(57)【要約】本発明は安全かつ調製が容易な、肝線維症などの臓器線維症の予防及び／又は治療のための細胞製剤を提供することを課題とし、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む、肝線維症などの臓器線維症を予防及び／又は治療するための細胞製剤を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞を含む、臓器線維症を予防及び／又は治療するための細胞製剤。
【請求項２】
臓器線維症が、消化器、呼吸器、循環器、泌尿生殖器、運動器、脳神経系、内分泌器官、もしくは皮膚に生じる線維症である、請求項１に記載の細胞製剤。
【請求項３】
臓器線維症が、消化器に生じる線維症である、請求項２に記載の細胞製剤。
【請求項４】
臓器線維症が、肝線維症である、請求項３に記載の細胞製剤。
【請求項５】
前記多能性幹細胞が、肝芽細胞または肝細胞マーカーを発現する細胞へと分化する能力を有する、請求項４に記載の細胞製剤。
【請求項６】
対象に投与した時に、非投与対照と比較して、血清総ビリルビン及び／又は血清アルブミン値を改善させる、請求項４または５に記載の細胞製剤。
【請求項７】
臓器線維症が、皮膚に生じる線維症である、請求項２に記載の細胞製剤。
【請求項８】
臓器線維症が、肺に生じる線維症である、請求項２に記載の細胞製剤。
【請求項９】
前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
【請求項１０】
生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞を含む、組織線維化の抑制および／または線維化組織の溶解のための、細胞製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療における細胞製剤に関する。より具体的には、線維化が生じた臓器の修復及び再生に有効な多能性幹細胞を含有する細胞製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器線維症は、微生物、化学物質、免疫反応など生体内の反応、食習慣、環境、遺伝的背景など様々な原因(原因不明も含む)により生じる感染、炎症、脂肪等生体内物質の蓄積、組織・細胞の変性等により臓器に傷害・壊死等を受けた後、十分に再生せず、結合組織が増加して線維化することにより生じる疾患であり、肝臓、肺、心臓、腎臓、脳神経系などの各種臓器のほか、筋肉、骨や皮膚など多くの臓器や組織に生じることが知られている。【０００３】
肝臓に生じる線維症である肝硬変は、様々な原因による肝臓疾患が慢性的に進行した末に最終的に到達する病態であり、機能的肝細胞の減少と線維組織の増生による肝機能の著しい低下をきたす。肝硬変の患者数は日本では約３０万人、世界中では約２０００万人いるとされているが、肝硬変による深刻な肝不全に対する有効な内科的治療法は確立していない。現状では、様々な対症療法により慢性の肝疾患から肝硬変への進行を如何に遅らせるかが主要な治療法である。【０００４】
肺線維症には、間質性肺炎などの肺炎にともなう肺損傷に起因する線維症のほか、原因不明の特発性肺線維症があり、咳、胸痛、呼吸困難などを発症する予後不良の疾患である。心筋線維症は、冠循環不全や感染・免疫反応などによる心筋症、および弁膜症などを原疾患として心筋や心臓弁の組織が線維化するものであり、進行すると心不全状態に至る。
腎臓では、慢性腎臓病の進行にともない腎臓組織内に線維化を来たすと、腎機能が急激に悪化して回復が不可能な状態に達する。このように、様々な臓器、組織において原疾患の進行にともなって臓器・組織の線維化が生じていくことが知られているが、いずれの疾患でも線維化の進展は、当該臓器、組織の機能の不可逆的な悪化をきたす極めて予後不良な、現在の医学では治療困難な病態である。【０００５】
肝硬変では唯一有効な治療法として肝臓移植があるが、これには臓器提供者の不足、高い医療コスト、生体肝移植の場合にはドナーに対するリスクなど多くの問題を抱えている。また、肝移植を必要とする肝移植待機者が年々増加するのにもかかわらず臓器提供者が不足しているため移植を待つ間に死亡する移植待機中死亡者の増加も大きな課題である。【０００６】
近年、病態臓器の移植治療にとって代わり得る治療法として幹細胞移植が注目されている。たとえば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、慢性肝疾患における肝線維化および炎症を抑制させることが報告されている（例えば、非特許文献１）。しかし、ＭＳＣは、傷害を受けた肝組織への生着および新規肝細胞の形成の頻度が低く、線維化抑制や炎症低減の効果のほとんどはＭＳＣに基づく抗炎症作用、線維化抑制因子や保護因子産生に起因するものであった（例えば、非特許文献２）。また、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から肝前駆細胞を誘導し、肝内に移植する研究も進んでいるが、混在する未分化細胞の存在やゲノムの不安定性によるがん化など、克服すべき重要な課題が残されている。従って、機能的肝細胞の補充を行うことができる効率の良い幹細胞療法によって、根本的解決策が提供されることが望まれている。【０００７】
本発明者らの一人である出澤の研究により、間葉系細胞画分に存在し、遺伝子導入やサイトカイン等による誘導操作なしに得られる、ＳＳＥＡ−３（Ｓｔａｇｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ−３）を表面抗原として発現している多能性幹細胞（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ；Ｍｕｓｅ細胞）が間葉系細胞画分の有する多能性を担っており、組織再生を目指した疾患治療に応用できる可能性があることが分かってきた（特許文献１；非特許文献３〜５）。しかしながら、線維症の予防及び／又は治療にＭｕｓｅ細胞を使用し、期待される治療効果が得られることを明らかにした例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第5185443号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Transplantation 2004; 78: 83-88
【非特許文献２】The Journal of surgical research 2014; 186: 408-416
【非特許文献３】Proc. Natl．Acad．Sci．USA，2010; 107: 8639-8643
【非特許文献４】Proc. Natl．Acad．Sci．USA，2011; 108: 9875-9880
【非特許文献５】Nat. Protc., 2013; 8: 1391-1415
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、臓器線維症の予防及び／又は治療のための細胞製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ヒト細胞を拒絶しない免疫不全マウスの肝線維症モデルにおいて、ヒトＭｕｓｅ細胞を血管内投与することにより、Ｍｕｓｅ細胞が傷害された肝臓に集積・生着して傷害肝臓を再建及び修復し、肝機能の改善又は回復をもたらすことを見出し、それにより、Ｍｕｓｅ細胞が肝線維症をはじめとした臓器線維症の治療や予防に好適に使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞を含む、臓器線維症を予防及び／又は治療するための細胞製剤。
［２］臓器線維症が、消化器、呼吸器、循環器、泌尿生殖器、運動器、脳神経系、内分泌器官、もしくは皮膚に生じる線維症である、［１］に記載の細胞製剤。
［３］臓器線維症が、消化器に生じる線維症である、［２］に記載の細胞製剤。
［４］臓器線維症が、肝線維症である、［３］に記載の細胞製剤。
［５］前記多能性幹細胞が、肝芽細胞または肝細胞マーカーを発現する細胞へと分化する能力を有する、［４］に記載の細胞製剤。
［６］対象に投与した時に、非投与対照と比較して、血清総ビリルビン及び／又は血清アルブミン値を改善させる、［４］または［５］に記載の細胞製剤。
［７］臓器線維症が、皮膚に生じる線維症である、［２］に記載の細胞製剤。
［８］臓器線維症が、肺に生じる線維症である、［２］に記載の細胞製剤。
［９］前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
[１０]生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞を含む、組織線維化の抑制および／または線維化組織の溶解のための、細胞製剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明では、線維症を患っている対象に対し、Ｍｕｓｅ細胞を血管等から投与あるいは対象臓器およびその周辺に直接投与することにより、線維化傷害臓器に集積したＭｕｓｅ細胞が線維化の進展を抑制あるいは形成されている線維組織を溶解するとともに、当該臓器を構成する細胞に自ら分化するという再生メカニズムによって、線維症における線維組織を消失させ、臓器の機能を改善させることができる。【００１４】
Ｍｕｓｅ細胞は、傷害を受けた肝臓等の臓器へ効率的に遊走して生着することができ、生着した部位で肝細胞等の肝構成細胞へと自発的に分化するので移植に先立って治療対象細胞への分化誘導が不要である。また、非腫瘍形成性であり安全性にも優れる。さらに、Ｍｕｓｅ細胞は免疫拒絶を受けないことから、ドナーから製造された他家製剤による治療も可能である。従って、上記に示す優れた性能を有するＭｕｓｅ細胞によって、臓器線維症患者の治療に対する容易に実行可能な手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｍｕｓｅ細胞のキャラクタリゼーション。（Ａ）ヒトＢＭ−ＭＳＣより選別されたＳＳＥＡ−３（＋）−Ｍｕｓｅ細胞（ゲートＰ３）およびＳＳＥＡ−３（−）−非Ｍｕｓｅ細胞（ゲートＰ６）。上段は染色無し、中段は二次抗体のみ、下段はＳＳＥＡ−３抗体。（Ｂ）Ｍクラスター、Ｍｕｓｅ細胞、非Ｍｕｓｅ細胞におけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮａｎｏｇに対するＱ−ＰＣＲの結果を示す。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１。（Ｃ）ゼラチンコートディッシュ上の単一のＭクラスターから増殖した細胞の顕微鏡写真。（Ｄ）ゼラチンコート培養皿上の単一のＭクラスターから増殖した細胞の免疫染色結果を示す顕微鏡写真。ＤＬＫ、α−フェトプロテイン、サイトケラチン１９、およびサイトケラチン１８の各マーカーで染色した。スケールバー：５０μｍ。
【図２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、Ｍｕｓｅ細胞の、四塩化炭素（ＣＣｌ４）投与前（intact）、投与１、２４、４８時間後の動物から得た血清および肝臓への遊走についての結果を示す。非Ｍｕｓｅ細胞で観察される遊走に比べ、Ｍｕｓｅ細胞は、（Ａ）血清および（Ｂ）肝組織に高い効率で遊走した。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３】２４ｈｒｓ−ＣＣｌ４処理肝傷害モデルにおけるＭｕｓｅ細胞および非Ｍｕｓｅ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ動態についての結果を示す。（Ａ）ＣＣｌ４処理した群および非傷害群に対し、ヒトＭｕｓｅ細胞または非Ｍｕｓｅ細胞を静脈注射した２週間後の肝臓中に存在するヒトゲノム特異的Ａｌｕ配列の定量結果を示す。（Ｂ）細胞注入後３０日目の時点における肝臓のhuman golgi（Ｈ−Ｇｏｌｇｉ) 免疫染色（ヒト細胞のゴルジ体を標識するため、マウス肝臓内に生着したヒトMuse細胞の局在を反映する）の結果を示す顕微鏡写真。（Ｃ）肝臓切片における、１ｍｍ２あたりの総細胞数に対するＨ−Ｇｏｌｇｉ（＋）細胞の数を示す。＊＊＊：Ｐ＜０．００１。（Ｄ，Ｅ）Ｈ−Ｇｏｌｇｉ／ヒトミトコンドリアおよび肝細胞マーカーＨｅｐＰａｒ−１に対する二重染色の結果を示す顕微鏡写真。スケールバー：５０μｍ。
【図４】肝線維症モデルにおける機能的および組織学的評価を示す。（Ａ）ＣＣｌ４処理による肝線維症モデルマウスの作製手順とＭｕｓｅ細胞投与手順を示す。（Ｂ，Ｃ）ＣＣｌ４処理開始後８週目のＭｕｓｅ群、溶媒群、および非Ｍｕｓｅ群における血清総ビリルビン（Ｂ）および血清アルブミン（Ｃ）濃度を示す。（Ｄ，Ｅ）シリウスレッド染色（Ｄ）およびマッソン・トリクローム染色（Ｅ）による、肝線維化面積の評価を示す顕微鏡写真。グラフは面積を数値化した結果を示す。＊＊：Ｐ＜０．０１，＊＊＊：Ｐ＜０．００１。スケールバー：５０μｍ。
【図５】ＣＣｌ４処理による肝線維症モデルにおけるヒトＭｕｓｅ細胞の肝臓組織への分化についての結果を示す。（Ａ）ＣＣｌ４処理開始後８週目の時点における肝臓内に存在するＨ−Ｇｏｌｇｉ（＋）細胞の数を示す。Ｍｕｓｅ群では相当数のＨ−Ｇｏｌｇｉ（＋）細胞が肝臓内の血管周辺で観察された。一方、非Ｍｕｓｅ群ではそれらの細胞はほとんど観察できなかった。（Ｂ）肝臓切片における、１ｍｍ２あたりの総細胞数に対するＨ−Ｇｏｌｇｉ（＋）細胞の数を示す。＊＊＊：Ｐ＜０．００１。（Ｃ）Ｈ−Ｇｏｌｇｉ（＋）細胞におけるＨｅｐＰａｒ−１（肝細胞マーカー）の発現を示す免疫染色結果（顕微鏡写真）を示す。（Ｄ）Ｈ−Ｇｏｌｇｉ（＋）細胞におけるヒトアルブミンの発現を示す免疫染色結果（顕微鏡写真）を示す。（Ｅ）ヒトミトコンドリア（＋）細胞（ヒト細胞であることを表す。）におけるヒトアンチトリプシン（肝細胞マーカー）の発現を示す免疫染色結果（顕微鏡写真）を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図６】ＣＣｌ４処理開始後８週目のＭｕｓｅ群のＦＩＳＨおよび機能分析の結果を示す。（Ａ）上段には、ＦＩＳＨの結果を示し、下段には、隣接する切片におけるＨ−Ｇｏｌｇｉ／ＨｅｐＰａｒ−１の免疫染色結果（顕微鏡写真）を示す。ＦＩＳＨにおいて、マウス染色体は緑色に色分けしてあり、ヒト染色体は赤色に色分けしてある。結果において、＊１の細胞はマウスの細胞と考えられ、＊２および＊３はマウスの細胞と融合していないヒト細胞であり、＊４はヒトーマウス融合細胞である。切片は８〜１０μｍの厚さで作製されたため、隣接する切片同士で核小体の位置や細胞質の形は厳密には一致しない。しかし、ＦＩＳＨの＊１、＊２、および＊３の細胞は、免疫染色における対応する細胞に投影可能である。＊４の細胞は免疫染色において投影されなかった。＊１の細胞はＨ−Ｇｏｌｇｉに対して陰性である。＊２および＊３の細胞はＨ−Ｇｏｌｇｉ（＋）およびＨｅｐＰａｒ−１に対して二重陽性であり、Ｈ−Ｇｏｌｇｉ（＋）−ヒトＭｕｓｅ細胞が肝細胞マーカーＨｅｐＰａｒ−１（＋）細胞にマウス肝細胞と融合することなく分化したことが示唆される。スケールバー：２５μｍ。（Ｂ）ヒト特異的-アルブミン、-ＣＹＰ１Ａ２、-Ｇｌｃ−６−Ｐａｓｅ、ならびにヒトおよびマウスベータアクチンに対するＲＴ−ＰＣＲの結果を示す（写真）。ヒト肝臓を陽性対照として使用し、溶媒群の肝臓を陰性対照として使用した。
【図７】Ｃｏｎｔｒｏｌ群、ブレオマイシン（ＢＬＭ）２８日＋Ｍｕｓｅ細胞投与群、ＢＬＭ２８日＋媒体投与群での皮膚コラーゲン量を示す図。
【図８】Ｃｏｎｔｒｏｌ群、ＢＬＭ２８日＋Ｍｕｓｅ細胞投与群、ＢＬＭ２８日＋媒体投与群での真皮層の厚さを示す図。
【図９】Ｃｏｎｔｒｏｌ群、ＢＬＭ２８日＋Ｍｕｓｅ細胞投与群、ＢＬＭ２８日＋媒体投与群の皮膚切片のヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す図（顕微鏡写真、１００倍）。両矢印は皮膚の厚さを示す。
【図１０】Ｃｏｎｔｒｏｌ群とＭｕｓｅ細胞投与群の肺左葉および全葉における線維化スコアを示す図。
【図１１】Ｃｏｎｔｒｏｌ群とＭｕｓｅ細胞投与群の肺切片のヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す図（顕微鏡写真）。
【図１２】Ｃｏｎｔｒｏｌ群とＭｕｓｅ細胞投与群の呼吸促迫の頻度の経時変化を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む、臓器線維症を予防及び／又は治療するための細胞製剤に関する。本発明を以下に詳細に説明する。
【００１７】
１．適用疾患
本発明は、ＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む細胞製剤を用いて、臓器線維症の予防及び／又は治療を行う。ここで、「臓器線維症」とは、微生物、化学物質、免疫反応など生体内の反応、食習慣、環境、遺伝的背景など様々な原因(原因不明も含む)により生じる感染、炎症、脂肪等生体内物質の蓄積、組織・細胞の変性など様々な原因により臓器・組織内に線維化が生じ、それら臓器・組織の機能が傷害される疾患であれば特に限定されない。例えば、肝臓（肝線維症）、膵臓（膵線維症）、大腸などの消化器に生じる線維症のほか、肺（肺線維症）などの呼吸器に生じる線維症、心臓（心筋線維症）、骨髄（骨髄線維症）、脾臓などの循環器に生じる線維症、腎臓（腎線維症）などの泌尿生殖器に生じる線維症、筋肉などの運動器に生じる線維症、脳神経系、内分泌器官、皮膚などに生じる各種線維症などが挙げられる。
【００１８】
２．細胞製剤
（１）多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）
本発明の細胞製剤に使用される多能性幹細胞は、本発明者らの一人である出澤が、ヒト生体内にその存在を見出し、「Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｓｔｒｅｓｓ Ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞」と命名した細胞である。Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液、脂肪組織（Ｏｇｕｒａ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．，Ｎｏｖ ２０，２０１３（Ｅｐｕｂ）（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ Ｊａｎ １７，２０１４））や皮膚の真皮結合組織等から得ることができるほか、広く組織や臓器にも存在することが知られている。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞であり、例えば、細胞表面マーカーである「ＳＳＥＡ−３（Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ−３）」陽性細胞、好ましくはＳＳＥＡ−３陽性かつＣＤ−１０５陽性の二重陽性細胞として同定される。したがって、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ−３単独またはＳＳＥＡ−３およびＣＤ−１０５の発現を指標として生体組織から分離することができる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に開示されている。また、Ｍｕｓｅ細胞が様々な外的ストレスに対する耐性が高いことを利用して、蛋白質分解酵素処理や、低酸素条件、低リン酸条件、低血清濃度、低栄養条件、熱ショックへの暴露、有害物質存在下、活性酸素存在下、機械的刺激下、圧力処理下など各種外的ストレス条件下での培養によりＭｕｓｅ細胞を選択的に濃縮することができる。なお、本明細書においては、線維症を治療するための細胞製剤として、ＳＳＥＡ−３を指標として用いて、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から調製された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を単に「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」と記載することがある。また、本明細書においては、「非Ｍｕｓｅ細胞」とは、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織に含まれる細胞であって、「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」以外の細胞を指すことがある。
【００１９】
Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、細胞表面マーカーであるＳＳＥＡ−３またはＳＳＥＡ−３およびＣＤ−１０５を指標として生体組織（例えば、間葉系組織）から調製することができる。ここで、「生体」とは、哺乳動物の生体をいう。本発明において、生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物には、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、生体の組織から直接マーカーを持って分離される点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）やｉＰＳ細胞と明確に区別される。また、「間葉系組織」とは、骨、滑膜、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、歯髄、臍帯、臍帯血、羊膜などの組織及び各種臓器に存在する組織をいう。例えば、Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄や皮膚、脂肪組織、血液、歯髄、臍帯、臍帯血、羊膜などから得ることができる。例えば、生体の間葉系組織を採取し、この組織からＭｕｓｅ細胞を調製し、利用することが好ましい。また、上記調製手段を用いて、線維芽細胞や骨髄間葉系幹細胞などの培養間葉系細胞からＭｕｓｅ細胞を調製してもよい。
【００２０】
また、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に外的ストレス刺激を与えることにより、該外的ストレスに耐性の細胞を選択的に増殖させてその存在比率を高めた細胞を回収することを含む方法によっても調製することができる。
前記外的ストレスは、プロテアーゼ処理、低酸素濃度での培養、低リン酸条件下での培養、低血清濃度での培養、低栄養条件での培養、熱ショックへの暴露下での培養、低温での培養、凍結処理、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養、振とう処理下での培養、圧力処理下での培養又は物理的衝撃のいずれか又は複数の組み合わせであってもよい。
前記プロテアーゼによる処理時間は、細胞に外的ストレスを与えるために合計０．５〜３６時間行うことが好ましい。また、プロテアーゼ濃度は、培養容器に接着した細胞を剥がすとき、細胞塊を単一細胞にばらばらにするとき、又は組織から単一細胞を回収するときに用いられる濃度であればよい。
前記プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ又はＮ末端スレオニンプロテアーゼであることが好ましい。更に、前記プロテアーゼがトリプシン、コラゲナーゼ又はジスパーゼであることが好ましい。
【００２１】
なお、本発明の細胞製剤においては、使用されるＭｕｓｅ細胞は、細胞移植を受けるレシピエントに対して自家であってもよく、又は他家であってもよい。
【００２２】
上記のように、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ−３陽性またはＳＳＥＡ−３およびＣＤ−１０５の二重陽性を指標にして生体組織から調製することができるが、ヒト成人皮膚には、種々のタイプの幹細胞及び前駆細胞を含むことが知られている。しかしながら、Ｍｕｓｅ細胞は、これらの細胞と同じではない。このような幹細胞及び前駆細胞には、皮膚由来前駆細胞（ＳＫＰ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、メラノブラスト（ＭＢ）、血管周囲細胞（ＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。これらの細胞に固有のマーカーの「非発現」を指標として、Ｍｕｓｅ細胞を調製することができる。より具体的には、Ｍｕｓｅ細胞は、ＣＤ３４（ＥＰ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）（ＭＢのマーカー）、ＣＤ１４６（ＰＣ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）（ＮＣＳＣのマーカー）、ＮＧ２（ＰＣのマーカー）、ｖＷＦ因子（フォンビルブランド因子）（ＥＰのマーカー）、Ｓｏｘ１０（ＮＣＳＣのマーカー）、Ｓｎａｉ１（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｌｕｇ（ＳＫＰのマーカー）、Ｔｙｒｐ１（ＭＢのマーカー）、及びＤｃｔ（ＭＢのマーカー）からなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、限定されないが、ＣＤ１１７及びＣＤ１４６の非発現を指標に調製することができ、さらに、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ及びＣＤ２７１の非発現を指標に調製することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に調製することができる。
【００２３】
また、本発明の細胞製剤に使用される上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、以下： 
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。好ましくは、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、上記性質を全て有する。ここで、上記（ｉ）について、「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、ＴＲＡＰＥＺＥ  ＸＬ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、例えば、体細胞であるヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はＨｅｌａ細胞に比べて１／５以下、好ましくは１／１０以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。上記（ｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、三胚葉（内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系）に分化する能力を有し、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導培養することにより、肝細胞（肝芽細胞または肝細胞マーカーを発現する細胞を含む）、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、脂肪細胞等に分化し得る。また、ｉｎ  ｖｉｖｏで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を示す場合がある。さらに、静注により生体に移植することで傷害を受けた臓器（心臓、皮膚、脊髄、肝、筋肉等）に遊走及び生着し、組織に応じた細胞に分化する能力を有する。上記（ｉｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、浮遊培養では増殖速度約１．３日で増殖するが、浮遊培養では１細胞から増殖し、胚様体様細胞塊を作り１４日間程度で増殖が止まる、という性質を有するが、これらの胚様体様細胞塊を接着培養に持っていくと、再び細胞増殖が開始され、細胞塊から増殖した細胞が広がっていく。さらに精巣に移植した場合、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。また、上記（ｉｖ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、セルフリニューアル（自己複製）能を有する。ここで、「セルフリニューアル」とは、１個のＭｕｓｅ細胞から浮遊培養で培養することにより得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞から３胚葉性の細胞への分化が確認できると同時に、胚様体様細胞塊の細胞を再び１細胞で浮遊培養に持っていくことにより、次の世代の胚様体様細胞塊を形成させ、そこから再び３胚葉性の分化と浮遊培養での胚様体様細胞塊が確認できることをいう。セルフリニューアルは１回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。
【００２４】
（２）細胞製剤の調製及び使用
本発明の細胞製剤は、限定されないが、上記（１）で得られたＭｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を生理食塩水や適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁させることによって得られる。この場合、自家又は他家の組織から分離したＭｕｓｅ細胞数が少ない場合には、細胞移植前に細胞を培養して、所定の細胞数が得られるまで増殖させてもよい。なお、すでに報告されているように（国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレット）、Ｍｕｓｅ細胞は、腫瘍化しないため、生体組織から回収した細胞が未分化のまま含まれていても癌化の可能性が低く安全である。また、回収したＭｕｓｅ細胞の培養は、特に限定されないが、通常の増殖培地（例えば、１０％仔牛血清を含むα−最少必須培地（α−ＭＥＭ）など）において行うことができる。より詳しくは、上記国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレットを参照して、Ｍｕｓｅ細胞の培養及び増殖において、適宜、培地、添加物（例えば、抗生物質、血清）等を選択し、所定濃度のＭｕｓｅ細胞を含む溶液を調製することができる。ヒト対象に本発明の細胞製剤を投与する場合には、ヒトの腸骨から骨髄液を採取し、例えば、骨髄液からの接着細胞として骨髄間葉系幹細胞を培養して有効な治療量のＭｕｓｅ細胞が得られる細胞量に達するまで増やした後、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ−３の抗原マーカーを指標として分離し、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。あるいは、例えば、骨髄液から得られた骨髄間葉系幹細胞を外的ストレス条件下で培養して有効な治療量に達するまでＭｕｓｅ細胞を増殖、濃縮した後、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。
【００２５】
また、Ｍｕｓｅ細胞の細胞製剤への使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）や間葉系幹細胞に含まれるＭｕｓｅ細胞以外の細胞又は成分を細胞製剤に含有させてもよい。当業者は、これら因子及び薬剤を適切な濃度で細胞製剤に添加することができる。このように、Ｍｕｓｅ細胞は、各種添加物を含む医薬組成物として使用することも可能である。
【００２６】
上記で調製される細胞製剤中に含有するＭｕｓｅ細胞数は、線維症の治療において所望の効果（例えば、肝線維症の場合、血清総ビリルビンおよびアルブミンの回復、および線維化の減少など）が得られるように、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜、調整することができる。なお、対象とする個体はヒトを含むがこれに限定されない。また、本発明の細胞製剤は、所望の治療効果が得られるまで、複数回（例えば、２〜１０回）、適宜、間隔（例えば、１日に２回、１日に１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、６カ月に１回）をおいて投与されてもよい。したがって、対象の状態にもよるが、治療上有効量としては、例えば、一個体あたり一回につき１×１０３細胞〜１×１０8細胞で１〜１０回の投与量が好ましい。一個体における投与総量としては、限定されないが、１×１０３細胞〜１×１０８細胞、１×１０４細胞〜５×１０７細胞、２×１０４細胞〜２×１０７細胞、５×１０４細胞〜５×１０６細胞、１×１０５細胞〜１×１０9細胞などが挙げられる。
【００２７】
本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、傷害を受けた臓器へと遊走し、生着する性質を有する。したがって、細胞製剤の投与において、細胞製剤の投与部位、投与される血管の種類（静脈及び動脈）は限定されない。
【００２８】
本発明の細胞製剤は、線維症患者の傷害臓器の機能を改善又は正常（又は正常値）に回復することができる。本明細書において使用するとき、臓器機能の「改善」とは、線維症に伴う各種の症状の緩和及び進行の抑制を意味し、好ましくは、日常生活に差し支えない程度にまで症状を緩和することを意味する。また、臓器機能を「正常に回復する」とは、線維症に起因した全ての症状が臓器傷害前の状態に戻ることを意味する。
【００２９】
例えば、肝線維症の場合、本発明の細胞製剤を投与した後の肝臓機能の評価は、血清総ビリルビン値やアルブミン値または肝臓マーカー遺伝子の発現を測定したりすることにより行うことができる。
【００３０】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
材料と方法
ヒトＭｕｓｅ細胞の調製
ヒトＭｕｓｅ細胞の調製は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に記載された方法に従って行った。より具体的には、実施例１で用いたＭｕｓｅ細胞は、ヒト骨髄液から接着性を有する間葉系細胞を培養し、増殖を経て、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団をＳＳＥＡ−３陽性細胞としてＦＡＣＳにて分離して得た。実施例２〜４で用いたＭｕｓｅ細胞は、間葉系幹細胞をストレス条件下で培養することにより拡大富化培養して得た。また、非Ｍｕｓｅ細胞は、上記間葉系細胞のうち、ＳＳＥＡ−３陰性の細胞群であり、対照として用いた。その後、リン酸緩衝生理食塩水又は培養液を用いて、細胞を所定濃度に調整し、以下の実験に使用した。【００３２】
＜実施例１＞
肝線維症モデルマウスに対するヒトＭｕｓｅ細胞の移植
ＣＢ１７／Ｉｃｒ−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞／ＣｒｌＣｒｌｊ（ＳＣＩＤ）マウスを全ての研究に用いた。全ての動物実験は、東北大学（仙台、日本）の実験動物の人道的管理と使用のための基準に従って行った。肝線維症モデル作製の実験手順は、International Journal of Molecular Science 2012; 13: 3598-3617およびJournal of Biochemistry 2003; 134: 551-558も参照した。具体的には、ＳＣＩＤマウスの肝線維症モデルをＣＣｌ４（０．５ｍｌ／ｋｇ）の腹腔内注射を行うことにより作製した。
ヒトＭｕｓｅ細胞または非Ｍｕｓｅ細胞（５×１０４細胞）を肝線維症モデルマウスの尾静脈に注入した。【００３３】
統計分析
２群間の有意差は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて評価した。３群以上の間での統計的な有意差は、ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて評価した。Ｐ値が＜０．０５（図中、＊によって示す）の場合に有意であると判定し、＜０．０１（＊＊）または＜０．００１（＊＊＊）の場合に高度に有意であると判定した。【００３４】
結果
＜Ｍｕｓｅ細胞のキャラクタリゼーション＞
ＳＳＥＡ−３陽性のヒトＭｕｓｅ細胞（ヒトＢＭ−ＭＳＣの約２％）およびＳＳＥＡ−３陰性の非Ｍｕｓｅ細胞（対照群）をＦＡＣＳによって分離した（図１Ａ）。これらについて単細胞浮遊培養を行ったところ、Ｍｕｓｅ細胞だけが、浮遊培養時に形成されるＥＳ細胞由来胚葉体に類似した単一細胞由来クラスター（Ｍクラスター）を生成し、一方、非Ｍｕｓｅ細胞はこのようなクラスターを全く形成しなかった（データは示さず）。接着培養Ｍｕｓｅ細胞、接着培養非Ｍｕｓｅ細胞、およびＭクラスターにおける多能性マーカーの遺伝子発現を調べたところ、接着培養Ｍｕｓｅ細胞は、接着培養非Ｍｕｓｅ細胞と比べ、多能性マーカーであるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮａｎｏｇが高い遺伝子発現を示すことが示された。さらに、接着培養非Ｍｕｓｅ細胞のＳＯＸ２およびＮａｎｏｇについては検出閾値未満であった。特にＭクラスターにおけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮａｎｏｇの発現量については、接着培養Ｍｕｓｅ細胞のものと比べて、それぞれ約９倍、約５４倍、および約３５倍高く、統計的有意差を示した（図１Ｂ）。Ｍｕｓｅ細胞が１細胞から三胚葉系列細胞（triploblastic lineage cells）に分化する能力が、Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107: 8639-8643に記載されたのと同様に確認された。Ｍｕｓｅ細胞は既に、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ−４）による誘導でアルファフェトプロテイン／アルブミン陽性細胞に分化することが報告されている（Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108: 9875-9880）。そこで、ゼラチンコート培養皿上で１細胞から浮遊培養で形成されたＭクラスターから増殖した細胞（図１Ｃ）が、自発的に肝芽細胞・肝細胞マーカーを発現する細胞へと分化するかどうかを確認したところ、これらの細胞はＤＬＫ（１．５±０．６％）、アルファフェトプロテイン（３．０±０．８％）、サイトケラチン１９（１．７±０．４％）、およびサイトケラチン１８（２．０±０．９％）に対して陽性の細胞を含んでいた（図１Ｄ）。非Ｍｕｓｅ細胞は単細胞浮遊培養においてクラスターを形成しないため、それらを単離後すぐにゼラチンコート培養皿に直接播種し、Ｍクラスターと同じ長さの時間培養した。しかし、非Ｍｕｓｅ細胞は肝芽細胞・肝細胞系列マーカーの発現を何ら示さなかった（データは示さず）。従って、Ｍｕｓｅ細胞は肝芽細胞・肝細胞系列細胞への高い分化能を有しているが非Muse細胞にはそのような能力がないと考えられる。【００３５】
＜Ｍｕｓｅ細胞は傷害を受けた肝臓へと効率的に遊走し、生着する＞
次に、ヒトＭｕｓｅ細胞が肝傷害モデルの血清および肝組織へ遊走する能力を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて試験した。このために、四塩化炭素（ＣＣｌ４）の単回腹腔内投与をヒト細胞を拒絶しない免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス）において行い、血清および傷害肝組織を１、２４、および４８時間後の時点で採取した。対照として、四塩化炭素（ＣＣｌ４）非投与のＳＣＩＤマウスの血清および肝組織を採取した。遊走能の評価には、ボイデンチャンバー法を用いた。インサートの下側に採取した血清または組織、上側にヒトＭｕｓｅ細胞または非Ｍｕｓｅ細胞を加え、インサートを通過したヒトＭｕｓｅ細胞数または非Ｍｕｓｅ細胞数を計測した。その結果、非傷害マウスの血清においてはＭｕｓｅおよび非Ｍｕｓｅ細胞の遊走はごくわずかであり、両者間に統計的差異は無かった（図２Ａ）。ＣＣｌ４注射後１時間の血清（１ｈｒ−ＣＣｌ４）では、Ｍｕｓｅ細胞および非Ｍｕｓｅ細胞の両者で遊走がわずかに増加したが、Ｍｕｓｅ細胞および非Ｍｕｓｅ細胞の両者において、非傷害の場合と１ｈｒ−ＣＣｌ４との間で統計的差異は無かった。しかし、２４ｈｒｓ−ＣＣｌ４の血清では遊走したＭｕｓｅ細胞の数が大幅に増加し、非傷害および１ｈｒ−ＣＣｌ４に対して統計的有意差が存在した（両者ともｐ＜０．００１）。また、２４時間の時点で遊走した細胞の数の増加は、Ｍｕｓｅ細胞の１ｈｒ−ＣＣｌ４におけるよりも約１２倍大きかった。一方、非Ｍｕｓｅ細胞においてはそのような劇的な変化は認められなかった。２４時間の時点でＭｕｓｅ細胞のほうが非Ｍｕｓｅ細胞よりも３〜４倍高い遊走率となり、両者間に統計的有意差が認められた（ｐ＜０．００１）。４８ｈｒｓ−ＣＣｌ４の血清では、２４ｈｒｓ−ＣＣｌ４で見られたほどの水準では無かったが、依然としてＭｕｓｅ細胞と非Ｍｕｓｅ細胞との間で統計的差異が認められた（Ｐ＜０．０１）（図２Ａ）。【００３６】
血清の場合と同様、２４ｈｒｓ−ＣＣｌ４の肝組織ではＭｕｓｅ細胞の遊走数が最大となり、非Ｍｕｓｅ細胞との比較において（ｐ＜０．００１）、または非傷害、１ｈｒ−ＣＣｌ４、もしくは４８ｈｒｓ−ＣＣｌ４の肝組織のＭｕｓｅ細胞との比較において、統計的有意差を示した（それぞれｐ＜０．００１）。２４ｈｒｓ−ＣＣｌ４の肝臓へ遊走したＭｕｓｅ細胞の数は、１ｈｒ−ＣＣｌ４のＭｕｓｅ細胞における場合の約７倍であり、２４ｈｒｓ−ＣＣｌ４の非Ｍｕｓｅ細胞における場合の約４倍であった。非Ｍｕｓｅ細胞では顕著な遊走が検出されなかった（図２Ｂ）。これらの結果から、非Ｍｕｓｅ細胞とは異なり、Ｍｕｓｅ細胞がＣＣｌ４−肝傷害モデルの血清や肝臓に対して強力な遊走活性を有することが示された。【００３７】
尾静脈注射されたヒトＭｕｓｅ細胞および非Ｍｕｓｅ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ動態を分析した。ＳＣＩＤマウスを用いて、非傷害のマウスと四塩化炭素（ＣＣｌ４）の単回腹腔内投与を行った２４時間後のマウス（２４ｈｒｓ−ＣＣｌ４−肝傷害マウス）を準備し、ヒトＭｕｓｅ細胞または非Ｍｕｓｅ細胞を尾静脈に注入した。Ｍｕｓｅ細胞投与後２週目の非傷害および２４ｈｒｓ−ＣＣｌ４−肝傷害マウスの各臓器に対してヒト特異的Ａｌｕ配列のＱ−ＰＣＲを行い、ヒトＭｕｓｅ細胞および非Ｍｕｓｅ細胞の分布を調べた。非傷害マウスでは、Ｍｕｓｅ細胞注射マウスおよび非Ｍｕｓｅ細胞注射マウスの両者において、Ａｌｕ配列の低シグナルが肺において検出され、他の臓器ではシグナルは検出限界未満であった（図３Ａ）。Ｍｕｓｅ細胞注射を行った２４ｈｒｓ−ＣＣｌ４−肝傷害モデルの場合、シグナルは肝臓において最大であり、肺ではより低く、他の臓器では検出限界未満であった。一方、非Ｍｕｓｅ細胞を注射したマウスでは、肝臓においても、肺以外の他の臓器においても、シグナルは検出閾値未満となった（図３Ａ）。【００３８】
次に、肝傷害モデル（２４ｈｒｓ−ＣＣｌ４−肝傷害マウス）の細胞投与後３０日目におけるヒトＭｕｓｅ細胞の生着と分化を、抗ヒトゴルジ複合体（Ｈ−Ｇｏｌｇｉ）抗体または抗ヒトミトコンドリア抗体を用いてヒト細胞の生着と分化を検証した。傷害を受けた肝臓の組織像は極めて不均質であるため、傷害を受けた領域と正常に見える領域の両者から異なる１０領域を任意に選択し、それら全てに対して測定を行った。Ｍｕｓｅ群で検出されたＨ−Ｇｏｌｇｉ（＋）細胞の数(1mm２の肝臓切片中における全細胞の１．８９±０．６５％）は、非Ｍｕｓｅ群における数（０．０４±０．０８％）の約４８倍であり、高い統計的有意差（ｐ＜０．００１）を示した（図３Ｂ，Ｃ）。組織学的分析によると、Ｈ−Ｇｏｌｇｉ（＋）細胞はＭｕｓｅ群で主に肝臓内の血管周辺に分布しており、静脈注射されたＭｕｓｅ細胞が血管から肝臓へと生着したことが示唆された（図３Ｂ）。ヒトＭｕｓｅ細胞が傷害を受けた肝臓内に生着したことは、ヒト特異的なミトコンドリアの検出によっても確認された（図３Ｄ）。Ｈ−Ｇｏｌｇｉ／ヒトミトコンドリアおよび肝細胞マーカーに対する二重染色により、ヒトミトコンドリア（＋）細胞の４９．８±１．９％がヒト特異的アルブミンに対して陽性であり、Ｈ−Ｇｏｌｇｉ（＋）の８０．４±３．２％がヒト前駆／成熟肝細胞マーカーＨｅｐＰａｒ−１（図３Ｄ，Ｅ）に対して陽性であることが示された。【００３９】
これらの結果は全て、Ｍｕｓｅ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで傷害を受けた肝臓に遊走して集積し、また、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト特異的アルブミンおよびＨｅｐＰａｒ−１陽性細胞に分化する、極めて高い能力を有している一方で、非Ｍｕｓｅ細胞はこのような能力を示さなかったことを表している。【００４０】
＜Ｍｕｓｅ細胞は肝線維症モデルにおいて機能を改善し、線維化を減少させる＞
肝線維症モデル作製の実験手順、ならびに注射を行う細胞数およびタイミングを、図４Ａに示した。具体的には、ＳＣＩＤマウスの肝線維症モデルをＣＣｌ４（０．５ｍｌ／ｋｇ）の腹腔内注射を毎週２回ずつ、８週まで行うことにより作製した。
５×１０４細胞のヒトＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｓｅ群、ｎ＝８）または非Ｍｕｓｅ細胞（非Ｍｕｓｅ群、ｎ＝８）、あるいは等量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（媒体群；ｎ＝８）を、２、４、および６週の時点で肝線維症モデルマウスの尾静脈に注入し、データを８週の時点で収集した。【００４１】
Ｍｕｓｅ、非Ｍｕｓｅ、および溶媒群において、８週まで腫瘍形成は観察されなかった（データは示さず）。８週目には、血清総ビリルビンが、Ｍｕｓｅ群（０．２６±０．０５ｍｇ／ｄｌ）において、溶媒群（０．７４±０．０５ｍｇ／ｄｌ，ｐ＜０．００１）および非Ｍｕｓｅ群（０．４８±０．１２ｍｇ／ｄｌ，ｐ＜０．００１）と比べて有意に低くなり、Ｍｕｓｅ群では溶媒群と比べて約２．８倍の低さとなった。Ｍｕｓｅ群ほどではないが、非Ｍｕｓｅ群の総ビリルビンは溶媒群の１．５倍の低さであり、統計的有意差（ｐ＜０．００１）が存在した。これは、中程度の回復を示唆している（図４Ｂ）。Ｍｕｓｅ群の血清アルブミン濃度は３群中で最も高く（２．９９±０．１１ｇ／ｄｌ）、溶媒群（２．６５±０．０８ｇ／ｄｌ，ｐ＜０．００１）および非Ｍｕｓｅ群（２．８１±０．０６ｇ／ｄｌ，ｐ＜０．０１）と比べて高度な統計的有意差が存在した。Ｍｕｓｅ群ほどではないものの、非Ｍｕｓｅ群は溶媒群と比べて血清アルブミンの中程度の回復を示した（ｐ＜０．０１）（図４Ｃ）。【００４２】
主にＩ／ＩＩＩ型コラーゲンからなる線維化の程度を、シリウスレッド染色およびマッソン・トリクローム染色により評価した。８週において、典型的な結節性隔壁（internodular septum）を伴う線維化領域の広がりが溶媒群において認められた。一方、線維化面積はＭｕｓｅ群において最小であった。シリウスレッド染色によると、Ｍｕｓｅ群（切片あたりの総面積の０．７５±０．１５％）は、溶媒群（２．９１±０．３５％）および非Ｍｕｓｅ群（１．８６±０．１３％）と比較して最小の線維化面積を示し、双方に対して統計的有意差（ｐ＜０．００１）が存在した。これは溶媒群に対して線維化が７５％改善されたことに相当する（図４Ｄ）。非Ｍｕｓｅ群と溶媒群との間には統計的差異が認められ（ｐ＜０．００１）、非Ｍｕｓｅ群では溶媒群に対して３６％相当の線維化の改善が見られた。これは、非Ｍｕｓｅ群における中程度の効果を示唆している（図４Ｄ）。同様な結果がマッソン・トリクローム染色によっても観察された。Ｍｕｓｅ群は３群中で最小の線維化面積（０．７３±０．１５％）を示し、溶媒群（１．９０±０．１２％，ｐ＜０．００１）および非Ｍｕｓｅ群（１．１１±０．１５％，ｐ＜０．０１）と比較して高度な統計的有意差が存在した。これは溶媒群に対して線維化が６２％改善されたことに相当する（図４Ｅ）。Ｍｕｓｅ群ほどではないが、非Ｍｕｓｅ群も溶媒群に対して統計的差異（ｐ＜０．００１）を示し、溶媒群に対して４２％の改善に相当した（図４Ｅ）。【００４３】
これらの結果は、血清総ビリルビンおよびアルブミンにより測定される肝機能の改善において、また８週までのマウス肝線維症モデルの線維化の減少において、ヒトＭｕｓｅ群が、非Ｍｕｓｅ群よりも有効であることを示している。【００４４】
＜Ｍｕｓｅ細胞は肝線維症モデルにおいて自発的ｉｎ  ｖｉｖｏ分化により新たな肝細胞を提供する＞
８週の時点で、ヒトＭｕｓｅ細胞は血管周囲の領域に多数検出されたが、非Ｍｕｓｅ細胞はごくわずかな数しか検出されなかった（図５Ａ）。１ｍｍ２切片内の総細胞数におけるＨ−Ｇｏｌｇｉ（＋）細胞の数は、Ｍｕｓｅ群において高かった（５．７８±２．３９％）が、非Ｍｕｓｅ群において極めて低く（０．２７±０．１２％）、統計的有意差が存在した（ｐ＜０．００１）。Ｍｕｓｅ群における割合は約２１倍であった（図５Ａ，Ｂ）。【００４５】
Ｍｕｓｅ群において、免疫染色をさらに行った。Ｈ−Ｇｏｌｇｉおよびヒトミトコンドリアに対して陽性のＭｕｓｅ細胞が肝臓に検出され、ＨｅｐＰａｒ−１（Ｈ−Ｇｏｌｇｉ（＋）細胞の７１．１±１５．２％）（図５Ｃ）、ヒトアルブミン（Ｈ−Ｇｏｌｇｉ（＋）細胞の５４．３±８．２％）（図５Ｄ）、およびヒトアンチトリプシン（ヒトミトコンドリア（＋）細胞の４７．９±４．６％）（図５Ｅ）の発現が見られた。従って、生着したヒトＭｕｓｅ細胞はその後、肝細胞マーカー陽性細胞へと自発的に分化することが示唆される。【００４６】
これまでの研究により、傷害を受けた肝臓において骨髄由来の肝細胞が、細胞融合によって形成される場合があることが明らかになっている。そこで、本研究における前述の分化が細胞融合の結果によるものなのか否かを調べるため、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を行い、宿主肝細胞（マウス起源、緑色に色分け）と注入したＭｕｓｅ細胞（ヒト起源、赤色に色分け）との間で細胞融合が存在するか調べた（図６Ａ）。各ＦＩＳＨ試料に隣接する切片に対してＨ−ＧｏｌｇｉおよびＨｅｐＰａｒ−１の二重染色を行い、分化したヒトＭｕｓｅ細胞からＦＩＳＨシグナルが得られるかどうか推測した。その結果、ＦＩＳＨにおける細胞とほぼ一致するＨ−Ｇｏｌｇｉ（＋）／ＨｅｐＰａｒ−１（＋）−ヒトＭｕｓｅ細胞のうち、わずか２．６±０．２％が細胞融合によって生成したことが示唆された。逆に言えば、これにより、マウス肝組織に取り込まれたヒトＭｕｓｅ細胞の約９７％が、細胞融合によることなく肝細胞マーカー陽性細胞に分化したことが示唆される。【００４７】
ヒト特異的アルブミン、薬物代謝に関与する酵素であるヒトチトクロームＰ４５０  １Ａ２（ＣＹＰ１Ａ２）、および遊離グルコース形成と関連する酵素であるヒトグルコースー６−ホスファターゼ（Ｇｌｃ−６−Ｐａｓｅ）等のヒト特異的な、成熟した機能的肝細胞のマーカーの発現をＲＴ−ＰＣＲで調べたところ、Ｍｕｓｅ群の肝臓で高い発現が見られた。一方、非Ｍｕｓｅ群および溶媒群において、これらのマーカーは発現していなかった。注目すべき事に、ヒトベータアクチンのシグナルは非Ｍｕｓｅ移植肝において検出限界未満であり（図６Ｂ）、このことは図５ＡおよびＢにおける非Ｍｕｓｅ群の組織学的データと整合する。【００４８】
なお、線維化改善のメカニズムの一つとしてメタロプロテアーゼなどのプロテアーゼがコラーゲンなどの線維を溶解することが考えられた。【００４９】
以上より、Ｍｕｓｅ細胞は肝芽細胞・肝細胞系列へｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化する能力を示した。Ｍｕｓｅ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＣｌ４処理されたマウスの血清および肝臓に向かって遊走する高い能力を示し、また、傷害を受けた肝臓にｉｎ  ｖｉｖｏで特異的に集積する一方で、他の臓器には特異的集積を示さなかった。Ｍｕｓｅ細胞は肝臓へ生着した後、宿主肝細胞と融合することなく、ＨｅｐＰａｒ−１（７１．１±１５．２％）、ヒトアルブミン（５４．３±８．２％）、およびアンチトリプシン（４７．９±４．６％）陽性細胞へとｉｎ  ｖｉｖｏにおいて自発的に分化し、８週の時点でＣＹＰ１Ａ２やＧｌｃ−６−Ｐａｓｅ等の成熟した機能的ヒトマーカーを発現した。さらに、血清総ビリルビンおよびアルブミンのかなりの回復、および線維化の減少が認められた。
これらの結果は、Ｍｕｓｅ細胞が肝線維症の予防や治療に有効であることを示唆しており、さらには、他の線維症の予防や治療にも有効であることを示唆している。【００５０】
＜実施例２＞
Ｍｕｓｅ細胞の皮膚線維化モデルでの評価
Sci Rep. 2015 Aug 20;5:12466. doi: 10.1038/srep12466.に記載の方法にしたがってＢＬＭ誘発皮膚線維化モデルマウスを作製した。マウスはC57BL/6J、雌（日本エスエルシー（株））を用いた。なお、Ｃｏｎｔｒｏｌ群ではＢＬＭの代わりに生理食塩水を投与した。
ＢＬＭ投与から１４日目に尾静脈から1×106細胞／体重（ｋｇ）のＭｕｓｅ細胞を投与した。一方、媒体投与群は１４日目に尾静脈から媒体を投与した。
ＢＬＭ投与から２８日目に皮膚組織を単離し、コラーゲン定量、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色および真皮層の厚さ解析を行った。【００５１】
皮膚コラーゲン解析は以下のようにして行った。
皮膚片を0.5 M 酢酸/ペプシン溶液を用いてホモジナイズし、一晩４℃で撹拌した。得られた抽出物を用いて、皮膚コラーゲン濃度について、Sircol collagen assay kit （Biocolor 社、Cat No.: S1000）を用いて測定した。【００５２】
ＨＥ染色および真皮層の厚さの解析は、まず、皮膚の切片（４μｍ）を作成し、ＨＥ染色を行い、光学顕微鏡を用いて１００倍の視野にて、１切片あたり５視野の写真を撮影した。表皮層直下から皮下脂肪までの距離を真皮層の厚さとし、ImageJ を用いて計測した。【００５３】
血漿ヒアルロン酸解析
マウスから得られた血漿を用いて、ELISA法（Quantikine Hyaluronan ELISA Kit, R&D systems,Inc.）により血漿中のヒアルロン酸濃度について測定した。【００５４】
結果
１．皮膚コラーゲン量
皮膚コラーゲン量の解析結果を図７に示す。ＢＬＭ２８日＋媒体投与群では、ＢＬＭを投与しないＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して皮膚コラーゲン量の有意な増加が認められた。また、ＢＬＭ２８日＋Ｍｕｓｅ細胞投与群では、ＢＬＭ２８日＋媒体投与群と比較して皮膚コラーゲン量の有意な減少が認められた。【００５５】
２．ＨＥ染色および真皮層の厚さ
ＨＥ染色像を図９に、真皮層の厚さを図８に示す。ＢＬＭ２８日＋媒体投与群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して真皮層の厚さの有意な増加が認められた。また、ＢＬＭ２８日＋Ｍｕｓｅ細胞投与群では、ＢＬＭ２８日＋媒体投与群と比較して真皮層の厚さの有意な減少が認められた。【００５６】
３．血漿ヒアルロン酸濃度
血漿ヒアルロン酸濃度において、Ｃｏｎｔｒｏｌ群とＢＬＭ２８日＋媒体投与群の間で有意な差は認められなかった。一方、ＢＬＭ２８日＋Ｍｕｓｅ細胞投与群では、ＢＬＭ２８日＋媒体投与群と比較して血漿ヒアルロン酸濃度の増加傾向を示した。【００５７】
＜実施例３＞
Ｍｕｓｅ細胞の肺線維化モデルでの評価
ＢＬＭ溶液（14 μg/ 25 μL/lung）を気管内投与し、ＢＬＭ肺線維症モデルマウスを作製した（医学と薬学、６２（４）：６６１−６６８、２００９）。マウスはＣｒｌ：ＣＤｌ（ＩＣＲ）、雄（日本チャールス・リバー（株））を用いた。ＢＬＭ投与２１日後に尾静脈から1×106細胞／体重（ｋｇ）のＭｕｓｅ細胞又は媒体を投与した。【００５８】
ホルマリン固定した肺を取り出し、マッソン・トリクローム染色標本を作製した。マッソン・トリクローム染色標本を用いて肺の葉ごとに線維化のスコア化を行った。
肺線維化スコアについては、下記の肺線維化の評価基準にて程度を分類した。その後、各群の肺線維化スコアの平均値に近い像の写真をそれぞれ撮影した（図１１）。なお、線維化スコアの評価は、ＢＬＭ投与２１及び３５日後の肺組織を用いて行った。【００５９】
肺線維化の評価基準（数値はスコア）
O：正常
1：肺胞あるいは気管支壁の軽度の線維性肥厚を認める
2：肺胞あるいは気管支壁の中等度の線維性肥厚はあるが、明らかな肺の構造的変化は伴わない
3 ：明らかな肺の構造的変化と、小線維化巣の形成を認める
4：強い肺の構造的変化と、大きな線維化巣の形成を認める
5：全体が線維化で置き換えられる【００６０】
ＢＬＭ投与後に出現する呼吸促迫に対するＭｕｓｅ細胞の効果を検討するため、Ｃｏｎｔｒｏｌ群とＭｕｓｅ細胞投与群のＢＬＭ投与２１日後から３５日後までの呼吸促迫の出現数をそれぞれカウントした。【００６１】
結果
１．肺線維化スコア
肺線維化スコアの結果を図１０に示す。その結果、ＢＬＭ投与２１日後で線維化が形成されており、その線維化の程度は３５日後においても変わらなかった。
一方、ＢＬＭ投与３５日後において、Ｍｕｓｅ細胞投与群では媒体投与群と比較して線維化スコアは低値となり、さらに肺葉毎の線維化スコアを比較したところ、左肺で抑制傾向（ｐ＝0.086） が認められた。【００６２】
２．呼吸促迫出現数
図１２で示すように、Ｍｕｓｅ細胞投与群では、ＢＬＭ投与２９日後から３５日後まで、媒体投与群に比べて、呼吸促迫出現数は有意に減少した。【００６３】
＜実施例４＞
Ｍｕｓｅ細胞の肝線維化モデルでの評価
10%四塩化炭素10 mL/kgをマウスに腹腔内に２回／週の頻度で１２週間投与し、肝線維化を誘発した。マウスはBALB/c、雌（日本チャールス・リバー（株））を用いた。
四塩化炭素初回投与から５７日目に1×106細胞／体重（kg）（低用量群）および1×107細胞／体重（kg）（高用量群）のＭｕｓｅ細胞を尾静脈から投与した。【００６４】
四塩化炭素初回投与から８４日目に、肝臓を取り出し、ＨＥ染色およびマッソン・トリクローム染色を実施した。光学顕微鏡を用いて、線維化の程度を観察した。
認められた変化は、グレーディング（0，none；1，minimal；2，mild；3，moderate；4，severe）して評価した。【００６５】
四塩化炭素初回投与から８４日目に血液を採取し、ドライケム（富士メディカルシステム株式会社）を用いて、血漿中のALT（GPT）、AST（GOT）、ALB（アルブミン）、CHE（コリンエステラーゼ）およびTBIL（総ビリルビン）を測定した。【００６６】
結果
１．線維化レベル
線維化の程度を表１に示す。媒体対照群の線維化の程度は１０例中１０例でレベル２であった。
Ｍｕｓｅ細胞低用量群の線維化の程度は、１０例中９例がレベル１で、１例がレベル２であった。
Ｍｕｓｅ細胞高用量群の線維化の程度は、１０例中７例がレベル１で、３例がレベル２であった。
Ｍｕｓｅ細胞投与両群とも、媒体対照群と比較して有意な線維化の改善が認められた。【００６７】
【表１】
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【００６８】
２．血漿中ALT(GPT)、AST(GOT)、ALB、CHEおよびTBILの測定 
媒体対照群ではALT，AST/ALT比，TBILにおいて肝炎を示す変化が認められたが、Ｍｕｓｅ細胞投与群では、低用量、高用量ともにALT、AST/ALT比およびTBILにおいて有意な改善効果を示した。また、ALB、CHEにおいては、溶媒対照群に比較して若干の改善傾向が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の細胞製剤は、線維症患者に投与することにより、傷害部位において組織を再建及び修復し、機能を回復させることができ、線維症の予防や治療に応用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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