(57)【要約】  本発明は、培養血小板の機能劣化を抑制しながら、培養血小板を含有する培養血小板浮遊液から効率的に除水し、濃縮することを可能とする中空糸膜モジュールを提供することを目的とする。本発明は、表面に存在する孔の平均孔径が２μｍ以下の中空糸膜が、中空糸膜の内部へ濃縮前の培養血小板懸濁液を供給するための流入口を少なくとも一つ有するケーシングに複数本充填されてなる培養血小板濃縮モジュールであって、複数本の中空糸膜の総断面積（Ｘ）を前記流入口の総断面積（Ｙ１）で除した値（Ｘ／Ｙ１）が４．０以下である培養血小板濃縮モジュールである。
2018062073.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に存在する孔の平均孔径が２μｍ以下の中空糸膜が、前記中空糸膜の内部へ濃縮前の培養血小板懸濁液を供給するための流入口を少なくとも一つ有するケーシングに複数本充填されてなる培養血小板濃縮モジュールであって、前記複数本の中空糸膜の総断面積（Ｘ）を前記流入口の総断面積（Ｙ１）で除した値（Ｘ／Ｙ１）が４．０以下である培養血小板濃縮モジュール。
【請求項２】
前記ケーシングは、前記中空糸膜の内部を通過した濃縮後の培養血小板懸濁液を流出させるための流出口を少なくとも一つ有するとともに、前記複数本の中空糸膜の総断面積（Ｘ）を前記流出口の総断面積（Ｙ２）で除した値（Ｘ／Ｙ２）が４．０以下である、請求項１に記載の培養血小板濃縮モジュール。
【請求項３】
前記複数の中空糸膜の総断面積（Ｘ）を前記複数の中空糸膜の総膜面積（Ｚ）で除した値（Ｘ／Ｚ）が０．０００４以下である、請求項１または２に記載の培養血小板濃縮モジュール。
【請求項４】
流入口から流出口へ２Ｌ／ｍｉｎの流量で液を供給した場合の圧力損失が１０ｋＰａ以下である、請求項１〜３のいずれかに記載の培養血小板濃縮モジュール。
【請求項５】
前記中空糸膜の総膜面積（Ｚ）が０．１ｍ２以上１ｍ２以下である、請求項１〜４のいずれかに記載の培養血小板濃縮モジュール。
【請求項６】
前記中空糸膜の内表面に親水性高分子が担持されてなる、請求項１〜５のいずれかに記載の培養血小板濃縮モジュール。
【請求項７】
前記親水性高分子が、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ビニルピロリドンと酢酸ビニルの共重合体、および酢酸ビニルとビニルカプロラクタムの共重合体からなる群より選択される１または２以上の高分子である、請求項６に記載の培養血小板濃縮モジュール。
【請求項８】
前記中空糸膜の透水性が３０ｍＬ／ｈｒ／Ｐａ／ｍ２以上である、請求項１〜７のいずれかに記載の培養血小板濃縮モジュール
【請求項９】
前記中空糸膜がポリスルホン系中空糸膜である、請求項１〜８のいずれかに記載の培養血小板濃縮モジュール。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の培養血小板濃縮モジュールを用いて培養血小板を濃縮する工程を含む血小板製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養血小板濃縮モジュールおよびそれを用いた血小板製剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
輸血に用いられる血小板製剤は現在すべて献血により採取された血液成分から製造されている。しかし、高齢社会到来によるドナー不足の懸念から献血に依存しない培養血小板の製剤製造に関する研究開発が進められている。培養血小板を得る方法として、例えば骨髄や臍帯血由来の造血幹細胞から血小板を産生する培養法（非特許文献１）や多能性幹細胞から血小板を産生する培養法がある（非特許文献２）。いずれの手法でも、一回の輸血に必要な血小板個数が約二千億個と莫大であるため、数十リットルから数百リットル規模での培養が必須である。それに対して一回の輸血に投与する輸液量は数百ミリリットルであるため、培養血小板製剤の製造には培養血小板の濃縮工程が必須となる。なお、本明細書において「培養血小板」とは、生体外での培養工程を含む製造工程により作製された血小板を指す。【０００３】
現在、全血由来の血小板の濃縮には、主に遠心法も用いられているが、培養血小板を濃縮する場合のように大量の液体を処理する必要がある際には、処理時間が長くなり、遠心の負荷により血小板の機能が劣化しやすくなるため、事実上適用することができない。【０００４】
一方、従来から、赤血球と血漿との分離には、中空糸膜モジュールを用いる方法が用いられてきた（特許文献１及び２）。このような方法に適用する中空糸膜としては、目詰まり汚れが生じにくいポリスルホン系樹脂の多孔質膜（特許文献３）やポリスルホン系ポリマーおよび親水性高分子からなる原液を紡糸することで耐久性を向上させた膜（特許文献４）といった改良技術も開発されている。さらに、献血由来の血小板浮遊液から血漿成分を浄化する技術も開発されている（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】日本国特開昭６２−２９０４６９号公報
【特許文献２】日本国特開昭５４−１５４７６号公報
【特許文献３】日本国特開昭６１−２３８８３４号公報
【特許文献４】日本国特開２０００−３３４２７７号公報
【特許文献５】日本国特開２０１２−１４３５５４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＢＬＯＯＤ，  １  ＪＵＮＥ  １９９３    ＶＯＬ．  ８１，  Ｎｏ．  １１  ｐ２８４４−２８５３
【非特許文献２】ＢＬＯＯＤ，  １  ＪＵＮＥ  ２００８    ＶＯＬ．  １１１，  Ｎｏ．  １１  ｐ５２９８−５３０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、培養血小板の濃縮工程において、中空糸膜を用いて培養液を除液して濃縮する方法が考えられる。中空糸膜は、処理する液体の量に応じて、モジュール内に収容する中空糸膜の数や長さを容易に調整することができるため、大量処理への対応が可能となる。【０００８】
しかし、培養血小板は、血小板の保存に適さない培養環境に長時間さらされており、採血後短時間で製造され適切な環境で保存される献血血小板よりも劣化しやすい。そのため、中空糸膜を用いて培養液を除液する際に培養血小板が壊れて機能が劣化することが問題となっている。【０００９】
本発明は、培養血小板の機能劣化を抑制しながら、培養血小板を含有する培養血小板浮遊液から効率的に除水し、濃縮することを可能とする中空糸膜モジュールを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、表面に存在する孔の平均孔径が２μｍ以下の中空糸膜が、中空糸膜の内部へ濃縮前の培養血小板懸濁液を供給するための流入口を少なくとも一つ有するケーシングに複数本充填されてなる培養血小板濃縮モジュールであって、複数本の中空糸膜の総断面積（Ｘ）を前記流入口の総断面積（Ｙ１）で除した値（Ｘ／Ｙ１）が４．０以下である培養血小板濃縮モジュール、および当該モジュールを用いて培養血小板を濃縮する工程を含む血小板製剤の製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、培養血小板を劣化させることなく、培養血小板浮遊液から液体を除去することができ、高い品質を維持しながら効率よく培養血小板浮遊液を濃縮することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の培養血小板濃縮モジュールを用いた濃縮装置の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の培養血小板濃縮モジュールについて説明する。一部、図面を参照して本発明の実施形態を説明する場合があるが、本発明は図示された実施態様に限定されるものではない。
【００１４】
本発明の培養血小板濃縮モジュール（以下、単に「モジュール」という場合がある。）に充填される中空糸膜は、ヒト血小板の大きさが３〜４μｍであることから、その表面に存在する孔の平均孔径（以下、単に「平均孔径」という場合がある）を２μｍ以下とする。ここで、中空糸膜の「表面」とは、ストロー状に成形された中空糸膜の外側の表面である「外表面」、およびストロー状の中空糸膜の内側の表面である「内表面」の双方を指すものとする。ヒト血小板に比べて上記の平均孔径が大きい場合には、血小板が中空糸膜の孔内部へ侵入し目詰まりが生じて、除水効率が低下するばかりか、モジュールを通過する血小板が減少し、回収率が著しく低下してしまう。また、上記の平均孔径がヒト血小板と同等の場合には、血小板が中空糸膜の内表面に存在する孔を閉塞することから、やはり除水効率が低下するばかりか、閉塞を除去しようとすれば血小板の劣化につながりかねない。平均孔径が２μｍ以下であれば、中空糸膜の表面にケーク層が積層し除水効率が低下するものの、このようなケーク層は血小板を劣化することなく除去できる場合が多い。
【００１５】
本発明の培養血小板濃縮モジュールは、このような中空糸膜がケーシングに複数本充填されてなる。ケーシングは、中空糸膜の内側へ液を供給するための流入口と、前記中空糸膜の内側から液を流出させるための流出口を少なくとも一つずつ有する。そして、中空糸膜の総断面積（Ｘ）を流入口の総断面積（Ｙ１）で除した値（Ｘ／Ｙ１）が４．０以下となるようにする。好ましくは、中空糸膜の総断面積（Ｘ）を流出口の総断面積（Ｙ２）で除した値（Ｘ／Ｙ２）も４．０以下となるようにする。
【００１６】
図１に示す中空糸膜モジュールは、筒状のケーシング５１と、ケーシング５１の両端に接続固定されたヘッダー５２及び５３とを有し、ヘッダー５２の頂部には、中空糸膜の内部へ濃縮前の培養血小板浮遊液を供給するための流入口４１が突出して形成されており、ヘッダー５３の頂部には、中空糸膜の内部を通過した濃縮後の培養血小板浮遊液を流出させるための流出口４２が突出して形成されている。さらに、ケーシング５１の側部には、中空糸膜の内部から中空糸膜表面の孔を通過して中空糸膜の外部に滲出した廃液を排出するための排出口４３が形成されている。
【００１７】
複数本の中空糸膜は、筒状のケーシング５１内の長軸方向の全長にわたって束状に配置されている。中空糸膜の両端部は、中空糸膜の内腔が閉塞されないようにして、硬化したポッティング剤によって形成されたヘッダー５２側の隔壁及びヘッダー５３側の隔壁により、ケーシング５１の内周面に固定されている。特に限定されないが、モジュール内に保持される中空糸膜は、前述の通り濃縮するための血小板浮遊液が数十リットル〜数百リットルに上るため、４００本以上であることが好ましく、１０００本以上であることがより好ましく、２５００本以上であることがさらに好ましく、４０００本以上であることが一層好ましい。
【００１８】
中空糸膜の断面積とは、ストロー状の中空糸膜を輪切りにした際の内円の面積であり、下記の式により算出される。
中空糸膜断面積＝π（中空糸膜内径／２）２  （π＝円周率）
ここで、中空糸膜内径は、モジュール内でランダムに選別した１６本の中空糸膜の膜厚をマイクロウォッチャーの１０００倍レンズ（例えば、ＶＨ−Ｚ１００；株式会社ＫＥＹＥＮＣＥ）で測定して平均値を求め、以下の式より算出した値をいう。なお、中空糸膜外径とは、ランダムに選別した１６本の中空糸膜の外径をレーザー変位計（例えば、ＬＳ５０４０Ｔ；株式会社ＫＥＹＥＮＣＥ）で測定して求めた平均値をいう。
中空糸膜内径＝中空糸膜外径−２×膜厚の平均値
中空糸膜の総断面積（Ｘ）とは、モジュールを中空糸膜の繊維軸方向と垂直な方向で切断した断面に表れる複数本の中空糸膜の断面積の総和である。
【００１９】
流入口の断面積、流出口の断面積とは、流入口または流出口の最狭窄部分を流れ方向に対して垂直に切断した断面の面積であり、例えば流入口または流出口が円筒であれば、円筒の内径から算出される円の面積である。流入口の総断面積（Ｙ１）または流出口の総断面積（Ｙ２）とは、流入口または流出口が１つの場合はその流入口の断面積であり、複数の場合は各流入口または流出口の断面積の総和である。
【００２０】
培養血小板は献血血小板よりも圧力変化に弱く、中空糸膜の総断面積と流入口または流出口の総断面積の差が大きいと、工程中の圧力変化が大きくなり劣化しやすい。そのため、中空糸膜の総断面積（Ｘ）を流入口の総断面積（Ｙ１）で除した値（Ｘ／Ｙ１）は４．０以下が好ましく、２．０以下であることがより好ましく、０．８以上１．２以下が最も好ましい。また同様に、中空糸膜の総断面積（Ｘ）を流出口の総断面積（Ｙ２）で除した値（Ｘ／Ｙ２）は４．０以下が好ましく、２．０以下であることがより好ましく、０．８以上１．２以下が最も好ましい。
【００２１】
また、本発明のモジュールにおいては、モジュールに含まれる中空糸膜の総膜面積が０．１ｍ２以上１ｍ２以下であることが好ましい。
【００２２】
中空糸膜の総膜面積（Ｚ）は、中空糸膜の内側の表面の面積であり、下記式で求められる。
中空糸膜の内表面面積＝π×中空糸膜内径×有効長
ここで、有効長とは、中空糸膜モジュールに充填された中空糸膜の全長からポッティング材が付着している部分を除いた部分の長さ、すなわち実際に血小板の濃縮に機能し得る部分の長さである。中空糸膜の総膜面積（Ｚ）とは、モジュールに充填された中空糸膜の内表面面積の総和であり、中空糸膜が均一である場合には、下記式によって算出される。
中空糸膜の総膜面積＝中空糸膜の内表面面積×本数
中空糸膜の総膜面積（Ｚ）に対して処理する血小板数が増えると、膜表面へ堆積するケーク層が厚くなり、血小板を劣化させやすい。モジュールに充填する中空糸膜の総膜面積（Ｚ）は０．１ｍ２以上であることが好ましい。一方、ケーク層が膜表面に広く積層して血小板の回収率が低減することを防ぐため、中空糸膜の総膜面積は１．０ｍ２以下であることが好ましい。
【００２３】
中空糸膜の総断面積（Ｘ）は、中空糸膜内側を通過する液の線速度（膜腔内通過線速度）に対し、また中空糸膜の総膜面積（Ｚ）は中空糸膜の内側から外側に液が通過する線速度（膜面通過線速度）に対し、以下の式のように影響している。
膜腔内通過線速度＝流入流量÷中空糸膜総断面積（Ｘ）
膜面通過線速度＝排出流量÷中空糸膜総膜面積（Ｚ）
膜腔内通過線速度が小さい場合には血小板が中空糸膜表面に積層したケーク層が形成しやすくなり、モジュールの機能が劣化する傾向がある。ケーク層を形成した分モジュールを通過して回収できる血小板数が減少し、さらにケーク層を形成するのは正常な血小板であるため、回収される血小板は相対的に機能が劣化した血小板が多くなってしまう。膜腔内通過線速度を大きくするために流入流量を増やすもしくは中空糸膜総断面積（Ｘ）を小さくすると圧力変化が大きくなり血小板が劣化しやすい。そのため中空糸膜の総断面積が２ｃｍ２以上１０ｃｍ２以下であることが好ましく、２ｃｍ２以上５ｃｍ２以下であることがより好ましい。
【００２４】
膜面通過線速度が膜腔内通過線速度に対して大きくなると、血小板が中空糸膜表面に積層してケーク層を形成しやすくなり、モジュールの機能が劣化するとともに、モジュールを通過して回収できる血小板数が減少する傾向がある。さらに、中空糸膜表面にケーク層を形成するのは主として正常な血小板、すなわちアネキシン陰性の血小板であるため、回収される血小板は相対的に機能が劣化した血小板、すなわちアネキシン陽性の血小板が多くなってしまう。膜腔内通過線速度と膜面通過線速度を調整するのに流入流量と排出流量を増減させることもできるが、その場合十分な濃縮率を達成しにくくなってしまう。そのため、中空糸膜の総断面積（Ｘ）を中空糸膜の総膜面積（Ｚ）で除した値（Ｘ／Ｚ）が０．０００５以下であることが好ましく、０．０００４以下であることがより好ましい。
【００２５】
本発明の培養血小板用濃縮モジュールに用いる中空糸膜は、透水性が３０ｍＬ／ｈｒ／Ｐａ／ｍ２以上であることが好ましい。中空糸膜の透水性が３０ｍＬ／ｈｒ／Ｐａ／ｍ２未満の場合には、除水効率が低下する場合や、血小板の活性化が起こりやすくなる場合がある。
【００２６】
本発明の培養血小板用濃縮モジュールに用いる中空糸膜は、ポリスルホン系中空糸膜であることが好ましい。「ポリスルホン系中空糸膜」とは、ポリスルホン系ポリマーを主たる原料（全原料のうち５０質量％以上を占める原料）として製膜した中空糸膜をいう。ここで「ポリスルホン系ポリマー」とは、その主鎖に芳香環、スルフォニル基及びエーテル基を有するポリマーをいう。
【００２７】
ポリスルホン系ポリマーとしては、例えば、下記一般式（Ｉ）で示されるポリスルホン、下記一般式（ＩＩ）で示されるポリスルホン、ポリエーテルスルホン又はポリアリルエーテルスルホン等が挙げられるが、一般式（Ｉ）で示されるポリスルホン又は一般式（ＩＩ）で示されるポリスルホンが好ましく、中でもｎ数が５０〜８０であるものがより好ましい。なお、一般式（Ｉ）で示されるポリスルホン等と、他のモノマーとのブロック共重合体や、一般式（Ｉ）で示されるポリスルホン等の変性体も「ポリスルホン系ポリマー」に包含される。一般式（Ｉ）で示されるポリスルホン等と、他のモノマーとのブロック共重合体における「他のモノマー」由来の構造は、ブロック共重合体全体に対して１０質量％以下であることが好ましい。
【００２８】
【化１】
2018062073.tif 000003
【００２９】
【化２】
2018062073.tif 000004
【００３０】
より具体的なポリスルホンとしては、例えば、ユーデル（登録商標）ポリスルホンＰ−１７００、Ｐ−３５００（ソルベイ社製）、ウルトラソンＳ３０１０、Ｓ６０１０（ＢＡＳＦ社）、レーデルＡ（ソルベイ社）、ウルトラソンＥ（ＢＡＳＦ社）が挙げられる。
【００３１】
本発明の培養血小板用濃縮モジュールに用いる中空糸膜は、内表面に親水性高分子が担持されたものであることが好ましい。中空糸膜の内表面に親水性成分が担持されている、とは、親水性高分子が中空糸膜の内表面に共有結合している場合に限られず、何らかの形で中空糸膜の内表面に固定されている状態を指す。
【００３２】
親水性高分子とは、水溶性の高分子化合物であるか、又は非水溶性であっても静電相互作用や水素結合により水分子と相互作用する高分子をいう。親水性高分子としては、例えば、メタクリル酸、アクリル酸、イタコン酸、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシプロピルアクリレート、グリセロールメタクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ジメチルアミノエチルメタクリレート、メチレンビスアクリルアミド、ダイアセトンアクリルアミド、ビニルピロリドン、ビニルアルコール、エチレングリコール若しくはプロピレングリコールをモノマーとする単独重合体又はこれら化合物の少なくとも一つをモノマーとして含む共重合体が挙げられるが、ビニルピロリドンの重合体であるポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ビニルピロリドンと酢酸ビニルの共重合体、および酢酸ビニルとビニルカプロラクタムの共重合体が好ましい。
【００３３】
中空糸膜の内表面における親水性高分子の存在率は、３０〜６０％であることが好ましい。中空糸膜の内表面における親水性高分子の存在率は、中空糸膜の内表面をＸ線光電子分析（ＸＰＳ）により測定して得た疎水性高分子特異的原子の測定値と親水性高分子特異的原子の測定値によって求めることができる。
【００３４】
例えば、疎水性高分子がポリスルホンであり、親水性高分子がポリビニルピロリドンである場合、親水性高分子の存在率は中空糸膜内表面のビニルピロリドン単位の含有率（ＲＶＰ）（質量％）として測定できる。つまり、ビニルピロリドン単位由来の窒素量の測定値（ＲＮ）（原子数％）とポリスルホンのスルホン基由来の硫黄量の測定値（ＲＳ）（原子数％）から、次の式により中空糸膜内表面でのＲＶＰ（質量％）を算出できる。ここで、１１１はビニルピロリドン単位の分子量であり、４４２はポリスルホンを構成する繰り返し単位の分子量である。
ＲＶＰ＝（ＲＮ×１１１）／（ＲＮ×１１１＋ＲＳ×４４２）×１００
特異的原子がない場合にはＸＰＳにより測定した官能基の測定値からも算出できる。例えば、親水性高分子がビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体である場合は、下記のように求めることができる。ビニルピロリドン単位の分子量は１１１、ポリスルホンを構成する繰り返し単位の分子量は４４２、酢酸ビニル単位の分子量は８６である。表面の酢酸ビニル単位の含有率（ＲＶＡ）（質量％）は、窒素量（ＲＮ）（原子数％）と硫黄量（ＲＳ）（原子数％）、エステル基由来の炭素量（ＲＣｏｏ）（原子数％）の値から、下式より算出される。
中空糸膜表面の酢酸ビニルの含有率（ＲＶＡ）（質量％）
＝（ＲＣｏｏ×８６）／（ＲＮ×１１１＋ＲＳ×４４２＋ＲＣｏｏ×８６）×１００
また、中空糸膜表面のビニルピロリドン単位の含有率（ＲＶＰ）（質量％）は、下式より算出される。
【００３５】
ＲＶＰ＝（ＲＮ×１１１）／（ＲＮ×１１１＋ＲＳ×４４２＋ＲＣｏｏ×８６）×１００
そして、中空糸膜内表面のビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体の存在率は、ビニルピロリドン含有率（ＲＶＰ）と酢酸ビニル含有率（ＲＶＡ）の和として算出できる。
中空糸膜内表面の親水性基含有高分子の存在率（質量％）＝ＲＶＰ＋ＲＶＡ
中空糸膜の内表面における親水性高分子の存在率が３０質量％以上であれば、中空糸膜の内表面に付着した血小板の剥離が容易になる。中空糸膜の内表面における親水性高分子の存在率は３５質量％がより好ましい。一方、中空糸膜の内表面における親水性高分子の存在率が６０質量％以下であると、親水性高分子が過剰に存在することで中空糸膜の内表面で膨潤が生じ、濾過抵抗が大きくなるのを防止することができる。
【００３６】
中空糸膜の内表面に親水性成分を担持させる方法としては、例えば、物理的吸着によってコーティングする方法、熱もしくは放射線によって親水性高分子を中空糸膜と中空糸膜とを架橋する方法、および化学反応によって親水性高分子と中空糸膜との間に化学結合を形成させる方法が挙げられる。
【００３７】
中空糸膜の製膜時には二重環状口金から製膜原液を吐出する際に内側に注入液を流すが、この注入液に親水性高分子を添加しておくと、中空糸膜が相分離して膜構造が決定する前に注入液中の親水性高分子が製膜原液側に拡散するため、効率的に中空糸膜の内表面に親水性高分子を付着させることができる。この方法により中空糸膜の内表面に親水性高分子を付着させた状態で、前述の熱処理、放射線処理、化学反応等を行うことにより、親水性高分子を中空糸膜の内表面に容易に固定することができる。
【００３８】
本発明の培養血小板用濃縮モジュールは、濃縮前の培養血小板浮遊液（処理前液）のモジュールの通過によるアネキシン陽性化率が２０％以下であることが好ましい。アネキシン陽性化とは、培養血小板浮遊液がモジュールを通過する間に、そこに含まれる培養血小板の細胞表面にホスファチジルセリンが出現し、モジュールの通過後アネキシンによって検出されるようになることを意味し、モジュール通過前後のアネキシン陽性率の差分がアネキシン陽性化率である。アネキシン陽性率が高い血小板浮遊液は、輸血した場合に血栓形成の促進や循環時間の短縮が起こることが報告されており、直接製剤製造に用いることができない。モジュールのアネキシン陽性化率は５％以下であることがより好ましく、２％以下であることがさらに好ましい。
【００３９】
培養血小板は圧力変化によって劣化するため、本発明の培養血小板濃縮モジュールは、流入口から流出口へ２Ｌ／ｍｉｎの流量で液を供給した場合の圧力損失が１０ｋＰａ以下であることが好ましい。モジュールの圧力損失とは、モジュールの流入口と流出口で測定される圧力差であり、以下のようにして測定することができる。モジュールの流入口の直前と流出口の直後に、流れ方向に対して垂直に分岐させた回路を設け、その先に圧力計を設置する。そして、ローラーポンプ等を使用して流量２Ｌ／ｍｉｎでモジュールに処理前液を流すとともに、流入口側の圧力および流出口側の圧力を測定し、下記式から圧力損失を求める。
圧力損失＝流入口側の圧力−流出口側の圧力
モジュールの圧力損失は、５ｋＰａ以下であることがより好ましい。
【００４０】
本発明の培養血小板濃縮モジュールの流入口から培養血小板を含む培養液を流入させ、中空糸膜の外側の排出口から液体を排出するクロスフローを行うことで、濃縮された血小板浮遊液を製造することができる。クロスフローにおいては、モジュールへ供給する処理前液の流量とモジュールから排出される廃液の流量によって濃縮率を決定することができる。例えば、培養血小板浮遊液を５倍に濃縮し、血小板回収率を８０％以上にするには、総膜面積が１ｍ２の中空糸膜が収容された濃縮モジュールの場合、供給流量液と排出流量をそれぞれ１Ｌ／ｍｉｎと８００ｍｌ／ｍｉｎにすることが好ましく、５００ｍＬ／ｍｉｎと４００ｍＬ／ｍｉｎにすることがより好ましい。そして、濃縮後の培養血小板浮遊液の液体成分を遠心などによって保存液に置換することで血小板製剤を製造することができる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４２】
［測定例１：平均孔径］
「表面に存在する孔の平均孔径」は、以下の方法により測定及び算出した。まず、電界放射型走査型電子顕微鏡（例えば、Ｓ−８００；日立製作所）で中空糸膜の表面の１０００倍画像を撮影した。次に、Ｍａｔｒｏｘ  Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ２．２（Ｍａｔｒｏｘ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ．）で、孔の部分を白く、それ以外の部分を黒く反転させる画像処理を行い、白い孔の個数（以下、「総開孔数」）及び白い孔の部分のピクセル数の総和（以下、「総開孔面積」）を求め、以下の式１により、画像１枚当たりの平均孔径を算出した。これらの測定作業を中空糸５本につきそれぞれランダムに１０箇所ずつ、計５０回繰り返し、全５０枚の画像についての平均値を「表面に存在する孔の平均孔径」とした。なお、上記の１０００倍画像の撮影条件は以下のとおりであった。
［撮影条件］
画像サイズ  ：  ６５５×７４０ピクセル
画像解像度  ：  ０．１４０８４５μｍ／ピクセル
画像面積Ｓ  ：  ９６１５．２μｍ２（縦９２．３μｍ×横１０４．２μｍ角）
平均孔径（μｍ）＝総開孔面積／総開孔数  ・・・・式１
［測定例２：透水性］
中空糸膜の透水性は、以下の方法により測定及び算出した。まず、プラスチック管に中空糸膜を挿入し、中空糸膜の両端をプラスチック管両端部の内壁に接着固定して、有効長１０ｃｍのモジュールを作成した。次に、中空糸膜の外側から１．３×１０４Ｐａの水圧をかけ、中空糸膜の内側に流出してくる単位時間当たりの水の量を測定し、下記式より算出した。
透水性（ｍＬ／ｈｒ／Ｐａ／ｍ２）＝ＱＷ／（Ｔ×Ｐ×Ａ）
ＱＷ  ：  中空糸膜の内側に流出した水の量（ｍＬ）
Ｔ    ：  水圧をかけた時間（ｈｒ）
Ｐ    ：  水圧（Ｐａ）
Ａ    ：  中空糸膜の外表面の面積（ｍ２）
［測定例３：親水性高分子の存在率］
Ｘ線電子分光法（ＸＰＳ）を用いて、ＲＮ、ＲＳ、Ｒｃｏｏをそれぞれ測定した。測定角９０°で測定し、表面からの深さが約１０ｎｍまでの領域が検出された。また、測定値は３箇所の平均値を用いた。【００４３】
エステル基の測定値Ｒｃｏｏは下記のように測定した。エステル基由来の炭素量を、エステル基（ＣＯＯ）由来の炭素ピークはＣ１ｓのＣＨやＣ−Ｃ由来のメインピークから＋４．０〜４．２ｅＶに現れるピークをピーク分割することによって求めた。全元素に対する該ピーク面積の割合を算出することで、エステル基由来の炭素量（原子数％）が求まる。より具体的には、Ｃ１ｓには、主にＣＨｘ、Ｃ−Ｃ、Ｃ＝Ｃ、Ｃ−Ｓ由来の成分、主にＣ−Ｏ、Ｃ−Ｎ由来の成分、π―π＊サテライト由来の成分、Ｃ＝Ｏ由来の成分、ＣＯＯ由来の成分の５つの成分から構成される。したがって、５つの成分でピーク分割を行う。ＣＯＯ由来の成分は、ＣＨｘやＣ−Ｃのメインピーク（２８５ｅＶ付近）から＋４．０〜４．２ｅＶに現れるピークである。この各成分のピーク面積比は、小数点第１桁目を四捨五入し、算出した。Ｃ１ｓの炭素量（原子数％）から、ＣＯＯ由来の成分のピーク面積比を乗ずることで求めた。ピーク分割の結果、０．４％以下となるものは検出限界以下として切り捨てた。【００４４】
中空糸膜内表面の親水性ポリマー量は、ＸＰＳから得られた測定値から前述の計算式により算出した。【００４５】
［測定例４：圧力損失］
図１に示すように、流入口４１にローラーポンプ２１と圧力計３１を接続し、ローラーポンプ２１の先には供給バッグ１１を接続した。濾液の排出口４３にローラーポンプ２２を備えた流路を接続し、その先に廃液バッグ１３を接続した。また、流出口４２に、圧力計３２と回収バック１２を接続した。【００４６】
次に、中空糸膜モジュール５１の内部の空気を除去するため、供給バッグ１１にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を入れ、ローラーポンプ２１によって２Ｌ／ｍｉｎの流量で流出口４２から気泡が出なくなるまで送液し、プライミングを行った。その後、圧力計３１および３２が示す数値から、モジュールの圧力損失を算出した。【００４７】
［測定例５：ＰＡＣ−１反応率］
測定検体を二つに分け、それぞれ抗ＣＤ４２ａ抗体、抗ＣＤ４２ｂ抗体、抗ＣＤ６２Ｐ抗体およびＰＡＣ−１と混合したサンプル（以下サンプルＡ）と、サンプルＡに終濃度０．２μＭとなるようＰＭＡを添加したサンプル（以下サンプルＢ）を用意した。まず、サンプルＡを用いて、フローサイトメーターで散乱光パターンによるゲートに加えて、ＣＤ４１ａとＣＤ４２ｂの蛍光標識を用いて、共陽性領域を血小板のゲートとした。次にゲートされた血小板分画をＰＡＣ−１の蛍光標識と抗ＣＤ６２Ｐの蛍光標識で展開し、陰性と陽性が１００％と０％となるぎりぎりにそれぞれ陽性ゲートを設定した。この設定を固定したまま、サンプルＡの代わりにサンプルＢを測定し、ＰＡＣ−１と抗ＣＤ６２Ｐ抗体の双方の陽性ゲート中に測定された血小板の割合をＰＡＣ−１反応率とした。【００４８】
［測定例６：アネキシン陽性率、血小板総数］
アネキシン陽性率は、フローサイトメーター（例えば、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて以下のように測定した。まず、モジュールに流入させる前の血小板浮遊液をサンプリングし、測定検体（処理前）とする。次にモジュールの流入口からローラーポンプ等によって、２Ｌ／ｍｉｎで血小板浮遊液を流入させてモジュールを通過させ、流出口から流出した血小板浮遊液をサンプリングし測定検体（処理後）とする。測定検体をそれぞれ抗ＣＤ４１ａ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  ５５５４６７）および抗ＣＤ４２ｂ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  ５５５４７３）と混合したサンプル（以下サンプルＡ）と、サンプルＡにさらにＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ，  ５６０５０６）とＡｎｎｅｘｉｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  ５５６４５４）を混合したサンプル（以下サンプルＢ）を用意する。サンプルが濃い場合には前記Ａｎｎｅｘｉｎ  ｂｕｆｆｅｒで適当な希釈率で希釈してもよい。フローサイトメーターの測定においては、まず、サンプルＡを用いて、フローサイトメーターで散乱光パターンによるゲートに加えて、ＣＤ４１ａとＣＤ４２ｂの蛍光標識を用いて、共陽性領域を血小板のゲートとした。血小板ゲート内に測定された数から下記式によって血小板総数を算出することができる。
血小板総数（個）＝血小板ゲート内測定値（個）÷測定容量（Ｌ）×希釈率×血小板浮遊液の容量（Ｌ）
次にゲートされた血小板分画をＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖの蛍光標識で展開し、陰性と陽性が１００％と０％となる境界に陽性ゲートを設定する。この設定を固定したまま、サンプルＡの代わりにサンプルＢを測定し、陽性ゲート中に測定された血小板の割合を各検体のアネキシン陽性率とした。【００４９】
［測定例７：アネキシン陽性化率、血小板回収率］
１６Ｌの培養血小板を含む培養液にＡＣＤ−Ａ液（テルモ）を１０％添加した血小板浮遊液を測定検体（処理前液）とし、処理前液中の血小板数、アネキシン陽性率およびＰＡＣ−１反応率を測定した。【００５０】
測定例４のようにプライミングを行った後、供給バッグ１１の中身を血小板浮遊液（処理前液）に変更し、回収バッグ１２も空にした。そして、ローラーポンプ２１を５００ｍＬ／ｍｉｎ、ローラーポンプ２２を４００ｍＬ／ｍｉｎで同時に送液を開始し、血小板浮遊液を濃縮した。供給バッグ１１内の血小板培養浮遊液（処理前液）がなくなった後、両方のポンプを止め、供給バッグ１１に再びＰＢＳを添加し、ローラーポンプ２１を５００ｍＬ／ｍｉｎの流量で１分間送液した。【００５１】
送液終了後、回収バッグ１２の端部を封じて回路から切り離した。数回転倒混和した後に、回収バッグ１２から処理後液をサンプリングし、測定検体（処理後液）として血小板数、アネキシン陽性率およびＰＡＣ−１反応率を測定した。【００５２】
アネキシン陽性化率は、測定検体（処理後液）のアネキシン陽性率から測定検体（処理前液）のアネキシン陽性率を引くことにより求めた。【００５３】
また、濃縮前の血小板総数を１００％とした場合の濃縮後の血小板総数の割合を血小板回収率として算出した。【００５４】
［実施例１］
１５質量部のユーデル（登録商標）ポリスルホン（Ｐ３５００；ソルベイ社）、８質量部のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（Ｋ９０；ＩＳＰ社）、７５質量部のジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）及び２質量部の水からなる混合物を、９０℃で混合溶解した後に、５０℃に保温したものを製膜原液とした。また、８０質量部のＤＭＡＣ及び２０質量部の水からなる混合溶液に、３０質量部のＰＶＰ（Ｋ３０；ＩＳＰ社）を加え混合溶解したものを芯液とした。【００５５】
外径１．０ｍｍ／内径０．７ｍｍのオリフィス型二重円筒型口金を用いて、外側の筒から製膜原液を、内側の筒から芯液を、それぞれ同時に吐出し、３０℃に設定した長さ７０ｍｍの乾式部を通過させた後、８５質量部の水及び１５質量部のＤＭＡＣからなる混合溶液を入れた９０℃の凝固浴に浸漬して凝固させ、さらに８０℃の温水浴で温水洗浄してからカセ枠に巻き取り、湿潤状態の中空糸膜を得た。製膜速度を４０ミリ／分としたところ、中空糸膜内径は３００μｍ、中空糸膜の膜厚は８０μｍとなった。【００５６】
得られた湿潤状態の中空糸膜を０．４ｍの長さに切断して小分けし、９０℃の温水浴に５０分間浸漬して温水洗浄した後、１００℃で１０時間の乾燥処理を行い、さらに乾熱乾燥機により１７０℃で５時間の加熱により、ＰＶＰの架橋を行って中空糸膜を得た。得られた中空糸膜の平均孔径、透水性、内表面における親水性高分子（ＰＶＰ）の存在率を、前述の測定例に従ってそれぞれ算出した。【００５７】
得られた中空糸膜から、以下のようにして中空糸膜モジュールを作製した。まず、内径４４ｍｍ、長さ２２０ｍｍのサイズの円筒状のケーシングに、上記のようにして得られた中空糸膜を５２４３本束にして挿入し、端部を６０％グリセリン水溶液に浸し、４０℃で３日間乾燥させた。続いて端部をポリウレタン樹脂からなるポッティング剤によって封止した後、中空糸膜が両面とも外側に向かって開口するように、ポッティング剤をケース断面と平行な方向に沿ってカットし、２．１ｃｍ２の断面積を有する口（流入口および流出口）を１つ備えたヘッダーを両側に取り付けた。中空糸膜を充填したケーシング内に８０℃の熱水（３．５Ｌ）を５００ｍＬ／ｍｉｎで流し込んで洗浄し、その後さらに常温水（２Ｌ）を５００ｍＬ／ｍｉｎ流し込んで洗浄した。洗浄後、０．１質量％のエタノールを溶解したビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（ＶＡ６４；ＢＡＳＦ社）の１０００ｐｐｍ水溶液を充填し、ケースの外側からγ線２５ｋＧｙを照射して、放射線照射架橋処理によりＶＡ６４を中空糸膜表面に固定し、有効長１９５ｍｍのモジュールを作製した。【００５８】
［実施例２］
実施例１と同様にして常温水洗浄の工程まで実施し、その後のＶＡ６４付加工程を実施せずにモジュールを作製した。【００５９】
［実施例３］
モジュールケースのケース長を切断し、１／２の長さ（有効長１０１．５ｍｍ）に変更した以外は実施例１と同一の方法でモジュールを作製した。【００６０】
実施例３の結果において、表１に示すアネキシン陽性化率は１９％と成績の悪い結果となっている。しかしこれは中空糸膜総断面積（Ｘ）と中空糸総膜面積（Ｚ）の比が０．０００４を超えているために、血小板の回収率が低下したために生じた見かけ上の結果である。中空糸膜の総断面積（Ｘ）は、中空糸膜内側を通過する液の線速度（膜腔内通過線速度）に対し、また中空糸膜の総膜面積（Ｚ）は中空糸膜の内側から外側に液が通過する線速度（膜面通過線速度）に対し影響している。膜面通過線速度が膜腔内通過線速度に対して大きくなると、血小板が中空糸膜表面に積層したケーク層が形成しやすくなる。このときケーク層を形成するのはアネキシン陰性の正常な血小板であるため、回収される血小板は相対的にアネキシン陽性の血小板が多くなり、アネキシン陽性化率も見かけ上上昇してしまうと考えられる。【００６１】
実際には、実施例３の評価におけるアネキシン陽性血小板数は、モジュール通過前が３．４×１０９個、モジュール通過後が２．８×１０９個であり、濃縮により微減していた。一部、アネキシン陽性の血小板も正常な血小板に混じって中空糸膜に残留しているとしても、その数は少ないと考えられるため、この結果からは、実施例３のモジュールを用いた濃縮によってもアネキシン陽性の血小板の絶対数はほとんど増えていないことが伺える。【００６２】
［比較例１］
モジュールケースのヘッダーを、０．８ｃｍ２の断面積を有する口（流入口および流出口）を１つ備えたルアーロックタイプのものに変更した以外は実施例１と同一の方法でモジュールを作製した。【００６３】
［比較例２］
モジュールケースのケース長を切断し、１／２の長さ（有効長１０１．５ｍｍ）に変更した以外は比較例１と同一の方法でモジュールを作製した。【００６４】
［比較例３］
１５部のポリメチルメタクリレート（パラスチレンスルホン酸／カチオン性ポリマー＝３／２；以下、「ＰＭＭＡ」）及び８５部のジメチルスルホキシド／グリセリン混合液（ジメチルスルホキシド／グリセリン＝８５／１５）からなる混合物を、１２０℃で溶解した後に、１０５℃に保温したものを製膜原液とした。また、９３部のジメチルスルホキシド及び７部の水からなる混合物を、芯液とした。【００６５】
外径０．９ｍｍ／内径０．６５ｍｍのオリフィス型二重円筒型口金を用いて、外側の筒から製膜原液を、内側の筒から芯液を、それぞれ同時に吐出し、３０℃に設定した長さ１００ｍｍの乾式部を通過させた後、９０部の水及び１０部のジメチルスルホキシドからなる混合溶液を入れた９０℃の凝固浴に浸漬して凝固させ、さらに８０℃の温浴で温水洗浄してから７５質量％のグリセリン水溶液を付与し、カセ枠に巻き取って中空糸膜を得た。なお、製膜速度を５０ｍ／分としたところ、中空糸膜内径は３００μｍ、中空糸膜の膜厚は９０μｍとなった。【００６６】
得られた中空糸膜を用いて、比較例１と同一の方法でモジュールを作製した。【００６７】
各実施例、比較例で作製した中空糸膜の素材、平均孔径および透水性、ならびに、それを用いて作製した培養血小板濃縮モジュールにおける流入口総断面積（Ｙ１）、流出口総断面積（Ｙ２）、中空糸膜総断面積（Ｘ）、中空糸膜総膜面積（Ｚ）、Ｘ／Ｙ１、Ｘ／Ｙ２、Ｘ／Ｚ、圧力損失および濃縮した培養血小板に関する各種評価各測定例に従って測定した結果を表１に示す。【００６８】
【表１】
2018062073.tif 000005
【符号の説明】
【００６９】
１１・・・供給バッグ、１２・・・回収バッグ、１３・・・廃液バッグ、２１・・・ローラーポンプ、２２・・・ローラーポンプ、３１・・・圧力計、３２・・・圧力計、４１流入口、４２・・・流出口、４３・・・排出口、５１・・・ケーシング、５２・・・ヘッダー、５３・・・ヘッダー
【図１】
2018062073.tif 000006
【国際調査報告】
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2018062073.tif 000008
2018062073.tif 000009
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