(57)【要約】  高い特異性・親和性を有する新たな抗Ｂ７−Ｈ４抗体を作製し、それを利用したがん治療用組成物を提供することを課題とし、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質の細胞外ドメインタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を新たに作製し、さらに、該モノクローナル抗体の抗体依存性細胞傷害活性を増強するために、該モノクローナル抗体とエフェクター細胞とを結合させた「抗Ｂ７−Ｈ４抗体−エフェクター細胞複合体」や、該モノクローナル抗体の抗原認識領域とエフェクター細胞抗原認識領域とを含む二重特異性抗体を作製し、がん治療用組成物として使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかの領域を含む、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質の細胞外ドメインを認識する抗体。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列又は配列番号４の第３番目〜第１１１番目に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号６の第４番目〜第１０４番目に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１６又は１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｆ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｇ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【請求項２】
以下の（Ａ’）〜（Ｇ’）のいずれかの核酸配列を含む、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質の細胞外ドメインを認識する抗体をコードする核酸。
（Ａ’）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする核酸配列；（Ｂ’）配列番号４に示されるアミノ酸配列又は配列番号４の第３番目〜第１１１番目に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号６の第４番目〜第１０４番目に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；
（Ｃ’）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；
（Ｄ’）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１６又は１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；
（Ｅ’）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；
（Ｆ’）配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；
（Ｇ’）配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；
【請求項３】
以下の（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかの核酸配列を含む、請求項２記載の核酸。
（Ａ）配列番号１に示される核酸配列；
（Ｂ）配列番号３に示される核酸配列又は配列番号３８の第６４番目〜第３９０番目に示される核酸配列、及び配列番号５に示される核酸配列、若しくは配列番号３６の第７６番目〜第３７８番目に示される核酸配列、又は配列番号７に示される核酸配列；
（Ｃ）配列番号９に示される核酸配列、及び配列番号１１に示される核酸配列；
（Ｄ）配列番号１３に示される核酸配列、及び配列番号１５又は１７に示される核酸配列；
（Ｅ）配列番号１９に示される核酸配列、及び配列番号２１に示される核酸配列；
（Ｆ）配列番号２３に示される核酸配列、及び配列番号２５に示される核酸配列；
（Ｇ）配列番号２７に示される核酸配列、及び配列番号２９に示される核酸配列；
【請求項４】
請求項２又は３記載の核酸を含有するベクター。
【請求項５】
請求項４記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項６】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
請求項６記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項８】
請求項１又は６記載の抗体を備えた、がん細胞検出用キット。
【請求項９】
請求項１又は６記載の抗体からなる第一抗体と、エフェクター細胞抗原を認識する第二抗体とが結合した、抗体連結体。
【請求項１０】
第二抗体がＣＤ３抗原を認識する抗体である、請求項９記載の抗体連結体。
【請求項１１】
請求項９又は１０記載の抗体連結体を含むがん治療用組成物であって、前記抗体連結体によってエフェクター細胞ががん細胞に送達される、がん治療用組成物。
【請求項１２】
請求項１又は６記載の抗体からなる第一抗体と、エフェクター細胞抗原を認識する第二抗体とが結合した抗体連結体に、エフェクター細胞が結合した連結抗体−細胞複合体。
【請求項１３】
第一抗体と第二抗体とが、前記第一抗体及び前記第二抗体の双方を認識する第三抗体を介して結合した、請求項１２記載の連結抗体−細胞複合体。
【請求項１４】
第一抗体及び第二抗体が同一の動物種由来のＩｇＧ抗体であり、且つ、第三抗体が前記動物種のＩｇＧ抗体を認識する抗体である、請求項１２又は１３記載の連結抗体−細胞複合体。
【請求項１５】
第一抗体及び第二抗体がマウス由来のＩｇＧ抗体であり、且つ、第三抗体がマウス由来のＩｇＧ抗体を認識する抗体である、請求項１２〜１４のいずれかに記載の連結抗体−細胞複合体。
【請求項１６】
エフェクター細胞が、治療対象となるがん患者から採取されたエフェクター細胞である、請求項１２〜１５のいずれかに記載の連結抗体−細胞複合体。
【請求項１７】
請求項１２〜１６のいずれかに記載の連結抗体−細胞複合体を有効成分として含有するがん治療用組成物。
【請求項１８】
以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかの領域と、エフェクター細胞抗原を認識する領域とを含む、二重特異性抗体。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列又は配列番号４の第３番目〜第１１１番目に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号６の第４番目〜第１０４番目に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１６又は１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｆ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｇ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【請求項１９】
エフェクター細胞抗原を認識する領域が、ＣＤ３抗原を認識する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である、請求項１８記載の二重特異性抗体。
【請求項２０】
一本鎖抗体である請求項１８又は１９記載の二重特異性抗体。
【請求項２１】
配列番号３２又は３７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１８〜２０のいずれかに記載の二重特異性抗体。
【請求項２２】
Ｆａｂ−ｓｃＦｖ融合体である請求項１８又は１９記載の二重特異性抗体。
【請求項２３】
配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含む長鎖と、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含む短鎖とを含む、請求項１８、１９、及び２２のいずれかに記載の二重特異性抗体。
【請求項２４】
請求項１８〜２３のいずれかに記載の二重特異性抗体をコードする核酸。
【請求項２５】
以下の（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかの配列を含む、請求項２４記載の核酸。
（Ａ）配列番号１に示される核酸配列；
（Ｂ）配列番号３に示される核酸配列又は配列番号３８の第６４番目〜第３９０番目に示される核酸配列、及び配列番号５に示される核酸配列、若しくは配列番号３６の第７６番目〜第３７８番目に示される核酸配列、又は配列番号７に示される核酸配列；
（Ｃ）配列番号９に示される核酸配列、及び配列番号１１に示される核酸配列；
（Ｄ）配列番号１３に示される核酸配列、及び配列番号１５又は１７に示される核酸配列；
（Ｅ）配列番号１９に示される核酸配列、及び配列番号２１に示される核酸配列；
（Ｆ）配列番号２３に示される核酸配列、及び配列番号２５に示される核酸配列；
（Ｇ）配列番号２７に示される核酸配列、及び配列番号２９に示される核酸配列；
【請求項２６】
配列番号３１又は３６に示される核酸配列を含む、請求項２４又は２５記載の核酸。
【請求項２７】
配列番号３８に示される核酸配列を含む核酸と、配列番号４０に示される核酸配列を含む核酸とを含む、請求項２４又は２５記載の核酸。
【請求項２８】
請求項２４〜２７のいずれかに記載の核酸を含有するベクター。
【請求項２９】
請求項２８記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項３０】
請求項１８〜２３のいずれかに記載の二重特異性抗体を含むがん治療用組成物であって、前記二重特異性抗体によってエフェクター細胞ががん細胞に送達される、がん治療用組成物。
【請求項３１】
請求項１８〜２３のいずれかに記載の二重特異性抗体と、エフェクター細胞とが結合した、二重特異性抗体−細胞複合体。
【請求項３２】
エフェクター細胞が、治療対象となるがん患者から採取されたエフェクター細胞である、請求項３１記載の二重特異性抗体−細胞複合体。
【請求項３３】
請求項３１又は３２記載の二重特異性抗体−細胞複合体を有効成分として含有するがん治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質の細胞外ドメインを認識する抗体や、上記抗体とエフェクター細胞が結合した連結抗体−細胞複合体や、上記抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む二重特異性抗体等に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ７−Ｈ４は、Ｂ７ファミリーに属する膜タンパク質であり、免疫チェックポイント分子として知られている（非特許文献１）。肺、肝臓、卵巣等の様々な正常組織において、低レベルのＢ７−Ｈ４ ｍＲＮＡ発現が認められることが明らかにされているが、これらの正常組織におけるＢ７−Ｈ４タンパク質の発現は確認されていない。一方、卵巣がん、子宮がん、子宮内膜がん等の様々ながん組織においては、ステージに関わりなく、Ｂ７−Ｈ４タンパク質が高発現することが明らかになっている（非特許文献２）。これらのことから、Ｂ７−Ｈ４は、新たながんの分子マーカーやがん治療の標的分子として期待されているが、Ｂ７−Ｈ４の発現やその作用については、未だ不明な点が多く残されている。【０００３】
近年の抗体工学の進歩により、ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体のようにヒトに対する抗原性が低く、臨床応用可能な遺伝子組換え抗体の作製が可能となったことから、特にがん治療分野を中心に抗体医薬品が次々と開発・認可されてきている。医薬として開発されている抗体のほとんどは分子量約１５０ｋＤａのヒトＩｇＧであり、そのＦｃ領域に２本のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が結合する糖蛋白質である。Ｆｃ領域はＦｃ受容体や補体などが結合する領域であり、この部分を通じて抗体依存性細胞傷害活性（antibody-dependent cellular cytotoxicity;ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞傷害活性（complement-dependent cytotoxicity;ＣＤＣ）といったエフェクター活性が発揮されると考えられている。
実際、がん患者Ｆｃ受容体の多型解析から、非ホジキンリンパ腫治療薬抗ＣＤ２０抗体Ｒｉｔｕｘａｎ（Ｒ）（リツキシマブ）や乳がん治療薬抗Ｈｅｒ２抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｒ）（トラスツズマブ）の主な抗腫瘍メカニズムの一つはＡＤＣＣ活性であることが明らかにされており（非特許文献３−７）、医薬開発に応用可能なＡＤＣＣ活性増強技術の開発が次世代抗体技術として注目されている。【０００４】
Ｂ７−Ｈ４を特異的に認識する抗体としては、既にいくつかのモノクローナル抗体が開示されている（例えば、特許文献１及び２）。特に、特許文献１には、インビトロにおいてＢ７−Ｈ４を発現するがん細胞に対してＡＤＣＣ活性を奏する抗Ｂ７−Ｈ４抗体が開示されているが、かかる抗体がインビボにおいてＡＤＣＣ活性を奏する可能性については明らかにされていない。また、特許文献１には、上記抗Ｂ７−Ｈ４抗体又はその断片を含む二重特異性分子が開示されており、具体例として、Ｂ７−Ｈ４とＦｃ受容体とを認識する二重特異性分子や該二重特異性分子により、Ｂ７−Ｈ４発現細胞をエフェクター細胞に向かわせて、Ｆｃ受容体を介したエフェクター細胞活性（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用等）が誘導できる可能性が記載されているが、その効果は実際には確認されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１１−５０５３７２号公報
【特許文献２】特表２０１６−５０９５８２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Immunity, 18, 849 (2003)
【非特許文献２】Gynecol Oncol., 134, 181 (2014)
【非特許文献３】Blood 99, 754 (2002)
【非特許文献４】Cancer Res., 64, 4664 (2004)
【非特許文献５】Arthritis Rheum., 48, 455 (2003)
【非特許文献６】J. Clin. Oncol., 21, 3940 (2003)
【非特許文献７】Clin. Cancer Res., 10, 5650 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、高い特異性・親和性を有する新たな抗Ｂ７−Ｈ４抗体を作製し、さらに、該抗体のＡＤＣＣ活性を増強させた「連結抗体−細胞複合体」や「二重特異性抗体」等を作製することにより、効果的ながん治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質の細胞外ドメインタンパク質を抗原としてマウスを免疫し、Ｂ７−Ｈ４への結合能を有する抗体を産生する複数のハイブリドーマ株を作製した。そして、ＥＬＩＳＡ法及びサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、得られたハイブリドーマ株由来の抗体の中から、遊離型Ｂ７−Ｈ４に対して高い特異性と親和性を有する８種の抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．０５１、Ｈ４．０７９、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１４０、Ｈ４．１６０、及びＨ４．２０９）を選定し、さらに、Ｂ７−Ｈ４タンパク質を一過性に過剰発現させた培養細胞を用いた免疫染色実験により、上記抗Ｂ７−Ｈ４抗体のうち、少なくともＨ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１２１、及びＨ４．２０９は細胞表面上に発現するＢ７−Ｈ４を認識できることを明らかにした。【０００９】
続いて、本発明者らは、上記抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．１１３、Ｈ４．２０９）を用いて、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質を発現する培養がん細胞の免疫染色を行った。しかし、得られた結果は、実験に用いたいずれの抗Ｂ７−Ｈ４抗体も、がん細胞と安定した結合を保てないことを示唆するものであった。このため、本発明者らは、がん治療のために上記抗Ｂ７−Ｈ４抗体を単独で用いた場合には、十分なＡＤＣＣ活性を奏することはできないであろうと考えた。【００１０】
そこで、本発明者らは、上記抗Ｂ７−Ｈ４抗体のＡＤＣＣ活性を増強する方法を鋭意検討し、上記抗Ｂ７−Ｈ４抗体とエフェクター細胞とを予め結合させて標的細胞に作用させれば、間接的な抗体依存性細胞傷害（indirect ADCC；ｉＡＤＣＣ）を誘導できるのではないかという独創的なアイディアを思いつき、実際に「抗Ｂ７−Ｈ４抗体−エフェクター細胞複合体」を作製してその効果を確認した。すなわち、本発明者らは、ヒト末梢血より単離したエフェクター細胞に、抗ＣＤ３抗体、ラビット抗マウスイムノグロブリンポリクローナル抗体、及び抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．１１３、又はＨ４．２０９）を順に結合させて４種類の抗Ｂ７−Ｈ４抗体−エフェクター細胞複合体（抗Ｂ７−Ｈ４抗体−エフェクター細胞複合体、Ｈ４．０１８−エフェクター細胞複合体、Ｈ４．０２５−エフェクター細胞複合体、Ｈ４．１１３−エフェクター細胞複合体、及びＨ４．２０９−エフェクター細胞複合体）を作製し、これらの抗Ｂ７−Ｈ４抗体−エフェクター細胞複合体を用いた細胞傷害性アッセイを行った結果、少なくともＨ４．０２５−エフェクター細胞複合体は、標的がん細胞に対する細胞傷害活性を奏することが明らかとなった。【００１１】
さらに、本発明者らは、上記抗Ｂ７−Ｈ４抗体のうちの７種の抗体（Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．０５１、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１２１、Ｈ４．１４０、及びＨ４．２０９）の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列及び遺伝子配列を解析して、得られた配列情報に基づいて、Ｂ７−Ｈ４とＣＤ３抗原（Ｔ細胞抗原）の両方を認識する２種類の二重特異性抗体（ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−ｓｃＦｖ）を作製し、それらの効果をin vitro及びin vivoにおいて確認した。その結果、上記ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−ｓｃＦｖはいずれも、Ｂ７−Ｈ４を発現するがん細胞に対して濃度依存的な細胞傷害活性を示すこと、また、担がんマウスに上記Ｆａｂ−ｓｃＦｖを投与すると、腫瘍サイズの退縮、腫瘍組織内へのＦａｂ−ｓｃＦｖの集積及びＣＤ８陽性キラーＴ細胞の浸潤、腫瘍組織におけるＢ７−Ｈ４陽性のがん細胞の減少・消滅など、優れた抗腫瘍作用が認められることを明らかにし、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、（１）（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列又は配列番号４の第３番目〜第１１１番目に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号６の第４番目〜第１０４番目に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｃ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｄ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１６又は１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｅ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｆ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｇ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；の（ａ）〜（ｇ）のいずれかの領域を含む、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質の細胞外ドメインを認識する抗体や、（２）（Ａ’）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする核酸配列；（Ｂ’）配列番号４に示されるアミノ酸配列又は配列番号４の第３番目〜第１１１番目に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号６の第４番目〜第１０４番目に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；（Ｃ’）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；（Ｄ’）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１６又は１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；（Ｅ’）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；（Ｆ’）配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；（Ｇ’）配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；の（Ａ’）〜（Ｇ’）のいずれかの核酸配列を含む、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質の細胞外ドメインを認識する抗体をコードする核酸に関する。【００１３】
また、本発明は、（３）（Ａ）配列番号１に示される核酸配列；（Ｂ）配列番号３に示される核酸配列又は配列番号３８の第６４番目〜第３９０番目に示される核酸配列、及び配列番号５に示される核酸配列、若しくは配列番号３６の第７６番目〜第３７８番目に示される核酸配列、又は配列番号７に示される核酸配列；（Ｃ）配列番号９に示される核酸配列、及び配列番号１１に示される核酸配列；（Ｄ）配列番号１３に示される核酸配列、及び配列番号１５又は１７に示される核酸配列；（Ｅ）配列番号１９に示される核酸配列、及び配列番号２１に示される核酸配列；（Ｆ）配列番号２３に示される核酸配列、及び配列番号２５に示される核酸配列；（Ｇ）配列番号２７に示される核酸配列、及び配列番号２９に示される核酸配列；の（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかの核酸配列を含む、上記（２）記載の核酸や、（４）上記（２）又は（３）記載の核酸を含有するベクターや、（５）上記（４）記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体に関する。【００１４】
さらに、本発明は、（６）モノクローナル抗体である、上記（１）に記載の抗体や、（７）上記（６）記載の抗体を産生するハイブリドーマや、（８）上記（１）又は（６）記載の抗体を備えた、がん細胞検出用キットや、（９）上記（１）又は（６）記載の抗体からなる第一抗体と、エフェクター細胞抗原を認識する第二抗体とが結合した、抗体連結体や、（１０）第二抗体がＣＤ３抗原を認識する抗体である、上記（９）記載の抗体連結体や、（１１）上記（９）又は（１０）記載の抗体連結体を含むがん治療用組成物であって、前記抗体連結体によってエフェクター細胞ががん細胞に送達される、がん治療用組成物や、（１２）上記（１）又は（６）記載の抗体からなる第一抗体と、エフェクター細胞抗原を認識する第二抗体とが結合した抗体連結体に、エフェクター細胞が結合した連結抗体−細胞複合体や、（１３）第一抗体と第二抗体とが、前記第一抗体及び前記第二抗体の双方を認識する第三抗体を介して結合した、上記（１２）記載の連結抗体−細胞複合体や、（１４）第一抗体及び第二抗体が同一の動物種由来のＩｇＧ抗体であり、且つ、第三抗体が前記動物種のＩｇＧ抗体を認識する抗体である、上記（１２）又は（１３）記載の連結抗体−細胞複合体や、（１５）第一抗体及び第二抗体がマウス由来のＩｇＧ抗体であり、且つ、第三抗体がマウス由来のＩｇＧ抗体を認識する抗体である、上記（１２）〜（１４）のいずれかに記載の連結抗体−細胞複合体や、（１６）エフェクター細胞が、治療対象となるがん患者から採取されたエフェクター細胞である、上記（１２）〜（１５）のいずれかに記載の連結抗体−細胞複合体や、（１７）上記（１２）〜（１６）のいずれかに記載の連結抗体−細胞複合体を有効成分として含有するがん治療用組成物に関する。【００１５】
また、本発明は、（１８）（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列又は配列番号４の第３番目〜第１１１番目に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号６の第４番目〜第１０４番目に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｃ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｄ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１６又は１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｅ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｆ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｇ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；の（ａ）〜（ｇ）のいずれかの領域と、エフェクター細胞抗原を認識する領域とを含む、二重特異性抗体や、（１９）エフェクター細胞抗原を認識する領域が、ＣＤ３抗原を認識する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である、上記（１８）記載の二重特異性抗体や、（２０）一本鎖抗体である上記（１８）又は（１９）記載の二重特異性抗体や、（２１）配列番号３２又は３７に示されるアミノ酸配列を含む、上記（１８）〜（２０）のいずれかに記載の二重特異性抗体や、（２２）Ｆａｂ−ｓｃＦｖ融合体である上記（１８）又は（１９）記載の二重特異性抗体や、（２３）配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含む長鎖と、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含む短鎖とからなる、上記（１８）、（１９）、及び（２２）のいずれかに記載の二重特異性抗体や、（２４）上記（１８）〜（２３）のいずれかに記載の二重特異性抗体をコードする核酸に関する。【００１６】
さらに、本発明は、（２５）（Ａ）配列番号１に示される核酸配列；（Ｂ）配列番号３に示される核酸配列又は配列番号３８の第６４番目〜第３９０番目に示される核酸配列、及び配列番号５に示される核酸配列、若しくは配列番号３６の第７６番目〜第３７８番目に示される核酸配列、又は配列番号７に示される核酸配列；（Ｃ）配列番号９に示される核酸配列、及び配列番号１１に示される核酸配列；（Ｄ）配列番号１３に示される核酸配列、及び配列番号１５又は１７に示される核酸配列；（Ｅ）配列番号１９に示される核酸配列、及び配列番号２１に示される核酸配列；（Ｆ）配列番号２３に示される核酸配列、及び配列番号２５に示される核酸配列；（Ｇ）配列番号２７に示される核酸配列、及び配列番号２９に示される核酸配列；の（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかの配列を含む、上記（２４）記載の核酸や、（２６）配列番号３１又は３６に示される核酸配列を含む、上記（２４）又は（２５）記載の核酸や、（２７）配列番号３８に示される核酸配列を含む核酸と、配列番号４０に示される核酸配列を含む核酸とを含む、上記（２４）又は（２５）記載の核酸や、（２８）上記（２４）〜（２７）のいずれかに記載の核酸を含有するベクターや、（２９）上記（２８）記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体や、（３０）上記（１８）〜（２３）のいずれかに記載の二重特異性抗体を含むがん治療用組成物であって、前記二重特異性抗体によってエフェクター細胞ががん細胞に送達される、がん治療用組成物や、（３１）上記（１８）〜（２３）のいずれかに記載の二重特異性抗体と、エフェクター細胞とが結合した、二重特異性抗体−細胞複合体や、（３２）エフェクター細胞が、治療対象となるがん患者から採取されたエフェクター細胞である、上記（３１）記載の二重特異性抗体−細胞複合体や、（３３）上記（３１）又は（３２）記載の二重特異性抗体−細胞複合体を有効成分として含有するがん治療用組成物に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、遊離型ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質及び／又は細胞表面上に存在するヒトＢ７−Ｈ４タンパク質を、特異的且つ高感度に検出可能な抗Ｂ７−Ｈ４抗体を製造することができる。また、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体とエフェクター細胞を認識する抗体を連結させた「抗体連結体」や、該抗体連結体にさらにエフェクター細胞を連結させた「連結抗体−細胞複合体」は、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体のＡＤＣＣ活性を増強し、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質を発現するがん細胞を特異的に死滅させることができる。さらに、本発明によれば、上記抗Ｂ７−Ｈ４抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の配列情報に基づいて、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質とエフェクター細胞抗原の両方を認識する二重特異性抗体を作製することができる。かかる二重特異性抗体は、エフェクター細胞をがん細胞に特異的に送達して効率的なＡＤＣＣを誘導し得るものであり、がん治療用医薬組成物として利用できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ヒトＢ７−Ｈ４、ヒトＢ７−Ｈ１、及びヒトＢ７−ＤＣタンパク質に対する、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．０５１、Ｈ４．０７９、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１４０、Ｈ４．１６０、及びＨ４．２０９）の結合能を調べた結果を示す図である。
【図２】異なる濃度のヒトＢ７−Ｈ４に対する、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．０５１、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１４０、及びＨ４．２０９）の結合能を調べた結果を示す図である。
【図３】本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．０５１、Ｈ４．０７９、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１２１、Ｈ４．１４０、Ｈ４．１６０、及びＨ４．２０９）及び市販の抗体（Ｈ７４クローン）により、ヒトＢ７−Ｈ４発現２９３Ｆ細胞を免疫染色した結果を示す図である。
【図４】複数のがん細胞株におけるＢ７−Ｈ４の発現を、市販の抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ７４クローン）を用いて確認した結果を示す図である。
【図５】本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．１１３、Ｈ４．２０９）のＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞への結合を、４つの異なる条件下において調べた結果を示す図である。
【図６】（ａ）本発明の連結抗体−細胞複合体の模式図を示す図である。（ｂ）本発明の連結抗体−細胞複合体による間接的な抗体依存性細胞傷害活性を調べた結果を示す図である。なお、図中の「Ｈ４．０１８」、「Ｈ４．０２５」、「Ｈ４．１１３」、及び「Ｈ４．２０９」は、本発明の「Ｈ４．０１８−エフェクター細胞複合体」、「Ｈ４．０２５−エフェクター細胞複合体」、「Ｈ４．１１３−エフェクター細胞複合体」、及び「Ｈ４．２０９−エフェクター細胞複合体」をそれぞれ示す。
【図７】Ｈ４．０１８の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
【図８】Ｈ４．０２５の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号３）及びアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
【図９】Ｈ４．０２５の軽鎖可変領域（κ鎖）の核酸配列（配列番号５）及びアミノ酸配列（配列番号６）を示す図である。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
【図１０】Ｈ４．０２５の軽鎖可変領域（λ鎖）の核酸配列（配列番号７）及びアミノ酸配列（配列番号８）を示す図である。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
【図１１】Ｈ４．０５１の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号９）及びアミノ酸配列（配列番号１０）を示す図である。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
【図１２】Ｈ４．０５１の軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号１１）及びアミノ酸配列（配列番号１２）を示す図である。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
【図１３】Ｈ４．１１３の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号１３）及びアミノ酸配列（配列番号１４）を示す図である。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
【図１４】Ｈ４．１１３の軽鎖可変領域（κ鎖）の核酸配列（配列番号１５）及びアミノ酸配列（配列番号１６）を示す図である。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
【図１５】Ｈ４．１１３の軽鎖可変領域（λ鎖）の核酸配列（配列番号１７）及びアミノ酸配列（配列番号１８）を示す図である。
【図１６】Ｈ４．１２１の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号１９）及びアミノ酸配列（配列番号２０）を示す図である。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
【図１７】Ｈ４．１２１の軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号２１）及びアミノ酸配列（配列番号２２）を示す図である。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
【図１８】Ｈ４．１４０の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号２３）及びアミノ酸配列（配列番号２４）を示す図である。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
【図１９】Ｈ４．１４０の軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号２５）及びアミノ酸配列（配列番号２６）を示す図である。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
【図２０】Ｈ４．２０９の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号２７）及びアミノ酸配列（配列番号２８）を示す図である。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
【図２１】Ｈ４．２０９の軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号２９）及びアミノ酸配列（配列番号３０）を示す図である。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
【図２２】本発明の二重特異性抗体(ＢｓＡｂ)の構造を示す図である。
【図２３−１】本発明のＢｓＡｂの核酸配列（配列番号３１の第１〜第４９５番目までの核酸配列）及びアミノ酸配列（配列番号３２の第１〜第１６５番目までのアミノ酸配列）を示す図である。
【図２３−２】本発明のＢｓＡｂの核酸配列（配列番号３１の第４９６〜第１０３５番目までの核酸配列）及びアミノ酸配列（配列番号３２の第１６６〜第３４５番目までのアミノ酸配列）を示す図である。
【図２３−３】本発明のＢｓＡｂの核酸配列（配列番号３１の第１０３６〜第１５００番目までの核酸配列）及びアミノ酸配列（配列番号３２の第３４６〜第５００番目までのアミノ酸配列）を示す図である。
【図２４】本発明のｓｃＦｖ−ｓｃＦｖの構造を示す図である。
【図２５−１】本発明のｓｃＦｖ−ｓｃＦｖの核酸配列（配列番号３６の第１〜第５４０番目までの核酸配列）及びアミノ酸配列（配列番号３７の第１〜第１８０番目までのアミノ酸配列）を示す図である。
【図２５−２】本発明のｓｃＦｖ−ｓｃＦｖの核酸配列（配列番号３６の第５４１〜第１０８０番目までの核酸配列）及びアミノ酸配列（配列番号３７の第１８１〜第３６０番目までのアミノ酸配列）を示す図である。
【図２５−３】本発明のｓｃＦｖ−ｓｃＦｖの核酸配列（配列番号３６の第１０８１〜第１６０２番目までの核酸配列）及びアミノ酸配列（配列番号３７の第３６１〜第５３３番目までのアミノ酸配列）を示す図である。
【図２６】本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖの構造を示す図である。
【図２７−１】本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖの長鎖の核酸配列（配列番号３８の第１〜第５４０番目までの核酸配列）及びアミノ酸配列（配列番号３９の第１〜第１８０番目までのアミノ酸配列）を示す図である。
【図２７−２】本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖの長鎖の核酸配列（配列番号３８の第５４１〜第１０８０番目までの核酸配列）及びアミノ酸配列（配列番号３９の第１８１〜第３６０番目までのアミノ酸配列）を示す図である。
【図２７−３】本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖの長鎖の核酸配列（配列番号３８の第１０８１〜第１５２１番目までの核酸配列）及びアミノ酸配列（配列番号３９の第３６１〜第５０６番目までのアミノ酸配列）を示す図である。
【図２８−１】本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖの短鎖の核酸配列（配列番号４０の第１〜第５４０番目までの核酸配列）及びアミノ酸配列（配列番号４１の第１〜第１８０番目までのアミノ酸配列）を示す図である。
【図２８−２】本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖの短鎖の核酸配列（配列番号４０の第５４１〜第７２６番目までの核酸配列）及びアミノ酸配列（配列番号４１の第１８１〜第２４１番目までのアミノ酸配列）を示す図である。
【図２９】抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ４.０２５）及び本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖを用いて、４種の乳がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＳＫＢＲ３細胞、及びＺＲ７５細胞）の免疫染色を行った結果を示す図である。
【図３０】乳がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞）に対する、本発明のｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−ｓｃＦｖの細胞傷害活性を調べた結果を示す図である。図中、「％Ｌｙｓｉｓ」は、測定シグナルと界面活性剤により可溶化された細胞による総シグナルとの比率を示し、「ｎｇ／ｍｌ」は、本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖの添加濃度を示す。
【図３１】４種のがん細胞に対する、本発明のｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−ｓｃＦｖの細胞傷害活性を調べた結果を示す図である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＺＲ７５細胞、及びＳＫＢＲ３細胞は乳がん由来の、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞は肺扁平上皮がん由来の細胞株である。
【図３２】担がんマウスの腫瘍サイズに及ぼす本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖの影響を調べた結果を示す図である。担がんマウスは、ヒト末梢血単核球及びヒトがん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞又はＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞）をＭＨＣノックアウトＮＯＧマウスに移植することによって作製した。
【図３３】担がんマウスの腫瘍組織に及ぼす本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖの影響を、ヘマトキシリンエオジン染色により調べた結果を示す図である。図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は未処理の担がんマウス由来の腫瘍組織を、「ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｅａｔｅｄ」は本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖを投与した担がんマウス由来の腫瘍組織をそれぞれ示す。
【図３４】担がんマウスの腫瘍組織に及ぼす本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖの影響を、抗ＣＤ８抗体及び抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ４.０２５）を用いた免疫染色により調べた結果を示す図である。図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は未処理の担がんマウス由来の腫瘍組織を、「ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｅａｔｅｄ」は本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖを投与した担がんマウス由来の腫瘍組織をそれぞれ示す。
【図３５】担がんマウスにおける、本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖの局在を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の抗体としては、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質の細胞外ドメインを認識する抗体であって、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列又は配列番号４の第３番目〜第１１１番目に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号６の第４番目〜第１０４番目に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｃ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｄ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１６又は１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｅ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｆ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｇ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；の（ａ）〜（ｇ）のいずれかの領域を含む抗体であれば特に制限されないが、上記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、及び（ｇ）のいずれかの領域を含む抗体であることが好ましく、上記（ｂ）の領域を含む抗体であることがより好ましい。ここで「抗体」とは、完全長の抗体又はその断片を意味し、生物からの天然抗体、改変抗体、及び遺伝子組換えにより作製された抗体のいずれであってもよい。また、本発明の抗体の形態としては、例えば、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）２断片、ｓｃＦＶ（１本鎖抗体）等を好適に挙げることができるが、特にモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００２０】
上記本発明の抗体のうち、上記（ｂ）又は（ｄ）の領域を含む抗体はそれぞれ、２種類の軽鎖可変領域（カッパ（κ）及びラムダ(λ)）のうちの一方、又は、両方の軽鎖可変領域を含んでいてもよい。より具体的には、上記（ｂ）の領域を含む抗体としては、ｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号６（κ鎖）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；ii）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号８（λ鎖）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；iii）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号６（κ鎖）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号８（λ鎖）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；のｉ）〜iii）のいずれかの抗体を挙げることができ、上記（ｄ）の領域を含む抗体としては、iv）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１６（κ鎖）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；ｖ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１８（λ鎖）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；vi）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６（κ鎖）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号１８（λ鎖）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；のiv）〜vi）のいずれかの抗体を挙げることができる。
【００２１】
また、本発明の核酸としては、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質の細胞外ドメインを認識する抗体をコードする核酸であって、（Ａ’）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする核酸配列；（Ｂ’）配列番号４に示されるアミノ酸配列又は配列番号４の第３番目〜第１１１番目に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号６の第４番目〜第１０４番目に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；（Ｃ’）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；（Ｄ’）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１６又は１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；（Ｅ’）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；（Ｆ’）配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；（Ｇ’）配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列；のいずれかを含む核酸であれば特に制限されず、上記核酸配列は発現させる宿主細胞に合わせてコドン配列の最適化がされていてもよい。より具体的には、上記核酸配列としては、（Ａ）配列番号１に示される核酸配列；（Ｂ）配列番号３に示される核酸配列又は配列番号３８の第６４番目〜第３９０番目に示される核酸配列、及び配列番号５に示される核酸配列、若しくは配列番号３６の第７６番目〜第３７８番目に示される核酸配列、又は配列番号７に示される核酸配列；（Ｃ）配列番号９に示される核酸配列、及び配列番号１１に示される核酸配列；（Ｄ）配列番号１３に示される核酸配列、及び配列番号１５又は１７に示される核酸配列；（Ｅ）配列番号１９に示される核酸配列、及び配列番号２１に示される核酸配列；（Ｆ）配列番号２３に示される核酸配列、及び配列番号２５に示される核酸配列；（Ｇ）配列番号２７に示される核酸配列、及び配列番号２９に示される核酸配列；のいずれかの核酸配列を含む核酸を好適に例示することができる。
【００２２】
本発明のベクターとしては、前記本発明の核酸を含むものであれば特に制限されず、本発明の核酸を発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。上記発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、本発明の核酸によりコードされる重鎖又は軽鎖可変領域のポリペプチドを発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、動物細胞用発現ベクター、酵母用発現ベクター、細菌用発現ベクター等を用いることができるが、動物細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好ましい。
【００２３】
上記動物細胞用発現ベクターとしては、例えば、pcDNA3（Stratagene社製）、pCMV-FLAG6a（Sigma社製)、pEGFP-C3（Clontech社製)、pcDM8（フナコシ社より市販)、pAGE107〔特開平3-22979; Cytotechnology, 3, 133,(1990)〕、pAS3-3（特開平2-227075)、pCDM8〔Nature, 329, 840,(1987)〕、pcDNAI/Amp（Invitrogen社製)、pREP4（Invitrogen社製)、pAGE103〔J.Blochem., 101, 1307(1987)〕、pAGE210等を例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトCMV)のIE（immediateearly)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等を挙げることができる。また、上記酵母用発現ベクターとしては、例えば、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、Ycp5O(ATCC37419)、pHS19、pHS15等を例示することができる。酵母用のプロモーターとしては、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。さらに、上記細菌用発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2(いずれもべーリンガーマンハイム社より市販)、pGEX4T(Amersham Bioscience社製)、pKK233-2(Pharmacia社製)、pSE280(Invitrogen社製)、pGEMEX-1(Promega社製)、pQE-8(QIAGEN社製)、pQE-30(QIAGEN社製)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200〔Agrc.Biol.Chem., 48, 669(1984)〕、PLSA1〔Agrc. Blo1. Chem., 53, 277(1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII SK(+)、pBluescriptII SK(-)(Stratagene社製)、pTrS30(FERMBP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX(Pharmacia社製)、pET-3(Novagen社製)、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔Gene, 33, 103(1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103(1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29(宝酒造社製)、pUC118(宝酒造社製)、pQE-30(QIAGEN社製)等が挙げられる。細菌用のプロモーターとしては、例えば、trpプロモーター(P trp)、lacプロモーター(P lac)、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーター等を挙げることができる。
【００２４】
本発明の形質転換体としては、上記本発明のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体であれば特に制限されず、ここで使用される宿主細胞としては、例えば、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、シロイヌナズナ等の植物細胞等を挙げることができる。また、本発明の組換えベクターの宿主細胞への導入方法は、宿主細胞の種類に応じて適切な方法を用いることができる。該導入方法として、具体的には、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染等を例示することができる。
【００２５】
本発明のモノクローナル抗体としては、特に制限されないが、例えば、以下の実施例に記載のＨ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．０５１、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１２１、Ｈ４．１４０、及びＨ４．２０９等を好適に挙げることができる。より具体的には、上記（ａ）の領域（配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域）を含むモノクローナル抗体としてはＨ４．０１８を、上記（ｂ）の領域（配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６又は８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域）を含むモノクローナル抗体としてはＨ４．０２５を、上記（ｃ）の領域（配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域）を含むモノクローナル抗体としてはＨ４．０５１を、上記（ｄ）の領域（配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１６又は１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域）を含むモノクローナル抗体としてはＨ４．１１３を、上記（ｅ）の領域（配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域）を含むモノクローナル抗体としてはＨ４．１２１を、上記（ｆ）の領域（配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域）を含むモノクローナル抗体としてはＨ４．１４０を、上記（ｇ）の領域（配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域）を含むモノクローナル抗体としてはＨ４．２０９を、それぞれ好適に例示することができる。本発明のモノクローナル抗体としては、遊離型ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質と細胞表面上に存在するヒトＢ７−Ｈ４タンパク質の両方を認識できるという点で、Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１２１、及びＨ４．２０９が好ましく、なかでも、Ｈ４．０２５が特に好ましい。
【００２６】
上記本発明のモノクローナル抗体のうち、上記（ｂ）又は（ｄ）の領域を含むモノクローナル抗体はそれぞれ、２種類の軽鎖可変領域（カッパ（κ）及びラムダ(λ)）のうちの一方、又は、両方の軽鎖可変領域を含んでいてもよい。より具体的には、上記（ｂ）の領域を含むモノクローナル抗体は、Ｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号６（κ鎖）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むモノクローナル抗体；II）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号８（λ鎖）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むモノクローナル抗体；III）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号６（κ鎖）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号８（λ鎖）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むモノクローナル抗体；のＩ）〜III）のいずれかのモノクローナル抗体、或は、上記Ｉ）及びII）のモノクローナル抗体が混合した抗体であってもよく、また、上記（ｄ）の領域を含むモノクローナル抗体は、IV）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１６（κ鎖）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むモノクローナル抗体；Ｖ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１８（λ鎖）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むモノクローナル抗体；VI）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６（κ鎖）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号１８（λ鎖）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むモノクローナル抗体；のIV）〜VI）のいずれかのモノクローナル抗体、或は、上記IV）及びＶ）のモノクローナル抗体が混合した抗体であってもよい。
【００２７】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）等の任意の方法を用いて作製することができるが、特にハイブリドーマ法により作製することが好ましい。また、本発明のハイブリドーマとしては、上記本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであれば特に制限されないが、より具体的には、以下の実施例に記載のハイブリドーマクローン＃１８、＃２５、＃５１、＃１１３、＃１２１、＃１４０、及び＃２０９（それぞれ、本発明のモノクローナル抗体Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．０５１、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１２１、Ｈ４．１４０、及びＨ４．２０９を産生するハイブリドーマクローン）を好適に例示することができ、中でも、ハイブリドーマクローン＃１８、＃２５、＃１１３、＃１２１、及び＃２０９を好ましく例示することができ、ハイブリドーマクローン＃２５を特に好ましく例示することができる。
【００２８】
本発明のがん細胞検出用キットとしては、上記本発明の抗体を備えたものであれば特に制限されないが、特に、上記本発明のモノクローナル抗体を備えたものを好適に例示することができる。本発明のがん細胞検出用キットに含まれる抗体は、検出方法に応じて、フルオレセインイソシアネート、テトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ、３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、フィコエリトリン等の酵素で標識されていてもよく、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質等と融合させた融合タンパク質であってもよい。また、本発明のがん細胞検出用キットは、上記本発明の抗体に加えて、ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、免疫染色法、ＲＩＡ法等の公知のタンパク質検出及び／又は測定方法のための試薬、溶液、希釈剤、洗浄用緩衝液、標準物質、上記本発明の抗体に対し特異的に免疫学的反応をする標識抗体（二次抗体）、発色・発光又は蛍光を生じさせる基質試薬、手順と評価方法を記載した手順書等をさらに含んでいてもよく、簡便に検査できるよう構成されたものが好ましい。上記本発明のがん細胞検出用キットは、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質を発現するがん細胞やがん組織であれば、どのような種類のがんに対しても使用できるが、特に、Ｂ７−Ｈ４タンパク質が高発現することが知られている卵巣がん、子宮がん、子宮内膜がん、肺がん、乳がん等の検出に好適に使用することができる。
【００２９】
本発明はさらに、上記本発明の抗体と、エフェクター細胞抗原を認識する抗体とが結合した「抗体連結体」や、該抗体連結体とエフェクター細胞とが結合した「連結抗体−細胞複合体」に関する。上記本発明の抗体連結体としては、上記本発明の抗体からなる第一抗体と、エフェクター細胞抗原を認識する第二抗体とが結合したものであれば特に制限されないが、第二抗体がＣＤ３抗原を認識する抗体であることが好ましく、また、上記本発明の連結抗体−細胞複合体としては、上記本発明の抗体からなる第一抗体と、エフェクター細胞抗原を認識する第二抗体とが結合した抗体連結体に、エフェクター細胞が結合したものであれば特に制限されないが、第一抗体と第二抗体とが、前記第一抗体及び前記第二抗体の双方を認識する第三抗体を介して結合していることが好ましく、第一抗体及び第二抗体が同一の動物種由来のＩｇＧ抗体であり、且つ、第三抗体が前記動物種のＩｇＧ抗体を認識する抗体であることがより好ましく、第一抗体及び第二抗体がマウス由来のＩｇＧ抗体であり、且つ、第三抗体がマウス由来のＩｇＧ抗体を認識する抗体であることが特に好ましい。ここで「エフェクター細胞」とは、Ｆｃ受容体を発現する免疫系の細胞であって、標的細胞の細胞表面上に結合した抗体のＦｃ領域と結合して該標的細胞を死滅させる活性を有する細胞を意味し、具体的には、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等を好適に例示することができるが、特に、Ｔ細胞であることが好ましい。また、上記エフェクター細胞はどのような動物種に由来するものであってもよく、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル等に由来するエフェクター細胞を好適に例示することができるが、ヒト由来のエフェクター細胞であることが好ましく、治療対象となるがん患者から採取されたエフェクター細胞であることが特に好ましい。
【００３０】
上記本発明の「抗体連結体」及び「連結抗体−細胞複合体」は、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質に対する結合能を維持しながら、増強されたＡＤＣＣ活性を奏する（なお、本明細書においては、「抗体連結体」及び「連結抗体−細胞複合体」により誘導されるＡＤＣＣを、「間接的なＡＤＣＣ（ｉＡＤＣＣ）」と称する場合がある）。すなわち、エフェクター細胞の存在下で、本発明の抗体を単独で標的細胞（ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質を発現するがん細胞）に作用させてもＡＤＣＣ活性が不十分、又は全く認められない場合であっても、かかる本発明の抗体を用いて上記「抗体連結体」又は「連結抗体−細胞複合体」を作製することにより、エフェクター細胞を効率的に標的細胞へと送達して標的細胞の溶解を引き起こすことができる。従って、上記本発明の「抗体連結体」及び「連結抗体−細胞複合体」は、がん治療用組成物の成分として利用できる。本発明の「抗体連結体を含むがん治療用組成物」としては、本発明の抗体連結体を含み、且つ、該抗体連結体によってエフェクター細胞ががん細胞に送達されるものであれば特に制限されず、また、本発明の「連結抗体−細胞複合体を含むがん治療用組成物」としては、本発明の連結抗体−細胞複合体を有効成分として含むものであれば特に制限されない。ここで、治療の対象となる「がん」としては、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質を発現するがんであればどのような種類のがんであってもよいが、Ｂ７−Ｈ４タンパク質を高発現する卵巣がん、子宮がん、子宮内膜がん、肺がん、乳がん等を特に好適に例示することができる。
【００３１】
また、本発明は、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質と、エフェクター細胞抗原とを認識する二重特異性抗体に関する。上記本発明の二重特異性抗体としては、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列又は配列番号４の第３番目〜第１１１番目に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号６の第４番目〜第１０４番目に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｃ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｄ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１６又は１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｅ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｆ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｇ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；の（ａ）〜（ｇ）のいずれかの領域と、エフェクター細胞抗原を認識する領域とを含むものであれば特に制限されず、上記「エフェクター細胞抗原」としては、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等のエフェクター細胞の細胞表面上に特異的又は高レベルで存在する抗原であればどのような抗原であってもよく、具体的には、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ４４、Ｃ６９、Ａ１３、Ｇ１等のＴ細胞抗原や、３Ｇ８、Ｂ７３．１、ＬＥＵＬ１、ＶＥＰ１３、ＡＴ１０等のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞抗原を好適に例示することができるが、Ｔ細胞抗原であるＣＤ３を特に好適に例示することができる。
【００３２】
上記本発明の二重特異性抗体は、当技術分野で公知の様々な方法により製造することができ、具体的には、例えば、上記本発明の抗体における抗原結合領域と、エフェクター細胞抗原を認識する領域とを遺伝子操作により融合させて一本鎖抗体を作製する方法や、ハイブリッドハイブリドーマ、即ちクワドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）と呼ばれる２種類の異なるモノクローナル抗体産生細胞の融合体を用いて産生する方法や（米国特許第４，４７４，８９３号公報）、２種類のモノクローナル抗体のＦａｂ断片又はＦａｂ’断片を化学的に結合させて作製する方法や（M.Brennan et al.,Science 1985,229(1708):81-3）、２つの完全なモノクローナル抗体を共有結合することで作製する方法（B.Karpovsky et al.,J.Exp.Med.1984,160(6):1686-701）等を挙げることができる。なかでも、本発明の二重特異性抗体としては、上記本発明の抗体における抗原結合領域を含むｓｃＦｖと、エフェクター細胞抗原を認識する領域を含むｓｃＦｖとを遺伝子操作により融合させて作製された一本鎖抗体（ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ）や、上記本発明の抗体における抗原結合領域を含むＦａｂとエフェクター細胞抗原を認識する領域を含むｓｃＦｖとを融合させたＦａｂ−ｓｃＦｖであることが好ましい。本発明の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ）としては、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４由来の重鎖及び軽鎖可変領域と、エフェクター細胞抗原を認識する抗体由来の重鎖及び軽鎖可変領域とが、単一のタンパク質鎖として作製されるのを可能にする合成リンカーを介して組み合わされている二価抗体であれば特に制限されないが、具体的には、配列番号３２又は３７に示されるアミノ酸配列を含む一本鎖抗体を好適に例示することができる。また、本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖとしては、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４由来の重鎖及び軽鎖可変領域を含むＦａｂと、エフェクター細胞抗原を認識する抗体由来の重鎖及び軽鎖可変領域と含むｓｃＦｖとが組み合わされたＦａｂ−ｓｃＦｖや、或は逆に、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４由来の重鎖及び軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖと、エフェクター細胞抗原を認識する抗体由来の重鎖及び軽鎖可変領域と含むＦａｂとが組み合わされたＦａｂ−ｓｃＦｖであれば特に制限されないが、具体的には、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含む長鎖と、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含む短鎖とからなるＦａｂ−ｓｃＦｖを好適に例示することができる。
【００３３】
また、本発明は、上記本発明の二重特異性抗体をコードする核酸に関する。上記「本発明の二重特異性抗体をコードする核酸」としては、（Ａ）配列番号１に示される核酸配列；（Ｂ）配列番号３に示される核酸配列又は配列番号３８の第６４番目〜第３９０番目に示される核酸配列、及び配列番号５に示される核酸配列、若しくは配列番号３６の第７６番目〜第３７８番目に示される核酸配列、又は配列番号７に示される核酸配列；（Ｃ）配列番号９に示される核酸配列、及び配列番号１１に示される核酸配列；（Ｄ）配列番号１３に示される核酸配列、及び配列番号１５又は１７に示される核酸配列；（Ｅ）配列番号１９に示される核酸配列、及び配列番号２１に示される核酸配列；（Ｆ）配列番号２３に示される核酸配列、及び配列番号２５に示される核酸配列；（Ｇ）配列番号２７に示される核酸配列、及び配列番号２９に示される核酸配列；の（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかの配列を含むものであれば特に制限されないが、配列番号３１又は３６に示される核酸配列を含むもの、或は、配列番号３８に示される核酸配列を含む核酸と、配列番号４０に示される核酸配列を含む核酸とを含むものを特に好適に例示することができる。上記「本発明の二重特異性抗体をコードする核酸」を含有するベクター及び該ベクターを導入して得られる形質転換体は、上述の方法により適切に作製することができる。
【００３４】
上記本発明の二重特異性抗体、及び該二重特異性抗体とエフェクター細胞を結合させて作製した二重特異性抗体−細胞複合体は、上記本発明の「抗体連結体」及び「連結抗体−細胞複合体」と同様に、ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質を発現するがん細胞に対してｉＡＤＣＣ活性を奏すると考えられるため、がん治療用組成物の成分として利用できる。該がん治療用組成物としては、本発明の二重特異性抗体を含み、且つ、該二重特異性抗体によってエフェクター細胞ががん細胞に送達されるがん治療用組成物や、本発明の二重特異性抗体−細胞複合体を含むがん治療用組成物であれば特に制限されない。ここで、治療の対象となる「がん」としては、Ｂ７−Ｈ４タンパク質を発現するがんであればどのような種類のがんであってもよいが、Ｂ７−Ｈ４タンパク質を高発現する卵巣がん、子宮がん、子宮内膜がん、肺がん、乳がん等を特に好適に例示することができる。
【００３５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
［ヒトＢ７−Ｈ４抗原タンパク質及びその発現細胞の作製］
モノクローナル抗体の作製と評価に用いるために、（１）Ｂ７−Ｈ４可溶型組換えタンパク質、及び（２）Ｂ７−Ｈ４膜発現型遺伝子導入細胞を作製した。
（１）Ｂ７−Ｈ４可溶型組換えタンパク質（遊離型抗原）
ヒトＢ７−Ｈ４アイソフォーム１タンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号；ＮＰ＿０７８９０２、配列番号３３）の細胞外ドメインは、第２５番目のロイシン（Ｌｅｕ２５）から第２５９番目のセリン（Ｓｅｒ２５９）までの領域により構成される。本研究では、この細胞外ドメイン（Ｌｅｕ２５からＳｅｒ２５９までの領域）のアミノ酸配列をコードする核酸配列のＮ末端相当側にイムノグロブリン由来のシグナルペプチドをコードする核酸配列を、Ｃ末端相当側に６連ヒスチジンタグをコードする核酸配列および終止コドンをそれぞれ付加した核酸断片を作製し、該核酸断片をｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターに組み込んでＢ７−Ｈ４可溶型タンパク質発現ベクターを作製した。該発現ベクターを２９３Ｆ細胞（ライフテクノロジー社）に遺伝子導入して培養し、培養上清を回収した。ヒスチジンタグ親和性カラムを用いた一般的な方法によって、得られた培養上清からヒトＢ７−Ｈ４可溶型組換えタンパク質を精製した。
また、陰性コントロールとして使用するために、ヒトＢ７−Ｈ１タンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号；ＡＡＦ２５８０７、配列番号３４）、及びヒトＢ７−ＤＣタンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号;ＮＰ＿０７９５１５、配列番号３５）についても、上記同様の方法での細胞外ドメインに対応するタンパク質の作製及び精製を行った（なお、ヒトＢ７−Ｈ１では第１９番目のフェニルアラニン〜第２３８番目のアルギニン、ヒトＢ７−ＤＣでは第２０番目のロイシン〜第２２０番目のトレオニンの領域が細胞外ドメインである）。
以下、ここで作製したヒトＢ７−Ｈ４、ヒトＢ７−Ｈ１、及びヒトＢ７−ＤＣタンパク質の細胞外ドメイン領域を含む組換えタンパク質を、それぞれ「遊離型Ｂ７−Ｈ４」、「遊離型Ｂ７−Ｈ１」、及び「遊離型Ｂ７−ＤＣ」と称する場合がある。
（２）Ｂ７−Ｈ４膜発現型遺伝子導入細胞
ヒトＢ７−Ｈ４アイソフォーム１タンパク質の全長（Ｍｅｔ１からＬｙｓ２８２；配列番号３３）をコードする核酸配列をｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターに組み込んで、Ｂ７−Ｈ４全長タンパク質発現ベクターを作製した。該発現ベクターを２９３Ｆ細胞に遺伝子導入して４８時間培養し、細胞膜上にヒトＢ７−Ｈ４を一過性に発現するヒトＢ７−Ｈ４膜発現型遺伝子導入細胞を作製した（以下、かかる細胞を「Ｂ７−Ｈ４発現２９３Ｆ細胞」と称する場合がある）。また、Ｂ７−Ｈ４遺伝子の入っていないｐｃＤＮＡ３．３ベクターを２９３Ｆ細胞に導入して４８時間培養し、ヒトＢ７−Ｈ４を発現していない「コントロール２９３Ｆ細胞」を作製した。
【実施例２】
【００３７】
［ハイブリドーマの作製］
実施例１で作製した遊離型Ｂ７−Ｈ４とフロイントアジュバントとを混合してＢＡＬＢ／ｃＡマウスの背部に接種し、Ｂ７−Ｈ４特異的抗体産生細胞を誘導した。抗原（Ｂ７−Ｈ４）感作後のマウスから採取した脾臓細胞と、ミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ；アメリカ培養細胞系統保存機関より入手）とを、慣用的な方法を用いて融合させてハイブリドーマを作製し単離した。
【実施例３】
【００３８】
［抗Ｂ７−Ｈ４抗体産生ハイブリドーマの選別］
実施例２により得られた複数のハイブリドーマ株の抗体産生能を、ＥＬＩＳＡ法により調べた。
具体的には、９６穴インモビライザーアミノプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に遊離型Ｂ７−Ｈ４を添加して室温で２時間インキュベートし、プレート表面に遊離型Ｂ７−Ｈ４を固定化した。同時に、遊離型Ｂ７−Ｈ４を固定化していないウェルを陰性コントロールとして設けた。インキュベート後に、固定されていない抗原を取り除き、３％のＢＳＡを含むＰＢＳでウェルを満たして４℃で一晩インキュベートした。この工程によりプレート表面の非特異的結合能をブロックし、ＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。
実施例２により得られた複数のハイブリドーマ株の培養上清を、それぞれ０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで２倍に希釈して上清サンプルを調製した。上記ＥＬＩＳＡ用プレートのウェルからバッファーを取り除いた後に、上清サンプルを添加し、室温で二時間インキュベートした。プレートを洗浄して非結合の抗体を取り除いた後に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＧＥヘルスケア社）を添加して１時間インキュベートした。ウェルを洗浄した後に、ペルオキシダーゼ基質（ＢＤバイオサイエンス社）を添加して３０分間インキュベートし、さらに、０．１Ｍ以上の濃度の硫酸溶液を加え発色反応を停止させた。各ウェル内の溶液の４５０ｎｍ波長の吸収を測定することにより、上清サンプル中にＢ７−Ｈ４を認識する抗体が含まれるかどうかを調べた。
上記ＥＬＩＳＡ法の結果を表１に示す。本研究では、上清サンプル中の抗Ｂ７−Ｈ４抗体が含まれていると判断する指標として、Ｂ７−Ｈ４固定化ウェルにおける吸光度が１．０以上であり、且つ、陰性コントロールウェルにおける吸光度が０．１以下であるという条件を設けた。実験結果を表１に示す。ハイブリドーマクローン＃１８、＃２１、＃２５、＃５１、＃７７、＃７９、＃１１３、＃１２１、＃１４０、＃１６０、＃１６７、及び＃２０９由来の上清サンプルは上記条件を満たしていたことから、抗Ｂ７−Ｈ４抗体が含まれていると判断した。すなわち、以上の結果から、抗Ｂ７−Ｈ４抗体産生能を有する１２株のハイブリドーマが得られたことが明らかとなった（表１）。これらのハイブリドーマクローンは引き続き二次単離を行い、同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で抗体産生能を再度確認した後に、−１５０℃環境下で保存した。
なお、本発明者らは、ハイブリドーマクローン＃１８、＃２１、＃２５、＃５１、＃７７、＃７９、＃１１３、＃１２１、＃１４０、＃１６０、＃１６７、及び＃２０９のから産生される抗Ｂ７−Ｈ４モノクローナル抗体を、それぞれＨ４．０１８、Ｈ４．０２１、Ｈ４．０２５、Ｈ４．０５１、Ｈ４．０７７、Ｈ４．０７９、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１２１、Ｈ４．１４０、Ｈ４．１６０、Ｈ４．１６７、Ｈ４．２０９と命名した。また、以下、これらの抗体を「本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体」と称する場合がある。【００３９】
【表１】
2018021301.tif 000002
【実施例４】
【００４０】
［抗体の結合能についての一次選別］
上記本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体のうち、十分な量の精製ができた８種の抗体（Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．０５１、Ｈ４．０７９、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１４０、Ｈ４．１６０、及びＨ４．２０９）について、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により特異性及び結合能を調べた。
具体的には、Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．０５１、Ｈ４．０７９、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１４０、Ｈ４．１６０、及びＨ４．２０９をそれぞれ５μｇ／ｍｌの濃度となるようにＰＢＳで希釈して、９６穴インモビライザーアミノプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）のウェルに添加し、室温で１時間インキュベートすることにより固定化した。非固定の抗体を取り除いた後、３％ＢＳＡを含むＰＢＳでウェルを満たして室温で２時間インキュベートすることによりプレート表面の非特異的結合能をブロックし、サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。
次に、実施例１で作製した遊離型抗原タンパク質（遊離型Ｂ７−Ｈ４、遊離型Ｂ７−Ｈ１、又は遊離型Ｂ７−ＤＣ）を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで希釈し、各抗原タンパク質を０．０１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で含む希釈溶液を作製した。サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートからバッファーを取り除いた後に、各抗原タンパク質の希釈溶液をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。非結合の抗原を取り除いた後、全てのウェルにビオチン化したＨ４．０２５（２μｇ／ｍｌ）を添加し、室温で３０分インキュベートした。非結合のビオチン化Ｈ４．０２５を取り除いた後に、希釈したストレプトアビジン結合ＨＲＰ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）をウェルに入れビオチン化抗体と結合させた。ウェルを洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質（ＢＤバイオサイエンス）をウェルに入れ３０分インキュベートし、０．１Ｍ以上の硫酸用液を加え発色反応を停止させた後、４５０ｎｍ波長の吸収を測定した。
上記サンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を図１及び２に示す。Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ１、及びＢ７−ＤＣに対する本発明の抗体の結合能を調べた結果、実験に用いた８種の抗体（Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．０５１、Ｈ４．０７９、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１４０、Ｈ４．１６０、及びＨ４．２０９）はいずれもＢ７−Ｈ４と特異的に結合し、Ｂ７−Ｈ１又はＢ７−ＤＣには結合しないことが明らかとなった（図１）。また、異なる濃度のＢ７−Ｈ４に対する本発明の抗体の結合能を調べた結果、実験に用いた６種の抗体（Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．０５１、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１４０、及びＨ４．２０９）はいずれもＢ７−Ｈ４濃度依存的に結合が増加することが明らかとなった（図２）。
【実施例５】
【００４１】
［抗体の結合能についての二次選別］
実施例４により、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体が遊離型Ｂ７−Ｈ４を特異的に認識できることが明らかとなった。そこで次の実験では、細胞表面上に発現するＢ７−Ｈ４に対する本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体の結合能を、免疫染色により調べた。
具体的には、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体のうち、９種の抗体（Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．０５１、Ｈ４．０７９、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１２１、Ｈ４．１４０、Ｈ４．１６０、及びＨ４．２０９）を、それぞれ８μｇ／ｍｌの濃度に調製して一次抗体溶液を作製し、実施例１で作製した「Ｂ７−Ｈ４発現２９３Ｆ細胞」又は「コントロール２９３Ｆ細胞」と混合した。また、ポジティブコントロールとして、市販の抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ７４クローン、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）を同様に「Ｂ７−Ｈ４発現２９３Ｆ細胞」又は「コントロール２９３Ｆ細胞」と混合した。４℃で３０分間インキュベートした後に、Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）標識ポリクローナル抗マウスイムノグロブリン抗体（４μｇ／ｍｌ）を加え、さらに４℃で３０分間インキュベートし、各細胞の染色強度をフローサイトメーターＦＡＣＳＴＭＣａｎｔｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。
図３に結果を示すように、Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１２１、及びＨ４．２０９により、Ｂ７−Ｈ４発現２９３Ｆ細胞が染色されることが明らかとなった。特に、Ｈ４．０１８及びＨ４．０２５を用いた場合には、強いシグナルが得られることが明らかとなった。
【実施例６】
【００４２】
［がん細胞への抗体の結合能］
次に、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体が、Ｂ７−Ｈ４を発現するがん細胞への結合能を有するかを調べた。
複数のがん細胞株におけるＢ７−Ｈ４の発現を、市販の抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ７４クローン）を用いて確認した（なお、この実験に用いたがん細胞株は、全てアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、又は国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより購入した）。具体的には、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（乳がん細胞株）、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞（肺扁平上皮がん細胞株）ＣＡＬ２７細胞（頭頚がん細胞株）、ＭＫＮ７４細胞（胃がん細胞株）、及びＣＯＬＯ２０１細胞（大腸がん細胞株）を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培養液を用いて３６時間以上の培養した後、市販のフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ７４クローン、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＩｎｃ．）を添加して４℃で３０分間インキュベートした。細胞の染色強度は、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。
図４に結果を示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ７４クローン）により染色されたが、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞、ＣＡＬ２７細胞、ＭＫＮ７４細胞、及びＣＯＬＯ２０１細胞では抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ７４クローン）による染色は認められなかった。以上の結果から、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は細胞表面上にＢ７−Ｈ４を発現することが明らかとなった。また、この結果は、定量ＰＣＲの結果とも一致していた。
次に、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞と本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体との結合を調べた。具体的には、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体のうち、４種の抗体（Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．１１３、Ｈ４．２０９）を１０μｇ／ｍｌの濃度でＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に添加し、次のｉ）〜iv）の条件でインキュベートした。
ｉ）４℃で３０分間、０．１％アジ化ナトリウムを添加した条件；
ii）室温で３０分間、０．１％アジ化ナトリウムを添加した条件；
iii）室温で３０分間、アジ化ナトリウムを添加しない条件；
iv）３７度で１８時間、５％ＣＯ２培養条件；
インキュベート後に、二次抗体としてＰＥ標識ポリクローナル抗マウスイムノグロブリン抗体を４μｇ／ｍｌの濃度で添加して、４℃で３０分間インキュベートし、フローサイトメーターＦＡＣＳＴＭＣａｎｔｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞の染色強度を測定した。
結果を図５に示す。Ｈ４．１１３及びＨ４．２０９を用いた場合、上記ｉ）〜iv）のいずれのインキュベート条件でも、染色シグナルは得られなかった。一方、Ｈ４．０１８及びＨ４．０２５を用いた場合、上記ｉ）及びii）のインキュベート条件では染色シグナルが認められたが、上記iii）及びiv）のインキュベート条件では染色シグナルはほとんど認められなかった。以上の結果から、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ４．０１８及びＨ４．０２５）は、がん細胞の膜表面上に発現するＢ７−Ｈ４とは結合するものの、その結合は不安定であることが示唆された。特に生体内に近い条件である、インキュベート条件iv）では、Ｈ４．０１８及びＨ４．０２５のいずれの抗体でも結合が認められなかった。
以上の実施例３〜６の結果により、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体のなかでも、特にＨ４．０２５は遊離型Ｂ７−Ｈ４に対して優れた結合能を有するが、がん細胞の膜表面上に発現するＢ７−Ｈ４に対しては安定した結合を維持することが困難である可能性が示唆された。これらの結果から、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体は、単独では、十分な抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ；Antibody-Dependent-Cellular-Cytotoxicity）活性を有さない可能性が考えられた。
【実施例７】
【００４３】
［抗Ｂ７−Ｈ４抗体とエフェクター細胞との複合体の作製］
そこで本発明者らは、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体と、エフェクター細胞とを予め結合させることにより、抗体依存性の細胞傷害(ＡＤＣＣ）を誘導できるのではないかと考え、抗Ｂ７−Ｈ４抗体を纏ったエフェクター細胞を作製した（以下、かかる細胞を「抗Ｂ７−Ｈ４抗体−エフェクター細胞複合体」と称する場合がある）。
具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ）を用いて、常法に従って、ヒト末梢血より単核球画分を比重分離した。次に、抗ＣＤ１４マイクロビーズ及び抗ＣＤ１９マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｋ．Ｋ．）を用いたネガティブセレクションを行い、上記単核球画分からＴ細胞を濃縮して、エフェクター細胞を調製した。なお、上記ネガティブセレクションは、使用したビーズに添付の説明書に記載の手法に従って行った。
得られたエフェクター細胞と、高濃度（０．２ｍｇ／ｍｌ）の抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３クローン；ＡＴＣＣより購入した）とを氷水中で１０分間反応させた後に、未結合の抗体を洗浄し、０．５ｍｇ／ｍｌのラビット抗マウスイムノグロブリンポリクローナル抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）をさらに加えて氷水中で１０分間反応させた。反応後に未結合の抗体を洗浄し、０．５ｍｇ／ｍｌの抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．１１３、又はＨ４．２０９）を加えて氷水中で１０分間反応させた。最後に、未結合の抗体を洗浄することにより、抗Ｂ７−Ｈ４抗体を纏ったエフェクター細胞を作製した。すなわち、図６（ａ）に示すように、ここで作製された「抗Ｂ７−Ｈ４抗体−エフェクター細胞複合体」は、抗ＣＤ３抗体及び抗マウスＩｇＧ抗体を介して、エフェクター細胞と抗Ｂ７−Ｈ４抗体とを間接的に結合させた細胞である。
なお、以下、Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．１１３、又はＨ４．２０９を用いて作製した「抗Ｂ７−Ｈ４抗体−エフェクター細胞複合体」を、それぞれ「Ｈ４．０１８−エフェクター細胞複合体」、「Ｈ４．０２５−エフェクター細胞複合体」、「Ｈ４．１１３−エフェクター細胞複合体」、「Ｈ４．２０９−エフェクター細胞複合体」と称する場合がある。
【実施例８】
【００４４】
［細胞傷害性アッセイ］
実施例７により作製した「抗Ｂ７−Ｈ４抗体−エフェクター細胞複合体」の間接的な抗体依存性細胞傷害（indirect ADCC：ｉＡＤＣＣ）活性を調べた。
具体的には、ＤＥＬＦＩＡ ＥｕＴＤＡ非放射性細胞毒性検出キット（パーキンエルマー社製、製造番号ＡＤ０１１６）を用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（Ｂ７−Ｈ４を発現するがん細胞）を蛍光キレート剤（ＴＤＡ）で標識した（以下、かかる細胞を「ＴＤＡ標識がん細胞」と記載する場合がある）。ＴＤＡ標識がん細胞の細胞内に存在するＴＤＡは、細胞溶解によって上清中に放出される。この上清にユーロピウム（Ｅｕ）溶液を反応させると強い蛍光を示す安定なキレート（ＥｕＴＤＡ）が形成されるので、蛍光強度を測定することにより、細胞傷害性の程度を評価することができる。
４℃条件下で、ＴＤＡ標識がん細胞を９６ウェルＵ底プレートに播種し（１００００細胞／ウェル）、さらに、実施例７で作製した抗Ｂ７−Ｈ４抗体−エフェクター細胞複合体を加えて混合した。プレートを４℃、２００Ｇで１分間遠心することにより細胞を沈殿させ、その後、３７℃、５％ＣＯ２環境下で３時間反応させた。反応後の上清を回収して、プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯｓｘマルチラベルカウンター；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて蛍光強度を測定した。なお、測定はプレートリーダーに添付された指示書に従って、通常の手法により行った。得られたシグナルから、ＴＤＡ標識がん細胞の傷害の程度（溶解の起こった細胞の割合）を算出した。
結果を図６（ｂ）に示す。アッセイに用いた抗Ｂ７−Ｈ４抗体−エフェクター細胞複合体のうち、Ｈ４．０２５−エフェクター細胞複合体では、標的細胞（ＴＤＡ標識がん細胞）に対するその割合が増加するのに依存して、上清中の蛍光発光が有意に増加することが明らかとなった。一方、Ｈ４．０１８−エフェクター細胞複合体、Ｈ４．１１３−エフェクター細胞複合体、及びＨ４．２０９−エフェクター細胞複合体では、標的細胞に対するその割合が増加しても、蛍光発光の有意な増加は認められなかった。以上の結果から、少なくともＨ４．０２５−エフェクター細胞複合体は、標的がん細胞に対して細胞傷害活性を有することが明らかとなった。
【実施例９】
【００４５】
［抗体のアミノ酸配列及び核酸配列］
本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体のうち、実施例３〜５の結果から優れた親和性及び特異性が認められた７種の抗体（Ｈ４．０１８、Ｈ４．０２５、Ｈ４．０５１、Ｈ４．１１３、Ｈ４．１２１、Ｈ４．１４０、Ｈ４．２０９）について、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の核酸配列及びアミノ酸配列を解析した。
（１）Ｈ４．０１８
Ｈ４．０１８の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）を図７に示す。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
（２）Ｈ４．０２５
Ｈ４．０２５の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号３）及びアミノ酸配列（配列番号４）を図８に示す。また、Ｈ４．０２５の軽鎖はκ鎖とλ鎖の２種類が存在していた。Ｈ４．０２５の軽鎖可変領域（κ鎖）の核酸配列（配列番号５）及びアミノ酸配列（配列番号６）を図９に、Ｈ４．０２５の軽鎖可変領域（λ鎖）の核酸配列（配列番号７）及びアミノ酸配列（配列番号８）を図１０にそれぞれ示す。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
（３）Ｈ４．０５１
Ｈ４．０５１の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号９）及びアミノ酸配列（配列番号１０）を図１１に示す。また、Ｈ４．０５１の軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号１１）及びアミノ酸配列（配列番号１２）を図１２に示す。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
（４）Ｈ４．１１３
Ｈ４．１１３の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号１３）及びアミノ酸配列（配列番号１４）を図１３に示す。また、Ｈ４．１１３の軽鎖はκ鎖とλ鎖の２種類が存在していた。Ｈ４．１１３の軽鎖可変領域（κ鎖）の核酸配列（配列番号１５）及びアミノ酸配列（配列番号１６）を図１４に、Ｈ４．１１３の軽鎖可変領域（λ鎖）の核酸配列（配列番号１７）及びアミノ酸配列（配列番号１８）を図１５にそれぞれ示す。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
（５）Ｈ４．１２１
Ｈ４．１２１の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号１９）及びアミノ酸配列（配列番号２０）を図１６に示す。また、Ｈ４．１２１の軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号２１）及びアミノ酸配列（配列番号２２）を図１７に示す。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
（６）Ｈ４．１４０
Ｈ４．１４０の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号２３）及びアミノ酸配列（配列番号２４）を図１８に示す。また、Ｈ４．１４０の軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号２５）及びアミノ酸配列（配列番号２６）を図１９に示す。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
（７）Ｈ４．２０９
Ｈ４．２０９の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号２７）及びアミノ酸配列（配列番号２８）を図２０に示す。また、Ｈ４．２０９の軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号２９）及びアミノ酸配列（配列番号３０）を図２１に示す。なお、図中の網掛け部分はＣＤＲ３領域を示す。
【実施例１０】
【００４６】
［二重特異性抗体の作製］
本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体のアミノ酸配列情報を基に、Ｂ７−Ｈ４抗原とＴ細胞のＣＤ３抗原の両方に結合する二重特異性抗体(ＢｓＡｂ)を作製することができる（以下、かかる抗体を「本発明のＢｓＡｂ」と称する場合がある）。
本発明のＢｓＡｂは、例えば、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列、抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、及び抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を、それぞれリンカーを挟んで、或は直接連結させることにより作製できる。図２２に、Ｈ４．０２５の軽鎖λ鎖可変領域及びＨ４．０２５の重鎖可変領域を用いたＢｓＡｂの構造を示す。また、かかるＢｓＡｂの核酸配列（配列番号３１）及びアミノ酸配列（配列番号３２）を、図２３−１〜図２３−３に示す。本発明者らが作製した２種類の本発明のＢｓＡｂについて、以下の実施例１２及び１３において詳細に述べる。
【実施例１１】
【００４７】
［ＢｓＡｂ−エフェクター細胞複合体による細胞傷害性アッセイ］
本発明のＢｓＡｂとエフェクター細胞とを結合させ、ＢｓＡｂ−エフェクター細胞複合体を作製する。具体的には、実施例７と同様の方法によりエフェクター細胞を調製し、本発明のＢｓＡｂを４℃又は室温又は３７℃の環境下で結合させることにより、ＢｓＡｂ−エフェクター細胞複合体を形成させる。さらに、ＢｓＡｂ−エフェクター細胞複合体を用いてＡＤＣＣの誘導を試みる。
【実施例１２】
【００４８】
［ＢｓＡｂの作製：ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ］
発明者らは、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体のアミノ酸配列を含む一本鎖抗体と、抗ＣＤ３抗体のアミノ酸配列を含む一本鎖抗体とを連結させたＢｓＡｂ（single chain fragment variable-single chain fragment variable抗体；ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ）を作製した（以下、かかる抗体を「本発明のｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ」と称する場合がある）。
具体的には、本発明のｓｃＦｖ−ｓｃＦｖは、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列、抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、それぞれリンカーを挟んで連結させることにより作製した。図２４に、Ｈ４．０２５の軽鎖可変領域及びＨ４．０２５の重鎖可変領域を用いた本発明のｓｃＦｖ−ｓｃＦｖの構造を示す。また、かかるｓｃＦｖ−ｓｃＦｖの核酸配列（配列番号３６）及びアミノ酸配列（配列番号３７）を、図２５に示す。なお、配列番号３６は、Ｈ４．０２５の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むが、かかる塩基配列は大腸菌発現系を用いることを想定してコドン最適化を行っているため、配列番号３、５、及び７とは異なっている。配列番号３６及び３７において、Ｈ４．０２５の軽鎖及び重鎖可変領域に対応する領域は次の通りである（表２）。
＜軽鎖可変領域＞
配列番号３６の第７６番目（ａ）から第３７８番目（ｔ）までの領域は、配列番号５の第１０番目（ａ）から第３１２番目（ｔ）までの領域に対応する。
配列番号３７の第２６番目（Ｍｅｔ）から第１２６番目（Ｇｌｙ）までの領域は、配列番号６の第４番目（Ｍｅｔ）から第１０４番目（Ｇｌｙ）までの領域に対応する。
＜重鎖可変領域＞
配列番号３６の第４４８番目（ｇ）から第７８０番目（ｔ）までの領域は、配列番号３の全長に対応する。
配列番号３７の第１５０番目（Ｇｌｕ）から第２６０番目（Ｇｌｙ）までの領域は、配列番号４の全長に対応する。【００４９】
【表２】
2018021301.tif 000003
【実施例１３】
【００５０】
［ＢｓＡｂの作製：Ｆａｂ−ｓｃＦｖ］
さらに、発明者らは、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体のアミノ酸配列を含むＦａｂ抗体と、抗ＣＤ３抗体のアミノ酸配列を含む一本鎖抗体と組み合わせたＢｓＡｂ（fraction antigen binding-single chain fragment variable；Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）を作製した（以下、かかる抗体を「本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖ」と称する場合がある）。
具体的には、本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖは、本発明の抗Ｂ７−Ｈ４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、及びヒトイムノグロブリンの定常領域（ＣＬ）のアミノ酸配列を含む短鎖と、抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列、ヒトイムノグロブリンの定常領域（ＣＨ１）のアミノ酸配列、抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む長鎖とを、ジスルフィド結合によって結合させることによって作製した。図２６に、Ｈ４．０２５の軽鎖可変領域及びＨ４．０２５の重鎖可変領域を用いたＦａｂ−ｓｃＦｖの構造を示す。また、図２７〜２８に、かかるＦａｂ−ｓｃＦｖの長鎖の核酸配列及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号３８及び３９）と、短鎖の核酸配列及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号４０及び４１）とを示す。なお、配列番号３８及び４０は、Ｈ４．０２５の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むが、かかる塩基配列は大腸菌発現系を用いることを想定してコドン最適化を行っているため、配列番号３、５、及び７とは異なっている。配列番号３８〜４１において、Ｈ４．０２５の軽鎖及び重鎖可変領域に対応する領域は次の通りである（表３）。
＜軽鎖可変領域＞
配列番号４０の第７６番目（ａ）から第３７８番目（ｔ）までの領域は、配列番号５の第１０番目（ａ）から第３１２番目（ｔ）までの領域に対応する。
配列番号４１の第２６番目（Ｍｅｔ）から第１２６番目（Ｇｌｙ）までの領域は、配列番号６の第４番目（Ｍｅｔ）から第１０４番目（Ｇｌｙ）までの領域に対応する。
＜重鎖可変領域＞
配列番号３８の第６４番目（ｃ）から第３９０番目（ｔ）までの領域は、配列番号３の第７番目（ｃ）から第３３３番目（ｔ）までの領域に対応する。
配列番号３９の第２２番目（Ｇｌｎ）から第１３０番目（Ｇｌｙ）までの領域は、配列番号４の第３番目（Ｇｌｎ）から第１１１番目（Ｇｌｙ）までの領域に対応する。【００５１】
【表３】
2018021301.tif 000004
【実施例１４】
【００５２】
［がん細胞への二重特異性抗体の結合能］
次に、本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖが、Ｂ７−Ｈ４を発現するがん細胞への結合能を有するかを実施例６と同様の方法で調べた。
具体的には、４種の乳がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＳＫＢＲ３細胞、ＺＲ７５細胞）を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培養液を用いて３６時間以上培養した。続いて、蛍光色素Ｃｙ５．５で標識した本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖ、又は無標識抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ４.０２５）を上記培養細胞に添加して、４℃で３０分間インキュベートした。抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ４.０２５）を添加した細胞は、インキュベート後に洗浄して抗Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）標識ポリクローナル抗マウスイムノグロブリン抗体（４μｇ／ｍｌ）を加え、さらに、４℃で３０分間インキュベートした。細胞の染色強度は、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。図２９に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞及びＺＲ７５細胞は、抗Ｂ７−Ｈ４抗体（Ｈ４.０２５）及び本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖにより染色されたが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＳＫＢＲ３細胞はどちらの抗体でも染色されなかった。以上の結果から、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞及びＺＲ７５細胞はＢ７−Ｈ４を発現するが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はＢ７−Ｈ４を発現しないことが明らかとなった。
【実施例１５】
【００５３】
［本発明のＢｓＡｂによる細胞傷害性アッセイ］
がん細胞株に対する、本発明のＢｓＡｂ（本発明のｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−ｓｃＦｖ）の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を調べた。
具体的には、実施例７に記載の方法によって調製したヒト末梢血単核球画分に、がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞）と本発明のＢｓＡｂとを加え、３７℃、５％ＣＯ２環境下で１６時間反応させた。培養上清を回収し、TAKARA LDH Cytotoxicity Detection Kit（タカラバイオ株式会社）を用いて死細胞数を測定し、がん細胞に対する傷害能（％Ｌｙｓｉｓ）及び５０％最大作用濃度（ＥＣ５０）を算出した。図３０に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に対する５０％最大作用濃度（ＥＣ５０）は、本発明のｓｃＦｖ−ｓｃＦｖでは６８ｎｇ／ｍｌであり、本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖでは１３ｎｇ／ｍｌであった。また、図３１に示すように、ＺＲ−７５細胞（Ｂ７−Ｈ４発現陽性；図２９参照のこと）に対しては、本発明のＢｓＡｂ依存性の細胞傷害が認められたが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（Ｂ７−Ｈ４発現陰性；図２９参照のこと）、ＳＫＢＲ３細胞（Ｂ７−Ｈ４発現陰性；図２９参照のこと）、及びＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞（肺扁平上皮がん細胞）に対しては、本発明のＢｓＡｂ依存性の細胞傷害活性は認められなかった。
【実施例１６】
【００５４】
［担がんマウスに及ぼす本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖの影響］
次に、マウスに移植したヒト腫瘍に対して、本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖが抗腫瘍効果を示すことが出来るかどうかを検討した。
具体的には、ＭＨＣノックアウトＮＯＧマウス（ＮＯＤ/Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ,ＩＬ−２ＲγＫＯ,ＩaβＫＯ，β２ｍＫＯ、実験動物中央研究所）にヒト末梢血単核球を移植し、翌日、乳がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞株）又は肺がん細胞株（ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞株）を移植した。がん細胞株の移植から２週間目以降に、本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖをマウス１匹あたり０．２μｇから２００μｇの範囲で投与した。具体的には、腫瘍サイズの確認実験に用いたマウス（図３２）には、本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖを１回当り５μｇ／２０ｇ体重で投与し、染色実験に用いたマウス（図３３及び３４）には、０．２μｇ、２μｇ、２０μｇ、及び２００μｇの本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖを３〜４日の間隔で、４回の漸増投与を行った。
図３２に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の移植により形成された腫瘍のサイズは、本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖの投与により縮小することが明らかとなった。一方、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞の移植により形成された腫瘍のサイズは、本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖの投与による影響を受けなかった。また、図３３に示すように、腫瘍組織切片のヘマトキシリンエオジン染色を行った結果、本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖを投与した担がんマウスにおいては、腫瘍内のがん細胞が消滅することが明らかとなった。さらに、図３４に示すように、腫瘍組織切片の免疫組織染色の結果、本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖを投与した担がんマウスにおいては、腫瘍内へのＣＤ８陽性キラーＴ細胞の浸潤が確認できるとともに、Ｂ７−Ｈ４陽性のがん細胞の消滅も確認できた。
【実施例１７】
【００５５】
［担がんマウスにおける本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖの局在］
マウスに投与した本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖがマウス異種移植腫瘍に集積するかどうかを確認した。
具体的には、ＭＨＣノックアウトＮＯＧマウス(実験動物中央研究所)に、がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）を移植し、２週間目以降に、蛍光色素Ｃｙ５．５でラベルした本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖをマウス１匹あたり０．５マイクログラムから２００マイクログラムの範囲で投与した。図３５に示すように、本発明のＦａｂ−ｓｃＦｖは、投与後２８日目までの間、移植腫瘍組織に集積することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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