(57)【要約】  従来の酵素反応及び質量分析法に用いられる化合物は、ターゲット酵素に応じて、アルキル鎖の長さなど基質化合物の構造を変更する必要があることから、生成化合物の質量分析条件が一定しない、感度が低下するといった問題があった。本発明では、安定して高感度に微量成分を検出するための酵素反応及び微量分析方法に用いる化合物を提供する。  本発明の化合物は、特定部位に窒素原子、アミド結合及びグリコシド結合を有することが特徴であり、酵素との反応性が高く、また、質量分析装置で非常に検出し易い化合物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
2018003652.tif 000017
または、下記一般式（２）
【化２】
2018003652.tif 000018
または、下記一般式（３）
【化３】
2018003652.tif 000019
または、下記一般式（４）
【化４】
2018003652.tif 000020
（一般式（１）、（２）、（３）及び（４）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互いに同一である又は互いに異なる、置換基を有しない又は置換基Ｗを有するアルキル基、アリール基、シクロアルキル基、複素環基であり、Ｗは、Ｃ１〜１０の飽和もしくは不飽和炭化水素基、アリール基、ヘテロシクリル基、アルコキシ基、フルオロアルキル基、アシル基、エステル基、ヒドロキシル基、アミノ基、アミド基、カルボキシル基、スルホニル基、ニトロ基、シアノ基、スルフェニル基、スルホ基、メルカプト基、シリル基またはハロゲン基を表し、Ｒ5は、−Ｘ−Ｙ基、−Ｙ基又は−Ｘ−Ｈ基以外の置換基を有しない又は−Ｘ−Ｙ基、−Ｙ基又は−Ｘ−Ｈ基以外の置換基Ｗを有するアリール基、シクロアルキル基、複素環基であり、Ａ1及びＡ2は、互いに同一である又は互いに異なる、置換基を有しない又は置換基Ｗを有するアルキル基であり、Ｘは、硫黄原子又は酸素原子であり、一般式（１）及び（２）中、Ｙは、糖類である。）で表される化合物、または、その塩。
【請求項２】
一般式（１）ないし（４）中の、Ｒ5はフェニル基であることを特徴とする請求項１に記載の化合物、または、その塩。
【請求項３】
一般式（１）または（２）中の、Ｙはガラクトースであることを特徴とする請求項１に記載の化合物、または、その塩。
【請求項４】
一般式（１）及び（３）中の、Ｘが酸素原子であり、オクタノール／水分配係数ＬｏｇＰが１〜５、分子量が１００〜１０００である、請求項１に記載の化合物、または、その塩。
【請求項５】
一般式（１）または（２）が、下記一般式（５）であることを特徴とする請求項１に記載の化合物、または、その塩。
【化５】
2018003652.tif 000021
【請求項６】
一般式（３）または（４）が、下記一般式（６）であることを特徴とする請求項１に記載の化合物、または、その塩。
【化６】
2018003652.tif 000022
【請求項７】
酵素と請求項１または２に記載の一般式（１）または（２）の化合物を反応させて、請求項１または２に記載の一般式（３）または（４）の化合物を得る工程を含む、質量分析方法。
【請求項８】
酵素が、グリコシダーゼであることを特徴とする、請求項７に記載の質量分析方法。
【請求項９】
酵素が、ガラクトシダーゼであることを特徴とする、請求項７に記載の質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量成分を検出するための酵素反応及び質量分析方法に用いる化合物並びに該化合物を用いた酵素反応及び質量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析装置は物質をイオン化し、真空中でのイオンの移動度を基にｍ／ｚ（イオンの質量を統一原子量質量単位で割り、さらにイオンの電荷数で割った値。斜字表記）と強度を測定する装置である。特定のｍ／ｚ値のイオンのみが検出器に導入されるようコントロールするが、導入されるイオンのｍ／ｚにはある程度の幅が生じ、また異なるイオン種であっても同じｍ／ｚとなることもある。より特定のイオン種を選択するため、開裂により生じたフラグメントイオンを利用することが行われる。まずイオンをｍ／ｚで一次選択した後に、イオンを開裂し、イオン内結合の開裂により生じたフラグメントイオンのｍ／ｚで二次選択することにより選択性を向上させることができる。開裂により生じた特定のフラグメントイオンを連続的に検出する、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）は、選択性と定量性が高い分析方法である。このとき、特定のフラグメントイオンが安定して生成し、その生成割合が高い方が感度や再現性が良くなる。有機化合物は炭素原子が連なった主鎖が構造の骨格になるが、主鎖の炭素鎖に窒素原子や酸素原子を含むことにより、特定の場所で開裂しやすくなる（非特許文献１）。【０００３】
生体成分の分析に酵素を使い検出化合物を増幅することが広く行われている。例えば、遺伝子組み換えに置いて特定の遺伝子が発現しているかどうか確認するために、目的遺伝子と共にガラクトシダーゼ遺伝子を組み込むことがある。特定の遺伝子が発現した場合には同時にガラクトシダーゼが発現し、５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌβ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを加えると、酵素反応により本化合物からガラクトースが遊離して発色し、特定の遺伝子が発現していることを判断することができる（非特許文献２）。【０００４】
また、酵素免疫法では抗体に結合した酵素、若しくは抗体にビオチン−アビジン複合体を介して結合した酵素の反応により生成した化合物を光学的に検出することは知られるところである。例えば酵素をペルオキシダーゼとし、反応基質のテトラメチルベンチジンが電子を２個得てキノンイミニウムダブルカチオンラジカルとなり青色に発色する系などが知られている。いずれも酵素反応は酵素１分子に対し多分子の基質が反応し、増幅することが利用されている（非特許文献３）。【０００５】
基質化合物と酵素との反応により生じた生成化合物を、質量分析法を用いることにより、酵素反応を検出する方法として、リソソーム酵素及びリソソーム酵素をターゲットとする基質を用いた方法が知られている（特許文献１）。【０００６】
かかる方法は、ターゲット酵素に応じて、アルキル鎖の長さなど基質化合物の構造を変更する必要があることから、生成化合物の質量分析条件が一定しない、感度が低下するといった問題があり、安定した分析対象の微量分析を行う方法としては十分ではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００９−５３０３１０号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】中田尚男、J. Mass Spectrom. Soc. Jpn.、63巻1号31-43、2015年
【非特許文献２】S. Muto, Q-M. Zhang, S. Yonei, J. Bacteriol., 175, 2645-2651, 1993
【非特許文献３】The Immunoassay Handbook Fourth Edition, David Wild編、2013年、Elsevier出版（イギリス）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、安定して高感度に微量成分を検出するための酵素反応及び微量分析方法に用いる化合物並びに該化合物を用いた酵素反応及び質量分析方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的に鑑み、本発明者らは、酵素反応及び質量分析法に適した化合物について鋭意検討する中で、特定部位に窒素原子、アミド結合及びグリコシド結合を有する基質化合物が、酵素との反応性が高く、また、当該酵素反応によって生成した化合物（生成化合物）が質量分析装置で非常に検出し易いことを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
ここで、「検出し易い」とは、質量分析装置において強い信号強度を与えるほか、検出対象となる生成化合物の質量分析結果が、基質化合物の質量分析結果と干渉しないようにそれぞれの質量の差が大きくなることをいう。また、質量分析において、クロマトグラフィーによる検出化合物の分離が行われることが多く、この際に分離し易いことをいう。かかる分離では、化合物の疎水性を主に認識する分離剤が用いられることが多く、基質化合物と生成化合物の疎水性の差が大きくことなることが求められる。【００１２】
すなわち、本発明は以下に関する。【００１３】
［１］  下記一般式（１）【００１４】
【化１】
2018003652.tif 000002
【００１５】
または、下記一般式（２）【００１６】
【化２】
2018003652.tif 000003
【００１７】
または、下記一般式（３）【００１８】
【化３】
2018003652.tif 000004
【００１９】
または、下記一般式（４）【００２０】
【化４】
2018003652.tif 000005
【００２１】
（一般式（１）、（２）、（３）及び（４）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互いに同一である又は互いに異なる、置換基を有しない又は置換基Ｗを有するアルキル基、アリール基、シクロアルキル基、複素環基であり、Ｗは、Ｃ１〜１０の飽和もしくは不飽和炭化水素基、アリール基、ヘテロシクリル基、アルコキシ基、フルオロアルキル基、アシル基、エステル基、ヒドロキシル基、アミノ基、アミド基、カルボキシル基、スルホニル基、ニトロ基、シアノ基、スルフェニル基、スルホ基、メルカプト基、シリル基またはハロゲン基を表し、Ｒ5は、−Ｘ−Ｙ基、−Ｙ基又は−Ｘ−Ｈ基以外の置換基を有しない又は−Ｘ−Ｙ基、−Ｙ基又は−Ｘ−Ｈ基以外の置換基Ｗを有するアリール基、シクロアルキル基、複素環基であり、Ａ1及びＡ2は、互いに同一である又は互いに異なる、置換基を有しない又は置換基Ｗを有するアルキル基であり、Ｘは、硫黄原子又は酸素原子であり、一般式（１）及び（２）中、Ｙは、糖類である。）で表される化合物、または、その塩に関する。【００２２】
［２］  一般式（１）及び（３）中の、Ｘが酸素原子であり、オクタノール／水分配係数ＬｏｇＰが１〜５、分子量が１００〜１０００である、［１］に記載の化合物、または、その塩。に関する。【００２３】
［３］  酵素と請求項１に記載の一般式（１）又は（２）の化合物を反応させて、［１］または［２］に記載の一般式（３）又は（４）の化合物を得る工程を含む、質量分析方法に関する。【００２４】
［４］  酵素が、グリコシターゼであることを特徴とする、［３］に記載の質量分析方法に関する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、酵素免疫法などの酵素反応に用いられる微量の酵素等を、質量分析装置を用いて、安定して高感度で検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】化合物ＨＶに関するＨＰＬＣデータを示す図。
【図２】化合物ＨＶに関するＮＭＲデータを示す図。
【図３】化合物ＨＶＧに関するＨＰＬＣデータを示す図。
【図４】化合物ＨＶＧに関するＮＭＲデータを示す図。
【図５】化合物ＨＶＧの３．０ｐｇ／ｍＬの試料を分析した結果を示す図。
【図６】化合物ＨＶの３．０ｐｇ／ｍＬの試料を分析した結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
酵素反応及び質量分析法に適した本発明の基質化合物は、下記一般式（１）又は（２）で表され、生成化合物は下記一般式（３）又は（４）で表される。下記一般式（１）又は（２）で表される化合物が酵素と反応し、生成化合物である下記一般式（３）又は（４）で表される化合物を、質量分析装置を用いて分析を行うことにより、特定の酵素を安定して高感度で検出することが可能となる。
【００２８】
【化１】
2018003652.tif 000006
【００２９】
【化２】
2018003652.tif 000007
【００３０】
【化３】
2018003652.tif 000008
【００３１】
【化４】
2018003652.tif 000009
【００３２】
一般式（１）、（２）、（３）及び（４）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互いに同一である又は互いに異なる、置換基を有しない又は置換基Ｗを有するアルキル基、アリール基、シクロアルキル基、複素環基である。アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の炭素数１〜１０のアルキル基が挙げられる。アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。シクロアルキル基としては、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。複素環としては、例えば、イミダゾール環、イミダゾリン環、イミダゾリジン環、１，２，４−トリアゾール環、テトラゾール環、オキサゾリン環、オキサゾール環、オキサゾリジン環、チアゾリン環、チアゾール環、チアゾリジン環等が挙げられる。置換基Ｗは、Ｃ１〜１０の飽和もしくは不飽和炭化水素基、アリール基、ヘテロシクリル基、アルコキシ基、フルオロアルキル基、アシル基、エステル基、ヒドロキシル基、アミノ基、アミド基、カルボキシル基、スルホニル基、ニトロ基、シアノ基、スルフェニル基、スルホ基、メルカプト基、シリル基またはハロゲン基等が挙げられる。
【００３３】
一般式（１）、（２）、（３）及び（４）中、Ｒ5は、−Ｘ−Ｙ基、−Ｙ基又は−Ｘ−Ｈ基以外の置換基を有しない又は−Ｘ−Ｙ基、−Ｙ基又は−Ｘ−Ｈ基以外の置換基Ｗを有するアリール基、シクロアルキル基、複素環基であり、Ａ1及びＡ2は、互いに同一である又は互いに異なる、置換基を有しない又は置換基Ｗを有するアルキル基であり、Ｘは、硫黄原子又は酸素原子である。アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の炭素数１〜１０のアルキル基が挙げられる。アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。シクロアルキル基としては、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。複素環としては、例えば、イミダゾール環、イミダゾリン環、イミダゾリジン環、１，２，４−トリアゾール環、テトラゾール環、オキサゾリン環、オキサゾール環、オキサゾリジン環、チアゾリン環、チアゾール環、チアゾリジン環等が挙げられる。置換基Ｗは、Ｃ１〜１０の飽和もしくは不飽和炭化水素基、アリール基、ヘテロシクリル基、アルコキシ基、フルオロアルキル基、アシル基、エステル基、ヒドロキシル基、アミノ基、アミド基、カルボキシル基、スルホニル基、ニトロ基、シアノ基、スルフェニル基、スルホ基、メルカプト基、シリル基またはハロゲン基等が挙げられる。
【００３４】
一般式（１）及び（２）中、Ｙは、糖類であり、糖類中の１位の炭素原子が、Ｒ5またはＸと結合する。糖類としてはペンタオース、ヘキソース等が挙げられる。ヘキソースとしては、アルドヘキソース、ケトヘキソース等が挙げられる。アルドヘキソースとしては、ガラクトース、グルコース、マンノース等が挙げられ、ケトヘキソースとしては、フルクトース、プシコース、ソルボース等が挙げられる。糖類のなかでも、基質特異性と活性が高い酵素が得やすいという観点から、アルドヘキソースが好ましく、その中でも、グルコース、ガラクトースがより好ましく、Ｄ−グルコースやＤ−ガラクトースがさらに好ましい。
【００３５】
一般式（１）、（２）、（３）及び（４）で表される化合物の塩としては、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩等が挙げられ、製造及び溶解性の観点から塩酸塩が望ましい。
【００３６】
酵素反応に用いられる酵素として、例えば、グリコシダーゼが挙げられる。グリコシダーゼとしては、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、キチナーゼ、フコシダーゼ、アミラーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、ラクターゼ、ヘキソサミニダーゼ等が挙げられ、活性の強さ及び特異性の観点から、ラクターゼを含むβ−ガラクトシダーゼ、アミラーゼを含むα−グルコシダーゼがより好ましい。
【００３７】
一般式（１）及び（２）で表される化合物に関し、特定部位に窒素原子、アミド結合及びグリコシド結合を有する基を有し、Ｒ5部分がアリール基、シクロアルキル基、複素環基であることにより、酵素反応が良好に進行することを特徴とする。例えば、酵素反応により、一般式（１）及び（２）中の−Ｙ基の遊離を容易にするために、Ｒ5部分は、６員環構造を有するアリール基、シクロアルキル基、複素環基であることが好ましい。
【００３８】
一般式（１）、（２）、（３）及び（４）で表される化合物に関し、特定部位にアミド結合を有することにより、質量分析測定のイオン化において陽イオンを生成しやすく、質量分析装置測定での感度が高くなるという効果を奏することを特徴とする。
【００３９】
一般式（１）及び（２）で表される化合物に関し、特定部位にグルコシド結合を有することにより、特定の酵素による切断の選択性が向上するため、特定の酵素が存在するときのみに（３）及び（４）の化合物を生成するという効果を奏することを特徴とする。
【００４０】
一般式（３）及び（４）で表される化合物に関し、質量分析装置において強い信号強度を与えるために、緩衝液−有機溶媒系にて溶解し易い性質を有するのが好ましく、具体的には、オクタノール／水分配係数（ｌｏｇＰ）が１から５範囲に含まれることが好ましい。
【００４１】
また、一般式（３）及び（４）で表される化合物は、主鎖の炭素間結合の中の特定部位に窒素原子を有し、さらには、特定部位にアミド結合を有する基を有することから、特定のフラグメントイオンを発生させ、安定して高感度な検出が可能となる。
【００４２】
化合物の質量が異なっても同位体元素の存在や付加イオンなどにより質量分析では干渉する場合がある。付加イオンとしては水素原子、アンモニウム、ナトリウム、カリウムなどのイオンが知られている。これらを排除するためには基質化合物と生成化合物のｍ／ｚ値（質量／電荷数）が４０以上離れていることが好ましい。
【００４３】
また夾雑物として、試料由来の化合物の他、移動相に用いられている水やアセトニトリルなどの有機溶媒、アンモニアやギ酸などの塩やこれらが数分子集まったクラスターなどがある。これらのフラグメントイオンとの干渉を回避するために、一般式（１）及び一般式（２）で表される化合物のｍ／ｚ値が１００以上あることが好ましい。例えば、一般式（１）中、ＹがＤ−ガラクトースであり、酵素としてβ−ガラクトシダーゼを用いた場合、β−ガラクトシダーゼはガラクトースを遊離するため、基質化合物と生成化合物の分子量の差が１６２となり、質量分析装置において明確に区別することが可能となる。
【００４４】
酵素反応溶液中には、通常、基質化合物と生成化合物の双方が存在しており、基質化合物が生成化合物のイオン化を阻害することも予想され、これを避けるためにクロマトグラフィーで両物質を分離することが行われる。基質化合物と生成化合物をクロマトグラフィーなどで分離しやすくするために、酵素反応において、基質化合物とは大きく構造・性質が異なる生成化合物が生じることが好ましい。例えば、クロマトグラフィーでは、化合物の疎水性を主に認識する分離剤が用いられることが多いことから、基質化合物と生成化合物とでは、疎水性が大きく異なること好ましい。
【００４５】
本発明では、糖という親水性が高い化合物を酵素反応により分離するため、基質化合物と生成化合物では疎水性が大きく異なる。例えば、一般式（１）及び（２）で表される基質化合物が、以下に示される［化５］の化合物（以下「ＨＶＧ」と記載）である場合、ｌｏｇＰ計算値は３．６であり、酵素反応により親水性が強いガラクトース（ｌｏｇＰ値−３．４）を分離することにより、一般式（３）及び（４）で表される化合物として、以下に示される化合物［化６］（以下「ＨＶ」と記載）が生成される。ＨＶのｌｏｇＰ計算値は４．９であり、ＨＶＧのｌｏｇＰ計算値と比較して疎水性が大きく異なる。
【００４６】
【化５】
2018003652.tif 000010
【００４７】
【化６】
2018003652.tif 000011
【実施例】
【００４８】
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００４９】
各生成物については以下の条件で分析を行った。【００５０】
核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）  
VARIAN社NMR装置  400MHz  
液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）  
ＬＣ部条件：  
装置：島津製作所  LC-20  
カラム：アジレントテクノロジー  Eclipse XDB-C18  
（カラム長150mm、内径4.6mm、充填剤粒子径5μm）  
カラム温度：40℃  
流速：1.5mL/分  
検出装置：紫外分光（ＵＶ）検出器  測定波長254nm  
溶離液Ａ：0.037%(V/V)トリフルオロ酢酸水溶液  
溶離液Ｂ：0.018%(V/V)トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液  
グラジェント条件： 0分  Ｂ液10%  
10分  Ｂ液80%  
15分  Ｂ液80%  
ＭＳ部条件：  
島津製作所  2010MSD（イオン化装置ES-API）【００５１】
［化合物ＨＶの合成］
【実施例１】
【００５２】
ＨＶは、以下の方法で合成した。【００５３】
【化７】
2018003652.tif 000012
【００５４】
窒素置換したフラスコに化合物Ｂ（２．０ｇ、４．２ｍｍｏｌ）、化合物Ａである４−アミノフェノール（１．１５ｇ、１０．６ｍｍｏｌ、２．５当量）および溶媒としてＤＭＦ（Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド）５ｍＬ  を仕込み０℃に冷却した。ここに、ＤＭＡＰ（Ｎ、Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン、１１５ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ、０．３当量）およびＥＤＣ・ＨＣｌ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩、８９０ｍｇ、４．７ｍｍｏｌ、１．１当量）加え、ＤＩＥＡ（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、５４６ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ、１．０当量）を０℃で保ちながら滴下した。２０℃に昇温し３時間反応した。反応液を１５０ｍＬの水に注加し、酢酸エチル１５０ｍＬで５回抽出し、残った水相を更にジクロロメタン／メタノールの１０対１の混合液５０ｍＬで６抽出した。得られた全ての有機相を合わせて飽和食塩水５０ｍＬ  で３回洗浄し、有機溶媒を４５℃で減圧下留去した。得られた残渣を、分取ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ）を用いて下記条件で精製し、目的とするＨＶ０．６ｇ（収率２５％）を得た。ＮＭＲよりＨＶの構造を支持しており、ＨＰＬＣの測定から９７．０％の純度であることを確認した。ＨＰＬＣデータを図１に、ＮＭＲデータを図２に示す。【００５５】
［化合物ＨＶＧの合成］
【実施例２】
【００５６】
ＨＶＧは、以下の方法で合成した。【００５７】
【化８】
2018003652.tif 000013
【００５８】
ＨＶ（５０ｍｇ、８８．５μｍｏｌ）および化合物Ｃ（１０９ｍｇ、２２６μｍｏｌ、３当量）をＤＭＦ  ２．０ｍＬに溶解し、２０℃で炭酸セシウム（１１５ｍｇ、３５４μｍｏｌ、４当量）を加え、同温での１６時間撹拌下で反応を行った。反応混合物を２０ｍＬの水に注加し、酢酸エチル２０ｍＬで３回抽出した。酢酸エチルの抽出液を合わせて、飽和食塩水２０ｍＬで３回洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を４０℃で減圧下留去した。  残渣を分取ＴＬＣ（シリカゲル、ジクロロメタンとメタノールの混合溶液を展開溶媒に使用）で精製し淡黄色油状の化合物ＤであるＨＶＡを４０ｍｇ（収率３８％）得た。【００５９】
【化９】
2018003652.tif 000014
【００６０】
窒素気流下で１ｍｏｌ／Ｌのナトリウムメトキシドのメタノール溶液（８．９４μＬ、０．２当量）に２０℃でＨＶＡ（４０ｍｇ、４４．７μｍｏｌ）を一度に加え、２５℃で３時間反応した。反応液を減圧下留去し残渣を分取ＨＰＬＣ（精製条件は以下に記載）で精製し淡黄色結晶のＨＶＧを３．３ｍｇ（収率１０％）得た。【００６１】
分取ＨＰＬＣ条件  
装置：Gilson 281  セミ分取HPLCシステム  
分取カラム：Agela Venusil XBP C18  
（カラム長150mm、内径25mm、充填剤粒子径5μm）  
流速：25mL/分  
検出装置：ＵＶ（紫外可視分光）検出器  測定波長220および254nm  
溶離液Ａ：10mM 炭酸水素アンモニウム水溶液  
溶離液Ｂ：アセトニトリル  
グラジェント条件： 0分  Ｂ液20%  
12分  Ｂ液40%  
14分  Ｂ液100%【００６２】
ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳ（計算値の分子量７２６）よりＨＶＧの構造を支持しており、ＨＰＬＣの測定（カラムはフェノメネックス  ＬＵＮＡ  Ｃ１８  カラム長５０ｍｍ、内径２ｍｍ、充填剤粒子径５μｍ  を使用）から９９．２％の純度であることを確認した。ＨＰＬＣデータを図３に、ＮＭＲデータを図４に示す。【００６３】
［化合物ＨＶ及びＨＶＧの分析］
【実施例３】
【００６４】
株式会社島津製作所製  高速液体クロマトグラフ質量分析計  ＬＣＭＳ−２０１０を用いて、以下の高速液体クロマトフィー及び質量分析条件において分析を行った。【００６５】
ＨＰＬＣ条件  
ＨＰＬＣシステム：島津  30Aシステム，株式会社島津製作所  
分析カラム      ：HITACHI Lachrom Ultra C18（2.0mm×50mm，2μm，  
日立ハイテクノロジーズ）  
移動相Ａ        ：0.1%ギ酸溶液  
移動相Ｂ        ：アセトニトリル  
ニードル洗浄液  ：アセトニトリル  
移動相Ａ及び移動相Ｂをタイムプログラムに従いグラジエントを行う。  
タイムプログラム：グラジエント（以下の容量比で行う）【００６６】
【表１】
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【００６７】
流速                      ：0.2mL/min  
カラム恒温槽設定温度      ：40℃  
オートサンプラー設定温度  ：室温（設定なし）  
注入量                    ：10μL  
ＭＳ／ＭＳシステム導入時間：2.00分〜7.00分  
ＭＳ／ＭＳ条件  
ＭＳ／ＭＳシステム：API 6500 (AB SCIEX)  
Ion Source                ：ESI  
Scan Type                 ：MRM  
Polarity                  ：Positive  
Source Temperature        ：600℃【００６８】
【表２】
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【００６９】
ＨＶＧの３．０ｐｇ／ｍＬの試料を分析した結果を図５に示す。【００７０】
ＨＶの３．０ｐｇ／ｍＬの試料を分析した結果を図６に示す。【００７１】
本分析結果より、ＪＩＳ  Ｋ０１３６（２０１５）高速液体クロマトグラフィー質量分析通則に基づき、ＬＯＤ（Ｓ／Ｎ＝３）を計算したところ、ＨＶＧ４．０ａｍｏｌ、ＨＶ１．７ａｍｏｌ、ベラパミル  ２．６ａｍｏｌとなった。本実験より、質量分析装置にて高感度で検出される物質として知られるベラパミルと、ＨＶは同程度の感度を有することがわかった。【００７２】
［酵素反応について］
【実施例４】
【００７３】
５％（ｖ／ｖ）メタノール、１ｍｍｏｌ塩化マグネシウム含有１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）中、ＨＶＧ２０ｎｇ／ｍｌ、ガラクトシダーゼ０．５ｎｇ／ｍｌとなるよう調整し、３７℃にて１時間反応させたところ、０．５３２ｎｇ／ｍｌのＨＶが生成した。ＨＶＧの代わりに、ｐ−ニトロフェニルガラクトシドを基質として反応させたところ、０．５３２ｎｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェノールが生成した。本実施例により、ＨＶＧは、ガラクトシダーゼの良い基質として知られるｐ−ニトロフェニルガラクトシドと同程度の酵素感受性を示すことがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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