【手続補正書】
【提出日】令和1年10月11日(2019.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
四重特異性の四量体型結合剤を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株であって、前記結合剤は、連結された第一のＶＨＨペプチド単量体、第二のＶＨＨペプチド単量体、第三のＶＨＨペプチド単量体、及び第四のＶＨＨペプチド単量体を含み、かつそれらのＶＨＨペプチド単量体は、独立して、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）のエピトープに対して結合特異性を有する、操作された酵母菌株。
【請求項２】
前記第一のＶＨＨペプチド単量体、前記第二のＶＨＨペプチド単量体、前記第三のＶＨＨペプチド単量体、及び前記第四のＶＨＨペプチド単量体は、それぞれ異なるエピトープに対する結合特異性を有する、或いは前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つは、ＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つは、ＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項１に記載の操作された酵母菌株。
【請求項３】
前記ＶＨＨペプチド単量体は、独立して、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する、請求項１又は２に記載の操作された酵母菌株。
【請求項４】
前記結合剤はＡＢＡＢであり、ここで前記第一の単量体及び前記第三の単量体は、ＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記第一の単量体及び前記第三の単量体は、それぞれＶＨＨペプチド単量体ＡＨ３（配列番号７）及びＡＡ６（配列番号５）であり、かつ前記第二の単量体及び前記第四の単量体は、ＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記第二の単量体及び前記第四の単量体は、それぞれＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）及びＥ３（配列番号３）である、請求項１に記載の操作された酵母菌株。
【請求項５】
前記ＡＢＡＢ結合剤は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持するか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持するか、又はその両方を維持する、請求項４に記載の操作された酵母菌株。
【請求項６】
前記ＡＢＡＢ結合剤は、ＡＴ分泌シグナル（ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡ（配列番号９９））及びＩＶＳ分泌シグナル（ＭＬＬＱＡＦＬＦＬＬＡＧＦＡＡＫＩＳＡ（配列番号１０３））から選択されるＮ末端分泌シグナルを更に含む、請求項４又は５に記載の操作された酵母菌株。
【請求項７】
前記ＡＢＡＢ結合剤は、酵母内のプラスミドから発現され、ここで該ＡＢＡＢ結合剤は、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持するか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持するか、又はその両方を維持する、請求項４に記載の操作された酵母菌株。
【請求項８】
前記プラスミドは、ｐＣＥＶ−ＵＲＡ３−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ−ｃＭｙｃ（配列番号８８）である、請求項７に記載の操作された酵母菌株。
【請求項９】
前記ＡＢＡＢ結合剤のコーディング配列は、酵母の染色体中に組み込まれており、ここで該ＡＢＡＢ結合剤は、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持するか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持するか、又はその両方を維持する、請求項４に記載の操作された酵母菌株。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株と、医薬品に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬製剤。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の操作された酵母菌株の製造方法であって、（ａ）サッカロマイセス属酵母菌株を、前記結合剤をコードする発現ベクターで形質転換させることと、（ｂ）（ａ）の酵母を該結合剤の産生についてスクリーニングすることとを含む、方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の操作された酵母菌株の製造方法であって、（ａ）前記結合剤をコードするポリヌクレオチド配列を、サッカロマイセス属酵母菌株のゲノム中に染色体組込みすることと、（ｂ）（ａ）の酵母を該結合剤の産生についてスクリーニングすることとを含む、方法。
【請求項１３】
前記操作されたサッカロマイセス属酵母菌株は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記発現ベクターは、プラスミドｐＣＥＶ−ＵＲＡ３−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ−ｃＭｙｃ（配列番号８８）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
染色体組込みは、
（ａ）前記ＡＢＡＢ結合剤をコードするポリヌクレオチド配列を、プラスミドｐＣＥＶ−Ｇ４−Ｋｍ−ＴＥＦ−ＡＴ−ｙＡＢＡＢ  ｈＡＡ６Ｔ８３Ｎ−タグなし（配列番号９０）から、（ｉ）選択された酵母染色体組込み部位に相同な核酸配列、並びに（ｉｉ）該プラスミドのＡＢＡＢ結合剤をコードする配列の５’領域及び３’領域に相同な核酸配列を含むプライマーを使用して増幅させて、組込みカセットを作製することと、
（ｂ）酵母を（ａ）で作製された組込みカセットと一緒にｐＣＲＩ−Ｓｂ−δ１（配列番号９１）又はｐＣＲＩ−Ｓｂ−δ２（配列番号９２）で形質転換させることで、相応の酵母染色体のδ部位内で、二本鎖切断の部位中への組込みカセットの自発的組込みを促進する条件下で二本鎖切断を誘導することと、
（ｃ）（ｂ）の形質転換された酵母を、ＡＢＡＢ結合剤の産生についてスクリーニングすることと、
により行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記スクリーニングは、イムノアッセイを使用して実施される、請求項１１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つのＶＨＨペプチド単量体を含むＶＨＨペプチド結合剤を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株であって、各々のＶＨＨペプチド単量体は、独立して、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）又はトキシンＢ（ＴｃｄＢ）の固有のエピトープに対して結合特異性を有する、操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項１８】
前記ＶＨＨペプチド結合剤は、２つ、３つ、又は４つの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含む、請求項１７に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項１９】
前記ＶＨＨペプチド結合剤は４つの連結されたＶＨＨペプチド単量体を含み、かつ前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つは、ＴｃｄＡのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記ＶＨＨペプチド単量体のうち２つは、ＴｃｄＢのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項１８に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項２０】
前記ＶＨＨペプチド単量体は、ＶＨＨペプチド単量体５Ｄ（配列番号１）、Ｅ３（配列番号３）、ＡＡ６（配列番号５）及びＡＨ３（配列番号７）、又はその配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するその配列変異体からなる群から選択され、かつ該配列変異体は、ＴｃｄＡ結合特異性及び／又はＴｃｄＢ結合特異性を維持するか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持するか、又はその両方を維持する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項２１】
前記ＶＨＨペプチド単量体は、リンカー−１（配列番号９）、リンカー−２（配列番号１１）及びリンカー−３（配列番号１３）から独立して選択されるリンカーを使用して連結される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項２２】
前記配列変異体の変異アミノ酸は、ＶＨＨペプチド単量体の骨格領域に位置している、請求項２０又は２１に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項２３】
クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡ（ＴｃｄＡ）若しくはトキシンＢ（ＴｃｄＢ）の固有のエピトープ、又は両方に対する結合特異性を有する治療タンパク質を産生する操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項２４】
前記サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである、請求項１〜９及び１７〜２３のいずれかに記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項２５】
前記治療タンパク質は、抗体である、請求項２３又は２４に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項２６】
前記サッカロマイセス属酵母菌株は、（ａ）サッカロマイセス属酵母菌株を、前記治療タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換させること、及び（ｂ）（ａ）の酵母を該治療タンパク質の産生についてスクリーニングすることによって操作されている、請求項２３〜２５のいずれかに記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項２７】
前記サッカロマイセス属酵母菌株は、（ａ）前記治療タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を、該サッカロマイセス属酵母菌株のゲノム中に染色体組込みすること、及び（ｂ）（ａ）の酵母を該治療タンパク質の産生についてスクリーニングすることによって操作されている、請求項２３〜２５のいずれかに記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項２８】
前記スクリーニングは、イムノアッセイを使用して実施される、請求項２６又は２７に記載の操作されたサッカロマイセス属酵母菌株。
【請求項２９】
被験体におけるＣ．ディフィシルによって誘発された疾患症状を治療又は予防するための組成物であって、治療的有効量の請求項１〜９及び１７〜２８のいずれかに記載の操作された酵母菌株を含有し、且つ前記被験体がＣ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う、組成物。
【請求項３０】
Ｃ．ディフィシルに感染した被験体におけるＣ．ディフィシルのトキシンＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢを中和するための組成物であって、治療的有効量の請求項１〜９及び１７〜２８のいずれかに記載の操作された酵母菌株を含有し、且つ前記被験体がＣ．ディフィシル感染症を伴う、組成物。
【請求項３１】
被験体におけるＣ．ディフィシル感染症を治療又は予防するための組成物であって、治療的有効量の請求項１〜９及び１７〜２８のいずれかに記載の操作された酵母菌株を含有し、且つ前記被験体がＣ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う、組成物。
【請求項３２】
Ｃ．ディフィシル感染症を伴う被験体における正常な腸機能を維持するための組成物であって、治療的有効量の請求項１〜９及び１７〜２８のいずれかに記載の操作された酵母菌株を含有し、且つ前記被験体がＣ．ディフィシル感染症又はＣ．ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う、組成物。
【請求項３３】
前記操作された酵母菌株と、医薬品に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬製剤である、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記中和は、部分的又は完全な中和である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３５】
治療的有効量の抗生物質と併用投与される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記治療的有効量の操作された酵母菌株は、被験体の体重１ｋｇ当たり１０μｇから１００ｍｇの間の該操作された酵母菌株である、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記サッカロマイセス属酵母は、Ｓ．セレビシエ又はＳ．ボウラルディである、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記操作された酵母菌株は、被験体へと経口で、鼻内で、又は直腸内で投与される、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
Ｃ．ディフィシルにより誘発された疾患症状は、下痢である、請求項２９に記載の組成物。