【手続補正書】
【提出日】平成31年4月24日(2019.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
【図１Ａ】Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００システムを使用した生体分子相互作用分析によって決定したヒト及びマウスａＰ２に対する抗ａＰ２モノクローナル抗体（ＣＡ３３、ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３及びＨ３）の結合親和性（ＫＤ（Ｍ））を列挙している表の図である。
【図１Ｂ】ビヒクル又は抗ａＰ２抗体を用いて肥満マウス（高脂肪食（ＨＦＤ）を与えた）を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ研究設計及び抗体レジメンを記載している概略図である。マウス（２１週齢）に、抗体投与前の１５週間、ＨＦＤを与えた（各群についてｎ＝１０）。抗ａＰ２抗体を、３３ｍｇ／ｋｇの濃度にて１週間に２回、皮下注射によって投与した。
【図１Ｃ】ビヒクル又は抗ａＰ２モノクローナル抗体ＣＡ３３、ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３又はＨ３を用いて処置したマウスにおける０週（白抜きの棒）又は４週（黒抜きの棒）での血漿インスリンレベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。＊ｐ＜０．０５。
【図１Ｄ】ビヒクル又は抗ａＰ２モノクローナル抗体ＣＡ３３、ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３又はＨ３を用いて処置した高脂肪食（ＨＦＤ）の肥満マウスにおける０週（白抜きの棒）又は４週（黒抜きの棒）での血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を示す棒グラフの図である。日中の食餌離脱の６時間後に血糖値を測定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図１Ｅ】ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）の間の血糖値（ｍｇ／ｄｌ）対時間（分）を示す線グラフの図である。ビヒクル（ダイヤモンド）又は抗ａＰ２モノクローナル抗体（グルコース１ｋｇ当たり０．７５ｇ）（ＣＡ３３；四角）（ＣＡ１５；三角）を用いたＨＦＤの肥満マウスにおける２週間の処置の後に試験を実施した。＊ｐ＜０．０５。
【図１Ｆ】インスリン負荷試験（ＩＴＴ）の間のインスリンレベル（ｍｇ／ｄｌ）対時間（分）を示す線グラフの図である。ビヒクル（ダイヤモンド）又は抗ａＰ２モノクローナル抗体（インスリン１ｋｇ当たり０．７５ＩＵ）（ＣＡ３３；四角）（ＣＡ１５；三角）を用いたＨＦＤの肥満マウスの３週間の処置後にこの試験を実施した。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１Ｇ】ビヒクル又は抗ａＰ２モノクローナル抗体ＣＡ３３、ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３又はＨ３を用いて処置したマウスにおける０週（白抜きの棒）又は４週（黒抜きの棒）での体重（ｇ）を示す棒グラフの図である。給餌状態において体重を測定した。＊ｐ＜０．０５。
【図２Ａ】関連タンパク質ＦＡＢＰ３（灰色の棒）及びＦＡＢＰ５／Ｍａｌ１（薄灰色の棒）と比較したａＰ２（黒色の棒）に対する抗ａＰ２抗体ＣＡ３３及びＨ３についてオクテット分析（ｏｃｔｅｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によって決定したシグナル相互作用（ｎｍ）の棒グラフの図である。
【図２Ｂ】ビヒクル、ＣＡ３３又はＨ３を用いて３週間処置したＨＦＤ給餌マウスにおけるＥＬＩＳＡによって決定した血漿ａＰ２レベル（ｎｇ／ｍｌ）の棒グラフの図である（ｎ＝１０のマウス／群）。実験を開始する前にマウスに１２週間ＨＦＤを与えていた。各群（ビヒクル、ＣＡ３３又はＨ３）からの３匹のマウス由来の血清中のａＰ２を検出するためのウェスタンブロットを差込み図において示す。＊＊ｐ＜０．０１。
【図２Ｃ】Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって決定したＣＡ３３、ＣＡ１３、ＣＡ１５及びＣＡ２３に対するＨ３の抗体交差遮断（ｃｒｏｓｓｂｌｏｃｋｉｎｇ）の表の図である。＋＋＝完全な遮断；＋＝部分的遮断；−＝交差遮断なし。
【図２Ｄ】水素重水素交換質量分析（ＨＤＸ）によって識別した、ＣＡ３３及びＨ３との相互作用に関連するａＰ２残基のエピトープ配列を示す図である（配列番号２参照）。相互作用する残基には下線を引いている。
【図２Ｅ】ａＰ２と共結晶化した（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅｄ）ＣＡ３３のＦａｂ及びａＰ２と共結晶化したＨ３のＦａｂの重ね合わせた画像の図である。
【図２Ｆ】ａＰ２上のＣＡ３３エピトープの高解像度マッピングである。両方の分子における相互作用残基を示す図である。水素結合は破線として示す。ａＰ２におけるＫ１０の側鎖はＹ９２のフェニル側鎖と疎水性相互作用を生じる。
【図２Ｇ】ＩｇＧ対照抗体（丸）又はＣＡ３３抗体（四角）の存在下でのａＰ２に対するパリナリン酸（ｐａｒａｎａｒｉｃ  ａｃｉｄ）結合（相対蛍光）対ｐＨを示す線グラフの図である。
【図２Ｈ】増加させている濃度の脂質負荷ａＰ２との反応におけるａＰ２に対するＣＡ３３結合（共鳴単位）対時間（秒）を示すグラフの図である。
【図２Ｉ】増加させている濃度の脱脂質化（ｄｅ−ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）ａＰ２との反応におけるａＰ２に対するＣＡ３３結合（共鳴単位）対時間（秒）を示すグラフの図である。
【図３Ａ】３週間のＣＡ３３抗体又はビヒクル処置の前（白抜きの棒）及び後（黒抜きの棒）のＨＦＤ誘発性肥満ａＰ２−／−マウスにおける空腹時血糖（ｍｇ／ｄｌ）を示す棒グラフの図である。
【図３Ｂ】３週間のＣＡ３３抗体又はビヒクル処置の前（白抜きの棒）及び後（黒抜きの棒）のＨＦＤ誘発性肥満ａＰ２−／−マウスにおける体重（ｇ）を示す棒グラフの図である。
【図３Ｃ】ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）の間のＨＦＤ誘発性肥満ａＰ２−／−マウスにおける血糖値（ｍｇ／ｄｌ）対時間（分）を示す線グラフの図である。ａＰ２−／−マウスにおいて２週間のビヒクル（三角）又はＣＡ３３抗体処置（四角）後に試験を実施した。
【図３Ｄ】３週間のＣＡ３３抗体又はビヒクル処置の前（白抜きの棒）及び後（黒抜きの棒）のｏｂ／ｏｂマウスにおける体重（ｇ）を示す棒グラフの図である（ｎ＝１０のマウス／群）。＊＊ｐ＜０．０１。
【図３Ｅ】３週間のＣＡ３３抗体又はビヒクル処置の前（白抜きの棒）及び後（黒抜きの棒）のｏｂ／ｏｂマウスにおける空腹時血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を示す棒グラフの図である（ｎ＝１０のマウス／群）。＊＊ｐ＜０．０１。
【図３Ｆ】３週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３抗体処置（黒抜きの棒）後のｏｂ／ｏｂマウスにおける血漿インスリンレベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図３Ｇ】ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）の間のｏｂ／ｏｂマウスにおける血糖値（ｍｇ／ｄｌ）対時間（分）を示す線グラフの図である。ａＰ２−／−マウスにおいて２週間のビヒクル（三角）又はＣＡ３３抗体処置（四角）後に試験を実施した。＊ｐ＜０．０５。
【図４Ａ】ビヒクル又はＣＡ３３を用いた５週間の処置後のＨＦＤ誘発性肥満マウス由来のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した肝臓の代表的な画像の図である。スケールバーは５０μｍである。
【図４Ｂ】ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３抗体（黒抜きの棒）を用いた５週間の処置後のＨＦＤ誘発性肥満マウスにおける肝臓トリグリセリド（ＴＧ）含有量（組織１ｇ当たりのｍｇ）の棒グラフの図である。＊＊ｐ＜０．０５。
【図４Ｃ】５週間のビヒクル（黒色の棒）又はＣＡ３３処置（灰色の棒）後のＨＦＤ誘発性肥満マウス由来の肝臓試料中の脂質合成遺伝子ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ（Ｓｃｄ１）、脂肪酸合成酵素（Ｆａｓｎ）及びアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（Ａｃｃ１）のｍＲＮＡ発現を示す棒グラフの図である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図４Ｄ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後のＨＦＤ誘発性肥満マウスにおける血漿非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）のレベル（ｍｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図４Ｅ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後のＨＦＤ誘発性肥満マウスにおける血漿グリセロールのレベル（ｍｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。＊ｐ＜０．０５。
【図４Ｆ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後のＨＦＤ誘発性肥満マウスにおける血漿総コレステロールのレベル（ｍｇ／ｄｌ）を示す棒グラフの図である。＊ｐ＜０．０５。
【図４Ｇ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後のＨＦＤ誘発性肥満マウスにおける血漿トリグリセリドのレベル（ｍｇ／ｄｌ）を示す棒グラフの図である。
【図４Ｈ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後のＨＦＤ誘発性肥満マウスにおける血漿ＦＡＢＰ３又はＦＡＢＰ５（Ｍａｌ１）のレベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。
【図４Ｉ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後のＨＦＤ誘発性肥満マウスにおける血漿グルカゴンのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。
【図４Ｊ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後のＨＦＤ誘発性肥満マウスにおける血漿アディポネクチンのレベル（μｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。
【図５Ａ】５週間のビヒクル又はＣＡ３３処置後の二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）によって決定した体脂肪質量（ｇ）（白抜きの棒）及び除脂肪質量（ｇ）（灰色の棒）の棒グラフの図である（ｎ＝１０／群）。＊ｐ＜０．０５。
【図５Ｂ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後の肥満マウスの肝臓重量（ｇ）及び体重％を示す棒グラフの図である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図５Ｃ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３処置（黒抜きの棒）後の明所又は暗所におけるマウスについての身体活動（活動単位−ＡＵ）を示す棒グラフの図である。
【図５Ｄ】ＨＦＤでのビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３で５週間処置したマウス（黒抜きの棒）後の肥満マウスにおける総食物摂取（ｇ）を示す棒グラフの図である（ｎ＝８／群）。
【図５Ｅ】ビヒクル（白抜きの棒）と比較して、ＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いて８週間処置したマウスにおける明期及び暗期の間の体積によるＶＯ２濃度を示す棒グラフの図である。
【図５Ｆ】ビヒクル（白抜きの棒）と比較して、ＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いて８週間処置したマウスにおける明期及び暗期の間の算出した呼吸商（ＲＥＲ）を示す棒グラフの図である。
【図５Ｇ】ビヒクル（白抜きの棒）と比較して、ＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いて８週間処置したマウスにおける褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の重量を示す棒グラフの図である。
【図５Ｈ】ビヒクル（白抜きの棒）と比較して、ＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いた８週間の処置後のマウスにおけるＢＡＴの代表的なＨ＆Ｅ染色した切片を示す画像の図である。
【図５Ｉ】ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３で５週間処置したマウス（黒抜きの棒）後の肥満マウスにおける性腺周囲（ｐｅｒｉｇｏｎａｄａｌ）白色脂肪組織（ＰＧＷＡＴ）の重量を示す棒グラフの図である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図５Ｊ】ビヒクル（左の画像）又はＣＡ３３（右の画像）を用いた５週間の処置後のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した精巣上体脂肪組織の代表的な画像の図である。スケールバーは２００μｍである。
【図５Ｋ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３で処置したマウス（黒抜きの棒）後のＦＡＣＳによって決定した脂肪組織におけるＦ４／８０＋Ｍａｃ細胞（％）を示す棒グラフの図である。
【図５Ｌ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３で処置したマウス（黒抜きの棒）後のＦＡＣＳ分析によって決定した脂肪組織におけるＣＤ１１ｂ＋細胞（％）を示す棒グラフの図である。
【図５Ｍ】５週間のビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３で処置したマウス（黒抜きの棒）後の性腺周囲白色脂肪組織（ＰＧ−ＷＡＴ）におけるＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１、Ｆ４／８０又はＣＤ６８についてのｍＲＮＡレベル（ｍＲＮＡ／Ｔｂｐ）を示す棒グラフの図である。
【図５Ｎ】ビヒクル又はＣＡ３３を用いて３週間処置したマウスにおける脂肪組織ａＰ２／ＦＡＢＰ４タンパク質レベルを示すウェスタンブロットの図である。ａＰ２−／−、ｍａｌ１−／−及びａＰ２／ｍａｌ１−／−動物由来の脂肪組織試料をタンパク質対照として含んだ。β−チューブリンを負荷対照として示す。
【図５Ｏ】ビヒクル又はＣＡ３３を用いて３週間処置したマウスにおける脂肪組織Ｍａｌ１／ＦＡＢＰ５タンパク質レベルを示すウェスタンブロットの図である。ａＰ２−／−、ｍａｌ１−／−及びａＰ２／ｍａｌ１−／−動物由来の脂肪組織試料をタンパク質対照として含んだ。β−チューブリンを負荷対照として示す。
【図５Ｐ】ビヒクル又はＣＡ３３を用いて３週間処置したマウスにおけるａＰ２又はｍａｌ１のいずれかについての相対タンパク質レベルの棒グラフの図である。図５Ｐに示した結果は図５Ｎ及び５Ｏに示したウェスタンブロットを定量化している。
【図６Ａ】糖新生遺伝子ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（Ｐｃｋ１）及びグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ｐｃ）のｍＲＮＡ発現を示す棒グラフの図である。肝臓試料を、ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いて４週間処置した肥満マウスから日中の食餌離脱の６時間後に採取した（各群についてｎ＝１０）。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ｂ】肝臓試料中のＰｃｋ１の酵素活性（ｎＭ／分／ｇ）を示す棒グラフの図である。肝臓試料を、ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いて４週間処置した肥満マウスから日中の食餌離脱の６時間後に採取した（各群についてｎ＝１０）。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ｃ】ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いて４週間処置したマウスについての肝臓ミクロソーム画分中のグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ｐｃ）の酵素活性（Ｕ／ｍｇ）を示す棒グラフの図である（各群についてｎ＝１０）。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ｄ】高インスリン血症−正常血糖クランプの間の血糖（ｍｇ／ｄｌ）対時間を示す線グラフの図である。クランプ研究は、ビヒクル（ダイヤモンド）又はＣＡ３３（四角）を用いた５週間の処置後、高脂肪食（ＨＦＤ）での肥満マウスにおいて実施した（各群についてｎ＝７）。
【図６Ｅ】ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いた５週間の処置の後の高脂肪食（ＨＦＤ）での肥満マウスにおけるグルコール注入率（ＧＩＲ）（ｍｇ／ｋｇ／分）を示す棒グラフの図である。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ｆ】ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いた５週間の処置後の高脂肪食（ＨＦＤ）での肥満マウスにおけるクランプ肝臓グルコース産生（ｃ−ＨＧＰ）（ｍｇ／ｋｇ／分）を示す棒グラフの図である。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ｇ】ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いた５週間の処置後の高脂肪食（ＨＦＤ）での肥満マウスにおける全身グルコース消失率（ＲＤ）（ｍｇ／ｋｇ／分）を示す棒グラフの図である。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ｈ】ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いた５週間の処置後のＨＦＤでの肥満マウスにおける下腿三頭筋におけるグルコース取込み（ｍｇ／ｋｇ／分）を示す棒グラフの図である。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ｉ】ビヒクル（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）を用いた５週間の処置後の高脂肪食（ＨＦＤ）での肥満マウスにおける全身解糖を示す棒グラフの図である。＊ｐ＜０．０５。
【図７Ａ】ビヒクル対照に対する高親和性抗体（ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３及びＨ３）を使用した２週間の選択的抗体処置後のブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）におけるグルコースレベル（ｍｇ／ｄｌ）対時間（分）を示す線グラフの図である。
【図７Ｂ】ビヒクル対照に対する高親和性抗体（ＣＡ１３、ＣＡ１５、ＣＡ２３及びＨ３）を使用した３週間の選択的抗体処置後のインスリン耐性試験（ＩＴＴ）におけるグルコースレベル（ｍｇ／ｄｌ）対時間（分）を示す線グラフの図である。
【図８Ａ】ＨＦＤ−マウスの高インスリン血症−正常血糖クランプの間のビヒクル対照（白抜きの棒）又はＣＡ３３（黒抜きの棒）で処置したマウスにおける基礎肝臓グルコース産生（ｍｇ／ｋｇ／分）を示す棒グラフの図である。
【図８Ｂ】ＨＦＤ−マウスの高インスリン血症−正常血糖クランプの間のＣＡ３３マウス（黒抜きの棒）又はビヒクル対照マウス（白抜きの棒）における血清インスリンレベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図８Ｃ】ＨＦＤ−マウスの高インスリン血症−正常血糖クランプの間のビヒクル対照（白抜きの棒）又はＣＡ３３で処置した（黒抜きの棒）マウスの性腺白色脂肪組織（ＧＷＡＴ）におけるグルコース取込み（ｍｇ／ｋｇ／分）を示す棒グラフの図である。
【図９】１型糖尿病についてのＮＯＤマウスモデルにおける糖尿病発生率（％）対時間（処置の週）を示す線グラフの図である。ＮＯＤマウスはビヒクル（ダイヤモンド）又はａＰ２モノクローナル抗体ＣＡ３３（四角）を用いて処置した。
【図１０Ａ】１型糖尿病についてのＮＯＤマウスモデルにおける死亡率（％）対時間（処置の週）を示す線グラフの図である。ＮＯＤマウスはビヒクル（ダイヤモンド）又はａＰ２モノクローナル抗体ＣＡ３３（四角）を用いて処置した。
【図１０Ｂ】６時間の絶食後、ＰＢＳで処置した又はａＰ２抗体で処置したＮＯＤマウスにおける血糖値（ｍｇ／ｄＬ）を示す棒グラフの図である。
【図１０Ｃ】６時間の絶食後、ＰＢＳで処置した又はａＰ２抗体で処置したＮＯＤマウスにおけるインスリンレベル（ｎｇ／ｍＬ）を示す線グラフの図である。
【図１１Ａ】ＮＯＤ  ａＰ２＋／＋及びＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスをブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）に供した線グラフの図である。
【図１１Ｂ】ＮＯＤ  ａＰ２＋／＋及びＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスをインスリン耐性試験（ＩＴＴ）に供した線グラフの図である。
【図１２Ａ】低又は高グルコースのいずれかでの刺激後のＮＯＳ  ａＰ２＋／＋及びＮＯＤ  ａＰ２−／−マウス島からのインスリン（ＤＮＡ１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ）分泌を示す棒グラフの図である。
【図１２Ｂ】４週齢のＮＯＤ  ａＰ２＋／＋（左の棒）及びＮＯＤ  ａＰ２−／−マウス（右の棒）の単離した島からの総インスリン（ＤＮＡ１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ）含有量を示す棒グラフを示す図である。
【図１２Ｃ】７週齢のＮＯＤ  ａＰ２＋／＋（左の棒）及びＮＯＤ  ａＰ２−／−マウス（右の棒）の単離した島からの総インスリン（ＤＮＡ１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ）含有量を示す棒グラフを示す図である。
【図１３】膵臓切開後のＮＯＤ  ａＰ２＋／＋マウスと比較したＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスにおいて見える島の数を示す図である。
【図１４Ａ】ＮＯＤ  ａＰ２＋／＋及びＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスにおける染色したベータ細胞を示す図である。
【図１４Ｂ】ＮＯＤ  ａＰ２＋／＋及びＮＯＤ  ａＰ２−／−マウスにおける染色したベータ細胞を後に定量化した棒グラフを示す図である。
【図１５Ａ】低又は高グルコースのいずれかでの刺激後、ラットインスリノーマベータ細胞系（ＩＮＳ１）からのグルコース刺激性インスリン（ＤＮＡ１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ）分泌を示す棒グラフを示す図である。
【図１５Ｂ】低又は高グルコースのいずれかでの刺激後、ａＰ２欠損ｃ５７ｂ／６マウス（マウス島）からのグルコース刺激性インスリン（ＤＮＡ１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ）分泌を示す棒グラフを示す図である。
【図１５Ｃ】低又は高グルコースのいずれかでの刺激後、ヒト島からのグルコースで刺激したインスリン（ＤＮＡ１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ）分泌を示す棒グラフを示す図である。
【図１５Ｄ】１０μｇ／ｍｌのａＰ２を用いた２０分の処置後、ａＰ２がマウス島内に取り込まれることを示す図である（ｎ＝５）。
【図１５Ｅ】低又は高グルコースのいずれかでの刺激後、ＩＮＳ１ベータ細胞からの「絶食」状態下で２４時間のａＰ２処置後のインスリン（ＤＮＡ１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ）分泌を示す棒グラフの図である。
【図１５Ｆ】低又は高グルコースのいずれかでの刺激後、ａＰ２−／−マウスから単離した初代島からの「絶食」状態下で２４時間のａＰ２処置後のインスリン（ＤＮＡ１μｇ当たりのｎｇ／ｍｌ）分泌を示す棒グラフの図である。
【図１６】マウス（ラットインスリンプロモーター−リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス−糖タンパク質、又はＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰ、マウス）における１型糖尿病の誘発性モデルの略図である。マウスにＬＣＭＶを注射し、これにより、β−細胞の破壊及び糖尿病の発症を導く。
【図１７】ａＰ２−／−（Ｃ群）及び３３ｍｇ／ｋｇのＣＡ３３（Ｂ群）又はＰＢＳ対照（Ａ群）のいずれかを週に２回注射し、通常の食餌を与えたａＰ２−正常マウスの群の１型糖尿病誘発性マウスモデル（ＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰマウス）におけるａＰ２−抗体投与スケジュールを示す概略図である。
【図１８】ａＰ２−／−（三角）及び３３ｍｇ／ｋｇのＣＡ３３（四角）又は対照（ＰＢＳ）（丸）のいずれかを週に２回注射し、通常の食餌を与えたａＰ２−正常マウスの群の１型糖尿病誘発性マウスモデル（ＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰマウス）における６時間の空腹時血糖測定（ｍｇ／ｄｌ）対時間（日数）を示す線グラフに図である。ＣＡ３３で処置した及びａＰ２欠損動物は、ビヒクルで処置した動物と比較して、ＬＣＭＶ投与後、有意に低い空腹時血糖を有した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図１９】ａＰ２−／−（三角）及び３３ｍｇ／ｋｇのＣＡ３３（四角）又は対照（ＰＢＳ）（丸）のいずれかを週に２回注射し、高脂肪食を与えたａＰ２−正常マウスの群の１型糖尿病誘発性マウスモデル（ＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰマウス）における１型糖尿病の発生率を示す棒グラフの図である。糖尿病は２５０ｍｇ／ｄｌより高い６時間空腹時血糖測定として定義した。ＣＡ３３処置は、ａＰ２遺伝的欠損動物において観測されたものと同様であるＲＩＰ−ＬＣＭＶ−ＧＰモデルにおける１型糖尿病の発症に対する防御を与えた。
【図２０Ａ】ＧＰ＋対照マウス、ＧＰ＋  ａＰ２−／−マウス又はＬＣＭＶによる注射の１４日後、ＣＡ３３を用いて処置したＧＰ＋マウスにおける島浸潤（％；非膵島炎（白抜きの棒）；膵島周囲炎（格子柄の棒）；軽度膵島炎（灰色の棒）；重度膵島炎（黒色の棒））を示す棒グラフの図である。マウスは、ＬＣＭＶ感染の１４日前に開始して、週に２回の注射によって１．５ｍｇのＣＡ３３又はビヒクルを用いて処置した。膵島炎スコア付けはＨ＆Ｅ染色した膵臓切片で実施した。各々の島は、「非膵島炎」、「膵島周囲炎」、「軽度膵島炎」又は「重度膵島炎」のいずれかとしてスコア付けした。棒グラフは、分析した各々の動物における各々の島の種類の百分率を表す。
【図２０Ｂ】ほとんど又は全くない膵島炎を示す島の代表的な写真の図である。
【図２０Ｃ】重度膵島炎を示す島の代表的な写真の図である。
【図２０Ｄ】ＧＰ＋対照マウス、ＧＰ＋  ａＰ２−／−マウス又はＬＣＭＶによる注射の１４日後、ＣＡ３３を用いて処置したＧＰ＋マウスにおける軽度膵島炎（％）を有する島を示す棒グラフの図である。マウスは、ＬＣＭＶ感染の１４日前に開始して、週に２回の注射によって１．５ｍｇのＣＡ３３又はビヒクルを用いて処置した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【図２０Ｅ】ＧＰ＋対照マウス、ＧＰ＋  ａＰ２−／−マウス又はＬＣＭＶによる注射の１４日後、ＣＡ３３を用いて処置したＧＰ＋マウスにおける重度膵島炎（％）を有する島を示す棒グラフの図である。マウスは、ＬＣＭＶ感染の１４日前に開始して、週に２回の注射によって１．５ｍｇのＣＡ３３又はビヒクルを用いて処置した。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図２１Ａ】ＧＰ＋対照マウス、ＧＰ＋  ａＰ２−／−マウス又はＬＣＭＶによる注射の１４日後、ＣＡ３３を用いて処置したＧＰ＋マウスにおけるＡＴＦ６（左の列）又はＸＢＰ１（右の列）について染色した島の一連の代表的な画像の図である。マウスは、ＬＣＭＶ感染の１４日前に開始して、週に２回の注射によって１．５ｍｇのＣＡ３３又はビヒクルを用いて処置した。
【図２１Ｂ】ＧＰ＋対照マウス、ＧＰ＋  ａＰ２−／−マウス又はＬＣＭＶによる注射の１４日後、ＣＡ３３を用いて処置したＧＰ＋マウス由来の膵臓試料中のＡＴＦ６レベル（相対蛍光強度、ＲＦＩ）を示す棒グラフの図である。マウスは、ＬＣＭＶ感染の１４日前に開始して、週に２回の注射によって１．５ｍｇのＣＡ３３又はビヒクルを用いて処置した。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図２１Ｃ】ＧＰ＋対照マウス、ＧＰ＋  ａＰ２−／−マウス又はＬＣＭＶによる注射の１４日後、ＣＡ３３を用いて処置したＧＰ＋マウス由来の膵臓試料中のｓＸＢＰ１レベル（相対蛍光強度、ＲＦＩ）を示す棒グラフの図である。マウスは、ＬＣＭＶ感染の１４日前に開始して、週に２回の注射によって１．５ｍｇのＣＡ３３又はビヒクルを用いて処置した。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図２２Ａ】示した時点（週）におけるＡｐｏＥノックアウトマウス（アテローム性動脈硬化症マウスモデル）の平均体重に基づいて３３ｍｇ／ｋｇの投薬量を達成するための抗体用量（μｇ）及び注射体積（μｌ）の算定を提供している表の図である。
【図２２Ｂ】ＰＢＳ（丸）、ＣＡ３３（四角）又はＣＡ１５（三角）を用いて処置したＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるアテローム性動脈硬化症病変領域（％）を示すグラフの図である。屠殺したＡｐｏＥノックアウトマウス由来の大動脈を、近位大動脈から腸骨分岐点まで切断し、大動脈を正面調製物（ｅｎ  ｆａｃｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）においてピンで固定した。正面をピンで固定した大動脈をＳｕｄａｎ  ＩＶで染色した。病変領域の定量化を、ＮＩＨにおいて開発されたＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して達成した。ピンで固定した大動脈の外側周囲を、白色バックグラウンドとして大動脈の全領域を画定するためにソフトウェアにおいて定義した。次いでＳｕｄａｎ  ＩＶで赤色に染色した病変の領域のパーセントを測定し、ソフトウェアによって算出した。＊ｐ＜０．０５。
【図２２Ｃ】ウェスタンダイエット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｄｉｅｔ）を与え、ビヒクルを用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウス由来の正面をピンで留めた大動脈の代表的な画像の図である。
【図２２Ｄ】ウェスタンダイエットを与え、ＣＡ３３（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウス由来の正面をピンで留めた大動脈の代表的な画像の図である。
【図２２Ｅ】ウェスタンダイエットを与え、ＣＡ１５（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウス由来の正面をピンで留めた大動脈の代表的な画像の図である。
【図２２Ｆ】ＰＢＳ（丸）、ＣＡ３３（四角）又はＣＡ１５（三角）を用いて１２週間処置したマウスにおけるＡｐｏＥノックアウトマウスの平均体重（ｇ）対年齢（週齢）を示す線グラフの図である。ＡｐｏＥノックアウトマウスにウェスタンダイエットを与え、ビヒクル又は抗体（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置した。
【図２２Ｇ】ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウスの脂肪組織におけるａＰ２タンパク質発現を示す図である。
【図２２Ｈ】１２週のウェスタンダイエットの後のＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ＋／＋及びＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウスにおけるａＰ２のレベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフの図である。
【図２２Ｉ】１２週のウェスタンダイエットの後のＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ＋／＋及びＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウスにおけるトリグリセリドのレベル（ｍｇ／ｄｌ）を示す棒グラフの図である。
【図２２Ｊ】１２週のウェスタンダイエットの後のＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ＋／＋及びＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウスにおけるコレステロールのレベル（ｍｇ／ｄｌ）を示す棒グラフの図である。
【図２２Ｋ】ＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ＋／＋及びＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化症病変領域を示す棒グラフの図である。
【図２２Ｌ】１２週間ウェスタンダイエットを与えたＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ＋／＋及びＡｐｏＥ−／−ａＰ２ａｄｉｐ−／−マウス由来の正面をピンで留めた大動脈の代表的な画像の図である。
【図２３Ａ】ＰＢＳ（黒色の棒）、ＣＡ３３（薄灰色の棒）又はＣＡ１５（灰色の棒）を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスの平均体重（ｇ）を示す棒グラフの図である。ＡｐｏＥノックアウトマウスにウェスタンダイエットを与え、ビヒクル又は抗体（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置した。ＣＡ３３で処置したマウスは、ビヒクルで処置したマウスより統計的に有意に低い平均体重を示す。＊ｐ＜０．０５。
【図２３Ｂ】ＰＢＳ（黒色の棒）、ＣＡ３３（薄灰色の棒）又はＣＡ１５（灰色の棒）を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスの肝臓重量（ｇ）を示す棒グラフの図である。ＡｐｏＥノックアウトマウスにウェスタンダイエットを与え、ビヒクル又は抗体（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置した。ＣＡ３３で処置したマウスは、ビヒクルで処置したマウスより統計的に有意に低い肝臓重量を示す。＊ｐ＜０．０５。
【図２３Ｃ】ＰＢＳ（黒色の棒）、ＣＡ３３（薄灰色の棒）又はＣＡ１５（灰色の棒）を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスの体重−肝臓重量（ｇ）を示す棒グラフの図である。ＡｐｏＥノックアウトマウスにウェスタンダイエットを与え、ビヒクル又は抗体（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置した。ＣＡ３３で処置したマウスは、ビヒクルで処置したマウスより低い平均体重−肝臓重量を示す。
【図２３Ｄ】ＰＢＳ（黒色の棒）、ＣＡ３３（薄灰色の棒）又はＣＡ１５（灰色の棒）を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスの平均体重、除脂肪質量又は脂肪質量（ｇ）を示す棒グラフの図である。ＡｐｏＥノックアウトマウスにウェスタンダイエットを与え、ビヒクル又は抗体（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置し、体重、除脂肪質量及び脂肪質量を二重Ｘ線吸収（ＤＥＸＡ）分光法によって測定した。
【図２４Ａ】ＰＢＳ（黒色の棒）、ＣＡ３３（薄灰色の棒）又はＣＡ１５（灰色の棒）を用いて処置したＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるブドウ糖負荷試験前の空腹時基礎グルコースレベル（ｍｇ／ｄｌ）の棒グラフの図である。ＡｐｏＥノックアウトマウスにウェスタンダイエットを与え、ビヒクル又は抗体（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置した。ＣＡ３３で処置したマウスは、ビヒクルで処置したマウスより統計的に有意に低い空腹時血糖を有する。＊ｐ＜０．０５。
【図２４Ｂ】ＰＢＳ（三角）、ＣＡ３３（四角）又はＣＡ１５（丸）を用いて処置したＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるブドウ糖負荷試験の間のグルコースレベル（ｍｇ／ｄｌ）対時間（分）の線グラフの図である。ＡｐｏＥノックアウトマウスにウェスタンダイエットを与え、ビヒクル又は抗体（３３ｍｇ／ｋｇ）を用いて１２週間処置した。ブドウ糖負荷試験は、一晩（１６時間）の絶食後、意識のあるマウスへの経口グルコース投与（１．０ｇ／ｋｇ）によって実施した。
【図２５Ａ】ＰＢＳ（三角）、ＣＡ３３（四角）又はＣＡ１５（丸）を用いて６週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるリポタンパク質画分（総リポタンパク質、非常に低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）又は高密度のリポタンパク質（ＨＤＬ））中のコレステロール（ｍｇ／ｄｌ）の棒グラフの図である。リポタンパク質の粒径分布は、血漿のプールした試料を使用して、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって決定した。＊ｐ＜０．０５。
【図２５Ｂ】ＰＢＳ（三角）、ＣＡ３３（四角）又はＣＡ１５（丸）を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるリポタンパク質画分（総リポタンパク質、非常に低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）又は高密度のリポタンパク質（ＨＤＬ））中のコレステロール（ｍｇ／ｄｌ）の棒グラフの図である。リポタンパク質の粒径分布は、血漿のプールした試料を使用して、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって決定した。＊ｐ＜０．０５。
【図２６Ａ】ＰＢＳ（三角）、ＣＡ３３（四角）又はＣＡ１５（丸）を用いて６週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるリポタンパク質画分（総リポタンパク質、非常に低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）又は高密度のリポタンパク質（ＨＤＬ））中のトリグリセリド（ｍｇ／ｄｌ）の棒グラフの図である。リポタンパク質の粒径分布は、血漿のプールした試料を使用して、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって決定した。＊ｐ＜０．０５。
【図２６Ｂ】ＰＢＳ（三角）、ＣＡ３３（四角）又はＣＡ１５（丸）を用いて１２週間処置したＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるリポタンパク質画分（総リポタンパク質、非常に低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）又は高密度のリポタンパク質（ＨＤＬ））中のトリグリセリド（ｍｇ／ｄｌ）の棒グラフの図である。リポタンパク質の粒径分布は、血漿のプールした試料を使用して、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって決定した。＊ｐ＜０．０５。
【図２７】抗ヒトａＰ２ヒト化カッパ軽鎖可変領域抗体断片を提供した図であり、９０９配列（配列番号４４５）はウサギ可変軽鎖配列であり、９０９ｇＬ１（配列番号４４６）、ｇＬ１０（配列番号４４８）、ｇＬ１３（配列番号４８７）、ｇＬ５０（配列番号４８８）、ｇＬ５４（配列番号４５０）及びｇＬ５５配列（配列番号４５２）は、アクセプターフレームワークとしてＩＧＫＶ１−１７（配列番号５０６）ヒト生殖細胞系列を使用した９０９可変軽鎖のヒト化移植である。ＣＤＲは太字／下線で示され、一方、適用可能なドナー残基は太字／イタリックで示され、強調されている：２Ｖ、３Ｖ、６３Ｋ及び７０Ｄ。システイン残基を除去するためのＣＤＲＬ３における突然変異は太字／下線で示され、強調されている：９０Ａ。
【図２８】抗ヒトａＰ２ヒト化重鎖可変領域抗体断片を提供した図であり、９０９配列（配列番号４５４）はウサギ可変重鎖配列であり、９０９ｇＨ１（配列番号４５５）、ｇＨ１４（配列番号４５７）、ｇＨ１５（配列番号４５９）、ｇＨ６１（配列番号４６１）及びｇＨ６２配列（配列番号４６３）は、アクセプターフレームワークとしてＩＧＨＶ４−４（配列番号４８１）ヒト生殖細胞系列を使用した９０９可変重鎖のヒト化移植である。ＣＤＲは太字／下線で示される。ベータシート鎖ＤとＥとの間のループにおけるフレームワーク３内の２つの残基ギャップはｇＨ１において強調されている：７５及び７６。適用可能なドナー残基は太字／イタリックで示され、強調されている：２３Ｔ、６７Ｆ、７１Ｋ、７２Ａ、７３Ｓ、７４Ｔ、７７Ｔ、７８Ｖ、７９Ｄ、８９Ｔ及び９１Ｆ。システイン残基を除去するためのＣＤＲ−Ｈ２における突然変異は太字／下線で示され、強調されている：５９Ｓ。潜在的なアスパルタート異性化部位を除去するためのＣＤＲ−Ｈ３における突然変異は太字／下線で示され、強調されている：９８Ｅ。Ｎ末端グルタミン残基はグルタミン酸と置き換えられ、太字で示され、強調されている：１Ｅ。
【図２９】ａＰ２とネズミ由来の抗ａＰ２抗体との間の重要な接触点を表す図である。図に示されるように、重及び軽鎖のＣＤＲ領域を有する特定のアミノ酸残基の置換の結果、親抗体Ｈ３と比較して、変化した抗体の親和性の減少が生じた。
【図３０Ａ】親抗体Ｈ３と比較して、ネズミ由来の抗ａＰ２抗体における結合親和性の低下を誘導するためのアミノ酸置換を提供した図であり、ｇ１＝野生型親Ｈ３である。結合親和性（μＭ）をＣＡ３３及び２つの低下した親和性のＨ３様抗体について示す。
【図３０Ｂ】親抗体Ｈ３と比較して、ネズミ由来抗ａＰ２抗体における結合親和性の低下を誘導するためのアミノ酸置換を詳述している重鎖のタンパク質配列を提供した図であり、ｇ１＝野生型親Ｈ３である。ＣＤＲは下線が引かれ、アミノ酸置換は太字で示されている。
【図３０Ｃ】親抗体Ｈ３と比較して、ネズミ由来の抗ａＰ２抗体における結合親和性の低下を誘導するためのアミノ酸置換を詳述している軽鎖のタンパク質配列を提供した図であり、ｇ１＝野生型親Ｈ３である。ＣＤＲは下線が引かれ、アミノ酸置換は太字で示されている。
【図３１】結合親和性を低下させるように突然変異されているネズミ由来の抗ａＰ２抗体についてヒト及びマウスａＰ２に対する親和性データを示す表の図である。結合親和性（ＫＤ）を、各抗体（ＡＰＰ５１６８／ＰＢ１１７２及びＡＰＰ５１６９／ＰＢ１１７１）について２つのクローンで示し、平均結合親和性（ＫＤ）を示す（μＭ）。
【図３２】ａＰ２が、ＦｏｘＯ１依存的に糖新生遺伝子発現を調節することを示す図である。初代肝細胞を、３時間（図３２Ａ、図３２Ｂ、図３２Ｃ、図３２Ｄ及び図３２Ｅ）又は６時間（図３２Ｆ）、２μＭのホルスコリン（ｆｓｋ）の存在下又は非存在下で５０μｇのａＰ２と共に又はそれを有さずにインキュベートした。図３２Ａと図３２Ｂは肝細胞における糖新生遺伝子発現（それぞれＧ６ｐｃ及びＰｃｋ１）に対するａＰ２の効果に対するホルスコリン刺激の影響及びこのプロセスにおけるａＰ２脂質結合の役割を示す図である（ｎ＝４）。ｍｕｔ：脂質結合突然変異体、ｄｅｌｉｐ：脱脂質化ａＰ２、ＷＴ：脂質負荷ａＰ２。図３２Ｃは、ｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンによる転写因子のスクリーニング並びにホルスコリン及びａＰ２刺激性Ｇ６ｐｃ発現に対する効果を示す（ｎ＝４）。図３２Ｄは、ａＰ２媒介性Ｇ６ｐｃ発現に対するアデノウイルス媒介性ＦｏｘＯ１ノックダウンの効果を示す（ｎ＝４）。図３２Ｅは、ＦｏｘＯ１についてタンパク質レベルにおけるノックダウン効率を示す。図３２Ｆは、初代肝細胞におけるＦＨＲＥルシフェラーゼ活性のａＰ２刺激の効果を示す（ｎ＝６）。図３２Ｇは、アデノウイルス媒介性ＦｏｘＯ１ノックダウン及びａＰ２刺激後の肝細胞からのグルコース産生を示す図である（ｎ＝５）。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊、＊＊及びＮＳはそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及び有意差なしを示す。
【図３３】ａＰ２が糖新生遺伝子発現を調節するために脂肪酸代謝を変化させることを示す図である。図３３Ａ及び図３３Ｂは、ビヒクル又は５０μＭのエトモキシルと３０分間プレインキュベートし、２μＭのホルスコリン（ｆｓｋ）の存在下又は非存在下で３時間、５０μｇ／ｍｌのａｐ２で刺激した初代肝細胞からのＧ６ｐｃ及びＰｃｋ１発現についてそれぞれ一覧にした結果を示す（ｎ＝４）。図３３Ｃと図３３Ｄは、酸素消費速度（ＯＣＲ、図３３Ｃ、ｎ＝６）又は脂肪酸取込み（図３３Ｄ、ｎ＝５）を測定するために示した時間について、初代肝細胞を、５０μｇ／ｍｌのａＰ２で２時間刺激し、１５０μＭのパルミタート（図３３Ｃ）又は１５０μＭのオレアート（図３３Ｄ）で刺激したときに得られた結果を示す。図３３Ｅ及び図３３Ｆは、初代肝細胞を５０μｇ／ｍｌのａＰ２で２時間刺激し、細胞を、２μＭのホルスコリン（ｆｓｋ）／１００μＭのパルミタートの存在下又は非存在下で３時間、５０μｇ／ｍｌのａｐ２でさらに刺激したときにＧ６ｐｃ及びＰｃｋ１についてそれぞれ得られたｍＲＮＡレベルを示す（ｎ＝４）。図３３Ｇ及び図３３Ｈは、初代肝細胞を、５μＭのトリアクシンＣと３０分間プレインキュベートし、同じ濃度のトリアクシンＣを用いて又は用いずに図３３Ｄのようにさらに処理したときにＧ６ｐｃ及びＰｃｋ１についてそれぞれ得られたｍＲＮＡレベルを示す（ｎ＝４）。図３３Ｉは、初代肝細胞をビヒクル又はａＰ２のいずれかを用いて処置した後の初代肝細胞における核脂肪アシル−ＣｏＡ（ｐｍｏｌ／１０６細胞）のレベルを示す。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊、＊＊及びＮＳはそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及び有意差なしを示す。
【図３４】ａＰ２によって調節された新規ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２転写複合体の存在を実証する図である。初代肝細胞を、２μＭのホルスコリン（ｆｓｋ）の存在下又は非存在下で３時間（図３４Ａ及びＢ）又は９０分（図３４Ｈ、Ｋ、Ｍ及びＮ）、５０μｇ／ｍｌのａＰ２（図３４Ａ、Ｂ、Ｈ、Ｌ、Ｍ及びＮ）で刺激した。図３４Ａと図３４Ｂは、Ｇ６ｐｃ及びＰｃｋ１それぞれのａＰ２誘発性発現に対するアデノウイルス媒介性ＣｔＢＰ１及びＣｔＢＰ２ノックダウンの効果を示す（ｎ＝４）。図３４Ｃは、長方形によって示されるヒト及びマウスＦｏｘＯ配列におけるＰｘＤＬＳ様モチーフを示す（配列番号６０３〜６１０）。図３４Ｄ及び図３４Ｅは、ＣｔＢＰ又はＦｏｘＯ１の相互免疫共沈降によって示される初代肝細胞における内因性ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ複合体を示す。図３４Ｆは及び図３４Ｇは、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体におけるＰｘＤＬモチーフの重要な役割を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ＣｔＢＰ２発現プラスミドと共に対照プラスミド、ＦＬＡＧ野生型ＦｏｘＯ１又は突然変異ＦＬＡＧ−ＦｏｘＯ１（Ｍｕｔ：ＰＳＤＬ＞ＰＳＡＳ、Δｐｓｄｌ：ＰｘＤＬモチーフ欠失）のいずれかをトランスフェクトした。複合体はＦＬＡＧアガロースビーズで免疫沈降させた。図３４Ｈは、ａＰ２処置による天然ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体の解離を示す。内因性ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体を初代肝細胞から免疫沈降させた。図３４Ｉ及び図３４Ｊは、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体の栄養素感知能力を示す。ＨＥＫ２９３細胞にＦＬＡＧ野生型ＦｏｘＯ１及びＣｔＢＰ２をトランスフェクトした。増加させている濃度のオレオイル−ＣｏＡ（０、５０、１５０、５００μＭ）（図３４Ｉ）又はＮＡＤＨ（０、１０、３０、１００μＭ）（図３４Ｊ）を細胞溶解物に加え、ＦＬＡＧアガロースビーズで免疫沈降させた。図３４Ｋは、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体に対する細胞質酸化還元状態の効果を示す。ＨＥＫ２９３細胞にＦＬＡＧ野生型ＦｏｘＯ１及びＣｔＢＰ２をトランスフェクトし、異なる割合のラクタート及びピルバートと１時間インキュベートした。図３４Ｌは、ＦｏｘＯ１及びＣｔＢＰ２の核／細胞質内局在に対するホルスコリン及びａＰ２処置の効果を示す。ＮＥ：核抽出物。図３４Ｍ及び図３４ＮはＧ６ｐｃプロモーターにおけるＦｏｘＯ１又はＣｔＢＰ２のクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析（ｎ＝４）をそれぞれ示す。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊及び＊＊はそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１を示す。
【図３５】ＣｔＢＰ２による糖新生遺伝子発現の微調整された調節を示す図である。初代肝細胞を、ＣｔＢＰ２のノックダウン（図３５Ａ、Ｂ）又は過剰発現（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）後、ビヒクル又は２μＭのホルスコリン（ｆｓｋ）で３時間（Ａ、Ｄ及びＥ）又は６時間（Ｂ、Ｆ）刺激した。図３５Ａは、Ｇ６ｐｃ発現に対するＣｔＢＰ２及び／又はＦｏｘＯ１ノックダウンの効果を示す（ｎ＝５）。より明らかにｆｓｋの非存在下でのデータを示すためにｙ軸スケールを差込み図において拡大している。図３５Ｂは、ＣｔＢＰ２ノックダウン後のＦＨＲＥルシフェラーゼ活性を示す（ｎ＝８）。図３５Ｃは、初代肝細胞におけるＧＵＳ及びＣｔＢＰ２過剰発現を示す。図３５Ｄ及び図３５Ｅは、ＣｔＢＰ２過剰発現による糖新生遺伝子発現の調節を示す（ｎ＝４）。図３５Ｆは、ＣｔＢＰ２過剰発現後のＦＨＲＥルシフェラーゼ活性を示す（ｎ＝８）。図３５Ｇは、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体に対するインスリン及びｃＡＭＰシグナリングの急性活性化の効果を示す。ＦＬＡＧ−ＦｏｘＯ１及びＣｔＢＰ２をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ビヒクル、１００ｎＭのインスリン（ｉｎｓ）又は５０μＭのホルスコリン（ｆｓｋ）のいずれかで３０分間刺激した。
【図３６】ｉｎ  ｖｉｖｏでの内因性ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体の調節を示す図である。図３６Ａ、図３６Ｃ、図３６Ｅ、図３６Ｇ及び図３６Ｊ：以下のマウスの群からの肝臓ホモジネートを免疫共沈降に供して、内因性ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体をアッセイした。全てのマウスを４〜６時間の絶食後に屠殺した。図３６Ａ及び図３６Ｂ：遺伝的肥満ｏｂ／ｏｂマウス及びそれらの対照痩せマウスである。図３６Ｃ及び図３６Ｄ：食餌誘発性肥満マウス（１６週間高脂肪食（ＨＦＤ））及びそれらの対照痩せマウス（通常の食餌（ＮＣ））である。図３６Ｅ及び図３６Ｆ：１６週間の通常の食餌（ＮＣ）又は高脂肪食（ＨＦＤ）でのａＰ２ノックアウト（ＫＯ）又はそれらの対照野生型（ＷＴ）マウスである。図３６Ｇ及び図３６Ｈ：モノクローナルａＰ２抗体（ＣＡ３３）又はビヒクルを用いて処置した食餌誘発性肥満マウス（ＨＦＤ）、並びに対照痩せマウス（ＮＣ）である。図３６Ｉ、図３６Ｊ、図３６Ｋ、図３６Ｌ及び図３６Ｍ：組換えａＰ２を野生型痩せマウスに５日間投与した。血清ａＰ２レベルを分析した（ｎ＝４）。血清ａＰ２レベル（図３６Ｉ）及びＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体（図３６Ｊ及び図３６Ｋ）、及び肝臓における遺伝子発現（図３６Ｌ及び図３６Ｍ）を分析した（ｎ＝４）。図３６Ｎは、形質導入の５日後の野生型痩せマウスの肝臓におけるＣｔＢＰ２のアデノウイルス媒介性ノックダウンからの結果を示す（ｎ＝６）。＊及び＊＊はそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１を示す。
【図３７】肝臓におけるＣｔＢＰ２機能獲得は耐糖能を改善し、肥満マウスにおける脂肪症を寛解する図である。ＣｔＢＰ２は、アデノウイルス形質導入によって食餌誘発性肥満マウス（１４週間の食餌）の肝臓内で過剰発現した。ＨＦＤ：高脂肪食、ＮＣ：通常の食餌。図３７Ａ及び図３７Ｂは一晩絶食後の体重の測定を一覧にする（ｎ＝４〜５）。図３７Ｃ、図３７Ｄ及び図３７Ｑ：ＡｄＧＵＳ又はＡｄＣｔＢＰ２を形質導入した食餌誘発性肥満マウスを、ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ、図３７Ｃ）、インスリン負荷試験（ＩＴＴ、図３７Ｄ）及びピルバート負荷試験（ＰＴＴ、図３７Ｑ）に供した（ｎ＝１０〜１２）。図３７Ｅ、図３７Ｆ及び図３７Ｇ：Ｇ６ｐｃ、Ｐｃｋ１、又はＡｌｂ  ｍＲＮＡについての肝臓におけるそれぞれの遺伝子発現である（ｎ＝４〜５）。図３７Ｈは、肝臓におけるＣｔＢＰ２機能獲得は耐糖能を改善し、肥満マウスにおける脂肪症を寛解する図である。図３７Ｉは、一覧にした肝臓トリグリセリド含有量を示す（ｎ＝１０）。図３７Ｊは一覧にした血清ＡＬＴレベルを示す（ｎ＝１０）。図３７Ｋ、図３７Ｌ、図３７Ｍ、図３７Ｎ及び図３７Ｏは、肝臓におけるＭｌｘｉｐｌ／Ｓｒｅｂｆ１ｃ（図３７Ｋ及び３７Ｌ）及び脂質合成遺伝子（図３７Ｍ、図３７Ｎ及び図３７Ｏ）発現を示す（ｎ＝１０）。マウスは一晩の絶食後に屠殺した。図３７Ｐは、潜在的な調節機構を示す概略図である。ＡＣＳＬ；アシル−ＣｏＡ合成酵素。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊、＊＊及びＮＳはそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及び有意差なしを示す。
【図３８】ｃＡＭＰ刺激が、ａＰ２誘発性糖新生遺伝子発現を増幅させる図である。図３８Ａと図３８Ｂは、初代肝細胞を、２μＭのホルスコリン（ｆｓｋ）の非存在下又は存在下で３時間、５０μｇ／ｍｌのａＰ２を用いて又は用いずに刺激したときからのＧ６ｐｃ及びＰｃｋ１  ｍＲＮＡレベルをそれぞれ示す（ｎ＝４）。ｙ軸のスケールはｆｓｋの非存在下でのデータをより明確に示すために差込み図において拡大している。図３８Ｃ及び図３８Ｄにおいて、初代肝細胞を、ＰＫＡ阻害剤（Ｈ８９、２０μＭ）を用いて又は用いずに図３８Ａと同様に処置した（ｎ＝４）；Ｇ６ｐｃ  ｍＲＮＡ及びＰｃｋ１  ｍＲＮＡレベルを測定し、一覧にした。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊＊はスチューデントのｔ検定によって決定したｐ＜０．０１を示す。
【図３９】糖新生遺伝子のａＰ２媒介性上方制御に関与している転写因子（単数又は複数）のスクリーニングを示す図である。図３９Ａ、図３９Ｂ及び図３９Ｃは、図３２Ｃに示した実験に対応するｍＲＮＡレベルにおけるノックダウン効率を示す（ｎ＝４）。図３９Ｄ、図３９Ｅ、図３９Ｆ及び図３９Ｇは、糖新生遺伝子のａＰ２依存性上方制御に関与している転写因子（単数又は複数）のスクリーニングを示す。初代肝細胞を、Ｈｉｆ１ａ、Ｐｐａｒｇｃ１ａ又はＳｔａｔ３のノックダウン後、図３２Ａと同様に処置した（ｎ＝４）。図３９Ｈは、図３２のようにＦｏｘｏ１発現レベルを示す（ｎ＝４）。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊及び＊＊はそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１を示す。
【図４０】ａＰ２によるＣｔＢＰ２依存性転写活性化の図である。図４０Ａ、図４０Ｂ、図４０Ｃ及び図４０Ｄは、図３４に対応するｍＲＮＡ及びタンパク質レベルにおけるノックダウン効率を示す（ｎ＝４）。図４０Ｅ、図４０Ｆ及び図４０Ｇは、ＨＮＦ４αのアデノウイルス媒介性ノックダウン後の初代肝細胞における糖新生遺伝子発現を示す（ｎ＝４）。Ｇ６ｐｃ及びＰｃｋ１についての遺伝子発現プロファイルを図４０Ｅ及び図４０Ｆにそれぞれ示し、そしてタンパク質レベルにおけるノックダウン効率を図４０Ｇに示す。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊及び＊＊はそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１を示す。
【図４１】ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ複合体の特徴付けの図である。図４１Ａ及び図４１Ｂは、ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ１相互作用についての突然変異誘発研究の結果を示す。ＣｔＢＰ１発現プラスミドと共に野生型ＦＬＡＧ  ＦｏｘＯ１（ＷＴ）又は突然変異ＦｏｘＯ１（Ｍｕｔ：ＰＳＤＬ＞ＰＳＡＳ、Δｐｓｄｌ：ＰｘＤＬモチーフ欠失）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を溶解し、免疫共沈降に供した。図４１Ｃは、ホルスコリン（ｆｓｋ、２μＭ）の存在下又は非存在下で５０μｇ／ｍｌのａＰ２と初代肝細胞を２時間インキュベートすると、天然ＦｏｘＯ１／ＣｔＢＰ２複合体が免疫沈降した結果を示す。図４１Ｄは、細胞のラクタート／ピルバート比を示す。初代肝細胞は図３３Ｅのように処置した。図４１Ｅは図３４Ｌに対応する免疫細胞化学を示す。図４１ＦはＦｏｘＯ１のリン酸化及びアセチル化のレベルを示す。初代肝細胞はホルスコリン（ｆｓｋ、２μＭ）及び／又は５０μｇ／ｍｌのａＰ２を用いて３０分間処置した。
【図４２】特定の遺伝子の発現に対するＣｔＢＰ２過剰発現の効果を示す図である。初代肝細胞を図３５Ｄのように処理し、遺伝子発現プロファイルを分析した。
【図４３】組換えａＰ２のｉｎ  ｖｉｖｏ投与の結果を示す図である。組換えａＰ２を野生型痩せマウスに５日間投与した（ｎ＝４）。図４３Ａ、図４３Ｂ、図４３Ｃ、図４４Ｄ、及び図４４Ｅは、ａＰ２の腹腔内注射の前（０日）及び後（５日）の体重、血清インスリンレベル、グルカゴン、グリセロール及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）についての結果をそれぞれ示す。図４３Ｆ及び図４３Ｇは、組換えａＰ２を用いて処置した野生型又は肝臓特異的ＦｏｘＯ１  ＫＯマウスにおけるＰｃｋ１及びＦｏｘｏ１についてのｍＲＮＡレベルを示す（ｎ＝７〜８）。データは平均±ＳＥＭとして表す。ＮＳはスチューデントのｔ検定によって決定した有意差なしを示す。
【図４４】ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣｔＢＰ２過剰発現の図である。図４４Ａは、肝臓におけるＧＵＳ及びＣｔＢＰ２の過剰発現のタンパク質レベルを示す。図４４Ｂは、ＩＴＴ研究（図３７Ｄ、ｎ＝１０〜１２）においてベースラインに正規化していない血糖値を示す。図４４Ｃは、ＧＵＳ又はＣｔＢＰ２を過剰発現した肝臓における血清インスリンレベルを示す。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊及び＊＊はそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１を示す。
【図４５】肝臓脂肪症の発症におけるＣｔＢＰ２の関与の図である。図４５Ａ、図４５Ｂ、図４５Ｃ、図４５Ｄ、図４５Ｅ及び図４５Ｆは、野生型初代肝細胞（図４５Ａ、図４５Ｂ、図４５Ｃ、図４５Ｄ、ｎ＝４）又はＦｏｘＯ１ノックアウト肝細胞（図４５Ｅ及び図４５Ｆ、ｎ＝５）における脂質合成遺伝子発現に対するＣｔＢＰ２過剰発現の効果を示す。図４５Ｇ、図４５Ｈ、図４５Ｉ及び図４５Ｊは野生型痩せマウスにおけるＡｄ／ｓｈＣｔＢＰ２形質導入の１４日後に分析した肝臓試料からの結果を示す。図４５Ｇは代表的なヘマトキシリン及びエオシン染色した肝臓切片を示す。図４５Ｈは、肝臓トリグリセリド含有量を示す（ｎ＝６）。図４５Ｉ及び図４５Ｊは、肝臓ステアロイル（Ｓｔｅａｒｙｏｌ）−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（Ｓｃｄ１）及び脂肪酸合成酵素（Ｆａｓｎ）発現をそれぞれ示す（ｎ＝６）。マウスを一晩の絶食後に屠殺した。データは平均±ＳＥＭとして表す。＊及び＊＊はそれぞれ、スチューデントのｔ検定によって決定した、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１を示す。
【図４６】組換えａＰ２の付加がＦＯＸＯ１転座及び活性を活性化することを示す図である。図４６Ａは１０μｇ／ｍｌのａＰ２を用いて２０分間処置したマウス及びヒト島におけるＦＯＸＯ１の核転座を示す（Ｎ＝３のマウス島、Ｎ＝１のヒト島）。図４６Ｂは１０μｇ／ｍｌのａＰ２を用いて２４時間処置したＩＮＳ１細胞におけるＦＯＸＯ１標的遺伝子の遺伝子発現の変化を示す（Ｎ＝４／群）。図４６Ｃは１０μｇ／ｍｌのａＰ２処置の２４時間後の増加したＶＥＧＦＡタンパク質を示すＦＯＸＯ１標的遺伝子発現における変化の検証を示す（Ｎ＝３／群）。
【図４７】オボアルブミン又はビヒクルのいずれかを用いて処置した野生型及びａＰ２ノックアウトマウスにおけるメタコリンチャレンジ試験の間の気道抵抗（ｃｍＨ２Ｏ．ｓ／ｍｌ）対メタコリン（ｍｇ／ｍｌ）の線グラフの図である。