(57)【要約】  本発明の課題は、パノビノスタットまたはその塩を含有し、骨髄への高いターゲッティング能を示す脂質粒子組成物、および上記脂質粒子組成物を含む医薬組成物を提供することである。本発明によれば、パノビノスタットまたはその塩を含有する脂質粒子組成物であって、脂質粒子がリン脂質およびコレステロール類を含む脂質粒子組成物が提供される。
2018124033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パノビノスタットまたはその塩を含有する脂質粒子組成物であって、脂質粒子がリン脂質およびコレステロール類を含む脂質粒子組成物。
【請求項２】
パノビノスタットまたはその塩を含有する脂質粒子組成物であって、パノビノスタット量として４ｍｇ／ｋｇの脂質粒子組成物をマウスの尾静脈に単回投与した後から無限時間までの、下記式１で表される面積比が５以上である脂質粒子組成物。
式１：  （骨髄中濃度−時間曲線下面積）／（消化管中濃度−時間曲線下面積）
【請求項３】
脂質粒子の平均粒子径が５０ｎｍ〜５００ｎｍである、請求項１または２に記載の脂質粒子組成物。
【請求項４】
リモートローディング法によりパノビノスタットまたはその塩が脂質粒子に内包されている、請求項１から３の何れか一項に記載の脂質粒子組成物。
【請求項５】
パノビノスタットまたはその塩の固化物が脂質粒子の表面および内部の少なくとも一部に存在している、請求項１から４の何れか一項に記載の脂質粒子組成物。
【請求項６】
脂質粒子がリン脂質およびコレステロール類を含む、請求項２から５の何れか一項に記載の脂質粒子組成物。
【請求項７】
リン脂質として、グリセロール骨格を有するリン脂質を含む、請求項１から６の何れか一項に記載の脂質粒子組成物。
【請求項８】
グリセロール骨格を有するリン脂質が、ホスファチジルコリンである、請求項７に記載の脂質粒子組成物。
【請求項９】
リン脂質として、スフィンゴリン脂質を含む、請求項１から６の何れか一項に記載の脂質粒子組成物。
【請求項１０】
スフィンゴリン脂質が、スフィンゴミエリンである、請求項９に記載の脂質粒子組成物。
【請求項１１】
リン脂質が、炭素数２０以上の脂肪酸残基を含む、請求項１から１０の何れか一項に記載の脂質粒子組成物。
【請求項１２】
脂質粒子が、ポリエチレングリコール脂質をさらに含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の脂質粒子組成物。
【請求項１３】
脂質粒子を構成する全脂質におけるポリエチレングリコール脂質の比率が５モル％以下である、請求項１２に記載の脂質粒子組成物。
【請求項１４】
脂質粒子が、ポリエチレングリコール脂質を実質的に含まない、請求項１から１１の何れか一項に記載の脂質粒子組成物。
【請求項１５】
脂質粒子が、アニオン性脂質を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の脂質粒子組成物。
【請求項１６】
請求項１から１５の何れか一項に記載の脂質粒子組成物を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
抗がん剤である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パノビノスタットまたはその塩を含有する脂質粒子組成物、および上記脂質粒子組成物を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
パノビノスタットは、 多発性骨髄腫の治療に用いられるヒドロキサム酸誘導体であり、非選択的ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬の一つである。パノビノスタットは、商品名ファリーダック（登録商標）としてカプセル型経口剤の形態で市販されている。【０００３】
一方、リポソーム製剤によって、薬剤をがんに集積させ、長期間に渡って曝露させることが多く検討されている。リポソーム製剤とは、脂質膜からなるリポソーム中に薬物を内包した製剤である。【０００４】
例えば、非特許文献１には、骨髄を標的としたリポソーム製剤が記載されている。非特許文献１には、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−（３−カルボキシル−１−オキソプロピル）−１，５−ジヘキサデシルエステル（ＳＡ脂質）、およびポリ（エチレングルコール）を含むリポソームが記載されており、ＳＡ脂質成分が骨髄食細胞による食作用を誘導する活性因子であることが記載されている。【０００５】
非特許文献２には、シタラビンとダウノルビシンを内包するリポソーム（ＣＰＸ−３５１）が、高い骨髄集積性を示すことが記載されている。非特許文献２には、ＣＰＸ−３５１の骨髄における蓄積が、正常マウスにおいては空リポソームと比較して２０％〜５０％高く、白血病モデルマウスにおいては空リポソームと比較して７５％高いことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Keitaro Sou et al., Expert Opin Drug Deliv. 2011 March ; 8(3): 317-328
【非特許文献２】Abstract 5534: Liposome accumulation within leukemia engrafted bone marrow is significantly enhanced when the formulation contains cytarabine plus daunorubicin,, Sharon A. Johnstone, Sherwin Xie, Troy Harasym, Lawrence Mayer and Paul G. Tardi, DOI: 10.1158/1538-7445.AM10-5534 Published 15 April 2010, Proceedings: AACR 101st Annual Meeting 2010, Apr 17‐21, 2010; Washington, DC
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の通り、高い骨髄集積性を示すリポソームについての数例の報告はあるが、パノビノスタットまたはその塩を含有し、骨髄への高いターゲッティング能を示すリポソーム組成物についての知見はない。本発明は、パノビノスタットまたはその塩を含有し、骨髄への高いターゲッティング能を示す脂質粒子組成物、および上記脂質粒子組成物を含む医薬組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、パノビノスタットまたはその塩を含有する脂質粒子組成物であって、脂質粒子がリン脂質およびコレステロール類を含む脂質粒子組成物が、骨髄への高いターゲッティング能を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、下記を提供する。
［１］  パノビノスタットまたはその塩を含有する脂質粒子組成物であって、脂質粒子がリン脂質およびコレステロール類を含む脂質粒子組成物。
［２］  パノビノスタットまたはその塩を含有する脂質粒子組成物であって、パノビノスタット量として４ｍｇ／ｋｇの脂質粒子組成物をマウスの尾静脈に単回投与した後から無限時間までの、下記式１で表される面積比が５以上である脂質粒子組成物。
式１：  （骨髄中濃度−時間曲線下面積）／（消化管中濃度−時間曲線下面積）
［３］  脂質粒子の平均粒子径が５０ｎｍ〜５００ｎｍである、［１］または［２］に記載の脂質粒子組成物。
［４］  リモートローディング法によりパノビノスタットまたはその塩が脂質粒子に内包されている、［１］から［３］に記載の脂質粒子組成物。
［５］  パノビノスタットまたはその塩の固化物が脂質粒子の表面および内部の少なくとも一部に存在している、［１］から［４］の何れか一項に記載の脂質粒子組成物。
［６］  脂質粒子がリン脂質およびコレステロール類を含む、［２］から［５］の何れか一項に記載の脂質粒子組成物。
［７］  リン脂質として、グリセロール骨格を有するリン脂質を含む、［１］から［６］の何れか一項に記載の脂質粒子組成物。
［８］  グリセロール骨格を有するリン脂質が、ホスファチジルコリンである、［７］に記載の脂質粒子組成物。
［９］  リン脂質として、スフィンゴリン脂質を含む、［１］から［６］の何れか一項に記載の脂質粒子組成物。
［１０］  スフィンゴリン脂質が、スフィンゴミエリンである、［９］に記載の脂質粒子組成物。
［１１］  リン脂質が、炭素数２０以上の脂肪酸残基を含む、［１］から［１０］の何れか一項に記載の脂質粒子組成物。
［１２］  脂質粒子が、ポリエチレングリコール脂質をさらに含む、［１］から［１１］の何れか一項に記載の脂質粒子組成物。
［１３］  脂質粒子を構成する全脂質におけるポリエチレングリコール脂質の比率が５モル％以下である、［１２］に記載の脂質粒子組成物。
［１４］  脂質粒子が、ポリエチレングリコール脂質を実質的に含まない、［１］から［１１］の何れか一項に記載の脂質粒子組成物。
［１５］  脂質粒子が、アニオン性脂質を含む、［１］から［１４］のいずれか一項に記載の脂質粒子組成物。
［１６］  ［１］から［１５］の何れか一項に記載の脂質粒子組成物を含む、医薬組成物。
［１７］  抗がん剤である、［１６］に記載の医薬組成物。【００１０】
［１８］  ［１］から［１７］の何れか一に記載の脂質粒子組成物を対象に投与することを含む、対象の処置方法。
［１９］  がんの治療において使用するための、［１］から［１７］の何れか一に記載の脂質粒子組成物。
［２０］  医薬組成物の製造のための、［１］から［１７］の何れか一に記載の脂質粒子組成物の使用。
［２１］  抗がん剤の製造のための、［１］から［１７］の何れか一に記載の脂質粒子組成物の使用。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の脂質粒子組成物および医薬組成物は、骨髄への高いターゲッティング能を示す。本発明の脂質粒子組成物および医薬組成物によれば、治療指数を向上した医薬組成物を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、パノビノスタット含有脂質粒子の透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ;  ＴＥＭ）による画像を示す。
【図２】図２は、パノビノスタット含有脂質粒子またはパノビノスタット溶液の投与後の血漿中のパノビノスタット濃度の測定の結果を示す。
【図３】図３は、パノビノスタット含有脂質粒子またはパノビノスタット溶液の投与後の組織中のパノビノスタット濃度の測定の結果を示す。
【図４】図４は、Ｍｏｌｍ−１３同所モデルマウスにおける白血病細胞への増殖阻害活性を測定した結果を示す。
【図５】図５は、骨髄中マクロファージ数および細胞中脂質粒子量を解析した結果を示す。
【図６】図６は、骨髄中のサイトカインの発現を解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００１４】
「空リポソーム」とは、薬物を含有していないリポソームを意味する。
「放出」とは、脂質粒子（リポソームなど）に含有された薬物が、脂質粒子（リポソームなど）を構成する脂質膜を通過して、脂質粒子（リポソームなど）の外部へ出ることを意味する。
「血中滞留性」とは、脂質粒子（リポソームなど）組成物を投与した対象において、脂質粒子（リポソームなど）に封入された状態の薬物が血液中に存在する性質を意味する。
【００１５】
「脂質粒子（リポソームなど）の平均粒子径」とは、脂質粒子（リポソームなど）組成物中に存在する脂質粒子（リポソームなど）の体積平均粒子径を意味する。本発明の脂質粒子組成物中に含まれる脂質粒子の平均粒子径は動的光散乱法を用いて測定する。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、濃厚系粒子アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子社製）、ナノトラックＵＰＡ（日機装社製）およびナノサイザー（マルバーン社製）等が挙げられる。
【００１６】
「対象」とは、疾病等の予防若しくは治療を必要とするヒト、マウス、サル、家畜等の哺乳動物であり、好ましくは、疾病等の予防若しくは治療を必要とするヒトである。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の脂質粒子組成物は、パノビノスタットまたはその塩を含有する脂質粒子組成物であって、脂質粒子がリン脂質およびコレステロール類を含む脂質粒子組成物である。
【００１８】
（脂質粒子）
脂質粒子とは、脂質から構成される粒子を意味し、特に限定されない。本発明の脂質粒子には、脂質二分子膜より構成される閉鎖小胞体であるラメラ構造を持つリポソームが含まれる。リポソームとは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。内水相には、水等が含まれる。リポソームは通常、閉鎖小胞外の水溶液（外水相）に分散した状態で存在する。リポソームはシングルラメラ（単層ラメラまたはユニラメラとも呼ばれ、二重層膜が一重の構造である。）であっても、多層ラメラ（マルチラメラとも呼ばれ、タマネギ状の形状の多数の二重層膜の構造である。個々の層は水様の層で仕切られている。）であってもよいが、本発明では、医薬用途での安全性および安定性の観点から、シングルラメラのリポソームであることが好ましい。
【００１９】
本発明の脂質粒子には、前述のリポソームのような脂質二分子膜構造（ラメラ構造）を持たない、粒子内部も構成成分が詰まった構造を持つ粒子も含まれる。
脂質形成の形態は、電子顕微鏡観察またはエックス線を用いた構造解析などにより確認できる。例えば、Ｃｒｙｏ透過型電子顕微鏡観察（ＣｒｙｏＴＥＭ法）を用いた方法により、リポソームのように脂質粒子が脂質二分子膜構造（ラメラ構造）および内水層を持つ構造、またはリポソームのように脂質粒子が脂質二分子膜構造（ラメラ構造）および内水層を持たず粒子内部に電子密度が高いコアを持っていることから、脂質をはじめとする構成成分が詰まった構造を有していることを確認できる。エックス線小角散乱（ＳＡＸＳ）測定によっても、脂質粒子が脂質二分子膜構造（ラメラ構造）の有無を確認できる。
【００２０】
脂質粒子は、薬物を内包することのできる脂質粒子であれば、その形態は特に限定されない。「内包」とは、脂質粒子に対して薬物が内水相および／または膜自体に含まれる形態をとることを意味する。例えば、膜で形成された閉鎖空間内に薬物を封入する形態、膜自体に内包する形態等が挙げられ、これらの組合せでもよい。
【００２１】
脂質粒子の平均粒子径は、一般的には１０ｎｍ〜１０００ｎｍであり、５０ｎｍ〜５００ｎｍが好ましく、１００ｎｍ〜５００ｎｍがより好ましく、１００ｎｍ〜３００ｎｍがさらに好ましい。
脂質粒子は球状またはそれに近い形態をとることが好ましい。
【００２２】
本発明にかかる脂質粒子のゼータ電位は、とく印限定されないが、好ましくは−１０ｍＶ以下であり、より好ましくは−１５ｍＶ以下であり、さらに好ましくは−２０ｍＶ以下であり、−２５ｍＶ以下とすることも好ましく、−３０ｍＶ以下とすることもより好ましい。
【００２３】
脂質粒子の脂質二重層を構成する成分は、脂質から選ばれる。脂質として、水溶性有機溶媒およびエステル系有機溶媒の混合溶媒に溶解するものを任意に使用することができる。脂質としては、例えば、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類、リゾリン脂質およびそれらの誘導体等が挙げられる。これらの成分は、単一種または複数種の成分から構成されてよい。本発明における脂質粒子は、少なくとも、リン脂質およびコレステロール類を含む。
【００２４】
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、カルジオリピン等の天然もしくは合成のリン脂質、またはこれらに水素添加したもの（例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ））等が挙げられる。なお、本発明において、「リン脂質」とはリン脂質に修飾を加えたリン脂質誘導体も包含する。
【００２５】
本発明においては、リン脂質としては、グリセロール骨格を有するリン脂質を含むことが好ましい。グリセロール骨格を有するリン脂質としては、ホスファチジルコリンが特に好ましい。ホスファチジルコリンとしては、１，２−ｄｉａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ等を使用することができる。また、本発明においては、リン脂質として、スフィンゴリン脂質を含むことも好ましい。スフィンゴリン脂質としては、スフィンゴミエリンなどを使用することができる。
【００２６】
本発明におけるリン脂質は、炭素数２０以上の脂肪酸残基を含むことが、パノビノスタットまたはその塩の放出を低減し、血中滞留性を向上させるという観点から、好ましい。
【００２７】
リン脂質以外の脂質としては、リン酸を含まない脂質が挙げられ、例えば、リン酸部分をその分子内に有しないグリセロ脂質、リン酸部分をその分子内に有しないスフィンゴ脂質等が挙げられる。なお、本発明において、「リン脂質以外の脂質」とはリン脂質以外の脂質に修飾を加えたリン脂質以外の脂質の誘導体も包含する。
【００２８】
コレステロール類としては、シクロペンタヒドロフェナントレンを基本骨格とし、その一部あるいはすべての炭素が水素化されているコレステロールおよびその誘導体を挙げることができる。例えば、コレステロールが挙げられる。脂質粒子の平均粒子径を１００ｎｍ以下に微細化していくと脂質膜の曲率が高くなる。脂質粒子において配列した膜のひずみも大きくなる。脂質による膜のひずみを埋める（膜安定化効果）ために、コレステロール等を添加することが有効である。
【００２９】
脂質粒子において、コレステロールの添加は、脂質粒子の膜のすきまを埋めること等により、脂質粒子の膜の流動性を下げることが期待される。
【００３０】
本発明に係る脂質粒子を構成する脂質の合計量に対するコレステロール類の含有率は１０ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ％が好ましく、２０ｍｏｌ％〜４５ｍｏｌ％がより好ましく、３０ｍｏｌ％〜４５ｍｏｌ％がさらに好ましく、３５ｍｏｌ％〜４５ｍｏｌ％がとくに好ましい。
【００３１】
本発明における脂質粒子は、親水性高分子で修飾した脂質を含んでいてもよい。
親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類、ポリプロピレングリコール類、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、合成ポリアミノ酸等が挙げられる。上記の親水性高分子は、それぞれ単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００３２】
これらの中でも、組成物の血中滞留性の観点から、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類およびポリプロピレングリコール類が好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリセリン（ＰＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）がより好ましい。汎用性および血中滞留性の観点から、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がさらに好ましい。
【００３３】
ポリエチレングリコールの重量平均分子量は、特に限定されないが、５００〜１０，０００ダルトンであり、好ましくは１，０００〜７，０００ダルトンであり、より好ましくは２，０００〜５，０００ダルトンである。
【００３４】
本発明における脂質粒子の第一の態様としては、脂質粒子に含まれる主たる脂質とともに、ＰＥＧによって修飾された脂質（ポリエチレングリコール脂質）を用いることが好ましい。ポリエチレングリコール脂質としては、例えば、１、２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ５０００（日本油脂社製）およびジステアロイルグリセロール−ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）等の１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールが挙げられる。
【００３５】
脂質粒子を構成する全脂質におけるポリエチレングリコール脂質の比率は、一般的には０．０１〜１０モル％であり、好ましくは０．０５〜８モル％であり、より好ましくは０．１〜７モル％であり、５モル％以下とすることも好ましく、１モル％以下とすることもより好ましい。
【００３６】
本発明における脂質粒子の第二の形態としては、脂質粒子が実質的にポリエチレングリコール脂質を含まないことが好ましい。
【００３７】
本発明における脂質粒子は、脂質粒子に含まれる主たる脂質とともにアニオン性の脂質を含むことも好ましい。アニオン性の脂質としては、例えば、１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＧ−６０６０ＬＳ、日油製）などのホスファチジルグリセロールを有する脂質、１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ，  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＡ−６０６０ＬＳ、日油製）などのホスファチジン酸を有する脂質、１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ，  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＳ−６０６０ＬＳ、日油製）などのホスファチジルセリンを有する脂質、１−Ｓｔｅａｒｏｙｌ−２−ｌｙｓｏ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−  ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＣＯＴＳＯＭＥ  ＭＣ−８０Ｈ、日油製）などのリゾリン脂質、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ（ＣＨＥＭＳ，Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）などのアニオン性基を有するステロイド誘導体、ステアリン酸などの脂肪酸などが挙げられる。
【００３８】
脂質粒子を構成する全脂質におけるアニオン性脂質の比率は、とくに限定されないが、０．０１〜５０モル％であり、好ましくは０．０５〜３０モル％であり、より好ましくは０．１〜１０モル％である。アニオン性脂質はＰＥＧ脂質と組み合わせて使用してもよく、ＰＥＧ脂質は用いずいに単独で用いてもよい。また、上記の親水性高分子は、それぞれ単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００３９】
脂質粒子には、上記の成分の他に、血中滞留性の改善のために親水性高分子等、膜構造の安定剤として脂肪酸またはジアセチルホスフェート等、抗酸化剤としてα−トコフェロール等を加えてもよい。本発明では、医薬用途において静脈注射用途での使用が認められていない分散助剤等の添加剤、例えば、界面活性剤等を用いないことが好ましい。
【００４０】
（パノビノスタット）
本発明の脂質粒子組成物は、薬物としてパノビノスタットまたはその塩を含有する。
パノビノスタット（Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）は、多発性骨髄腫の治療に用いられるヒドロキサム酸誘導体であり、非選択的ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬の一つである。パノビノスタットの化学構造を以下に示す。
【００４１】
【化１】
2018124033.tif 000003
【００４２】
パノビノスタットの塩としては、通常知られているアミノ基などの塩基性基における塩を挙げることができる。
塩基性基における塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、ホウ酸、硝酸および硫酸などの鉱酸との塩；ギ酸、酢酸、乳酸、クエン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、トリクロロ酢酸およびトリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩；ならびにメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩が挙げられる。パノビノスタットの塩の一例としては、パノビノスタットの乳酸塩を挙げることができ、その構造を以下に示す。
【００４３】
【化２】
2018124033.tif 000004
【００４４】
（脂質粒子組成物に含有されるパノビノスタットまたはその塩）
本発明の脂質粒子組成物においては、脂質粒子内におけるパノビノスタットまたはその塩の存在状態は特に限定しないが、後述のように空リポソームとの骨髄への集積性の違いから、パノビノスタットまたはその塩の少なくとも一部は脂質粒子を認識する血液中のたんぱく質またはマクロファージ等の細胞による認識に影響を与える形態で存在しているものと推定される。すなわち、パノビノスタットまたはその塩の一部が脂質粒子の膜表面に存在しているか、膜表面に存在する脂質分子の運動性に影響を与える状態で存在していると推定される。
【００４５】
本発明の脂質粒子組成物において、内包されるパノビノスタットまたはその塩が高濃度である場合、パノビノスタットまたはその塩の存在状態としては、図１のＴＥＭ画像から読み取れるように、パノビノスタットまたはその塩のうちの一部が、固化物として、脂質粒子の表面および内部の少なくとも一部に存在している場合がある。このような場合においても、パノビノスタットまたはその塩の残部は、脂質粒子の内水相に溶解状態で存在していてもよい。ここで、溶解状態とは、脂質粒子の体積に対して充填した薬物の量が、その内水相の組成液での薬物の飽和溶解度以下の場合、溶解状態で内包されたものとみなす。また、飽和溶解度以上においても、Ｃｒｙｏ−ＴＥＭ［凍結試料の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による観察］で薬物結晶が観察されない、またはＸＲＤ測定で結晶格子に起因する回折パターンが観察されない場合、脂質粒子に内包された薬物の大部分が溶解し、溶解状態で存在するものとみなせる。
【００４６】
本発明において、固化物とは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により観察できる固体を意味する。
【００４７】
（パノビノスタットまたはその塩／脂質比）
本発明における脂質粒子におけるパノビノスタットまたはその塩／脂質比は１０〜５００ｍｇ／ｍｍｏｌであり、２０〜４００ｍｇ／ｍｍｏｌが好ましく、３０〜３００ｍｇ／ｍｍｏｌがより好ましい。パノビノスタットの塩を含む場合、パノビノスタットまたはその塩／脂質比においてはパノビノスタットとして換算した量で計算する。なお、パノビノスタットまたはその塩／脂質比における脂質とは、脂質粒子を構成する脂質すべてを意味し、脂質にはコレステロールやリゾリン脂質も含まれる。
【００４８】
（脂質粒子組成物）
本発明の脂質粒子組成物においては、パノビノスタット量として４ｍｇ／ｋｇの脂質粒子組成物をマウスの尾静脈に単回投与した後から無限時間までの、下記式１で表される面積比が１より大きいことが好ましく、２以上がより好ましく、３以上がより一層好ましく、５以上がさらに好ましく、１０以上がさらに一層好ましく、１２以上が特に好ましい。
式１：  （骨髄中濃度−時間曲線下面積）／（消化管中濃度−時間曲線下面積）
【００４９】
本発明の脂質粒子組成物においては、下記の式２で示される骨髄集積率（％ＩＤ／ｇ）が、好ましくは１０％ＩＤ／ｇ以上であり、より好ましくは１５％ＩＤ／ｇ以上であり、より好ましくは２０％ＩＤ／ｇ以上であり、さらに好ましくは３０％ＩＤ／ｇ以上であり、特に好ましくは４０％ＩＤ／ｇ以上である。本発明の実施例に示す骨髄集積率は、ＤｉＩ（１，１’−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−３，３，３’，３’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ）で標識したパノビノスタット含有脂質粒子組成物（パノビノスタット量として６ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇ）をマウスの尾静脈に投与した後７２時間後における、大腿骨骨髄１ｇ当たりの投与した脂質粒子のうち骨髄に集積した割合（％  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｄｏｓｅ／ｇ）として求めたものであり、下記式２で示される。
式２：骨髄集積率（％ＩＤ／ｇ）＝骨髄中ＤｉＩ濃度（ｎｇ／ｇ）／（投与液中ＤｉＩ濃度（ｎｇ／ｍＬ）×投与容量（ｍＬ））×１００
【００５０】
上記の骨髄集積率（％ＩＤ／ｇ）を求めるためには、本発明で使用したＤｉＩとは異なる標識を使用してもよいし、標識を用いず、脂質粒子を構成する脂質をトレースすることにより骨髄集積率を求めてもよい。また、本発明の実施例に示すように脂質粒子組成物をあらかじめ標識しておく方法のほかにも、実施例２５に示すように脂質粒子組成物をあとから標識する方法を用いて骨髄集積率を求めることもできる。
【００５１】
本発明の脂質粒子組成物は、パノビノスタットまたはその塩を含有する脂質粒子と、上記脂質粒子を分散する水性溶媒とを含むことができる。
【００５２】
本発明の脂質粒子組成物は、投与経路に関連して、医薬的に許容される等張化剤、安定化剤、酸化防止剤、およびｐＨ調整剤の少なくとも一種を含んでもよい。
【００５３】
等張化剤としては、特に限定されないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムのような無機塩類、グリセロール、マンニトール、ソルビトールのようなポリオール類、グルコース、フルクトース、ラクトース、またはスクロースのような糖類が挙げられる。
【００５４】
安定化剤としては、特に限定されないが、例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、またはスロースのような糖類が挙げられる。
【００５５】
酸化防止剤としては、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸、尿酸、トコフェロール同族体（例えば、ビタミンＥ、トコフェロールα、β、γ、δの４つの異性体）、システイン、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、没食子酸プロピル、ＢＨＴ（ジブチルヒドロキシトルエン）、ＢＨＡ（ブチルヒドロキシアニソール）、ピロ亜硫酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤および酸化防止剤は、それぞれ単独でまたは２種以上組み合わせて使用することができる。
【００５６】
ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、クエン酸、酢酸、トリエタノールアミン、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム等が挙げられる。
【００５７】
本発明の脂質粒子組成物は、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、塩化ナトリウム、糖類、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される添加物を含有してもよい。
【００５８】
本発明の脂質粒子組成物を充填する容器は、特に限定されないが、酸素透過性が低い材質であることが好ましい。例えば、プラスチック容器、ガラス容器、アルミニウム箔、アルミ蒸着フィルム、酸化アルミ蒸着フィルム、酸化珪素蒸着フィルム、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリ塩化ビニリデン、等をガスバリア層として有するラミネートフィルムによるバック等が挙げられ、必要に応じて、着色ガラス、アルミニウム箔やアルミ蒸着フィルム等を使用したバック等を採用することで遮光することもできる。
【００５９】
脂質粒子組成物を充填する容器において、容器内の空間部に存在する酸素による酸化を防ぐために、容器空間部および薬液中のガスを窒素等の不活性ガスで置換することが好ましい。例えば、注射液を窒素バブリングし、容器への充填を窒素雰囲気下で行うことが挙げられる。
【００６０】
脂質粒子組成物中の脂質や原薬の分解を防ぐために、凍結乾燥を行うことも好ましい。例えば、スクロースを含む水相に脂質粒子を分散させ、凍結乾燥を行うことが上げられる。
【００６１】
（脂質粒子組成物の製造方法）
本発明の脂質粒子組成物の製造方法は、特に限定されないが、一例としては、
（ａ）油相の調製；
（ｂ）水相の調製；
（ｃ）乳化による脂質粒子形成；
（ｄ）エクストルーダーによる整粒；
（ｅ）透析による脂質粒子外水相液の置換；
（ｆ）リモートローディングによるパノビノスタットの脂質粒子への内包；および
（ｇ）透析による外水相パノビノスタットの除去：
という工程により製造することができる。
【００６２】
＜（ａ）油相の調製＞
（ａ）油相の調製においては、脂質粒子を構成する各成分（リン脂質、コレステロール類など）と有機溶媒とを混合し、混合物を加温して上記成分を溶解することにより油相を製造することができる。
油相において使用する有機溶媒は特に限定されないが、例えば、水と任意に混じりあう水溶性有機溶媒を用いることが出来る。
【００６３】
水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノールおよびｔ−ブタノール等のアルコール類、グリセリン、エチレングリコールおよびプロピレングリコール等のグリコール類、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール類等が挙げられる。これらのなかでも、アルコール類が好ましい。アルコール類としては、エタノール、メタノール、２−プロパノールおよびｔ−ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、エタノール、２−プロパノールおよびｔ−ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることがより好ましく、エタノールであることがさらに好ましい。
【００６４】
脂質の濃度は、特に限定されず、適宜調整することが可能である。
【００６５】
＜（ｂ）水相の調製＞
水相としては、水（蒸留水、注射用水等）、生理食塩水、各種緩衝液または糖類の水溶液およびこれらの混合物（水性溶媒）を使用することができる。本発明において、後述するリモートローディングによってパノビノスタットを脂質粒子へ内包させる場合には、水相としてアンモニウム塩を含む水溶液を使用することが好ましい。
【００６６】
緩衝液としては、有機系、無機系に限定されることはないが、体液に近い水素イオン濃度付近に緩衝作用を有する緩衝液が好適に用いられ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液およびグッドバッファー等が挙げられる。脂質粒子の内水相は、脂質粒子を製造する際に、脂質粒子を分散する水溶液であってもよいし、新たに添加される、水、生理食塩水、各種緩衝液または糖類の水溶液およびこれらの混合物であってもよい。外水相または内水相として用いる水は、不純物（埃、化学物質等）を含まないことが好ましい。
【００６７】
生理食塩水とは、人体と等張になるように調整された無機塩溶液を意味し、さらに緩衝機能を持っていてもよい。生理食塩水としては、塩化ナトリウムを０．９ｗ／ｖ％（質量／体積パーセント）含有する食塩水、ＰＢＳおよびトリス緩衝生理食塩水等が挙げられる。
【００６８】
本発明において、水相とは、外水相および内水相の両方を包含する。
本発明における外水相とは、脂質粒子を分散する水溶液を意味する。例えば注射剤の場合においては、バイアル瓶またはプレフィルドシリンジ包装されて保管された脂質粒子の分散液の脂質粒子の外側を占める溶液が外水相となる。また、添付された分散用液またはその他溶解液により投与時に用時分散した液についても同様に、脂質粒子の分散液の脂質粒子の外側を占める溶液が外水相となる。
本発明における内水相とは、脂質粒子の脂質二重膜を隔てた閉鎖小胞内の水相を意味する。
【００６９】
＜（ｃ）乳化による脂質粒子形成＞
乳化工程では、少なくとも１種の脂質が有機溶媒に溶解している油相と水相とを混合して脂質を含む水溶液を攪拌して乳化することができる。脂質が有機溶媒に溶解している油相および水相を混合し撹拌し、乳化することで、油相および水相がＯ／Ｗ型（水中油型）に乳化した乳化液が調製される。混合後、油相由来の有機溶媒の一部または全部を蒸発によって除去することにより、脂質粒子が形成される。または、油相中の有機溶媒の一部または全部が撹拌・乳化の過程で蒸発して、脂質粒子が形成される。
【００７０】
撹拌する方法としては、粒子微細化のために、超音波または機械的せん断力が用いられる。また、粒子径の均一化のためには、一定の孔径のフィルターを通すエクストルーダー処理またはマイクロフルイダイザー処理を行うことができる。エクストルーダー等を用いれば、副次的に形成された多胞脂質粒子をばらして単胞脂質粒子にすることができる。
【００７１】
乳化工程は、乳化する工程であれば限定されることはないが、好ましくは高せん断をかけ、有機溶媒を含む乳化工程で微粒子化する工程である。必要に応じて、乳化工程で用いた有機溶媒を蒸発させる（脱溶媒する）ことで脂質粒子を形成することができる。
【００７２】
脂質粒子を製造する際の乳化工程の液温は、適宜調整することが可能であるが、油相と水相との混合時の液温を使用する脂質の相転移温度以上とすることが好ましく、例えば、相転移温度が３５〜４０℃の脂質を使用する場合、３５℃〜７０℃とすることが好ましい。
【００７３】
乳化工程においては、脂質粒子を含む水溶液から有機溶媒と水を蒸発させてもよい。ここで言う蒸発とは、油相由来の有機溶媒と水相由来の水の一部または全部を蒸発工程として強制的に除去してもよいし、油相由来の有機溶媒と水相由来の水の一部または全部が撹拌・乳化の過程で自然に蒸発するものでもよい。
【００７４】
蒸発の方法は、特に限定されないが、例えば、有機溶媒と水を加熱することにより蒸発させる工程、乳化後に静置または緩やかな撹拌を継続する工程、および真空脱気を行う工程の少なくとも一つを行えばよい。
【００７５】
＜（ｄ）エクストルーダーによる整粒＞
得られた脂質粒子は、透析法、ろ過法またはエクストルージョン処理等を用いて粒径を均一にすることができる。
エクストルージョン処理とは、細孔を有するフィルターに脂質粒子を通過させることで、物理的なせん断力を施し、微粒化する工程を意味する。脂質粒子を通過させる際、脂質粒子分散液およびフィルターを、脂質粒子を構成する膜の相転移温度以上の温度に保温することで、速やかに微粒化することができる。
なお、エクストルーダーによる整粒は行ってもよいし、行わなくてもよい。
【００７６】
＜（ｅ）透析による脂質粒子外水相液の置換＞
本発明において、リモートローディングによってパノビノスタットを脂質粒子へ内包させる場合には、透析により脂質粒子外水相液を置換してもよい。透析液として、０．１〜５質量％のＮａＣｌ水溶液を使用することができるが、特に限定されない。上記した透析液を用いて、脂質粒子液を透析することにより、外水相に存在するアンモニウム塩を除去し、透析液で外水相を置換した脂質粒子を得ることができる。
【００７７】
＜（ｆ）リモートローディング法によるパノビノスタットの脂質粒子への内包＞
本発明においては、リモートローディング法によってパノビノスタットを脂質粒子へ内包させることが好ましい。
【００７８】
本発明においてリモートローディング法とは、薬物が内封されていない空リポソームを製造し、リポソーム外液に薬物を加えることによりリポソームに薬物を導入する方法を意味する。リモートローディングの方法については特に限定されないが、クエン酸緩衝液や硫酸アンモニウムを用いた方法が例示される。
【００７９】
リモートローディング法では、外液に加えられた薬物が、能動的に脂質粒子へと移行し、脂質粒子へと取り込まれる。このドライビングフォースとしては、溶解度勾配、イオン勾配、ｐＨ勾配等が用いられている。例えば、脂質粒子膜を隔てて形成されるイオン勾配を用いて薬物を脂質粒子内部に導入する方法がある。例えば、Ｎａ+／Ｋ+濃度勾配を利用してリモートローディング法により予め形成されている脂質粒子中に薬物を添加する技術がある。
【００８０】
イオン勾配の中でもプロトン濃度勾配が一般的に用いられ、例えばクエン酸を用いて、脂質粒子膜の内側（内水相）ｐＨが、外側（外水相）ｐＨよりも低いｐＨ勾配をもつ態様が挙げられる。ｐＨ勾配は、具体的に、アンモニウムイオン勾配および／またはプロトン化しうるアミノ基を有する有機化合物の濃度勾配等により形成することができる。
【００８１】
アンモニウムイオン元は、特に限定されることはないが、水溶性のアンモニウム塩が好適に用いられ、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ぎ酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等が挙げられる。
【００８２】
＜（ｇ）透析による外水相パノビノスタットの除去＞
パノビノスタットを内包した脂質粒子液は、脂質粒子に含まれなかったパノビノスタットを除去するために、透析を行ってもよい。例えば、所定濃度のスクロース／ヒスチジンバッファーを透析液として用いて、パノビノスタットを内包した脂質粒子液に対して、透析を行うことにより、外水相に存在するパノビノスタットを除去し、透析液で外水相を置換した脂質粒子組成物を得ることができる。
【００８３】
＜無菌ろ過＞
上記で得られた脂質粒子組成物は、無菌ろ過を行うことが好ましい。ろ過の方法としては、中空糸膜、逆浸透膜またはメンブレンフィルター等を用いて、脂質粒子を含む水溶液から不要な物を除去することができる。本発明では、滅菌できる孔径をもつフィルター（好ましくは０．２μｍのろ過滅菌フィルター）によってろ過することが好ましい。
【００８４】
脂質粒子の変形による平均粒子径への影響を防ぐために、無菌ろ過工程および後述する無菌充填工程は、脂質粒子を構成する脂質の相転移温度以下で行うことが好ましい。例えば、脂質の相転移温度が５０℃付近である場合、０〜４０℃程度が好ましく、より具体的には５〜３０℃程度で製造されることが好ましい。
【００８５】
＜無菌充填＞
無菌ろ過の後に得られた脂質粒子組成物は、医療用途として無菌充填することが好ましい。無菌充填の方法は公知のものが適用できる。容器に無菌的に充填することで医療用として好適な脂質粒子組成物が調製できる。
【００８６】
（医薬組成物）
本発明の脂質粒子組成物は、医薬組成物として使用することができる。即ち、本発明によれば、本発明の脂質粒子組成物を含む、医薬組成物が提供される。
【００８７】
本発明の医薬組成物の投与経路としては、非経口的投与が好ましい。例えば、点滴等の静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、眼内注射および髄腔内注射を挙げることができる。投与方法としては、シリンジまたは点滴による投与が挙げられる。
【００８８】
脂質粒子組成物に含まれる薬物としてのパノビノスタットまたはその塩の投与量および投与回数は、パノビノスタットまたはその塩の質量として、１日あたり、一般的には０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲で設定することができるが、本発明の脂質粒子組成物はこれらの投与量に限定されるものではない。
【００８９】
本発明の医薬組成物は、好ましくは抗がん剤として使用することができる。
本発明の医薬組成物の適用対象であるがんの種類は、特に限定されないが、例えば、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病、骨髄転移がん、骨肉腫、慢性骨髄単球性白血病、ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、乳がん、前立腺がん、子宮体がん、卵巣がん、肺がん、胃（胃腺）がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、頚部扁平上皮がん、食道がん、膀胱がん、メラノーマ、大腸がん、腎細胞がん、非ホジキンリンパ腫および尿路上皮がん等が挙げられる。
【実施例】
【００９０】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかし、本発明は実施例に限定されるものではない。【００９１】
［脂質粒子組成物の作製］
＜実施例１＞
（ａ）油相の調製
１，２−ｄｉａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ(日本精化製、以下、Ｃ２０ＰＣとする)、ＰＥＧリン脂質（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ、日油製、以下、ＤＳＰＥ−ＰＥＧとする）、コレステロールをそれぞれ０．４９５ｇ、０．１５３ｇ、０．１５３ｇ秤量した。脂質粒子をＤｉＩ（１，１’−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−３，３，３’，３’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ）で標識するため、全脂質に対して０．２ｍｏｌ％となる分量のＤｉＩを秤量し、エタノールに溶解させた。このＤｉＩエタノール溶液にエタノールを加え、全量で１１．２５ｍＬとし、さらに酢酸エチル３．７５ｍＬを加えた。秤量した脂質とこの有機溶媒を混合し、６０℃に加温して脂質を溶解し油相とした。【００９２】
（ｂ）水相の調製
硫酸アンモニウム０．９ｇを水４０ｇに溶解し、水相を調製した。【００９３】
（ｃ）乳化による脂質粒子形成
（ｂ）で調製した水相を７０℃に加温し、（ａ）で調製した油相全量を添加した後（容積比：水相／油相＝８／３）、乳化機（エクセルオートホモジナイザーＥＤ−３、日本精機製作所製）にて、３０００ｒｐｍ（ｒｏｔａｔｉｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ：１／６０ｓ-1）にて３０分間混合した。つづいて、６５℃で加温しながら３００ｒｐｍで攪拌を続けることで有機溶媒と水を蒸発させ、液が１５ｇまで濃縮された時点で加温と攪拌を止め、蒸発を停止した。【００９４】
（ｄ）エクストルーダーによる整粒
実施例１では整粒を実施してはいないが、下記表に記載の実施例のうち、「整粒」の欄にフィルターサイズの記載があるものは以下の要領で整粒を実施した。７０℃の加温下でエクストルーダー（Ｍｉｎｉ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用い、（ｃ）で得た液をフィルターに順次通過させることで整粒した。フィルターのサイズは各表の「整粒」欄に記載のものを使用した。複数のフィルターサイズの記載のある実施例では、孔径の大きいフィルターで整粒した後、引き続き孔径の小さいフィルターで整粒した。【００９５】
（ｅ）透析による脂質粒子外水相液の置換
透析液として２．４３質量％のＮａＣｌ水溶液を用いた。この透析液を用いて、（ｃ）または（ｄ）で得た液に対して、室温にて透析を行い、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換した脂質粒子を得た。【００９６】
（ｆ）リモートローディングによるパノビノスタットの脂質粒子への内包
パノビノスタット（ＡＰＡＣ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ，  ＬＬＣ製）に注射用水を加え、１０ｍｇ／ｍＬとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してパノビノスタットを溶解させた。このパノビノスタット溶液に脂質粒子を１／１の容積比で加えた後、６０℃で１２０分間加温した。【００９７】
（ｇ）透析による外水相パノビノスタットの除去
透析液として９．４質量％スクロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーを調製した。この透析液を用いて、（ｆ）で得た液に対して、室温にて透析を行い、外水相に存在するパノビノスタットを除去し、透析液で外水相を置換したパノビノスタット含有脂質粒子を得た。【００９８】
＜実施例２＞
ＤＳＰＥ−ＰＥＧの使用量を０．０１５３ｇとしたこと以外は実施例１と同様にして、パノビノスタット含有脂質粒子を得た。【００９９】
＜実施例３〜１３＞
下記表に記載した脂質組成とすること以外は、実施例１と同様にして、パノビノスタット含有脂質粒子を得た。下記表において、ＳＭはＳｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＮＭ−１０、日油製）を示し、ＤＨＳＭは、Ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＮＭ−１０（日油製）に対し水素添加した合成品）を示す。【０１００】
＜実施例１４＞
（ａ）油相の調製
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＮＭ−１０、日油製、以下、ＳＭとする）、ＰＥＧリン脂質（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ、日油製、以下、ＤＳＰＥ−ＰＥＧとする）、コレステロールをそれぞれ０．４２０ｇ、０．０１４ｇ、０．１５５ｇ秤量した。脂質粒子をＤｉＩ（１，１’−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−３，３，３’，３’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ）で標識するため、全脂質に対して０．２ｍｏｌ％となる分量のＤｉＩを秤量し、エタノールに溶解させた。このＤｉＩエタノール溶液にエタノールを加え、全量で１１．２５ｍＬとし、さらに酢酸エチル３．７５ｍＬを加えた。秤量した脂質とこの有機溶媒を混合し、７０℃に加温して脂質を溶解し油相とした。【０１０１】
（ｂ）水相の調製
硫酸アンモニウム０．９ｇを水４０ｇに溶解し、水相を調製した。【０１０２】
（ｃ）乳化による脂質粒子形成
（ｂ）で調製した水相を７０℃に加温しマグネチックスターラーで攪拌し、そこに（ａ）で調製した油相全量を添加し３０秒間攪拌した（容積比：水相／油相＝８／３）。つづいて、６５℃で加温しながら３００ｒｐｍで攪拌を続けることで有機溶媒と水を蒸発させ、液が１５ｇまで濃縮された時点で加温と攪拌を止め、蒸発を停止した。【０１０３】
（ｄ）エクストルーダーによる整粒
７０℃の加温下でエクストルーダー（Ｍｉｎｉ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用い、（ｃ）で得た液をフィルターに順次通過させることで整粒した。フィルターのサイズは各表の「整粒」欄に記載のものを使用した。複数のフィルターサイズの記載のある実施例では、孔径の大きいフィルターで整粒した後、引き続き孔径の小さいフィルターで整粒した。【０１０４】
（ｅ）透析による脂質粒子外水相液の置換
透析液として７２０ｍＭのＮａＣｌ水溶液を用いた。この透析液を用いて、（ｄ）で得た液に対して、室温にて透析を行い、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換した脂質粒子を得た。【０１０５】
（ｆ）リモートローディングによるパノビノスタットの脂質粒子への内包
パノビノスタット（ＡＰＡＣ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ，  ＬＬＣ製）に注射用水を加え、４ｍｇ／ｍＬとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約４に調整してパノビノスタットを溶解させた。このパノビノスタット溶液と７２０ｍＭのＮａＣｌ水溶液と脂質粒子を５／３／２、の容積比で混合した後、６０℃で１２０分間加温した。【０１０６】
（ｇ）透析による外水相パノビノスタットの除去
透析液として９．４質量％スクロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーを調製した。この透析液を用いて、（ｆ）で得た液に対して、室温にて透析を行い、外水相に存在するパノビノスタットを除去し、透析液で外水相を置換したパノビノスタット含有脂質粒子を得た。【０１０７】
＜実施例１５〜２５＞
表２〜４に記載した脂質組成にて、実施例１４と同様にしてパノビノスタット含有脂質粒子を得た。実施例２５ではＤｉＩは添加せずに脂質粒子を作製した。表２〜４において、Ｃ２０ＰＣは１，２−ｄｉａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（日本精化製）を、ＨＳＰＣは水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＮＣ−２１、日油製）を、ＤＰＰＧは１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＧ−６０６０ＬＳ、日油製）を、ＤＰＰＡは１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ，  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＡ−６０６０ＬＳ、日油製）を、ＤＰＰＳは１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ，  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＳ−６０６０ＬＳ、日油製）を示す。（ｆ）リモートローディングによるパノビノスタットの脂質粒子への内包工程において、実施例１７〜２５ではパノビノスタット溶液を３．６ｍｇ／ｍＬとした。また、パノビノスタット溶液と７２０ｍＭのＮａＣｌ水溶液と脂質粒子の混合比率は、実施例１６では８／５／５、実施例１７〜２５では２／１／１とした。【０１０８】
実施例２２のみ平均粒子径が３３１ｎｍと他より大きい。これは、ＤＬＳによる粒径測定において１μｍ付近に凝集物のピークが観察されたことで、平均粒子径が大きく算出されたものである。実施例２２はゼータ電位の絶対値が小さく粒子同士の静電相反発が小さい。また、立体反発により粒子同士の合一を妨げるＤＳＰＥ−ＰＥＧのような素材も添加されていない。骨髄集積率は高いが、粒子の安定性の観点から他の実施例の方が好ましい態様であると言える。【０１０９】
＜実施例２５＞
実施例２５では（ａ）油相の調製時にはＤｉＩを添加せず、（ｇ）にてスクロース／ヒスチジンバッファーで透析まで行った脂質粒子に対してＤｉＩでの染色を行った。脂質粒子液５００μＬに、３ｍｇ／ｍＬのＤｉＩ／エタノール溶液５μＬを混合して十分に攪拌したのち、ゲルろ過法で（ＰＤ  ＭｉｎｉＴｒａｐ  Ｇ−２５、ＧＥヘルスケア製）外水相を９．４質量％スクロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーで置換し、余剰なＤｉＩを除去した。【０１１０】
＜比較例１＞
パノビノスタットをポリオキシル３５ヒマシ油（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒｅ  ＥＬ、ＳＩＧＭＡ社製）とポリエチレングリコール４００（和光純薬工業社製）の体積比１：４混合液に超音波を照射しながら溶解した。得られた溶液と生理食塩水とを体積比１：７で混合することにより、０．５ｍｇ／ｍＬのパノビノスタット溶液を得た。【０１１１】
＜比較例２＞
実施例１における（ａ）〜（ｅ）と同様の工程により脂質粒子を調製し、さらに実施例１における（ｇ）と同様にして外水相を実施例１と同様の溶液に置換することにより、パノビノスタットを含有しない脂質粒子を得た。【０１１２】
＜比較例３＞
ＨＳＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧをそれぞれ１６．６３ｇ、２．０４ｇ、４．１５ｇを秤量し、全脂質に対して０．２ｍｏｌ％となる分量のＤｉＩとともに、エタノール３０３．７５ｍＬ、酢酸エチル１０１．２５ｍＬに溶解させ油相とした。１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム５．６ｇ、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム３７．６ｇ、注射用水１０３７ｇを混合し水相とした。上記油相を水相に混合し、乳化法を用いてＤｉＩで標識した空リポソームを作製した。０．０９質量％の塩化ナトリウム水溶液を用いてＴＦＦにて外水相を置換し、続いてパッシブローディング法にてペメトレキセドを封入した。９．４質量％スクロース、０．１５５質量％ヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーで透析を行い、ペメトレキセドを含有する脂質粒子を得た。【０１１３】
＜比較例４＞
ＨＳＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧをそれぞれ１２．４２ｇ、４．１４ｇ、４．１４ｇを秤量し、全脂質に対して０．２ｍｏｌ％となる分量のＤｉＩとともに、エタノール３０３．４ｍＬ、酢酸エチル１０１．２５ｍＬに溶解させ油相とした。硫酸アンモニウム２６．７３ｇをＭｉｌｌｉＱ水１０８０ｇに溶解し水相とした。乳化法を用いて硫酸アンモニウムを含有するＤｉＩで標識した空リポソームを作製した。４１７ｍＭの塩化ナトリウム水溶液を用いてＴＦＦにて外水相を置換し、続いてリモートローディング法でドキソルビシン塩酸塩を封入した。９．４質量％スクロース、０．１５５質量％ヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーで透析を行い、ドキソルビシン塩酸塩を含有する脂質粒子を得た。脂質粒子の組成はドキシル注２０ｍｇの添付文書に記載の組成を参考にした（ドキソルビシン塩酸塩２ｍｇ／ｍＬ、ＨＳＰＣ９．５８ｍｇ／ｍＬ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３．１９ｍｇ／ｍＬ、コレステロール３．１９ｍｇ／ｍＬ）。定量の結果、ドキソルビシン塩酸塩２．２４ｍｇ／ｍＬ、ＨＳＰＣ１１．５ｍｇ／ｍＬ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ４．１ｍｇ／ｍＬ、コレステロール４．２ｍｇ／ｍＬであった。【０１１４】
［物性測定および評価］
＜平均粒子径＞
本発明において、粒子径とは、動的光散乱法により測定されるキュムラント平均粒子径を意味する。各表に記載の実施例および比較例の平均粒子径は、オートサンプラー付き濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００ＡＳ（大塚電子社製）により動的光散乱法で測定したキュムラント平均粒子径である。測定結果を各表に示す。【０１１５】
＜ゼータ電位＞
本発明において、ゼータ電位とは、レーザードップラー法により測定された値を意味する。各表に記載の実施例のゼータ電位は、外水相と同じ９．４質量％スクロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーで脂質粒子液を２０倍に希釈し、ゼータ電位・粒径測定システム  ＥＬＳＺ−２（大塚電子社製）により測定した値である。測定結果を各表に示す。【０１１６】
＜ＡＰＩ濃度＞
本発明において、各表に記載のＡＰＩ濃度とは、脂質粒子に含まれるパノビノスタット（フリー体）の量を、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）にて測定した値である。パノビノスタットの検出には２７９ｎｍの紫外光（ＵＶ）を用いた。【０１１７】
＜脂質濃度＞
本発明において、各表に記載の脂質濃度とは、脂質粒子に含まれる各脂質をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）にて定量した各脂質の濃度の総和である。脂質の検出にはコロナ荷電化粒子検出器（Ｃｏｒｏｎａ  ＣＡＤ（ｃｈａｒｇｅｄ  ａｅｒｏｓｏｌ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ））を用いた。【０１１８】
＜透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による観察＞
実施例１の脂質粒子組成物を急速凍結し、汎用ＴＥＭを用いクライオ条件下で観察し、ＴＥＭ画像を得た。得られたＴＥＭ画像を図１に示す。図１のＴＥＭ画像から、パノビノスタットの固化物が脂質粒子の表面および内部の少なくとも一部に存在していることが分かる。【０１１９】
＜骨髄中の脂質粒子の集積率の測定＞
試験にはＩＣＲマウス（雄、７週齢、なおＩＣＲはＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの頭文字）を用いた。蛍光色素（ＤｉＩ）で標識した実施例１および３〜７で調製したパノビノスタット含有脂質粒子（薬物量として６ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈より投与した。また、蛍光色素（ＤｉＩ）で標識した実施例２および８〜１３で調製したパノビノスタット含有脂質粒子（薬物量として４ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈より投与した。また、蛍光色素（ＤｉＩ）で標識した比較例２で調製したパノビノスタットを含有しない脂質粒子（脂質量として実施例１と同量）を尾静脈より投与した。また、蛍光色素（ＤｉＩ）で標識した比較例３で調整したペメトレキセドを含有する脂質粒子（薬物量として１．５ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈より投与した。また、蛍光色素（ＤｉＩ）で標識した比較例４で調整したドキソルビシン塩酸塩を含有する脂質粒子（薬物量として１６．７ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈より投与した。【０１２０】
投与後７２時間に解剖し、大腿骨骨髄を採取した。採取した骨髄について、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）蛍光検出器を用いて投与液および組織中ＤｉＩ濃度を定量し、骨髄集積率を下記式２により算出した。なお、骨髄集積率、骨髄１ｇあたりの、投与した脂質粒子のうち骨髄に集積した割合（％  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｄｏｓｅ／ｇ）（％ＩＤ／ｇとも表記する）で示した。測定結果を各表に示す。【０１２１】
式２：骨髄集積率（％ＩＤ／ｇ）＝骨髄中ＤｉＩ濃度（ｎｇ／ｇ）／（投与液中ＤｉＩ濃度（ｎｇ／ｍＬ）×投与容量（ｍＬ））×１００【０１２２】
【表１】
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【０１２３】
【表２】
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【０１２４】
【表３】
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【０１２５】
【表４】
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【０１２６】
比較例２〜４の脂質粒子組成物と比較して、本発明の実施例１〜２５の脂質粒子組成物は、高い骨髄集積性を示した。【０１２７】
実施例３〜５および２２〜２４より、添加するＤＳＰＥ−ＰＥＧは少ない方が骨髄への集積性が良好であった。また、実施例１０〜１３より、粒子径が大きいほど骨髄への集積能が良好であるが、一方で、１００ｎｍ程度の小さな脂質粒子であっても、パノビノスタットを内包しない脂質粒子（空リポソーム）に比べて高い骨髄集積性が得られた。実施例１４〜１７からは、アニオン性脂質の添加により骨髄集積性が向上した。【０１２８】
パノビノスタットを内包する脂質粒子は、以降の解析に示すとおりマクロファージに認識されることで骨髄への高い集積が得られているものと推測される。上記の因子はいずれもマクロファージからの認識されやすさに影響を与えることで間接的に骨髄集積能を高めるのに寄与するものと考えられる。例えば、アニオン性脂質の添加によりゼータ電位が低下すると、マクロファージのスカベンジャーレセプターに認識されやすくなるなどの効果があり、これが骨髄集積性の向上に繋がっているものと考えられる。【０１２９】
＜組織中のパノビノスタット濃度の測定＞
ＩＣＲマウス（雄、７週齢）に実施例１、２、１４および１９で調製したパノビノスタット含有脂質粒子（薬物量として４ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈より投与した。また、ＩＣＲマウス（雄、７週齢）に、比較例１で調製したパノビノスタット溶液（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与した。薬効試験での用量を想定し、実施例１、２、１４および１９で調製したパノビノスタット含有脂質粒子の投与量は単回投与での最大耐量を設定し、比較例１で調製したパノビノスタット溶液の投与量は８日間連日投与での最大耐量を設定した。【０１３０】
実施例１、２、１４および１９で調製したパノビノスタット含有脂質粒子を投与したマウスについては、投与後３、６、２４、７２、１６８時間で解剖した。比較例１で調製したパノビノスタット溶液を投与したマウスについては、投与後１、３、６、２４、７２時間で解剖し、血液、大腿骨骨髄および消化管（回腸下部）を採取した。血液は８００×ｇ、１０分間遠心し、血漿を回収した。消化管は凍結破砕によりホモジナイズ処理を行った。採取した血漿、骨髄および消化管について、液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて、組織中パノビノスタット濃度の定量を行った。得られた組織中パノビノスタット濃度推移より薬物動態解析ソフトＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）（Ｃｅｒｔａｒａ）を用いて単回投与後の無限時間までの組織中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。さらに組織中ＡＵＣの骨髄／消化管比を次の式１より算出した。結果を、図２および図３、並びに表５に示す。【０１３１】
式１：骨髄／消化管比＝骨髄中パノビノスタットＡＵＣ／消化管中パノビノスタットＡＵＣ＝（骨髄中濃度−時間曲線下面積）／（消化管中濃度−時間曲線下面積）【０１３２】
＜組織中のペメトレキセド濃度の測定＞
ＩＣＲマウス（雄、７週齢）に比較例３で調製したペメトレキセド含有脂質粒子（薬物量として１．５ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈より投与した。【０１３３】
比較例３で調製したペメトレキセド含有脂質粒子を投与したマウスについては、投与後２４、７２、１２０、１６８時間で解剖し、血液、大腿骨骨髄および消化管（回腸下部）を採取した。パノビノスタットと同様に組織中ペメトレキセド濃度を定量し、ＡＵＣおよび組織中ＡＵＣの骨髄／消化管比を算出した。結果を表５に示す。【０１３４】
【表５】
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【０１３５】
上記の結果から、比較例１で調製したパノビノスタット溶液および比較例３で調製したペメトレキセド含有脂質粒子と比較して、実施例１、２、１４および１９で調製したパノビノスタット含有脂質粒子は、組織中のパノビノスタットＡＵＣについて、骨髄／消化管の比が高く、骨髄集積性が良好であることが示された。【０１３６】
＜Ｍｏｌｍ−１３同所モデルマウスを用いた薬効試験＞
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（雄、８週齢）にシクロホスファミド（１２５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与、２日間連日投与）およびウサギ抗アシアロＧＭ１抗体（和光純薬工業）（０．４ｍｇ、腹腔内投与、単回投与）による免疫抑制を施した。ヒト白血病細胞株であるＭｏｌｍ−１３細胞  ３×１０6個を静脈内に移植し、骨髄に生着させた。移植後８日目から実施例１で調製したパノビノスタット含有脂質粒子（薬剤量として８ｍｇ／ｋｇ、尾静脈内投与、単回投与）、比較例１で調製したパノビノスタット溶液（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与、８日間連日投与）、および陰性対照として比較例２で調製したパノビノスタットを含まない脂質粒子（実施例１で調製したパノビノスタット含有脂質粒子の８ｍｇ／ｋｇに相当する脂質量、尾静脈内投与、単回投与）を投与開始した。また、非移植群として免疫抑制および移植を実施しない群を設定した。移植後１６日後（投与開始８日後）のマウスを解剖し、大腿骨骨髄を採取した。得られた骨髄を溶血バッファーで処理して赤血球を除去した後、ＰｅｒＣＰ標識抗ヒトＣＤ４５抗体、およびＤＡＰＩ（４，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）で染色した。なお、ＰｅｒＣＰは、ペリジニンクロロフィル（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｎｃｈｒｏｒｏｐｈｙｌｌ）を示す。フローサイトメトリーを用いて、骨髄生細胞中の白血病細胞（ヒトＣＤ４５陽性、ＤＡＰＩ陰性細胞）の割合を測定し、Ｍｏｌｍ−１３同所モデルマウスにおける白血病細胞への増殖阻害活性を比較した。測定結果を図４に示す。【０１３７】
図４の結果から、比較例１で調製したパノビノスタット溶液および比較例２で調製したパノビノスタットを含まない脂質粒子と比較して、実施例１で調製したパノビノスタット含有脂質粒子は、高い白血病細胞の増殖阻害活性を示し、その効果は用量に依存していることが分かった。【０１３８】
＜骨髄中マクロファージ数および細胞中脂質粒子量の解析＞
ＩＣＲマウス（雄、７週齢）にＤｉＩ標識した実施例２で調製したパノビノスタット含有脂質粒子を、薬物量として６ｍｇ／ｋｇ尾静脈より投与した。非投与、投与６時間後、投与９６時間後のマウスを解剖し、大腿骨骨髄を採取した。得られた骨髄を溶血バッファーで処理して赤血球を除去した後、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗マウスＦ４／８０抗体、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ１１ｂ抗体、およびＤＡＰＩで染色した。ＦＩＴＣは、フルオレセインイソチオシアネート  (ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ)を示す。フローサイトメトリーを用いて、骨髄生細胞中のマクロファージ（マウスＦ４／８０陽性、マウスＣＤ１１陽性、ＤＡＰＩ陰性細胞）の割合を測定した。さらに、投与後９６時間の試料について、細胞内のＤｉＩの蛍光強度を指標として細胞に取り込まれた脂質粒子量を解析した。解析結果を図５に示す。図５において、Ｍφは、マクロファージを示す。【０１３９】
図５の結果から、実施例２で調製したパノビノスタット含有脂質粒子の投与後の時間の経過に伴って、骨髄中マクロファージ数は増加し、増加したマクロファージにパノビノスタット含有脂質粒子が取り込まれていることが分かった。【０１４０】
＜骨髄中サイトカイン発現解析＞
ＩＣＲマウス（雄、７週齢）に実施例２で調製したパノビノスタット含有脂質粒子（薬剤量として４ｍｇ／ｋｇ、尾静脈内投与、単回投与）および比較例１で調製したパノビノスタット溶液（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与、単回投与）を投与し、投与７２時間後のマウスを解剖して大腿骨骨髄を採取した。また、陰性対照として非投与のマウスについても大腿骨骨髄を得た。骨髄重量の３倍量のＰＢＳを添加後に３００×ｇ、５分間遠心し、上清を回収した。得られた骨髄上清についてＢＣＡ法（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ法）によるタンパク質濃度測定を行い、各試料を８ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に希釈した。Ｂｉｏ−ＰｌｅｘマウスサイトカインＧＩ２３−ＰｌｅｘパネルおよびＢｉｏ−Ｐｌｅｘ２００システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて各試料中のサイトカイン濃度を定量した。非投与におけるサイトカイン発現量の平均値を１とした時の相対発現量変化を示した。解析結果を図６に示す。【０１４１】
図６において、ＩＬはインターロイキン、Ｇ−ＣＳＦは顆粒球コロニー刺激因子を示し、ＧＭ−ＣＳＦは顆粒球単球コロニー刺激因子を示し、ＩＦＮはインターフェロンを示し、ＫＣはケラチノサイトケモアトラクタントを示し、ＭＣＰは、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎを示し、ＭＩＰは、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎを示し、ＰＡＮＴＥＳは、ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖｅｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄを示し、ＴＮＦは腫瘍壊死因子を示す。【０１４２】
図６の結果から、非投与の場合と比較して、実施例２で調製したパノビノスタット含有脂質粒子または比較例１で調製したパノビノスタット溶液を投与した場合には、サイトカインの発現が増加する傾向が認められ、実施例２で調製したパノビノスタット含有脂質粒子ではサイトカイン発現がさらに増強された。骨髄にマクロファージが集積する要因としてサイトカイン発現の増加が考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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