(57)【要約】  検出対象である生物粒子を含む試料から前記生物粒子の画像である生物画像を取得する生物画像取得部と、前記生物粒子の塩基配列情報を取得する塩基配列情報取得部と、同種の生物粒子から取得された前記生物画像及び前記塩基配列情報を対応付けて統合データベースに登録する統合部と、を備える統合システムである。
2018199326.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象である生物粒子を含む試料から前記生物粒子の画像である生物画像を取得する生物画像取得部と、
前記生物粒子の塩基配列情報を取得する塩基配列情報取得部と、
同種の生物粒子から取得された前記生物画像及び前記塩基配列情報を対応付けて統合データベースに登録する統合部と、
を備える統合システム。
【請求項２】
前記生物画像取得部によって取得された画像に基づいて、前記試料中における前記生物粒子の種類毎に個体数に関する情報を取得する生物情報判定部をさらに備え、
前記統合部は、前記生物画像及び前記塩基配列情報に加えてさらに前記画像に基づいて得られた個体数に関する情報を対応付けて統合データベースに登録する、請求項１に記載の統合システム。
【請求項３】
前記塩基配列情報取得部によって取得された塩基配列情報に基づいて、前記試料中における前記生物粒子の種類毎に個体数に関する情報を取得する塩基配列情報判定部をさらに備え、
前記統合部は、前記生物画像及び前記塩基配列情報に加えてさらに前記塩基配列情報に基づいて得られた個体数に関する情報を対応付けて統合データベースに登録する、請求項１又は２に記載の統合システム。
【請求項４】
生物画像取得部は、前記試料を含む流体がフローセル中を流れる状態において前記流体を撮像することによって前記生物画像を取得する、請求項１から３のいずれか一項に記載の統合システム。
【請求項５】
前記生物画像取得部によって取得された画像に基づいて、前記試料中における前記生物粒子の種類毎に個体数に関する情報である第一個体情報を取得する生物情報判定部と、
前記塩基配列情報取得部によって取得された塩基配列情報に基づいて、前記試料中における前記生物粒子の種類毎に個体数に関する情報である第二個体情報を取得する塩基配列情報判定部と、をさらに備え、
前記統合部は、前記第一個体情報と前記第二個体情報とが所定の基準に基づいて類似の情報であると判定された場合に、前記第一個体情報に対応する前記画像と、前記第二個体情報に対応する前記塩基配列情報と、を対応付けて前記統合データベースに登録する、請求項１に記載の統合システム。
【請求項６】
前記統合データベースに登録された前記生物画像及び前記塩基配列情報との対応付けに基づいて、新たに取得された生物画像の生物粒子の塩基配列情報を同定する、又は、新たに取得された生物の塩基配列情報の生物画像を同定する、解析部をさらに備える、請求項１から５のいずれか一項に記載の統合システム。
【請求項７】
前記解析部は、前記生物粒子に関して得られる属性情報にさらに基づいて同定する請求項６に記載の統合システム。
【請求項８】
前記統合部は、前記生物画像又は前記塩基配列情報に基づいて、前記生物粒子の分類群を推定する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の統合システム。
【請求項９】
検出対象である生物粒子を含む試料から前記生物粒子の画像である生物画像を取得する生物画像取得ステップと、
前記生物粒子の塩基配列情報を取得する塩基配列情報取得ステップと、
同種の生物粒子から取得された前記生物画像及び前記塩基配列情報を対応付けて統合データベースに登録する統合ステップと、
を有する統合方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物の画像等のデータベースの技術に関する。
本願は、２０１７年４月２８日に、日本に出願された特願２０１７−０９０８０９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、生物の同定や分類に必要な情報のデータベースを構築することが行われている。例えば、非特許文献１〜３に示されるようなデータベースがある。これらのデータベースでは、生物から得られた個別の塩基配列情報等の情報が登録され、活用されている。
また、非特許文献１に開示された技術では、画像データへのリンクがデータベースに登録されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】”MycoBank Database”、[online]、[平成29年4月28日検索]、インターネット〈URL:http://www.mycobank.org/〉
【非特許文献２】”JBIF 地球規模生物多様性情報機構日本ノード”、[online]、[平成29年4月28日検索]、インターネット〈URL:http://www.gbif.jp/bol〉
【非特許文献３】“BISMaL”、[online]、[平成29年4月28日検索]、インターネット〈URL:http://www.godac.jamstec.go.jp/bismal/j/using.html〉
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来は個別に生物の塩基配列情報を取得することは可能であったが、その情報を活用することが難しいことがあった。
そこで、本発明は、塩基配列情報を有するデータベースであってより活用しやすいデータベースを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様は、検出対象である生物粒子を含む試料から前記生物粒子の画像である生物画像を取得する生物画像取得部と、前記生物粒子の塩基配列情報を取得する塩基配列情報取得部と、同種の生物粒子から取得された前記生物画像及び前記塩基配列情報を対応付けて統合データベースに登録する統合部と、を備える統合システムである。【０００６】
本発明の一態様は、上記の統合システムであって、前記生物画像取得部によって取得された画像に基づいて、前記試料中における前記生物粒子の種類毎に個体数に関する情報を取得する生物情報判定部をさらに備え、前記統合部は、前記生物画像及び前記塩基配列情報に加えてさらに前記画像に基づいて得られた個体数に関する情報を対応付けて統合データベースに登録する。【０００７】
本発明の一態様は、上記の統合システムであって、前記塩基配列情報取得部によって取得された塩基配列情報に基づいて、前記試料中における前記生物粒子の種類毎に個体数に関する情報を取得する塩基配列情報判定部をさらに備え、前記統合部は、前記生物画像及び前記塩基配列情報に加えてさらに前記塩基配列情報に基づいて得られた個体数に関する情報を対応付けて統合データベースに登録する。【０００８】
本発明の一態様は、上記の統合システムであって、生物画像取得部は、前記試料を含む流体がフローセル中を流れる状態において前記流体を撮像することによって前記生物画像を取得する。【０００９】
本発明の一態様は、上記の統合システムであって、前記生物画像取得部によって取得された画像に基づいて、前記試料中における前記生物粒子の種類毎に個体数に関する情報である第一個体情報を取得する生物情報判定部と、前記塩基配列情報取得部によって取得された塩基配列情報に基づいて、前記試料中における前記生物粒子の種類毎に個体数に関する情報である第二個体情報を取得する塩基配列情報判定部と、をさらに備え、前記統合部は、前記第一個体情報と前記第二個体情報とが所定の基準に基づいて類似の情報であると判定された場合に、前記第一個体情報に対応する前記画像と、前記第二個体情報に対応する前記塩基配列情報と、を対応付けて前記統合データベースに登録する。【００１０】
本発明の一態様は、上記の統合システムであって、前記統合データベースに登録された前記生物画像及び前記塩基配列情報との対応付けに基づいて、新たに取得された生物画像の生物粒子の塩基配列情報を同定する、又は、新たに取得された生物の塩基配列情報の生物画像を同定する、解析部をさらに備える。【００１１】
本発明の一態様は、上記の統合システムであって、前記解析部は、前記生物粒子に関して得られる属性情報にさらに基づいて同定する。【００１２】
本発明の一態様は、上記の統合システムであって、前記統合部は、前記生物画像又は前記塩基配列情報に基づいて、前記生物粒子の分類群を推定する。【００１３】
本発明の一態様は、検出対象である生物粒子を含む試料から前記生物粒子の画像である生物画像を取得する生物画像取得ステップと、前記生物粒子の塩基配列情報を取得する塩基配列情報取得ステップと、同種の生物粒子から取得された前記生物画像及び前記塩基配列情報を対応付けて統合データベースに登録する統合ステップと、を有する統合方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、塩基配列情報を有するデータベースにおいて、データベースの活用がより容易となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施形態に係る統合システムの概略を示す。
【図２】画像データベースが記憶する情報の具体例を示す図である。
【図３】塩基配列情報データベースが記憶する情報の具体例を示す図である。
【図４】統合データベースが記憶する情報の具体例を示す図である。
【図５】第１の変形例における統合システム９０の概略を示す図である。
【図６】本発明の一実施形態に係る生物粒子の画像取得方法の概略を示す。
【図７】本発明の一実施形態に係る生物粒子の画像取得方法における工程の一例を示す。
【図８】本発明の一実施形態に係る生物粒子を含む試料の前処理装置の構成例を示す。
【図９】本発明の一実施形態に係る生物粒子画像取得装置の構成例を示す。
【図１０】本発明の一実施形態に係る方法で取得したメイオファウナの画像の一例を示す。（ａ）は線虫類、（ｂ）はカイアシ類、（ｃ）はノープリウス幼生、（ｄ）は動吻動物、（ｅ）は有孔虫である。
【図１１】本発明の一実施形態に係る方法で取得した画像に基づき計数したメイオファウナの個体数と、顕微鏡下で計数された個体数との相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図１は、本発明の一実施形態に係る統合システム９０の概略を示す図である。以下、統合システム９０の詳細について説明する。統合システム９０は、リファレンスデータベース９１０、生物画像取得部９２０、生物情報判定部９３０、画像データベース９４０、ゲノム情報取得部９５０、ゲノム情報判定部９６０、ゲノム情報データベース９７０、統合部９８０及び統合データベース９９０を備える。また、解析部８００は、統合システム９０によって生成された統合データベース９９０のデータに基づいて解析処理を行う。
【００１７】
リファレンスデータベース９１０は、磁気ハードディスク装置や半導体記憶装置等の記憶装置を用いて構成される。リファレンスデータベース９１０は、リファレンスデータを記憶する。リファレンスデータには、画像リファレンスデータと、塩基配列リファレンスデータと、がある。
【００１８】
画像リファレンスデータは、既に公知となっている画像情報と種別情報とを対応付けたデータである。画像リファレンスデータに含まれる画像情報は、画像そのもののデータであってもよいし、画像から得られる特徴量を示すデータであってもよい。なお、特徴量としては、分類群識別のための形態的特徴（画像）を含む。画像リファレンスデータを用いることによって、試料から得られた生物粒子の画像がどのような種類の生物の画像であるかを判定することが可能である。
【００１９】
塩基配列リファレンスデータは、既に公知となっている塩基配列情報と種別情報とを対応付けたデータである。塩基配列リファレンスデータに含まれる塩基配列情報は、塩基配列そのものを示す情報であってもよいし、塩基配列から得られる特徴量を示すデータであってもよい。なお、特徴量としては、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースにおいて用いられているメタデータが用いられてもよい。塩基配列リファレンスデータを用いることによって、試料から得られた生物粒子の塩基配列情報がどのような種類の生物の塩基配列情報であるかを判定することが可能である。
【００２０】
生物画像取得部９２０は、検出対象である生物粒子を含む試料から生物粒子の生物画像を取得する。生物画像取得部９２０は、どのような手段によって生物画像を取得してもよい。例えば、試料を含む流体がフローセル中を流れる状態において流体を撮像することによって生物画像が取得されてもよい。なお、生物画像取得部９２０の具体例について後述する。
【００２１】
生物情報判定部９３０は、生物画像取得部９２０によって取得された生物画像について、その生物画像の生物粒子がどのような種類の生物であるか判定する。生物情報判定部９３０は、例えば取得された生物画像と、リファレンスデータベース９１０に記憶される画像リファレンスデータと、に基づいて生物の種類を判定してもよい。生物情報判定部９３０は、判定結果である種別情報（生物の種類を示す情報）と、画像とを対応付けて画像データベース９４０に登録する。本実施形態では、生物情報判定部９３０は、さらに試料が採取された日時を示す日時情報、試料が採取された海域を示す海域情報、その種類の生物の個体数に関する第一個体数情報を対応付けて登録する。なお、取得された画像データと、リファレンスデータベース９１０の画像との判定には、例えば、画像認識技術に用いられている生物の形状、及び、特徴、あるいは、特徴形状の関係、距離、サイズ、色等が用いられてもよい。特徴形状の関係とは、複数の特徴的な形状部分の位置関係や向きの関係を示す。距離とは、複数の特徴的な形状間の距離を示す。
【００２２】
第一個体数情報は、生物情報判定部９３０によって画像に基づいて取得される。例えば、生物情報判定部９３０は、処理の対象となっている試料から検出された生物粒子の個体数を、生物粒子の種類毎に取得してもよい。生物情報判定部９３０は、このようにして取得された種類毎の個体数を第一個体数情報として取得してもよい。生物情報判定部９３０は、処理の対象となっている試料から検出された全種類の生物粒子の個体数に対する、各種類の個体数の割合（出現割合）を示す値（例えばパーセント値）を第一個体数情報として取得してもよい。
【００２３】
画像データベース９４０は、磁気ハードディスク装置や半導体記憶装置等の記憶装置を用いて構成される。画像データベース９４０は、生物情報判定部９３０によって取得された情報をデータベースとして記憶する。図２は、画像データベース９４０が記憶する情報の具体例を示す図である。画像データベース９４０は、種別情報、日時情報、海域情報、画像及び第一個体数情報の各値を有するテーブルを記憶する。画像データベース９４０のテーブルに登録される画像は、検出された個体全ての画像である必要は無く、同一の種類の生物粒子から得られた複数の生物画像のうち、代表の画像であってもよい。どのような画像が代表の画像として選択されるかは、どのような判定基準に基づいて決定されてもよい。例えば、人の目で最も鮮明に写っていると考えられる画像が代表の画像として選択されてもよい。例えば、生物の体の部分が最も大きい画像が代表の画像として選択されてもよい。このような処理は、例えば生物情報判定部９３０によって実行されてもよい。
【００２４】
塩基配列情報取得部９５０は、検出対象である生物粒子を含む試料から生物粒子の塩基配列情報を取得する。塩基配列情報取得部９５０は、どのような手段によって塩基配列情報を取得してもよい。例えば、試料からＤＮＡ抽出、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）及びシーケンス解析を実行することによって塩基配列情報が取得されてもよい。例えば、次世代シーケンサーを用いた大規模塩基配列解析（例えば、メタゲノム解析等と呼ばれる塩基配列解析法）によって塩基配列情報が取得されてもよい。この場合、例えばＰＣＲ法を用いて分類群を識別する塩基配列断片の増幅産物を解析するメタバーコーディングあるいはアンプリコン解析と呼ばれる手法、あるいは、ショットガンシーケンスと呼ばれる試料中の生物種混合核酸に由来する塩基配列を用いることも可能である。塩基配列解析に用いられる核酸には、ＤＮＡあるいはＲＮＡの逆転写物（Ｃ−ＤＮＡ）が用いられてもよい。
【００２５】
塩基配列情報取得部９５０が処理の対象とする試料は、生物画像取得部９２０が処理の対象とする試料と同一の試料である。すなわち、同一の試料について、画像と塩基配列情報とが取得される。なお、必須では無いが、処理の順番としては、生物画像取得部９２０がまず画像を取得し、その後に対象となった試料について塩基配列情報取得部９５０が塩基配列情報を取得してもよい。より直接的なサンプル画像と塩基配列取得のためには、このような順番で処理を行った試料（画像取得を行った試料を回収し、これ）からＤＮＡ解析を行ってもよい。
【００２６】
塩基配列情報判定部９６０は、塩基配列情報取得部９５０によって取得された塩基配列情報について、その塩基配列情報の生物粒子がどのような種類の生物であるか判定する。このような判定は、例えば相同性検索を行うことによって実現されてもよい。このような判定は、例えば塩基配列情報のうち、各生物において保存性が高い部分の塩基配列情報に基づいて判定されることが好ましい。例えば、真核生物に関しては１８Ｓリボソームが判定に用いられてもよい。
塩基配列情報判定部９６０は、例えば取得された塩基配列情報と、リファレンスデータベース９１０に記憶される塩基配列リファレンスデータと、に基づいて生物の種類を判定してもよい。塩基配列情報判定部９６０は、判定結果である種別情報と、塩基配列情報とを対応付けて塩基配列情報データベース９７０に登録する。本実施形態では、塩基配列情報判定部９６０は、さらに試料が採取された日時を示す日時情報、試料が採取された海域を示す海域情報、その種類の生物の個体数に関する第二個体数情報を対応付けて登録する。
【００２７】
第二個体数情報は、塩基配列情報判定部９６０によって塩基配列情報に基づいて取得される。例えば、塩基配列情報判定部９６０は、処理の対象となっている試料から検出された生物粒子の個体数を、リード数（取得配列数）に基づいて生物粒子の種類毎に取得してもよい。塩基配列情報判定部９６０は、このようにして取得された種類毎の個体数を第二個体数情報として取得してもよい。塩基配列情報判定部９６０は、処理の対象となっている試料から検出された全種類の生物粒子の個体数に対する、各種類の個体数の割合（出現割合）を示す値（例えばパーセント値）を第二個体数情報として取得してもよい。
【００２８】
塩基配列情報データベース９７０は、磁気ハードディスク装置や半導体記憶装置等の記憶装置を用いて構成される。塩基配列情報データベース９７０は、塩基配列情報判定部９６０によって取得された情報をデータベースとして記憶する。図３は、塩基配列情報データベース９７０が記憶する情報の具体例を示す図である。塩基配列情報データベース９７０は、種別情報、日時情報、海域情報、塩基配列情報及び第二個体数情報の各値を有するテーブルを記憶する。塩基配列情報データベース９７０のテーブルに登録される塩基配列情報は、検出された個体全ての塩基配列情報である必要は無く、同一の種類の生物粒子から得られた複数の塩基配列情報のうち、代表の塩基配列情報であってもよい。どのような塩基配列情報が代表の塩基配列情報として選択されるかは、どのような判定基準に基づいて決定されてもよい。例えば、最も代表的と考えられる塩基配列情報が代表の塩基配列情報として任意で選択されてもよい。例えば、その特徴量が最も平均値に近い塩基配列情報が代表の塩基配列情報として選択されてもよい。このような処理は、例えば塩基配列情報判定部９６０によって実行されてもよい。
【００２９】
統合部９８０は、画像データベース９４０の情報と、塩基配列情報データベース９７０の情報と、を統合することによって統合データベースを生成する。このとき、統合部９８０は、画像データベース９４０における種別情報と、塩基配列情報データベース９７０における種別情報と、をキーに各データベースを統合する。すなわち、統合部９８０は、画像データベース９４０のレコードと、塩基配列情報データベース９７０のレコードと、について、同じ種別情報を有するレコード同士を結合することによってデータベースを統合する。なお、統合部９８０での画像データベース９４０の情報と塩基配列情報データベース９７０の情報との統合では、いわゆるビッグデータに用いられているdeep Learning等のＡＩ技術を用いて、サンプル生物の個体数情報、及び、分布、あるいは、種別情報、若しくは、分類情報を統合的に判断してもよい。
【００３０】
統合データベース９９０は、磁気ハードディスク装置や半導体記憶装置等の記憶装置を用いて構成される。統合データベース９９０は、統合部９８０によって統合された統合データベースを記憶する。図４は、統合データベース９９０が記憶する情報の具体例を示す図である。統合データベース９９０は、種別情報、日時情報、海域情報、画像、第一個体数情報、塩基配列情報及び第二個体数情報の各値を有するテーブルを記憶する。
【００３１】
解析部８００は、統合データベース９９０に登録されている情報に基づいて解析処理を実行する。解析部８００が実行する解析処理はどのようなものであってもよい。以下に解析部８００が実行する解析処理の具体例について説明する。例えば、解析部８００は、新たな試料から取得された生物粒子の画像に基づいて、塩基配列情報を取得してもよい。このような処理は、画像情報と塩基配列情報とが統合された統合データベース９９０を用いることでより容易に実行することが可能となる。例えば、解析部８００は、新たな試料から取得された生物粒子の塩基配列情報に基づいて、生物画像を取得してもよい。このような処理は、画像情報と塩基配列情報とが統合された統合データベース９９０を用いることでより容易に実行することが可能となる。
【００３２】
解析部８００は、新たな試料から得られる生物の個体数について、その生物の塩基配列情報に基づいて統合データベース９９０から得られる個体情報を用いて推定してもよい。このような処理は、統合データベース９９０を用いることで、容易に実行することが可能となる。解析部８００は、処理対象となる海域における各生物種の個体数の割合について、他の海域において類似の海域が無いか判定してもよい。類似の海域が存在する場合には、同様の環境が複数存在し、一方で生体のバランスが崩れたとしても他方で維持することができると判断することも可能である。
【００３３】
解析部８００は、新たな試料から得られる生物粒子の画像及び塩基配列情報に基づいて、その生物がどのような生物のどのような成長状態であるかを判定してもよい。このような処理は、画像又は塩基配列情報のいずれか一方のみでは生物の種別及び成長状態の判定が困難なケースに有用である。例えば、ノープリウス幼生は、複数種の生物において類似した外観を有している。そのため、画像のみでは判定が困難である。一方で、ノープリウス幼生の塩基配列情報は生物の種別毎に異なるため生物の種別については判定可能である。しかしながら、塩基配列情報に基づいて成長状態を判定することが困難である。そのため、ノープリウス幼生であるか成体であるのかについて塩基配列情報のみに基づいて判定することは困難である。このような問題に対し、上述した解析部８００は、生物粒子の画像及び塩基配列情報に基づいて判定するため、画像に基づいてノープリウス幼生であるか成体であるかを判定することが可能であり、塩基配列情報に基づいて生物の種別を判定することが可能である。その結果、生物の種別及び成長状態について高い精度で判定することが可能となる。
【００３４】
解析部８００は、統合データベース９９０に登録されたデータに基づいて、リファレンスデータベース９１０の内容を更新してもよい。例えば、統合データベース９９０に登録された画像と種別情報とに基づいて、画像リファレンスデータの画像や特徴量が更新されてもよい。例えば、統合データベース９９０に登録された塩基配列情報と種別情報とに基づいて、塩基配列情報リファレンスデータの塩基配列情報や特徴量が更新されてもよい。
【００３５】
このように構成された統合システム９０によれば、塩基配列情報を有するデータベースにおいて、データベースの活用がより容易となる。具体的には、上述した解析部８００のように、これまでのデータベースでは実行が困難又は労力を要していた解析処理が、より容易に実行することが可能となる。
【００３６】
また、統合システム９０では、同一の試料について、生物画像と塩基配列情報とを対応付けた統合データベース９９０が構築される。従来は、取得された生物の画像と、その画像に写っている生物から得られた塩基配列とを対応付けてデータベースに登録するようなことは困難であった。しかしながら、上述したように、統合システム９０では、同一試料から得られた生物画像と塩基配列情報とを対応付けて登録することが可能となる。
【００３７】
なお、生物情報判定部９３０、塩基配列情報判定部９６０、統合部９８０及び解析部８００の一部又は全部は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）やメモリ等を備えた情報処理装置がプログラムを実行することによって実現されてもよいし、ＡＳＩＣ等のハードウェアを用いて実現されてもよい。
【００３８】
（第１の変形例）
上述した実施形態では、検出対象である生物粒子は予めリファレンスデータベース９１０に画像や塩基配列情報が登録されているものであった。次に、リファレンスデータベース９１０に画像及び塩基配列情報が登録されていない生物粒子が試料内に存在している場合の統合システム９０の動作について説明する。
【００３９】
生物情報判定部９３０は、生物画像取得部９２０によって取得された生物画像について生物粒子の種類を判定できない。生物情報判定部９３０は、検出対象の生物粒子の画像について類似の画像を有する生物粒子の個体数に関する情報（第一個体数情報）を取得する。生物情報判定部９３０は、種類が判定できない生物粒子の画像について、画像に関する情報と第一個体情報とを画像データベース９４０に登録する。また、生物情報判定部９３０は、生物画像取得部９２０によって取得された生物画像が、リファレンスデータベース９１０に登録されているいずれの画像とも合致しない場合、種別情報として未確認識別子を登録する。未確認識別子は、上述のとおり、リファレンスデータベース９１０に登録されているいずれの画像とも合致しないことを示す情報である。
【００４０】
塩基配列情報判定部９６０は、塩基配列情報取得部９５０によって取得された塩基配列情報について生物粒子の種類を判定できない。塩基配列情報判定部９６０は、検出対象の生物粒子の塩基配列情報について類似の塩基配列情報を有する生物粒子の個体数に関する情報（第二個体数情報）を取得する。塩基配列情報判定部９６０は、種類が判定できない生物粒子の塩基配列情報について、塩基配列情報と第二個体情報とを塩基配列情報データベース９７０に登録する。また、塩基配列情報判定部９６０は、塩基配列情報取得部９５０によって取得された塩基配列情報が、リファレンスデータベース９１０に登録されているいずれの塩基配列情報とも合致しない場合、種別情報として未確認識別子を登録する。未確認識別子は、上述のとおり、リファレンスデータベース９１０に登録されているいずれの塩基配列情報とも合致しないことを示す情報である。このとき、塩基配列情報判定部９６０は、未確認識別子に対応付けてさらに相同性情報を登録してもよい。相同性情報は、相同性検索の結果に関する情報である。相同性情報は、例えば最も高い値を示した相同率の値と、最も高い相同率が得られた生物の名称に関する情報である。名称に関する情報として、例えば属名及び種名が用いられてもよい。最も高い相同率を示す生物が複数検索された場合には、複数の情報全てが登録されてもよい。
【００４１】
統合部９８０は、画像データベース９４０の情報と、塩基配列情報データベース９７０の情報と、を統合することによって統合データベースを生成する。本説明のようにリファレンスデータベース９１０に情報が登録されていない生物粒子に関する処理では、統合部９８０は、画像データベース９４０における第一個体情報と、塩基配列情報データベース９７０における第二個体情報と、をキーに各データベースを統合する。すなわち、統合部９８０は、画像データベース９４０のレコードと、塩基配列情報データベース９７０のレコードと、について、第一個体情報と第二個体情報とが類似するレコード同士を結合することによってデータベースを統合する。例えば、第一個体情報及び第二個体情報がいずれも全種類の生物粒子の個体数に対する割合を示す場合には、その割合の値の差が最も小さいレコード同士が結合されてもよい。第一個体情報と第二個体情報とが類似するとは、言い換えると、試料内でほぼ同じ個体数の画像及び塩基配列情報が取得されたことを意味する。
そのため、リファレンスデータベース９１０に未登録の生物粒子についても、個体数を元に同種の生物種別の画像と塩基配列情報とを高精度で対応付けることが可能となる。統合部９８０によって統合データベース９９０に登録されたレコードは、リファレンスデータベース９１０に追加登録されてもよい。図５は、このように追加登録を行うように構成された第１の変形例における統合システム９０の概略を示す図である。このように構成されることによって、その後の生物情報判定部９３０や塩基配列情報判定部９６０等の処理において、それまで同定できなかった生物粒子についても、リファレンスデータベース９１０を用いた同定が可能となる。
統合部９８０は、種別情報として未確認識別子が登録されたレコードについては、分類群推定処理を行ってもよい。以下、分類群推定処理について説明する。統合部９８０は、未確認識別子と対応づけて登録されている相同性情報に基づいて、分類群を推定してもよい。例えば、統合部９８０は、未確認識別子が登録されたレコードの生物について、相同性情報として登録されている生物と近い分類群の生物であると推定してもよい。統合部９８０は、未確認識別子が登録されたレコードの生物について、検索された配列を使って系統樹を作り、その結果から分類群を推定してもよい。統合部９８０は、相同性情報及び系統樹に基づいて分類群を推定してもよい。より具体的には、統合部９８０は、相同性情報に基づいて推定した際に複数の分類群が推定された場合には、検索された配列を使って系統樹を作り、その結果に基づいて分類群を推定してもよい。また、相同性情報に基づいて推定した結果と系統樹に基づいて推定した結果とが異なる場合には、統合部９８０は所定の一方の系統樹に基づいた推定結果を優先してもよい。上述した処理によって、未確認識別子が登録されたレコードについて画像と塩基配列情報との対応付けが行われている場合、さらにこの画像に基づいて分類群推定処理が行われてもよい。例えば、複数の分類群が推定された場合には、各分類群における代表的な画像（リファレンスデータベース９１０に登録されている画像）と、未確認識別子の画像とを画像解析し、より近い特徴を有している画像の分類群が推定結果として得られてもよい。統合部９８０は、未確認識別子が登録されたレコードについて、生物画像と塩基配列情報との対応付けを以下のように行ってもよい。まず、統合部９８０は、塩基配列情報に関して得られる相同性情報及び／又は系統樹に基づいて分類群を推定する。統合部９８０は、推定結果として得られた分類群を基に、未確認識別子が登録されたレコードの中から生物画像を選択する。統合部９８０が生物画像を選択する手法の具体例としては、例えば以下に示す２つの手法がある。ただし、以下に示す２つの手法に限定される必要は無い。（１）分類群に含まれる学名等の種別情報に基づいて、画像データベース９４０から近縁の種別情報を有するレコードの生物画像を取得する。（２）分類群に含まれる学名等の種別情報に基づいて、論文や図鑑等の既存のデータから生物の画像を検索し、検索結果として得られた画像に類似する生物画像をレコードの中から取得する。このようにして得られた分類群の推定結果は、上述した処理によってリファレンスデータベース９１０に追加登録されてもよい。
【００４２】
（第２の変形例）
上述した実施形態では、検出対象である生物粒子は予めリファレンスデータベース９１０に画像及び塩基配列情報が登録されているものであるか、画像及び塩基配列情報のいずれもが登録されていないものであった。次に、リファレンスデータベース９１０に画像又は塩基配列情報の一方が登録されており、他方が登録されていない生物粒子が試料内に存在している場合もありえる。具体例として、リファレンスデータベース９１０に画像が登録されており、塩基配列情報が登録されていないケースについて説明する。
【００４３】
生物情報判定部９３０は、生物画像取得部９２０によって取得された生物画像について生物粒子の種類を判定できる。生物情報判定部９３０は、生物画像取得部９２０によって取得された生物画像について、その生物画像の生物粒子がどのような種類の生物であるか判定する。生物情報判定部９３０は、判定結果である種別情報（生物の種類を示す情報）と、画像と、その種類の生物の個体数に関する第一個体数情報と、を対応付けて画像データベース９４０に登録する。
【００４４】
塩基配列情報判定部９６０は、塩基配列情報取得部９５０によって取得された塩基配列情報について生物粒子の種類を判定できない。塩基配列情報判定部９６０は、検出対象の生物粒子の塩基配列情報について類似の塩基配列情報を有する生物粒子の個体数に関する情報（第二個体数情報）を取得する。塩基配列情報判定部９６０は、種類が判定できない生物粒子の塩基配列情報について、塩基配列情報と第二個体情報とを塩基配列情報データベース９７０に登録する。
【００４５】
統合部９８０は、画像データベース９４０の情報と、塩基配列情報データベース９７０の情報と、を統合することによって統合データベースを生成する。本説明のようにリファレンスデータベース９１０に画像及び塩基配列情報のいずれか一方の情報が登録されていない生物粒子に関する処理では、統合部９８０は、画像データベース９４０における第一個体情報と、塩基配列情報データベース９７０における第二個体情報と、をキーに各データベースを統合する。すなわち、統合部９８０は、画像データベース９４０のレコードと、塩基配列情報データベース９７０のレコードと、について、第一個体情報と第二個体情報とが類似するレコード同士を結合することによってデータベースを統合する。例えば、第一個体情報及び第二個体情報がいずれも全種類の生物粒子の個体数に対する割合を示す場合には、その割合の値の差が最も小さいレコード同士が結合されてもよい。第一個体情報と第二個体情報とが類似するとは、言い換えると、試料内でほぼ同じ個体数の画像及び塩基配列情報が取得されたことを意味する。そのため、リファレンスデータベース９１０に画像及び塩基配列情報のいずれか一方が未登録の生物粒子についても、個体数を元に同種の生物種別の画像と塩基配列情報とを高精度で対応付けることが可能となる。統合部９８０によって統合データベース９９０に登録されたレコードは、リファレンスデータベース９１０に追加登録されてもよい。なお、塩基配列情報に、種類同定に関する情報が記憶されている場合は、リファレンスデータベース９１０に記憶されている情報から生物の形状、特徴を推定して画像データベース９４０から出力された対象の画像を確認して統合してもよい。なお、画像に種類同定に関する情報が記憶されている場合には、リファレンスデータベース９１０に記憶されている特徴量（分類群識別のための形態的特徴（画像））から、特徴的な塩基配列を推定して、塩基配列情報データベース９７０から出力された塩基配列情報を確認して統合してもよい。また、塩基配列情報に、種類同定に関する情報が記憶されている場合には、リファレンスデータベース９１０に記憶されている情報から生物の形状、特徴を推定して画像データベース９４０から出力された対象の画像を確認して統合してもよい。
【００４６】
（第３の変形例）
上述した第１の変形例又は第２の変形例において、塩基配列解析に用いられる核酸には、ＲＮＡの逆転写物（Ｃ−ＤＮＡ）が用いられてもよい。このように構成されることによって、ＤＮＡには現存しない（過去生息していた）塩基配列が含まれる可能性があるのに対し、生物画像取得部９２０から得られる生物画像は現存する（生きている）ものが対象となる。そのため、現存する生物を対象とするＲＮＡの塩基配列情報に基づく第二個体情報（生態数や分布）に基づいて、さらに効率よく画像に基づく第一個体情報と統合することが可能となる。また、ＲＮＡが用いられることによって真核生物の場合イントロン（転写に使われない配列）が含まれないという利点もある。このようにイントロンが含まれないことにより、解析対象とする遺伝子塩基配列をより確実に取得することが可能となる。
【００４７】
（第４の変形例）
検出対象である生物粒子の大きさが検出される場合には、生物情報判定部９３０は、取得された生物画像と、生物粒子の大きさに関する情報と、に基づいて生物の種類を判定しても良い。この場合、リファレンスデータベース９１０には、画像リファレンスデータに対して、その画像の生物の大きさに関する情報が含まれていることが望ましい。このように構成されることによって、見た目が似ている生物であっても、大きさが異なる生物であれば、生物情報判定部９３０においてより高い精度で判定することが可能となる。なお、検出対象である生物粒子の大きさに関する情報は、例えば後述する篩分け部１１０によって得ることができる。すなわち、複数の篩のうちいずれの篩を通過していずれの篩を通過しなかったかを示す情報を大きさに関する情報として用いることが可能である。
【００４８】
このように生物粒子の大きさに関する情報を用いて生物の種類を判定する処理は、塩基配列情報判定部９６０において用いられてもよい。すなわち、塩基配列情報判定部９６０は、取得された塩基配列情報と、生物粒子の大きさに関する情報と、に基づいて生物の種類を判定しても良い。
【００４９】
このように生物粒子の大きさに関する情報を用いて生物の種類を判定する処理は、解析部８００において用いられてもよい。例えば、解析部８００は、新たな試料から取得された生物粒子の画像と、その生物粒子の大きさに関する情報と、に基づいて生物の種類を判定しても良い。この場合、統合データベース９９０は、生物粒子の大きさに関する情報を有している。例えば、解析部８００は、新たな試料から取得された生物粒子の塩基配列情報と、その生物粒子の大きさに関する情報と、に基づいて生物の種類を判定しても良い。例えば、解析部８００は、新たな試料から取得された生物粒子の画像と、その生物粒子の塩基配列情報と、その生物粒子の大きさに関する情報と、に基づいて生物の種類を判定しても良い。
【００５０】
（第５の変形例）
生物情報判定部９３０は、取得された生物画像と、検出対象となっている試料が採取された場所に関する情報と、に基づいて生物の種類を判定しても良い。試料が採取された場所に関する情報とは、試料が採取された海域を示す情報であってもよいし、試料が採取された海の深度を示す情報であってもよいし、その両方であってもよい。この場合、リファレンスデータベース９１０には、画像リファレンスデータに対して、その画像の生物が生息している場所に関する情報が含まれていることが望ましい。このように構成されることによって、見た目が似ている生物であっても、生息している場所が異なる生物であれば、生物情報判定部９３０においてより高い精度で判定することが可能となる。
【００５１】
また、生物情報判定部９３０は、取得された生物画像に基づく生物の種類の判定結果が非常に信頼度の高い判定結果として得られたにも関わらず、試料が採取された場所に関する情報がリファレンスデータベース９１０の内容と一致しない場合、検出された生物の新たな生息場所の候補として、試料が採取された場所に関する情報を出力してもよい。このように構成されることによって、これまで生息場所として認識されていなかった場所を、新たな生息場所として発見することが可能となる。
【００５２】
このように試料が採取された場所に関する情報を用いて生物の種類を判定する処理は、塩基配列情報判定部９６０において用いられてもよい。すなわち、塩基配列情報判定部９６０は、取得された塩基配列情報と、試料が採取された場所に関する情報と、に基づいて生物の種類を判定しても良い。
【００５３】
このように試料が採取された場所に関する情報を用いて生物の種類を判定する処理は、解析部８００において用いられてもよい。例えば、解析部８００は、新たな試料から取得された生物粒子の画像と、その試料が採取された場所に関する情報と、に基づいて生物の種類を判定しても良い。この場合、統合データベース９９０は、生物粒子の生息場所に関する情報を有している。例えば、解析部８００は、新たな試料から取得された生物粒子の塩基配列情報と、その試料が採取された場所に関する情報と、に基づいて生物の種類を判定しても良い。例えば、解析部８００は、新たな試料から取得された生物粒子の画像と、その生物粒子の塩基配列情報と、その試料が採取された場所に関する情報と、に基づいて生物の種類を判定しても良い。
【００５４】
なお、第４及び第５の変形例として示した生物粒子の大きさに関する情報と、試料が採取された場所に関する情報と、は生物に関する属性情報（以下「メタ情報」という。）の具体例にすぎない。メタ情報は、検出対象となっている生物に関する情報であればどのような情報であってもよい。生物に関するメタ情報としてどのようなものが用いられてもよい。例えば、生物の外観の色に関する情報、生物の活動時期に関する情報、生物が補食する物に関する情報、がメタ情報として同様に判定に用いられてもよい。
【００５５】
（第６の変形例）
解析部８００を備える装置として、どのような装置が実装されてもよい。例えば、携帯電話機やスマートフォンやパーソナルコンピューター等の汎用の情報処理装置において解析部８００が実装されてもよい。このような実装は、例えば配布可能なアプリケーションプログラムとして実装されてもよい。この場合、アプリケーションプログラムがインストールされた情報処理装置は、ユーザーの操作にしたがって、サーバーに実装された統合データベース９９０の情報を取得することによって試料から取得された画像や塩基配列情報に応じた生物の種別に関する情報などを取得しても良い。
【００５６】
また、このような実装は、サーバーに実装された解析部８００に対するインターフェースをユーザーに提供するためのアプリケーションプログラムとして実装されてもよい。この場合、アプリケーションプログラムがインストールされた情報処理装置は、ユーザーの操作にしたがって、試料から取得された画像や塩基配列情報をサーバーの解析部８００に問い合わせることによって、生物の種別に関する情報などを取得しても良い。
【００５７】
以下、生物画像取得部９２０の一具体例について詳細に説明する。
＜生物粒子を含む試料の前処理方法＞
[第１実施形態]
一実施形態において、本発明は、検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程(以下、「工程（Ｉ）」という。)と、前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程(以下、「工程（ＩＩ）」という。)と、を含む、生物粒子を含む試料の前処理方法である。
【００５８】
本実施形態の方法の概略を、図６を参照して説明する。
まず、検出対象である生物粒子を含む試料１を、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と、目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とを使用して篩分けし、篩（Ａ）を通過し、かつ篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する（図６（ａ）；工程（Ｉ））。
次に、画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液２を添加して、適宜撹拌する（図６（ｂ））。その後、画分（１ｂ）とコロイド溶液２とを含む混合物３を、遠心分離して、上清画分（Ｓ０）を取得する（図６（ｃ））。（以上、工程（ＩＩ））。
以下、本実施形態の方法の各工程について、説明する。
【００５９】
（工程（Ｉ））
工程（Ｉ）は、検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程である。
【００６０】
工程（Ｉ）では、検出対象である生物粒子を含む試料１の篩分けを行う。本実施形態の方法において、検出対象とする生物粒子は、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない生物粒子である。そのような生物粒子の例としては、メイオファウナを挙げることができる。  メイオファウナとは、目開き１ｍｍの篩を通過し、目開き３２μｍの篩に捉えられる生物の総称である。メイオファウナは、物質循環や堆積物の安定に大きな影響を与えることが知られており、深海生態系の重要な構成要素である。また、世代時間が短く、環境の変化に素早く反応することから、環境の変化を検出しやすい。さらに、メイオファウナは、生物の生息密度が低い深海底でも生息密度が高く、定量採集も容易であることから、統計解析が容易である。これらのことから、メイオファウナは、深海底における環境影響評価の対象生物として重要視されている。なお、検出対象とする生物粒子は、目開き２５０〜５００μｍの篩を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩を通過しない粒子であってもよく、目開き２５０μｍの篩を通過し、かつ目開き６３μｍの篩を通過しない粒子であってもよい。
【００６１】
本実施形態の方法では、堆積物を多く含む試料であっても、生物種を分類するのに十分な画質の画像を取得することができる。そのため、検出対象とする生物粒子は、堆積物中に生息する生物であってもよい。そのような生物の例としては、例えば、海底、湖底、又は川底等に生息する底生生物等を挙げることができる。底生生物であるメイオファウナは、この点からも、検出対象の生物粒子として適している。
【００６２】
本実施形態の方法で検出対象とする生物粒子は、生物体全体であってもよく、生物体の一部であってもよい。また、生物粒子は、胞子等の休眠中の粒子や、卵等であってもよい。また、生きているものに限定されず、死骸であってもよい。
【００６３】
本実施形態の方法で篩分けする試料１は、検出対象とする生物粒子を含むものであれば、特に限定されない。試料１としては、例えば、検出対象とする生物粒子が生息する環境から採取された試料等が挙げられる。本実施形態の方法では、試料が堆積物を含んでいても構わないため、海底、湖底、又は川底等から採取された堆積物試料を試料１として用いてもよい。例えば、検出対象とする生物粒子がメイオファウナである場合には、深海底から採取された堆積物試料を、試料１として用いることができる。
【００６４】
本実施形態の方法で篩分けする試料１は、環境中から採取されたそのままの試料であってもよいし、固定や染色等の処理が施されたものであってもよい。試料の固定処理を行った場合には、試料の腐敗を防ぐことができる。そのため、採取した試料をすぐに使用しない場合には、試料の固定処理を行うことが好ましい。固定処理の方法は、特に限定されず、一般的に用いられる方法で試料の固定処理を行えばよい。例えば、ホルマリン、エタノール、ルゴール液、グルタールアルデヒド、ＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等の試薬を用いたり、冷凍することによって固定処理を行うことができる。好適な固定処理の方法としては、ホルマリン固定を挙げることができる。
【００６５】
また、試料の染色処理を行った場合には、後に、前処理試料中の生物粒子の画像を取得した場合に、当該画像において、生物粒子の視認が容易になる。そのため、篩分けを行う前に、試料１中の生物粒子は、色素等により染色されていることが好ましい。染色処理の方法は、特に限定されず、一般的に用いられる色素等を使用して試料の染色処理を行えばよい。例えば、ローズベンガル、コンゴーレッド、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｇｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等を用いて、染色処理を行うことができる。好適な染色処理の方法としては、ローズベンガル染色を挙げることができる。
【００６６】
試料１の篩分けには、少なくとも２つの篩を使用する。一方は、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）であり、他方は、目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）である。目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）は、試料１から、前記篩を通過しない画分を除去するために使用する。また、目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）は、試料１から、前記篩を通過する画分を除去するために使用する。そして、工程（Ｉ）では、試料１において、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分を取得する。これにより、試料１に含まれる径の大きい堆積物を除去するとともに、検出対象とする生物粒子よりも小さい粒子を除去することができる。
【００６７】
上記篩（Ａ）及び（Ｂ）は、上記の範囲の目開きを有するものであれば、特に限定されず、一般的に使用されるものを用いればよい。また、検出対象とする生物粒子のサイズに合わせて、上記範囲内で、目開きのサイズを変動させてもよい。篩分けで取得する画分（１ｂ）の目開きの範囲を狭くすることにより、後の撮像工程において、検出対象とする生物粒子をより効率よく撮像することができる。
【００６８】
例えば、検出対象とする生物粒子がメイオファウナである場合、約９８％以上の個体が３８〜５００μｍの篩画分に存在し、約８３％以上の個体が３８〜２５０μｍの篩画分に存在し、約７５％の個体が６３〜２５０μｍの篩画分に存在する（表１参照）。そのため、工程（Ｉ）では、２５０〜５００μｍの篩を通過し、かつ３２〜６３μｍの篩を通過しない画分を取得するようにしてもよく、２５０〜５００μｍの篩を通過し、かつ３８〜６３μｍの篩を通過しない画分を取得するようにしてもよく、また、２５０μｍの篩を通過し、かつ６３μｍの篩を通過しない画分を取得するようにしてもよい。
【００６９】
本工程における篩分けの方法は、特に限定されず、一般的に用いられる方法で篩分けを行えばよい。例えば、図６（ａ）に示されるように、容器１０に、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と、目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とを設置し、試料１を、篩（Ａ）の上から注入することにより、篩分けを行ってもよい。これにより、試料１は、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過しない画分（１ａ）と、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）と、目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過する画分（１ｃ）とに篩分けされる。
【００７０】
なお、図６（ａ）の例では、容器１０を振とう機１３上に設置し、振とう機１３で振とうしながら篩分けを行っている。振とうしながら篩分けを行うことにより、篩分けに要する時間を短縮することができる。
【００７１】
篩分けの後は、例えば、篩（Ａ）を捕捉された粒子ごと除去し、篩（Ｂ）を捕捉された粒子ごと取得することにより、画分（１ｂ）を取得することができる。
【００７２】
なお、図６（ａ）の例では、容器１０に、篩（Ａ）と篩（Ｂ）とを設置したが、篩（Ａ）と篩（Ｂ）の設置方法はこれに限定されない。例えば、篩（Ａ）を通過しない画分（１ａ）を捕集する容器と、篩（Ａ）を通過しかつ篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を捕集する容器と、篩（Ｂ）を通過する画分（１ｃ）を捕集する容器とを、別々の容器とし、篩（Ａ）を通過しない画分（１ａ）を捕集する容器に篩（Ａ）を設置し、篩（Ａ）を通過しかつ篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を捕集する容器に篩（Ｂ）を設置するようにしてもよい。この場合、試料１の篩分けを行った後、篩（Ｂ）を設置した容器を取得することにより、画分（１ｂ）を取得することができる。
【００７３】
（工程（ＩＩ））
工程（ＩＩ）は、画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程である。
【００７４】
工程（ＩＩ）では、まず、画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液２を添加する（図６（ｂ））。図６（ｂ）の例では、遠沈管２１に、画分（１ｂ）を入れ、コロイド溶液２を添加して、画分（１ｂ）とコロイド溶液２とを含む混合物３を取得している。コロイド溶液２は、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するものであれば、特に限定されない。画分１ｂに含まれる生物粒子の密度は約１．０〜１．２ｇ／ｃｍ３であり、堆積物粒子の密度は約２．５〜２．８ｇ／ｃｍ３である。そのため、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液２を、画分１ｂに添加することにより、遠心分離を行った際に、生物粒子と堆積物とを、上清画分と沈殿とに分離することができる。コロイド溶液２の密度は、１．１０〜２．００ｇ／ｃｍ３であることが好ましく、１．１０〜１．５０ｇ／ｃｍ３であることがより好ましい。
【００７５】
また、コロイド溶液２は、ｐＨが４．０〜１１．０であることが好ましい。ｐＨがこの範囲であれば、生物粒子への悪影響を避けることができる。
【００７６】
工程（ＩＩ）で使用可能なコロイド溶液２の例としては、コロイド状シリカを挙げることができる。また、コロイド溶液２は、市販のものを用いてもよい。例えば、ＬＵＤＯＸ（登録商標）  ＨＳ−４０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；密度１．３ｇ／ｃｍ３、ｐＨ９．５−１０．３）、Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）（ＧＥヘルスケア；密度１．１３ｇ／ｃｍ３、ｐＨ９．０）、ＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１．２５ｇ／ｃｍ３、ｐＨ５．０）等をコロイド溶液２として用いることができる。
【００７７】
コロイド溶液２の添加量は、特に限定されず、画分（１ｂ）を懸濁できる量であればよい。例えば、コロイド溶液２の添加量は、篩分け前の試料１との体積比として、試料１：コロイド溶液２＝１：１〜５となるようにすることができる。
【００７８】
画分（１ｂ）に、コロイド溶液２を添加した後、画分（１ｂ）とコロイド溶液２とを含む混合物３を、遠心分離機２０で遠心分離する（図６（ｃ））。これにより、混合物３は、上清画分（Ｓ０）と、沈殿（Ｐ０）とに分離する。上清画分（Ｓ０）には、検出対象である生物粒子が多く含まれており、沈殿（Ｐ０）には、堆積物が多く含まれている。
【００７９】
本工程における遠心分離の条件は、検出対象とする生物粒子の種類に応じて、適宜選択することができる。例えば、検出対象がメイオファウナである場合には、遠心分離の条件として、６００〜１０００Ｇを挙げることができ、７００〜９００Ｇとすることが好ましく、７５０〜８５０Ｇとすることがより好ましく、８００Ｇとすることが特に好ましい。
また、遠心分離の時間としては、３〜３０分を例示することができ、５〜２０分が好ましく、８〜１５分がより好ましく、１０分が特に好ましい。
【００８０】
遠心分離後は、ピペット等を用いて、上清画分（Ｓ０）を取得すればよい。
【００８１】
本実施形態の試料前処理方法により調製された試料は、例えば、生物粒子の画像を取得するための試料として使用することができる。例えば、後述する図６（ｄ）に示されるようなフローセルを備えた撮像装置において、フローセルに投入するための試料として好適に用いることができる。
【００８２】
本実施形態の試料前処理方法によれば、多くの堆積物を含む試料であっても、堆積物を効率的に除去して、生物粒子の画像を取得するために適した試料を調製することができる。また、本実施形態の試料前処理方法により調製された試料が、コロイド溶液を含む場合には、生物粒子の画像を取得するためにフローセルに投入した際に、フローセル中での生物粒子の沈降を防ぐことができ、フローセルが生物粒子で詰まることを防止することができる。
【００８３】
また、本実施形態の試料前処理方法により調製された試料は、ゲノム解析等の様々な解析に供することもできる。
【００８４】
（任意工程）
本実施形態の方法は、上記工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）に加えて、さらに、上清画分（Ｓ０）を調製する工程を含んでいてもよい。
【００８５】
上清画分（Ｓ０）を調製する工程としては、例えば、上清画分（Ｓ０）にコロイド溶液２を添加する工程を挙げることができる。上清画分（Ｓ０）は、通常、コロイド溶液２を含むが、さらにコロイド溶液２を添加することにより、試料中での生物粒子の浮力を調整することができる。
【００８６】
また、上清画分（Ｓ０）を調製する工程としては、篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けして篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、前記画分にコロイド溶液２を添加する工程を挙げることもできる。篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けすることにより、余分なコロイド粒子を除去し、対象とする生物粒子を濃縮することができる。また、篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きの篩を用いることにより、検出対象とする生物粒子のロストを少なくすることができる。篩（Ｃ）の目開きは、工程（Ｉ）で使用した篩（Ｂ）の目開きよりも小さければ、特に限定されないが、例えば、３０〜６３μｍを挙げることができる。
【００８７】
なお、本工程で使用するコロイド溶液２は、工程（ＩＩ）で使用したものと同様のものを用いればよい。
【００８８】
[第２実施形態]
一実施形態において、本発明は、検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程（以下、「工程Ｉ」という。）と、前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程（以下、「工程ＩＩ」という。）と、前記遠心分離後の沈殿（Ｐｎ−１）を、コロイド溶液に懸濁して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓｎ）を取得することを、ｎ回（ｎは１以上の整数であり、沈殿（Ｐｎ−１）はｎ−１回目の遠心分離後に得られる沈殿であり、上清画分（Ｓｎ）はｎ回目の遠心分離後に得られる上清画分である。）行う工程（以下、「工程ＩＩ’」という。）と、を含む、生物粒子の画像を取得するための試料前処理方法である。
【００８９】
本実施形態の方法の概略を、図６及び図７を参照して説明する。
まず、検出対象である生物粒子を含む試料１を、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と、目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とを使用して篩分けし、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する（図６（ａ）；工程（Ｉ））。
次に、画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液２を添加して、適宜撹拌する（図６（ｂ））。その後、画分（１ｂ）とコロイド溶液２とを含む混合物３を、遠心分離して、上清画分（Ｓ０）を取得する（図６（ｃ））。（以上、工程（ＩＩ））
次に、遠心分離後の沈殿（Ｐ０）に、コロイド溶液２を添加して（図７（ａ））、沈殿（Ｐ０）をコロイド溶液２に懸濁し、懸濁物６を作成する（図７（ｂ））。そして、懸濁物６を遠心分離し、上清画分（Ｓ１）を取得する（図７（ｃ））。このようにして、ｎ回分遠心分離した後の上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を取得する（図７（ａ）−ｎ〜（ｃ）−ｎ））。（以上、工程（ＩＩ’））
以下、本実施形態の方法の各工程について、説明する。
【００９０】
（工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ））
工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）は、上述の第１実施形態の方法における工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）と同じである。そのため、説明は省略する。
【００９１】
（工程（ＩＩ’））
工程（ＩＩ’）は、遠心分離後の沈殿（Ｐｎ−１）を、コロイド溶液に懸濁して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓｎ）を取得することを、ｎ回（ｎは１以上の整数であり、沈殿（Ｐｎ−１）はｎ−１回目の遠心分離後に得られる沈殿であり、上清画分（Ｓｎ）はｎ回目の遠心分離後に得られる上清画分である。）行う工程である。
【００９２】
工程（ＩＩ’）においては、工程（ＩＩ）における遠心分離で得られた沈殿（Ｐ０）に、コロイド溶液２を添加する（図７（ａ））。コロイド溶液２は、工程（ＩＩ）で用いたものと同じものを用いればよい。そして、コロイド溶液２に、沈殿（Ｐ０）を懸濁し、懸濁物６を得る（図７（ｂ））。この懸濁物６を遠心分離すると、上清画分（Ｓ１）と沈殿（Ｐ１）とに分離する（図７（（ｃ））。上清画分（Ｓ１）には、沈殿（Ｐ０）に残存していた生物粒子が移行し、沈殿（Ｐ１）には堆積物が残存する。
【００９３】
上記の遠心分離の条件は、工程（ＩＩ）における遠心分離の条件と同じであってもよく、異なっていてもよいが、同じであることが好ましい。遠心分離後は、ピペット等を用いて、上清画分（Ｓ１）を取得すればよい。
【００９４】
上記遠心分離で得られた沈殿（Ｐ１）に、必要に応じて、再度、コロイド溶液２を添加し、懸濁して、遠心分離を行う。そして、遠心分離後に得られた上清画分（Ｓ２）を取得する。このようにしてｎ回目の遠心分離で得られる上清画分を上清画分（Ｓｎ）、ｎ回目の遠心分離で得られる沈殿を沈殿（Ｐｎ）とすると、沈殿（Ｐｎ−１）にコロイド溶液２を添加し、懸濁して、遠心分離を行うことをｎ回行うことにより、上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を取得することができる。
【００９５】
本工程において、ｎは１以上の整数であればよく、遠心分離の回数は特に限定されない。遠心分離の回数を多くするほど（ｎが大きくなるほど）、沈殿（Ｐｎ）に残存する生物粒子の回収率を上げることができる。通常、ｎは、１〜５の整数とすることができ、１〜３の整数であってもよく、例えば２又は３とすることができる。
【００９６】
なお、沈殿（Ｐｎ−１）に対するコロイド溶液２の添加量は、沈殿（Ｐｎ−１）を懸濁できる量であれば特に限定されない。沈殿（Ｐｎ−１）の量に応じて、適当な量のコロイド溶液２を添加し、沈殿（Ｐｎ−１）を懸濁すればよい。例えば、添加するコロイド溶液２の量は、沈殿（Ｐｎ−１）との体積比として、沈殿（Ｐｎ−１）：コロイド溶液２＝２：３等を挙げることができる。
【００９７】
本実施形態の方法によって前処理された試料は、通常、コロイド溶液２を含む。工程（ＩＩ）で得られた上清画分（Ｓ０）、及び工程（ＩＩ’）で得られた上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）は、その一部又は全部を混合し、後述する画像の取得や解析等に用いることができる。
【００９８】
本実施形態の試料前処理方法により調製された試料は、第１実施形態の方法で調製された試料と同様に、生物粒子の画像を取得するための試料として使用することができる。
【００９９】
本実施形態の方法によれば、多くの堆積物を含む試料であっても、堆積物を効率的に除去して、生物粒子の画像を取得するために適した試料を調製することができる。また、工程（ＩＩ’）において、遠心分離で得られた沈殿にコロイド溶液を添加してさらに遠心分離を行っているため、沈殿に生物粒子が残存していた場合であっても、当該生物粒子を回収することができる。
【０１００】
また、本実施形態の試料前処理方法により調製された試料は、第１実施形態の方法で調製された試料と同様に、ゲノム解析等の様々な解析に供することもできる。
【０１０１】
（任意工程）
本実施形態の方法は、上記工程（Ｉ）、工程（ＩＩ）及び工程（ＩＩ’）に加えて、さらに、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を調製する工程を含んでいてもよい。
【０１０２】
上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を調製する工程としては、例えば、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）にコロイド溶液２を添加する工程を挙げることができる。上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）は、通常、コロイド溶液２を含むが、さらにコロイド溶液２を添加することにより、試料中での生物粒子の浮力を調整することができる。
【０１０３】
なお、コロイド溶液２の添加は、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）のそれぞれに対して、個別に行ってもよく、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の一部又は全部の混合物に対して、行ってもよい。コロイド溶液２の添加を、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）のそれぞれに対して、個別に行った場合には、コロイド溶液２の添加後に、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の一部又は全部を混合してもよい。
【０１０４】
また、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を調製する工程としては、上記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けして篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、前記画分にコロイド溶液２を添加する工程を挙げることもできる。篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けすることにより、余分なコロイド粒子を除去して、対象とする生物粒子を濃縮することができる。また、篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きの篩を用いることにより、検出対象とする生物粒子のロストを少なくすることができる。篩（Ｃ）の目開きは、工程（Ｉ）で使用した篩（Ｂ）の目開きよりも小さければ、特に限定されないが、例えば、３０〜６３μｍを挙げることができる。
【０１０５】
なお、本工程で使用するコロイド溶液２は、工程（ＩＩ）で使用したもの同様のものを用いればよい。
【０１０６】
篩（Ｃ）を用いた篩分けは、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）のそれぞれに対して、個別に行ってもよく、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の一部又は全部の混合物に対して、行ってもよい。篩分け及びコロイド溶液２の添加を、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）のそれぞれに対して、個別に行った場合には、篩分け及びコロイド溶液２の添加後に、得られた試料の一部又は全部を混合してもよい。
【０１０７】
＜生物粒子の画像取得方法＞
[第１実施形態]
一実施形態において、本発明は、検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程（以下、工程（Ｉ）という。）と、前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程（以下、工程（ＩＩ）という。）と、前記上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体をフローセルに流しながら、前記フローセルを流れる流体を撮像する工程（以下、工程（ＩＩＩ）という。）と、を含む、生物粒子の画像取得方法である。
【０１０８】
本実施形態の方法の概略を、図６を参照して説明する。
まず、検出対象である生物粒子を含む試料１を、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と、目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とを使用して篩分けし、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する（図６（ａ）；工程（Ｉ））。
次に、画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液２を添加して、適宜撹拌する（図６（ｂ））。その後、画分（１ｂ）とコロイド溶液２とを含む混合物３を、遠心分離して、上清画分（Ｓ０）を取得する（図６（ｃ））。（以上、工程（ＩＩ））。
次に、上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体４を、フローセル３１に流しながら、カメラ３２により、フレーム４０内のフローセル３１を撮像する（図６（ｄ）；工程（ＩＩＩ））。なお、図６（ｄ）の例では、対物レンズ３３を介して撮像を行っている。
これにより、撮像時に、フレーム４０内に存在していた生物粒子５ｂの画像４１を取得することができる。
以下、本実施形態の方法の各工程について、説明する。
【０１０９】
（工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ））
工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）は、上述の「＜生物粒子を含む試料の前処理方法＞」における工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）と同じである。そのため、説明は省略する。
【０１１０】
（工程（ＩＩＩ））
工程（ＩＩＩ）は、前記上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体をフローセルに流しながら、前記フローセルを流れる流体を撮像する工程である。
【０１１１】
工程（ＩＩＩ）では、まず、上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体４を、フローセル３１に流す。フローセル３１に流す流体４は、コロイド溶液２を含むことが好ましい。流体４が、コロイド溶液２を含むことにより、検出対象である生物粒子の沈降を防ぎ、生物粒子によりフローセル３１が詰まることを防止することができる。
【０１１２】
上清画分（Ｓ０）は、通常コロイド溶液２を含むため、上清画分（Ｓ０）をそのまま流体４としてフローセル３１に流してもよい。また、上清画分（Ｓ０）に、さらにコロイド溶液２を添加したものを、流体４として、フローセル３１に流してもよい。
【０１１３】
また、上清画分（Ｓ０）に対して、篩分け等の処理を行い、所定の画分を取得して流体４を調製し、フローセル３１に流すようにしてもよい。例えば、上記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）を用いて、上清画分（Ｓ０）から余分なコロイド粒子を除き、篩（Ｃ）を通過しない画分を取得して、当該画分にコロイド溶液２を添加し、流体４としてもよい。すなわち、流体４は、上清画分（Ｓ０）を、篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けして篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、前記画分にコロイド溶液２を添加したものを含んでいてもよい。篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けすることにより、余分なコロイド粒子を除去して、対象とする生物粒子が濃縮され、効率よく撮像を行うことができる。また、篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きの篩を用いることにより、検出対象とする生物粒子のロストを少なくすることができる。篩（Ｃ）の目開きは、工程（Ｉ）で使用した篩（Ｂ）の目開きよりも小さければ、特に限定されないが、例えば、３０〜６３μｍを挙げることができる。
【０１１４】
本工程では、上記のように調製した上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体４を、フローセル３１に流しながら、フローセル３１を流れる流体４を撮像する。図６（ｄ）の例では、撮像装置３０内に設置されたカメラ３２により、対物レンズ３３を介して、フローセル３１を流れる流体４が撮像される。図６（ｄ）の例では、フローセル３１の撮像部分（フレーム４０）には、光源３４により、光が照射されるようになっている。
【０１１５】
フローセル３１は、内部を流れる流体４を撮像可能なように、透明度の高いものであることが好ましい。フローセル３１の形状は、特に限定されないが、カメラ３２による撮像面が平面となる形状であることが好ましい。フローセル３１の形状の例としては、例えば、直方体が挙げられる。フローセル３１のサイズは、特に限定されず、検出対象の生物粒子に応じて、適宜選択することができる。例えば、検出対象がメイオファウナである場合には、カメラ３２による撮像面に対する奥行方向の内径が、１５０〜５００μｍのものを用いることができる。当該内径は、２００〜４００μｍであることが好ましく、２５０〜３５０μｍであることがより好ましい。
なお、本明細書において、フローセルの「奥行方向の内径」という場合、撮像面に対して垂直方向のフローセルの内径を意味するものとする。また、フローセルの「幅方向の内径」という場合、撮像面に対して平行な方向のフローセルの内径を意味するものとする。
【０１１６】
フローセル３１への流体４の投入方法は、特に限定されない。例えば、ピペット等で投入を行ってもよく、フローセル３１の上流側にチューブを接続し、当該チューブの上流端を容器等に入った流体４に接触させて、流体４を吸い上げることにより行ってもよい。また、フローセル３１内の流体４の流れは、例えば、フローセル３１の下流側にチューブ等を介してポンプを接続し、ポンプを稼働させること等により、作り出すことができる。また、流体４をフローセル３１に投入する前に、フローセル３１内（フローセル３１の上流側にチューブを接続した場合は、そのチューブ内も）をコロイド溶液２で満たしておくことが好ましい。
【０１１７】
図６（ｄ）の例では、対物レンズ３３を介して、カメラ３２により撮像を行っている。対物レンズ３３を用いることにより、生物粒子の拡大画像を取得することができる。対物レンズ３３の倍率は、特に限定されず、検出対象の生物粒子に応じて、適宜選択することができる。例えば、検出対象がメイオファウナである場合には、倍率１〜２０倍の対物レンズを用いることができ、倍率２〜１０倍であることが好ましく、倍率２〜５倍であることがより好ましい。なお、対物レンズ３３を用いずに撮像し、撮像後に、画像の拡大処理を行うようにしてもよい。
【０１１８】
また、図６（ｄ）の例では、光源３４により、撮像部分に光を照射して、撮像を行っている。撮像部分に光を照射して撮像を行うことにより、より鮮明な画像を取得することができる。光源３４は、撮像に合わせて間欠的に光を照射するものであってもよく、常時光を照射するものであってもよい。照射する光は、特に限定されないが、可視光であることが好ましい。なお、工程（Ｉ）において、試料１に、蛍光色素で染色処理をした試料を用いた場合には、当該蛍光色素を励起する波長の光を照射してもよい。
【０１１９】
また、図６（ｄ）の例では、カメラ３２は、フローセル３１上のフレーム４０内に存在する流体４の画像を取得するようになっている。カメラ３２が撮像する画像は、静止画であってもよく、動画であってもよい。静止画を撮像する場合、カメラ３２は、所定時間毎に撮像を行うものであることが好ましい。撮像間隔は、フローセル３１を流れる流体４の流速に応じて、適宜選択すればよい。撮像間隔は、例えば、５〜５０回／秒等とすることができる。
【０１２０】
上記のような構成の撮像装置３０において、フローセル３１に、上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体４を流すと、流体４に含まれる生物粒子５ａ〜５ｃが、流体４の流れに応じてフローセル３１内を移動する。この間、カメラ３２は、フローセル３１上のフレーム４０の画像を連続的に取得している。そのため、生物粒子５ａ〜５ｃがフレーム４０内に移動すると、生物粒子５ａ〜５ｃの画像が撮像される。図６（ｄ）の例では、生物粒子５ｂの画像が撮像されている。その結果、生物粒子５ｂの画像４１を取得することができる（図６（ｅ））。
【０１２１】
本実施形態の方法によって取得された生物粒子の画像は、生物種を分類するための解析に供することができる。例えば、本実施形態の方法によって取得された画像を、目視又は画像解析プログラム等で分類することにより、従来の検鏡による方法よりも、迅速に生物相の解析を行うことが可能となる。
【０１２２】
本実施形態の方法によれば、篩分け処理及び遠心処理によって堆積物を除去できるため、堆積物を含む試料であっても効率よく生物粒子の画像を取得することができる。また、フローセルを流れる流体がコロイド溶液を含む場合には、フローセル中での生物粒子の沈降を防ぐことができ、生物粒子によりフローセルが詰まることを防止することができる。
【０１２３】
（任意工程）
本実施形態の方法は、上記工程（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に加えて、撮像が終了した流体４を回収する工程をさらに含んでいてもよい。撮像が終了した流体４を回収することにより、流体４に含まれる生物粒子のさらなる解析が可能になる。
【０１２４】
撮像を終了した流体４を回収する場合には、例えば、フローセル３１の下流側にチューブ等を接続し、チューブの下流端を密閉容器内等に設置するようにすればよい。前記密閉容器にポンプ等を接続し、密閉容器内の空気を排出するようにすれば、フローセル３１内に流体４の流れを作り出すことができ、さらに、前記密閉容器内に撮像を終了した流体４を回収することができる。
【０１２５】
上記のようにして回収された流体４に含まれる生物粒子は、ポンプ等で潰されることなく、ほとんどダメージを受けていない。そのため、生物粒子のさらなる解析に供することができる。
【０１２６】
[第２実施形態]
一実施形態において、本発明は、検出対象である生物粒子を含む試料を篩分けして、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する工程（以下、「工程（Ｉ）」という。）と、前記画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液を添加して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓ０）を取得する工程（以下、「工程（ＩＩ）」という。）と、前記遠心分離後の沈殿（Ｐｎ−１）を、前記コロイド溶液に懸濁して、遠心分離を行い、遠心分離後の上清画分（Ｓｎ）を取得することを、ｎ回（ｎは１以上の整数であり、沈殿（Ｐｎ−１）はｎ−１回目の遠心分離後に得られる沈殿であり、上清画分（Ｓｎ）はｎ回目の遠心分離後に得られる上清画分である。）行う工程（以下、「工程（ＩＩ’）」という。）と、前記上清画分（Ｓ０）及び前記のｎ回分の上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の少なくとも一部を含む流体をフローセルに流しながら、前記フローセルを流れる流体を撮像する工程（以下、「工程（ＩＩＩ’）」という。）と、を含む、生物粒子の画像取得方法。である。
【０１２７】
本実施形態の方法の概略を、図６及び図７を参照して説明する。
まず、検出対象である生物粒子を含む試料１を、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と、目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とを使用して篩分けし、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する（図６（ａ）；工程（Ｉ））。
次に、画分（１ｂ）に、１．１０〜２．４５ｇ／ｃｍ３の密度を有するコロイド溶液２を添加して、適宜撹拌する（図６（ｂ））。その後、画分（１ｂ）とコロイド溶液２とを含む混合物３を、遠心分離して、上清画分（Ｓ０）を取得する（図６（ｃ））。（以上、工程（ＩＩ））
次に、遠心分離後の沈殿（Ｐ０）に、コロイド溶液２を添加して（図７（ａ））、沈殿（Ｐ０）をコロイド溶液２に懸濁し、懸濁物６を作成する（図７（ｂ））。そして、懸濁物６を遠心分離し、上清画分（Ｓ１）を取得する（図７（ｃ））。このようにして、ｎ回遠心分離した後の上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を取得する（図７（ａ）−ｎ〜（ｃ）−ｎ））。（以上、工程（ＩＩ’））
次に、上清画分（Ｓ０）及びｎ回分の上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の少なくとも一部を含む流体４を、フローセル３１に流しながら、カメラ３２により、フレーム４０内のフローセル３１を撮像する（図６（ｄ）；工程（ＩＩＩ’））。なお、図６（ｄ）の例では、対物レンズ３３を介して撮像を行っている。これにより、撮像時に、フレーム４０内に存在していた生物粒子５ｂの画像４１を取得することができる。
以下、本実施形態の方法の各工程について、説明する。
【０１２８】
（工程（Ｉ）、工程（ＩＩ）及び工程（ＩＩ’））
工程（Ｉ）、工程（ＩＩ）及び工程（ＩＩ’）は、上述の「＜生物粒子を含む試料の前処理方法＞」における工程（Ｉ）、工程（ＩＩ）及び工程（ＩＩ’）と同じである。そのため、説明は省略する。
【０１２９】
（工程（ＩＩＩ’））
工程（ＩＩＩ’）は、前記上清画分（Ｓ０）及び前記のｎ回分の上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の少なくとも一部を含む流体をフローセルに流しながら、前記フローセルを流れる流体を撮像する工程である。
【０１３０】
工程（ＩＩＩ’）では、工程（ＩＩ）で得られた上清画分（Ｓ０）、及び工程（ＩＩ’）で得られた上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の少なくとも一部を含む流体４を、フローセル３１に流す。流体４は、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の一部又は全てを混合し、当該混合物の少なくとも一部を含むように、調製してもよい。好ましくは、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓ０）の全てを混合し、当該混合物の少なくとも一部を含むように流体４を調製する。
【０１３１】
フローセル３１に流す流体４は、第１実施形態の方法と同様に、コロイド溶液２を含むことが好ましい。上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）は、通常コロイド溶液２を含むため、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）をそのまま流体４としてフローセル３１に流してもよい。また、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）に、さらにコロイド溶液２を添加したものを、流体４として、フローセル３１に流してもよい。上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の混合物を使用する場合には、当該混合物に、コロイド溶液２を添加するようにしてもよい。
【０１３２】
また、第１実施形態の方法と同様に、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）に対して、さらに篩分け等の処理を行い、所定の画分を取得して流体４を調製し、フローセル３１に流すようにしてもよい。例えば、上記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）を用いて、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の篩分けを行い、前記篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、当該画分にコロイド溶液２を添加して、流体４としてもよい。篩（Ｃ）を用いた篩分け及びコロイド溶液２の添加は、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）のそれぞれに対して、個別に行ってもよく、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の一部又は全部の混合物に対して、行ってもよい。篩分け及びコロイド溶液２の添加を、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）のそれぞれに対して、個別に行った場合には、篩分け及びコロイド溶液２の添加後に、得られた試料の一部又は全部を混合してもよい。すなわち、流体４は、上清画分（Ｓ０）及び／又は上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）を、前記篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けして篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、前記画分にコロイド溶液２を添加したものを含んでいてもよい。また、上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の混合物を使用する場合には、篩（Ｃ）を用いて、当該混合物の篩分けを行い、篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、当該画分にコロイド溶液２を添加して、流体４とすればよい。篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）で篩分けすることにより、余分なコロイド粒子を除去して、対象とする生物粒子が濃縮され、効率よく撮像を行うことができる。また、篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きの篩を用いることにより、検出対象とする生物粒子のロストを少なくすることができる。篩（Ｃ）の目開きは、工程（Ｉ）で使用した篩（Ｂ）の目開きよりも小さければ、特に限定されないが、例えば、３０〜６３μｍを挙げることができる。
【０１３３】
本工程では、上記のように調製した上清画分（Ｓ０）及び上清画分（Ｓ１）〜（Ｓｎ）の少なくとも一部を含む流体４を、フローセル３１に流しながら、フローセル３１を流れる流体４を撮像する。フローセル３１は、第１実施形態の方法と同様のものとすることができる。また、フローセル３１への流体４の投入方法、及びフローセル３１を流れる流体４の撮像方法等もまた、第１実施形態の方法と同様の方法で行うことができる。
【０１３４】
本実施形態の方法によって取得された生物粒子の画像は、第１実施形態の方法で取得された画像と同様に、生物種を分類するための解析に供することができる。
【０１３５】
本実施形態の方法によれば、篩分け処理及び遠心処理によって堆積物を除去できるため、堆積物を含む試料であっても効率よく生物粒子の画像を取得することができる。また、工程（ＩＩ’）において、遠心分離で得られた沈殿にコロイド溶液を添加してさらに遠心分離を行っているため、当該沈殿に生物粒子が残存していた場合であっても、当該生物粒子を回収することができる。
【０１３６】
（任意工程）
本実施形態の方法は、第１実施形態の方法と同様に、上記工程（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ’）及び（ＩＩＩ’）に加えて、撮像が終了した流体４を回収する工程をさらに含んでいてもよい。撮像が終了した流体４を回収することにより、流体４に含まれる生物粒子のさらなる解析が可能になる。撮像を終了した流体４を回収する方法もまた、第１実施形態の方法と同様に行えばよい。
【０１３７】
＜生物粒子を含む試料の前処理装置＞
一実施形態において、本発明は、上記生物粒子を含む試料の前処理方法を実現するための生物粒子を含む試料の前処理装置を提供する。本実施形態の生物粒子を含む試料の前処理装置は、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とを備え、検出対象である生物粒子を含む試料の篩分けを行って、前記篩（Ａ）を通過し、かつ前記篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する篩分け部と、前記篩分け部で取得された画分（１ｂ）に、コロイド溶液を添加するコロイド溶液添加部と、前記コロイド溶液が添加された画分（１ｂ）を遠心分離する遠心分離部と、前記遠心分離部における遠心分離後に、上清画分を取得する上清画分取得部と、を備える。
以下、本実施形態の生物粒子を含む試料の前処理装置の構成の一例について説明する。
【０１３８】
図８は、本実施形態の生物粒子を含む試料の前処理装置の構成の一例を示したものである。図８に示す前処理装置１００は、篩分け部１１０と、コロイド溶液添加部１２０と、遠心分離部１３０と、上清画分取得部１４０と、を備える。
【０１３９】
篩分け部１１０は、検出対象である生物粒子を含む試料１の篩分けを行って、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得するためのユニットである。篩分け部１１０は、少なくとも、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とを備えており、これらの篩により、試料１の篩分けを行う。篩分け部１１０は、例えば、図６（ａ）に示すような構成としてもよい。図６（ａ）の例では、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）と目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）とが容器１０に設置されており、振とう機１３により振とうしながら、篩分けを行う構成となっている。篩分け終了後は、目開き２５０〜１０００μｍの篩（Ａ）を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する。
【０１４０】
なお、篩分け部１１０の構成は、図６（ａ）の例に限定されず、例えば、篩（Ａ）と篩（Ｂ）とが別々の容器に設置されていてもよい。この場合、篩分け終了後に、各篩が設置された容器を分離し、篩（Ｂ）が設置された容器ごと画分（１ｂ）を取得することができる。
【０１４１】
コロイド溶液添加部１２０は、篩分け部１１０で取得された画分（１ｂ）に、コロイド溶液２を添加するためのユニットである。コロイド溶液２は、上述の「＜生物粒子の画像取得方法＞」における工程（ＩＩ）で使用するものと同じである。コロイド溶液添加部１２０は、例えば、ピペット、チューブ、ガラス管等により、コロイド溶液２を画分（１ｂ）に添加する構成とすることができる。
【０１４２】
遠心分離部１３０は、コロイド溶液添加部１２０においてコロイド溶液２が添加された画分（１ｂ）を、遠心分離するためのユニットである。なお、図８では、画分（１ｂ）とコロイド溶液２が混合されたものを混合物３として表している。遠心分離部１３０は、一般的な遠心分離機が備える構成とすることができる。遠心分離部１３０における遠心分離の条件は、操作パネル等により、設定できるようにしてもよい。
【０１４３】
上清画分取得部１４０は、遠心分離部１３０における遠心分離後に、上清画分（Ｓ０）を取得するためのユニットである。上清画分取得部１４０は、例えば、ピペット、チューブ、ガラス管等により、上清画分（Ｓ０）を取得するようにしてもよく、遠沈管から直接他の容器に上清画分（Ｓ０）を移す構成としてもよい。
【０１４４】
上記のような構成を備える前処理装置１００の動作の一例について説明する。
【０１４５】
まず、検出対象である生物粒子を含む試料１を、篩分け部１１０に投入する。篩分け部１１０では、試料１の篩分けを行い、目開き２５０〜１０００μｍの篩を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩を通過しない画分（１ｂ）を取得する。篩分け部１１０での篩分けにより、試料１に含まれる堆積物粒子の多くが除去される。
【０１４６】
篩分け部１１０で取得された画分（１ｂ）は、コロイド溶液添加部１２０により、コロイド溶液２が添加される。これにより、画分（１ｂ）とコロイド溶液２との混合物３が調製される。
【０１４７】
混合物３は、遠心分離部１３０に投入され、遠心分離が行われる。これにより、混合物３は、上清画分（Ｓ０）と沈殿（Ｐ０）とに分離される。上清画分（Ｓ０）には検出対象とする生物粒子が含まれており、沈殿（Ｐ０）には堆積物粒子が含まれている。遠心分離部１３０での遠心分離により、堆積物粒子をほとんど含まない上清画分（Ｓ０）を取得することができる。その後、上清画分（Ｓ０）は、上清画分取得部１４０により取得され、適宜調製が行われて、生物粒子を含む試料の前処理が完了する。
【０１４８】
本実施形態の生物粒子を含む試料の前処理装置は、上記のような構成を備えるため、堆積物粒子を多く含む試料であっても、その後の解析に十分な品質の試料を調製することができる。また、本実施形態の生物粒子を含む試料の前処理装置により調製された試料は、画像取得装置等で生物粒子の画像を取得した場合に、その後の解析に十分な画質の画像を取得することができる。
【０１４９】
なお、前処理装置１００は、上記の構成以外の他の構成を備えていてもよい。例えば、前処理装置１００は、沈殿懸濁部を備えていてもよい。沈殿懸濁部は、遠心分離部１３０における遠心分離の後、上清画分取得部１４０により上清画分（Ｓ０）が取得された後の沈殿（Ｐ０）に、コロイド溶液２を添加して沈殿を懸濁するためのユニットである。沈殿懸濁部においてコロイド溶液２に懸濁された沈殿（Ｐ０）は、遠心分離部１３０において、再度、遠心分離される。遠心分離後は、上清画分取得部１４０により、上清画分（Ｓ１）が取得される。これにより、沈殿（Ｐ０）に、検出対象とする生物粒子が残存していた場合であっても、当該生物粒子を回収することができる。なお、再度の遠心分離によって得られた沈殿（Ｐ１）を、沈殿懸濁部において、さらにコロイド溶液２に懸濁し、遠心分離部１３０において、再度、遠心分離を行ってもよい。このようにしてｎ回目の遠心分離で得られる上清画分を上清画分（Ｓｎ）、ｎ回目の遠心分離で得られる沈殿を沈殿（Ｐｎ）とすると、沈殿（Ｐｎ−１）にコロイド溶液２を添加し、懸濁して、遠心分離を行うことをｎ回行ってもよい。沈殿懸濁部において沈殿（Ｐ０）〜（Ｐｎ−１）の懸濁を行う回数は、操作パネル等により設定できるようにしてもよい。
【０１５０】
沈殿懸濁部は、上清画分取得後の遠沈管に、ピペット、チューブ、ガラス管等によりコロイド溶液２を添加して、遠沈管を振とうすることにより沈殿を懸濁する構成としてもよく、コロイド溶液２の添加後にピペッティング等を行うことにより、沈殿を懸濁する構成としてもよい。また、コロイド溶液２の添加は、コロイド溶液添加部１２０により行うようにすることもできる。
【０１５１】
また、前処理装置１００は、上清画分調製部を備えていてもよい。上清画分調製部は、上清画分取得部１４０により取得された上清画分（Ｓ０）〜（Ｓｎ）を、その後の解析用にさらに調製するためのユニットである。上清画分調製部は、例えば、上清画分取得部１４０によって取得された上清画分（Ｓ０）〜（Ｓｎ）を混合する構成を備えることができる。また、上清画分（Ｓ０）〜（Ｓｎ）に、コロイド溶液を添加する構成を備えていてもよい。あるいは、篩（Ｂ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｃ）を備え、上清画分（Ｓ０）〜（Ｓｎ）を篩分けして、篩（Ｃ）を通過しない画分を取得し、当該画分にコロイド溶液を添加する構成を備えていてもよい。
【０１５２】
前処理装置１００は、その他、装置全体の動作を制御する制御部等を備えることができる。
【０１５３】
＜生物粒子画像取得装置＞
一実施形態において、本発明は、上記生物粒子の画像取得方法を実現するための生物粒子画像取得装置を提供する。本実施形態の生物粒子画像取得装置は、篩（Ａ）と、前記篩（Ａ）の目開きよりも小さい目開きを有する篩（Ｂ）とを備え、検出対象である生物粒子を含む試料の篩分けを行って、前記篩（Ａ）を通過し、かつ前記篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する篩分け部と、前記篩分け部で取得された画分（１ｂ）に、コロイド溶液を添加するコロイド溶液添加部と、前記コロイド溶液が添加された画分（１ｂ）を遠心分離する遠心分離部と、前記遠心分離部における遠心分離後に、上清画分を取得する上清画分取得部と、フローセルとカメラとを備え、前記上清画分取得部で取得された前記上清画分の少なくとも一部を含む流体を前記フローセルに流しながら、前記フローセルを流れる前記流体を撮像する撮像部と、を備える。前記篩（Ａ）は、前記フローセルの幅方向及び奥行方向の内径のいずれか大きい方よりも小さい目開きを有する。
以下に、本実施形態の生物粒子画像取得装置の構成の一例について説明する。
【０１５４】
図９は、本実施形態の生物粒子画像取得装置の構成の一例を示したものである。図９に示す生物粒子画像取得装置２００は、篩分け部１１０と、コロイド溶液添加部１２０と、遠心分離部１３０と、上清画分取得部１４０と、撮像部１５０と、流体回収部１６０と、を備える。
【０１５５】
篩分け部１１０は、検出対象である生物粒子を含む試料１の篩分けを行って、篩（Ａ）を通過し、かつ篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得するためのユニットである。篩（Ａ）は、篩（Ｂ）よりも大きい目開きを有する。篩（Ａ）は、検出対象である生物粒子よりも大きい粒子を除去するためのものである。篩（Ａ）の目開きは、検出対象である生物粒子の大きさに基づき、適宜選択することができる。ただし、篩（Ａ）の目開きは、撮像部１５０が備えるフローセルを通過可能なサイズの最大値以下に設定される。具体的には、篩（Ａ）は、フローセルの幅方向及び奥行方向の内径のいずれか大きい方よりも小さい目開きを有する。あるいは、篩（Ａ）の目開きは、フローセルの流路設計において、生物粒子が通過可能な最大サイズより小さい目開きとしてもよい。
【０１５６】
篩（Ｂ）は、篩（Ａ）よりも小さい目開きを有する。篩（Ｂ）は、検出対象である生物粒子よりも小さい粒子を除去するためのものである。篩（Ｂ）の目開きは、検出対象である生物粒子の大きさに基づき、適宜選択することができる。ただし、篩（Ｂ）は、撮像部１５０が備えるカメラが焦点を合わせることが可能な粒子径の最小値以上の目開きを有することが好ましい。カメラが焦点を合わせることが可能な粒子径の最小値は、撮像部１５０が備えるフローセルの奥行方向の内径と、カメラの焦点深度により規定される。したがって、篩（Ｂ）の目開きは、検出対象である生物粒子の大きさと、フローセルの奥行方向の内径と、カメラの焦点深度に基づいて、選択してもよい。
【０１５７】
例えば、カメラの焦点深度は、一般的には、下記式（１）のＢｅｒｅｋの式で表すことができる。
【０１５８】
【数１】
2018199326.tif 000003
D.O.F       ：焦点深度（Depth of Focus）
ω      ：目の分解能（0.014：目の視角を5分とした場合）
M       ：総合倍率
λ      ：光の波長（可視光の場合λ＝0.55mm）
NA ：カメラで規定される開口数
【０１５９】
ここで、例えば、Ｍ＝１０００、ＮＡ＝０．９０とすると、Ｄ．Ｏ．Ｆ＝０．７３μｍとなる。また、例えば、Ｍ＝４、ＮＡ＝０．９０とすると、Ｄ．Ｏ．Ｆ＝１８２．５μｍとなる。
また、例えば、１／２インチＨＤカメラの場合、ＣＣＤサイズは６．４ｍｍ（Ｗ）×４．８ｍｍ（Ｈ）であり、ＣＣＤ画素数は１９８０（Ｗ）×１０８０（Ｈ）であり、分解能は幅（Ｗ）３．２μｍ、高さ（Ｈ）４．４μｍである。したがって、Ｍ＝４とすると、カメラが焦点を合わせることが可能な粒子径の最小値は、幅（Ｗ）０．８μｍ、高さ（Ｈ）１．１μｍとなる。
このように、焦点深度、及びカメラの仕様が設定されると、総合倍率（Ｍ）が決まり、カメラが焦点を合わせることが可能な粒子径の最小値が決定される。
【０１６０】
なお、光学系での限界分解能は、０．２μｍとされているため、篩（Ｂ）の目開きは０．２μｍ以上としてもよい。例えば、篩（Ｂ）の目開きは、検出対象である生物粒子の細部に合わせて、１μｍ以上としてもよく、１０μｍ以上としてもよく、２０μｍ以上としてもよい。
【０１６１】
例えば、検出対象である生物粒子がメイオファウナである場合、篩（Ａ）の目開きとしては２５０〜１０００μｍが挙げられ、篩（Ｂ）の目開きとしては３２〜６２μｍが挙げられる。
篩（Ａ）及び篩（Ｂ）は、検出対象である生物粒子のサイズ、フローセルのサイズ、及びカメラの焦点深度に基づいて、操作者が、各々適切な目開きのものを選択して、篩分け部１１０に設置してもよい。あるいは、篩分け部１１０が、目開きの異なる複数種類の篩を備え、検出対象である生物粒子、フローセルのサイズ、及びカメラの焦点深度に応じて、篩（Ａ）及び篩（Ｂ）を選択するものであってもよい。この場合、操作者の選択により、篩分け部１１０に篩（Ａ）及び篩（Ｂ）が設置されるものであってよい。あるいは、検出対象である生物粒子、フローセルのサイズ、及びカメラの焦点深度に応じて、生物粒子画像取得装置２００が自動的に篩（Ａ）及び篩（Ｂ）を選択し、篩分け部１１０に設置するものであってもよい。生物粒子画像取得装置２００は、生物検出対象である生物粒子のサイズ、フローセルのサイズ、及びカメラの焦点深度等を入力するための入力部等を備えていてもよい。
篩分け部１１０の他の構成については、上記生物粒子を含む試料の前処理装置１００において説明したものと同様とすることができる。
【０１６２】
コロイド溶液添加部１２０、遠心分離部１３０、及び上清画分取得部１４０は、上記生物試料を含む試料の前処理装置１００において説明したものと同じである。
【０１６３】
撮像部１５０は、上清画分取得部１４０で取得された上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体４をフローセルに流しながら、前記フローセルを流れる前記流体をカメラで撮像するためのユニットである。撮像部１５０は、少なくとも、フローセルとカメラとを備える。
【０１６４】
撮像部１５０は、例えば、図６（ｄ）のような構成としてもよい。図６（ｄ）の例では、フローセル３１とカメラ３２とを備え、フローセル３１とカメラ３２との間に対物レンズ３３が設置されて、カメラ３２が対物レンズ３３を介して、フローセル３１のフレーム４０部分を撮像する構成となっている。また、光源３４により、フレーム４０部分に光が照射されるようになっている。
【０１６５】
フローセル３１は、検出対象の生物粒子に応じて、適宜選択すればよい。例えば、検出対象がメイオファウナである場合には、フローセル３１は、撮像面に対する奥行方向の内径を１５０〜５００μｍとすることができる。また、フローセル３１の下流側にポンプ等を接続し、フローセル３１に投入された流体を、当該ポンプ等で吸引することにより、フローセル３１内に流体の流れを作り出すようにしてもよい。
【０１６６】
カメラ３２は、静止画用のものであってもよく、動画用のものであってもよい。静止画用のものである場合には、連続撮像が可能なものであることが好ましく、所定時間毎に連続撮像を行うものであることがより好ましい。また、操作パネル等により、撮像間隔を設定できるようにしてもよい。
【０１６７】
対物レンズ３３は、フレーム４０の拡大画像を取得するために用いられる。対物レンズ３３の倍率は、検出対象の生物粒子に応じて、適宜選択すればよい。例えば、検出対象がメイオファウナである場合には、倍率１０〜１００倍の対物レンズを使用することができる。
【０１６８】
光源３４は、フレーム４０に光を照射して、より鮮明な画像を取得するために用いられる。光源３４は、カメラ３２による撮像間隔に合わせて間欠的に光を照射するものであってもよく、常時光を照射するものであってもよいが、所定間隔で光を照射するフラッシュ光源であることが好ましい。また、操作パネル等により、照射間隔を設定できるようにしてもよい。
【０１６９】
光源３４から照射される光は、特に限定されないが、可視光であることが好ましい。また、検出対象の生物粒子が蛍光色素で染色されたものである場合には、当該蛍光色素を励起する波長の光を照射するものであってもよい。
【０１７０】
上記のような構成を備える生物粒子画像取得装置２００の動作の一例について説明する。
【０１７１】
まず、検出対象である生物粒子を含む試料１を、篩分け部１１０に投入する。篩分け部１１０では、試料１の篩分けを行い、篩（Ａ）を通過し、かつ篩（Ｂ）を通過しない画分（１ｂ）を取得する。篩分け部１１０での篩分けにより、試料１に含まれる堆積物粒子の多くが除去される。
【０１７２】
篩分け部１１０で取得された画分（１ｂ）は、コロイド溶液添加部１２０により、コロイド溶液２が添加される。これにより、画分（１ｂ）とコロイド溶液２との混合物３が調製される。
【０１７３】
混合物３は、遠心分離部１３０に投入され、遠心分離が行われる。これにより、混合物３は、上清画分（Ｓ０）と沈殿（Ｐ０）とに分離される。上清画分（Ｓ０）には検出対象とする生物粒子が含まれており、沈殿（Ｐ０）には堆積物粒子が含まれている。遠心分離部１３０での遠心分離により、堆積物粒子をほとんど含まない上清画分（Ｓ０）を取得することができる。その後、上清画分（Ｓ０）は、上清画分取得部１４０により取得され、適宜調製が行われて、上清画分（Ｓ０）の少なくとも一部を含む流体４として調製される。
【０１７４】
流体４は、撮像部１５０に投入されて、撮像が行われる。流体４は、撮像部１５０内において、フローセルに流され、フローセル上の撮像フレーム内に存在する流体の画像が、カメラにより撮像される。生物粒子画像取得装置２００では、このようにして、検出対象とする生物粒子の画像を取得することができる。
【０１７５】
本実施形態の生物粒子画像取得装置は、上記のような構成を備えるため、堆積物粒子を多く含む試料であっても、その後の解析に十分な画質の画像を取得することができる。また、画像取得までの操作を自動で行うことができるため、従来、検鏡による解析に要していた時間と手間を省くことができる。
【０１７６】
なお、生物粒子画像取得装置２００は、上記の構成以外の他の構成を備えていてもよい。図９に示す例では、生物粒子画像取得装置２００は、流体回収部１６０を備えている。
流体回収部１６０は、撮像部１５０において撮像を終了した流体４を回収するためのユニットである。流体回収部１６０は、例えば、流体４を回収するための容器と、当該容器に流体４を導くためのチューブと、当該チューブ内での流体４の流れを作るポンプ等を備える構成とすることができる。例えば、撮像部１５０内のフローセル３１の下流端にチューブを接続し、当該チューブを流体回収部１６０内の容器と接続する構成とすることができる。また、当該容器にポンプを接続し、当該容器内の空気を排出して、フローセルを通過した流体４を、前記チューブを介して、前記容器に回収する構成としてもよい。
流体回収部１６０で回収された流体４は、さらなる解析に使用することができる。
【０１７７】
また、生物粒子画像取得装置２００は、上記生物粒子を含む試料の前処理装置１００と同様に、沈殿懸濁部、上清画分調製部等を備えていてもよい。沈殿懸濁部及び上清画分調製部は、前処理装置１００において説明したものと同じである。
【０１７８】
生物粒子画像取得装置２００は、その他、撮像部１５０で取得した画像を表示する画像表示部、取得した画像を解析する画像解析部、装置全体の動作を制御する制御部等を備えることができる。
【実施例】
【０１７９】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１８０】
＜試験例１＞
［解析用試料］
北海道釧路沖の３測点（水深５６０ｍ、３３００ｍ、７１００ｍ）で得られた堆積物試料を用いた。【０１８１】
［試料の篩分け］
前記堆積物試料を、目合い１ｍｍ、５００μｍ、２５０μｍ、１２５μｍ、６３μｍ、及び３８μｍの６つの篩を用いて、篩分けした。前記各篩に捉えられたメイオファウナの個体数を、検鏡により確認した。【０１８２】
［結果］
各篩に捉えられたメイオファウナの個体数を表１に示す。６３〜２５０μｍの篩区分に、約８０％の個体が入っていた。【０１８３】
【表１】
2018199326.tif 000004
【０１８４】
＜試験例２＞
［解析用試料］
岩手県大槌湾沖の４測点（水深７２ｍ、３０３ｍ、１０６４ｍ、１６７７ｍ）で得られた堆積物試料を用いた。【０１８５】
［解析用画像を取得するための試料前処理］
前記堆積物試料を５％中和ホルマリンで固定し、堆積物試料中の生物をローズベンガルで染色した（終濃度０．０５ｇ／Ｌ）。
前記染色操作後の堆積物試料約２６．４ｍＬを、振とうしながら篩分けした。篩分けには、目開き２５０μｍの篩と、目開き６３μｍの篩を使用し、目開き２５０μｍの篩を通過し、かつ目開き６３μｍの篩を通過しない試料を回収した。
回収した試料を５０ｍＬ遠沈管に入れ、コロイド状シリカ（ＬＵＤＯＸ  ＨＳ−４０、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を約３０ｍＬ加えて、試料をコロイド状シリカに懸濁した。その後、遠心分離機（ＬＣ２００、ＴＯＭＹ）を用いて、８００Ｇで１０分間遠心した。遠心後の遠沈管から上清を採取し、目開き３２μｍの篩上に捕集した。
上清を採取した後、遠沈管内の沈殿にコロイド状シリカを約３０ｍＬ加えて、沈殿をコロイド状シリカに懸濁した。その後、遠心分離機を用いて、８００Ｇで１０分間遠心した。遠心後の遠沈管から上清を採取し、目開き３２μｍの篩上に捕集した。この作業をさらに１回行った。
上記の遠心３回分の上清から目開き３２μｍの篩上に捕集された試料を、コロイド状シリカ約１０ｍＬに懸濁し、新たな５０ｍＬ遠沈管に回収した。【０１８６】
［解析用画像の取得］
解析用画像の取得は、カメラ付き流動微粒子計数装置ＦｌｏｗＣＡＭ（Ｆｌｕｉｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。対物レンズは倍率４倍のものを使用し、フローセルはカメラの撮像面に対する奥行方向の内径が３００μｍのものを使用した。
また、ＦｌｏｗＣＡＭを通過した試料を回収するために、新たな５０ｍＬ遠沈管を準備した。当該遠沈管の上部をパラフィルムで密閉し、チューブを２本刺し、一方のチューブの他端をフローセルの下流側に接続した。もう一方のチューブの他端は、ペリスタティックポンプ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続した。この構成により、ペリスタティックポンプを稼働すると、フローセルから前記チューブに試料が流れ、遠沈管内に試料が回収される。このようにして、ＦｌｏｗＣＡＭを通過した試料を遠沈管に捕集した。
なお、フローセル及びフローセルに接続するチューブは、試料投入前に、予めコロイド状シリカ溶液で満たしておいた。【０１８７】
上記のような構成において、遠沈管に回収した試料を軽く撹拌し、パスツールピペットを用いて、ＦｌｏｗＣＡＭのフローセルに投入し、撮像を行った。撮像は、Ａｕｔｏ  Ｉｍａｇｅ  Ｍｏｄｅで行い、Ａｕｔｏ  Ｉｍａｇｅ  Ｒａｔｅ（１秒間に撮像される画像の数）を２０に設定した。また、Ｆｌａｓｈ  Ｄｕｒａｔｉｏｎは、１０μｓに設定した。【０１８８】
［画像の解析］
撮像した画像は、ＦｌｏｗＣＡＭ付属のソフトＶｉｓｕａｌＳｐｒｅａｄＳｈｅｅｔのソート機能Ｒｅｄ／Ｂｌｕｅ  Ｒａｔｉｏでソートし、目視にて各画像を確認して生物を選別し、高次分類群ごとに計数した。なお、ここでは、目視により選別を行ったが、各画像から得られた生物の形態、ひげ等の形態的特徴から、プログラム等で自動的に、生物画像の選別・分類を行うようにしてもよい。生物画像の選別は、画像解析ソフトやＡＩ（人工知能）等により行ってもよい。【０１８９】
［結果］
ＦｌｏｗＣＡＭへの試料の投入に使用した遠沈管、及び計数を終えた後のチューブ内を検鏡したが、残っていた生物個体は数個体であった。
ＦｌｏｗＣＡＭで撮像された画像の一例を図１０に示す。ＦｌｏｗＣＡＭで撮像された画像は、目視により生物を選別するのに十分な画質であった。
ＦｌｏｗＣＡＭで観察された生物個体数と、ＦｌｏｗＣＡＭ通過後に遠沈管に捕集された個体数を比較して撮影効率を計算した。その結果、撮影効率は、メイオファウナ全体で５７．９±１４．８％、線虫類で５８．９±１９．６％、カイアシ類で３４．６±３．７％であった。また、ＦｌｏｗＣＡＭで計数した個体数と、遠沈管に捕集された試料を検鏡により計数した個体数とは、有意な相関を示した（メイオファウナ全体：ｒ＝０．９５、ｐ＜０．０５；線虫類：ｒ＝０．９５、ｐ＜０．０５；カイアシ類：ｒ＝１．００、ｐ＜０．０１；図１１）。
以上より、本方法は、従来の検鏡による方法で得られる生物個体数の解析結果と、相関の高い解析結果を得られることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１９０】
本発明によれば、堆積物粒子が存在する場合であっても、迅速に生物粒子の解析を行うことができる技術が提供される。また、堆積物がなく、水、若しくは、海水から直接、生物画像及び塩基配列情報を取得し、迅速に生物粒子の解析を行うことができる技術が提供される。
【符号の説明】
【０１９１】
１…試料
１ａ…目開き２５０〜１０００μｍの篩を通過しない画分
１ｂ…目開き２５０〜１０００μｍの篩を通過し、かつ目開き３２〜６３μｍの篩を通過しない画分
１ｃ…目開き３２〜６３μｍの篩を通過する画分
２…コロイド溶液
３…画分（１ｂ）とコロイド溶液２とを含む混合物
４…流体
５ａ〜５ｃ…生物粒子
６…懸濁物
１０…容器
１３…振とう機
２０…遠心分離機
２１…遠沈管
３０…撮像装置
３１…フローセル
３２…カメラ
３３…対物レンズ
３４…光源
４０…フレーム
４１…画像
１００…生物粒子を含む試料の前処理装置
１１０…篩分け部
１２０…コロイド溶液添加部
１３０…遠心分離部
１４０…上清画分取得部
１５０…撮像部
１６０…流体回収部
２００…生物粒子画像取得装置
Ａ…目開き２５０〜１０００μｍの篩
Ｂ…目開き３２〜６３μｍの篩
Ｓ０〜Ｓｎ…上清画分
Ｐ０〜Ｐｎ…沈殿
９０…統合システム
９１０…リファレンスデータベース
９２０…生物画像取得部
９３０…生物情報判定部
９４０…画像データベース
９５０…塩基配列情報取得部
９６０…塩基配列情報判定部
９７０…塩基配列情報データベース
９８０…統合部
９９０…統合データベース
８００…解析部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月12日(2018.9.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象である生物粒子を含む試料から前記生物粒子の画像である生物画像を取得する生物画像取得部と、
前記生物粒子の塩基配列情報を取得する塩基配列情報取得部と、
同種の生物粒子から取得された前記生物画像及び前記塩基配列情報を対応付けて統合データベースに登録する統合部と、
前記生物画像取得部によって取得された画像に基づいて、前記試料中における前記生物粒子の種類毎に個体数に関する情報を取得する生物情報判定部と、
前記塩基配列情報取得部によって取得された塩基配列情報に基づいて、前記試料中における前記生物粒子の種類毎に個体数に関する情報を取得する塩基配列情報判定部と、を備え、
前記統合部は、前記生物画像及び前記塩基配列情報に加えてさらに前記画像に基づいて得られた個体数に関する情報と、前記塩基配列情報に基づいて得られた個体数に関する情報と、を対応付けて前記統合データベースに登録する、
統合システム。
【請求項２】
検出対象である生物粒子を含む試料から前記生物粒子の画像である生物画像を取得する生物画像取得部と、
前記生物粒子の塩基配列情報を取得する塩基配列情報取得部と、
同種の生物粒子から取得された前記生物画像及び前記塩基配列情報を対応付けて統合データベースに登録する統合部と、
前記生物画像取得部によって取得された画像に基づいて、前記試料中における前記生物粒子の種類毎に個体数に関する情報である第一個体情報を取得する生物情報判定部と、
前記塩基配列情報取得部によって取得された塩基配列情報に基づいて、前記試料中における前記生物粒子の種類毎に個体数に関する情報である第二個体情報を取得する塩基配列情報判定部と、をさらに備え、
前記統合部は、前記第一個体情報と前記第二個体情報とが所定の基準に基づいて類似の情報であると判定された場合に、前記第一個体情報に対応する前記画像と、前記第二個体情報に対応する前記塩基配列情報と、を対応付けて前記統合データベースに登録する、
統合システム。
【請求項３】
検出対象である生物粒子を含む試料から前記生物粒子の画像である生物画像を取得する生物画像取得部と、
前記生物粒子の塩基配列情報を取得する塩基配列情報取得部と、
同種の生物粒子から取得された前記生物画像及び前記塩基配列情報を対応付けて統合データベースに登録する統合部と、
前記生物画像取得部によって取得された画像に基づいて、前記試料から検出された全種類の生物粒子の個体数に対する、各種類の個体数の割合である出願割合を示す値を取得する生物情報判定部と、
前記塩基配列情報取得部によって取得された塩基配列情報に基づいて、前記試料から検出された全種類の生物粒子の個体数に対する、各種類の個体数の割合である出願割合を示す値を取得する塩基配列情報判定部と、を備え、
前記統合部は、前記生物画像及び前記塩基配列情報に加えてさらに前記画像に基づいて得られた出現割合を示す値と、前記塩基配列情報に基づいて得られた前記出現割合を示す値と、を対応付けて前記統合データベースに登録する、
統合システム。
【請求項４】
生物画像取得部は、前記試料を含む流体がフローセル中を流れる状態において前記流体を撮像することによって前記生物画像を取得する、請求項１から３のいずれか一項に記載の統合システム。
【請求項５】
前記生物画像取得部によって取得された画像に基づいて、前記試料中における前記生物粒子の種類毎に個体数に関する情報である第一個体情報を取得する生物情報判定部と、
前記塩基配列情報取得部によって取得された塩基配列情報に基づいて、前記試料中における前記生物粒子の種類毎に個体数に関する情報である第二個体情報を取得する塩基配列情報判定部と、をさらに備え、
前記統合部は、前記第一個体情報と前記第二個体情報とが所定の基準に基づいて類似の情報であると判定された場合に、前記第一個体情報に対応する前記画像と、前記第二個体情報に対応する前記塩基配列情報と、を対応付けて前記統合データベースに登録する、請求項１又は３に記載の統合システム。
【請求項６】
前記統合データベースに登録された前記生物画像及び前記塩基配列情報との対応付けに基づいて、新たに取得された生物画像の生物粒子の塩基配列情報を同定する、又は、新たに取得された生物の塩基配列情報の生物画像を同定する、解析部をさらに備える、請求項１から５のいずれか一項に記載の統合システム。
【請求項７】
前記解析部は、前記生物粒子に関して得られる属性情報にさらに基づいて同定する請求項６に記載の統合システム。
【請求項８】
前記統合部は、前記生物画像又は前記塩基配列情報に基づいて、前記生物粒子の分類群を推定する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の統合システム。
【請求項９】
前記解析部は、前記生物画像に基づいて前記生物粒子の成長状態を判定し、前記塩基配列情報に基づいて前記生物粒子の種別を判定する、請求項６に記載の統合システム。
【請求項１０】
検出対象である生物粒子を含む試料から前記生物粒子の画像である生物画像を取得する生物画像取得ステップと、
前記生物粒子の塩基配列情報を取得する塩基配列情報取得ステップと、
同種の生物粒子から取得された前記生物画像及び前記塩基配列情報を対応付けて統合データベースに登録する統合ステップと、
前記生物画像取得ステップにおいて取得された画像に基づいて、前記試料から検出された全種類の生物粒子の個体数に対する、各種類の個体数の割合である出願割合を示す値を取得する生物情報判定ステップと、
前記塩基配列情報取得ステップにおいて取得された塩基配列情報に基づいて、前記試料から検出された全種類の生物粒子の個体数に対する、各種類の個体数の割合である出願割合を示す値を取得する塩基配列情報判定ステップと、を有し、
前記統合ステップにおいて、前記生物画像及び前記塩基配列情報に加えてさらに前記画像に基づいて得られた出現割合を示す値と、前記塩基配列情報に基づいて得られた前記出現割合を示す値と、を対応付けて前記統合データベースに登録する、
統合方法。
【国際調査報告】
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