(57)【要約】  本発明の目的の１つは、低消化速度及び高消化性を兼ね備える高分子グルカンを提供することである。  分岐状グルカンを基質として、(1)特定濃度のブランチングエンザイムと、(2)４−α−グルカノトランスフェラーゼ及び／又はエキソ型アミラーゼとを作用させることによって、消化速度が遅く、難消化性成分を殆ど含まず、低消化速度及び高消化性を両立できる高分子グルカンが生成する。
2018123901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−１，４−グルコシド結合による主鎖にα−１，６−グルコシド結合による分岐鎖が結合している高分子グルカンであって、
平均分子量が１万〜５０万であり、
α−１，６−グルコシド結合をイソアミラーゼで消化することにより直鎖状の単位鎖長に分解した後に、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって単位鎖長分布を分析すると、下記特性(i)〜(iii)を満たす、高分子グルカン：
(i)重合度６〜１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度１〜５を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ1-5／ＤＰ6-10）×１００）が３３〜５０％である。
(ii)重合度６〜１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度１１〜１５を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ11-15／ＤＰ6-10）×１００）が８０〜１２５％である。
(iii)重合度６〜１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度２６〜３０を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ26-30／ＤＰ6-10）×１００）が１６〜４３％である。
【請求項２】
更に、前記単位鎖長分布を分析すると、下記特性(iv)〜(vii)の内、少なくとも１つを満たす、請求項１に記載の高分子グルカン：
(iv)重合度６−１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度１６−２０を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ16-20／ＤＰ6-10）×１００）が５３〜８５％である。
(v)重合度６−１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度２１−２５を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ21-25／ＤＰ6-10）×１００）が３１〜６２％である。
(vi)重合度６−１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度３１−３５を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ31-35／ＤＰ6-10）×１００）が８〜３０％である。
(vii)重合度６−１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度３６−４０を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ36-40／ＤＰ6-10）×１００）が３〜２１％である。
【請求項３】
下記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化性試験において求められる初期消化速度係数ｋが０．０２９未満であり、且つ酵素反応開始から１２０分間までに分解されない成分の割合が１０％未満である、請求項１又は２に記載の高分子グルカン：
[ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化性試験の方法]
５ｗ／ｖ％高分子グルカン水溶液１００μＬ、１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）２０μＬ、蒸留水７１６μＬを混合し、更に２５０Ｕ／ｍＬの濃度のブタ膵臓由来α−アミラーゼ液４μＬ、及びα−グルコシダーゼ活性で０．３Ｕ／ｍＬに相当する濃度のラット小腸アセトンパウダー液１６０μＬを添加して３７℃で反応を開始する。経時的に、各反応液中のグルコース濃度を測定し、高分子グルカンから遊離したグルコース量を測定する。
初期消化速度係数ｋは、下記式に従って算出する。
【数１】
2018123901.tif 000034
【請求項４】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化性試験において、酵素反応開始から２０分間までに分解される成分の割合が４５％未満であり、且つ酵素反応開始２０分後から１２０分間後までの間で分解される成分の割合が５０％以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の高分子グルカン。
【請求項５】
α−１，４−グルコシド結合による主鎖の非還元末端がα−１，６−グルコシド結合による分岐構造を有していない、請求項１〜４のいずれかに記載の高分子グルカン。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の高分子グルカンを含む、飲食品。
【請求項７】
血糖値及び／又は血中インスリン濃度の上昇抑制用である、請求項６に記載の飲食品。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の高分子グルカンを含む、輸液。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載の高分子グルカンを含む、医薬品。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれかに記載の高分子グルカンの製造方法であって、
分岐状グルカンを基質として、ブランチングエンザイム１００〜４，０００Ｕ／ｇ基質と、４−α−グルカノトランスフェラーゼとを、同時に又は任意の順で段階的に反応させ、請求項１〜５のいずれかに記載の高分子グルカンが生成している時点で反応を停止する、
高分子グルカンの製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載の高分子グルカンの製造方法であって、
分岐状グルカンを基質として、ブランチングエンザイム１００〜４，０００Ｕ／ｇ基質を反応させ、次いでエキソ型アミラーゼを反応させ、請求項１〜５のいずれかに記載の高分子グルカンが生成している時点で反応を停止する、
高分子グルカンの製造方法。
【請求項１２】
前記４−α−グルカノトランスフェラーゼが、アミロマルターゼ及び／又はシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼである、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記エキソ型アミラーゼが、β−アミラーゼである、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記分岐状グルカンが、ワキシー澱粉である、請求項１０〜１３のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低消化速度及び高消化性を兼ね備える高分子グルカンに関する。また、本発明は、当該高分子グルカンの製造方法、及び当該高分子グルカンを使用した各種製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭水化物はエネルギー源として必須の栄養素である。炭水化物の代表的なものにデンプンがあるが、天然のデンプンは加工食品の原料として使用する場合、水への溶解のしにくさなどの加工性の低さ、老化性などの保存安定性などが問題となる。これらの問題を解決するために、酸や酵素で部分的に加水分解した高分子グルカン、いわゆるデキストリンが開発されている。しかしながら、デキストリンは、加工性や保存安定性等の特性は改善されているものの、消化速度が速くなるという特性があり、摂取後の血糖値やインスリン値の急激な上昇を招く点で問題点がある。摂取後の血糖値やインスリン値の急激な上昇は、肥満や糖尿病の原因の一つになっていると考えられている。そこで、この問題に対し、化学反応や酵素反応によりデキストリンの化学構造を変えることで消化速度を落とそうとする試みが行われている（非特許文献１）。【０００３】
従来、酵素反応を利用してデキストリンの構造を改変し消化速度を落とす方法としては、デキストリンの結晶性を上げて消化酵素が作用しにくくする方法（特許文献１、非特許文献２）と、デキストリン中のα−１，６‐グルコシド結合の割合を増やす方法（特許文献３、５、非特許文献３）、α−１，６−グルコシド結合以外のα−１，２、α−１，３‐グルコシド結合の割合を増やす方法（特許文献６）等が報告されている。しかし、これらの方法は、いずれも、デキストリンの消化速度を十分（天然のグリコーゲンの消化速度未満）に低下させようとすると、消化できない構造（難消化性の構造）部分が増加し、エネルギー源として利用できる構造部分が減るという欠点がある。【０００４】
また、従来、使用する酵素の種類や使用量を工夫することで、難消化性成分を低減させ、且つ消化性の遅いデキストリンが合成できることも報告されている（特許文献２、非特許文献４）。しかしながら、これらのデキストリンでも、消化速度を低下させるために、ヒトの消化酵素が分解できないα−１，３‐グルコシド結合が含まれており、少なくともこの結合を含む部分はエネルギー源として利用できない。また、これらのデキストリンは、消化速度を低下させるために酵素反応を十分行う結果として、分子量が低下しており、それに伴う溶液の浸透圧の上昇、還元糖量の増加等を招いてしまう。浸透圧が高い飲料は、下痢や腹部膨満感の原因となるため、溶液の浸透圧は低くすることが望ましいと考えられており、また、還元糖量が多いと、製品の保存時の着色等の問題も生じる。【０００５】
このように、低消化速度、高消化性、且つ高分子という特性を持つグルカンは、生理機能面や加工適性等で価値が高いものの、このような特性を有するグルカンは知られていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Critical Reviews in Food Science and Nutrition 49, 852-867 (2009).
【非特許文献２】Cereal Chemistry 81, 404-408 (2004).
【非特許文献３】Carbohydrate Polymers 132, 409-418 (2015).
【非特許文献４】Journal of Applied Glycoscience 61, 45-51 (2014).
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2004-131682号公報
【特許文献２】特開2015-109868号公報
【特許文献３】特開2001-11101号公報
【特許文献４】特開2009-524439号公報
【特許文献５】特開2012-120471号公報
【特許文献６】特開平11-236401号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、低消化速度及び高消化性を兼ね備える高分子グルカンを提供することである。更に、本発明の他の目的は、当該高分子グルカンを使用した各種製品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、澱粉、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン、高度分岐環状グルカン等の分岐状グルカンを基質として、(1)特定濃度のブランチングエンザイムと、(2)４−α−グルカノトランスフェラーゼ及び／又はエキソ型アミラーゼとを作用させることによって、消化速度が遅く、難消化性成分を殆ど含まず、低消化速度及び高消化性を両立できる高分子グルカンが生成することを見出した。【００１０】
また、本発明者等は、前記高分子グルカンの構造として、α−１，４−グルコシド結合による主鎖にα−１，６−グルコシド結合による分岐鎖が結合しており、平均分子量が１万〜５０万の高分子グルカンであって、α−１，６−グルコシド結合をイソアミラーゼで消化した後に、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって単位鎖長分布を分析すると、下記特性(i)〜(iii)を満たすことを見出した。
(i)重合度６〜１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度１〜５を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ1-5／ＤＰ6-10）×１００）が３３〜５０％である。
(ii)重合度６〜１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度１１〜１５を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ11-15／ＤＰ6-10）×１００）が８０〜１２５％である。
(iii)重合度６〜１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度２６〜３０を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ26-30／ＤＰ6-10）×１００）が１６〜４３％である。【００１１】
本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  α−１，４−グルコシド結合による主鎖にα−１，６−グルコシド結合による分岐鎖が結合している高分子グルカンであって、
平均分子量が１万〜５０万であり、
α−１，６−グルコシド結合をイソアミラーゼで消化することにより直鎖状の単位鎖長に分解した後に、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって単位鎖長分布を分析すると、下記特性(i)〜(iii)を満たす、高分子グルカン：
(i)重合度６〜１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度１〜５を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ1-5／ＤＰ6-10）×１００）が３３〜５０％である。
(ii)重合度６〜１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度１１〜１５を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ11-15／ＤＰ6-10）×１００）が８０〜１２５％である。
(iii)重合度６〜１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度２６〜３０を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ26-30／ＤＰ6-10）×１００）が１６〜４３％である。
項２．  更に、前記単位鎖長分布を分析すると、下記特性(iv)〜(vii)の内、少なくとも１つを満たす、項１に記載の高分子グルカン：
(iv)重合度６−１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度１６−２０を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ16-20／ＤＰ6-10）×１００）が５３〜８５％である。
(v)重合度６−１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度２１−２５を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ21-25／ＤＰ6-10）×１００）が３１〜６２％である。
(vi)重合度６−１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度３１−３５を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ31-35／ＤＰ6-10）×１００）が８〜３０％である。
(vii)重合度６−１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度３６−４０を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ36-40／ＤＰ6-10）×１００）が３〜２１％である。
項３．  下記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化性試験において求められる初期消化速度係数ｋが０．０２９未満であり、且つ酵素反応開始から１２０分間までに分解されない成分の割合が１０％未満である、項１又は２に記載の高分子グルカン：
[ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化性試験の方法]
５ｗ／ｖ％高分子グルカン水溶液１００μＬ、１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）２０μＬ、蒸留水７１６μＬを混合し、更に２５０Ｕ／ｍＬの濃度のブタ膵臓由来α−アミラーゼ液４μＬ、及びα−グルコシダーゼ活性で０．３Ｕ／ｍＬに相当する濃度のラット小腸アセトンパウダー液１６０μＬを添加して３７℃で反応を開始する。経時的に、各反応液中のグルコース濃度を測定し、高分子グルカンから遊離したグルコース量を測定する。
初期消化速度係数ｋは、下記式に従って算出する。
【数１】
2018123901.tif 000003
項４．  前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化性試験において、酵素反応開始から２０分間までに分解される成分の割合が４５％未満であり、且つ酵素反応開始２０分後から１２０分間後までの間で分解される成分の割合が５０％以上である、項１〜３のいずれかに記載の高分子グルカン。
項５．  α−１，４−グルコシド結合による主鎖の非還元末端がα−１，６−グルコシド結合による分岐構造を有していない、項１〜４のいずれかに記載の高分子グルカン。
項６．  項１〜５のいずれかに記載の高分子グルカンを含む、飲食品。
項７．  血糖値及び／又は血中インスリン濃度の上昇抑制用である、項６に記載の飲食品。
項８．  項１〜５のいずれかに記載の高分子グルカンを含む、輸液。
項９．  項１〜５のいずれかに記載の高分子グルカンを含む、医薬品。
項１０．  項１〜５のいずれかに記載の高分子グルカンの製造方法であって、
分岐状グルカンを基質として、ブランチングエンザイム１００〜４，０００Ｕ／ｇ基質と、４−α−グルカノトランスフェラーゼとを、同時に又は任意の順で段階的に反応させ、項１〜５のいずれかに記載の高分子グルカンが生成している時点で反応を停止する、
高分子グルカンの製造方法。
項１１．  項１〜５のいずれかに記載の高分子グルカンの製造方法であって、
分岐状グルカンを基質として、ブランチングエンザイム１００〜４，０００Ｕ／ｇ基質を反応させ、次いでエキソ型アミラーゼを反応させ、項１〜５のいずれかに記載の高分子グルカンが生成している時点で反応を停止する、
高分子グルカンの製造方法。
項１２．  前記４−α−グルカノトランスフェラーゼが、アミロマルターゼ及び／又はシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼである、項１０に記載の製造方法。
項１３．  前記エキソ型アミラーゼが、β−アミラーゼである、項１１に記載の製造方法。
項１４．  前記分岐状グルカンが、ワキシー澱粉である、項１０〜１３のいずれかに記載の製造方法。
項１５．  血糖値及び／又は血中インスリン濃度の上昇抑制剤を製造するための、項１〜４のいずれかに記載の高分子グルカンの使用。
項１６．  血糖値及び／又は血中インスリン濃度の上昇の抑制が求められる人に、項１〜４のいずれかに記載の高分子グルカンを投与する、血糖値及び／又は血中インスリン濃度の上昇抑制方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の高分子グルカンは、特定の単位鎖長分布を有することによって低消化速度を実現できており、摂取されると、生体内では緩やかに消化され、血糖値やインスリン値を急激に上昇するのを抑制することができる。また、本発明の高分子グルカンは、ほとんど難消化性成分を含んでいないため、高消化性を備え、エネルギー源として効率的に利用することもできる。このような低消化速度と高消化性を両立させた高分子グルカンは、従来報告されておらず、飲食品や医薬等の分野において、従来の分岐状グルカン（澱粉、デキストリン等）の代替品として好適に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の高分子グルカン、従来のデキストリン、グリコーゲン及び難消化性デキストリンの単位鎖長分布のモデル図である。
【図２】実施例１で得られた高分子グルカンの単位鎖長分布を示す図である。
【図３】実施例１−３及び１−６の高分子グルカンを酵素法による結合様式の分析を行った結果（生成物の分析結果）を示す図である。
【図４】比較例１で得られた分岐状グルカンの単位鎖長分布を示す図である。
【図５】比較例２で得られた分岐状グルカンの単位鎖長分布を示す図である。
【図６】比較例３の酵素合成分岐グルカンの単位鎖長分布を示す図である。
【図７】比較例４の天然グリコーゲンの単位鎖長分布を示す図である。
【図８】実施例２で得られた高分子グルカンの単位鎖長分布を示す図である。
【図９】実施例３で得られた高分子グルカンの単位鎖長分布を示す図である。
【図１０】実施例４で得られた高分子グルカンの単位鎖長分布を示す図である。
【図１１】比較例５で得られた分岐状グルカンの単位鎖長分布を示す図である。
【図１２】実施例５で得られた高分子グルカンの単位鎖長分布を示す図である。
【図１３】比較例６で得られた分岐状グルカンの単位鎖長分布を示す図である。
【図１４】実施例１−３の高分子グルカン及びグルコースを経口摂取した際の血糖値及び血中インスリン値について、経時的変化及び血中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）示す図である。
【図１５】実施例１−３の高分子グルカン及び比較例１−３の分岐状グルカンを経口摂取した際の血糖値及び血中インスリン値について、経時的変化及び血中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．定義
本明細書において、「低消化速度」とは、経口摂取後に高分子グルカンが消化される速度が遅いことを指し、例えば、後述するｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化性試験における初期消化速度係数ｋが０．０２９未満であることが挙げられる。
【００１５】
本明細明細書において、「高消化性」とは、高分子グルカンに含まれる難消化性成分が少なく、経口摂取後にエネルギーとして利用可能な成分量が多いことを指し、例えば、後述するｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化性試験において、消化酵素による１２０分の加水分解反応後、グルコースまで分解されなかった成分が１０％未満であることが挙げられる。
【００１６】
本明細書において、イソアミラーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、及びα−グルコシダーゼの１単位（１Ｕ）は、以下の酵素量を指す。
イソアミラーゼ１Ｕ：カキグリコーゲンから１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素量。
α−アミラーゼ１Ｕ：可溶性澱粉から3分間に1ｍｇのマルトースを生成する酵素量。
グルコアミラーゼ１Ｕ：可溶性澱粉から３０分間に１０ｍｇのグルコースを生成する酵素量。
α−グルコシダーゼ１Ｕ：p-ニトロフェニル-α-Ｄ-グルコピラノシドから１分間に１μｍｏｌの４−ニトロフェノールを遊離する酵素量。
【００１７】
本明細書において、「ラット小腸アセトンパウダー」とは、ラットの小腸をホモジネーとした後にアセトンを加えて冷却し、生じた沈殿を回収して乾燥することにより得られる、α−グルコシダーゼを含む粗酵素粉末製剤である。
【００１８】
２．高分子グルカン
本発明の高分子グルカンは、α−１，４−グルコシド結合による主鎖にα−１，６−グルコシド結合による分岐鎖が結合している高分子グルカンであって、分子量が１万〜５０万であり、α−１，６−グルコシド結合をイソアミラーゼで消化することにより直鎖状の単位鎖長に分解すると特定の単位鎖長分布を示すことを特徴とする。以下、本発明の高分子グルカンについて詳述する。
【００１９】
２−１．Ｄ−グルコースの結合様式
本発明の高分子グルカンは、α−１，６−グルコシド結合を持つ分岐状α−１，４−グルカンである。
【００２０】
本発明の高分子グルカンにおいて、α−１，６−グルコシド結合による分岐頻度については、後述する単位鎖長分布を充足することを限度として特に制限されないが、例えば、約７％以上、好ましくは約７．５％以上、更に好ましくは約８％以上が挙げられる。また、当該分岐頻度の上限値についても、後述する単位鎖長分布を充足することを限度として特に制限されないが、例えば、約１１％以下、好ましくは約１０．５％以下、更に好ましくは約１０％以下が挙げられる。本発明の高分子グルカンにおける当該分岐頻度として、具体的には、約７〜約１１、好ましくは約７．５〜約１０．５、更に好ましくは約８〜約１０が挙げられる。
【００２１】
なお、本発明において、α−１，６−グルコシド結合による分岐頻度は、以下の式によって計算される値である。
【数２】
2018123901.tif 000004
【００２２】
本発明の高分子グルカンにおいて、α−１，６−グルコシド結合による分岐鎖は、主鎖に対して不均一に分布していてもよいし、均一に分布していてもよい。
【００２３】
また、本発明の高分子グルカンの結合様式の好適な態様として、α−１，４−グルコシド結合による主鎖の非還元末端がα−１，６−グルコシド結合による分岐構造を有していないことが挙げられる。
【００２４】
２−２．平均分子量及び平均重合度
本発明の高分子グルカンの平均分子量は１万〜５０万である。本発明の高分子グルカンの一態様として、平均分子量が、好ましくは約５万以上、更に好ましくは約１０万以上が挙げられる。また、本発明の高分子グルカンの一態様として、平均分子量が、好ましくは約３０万以下、更に好ましくは約２０万以下が挙げられる。本発明の高分子グルカンの好適な態様として、平均分子量が、好ましくは約５万〜約３０万、更に好ましくは約１０万〜約２０万が挙げられる。本発明の高分子グルカンは、このような平均分子量を満たすことによって、飲料に添加しても浸透圧の上昇を抑制することが可能になり、また、配合される各種製品における還元糖量の増加を抑制することも可能になる。
【００２５】
本発明において、高分子グルカンの平均分子量は、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法によって測定される重量平均分子量を指す。高分子グルカンの平均分子量の詳細な測定条件については、実施例の欄に示す通りである。
【００２６】
また、本発明の高分子グルカンの平均重合度については、前記平均分子量を満たす範囲であればよいが、例えば、約６０以上、好ましくは約８０以上、更に好ましくは約１００以上、特に好ましくは約１２０以上が挙げられる。また、本発明の高分子グルカンの平均重合度の上限値についても、前記平均分子量を満たす範囲であればよいが、例えば、約３．５×１０3以下、好ましくは約３×１０3以下、更に好ましくは約２．５×１０3以下、特に好ましくは約２×１０3以下が挙げられる。より具体的には、本発明の高分子グルカンの平均重合度として、例えば、約６０〜約３．５×１０3、好ましくは約８０〜３×１０3、更に好ましくは約１００〜２．５×１０3、特に好ましくは約１２０〜２×１０3が挙げられる。
【００２７】
本発明において、高分子グルカンの平均重合度は、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量を、グルコースの分子量から水分子の分子量を除いた１６２で割った値を指す。また、後述する基質の平均重合度の測定方法についても同様である。
【００２８】
２−３．単鎖長分布
澱粉等のα−１，６−グルコシド結合を持つ分岐状α−１，４−グルカンは、イソアミラーゼなど適切な酵素処理によりα−１，６−グルコシド結合のみを完全に分解し、直鎖状α−１，４−グルカンのみに変換することができる。このように分岐状α−１，４−グルカンが分解された直鎖状α−１，４−グルカンは、分岐状α−１，４−グルカンの単位鎖といい、その重合度を単位鎖長という。分岐状α−１，４−グルカンから得られる単位鎖は、様々の重合度を持ち、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法等によって各重合度の単位鎖長の濃度分布（単位鎖長分布）を得ることができる。
【００２９】
本発明の高分子グルカン、従来のデキストリン、グリコーゲン及び難消化性デキストリンの単位鎖長分布のモデル図を図１に示す。図１に示すように、本発明の高分子グルカンの単位鎖長分布は、従来のデキストリンで認められる単位鎖長分布と比較し、短鎖長側（重合度５〜１５程度の範囲内）に高い濃度を示す高いピーク現れることが特徴になっている。また、本発明の高分子グルカンは、突出したピークがなく、全体的になだらかな分布を示し、重合度１０以下の短鎖長側と重合度２５以上の長鎖長側の両方に高い濃度を示すピークが現れる点でも、従来のデキストリン、グリコーゲン及び難消化性デキストリンとは異なる特徴を有している。即ち、本発明の高分子グルカンにおいて、特定の単位鎖長分布を有していることが特徴の一つになっている。限定的な解釈を望むものではないが、本発明の高分子グルカンは、このような特定の単位鎖長分布を有していることによって、低消化速度と高消化性を両立させることが可能になっていると考えられる。
【００３０】
具体的には、本発明の高分子グルカンの構造上の特徴として、α−１，６−グルコシド結合をイソアミラーゼで消化することにより直鎖状の単位鎖長に分解した後に、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって単位鎖長分布を分析すると、下記特性(i)〜(iii)を満たすことが挙げられる。
(i)重合度６〜１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度１〜５を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ1-5／ＤＰ6-10）×１００；以下、「ＤＰ1-5率」と表記することがある）が３３〜５０％である。
(ii)重合度６〜１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度１１〜１５を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ11-15／ＤＰ6-10）×１００；以下、「ＤＰ11-15率」と表記することがある）が８０〜１２５％である。
(iii)重合度６〜１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度２６〜３０を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ26-30／ＤＰ6-10）×１００；以下、「ＤＰ26-30率」と表記することがある）が１６〜４３％である。
【００３１】
本発明の高分子グルカンは、前記特性(i)に規定しているDＰ1-5率が３３〜５０％であり、従来のデキストリンに比べて、短鎖長側に高い濃度を示す高いピーク現れることが一つの特徴になっている（図１参照）。前記特性(i)に規定しているＤＰ1-5率として、より効果的に消化速度を遅くするという観点から、好ましくは３５〜４８％、更に好ましくは３５〜４５％が挙げられる。
【００３２】
また、本発明の高分子グルカンは、前記特性(i)に規定しているＤＰ11-15率が８０〜１２５％であり、重合度６〜１０を示す各ピークのエリア面積の合計値と重合度１１〜１５を示す各ピークのエリア面積の合計値が比較的近似する値になっているのに対して、従来のデキストリンではＤＰ11-15率が１２５％を大幅に上回っており、ＤＰ11-15率の点でも、従来のデキストリンとは構造上明らかに異なっている（図１参照）。前記特性(ii)に規定しているＤＰ11-15率として、より効果的に消化速度を遅くするという観点から、好ましくは８５〜１２０％、更に好ましくは９０〜１１０％が挙げられる。
【００３３】
更に、本発明の高分子グルカンは、前記特性(iii)に規定しているＤＰ26-30率が１６〜４３％であり、従来のデキストリンに比べて、長鎖長側に高い濃度を示すピークが現れることも一つの特徴になっている（図１参照）。前記特性(iii)に規定しているＤＰ26-30率として、より効果的に消化速度を遅くするという観点から、好ましくは１８〜４２％、更に好ましくは２０〜４１％が挙げられる。
【００３４】
また、本発明の高分子グルカンの構造上の好適な特徴として、前記方法で測定される単位鎖長分布が、前記特性(i)〜(iii)を満たすことに加えて、下記特性(iv)〜(vii)の内、少なくとも１つの特性、好ましくは３つの特性、更に好ましくは４つ（全て）を満たすものが挙げられる。
(iv)重合度６−１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度１６−２０を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ16-20／ＤＰ6-10）×１００；以下、「ＤＰ16-20率」と表記することがある）が５３〜８５％である。
(v)重合度６−１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度２１−２５を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ21-25／ＤＰ6-10）×１００；以下、「ＤＰ21-25率」と表記することがある）が３１〜６２％である。
(vi)重合度６−１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度３１−３５を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ31-35／ＤＰ6-10）×１００；以下、「ＤＰ31-35率」と表記することがある）が８〜３０％である。
(vii)重合度６−１０を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度３６−４０を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合（（ＤＰ36-40／ＤＰ6-10）×１００；以下、「ＤＰ36-40率」と表記することがある）が３〜２１％である。
【００３５】
前記特性(iv)に規定しているＤＰ16-20率として、好ましくは５５〜８４％、更に好ましくは６０〜８３％が挙げられる。
【００３６】
前記特性(v)に規定しているＤＰ21-25率として、好ましくは３５〜６１％、更に好ましくは３９〜６０％が挙げられる。
【００３７】
前記特性(vi)に規定しているＤＰ31-35率として、好ましくは１１〜２９％、更に好ましくは１４〜２９％が挙げられる。
【００３８】
前記特性(vi)に規定しているＤＰ36-40率として、好ましくは５〜２０％、更に好ましくは７〜２０％が挙げられる。
【００３９】
また、本発明の高分子グルカンの一態様として、前記方法で測定される単位鎖長分布において、重合度１から重合度５までのピーク面積の合計が、重合度１から重合度５０までのピーク面積の合計に対して７．０〜１４．０％、好ましくは８〜１２％、更に好ましくは８〜１０％を占めていることが挙げられる。
【００４０】
また、本発明の高分子グルカンの一態様として、前記方法で測定される単位鎖長分布において、重合度１から重合度７までのピーク面積の合計が、重合度１から重合度５０までのピーク面積の合計に対して１４〜２４％、好ましくは１５〜２２％、更に好ましくは１６〜２０％を占めていることが挙げられる。
【００４１】
また、本発明の高分子グルカンの一態様として、前記方法で測定される単位鎖長分布において、重合度１から重合度１０までのピーク面積の合計が、重合度１から重合度５０までのピーク面積の合計に対して２４〜４０％、好ましくは２６〜４０％、更に好ましくは１８〜３６％を占めていることが挙げられる。
【００４２】
更に、本発明の高分子グルカンの一態様として、前記方法で測定される単位鎖長分布において、重合度１１から重合度２４までのピーク面積の合計が、重合度１から重合度５０までのピーク面積の合計に対して４５〜５５％、好ましくは４６〜５３％、更に好ましくは４７〜５０％を占めていることが挙げられる。
【００４３】
また、本発明の高分子グルカンの一態様として、前記方法で測定される単位鎖長分布において、重合度６から重合度１０までのピーク面積の合計が、重合度１から重合度５０までのピーク面積の合計に対して２０〜３０％、好ましくは２０〜２８％、更に好ましくは２０〜２６％を占めていることが挙げられる。
【００４４】
また、本発明の高分子グルカンの一態様として、前記方法で測定される単位鎖長分布において、重合度６から重合度１５までのピーク面積の合計が、重合度１から重合度５０までのピーク面積の合計に対して４０〜５５％、好ましくは４０〜５４％、更に好ましくは４０〜５０％を占めていることが挙げられる。
【００４５】
また、本発明の高分子グルカンの一態様として、前記方法で測定される単位鎖長分布において、重合度６から重合度４０までのピーク面積の合計が、重合度１から重合度５０までのピーク面積の合計に対して８５〜９０％、好ましくは８６〜９０％、更に好ましくは８７〜９０％を占めていることが挙げられる。
【００４６】
更に、本発明の高分子グルカンの一態様として、前記方法で測定される単位鎖長分布において、重合度１から重合度１０までのピーク面積と重合度１１から重合度２４までのピーク面積との合計値を、重合度１１から重合度２４までピーク面積の合計値で割った値（｛（ＤＰ1-10）＋（ＤＰ25-50）｝／ＤＰ11-24）が、例えば、１．０±０．２、好ましくは１．０±０．１を満たすことが挙げられる。
【００４７】
本発明の高分子グルカンの好適な一態様として、前記方法で測定される単位鎖長分布において、重合度の数を１毎に区分した各重合度のピーク面積の割合に突出した数値がないことが挙げられ、具体的には、重合度１から重合度５０までのピーク面積の合計に対して、重合度１から重合度５０までに存在する何れの単独の重合度のピーク面積の割合も、６％以下、好ましくは５％以下であることが挙げられる。
【００４８】
更に、本発明の高分子グルカンの好適な一態様として、前記方法で測定される単位鎖長分布から算出される下記「20％−60％累計プロットの傾き」が、６以下、好ましくは５．５以下になるものが挙げられる。当該20％−60％累計プロットの傾きは、単位鎖長の分布の広がり方と相関しており、特定範囲の重合度の単位鎖長が多く存在する場合、当該傾きは大きくなる。
【数３】
2018123901.tif 000005
【００４９】
本発明において、前述する単位鎖長分布の特性を特定するには、前記方法で測定される単位鎖長分布における重合度の分布範囲は、重合度１から重合度５０まで特定できていればよいが、前記方法で測定される単位鎖長分布におけるピークは、通常、重合度が１〜１０００、好ましくは１〜２００、更に好ましくは１〜１００の範囲に分布し得る。
【００５０】
なお、単位鎖長分布を測定する際に、高分子グルカンのα−１，６−グルコシド結合をイソアミラーゼで消化して直鎖状の単位鎖長を得るには、例えば、測定対象となる高分子グルカン２．５ｍｇ／ｍＬ及びイソアミラーゼ１０Ｕ／ｍＬを含む反応液（２０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．５）中で、３７℃、１８時間程度インキュベートすればよい。なお、分岐鎖がない直鎖状の単位鎖長が得られていることについては、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって確認することができる。なお、前記イソアミラーゼとしては、例えば、Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種由来イソアミラーゼを使用できる。
【００５１】
２−４．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化性
本発明の高分子グルカンは、前述する特性を備えることによって、生体内では緩やかに消化され、血糖値やインスリン値を急激に上昇させない低消化速度と、難消化性成分をほとんど有しないことによる高消化性との２つの消化特性を併せ持つことができる。
【００５２】
具体的には、本発明の高分子グルカンが備え得る消化特性の一態様として、後述するｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化性試験において、反応開始から３０分までの消化速度係数（初期消化速度係数）ｋが０．０２９未満、好ましくは０．０１０〜０．０２８、更に好ましくは０．０２０〜０．０２７であることが挙げられる。
【００５３】
更に、本発明の高分子グルカンが備え得る消化特性の一態様として、後述するｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化性試験において酵素反応開始から１２０分間までに分解されない成分（難消化性画分）の割合が、１０％未満、好ましくは０〜９％、更に好ましくは０〜８％であることが挙げられる。
【００５４】
本発明の高分子グルカンが備え得る消化特性の一態様として、後述するｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化性試験において酵素反応開始から２０分間までに分解される成分（易消化性画分）の割合が、４５％未満、好ましくは１０〜４３％、更に好ましくは２０〜４１％であることが挙げられる。
【００５５】
また、本発明の高分子グルカンが備え得る消化特性の一態様として、後述するｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化性試験において酵素反応開始２０分後から１２０分間後までの間で分解される成分（緩消化性画分）の割合が、５０％以上、好ましくは５１〜９０％、更に好ましくは５２〜８０％であることが挙げられる。
【００５６】
なお、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化性試験は、以下の手順に従って行われる。
[ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化性試験の方法]
Ｅｎｇｌｙｓｔら（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、１９９２、４６、Ｓ３３〜Ｓ５０）の方法を基に改変した方法を用いた。５ｗ／ｖ％高分子グルカン水溶液１００μＬ、１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）２０μＬ、蒸留水７１６μＬを混合し、更に２５０Ｕ／ｍＬの濃度のブタ膵臓由来α−アミラーゼ液４μＬ、及びα−グルコシダーゼ活性で０．３Ｕ／ｍＬに相当する濃度のラット小腸アセトンパウダー抽出液１６０μＬを添加して３７℃で反応を開始する。ラット小腸アセトンパウダー抽出液は、ラット小腸アセトンパウダー１５０ｍｇを５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）３ｍＬに懸濁し、遠心上清をラット小腸粘膜酵素の粗酵素液として調製する。経時的に、各反応液中のグルコース濃度を測定し、高分子グルカンから遊離したグルコース量を測定する。より具体的な試験方法は、実施例の欄に記載の通りである。なお、前記ブタ膵臓由来α−アミラーゼ及びラット小腸アセトンパウダーとしては、例えば、Ｓｉｇｍａ社製のものを使用できる。
【００５７】
初期消化速度係数ｋは、ＢｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈらのＬｏｇａｒｉｔｈｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｌｏｐｅ  （ＬＯＳ）  ｐｌｏｔ法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ８７  （２０１２）  ２１８９−２１９７）の手法に従って求められる。具体的には、初期消化速度係数ｋは、以下の式から算出される。
【数４】
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【００５８】
また、高分子グルカンに含まれる易消化性画分、緩消化性画分、及び難消化性画分の割合（％）は、以下の式から算出される。
【数５】
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【００５９】
２−５．用途
本発明の高分子グルカンは、従来の澱粉と同様の用途に使用することができる。具体的には、本発明の高分子グルカンは、飲食品、輸液、食品添加剤、医薬品、接着剤等の各種製品に配合して使用することができる。また、本発明の高分子グルカンは、水に溶解させた際の糊液の粘度が低いという特性があり、生物崩壊性プラスチックの原料、澱粉からシクロデキストリン等を製造する際の中間物質、澱粉加工工業における原料等としても好適にも使用できる。
【００６０】
特に、本発明の高分子グルカンは、人体のエネルギー源として機能するので、飲食品の配合成分として使用することが好適である。特に、本発明の高分子グルカンは、低消化速度及び高消化性を兼ね備えているので、血糖値や血中インスリン濃度の急激な上昇の抑制が求められる人に対する飲食品に好適に使用される。即ち、本発明の高分子グルカンが配合された飲食品は、血糖値及び／又は血中インスリン濃度の上昇抑制用の飲食品として提供することができる。本発明の高分子グルカンが配合された飲食品の好適な具体例としては、コーヒー、醤油、たれ、麺類のつゆ、ソース、ダシの素、シチューの素、スープの素、複合調味料、カレーの素、ゼリー、キャラメル、ガム、チョコレート、クッキー、クラッカー、アイスクリーム、シャーベット、ジュース、粉末ジュース、和生菓子、洋生菓子、冷凍食品、冷蔵食品、餅、おにぎり、スポーツ中又はスポーツの後に摂取される飲料及び食品（スポーツ飲料及びスポーツ食品）；腹膜透析患者、糖尿病患者、腎臓病患者等の患者用飲食品等が挙げられる。
【００６１】
本発明の高分子グルカンを各種製品に配合する場合、その配合量については、配合対象となる製品の種類や形態等に応じて適宜設定すればよいが、例えば飲食品組成物の場合であれば、本発明の高分子グルカンの配合量として、１００質量％以下、好ましくは７５質量％以下、更に好ましくは５０質量％以下が挙げられる。また、飲食品組成物における本発明の高分子グルカンの配合量の下限値については、特に制限されないが、例えば、０．１質量％以上、好ましくは１質量％以上、更に好ましくは３質量％以上、特に好ましくは８質量％以上、最も好ましくは１０質量％以上が挙げられる。飲食品組成物における本発明の高分子グルカンの配合量として、具体的には、０．１〜１００質量％、好ましくは１〜１００質量％、更に好ましくは３〜１００質量％、特に好ましくは８〜７５質量％、最も好ましくは１０〜５０質量％が挙げられる。
【００６２】
また、前述する通り、本発明の高分子グルカンは、人体のエネルギー源として機能すると共に、血糖値や血中インスリン濃度の急激な上昇を抑制することができる。従って、本発明の高分子グルカンは、血糖値及び／又は血中インスリン濃度の上昇抑制剤として、飲食品、医薬品等に配合して使用することができる。即ち、本発明は、更に、血糖値及び／又は血中インスリン濃度の上昇抑制剤を製造するための、当該高分子グルカンの使用を提供する。また、本発明は、血糖値及び／又は血中インスリン濃度の上昇の抑制が求められる人に、当該高分子グルカンを炭水化物源として投与する、血糖値及び／又は血中インスリン濃度の上昇抑制方法をも提供する。当該方法において、高分子グルカンの投与量は、例えば、１回当たり、１〜２００ｇ程度に設定すればよい。
【００６３】
３．高分子グルカンの製造方法
本発明の高分子グルカンの製造方法については、特に制限されないが、好適な例として、(1)分岐状グルカンを基質として、ブランチングエンザイム１００〜４，０００Ｕ／ｇ基質と、４−α−グルカノトランスフェラーゼとを、同時に又は任意の順で段階的に反応させ、本発明の高分子グルカンが生成している時点で反応を停止する方法（以下、第１法）、(2)分岐状グルカンを基質として、ブランチングエンザイム１００〜４，０００Ｕ／ｇ基質を反応させ、次いでエキソ型アミラーゼを反応させ、本発明の高分子グルカンが生成している時点で反応を停止する方法（以下、第２法）が挙げられる。以下、当該第１法及び第２法を用いた本発明の高分子グルカンの製造方法について詳述する。
【００６４】
３−１．第１法
３−１−１．基質
第１法では、基質として分岐状グルカンを使用する。本発明で使用される分岐状グルカンは、Ｄ−グルコースがα−１，４−グルコシド結合により連結した直鎖状グルカンが、α−１，６−グルコシド結合により分岐しているグルカンである。本発明では、分岐状グルカンとして、α−１，６−グルコシド結合以外の結合によって分岐されていないものが好ましい。α−１，６−グルコシド結合以外の結合による分岐構造が多いと、当該構造部分が合成される高分子グルカンに残存して難消化性を示し、高消化性を有する高分子グルカンが得られなくなる。また、基質として使用される分岐状グルカンは、イソアミラーゼ処理及びプルラナーゼ処理をされていないことが望ましい。
【００６５】
基質として使用される分岐状グルカンの分岐頻度については、特に制限されないが、例えば、分岐頻度の下限として、３％以上、好ましくは４％以上、更に好ましくは５％以上、特に好ましくは６％以上が挙げられる。また、天然の分岐状グルカンは通常、それほど分岐頻度が高くなく、分岐頻度の上限については、１０％以下、は９％以下、８％以下、７％以下、等であり得る。基質として使用される分岐状グルカンの分岐頻度として、より具体的には、例えば３〜１０％、好ましくは４〜９％、更に好ましくは５〜８％が挙げられる。
【００６６】
基質として使用される分岐状グルカンの平均重合度については、特に制限されないが、例えば、平均重合度の下限として、約７０以上、好ましくは約８０以上、更に好ましくは約９０以上、特に好ましくは約１００以上が挙げられる。また、基質として使用される分岐状グルカンの平均重合度の上限については、例えば、約１×１０7以下、好ましくは約３×１０6以下、更に好ましくは約１×１０6以下、特に好ましくは約５×１０5以下、最も好ましくは約３×１０5以下が挙げられる。基質として使用される分岐状グルカンの平均重合度として、より具体的には、例えば、約７０〜約１×１０7、好ましくは約８０〜約３×１０6、更に好ましくは約９０〜約１×１０6、特に好ましくは約１００〜約５×１０5、最も好ましくは約１００〜約３×１０5が挙げられる。
【００６７】
基質として使用される分岐状グルカンの好適な例としては、澱粉、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン、高度分岐環状グルカン等が挙げられる。以下、これらの分岐状グルカンについて詳述する。
【００６８】
澱粉
本発明において、「澱粉」とは、アミロースとアミロペクチンとの混合物をいう。基質として使用される澱粉としては、アミロペクチン含量の高いものが好ましい。澱粉としては、通常市販されている澱粉であればどのような澱粉でも用いることができる。澱粉に含まれるアミロースとアミロペクチンとの比率は、澱粉を産生する植物の種類によって異なる。モチゴメ、モチトウモロコシなどの有する澱粉のほとんどはアミロペクチンである。他方、アミロースのみからなり、かつアミロペクチンを含まない澱粉は、通常の植物からは得られない。澱粉は、天然の澱粉、澱粉分解物、及び化工澱粉に区分される。これらの澱粉の中でも、本発明で使用される基質として、好ましくは、天然の澱粉、及び天然の澱粉の分解物、更に好ましくは天然の澱粉が挙げられる。
【００６９】
天然の澱粉は、原料により、いも類澱粉及び穀類澱粉に分類され、本発明では、基質としてこれらのいずれを使用してもよい。いも類澱粉としては、例えば、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、甘藷澱粉、くず澱粉、わらび澱粉等が挙げられる。穀類澱粉としては、例えば、コーンスターチ、小麦澱粉、米澱粉等が挙げられる。天然の澱粉は、ハイアミロース澱粉（例えば、ハイアミロースコーンスターチ）又はワキシー澱粉であってもよい。更に、澱粉は可溶性澱粉であってもよい。可溶性澱粉とは、天然の澱粉に種々の処理を施すことにより得られる、水溶性の澱粉をいう。本発明で使用される基質として、好ましくはワキシー澱粉が挙げられる。
【００７０】
また、基質として使用される澱粉は、澱粉粒の状態であってもよい。本発明において、「澱粉粒」とは、天然の結晶構造を少なくとも一部保持している澱粉分子をいう。澱粉粒は、未処理の澱粉粒であってもよく、未処理の澱粉粒を化学修飾または物理処理することによって得られる澱粉粒であってもよい。食品として分類される酵素処理澱粉を使用することが好ましい場合には、使用される澱粉粒は、代表的には、植物から得られた未処理の澱粉粒であり、例えば、糊化過程を経ていない澱粉粒が挙げられる。また、澱粉粒としては、水中に懸濁した状態での加熱により澱粉粒が破裂することにより懸濁液が流動性を失うという特性を示すあらゆる澱粉粒が使用可能である。基質として使用される澱粉粒として、好ましくは、アミロペクチン含量が高いものが挙げられる。
【００７１】
植物は、アミロプラスト内に澱粉分子を顆粒として（すなわち、大きな結晶として）貯蔵している。この顆粒は澱粉粒と呼ばれる。澱粉粒内では、澱粉分子同士が水素結合等によって結合している。そのため、澱粉粒はそのままでは水に溶け難く、消化もされ難い。澱粉粒を水とともに加熱すると膨潤し、分子がほぐれてコロイド状になる。この変化は「糊化」と呼ばれる。澱粉粒の大きさ及び形態は、その澱粉粒が得られた植物によって異なる。例えば、トウモロコシの澱粉粒（コーンスターチ）の平均粒径は約１２μｍ〜約１５μｍであり、他の澱粉粒と比べて小さめで大きさは揃っている。コムギおよびオオムギの澱粉粒は、粒径約２０μｍ〜約４０μｍの大型の澱粉粒と粒径数μｍの小型の澱粉粒の２種の大きさに分かれる。コメではアミロプラスト内に直径数μｍの角ばった澱粉小粒が多数蓄積される複粒構造となる。バレイショの澱粉粒は平均粒径約４０μｍであり、澱粉原料として一般に利用されているものの中では最も大きい。本発明においては、市販されている各種の澱粉粒を基質として使用することができる。植物等から澱粉粒を精製するなどの方法により澱粉粒を調製して、基質として使用してもよい。
【００７２】
澱粉粒の状態では澱粉分子同士が強く結合しているため、酵素が作用し難い。食品として扱われる酵素処理澱粉を得るための特定の実施形態では、本発明で使用される澱粉粒は、植物から単離または精製されているが、酸処理、化学修飾処理および熱処理を受けていないものである。本明細書中では、用語「未処理」の澱粉粒とは、天然で生成される澱粉粒であって、自然状態で共存している他の成分（例えば、タンパク質、脂質など）から澱粉粒を分離するために必要な処理以外の処理が施されていない澱粉粒をいう。したがって、植物などから不純物を除去して澱粉を精製する工程などの、澱粉粒を調製する方法における各工程は、本明細書中においては、澱粉粒の処理には含まれない。澱粉粒としては、通常市販されている澱粉粒であればどのような澱粉粒でも使用され得る。
【００７３】
澱粉粒は、糊化処理を施されていない澱粉であることが好ましい。澱粉粒は、天然の結晶構造を少なくとも一部保持しており、酵素が作用し難い。澱粉粒は、例えば、３０℃の水に澱粉粒を加えることにより４０重量％の水懸濁液を作製し、この懸濁液を１００℃にて１０分間加熱した後６０℃に冷却した場合に得られる溶液の流動性がないものであることが好ましい。なお、「溶液の流動性がない」とは、例えば容量１００ｍＬのガラスビーカーに１０分間加熱済みの５０ｇの溶液（６０℃）を入れ、そのビーカーを反転させて溶液サンプルの下側が開放された状態で６０℃にて１分間放置した場合に、入れた溶液の２０重量％以上（すなわち、１０ｇ以上）の溶液がビーカー中に残ることをいう。溶液の流動性がないと、溶液に酵素を均一に拡散させることが困難である。ここで、「溶液に流動性がある」とは、例えば容量１００ｍＬのガラスビーカーに溶液を入れ、そのビーカーを反転させたときに重力によって１分間以内に全体の８０％以上の溶液が流れ落ちる状態を指す。この状態の溶液であれば酵素を添加して攪拌することにより、澱粉を溶液中に均一に分散することができる。流動性がある溶液は通常の製造工程中のラインを詰まらせることはない。
【００７４】
また、基質として使用される加工澱粉は、化学修飾又は物理処理のいずれか少なくとも一方が施されているものであればよい。
【００７５】
化学修飾された澱粉としては、例えば、アセチル化アジピン酸架橋澱粉、アセチル化酸化澱粉、アセチル化リン酸架橋澱粉、オクテニルコハク酸澱粉ナトリウム、酢酸澱粉、酸化澱粉、漂白澱粉、ヒドロキシプロピル化リン酸架橋澱粉、ヒドロキシプロピル澱粉、リン酸架橋澱粉、リン酸化澱粉、リン酸化モノエステル化リン酸架橋澱粉等が挙げられる。「アセチル化アジピン酸架橋澱粉」とは、澱粉を無水酢酸および無水アジピン酸でエステル化して得られたものをいう。「アセチル化酸化澱粉」とは、澱粉を次亜塩素酸ナトリウムで処理した後、無水酢酸でエステル化して得られたものをいう。「アセチル化リン酸架橋澱粉」とは、澱粉をトリメタリン酸ナトリウムまたはオキシ塩化リンおよび無水酢酸または酢酸ビニルでエステル化して得られたものをいう。「オクテニルコハク酸澱粉ナトリウム」とは、澱粉を無水オクテニルコハク酸でエステル化して得られたものをいう。「酢酸澱粉」とは、澱粉を無水酢酸または酢酸ビニルでエステル化して得られたものをいう。「酸化澱粉」とは、澱粉を次亜塩素酸ナトリウムで処理して得られたものであって、厚生労働省告示４８５号記載の純度試験法に準じて試料澱粉中のカルボキシ基（カルボキシル基ともいう）の分析を行った場合にカルボキシ基が１．１％以下であるものをいう。ただし、カルボキシ基の量がこの範囲にあっても「漂白澱粉」は「酸化澱粉」の定義には含まれない。「漂白澱粉」とは、澱粉を次亜塩素酸ナトリウムで処理して得られたものであって、厚生労働省告示４８５号記載の純度試験法に準じて試料澱粉中のカルボキシ基の分析を行った場合にカルボキシ基が０．１％以下であるものであって、厚生労働省告示４８５号記載の酸化澱粉の「確認試験（３）」による試験結果が陰性でかつ粘度等の澱粉の性質に生じた変化が酸化によるものでないことを合理的に説明できるものをいう。カルボキシ基の量が０．１％以下であっても粘度等の澱粉の性質が天然澱粉から変化しているものは酸化澱粉に分類され、日本では食品としては取り扱われず、食品添加物として取り扱われる。「ヒドロキシプロピル化リン酸架橋澱粉」とは、澱粉をトリメタリン酸ナトリウムまたはオキシ塩化リンでエステル化し、酸化プロピレンでエーテル化して得られたものをいう。「ヒドロキシプロピル澱粉」とは、澱粉を酸化プロピレンでエーテル化して得られたものをいう。「リン酸架橋澱粉」とは、澱粉をトリメタリン酸ナトリウムまたはオキシ塩化リンでエステル化して得られたものをいう。「リン酸化澱粉」とは、澱粉をオルトリン酸、そのカリウム塩もしくはナトリウム塩またはトリポリリン酸ナトリウムでエステル化して得られたものをいう。「リン酸モノエステル化リン酸架橋澱粉」とは、澱粉をオルトリン酸、そのカリウム塩もしくはナトリウム塩またはトリポリリン酸ナトリウムでエステル化し、トリメタリン酸ナトリウムまたはオキシ塩化リンでエステル化して得られたものをいう。
【００７６】
物理処理された澱粉粒としては、例えば、湿熱処理澱粉および熱抑制澱粉が挙げられる。「湿熱処理澱粉」とは、澱粉を糊化しない程度の低水分状態で加熱処理することにより得られる加工澱粉をいう。「澱粉を糊化させない程度の低水分状態」としては、具体的には、水分含量が５０重量％以下程度、好ましくは５〜３０重量％程度以下、より好ましくは５〜２５重量％程度、更に好ましくはま５〜２０重量％程度であることが挙げられる。「熱抑制処理澱粉」とは、極めて低水分に乾燥した澱粉粒を、ドライ加熱処理することにより澱粉粒の結晶構造を強化した加工澱粉をいう。「極めて低水分に乾燥した澱粉粒」とは、具体的には、澱粉粒の水分含量が１％未満程度、好ましくは０％程度であることが挙げられる。
【００７７】
基質として使用される澱粉の平均重合度については、特に制限されないが、その下限として、例えば、約１×１０3以上、好ましくは約５×１０3以上、更に好ましくは約１×１０4以上、特に好ましくは約２×１０4以上が挙げられる。また、基質として使用される澱粉の平均重合度の上限については、特に制限されないが、例えば、約１×１０7以下、好ましくは約３×１０6以下、更に好ましくは約１×１０6以下、特に好ましくは約３×１０5以下が挙げられる。基質として使用される澱粉の平均重合度として、より具体的には、約１×１０3〜約１×１０7、好ましくは約５×１０3〜３×１０6、更に好ましくは約１×１０4〜１×１０6、特に好ましくは約２×１０4〜約３×１０5が挙げられる。
【００７８】
アミロペクチン
アミロペクチンとは、α−１，４−グルコシド結合によって連結されたグルコース単位に、α−１，６−グルコシド結合でグルコース単位が連結された分岐状分子である。アミロペクチンは天然の澱粉中に含まれる。アミロペクチンとして、例えば、アミロペクチン１００％からなるワキシーコーンスターチを用いることができる。
【００７９】
基質として使用されるアミロペクチンの平均重合度については、特に制限されないが、その下限として、例えば、約１×１０3以上、好ましくは約５×１０3以上、更に好ましくは約１×１０4以上、特に好ましくは約２×１０4以上が挙げられる。また、基質として使用されるアミロペクチンの平均重合度の上限については、特に制限されないが、例えば、約１×１０7以下、好ましくは約３×１０6以下、更に好ましくは約１×１０6以下、特に好ましくは約３×１０5以下が挙げられる。基質として使用されるアミロペクチンの平均重合度として、より具体的には、約１×１０3〜約１×１０7、好ましくは約５×１０3〜約３×１０6、更に好ましくは約１×１０4〜約１×１０6、特に好ましくは約２×１０4〜約３×１０5が挙げられる。
【００８０】
グリコーゲン
グリコーゲンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、高頻度の枝分かれを有するグルカンである。グリコーゲンは、動物の貯蔵多糖として殆どのあらゆる細胞に顆粒状態で広く分布している。グリコーゲンは、植物中では、例えば、トウモロコシのスイートコーン種の種子に存在している。グリコーゲンは、代表的には、グルコースのα−１，４−グルコシド結合の糖鎖に対して、グルコースおよそ３単位おきに１本程度の割合で、平均重合度１２〜１８のグルコースのα−１，４−グルコシド結合の糖鎖がα−１，６−グルコシド結合で結合している。α−１，６−グルコシド結合で結合している分枝鎖にも同様にグルコースのα−１，４−グルコシド結合の糖鎖がα−１，６−グルコシド結合で結合している。そのため、グリコーゲンは網状構造を形成する。
【００８１】
基質として使用されるグリコーゲンは、動物由来であってもよく、植物由来であってもよい。また、グリコーゲンは、酵素合成により製造できることも知られており（特開２００８−０９５１１７号公報）、本発明では、酵素合成によって得られたグリコーゲンを基質として使用してもよい。
【００８２】
基質として使用されるグリコーゲンの平均重合度については、特に制限されないが、その下限として、例えば、約５００以上、好ましくは約１×１０3以上、更に好ましくは約２×１０3以上、特に好ましくは約３×１０3以上が挙げられる。また、基質として使用されるグリコーゲンの平均重合度の上限については、特に制限されないが、例えば、約１×１０7以下、好ましくは約３×１０6以下、更に好ましくは約１×１０6以下、特に好ましくは約３×１０5以下が挙げられる。基質として使用されるグリコーゲンの平均重合度として、より具体的には、約５００〜約１×１０7、好ましくは約１×１０3〜３×１０6、更に好ましくは約２×１０3〜約１×１０6、特に好ましくは約３×１０3〜約３×１０5が挙げられる。
【００８３】
基質として使用されるグリコーゲンは、化学修飾が施されたグリコーゲン誘導体であってもよい。グリコーゲン誘導体としては、例えば、グリコーゲンのアルコール性水酸基の少なくとも１つが、グリコシル化、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化、リン酸化等によって化学修飾された誘導体が挙げられる。また、グリコーゲン誘導体は、同一分子内に１種の化学修飾が施されていてもよく、また同一分子内に２種以上の化学修飾が施されていてもよい。
【００８４】
デキストリン
デキストリンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、澱粉とマルトースとの中間の複雑さをもつグルカンである。デキストリンは、澱粉を酸、アルカリまたは酵素によって部分的に分解することによって得ることができる。
【００８５】
基質として使用されるデキストリンの平均重合度については、特に制限されないが、その下限として、例えば、約５０以上、好ましくは約６０以上、更に好ましくは約７０以上、特に好ましくは約８０以上が挙げられる。また、基質として使用されるデキストリンの平均重合度の上限については、特に制限されないが、例えば、約１×１０4以下、好ましくは約９×１０3以下、更に好ましくは約７×１０3以下、特に好ましくは約５×１０3以下が挙げられる。基質として使用されるデキストリンの平均重合度として、より具体的には、約５０〜約１×１０4、好ましくは約６０〜９×１０3、更に好ましくは約７０〜約７×１０3、特に好ましくは約８０〜約５×１０3が挙げられる。
【００８６】
基質として使用されるデキストリンは、化学修飾が施されたデキストリン誘導体であってもよい。デキストリン誘導体としては、例えば、デキストリンのアルコール性水酸基の少なくとも１つが、グリコシル化、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化、リン酸化等によって化学修飾された誘導体が挙げられる。また、デキストリン誘導体は、同一分子内に１種の化学修飾が施されていてもよく、また同一分子内に２種以上の化学修飾が施されていてもよい。
【００８７】
酵素合成分岐グルカン
酵素合成分岐グルカンとは、酵素を使用して合成された分岐状グルカンをいう。ＳＰ−ＧＰ法でのアミロースの合成（国際公開第ＷＯ０２／０９７１０７号パンフレット（第１２７頁−第１３４頁）、Ｈ．Ｗａｌｄｍａｎｎら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １５７  （１９８６）  ｃ４−ｃ７）の際に反応液中にブランチングエンザイムを加えることにより、分岐構造を有するグルカンを合成することができる。分岐の程度はブランチングエンザイムの添加量によって適宜調整可能である。
【００８８】
基質として使用される酵素合成分岐グルカンの平均重合度については、特に制限されないが、その下限として、例えば、約７０以上、好ましくは約８０以上、更に好ましくは約１００以上、特に好ましくは約２００以上が挙げられる。また、基質として使用される酵素合成分岐グルカンの平均重合度の上限については、特に制限されないが、例えば、約２×１０5以下、好ましくは約１×１０5以下、更に好ましくは約５×１０4以下、特に好ましくは約３×１０4以下が挙げられる。基質として使用される酵素合成分岐グルカンの平均重合度として、より具体的には、約７０〜約２×１０5、好ましくは約８０〜約１×１０5、更に好ましくは約１００〜約５×１０4、特に好ましくは約２００〜約３×１０4が挙げられる。
【００８９】
基質として使用される酵素合成分岐グルカンは、化学修飾が施された酵素合成分岐グルカン誘導体であってもよい。酵素合成分岐グルカン誘導体としては、例えば、酵素合成分岐グルカンのアルコール性水酸基の少なくとも１つが、グリコシル化、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化、リン酸化等によって化学修飾された誘導体が挙げられる。また、酵素合成分岐グルカン誘導体は、同一分子内に１種の化学修飾が施されていてもよく、また同一分子内に２種以上の化学修飾が施されていてもよい。
【００９０】
高度分岐環状グルカン
高度分岐環状グルカンとは、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有するグルカンであり、特許第３１０７３５８号に記載される方法によって製造される。特許第３１０７３５８号に記載される方法では、ＢＥ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ又はシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を単独で使用するため、高度分岐状環状グルカンの鎖長分布は、本発明の高分子グルカンが備える鎖長分布とは異なっている。高度分岐環状グルカンは、分子全体として少なくとも１つの分岐を有すればよい。
【００９１】
基質として使用される高度分岐環状グルカンの分子全体としての平均重合度については、特に制限されないが、その下限として、例えば、約５０以上、好ましくは約６０以上、更に好ましくは約８０以上、特に好ましくは約１００以上が挙げられる。また、基質として使用される高度分岐環状グルカンの分子全体としての平均重合度の上限については、特に制限されないが、例えば、約１×１０4以下、好ましくは約７×１０3以下、更に好ましくは約５×１０3以下、特に好ましくは約４×１０3以下が挙げられる。基質として使用される高度分岐環状グルカンの分子全体としての平均重合度として、より具体的には、約５０〜約１×１０4、好ましくは約６０〜約７×１０3、更に好ましくは約８０〜約５×１０3、特に好ましくは約１００〜約４×１０3が挙げられる。
【００９２】
高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分の重合度については、特に制限されないが、その下限として、例えば、約１０以上、好ましくは約１５以上、更に好ましくは約２０以上が挙げられる。また、当該内分岐環状構造部分の重合度の上限については、特に制限されないが、例えば、約５００以下、好ましくは約３００以下、更に好ましくは約１００以下が挙げられる。当該内分岐環状構造部分の重合度として、より具体的には、約１０〜約５００、好ましくは約１５〜約３００、更に好ましくは約２０〜約１００が挙げられる。
【００９３】
高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の重合度については、特に制限されないが、その下限として、例えば、約４０以上、好ましくは約１００以上、更に好ましくは約３００以上が挙げられる。また、当該外分岐構造部分の重合度の上限については、特に制限されないが、例えば、約３×１０3以下、好ましくは約１×１０3以下、更に好ましくは約５００以下が挙げられる。当該外分岐構造部分の重合度として、より具体的には、約４０〜約３×１０3以下、好ましくは約１００〜約１×１０3、更に好ましくは約３００〜約５００が挙げられる。
【００９４】
また、高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分のα−１，６−グルコシド結合の数については、少なくとも１個あればよいが、例えば１個以上、５個以上、１０個以上などであり得る。また、当該内分岐環状構造部分のα−１，６−グルコシド結合の数は、例えば約２００個以下、約５０個以下、約３０個以下、約１５個以下、約１０個以下などであり得る。当該内分岐環状構造部分のα−１，６−グルコシド結合の数として、より具体的には、１〜２００、好ましくは５〜５０、更に好ましくは１０〜３０が挙げられる。
【００９５】
高度分岐環状グルカンは、単一の重合度のものを単独で用いてもよく、また、異なる重合度のものを２種以上組み合わせた混合物であってもよい。高度分岐環状グルカンとして、異なる重合度のものを２種以上組み合わせて使用する場合、最大の重合度のものと最小の重合度のものとの重合度の比が約１００以下、好ましくは約５０以下、更に好ましくは約１０以下であることが望ましい。
【００９６】
基質として使用される高度分岐環状グルカンは、好ましくは、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０から５×１０3の範囲にあるグルカンであって、ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、グルカンが挙げられる。この外分岐構造部分の各単位鎖の重合度は、平均で好ましくは約１０以上、更に好ましくは約２０以下である。
【００９７】
高度分岐環状グルカンは、例えば、江崎グリコ株式会社から「クラスターデキストリン」として市販されており、当該市販品を基質として使用することもできる。
【００９８】
基質として使用される高度分岐環状グルカンは、化学修飾が施された高度分岐環状グルカン誘導体であってもよい。高度分岐環状グルカン誘導体としては、例えば、高度分岐環状グルカンのアルコール性水酸基の少なくとも１つが、グリコシル化、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化、リン酸化等によって化学修飾された誘導体が挙げられる。また、高度分岐環状グルカン誘導体は、同一分子内に１種の化学修飾が施されていてもよく、また同一分子内に２種以上の化学修飾が施されていてもよい。
【００９９】
３−１−２．酵素
ブランチングエンザイム（ＢＥ）
ブランチングエンザイム（系統名：１，４−α−Ｄ−グルカン：１，４−α−Ｄ−グルカン  ６−α−Ｄ−（１，４−α−Ｄ−グルカノ）−トランスフェラーゼ、ＥＣ  ２．４．１．１８；以下、ＢＥと表記することもある）は、α−１，４−グルコシド結合を切断し、別のグルコース残基の６位ＯＨ基に転移することにより、α−１，６−グルコシド結合を形成する酵素である。ＢＥは当該分野において１，４−α−グルカン分枝酵素、枝作り酵素又はＱ酵素とも呼ばれている。ＢＥは、動物、植物、糸状菌、酵母および細菌に広く分布しており、グリコーゲン又は澱粉の分岐結合合成を触媒している。
【０１００】
本発明の高分子グルカンの製造に使用されるＢＥは、好ましくは、耐熱性ＢＥである。耐熱性ＢＥとは、ブランチングエンザイム活性測定を、反応温度を変化させて行った場合の反応の至適温度が４５℃以上であるＢＥをいう。
【０１０１】
ブランチングエンザイム活性（ＢＥ活性）とは、アミロースとヨウ素との複合体の６６０ｎｍにおける吸光度を減少させる活性であり、ＢＥがα−１，４−グルコシド結合を切断し、別のグルコース残基の６位ＯＨ基に転移することにより、α−１，６−グルコシド結合を形成し、アミロースの直鎖状部分を減少させる作用に基づいて発揮される。
【０１０２】
ＢＥ活性測定法は当該分野で公知であり、例えば、Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００３．５０：ｐ．１５−２０に記載されている。ＢＥのブランチングエンザイム活性は、例えば、以下のようにして測定することができる。先ず、５０μＬの基質液（０．１２％（ｗ／ｖ）アミロース（ＴｙｐｅＩＩＩ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製））に５０μＬの酵素液を添加することによって反応を開始する。反応は、そのＢＥの反応至適温度で行う。１０分間ＢＥを作用させた後、１ｍＬの０．４ｍＭ塩酸溶液を添加することによって反応を停止する。その後、１ｍＬのヨウ素液を添加し、よく混合した後、６６０ｎｍの吸光度を測定する。対照液として、酵素液添加前に０．４ｍＭ塩酸溶液を添加したものを同時に調製する。基質液は、１００μＬの１．２％（ｗ／ｖ）アミロースＴｙｐｅＩＩＩ溶液（ジメチルスルホキシドに溶解させる）に、２００μＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、更に７００μＬの蒸留水を添加してよく混合することにより調製する。但し、緩衝液のｐＨは、そのＢＥの反応至適ｐＨに合わせる。ヨウ素液は０．１２５ｍＬのストック溶液（２．６重量％Ｉ２、２６重量％ＫＩ水溶液）に０．５ｍＬの１規定塩酸を混合し、蒸留水で６５ｍＬとすることにより調製する。測定された６６０ｎｍの吸光度の値に基づいて、以下の計算式に従って酵素液のＢＥ活性が算出される。
【数６】
2018123901.tif 000008
【０１０３】
また、このＢＥ活性から、基質１ｇあたりのＢＥ活性を計算することができる。また、本明細書においては、ＢＥの活性としては、原則としてＢＥ活性を用いる。ＢＥ活性の単位は「単位」又は「Ｕ」を表す。
【０１０４】
ＢＥの反応至適温度は、通常は約４５℃〜約９０℃である。ここで、「反応至適温度」とは、前記ＢＥ活性測定法において温度のみ変化させて行ったときに、最も活性が高い温度をいう。本発明で使用されるＢＥの反応至適温度として、好ましくは約４５℃以上、更に好ましくは約５０℃以上、より好ましくは約５５℃以上、特に好ましくは約６０℃以上、最も好ましくは約６５℃以上が挙げられる。本発明で使用されるＢＥの反応至適温度の上限については、特に制限されないが、例えば、約９０℃以下、約８５℃以下、約８０℃以下、約７５℃以下等が挙げられる。
【０１０５】
本発明で使用されるＢＥは、基質に作用させる際の温度においてＢＥ活性を有することが好ましい。基質に作用させる際の温度において「ＢＥ活性を有する」とは、そのＢＥの反応至適温度の代わりに、基質に作用させる際の温度においてＢＥを作用させること以外は前記ＢＥ活性測定法と同じ方法で測定を行った場合にＢＥ活性が検出されることをいう。基質に作用させる際の温度におけるＢＥ活性としては、例えば、約１０Ｕ／ｍＬ以上、好ましくは約２０Ｕ／ｍＬ以上、更に好ましくは約３０Ｕ／ｍＬ以上、特に好ましくは約４０Ｕ／ｍＬ以上、最も好ましくは約５０Ｕ／ｍＬ以上が挙げられる。基質に作用させる際の温度でのＢＥ活性は高いほど好ましく、その上限については、特に制限されないが、例えば、５００，０００Ｕ／ｍＬ以下、２００，０００Ｕ／ｍＬ以下、１００，０００Ｕ／ｍＬ以下、８０，０００Ｕ／ｍＬ以下、５０，０００Ｕ／ｍＬ以下等が挙げられる。
【０１０６】
ＢＥは、国際生化学分子生物学連合の定める酵素番号ＥＣ  ２．４．１．１８に分類される酵素であることを限度として特に制限されないが、例えば、Ａｑｕｉｆｅｘ属、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌由来が挙げられる。本発明で使用されるＢＥとして、好ましくはＡｑｕｉｆｅｘ属に属する細菌由来が挙げられる。
【０１０７】
本発明で使用されるＢＥの由来細菌としては、具体的には、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、更に好ましくはＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓが挙げられる。なお、最近では、好熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌と記載されることも多い。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓと同一の細菌を指す。
【０１０８】
本明細書において、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を宿主に導入して、その宿主を培養して酵素を得た場合であっても、その酵素はその生物に「由来する」という。
【０１０９】
本発明で使用されるＢＥは、野生型のＢＥのアミノ酸配列に対して、１又は２以上のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されてなる改変型のＢＥであってもよい。例えば、ＷＯ２０００／０５８４４５号公報には、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ由来ＢＥの改変体が記載されている。改変型のＢＥは、改変を導入する前のＢＥと同等以上のＢＥ活性を有することが好ましい。改変型のＢＥに導入されるアミノ酸残基の改変は、アミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で行われていてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で行われていてもよい。また、アミノ酸残基の改変は、１残基ずつ点在していてもよく、数残基連続していてもよい。
【０１１０】
ＢＥは、それを産生する細菌を培養することにより得ることができる。また、ＢＥのアミノ酸配列及び塩基配列は公知であるので、ＢＥは遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。例えば、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５由来の天然のＢＥをコードする塩基配列のクローニング方法は、Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００３．５０：ｐ．１５−２０、及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍａａｒｅｌ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｅ．  Ｃ．ら、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、２００３、２１巻、ｐ１９９−２０７に記載されている。また、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ９７８５由来の天然のＢＥをコードする塩基配列のクローニング方法は、Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｍ．Ｌ．ら，Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１．５７（５−６）：ｐ．６５３−９及び特表２００２−５３９８２２号公報に記載されている。更に、本発明では、市販品のＢＥを使用してもよい。
【０１１１】
４−α−グルカノトランスフェラーゼ
４−α−グルカノトランスフェラーゼは、供与体分子の非還元末端からグルコシル基又は２個以上のグルコースからなるユニットを受容体分子の非還元末端に転移する酵素である。本発明で用いられる４−α−グルカノトランスフェラーゼは、国際生化学分子生物学連合の定める酵素番号ＥＣ  ２．４．１．２５に分類される酵素、及び／又は酵素番号ＥＣ  ２．４．１．１９に分類される酵素を利用し得る。酵素番号ＥＣ  ２．４．１．２５に分類される酵素（以下、ＭａｌＱと表記することもある）は、アミロマルターゼ、ディスプロポーショネーティングエンザイム、Ｄ−酵素、不均化酵素などとも呼ばれる酵素である。微生物由来のＭａｌＱはアミロマルターゼと呼ばれ、植物由来のＭａｌＱはＤ−酵素と呼ばれている。酵素番号ＥＣ  ２．４．１．１９に分類される酵素（以下、ＣＧＴａｓｅと表記することもある）は、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼと呼ばれており、供与体分子の非還元末端の６〜８個のグルコース鎖を認識してこの部分を環状化させるように転移反応を行い、重合度６〜８個のシクロデキストリンと非環状リミットデキストリンとを生成し得る酵素である。
【０１１２】
４−α−グルカノトランスフェラーゼとしてＭａｌＱを使用する場合、アミロマルターゼであってもよく、またＤ−酵素であってもよい。また、本発明では、ＭａｌＱとして、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅという、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性とアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性を併せ持つ酵素（ＥＣ  ３．２．１．３３＋ＥＣ  ２．４．１．２５）を使用してもよい。
【０１１３】
４−α−グルカノトランスフェラーゼとしてＭａｌＱを使用する場合、微生物由来又は植物由来のいずれのＭａｌＱを使用してもよい。ＭａｌＱの由来微生物としては、例えば、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等が挙げられる。また、ＭａｌＱの由来植物としては、例えば、馬鈴薯、サツマイモ、ヤマイモ、キャッサバ等の芋類；トウモロコシ、イネ、コムギ、などの穀類、えんどう豆、大豆等の豆類等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓが挙げられる。
【０１１４】
４−α−グルカノトランスフェラーゼとしてＣＧＴａｓｅを使用する場合、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ、Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．Ａ２−５ａ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１３８６４）等の微生物由来のものを使用することができる。
【０１１５】
４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性測定は、以下の方法従って行われる。ＭａｌＱの場合は、１０ｗ/ｖ％マルトトリオース、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、酵素を含む反応液１２０μｌを７０℃で１０分間インキュベートし、その後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止する。グルコースオキシダーゼ法により反応液中のグルコース量を測定する。ＭａｌＱの単位量は、１分間に１μｍｏｌグルコースを生成する４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を１単位(Ｕ又はＵｎｉｔ)とする。ＣＧＴａｓｅの場合は、ブルーバリュー法により測定する。具体的には、１．２ｗ／ｖ％可溶性澱粉、５０ｍＭ酢酸バッファー、酵素を含む反応溶液２５０μｌを４０℃で１０分間インキュベートし、その後、反応停止液（０．５Ｎ酢酸：０．５Ｎ塩酸＝５：１）５００μｌを加えて撹拌し反応を停止する。反応液のうち１００μｌに５ｍｌのＩ2溶液を加え６６０ｎｍ吸光度（Ａ６６０）測定する。ＣＧＴａｓｅの単位量は、１分間にＡ６６０を１０％低下させる４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を１単位(Ｕ又はＵｎｉｔ)とする。なお、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性の測定において、４−α−グルカノトランスフェラーゼの性質に応じて、測定時の反応温度、反応ｐＨ等を適宜調整し得る。
【０１１６】
４−α−グルカノトランスフェラーゼの反応至適温度は、通常は約４５℃〜約９０℃である。ここで、「反応至適温度」とは、前記４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性測定法において温度のみ変化させて行ったときに、最も活性が高い温度をいう。本発明で使用される４−α−グルカノトランスフェラーゼの反応至適温度として、好ましくは約４５℃以上、更に好ましくは約５０℃以上、より好ましくは約５５℃以上、特に好ましくは約６０℃以上、最も好ましくは約６５℃以上が挙げられる。本発明で使用される４−α−グルカノトランスフェラーゼの反応至適温度の上限については、特に制限されないが、例えば、約９０℃以下、約８５℃以下、約８０℃以下、約７５℃以下等が挙げられる。
【０１１７】
本発明で使用される４−α−グルカノトランスフェラーゼは、基質に作用させる際の温度において４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有することが好ましい。基質に作用させる際の温度において「４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有する」とは、７０℃で１０分間のインキュベーションの代わりに、基質に作用させる際の温度において１０分間のインキュベーションすること以外は上記の４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性測定法と同じ方法で測定を行った場合に４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性が検出されることをいう。基質に作用させる際の温度における４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性としては、例えば、約１Ｕ／ｍＬ以上、好ましくは約２Ｕ／ｍＬ以上、更に好ましくは約５Ｕ／ｍＬ以上、特に好ましくは約１０Ｕ／ｍＬ以上、最も好ましくは約２０Ｕ／ｍＬ以上が挙げられる。基質に作用させる際の温度での４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性は高いほど好ましく、その上限については、特に制限されないが、例えば、約５，０００Ｕ／ｍＬ以下、約２，０００Ｕ／ｍＬ以下、約１，０００Ｕ／ｍＬ以下、約５００Ｕ／ｍＬ以下、約２５０Ｕ／ｍＬ以下等が挙げられる。
【０１１８】
本発明で使用される４−α−グルカノトランスフェラーゼは、野生型の４−α−グルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列に対して、１又は２以上のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されてなる改変型の酵素であってもよい。改変型の４−α−グルカノトランスフェラーゼは、改変を導入する前の４−α−グルカノトランスフェラーゼと同等以上の４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有することが好ましい。改変型の４−α−グルカノトランスフェラーゼに導入されるアミノ酸残基の改変は、アミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で行われていてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で行われていてもよい。また、アミノ酸残基の改変は、１残基ずつ点在していてもよく、数残基連続していてもよい。
【０１１９】
４−α−グルカノトランスフェラーゼは、それを産生する微生物や植物から単離することにより得ることができる。また、４−α−グルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列及び塩基配列は公知であるので、４−α−グルカノトランスフェラーゼは遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。
【０１２０】
更に、本発明では、市販品の４−α−グルカノトランスフェラーゼを使用してもよい。例えば、ＣＧＴａｓｅの場合であれば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣＧＴａｓｅ（例えば、株式会社林原生物化学研究所、岡山）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ由来のＣＧＴａｓｅ（例えば、商品名：コンチザイム、天野エンザイム株式会社、名古屋）等の市販品があり、本発明では、これらの市販のＣＧＴａｓｅを使用することもできる。
【０１２１】
３−１−３．酵素反応
第１法では、基質となる分岐状グルカンに対して、ＢＥを１００〜４，０００Ｕ／ｇ基質と、４−α−グルカノトランスフェラーゼとを、同時に又は任意の順で段階的に反応させ、本発明の高分子グルカンが生成している時点で反応を停止させる。
【０１２２】
第１法における酵素反応を行うに当たり、先ず、基質液を調製する。基質として固体の澱粉を使用する場合、澱粉を加熱により糊化し、又は澱粉の糊化の前にＢＥを添加し、その後、澱粉及びＢＥを含む混合液の温度を上昇させることで澱粉を糊化させたものを基質液として利用することができる。また、例えばα-アミラーゼを利用するような一般的な液化工程により得られた澱粉液化液を基質液として利用してもよい。その後、酵素反応に適切な温度まで澱粉液化液（基質液）の温度を下げてから、ＢＥ及び４−α−グルカノトランスフェラーゼを用いた酵素反応に供することが好ましい。
【０１２３】
澱粉の糊化開始温度は、アミログラフによって測定することができる。糊化開始温度の測定方法については、「澱粉科学の事典」（不破ら編集、株式会社朝倉書店、２００３年）の１９４頁〜１９７頁に記載される。
【０１２４】
第１法における酵素反応には、酵素として、所定濃度のＢＥと、４−α−グルカノトランスフェラーゼとを使用する。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、ＭａｌＱ又はＣＧＴａｓｅのいずれか一方のみを使用してもよく、これらの双方を使用してもよい。
【０１２５】
第１法における酵素反応における酵素の添加タイミングとしては、具体的には、下記態様１〜５が挙げられる。
態様１：ＢＥ及び４−α−グルカノトランスフェラーゼの双方を同時に添加して反応させる。
態様２：最初に４−α−グルカノトランスフェラーゼのみを添加し、ある程度反応が進んだ時点でＢＥを添加して反応させる。
態様３：最初にＢＥのみを添加し、ある程度反応が進んだ時点で４−α−グルカノトランスフェラーゼを添加して反応させる。
態様４：最初に４−α−グルカノトランスフェラーゼのみを添加し、ある程度反応が進んだ時点で一度酵素を失活させ、次いでＢＥを添加して反応させる。
態様５：最初にＢＥのみを添加し、ある程度反応が進んだ時点で一度酵素を失活させ、次いで４−α−グルカノトランスフェラーゼを添加して反応させる。
【０１２６】
前記態様１〜５において、反応がある程度進んだ段階で、必要に応じて、ＢＥ及び４−α−グルカノトランスフェラーゼのうちの少なくとも１つを更に追加添加してもよい。
【０１２７】
前記態様１のように、基質に、所定濃度のＢＥと、４−α−グルカノトランスフェラーゼとを同時に作用させると、クラスターへの分断とグルカン鎖の転移とが同時に行われると考えられる。基質にＢＥと４−α−グルカノトランスフェラーゼを同時反応させると、４−α−グルカノトランスフェラーゼの不均化反応により、ＢＥの反応場が形成されることで、分岐状部分のグルカン鎖の転移が行われ、分岐反応が相乗的に触媒されることが期待できる。
【０１２８】
また、前記態様２及び４のように、基質に先ず４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させると、分岐状グルカンが分子量約３万〜５０万程度のクラスターに分断されると共に、不均化反応により、長鎖長の糖鎖と単鎖長の糖鎖が形成されると考えられる。その後、所定濃度のＢＥを作用させることにより、分岐状部分のグルカン鎖の転移が行われ、得られる高分子グルカンの分岐頻度が高まると考えられる。
【０１２９】
また、前記態様３及び５のように、基質に先ず所定濃度のＢＥを作用させると、クラスターへの分断と分岐状部分のグルカン鎖の転移が行われると考えられる。その後、４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させることにより、不均化反応により短鎖長及び長鎖長が増大すると考えられる。
【０１３０】
反応開始時の基質濃度については、使用する基質の種類等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、約５０ｇ／ｌ以上、好ましくは約１００ｇ／ｌ以上、更に好ましくは約１５０ｇ／ｌ以上が挙げられる。また、反応開始時の基質濃度の上限としては、溶液の粘度が著しく高くならない範囲で適宜設定すればよいが、例えば、約３００ｇ／ｌ以下、好ましくは約２５０ｇ／ｌ以下、更に好ましくは約２００ｇ／ｌ以下が挙げられる。反応開始時の基質濃度として、より具体的には、５０〜３００ｇ／ｌ、好ましくは１００〜２５０ｇ／ｌ、更に好ましくは１５０〜２００ｇ／ｌが挙げられる。
【０１３１】
また、ＢＥの添加量については、１００〜４，０００Ｕ／ｇ基質に設定する。１００Ｕ／ｇ基質より少ないＢＥの量では、反応が進まず、ＢＥの作用によってもとの基質と大きな構造上の差が生じ難くなり、４−α−グルカノトランスフェラーゼとの相乗効果によって本発明の高分子グルカンとは異なるが近い構造が得られるものの、その消化性はやや早く、目的の緩やかな初期消化性は得られ難くなる。また、４，０００Ｕ／ｇ基質より多いＢＥの量では、４−α−グルカノトランスフェラーゼとの相乗効果によって、短鎖長の糖鎖の量や分岐頻度が大きくなって、難消化性成分が増大するため、本発明の高分子グルカンは得られなくなる。より効率的に本発明の高分子グルカンを製造するという観点から、ＢＥの添加量として、好ましくは１５０〜３，０００Ｕ／ｇ基質、更に好ましくは２００〜２，０００Ｕ／ｇ基質が挙げられる。
【０１３２】
また、４−α−グルカノトランスフェラーゼの添加量については、使用する４−α−グルカノトランスフェラーゼの種類、反応時間、反応温度等を勘案して適宜設定すればよい。
【０１３３】
例えば、４−α−グルカノトランスフェラーゼとしてＭａｌＱを単独で使用する場合であれば、反応開始時の溶液中の基質に対して、代表的には０．２５Ｕ／ｇ基質以上、好ましくは０．３Ｕ／ｇ基質以上、より好ましくは０．５Ｕ／ｇ基質以上が挙げられる。また、ＭａｌＱを単独で使用する場合、その添加量の上限としては、本発明の高分子グルカンが合成される範囲で適宜設定すればよいが、代表的には約５０Ｕ／ｇ基質以下、好ましくは１０Ｕ／ｇ基質以下、更に好ましくは約１Ｕ／ｇ基質以下が挙げられる。ＭａｌＱを単独で使用する場合、その添加量として、より具体的には、０．２５〜５０Ｕ／ｇ基質、好ましくは０．３〜１０Ｕ／ｇ基質、更に好ましくは０．５〜１Ｕ／ｇ基質が挙げられる。０．１Ｕ／ｇ基質より少ないＭａｌＱの量では、十分な不均化反応が得られず、ＢＥとの相乗効果による本発明の高分子グルカンが得られ難くなる。また、５０Ｕ／ｇ基質より多いＭａｌＱの量では、過剰な不均化反応によって、本発明の高分子グルカンが得られ難くなり、更に高分子の生成物の沈殿が生じたりする。
【０１３４】
また、例えば、４−α−グルカノトランスフェラーゼとしてＣＧＴａｓｅを単独で使用する場合であれば、反応開始時の溶液中の基質に対して、代表的には１０Ｕ／ｇ基質以上、好ましくは２５Ｕ／ｇ基質以上、更に好ましくは５０Ｕ／ｇ基質以上が挙げられる。また、ＣＧＴａｓｅを単独で使用する場合、その添加量の上限としては、本発明の高分子グルカンが合成される範囲で適宜設定すればよいが、代表的には５００Ｕ／ｇ基質以下、好ましくは２５０Ｕ／ｇ基質以下、更に好ましくは１００Ｕ／ｇ基質以下が挙げられる。ＣＧＴａｓｅを単独で使用する場合、その添加量として、より具体的には、１０〜５００Ｕ／ｇ基質、好ましくは２５〜２５０Ｕ／ｇ基質、更に好ましくは５０〜１００Ｕ／ｇ基質が挙げられる。１０Ｕ／ｇ基質より少ないＣＧＴａｓｅの量では、十分な不均化反応が得られず、ＢＥとの相乗効果による本発明の高分子グルカンが得られ難くなる。また、５００Ｕ／ｇ基質より多い４−α−グルカノトランスフェラーゼの量では、多量のシクロデキストリンの生成や、過剰な不均化反応によって、本発明の高分子グルカンが得られ難くなり、更に高分子の生成物の沈殿が生じたりする。
【０１３５】
また、例えば、４−α−グルカノトランスフェラーゼとしてＭａｌＱとＣＧＴａｓｅを併用する場合であれば、それぞれを単独で使用する場合よりも、各酵素の使用量を減らすことができる。具体的には、ＭａｌＱとＣＧＴａｓｅを併用する場合の各酵素の添加量として、以下に示すＭａｌＱの％酵素量ＸとＣＧＴａｓｅの％酵素量Ｙの合計値（Ｘ＋Ｙ）が、１００以上、好ましくは１００〜５０００、更に好ましくは１００〜１０００、特に好ましくは１００〜５００が挙げられる。
【数７】
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【０１３６】
即ち、例えば、ＭａｌＱの使用量が０．２Ｕ／ｇ基質であり、且つＣＧＴａｓｅの使用量が５Ｕ／ｇ基質である場合、ＭａｌＱの％酵素量Ｘは８０、ＣＧＴａｓｅの％酵素量Ｙは５０になり、前記合計値（Ｘ＋Ｙ）は１３０になる。
【０１３７】
酵素反応が行われる溶液（反応液）には、酵素反応を阻害しないことを限度として、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤が含まれていてもよい。反応液のｐＨは、使用する酵素が活性を発揮し得るｐＨになるように適宜設定すればよいが、使用する酵素のいずれかの至適ｐＨ付近であることが好ましい。前記態様２〜５のように、ＢＥと４−α−グルカノトランスフェラーゼを段階的に作用させる場合は、ＢＥを作用させる段階ではＢＥに適切なｐＨに、４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させる段階では４−α−グルカノトランスフェラーゼに適切なｐＨに調整してもよい。反応液のｐＨとしては、代表的には約２以上、好ましくは約３以上、更に好ましくは約４以上、より好ましくは約５以上、特に好ましくは約６以上、最も好ましくは約７以上が挙げられる。反応液のｐＨの上限についても、使用する酵素の特性に応じて設定すればよいが、代表的には約１３以下、好ましくは約１２以下、更に好ましくは約１１以下であり、より好ましくは約１０以下、特に好ましくは約９以下、最も好ましくは約８以下が挙げられる。反応液のｐＨとして、より具体的には、使用する酵素の至適ｐＨの±３以内、好ましくは至適ｐＨの±２以内、更に好ましくは至適ｐＨの±１以内、特に好ましくは至適ｐＨの±０．５以内が挙げられる。
【０１３８】
酵素反応を行う際の反応温度については、各酵素が所望の活性を発揮できる範囲で適宜設定すればよいが、例えば、約３０℃以上、好ましくは約４０℃以上、更に好ましくは約５０℃以上、より好ましくは約５５℃以上、特に好ましくは約６０℃以上であり、最も好ましくは約６５℃以上が挙げられる。反応温度の上限値については、各酵素が失活しない範囲で適宜設定すればよいが、例えば、約１５０℃以下、約１４０℃以下、約１３０℃以下、約１２０℃以下、約１１０℃以下、約１００℃以下等であればよいが、好ましくは約９０℃以下、更に好ましくは約８５℃以下、より好ましくは約８０℃以下、特に好ましくは約７５℃以下であり、最も好ましくは約７０℃以下が挙げられる。反応温度として、より具体的には、約３０〜約１５０℃、好ましくは約４０〜約９０℃、更に好ましくは約５０〜約８５℃、より好ましくは約５５〜約８０℃、特に好ましくは約６０〜約７５℃、最も好ましくは約６５〜約７０℃が挙げられる。反応温度は、公知の加熱手段を使用して調節することができ、反応液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。
【０１３９】
酵素反応の反応時間は、短すぎる場合には本発明の高分子グルカンが生成できない場合があり得る。逆に長すぎる場合には酵素反応は定常状態となり、目的の高分子グルカンが得られる。但し、反応時間が長すぎると、製造コストが増大するため好ましくない。そのため、本発明の高分子グルカンが生成している適切な段階で酵素反応を終了させることが必要になる。酵素反応の反応時間については、使用する基質の種類や量、使用する酵素の種類や量、反応温度、酵素の残存活性、酵素の添加タイミングを考慮して設定すればよい。
【０１４０】
例えば、前記態様１において、ＢＥと４−α−グルカノトランスフェラーゼを同時に添加して反応させる際の反応時間として、例えば、１時間以上、好ましくは２時間以上、更に好ましくは５時間以上、特に好ましくは１０時間以上、最も好ましくは２４時間以上が挙げられる。当該反応時間に特に上限はないが、例えば、１００時間以下、好ましくは７２時間以下、更に好ましくは４８時間以下、特に好ましくは３６時間以下である。より具体的には、当該反応時間として、１〜１００時間、好ましくは５〜７２時間、更に好ましくは１０〜４８時間、特に好ましくは２４〜３６時間が挙げられる。
【０１４１】
前記態様２において、４−α−グルカノトランスフェラーゼ添加後ＢＥ添加前までの反応時間として、例えば、０．５時間以上、好ましくは０．７５時間以上、更に好ましくは１時間以上、特に好ましくは２時間以上が挙げられる。当該反応時間に特に上限はないが、例えば、２４時間以下、好ましくは１２時間以下、更に好ましくは８時間以下、特に好ましくは４時間以下が挙げられる。より具体的には、当該反応時間として、０．５〜２４時間、好ましくは０．７５〜１２時間、更に好ましくは１〜８時間、特に好ましくは２〜４時間が挙げられる。
【０１４２】
また、前記態様２において、ＢＥ添加後の反応時間として、例えば、１時間以上、好ましくは５時間以上、更に好ましくは１０時間以上、特に好ましくは２４時間以上が挙げられる。当該反応時間に特に上限はないが、例えば、１００時間以下、好ましくは７２時間以下、更に好ましくは４８時間以下、特に好ましくは３６時間以下が挙げられる。より具体的には、当該反応時間として、１〜１００時間、好ましくは５〜７２時間、更に好ましくは１０〜４８時間、特に好ましくは２４〜３６時間が挙げられる。
【０１４３】
前記態様３において、ＢＥ添加後４−α−グルカノトランスフェラーゼ添加前までの反応時間として、例えば、０．５時間以上、好ましくは０．７５時間以上、更に好ましくは１時間以上、特に好ましくは２時間以上が挙げられる。当該反応時間に特に上限はないが、例えば、２４時間以下、好ましくは１２時間以下、更に好ましくは８時間以下、特に好ましくは４時間以下が挙げられる。より具体的には、当該反応時間として、０．５〜２４時間、好ましくは０．７５〜１２時間、更に好ましくは１〜８時間、特に好ましくは２〜４時間が挙げられる。
【０１４４】
また、前記態様３において、４−α−グルカノトランスフェラーゼ添加後の反応時間として、例えば、１時間以上、好ましくは５時間以上、更に好ましくは１０時間以上、特に好ましくは２４時間以上が挙げられる。当該反応時間に特に上限はないが、例えば、１００時間以下、好ましくは７２時間以下、更に好ましくは４８時間以下、特に好ましくは３６時間以下が挙げられる。より具体的には、当該反応時間として、１〜１００時間、好ましくは５〜７２時間、更に好ましくは１０〜４８時間、特に好ましくは２４〜３６時間が挙げられる。
【０１４５】
前記態様４において、４−α−グルカノトランスフェラーゼ添加後失活工程前までの反応時間として、例えば、１時間以上、好ましくは４時間以上、更に好ましくは１２時間以上、特に好ましくは２４時間以上が挙げられる。当該反応時間に特に上限はないが、例えば、７２時間以下、好ましくは６０時間以下、更に好ましくは４８時間以下、特に好ましくは３６時間以下が挙げられる。より具体的には、当該反応時間として、１〜７２時間、好ましくは４〜６０時間、更に好ましくは１２〜４８時間、特に好ましくは２４〜３６時間が挙げられる。
【０１４６】
また、前記態様４において、ＢＥ添加後の反応時間として、例えば、１時間以上、好ましくは５時間以上、更に好ましくは１０時間以上、特に好ましくは２４時間以上が挙げられる。当該反応時間に特に上限はないが、例えば、１００時間以下、好ましくは７２時間以下、更に好ましくは４８時間以下、特に好ましくは３６時間以下が挙げられる。より具体的には、当該反応時間として、１〜１００時間、好ましくは５〜７２時間、更に好ましくは１０〜４８時間、特に好ましくは２４〜３６時間が挙げられる。
【０１４７】
前記態様５において、４−α−グルカノトランスフェラーゼ添加後失活工程前までの反応時間として、例えば、１時間以上、好ましくは４時間以上、更に好ましくは１２時間以上、特に好ましくは２４時間以上が挙げられる。当該反応時間に特に上限はないが、例えば、７２時間以下、好ましくは６０時間以下、更に好ましくは４８時間以下、特に好ましくは３６時間以下が挙げられる。より具体的には、当該反応時間として、１〜７２時間、好ましくは４〜６０時間、更に好ましくは１２〜４８時間、特に好ましくは２４〜３６時間が挙げられる。
【０１４８】
また、前記態様５において、ＢＥ添加後の反応時間として、例えば、１時間以上、好ましくは５時間以上、更に好ましくは１０時間以上、特に好ましくは２４時間以上が挙げられる。当該反応時間に特に上限はないが、例えば、１００時間以下、好ましくは７２時間以下、更に好ましくは４８時間以下、特に好ましくは３６時間以下が挙げられる。より具体的には、当該反応時間として、１〜１００時間、好ましくは５〜７２時間、更に好ましくは１０〜４８時間、特に好ましくは２４〜３６時間が挙げられる。
【０１４９】
また、前記態様１のようにＢＥと４−α−グルカノトランスフェラーゼを同時に添加して作用させる方法を採用し、且つ基質として澱粉粒を使用する場合には、澱粉の糊化開始温度以下でＢＥ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ、及び澱粉粒を含む混合液を調製し、その温度のまま、又は、その後、澱粉の糊化温度内であり、調製時の温度よりも高い温度であって、ＢＥ及び４−α−グルカノトランスフェラーゼが作用し得る温度に混合液の温度を上昇させることにより、酵素反応を進行させる方法（以下、実施態様Ａと表記することもある）を採用してもよい。澱粉の糊化開始温度は、使用する澱粉粒を得た植物、その植物の収穫時期、その植物の栽培地等によって異なり得る。一般に、通常のトウモロコシ澱粉の糊化開始温度は約７０．７℃であり、ワキシーコーンスターチ（モチトウモロコシ）の糊化開始温度は約６７．５℃であり、コメ澱粉の糊化開始温度は約７３．５℃であり、馬鈴薯澱粉の糊化開始温度は約６２．６℃であり、タピオカ澱粉の糊化開始温度は約６８．４℃であり、そして緑豆澱粉の糊化開始温度は約７１．０℃である。
【０１５０】
実施態様Ａにおいて、澱粉粒の糊化開始温度以下でＢＥ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ、及び澱粉粒を含む混合液を調製する際の調製温度としては、使用する澱粉粒に応じて適宜設定すればよいが、例えば、約０℃以上、好ましくは約１０℃以上、更に好ましくは約１５℃以上、特に好ましくは約２０℃以上、最も好ましくは約２５℃以上が挙げられる。また当該調製温度の上限については、澱粉粒の糊化開始温度以下であることを限度として特に制限されないが、例えば、約６７．５℃以下、好ましくは約６０℃以下、更に好ましくは約５０℃以下、特に好ましくは約４０℃以下、最も好ましくは約３５℃以下である。当該調製温度として、具体的には、約０〜約６７．５℃、好ましくは約１０〜約６０℃、更に好ましくは約１５〜約５０℃、特に好ましくは約２０〜約４０℃、最も好ましくは約２５〜約３５℃が挙げられる。
【０１５１】
実施態様Ａにおいて、酵素反応を進行させる際の温度（即ち、澱粉の糊化温度内であり、調製時の温度よりも高い温度）としては、使用する酵素の至適温度等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、約３０℃以上、好ましくは約３５℃以上、更に好ましくは約４０℃以上、特に好ましくは約４５℃以上、最も好ましくは約５０℃以上が挙げられる。また、当該温度の上限については、使用する酵素の特性等に応じて適宜設定されるが、例えば、約８０℃以下、約７５℃以下、約７０℃以下、約６５℃以下、約６０℃以下、約５５℃以下、５０℃以下等が挙げられる。当該温度として、より具体的には、約３０〜約８０℃、好ましくは約３５〜約７５℃、更に好ましくは約４０〜約７５℃、特に好ましくは約４５〜約７５℃、最も好ましくは約５０〜約７５℃が挙げられる。また、この反応の際の温度は、一定の温度であってもよく、徐々に上昇してもよい。
【０１５２】
酵素反応は、温水ジャケットと攪拌装置を備えたステンレス製反応タンク等の公知の酵素反応装置を用いて行うことができる。
【０１５３】
酵素反応によって本発明の高分子グルカンを生成させた後に、反応液は、必要に応じて、例えば１００℃程度で６０分間程度加熱することによって反応溶液中の酵素を失活させてもよい。また、酵素を失活させる処理を行うことなく、そのまま保存されてもよいし、本発明の高分子グルカンの精製工程に供してもよい。
【０１５４】
３−１−４．精製工程
前記酵素反応によって得られた本発明の高分子グルカンは、必要に応じて精製工程の供される。精製することにより除去される不純物の例は、ＢＥ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ、副生し得る低分子量グルカン、無機塩類等である。
【０１５５】
本発明の高分子グルカンの精製方法としては、例えば、有機溶媒を用いて沈殿させる方法（Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈｏｃｈら、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，６４，２９５７（１９４２））が挙げられる。有機溶媒を用いる精製に使用され得る有機溶媒の例としては、アセトン、ｎ−アミルアルコール、ペンタゾール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ヘキシルアルコール、２−エチル−１−ブタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール、ｎ−ブチルアルコール、３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、ｄ，ｌ−ボルネオール、α−テルピネオール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソアミルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、メントール、メタノール、エタノール、エーテル等が挙げられる。
【０１５６】
また、発明の高分子グルカンの精製は、水に溶解している高分子グルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画やクロマトグラフィー等の分離処理に供して、ＢＥ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ、副生し得る低分子量グルカン、無機塩類などを除去する方法によって行うこともできる。精製に使用され得る限外濾過膜の例としては、分画分子量約１×１０3〜約１×１０4、好ましくは約５×１０3〜約５×１０4、更に好ましくは約１×１０4〜約３×１０4の限外濾過膜（例えば、ダイセル製ＵＦ膜ユニット）が挙げられる。また、クロマトグラフィーに使用され得る担体の例としては、ゲル濾過クロマトグラフィー用担体、配位子交換クロマトグラフィー用担体、イオン交換クロマトグラフィー用担体および疎水クロマトグラフィー用担体が挙げられる。
【０１５７】
３−２．第２法
３−２−１．基質
第２法でも、基質として分岐状グルカンを使用する。第２法で使用される基質の種類、好適なもの等については、第１法で使用されるものと同様である。
【０１５８】
３−２−２．酵素
ブランチングエンザイム（ＢＥ）
第２法で使用されるＢＥの特性、由来等は、第１法で使用されるものと同様である。
【０１５９】
エキソ型アミラーゼ
β−アミラーゼとは、非還元性末端からα−１，４−グルコシド結合をマルトース単位で順次加水分解するエキソ型アミラーゼである。
【０１６０】
本発明で使用されるエキソ型アミラーゼは、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼなどのいずれであってもよい。これらのエキソ型アミラーゼの中でも、α−１，６−グルコシド結合を分解する活性を有しないもの又は当該活性が弱いものが好ましく、β−アミラーゼ、α−１，６−グルコシド結合を分解する活性を有していないグルコアミラーゼ、α−１，６−グルコシド結合を分解する活性を有していないα−グルコシダーゼが特に好ましく、β−アミラーゼが最も好ましい。
【０１６１】
本発明で使用されるエキソ型アミラーゼの由来については、特に制限されず、小麦、大麦、大豆、サツマイモ等の植物由来、細菌由来、カビ由来等のいずれであってもよい。
【０１６２】
本発明において、β−アミラーゼの酵素量１単位（Ｕ又はＵｎｉｔ）は、可溶性澱粉から１分間に１μｍｏｌのマルトースを生成する酵素量を指す。また、グルコアミラーゼの酵素量１単位（Ｕ又はＵｎｉｔ）は、可溶性澱粉から３０分間に１０ｍｇのグルコースを生成する酵素量を指す。また、α−グルコシダーゼの酵素量１単位（Ｕ又はＵｎｉｔ）は、p-ニトロフェニル-α-Ｄ-グルコピラノシドから１分間に１μｍｏｌの４−ニトロフェノールを遊離する酵素量を指す。
【０１６３】
エキソ型アミラーゼの反応至適温度は、由来等に応じて異なるが、例えば甘藷由来β−アミラーゼでは、通常は約６０℃〜約７０℃である。ここで、「反応至適温度」とは、前記エキソ型アミラーゼ活性測定法において温度のみ変化させて行ったときに、最も活性が高い温度をいう。本発明で使用される大豆由来エキソ型アミラーゼの反応至適温度として、好ましくは約３０℃以上、更に好ましくは約３５℃以上、より好ましくは約３７℃以上、特に好ましくは約４０℃以上、最も好ましくは約４５℃以上が挙げられる。本発明で使用されるエキソ型アミラーゼの反応至適温度の上限については、特に制限されないが、例えば、約６５℃以下、約６０℃以下、約５５℃以下、約５０℃以下等が挙げられる。
【０１６４】
本発明で使用されるエキソ型アミラーゼは、野生型のエキソ型アミラーゼのアミノ酸配列に対して、１又は２以上のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されてなる改変型の酵素であってもよい。改変型のエキソ型アミラーゼは、改変を導入する前のエキソ型アミラーゼと同等以上のエキソ型アミラーゼ活性を有することが好ましい。改変型のエキソ型アミラーゼに導入されるアミノ酸残基の改変は、アミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で行われていてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で行われていてもよい。また、アミノ酸残基の改変は、１残基ずつ点在していてもよく、数残基連続していてもよい。
【０１６５】
エキソ型アミラーゼは、それを産生する植物、細菌、カビ等から単離することにより得ることができる。また、エキソ型アミラーゼのアミノ酸配列及び塩基配列は公知であるので、エキソ型アミラーゼは遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。
【０１６６】
また、エキソ型アミラーゼについては、大豆由来のβ−アミラーゼ（ナガセケムテック製、βアミラーゼ  #１５００）等の市販品があり、本発明では、これらの市販のβ−アミラーゼを使用することもできる。
【０１６７】
３−２−３．酵素反応
第２法では、基質となる分岐状グルカンに対して、ブランチングエンザイム１００〜４，０００Ｕ／ｇ基質を反応させ、次いでエキソ型アミラーゼを反応させ、本発明の高分子グルカンが生成している時点で反応を停止させる。
【０１６８】
第２法における酵素反応を行うに当たり、先ず、基質液を調製する。基質液の調製方法については、第１法の場合と同様である。
【０１６９】
第２法における酵素反応には、酵素として、所定濃度のＢＥと、エキソ型アミラーゼとを使用する。第２法における酵素反応における酵素の添加タイミングとしては、具体的には、下記態様I及びIIが挙げられる。
態様Ｉ：最初にＢＥのみを添加し、ある程度反応が進んだ時点でエキソ型アミラーゼを添加して反応させる。
態様II：最初にＢＥのみを添加し、ある程度反応が進んだ時点で一度酵素を失活させ、次いでエキソ型アミラーゼを添加して反応させる。
【０１７０】
前記態様I及びIIの中でも、本発明の高分子グルカンをより一層効率的に製造するという観点から、好ましくは前記態様IIが挙げられる。
【０１７１】
前記態様I及びIIにおいて、反応がある程度進んだ段階で、必要に応じて、ＢＥ及びエキソ型アミラーゼのうちの少なくとも１つを更に追加添加してもよい。
【０１７２】
前記態様I及びIIのように、基質に先ずＢＥを作用させると、クラスター分断と分岐状部分のグルカン鎖の移行が行われると考えられる。その後、エキソ型アミラーゼを作用させることにより、短鎖長が増大すると考えられる。
【０１７３】
反応開始時の基質濃度については、使用する基質の種類等に応じて適宜設定すればよく、その具体的範囲については、第１法の場合と同様である。
【０１７４】
また、ＢＥの添加量については、第１法の場合と同様である。
【０１７５】
また、エキソ型アミラーゼの添加量については、使用するエキソ型アミラーゼの種類、反応時間、反応温度等を勘案して適宜設定すればよいが、反応開始時の溶液中の基質に対して、代表的には約０．５Ｕ／ｇ基質以上、好ましくは約１．０Ｕ／ｇ基質以上、更に好ましくは約１．５Ｕ／ｇ基質以上が挙げられる。また、エキソ型アミラーゼの添加量の上限としては、本発明の高分子グルカンが合成される範囲で適宜設定すればよいが、代表的には約１５０Ｕ／ｇ基質以下、好ましくは約７５Ｕ／ｇ基質以下、更に好ましくは約１５Ｕ／ｇ基質以下が挙げられる。エキソ型アミラーゼの添加量として、より具体的には、約０．５〜約１５０Ｕ／ｇ基質、好ましくは約１．０〜約７５Ｕ／ｇ基質、更に好ましくは約１．５〜約１５Ｕ／ｇ基質が挙げられる。約０．５Ｕ／ｇ基質より少ないエキソ型アミラーゼの量では、基質を十分に加水分解できず、本発明の高分子グルカンが得られ難くなる。また、約１５０Ｕ／ｇ基質より多いエキソ型アミラーゼの量では、過剰な加水分解反応により、本発明の高分子グルカンが得られ難くなる。
【０１７６】
酵素反応が行われる溶液（反応液）には、酵素反応を阻害しないことを限度として、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤が含まれていてもよい。反応液のｐＨは、使用する酵素が活性を発揮し得るｐＨになるように適宜設定すればよいが、使用する酵素のいずれかの至適ｐＨ付近であることが好ましい。第２法において、ＢＥを作用させる段階ではＢＥに適切なｐＨに、エキソ型アミラーゼを作用させる段階ではエキソ型アミラーゼに適切なｐＨに調整してもよい。反応液のｐＨの具体的範囲については、第１法の場合と同様である。
【０１７７】
酵素反応を行う際の反応温度については、各酵素が所望の活性を発揮できる範囲で適宜設定すればよい。
【０１７８】
具体的には、前記態様I及びIIにおけるＢＥ添加後エキソ型アミラーゼ添加前の反応温度については、第１法の場合の反応温度と同様である。
【０１７９】
また、前記態様I及びIIにおけるエキソ型アミラーゼ添加後の反応温度については、例えば、約２５℃以上、更に好ましくは約３０℃以上、特に好ましくは約３５℃以上が挙げられる。かかる場合の反応温度の上限については、各酵素が失活しない範囲で適宜設定すればよいが、例えば、約４０℃以下であり、好ましくは約３７℃以下が挙げられる。かかる場合の反応温度として、具体的には、約２５〜約３０℃、好ましくは約３０〜約３７℃、更に好ましくは約３５〜約３７℃が挙げられる。
【０１８０】
酵素反応の反応時間は、短すぎる場合には本発明の高分子グルカンが生成できず、逆に長すぎる場合には、エキソ型アミラーゼによる加水分解が進行しすぎて本発明の高分子グルカンが得られなくなることがあるので、本発明の高分子グルカンが生成している適切な段階で酵素反応を終了させる必要がある。酵素反応の反応時間については、使用する基質の種類や量、使用する酵素の種類や量、反応温度、酵素の残存活性、酵素の添加タイミングを考慮して設定すればよい。
【０１８１】
具体的には、ＢＥ添加後エキソ型アミラーゼ添加前までの反応時間として、１時間以上、好ましくは１０時間以上、更に好ましくは１８時間以上、特に好ましくは２４時間以上が挙げられる。当該反応時間に特に上限はないが、例えば、１００時間以下、好ましくは７２時間以下、更に好ましくは４８時間以下、特に好ましくは３６時間以下が挙げられる。より具体的には、当該反応時間として、１〜１００時間、好ましくは１０〜７２時間、更に好ましくは１８〜４８時間、特に好ましくは２４〜３６時間が挙げられる。
【０１８２】
また、エキソ型アミラーゼ添加後の反応時間として、０．２５時間以上、好ましくは０．５時間以上、更に好ましくは０．７５時間以上、特に好ましくは１時間以上が挙げられる。当該反応時間に特に上限はないが、例えば、２．７５時間以下、好ましくは２．２５時間以下、更に好ましくは２時間以下、特に好ましくは１．５時間以下が挙げられる。より具体的には、当該反応時間として、０．２５〜２．７５時間、好ましくは０．５〜２．２５時間、更に好ましくは０．７５〜２時間、特に好ましくは１〜１．５時間が挙げられる。
【０１８３】
酵素反応は、温水ジャケットと攪拌装置を備えたステンレス製反応タンク等の公知の酵素反応装置を用いて行うことができる。
【０１８４】
第２法によって本発明の高分子グルカンを生成させた後に、反応液は、必要に応じて、例えば、１００℃程度で６０分間程度加熱することによって反応溶液中の酵素を失活させてもよい。また、酵素を失活させる処理を行うことなく、そのまま保存されてもよいし、本発明の高分子グルカンの精製工程に供してもよい。
【０１８５】
３−２−４．精製工程
反応後に生じた本発明の高分子グルカンの精製方法については、第１法の場合と同様である。
【実施例】
【０１８６】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下に示す実施例に限定して解釈されるものではない。【０１８７】
以下、単位鎖長分布の分析結果に関し、表記「ＤＰX-Y」は、重合度Ｘから重合度Ｙまでのピーク面積の積算値を示し、例えば、ＤＰ1-5とは重合度１から重合度５までのピーク面積の積算値を意味する。また、単位鎖長分布の分析結果に関し、表記「ＤＰX-Y割合」とは、重合度１から重合度５０までのピーク面積の積算値に対する重合度Ｘから重合度Ｙまでのピーク面積の積算値の割合（％）を示し、例えば、ＤＰ1-5割合とは、重合度１から重合度５０までのピーク面積の積算値に対する重合度１から重合度５までのピーク面積の積算値の割合（％）を意味する。【０１８８】
また、単位鎖長分布の分析結果に関し、「Top peak割合（％）」とは、重合度１から重合度５０までのピーク面積の積算値に対する、重合度１から重合度５０までのピークの中でピーク面積が最も大きい重合度のピーク面積の割合（％）である。【０１８９】
［試験方法］
（１）高分子グルカンの分子量の測定
高分子グルカンの重量平均分子量はＧＰＣ−ＭＡＬＳ法によって測定した。具体的には、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法は、多角度レーザー光散乱光度計（ＭＡＬＳ、ワイアットテクノロジー社製、ＨＥＬＥＯＳ  II）と示差屈折計（株式会社島津製作所製、ＲＩＤ−２０Ａ）の検出器と高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（カラム：昭和電工株式会社製、ＯＨＰＡＫ ＳＢ−８０４ＨＱもしくはＳＢ−８０６Ｍ ＨＱ）を組み合わせた分析装置を利用して分子量分析を行った。溶媒には１００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液を使用した。測定手順は、先ず、高分子グルカンの粉末５０ｍｇを１０ｍＬの１００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液に溶解しサンプルの調整をした。サンプルを孔径０．４５μｍの膜でろ過を行い、得られた濾液のうちの１００μＬを上記ＨＰＬＣシステムに注入した。【０１９０】
多角度レーザー光散乱高度計は、光を測定試料に照射したときに生じる散乱(レイリー散乱)の光強度を計測する(静的光散乱測定)。光散乱強度は、分子量の大きさに関係し、分子量の大きいものでは干渉作用が強くなり、小さいものでは弱くなるため、絶対分子量として測定することができる。光散乱強度、散乱角度、分子量の基本関係は以下の式で表される。
【数８】
2018123901.tif 000010
【０１９１】
示差屈折計は、光の屈折率の差によって試料溶液の濃度を測定するのに用いた。GPCにより分離した試料溶液の濃度と重量平均分子量の測定値から試料溶液全体の平均分子量を算出した。【０１９２】
（２）高分子グルカンの分岐頻度の測定
高分子グルカンの分岐頻度はα−１，６−グルコシド結合の数と分子中のグルコース単位総数を測定することにより算出した。α−１，６−グルコシド結合の数は、グルカンの非還元末端当量測定により求めた。具体的には、２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）溶液中で、高分子グルカン０．２５ｗ／ｖ％にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来イソアミラーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）１０Ｕ／ｍＬを、３７℃で１８時間作用させた後の還元力を改変パークジョンソン法（Ｈｉｚｕｋｕｒｉら、Ｓｔａｒｃｈ，Ｖｏｌ．，３５，ｐｐ．３４８−３５０，（１９８３））にて測定することにより、非還元末端当量を求めた。【０１９３】
また、分子中のグルコース単位総数は、全糖量測定により求めた。具体的には、２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）溶液中で、高分子グルカン０．２５ｗ／ｖ％に対して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来イソアミラーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）１０Ｕ／ｍＬ、細菌由来α‐アミラーゼ（ナガセ）２０Ｕ／ｍＬ、及びＲｈｉｚｏｐｕｓ由来グルコアミラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ製）１０Ｕ／ｍＬを、３７℃で１８時間作用させてグルコースまで完全分解し、グルコース量をグルコースオキシダーゼ法（和光純薬社製、グルコース ＣII−テストワコー）にて測定することにより求めた。【０１９４】
求めたα−１，６−グルコシド結合の数と分子中のグルコース単位総数から、前記式に従って分岐頻度を算出した。【０１９５】
（３）単位鎖長分布の測定
高分子グルカンの分子内の直線状α‐１，４‐グルカン（単位鎖長）を、長さ（重合度）によって分離し、各重合度の単位鎖長の濃度分布を分析した。具体的には、先ず、２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）溶液中で、高分子グルカン０．２５ｗ／ｖ％に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来イソアミラーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）１０Ｕ／ｍＬを３７℃で１８時間作用させて、高分子グルカンのα‐１，６−グルコシル結合を完全に消化させた。次いで、イソアミラーゼによる消化産物を、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって単位鎖長分布の分析を行った。【０１９６】
ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法は、Ｄｉｏｎｅｘ社製ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ装置（送液システム：ＤＸ３００、検出器：ＰＡＤ−２、カラム：Ｃａｒｂｏ  Ｐａｃ  ＰＡ１００）を使用して行った。溶出は、流速：１ｍＬ／分、ＮａＯＨ濃度：１５０ｍＭ、酢酸ナトリウム濃度：０分−５０ｍＭ、２分−５０ｍＭ、２７分−３５０ｍＭ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｕｒｖｅ Ｎｏ．４）、５２分−８５０ｍＭ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｃｕｒｖｅ  Ｎｏ．８）、５４分−８５０ｍＭの条件で行った。Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｃｕｒｖｅ  Ｎｏ．４及びＮｏ．８のプログラムは、Ｄｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−３０００システムに予め組み込まれているプログラムである。【０１９７】
得られた単位鎖長分布の解析は以下のように行った。高分子グルカン分子における各重合度の単位鎖長の割合は、重合度1から重合度５０までのピーク面積値を合計した値を１００％として換算した。横軸に重合度、縦軸に単位鎖長の割合をプロファイルすることで高分子グルカンの構造的特徴を単位鎖長の点から比較した。なお、殆どの高分子グルカン分子において重合度５０超のピークは検出されず、重合度５０超のピークが検出された高分子グルカン分子であっても、当該ピークは検出限界程度の僅かなものに過ぎなかった。【０１９８】
また、得られた単位鎖長分布に基づいて、前記「20％−60％累計プロットの傾き」につても算出した。【０１９９】
（４）メチル化法による高分子グルカンの末端構造の分析
高分子グルカンの末端構造をメチル化法により分析した。メチル化法は箱守のＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６４，  ５５（２），ｐ２０５−２０８に記載されている手法に従って行った。高分子グルカン１ｍｇを試験管にとり、１ｇのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に２０ｍｇの水酸化ナトリウムを加えて調製した溶液を５００μＬ加え、さらにヨウ化メチルを２００μＬ加えて、室温で１５分攪拌しメチル化した。水とクロロホルムを加えて液液抽出を３回行い、クロロホルム相をエバポレーターで溶媒除去した。メチル化された高分子グルカンに２Ｍトリフルオロ酢酸５００μＬ加えて、９０℃で１時間攪拌して加水分解した。その後、トルエンを２００μＬ加えてエバポレーターで溶媒除去した。加水分解後、２５０ｍＭ水素化ホウ酸ナトリウム水溶液を５００μＬ加えて、室温で一晩攪拌し還元した。更に、酢酸を泡が出なくなるまで加え、トルエンを２００μＬ加えてエバポレーターで溶媒除去した。最後に、ピリジン２００μＬと無水酢酸２００μＬを加え、９０℃で２０分攪拌してアセチル化を行った。反応後、トルエンを２００μＬ加えてエバポレーターで溶媒除去し、水とクロロホルムを加えて液液抽出を３回行い、クロロホルム相を回収して、エバポレーターで溶媒除去し、部分メチル化糖を合成した。【０２００】
部分メチル化糖の分析はガスクロマトグラフィー質量分析法によって行った。分析はＧＣ−ＭＳ−ＱＰ２０１０Ｐｌｕｓ（島津社製）、カラムはＤＢ−２２５（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて行った。分析条件は、キャリアガス；ヘリウム、カラム温度；１７０℃→２１０℃（昇温速度３℃／ｍｉｎ）、気化室温度；２３０℃、検出器温度；２３０℃とした。試料はクロロホルムに溶解して調製した。【０２０１】
（５）酵素法による高分子グルカンの結合様式の分析
高分子グルカンの結合様式を酵素法により分析した。イソアミラーゼはα−１，６−グルコシド結合を加水分解し、α−アミラーゼおよびβ−アミラーゼはα−１，４−グルコシド結合を加水分解する。また、イソアミラーゼは非還元末端部分のα−１，６−グルコシド結合を加水分解することができない。この３種類の酵素を作用させることでα−１，４−グルコシド結合およびα−１，６−グルコシド結合以外のグルコシド結合の有無及び、非還元末端部分の分岐の有無を確認した。【０２０２】
具体的には、先ず、２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）溶液中で、高分子グルカン０．２５ｗ／ｖ％に対して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来イソアミラーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）１０Ｕ／ｍＬを、３７℃で１８時間作用させ、その後、細菌由来α−アミラーゼ（ナガセケムテック製）２０Ｕ／ｍＬ、及び大豆由来β−アミラーゼ（ナガセケムテック製）３０Ｕ／ｍＬを３７℃で１８時間作用させた。得られた酵素分解物について、前記「（３）単位鎖長分布の測定」の欄に示す、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法と同条件で分析を行った。【０２０３】
（６）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  消化性試験
本試験では、消化速度試験として、生体内における糖質の消化性をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて模擬的に評価する加水分解試験を採用した。本試験方法は、Ｅｎｇｌｙｓｔら（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、１９９２、４６Ｓ３３〜Ｓ５０）の方法を基に改変した方法で、糖質に消化酵素（ブタ膵臓由来α-アミラーゼおよびラット小腸粘膜酵素）を作用させ、分解によって放出されるグルコース量を経時的に測定する方法である。消化酵素と試験物質は以下のように調製した。Ｓｉｇｍａ社製のブタ膵臓由来α−アミラーゼを５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）で懸濁し、活性２５０Ｕ／ｍＬの酵素溶液に調製した。また、Ｓｉｇｍａ社製のラット小腸アセトンパウダー１５０ｍｇを５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）３ｍＬに懸濁し、遠心した上清をラット小腸アセトンパウダー抽出液として得た。この抽出液をラット小腸粘膜酵素液として使用した。測定対象となる高分子グルカンは蒸留水で５ｗ／ｖ％に調整し、１００℃、５分加熱して完全溶解させた。５０ｍｇ／ｍＬのラット小腸アセトンパウダーに含まれるα−グルコシダーゼの活性は０．３Ｕ／ｍＬであった。【０２０４】
本試験は、具体的には以下の手順で行った。５ｗ／ｖ％の高分子グルカン又は同濃度の他のサンプルの水溶液１００μＬ、１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）２０μＬ、蒸留水７１６μＬを混合し、更に各酵素溶液（α−アミラーゼ４μＬ（１Ｕ／ｍＬ）、及びラット小腸粘膜酵素液１６０μＬ（α‐グルコシダーゼ；０．０５Ｕ／ｍＬ）)を添加して反応を開始した。反応温度は３７℃に設定し、反応開始後０分、１０分、２０分、３０分、６０分、９０分、及び１２０分に反応溶液１００μＬを取り、１００℃、５分処理して反応を停止した。これらの反応停止溶液のグルコース濃度を和光純薬工業社製のグルコースＣIIテストワコーを用いて定量した。【０２０５】
得られた消化速度試験の結果から、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ らのＬｏｇａｒｉｔｈｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｌｏｐｅ  （ＬＯＳ）  ｐｌｏｔ法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ８７  （２０１２）  ２１８９−２１９７）を使用して、前述する算出式を使用して、反応開始から３０分までの反応において認められる初期分解速度係数ｋを求めた。【０２０６】
また、得られた消化速度試験の結果から、前述する算出式を使用して、高分子グルカン又は他のサンプルに含まれる易消化性画分、緩消化性画分、及び難消化性画分の割合（％）を求めた。【０２０７】
（７）経口摂取時の血糖値およびインスリン値の変化の測定
１０時間以上絶食（水以外）した健常な成人を対象にクロスオーバー・オープン試験を実施した。被験サンプルである高分子グルカン又は対照糖質のグルコースを５０ｇ経口摂取させ、摂取前空腹時と糖質摂取後１０分、２０分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、及び１２０分の血糖値及び血中インスリン値を測定した。【０２０８】
［酵素の準備］
（１）Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ＢＥの製造
特開２００８−９５１１７の製造例１に記載された組換えプラスミドｐＡＱＢＥ１を保持する大腸菌ＴＧ−１株を用いて、同特許文献に示された方法に従って、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来ＢＥ（ＡｑＢＥ）を含む酵素液（ＡｑＢＥ酵素液）を得た。【０２０９】
（２）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来アミロマルターゼの製造
Ｔｅｒａｄａら（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６５巻、９１０−９１５（１９９９））に記載されたプラスミドｐＦＧＱ８を保持する大腸菌ＭＣ１０６１株を用いて、同文献に示された方法に従って、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来アミロマルターゼ（ＴａｑＭａｌＱ）を含む酵素液（ＴａｑＭａｌＱ酵素液）を得た。【０２１０】
（３）ＣＧＴａｓｅ及びβ−グルコシダーゼ
ＣＧＴａｓｅ（コンチザイム、天野エンザイム株式会社）及びβ−アミラーゼ（ナガセケムテック社製、＃１５００）を購入し、ＣＧＴａｓｅ酵素液及びβ−アミラーゼ酵素液を準備した。【０２１１】
［実施例１：ワキシーコーンスターチ、ＡｑＢＥ、及びＴａｑＭａｌＱを用いた高分子グルカンの製造］
ワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業株式会社製）２００ｇを１Ｌの２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、懸濁液を１００℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。使用したワキシーコーンスターチの分岐頻度は６．５％であり、平均重合度は約１×１０5であり、重量平均分子量は約２×１０7であった。次いで、約７０℃まで冷却した糊液に、ＡｑＢＥ酵素液を２００Ｕ／ｇ基質（実施例１−１）、３００Ｕ／ｇ基質（実施例１−２）、７００Ｕ／ｇ基質（実施例１−３）、１０００Ｕ／ｇ基質（実施例１−４）、２０００Ｕ／ｇ基質（実施例１−５）となるように添加し、同時にＴａｑＭａｌＱ酵素液を０．５Ｕ／ｇ基質となるように添加して７０℃で２４時間反応させた。また、約７０℃まで冷却した糊液に、ＡｑＢＥ酵素液を２００Ｕ／ｇ基質及びＴａｑＭａｌＱ酵素液を０．２５Ｕ／ｇ基質となるよう同時に添加して７０℃で２４時間反応させた（実施例１−６）。反応後、反応液を１００℃で２０分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液を凍結乾燥し、粉末状の高分子グルカンを得た。【０２１２】
高分子グルカンの製造に使用した酵素濃度、並びに得られた高分子グルカンの重量平均分子量、分岐頻度、及び還元糖量を測定した結果を表１に示し、得られた高分子グルカンの単位鎖長分布の分析結果を表２に示す。また、得られた高分子グルカンの単位鎖長分布のグラフを図２に示す。実施例１−１〜１−６の高分子グルカンの単位鎖長分布は、いずれも、重合度５〜１５程度の短鎖長側と重合度２５以上の長鎖長側の両方に高い濃度を示すピークがあり、且つ突出したピークがなく全体的になだらかな分布を示し、従来の分岐状グルカンとは、異なる構造を有していることが確認された。【０２１３】
また、実施例１−３及び１−６の高分子グルカンについて、メチル化法による末端構造の分析を行ったところ、末端分岐構造に由来する部分メチル化糖が検出されなかった。即ち、実施例１−３及び１−６の高分子グルカンは、末端分岐構造を有していないことが明らかとなった。また、比較のために、非還元末端にα−１，６分岐の構造を持つことが分かっている高分岐デキストリンＨＢＤ−２０（松谷化学工業株式会社製）についても、メチル化法による末端構造の分析を行ったところ、末端分岐構造に由来する部分メチル化糖が検出された。【０２１４】
更に、実施例１−３及び１−６の高分子グルカンについて、酵素法による結合様式の分析を行って得られた生成物の分析結果を図３に示す。図３から分かるように、実施例１−３及び１−６の高分子グルカンの酵素分解物のピークはグルコース及びマルトースのみであった。この結果から、これら高分子グルカンはα−１，４−グルコシド結合及びα−１，６−グルコシド結合のみを結合様式に持ち、α−１，６−グルコシド結合は糖鎖の非還元末端にはないことが明らかとなった。【０２１５】
【表１】
2018123901.tif 000011
【０２１６】
【表２】
2018123901.tif 000012
【０２１７】
［比較例１：ＡｑＢＥのみを用いた分岐状グルカンの製造］
ワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業株式会社製）２００ｇを１Ｌの２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、懸濁液を１００℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た（比較例１−１）。使用したワキシーコーンスターチの分岐頻度は６．５％であり、平均重合度は約１×１０5であり、重量平均分子量は約２×１０7であった。約７０℃まで冷却した糊液に、ＡｑＢＥ酵素液を５０Ｕ／ｇ基質（比較例１−２）、１００Ｕ／ｇ基質（比較例１−３）、２００Ｕ／ｇ基質（比較例１−４）、５００Ｕ／ｇ基質（比較例１−５）、７００Ｕ／ｇ基質（比較例１−６）、５０００Ｕ／ｇ基質（比較例１−７）、又は１００００Ｕ／ｇ基質（比較例１−８）となるように添加して７０℃で２４時間反応させた。反応後、反応液を１００℃で２０分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液を凍結乾燥し、粉末状の分岐状グルカンを得た。【０２１８】
高分子グルカンの製造に使用した酵素濃度、並びに得られた分岐状グルカンの重量平均分子量、分岐頻度、及び還元糖量を測定した結果を表３に示し、得られた分岐状グルカンの単位鎖長分布の分析結果を表４に示す。また、得られた分岐状グルカンの単位鎖長分布のグラフを図４に示す。比較例１−１〜１−８の分岐状グルカンの単位鎖長分布は、いずれも、重合度１１〜１６程度の領域に高い濃度で局在化しており、前記特性(i)〜(iii)を満たすものではなかった。【０２１９】
【表３】
2018123901.tif 000013
【０２２０】
【表４】
2018123901.tif 000014
【０２２１】
［比較例２：ワキシーコーンスターチ、少量又は過剰のＡｑＢＥ及びＴａｑＭａｌＱを用いた分岐状グルカンの製造］
ワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業株式会社製）２００ｇを１Ｌの２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、懸濁液を１００℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。使用したワキシーコーンスターチの分岐頻度は６．５％であり、平均重合度は約１×１０5であり、重量平均分子量は約２×１０7であった。約７０℃まで冷却した糊液に、ＡｑＢＥ酵素液を５０Ｕ／ｇ基質（比較例２−１）、又は５０００Ｕ／ｇ基質(比較例２−２)となるように添加し、同時にＴａｑＭａｌＱ酵素液を０．５Ｕ／ｇ基質となるように添加して７０℃で２４時間反応させた。反応後、反応液を１００℃で２０分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液を凍結乾燥し、粉末状の分岐状グルカンを得た。【０２２２】
分岐状グルカンの製造に使用した酵素濃度、並びに得られた分岐状グルカンの重量平均分子量、分岐頻度、及び還元糖量を測定した結果を表５に示し、得られた分岐状グルカンの単位鎖長分布の分析結果を表６に示す。また、得られた分岐状グルカンの単位鎖長分布のグラフを図５に示す。比較例２−１及び２−２の分岐状グルカンの単位鎖長分布は、いずれも、前記特性(i)〜(iii)を満たすものではなかった。【０２２３】
【表５】
2018123901.tif 000015
【０２２４】
【表６】
2018123901.tif 000016
【０２２５】
［比較例３：酵素合成分岐グルカンの分析］
特開２００８−９５１１７号公報に記載の手法に従って合成された酵素合成分岐グルカンについて、重量平均分子量、分岐頻度、還元糖量、及び単位鎖長分布の測定を行った。【０２２６】
酵素合成分岐グルカンの重量平均分子量、分岐頻度、及び還元糖量を測定した結果を表７に示し、酵素合成分岐グルカンの単位鎖長分布の分析結果を表８に示す。また、酵素合成分岐グルカンの単位鎖長分布のグラフを図６に示す。比較例３の酵素合成分岐グルカンの単位鎖長分布は、いずれも、重合度１１〜１６程度の領域に高い濃度で局在化しており、前記特性(i)〜(iii)を満たすものではなかった。【０２２７】
【表７】
2018123901.tif 000017
【０２２８】
【表８】
2018123901.tif 000018
【０２２９】
［比較例４：天然グリコーゲンの分析］
牛肝臓由来のグリコーゲン（Ｓｉｇａｍ社製）及び牡蠣由来のグリコーゲン（ＭＢ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）について、重量平均分子量、分岐頻度、還元糖量、及び単位鎖長分布の測定を行った。【０２３０】
各天然グリコーゲンの重量平均分子量、分岐頻度、及び還元糖量を測定した結果を表９に示し、各天然グリコーゲンの単位鎖長分布の分析結果を表１０に示す。また、各天然グリコーゲンの単位鎖長分布のグラフを図７に示す。比較例４−１及び４−２の天然コラーゲンは、重合度１１〜１６程度の領域に高い濃度で局在化しており、前記特性(i)〜(iii)を満たすものではなかった。【０２３１】
【表９】
2018123901.tif 000019
【０２３２】
【表１０】
2018123901.tif 000020
【０２３３】
［実施例２：タピオカ澱粉、ＡｑＢＥ、及びＴａｑＭａｌＱを用いた高分子グルカンの製造］
タピオカ澱粉（東海澱粉株式会社製）２００ｇを１Ｌの２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、懸濁液を１００℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。使用したタピオカ澱粉の分岐頻度は４．８％であり、平均重合度は約３×１０4であり、重量平均分子量は約5×１０6であった。約７０℃まで冷却した糊液に、ＡｑＢＥ酵素液を１４００Ｕ／ｇ基質となるように添加し、同時にＴａｑＭａｌＱ酵素液を０．２５Ｕ／ｇ基質となるように添加して７０℃で２４時間反応させた。反応後、反応液を１００℃で２０分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液を凍結乾燥し、粉末状の高分子グルカンを得た。【０２３４】
高分子グルカンの製造に使用した酵素濃度、並びに得られた高分子グルカンの重量平均分子量、分岐頻度、及び還元糖量を測定した結果を表１１に示し、得られた高分子グルカンの単位鎖長分布の分析結果を表１２に示す。また、得られた高分子グルカンの単位鎖長分布のグラフを図８に示す。実施例２の高分子グルカンは、重合度５〜１５程度の短鎖長側と重合度２５以上の長鎖長側の両方に高い濃度を示すピークがあり、且つ突出したピークがなく全体的になだらかな分布を示し、従来の分岐状グルカンとは、異なる構造を有していることが確認された。【０２３５】
【表１１】
2018123901.tif 000021
【０２３６】
【表１２】
2018123901.tif 000022
【０２３７】
［実施例３：ワキシーコーンスターチ、ＡｑＢＥ、及びＣＧＴａｓｅを用いた高分子グルカンの製造］
ワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業株式会社製）２００ｇを１Ｌの２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、懸濁液を１００℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。使用したワキシーコーンスターチの分岐頻度は６．５％であり、平均重合度は約１×１０5であり、重量平均分子量は約２×１０7であった。次いで、約７０℃まで冷却した糊液に、ＡｑＢＥ酵素液を７００Ｕ／ｇ基質となるように添加し、同時にＣＧＴａｓｅ（コンチザイム、天野エンザイム株式会社）酵素液を１０Ｕ／ｇ基質（実施例３−１）又は５０Ｕ／ｇ基質（実施例３−２）となるように添加して６０℃で２４時間反応させた。反応後、反応液を１００℃で２０分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液を凍結乾燥し、粉末状の高分子グルカンを得た。【０２３８】
高分子グルカンの製造に使用した酵素濃度、並びに得られた高分子グルカンの重量平均分子量、分岐頻度、及び還元糖量を測定した結果を表１３に示し、得られた高分子グルカンの単位鎖長分布の分析結果を表１４に示す。また、得られた高分子グルカンの単位鎖長分布のグラフを図９に示す。実施例３の高分子グルカンでも、実施例１及び２と同様に、重合度５〜１５程度の短鎖長側と重合度２５以上の長鎖長側の両方に高い濃度を示すピークがあり、且つ突出したピークがなく全体的になだらかな分布を示していた。【０２３９】
【表１３】
2018123901.tif 000023
【０２４０】
【表１４】
2018123901.tif 000024
【０２４１】
［実施例４：ワキシーコーンスターチ、ＡｑＢＥ、ＭａｌＱ及びＣＧＴａｓｅを用いた高分子グルカンの製造］
ワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業株式会社製）２００ｇを１Ｌの２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、懸濁液を１００℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。使用したワキシーコーンスターチの分岐頻度は６．５％であり、平均重合度は約１×１０5であり、重量平均分子量は約２×１０7であった。次いで、約６０℃まで冷却した糊液に、ＡｑＢＥ酵素液を７００Ｕ／ｇ基質となるように添加し、同時にＣＧＴａｓｅ酵素液を２Ｕ／ｇ基質及びＴａｑＭａｌＱ酵素液を０．２Ｕ／ｇ基質（実施例４−１）、或はＣＧＴａｓｅ酵素液を５Ｕ／ｇ基質及びＴａｑＭａｌＱ酵素液を０．２Ｕ／ｇ基質（実施例４−２）となるように添加して、６０℃で２４時間反応させた。反応後、反応液を１００℃で２０分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液を凍結乾燥し、粉末状の高分子グルカンを得た。【０２４２】
高分子グルカンの製造に使用した酵素濃度、並びに得られた高分子グルカンの重量平均分子量、分岐頻度、及び還元糖量を測定した結果を表１５に示し、得られた高分子グルカンの単位鎖長分布の分析結果を表１６に示す。また、得られた高分子グルカンの単位鎖長分布のグラフを図１０に示す。実施例４の高分子グルカンでも、重合度５〜１５程度の短鎖長側と重合度２５以上の長鎖長側の両方に高い濃度を示すピークがあり、且つ突出したピークがなく全体的になだらかな分布を示していた。【０２４３】
【表１５】
2018123901.tif 000025
【０２４４】
【表１６】
2018123901.tif 000026
【０２４５】
［比較例５：ワキシーコーンスターチ、ＡｑＢＥ、及び少量のＭａｌＱ又はＣＧＴａｓｅを用いた分岐状グルカンの製造］
ワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業株式会社製）２００ｇを１Ｌの２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、懸濁液を１００℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。使用したワキシーコーンスターチの分岐頻度は６．５％であり、平均重合度は約１×１０5であり、重量平均分子量は約２×１０7であった。次いで、約６０℃まで冷却した糊液に、ＡｑＢＥ酵素液を７００Ｕ／ｇ基質となるように添加し、同時にＴａｑＭａｌＱ酵素液を０．２Ｕ／ｇ基質（比較例５−１）又はＣＧＴａｓｅ酵素液を５Ｕ／ｇ基質（比較例５−２）、或はＣＧＴａｓｅ酵素液を２Ｕ／ｇ基質及びＴａｑＭａｌＱ酵素液を０．１Ｕ／ｇ基質（比較例５−３）となるように添加して、６０℃で２４時間反応させた。反応後、反応液を１００℃で２０分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液を凍結乾燥し、粉末状の分岐状グルカンを得た。【０２４６】
分岐状グルカンの製造に使用した酵素濃度、並びに得られた分岐状グルカンの重量平均分子量、分岐頻度、及び還元糖量を測定した結果を表１７に示し、得られた分岐状グルカンの単位鎖長分布の分析結果を表１８に示す。また、得られた分岐状グルカンの単位鎖長分布のグラフを図１１に示す。比較例５−１〜５−３の分岐状グルカンでは、ＭａｌＱ及び／又はＣＧＴａｓｅによる不均化反応が十分に進行しておらず、前記特性(i)〜(iii)を満たすものではなかった。【０２４７】
【表１７】
2018123901.tif 000027
【０２４８】
【表１８】
2018123901.tif 000028
【０２４９】
［実施例５：ワキシーコーンスターチ、ＡｑＢＥ、及びβ−アミラーゼを用いた高分子グルカンの製造］
ワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業株式会社製）２００ｇを１Ｌの２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、懸濁液を１００℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。使用したワキシーコーンスターチの分岐頻度は６．５％であり、平均重合度は約１×１０5であり、重量平均分子量は約２×１０7であった。次いで、約７０℃まで冷却した糊液に、ＡｑＢＥ酵素液を１００Ｕ／ｇ基質となるように添加し、７０℃で２４時間反応させた。反応後、反応液を１００℃で２０分間加熱してＢＥを失活させた。その後、３７℃まで冷却し、β−アミラーゼ酵素液を１５Ｕ／ｇ基質となるように添加して、３７℃で１時間（実施例５−１）又は２時間（実施例５−２）反応させた。反応後、反応液を１００℃で２０分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液に当量のエタノールを加え、沈殿物を遠心して回収した（エタノール沈殿）。エタノール沈殿は３回繰り返した後、回収した沈殿物を水に溶解させ、この溶液を凍結乾燥し、粉末状の高分子グルカンを得た。【０２５０】
高分子グルカンの製造に使用した酵素濃度、並びに得られた高分子グルカンの重量平均分子量、分岐頻度、還元糖量、収率を測定した結果を表１９に示し、得られた高分子グルカンの単位鎖長分布の分析結果を表２０に示す。また、得られた高分子グルカンの単位鎖長分布のグラフを図１２に示す。【０２５１】
実施例５−１及び５−２の高分子グルカンは、重合度５〜１５程度の短鎖長側と重合度２５以上の長鎖長側の両方に高い濃度を示すピークがあり、且つ突出したピークがなく全体的になだらかな分布を示していた。但し、製造時にβ−アミラーゼを使用しており、大量のマルトースが副生されるため、収率は高くなかった。【０２５２】
【表１９】
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【０２５３】
【表２０】
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【０２５４】
［比較例６：ワキシーコーンスターチ、ＡｑＢＥ、及びβ−アミラーゼを用いて、β−アミラーゼ処理を長時間行うことによる分岐状グルカンの製造］
ワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業株式会社製）２００ｇを１Ｌの２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、懸濁液を１００℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。使用したワキシーコーンスターチの分岐頻度は６．５％であり、平均重合度は約１×１０5であり、重量平均分子量は約２×１０7であった。次いで、約７０℃まで冷却した糊液に、ＡｑＢＥ酵素液を１００Ｕ／ｇ基質となるように添加し、７０℃で２４時間反応させた。反応後、反応液を１００℃で２０分間加熱してＢＥを失活させた。その後、３７℃まで冷却し、β−アミラーゼ酵素液を１５Ｕ／ｇ基質となるように添加して、３７℃で３時間（比較例６−１）、４時間（比較例６−２）、又は６時間（比較例６−３）反応させた。反応後、反応液を１００℃で２０分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液に当量のエタノールを加え、沈殿物を遠心して回収した（エタノール沈殿）。エタノール沈殿は３回繰り返した後、回収した沈殿物を水に溶解させ、この溶液を凍結乾燥し、粉末状の分岐状グルカンを得た。【０２５５】
分岐状グルカンの製造に使用した酵素濃度、並びに得られた分岐状グルカンの重量平均分子量、分岐頻度、還元糖量、及び収率を測定した結果を表２１に示し、得られた分岐状グルカンの単位鎖長分布の分析結果を表２２に示す。また、得られた分岐状グルカンの単位鎖長分布のグラフを図１３に示す。比較例６−１〜６−３の分岐状グルカンは、重合度１６以下の領域に高い濃度で局在化しており、前記特性(i)〜(iii)を満たすものではなかった。【０２５６】
【表２１】
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【０２５７】
【表２２】
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【０２５８】
［実施例６：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  消化性試験］
実施例１〜５の高分子グルカン、比較例１、２、５、及び６の分岐状グルカン、比較例３の酵素合成分岐グルカン、並びに比較例４の天然グリコーゲンについて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化性試験を行い、初期分解速度係数ｋ、並びに易消化性画分、緩消化性画分、及び難消化性画分の各割合（％）を求めた。【０２５９】
得られた結果を表２３に示す。実施例の高分子グルカンは、いずれも、初期分解速度係数ｋ値が０．０２９未満であり、難消化性画分は１０％未満になっていた。これに対して、比較例の分岐状グルカンでは、初期分解速度係数ｋ値が０．０２９以上であるか、初期分解速度係数ｋ値が０．０２９未満である場合は難消化性画分が１０％以上であった。また、酵素合成分岐グルカン及び天然グリコーゲンでは、初期分解速度係数ｋ値が０．０２９以上で、難消化性画分も１０％以上であった。【０２６０】
【表２３】
2018123901.tif 000033
【０２６１】
［実施例７：経口摂取時の血糖値及び血中インスリン値の変化（実施例１−３とグルコースとの比較試験）］
実施例１−３の高分子グルカン及びグルコースを用いて、健常人１０名により、経口摂取した際の血糖値および血中インスリン値の測定をクロスオーバー・オープン試験にて実施した。被験者は１０時間以上水以外絶食した状態で高分子グルカンまたはグルコースを摂取した。【０２６２】
高分子グルカン及びグルコースの摂取前空腹時の血中血糖値およびインスリン値を基準として変化量をプロットした結果、並びに血糖値及び血中インスリン値について血中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した結果を図１４に示す。【０２６３】
この結果、実施例１−３の高分子グルカンの場合には、グルコースの場合に比べて、血糖値の上昇は糖質摂取後１０分と２０分で有意に低値を示し、初期血糖値の上昇が緩やかであることが明らかとなった。一方で、実施例１−３の高分子グルカンとグルコースでは、血糖値のＡＵＣ値には有意差は無く、実施例１−３の高分子グルカンは高効率にグルコースへ分解されることが確認された。【０２６４】
また、実施例１−３の高分子グルカンの場合には、グルコースを摂取した場合に比べて、血中インスリン値の上昇は糖質摂取後１０分、２０分、３０分、９０分で有意に低値を示し、実施例１−３の高分子グルカンは、摂取後のインスリン分泌が緩やかであることが確認された。更に、実施例１−３の高分子グルカンは、インスリンのＡＵＣ値がグルコースの場合と比べ有意に低値を示し、インスリンが分泌しにくい糖質であることも明らかとなった。【０２６５】
以上の結果より、本発明で規定されている特定の単位鎖長分布を有する高分子グルカンは、摂取後の初期血糖値上昇が緩やかで、且つインスリン分泌も緩やかな糖質であることが確認された。【０２６６】
［実施例８：経口摂取時の血糖値及び血中インスリン値の変化（実施例１−１と比較例１−３との比較試験）］
実施例１−１の高分子グルカンと比較例１−３の分岐状グルカンを用いて、健常人１名により、経口摂取した際の血糖値および血中インスリン値の測定をクロスオーバー・オープン試験にて実施した。被験者は１０時間以上水以外絶食した状態で高分子グルカンまたは分岐状グルカンを摂取した。【０２６７】
グルカンの摂取前空腹時の血中血糖値およびインスリン値を基準として変化量をプロットした結果、並びに血糖値及び血中インスリン値について血中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した結果を図１５に示す。【０２６８】
この結果、実施例１−１の高分子グルカンは、比較例１−３の分岐状グルカンに比して、摂取後３０分までの初期血糖値の上昇値は低値を示し、緩やかに消化される糖質であることが分かった。また、実施例１−１の高分子グルカンは、比較例１−３の分岐状グルカンに比して、血中インスリン値の上昇値も摂取後３０分までは低値を示し、緩やかなインスリン分泌をする糖質であることが分かった。一方で、血糖値のＡＵＣ値に関しては、実施例１−１の高分子グルカンのＡＵＣ値は、比較例１−３の分岐状グルカンのＡＵＣ値の約９０％であり、両者は、糖質の分解量の点では殆ど同じであった。また、インスリン値のＡＵＣ値に関しては、実施例１−１の高分子グルカンのＡＵＣ値は、比較例１−３の分岐状グルカンのＡＵＣ値の約５０%と大きく低下しており、実施例１−１の高分子グルカンはインスリンが分泌しにくい糖質であることが分かった。【０２６９】
以上の結果からも、本発明で規定されている特定の単位鎖長分布を有する高分子グルカンは、摂取後の初期血糖値上昇が緩やかで、且つインスリン分泌も緩やかな糖質であることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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