(57)【要約】  本発明は、メチル化された複数の環状分子と、末端基を有する直鎖状分子とを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を提供する。粉末状の水酸化ナトリウム存在下で酸分解性ポリロタキサンとヨウ化メチルを反応させる工程を含む製造方法によって、メチル化された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を製造することができる。メチル化された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物は、ライソゾーム病や癌などの疾患の治療薬として有用となりうる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチル化された複数の環状分子と、末端基を有する直鎖状分子とを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物。
【請求項２】
細胞内の酸性環境下またはｐＨ４．０〜６．０の酸性環境下で分解する、請求項１記載のポリロタキサン化合物。
【請求項３】
環状分子がβ−シクロデキストリンである、請求項１または２のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
【請求項４】
β−シクロデキストリンの水酸基がメチル化されている、請求項３記載のポリロタキサン化合物。
【請求項５】
β−シクロデキストリンが１分子あたり６〜２１個のメチル基を有する、請求項３または４記載のポリロタキサン化合物。
【請求項６】
直鎖状分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む、請求項１〜５のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
【請求項７】
直鎖状分子がポロキサマーを含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
【請求項８】
直鎖状分子の分子量が４０００〜７０００である、請求項１〜７のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
【請求項９】
直鎖状分子と環状分子との分子数の比率が１：１０〜１：１５であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
【請求項１０】
末端基が、置換基を有する又は有さないＯ−トリフェニルメチル基、置換基を有する又は有さないＳ−トリフェニルメチル基、および置換基を有する又は有さないＮ−トリフェニルメチル基から成る群より選択される、請求項１〜９のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
【請求項１１】
末端基が直鎖状分子にペプチド結合、カーバメート結合、エステル結合、またはエーテル結合を介して連結されている、請求項１〜１０のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
【請求項１２】
下記構造式を有する、メチル化されたβ−シクロデキストリンと直鎖状分子を含むポリロタキサン化合物であって、
【化１】
2017188257.tif 000010
ここで、ｍはポロキサマー中のポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示す整数であり、ｎはポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す整数であり、ｘはβ−シクロデキストリンの数を示す整数であり、
β−シクロデキストリンが１分子あたり６〜２１個のメチル基を有し、直鎖状分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含み、直鎖状分子の平均分子量が４０００〜７０００であり、β−シクロデキストリンの数ｘが１０〜１５であり、末端基がＮ−トリフェニルメチル基から成り、酸分解性であり、全体の平均分子量が１８，０００〜２７，０００であるポリロタキサン化合物。
【請求項１３】
メチル化された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の製造方法であって、粉末状の水酸化ナトリウム存在下で酸分解性ポリロタキサンとヨウ化メチルを反応させる工程を含む、製造方法。
【請求項１４】
メチル化された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の製造方法であって、ポロキサマーの両末端に一級アミノ基を有するポロキサマーを得る工程、前記ポロキサマーとβ−シクロデキストリンとを反応させて擬ポリロタキサンを得る工程、前記擬ポリロタキサンの両末端をＮ−トリチルグリシンでキャッピングする工程、および粉末状の水酸化ナトリウム存在下で酸分解性ポリロタキサンとヨウ化メチルを反応させる工程を含む、製造方法。
【請求項１５】
メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞においてオートファジーを誘導するための組成物。
【請求項１６】
メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、癌を治療するための医薬組成物。
【請求項１７】
癌がアポトーシス耐性の癌である、請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１８】
メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞内のコレステロール蓄積に起因する疾患またはオートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項１９】
メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項２０】
環状分子として置換基を有するβ−シクロデキストリンと、直鎖状分子として末端にＮ−トリフェニルメチル基を有するポロキサマーとを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物。
【請求項２１】
環状分子として置換基を有するβ−シクロデキストリンと、直鎖状分子として末端にＮ−トリフェニルメチル基を有するポロキサマーとを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項２２】
下記構造式を有する、ヒドロキシエトキシエチル化されたβ−シクロデキストリンと直鎖状分子を含むポリロタキサン化合物であって、
【化２】
2017188257.tif 000011
ここで、ｍはポロキサマー中のポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示す整数であり、ｎはポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す整数であり、ｘはβ−シクロデキストリンの数を示す整数であり、
β−シクロデキストリンが１分子あたり６〜２１個のヒドロキシエトキシエチル基を有し、直鎖状分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含み、直鎖状分子の平均分子量が４０００〜７０００であり、β−シクロデキストリンの数ｘが１０〜１５であり、末端基がＮ−トリフェニルメチル基から成り、酸分解性であるポリロタキサン化合物。
【請求項２３】
請求項２２に記載のポリロタキサン化合物を含む、細胞においてオートファジーを誘導するための組成物、アポトーシス耐性の癌を治療するための医薬組成物、細胞内のコレステロール蓄積に起因する疾患またはオートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための医薬組成物、または、ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、特願２０１６−９０１２１号（出願日：２０１６年４月２８日）の優先権の利益を享受する出願であり、これは引用することによりその全体が本明細書に取り込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、メチル化された複数の環状分子を有する、酸分解性のポリロタキサン化合物、およびその合成方法に関する。より詳細には、メチル化された複数のβ−シクロデキストリンを有する、酸分解性のポリロタキサン化合物、およびその合成方法に関する。また、メチル化された複数の環状分子を有する、酸分解性のポリロタキサン化合物のオートファジー誘導剤としての使用、および疾患の治療薬としての使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ポリロタキサンは、軸となる直鎖状の分子（主軸とも言う）が複数の大環状分子（リング）を貫通した構造を有する化合物であり、軸の両末端に嵩高い部位を結合させることで、立体障害により大環状分子が軸から抜けなくなっている。両末端の嵩高い部位はストッパーまたはキャップ、末端基と呼ばれる。ストッパーがない場合や、ストッパーがあっても嵩高さが不十分な場合は、リングと軸が分かれることがあり、擬ロタキサンと呼ばれる。【０００４】
国際公開パンフレットＷＯ２０１５／０２５８１５（特許文献１）には、β−シクロデキストリンを環状分子として含有する酸分解性ポリロタキサンが開示されている。この酸分解性ポリロタキサンは、細胞内環境で分解し、貫通していたβ−シクロデキストリンを細胞内局所で放出することが可能である。従来的な遊離β−シクロデキストリンは主に細胞膜と作用することから、酸分解性ポリロタキサンはβ−シクロデキストリンの作用部位を変化させることが可能な化合物として、疾患治療への応用が検討されている。上記ＷＯ２０１５／０２５８１５では、細胞のリソソームにコレステロールが蓄積するニーマンピック病Ｃ型に対する治療効果が試験され、酸分解性ポリロタキサンは従来のβ−シクロデキストリンよりも低濃度でコレステロールの蓄積を改善することが報告されている。【０００５】
β−シクロデキストリンによる物質包接作用は、β−シクロデキストリンへの化学修飾によって変化することが知られている。様々なβ−シクロデキストリン誘導体の中でも、水酸基をメチル化した誘導体（メチル化β−シクロデキストリン）はコレステロールやアダマンタン等、種々の化合物との結合定数（錯安定度定数）が最も高いことが知られている（非特許文献１）。よって、メチル化β−シクロデキストリンを環状分子として有する酸分解性ポリロタキサンは上記ニーマンピック病Ｃ型に対する治療効果を高めることや、新たな細胞機能を誘導することが期待されるものの、メチル化β-シクロデキストリンを含有する酸分解性ポリロタキサンの合成は、これまで達成されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０２５８１５号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】T.Irie, K.Uekama, J. Pharm. Sci. 1997, 86(2), pp.147-162.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、メチル化された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、メチル化された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の合成方法を提供することを目的の一つとする。さらに、本発明は、メチル化された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、疾患の治療剤を提供することを別の目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の態様は以下の事項に関する。
［１］メチル化された複数の環状分子と、末端基を有する直鎖状分子とを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物。
［２］細胞内の酸性環境下で分解する、［１］記載のポリロタキサン化合物。
［３］ｐＨ４．０〜６．０の酸性環境下で分解する、［１］または［２］記載のポリロタキサン化合物。
［４］環状分子がβ−シクロデキストリンである、［１］〜［３］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［５］β−シクロデキストリンの水酸基がメチル化されている、［４］記載のポリロタキサン化合物。
［６］β−シクロデキストリンが１分子あたり６〜２１個のメチル基を有する、［４］または［５］記載のポリロタキサン化合物。
［７］直鎖状分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む、［１］〜［６］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［８］直鎖状分子がポロキサマーを含む、［１］〜［７］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［９］直鎖状分子の分子量が４０００〜７０００である、［１］〜［８］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１０］直鎖状分子と環状分子との分子数の比率が１：１０〜１：１５であることを特徴とする、［１］〜［９］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１１］末端基が、置換基を有する又は有さないＯ−トリフェニルメチル基、置換基を有する又は有さないＳ−トリフェニルメチル基、および置換基を有する又は有さないＮ−トリフェニルメチル基から成る群より選択される、［１］〜［１０］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１２］末端基が直鎖状分子にペプチド結合、カーバメート結合、エステル結合、またはエーテル結合を介して連結されている、［１］〜［１１］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１３］メチル化された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の製造方法であって、粉末状の水酸化ナトリウム存在下で酸分解性ポリロタキサンとヨウ化メチルを反応させる工程を含む、製造方法。
［１４］メチル化された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の製造方法であって、ポロキサマーの両末端に一級アミノ基を有するポロキサマーを得る工程、前記ポロキサマーとβ−シクロデキストリンとを反応させて擬ポリロタキサンを得る工程、前記擬ポリロタキサンの両末端をＮ−トリチルグリシンでキャッピングする工程、および粉末状の水酸化ナトリウム存在下で酸分解性ポリロタキサンとヨウ化メチルを反応させる工程を含む、製造方法。
［１５］メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞においてオートファジーを誘導するための組成物。
［１６］メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、癌を治療するための医薬組成物。
［１７］癌がアポトーシス耐性の癌である、［１６］記載の医薬組成物。
［１８］メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞内のコレステロール蓄積に起因する疾患またはオートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための医薬組成物。
［１９］メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための医薬組成物。
［２０］メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞においてオートファジーを誘導するための方法。
［２１］対象に対して、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を投与する工程を含む、癌を治療するための方法。
［２２］癌がアポトーシス耐性の癌である、［２１］記載の方法。
［２３］対象に対して、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を投与する工程を含む、細胞内のコレステロール蓄積に起因する疾患またはオートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための方法。
［２４］対象に対して、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を投与する工程を含む、ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための方法。
［２５］細胞においてオートファジーを誘導するための薬剤の製造における、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用。
［２６］癌を治療するための薬剤の製造における、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用。
［２７］癌がアポトーシス耐性の癌である、［２６］記載の使用。
［２８］細胞内のコレステロール蓄積に起因する疾患またはオートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための薬剤の製造における、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用。
［２９］ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための薬剤の製造における、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用。
［３０］環状分子として置換基を有するβ−シクロデキストリンと、直鎖状分子として末端にＮ−トリフェニルメチル基を有するポロキサマーとを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物。
［３１］環状分子として置換基を有するβ−シクロデキストリンと、直鎖状分子として末端にＮ−トリフェニルメチル基を有するポロキサマーとを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための医薬組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の一態様によると、メチル化された複数の環状分子と、末端基を有する直鎖状分子とを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物が提供される。このようなポリロタキサン化合物は、酸性環境下で分解し、メチル化された複数の環状分子を放出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ポリロタキサンのβ−シクロデキストリンにメチル基を導入するための反応スキームを示した図である。
【図２】サイズクロマトグラフィーの結果を示した図である。ＰＲＸおよびＭｅ−ＰＲＸは溶出時間がβ−ＣＤよりも早く、高分子量化していることから、合成が確認される。
【図３】Ｍｅ−ＰＲＸのプロトン核磁気共鳴スペクトルの結果を示した図である。
【図４】ＨＥＥ−ＰＲＸのサイズクロマトグラフィーの結果を示した図である。
【図５】Ｍｅ−ＰＲＸのプロトン核磁気共鳴スペクトルの結果を示した図である。
【図６】Ｍｅ−ＰＲＸのＮ−トリチル基脱離率を示した図である。
【図７】Ｍｅ−ＰＲＸのサイズクロマトグラフィーの結果を示した図である。Ｎ−トリチル基の脱離率に応じて１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３に由来したピークが減少し、β−ＣＤ由来のピークが増加した。
【図８】ＨＥＥ−ＰＲＸのＮ−トリチル基脱離率を示した図である。
【図９】ＨＥＥ−ＰＲＸのサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果を示した図である。Ｎ−トリチル基の脱離率に応じてＨＥＥ−ＰＲＸに由来したピークが減少し、β−ＣＤ由来のピークが増加した。
【図１０】さまざまな濃度の各種Ｍｅ−ＰＲＸの６００ｎｍにおける透過率の測定結果を示した図である。
【図１１】３−メチルアデニン（３−ＭＡ）の存在下および非存在下においてＤＭ−β−ＣＤまたはＭｅ−ＰＲＸで処置した細胞中のＧＦＰ陽性オートファゴソームを示した写真（左）と、３−メチルアデニン（３−ＭＡ）の存在下および非存在下においてＤＭ−β−ＣＤまたはＭｅ−ＰＲＸで処置した細胞中のＧＦＰ陽性のオートファゴソーム数を計測した結果を示すグラフ（右）である。
【図１２】Ｍｅ−Ｐ１０３、ＨＥＥ−ＰＲＸ、およびＭｅ−β−ＣＤで処置したＨｅＬａ細胞の細胞生存率を示したグラフである。
【図１３】オートファジー阻害剤である３−メチルアデニンの存在下で細胞をＭｅ−ＰＲＸとＭｅ−β−ＣＤで処置した場合の細胞生存率を示したグラフである。
【図１４】Ｃａｓｐａｓｅ阻害剤であるｚＶＡＤ−ＦＭＫの存在下で、Ｂａｘ／Ｂａｋ  ＤＫＯ  ＭＥＦ細胞をＭｅ−ＰＲＸ、Ｍｅ−β−ＣＤ、またはＤＭ−β−ＣＤにより処置した場合の細胞の写真（左）と、細胞生存率を示したグラフ（右）である。
【図１５】ＨＰ−β−ＣＤまたはＰＲＸで処置したニーマン・ピック病Ｃ型患者由来皮膚繊維芽細胞におけるコレステロールの局在を観察した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明者らは、粉末状の水酸化ナトリウム存在下で酸分解性ポリロタキサンとヨウ化メチルを反応させることにより、メチル化された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を製造した。
【００１３】
ポリロタキサン（ＰＲＸ）化合物
ロタキサンは、大環状分子を直鎖状分子が貫通し、直鎖状分子の両末端に嵩高い部位を結合させることで、立体障害でリングが軸から抜けなくなったものである。ポリロタキサンでは、複数の大環状分子の環内を１本の直鎖状分子が貫いている。
【００１４】
本発明において用いられる直鎖状分子や環状分子は特に限定されないが、直鎖状分子としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体（ポロキサマー）、ポリエチレンイミン、ポリアミノ酸、及びポリメチルビニルエーテルからなる群より選ばれる一種又は二種以上であることが好ましい。また、直鎖状分子の平均分子量は１０００〜２００００、特に２０００〜１００００あるいは４０００〜７０００であることが好ましく、例えば、分子量およそ５０００のポロキサマーが使用されうる。
【００１５】
環状分子としては、α、β又はγ−シクロデキストリンであることが好ましいが、これと類似の環状構造を持つものであってもよく、そのような環状構造としては環状ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルアミン、環状ポリアミン等が挙げられる。コレステロール包接能の観点から好ましい環状分子は、β−またはγ−シクロデキストリンであり、β−シクロデキストリンが特に好ましい。
【００１６】
本発明に係るポリロタキサンに含まれる環状分子はメチル基を有する。環状分子は、好ましくはβ−シクロデキストリンであり、β−シクロデキストリンの水酸基がメチル化されている。β−シクロデキストリンは、例えば、１分子あたり１〜２１個、好ましくは６〜２１個のメチル基を有する。環状分子は、メチル基以外の置換基を有していても良い。他の置換基としては、例えば、２−ヒドロキシエトキシエチル（ＨＥＥ）基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、ヒドロキシエトキシエチル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル基（ＤＭＡＥ基と称することもある）、カルボキシル基、一級アミノ基、若しくはポリエチレングリコールなどの水溶性高分子や、トランスフェリンなどのタンパク質分子、オリゴアルギニンなどのペプチド分子などが挙げられる。これらの基は、環状分子に直接結合していても、リンカーを介して結合していても良い。リンカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カルバミン酸エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）、エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−）、カルボネート結合（−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−）、エーテル結合（−Ｏ−）などが挙げられる。
【００１７】
直鎖状分子と環状分子の組み合わせとしては、β−シクロデキストリンとポロキサマーとの組合せが好ましい。なお、β−シクロデキストリンとポロキサマーとの組合せによるポリロタキサンの合成は、上記の特許文献１にも開示されており、その内容は参照により本明細書にも取り込まれる。好ましい直鎖状分子の分子数と環状分子の分子数との比率は１：４〜１：５０であり、１：８〜１：２０の比率がより好ましく、例えば、１：１０〜１：１５の比率が用いられる。すなわち、好ましくは直鎖状分子１分子に４〜５０個の環状分子が含まれ、より好ましくは８〜２０個の環状分子が含まれ、例えば、１０〜１５個の環状分子が含まれうる。
【００１８】
本発明において用いられる末端基（嵩高い置換基とも言う）としては、例えば、Ｏ−トリフェニルメチル（Ｏ−Ｔｒｔ）基、Ｓ−トリフェニルメチル（Ｓ−Ｔｒｔ）基、Ｎ−トリフェニルメチル（Ｎ−Ｔｒｔ）基が挙げられるが、限定はされない。末端基は、置換基を有するＯ−トリフェニルメチル基、Ｓ−トリフェニルメチル基、Ｎ−トリフェニルメチル基などであってもよい。好ましくは、Ｎ−トリフェニルメチル基が用いられる。Ｎ−Ｔｒｔ基は、弱酸性環境下において分解され、ポリロタキサン骨格が崩壊し、β−ＣＤなどの環状分子がリリースされる。末端基は、ペプチド結合、カーバメート結合、エステル結合、エーテル結合などを介して直鎖状分子に連結されうるが、好ましくはペプチド結合が用いられる。よって、本発明の一態様は、環状分子として置換基を有するβ−シクロデキストリンと、直鎖状分子として末端にＮ−トリフェニルメチル基を有するポロキサマーとを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物に関する。β−シクロデキストリンが有する置換基は、好ましくはメチル基であるが、限定はされず、例えば、２−ヒドロキシエトキシエチル（ＨＥＥ）基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、ヒドロキシエトキシエチル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル基（ＤＭＡＥ基と称することもある）、カルボキシル基、一級アミノ基、若しくはポリエチレングリコールなどの水溶性高分子や、トランスフェリンなどのタンパク質分子、オリゴアルギニンなどのペプチド分子などであってもよい。これらの基は、環状分子に直接結合していても、リンカーを介して結合していても良い。リンカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カルバミン酸エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）、エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−）、カルボネート結合（−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−）、エーテル結合（−Ｏ−）などが挙げられる。
【００１９】
本発明に係るポリロタキサン化合物は、酸分解性の結合を介して末端基が直鎖状分子に連結された構造を有していても良い。酸分解性の結合としては、例えば、アセタール結合、ケタール結合、ジスルフィド結合、エステル結合、オルトエステル結合、ビニルエーテル結合、ヒドラジド結合、アミド結合などが挙げられるが、限定はされない。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。末端基としては、例えば、Ｎ−トリチルグリシン、１以上のベンゼン環を有する基、１以上の第三ブチルを有する基等が使用されうるが、これらに限定はされない。１以上のベンゼン環を有する基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フレオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ベンジルエステル（ＯＢｚ）基等が挙げられ、また、１以上の第三ブチルを有する基としては、第三ブチルカルボニル（Ｂｏｃ）基、アミノ酸第三ブチルエステル（ＯＢｕ基）等が挙げられる。なお、酸分解性の結合と末端基とは、直接的に連結されている必要はなく、当業者に公知のリンカー部分を介して連結されていてもよい。
【００２０】
本発明に係るポリロタキサンの数平均分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１万〜１０万程度とすることが好ましい。
【００２１】
本発明に係るポリロタキサン化合物としては、直鎖状分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含むポロキサマーであり、環状分子がβ−シクロデキストリンであり、末端基がＮ−トリフェニルメチル基であり、末端基が直鎖状分子にペプチド結合を介して連結されていることが特に好ましい。この場合、ポロキサマーの分子量は４０００〜７０００（例えば、約５０００）であり、直鎖状分子１分子あたりのβ−シクロデキストリンの数は１０〜１５個（例えば、約１２個）でありうる。よって、本発明に係るポリロタキサン化合物は、以下に示す化学構造を有するポリロタキサンを含む：
【化１】
2017188257.tif 000003
ここで、ｍは、ポロキサマー中のポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示す整数である（ここでは、括弧内にポリプロピレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｍ／３」と記載しているが、ｍが３の倍数である必要は無い）。ｎは、ポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す整数である。ｘは、β−シクロデキストリンの数を示す整数である。Ｒは、置換基を示しており化学結合Ｌを介してβ−シクロデキストリンに結合している。ここでは、β−シクロデキストリンが括弧内の環状構造として示されている。図示の都合上、β−シクロデキストリン上の置換基（例えば、メチル基）は１つのみが示されているが、置換基の数は複数であってもよい。場合によっては化学結合Ｌは介さなくてもよい。Ｚは、キャッピング分子（例えば、Ｎ−トリフェニルメチル基）を示しており化学結合Ｙ（例えば、ペプチド結合）を介して主軸高分子両末端に結合している。場合によっては化学結合Ｙは介さなくてもよい。
【００２２】
細胞内環境
本発明に係るポリロタキサン化合物は、酸性環境下で分解する酸分解性のポリロタキサン化合物であり、例えば、ｐＨ４．０〜６．０の酸性環境下で分解する。上述のとおり、末端基としてＮ−Ｔｒｔ基を用いた場合、Ｎ−Ｔｒｔ基は弱酸性環境下において分解され、ポリロタキサン骨格が崩壊し、β−ＣＤなどの環状分子がリリースされる。
【００２３】
ヒトを含む真核生物の細胞内には、リソソームや後期エンドソームといった小胞が存在しており、これらの小胞の内腔は酸性化されていることが知られている。例えば、リソソームの内腔のｐＨは５前後である。よって、本発明に係るポリロタキサン化合物は、これらの小胞に取り込まれることにより分解されうる。本発明に係るポリロタキサン化合物は、分解に伴い、β−ＣＤなどの環状分子をリリースする。例えば、リソソーム内でβ−シクロデキストリンが放出された場合、リソソーム内に存在するコレステロールを包接することができ、それにより、リソソーム内のコレステロールの過剰蓄積を原因とするニーマン・ピック病Ｃ型などのライソゾーム病が治療もしくは予防されうる。
【００２４】
上述のとおり、メチル化されたβ−シクロデキストリンは、コレステロールの包接能が特に高いことが知られている。細胞内のコレステロールをメチル化されたβ−シクロデキストリンが包接することで、細胞内の過剰なコレステロールが引き起こす疾患の治療が可能であることが当業者には理解される。よって、本発明の一態様は、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞内のコレステロール蓄積に起因する疾患を治療するための医薬組成物に関する。また、別の観点からは、本発明の一態様は、対象に対して、好ましくはヒトに対して、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を投与する工程を含む、ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための方法に関する。さらに、本発明の一態様は、ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための薬剤の製造における、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用にも関する。細胞内のコレステロール蓄積に起因する疾患としては、ライソゾーム病、より具体的には、ゴーシェ病（Ｇａｕｃｈｅｒ病）、ニーマン・ピック病Ａ型（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ病Ａ型）、ニーマン・ピック病Ｂ型（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ病Ｂ型）、ニーマン・ピック病Ｃ型（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ病Ｃ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス（「Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ  Ｓａｎｄｈｏｆｆ  ＡＢ型」と称することもある。）、クラッベ病（Ｋｒａｂｂｅ病）、異染性白質変性症、マルチプルサルタファーゼ欠損症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｕｌｆａｔｅｓｅ欠損症）、ファーバー病（Ｆａｒｂｅｒ病）、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型（「ハンター病」と称することもある。）、ムコ多糖症ＩＩＩ型（「サンフィリポ病」と称することもある。）、ムコ多糖症ＩＶ型、ムコ多糖症ＶＩ型（「マロトー・ラミー病」と称することもある。）、ムコ多糖症ＶＩＩ型（「スライ病」と称することもある。）、ムコ多糖症ＩＸ型（「Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ欠損症」と称することもある。）、シアリドーシス、ガラクトシアリドーシス、Ｉ−ｃｅｌｌ病／ムコリピドーシスＩＩＩ型、α−マンノシドーシス、β−マンノシドーシス、フコシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、シンドラー／神崎病（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ／神崎病）、ウォルマン病（Ｗｏｌｍａｎ病）、ダノン病（Ｄａｎｏｎ病）、遊離シアル酸蓄積症、セロイドリポフスチノーシス、ファブリー病が挙げられる。なお、前記ライソゾーム病は、オートファゴソームの蓄積を生じる、オートファジー機能異常に起因する疾患でもある。
【００２５】
よって、本発明の一態様は、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための医薬組成物に関する。また、別の観点からは、本発明の一態様は、対象に対して、好ましくはヒトに対して、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を投与する工程を含む、ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための方法に関する。さらに、本発明の一態様は、ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための薬剤の製造における、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用にも関する。また、本発明の一態様は、上述のように、環状分子として置換基を有するβ−シクロデキストリンと、直鎖状分子として末端にＮ−トリフェニルメチル基を有するポロキサマーとを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物にも関する。さらに、本発明の一態様は、環状分子として置換基を有するβ−シクロデキストリンと、直鎖状分子として末端にＮ−トリフェニルメチル基を有するポロキサマーとを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための医薬組成物にも関する。
【００２６】
オートファジー
本発明者らは、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を作用させることにより、細胞にオートファジーを誘導できることを見出した。シクロデキストリンは、好ましくはβ−シクロデキストリンである。よって、本発明の一態様は、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞においてオートファジーを誘導するための組成物に関する。また、別の観点からは、本発明の一態様は、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞においてオートファジーを誘導するための方法に関する。さらに、本発明の一態様は、細胞においてオートファジーを誘導するための薬剤の製造における、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用にも関する。
【００２７】
また、本発明に係るメチル化ポリロタキサンは、細胞にオートファジー性細胞死を誘発しうる。オートファジー性細胞死を利用して、癌細胞に細胞死を誘導できることが当業者には知られている。よって、本発明の一態様は、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、癌を治療するための医薬組成物、好ましくはアポトーシス耐性の癌を治療するための医薬組成物に関する。また、別の観点からは、本発明の一態様は、対象に対して、好ましくはヒトに対して、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を投与する工程を含む、癌を治療するため、特にアポトーシス耐性の癌を治療するための方法に関する。さらに、本発明の一態様は、癌を治療するための薬剤の製造における、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用にも関する。
【００２８】
また、本発明に係るメチル化ポリロタキサンは、細胞にオートファジーを誘導することから、オートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するために使用されうることが当業者には理解される。よって、本発明の一態様は、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、オートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための医薬組成物に関する。また、別の観点からは、本発明の一態様は、対象に対して、好ましくはヒトに対して、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を投与する工程を含む、オートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための方法に関する。さらに、本発明の一態様は、オートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための薬剤の製造における、メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用にも関する。オートファジーの機能障害に起因する疾患としては、例えば、上述のライソゾーム病や、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患が挙げられる。
【００２９】
製造方法
メチル化された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物は、粉末状の水酸化ナトリウム存在下で酸分解性ポリロタキサンとヨウ化メチルを反応させる工程を含む方法により、製造されうる。より具体的には、本発明に係る製造方法の一態様は、ポロキサマーの両末端に一級アミノ基を有するポロキサマーを得る工程（工程Ａ）、前記ポロキサマーとβ−シクロデキストリンとを反応させて擬ポリロタキサンを得る工程（工程Ｂ）、前記擬ポリロタキサンの両末端をＮ−トリチルグリシンでキャッピングする工程（工程Ｃ）、および粉末状の水酸化ナトリウム存在下で酸分解性ポリロタキサンとヨウ化メチルを反応させる工程（工程Ｄ）を含む。
【００３０】
本発明に係る方法において、粉末状の水酸化ナトリウム存在下で酸分解性ポリロタキサンとヨウ化メチルを反応させる際には、脱水ジメチルスルホオキシドに溶解させたポリロタキサンが用いられうる。また、粉末化水酸化ナトリウムの存在下での酸分解性ポリロタキサンとヨウ化メチルとの反応は、３０分から３時間程度、好ましくは約１時間、撹拌することで行うことができる。撹拌は激しく行うことが好ましい。メチル基修飾数は、反応時のヨウ化メチルの当量により制御することが可能である。
【００３１】
医薬組成物
本発明に係るポリロタキサン化合物は、上記のような疾患の治療または予防に用いる医薬組成物中の有効成分として利用することができる。よって、本発明の一つの態様は、疾患の治療または予防に用いる医薬組成物に関する。本発明に係る医薬組成物中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。担体にも、特に制限はなく、例えば、剤形等に応じて適宜選択することができる。本発明に係る医薬組成物における含有量についても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。好ましくは、本発明に係る医薬組成物は、体温付近、例えば、３４℃〜４２℃、より好ましくは３５℃〜３８℃あるいは３７℃において水溶性である。
【００３２】
本発明に係る医薬組成物の剤形としては、特に制限はなく、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、吸入散剤などが挙げられる。注射剤としては、例えば、本発明に係るポリロタキサン化合物に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００３３】
本発明に係る医薬組成物の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、医薬組成物の剤形、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。例えば、局所投与としては、脳室内投与などが挙げられる。
【００３４】
本発明に係る医薬組成物の投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、好ましくはヒトである。
【００３５】
本発明に係る医薬組成物の投与量としては、特に制限はなく、投与形態や、投与対象の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。
【００３６】
本発明に係る医薬組成物の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記疾患に感受性の患者に対して予防的に投与されてもよいし、症状を呈する患者に治療的に投与されてもよい。また、投与回数としても、特に制限はなく、投与対象の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
【００３７】
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
【実施例】
【００３８】
＜例１：ポリロタキサンの製造＞
線状高分子としてプルロニックＰ１０３（ＡＤＥＫＡ社製、商品名：アデカプルロニックＰ−１０３；ポリエチレングリコ−ル（以下、「ＰＥＧ」と称することがある。）とポリプロピレングリコ−ル（以下、「ＰＰＧ」と称することがある。）が、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの順に重合した共重合体；ＰＰＧ部分の数平均分子量は３２５０、ＰＥＧ部分の数平均分子量は８１０×２）を用い、以下のようにして、その両末端に一級アミノ基を結合させた。【００３９】
前記プルロニックＰ１０３を１０ｇ、１，１’−カルボニルジイミダゾ−ル（シグマ−アルドリッチ社製）を１２．８ｇ量り取り、広口瓶へ加えた。テトラヒドロフラン（関東化学社製）を１３５ｍＬ加えて溶解させ、室温で２４時間撹拌した。反応後、超純水を１ｍＬ加え１０分間撹拌した。エチレンジアミン（和光純薬社製）を２．４５ｇ量り取り、ナス型フラスコへ加え、テトラヒドロフランを１０ｍＬ加え溶解させた。プルロニックＰ１０３反応溶液をナス型フラスコへ滴下して加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量３５００の透析膜（スペクトラム社製）へ加え、メタノール（関東化学社製）に対し透析をすることで未反応物を除去した。ロータリーエバポレーターで濃縮することで両末端に一級アミノ基を有するプルロニックＰ１０３（以下、「Ｐ１０３−ＮＨ２」と称することがある。）を７．２２ｇ得た。【００４０】
前記Ｐ１０３−ＮＨ２と、β−シクロデキストリン（以下、「β−ＣＤ」と称することがある。）を用い、以下のようにして、擬ポリロタキサンを調製した。【００４１】
前記β−ＣＤを６．８１ｇ量り取り、広口瓶に加え、リン酸緩衝溶液３４０ｍＬに溶解させた。前記Ｐ１０３−ＮＨ２を１ｇ量り取り、少量のメタノールに溶解させた。Ｐ１０３−ＮＨ２溶液をβ−ＣＤ溶液に加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。回収した固体を凍結乾燥することで擬ポリロタキサンを３．８８ｇ得た。【００４２】
前記擬ポリロタキサンの両端部を、以下のようにしてＮ−トリチルグリシン（シグマ−アルドリッチ社製）でキャッピングすることにより、複数のβ−ＣＤを貫通した線状高分子の両端部に酸性ｐＨ環境下で脱離する嵩高い置換基を有するポリロタキサン（以下、「ＰＲＸ」と称することがある。）を得た。【００４３】
Ｎ−トリチルグリシンを７６０ｍｇ、Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ社製）を２７６ｍｇ、Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（東京化成工業社製）を５３６ｍｇ量り取り、スクリュー管に加え、脱水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬社製）を６．４６ｍＬ加え、室温で３時間撹拌した。前記擬ポリロタキサンに対し、超純水１７．２ｍＬ、メタノール８．６２ｍＬ、および前記Ｎ−トリチルグリシン反応溶液を加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。メタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、超純水の順で得られた沈殿物を洗浄し、未反応物を除去した。回収した固体を凍結乾燥することで末端をＮ−トリチルグリシンでキャッピングされたポリロタキサンを１．７９ｇ得た。【００４４】
前記ポリロタキサンのβ−ＣＤにメチル（以下、「Ｍｅ」と称することがある。）基を以下のようにして導入し（図１）、メチル化ポリロタキサン（以下、「Ｍｅ−ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子当たりのβ−ＣＤ平均貫通数は１２．８；Ｍｅ基の修飾数は平均１２．２）。メチル化ＰＲＸの一般化学構造を以下に示す：
【化２】
2017188257.tif 000004
ここで、ｍは、ポロキサマー中のポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示す整数である。ｎは、ポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す整数である。ｘは、β−シクロデキストリンの数を示す整数である。ここでは、β−シクロデキストリンが括弧内の環状構造として示されている。図示の都合上、β−シクロデキストリン上の置換基は１つのみが示されているが、置換基の数は複数であってもよい。【００４５】
前記ポリロタキサンを３００ｍｇ量り取り、脱水ジメチルスルホキシド（和光純薬社製）１５ｍＬに溶解させた。粉末化した水酸化ナトリウム（和光純薬社製）３２２ｍｇ、ヨウ化メチル（和光純薬社製）１６７μＬを続けて加え、１時間激しく撹拌した。反応後、ジエチルエーテル（昭和エーテル社製）を加え沈殿物を回収し、分画分子量３５００の透析膜へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応物を除去した。回収した水溶液を凍結乾燥させることでメチル基を導入した、末端をＮ−トリチルグリシンでキャッピングされたポリロタキサン（Ｍｅ−ＰＲＸ）を２２７ｍｇ得た（図２）。【００４６】
前記Ｍｅ−ＰＲＸについて、溶離液を１０ｍＭ  ＬｉＢｒ含有ジメチルスルホオキシドとしたサイズ排除クロマトグラフィー測定、及び重水（関東化学社製）中で測定した４００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトル測定を行った。【００４７】
図２に示すサイズクロマトグラフィーの結果において、ＰＲＸ、及びＭｅ−ＰＲＸは溶出時間がβ−ＣＤよりも早く高分子量化していることから、合成が確認された。また、遊離β−ＣＤやＮ−トリチル基のピークが見られないことから、Ｍｅ−ＰＲＸは超分子構造を損なうことなく高純度で合成されたことが示された。図３に示すプロトン核磁気共鳴スペクトルの結果から、ポリロタキサンのβ−ＣＤに導入されたＭｅ基の修飾数がＰＲＸのβ−ＣＤ１分子あたり１２．２であることが明らかとなった。【００４８】
また、プルロニックＰ１０３を主軸高分子としたＭｅ−ＰＲＸの他に、プルロニックＰ１２３（シグマ−アルドリッチ社製；平均分子量５８００）、プルロニックＰ１０５（第一工業製薬社製、商品名：エパンＵ−１０５；平均分子量６５００）、プルロニックＰ８４（ＡＤＥＫＡ社製、商品名：アデカプルロニックＰ−８４；平均分子量４２００）、プルロニックＬ１２１（シグマ−アルドリッチ社製；平均分子量４４００）を主軸高分子としたＭｅ−ＰＲＸを合成した。プロトン核磁気共鳴スペクトルの結果から、算出したβ−ＣＤ貫通数、Ｍｅ基修飾数、及び分子量を以下の表１に示す。
【表１】
2017188257.tif 000005
【００４９】
前記Ｎ−トリチルグリシンでキャッピングを行ったポリロタキサンについて、上記のように調製した軸高分子をプルロニックＰ１２３としたポリロタキサンのβ−ＣＤにヒドロキシエトキシエチル（以下「ＨＥＥ」）基を以下の様に導入し、水溶性のポリロタキサン（以下、「ＨＥＥ−ＰＲＸ」）を得た（ポリロタキサン当たりのβ−ＣＤの平均貫通数は１２．７；β−ＣＤ一つ当たりのＨＥＥ基の修飾数は６．５３）。ヒドロキシエトキシエチル化ＰＲＸの一般化学構造を以下に示す：
【化３】
2017188257.tif 000006
ここで、ｍは、ポロキサマー中のポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示す整数である。ｎは、ポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す整数である。ｘは、β−シクロデキストリンの数を示す整数である。ここでは、β−シクロデキストリンが括弧内の環状構造として示されている。図示の都合上、β−シクロデキストリン上の置換基は１つのみが示されているが、置換基の数は複数であってもよい。【００５０】
前記プルロニックＰ１２３を主軸高分子とした末端がＮ−トリチルグリシンでキャッピングされたポリロタキサンを２００ｍｇ量り取り、窒素雰囲気下でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０ｍＬに溶解した。１，１’−カルボニルジイミダゾールを２８２ｍｇ加え、室温で２４時間撹拌した。その後、反応溶液に２−（２−アミノエトキシ）エタノール（東京化成工業社製）を９００μＬ加え、さらに室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量３，５００の透析膜へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応物を除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することで、β−ＣＤにヒドロキシエトキシエチル基が導入され、プルロニックの末端がＮ−トリチルグリシンでキャッピングされたポリロタキサン（ＨＥＥ−ＰＲＸ）を得た。【００５１】
前記ＨＥＥ−ＰＲＸについて、溶離液を１０ｍＭ  ＬｉＢｒ含有ジメチルスルホオキシドとしたサイズ排除クロマトグラフフィー測定、及び重水（関東化学社製）中で測定した、４００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトル測定を行った。【００５２】
図４に示すサイズクロマトグラフィーの結果から、ＰＲＸ、及びＨＥＥ−ＰＲＸは溶出時間がβ−ＣＤよりも早く、高分子量化していることより合成が確認された。また、遊離β−ＣＤやＮ−トリチル基のピークが見られないことから、ＨＥＥ−ＰＲＸは超分子構造を損なうことなく高純度で合成されたことが示された。図５に示すプロトン核磁気共鳴スペクトルの結果から、ポリロタキサンのβ−ＣＤに導入されたＨＥＥ基の修飾数がＰＲＸのβ−ＣＤ１分子あたり６．５３であることが明らかとなった。【００５３】
＜例２：ｐＨ酸分解性＞
１０ｍｇの１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３を２ｍＬの１０ｍＭ酢酸緩衝食塩水（ｐＨ５．０）、または１０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）（以下、「ＰＢＳ」と称することがある。）に溶解し、３７℃で所定の時間（１、３、６、１２、２４、４８時間）静置した。時間毎に１００μＬ回収し、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）２００μＬ、アセトニトリル（関東化学社製）３００μＬと混合した。０．２２μｍのフィルタ−を通し、ガラスバイアルに加え、高速液体クロマトグラフィー（日本分光社製）測定を行った。カラムとしてＣｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ  ｐａｃｋｅｄ  ｃｏｌｕｍｎ及びＣｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ  ｇｕａｒｄ  ｃｏｌｕｍｎ（ナカライテスク社製）、溶離液として超純水：アセトニトリル＝２０：８０を使用し、カラム温度４０℃、流速０．８ｍＬ／ｍｉｎにて測定を行い、１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３より脱離したＮ−トリチル基の２０５ｎｍにおける吸収強度を求めた。Ｎ−トリチル基が完全に脱離した際の吸収強度を１００％として、以下のようにしてＮ−トリチル基脱離率を算出した。結果を図６に示す。【００５４】
また、各ｐＨ、時間毎の１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３測定溶液を凍結乾燥し、溶離液を１０ｍＭ  ＬｉＢｒ含有ジメチルスルホオキシドとしたサイズ排除クロマトグラフィー分析（東ソー社製）により１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３の分解とβ−ＣＤの放出を確認した。結果を図７に示す。【００５５】
［試料］
（１）１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３（例１で作製）
（２）ＨＥＥ−ＰＲＸ【００５６】
［Ｎ−トリチル基脱離率の算出方法］
脱離率（％）＝｛（各ｐＨ、時間におけるＭｅ−ＰＲＸ溶液の吸収強度）／（Ｎ−トリチル基が完全に脱離した際の吸収強度）｝×１００【００５７】
図６の結果から、１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３はｐＨ５．０では３時間で６０．９％、２４時間で１００％のＮ−トリチル基が脱離したのに対し、ｐＨ７．４では４８時間後でも脱離率は１０．５％であった。また図７の結果より、Ｎ−トリチル基の脱離率に応じて１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３に由来したピークが減少し、β−ＣＤ由来のピークが増加した。以上の結果より、生理ｐＨ条件下ではＭｅ−ＰＲＸは安定であるが、酸性ｐＨ環境下では末端のＮ−トリチルが脱離し、ポリロタキサン構造が崩壊することが明らかとなった。図８の結果から、ＨＥＥ−ＰＲＸはｐＨ５．０では３時間で６６．９％，２４時間で９８．８％のＮ−トリチル基が脱離したのに対し，ｐＨ７．４では４８時間後でも脱離率は７．３３％であった。また図９の結果より、Ｎ−トリチル基の脱離率に応じてＨＥＥ−ＰＲＸに由来したピークが減少し、β−ＣＤ由来のピークが増加した。以上より、ＨＥＥ−ＰＲＸはＭｅ−ＰＲＸと同様に酸性ｐＨ環境下で末端のＮ−トリチルが脱離し、ポリロタキサン構造が崩壊することが明らかとなった。【００５８】
＜例３：温度応答性の評価＞
各濃度のＭｅ−ＰＲＸ（表１）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍＬに石英セル中で溶解させた。ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（日本分光社製）を用いて、６００ｎｍにおける透過率測定（昇温温度：１．０℃／ｍｉｎ）を行った。結果を図１０に示す。【００５９】
図１０の結果は、主軸高分子の異なる各Ｍｅ−ＰＲＸの透過率が２．５ｍｇ／ｍＬにおいて５０％となる温度（ＬＣＳＴ）は、１３．８Ｍｅ−Ｐ１０５（４６．９℃）＞１４．３Ｍｅ−Ｐ１２３（４０．０℃）＞１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３（３９．１℃）＞１５．３Ｍｅ−Ｐ８４（３３．１℃）＞１５．２Ｍｅ−Ｌ１２１（３０．６℃）の順に低下することを示している。各プルロニック（ポロキサマー）は分子鎖に占めるＰＰＧ部分の重量分率が異なるが、ＰＰＧ重量分率が増加するにつれてＬＣＳＴが低下することが明らかとなった。また、メチル基修飾数が異なるプルロニックＰ１２３を軸高分子としたＭｅ−ＰＲＸでは、６．３Ｍｅ−Ｐ１２３では４３．０℃、１４．１Ｍｅ−Ｐ１２３では３６．５℃、２１．０Ｍｅ−Ｐ１２３では３５．９℃であり、メチル基導入数の増加に伴いＬＣＳＴが低下することが明らかとなった。Ｍｅ−ＰＲＸは構成成分により相転移温度を調整することが可能であることが示された。【００６０】
＜例４：オートファジーの誘導評価＞
ＧＦＰ−ＬＣ３を安定発現するＨｅＬａ細胞を３５ｍｍガラスボトムディッシュに１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの濃度で播種し、１日インキュベ−ションした。下記試料をβ−シクロデキストリン濃度換算で１ｍＭとなるように培地中に加えた。２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行い、細胞中のＧＦＰ陽性のオートファゴソーム数を計測した。また、オートファジー阻害剤である３−メチルアデニン（メルク社製）を１０ｍＭの濃度で培地に添加した状態で前記と同様の実験を行った。結果を図１１に示す。【００６１】
［試料］
（１）１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３（例１で作製）
（２）メチル−β−シクロデキストリン（以下、「Ｍｅ−β−ＣＤ」と称する。；下記構造式（１）で表される化合物；シグマ−アルドリッチ社製；製品番号３３２６１５；構造式（１）では、前記メチル基の修飾がｘ個（ｘ＝０〜２１）の場合を示している。）
【化４】
2017188257.tif 000007
構造式（１）【００６２】
各試料を添加した細胞中のＧＦＰ−ＬＣ３陽性のオートファゴソーム数の計測を行った結果、１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３を作用させた細胞中には、未処理細胞、ＤＭ−β−ＣＤを作用させた細胞よりも有意に多いＧＦＰ−ＬＣ３陽性オートファゴソームが生成していることが確認された。これらの小胞は３−メチルアデニンにより生成数が減少したことより、オートファジーの誘導により生成したオートファゴソームであると考えられる。以上の結果より、Ｍｅ−ＰＲＸはオートファジーの誘導作用を示すことが明らかとなった。【００６３】
＜例５：細胞死の評価＞
９６ｗｅｌｌプレートにＨｅＬａ細胞を０．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、一日インキュベーションした。下記試料をβ−シクロデキストリン濃度換算で、各濃度培地に加えた。４８時間後にＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８（同仁化学研究所社製）を添加し、３７℃で１．５時間インキュベーションした。マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定することで、細胞生存率を評価した。結果を図１２に示す。また、オートファジー阻害剤である３−メチルアデニンを１０ｍＭの濃度で培地に添加した状態で、下記試料をβ−シクロデキストリン濃度換算で１２．２Ｍｅ−ＰＲＸを１ｍＭ、Ｍｅ−β−ＣＤを２ｍＭとなるように培地中に加えた。前記と同様の実験を行い、細胞生存率を評価した。結果を図１３に示す。【００６４】
［試料］
（１）１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３（例１で作製）
（２）ＨＥＥ−ＰＲＸ（例１で作製）
（３）Ｍｅ−β−ＣＤ【００６５】
各試料を添加した細胞の生存率を評価した結果、１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３を作用させた細胞は、ＨＥＥ−ＰＲＸやＭｅ−β−ＣＤを作用させた細胞よりも有意に細胞生存率が低下、つまり細胞死を強く誘導していた。この結果は１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３が、メチル化β−ＣＤを細胞内局所に放出し作用したためと考えられる。また３−メチルアデニンの存在下では、Ｍｅ−β−ＣＤを作用させた細胞は細胞生存率が低下したのに対し、１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３を作用させた細胞では細胞生存率が増加した。つまり１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３は、オートファジー阻害下では細胞死の誘導が抑制されたものと考えられる。以上の結果より、Ｍｅ−ＰＲＸはオートファジー細胞死の誘導作用を示すことが明らかとなった。【００６６】
＜例６：アポトーシス抵抗性細胞に対する細胞死の誘導評価＞
９６ｗｅｌｌプレートに、抗アポトーシス細胞としてアポトーシス亢進性タンパク質Ｂａｘ／ＢａｋをノックアウトしたＢａｘ／Ｂａｋ  ＤＫＯ  ＭＥＦ細胞を０．２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、一日インキュベーションした。Ｃａｓｐａｓｅ阻害剤であるｚＶＡＤ−ＦＭＫを５０μＭの濃度で培地に添加した状態で、下記試料をβ−シクロデキストリン濃度換算で、１２．２Ｍｅ−ＰＲＸを０．７５ｍＭ、Ｍｅ−β−ＣＤを２ｍＭとなるよう培地に加えた。４８時間後にＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８（同仁化学研究所社製）を添加し、３７℃で１．５時間インキュベーションした。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定することで、細胞生存率を評価した。結果を図１４に示す。【００６７】
［試料］
（１）１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３（例１で作製）
（２）Ｍｅ−β−ＣＤ
（３）２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン（以下、「ＤＭ−β−ＣＤ」と称することがある；下記構造式（２）で表される化合物；シグマ−アルドリッチ社製；製品番号Ｈ０５１３）
【化５】
2017188257.tif 000008
構造式（２）【００６８】
各試料を添加した細胞の生存率を評価した結果、Ｍｅ−β−ＣＤ、ＤＭ−β−ＣＤを作用させた細胞は、正常細胞 (ＷＴ  ＭＥＦ)と比較してアポトーシス抵抗性細胞 (Ｂａｘ／Ｂａｋ  ＤＫＯ  ＭＥＦ + ｚＶＡＤ)において細胞生存率が有意に増加していた。一方１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３を作用させた細胞では、ＷＴ  ＭＥＦ細胞の細胞生存率が７．５１％に対してＢａｘ／Ｂａｋ  ＤＫＯ  ＭＥＦ細胞 + ｚＶＡＤでは８．５０％であり，同等な殺細胞作用を示していた。この結果は、Ｍｅ−β−ＣＤやＤＭ−β−ＣＤがアポトーシスを誘導したのに対し、１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３はアポトーシスとは異なる細胞死を誘導したと考えられる。Ｍｅ−ＰＲＸによるオートファジー細胞死は、アポトーシス抵抗性細胞種に対して有意に細胞死を誘導するものと期待される。【００６９】
＜例７：ＮＰＣ病細胞中のコレステロール減少作用＞
健常者由来皮膚線維芽細胞（以下、「ＮＨＦ」と称する。Ｃｏｒｅｉｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手）、ニーマン・ピック病Ｃ型患者由来皮膚繊維芽細胞（以下、「ＮＰＣ１」と称する。Ｃｏｒｅｉｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手）を用い、以下のようにして細胞内のコレステロールの集積を調べた前記ＮＰＣ１をガラスボトムディッシュに播種し（細胞数：１×１０４個／ディッシュ）、３７℃で２４時間培養後、下記試料をシクロデキストリン濃度に換算して１０μＭ〜１０００μＭ添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。前記培養後、４％パラホルムアルデヒド溶液で細胞を固定し、５０μｇ／ｍＬに調製したフィリピン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）のＰＢＳ溶液を加え４５分間室温で静置した。ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点レーザー操作顕微鏡ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ１０ｉ（オリンパス社製）でコレステロールの局在を観察した。結果を図１５に示す。【００７０】
［試料］
（１）ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン  １０００μＭ（以下、「ＨＰ−β−ＣＤ」と称することがある；下記構造式（３）で表される化合物；シグマ−アルドリッチ社製；製品番号３３２６０７；構造式（３）では、前記ヒドロキシプロピル基の修飾がｘ個（ｘ＝１〜７）の場合を示している。）
（２）ＨＥＥ−ＰＲＸ（例１で作製）  １００μＭ（β−ＣＤ濃度換算）
（３）ＨＥＥ−ＰＲＸ  １０００μＭ（β−ＣＤ濃度換算）
（４）１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３（例１で作製）  １００μＭ（β−ＣＤ濃度換算）
（５）１２．２Ｍｅ−Ｐ１０３  １０００μＭ（β−ＣＤ濃度換算）
【化６】
2017188257.tif 000009
構造式（３）【００７１】
図１５の結果から、前記ＮＨＦ細胞に比べ、前記ＮＰＣ１細胞では多量のコレステロールが細胞内に沈着している様子が認められた。前記ＮＰＣ１細胞に対し、前記ＨＰ−β−ＣＤを１０００μＭの濃度で作用させると蛍光強度が減少したことより、コレステロールの排泄が促進されたと予想される。一方、細胞内分解性結合を有するＨＥＥ−ＰＲＸでは１０００μＭの濃度で処理した場合には、前記ＮＨＦ細胞と同程度まで蛍光強度が減少し、前記ＨＰ−β−ＣＤよりも優れたコレステロール除去作用が示された。Ｍｅ−ＰＲＸ（１２．２Ｍｅ−ＰＲＸ）で処理したＮＰＣ１細胞も、前記ＮＨＦ細胞と同程度まで蛍光強度が減少し、前記ＨＰ−β−ＣＤよりも優れたコレステロール除去作用が示された。【００７２】
本明細書には、本発明の好ましい実施態様を示してあるが、そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは、当業者には明らかであり、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、様々な変形、変更、置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が、本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また、本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む、全ての刊行物に記載の内容は、その引用によって、本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
上記のとおり、粉末状の水酸化ナトリウム存在下で酸分解性ポリロタキサンとヨウ化メチルを反応させる工程を含む製造方法によって、メチル化された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物が製造された。特に、メチル化された複数のβ−シクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物は、リソソーム内のコレステロールの過剰蓄積を原因とするニーマン・ピック病Ｃ型などのライソゾーム病の治療もしくは予防、癌、特にアポトーシス耐性の癌の治療等において有用となりうる。
【図１】
2017188257.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2017188257.tif 000019
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年10月24日(2017.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
メチル化された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の製造方法であって、ポロキサマーの両末端に一級アミノ基を有するポロキサマーを得る工程、前記ポロキサマーとβ−シクロデキストリンとを反応させて擬ポリロタキサンを得る工程、前記擬ポリロタキサンの両末端をＮ−トリチルグリシンでキャッピングする工程、および粉末状の水酸化ナトリウム存在下で酸分解性ポリロタキサンとヨウ化メチルを反応させる工程を含む、製造方法。
【請求項１５】
メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞においてオートファジー細胞死を誘導するための組成物。
【請求項１６】
メチル化された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、オートファジー細胞死を誘導することにより、癌を治療するための医薬組成物。
【請求項１７】
癌がアポトーシス耐性の癌である、請求項１６記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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