(57)【要約】  自己免疫疾患の予防および／または治療に用いられる薬剤を提供するために、抗ＤＯＣＫ８抗体、ＤＯＣＫ８タンパク質、または、ＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列を有効成分として含有している薬剤を用いる。
2018159549.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＤＯＣＫ８抗体を有効成分として含有することを特徴とする、自己免疫疾患の予防および／または治療剤。
【請求項２】
上記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）であることを特徴とする、請求項１に記載の自己免疫疾患の予防および／または治療剤。
【請求項３】
上記抗ＤＯＣＫ８抗体は、配列番号１、２または５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、当該ポリペプチドの部分配列に結合するものであることを特徴とする、請求項１または２に記載の自己免疫疾患の予防および／または治療剤。
【請求項４】
上記抗ＤＯＣＫ８抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載の自己免疫疾患の予防および／または治療剤。
【請求項５】
ＤＯＣＫ８タンパク質、ＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列、または、ＤＯＣＫ８タンパク質若しくはＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列の発現ベクターを有効成分として含有していることを特徴とする、自己免疫疾患の予防用および／または治療用のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患の予防および／または治療剤、並びに、自己免疫疾患の予防用および／または治療用のワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、本来、外界からの有害な異物の侵入に対する生体の防御機構として存在するものである。しかし、時にはこの免疫系の働きが、結果的に生体に有害であることがある。生体は、外界からの異物に対してのみならず、自己の成分に対しても免疫応答を起こすことが知られており、自己免疫現象と呼ばれている。そして、自己免疫によってある種の病態が生じた疾患は、自己免疫疾患と呼ばれている。【０００３】
自己免疫疾患は、全身性の疾患であるが、臓器特異性のある疾患（臓器特異的自己免疫疾患）と、臓器特異性のない疾患（臓器非特異的自己免疫疾患）との２つに大別される。これら自己免疫疾患の多くは、組織に病変が認められるとともに、組織傷害を伴うものである。【０００４】
臓器非特異的自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、抗ｄｓＤＮＡ抗体などの自己抗体の産生の増加に起因することが知られているが、ＳＬＥを引き起こす過程の分子生物学的な研究、多様な病態との関連の解明、さらには治療法の開発が期待されている。【０００５】
実験動物を同一の抗原で繰り返して免疫し続けると、免疫応答は極期をむかえ、やがて疲弊する。その結果として、組織傷害を伴う種々の自己免疫疾患（病態）が生じることが知られている（例えば、特許文献１参照および非特許文献１参照）。【０００６】
自己免疫疾患による組織傷害に関する研究は現在進みつつあり、組織傷害に、抗原提示細胞による抗原のクロスプレゼンテーションが関わっていることが明らかにされている。具体的には、（１）自己免疫疾患を患うと、樹状細胞における抗原のクロスプレゼンテーションが増強されること、（２）樹状細胞におけるクロスプレゼンテーションが増強されるとＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化し、当該ＣＤ８＋Ｔ細胞によって細胞傷害が誘導されること、が明らかにされている（例えば、特許文献２および非特許文献１参照）。【０００７】
本発明者らは、マウスに対して抗原による免疫操作を繰り返すことによって、自己応答性・自己抗体誘導性ＣＤ４  Ｔ細胞（autoantibody-inducing CD4 T cells；ａｉＣＤ４  Ｔ細胞）という新たなタイプのＴ細胞が末梢にて生成され、ａｉＣＤ４  Ｔ細胞が多様な自己抗体を誘導するとともに、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を成熟させて種々の臓器障害を惹起して、ＳＬＥを発症させる、ということをこれまでに報告し（非特許文献１）、さらに、ａｉＣＤ４  Ｔ細胞が、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ１２２ｌｏｗ（ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏ）のＣＤ４  Ｔ細胞亜集団に存在すること、この細胞亜集団をナイーブなマウスに養子移入すると、移入２週間後のレシピエントマウスの血清中に自己抗体が観察されることを見出している（非特許文献２参照）。【０００８】
更に、本発明者らは、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞をより簡便に特定するためのマーカーを見出し、これに基づいて自己免疫疾患の客観的かつ正確な診断を可能とする技術の開発に成功している（特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開２００６−２８８３８２号公報（２００６年１０月２６日公開）」
【特許文献２】日本国公開特許公報「特開２０１０−００４７５０号公報（２０１０年  １月１４日公開）」
【特許文献３】日本国公開特許公報「特開２０１７−００３３２９号公報（２０１７年  １月  ５日公開）」
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Tsumiyama K. et al., PLoS ONE, Vol.4, No.12, e8382, 2009
【非特許文献２】Miyazaki Y. et al., The Journal of Immunology vol.192, no.2, supplement 177.7、2014
【非特許文献３】Zhang Q et al., N Engl J Med 361(21): 2046-2055, 2009
【非特許文献４】Randall KL et al., Nat Immunol 10(12): 1283-1291, 2009
【非特許文献５】Randall KL et al. Disease Markers 29: 141-150, (2010)
【非特許文献６】Randall KL et al., J Exp Med 208(11): 2305-2320, 2011
【非特許文献７】Werner M and Jumaa H, Nat Immunol 13(6): 525-526, 2012
【非特許文献８】Jabara HH et al., Nat Immunol 13(6): 612-620, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、自己免疫疾患の予防および／または治療に用いられる薬剤に関しては、いまだ十分とはいえず、新規薬剤の更なる開発が望まれていた。【００１２】
本発明は、自己免疫疾患の予防および／または治療に用いられる新たな薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、鋭意検討した結果、抗ＤＯＣＫ８抗体を用いることによって、自己免疫疾患の症状を改善できることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明者が見出した知見は、ＤＯＣＫ８タンパク質が自己免疫疾患の発症過程に関与していることを示唆する知見であり、当該分野にとって、驚くべき知見であった。【００１４】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る自己免疫疾患の予防および／または治療剤は、抗ＤＯＣＫ８抗体を有効成分として含有することを特徴としている。【００１５】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る自己免疫疾患の予防用および／または治療用のワクチンは、ＤＯＣＫ８タンパク質、ＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列、または、ＤＯＣＫ８タンパク質若しくはＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列の発現ベクターを有効成分として含有していることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の一態様によれば、自己免疫疾患の予防および／または治療を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の実施例における、タンパク尿の試験結果を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例における、ＤＯＣＫ８タンパク質の局在に関する試験結果を示す像である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。
【００１９】
〔１．自己免疫疾患の予防および／または治療剤〕
上述のとおり、本発明者らは、これまで、dedicator of cytokinesis protein 8（以下、ＤＯＣＫ８）を発現するＣＤ４  Ｔ細胞（ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４  Ｔ細胞（ＤＯＣＫ８＋ ＣＤ４  Ｔ細胞ともいう。））の増加を指標として、自己免疫疾患の診断を行う技術を報告している（特許文献３）。しかしながら、このＤＯＣＫ８＋  ＣＤ４  Ｔ細胞がどのような機序にて自己免疫疾患の発症過程に関与しているか否かは、不明であった。そこで、本発明者らが鋭意検討した結果、驚くべきことに、ＤＯＣＫ８に対する抗体に、自己免疫疾患の予防／治療効果があることが分かった。なお、ＤＯＣＫ８＋  ＣＤ４  Ｔ細胞の存在が自己免疫疾患の診断指標の一つになり得るとしても、そこから治療薬の開発には非常に大きなギャップが存在することを念のため付言しておく。
【００２０】
本実施の形態の自己免疫疾患の予防および／または治療剤は、抗ＤＯＣＫ８抗体を有効成分として含有するものである。
【００２１】
本明細書において「自己免疫疾患」とは、自己成分（例えば、免疫グロブリンなど）に対する自己抗体（例えば、抗Ｓｍ抗体、抗ｄｓＤＮＡ抗体、リウマチ因子（ＲＦ：rheumatoid factor））が検出され、自己免疫が病態に関与している疾患を意図する。自己免疫疾患としては、臓器特異的自己免疫疾患（例えば、慢性甲状腺炎、原発性粘膜水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交感性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、およびシェーグレン症候群など）、および、臓器非特異的自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、および混合結合組織病など）が挙げられる。関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症および混合結合組織病は、膠原病として知られている。すなわち膠原病は、全身性自己免疫疾患に含まれるものである。本発明の一態様における自己免疫疾患は、膠原病であることが好ましく、全身性エリテマトーデスであることが更に好ましい。
【００２２】
ＤＯＣＫ８タンパク質は、ＤＯＣＫファミリータンパク質のメンバーであり、グアニンヌクレオチド交換因子（guanine nucleotide exchange factor：ＧＥＦ）の機能を有する分子量２３８ｋＤａのタンパク質である。ＤＯＣＫ８タンパク質は、Ｒｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質の活性化を介してアクチン細胞骨格の重合を制御することが知られている。アクチン細胞骨格の再構成は、細胞の分化・増殖、遊走、シグナル伝達など様々な細胞機能に関わっている。
【００２３】
近年、ヒトＤＯＣＫ８遺伝子の欠損が重症複合免疫不全症を引き起こすことが発見されたことをきっかけに、ＤＯＣＫ８の免疫学的な研究成果が複数報告されている（非特許文献３〜８参照）。
【００２４】
なお、本明細書において、「ＤＯＣＫ８」は、特に説明がない場合は、ＤＯＣＫ８タンパク質およびＤＯＣＫ８タンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の両方を意図する。
【００２５】
抗ＤＯＣＫ８抗体は、ＤＯＣＫ８タンパク質、または、ＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列に結合するものである。このとき、結合対象であるＤＯＣＫ８タンパク質の由来は、特に限定されず、例えば哺乳動物を挙げることができる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、ヒトであり、より好ましくはヒトである。
【００２６】
後述する実施例では、細胞膜の表面に存在するＤＯＣＫ８タンパク質が、ＳＬＥの発症メカニズムに関与していることが示唆されている。それ故に、本実施形態に係る抗ＤＯＣＫ８抗体は、ＤＯＣＫ８タンパク質の細胞膜への局在を阻害する抗体であってもよい。例えば、ＤＯＣＫ８タンパク質が細胞膜に局在している細胞Ａ、および、任意の抗体が加えられた当該細胞Ｂの各々を、抗ＤＯＣＫ８抗体を用いて免疫染色し、細胞Ｂにおける細胞膜近傍の染色強度が、細胞Ａにおける細胞膜近傍の染色強度よりも低下していれば、当該任意の抗体を、ＤＯＣＫ８タンパク質の細胞膜への局在を阻害する抗体であると判定することができる。
【００２７】
より具体的に、抗ＤＯＣＫ８抗体は、配列番号１または５で示されるアミノ酸配列からなるヒト由来のポリペプチド、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるマウス由来のポリペプチド、または、これらのポリペプチドの部分配列に結合するものであってもよい。
【００２８】
上記部分配列を構成するアミノ酸の数は、特に限定されず、例えば、４００個以下、３５０個以下、３００個以下、２００個以下、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、または、１０個以下であってもよい。また、上記部分配列を構成するアミノ酸の数の下限値は、特に限定されず、例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または、１０個であってもよい。
【００２９】
抗ＤＯＣＫ８抗体は、ＤＯＣＫ８タンパク質、または、ＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列に特異的に結合する抗体である。なお、本明細書において、抗体がＤＯＣＫ８タンパク質、または、ＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列に「特異的に結合する」とは、その抗体が、他のポリペプチドに対してよりも、ＤＯＣＫ８タンパク質、または、ＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列に対して、高い親和性で結合することを意図する。ここで「高い親和性」とは、例えば、結合定数（Ｋａ：binding constant）が、１０７Ｍ−１以上、好ましくは１０８Ｍ−１以上、より好ましくは１０９Ｍ−１以上、より好ましくは１０１０Ｍ−１以上、より好ましくは１０１１Ｍ−１以上、より好ましくは１０１２Ｍ−１以上、最も好ましくは１０１３Ｍ−１以上である親和性を意図する。
【００３０】
抗ＤＯＣＫ８抗体は、抗ＤＯＣＫ８抗体の全体を含むもの、抗ＤＯＣＫ８抗体の全体からなるもの、抗ＤＯＣＫ８抗体の断片を含むもの、または、抗ＤＯＣＫ８抗体の断片からなるものであってもよい。例えば、ＤＯＣＫ８抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または、これらの断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、または、Ｆｖ）であってもよい。例えば、抗ＤＯＣＫ８抗体がモノクローナル抗体であれば、抗ＤＯＣＫ８抗体がＤＯＣＫ８タンパク質以外の対象に非特異的に結合することを低減することができるので、本実施の形態の自己免疫疾患の予防および／または治療剤の薬理効果を上げることができるとともに、本実施の形態の自己免疫疾患の予防および／または治療剤の副作用の発生を抑えることができる。抗ＤＯＣＫ８抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、または、これらの断片であってもよい。
【００３１】
抗ＤＯＣＫ８抗体は、周知の方法（例えば、（１）ＨａｒＬｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）」、および、（２）岩崎ら、「単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）にしたがって作製することができる。勿論、抗ＤＯＣＫ８抗体として、市販の抗体を用いることも可能である。
【００３２】
モノクローナル抗体は、当該分野において周知の方法（例えば、（１）ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５））、（２）トリオーマ法、（３）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２（１９８３））、および、（４）ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６（１９８５）））にしたがって作製することができる。
【００３３】
モノクローナル抗体は、ファージディスプレイ法にしたがって作製することもできる。ファージディスプレイ法によるモノクローナル抗体の作製方法は、公知の方法を用いればよい。ファージディスプレイ法によるモノクローナル抗体の作製方法の一例を、以下に説明する。まず、ＤＯＣＫ８タンパク質を免疫した動物からｍＲＮＡを調製し、当該ｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを調製し、当該ｃＤＮＡから、抗体の可変領域のみをコードする１本鎖抗体（ｓｃＦＶ）遺伝子を作製する。次いで、当該１本鎖抗体遺伝子をファージミドベクターに挿入し、当該ファージミドベクターを大腸菌に導入した後、当該大腸菌にファージを感染させる。これによって、ｓｃＦＶ抗体をファージ被膜上に発現させることができる。ファージ被膜上に発現されたｓｃＦＶ抗体の中から、ＤＯＣＫ８タンパク質に結合するものをスクリーニングすることによって、抗ＤＯＣＫ８モノクローナル抗体を作製することができる。なお、ｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの調製、１本鎖抗体遺伝子のファージミドベクターへの挿入、ファージミドベクターの大腸菌への導入、ファージの感染、および、抗体のスクリーニングは、周知の方法にしたがって行えばよい。
【００３４】
キメラ抗体とは、定常領域がヒトの抗体の定常領域に置き換えられている抗体を意図する。キメラ抗体は、周知方法にしたがって作製され得る（例えば、欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３を参照）。
【００３５】
ヒト化抗体とは、Ｈ鎖およびＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ：complementarity determining region）以外がヒトの抗体の構造に置き換えられている抗体を意図する。
【００３６】
ヒト抗体とは、ヒトの抗体生産に関与する遺伝子が導入されたトランスジェニック動物を用いて作製された抗体を意図する（例えば、欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３を参照）。
【００３７】
Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、および、Ｆｖは、抗体の全体をプロテアーゼ（例えば、パパイン、または、ペプシン）によって分解し、必要に応じて、分解物を更に還元することによって得ることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、および、Ｆｖは、抗体を生産するハイブリドーマから、これらのｃＤＮＡを単離し、当該ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主に導入することによって得ることができる。この場合には、抗体フラグメントは、抗体フラグメントと別のタンパク質との融合タンパク質として得ることもできる。
【００３８】
本実施の形態の自己免疫疾患の予防および／または治療剤に含有されている抗ＤＯＣＫ８抗体の量は、特に限定されず、例えば、予防および／または治療剤を１００重量％とした場合に、０．００１重量％〜１００重量％であってもよく、０．０１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜９５重量％であってもよく、０．１重量％〜９０重量％であってもよく、０．１重量％〜８０重量％であってもよく、０．１重量％〜７０重量％であってもよく、０．１重量％〜６０重量％であってもよく、０．１重量％〜５０重量％であってもよく、０．１重量％〜４０重量％であってもよく、０．１重量％〜３０重量％であってもよく、０．１重量％〜２０重量％であってもよく、０．１重量％〜１０重量％であってもよい。
【００３９】
本実施の形態の自己免疫疾患の予防および／または治療剤に含有されている抗ＤＯＣＫ８抗体の量は、特に限定されず、例えば、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、１ｍｇ〜９００ｍｇ、１ｍｇ〜８００ｍｇ、１ｍｇ〜７００ｍｇ、１ｍｇ〜６００ｍｇ、１ｍｇ〜５００ｍｇ、１ｍｇ〜４００ｍｇ、１ｍｇ〜３００ｍｇ、１ｍｇ〜２００ｍｇ、または、１ｍｇ〜１００ｍｇであってもよい。
【００４０】
本実施の形態の自己免疫疾患の予防および／または治療剤は、抗ＤＯＣＫ８抗体以外の成分（例えば、薬学的に受容可能なキャリア）を含んでいてもよい。抗ＤＯＣＫ８抗体以外の成分としては、本実施の形態の自己免疫疾患の予防および／または治療剤が固形製剤である場合には、賦形剤、滑沢剤、結合剤および崩壊剤を挙げることができ、本実施の形態の自己免疫疾患の予防および／または治療剤が液状製剤である場合には、溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤および無痛化剤を挙げることができる。その他、抗ＤＯＣＫ８抗体以外の成分として、防腐剤、抗酸化剤および安定化剤も挙げることができる。
【００４１】
上記「賦形剤」としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプンおよび結晶セルロースを挙げることが、これらに限定されない。
【００４２】
上記「滑沢剤」としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ワックス、タルクおよびコロイドシリカを挙げることが、これらに限定されない。
【００４３】
上記「結合剤」としては、例えば、α化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンを挙げることが、これらに限定されない。
【００４４】
上記「崩壊剤」としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウムおよびカルボキシメチルスターチナトリウムを挙げることが、これらに限定されない。
【００４５】
上記「溶剤」としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油およびトリカプリリンを挙げることが、これらに限定されない。
【００４６】
上記「溶解補助剤」としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを挙げることが、これらに限定されない。
【００４７】
上記「懸濁剤」としては、例えば、界面活性剤（例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン）および親水性高分子（例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース）を挙げることが、これらに限定されない。
【００４８】
上記「等張化剤」としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリンおよびＤ−マンニトールを挙げることが、これらに限定されない。
【００４９】
上記「緩衝剤」としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩を挙げることが、これらに限定されない。
【００５０】
上記「無痛化剤」としては、例えば、ベンジルアルコールを挙げることが、これに限定されない。
【００５１】
上記「防腐剤」としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸およびソルビン酸を挙げることが、これらに限定されない。
【００５２】
上記「抗酸化剤」としては、例えば、亜硫酸塩およびアスコルビン酸を挙げることが、これらに限定されない。
【００５３】
上記「安定化剤」としては、製薬分野において通常用いられるものであればよく、特に限定されない。
【００５４】
本実施の形態の自己免疫疾患の予防および／または治療剤に含有されている抗ＤＯＣＫ８抗体以外の成分の量は、特に限定されず、例えば、予防および／または治療剤を１００重量％とした場合に、０重量％〜９９．９９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５重量％〜９９．９重量％であってもよく、１０重量％〜９９．９重量％であってもよく、２０重量％〜９９．９重量％であってもよく、３０重量％〜９９．９重量％であってもよく、４０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５０重量％〜９９．９重量％であってもよく、６０重量％〜９９．９重量％であってもよく、７０重量％〜９９．９重量％であってもよく、８０重量％〜９９．９重量％であってもよく、９０重量％〜９９．９重量％であってもよい。
【００５５】
本実施の形態の自己免疫疾患の予防および／または治療剤に含有されている抗ＤＯＣＫ８抗体以外の成分の量は、特に限定されず、例えば、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、１ｍｇ〜９００ｍｇ、１ｍｇ〜８００ｍｇ、１ｍｇ〜７００ｍｇ、１ｍｇ〜６００ｍｇ、１ｍｇ〜５００ｍｇ、１ｍｇ〜４００ｍｇ、１ｍｇ〜３００ｍｇ、１ｍｇ〜２００ｍｇ、または、１ｍｇ〜１００ｍｇであってもよい。
【００５６】
本実施の形態の自己免疫疾患の予防および／または治療剤の投与方法は、特に限定されず、経口的に投与されてもよいし、非経口的に、静脈内、直腸内、腹腔内、筋肉内、鼻内または皮下に投与されてもよい。
【００５７】
本実施の形態の自己免疫疾患の予防および／または治療剤の剤形は、特に限定されず、例えば、注射剤（例えば、腹腔内注射、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、または、点滴注射剤）、点鼻剤、または、坐剤であってもよい。
【００５８】
〔２．自己免疫疾患の予防用および／または治療用のワクチン〕
後述する実施例に示すように、抗ＤＯＣＫ８抗体によって、自己免疫疾患を予防および／または治療することができる。このことは、生体に投与されて抗ＤＯＣＫ８抗体の生産を誘導することができる物質（例えば、抗原）を含有しているワクチンも、自己免疫疾患を予防および／または治療することができることを示している。
【００５９】
それ故に、本実施の形態の自己免疫疾患の予防用および／または治療用のワクチンは、ＤＯＣＫ８タンパク質、ＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列、または、ＤＯＣＫ８タンパク質若しくはＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列の発現ベクターを有効成分として含有している。
【００６０】
例えば、本実施の形態の自己免疫疾患の予防用および／または治療用のワクチンは、投与対象とは異なる種に由来するＤＯＣＫ８タンパク質、投与対象とは異なる種に由来するＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列、または、投与対象とは異なる種に由来するＤＯＣＫ８タンパク質若しくはＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列の発現ベクターを有効成分として含有していてもよい。
【００６１】
本実施の形態の自己免疫疾患の予防用および／または治療用のワクチンと、上述した自己免疫疾患の予防および／または治療剤とは、有効成分として用いる物質のみが異なり、その他の構成は同じであってもよい。本実施の形態の自己免疫疾患の予防用および／または治療用のワクチンに関して、有効成分以外については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。
【００６２】
有効成分であるＤＯＣＫ８タンパク質、および、ＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列としては、配列番号１または５で示されるアミノ酸配列からなるヒト由来のポリペプチド、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるマウス由来のポリペプチド、および、これらのポリペプチドの部分配列を挙げることができる。
【００６３】
上記部分配列を構成するアミノ酸の数は、特に限定されず、例えば、４００個以下、３５０個以下、３００個以下、２００個以下、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、または、１０個以下であってもよい。また、上記部分配列は、ＤＯＣＫ８タンパク質の中の部分配列であればよく、ＤＯＣＫ８タンパク質中の位置は限定されない。
【００６４】
ＤＯＣＫ８タンパク質、および、ＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列は、公知の方法によって作製することができる。例えば、（ｉ）公知のペプチド合成装置を用いて作製することも可能であるし、（ｉｉ）ＤＯＣＫ８タンパク質、および、ＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列をコードするｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを所望の宿主（例えば、大腸菌、および、酵母など）に導入することによって作製することも可能である。
【００６５】
有効成分であるＤＯＣＫ８タンパク質、または、ＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列の発現ベクターは、ＤＯＣＫ８タンパク質、または、ＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列をコードするｃＤＮＡが、ベクターに発現可能に挿入されているものである。
【００６６】
ベクターの具体的な例としては、特に限定されず、例えば、プラスミド、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および、レトロウイスルベクター）、または、ウイルス粒子を挙げることができる。当該ベクターに挿入されるプロモーターの具体的な例としては、特に限定されず、上述したベクターに応じて適宜選択すればよい。
【００６７】
上記ベクターの中に、ＤＯＣＫ８タンパク質、または、ＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列をコードするｃＤＮＡが、発現可能に挿入される。当該ｃＤＮＡの具体的な塩基配列は、特に限定されない。ＤＯＣＫ８タンパク質、または、ＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列をコードするｃＤＮＡとしては、配列番号３で示される塩基配列からなるヒト由来のポリヌクレオチド、配列番号４で示される塩基配列からなるマウス由来のポリヌクレオチド、および、これらのポリヌクレオチドの部分配列を挙げることができる。
【００６８】
本実施の形態の自己免疫疾患の予防用および／または治療用のワクチンに含有されている有効成分の量は、特に限定されず、例えば、予防用および／または治療用のワクチンを１００重量％とした場合に、０．００１重量％〜１００重量％であってもよく、０．０１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜９５重量％であってもよく、０．１重量％〜９０重量％であってもよく、０．１重量％〜８０重量％であってもよく、０．１重量％〜７０重量％であってもよく、０．１重量％〜６０重量％であってもよく、０．１重量％〜５０重量％であってもよく、０．１重量％〜４０重量％であってもよく、０．１重量％〜３０重量％であってもよく、０．１重量％〜２０重量％であってもよく、０．１重量％〜１０重量％であってもよい。
【００６９】
本実施の形態の自己免疫疾患の予防用および／または治療用のワクチンに含有されている抗有効成分の量は、特に限定されず、例えば、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、１ｍｇ〜９００ｍｇ、１ｍｇ〜８００ｍｇ、１ｍｇ〜７００ｍｇ、１ｍｇ〜６００ｍｇ、１ｍｇ〜５００ｍｇ、１ｍｇ〜４００ｍｇ、１ｍｇ〜３００ｍｇ、１ｍｇ〜２００ｍｇ、または、１ｍｇ〜１００ｍｇであってもよい。
【００７０】
本発明の一態様は、以下のように構成することもできる。
【００７１】
本発明の一態様に係る自己免疫疾患の予防および／または治療剤は、抗ＤＯＣＫ８抗体を有効成分として含有することを特徴としている。
【００７２】
本発明の一態様に係る自己免疫疾患の予防および／または治療剤では、上記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）であることが好ましい。
【００７３】
本発明の一態様に係る自己免疫疾患の予防および／または治療剤では、上記抗ＤＯＣＫ８抗体は、配列番号１、２または５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、当該ポリペプチドの部分配列に結合するものであることが好ましい。
【００７４】
本発明の一態様に係る自己免疫疾患の予防および／または治療剤では、上記抗ＤＯＣＫ８抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００７５】
本発明の一態様に係る自己免疫疾患の予防用および／または治療用のワクチンは、ＤＯＣＫ８タンパク質、ＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列、または、ＤＯＣＫ８タンパク質若しくはＤＯＣＫ８タンパク質の部分配列の発現ベクターを有効成分として含有していることを特徴としている。
【実施例】
【００７６】
〔試験１〕
ＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Japan Inc.）に、卵白アルブミン（ＯＶＡ：grade V; Sigma）０．５ｍｇ、または、ＰＢＳを、５日毎に繰り返し腹腔内投与した。これによって、自己免疫疾患の症状を呈するマウスを作製した。【００７７】
６回目、９回目および１２回目のＯＶＡの投与、並びに、６回目、９回目および１２回目のＰＢＳの投与の２４時間前に、ｒａｂｂｉｔ由来の抗ＤＯＣＫ８抗体５０μｇ、または、ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ（ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ）５０μｇを、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ投与した。【００７８】
なお、当該抗ＤＯＣＫ８抗体としては、市販の抗ＤＯＣＫ８ポリクローナル抗体（proteintech社、DOCK8 Polyclonal Antibody、Catalog No. 11622-1-AP、抗原：配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）を用いた。【００７９】
１２回目のＯＶＡの投与後、および、１２回目のＰＢＳの投与後に、アルブスティックス（登録商標）（SIEMENS）を用いた呈色反応により、全身性エリテマトーデスでの腎炎発症の指標となるタンパク尿（proteinuria）を検出した。また、周知の方法にしたがってＨＥ（Hematoxylin-Eosin）染色を行い、ＷＨＯの分類にしたがって腎臓の病理学的評価を行った。具体的には、「Weening JJ et al., The classification of glomerulonephritis in systemic lupus erythematosus revised. J Am Soc Nephrol 15（2）:241-250, 2004」に記載の基準にしたがって、観察した腎臓の症状を、クラスＩ〜ＩＩ、クラスＩＩＩ、クラスＩＶ、および、クラスＶに分類し、腎臓の病理学的評価を行った。【００８０】
図１に、タンパク尿の試験結果を示し、下記の表１に、ＷＨＯの分類にしたがった腎臓の病理学的評価を示す。【００８１】
図１に示すように、６回目、９回目および１２回目のＯＶＡの投与前にｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧを投与したＢＡＬＢ／ｃマウス群（図１の「ＯＶＡ×１２  ＋  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ」）では、タンパク尿が検出された。一方、６回目、９回目および１２回目のＯＶＡの投与前に抗ＤＯＣＫ８抗体を投与したＢＡＬＢ／ｃマウス群（図１の「ＯＶＡ×１２  ＋  ａｎｔｉ−ＤＯＣＫ８  Ａｂ」）では、タンパク尿のレベルが低下した。なお、図１において「ＰＢＳ×１２  ＋  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ」は、６回目、９回目および１２回目のＰＢＳの投与前にｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧを投与したＢＡＬＢ／ｃマウス群の試験結果である。【００８２】
また、表１に示すように、６回目、９回目および１２回目のＯＶＡの投与前にｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧを投与したＢＡＬＢ／ｃマウス群（表１の「ＯＶＡ×１２  ＋  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ」）では、ＷＨＯ分類におけるＩＶ型およびＶ型など重症の腎炎が検出された。一方、６回目、９回目および１２回目のＯＶＡの投与前に抗ＤＯＣＫ８抗体を投与したＢＡＬＢ／ｃマウス群（表１の「ＯＶＡ×１２  ＋  ａｎｔｉ−ＤＯＣＫ８  Ａｂ」）では、腎炎がほぼ完全に抑制された。なお、表１において「ＰＢＳ×１２  ＋  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ」は、６回目、９回目および１２回目のＰＢＳの投与前にｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧを投与したＢＡＬＢ／ｃマウス群の試験結果である。【００８３】
【表１】
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〔試験２〕
ＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Japan Inc.）に、卵白アルブミン（ＯＶＡ：grade V; Sigma）０．５ｍｇを、５日毎に繰り返し腹腔内投与した。これによって、自己免疫疾患の症状を呈するマウスを作製した。【００８４】
６回目、９回目および１２回目のＯＶＡの投与の２４時間前に、ｒａｂｂｉｔ由来の抗ＤＯＣＫ８抗体（〔試験１〕に用いたものと同じ抗体）５０μｇ、または、ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ（ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ）５０μｇを、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ投与した。【００８５】
１２回目のＯＶＡの投与後に採血を行い、血清中の自己抗体（具体的には、ＲＦ（rheumatoid factor）、ａｎｔｉ−Ｓｍ  Ａｂ、および、ａｎｔｉ−ｄｓＤＮＡ  Ａｂ）をＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）により検出した。【００８６】
下記の表２にＥＬＩＳＡの試験結果を示す。【００８７】
また、表２に示すように、６回目、９回目および１２回目のＯＶＡの投与前にｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧを投与したＢＡＬＢ／ｃマウス群（表２の「ＯＶＡ×１２  ＋  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ」）と比較して、６回目、９回目および１２回目のＯＶＡの投与前に抗ＤＯＣＫ８抗体を投与したＢＡＬＢ／ｃマウス群（図３の「ＯＶＡ×１２  ＋  ａｎｔｉ−ＤＯＣＫ８  Ａｂ」）では、３種類の自己抗体の全てが、有意に減少した。【００８８】
【表２】
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〔試験３〕
ＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Japan Inc.）に、卵白アルブミン（ＯＶＡ：grade V; Sigma）０．５ｍｇを、５日毎に繰り返し腹腔内投与した。これによって、自己免疫疾患の症状を呈するマウスを作製した。【００８９】
１２回目のＯＶＡの投与の後、Ｔ細胞を幾つかの亜集団に分画した。周知の方法にしたがって、各亜集団のＴ細胞から、細胞質画分と、膜画分とを取得した。【００９０】
１レーンあたり１０μｇの細胞質画分、および、１レーンあたり１０μｇの膜画分を電気泳動（１０％ポリアクリルアミドゲル）に供し、各画分に含有されるタンパク質を分離した。抗ＤＯＣＫ８抗体を用いたウエスタンブロット法にて、分離されたタンパク質に含まれているＤＯＣＫ８タンパク質を検出した。その結果を図２に示す。【００９１】
図２において、レーン１および５は、各々、Ｗｈｏｌｅ  Ｔ細胞に由来する、細胞質画分および膜画分の試験結果である。また、レーン２および６は、各々、ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ１２２ｈｉｇｈ細胞に由来する、細胞質画分および膜画分の試験結果である。また、レーン３および７は、各々、ＰＤ−１−ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ１２２ｌｏｗ細胞に由来する、細胞質画分および膜画分の試験結果である。また、レーン４および８は、各々、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ１２２ｌｏｗ細胞に由来する、細胞質画分および膜画分の試験結果である。【００９２】
これらの細胞のうち、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ１２２ｌｏｗ細胞に、自己応答性・自己抗体誘導性ＣＤ４  Ｔ細胞（autoantibody-inducing CD4 T cells；ａｉＣＤ４  Ｔ細胞）が含まれている。また、図２において、略２３０ｋＤａの位置に観察される像が、ＤＯＣＫ８タンパク質に対応する。【００９３】
図２のレーン４および８から明らかなように、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ１２２ｌｏｗ細胞では、細胞質画分のみならず、膜画分に多くのＤＯＣＫ８タンパク質が含まれていた。このことは、Ｄ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ１２２ｌｏｗ細胞では、細胞膜の表面に多くのＤＯＣＫ８タンパク質が局在していることを示している。なお、抵ＤＯＣＫ８抗体を用いたフローサイトメトリーによってＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ１２２ｌｏｗ細胞を認識できることからも、Ｄ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ１２２ｌｏｗ細胞では、細胞膜の表面に多くのＤＯＣＫ８タンパク質が局在していると考えられる。【００９４】
これまでの研究から、ＣＤ４  Ｔ細胞亜集団（具体的には、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ１２２ｌｏｗ）に含まれるａｉＣＤ４  Ｔ細胞が、多様な自己抗体を誘導するとともに、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を成熟させて種々の臓器障害を惹起して、ＳＬＥを発症させることが知られている。それ故に、本試験結果は、細胞質画分に存在するＤＯＣＫ８タンパク質のみならず、細胞膜の表面に存在するＤＯＣＫ８タンパク質が、ＳＬＥの発症メカニズムに関与していることを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の一態様は、自己免疫疾患の予防および／または治療に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018159549.tif 000009
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