【手続補正書】
【提出日】平成31年4月8日(2019.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミドである化合物またはその塩。
【請求項２】
ＰＰＰ１Ｒ１１５Ｂ選択的な阻害剤である、（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミドまたはその塩を含む組成物。
【請求項３】
ＰＰＰ１Ｒ１１５Ｂ選択的な阻害剤である、（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミドまたは薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物。
【請求項４】
ミスフォールドしたタンパク質の蓄積またはプロテオスタシス障害に関連する障害の治療における使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物、組成物または医薬組成物。
【請求項５】
障害がポリグルタミン障害である、請求項４に記載の使用のための、化合物、組成物または医薬組成物。
【請求項６】
ポリグルタミン障害が、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び運動失調症から選択される、請求項５に記載の使用のための、化合物、組成物または医薬組成物。
【請求項７】
ポリグルタミン障害がハンチントン病である、請求項６に記載の使用のための、化合物、組成物または医薬組成物。
【請求項８】
ポリグルタミン障害が、パーキンソン病またはアルツハイマー病である、請求項６に記載の使用のための、化合物、組成物または医薬組成物。
【請求項９】
障害が、網膜変性、緑内障、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、タウオパシーおよびプリオン病から選択される、請求項４に記載の使用のための、化合物、組成物または医薬組成物。
【請求項１０】
微小管結合タンパク質タウの凝集に関連する障害の治療における使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物、組成物または医薬組成物。
【請求項１１】
障害が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン症候群および認知症、嗜銀顆粒性疾患、慢性外傷性脳症、大脳皮質基底核変性症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、ダウン症候群、家族性英国型認知症（ＦＢＤ）、家族性デンマーク型認知症（ＦＤＤ）、前頭側頭葉認知症および１７番染色体連鎖パーキンソン症候群（ＦＴＤＰ−１７）（ＭＡＰＴ変異によって引き起こされる）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）（いくつかの事例はＣ９ＯＲＦ７２変異によって引き起こされる）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカ病、グアドループパーキンソン症候群、筋緊張性ジストロフィー、脳の鉄蓄積を伴う神経変性、Ｃ型ニーマンピック病、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン病、ピック病、脳炎後パーキンソン症候群、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、ＳＬＣ９Ａ６関連性精神遅滞、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化型認知症、球状のグリア封入を伴う白質タウオパシーから選択される、請求項１０に記載の化合物、組成物または医薬組成物。
【請求項１２】
障害が、ミエリン障害、例えば、多発性硬化症、ペリツェウスメルツバッハー病、白質消失病、急性散在性脳脊髄炎、脳室周囲白質軟化症、脳室周囲白質傷害、脊髄癆、デビック病、視神経炎、進行性多巣性白質脳症、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシー、抗ＭＡＧ末梢性ニューロパシー、副腎脳白質ジストロフィー、副腎脊髄神経症、びまん性白質傷害、ギランバレー症候群、橋中央ミエリン溶解、白質ジストロフィーなどの遺伝性脱髄疾患、およびシャルコ−マリートゥース（ＣＭＴ）病の治療における使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物、組成物または医薬組成物。
【請求項１３】
小胞体（ＥＲ）において作られる任意のタンパク質のミスフォールディングまたは輸送欠陥に起因する疾患の治療における使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物、組成物または医薬組成物。
【請求項１４】
膜貫通タンパク質（ＣＦＴＲ）のフォールディングを損なわせる変異によって引き起こされる嚢胞性線維症；ホルモンであるチログロブリンのミスフォールディングおよび／または輸送欠陥に起因するチログロブリン欠乏を伴う先天性甲状腺機能低下性甲状腺腫；循環性アルギニンバソプレッシンのミスフォールディングおよび非存在によって引き起こされる家族性神経下垂体性尿崩症（これには、特定の形態の遺伝的に受け継いだ腎性尿崩症も含まれ得る）；疾患がコラーゲンのフォールド、集合および合成の失敗によって引き起こされるプロコラーゲン生合成障害、例えば、これに限定されないが骨形成不全；より一般には、タンパク質のミスフォールディング／合成の欠乏またはミスローカリゼーションが作用機序に存在する結合組織の任意の遺伝的な疾患、例えば、細胞外マトリックスのタンパク質の欠陥に関連する成長板異形成；合成の欠乏、細胞内輸送の変化、または異常な機能の原因となるＬＤＬレセプターにおける変異によって引き起こされる分子の欠陥を伴う、高コレステロール血症；アルファ１アンチトリプシンのミスフォールディングに起因するアルファ−１アンチトリプシン欠損症；リソソーム機能に関連するタンパク質のミスフォールディングに起因するリソソーム障害、例えば、ゴーシェ病、ニーマンピック病およびアンダーソンファブリー病；ロドプシンタンパク質のミスフォールディング、それらのＥＲ滞留、その結果としてのＥＲストレスおよび細胞死によって引き起こされる遺伝性網膜変性の最も一般的な形態である、網膜色素変性症（ｒｅｔｉｎｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）（ＲＰ）；ならびにＥＲストレスに関連する炎症性腸疾患の治療における使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物、組成物または医薬組成物。
【請求項１５】
（ｉ）代謝疾患、例えば、糖尿病、ウォルコットラリソン症候群、肥満症、インスリン抵抗性、高脂血症、脂肪性肝疾患およびアテローム性動脈硬化症の治療；または（ｉｉ）関節リウマチ、１型糖尿病または白斑の治療における使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物、組成物または医薬組成物。
【請求項１６】
試験化合物をスクリーニングして、化合物が、ホロホスファターゼに選択的にまたは非選択的に結合するかどうかを決定するための方法であって：
ｉ）捕捉／固定化されている第１のホロホスファターゼを提供するステップと；
ｉｉ）試験化合物を第１のホロホスファターゼに結合するその能力に関して試験するステップと；
ｉｉｉ）捕捉／固定化されている第２のホロホスファターゼを提供するステップと；
ｉｖ）同じ試験化合物を第２のホロホスファターゼに結合するその能力に関して試験するステップと；
ｖ）試験化合物の前記第１のホロホスファターゼとの結合と前記第２のホスファターゼとの結合を比較するステップと
を含み、
ホロホスファターゼに結合する化合物が、前記第１のホロホスファターゼに選択的に結合するが、前記第２のホスファターゼに結合せず；または、前記第２のホロホスファターゼに結合するが、前記第１に結合せず；またはホロホスファターゼに結合する化合物が、前記第１のホロホスファターゼおよび前記第２のホロホスファターゼの両方に非選択的に結合する、方法。
【請求項１７】
前記第１および／または前記第２のホロホスファターゼが、触媒および１つまたは複数の調節サブユニットから構成されるオリゴマー酵素である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ホロホスファターゼが、単離され、精製される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１および／または第２のホロホスファターゼの調節および／または触媒サブユニットが、２つのタグとともに発現され、２つのステップの手順において精製を促進する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ホロホスファターゼの調節サブユニットが、切断形態である、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ホロホスファターゼが、再構成される、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
試験化合物を結合するその能力に関して試験する前記ステップが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アプローチを使用して結合親和性を決定することによる、請求項１６から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ホロホスファターゼが、表面に固定化されている、請求項１６から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ホロホスファターゼが、前記第１または第２の調節サブユニットを添加する前に、最初に表面に触媒サブユニットを捕捉することによって再構成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
表面が、ＳＰＲ分析に適するチップである、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
ホロホスファターゼが、親和性捕捉方法を使用して固定化されている、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
親和性捕捉方法が、ビオチン：ストレプトアビジンを使用することである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１または第２のホロホスファターゼの調節サブユニットが、Ｒ１５Ａである、請求項１６から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１または第２のホロホスファターゼの調節サブユニットが、Ｒ１５Ｂである、請求項１６から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記１つまたは複数の触媒サブユニットが、ＰＰ１ｃである、請求項１６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
触媒サブユニットＰＰ１ｃが、チップに最初に固定化され、次にそれは調節サブユニットに結合される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ｖｉ）触媒サブユニットが捕捉／固定化されている前記第１および第２のホロホスファターゼの触媒サブユニットを提供するステップと；
ｖｉｉ）候補ホスファターゼ阻害剤分子を、触媒サブユニットに結合するその能力に関して試験するステップと
をさらに含む、請求項１６から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
検証アッセイにおいて候補ホスファターゼ阻害剤として試験化合物の活性を確認するステップをさらに含む、請求項１６から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１６から３３のいずれか一項に記載のスクリーニングの方法における使用のためのキット。
【請求項３５】
第１の表面に捕捉される第１のホロホスファターゼおよび第２の表面に捕捉される第２のホロホスファターゼを含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記第１および／または第２の表面が、ＳＰＲに適するチップである、請求項３５に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
一実施形態において、ホロホスファターゼ、すなわち、前記第１および／または前記第２のホロホスファターゼは、触媒および１つまたは複数の調節サブユニットから構成されるオリゴマー酵素である。実質的に全ての側面の細胞機能を調節する４００超のホスファターゼが存在し、例えば、Ｈｅｒｏｅｓら（２０１２）において論評されている。少数の触媒サブユニットを共有する２００を超える調節サブユニットが存在する。ホスファターゼの調節サブユニットは、内因的に無秩序、すなわち、自然に組織化されておらず（Ｂｏｌｌｅｎら、２０１０；Ｃｈｏｙら、２０１２ａ）、それらの触媒サブユニットとの結合に際してのみ組織化されることになる傾向がある。このような自然に組織化されていない分子の阻害剤を同定するため以前に提供されていた方法は存在せず、このような方法の開発は一般に問題があることがその理由である。単独で使用される場合（タグ化または未タグ化）、ホスファターゼの自然に組織化されていない調節サブユニットは、全体的に不安定であるかまたは沈殿する。したがって、調節サブユニット単独を使用することにより、関連性のある生物学的活性の化合物が同定されることは可能ではなかった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本方法は、相互作用パートナーに結合したときに自然に組織化されていないタンパク質である調節サブユニットを含有する複合体を生成させ、スクリーニングのためにそれを使用することを可能にし、したがって、このクラスのタンパク質が同定される新薬ターゲティングを可能にする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
一実施形態において、本発明の実施形態の任意の態様に従う試験化合物に関してスクリーニングするための方法は、以下の追加のステップ：
ｖｉ）捕捉／固定化されている前記第１および第２のホロホスファターゼの触媒サブユニットを提供するステップと；
ｖｉｉ）候補ホスファターゼ阻害剤分子を、触媒サブユニットに結合するその能力に関して試験するステップと
をさらに含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
【図１】実施例１のＲ１５Ｂ阻害剤とＲ１５Ｂ−ＰＰ１の選択的な結合をＲ１５Ａ−ＰＰ１と対比して示す図である。
【図２】実施例１の選択的なＲ１５Ｂ阻害剤が、ストレスの非存在下で細胞においてｅＩＦ２αの一過性のリン酸化を誘導し、細胞においてＲ１５Ａの発現を誘導することを示す図である。
【図３】実施例１の選択的なＲ１５Ｂ阻害剤が、ストレスから細胞を保護することを示す図である。
【図４】ストレスに続くｅＩＦ２αリン酸化における選択的なＲ１５Ｂ阻害剤の効果を示す図である。実施例１の化合物は、ストレスに続くｅＩＦ２αリン酸化を延長させる。
【図５】広範な組織分布を呈する、実施例１の化合物の組織分布を示す図である。
【図６】実施例１の化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）でのマウスの処置が、毒性ではないことを示す図である。
【図７】実施例１の化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）でのマウスの処置が、グアナベンズの副作用を生じさせないことを示す図である。
【図８】実施例１の化合物での処置後の哺乳動物におけるＲ１５Ａの誘導を示す図である。
【図９】哺乳動物における疾患を予防することにおける、実施例１のＲ１５Ｂ阻害剤の有効性を示す図である。図９において使用される例は、マウスモデルＨＤ８２Ｇｌｎを使用したハンチントン病である（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、８、３８７〜４０７、１９９９）。ＷＴ：野生型マウス。Ｔｇ：ＨＤ８２Ｇｌｎ。
【図１０】ビヒクルまたは実施例１の化合物で処置された指示された遺伝子型において、培養された後根神経節（ＤＲＧ）からのミエリン節間を赤色（桿形状）、核を青色（球状の「斑点」形状）で示す図である。ＰＭＰ２２−変異体マウスにおけるミエリン節間は、より短い。実施例１の化合物での処置は、変異体ＤＲＧにおけるミエリン節間の長さを増加させたことから、ミエリン形成が改善されたことが明らかになる。
【図１１】実施例１の化合物での処置後の肥満マウスｄｂ／ｄｂ動物（１条件当たりｎ＝５）における血液グルコースレベルを示す図である。
【図１２】組換えタンパク質ＭＢＰ−Ｒ１５Ａ３２５〜６３６−Ｈｉｓ、ＭＢＰ−Ｒ１５Ｂ３４０〜６９８−Ｈｉｓを示すＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（Ｃｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）染色ゲルを示す図である。
【図１３Ａ】ビオチン化（ｂｉｏｔｙｎｉｌａｔｅｄ）グアナベンズ（Ｂｉｏ−ＧＢＺ）とＲ１５ＡおよびＲ１５Ｂの結合親和性を決定するため使用されるＳＰＲ法を例示する画像を示す図である。
【図１３Ｂ】ＳＰＲセンサーチップ表面に固定化されたｂｉｏ−ＧＢＺに結合するＲ１５ＡおよびＲ１５ＢのＳＰＲセンサーグラムを示す図である。Ｒ１５Ａ／Ｂ濃度＝０．０２４４〜１２．５μＭ。
【図１４】図１３Ｂからの応答単位が、定常状態の結合定数（ＫＤ）を決定するためのタンパク質濃度に対するプロットを示す図である。Ｒ１５Ａ（○、青色）およびＲ１５Ｂ（▲、マゼンタ色）の結合。ｂｉｏ−ＧＢＺに対するＲ１５ＡのＫＤは１１μＭであり、ｂｉｏ−ＧＢＺに対するＲ１５ＢのＫＤは１２３μＭである。
【図１５】上のパネル：組換えｂｉｏ−ＰＰ１（部分的に精製）、ＭＢＰ−Ｒ１５Ａ３２５〜６３６−ＨｉｓおよびＭＢＰ−Ｒ１５Ｂ３４０〜６９８−Ｈｉｓ（インプット）を示すＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ染色ゲルを示す図である。ＢＡＰ−ＰＰ１ｃは、ニュートラアビジンビーズで精製され、Ｒ１５ＡおよびＲ１５Ｂと結合していた（結合）。Ｂｉｏ−ＰＰ１ｃ＝ビオチン化ＰＰ１。下のパネル：ビオチン化ＰＰ１ｃを示す免疫ブロットを示す図である。
【図１６】ヒトＲ１５ＡおよびＲ１５Ｂのアラインメントの図である。機能上関連するにもかかわらず、Ｒ１５ＡおよびＲ１５Ｂは異なっており、２３％の同一性のみを共有する。
【図１７】ストレプトアビジン（ＳＡ）−ＳＰＲチップにおけるＲ１５ホロホスファターゼの再構成を描写する画像を示す図である。
【図１８】ＳＰＲセンサーチップに固定化されたＲ１５Ａ−ＰＰ１ｃホロホスファターゼに結合するグアナベンズのＳＰＲセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍｓ）を示す図である。
【図１９】ＳＰＲセンサーチップに固定化されたＲ１５Ｂ−ＰＰ１ｃホロホスファターゼに結合するグアナベンズのＳＰＲセンサーグラムを示す図である。
【図２０】ＳＰＲセンサーチップに固定化されたＰＰ１ｃホロホスファターゼに結合するグアナベンズのＳＰＲセンサーグラムを示す図である。
【図２１】本発明のＳＰＲチップに固定化されたＲ１５Ａ−ＰＰ１ｃ、Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１ｃおよびＰＰ１ｃに対するＧＢＺの定常状態の親和性を示す図である。ストレプトアビジンセンサーチップ表面に固定化されたＲ１５Ａ／ＰＰ１ｃ（○）およびＲ１５Ｂ／ＰＰ１ｃ（▲）に対するＧＢＺの結合。応答単位を、定常状態の結合定数（ＫＤ）を決定するため化合物濃度に対してプロットした。Ｒ１５Ａに対するＧＢＺのＫＤは０．１２２１μＭであり、Ｒ１５Ｂに対するＧＢＺについて結合は検出されなかった。
【図２２】本発明のＳＰＲチップに固定化されたＲ１５Ａ−ＰＰ１ｃ、Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１ｃおよびＰＰ１ｃに対するＳｅｐｈｉｎ１の定常状態の親和性を示す図である。Ｒ１５Ａに対するＳｅｐｈｉｎ１のＫＤは０．７８６μＭであり、Ｒ１５Ｂに対しては２３μＭである。
【図２３】本発明のＳＰＲチップに固定化されたＲ１５Ａ−ＰＰ１ｃ、Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１ｃおよびＰＰ１ｃに対するサルブリナルの定常状態の親和性を示す図である。
【図２４】本発明のＳＰＲチップに固定化されたＲ１５Ａ−ＰＰ１ｃ、Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１ｃおよびＰＰ１ｃに対するＴＳＴ３の定常状態の親和性を示す図である。
【図２５】本発明のＳＰＲチップに固定化されたＲ１５Ａ−ＰＰ１ｃ、Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１ｃおよびＰＰ１ｃに対する異なる化合物の定常状態の親和性を示す図である。ＧＢＺ、Ｓｅｐｈｉｎ１  Ｓａｌ００３およびＴＳＴ３ならびにｅＩＦ２αホロホスファターゼ（ｈｏｌｏｐｈｏｓｐａｔａｓｅｓ）またはＰＰ１ｃ単独についてのそれらのそれぞれの親和性（ＫＤ）を示す表である。（−−）：結合なし。少なくとも３つの独立した実験の代表的な結果が、各パネルに示される。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３である。ＫＤ値を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００分析ソフトウェア（Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ１．０）による定常状態の親和性モデルで計算した。
【図２６】カリクリンＡ（ＰＰ１の触媒阻害剤）とは対照的に、ＧＢＺおよびＳｅｐｈｉｎ１と同様にＴＳＴ３はＰＰ１ｃを阻害しないことを示す図である。
【図２７】ＴＳＴ３は、Ｒ１５Ｂを選択的に阻害することによってｅＩＦ２αリン酸化を一過性に誘導することを示す図である。ＴＳＴ３で１０μＭで処置したＨｅＬａ細胞溶解物における示されるタンパク質の免疫ブロット。
【図２８】ＴＳＴ３は、Ｒ１５Ｂを選択的に阻害するが、Ｒ１５Ａを阻害しないため、タンパク質合成を一過性に低減させることを示す図である。ＴＳＴ３で１０μＭで示される時間で処置したＨｅＬａ細胞溶解物からの３５Ｓ−メチオニンで放射性標識された新しく合成されたタンパク質のオートラジオグラム。下のパネル：ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ染色。
【図２９】ＴＳＴ３は、ＧＢＺの存在下でタンパク質合成を持続的に阻害することを示す図である。ＴＳＴ３＋／−ＧＢＺで１０μＭで示される時間で処置したＨｅＬａ細胞溶解物からの３５Ｓ−メチオニンで放射性標識された新しく合成されたタンパク質のオートラジオグラム。下のパネル：ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ染色。
【図３０】ＴＳＴ３は、ＧＢＺの存在下でｅＩＦ２αリン酸化を持続的に誘導することを示す図である。ＴＳＴ３＋ＧＢＺで１０μＭで処置したＨｅＬａ細胞溶解物における示されるタンパク質の免疫ブロット。
【図３１】ＴＳＴ３活性は、ｒ１５ｂノックアウト細胞において消失することを示す図である。ＴＳＴ３で１０μＭで示される時間で処置したｒ１５ａｍｕｔ／ｍｕｔまたはｒ１５ｂｍｕｔ／ｍｕｔ  ＭＥＦ溶解物における示されるタンパク質の免疫ブロット。
【図３２】ＴＳＴ３は、ｒ１５Ｂ−／−細胞においてタンパク質合成に効果を有しないことを示す図である。上のパネル：ＴＳＴ３で１０μＭで示される時間で処置したｒ１５ａｍｕｔ／ｍｕｔまたはｒ１５ｂｍｕｔ／ｍｕｔ  ＭＥＦ溶解物からの３５Ｓ−メチオニンで放射性標識された新しく合成されたタンパク質のオートラジオグラム。
【図３３】本発明に従うアッセイ方法の例が示される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
ｅＩＦ２αのαサブユニットのリン酸化は、種々のストレスに対する防御の第一線であり、アンフォールドタンパク質応答（ＵＰＲ）および統合ストレス応答（ＩＳＲ）の２つの部分的にオーバーラップするシグナル伝達経路の中心的な要素である。ｅＩＦ２αリン酸化を元に戻すために、哺乳動物細胞は２つのｅＩＦ２αホスファターゼを有する。ｅＩＦ２αホスファターゼは、約２００の他のホスファターゼと触媒サブユニットＰＰ１ｃを共有する二量体ホロ酵素であり、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ（Ｎｏｖｏａら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１５３、１３４５〜１３５５、２００１）ストレス誘導性タンパク質または構成的に発現されるＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ（Ｊｏｕｓｓｅら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１６３、７６７〜７７５、２００３）の２つの関連した調節サブユニットのうちの１つに結合される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ（「Ｒ１５Ａ」）阻害はＰＰＰ１Ｒ１５ＡおよびＰＰ１から構成されるストレス誘発性ｅＩＦ２αホスファターゼを選択的に阻害し、一方で、高度に関連する、構成的なホスファターゼＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ−ＰＰ１には害を及ぼさない。ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害は、ストレスを受けた細胞におけるｅＩＦ２αリン酸化を延長し、これによりストレスを受けた細胞において長期的な翻訳の減弱がもたらされる。結果として、シャペロン有効性がストレスを受けた細胞において増加する。その理由は、新しく合成されたタンパク質のフォールディングの補助に通常関与するシャペロンは翻訳が低下した場合に有効となるからである。これにより、タンパク質フォールディングが支持され、細胞をタンパク質プロテオスタシス欠陥からレスキューする。したがって、原理的に、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害剤は、タンパク質のミスフォールディングストレスが関与する哺乳動物疾患を処置し得る。ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ／ＧＡＤＤ３４ノックアウトマウスが野生型マウスとほとんど区別不能であるのでＰＰＰ１Ｒ１５Ａの阻害は安全と予想されることから、哺乳動物におけるＰＰＰ１Ｒ１５Ａの阻害は魅力的な治療可能性を有する（Ｍａｒｃｉｎｉａｋら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１８、３０６６〜３０７７、２００４）。しかし、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ阻害剤で処置できる治療適応の数は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａが発現され、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａが疾患作用機序に存在する疾患に限定されると予想される。したがって、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａの阻害は、強力かつ安全であり得るが、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａが関与する疾患に限定される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
一実施形態において、「選択的な阻害剤」は、Ｒ１５ＡまたはＲ１５Ｂなどの１つのホロホスファターゼと別のものとの間のＫＤ値における差が、３倍および、好ましくは３倍超、またはなおより好ましくは１０または２０倍の範囲である化合物として定義されてもよい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
任意選択で、アッセイは、スクリーニングまたはハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）として使用される。
結合アッセイは、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂに選択的に結合する候補に関するスクリーニングに使用することができるが、候補の特性は必ずしも結合アッセイによって予想されない。したがって、候補がＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ機能を阻害するかどうかを評価するため他のアッセイが必要とされる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
療法適用
ＰＰＰ１Ｒ１５Ａおよび／またはＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの阻害剤を含む、本発明の任意の態様または実施形態に従うアッセイを使用して同定される阻害剤は、種々の疾患および障害を処置することおよび予防することにおいて、潜在的な療法適用を有する。ｅＩＦ２α脱リン酸の阻害は翻訳を低下させ、結果として、フォールディングを支持するシャペロンの有効性を増加させる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ関連疾患は、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂを阻害することによって改善させることができる疾患である。これらには、ミスフォールドしたタンパク質の蓄積またはタンパク質ホメオスタシス（プロテオスタシス）の撹乱に関連する障害が含まれ、例えば、ハンチントン病ならびに別のポリグルタミン障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、運動失調症および他のポリグルタミン障害ならびに網膜変性、緑内障、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびプリオン病；微小管結合タンパク質タウの凝集に関連する障害、ならびに、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症およびパーキンソン認知症症候群、嗜銀顆粒性疾患（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｒａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性外傷性脳症、大脳皮質基底核変性症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、ダウン症候群、家族性英国型認知症（ＦＢＤ）、家族性デンマーク型認知症（ＦＤＤ）、前頭側頭葉認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）および１７番染色体連鎖パーキンソン症候群（ＦＴＤＰ−１７）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカ病、グアドループパーキンソン症候群（Ｇａｕｄｅｌｏｕｐｅａｎ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）、筋緊張性ジストロフィー、脳の鉄蓄積を伴う神経変性、Ｃ型ニーマンピック病、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン病（ｎｏｎ−Ｇｕａｍａｎｉａｎ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅｓ）、ピック病、脳炎後パーキンソン症候群、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、ＳＬＣ９Ａ６関連性精神遅滞、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化型認知症（ｔａｎｇｌｅ−ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、および球状のグリア封入を伴う白質タウオパシー；ミエリン障害、例えば、多発性硬化症、ペリツェウスメルツバッハー病、白質消失病、急性散在性脳脊髄炎、脳室周囲白質軟化症、脳室周囲白質傷害、脊髄癆、デビック病、視神経炎、進行性多巣性白質脳症、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシー、抗ＭＡＧ末梢性ニューロパシー（ａｎｔｉ−ＭＡＧ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、副腎脳白質ジストロフィー、副腎脊髄神経症、びまん性白質傷害（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｗｈｉｔｅ  ｍａｔｔｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ）、ギランバレー症候群、橋中央ミエリン溶解、白質ジストロフィーなどの遺伝性脱髄疾患、およびシャルコ−マリートゥース病；小胞体（ＥＲ）において作られる任意のタンパク質のミスフォールディングまたは輸送欠陥によって引き起こされる疾患、例えば、嚢胞性線維症、先天性甲状腺機能低下性甲状腺腫、家族性神経下垂体性糖尿病（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｎｅｕｒｏｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ  ｄｉａｂｅｔｅｓ）、骨形成不全を含むプロコラーゲン生合成障害、高コレステロール血症、アルファ−１アンチトリプシン欠損症、リソソーム障害、網膜色素変性症（ｒｅｔｉｎｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）（ＲＰ）、および炎症性腸疾患；代謝疾患、例えば、糖尿病、ウォルコットラリソン症候群、肥満症、インスリン抵抗性、高脂血症、脂肪性肝疾患およ���アテローム性動脈硬化症；および関節リウマチ、１型糖尿病および白斑を含む他の障害が含まれる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
一実施形態において、疾患は、ミエリン障害である。
ミエリンは、中枢および末梢神経系の両方に豊富なタンパク質である。ミエリンは、末梢神経系中の中枢神経系中のオリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞の２つの細胞型によって産生される。ミエリンは、軸索の周囲に鞘を形成して軸索に沿う電気的インパルスの伝導の速度を保証し、軸索からの電流の散逸を防止する。ミエリン機能は、神経系にとって必須である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
ＣＭＴ疾患は、いくつかの遺伝子中の変異によって引き起こされるミエリンニューロパシーのグループである。末梢性ミエリンタンパク質ＰＭＰ２２中の変異は、ＣＭＴの最も共通する原因である。ＰＭＰ２２（Ｔｒｅｍｂｌｅｒ−Ｊ）中の変異は、ＰＭＰ２２のミスフォールディングを引き起こし、末梢神経系中のミエリンにおける欠陥に起因して、マウスにおいてヒトにおけるＣＭＴに似た疾患をもたらす。出願人は、実施例１の化合物が、神経障害性マウスからの外植片におけるミエリン形成を改善することができることを実証した。出願人は、神経障害性マウスからの外植片におけるミエリン形成を改善することが、哺乳動物における有効性を予想することを実証した（Ｄａｓら、近刊）。したがって、実施例１の化合物は、哺乳動物におけるＣＭＴを処置することにおいて有用であり、さらに、機構が類似しており、ｅＩＦ２α経路が関与することが公知である（ＬｉｎおよびＰｏｐｋｏ、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１２、３７９〜３８５、２００９）他のミエリン障害を処置することにおいて有用である。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
一実施形態において、疾患は、代謝疾患である。
代謝疾患、例えば、糖尿病、肥満、インスリン抵抗性、高脂血症、脂肪性肝疾患、およびアテローム性動脈硬化症が、病理学的なＥＲストレスに関連することが公知であり、ＵＰＲの薬理学的なモジュレーターが、治療の利益を有し得ることが考えられる（ＣａｏおよびＫａｕｆｍａｎ、２０１２、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、ｖｏｌ．２２（１６））。しかし、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤が以前に利用可能ではなく、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害が有害であると予想されたのに加えて、ホスファターゼを阻害することが困難であったことから、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂが代謝疾患における治療標的であり得るかどうかは不確かであった。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
本発明者らは、実施例１の化合物が、哺乳動物における代謝性障害を改善することができることを実証した（図１１）。したがって、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、例えば、糖尿病、肥満、脂肪性肝疾患、およびアテローム性動脈硬化症に限定されない、代謝性障害を処置するため有用である。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
一実施形態において、本明細書において記載されるＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は、代謝性障害の処置における使用のためのものである。
好ましい実施形態において、代謝性障害は、糖尿病、肥満、脂肪性肝疾患、およびアテローム性動脈硬化症から選択される。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
プロドラッグ
本発明は、プロドラッグ形態の本発明の化合物、すなわち、任意の例示的な化合物による活性親薬物をインビボで放出する共有結合化合物をさらに含む。そのようなプロドラッグは、概して、ヒトまたは哺乳類対象への投与時に修飾を元に戻せるように１つまたは複数の適切な基が修飾された本発明の化合物である。元に戻すことは通常、そのような対象において自然に存在する酵素によって実施されるが、元に戻すことをインビボで実施するために、そのようなプロドラッグと一緒に第２の薬剤を投与することが可能である。そのような修飾の例は、エステル（例えば、上述したもののいずれか）を含み、ここで、元に戻すことはエステラーゼ等によって行われ得る。他のそのような系は、当業者には公知である。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
実施例Ａ
本発明による化合物の調製
本発明による化合物は、以下の手順により調製することができる：
一般的手順Ａ：
エタノール（３００ｍｌ）中のベンズアルデヒドの溶液（１当量）に、順次に塩酸アミノグアニジン（１当量）および酢酸ナトリウム（１当量）を２５℃で添加した。得られた反応混合物を、８０℃で次の約６時間加熱した。反応完了を、ジクロロメタン／メタノール（８／２）を移動相として使用したＴＬＣでモニターした。反応の完了後、反応混合物を、２５℃に冷却させ、ＮａＨＣＯ３の飽和溶液（７００ｍｌ）に入れた。得られた沈殿物を、真空下で濾別し、水（１００ｍｌ）で洗浄した。得られた固形物を、ジエチルエーテル（２×２５ｍｌ）で粉砕して、真空下で乾燥して、所望の置換されたアミノグアニジン誘導体を得た。
以下の化合物を、一般的手順Ａにより調製した：
実施例１：（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド
一般的手順Ａに従って２，３−ジクロロベンズアルデヒドから８５％収率で調製した（モノアセタート塩と考慮）ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２３１．２３（Ｍ＋Ｈ）。1H-NMR (DMSO-d6): δ(ppm) 11.85 (brs, 1H); 8.35 (s, 1H); 8.19-8.21 (dd, 1H); 7.56-7.59 (dd, 1H); 7.32-7.36 (t, 1H); 7.04 (brs, 4H); 1.84 (s, 3H); MS (ESI+): m/z = 231.23 [M+H]+
実施例２：（Ｅ）−２−（２−クロロ−４−フルオロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド
一般的手順Ａに従って２−クロロ−４−フルオロベンズアルデヒドから６７％収率で調製した。1H-NMR (DMSO-d6): δ(ppm) 5.80 (brs, 2H); 5.84 (brs, 2H); 7.19-7.34 (m, 4H); 8.16 (s, 1H); MS (ESI+): m/z = 215.1 [M+H]+
実施例３：（Ｅ）−２−（３，４，５−トリクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド
一般的手順Ａに従って３，４，５−トリクロロベンズアルデヒドから７０．８８％収率で調製した。
1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 7.96 (s, 2H); 7.89 (s, 1H); 6.20 (brs, 2H); 5.69 (brs, 2H); MS (ESI+): m/z = 265.1 [M+H]+
実施例４：（Ｅ）−２−（２，４，５−トリクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド
一般的手順Ａに従って２，４，５−トリクロロベンズアルデヒドから７８．７６％収率で調製した。
1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 8.43 (s, 1H); 8.12 (s, 1H); 7.77 (s, 1H); 6.33 (brs, 2H); 5.83 (brs, 2H); MS (ESI+): m/z =265.17 [M+H]+
タンパク質発現、精製および表面プラズモン共鳴による分析
タンパク質発現および精製
ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ３２５〜６３６およびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ３４０〜６９８を発現させ、次の通り精製した：ＰＰＰ１Ｒ１５Ａの３２５〜６３６およびＰＰＰ１Ｒ１５Ｂの３４０〜６９８のアミノ酸をコードするｃＤＮＡをＨｉｓ−タグ化し、ｐＭＡＬ−ｃ５ｘにクローニングした。Ｒ１５ＡおよびＲ１５Ｂのアミノ酸配列は、図１６に記される。組換えＰＰＰ１Ｒ１５Ａ／ＢをＢＬ２１−Ｇｏｌｄ細胞において発現させ、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いてＭＢＰＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）におけるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ヒトＰＰ１γ（ＰＰ１ｃ）をコードするｃＤＮＡを、バキュロウイルストランスファーベクターｐＤＷ４６４にクローニングしてビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）を付加した。ベクターは、大腸菌ビオチンホロ酵素合成酵素（ＢｉｒＡ）もコードするため、ＢＡＰ−タグ化タンパク質をＳｐｏｄｏｐｔｅｒｅ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞中でインビボでビオチン化することができる（Ｄｕｆｆｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６２、１２２〜１２８、１９９８）。Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して組換えバクミドＤＮＡを生成し、Ｓｆ９昆虫細胞を使用してウイルスストックを増幅した。培養物を１，２００ｇで１５分間遠心分離することによって採取し、細胞ペレットを溶解緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ、５％グリセロール、１ＰｉＣ錠剤（Ｒｏｃｈｅ）／５０ｍｌおよび０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ）に再懸濁し、続いて穏やかに超音波処理した。タンパク質を最初に５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いてＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって確認された陽性画分を、プールし、約１μＭに濃縮し、−８０℃で貯蔵した。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
ビオチン−ＰＰ１表面を使用した小分子とｅＩＦ２αホロホスファターゼ複合体の定常状態の結合定数の決定
わずかな変更を施して、同じ手順および条件を全ての結合実験に使用した。小分子を、１００％ＤＭＳＯ中に５０ｍＭ貯蔵溶液として貯蔵した。結合定数の決定の前、化合物の１２または８つの濃度のいずれかの連続希釈を、９６ウェルプレートのランニング緩衝剤で調製した。各々の化合物希釈系列より前に、調節サブユニットＲ１５ＡまたはＲ１５Ｂを、ランニング緩衝剤で１５μＭに希釈し、ビオチン−ＰＰ１表面に捕捉させ、センサーチップ表面にホロホスファターゼ複合体を形成させた。次いで、表面を再生することなく、化合物希釈系列をチップの表面上に注入した。センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００査定ソフトウェアを使用して分析し、結合定数を定常状態モデルに基づいて決定した。運動実験は異なる濃度の化合物を使用して行い、それらそれぞれの平衡結合レベルを決定する。これらの平衡応答レベル（Ｒｅｑ）は、濃度に対してプロットされ、グローバルフィットを使用してフィッティングされ、これにより定常状態親和性定数を決定できる（すなわち、５０％飽和での濃度がＫＤである）（Ｆｒｏｓｔｅｌｌ−Ｋａｒｌｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４３、１９８６〜１９９２、２０００）。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
動物試験
全ての動物ケアおよび手順を、地域の倫理的な承認を受けた研究における動物の使用における規則（１９８６年の英国動物科学的処置法）に準拠して実施した。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
ＤＲＧ培養
１３．５または発生時（Ｅ１３．５）における野生型またはＰｍｐ２２Ｔｒ−Ｊ（ＰＭＰ２２変異体）（Ｈｅｎｒｙら、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４２、６８８〜７０６、１９８３）の胚から解剖した後根神経節（ＤＲＧ）を、４ｇ／ｌグルコース、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２％Ｂ２７サプリメントおよび５０ｎｇ／ｍｌニューロン成長因子（ＮＧＦ）を補充した神経基礎（ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）培地中でコラーゲンでコーティングしたカバーガラスにおいて７日間培養した。シュワン細胞を分化させ、ミエリン形成を誘導させるため、培養したＤＲＧを、次にＣ−培地（４ｇ／ｌグルコース、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＮＧＦを補充したＭＥＭ培地）において維持した。Ｃ−培地を、新たに添加した５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸±５ｎＭの実施例Ｉの化合物で１日おきに置き換え、シュワン細胞によるミエリン形成のために１４日間培養した。培養したＤＲＧを、次に４％パラホルムアルデヒド中で固定し、ＭＢＰ（ラットミエリン塩基性タンパク質、１／２５０希釈、ａｂ７３４９８）で免疫染色した。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
代謝疾患におけるＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ有効性の評価（図１１）
代謝疾患、例えば、糖尿病、肥満、脂肪性肝疾患、およびアテローム性動脈硬化症が、病理学的なＥＲストレスに関連することが公知であり、ＵＰＲの薬理学的なモジュレーターが、治療の利益を有し得ることが考えられる。本研究の前には利用可能なＰＰＰ１Ｒ１５Ｂ阻害剤は存在しなかったので、ＰＰＰ１Ｒ１５Ｂが代謝疾患における治療標的であり得るかどうかは不確かであった。本発明者らはこの可能性を試験して、実施例１の化合物での肥満マウスの処置が、これらの哺乳動物において病理学的な高い血液グルコースを低減させることを見出した（図１１）。これにより、実施例１の化合物での処置が、代謝性障害を改善できることが示される。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
１つの疾患モデルにおいて、実施例１の化合物での処置が有益であることが示されたので、本発明の化合物が、他の哺乳動物の代謝性障害、例えば、糖尿病、肥満、脂肪性肝疾患、およびアテローム性動脈硬化症に対し有益であることが明白である。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
材料および方法
タンパク質発現および精製
ＭＢＰ−Ｒ１５Ａ３２５〜６３６−ＨｉｓおよびＭＢＰ−Ｒ１５Ｂ３４０〜６９８−Ｈｉｓを、発現させ、前の記載（Ｄａｓら（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８、２３９〜２４２）の通り精製した。ヒトＰＰ１γをコードするｃＤＮＡを、バキュロウイルストランスファーベクターｐＤＷ４６４にクローニングしてＮ末端ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）を付加した。ベクターは、大腸菌ビオチンホロ酵素合成酵素（ＢｉｒＡ）もコードするため、ＢＡＰ−タグ化タンパク質をＳｐｏｄｏｐｔｅｒｅ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞中でインビボでビオチン化（ｂｉｏ−ＰＰ１ｃ）することができる（Ｄｕｆｆｙら（１９９８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６２、１２２〜１２８）。Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して組換えバクミドＤＮＡを生成し、Ｓｆ９昆虫細胞を使用してウイルスストックを増幅した。タンパク質を、Ｉｎｓｅｃｔ−Ｘｐｒｅｓｓ培地（Ｌｏｎｚａ）中でＳｆ９昆虫細胞を使用して産生した。ｂｉｏ−ＰＰ１を、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において陰イオン交換クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒａｐｈｙ）、続いてゲル濾過（ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。タンパク質を、ＢＯＬＴ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析し、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色し、ビオチン化ＰＰ１の存在をＰｉｅｒｃｅ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したウエスタンブロットによって確認した。これは部分的に純粋なタンパク質をもたらし、完全な精製は、ビオチンとストレプトアビジンの高親和性および特異性に起因して後の段階で達した（ＳＰＲチップにおいて）。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
ｂｉｏ−ＰＰ１ｃ表面を使用した小分子とＲ１５ホロホスファターゼ複合体の定常状態の結合定数の決定
わずかな変更を施して、同じ手順および条件を全ての結合実験に使用した。小分子を、１００％ＤＭＳＯ中に５０ｍＭ貯蔵溶液として貯蔵した。結合定数の決定の前、化合物の１２または８つの濃度のいずれかの連続希釈を、９６ウェルプレートのランニング緩衝剤中に調製した。各々の化合物希釈系列より前に、調節サブユニットＭＢＰ−Ｒ１５Ａ３２５〜６３６−ＨｉｓまたはＭＢＰ−Ｒ１５Ｂ３４０〜６９８−Ｈｉｓを、ランニング緩衝剤で１０μＭに希釈し、流速３０μｌ／分で１分間ｂｉｏ−ＰＰ１ｃ表面に捕捉し、ホロホスファターゼ複合体をセンサーチップ表面に形成させた。これを、続いて１分間の安定化期間をおき、任意の非特異的な結合物を洗い流した。次いで、表面を再生することなく、化合物希釈系列を、チップの表面に流速３０μｌ／分で１分間注入し、続いて２分間の解離時間をおいた。各々の希釈系列の後に、表面を３Ｍ  ＮａＣｌを使用して９０秒間再生した。再生後、ＳＰＲ応答は一般的には基礎レベルに戻り、ｂｉｏ−ＰＰ１ｃ表面は次の化合物希釈系列のために整えられた。サンプル間のＤＭＳＯ濃度における小さな変動を補正可能にするために、０．０６〜８％ＤＭＳＯの範囲の８つの溶媒サンプルを５０サイクルごとに注入した。フローセル温度は、１０℃であった。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９１】
データ分析
センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００査定ソフトウェアを使用して分析し、結合定数を定常状態モデルに基づいて決定した。運動実験は異なる濃度の化合物を使用して行い、それらそれぞれの平衡結合レベルを決定する。これらの平衡応答レベル（Ｒｅｑ）は、濃度に対してプロットされ、グローバルフィットを使用してフィッティングされ、これにより定常状態親和性定数を決定できる（すなわち、５０％飽和での濃度がＫＤである）。ＫＤ値（上記のＦｒｏｓｔｅｌｌ−Ｋａｒｌｓｓｏｎ（２０００））
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
動物
全ての動物ケアおよび手順を、地域の倫理的な承認を受けた研究における動物の使用における規則（１９８６年の英国動物科学的処置法およびＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵ）に準拠して実施した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙまたはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得た。ＨＤ−Ｎ１７１−８２Ｑ（ＨＤ）トランスジェニックマウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得て、混合したバックグラウンド（Ｃ３Ｈ／Ｂ６）で維持した。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９８】
薬物動態試験
薬物動態試験を、ＸｅｎｏＧｅｓｉｓによって実施した。ＴＳＴ３を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄に経口的に投与した。血漿サンプルを、内部標準を含有するメタノールでのタンパク質沈殿によって調製した。組織を、秤量し、均質化（リン酸緩衝生理食塩水中１：３）によって調製し、内部標準を含有するメタノールでタンパク質沈殿させた。メタノールの添加後、血漿および組織サンプルを、−２０℃で≧１時間（または一晩）置いてタンパク質を沈殿させた。サンプルを、次に２，５００×ｇ（３，４００ｒｐｍ）で２０分間４℃で遠心分離した。上清を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０２】
化合物合成
合成手順：
メタノール（２２０ｍｌ）中の２，３−ジクロロベンズアルデヒド（２２．００ｇ、０．１２５７０ｍｏｌ）および重炭酸アミノグアニジン（１７．１ｇ、０．１２５７０ｍｏｌ）の懸濁液に、２５℃で酢酸（２２ｍｌ）を添加した。得られた反応混合物を、７０℃で次の約３０分間加熱した。加熱に際して、懸濁液は透明になった。反応完了を、ジクロロメタン／メタノール（８／２）を移動相として使用したＴＬＣでモニターした。反応の完了後、反応混合物を、２５℃に冷却させ、真空下で濃縮した。得られた残留物をジエチルエーテル（１００ｍｌ）に懸濁し、得られた生成物を濾過によって収集した。このプロセスを、３回反復した。上記プロセスの終了時に、本発明者らは、所望の（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミド（「ＴＳＴ３）を得ることができた。ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２３１．２３（Ｍ＋Ｈ）。得られた生成物を、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、電位差滴定、ＨＰＬＣおよびＣＨＮ分析によっても分析した。
本願発明には、下記の態様もある。
態様１
試験化合物をスクリーニングして、化合物が、ホロホスファターゼに選択的にまたは非選択的に結合するかどうかを決定するための方法であって：
ｉ）捕捉／固定化されている第１のホロホスファターゼを提供するステップと；
ｉｉ）試験化合物を第１のホロホスファターゼに結合するその能力に関して試験するステップと；
ｉｉｉ）捕捉／固定化されている第２のホロホスファターゼを提供するステップと；
ｉｖ）同じ試験化合物を第２のホロホスファターゼに結合するその能力に関して試験するステップと；
ｖ）試験化合物の前記第１のホロホスファターゼとの結合と前記第２のホスファターゼとの結合を比較するステップと
を含み、
ホロホスファターゼに結合する化合物が、前記第１のホロホスファターゼに選択的に結合するが、前記第２のホスファターゼに結合せず；または、前記第２のホロホスファターゼに結合するが、前記第１に結合せず；またはホロホスファターゼに結合する化合物が、前記第１のホロホスファターゼおよび前記第２のホロホスファターゼの両方に非選択的に結合する、方法。
態様２
前記第１および／または前記第２のホロホスファターゼが、触媒および１つまたは複数の調節サブユニットから構成されるオリゴマー酵素である、態様１に記載の方法。
態様３
ホロホスファターゼが、単離され、精製される、態様１または２に記載の方法。
態様４
前記第１および／または第２のホロホスファターゼの調節および／または触媒サブユニットが、２つのタグとともに発現され、２つのステップの手順において精製を促進する、態様３に記載の方法。
態様５
ホロホスファターゼの調節サブユニットが、切断形態である、態様１から４のいずれか一項に記載の方法。
態様６
ホロホスファターゼが、再構成される、態様１から５のいずれか一項に記載の方法。
態様７
試験化合物を結合するその能力に関して試験する前記ステップが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アプローチを使用して結合親和性を決定することによる、態様１から６のいずれか一項に記載の方法。
態様８
ホロホスファターゼが、表面に固定化されている、態様１から７のいずれか一項に記載の方法。
態様９
前記ホロホスファターゼが、前記第１または第２の調節サブユニットを添加する前に、最初に表面に触媒サブユニットを捕捉することによって再構成される、態様８に記載の方法。
態様１０
表面が、ＳＰＲ分析に適するチップである、態様８または９に記載の方法。
態様１１
ホロホスファターゼが、親和性捕捉方法を使用して固定化されている、態様８から１０のいずれか一項に記載の方法。
態様１２
親和性捕捉方法が、ビオチン：ストレプトアビジンを使用することである、態様１１に記載の方法。
態様１３
前記第１または第２のホロホスファターゼの調節サブユニットが、Ｒ１５Ａである、態様１から１２のいずれか一項に記載の方法。
態様１４
前記第１または第２のホロホスファターゼの調節サブユニットが、Ｒ１５Ｂである、態様１から１２のいずれか一項に記載の方法。
態様１５
前記１つまたは複数の触媒サブユニットが、ＰＰ１ｃである、態様１から１４のいずれか一項に記載の方法。
態様１６
触媒サブユニットＰＰ１ｃが、チップに最初に固定化され、次にそれは調節サブユニットに結合される、態様１５に記載の方法。
態様１７
ｖｉ）触媒サブユニットが捕捉／固定化されている前記第１および第２のホロホスファターゼの触媒サブユニットを提供するステップと；
ｖｉｉ）候補ホスファターゼ阻害剤分子を、触媒サブユニットに結合するその能力に関して試験するステップと
をさらに含む、態様１から１６のいずれか一項に記載の方法。
態様１８
検証アッセイにおいて候補ホスファターゼ阻害剤として試験化合物の活性を確認するステップをさらに含む、態様１から１７のいずれか一項に記載の方法。
態様１９
態様１から１８のいずれか一項に記載のスクリーニングの方法における使用のためのキット。
態様２０
第１の表面に捕捉される第１のホロホスファターゼおよび第２の表面に捕捉される第２のホロホスファターゼを含む、態様２０に記載のキット。
態様２１
前記第１および／または第２の表面が、ＳＰＲに適するチップである、態様２１に記載のキット。
態様２２
ＰＰＰ１Ｒ１１５Ｂ選択的な阻害剤である、（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミドを含む組成物。
態様２３
ＰＰＰ１Ｒ１１５Ｂ選択的な阻害剤である、（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミドを含む医薬組成物。
態様２４
ミスフォールドしたタンパク質の蓄積またはプロテオスタシス障害に関連する障害における使用のための、態様２４または２５に記載の組成物。
態様２５
障害がハンチントン病である、態様２６に記載の組成物。
態様２６
対象に、治療有効量のＰＰＰ１Ｒ１１５Ｂ選択的な阻害剤である、（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミドを投与するステップを含む、ミスフォールドしたタンパク質の蓄積またはプロテオスタシス障害に関連する障害を有する対象を処置する方法。
態様２７
ミスフォールドしたタンパク質の蓄積またはプロテオスタシス障害に関連する障害の処置における使用のための医薬の製造における、ＰＰＰ１Ｒ１１５Ｂ選択的な阻害剤である、（Ｅ）−２−（２，３−ジクロロベンジリデン）ヒドラジン−１−カルボキシイミドアミドの使用。