(57)【要約】  細胞封入用デバイスは、細胞を培養してなる多細胞構造体を構築するための細胞封入用デバイスであって、多孔質膜を少なくとも一部に備える。組織型チップは、１種類の細胞が封入された前記細胞封入用デバイスを備える。器官型チップは、少なくとも２種類の細胞が封入された前記細胞封入用デバイスを備える。多細胞構造体を提供するためのキットは、前記組織型チップ又は前記器官型チップと培養液とを含む開閉可能な密封容器を備える。器官型チップシステムは、前記組織型チップ又は前記器官型チップを少なくとも２つ備え、前記組織型チップ、又は前記器官型チップが細胞封入性を保ちながら連結されている。細胞の培養方法は、前記細胞封入用デバイスを用いる方法である。細胞の運搬方法は、前記細胞封入用デバイスに細胞を用いる方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養してなる多細胞構造体を構築するための細胞封入用デバイスであって、
多孔質膜を少なくとも一部に備えることを特徴とする細胞封入用デバイス。
【請求項２】
前記多孔質膜が気相中で液密性を有し、液相中で半透性を有する半透膜である請求項１に記載の細胞封入用デバイス。
【請求項３】
培養液に懸濁した多細胞を注入でき、内部容積が１０ｍＬ以下である請求項１又は２に記載の細胞封入用デバイス。
【請求項４】
全体が前記半透膜からなる請求項２又は３に記載の細胞封入用デバイス。
【請求項５】
前記半透膜が生体適合性を有する材料からなる請求項２〜４のいずれか一項に記載の細胞封入用デバイス。
【請求項６】
前記生体適合性を有する材料がゲル化する細胞外マトリックス由来成分である請求項５に記載の細胞封入用デバイス。
【請求項７】
前記ゲル化する細胞外マトリックス由来成分がネイティブコラーゲン、又はアテロコラーゲンである請求項６に記載の細胞封入用デバイス。
【請求項８】
１種類の細胞が封入された請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞封入用デバイスを備えることを特徴とする組織型チップ。
【請求項９】
前記細胞の密度が、２．０×１０３細胞／ｍＬ以上１．０×１０９細胞／ｍＬ以下である請求項８に記載の組織型チップ。
【請求項１０】
少なくとも２種類の細胞が封入された請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞封入用デバイスを備えることを特徴とする器官型チップ。
【請求項１１】
前記細胞の密度が、２．０×１０３細胞／ｍＬ以上１．０×１０９細胞／ｍＬ以下である請求項１０に記載の器官型チップ。
【請求項１２】
多細胞構造体を提供するためのキットであって、
請求項８若しくは９に記載の組織型チップ、又は請求項１０若しくは１１に記載の器官型チップと培養液とを含む開閉可能な密封容器を備えることを特徴とするキット。
【請求項１３】
請求項８若しくは９に記載の組織型チップ、又は請求項１０若しくは１１に記載の器官型チップを少なくとも２つ備え、前記組織型チップ、又は前記器官型チップが細胞封入性を保ちながら連結されていることを特徴とする器官型チップシステム。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞封入用デバイスを用いることを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞封入用デバイスに細胞を用いることを特徴とする細胞の運搬方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞封入用デバイス、組織型チップ、器官型チップ、器官型チップシステム、前記細胞封入用デバイスを用いた細胞の培養方法、及び前記細胞封入用デバイスを用いた細胞の運搬方法に関する。
本願は、２０１６年６月２８日に、日本に出願された特願２０１６−１２７８２３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
創薬や動物実験代替法に関連する企業では、細胞バンク等から凍結細胞を購入後、継代培養して増殖した細胞を凍結保存するとともに、一部の細胞で培養モデルを作製して開発に必要な試験を実施している。つまり、開発に必要な試験を実施するまでに、莫大なコストと時間とを消費している。さらに、単層培養の細胞ではなく、より生体に近しい「組織型培養モデル」が求められている。
また、再生医療の分野では、細胞移植による治療技術が急速に発展しているが、幹細胞等、貴重な限られた数の細胞を移植部位に生着させるための技術開発が喫緊の課題となっている。【０００３】
「組織型培養モデル」に関連した技術としては、例えば、各種ゲル包埋培養技術、スフェロイド培養技術（例えば、特許文献１参照。）、及び各種チャンバー培養技術（例えば、特許文献２参照。）等が挙げられる。
また、「医療用細胞移植デバイス」に関連した技術としては、例えば、ハイドロゲル膜付着型細胞シート移植技術（例えば、特許文献３参照。）、マイクロカプセル封入技術（例えば、特許文献４参照。）、及びアテロコラーゲンゲル包埋技術（例えば、特許文献５参照。）等が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−６５５５５号公報
【特許文献２】再公表ＷＯ２００８／１３００２５号公報
【特許文献３】特開２０１５−３５９７８号公報
【特許文献４】特表２００２−５３８１９４号公報
【特許文献５】再公表ＷＯ２００６／０１１２９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１及び２に記載の「組織型培養モデル」に関連した従来技術は、いずれも培養操作が煩雑であり、組織型培養モデルの構築にコストと時間とを要する。それだけでなく、生産再現性が必ずしも良くないため、ロット間の差もあった。さらに、スフェロイド培養技術等、細胞が露出された状態にある培養技術は、３次元組織を構成している個々の細胞の保護性能が必ずしも良くなかった。
また、特許文献３、４及び５に記載の「医療用細胞移植デバイス」に関連した従来技術において、ハイドロゲル膜付着型細胞シート移植技術は細胞シートが露出された状態であるため細胞保護性能が必ずしも良くなかった。一方、細胞保護性能に優れたマイクロカプセル封入技術、及びアテロコラーゲンゲル包埋技術には以下の課題があった。つまり、マイクロカプセル封入技術は、操作が煩雑であり膵島等、限られた細胞にしか使用できなかった。また、アテロコラーゲンゲル包埋技術は、移植部位での細胞生着が必ずしも良くなかった。
また、上述の「組織型培養モデル」及び「医療用細胞移植デバイス」に関連した従来技術では、細胞を長期的に培養下で維持することが難しく、培養モデル又は移植用の再生組織を構築後、即座に使用しなければならず、時間的制約があった。【０００６】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、細胞保護性能が優れるのみならず、取扱いも容易であって、細胞の長期間培養が可能な細胞封入用デバイスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、コラーゲン等の多孔質膜を備えた細胞封入用デバイスを作製し、当該細胞封入用デバイスに細胞を封入し培養することで、取り扱いが容易で、高機能な組織型チップが得られることを見出した。【０００８】
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る細胞封入用デバイスは、細胞を培養してなる多細胞構造体を構築するための細胞封入用デバイスであって、多孔質膜を少なくとも一部に備える。
前記多孔質膜が気相中で液密性を有し、液相中で半透性を有する半透膜であってもよい。
上記態様の細胞封入用デバイスにおいて、培養液に懸濁した多細胞を注入でき、内部容積が１０ｍＬ以下であってもよい。
上記態様の細胞封入用デバイスにおいて、全体が前記半透膜からなってもよい。
前記半透膜が生体適合性を有する材料からなってもよい。
前記生体適合性を有する材料がゲル化する細胞外マトリックス由来成分であってもよい。
前記ゲル化する細胞外マトリックス由来成分がネイティブコラーゲン、又はアテロコラーゲンであってもよい。【０００９】
本発明の第２態様に係る組織型チップは、１種類の細胞が封入された上記第１態様に係る細胞封入用デバイスを備える。
前記細胞の密度が、２．０×１０３細胞／ｍＬ以上１．０×１０９細胞／ｍＬ以下であってもよい。【００１０】
本発明の第３態様に係る器官型チップは、少なくとも２種類の細胞が封入された上記第１態様に係る細胞封入用デバイスを備える。
前記細胞の密度が、２．０×１０３細胞／ｍＬ以上１．０×１０９細胞／ｍＬ以下であってもよい。【００１１】
本発明の第４態様に係るキットは、多細胞構造体を提供するためのキットであって、上記第２態様に係る組織型チップ又は上記第３態様に係る器官型チップと培養液とを含む開閉可能な密封容器を備える。【００１２】
本発明の第５態様に係る器官型チップシステムは、上記第２態様に係る組織型チップ又は上記第３態様に係る器官型チップを少なくとも２つ備え、前記組織型チップ又は前記器官型チップが細胞封入性を保ちながら連結されている。【００１３】
本発明の第６態様に係る細胞の培養方法は、上記第１態様に係る細胞封入用デバイスを用いる方法である。【００１４】
本発明の第７態様に係る細胞の運搬方法は、上記第１態様に係る細胞封入用デバイスを用いる方法である。
【発明の効果】
【００１５】
上記態様によれば、細胞保護性能が優れるのみならず、取扱いも容易であって、細胞の長期間培養が可能な細胞封入用デバイスを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の第１実施形態に係る細胞封入用デバイスを模式的に示す斜視図である。
【図２】本発明の第２実施形態に係る細胞封入用デバイスを模式的に示す斜視図である。
【図３】本発明の第３実施形態に係る細胞封入用デバイスを模式的に示す斜視図である。
【図４】（Ａ）は、本発明の第１実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。（Ｂ）は、本発明の第２実施形態に係る器官型チップシステム模式的に示す斜視図である。（Ｃ）は、本発明の第３実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。（Ｄ）は、本発明の第４実施形態に係る器官型チップシステを模式的に示す斜視図である。
【図５】製造例１において作製された細胞封入用デバイスを示す画像である。
【図６】（Ａ）は、実施例１におけるＨｅｐＧ２細胞を製造例１で作製された細胞封入用デバイスに注入する様子を示す画像である。（Ｂ）は、実施例１におけるＨｅｐＧ２細胞を封入した製造例１で作製された細胞封入用デバイスの培養の様子を示す画像である。
【図７】（Ａ）は、実施例１における培養開始から６時間後のＨｅｐＧ２細胞の様子を示す画像である。（Ｂ）は、実施例１における培養１日目のＨｅｐＧ２細胞の様子を示す画像である。（Ｃ）は、実施例１における培養２日目のＨｅｐＧ２細胞の様子を示す画像である。（Ｄ）は、実施例１における培養７日目のＨｅｐＧ２細胞の様子を示す画像である。（Ｅ）は、実施例１における培養１２日目のＨｅｐＧ２細胞の様子を示す画像である。（Ｆ）は、実施例１における培養１４日目のＨｅｐＧ２細胞の様子を示す画像である。
【図８】（Ａ）は、実施例２における培養７日目のＨｅｐＧ２細胞の肝組織型チップにＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＦＤ）を１時間取り込ませた後に洗浄し、さらに１時間培養した後に位相差顕微鏡を用いて観察した結果を示す画像である。下段は、上段の四角に囲まれた部分の拡大画像である。（Ｂ）は、実施例２における培養７日目のＨｅｐＧ２細胞の肝組織型チップにＦＤを１時間取り込ませた後に洗浄し、さらに１時間培養した後に代謝物であるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの動態を、蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す画像である。下段は、上段の四角に囲まれた部分の拡大画像である。（Ｃ）は、（Ａ）及び（Ｂ）の画像の融合画像である。下段は、上段の四角に囲まれた部分の拡大画像である。
【図９】（Ａ）は、製造例２における環状（内径：１１ｍｍ、外径：２０ｍｍ）に切り出した厚さ３ｍｍのシリコーン膜を示す画像である。（Ｂ）は、製造例２における側面にステンレス管を貫通させて２カ所に穴を開けた環状シリコーン膜を示す画像である。（Ｃ）は、製造例２における環状シリコーン膜の天面及び底面にコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体を貼り付けた細胞封入用デバイスを示す画像である。（Ｄ）は、製造例２におけるゲルローディングチップを側面に貫通させた細胞封入用デバイスを示す画像である。（Ｅ）は、製造例２における細胞封入用デバイスの内部へ培養液を注入する様子を示す画像である。（Ｆ）は、製造例２における細胞封入用デバイスの内部へ培養液を注入する様子を示す画像である。（Ｇ）は、製造例２におけるチューブで連結した２つの細胞封入用デバイスへ培養液を通液する様子を示す画像である。（Ｈ）は、製造例２における培養液の注入後に爪楊枝で栓をした細胞封入用デバイスを示す画像である。
【図１０Ａ】製造例３におけるＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を細胞封入用デバイスに注入する様子を示す画像である。
【図１０Ｂ】製造例３におけるＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を封入した細胞封入用デバイスの様子を示す画像である。
【図１１Ａ】実施例３における培養４日目のコントロール及び肝組織チップの位相差顕微鏡像及び蛍光顕微鏡像（ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭとｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１とによる染色像）である。
【図１１Ｂ】実施例３における培養３２日目のコントロール及び肝組織チップの位相差顕微鏡像及び蛍光顕微鏡像（ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭとｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１とによる染色像）である。
【図１２Ａ】実施例４における培養３２日目のＨｅｐＧ２細胞の肝組織型チップにＦＤを１時間取り込ませた後に洗浄し、さらに１時間培養した後に位相差顕微鏡を用いて観察した結果を示す画像である。
【図１２Ｂ】実施例４における培養３２日目のＨｅｐＧ２細胞の肝組織型チップにＦＤを１時間取り込ませた後に洗浄し、さらに１時間培養した後に代謝物であるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの動態を、蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す画像である。
【図１３Ａ】実施例５における培養４、１６及び３２日目のコントロール及び肝組織チップのアルブミン合成の活性を測定した結果を示すグラフである。
【図１３Ｂ】実施例５における培養４、１６及び３２日目のコントロール及び肝組織チップの尿素合成の活性を測定した結果を示すグラフである。
【図１３Ｃ】実施例５における培養３、１４及び２８日目のコントロール及び肝組織チップのＣＹＰ３Ａ４活性を測定した結果を示すグラフである。
【図１４Ａ】製造例４におけるヒト真皮由来線維芽細胞の懸濁液を細胞封入用デバイスに注入する様子を示す画像である。
【図１４Ｂ】製造例４におけるヒト真皮由来線維芽細胞の懸濁液を封入した細胞封入用デバイスの様子を示す画像である。
【図１５】実施例６における培養１、２、３及び８日目の真皮組織型チップの位相差顕微鏡像である。
【図１６】実施例６における培養１００日目の真皮組織型チップの位相差顕微鏡像及び蛍光顕微鏡像（ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭとｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１とによる染色像）である。
【図１７Ａ】実施例７における培養１５日目の真皮組織型チップから回収して培養した、培養２日目のヒト真皮由来線維芽細胞の培位相差顕微鏡像である。
【図１７Ｂ】実施例７における培養１５日目の真皮組織型チップから回収して培養した、培養７日目のヒト真皮由来線維芽細胞の培位相差顕微鏡像である。
【図１８Ａ】実施例８における培養２１日目の真皮組織型チップから回収して培養した、培養開始から３０分後のヒト真皮由来線維芽細胞の培位相差顕微鏡像である。
【図１８Ｂ】実施例８における培養２１日目の真皮組織型チップから回収して培養した、培養１日目のヒト真皮由来線維芽細胞の培位相差顕微鏡像である。
【図１９】実施例９における培養２８日目のコントロール及び肝組織チップの位相差顕微鏡像及び蛍光顕微鏡像（ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭとｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１とによる染色像）である。
【図２０Ａ】実施例１０における培養３５日目のＨｅｐＧ２細胞の肝組織型チップにＦＤを１時間取り込ませた後に洗浄し、さらに１時間培養した後に位相差顕微鏡を用いて観察した結果を示す画像である。
【図２０Ｂ】実施例１０における培養３５日目のＨｅｐＧ２細胞の肝組織型チップにＦＤを１時間取り込ませた後に洗浄し、さらに１時間培養した後に代謝物であるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの動態を、蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す画像である。
【図２１Ａ】実施例１１における培養３、７、１４、２１及び２８日目のコントロール及び肝組織チップのアルブミン合成の活性を測定した結果を示すグラフである。
【図２１Ｂ】実施例１１における培養３、７、１４、２１及び２８日目のコントロール及び肝組織チップの尿素合成の活性を測定した結果を示すグラフである。
【図２１Ｃ】実施例１１における培養３、７、１４、２１及び２８日目のコントロール及び肝組織チップのＣＹＰ３Ａ４活性を測定した結果を示すグラフである。
【図２２】実施例１２における細胞封入用デバイス４及び５の内側から外側へ透過したタンパク量を経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図２３】実施例１３における細胞封入用デバイス４、６−１及び６−２の内側から外側へ透過したタンパク量を経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図２４Ａ】実施例１４における３７℃での培養１日目、並びに、２５℃での保存１、２、３及び６日目の肝組織型チップ４の蛍光顕微鏡像である。なお、上は、ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭによる染色像である。また、下は、ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１による染色像である。
【図２４Ｂ】実施例１４における３７℃での培養１日目、並びに、２５℃での保存１、２、３及び６日目の肝組織型チップ６−１の蛍光顕微鏡像である。なお、上は、ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭによる染色像である。また、下は、ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１による染色像である。
【図２５Ａ】実施例１５における２５℃での保存１、２、３及び６日目後、１日間（２４時間）３７℃において後培養を行った肝組織型チップ４の蛍光顕微鏡像である。なお、上は、ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭによる染色像である。また、下は、ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１による染色像である。
【図２５Ｂ】実施例１５における２５℃での保存１、２、３及び６日目後、１日間（２４時間）３７℃において後培養を行った肝組織型チップ６−１の蛍光顕微鏡像である。なお、上は、ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭによる染色像である。また、下は、ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１による染色像である。
【図２６】実施例１５における２５℃での保存１、２、３及び６日目後、１日間（２４時間）３７℃において後培養を行った肝組織型チップ４及び肝組織型チップ６−１の細胞生存率を示すグラフである。
【図２７Ａ】製造例７における留置針カテーテル付き細胞封入用デバイスを示す画像である。
【図２７Ｂ】製造例７におけるヒト真皮由来線維芽細胞の懸濁液を細胞封入用デバイスに注入する様子を示す画像である。
【図２８】実施例１６における培養１日目の真皮組織型チップを撮影した画像である。左図は、培養液中の培養１日目の真皮組織型チップを示す画像であり、右図は、培養液から培養１日目の真皮組織型チップを取り出した画像である。
【図２９】実施例１６における培養０、１、２及び３日目の真皮組織型チップの位相差顕微鏡像である。
【図３０Ａ】製造例８におけるアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体のみで構成された細胞封入用デバイスを示す画像である。
【図３０Ｂ】製造例８におけるヒト真皮由来線維芽細胞の懸濁液を細胞封入用デバイスに注入する様子を示す画像である。
【図３１】実施例１７における培養１日目の真皮組織型チップを撮影した画像である。左図は、培養液中の培養１日目の真皮組織型チップを示す画像であり、右図は、培養液から培養１日目の真皮組織型チップを取り出した画像である。
【図３２】実施例１７における培養０、１、２及び３日目の真皮組織型チップの位相差顕微鏡像である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。
【００１８】
＜＜細胞封入用デバイス＞＞
本実施形態の細胞封入用デバイスは、細胞を培養してなる多細胞構造体を構築するための細胞封入用デバイスであって、多孔質膜を少なくとも一部に備える。
【００１９】
本実施形態の細胞封入用デバイスは、ピンセット等で容易に取り扱うことができる。また、従来では、培養モデル又は移植用の再生組織として多細胞構造体を作製後、１〜３日以内に使用しなければならず、時間的制約があった。これに対し、本実施形態の細胞封入用デバイスは、細胞を３〜３０日程度、長期間培養することが可能であり、時間的制約を受けない。
【００２０】
本明細書において、「多孔質膜」とは、細孔を多数有する膜を意味し、空隙を有する膜、細孔と空隙とを有する膜も包含する。
本実施形態の細胞封入用デバイスにおいて、例えば、細胞が封入された本実施形態の細胞封入用デバイスを、培養液を含む容器内に入れた場合に、細胞を細胞封入用デバイスの外部に透過させない。一方、培養液に溶解している栄養分を細胞封入用デバイスの内部に透過させるとともに、培養液に溶解した老廃物を含む細胞生産物を細胞封入用デバイスの外部に透過させることができる。このため、本実施形態の細胞封入用デバイスは、細胞の長期間培養に用いることができる。
【００２１】
本明細書において、「多細胞構造体」とは、複数の細胞が細胞−基質間の結合、及び細胞−細胞間の結合を形成した単層細胞又は多層細胞からなる３次元構造体を意味する。本実施形態における多細胞構造体は、１種類以上の機能細胞と、その足場の役割を果たす基質と、により構成されている。すなわち、本実施形態における多細胞構造体は、複数の機能細胞と基質とが相互作用することで、より生体内の組織又は器官に類似した形態を構築しているものである。したがって、多細胞構造体には、血管及び／又は胆管等の毛細管網様構造が３次元的に構築されていてもよい。このような毛細管網様構造は、多細胞構造体の内部にのみ形成されていてもよく、少なくともその一部が多細胞構造体の表面又は底面に露出されるように形成されていてもよい。
【００２２】
＜構造＞
図１は、本発明の第１実施形態に係る細胞封入用デバイスを模式的に示す斜視図である。
ここに示す細胞封入用デバイス１０は、多孔質膜１を天面及び底面に備え、部材２により側面を封止された円柱の形状をしている。図１において、多孔質膜を天面及び底面に備えるものを例示したが、天面、底面又は側面等の一部に備えるものでもよい。又は、天面、底面及び側面等の全体が多孔質膜のうち、後述に示す半透膜からなるものでもよい。中でも、本実施形態の細胞封入用デバイスは、培養モデルとして用いる場合には、多孔質膜を天面及び底面に備えるものが好ましい。また、医療用細胞移植デバイスとして用いる場合には、全体が半透膜からなるものであることが好ましい。
【００２３】
図１において、細胞封入用デバイスの形状が円柱であるものを示したが、その他の形状でもよい。本実施形態の細胞封入用デバイスの形状は、細胞を封入でき、細胞に均一に酸素及び培養液に溶解している栄養分が行き渡る形状であればよい。また、本実施形態の細胞封入用デバイスは、培養液をデバイス内部に満たしていてもよく、培養液を満たさずに気体部分を残していてもよい。本実施形態の細胞封入用デバイスの形状としては、例えば、円柱、円錐、円錐台、角錐、角錐台、球、多面体（例えば、四面体、五面体、六面体（立方体含む）、八面体、十二面体、二十面体、二十四面体、ケプラー・ポアンソ立体等）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２４】
図１に示すように細胞封入用デバイスの形状が円柱である場合、細胞封入用デバイスの内径は、１ｍｍ以上６０ｍｍ以下であることが好ましく、３ｍｍ以上３５ｍｍ以下であることがより好ましく、５ｍｍ以上２６ｍｍ以下であることがさらに好ましい。
また、細胞封入用デバイスの外径は、３ｍｍ以上６８ｍｍ以下であることが好ましく、５ｍｍ以上４３ｍｍ以下であることがより好ましく、７ｍｍ以上３２ｍｍ以下であることがさらに好ましい。
また、細胞封入用デバイスの厚み（円柱の高さ）は、５μｍ以上であって、５０μｍ以上１５ｍｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以上１０ｍｍ以下であることがより好ましく、２００μｍ以上２．５ｍｍ以下であることがさらに好ましい。
なお、本明細書において、「細胞封入用デバイスの厚み（円柱の高さ）」は、細胞封入用デバイスの天面の外側の縁部から、底面の外側の縁部までの距離を意味する。
【００２５】
図１において、天面及び底面が平面であるものを示したが、天面及び底面が凹部構造、又は凸部構造であってもよい。特に、天面及び底面が凹部構造であるとき、天面の内側の凹部の中心部（天面の内側の最凹部）と底面の内側の凹部の中心部（底面の内側の最凹部）とが接触せず、一定の距離（例えば、５μｍ以上）を保っていることが好ましい。これにより、細胞封入用デバイスの厚み（円柱の高さ）、すなわち、細胞封入用デバイスの天面の外側の縁部から、底面の外側の縁部までの距離が、天面の外側の凹部の中心部（天面の外側の最凹部）から底面の外側の凹部（底面の外側の最凹部）の中心部までの距離よりも長くなる。これにより、例えば、天面から薬剤を添加した場合に、添加した薬剤の方向性を維持することができる。さらに、天面及び底面が凹部構造であるため、天面及び底面の外側に新たに細胞を播種して培養することが可能となる。
【００２６】
本実施形態の細胞封入用デバイスの内部容積は、培養液に懸濁した多細胞を注入でき、細胞の活性をアッセイする試験等のインビトロ試験系で用いられる多細胞構造体を構築することができる程度のスモールスケールであればよい。具体的には、例えば、１０ｍＬ以下であることが好ましく、１０μＬ以上５ｍＬ以下であることがより好ましく、１５μＬ以上２ｍＬ以下であることがさらに好ましく、２０μＬ以上１ｍＬ以下であることが特に好ましい。内部容積が上記上限値以下であることにより、十分に酸素及び培養液の栄養分が供給され、細胞を効率よく長期間に渡り培養することができる。また、内部容積が上記下限値以上であることにより、インビトロ試験系で用いるのに十分な細胞数及び細胞密度の細胞を得ることができる。
【００２７】
図２は、本発明の第２実施形態に係る細胞封入用デバイスを模式的に示す斜視図である。
なお、図２以降の図において、既に説明済みの図に示すものと同じ構成要素には、その説明済みの図の場合と同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。
ここに示す細胞封入用デバイス２０は、支持体３を備えている以外は、図１に示す細胞封入用デバイス１０と同じものである。すなわち、細胞封入用デバイス２０は、多孔質膜１を天面及び底面に備え、部材２により側面を封止された円柱の形状をしており、外側面に支持体３を備える。
【００２８】
細胞封入用デバイス２０は、支持体３を有することにより、例えば、細胞が封入された細胞封入用デバイス２０を一回り大きい容器に固定することで、細胞を気相にて培養することができる。また、細胞封入用デバイス２０は、支持体３を有することにより、例えば、細胞が封入された細胞封入用デバイス２０は、培養液中において、浮力により浮くことができる。また、細胞封入用デバイス２０のように天面及び底面に多孔質膜１を備える場合、天面は空気に接し、底面は培養液に接するため、細胞を気相及び液相にて培養することができる。
また、支持体３は、細胞封入用デバイス２０に固定されていてもよく、取り外し可能であってもよい。
【００２９】
図３は、本発明の第３実施形態に係る細胞封入用デバイスを模式的に示す斜視図である。
ここに示す細胞封入用デバイス３０は、チューブ４を備えている以外は、図１に示す細胞封入用デバイス１０と同じものである。すなわち、細胞封入用デバイス３０は、多孔質膜１を天面及び底面に備え、部材２により側面を封止された円柱の形状をしている。さらに、細胞封入用デバイス３０の外側面において向かい合うようにチューブ４を備え、チューブ４は細胞封入用デバイス３０の内部に挿入されており、２つのチューブ４及び細胞封入用デバイス３０は連通している。
【００３０】
細胞封入用デバイス３０は、チューブ４を備えることにより、培養液を側面からも供給することができる。さらに、チューブ４を備える細胞封入用デバイス３０同士を連結させることにより、後述に示す器官型チップシステムを構築することができる。
また、チューブ４の細胞封入用デバイス３０が挿入されている側と反対側の先端には、栓や弁等の開閉可能な装置（図示せず）を備えることが好ましい。
【００３１】
本実施形態の細胞封入用デバイスは、図１〜３に示すものに限定されず、本実施形態の細胞封入用デバイスの効果を損なわない範囲内において、図１〜３に示すものの一部の構成が変更又は削除されたものや、これまでに説明したものにさらに他の構成が追加されたものであってもよい。
例えば、図１、２に示す細胞培養用デバイスにおいて、部材は注入孔を備えていてもよい。注入孔を備える場合、該注入孔を閉じるための栓を備えることが好ましい。
注入孔の形状は、特別な限定はなく、例えば、円形、多角形（正多角形等も含む）、楕円形等が挙げられる。
注入孔の半径は、細胞培養用デバイスの厚み（すなわち、部材の高さ）に応じて適宜調整すればよく、例えば１０μｍ以上１０００μｍ以下であればよい。
また、本実施形態の細胞封入用デバイスにおいては、各構成（多孔質膜、部材等）の大きさや形状は、目的に応じて任意に調節できる。
【００３２】
＜各構成＞
［多孔質膜］
本実施形態の細胞封入用デバイスに用いられる多孔質膜としては、内部に封入された細胞が外部に透過しない程度の孔を有する膜であればよく、特別な限定はない。多孔質膜としては、例えば、濾紙、半透膜（例えば、限外濾過膜等）、不織布、ガーゼ様メッシュ、各種メンブレンフィルター等が挙げられ、これらに限定されない。
【００３３】
また、本実施形態における多孔質膜の細孔の大きさとしては、例えば０．０１μｍ以上１，５００μｍ以下であればよく、例えば０．０１μｍ以上１．０μｍ以下であればよく、例えば０．０１μｍ以上０．４５μｍ以下があればよい。前記孔の大きさは、内部に封入する細胞又は後述する小さな生命個体の大きさに応じて適宜選択すればよい。
【００３４】
中でも、本実施形態における多孔質膜は、気相中で液密性を有し、液相中で半透性を有する半透膜であることが好ましい。半透膜は、気相中で液密性を有するため、例えば、本実施形態の細胞封入用デバイスの内部に培養液等の液体を含んでいる場合に、気相中において、液体が漏れず、内部に保つことができる。この液密性は、半透膜上での表面張力によるものである。一方、気体を通すことができるため、内部に液体を含む場合、内部の液体は経時的に蒸発する。
また、本実施形態の細胞封入用デバイスに用いられる半透膜は、液相中で半透性を有するため、例えば、細胞が封入された本実施形態の細胞封入用デバイスを、培養液を含む容器内に入れた場合に、細胞封入用デバイス内の細胞はデバイスの外部に透過させず、一方、培養液に溶解している栄養分を細胞封入用デバイスの内部に透過させるとともに、培養液に溶解した老廃物を含む細胞生産物を細胞封入用デバイスの外部に透過させることができる。このため、本実施形態の細胞封入用デバイスは、細胞の長期間培養に用いることができる。
より具体的には、本実施形態の細胞封入用デバイスに用いられる半透膜は、例えば、分子量約１，０００,０００以下の高分子化合物を透過することができるものであればよく、例えば、分子量約２００，０００以下の分子化合物を透過することができるものであればよい。
【００３５】
本明細書において、「液密性」とは、液体が漏れない状態を意味する。
また、本明細書において、「半透性」とは、一定の分子量以下の分子又はイオンのみを透過可能な性質を意味し、「半透膜」とは、当該性質を有する膜である。
【００３６】
前記多孔質膜の材料としては、細胞毒性のないものであればよく、天然高分子化合物であってもよく、合成高分子化合物であってもよい。また、前記多孔質膜が半透膜である場合、その材料としては、生体適合性を有する材料であることが好ましく、生体吸収性を有する材料であることがより好ましい。本実施形態の細胞封入用デバイスの全体が生体適合性又は生体吸収性を有する半透膜からなるものである場合、医療用細胞移植デバイスとして活用することができる。
なお、本明細書において、「生体適合性」とは、生体組織と材料との適合性を示す評価基準を意味する。また、「生体適合性を有する」とは、材料それ自体が毒性を有さず、内毒素等の微生物由来の成分を有さず、生体組織を物理的に刺激することなく、生体組織を構成するタンパク質や細胞等と相互作用しても拒絶されない状態を意味する。また、本明細書において、「生体吸収性」とは、生体内に一定期間、材料がその形状又は物性を保持し、その後分解及び吸収されることで生体内への導入部分から消失しうる性質を意味する。
【００３７】
前記天然高分子化合物としては、例えば、ゲル化する細胞外マトリックス由来成分、多糖類（例えば、アルギネート、セルロース、デキストラン、プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎｅ）、ポリヒアルロン酸、及びそれらの誘導体等）、キチン、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）（特に、ポリ（β−ヒドロキブチレート）、ポリ（３−ヒドロキシオクタノエート））、ポリ（３−ヒドロキシ脂肪酸）、フィブリン、寒天、アガロース等が挙げられ、これらに限定されない。
前記セルロースには、合成により改質されたものも含み、例えば、セルロース誘導体（例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、キトサン等）等が挙げられる。より具体的なセルロース誘導体としては、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、セルローススルフェートナトリウム塩等が挙げられる。
【００３８】
中でも、前記天然高分子化合物としては、優れた保水性を有することから、ゲル化する細胞外マトリックス由来成分、フィブリン、寒天、又はアガロースであることが好ましい。
ゲル化する細胞外マトリックス由来成分としては、例えば、コラーゲン（I型、II型、III型、V型、XI型等）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等を含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ゼラチン等が挙げられ、これらに限定されない。それぞれのゲル化に至適な塩等の成分、その濃度、ｐＨ等を選択し多孔質膜（特に、半透膜）を作製することが可能である。また、原料を組み合わせることで、様々な生体内組織を模倣した多孔質膜（特に、半透膜）を得ることができる。
【００３９】
前記合成高分子化合物としては、例えば、ポリホスファゼン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド（例えば、ナイロン等）、ポリエステルアミド、ポリ（アミノ酸）、ポリ無水物、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート（アクリル樹脂）、ポリアルキレン（例えば、ポリエチレン等）、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール等）、ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド等）、ポリアルキレンテレフタレート（例えば、ポリエチレンテレフタレート等）、ポリオルトエステル、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリエステル、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド等）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリ［ラクチド−ｃｏ−（ε−カプロラクトン）］、ポリ［グリコリド−ｃｏ−（ε−カプロラクトン）］等）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、及びこれらのコポリマー等が挙げられ、これらに限定されない。
前記ポリアクリレート（アクリル樹脂）としてより具体的には、例えば、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）等が挙げられる。
【００４０】
中でも、前記合成高分子化合物としては、生体吸収性を有することから、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド等）、ポリエチレンテレフタレート、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリ［ラクチド−ｃｏ−（ε−カプロラクトン）］、ポリ［グリコリド−ｃｏ−（ε−カプロラクトン）］等）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、ポリオルトエステル、又はコポリマーであることが好ましい。
【００４１】
本実施形態における多孔質膜の材料は、上記に例示された材料のうち１種類から構成されていてもよく、２種類以上から構成されていてもよい。また、本実施形態における多孔質膜の材料は、天然高分子化合物又は合成高分子化合物のうちいずれかで構成されていてもよく、天然高分子化合物及び合成高分子化合物の両方から構成されていてもよい。
【００４２】
中でも、本実施形態における多孔質膜が半透膜である場合、その材料としては、天然高分子化合物が好ましく、ゲル化する細胞外マトリックス由来成分がより好ましく、コラーゲンがさらに好ましい。また、コラーゲンの中でもより好ましい原料としては、ネイティブコラーゲン又はアテロコラーゲンを例示できる。
【００４３】
本実施形態における多孔質膜の材料が、細胞外マトリックス由来成分である場合に、細胞外マトリックス由来成分を多孔質膜（特に、半透膜）の単位面積１ｃｍ２あたり０．１ｍｇ以上１０．０ｍｇ以下含有することが好ましく、０．５ｍｇ以上５．０ｍｇ以下含有することがより好ましい。特に、細胞外マトリックス由来成分がアテロコラーゲンである場合、アテロコラーゲンを多孔質膜（特に、半透膜）の単位面積１ｃｍ２あたり０．５ｍｇ以上１０．０ｍｇ以下含有することが好ましく、１ｃｍ２あたり２．５ｍｇ以上５．０ｍｇ以下含有することがより好ましい。
多孔質膜（特に、半透膜）における細胞外マトリックス由来成分（特に、アテロコラーゲン）の含有量が上記範囲であることにより、細胞を細胞封入用デバイス内に注入し、培養することが可能な強度とすることができる。
なお、「該膜の単位面積１ｃｍ２あたりの重量」とは、膜の厚さを任意として、該材料片１ｃｍ２あたりに含有される成分の重量を指す。
【００４４】
本実施形態における多孔質膜の厚さは特に制限されないが、１μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましく、１μｍ以上５００μｍ以下であることがより好ましく、５μｍ以上３００μｍ以下であることがさらに好ましく、１０μｍ以上２００μｍ以下であることが特に好ましい。多孔質膜の厚さが上記範囲であることにより、細胞を細胞封入用デバイス内に注入し、培養することが可能な強度とすることができる。また、多孔質膜が半透膜である場合、その厚さが上記範囲であることにより、本実施形態の細胞封入用デバイスを医療用細胞移植デバイスとして好適に用いることができる。
【００４５】
また、本実施形態における多孔質膜は、使用時に破れる虞がなく、実用上大変優れるものである。特に医療用細胞移植デバイスに用いる場合、多孔質膜（特に、半透膜）の強度は、移植操作に耐え得る強度を有する。
【００４６】
（多孔質膜の製造方法）
１．合成高分子化合物を用いた多孔質膜の製造方法
例えば、多孔質膜の構成材料が前記合成高分子化合物である場合は、公知の方法（例えば、特開２００１−１４９７６３号公報等参照。）を用いて製造することができる。
前記合成高分子化合物を用いた多孔質膜の製造方法としてより具体的には、まず、合成高分子化合物を有機溶剤中に溶解した製膜原液を調製する。
有機溶剤としては、合成高分子化合物に対する良溶剤であればよく、例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が挙げられ、これらに限定されない。
合成高分子化合物と有機溶剤との混合割合は、使用する合成高分子化合物及び有機溶剤の種類に応じて適宜調整すればよく、例えば、合成高分子化合物１５重量％、有機溶剤８５重量％であればよい。
また、溶解時における有機溶剤の温度は、通常３０℃以上１００℃以下であればよく、好ましくは５０℃以上８０℃以下である。
【００４７】
次いで、調製した製膜原液を例えばノズルから吐出させる方法等を用いて、凝固液中で凝固させ、所定形状の多孔質膜を作製する。
凝固液としては、有機溶剤と水との混合液を用いることが好ましい。凝固液に用いる有機溶剤としては、合成高分子化合物の溶解に用いた有機溶剤として例示されたものと同様のものを用いることができる。なお、凝固液に用いる有機溶剤は、合成高分子化合物の溶解に用いた有機溶剤とは同じ種類であってもよく、異なる種類であってもよい。
また、凝固液中における水の割合は、例えば、３０重量％以上８０重量％以下であればよい。
さらに、凝固速度を調整する目的で、凝固液中に、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、グリセリン等のアルコール類やエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類を添加してもよい。
【００４８】
得られた多孔質膜は、蒸留水等で洗浄し、さらに、紫外線照射等による滅菌を行い、使用すればよい。
【００４９】
２．ハイドロゲルを用いた多孔質膜の製造方法
また、例えば、多孔質膜の構成材料がハイドロゲルである場合は、公知の方法（例えば、国際公開第２０１２／０２６５３１号、特開２０１２−１１５２６２号公報、及び特開２０１５−３５９７８号公報等参照。）を用いて製造することができる。
なお、本明細書において、「ハイドロゲル」とは、高分子化合物が化学結合によって網目構造をとり、その網目に多量の水を保有した物質を示す。ハイドロゲルとしてより具体的には、天然物高分子化合物や合成高分子化合物の人工素材に架橋を導入してゲル化させたものを意味する。
ハイドロゲルには、例えば、上述のゲル化する細胞外マトリックス由来成分、フィブリン、寒天、アガロース、セルロース等の天然高分子化合物、及びポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（ＩＩ−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ等の合成高分子化合物が含まれる。
【００５０】
ハイドロゲルを用いた多孔質膜の製造方法としてより具体的には、まず、鋳型に完全にはゲル化していない状態のハイドロゲル（以下、「ゾル」と称することがある。）を配置し、ゲル化を誘導する。
ゾルがコラーゲンゾルである場合、コラーゲンゾルは至適な塩濃度を有するものとして、生理食塩水、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、基礎培養液、無血清培養液、血清含有培養液等を用いて、調製したものを用いればよい。また、コラーゲンゲル化の際の溶液のｐＨは、例えば６以上８以下であればよい。
特に無血清培養液を用いる場合、他動物血清成分中に含まれる移植に適さない物質（例えば、抗原、病原因子等）が多孔質膜に含まれることを回避できるため、医療用細胞移植デバイスに用いる場合に好適な多孔質膜（特に、半透膜）を得ることができる。
【００５１】
また、コラーゲンゾルの調製は例えば４℃程度で行えばよい。その後、ゲル化する際の保温は、用いるコラーゲンの動物種に依存したコラーゲンの変性温度より低い温度とすればよく、一般的には２０℃以上３７℃以下の温度で保温することで数分から数時間でゲル化を行うことができる。
【００５２】
また、多孔質膜を作製するためのコラーゲンゾルの濃度は、０．１％以上１．０％以下であることが好ましく、０．２％以上０．６％以下であることがより好ましい。コラーゲンゾルの濃度が上記下限値以上であることにより、ゲル化が弱すぎず、また、コラーゲンゾルの濃度が上記上限値以下であることにより、均一なコラーゲンゲルからなる多孔質膜（特に、半透膜）を得ることができる。
【００５３】
さらに、得られたハイドロゲルを乾燥し、ハイドロゲル乾燥体としてもよい。ハイドロゲルを乾燥させることにより、ハイドロゲル内の自由水を完全に除去し、さらに結合水の部分除去を進行させることができる。
【００５４】
さらに、得られたハイドロゲル乾燥体をＰＢＳや使用する培養液等で再水和することで、ビトリゲル（登録商標）としてもよい。
このガラス化工程（ハイドロゲル内の自由水を完全に除去した後に、結合水の部分除去を進行させる工程）の期間を長くするほど、再水和した際には透明度、強度に優れたビトリゲル（登録商標）を得ることができる。なお、必要に応じて短期間のガラス化後に再水和して得たビトリゲル（登録商標）をＰＢＳ等で洗浄し、再度ガラス化することもできる。
【００５５】
乾燥方法としては、例えば、風乾、密閉容器内で乾燥（容器内の空気を循環させ、常に乾燥空気を供給する）、シリカゲルを置いた環境下で乾燥する等、種々の方法を用いることができる。例えば、風乾の方法としては、１０℃４０％湿度で無菌に保たれたインキュベーターで２日間乾燥させる、若しくは無菌状態のクリーンベンチ内で一昼夜、室温で乾燥する等の方法を例示することができる。
【００５６】
なお、本明細書において、「ビトリゲル（登録商標）」とは、従来のハイドロゲルをガラス化（ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した後に再水和して得られる安定した状態にあるゲルのことを指し、本発明者によって、「ビトリゲル（ｖｉｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）」と命名されている。
また、本明細書においては、ハイドロゲルからなる多孔質膜の製造工程を詳細に説明するにあたり、当該ガラス化工程の直後であり再水和の工程を経ていないハイドロゲルの乾燥体に対しては、単に「ハイドロゲル乾燥体」とした。そして、当該ガラス化工程の後に再水和の工程を経て得られたゲルを「ビトリゲル（登録商標）」として区別して表した。また、そのビトリゲル（登録商標）をガラス化させて得られた乾燥体を「ビトリゲル（登録商標）乾燥体」とした。また、ビトリゲル（登録商標）乾燥体に紫外線照射する工程を施して得られるものを「紫外線照射処理を施したビトリゲル（登録商標）乾燥体」とした。また、「紫外線照射処理を施したビトリゲル（登録商標）乾燥体」に再水和する工程を施して得られるゲルを「ビトリゲル（登録商標）材料」とした。また、ビトリゲル（登録商標）材料をガラス化させて得られた乾燥体を「ビトリゲル（登録商標）材料の乾燥体」とした。従って、「ビトリゲル（登録商標）」及び「ビトリゲル（登録商標）材料」は水和体である。
【００５７】
つまり、得られたビトリゲル（登録商標）を再乾燥することで、再ガラス化させて、ビトリゲル（登録商標）乾燥体としてもよい。
乾燥方法としては、上述に例示した方法と同様の方法が挙げられる。
【００５８】
また、得られたビトリゲル（登録商標）乾燥体に紫外線を照射して、「紫外線照射処理を施したビトリゲル（登録商標）乾燥体」としてもよい。
紫外線の照射には、公知の紫外線照射装置を使用することができる。
ビトリゲル（登録商標）乾燥体への紫外線の照射エネルギーは、単位面積あたりの総照射量が、０．１ｍＪ／ｃｍ２以上６０００ｍＪ／ｃｍ２以下であることが好ましく、１０ｍＪ／ｃｍ２以上４０００ｍＪ／ｃｍ２以下であることがより好ましく、１００ｍＪ／ｃｍ２以上３０００ｍＪ／ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。総照射量が上記の範囲であることにより、続く再水和工程において得られるビトリゲル（登録商標）材料の透明度及び強度を特に好ましいものとすることができる。
【００５９】
また、ビトリゲル（登録商標）乾燥体への紫外線の照射は、複数回繰り返し行ってもよい。ビトリゲル（登録商標）乾燥体への紫外線の照射を繰り返す場合、１度目の紫外線の照射を行った後に、紫外線照射処理を施したビトリゲル（登録商標）乾燥体の再水和及び再ガラス化の工程を行い、その後２度目以降の再ガラス化後のビトリゲル（登録商標）材料の乾燥体への紫外線の照射を行うことが好ましい。
単位面積あたりの紫外線総照射量が同一であるとき、ビトリゲル（登録商標）乾燥体への紫外線の照射を、複数回に分割して繰り返して行うことで、続く再水和工程において得られるビトリゲル（登録商標）材料の透明度及び強度をより高めることができる。また分割の回数は多いほど好ましい。例えば、ビトリゲル（登録商標）乾燥体への紫外線の照射の単位面積あたりの総照射量が、１０００ｍＪ／ｃｍ２以上４０００ｍＪ／ｃｍ２以下の範囲であるとき、該範囲内での照射回数が２回以上１０回以下であることが好ましく、２回以上６回以下であることがより好ましい。
また、ビトリゲル（登録商標）乾燥体への紫外線の照射を繰り返す場合、紫外線の照射部位を、ビトリゲル（登録商標）乾燥体の一方の面と他方の面（上面と下面）とに分けて照射して、その総照射量を、ビトリゲル（登録商標）乾燥体への単位面積あたりの紫外線総照射量としてもよい。
【００６０】
紫外線の照射を、ビトリゲル（登録商標）乾燥体に行うことで、続く再水和工程において得られるビトリゲル（登録商標）材料の強度と透明度が高まることは、ビトリゲル（登録商標）材料内の高分子化合物同士が、紫外線によって架橋されるからと考えられる。つまり、当該操作により、高い透明度及び強度をビトリゲル（登録商標）材料に維持させることができると考えられる。
【００６１】
さらに、得られた紫外線照射処理を施したビトリゲル（登録商標）乾燥体をＰＢＳや使用する培養液等で再水和することで、ビトリゲル（登録商標）材料としてもよい。
【００６２】
さらに、得られたビトリゲル（登録商標）材料を乾燥することで、再ガラス化させて、ビトリゲル（登録商標）材料の乾燥体としてもよい。
乾燥方法としては、上述に例示した方法と同様の方法が挙げられる。
【００６３】
［部材］
本実施形態の細胞封入用デバイスにおいて、多孔質膜以外の部分を構成する部材は、液密性を有するものであればよい。また、本実施形態の細胞封入用デバイスにおいて、多孔質膜以外の部分を構成する部材は、通気性を有するものであってもよく、通気性を有さないものであってもよい。
前記部材が、通気性を有するものである場合、酸素透過係数が、例えば１００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であればよく、例えば１０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上３０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であればよく、例えば１２００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上２５００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であればよい。さらに、二酸化炭素透過係数が、例えば１０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上２００００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であればよく、例えば３０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上１５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であればよく、例えば５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上１００００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であればよい。
また、前記部材が通気性を有さないものである場合、酸素透過係数が例えば１００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であればよく、例えば５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であればよい。さらに、二酸化炭素透過係数が、例えば１０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であればよく、例えば５００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であればよい。
【００６４】
本実施形態の細胞封入用デバイスにおいて、多孔質膜以外の部分を構成する部材の材料としては、細胞の培養に適したものであればよい。多孔質膜以外の部分を構成する材料としては、例えば、ソーダ石灰ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、バイコール（登録商標）ガラス、石英ガラス等のガラス材料；ウレタンゴム、ニトリルゴム、シリコーンゴム、シリコーン樹脂（例えば、ポリジメチルシロキサン）、フッ素ゴム、アクリルゴム、イソプレンゴム、エチレンプロピレンゴム、クロロスルホン化ポリエチレンゴム、エピクロルヒドリンゴム、クロロプレンゴム、スチレン・ブタジエンゴム、ブタジエンゴム、ポリイソブチレンゴム等のエラストマー材料；ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（酢酸ビニル−共−無水マレイン酸）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミン等の樹状ポリマーを含むプラスチック；ポリ（酢酸ビニル−共−無水マレイン酸）、ポリ（スチレン−共−無水マレイン酸）、ポリ（エチレン−共−アクリル酸）、又はこれらの誘導体等のコポリマー等が挙げられ、これらに限定されない。
【００６５】
また、部材の形状は、本実施形態の細胞封入用デバイスの全体形状、及び本実施形態の細胞封入用デバイスを構成する部分に応じて、適宜選択することができる。
また、部材には、個々の細胞封入用デバイスを識別するための工夫（例えば、着色、印字等）が施されていてもよい。
【００６６】
（部材の製造方法）
本実施形態における部材は、用いる材料に応じて、公知の方法を用いて製造することができる。
例えば、部材の材料としてエラストマー材料又はプラスチックを用いる場合の製造方法としては、圧縮成形法、射出成形法、押出成形法等が挙げられ、これらに限定されない。
また、例えば、部材の材料としてガラス材料を用いる場合の製造方法としては、例えば、液滴成形法、ダンナー法、オーバーフロー法、フロート法、ブロー成形法、プレス成型法等が挙げられ、これらに限定されない。
【００６７】
［支持体］
本実施形態の細胞封入用デバイスに用いられる支持体の材料としては、例えば、ポリアミド（例えば、ナイロン等）、ポリオレフィン系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド系樹脂、シリコーン樹脂等の有機材料；セラミックス、ガラス等の無機材料等が挙げられ、特別な限定はない。
【００６８】
また、支持体の形状は、例えばシート状、棒状等が挙げられ、これらに限定されない。
また、支持体には、個々の細胞封入用デバイスを識別するための工夫（例えば、着色、印字等）が施されていてもよい。
【００６９】
（支持体の製造方法）
本実施形態における支持体は、用いる材料に応じて、公知の方法を用いて製造することができる。
例えば、支持体の材料として有機材料を用いる場合の製造方法としては、例えば、圧縮成形法、カレンダー成形法、射出成形法、押出成形法、インフレーション成形等が挙げられ、これらに限定されない。
また、例えば、支持体の材料としてガラスを用いる場合の製造方法としては、例えば、上述の（部材の製造方法）に例示された方法と同様のものが挙げられる。
また、例えば、支持体の材料としてセラミックスを用いる場合の製造方法としては、例えば、乾式成形法（例えば、金型成形法、冷間静水圧成形法、ホットプレス法、熱間静水成形法等）、塑性成形法（例えば、ろくろ成形法、押出成形法、射出成型法）、鋳込み成形法（例えば、泥漿鋳込み法、加圧鋳込み法、回転鋳込み法等）、テープ成形法等が挙げられ、これらに限定されない。
【００７０】
［チューブ］
本実施形態の細胞封入用デバイスに用いられるチューブの材料としては、特別な限定はなく、例えば、細胞封入用デバイスを医療用細胞移植デバイスとして活用する場合には、前記チューブの材料としては、生体適合性を有する材料であることが好ましい。前記生体適合性を有する材料としては、上述の「多孔質膜」において例示された天然高分子化合物及び合成高分子化合物が挙げられる。
【００７１】
また、細胞封入用デバイスを細胞の活性をアッセイする試験等のインビトロ試験系で用いられる多細胞構造体を構築するために用いる場合には、上記生体適合性を有する材料であってもよく、又は細胞の培養に適した材料であってもよい。前記生体適合性を有する材料としては、上述の「多孔質膜」において例示された天然高分子化合物及び合成高分子化合物が挙げられる。前記細胞の培養に適した材料としては、上述の［部材］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、チューブとして好適に用いられるものとしてより具体的には、例えば、医療用カテーテル、留置針等が挙げられる。
【００７２】
（チューブの製造方法）
本実施形態におけるチューブは、用いる材料に応じて、公知の方法を用いて製造することができる。
具体的な製造方法としては、上述の「多孔質膜の製造方法」及び「部材の製造方法」において例示された方法と同様の方法を用いて、チューブ状となるように成形すればよい。
【００７３】
＜＜細胞封入用デバイスの製造方法＞＞
本実施形態の細胞封入用デバイスは、所望の形状となるように、多孔質膜のみ、又は多孔質膜と部材とを組み立てることにより製造することができる。また、必要に応じて、支持体及びチューブを備え付ければよい。
多孔質膜、部材、支持体及びチューブそれぞれの製造方法は、先に説明したとおりである。
【００７４】
より具体的には、図１に示す本実施形態の細胞封入用デバイスの製造方法を以下に詳細に説明する。
まず、部材２の天面及び底面と同じ大きさ、又は部材２の天面及び底面よりも一回り大きい多孔質膜１を２枚準備する。次いで、準備した多孔質膜１をそれぞれ部材２の天面及び底面となるように、接合させる。
【００７５】
多孔質膜１と部材２との接合方法としては、例えば、接着剤による接合方法、両面テープによる接合方法、ヒートシーラーや熱板、超音波、レーザー等を用いて熱溶着により接合する方法、ほぞとほぞ穴とを作製することにより接合するほぞ接ぎによる方法（例えば、片胴付き、二方胴付き、三方胴付き、四方胴付き、小根付き、面腰ほぞ、二枚ほぞ、二段ほぞ等）等が挙げられ、これらに限定されない。また、これらの接合方法のうち１種類を用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００７６】
また、前記接着剤としては、細胞毒性がないものであればよく、例えば、ウレタン系接着剤、シアノアクリレート系接着剤、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、リン酸カルシウム系接着剤、レジン系セメント等の合成化合物の接着剤；フィブリン糊、ゼラチン糊等の天然化合物の接着剤等が挙げられる。
また、前記両面テープとしては、細胞毒性がないものであればよく、医療用途にて用いられているもの等が好適に用いられる。具体的には、例えば、支持体の両面に粘着剤層が積層された構造を有し、前記粘着剤層がゴム系、アクリル系、ウレタン系、シリコーン系、ビニルエーテル系の公知の粘着剤からなるもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、３Ｍジャパン社製の皮膚貼付用両面テープ（製品番号：１５１０、１５０４ＸＬ、１５２４等）、日東電工社製の皮膚用両面粘着テープ（製品番号：ＳＴ５０２、ＳＴ５３４等）、ニチバンメディカル社製の医療用両面テープ（製品番号：＃１０８８、＃１０２２、＃１０１０、＃８０９ＳＰ、＃４１４１２５、＃１０１０Ｒ、＃１０８８Ｒ、＃８８１０Ｒ、＃２１１０Ｒ等）、ＤＩＣ社製の薄型発泡体基材両面接着テープ（製品番号：＃８４０１０、＃８４０１５、＃８４０２０等）等が挙げられる。
なお、白や黒等の着色された色の異なる両面接着テープ（例えば、ＤＩＣ社製の＃８４０１０ＷＨＩＴＥ及び＃８４０１０ＢＬＡＣＫ等）を、それぞれ部材２の天面及び底面に用いることで、多孔質膜１が透明又は半透明である場合には、天面側及び底面側を目視で容易に区別することができる。
【００７７】
次いで、ＵＶ照射等により殺菌し、必要に応じて、多孔質膜１又は部材２の大きさを整えることで、細胞封入用デバイス１０を得ることができる。
【００７８】
また、図２に示す本実施形態の細胞封入用デバイス２０のように支持体３を備える場合、予め支持体３を多孔質膜１又は部材２に接合させておいてもよい。又は、組み立てられた細胞封入用デバイス２０に支持体３を接合させてもよい。接合方法としては、上述の多孔質膜と部材との接合方法と同様の方法により固定されていてもよく、留具等を用いて取り外し可能なように取り付けられていてもよい。
【００７９】
また、図３に示す本実施形態の細胞封入用デバイス３０のようにチューブを備える場合、予め多孔質膜１又は部材２にチューブ４を挿入しておいてもよい。又は、組み立てられた細胞封入用デバイス３０にチューブ４を挿入してもよい。チューブの挿入方法としては、例えば、チューブとして留置針を用いる場合、細胞封入用デバイスに留置針を差し込み、その後、内筒針を抜くことで、チューブを挿入することができる。
【００８０】
＜＜細胞封入用デバイスの使用方法＞＞
本実施形態の細胞封入用デバイスは後述に示すとおり、例えば、細胞の培養、細胞の運搬、組織型チップ、器官型チップ、器官型チップシステム等に使用することができる。
【００８１】
本明細書において、「組織」とは、１種類の幹細胞が分化していく一定の系譜に基づいたパターンで集合した構造の単位を示し、全体として一つの役割を有する。例えば、表皮角化細胞は、表皮の基底層に存在する幹細胞が有棘層を経て顆粒層を構成する細胞へと分化し、終末分化して角質層を形成することで、表皮としてのバリア機能を発揮している。よって、本実施形態の組織型チップは、１つの細胞系譜に由来する１種類の細胞を含み多細胞構造体を構築することにより、例えば、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織等を再現することができる。
また、本明細書において、「器官」とは、２種類以上の組織から構成され、全体として一つの機能を担う。よって、本実施形態の器官型チップは、細胞系譜の異なる少なくとも２種類の細胞を含み多細胞構造体を構築することにより、例えば、胃、腸、肝臓、腎臓等を再現することができる。
さらに、本明細書において、「器官系」とは、同じような機能をもった２つ以上の器官や、全体として一連の機能を担う２つ以上の器官のまとまりを示す。よって、本実施形態の器官型チップシステムは、組織型チップ、又は器官型チップを複数組み合わせることにより、例えば、消化器系、循環器系、呼吸器系、泌尿器系、生殖器系、内分泌系、感覚器系、神経系、運動器系、神経系等の器官系を再現することができる。なお、生体はこれらの器官系の相互作用によりホメオスタシスを維持している。本実施形態の器官型チップシステムでは、器官系の異なる器官型チップを複数組み合わせることができるため、器官系の異なる器官の相互作用を解析することも可能となる。例えば、小腸型チップ、肝臓型チップ、神経型チップの順に連結した器官型チップシステムにおいて、小腸型チップに薬剤を添加した場合、小腸型チップで吸収された薬剤が肝臓型チップで代謝され、肝臓型チップで排出された薬剤の肝代謝物が神経型チップに及ぼす毒性等を解析することが可能となる。
【００８２】
＜細胞の培養方法＞
本実施形態の細胞の培養方法は、上述の細胞封入用デバイスを用いる方法である。
【００８３】
本実施形態の培養方法によれば、容易に細胞を培養し、多細胞構造体を構築することができる。また、細胞を３〜３０日程度維持することができ、従来よりも長期間細胞を維持することができる。さらに、本実施形態の培養方法によれば、後述の組織型チップを得ることができる。
【００８４】
本実施形態の培養方法において、以下に詳細を説明する。
まず、細胞を懸濁した培養液を準備する。次いで、注射針（翼状針、留置針等含む）等を使用して、上述の細胞封入用デバイス内に懸濁液を注入する。
注射針は、多孔質膜に刺して注入してもよく、部材に刺して注入してもよい。注射針を多孔質膜に刺す場合においては、上述の「多孔質膜」に例示された材料、含有量、及び厚さとなるような多孔質膜を有する細胞封入用デバイスを用いることで、破れることなく使用することができる。
また、細胞を懸濁した培養液の注入後、注入した部位（多孔質膜又は部材）の材質が、硬度が高く弾性が低いものである場合は、硬度が低く弾性が高い材質のもので注入孔を塞ぐことが好ましい。一方、注入した部位（多孔質膜又は部材）の材質が、硬度が低く弾性が高いものである場合は、硬度が高く弾性が低い材質のもので、注入孔を塞ぐことが好ましい。
より具体的には、例えば、注入した部位がシリコーンからなる部材である場合は、ステンレスの針金等を用いて注入孔を塞げばよく、また、例えば、注入した部位がポリアクリレートからなる部材である場合は、シリコーンからなる糸、又は、ステンレスからなる針金等で注入孔を塞げばよい。
【００８５】
次いで、細胞を懸濁した培養液が注入された細胞封入用デバイスは、気相及び／又は液相にて培養し、多細胞構造体を構築させればよい。気相での培養は、例えば、空のシャーレ等の容器を用いて行えばよく、細胞が乾燥し死滅しない程度の時間において培養すればよい。また、液相での培養は、例えば、培養液を含むシャーレ等の容器を用いて行えばよい。また、気相及び液相での培養は、例えば、図２に示す支持体を有する細胞封入用デバイスを用いて、培養液を含むシャーレ等の容器に該細胞封入用デバイスを浮かべて行えばよい。
【００８６】
本実施形態の培養方法において用いられる細胞としては、例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞、は虫類細胞、両生類細胞、魚類細胞等の脊椎動物細胞；昆虫細胞、甲殻類細胞、軟体動物細胞、原生動物細胞等の無脊椎動物細胞；グラム陽性細菌（例えば、バチルス種等）、グラム陰性細菌（例えば、大腸菌等）等の細菌：酵母、植物細胞、及びそれらの単一細胞又は複数の細胞から構成される小さな生命個体等が挙げられる。
【００８７】
前記小さな生命個体としては、例えば、アメーバ、ゾウリムシ、ミカヅキモ、ハネケイソウ、クロレラ、ミドリムシ、ウチワヒゲムシ等の単細胞生物；ミジンコ、アルテミアの幼生、カイアシ亜網類、貝虫亜綱類、鞘甲亜綱の幼生、コノハエビ亜綱の幼生、フクロエビ上目類の幼生、ホンエビ上目類の幼生等の微小甲殻類動物；プラナリア（細切断後の再生プラナリアも含む）、陸生節足動物の幼生、線形動物、植物の種子（特に、発芽種子）、カルス、プロトプラスト、海洋微生物（例えば、ビブリオ属、シュードモナス属、エロモナス属、アルテロモナス属、フラボバクテリウム属、サイトファーガ属、フレキシバクター属等の海洋細菌、藍藻、クリプト藻、渦鞭毛藻、珪藻、ラフィド藻、黄金色藻、ハプト藻、ユーグレナ藻、プラシノ藻、緑藻等の藻類等）、仔稚魚、仔稚貝等が挙げられ、これらに限定されない。
【００８８】
例えば、本実施形態の細胞封入用デバイスを用いて発芽種子を培養する場合において、細胞封入用デバイスの天面は発芽した芽が貫くことができる程度の硬度を有し、且つ生分解性材料からなることにより、発芽種子をデバイス内に入れたものをそのまま土壌に植え込み、植物体を生育することができる。
なお、本明細書において「生分解性材料」とは、土壌中又は水中の微生物等によって無機物に分解される性質を有する材料を意味する。
【００８９】
前記脊椎動物細胞（特に、哺乳動物細胞）としては、例えば、生殖細胞（精子、卵子等）、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離されたがん細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が挙げられ、これらに限定されない。また、これら細胞の細胞塊（スフェロイド）を用いてもよい。また、生体の正常組織又はがん組織から分離された小さな組織片を、そのまま細胞塊と同様に用いてもよい。
【００９０】
生体を構成する体細胞としては、例えば、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳、神経組織等の任意の組織から採取される細胞等が挙げられ、これらに限定されない。体細胞として、より具体的には、例えば、線維芽細胞、骨髄細胞、免疫細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、マクロファージ、単球、等）、赤血球、血小板、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、表皮角化細胞（ケラチノサイト）、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、肝細胞、膵島細胞（例えば、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞等）、軟骨細胞、卵丘細胞、グリア細胞、神経細胞（ニューロン）、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心筋細胞、食道細胞、筋肉細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞等）、メラニン細胞、単核細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００９１】
幹細胞とは、自己を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞である。幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、がん幹細胞、毛包幹細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００９２】
前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞又は生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。
【００９３】
がん細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞であり、周囲の組織に浸潤し、又は転移を起こす悪性新生物である。がん細胞の由来となる癌としては、例えば、乳癌（例えば、浸潤性乳管癌、非浸潤性乳管癌、炎症性乳癌等）、前立腺癌（例えば、ホルモン依存性前立腺癌、ホルモン非依存性前立腺癌等）、膵癌（例えば、膵管癌等）、胃癌（例えば、乳頭腺癌、粘液性腺癌、腺扁平上皮癌等）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫等）、結腸癌（例えば、消化管間質腫瘍等）、直腸癌（例えば、消化管間質腫瘍等）、大腸癌（例えば、家族性大腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、消化管間質腫瘍等）、小腸癌（例えば、非ホジキンリンパ腫、消化管間質腫瘍等）、食道癌、十二指腸癌、舌癌、咽頭癌（例えば、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌等）、頭頚部癌、唾液腺癌、脳腫瘍（例えば、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫等）、神経鞘腫、肝臓癌（例えば、原発性肝癌、肝外胆管癌等）、腎臓癌（例えば、腎細胞癌、腎盂と尿管の移行上皮癌等）、胆嚢癌、膵臓癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌（例、上皮性卵巣癌、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍等）、膀胱癌、尿道癌、皮膚癌（例えば、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌等）、血管腫、悪性リンパ腫（例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等）、メラノーマ（悪性黒色腫）、甲状腺癌（例えば、甲状腺髄様癌等）、副甲状腺癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、ユーイング腫瘍、子宮肉腫、軟部組織肉腫等）、転移性髄芽腫、血管線維腫、隆起性皮膚線維肉腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形癌（例えば、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍等）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、慢性骨髄増殖性疾患、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病等）等が挙げられ、これらに限定されない。
また、本明細書において、「癌」とは、診断名を表す際に用いられ、「がん」とは、悪性新生物の総称を表す際に用いられる。
【００９４】
細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株としては、例えば、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ−３３Ａ、ＨＴ−２９、ＡＥ−１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｖｅｒｏ等が挙げられ、これらに限定されない。
【００９５】
本実施形態の培養方法に用いられる動物細胞の培養液は、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基礎培養液であればよく、細胞の種類により適宜選択することができる。前記培養液としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）等が挙げられ、これらに限定されない。
また、細菌、酵母、植物細胞、及びそれらの単一細胞又は複数の細胞から構成される小さな生命個体の培養液は、各々の生育に適した組成の培養液を調製すればよい。
【００９６】
また、本実施形態の培養方法において、細胞を懸濁する培養液に、細胞外マトリックス由来成分、生理活性物質等を混合し、注入してもよい。
前記細胞マトリックス由来成分としては、上述の「多孔質膜」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、前記生理活性物質としては、例えば、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子等が挙げられ、これらに限定されない。例えば、分化誘導因子を含むことにより、注入する細胞が幹細胞、又は前駆細胞等である場合、該幹細胞、又は前駆細胞を分化誘導し、所望の組織を再現した多細胞構造体を構築させることができる。
【００９７】
また、本実施形態の培養方法において、細胞を懸濁した培養液を細胞封入用デバイスの容量一杯になるように注入してもよく、又は、細胞封入用デバイスの容量に満たない量を注入してもよい。例えば、細胞封入用デバイスが図１に示すように多孔質膜を天面及び底面に備える構造であり、多孔質膜の材料がコラーゲンである場合、注射針等により細胞を懸濁した培養液を細胞封入用デバイスの容量に満たない量注入し、引き抜く。これにより、減圧で細胞封入用デバイスの天面と底面とが凹み、天面の多孔質膜と底面の多孔質膜に細胞が挟まれ、コラーゲンを用いたサンドイッチ培養を行うことができる。
【００９８】
本実施形態の培養方法において、動物細胞の培養条件としては、培養する細胞の種類により適宜選択することができる。
培養温度としては、例えば２５℃以上４０℃以下であってもよく、例えば３０℃以上３９℃以下であってもよく、例えば３５℃以上３９℃以下であってもよい。
また、培養環境は、例えば約５％のＣＯ２条件下であってもよい。
培養時間としては、細胞の種類、細胞数等により適宜選択することができ、例えば３日以上３０日以下であってもよく、例えば５日以上２０日以下であってもよく、例えば７日以上１５日以下であってもよい。
また、細菌、酵母、植物細胞、及びそれらの単一細胞又は複数の細胞から構成される小さな生命個体の培養条件は、各々の生育に適した環境や時間を設定すればよい。
【００９９】
＜細胞の運搬方法＞
本実施形態の細胞の運搬方法は、上述の細胞封入用デバイスを用いる方法である。
【０１００】
本実施形態の運搬方法によれば、細胞を安全かつ確実に運搬することができ、長期間の運搬にも対応することができる。
本実施形態の運搬方法について、以下に詳細に説明する。
【０１０１】
まず、細胞を懸濁した培養液を準備する。次いで、注射針（翼状針、留置針等含む）等を使用して、上述の細胞封入用デバイス内に細胞を懸濁した培養液を注入する。
本実施形態の運搬方法において用いられる細胞又は小さな生命個体としては、上述の「細胞の培養方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、本実施形態の運搬方法において用いられる培養液としては、上述の「細胞の培養方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１０２】
また、本実施形態の細胞の運搬方法において、細胞が動物細胞である場合、細胞を懸濁する培養液に、細胞外マトリックス由来成分、生理活性物質等を混合し、注入してもよい。
前記細胞マトリックス由来成分としては、上述の「多孔質膜」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、前記生理活性物質としては、上述の「細胞の培養方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１０３】
細胞封入用デバイス内に封入された細胞は、多細胞構造体が構築される途中の段階であってもよく、多細胞構造体が構築された後であってもよい。中でも、すぐにインビトロ試験系又は生体移植に利用することができることから、本実施形態の運搬方法における細胞封入用デバイス内に封入された細胞は多細胞構造体が構築された後であることが好ましい。
【０１０４】
次いで、細胞が封入された細胞封入用デバイス（後述の組織型チップ、又は後述の器官型チップ）を、培養液を含む開閉可能な密封容器に封入し、運搬する。
【０１０５】
本実施形態の運搬方法における密封容器は、開閉可能なものであればよく、特別な限定はない。密封容器としては、例えば、スクリューキャップ付のコニカルチューブ、スクリューキャップ付の細胞培養用フラスコ等が挙げられ、これらに限定されない。
【０１０６】
運搬する条件としては、運搬する細胞又は小さな生命個体の種類により適宜選択することができる。
運搬時の温度としては、例えば４℃以上４０℃以下であってもよく、例えば１０℃以上３９℃以下であってもよく、例えば１８℃以上３７℃以下であってもよい。
また、運搬時の環境は、細胞が動物細胞である場合、前記細胞が封入された細胞封入用デバイスが、培養液が容量一杯まで満たされた密封容器に封入された状態であってもよい。又は、前記細胞が封入された細胞封入用デバイスが、培養液が容量の一部に満たされた密封容器に封入された状態であって、前記密封容器内の気体部分において、例えば約５％ＣＯ２を含有する空気の条件下であってもよい。
運搬時間としては、細胞の種類、細胞数等により適宜選択することができ、例えば１時間以上３０日以下であってもよく、例えば１日以上２０日以下であってもよく、例えば２日以上７日以下であってもよい。
【０１０７】
前記細胞が封入された細胞封入用デバイス（後述の組織型チップ、又は後述の器官型チップ）は、そのままをインビトロ試験系又は生体移植に利用してもよく、細胞封入用デバイスを破壊し、封入された細胞を取り出して、増殖培養する目的や移植する目的等で使用してもよい。
【０１０８】
＜組織型チップ＞
本実施形態の組織型チップは、１種類の細胞（特に、動物細胞）が封入された上述の細胞封入用デバイスを備える。
【０１０９】
本実施形態の組織型チップは、一から培養モデルを構築する必要がなく、従来の培養モデル、又は動物実験の代替として、各種疾患に対する候補薬剤のスクリーニング、若しくは候補薬剤をはじめとする化学物質の正常な組織に対する動態及び毒性の評価試験系に活用することができる。
さらに、従来の培養モデル又は移植用の再生組織は構築後、即座に使用しなければならず、時間的制約があったのに対し、本実施形態の組織型チップは、長期間培養が可能である。
また、本実施形態の組織型チップにおいて、細胞封入用デバイスが生体適合性を有する材料からなる場合、医療用細胞移植デバイスとして再生医療への活用が期待できる。
【０１１０】
本実施形態の組織型チップに封入された細胞としては、上述の「細胞の培養方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、封入された細胞の種類は、構築したい組織の種類に応じて、適宜選択されたものであればよい。
また、本実施形態の組織型チップに封入された細胞は、多細胞構造体が構築される途中の段階であってもよく、多細胞構造体が構築された後であってもよい。本実施形態の組織型チップは、封入された細胞が多細胞構造体を構築した後であっても、３〜２１日程度の長期間培養が可能である。
【０１１１】
本実施形態の組織型チップに封入された細胞の密度は、構築したい組織の種類により異なるが、２．０×１０３細胞／ｍＬ以上１．０×１０９細胞／ｍＬ以下であることが好ましく、２．０×１０５細胞／ｍＬ以上１．０×１０７細胞／ｍＬ以下であることがより好ましい。
細胞密度が上記範囲内であることにより、生体組織により近い細胞密度の組織型チップを得ることができる。
【０１１２】
本実施形態の組織型チップは、上述の「細胞の培養方法」に記載の方法を用いて、製造することができる。また、製造後の組織型チップの維持条件についても、上述の「細胞の培養方法」に記載の培養条件と同条件とすればよい。また、組織型チップの内部には、培養液や空気等の気体を含んでいてもよく、培養液や空気等の気体を含まなくてもよい。組織型チップ内に培養液や空気等の気体を含まない場合、細胞、又は細胞及び細胞外マトリックス由来成分が密に接着しており、生体内の組織により近しい構成の多細胞構造体を構築している。
【０１１３】
＜器官型チップ＞
本実施形態の器官型チップは、少なくとも２種類の細胞（特に、動物細胞）が封入された上述の細胞封入用デバイスを備える。
【０１１４】
本実施形態の器官型チップは、一から培養モデルを構築する必要がなく、従来の培養モデル、又は動物実験の代替として、各種疾患に対する候補薬剤のスクーニング、若しくは候補薬剤をはじめとする化学物質の正常な器官に対する動態及び毒性の評価試験系に活用することができる。
さらに、従来の培養モデル又は移植用の再生組織は構築後、即座に使用しなければならず、時間的制約があったのに対し、本実施形態の器官型チップは、長期間培養が可能である。
また、本実施形態の器官型チップにおいて、細胞封入用デバイスが生体適合性を有する材料からなる場合、医療用細胞移植デバイスとして再生医療への活用が期待できる。
【０１１５】
本実施形態の器官型チップに封入された細胞としては、上述の「細胞の培養方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、封入された細胞の種類は、少なくとも２種類の細胞が封入されていればよく、構築したい器官の種類に応じて、適宜選択されたものであればよい。
また、本実施形態の器官型チップに封入された細胞は、多細胞構造体が構築される途中の段階であってもよく、多細胞構造体が構築された後であってもよい。本実施形態の器官型チップは、封入された細胞が多細胞構造体を構築した後であっても、３〜２１日程度の長期間培養が可能である。
また、例えば、本実施形態の器官型チップにおいて、前記細胞封入用デバイスの内側の天面に上皮系細胞（例えば、表皮角化細胞等）からなる多細胞構造体（すなわち、上皮組織）を構築し、内側の底面に間充織細胞（例えば、真皮線維芽細胞等）からなる多細胞構造体（すなわち、間充織組織）を構築することで、細胞封入用デバイス内で組織間での物質の授受を容易に再現することができる。
【０１１６】
本実施形態の器官型チップに封入された細胞の密度は、構築したい器官の種類により異なるが、２．０×１０３細胞／ｍＬ以上１．０×１０９細胞／ｍＬ以下であることが好ましく、２．０×１０５細胞／ｍＬ以上１．０×１０７細胞／ｍＬ以下であることがより好ましい。
細胞密度が上記範囲内であることにより、生体内の器官により近い細胞密度の器官型チップを得ることができる。
【０１１７】
本実施形態の器官型チップは、上述の「細胞の培養方法」に記載の方法を用いて、製造することができる。また、製造後の器官型チップの維持条件についても、上述の「細胞の培養方法」に記載の培養条件と同条件とすればよい。また、器官型チップの内部には、培養液や空気等の気体を含んでいてもよく、培養液や空気等の気体を含まなくてもよい。器官型チップ内に培養液や空気等の気体を含まない場合、細胞、又は細胞及び細胞外マトリックス由来成分が密に接着しており、生体内の器官により近しい構成の多細胞構造体を構築している。
【０１１８】
＜多細胞構造体を提供するためのキット＞
本実施形態のキットは、多細胞構造体を提供するためのキットであって、上述の組織型チップ又は上述の器官型チップと培養液とを含む開閉可能な密封容器を備える。
【０１１９】
本実施形態のキットは、一から培養モデルを構築する必要がなく、従来の培養モデル又は動物実験の代替として、各種疾患に対する候補薬剤のスクリーニング又は候補薬剤をはじめとする化学物質の正常な組織や器官に対する動態及び毒性の評価試験系に活用することができる。
さらに、従来の培養モデル又は移植用の再生組織は構築後、即座に使用しなければならず、時間的制約があったのに対し、本実施形態のキットは、長期間培養が可能である。
【０１２０】
本実施形態のキットにおける組織型チップ又は器官型チップに封入された細胞は、多細胞構造体が構築される途中の段階であってもよく、多細胞構造体が構築された後であってもよい。中でも、すぐにインビトロ試験系又は生体移植に利用することができることから、本実施形態のキットにおける組織型チップ又は器官型チップに封入された細胞は多細胞構造体が構築された後であることが好ましい。
【０１２１】
本実施形態のキットにおける密封容器は、上述の「細胞の運搬方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１２２】
密封容器の材料としては、液密性を有するものであればよい。また、密封容器は、通気性を有するものであってもよく、通気性を有さないものであってもよい。密封容器の材料としてより具体的には、上述の「部材」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、密封容器の材料としては、壊れにくく、軽量であることから、プラスチックであることが好ましい。
【０１２３】
本実施形態のキットにおける培養液は、組織型チップ又は器官型チップに封入された細胞の種類により適宜選択することができ、具体的には、上述の「細胞の培養方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、本実施形態のキットにおいて、培養液は、密封容器の容量一杯に含まれることが好ましい。これは、密封容器に培養液を容量一杯まで注ぎ、密封することで、組織型チップ又は器官型チップの乾燥を防ぎ、組織型チップ又は器官型チップを安全に持ち運ぶことができる。
【０１２４】
本実施形態のキットにおいて、密封容器の中に含まれる組織型チップ又は器官型チップは１つであってもよく、２つ以上であってもよい。２つ以上である場合、同じ種類の多細胞構造体が構築された組織型チップ又は器官型チップであることが好ましい。
【０１２５】
本実施形態のキットは、さらに、密封容器に含まれる培養液とは別に、培養液を備えていてもよい。培養液が密封容器に含まれるものと同じ種類であってもよく、別の種類であってもよい。培養液を別に備えることにより、本実施形態のキットをインビトロ試験系又は生体移植等において使用するまでの間、組織型チップ、又は器官型チップを培養するための交換用培養液として用いることができる。
【０１２６】
＜器官型チップシステム＞
本実施形態の器官型チップシステムは、上述の組織型チップ又は上述の器官型チップを少なくとも２つ備え、前記組織型チップ又は前記器官型チップが細胞封入性を保ちながら連結されている。
【０１２７】
本実施形態の器官型チップシステムは、一から培養モデルを構築する必要がなく、従来の培養モデル、又は動物実験の代替として、各種疾患に対する候補薬剤のスクリーニング、若しくは候補薬剤をはじめとする化学物質の正常な複数の組織や器官に対する動態及び毒性の評価試験等への活用が期待できる。
【０１２８】
図４の（Ａ）は、本発明の第１実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。
ここに示す器官型チップシステム１Ａは、３つの組織型チップ１００がそれぞれチューブ１０１を介して連結した構造である。
例えば、培養液を左側の矢印の方向から右側の矢印の方向へ流すことにより、３つの組織型チップ１００を連結されたままの状態で培養することができる。また、例えば、各種疾患に対する候補薬剤を左側の矢印の方向から右側の矢印の方向へ流すことにより、疾患に対する薬効、薬剤及びその代謝物の代謝経路や細胞毒性等を検証することができる。
【０１２９】
図４の（Ａ）に示す組織型チップ１００は、上述の「組織型チップ」に記載のものと同様のものである。組織型チップ１００に構築された多細胞構造体を構成する細胞（図示せず）の種類は、所望の器官、又は器官系の種類により適宜選択することができる。
また、図４の（Ａ）に示すチューブ１０１は、図３のチューブ４と同様であり、その構成は上述の「チューブ」に記載のものと同様のものである。
【０１３０】
図４の（Ｂ）は、本発明の第２実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。
ここに示す器官型チップシステム１Ｂは、同じ大きさの３つの組織型チップ２００が積み重ねられた構造である。このとき、それぞれの組織型チップ２００の少なくとも天面及び底面は多孔質膜である。
例えば、培養液を上側の矢印の方向から下側の矢印の方向へ流すことにより、３つの組織型チップ２００を積み重ねたままの状態で培養することができる。また、例えば、各種疾患に対する候補薬剤を上側の矢印の方向から下側の矢印の方向へ流すことにより、疾患に対する薬効、薬剤及びその代謝物の代謝経路や細胞毒性等を検証することができる。
【０１３１】
図４の（Ｃ）は、本発明の第３実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。
ここに示す器官型チップシステム１Ｃは、大きさの異なる４つの組織型チップ３００を有し、一番大きな組織型チップ３００の中に、小さな組織型チップ３００が封入された構造である。このとき、一番大きな組織型チップ３００の少なくとも天面及び底面は多孔質膜であり、一番大きな組織型チップ３００に封入された組織型チップ３００は全面多孔質膜である。
例えば、培養液を含むシャーレ等の容器に器官型チップシステム１Ｃを入れることで培養することができる。また、例えば、各種疾患に対する候補薬剤を含むシャーレ等の容器に器官型チップシステム１Ｃを入れることにより、疾患に対する薬効、薬剤及びその代謝物の代謝経路や細胞毒性等を検証することができる。
【０１３２】
図４の（Ｄ）は、本発明の第４実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。
ここに示す器官型チップシステム１Ｄは、大きさの異なる４つの組織型チップ４００が大きい順に下から積み重ねられた構造である。このとき、それぞれの組織型チップ４００の少なくとも天面及び底面は多孔質膜である。
例えば、培養液を上側の矢印の方向から下側の矢印の方向へ流すことにより、４つの組織型チップ４００を積み重ねたままの状態で培養することができる。また、例えば、各種疾患に対する候補薬剤を上側の矢印の方向から下側の矢印の方向流すことにより、疾患に対する薬効、薬剤及びその代謝物の代謝経路や細胞毒性等を検証することができる。
【０１３３】
本実施形態の器官型チップシステムは、図４の（Ａ）〜（Ｄ）に限定されず、本実施形態の器官型チップシステムの効果を損なわない範囲内において、図４の（Ａ）〜（Ｄ）に示すものの一部の構成が変更又は削除されたものや、これまでに説明したものにさらに他の構成が追加されたものであってもよい。
【０１３４】
例えば、図４の（Ａ）〜（Ｄ）において組織型チップを備える場合を例示したが、器官型を少なくとも一部に備えるものであってもよい。
例えば、図４の（Ａ）に示す器官型チップシステムは、各チューブが栓や弁等の開閉可能な装置を備えていてもよい。
また、図４の（Ｂ）及び図４の（Ｄ）に示す器官型チップシステムは、それぞれの組織型チップが支持体を有していてもよく、さらに、それぞれの組織型チップを固定するために、天面及び底面の外周を接着剤等で固定していてもよい。
また、本実施形態の器官型チップシステムにおいては、各構成（組織型チップ、チューブ等）の大きさや形状は、目的に応じて任意に調節できる。
【０１３５】
本実施形態の器官型チップシステムは、それ自体で、例えば、肝臓、胃、腸等の臓器を再現することができる。さらに、本実施形態の器官型チップシステムを複数組み合わせることにより、例えば、消化器系、循環器系、呼吸器系、泌尿器系、生殖器系、内分泌系、感覚器系、神経系、運動器系、神経系等の器官系を再現することができる。
【実施例】
【０１３６】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１３７】
［製造例１］細胞封入用デバイス（支持体付き）の作製１
（１）まず、環状ナイロン膜支持体付きネイティブコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜（ネイティブコラーゲンの単位面積あたりの含有量：０．５ｍｇ／ｃｍ２）（以下、単に「コラーゲンビトリゲル（登録商標）膜」と称する場合がある。）を公知の方法（参考文献：特開２０１５−３５９７８号公報）に準じて調製した。【０１３８】
（２）次いで、調製したコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を、ビニールシート上に伸展し、その上にシリコンリング（内径９．８ｍｍ×厚さ１．９ｍｍ）を載せた。【０１３９】
（３）次いで、コラーゲンビトリゲル（登録商標）膜上のシリコンリングの周囲に、０．２５％コラーゲンゾル溶液０．４ｍＬを添加し、もう1枚のコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を重ね合わせることで、シリコンリングを２枚のコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜のほぼ中央に挟みこんだ。
公知の方法（参考文献：特開２０１５−２０３０１８号公報）に準じて、接着剤として使用した０．２５％コラーゲンゾル溶液は、細胞培養用コラーゲン酸性溶液Ｉ−ＡＣ（高研社製）と、培養液として１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ（以下、単に「培養液」と称する場合がある。）と、を等量混合し調製した。【０１４０】
（４）次いで、１０℃、湿度４０％のインキュベーター内で、クリーン風乾機を用いて、乾燥（ガラス化）した。【０１４１】
（５）次いで、一回り小さいシリコンリング（内径７．８ｍｍ×厚さ１．９ｍｍ）をアルミホイルで包み、乾燥させたコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜に挟まれたシリコンリングの上に重ねて、シリコンリング内側のコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体をマスクし、紫外線（以下、「ＵＶ」と称する場合がある）照射（単位面積あたりのＵＶ総照射量：４００ｍＪ／ｃｍ２）した。【０１４２】
（６）ＵＶ照射後のコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体を裏返して、同様にシリコンリング内側のコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体をマスクし、ＵＶ照射（単位面積あたりのＵＶ総照射量：４００ｍＪ／ｃｍ２）した。【０１４３】
（７）シャーレ内等でガラス化を進行させて、細胞封入用デバイスを作製した（図５参照）。
作製した細胞封入用デバイスに、１ｍＬツベルクリン針付きシリンジを用いて、培養液を注入したが、針を取り外した後もデバイス内部から培養液が漏れることなく保持できることが確認された。【０１４４】
［実施例１］ヒト肝がん細胞株のＨｅｐＧ２細胞を用いた肝組織型チップの作製１
（１）予め培養したＨｅｐＧ２細胞（理化学研究所バイオリソースセンターより購入、ＲＣＢ１６４８）を回収し、２．０×１０５細胞／ｍＬとなるように培養液と混合し、ＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を調製した。【０１４５】
（２）次いで、ＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を１ｍＬツベルクリン針付きシリンジ内に充填した。次いで、製造例１で作製した細胞封入用デバイスにシリコンリングの外周部からツベルクリン針の先端をシリコンリング内部に僅かに射し入れた。次いで、ＨｅｐＧ２細胞の懸濁液１６０μＬを細胞封入用デバイス内に注入した（図６の（Ａ）参照）。【０１４６】
（３）次いで、シャーレ（直径６０ｍｍ）内に５ｍＬの培養液を注入し、培養液上に（２）でＨｅｐＧ２細胞を封入したデバイスを浮かべて、気相及び液相での培養を開始した（図６の（Ｂ）参照）。【０１４７】
（４）次いで、一日置きに培養液を交換し、細胞封入用デバイスに封入されたＨｅｐＧ２細胞を、位相差顕微鏡を用いて、培養開始から６時間後、培養１日目、２日目、７日目、１２日目、及び１４日目と経時的に観察し、撮影した（図７の（Ａ）〜（Ｆ）参照）。【０１４８】
図７の（Ａ）〜（Ｆ）から、経時的にＨｅｐＧ２細胞が増殖し、培養２日目には毛細胆管様構造が形成されていることが確かめられた。【０１４９】
［実施例２］ＨｅｐＧ２細胞の肝組織型チップによるモデル薬剤の代謝と代謝物の毛細胆管様構造への排泄と蓄積１
（１）モデル薬剤としてのＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＦＤ）を２５０μｇ／ｍＬの濃度で含有する培養液を調製して、シャーレ（直径６０ｍｍ）内に５ｍＬ注入した。【０１５０】
（２）次いで、実施例１においてＨｅｐＧ２細胞を用いて作製した培養７日目の肝組織型チップを、（１）で調製したＦＤ含有培養液中に沈めて１時間培養することで細胞内にＦＤを取り込ませた。【０１５１】
（３）次いで、５ｍＬのハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）を注入した新しいシャーレ（直径６０ｍｍ）内へ移し入れ洗浄した。この作業を２回行った後、ＨｅｐＧ２細胞により代謝されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの緑色蛍光（励起波長：４９０ｎｍ、蛍光波長：５１４ｎｍ）が細胞質に均一に分布していることを蛍光顕微鏡の観察により確認した。
ＦＤは、そのままでは蛍光を発しないが、細胞内のエステラーゼ活性によりエステル結合が切れることで、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの緑色蛍光（励起波長：４９０ｎｍ、蛍光波長：５１４ｎｍ）が観察される。【０１５２】
（４）次いで、５ｍＬの新鮮な培養液を注入した新しいシャーレ（直径６０ｍｍ）内へ肝組織型チップを移し入れ、培養液中に沈めて１時間培養した。１時間後の細胞におけるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの排出を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡の観察により確認した（図８の（Ａ）〜（Ｃ）参照。）。【０１５３】
図８の（Ａ）〜（Ｃ）から、細胞質に分布していたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎが毛細胆管様構造へ排泄されて蓄積することが確かめられた。【０１５４】
［製造例２］細胞封入用デバイス（任意の形状）の作製２
（１）厚さ３ｍｍのシリコーン膜を環状（内径：１１ｍｍ、外径：２０ｍｍ）に切り出した後（図９の（Ａ）参照。）、シリコーン膜の厚みのほぼ中央部分で環状の内部と外部を貫通するようにステンレス管（内径：０．９ｍｍ、外径：１．２６ｍｍ）を通すことで、側面の２カ所に穴を開けた（図９の（Ｂ）参照。）。【０１５５】
（２）次いで、（１）で作製した環状シリコーン膜を側面の部材となるように天面及び底面に、コラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体を公知の方法（参考文献：特開２０１２−１１５２６２号公報）に準じてウレタン系接着剤で接着した（図９の（Ｃ）参照。）。次いで、ゲルローディングチップを側面の２カ所の穴に貫通させることで、細胞封入用デバイスを作製した（図９の（Ｄ）参照。）。
なお、シリコーン膜は様々な厚さのものが市販されており、それらを所望の形状で切り出すことで側面の部材を作製した後、その側面の部材の天面及び底面にコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体を貼り付けることで、任意の形状の細胞封入用デバイスが作製できる。【０１５６】
（３）次いで、（２）で作製した細胞封入用デバイスのゲルローディングチップにシリンジを接続することで、デバイス内部に適当量の培養液を注入できることを確認した（図９の（Ｅ）及び（Ｆ）参照。）。
また、２つの細胞封入用デバイスをゲルローディングチップの先端部分のチューブで連結することで、一方の細胞封入用デバイスから他方の細胞封入用デバイスへと培養液を通液できることを確認した（図９の（Ｇ）参照。）。【０１５７】
（４）次いで、適当量の培養液を注入した細胞封入用デバイスよりゲルローディングチップを外した後、その穴に爪楊枝で栓を施すことで、細胞封入用デバイスの内部より培養液が漏れ出ないことを確認した（図９の（Ｈ）参照。）。
なお、本実施例では栓として木製の爪楊枝を用いたが、培養用にはアクリル等のプラスチック製又はステンレス製の栓が好ましい。【０１５８】
以上の結果から、本実施形態の細胞封入用デバイスによれば、細胞を長期間培養することができ、多細胞構造体を構築できることが確かめられた。【０１５９】
［製造例３］細胞封入用デバイス（支持体なし）の作製３
（１）製造例１で用いたシリコンリングより一回り小さいシリコンリング（内径７．８ｍｍ、厚さ１．９ｍｍ）を用いて、製造例１と同様の方法を用いて、細胞封入用デバイスを作製した。次いで、環状ナイロン膜を除去し、外周部にはみ出たコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体をシリコンリング周囲にコラーゲンゾルと共に折り込んで乾燥した。【０１６０】
（２）次いで、シリコンリング内側のコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体をマスクして、両面にＵＶ照射（片面照射量：４００ｍＪ／ｃｍ２、総照射量：８００ｍＪ／ｃｍ２）で接着固定して、支持体なしの細胞封入用デバイスを作製した。
得られた支持体なしの細胞封入用デバイスについて、留置針を使用してＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を安全に封入できることを確認した（図１０Ａ及び図１０Ｂ）参照）。【０１６１】
［実施例３］ヒト肝がん細胞株のＨｅｐＧ２細胞を用いた肝組織型チップの作製２
（１）予め培養したＨｅｐＧ２細胞（理化学研究所バイオリソースセンターより購入、ＲＣＢ１６４８）を回収し、２．４×１０５細胞／ｍＬとなるように培養液と混合し、ＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を調製した。【０１６２】
（２）製造例３で得られた細胞封入用デバイスのシリコンリング壁面より留置針を突き刺して内筒針を除去して、留置針カテーテルを装着した。次いで、この留置針カテーテルを使用して１００μＬのＨｅｐＧ２細胞の懸濁液（２．４×１０５細胞／ｍＬ）を注入して、肝組織型チップを作製した。シリコンリングの内側底面積は０．４８ｃｍ２であるため、初期播種密度は５．０×１０４細胞／ｃｍ２であった。【０１６３】
（３）２４ウェルプレートのウェル内に１．０ｍＬの培養液を注入し、（２）で作製した肝組織型チップを培養液中に沈めて培養を開始した。コントロールとして、２４ウェルプレートのウェル内に初期播種密度が５．０×１０４細胞／ｃｍ２となるように調製した１．０ｍＬのＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を注入して、培養を開始した。その後、一日毎に各ウェル内の培養液を交換して、約１ヶ月間培養して以下の解析を行った。【０１６４】
（４）位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡により経時的に観察して、多細胞集団の形態変化の解析及びｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭとｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１とを用いた生死判定を行った。培養４日目のコントロール及び肝組織型チップの位相差顕微鏡像及び蛍光顕微鏡像を図１１Ａに示す。また、培養３２日目のコントロール及び肝組織型チップの位相差顕微鏡像及び蛍光顕微鏡像を図１１Ｂに示す。【０１６５】
図１１Ａから、培養４日目では、コントロールの細胞は増殖して多くの不均一な凝集塊を形成し、凝集塊中心部に死んだ細胞が集積した。一方、肝組織型チップの細胞は均一に増殖して毛細胆管様構造を形成し、ほぼ生存していた。
また、図１１Ｂから、培養３２日目では、コントロールの細胞は巨大な凝集塊を形成し、凝集塊内部に多くの死んだ細胞が分散していた。一方、肝組織型チップの細胞は規則的な緻密構造を形成し、ほぼ生存していることが明らかとなった。【０１６６】
［実施例４］ＨｅｐＧ２細胞の肝組織型チップによるモデル薬剤の代謝と代謝物の毛細胆管様構造への排泄と蓄積２
（１）モデル薬剤としてのＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＦＤ）を２５μｇ／ｍＬの濃度で含有するＨＢＳＳを調製して、シャーレ（直径６０ｍｍ）内に５ｍＬ注入した。【０１６７】
（２）次いで、実施例３においてＨｅｐＧ２細胞を用いて作製した培養３２日目の肝組織型チップを、（１）で調製したＦＤ含有ＨＢＳＳ中に沈めて１時間培養することで細胞内にＦＤを取り込ませた。【０１６８】
（３）次いで、５ｍＬのＨＢＳＳを注入した新しいシャーレ（直径６０ｍｍ）内へ移し入れ洗浄した。この作業を２回行った後、ＨｅｐＧ２細胞により代謝されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの緑色蛍光（励起波長：４９０ｎｍ、蛍光波長：５１４ｎｍ）が細胞質に均一に分布していることを蛍光顕微鏡の観察により確認した。【０１６９】
（４）次いで、５ｍＬの新鮮なＨＢＳＳを注入した新しいシャーレ（直径６０ｍｍ）内へ肝組織型チップを移し入れ、ＨＢＳＳ中に沈めて１時間培養した。１時間後の細胞におけるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの排出を位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡の観察により確認した（図１２Ａ（位相差顕微鏡像）及び図１２Ｂ（蛍光顕微鏡像）参照。）。【０１７０】
図１２Ａ及び図１２Ｂから、細胞質に分布していたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎが毛細胆管様構造へ排泄されて蓄積することが確かめられた。【０１７１】
［実施例５］ＨｅｐＧ２細胞の肝組織型チップにおける肝組織特異的機能の評価１
（１）肝組織特異的機能を評価するために、実施例３においてＨｅｐＧ２細胞を用いて作製した肝組織型チップについて、アルブミン合成（培養４、１６及び３２日目を評価）、尿素合成（培養４、１６及び３２日目を評価）及びＣＹＰ３Ａ４活性（培養３、１４及び２８日目を使用）を経時的に解析した。具体的には、アルブミン合成は、Ｈｕｍａｎ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｔ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ,Ｉｎｃ.製）を測定キットとして用いて測定した。尿素合成はＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ  Ｕｒｅａ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を測定キットとして用いて測定した。ＣＹＰ３Ａ４活性は、Ｐ４５０−Ｇｌｏ（登録商標）  ＣＹＰ３Ａ４  ａｓｓａｙ  ｗｉｔｈ  Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−ＩＰＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を測定キットとして用いて測定した。なお、比活性は播種細胞数より算出した。また、実施例３のコントロールについても同様に、アルブミン合成（培養４、１６及び３２日目を評価）、尿素合成（培養４、１６及び３２日目を評価）及びＣＹＰ３Ａ４活性（培養３、１４及び２８日目を使用）を経時的に解析した。結果を図１３Ａ（アルブミン合成）、図１３Ｂ（尿素合成）及び図１３Ｃ（ＣＹＰ３Ａ４活性）に示す。【０１７２】
図１３Ａ、図１３Ｂ及び図１３Ｃから、肝組織型チップはコントロールに比べて、アルブミン合成、尿素合成及びＣＹＰ３Ａ４活性共に、培養初期より約１ヶ月間にわたり向上して維持することが明らかとなった。
なお、ＣＹＰ３Ａ４活性については、ヒト初代凍結肝細胞の平均的な活性に匹敵すると考えられている分化型ＨｅｐａＲＧ細胞も同時に比較解析したところ、分化型ＨｅｐａＲＧ細胞のＣＹＰ３Ａ４活性は、２０７，６５５±３１，１１１（ＲＬＵ／１０６ｃｅｌｌｓ）であった。したがって、肝組織型チップのＣＹＰ３Ａ４活性は、分化型ＨｅｐａＲＧ細胞の約１／３以上のレベルに達していることが分かった。【０１７３】
［製造例４］細胞封入用デバイス（切削加工及び成形加工したプラスチック製リングを利用）の作製４
（１）壁面孔路付きのプラスチック製の大リング及び小リングを準備した。大リングは、厚さ２．０ｍｍの壁面孔路（径０．７０ｍｍ）付きで、内側空間体積１．０ｍＬ、内径２５．２４ｍｍ、内側底面積５．００ｃｍ２であった。一方、小リングは、厚さ２．０ｍｍの壁面孔路（径０．７０ｍｍ）付きで、内側空間体積０．１ｍＬ、内径７．９８ｍｍ、内側底面積０．５０ｃｍ２であった。大リング及び小リングともに、壁面孔路は直径８００μｍのステンレス球で栓ができた。
これらプラスチック製の大リング及び小リングの両面に、ポリウレタン系接着剤を用いて、製造例１の（１）と同様の方法を用いて調製したコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜の乾燥体を直接接着して、細胞封入用デバイスを作製した。【０１７４】
（２）次いで、得られた細胞封入用デバイスについて、壁面孔路から留置針カテーテルを使用してヒト真皮由来線維芽細胞の懸濁液を安全に注入し、壁面孔路をステンレス球で栓をすることで細胞を封入できることを確認した（図１４Ａ及び図１４Ｂ参照）。【０１７５】
［実施例６］ヒト真皮由来線維芽細胞を用いた真皮組織型チップの作製１
（１）予め培養したヒト真皮由来線維芽細胞を回収し、１．０×１０５細胞／ｍＬとなるように培養液と混合し、ヒト真皮由来線維芽細胞の懸濁液を調製した。【０１７６】
（２）製造例４においてプラスチック製小リングを用いて作製した細胞封入用デバイスに、壁面孔路から留置針カテーテルを使用して１００μＬのヒト真皮由来線維芽細胞の懸濁液（１．０×１０５細胞／ｍＬ）を注入した。次いで、壁面孔路をステンレス球で栓をすることで真皮組織型チップを作製した。なお、初期播種密度は２．０×１０４／ｃｍ２であった。【０１７７】
（３）２４ウェルプレートのウェル内に１．０ｍＬの培養液を注入し、（２）で作製した真皮組織型チップを培養液中に沈めて培養を開始した。その後、一日毎に各ウェル内の培養液を交換して、２１日間培養した。【０１７８】
（４）位相差顕微鏡により経時的に観察して、多細胞集団の形態変化の解析を行った。培養１、２、３及び８日目の真皮組織型チップの位相差顕微鏡像を図１５に示す。【０１７９】
図１５から、ヒト真皮由来線維芽細胞はコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜に接着した後、良好に増殖して多層化することが確かめられた。【０１８０】
（５）さらに、前記真皮組織型チップについて、培養を継続し、一日毎に各ウェル内の培養液を交換して、培養開始から１００日目まで培養した。【０１８１】
（６）１００日間培養した真皮組織型チップについて、位相差顕微鏡観察、及びｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭとｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１とを用いた生死判定を行った。１００日間培養した真皮組織型チップの位相差顕微鏡像及び蛍光顕微鏡像を図１６に示す。【０１８２】
図１６から、１００日間培養した真皮組織型チップの細胞は、多層化増殖して規則的な緻密構造を形成し、大半は生存していることが明らかとなった。【０１８３】
［実施例７］真皮組織型チップからのヒト真皮由来線維芽細胞の回収１
（１）実施例６において作製した培養１５日目の真皮組織型チップを０．５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼで処理して、真皮組織型チップからヒト真皮由来線維芽細胞を回収できるか検討した。その結果、３７℃で２０分間処理することで、コラーゲンビトリゲル（登録商標）膜が消化され、ヒト真皮由来線維芽細胞をデバイスより分離できることが明らかとなった。【０１８４】
（２）次いで、回収されたヒト真皮由来線維芽細胞をプラスチック製培養皿内で培養し、位相差顕微鏡により経時的に観察した。培養２日目及び７日目のヒト真皮由来線維芽細胞の位相差顕微鏡像を図１７Ａ（培養２日目）及び図１７Ｂ（培養７日目）に示す。【０１８５】
図１７Ａ及び図１７Ｂから、真皮組織型チップから回収されたヒト真皮由来線維芽細胞が良好に増殖することが明らかとなった。【０１８６】
［実施例８］真皮組織型チップからのヒト真皮由来線維芽細胞の回収２
（１）実施例６において作製した培養２１日目の真皮組織型チップを眼科用ハサミでプラスチック製リングの内縁に沿ってコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を切り出した。次いで、培養液を注いだプラスチック製培養皿へ移し入れて、細切することで多数の小さい切断片とした。次いで、この切断片を培養することで、ヒト真皮由来線維芽細胞を分離できるか検討するために、位相差顕微鏡により経時的に観察した。培養開始から３０分後及び培養１日目のヒト真皮由来線維芽細胞の位相差顕微鏡像を図１８Ａ（培養開始から３０分後）及び図１８Ｂ（培養１日目）に示す。【０１８７】
図１８Ａ及び図１８Ｂから、真皮組織型チップから回収されたヒト真皮由来線維芽細胞が良好に増殖することが明らかとなった。【０１８８】
［実施例９］ヒト肝がん細胞株のＨｅｐＧ２細胞を用いた肝組織型チップの作製３
（１）予め培養したＨｅｐＧ２細胞（理化学研究所バイオリソースセンターより購入、ＲＣＢ１６４８）を回収し、２．５×１０５細胞／ｍＬとなるように培養液と混合し、ＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を調製した。【０１８９】
（２）製造例４においてプラスチック製小リングを用いて作製した細胞封入用デバイスに、壁面孔路から留置針カテーテルを使用して１００μＬのＨｅｐＧ２細胞の懸濁液（２．５×１０５細胞／ｍＬ）を注入した。次いで、壁面孔路をステンレス球で栓をして、肝組織型チップを作製した。初期播種密度は、５．０×１０４／ｃｍ２であった。【０１９０】
（３）２４ウェルプレートのウェル内に１．０ｍＬの培養液を注入し、（２）で作製した肝組織型チップを培養液中に沈めて培養を開始した。コントロールとして、２４ウェルプレートのウェル内に初期播種密度が５．０×１０４細胞／ｃｍ２となるように調製した１．０ｍＬのＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を注入して、培養を開始した。その後、一日毎に各ウェル内の培養液を交換して、約１ヶ月間培養して以下の解析を行った。【０１９１】
（４）位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡により経時的に観察して、多細胞集団の形態変化の解析及びｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭとｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１とを用いた生死判定を行った。培養２８日目のコントロール及び肝組織型チップの位相差顕微鏡像及び蛍光顕微鏡像を図１９に示す。【０１９２】
図１９から、培養２８日目では、コントロールの細胞は巨大な凝集塊を形成し、凝集塊内部に多くの死んだ細胞が分散していた。一方、肝組織型チップの細胞は規則的な緻密構造を形成し、ほぼ生存していることが明らかとなった。【０１９３】
［実施例１０］ＨｅｐＧ２細胞の肝組織型チップによるモデル薬剤の代謝と代謝物の毛細胆管様構造への排泄と蓄積３
（１）モデル薬剤としてのＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＦＤ）を２５μｇ／ｍＬの濃度で含有するＨＢＳＳを調製して、シャーレ（直径６０ｍｍ）内に５ｍＬ注入した。【０１９４】
（２）次いで、実施例９においてＨｅｐＧ２細胞を用いて作製した培養３５日目の肝組織型チップを、（１）で調製したＦＤ含有ＨＢＳＳ中に沈めて１時間培養することで細胞内にＦＤを取り込ませた。【０１９５】
（３）次いで、５ｍＬのＨＢＳＳを注入した新しいシャーレ（直径６０ｍｍ）内へ移し入れ洗浄した。この作業を２回行った後、ＨｅｐＧ２細胞により代謝されたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの緑色蛍光（励起波長：４９０ｎｍ、蛍光波長：５１４ｎｍ）が細胞質に均一に分布していることを蛍光顕微鏡の観察により確認した。【０１９６】
（４）次いで、５ｍＬの新鮮なＨＢＳＳを注入した新しいシャーレ（直径６０ｍｍ）内へ肝組織型チップを移し入れ、ＨＢＳＳ中に沈めて１時間培養した。１時間後の細胞におけるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの排出を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡の観察により確認した（図２０Ａ（位相差顕微鏡像）及び図２０Ｂ（蛍光顕微鏡像）参照。）。【０１９７】
図２０Ａ及び図２０Ｂから、細胞質に分布していたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎが毛細胆管様構造へ排泄されて蓄積することが確かめられた。【０１９８】
［実施例１１］ＨｅｐＧ２細胞の肝組織型チップにおける肝組織特異的機能の評価２
（１）肝組織特異的機能を評価するために、実施例９においてＨｅｐＧ２細胞を用いて作製した肝組織型チップについて、アルブミン合成、尿素合成及びＣＹＰ３Ａ４活性を経時的に解析した（培養３、７、１４、２１及び２８日目を評価）。具体的には、アルブミン合成は、Ｈｕｍａｎ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｔ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ,Ｉｎｃ.製）を測定キットとして用いて測定した。尿素合成はＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ  Ｕｒｅａ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を測定キットとして用いて測定した。ＣＹＰ３Ａ４活性は、Ｐ４５０−Ｇｌｏ（登録商標）  ＣＹＰ３Ａ４  ａｓｓａｙ  ｗｉｔｈ  Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−ＩＰＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を測定キットとして用いて測定した。なお、比活性は播種細胞数より算出した。また、実施例９のコントロールについても同様に、アルブミン合成、尿素合成及びＣＹＰ３Ａ４活性を経時的に解析した（培養３、７、１４、２１及び２８日目を評価）。結果を図２１Ａ（アルブミン合成）、図２１Ｂ（尿素合成）及び図２１Ｃ（ＣＹＰ３Ａ４活性）に示す。【０１９９】
図２１Ａ、図２１Ｂ及び図２１Ｃから、肝組織型チップはコントロールに比べて、アルブミン合成、尿素合成及びＣＹＰ３Ａ４活性共に、培養初期より約１ヶ月間にわたり向上して維持することが明らかとなった。
なお、ＣＹＰ３Ａ４活性については、ヒト初代凍結肝細胞の平均的な活性に匹敵すると考えられている分化型ＨｅｐａＲＧ細胞も同時に比較解析したところ、分化型ＨｅｐａＲＧ細胞のＣＹＰ３Ａ４活性は、１７９，４４７±１５，２８７（ＲＬＵ／１０６ｃｅｌｌｓ）であった。したがって、７日間以上培養した肝組織型チップのＣＹＰ３Ａ４活性は、分化型ＨｅｐａＲＧ細胞の約１／２以上のレベルに達していることが分かった。【０２００】
［製造例５］細胞封入用デバイス（切削加工及び成形加工したプラスチック製リングを利用、片面にコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体、もう片面に透析膜を貼付）の作製５
（１）壁面孔路付きのプラスチック製小リングを準備した。小リングの大きさは、内径７．９８ｍｍ、外径１３．０ｍｍ、厚さ２．０ｍｍ（内側空間体積０．１ｍＬ、内側底面積０．５０ｃｍ２）であった。このプラスチック製小リングの片面に、ポリウレタン系接着剤を用いて、製造例１の（１）と同様の方法を用いて調製したコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜の乾燥体を直接接着した。【０２０１】
（２）次いで、透析膜（三光純薬社製、透析膜用セルロースチューブ、分子量カット:１４，０００）を準備し、水和させてチューブを切り開いた。次いで、切り開いた透析膜を支持フィルムと共に環状磁石に挟んで乾燥させた状態で、小リングのもう一方の面にポリウレタン系接着剤を用いて、直接接着した。次いで、支持フィルムを除去してリング外周の余分な部分を切断することで細胞封入用デバイスを作製した。【０２０２】
［製造例６］細胞封入用デバイス（切削加工及び成形加工したプラスチック製リングを利用、片面にコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体、もう片面にメンブレンフィルターを貼付）の作製６
（１）壁面孔路付きのプラスチック製小リングを準備した。小リングの大きさは、内径７．９８ｍｍ、外径１３．０ｍｍ、厚さ２．０ｍｍ（内側空間体積０．１ｍＬ、内側底面積０．５０ｃｍ２）であった。このプラスチック製小リングの片面に、ポリウレタン系接着剤を用いて、製造例１の（１）と同様の方法を用いて調製したコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜の乾燥体を直接接着した。【０２０３】
（２）次いで、ＰＴＦＥメンブレンフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、オムニポア（登録商標）メンブレン、直径：１３．０ｍｍ、孔径：０．２μｍ及び０．４５μｍ）を準備し、７０％エタノールに浸潤させ、滅菌し、乾燥させた。次いで、乾燥させた各メンブレンフィルターを、小リングのもう一方の面にポリウレタン系接着剤を用いて、直接接着し、メンブレンの孔径が異なる２種類の細胞封入用デバイスを作製した。【０２０４】
［実施例１２］細胞封入用デバイスのタンパク透過性試験１
（１）製造例４で壁面孔路付きのプラスチック製小リングを用いて作製した両面にコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体が貼付された細胞封入用デバイス（以下、「細胞封入用デバイス４」と称する場合がある）、及び、製造例５で壁面孔路付きのプラスチック製小リングを用いて作製した片面にコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体が貼付され、もう一方の面に透析膜が貼付された細胞封入用デバイス（以下、「細胞封入用デバイス５」と称する場合がある）を準備した。【０２０５】
（２）次いで、細胞封入用デバイス４及び細胞封入用デバイス５に、１００μＬの３０％ＦＢＳ溶液を注入した。なお、３０％ＦＢＳ溶液は、３．０ｍＬのＦＢＳと７．０ｍＬのＰＢＳを混和して調製した。【０２０６】
（３）次いで、１２ウェルプレートの各ウェルに３．０ｍＬのＰＢＳを分注した。【０２０７】
（４）次いで、１００μＬの３０％ＦＢＳ溶液が封入された細胞封入用デバイス４及び細胞封入用デバイス５を下面がコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜となるように１個ずつ１２ウェルプレートの各ウェルに沈めた。次いで、３７℃インキュベーター内で振盪（７０ｒｐｍ）を開始した。【０２０８】
（５）次いで、経時的にデバイス内からデバイス外へ透過したタンパク量を測定した（培養開始から３０分後、１時間後、２時間後、６時間後及び２４時間後）。結果を図２２に示す。【０２０９】
図２２から、細胞封入用デバイス４及び細胞封入用デバイス５のタンパク透過性を比較した結果、細胞封入用デバイス５のタンパク透過性は細胞封入用デバイス４より劣ることが分かった。【０２１０】
［実施例１３］細胞封入用デバイスのタンパク透過性試験２
（１）製造例４で壁面孔路付きのプラスチック製小リングを用いて作製した両面にコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体が貼付された細胞封入用デバイス（以下、「細胞封入用デバイス４」と称する場合がある）、並びに、製造例６で壁面孔路付きのプラスチック製小リングを用いて作製した片面にコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体が貼付され、もう一方の面にＰＴＦＥメンブレンフィルター（孔径：０．２μｍ）が貼付された細胞封入用デバイス（以下、「細胞封入用デバイス６−１」と称する場合がある）、及び、製造例６で壁面孔路付きのプラスチック製小リングを用いて作製した片面にコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体が貼付され、もう一方の面にＰＴＦＥメンブレンフィルター（孔径：０．４５μｍ）が貼付された細胞封入用デバイス（以下、「細胞封入用デバイス６−２」と称する場合がある）を準備した。【０２１１】
（２）次いで、細胞封入用デバイス４、細胞封入用デバイス６−１及び細胞封入用デバイス６−２に、１００μＬの３０％ＦＢＳ溶液を注入した。なお、３０％ＦＢＳ溶液は、３．０ｍＬのＦＢＳと７．０ｍＬのＰＢＳを混和して調製した。【０２１２】
（３）次いで、１２ウェルプレートの各ウェルに３．０ｍＬのＰＢＳを分注した。【０２１３】
（４）次いで、１００μＬの３０％ＦＢＳ溶液が封入された細胞封入用デバイス４、細胞封入用デバイス６−１及び細胞封入用デバイス６−２を下面がコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜となるように１個ずつ１２ウェルプレートの各ウェルに沈めた。次いで、３７℃インキュベーター内で振盪（７０ｒｐｍ）を開始した。【０２１４】
（５）次いで、経時的にデバイス内からデバイス外へ透過したタンパク量を測定した（培養開始から５分後、３０分後、２時間後、６時間後及び２４時間後）。結果を図２３に示す。【０２１５】
図２３から、細胞封入用デバイス４、細胞封入用デバイス６−１及び細胞封入用デバイス６−２のタンパク透過性を比較した結果、細胞封入用デバイス間で大きな差が無いことが分かった。【０２１６】
［実施例１４］ヒト肝がん細胞株のＨｅｐＧ２細胞を用いた肝組織型チップの作製４及び保存試験１
（１）予め培養したＨｅｐＧ２細胞（理化学研究所バイオリソースセンターより購入、ＲＣＢ１６４８）を回収し、２．５×１０５細胞／ｍＬとなるように培養液と混合し、ＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を調製した。【０２１７】
（２）製造例４において作製した細胞封入用デバイス４に、壁面孔路から留置針カテーテルを使用して１００μＬのＨｅｐＧ２細胞の懸濁液（２．５×１０５細胞／ｍＬ）を注入した。次いで、壁面孔路をステンレス球で栓をして、肝組織型チップ（以下、「肝組織型チップ４」と称する場合がある）を作製した。初期播種密度は、５．０×１０４／ｃｍ２であった。この肝組織型チップを５つ作製した。【０２１８】
（３）また、製造例６において作製した細胞封入用デバイス６−１に、壁面孔路から留置針カテーテルを使用して１００μＬのＨｅｐＧ２細胞の懸濁液（２．５×１０５細胞／ｍＬ）を注入した。次いで、壁面孔路をステンレス球で栓をして、肝組織型チップ（以下、「肝組織型チップ６−１」と称する場合がある）を作製した。初期播種密度は、５．０×１０４／ｃｍ２であった。この肝組織型チップを５つ作製した。【０２１９】
（４）次いで、２４ウェルプレートのウェル内に１．０ｍＬの培養液を注入し、（２）及び（３）で作製した肝組織型チップ４及び肝組織型チップ６−１を培養液中に沈めて、５％ＣＯ２存在下、３７℃浸潤インキュベーター内で培養を開始した。【０２２０】
（５）２４時間（丸一日間）培養した後、各肝組織型チップ１個ずつｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭとｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１とを用いた生死判定を行った。その結果、何れのデバイスにおいても、細胞はコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜に良好に接着して生存していることが確認された（図２４Ａ（「肝組織型チップ４」）及び図２４Ｂ（「肝組織型チップ６−１」）の「３７℃培養１日目」参照）。【０２２１】
（６）次いで、残りの各肝組織型チップ４個については、培養液を注いだ１５ｍＬコニカルチューブを準備し、コニカルチューブ内に各肝組織型チップ１個ずつ移し入れた。次いで、コニカルチューブに、さらに気体が入らないように培養液を満たして密封した。【０２２２】
（７）次いで、肝組織型チップ４又は肝組織型チップ６−１を１個ずつ密封したコニカルチューブを２５℃気相インキュベーター内に移し入れて、２５℃における保存を開始した。【０２２３】
（８）２５℃に保存した各肝組織型チップを、保存後１、２、３及び６日目に１個ずつ取り出した。その直後に、ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭとｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１とを用いた生死判定を行った。結果を図２４Ａ（「肝組織型チップ４」）及び図２４Ｂ（「肝組織型チップ６−１」）に示す。【０２２４】
図２４Ａ及び図２４Ｂから、ｃａｌｃｅｉｎ陽性細胞は、２５℃３日間以上の保存では、肝組織型チップ４及び肝組織型チップ６−１のいずれにおいても保存前と比較して減少した。一方、eｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１陽性細胞は、２５℃のいずれの保存期間においても、肝組織型チップ４及び肝組織型チップ６−１の両方とも保存前と比較して同等に僅かであることが分かった。このことから、２５℃の保存直後であれば、肝組織型チップ４及び肝組織型チップ６−１のいずれにおいても、６日間にわたり良好に生存細胞を維持できることが示唆された。【０２２５】
［実施例１５］ヒト肝がん細胞株のＨｅｐＧ２細胞を用いた肝組織型チップの作製５及び保存試験２
（１）予め培養したＨｅｐＧ２細胞（理化学研究所バイオリソースセンターより購入、ＲＣＢ１６４８）を回収し、２．５×１０５細胞／ｍＬとなるように培養液と混合し、ＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を調製した。【０２２６】
（２）製造例４において作製した細胞封入用デバイス４に、壁面孔路から留置針カテーテルを使用して１００μＬのＨｅｐＧ２細胞の懸濁液（２．５×１０５細胞／ｍＬ）を注入した。次いで、壁面孔路をステンレス球で栓をして、肝組織型チップ（以下、「肝組織型チップ４」と称する場合がある）を作製した。初期播種密度は、５．０×１０４／ｃｍ２であった。この肝組織型チップを４つ作製した。【０２２７】
（３）また、製造例６において作製した細胞封入用デバイス６−１に、壁面孔路から留置針カテーテルを使用して１００μＬのＨｅｐＧ２細胞の懸濁液（２．５×１０５細胞／ｍＬ）を注入した。次いで、壁面孔路をステンレス球で栓をして、肝組織型チップ（以下、「肝組織型チップ６−１」と称する場合がある）を作製した。初期播種密度は、５．０×１０４／ｃｍ２であった。この肝組織型チップを４つ作製した。【０２２８】
（４）次いで、２４ウェルプレートのウェル内に１．０ｍＬの培養液を注入し、（２）及び（３）で作製した肝組織型チップ４及び肝組織型チップ６−１を培養液中に沈めて、５％ＣＯ２存在下、３７℃浸潤インキュベーター内で培養を開始した。【０２２９】
（５）２４時間（丸一日間）培養した後、培養液を注いだ１５ｍＬコニカルチューブを準備し、コニカルチューブ内に各肝組織型チップ１個ずつ移し入れた。次いで、コニカルチューブに、さらに気体が入らないように培養液を満たして密封した。【０２３０】
（６）次いで、肝組織型チップ４又は肝組織型チップ６−１を１個ずつ密封したコニカルチューブを２５℃気相インキュベーター内に移し入れて、２５℃における保存を開始した。【０２３１】
（７）２５℃に保存した各肝組織型チップを、保存後１、２、３及び６日目に１個ずつ取り出した。次いで、２４ウェルプレートのウェル内に１．０ｍＬの培養液を注入し、取り出した各肝組織型チップを培養液中に沈めて、５％ＣＯ２存在下の３７℃湿潤インキュベーター内で２４時間（丸１日間）にわたり、後培養した。３７℃での２４時間（丸１日間）の後培養後、ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭとｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１とを用いた生死判定を行った。結果を図２５Ａ（「肝組織型チップ４」）及び図２５Ｂ（「肝組織型チップ６−１」）に示す。【０２３２】
図２５Ａ及び図２５Ｂから、ｃａｌｃｅｉｎ陽性細胞は、肝組織型チップ４では２５℃３日間以上の保存、また、肝組織型チップ６−１では２５℃６日間の保存で減少することが分かった。一方、ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１陽性細胞は、肝組織型チップ４では２５℃３日間以上の保存、また、肝組織型チップ６−１では２５℃６日間の保存で増加することが分かった。【０２３３】
そこで、図２５Ａ及び図２５Ｂの蛍光顕微鏡像を用いて、一辺１００μｍの正方形が重ならないような任意の三カ所を選択して、その正方形内のｃａｌｃｅｉｎ及びｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１の陽性細胞を計測して、細胞生存率を解析した。結果を図２６に示す。【０２３４】
図２６から、肝組織型チップ６−１では、２５℃保存後の後培養でも肝組織型チップ４より良好に細胞生存率を維持していた。特に、肝組織型チップ６−１では、２５℃での３日間保存後の３７℃での後培養１日目において、７７．３±９．２％の細胞生存率を維持できることが分かった。【０２３５】
［製造例７］細胞封入用デバイス（留置針カテーテル付き、アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）のみで構成）の作製７
（１）アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体は、内径３４ｍｍの壁面鋳型内に１０．０ｍＬの０．５％アテロコラーゲンゾルを注ぎ、アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体（コラーゲン量：５．５ｍｇ／ｃｍ２）を公知の方法（参考文献：国際公開第２０１２／０２６５３１号）に準じて作製した。
なお、０．５％アテロコラーゲンゾルは、氷上で無血清培養液６ｍＬを５０ｍＬコニカルチューブに分注した後、ブタ由来アテロコラーゲン溶液（関東化学社製、コラーゲン濃度１．０質量％）６ｍＬを添加し、３回ピペッティングを行うことで調製した。
また、使用した無血清培養液は、以下に示す組成であった。
無血清培養液：ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１８８５−０８４）
＋２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．１５６３０−０８０）
＋１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．１５１４０−１４８）【０２３６】
（２）次いで、（１）で作製したアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体２枚をＰＢＳで再水和して、アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜２枚を調製した。次いで、ビニールシート上に１枚のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を伸展し、その上に０．５ｍＬの０．５％アテロコラーゲンゾルを添加してはみ出ないように広げた。このアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜上のほぼ中心に、留置針カテーテル（ニプロ社製、「ニプロセーフレットキャス  ＮＩＣ★２６×３／４（商品名）」、カテーテル、ゲージ数２６Ｇ、外径：０．６ｍｍ、長さ：１９ｍｍ）の先端がくるように留置針カテーテルを重ね置いた。次いで、もう1枚のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を覆い被せた。
なお、０．５％アテロコラーゲンゾルは、公知の方法（参考文献：特開２０１５−２０３０１８号公報）に準じて、接着剤として使用した。【０２３７】
（３）次いで、１０℃、湿度４０％のインキュベーター内で、クリーン風乾機を用いて、乾燥（ガラス化）した。【０２３８】
（４）次いで、シリコンリング（内径１１．８ｍｍ×厚さ２．４ｍｍ）をアルミホイルで包み、留置針カテーテルを挟んだ円形のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体の中心と同心なるように重ねることで、アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体の内側をマスクした。次いで、ＵＶ照射（単位面積あたりのＵＶ総照射量：４００ｍＪ／ｃｍ２）した。【０２３９】
（５）ＵＶ照射後のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体を裏返して、同様にアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体の内側をマスクし、ＵＶ照射（単位面積あたりのＵＶ総照射量：４００ｍＪ／ｃｍ２）した。【０２４０】
（６）次いで、シャーレ内等でガラス化を進行させて、留置針カテーテル付き細胞封入用デバイスを作製した（図２７Ａ参照）。【０２４１】
（７）次いで、得られた細胞封入用デバイスについて、留置針カテーテルからヒト真皮由来線維芽細胞の懸濁液を安全に注入し、細胞を封入できることを確認した（図２７Ｂ参照）。【０２４２】
［実施例１６］ヒト真皮由来線維芽細胞を用いた真皮組織型チップの作製２
（１）予め培養したヒト真皮由来線維芽細胞を回収し、５．２×１０５細胞／ｍＬとなるように培養液と混合し、ヒト真皮由来線維芽細胞の懸濁液を調製した。【０２４３】
（２）次いで、製造例７において作製した留置針カテーテル付き細胞封入用デバイスを培養液で再水和した後、留置針カテーテルにシリンジを接続して６００μＬのヒト真皮由来線維芽細胞の懸濁液（５．２×１０５細胞／ｍＬ）を注入して、真皮組織型チップを作製した。次いで、留置針カテーテルを軽く引張り、真皮組織型チップより除去した。この時、細胞封入用デバイスに注入した懸濁液は半分近く外側に漏れ出てしまったが、半分程度は注入した状況を維持できた。そのため、初期播種密度は計算不可能であった。【０２４４】
（３）次いで、直径６ｃｍのシャーレ内に５．０ｍＬの培養液を注入し、（２）で作製した真皮組織型チップを培養液中に沈めて培養を開始した。その後、一日毎に各ウェル内の培養液を交換して、３日間培養した。培養１日目の真皮組織型チップを撮影した画像を図２８に示す。【０２４５】
（４）位相差顕微鏡により経時的に観察して、多細胞集団の形態変化の解析を行った。培養０（２時間）、１、２及び３日目の真皮組織型チップの位相差顕微鏡像を図２９に示す。【０２４６】
図２９から、ヒト真皮由来線維芽細胞はアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜に接着した後、良好に増殖することが確かめられた。【０２４７】
［製造例８］細胞封入用デバイス（アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）のみで構成）の作製８
（１）製造例７の（１）と同様の方法を用いて、アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体４枚を作製した。４枚のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体について、各膜厚をデジマチックマイクロメーター（ミツトヨ社製）で計測した結果、７４±１１μｍであった。【０２４８】
（２）次いで、（１）で作製したアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体２枚をＰＢＳで再水和して、２枚のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を調製した。ビニールシート上に１枚のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を伸展した。次いで、その上に０．５ｍＬの０．５％アテロコラーゲンゾルを添加してはみ出ないように広げた後、もう１枚のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を覆い被せた。
なお、０．５％アテロコラーゲンゾルは、公知の方法（参考文献：特開２０１５−２０３０１８号公報）に準じて、接着剤として使用した。残りの２枚のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜についも、同様に上述の操作を繰り返して行うことで、アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体２枚の二重層体を２組作製した。【０２４９】
（３）次いで、１０℃、湿度４０％のインキュベーター内で、クリーン風乾機を用いて、乾燥（ガラス化）した。【０２５０】
（４）次いで、ＵＶ照射（単位面積あたりのＵＶ総照射量：４００ｍＪ／ｃｍ２）した。さらに、ＵＶ照射後のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜二重層接着乾燥体を裏返して、ＵＶ照射（単位面積あたりのＵＶ総照射量：４００ｍＪ／ｃｍ２）した。【０２５１】
（５）次いで、アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体２枚の二重層接着乾燥体をＰＢＳで再水和した。次いで、直径１３ｍｍのポンチを用いて、１組の二重層接着体より直径１３ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜二重層接着体を２つ切り抜き、計４つの直径１３ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜二重層接着体を調製した。【０２５２】
（６）次いで、ビニールシート上に１つの直径１３ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜二重層接着体を伸展した。次いで、その上に９０μＬの０．５％アテロコラーゲンゾルを添加してはみ出ないように広げた後、もう１つの直径１３ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜二重層接着体を覆い被せることで、四重層体を作製した。さらに、この四重層体の上に９０μＬの０．５％アテロコラーゲンゾルを添加してはみ出ないように広げた後、もう１つの直径１３ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜二重層接着体を覆い被せることで、六重層体を作製した。さらに、この六重層体の上に９０μＬの０．５％アテロコラーゲンゾルを添加してはみ出ないように広げた後、もう１つの直径１３ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜二重層接着体を覆い被せることで、八重層体を作製した。【０２５３】
（７）次いで、１０℃、湿度４０％のインキュベーター内で、クリーン風乾機を用いて、乾燥（ガラス化）した。【０２５４】
（８）次いで、ＵＶ照射（単位面積あたりのＵＶ総照射量：４００ｍＪ／ｃｍ２）した。さらに、ＵＶ照射後のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜八重層接着乾燥体を裏返して、ＵＶ照射（単位面積あたりのＵＶ総照射量：４００ｍＪ／ｃｍ２）した。【０２５５】
（９）直径１３ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜八重層接着乾燥体をＰＢＳで再水和した。次いで、直径８ｍｍのポンチを用いて、前記ポンチを直径１３ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜八重層接着体の同心状に置いて、直径８ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜八重層接着体を切り抜くことで、リング状のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜八重層接着体（内径８ｍｍ、外径１３ｍｍ）を作製した。【０２５６】
（１０）次いで、１０℃、湿度４０％のインキュベーター内で、クリーン風乾機を用いて、乾燥（ガラス化）することで、リング状のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜八重層接着乾燥体（内径８ｍｍ、外径１３ｍｍ）を作製した。【０２５７】
（１１）次いで、製造例７の（１）と同様の方法を用いて、アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体１枚を作製した。次いで、作製した１枚のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体をＰＢＳで再水和して、アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を調製した。次いで、アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を直径１３ｍｍのポンチを用いて切り抜くことで、直径１３ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を作製した。
一方、（１０）で作製したリング状のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜八重層接着乾燥体（内径８ｍｍ、外径１３ｍｍ）についてもＰＢＳで再水和して、リング状のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜八重層接着体（内径８ｍｍ、外径１３ｍｍ）を調製した。【０２５８】
（１２）ビニールシート上に直径１３ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を伸展し、その上に９０μＬの０．５％アテロコラーゲンゾルを添加してはみ出ないように広げた。次いで、この上に、（１１）で調製したリング状のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜八重層接着体（内径８ｍｍ、外径１３ｍｍ）を重層した。【０２５９】
（１３）次いで、１０℃、湿度４０％のインキュベーター内で、クリーン風乾機を用いて、乾燥（ガラス化）した。【０２６０】
（１４）次いで、直径１３ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体を貼った面を上にして、ＵＶ照射（単位面積あたりのＵＶ総照射量：４００ｍＪ／ｃｍ２）した。【０２６１】
（１５）片面にアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体を接着したリング状のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜八重層接着乾燥体（内径８ｍｍ、外径１３ｍｍ）をＰＢＳで再水和した。次いで、アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を接着してない側ののリング面上に、適当量の０．５％アテロコラーゲンゾルを添加してはみ出ないように広げた。【０２６２】
（１６）次いで、製造例７の（１）と同様の方法を用いて、アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体１枚を作製した。次いで、作製した１枚のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体をＰＢＳで再水和して、アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を調製した。次いで、アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を直径１３ｍｍのポンチを用いて切り抜くことで、直径１３ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を作製した。次いで、ビニールシート上に直径１３ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜を伸展した。このアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜の上に、前記アテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜と、（１５）で調製した片面にアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体を接着したリング状のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜八重層接着体（内径８ｍｍ、外径１３ｍｍ）のアテロコラーゲンゾルを塗布した面とが接着するように覆い被せた。【０２６３】
（１７）次いで、１０℃、湿度４０％のインキュベーター内で、クリーン風乾機を用いて、乾燥（ガラス化）した。【０２６４】
（１８）次いで、新たに直径１３ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体を貼った面を上にして、ＵＶ照射（単位面積あたりのＵＶ総照射量：４００ｍＪ／ｃｍ２）した。【０２６５】
（１９）次いで、シャーレ内等でガラス化を進行させて、リング状のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜八重層接着乾燥体（内径８ｍｍ、外径１３ｍｍ）の両面に直径１３ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体を接着した細胞封入用デバイスを作製した（図３０Ａ参照）。【０２６６】
（２０）次いで、得られた細胞封入用デバイスについて、細胞封入用デバイスの天井面に留置針を突き刺して内筒針を除去して留置針カテーテルを装着した。次いで、この留置針カテーテルを使用して、ヒト真皮由来線維芽細胞の懸濁液を安全に注入し、細胞を封入できることを確認した（図３０Ｂ参照）。【０２６７】
［実施例１７］ヒト真皮由来線維芽細胞を用いた真皮組織型チップの作製３
（１）予め培養したヒト真皮由来線維芽細胞を回収し、５．２×１０５細胞／ｍＬとなるように培養液と混合し、ヒト真皮由来線維芽細胞の懸濁液を調製した。【０２６８】
（２）次いで、製造例８において作製したリング状のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜八重層接着乾燥体（内径８ｍｍ、外径１３ｍｍ）の両面に直径１３ｍｍのアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体を接着した細胞封入用デバイスの天井側のアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体より留置針を突き刺して内筒針を除去し留置針カテーテルを装着した。次いで、この留置針カテーテルにシリンジを接続して１４０μＬのヒト真皮由来線維芽細胞の懸濁液（５．２×１０５細胞／ｍＬ）を注入して、真皮組織型チップを作製した。次いで、留置針カテーテルを軽く引張り、細胞封入用デバイスより除去した。この時、細胞封入用デバイスに注入した懸濁液は殆ど漏れ出なかったため、初期播種密度は１．４５×１０５／ｃｍ２であった。【０２６９】
（３）次いで、直径６ｃｍのシャーレ内に５．０ｍＬの培養液を注入し、（２）で作製した真皮組織型チップを培養液中に沈めて培養を開始した。その後、一日毎に各ウェル内の培養液を交換して、３日間培養した。培養１日目の真皮組織型チップを撮影した画像を図３１に示す。【０２７０】
（４）位相差顕微鏡により経時的に観察して、多細胞集団の形態変化の解析を行った。培養０（２時間）、１、２及び３日目の真皮組織型チップの位相差顕微鏡像を図３２に示す。【０２７１】
図３２から、ヒト真皮由来線維芽細胞はアテロコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜に接着した後、良好に増殖することが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【０２７２】
本実施形態の細胞封入用デバイスは、細胞保護性能が優れるのみならず取扱いも容易であって、細胞の長期間培養が可能である。
さらに、本実施形態の細胞封入用デバイスを用いて、組織型チップ、器官型チップ、又は器官型チップシステムを構築することにより、従来の培養モデル、又は動物実験の代替として、疾患に対する薬効、薬剤及びその代謝物の代謝経路や細胞毒性の確認試験等への活用が期待できる。
また、本実施形態の細胞封入用デバイスが生体適合性を有する材料からなる場合、医療用細胞移植デバイスとして再生医療への活用が期待できる。
また、本実施形態の細胞封入用デバイスを用いて、細胞を安全かつ確実に運搬することができ、長期間の運搬にも対応することができる。
また、本実施形態の細胞封入用デバイスは、動物細胞以外の細胞又は小さな生命個体を封入し、生育又は成育することができる。
【符号の説明】
【０２７３】
１…多孔質膜、２…部材、３…支持体、４，１０１…チューブ、１０，２０，３０…細胞封入用デバイス、１００，２００，３００，４００…組織型チップ、１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｄ…器官型チップシステム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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