または非置換のアラルキル基であることがより好ましく、Ｙ１およびＹ２がＮＨであり、かつ、Ｒ１およびＲ２が４-ヒドロキシベンジル基、４−（ヒドロキシメチル）ベンジル基または４−（メトキシメチル）ベンジル基であることがさらにより好ましい。
【００２５】
マンノースの１位でエーテル結合を介してシクロヘキサン骨格と結合した構造における具体的構造としては、特に限定されるものではないが、例えば、下記構造を有する。
【化２７】
2018004004.tif 000028
式中、
Ｒ１’、Ｒ２’、Ｙ１’、Ｙ２’およびＲ3’は、それぞれ対応する、Ｒ１、Ｒ２、Ｙ１、Ｙ２およびＲ3と同義である。
【００２６】
上述した構造を有する糖鎖リガンドとして具体的には、下記構造のいずれかの構造で示される糖鎖リガンドが例示できる。
【化２８】
2018004004.tif 000029
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｙ１およびＹ２は、上記と同義であり、
Ｒ１’’、Ｒ２’’、Ｙ１’’、Ｙ２’’およびＲ３’’は、それぞれ対応する、Ｒ１、Ｒ２、Ｙ１、Ｙ２およびＲ3と同義であり、好ましい置換基の組み合わせも同義である。
【００２７】
上述した構造を有する糖鎖リガンドとしてより具体的には、下記構造のいずれかの構造で示される糖鎖リガンドが例示できる。
【化２９】
2018004004.tif 000030
式中、
Ｒ1’、Ｒ２’、Ｙ1’およびＹ２’は、前記と同義であり、
Ｒ1’’’、Ｒ２’’’、Ｙ1’’’、Ｙ２’’’およびＲ３’’’は、それぞれ対応する、Ｒ１、Ｒ２、Ｙ１、Ｙ２およびＲ3と同義であり、好ましい置換基の組み合わせも同義である。
【００２８】
本発明における糖鎖リガンド構造は、国際公開第２０１１／０００７２１号、モレキュラーダイバーシティー  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ），２０１１年，大１５巻，ｐ３４７−３６０、ケミストリー  エー・ヨーロピアン・ジャーナル（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ），２０１３年，第１９巻，ｐ４７８６−４７９７およびエーシーエス・ケミカル・バイオロジー  （ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），２０１０年，第５巻，ｐ３０１−３１２を参考に製造することができる。
【００２９】
本発明における「オリゴヌクレオチド」としては、核酸医薬として用いることが知られたオリゴヌクレオチドを用いることができる。本発明において、核酸医薬とは、アンチセンス、デコイ核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびａｎｔｉｍｉＲＮＡなどとして用いられるヌクレオチドを意味する。
本発明においては、リンカーとオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドを構成する糖部分の３’位または５’位を介してリンカーと結合するだけでなく、ヌクレオチドを構成する塩基部分を介してリンカーと結合していてもよい。本発明においては、オリゴヌクレオチドは、リンカーとオリゴヌクレオチドを結合する構造を有する基として理解されてよく、例えば、オリゴヌクレオチドが、−Ｏ−Ｐ（Ｚ）（Ｚ’）Ｏ−（式中、ＺおよびＺ’は、それぞれ独立して、酸素原子またはイオウ原子である。）を介してリンカーと結合している場合、Ｘとしてのオリゴヌクレオチドとしては、−Ｏ−Ｐ（Ｚ）（Ｚ’）Ｏ−オリゴヌクレオチドとして理解されてもよい。
また、オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドであってもよい。
核酸複合体におけるリンカーとオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドなどのヌクレオチドで結合してもよいが、例えばオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端で結合する。オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合には、リンカーは、二本鎖核酸を構成するセンス鎖の３’末端または５’末端と結合していることが好ましいが、当該結合に限定されるものではない。
本発明において、標的ｍＲＮＡに対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンスヌクレオチドと称し、アンチセンスヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンスヌクレオチドとも称する。
【００３０】
本発明で用いられる核酸複合体を構成するオリゴヌクレオチドは、哺乳動物細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を制御する能力を有するものであればいかなる形状でもよく、一本鎖のオリゴヌクレオチドまたは二本鎖のオリゴヌクレオチドが好適に用いられる。
【００３１】
オリゴヌクレオチドとしては、ヌクレオチドまたはヌクレオチドと同等の機能を有する分子の重合体であればいかなる分子であってもよく、例えばデオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、リボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの重合体であるキメラ核酸が挙げられる。また、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびキメラ核酸において、少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチドやリボヌクレオチド等のヌクレオチドがヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体であってもよい。なお、ＲＮＡ中のウラシル（Ｕ）は、ＤＮＡにおいてはチミン（Ｔ）に一義的に読み替えられる。
ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えば、ヌクレオチドに修飾を施したヌクレオチド誘導体等が挙げられ、例えばＤＮＡまたはＲＮＡと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、または可視化させるために、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
【００３２】
ヌクレオチド誘導体としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド等、糖部、リン酸ジエステル結合および塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等が挙げられる。
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、２’−修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
２’−修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの２’−ＯＨ基がＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群（Ｒはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数１〜６のアルキルであり、Ｒ’はアルキレン、好ましくは炭素数１〜６のアルキレンである）から選択される置換基で置換された２’−修飾ヌクレオチドが挙げられ、２’−修飾としては、好ましくはＦ、メトキシ基およびエトキシ基での置換が挙げられる。また、２−（ｍｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ基、３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｏｘｙ基、２−［（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｏｘｙ］ｅｔｈｏｘｙ基、３−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｏｘｙ基、２−［２−（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ］ｅｔｈｏｘｙ基、２−（ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｏｘｏｅｔｈｏｘｙ基、２−（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ基および２−ｃｙａｎｏｅｔｈｏｘｙ  基からなる群から選択される置換基で置換された２’−修飾ヌクレオチド等も挙げられる。
また、糖部修飾ヌクレオチドとしては、糖部に架橋構造を導入することにより２つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）（ＢＮＡ）も好適に用いられる。具体的には、２´位の酸素原子と４´位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）  ［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ３８，  ８７３５  （１９９７）およびＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ５４，  ３６０７  （１９９８）］、エチレン架橋構造型人工核酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＥＮＡ）［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３２，  ｅ１７５  （２００４）］、Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ｅｔｈｙｌ  （ｃＥｔ）［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５，  １５６９  （２０１０）］、Ａｍｉｄｏ−Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  （ＡｍＮＡ）［Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  １３，  ２５１３  （２０１２）］および２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｓｐｉｒｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  （ｓｃｐＢＮＡ）［Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ５１，  ９７３７  （２０１５）］等が挙げられる。
さらにペプチド核酸（ＰＮＡ）［Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．，  ３２，  ６２４  （１９９９）］、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）［Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２３，  ４６５３  （２００１）］、ペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）［Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２２，  ６９００  （２０００）］等も糖部修飾ヌクレオチドとして挙げられる。
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等が挙げられ、好ましくはリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチドが挙げられる。
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数１〜６のアルキル基、ハロゲン基で置換されたもの、メチル基が水素原子、ヒドロキシメチル基、炭素数２〜６のアルキル基で置換されたもの、アミノ基が炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルカノイル基、オキソ基、ヒドロキシ基等に置換されたものが挙げられる。なお、シトシン（Ｃ）の代わりに５−メチルシトシン（５−ｍＣ）を塩基修飾ヌクレオチドとして用いることも、本発明の好ましい形態の一つである。
ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に、ペプチド、蛋白質、糖、脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素など、別の化学物質を、直接またはリンカーを介して付加したものもあげられ、具体的には、５’−ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Ｃｙ５付加ヌクレオチド誘導体、Ｃｙ３付加ヌクレオチド誘導体、６−ＦＡＭ付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等があげられる。
ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
オリゴヌクレオチドは、その分子中の一部あるいは全部の原子が質量数の異なる原子（同位体）で置換されたものも包含する。
【００３３】
本明細書において「相補」とは、２つの塩基間で塩基対合をし得る関係を意味し、例えば、アデニンとチミンまたはウラシルとの関係、並びにグアニンとシトシンとの関係のように緩やかな水素結合を介して、二重鎖領域全体として２重螺旋構造をとるものをいう。
本明細書において「相補的」とは、２つのヌクレオチド配列が完全に相補する場合だけでなく、ヌクレオチド配列間で０〜３０％、０〜２０％または０〜１０％のミスマッチ塩基を有することができ、例えば、標的ｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの部分塩基配列と完全に相補する塩基配列において、１つまたは複数の塩基の置換を含んでよいことを意味する。具体的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の標的配列に対して１〜８個、好ましくは１〜６個、１〜４個、１〜３個、特に２個または１個のミスマッチ塩基を有していてもよい。
また、「相補的」とは、一方のヌクレオチド配列が、他方のヌクレオチド配列と完全に相補する塩基配列において、１つまたは複数の塩基が付加および／または欠失した配列である場合を包含する。例えば、標的ｍＲＮＡとアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける塩基の付加および／または欠失により、アンチセンス鎖および／または標的ｍＲＮＡ領域に１個または２個のバルジ塩基を有してもよい。
ただし、以下、「相補的」と記載する箇所において、「相補」の意味も包含する形で記載する。
【００３４】
本発明で用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、標的遺伝子をコードするＤＮＡ、標的遺伝子をコードするＤＮＡから転写されるｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ前駆体またはｍｉｃｒｏＲＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドであり、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とするＤＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡと二本鎖を形成することによりＤＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ前駆体またはｍｉｃｒｏＲＮＡの働きを抑制する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドには、標的となるＤＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ前駆体またはｍｉｃｒｏＲＮＡと完全に相補的であるもののみならず、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ前駆体またはｍｉｃｒｏＲＮＡとストリジェントな条件でハイブリダイズできる限り、１もしくは数個のミスマッチが存在するものも含まれる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとは、標的遺伝子にハイブリダイズする核酸であれば、ヘアピンオリゴマー、環状オリゴマーの形態中に導入されてもよく、内部または末端のバルジまたはループなどの構造要素を含有してもよい。
【００３５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、８〜８０塩基であり、８〜３０塩基が好ましい。例えば、８〜２０塩基、１０〜２０塩基、１３〜２０塩基、１３〜１６塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基であり得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内に導入されると、相補的なｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡと結合し蛋白質に翻訳されるのを立体的に阻害して、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
またアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内において、相補的なｍｉｃｒｏＲＮＡ前駆体またはｍｉｃｒｏＲＮＡと結合し、ｍｉｃｒｏＲＮＡの機能を立体的に阻害することもできる。
またアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内において、相補的なｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ前駆体と結合し、ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ前駆体を切断することもある。このような例として、ＲＮＡとＤＮＡの二重鎖のＲＮＡ鎖を切断するエンドヌクレアーゼであるＲＮａｓｅＨを介した作用が知られている。本発明の細胞内のアンチセンスオリゴヌクレオチドがｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ前駆体と二重鎖を形成するとＲＮａｓｅＨに認識され、相補的なｍＲＮＡ鎖を酵素的に分解することができる。
ＲＮａｓｅＨによるｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ前駆体の切断を誘導するには、４〜８０個の連続したＤＮＡ領域を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。この場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは０〜８０％の糖部修飾ヌクレオチドを持つことが好ましく、１０〜６０％がより好ましく、２０〜５０％がさらに好ましい。また、糖部修飾ヌクレオチドを持つ場合の連続したＤＮＡ領域は、４〜２０個がより好ましく、４〜１５個がさらに好ましく、５〜１０個が最も好ましい。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける糖部修飾ヌクレオチドの位置は、５’末端近傍および／または３’末端近傍に配置することが好ましく、５’端から全長の長さの２５％以内の位置および／または３’端から全長の長さの２５％以内の位置に配置することがより好ましい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的なオリゴ核酸と二重鎖を形成させ、二重鎖核酸として細胞内に導入することで標的遺伝子の発現抑制を誘導することもできる（国際公開第２００５／１１３５７１号を参照）。この場合の二重鎖核酸をリガンドで修飾する位置は、相補的なオリゴ核酸の５’末端または３’末端が好ましい。
【００３６】
本発明で用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のプロモーター配列等に対して相補的な塩基配列を用いることで、標的遺伝子の発現を亢進させることもできる（国際公開第２０１３／１７３６０１号および国際公開第２０１３／１７３６３７号を参照）。
【００３７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを製造する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等が挙げられる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法、ＣＥＭ法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３５，  ３２８７  （２００７）］等を挙げることができ、例えば、ＡＢＩ３９００ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製）により合成することができる。合成が終了した後は、固相からの脱離、保護基の脱保護および目的物の精製等を行う。精製により、純度９０％以上、好ましくは９５％以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを得るのが望ましい。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造する酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはＤＮＡを鋳型としてファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写による方法が挙げられる。
【００３８】
本発明で用いられる二本鎖のオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸および／または該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であれば、いずれのオリゴヌクレオチドまたはその誘導体から構成されていてもよい。
本発明で用いられる二本鎖のオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とが、二重鎖を形成することができればいずれの長さでもよいが、二重鎖を形成できる配列の長さは、通常１１〜３５塩基であり、１５〜３０塩基が好ましく、１７〜２５塩基がより好ましく、１７〜２３塩基がさらに好ましく、１９〜２３塩基が特に好ましい。
本発明で用いられる、標的タンパク質の発現を抑制する二本鎖のオリゴヌクレオチドとしては、標的ｍＲＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であって、かつ標的タンパク質の発現を抑制する一本鎖核酸、もしくは標的ｍＲＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなり、かつ標的タンパク質の発現を抑制する二本鎖核酸が好適に用いられる。
【００３９】
二本鎖のオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のプロモーター配列等に相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなる分子を用いることで、標的遺伝子の発現を亢進させることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ４１，  １００８６  （２０１３）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ５９，  ２１６  （２０１４）］。
【００４０】
二本鎖のオリゴヌクレオチドとは、二本のオリゴヌクレオチドが対合し二重鎖領域を有するヌクレオチドをいう。二重鎖領域とは、二本鎖を構成するヌクレオチドまたはその誘導体が塩基対を構成して二重鎖を形成している部分をいう。二重鎖領域は、通常１１〜２７塩基対であり、１５〜２５塩基対が好ましく、１５〜２３塩基対がより好ましく、１７〜２１塩基対がさらに好ましい。
二本鎖のオリゴヌクレオチドを構成する一本鎖のオリゴヌクレオチドは、通常１１〜３０塩基からなるが、１５〜２９塩基からなることが好ましく、１５〜２７塩基からなることがより好ましく、１５〜２５塩基からなることがさらに好ましく、１７〜２３塩基からなることが特に好ましい。
【００４１】
二本鎖のオリゴヌクレオチドにおいて、二重鎖領域に続く３’側または５’側に二重鎖を形成しない追加のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有する場合には、これを突出部（オーバーハング）と呼ぶ。突出部を有する場合には、突出部を構成するヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはこれらの誘導体であってもよい。
突出部を有する二本鎖のオリゴヌクレオチドとしては、少なくとも一方の鎖の３’末端または５’末端に１〜６塩基、通常は１〜３塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、２塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、例えばｄＴｄＴまたはＵＵからなる突出部を有するものがあげられる。突出部は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのみ、センスオリゴヌクレオチドのみ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドとセンスオリゴヌクレオチドの両方に有することができるが、アンチセンスオリゴヌクレオチドに突出部を有する二本鎖のオリゴヌクレオチドが好ましく用いられる。なお、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、二重鎖領域とそれに続く突出部とを含む。
【００４２】
二本鎖のオリゴヌクレオチドとしては、標的遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列と同一の配列からなる核酸を用いてもよいが、該核酸の少なくとも一方の鎖の５’末端または３’末端が１〜４塩基削除された核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなる二本鎖核酸を用いてもよい。
二本鎖のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ同士が二重鎖を形成した二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ＤＮＡ同士が二重鎖を形成した二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、またはＲＮＡとＤＮＡが二重鎖を形成したハイブリッド核酸であってもよい。あるいは、二本鎖のうちの一方もしくは両方の鎖がＤＮＡとＲＮＡとのキメラ核酸であってもよい。好ましくは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から２番目のヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ配列の３’末端から２番目のデオキシリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から２〜７番目のヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡ配列の３’末端から２〜７番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から２〜１１番目のヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡ配列の３’末端から２〜１１番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から１１番目のヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡ配列の３’末端から１１番目のデオキシリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から９〜１３番目のヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡ配列の３’末端から９〜１３番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から７〜１５番目のヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡ配列の３’末端から７〜１５番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。
【００４３】
二本鎖核酸領域内のヌクレオチドに対して、修飾ヌクレオチドは、５０〜１００％含まれることが好ましく、７０〜１００％含まれることがより好ましく、９０〜１００％含まれることがさらに好ましい。
【００４４】
二本鎖のオリゴヌクレオチドは化学的に合成することができ、一般に固相オリゴヌクレオチド合成法を使用することによって合成することができる（たとえば、Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８０４，６８３号明細書；米国特許第５，８３１，０７１号明細書；米国特許第５，９９８，２０３号明細書；米国特許第６，１１７，６５７号明細書；米国特許第６，３５３，０９８号明細書；米国特許第６，３６２，３２３号明細書；米国特許第６，４３７，１１７号明細書；米国特許第６，４６９，１５８号明細書；Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，１１１，０８６号明細書；米国特許第６，００８，４００号明細書；米国特許第６，１１１，０８６号明細書を参照）。
ＲＮＡは、酵素的または部分／全有機合成によって生成してもよく、また修飾されたリボヌクレオチドは、インビトロで酵素的または有機合成によって導入することができる。一つの態様において、それぞれの鎖は、化学的に調製される。ＲＮＡ分子を化学的に合成する方法は、当該技術分野において公知である［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３２，  ９３６  （１９９８）を参照］。
【００４５】
本発明で用いられるＲＮＡとしては、標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基、好ましくは１７〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基の配列（以下、配列Ｘとする）および配列Ｘと相補的な塩基の配列（以下、相補的配列Ｘ’とする）を含んでいるＲＮＡがあげられ、例えば、配列Ｘを含むセンスオリゴヌクレオチドおよび相補的配列Ｘ’を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡ、該センスオリゴヌクレオチドと該アンチセンスオリゴヌクレオチドとが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれたヘアピン構造を有するＲＮＡが挙げられる。
配列Ｘを含むセンスオリゴヌクレオチドとしては、塩基として配列Ｘのみを含んでいるＲＮＡ（以下、配列Ｘ鎖とする）、配列Ｘ鎖の３’端もしくは５’端または両端に１〜６個、好ましくは２〜４個のヌクレオチドが同一または異なって付加されたＲＮＡが挙げられる。
相補的配列Ｘ’を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、塩基として相補的配列Ｘ’のみを含んでいるＲＮＡ（以下、相補的配列Ｘ’鎖とする）、相補的配列Ｘ’鎖の３’端もしくは５’端または両端に１〜６個、好ましくは２〜４個のヌクレオチドが同一または異なって付加された、二本鎖ＲＮＡ等が挙げられる。
【００４６】
配列Ｘを含むセンスオリゴヌクレオチドと相補的配列Ｘ’を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドとが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれたヘアピン構造を有するＲＮＡのスペーサーオリゴヌクレオチドとしては、６〜１２塩基のヌクレオチドが好ましく、その５’端の配列は２個のＵであるのが好ましい。スペーサーオリゴヌクレオチドの例として、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。スペーサーオリゴヌクレオチドによってつながれる２つのＲＮＡの順番はどちらが５’側になってもよく、配列Ｘを含むセンス鎖が５’側になることが好ましい。
配列Ｘ鎖および相補的配列Ｘ’鎖に付加されるヌクレオチド、ならびにスペーサーオリゴヌクレオチドの塩基は、グアニン、アデニン、シトシン、チミンおよびウラシルのいずれか１種または複数種でもよく、またそれぞれの塩基に結合する糖が、リボース、デオキシリボースまたは２’位の水酸基が修飾基で置換されたリボースのいずれでもよいが、付加されるヌクレオチドとしては、ウリジル酸（Ｕ）およびデオキシチミジル酸（ｄＴ）のいずれか１種または２種がより好ましい。また、配列Ｘ鎖の３’端に付加されるヌクレオチドの塩基の配列を、標的遺伝子のｍＲＮＡ内で配列Ｘと隣接するヌクレオチドの塩基の配列と同じ塩基配列としてもよい。また、相補的配列Ｘ’鎖の３’端に付加されるヌクレオチドの塩基の配列を、標的遺伝子のｍＲＮＡ内で配列Ｘと隣接するヌクレオチドの塩基の配列と相補的な塩基配列としてもよい。
【００４７】
本発明で用いられるＲＮＡのより好ましい例としては、例えば、（ａ）配列Ｘを含むセンスオリゴヌクレオチドおよび相補的配列Ｘ’を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡであり、配列Ｘが標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１９〜２１塩基の配列であって、センスオリゴヌクレオチドが配列Ｘ鎖および配列Ｘ鎖の３’端に２〜４個の同一または異なって付加されたヌクレオチドからなり、アンチセンスオリゴヌクレオチドが相補的配列Ｘ’鎖および相補的配列Ｘ’鎖の３’端に２〜４個の同一または異なって付加されたヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡ、（ｂ）配列Ｘを含むセンスオリゴヌクレオチドおよび相補的配列Ｘ’を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡであり、配列Ｘが標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する２３〜２５塩基の配列であって、センスオリゴヌクレオチドが配列Ｘ鎖であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドが相補的配列Ｘ’鎖である二本鎖ＲＮＡ、（ｃ）配列Ｘを含むセンスオリゴヌクレオチドおよび相補的配列Ｘ’を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡであり、配列Ｘが標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する２３〜２７塩基の配列であって、センスオリゴヌクレオチドが配列Ｘ鎖および配列Ｘ鎖の３’端に２〜４個の同一または異なって付加されたヌクレオチドからなり、アンチセンスオリゴヌクレオチドが相補的配列Ｘ’鎖および相補的配列Ｘ’鎖の３’端に２〜４個の同一または異なって付加されたヌクレオチドからなり、相補的配列Ｘ’鎖の３’端に付加されるヌクレオチドの塩基の配列が、標的遺伝子のｍＲＮＡ内で配列Ｘと隣接するヌクレオチドの塩基の配列と相補的な塩基配列である、二本鎖ＲＮＡ等が挙げられる。
また、本発明で用いられるＲＮＡとしては、好ましくはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡが挙げられる。
【００４８】
一本鎖のオリゴヌクレオチドは、固相ホスホロアミダイト法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３０，２４３５  （１９９３）を参照］を使用して合成され、脱保護され、およびＮＡＰ−５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上で脱塩される。オリゴマーは、１５分工程のリニア勾配を使用するＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑカラム−１．０ｃｍ。高さ．２５  ｃｍ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）でのイオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ＩＥ−ＨＰＬＣ）を使用して精製する。勾配は、９０：１０の緩衝液Ａ：Ｂから５２：４８の緩衝液Ａ：Ｂに変化し、緩衝液Ａは１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．５であり、および緩衝液Ｂは、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．５（１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ）である。試料は、２６０ｎｍにてモニターされ、全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークは、収集され、プールされ、ＮＡＰ−５カラムで脱塩され、および凍結乾燥される。
【００４９】
各一本鎖のオリゴヌクレオチドの純度は、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＰＡＣＥ  ５０００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．，  Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  Ｃａｌｉｆ）でのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって決定される。ＣＥキャピラリーは、１００μｍの内径を有し、ｓｓＤＮＡ  １００Ｒ  Ｇｅｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を含む。典型的には、約０．６ｎｍｏｌｅのオリゴヌクレオチドをキャピラリーに注射して、４４４Ｖ／ｃｍの電界において実行して、２６０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって検出される。変性トリス−ホウ酸−７ｍｏｌ／Ｌ−尿素泳動緩衝液は、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒから購入する。以下に記述した実験に使用するための、ＣＥによって評価すると少なくとも９０％純粋である一本鎖のオリゴヌクレオチドが得られる。化合物同一性は、製造業者の推奨プロトコルにしたがって、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ．ＴＭ．Ｂｉｏｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙワークステーション（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，、Ｃａｌｉｆ．）でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分光法によって検証される。一本鎖のオリゴヌクレオチドの相対的な分子質量は、予想される分子質量の０．２％以内で得ることができる。
一本鎖のオリゴヌクレオチドは、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸カリウム、３０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．５からなる緩衝液中に１００μｍｏｌ／Ｌ濃度にて再懸濁させる。相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を同等のモル量で混合して、５０μｍｏｌ／Ｌ二本鎖のオリゴヌクレオチドの最終溶液を得る。試料を９５℃まで５分間加熱して、使用前に室温に冷却させる。二本鎖核酸は、−２０℃にて保存する。一本鎖のオリゴヌクレオチドは、凍結乾燥させるか、またはヌクレアーゼフリー水中に、−８０℃で貯蔵する。
【００５０】
本発明における「リンカー」としては、核酸複合体として用いることが知られた任意のをリンカーを用いることができる。
リンカー構造の例示としては、例えば、国際公開第２００９／０７３８０９号、国際公開第２０１３／０７５０３５号、国際公開第２０１５／１０５０８３号、国際公開第２０１４／１７９６２０号、国際公開第２０１５／００６７４０号、国際公開第２０１７／０１０５７５号に開示される構造を採用することができる。
【００５１】
リンカーは、直鎖構造であってもよいが、分岐構造となる下記構造のいずれかの構造を有することが好適である。
例えば下記分岐を有することにより、複数の糖鎖リガンドを分子内に有する核酸複合体とすることができ、糖鎖リガンドを２〜８個有することが好適である。
【化３０】
2018004004.tif 000031
式中、
Ｘ１は、ＣＨまたは窒素原子である。
Ｘ２〜Ｘ４は、それぞれ独立して、ＣＨまたは窒素原子である。
【００５２】
リンカーは、下記構造のいずれかの構造をさらに有していることが好適である。
【化３１】
2018004004.tif 000032
【００５３】
本発明において、リンカーが、下記構造を有する場合、例えば、国際公開第２００９／０７３８０９号、国際公開第２０１３／０７５０３５号、国際公開第２０１５／１０５０８３号、国際公開第２０１４／１７９６２０号、国際公開第２０１５／００６７４０号、国際公開第２０１７／０１０５７５号を参考にしてリンカーを製造することができる。
【化３２】
2018004004.tif 000033
Ｘ１は、上記と同義である。
【００５４】
本発明において、リンカーが、下記構造を有する場合、以下に例示するような方法により本発明の核酸複合体を製造することができる。
【化３３】
2018004004.tif 000034
Ｘ２〜Ｘ４は、それぞれ独立して、上記と同義である。Ｘ２〜Ｘ４は、例えば全てＣＨであり、この場合は下記構造で表される。
【化３４】
2018004004.tif 000035
これらの場合、本発明の核酸複合体は、下記式１で表される核酸複合体であることが好適である。
式１：
【化３５】
2018004004.tif 000036
式１中、
Ｘは、オリゴヌクレオチドであり、
Ｘ２〜Ｘ４は、それぞれ独立して、上記と同義である。
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖鎖リガンドであり、
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーを構成する部分構造である。
【００５５】
式１においては、下記構造がリンカーであり、
【化３６】
2018004004.tif 000037
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、リンカーを構成する部分構造であり、
Ｘ２〜Ｘ４は、それぞれ独立して、上記と同義である。
なお、以下、上記式１の核酸複合体について説明するが、核酸複合体が、以下の構造を有するとして置き換えて、式１での説明を適用できる。
【化３７】
2018004004.tif 000038
なお、Ｓ４は、Ｓ１およびＳ２と同義に理解することができ、Ｘ１は、上記と同義であり、Ｌ３は、糖鎖リガンドである。
【００５６】
式１において、Ｓ１およびＳ２は、Ｓ３のベンゼン環上の置換位置に対して、それぞれオルト位、メタ位、パラ位でベンゼン環と結合し得るが、下記式１−１で表される核酸複合体であることが好適である。式１におけるＳ１およびＳ２のベンゼン環への結合手は、ベンゼン環上のＳ３の置換位置以外で任意の位置であり得ることを意味する。
式１−１：
【化３８】
2018004004.tif 000039
式１−１中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義である。
本明細書において、前記と同義とは、式１−１中を例示して説明すると、式１−１中のＸ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２それぞれについて、式１において前記するＸ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２それぞれについての定義と同様の基であり得ることを意味している。
【００５７】
本発明においては、Ｓ３とオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドを構成する糖部分の３’位または５’位を介してＳ３と結合するだけでなく、ヌクレオチドを構成する塩基部分を介してＳ３と結合していてもよい。本発明においては、オリゴヌクレオチドは、Ｓ３とオリゴヌクレオチドを結合する構造を有する基として理解されてよく、例えば、オリゴヌクレオチドが、−ＯＰ（Ｚ）（Ｚ’）Ｏ−（式中、ＺおよびＺ’は、それぞれ独立して、酸素原子またはイオウ原子である。）を介してＳ３と結合している場合、Ｘとしてのオリゴヌクレオチドとしては、−Ｏ−Ｐ（Ｚ）（Ｚ’）Ｏ−オリゴヌクレオチドとして理解されてもよい。
【００５８】
式１において、Ｓ１とＳ２は、糖鎖リガンドであるＬ１とＬ２と、ベンゼン環とを連結する構造であれば特に限定されるものではなく、核酸複合体において用いられる公知の構造を採用してもよい。Ｓ１とＳ２は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
糖鎖リガンドであるＬ１とＬ２は、Ｓ１およびＳ２とグリコシド結合により連結していることが好ましく、Ｓ１およびＳ２は、ベンゼン環と、例えば、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−結合によりそれぞれ連結していてもよい。
【００５９】
Ｓ３は、オリゴヌクレオチドとの結合部を有するリンカーであり、オリゴヌクレオチドであるＸと、ベンゼン環とを連結する構造であれば特に限定されるものではなく、核酸複合体において用いられる公知の構造を採用してよい。
オリゴヌクレオチドであるＸは、Ｓ３とホスホジエステル結合により連結していることが好ましく、Ｓ３は、ベンゼン環と、例えば、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−結合により連結していてもよい。
【００６０】
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３のリンカーを構成する部分構造としては、例えば、国際公開第２００９／０７３８０９号、国際公開第２０１３／０７５０３５号、国際公開第２０１５／１０５０８３号、国際公開第２０１４／１７９６２０号、国際公開第２０１５／００６７４０号に開示される構造を採用してもよい。
【００６１】
本発明において、核酸複合体は、下記式２で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式２：
【化３９】
2018004004.tif 000040
式２中、
Ｘ、Ｘ２〜Ｘ４、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義であり、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５およびＰ６、ならびにＴ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは非置換の炭素数２〜１２のアルキレン、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ｎは０〜９９の整数であり、
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式２−１で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｐ２またはＰ３あるいはＰ５またはＰ６との結合点であり、ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、
式２−１：
【化４０】
2018004004.tif 000041
ｐ１およびｐ２は、それぞれ独立して、１、２または３の整数であり、
ｑ１、ｑ２、ｑ３およびｑ４は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、
ただし、ｐ１およびｐ２がそれぞれ２または３の整数であるとき、それぞれのＰ３およびＰ６、Ｑ２およびＱ４、Ｔ１およびＴ２ならびにＬ１およびＬ２は、同一または異なっていてもよい。
【００６２】
Ｐ１およびＰ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ、−ＮＨ−ＣＯ−または−ＣＯ−ＮＨ−であることが好ましく、−Ｏ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−ＣＯ−ＮＨ−であることが好ましく、−ＮＨ−ＣＯ−であることがさらに好ましい。
Ｐ１またはＰ４が、例えば、−ＮＨ−ＣＯ−である場合、−ＮＨ−ＣＯ−ベンゼン環という部分構造を有する。
【００６３】
Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ｎは１〜９９の整数であるが、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンであることが好ましく、無置換の炭素数１〜１２のアルキレンであることがより好ましく、無置換の炭素数１〜６のアルキレンであることがさらに好ましく、無置換の炭素数１〜４のアルキレンであることがよりさらに好ましい。
【００６４】
Ｐ２およびＰ５は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、存在しないか、−ＣＯ−Ｏ−または−ＣＯ−ＮＨ−であることが好ましく、存在しないか、−ＣＯ−ＮＨ−であることがより好ましい。Ｐ２およびＰ５が、例えば、−ＣＯ−ＮＨ−である場合、Ｂ１−ＣＯ−ＮＨ−Ｑ１およびＢ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｑ３という部分構造を有する。
【００６５】
−（Ｐ２−Ｑ１）ｑ１−および−（Ｐ５−Ｑ３）ｑ３−がそれぞれ独立して、存在しないか、または下記式３−１〜式３−３で表されるいずれかの構造であることが好適である。
式３−１：
【化４１】
2018004004.tif 000042
式３−２：
【化４２】
2018004004.tif 000043
式３−３：
【化４３】
2018004004.tif 000044
式３−１〜３−３中、
ｍ５およびｍ６は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、式３−１〜式３−３の構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｂ１またはＢ２あるいはＰ１またはＰ４との結合点である。
【００６６】
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｐ２またはＰ３あるいはＰ５またはＰ６との結合点であり、ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は、それぞれ独立して、０〜１０の整数である。
【化４４】
2018004004.tif 000045
Ｂ１およびＢ２は、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、イミノ二酢酸等の非天然アミノ酸を含むアミノ酸、または１，３−プロパンジオール等のアミノアルコールに由来する基であることが好ましく、Ｂ１およびＢ２がグルタミン酸およびアスパラギン酸に由来する基である場合、グルタミン酸およびアスパラギン酸のアミノ基がそれぞれ結合して、Ｐ２およびＰ５として、−ＮＨ−ＣＯ−結合であることが好ましく、Ｂ１およびＢ２がリジンに由来する基である場合、リジンのカルボキシル基がそれぞれ結合して、Ｐ２およびＰ５として、−ＣＯ−ＮＨ−結合であることが好ましく、Ｂ１およびＢ２がイミノ二酢酸に由来する基である場合、イミノ二酢酸のアミノ基がそれぞれ結合して、Ｐ２およびＰ５として、−ＣＯ−結合となることが好ましい。
【００６７】
Ｘ２〜Ｘ４は、それぞれ独立して、ＣＨであることが好ましく、Ｘ２〜Ｘ４が同時にＣＨであることがより好ましい。
【００６８】
本発明において、核酸複合体は、下記式４−１〜４−９で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式４−１：
【化４５】
2018004004.tif 000046
式４−２：
【化４６】
2018004004.tif 000047
式４−３：
【化４７】
2018004004.tif 000048
式４−４：
【化４８】
2018004004.tif 000049
式４−５：
【化４９】
2018004004.tif 000050
式４−６：
【化５０】
2018004004.tif 000051
式４−７：
【化５１】
2018004004.tif 000052
式４−８：
【化５２】
2018004004.tif 000053
式４−９：
【化５３】
2018004004.tif 000054
式４−１〜４−９中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ３、Ｐ３、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｑ２、Ｑ４、ｑ２およびｑ４はそれぞれ前記と同義である。
【００６９】
Ｐ３およびＰ６は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、−ＯＣＯ−または−ＮＨ−ＣＯ−であることが好ましく、−ＮＨ−ＣＯ−であることがより好ましい。Ｐ３およびＰ６が、例えば、−ＮＨ−ＣＯ−である場合、それぞれ、Ｂ１−ＮＨ−ＣＯ−Ｑ２およびＢ２−ＮＨ−ＣＯ−Ｑ４という部分構造を有する。
【００７０】
Ｔ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、−Ｏ−または−Ｓ−であることが好ましく、−Ｏ−であることがより好ましい。
【００７１】
本発明において、核酸複合体は、下記式５で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式５では、式２におけるＰ１とＰ４、Ｐ２とＰ５、Ｐ３とＰ６、Ｑ１とＱ３、Ｑ２とＱ４、Ｂ１とＢ２、Ｔ１とＴ２、Ｌ１とＬ２、ｐ１とｐ２、ｑ１とｑ３ならびにｑ２とｑ４がそれぞれ同一である。
式５：
【化５４】
2018004004.tif 000055
式５中、
Ｘ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、ｐ１、ｑ１およびｑ２はそれぞれ前記と同義である。
また、式５におけるＸ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、ｐ１、ｑ１およびｑ２は、各々、上述した好適な基であって良いが、Ｐ１が−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−Ｏ−であることが好ましい。
式５における−（Ｐ２−Ｑ１）ｑ１−は、存在しないか、または上記式３−１〜式３−３で表されるいずれかの構造であることが好適である。
【００７２】
本発明において、核酸複合体は、下記式６−１〜６−９で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式６−１：
【化５５】
2018004004.tif 000056
式６−２：
【化５６】
2018004004.tif 000057
式６−３：
【化５７】
2018004004.tif 000058
式６−４：
【化５８】
2018004004.tif 000059
式６−５：
【化５９】
2018004004.tif 000060
式６−６：
【化６０】
2018004004.tif 000061
式６−７：
【化６１】
2018004004.tif 000062
式６−８：
【化６２】
2018004004.tif 000063
式６−９：
【化６３】
2018004004.tif 000064
式６−１〜式６−９中、
Ｘ、Ｓ３、Ｐ３、Ｑ２、Ｔ１、およびＬ１は、それぞれ前記と同義である。
【００７３】
本発明において、核酸複合体は、下記式７−１〜式７−９のいずれかで表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式７−１：
【化６４】
2018004004.tif 000065
式７−２：
【化６５】
2018004004.tif 000066
式７−３：
【化６６】
2018004004.tif 000067
式７−４：
【化６７】
2018004004.tif 000068
式７−５：
【化６８】
2018004004.tif 000069
式７−６：
【化６９】
2018004004.tif 000070
式７−７：
【化７０】
2018004004.tif 000071
式７−８：
【化７１】
2018004004.tif 000072
式７−９：
【化７２】
2018004004.tif 000073
式７−１０：
【化７３】
2018004004.tif 000074
式７−１１：
【化７４】
2018004004.tif 000075
式７−１２：
【化７５】
2018004004.tif 000076
式７−１３：
【化７６】
2018004004.tif 000077
式７−１４：
【化７７】
2018004004.tif 000078
式７−１５：
【化７８】
2018004004.tif 000079
式７−１６：
【化７９】
2018004004.tif 000080
式７−１７：
【化８０】
2018004004.tif 000081
式７−１８：
【化８１】
2018004004.tif 000082
式７−１９：
【化８２】
2018004004.tif 000083
式７−２０：
【化８３】
2018004004.tif 000084
式７−２１：
【化８４】
2018004004.tif 000085
式７−１〜式７−２１中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ３、n２またはn３は、それぞれ前記と同義である。Ｌ１とＬ２は同一であってもよく、異なっていてもよく、同一であることが好適である。
式７−１〜式７−９において、各アルキレン基部分を鎖長の異なるアルキレン鎖を導入することにより、また、アミド結合等を他の結合に置換することにより、式７−１〜式７−９で表される構造を有する核酸複合体以外の核酸誘導体を製造することもできる。
【００７４】
上述したように、本発明の核酸複合体に用いられるリンカーは、下記構造を有することが好適である。
【化８５】
2018004004.tif 000086
（式中、
ｎ１は、１〜１００の整数である。）
ｎ１は５〜９５の整数であることが好ましく、１０〜８０の整数であることがより好ましく、１５〜６０の整数であることがさらに好ましく、２０〜４０の整数であることがよりさらに好ましい。
【００７５】
ｎ２およびｎ３はそれぞれ同一または異なって、５〜９５の整数であることが好ましく、１０〜８０の整数であることがより好ましく、１５〜６０の整数であることがさらに好ましく、２０〜４０の整数であることがよりさらに好ましい。
【００７６】
本発明において、核酸複合体は、下記式１１で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式１１：
【化８６】
2018004004.tif 000087
式１１中、
Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２は、それぞれ前記と同義であり、
Ｐ７およびＰ８は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ５、Ｑ６およびＱ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ８−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ｎ８は０〜９９の整数であり、
Ｂ３は、、下記式１１−１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ５およびＱ６との結合手を意味し、
式１１−１：
【化８７】
2018004004.tif 000088
ｑ５およびｑ６は、それぞれ独立して、０〜１０の整数である。
【００７７】
Ｐ７は、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、−Ｏ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−ＣＯＮＨ−であることが好ましく、−Ｏ−または−ＮＨ−ＣＯ−であることがより好ましい。Ｐ７が、例えば、−Ｏ−である場合、ベンゼン環−Ｏ−という部分構造を有する。
【００７８】
Ｐ８は、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、存在する場合、−ＣＯ−Ｏ−または−ＣＯ−ＮＨ−であることが好ましく、−ＣＯ−ＮＨ−であることがより好ましい。Ｐ８が、例えば、−ＣＯ−ＮＨ−である場合、Ｑ６−ＣＯ−ＮＨ−という部分構造を有する。
【００７９】
Ｑ５、Ｑ６およびＱ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ８−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ｎ８は０〜９９の整数であるが、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンであることが好ましく、無置換の炭素数１〜１２のアルキレンであることがより好ましく、無置換の炭素数１〜６のアルキレンであることがさらに好ましく、無置換の炭素数１〜４のアルキレンであることがよりさらに好ましい。
【００８０】
−（Ｐ７−Ｑ５）ｑ５−は、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ１５−ＮＨ−および−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１６−ＮＨ−であり、ｍ１５およびｍ１６は、それぞれ独立して、１〜１０の整数であることが好適である。
【００８１】
本発明において、核酸複合体は、下記式１２−１〜式１２−１２のいずれかで表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式１２−１：
【化８８】
2018004004.tif 000089
式１２−２：
【化８９】
2018004004.tif 000090
式１２−３：
【化９０】
2018004004.tif 000091
式１２−４：
【化９１】
2018004004.tif 000092
式１２−５：
【化９２】
2018004004.tif 000093
式１２−６：
【化９３】
2018004004.tif 000094
式１２−７：
【化９４】
2018004004.tif 000095
式１２−８：
【化９５】
2018004004.tif 000096
式１２−９：
【化９６】
2018004004.tif 000097
式１２−１０：
【化９７】
2018004004.tif 000098
式１２−１１：
【化９８】
2018004004.tif 000099
式１２−１２：
【化９９】
2018004004.tif 000100
式１２−１〜１２−１２中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２は、それぞれ前記と同義であり、ｎ１’〜ｎ１２’はそれぞれ独立して、１〜１０の整数である。
【００８２】
本発明の別の好ましい態様の一つとして、以下の構造を有する核酸複合体が挙げられる。
【化１００】
2018004004.tif 000101
【化１０１】
2018004004.tif 000102
式〜式中、
Ｘ、Ｌ１、Ｓ３またはn２はそれぞれ前記と同義である。
【００８３】
本発明の核酸複合体は、式１で表される核酸複合体において、式２および式１１の構造を併せて持つ核酸複合体であることが好ましく、該核酸複合体において、式１１の構造であって、式２が、式４−１〜式４−９であってもよく、式６−１〜式６−９であってもよく、式７−１〜式７−９であってもよく、式２が、式４−１〜式４−９、式６−１〜式６−９、あるいは式７−１〜式７−９である場合に、式１１が、式１２−１〜式１２−１２であってもよい。本発明の核酸複合体は、式１で表される核酸複合体において、式４−１〜式４−９のいずれか１つの構造および式１２−１〜式１２−１２のいずれか１つの構造を併せて持つ核酸複合体、式６−１〜式６−９のいずれか１つの構造および式１２−１〜式１２−１２のいずれか１つの構造を併せて持つ核酸複合体、式７−１〜式７−９のいずれか１つの構造および式１２−１〜式１２−１２のいずれか１つの構造を併せて持つ核酸複合体であることがより好適である。
【００８４】
なお、本明細書において、糖鎖リガンドを「Ｌｉｇａｎｄ」や「Ｌ１」等で表す場合には、糖鎖リガンドに直接結合しているリンカーの一部（例えば、−Ｏ−（ＣＨ２）２−）を含んで表す場合もある。
【００８５】
本発明の核酸複合体は、いずれかの窒素原子上の孤立電子対に、水素イオンが配位した場合に、製薬上許容し得る陰イオンと塩を形成していてもよい。
本発明において、製薬上許容し得る陰イオンとしては、例えば塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の無機イオン、酢酸イオン、シュウ酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、クエン酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン等の有機酸イオン等が挙げられる。
【００８６】
本発明の核酸複合体の製造法について説明する。なお、以下に示す製造法において、定義した基が該製造法の条件下で変化するかまたは該製造法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される保護基の導入および除去方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法］等を用いることにより、目的化合物を製造することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
式１で表される核酸重合体は、固相合成によっても合成することができる。
【００８７】
式１で表される核酸重合体は、核酸複合体として公知のリンカー構造の合成方法を参考にして合成することができる。
式１で表される核酸複合体における、Ｓ１をリンカーとしたＬ１−ベンゼン環ユニットやＳ２をリンカーとしたＬ２−ベンゼン環ユニットの合成は、例えば、式２で表される核酸複合体を例として説明する。
式２で表される核酸複合体におけるＬ１−ベンゼン環ユニットやＬ２−ベンゼン環ユニットは、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、およびＰ６ならびにＴ１およびＴ２により連結している。
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、およびＰ６ならびにＴ１およびＴ２の−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−または−ＣＯ−ＮＨ−結合は、例えば、第４版実験化学講座１９「有機化合物の合成Ｉ」丸善（１９９２年）、第４版実験化学講座２０「有機化合物の合成ＩＩ」、丸善（１９９２年））等に記載の結合反応の方法を参考にして、式２で表される構造を形成するのに適切な原料を選択することにより適宜合成することができる。
また、ベンゼン環から順次、Ｑ１を部分構造として有する化合物、Ｂ１を部分構造として有する化合物を結合させることで、Ｌ１−ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
Ｌ１とＱ２を部分構造として有する化合物を別途合成し、Ｌ１とＱ２を部分構造として有する化合物をベンゼン環、Ｑ１およびＢ１を部分構造として有するＬ１−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させることにより、Ｌ１−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
Ｌ２−ベンゼン環ユニットについても同様に、ベンゼン環から順次、Ｑ３を部分構造として有する化合物、Ｂ２を部分構造として有する化合物を結合させることで、Ｌ２−ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
Ｌ２とＱ４を部分構造として有する化合物を別途合成し、Ｌ２とＱ４を部分構造として有する化合物をベンゼン環、Ｑ３およびＢ２を部分構造として有するＬ２−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させることにより、Ｌ２−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
【００８８】
Ｑ１を部分構造として有する化合物、Ｑ３を部分構造として有する化合物としては、炭素数１〜１０のアルキレンまたは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−の両末端に、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基を有する化合物が挙げられる。
Ｂ１を部分構造として有する化合物、Ｂ２を部分構造として有する化合物としては、下記式２−１で表されるいずれかの構造を有し、各構造における末端の黒丸点において、それぞれ、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、またはチオール基を有する化合物が挙げられる。
式２−１：
【化１０２】
2018004004.tif 000103
Ｂ１を部分構造として有する化合物、Ｂ２を部分構造として有する化合物の具体例としては、グリコール、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、Ｔｒｉｓ、イミノ二酢酸、２−アミノ−１，３−プロパンジオール等が挙げられ、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、イミノ二酢酸が好ましい。
【００８９】
Ｌ１、Ｑ２およびＢ１を部分構造として有する化合物を合成してから、Ｑ１とベンゼン環を有する化合物と結合することにより、Ｌ１−ベンゼン環ユニット構造を製造してもよい。
Ｌ２、Ｑ４およびＢ２を部分構造として有する化合物を合成してから、Ｑ３とベンゼン環を有する化合物と結合することにより、Ｌ２−ベンゼン環ユニット構造を製造してもよい。
本発明においては、［Ｌ１−Ｔ１−（Ｑ２−Ｐ３）ｑ２−］ｐ１−Ｂ１−（Ｐ２−Ｑ１）ｑ１−Ｐ１−である部分構造と、［Ｌ２−Ｔ２−（Ｑ３−Ｐ６）ｑ４−］ｐ２−Ｂ２−（Ｐ５−Ｑ３）ｑ３−Ｐ２−である部分構造とは同一または異なっていても良いが、同一であることが好ましい。
【００９０】
糖鎖リガンドのＬ１−Ｔ１−Ｑ２に相当するユニットとして、例えば、Ｌ３−Ｔ１−Ｑ２−ＣＯＯＨ、Ｌ３−Ｔ１−（Ｑ２−Ｐ３）ｑ２−１−Ｑ２−ＮＨ２等が挙げられる。具体的には、Ｌ３−Ｏ―炭素数１〜１２のアルキレン―ＣＯＯＨや、Ｌ３−炭素数１〜１２のアルキレン−ＣＯ−ＮＨ−炭素数２〜１２のアルキレン−ＮＨ２等が挙げられる。
Ｌ３は、脱保護することにより、Ｌ１となる糖鎖リガンド誘導体であれば特に限定されない。糖鎖リガンドの置換基としては、糖質化学の分野で汎用される置換基であれば特に限定されないが、Ａｃ基が好ましい。
【００９１】
Ｓ１をリンカーとしたＬ１−ベンゼン環ユニットやＳ２をリンカーとしたＬ２−ベンゼン環ユニットの合成は、具体的には実施例に記載の方法を参考にして、アルキレン鎖の炭素数を適宜増減し、また、末端アミノ基や末端カルボキシル基を、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−または−ＣＯＮＨ−結合を形成し得る基に変換した化合物を用いることにより、合成することができる。また、Ｌ１の糖鎖リガンドについても、実施例においては、マンノース誘導体、マンノースまたはＮ−アセチルガラクトサミンを例示しているが、他の糖鎖リガンドに変更して実施することができる。
【００９２】
式１で表される核酸複合体における、Ｓ３をリンカーとしたＸ−ベンゼン環ユニットの合成は、例えば、式１１で表される核酸複合体を例として説明する。
式１１で表される核酸複合体におけるＸ−ベンゼン環ユニットは、オリゴヌクレオチドの結合以外に、Ｐ７およびＰ８により表される結合を有する。
Ｐ７およびＰ８の−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−または−ＣＯ−ＮＨ−結合は、例えば、第４版実験化学講座１９「有機化合物の合成Ｉ」丸善（１９９２年）、第４版実験化学講座２０「有機化合物の合成ＩＩ」、丸善（１９９２年））に記載の結合反応の方法を参考にして、式１１で表される構造を形成するのに適切な原料を選択することにより適宜合成することができる。
また、ベンゼン環から順次、Ｑ５を部分構造として有する化合物、Ｂ３を部分構造として有する化合物を結合させることで、Ｘ−ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
【００９３】
ＸとＱ７を部分構造として有する化合物や、ＸとＱ６を部分構造として有する化合物を別途合成し、ＸとＱ７を部分構造として有する化合物やＸとＱ６を部分構造として有する化合物をベンゼン環およびＱ５を部分構造として有するＸ−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させて、Ｂ３部分を構築することにより、Ｘ−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
具体的には、ベンゼン環およびＱ５を部分構造として有するＸ−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物の末端にアジド基を有する場合を例にとると、実施例に開示するような末端結合性官能基化したオリゴヌクレオチドを反応させることにより、環化付加させて、トリアゾール環を形成させて、Ｂ３部分を構築することにより、Ｘ−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
【００９４】
Ｑ５を部分構造として有する化合物、Ｑ６を部分構造として有する化合物、Ｑ７を部分構造として有する化合物としては、炭素数１〜１０のアルキレンまたは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ８−ＣＨ２ＣＨ２−の両末端に、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基を有する化合物が挙げられる。
【００９５】
Ｌ１−ベンゼン環ユニット構造、Ｌ２−ベンゼン環ユニット構造と、Ｘ−ベンゼン環ユニット構造とは、それぞれ順次製造していくことができるが、Ｌ１−ベンゼン環ユニット構造およびＬ２−ベンゼン環ユニット構造を合成してから、Ｘ−ベンゼン環ユニット構造を結合させることが好ましい。特に、オリゴヌクレオチド部分を有するＸについては、糖鎖リガンド複合体合成の最終工程近くで化合物内に導入することが好ましい。
【００９６】
製造方法１
式１−１においてＰ１およびＰ４が−ＮＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−または−Ｓ−ＣＯ−である、Ｌ１−ベンゼン環ユニット構造およびＬ２−ベンゼン環ユニット構造は以下の方法で製造することができる。
【化１０３】
2018004004.tif 000104
（式中、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｔ１、Ｔ２、L１、Ｌ２、ｑ１、ｑ２、ｑ３およびｑ４はそれぞれ前記と同義であり、ｑ２’はｑ２より１小さい整数を表し、ｑ４’はｑ４より１小さい整数を表し、Ｐ１’およびＰ４’は、それぞれ独立して、−ＮＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−または−Ｓ−ＣＯ−を表し、ＺはＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メタンスルホニルオキシ、p-トルエンスルホニルオキシまたはカルボン酸を表し、Ｂ１’およびＢ２’は下記式の構造体のいずれか１つを表し、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３、ＰＧ４、ＰＧ５、ＰＧ６およびＰＧ７はそれぞれ適切な保護基を表す。）
式：
【化１０４】
2018004004.tif 000105
ｍ１、ｍ２、ｍ３またはｍ４はそれぞれ独立して、０〜１０の整数を表す。
【００９７】
工程１
化合物（Ｉ−Ｃ）は、化合物（Ｉ−Ａ）と化合物（Ｉ−Ｂ）を、テトロヒドロフラン等の溶媒中、トリフェニルホスフィンポリマー担持体を加え、氷冷下、ジイソプロピルアゾジカルボキシレートトルエン溶液を反応させる事により製造する事ができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，２−ジメトキシエタン、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
化合物（Ｉ−Ａ）は市販品として得る事ができる。
【００９８】
工程２
化合物（Ｉ−Ｄ）は化合物（Ｉ−Ｃ）を用い、メタノール等の溶媒中、氷冷下、塩基の存在下、反応させる事により製造する事ができる。
溶媒としては、製造方法１工程１で例示したものが挙げられる。
塩基としては、例えば炭酸セシウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム  ｔｅｒｔ−ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）等が挙げられる。
【００９９】
工程３
化合物（Ｉ−Ｆ）は化合物（Ｉ−Ｄ）および化合物（Ｉ−Ｅ）を、無溶媒でまたは溶媒中、１〜３０当量の塩基、縮合剤および必要に応じて０．０１〜３０当量の添加剤の存在下、室温と２００  ℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，２−ジメトキシエタン、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ピリジンがあげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、製造方法１工程２で例示したものが挙げられる。
縮合剤としては、例えば１，３−ジシクロヘキサンカルボジイミド（DCC）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）、カルボニルジイミダゾール、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルホロホスファート、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスファート、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、ヨウ化  ２−クロロ−１−メチルピリジニウム等が挙げられる。
添加剤としては、例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等が挙げられる。
【０１００】
工程４
化合物（Ｉ−Ｈ）は化合物（Ｉ−Ｆ）および化合物（Ｉ−Ｇ）を用い、製造方法１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
【０１０１】
工程５
化合物（Ｉ−Ｊ）は化合物（Ｉ−Ｈ）および化合物（Ｉ−Ｉ）を用い、製造方法１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
また、ＤＰ工程と工程５を繰り返し行うことで、望みのｑ１の値に調整された化合物（Ｉ−Ｊ）を製造することができる。
【０１０２】
工程６
化合物（Ｉ−Ｌ）は化合物（Ｉ−Ｊ）および化合物（Ｉ−Ｋ）を用い、製造方法１の工程３製造方法１の工程２と同様の条件で製造する事ができる。
【０１０３】
工程７
化合物（Ｉ−Ｎ）は化合物（Ｉ−Ｌ）および化合物（Ｉ−Ｍ）を用い、製造方法１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
【０１０４】
工程８〜１０
化合物（Ｉ’）は化合物（Ｉ−Ｏ）、化合物（Ｉ−Ｐ）および化合物  （Ｉ−Ｑ）を用い、製造方法１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
また、ＤＰ工程と工程８を繰り返し行うことで、望みのｑ3の値に調整された化合物（Ｉ’）を製造することができる。
【０１０５】
工程ＤＰ
有機合成化学で常用される方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法等］を適切に用いることで製造することができる。
化合物（Ｉ−Ｂ）、化合物（Ｉ−Ｅ）、化合物（Ｉ−Ｇ）、化合物（Ｉ−Ｉ）、化合物（Ｉ−Ｋ）、化合物（Ｉ−Ｍ）、化合物（Ｉ−Ｏ）、化合物（Ｉ−Ｐ）および化合物（Ｉ−Ｑ）は市販品として、または「実験化学講座第４版  有機合成、ｐ．  ２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせる事、もしくはそれに準じた方法で得る事ができる。
【０１０６】
製造方法２
式２においてＰ１およびＰ４が−Ｏ−であり、Ｘ２〜Ｘ４がＣＨであるＬ１−ベンゼン環ユニット構造およびＬ２−ベンゼン環ユニット構造は以下の方法で製造することができる。
【化１０５】
2018004004.tif 000106
（式中、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｌ１、Ｌ２、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ２’、ｑ４’、Ｚ、Ｂ１’またはＢ２’はそれぞれ前記と同義でありＰＧ８、ＰＧ９、ＰＧ１０、ＰＧ１１、ＰＧ１２、ＰＧ１３およびＰＧ１４はそれぞれ適切な保護基を表す）
【０１０７】
工程１３
化合物（ＩＩ−Ｃ）は化合物（ＩＩ−Ａ）と化合物（ＩＩ−Ｂ）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドな等の溶媒に溶解し、炭酸水素カリウム等の塩基を加えて、室温〜２００℃にて５分間〜１００時間反応させる事により製造する事ができる。
溶媒としては、製造工程１の工程２に例示したものが挙げられる。
塩基としては、製造方法１の工程３で例示したものが挙げられる。
【０１０８】
工程１４
化合物（ＩＩ−Ｅ）は化合物化合物（ＩＩ−Ｃ）と化合物（ＩＩ−Ｄ）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド等の溶媒に溶解し、炭酸水素カリウム等の塩基を加えて、室温〜２００℃で５分間〜１００時間反応させる事により製造する事ができる。
溶媒としては、製造工程１の工程２で例示したものが挙げられる。
塩基としては、製造方法１の工程３で例示したものが挙げられる。
化合物（ＩＩ−Ａ）は市販品として得る事ができる。
【０１０９】
工程１５
化合物（ＩＩ−Ｇ）は化合物（ＩＩ−Ｅ）および化合物（ＩＩ−Ｆ）を用い、製造方法１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
【０１１０】
工程１６
化合物（ＩＩ−Ｉ）は化合物（ＩＩ−Ｇ）および化合物（ＩＩ−Ｈ）を用い、製造方法１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
また、ＤＰ工程と工程１６を繰り返し行うことで、望みのｑ１の値に調整された化合物（ＩＩ−Ｉ）を製造することができる。
【０１１１】
工程１７
化合物（ＩＩ−Ｋ）は化合物（ＩＩ−Ｉ）および化合物（ＩＩ−Ｊ）を用い、製造方法１の工程２と同様の条件で製造する事ができる。
【０１１２】
工程１８
化合物（ＩＩ−Ｍ）は化合物（ＩＩ−Ｋ）および化合物（ＩＩ−Ｌ）を用い、製造方法１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
【０１１３】
工程１９−２１
化合物（ＩＩ’）は化合物（ＩＩ−Ｍ），  化合物（ＩＩ−Ｎ），  化合物（ＩＩ−Ｏ）および化合物（ＩＩ−Ｐ）を用い、製造方法１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
また、ＤＰ工程と工程１９を繰り返し行うことで、望みのｑ３に調整された化合物（ＩＩ’）を製造することができる。
【０１１４】
工程ＤＰ
有機合成化学で常用される方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法等］を適切に用いることで製造することができる。
【０１１５】
化合物（ＩＩ−Ｂ），化合物（ＩＩ−Ｄ），化合物（ＩＩ−Ｆ），化合物（ＩＩ−Ｈ），化合物（ＩＩ−Ｊ），化合物（ＩＩ−Ｌ），化合物（ＩＩ−Ｎ），化合物（ＩＩ−Ｏ）および化合物（ＩＩ−Ｐ）は市販品として、または「実験化学講座第４版  有機合成、ｐ．  ２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせる事、もしくはそれに準じた方法で得る事ができる。
【０１１６】
本発明においては、下記式６で表される化合物が中間体として挙げられる。
式６：
【化１０６】
2018004004.tif 000107
（式６中、
Ｙ９およびＹ１０は、Ｐ１およびＰ４として示される基であってもよいが、好適には、酸素原子または−ＮＨ−であり、
Ｒ１７およびＲ１８は、それぞれ独立して、水素原子、マレイミド基、置換もしくは非置換の炭素数１〜２０のアルキル基、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、−［Ｑ８−Ｐ９］ｑ７−Ｒ１９、または−［Ｑ９−Ｐ１０］ｑ８−Ｂ４−［（Ｐ１１−Ｑ１０）ｑ７］ｐ３−Ｔ３−Ｌ３であり、
Ｐ９〜Ｐ１１およびＴ３は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ８〜Ｑ１０は、存在しないか、または、置換もしくは非置換の炭素数２〜１２のアルキレン、−ＣＨ２ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−または−ＣＨ２ＣＨ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ｎは０〜９９の整数であり、
Ｒ１９は、水素原子、マレイミド基、置換もしくは非置換の炭素数１〜２０のアルキル基、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）であり、
Ｂ４は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式で表される群からなる炭素骨格構造であり、各炭素骨格構造における末端の黒丸点は、それぞれ、カルボニル基またはＰ９との結合点であり、ｍ１およびｍ２は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、
【化１０７】
2018004004.tif 000108
ｐ３は、１、２または３の整数であり、
ｑ７は、０〜１０の整数であり、
Ｌ３は、保護されていてもよい糖鎖リガンドである。
【０１１７】
本発明においては、糖鎖リガンドを有する式６の化合物を、式７の化合物と反応させることにより、本発明の核酸複合体を製造することができる。
式７：
【化１０８】
2018004004.tif 000109
【０１１８】
本明細書における核酸複合体は、例えば酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等の塩として得ることも可能である。
【０１１９】
酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられ、アンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、有機アミン付加塩としては、例えば、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられ、アミノ酸付加塩としては、例えば、リジン、グリシン、フェニルアラニン等の付加塩が挙げられる。
【０１２０】
本明細書の核酸複合体の塩を調製したい場合には、該複合体が所望の塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、該複合体を適当な溶媒に溶解または懸濁し、対応する酸または塩基を加え、単離・精製すればよい。また、該複合体塩を形成する対イオンを異なる対イオンに変換する際には、該複合体塩を適当な溶媒に溶解または懸濁した後、酸、塩基および／または塩（塩化ナトリウム、塩化アンモニウム等の無機塩等）を数当量〜大過剰量加えて単離、精製すればよい。
【０１２１】
本明細書の核酸複合体の中には、幾何異性体、光学異性体等の立体異性体、互変異性体等が存在し得るものもあるが、全ての可能な異性体およびそれらの混合物も本発明に包含される。
【０１２２】
また、本明細書の核酸複合体は、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもああり、これらの付加物も本発明に包含される。
【０１２３】
さらに、本発明の核酸複合体は、分子中の一部あるいは全部の原子が質量数の異なる原子（同位体）（例えば、重水素原子等）で置換されたものも包含される。
【０１２４】
本発明の核酸複合体の具体例を示す。ただし、本発明の核酸複合体は、これらに限定されるものではない。図中の帯状構造はオリゴヌクレオチドを表す。
【０１２５】
【化１０９】
2018004004.tif 000110
【０１２６】
【化１１０】
2018004004.tif 000111
【０１２７】
【化１１１】
2018004004.tif 000112
【０１２８】
【化１１２】
2018004004.tif 000113
【０１２９】
【化１１３】
2018004004.tif 000114
【０１３０】
【化１１４】
2018004004.tif 000115
【０１３１】
本発明の医薬組成物は、核酸複合体を含む。本発明の核酸複合体は、糖鎖リガンドが非還元末端にＯ結合マンノースを有することにより、標的細胞に認識され、細胞内に導入される。
本発明の核酸複合体は、哺乳動物に投与して、生体内において、標的遺伝子の発現を低下または停止させることで抑制し、標的遺伝子に関連する疾患の治療に用いることができる。
本発明の核酸複合体を治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、特に限定されるものではないが、例えば、静脈内投与、皮下投与及び筋肉内投与等が挙げられ、好ましくは静脈内投与である。
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路等によって異なるが、例えば二本鎖のオリゴヌクレオチドに換算した１日投与量が０．１μｇ〜１０００  ｍｇとなるように投与すればよく、１日投与量が１〜１００  ｍｇとなるように投与することがより好ましい
【０１３２】
静脈内投与または筋肉内投与に適当な製剤としては、例えば注射剤があげられ、調製した液剤をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該液剤から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該液剤を凍結乾燥して使用する、および／または例えばマンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトースもしくはグリシン等の賦形剤を加えた液剤を凍結乾燥して使用することもできる。
注射剤の場合、液剤または溶媒を除去または凍結乾燥した組成物に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理食塩水またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはＥＤＴＡ等の抗酸化剤、またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
【実施例】
【０１３３】
次に、実施例および試験例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例および試験例に限定されるものではない。なお、実施例に示されたプロトン核磁気共鳴スペクトル(1H NMR)は、270MHz、300MHzまたは400MHzで測定されたものであり、化合物および測定条件によっては交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。また、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いているが、brとは見かけ上幅広いシグナルであることを表す。【０１３４】
実施例1  リンカーユニットの合成1
化合物9合成
【化１１５】
2018004004.tif 000116
【０１３５】
工程1
5-ヒドロキシイソフタル酸ジメチル(化合物1, 和光純薬工業社製, 5.0443 g, 24 mmol)をテトラヒドロフラン(和光純薬工業社製25 mL)に溶解し、2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-1-エタノール（（東京化成工業社製, 4.0343 g, 25.03 mmol）、およびトリフェニルホスフィン ポリマー担持体（アルドリッチ社製, 6.61 g, 25.2 mmol）を加えた後、氷冷下、40％ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(DIAD)トルエン溶液 (東京化成工業社製, 13.26 mL, 25.2 mmol)を加え、室温にて一晩攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、ろ液を留去した後、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=95/5〜80/20)で精製することにより、化合物2(5.3071 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 254 (M + H)+, 脱Boc体として検出【０１３６】
工程2
工程1で合成した化合物2(5.3071 g, 15.02 mmol)をメタノール(25 mL)に溶解し、氷冷下、2mol/L水酸化ナトリウム水溶液(和光純薬工業社製, 13 mL)を加え、室温にて4時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 324 (M - H)-【０１３７】
工程3
工程2で合成した化合物3(0.9372 g, 2.8809 mmol)、βアラニンメチルエステル塩酸塩(東京化成工業株式会社製, 0.8082 g, 5.7902 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド(10 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(2.52 mL, 14.40 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (2.1908 g,  5.76 mmol)を加えて、室温にて終夜撹拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物4を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 496 (M + H)+【０１３８】
工程4
工程3で合成した化合物4(0.9622 g, 1.9518 mmol)を用い、ジクロロメタン(10 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸(2.5mL, 32.4 mmol)を加えて、室温にて2時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物5を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 396 (M + H)+【０１３９】
工程5
工程4で合成した化合物5(0.1146 g, 0.290 mmol)およびN-スクシンイミジル15-アジド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカン酸(N3-PEG4-NHS， 東京化成工業株式会社製, 0.0750 g, 0.1931 mmol)をテトラヒドロフラン(6 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(0.337 mL, 1.931 mmol)を加えて、室温にて2時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物6を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 669 (M + H)+【０１４０】
工程6
工程5で合成した化合物6(0.1291 g, 0.193 mmol)を用い、工程2と同様の方法で化合物7を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 641 (M + H)+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 2.35 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.51-2.54 (4H, m), 3.38-3.65 (24H, m), 4.07 (2H, t, J = 5.4 Hz), 7.51 (2H, br s), 7.89 (1H, br s), 8.13 (1H, dd, J = 5.3, 2.7 Hz), 8.63 (2H, t, J = 5.4 Hz)【０１４１】
工程7
工程6で合成した化合物7(0.1252 g, 0.193 mmol)およびL-グルタミン酸 ジ-tert-ブチルエステル(渡辺化学株式会社製, 0.1180 g, 0.399 mmol)を用い、工程3と同様の方法で化合物8(0.0521 g, 収率24%)を得た。
ESI-MS m/z: 1124 (M + H)+【０１４２】
工程8
工程7で合成した化合物8(0.0521 g, 0.0464 mmol)を用い、ジクロロメタン(2 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸(0.2 mL, 32.4 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物9を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 899 (M + H)+
1H -NMR (DMSO-D6) δ: 1.70-1.82 (2H, m), 1.90-2.02 (2H, m), 2.23-2.30 (4H, m), 2.35 (2H, t, J = 5.3 Hz), 2.44 (4H, t, J = 7.4 Hz), 3.38-3.65 (24H, m), 4.07 (2H, t, J = 5.3 Hz), 4.17-4.26 (2H, m), 7.51 (2H, d, J = 1.3 Hz), 7.89 (1H, br s), 8.13 (1H, dd, J = 10.0, 5.0 Hz), 8.21 (2H, d, J = 7.6 Hz), 8.57 (2H, t, J = 5.8 Hz)【０１４３】
実施例2  リンカーユニットの合成2
化合物19の合成
【化１１６】
2018004004.tif 000117
【０１４４】
工程9
実施例1の工程1で合成した化合物2(2.1 g, 5.940 mmol)を用い、実施例1の工程4と同様の方法で化合物10を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 254 (M + H)+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 3.26 (2H, t, J = 5.1 Hz), 3.90 (6H, s), 4.30 (2H, t, J = 5.1 Hz), 7.77 (2H, dd, J = 1.5, 0.8 Hz), 8.13 (1H, dd, J = 1.4, 0.7 Hz).【０１４５】
工程10
工程9で合成した化合物10 (0.427 g, 1.686 mmol)とオーガニック・アンド・バイオモレキュラー・ケミストリー (Organic & Biomolecular chemistry), 第13巻, 1778?1791頁, 2015年に記載された方法で合成した6-アジドヘキサン酸ピロリジニルエステル(0.6 g, 2.360 mmol)を用い、実施例1の工程5と同様の方法で化合物11(0.248 g, 収率38%)を得た。
ESI-MS m/z: 393 (M + H)+
1H-NMR (CDCl3) δ: 1.37-1.44 (2H, m), 1.64-1.69 (4H, m), 2.23 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.25 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.71 (2H, dd, J = 5.3, 2.7 Hz), 3.95 (6H, s), 4.13 (2H, t, J = 6.7 Hz), 7.75 (2H, dd, J = 1.5, 0.8 Hz), 8.30 (1H, dd, J = 1.4, 0.7 Hz).【０１４６】
工程11
工程10で合成した化合物11(0.248 g, 0.632 mmol)を用い、実施例1の工程2と同様の方法で化合物12を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 365 (M + H)+
1H-NMR (MeOD) δ: 1.37-1.41 (2H, m), 1.60-1.65 (4H, m), 2.25 (2H, t, J = 7.4 Hz), 3.25 (2H, t, J = 6.7 Hz), 3.63 (2H, t, J = 4.9 Hz), 4.18 (2H, t, J = 5.2 Hz), 7.79 (2H, dd, J = 1.6, 0.8 Hz), 8.27 (1H, dd, J = 1.4, 0.7 Hz).【０１４７】
工程12
工程11で得られた化合物12(0.230 mg, 0.631 mmol)をテトラヒドロフラン(274.7μL)に溶解し、N-ヒドロキシスクシイミド(0.174 g, 1.515 mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (0.313 g, 1.515 mmol)を加え、室温、アルゴン雰囲気下にて一晩撹拌した。減圧下で溶媒留去し、その後、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物13の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z： 559 (M + H)+【０１４８】
工程13
工程12で合成した化合物13(0.200 g, 0.358 mmol)、6-アミノヘキサン酸(ナカライテスク社製、0.141 g, 1.074 mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(0.139 mL, 1.074 mmol)を用い、リン酸緩衝液/ジメチルスルホキシド混合溶媒中 (v/v = 1/1, 50 mL)にて、室温で終夜攪拌した。反応液に10%クエン酸溶液(50 mL)を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することで化合物14(0.157 g, 収率74%)を得た。
ESI-MS m/z: 591 (M + H)+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.26-1.33 (8H, m), 1.51-1.53 (10H, m), 2.10 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.21 (4H, t, J = 7.4 Hz), 3.25 (8H, t, J = 6.5 Hz), 4.08 (2H, t, J = 5.4 Hz), 7.48-7.51 (2H, br m), 7.87-7.89 (1H, br m), 8.07-8.08 (1H, br m), 8.53-8.54 (2H, br m).【０１４９】
工程14
工程13で合成した化合物14(0.1442 g, 0.2441 mmol)を用い、工程12と同様の方法で化合物15を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 785 (M + H)+【０１５０】
工程15
工程14で合成した化合物15(0.0958 g, 0.1221 mmol)を用い、工程13と同様の方法で化合物16を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 818 (M + H)+【０１５１】
工程16
1)化合物17の合成
工程12で合成した化合物13(0.0209 g, 0.0375 mmol)とカルボキシル-(12エチレングリコール)エチルアミン(サーモサイエンティフィック社製, 0.0674 g, 0.1091 mmol)を用い、工程13と同様の方法で化合物17(0.0580 g, 収率99%)を得た。
ESI-MS m/z: 1564 (M + H)+
2)化合物18の合成
工程12で合成した化合物13(0.0047 g, 0.00654 mmol)とカルボキシル-(24エチレングリコール)エチルアミン(サーモサイエンティフィック社製,0.0225 g, 0.01963 mmol)を用い、工程13と同様の方法で化合物18(0.0144 g, 収率79%)を得た。
ESI-MS m/z: 2622 (M + H)+【０１５２】
工程17
1)化合物19の合成
工程16で合成した化合物17(0.0580 g, 0.0375 mmol)を用い、工程12と同様の方法で化合物19を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1759 (M + H)+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.22-1.25 (6H, m), 2.10 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.81 (8H, br s), 2.93 (4H, t, J = 6.1 Hz), 3.26-3.27 (6H, m), 3.43-3.45 (2H, m), 3.49-3.50 (92H, m), 3.71 (4H, t, J = 6.0 Hz), 4.07 (2H, t, J = 6.0 Hz), 7.53 (2H, dd, J = 1.5, 0.8 Hz), 7.93 (1H, dd, J = 1.5, 0.8 Hz), 8.05-8.07 (1H, br m), 8.59-8.61 (2H, br m).
2)化合物20の合成
工程16で合成した化合物18(0.0580 g, 0.0375 mmol)を用い、工程12と同様の方法で化合物20を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 2817 (M + H)+【０１５３】
実施例3  リンカーユニットの合成3
化合物22の合成
【化１１７】
2018004004.tif 000118
【０１５４】
工程18
(a)；実施例2の工程12で合成した化合物13(10 mg, 17.9 μmol)をテトラヒドロフラン(90 μL)とリン酸緩衝液 (90 μL)との混合溶液に溶解し、カルボキシル-(12オリゴエチレングリコール)エチルアミン(サーモサイエンティフィック社製,22.1 mg, 35.8 μmol)を加え、室温、アルゴン雰囲気下にて1h撹拌した。減圧下で溶媒留去し、その後、クロロホルム、10%クエン酸水溶液にて抽出した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物17の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z： 1564 (M+H)+
(b)；実施例2の工程12で合成した化合物13(10 mg, 17.9 μmol)をテトラヒドロフラン(90 μL)とリン酸緩衝液 (90μL)との混合溶液に溶解し、カルボキシル-(24オリゴエチレングリコール)エチルアミン(サーモサイエンティフィック社製,41 mg, 35.8μmol)を加え、室温、アルゴン雰囲気下にて1h撹拌した。減圧下で溶媒留去し、その後、クロロホルム、10%クエン酸水溶液にて抽出した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物18の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z： 2622 (M + H)+【０１５５】
工程19
(a)；工程18で合成した化合物17(14 mg, 8.9 μmol)をテトラヒドロフラン(90μL)に溶解し、L-グルタミン酸 ジ-tert-ブチルエステル(渡辺化学株式会社製, 5.2 mg, 17.9 μmol)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (6.8 mg, 17.9 μmol)、ジイソプロピルエチルアミン(3.1 μL, 17.9μmol)を加え、室温でアルゴン雰囲気下、一晩撹拌した。減圧下で溶媒留去し、その後、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。その後、逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製し、化合物21a (4.5 mg, 収率25%)を得た。
ESI-MS m/z： 2046 (M + H)+
1H-NMR (CDCl3) δ: 1.44-1.46 (36H, m), 1.61-1.66 (4H, m), 1.89-1.91 (4H, m), 2.06-2.16 (2H, m), 2.20-2.37 (6H, m), 2.50 (4H, t, J = 6.0 Hz), 3.26 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.59-3.68 (98H, m), 3.71-3.76 (4H, m), 4.14 (2H, t, J = 5.2 Hz), 4.48-4.50 (2H, m), 7.59 (2H, dd, J = 1.3, 0.6 Hz), 7.92 (1H, br s).
(b)；工程18で合成した化合物18(23.4 mg, 8.9 μmol)をテトラヒドロフラン(90 μL)に溶解し、L-グルタミン酸α,γ-ジ(t-ブチルエステル)塩酸塩(5.2 mg, 17.9 μmol)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩(6.8 mg, 17.9 μmol)、ジイソプロピルエチルアミン(3.1 μL, 17.9 μmol)を加え、室温でアルゴン雰囲気下、一晩撹拌した。減圧下で溶媒留去し、その後、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。その後、逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製し、化合物21b(7.4 mg, 収率27%)を得た。
ESI-MS m/z： 1553 (M - 2H)2-
1H-NMR (CDCl3) δ: 1.44 (18H, s), 1.46 (18H, s), 1.62-1.67 (4H, m), 1.86-1.89 (2H, m), 2.20-2.36 (10H, m), 2.51 (4H, t, J = 5.8 Hz), 3.26 (2H, t, J = 7.0 Hz), 3.63-3.65 (194H, m), 3.73-3.76 (4H, m), 4.14 (2H, t, J = 5.1 Hz), 4.46-4.50 (2H, m), 7.60 (2H, dd, J = 1.0, 0.5 Hz), 7.92 (1H, br s)【０１５６】
工程20
(a)；工程19で合成した化合物21a(4.5 mg, 2.1 μmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法により化合物22aを定量的に得た。
ESI-MS m/z： 1822 (M + H)+
(b)；工程19で合成した化合物21b(4.5 mg, 2.1 μmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法により化合物22bを定量的に得た。
ESI-MS m/z： 2878 (M + H)+【０１５７】
実施例4  リンカーユニットの合成4
化合物26の合成
【化１１８】
2018004004.tif 000119
【０１５８】
工程21
実施例2の工程11で合成した化合物12(10 mg, 27.4 μmol)をテトラヒドロフラン(274.7 μmol)に溶解し、L-グルタミン酸 ジ-tert-ブチルエステル(渡辺化学株式会社製, 32.5 mg, 109.8 μmol)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩(41.7 mg, 109.8 μmol)、ジイソプロピルエチルアミン(24.2 μL, 137.3 μmol)を加え、室温でアルゴン雰囲気下、一晩撹拌した。減圧下で溶媒留去し、その後、クロロホルム、10%クエン酸水溶液にて抽出した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物23の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z： 847 (M + H)+【０１５９】
工程22
工程21で合成した化合物23(139.4 mg, 164.6 μmol)を塩化メチレン(1.3 mL)およびトリフルオロ酢酸(0.3 mL)に溶解し、室温で一晩撹拌した。減圧下で溶媒留去し、化合物24を定量的に得た。
ESI-MS m/z： 623 (M + H)+【０１６０】
工程23
工程22で合成した化合物24(100 mg, 160.7 μmol)をジメチルアミン(1 mL)に溶解し、N-ヒドロキシスクシイミド (81.3 mg, 707 μmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(135.4 mg, 707 μmol)を加え、室温、アルゴン雰囲気下にて一晩撹拌し、化合物25の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1011 (M + H)+【０１６１】
工程24
(a)；工程23で合成した化合物25(16.2 mg, 16 μmol)をリン酸緩衝液(95 μL)に溶解し、カルボキシル-(エチレングリコール)エチルアミン(80.4 mg, 129.8 μmol)を加え、室温、アルゴン雰囲気下にて1h撹拌した。減圧下で溶媒留去し、逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製し、化合物26a(6.2 mg, 収率21%)を得た。
ESI-MS m/z: 1511 (M + 2H)2+
(b)；工程23で合成した化合物25(16.2 mg, 16 μmol)をリン酸緩衝液 (95 μL)に溶解し、カルボキシル-(エチレングリコール)エチルアミン(149.3 mg, 129.8 μmol)を加え、室温、アルゴン雰囲気下にて1h撹拌した。減圧下で溶媒留去し、逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製し、化合物26b(5.5 mg, 収率11%)を得た。
ESI-MS m/z: 2566 (M + 2H)2+【０１６２】
実施例5  糖鎖リガンド−リンカーユニットの合成1
化合物27,28の合成
【化１１９】
2018004004.tif 000120
【０１６３】
工程25
実施例1の工程6で合成した化合物7(0.8 mg, 1.249 μmol)、エーシーエス・ケミカル・バイオロジー (ACS Chemical Biology), 第5巻, 301?312頁, 2010年に記載された方法で合成したアミノエチル基が修飾されたα(1,2)α(1,6)シュードマンノトリオース (3.0 mg, 5.0 μmol)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (3.8 mg, 10 μmol)、ジイソプロピルエチルアミン (1.7 μL, 10 μmol)をN,N-ジメチルアセトアミド (1 mL)に溶解し、室温で二日間静置した。混合物を、逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製し、化合物25(1.6 mg, 収率71%)を得た。
ESI-MS m/z: 1802 (M - H)-【０１６４】
工程26
実施例1の工程8で合成した化合物9(0.9 mg, 1.04 μmol)、工程25に記載のα(1,2)α(1,6)シュードマンノトリオース (8.34 g, 8.34 μmol)を用い、工程25と同様の方法で化合物26(2.3 mg, 収率68%)を得た。
ESI-MS m/z: 1611 (M - 2H)2-【０１６５】
実施例6  糖鎖リガンド−リンカーユニットの合成2
化合物29,30,31,32,33の合成
【化１２０】
2018004004.tif 000121
【０１６６】
工程27
実施例2の工程12で合成した化合物13(0.6 mg, 0.00111 mmol)および実施例5の工程25に記載のα(1,2)α(1,6)シュードマンノトリオース(2.0 mg, 0.00334 mmol)を用い、実施例2の工程13と同様の方法で化合物29(1.1 mg, 収率65%)を得た。
ESI-MS m/z: 1528 (M + H)+【０１６７】
工程28
実施例2の工程13で合成した化合物14(0.66 mg, 0.00111 mmol)を用い、実施例5の工程25と同様の方法で化合物30 (0.3 mg, 収率15%)を得た。
ESI-MS m/z: 1754 (M + H)+【０１６８】
工程29
実施例2の工程15で合成した化合物16(0.91 mg, 0.00111 mmol)を用い、実施例5の工程25と同様の方法で化合物31 (0.4 mg, 収率18%)を得た。
ESI-MS m/z: 1981 (M + H)+【０１６９】
工程30
実施例2の工程17で合成した化合物19(1.95 mg, 0.00111 mmol)を用い、実施例2の工程13と同様の方法で化合物32(0.5 mg, 収率17%)を得た。
ESI-MS m/z: 2728 (M + H)+【０１７０】
工程31
実施例2の工程16で合成した化合物18(2.91 mg, 0.00111 mmol)を用い 、実施例5の工程25と同様の方法で化合物33 (2.2 mg, 収率52%)を得た。
ESI-MS m/z: 1892 (M + 2H)2+【０１７１】
実施例7  糖鎖リガンド−リンカーユニットの合成3
化合物34,35の合成
【化１２１】
2018004004.tif 000122
【０１７２】
工程32
(a)；実施例3の工程20で得られた化合物22a(2 mg, 1.1 μmol)を用い、実施例5の工程25と同様の方法で化合物34a(2 mg, 収率44%)を得た。
ESI-MS m/z: 2073 (M - 2H)2-
(b)；実施例3の工程20で得られた化合物22a(3.1 mg, 1.1 μmol)を用い、実施例5の工程25と同様の方法で化合物34b(1.8 mg, 収率37%)を得た。
ESI-MS m/z: 2601 (M - 2H)2-【０１７３】
工程33
(a)；実施例4の工程24で得られた化合物26a(3.1 mg, 1.1 μmol)を用い、実施例5の工程25と同様の方法で化合物35a(3 mg, 収率55%)を得た。
ESI-MS m/z;；2671 (M - 2H)2-
(b)；実施例4の工程24で得られた化合物26b(2.7 mg, 0.5 μmol)を用い、実施例5の工程25と同様の方法で化合物35b(2.2 mg, 収率56%)を得た。
ESI-MS m/z； 2486 (M - 2H)2-【０１７４】
比較例1  糖鎖リガンド−リンカーユニットの合成4
化合物38の合成
【化１２２】
2018004004.tif 000123
【０１７５】
工程34
ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958?16961頁, 2014年に記載された方法で合成した化合物36 (0.9602 g, 2.1460 mmol)をN,N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、N-Boc-エチレンジアミン （シグマアルドリッチ社製, 0.6877 g, 4.292 mmol）、ジイソプロピルエチルアミン (1.90 mL, 10.87 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩 (和光純薬工業社製, 1.6437 g, 4.3229 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで2回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物37の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 590 (M + H)+【０１７６】
工程35
工程34で合成した化合物37 (1.2654 g, 2.1460 mmol)をジクロロメタン (15 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸 (4 mL)を加えて、室温にて一晩攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、逆相カラムクロマトグラフィー (水/メタノール=80/20)で溶出させることにより、化合物38(0.3879 g, 収率37 %)を得た。
ESI-MS m/z: 490 (M + H)+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.46-1.52 (4H, m), 1.78 (3H, s), 1.90 (3H, s), 2.00 (3H, s), 2.08 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.11 (3H, s), 2.85 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.27 (2H, dd, J = 12.3, 6.2 Hz), 3.67-3.69 (1H, m), 3.68-3.73 (1H, m), 3.86-3.90 (1H, m), 4.01-4.04 (3H, m), 4.49 (1H, d, J = 8.4 Hz), 4.97 (1H, dd, J = 11.3, 3.4 Hz), 5.22 (1H, d, J = 3.5 Hz), 7.86 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.95-8.02 (1H, m).【０１７７】
比較例2  糖鎖リガンド−リンカーユニットの合成5
【化１２３】
2018004004.tif 000124
【０１７８】
化合物39の合成
工程36
実施例1の工程6で合成した化合物7(4.36 mg, 0.006 mmol)、比較例1の工程35で合成した化合物38(10 mg, 0.02 mmol) を用い、実施例5の工程25と同様の方法で化合物39 (7 mg, 収率65%)を得た。
ESI-MS m/z: 1581 (M - H)-【０１７９】
化合物40の合成
工程37
実施例1の工程8で合成した化合物9(10 mg, 0.011 mmol))、比較例1の工程35で合成した化合物38(43.9 mg, 0.090 mmol) を用い、実施例5の工程25と同様の方法で化合物39 (22 mg, 収率72%)を得た。
ESI-MS m/z: 2785 (M - 2H)2-【０１８０】
実施例8  核酸複合体の合成1
【化１２４】
2018004004.tif 000125
【０１８１】
工程38
モレキュールズ(Molecules), 第17巻, 13825-13854頁, 2012年に記載された方法で合成した末端結合性官能基化した化合物41を用いて、エーシーエスナノ(ACS nano)、第9巻、9652-9664頁、2015年に記載された方法により化合物42を得た。【０１８２】
工程39
Symmetric Doubler Phosphoramidite(Glen Research社製, カタログ番号 10-1920-90)を用い  モレキュールズ(Molecules), 第17巻, 13825-13854頁, 2012年に記載された方法で合成した末端結合性官能基化した化合物43にN-スクシイミジル3-(2-ピリジルジチオール)プロピオネートのジメチルスルホキシド溶液を加え、リン酸緩衝液中で室温、4時間静置した。反応溶液にジチオトレイトールを添加し、室温で一晩静置した。混合物をゲルろ過処理(Napカラム、GEヘルスケア社製、溶出溶媒; 20mmol/L酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液 (pH5.0)および限外ろ過を行うことで化合物44を得た。【０１８３】
工程40
ジベンゾサイクロオクチン-N-ヒドロキシスクシイミドエステルを用い、工程39と同様の方法で化合物45を得た。
【化１２５】
2018004004.tif 000126
【０１８４】
工程41
ACSケミカルバイオロジー、第5巻、3号、301-312頁, 2010年に記載された方法で合成した化合物46に実施例8の工程38で合成した化合物42を加えて、室温にて1時間静置した。陰イオン交換クロマトグラフィー(GE Healthcare, MonoQ 5/50GL, 10μm, 5.0 mm x 50 mm、A液： 10mM Tris緩衝液/30%アセトニトリル, B液: 10mM Tris緩衝液/30%アセトニトリル/1M NaBrによるグラジエント)あるいは逆相液体クロマトグラフィー (ウォーターズ, X BridgeC18, 5μm, 4.6 mmx250 mm、0.1M酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液, B液:アセトニトリルによるグラジエント)のいずれかの方法で精製する事により、1本鎖の核酸複合体47を得た。
表1の化合物群もしくはバイオコンジュゲートケミストリー(Bioconjugate Chemistry), 第14巻, 232-238頁、2003年に記載された方法で合成した糖鎖マレイミド付加体に、モレキュールズ(Molecules), 第17巻, 13825-13854頁, 2012年に記載された方法で合成した末端結合性官能基化したチオール核酸、化合物42、44もしくは45を用い、同様の方法により表2の核酸複合体を得た。【０１８５】
表1
【表１】
2018004004.tif 000127
【表２】
2018004004.tif 000128
【０１８６】
表2
【表３】
2018004004.tif 000129
【０１８７】
【表４】
2018004004.tif 000130
【０１８８】
本実施例により合成した核酸複合体における核酸の配列および質量分析結果を表3aおよび表3bに示す。なお、表３aおよび表３bにおける「化合物」欄の記載は、［表中の化合物番号］_［核酸おけるリガンド等が結合する位置］_［核酸複合体における核酸配列の略号］-［核酸の種類（ASOまたはssRNA）］を示す。【０１８９】
表3a
【表５】
2018004004.tif 000131
【０１９０】
表3b
【表６】
2018004004.tif 000132
【０１９１】
表中、nはDNAを、N(M)は2’-O-メチル修飾RNAを、N(F)は2’-フッ素修飾RNAを、N(L)はLNAを、5(L)はLNAmCを、^はホスホロチオエート修飾を、ssはセンス鎖を、asはアンチセンス鎖を、太文字番号は実施例中の化合物番号に相当する修飾基をそれぞれ示す。以下、各表において同様である。【０１９２】
工程38
工程41で合成した1本鎖の核酸複合体は、混合緩衝液（100 mmol/L酢酸カリウム、30 mmol/L 2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸、HEPES)-KOH(pH 7.4)、2 mmol/L酢酸マグネシウム）にて濃度調整（50 μmol/L）した。センス鎖とアンチセンス鎖（50 μmol/L）を各々等量混合し、80℃で10分間静置した。アンチセンス鎖配列は、表2に記載されている通りである。徐々に温度を下げ、37℃で1時間静置し、2本鎖の核酸複合体を得た。
本実施例により合成した核酸複合体を表4に示し、核酸複合体における核酸の配列を表5に示す。なお、表5における「化合物欄」の記載は、［表中の化合物番号］_［核酸複合体における核酸配列の略号］−［核酸の種類（siRNA）］を示し、また「一本鎖名称」欄の記載おいて、センス鎖（ss）は［表中の化合物番号］_［核酸おけるリガンド等が結合する位置］_［核酸複合体における核酸配列の略号］-［核酸の種類（ssRNA）］を示し、アンチセンス鎖（as）は［核酸複合体における核酸配列の略号］−［核酸の種類（as-RNA）］をそれぞれ示す。【０１９３】
表4
【表７】
2018004004.tif 000133
【０１９４】
【表８】
2018004004.tif 000134
【０１９５】
表5
【表９】
2018004004.tif 000135
【０１９６】
比較例3  核酸複合体の合成2
工程43
比較例2の工程36および37で合成した化合物39および40に実施例8の工程37で合成した化合物42を添加し、室温にて1時間静置した。反応混合物に炭酸ナトリウムを加え、4℃で一晩静置した。実施例8の工程41と同様の方法で精製する事により、表6の核酸複合体を得た。【０１９７】
表6
【表１０】
2018004004.tif 000136
【０１９８】
本比較例により合成した核酸複合体における核酸の配列および質量分析結果を表7aおよび表7bに示す。なお、表７aおよび表7bにおける「化合物欄」の記載は、［表中の化合物番号］_［核酸おけるリガンド等が結合する位置］_［核酸複合体における核酸配列の略号］_［核酸の種類（ASOまたはssRNA）］を示す。【０１９９】
表7a
【表１１】
2018004004.tif 000137
【０２００】
表7b
【表１２】
2018004004.tif 000138
【０２０１】
工程40
工程43で合成した1本鎖の糖鎖複合体は、実施例8の工程42と同様の方法で2本鎖の糖鎖複合体を得た。
本比較例により合成した核酸複合体を表8に示し、核酸複合体における核酸の配列を表9に示す。なお、表９における「化合物欄」の記載は、［表中の化合物番号］_［核酸複合体における核酸配列の略号］_［核酸の種類（siRNA）］を示し、また「一本鎖名称」欄の記載おいて、センス鎖（ss）は［表中の化合物番号］_［核酸おけるリガンド等が結合する位置］_［核酸複合体における核酸配列の略号］-核酸の種類（ssRNA）を示し、アンチセンス鎖（as）は［核酸複合体における核酸配列の略号］−[核酸の種類（as-RNA）]をそれぞれ示す。【０２０２】
表8
【表１３】
2018004004.tif 000139
【０２０３】
表9
【表１４】
2018004004.tif 000140
【０２０４】
実施例9  糖鎖リガンド−リンカーユニットの合成6
【化１２６】
2018004004.tif 000141
【０２０５】
工程42
実施例1の工程1で合成した化合物2 (8.17 g, 23.12 mmol)を用い、実施例1の工程4と同様の方法で化合物75を(3.7 g, 14.63 mmol, 収率63%)得た。
ESI-MS m/z: 254 (M + H)+ 【０２０６】
工程43
実施例9の工程42で合成した化合物75 (3.70 g, 14.63 mmol)をテトラヒドロフラン (10 mL)に溶解し、氷冷下、塩化ベンゾイル (4.12 mL, 29.3  mmol)を加えて、室温にて1時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物76 (3.82 g, 9.86 mmol, 収率67%)を得た。
ESI-MS m/z: 432 (M + HCOO)-【０２０７】
工程44
実施例9の工程43で合成した化合物76 (3.82 g, 9.86 mmol)を用い、実施例1の工程2と同様の方法で化合物77を(3.07 g, 8.56 mmol, 収率87%)得た。
ESI-MS m/z: 360 (M + H)+【０２０８】
工程45
実施例9の工程44で合成した化合物77 (213 mg, 0.592 mmol)およびイミノ二酢酸ジ-tert-ブチルエステル (375 mg, 1.529 mmol)を用い、実施例1の工程7と同様の方法で化合物78を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 858 (M + HCOO)- 【０２０９】
工程46
STEP1: 実施例9の工程45で合成した化合物78 (482 mg, 0.593 mmol)を用い、をメタノール (10 mL)に溶解し、パラジウム/炭素による接触水素還元を行った。得られた溶液留分を減圧下、溶媒を留去をした。
STEP2: 得られた粗生成物を用い、実施例2の工程9と同様の方法でアルキルアジド基を有するカップリング化合物を得た。
STEP3: STEP2で得られた化合物を用い、実施例１の工程8と同様の方法で化合物79 (238 mg,収率92%)を得た。
ESI-MS m/z: 595 (M + H)+【０２１０】
工程47
実施例9の工程46で合成した化合物79 (0.8 mg, 1.346 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物80を(1.3 mg, 0.445 μmol,)得た。
ESI-MS m/z: 2918 (M - H)- 【０２１１】
実施例10  糖鎖リガンド−リンカーユニットの合成7
【化１２７】
2018004004.tif 000142
【０２１２】
工程48
1,3-ジヒドロキシ2-アミノプロパン81 (東京化成工業社製, 0.55 g, 6.03 mmol)をジメチルスルホキシド(15 mL)に溶解し、氷冷下、水酸化ナトリウム水溶液(2 mmol/L, 3 mL)を加えた後、ジメチルスルホキシド(2.2  mL)に溶解したアクリル酸tert-ブチルエステル (1.93 g, 15.07 mmol)を徐々に添加し、室温で４時間反応した。混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール= 98/2 ⇒ 90/10)で精製することにより、化合物82 (0.74 g, 収率35%)を得た。
ESI-MS m/z: 348 (M + H)+【０２１３】
工程49
実施例10の工程48で合成した化合物82 (0.150 g, 0.433 mmol)を用い、実施例1の工程7と同様の方法で化合物83を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1062 (M + HCOO)-【０２１４】
工程50(Zの脱保護、アルキルアジドのアミド化、TFAの脱保護)
実施例10の工程49で合成した化合物83 (0.149 g, 0.147 mmol)を用い、実施例9の工程46と同様の方法で化合物84を(91.4 mg, 0.114 mmol, 収率67%)得た。
ESI-MS m/z: 799 (M + H)+ 【０２１５】
工程51
実施例10の工程51で合成した化合物84 (1.3 mg, 1.4 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物85を(2.4 mg, 0.768 μmol, 収率54.9%)得た。
ESI-MS m/z: 1562 (M + 2H) 2+ 【０２１６】
実施例11  糖鎖リガンドーリンカーユニットの合成８
【化１２８】
2018004004.tif 000143
【０２１７】
工程52
3,5-ジヒドロキシ安息香酸86（東京化成工業社製, 2.11 g, 13.69 mmol）をN, N’-ジメチルホルムアミド（35 mL）に溶解し、炭酸水素カリウム（1.716 g, 17.14 mmol）および臭化ベンジル（3.51 g, 2.439 mL, 20.54 mmol）を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウムを加え、ジクロロメタンで抽出した後、有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=50/50）で精製することにより、化合物87を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 245 (M + H)+ 【０２１８】
工程53
工程52で合成した化合物87（3.34 g, 13.69 mmol）をN, N’-ジメチルホルムアミド（40 mL）に溶解し、炭酸カリウム（7.57 g, 54.8 mmol）およびtert-ブチルブロモ酢酸（4.42 mL, 30.1 mmol）を加え、90℃で4時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウムを加え、ジクロロメタンで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=75/25）で精製することにより、化合物88（5.67 g, 収率88%）を得た。
ESI-MS m/z: 471 (M - H)- 【０２１９】
工程54
工程53で合成した化合物88（5.67 g, 12.00 mmol）をジクロロメタン（40 mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（10 mL, 130.0 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物89の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 359 (M - H)- 【０２２０】
工程55
イミノ二酢酸ジ-tert-ブチルエステル (0.407 g, 1.660 mmol)および実施例11の工程54で合成した化合物89 (0.239 g, 0.664 mmol)を用い、実施例1の工程7と同様の方法で化合物90を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 813 (M - H)-【０２２１】
工程56
[STEP1] 実施例11の工程55で合成した化合物90 (541 mg, 0.664 mmol)を用い、メタノール (8 mL)に溶解し、パラジウム/炭素による接触水素還元を行った。得られた溶液留分を減圧下、溶媒を留去をした。
[STEP2] 得られた粗生成物および3-アジドプロパン-1-アミン(0.101 g, 1.009 mmol)を用い、実施例1の工程7と同様の方法ででカップリング化合物を得た。
STEP3: 得られた化合物引退して粗生成物を用い、実施例１の工程8と同様の方法で化合物91を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 583 (M + H)+【０２２２】
工程57
実施例10の工程50で合成した化合物84 (2.0 mg, 1.476 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物92を(2.0 mg, 収率47%)得た。
ESI-MS m/z: 1456 (M + 2H) 2+【０２２３】
実施例12  糖鎖リガンドーリンカーユニットの合成９
【化１２９】
2018004004.tif 000144
【０２２４】
工程58
実施例9の工程44で合成した化合物77(63 mg, 0.175 mmol)をジクロロメタン(5 mL)に溶解し、トリエチルアミン(0.24 mL, 1.75 mmol)を加えた後にペンタフルオロフェニル-2,2,2-トリフルオロ酢酸(0.119 mL, 0.699 mmol)を加えて、室温で４時間撹拌した。混合物にクロロホルム添加し、有機層を10%クエン酸水溶液、飽和食塩水、および炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することで化合物93を定量的に取得した。
ESI-MS m/z:(モノエステル体（PEPが一つ付加した化合物）として検出) 524 (M - H)-【０２２５】
工程59
実施例12の工程58で合成した化合物93 (0.121 g, 0.175 mmol)をジメチルスルホキシド (8 mL)に溶解し、カルボキシル-(12オリゴエチレングリコール)エチルアミン(0.510 g, 0.444 mmol)を加え、室温、アルゴン雰囲気下にて1h撹拌した。減圧下で溶媒留去し、その後、クロロホルム、10%クエン酸水溶液にて抽出した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物94の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z： 2614 (M-H)- 【０２２６】
工程60
実施例12の工程59で合成した化合物94 (0.333 g, 0.092 mmol)を用い、実施例1の工程7と同様の方法で化合物95を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1537 (M + 2H)2+【０２２７】
工程61
実施例12の工程60で合成した化合物95 (0.138 g, 0.045 mmol)を用い、実施例9の工程42と同様の方法で化合物96を(0.0825 g, 収率58%)得た。
ESI-MS m/z: 1426 (M + 2H)2+【０２２８】
工程62
実施例12の工程61で合成した化合物96 (4.2 mg, 14.04 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物97を(2.1 mg, 収率29%)得た。
ESI-MS m/z: 2590 (M + 2H) 2+【０２２９】
実施例13  糖鎖リガンドーリンカーユニットの合成１０
【化１３０】
2018004004.tif 000145
【０２３０】
工程63
実施例12の工程59で合成した化合物94 (0.189 g, 0.052 mmol)および実施例10 の工程48で合成した化合物 82(0.051 g, 0.148 mmol)を用い、実施例1の工程7と同様の方法で化合物98を(0.087 g, 収率51%)得た。
ESI-MS m/z: 1639 (M + 2H) 2+【０２３１】
工程64
実施例13の工程63で合成した化合物98 (0.087 g, 0.027 mmol)を用い、実施例9の工程42と同様の方法で化合物99を(38.5 mg,収率43%)得た。
ESI-MS m/z: 1529 (M + 2H) 2+ 【０２３２】
工程65
実施例13の工程64で合成した化合物99 (4.7 mg, 1.403 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物100を(2.4 mg,収率32%)得た。
ESI-MS m/z: 2689 (M + 2H)2+ 【０２３３】
実施例14  糖鎖リガンドーリンカーユニットの合成１１
【化１３１】
2018004004.tif 000146
【０２３４】
工程66
[STEP1] 実施例11の工程54で合成した化合物86(0.0678 g, 0.1888 mmol)を用い、実施例12の工程58と同様の方法により活性エステル体を取得した。
[STEP2] STEP１より取得した活性エステル(0.1283 g, 0.185 mmol)を用い、実施例12  の工程59と同様の方法により化合物101(0.2819 g, 0.108 mmol, 収率58.1%)を取得した。
ESI-MS m/z: 2615 (M - H)- 【０２３５】
工程64
実施例14の工程66で合成した化合物101 (0.282 g, 0.108 mmol)を用い、実施例9の工程45と同様の方法で化合物102(0.085 g, 0.028 mmol, 収率26%)を得た。
ESI-MS m/z:( tBu基が脱離した状態で検出) 712 (M + 4H)4+ 【０２３６】
工程64
実施例14の工程67で合成した化合物102 (84.5 mg, 0.028 mmol)を用い、実施例11の工程56と同様の方法で化合物103を(57.9 mg,収率66%)得た。
ESI-MS m/z: 2837 (M - H)-【０２３７】
工程69
実施例14の工程69で合成した化合物103 (4.8 mg, 1.528 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物104(2.6 mg,収率33%)を得た。
ESI-MS m/z: 2584 (M + 2H) 2+ 【０２３８】
実施例15  糖鎖リガンドーリンカーユニットの合成１２
【化１３２】
2018004004.tif 000147
【０２３９】
工程70
[STEP1] 実施例11の工程54で合成した化合物86(4 mg, 0.011 mmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法でリガンド付加した化合物を(6.0 mg,収率36%)取得した。
[STEP2] STEP１より取得した化合物(6.0 mg, 3.94 μmol)を用い、実施例9  工程42のSTEP1と同様の方法により化合物105(5.6 mg,収率99%)を取得した。
ESI-MS m/z: 1522 (M - H)-【０２４０】
実施例16  糖鎖リガンドーリンカーユニットの合成１３
【化１３３】
2018004004.tif 000148
【０２４１】
工程71
実施例14の工程67で合成した化合物99 (0.204 g, 0.067 mmol)を用い、実施例9の工程45と同様の方法で化合物106を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 2846 (M - H)-【０２４２】
工程72
実施例16の工程71で合成した化合物106 (16.7 mg, 5.22 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物107(6.3 mg,収率23%)を得た。
ESI-MS m/z: 2586 (M - H)-【０２４３】
工程73
実施例16の工程72で合成した化合物107(6.3 mg, 1.218 μmol)を用い、実施例9  工程46のSTEP1と同様の方法により化合物108(5.6 mg,収率90%)を取得した。
ESI-MS m/z: 2540 (M - 2H) 2- 【０２４４】
実施例17  糖鎖リガンドーリンカーユニットの合成１４
【化１３４】
2018004004.tif 000149
【０２４５】
工程74
国際公開2009/073809号に記載された方法で合成した化合物109(0.209 g, 0.414 mmol)を用いて、実施例2の工程9と同様の方法により化合物110(0.116 g,収率43%)を取得した。
ESI-MS m/z: 645 (M + H)+【０２４６】
工程75
実施例17の工程74で合成した化合物110 (0.116 g, 0.179 mmol)を用い、実施例9の工程44と同様の方法で化合物111を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 477 (M + H)+【０２４７】
工程76
実施例17の工程75で合成した化合物111 (1.1 mg, 1.821 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物112(1.6 mg,収率40%)を得た。
ESI-MS m/z: 2219 (M - H)-【０２４８】
実施例18  糖鎖リガンドーリンカーユニットの合成１５
【化１３５】
2018004004.tif 000150
【０２４９】
工程77
実施例17の工程75で合成した化合物111 (30 mg, 0.05 mmol)を用い、実施例14の工程62と同様の方法で化合物113(88.2 mg,収率43%)を得た。
ESI-MS m/z: 1930 (M - 2H) 2-【０２５０】
工程78
実施例18の工程77で合成した化合物113 (8.1 mg, 2.098 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物114(5.9 mg,収率50. %)を得た。
ESI-MS m/z: 2801 (M - 2H)2-【０２５１】
実施例19  糖鎖リガンドーリンカーユニットの合成１６
【化１３６】
2018004004.tif 000151
【０２５２】
工程79
イミノ二酢酸ジ-tert-ブチルエステル115(東京化成工業社製, 0.197 g, 0.803 mmol)を用いて、実施例2の工程9と同様の方法により化合物116を定量的に取得した。
ESI-MS m/z:[ tBu基が脱離した状態で検出] 273 (M + H)+【０２５３】
工程80
実施例19の工程79で合成した化合物116 (0.309 g, 0.803 mmol)を用い、実施例9の工程45と同様の方法で化合物117を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 273 (M + H)+【０２５４】
工程81
実施例17の工程76で合成した化合物117 (1.2 g, 2.62 mmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物118(1.1 mg, 0.766 mmol, 収率29%)を得た。
ESI-MS m/z: 1436 (M + H)+【０２５５】
実施例20  糖鎖リガンドーリンカーユニットの合成１７
【化１３７】
2018004004.tif 000152
【０２５６】
工程82
実施例10の工程47で合成した化合物82 (0.159 g, 0.459 mmol)を用いて、実施例2の工程9と同様の方法により化合物119(0.096 g, 0.197 mmol, 収率43%)を取得した。
ESI-MS m/z: 487 (M + H)+【０２５７】
工程83
実施例20の工程82で合成した化合物119 (96 mg, 0.197 mmol)を用い、実施例9の工程41と同様の方法で化合物120を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 375 (M + H)+【０２５８】
工程84
実施例20の工程83で合成した化合物120 (1.0 mg, 2.55 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物121(2.6 mg,収率66%)を得た。
ESI-MS m/z: 1539 (M + H)+【０２５９】
実施例21  糖鎖リガンドーリンカーユニットの合成１８
【化１３８】
2018004004.tif 000153
【０２６０】
工程85
ケミストリー ヨーロピアンジャーナル(Chemistry European Journal), 第19巻, 4786-4797頁, 2013年に記載された方法で合成した化合物122 (1 g, 0.914 mmol)および4-(アミノメチル)フェノール塩酸塩(0.362 g, 2.287 mmol)を用い、前述記載の文献方法により化合物123(0.22 g, 収率23%)を得た。
ESI-MS m/z: 1062 (M + H)+ 【０２６１】
工程86
実施例21の工程85で合成した化合物123(0.2 g, 0.191 mmol)を25%アンモニア水溶液に溶解し、ピリジン（2 mL）およびトリメチルホスフィン(0.12 mL)を添加した後、室温で１６時間撹拌した。  混合物を減圧濃縮し、残査をカラムクロマトグラフィーで精製する事で化合物124（0.048 g, 収率25%）を取得した。
ESI-MS m/z: 1037 (M + H)+【０２６２】
工程87
[STEP1] ケミストリー ヨーロピアンジャーナル(Chemistry European Journal), 第19巻, 4786-4797頁, 2013年に記載された方法で合成した化合物122 (0.5 g, 0.457 mmol)を用い、工程84と同様の方法によりカップリング化合物 (0.2 g, 収率42%)を得た。
[STEP2] STEP1で合成した化合物 (0.2 g, 0.191 mmol)をノルマルブタノール(2 mL)に溶解し、白金/炭素(200 mg)を用いて12時間接触還元を行った。反応液を減圧濃縮し、残査をカラムクロマトグラフィーで精製する事で化合物125（0.060 g, 収率30%）を取得した。
ESI-MS m/z: 1019 (M + H)+【０２６３】
実施例22  糖鎖リガンドーリンカーユニットの合成１９
【化１３９】
2018004004.tif 000154
【０２６４】
工程88
[STEP1] 実施例1の工程4で合成した化合物5(3.39 g, 8.584 mmol)を用い実施例2の工程10と同様の方法でアジド基を有するカップリング化合物を粗生成物(2.293 g, 収率50%)として得た。
[STEP2] STEP1得られた化合物 (2.293 g, 4.29 mmol)を用い、実施例1の実の工程2と同様の方法により、カルボン酸エステルを加水分解体(2.021 g, 収率93%)を取得した
[STEP3] STEP2で得られた化合物(0.100 g, 0.197 mmol)を用いて実施例12の工程54と同様の方法により活性エステル体を定量的に取得した。
[STEP3] STEP3の方法で得られた活性エステル(0.214g, 0.255 mmol)を用い、実施例12の工程55と同様の方法により化合物126(0.216 g, 収率85%)を得た。
ESI-MS m/z: 2763 (M - H)-【０２６５】
工程89
R= R1における結果を以下に示した。  R2の場合においても同様の結果が得られる
[STEP1] 実施例21の工程86で合成した化合物124(9.9 mg, 0.069 mmol)をメタノール（500 μL）に溶解し、28%ナトリウムメトキシド/メタノール溶液(14 uL)を添加した後、室温で一晩静置した。混合物を逆相クロマトグラフィー(水/アセトニトリル)で精製する事によりベンゾイル基が脱保護された目的物を定量的に取得した。
[STEP2] 実施例21の工程87で取得した化合物125(1.4 mg, 0.502 μmol)およびSTEP１より取得した化合物(4.2 mg, 5.02 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物127(0.6 mg, 収率30%)を取得した。
ESI-MS m/z: 1982 (M - 2H) 2- 【０２６６】
実施例23  糖鎖リガンドーリンカーユニットの合成２０
【化１４０】
2018004004.tif 000155
【０２６７】
工程90
実施例3の工程18で合成した化合物126 (24 mg, 7.30 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物129(11 mg, 48%)を得た。
ESI-MS m/z: 1608 (M - 2H) 2-【０２６８】
実施例24  糖鎖リガンドーリンカーユニットの合成２１
【化１４１】
2018004004.tif 000156
【０２６９】
工程91
化合物130の合成
[STEP1]   実施例3の工程20で合成した化合物22b (4 mg, 1.342 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法でリガンド付加体 (0.9 mg, 10%)を得た。
[STEP2] STEP１より取得した化合物(0.9 mg, 0.129 μmol)をメタノール(0.6 mL)に溶解し、ナトリウムメトキシド(2 μL, 10 μmol)を添加後、室温で3時間反応させた。  反応液を逆相クロマトグラフィーで分取し、凍結乾燥する事で化合物130(0.3 mg, 44%)を取得した。
ESI-MS m/z: 2642 (M - 2H)2-
化合物131の合成
実施例3の工程20で合成した化合物22b (22 mg, 5.88 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物131(3.6 mg, 17%)を得た。
ESI-MS m/z: 1851 (M + 2H) 2+【０２７０】
実施例25  核酸複合体の合成３
工程92
[Method 1]実施例9の工程38と同様の方法で表10-1〜表10-3記載の化合物を用いて第表11-1〜表11-4記載の一本鎖の核酸複合体132〜151を得た。表11-3中のX,Yはオリゴヌクレオチドの3’末端のヌクレオチド構造を表す。
[Method 2]  モレキュールズ(Molecules)、第17巻、13825-13843頁、2012年に記載された方法で合成した末端がアミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチドおよび化合物105を用い、バイオコンジュゲートケミストリー, 第22巻,1723-1728頁, 2011年の方法にて表11-3記載の一本鎖の核酸複合体152および153を得た。
本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を表12に示す。
表10-1
【表１５】
2018004004.tif 000157
【０２７１】
表10-2
【表１６】
2018004004.tif 000158
【０２７２】
表11-1
【表１７】
2018004004.tif 000159
【０２７３】
表11-2
【表１８】
2018004004.tif 000160
【０２７４】
表11-3
【表１９】
2018004004.tif 000161
【０２７５】
表11-4
【表２０】
2018004004.tif 000162
【０２７６】
表12
【表２１】
2018004004.tif 000163
実施例26  核酸複合体の合成４【０２７７】
工程92
工程91で合成した1本鎖の糖鎖複合体は、実施例8の工程38と同様の方法で2本鎖の糖鎖複合体154-175を得た。本実施例により合成した核酸複合体を表13-1〜表13-4に示す。表13-3中のX,Yはセンス鎖の3’末端のヌクレオチドを表す。【０２７８】
表13-1
【表２２】
2018004004.tif 000164
【０２７９】
第13-2
【表２３】
2018004004.tif 000165
【０２８０】
表13-3
【表２４】
2018004004.tif 000166
表13-4
【表２５】
2018004004.tif 000167
【０２８１】
本実例により合成した核酸複合体の配列を表14に示す。なお表14における「化合物欄」の記載は、［表中の化合物番号］_［核酸複合体における核酸配列の略号］_［核酸の種類（siRNA）］を示し、また「一本鎖名称」欄の記載おいて、センス鎖（ss）は［表中の化合物番号］_［核酸おけるリガンド等が結合する位置］_［核酸複合体における核酸配列の略号］-核酸の種類（ssRNA）を示し、アンチセンス鎖（as）は［核酸複合体における核酸配列の略号］−[核酸の種類（as-RNA）]をそれぞれ示す。【０２８２】
表14
【表２６】
2018004004.tif 000168
【表２７】
2018004004.tif 000169
【０２８３】
実施例27  核酸複合体の合成５
工程93
実施例26, 27と同様の方法で、化合物148において配列の異なる核酸複合体をそれぞれ得た。以下に核酸複合体の配列および質量分析結果を表15、二本鎖複合体の配列を表16に示す。【０２８４】
表15
【表２８】
2018004004.tif 000170
【０２８５】
表16
【表２９】
2018004004.tif 000171
【０２８６】
試験例1： CD45 ASOによるヒト単球由来樹状細胞のmRNAノックダウン試験
10%ウシ胎児血清を含むアールピーエムアイ1640培地 (RPMI1640培地, ナカライテスク社製, 30264-56)(以下10%FBS RPMI1640培地と記載)及びDNase I溶液 (DNase I Solution , StemCell Technology社製, 07900)を用い、ヒトCD14陽性単球細胞 (Untouched Frozen NPB-CD14+ Monocytes, Allcells社製, PB011F)を添付のプロトコルに従って融解した。
その後、組み換えヒトインターロイキン-4 (Recombinant Human IL-4 Protein, R&D System社製, 204-IL)(以下IL-4と記載)を最終濃度100 ng/mL、組み換えヒト顆粒球単球コロニー刺激因子 (Recombinant Human GM-CSF Protein CF, R&D System社製, 215-GM-050/CF) (以下GM-CSFと記載)を最終濃度50 ng/mLとなるように添加し、106 cells/mLの密度で浮遊培養用マルチプレート (SUMILON社製, MS-8006R)に播種し、37 ℃、5%CO2条件下で培養した。
培養開始から3日後及び6日後にIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 50 ng/mLを含む10%FBS RPMI1640培地で培地を半量交換し、樹状細胞へ誘導した。
培養開始から8日後に細胞を回収し、また接着細胞もエチレンジアミン四酢酸溶液 (0.2g/L‐EDTA Solution, ナカライテスク社製, 14367-74)を用いて回収した。遠心操作の後に新しいIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 50 ng/mLを含む10%FBS RPMI1640培地に1,250,000 cells/mLとなるよう再懸濁させ、超低吸着96wellプレート (Corning社製, 3474)に80uLずつ播種した。
被験サンプルとしてはKAC_008及びKAC_009を用い、比較対照としてリガンドを持たないKAC_CTR_001及びCD45遺伝子には相補部位を有さないKAC_CTR_002を設けた。KAC_008の最終濃度は1 μmol/L及び0.3 μmol/Lの2点、KAC_009及びKAC_CTR_001は1 μmol/L, 0.3 μmol/L, 0.1 μmol/Lおよび0.03 umol/Lの4点、KAC_CTR_002は1 μmol/L、N=3で実施した。
核酸複合体溶液の希釈については以下の手順で行った。クエン酸緩衝液 (20 mM Citrate(pH7), 150 mM NaCl)に50 μMで調製された核酸複合体溶液をオプティメム (Opti-MEM（登録商標） I Reduced Serum Medium, Life technologies社製, 31985-070)で5 μMへ希釈し、更なる溶液の希釈にはクエン酸緩衝液とオプティメムが1対9となるように調製した溶液を用いて希釈を行った。希釈した核酸複合体溶液を20 μLずつ細胞溶液に添加、陰性対照群には希釈溶液を20 μL添加して、37 ℃、5%CO2条件下で2日間培養した。
RNAを含む細胞溶解液の調製にはスーパープレップセルライシスキット (SuperPrep（登録商標） Cell Lysis & RT Kit for qPCR, TOYOBO社製, SCQ-101)を用い、同キット付属のアールティーキット (RT Kit for qPCR)を用いてキットに添付された説明書に従って逆転写反応を行い、cDNAを作成した。
このcDNAをPCR反応の鋳型に用い、QuantStudio 12K Flex リアルタイムPCRシステム (アプライドバイオシステムズ社製)を用い、タックマンプローブ (Taqman probe)法によりCD45の遺伝子、及び対照としてグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)(以下GAPDHと記載)の遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、GAPDHのmRNA増幅量を内部対照として、CD45のmRNAの準定量値を算出した。また、陰性対照群におけるCD45及びGAPDHのmRNA増幅量を同様にそれぞれ測定し、CD45のmRNAの準定量値を算出した。
CD45遺伝子の測定にはタックマンプローブHs00894727_m1 (アプライドバイオシステムズ社製)を、GAPDH遺伝子の測定にはHs02758991_g1 (アプライドバイオシステムズ社製)を用い、反応試薬にはTaqMan Gene Expression Master Mix (アプライドバイオシステムズ社製, 4369542)を用いて添付のプロトコルに従って実施した。核酸複合体（ASO導入検体）の標的mRNA量は、陰性対照群（ASO未導入群）におけるCD45のmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図1に示す。
本結果から、被験サンプル(KAC_008, KAC_009) が比較対照 (KAC_CTR_001, KAC_CTR_002)に比べ、強いノックダウン効果を示す事を確認した。【０２８７】
試験例2：Beta-2 Microglobulin(以下B2Mと記載)に対するASOを用いたヒト単球由来樹状細胞のタンパク質ノックダウン試験
試験例1と同様の手順でヒトCD14陽性単球細胞から樹状細胞を誘導し、超低吸着6 well plate (Corning社製, 3471)に播種し、37 ℃、5%CO2条件下で培養した。3日後にIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 50 ng/mLを含む10%FBS RPMI1640培地で培地を半量交換させ、樹状細胞へ誘導した。
培養開始から6日後に細胞を回収し、遠心操作の後に新しいIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 50ng/mLを含む10%FBS RPMI1640培地に125000 cells/mLとなるよう再懸濁させ、超低吸着96 well plate (Corning社製, 3474)に80 μLずつ播種した。
被験サンプルとしてKAC_010及びKAC_012を用い、比較対照としてリガンドを有さないKAC_CTR_003及びGalNAcリガンドを有するKAC_013, KAC_014を設けた。各ASOの最終濃度は0.3 μmol/L, 0.1 μmol/Lの2点、N=2で実施した。
核酸複合体溶液の希釈については以下の手順で行った。クエン酸緩衝液に40 μMで調製された各核酸複合体溶液をオプティメムで1.5 μMに希釈し、更なる溶液の希釈にはクエン酸緩衝液とオプティメムが3対77となるように調製した溶液を用い希釈を行った。希釈した核酸複合体溶液を20uLずつ細胞溶液に添加し、陰性対照群には希釈溶液を20 μL添加し、37 ℃、5%CO2条件下で培養した。
核酸添加1日後に細胞を回収し、遠心操作後に新しいIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 50 ng/mLを含む10%FBS RPMI1640培地 80 μLに再懸濁させ37 ℃、5%CO2条件下でさらに3日間培養した。
細胞の洗浄溶液は、1%(w/v) BSA含有リン酸緩衝生理食塩水 500 mLに対し、10%アジ化ナトリウム溶液(ナカライテスク社製)を2.5 mL, 0.5 M EDTA溶液 (EDTA (0.5 M), pH 8.0, Ambion社製, AM9260G)を685 μL加えることで調製した。また、上記洗浄溶液に対し20 %(v/v)となるようFcR ブロッキング試薬, ヒト (ミルテニーバイオテク社製、130-059-901)を加えることでFcRブロッキング溶液調製した。
核酸添加4日後に細胞を回収、遠心操作を行った後に、洗浄溶液で一度洗浄操作を行った。上清を除いた後にFcRブロッキング溶液を90 μLずつ添加し、氷上30分静置することでブロッキング反応を行った。
新しいプレートにFcRブロッキング溶液15 μLとB2Mタンパク質に対する抗体 (APC anti-human β2-microglobulin Antibody, Biolegend社製, 316312) 5 μLの混合液を用意しておき、FcRブロッキング後の細胞溶液を80uL加え氷上静置することで抗体を反応させた。
1時間後細胞を回収し、洗浄溶液で3回洗浄を行ったのちに200 μLに再懸濁してBD FACSCantoTM II フローサイトメーター (ベクトン・ディッキンソン社製)にて測定した。
解析ではFlowJo 7.6.5 (トミーデジタルバイオロジー社製)を用い、前方散乱光(FSC)と側方散乱光(SSC)で細胞画分にゲートをかけ、平均蛍光強度 (Mean Fluorescence Intensity)(以下MFIと記載)として幾何平均(Geometric means of the fluorescence intensity)の値により、細胞表面抗原の発現量を測定した。
MFI値の平均値を表した結果を図2に示す。本結果から、被験サンプル(KAC_010, KAC_012)が、比較対照 (KAC_013, KAC_014, KAC_CTR_003)に比べ、低濃度域においてB2Mタンパク質を強くノックダウンする事を確認した。【０２８８】
試験例3：B2M-siRNAを用いたヒト単球由来樹状細胞のタンパク質ノックダウン試験
試験2と同様の手順で樹状細胞を誘導し、培養開始から6日後に超低吸着96 wellプレートに細胞を播種した。
被験サンプルとしてKsiRC_010, KsiRC_011及びKsiRC_012を用い、比較対照としてリガンドを有さないKsiRC_CTR_001及びGalNAcリガンドを有するKsiRC_013及びKsiRC_014を設けた。各siRNAの最終濃度は3 μmol/L, 1 μmol/L, 0.3 μmol/Lの3点、N=1で実施し、核酸を含まない陰性対照群に関してはN=3で実施した。
核酸複合体溶液の希釈については以下の手順で行った。クエン酸緩衝液に40 μMで調製された各核酸をオプティメムで15 μMへ希釈し、更なる溶液の希釈にはクエン酸緩衝液とオプティメムが21対35となるように調製した溶液を用い希釈を行った。希釈した核酸複合体溶液を20 μLずつ細胞溶液に添加し、陰性対照群には希釈溶液を20 μL添加して37 ℃、5%CO2条件下で培養した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、遠心操作を行った後に洗浄溶液で一度洗浄操作を行い、その後は試験例2と同様の手法で細胞表面抗原のB2Mタンパク質の発現量を測定及び解析を実施した。
その結果を図3に示す。陰性対照群については平均±標準偏差を示す。被験サンプル(KsiRC_010, KsiRC_011, KsiRC_012)は、比較対照(KsiRC_013, KsiRC_014, KsiRC_CTR_001)に比べ、顕著なB2Mタンパク質のノックダウンを示した。【０２８９】
試験例4：B2M-siRNAを用いたヒト単球由来樹状細胞のmRNAノックダウン試験
試験例2と同様の手順で樹状細胞を誘導し、培養開始から6日後に超低吸着96wellプレートに細胞を播種した。
被験サンプルとしてはKsiRC_010を用い、比較対照としてリガンドを有さないKsiRC_CTR_001を設けた。各siRNAの最終濃度は3 μmol/L, 1 μmol/L, 0.3 μmol/Lの3点、N=3で実施した。
核酸複合体溶液の希釈及び添加については試験例3と同様の手法で行い、37 ℃、5%CO2条件下で培養した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、遠心操作を行った後に洗浄溶液で一度洗浄操作を行い、その後は試験例1と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。
B2M遺伝子の測定にはタックマンプローブHs00984230_m1 (アプライドバイオシステムズ社製) を、GAPDH遺伝子の測定にはHs02758991_g1 (アプライドバイオシステムズ社製)を用い、反応試薬にはTaqMan Gene Expression Master Mixを用いて添付のプロトコルに従って実施した。siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、B2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図4に示す。
被験サンプル (KsiRC_010)は, 比較対照 (KsiRC_CTR_001)に比べ顕著なノックダウン活性の向上を示した。【０２９０】
試験例5：B2M-siRNAを用いたヒト単球由来樹状細胞のタンパク質ノックダウン試験
試験例3と同様の手順で樹状細胞を誘導し、培養開始から6日後に超低吸着96 wellプレートに細胞を播種した。
被験サンプルとしてKsiRC_010, KsiRC_003, KsiRC_004, KsiRC_005, KsiRC_006, KsiRC_008, KsiRC_001, KsiRC_002, KsiRC_007を用い、比較対照にはリガンドを有さないKsiRC_CTR_001、KsiRC_008のsiRNA配列を変更したコントロール体KsiRC_009 (GAPDH標的配列)を設けた。各siRNAの最終濃度は1 μmol/L, 0.3 μmol/Lの2点、N=1で実施し、核酸を含まない陰性対照群に関してはN=2で実施した。
核酸複合体溶液の希釈については以下の手順で行った。クエン酸緩衝液に20 μMで調製された各核酸をオプティメムで5 μMに希釈し、更なる溶液の希釈にはクエン酸緩衝液とオプティメムが1対3となるように調製した溶液を用い希釈を行った。希釈した核酸複合体溶液を20 μLずつ細胞溶液に添加し、陰性対照群には希釈溶液を20 μL添加して37 ℃、5%CO2条件下で培養した。
核酸添加4日後細胞を回収し、遠心操作を行った後に、洗浄溶液で一度洗浄操作を行った。上清を除いた後にFcRブロッキング溶液を75 μLずつ添加し、氷上30分静置することでブロッキング反応を行った。
新しいプレートにB2Mに対する抗体 (APC anti-human β2-microglobulin Antibody, Biolegend社製, 316312) 5 μL、LIVE/DEAD（登録商標） Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific社 L34957) 1 μL、HLA-DRに対する抗体 (Brilliant Violet 421TM anti-human HLA-DR Antibody, Biolegend社製, 307635) 5 μL、CD11cに対する抗体 (PE anti-human CD11c Antibody, Biolegend社製, 301606) 5 μLを含む混合液を用意し、ブロッキング操作をした細胞溶液を65uL加え氷上で1時間静置した。
その後細胞を回収し、洗浄溶液で3回洗浄を行ったのちに、200 μLに再懸濁してBD FACSVerseTM フローサイトメーター (ベクトン・ディッキンソン社製)にて測定した。
解析ではFlowJo 7.6.5を用いた。前方散乱光 (FSC)と側方散乱光 (SSC)で細胞にゲートをかけ、LIVE DEADの陰性画分を生細胞としてHLA-DR及びCD11c陽性画分を解析対象とした。APCチャネルの平均蛍光強度として幾何平均 (Geometric means of the fluorescence intensity)の値により、細胞表面抗原の発現量を測定した。
得られた値を図5に示す。陰性対照群については平均値を示す。被験サンプル (KsiRC_010, KsiRC_003, KsiRC_004, KsiRC_005, KsiRC_006, KsiRC_008, KsiRC_001, KsiRC_002, KsiRC_007)は、比較対照 (KsiRC_CTR_001, KsiRC_009)に比べ、顕著なB2Mタンパク質のノックダウンを示した。【０２９１】
試験例6： B2M-siRNAを用いたヒト単球由来樹状細胞のmRNAノックダウン試験
X-VIVO15TM培地 (X-VIVOTM 15 Chemically Defined, Serum-free Hematopoietic Cell Medium, Lonza社製, 04-418Q)を用い、ヒトCD14陽性単球細胞 (Untouched Frozen NPB-CD14+ Monocytes, Allcells社製, PB011F)を添付のプロトコルに従って融解した。
その後、組み換えヒトインターロイキン-4 (Recombinant Human IL-4 Protein, R&D System社製, 204-IL)(以下IL-4と記載)を最終濃度100 ng/mL、組み換えヒト顆粒球単球コロニー刺激因子 (Human GM-CSF premium grade, Miltenyi Biotec社製, 130-093-864, 130-093-865) (以下GM-CSFと記載)を最終濃度100 ng/mLとなるように添加し、106 cells/mLの密度で6 wellプレート (Falcon(R) マルチウェルセルカルチャープレート 6 well, Corning社製, 353046)に播種し、37 ℃、5%CO2条件下で培養した。培養開始から2日後及び3日後に培地を交換し、樹状細胞へ誘導した。
培養開始から6日後に細胞を回収し、また接着細胞もエチレンジアミン四酢酸溶液 (0.2g/L‐EDTA Solution, ナカライテスク社製, 14367-74)を用いて回収した。遠心操作の後に新しいIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 100 ng/mLを含むX-VIVO15TM培地に500,000 cells/mLとなるよう再懸濁させ、超低吸着96wellプレート (Corning社製, 3474)に200 μLずつ播種し、37 ℃、5%CO2条件下でさらに3日間培養した。
培養開始から9日後に細胞を回収し、遠心操作の後に新しいIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 100 ng/mLを含むX-VIVO15TM培地に625,000 cells/mLとなるよう再懸濁させ、超低吸着96wellプレートに80μLずつ播種した。
被験サンプルとしてはKsiRC_025, KsiRC_027及びKsiRC_029を用い、比較対照としてリガンドを持たないKsiRC_CTR_001を設けた。各siRNAの最終濃度は0.3 μmol/L, 0.1 μmol/L、N=3で実施した。
試験例1-5と同様にオプティメム (Opti-MEM（登録商標） I Reduced Serum Medium, Life technologies社製, 31985-070, 31985-088)を用いて希釈した核酸複合体溶液を20 μLずつ細胞溶液に添加、陰性対照群には希釈溶液を20 μL添加して、37 ℃、5%CO2条件下で4日間培養した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、その後は試験例4と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。
siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、B2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図6に示す。
被験サンプル (KsiRC_025, KsiRC_027及びKsiRC_029)は, 比較対照 (KsiRC_CTR_001)に比べ顕著なノックダウン活性の向上を示した。【０２９２】
試験例7： B2M-siRNAを用いたヒト単球由来樹状細胞のmRNAノックダウン試験
試験例6と同様の手法でヒト単球由来樹状細胞を誘導し、各種B2M siRNAの活性を評価した。
被験サンプルとしてはKsiRC_030, KsiRC_031, KsiRC_032, KsiRC_015, KsiRC_016, KsiRC_018, KsiRC_019及びKsiRC_017を用い、比較対照としてリガンドを持たないKsiRC_CTR_001を設けた。各siRNAの最終濃度は0.03 μmol/L, 0.01 μmol/L、N=3で実施した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、その後は試験例6と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。
siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、B2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図7に示す。
被験サンプル (KsiRC_030, KsiRC_031, KsiRC_032, KsiRC_015, KsiRC_016, KsiRC_018, KsiRC_019及びKsiRC_017)は, 比較対照 (KsiRC_CTR_001)に比べノックダウン活性の向上を示した。【０２９３】
試験例8： B2M-siRNAを用いたヒト単球由来樹状細胞のmRNAノックダウン試験
試験例6と同様の手法でヒト単球由来樹状細胞を誘導し、各種B2M siRNAの活性を評価した。
被験サンプルとしてはKsiRC_020を用い、比較対照としてリガンドを持たないKsiRC_CTR_001を設けた。各siRNAの最終濃度は0.03 μmol/L, 0.01 μmol/L、N=3で実施した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、その後は試験例7と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。
siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、B2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図8に示す。
被験サンプル (KsiRC_020)は, 比較対照 (KsiRC_CTR_001)に比べノックダウン活性の向上を示した。【０２９４】
試験例9： B2M-siRNAを用いたヒト単球由来樹状細胞のmRNAノックダウン試験
試験例6と同様の手法でヒト単球由来樹状細胞を誘導し、各種B2M siRNAの活性を評価した。
被験サンプルとしてはKsiRC_023, KsiRC_024, KsiRC_021及びKsiRC_028を用い、比較対照としてリガンドを持たないKsiRC_CTR_001を設けた。各siRNAの最終濃度は0.03 μmol/L, 0.01 μmol/L、N=3で実施した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、その後は試験例8と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。
siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、B2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図9に示す。
被験サンプル (KsiRC_023, KsiRC_024, KsiRC_021, KsiRC_028)は, 比較対照(KsiRC_CTR_001)に比べノックダウン活性の向上を示した。【０２９５】
試験例10： B2M-siRNAを用いたヒト単球由来樹状細胞のmRNAノックダウン試験
試験例6と同様の手法でヒト単球由来樹状細胞を誘導し、各種B2M siRNAの活性を評価した。
被験サンプルとしてはKsiRC_035, KsiRC_036, KsiRC_022, KsiRC_033, KsiRC_034)を用い、比較対照としてリガンドを持たないKsiRC_CTR_001を設けた。各siRNAの最終濃度は0.01 μmol/L, 0.003 μmol/L、N=3で実施した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、その後は試験例9と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。
siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、B2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図10に示す。
被験サンプル (KsiRC_035, KsiRC_036, KsiRC_022, KsiRC_033, KsiRC_034)は, 比較対照 (KsiRC_CTR_001)に比べノックダウン活性の向上を示した。【０２９６】
試験例11： B2M-siRNAを用いた成熟ヒト単球由来樹状細胞のmRNAノックダウン試験
試験例6と同様の手法でヒト単球由来樹状細胞を誘導し、培養開始から6日後に細胞を回収後、新しいIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 100 ng/mLを含むX-VIVO15TM培地に500,000 cells/mLとなるよう再懸濁させ、超低吸着96wellプレート (Corning社製, 3474)に200μLずつ播種した。この際、特許記載のCD40 抗体（国際公開第02/088186号，Clone：KM341-1-19)を添加し、37 ℃、5%CO2条件下で３日間培養することで成熟樹状細胞を調製した。
培養開始から9日後に細胞を回収し、遠心操作の後に新しいIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 100 ng/mL, CD40抗体を含むX-VIVO15TM培地に625,000 cells/mLとなるよう再懸濁させ、超低吸着96wellプレート (Corning社製, 3474)に80μLずつ播種した。
被験サンプルとしてはKsiRC_003, KsiRC_031, KsiRC_001を用い、比較対照としてリガンドを持たないKsiRC_CTR_001を設けた。各siRNAの最終濃度は0.3 μmol/L, 0.1 μmol/L、N=3で実施した。
試験例1-5と同様にオプティメムを用いて希釈した核酸複合体溶液を20 μLずつ細胞溶液に添加、陰性対照群には希釈溶液を20 μL添加して、37 ℃、5%CO2条件下で4日間培養した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、その後は試験例10と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、B2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図11に示す。
被験サンプル (KsiRC_003, KsiRC_031, KsiRC_001)は, 比較対照(KsiRC_CTR_001)に比べノックダウン活性の向上を示した。【０２９７】
試験例12：ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシル卜ランスフェラ一ゼ1(以下HPRT1と記載)-siRNAを用いたヒト単球由来樹状細胞のmRNAノックダウン試験
試験例11と同様の手法で成熟ヒト単球由来樹状細胞を誘導し、各種HPRT1 siRNAの活性を評価した。
被験サンプルとしてはKsiRC_037を用い、比較対照としてリガンドを持たないKsiRC_CTR_002を設けた。各siRNAの最終濃度は0.3 μmol/L, 0.1 μmol/L, 0.03 μmol/L、N=3で実施した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、その後は試験例11と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。
HPRT1遺伝子の測定にはタックマンプローブHs99999909_m1 (アプライドバイオシステムズ社製) を、GAPDH遺伝子の測定にはHs02758991_g1 (アプライドバイオシステムズ社製)を用い、反応試薬にはTaqMan Gene Expression Master Mixを用いて添付のプロトコルに従って実施した。siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、HPRT1のmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図12に示す。
被験サンプル (KsiRC_037)は, 比較対照 (KsiRC_CTR_002)に比べノックダウン活性の向上を示した。【０２９８】
試験例13： B2M-siRNAを用いたヒト単球由来マクロファージ細胞のmRNAノックダウン試験
X-VIVO15TM培地を用い、ヒトCD14陽性単球細胞 (Untouched Frozen NPB-CD14+ Monocytes, Allcells社製, PB011F)を添付のプロトコルに従って融解した。
その後、GM-CSFを最終濃度100 ng/mLとなるように添加し、375,000 cells/mLの密度に希釈後、96 wellプレート (NuncTM MicroWellTM 96-Well Microplates, Thermo Fisher Scientific社製, 167008)に200 μL播種、37 ℃、5%CO2条件下で培養することで単球由来マクロファージ細胞を調製した。
培養開始から7日後に上清を除去し、新しい GM-CSF 125 ng/mLを含むX-VIVO15TM培地を80 μLずつ添加した。
被験サンプルとしてはKsiRC_001, KsiRC_030, KsiRC_031及びKsiRC_032を用い、比較対照としてリガンドを持たないKsiRC_CTR_001を設けた。各siRNAの最終濃度は1 μmol/L, 0.3 μmol/L, 0.1 μmol/L、N=3で実施した。
試験例1-5と同様にオプティメムを用いて希釈した核酸複合体溶液を20 μLずつ細胞溶液に添加、陰性対照群には希釈溶液を20 μL添加して、37 ℃、5%CO2条件下で4日間培養した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、その後は試験例12と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、B2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図13に示す。
被験サンプル (KsiRC_001, KsiRC_030, KsiRC_031及びKsiRC_032)は, 比較対照 (KsiRC_CTR_001)に比べノックダウン活性の向上を示した。
【産業上の利用可能性】
【０２９９】
本発明の核酸複合体は、哺乳動物に投与して、生体内において、各種関連疾患を治療するために用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０３００】
配列番号1は、CD45-ASOの塩基配列を示す。
配列番号2は、ApoB-ASOの塩基配列を示す。
配列番号3は、B2M-ASOの塩基配列を示す。
配列番号4は、B2M-ssRNAの塩基配列を示す。
配列番号5は、B2M-asRNAの塩基配列を示す。
配列場号6は、GAPDH-ssRNAの塩基配列を示す。
配列番号7は、GAPDH-asRNAの塩基配列を示す。
配列番号8は、Hprt-1ssRNAの塩基配列を示す。
配列番号9は、Hprt-1asRNAの塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
2018004004000001.app
【国際調査報告】
2018004004.tif 000204
2018004004.tif 000205
2018004004.tif 000206
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