(57)【要約】  本発明の課題は、特定抗原を認識するＢ細胞を含むＢ細胞集団を効率良く製造する方法を提供することである。本発明によれば、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ−２１の非存在下、ＩＬ−４の非存在下、かつＩＬ−２１及びＩＬ−４以外のサイトカインの存在下において特定抗原と共にＢ細胞を含む細胞集団を培養する工程ｃ；及びＦａｓを介した刺激を付与しながら前記Ｂ細胞を含む細胞集団を培養し、前記特定抗原を認識するＢ細胞を含むＢ細胞集団を得る工程ｄ、を含む、Ｂ細胞集団の製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ−２１の非存在下、ＩＬ−４の非存在下、かつＩＬ−２１及びＩＬ−４以外のサイトカインの存在下において特定抗原と共にＢ細胞を含む細胞集団を培養する工程ｃ；及び
Ｆａｓを介した刺激を付与しながら前記Ｂ細胞を含む細胞集団を培養し、前記特定抗原を認識するＢ細胞を含むＢ細胞集団を得る工程ｄ、
を含む、Ｂ細胞集団の製造方法。
【請求項２】
前記サイトカインが、ＩＬ−２１及びＩＬ−４以外のインターロイキンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１０ファミリー及びＩＬ−１２ファミリーから選択される少なくとも１種のサイトカインである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４及びＩＬ−２７から選択される少なくとも１種である、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｄにおいて、Ｆａｓを介した刺激を付与しながらＩＬ−２１の存在下又はＩＬ−２１及びＩＬ−２の存在下で前記Ｂ細胞を含む細胞集団を培養する、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程ｄを、特定抗原の非存在下で行う、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程ｃに先立って、Ｂ細胞を含む細胞集団を、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ−４の存在下又はＩＬ−４及びＩＬ−２の存在下で培養する工程ａをさらに含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程ａと工程ｃとの間に、Ｂ細胞を含む細胞集団を、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ−２１の存在下又はＩＬ−２１及びＩＬ−２の存在下で培養する工程ｂをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程ｃが、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及び特定抗原を提示した担体を用いてＢ細胞を含む細胞集団を培養する工程である、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及び特定抗原を提示した担体が、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及び特定抗原を提示したフィーダー細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程ｄが、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬを提示した担体を用いてＢ細胞を含む細胞集団を培養する工程である、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬを提示した担体が、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬを提示したフィーダー細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｂ細胞が、ヒトＢ細胞である、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３の何れか一項に記載の製造方法により得られたＢ細胞集団を培養することによってモノクローナル抗体を製造する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ細胞集団の製造方法、及びそれを用いたモノクローナル抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の抗原に対して高い選択性を示すモノクローナル抗体は、抗体医薬としての開発が期待され、特に癌細胞を標的とする抗体医薬の開発が進んでいる。モノクローナル抗体を有効成分とする医薬をヒトの治療に適用するには、異種抗原の量が少ないヒトの抗体を投与することが、拒絶反応回避の観点から最も理想的である。このため多くのキメラ抗体やヒト化抗体が開発されている。【０００３】
一般にヒト治療用のキメラ抗体やヒト化抗体は、抗原をマウス等に複数回免疫した後に、脾臓やリンパ節の細胞をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを形成し、ハイブリドーマが産生するマウスＩｇＧ抗体を基に、組換え技術を用いて作製している。しかしながら、マウス等の動物個体を用いることや、高い親和性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択することには時間がかかり、組換え技術により得られた抗体の活性を確認する必要がある。このため、上記の方法では、目的とする抗体の作製に時間がかかる上に、その効果はヒトに投与するまで確定できない。また、免疫抗原が個体毒性を示す場合には個体への免疫は困難である。さらに、動物種間で保存性の高いタンパク抗原を抗原とする場合、免疫学的寛容のために抗体が産生されにくい。【０００４】
Ｂ細胞は、骨髄に由来する細胞で表面にＢ細胞レセプター(BCR)をもつ免疫細胞であり、抗体を産生する細胞である。Ｂ細胞は、造血幹細胞から発生し、プロＢ細胞及びプレＢ細胞を経て、Ｂ細胞へと分化する。抗原に対する高い親和性を示す抗体を産生するＢ細胞は胚中心で選択されることが知られているが、この選択の機構は充分には解明されていない。特定の抗原に対して高い親和性を示す抗体を産生するＢ細胞を人為的に増殖させて濃縮することができれば、特定の抗原に対して高い親和性を示すモノクローナル抗体をより短時間で作製できる。【０００５】
特許文献１には、特定抗原に特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団の製造方法であって、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を、ＩＬ−２１の存在下で、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体、Ｆａｓを介した刺激を付与しながら、前記特定抗原と共に培養して前記特定抗原に特異的な抗原特異的Ｂ細胞を選別し、前記特定抗原に特異的なＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む抗原特異的Ｂ細胞集団を得ることを含む当該製造方法が記載されている。【０００６】
特許文献２には、Ｂａｃｈ２遺伝子の発現が上昇しているＢ細胞を、ＣＤ４０及び／又は ＢＡＦＦ受容体に対する作用手段の存在下において培養する工程を含む、Ｂ細胞集団の製造方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５５５０１３２号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１６／００２７６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、特定抗原を認識するＢ細胞を含むＢ細胞集団を効率良く製造する方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ−２１の非存在下、ＩＬ−４の非存在下、かつＩＬ−２１及びＩＬ−４以外のサイトカインの存在下において特定抗原と共にＢ細胞を含む細胞集団を培養し、次いで、Ｆａｓを介した刺激を付与しながら前記Ｂ細胞を含む細胞集団を培養することによって、特定抗原を認識するＢ細胞を含むＢ細胞集団を効率良く製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］  ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ−２１の非存在下、ＩＬ−４の非存在下、かつＩＬ−２１及びＩＬ−４以外のサイトカインの存在下において特定抗原と共にＢ細胞を含む細胞集団を培養する工程ｃ；及び
Ｆａｓを介した刺激を付与しながら前記Ｂ細胞を含む細胞集団を培養し、前記特定抗原を認識するＢ細胞を含むＢ細胞集団を得る工程ｄ、
を含む、Ｂ細胞集団の製造方法。
［２］  前記サイトカインが、ＩＬ−２１及びＩＬ−４以外のインターロイキンである［１］に記載の方法。
［３］  前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１０ファミリー及びＩＬ−１２ファミリーから選択される少なくとも１種のサイトカインである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］  前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４及びＩＬ−２７から選択される少なくとも１種である、［１］から［３］の何れか一に記載の方法。
［５］  工程ｄにおいて、Ｆａｓを介した刺激を付与しながらＩＬ−２１の存在下又はＩＬ−２１及びＩＬ−２の存在下で前記Ｂ細胞を含む細胞集団を培養する、［１］から［４］の何れか一に記載の方法。
［６］  工程ｄを、特定抗原の非存在下で行う、［１］から［５］の何れか一に記載の方法。
［７］  工程ｃに先立って、Ｂ細胞を含む細胞集団を、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ−４の存在下又はＩＬ−４及びＩＬ−２の存在下で培養する工程ａをさらに含む、［１］から［６］の何れか一に記載の方法。
［８］  工程ａと工程ｃとの間に、Ｂ細胞を含む細胞集団を、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ−２１の存在下又はＩＬ−２１及びＩＬ−２の存在下で培養する工程ｂをさらに含む、［７］に記載の方法。
［９］  前記工程ｃが、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及び特定抗原を提示した担体を用いてＢ細胞を含む細胞集団を培養する工程である、［１］から［８］の何れか一に記載の方法。
［１０］  ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及び特定抗原を提示した担体が、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及び特定抗原を提示したフィーダー細胞である、［９］に記載の方法。
［１１］  前記工程ｄが、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬを提示した担体を用いてＢ細胞を含む細胞集団を培養する工程である、［１］から［１０］の何れか一に記載の方法。
［１２］  ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬを提示した担体が、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬを提示したフィーダー細胞である、［１１］に記載の方法。
［１３］  前記Ｂ細胞が、ヒトＢ細胞である、［１］から［１２］の何れか一に記載の方法。
［１４］  ［１］から［１３］の何れか一に記載の製造方法により得られたＢ細胞集団を培養することによってモノクローナル抗体を製造する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、特定抗原を認識するＢ細胞を含むＢ細胞集団を簡便に効率良く製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の実施例におけるＢ細胞集団の選別工程の培養スケジュールである。
【図２】図２は、本発明の実施例におけるＢ細胞選別工程後の細胞集団の、抗CD19抗体及びAlexa647標識Her2-Tag2を用いた二次元染色の結果を示す。
【図３】図３は、本発明の実施例及び比較例におけるＢ細胞選別方法の選択効率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について説明する。
本発明のＢ細胞集団の製造方法は、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ−２１の非存在下、ＩＬ−４の非存在下、かつＩＬ−２１及びＩＬ−４以外のサイトカインの存在下において特定抗原と共にＢ細胞を含む細胞集団を培養する工程ｃ；及びＦａｓを介した刺激を付与しながら前記Ｂ細胞を含む細胞集団を培養し、前記特定抗原を認識するＢ細胞を含むＢ細胞集団を得る工程ｄを含む、方法である。本発明の方法で製造される特定抗原を認識するＢ細胞は、特定抗原に特異的なＢ細胞であることが好ましい。
【００１４】
＜工程ｃについて＞
本発明における工程ｃは、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ−２１の非存在下、ＩＬ−４の非存在下、かつＩＬ−２１及びＩＬ−４以外のサイトカインの存在下において特定抗原と共にＢ細胞を含む細胞集団を培養する工程である。
【００１５】
本発明に用いられるＢ細胞を含有する細胞集団は、一般には末梢血細胞、骨髄細胞又は、リンパ系臓器、例えば脾臓細胞などに由来する細胞集団であれば良く、特に限定されない。またＢ細胞としては、抗原未反応のナイーブＢ細胞であっても、抗原接触後の記憶Ｂ細胞であってもよい。ここで本明細書における「ナイーブＢ細胞」とは、抗原未反応の成熟Ｂ細胞を一般に指し、ＣＸＣＲ５陽性且つＣＤ４０陽性の表面抗原を示す細胞が該当する。
【００１６】
また、本発明に用いられる細胞集団は、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）及びＦａｓを有し且つ抗原を認識可能なＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現しているものであればよく、本発明を妨げない範囲であれば、分化段階における他のステージのＢ細胞が含まれていてもよい。培養の選択効率の観点から、ＣＤ１３８陽性（プラズマ）細胞や、Ｂ細胞以外の細胞、例えば、Ｔ細胞、単球、ＮＫ細胞等を除去することが好ましい。
【００１７】
本発明において用いられる細胞集団は、免疫系が確立された生物由来の細胞集団であればよく、哺乳動物の霊長類、例えばヒト、サルなど、有蹄類、例えばブタ、ウシ、ウマなど、小型哺乳類の齧歯類、例えばマウス、ラット、ウサギなど、鳥類、例えばニワトリ、ウズラなどが含まれる。本細胞集団の由来としては霊長類であることが好ましく、ヒトを例示することができる。即ち、本発明で用いるＢ細胞は好ましくはヒトＢ細胞である。脾臓等の生体組織から細胞集団を調整する方法は、通常のＢ細胞集団を調製する条件をそのまま適用すればよい。また、生体由来の細胞集団に限定されず、確立されたＢ細胞株であってもよい。
【００１８】
Ｂ細胞集団の培養は、通常、Ｂ細胞の培養に用いられる培地による通常の培養条件であればよい。このような培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）やＲＰＭＩ−１６４０などを挙げることができる。これらの培地に対しては、通常、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。
【００１９】
培養温度などの培養条件は、一般的なＢ細胞に対して用いられる培養条件をそのまま適用することができ、例えば、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2の条件が挙げられる。
【００２０】
細胞集団の培地への播種密度は、細胞集団の由来や組織から調製した細胞の状態、また同一培養系内で行う培養日数によって異なるが、一般に、１×１０2個〜１×１０7個／ｃｍ2、好ましくは１×１０3個〜１×１０6個／ｃｍ2とすればよく、特にヒトＢ細胞は高密度で培養を開始した場合の増殖率がよいことから、好ましくは１×１０4個〜１×１０6個／ｃｍ2とすればよい。この範囲であれば、３日間程度の培養後に増殖状態になることを予防できる。
【００２１】
本発明に用いられるＢ細胞は、特定の抗原に対して刺激を行う段階で、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体、及びＦａｓを介した刺激により細胞内シグナルを生じさせるために、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）及びＦａｓを有することを要する。これらの分子に対する刺激は、これらの分子を外部から認識してＣＤ４０、ＢＡＦＦ受容体及びＦａｓを有するＢ細胞の内部に細胞内シグナルを生じさせるものであれば制限はなく、これらの分子の全部又は一部を認識する抗体又は抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＢＡＦＦ及びＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）を挙げることができる。なお、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激は、ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦのうち１つ以上を、ＣＤ４０又はＢＡＦＦ受容体に対する抗体又は抗体断片に代えて与える形態も可能である（特許文献１参照）。
【００２２】
ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０に対するリガンドであり、ＣＤ４０Ｌのアミノ酸配列は公知となっている（例えば、Nature, Vol.357, pp.80-82 (1992)及び、EMBO J., Vol.11, pp.4313-4321 (1992)参照）。本発明では、ＣＤ４０Ｌの配列のうち、受容体結合能に関与する活性ドメインの結合能が失われない程度に保存されていればよく、例えば、活性ドメインの８０％以上のアミノ酸配列相同性があれば、本発明において利用可能である。このようなＣＤ４０Ｌは、自然に発現する細胞から単離したものであってもよく、既知のアミノ酸配列に基づいて合成したものであってもよい。また、ＣＤ４０Ｌは、培養系中のＢ細胞に対してＣＤ４０Ｌの存在に対応したシグナルを与えることができる形態であればよく、遊離型であっても、膜結合型であってもよい。
【００２３】
遊離型ＣＤ４０ＬなどのＣＤ４０の刺激因子は、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む細胞集団を形成するためには、Ｂ細胞が増殖を維持可能な濃度で培養系に存在すればよく、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌだが、Ｂ細胞の増殖に伴う相対的な減少を考慮して好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌとすることができる。
【００２４】
ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子：B cell activation factor belonging to the tumor necrosis factor family）は、ＴＮＦ類縁分子であって抗原と反応したＢ細胞の増殖、分化等に関与していることが知られている分子であり、ＢＡＦＦのアミノ酸配列は既に公知となっている（例えば、J Exp Med, Vol.189, pp.1747-1756 (1999)及び、Science, Vol. 285, pp.260-263 (1999)及び、J Bio Chem, Vol.274, pp.15978-15981, (1999)）。本発明では、ＢＡＦＦの配列のうち、受容体結合能に関与する活性ドメインの結合能が失われない程度に保存されていればよく、例えば、活性ドメインの８０％以上のアミノ酸配列相同性があれば、本発明において利用可能である。このようなＢＡＦＦは、自然に発現する細胞から単離したものであってもよく、既知のアミノ酸配列に基づいて合成したものであってもよい。また、ＢＡＦＦは、培養系中のＩｇＧ陽性Ｂ細胞に対してＢＡＦＦの存在に対応したシグナルを与えることができる形態であればよく、遊離型（即ち、分泌型）であっても、膜結合型であってもよい。
【００２５】
遊離型ＢＡＦＦなどのＢＡＦＦ受容体の刺激因子は、ＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む細胞集団を形成するためには、Ｂ細胞が増殖を維持可能な濃度で培養系に存在すればよく、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、高濃度であればより生存支持活性が期待できるとの観点から好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ濃度とすることができる。
【００２６】
なお、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦの由来としては、上述した細胞集団と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、マウス、ヒトを例示する事ができる。また提示対象となる上記細胞集団と同一の主に由来するものであってもよく、異なる主に由来するものであってもよい。
【００２７】
ＣＤ４０又はＢＡＦＦ受容体に対する抗体又は抗体断片は、当業界で既知の方法に従って得ることができる。ＣＤ４０又はＢＡＦＦ受容体に対して結合能を有する抗体であれば、特に制限はない。
これらの抗体又は抗体断片は、担体の表面に提示された形態であっても、抗体表面に固定化されていない遊離型又は可溶化形態であってもよい。
【００２８】
工程ｃにおいては、ＩＬ−２１の非存在下、ＩＬ−４の非存在下、かつＩＬ−２１及びＩＬ−４以外のサイトカインの存在下において特定抗原と共にＢ細胞を含む細胞集団を培養する。
【００２９】
ＩＬ−２１及びＩＬ−４以外のサイトカインとしては、Ｂ細胞活性化因子（Ｂ細胞を活性化及び／又は分化させることが知られる、任意の各種サイトカイン又は成長因子）を使用することができる。具体的には、特には限定されないが、インターロイキン（現在までにＩＬ−１〜ＩＬ−３８およびＩＬ−１７Ｂ〜ＩＬ−１７Ｄなどのサブファミリー、ＯＳＭ（オンコスタチンＭ）、ＬＩＦ（白血球遊走阻止因子）、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、ＣＴ−１を含む）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−δ、ＩＦＮ−γ、Ｃ型ケモカインＸＣＬ１およびＸＣＬ２、Ｃ−Ｃ型ケモカイン（現在までにＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８を含む）、ＣＸＣ型ケモカイン（現在までにＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１７を含む）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー（現在までにＴＮＦＳＦ１〜ＴＮＦＳＦ１８を含む）、Ｔｏｌｌ様受容体作動薬（ＬＰＳおよびＣｐＧを含む）、ＴＧＦ−βスーパーファミリー（ＴＧＦ−βおよびアクチビンを含む）および細胞増殖因子（ＳＣＦ、Ｆｌｔ３リガンド、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インスリンなどの受容体型チロシンキナーゼを介してシグナルを伝達するものを含む）などを挙げることができ、上記の中からＢ細胞表面にその受容体が発現しているものを使用することができる。
【００３０】
ＩＬ−２１及びＩＬ−４以外のサイトカインとしては、ＩＬ−２１及びＩＬ−４以外のインターロイキンであることが好ましい。
ＩＬ−２１及びＩＬ−４以外のサイトカインとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−１０ファミリー及びＩＬ−１２ファミリーから選択される少なくとも１種のサイトカインであることが好ましい。
【００３１】
ＩＬ−１０ファミリー及びＩＬ−１２ファミリーに属するサイトカインは、天然由来のものであってもよく、生物工学的に得られた組換え体のものであってもよい。ＩＬ−１０ファミリー及びＩＬ−１２ファミリーに属するサイトカインの由来としては、上述した細胞集団と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられる。これらの分子はそれぞれ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、例えばマウス、ヒトなどを挙げることができる。また、提示対象となる上記細胞集団と同一の種に由来する分子であってもよく、異なる種に由来する細胞であってもよい。
【００３２】
ＩＬ−１０サイトカインファミリーには、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４、ＩＬ−２６が含まれる。Ｂ細胞に対する作用機序はまだ全て明らかになっていないが、Ｂ細胞の分化を抑制することが報告されている。（非特許文献：Ｂｌｏｏｄ，  １１５（９）：１７１８−２６  （２０１０））
【００３３】
ＩＬ−１２サイトカインファミリーには、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＩＬ−３０、ＩＬ−３５が含まれる。Ｂ細胞に対する作用機序はまだ全て明らかになっていないが、シグナル伝達兼転写活性化因子ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３を介してヒトＢ細胞を活性化させることが報告されている。（非特許文献：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １７６（１０）：５８９０−７  （２００６））
【００３４】
ＩＬ−２１及びＩＬ−４以外のサイトカインの具体例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４及びＩＬ−２７から選択される少なくとも１種を挙げることができる。
【００３５】
ＩＬ−２１及びＩＬ−４以外のサイトカイン（ＩＬ−１０ファミリー又はＩＬ−１２ファミリーに属するサイトカインなど）の濃度は、特定抗原に対して親和性を有するＢ細胞を増殖可能な量であればよく、一般に、１０ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬとすることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬとすることが更に好ましい。
【００３６】
また、ＩＬ−２１及びＩＬ−４以外のサイトカインがＩＬ−２の場合には、１ｕｎｉｔ／ｍＬ〜１０００ｕｎｉｔ／ｍＬとすることが好ましく、１０ｕｎｉｔ／ｍＬ〜５００ｕｎｉｔ／ｍＬとすることが更に好ましい。
ＩＬ−２の１ｕｎｉｔとは、サイトカインの比活性（unit/mg）で定義され、そのサイトカインの反応容量曲線がシグモイド曲線を描く場合にのみ適用される単位である。比活性は、
比活性（ｕｎｉｔ／ｍｇ）＝１×１０6／ＥＤ50（ｎｇ／ｍＬ）
で算出されるため、ＥＤ50（ｎｇ／ｍＬ）に依存する。ＥＤ50（ｎｇ／ｍＬ）は最大反応の５０％の反応を引き起こすサイトカイン濃度として定義され、通常、標準化されたバイオアッセイの結果によって決定される。ＩＬ−２の場合、マウスＣＴＬＬ−２アッセイによって算出されたＥＤ50（ｎｇ／ｍＬ）が採用されている。
【００３７】
工程ｃにおいては、特定抗原と共にＢ細胞を含む細胞集団を培養する。
工程ｃにおいて、Ｂ細胞に対して提示される特定抗原は、Ｂ細胞が親和性を示す抗原を意味し、目的に応じて適宜選択される。抗原の種類としては、抗原性を示すものであれば特に制限はなく、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、糖鎖、脂質、アミノ酸、ペプチド、タンパク、ハプテン、低分子化合物などを挙げることができる。これらの物質は、Ｂ細胞が認識できる形態で提示されていればよく、遊離型であっても、担体固定型であってもよい。Ｂ細胞への確実な提示の観点から、抗原は担体に固定された形態であることが好ましい。
【００３８】
Ｂ細胞による抗原認識性を高めるために、用いられる抗原には、抗原単独で用いられる形態の他に、既知の補助分子を付加した形態、抗体分子との結合形態など、当業界で既知の抗原性を高める形態を適用してもよい。
【００３９】
抗原の提示に抗体分子との結合形態を適用した場合あるいはタンパク抗原と抗体Ｆｃ領域との融合タンパクを適用した場合には、担体表面に抗原を展示させるための足場、例えばＦｃ受容体分子又はプロテインＡやプロテインＧ、プロテインＬなどを更に用いればよい。
【００４０】
また担体の構成成分に対して結合するタンパク質と、抗原蛋白の融合タンパク質を用いてもよい。また、抗原としての膜型タンパク質を提示する場合は、その遺伝子を発現ベクターの形で担体としての細胞に導入して発現させてもよい。それ以外のタンパクの場合には、適当なシグナルペプチド（分泌タンパクの場合は不要）と適当な膜貫通領域（例えばＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩのもの）との融合タンパクとして発現させることのできる発現ベクターを担体としての細胞に導入して発現させてもよい。
【００４１】
工程ｃにおいては、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及び特定抗原を提示した担体を用いてＢ細胞を含む細胞集団を培養することが好ましい。
【００４２】
ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦは、培養系中のＢ細胞に対して確実に細胞内シグナルを与える観点から、担体の表面に提示された形態であることが好ましい。
【００４３】
各分子を表面に提示するために用いられる担体としては、細胞、人工脂質二重膜、ポリスチレンもしくはポリエチレンテレフタラートなどのプラスチック、コラーゲン、ナイロン、ニトロセルロース、寒天、アガロース、セファロースなどの多糖、紙、ガラスなどを、上記分子を表面に提示するために通常用いられるものであれば、特に制限される事なく挙げる事ができる。担体の形状には特に制限はなく、シート状、平板状、球状、スポンジ状、繊維状などのいずれの形状としてもよい。担体としては、細胞の確実な選択性の観点から、細胞であることが好ましい。担体として使用可能な細胞としては、線維芽細胞（例えば３Ｔ３細胞やＬ細胞など）、上皮細胞（例えばＨｅＬａ細胞）、胎児腎臓細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞など）、濾胞樹状細胞などを挙げる事ができる。なかでも、増殖速度が速く、細胞表面積が大きい、フィーダー細胞の除去が簡便である観点から、線維芽細胞が好ましい。
【００４４】
ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及び特定抗原を提示した担体は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及び特定抗原を提示したフィーダー細胞であることが好ましい。
ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及び特定抗原を細胞表面に提示されたフィーダー細胞は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及び特定抗原の既知の配列に基づいて、当業者であれば遺伝子組み換え技術等を用いて作製することができる。
【００４５】
フィーダー細胞の由来としては、上述した細胞集団と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、マウス、ヒトなどを例示する事ができる。また、フィーダー細胞は、提示対象となる上記細胞集団と同一の種に由来する細胞であってもよく、異なる種に由来する細胞であってもよい。
なお、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及び特定抗原は、Ｂ細胞に対して細胞内シグナルを生じさせることができれば、必ずしも同一のフィーダー細胞状に存在していなくてもよい。
【００４６】
＜工程ｄについて＞
本発明における工程ｄは、Ｆａｓを介した刺激を付与しながらＢ細胞を含む細胞集団を培養し、特定抗原を認識するＢ細胞を含むＢ細胞集団を得る工程である。
【００４７】
Ｆａｓを介した刺激は、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）により付与することができる。Ｆａｓを介した刺激は、Ｆａｓに対する抗体又は抗体断片与える形態も可能である（特許文献１参照）。
【００４８】
Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）は、ＴＮＦファミリーに属するデス因子、即ちアポトーシス誘導活性を示すサイトカインであり、そのアミノ酸配列は公知となっている（例えば、Cell, Vol.75, pp.1169-1178 (1993)）参照。本発明では、ＦａｓＬの配列のうち、受容体結合能に関与する活性ドメインの結合能が失われない程度に保存されていればよく、例えば、活性ドメインの８０％以上のアミノ酸配列相同性があれば、本発明において利用可能である。このようなＦａｓＬは、自然に発現する細胞から単離したものであってもよく、既知のアミノ酸配列に基づいて合成したものであってもよい。また、ＦａｓＬは、培養系中のＩｇＧ陽性Ｂ細胞に対してＦａｓの存在に対応したシグナルを与えることができる形態であればよく、細胞内シグナルを生じさせることができれば遊離型であっても、膜結合型であってもよい。
【００４９】
ＦａｓＬは、一般的にＢ細胞に対してアポトーシスを誘導可能な濃度で培養系に存在していればよく、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、また抗原刺激による細胞死の抑制を誘導する観点から、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの濃度とすることができる。
【００５０】
なお、ＦａｓＬの由来としては、上述した細胞集団と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、マウス、ヒトを例示する事ができる。また提示対象となる上記細胞集団と同一の主に由来するものであってもよく、異なる主に由来するものであってもよい。
【００５１】
Ｆａｓに対する抗体又は抗体断片は、当業界で既知の方法に従って得る事ができる。Ｆａｓに対して結合能を有する抗体であれば、特に制限はない。
これらの抗体又は抗体断片は、担体の表面に提示された形態であっても、抗体表面に固定化されていない遊離型又は可溶化形態であってもよい。
【００５２】
工程ｄにおいては、好ましくは、Ｆａｓを介した刺激を付与しながらＩＬ−２１の存在下又はＩＬ−２１及びＩＬ−２の存在下でＢ細胞を含む細胞集団を培養することができる。  また、工程ｄは、特定抗原の非存在下で行うことが好ましい。
【００５３】
工程ｄにおいてＩＬ−２１を存在させる場合、その濃度は、一般に、１ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬとすることが好ましく、１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬとすることが更に好ましい。
工程ｄにおいてＩＬ−２を存在させる場合、その濃度は、１ｕｎｉｔ／ｍＬ〜１０００ｕｎｉｔ／ｍＬとすることが好ましく、１０ｕｎｉｔ／ｍＬ〜５００ｕｎｉｔ／ｍＬとすることが更に好ましい。
【００５４】
工程ｄは、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬを提示した担体を用いてＢ細胞を含む細胞集団を培養することが好ましい。即ち。ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ又はＦａｓＬは、培養系中のＢ細胞に対して確実に細胞内シグナルを与える観点から、担体の表面に提示された形態であることが好ましい。各分子を表面に提示するために用いられる担体としては、本明細書中上記したものを挙げることができる。
ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬを提示した担体は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬを提示したフィーダー細胞であることが特に好ましい。ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬを細胞表面に提示されたフィーダー細胞は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬの既知の配列に基づいて、当業者であれば遺伝子組み換え技術等を用いて作製することができる。
【００５５】
フィーダー細胞の由来としては、上述した細胞集団と同様に、哺乳動物の霊長類、有蹄類、小型哺乳類の齧歯類、鳥類などが挙げられ、好ましくは、齧歯類及び哺乳類由来のものであり、マウス、ヒトなどを例示する事ができる。また、フィーダー細胞は、提示対象となる上記細胞集団と同一の種に由来する細胞であってもよく、異なる種に由来する細胞であってもよい。
【００５６】
なお、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ及びＦａｓＬは、Ｂ  細胞に対して細胞内シグナルを生じさせることができれば、必ずしも同一のフィーダー細胞状に存在していなくてもよい。
【００５７】
＜工程ｃ及び工程ｄからなる選別工程＞
上記した工程ｃ及び工程ｄからなる工程を、選別工程ともいう。選別工程は、播種密度及び細胞種などの条件によって異なる場合もあるが、確実な選別の観点から一般に選別工程開始後１日以上とし、確実な選別の観点から１日〜３日としてもよく、１日〜２日とすることが好ましいが、細胞の生存能が維持されれば、より長期であってもよく、より長期に培養することによって、より高い親和性を有する抗原特異的Ｂ細胞を得ることができる。
【００５８】
またＢ細胞の抗原に対する親和性を向上させるために、選別工程はフィーダー細胞を更新させながら、繰り返し行ってもよい。その際、Ｂ細胞の抗原に対する親和性を向上させるために、工程を繰り返す毎に抗原の濃度や価数を変化（減少）させてもよい。さらに、Ｂ細胞の抗原に対する親和性を向上させるために、Ｂ細胞の抗原に対する親和性を向上させるために、直前の工程の培養上清、又は培養上清中に産生された抗体を次の工程を行う際に培養系へ加えてもよい。これにより、Ｂ細胞受容体と抗体との競合が生じて、より高い親和性のＢ細胞受容体を持つＢ細胞が選別され得る。
【００５９】
＜工程ａ及び工程ｂについて＞
本発明においては、工程ｃに先立って、Ｂ細胞を含む細胞集団を、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ−４の存在下又はＩＬ−４及びＩＬ−２の存在下で培養する工程ａをさらに設けてもよい。
本発明においては、工程ａと工程ｃとの間に、Ｂ細胞を含む細胞集団を、ＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激を付与しながら、ＩＬ−２１の存在下又はＩＬ−２１及びＩＬ−２の存在下で培養する工程ｂをさらに設けてもよい。
【００６０】
工程ａ及び工程ｂにおけるＣＤ４０及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激の付与は、本明細書中上記した方法と同様に行うことができる。
工程ａを行う場合、その培養期間は特に限定されないが、一般的には１〜１４日間であり、好ましくは３〜１０日間である。
工程ｂを行う場合、その培養期間は特に限定されないが、一般的には１〜７日間であり、好ましくは２〜４日間である。
【００６１】
工程ａにおけるＩＬ−４の濃度は、一般に、１ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬとすることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬとすることが更に好ましい。
工程ａにおけるＩＬ−２の濃度は、１ｕｎｉｔ／ｍＬ〜１０００ｕｎｉｔ／ｍＬとすることが好ましく、１０ｕｎｉｔ／ｍＬ〜５００ｕｎｉｔ／ｍＬとすることが更に好ましい。
【００６２】
工程ｂにおけるＩＬ−２１の濃度は、一般に、１ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬとすることが好ましく、１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬとすることが更に好ましい。
工程ｂにおけるＩＬ−２の濃度は、１ｕｎｉｔ／ｍＬ〜１０００ｕｎｉｔ／ｍＬとすることが好ましく、１０ｕｎｉｔ／ｍＬ〜５００ｕｎｉｔ／ｍＬとすることが更に好ましい。
【００６３】
＜特定抗原を認識するＢ細胞を含むＢ細胞集団＞
上記した本発明の方法により、特定抗原を認識するＢ細胞を含むＢ細胞集団が製造される。上記の特定抗原を認識するＢ細胞を含むＢ細胞集団は、「抗原特異的Ｂ細胞集団」であることが好ましい。「抗原特異的Ｂ細胞集団」とは、得られた細胞を総括する意味で用いられ、細胞の数に限定されない。即ち、複数個の細胞をさす場合に用いられる他、１個の細胞のみが存在する場合にも同様に用いられる。
【００６４】
本発明の方法で製造される特定抗原を認識するＢ細胞を含むＢ細胞集団では、用いられた特定抗原に対して特異性を有するＢ細胞から主として構成されていることが好ましい。このような抗原特異的Ｂ細胞集団は、例えば、同様の抗原と一次接触した生体由来の末梢血中に存在するＢ細胞集団よりも、抗原に対して特異性を有するＢ細胞の密度が高い。
従って、本発明の方法で製造される抗原特異的Ｂ細胞集団であれば、特定抗原に対して親和性を有するＢ細胞を大量に必要とするモノクローナル抗体の製造や、細胞治療等に好適に用いることができる。
【００６５】
＜モノクローナル抗体の製造方法＞
本発明によれば、上記した本発明の製造方法により得られたＢ細胞集団を培養することによってモノクローナル抗体を製造する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法が提供される。これにより、特定抗原に対するモノクローナル抗体を簡便に且つ迅速に得ることができる。
【００６６】
本発明によるモノクローナル抗体の製造方法では、周知のハイブリドーマ作製方法を、上記のＢ細胞集団に対して適用すればよい。具体的には、本発明により得られたＩｇＧ陽性Ｂ細胞を含む細胞集団に対して、ミエローマ細胞等を周知の方法による細胞融合法を用いてハイブリドーマを得て、このハイブリドーマの中から、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法等を用いて単離し、単離されたハイブリドーマが産生する抗体を回収すればよい。あるいは、上記の抗原特異的Ｂ細胞集団から抗体遺伝子を単離して、遺伝子組み換えによりモノクローナル抗体を作製する方法でもよい。
【００６７】
以下に記載の実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６８】
（１）細胞の培養
Ｂ細胞の培養は、特に断らない限り、ＲＰＭＩ−１６４０（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５５ｎＭ  ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム添加）をＢ細胞培養培地として用いて、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2、３７℃の条件下で行った。【００６９】
Ｂ細胞の培養時に用いる、ＣＤ４０Ｌ及びＢＡＦＦを細胞表面に提示するフィーダー細胞、４０ＬＢ細胞の培養は、特に断らない限り、Ｄ−ＭＥＭ（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン添加）を４０ＬＢ細胞培養培地として用いて、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2、３７℃の条件下で行った。【００７０】
Ｂ細胞培養実験時には、直径９０ｍｍ細胞培養プレート（住友ベークライト製）に、４０ＬＢ細胞を２．７×１０6個播種し、２４時間培養して単一層を形成させた後、１２０ＧｙのＸ線を照射してから使用した。【００７１】
（２）フィーダー細胞の調製
抗原特異的Ｂ細胞集団を選択するＦＡＩＳ（Ｆａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉＧＢ−ｃｅｌｌ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）法(PLoS One, 19;9(3):e92732.2014）)を行うため、４０ＬＢ−Ｈｅｒ２及び４０ＬＢ−ＦａｓＬ細胞を用いた。【００７２】
４０ＬＢ−Ｈｅｒ２細胞は４０ＬＢ細胞にヒトＨｅｒ２を、常法に従ってレンチウィルスベクターにより導入し、恒常的に発現させてクローン作製した。
４０ＬＢ−ＦａｓＬ細胞は特許文献１の記載と同様に、４０ＬＢ細胞にマウスＦａｓＬを常法に従ってレトロウィルスベクターにより導入し、恒常的に発現させてクローン作製した。【００７３】
（３）ヒトＢ細胞の調製
健常人のヒト末梢血からＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐチューブ（ＡＸＩＳ  ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて単核球を分離し、ＦｃＲ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いた後、さらにＣＤ２陰性細胞及びＣＤ２３５ａ陰性細胞を、ビオチン−抗ヒトＣＤ２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ビオチン−抗ヒトＣＤ２３５ａ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｌｕｓ−ＤＭ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を使用し、ＢＤ  ｉＭａｇ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍａｇｎｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて回収した。回収した細胞の内ＣＤ１９陽性細胞を、ＰＥ−抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を使用し、セルソーター（ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＡｒｉａIII）を用いて回収した。
上記で調製したＢ細胞は図１の計画に従って培養を行った。【００７４】
（４）抗原特異的Ｂ細胞受容体発現Ｂ細胞集団の調製
抗原特異的Ｂ細胞を含むＢ細胞集団は以下のようにして得た。
即ち、ＣＳＩＶ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓベクター（Cancer Science, Vol.105, pp.402-408（2014））を組み換え、Ｈｅｒ２抗原特異的Ｂ細胞受容体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体遺伝子）の重鎖及び軽鎖を組み込んだＣＳＩＶ−ＣＭＶ−ｍＧＫ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  ｋａｐｐａ−Ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）−ＩＲＥＳ２−  ｍＧＨ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）を作製し、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ発現ベクターを構築した。この発現レンチウィルスベクターを用いて、回収したＣＤ１９陽性Ｂ細胞に、常法に従いＨｅｒ２抗原特異的Ｂ細胞受容体を発現させたＢ細胞集団を得た。【００７５】
（５）ヒトＢ細胞の調製（培養工程）
上記で得られた抗原特異的Ｂ細胞を含む集団は、単一層を形成させた４０ＬＢ細胞上で、７日間一次培養した。培養時はヒトＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）、ヒトＩＬ−２（５０ｕｎｉｔ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）を含有するＢ細胞培地を用いて、１×１０5個／ｃｍ2の細胞密度でＣＯ2インキュベーターにて培養した（本明細書に記載した工程ａ）。【００７６】
培養７日目に全細胞を、２ｍＭのＥＤＴＡと０．５質量％のＢＳＡを含むＤ−ＰＢＳを用いてフィーダー細胞ごと回収した。回収した培養Ｂ細胞は、ビオチン−抗マウスＨ−２Ｋd抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及びビオチン抗ヒトＣＤ１３８抗体（社製）とＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｌｕｓ−ＤＭ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を使用し、ＢＤ  ｉＭａｇ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍａｇｎｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いてフィーダー細胞及び抗体産生細胞を除去した。フィーダー細胞を除去したＢ細胞は、新たに準備された４０ＬＢ細胞が播種された９０ｍｍディッシュに、ヒトＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）、ヒトＩＬ−２（５０ｕｎｉｔ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）を含有するＢ細胞培地を用いて５×１０4個／ｃｍ2以下の細胞密度で播種して培養を行った（本明細書に記載した工程ｂ）。【００７７】
（６）抗原特異的Ｂ細胞の選択培養（選択工程）
培養１０日目に、Ｈｅｒ２抗原特異的Ｂ細胞の選択培養を行うため、回収した培養Ｂ細胞から（５）と同様にしてフィーダー細胞及び抗体産生細胞を除去した。フィーダー細胞を除去したＢ細胞は、新たに準備された４０ＬＢ細胞が播種された９０ｍｍディッシュに、ヒトＩＬ−２（５０ｕｎｉｔ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）を含有するＢ細胞培地を用いて２×１０5個／ｃｍ2の細胞密度で播種し、抗原刺激前培養を行った。その際Ｂ細胞培地中に存在するサイトカインが、ヒトＩＬ−２のみ、ヒトＩＬ−２に加えて共通・鎖を持つ受容体を刺激するサイトカインファミリーであるヒトＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）及びヒトＩＬ−２１（５０ｎｇ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）をそれぞれ添加する条件、ヒトＩＬ−２に加えてＩＬ−１０サイトカインファミリーであるヒトＩＬ−２０（５０ｎｇ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）及びヒトＩＬ−２４（１００ｎｇ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）をそれぞれ添加する条件、ヒトＩＬ−２に加えてＩＬ−１２サイトカインファミリーであるヒトＩＬ−２７（５０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加する条件を追加した。【００７８】
４８時間後（即ち、培養１２日目）、全細胞をビオチン−抗マウスＨ−２Ｋd抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及びビオチン抗ヒトＣＤ１３８抗体（社製）とＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｌｕｓ−ＤＭ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を使用し、ＢＤ  ｉＭａｇ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍａｇｎｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いてフィーダー細胞及び抗体産生細胞を除去した。フィーダー細胞及び抗体産生細胞を除去した抗原刺激前培養を行ったＢ細胞集団は、引き続き同じ条件のサイトカインを含有するＢ細胞培地に懸濁し、単一層を形成させた４０ＬＢ−Ｈｅｒ２細胞と共に培養することで抗原特異的なＢ細胞に抗原刺激を与えた（本明細書に記載した工程ｃ）。【００７９】
４８時間後（即ち、培養１４日目）、全細胞を上記と同様の方法によりフィーダー細胞及び抗体産生細胞を除去した。４０ＬＢ−Ｈｅｒ２細胞及び抗体産生細胞を除去した抗原刺激培養を行った各条件のＢ細胞は、ヒトＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）及びヒトＩＬ−２（５０ｕｎｉｔ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）を含有するＢ細胞培地に懸濁し、単一層を形成させた４０ＬＢ−ＦａｓＬ細胞と共に培養することで培養Ｂ細胞集団全てに細胞死刺激を与えた（本明細書に記載した工程ｄ）。【００８０】
２４時間後（即ち、培養１５日目）、全細胞をビオチン−抗マウスＨ−２Ｋd抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及びビオチン抗ヒトＣＤ１７８（ＦａｓＬ）抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）とＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐｌｕｓ−ＤＭ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を使用し、ＢＤ  ｉＭａｇ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍａｇｎｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて４０ＬＢ−ＦａｓＬ細胞を除去した。さらに４０ＬＢ−ＦａｓＬ細胞を除去したＢ細胞集団は、ＣｌｉｏＣｅｌｌ  Ｐｒｏ  Ｋｉｔ（ＣｌｉｏＣｅｌｌ社製）を用いて死細胞を除去した。フィーダー細胞及び死細胞を除去したＢ細胞集団は、ヒトＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）及びヒトＩＬ−２（５０ｕｎｉｔ／ｍＬ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ  社製）を含有するＢ細胞培地に懸濁し、新たな４０ＬＢ細胞上で回復培養を行った。【００８１】
細胞死刺激後に回復培養を行い、６日間培養した細胞を回収し、Ｈｅｒ２抗原特異的Ｂ細胞を、ＦＩＴＣ−抗マウスＨ−２Ｋd抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ＰＥ−抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、Ａｌｅｘａ６４７標識Ｈｅｒ２−Ｔａｇ２タンパクを用いて、フローサイトメーター（ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＡｒｉａIII）を用いて検出した。結果を図２に示す。【００８２】
図中に示された数値はそれぞれの領域内に含まれる細胞の割合（％）を示す。
図２で示された、選択を行わなかった際の細胞の割合と、選択を行った際の細胞の割合から、選択培養による選択効率（倍数）を図３に示す。
図３に示されるように、選択工程時のサイトカイン条件を、特許文献１で示されたＩＬ−２１非存在下もしくはＩＬ−１０サイトカインファミリーやＩＬ−１２サイトカインファミリーに変更した結果、抗原特異的Ｂ細胞の選択効率が向上することが確認された。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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