(57)【要約】  単純な培養操作で、容易に特定の幹細胞を選択的に分離培養する。骨髄液に含まれる細胞を、少なくとも培養面にリン酸カルシウム類を含有する不織布上で培養する、骨髄由来間葉系幹細胞の分離方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄液に含まれる細胞を、少なくとも培養面にリン酸カルシウム類を含有する不織布上で培養する、骨髄由来間葉系幹細胞の分離方法。
【請求項２】
前記リン酸カルシウム類がハイドロキシアパタイトである、請求項１記載の幹細胞の分離方法。
【請求項３】
骨髄液に含まれる細胞群から間葉系幹細胞を分離するための、リン酸カルシウム類を含有する不織布の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄液に含まれる細胞群から間葉系幹細胞を分離する幹細胞の分離方法、及びこの方法を実施するためのリン酸カルシウム類を含有する不織布の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、幹細胞又は幹細胞から派生した細胞を用いて、ダメージを受けた患者の細胞や組織を修復したり再生したりする幹細胞治療の開発が進んでいる。
特に骨髄液から単離される骨髄由来間葉系幹細胞は、内臓、血管系、骨・軟骨、脂肪、筋肉、さらに神経へ分化が可能な細胞であり、顎骨等の骨再生や筋萎縮性側索硬化症の治療等への応用が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−０３４４３６号公報
【特許文献２】特開２００８−１９９８９７号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】"脂肪幹細胞分離キット"、［online］、2012年11月6日、フナコシ株式会社、インターネット（URL：http://www.funakoshi.co.jp/contents/6904）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
骨髄由来の間葉系幹細胞は、骨髄液に含まれる骨髄細胞のうち０．１％程度しか含まれていない。そこで、当該細胞を単離し増殖させるために、不織布フィルタ等に骨髄液を通す方法が提案されている（特許文献１等）。
しかしながら、この方法では、細胞の懸濁液を調製する必要があり、懸濁液の濃度調整等も必要となる。【０００６】
また、特許文献２では、ハイドロキシアパタイト等のリン酸カルシウム類を含有する繊維状シートを用いて細胞を三次元培養ですることが開示されている。
また、非特許文献１では、ハイドロキシアパタイトを塗布した繊維状シートにより、脂肪組織をトラップして培養することで脂肪幹細胞を分離することが提案されている。この方法は、脂肪幹細胞の分離には、脂肪組織が繊維状構造にトラップされやすいという性質を利用するものである。しかしながら、脂肪細胞はトラップされ易くても、骨髄液は液状組織のため、骨髄液が繊維状構造にトラップされやすいとは言えない。【０００７】
本発明は、かかる従来技術の実情に鑑みてなされたものであり、単純な培養操作で、容易に特定の幹細胞を選択的に分離培養することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく、骨髄液に含まれる細胞からの間葉系幹細胞の分離方法について鋭意検討を行った。
その結果、少なくとも細胞を培養する面（培養面）がリン酸カルシウム類を含有する不織布上で、骨髄液に含まれる細胞の培養を試みると、骨髄由来間葉系幹細胞のみが不織布表面に接着するため、骨髄由来間葉系幹細胞を選択的に分離培養することができ、結果として、骨髄由来間葉系幹細胞を分離することができることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
かくして本発明によれば、下記（１）の骨髄由来間葉系幹細胞の分離方法、（２）のリン酸カルシウム類を含有する不織布の使用が提供される。
（１）骨髄液に含まれる細胞を、少なくとも培養面にリン酸カルシウム類を含有する不織布上で培養する、骨髄由来間葉系幹細胞の分離方法。
（２）前記リン酸カルシウム類がハイドロキシアパタイトである、上記（１）に記載の幹細胞の分離方法。
（３）骨髄液に含まれる細胞群から間葉系幹細胞を分離するための、リン酸カルシウム類を含有する不織布の使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、単純な培養操作で、容易に特定の幹細胞を選択的に分離培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１におけるハイドロキシアパタイト塗布不織布上に増殖している培養開始から５日後の骨髄由来の間葉系幹細胞（以下、「ＭＳＣ」という）の位相差顕微鏡写真である。
【図２】図２は、実施例１において、フラスコ内で継代培養されているＭＳＣの位相差顕微鏡写真である。
【図３】図３は、比較例におけるＭＳＣの位相差顕微鏡写真である。
【図４】図４は、比較例におけるＭＳＣの位相差顕微鏡写真である。
【図５】図５は、実施例２における脂肪細胞が染色された顕微鏡写真である。
【図６】図６は、実施例２における骨芽細胞が染色された顕微鏡写真である。
【図７】図７は、実施例２における軟骨細胞が染色された顕微鏡写真である。
【図８】図８は、実施例２における神経細胞が染色された蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明の一態様は、骨髄液に含まれる細胞を、少なくとも培養面にリン酸カルシウム類を含有する不織布上で培養する、骨髄由来間葉系幹細胞の分離方法である。
本発明の不織布において、「少なくとも培養面にリン酸カルシウム類を含有する」とは、少なくとも細胞を培養する面（細胞と接触する部分、例えば、不織布の片面を構成する繊維）が、リン酸カルシウム類を含むことを意味する。なお、培養面がリン酸カルシウム類のみからなることとしてもよい。
【００１３】
本発明に用いる少なくとも培養面にリン酸カルシウム類を含有する不織布（以下、単に「本発明に用いる不織布」又は「不織布」ということがある）は、織布のように規則的に繊維が織られたものではなく、繊維同士が不規則に絡み合っているものである。
本発明に用いるリン酸カルシウム類を含有する不織布は、リン酸カルシウム類を含有することができるものであれば特に限定されない。
【００１４】
不織布の材質（原料）としては、例えば、天然繊維（木綿、麻、羊毛等）、再生繊維（レーヨン、キュプラ）、半合成繊維（アセテート、プロミックス）、合成繊維（ナイロン、ポリエステル、アクリル系、ビニロン、ポリ塩化ビニル、ビニリデン、ポリオレフィン系、ポリウレタン、ポリクラール、フルオロカーボン系、ノボロイド系等）、無機繊維（ガラス繊維、炭素繊維、アルミナ繊維、シリコンカーバイド繊維、スラグ繊維、金属繊維等）等公知のものが挙げられる。
【００１５】
本発明に用いる不織布を製造する方法に格別な制限はなく、一般的な不織布の製造方法を採用することができる。なかでも、後述する好ましい繊維径、目付量及び表面被覆率を有するリン酸カルシウム類を含有する不織布を得るためには、メルトブロー法を用いる方法が好適に採用される。
【００１６】
本発明に用いる不織布は、少なくとも培養面にリン酸カルシウム類を含有するものである。
リン酸カルシウム類としては、リン酸水素カルシウム二水和物、リン酸水素カルシウム無水物、リン酸三カルシウム、第２リン酸カルシウム、第２リン酸水素カルシウム、第３リン酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、リン酸四カルシウム、オクタリン酸カルシウム、各種アパタイト類（例えば、ハイドロキシアパタイト、フッ素アパタイト、塩酸アパタイト、炭酸アパタイト等）等が挙げられる。これらのリン酸カルシウム類は、一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。また、ポリマー粒子表面を前述のリン酸カルシウム類で被覆したもの（特開平７−１９４９７０号公報参照。）もリン酸カルシウム類として用いてもよい。
【００１７】
リン酸カルシウム類を不織布に含有させる方法は特に制限されず、特開平５−２２２６９３号公報等に記載された公知技術を用いることができる。より具体的には、不織布にリン酸カルシウム類を塗布し乾燥する方法；不織布をリン酸カルシウム類溶液に含浸させた後、乾燥する方法；バインダー（接着剤）を用いて不織布上に積層する方法；等が挙げられる。
【００１８】
本発明に用いる不織布の繊維径は、好ましくは１０〜３０μｍ、より好ましくは１５〜２５μｍである。ここで繊維径は、不織布の表面をデジタルマイクロスコープＶＨＸ−１０００（キーエンス社製）を用いて撮影し、測定した値である。
【００１９】
本発明に用いる不織布の目付量は、好ましくは０．８ｍｇ／ｃｍ２〜１．２ｍｇ／ｃｍ２である。ここで目付量は、３ｃｍ四方の不織布の重量から単位面積当たりの重量を算出した値である。
【００２０】
本発明に用いる不織布の表面被覆率は、好ましくは８０〜１００％、より好ましくは９０〜１００％である。ここで表面被覆率は、前記デジタルマイクロスコープで撮影した画像を、画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ  Ｊ）を用いて、画像全体の面積から繊維が存在していない空隙部を除いた面積を画像全体の面積から除して換算した値である。
このような繊維径、目付量及び表面被覆率を有する、リン酸カルシウム類を含有する不織布を用いることにより、本発明のより優れた効果を得ることができる。
【００２１】
本発明に用いる不織布は、通常、滅菌処理して用いられる。滅菌処理の方法に格別な制限はなく、高圧蒸気法や乾熱法等の加熱法；γ線や電子線等の放射線を照射する放射線法や高周波を照射する照射法；酸化エチレンガス（ＥＯＧ）等のガスを接触させるガス法；滅菌フィルタを用いる濾過法；など、医療分野で一般的に採用される方法から任意に選択することができる。
【００２２】
本発明に用いる不織布は、通常、細胞を培養するのに用いられる様々な容器の中に入れて用いることができる。不織布は浮いていても、底面に沈んでいても良く、細胞はリン酸カルシウム類を含有する不織布の片面に接着していても、両面に接着していても良い。細胞の保持性の観点から、リン酸カルシウム類を含有する不織布は容器の底面全面を覆い、リン酸カルシウム類を含有する不織布の片面にて細胞を増殖させることが望ましい。
リン酸カルシウム類を含有する不織布を入れる容器の材質は特に制限されない。例えば、細胞培養用のポリスチレン製の容器やガラス製の容器等が挙げられる。
【００２３】
本発明に用いる不織布上で培養される骨髄液は、骨髄由来間葉系幹細胞を含む複数種類の細胞を含む骨髄由来の細胞を含むものであれば、骨髄液そのものであっても、骨髄液から一部の細胞が既に分離されたものであっても良い。
【００２４】
少なくとも培養面にリン酸カルシウム類を含有する不織布を用いて、骨髄液より骨髄由来間葉系幹細胞を分離するための培地は、分離対象となる幹細胞を増殖させることのできる培地であれば、特に制限されない。なかでも、未分化性を維持したまま増殖させることのできる培地を用いるのが好ましい。このような培地は市販されており、例えば、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製のＳｔｅｍｌｉｎｅシリーズや間葉系幹細胞増殖培地シリーズ等が挙げられる。
【００２５】
培地には、添加剤を配合することもできる。添加剤としては、タンパク質等の誘導因子、ミネラル、金属、ビタミン成分等が挙げられる。
これらの添加剤は一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２６】
細胞の培養条件は特に限定されず、用いる細胞や目的に応じて適宜決定することができる。
例えば、二酸化炭素（ＣＯ２）濃度が５％程度で、温度が２０℃〜３７℃の範囲で一定に維持された、加湿された恒温器を用いて細胞を培養することができる。
【００２７】
本発明は、少なくとも培養面にリン酸カルシウム類を含有する不織布上で、骨髄液に含まれる細胞を培養すると、骨髄由来間葉系幹細胞のみが接着して培養することができ、結果として、骨髄由来間葉系幹細胞を分離することができるというものである。
【００２８】
分離された骨髄由来間葉系幹細胞は、幹細胞治療用途に用いるほか、更に分化誘導培地にて培養することにより分化細胞を得、創薬用途や医療用途に利用することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を、実施例によりさらに詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。【００３０】
［実施例１］
＜骨髄液からのＭＳＣの分離＞
ヒトより採取した骨髄液１０ｍｌにＨａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）を等量加え、良く攪拌し骨髄液希釈液を調製した。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎａｋｏｓｈｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ／６９０４より購入可能な脂肪幹細胞分離キット（バイオ未来工房社製）に含まれている、ハイドロキシアパタイトが塗布された中芯ポリエチレン外層ポリプロピレン不織布を直径２ｃｍの円形に切り取り、１００μｍのセルストレーナー〔コーニング社製、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）型番３５２３６０〕にセットした。そこへ、先に調製した骨髄液希釈液を通し、ＨＢＳＳで２回洗浄した後、不織布をそれぞれ別の細胞培養用ポリスチレン製ディッシュ〔コーニング社製、ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）、直径３５ｍｍのＴＣＰＳ〕に入れた。その後、当該ディッシュに２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した間葉系幹細胞増殖培地〔シグマアルドリッチ社製、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）〕を入れ、５％ＣＯ２雰囲気、３７℃の条件で培養した。
培養開始５日後の位相差電子顕微鏡写真（倍率４０倍）を図１に示す。
培養開始６日後に細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで剥離した後、２７９．８ｍＬの細胞培養用フラスコ（エッペンドルフ社製、型番「Ｔ−７５」）に移し、同じ培地で４日間継代培養すると９０％コンフルエントになる。細胞培養用フラスコに移したときの位相差顕微鏡写真（倍率４０倍）を図２に示す。【００３１】
［比較例］
中芯ポリエチレン外層ポリプロピレン不織布（１０ｍｍ×３２ｍｍ）を６穴プレート入れ、そこにＭＳＣの懸濁液、３ｍＬ（０．４５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を添加し、３日間培養した。培地は２％ＦＢＳを添加した間葉系幹細胞増殖培地〔シグマアルドリッチ社製、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）〕を用いた。
その結果、中芯ポリエチレン外層ポリプロピレン不織布上には、ＭＳＣが僅かに接着しているだけで（図３）、プレート底面には１００％コンフルエントな状態で接着しており（図４）、幹細胞の分離効果が得られなかった。【００３２】
［実施例２］
実施例１において分離され、その後４日間継代されたＭＳＣ（以下、「継代ＭＳＣ」という）の分化誘導実験を、以下の通り行った。
（１）脂肪細胞への分化
継代ＭＳＣを２４ウェルマルチプレート〔コーニング社製、ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）型番３５３０４７〕に、１．９×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した間葉系幹細胞増殖培地〔シグマアルドリッチ社製、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）〕を入れ、５％ＣＯ２雰囲気３７℃の条件で培養した。２４時間経過後、培地を捨て、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄してから、脂肪細胞分化培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製、型番ＢＢＤＭ２）に交換して、１週間培養した。その後、培地を、脂肪細胞培養用培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製、型番ＢＢＡＭ１）に交換して１週間さらに培養した後、Ｏｉｌ−Ｒｅｄ染色した。脂肪細胞が染色された顕微鏡写真を図５に示す。
図５から、Ｏｉｌ−Ｒｅｄ染色された脂肪滴を持つ脂肪細胞が見られ、実施例１で得られた継代ＭＳＣは、脂肪細胞への分化能を有することが確認された。【００３３】
（２）骨芽細胞への分化
継代ＭＳＣを、２４ウェルマルチプレート〔コーニング社製、ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）型番３５３０４７〕に、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した間葉系幹細胞増殖培地〔シグマアルドリッチ社製、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）〕を入れ、５％ＣＯ２雰囲気３７℃の条件で培養した。その後、細胞の密集度６０％程度（約６０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）で、培地を骨芽細胞分化培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製、型番ＢＢＯＢ１）に交換して２週間さらに培養した。その後、細胞をＡｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ染色した。骨芽細胞が染色された顕微鏡写真を図６に示す。
図６から、骨芽細胞とその周囲がＡｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄで薄い赤に染色されたことから、カルシウムの沈着が認められ、実施例１で得られた継代ＭＳＣは、骨芽細胞への分化能も有することが確認された。【００３４】
（３）軟骨細胞への分化
２４ウェルマルチプレート〔コーニング社製、ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）型番３５３０４７〕のウェルに、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した間葉系幹細胞増殖培地（シグマアルドリッチ社製、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標））に、継代ＭＳＣを１．６×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した高濃度細胞液５μＬを滴下して、２時間放置し細胞塊を形成させた。その後、各ウェルに軟骨細胞分化培地（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製、ＳｔｅｍＰｒｏ  Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；型番Ａ１００７０−０１）約２ｍｌを追加し、５％ＣＯ２雰囲気、３７℃の条件で、４〜５日間隔で培地交換しながら２週間培養した。その後、培養細胞をＡｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ染色した。軟骨細胞が染色された顕微鏡写真を図７に示す。
図７から、軟骨細胞とその周囲がＡｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅで青く染色されたことから、軟骨に多く含まれる酸性ムコ多糖の沈着が認められ、実施例１で得られた継代ＭＳＣは、軟骨細胞への分化能も有することが確認された。【００３５】
（４）神経細胞への分化
継代ＭＳＣを、２４ウェルマルチプレート〔コーニング社製、ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）型番３５３０４７〕に、４．８×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した間葉系幹細胞増殖培地〔シグマアルドリッチ社製、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）〕を入れ、５％ＣＯ２雰囲気３７℃の条件で培養した。４８時間経過後、細胞の密集度３０％程度（約３０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）で培地を捨て、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄してから、培地を神経細胞分化培地（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製、ＨｙＣｌｏｎｅ  ＡｄｖａｎｃｅＳＴＥＭ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）に交換して２日間培養したところ、神経突起の形成が確認できた。そこで、蛍光色素〔サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８〕でラベリングしたマウス抗β−Ｔｕｂｕｌｉｎ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ抗体（フナコシ社より入手）で蛍光染色した。神経細胞が染色された蛍光顕微鏡写真を図８に示す。
図８から、細胞体及び突起が緑色に染色されていることから、成熟哺乳動物の神経細胞であることが認められ、実施例１で得られた継代ＭＳＣは、神経細胞への分化能も有することが確認された。【００３６】
以上の結果から、少なくとも培養面にリン酸カルシウム類を含有する不織布を用いることで、骨髄液から骨髄由来間葉系幹細胞を容易に単離し、増殖させることができること、増殖させた幹細胞が高い分化能を有することがわかる。
【図１】
2018097198.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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2018097198.tif 000011
2018097198.tif 000012
2018097198.tif 000013