(57)【要約】  ＡＬＫ阻害剤であるブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、及びＡＺＤ３４６３に代表される化合物を有効成分とする医薬が、ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓに点突然変異を有する化学療法薬に耐性を獲得した非小細胞肺癌に有効であることを見出した。さらに、抗ＥＧＦＲ抗体を併用することによって、腫瘍増殖に顕著な抑制効果を示す。第１世代の治療薬であるゲフィチニブ、第３世代の治療薬であるオシメルチニブに対して耐性を有する非小細胞肺癌に対して有効な治療薬となる。【選択図】なし
2017200016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）で示される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌治療薬。
【化１】
2017200016.tif 000026
上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
【化２】
2017200016.tif 000027
Ｒ２は、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
【化３】
2017200016.tif 000028
【請求項２】
前記化合物がブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、又はＡＺＤ３４６３である請求項１記載のＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌治療薬。
【請求項３】
前記ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌がＥＧＦＲの７９７位の変異を有する癌である請求項１又は２記載の非小細胞肺癌治療薬。
【請求項４】
前記非小細胞肺癌がＥＧＦＲの７９７位、及び７９０位に変異を有する癌である請求項１〜３いずれか１項に記載の非小細胞肺癌治療薬。
【請求項５】
抗ＥＧＦＲ抗体と併用投与される請求項１〜４いずれか１項記載の非小細胞肺癌治療薬。
【請求項６】
ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌において、
ＥＧＦＲの７９７位の変異を検出する一般式（Ｉ）で示される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする医薬の有効性を検査する方法。
【化４】
2017200016.tif 000029
上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
【化５】
2017200016.tif 000030
Ｒ２は、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
【化６】
2017200016.tif 000031
【請求項７】
前記化合物がブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、又はＡＺＤ３４６３である請求項６に記載の医薬の有効性を検査する方法。
【請求項８】
前記ＥＧＦＲの７９７位の変異の検出が、
核酸、及び／又はタンパク質を検出するものであることを特徴とする請求項６又は７記載の前記医薬の有効性を検査する方法。
【請求項９】
前記核酸の検出が、ＰＣＲによるものであり、
前記タンパク質の検出が、抗体によるものである請求項８記載の前記医薬の有効性を検査する方法。
【請求項１０】
ＥＧＦＲの７９７位の変異を検出するＰＣＲプライマー、又は抗体を含む一般式（Ｉ）で示される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする医薬の有効性検査キット。
【化７】
2017200016.tif 000032
上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
【化８】
2017200016.tif 000033
Ｒ２は、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
【化９】
2017200016.tif 000034
【請求項１１】
前記化合物がブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、又はＡＺＤ３４６３である請求項１０記載の医薬の有効性検査キット。
【請求項１２】
ＥＧＦＲのエクソン１９の欠失変異、Ｌ８５８Ｒの変異、及びＴ７９０Ｍの変異を検出するＰＣＲプライマー、又は抗体をさらに含む請求項１０又は１１に記載する医薬の有効性検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子変異を有する肺癌の治療において、ＥＧＦＲ-ＴＫＩ（ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）に対する耐性を獲得した癌の治療に関する。特に、ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌の最初の治療薬として選択されるゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、又はアファチニブ（ａｆａｔｉｎｉｂ）に対して耐性を獲得した後、オシメルチニブ（ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）にも耐性を獲得した癌に対して奏功する治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
本邦における肺癌の死亡率は、１９６０年には１０万対で男性で７．９人、女性で３．２人であったが、近年は急速に増加の一途をたどっている。国立がん研究センターから発表された２０１５年の肺癌死亡者予測数は７７，２００人で部位別の癌死亡で第１位であり、男性では５５，３００人で第１位、女性でも２１，９００人で第２位になっている。【０００３】
２００４年に大野、中村らによって報告された２０２０年の我が国での肺癌の１年間の新患者予測数は男性約９１，０００人、女性約３４，０００人であったが、前述の国立がんセンターからの発表ではすでに２０１５年時点で男性９０，７００人、女性４２，８００人の新患者数が推計されており（非特許文献１）、２０２０年の時点ではこの予測をさらに上回ることが危惧され、治療法の開発は大きな課題となっている。世界的に見ても肺癌による死亡者数は増加している。国際対がん連合（ＵＩＣＣ）の統計によれば、肺癌による死亡者数はがんの中でも最多となっており、がんによる全死亡のうち１／５に相当するといわれている。【０００４】
肺癌は、非小細胞肺癌と小細胞肺癌の２つに大別され、非小細胞肺癌は肺癌全体の約８０−８５％、小細胞肺癌が約１０−１５％を占めている。切除不能の進行非小細胞肺癌では、根治照射が可能な場合には化学放射線治療が標準であり、根治的放射線照射不能IIIＢ期およびIV期の非小細胞肺癌の標準治療は化学療法である。１９９５年にシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ＣＤＤＰ）と既存の抗がん剤を併用した化学療法群が、ｂｅｓｔ  ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  ｃａｒｅ（ＢＳＣ）群と比べて生存期間中央値（ＭＳＴ：ｍｅｄｉａｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｔｉｍｅ）を６−８週、１年生存率を１５％改善したことが示された。その後に行われた、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）による４群比較第III相（ＥＣＯＧ１５９４）試験（非特許文献２）や、本邦におけるＦＡＣＳ（Ｆｏｕｒ  Ａｒｍｓ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ）試験（非特許文献３）などの結果により、プラチナ製剤および第３世代抗癌剤のいずれかの組み合わせが非小細胞肺癌に対する標準治療として確立した。さらに、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）（ＢＭＤＪ，ＰＡＲＡＭＯＵＮＴ試験（非特許文献４））やベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（ＥＣＯＧ４５９９試験（非特許文献５））といった非扁平上皮癌に対して有効な薬剤が開発されたことにより生存期間の延長が達成され、これらの薬剤が肺腺癌に対する治療の重要な位置を占めてきた。しかしながら、生存期間延長効果は、ペメトレキセドやベバシズマブの登場によって、前述のＥＣＯＧ試験やＦＡＣＳ試験において示された殺細胞性抗がん剤による生存期間延長効果の１年前後から、おおよそ半年から１年弱の上乗せが得られたものの、それ以上の進展は乏しく足踏み状態となっていた。【０００５】
一方で、ＥＧＦＲ−ＴＫＩの有効性が示されてきた。２００４年に非小細胞肺癌でのＥＧＦＲ遺伝子変異の存在が報告され、ＥＧＦＲ遺伝子変異の有無とＥＧＦＲ−ＴＫＩの効果が関連していることが示された（非特許文献６、７）。ＥＧＦＲ−ＴＫＩは、細胞内のＥＧＦＲチロシンキナーゼのＡＴＰ結合部位に結合し、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害することによりＥＧＦＲのシグナル伝達を阻害する薬剤で、本邦ではゲフィチニブ（製品名：Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））とエルロチニブ（製品名：Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、アファチニブ（製品名：Ｇｉｏｔｒｉｆ（登録商標））が承認されている。【０００６】
ＥＧＦＲ遺伝子変異は、チロシンキナーゼ領域であるエクソン１８−２１が大半を占め、エクソン１９の欠失変異が４８％、Ｌ８５８Ｒ（８５８番目のロイシンのアルギニンへの置換。以下、点突然変異はアミノ酸の位置、及び置換前後の配列で記載する。）が４３％を占め、その他Ｇ７１９Ｘや稀な変異が１５％程度を占めることが明らかにされている。エクソン１９の欠失変異は７４６−７５０のＥＬＲＥＡの５つのアミノ酸を中心とする部位の単純欠失変異が最も多いが、欠失アミノ酸の個数や、アミノ酸置換を伴うものなど、非常に多くのバリエーションを含んでいる（非特許文献８）。【０００７】
最初に開発が進んだＥＧＦＲ−ＴＫＩであるゲフィチニブは、幾つかの臨床試験を経て２次治療以後での腫瘍縮小効果がまず示された。しかし、しばしば劇的な効果を認める症例があることが知られていたものの、当初は真の効果予測因子は明らかではなかった。また、患者選択を行わない対象症例での第III相試験では有意な延命効果は示されなかった。【０００８】
しかし、ＥＧＦＲ−ＴＫＩの有効性が期待される臨床背景（非喫煙者、アジア人、腺癌）の症例に患者選択を行いゲフィチニブと、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ、ＣＢＤＣＡ）／パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、ＰＴＸ）併用療法を比較する第III相試験であるＩＰＡＳＳ（Ｉｒｅｓｓａ  Ｐａｎ  Ａｓｉａ  Ｓｔｕｄｙ）が行われ、ゲフィチニブ群でＰＦＳ（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ、無増悪生存期間）が有意に延長することが示された（非特許文献９）。このＩＰＡＳＳ試験ではＥＧＦＲ遺伝子変異の有無で部分解析が行われており、ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性群においては有意にＰＦＳが良好（ＨＲ（ハザード比）＝０．４８、ゲフィチニブ群  ９．５か月、ＣＢＤＣＡ＋ＰＴＸ群  ６．３か月）であったが、変異陰性群では臨床背景で選択しているにもかかわらず、ゲフィチニブでのＰＦＳは不良（ＨＲ＝２．８５、ゲフィチニブ群  １．５か月、ＣＢＤＣＡ＋ＰＴＸ群  ５．５か月）であり、ＥＧＦＲ遺伝子変異が効果予測因子であることが示された。この後、ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性症例の患者を選択して行った、１次治療におけるＥＧＦＲ−ＴＫＩとプラチナ併用療法の比較第III相試験が複数行われ、現在までに報告されているすべての試験においてＥＧＦＲ−ＴＫＩによるＰＦＳの有意な延長が示されている。【０００９】
その中で、本邦において行われたゲフィチニブとＣＢＤＣＡ＋ＰＴＸの比較第III相試験であるＮＥＪ００２試験（非特許文献１０）やゲフィチニブとＣＤＤＰ＋ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、ＤＴＸ）併用療法の比較第III相試験であるＷＪＴＯＧ３４０５試験（非特許文献１１）では、ゲフィチニブ群においてＰＦＳが有意に延長することが示されている（ＮＥＪ００２；ＨＲ＝０．３０、ゲフィチニブ群  １０．８ヶ月、ＣＢＤＣＡ＋ＰＴＸ群  ５．４ヶ月、ＷＪＴＯＧ３４０５；ＨＲ＝０．５２０、ゲフィチニブ群  ９．６ヶ月、ＣＤＤＰ＋ＤＴＸ群  ６．６ヶ月）。これらの試験では、その後の報告において生存中央値がＷＪＴＯＧ３４０５で３４．８ヶ月、ＮＥＪ００２で２７．７ヶ月であることが示されており、ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性患者にＥＧＦＲ−ＴＫＩを投与する重要性が広く示されることとなった。【００１０】
このＥＧＦＲ−ＴＫＩの発見を皮切りに肺腺癌においては、ＥＭＬ４−ＡＬＫ転座融合、ＲＥＴ転座融合、ＲＯＳ１転座融合、ＨＥＲ２変異、ＢＲＡＦ変異などといった治療ターゲットとなる癌原遺伝子が次々と発見され、対応する治療薬の開発がそれぞれの疾患を有する患者に大きなメリットをもたらしている。癌原遺伝子の有無を正確に検出することと、対応する適切な分子標的薬治療を行うことの有益性が、Ｋｒｉｓらによっても２０１４年に報告され、いまや肺癌治療において必須の領域となった（非特許文献１２）。【００１１】
このように分子標的薬が臨床にもたらしたインパクトは代えがたいものであるが、治療効果は開始早期にいかに大きくともおおよそ１年〜数年程度しか持続せず、ほぼすべての症例で獲得耐性が出現することで病状が再燃する。ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性肺癌に対する第１世代薬であるゲフィチニブやエルロチニブ投与後の獲得耐性の機序は研究が進んでいる。非特許文献１３によれば、おおよそ６０％前後がゲートキーパー変異といわれる阻害剤の結合部位に生じる変異であり、ＥＧＦＲタンパク質のＡＴＰ結合部位内に存在する７９０番目のスレオニンがメチオニンに置換することで阻害薬のＡＴＰ結合阻害能が低下するものであることが明らかになっている。当初、ゲフィチニブやエルロチニブ耐性例に対しての治療開発はさまざまな臨床試験において複数行われたが、いずれも十分に有益な治療効果を示すことができず、唯一奏効率２９％が得られたアファチニブとセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）の併用療法も有害事象が強く臨床現場に応用されていない（非特許文献１４）。【００１２】
次いでＴ７９０Ｍ陽性ＥＧＦＲを標的とした共有結合型ＥＧＦＲ−ＴＫＩが相次いで開発が開始された。最も開発が先行していたオシメルチニブ（ＡＺＤ９２９１、製品名：Ｔａｇｒｉｓｓｏ（登録商標））は２０１４年ＡＳＣＯ  ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇにて第１／２相試験の結果が報告された（非特許文献１５、１６）のを皮切りに、Ｔ７９０Ｍ陽性ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性肺癌での良好な治療成績が次々と発表され、２０１５年１１月には米国ＦＤＡによって承認されており、２０１６年中には日本でも承認され、保険適用されることとなった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】大野ゆう子、中村隆、他。日本の癌罹患の将来推計−ベイズ型ポワソン・コウホートモデルによる解析に基づく２０２０年までの予測：がん・統計白書−罹患／死亡／予後／−２００４、大島明、ほか（編）、篠原出版新社、2004年
【非特許文献２】Shiller, J. H., et al., N. Engl. J. Med.,2002, Vol.346, p.92-98.
【非特許文献３】Ohe Y., et al., Ann. Oncol., 2007, Vol.8,p.317-323.
【非特許文献４】Paz-Ares L.G., et al., J. Clin. Oncol.,2013, Vol.31, p.2895-2902.
【非特許文献５】Sandler, A., et al., N. Engl. J. Med.,2006, Vol.355, p.2542-2550.
【非特許文献６】Paez, J.G., et l., Science, 2004, Vol.304,p.1497-1500.
【非特許文献７】Lynch, T. J., et al., N. Engl. J. Med.,2004, 350, p.2129-2139.
【非特許文献８】Mitsudomi T., et al., The FEBS J., 2010,277, p.301-308.
【非特許文献９】Mok, T. S., et al., N. Engl. J. Med., 2009,Vol.361, p.947-957.
【非特許文献１０】Maemondo, M., et al., N. Engl. J. Med.,2010, Vol.362, p.2380-2388.
【非特許文献１１】Mitsudomi, T., et al., Lancet Oncol. 2010,Vol.11, p.121-128.
【非特許文献１２】Kris M.G., et al., JAMA, 2014, Vol.311, p.1998-2006.
【非特許文献１３】Yu, H.A., et al., Clin. Cancer Res., 2013,Vol.19, p.2240-2247.
【非特許文献１４】Janjigian, Y.Y., et al., Cancer Discov.,2014, Vol.4, p.1036-45.
【非特許文献１５】Cross, D.A., et al., Cancer Discov., 2014,Vol.4, p.1046-1061.
【非特許文献１６】Janne, P.A., et al., N. Engl. J. Med.,2015, Vol.372, p.1689-1699.
【非特許文献１７】Thress, K.S., et al. Nat. Med., 2015,Vol.21(6), pp.560-562.
【非特許文献１８】Eberlein, C.A., et al., Cancer Res., 2015,Vol.75, p.2489-2500.
【非特許文献１９】Ercan D., et al., Clin. Cancer Res., 2015,Vol.21, p.3913-23.
【非特許文献２０】Niederst, M.J., et al., Clin. Cancer Res.,2015, Vol.21, p.3924-3933.
【非特許文献２１】Jia, Y., et al., Nature, 2016, Vol.534,p.129-132.
【非特許文献２２】Li, S., et al., Cancer Cell, 2005, Vol.7,p.301-311.
【非特許文献２３】Sickmier, E. A., et al., PLOS ONE, 2016,DOI:10.1371/journal.pone.0163366.
【非特許文献２４】Brower, M.E., et al., 2015, FDA PhamacologyReview(s), Reference ID:3796870.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
オシメルチニブの臨床への登場で、ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性肺癌の治療方針としてＴＫＩの重要性がさらに増すことが確実であると考えられる。しかし、２０１５年には良好な治療効果と同時にその耐性機構もすでに報告されている。オシメルチニブのＴ７９０Ｍ陽性ＥＧＦＲ肺癌を対象とした臨床試験症例において、オシメルチニブ耐性となった患者の血漿中ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡからはＣ７９７Ｓ変異が検出された（非特許文献１７）。他の患者からは、それ以外のパターンとしてＴ７９０Ｍ変異の消失による異なる３種類の耐性が出現したことが報告され（非特許文献１８、１９）、これを裏付けるような報告が他の第３世代ＥＧＦＲ−ＴＫＩであるＣＯ−１６８６の臨床試験で得られた知見からも見て取れる。【００１５】
Ｔ７９０Ｍ消失とｂｙｐａｓｓ  ｐａｔｈｗａｙ依存の耐性機構については、その性質から克服法として併用療法等の想定が可能であるが、Ｃ７９７Ｓ変異の出現については現時点では有効な対策が明確に示されていない。Ｎｉｅｄｅｒｓｔらによる、Ｃ７９７Ｓの出現がＴ７９０Ｍと同一の遺伝子上（ｃｉｓ）か、対立遺伝子上（ｔｒａｎｓ）かに関する研究によれば、ｔｒａｎｓの場合には第１世代ＥＧＦＲ−ＴＫＩ（ゲフィチニブやエルロチニブ）と第３世代ＥＧＦＲ−ＴＫＩ（オシメルチニブなど）の併用が有効であること、ｃｉｓの場合には現存するＴＫＩでは全く無効であることが示唆されていて（非特許文献２０）、特にｃｉｓの克服困難が予想される。また、Ｔ７９０ＭとＣ７９７Ｓがｔｒａｎｓに出現するということが、臨床において再現されるかどうかは現在のところ明らかではない。【００１６】
Ｃ７９７Ｓ変異出現による獲得耐性は、第３世代耐性症例の総数自体が十分蓄積されていないということを差し引く必要はあるものの、２０１５年ＷＣＬＣ（Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ）において報告された頻度を参考にすれば、肺癌全体の４−５％に相当することが推量される。その頻度は、ＡＬＫ陽性肺癌症例とおおよそ同程度であり一定の臨床上の比重を占めるといえる。したがって、この集団に対する治療法を確立することは臨床上重要な課題である。【００１７】
最近、Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ、及びＣ７９７Ｓの変異を有するＥＧＦＲ変異体に対して、ＥＡＩ０４５がアロステリック阻害剤として有効であることが明らかとなった。ＥＡＩ０４５は、抗ＥＧＦＲ抗体医薬であるセツキシマブと併用投与することによって、マウスモデルにおいて顕著な腫瘍増殖に対する阻害効果があることが示されている（非特許文献２１）。しかしながら、ＥＡＩ０４５は開発段階の化合物であり、すぐに実臨床で使用できるわけではない。また、ＥＧＦＲ変異陽性肺癌の約半数を占めるエクソン１９欠失型変異型には有効ではない。したがって、Ｃ７９７Ｓ変異を有するＥＧＦＲ変異体に対して有効な治療薬が必要であるという現状には変わりがない。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、以下の医薬、医薬の有効性を検査する方法、及び検査キットに関する。
（１）一般式（Ｉ）で示される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌治療薬。
【化１】
2017200016.tif 000003
上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
【化２】
2017200016.tif 000004
Ｒ２は、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
【化３】
2017200016.tif 000005
（２）前記化合物がブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、又はＡＺＤ３４６３である（１）記載のＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌治療薬。
（３）前記ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌がＥＧＦＲの７９７位の変異を有する癌である（１）又は（２）記載の非小細胞肺癌治療薬。
（４）前記非小細胞肺癌がＥＧＦＲの７９７位、及び７９０位に変異を有する癌である（１）〜（３）いずれか１つに記載の非小細胞肺癌治療薬。
（５）抗ＥＧＦＲ抗体と併用投与される（１）〜（４）いずれか１つ記載の非小細胞肺癌治療薬。
（６）ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌において、ＥＧＦＲの７９７位の変異を検出する一般式（Ｉ）で示される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする医薬の有効性を検査する方法。
【化４】
2017200016.tif 000006
上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
【化５】
2017200016.tif 000007
Ｒ２は、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
【化６】
2017200016.tif 000008
（７）前記化合物がブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、又はＡＺＤ３４６３である（６）に記載の医薬の有効性を検査する方法。
（８）前記ＥＧＦＲの７９７位の変異の検出が、核酸、及び／又はタンパク質を検出するものであることを特徴とする（６）又は（７）記載の前記医薬の有効性を検査する方法。
（９）前記核酸の検出が、ＰＣＲによるものであり、前記タンパク質の検出が、抗体によるものである（８）記載の前記医薬の有効性を検査する方法。
（１０）ＥＧＦＲの７９７位の変異を検出するＰＣＲプライマー、又は抗体を含む一般式（Ｉ）で示される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする医薬の有効性検査キット。
【化７】
2017200016.tif 000009
上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
【化８】
2017200016.tif 000010
Ｒ２は、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
【化９】
2017200016.tif 000011
（１１）前記化合物がブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、又はＡＺＤ３４６３である（１０）記載の医薬の有効性検査キット。
（１２）ＥＧＦＲのエクソン１９の欠失変異、Ｌ８５８Ｒの変異、及びＴ７９０Ｍの変異を検出するＰＣＲプライマー、又は抗体をさらに含む（１０）又は（１１）に記載する医薬の有効性検査キット。
また、以下の非小細胞肺癌の治療方法に関する。
（１３）ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌の治療方法であって、ＥＧＦＲの７９７位の変異を検出し、下記一般式（Ｉ）で示される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする医薬と、抗ＥＧＦＲ抗体とを併用することを特徴とする治療方法。
【化１０】
2017200016.tif 000012
上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
【化１１】
2017200016.tif 000013
Ｒ２は、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
【化１２】
2017200016.tif 000014
（１４）前記化合物がブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、又はＡＺＤ３４６３である治療方法。
（１５）前記抗ＥＧＦＲ抗体が、セツキシマブ、パニツムマブ、又はネシツムマブである（１３）又は（１４）記載の非小細胞肺癌治療法。
【発明の効果】
【００１９】
本明細書に記載の化合物により、オシメルチニブに代表される第３世代ＥＧＦＲ-ＴＫＩ耐性となったＥＧＦＲの７９７位に変異を生じた癌に対して治療を行うことができる。すなわち、ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌は、まず、ゲフィチニブ、エルロチニブ、又はアファチニブによる治療が行われる。これら医薬による治療によって、ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ変異により不応となった場合は、オシメルチニブ等第３世代のＥＧＦＲ−ＴＫＩにより治療が行われる。さらに、Ｃ７９７Ｓの変異によりオシメルチニブ等に不応となった場合、すなわち、癌の原因となるＥＧＦＲのエクソン１９の欠失、あるいはＬ８５８Ｒの変異、第２の変異であるＴ７９０Ｍに加えて、第３の変異であるＣ７９７Ｓの変異を獲得した三重変異体ＥＧＦＲを発現する非小細胞肺癌に対し、本発明の治療薬を使用することにより有用な治療効果を得ることが可能となった。さらに、抗ＥＧＦＲ抗体と併用することによって、より強い効果を得ることができる。特に、抗ＥＧＦＲ抗体との併用は、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験において、癌の縮小効果が認められ、治療薬に対して耐性を獲得した肺癌の治療に効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異体を発現する細胞株の増殖を阻害する薬剤のスクリーニング結果を示す図。
【図２Ａ】Ｂａ／Ｆ３を親株とするＥＧＦＲのエクソン１９欠失変異体発現細胞に対するゲフィチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、及びブリガチニブ（ｂｒｉｇａｔｉｎｉｂ）の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図２Ｂ】ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対する上記化合物の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図２Ｃ】ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対する上記化合物の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図２Ｄ】ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対する上記化合物の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図２Ｅ】ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞でのアファチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブのＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図２Ｆ】ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞でのアファチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブのＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図３Ａ】Ｂａ／Ｆ３を親株とするＥＧＦＲのＬ８５８Ｒ変異体発現細胞に対するゲフィチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、及びブリガチニブの細胞生存率に対する効果を示す図。
【図３Ｂ】ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞に対する上記化合物の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図３Ｃ】ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞に対する上記化合物の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図３Ｄ】ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞に対する上記化合物の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図４Ａ】Ｂａ／Ｆ３を親株とするＥＧＦＲのＬ８５８Ｒ変異体発現細胞でのアファチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブのＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図４Ｂ】ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞での上記化合物によるＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図４Ｃ】ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞での上記化合物によるＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図４Ｄ】ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞での上記化合物によるＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図５】ＡＬＫ阻害剤の構造を示す図。
【図６Ａ】Ｂａ／Ｆ３を親株とするＥＧＦＲのエクソン１９欠失変異体発現細胞に対するＡＬＫ阻害剤であるブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３、ＴＡＥ６８４、セリチニブ、ＡＳＰ３０２６の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図６Ｂ】ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対する上記ＡＬＫ阻害剤の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図６Ｃ】ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対する上記ＡＬＫ阻害剤の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図６Ｄ】ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対する上記ＡＬＫ阻害剤の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図７Ａ】Ｂａ／Ｆ３を親株とするＥＧＦＲのＬ８５８Ｒ変異体発現細胞に対する上記ＡＬＫ阻害剤の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図７Ｂ】ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞に対する上記ＡＬＫ阻害剤の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図７Ｃ】ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞に対する上記ＡＬＫ阻害剤の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図７Ｄ】ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞に対する上記ＡＬＫ阻害剤の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図８Ａ】Ｂａ／Ｆ３を親株とするＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞でのＡＬＫ阻害剤であるブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＴＡＥ６８４、セリチニブ、ＡＳＰ３０２６のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図８Ｂ】ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞での上記ＡＬＫ阻害剤のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図８Ｃ】ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞での上記ＡＬＫ阻害剤のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図８Ｄ】ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞での上記ＡＬＫ阻害剤のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図９Ａ】ヒト肺癌細胞株ＰＣ９（ＥＧＦＲエクソン１９欠失変異体）に対するゲフィチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブの細胞生存率に対する効果を示す図。
【図９Ｂ】ＰＣ９を親株とするＴ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対する上記化合物の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図９Ｃ】ＰＣ９を親株とする三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対する上記化合物の細胞生存率に対する効果を示す図。
【図１０Ａ】ＰＣ９細胞での種々のチロシンキナーゼ阻害剤のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図１０Ｂ】ＰＣ９を親株とするＴ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞での種々のチロシンキナーゼ阻害剤のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図１０Ｃ】ＰＣ９を親株とする三重変異体発現細胞での種々のチロシンキナーゼ阻害剤のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図１０Ｄ】ＰＣ９、及びその変異体におけるＡＺＤ３４６３のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図１１Ａ】ＥＧＦＲの変異のない細胞株に対するアファチニブの効果を示す図。
【図１１Ｂ】ＥＧＦＲの変異のない細胞株に対するオシメルチニブの効果を示す図。
【図１１Ｃ】ＥＧＦＲの変異のない細胞株に対するブリガチニブの効果を示す図。
【図１１Ｄ】アファチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブの各細胞株に対する効果をまとめた図。
【図１２Ａ】ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異を有するＢａ／Ｆ３を移植したマウスに対するブリガチニブ、オシメルチニブの効果を示す図。
【図１２Ｂ】ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異を有するＢａ／Ｆ３を移植したマウスに対するブリガチニブ、オシメルチニブの効果を示す図。
【図１３Ａ】ＰＣ９を親株とするＴ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞を移植したマウスに対するブリガチニブ、オシメルチニブの効果を示す図。
【図１３Ｂ】上記マウスの生存曲線を示す図。
【図１３Ｃ】マウスに移植した上記欠失変異体発現細胞に対するブリガチニブ、及びブリガチニブとセツキシマブ併用処置のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図１４Ａ】ＰＣ９を親株とする三重変異体発現細胞を移植したマウスに対するブリガチニブ、オシメルチニブの効果を示す図。
【図１４Ｂ】マウスに移植した上記三重変異体発現細胞に対するオシメルチニブ、ブリガチニブ処置のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図１５Ａ】ＰＣ９を親株とする三重変異体発現細胞の細胞生存率に対するセツキシマブとチロシンキナーゼ阻害剤の併用効果を検討した図。
【図１５Ｂ】上記三重変異体細胞株のＥＧＦＲシグナル伝達系に対するブリガチニブ、セツキシマブの効果を解析した図。
【図１５Ｃ】上記三重変異体細胞株を移植したマウスに対するブリガチニブ、オシメルチニブ、セツキシマブ、及びブリガチニブとセツキシマブ併用投与の効果を示す図。
【図１５Ｄ】マウスに移植した上記三重変異体発現細胞に対するブリガチニブ、オシメルチニブ、セツキシマブ、ブリガチニブとセツキシマブの併用処置のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。
【図１５Ｅ】上記三重変異体発現細胞を移植したマウスの生存曲線を示す図。
【図１６Ａ】Ｂａ／Ｆ３を親株とする三重変異体発現細胞の細胞生存率に対するセツキシマブとチロシンキナーゼ阻害剤の併用効果を検討した図。
【図１６Ｂ】上記三重変異体細胞株のＥＧＦＲシグナル伝達系に対するブリガチニブ、セツキシマブの効果を解析した図。
【図１７Ａ】Ｂａ／Ｆ３を親株とする三重変異体発現細胞の細胞生存率に対するパニツムマブとチロシンキナーゼ阻害剤の併用効果を検討した図。
【図１７Ｂ】ＰＣ９を親株とする三重変異体発現細胞の細胞生存率に対するパニツムマブとブリガチニブ、又はオシメルチニブとの併用効果を検討した図。
【図１７Ｃ】ＰＣ９を親株とする三重変異体発現細胞を移植したマウスにおけるパニツムマブ、ブリガチニブのＥＧＦＲシグナル伝達系に対する効果を解析した図。
【図１８Ａ】ＰＣ９を親株とする三重変異発体現細胞を移植したマウスに対するブリガチニブ、パニツムマブ、及びその併用投与の効果を示す図。
【図１８Ｂ】上記マウスの生存曲線を示す図。
【図１９】ＪＦＣＲ−１６３（Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ／Ｃ７９７Ｓ三重変異株）を移植したマウスに対するブリガチニブ、パニツムマブの併用投与の効果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下データを示しながら、Ｃ７９７Ｓの点突然変異を有する非小細胞肺癌であって、ゲフィチニブに代表される第１世代のＥＧＦＲ−ＴＫＩ、オシメルチニブ（ＡＺＤ９２９１）に代表される第３世代のＥＧＦＲ−ＴＫＩに耐性を獲得した癌に対して効果を奏する化合物、該化合物の有効性を検査する方法、及び治療方法について説明する。
【００２２】
本発明者らはＡＬＫ阻害剤ブリガチニブが、オシメルチニブで治療した後に出現するＣ７９７Ｓの点突然変異を有する細胞に対して増殖抑制を引き起こすことを見出した。本発明者らは、オシメルチニブに対して耐性を獲得した細胞がＣ７９７Ｓの変異を有することに着目し、Ｃ７９７Ｓ、Ｔ７９０Ｍの変異を併せもつ細胞株を用いて多数の化合物をスクリーニングした。その結果、下記一般式で示されるＡＬＫ阻害剤が細胞増殖を抑制することを見出した。
【００２３】
【化１３】
2017200016.tif 000015
上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
【化１４】
2017200016.tif 000016
Ｒ２は、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
【化１５】
2017200016.tif 000017
【００２４】
この細胞増殖抑制は、ＥＧＦＲの活性を低下させることによって誘導されることから、第３世代のＥＧＦＲ-ＴＫＩに対して耐性を有する肺癌に対して有効な医薬となる。また、上記化合物を有効成分とした医薬は、ここで検討したＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌だけではなく、ＥＧＦＲに同様の突然変異Ｃ７９７Ｓを有する腫瘍についても同様に効果を奏するものと考えられる。
【００２５】
さらに、これら化合物と抗ＥＧＦＲ抗体と併用することによって、より強い腫瘍縮小効果が得られることが明らかとなった。抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲ活性を阻害するものであればどのようなものを用いてもよい。このような抗体としては、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により非小細胞肺癌（扁平上皮肺癌）治療薬として承認されたネシツムマブ、現在結腸・直腸癌などの治療に用いられているセツキシマブ、パニツムマブが例示されるがこれに限ることなく、ＥＧＦＲ活性を阻害する抗体であればどのような抗体であってもよい。現在使用されている抗体は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、リガンドであるＥＧＦとの結合を阻害すると考えられている（非特許文献２２−２４）。治療に用いる抗体は、ＥＧＦＲ活性を阻害することができれば、これら抗体とエピトープが重複するような抗体であってもよいし、異なるエピトープを認識していてもよい。
【００２６】
以下の実施例で示すように、上記化合物を有効成分とする治療薬が有効な症例は、ＥＧＦＲの７９７位にシステインからセリンへの点突然変異が生じている症例である。したがって、これら医薬の有効性を確認するための検査は、ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓの変異を検出することができれば、どのような方法であってもよい。
【００２７】
遺伝子の変異を検出する方法としては、ＰＣＲをベースとした検査方法や、ダイレクトシークエンス法などＥＧＦＲの７９７位の配列を確認することができればどのような方法であってもよい。また、ＥＧＦＲタンパク質の変異を検出するのであれば、Ｃ７９７Ｓの変異を特異的に認識する抗体を用いて、組織染色、ＥＬＩＳＡ等の方法により変異を検出すればよい。検査する対象としては、腫瘍組織の他、胸水をはじめとする体腔液、喀痰、吸引痰、血液など腫瘍細胞が含まれているものであればどのようなものを用いてもよい。
以下、データを示しながら本発明について説明する。
【００２８】
１．ブリガチニブのＥＧＦＲ変異体に対する効果
≪ＥＧＦＲ変異体、及び変異体発現細胞株の作製≫
前述のように、ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌は、エクソン１９の欠失、あるいはＬ８５８Ｒの変異がほとんどであり、併せて全体の８０％以上を占める。そこで、エクソン１９の欠失変異、Ｌ８５８Ｒ点突然変異を有する細胞株を作製して解析を行った。
【００２９】
野生型ＥＧＦＲはＡ５４９細胞株のｃＤＮＡより得た。ＥＧＦＲ変異体であるエクソン１９欠失変異体はＨＣＣ８２７細胞株、Ｌ８５８Ｒ変異体は肺癌標本よりＰＣＲによって増幅し、夫々ｐＥＮＴＲベクター（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）に活性型の完全長ＥＧＦＲを含むようにクローニングした。
【００３０】
Ｔ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓの変異は、以下のプライマーを用いて、夫々単一の変異、あるいは二重変異として、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（アジレント社製）によって各ＥＧＦＲに導入した。
【００３１】
Ｔ７９０Ｍ  Ｆ：ＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣ（配列番号１）
Ｔ７９０Ｍ  Ｒ：ＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＧ（配列番号２）
Ｃ７９７Ｓ  Ｆ：ＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＴＡ（配列番号３）
Ｃ７９７Ｓ  Ｒ：ＴＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧ（配列番号４）
【００３２】
得られたＥＧＦＲ変異体を、レンチウイルスベクター、ｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５−ＤＥＳＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に挿入し各ＥＧＦＲ変異体を構築した。ＥＧＦＲ変異体は、Ｖｉｒａ-Ｐｏｗｅｒ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によってマウスプロＢ細胞Ｂａ／Ｆ３に導入した。
【００３３】
≪ＥＧＦＲ変異体発現細胞に対するチロシンキナーゼ阻害剤の効果≫
Ｂａ／Ｆ３細胞に、肺癌と同様にＥＧＦＲのエクソン１９に欠失変異を有し、さらにＣ７９７Ｓの変異を導入した細胞株（ＢａＦ３  Ｃ７９７Ｓ／ｄｅｌ１９）、また、第１世代の医薬の耐性として出現する点突然変異である７９０位のスレオニンからメチオニンへの変異であるＴ７９０Ｍを導入した変異株（ＢａＦ３  Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９）、第３世代の医薬の耐性として出現する点突然変異である７９７位のシステインがセリンに変異したＣ７９７Ｓ変異をさらに導入した変異株（ＢａＦ３  Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９）を用いて、Ｃ７９７Ｓ変異を有する細胞株の増殖を阻害する薬剤のスクリーニングを行った。
【００３４】
上記４種のＢａ／Ｆ３細胞変異体株に３０種のチロシンキナーゼ阻害剤を１００ｎＭの濃度になるように添加してその効果を解析した。７２時間後に、細胞の生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏアッセイ（登録商標、プロメガ社製）により解析した。用いたチロシンキナーゼ阻害剤とその入手先を表１に示す。
【００３５】
【表１】
2017200016.tif 000018
【００３６】
ＤＭＳＯを添加したものをコントロールとした相対的な生存率を図１に示す。ブリガチニブとポナチニブ（ｐｏｎａｔｉｎｉｂ）のみが、表１に示す解析に用いた阻害剤のうち、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／エクソン１９の欠失変異体に対して１００ｎＭの濃度で５０％程度の阻害効果を示した。しかしながら、ポナチニブは親株であるＢａ／Ｆ３に対しても、同程度のＩＣ５０であったことから、Ｃ７９７Ｓに変異を有するＥＧＦＲ変異体に対して特異的に増殖阻害効果を有するものではないと考えられる。
【００３７】
≪Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対するブリガチニブの効果≫
上記のスクリーニングの結果、ブリガチニブがＣ７９７Ｓ変異体発現細胞に対して増殖抑制効果を有することが明らかとなったので、ゲフィチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、本発明者らがＣ７９７Ｓ変異に対して有効であることを見出したブリガチニブの濃度を変えて処理を行い細胞の生存率を求めた。
【００３８】
２０００個のＢａ／Ｆ３変異体細胞を９６穴プレートに播種し、各細胞を０．３ｎＭ〜１００００ｎＭのゲフィチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブで処理し、７２時間後に細胞の生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏアッセイにより解析した。
【００３９】
図２Ａ〜Ｄに薬剤処理による各変異体細胞株の生存率を、表２にＩＣ５０を示す。ＥＧＦＲのエクソン１９の欠失変異（ｄｅｌ１９）に対しては、アファチニブ、オシメルチニブ、ゲフィチニブが細胞増殖抑制効果を示した（図２Ａ）。また、エクソン１９の変異に加えて、Ｔ７９０Ｍの変異（Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９）を有するＢａ／Ｆ３は、オシメルチニブにＩＣ５０６．７ｎＭと高い反応性を示したが、ゲフィチニブに対してはＩＣ５０５６０３ｎＭと強い耐性を示した（表２）。
【００４０】
ＥＧＦＲのエクソン１９の欠失変異に加えて、Ｃ７９７Ｓの点突然変異を有する細胞株（Ｃ７９７Ｓ／ｄｅｌ１９）に対しては、ゲフィチニブ、アファチニブが細胞増殖抑制を示した（図２Ｃ）。
【００４１】
一方、ＥＧＦＲのエクソン１９の欠失変異に加えて、７９７位、７９０位の２か所に点突然変異を有する三重変異体発現細胞株（Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９）に対しては、ゲフィチニブ、アファチニブ、オシメルチニブはいずれも、細胞を高濃度で処理しても増殖を抑制しないのに対し、ブリガチニブはＩＣ５０６７．２ｎＭの低濃度で細胞増殖を抑制した（図２Ｄ、表２）。すなわち、ブリガチニブは、エクソン１９の欠失変異、Ｔ７９０Ｍの変異に加えて、Ｃ７９７Ｓの変異を有する細胞に対して有効に作用する。
【００４２】
【表２】
2017200016.tif 000019
【００４３】
次に、Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９細胞株を１０、１００、１０００ｎＭのアファチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブで処理した際のＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系のリン酸化をウェスタンブロッティングにより解析した（図２Ｅ、Ｆ）。
【００４４】
抗ｐｈｏｓｐｈｏ-ＥＧＦＲ抗体（Ｔｙｒ１０６８、Ａｂｃａｍ社製、ａｂ５６４４）、抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、＃４２６７）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ-Ａｋｔ抗体（Ｓｅｒ４７３、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、＃４０６０）、抗Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、＃４６９１）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ-ＥＲＫ抗体（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、＃９１０１）、抗ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、＃９１０２）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６抗体（Ｓｅｒ２４０／２４４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、＃５３６４）、抗Ｓ６抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、＃２２１７）、抗β-アクチン抗体（シグマ−アルドリッチ社製、Ａ５２２８）を用いて、各タンパク質の検出を行った。
【００４５】
Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９細胞を用いた結果を図２Ｅに、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９細胞を用いた結果を図２Ｆに示す。オシメルチニブは、Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９  Ｂａ／Ｆ３細胞ではＥＧＦＲのリン酸化を強く抑制しているものの、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９  Ｂａ／Ｆ３細胞では全くＥＧＦＲのリン酸化を抑制しなかった。また、アファチニブは、Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９  Ｂａ／Ｆ３細胞では、１００ｎＭで処理した場合には、ＥＧＦＲのリン酸化の抑制が認められるものの、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９  Ｂａ／Ｆ３細胞では全くリン酸化の抑制が認められなかった。これに対し、ブリガチニブはいずれの細胞でもＥＧＦＲ、及び下流のシグナルのリン酸化を抑制している。特に、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９細胞では、ＥＧＦＲ及び下流のシグナル伝達系であるＡｋｔ、ＥＲＫ、Ｓ６のリン酸化の減少が認められるのはブリガチニブのみであった。なお、ここでは示さないが、ゲフィチニブはＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化に対して、アファチニブと同様の効果を示した。
【００４６】
≪Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞におけるブリガチニブの効果≫
肺癌においてＥＧＦＲエクソン１９内のアミノ酸欠失変異とともに多く見られる変異として、ＥＧＦＲの８５８位のアミノ酸であるロイシンがアルギニンへと置換された点突然変異Ｌ８５８Ｒがある。そこで、Ｌ８５８Ｒの変異に対する各薬剤の効果について解析を行った。
【００４７】
８５８位のロイシンをアルギニンに変異させたＢａ／Ｆ３（ＢａＦ３  Ｌ８５８Ｒ）、Ｔ７９０Ｍの変異とＬ８５８Ｒの変異の重複変異を有するＢａ／Ｆ３（ＢａＦ３  Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ）、Ｃ７９７ＳとＬ８５８Ｒの重複変異を有するＢａ／Ｆ３（ＢａＦ３  Ｃ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒ）、上記３つの変異を有するＢａ／Ｆ３（ＢａＦ３  Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ）を用いて、ゲフィチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブの効果を解析した。上記と同様にしてＢａ／Ｆ３変異株を作製し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏアッセイにより細胞の生存率を求めた。結果を図３、表３に示す。
【００４８】
アファチニブ、ゲフィチニブ、オシメルチニブは、Ｌ８５８Ｒの点突然変異を有する細胞の増殖を阻害する。特に、アファチニブは、Ｌ８５８Ｒ変異体株に対して非常に強く細胞増殖抑制効果が見られた。一方、ブリガチニブはＬ８５８Ｒの点突然変異を有する細胞に対しては、細胞増殖抑制効果は低い（図３Ａ）。また、Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒの重複変異を有する細胞に対しては、オシメルチニブは強い細胞増殖抑制効果を奏するが（ＩＣ５０  ５．８ｎＭ）、アファチニブはＩＣ５０が３９．２ｎＭ、ゲフィチニブは、ＩＣ５０が５９２２ｎＭとほとんど効果を示さない。ブリガチニブは、ゲフィチニブと比較すると有意な細胞増殖抑制効果を示すが、その効果はオシメルチニブに比べて非常に弱い（図３Ｂ）。また、Ｃ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒの重複変異に対して効果を有するのはアファチニブ（ＩＣ５０  ７．７ｎＭ）、ゲフィチニブのみであり（ＩＣ５０  １５．５ｎＭ）、オシメルチニブはほとんど細胞増殖抑制効果を示さず、ブリガチニブはオシメルチニブと比較すると有意な細胞増殖抑制効果を示すが、アファチニブ、ゲフィチニブと比較するとその効果は弱い（図３Ｃ）。一方、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒの３つの変異を有するＢａ／Ｆ３細胞に対しては、ブリガチニブは顕著な細胞増殖抑制効果を有するが（ＩＣ５０  １６１．５ｎＭ）、オシメルチニブ（ＩＣ５０  １１７１ｎＭ）、アファチニブ（ＩＣ５０  ８０４．２ｎＭ）、ゲフィチニブ（ＩＣ５０  ＞１００００ｎＭ）はほとんど効果を示さない（図３Ｄ）。
【００４９】
【表３】
2017200016.tif 000020
【００５０】
次に、Ｌ８５８Ｒの変異を有する上記４種の細胞株を用いてＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系のリン酸化を解析した（図４Ａ〜Ｄ）。アファチニブは、Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞では、ＥＧＦＲ及び下流のシグナル伝達系のリン酸化を強く抑制し、Ｃ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞ではそれよりは幾分弱い効果、Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒでは非常に弱い抑制効果が認められるものの、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞では、ほとんど抑制効果が認められなかった。
【００５１】
オシメルチニブは、Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞ではアファチニブより弱いもののシグナル伝達系のリン酸化に対して抑制効果が認められ、Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞では、最も強い抑制効果が認められる。一方、Ｃ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞では、オシメルチニブは、ほとんどリン酸化抑制効果が認められなかった。
【００５２】
ブリガチニブは、Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ、Ｃ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞でもＥＧＦＲシグナル伝達系に対して一定のリン酸化抑制効果が認められた。さらに、ブリガチニブは、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞では、唯一ＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を抑制する効果が認められた化合物であった。この結果は、図３で示した細胞生存率の結果と非常に良く一致しており、ブリガチニブはＥＧＦＲシグナル伝達系の抑制を介して細胞増殖を抑制しているものと考えられる。
【００５３】
以上の結果から、ブリガチニブはＣ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍの重複した点突然変異を有する活性型ＥＧＦＲに対して細胞増殖抑制効果を備えているものと考えられる。かつブリガチニブは、癌の原因となった活性型ＥＧＦＲの変異がエクソン１９の欠失変異であっても、点突然変異Ｌ８５８Ｒであっても同じように細胞増殖を抑制する効果がある。なお、ここでは示さないが、ゲフィチニブはＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化に対して、アファチニブより弱いものの同様の効果を示した。
【００５４】
２．ＡＬＫ阻害剤のＥＧＦＲ変異体に対する効果
≪三重変異体に効果を奏する他のＡＬＫ阻害剤の探索≫
ブリガチニブはＡＬＫ阻害剤であることから、他のＡＬＫ阻害剤が、ブリガチニブと同様の効果を有するか解析した。解析したＡＬＫ阻害剤は、ブリガチニブに加えてその類縁体であるＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３、ＴＡＥ６８４、ＬＤＫ３７８（ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ、セリチニブ）、ＡＳＰ３０２６の６つの化合物である（図５）。
【００５５】
まず、Ｂａ／Ｆ３にエクソン１９の欠失変異体（ｄｅｌ１９）、Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９（Ｔ／Ｄ）、Ｃ７９７Ｓ／ｄｅｌ１９（Ｃ／Ｄ）、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９（Ｃ／Ｔ／Ｄ）変異体を導入した細胞株を用いて細胞生存率の解析を行った。結果を図６Ａ〜Ｄ、表４に示す。
【００５６】
【表４】
2017200016.tif 000021
【００５７】
ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３は、いずれの変異を有するＥＧＦＲ変異体を導入したＢａ／Ｆ３に対しても、強い細胞増殖抑制効果を示した。特にブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体は、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９変異体に対して、夫々ＩＣ５０６７．２ｎＭ、ＩＣ５０５９．１ｎＭと非常に強い増殖抑制効果を示した。
【００５８】
次に、Ｂａ／Ｆ３にＬ８５８Ｒ（Ｌ８５８Ｒ）、Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ（Ｔ/Ｌ）、Ｃ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒ（Ｃ／Ｌ）、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ（Ｃ／Ｔ／Ｌ）の変異体を導入した細胞株についても細胞生存率の解析を行った（図７Ａ〜Ｄ、表５）。
【００５９】
【表５】
2017200016.tif 000022
【００６０】
ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３は、いずれの変異を有するＥＧＦＲ変異体を導入したＢａ／Ｆ３に対しても、強い細胞増殖抑制効果を示した。ブリガチニブは、Ｌ８５８Ｒをベースに有するＥＧＦＲ変異体発現細胞では、Ｃ７９７Ｓの変異とＴ７９０Ｍの変異を併せもつ場合に強い細胞増殖抑制効果が見られた（図７Ｄ）。一方、エクソン１９の欠失変異をベースに有するＥＧＦＲ変異体発現細胞では、Ｔ７９０Ｍ変異のみの場合には細胞増殖抑制効果がやや低下するが、Ｃ７９７Ｓ変異単独またはＣ７９７ＳとＴ７９０Ｍの両方の変異（三重変異）があれば高い細胞増殖抑制効果を有する点で変異体による差が見られた（図６Ｂ〜Ｄ）。しかしながら、ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３は、Ｔ７９０Ｍに加えて、Ｃ７９７Ｓの変異を有するＥＧＦＲ変異細胞株に、高い細胞増殖抑制効果を有するという点では同様の効果を奏している。
【００６１】
また、同じＡＬＫ阻害剤であってもＴＡＥ６８４、セリチニブ、ＡＳＰ３０２６はＥＧＦＲ変異体発現細胞に対する細胞増殖抑制効果はほとんど見られなかった。図５に示すブリガチニブをはじめとする６つの化合物は基本骨格が同じであり、非常に類似した化合物である。しかしながら、ＥＧＦＲ変異体に対する効果は異なることが明らかとなった。
【００６２】
ＡＬＫ阻害剤の解析結果から、下記一般式（Ｉ）で表される化合物がＣ７９７Ｓに変異を有するＥＧＦＲに対して効果を有すると考えられる。
【化１６】
2017200016.tif 000023
上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
【化１７】
2017200016.tif 000024
Ｒ２は、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
【化１８】
2017200016.tif 000025
これらの化合物であれば、ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３と同等の骨格を有するので、ＥＧＦＲ変異体に対してブリガチニブ等と同様の効果を示すものと考えられる。
【００６３】
次に、各化合物のＥＧＦＲ、及びＥＧＦＲの下流のシグナル伝達系のリン酸化に対する抑制効果を解析した（図８Ａ〜Ｄ）。Ｂａ/Ｆ３を親株とするエクソン１９の欠失変異をベースに有するＥＧＦＲ変異体発現細胞（図８Ａ、Ｂ）、Ｌ８５８Ｒの変異をベースに有するＥＧＦＲ変異体発現細胞（図８Ｃ、Ｄ）を用いて解析を行った。細胞生存率に対する効果と同様に、ブリガチニブ、及びその類縁体であるＡＰ２６１１３類縁体はＥＧＦＲシグナル伝達系に対して阻害活性を示す。特にＣ７９７Ｓ、Ｔ７９０Ｍの変異を併せ持つ場合には、強い抑制効果を示す。一方、ＴＡＥ６８４、セリチニブ、ＡＳＰ３０２６は、１μＭの高濃度で処理してもほとんどＥＧＦＲシグナル伝達系に対する抑制効果を示さなかった。
≪ヒト肺癌由来細胞株ＰＣ９を用いた解析≫
【００６４】
ここまで、解析に用いてきたＢａ／Ｆ３細胞は、マウスのｐｒｏＢ細胞由来の株であることから、ヒト肺癌由来細胞株でも同様の結果を得ることができるかＰＣ９を用いて解析を行った。ＰＣ９は、ＥＧＦＲのエクソン１９に欠失変異を有するヒト非小細胞肺癌由来の細胞株である。ＰＣ９を用いて、ＥＧＦＲ変異体発現細胞を同様に作製し、これら化合物の効果の解析を行った（図９）。親株であるＰＣ９（ｄｅｌ１９）に、エクソン１９の欠失に加えて、さらにＴ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍの変異を有するＥＧＦＲを発現する細胞を作製し、ゲフィチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブを０．３ｎＭ〜１００００ｎＭまで濃度を変えて添加し、７２時間後の細胞の生存率を上記と同様にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイにより求めた。
【００６５】
Ｂａ／Ｆ３細胞株で作製したＥＧＦＲ変異体と同様に、親株のＰＣ９（エクソン１９欠失変異）に対しては、ゲフィチニブ、オシメルチニブは細胞増殖抑制効果を示すのに対し、ブリガチニブは非常に弱い細胞増殖抑制効果しか示さなかった（図９Ａ）。ＰＣ９にＴ７９０Ｍ変異を導入した細胞株（Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９）では、オシメルチニブは非常に強い細胞増殖抑制効果を示すのに対し、ブリガチニブは弱い細胞増殖抑制効果を示し、ゲフィチニブはほとんど細胞増殖抑制効果を示さなかった（図９Ｂ）。さらに、Ｃ７９７Ｓの変異を有する三重変異体（Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９）に対しては、ブリガチニブは細胞増殖抑制効果を示すのに対し、ゲフィチニブ、オシメルチニブは高濃度で処理してもほとんど細胞増殖抑制効果を示さなかった（図９Ｃ）。
【００６６】
次に、ＰＣ９、及びＰＣ９を親株とする細胞株を種々のチロシンキナーゼ阻害剤で処理し、ＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系のリン酸化をウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す（図１０）。親株であるＰＣ９において、アファチニブは非常に強く、オシメルチニブ、ゲフィチニブもＥＧＦＲ、及びその下流のシグナル伝達系のリン酸化を強く抑制した。一方、ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体はＥＧＦＲシグナル伝達系の活性化を抑制する効果を示すもののアファチニブと比較するとその効果は弱いものであった（図１０Ａ）。
【００６７】
ＰＣ９にＴ７９０Ｍを導入した細胞株では、オシメルチニブ、アファチニブ、ブリガチニブの順でＥＧＦＲのリン酸化、及びその下流のシグナル伝達系を抑制する効果が見られた。また、ＡＰ２６１１３類縁体は、ブリガチニブと同等の抑制効果を示したが、ゲフィチニブはほとんどリン酸化抑制効果を示さなかった（図１０Ｂ）。
【００６８】
ＰＣ９の三重変異体に対しては、ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体は、ＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系のリン酸化に対する抑制効果を示すのに対し、アファチニブ、オシメルチニブ、ゲフィチニブはいずれもＥＧＦＲのリン酸化に対する抑制効果を示さなかった（図１０Ｃ）。さらに、ＡＺＤ３４６３についても、これら変異体に対する効果を解析した（図１０Ｄ）。ＡＺＤ３４６３もブリガチニブやＡＰ２６１１３類縁体と同様に、Ｃ７９７Ｓに変異を有するＰＣ９の三重変異体発現細胞において、ＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を抑制する効果があった。また、ＡＺＤ３４６３は、親株であるＰＣ９、さらに、Ｔ７９０Ｍ変異を導入したＥＧＦＲ変異体発現細胞でも、ＥＧＦＲ及びその下流のシグナル伝達系に対してリン酸化を抑制する効果が見られた。
【００６９】
以上の結果から、ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３は、Ｂａ／Ｆ３で得られた結果と同様の効果をヒト肺癌細胞であるＰＣ９でも奏することが示された。
【００７０】
≪野生型ＥＧＦＲ発現細胞におけるチロシンキナーゼ阻害剤の効果≫
ブリガチニブの細胞増殖に対する効果をＥＧＦＲの点突然変異や欠失変異以外の変異を有する細胞株を用いて解析した。用いた細胞株はＥＧＦＲが増幅しているＡ４３１、Ｋ−ｒａｓに変異を有するＡ５４９、Ｈ４６０を用いて解析を行った。Ａ４３１はヒト類上皮細胞癌、Ａ５４９、Ｈ４６０はヒト肺癌由来の細胞株である。なお、ＥＧＦＲについては、Ａ４３１は増幅しているものの変異はなく、Ａ５４９、Ｈ４６０についてもＥＧＦＲには変異は認められない。
【００７１】
アファチニブ、オシメルチニブはＥＧＦＲが増幅しているＡ４３１に対しては細胞増殖を抑制する。また、Ｋ−ｒａｓに変異のある細胞株では、アファチニブがＡ５４９に対して弱い細胞増殖抑制効果を示すものの、他はほとんど細胞増殖に対して抑制効果を示さない。一方、ブリガチニブはいずれの細胞株に対しても細胞増殖抑制効果を示さなかった。これはブリガチニブが、野生型ＥＧＦＲに対しては細胞増殖を抑制しないこと、すなわち癌細胞のみを標的とし、正常細胞の増殖を抑制しないことを示している。
【００７２】
３．ブリガチニブのｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果
≪ＥＧＦＲ変異体を発現するＢａ／Ｆ３を移植したマウスを用いた検討≫
培養細胞系を用いた実験で示したＣ７９７Ｓに変異を有するＥＧＦＲに対するブリガチニブの効果が、ｉｎ  ｖｉｖｏでも同様に生じるか解析を行った。
【００７３】
Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９変異体、又はＴ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９変異体を発現する２×１０６個のＢａ／Ｆ３細胞を５０μｌのＨＢＳＳに懸濁し、ＳＣＩＤマウスの皮下に移植した。腫瘍細胞の増殖は、週２回、キャリパーで腫瘍の幅と長さを測定し、堆積を計算によって求めた（０．５×長さ×幅×幅（ｍｍ３））。マウスは、腫瘍の大きさが１００ｍｍ３に達した後、溶媒のみ、５０ｍｇ／ｋｇ  オシメルチニブ、又は７５ｍｇ／ｋｇ  ブリガチニブの３つの群にランダムに分け、１日１回、強制経口投与を行った。投与開始日の腫瘍容積を１として投与後の腫瘍容積の変化を算出した。図１２ＡにＣ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９変異体発現細胞、図１２ＢにＴ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９変異体発現細胞を移植した結果を示す。
【００７４】
培養細胞を用いた実験結果と同様に、ブリガチニブは、Ｃ７９７Ｓ及びＴ７９０Ｍ変異を併せ持つＣ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９に対しては強い増殖抑制効果を有していた（図１２Ａ）。また、Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９に対しても増殖抑制効果が認められた（図１２Ｂ）。オシメルチニブは、Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９に対しては効果を有するものの、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９に対してはほとんど抑制効果を示さなかった。
【００７５】
以上の結果から、ブリガチニブは培養細胞だけではなく、ｉｎ  ｖｉｖｏでもＣ７９７Ｓ及びＴ７９０Ｍ変異を併せ持つＥＧＦＲの変異に対して効果を有することが明らかとなった。
【００７６】
≪ＥＧＦＲ変異体を発現するＰＣ９を移植したマウスを用いた検討≫
ＰＣ９を親株とする細胞株について、同様にｉｎ  ｖｉｖｏでブリガチニブの効果の確認を行った（図１３）。ＰＣ９細胞に、エクソン１９の欠失に加えてさらにＴ７９０Ｍの変異を有するＥＧＦＲを発現する細胞をＢａｌｂ−ｃ  ｎｕ／ｎｕ  マウスの皮下に移植し、腫瘍容積が平均２００ｍｍ３に達した後、溶媒のみ、５０ｍｇ／ｋｇ  オシメルチニブ、又は７５ｍｇ／ｋｇ  ブリガチニブの３群、各５匹にランダムに分け、１日１回、強制経口投与を行った。腫瘍容積は上記と同様にして計測した。オシメルチニブは、腫瘍増殖に対して顕著な効果が見られた。ブリガチニブは、オシメルチニブほどの顕著な効果は見られないものの、溶媒のみを投与した群に比べて、明らかな腫瘍増殖抑制効果が見られた（図１３Ａ）。
【００７７】
カプラン−マイヤー法に基づく生存曲線を図１３Ｂに示す。Ｔ７９０Ｍを発現するＰＣ９を移植したオシメルチニブ投与群もブリガチニブ投与群もいずれも観察期間中生存していた。なお、ブリガチニブ処理群で死亡した１匹のマウスは１０日目に経口投与時に誤って死亡したものである。
【００７８】
マウスに移植した腫瘍におけるＥＧＦＲ、及びその下流のシグナル伝達系のタンパク質のリン酸化について検討を行った（図１３Ｃ）。上記と同様にして腫瘍を移植後、溶媒のみ、７５ｍｇ／ｋｇ  ブリガチニブ投与、７５ｍｇ／ｋｇ  ブリガチニブに加えて、週３回セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、メルク株式会社製）を１ｍｇ／マウスの用量で投与し、１０日後に腫瘍を摘出し、ウェスタンブロッティングにより解析を行った。各群２匹ずつの結果を示している。ブリガチニブ投与群では、コントロールである溶媒のみを投与した群と比較して、いずれもＥＧＦＲ、及びその下流のシグナル伝達系のリン酸化が抑制されていた。また、セツキシマブを併用した群では、ブリガチニブ単独投与群に比べて、より強い効果を得ることができた（図１３Ｃ）。
【００７９】
次に、ＰＣ９細胞にＣ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９の変異を有するＥＧＦＲを発現させ、上記と同様にしてＢａｌｂ−ｃ  ｎｕ／ｎｕに移植し、オシメルチニブ、及びブリガチニブの効果を検討した（図１４）。オシメルチニブはＥＧＦＲの三重変異に対しては、ほとんど効果がないのに対して、ブリガチニブは腫瘍増殖に対して有意な増殖抑制効果を示した（図１４Ａ）。マウス移植後の腫瘍におけるＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系に関して、上記と同様にしてウェスタンブロッティングにより解析した。その結果、ブリガチニブはＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系に対して、明らかなリン酸化の抑制効果が見られたのに対し、オシメルチニブ投与群ではリン酸化抑制効果はほとんど見られなかった（図１４Ｂ）。
【００８０】
４．抗ＥＧＦＲ抗体との併用効果
≪セツキシマブ併用の効果≫
抗ＥＧＦＲ抗体はＥＧＦＲのリン酸化を抑制することから、ＥＧＦＲに変異を有し、恒常的に活性化している腫瘍に対して効果があることが知られている。ブリガチニブの効果が抗ＥＧＦＲ抗体と相乗効果があるか検討を行った。
【００８１】
上記で検討したように、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９の変異を有するＥＧＦＲを発現させたＰＣ９に対してブリガチニブは低濃度で細胞増殖に対して増殖抑制効果を示すが、オシメルチニブは高濃度で処理しなければ細胞増殖に対して効果を示さない（図９Ｃ参照）。ブリガチニブ、又はオシメルチニブと併用して、セツキシマブで処理を行い細胞増殖に対する効果を検討した（図１５Ａ）。
【００８２】
Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９の変異を有するＥＧＦＲを発現させたＰＣ９に、ブリガチニブ、オシメルチニブは３００ｎＭ、セツキシマブは１０μｇ／ｍｌの濃度で培養液に添加し、７２時間後に細胞の生存率を上記と同様にしてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏアッセイにより解析した。セツキシマブは１０μｇ／ｍｌの濃度では、細胞増殖に対する効果は見られない。一方、ブリガチニブは、３００ｎＭ濃度で処理した場合、単独でも細胞増殖に対し抑制効果は見られるものの、セツキシマブと併用して添加することにより、細胞生存率は約５０％と強い抑制効果が得られた。これに対し、オシメルチニブはセツキシマブと併用しても細胞増殖に対して効果が得られなかった。
【００８３】
Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９の変異を有するＥＧＦＲを発現させたＰＣ９に、セツキシマブ存在下、非存在下で、ブリガチニブを０〜１０００ｎＭ濃度の範囲で処理し、ＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系のリン酸化をウェスタンブロッティングにより解析した（図１５Ｂ）。セツキシマブとブリガチニブを併用して処理した細胞では、ブリガチニブ単独に比べてより強くＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系のタンパク質のリン酸化が抑制されていた。特に、ＥＧＦＲの下流のシグナル伝達系ではより一層強いシグナル抑制効果が見られた。
【００８４】
三重変異を有するＥＧＦＲを発現するＰＣ９を上記と同様にしてマウスに移植し、溶媒のみ、ブリガチニブ単独、オシメルチニブ単独、セツキシマブ単独、ブリガチニブとセツキシマブを併用して投与し、腫瘍細胞の増殖を腫瘍容積により検討した（図１５Ｃ）。ブリガチニブは７５ｍｇ／ｋｇ、オシメルチニブは５０ｍｇ／ｋｇの用量で、１日１回、強制経口投与を行い、セツキシマブは、週３回１ｍｇ／マウスの用量で投与した。コントロールである溶媒のみを投与した群と比較して、ブリガチニブ単独、オシメルチニブ単独、セツキシマブ単独投与群でも一定の腫瘍増殖抑制効果が見られたが、ブリガチニブとセツキシマブを併用投与した群では、明らかな腫瘍増殖抑制効果が見られ、徐々に腫瘍の退縮が観察された（図１５Ｃ）。
【００８５】
マウス移植後の腫瘍におけるＥＧＦＲ、及びその下流のシグナル伝達系のリン酸化を上記と同様にしてウェスタンブロッティングにより解析を行った（図１５Ｄ）。図１５Ｃで示した結果と呼応して、ブリガチニブとセツキシマブを併用投与した群から得た腫瘍ではＥＧＦＲ、及びその下流のシグナル伝達系のリン酸化が著しく抑制されていた。
【００８６】
カプラン−マイヤー法に基づく生存曲線を図１５Ｅに示す。三重変異を有するＥＧＦＲを発現するＰＣ９を移植した場合、オシメルチニブ単独投与では、ほとんど効果がないのに対し、ブリガチニブ単独、セツキシマブ単独投与では一定の延命効果を有していた。これに対し、ブリガチニブとセツキシマブを併用して投与した群では６０日の観察期間中、すべてのマウスが生存していた。したがって、三重変異を有するＥＧＦＲを発現する腫瘍に対しては、ブリガチニブとセツキシマブを併用して投与することが望ましい。
【００８７】
次に、Ｂａ／Ｆ３細胞に、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９の変異を有するＥＧＦＲを発現させ、抗ＥＧＦＲ抗体との併用効果の解析を行った（図１６）。３０ｎＭ  ブリガチニブ、３０ｎＭ  ＡＰ２６１１３類縁体、１００ｎＭ  ＡＺＤ３４６３、３００ｎＭオシメルチニブに１０μｇ／ｍｌセツキシマブ存在下、又は非存在下で細胞を培養し、７２時間後に細胞の生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏアッセイにより評価した。
【００８８】
ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３、オシメルチニブは単独でも細胞生存率を低下する効果が見られるが、１０μｇ／ｍｌの濃度ではセツキシマブ単独では細胞生存率を低下する効果は見られなかった。また、１０μｇ／ｍｌの濃度ではセツキシマブ単独での効果は見られないのにも関わらず、ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３と併用することによって、細胞生存率に対するより強い効果が見られた。一方、オシメルチニブではセツキシマブの併用効果は観察されなかった。
【００８９】
Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９の変異を有するＥＧＦＲを発現させたＢａ／Ｆ３細胞に、セツキシマブ存在下、非存在下で、ブリガチニブを０〜１０００ｎＭ濃度の範囲で処理し、ＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系のリン酸化をウェスタンブロッティングにより解析した（図１６Ｂ）。セツキシマブとブリガチニブを併用して処理した細胞では、ブリガチニブ単独に比べてより強いシグナル抑制効果が見られた。特に、ＥＧＦＲの下流のシグナル伝達系ではより一層強いシグナル抑制効果が見られた。
【００９０】
≪パニツムマブ併用の効果≫
ブリガチニブ等との併用効果がセツキシマブ特有のものではないことを確認するために、ＥＧＦＲの活性を阻害する他の抗ＥＧＦＲ抗体を用いて同様の解析を行った（図１７）。Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９の変異を有するＥＧＦＲを発現させたＢａ／Ｆ３細胞の培養液に、２０μｇ／ｍｌパニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、武田薬品工業製）存在下、又は非存在下で、１００ｎＭ  ブリガチニブ、１００ｎＭ  ＡＰ２６１１３類縁体、又は３００ｎＭ  オシメルチニブを添加し、細胞を培養し７２時間後に細胞の生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏアッセイにより評価した。セツキシマブで検討した結果と同様に、２０μｇ／ｍｌの濃度では、パニツムマブ単独では細胞生存率に対して効果が得られないものの、ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体と併用した場合に、細胞生存率の著しい減少が見られた。また、オシメルチニブに対してはパニツムマブの併用効果は見られなかった（図１７Ａ）。
【００９１】
ＰＣ９細胞にＣ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９の変異を有するＥＧＦＲを発現させた細胞についても同様にパニツムマブの効果の検討を行った。３００ｎＭ  ブリガチニブ、又は３００ｎＭ  オシメルチニブを培養液に添加し、２０μｇ／ｍｌパニツムマブ存在下、又は非存在下で細胞を培養し、７２時間後に細胞の生存率を同様にして評価した。ＥＧＦＲ三重変異体を発現しているＢａ／Ｆ３細胞と同様に、ブリガチニブではパニツムマブとの併用効果が見られるものの、オシメルチニブでは併用効果を見ることはできなかった（図１７Ｂ）。
【００９２】
ＥＧＦＲの三重変異体を発現するＰＣ９を移植したマウスにおけるパニツムマブ、ブリガチニブのＥＧＦＲシグナル伝達系に対する効果をウェスタンブロッティングにより解析した。ＥＧＦＲの三重変異体を発現するＰＣ９をマウスに移植し、ブリガチニブは７５ｍｇ／ｋｇで１日１回強制経口投与を行い、パニツムマブは腹腔内に０．５ｍｇ／マウスの用量で週２回投与し、８日後に各群２匹のマウスから腫瘍を取り出しウェスタンブロッティングにより解析した。ブリガチニブ単独、パニツムマブ単独でもＥＧＦＲシグナル伝達系の活性化に対して抑制効果は見られるものの、ブリガチニブとパニツムマブを投与した群では、ＥＧＦＲシグナル伝達系の活性化が顕著に抑制されていた（図１７Ｃ）。
【００９３】
ＥＧＦＲの三重変異体を発現するＰＣ９を移植したマウスにおいて、ブリガチニブと抗ＥＧＦＲ抗体の併用効果を検討した。三重変異ＥＧＦＲを発現するＰＣ９を移植し、腫瘍容積が２００〜３００ｍｍ３に達した後、マウスを各５匹ずつ、溶媒のみ、ブリガチニブ単独、パニツムマブ単独、ブリガチニブとセツキシマブの併用、ブリガチニブとパニツムマブの併用で投与し、腫瘍容積と生存率の解析を行った。
【００９４】
なお、ブリガチニブは７５ｍｇ／ｋｇ、又は３７．５ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回強制経口投与を行い、パニツムマブは０．５ｍｇ／マウス、セツキシマブは１ｍｇ／マウスの用量で週２回腹腔内投与を行い、経時的に腫瘍容量と生存率を解析した（図１８）。なお、マウスにおいてブリガチニブ３７．５ｍｇ／ｋｇでの投与は、ヒトでの投与量よりやや少ない用量に対応する。
【００９５】
上記でセツキシマブを用いて解析した場合と同様に、パニツムマブ単独でもコントロールである溶媒投与群と比較して、腫瘍増殖に対して一定の効果が得られるものの完全な腫瘍抑制効果は得られない。一方、ブリガチニブと抗ＥＧＦＲ抗体であるパニツムマブ、又はセツキシマブを併用して投与した場合には腫瘍増殖効果が得られるだけではなく、徐々に腫瘍が退縮するという結果が得られた（図１８Ａ）。
【００９６】
カプラン−マイヤー法による生存曲線による解析結果においても、ブリガチニブとパニツムマブ、又はセツキシマブを併用して投与した場合には約６０日目まですべてのマウスが生存していた。一方、ブリガチニブ単独、パニツムマブ単独投与群では、コントロールよりは長期に生存していたものの、４０日前後ですべてのマウスが死亡した。
【００９７】
さらに、ヒト肺癌細胞から樹立した細胞株を用いてブリガチニブとパニツムマブの併用効果の解析を行った。ＪＦＣＲ−１６３細胞株は、がん研究会においてオシメルチニブに不応の患者の胸水から樹立した細胞株であり、ＥＧＦＲの三重変異（Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ／Ｃ７９７Ｓ）を有している。ＪＦＣＲ−１６３細胞を上記と同様にして、Ｂａｌｂ−ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス各２匹に移植し、腫瘍容積が約１００ｍｍ３に達した後、マウスをランダムに２群に分け、一方を処置群、他方を溶媒のみを投与するコントロール群とした。処置群は、５０ｍｇ／ｋｇの用量でブリガチニブを１日１回強制経口投与し、パニツムマブは０．５ｍｇ／ｋｇの用量で週１回腹腔内投与を行った。経時的に腫瘍容量を計測した結果、溶媒のみを投与したコントロール群は腫瘍容量の増大が認められたが、ブリガチニブとパニツムマブを併用投与した群では腫瘍容量の増加は認められなかった。
【００９８】
Ｌ８５８Ｒ変異をベースに有する三重変異であっても、エクソン１９欠失変異をベースに有する三重変異であっても、ブリガチニブと抗ＥＧＦＲ抗体の併用投与による効果が認められたことは、第３世代のＥＧＦＲ-ＴＫＩによってＣ７９７Ｓに変異を生じ耐性を獲得した肺癌の治療に大きな意味を持つ。
【００９９】
これらの結果から、癌の原因となるＥＧＦＲのエクソン１９の欠失、あるいはＬ８５８Ｒの変異、第２の変異であるＴ７９０Ｍに加えて、第３の変異であるＣ７９７Ｓの変異のあるＥＧＦＲ変異体に対して、ブリガチニブ、あるいはこれと同様の骨格を有する化合物と抗ＥＧＦＲ抗体を併用することによって、より強い治療効果を得ることができることが示された。抗ＥＧＦＲ抗体としては、ここではセツキシマブ、パニツムマブについて検討を行ったが、リガンドの結合を制御しうる抗体であれば同様の効果を奏するものと考えられる。
【０１００】
上記示してきたように、ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３に代表される一般式（Ｉ）で表される化合物は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性となった腫瘍のうちＣ７９７Ｓに変異を有するＥＧＦＲ変異体に対して増殖抑制効果を備えている。さらに、セツキシマブ、パニツムマブのような抗ＥＧＦＲ抗体と併用することにより、より強い効果を得ることができる。したがって、ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性非小細胞肺癌において、現在のところ効果的な治療法がない第３世代のＥＧＦＲ-ＴＫＩ耐性腫瘍に対して効果的な治療薬となり得る。
【図１】
2017200016.tif 000035
【図２】
2017200016.tif 000036
【図３】
2017200016.tif 000037
【図４】
2017200016.tif 000038
【図５】
2017200016.tif 000039
【図６】
2017200016.tif 000040
【図７】
2017200016.tif 000041
【図８】
2017200016.tif 000042
【図９】
2017200016.tif 000043
【図１０】
2017200016.tif 000044
【図１１】
2017200016.tif 000045
【図１２】
2017200016.tif 000046
【図１３】
2017200016.tif 000047
【図１４】
2017200016.tif 000048
【図１５】
2017200016.tif 000049
【図１６】
2017200016.tif 000050
【図１７】
2017200016.tif 000051
【図１８】
2017200016.tif 000052
【図１９】
2017200016.tif 000053
【配列表】
2017200016000001.app
【国際調査報告】
2017200016.tif 000054
2017200016.tif 000055
2017200016.tif 000056
2017200016.tif 000057