(57)【要約】  アルポート症候群の分子治療法を確立する。COL4A5遺伝子のcDNAに相補的なヌクレオチド配列からなる塩基数１５〜３０のオリゴヌクレオチドであって、アルポート症候群の患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンのスキッピングを誘導できる前記オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。前記オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物を含む、医薬（アルポート症候群治療薬）。
2018123925.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
COL4A5遺伝子のcDNAに相補的なヌクレオチド配列からなる塩基数１５〜３０のオリゴヌクレオチドであって、アルポート症候群の患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンのスキッピングを誘導できる前記オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
【請求項２】
アルポート症候群の患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンのヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列からなる請求項１記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
【請求項３】
アルポート症候群の患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンが、COL4A5遺伝子のエクソン24、20又は21である請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
【請求項４】
配列番号１〜２８、３７〜４１、５１又は５２のいずれかの配列（但し、配列中のtはuであってもよく、uはtであってもよい）の全部又は一部を含む請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドを構成する糖及び／又はリン酸ジエステル結合の少なくとも１個が修飾されている請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドを構成する糖がD-リボフラノースであり、糖の修飾がD-リボフラノースの2’位の水酸基の修飾である請求項５記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
【請求項７】
糖の修飾がD-リボフラノースの2’-O-アルキル化及び／又は2’-O, 4’-C-アルキレン化である請求項６記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
【請求項８】
リン酸ジエステル結合の修飾がホスホロチオエートである請求項５〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物を含む、医薬。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物を含む、アルポート症候群治療薬。
【請求項１１】
COL4A5遺伝子のcDNAに相補的なヌクレオチド配列からなる塩基数１５〜３０のオリゴヌクレオチドであって、アルポート症候群の患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンのスキッピングを誘導できる前記オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物を医薬的に有効な量で被験者に投与することを含む、アルポート症候群の治療方法。
【請求項１２】
アルポート症候群の治療のための、COL4A5遺伝子のcDNAに相補的なヌクレオチド配列からなる塩基数１５〜３０のオリゴヌクレオチドであって、アルポート症候群の患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンのスキッピングを誘導できる前記オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物の使用。
【請求項１３】
アルポート症候群を治療する方法に使用するための、COL4A5遺伝子のcDNAに相補的なヌクレオチド配列からなる塩基数１５〜３０のオリゴヌクレオチドであって、アルポート症候群の患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンのスキッピングを誘導できる前記オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルポート症候群治療薬に関し、より詳細には、アルポート症候群の患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンのスキッピングを誘導できるオリゴヌクレオチド及びそれを含む医薬（好適には、アルポート症候群治療薬）に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルポート症候群は重篤な遺伝性腎疾患で、そのほとんどが30歳までに末期腎不全へと進行する。最も頻度の高いX染色体連鎖型アルポート症候群（XLAS）は4型コラーゲンα5鎖をコードする遺伝子COL4A5遺伝子の異常で発症する。本発明者らはこれまで、300家系以上のXLAS患者の遺伝子診断を行ってきた。その結果、約15％程度の家系においては、ナンセンス変異などの完全な鎖長を有するタンパク質が発現しないtruncating変異を有し、その場合、ミスセンス変異のようなnon-truncating変異を有する場合より明らかに重症の臨床像を呈することを報告してきた（非特許文献１：Kidney Int. 2013年、85巻、p.1208-1213）。同様の報告はいくつかあり（非特許文献２：J Am Soc Nephrol.  2000年、11巻、p.649-657、非特許文献３：Nephrol Dial Transplant，2002年、17巻、p.1218-1227、非特許文献４：J Am Soc Nephrol，2010年、21巻、p.876-883）truncating変異を有する場合、non-truncating変異を有する場合と比較し、10年以上末期腎不全進行年齢が早いことが判明している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Kidney Int. 2013年、85巻、p.1208-1213
【非特許文献２】J Am Soc Nephrol.  2000年、11巻、p.649-657
【非特許文献３】Nephrol Dial Transplant，2002年、17巻、p.1218-1227
【非特許文献４】J Am Soc Nephrol，2010年、21巻、p.876-883
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、アルポート症候群の分子治療法を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、truncating変異を有するアルポート症候群患者に対し、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）を投与することで、truncating変異を有するエクソンのスキッピングを誘導する治療法を確立した（図１）。COL4A5遺伝子はcollagenous domainを形成する44エクソン中35エクソンが3の倍数の塩基数で構成されているため、これらのエクソンにtruncaing変異を有する患者においては、この治療法により、non-truncating変異へと置換することができる。これにより、重症の臨床像を呈するアルポート症候群患者の末期腎不全進行年齢を遅延させることが可能となる。本研究はXLASに対する世界初の分子治療の開発研究となる。【０００６】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）COL4A5遺伝子のcDNAに相補的なヌクレオチド配列からなる塩基数１５〜３０のオリゴヌクレオチドであって、アルポート症候群の患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンのスキッピングを誘導できる前記オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
（２）アルポート症候群の患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンのヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列からなる（１）記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
（３）アルポート症候群の患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンが、COL4A5遺伝子のエクソン24、20又は21である（１）又は（２）記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
（４）配列番号１〜２８、３７〜４１、５１又は５２のいずれかの配列（但し、配列中のtはuであってもよく、uはtであってもよい）の全部又は一部を含む（１）〜（３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
（５）オリゴヌクレオチドを構成する糖及び／又はリン酸ジエステル結合の少なくとも１個が修飾されている（１）〜（４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
（６）オリゴヌクレオチドを構成する糖がD-リボフラノースであり、糖の修飾がD-リボフラノースの2’位の水酸基の修飾である（５）記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
（７）糖の修飾がD-リボフラノースの2’-O-アルキル化及び／又は2’-O, 4’-C-アルキレン化である（６）記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
（８）リン酸ジエステル結合の修飾がホスホロチオエートである（５）〜（７）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物を含む、医薬。
（１０）（１）〜（８）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物を含む、アルポート症候群治療薬。
（１１）COL4A5遺伝子のcDNAに相補的なヌクレオチド配列からなる塩基数１５〜３０のオリゴヌクレオチドであって、アルポート症候群の患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンのスキッピングを誘導できる前記オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物を医薬的に有効な量で被験者に投与することを含む、アルポート症候群の治療方法。
（１２）アルポート症候群の治療のための、COL4A5遺伝子のcDNAに相補的なヌクレオチド配列からなる塩基数１５〜３０のオリゴヌクレオチドであって、アルポート症候群の患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンのスキッピングを誘導できる前記オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物の使用。
（１３）アルポート症候群を治療する方法に使用するための、COL4A5遺伝子のcDNAに相補的なヌクレオチド配列からなる塩基数１５〜３０のオリゴヌクレオチドであって、アルポート症候群の患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンのスキッピングを誘導できる前記オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、COL4A5遺伝子のエクソンにtruncaing変異を有する患者において、truncaing変異をnon-truncating変異へと置換することができ、その結果、重症の臨床像を呈するアルポート症候群患者の末期腎不全進行年齢を遅延させることが可能となる。また、本発明により、難聴、眼病変の進行予防が可能となる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2016‐254906及び特願2017‐077374の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明のアルポート症候群治療薬による治療原理を説明する模式図を示す。
【図２】(A)COL4A5のエクソン24に対する、実施例1〜27の化合物の効果を示す図。(B,C)フラグメント1はエクソン24がスキッピングを起こす前の配列であるのに対し、フラグメント2は、エクソン24がスキッピングしている配列を有していることを示す図。
【図３】腎糸球体上皮細胞ポドサイトにExon 24に対するオリゴヌクレオチド（実施例1、実施例2、実施例3）を導入した際に、COL4A5タンパクの発現（緑色）上昇、及び、Synaptopodin（赤色）の発現上昇を示す図。
【図４】COL4A5のエクソン20に対する、実施例28〜33の化合物の効果を示す図。
【図５】(A)COL4A5のエクソン20に対する、実施例31、及び、34〜51の化合物の効果を示す図。(B,C)フラグメント3はエクソン20がスキッピングを起こす前の配列であるのに対し、フラグメント4は、エクソン20がスキッピングしている配列を有していることを示す図。
【図６】COL4A5のエクソン20に対する、実施例31、43、及び、52〜74の化合物の効果を示す図。
【図７】(A)COL4A5のエクソン20に対する、実施例31、43、及び、52〜74の化合物の効果を示す図。(B,C)フラグメント5はエクソン20がスキッピングを起こす前の配列であるのに対し、フラグメント6は、エクソン20がスキッピングしている配列を有していることを示す図。
【図８】(A)COL4A5のエクソン24に対する、実施例1、2、3、及び13の化合物の効果を示す図。(B,C)フラグメント7はエクソン24がスキッピングを起こす前の配列であるのに対し、フラグメント8は、エクソン24がスキッピングしている配列を有していることを示す図。
【図９】COL4A5のエクソン24に対する、実施例1〜3、及び、75〜98の化合物の効果を示す図。
【図１０】COL4A5のエクソン24に対する、実施例1〜3、及び、75〜98の化合物の効果を示す図。
【図１１】COL4A5のエクソン24に対する、実施例83、及び、85の化合物の効果を示す図。
【図１２】腎糸球体上皮細胞ポドサイトにExon 24に対するオリゴヌクレオチド（実施例1、実施例2、実施例3、実施例83、及び、実施例85）を導入した際に、COL4A5タンパクの発現（緑色）上昇、及び、Synaptopodin（赤色）の発現上昇を示す図。
【図１３Ａ】(A)COL4A5のエクソン21に対する、実施例99〜139の化合物の効果を示す図。
【図１３ＢＣ】(B,C)フラグメント9はエクソン21がスキッピングを起こす前の配列であるのに対し、フラグメント10は、エクソン21がスキッピングしている配列を有していることを示す図。
【図１４】（A）COL4A5のエクソン21に対する、実施例99〜139の化合物の効果を示す図。(B,C)フラグメント11（図中、F11と示す）はエクソン21がスキッピングを起こす前の配列であるのに対し、フラグメント12（図中、F12と示す）は、エクソン21がスキッピングしている配列を有していることを示す図。
【図１５】COL4A5のエクソン21に対する、実施例99〜139の化合物の効果を示す図。
【図１６】COL4A5のエクソン21に対する、実施例105、114、116の化合物の効果を示す図。
【図１７】腎糸球体上皮細胞ポドサイトにExon 21に対するオリゴヌクレオチド（実施例102、実施例114、及び、実施例116）を導入した際に、COL4A5タンパクの発現（緑色）上昇、及び、Synaptopodin（赤色）の発現上昇を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
【００１０】
本発明は、COL4A5遺伝子のcDNAに相補的なヌクレオチド配列からなる塩基数１５〜３０のオリゴヌクレオチドであって、アルポート症候群の患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンのスキッピングを誘導できる前記オリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物を提供する。
【００１１】
本発明において、アルポート症候群は、X染色体連鎖型アルポート症候群（XLAS）であるとよい。XLASは4型コラーゲンα5鎖をコードする遺伝子COL4A5遺伝子の異常で発症する。COL4A5遺伝子はcollagenous domainを形成する44エクソン中35エクソンが3の倍数の塩基数で構成されているため、これらのエクソンにtruncaing変異を有する患者においては、本発明のオリゴヌクレオチドを投与する治療法により、non-truncating変異へと置換することができる。
【００１２】
truncating変異とは、ナンセンス変異、フレームシフト変異、スプライスサイト変異などにより、タンパク質合成が途中で中断される変異である。一方、non-truncating変異では、ミスセンス変異やエクソン欠失変異などの変異を持つが、読み取り枠がずれることなくタンパク質合成が行われる。
また、ミスセンス変異を持ち重症化が懸念されるXLAS患者であって、ミスセンス変異が３の倍数のエクソン上にある場合、本発明のオリゴヌクレオチドを用いてエクソンスキッピングさせると、短縮化したタンパク質になるが、機能するタンパク質であれば、軽症化することも期待でき、本発明のオリゴヌクレオチドを投与する治療法の対象になりうる。
【００１３】
本発明のオリゴヌクレオチドがスキッピングの対象とするエクソンは、COL4A5遺伝子のcollagenous domainに位置するエクソン（エクソン3-46）のうち3の倍数の塩基数であるとよい。3の倍数の塩基数であるものは、エクソン３-１８、２０-２２、２４、２６、２７、３０-３５、３８-４１、４４-４６である。  
本発明のオリゴヌクレオチドは、アルポート症候群（特に、XLAS）患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンを標的とするものであるとよく、例えば、アルポート症候群（特に、XLAS）患者のCOL4A5遺伝子のエクソン３-１８、２０-２２、２４、２６、２７、３０-３５、３８-４１、４４-４６のヌクレオチド配列中の連続する１５〜３０個のヌクレオチドからなる配列に相補的なヌクレオチド配列を含むものである。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、アルポート症候群（特に、XLAS）患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソン（例えば、エクソン３-１８、２０-２２、２４、２６、２７、３０-３５、３８-４１、４４-４６のヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列からなるとよい。
【００１４】
アルポート症候群（特に、XLAS）患者のCOL4A5遺伝子における、truncating変異を有し、かつ3の倍数の塩基数であるエクソンのヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１〜２８、３７〜４１、５１又は５２のいずれかの配列（但し、配列中のtはuであってもよく、uはtであってもよい）の全部又は一部を含むものを例示することができる。本発明において「配列の一部」とは、通常、当該配列全体の80％以上であり、好適には、85％であり、さらに好適には、90％であり、最も好適には、94%である。本発明のオリゴヌクレオチドの塩基数は、１５〜３０が適当であり、１５〜２１が好ましく、１６〜２０がより好ましい。
【００１５】
本発明のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を構成するヌクレオチドは、天然型DNA、天然型RNA、DNA/RNAのキメラ、これらの修飾体のいずれであってもよいが、少なくとも１つが修飾ヌクレオチドであることが好ましい。
【００１６】
修飾ヌクレオチドとしては、糖が修飾されたもの（例えば、Ｄ−リボフラノースが2'-O-アルキル化されたもの、Ｄ−リボフラノースが2'-O, 4'-C-アルキレン化されたもの）、リン酸ジエステル結合が修飾（例えば、チオエート化）されたもの、塩基が修飾されたもの、それらを組み合わせたものなどを例示することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１個のＤ−リボフラノースが2'-O-アルキル化されたものや2'-O, 4'-C-アルキレン化されたものは、ＲＮＡに対する結合力が高いこと、ヌクレアーゼに対する耐性が高いことから、天然型のヌクレオチド（すなわち、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ）より高い治療効果が期待できる。また、オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１個のリン酸ジエステル結合がチオエート化されたものも、ヌクレアーゼに対する耐性が高いことから、天然型のヌクレオチド（すなわち、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ）より高い治療効果が期待できる。上記のような修飾された糖と修飾されたリン酸の両者を含むオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対する耐性がより高いことから、さらに高い治療効果が期待できる。
【００１７】
オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）について、糖の修飾の例としては、Ｄ−リボフラノースの2'-O-アルキル化（例えば、2'-O-メチル化、2'-O-アミノエチル化、2'-O-プロピル化、2'-O-アリル化、2'-O-メトキシエチル化、2'-O-ブチル化、2'-O-ペンチル化、2'-O-プロパルギル化など）、Ｄ−リボフラノースの2'-O,4'-C-アルキレン化（例えば、2'-O,4'-C-エチレン化、2'-O,4'-C-メチレン化、2'-O,4'-C-プロピレン化、2'-O,4'-C-テトラメチレン化、2'-O,4'-C-ペンタメチレン化など）、Ｄ−リボフラノースの2’-deoxy-2’-C,4’-C-メチレンオキシメチレン化、S-cEt（2',4'-constrained ethyl）、AmNA、3'-デオキシ-3'-アミノ-2'-デオキシ-D-リボフラノース、3'-デオキシ-3'-アミノ-2'-デオキシ-2'-フルオロ-D-リボフラノースなどを挙げることができる。
【００１８】
オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）について、リン酸ジエステル結合の修飾の例としては、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、メチルチオホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロアミデート結合などを挙げることができる。
【００１９】
塩基の修飾の例としては、シトシンの5-メチル化、5-フルオロ化、5-ブロモ化、5-ヨード化、N4-メチル化、チミンの5-デメチル化（ウラシル）、5-フルオロ化、5-ブロモ化、5-ヨード化、アデニンのN6-メチル化、8-ブロモ化、グアニンのN2-メチル化、8-ブロモ化などを挙げることができる。
【００２０】
オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、市販の合成機（例えば、パーキンエルマー社のホスホロアミダイド法によるモデル３９２）などを用いて、文献（Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984))に記載の方法に準じて合成することができる。その際に用いられるホスホロアミダイト試薬は、天然型のヌクレオシド及び2'-O-メチルヌクレオシド（すなわち、2'-O-メチルグアノシン、2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルウリジン）については、市販の試薬を用いることができる。アルキル基の炭素数が２〜６個の2'-O-アルキルグアノシン、アデノシン、シチジンおよびウリジンについては、以下の通りである。
【００２１】
2'-O-アミノエチルグアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジンは、文献（Blommers et al. Biochemistry (1998), 37, 17714-17725.）に従って合成できる。
【００２２】
2'-O-プロピルグアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.）に従って合成できる。
【００２３】
2'-O-アリルグアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジンは、市販の試薬を用いることができる。
【００２４】
2'-O-メトキシエチルグアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジンは、特許（US6261840）または、文献（Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504.に従って合成できる。
【００２５】
2'-O-ブチルグアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.）に従って合成できる。
【００２６】
2'-O-ペンチルグアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.）に従って合成できる。
【００２７】
2'-O-プロパルギルグアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジンは、市販の試薬を用いることができる。
【００２８】
2'-O, 4'-C-メチレングアノシン、アデノシン、シチジン、5-メチルシチジンおよびチミジンについては、WO99/14226に記載の方法に従って、アルキレン基の炭素数が２〜５個の2'-O, 4'-C-アルキレングアノシン、アデノシン、シチジン、5-メチルシチジンおよびチミジンについては、WO00/47599に記載の方法に従って製造することができる。
Ｄ−リボフラノースの2’-deoxy-2’-C,4’-C-メチレンオキシメチレン化されたヌクレオシドは、文献（Wang,G. et al. Tetrahedron (1999), 55, 7707-7724に従って合成できる。
【００２９】
S-cEt（constrained ethyl）は、文献（Seth,P.P. et al. J.Org.Chem (2010), 75, 1569-1581.）に従って合成できる。
【００３０】
AmNAは、文献（Yahara,A. et al. ChemBioChem (2012), 13, 2513-2516.）または、WO2014/109384に従って合成できる。
【００３１】
核酸塩基のうち、ウラシル（U）とチミン（T）は、互換性がある。ウラシル（U）とチミン（T）のどちらも、相補鎖のアデニン（A）との塩基対形成に使うことができる。  ホスホロアミダイト試薬をカップリング後、硫黄、テトラエチルチウラムジスルフィド（TETD、アプライドバイオシステム社）、Beaucage試薬（Glen Research社）、または、キサンタンヒドリドなどの試薬を反応させることにより、ホスホロチオエート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成することができる（Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990), PCT/WO98/54198）。
【００３２】
合成機で用いるコントロールド  ポア  グラス（CPG）としては、2'-O-メチルヌクレオシドの結合したものは、市販のものを利用することができる。また、2'-O, 4'-C-メチレングアノシン、アデノシン、5-メチルシチジンおよびチミジンについては、WO99/14226に記載の方法に従って、アルキレン基の炭素数が２〜５個の2'-O, 4'-C-アルキレングアノシン、アデノシン、5-メチルシチジンおよびチミジンについては、WO00/47599に記載の方法に従って製造したヌクレオシドを文献（Oligonucleotide Synthesis, Edited by M.J.Gait, Oxford University Press, 1984）に従って、CPGに結合することができる。修飾されたCPG（特開平７−８７９８２の実施例１２ｂに記載）を用いることにより、3'末端に2-ヒドロキシエチルリン酸基が結合したオリゴヌクレオチドを合成できる。また、3'-amino-Modifier C3 CPG, 3'-amino-Modifier C7 CPG, Glyceryl CPG, (Glen Research), 3'-specer C3 SynBase CPG 1000, 3'-specer C9 SynBase CPG 1000（link technologies）を使えば、3'末端にヒドロキシアルキルリン酸基、または、アミノアルキルリン酸基が結合したオリゴヌクレオチドを合成できる。
【００３３】
本発明のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、アルポート症候群の治療に用いることができる。
【００３４】
オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、医薬的に許容できる塩の形態で用いてもよい。「医薬的に許容される塩」とは、オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）の塩をいい、そのような塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩などのアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩などの無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、りんご酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などを挙げることができる。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。
【００３５】
また、オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）及びその医薬的に許容される塩は、溶媒和物（例えば、水和物）としても存在することがあり、そのような溶媒和物であってもよい。
【００３６】
オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、その医薬的に許容される塩又は溶媒和物をアルポート症候群の治療に使用する場合には、それ自体あるいは適宜の医薬的に許容される賦形剤、希釈剤などと混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤などにより経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、貼付剤若しくは外用剤などにより非経口的に投与することができる。
【００３７】
これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バイレショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムにような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩などの無機系賦形剤など）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩：無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；上記澱粉誘導体など）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、前記賦形剤と同様の化合物など）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類など）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤など）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；ソルビン酸など）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される甘味料、酸味料、香料など）、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【００３８】
本発明の治療薬は、０．１〜２５０μmoles／ｍｌのオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含有するとよく、好ましくは、１〜５０μmoles／ｍｌのオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、その医薬的に許容される塩又は溶媒和物、0.02〜10％ｗ／ｖの炭水化物又は多価アルコール及び0.01〜0.4％ｗ／ｖの医薬的に許容できる界面活性剤を含有させておいてもよい。
【００３９】
上記炭水化物としては、単糖類及び／又は２糖類が特に好ましい。これら炭水化物及び多価アルコールの例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、ラクトース、マルトース、マンニトール及びソルビトールが挙げられる。これらは、単独で用いても、併用してもよい。
【００４０】
また、界面活性剤の好ましい例としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノ〜トリ−エステル、アルキルフェニルポリオキシエチレン、ナトリウムタウロコラート、ナトリウムコラート、及び多価アルコールエステルが挙げられる。このうち特に好ましいのは、ポリオキシエチレンソルビタンモノ〜トリ−エステルであり、ここにおいてエステルとして特に好ましいのは、オレエート、ラウレート、ステアレート及びパルミテートである。これらは単独で用いても、併用してもよい。
【００４１】
また、本発明の治療薬は、更に好ましくは、0.03〜0.09Ｍの医薬的に許容できる中性塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び／又は塩化カルシウムを含有させておいてもよい。
【００４２】
また、本発明の治療薬は、更に好ましくは、0.002〜0.05Ｍの医薬的に許容できる緩衝剤を含有することができる。好ましい緩衝剤の例としては、クエン酸ナトリウム、ナトリウムグリシネート、リン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが挙げられる。これらの緩衝剤は、単独で用いても、併用してもよい。
【００４３】
さらに、上記の治療薬は、溶液状態で供給してもよい。しかし、ある期間保存する必要がある場合等のために、オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を安定化して治療効果の低下を防止する目的で通常は凍結乾燥しておくことが好ましく、その場合は用時に溶解液（注射用蒸留水など）で再構成（reconstruction）して、即ち投与される液体状態にして用いればよい。従って、本発明の治療薬は、各成分が所定の濃度範囲になるよう溶解液で再構成して使用するための、凍結乾燥された状態のものも包含する。凍結乾燥物の溶解性を促進する目的で、アルブミン、グリシン等のアミノ酸を更に含有させておいてもよい。
【００４４】
オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、その医薬的に許容される塩又は溶媒和物をヒトに投与する場合には、例えば、成人１日あたり約０．０１〜１００mg/kg（体重）、好ましくは０．１〜２０mg/kg（体重）の投与量で、１回または数回に分けて皮下注射、点滴静脈注射、または、静脈注射するとよいが、その投与量や投与回数は、疾患の種類、症状、年齢、投与方法などにより適宜変更しうる。
【００４５】
アルポート症候群患者へのオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、その医薬的に許容される塩又は溶媒和物の投与は、例えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、その医薬的に許容される塩又は溶媒和物を当業者に周知の方法で製造し、これを常法により滅菌処理し、例えば１２５ｍｇ／ｍｌの注射用溶液を調製する。この溶液を、患者静脈内にオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）の投与量が体重１ｋｇ当たり例えば１０ｍｇとなるように、例えば輸液の形で点滴投与する。投与は、例えば１週間の間隔で行い、その後も、尿蛋白の減少、腎機能障害進行の抑制などにより治療効果の確認をしながら、適宜この治療を繰り返す。
【００４６】
本発明のアルポート症候群治療薬は、ACE阻害薬やアンギオテンシン受容体拮抗薬などの他の治療剤と併用してもよい。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
HO-Cm1s-Ce2s-Cm1s-Um1s-Ge2s-Gm1s-Cm1s-Ae2s-Am1s-Um1s-Ce2s-Cm1s-Am1s-Te2s-Cm1s-Cm1s-Te2s-Gm1ｔ-H (ex24_011)（配列番号１）
核酸自動合成機（BioAutomation製MerMade 192X）を用い、ホスホロアミダイト法（Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)を用いて合成を行った。試薬としては、アクチベーター溶液-3 (0.25 mol/L 5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール・アセトニトリル溶液、和光純薬工業製、product No. 013-20011)、CAP A for AKTA (1-メチルイミダゾール・アセトニトリル溶液、Sigma-Aldrich製、product No. L040050)、Cap B1 for AKTA (無水酢酸・アセトニトリル溶液、Sigma-Aldrich製、product No. L050050)、Cap B2 for AKTA (ピリジン・アセトニトリル溶液、Sigma-Aldrich製、product No. L050150)、DCA Deblock (ジクロロ酢酸・トルエン溶液、Sigma-Aldrich製、product No. L023050)を用いた。ホスホロチオエート結合を形成するためのチオ化試薬として、0.2 Mになるようにフェニルアセチルジスルフィド（CARBOSYNTH製、product No. FP07495）を、アセトニトリル (脱水、関東化学製、product No. 01837-05)、ピリジン (脱水、関東化学製、product No. 11339-05)1:1(v/v)溶液を用いて溶解して用いた。アミダイト試薬としては、2'-O-Meヌクレオシドのホスホロアミダイト(アデノシン体product No. ANP-5751, シチジン体product No. ANP-5752,グアノシン体product No. ANP-5753, ウリジン体product No. ANP-5754)はChemGenes製のものを用いた。非天然型のホスホロアミダイトは特開２０００−２９７０９７の実施例14(5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O,4'-C-エチレン-6-N-ベンゾイルアデノシン-3'-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、実施例27 (5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O,4'-C-エチレン-2-N-イソブチリルグアノシン-3'-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、実施例22（5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O,4'-C-エチレン-4-N-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3'-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、実施例9（5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O,4'-C-エチレン-5-メチルウリジン-3'-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、の化合物を用いた。固相担体として、Glen Unysupport FC 96ウェルフォーマット0.2 μmol（GlenResearch製）を用い、表記の化合物を合成した。但し、アミダイト体の縮合に要する時間は、約9分とした。【００４８】
目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を600 μLの濃アンモニア水で処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。オリゴマーの混合溶液を、Clarity QSP DNA Loading Buffer（Phenomenex製）300 μLを混合し、Clarity SPE 96 well plate（Phenomenex製）上にチャージした。Clarity QSP DNA Loading Buffer:水 = 1:1溶液1 mL、水3 mL、3%ジクロロ酢酸(DCA)水溶液3 mL、水6 mLの順に添加した後、20 mM Tris水溶液:アセトニトリル = 9:1溶液にて抽出される成分を集めた。溶媒留去後、目的化合物を得た。本化合物は、逆相HPLC（カラム（Phenomenex, Clarity 2.6 μm Oligo-MS 100A (2.1×50 mm)）、A溶液：100 mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8 mMトリエチルアミン水溶液、B溶液：メタノール、B%：10% → 25%（4min, linear gradient）；60℃；0.5 mL/min；260nm）で分析すると、2.887分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した（計算値：6276.73、実測値：6276.64）。【００４９】
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5)（NCBI-GenBank accession No. NG_011977）のヌクレオチド番号162604-162621に相補的な配列である。【００５０】
実施例2及び3の化合物も実施例1と同様に合成した。実施例1のデータ、及び、実施例2及び3について表１に記載する。
表１
---------------------------------------------------------------------
実施例 配列名称 配列 (5’-3’)     開始   終了   分子量  配列番号
---------------------------------------------------------------------
1      ex24_011 cCcuGgcAauCcaTccTg 162604 162621 6276.64   １
2      ex24_b04 cCugGcaAucCauCcuGu 162603 162620 6263.60   ２
3      ex24_b05 cTggCaaTccAucCugTc 162602 162619 6291.66   ３
---------------------------------------------------------------------
表中の配列において大文字はENA、小文字は2’-OMe-RNAを示す。開始および終了については、Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5)（NCBI-GenBank accession No. NG_011977）のヌクレオチド番号を示す。表中の分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
（実施例４）
HO-Cm1s-Ce2s-Cm1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Am1s-Am1s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Am1s-Um1s-Ce2s-Cm1s-Te2s-Gm1ｔ-H (ex24_c01)（配列番号１）
実施例１と同様の条件で合成した目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を600 μLの濃アンモニア水で処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。オリゴマーの混合溶液を、Clarity QSP DNA Loading Buffer（Phenomenex製）300 μLを混合し、Clarity SPE 96 well plate（Phenomenex製）上にチャージした。Clarity QSP DNA Loading Buffer:水 = 1:1溶液1 mL、0.1 M炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液(TEAB):水 = 8:2溶液 1mL、3%ジクロロ酢酸(DCA)水溶液3 mL、水2 mL、20 mM Tris水溶液1 mLの順に添加した後、20 mM Tris水溶液:アセトニトリル = 9:1溶液にて抽出される成分を集めた。溶媒留去後、目的化合物を得た。本化合物は、逆相HPLC（カラム（Phenomenex, Clarity 2.6 μm Oligo-MS 100A (2.1×50 mm)）、A溶液：100 mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8 mMトリエチルアミン水溶液、B溶液：メタノール、B%：10% → 25%（4min, linear gradient）；60℃；0.5 mL/min；260 nm）で分析すると、2.733分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した（計算値：6304.76、実測値：6304.75）。【００５１】
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5)（NCBI-GenBank accession No. NG_011977）のヌクレオチド番号162604-162621に相補的な配列である。【００５２】
実施例5乃至27の化合物も実施例4と同様に合成した。実施例4のデータ、及び、実施例5乃至27について表２に記載する。
表２
---------------------------------------------------------------------
実施例 配列名称 配列 (5’-3’)     開始   終了   分子量  配列番号
---------------------------------------------------------------------
4      ex24_c01 cCcTggCaaucCauCcTg 162604 162621 6304.75   １
5      ex24_c02 cCcTggCaaucCaucCTg 162604 162621 6304.74   １
6      ex24_c03 cCcTggCaaTcCauCcTg 162604 162621 6330.76   １
7      ex24_c04 CcCuggCaaTcCauCcTg 162604 162621 6330.76   １
8      ex24_c05 cCcTggCaAuCcAuCcTg 162604 162621 6328.75   １
9      ex24_c06 cCcTggCaaTcCaTcCTg 162604 162621 6356.79   １
10     ex24_c07 CCcTggCaaTcCaTcCTg 162604 162621 6382.80   １
11     ex24_c08 cCcTgGcAaTcCaTcCuG 162604 162621 6340.74   １
12     ex24_c09 cCuggCaaTcCauCcTgu 162603 162620 6305.74   ２
13     ex24_c10 CcTggCaauccauCcTgT 162603 162620 6305.74   ２
14     ex24_c11 cCuggCaaTcCauCcTgT 162603 162620 6661.74   ２
15     ex24_c12 ccTggCaAuCcAuCcTgu 162603 162620 6303.72   ２
16     ex24_c13 cCTggCaaTcCauCcTgT 162603 162620 6357.76   ２
17     ex24_c14 CcTggCaAuCcAuCcTgu 162603 162620 6329.73   ２
18     ex24_c15 cCTggCaaTcCaTCcTgT 162603 162620 6383.78   ２
19     ex24_c16 CcTggCaAuCcAuCcTgT 162603 162620 6355.75   ２
20     ex24_c17 cTggCaaTccaTcCugTc 162602 162619 6305.73   ３
21     ex24_c18 cTggCaauCcaTccTguC 162602 162619 6305.73   ３
22     ex24_c19 cTggCaaTcCaTcCugTc 162602 162619 6331.77   ３
23     ex24_c20 CTggCaauCcaTcCugTc 162602 162619 6331.75   ３
24     ex24_c21 cTggCaAuCcAuCcTgTc 162602 162619 6329.74   ３
25     ex24_c22 CTggCaaTccAucCugTC 162602 162619 6343.75   ３
26     ex24_c23 CTggCaaTcCaTcCugTC 162602 162619 6383.78   ３
27     ex24_c24 cTgGcAaTcCaTcCuGuC 162602 162619 6341.74   ３
---------------------------------------------------------------------
表中の配列において大文字はENA、小文字は2’-OMe-RNAを示す。開始および終了については、Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5)（NCBI-GenBank accession No. NG_011977）のヌクレオチド番号を示す。表中の分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
（実施例２８）
HO-Um1s-Ae2s-Um1s-Am1s-Ge2s-Cm1s-Um1s-Te2s-Am1s-Cm1s-Te2s-Am1s-Gm1s-Ge2s-Am1s-Gm1s-Ge2s-Am1ｔ-H (ex20_001)（配列番号４）
実施例１と同様の条件で合成および精製を行い、目的化合物を得た。本化合物は、逆相HPLC（カラム（Phenomenex, Clarity 2.6 μm Oligo-MS 100A (2.1×50 mm)）、A溶液：100 mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8 mMトリエチルアミン水溶液、B溶液：メタノール、B%：10% → 25%（4 min, linear gradient）；60℃；0.5 mL/min；260 nm）で分析すると、3.113分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した（計算値：6401.73、実測値：6401.69）。【００５３】
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5)（NCBI-GenBank accession No. NG_011977）のヌクレオチド番号156301-156318に相補的な配列である。【００５４】
実施例29乃至33の化合物も実施例28と同様に合成した。実施例28のデータ、及び、実施例29乃至33について表３に記載する。
表３
---------------------------------------------------------------------
実施例 配列名称 配列 (5’-3’)     開始   終了   分子量  配列番号
---------------------------------------------------------------------
28     ex20_001 uAuaGcuTacTagGagGa 156301 156318 6401.69   ４
29     ex20_002 gCuuAcuAggAggAauGu 156297 156314 6403.65   ５
30     ex20_022 gGagGucCagGaaTggAa 156217 156234 6518.74   ６
31     ex20_023 gTccAggAauGgaAauTc 156213 156230 6400.68   ７
32     ex20_024 aGgaAugGaaAuuCcaGg 156209 156226 6449.71   ８
33     ex20_044 uAacTgcAgcCccTaaGa 156129 156146 6333.72   ９
---------------------------------------------------------------------
表中の配列において大文字はENA、小文字は2’-OMe-RNAを示す。開始および終了については、Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5)（NCBI-GenBank accession No. NG_011977）のヌクレオチド番号を示す。表中の分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
（実施例３４〜７４）
HO-Am1s-Ae2s-Um1s-Am1s-Te2s-Am1s-Gm1s-Ce2s-Um1s-Um1s-Ae2s-Cm1s-Um1s-Ae2s-Gm1s-Gm1s-Ae2s-Gm1ｔ-H (ex20_b02)（配列番号１０）
実施例４と同様の条件で合成および精製を行い、目的化合物を得た。本化合物は、逆相HPLC（カラム（Phenomenex, Clarity 2.6 μm Oligo-MS 100A (2.1×50 mm)）、A溶液：100 mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8 mMトリエチルアミン水溶液、B溶液：メタノール、B%：10% → 25%（4 min, linear gradient）；60℃；0.5 mL/min；260 nm）で分析すると、3.213分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した（計算値：6385.74、実測値：6385.78）。【００５５】
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5)（NCBI-GenBank accession No. NG_011977）のヌクレオチド番号156303-156320に相補的な配列である。【００５６】
実施例35乃至74の化合物も実施例34と同様に合成した。実施例34のデータ、及び、実施例35乃至74について、表４に記載する。
表４
---------------------------------------------------------------------
実施例 配列名称 配列 (5’-3’)     開始   終了   分子量  配列番号
---------------------------------------------------------------------
34     ex20_b02 aAuaTagCuuAcuAggAg 156303 156320 6385.78   １０
35     ex20_b03 aTauAgcTuaCuaGgaGg 156302 156319 6415.82   １１
36     ex20_b04 aTagCuuAcuAggAggAa 156300 156317 6424.80   １２
37     ex20_b05 uAgcTuaCuaGgaGgaAu 156299 156316 6401.77   １３
38     ex20_b07 cTuaCuaGgaGgaAugTg 156296 156313 6431.74   １４
39     ex20_b09 uAcuAggAggAauGugAg 156294 156311 6452.71   １５
40     ex20_b10 gAggTccAggAauGgaAa 156216 156233 6488.77   １６
41     ex20_b11 aGguCcaGgaAugGaaAu 156215 156232 6449.75   １７
42     ex20_b12 gGucCagGaaTggAaaTu 156214 156231 6454.75   １８
43     ex20_b13 uCcaGgaAugGaaAuuCc 156212 156229 6360.71   １９
44     ex20_b14 cCagGaaTggAaaTucCa 156211 156228 6411.78   ２０
45     ex20_b15 cAggAauGgaAauTccAg 156210 156227 6409.73   ２１
46     ex20_b16 cCauAacTgcAgcCccTa 156132 156149 6283.74   ２２
47     ex20_b17 cAuaAcuGcaGccCcuAa 156131 156148 6265.72   ２３
48     ex20_b18 aTaaCugCagCccCuaAg 156130 156147 6361.79   ２４
49     ex20_b19 aAcuGcaGccCcuAagAu 156128 156145 6305.72   ２５
50     ex20_b20 aCugCagCccCuaAgaTu 156127 156144 6338.76   ２６
51     ex20_b21 cTgcAgcCccTaaGauTc 156126 156143 6300.73   ２７
52     ex20_c01 gTcCaggAaTggaaAuTc 156213 156230 6428.77   ２８
53     ex20_c02 gTcCaggAaTggaaaTuC 156213 156230 6442.78   ２８
54     ex20_c03 gTCcaggaATggaaaTTc 156213 156230 6442.78   ２８
55     ex20_c04 gTccAggAaTggaAauTc 156213 156230 6414.75   ２８
56     ex20_c05 gTccAggAauggaAauTc 156213 156230 6388.73   ２８
57     ex20_c06 gTcCaggaaTggaaaTuC 156213 156230 6430.78   ２８
58     ex20_c07 gTcCaggaaTggaaAuTc 156213 156230 6416.77   ２８
59     ex20_c08 gTccAggaaTggAaaTuc 156213 156230 6402.76   ２８
60     ex20_c09 gTccAggaauggaAauTc 156213 156230 6376.73   ２８
61     ex20_c10 gTcCaggaauggaaaTuC 156213 156230 6404.76   ２８
62     ex20_c11 gTcCaggaaTggaaauTc 156213 156230 6404.77   ２８
63     ex20_c12 uCcAggAaTggAaAuuCc 156212 156229 6386.75   １９
64     ex20_c13 TccAggAauggAaaTucC 156212 156229 6374.74   １９
65     ex20_c14 uCcAggaAuggAaAuuCc 156212 156229 6360.73   １９
66     ex20_c15 TcCaggAaTggaaaTuCc 156212 156229 6402.77   １９
67     ex20_c16 uCcAggAaTggaaaTuCc 156212 156229 6388.77   １９
68     ex20_c17 uCcAggAauggAaAuuCc 156212 156229 6360.73   １９
69     ex20_c18 uCcAggaauggaAaTuCc 156212 156229 6362.74   １９
70     ex20_c19 TcCaggaaTggaaaTuCc 156212 156229 6390.77   １９
71     ex20_c20 TcCaggaaTggaaauTcC 156212 156229 6390.77   １９
72     ex20_c21 uCcAggaauggaaaTuCc 156212 156229 6350.74   １９
73     ex20_c22 uCcaggAauggAaauuCc 156212 156229 6336.73   １９
74     ex20_c23 ucCaggAauggAaauTcc 156212 156229 6336.72   １９
---------------------------------------------------------------------
表中の配列において大文字はENA、小文字は2’-OMe-RNAを示す。開始および終了については、Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5)（NCBI-GenBank accession No. NG_011977）のヌクレオチド番号を示す。表中の分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
【００５７】
なお、本明細書において、At、Gt、5meCt、Ct、Tt、Ut、Ap、Gp、5meCp、Cp、Tp、Up、As、Gs、5meCs、Cs、Ts、Us、Am1t、Gm1t、Cm1t、5meCm1t、Um1t、Am1p、Gm1p、Cm1p、5meCm1p、Um1p、Am1s、Gm1s、Cm1s、5meCm1s、Um1s、A2t、G2t、C2t、T2t、Ae2p、Ge2p、Ce2p、Te2p、Ae2s、Ge2s、Ce2s、Te2s、A1t、G1t、C1t、T1t、Ae1p、Ge1p、Ce1p、Te1p、Ae1s、Ge1s、Ce1s、Te1s、Am2t、Gm2t、5meCm2t、Tm2t、Am2p、Gm2p、5meCm2p、Tm2p、Am2s、Gm2s、5meCm2s、Tm2sは、下記に示す構造を有する基である。
【００５８】
2018123925.tif 000003
【００５９】
2018123925.tif 000004
【００６０】
2018123925.tif 000005
【００６１】
2018123925.tif 000006
【００６２】
2018123925.tif 000007
【００６３】
（試験例１）  ENAオリゴヌクレオチドによるエクソンスキッピング誘導能の解析
HMVEC（皮膚微小血管内皮細胞）培養
以下のようにして、HMVECの培養を行った。
正常新生児（単一）由来皮膚微小血管内皮細胞HMVEC(CC-2813、Lonza社)を、維持培地（EGM-2MV; CC-3202、Lonza社）にて培養した。また、3.7x105/10 cm dishの播種密度で継代し、実験には6継代目までの細胞を使用した。96 well plateに2-5x103 cells/wellの密度で細胞を播種し、翌日新鮮維持培地に交換後、後述のように実施例で製造したオリゴヌクレオチドを導入した。【００６４】
尿中落下細胞初代培養系作製
以下のようにして、尿中落下細胞の初代培養系を作製した。
X連鎖型アルポート症候群と遺伝子診断された患者より、尿（〜100 mL程度）を採取した。遠心（1,400 rpm x 10 min）により上清を廃棄し、細胞塊をcold PBSによって２回洗浄した。細胞塊を維持培地（EGM-MV (Lonza)、20%FBS、penicillin (100 U/ml)、streptomycin (1 mg/ml)、rifampicin (8 μg/ml)）にて懸濁し、37℃、5%CO2インキュベーターにて、培養した。2継代目以降は、rifampicin抜きの維持培地にて、培養した。【００６５】
腎糸球体上皮細胞（ポドサイト）への分化誘導
以下のようにして、患者由来尿中落下細胞から腎糸球体上皮細胞（ポドサイト）への分化を誘導した。
96 well plateに1x104 cells/wellの密度で細胞を播種し、翌日(分化誘導0日目)、分化誘導培地（DMEM/F12、5%FBS、1xITS supplement、12.5 μM レチノイン酸）に交換した。以後3日ごとに培地を交換した。分化誘導8日目に、後述のように実施例で製造したオリゴヌクレオチドを導入した。【００６６】
実施例で製造したオリゴヌクレオチドをトランスフェクション
以下のようにして、実施例で製造したオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
下記A液とB液を作製後、混合した。
2018123925.tif 000008
上記の混合液を5分間室温でインキュベーションした。作製した溶液を、1 wellにつき10 μLずつ加え、48時間インキュベーションした。【００６７】
RNA抽出
以下のようにしてRNAの抽出を行った。
オリゴヌクレオチドをトランスフェクション後48時間インキュベーションした細胞を、cold PBSにて１回洗浄した。SuperPrep Cell Lysis Kit & RT Kit for qPCR（TOYOBO）の細胞溶解液を、1 wellにつき50 μLずつ加え、30秒間振盪後、室温で5分間インキュベーションした。SuperPrep Cell Lysis Kit & RT Kit for qPCRの反応停止液を、1 wellにつき10 μLずつ加え、30秒間振盪後、室温で2分間インキュベーションした。合計60 μLの細胞溶解液を回収し、後述の逆転写反応を行った。【００６８】
逆転写反応
以下のようにして逆転写反応を行った。
SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCRの逆転写反応マスターミックス 32 μLと細胞溶解液 8 μLを混合した。逆転写反応を以下のように行った（37℃ 15 min、50℃ 5 min、98℃ 5 min、4℃ Hold）。最終産物は-30℃にて保存した。【００６９】
PCR反応とフラグメント配列解析
以下のようにしてPCR反応とフラグメント配列解析を行った。
下記のように、PCR反応液を調整した。
2018123925.tif 000009
【００７０】
以下のようにPCR反応を行った（94℃ 5 min、(94℃ 30 sec、60℃ 30 sec、72℃ 30 sec)x 30-38 cycles、72℃ 5 min、4℃ Hold）。【００７１】
解析用プライマーは下記のように設計した。
1)全COL4A5発現解析用（Exon 1-7）
Forward (5’-3’): cagaggctgcggcttgctat（配列番号２９）
Reverse (5’-3’): ccacgttctcccttggttcca（配列番号３０）
2)Exon 20スキッピング解析用（Exon 17-22）
Forward (5’-3’): gggatggtgaaaagggccaaaaag（配列番号３１）
Reverse (5’-3’): cctttgtcacctttcactccttgt（配列番号３２）
3)Exon 24スキッピング解析用（Exon 21-26）
Forward (5’-3’): caaggagtgaaaggtgacaaaggt（配列番号３３）
Reverse (5’-3’): ccctttaggacctggtattcctg（配列番号３４）
4)内在性コントロール遺伝子（GAPDH）解析用
Forward (5’-3’): cccttcattgacctcaac（配列番号３５）
Reverse (5’-3’): ttcacacccatgacgaac（配列番号３６）
【００７２】
PCR産物はエチジウムブロマイドを含む1.8%アガロースゲルにて電気泳動し、解析した。各フラグメントは、PCR purification kit （QIAGEN社）にてゲルから抽出し、BigDye v1.1を用いてシークエンス反応を行った。ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer （Applied Biosystems社）とCLC Main Workbench 6（CLC bio社）にて塩基配列を確認した。【００７３】
分化ポドサイトの免疫蛍光染色
以下のように、免疫蛍光染色を行った。
分化ポドサイトをPBSで洗浄し、。4%パラホルムアルデヒド+4%スクロース/PBSで室温10分間、固定した。PBSで3回洗浄後、0.1%Triton X-100/PBSで室温5分間、透過処理した。PBSで3回洗浄後、5% Fetal bovine serum/PBSでブロッキングした。1次抗体（ラット 抗-COL4A5 H53抗体、重井医学研究所; 佐渡義一先生からの供与、マウス 抗-Synaptopodin抗体、新潟大学医歯学総合研究科腎研究センター；矢尾板永信先生から供与されたマウスハイブリドーマ上清を使用）を4℃で一晩反応させた。PBSで3回洗浄後、2次抗体（Alexa Fluor 488 ヤギ 抗-ラットIgG、Alexa Fluor 555 ヤギ 抗-マウスIgG）を室温1時間反応させた。PBSで3回洗浄後、核染色のため、Hoechst33342を室温10分間反応させた。封入後、蛍光顕微鏡で観察した。【００７４】
HMVECまたはアルポート症候群患者由来尿中落下細胞における、実施例化合物によるエクソンスキッピング
図２に示したように、HMVECを用いてExon 24に対するオリゴヌクレオチド（実施例1〜実施例27）のExon 24スキッピングについて調べたところ、実施例1〜実施例27のオリゴヌクレオチドでExon 24スキッピングが認められた（図２A）。特に、実施例1、実施例2、実施例3、実施例13が高いスキッピング効率を示した。また、ゲルで見られたフラグメントのシークエンス解析を行ったところ、フラグメント２が、Exon 24がスキッピングしている配列であることを確認した（図２B、及び、2C）。【００７５】
図３に示したように、Exon 24に変異を有するアルポート症候群患者由来尿中落下細胞を、COL4A5発現細胞である腎糸球体上皮細胞ポドサイトに分化誘導し、Exon 24に対するオリゴヌクレオチド3種類（実施例1、実施例2、実施例3）を各50 nM導入し、効果を確認した。COL4A5と分化ポドサイトマーカーであるSynaptopodin（ヤギ 抗-Synaptopodin抗体、SantaCruz社）の発現を評価した。非導入細胞（Mock）に対し、オリゴヌクレオチド導入細胞ではCOL4A5タンパクの発現（緑色）が上昇し、さらに分化ポドサイトマーカーであるSynaptopodin（赤色）の発現の上昇も確認された。このことから、オリゴヌクレオチドの導入はCOL4A5タンパクの発現上昇に寄与するのみならず、ポドサイトの分化能にも影響を与えている可能性が示唆された。【００７６】
図４に示したように、COL4A5高発現細胞HMVECを用いて、Exon 20に対するオリゴヌクレオチド（実施例28〜33）のExon 20スキッピングについて調べたところ、実施例28〜実施例33のオリゴヌクレオチドでExon 20スキッピングが認められた。特に、実施例31が高いスキッピング効率を示した。【００７７】
図５に示したように、COL4A5高発現細胞HMVECを用いて、Exon 20に対するオリゴヌクレオチド（実施例28〜33）のExon 20スキッピングについて調べたところ、実施例34〜実施例51のオリゴヌクレオチドでExon 20スキッピングが認められた（図５A）。特に、実施例43が高いスキッピング効率を示した。【００７８】
図６に示したように、COL4A5高発現細胞HMVECを用いてExon 20に対するオリゴヌクレオチド（実施例52〜実施例74）のExon 20スキッピングについて調べたところ、すべてのオリゴヌクレオチドでExon 20スキッピングが認められた。【００７９】
図７に示したように、Exon 20に変異を有するアルポート症候群患者由来尿中落下細胞を、COL4A5発現細胞である腎糸球体上皮細胞ポドサイトに分化誘導し、Exon 20に対するオリゴヌクレオチド（実施例52〜実施例74）のExon 20スキッピングについて調べたところ、すべてのオリゴヌクレオチドでExon 20スキッピングが認められた（図７A）。また、ゲルで見られたフラグメントのシークエンス解析を行ったところ、フラグメント６が、Exon 20がスキッピングしている配列であることを確認した（図７B、及び、７C）。【００８０】
図８に示したように、Exon 24に変異を有するアルポート症候群患者由来尿中落下細胞を、COL4A5発現細胞である腎糸球体上皮細胞ポドサイトに分化誘導し、Exon 24に対するオリゴヌクレオチド（実施例1, 2, 3, 13）を各5, 15, 50または100 nM導入し、Exon 24スキッピングについて調べたところ、すべてのオリゴヌクレオチドで濃度依存的にExon 24スキッピングが認められた（図８A）。また、ゲルで見られたフラグメントのシークエンス解析を行ったところ、フラグメント８が、Exon 24がスキッピングしている配列であることを確認した（図８B、及び、８C）。【００８１】
（実施例７５乃至９８）
実施例７５乃至９８の化合物も実施例４と同様に合成した。実施例７５乃至１２８の化合物の配列及びデータについて表５に記載する。
表５
---------------------------------------------------------------------
実施例 配列名称 配列 (5’-3’)     開始   終了   分子量  配列番号
---------------------------------------------------------------------
75     ex24_c25 cCcTggcaaTccauCcTg 162604 162621 6278.72  ３７
76     ex24_c26 CcCuggcaaTccauCcTg 162604 162621 6278.72  ３７
77     ex24_c27 cCcuggCaaTccaTccTg 162604 162621 6278.73  ３７
78     ex24_c28 cCcTggcaauccauCcTg 162604 162621 6252.72  ３７
79     ex24_c29 cCcuggCaaucCauccTg 162604 162621 6252.72  ３７
80     ex24_c30 ccCuggCaaucCaucCug 162604 162621 6252.70  ３７
81     ex24_c31 cCcTggcaauccauCcTg 162604 162621 6252.72  ３７
82     ex24_c32 CccuggCaaucCauccTg 162604 162621 6252.70  ３７
83     ex24_c33 CcTggcaaTccauccTgT 162603 162620 6279.67  ３８
84     ex24_c34 CcTggcaauCcauccTgT 162603 162620 6279.71  ３８
85     ex24_c35 CcTggcaaucCauccTgT 162603 162620 6279.71  ３８
86     ex24_c36 CcTggcaauccauccTgT 162603 162620 6253.71  ３８
87     ex24_c37 CcuggCaauccaTccugT 162603 162620 6253.68  ３８
88     ex24_c38 ccTggcAauccAuccTgu 162603 162620 6225.70  ３８
89     ex24_c39 ccTggcaaTccaTccugT 162603 162620 6253.69  ３８
90     ex24_c40 cCuggCaauccaTccugT 162603 162620 6253.69  ３８
91     ex24_c41 CuggCaaucCaucCuguC 162602 162619 6279.70  ３９
92     ex24_c42 CuggCaauCcaucCuguC 162602 162619 6279.71  ３９
93     ex24_c43 cTggCaauCcaucCugTc 162602 162619 6279.71  ３９
94     ex24_c44 CuggcAauccauCcuguC 162602 162619 6239.63  ３９
95     ex24_c45 CuggcaAuccaTccuguC 162602 162619 6239.68  ３９
96     ex24_c46 cTggcaAuccaTccugTc 162602 162619 6239.68  ３９
97     ex24_c47 cTggcaaTccaTccugTc 162602 162619 6253.69  ３９
98     ex24_c48 cTggcaaTccauccTgTc 162602 162619 6253.71  ３９
---------------------------------------------------------------------
表中の配列において大文字はENA、小文字は2’-OMe-RNAを示す。開始および終了については、Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5)（NCBI-GenBank accession No. NG_011977）のヌクレオチド番号を示す。表中の分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
【００８２】
（実施例９９乃至１３９）
実施例９９乃至１３９の化合物も実施例４と同様に合成した。実施例９９乃至１３９の化合物の配列及びデータについて表６に記載する。
表６
---------------------------------------------------------------------
実施例 配列名称 配列 (5’-3’)     開始   終了   分子量  配列番号
---------------------------------------------------------------------
99     ex21_010 cTugGagTccTuuAucAc 156703 156686 6265.65  ４０
100    ex21_011 gGagTccTuuAucAccTg 156700 156683 6304.68  ４１
101    ex21_b08 cCuuGgaGucCuuTauCa 156704 156687 6279.59  ４２
102    ex21_b09 uTggAguCcuTuaTcaCc 156702 156685 6293.67  ４３
103    ex21_b10 uGgaGucCuuTauCacCu 156701 156684 6279.67  ４４
104    ex21_c01 cCuuggAguccTuuauCa 156704 156687 6241.65  ４２
105    ex21_c02 ccTuggAguccTuuaTca 156704 156687 6241.64  ４２
106    ex21_c03 ccuTggAguccTuuAuca 156704 156687 6227.63  ４２
107    ex21_c04 ccTuggagTccuTuaTca 156704 156687 6255.57  ４２
108    ex21_c05 CcTuggagTccuuuaTcA 156704 156687 6267.66  ４２
109    ex21_c06 CcTuggaguCcuuuaTcA 156704 156687 6267.64  ４２
110    ex21_c07 CcTuggagucCuuuaTcA 156704 156687 6267.65  ４２
111    ex21_c08 cCuTggagTccuuuAuCa 156704 156687 6267.66  ４２
112    ex21_c09 cCuTggaguCcuuuAuCa 156704 156687 6267.65  ４２
113    ex21_c10 cTuggAguccuuTaucAc 156703 156686 6227.62  ４０
114    ex21_c12 CuTggaguCcuuuauCaC 156703 156686 6281.64  ４０
115    ex21_c13 CuTggagucCuuuauCaC 156703 156686 6281.67  ４０
116    ex21_c14 CuTggaguccTuuauCaC 156703 156686 6281.66  ４０
117    ex21_c15 uTggagTccuuTaucaCc 156702 156685 6255.66  ４３
118    ex21_c16 uTggAguccuuuaTcaCc 156702 156685 6241.63  ４３
119    ex21_c17 TuggAgucCuuuaTcacC 156702 156685 6267.62  ４３
120    ex21_c18 TuggAguccTuuaTcacC 156702 156685 6267.58  ４３
121    ex21_c19 uTggAgucCuuuaTcaCc 156702 156685 6267.65  ４３
122    ex21_c20 uTggAguccTuuaTcaCc 156702 156685 6267.58  ４３
123    ex21_c21 uTggagTccTuuaTcaCc 156702 156685 6281.67  ４３
124    ex21_c22 uTggagTccuTuaTcaCc 156702 156685 6281.66  ４３
125    ex21_c23 TuggagTccTuuaTcacC 156702 156685 6282.65  ４３
126    ex21_c24 uggAguCcuuuAucAccu 156701 156684 6213.62  ４４
127    ex21_c25 uGgaguCcuuuAucacCu 156701 156684 6227.63  ４４
128    ex21_c26 uggagucCuuTauCacCu 156701 156684 6255.61  ４４
129    ex21_c27 TggAguccuuuAucAccT 156701 156684 6239.64  ４４
130    ex21_c28 TggAguCcuuuaTcaCcu 156701 156684 6267.65  ４４
131    ex21_c29 TggAguccuuuAucAccT 156701 156684 6239.63  ４４
132    ex21_c30 TggagucCuuTauCacCu 156701 156684 6281.67  ４４
133    ex21_c31 TggagTccuTuauCaccT 156701 156684 6281.67  ４４
134    ex21_c32 TggagTccuTuauCacCu 156701 156684 6281.68  ４４
135    ex21_c33 uggagTccTuTauCacCu 156701 156684 6281.67  ４４
136    ex21_c34 ggAgucCuuuaTcacCug 156700 156683 6280.67  ４１
137    ex21_c35 ggAguCcuuTaucAccTg 156700 156683 6292.66  ４１
138    ex21_c36 gGagucCuuuaTcaccTg 156700 156683 6280.54  ４１
139    ex21_c37 ggAguCcuTuaTcaCcug 156700 156683 6306.61  ４１
---------------------------------------------------------------------
表中の配列において大文字はENA、小文字は2’-OMe-RNAを示す。開始および終了については、Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5)（NCBI-GenBank accession No. NG_011977）のヌクレオチド番号を示す。表中の分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
【００８３】
（試験例２）  ENAオリゴヌクレオチドによるエクソンスキッピング誘導能の解析
試験例１と同様に、HMVEC（皮膚微小血管内皮細胞）培養、尿中落下細胞初代培養系作製、腎糸球体上皮細胞（ポドサイト）への分化誘導、実施例で製造したオリゴヌクレオチドをトランスフェクション、RNA抽出、逆転写反応、PCR反応とフラグメント配列解析、及び、分化ポドサイトの免疫蛍光染色の操作を行った。【００８４】
HMVECまたはアルポート症候群患者由来尿中落下細胞における、実施例化合物によるエクソンスキッピング
図９に示したように、HMVECを用いてExon 24に対するオリゴヌクレオチド（実施例75〜実施例98）のExon 24スキッピングについて調べたところ、実施例75〜実施例98のすべてのオリゴヌクレオチドにおいて、図２と同様にExon 24がスキッピングしていることを示すフラグメント2が検出され、Exon 24スキッピングが認められた。【００８５】
図１０に示したように、Exon 24に変異を有するアルポート症候群患者由来尿中落下細胞を、COL4A5発現細胞である腎糸球体上皮細胞ポドサイトに分化誘導し、Exon 24に対するオリゴヌクレオチド（実施例75〜実施例98）のExon 24スキッピングについて調べたところ、図２と同様にExon 24がスキッピングしていることを示すフラグメント2が検出され、すべてのオリゴヌクレオチドでExon 24スキッピングが認められた。【００８６】
図１１に示したように、Exon 24に変異を有するアルポート症候群患者由来尿中落下細胞を、COL4A5発現細胞である腎糸球体上皮細胞ポドサイトに分化誘導し、Exon 24に対するオリゴヌクレオチド（実施例83、実施例85）を各0.05, 0.5, 5, 15, 50または100 nM導入し、Exon 24スキッピングについて調べたところ、すべてのオリゴヌクレオチドで濃度依存的にExon 24スキッピングが認められた。【００８７】
図１２に示したように、Exon 24に変異を有するアルポート症候群患者由来尿中落下細胞を、COL4A5発現細胞である腎糸球体上皮細胞ポドサイトに分化誘導し、Exon 24に対するオリゴヌクレオチド5種類（実施例1、実施例2、実施例3、実施例83、実施例85）を各50 nM導入し、効果を確認した。COL4A5と分化ポドサイトマーカーであるSynaptopodin（ヤギ 抗-Synaptopodin抗体、SantaCruz社）の発現を評価した。非導入細胞（Mock）に対し、オリゴヌクレオチド導入細胞ではCOL4A5タンパクの発現（緑色）が上昇し、さらに分化ポドサイトマーカーであるSynaptopodin（赤色）の発現の上昇も確認された。このことから、オリゴヌクレオチドの導入はCOL4A5タンパクの発現上昇に寄与するのみならず、ポドサイトの分化能にも影響を与えている可能性が示唆された。【００８８】
（試験例３）  ENAオリゴヌクレオチドによるエクソンスキッピング誘導能の解析
HEK293A（ヒト胎児腎細胞由来株化細胞）培養
以下のようにして、HEK293Aの培養を行った。
HEK293A (invitrogen社)を、維持培地（DMEM、Thermo Scientific社、10% Fetal Bovine Serum(Thermo Scientific社)を含む）にて10 cm dishまたはT75フラスコで培養した。トランスフェクション直前にTrypLE Express (Thermo Scientific社)により細胞をはがして細胞懸濁液とし、後述のように実施例で製造したオリゴヌクレオチドを、リバーストランスフェクション法にて導入した。【００８９】
実施例で製造したオリゴヌクレオチドのトランスフェクション
以下のようにして、実施例で製造したオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
下記A液とB液を作製後、混合した。
A液： Opti-MEM Medium (Thermofisher)                4.8 μL
実施例で製造した化合物（10 μM）                0.5 μL (最終濃度50 nM)
B液： Opti-MEM Medium                      5 μL
Lipofectamine RNAiMAX (Thermofisher)  0.3 μL
上記の混合液を15分間室温でインキュベーションした。作製した溶液を、96 well plate 1 wellにつき10.6 μLずつ分注した。このplateに2x104 cells/wellの密度で細胞を播種し24時間インキュベーションした。【００９０】
RNA抽出
以下のようにしてRNAの抽出を行った。
オリゴヌクレオチドをトランスフェクション後24時間インキュベーションした細胞を、cold PBSにて１回洗浄した。SuperPrep Cell Lysis Kit & RT Kit for qPCR（TOYOBO社）の細胞溶解液を、1 wellにつき50 μLずつ加え、30秒間振盪後、室温で5分間インキュベーションした。SuperPrep Cell Lysis Kit & RT Kit for qPCRの反応停止液を、1 wellにつき10 μLずつ加え、30秒間振盪後、室温で2分間インキュベーションした。合計60 μLの細胞溶解液を回収し、後述の逆転写反応を行った。【００９１】
逆転写反応
以下のようにして逆転写反応を行った。
SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCRの逆転写反応マスターミックス 32 μLと細胞溶解液 8 μLを混合した。逆転写反応を以下のように行った（37℃ 15 min、50℃ 5 min、98℃ 5 min、4℃ Hold）。最終産物は-20℃にて保存した。【００９２】
PCR反応とフラグメント配列解析
以下のようにしてPCR反応とフラグメント配列解析を行った。
下記のように、PCR反応液を調整した。
2018123925.tif 000010
【００９３】
以下のようにPCR反応を行った（94℃ 2 min、(94℃ 30 sec、55℃ 30 sec、68℃ 1 min)x 30-40 cycles、68℃ 10 min、4℃ Hold）。
解析用プライマーは下記のように設計した。
1)COL4A5 exon 21スキッピング解析用（Exon 20-23）
Forward (5’-3’): cagttatgggtcctcctggc（配列番号４５）
Reverse (5’-3’): agttgcaccagcttgtcctt（配列番号４６）
2)内在性コントロール遺伝子（ACTB）解析用
Forward (5’-3’): tggcacccagcacaatgaa（配列番号４７）
Reverse (5’-3’): ctaagtcatagtccgcctagaagca（配列番号４８）【００９４】
PCR産物はLabChip（登録商標） GX（Caliper LifeSciences）にて解析した。また、PCR産物をエチジウムブロマイドを含む2%アガロースゲルにて電気泳動し、NucleoSpin（登録商標） Gel and PCR Clean-up (MACHEREY-NAGEL社)にてゲルから抽出した。BigDye（登録商標） Terminator v3.1を用いて抽出したDNAのシークエンス反応を行った。Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer (Life technologies社)にて塩基配列を確認した。【００９５】
HEK293Aにおける、実施例化合物によるエクソンスキッピング
図１３に示したように、HEK293Aを用いてExon 21に対するオリゴヌクレオチド（実施例99〜実施例139）のExon 21スキッピングについて調べたところ、すべてのオリゴヌクレオチドでExon 21スキッピングが認められた（図１３A）。また、ゲルから抽出したフラグメントのシークエンス解析を行い、フラグメント9がスキッピング前の配列、フラグメント10がExon 21がスキッピングしている配列であることを確認した（図１３B, C）。【００９６】
（試験例４）  ENAオリゴヌクレオチドによるエクソンスキッピング誘導能の解析
試験例１と同様に、HMVEC（皮膚微小血管内皮細胞）培養、尿中落下細胞初代培養系作製、腎糸球体上皮細胞（ポドサイト）への分化誘導、実施例で製造したオリゴヌクレオチドをトランスフェクション、RNA抽出、逆転写反応、PCR反応とフラグメント配列解析、及び、分化ポドサイトの免疫蛍光染色の操作を行った。
但し、解析用プライマーは下記のように設計して用いた。
Exon 21スキッピング解析用（Exon 18-24）
Forward (5’-3’): GACCTCCTGGACTTGTAATTCCTA  （配列番号４９）
Reverse (5’-3’): CTCCTGGAATGCCTGGTAATCCT（配列番号５０）【００９７】
HMVECまたはアルポート症候群患者由来尿中落下細胞における、実施例化合物によるエクソンスキッピング
図１４Aに示したように、HMVECを用いてExon 21に対するオリゴヌクレオチド（実施例99〜実施例139）のExon 21スキッピングについて調べたところ、すべてのオリゴヌクレオチドでExon 21スキッピングが認められた。また、ゲルで見られたフラグメントのシークエンス解析を行ったところ、フラグメント11が、Exon 20がスキッピングしている配列であることを確認した（図１４B、及び、１４C）。Exon 21に対するオリゴヌクレオチドは、最終濃度5 nMになるように用いた。【００９８】
図１５に示したように、Exon 21に変異を有するアルポート症候群患者由来尿中落下細胞を、COL4A5発現細胞である腎糸球体上皮細胞ポドサイトに分化誘導し、Exon 21に対するオリゴヌクレオチド（実施例99〜実施例139）のExon 21スキッピングについて調べたところ、すべてのオリゴヌクレオチドでExon 21スキッピングが認められた。Exon 21に対するオリゴヌクレオチドは、最終濃度50 nMになるように用いた。【００９９】
図１６に示したように、Exon 21に変異を有するアルポート症候群患者由来尿中落下細胞を、COL4A5発現細胞である腎糸球体上皮細胞ポドサイトに分化誘導し、Exon 21に対するオリゴヌクレオチド（実施例105、実施例114、実施例116）を各0.05, 0.5, 5, 15, 50または100 nM導入し、Exon 21スキッピングについて調べたところ、すべてのオリゴヌクレオチドで濃度依存的にExon 21スキッピングが認められた。【０１００】
図１７に示したように、Exon 21に変異を有するアルポート症候群患者由来尿中落下細胞を、COL4A5発現細胞である腎糸球体上皮細胞ポドサイトに分化誘導し、Exon 21に対するオリゴヌクレオチド3種類（実施例102、実施例105、実施例114、実施例116）を各5 nM導入し、効果を確認した。COL4A5と分化ポドサイトマーカーであるSynaptopodin（ヤギ 抗-Synaptopodin抗体、SantaCruz社）の発現を評価した。非導入細胞（Mock）に対し、オリゴヌクレオチド導入細胞ではCOL4A5タンパクの発現（緑色）が上昇し、さらに分化ポドサイトマーカーであるSynaptopodin（赤色）の発現の上昇も確認された。このことから、オリゴヌクレオチドの導入はCOL4A5タンパクの発現上昇に寄与するのみならず、ポドサイトの分化能にも影響を与えている可能性が示唆された。【０１０１】
（実施例１４０及び１４１）
実施例１４０及び１４１の化合物も実施例４と同様に合成した。実施例１４０及び１４１の化合物の配列及びデータについて表７に記載する。
表７
---------------------------------------------------------------------
実施例 配列名称   配列 (5’-3’)     開始   終了   分子量  配列番号
---------------------------------------------------------------------
140  ex21_012-2   TccTuuAucAccTgg    156696 156682  5183.57   ５１
141  ex21_012-4   cTuuAucAccTggAg    156694 156680  5232.56   ５２
---------------------------------------------------------------------
表中の配列において大文字はENA、小文字は2’-OMe-RNAを示す。開始および終了については、Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5)（NCBI-GenBank accession No. NG_011977）のヌクレオチド番号を示す。表中の分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。【０１０２】
（実施例１４２）
HO-Te１s- Gm1s- Gm1s-Ae1s- Gm1s- Um1s- Cm1s- Cm1s- Um1s- Um1s- Um1s- Ae1s- Um1s- Cm1s- Ae1s- Cm1s- Cm1s- T1t-H (ex21_Lc29)（配列番号４４）
実施例１４２の化合物は、ホスホロアミダイト法（Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)を用いて合成を行った。LNA部分は、 WO99/14226に記載されたホスホロアミダイト体を用いて合成した。
本化合物は、逆相HPLC（カラム（X-Bridge C18 2.5 μm (4.6×75 mm)）、A溶液：100 mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8 mMトリエチルアミン水溶液、B溶液：メタノール、B%：5% → 30%（20min, linear gradient）；60℃；1 mL/min；260nm）で分析すると、12.87分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した（実測値：6173.88）。
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5)（NCBI-GenBank accession No. NG_011977）のヌクレオチド番号156701-156684に相補的な配列である。【０１０３】
（実施例１４３乃至２８０）
実施例１４３乃至２８０の化合物も実施例１４０と同様に合成することができる。実施例１４３乃至２８０の化合物の配列について表８乃至１１に記載する。
表８
---------------------------------------------------------------------
実施例 配列名称  配列 (5’-3’)     開始   終了   配列番号
---------------------------------------------------------------------
143    ex21_L010 cTugGagTccTuuAucAc 156703 156686 ４０
144    ex21_L011 gGagTccTuuAucAccTg 156700 156683 ４１
145    ex21_Lb08 cCuuGgaGucCuuTauCa 156704 156687 ４２
146    ex21_Lb09 uTggAguCcuTuaTcaCc 156702 156685 ４３
147    ex21_Lb10 uGgaGucCuuTauCacCu 156701 156684 ４４
148    ex21_Lc01 cCuuggAguccTuuauCa 156704 156687 ４２
149    ex21_Lc02 ccTuggAguccTuuaTca 156704 156687 ４２
150    ex21_Lc03 ccuTggAguccTuuAuca 156704 156687 ４２
151    ex21_Lc04 ccTuggagTccuTuaTca 156704 156687 ４２
152    ex21_Lc05 CcTuggagTccuuuaTcA 156704 156687 ４２
153    ex21_Lc06 CcTuggaguCcuuuaTcA 156704 156687 ４２
154    ex21_Lc07 CcTuggagucCuuuaTcA 156704 156687 ４２
155    ex21_Lc08 cCuTggagTccuuuAuCa 156704 156687 ４２
156    ex21_Lc09 cCuTggaguCcuuuAuCa 156704 156687 ４２
157    ex21_Lc10 cTuggAguccuuTaucAc 156703 156686 ４０
158    ex21_Lc12 CuTggaguCcuuuauCaC 156703 156686 ４０
159    ex21_Lc13 CuTggagucCuuuauCaC 156703 156686 ４０
160    ex21_Lc14 CuTggaguccTuuauCaC 156703 156686 ４０
161    ex21_Lc15 uTggagTccuuTaucaCc 156702 156685 ４３
162    ex21_Lc16 uTggAguccuuuaTcaCc 156702 156685 ４３
163    ex21_Lc17 TuggAgucCuuuaTcacC 156702 156685 ４３
164    ex21_Lc18 TuggAguccTuuaTcacC 156702 156685 ４３
165    ex21_Lc19 uTggAgucCuuuaTcaCc 156702 156685 ４３
166    ex21_Lc20 uTggAguccTuuaTcaCc 156702 156685 ４３
167    ex21_Lc21 uTggagTccTuuaTcaCc 156702 156685 ４３
168    ex21_Lc22 uTggagTccuTuaTcaCc 156702 156685 ４３
169    ex21_Lc23 TuggagTccTuuaTcacC 156702 156685 ４３
170    ex21_Lc24 uggAguCcuuuAucAccu 156701 156684 ４４
171    ex21_Lc25 uGgaguCcuuuAucacCu 156701 156684 ４４
172    ex21_Lc26 uggagucCuuTauCacCu 156701 156684 ４４
173    ex21_Lc27 TggAguccuuuAucAccT 156701 156684 ４４
174    ex21_Lc28 TggAguCcuuuaTcaCcu 156701 156684 ４４
175    ex21_Lc30 TggagucCuuTauCacCu 156701 156684 ４４
176    ex21_Lc31 TggagTccuTuauCaccT 156701 156684 ４４
177    ex21_Lc32 TggagTccuTuauCacCu 156701 156684 ４４
178    ex21_Lc33 uggagTccTuTauCacCu 156701 156684 ４４
179    ex21_Lc34 ggAgucCuuuaTcacCug 156700 156683 ４１
180    ex21_Lc35 ggAguCcuuTaucAccTg 156700 156683 ４１
181    ex21_Lc36 gGagucCuuuaTcaccTg 156700 156683 ４１
182    ex21_Lc37 ggAguCcuTuaTcaCcug 156700 156683 ４１
---------------------------------------------------------------------
表中の配列において大文字はLNA、小文字は2’-OMe-RNAを示す。開始および終了については、Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5)（NCBI-GenBank accession No. NG_011977）のヌクレオチド番号を示す。
表９
---------------------------------------------------------------------
実施例   配列名称 配列 (5’-3’)     開始   終了   配列番号
---------------------------------------------------------------------
183      ex24_L011 cCcuGgcAauCcaTccTg 162604 162621 １
184      ex24_Lb04 cCugGcaAucCauCcuGu 162603 162620 ２
185      ex24_Lb05 cTggCaaTccAucCugTc 162602 162619 ３
186      ex24_Lc01 cCcTggCaaucCauCcTg 162604 162621 １
187      ex24_Lc02 cCcTggCaaucCaucCTg 162604 162621 １
188      ex24_Lc03 cCcTggCaaTcCauCcTg 162604 162621 １
189      ex24_Lc04 CcCuggCaaTcCauCcTg 162604 162621 １
190      ex24_Lc05 cCcTggCaAuCcAuCcTg 162604 162621 １
191      ex24_Lc06 cCcTggCaaTcCaTcCTg 162604 162621 １
192      ex24_Lc07 CCcTggCaaTcCaTcCTg 162604 162621 １
193      ex24_Lc08 cCcTgGcAaTcCaTcCuG 162604 162621 １
194      ex24_Lc09 cCuggCaaTcCauCcTgu 162603 162620 ２
195      ex24_Lc10 CcTggCaauccauCcTgT 162603 162620 ２
196      ex24_Lc11 cCuggCaaTcCauCcTgT 162603 162620 ２
197      ex24_Lc12 ccTggCaAuCcAuCcTgu 162603 162620 ２
198      ex24_Lc13 cCTggCaaTcCauCcTgT 162603 162620 ２
199      ex24_Lc14 CcTggCaAuCcAuCcTgu 162603 162620 ２
200      ex24_Lc15 cCTggCaaTcCaTCcTgT 162603 162620 ２
201      ex24_Lc16 CcTggCaAuCcAuCcTgT 162603 162620 ２
202      ex24_Lc17 cTggCaaTccaTcCugTc 162602 162619 ３
203      ex24_Lc18 cTggCaauCcaTccTguC 162602 162619 ３
204      ex24_Lc19 cTggCaaTcCaTcCugTc 162602 162619 ３
205      ex24_Lc20 CTggCaauCcaTcCugTc 162602 162619 ３
206      ex24_Lc21 cTggCaAuCcAuCcTgTc 162602 162619 ３
207      ex24_Lc22 CTggCaaTccAucCugTC 162602 162619 ３
208      ex24_Lc23 CTggCaaTcCaTcCugTC 162602 162619 ３
209      ex24_Lc24 cTgGcAaTcCaTcCuGuC 162602 162619 ３
---------------------------------------------------------------------
表中の配列において大文字はLNA、小文字は2’-OMe-RNAを示す。開始および終了については、Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5)（NCBI-GenBank accession No. NG_011977）のヌクレオチド番号を示す。
表１０
---------------------------------------------------------------------
実施例 配列名称 配列 (5’-3’)       開始   終了     配列番号
---------------------------------------------------------------------
210     ex24_Lc25 cCcTggcaaTccauCcTg 162604 162621        ３７
211     ex24_Lc26 CcCuggcaaTccauCcTg 162604 162621        ３７
212     ex24_Lc27 cCcuggCaaTccaTccTg 162604 162621        ３７
213     ex24_Lc28 cCcTggcaauccauCcTg 162604 162621        ３７
214     ex24_Lc29 cCcuggCaaucCauccTg 162604 162621        ３７
215     ex24_Lc30 ccCuggCaaucCaucCug 162604 162621        ３７
216     ex24_Lc31 cCcTggcaauccauCcTg 162604 162621        ３７
217     ex24_Lc32 CccuggCaaucCauccTg 162604 162621        ３７
218     ex24_Lc33 CcTggcaaTccauccTgT 162603 162620        ３８
219     ex24_Lc34 CcTggcaauCcauccTgT 162603 162620        ３８
220     ex24_Lc35 CcTggcaaucCauccTgT 162603 162620        ３８
221     ex24_Lc36 CcTggcaauccauccTgT 162603 162620        ３８
222     ex24_Lc37 CcuggCaauccaTccugT 162603 162620        ３８
223     ex24_Lc38 ccTggcAauccAuccTgu 162603 162620        ３８
224     ex24_Lc39 ccTggcaaTccaTccugT 162603 162620        ３８
225     ex24_Lc40 cCuggCaauccaTccugT 162603 162620        ３８
226     ex24_Lc41 CuggCaaucCaucCuguC 162602 162619        ３９
227     ex24_Lc42 CuggCaauCcaucCuguC 162602 162619        ３９
228     ex24_Lc43 cTggCaauCcaucCugTc 162602 162619        ３９
229     ex24_Lc44 CuggcAauccauCcuguC 162602 162619        ３９
230     ex24_Lc45 CuggcaAuccaTccuguC 162602 162619        ３９
231     ex24_Lc46 cTggcaAuccaTccugTc 162602 162619        ３９
232     ex24_Lc47 cTggcaaTccaTccugTc 162602 162619        ３９
233     ex24_Lc48 cTggcaaTccauccTgTc 162602 162619        ３９
---------------------------------------------------------------------
表中の配列において大文字はLNA、小文字は2’-OMe-RNAを示す。開始および終了については、Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5)（NCBI-GenBank accession No. NG_011977）のヌクレオチド番号を示す。
表１１
---------------------------------------------------------------------
実施例 配列名称 配列 (5’-3’)       開始   終了     配列番号
---------------------------------------------------------------------
234     ex20_L001 uAuaGcuTacTagGagGa 156301 156318   ４
235     ex20_L002 gCuuAcuAggAggAauGu 156297 156314   ５
236     ex20_L022 gGagGucCagGaaTggAa 156217 156234   ６
237     ex20_L023 gTccAggAauGgaAauTc 156213 156230   ７
238     ex20_L024 aGgaAugGaaAuuCcaGg 156209 156226   ８
239     ex20_L044 uAacTgcAgcCccTaaGa 156129 156146   ９
240     ex20_Lb02 aAuaTagCuuAcuAggAg 156303 156320   １０
241     ex20_Lb03 aTauAgcTuaCuaGgaGg 156302 156319   １１
242     ex20_Lb04 aTagCuuAcuAggAggAa 156300 156317   １２
243     ex20_Lb05 uAgcTuaCuaGgaGgaAu 156299 156316   １３
244     ex20_Lb07 cTuaCuaGgaGgaAugTg 156296 156313   １４
245     ex20_Lb09 uAcuAggAggAauGugAg 156294 156311   １５
246     ex20_Lb10 gAggTccAggAauGgaAa 156216 156233   １６
247     ex20_Lb11 aGguCcaGgaAugGaaAu 156215 156232   １７
248     ex20_Lb12 gGucCagGaaTggAaaTu 156214 156231   １８
249     ex20_Lb13 uCcaGgaAugGaaAuuCc 156212 156229   １９
250     ex20_Lb14 cCagGaaTggAaaTucCa 156211 156228   ２０
251     ex20_Lb15 cAggAauGgaAauTccAg 156210 156227   ２１
252     ex20_Lb16 cCauAacTgcAgcCccTa 156132 156149   ２２
253     ex20_Lb17 cAuaAcuGcaGccCcuAa 156131 156148   ２３
254     ex20_Lb18 aTaaCugCagCccCuaAg 156130 156147   ２４
255     ex20_Lb19 aAcuGcaGccCcuAagAu 156128 156145   ２５
256     ex20_Lb20 aCugCagCccCuaAgaTu 156127 156144   ２６
257     ex20_Lb21 cTgcAgcCccTaaGauTc 156126 156143   ２７
258     ex20_Lc01 gTcCaggAaTggaaAuTc 156213 156230   ２８
259     ex20_Lc02 gTcCaggAaTggaaaTuC 156213 156230   ２８
260     ex20_Lc03 gTCcaggaATggaaaTTc 156213 156230   ２８
261     ex20_Lc04 gTccAggAaTggaAauTc 156213 156230   ２８
262     ex20_Lc05 gTccAggAauggaAauTc 156213 156230   ２８
263     ex20_Lc06 gTcCaggaaTggaaaTuC 156213 156230   ２８
264     ex20_Lc07 gTcCaggaaTggaaAuTc 156213 156230   ２８
265     ex20_Lc08 gTccAggaaTggAaaTuc 156213 156230   ２８
266     ex20_Lc09 gTccAggaauggaAauTc 156213 156230   ２８
267     ex20_Lc10 gTcCaggaauggaaaTuC 156213 156230   ２８
268     ex20_Lc11 gTcCaggaaTggaaauTc 156213 156230   ２８
269     ex20_Lc12 uCcAggAaTggAaAuuCc 156212 156229   １９
270     ex20_Lc13 TccAggAauggAaaTucC 156212 156229   １９
271     ex20_Lc14 uCcAggaAuggAaAuuCc 156212 156229   １９
272     ex20_Lc15 TcCaggAaTggaaaTuCc 156212 156229   １９
273     ex20_Lc16 uCcAggAaTggaaaTuCc 156212 156229   １９
274     ex20_Lc17 uCcAggAauggAaAuuCc 156212 156229   １９
275     ex20_Lc18 uCcAggaauggaAaTuCc 156212 156229   １９
276     ex20_Lc19 TcCaggaaTggaaaTuCc 156212 156229   １９
277     ex20_Lc20 TcCaggaaTggaaauTcC 156212 156229    １９
278     ex20_Lc21 uCcAggaauggaaaTuCc 156212 156229    １９
270     ex20_Lc22 uCcaggAauggAaauuCc 156212 156229    １９
280     ex20_Lc23 ucCaggAauggAaauTcc 156212 156229    １９
---------------------------------------------------------------------
表中の配列において大文字はLNA、小文字は2’-OMe-RNAを示す。開始および終了については、Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5)（NCBI-GenBank accession No. NG_011977）のヌクレオチド番号を示す。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明は、アルポート症候群の治療に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０５】
＜配列番号１＞実施例１、４〜１１で製造したオリゴヌクレオチド（ex24_011、ex24_c01、ex24_c02、ex24_c03、ex24_c04、ex24_c05、ex24_c06、ex24_c07、ex24_c08）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２＞実施例２、１２〜１９で製造したオリゴヌクレオチド（ex24_b04、ex24_c09、ex24_c10、ex24_c11、ex24_c12、ex24_c13、ex24_c14、ex24_c15、ex24_c16）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３＞実施例３、２０〜２７で製造したオリゴヌクレオチド（ex24_b05、ex24_c17、ex24_c18、ex24_c19、ex24_c20、ex24_c21、ex24_c22、ex24_c23、ex24_c24）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４＞実施例２８で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_001）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号５＞実施例２９で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_002）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号６＞実施例３０で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_022）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号７＞実施例３１で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_023）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号８＞実施例３２で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_024）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号９＞実施例３３で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_044）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１０＞実施例３４で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b02）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１１＞実施例３５で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b03）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１２＞実施例３６で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b04）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１３＞実施例３７で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b05）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１４＞実施例３８で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b07）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１５＞実施例３９で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b09）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１６＞実施例４０で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b10）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１７＞実施例４１で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b11）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１８＞実施例４２で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b12）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１９＞実施例４３、６３〜７４で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b13、ex20_c12、ex20_c13、ex20_c14、ex20_c15、ex20_c16、ex20_c17、ex20_c18、ex20_c19、ex20_c20、ex20_c21、ex20_c22、ex20_c23）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２０＞実施例４４で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b14）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２１＞実施例４５で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b15）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２２＞実施例４６で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b16）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２３＞実施例４７で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b17）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２４＞実施例４８で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b18）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２５＞実施例４９で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b19）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２６＞実施例５０で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b20）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２７＞実施例５１で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_b21）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２８＞実施例５２〜６２で製造したオリゴヌクレオチド（ex20_c01、ex20_c02、ex20_c03、ex20_c04、ex20_c05、ex20_c06、ex20_c07、ex20_c08、ex20_c09、ex20_c10、ex20_c11）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２９＞全COL4A5発現解析用（Exon 1-7）Forward (5’-3’)プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３０＞全COL4A5発現解析用（Exon 1-7）Reverse (5’-3’) プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３１＞COL4A5 Exon 20スキッピング解析用（Exon 17-22）Forward (5’-3’) プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３２＞COL4A5 Exon 20スキッピング解析用（Exon 17-22）Reverse (5’-3’) プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３３＞COL4A5 Exon 24スキッピング解析用（Exon 21-26）Forward (5’-3’) プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３４＞COL4A5 Exon 24スキッピング解析用（Exon 21-26）Reverse (5’-3’) プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３６＞内在性コントロール遺伝子（GAPDH）解析用Forward (5’-3’) プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３６＞内在性コントロール遺伝子（GAPDH）解析用Reverse (5’-3’) プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３７＞実施例７５〜８２で製造したオリゴヌクレオチド（ex24_c25、ex24_c26、ex24_c27、ex24_c28、ex24_c29、ex24_c30、ex24_c31、ex24_c32）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３８＞実施例８３〜９０で製造したオリゴヌクレオチド（ex24_c33、ex24_c34、ex24_c35、ex24_c36、ex24_c37、ex24_c38、ex24_c39）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３９＞実施例９１〜９８で製造したオリゴヌクレオチド（ex24_c41、ex24_c42、ex24_c43、ex24_c44、ex24_c45、ex24_c46、ex24_c47、ex24_c48）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４０＞実施例９９、１１３〜１１６で製造したオリゴヌクレオチド（ex21_010、ex21_c10、ex21_c12、ex21_c13、ex21_c14）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４１＞実施例１００、１３６〜１３９で製造したオリゴヌクレオチド（ex21_011、ex21_c34、ex21_c35、ex21_c36、ex21_c37）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４２＞実施例１０１、１０４〜１１２で製造したオリゴヌクレオチド（ex21_b08、ex21_c01、ex21_c02、ex21_c03、ex21_c04、ex21_c05、ex21_c06、ex21_c07、ex21_c08、ex21_c09）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４３＞実施例１０２、１１７〜１２５で製造したオリゴヌクレオチド（ex21_b09、ex21_c15、ex21_c16、ex21_c17、ex21_c18、ex21_c19、ex21_c20、ex21_c21、ex21_c22、ex21_c23）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４４＞実施例１０３、１２６〜１３５で製造したオリゴヌクレオチド（ex21_b10、ex21_c24、ex21_c25、ex21_c26、ex21_c27、ex21_c28、ex21_c29、ex21_c30、ex21_c31、ex21_c32、ex21_c33）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４５＞COL4A5 Exon 21スキッピング解析用（Exon 20-23）Forward (5’-3’) プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４６＞COL4A5 Exon 21スキッピング解析用（Exon 20-23）Reverse (5’-3’) プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４７＞内在性コントロール遺伝子（ACTB）解析用Forward (5’-3’) プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４８＞内在性コントロール遺伝子（ACTB）解析用Reverse (5’-3’) プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４９＞COL4A5 Exon 21スキッピング解析用（Exon 18-24）Forward (5’-3’) プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号５０＞COL4A5 Exon 21スキッピング解析用（Exon 18-24）Reverse (5’-3’) プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号５１＞実施例１４０で製造したオリゴヌクレオチド（ex21_012-2）のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号５２＞実施例１４１で製造したオリゴヌクレオチド（ex21_012-4）のヌクレオチド配列を示す。
【図１】
2018123925.tif 000011
【図２】
2018123925.tif 000012
【図３】
2018123925.tif 000013
【図４】
2018123925.tif 000014
【図５】
2018123925.tif 000015
【図６】
2018123925.tif 000016
【図７】
2018123925.tif 000017
【図８】
2018123925.tif 000018
【図９】
2018123925.tif 000019
【図１０】
2018123925.tif 000020
【図１１】
2018123925.tif 000021
【図１２】
2018123925.tif 000022
【図１３Ａ】
2018123925.tif 000023
【図１３ＢＣ】
2018123925.tif 000024
【図１４】
2018123925.tif 000025
【図１５】
2018123925.tif 000026
【図１６】
2018123925.tif 000027
【図１７】
2018123925.tif 000028
【配列表】
2018123925000001.app
【国際調査報告】
2018123925.tif 000029
2018123925.tif 000030
2018123925.tif 000031