(57)【要約】  以下の工程により、RNAの機能構造単位を含むRNAプローブを調製する：（１）RNAの配列情報に基づいてRNA中に含まれる１または複数のステム構造を認識する工程、（２）認識された前記１または複数のステム構造を基準としてモチーフ領域を抽出する工程、（３）抽出された前記モチーフ領域に、補助ステム領域を付加する工程、および（４）前記補助ステム領域に、DNAバーコード配列に対する相補配列であるバーコード領域を付加する工程。また、RNAの機能構造単位を含むRNAプローブを用いたタンパク質結合性RNAの検出方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むRNAプローブの調製方法：
（１）RNAの配列情報に基づいてRNA中に含まれる１または複数のステム構造を認識する工程、
（２）認識された前記１または複数のステム構造を基準としてモチーフ領域を抽出する工程、
（３）抽出された前記モチーフ領域に、第一の補助ステム部分配列と第二の補助ステム部分配列とを付加する工程、ここで、第二の補助ステム部分配列は、第一の補助ステム部分配列に対して相補的な配列であって、第一の補助ステム部分配列とハイブリダイズして二本鎖補助ステムを形成する、および、
（４）前記補助ステム領域に、DNAバーコード配列に対する相補配列であるバーコード領域を付加する工程。
【請求項２】
前記工程（２）が、
（２ａ）認識された前記ステム構造から１または複数を選択する工程、
（２ｂ）選択されたステム構造を仮想ループ構造に置き換える工程、および、
（２ｃ）選択するステム構造を変更して前記（２ａ）〜（２ｂ）を繰り返す工程
を含む、請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
以下の（１）〜（３）の領域を含むRNAプローブ：
（１）DNAバーコード配列に対する相補配列であるバーコード領域、
（２）第一の補助ステム部分配列と第二の補助ステム部分配列とを含み、ここで、第二の補助ステム部分配列は、第一の補助ステム部分配列に対して相補的な配列であって、第一の補助ステム部分配列とハイブリダイズして二本鎖補助ステムを形成する補助ステム領域、および、
（３）第一の補助ステム部分と第二の補助ステム部分とを連結する領域であって、多分岐ループ部分を有する高次構造を形成する配列を含むモチーフ領域。
【請求項４】
前記DNAバーコード配列に対する相補配列が、補助ステム領域および／またはモチーフ領域との間で塩基対または擬似ノット形成をしない配列である、請求項３に記載のRNAプローブ。
【請求項５】
前記DNAバーコード配列に対する相補配列の5’末端が、ウラシル以外の塩基である、請求項３または４に記載のRNAプローブ。
【請求項６】
3’末端を蛍光標識された、請求項３〜５のいずれか１項に記載のRNAプローブ。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のRNAプローブを複数含み、前記複数のRNAプローブがそれぞれ異なる配列のモチーフ領域を含む、RNAプローブライブラリ。
【請求項８】
支持体上にDNAバーコード配列を固定したマイクロアレイと、請求項７に記載のRNAプローブライブラリとを含む、RNA分析用キット。
【請求項９】
支持体上にDNAバーコード配列を固定したマイクロアレイと、請求項７に記載のRNAプローブライブラリとをハイブリダイズさせることにより製造される、RNAマイクロアレイ。
【請求項１０】
以下の工程を含む、タンパク質と結合するRNAを検出する方法：
（１）請求項３〜６のいずれか１項に記載のRNAプローブと対象タンパク質とを接触させる工程、
（２）工程（１）で得られたRNAプローブと対象タンパク質との結合体を単離する工程、
（３）工程（２）で単離された結合体からRNAプローブを抽出する工程、
（４）工程（３）で抽出されたRNAプローブを、支持体上にDNAバーコード配列を固定したマイクロアレイに接触させる工程、
（５）工程（４）でDNAバーコード配列とハイブリダイズしたRNAプローブを特定する工程、および、
（６）工程（５）で特定されたRNAプローブのモチーフ領域の配列を含むRNAを、当該対象タンパク質と結合するRNAとして検出する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、RNAの二次構造単位に基づいたRNAライブラリおよびそれを用いたスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質に翻訳されることなく、それ自身が機能性分子として働くRNA、いわゆる非コードRNAまたは機能性RNA が注目を集めている。例えば、機能性RNAは、タンパク質と特異的に相互作用し、RNA−タンパク質（RNP）複合体を形成し、遺伝子発現やスプライシングなどの分子機構を制御することが知られる（非特許文献１）。機能性RNAは、タンパク質と同様に、立体構造がその機能に重要であると考えられており、RNP相互作用は、RNAの構造変化によって大きく影響される。そのため、RNAの構造異常によって生じるRNAの機能の破綻が、疾患発症のリスクにも関係するとも報告されている。また、例えば、mRNAの非コード領域に存在するタンパク質発現制御配列として、内部リボソーム進入部位（IRES）が知られるが、IRESの機能も、その立体構造により制御されており、立体構造の変化によって大きく影響される。このように、特定の構造を有する非コードRNAは生命の機能に重要な種々の役割を果たしており、RNAの構造に着目したRNAの機能解析は、医学・生物学の研究において必須であるといえる。【０００３】
近年、RNA Bind-n-Seq法（非特許文献２）やRNAcompete法（非特許文献３、４）などに基づくRNAライブラリを用いたRNP相互作用の解析が行われている。しかし、これらの方法では、ランダムに生成された短い人工合成RNA配列を解析対象としており、実際に生体内に存在する複雑高次なRNA構造については解析できないという問題があった。また、ヒトおよびウイルスのゲノム配列に含まれるIRESを同定する研究も行われているが（非特許文献５）、この研究では、ライブラリに含められるRNAの長さの制限により、解析対象のRNAが短いランダム配列に分割されている。そのため、元のRNA構造が保存されない一方で、実在しないRNA構造が多数ライブラリに含まれてしまい、その結果として、偽陰性・擬陽性が多く生じ、正確なRNA機能構造解析が行えないという問題があった。【０００４】
そこで、本発明者らは、生体内に実在するRNA構造を反映した機能性RNAの解析方法として、miRBaseに登録されているPre-miRNAの構造情報に基づくRNAライブラリを用いたRNP相互作用の解析方法を確立した（特許文献１）。しかし、この方法では、miRBaseに登録されているmiRNA前駆体のループ構造以外のRNA構造をライブラリに含めることができないため、ごく限られたRNA構造についてしか解析できず、汎用性が低いことが問題となっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１０５１７９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Keene, J.D., Nat. Rev. Genet., Vol. 8, pp. 533-543 (2007)
【非特許文献２】Lambert, N. et al., Mol. Cell, Vol. 54, pp. 887-900 (2014)
【非特許文献３】Ray, D. et al., Nat. Biotechnol., Vol. 27, pp. 667-670 (2009)
【非特許文献４】Ray, D. et al., Nature, Vol. 499, pp. 172-177 (2013)
【非特許文献５】Weingarten-Gabbay, S. et al., Science, Vol. 351, aad4939-aad4939 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来技術の諸問題を解消し、広範なRNAから抽出された機能構造単位を含むRNAライブラリを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、RNAの配列情報のみに基づいてRNAの機能構造単位を正確に抽出し、生体内に実在するRNA構造を再現したRNAライブラリを作製することに成功した。【０００９】
すなわち、本発明は、以下を提供する。
［１］以下の工程を含むRNAプローブの調製方法：
（１）RNAの配列情報に基づいてRNA中に含まれる１または複数のステム構造を認識する工程、
（２）認識された前記１または複数のステム構造を基準としてモチーフ領域を抽出する工程、
（３）抽出された前記モチーフ領域に、第一の補助ステム部分配列と第二の補助ステム部分配列とを付加する工程、ここで、第二の補助ステム部分配列は、第一の補助ステム部分配列に対して相補的な配列であって、第一の補助ステム部分配列とハイブリダイズして二本鎖補助ステムを形成する、および、
（４）前記補助ステム領域に、DNAバーコード配列に対する相補配列であるバーコード領域を付加する工程。
［２］前記工程（２）が、
（２ａ）認識された前記ステム構造から１または複数を選択する工程、
（２ｂ）選択されたステム構造を仮想ループ構造に置き換える工程、および、
（２ｃ）選択するステム構造を変更して前記（２ａ）〜（２ｂ）を繰り返す工程
を含む、［１］に記載の調製方法。
［３］以下の（１）〜（３）の領域を含むRNAプローブ：
（１）DNAバーコード配列に対する相補配列であるバーコード領域、
（２）第一の補助ステム部分配列と第二の補助ステム部分配列とを含み、ここで、第二の補助ステム部分配列は、第一の補助ステム部分配列に対して相補的な配列であって、第一の補助ステム部分配列とハイブリダイズして二本鎖補助ステムを形成する補助ステム領域、および、
（３）第一の補助ステム部分と第二の補助ステム部分とを連結する領域であって、多分岐ループ部分を有する高次構造を形成する配列を含むモチーフ領域。
［４］前記DNAバーコード配列に対する相補配列が、補助ステム領域および／またはモチーフ領域との間で塩基対または擬似ノット形成をしない配列である、［３］に記載のRNAプローブ。
［５］前記DNAバーコード配列に対する相補配列の5’末端が、ウラシル以外の塩基である、［３］または［４］に記載のRNAプローブ。
［６］3’末端を蛍光標識された、［３］〜［５］のいずれか１項に記載のRNAプローブ。
［７］［３］〜［６］のいずれか１項に記載のRNAプローブを複数含み、前記複数のRNAプローブがそれぞれ異なる配列のモチーフ領域を含む、RNAプローブライブラリ。
［８］支持体上にDNAバーコード配列を固定したマイクロアレイと、［７］に記載のRNAプローブライブラリとを含む、RNA分析用キット。
［９］支持体上にDNAバーコード配列を固定したマイクロアレイと、［７］に記載のRNAプローブライブラリとをハイブリダイズさせることにより製造される、RNAマイクロアレイ。
［１０］以下の工程を含む、タンパク質と結合するRNAを検出する方法：
（１）請求項［３］〜［６］のいずれか１項に記載のRNAプローブと対象タンパク質とを接触させる工程、
（２）工程（１）で得られたRNAプローブと対象タンパク質との結合体を単離する工程、
（３）工程（２）で単離された結合体からRNAプローブを抽出する工程、
（４）工程（３）で抽出されたRNAプローブを、支持体上にDNAバーコード配列を固定したマイクロアレイに接触させる工程、
（５）工程（４）でDNAバーコード配列とハイブリダイズしたRNAプローブを特定する工程、および、
（６）工程（５）で特定されたRNAプローブのモチーフ領域の配列を含むRNAを、当該対象タンパク質と結合するRNAとして検出する工程。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、RNAの機能構造単位が分断されることなくRNAライブラリに含まれるため、従来では解析が困難であった、複数のループ構造を含む大きなRNA構造単位の機能を解析することが可能となる。また、RNAの機能構造単位をRNAの配列情報のみに基づいて抽出できることから、広範なRNAから抽出された機能構造単位を解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、従来公知のRNAライブラリ調製方法の概要を示す図である。
【図２】図２は、本発明のRNA構造ライブラリ調製方法の概要を示す図である。
【図３】図３は、LIN28A結合性モチーフの構造解析の結果を示す図である。
【図４】図４は、新規および公知のLIN28A結合性モチーフの構造を示す図である。
【図５】図５は、新規LIN28A結合性モチーフのLIN28A結合親和性を評価したゲルシフトアッセイの結果を示す図である。
【図６】図６は、HEK293FT細胞から得た細胞懸濁液について、抗eIF3b抗体を用いて行った共免疫沈降の結果を示す図である。
【図７】図７は、抗eIF3b抗体を用いた共免疫沈降により濃縮されたRNA構造の傾向を示す図である。
【図８】図８は、LIN28Aを用いた免疫沈降により濃縮されたRNA構造の傾向を示す図である。
【図９】図９は、eIF3複合体に対する結合親和性ランキング上位のRNAの二次構造を示す図である。
【図１０】図１０は、eIF3複合体に対する結合親和性ランキング下位のRNAの二次構造を示す図である。
【図１１】図１１は、2回の独立したスクリーニングにより検出された、各RNA構造に対応する蛍光強度をプロットした散布図である。
【図１２】図１２は、HIV-1 gag IRESの構造を示す図である。
【図１３】図１３は、スクリーニングで上位にランクされたRNAのeIF3複合体に対する結合親和性を確認したプルダウンアッセイの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
【００１３】
本発明は、以下の工程を含むRNAプローブの調製方法を提供する：
（１）RNAの配列情報に基づいてRNA中に含まれる１または複数のステム構造を認識する工程、
（２）認識された前記１または複数のステム構造を基準としてモチーフ領域を抽出する工程、
（３）抽出された前記モチーフ領域に、第一の補助ステム部分配列と第二の補助ステム部分配列とを付加する工程、ここで、第二の補助ステム部分配列は、第一の補助ステム部分配列に対して相補的な配列であって、第一の補助ステム部分配列とハイブリダイズして二本鎖補助ステムを形成する、および、
（４）前記補助ステムに、DNAバーコード配列に対する相補配列であるバーコード領域を付加する工程。
【００１４】
従来公知のRNAライブラリ調製方法の概要を図１に、本発明のRNAプローブの調製方法の概要を図2aに示す。図2aに示すように、本発明のRNAプローブの調製方法は、任意のRNAの配列情報からRNAの機能構造単位であるモチーフ領域を抽出して、RNAの機能構造単位に基づいたRNAプローブを調製するものである。
【００１５】
本発明のRNAプローブとは、対象となる物質と相互作用する可能性がある配列を有するRNAを含む核酸分子、好ましくは、RNAからなる核酸分子である。本発明において、対象となる物質は、好ましくは、タンパク質である。
【００１６】
本発明のRNAプローブの調製方法では、RNAの配列情報に基づいて、RNA中に含まれる１または複数のステム構造を認識する。
【００１７】
本発明において、「ステム構造」とは、RNAに含まれる任意の核酸配列と当該核酸配列に対して相補的な配列とにより形成される二重らせん構造を意味する。本発明において、「相補的」とは、２つの核酸配列がハイブリダイズする能力を意味し、２つの配列がハイブリダイズすればよいことから、ステム構造を構成する２つの核酸配列は、少なくとも70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、99 %、または100 %の配列相補性を有していればよい。
【００１８】
本発明のRNAプローブの調製方法において、RNA中のステム構造は、例えばCentroidFold（Hamada, M. et al., Bioinformatics, Vol. 25, pp 465-473, 2009）やIPknot（Sato, K. et al., Methods Biochem. Anal., Vol. 27, pp. i85-i93, 2011）などのRNA二次構造予測ソフトを用いて認識することができる。
【００１９】
本発明のRNAプローブの調製方法において、RNAの配列情報には任意のものを使用することができ、例えば、UTRdb（Grillo, G. et al., Nucl. Acids Res., Vol. 38, D75-D80, 2010）、IRESite（Mokrejs, M. et al., Nucl. Acids Res., Vol. 38, D131-D136, 2010）、GenBank（Benson, D. et al. , Nucl. Acids Res., Vol. 41, D36-D42, 2013）、RNAcentral（RNAcentral Consortium, Nucl. Acids Res., Vol. 43, D123-D129, 2015）などのRNA配列データベースからダウンロードしたものを使用することができる。また、RNAの配列情報だけでなく構造情報も含むデータベースからRNAの配列情報を入手してもよく、例えば、Rfam（Nawrocki, E. P. et al., Nucl. Acids Res., Vol. 43, D130-D137, 2015）、Structure Surfer（Berkowitz, N. D. et al., BMC Bioinformatics, Vol. 17, p. 215, 2016）などからダウンロードしたものを使用することができる。
【００２０】
次いで、認識されたRNA中のステム構造を基準として、当該RNAにおけるモチーフ領域を抽出する。
【００２１】
本発明において、「モチーフ領域」とは、RNAが対象となる物質と相互作用するための機能構造単位を意味する。本発明のRNAプローブの調製方法において抽出されるモチーフ領域は、単一のステム−ループ構造（ヘアピンループ構造）からなる場合もあれば、複数のステム−ループ構造（多分岐ループ構造）を含む場合もある。本発明のRNAプローブの調製方法では、ステム構造を基準としてモチーフ領域を抽出するため、モチーフ領域を分断することなく、RNA中に実在する機能構造単位を反映したRNAプローブを調製することができる。モチーフ領域は、その機能が維持されていることを限度として、任意の配列長であってよく、例えば500塩基以下、400塩基以下、300塩基以下、200塩基以下、150塩基以下、100塩基以下、50塩基以下であってよい。
【００２２】
ここで、モチーフ領域が複数のステム−ループ構造を含む場合、モチーフ領域を分断せずに抽出するためには、認識されたRNA中のステム構造の１または複数を選択する工程と、選択されたステム構造を仮想ループ構造に置き換える工程とを、選択するステム構造を変更して繰り返すことが好ましい。本発明において「仮想ループ構造」とは、本来ステム構造を構成する核酸配列およびその相補的な配列が、ハイブリダイズせずに一本鎖ループとして存在するとして仮定された構造である。選択するステム構造を変更して上記工程を繰り返すことにより、複数のステム−ループ構造を含み複雑な高次構造を形成するモチーフ領域についても正確に抽出することが可能となる。
【００２３】
次いで、抽出された前記モチーフ領域に、第一の補助ステム部分配列と第二の補助ステム部分配列とを付加する（図2bおよび2c）。第一の補助ステム部分と第二の補助ステム部分はハイブリダイズし、二本鎖補助ステムを形成する。ここで、第一の補助ステム部分配列は任意の核酸配列であってよく、第二の補助ステム部分配列は、当該第一のステムと相補的な配列であれば、任意の核酸配列であってよい。例えば、第一の補助ステム部分配列としては配列番号２に示される配列を、第二の補助ステム部分配列としては配列番号３に示される配列を、それぞれ使用することができる。以下に記載するように、本発明では、RNAプローブの3’末端に蛍光色素標識されたシチジン（3’,5’-cytidine bisphosphate-Cy5（pCp-Cy5））を付加させることが好適であることから、第一の補助ステム部分配列の5’末端にはグアニン（Ｇ）を付加することが望ましい。蛍光色素標識をシチジン（Ｃ）以外の塩基に対して標識する場合は、第一の補助ステム部分配列の5’末端には、対合する塩基を選択して付加することが望ましい。
【００２４】
さらに、前記補助ステムに、DNAバーコード配列に対する相補配列であるバーコード領域を付加する（図2bおよび2c）。本発明のDNAバーコード配列には、タグ（特表平10-507357号公報、特表2002-518060号公報）、ジップコード（特表2001-519648号公報）もしくは正規直交化配列（特開2002-181813号公報）、バーコード配列（Xu, Q. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 106, pp. 2289-2294, 2009）などを使用できる。DNAバーコード配列は、交差反応性（クロスハイブリダイゼーション）が少ないことが望ましい。また、DNAバーコード配列は、20〜30塩基の配列であることが好ましく、特に好ましくは25塩基である。
【００２５】
本発明のRNAプローブは、上記工程によりその配列が決定されれば、従来公知の任意の遺伝子工学的方法により合成されることができる。好ましくは、RNAプローブは、合成の受託業者に委託して合成された鋳型DNAを転写することによって作製することができる。DNAからのRNAへの転写を行うため、RNAプローブの配列を含むDNAは、プロモーター配列を有していても良い。特に限定されないが、好ましいプロモーター配列として、T7プロモーター配列が例示される。T7プロモーター配列を用いた場合、例えば、ライフテクノロジーズ社より提供されるMEGAshortscript（商標） T7 Transcription Kitを用いて所望のRNAプローブ配列を有するDNAよりRNAを転写行うことができる。本発明において、RNAは、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルのみならず、修飾RNAであってもよい。修飾RNAは、例えば、プソイドウリジン、５−メチルシトシン、５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２−チオウリジン、およびＮ６−メチルアデノシンが例示される。
【００２６】
本発明のRNAプローブの調製方法によれば、モチーフ領域を分断することなくRNAプローブ中に含めることができ、RNAプローブ中のモチーフ領域は、RNA中に実在する高次構造を再現することができる。
【００２７】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（３）の領域を含むRNAプローブを提供する：
（１）DNAバーコード配列に対する相補配列であるバーコード領域、
（２）第一の補助ステム部分配列と第二の補助ステム部分配列とを含み、ここで、第二の補助ステム部分配列は、第一の補助ステム部分配列に対して相補的な配列であって、第一の補助ステム部分配列とハイブリダイズして二本鎖補助ステムを形成する補助ステム領域、および、
（３）第一の補助ステム部分と第二の補助ステム部分とを連結する領域であって、多分岐ループ部分を有する高次構造を形成する配列を含むモチーフ領域。
【００２８】
本発明のRNAプローブに含まれるモチーフ領域には、上記のRNAプローブの調製方法により、任意のRNA配列情報から抽出したものを用いることができる。または、本発明のRNAプローブに含まれるモチーフ領域には、RNAストラクチュローム研究によりすでに特定された任意のRNA二次構造データから選択されたものを用いてもよい。
【００２９】
本発明のRNAプローブは、DNAバーコード配列に対する相補配列が、補助ステム領域および／またはモチーフ領域との間で塩基対または擬似ノット形成をしない配列であることが好ましい。塩基対または擬似ノット形成をしない配列は、例えば、IPknot（Sato, K. et al., Methods Biochem. Anal., Vol. 27, pp. i85-i93, 2011）などのRNA二次構造予測ソフトを用いることにより選択することができる。
【００３０】
本発明のRNAプローブは、DNAバーコード配列に対する相補配列の5’末端が、ウラシル以外の塩基であることが好ましい。これにより、鋳型DNA からRNAプローブへの転写効率のばらつきを防ぐことができるため、RNAプローブライブラリを調製するために複数のRNAプローブを同時に合成する上で、好ましい。
【００３１】
本発明のRNAプローブは、検出のために、蛍光色素（例えば、FITC、PE、Cy3、Cy5など）、放射性同位体、ジゴキシゲニン（DIG）、ビオチンなどにより標識されてよい。標識は、予め標識した核酸をプローブ合成時に取り込ませることによって行うことができ、例えば、第一の補助ステム部分配列の5’側に設置されたグアニン（Ｇ）に対して相補的であるシチジン（Ｃ）を蛍光標識し（例えばpCp-Cy5）、3’末端に取り込ませることで標識することができる。
【００３２】
また、本発明は、それぞれ異なる配列のモチーフ領域を含む複数のRNAプローブを含むRNAプローブライブラリを提供する。本発明では、RNAプローブを有するマイクロアレイを準備するためには、多種類のRNAプローブを同時に用意することが好ましく、効率的にRNAプローブを含有するオリゴ核酸ライブラリ合成（Oligonucleotide Library Synthesis）技術を用いて行うことが好ましい。本発明において特に限定されないが、Oligonucleotide Library Synthesisは、Agilent Technologies社に委託することによって作製することができる。
【００３３】
本発明のRNAプローブライブラリは、支持体上にDNAバーコード配列を固定したマイクロアレイと組み合わせて、RNA分析用キットとして提供することができる。RNA分析用キットには、適宜追加の構成、例えば、緩衝液、容器、使用説明書などを含めてもよい。
【００３４】
または、本発明のRNAプローブライブラリは、支持体上にDNAバーコード配列を固定したマイクロアレイとハイブリダイズさせて、RNAマイクロアレイとして提供することができる。
【００３５】
本発明において、DNAバーコード配列を固定するための支持体としては、シリコンなどの半導体、ガラス、ダイヤモンドなどの無機物、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン等の高分子物質を主成分とするフィルムなどを使用することができる。また、基板の形状としては、スライドガラス、マイクロウェルプレート、マイクロビーズ、繊維型などが挙げられるが、それらに制限されない。
【００３６】
支持体にDNAバーコード配列を付加する方法としては、予めDNAバーコード配列を有する核酸にアミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチンなどの官能基を導入しておき、一方、支持体にも該核酸と反応し得る官能基（例えば、アルデヒド基、アミノ基、SH基、ストレプトアビジンなど）を導入し、両官能基間の共有結合で固定化用支持体と核酸を架橋する方法や、ポリアニオン性の核酸に対して、固定化用支持体をポリカチオンコーティングして静電結合を利用して核酸を固定化する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。DNAバーコード配列の調製法としては、フォトリソグラフィー法を用いて核酸プローブを基板（例えば、ガラス、シリコンなど）上で1ヌクレオチドずつ合成するAffymetrix方式と、マイクロスポッティング法、インクジェット法、バブルジェット（登録商標）法などを用いて、予め調製されたDNAバーコード配列を有する核酸を基板上にスポッティングするStanford方式とが挙げられるが、30mer以上のプローブを用いる場合にはStanford方式、あるいは両者を組み合わせた手法を用いることが好ましい。DNAバーコード配列を付加された固定化用支持体は、受託業者に委託して作製することができる。
【００３７】
本発明のRNAプローブライブラリは、支持体上にDNAバーコード配列を固定したマイクロアレイとハイブリダイズさせることによって、支持体とRNAプローブを特異的に結合させることができる。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズ用の溶液の塩濃度、温度、プローブ濃度、反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度などを適宜変更して実施することができる。
【００３８】
本発明のRNAプローブライブラリを同一の支持体（例えば、1インチ×3インチのガラススライド）上にスポットすることが可能であり、例えば、500以上、1000以上、2000以上、3000以上、4000以上、5000以上、10000以上など、DNAマイクロアレイと同様の密度でRNAプローブ有するRNAマイクロアレイを提供することができる。
【００３９】
本発明のRNAマイクロアレイに対し、溶媒中で任意のタンパク質を供することで、当該タンパク質に対して結合するRNAプローブを検出することができる。この際、溶媒は、例えば、Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, 5 mM MgCl2, 0.1% Tween-20を含有する水溶液などであってよい。また、マイクロアレイに供する対象タンパク質の濃度は、5 nM、10 nM、20 nM、30 nM、40 nM、50 nM、60 nM、70 nM、80 nM、90 nM、100 nMであってよく、好ましくは、40 nM以下である。タンパク質の結合を検出するために、タンパク質は蛍光色素（例えば、FITC、PE、Cy3、Cy5など）、放射性同位体、ジゴキシゲニン（DIG）、ビオチンなどにより標識されていてよい。また、タンパク質に対する標識は、RNAプローブに対する標識とは異なることが好ましい。例えば、RNAプローブはCy5で標識され、タンパク質はCy3で標識されることができる。
【００４０】
また、本発明は、以下の工程を含む、タンパク質と結合するRNAを検出する方法を提供する：
（１）本発明のRNAプローブと対象タンパク質とを接触させる工程、
（２）工程（１）で得られたRNAプローブと対象タンパク質との結合体を単離する工程、
（３）工程（２）で単離された結合体からRNAプローブを抽出する工程、
（４）工程（３）で抽出されたRNAプローブを、支持体上にDNAバーコード配列を固定したマイクロアレイに接触させる工程、
（５）工程（４）でDNAバーコード配列とハイブリダイズしたRNAプローブを特定する工程、および、
（６）工程（５）で特定されたRNAプローブのモチーフ領域の配列を含むRNAを、当該対象タンパク質と結合するRNAとして検出する工程。
【００４１】
本発明の方法では、前記RNAプローブと対象タンパク質とを接触させる。この工程は、上記のRNAマイクロアレイとタンパク質との結合と同様の条件で行うことができる。この工程で使用するRNAプローブの量は、100 μg以下でよく、好ましくは、1 μgである。この工程で使用する対象タンパク質の量は、1 pmol、2 pmol、3 pmol、4 pmol、5 pmol、10 pmol、20 pmol、30 pmol、40 pmol、50 pmol、60 pmol、70 pmol、80 pmol、90 pmol、100 pmolであってよく、好ましくは20 pmol以下である。
【００４２】
次いで、RNAプローブと対象タンパク質との結合体を単離する。結合体の単離を容易にするために、対象タンパク質をレジンや磁性ビーズなどの担体に結合させてもよい。対象タンパク質を結合させるため、当該担体は、プロテイン A、G、または L、金属イオン（例えば、銅、ニッケル、亜鉛、コバルトのイオン）、ビオチン、グルタチオンなどと交差結合またはコーティングされていることが好ましい。対象タンパク質を担体と結合させるために、対象タンパク質にHisタグまたは GSTタグを付してもよいし、対象タンパク質に特異的な抗体を用いてもよい。
【００４３】
次いで、単離された結合体からRNAプローブを抽出する。RNAプローブの抽出は、従来公知の核酸抽出法により行うことができる。
【００４４】
次いで、抽出されたRNAプローブを、支持体上にDNAバーコード配列を固定したマイクロアレイに接触させ、DNAバーコード配列とハイブリダイズしたRNAプローブを特定する。この工程は、上で記載したのと同様にして行うことができる。
【００４５】
本発明のRNAプローブは、モチーフ領域を分断することなくRNAプローブ中に含み、元のRNAの機能を反映している。そのため、本発明の方法によれば、DNAバーコード配列とハイブリダイズしたRNAプローブのモチーフ領域の配列を含むRNAを、当該対象タンパク質と結合するRNAとして検出することができる。
【実施例】
【００４６】
以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００４７】
＜実施例１．RNA構造ライブラリの作製＞
以下に示す手順により、ヒト５’UTRについてのRNA構造ライブラリと、HIV-1ゲノムについてのRNA構造ライブラリとを作製した。【００４８】
＜１−１．ヒト５’UTRのRNA構造ライブラリの作製＞
Ａ．RNA構造配列の選択
UTRdb（Grillo, G. et al., Nucl. Acids Res., Vol. 38, D75-D80, 2010）に登録されているヒトの5’UTRの全配列情報をダウンロードした。RNAの二次構造予測の正確性および以下の検証実験においてレポーターmRNAを作製する際のコストと難易度を考慮して、5’UTRの全長が400ヌクレオチド以下の配列のみを選択した。選択した配列について、RNAの二次構造予測を行った。ソフトウェアとしてはCentroidFold（Hamada, M. et al., Bioinformatics, Vol. 25, pp 465-473, 2009）を使用した。なお、オプションのgammaは4に設定した。【００４９】
RNAの二次構造を、以下のアルゴリズムにより認識した。
（1）入力されたRNA配列から予測された二次構造に含まれるヘアピンループ構造を認識する。
（2）認識されたヘアピンループ構造を中心として、RNA構造を分割する。この作業を認識されたすべてのヘアピンループ構造について繰り返す。その結果、n個のヘアピンループ構造が認識された場合には、n+1個のRNA断片が形成される（nは自然数）。
（3）n個目のヘアピンループ構造に着目する。n個目のヘアピンループ構造は、第一のステム部分を含むn個目のRNA断片と、第一のステム部分に相補的な第二のステム部分を含むn+1個目のRNA断片とから構成される。すなわち、n個目のRNA断片とn+1個目のRNA断片とを結合させることにより、末端にステム構造を持つRNA構造が選択される。この構造を記録する。
（4）上記選択されたRNA構造中の二本鎖構造（ステム部分）を一本鎖構造（仮想ループ）に置き換える。
（5）（1）〜（4）を繰り返す。
（6）一本鎖構造に置き換えた部分を二本鎖構造に戻す。これにより、多分岐ループを持つRNA構造が選択される。
（7）ライブラリのサイズ上限（116塩基）に収まるようにステム構造を短くする。【００５０】
ライブラリのスケールを調整するために、以下の基準により、ライブラリに含まれるRNA構造の総数を9,000種類以下になるように選別した。
（1）UTRdbから、種間で保存された配列の情報を得た。
（2）種間で保存された配列のうち、選択されたRNA構造配列と重複がないものを排除した。
（3）配列の位置座標を定義した。RNA構造の5’ 末端をL、3’ 末端をR、種間で保存された配列の5’ 末端をLc, 3’ 末端をRcとした。これらの値は、元の5’UTR配列の5’ 末端から数えた数値で表される。
（4）種間で保存された配列よりもRNA構造配列の方が長い場合: L <= Lc+2塩基 かつ Rc-2 <= R  かつ (Rc-Lc) / (R-L) が0.13より大きい場合に採用する。
（5）RNA構造配列よりも種間で保存された配列の方が長い場合: Lc <= L+4塩基かつ R-4塩基 <= Rc かつ (R-L)/(Rc-Lc) が0.5865より大きい場合に採用する。
（6）RNA構造配列と種間で保存された配列の長さが等しい場合: Lc <= L+4塩基かつ R-4塩基 <= Rc かつ (Rc-Lc) / (R-L) が0.13より大きい場合に採用する。
（7）最終的に選ばれたRNA構造の中にはIRE (Iron response element) やBTG1の5’ UTRに存在する細胞内でeIF3に相互作用する既知の機能を有するRNA構造が含まれた。
（8）ライブラリの余った枠には、LIN28A、MS2、Roquine、L7Ae、U1AなどのRNA結合性タンパク質が結合するRNA構造をポジティブコントロールとして採用した。【００５１】
Ｂ．RNAプローブの調製
選別したRNAに、マイクロアレイでの解析のための補助配列を付加し、RNAプローブを調製した。RNAプローブは、鋳型DNAをin vitro転写することにより調製した。鋳型DNAは、5’末端から順に、（i）CC + T7 promoter + G（24塩基）、（ii）バーコード配列（25塩基）、（iii）G + Stem forward sequence（18塩基）、（iv）RNA構造配列（6〜116塩基）、および（v）Stem reverse sequence（17塩基）を含むように設計された。【００５２】
（i）CC + T7 promoter + G（24塩基）
5’-CCGCGCTAATACGACTCACTATAG- 3’（配列番号１）
（ii）バーコード配列（25塩基）
バーコード配列は、先行技術文献（Xu, Q. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 106, pp. 2289-2294, 2009）に開示された240,000種の25塩基長のDNA配列のうち、5’末端の1塩基目が Uである配列を除いた配列から、以下の（1）〜（3）に基づいて選択したものを用いた。バーコード配列は、各RNA構造配列につき3種類選択して使用した。3種類の異なるバーコード配列を使用することによって、バーコード配列がRNA構造配列とタンパク質との結合に与える影響およびハイブリダイゼーション効率の蛍光強度に対する影響を、統計処理により考慮することができる。
（1）RNA構造配列に補助配列を付加したRNA配列に対してIPknot（オプション：-g4 -g8）を適用する。
（2）RNA構造配列とバーコード配列とが塩基対・疑似ノットを形成しないことを確認する。
（3）バーコード配列とStem forward sequenceとが塩基対・疑似ノットを形成しないことを確認する。
（iii）G + Stem forward sequence（18塩基）
5’-GGTGTACGAAGTTTCAGC- 3’（配列番号２）
（iv）RNA構造配列（6〜116塩基）
上記アルゴリズムにより選択された配列を使用した。
（v）Stem reverse sequence（17塩基）
5’-GCTGAAGCTTCGTGCAC- 3’（配列番号３）【００５３】
上記のように設計した鋳型一本鎖DNAを、Agilent Technologies社に委託して合成した。鋳型DNAは、Library forward Primer（配列番号４）およびLibrary reverse Primer（配列番号５）を用いたPCRにより、適宜増幅した。鋳型一本鎖DNAについて、in vitro転写系（MEGAshortscriptTMT7 Transcription Kit, Thermo Fisher Scientific）における転写反応を行い、RNAプローブを調製した。20 μLの反応溶液（1×T7 Reaction Buffer、7.5 mM GTP Solution、7.5 mM ATP Solution、7.5 mM CTP Solution、7.5 mM UTP Solution、1×T7 Enzyme Mix、37.5 nM鋳型一本鎖DNA、2.5 μM CC-T719-G ssDNA（5’-CCGCGCTAATACGACTCACTATAG- 3’：配列番号１））を、37 ℃で20時間インキュベートした。その後、反応溶液にTURBO DNase（Thermo Fisher Scientific）を2 μL加えて混合し、37 ℃で15分間インキュベートした。15 μLのAmmonium Acetate Stop Solution（5M酢酸アンモニウム, 100 mM EDTA）を加え、反応を停止した。RNeasy MinElute Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて反応液を精製し、最終的に30 μL弱のRNAプローブ溶液を得た。【００５４】
Ｃ．RNAプローブのCy5蛍光ラベル
T4 RNA ligase（Thermo Fisher Scientific）により、RNAプローブの3’末端にpCp-Cy5（Jena Bioscience）を付加した。Cy5ラベルされたRNAプローブを、RNeasy MinElute Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて精製した。RNA濃度は260 nmの吸光度を、ラベルされたCy5濃度は650 nmの吸光度を、それぞれNanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific）により測定して決定した。【００５５】
Ｄ．25 mer DNAバーコードをスポットしたカスタムアレイの設計 
各RNAプローブに対して付加されたバーコード配列に対する相補鎖一本鎖DNAを調製し、CGH カスタムアレイ 8×60K (Agilent) にスポットを配置した。各RNAプローブにつき、2スポットずつ配置した。【００５６】
Ｅ．DNAマイクロアレイによるRNA構造ライブラリのスキャン
Cy5ラベルされたRNAプローブ16 ngを超純水18 μLに溶解し、4.5 μLの10×Blocking Agent（Agilent）と22.5 μLのRPM Hybridization Buffer（Agilent）を加え、混合した。104℃のヒートブロック上で5分間インキュベート後、氷上で5分間インキュベートした。8×60K アジレントマイクロアレイガスケットスライド（Agilent）に反応液の全量をアプライした。ハイブリダイゼーションチャンバ（Agilent）に、ガスケットスライドとCGH カスタムアレイ 8×60K（Agilent）を固定し、事前に55.5℃に加温されたハイブリダイゼーションオーブン（Robbins Scientific）に入れ、20 rpm、20時間のハイブリダイゼーション処理を行った。ガスケットスライドを取り出し、Gene Expression Wash Buffer 1（Agilent）で室温にて5分間洗浄し、Gene Expression Wash Buffer 2（Agilent）で37℃にて5分間洗浄した。スライドをスライドホルダーにはめ、SureScan（Agilent）を用いてAgilentG3_GX_2colorの設定で画像データを得た。ソフトウェア Feature Extraction（Agilent）でスポット別の蛍光強度のデータを得た。データはGene Spring（Agilent）に加え、Python、Juliaで記述したスクリプトにより解析を行った。Cy5の蛍光が、RNAプローブに対応するバーコード配列のスポットから検出されることを確認することにより、対応するスポットにRNAプローブが結合していることを確認した。【００５７】
＜１−２．HIV-1ゲノムのRNA構造ライブラリの作製＞
ヒト５’UTRに代えてHIV-1ゲノムを用いた以外は、１−１と同様にしてHIV-1ゲノムのRNA構造ライブラリを作製した。HIV-1ゲノムのRNA構造データは、SHAPE-MaP（Siegfried, N. A. et al., Nat. Methods, Vol. 11, pp. 959-965, 2014）により解析されたデータを使用した。RNA Structure（http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/index.html）で公開されているアルゴリズム「RemovePseudoKnots」を用いて、RNA構造情報を擬似ノットを考慮しない二次構造情報に変換し、さらに、同サイトで公開されているアルゴリズム「ct2dot」によりdot-blacket formatに変換した。【００５８】
＜実施例２．RIP-Chip法によるLIN28A結合性RNA配列の解析＞
ヒト５’UTRのRNA構造ライブラリおよびHIV-1ゲノムのRNA構造ライブラリを用いて、RIP-Chip法によりLIN28A結合性RNA配列の解析を行った。【００５９】
＜２−１．RNA免疫沈降＞
TALON Magnetic beads（Clontech）20 μL、Hisタグが付与された精製LIN28Aタンパク質20 pmolおよびCy5-RNAプローブ1 μgを、500 μLのProtein Binding Buffer（20 mM Hepes pH 7.8, 80 mM KCl, 20 mM NaCl, 10 % glycerol, 2 mM DTT, 0.2 μg/μL BSA）中で混合させた。その後、MACSmix Tube Rotator（Miltenyi Biotec）を用いて30分間、4 ℃にて撹拌した。その後、12-Tube Magnet（QIAGEN）を用いてTALON Magnetic beadsを保持し、溶液を除去した。Protein Binding BufferによりTALON Magnetic beadsを3回洗浄後、Elution Buffer（1 % SDS, 10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA）200 μLを加え、95 ℃で3分間インキュベートすることにより、LIN28Aタンパク質−RNAを溶出した。【００６０】
＜２−２．RNAの抽出および精製＞
上記溶液にPhenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 Mixed, pH 5.2（ナカライテスク）200 μLを加え、懸濁後、4 ℃、20,400×g で5分間遠心を行い、水層を約150 μL回収した。回収した水層にクロロホルム150μLを加え、懸濁後、4 ℃、20,400×g で5分間遠心を行い、水層を約100 μL回収した。回収した水層に100 %エタノールを200 μL、エタチンメイト（ニッポンジーン）を1 μL、3 M 酢酸ナトリウムを3.3 μL加え、-80℃で15分インキュベート後、4 ℃、20,400×g で15分遠心を行い、RNAを単離した。単離したRNAは80 %エタノールでリンス後乾燥させ、超純水20 μLに溶解させた。【００６１】
＜２−３．DNAマイクロアレイによるヒト５’UTRのRNA構造ライブラリのスキャン＞
得られたRNA溶液18 μLを用いて、上記１−１−Ｅと同様の手順により、マイクロアレイによるスキャニングを行った。結果の一部を表１に示す。既知のLIN28A結合性RNAであるhsa-let-7dのpre-miRNAのループ構造（配列番号６）（ランク15位）およびhsa-mir-98のpre-miRNAのループ構造（配列番号７）（ランク5位）が高順位で検出された一方、LIN28Aに結合しないことが知られているhsa-let-7a-3のpre-miRNAのループ構造（配列番号８）は、非常に低い順位となった（ランク6278位）。この結果から、本方法によってLIN28Aに対するRNA構造の結合能の評価が正常に実行可能であることが示された。【００６２】
表１．LIN28Aに対する結合親和性ランキング
【表１】
2018003809.tif 000002
【００６３】
＜２−４．RBPmotifによるモチーフ解析＞
LIN28Aに対する結合親和性が上位100位にランクされたRNA配列と下位500位にランクされたRNA配列をRBPmotif web server（http://www.rnamotif.org）に入力し、モチーフ解析を行った。結果を図3に示す。既知のLIN28A結合性モチーフと類似する結合モチーフとして、例えばGGAGなどが得られた（図3a）。また、これらのモチーフは、一本鎖領域に非常に多く存在することが明らかになった（図3b）。【００６４】
＜２−５．新規に発見したRNA構造のLIN28Aに対する結合親和性＞
上記２−３において得られた2位のRNA構造（配列番号９）に着目した。この構造は、GYG1の5’UTRに含まれるRNA構造である（以下、Rank2-GYG1と記載する、図4a）。Rank2-GYG1は、hsa-let-7dのpre-miRNAのループ（図4b）およびhsa-mir-98のpre-miRNAのループ（図4c）と、配列・構造ともに類似していることが明らかになった。Rank2-GYG1のLIN28Aに対する結合親和性を、EMSA（Electrophoresis Mobility Shift Assay）により確認した。まずRank2-GYG1、hsa-mir-98の前駆体のループ構造、hsa-let-7dの前駆体のループ構造、およびhsa-let-7a-3の前駆体のループ構造に対してステム構造を付与したRNAプローブを設計した。この配列の5’末端にCC + T7 promoter配列を付加し、その相補鎖を鋳型一本鎖DNAとして合成した（Greinerに委託）。T7-19mer（Greinerに委託合成）を用い、in vitro転写合成を上記１−１−Ｂと同様の手順により行った。【００６５】
EMSAは、以下の手順により行った。RNA溶液を95 ℃で5分間インキュベートした後、室温で10分間インキュベートした。次に、反応液（100 nM RNA、1.2, 0.6, 0.3, 0 μM LIN28A、1×Protein Binding Buffer（20 mM Hepes pH 7.8, 80 mM KCl, 20 mM NaCl, 10 % glycerol, 2 mM DTT, 0.2 μg/μL BSA））を調製し、室温で60分間インキュベートした。反応後、10× loading dye（0.25 % bromophenol blue、30 % glycerol）を1.2 μL 加えて混合した。15 mAでプレランを5分間行った後、非変性10 %ポリアクリルアミドゲルに混合液をアプライし、15 mA、30分間の電気泳動を行った。泳動後のゲルを、SYBR Green I及びIIで染色した。Gel Doc EZ （Bio-Rad）により撮像し、バンドを確認した。【００６６】
結果を図5に示す。非結合のRNAバンドの退行の程度から結合強度を判断した結果、Rank2-GYG1は、強い親和性をもってLIN28Aに結合することが明らかになった。【００６７】
＜実施例３．RIP-Chip法によるeIF3b結合性RNA配列の解析＞
ヒト５’UTRのRNA構造ライブラリおよびHIV-1ゲノムのRNA構造ライブラリを用いて、RIP-Chip法によりeIF3b結合性RNA配列の解析を行った。【００６８】
＜３−１．細胞溶解液の調製＞
HEK293FT細胞を10 cm dishに1.0×105/mLの濃度で播種した。48〜72時間の培養後、培地を除去し、PBSにより洗浄した。PBSを5 mL加えて細胞をセルスクレイパーで剥がし、50 mLチューブに回収した。4 ℃、300×gで５分間遠心し、上清を除去した。細胞のペレットに氷冷したPBSを加えて再懸濁し、4 ℃、300×gで５分間遠心し、上清を除去し、細胞のペレットを得た。細胞のペレットに10 mLのCell lysis buffer（NP40 Cell Lysis buffer（Thermo fisher Scientific）9 mL, Protease Inhibitor Cocktail（SIGMA）1 mL, PMSF 174.2 μL）を加え、氷上にて30分間インキュベートした。この間、10分おきに10秒間のボルテックス処理を行った。その後、4 ℃、13,000 rpmで10分間遠心した。上清を回収し、それらを-80 ℃にて凍結保存した。【００６９】
＜３−２．共免疫沈降とウエスタンブロッティング＞
Dynabeads Protein A Immunoprecipitation Kit（Thermo fisher Scientific）を主に使用し、メーカー推奨のプロトコルに準じた手順により共免疫沈降を行った。再懸濁した50 μL のDynabeadsを1.5 mL チューブに分注し、磁気ラックにチューブを設置して上清を取り除いた。200 μLのAb Binding Bufferと20 μLのウサギ抗eIF3b抗体（Bethyl, 0.2 mg/mL）を加え、常温で13分間チューブローテーターにより撹拌した。磁気ラックにチューブを設置して上清を取り除き、Kit付属のBinding/Washing Bufferを200 μL加えてDynabeads−抗体複合体を洗浄した。Bufferを除去し、回収した細胞溶解液（700 μg/μL）を1000 μLを加え、4 ℃で1時間チューブローテーターにより撹拌した。磁気ラックにチューブを設置して上清を取り除き、Washing BufferによりDynabeads−抗体−結合タンパク質複合体を3回洗浄した。20 μLのElution Bufferと20 μLの還元剤入り 6×SDS Sample Buffer（ナカライテスク）を加え、95 ℃で5分間インキュベートし、室温で15分間インキュベートした。Dynabeadsを取り除き、上清を回収した。【００７０】
回収したサンプルをSDS-PAGEにて泳動後、iBlot（Thermo fisher Scientific）を用いてフッ化ポリビニリデン（PVDF）膜にタンパク質を転写した。転写後のPVDF膜をBlocking One（ナカライテスク）中で一晩インキュベートした後、一次抗体を加えたTBS-T（200 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI, 0.5 % Tween）中で室温にて1時間インキュベートした。一次抗体には、ウサギ抗eIF3a抗体（Bethyl）（1:1000希釈）、ウサギ抗eIF3b抗体（Bethyl）（1:2000希釈）、またはウサギ抗eIF3d抗体（Bethyl）（1:1000希釈）を用いた。その後、抗体液を取り除き、TBS-Tにより4回洗浄後、二次抗体を加えたTBS-T中で室温にて30分間インキュベートした。二次抗体には、ヤギ抗ウサギ IgG (H + L)-HRP 複合体（Bio-Rad）（1:2000希釈）を用いた。その後、抗体液を取り除き、TBS-Tにより4回洗浄後、ECL Prime Western Blotting Detection Reagent（GE Healthcare）およびLAS4000（GE Healthcare）を用いてタンパク質を検出した。【００７１】
結果を図6に示す。eIF3a、eIF3b、eIF3dのすべてが検出され、eIF3bがeIF3aおよびeIF3dと結合していることが確認された。この結果から、上記手順により得られたeIF3複合体が、eIF3a、eIF3bまたはeIF3dに結合するRNA構造の検出に利用可能であると判断した。【００７２】
＜３−３．RNA共免疫沈降とRNAの抽出および精製＞
上記３−１および３−２と同様の手順によりDynabeads−抗体−eIF3複合体を得た。1 mLのRNP Binding Buffer（20 mM Hepes pH 7.8, 80 mM KCl, 20 mM NaCl, 10 % glycerol, 2 mM DTT, 0.2μg/μL BSA）で洗浄後、500 μLのRNP Binding BufferおよびCy5ラベルされたRNAプローブ500 ngを加え、4 ℃で1時間チューブローテーターにより撹拌した。磁気ラックにチューブを設置して上清を取り除き、500 μLのRNP Binding Bufferにより3回洗浄した。Elution Buffer（1 % SDS, 10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA）200 μLを加え、95 ℃で3分間インキュベートすることにより、eIF3複合体−RNAを溶出した。その後、上記２−２と同様の手順により精製RNA溶液を調製した。【００７３】
＜３−４．DNAマイクロアレイによるRNA構造ライブラリのスキャン＞
得られたRNA溶液18 μLを用いて、上記１−１−Ｅと同様の手順により、マイクロアレイによるスキャニングを行った。【００７４】
＜３−５．データ解析: RNAの二次構造予測と最小自由エネルギーの計算＞
ViennaRNA package 2.2.5 に含まれるソフトウェアRNAfoldを用いて、RNAの二次構造と、その構造の最小自由エネルギーを計算した。【００７５】
結果を図7に示す。この結果から、eIF3複合体に結合するRNAは、塩基数が多く長いものが多く（図7a）、かつ、最小自由エネルギーが低い、すなわち分子内で二本鎖構造を形成しているものが多いことが示された（図7b）。なお、これは、実施例２において得られたLIN28Aに結合するRNAにみられる傾向とは全く異なるものである（図8）。【００７６】
eIF3複合体に対する結合親和性が上位（1〜16位）にランクされたRNA配列と下位（8615〜8630位）にランクされたRNAについて、RNA構造を描画した。結果を図9および図10に示す。上位にランクされたRNAはいずれも長く、堅牢な二次構造を形成していた（図9）。これに対し、下位にランクされたRNAは、短く、単調なヘアピンループ構造をとるものが多かったが、長いRNAであっても結合親和性が低いものもあった（図10）。この結果から、結合親和性は、RNA中の配列モチーフやその他の構造的な特徴に依存することが理解された。【００７７】
＜３−６．HIV-1ゲノムにおけるeIF3b結合性RNA構造モチーフの検出＞
マイクロアレイによるスキャニングの結果のうち、HIV-1ゲノムに関連するeIF3b結合性RNA構造モチーフの上位の結果を表２に示す。HIV-1ゲノムの5’上流側に存在するHIV-1 gag IRES（Internal Ribosome Entry Site）領域に含まれるRNA構造が、高い結合親和性を示すものとして検出された（17位（上位0.2 %）および568位（上位6.6 %））。この結果から、本方法によってIRESなどの翻訳開始を制御する機能性RNA構造モチーフのスクリーニングが可能であることが示された。【００７８】
表２．eIF3b結合性RNA構造モチーフとHIV-1ゲノムにおける領域
【表２】
2018003809.tif 000003
【００７９】
＜実施例４． 機能性RNA構造モチーフのスクリーニング系の実用性の確認（1）＞
上記スクリーニング手法の再現性を評価するために、実施例３と同様の手順による再現実験を独立に2回行い、その結果について相関分析を行った。【００８０】
25 μL のDynabeads、10 μLの抗eIF3b抗体、HEK293FT細胞溶解液（1100 μg/μL）を用いた以外は、上記３−１および３−２と同様の手順により、Dynabeads−抗体−eIF3複合体を調製した。さらに、３−３と同様の手順により、eIF3b結合性RNAを精製した。精製されたRNAを18 μLの超純水に溶解し、上記１−１−Ｅと同様の手順により、マイクロアレイによるスキャニングを行い、蛍光強度のデータを取得し、解析した。【００８１】
結合親和性の評価のために、抗体を結合させていない Dynabeads Protein A を用いて調製したサンプルについて取得した蛍光強度により上記データを標準化した。2回の独立した再現実験結果から相関係数を算出した。なお、3 種類の RNA 構造プローブの平均値と標準偏差を用いて各 RNA 構造について結合親和性と変動係数（CV）を算出し、変動係数の値が 1 以上であった RNA 構造については解析から除外した。【００８２】
結果を図１１に示す。横軸は1回目の、縦軸は2回目の再現実験により得られた各 RNA 構造に対応する蛍光強度を示し、スケールの値は頻度を示す。図１１に示すように、相関係数（r）=0.96という高い再現性によりRNA 構造を取得することができた。また、本再現実験により、eIF3-40Sリボソームサブユニット複合体と強く結合することが知られており、上記３−６においても検出されたHIV-1 gag IRESを再度検出することができた（図１２）。これらの結果から、本実験系がスクリーニング手法として十分な実用性を有するものであることが確認された。【００８３】
＜実施例５．機能性RNA構造モチーフのスクリーニング系の実用性の確認（2）＞
上記スクリーニング手法によりeIF3複合体に対する結合親和性が上位にランクされたRNAについて、以下の手順によりプルダウンアッセイを行い、各RNAの結合親和性を比較した。【００８４】
＜５−１．プルダウン用DNA/RNAプローブの調製＞
Ａ．RNAプローブの調製
eIF3複合体に対する結合親和性が上位にランクされたRNAに、補助配列を付加し、RNAプローブを調製した。RNAプローブは、上記１−１−Ｂと同様の手順により、鋳型DNAをin vitro転写することにより調製した。鋳型DNAには、5’末端から順に、（i）T7 promoter + G、（ii）バーコード配列（25塩基）、（iii）Stem forward sequence、（iv）RNA構造配列、および（v）Stem reverse sequenceを含むように構成された配列を逆相補鎖変換した配列からなるDNAを用いた。【００８５】
表３．RNAプローブの鋳型DNAの配列
【表３】
2018003809.tif 000004
【００８６】
表４．RNAプローブの配列
【表４】
2018003809.tif 000005
【００８７】
Ｂ．ビオチン化DNAバーコードプローブの調製
RNAプローブを磁気ビーズに固定するためのビオチン化DNAバーコードプローブを調製した。5’末端から順に、（i）バーコード配列の相補配列（25塩基）、（ii）C（1塩基）、（iii）スペーサー（3塩基）、および（iv）3’末端ビオチン修飾を含むビオチン化DNAバーコードプローブを設計した。ビオチン化DNAバーコードプローブは、ファスマック社に委託して合成した（ノーマルスケール、HPLC 精製）。【００８８】
3’-biotinylated DNA Probe Barcode 25mer + C + 3spacer
CCAGACTCACAGCCGCGCTAGTATCCAAG-(Biotin)  （配列番号20）【００８９】
Ｃ．プルダウン用DNA/RNAプローブの調製
0.2 ml チューブに、2 μLの5×Hybridization Buffer（100 mM HEPES pH 7.8, 400 mM KCl, 100 mM NaCl）、1 μLのビオチン化DNAバーコードプローブ（100 μM）、120 pmolのRNAプローブを加え、超純水により10 μLに調製した。得られたプローブ液をサーマルサイクラーにて95℃で5分間熱処理し、その後、-0.1℃/秒にて 4℃ まで冷却し、10分間静置することにより、プルダウン用DNA/RNAプローブを得た。【００９０】
＜５−２．プルダウンアッセイ＞
以下の手順により、プルダウン用DNA/RNAプローブを磁気ビーズに固定化した。Streptavidin Mag Sepharose（GE Healthcare）を 1.5 ml チューブに 50 μL分注した。磁気ラックにチューブを設置して上清を取り除いた後、500 μLのBinding Buffer（20 mM HEPES pH 7.8, 80 mM KCl, 20 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM DTT, 0.2 μg/μL BSA）を加え、転倒混和した。磁気ラックにチューブを設置して上清を取り除き、500 μLのBinding Bufferと、上記５−１で調製されたプルダウン用DNA/RNAプローブを10 μL加え、4℃ で 3 時間、チューブローテーターで撹拌した。その後、磁気ラックにチューブを設置して上清を取り除き、600 μLのBinding Bufferによる洗浄を2回行った。【００９１】
得られた磁気ビーズに600 μLのBinding Bufferと2 μLのRNase inhibitor Murine（NEB、40 U/ml）を加え、さらに200 μLのHEK293FT細胞溶解液（1100 μg/μL）を加えた。4℃で12 時間、チューブローテーターで撹拌した後、磁気ラックにチューブを設置して上清を取り除いた。900 μLのBinding Bufferによる洗浄を4回行った。最後に、20 μLの5×Sample Buffer 2（ProteinSimple）を加え、95℃で5分間加熱した後、室温で10分間静置した。ビーズをスピンダウンし、サンプルを回収した。【００９２】
回収したサンプルを0.1×Sample Buffer 2（ProteinSimple）で5倍に希釈した後、5×fluorescent master mix と 1:4 の比率で混合した。その後、3秒間ボルテックスし、95℃で5分間加熱した。Antibody Diluent 2（ProteinSimple）にて1:20希釈したウサギ抗eIF3b抗体（Bethyl）を用いて、標準プロトコルのWes（ProteinSimple）により、DNA/RNAプローブ−磁気ビーズによりプルダウンされたeIF3複合体を検出した。【００９３】
結果を図１３に示す。eIF3複合体に対する結合親和性が上位にランクされたRNA（Rank 1、Rank 5、Rank 10）は、いずれもHIV-1 gag IRES（陽性対照）と同様の結合親和性を示した。一方、eIF3複合体に対する結合親和性が下位にランクされたRNAは、eIF3複合体に対する結合親和性を示さなかった。この結果から、上記スクリーニング手法により、機能性RNA構造を正確に選別できていることが裏付けられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図９−９】
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【図９−１０】
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【図９−１１】
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【図９−１２】
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【図９−１３】
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【図９−１４】
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【図９−１５】
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【図１０】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【図１０−９】
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【図１０−１０】
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【図１０−１１】
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【図１０−１２】
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【図１０−１３】
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【図１０−１４】
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【図１０−１５】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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