(57)【要約】本発明は、大腸菌などの汎用宿主を用いたタンパク質発現系において、プロテアーゼ処理を必要としない活性型の微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）、すなわちトランスグルタミナーゼ活性を有するＭＴＧ変異体、及びその製造方法等を提供する。本発明は、野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼにおけるプロペプチド部分のアミノ酸配列中のアミノ酸を変異させたタンパク質であって、トランスグルタミナーゼ活性を有することを特徴とする、前記タンパク質に係るものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼにおいて少なくともプロペプチド部分のアミノ酸配列中のアミノ酸を変異させたタンパク質であって、トランスグルタミナーゼ活性を有することを特徴とする、前記タンパク質。
【請求項２】
前記変異後のプロペプチド部分を有した状態で前記活性を有するものである、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
前記変異が、他のアミノ酸への置換である、請求項１又は２記載のタンパク質。
【請求項４】
前記変異させる、プロペプチド部分のアミノ酸配列中のアミノ酸が、リジン及び／又は少なくとも１つのチロシンを含むものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記少なくとも１つのチロシンを変異させた他のアミノ酸が、アラニン、グルタミン及びヒスチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
前記リジンを変異させた他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項４記載のタンパク質。
【請求項７】
野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列において第１０番目、第１２番目及び第１６番目からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、又は該置換されたアミノ酸配列のうち前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトランスグルタミナーゼ活性を有することを特徴とする、タンパク質。
【請求項８】
前記第１２番目及び／又は第１６番目のアミノ酸を変異させた他のアミノ酸が、アラニン、グルタミン及びヒスチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項７記載のタンパク質。
【請求項９】
前記第１０番目のアミノ酸を変異させた他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項７記載のタンパク質。
【請求項１０】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１０番目、第１２番目及び第１６番目からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項１１】
前記第１２番目及び／又は第１６番目のアミノ酸を変異させた他のアミノ酸が、アラニン、グルタミン及びヒスチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１０記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記第１０番目のアミノ酸を変異させた他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１０記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記トランスグルタミナーゼ活性は、野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼが有するトランスグルタミナーゼ活性と実質的に同等の活性レベルのものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列において、第２８番目〜第３０番目の塩基がリジン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換されたか、並びに／又は、第３４番目〜第３６番目及び／若しくは第４６番目〜第４８番目の塩基がチロシン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記（ａ）のＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一であり、かつトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項１６】
前記チロシン以外のアミノ酸が、アラニン、グルタミン及びヒスチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１５記載の遺伝子。
【請求項１７】
前記リジン以外のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１５記載の遺伝子。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の遺伝子を含む、組換えベクター。
【請求項１９】
請求項１８記載の組換えベクターを含む、形質転換体。
【請求項２０】
形質転換体が形質転換大腸菌である、請求項１９記載の形質転換体。
【請求項２１】
請求項１９又は２０記載の形質転換体を培養する工程と、得られる培養物からトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程とを含む、当該タンパク質の製造方法。
【請求項２２】
前記採取する工程が、タンパク質の精製工程を含む、請求項２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスグルタミナーゼ活性を有する組換えタンパク質に関する。詳しくは、微生物由来トランスグルタミナーゼのプロペプチド部分のアミノ酸を変異させた、上記組換えタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスグルタミナーゼ（Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ：ＴＧａｓｅ）とは、特定のグルタミン（Ｑ）側鎖のγ−カルボキシアミド基とリジン（Ｋ）側鎖のアミン基をはじめとする一級アミン、または水との間のアシル基転移反応を触媒し、イソペプチド結合を形成する翻訳後修飾酵素である。特にＴＧａｓｅのなかでも、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ由来ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ（ＭＴＧ）は、他のＴＧａｓｅと比べて、触媒活性の発現に補因子を必要とせず、微生物宿主による大量発現が容易、架橋活性（すなわち、上記イソペプチド結合を形成する活性）が高い等、産業上優位な特徴を有していることから、食品業界を中心に産業利用が盛んに行われてきた。一方、最近は、ＭＴＧの製薬分野への応用が試みられるようになり、特に、抗体の部位特異的修飾によるＡｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＡＤＣ）の調製に注目が集まっている（非特許文献１、２参照）。このように、ＭＴＧの適用範囲は拡がりを見せており、その機能改良により更なる応用が期待できる。しかしながら、遺伝子組換えの汎用宿主である大腸菌発現系においては、ＭＴＧの成熟型そのものの発現は困難であり、不溶化することが報告されている（特許文献１）。ＭＴＧにはプロペプチドと呼ばれる部分構造が、成熟型ＭＴＧのＮ末端側に融合した前駆体と呼ばれる構造が存在し、このプロペプチドはＭＴＧの正しい折りたたみを導く分子内シャペロンであり、活性型ＭＴＧを獲得するうえで必要不可欠な存在といえる。従って、プロペプチドを付加した状態においては、大腸菌での発現が可能である（非特許文献３参照）。一方で、プロペプチドを付加した状態で発現したＭＴＧ変異体は、活性部位を覆うプロペプチドの存在により活性を示さない。従って、大腸菌を宿主とした活性型組換え体ＭＴＧの調製は困難とされてきた。また、他の宿主を使った分泌発現系においても、活性型ＭＴＧを得るためには、最終的にプロペプチド部位を適当なプロテアーゼで切断する必要がある（特許文献２）。
先行研究において、上記の課題を解決するべく、大腸菌細胞質内でＭＴＧ前駆体とプロテアーゼを共発現させることで、発現と同時に活性型ＭＴＧの獲得に成功している。また、プロペプチド内のアミノ酸に変異導入し、複数の変異体をスクリーニングすることで、プロテアーゼ処理後にプロペプチドが除去されやすい、より高活性なＭＴＧの探索と発現プロセスの検討が行われている（非特許文献２参照）。
一方、ＭＴＧの改良に関してはＭＴＧ本体を改変するものが多く、プロペプチドそのものを改変することによってＭＴＧの性質を向上させようとする研究は少ない。その中で、プロペプチドそのものを改変した先行研究の一つに、ＭＴＧ前駆体をプロペプチドのＣ末端をリンカーとした融合タンパク質としてみなし、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ由来ＭＴＧに対して、プロペプチドのＣ末端にリンカーペプチドを挿入する事で、ＴＧａｓｅの性質を向上させる新しいアプローチの提案を行っている。このリンカーペプチドはドメイン間（プロペプチドと成熟体）の相互作用の調和を満たす上で必須の役割を担っている。リンカーペプチドとは決まった二次構造を持たず、生物学的条件を満たすためにある程度の柔軟性を持っているペプチドである。リンカーペプチドとしてはポリグリシン、ＧＳ、ＰＴ（ＰＴＰＰＴＴＰＴ）を使用したところ、全ての変異体で比活性は野生型より増加した。特にＧＳ、ＰＴリンカーを挿入したものは高い比活性を示した。一方、リンカーを挿入した変異体においてはｋｃａｔ／Ｋｍの値が増加したことから、酵素の触媒効率が上昇したと考えられる。これは、リンカーペプチドが活性部位近傍に位置し、リンカーペプチドと触媒領域との相互作用により触媒効率が上昇したためと推察されている。このように、プロペプチドに特定の配列を付与することでＭＴＧの活性向上に成功している（非特許文献４参照）。
近年、大腸菌宿主内に、ＭＴＧの組換え体とプロテアーゼを共発現することにより、この問題点をクリアできることが示された（非特許文献２参照）。しかしながら、プロテアーゼを用いる系では、ＭＴＧが部分的な加水分解を受け、失活を招く懸念がある。また、プロテアーゼと切断したプロペプチドを精製により完全に除去しなければ、ＭＴＧの反応効率が低下するため、後の反応に影響を与える懸念がある。何れにせよ、プロテアーゼ処理、その後の精製過程、が必要であり、これにかかるコストの増加などが考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平６−３０７７１号公報
【特許文献２】特開２００５−２２９８０７号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｉｅｇｍｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１５，５４，１−６
【非特許文献２】Ｒｉｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，２０１６，２５，４４２−４５５
【非特許文献３】Ｌ．Ｔ．Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２０１１，２８６，７３０１−７３０７
【非特許文献４】Ｃｈｅｎ  Ｋａｎｇｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１３，４０，３１７−３２５
【発明の概要】
【０００５】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、大腸菌などの汎用宿主を用いたタンパク質発現系において、プロテアーゼ処理を必要としない活性型ＭＴＧ（トランスグルタミナーゼ活性を有するＭＴＧ変異体）、及びその製造方法等を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、ＭＴＧ前駆体の状態、すなわちプロペプチドを有した状態で、トランスグルタミナーゼ活性（架橋活性）を発現する変異体の探索を行った。具体的には、遺伝子工学的にＭＴＧ前駆体が持つプロペプチドに変異を加え、活性部位−プロペプチド間の相互作用を調節することで、プロペプチドを有した状態でも自発的に上記活性を発現するＭＴＧ変異体を見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼにおいて少なくともプロペプチド部分のアミノ酸配列中のアミノ酸を変異させたタンパク質であって、トランスグルタミナーゼ活性を有することを特徴とする、前記タンパク質。
（２）前記変異後のプロペプチド部分を有した状態で前記活性を有するものである、上記（１）記載のタンパク質。
（３）前記変異が、他のアミノ酸への置換である、上記（１）又は（２）記載のタンパク質。
（４）前記変異させる、プロペプチド部分のアミノ酸配列中のアミノ酸が、リジン及び／又は少なくとも１つのチロシンを含むものである、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のタンパク質。
（５）前記少なくとも１つのチロシンを変異させた他のアミノ酸が、アラニン、グルタミン及びヒスチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記（４）記載のタンパク質。
（６）前記リジンを変異させた他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記（４）記載のタンパク質。
（７）野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列において第１０番目、第１２番目及び第１６番目からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、又は該置換されたアミノ酸配列のうち前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトランスグルタミナーゼ活性を有することを特徴とする、タンパク質。
（８）前記第１２番目及び／又は第１６番目のアミノ酸を変異させた他のアミノ酸が、アラニン、グルタミン及びヒスチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記（７）記載のタンパク質。
（９）前記第１０番目のアミノ酸を変異させた他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記（７）記載のタンパク質。
（１０）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１０番目、第１２番目及び第１６番目からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質
（１１）前記第１２番目及び／又は第１６番目のアミノ酸を変異させた他のアミノ酸が、アラニン、グルタミン及びヒスチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記（１０）記載のタンパク質。
（１２）前記第１０番目のアミノ酸を変異させた他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記（１０）記載のタンパク質。
（１３）前記トランスグルタミナーゼ活性は、野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼが有するトランスグルタミナーゼ活性と実質的に同等の活性レベルのものである、上記（１）〜（１２）のいずれか１つに記載のタンパク質。
（１４）上記（１）〜（１３）のいずれか１つに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（１５）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列において、第２８番目〜第３０番目の塩基がリジン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換されたか、並びに／又は、第３４番目〜第３６番目及び／若しくは第４６番目〜第４８番目の塩基がチロシン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記（ａ）のＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一であり、かつトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（１６）前記チロシン以外のアミノ酸が、アラニン、グルタミン及びヒスチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記（１５）記載の遺伝子。
（１７）前記リジン以外のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記（１５）記載の遺伝子。
（１８）上記（１４）〜（１７）のいずれか１つに記載の遺伝子を含む、組換えベクター。
（１９）上記（１８）記載の組換えベクターを含む、形質転換体。
（２０）形質転換体が形質転換大腸菌である、上記（１９）記載の形質転換体。
（２１）上記（１９）又は（２０）記載の形質転換体を培養する工程と、得られる培養物からトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程とを含む、当該タンパク質の製造方法。
（２２）前記採取する工程が、タンパク質の精製工程を含む、上記（２１）記載の方法。
発明の効果
本発明によれば、大腸菌等の微生物を宿主とした発現系においても容易に製造（精製等）することが可能な、ＭＴＧ変異体、すなわちトランスグルタミナーゼ活性を有する活性型ＭＴＧを提供することができる。当該ＭＴＧ変異体であれば、発現精製時のプロテアーゼ処理も不要となり、プロペプチドならびにプロテアーゼの除去にかかる手間とコストを大幅に削減することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ハイドロキサメート法による組換えＭＴＧ酵素活性の測定結果（ｐＨ６．０）を示す図である。
【図２】ハイドロキサメート法による組換えＭＴＧ酵素活性の測定結果（ｐＨ７．４）を示す図である。
【図３】ＦＲＥＴによるＭＴＧ変異体の活性評価の実験模式図である。
【図４】野生型ＭＴＧ前駆体（Ｙ１２  ＭＴＧ）のＦＲＥＴ測定結果を示す図である。（左：蛍光スペクトルの経時変化の様子；右：最大蛍光強度比に基づく架橋反応の進行度）
【図５】Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体のＦＲＥＴ測定結果を示す図である。（左：蛍光スペクトルの経時変化の様子；右：最大蛍光強度比に基づく架橋反応の進行度）
【図６】Ｙ１２Ｑ  ＭＴＧ変異体のＦＲＥＴ測定結果を示す図である。（左：蛍光スペクトルの経時変化の様子；右：最大蛍光強度比に基づく架橋反応の進行度）
【図７】Ｙ１６Ａ  ＭＴＧ変異体のＦＲＥＴ測定結果を示す図である。（左：蛍光スペクトルの経時変化の様子；右：最大蛍光強度比に基づく架橋反応の進行度）
【図８】Ｙ１６Ｑ  ＭＴＧ変異体のＦＲＥＴ測定結果を示す図である。（左：蛍光スペクトルの経時変化の様子；右：最大蛍光強度比に基づく架橋反応の進行度）
【図９】Ｋ１０Ｒ／Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体のＦＲＥＴ測定結果を示す図である。（左：蛍光スペクトルの経時変化の様子；右：最大蛍光強度比に基づく架橋反応の進行度）
【図１０】市販ＭＴＧ（Ｚｅｄｉｒａ社製）のＦＲＥＴ測定結果を示す図である。（左：蛍光スペクトルの経時変化の様子；右：最大蛍光強度比に基づく架橋反応の進行度）
【図１１】市販ＭＴＧ及び各ＭＴＧ変異体の架橋反応の進行度の比較結果を示す図である。
【図１２】Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体のＦＲＥＴ測定結果を示す図である。（左：蛍光スペクトルの経時変化の様子；右：最大蛍光強度比に基づく架橋反応の進行度）
【図１３】Ｋ１０Ｒ／Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体のＦＲＥＴ測定結果を示す図である。（左：蛍光スペクトルの経時変化の様子；右：最大蛍光強度比に基づく架橋反応の進行度）
【図１４】市販ＭＴＧ（Ｚｅｄｉｒａ社製）のＦＲＥＴ測定結果を示す図である。（左：蛍光スペクトルの経時変化の様子；右：最大蛍光強度比に基づく架橋反応の進行度）
【図１５】市販ＭＴＧ及び各ＭＴＧ変異体の架橋反応の進行度の比較結果を示す図である。
【図１６】Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体のＦＲＥＴ測定結果を示す図である。（左：蛍光スペクトルの経時変化の様子；右：最大蛍光強度比に基づく架橋反応の進行度）
【図１７】Ｋ１０Ｒ／Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体のＦＲＥＴ測定結果を示す図である。（左：蛍光スペクトルの経時変化の様子；右：最大蛍光強度比に基づく架橋反応の進行度）
【図１８】市販ＭＴＧのＦＲＥＴ測定結果を示す図である。（左：蛍光スペクトルの経時変化の様子；右：最大蛍光強度比に基づく架橋反応の進行度）
【図１９】市販ＭＴＧ及び各ＭＴＧ変異体の架橋反応の進行度の比較結果を示す図である。
【図２０】ＣＱ−ｔａｇ  ＥＧＦＰ組換体に対する蛍光色素修飾の結果を示す図である。
【図２１】ＮＫ−ｔａｇ  ＥＧＦＰ組換体に対する蛍光色素修飾結果を示す図である。（上段）Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体、Ｙ１２Ｑ  ＭＴＧ変異体；（中段）Ｙ１６Ａ  ＭＴＧ変異体；（下段）Ｋ１０Ｒ／Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体
【図２２】ハイドロキサメート法による組換えＭＴＧ酵素活性の測定結果（ｐＨ６．０）を示す図である。
【図２３】ハイドロキサメート法による組換えＭＴＧ酵素活性の測定結果（ｐＨ６．０）を示す図である。
【図２４】ハイドロキサメート法による組換えＭＴＧ酵素活性の測定結果（ｐＨ６．０）を示す図である。
【図２５】ハイドロキサメート法による組換えＭＴＧ酵素活性の測定結果（ｐＨ６．０）を示す図である。
【図２６】市販ＭＴＧ及び各ＭＴＧ変異体の架橋反応の進行度の比較結果を示す図である。
【図２７】市販ＭＴＧ及び各ＭＴＧ変異体の架橋反応の進行度の比較結果を示す図である。
【図２８】市販ＭＴＧ及び各ＭＴＧ変異体の架橋反応の進行度の比較結果を示す図である。
【図２９】各ＭＴＧ変異体の、Ｋ−ｔａｇ  ＥＧＦＰ組換体（ＥＧＦＰ−ＭＲＨＫＧＳ）に対する蛍光色素修飾結果を示す図である。
【図３０】各ＭＴＧ変異体の、Ｋ−ｔａｇ  ＥＧＦＰ組換体（ＭＫＨＫＧＳ−ＥＧＦＰ）に対する蛍光色素修飾結果を示す図である。
【図３１】各ＭＴＧ変異体の、Ｋ−ｔａｇ  ＥＧＦＰ組換体（ＭＫＨＫＧＳ−ＥＧＦＰ）に対する蛍光色素修飾結果を示す図である。
【図３２】各ＭＴＧ変異体の、Ｋ−ｔａｇ  ＥＧＦＰ組換体（ＥＧＦＰ−ＭＲＨＫＧＳ）に対する蛍光色素修飾結果を示す図である。
【図３３】各ＭＴＧ変異体の、Ｋ−ｔａｇ  ＥＧＦＰ組換体（ＥＧＦＰ−ＭＲＨＫＧＳ）に対する蛍光色素修飾結果を示す図である。
【図３４】各ＭＴＧ変異体の、Ｋ−ｔａｇ  ＥＧＦＰ組換体（ＥＧＦＰ−ＭＲＨＫＧＳ）に対する蛍光色素修飾結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１６−１３１８８３号明細書（２０１６年７月１日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
本明細書において、「ＭＴＧ」とは、前述のとおり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ由来ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅを意味する。また、「ＭＴＧ前駆体」とは、プロペプチド部分を有した状態のＭＴＧを意味し、「ＭＴＧ変異体」とは、ＭＴＧ前駆体におけるアミノ酸を変異（置換等）させたＭＴＧを意味する。
１．タンパク質
本発明のタンパク質は、微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）の変異体タンパク質である。詳しくは、本発明のタンパク質は、野生型のＭＴＧにおいて、少なくとも、そのプロペプチド部分のアミノ酸配列中のアミノ酸を変異させたタンパク質であって、かつトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質であり、好ましくは、前記変異後のプロペプチド部分を有した状態（前記変異後のプロペプチド部分がタンパク質分子中に存在した状態）で前記活性を有するものである。
通常、野生型のＭＴＧにおいては、プロペプチドと呼ばれる部分構造（プロペプチド部分）が、成熟型ＭＴＧのＮ末端側に融合したかたちで存在する。本明細書では、この成熟型ＭＴＧとプロペプチド部分との、いわば融合タンパク質を、ＭＴＧ前駆体という。ＭＴＧにおいてプロペプチド部分は、阻害剤の役目を果たし、適切な箇所でトランスグルタミナーゼ活性（架橋活性）を発現するための役割を有している。なお、この架橋活性とは、翻訳後修飾として、特定のグルタミン（Ｑ）側鎖のγ−カルボキシアミド基とリジン（Ｋ）側鎖のアミン基をはじめとする一級アミン、または水との間のアシル基転移反応を触媒し、イソペプチド結合を形成する活性のことである。また、ＭＴＧにおけるプロペプチド部分は、タンパク質の正しい折りたたみを導く分子内シャペロンであり、活性型ＭＴＧ、すなわち上記架橋活性を有する状態のＭＴＧを獲得する上で、必要不可欠な存在である。ＭＴＧの本来の宿主である放線菌内では、まずＭＴＧ前駆体が発現され、その後宿主が分泌する独自のプロテアーゼによってプロペプチド部分が除去され、成熟型ＭＴＧとなる。しかしながら、遺伝子組換えの汎用宿主である大腸菌発現系においては、成熟型ＭＴＧそのものの発現は困難である（不溶化してしまう）。また、プロペプチド部分を有した状態で発現させたものは、ＭＴＧの活性部位を覆うプロペプチド部分の存在により活性を示さないという問題もある。そのため、大腸菌を宿主とした活性型組換え体の調製は、従来困難とされてきた。他方、近年、大腸菌宿主内に、ＭＴＧの組換え体とプロテアーゼを共発現させることにより、上記問題を解決し得ることが示された。しかしながら、プロテアーゼを用いる系では、ＭＴＧが部分的な加水分解を受け、失活を招く懸念があり、さらに、プロテアーゼと切断したプロペプチドとを精製により完全に除去しなければＭＴＧの反応効率が低下するため、後の反応に影響を与えるという懸念があり、精製にかかるコストも増加するという問題がある。これらに対し、本発明は、上記プロテアーゼ処理なしに活性型ＭＴＧを提供するものであり、従来技術における問題を一挙に解決し得るものである。
本発明のタンパク質は、野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼにおいて少なくともプロペプチド部分のアミノ酸配列中のアミノ酸を変異させたタンパク質であって、トランスグルタミナーゼ活性を有することを特徴とするタンパク質である。好ましくは、前記変異後のプロペプチド部分を有した状態で前記活性を有するものであり、前記変異が、他のアミノ酸への置換であるものが挙げられる。置換されるアミノ酸は、少なくとも１つのチロシンを含むものであることが好ましく、この場合、置換後の他のアミノ酸としては、アラニン、グルタミン及びヒスチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく挙げられる。また、置換されるアミノ酸は、リジンを含むものであることが好ましく、この場合、置換後の他のアミノ酸としては、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン、アラニン、システイン、グルタミン、セリン、スレオニン（トレオニン）、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、チロシン及びヒスチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく挙げられ、より好ましくは、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
本発明のタンパク質としては、例えば、野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列において、第１０番目、第１２番目及び第１６番目からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、又は該置換されたアミノ酸配列のうち前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトランスグルタミナーゼ活性を有することを特徴とするタンパク質が好ましく挙げられる。なお、本明細書において、野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列とは、野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼにおけるシグナルペプチド部分を除いたアミノ酸配列において、そのＮ末端にメチオニン残基（Ｍ）を付加したアミノ酸配列のことを意味するものとする。この点は、後述する配列番号２のアミノ酸配列についても、同様である。また、配列番号１の塩基配列についても、同様に適用される。
ここで、上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、１個〜１０個程度、好ましくは１〜数個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であることが好ましい。当該欠失、置換又は付加等の変異の導入は、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えば、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、及びＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  ｋｉｔ、Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、上記欠失、置換又は付加の変異が導入されているかどうかは、各種アミノ酸配列決定法、並びにＸ線及びＮＭＲ等による構造解析法などを用いて確認することができる。
上記他のアミノ酸としては、第１２番目及び／又は第１６番目のアミノ酸残基に関しては、チロシン以外であれば、特に限定はされないが、例えば、アラニン、グルタミン及びヒスチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種を好ましく挙げることができる。また、第１０番目のアミノ酸残基に関しては、リジン以外であれば、特に限定はされないが、例えば、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン、アラニン、システイン、グルタミン、セリン、スレオニン（トレオニン）、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、チロシン及びヒスチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく挙げられ、より好ましくは、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である。当該第１０番目のアミノ酸を置換することにより、例えば、ＭＴＧの架橋活性は維持しつつ、ＭＴＧ自身の自己架橋物の生成を抑制することができる。
本発明のタンパク質はまた、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることが好ましい。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第１０番目、第１２番目及び第１６番目からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列（前記置換後のアミノ酸配列）において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質
配列番号２に示されるアミノ酸配列は、前述のとおり、野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼにおけるシグナルペプチド部分を除いたアミノ酸配列において、そのＮ末端にメチオニン残基（Ｍ）を付加したアミノ酸配列であり、計３７６個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
上記（ａ）のタンパク質における、「第１０番目、第１２番目及び第１６番目からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列」については、前述した説明が同様に適宜適用できる。
上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質に含まれるアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く、１個又は数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１〜数個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質であればよく、限定はされない。当該欠失、置換又は付加等の変異の導入方法や、変異が導入されているかどうかの確認は、前述と同様である。
また、上記（ａ）のタンパク質と機能的に同等なタンパク質としては、上記（ｂ）のタンパク質の他に、例えば、下記（ｃ）のタンパク質も挙げられる。
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列（前記置換後のアミノ酸配列）に対して、８０％以上の同一性（相同性）を有するアミノ酸配列を含み、かつトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質
当該（ｃ）のタンパク質としては、上記同一性が、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上のものがより好ましい。
上記（ｂ）や（ｃ）のタンパク質（いわゆる変異型のタンパク質）は、該タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子を用いて遺伝子工学的に作製することもできる。
本発明においては、トランスグルタミナーゼ活性は、例えば、後述する実施例に記載の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）による方法等により、評価・測定することができる。
本発明でいう前記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質は、野生型のＭＴＧと同様に、プロペプチド部分が、成熟型ＭＴＧのＮ末端側に融合した（結合した）状態のものであってもよいが、他の態様として、当該プロペプチド部分と、成熟型ＭＴＧのＮ末端側との間に、リンカー配列を有するものも好ましく挙げられる。当該リンカー配列としては、限定はされないが、例えば、１〜３０残基程度のアミノ酸配列であればよく、具体例としては、ＧＧＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＳ（トロンビンリンカー配列；配列番号１０）などが好ましく挙げられる。なお、野生型のＭＴＧのアミノ酸配列（配列番号２）において、Ｎ末端側から第４６番目のアミノ酸（プロリン）までが、プロペプチド部分であり、第４７番目のアミノ酸（アスパラギン酸）からＣ末端側までが、成熟型ＭＴＧのアミノ酸配列である。
本発明でいう前記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質は、天然物由来のペプチドであってもよいし、人工的に化学合成して得られたものであってもよく、限定はされない。
天然物由来のタンパク質は、天然物から公知の回収法及び精製法により直接得てもよいし、又は、公知の遺伝子組換え技術により、当該タンパク質をコードする遺伝子を各種発現ベクター等に組込んで細胞に導入し、発現させた後、公知の回収法及び精製法により得てもよい。あるいは、市販のキット、例えば、試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）及びＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）等を用いた無細胞タンパク質合成系により当該タンパク質を産生し、公知の回収法及び精製法により得てもよく、限定はされない。
また、化学合成タンパク質は、公知のタンパク質合成方法を用いて得ることができる。合成方法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法及び酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のタンパク質合成装置を使用してもよい。合成反応後は、クロマトグラフィー等の公知の精製法を組み合わせてタンパク質を精製することができる。
本発明においては、前記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質とともに、又はそれに代えて、当該タンパク質の誘導体を含むことができる。当該誘導体とは、当該タンパク質に由来して調製され得るものをすべて含む意味であり、例えば、構成アミノ酸の一部が非天然のアミノ酸に置換されたものや、構成アミノ酸（主にその側鎖）の一部に化学修飾が施されたもの等が挙げられる。
また本発明においては、前記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質、及び／又は、当該タンパク質の誘導体とともに、あるいはそれに代えて、当該タンパク質及び／又は当該誘導体の塩を含むことができる。当該塩としては、生理学的に許容される酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
当該塩は、塩酸などの適切な酸、又は水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用いて調製することができる。例えば、水中、又はメタノール、エタノール若しくはジオキサンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、標準的なプロトコルを用いて処理することにより調製することができる。
２．組換え遺伝子
上述した本発明のタンパク質をコードする遺伝子としては、限定はされないが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子が好ましく挙げられる。なお、以下の（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡは、いずれも本発明のタンパク質の構造遺伝子であることが好ましいが、これらＤＮＡを含む遺伝子としては、これらＤＮＡのみからなるものであってもよいし、これらＤＮＡを一部に含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列（転写プロモーター、ＳＤ配列、Ｋｏｚａｋ配列、ターミネーター等）をも含むものであってもよく、限定はされない。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列において、第２８番目〜第３０番目の塩基がリジン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換されたか、並びに／又は、第３４番目〜第３６番目及び／若しくは第４６番目〜第４８番目の塩基がチロシン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記（ａ）のＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一であり、かつトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
本発明において「コドン」とは、転写後のＲＮＡ配列上の３塩基連鎖（トリプレット）に限らず、ＤＮＡ配列上の３塩基連鎖をも意味する。よって、ＤＮＡ配列上のコドンの表記は、ウラシル（Ｕ）の代わりにチミン（Ｔ）を用いて行う。
配列番号１に示される塩基配列は、野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼをコードする１１３１個の塩基からなる塩基配列である。前述したとおり、本願明細書においては、配列番号１の塩基配列は、野生型の微生物由来トランスグルタミナーゼにおけるシグナルペプチド部分を除いたアミノ酸配列において、そのＮ末端にメチオニン残基（Ｍ）を付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列である。
また、上記（ａ）のＤＮＡとしては、前記チロシン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基がアラニン、グルタミン及びヒスチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種のコドンを示す塩基である場合のＤＮＡが好ましく挙げられる。
さらに、上記（ａ）のＤＮＡとしては、前記リジン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン、アラニン、システイン、グルタミン、セリン、スレオニン（トレオニン）、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、チロシン及びヒスチジンからなる群より選ばれる少なくとも１種のコドンを示す塩基が好ましく挙げられ、より好ましくは、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種のコドンを示す塩基である場合のＤＮＡが好ましく挙げられる。。
以上のような変異置換型のＤＮＡは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載の部位特異的変位誘発法に準じて調製することができる。具体的には、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができ、当該キットとしては、例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。
また、所望のアミノ酸のコドンを示す塩基となるようにミスセンス変異が導入されるように設計したＰＣＲプライマーを用い、野生型ＭＴＧをコードする塩基配列を含むＤＮＡ等をテンプレートとして、適当な条件下でＰＣＲを行うことにより調製することもできる。ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、限定はされないが、正確性の高いＤＮＡポリメラーゼであることが好ましく、例えば、Ｐｗｏ  ＤＮＡ（ポリメラーゼロシュ・ダイアグノスティックス）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ）、プラチナＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ（東洋紡）等が好ましい。ＰＣＲの反応条件は、用いるＤＮＡポリメラーゼの最適温度、合成するＤＮＡの長さや種類等により適宜設定すればよいが、例えば、サイクル条件であれば「９０〜９８℃で５〜３０秒（熱変性・解離）→５０〜６５℃で５〜３０秒（アニーリング）→６５〜８０℃で３０〜１２００秒（合成・伸長）」を１サイクルとして合計２０〜２００サイクル行う条件が好ましい。
上記（ｂ）のＤＮＡは、上記（ａ）のＤＮＡ若しくはそれと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、又はこれらを断片化したものをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、及びサザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法を実施し、ｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用してもよいし、市販のｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーを利用してもよく、限定はされない。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等を適宜参照することができる。
ハイブリダイゼーション法を実施における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって、バッファーの塩濃度が１５〜３３０ｍＭ、温度が２５〜６５℃、好ましくは塩濃度が１５〜１５０ｍＭ、温度が４５〜５５℃の条件を意味する。具体的には、例えば８０ｍＭで５０℃等の条件を挙げることができる。さらに、このような塩濃度や温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件も考慮し、上記（ｂ）のＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
ハイブリダイズするＤＮＡとしては、上記（ａ）のＤＮＡの塩基配列に対して少なくとも４０％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは６０％、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する塩基配列が挙げられる。
また、上記（ｂ）のＤＮＡは、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一である。
ここでいう「置換部位」とは、上記（ａ）のＤＮＡに含まれる塩基配列においてなされた塩基置換の部位であり、詳しくは、当該塩基置換により生じた変更後のコドンを示す塩基（トリプレット）の部位を意味する。
また「前記置換部位の塩基に対応する塩基」の「対応する塩基」とは、上記（ｂ）のＤＮＡが上記（ａ）のＤＮＡに対する相補鎖とハイブリダイズした場合に、このハイブリッドにおいて、前記置換部位の塩基に対する相補塩基（トリプレット）と、位置的に対向する関係にある塩基（トリプレット）を意味する。
上記（ｂ）のＤＮＡとしては、例えば、上記（ａ）のＤＮＡと比較して、塩基配列については完全に同一ではないが、翻訳された後のアミノ酸配列については完全に同一となるような塩基配列からなるＤＮＡ（すなわち上記（ａ）のＤＮＡにサイレント変異が施されたＤＮＡ）が、特に好ましい。
本発明のタンパク質をコードする遺伝子としては、翻訳後の個々のアミノ酸に対応するコドンは、特に限定はされないので、転写後、ヒト等の哺乳類において一般的に用いられているコドン（好ましくは使用頻度の高いコドン）を示すＤＮＡを含むものであってもよいし、また、大腸菌や酵母等の微生物や、植物等において一般的に用いられているコドン（好ましくは使用頻度の高いコドン）を示すＤＮＡを含むものであってもよい。
また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子としては、当該タンパク質が前述したリンカー配列を含むものである場合は、そのリンカー配列のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むものであってもよい。
３．組換えベクター及び形質転換体
本発明のタンパク質を発現させるためには、まず、上述した本発明の遺伝子を発現ベクターに組込んで組換えベクターを構築することが必要である。この際、発現ベクターに組込む遺伝子には、必要に応じて、予め、上流に転写プロモーター、ＳＤ配列（宿主が原核細胞の場合）及びＫｏｚａｋ配列（宿主が真核細胞の場合）を連結しておいてもよいし、下流にターミネーターを連結しておいてもよく、その他、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー等を連結しておくこともできる。なお、上記転写プロモーター等の遺伝子発現に必要な各要素は、初めから当該遺伝子に含まれていてもよいし、もともと発現ベクターに含まれている場合はそれを利用してもよく、各要素の使用態様は特に限定されない。
発現ベクターに当該遺伝子を組込む方法としては、例えば、制限酵素を用いる方法や、トポイソメラーゼを用いる方法など、公知の遺伝子組換え技術を利用した各種方法が採用できる。また、発現ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、レトロウイルスベクター、人工染色体ＤＮＡなど、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を保持し得るものであれば、限定はされず、使用する宿主細胞に適したベクターを適宜選択して使用することができる。
次いで、構築した上記組換えベクターを宿主に導入して形質転換体を得、これを培養することにより、本発明のタンパク質を発現させることができる。なお、本発明で言う「形質転換体」とは宿主に外来遺伝子が導入されたものを意味し、例えば、宿主にプラスミドＤＮＡ等を導入すること（形質転換）で外来遺伝子が導入されたもの、並びに、宿主に各種ウイルス及びファージを感染させること（形質導入）で外来遺伝子が導入されたものが含まれる。
宿主としては、上記組換えベクターが導入された後、本発明のタンパク質を発現し得るものであれば、限定はされず、適宜選択することができるが、例えば、ヒトやマウス等の各種動物細胞、各種植物細胞、細菌、酵母、植物細胞等の公知の宿主が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、例えば、ヒト繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。また、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等の昆虫細胞を用いることもできる。
細菌を宿主とする場合、例えば、大腸菌、枯草菌等が用いられる。
酵母を宿主とする場合は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等が用いられる。
植物細胞を宿主とする場合は、例えば、タバコＢＹ−２細胞等が用いられる。
形質転換体を得る方法は、限定はされず、宿主と発現ベクターとの種類の組み合わせを考慮し、適宜選択することができるが、例えば、電気穿孔法、リポフェクション法、ヒートショック法、ＰＥＧ法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、並びに、ＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等の各種ウイルスを感染させる方法などが好ましく挙げられる。
得られる形質転換体においては、組換えベクターに含まれる遺伝子のコドン型は、実際に用いた宿主のコドン型と一致していてもよいし、異なっていてもよく、限定はされない。
４．タンパク質の製法
本発明のタンパク質の製造は、具体的には、前述した形質転換体を培養する工程と、得られる培養物からトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程とを含む方法により実施することができる。ここで、「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。上記形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。目的のタンパク質は、上記培養物中に蓄積される。本発明においては、前記採取する工程は、タンパク質の精製工程を含んでいてもよい。
上記培養に用いる培地としては、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、公知の各種天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。
培養中は、形質転換体に含まれる組換えベクターの脱落及び目的タンパク質をコードする遺伝子の脱落を防ぐために、選択圧をかけた状態で培養してもよい。すなわち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合には、相当する薬剤を培地に添加することができ、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合には、相当する栄養因子を培地から除くことができる。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体等を培養する場合は、必要に応じて、好適なインデューサー（例えば、ＩＰＴＧ等）を培地に添加してもよい。
形質転換体の培養条件は、目的タンパク質の生産性及び宿主の生育が妨げられない条件であれば特に限定はされず、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３７℃で５〜１００時間行う。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられる。
培養後、目的タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより目的タンパク質を採取することができる。菌体又は細胞の破砕方法としては、フレンチプレス又はホモジナイザーによる高圧処理、超音波処理、ガラスビーズ等による磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ又はペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。破砕後、必要に応じて菌体又は細胞の破砕残渣（細胞抽出液不溶性画分を含む）を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。残渣を除去した後に得られた上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製したタンパク質溶液とすることができる。
また、目的のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合は、菌体や細胞そのものを遠心分離、膜分離等で回収して、未破砕のまま使用することも可能である。
一方、目的のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により菌体又は細胞を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により、培養物中から目的タンパク質を採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することもできる。
形質転換体等を培養して得られたタンパク質の生産収率は、例えば、培養液あたり、菌体湿重量又は乾燥重量あたり、粗酵素液タンパク質あたりなどの単位で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）等により確認することができる。
また、目的タンパク質の製造は、上述したような形質転換体を用いたタンパク質合成系のほか、生細胞を全く使用しない無細胞タンパク質合成系を用いて行うこともできる。
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管等の人工容器内で目的タンパク質を合成する系である。また、使用し得る無細胞タンパク質合成系としては、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系も含まれる。
この場合、使用する細胞抽出液の由来は、前述の宿主細胞であることが好ましい。細胞抽出液としては、例えば真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、より具体的には、ＣＨＯ細胞、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、ＨｅＬａ細胞、小麦胚芽、出芽酵母、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は、濃縮又は希釈して用いてもよいし、そのままでもよく、限定はされない。
細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿等によって得ることができる。
このような無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。例えば、試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）、ＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）等が挙げられる。
無細胞タンパク質合成によって産生された目的のタンパク質は、前述したようにクロマトグラフィー等の手段を適宜選択して、精製することができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００８】
ＭＴＧ変異体の調製
以下に示す各アミノ酸配列からなるＭＴＧ変異体（詳しくは、ＭＴＧ前駆体の変異体）をコードするＤＮＡを、ｐＥＴ２２ｂ＋のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ間に挿入し、組換え発現プラスミドベクターを構築した。なお、下記の各ＭＴＧ変異体のアミノ酸配列中、下線を付したアミノ酸は、置換変異したアミノ酸である。
ＭＴＧ変異体（Ｙ１２Ａ）のアミノ酸配列
2018004014.tif 000002
ＭＴＧ変異体（Ｙ１２Ｑ）のアミノ酸配列
2018004014.tif 000003
ＭＴＧ変異体（Ｙ１６Ａ）のアミノ酸配列
2018004014.tif 000004
2018004014.tif 000005
ＭＴＧ変異体（Ｙ１６Ｑ）のアミノ酸配列
2018004014.tif 000006
ＭＴＧ変異体（Ｋ１０Ｒ／Ｙ１２Ａ）のアミノ酸配列
2018004014.tif 000007
得られた組換え発現プラスミドベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に対してヒートショック法を用いて形質転換し、アンピシリンナトリウムを１００μｇ／ｍＬで含むＬＢ寒天培地に植菌、３７℃で一晩静置することでコロニーを得た。得られた大腸菌コロニーを、ＬＢ培地（アンピシリンナトリウム１００μｇ／ｍＬ含）、１０ｍＬに植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで４時間培養した。５００ｍＬのＬＢ培地に植え継ぎ、３７℃、１２０ｒｐｍで培養を行い、ＯＤ６００＝０．６に達した時点で、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを終濃度０．５ｍＭで添加し、培養温度を１５℃に下げ、さらに１６時間培養を継続した。菌体を６０００ｇ、７分の遠心分離で回収した。１×ＴＢＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、上清を全て捨て、ペレット状になった菌体を−８０℃で凍結保存した。凍結保存したペレットを１×ＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ  １５ｍＬに溶解させ、超音波処理（Ｏｕｔｐｕｔ  ４，Ｄｕｔｙ  ２０，１２．５ｍｉｎ）により菌体を破砕し、遠心分離（４℃，１８，０００×ｇ，２０ｍｉｎ）によって菌体と含タンパク質溶液とを分離した。得られた溶液を０．４５μｍ及び０．２２μｍＰＶＤＦメンブレンフィルターで濾過し不溶性画分および菌体を除去した。得られた溶液に対してＨｉｓＴｒａｐ  Ｅｘｃｅｌカラム（１ｍＬ）を用いて、Ｙ１６Ａ  ＭＴＧのＣ末端に導入されたヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ  Ｔａｇ）による精製を行った。タンパク質中の芳香族アミノ酸（チロシン・トリプトファン）の吸光度に由来する２８０ｎｍの吸収が確認されたフラクションを回収し、ＰＤ−１０カラムによって脱塩を行った。次に、ＨｉＴｒａｐ  Ｑカラム（１ｍＬ）によって陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行った。先程と同様に、２８０ｎｍの吸収が確認されたフラクションを回収し、ＰＤ−１０カラムによって１×ＰＢＳによるバッファー交換を行った。以下に各カラムでの精製条件を示す。
・ＨｉｓＴｒａｐ  Ｅｘｃｅｌ（１ｍＬ）
Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．４）
Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｐＨ７．４）
【表１】
2018004014.tif 000008
・ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（１ｍＬ）
Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）
Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ）
【表２】
2018004014.tif 000009
【実施例２】
【０００９】
ハイドロキサメート法（Ｊ．Ｅ．Ｆｏｌｋ  ＆  Ｐ．Ｗ．Ｃｏｌｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９６６，２４１，５５１８−５５２５）による組換えＭＴＧ前駆体の活性評価
１．Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（Ｚ−ＱＧ）、塩化ヒドロキシルアンモニウム、ならびに還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を混合した溶液（基質溶液）、トリクロロ酢酸と塩化鉄６水和物に濃塩酸を加えた溶液（反応停止液）、検量線としてＬ−グルタミン酸γ−モノヒドロキシアミン塩の希釈系列、および各ＭＴＧの希釈系列を作製した。
２．９６穴プレートにブランクである０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）、検量線希釈系列、各ＭＴＧ希釈系列を２０μＬずつそれぞれ添加した。
３．基質溶液８０μＬを各ｗｅｌｌに添加し、３７℃、１０ｍｉｎインキュベートした。
４．反応停止液を１００μＬ添加し、速やかにプレートリーダーにて５２５ｎｍの吸収を測定した。
５．検量線から、各ＭＴＧ条件で生成したヒドロキサム酸量を測定し、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。ここで、１分間に１μｍｏｌのハイドロキサメートを生成させる酵素量をＴＧａｓｅの活性単位、１Ｕ（ｕｎｉｔ）と定義した。ここで、各試薬の反応時における最終濃度は以下の通りである。［Ｚ−ＱＧ］＝３０ｍＭ、［塩化ヒドロキシルアンモニウム］＝０．１Ｍ、［ＧＳＨ］＝１０ｍＭ  ｉｎ  ０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ６．０）ｏｒ０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）。
2018004014.tif 000010
ｐＨ６．０（図１）ならびにｐＨ７４（図２）の条件における酵素活性測定結果を以下に示す。これらの結果からｐＨ６．０ではＹ１２Ａ  ＭＴＧ、Ｙ１２Ｑ  ＭＴＧは活性を示さなかったが、ｐＨ７．４ではＹ１２Ａ  ＭＴＧはわずかながら活性を示した。また、Ｙ１２Ｑ  ＭＴＧに関しても若干の活性の向上が見られた。しかしながら、市販ＭＴＧに比べると、ハイドロキサメート法における酵素活性は著しく低い。この結果より、Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ前駆体ならびにＹ１２Ｑ  ＭＴＧ前駆体は、Ｚ−ＱＧとヒドロキシルアミンのいずれか、または両方を基質として認識していないと考えられ、ＭＴＧと基質のアクセスが大幅に低減していることが強く示唆された。
【実施例３】
【００１０】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）による組換えＭＴＧ変異体の活性評価
Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−ＱＧ（２００μＭ）、ＣＲＫ−ｔａｇ  ＥＧＦＰ組換体（Ｃ末端にＭＲＨＫＧＳ（配列番号８）配列を持つ）（１０μＭ）ならびに各種組換えＭＴＧ変異体（１μＭ）を５０μＬの体積で３７℃条件下で混合した。経時的にサンプル溶液から５μＬ分取し、４９５μＬの１ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド溶液（ｉｎ  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））と混合し、架橋反応を停止させ、蛍光光度計（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＬＳ  ５５）で蛍光スペクトルを測定した（励起光波長：４６０ｎｍ、蛍光スペクトル測定範囲：４８０〜６８０ｎｍ）。
＜酵素反応条件＞
Ｌｙｓペプチド基質融合タンパク質：ＣＲＫ−ＥＧＦＰ（Ｃ末端ＭＲＨＫＧＳ）  １０μＭ
小分子Ｇｌｎ基質：ＴｅｘａｓＲｅｄ−ＱＧ  ２００μＭ
ＭＴＧ  １μＭ
蛍光スペクトル測定条件
励起波長  ４６０ｎｍ
測定波長  ４８０〜６８０ｎｍ
ＦＲＥＴによるＭＴＧ変異体の活性評価の実験模式図を、図３に示す。
図４〜１１に、ＦＲＥＴによる分析結果ならびに、ＥＧＦＰの極大蛍光強度とＴｅｘａｓ  Ｒｅｄの極大蛍光強度の比（Ｉ６１０／Ｉ５０８）に基づくＭＴＧの架橋反応進行度の経時変化を示す。
以上の結果より、Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体と市販ＭＴＧでは最終的に同程度の反応率に達していることから、Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体は市販ＭＴＧと同等の反応性を示すことが明らかとなった。しかしながら、ＦＲＥＴとハイドロキサメートの結果では活性の差が大きく異なることから、Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体の基質認識能の差が反映された結果と言える。また、野生型ＭＴＧ前駆体（Ｙ１２）よりも著しく活性が高いことが示された。
以上の結果から、Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体はプロペプチドを切断せずとも、架橋活性を発現する変異体であることが示された。同時に、市販ＭＴＧよりも初期活性が若干低いことが示された。
【実施例４】
【００１１】
（１）小分子１級アミン基質−小分子Ｇｌｎ基質間の反応
下記酵素反応条件に基づき、蛍光小分子基質を用いてＹ１２Ａ  ＭＴＧ変異体の架橋活性を評価した。その結果を図１１〜１３に示す。
＜酵素反応条件＞
小分子１級アミン基質：ＦＩＴＣ−ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ  １０μＭ
小分子Ｇｌｎ基質：ＴｅｘａｓＲｅｄ−ＱＧ  ２００μＭ
ＭＴＧ  １μＭ
蛍光スペクトル測定条件
励起波長  ４６０ｎｍ
測定波長  ４８０〜６８０ｎｍ
図１１〜１３の結果より、市販ＭＴＧに比べるとＹ１２Ａ  ＭＴＧ変異体はほとんど活性を示さないことが明らかとなり、図２のハイドロキサメート法による組換えＭＴＧ酵素活性測定結果を支持するものとなった。また、Ｋ１０Ｒ／Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体（二重変異体）は、Ｙ１２Ａ変異体に比べると僅かに高い活性を有することが示唆されたが、市販酵素に比べるとその活性は低いものであった。
（２）６アミノ酸Ｌｙｓペプチド基質−小分子Ｇｌｎ基質間の反応
下記酵素反応条件に基づき、蛍光小分子基質を用いてＹ１２Ａ  ＭＴＧ変異体の架橋活性を評価した。その結果を図１４〜１６に示す。
＜酵素反応条件＞
Ｌｙｓペプチド基質：ＦＡＭ−ＭＲＨＫＧＳ（配列番号８）  １０μＭ
小分子Ｇｌｎ基質：ＴｅｘａｓＲｅｄ−ＱＧ  ２００μＭ
ＭＴＧ  １μＭ
蛍光スペクトル測定条件
励起波長  ４８０ｎｍ
測定波長  ４９５〜６８０ｎｍ
図１４〜１６の結果より、Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体は、市販ＭＴＧに比べやや初期活性は劣るものの、酵素反応が平衡に達した時点での架橋効率はほぼ同等であることが示唆された。また、Ｋ１０Ｒ／Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体（二重変異体）は、Ｙ１２Ａ変異体と類似の触媒挙動を示した。
また、上記（１）の結果との比較から、Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体およびＫ１０Ｒ／Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体（二重変異体）は、ペプチド性Ｌｙｓ基質を用いると、小分子Ｇｌｎ基質に対しても十分な架橋活性を発現することが示された。
一方、図１１と図１９の横軸の比較から、同一の小分子Ｇｌｎ基質（ＴｅｘａｓＲｅｄ−ＱＧ）に対して、同一のＬｙｓペプチド基質配列（ＭＲＨＫＧＳ（配列番号８））を反応させているにも関わらず、タンパク質に付加配列として融合されたタンパク質性基質（ＣＲＫ−ＥＧＦＰ）の場合の方が、より早く反応することが示唆された。
（３）まとめ
以上の結果から、ＭＴＧの活性部位を覆うプロペプチド配列部に適当な変異（Ｙ１２Ｘ，Ｘ＝Ａ  ｏｒ  Ｑ；Ｙ１６Ｘ，Ｘ＝Ａ  ｏｒ  Ｑ；Ｋ１０Ｒ／Ｙ１２Ａ）を導入し、且つ、反応性の高いペプチド性の基質を利用することで、プロペプチドを有するＭＴＧ変異体においても触媒活性が発現することが明らかとなった。
【実施例５】
【００１２】
ＭＴＧ反応性ペプチドタグ付加タンパク質への蛍光色素修飾実験
ＣＱ−ｔａｇ  ＥＧＦＰ組換体（ＬＬＱＧ配列をＣ末端に持つ）、蛍光色素ＦＩＴＣ−ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ、ならびにＹ１２Ａ  ＭＴＧ変異体またはＹ１２Ｑ  ＭＴＧ変異体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で混合し、３７℃、１時間反応させた。また、ＮＫ−ｔａｇ  ＥＧＦＰ組換体（ＭＫＨＫＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号９）配列をＮ末端に持つ）、蛍光色素ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ならびにＹ１２Ａ  ＭＴＧ変異体またはＹ１２Ｑ  ＭＴＧ変異体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で混合し、３７℃、１時間反応させた。最後に、ＮＫ−ｔａｇ  ＥＧＦＰ組換体（ＭＫＨＫＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号９）配列をＮ末端に持つ）、蛍光色素ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ならびにＹ１６Ａ  ＭＴＧ変異体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で混合し、３７℃、１時間反応させた。
反応後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、蛍光イメージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ  Ｐｒｏ）によるタンパク質にラベルされたＦＩＴＣ由来の蛍光イメージを取得した。また、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）によるタンパク質の染色を行った。ここで、基質ペプチドタグを付加したＥＧＦＰ、蛍光色素ならびに各種ＭＴＧの濃度は、それぞれ１μＭ、２０μＭ、ならびに１μＭと設定した。結果を図１７、１８に示す。
図２０及び２１の結果より、
・小分子１級アミン基質―Ｇｌｎ基質ペプチド付加タンパク質間（図１７）
・Ｌｙｓ基質ペプチド付加タンパク質―小分子Ｇｌｎ基質（図１８）
の何れの場合においても、ＥＧＦＰ組換体の分子量付近に蛍光バンドが見られたことから、タンパク質に付加した基質ペプチド配列と小分子基質との間での架橋反応が進行することが明らかとなり、何れのＭＴＧプロ配列変異体も架橋活性を有することが示された。
また、図２０のＹ１２Ｑ  ＭＴＧ変異体のレーンにおいて、ＭＴＧ変異体に該当する箇所に薄いながらも蛍光バンドが確認され、Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体のレーンにおいてはそれが確認されなかったことから、変異を導入したＧｌｎ残基に１級アミン基質がラベルされていることが示唆された。
一方、図２１のＹ１２Ａ、Ｙ１２Ｑ、Ｙ１６ＡのいずれのＭＴＧ変異体のレーンにおいても、ＭＴＧ変異体に該当する箇所に蛍光バンドが確認された。市販ＭＴＧでは蛍光が確認されなかったことから、これらの変異体のプロペプチド配列中のＬｙｓ残基（Ｋ１０）に、小分子Ｇｌｎ基質（ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ）がラベルされていることが示唆された。このＫ１０をＡｒｇ残基に置換したＫ１０Ｒ／Ｙ１２Ａ  ＭＴＧ変異体（二重変異体）においては、ＭＴＧ自身のラベル産物は確認されなかった。
【実施例６】
【００１３】
下記の表３に示す各種ＭＴＧ変異体（詳しくは、ＭＴＧ前駆体の変異体）をコードするＤＮＡを作製し、実施例１と同様の方法を用いて、組換え発現プラスミドベクターの構築、タンパク質の発現及び精製を行い、各種ＭＴＧ変異体タンパク質を得た。各種ＭＴＧ変異体をコードするＤＮＡは、表３中の「変異導入位置」欄に示した変異態様であるＮｏ．２〜２１のＭＴＧ変異体をコードするＤＮＡである。詳しくは、実施例１において構築したＭＴＧ変異体をコードするＤＮＡと同様に、野生型のＭＴＧのアミノ酸配列（配列番号２）のＣ末端に「ＧＳＨＨＨＨＨＨ」（配列番号１１）のペプチドを付加したアミノ酸配列（表３中のＮｏ．１の野生型（ＷＴ）ＭＴＧのアミノ酸配列）をベースとし、当該アミノ酸配列のプロペプチド部分に表３中のＮｏ．２〜２１のアミノ酸置換変異を導入したり、リンカー配列（トロンビンリンカー配列：配列番号１０）の挿入をしたＭＴＧ変異体をコードするＤＮＡである。なお、表３中のＮｏ．９のＭＴＧ変異体（Ｋ１０Ｘ（Ｘ≠Ｋ，Ｒ）／Ｙ１２Ａ／ＴＬ）については、第１０番目のＫに関しては、Ｋ及びＲ以外の各種アミノ酸（すなわち、Ｘ（Ｘ≠Ｋ，Ｒ））に置換されたものである（図２４、２７、２８、３１参照）。
【表３】
2018004014.tif 000011
得られた野生型ＭＴＧ（Ｎｏ．１）及び各種ＭＴＧ変異体（Ｎｏ．２〜２１）について、１）小分子基質を用いたハイドロキサメート法、及び
２）ペプチド（タンパク質）基質を用いた方法としての、２−１）ペプチド架橋ＦＲＥＴ、２−２）タンパク質ラベル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
の各分析手法により、トランスグルタミナーゼ活性を測定・評価した。その結果を下記の表４にまとめて示した。なお、表４中の各評価結果（＋、−など）には、当該評価のベースとなる図面番号（図２２〜図３４）も併記した。
【表４】
2018004014.tif 000012
詳しくは、１）小分子基質を用いたハイドロキサメート法については、前述した実施例２の方法において、ｐＨ６．０とｐＨ７．０の条件のうちｐＨ６．０の条件でのみ行った以外は、当該方法と同様にして、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。その結果を、図２２〜２５に示した。
また、２）ペプチド（タンパク質）基質を用いた方法については、以下のとおりである。
２−１）ペプチド架橋ＦＲＥＴの方法では、前述した実施例３の方法と同様にして、酵素活性を評価した。その結果を、図２６〜２８に示した。ただし、図２７、２８に結果を示したＭＴＧ変異体については、使用濃度を１μＭではなく０．１μＭとして実施した。
２−２）タンパク質ラベル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の方法では、Ｋ−ｔａｇ  ＥＧＦＰ組換体（ＭＫＨＫＧＳ（配列番号１２）配列をＮ末端に持つアミノ酸配列からなるものであり、ＭＫＨＫＧＳ−ＥＧＦＰ（配列番号１４）とも称する）、蛍光色素ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ならびに各種ＭＴＧ変異体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で混合し、３７℃、１時間反応させた。反応後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、蛍光イメージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ  Ｐｒｏ）によるタンパク質にラベルされたＦＩＴＣ由来の蛍光イメージを取得した。また、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）によるタンパク質の染色を行った。ここで、基質ペプチドタグを付加したＥＧＦＰ、蛍光色素ならびに各種ＭＴＧの濃度は、それぞれ１μＭ、２０μＭ、ならびに１μＭと設定した。その結果を図３０、３１に示した。
また、上記とは異なるＫ−ｔａｇ  ＥＧＦＰ組換体（ＭＲＨＫＧＳ（配列番号１３）配列をＣ末端に持つアミノ酸配列からなるものであり、ＥＧＦＰ−ＭＲＨＫＧＳ（配列番号１５）とも称する）、蛍光色素ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、ならびに各種ＭＴＧ変異体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で混合し、３７℃、１時間反応させた。反応後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、蛍光イメージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ  Ｐｒｏ）によるタンパク質にラベルされたＦＩＴＣ由来の蛍光イメージを取得した。また、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）によるタンパク質の染色を行った。ここで、基質ペプチドタグを付加したＥＧＦＰ、蛍光色素ならびに各種ＭＴＧの濃度は、それぞれ１μＭ、２０μＭ、ならびに１μＭと設定した。その結果を図２９及び３２〜３４に示した。
2018004014.tif 000013
＜本実施例の考察＞
本実施例を総括したものが表４である。
まず、図２２、２３より、ハイドロキサメート法によるＭＴＧ活性測定において、Ｙ１２Ａ，Ｙ１２Ｑ，Ｙ１６Ａ，Ｙ１６Ｑ変異体においては、活性を示さないが、Ｙ１２，Ｙ１６の両方をＡに変異させたダブルミュータントに関しては、有意な活性向上が観察された。続いて、図２４において、Ｙ１２をＡに固定し、Ｋ１０を各種アミノ酸に置換したダブルミュータントに関しては、Ｄ，Ｅなどの酸性アミノ酸に置換した変異体において有意な活性向上が見られた。次に、図２５より、Ｙ１２Ｈ、Ｙ１６Ｈのシングルあるいはダブルミュータントにおいて、Ｙ１２Ｈの変異を有するＭＴＧ変異体において、有意な活性向上が見られ、さらにＹ１２Ｈ／Ｙ１６Ｈのダブルミュータントにおいては更なる活性向上が観察された。また、Ｙ１２Ａ変異を持たない、Ｋ１０ＤあるいはＫ１０Ｅ変異体においては有意な活性は見られなかった。
次に、図２６において、トロンビンリンカー配列のみを有するＷＴ／ＴＬは活性を示さないのに対して、Ｙ１２またはＹ１６にＡやＱの変異を導入した、シングルまたはダブルミュータントは、顕著な活性向上を示した。各変異体の活性の差異を見積もるため、ＭＴＧ濃度を１０分の１にして、同様の検討をおこなった。図２７、２８より、各Ｋ１０Ｘ／Ｙ１２Ａ／ＴＬ変異体において、Ｘ＝Ｄ＞Ｅ，Ｇ＞Ｋ（Ｙ１２Ａ／ＴＬ）＞Ａ，Ｃ，Ｎ＞Ｍ＞Ｈの順に高い架橋活性を示した。
最後に、図２９より、トロンビンリンカーの挿入により、僅かに活性が発現することが示された。さらに、図３０、３１から、Ｙ１２あるいはＹ１６に変異を導入したＭＴＧ変異体は、有意な活性向上を示した。さらに図３２、３３より、Ｋ１０Ｒ／Ｙ１２ＨあるいはＫ１０Ｒ／Ｙ１２Ｈ／Ｙ１６Ｈの変異を有するＭＴＧ変異体は、ｐＨ応答性を示し、ｐＨ６．０において、ｐＨ７．４よりも有意に高い活性を示した。最後に、図３４において、Ｙ１２あるいはＹ１６に変異を持たず、Ｋ１０ＤあるいはＫ１０Ｅの変異を持つシングルミュータントに関して、活性の発現が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００１４】
本発明によれば、大腸菌等の微生物を宿主とした発現系においても容易に製造（精製等）することが可能な、ＭＴＧ変異体、すなわちトランスグルタミナーゼ活性を有する活性型ＭＴＧを提供することができる。当該ＭＴＧ変異体であれば、発現精製時のプロテアーゼ処理も不要となり、プロペプチドならびにプロテアーゼの除去にかかる手間とコストを大幅に削減することができる。
さらに、本発明に係るＭＴＧ変異体は、反応性の低い小分子基質に対して架橋活性を示さないものであり、ＭＴＧをタンパク質の部位特異的修飾に用いる上で問題となりうる非特異的な架橋反応を防ぎ得るものである。すなわち、本発明に係るＭＴＧ変異体は、変異の導入されたプロペプチドよりも高い親和性を有するペプチド性基質を用いたときのみ、当該プロペプチドを有するＭＴＧ変異体によって基質認識をし、特定のペプチド配列選択的な架橋反応を行い得るものである。また、本発明に係るＭＴＧ変異体は、宿主内での対象タンパク質基質の部位特異的修飾にも用い得るものである。
【配列表フリーテキスト】
【００１５】
配列番号３：組換えタンパク質
配列番号４：組換えタンパク質
配列番号５：組換えタンパク質
配列番号６：組換えタンパク質
配列番号７：組換えタンパク質
配列番号８：ペプチド
配列番号９：ペプチド
配列番号１０：ペプチド
配列番号１１：ペプチド
配列番号１２：ペプチド
配列番号１３：ペプチド
配列番号１４：組換えタンパク質
配列番号１５：組換えタンパク質
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【国際調査報告】
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