(57)【要約】  本発明は、糖鎖抗原を特異的に測定することを可能にするイムノクロマト試験片及び検体添加用デバイス、並びにそれを用いたイムノクロマト法を提供することを目的とする、糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験法であって、検体と亜硝酸塩溶液を混合した後、酒石酸を接触させ、検体中の糖鎖抗原を抽出する工程が濾過工程で行われる方法である。
2017213227.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験法であって、検体と亜硝酸塩溶液を混合した後、酒石酸を接触させ、検体中の糖鎖抗原を抽出する工程が濾過工程で行われる方法。
【請求項２】
濾過工程が、酒石酸を含浸させた多孔質材料及びフィルターを含む検体添加用デバイス中で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
検体と亜硝酸塩溶液を混合した後、酒石酸を接触させる工程の後の中和工程がイムクロマト試験片と分離した部位で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
検体と亜硝酸塩溶液を混合した後、酒石酸を接触させる工程の後の中和工程が、イムノクロマト試験片上で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
中和試薬が、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
【請求項６】
糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
【請求項７】
糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片と酒石酸を含浸させた多孔質材料及びフィルターを含む検体添加用デバイスを有するキット。
【請求項８】
検体添加用デバイスにさらに中和試薬を含浸させた多孔質材料が含まれる、請求項７記載のキット。
【請求項９】
中和試薬が、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、請求項７又は８に記載のキット。
【請求項１０】
糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、請求項７〜９のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノクロマト試験片上で糖鎖抗原の亜硝酸抽出処理をすることが可能な、糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片及び検体添加用デバイス、並びにそれを用いたイムノクロマト法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖抗原の抽出方法として亜硝酸抽出法が知られている。この方法は主にＡ群β溶血性レンサ球菌、口腔内レンサ球菌等ストレプトコッカス属に属する微生物の糖鎖抗原の抽出に対して使用される。【０００３】
この亜硝酸抽出法は、菌体と亜硝酸水溶液を混合し、糖鎖抗原を露出させる方法であり、一般的な亜硝酸抽出法は、微生物を含む検体に亜硝酸ナトリウム水溶液と酢酸、塩酸等の酸性溶液とを混合することで亜硝酸を生成させた亜硝酸抽出液を混合し、微生物と該亜硝酸とを十分な時間反応させることにより実施される。上記の抽出液は強酸性であるので、反応後にトリス、水酸化ナトリウム等の塩基性溶液を添加し、抽出液を中和した後に分析するのが一般的である。【０００４】
一方、イムノクロマトを原理とする迅速診断薬の多くは、ウイルス又は細菌感染症を迅速・簡便に測定し、治療方針を決定する一つの手段として広く使用されている。【０００５】
一般的なイムノクロマトを原理とする迅速診断薬は、検体を検体浮遊液に浮遊させた後、その浮遊液をイムノクロマト試験片に供給することで迅速・簡便に測定できる。【０００６】
それに対し、例えばＡ群β溶血性レンサ球菌の糖鎖抗原を測定する際は、予め亜硝酸塩溶液と酸性溶液の２液を測定直前に混合し亜硝酸抽出液を調製し、検体と混合する。すなわち、Ａ群β溶血性レンサ球菌と亜硝酸と反応させた後、塩基性水溶液で中和する。中和した抽出液をイムノクロマト試験片に供給する。【０００７】
この方法で用いる亜硝酸抽出液は長時間保存することができないため、亜硝酸塩溶液と酸溶液は試験直前に混合・調製をする必要がある。また、この亜硝酸抽出液はｐＨが低すぎて抗原抗体反応に支障をきたすことから、ある程度のｐＨまで中和する必要がある。【０００８】
しかし、２液を混合する工程とさらに中和する工程が増えることから、一般的なイムノクロマト法を原理とする迅速診断薬と比較して試薬がより多くなり、操作が煩雑になりやすくなる。そのため、既存の迅速診断試薬では、中和試薬をイムノクロマト試験片にあらかじめ含ませることにより、亜硝酸塩溶液と酸性溶液を混合する操作のみで検体処理が出来るよう工夫されている。しかし、依然として従来のイムノクロマト法を原理とした迅速診断試薬に比較し操作工程が多いことから、混合する液量の間違いや混合する溶液の取り違い、２液を混合せずに抽出する等、正しく操作されないことから、正確に測定できないという問題があった。【０００９】
上述のようにイムノクロマトを原理とする迅速診断薬において、誤った方法で操作された場合、その迅速性・簡便性が故に誤った診断・治療を促し、治療を遅らせ、患者に不利益が生じる場合もある。【００１０】
そこで、イムノクロマト試験片に予め亜硝酸ナトリウムと中和試薬を含ませることにより、検体を酢酸等の酸性溶液に浮遊してイムノクロマト試験片に供給する操作のみで亜硝酸抽出処理をイムノクロマト試験片上で行う方法が報告されている（特許文献１）。【００１１】
しかし、亜硝酸ナトリウムは毒物及び劇物取締法で劇物に指定され、消防法で危険物第1類に属し、さらに水質汚濁防止法で施行令第２条有害物質に指定されていることから、取り扱いの難しい薬品である。上記イムノクロマト試験片を製造するあたり、高濃度の亜硝酸ナトリウム水溶液をイムノクロマト試験片の部材に塗布した上で乾燥させる製造工程が必要であるが、その作業は危険が伴われる。【００１２】
そこで、亜硝酸ナトリウムではなく、酸性溶液を予めイムノクロマト試験片に含ませることが考えられるが、一般的に酸性溶液として使用される塩酸や酢酸では従来の予め２液を混合した亜硝酸抽出液で処理して中和する方法と比較して、著しく劣る性能しか示せなかった。また液状酸性試薬の代わりにクエン酸等の固形状酸性試薬を含浸したイムノクロマト試験片を用いる方法も存在するが（特許文献２）、長期の保存安定性に向かず、非特異的な反応が生じるなどの問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開WO2005/121794号公報
【特許文献２】特表2008-509384号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、より効率的に糖鎖抗原を抽出すべく、糖鎖抗原の抽出工程を濾過工程で行うことにより、亜硝酸抽出の操作を簡便化し、かつ従来の亜硝酸抽出法と比較しても性能に遜色なく正確に、糖鎖抗原を特異的に測定することを可能にするイムノクロマト試験片及び検体添加用デバイス、並びにそれを用いたイムノクロマト法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本願発明者らは、糖鎖抗原を抽出し、イムノクロマト試験片を用いて測定するに当たり、抽出に必要な工程数が多くならないように、亜硝酸塩及び酸性試薬を用いて糖鎖抗原を抽出する方法について鋭意検討を行った。イムノクロマト試験片を用いて被検物質を測定する際、あらかじめフィルター等を含む検体添加用デバイスを用いて被検出物質が含まれる試料を濾過することがあるが、このデバイス中で糖鎖抗原を抽出することにより、迅速・簡便に測定できることを見出した。また、この際、酸性試薬を多孔質材料に乾燥させた状態で含ませその多孔質材料をデバイス中に含ませることについて検討を行った。しかし塩酸や酢酸等の液状酸性試薬は乾燥状態の多孔質材料上では揮発して消失することから、多孔質材料上には定着せず、十分な亜硝酸抽出が行われないことに着目した。そこで、酒石酸、リンゴ酸、マロン酸、マレイン酸、クエン酸等の固形状酸性試薬を用いることにより酸性試薬を乾燥状態の多孔質材料上でも揮発せずに定着させ、従来の予め亜硝酸ナトリウムと液状酸性試薬の２液を混合した亜硝酸抽出液で処理した後に中和する方法と比較して、迅速・簡便に測定でき、且つ性能も遜色なく測定することが可能であり、さらに上記固形状酸性試薬のなかでも酒石酸を使用することで、十分に抗原を抽出でき、保存性が安定し、かつ非特異的な反応が生じにくいことを見出し、本発明を完成した。【００１６】
すなわち、本発明は、糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験法であって、検体と亜硝酸塩溶液を混合した後、固形状酸性試薬として酒石酸を接触させる工程が濾過工程で行われることを特徴とする方法を提供する。【００１７】
本発明は以下のとおりである。
[１]  糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験法であって、検体と亜硝酸塩溶液を混合した後、酒石酸を接触させ、検体中の糖鎖抗原を抽出する工程が濾過工程で行われる方法。
[２]  濾過工程が、酒石酸を含浸させた多孔質材料及びフィルターを含む検体添加用デバイス中で行われる、[１]の方法。
[３]  検体と亜硝酸塩溶液を混合した後、酒石酸を接触させる工程の後の中和工程がイムノクロマト試験片と分離した部位で行われる、[１]又は[２]の方法。
[４]  検体と亜硝酸塩溶液を混合した後、酒石酸を接触させる工程の後の中和工程が、イムノクロマト試験片上で行われる、[１]又は[２]の方法。
[５]  中和試薬が、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、[１]〜[４]のいずれかのイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
[６]  糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、[１]〜[５]のいずれかのイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
[７]  糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片と酒石酸を含浸させた多孔質材料及びフィルターを含む検体添加用デバイスを有するキット。
[８]  検体添加用デバイスにさらに中和試薬を含浸させた多孔質材料が含まれる、[７]のキット。
[９]  中和試薬が、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、[７]又は[８]のキット。
[１０]  糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、[７]〜[９]のいずれかのキット。【００１８】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2016-115697号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のイムノクロマト試験片及び検体添加用デバイスを用いれば、従来の予め亜硝酸塩と液状酸性試薬の２液を混合した亜硝酸抽出液で処理した後に中和する方法と比較して、迅速・簡便に測定でき、且つ性能も遜色なく測定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】濾過工程で糖鎖抗原の抽出を行うための、濾過用の検体添加用デバイスの構造を示す図である。
【図２】中和試薬領域を有するイムノクロマト試験片（第１例）の構造を模式的に示す図である。
【図３】中和試薬領域を有するイムノクロマト試験片（第２例）の構造を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、糖鎖抗原の亜硝酸抽出処理を濾過工程で行うことで簡便化し、被検出物質である糖鎖抗原を迅速且つ正確に測定することを可能にする方法に係る。
【００２２】
以下に、本発明の方法について、より具体的な手順の一例を示し、本発明を説明する。
（１）ウイルスや細菌等に感染した患者の咽頭あるいは鼻腔等から採取した検体を後述するような亜硝酸塩溶液に浮遊させる。  
（２）この亜硝酸塩浮遊液（試料）を、濾過手段で濾過し、濾過の際に酸性試薬で処理し糖鎖抗原を抽出する。  
（３）この濾過液を、イムノクロマト試験片に滴加して、糖鎖抗原の有無を検出することにより、検体中の被検出物の有無を測定する。
【００２３】
この手順は一例であり、この手順に限定されない。
【００２４】
本発明の濾過工程は、検体添加用デバイスで行われる。検体添加用デバイスは、イムノクロマト試験片外の付属部品であり、採取した検体の亜硝酸処理を行うための容器としても用いることができる。糖鎖抗原抽出のための検体の亜硝酸処理は、検体を亜硝酸塩と混合し、さらに酸性試薬を混合することにより、亜硝酸を生成させて行う。このために、試料添加用デバイスには、予め亜硝酸塩溶液が入れてあってもよい。あるいは、予め検体を亜硝酸溶液と混合し、混合液を検体添加用デバイスに入れてもよい。該デバイスには、バイアル、シリンジ、チューブ等が含まれる。また、該デバイスは容器だけでなく、検体をイムノクロマト試験片に添加供給する際に検体を濾過するための濾過手段を含んでいる。検体添加用デバイスは、検体と亜硝酸塩溶液を収容する容器部分と容器内の検体をイムノクロマト試験片に添加供給する部分を含む。後者の検体を添加供給する部分は、検体を容器内から排出するためのノズル（開口部）を有する部分を有し、該部分は容器部分の蓋を兼ねることもできる。後者の検体をイムノクロマト試験片に添加供給する部分は、ノズル部分あるいは蓋部分ともいう。また、検体添加用デバイスが濾過手段を含む場合、後述のように検体添加用デバイスは濾過フィルターを含むフィルターハウジングからなるノズル部分と容器部分の２つの部品から構成されていてもよい。この場合のフィルターハウジングは、検体をフィルターに通す開口部とフィルターを通過した検体を排出する開口部を有し、両開口部の間にフィルターが存在する。容器は、例えば、検体をフィルターに圧力をかけて通すことができるシリンジ等を用いればよい。
【００２５】
亜硝酸処理に必要な酸性試薬は検体添加用デバイスにあらかじめ含ませておいてもよいし、検体の亜硝酸処理を行うときに添加してもよい。
【００２６】
酸性試薬としては、固形状酸性試薬が用いられる。
【００２７】
本発明で用いられる固形状酸性試薬は常温において固形状のものであり、高温において揮発しない性質を持ち、かつイムノクロマト試験片上で着色されないような試薬、具体的には乾燥状態で白色または乾燥熱や酸化で着色されにくい試薬が好ましい。
【００２８】
また抗原抽出能という観点では、価数の多い酸を用いればより少ない量で抽出できる。また同じ価数ならより酸解離定数が小さい試薬の方が効率良く抗原を抽出できる。
【００２９】
これら特性を持つ固形状酸性試薬としては、酒石酸、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸等を挙げることができるが、本発明において上記特性を全て有し、かつ液状酸性試薬と同等の抗原抽出能を有する固形状酸性試薬は酒石酸のみである。
【００３０】
酒石酸は、多孔質材料に含浸させ乾燥させて用いる。多孔質材料としては、一般的に用いられるろ紙、ガラス繊維、不織布等を用いることができる。
【００３１】
酒石酸を多孔質材料に含浸させるには、酒石酸を一度溶解させて塗布し乾燥させる。
【００３２】
本発明に用いられる酒石酸の使用量、すなわち多孔質材料に含浸させる量は、特に限定されないが、通常、イムノクロマト試験片の一試験片あたり0.01μg〜1mg程度であり、好ましくは0.1μg〜0.1mg程度である。もっとも、検体浮遊液の組成や滴加量などにより効果が得られる最適な量を選択することが好ましい。
【００３３】
図１には濾過手段と酒石酸を含む検体添加用デバイスの例を示すが、本発明の検体添加用デバイスは図１に示したものには限定されず、検体を収容でき、検体をイムノクロマト試験片の検体添加部位に添加できるデバイスであればどのような形態のものも含まれる。図１の検体添加用デバイス中、下の部分が検体を収容する容器部分であり、上の部分が検体添加ノズルを有する容器の蓋部分（ノズル部分ともいう）であり、該蓋部分にフィルターをセットすることができる。
【００３４】
図１Aは濾過手段である濾過フィルターと酒石酸を含ませた多孔質材料が接触せず分離しており、濾過フィルターよりも上流側に酒石酸を含ませた多孔質材料が存在する。この場合、酒石酸を含ませた多孔質材料は、デバイス内部、例えば容器部内部に適当な固定手段で固定しておいてもよいし、固定せず入れておいてもよい。あるいは、亜硝酸処理を行うときにデバイスに添加してもよい。ここで、上流とは検体添加用デバイスを用いて検体を添加するときの該デバイスに収容した検体流体の流れに関しての上流をいい、デバイス中において検体添加ノズルからより離れた部分を上流といい、検体添加ノズルに近い部分を下流という。図１Aのデバイスを用いるときは、デバイス中の亜硝酸塩溶液に検体を入れ、転倒混和して検体と亜硝酸塩溶液と多孔質材料中の酒石酸を接触混合することにより、検体の亜硝酸処理が行われる。また、検体と亜硝酸溶液をあらかじめ混合し、混合液をデバイス中の酒石酸を収容した容器に添加して、検体と亜硝酸塩溶液と多孔質材料中の酒石酸を接触混合することもできる。得られた混合物はフィルターを通してノズル部分からイムノクロマト試験片に添加される。
【００３５】
図１Bは、濾過フィルターと酒石酸を含ませた多孔質材料が接触して一体化しており、酒石酸を含ませた多孔質材料は、フィルターの上流側に設けられている。このデバイスにおいては、酒石酸を含ませた多孔質材料を１層又は複数層のフィルターからなる濾過フィルターの１層として組込むことができる。図１Bに示すデバイスにおいては、デバイスの下部の容器中に亜硝酸塩溶液が含まれており、最初に検体が亜硝酸溶液と混合される。混合した検体をイムノクロマト試験片に添加する際に検体が酒石酸を含ませた多孔質材料を通過し、この際に含浸した酒石酸が検体中に溶解する。検体と酒石酸が接触混合されることにより、検体の亜硝酸処理が行われる。該混合物はフィルターを通してノズル部分からイムノクロマト試験片に添加される。  
【００３６】
図１Cは、濾過フィルターと酒石酸を含ませた多孔質材料が接触して一体化しており、酒石酸を含ませた多孔質材料は、フィルターの下流側に設けられている。図１Cに示すデバイスにおいては、デバイスの下部の容器中に亜硝酸塩溶液が含まれており、最初に検体が亜硝酸溶液と混合される。混合した検体をイムノクロマト試験片に添加すると、混合した検体はフィルターを通り、酒石酸を含ませた多孔質材料を通過し、この際に含浸した酒石酸が検体中に溶解する。検体と酒石酸が接触混合されることにより、検体の亜硝酸処理が行われる。該混合物はフィルターを通してノズル部分からイムノクロマト試験片に添加される。  
【００３７】
図１Dは、濾過手段である濾過フィルターと酒石酸を含ませた多孔質材料が接触せず分離しており、濾過フィルターよりも下流側に酒石酸を含ませた多孔質材料が存在する。図１Dのデバイスにおいて、フィルターとノズルの間に適当な空間を設けその空間内に酒石酸を含ませた多孔質材料を含ませればよい。デバイスの下部の容器中に亜硝酸塩溶液が含まれており、最初に検体が亜硝酸溶液と混合される。混合した検体をイムノクロマト試験片に添加する際に検体はフィルターを通り、酒石酸を含ませた多孔質材料が存在する空間で酒石酸と検体が接触混合されることにより、検体の亜硝酸処理が行われる。検体は該空間内に一時的に貯留するため検体と酒石酸を含ませた多孔質材料の接触時間を長くすることができ、検体と酒石酸の十分な接触が達成される。なお、この際空間部分とデバイス外側とを連絡する空気孔を設けておくことが望ましい。このためには、図１Dに示すように、ノズル部分とフィルターを組込んだ部分を別体にすればよい。検体と酒石酸の混合物をイムノクロマト試験片に添加する際には、ノズル部分をフィルター組込み部分に押し付ければよく、空気孔が塞がれると同時にノズルより検体が滴加される（図１E）。このように、濾過手段に酒石酸を組込むことにより試料と酒石酸との接触混合と濾過が一工程でほぼ同時に行うことができる。また、検体添加用デバイスに酒石酸を組込んだ濾過手段を含ませることにより、検体中と酒石酸との接触混合、不純物の濾過、及び検体と酒石酸の混合物のイムノクロマト試験片への添加が一工程でほぼ同時に行うことができる。ここで、「一工程で行うことができる」とは検体の添加という一つの操作で、検体と亜硝酸塩溶液と酒石酸との接触混合と濾過、あるいは検体と亜硝酸塩溶液と酒石酸との接触混合、不純物の濾過、及び検体と亜硝酸塩溶液と酒石酸の混合物のイムノクロマト試験片への添加が連続的に行えるという意味であり、これらを同時に行うことは必要としない。なお、酒石酸は、使用するまでに外れないように組込んでおく必要がある。
【００３８】
検体添加用デバイスの大きさは限定されないが、例えば、高さ数cm、最も太い部分の直径が数cm程度である。デバイス中に含ませるフィルター、酒石酸を含む多孔質材料、中和試薬を含む多孔質材料の大きさも限定されないが、例えば、円形の場合、直径数mm〜数cm程度である。
【００３９】
イムノクロマト試験片は、被検出物質（抗原等）を捕捉する抗体（抗体１）が固定化された検出領域を有する支持体、移動可能な標識抗体（抗体２）を有する標識体領域、検体を滴加するサンプルパッド、展開された検体液を吸収する吸収帯、これら部材を１つに貼り合わせるためのバッキングシート等を具備する。
【００４０】
本発明のイムノクロマト試験片は、格納容器内に収められていてもよく、該格納容器により、例えば紫外線や空気中の湿気による劣化を防ぐことができる。また、汚染性、感染性の有る検体試料を用いる場合、格納容器によりアッセイを行う試験者が汚染又は感染するのを防止することができる。例えば適当な大きさの樹脂製ケースを格納容器として用い、該ケース中に本発明の装置を収納すればよい。また、抗原又は抗体を固定化した試験片の表面を樹脂製フィルム等（トップラミネート）で覆ってもよい。格納容器とその中に納められた試験片を、一体としてイムノクロマトデバイスという場合がある。
【００４１】
なお、検出領域の数及び標識体領域に含まれる標識抗体の種類は１つに限られるものではなく、複数の被検出物質に対応する抗体を用いることで、２つ以上の抗原を同一の試験片にて測定することができる。
【００４２】
支持体は、被検出物質（抗原）を捕捉するための抗体を固定化する性能を持つ材料であり、かつ液体が水平方向に通行することを妨げない性能を持つ。好ましくは、毛細管作用を有する多孔性薄膜であり、液体及びそれに分散した成分を吸収により輸送可能な材料である。支持体を成す材質は特に限定されるものではなく、例えばセルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ガラス繊維、ナイロン、ポリケトンなどが挙げられる。このうちニトロセルロースを用いて薄膜としたものがより好ましい。抗体を固定化したメンブレンを抗体固定化メンブレンと呼ぶ。
【００４３】
標識体領域は、標識抗体を含む多孔性基材から成り、基材の材質は一般的に用いられているガラス繊維や不織布等を用いることができる。該基材は、多量の標識抗体を含浸させるために、厚さ0.3mm〜0.6mm程度のパッド状であることが好ましい。標識抗体を含浸させ乾燥させた多孔性基材を乾燥パッドとも呼ぶ。
【００４４】
標識抗体の標識には、アルカリフォスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素、金コロイドのような金属コロイド、シリカ粒子、セルロース粒子、着色ポリスチレン粒子及び着色ラテックス粒子等が用いられることが多い。金属コロイド粒子、着色ポリスチレン粒子や着色ラテックス粒子等の着色粒子を用いる場合には、これらの標識試薬が凝集することによって着色が生じるので、この着色を測定する。抗体を固定化した粒子を抗体固定化粒子と呼ぶ。
【００４５】
検出領域は、被検出物質（抗原）を捕捉する抗体が固定化された支持体の一部の領域を指す。検出領域は、抗原を捕捉するための抗体を固定化した領域を少なくとも１つ設ける。検出領域は支持体に含まれていればよく、支持体上に抗体を固定化すればよい。
【００４６】
サンプルパッドは、検体を滴加するための部位であり、多孔性材料である。サンプルパッドはイムノクロマト試験片の最も上流にある部位である。該材料には一般的に用いられるろ紙、ガラス繊維、不織布等を用いることができる。多量の検体を免疫測定に用いるために、厚さ0.3mm〜1mm程度のパッド状であることが好ましい。検体には、検体を他の溶液に浮遊して得られる試料等、検体を用いて調製された試料も含む。
【００４７】
吸収帯は、支持体に供給され検出領域で反応に関与しなかった成分を吸収するための部材である。該材料には、一般的な天然高分子化合物、合成高分子化合物等からなる保水性の高いろ紙、スポンジ等を用いることができるが、検体の展開促進のためには吸水性が高いものが好ましい。
【００４８】
バッキングシートは、前述の全ての材料、すなわち支持体、サンプルパッド、標識体領域、吸収帯らが、部分的な重なりをもって貼付・固定されるための部材である。バッキングシートは、これら材料らが最適な間隔で配置・固定されるのであれば、必ずしも必要ではないが、製造上あるいは使用上の利便性から、一般的には用いた方が好ましい。
【００４９】
本発明のイムノクロマトグラフィー装置には、さらに対照表示領域(部材）が存在していてもよい。対照表示領域は試験が正確に実施されたことを示す部位である。例えば、対照表示領域は、検出領域の下流に存在し、検体試料が検出領域を通過し、対照表示領域に到達したときに着色等によりシグナルを発する。対照表示領域には、標識担体を結合させた抗体に結合する物質を固相化しておいてもよいし、検体が到達したときに色が変化するpHインジケーター等の試薬を固相化しておいてもよい。標識担体を結合させた抗体がマウスモノクローナル抗体の場合、抗マウスIgG抗体を用いればよい。
【００５０】
イムノクロマト試験片の大きさは限定されないが、例えば、縦の長さ数cm〜十数cm、横の長さ数mm〜数cm程度である。
【００５１】
上記の形態の試験片において、検体は、サンプルパッド、標識体領域、支持体、検出領域、吸収帯らの一連の接続により形成された多孔性流路を通過する。よって本形態においては、これら全てが検体移動領域となる。各構成材料の材質や形態によって、検体が材料内部を浸透せず界面を通行する形態もありうるが、本明細書で定義する検体移動領域は材料の内部か界面かを問わないため、該形態の試験片も本明細書の範囲に含まれる。
【００５２】
本発明のイムノクロマト試験片及び検体添加用デバイスを用いて、糖鎖抗原を抽出して測定する場合、亜硝酸塩溶液と酒石酸を用いて亜硝酸を生成させて糖鎖抗原を抽出する。抽出糖鎖抗原溶液は酸性のため、そのままでは抗原抗体反応が阻害されてしまうので、酒石酸溶液を中和する必要がある。酒石酸溶液の中和には中和試薬を用いる。中和試薬はイムノクロマト試験片上に含ませてもよいし、上述の検体添加用デバイス中に含ませてもよい。すなわち、中和工程は、イムノクロマト試験片上で行われるか、あるいは、検体添加用デバイス中などのイムノクロマト試験片と分離した部位で行われる。
【００５３】
中和試薬は、サンプルパッドに含浸させてもよいし、支持体に含浸させてもよいし、支持体とは別の不織布等の多孔質材料に含浸させて、得られた中和試薬含浸多孔質材料を、標識体領域よりも上流に配置してもよい。又は
中和試薬を含浸させたイムノクロマト試験片上の領域を中和試薬領域又は塩基性試薬領域と呼ぶ。
【００５４】
中和試薬領域を有するイムノクロマト試験片は、支持体上に上流からサンプルパット、中和試薬領域、標識体領域、検出領域及び吸収帯を有する。また、サンプルパット、中和試薬領域、標識体領域、検出領域及び吸収帯は、隣合う領域どうしで接触していても、いなくてもよい。さらに、中和試薬領域、標識体領域は必ずしも別々の多孔性材料に含浸する必要はなく、複数又は全ての領域を同一の多孔性材料に含浸されていてもよい。
【００５５】
中和試薬を検体添加用デバイスに含ませる場合は、中和試薬を多孔質材料に含浸させ、乾燥させて用いる。多孔質材料としては、一般的に用いられるろ紙、ガラス繊維、不織布等を用いることができる。乾燥させた中和試薬を含ませた多孔質材料を、酒石酸を含ませた多孔質材料の下流に位置するように含ませればよい。例えば、図１Aに示す検体添加用デバイスにおいては、フィルターが存在する部分に中和試薬を含ませた多孔質材料を設ければよい。また、図１Bに示す検体添加用デバイスの場合も、酒石酸を含ませた多孔質材料の下流のフィルターが存在する部分に中和試薬を含ませた多孔質材料を設ければよい。図１Cに示す検体添加用デバイスや図１Dに示す検体添加用デバイスの場合は、酒石酸を含ませた多孔質材料が検体添加用デバイスの最下流付近に設けられている。ノズルに中和試薬を含ませた多孔質材料を設けることも可能であるが、好ましくはイムノクロマト試験片上に設ける。
【００５６】
本発明に用いられる中和試薬は常温において固形状のものであり、高温において揮発しないものである。
【００５７】
本発明に用いられる好ましい中和試薬としては、トリス（トリスヒドロキシルメチルアミノメタン）、水酸化ナトリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸三ナトリウム、アルカリ領域に緩衝能をもつグッドバッファーを挙げることができる。
【００５８】
本発明に用いられる中和試薬の使用量、すなわちイムノクロマト試験片に含浸させる量は、特に限定されないが、通常、多孔質材料あたり、又はイムノクロマト試験片の一試験片あたり0.01μg〜1mg程度であり、好ましくは0.1μg〜0.1mg程度である。もっとも、使用する中和試薬の種類、検体浮遊液の組成や滴加量などにより効果が得られる最適な量を選択することが好ましい。
【００５９】
中和試薬をサンプルパッド又は多孔質材料に含浸させるには、中和試薬を一度溶解させて、溶液をサンプルバッド又は多孔質材料に塗布し、その後乾燥させればよい。
【００６０】
図２及び図３は、典型的なイムノクロマト試験片の好ましい１形態を示した図である。図２に示すイムノクロマト試験片を第１例と呼び、図３に示すイムノクロマト試験片を第２例と呼ぶ。なお、イムノクロマト試験片は、図２及び図３に示すものに限定されるものではない。図２及び図３中、９が支持体、１０が標識体領域、１１が検出領域、１２及び１３がサンプルパッド、１４が吸収帯、１５がバッキングシートを指している。また、試験片全体の上にトップラミネートを貼り付けてもよい。
【００６１】
図２Ａ及び図３Ａが上面図、図２Ｂ及び図３Ｂが切断断面図である。図２の例では、樹脂等でできたバッキングシート１５上に１個の検出領域１１が形成された支持体９、吸収帯１４、標識体領域１０、サンプルパッド１２・１３等がそれぞれ積層されている。そして図３に示すように、吸収帯１４の一方の端部と支持体９の一方の端部、支持体９の他方の端部と標識体領域１０の一方の端部、標識体領域１０の他方の端部とサンプルパッド１３の一方の端部がそれぞれ重ね合わされており、サンプルパッド１３の上流部に酒石酸が含浸され、少し間を離してサンプルバッドの下流部に中和試薬が含浸された中和試薬領域が存在する。図２の例では、標識体領域１０の上流に中和試薬領域１３が存在し、これらが重ね合わされており、これにより連続したラテラルフローの流路が形成されている。図３に示す試験片においては、中和試薬領域１３がサンプルパッドを兼ねている。すなわち、中和試薬領域がサンプルパッド上に存在する。中和試薬領域の上流にさらにサンプルパッドが存在してもよい。
【００６２】
なお、中和試薬を検体添加用デバイスに設ける場合は、イムノクロマト試験片上に中和試薬領域を設ける必要はない。
【００６３】
図１Ａ又は図１Ｂの検体添加用デバイスと図２に示す中和領域を有するイムノクロマト用試験片を用いて糖鎖抗原を測定する方法について述べる。図１Ａの検体添加用デバイスを用いる場合は、検体又は検体を用いて調製された試料を亜硝酸塩溶液と接触混合させ、検体を亜硝酸塩溶液に浮遊させ、検体添加用デバイスに添加することにより開始される。この際、検体5〜100μLと0.1M〜8Mの亜硝酸塩0.01〜2mLを混合し、検体添加用デバイスに添加すればよい。亜硝酸塩として、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等が挙げられる。図１Ｂの検体添加用デバイスを用いる場合は、検体添加用デバイスの容器部分にあらかじめ亜硝酸塩溶液が入れられており、そこに検体を添加する。検体添加用デバイスの容器部分に0.1M〜8Mの亜硝酸塩0.01〜2mLを入れておき、そこに検体5〜100μLを添加すればよい。
【００６４】
検体添加用デバイス中の検体をノズルからイムノクロマト用試験片のサンプルパッド１２に滴加するときに、検体はフィルターを通るとともに、多孔質材料に含ませた酒石酸と接触混合される。検体に混合した亜硝酸塩と酒石酸が反応し、遊離の亜硝酸が発生し、その亜硝酸の作用によって検体から糖鎖抗原が抽出される。抽出された糖鎖抗原を含む検体は、イムノクロマト試験片に添加される。検体添加用デバイス中に中和試薬が含まれる場合は、検体はイムノクロマト試験片に添加される前に中和され、イムノクロマト試験片上に中和試薬が含まれる場合は、検体はイムノクロマト試験片上で中和される。
【００６５】
中和試薬領域を含むイムノクロマト試験片を用いる場合、サンプルパッド１２に供された被検出物質である糖鎖抗原を含む検体は毛管作用によって、サンプルパッド１２及び中和試薬領域１３へ展開され、さらに、標識体領域１０、支持体９、吸収帯１４へと順次、水平方向に展開される。抽出された糖鎖抗原は酸性の展開溶液と共に中和試薬領域１３に展開移動し、中和試薬領域１３で糖鎖抗原を含む酸性の展開溶液のpHが中和され中性域に調整される。その結果、糖鎖抗原は中性条件下においてさらに下流に展開移動する。標識体領域１０では検体試料の展開と共に標識抗体が液中に放出され支持体９へと展開される。検体試料中に糖鎖抗原が存在する場合において、支持体９の検出領域１１では捕捉抗体により糖鎖抗原が特異的に捕捉され、なおかつ糖鎖抗原は標識抗体とも特異的反応により複合体を形成する。これにより検出領域では糖鎖抗原を介した抗体のサンドイッチが成立し、標識抗体−糖鎖抗原複合物を検出領域１１にて測定することができる。
【００６６】
本発明のイムノクロマト試験片を用いた方法によれば、検体中の糖鎖抗原の抽出は検体添加用デバイス中で行われるため、イムノクロマト試験片及び検体添加用デバイスを用いた測定の前にあらかじめ検体中の糖鎖抗原を抽出する必要はなく、１ステップで検体中の糖鎖抗原を測定することができる。
【００６７】
本発明の方法において、検体となる生体試料は、特に限定されないが、血清、血漿、血液、尿、便、唾液、組織液、髄液、拭い液等の体液等又はその希釈物が挙げられる。本発明の方法で用いる検体添加用デバイスには濾過手段が含まれているため、固形物等が含まれ濾過が必要となる、咽頭若しくは鼻腔ぬぐい液、咽頭若しくは鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、唾液、直腸拭い液、便、便懸濁液、角膜拭い液等が好適に用いられる。
【００６８】
本発明のイムノクロマト試験片を用いた方法において、測定対象となる被検出物質はイムノアッセイ、すなわち抗原抗体反応を利用したアッセイで測定し得る糖鎖抗原である。抗原としては亜硝酸抽出処理によって抽出される細菌の細胞壁に存在する糖鎖抗原である多糖体等が挙げられる。これらの物質を含む原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、ウイルス等も測定し得る。本発明のイムノクロマト試験片を用いた方法により、被験体の生体試料中に原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、ウイルス等に由来する糖鎖抗原が含まれているか否かを確認することができ、糖鎖抗原が含まれている場合、被験体は原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、ウイルス等による感染症に罹患していると判断することができる。例えば、Ａ群β溶血性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、大腸菌、レジオネラ、カンピロバクター等の感染の有無を検出することができる。
【実施例】
【００６９】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００７０】
実施例１：従来法と本発明法による効果
１．抗Streptococcus pyogenes（Ａ群β溶血性レンサ球菌）抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
抗Streptococcus pyogenes抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液及び抗ウサギIgG抗体を準備し、PETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンのサンプルパッド側に抗Streptococcus pyogenes抗体、吸収帯側に抗ウサギIgG抗体をそれぞれ線状に塗布した。その後、ニトロセルロースメンブレンを45℃、30分間乾燥させ、抗Streptococcus pyogenes抗体固定化メンブレンを得た。このメンブレンを本実施例において、「抗体固定化メンブレン」と呼ぶ。【００７１】
２．抗Streptococcus pyogenes抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
抗Streptococcus pyogenes抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子を0.1％になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1％になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris（pH9.0）、3％BSAに再浮遊し、0.04％抗Streptococcus pyogenes抗体結合着色ポリスチレン粒子浮遊液を得た。この粒子を、本実施例において、「抗体固定化粒子」と呼ぶ。【００７２】
３．抗Streptococcus pyogenes抗体結合着色ポリスチレン粒子の塗布・乾燥
２で作製した抗体固定化粒子浮遊液を不織布に所定量を塗布し、45℃、30分間乾燥させた。得られた不織布を、本実施例において、「乾燥パッド」と呼ぶ。【００７３】
４．中和試薬（塩基性試薬）含浸不織布の作製
中和試薬（塩基性試薬）として、2Mトリス（Trizma Base）を15μL/cmで不織布に塗布した。塗布後に直ちに45℃、１時間、乾燥して、中和試薬含浸不織布を得た。【００７４】
５．酸性試薬含浸不織布の作製
酸性試薬として、1M塩酸、1M酢酸、1Mマロン酸、1Mリンゴ酸、1Mマレイン酸、1Mクエン酸、1M酒石酸を3.75μLずつ不織布に塗布した。塗布後に直ちに45℃、１時間、乾燥して、酸性試薬含浸不織布を得た。【００７５】
６．Streptococcus pyogenes試験片の作製
１で作製した抗体固定化メンブレン、３で作製した乾燥パッド、４で作製した中和試薬（塩基性試薬）含浸不織布を他部材（バッキングシート、吸収帯）と貼り合せて５ｍｍ幅に切断し、Streptococcus pyogenes試験片とした。また５で作製した酸性試薬含浸不織布を試料ろ過フィルターへ組み込んだノズルを有するデバイスと中和試薬（塩基性試薬）含浸不織布をサンプルパッドとして用いた試験片を本実施例において、「本発明試験デバイス」及び「本発明試験片」と呼ぶ。「本発明試験デバイス」の構造は図１A、「本発明試験片」の構造は図２に示すとおりである。４、５で作製した酸性試薬及び中和試薬（塩基性試薬）含浸不織布の替わりに何も塗布していない不織布を用いて同様の試験片を作製し、従来例として使用した。何も塗布していない不織布を試料ろ過フィルターへ組み込んだノズル及びサンプルパッドとして用いた試験片を「従来法試験ノズル」「従来法試験片」と呼ぶ。なお、試験片は、検体の流れに沿って、上流から、中和試薬（塩基性試薬）含浸不織布、乾燥パッド（標識体領域）、抗体固定化メンブレン（検出領域）、吸収帯を具備するものである。【００７６】
７. 検体
Streptococcus pyogenesを培養し、培養液を生理食塩水で菌数1.0×107CFU/mLと0.25×107CFU/mLに調製した。【００７７】
また、陰性検体として、生理食塩水を用いた。【００７８】
８．  測定
検体20μLを亜硝酸ナトリウム溶液（2M NaNO2）180μLに浮遊し、そのうち75μLを本発明試験片に滴加した。また、従来法として亜硝酸ナトリウムと塩酸を混合した亜硝酸抽出液に検体を浮遊した後、トリス溶液で中和した検体浮遊液を従来法試験片に50μＬ滴加した。５分後に抗Streptococcus pyogenes抗体を固定化した所定位置上の着色ポリスチレン粒子の堆積の有無とその程度を目視判定にて行った。その線状の堆積の程度が強いものを順に＋＋＋、＋＋、＋とし、判定が難しい場合を±、堆積がみられなかったものを−とした。【００７９】
また比較例として、従来法である予め亜硝酸ナトリウムと酢酸を混合した亜硝酸抽出溶液に検体を浮遊した後、中和した検体を従来法試験ノズルにて従来法試験片に滴加する方法も実施した。【００８０】
９. 結果
【表１】
2017213227.tif 000003
【００８１】
表１に示されるように、従来法と比較して酸性試薬として塩酸、酢酸はStreptococcus pyogenesの検出感度が著しく低下した。これは、塩酸及び酢酸は揮発する性質を持つことから、酸性試薬含浸不織布を作成する際の乾燥工程において揮発することにより塗布量が減り、その結果、亜硝酸抽出処理ができなかったためと考えられる。【００８２】
一方、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸、酒石酸はそれぞれ常温では粉末状として存在するものであり、揮発性がないことから、酸性試薬含浸不織布を作製する際の乾燥工程においても塗布量が減ることなく、従来法と比較しても遜色なく亜硝酸抽出処理ができることから、感度が大幅に低下することは無かった。さらに従来法と比較して少ない操作で測定できた。しかしマロン酸やリンゴ酸は亜硝酸と反応してイムノクロマト試験片が着色してしまい、マレイン酸とクエン酸は非特異的な反応が生じた。その中で酒石酸はイムノクロマト試験片に着色せず、感度・特異性ともに従来法と比較しても遜色なかった。【００８３】
実施例２：酸性試薬の塗布量の検討
実施例１における酸性試薬の塗布量を変え、試験結果（表２）を比較検討した。
【表２】
2017213227.tif 000004
【００８４】
表２に示されるように、塗布量が1.875μL以下の塗布量では感度が低下する傾向が見られた。また、3.75μL以上に塗布しても感度が大幅に上がる傾向は見られなかった。【００８５】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【符号の説明】
【００８６】
１  蓋部分
２  検体収容容器部分
３  ノズル
４  ノズル部位
５  フィルター（一部が中和試薬を含ませた多孔質材料のときがある）
６  酒石酸を含ませた多孔質材料
７  酒石酸と検体が一時的に貯留し混合される空間
８  空気抜き穴
９  支持体（検出領域を含む）
１０  標識体領域
１１  検出領域
１２  サンプルパッド
１３  中和試薬領域
１４  吸収帯
１５  バッキングシート
【図１】
2017213227.tif 000005
【図２】
2017213227.tif 000006
【図３】
2017213227.tif 000007
【国際調査報告】
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2017213227.tif 000009
2017213227.tif 000010
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