【手続補正書】
【提出日】平成30年12月7日(2018.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞に対して活性な細胞毒性剤の産生体を特定するために変異原核細胞をスクリーニングするための方法であって
（ａ）産生体原核種の細胞を用意するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を活性化トランスポゾン（ＴｎＡ）でトランスポゾン変異生成することにより変異産生体細胞のプールを生成するステップであり、ここで前記ＴｎＡは、前記産生体細胞のＤＮＡにおけるその挿入部位又は近傍で遺伝子の転写を増加させることができる外向きプロモーター（ＴｎＡＰ）を含んでいる、ステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）のプールの個々のメンバーを、非混和性キャリア液体に懸濁されたある体積の水性増殖培地を含む微小液滴で１つ又は複数の標的細胞と共封入し、それにより、単一変異産生体細胞と１つ又は複数の標的細胞とをそれぞれ含む微小液滴のライブラリを生成するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の微小液滴ライブラリを、前記単一の変異産生体細胞と（１つ又は複数の）標的細胞との共培養に適切な条件下でインキュベートして微小培養物のライブラリを作製するステップであって、それによって、前記（１つ又は複数の）標的細胞に対して活性な細胞毒性剤を産生する変異産生体細胞が各微小培養物において標的細胞の増殖を追い越すステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の微小培養物のライブラリを、標的細胞が変異産生体細胞により増殖が追い越されているか又は圧倒されて消滅している微小培養物についてスクリーニングするステップと
を含む方法。
【請求項２】
標的細胞が変異産生体細胞により増殖が追い越されているか又は圧倒されて消滅している微小液滴における変異産生体細胞のＤＮＡをシーケンシングするステップをさらに含み、任意に、
（ｉ）前記ＴｎＡの挿入部位に隣接する又は近傍のＤＮＡが、例えば、トランスポゾン−細胞ＤＮＡジャンクションの選択的増幅を含むシーケンシングによって、配列決定され、並びに／或いは、
（ｉｉ）前記シーケンシングが、例えば、（ａ）逐次合成シーケンシング（ＳＢＳ）バイオケミストリー、及び／又は（ｂ）ナノポアシーケンシング、及び／又は（ｃ）トンネル電流シーケンシング、及び／又は（ｄ）パイロシーケンシング、及び／又は（ｅ）ライゲーションによるシーケンシング（ＳＯＬｉＤシーケンシング）、及び／又は（ｆ）イオン半導体、及び／又は（ｇ）質量分析シーケンシングから選択されるハイスループット超並列シーケンシングを含み、並びに／或いは、
（ｉｉｉ）前記ＴｎＡ挿入部位に隣接する又は近傍のＤＮＡの、約２５、５０、７５、１００又は１００を超える塩基対が配列決定され、並びに／或いは、
（ｉｖ）前記配列決定されるＤＮＡが、前記ＴｎＡ挿入部位に対して５’及び／又は３’である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的細胞が変異産生体細胞により増殖が追い越されているか又は圧倒されて消滅している微小液滴における変異産生体細胞のＴｎＡＰにより産生されたｍＲＮＡ転写物をシーケンシングして、ｍＲＮＡ転写プロファイルを作成するステップをさらに含み、任意に、
前記ｍＲＮＡ転写プロファイルが、
（ａ）ＴｎＡＰによって産生される前記ｍＲＮＡ転写物の配列、並びに／又は
（ｂ）ＴｎＡＰによって産生されるｍＲＮＡ転写物の開始及び終結、並びに／又は
（ｃ）ＴｎＡＰによって産生される前記ｍＲＮＡ転写物の長さ、並びに／又は
（ｄ）ＴｎＡＰによって産生される前記ｍＲＮＡ転写物の相対的存在量、並びに／又は
（ｅ）細胞ＤＮＡの転写部位、並びに／又は
（ｆ）ＴｎＡＰによって産生される前記ｍＲＮＡ転写物が、細胞ＤＮＡに関してセンス若しくはアンチセンスであるか、並びに／又は
（ｇ）ＴｎＡＰによって産生される前記ｍＲＮＡ転写物が、細胞ＤＮＡに関してＯＲＦに相当するか、並びに／又は
（ｈ）ＴｎＡＰによって産生される前記ｍＲＮＡ転写物が、原核タンパク質及び／若しくはタンパク質ドメインをコードしているか
の決定を含む、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）前記微小液滴が、実質的に球状であり、（ａ）１０μｍ〜５００μｍ、（ｂ）１０μｍ〜２００μｍ、（ｃ）１０μｍ〜１５０μｍ、（ｄ）１０μｍ〜１００μｍ、（ｅ）１０μｍ〜５０μｍ、又は（ｆ）約１００μｍの直径を有し、並びに／或いは、
（ｂ）前記微小液滴が、ゲル状態又は液体状態のある体積の水性増殖培地を含み、並びに／或いは、
（ｃ）前記微小液滴が、油外殻で包まれた水性増殖培地の内核と、連続水性相であるキャリア液体とを含み、任意に、
前記水性内核が、（ａ）１０μｍ〜５００μｍ、（ｂ）１０μｍ〜２００μｍ、（ｃ）１０μｍ〜１５０μｍ、（ｄ）１０μｍ〜１００μｍ、（ｅ）１０μｍ〜５０μｍ、若しくは（ｆ）約１００μｍの直径を有し、及び／又は、
前記油外殻が、（ａ）１０μｍ〜２００μｍ、（ｂ）１０μｍ〜２００μｍ、（ｃ）１０μｍ〜１５０μｍ、（ｄ）１０μｍ〜１００μｍ、（ｅ）１０μｍ〜５０μｍ、若しくは（ｆ）約１００μｍの厚さを有する、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記キャリア液体が、水非混和性液体であり、任意に、
（ｉ）、前記水非混和性液体が、油、例えば、（ａ）炭化水素油、（ｂ）フルオロカーボン油、（ｃ）エステル油、（ｄ）水性相の生物学的成分に対して低い溶解度を有する油、（ｅ）微小液滴間の分子拡散を阻害する油、（ｆ）疎水性及び疎油性である油、（ｇ）気体への良好な溶解度を有する油、及び／又は（ｈ）それらの任意の２種以上の組み合わせから選択される油であり、並びに／或いは、
（ｉｉ）前記微小液滴が、前記微小液滴が水性分散相を構成し、前記キャリア液体が連続油相を構成しているＷ／Ｏエマルジョンに含まれている、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記キャリア液体が、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である、水性液体であり、並びに、
前記微小液滴が任意に、Ｗ／Ｏ／Ｗダブルエマルジョンに含まれ、ここで前記微小液滴が、（ａ）分散相としての油外殻で包まれた水性増殖培地の内核と、（ｂ）連続水性相としての前記キャリア液体とを含んでいる、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記微小液滴がエマルジョンに含まれ、ここで前記キャリア液体が連続相を構成し、前記微小液滴が分散相を構成し、前記エマルジョンがさらに界面活性剤及び任意選択で補助界面活性剤を含んでおり、任意に、
（ａ）前記界面活性剤及び／又は前記補助界面活性剤が、分散相と連続相との界面に位置しており、並びに／或いは、
（ｂ）前記微小液滴が、請求項６に記載のＷ／Ｏ／Ｗダブルエマルジョンに含まれ、前記界面活性剤及び／又は前記補助界面活性剤が、水性核と油殻との界面に位置しており、並びに／或いは、
（ｃ）前記界面活性剤及び／又は前記補助界面活性剤が、非イオン性頭部基を有するフルオロ界面活性剤を含んでおり、並びに／或いは、
（ｄ）前記界面活性剤及び／又は前記補助界面活性剤が、パーフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）を含んでおり、並びに／或いは、
（ｅ）前記界面活性剤及び／又は前記補助界面活性剤が、ＰＦＰＥ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ブロック共重合体を含んでおり、前記ＰＦＰＥ−ＰＥＧブロック共重合体が、例えば、ジブロック又はトリブロック共重合体、例えば、ＰＦＰＥ−ＰＥＧ−ＰＦＰＥトリブロック共重合体である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記微小液滴が、単分散されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（Ａ）前記共封入ステップ（ｃ）が、水非混和性液体に分散された水性増殖培地の微小液滴を含むＷ／Ｏ型シングルエマルジョンが形成される条件下、（ａ）変異産生体細胞のプール、（ｂ）標的細胞の集団、（ｃ）水性増殖培地、（ｄ）水非混和性液体、例えば請求項５に記載の油、及び（ｅ）界面活性剤、例えば、請求項７に記載の界面活性剤を混合することを含み、任意に、
前記インキュベーションステップ（ｄ）の後に、水性キャリア液体、例えば請求項６に記載の水性キャリア液体を、水非混和性液体で包まれ水性キャリア液体に分散された水性増殖培地の微小液滴を含むＷ／Ｏ／Ｗダブルエマルジョンが形成される条件下、ステップ（ｃ）のシングルエマルジョンと混合することを含み、
或いは
（Ｂ）前記共封入ステップ（ｃ）が、水非混和性液体で包まれ水性キャリア液体に分散された水性増殖培地の微小液滴を含むＷ／Ｏ／Ｗダブルエマルジョンが形成される条件下、（ａ）変異産生体細胞のプール、（ｂ）標的細胞の集団、（ｃ）水性増殖培地、（ｄ）水非混和性液体、例えば請求項５に記載の油、（ｅ）界面活性剤、例えば、請求項７に記載の界面活性剤、及び（ｆ）水性キャリア液体、例えば請求項６に記載の水性キャリア液体を混合することを含み、任意に、
前記混合が、（ａ）ボルテックス及び／若しくは（ｂ）超音波処理、（ｃ）均質化、（ｄ）ピコインジェクション及び／若しくは（ｅ）フロー集束を含み、並びに／又は、
前記共封入ステップ（ｃ）が、（１つ又は複数の）変異産生体細胞及び／若しくは標的細胞を含まない空の微小液滴を除去することをさらに含み、例えば、前記変異産生体細胞及び／若しくは前記標的細胞が蛍光標識され、空の微小液滴がＦＡＤＳによって除去される、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記インキュベーションステップ（ｄ）が、前記微小液滴ライブラリを１５℃〜９５℃の温度で少なくとも１時間維持することを含み、任意に、
（ａ）前記微小液滴ライブラリが、（ｉ）１５℃〜４２℃、（ｉｉ）２０℃〜４０℃、（ｉｉｉ）２０℃〜３７℃、（ｉｖ）２０℃〜３０℃、又は（ｖ）約２５℃、（ｖｉ）４０℃〜６０℃、（ｖｉｉ）６０℃〜８０℃、又は（ｖｉｉｉ）８０℃〜９８℃の温度で維持されており、
（ｂ）前記インキュベーションステップ（ｄ）が、前記微小液滴ライブラリを、前記温度で、約２、４、６、１２、２４若しくは４８時間、又は、最長７日間、例えば１、２、３、４、５、６若しくは７日間、維持することを含み、
（ｃ）前記インキュベーションステップ（ｄ）が、前記微小液滴ライブラリを、前記温度で、最長２週間、例えば、１週間又は２週間、維持することを含む、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）前記スクリーニングステップ（ｅ）が、（ｉ）標的細胞を含有する微小液滴を除去することを含み、任意に、前記標的細胞が蛍光標識され、前記標的細胞を含有する微小液滴がＦＡＤＳによって除去され、及び／又は、（ｉｉ）標的細胞が変異産生体細胞により増殖が追い越されているか又は圧倒されて消滅している微小液滴についてのＦＡＤＳ選別を含み、並びに／或いは、
（ｂ）前記方法が、前記インキュベーションステップ（ｄ）の間に実施される効力解析ステップであって、変異産生体細胞と標的細胞との共培養における相対増殖速度が決定されるステップをさらに含み、任意に、（ｉ）前記効力解析ステップが、変異産生体細胞のみを含有する微小液滴のＦＡＤＳによる選択を含み、例えば、２回以上の連続的ラウンドのＦＡＤＳ選択が、インキュベーションの間に実施され、及び／又は、（ｉｉ）前記標的細胞が蛍光標識され、前記標的細胞を含有する微小液滴が連続的にインキュベーションにかけられる、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（Ａ）前記産生体原核種が、古細菌から選択され、例えば、（ａ）クレン古細菌門、（ｂ）ユリ古細菌門、（ｃ）コル古細菌門、（ｄ）ナノ古細菌門、及び（ｅ）タウム古細菌門、例えばハロフェラックス・ボルカニ若しくはスルホロブスｓｐｐ．の門から選択され、及び／又は、
前記産生体原核種が、細菌から選択され、例えば、（ａ）放線菌類、（ｂ）シュードモナスｓｐｐ．、及び（ｃ）バチルスｓｐｐ．から選択され、任意に、ストレプトマイセスｓｐｐ．、例えば、ストレプトマイセス・セリカラー、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・ベネズエラ、ストレプトマイセス・グリセウス、ストレプトマイセス・エバミティリス、ストレプトマイセス・ビンチェンジェンシス、クツネリア・アルビダ、サッカロポリスポラ・エリスラエア、マイコバクテリウム・マリナム、バチルス・アミロリケファシエンス亜種プランタルム、及びミクロモノスポラ・エキノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）から選択され、並びに／或いは、
（Ｂ）前記標的細胞が、細菌又は真核細胞であり、任意に、真菌、哺乳動物、高等植物細胞、原生動物、蠕虫細胞、藻類、若しくは無脊椎動物細胞であり、例えば、がん細胞、例えば、ヒトがん細胞であり、又は、例えば、シュードモナス・エルギノーサ、アシネトバクター・バウマンニ、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニアエ、スタフィロコッカス・アウレウス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・ファエカリス、及びエンテロバクターｓｐｐ．から選択される病原性細菌である、
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（Ａ）ステップ（ｃ）の変異産生体細胞及び／若しくは（１つ又は複数の）標的細胞が、例えば蛍光標識で標識されており、及び／又は、前記スクリーニングステップ（ｅ）が、ＦＡＤＳを含み、並びに／或いは、
（Ｂ）前記変異産生体細胞のプールが、（ａ）少なくとも０．５×１０５変異体、例えば、少なくとも１×１０５変異体、（ｂ）少なくとも５×１０５変異体、（ｃ）少なくとも１×１０６変異体、（ｄ）０．５×１０６〜２×１０６変異体、（ｅ）約１×１０６変異体、又は（ｆ）最大１０×１０６変異体を含み、並びに／或いは、
（Ｃ）前記トランスポゾン変異生成ステップ（ｂ）が、（ａ）細菌ＤＮＡの５０塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾン、（ｂ）細菌ＤＮＡの３０塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾン、（ｃ）細菌ＤＮＡの２５塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾン、（ｄ）細菌ＤＮＡの１５塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾン、（ｅ）細菌ＤＮＡの１０塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾン、又は（ｆ）細菌ＤＮＡの５塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾンの挿入率を生じ、並びに／或いは、
（Ｄ）前記トランスポゾン変異生成ステップ（ｂ）が、ＴｎＡを、前記産生体細菌種の細胞の（ａ）染色体（ゲノム）ＤＮＡ、（ｂ）プラスミドＤＮＡ、又は（ｃ）染色体（ゲノム）及びプラスミドＤＮＡの混合物に挿入することを含み、並びに／或いは、
（Ｅ）ステップ（ｂ）のトランスポゾン変異がｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こり、並びに／或いは、
（Ｆ）前記細胞毒性剤が、（ａ）抗生物質、（ｂ）抗悪性腫瘍剤、及び（ｃ）抗真菌剤から選択され、並びに／或いは、
（Ｇ）ステップ（ｂ）において、前記産生体原核種の細胞ＤＮＡへのＴｎＡ挿入が、
（ａ）潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくはオペロンの上流で起こり、そこでＴｎＡＰが、転写増加を駆動し、延いては前記潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくは前記オペロンの発現を導く、
（ｂ）潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくはオペロンの活性化因子の上流で起こり、そこでＴｎＡＰが、トランスに作用する活性化因子の転写増加を駆動し、前記潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくは前記オペロンの発現を増加させる、
（ｃ）潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくはオペロンの抑制因子を挿入により不活性化し、それにより前記潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくは前記オペロンの発現を増加させる、
（ｄ）細胞毒性剤合成に関与する酵素の上流で起こり、そこでＴｎＡＰが前記酵素の転写増加を駆動し、延いては前記酵素の発現増加を導く、
（ｅ）細胞毒性剤が基質となる酵素を挿入により不活性化し、それにより、前記細胞毒性剤のレベルを増加させる、
（ｆ）細胞毒性剤を副活性として生じる酵素の上流で起こり、そこでＴｎＡＰが転写増加を駆動し、延いては前記酵素の発現増加を導き、それにより、副活性を増加させて、前記細胞毒性剤のレベルを増加させる、
（ｇ）マルチドメイン酵素の１つ若しくは複数のドメインを挿入により不活性化し、それによりその機能を変化させて、直接的に若しくは間接的に、細胞毒性剤を合成する、
（ｈ）マルチドメイン酵素の１つ若しくは複数のドメインの上流で起こり、そこで、ＴｎＡＰが、前記１つ若しくは複数のドメインの転写増加を駆動し、それにより、前記酵素の機能を変化させて、直接的に若しくは間接的に細胞毒性剤を合成する、又は
（ｉ）コーディングレパートリーを変化させて、細胞毒性剤を直接的に若しくは間接的に発現させる、
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞毒性剤を特定する方法であって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法により、標的細胞に対して活性な細胞毒性剤の産生体を特定するために変異細菌をスクリーニングすることを含む方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法を含み、任意に、前記細胞毒性剤を、変異細菌から合成又は単離することをさらに含み、そして任意に、合成された又は単離された前記細胞毒性剤を、薬学的に許容される賦形剤と混合して、医薬組成物を製造することをさらに含む、細胞毒性剤を産生するためのプロセス。