【事件の表示】
　特願２００２−　５７１２３「変異したスブチリシンプロテアーゼ」拒絶査定不服審判事件〔平成１４年１０月２９日出願公開、特開２００２−３１５５９１〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．手続の経緯・本願発明　
　本願は、平成２年６月２６日（パリ条約による優先権主張１９８９年６月２６日、デンマーク）に国際出願された特願平２−５０９９３９号の一部を、平成１４年３月４日に新たな特許出願としたものであって、その請求項に係る発明は、平成１５年９月１１日付の手続補正書によって補正された本願明細書の記載から見て、その特許請求の範囲の請求項１〜１０に記載されとおりのものであるところ、その請求項１には以下のとおり記載されている（以下、これを「本願発明」という。）。　
「【請求項１】　正味の静電荷が同一pHにおいて親プロテアーゼに比較して変化しており、前記親プロテアーゼに比べて高いか又は低い等電点を有し、そして成熟スブチリシンBPN'の位置に対応する位置27、245、248及び252の少なくとも１部位のアミノ酸が他のアミノ酸により置換されている、変異したスブチリシンプロテアーゼ。」　
　
２．原審の拒絶査定の理由　
　これに対する原審の拒絶査定の理由となった、平成１５年３月４日付で通知した拒絶理由の理由１は、以下のとおりのものである。　
「１．この出願の下記の請求項に係る発明は、その出願前日本国内又は外国において頒布された下記の刊行物に記載された発明に基いて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。　
　　　　　　　　　　　　　　　　　記　
　引用例１：国際公開第８８／０８０３３号パンフレット（１９８８）　
　引用例２：Ｎａｔｕｒｅ，３１８［６０４４］（１９８５）ｐ．３７５−３７６　
　引用例３：Ｎａｔｕｒｅ，３２８［６１３０］（１９８７）ｐ．４９６−５００　
　引用例４：Ｎａｔｕｒｅ，３３０［６１４３］（１９８７）ｐ．８６−８８」　
　
３．当審の判断　
　以下、本願発明が、上記拒絶査定の理由により拒絶されるべきものかどうか、検討する。　
（３−１）引用例に記載された技術的事項　
引用例１：国際公開第８８／０８０３３号パンフレット（１９８８）
「スブチリシンアナログ」という名称の発明に関するＰＣＴ国際出願の国際公開パンフレットであり、　
（ｉ）「Ｂａｃｉｌｌｕｓスブチリシンは水溶液中で温度及びｐＨに大幅に依存する速度で不可逆的に失活する。ｐＨ値が４より低いか又は１１より高いと、失活速度は非常に迅速であり、ｐＨが４．５〜１０．５では該速度は著しく緩慢ではあるが、溶液のアルカリ度が増加するに従って増加する。」（対応する国内公表公報である特表平１−５０２９５７号公報の３頁左下欄１６〜２０行）、「各種の産業に必要な温度、ｐＨ、変性剤及び他の条件に関して改良された安定性を有する類のプロテアーゼを得ることが望ましい。」（同４頁左上欄４〜６行）、「液体洗濯用配合物中の保存安定性が高く、より広いｐＨ及び温度範囲で安定性及び活性を有するタンパク質分解酵素を使用することが望まれるようになった。」（同４頁左上欄１１〜１４行）と、天然に存在するプロテアーゼであるスブチリシンについて、その特性を改良すべきことが記載され、　
（ｉｉ）具体的にそのような改良された特性を有する酵素を得ようとする手法について、「洗剤配合物中で有用な修飾されたズブチリシンを製造する一アプローチはヨーロッパ特許出願第１３０７５８号に開示されており、該文献は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのスブチリシンのＴｙｒ−１、…Ｇｌｕ１５１及び／又はＡｌａ１５２位置に突然変異を誘発すると、安定性の変化、配座の変更、又は酵素の処理の変化が生じることを立証している。…しかしながら、このアプローチに開示された突然変異では、高温での安定性が野生型酵素よりも大きいか又は野生型酵素よりも広いｐＨ範囲で安定性を有するアナログは得られていない。」（同４頁左上欄１５行〜右上欄１１行）、「本発明のスブチリシンアナログは、（１）天然に産生するＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンのアミノ酸配列中に存在するカルシウム結合部位の１個以上のアミノ酸残基を負の電荷を有するアミノ酸で置換し、（２）天然に産生するＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンのアミノ酸配列中に存在するＡｓｎ−Ｇｌｙ配列のいずれかの残基を欠失又は置換させることにより修飾された天然に産生するＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンのアミノ酸配列を有することを特徴とする。…本発明のスブチリシンアナログは改良された熱及びｐＨ安定性、高い比活性及び広い基質特異性を示し、従ってこのようなアナログを含有する洗剤配合物の洗浄性を増加させる。」（同４頁左下欄８行〜右下欄２行）と記載されている。　
引用例２：Ｎａｔｕｒｅ，３１８［６０４４］（１９８５）ｐ．３７５−３７６
「蛋白工学を用いる酵素の触媒作用のｐＨ依存性の変更」というタイトルの論文であり、　
（ｉｉｉ）「化学修飾の研究により、セリンプロテアーゼによる触媒作用のｐＨ依存性は、全体の表面電荷の変化により変化することが示されており、このことは、ｐＨ依存性を調整する可能性のある一般的な方法が蛋白工学により活性部位の静電的環境を変え、イオン性の触媒グループのｐＫａ値を変えることであることを示唆する。」（３７５頁左欄３〜８行）、　
（ｉｖ）「この研究で、我々は、スブチリシンの活性部位から１４−１５Åのただ一つの表面電荷の変化が酵素のｐＨ依存性に対していかに重要な影響を与えるか、また、その効果の大きさが質的に静電理論と矛盾しない態様でイオン強度とともに変化することを示す。」（３７５頁１３〜１７行）、　
（ｖ）「静電効果の大きさについて我々が研究の対象に選んだ変異は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のスブチリシンにおける９９位のＡｓｐ→ｓｅｒである。」（３７５頁２７〜３０行）と、
　スブチリシンの活性部位のＨｉｓ６４から１４−１５オングストローム離れた負電荷を有するアミノ酸（Ａｓｐ）を電荷のないアミノ酸（Ｓｅｒ）で置換することが記載され、それにより、スブチリシンのｐＨ依存性及びｐＫａが変化することが記載されている。　
引用例３：Ｎａｔｕｒｅ，３２８［６１３０］（１９８７）ｐ．４９６−５００
「表面荷電を工夫することによる酵素の触媒作用の理論的修飾」というタイトルの論文であり、　
（ｖｉ）「部位指向性変異によるスブチリシンの表面電荷の変更は、有意にシフトしたｐＨ−活性プロフィール、より高い触媒活性、及び異なる特異性を有する酵素を産み出す。」（４９６頁要約欄１〜２行）、　
（ｖｉｉ）「（１）表面をより負に荷電すると、タンパク質中の酸性群がすべてイオン化によりプロトンを失うので、そのｐＫａ値が高くなる。反対に、表面をより正に荷電すると、全ての酸性群のｐＫａ値が低くなる。」（４９９頁右欄下９〜６行）と、　
　スブチリシンの表面電荷を変化させると、酵素活性が高まったり、酵素の特異性が変化したりすること、並びに、スブチリシン全体の負電荷が増すと、ｐＫａが上昇することが記載されている。　
引用例４：Ｎａｔｕｒｅ，３３０［６１４３］（１９８７）ｐ．８６−８８
「タンパク質の荷電を工夫することによる静電効果の予測」というタイトルの論文であり、　
（ｖｉｉｉ）８７頁の表２に、スブチリシンの各種アミノ酸残基を置換した際のｐＫａのシフトが記載されている。　
　
（３−２）本願発明との対比・判断　
　本願発明は、上述のとおり、「正味の静電荷が同一pHにおいて親プロテアーゼに比較して変化しており、前記親プロテアーゼに比べて高いか又は低い等電点を有し、そして成熟スブチリシンBPN'の位置に対応する位置27、245、248及び252の少なくとも１部位のアミノ酸が他のアミノ酸により置換されている、変異したスブチリシンプロテアーゼ。」というものであるところ、当該記載中の「等電点」については、本願明細書にも「等電点、pI０ 、は、酵素分子の複合体（必要に応じて金属または他のイオンを結合して有する）が中性である、すなわち、複合体上の静電荷の合計（正味の静電荷＝NEC ）がゼロに等しい、pH値として定義される。この合計において、もちろん、個々の静電荷の正または負の性質を考慮しなくてはならない。　等電点は、便利には、問題の酵素の中の種々の帯電した残基についてのpK値を使用する平衡の考察を使用し、次いで酵素分子のNEC がゼロに等しいpH値を反復して見いだすことによって、計算される。」（【００２３】）、「この計算を使用する１つの問題は、帯電した残基のpK値がそれらの環境に依存し、結局変動にさらされるということである。しかしながら、非常にすぐれた結果は特別の近似したpK値を実際の値に無関係に帯電した残基に割り当てることによって得ることができる。また、部分的に環境を考慮して、より複雑な計算を実施することができる。　pI０ は、また、等電点電気泳動によるか、あるいは酵素を含有する溶液を滴定することによって実験的に決定することができる。また、帯電した残基についての種々のpK値は滴定により実験的に決定することができる。」（【００２４】）と記載されているとおりであるから、親プロテアーゼのアミノ酸残基とは正味の正電荷が異なるアミノ酸残基により当該アミノ酸残基を置換すれば、これにより生じる変異体は「正味の静電荷が同一pHにおいて親プロテアーゼに比較して変化しており、前記親プロテアーゼに比べて高いか又は低い等電点を有する」ことになるものと認められるので、本願発明は、換言すれば、「成熟スブチリシンBPN'の位置に対応する位置27、245、248及び252の少なくとも１部位のアミノ酸が正味の静電荷が異なる他のアミノ酸により置換されている、変異したスブチリシンプロテアーゼ。」というものであるといえる。　
　これに対して、引用例１〜４に記載されているように、本願優先日には、スブチリシンプロテアーゼについて、天然のスブチリシンプロテアーゼは至適ｐＨ等が限られており、洗剤配合物等の用途に適合し得るように、至適ｐＨ等の異なる同効のプロテアーゼを得る動機付けが存在し、そのために、周知のスブチリシンのアミノ酸残基に種々の変異を導入し、適切な特性を有する変異体をスクリーニングすることが試みられ、実際に種々の特性の異なる変異体が得られていたものであり、本願発明の「成熟スブチリシンBPN'の位置に対応する位置27、245、248及び252の少なくとも１部位のアミノ酸が正味の静電荷が異なる他のアミノ酸により置換されている」スブチリシンプロテアーゼの変異体も、そのような適切な特性を有する変異体をスクリーニングする対象の一つとして、当業者が適宜想起し得るものである。　
　そして、本願明細書には、本願発明について具体的な実施例は何ら記載されておらず、また、「成熟スブチリシンBPN'の位置に対応する位置27、245、248及び252の少なくとも１部位のアミノ酸を正味の静電荷が異なる他のアミノ酸により置換する」ことにより親プロテアーゼよりも優れた特性を有する変異体が得られることについて、実施例に替わり得る合理的な説明もなされていないから、本願発明により格別顕著な効果が奏されるものと認めることができない。　
　したがって、本願発明は、引用例１〜４に記載された事項に基づいて、当業者が容易になし得たものである。　
　
（３−３）請求人の主張について　
（３−３−１）審判請求人は、平成１６年７月２９日付けの審判請求書についての手続補正書において、　
「本願発明は、ズブチリシンの27、245、248及び252位においてアミノ酸の置換などにより修飾されたスブチリシン変異体であって、変異の結果、生来のズブチリシンに比べて等電点が異なっており、至的pHであるその答電点付近において、生来のズブチリシンに比べて高い洗浄性能を有することを特徴としている」旨主張し、 
 当該主張を裏付けるものとして、各修飾位置に置換を有するポリペプチドが、生来のズブチリシンに比べて高い洗浄性能を有することを明らかにするために、27位、245及び252位、並びに248位のアミノ酸を置換した変異酵素の洗浄力を置換されていない生来の酵素と比較した実験結果を示している。　
（３−３−２）しかしながら、本願明細書自体には、本願発明について具体的な実施例は何ら記載されていないのは、上述のとおりである。　
　そして、本願発明の特定事項の一つである、変異したスブチリシンプロテアーゼが「親プロテアーゼに比べて高いか又は低い等電点」を有することについて、本願明細書には、「より低いpHに近付く方向の酵素の等電点、pI０ 、の変化は、また、酵素の最適な洗浄性能のpHをより低い値にシフトすることが発見され、これが意味するように、酵素が活性であるべき低いpHの洗浄液に対する酵素を設計するためには、既知のスブチリシン酵素の洗浄性能の改良は、より低いpI０ を有する突然変異の酵素を得るように既知のスブチリシン酵素のための遺伝子を突然変異させることによって得ることができる。　この発見は反対がまた可能であることを示す実験に導いた。これが意味するように、既知のスブチリシン酵素を、また、そのpI０ をより高い値にシフトし、これにより酵素に最適な洗浄性能のpHをより高いpH値にシフトすることによって高いpHの洗浄剤において使用するために設計出来る。」（【００５４】）と記載され、また、そのような等電点の変化したスブチリシンプロテアーゼの変異体について、「本発明は、１つの面において、正味の静電荷が同一pHにおいて親のプロテアーゼに比較して変化しており、そして突然変異したスブチリシンプロテアーゼの中に、前記親のプロテアーゼに関して、より少ないまたはより多い正に帯電したアミノ酸残基および／またはより多いまたはより少ない負に帯電したアミノ酸残基、またはより多いまたはより少ない正の帯電したアミノ酸残基および／またはより少ないまたはより多い負に帯電したアミノ酸残基が、アミノ酸残基の間で、１または２以上の位置１．２．３．４．６．９．10．12．14．15．17．18．19．20．21．22．24．25．27．37．38．40．41．43．44．45．46．49．50．51．52．53．54．55．56．57．58．59．60．61．62．75．77．78．79．87．91．94．97．98．99．100．101．103．104．105．106．107．108．109．112．113．115．116．117．118．126．128．129．130．131．133．134．136．137．140．141．143．144．145．146．155．156．158．159．160．161．162．163．164．165．166．167．171．172．173．182．183．184．185．186．188．189．191．192．194．195．204．206．209．210．211．212．213．214．215．216．217．218．236．237．238．239．240．241．242．243．244．245．247．248．249．252．253．254．255．256．257．259．260．261．262．263．265．269．272．275．に存在し、そしてこれにより前記スブチリシンプロテアーゼは、前記親のプロテアーゼのそれより、それぞれ、低いか、あるいは高い等電点pH（pI０ ）を有する、突然変異したスブチリシンプロテアーゼに関する。」（【００５５】〜【００５７】）と、非常に多数の部位（全長２７５アミノ酸の配列中の１５７箇所）の１又は２以上のアミノ酸残基を置換することにより得ることができる旨が記載されてはいる。　
　しかしながら、本願明細書に記載された、これを裏付けるべき実施例は、これらの部位のうちのわずか１５箇所の部位について、その１または２以上の位置を置換したもののみである。　
　そして、公表公報３１頁の第III表によれば、例えばＣ００１、Ｃ００２、Ｃ００３、Ｃ００８のように、同じpI０値の変異体であっても、置換部位等が異なると、同じｐＨ（特にこれらの変異体について、より至適ｐＨに近いｐＨ１０．２）における洗浄効果は必ずしも一致していない。　
　これらのことからすれば、変異体の洗浄効果は単に変異体のpI０値によってのみ決まるのではなく、変異の内容によって、そもそもの洗浄能力も変化することが窺えるから、本願明細書の記載に基づき、本願発明のスブチリシンプロテアーゼ変異体が、至適pHであるその等電点付近において、親プロテアーゼに比べて格別優れた効果を有するといえる根拠はなく、このことを合理的に理解することはできない。　
　よって、後の実験により、本願発明に規定する部位を異なるアミノ酸で置換した、いくつかの事例において、当該効果が確認されたとしても、当該効果は本願明細書の記載から合理的に予測できるものではないので、本願発明の容易性の判断をするにあたって、当該実験の結果を参酌することはできない。　
　しかも、当該実験結果のうち、２４５位、２４８位、２５２位に関するものは、洗浄溶液のｐＨ７．７〜８．１による試験結果のみが記載されているから、本願明細書に記載された、「より低い（高い）pHに近付く方向の酵素の等電点、pI０ 、の変化は、酵素の最適な洗浄性能のpHをより低い（高い）値にシフトする」という効果を裏付けるものとさえ、いえない。　
　更にまた、上記実験結果には、スブチリシン３０９のＮ２４８Ｄ変異体が親プロテアーゼであるスブチリシン３０９よりも洗浄効果が優れることが示されているが、引用例１に記載された、天然に産生するＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンの一つであるａｐｒＡスブチリシン（請求項２参照）のアミノ酸配列（第１表参照）の２４８位がＤであること、また、公知のスブチリシンプロテアーゼである、Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　Ａｍｙｌｏｓａｃｃｈａｒｉｔｉｃｕｓ並びにＭｅｓｅｎｔｉｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｅについても、その２４８位がＤである（必要なら、ＷＯ８８／０８１６４のＴａｂｌｅ４参照）ことからすると、スブチリシン３０９におけるＮ２４８Ｄの変異による程度の効果は、そもそも天然に産生するスブチリシン自体が有している程度のものと考えられるから、これをもって格別の効果ということはできない。　
　
４．むすび　
　以上のとおりであるから、本願発明は特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、その他の本願請求項に係る発明について検討するまでもなく、本特許出願は拒絶すべきものである。　
　よって、結論のとおり審決する。