(57)【要約】  安定性（熱、ｐＨ、溶媒）が向上したリパーゼ活性を有するポリペプチドを提供することを目的とする。  少なくとも、Ｎ末端側から、βシート（Ａ）、αへリックス（Ａ）、αへリックス（Ｂ）、αへリックス（Ｃ）、βシート（Ｂ）、及びαへリックス（Ｄ）を備え、リパーゼ活性を有しており、  前記βシート（Ａ）とαへリックス（Ａ）の間の領域が、表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基を含んでおり、及び／又は、  前記βシート（Ｂ）とαへリックス（Ｄ）の間の領域が、表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基を含んでいる、ポリペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、Ｎ末端側から、βシート（Ａ）、αへリックス（Ａ）、αへリックス（Ｂ）、αへリックス（Ｃ）、βシート（Ｂ）、及びαへリックス（Ｄ）を備え、リパーゼ活性を有しており、  前記βシート（Ａ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基がポリペプチドのＮ末端側から７〜１３位に存在し、アミノ酸残基数が２〜６で構成されており、  前記αへリックス（Ａ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１５〜２５位に存在し、アミノ酸残基数が３〜９で構成されており、  前記αへリックス（Ｂ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に７０〜９２位に存在し、アミノ酸残基数が４〜１５で構成されており  前記αへリックス（Ｃ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｂ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に３〜１１位に存在し、アミノ酸残基数が１１〜２０で構成されており、  前記βシート（Ｂ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に６５〜８１位に存在し、アミノ酸残基数が２〜８で構成されており、  前記αへリックス（Ｄ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に６〜１５位に存在し、アミノ酸残基数が２〜２４で構成されている、ポリペプチドであって  前記βシート（Ａ）とαへリックス（Ａ）の間の領域が、表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基を含んでおり、及び／又は、  前記βシート（Ｂ）とαへリックス（Ｄ）の間の領域が、表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基を含んでいる、ポリペプチド。【表１】
2018021324.tif 000023
【表２】
2018021324.tif 000024
【請求項２】
更に、αへリックス（Ｅ）、βシート（Ｃ）、βシート（Ｄ）、αへリックス（Ｇ）、及びβシート（Ｅ）を備え、  前記αへリックス（Ｅ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１７〜２８位に存在し、アミノ酸残基数が１３〜１９で構成されており、  前記βシート（Ｃ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｅ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に２〜８位に存在し、アミノ酸残基数が４〜８で構成されており、  前記βシート（Ｄ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１４〜２２位に存在し、アミノ酸残基数が３〜１１で構成されており、  前記αへリックス（Ｇ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に３〜１３位に存在し、アミノ酸残基数が４〜１３で構成されており、  前記βシート（Ｅ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｇ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に２４〜３６位に存在し、アミノ酸残基数が２〜６で構成されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
更に、αへリックス（Ｆ）、αへリックス（Ｈ）、及びβシート（Ｆ）を備え、  前記αへリックス（Ｆ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１〜５位に存在し、アミノ酸残基数が３〜１５で構成されており、  前記αへリックス（Ｈ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｇ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１〜１０位に存在し、アミノ酸残基数が２〜１３で構成されており、  前記βシート（Ｆ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ｅ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１〜５位に存在し、アミノ酸残基数が１５〜２３で構成されている、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
以下の（１）から（１２）のいずれかに示すポリペプチド。（１）配列番号１に示すアミノ酸配列において、２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、２４〜２６位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３２〜２３４位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、（３）配列番号３に示すアミノ酸配列において、２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、（４）配列番号４に示すアミノ酸配列において、２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、（５）配列番号１に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（６）配列番号２に示すアミノ酸配列における２４〜２６位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３２〜２３４位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（７）配列番号３に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（８）配列番号４に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（９）配列番号１に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（１０）配列番号２に示すアミノ酸配列における２４〜２６位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３２〜２３４位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（１１）配列番号３に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（１２）配列番号４に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４に記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、又は請求項９に記載の組成物を含む酵素剤。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、請求項９に記載の組成物、又は請求項１０に記載の酵素剤を、油脂に作用させる、油脂処理方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、請求項９に記載の組成物、又は請求項１０に記載の酵素剤を排水に作用させる、排水処理方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、請求項９に記載の組成物、又は請求項１０に記載の酵素剤を医薬中間体原料に作用させる、医薬中間体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、請求項９に記載の組成物、又は請求項１０に記載の酵素剤をファインケミカル素材原料に作用させる、ファインケミカル素材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、リパーゼ活性を有するポリペプチドに関する。具体的には、安定性に優れたリパーゼ活性を有するポリペプチド、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、組成物、酵素剤、ポリペプチドの製造方法、そのポリペプチドを用いた油脂処理方法、排水処理方法、医薬中間体の製造方法、及びファインケミカル素材の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ．ｃｅｐａｃｉａ）由来のリパーゼは、医薬中間体製造など幅広く商業利用されている酵素の一つである。しかしながら、溶媒存在下や高温条件下など酵素の使用条件によっては酵素の触媒活性が失われてしまうため、使用用途が限定されることが問題点として挙げられる。【０００３】  酵素の安定性（熱、ｐＨ、溶媒など）を向上させる方法として、蛋白質工学的手法が用いられている。蛋白質工学を用いた酵素の安定性向上の具体的な手法として、ループ領域への変異導入がこれまでに報告されており、例えば、非特許文献１では、枯草菌由来α−アミラーゼについて表面ループのヒンジ領域になる７残基に変異を導入することにより、標的残基のうち５残基の変異でデンプン分解活性が増大し、かつ安定な好冷性酵素を得られたことが報告されている。【０００４】  また例えば、非特許文献２では、動的表面ループを除去することで、ホスファチジルイノシトール合成型ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）属由来ホスホリパーゼＤの熱安定性を向上し得たことが報告されている。【０００５】  しかしながら、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、及び類縁菌由来のリパーゼに関しては当該手法を用いた報告は未だされていない。ループ領域への変異導入は、１アミノ酸置換やアミノ酸挿入、及びアミノ酸の欠損によりなされるが、変異導入点の選定など容易に実施できるものではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ループデザインによる耐熱性好冷酵素の創出、日び隆雄、伊藤貴文、西矢芳昭、科学研究費助成事業データベース、ｈｔｔｐｓ：／／ｋａｋｅｎ．ｎｉｉ．ａｃ．ｊｐ／ｄ／ｐ／２３６５８０９５．ｊａ．ｈｔｍｌ
【非特許文献２】Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｏｏｐ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｄ．，  Ｄａｍｎｊａｎｏｖｉｃ  Ｊ，  Ｎａｋａｎｏ  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｉｗａｓａｋｉ  Ｙ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ２０１４，  Ａｐｒ；  １１１（４）：６７４−８２．  Ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２５１４９．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｎｏｖ  ３０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  本発明は、前記現状に鑑みて、従来と比べて、安定性が向上したリパーゼ活性を有するポリペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）由来のリパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、特定のループ領域の３つのアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換することにより、リパーゼ活性の安定性、特に熱安定性が格段に向上することを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。【０００９】  すなわち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。項１．  少なくとも、Ｎ末端側から、βシート（Ａ）、αへリックス（Ａ）、αへリックス（Ｂ）、αへリックス（Ｃ）、βシート（Ｂ）、及びαへリックス（Ｄ）を備え、リパーゼ活性を有しており、  前記βシート（Ａ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基がポリペプチドのＮ末端側から７〜１３位に存在し、アミノ酸残基数が２〜６で構成されており、  前記αへリックス（Ａ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１５〜２５位に存在し、アミノ酸残基数が３〜９で構成されており、  前記αへリックス（Ｂ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に７０〜９２位に存在し、アミノ酸残基数が４〜１５で構成されており  前記αへリックス（Ｃ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｂ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に３〜１１位に存在し、アミノ酸残基数が１１〜２０で構成されており、  前記βシート（Ｂ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に６５〜８１位に存在し、アミノ酸残基数が２〜８で構成されており、  前記αへリックス（Ｄ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に６〜１５位に存在し、アミノ酸残基数が２〜２４で構成されている、ポリペプチドであって  前記βシート（Ａ）とαへリックス（Ａ）の間の領域が、表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基を含んでおり、及び／又は、  前記βシート（Ｂ）とαへリックス（Ｄ）の間の領域が、表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基を含んでいる、ポリペプチド。【表１】
2018021324.tif 000002
【表２】
2018021324.tif 000003
項２．  更に、αへリックス（Ｅ）、βシート（Ｃ）、βシート（Ｄ）、αへリックス（Ｇ）、及びβシート（Ｅ）を備え、  前記αへリックス（Ｅ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１７〜２８位に存在し、アミノ酸残基数が１３〜１９で構成されており、  前記βシート（Ｃ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｅ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に２〜８位に存在し、アミノ酸残基数が４〜８で構成されており、  前記βシート（Ｄ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１４〜２２位に存在し、アミノ酸残基数が３〜１１で構成されており、  前記αへリックス（Ｇ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に３〜１３位に存在し、アミノ酸残基数が４〜１３で構成されており、  前記βシート（Ｅ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｇ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に２４〜３６位に存在し、アミノ酸残基数が２〜６で構成されている、項１に記載のポリペプチド。項３．  更に、αへリックス（Ｆ）、αへリックス（Ｈ）、及びβシート（Ｆ）を備え、  前記αへリックス（Ｆ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１〜５位に存在し、アミノ酸残基数が３〜１５で構成されており、  前記αへリックス（Ｈ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｇ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１〜１０位に存在し、アミノ酸残基数が２〜１３で構成されており、  前記βシート（Ｆ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ｅ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１〜５位に存在し、アミノ酸残基数が１５〜２３で構成されている、項２に記載のポリペプチド。項４．  以下の（１）から（１２）のいずれかに示すポリペプチド。（１）配列番号１に示すアミノ酸配列において、２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、２４〜２６位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３２〜２３４位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、（３）配列番号３に示すアミノ酸配列において、２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、（４）配列番号４に示すアミノ酸配列において、２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位��アミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、（５）配列番号１に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（６）配列番号２に示すアミノ酸配列における２４〜２６位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３２〜２３４位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（７）配列番号３に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（８）配列番号４に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（９）配列番号１に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（１０）配列番号２に示すアミノ酸配列における２４〜２６位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３２〜��３４位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（１１）配列番号３に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（１２）配列番号４に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド。項５．  項１〜４に記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。項６．  項５に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。項７．  項６に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。項８．  項７に記載の形質転換体を培養する工程を含む、項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。項９．  項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを含む組成物。項１０．  項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、又は項９に記載の組成物を含む酵素剤。項１１．  項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、項９に記載の組成物、又は項１０に記載の酵素剤を、油脂に作用させる、油脂処理方法。項１２．  項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、項９に記載の組成物、又は項１０に記載の酵素剤を排水に作用させる、排水処理方法。項１３．  項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、項９に記載の組成物、又は項１０に記載の酵素剤を医薬中間体原料に作用させる、医薬中間体の製造方法。項１４．  項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、項９に記載の組成物、又は項１０に記載の酵素剤をファインケミカル素材原料に作用させる、ファインケミカル素材の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】  本発明によれば、ｐＨ、熱、溶媒等の安定性、特に熱安定性が向上したリパーゼ活性を有するポリペプチドを取得することができる。従って、本発明は、安定性に優れたリパーゼを必要とする用途等に利用することができる。また、本発明のポリペプチドは、高い安定性が求められる用途に好適に用いることができ、排水処理、医薬中間体製造、ファインケミカル素材製造、機能代替油脂製造、洗剤、食品加工、キラル合成、バイオエタノール等の分野で好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】バークホルデリア・セパシア由来リパーゼの立体構造を示す図である。
【図２】シュードモナス・グルマエ由来リパーゼの立体構造を示す図である。
【図３】シュードモナス・フルオレセンス由来リパーゼの立体構造を示す図である。
【図４】シュードモナス・エルギノーサ由来リパーゼの立体構造を示す図である。
【図５】バークホルデリア・セパシア由来リパーゼの立体構造とシュードモナス・グルマエ由来リパーゼの立体構造を重ね合わせた図である。黒がバークホルデリア・セパシア由来リパーゼで、灰色がシュードモナス・グルマエ由来リパーゼを示す。
【図６】バークホルデリア・セパシア由来リパーゼの立体構造とシュードモナス・フルオレセンス由来リパーゼの立体構造を重ね合わせた図である。黒がバークホルデリア・セパシア由来リパーゼで、灰色がシュードモナス・フルオレセンス由来リパーゼを示す。
【図７】バークホルデリア・セパシア由来リパーゼの立体構造とシュードモナス・エルギノーサ由来リパーゼの立体構造を重ね合わせた図である。黒がバークホルデリア・セパシア由来リパーゼで、灰色がシュードモナス・エルギノーサ由来リパーゼを示す。
【図８】三重変異体（Ｐ２３３Ｇ/Ｌ２３４Ｅ/Ｖ２３５Ｍ）のｐＨ安定性の評価結果の図である。
【図９】三重変異体（Ｐ２３３Ｇ/Ｌ２３４Ｅ/Ｖ２３５Ｍ）の有機溶媒安定性の評価結果の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】  以下、本発明を詳細に説明する。なお、配列表以外では、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現している。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
【００１３】  本明細書における「Ｆ４５Ｖ」等の表現は、アミノ酸置換の表記法である。例えば、「Ｆ４５Ｖ」とは、特定のアミノ酸配列におけるＮ末端側から４５番目のアミノ酸Ｆが、アミノ酸Ｖに置換されていることを意味する。また、本明細書における「Ｖ２７２Ａ／Ｈ２７３Ｇ」等の表現は、多重変異を意味している。例えば、「Ｖ２７２Ａ／Ｈ２７３Ｇ」とは、Ｖ２７２Ａ及びＨ２７３Ｇのアミノ酸置換を同時に導入していることを意味する。
【００１４】  また、本明細書において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプチファンが含まれる。また、「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。また、「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。また、「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
【００１５】  通常は翻訳開始点に対応するメチオニンをＮ末端の１番目の位置とするが、プロペプチド、プレペプチド、シグナルペプチドを含んだ状態で翻訳されて、これらのペプチドが切断された成熟体では、これらのペプチドが切断された後の成熟体のＮ末端を１番目の位置とする。例えば、本明細書における配列番号１は配列番号５から４４アミノ酸が切断された成熟体の配列であり、Ｎ末端アミノ酸残基はアラニン（Ａ）となっている。配列番号２は配列番号６から４０アミノ酸が切断された成熟体の配列であり、Ｎ末端アミノ酸残基はアスパラギン酸（Ｄ）となっている。配列番号７は配列番号Ｃから４４アミノ酸が切断された成熟体の配列であり、Ｎ末端アミノ酸残基はアラニン（Ａ）となっている。配列番号４は配列番号８から２６アミノ酸が切断された成熟体の配列であり、Ｎ末端アミノ酸残基はセリン（Ｓ）となっている。
【００１６】  また、特に明示しない限り、ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように表される。
【００１７】  また、本明細書において、「置換」とは、人為的にアミノ酸残基の置換を導入した場合のみならず、自然にアミノ酸残基の置換が導入された場合、すなわち、もともとアミノ酸残基が相違していた場合も含まれる。本明細書においては、アミノ酸残基の置換は、人為的な置換であってもよく、自然な置換であってもよいが、人為的な置換が好ましい。
【００１８】ポリペプチド  本発明のポリペプチドは、少なくとも、Ｎ末端側から、βシート（Ａ）、αへリックス（Ａ）、αへリックス（Ｂ）、αへリックス（Ｃ）、βシート（Ｂ）、及びαへリックス（Ｄ）を備え、リパーゼ活性を有しており、  前記βシート（Ａ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基がポリペプチドのＮ末端側から７〜１３位に存在し、アミノ酸残基数が２〜６で構成されており、  前記αへリックス（Ａ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１５〜２５位に存在し、アミノ酸残基数が３〜９で構成されており、  前記αへリックス（Ｂ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に７０〜９２位に存在し、アミノ酸残基数が４〜１５で構成されており、  前記αへリックス（Ｃ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｂ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に３〜１１位に存在し、アミノ酸残基数が１１〜２０で構成されており、  前記βシート（Ｂ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に６５〜８１位に存在し、アミノ酸残基数が２〜８で構成されており、  前記αへリックス（Ｄ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に６〜１５位に存在し、アミノ酸残基数が２〜２４で構成されている、ポリペプチドであって  前記βシート（Ａ）とαへリックス（Ａ）の間の領域が、表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基を含んでおり、及び／又は、  前記βシート（Ｂ）とαへリックス（Ｄ）の間の領域が、表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基を含んでいる、ポリペプチドである。
【００１９】
【表３】
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【００２０】
【表４】
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【００２１】基本構造  本発明は、少なくとも、Ｎ末端側から、βシート（Ａ）、αへリックス（Ａ）、αへリックス（Ｂ）、αへリックス（Ｃ）、βシート（Ｂ）、及びαへリックス（Ｄ）を順に備え、リパーゼ活性を有しており、  前記βシート（Ａ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基がポリペプチドのＮ末端側から７〜１３位に存在し、アミノ酸残基数が２〜６で構成されており、  前記αへリックス（Ａ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１５〜２５位に存在し、アミノ酸残基数が３〜９で構成されており、  前記αへリックス（Ｂ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に７０〜９２位に存在し、アミノ酸残基数が４〜１５で構成されており、  前記αへリックス（Ｃ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｂ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に３〜１１位に存在し、アミノ酸残基数が１１〜２０で構成されており、  前記βシート（Ｂ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に６５〜８１位に存在し、アミノ酸残基数が２〜８で構成されており、  前記αへリックス（Ｄ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前αへリックス（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に６〜１５位に存在し、アミノ酸残基数２〜２４で構成されている、ポリペプチドである。
【００２２】  Ｎ末端からβシート（Ａ）間の領域、βシート（Ａ）とαへリックス（Ａ）間の領域、αへリックス（Ａ）とαへリックス（Ｂ）間の領域、αへリックス（Ｂ）とβシート（Ｂ）間の領域、βシート（Ｂ）とαへリックス（Ｄ）間の領域、及びαへリックス（Ｄ）からＣ末端までの領域には、それぞれ１又は複数のアミノ酸残基を含む。これらの各領域には、１又は複数のループ、シート、又はヘリックスを含んでいてもよい。
【００２３】  なお、本発明において、ポリペプチドのＮ末端からβシート（Ａ）Ｎ末端側アミノ酸残基までの領域を領域（Ｉ）、βシート（Ａ）Ｃ末端側アミノ酸残基からαへリックス（Ａ）Ｎ末端側アミノ酸残基まで領域を領域（ＩＩ）、αへリックス（Ａ）Ｃ末端側アミノ酸残基からαへリックス（Ｂ）Ｎ末端側アミノ酸残基までの領域を領域（ＩＩＩ）、αへリックス（Ｂ）Ｃ末端側アミノ酸残基からαへリックス（Ｃ）Ｎ末端側アミノ酸残基までの領域を領域（ＩＶ）、αへリックス（Ｃ）Ｃ末端側アミノ酸残基からβシート（Ｂ）Ｎ末端側アミノ酸残基までの領域を領域（Ｖ）、βシート（Ｂ）Ｃ末端側アミノ酸残基からαへリックス（Ｄ）Ｎ末端側アミノ酸残基までの領域を領域（ＶＩ）、αへリックス（Ｄ）Ｃ末端側アミノ酸残基からポリペプチドのＣ末端までの領域を領域（ＶＩＩ）とする。
【００２４】  このようなポリペプチドは、分子量が３０〜３３ｋＤａ程度のリパーゼで認められる構造である。
【００２５】  具体的には、このような構造を有するポリペプチドは、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・テリトリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｅｒｒｉｔｏｒｉｉ）、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・アンビファリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ）、バークホルデリア・コンタミナンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ）、バークホルデリア・ラタ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｌａｔａ）、バークホルデリア・セミナリス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｅｍｉｎａｌｉｓ）、バークホルデリア・アンセナ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｔｈｉｎａ）等のバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属；シュードモナス・グルマエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｌｕｍａｅ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等のシュードモナス属；クロモバクテリウム・ヴィスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ）等のクロモバクテリウム属等が産生するリパーゼで認められている。
【００２６】  このような構造を有するポリペプチドとしては、具体的には、後述するタイプＩとタイプＩＩが挙げられる。タイプＩに含まれるポリペプチドとしては、例えば、バークホルデリア・セパシア由来リパーゼ、シュードモナス・グルマエ由来リパーゼ、シュードモナス・フルオレセンス由来リパーゼが挙げられる。これらの立体構造を図１〜３に示す。また、タイプＩＩに含まれるポリペプチドとしては、例えば、シュードモナス・エルギノーサ由来リパーゼが挙げられる。シュードモナス・エルギノーサ由来のリパーゼの立体構造を図４に示す。なかでも、タイプＩのポリペプチドが好ましい。なお、ポリペプチドのタイプＩ、タイプＩＩについては、ＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）（バージョンＭＯＥ２０１３）、ＰｙＭＯＬ、ＲａｓＭＯＬ、ＷｉｎＣｏｏｔ等のタンパク質の立体構造を解析するソフトウェアを用いて分析することにより、確認することができる。
【００２７】  前記立体構造において、αへリックス、βシートは、前記ソフトウェアのＭＯＥを用いて規定することができる。ループもまた前記ソフトウェアのＭＯＥを用いて規定することができる。なお、本発明においては、前記ソフトウェアで規定されるループに限定されず、αへリックスとβシート以外の部分を全てループと定義する。
【００２８】  以下に、タイプＩとタイプＩＩのポリペプチドについてそれぞれ詳細に説明する。なお、タイプＩ、タイプＩＩ以外のポリペプチドであっても、本発明のポリペプチドの基本構造を有するものは、本発明に含まれる。
【００２９】＜タイプＩ＞  タイプＩのポリペプチドとしては、例えば、配列番号１〜３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及びこれらと類似の立体構造を有するポリペプチドが挙げられる。タイプＩのポリペプチドの構成についてＮ末端からＣ末端まで順に説明する。
【００３０】Ｎ末端からβシート（Ａ）Ｎ末端側のアミノ酸残基までの領域（Ｉ）  領域（Ｉ）のアミノ酸残基数としては、６〜１３、好ましくは８〜１１である。領域（Ｉ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す１〜１０位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す１〜９位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す１〜１０位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００３１】βシート（Ａ）  βシート（Ａ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基がポリペプチドのＮ末端側から７〜１３位に存在し、好ましくは８〜１１位に存在し、さらに好ましくは９〜１０位に存在する。βシート（Ａ）を構成するアミノ酸残基数としては、２〜６、好ましくは３〜５、さらに好ましくは３〜４が挙げられる。  βシート（Ａ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えばｘ1ＩＬＶ（ｘ1は、いずれのアミノ酸残基であってもよく、好ましくはＩ又はＶである）が挙げられ、好ましくはＩＩＬＶが挙げられる。βシート（Ａ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す１１〜１４位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す１０〜１３位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す１１〜１４位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００３２】βシート（Ａ）Ｃ末端側アミノ酸残基からαへリックス（Ａ）Ｎ末端側アミノ酸残基までの領域（ＩＩ）  領域（ＩＩ）のアミノ酸残基数としては、１４〜２３、好ましくは１６〜２２、さらに好ましくは１７〜２１である。領域（ＩＩ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す１５〜３２位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す１４〜３１位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す１５〜３２位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００３３】αへリックス（Ａ）  αへリックス（Ａ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１５〜２５位に存在し、好ましくは１７〜２３位に存在し、さらに好ましくは１９〜２１に存在する。αへリックス（Ａ）を構成するアミノ酸残基数としては、３〜９、好ましくは４〜８、さらに好ましくは５〜７が挙げられる。  αへリックス（Ａ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＩＱｘ2ＤＬＱｘ3（ｘ2及びｘ3はそれぞれいずれのアミノ酸残基であってもよく、好ましくは、ｘ2はＥ又はＳ、ｘ3はＱ又はＳである。）が挙げられ、好ましくはＩＱＥＤＬＱＱ、ＩＱＳＤＬＱＳが挙げられる。αへリックス（Ａ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す３３〜３９位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す３２〜３８位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す３３〜３９位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００３４】αへリックス（Ａ）Ｃ末端側アミノ酸残基からαへリックス（Ｂ）Ｎ末端側アミノ酸残基までの領域（ＩＩＩ）  領域（ＩＩＩ）のアミノ酸残基数としては、６９〜９２、好ましくは７４〜８７、さらに好ましくは７８〜８３である。領域（ＩＩＩ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す４０〜１１７位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す３９〜１１６位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す４０〜１１９位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００３５】αへリックス（Ｂ）  αへリックス（Ｂ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に７０〜９２位に存在し、好ましくは７５〜８７位に存在し、さらに好ましくは７９〜８３位に存在する。αへリックス（Ｂ）を構成するアミノ酸残基数としては、４〜１５、好ましくは５〜１４、さらに好ましくは７〜１２が挙げられる。  αへリックス（Ｂ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＥＦＡＤＦＶＱＧＶＬ、ＥＦＡＤＦＶＱＤＶＬＫＴ、ＡＤＦＶＱＧＶＬ等が挙げられ、好ましくはＥＦＡＤＦＶＱＧＶＬが挙げられる。αへリックス（Ｂ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す１１８〜１２７位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す１１７〜１２８位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す１２０〜１２８位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００３６】αへリックス（Ｂ）Ｃ末端側アミノ酸残基からαへリックス（Ｃ）Ｎ末端側アミノ酸残基までの領域（ＩＶ）  領域（ＩＶ）のアミノ酸残基数としては、２〜１０、好ましくは４〜９、さらに好ましくは５〜８が挙げられる。領域（ＩＶ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す１２８〜１３３位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す１２９〜１３５位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す１２９〜１３３位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００３７】αへリックス（Ｃ）  αへリックス（Ｃ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｂ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に３〜１１位に存在し、好ましくは５〜１０位に存在し、さらに好ましくは６〜９位に存在する。αへリックス（Ｃ）を構成するアミノ酸残基数としては、１１〜２０、好ましくは１３〜１８、さらに好ましくは１４〜１７が挙げられる。  αへリックス（Ｃ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＬＳＳＴＶＩＡＡＦＶＮＶｘ4Ｇｘ5ＬＴ（ｘ4及びｘ5はそれぞれいずれのアミノ酸残基であってもよく、好ましくは、ｘ4はＦ又はＩ、ｘ5はＩ又はＡである。）、ＴＶＩＡＡＦＶＮＶＦＧＴＬＶ等が挙げられ、好ましくはＬＳＳＴＶＩＡＡＦＶＮＶｘ4Ｇｘ5ＬＴ（ｘ4及びｘ5は、それぞれいずれのアミノ酸残基であってもよく、好ましくは、ｘ4はＦ又はＩ、ｘ5はＩ又はＡである。）が挙げられ、より好ましくはＬＳＳＴＶＩＡＡＦＶＮＶＦＧＩＬＴ、ＬＳＳＴＶＩＡＡＦＶＮＶＩＧＡＬＴが挙げられる。αへリックス（Ｃ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す１３４〜１５０位、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２では１３６〜１４９位、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す１３４〜１５０位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００３８】αへリックス（Ｃ）Ｃ末端側アミノ酸残基からβシート（Ｂ）Ｎ末端側アミノ酸残基までの領域（Ｖ）  領域（Ｖ）のアミノ酸残基数としては、６４〜８０、好ましくは６８〜７６、さらに好ましくは７０〜７５が挙げられる。領域（Ｖ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す１５１〜２２２位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す１５０〜２２１位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す１５１〜２２２位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００３９】βシート（Ｂ）  βシート（Ｂ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に６５〜８１位に存在し、好ましくは６９〜７７位に存在し、さらに好ましくは７１〜７５位に存在する。βシート（Ｂ）を構成するアミノ酸残基数としては、２〜８、好ましくは３〜７、さらに好ましくは４〜６が挙げられる。  βシート（Ｂ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＶＴＧＡｘ6Ｄ（ｘ6は、いずれのアミノ酸残基であってもよく、好ましくはＴ又はＲである。）等が挙げられ、好ましくはＶＴＧＡＴＤが挙げられる。βシート（Ｂ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す２２３〜２２８位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す２２２〜２２７位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す２２３〜２２８位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００４０】βシート（Ｂ）Ｃ末端側アミノ酸残基からαへリックス（Ｄ）Ｎ末端側アミノ酸残基までの領域（ＶＩ）  領域（ＶＩ）のアミノ酸残基数としては、５〜１４、好ましくは７〜１２位、さらに好ましくは８〜１１が挙げられる。領域（ＶＩ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す２２９〜２３７位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す２２８〜２３５位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す２２９〜２３６位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００４１】αへリックス（Ｄ）  αへリックス（Ｄ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に６〜１５位に存在し、好ましくは８〜１３位に存在し、さらに好ましくは９〜１２位に存在する。αへリックス（Ｄ）を構成するアミノ酸残基数としては、２〜２４、好ましくは３〜２３、さらに好ましくは４〜２２が挙げられる。  αへリックス（Ｄ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＡＮｘ7ｘ8（ｘ7及びｘ8はそれぞれいずれのアミノ酸残基であってもよく、好ましくは、ｘ7はＡ又はＶ、ｘ8はＬ又はＴである。）、ＰＡＮＶＴ、ＳＴＬＡＬｘ9ｘ10ＴＧｘ11ＶＭｘ12（ｘ9、ｘ10、ｘ11、及びｘ12はそれぞれいずれのアミノ酸残基であってもよく、好ましくは、ｘ9はＦ又はＬ、ｘ10はＧ又はＡ、ｘ11はＴ又はＡ、ｘ12はＶ又はＩである。）、ＳＴＬＡＬＬＧＳＧＴＶＭＶＮ等が挙げられ、好ましくはＡＮｘ7ｘ8（ｘ7及びｘ8は、それぞれいずれのアミノ酸残基であってもよく、好ましくは、ｘ7はＡ又はＶ、ｘ8はＬ又はＴである。）、ＳＴＬＡＬＦＧＴＧＴＶＭＶ、ＳＴＬＡＬＬＡＴＧＡＶＭＩ、ＳＴＬＡＬＬＧＳＧＴＶＭＶＮ、が挙げられ、より好ましくはＡＮＡＬ、ＡＮＶＴ、ＳＴＬＡＬＦＧＴＧＴＶＭＶ、ＳＴＬＡＬＬＡＴＧＡＶＭＩ、更に好ましくはＡＮＡＬ、ＳＴＬＡＬＦＧＴＧＴＶＭＶが挙げられる。αへリックス（Ｄ）領域には、前記で例示した２種以上の配列が、直接又は数個のアミノ酸残基を介して連結した配列であることが好ましく、ＡＮＡＬ、ＳＴＬＡＬＦＧＴＧＴＶＭＶを含む配列であることが好ましい。αへリックス（Ｄ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す２３８〜２５６位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す２３６〜２５４位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す２３７〜２５７位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００４２】αへリックス（Ｄ）Ｃ末端側アミノ酸残基からポリペプチドのＣ末端までの領域（ＶＩＩ）  領域（ＶＩＩ）のアミノ酸配列の残基数としては、５５〜８８、好ましくは５８〜８４、さらに好ましくは６１〜８０が挙げられる。領域（ＶＩＩ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す２５７〜３２０位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す２５５〜３１８位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す２５８〜３２０位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００４３】  また、本発明のポリペプチドは、更に、領域（ＩＩＩ）において、Ｎ末端側から、αへリックス（Ｅ）、βシート（Ｃ）、αへリックス（Ｆ）、又はβシート（Ｄ）を備えていてもよい。これらのαへリックス、βシートの間の領域には、１又は複数のループ、αへリックス、又はβシートを含んでもよい。
【００４４】αへリックス（Ｅ）  αへリックス（Ｅ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１７〜２８位、好ましくは１９〜２６位、さらに好ましくは２１〜２４に存在し、アミノ酸残基数が１３〜１９、好ましくは１４〜１８、さらに好ましくは１５〜１７で構成される。  αへリックス（Ｅ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＲＧＥＱＬＬＡＹＶＫｘ13ＶＬＡｘ14Ｔ（ｘ13及びｘ14は、それぞれいずれのアミノ酸残基であってもよく、好ましくは、ｘ13はＴ又はＱ、ｘ14はＡ又はＱである。）等が挙げられ、好ましくはＲＧＥＱＬＬＡＹＶＫＴＶＬＡＡＴ、ＲＧＥＱＬＬＡＹＶＫＱＶＬＡＡＴ、ＲＧＥＱＬＬＡＹＶＫＱＶＬＡＱＴ、より好ましくはＲＧＥＱＬＬＡＹＶＫＴＶＬＡＡＴが挙げられる。αへリックス（Ｅ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す６１〜７６位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す６０〜７５位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す６１〜７６位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００４５】βシート（Ｃ）  βシート（Ｃ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｅ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に２〜８位、好ましくは３〜７位、さらに好ましくは４〜６に存在し、アミノ酸残基数が４〜８、好ましくは５〜７で構成される。  βシート（Ｃ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＶＮＬｘ15ＧＨ（ｘ15はいずれのアミノ酸残基であってもよく、好ましくはＶ又はＩである。）等が挙げられ、好ましくはＶＮＬＶＧＨが挙げられる。βシート（Ｃ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す８１〜８６位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す８０〜８５位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す８１〜８６位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００４６】αへリックス（Ｆ）  αへリックス（Ｆ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１〜５位、好ましくは２〜４位に存在し、アミノ酸残基数が３〜１５、好ましくは５〜１４、さらに好ましくは１０〜１３で構成される。  αへリックス（Ｆ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＧＧＬＴＳＲＹＶＡＡＶ、ＱＧＧＬＴＳＲＹＶＡＡＶ等が挙げられ、好ましくはＧＧＬＴＳＲＹＶＡＡＶが挙げられる。αへリックス（Ｆ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す８９〜９９位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す８７〜９８位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す８８〜９９位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００４７】βシート（Ｄ）  βシート（Ｄ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１４〜２２位、好ましくは１６〜２０位、さらに好ましくは１７〜１９位に存在する。また、βシート（Ｄ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｆ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に３〜１３位、好ましくは４〜１２位、さらに好ましくは４〜６位に存在する。βシート（Ｄ）は、アミノ酸残基数が３〜１１、好ましくは５〜９、さらに好ましくは、６〜８で構成される。  βシート（Ｄ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＶＡＳＶＴＴＩ等が挙げられる。βシート（Ｄ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す１０４〜１１０位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す１０３〜１０９位、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す１０４〜１１０位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００４８】  また、本発明のポリペプチドは、更に、領域（Ｖ）において、Ｎ末端側から、αへリックス（Ｇ）、αへリックス（Ｈ）、βシート（Ｅ）、又はβシート（Ｆ）を備えていてもよい。これらのαへリックス、βシートの間の領域には、１又は複数のループ、αへリックス、又はβシートを含んでもよい。
【００４９】αへリックス（Ｇ）  αへリックス（Ｇ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に３〜１３位、好ましくは４〜１２位、さらに好ましくは５〜１１に存在し、アミノ酸残基数が４〜１３、好ましくは５〜１２、さらに好ましくは６〜１１で構成される。  αへリックス（Ｇ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＡＬＡＡＬＫＴ、ＴＤＱＤＡＬＡＡＬＲ、ＡＬＡＡＬＱＴＬ等が挙げられ、好ましくはＡＬＡＡＬＫＴが挙げられる。αへリックス（Ｇ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す１６０〜１６６位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す１５５〜１６４位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す１６０〜１６７位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００５０】αへリックス（Ｈ）  αへリックス（Ｈ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｇ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１〜１０位、好ましくは２〜８位、さらに好ましくは２〜５位に存在し、アミノ酸残基数が２〜１３、好ましくは４〜１２、さらに好ましくは９〜１１で構成される。  αへリックス（Ｈ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＴＡｘ16ｘ17ＡＴＹＮｘ18Ｎ（ｘ16、ｘ17、及びｘ18はそれぞれいずれのアミノ酸残基であってもよく、好ましくは、ｘ16はＱ又はＲ、ｘ17はＡ又はＴ、ｘ18はＱ又はＲである。）等が挙げられ、好ましくはＴＡＱＡＡＴＹＮＱＮ、ＴＡＱＴＡＴＹＮＲＮ、又はＴＡＲＡＡＴＹＮＱＮが挙げられ、より好ましくはＴＡＱＡＡＴＹＮＱＮが挙げられる。αへリックス（Ｈ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す１６９〜１７８位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す１６８〜１７７位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す１６９〜１７８位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００５１】βシート（Ｅ）  βシート（Ｅ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｇ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に２４〜３６位、好ましくは２７〜３４位、さらに好ましくは２９〜３２に存在し、アミノ酸残基数が２〜６、好ましくは３〜５で構成される。また、βシート（Ｅ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｈ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１３〜２４位、好ましくは１５〜２２位、さらに好ましくは１７〜２０に存在する。βシート（Ｅ）は、アミノ酸残基数が２〜６、好ましくは３〜５で構成される。  βシート（Ｅ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＴＥＴＶ等が挙げられる。βシート（Ｅ）のアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す１９６〜１９９位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す１９５〜１９８位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す１９６〜１９９位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００５２】βシート（Ｆ）  βシート（Ｆ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ｅ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１〜５位、好ましくは２〜４位に存在し、アミノ酸残基数が１５〜２３、好ましくは１７〜２１、さらに好ましくは１８〜２０で構成される。  βシート（Ｆ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＮＴＨＬＬＹＳＷＡＧ、ＳＱＨＬＬＹＳＷ、ＩＱＰＴｘ19ｘ20Ｖ（ｘ19、及びｘ20はそれぞれいずれのアミノ酸残基であってもよく、好ましくは、ｘ19はＩ、Ｓ又はＦ、ｘ20はＳ又はＴである。）等が挙げられ、好ましくはＮＴＨＬＬＹＳＷＡＧ、ＩＱＰＴｘ19ｘ20Ｖ（ｘ19、及びｘ20はそれぞれいずれのアミノ酸残基であってもよく、好ましくは、ｘ19はＩ、Ｓ又はＦ、ｘ20はＳ又はＴである。）が挙げられ、より好ましくはＮＴＨＬＬＹＳＷＡＧ、ＩＱＰＴＩＳＶが挙げられる。βシート（Ｆ）領域には、前記で例示した２種以上の配列が、直接又は数個のアミノ酸残基を介して連結した配列であることが好ましく、ＮＴＨＬＬＹＳＷＡＧとＩＱＰＴＩＳＶを含む配列であることが好ましい。βシート（Ｆ）のアミノ酸配列としては、具体的には、バークホルデリア・セパシア由来のものであれば、配列番号１に示す２０２〜２２０位のアミノ酸残基、シュードモナス・グルマエ由来のものであれば、配列番号２に示す２０１〜２１９位のアミノ酸残基、シュードモナス・フルオレセンス由来のものであれば、配列番号３に示す２０２〜２２０位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００５３】  本発明のポリペプチドは、前述のβシート（Ａ）、αへリックス（Ａ）、αへリックス（Ｂ）、αへリックス（Ｃ）、βシート（Ｂ）、及びαへリックス（Ｄ）を基本的に有するものであるが、好ましくは、更にαへリックス（Ｅ）、βシート（Ｃ）、βシート（Ｄ）、αへリックス（Ｇ）、及びβシート（Ｅ）を備え、より好ましくは、更にαへリックス（Ｅ）、βシート（Ｃ）、αへリックス（Ｆ）、βシート（Ｄ）、αへリックス（Ｇ）、αへリックス（Ｈ）、βシート（Ｅ）、及びβシート（Ｆ）を備える。
【００５４】＜タイプＩＩ＞  タイプＩＩのポリペプチドとしては、例えば、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及びこれと類似の立体構造を有するポリペプチドが挙げられる。タイプＩＩのポリペプチドの構成についてＮ末端からＣ末端まで順に説明する。
【００５５】Ｎ末端からβシート（Ａ）Ｎ末端側のアミノ酸残基までの領域（Ｉ）  領域（Ｉ）のアミノ酸残基数としては、６〜１３、好ましくは８〜１１である。領域（Ｉ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す１〜１０位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００５６】βシート（Ａ）  βシート（Ａ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基がポリペプチドのＮ末端側７〜１３位に存在し、好ましくは８〜１１位に存在し、さらに好ましくは９〜１０位に存在する。βシート（Ａ）を構成するアミノ酸残基数としては、２〜６、好ましくは３〜５、さらに好ましくは３〜４が挙げられる。  βシート（Ａ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＶＬＡ等が挙げられる。βシート（Ａ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す１１〜１３位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００５７】βシート（Ａ）Ｃ末端側アミノ酸残基からαへリックス（Ａ）Ｎ末端側アミノ酸残基までの領域（ＩＩ）  領域（ＩＩ）のアミノ酸残基数としては、１４〜２３、好ましくは１６〜２２、さらに好ましくは１７〜２１である。領域（ＩＩ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す１４〜３３位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００５８】αへリックス（Ａ）  αへリックス（Ａ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１５〜２５位に存在し、好ましくは１７〜２３位に存在し、さらに好ましくは１９〜２１に存在する。αへリックス（Ａ）を構成するアミノ酸残基数としては、３〜９、好ましくは４〜８、さらに好ましくは５〜７が挙げられる。  αへリックス（Ａ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＡＬＲＲＤ等が挙げられる。αへリックス（Ａ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４では３４〜３８位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００５９】αへリックス（Ａ）Ｃ末端側アミノ酸残基からαへリックス（Ｂ）Ｎ末端側アミノ酸残基までの領域（ＩＩＩ）  領域（ＩＩＩ）のアミノ酸残基数としては、６９〜９２、好ましくは７４〜８７、さらに好ましくは７８〜８３である。領域（ＩＩＩ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す３９〜１２０位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００６０】αへリックス（Ｂ）  αへリックス（Ｂ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に７０〜９２位に存在し、好ましくは７５〜８７位に存在し、さらに好ましくは７９〜８３位に存在する。αへリックス（Ｂ）を構成するアミノ酸残基数としては、４〜１５、好ましくは５〜１４、さらに好ましくは７〜１２が挙げられる。  αへリックス（Ｂ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＩＰＰＧＳＡＧ等が挙げられる。αへリックス（Ｂ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す１２１〜１２７位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００６１】αへリックス（Ｂ）Ｃ末端側アミノ酸残基からαへリックス（Ｃ）Ｎ末端側アミノ酸残基までの領域（ＩＶ）  領域（ＩＶ）のアミノ酸残基数としては、２〜１０、好ましくは４〜９、さらに好ましくは５〜８が挙げられる。領域（ＩＶ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す１２８〜１３３位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００６２】αへリックス（Ｃ）  αへリックス（Ｃ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｂ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に３〜１１位に存在し、好ましくは５〜１０位に存在し、さらに好ましくは６〜９位に存在する。αへリックス（Ｃ）を構成するアミノ酸残基数としては、１１〜２０、好ましくは１３〜１８、さらに好ましくは１４〜１７が挙げられる。  αへリックス（Ｃ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＬＶＮＳＬＧＡＬＩＳＦＬＳＳＧＳＴ等が挙げられる。αへリックス（Ｃ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す１３４〜１５０位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００６３】αへリックス（Ｃ）Ｃ末端側アミノ酸残基からβシート（Ｂ）Ｎ末端側アミノ酸残基までの領域（Ｖ）  領域（Ｖ）のアミノ酸残基数としては、６４〜８０、好ましくは６８〜７６、さらに好ましくは７０〜７５が挙げられる。領域（Ｖ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す１５１〜２２２位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００６４】βシート（Ｂ）  βシート（Ｂ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に６５〜８１位に存在し、好ましくは６９〜７７位に存在し、さらに好ましくは７１〜７５位に存在する。βシート（Ｂ）を構成するアミノ酸残基数としては、２〜８、好ましくは３〜７、さらに好ましくは４〜６が挙げられる。  βシート（Ｂ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＫＮＧＴ等が挙げられる。βシート（Ｂ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す２２３〜２２６のアミノ酸残基が挙げられる。
【００６５】βシート（Ｂ）Ｃ末端側アミノ酸残基からαへリックス（Ｄ）Ｎ末端側アミノ酸残基までの領域（ＶＩ）  領域（ＶＩ）のアミノ酸残基数としては、５〜１４、好ましくは７〜１２位、さらに好ましくは８〜１１が挙げられる。領域（ＶＩ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す２２７〜２３７位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００６６】αへリックス（Ｄ）  αへリックス（Ｄ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ｂ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に６〜１５位に存在し、好ましくは８〜１３位に存在し、さらに好ましくは９〜１２位に存在する。αへリックス（Ｄ）を構成するアミノ酸残基数としては、２〜２４、好ましくは３〜２３、さらに好ましくは４〜２２が挙げられる。  αへリックス（Ｄ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＨＬＧＭ、ＩＲＤＮＹＲＭＮＨＬＤＥＶＮＱ等が挙げられる。αへリックス（Ｄ）領域には、前記で例示した２種以上の配列が、直接又は数個のアミノ酸残基を介して連結した配列であることが好ましく、ＨＬＧＭ、ＩＲＤＮＹＲＭＮＨＬＤＥＶＮＱを含む配列であることが好ましい。２種以上の配列が含まれる場合、その間にループが存在していてもよい。αへリックス（Ｄ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す２３８〜２５７位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００６７】αへリックス（Ｄ）のＣ末端側アミノ酸残基からポリペプチドのＣ末端までの領域（ＶＩＩ）  領域（ＶＩＩ）のアミノ酸配列の残基数としては、２１〜５１、好ましくは２４〜４９、さらに好ましくは２６〜４７が挙げられる。領域（ＶＩＩ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す２５８〜２８５位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００６８】  また、本発明のポリペプチドは、更に、領域（ＩＩＩ）において、Ｎ末端側から、αへリックス（Ｅ）、βシート（Ｃ）、及びβシート（Ｄ）を備えていることが好ましい。これらのαへリックス、βシートとの間の領域には、ループ、αへリックス、又はβシートを含んでもよい。
【００６９】αへリックス（Ｅ）  αへリックス（Ｅ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１７〜２８位、好ましくは１９〜２６位、さらに好ましくは２１〜２４に存在し、アミノ酸残基数が１３〜１９、好ましくは１４〜１８、さらに好ましくは１５〜１７で構成される。  αへリックス（Ｅ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＬＱＱＶＥＥＩＶＡＬＳＧＱＰＬＶ等が挙げられる。αへリックス（Ｅ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す６１〜７６位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００７０】βシート（Ｃ）  βシート（Ｃ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｅ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に２〜８位、好ましくは３〜７位、さらに好ましくは４〜６に存在し、アミノ酸残基数が４〜８、好ましくは５〜７で構成される。  βシート（Ｃ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＨＳＨＧＧＰ等が挙げられる。βシート（Ｃ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す８１〜８６位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００７１】βシート（Ｄ）  βシート（Ｄ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１４〜２２位、好ましくは１６〜２０位、さらに好ましくは１７〜１９位に存在し、アミノ酸残基数が３〜１１、好ましくは５〜９、さらに好ましくは６〜８で構成される。  βシート（Ｄ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＳＶＧＡＰＨＫ等が挙げられる。βシート（Ｄ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す１０４〜１１０位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００７２】  また、本発明のポリペプチドは、更に、領域（ＶＩ）において、Ｎ末端側から、αへリックス（Ｇ）、及びβシート（Ｅ）を備えていることが好ましい。これらのαへリックス、βシートの間の領域には、ループ、αへリックス、又はβシートを含んでもよい。
【００７３】αへリックス（Ｇ）  αへリックス（Ｇ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｃ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に３〜１３位、好ましくは４〜１２位、さらに好ましくは５〜１１に存在し、アミノ酸残基数が４〜１３、好ましくは５〜１２、さらに好ましくは６〜１１で構成される。  αへリックス（Ｇ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＥＳＬＮＳＥＧ等が挙げられる。αへリックス（Ｇ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す１６０〜１６６位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００７４】βシート（Ｅ）  βシート（Ｅ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基が前記αへリックス（Ｇ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に２４〜３６位、好ましくは２７〜３４位、さらに好ましくは２９〜３２位に存在し、アミノ酸残基数が２〜６、好ましくは３〜５で構成される。  βシート（Ｅ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＹＳＷＳ等が挙げられる。βシート（Ｅ）のアミノ酸配列としては、具体的には、シュードモナス・エルギノーサ由来のものであれば、配列番号４に示す１９６〜１９９位のアミノ酸残基が挙げられる。
【００７５】  本発明のポリペプチドは、前述のβシート（Ａ）、αへリックス（Ａ）、αへリックス（Ｂ）、αへリックス（Ｃ）、βシート（Ｂ）、及びαへリックス（Ｄ）を基本的に有するものであるが、好ましくは、更にαへリックス（Ｅ）、βシート（Ｃ）、βシート（Ｄ）、αへリックス（Ｇ）、及びβシート（Ｅ）を備える。
【００７６】アミノ酸置換領域  本発明のポリペプチドでは、前記βシート（Ａ）とαへリックス（Ａ）の間の領域が、表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基を含み、及び／又は、前記βシート（Ｂ）とαへリックス（Ｄ）の間の領域が、表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基を含む。  本発明のポリペプチドにおいて、前記βシート（Ａ）とαへリックス（Ａ）の間の領域（ＩＩ）に存在するループを含む領域のアミノ酸配列、好ましくはそのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に８〜１５位、好ましくは１０〜１３位、さらに好ましくは１１〜１２位に存在するアミノ酸配列は、表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基（３つのアミノ酸残基からなる配列）を含むように設定され、前記シート（Ｂ）とαへリックス（Ｄ）の間の領域（ＶＩ）に存在するループを含む領域のアミノ酸配列、好ましくはそのＮ末端側のアミノ酸残基が前記βシート（Ｂ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に３〜９位、好ましくは４〜８位、さらに好ましくは５〜７位に存在するアミノ酸配列は、表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基（３つのアミノ酸残基からなる配列）を含むように設定される。領域（ＩＩ）と領域（ＶＩ）の少なくとも一方に、このような変異を導入することにより、ポリペプチドのリパーゼ活性の熱安定性が向上し得る。
【００７７】  リパーゼ活性の熱安定性がより一層向上し得る点で、領域（ＩＩ）に含まれる前記アミノ酸配列としては、好ましくは、表ＩのＮｏ．１〜１２５、より好ましくはＮｏ．１〜９６、より一層好ましくはＮｏ．１〜６８、更に好ましくはＮｏ．１〜５０、特に好ましくはＮｏ．１〜４０、特に一層好ましくはＮｏ．１〜３３に示すいずれかのアミノ酸残基が挙げられ、領域（ＶＩ）に含まれる前記アミノ酸配列としては、好ましくは表ＩＩのＮｏ．１〜１５０、より好ましくはＮｏ．１〜１２９、より一層好ましくはＮｏ．１〜８８、更に好ましくはＮｏ．１〜６８、特に好ましくはＮｏ．１〜５５、特に一層好ましくはＮｏ．１〜４０に示すいずれかのアミノ酸残基が挙げられる。
【００７８】  前記βシート（Ａ）とαへリックス（Ａ）の間の領域（ＩＩ）に存在するアミノ酸置換領域となるアミノ酸配列は、少なくとも１のアミノ酸残基がループ（Ａ）領域に含まれ、好ましくは１〜３、より好ましくは２又は３のアミノ酸残基がループ（Ａ）領域に含まれる。
【００７９】  ループ（Ａ）領域は、前記βシート（Ａ）とαへリックス（Ａ）の間の領域（ＩＩ）に存在する。ループ（Ａ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基がβシート（Ａ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１〜１２位、好ましくは１〜１１、より好ましくは８〜１１に存在する。  ループ（Ａ）を構成するアミノ酸残基数は、１〜１３、好ましくは２〜１２である。ループ（Ａ）のアミノ酸配列としては、特に限定されず、例えば、ｘ21ｘ22Ｖ（ｘ21は及びｘ22はそれぞれいずれのアミノ酸残基であってもよく、好ましくは、ｘ21はＡ又はＶであり、ｘ22はＧ又はＮである。）、ＧＶＤ、ＨＧＬＡＧＴＤＫＦＡＮＶ等が挙げられ、好ましくはＡＧＶ、ＨＧＬＡＧＴＤＫＦＡＮＶ、ＶＧＶ、ＧＶＤ等が挙げられるが、ループ（Ａ）のアミノ酸配列に、領域（ＩＩ）の前記アミノ酸配列の少なくとも１のアミノ酸残基が含まれることが好ましい。
【００８０】  前記βシート（Ｂ）とαへリックス（Ｄ）の間の領域（ＶＩ）に存在するアミノ酸置換領域となるアミノ酸配列は、少なくとも１のアミノ酸残基がループ（Ｂ）領域にあり、好ましくは１〜３、より好ましくは２又は３のアミノ酸残基がループ（Ｂ）領域にある。
【００８１】  ループ（Ｂ）領域は、前記βシート（Ｂ）とαへリックス（Ｄ）の間の領域（ＶＩ）に存在する。ループ（Ｂ）は、そのＮ末端側のアミノ酸残基がβシート（Ｂ）のＣ末端側のアミノ酸残基を０位とした場合に１〜７位、好ましくは１〜６位、更に好ましくは１〜５位に存在する。ループ（Ｂ）を構成するアミノ酸残基数は、１〜１２、好ましくは２〜１１である。  ループ（Ｂ）のアミノ酸配列としては、特に限定されず、例えばＴＳＴｘ23ｘ24ｘ25ＶＤ（ｘ23、ｘ24、及びｘ25はそれぞれいずれのアミノ酸残基であってもよく、好ましくは。ｘ23はＩ又はＧであり、ｘ24はＰ又はＴであり、ｘ25はＶ又はＬである。）、ＴＳＴＧＴＬＤＶ、ＡＮＤＧＬＶＧＴＣＳＳ等が挙げられ、好ましくは、ＴＳＴＩＰＬＶＤ、ＴＳＴＩＰＬＶＤ、ＴＳＴＧＴＬＤＶ、ＡＮＤＧＬＶＧＴＣＳＳが挙げられるが、ループ（Ｂ）のアミノ酸配列に、領域（ＶＩ）の前記アミノ酸配列の少なくとも１のアミノ酸残基が含まれることが好ましい。
【００８２】  本発明のポリペプチドの総アミノ酸残基数としては、２７０〜３４０、好ましくは２８０〜３３０、より好ましくは２８５〜３２５、より一層好ましくは３００〜３２５、特に好ましくは３１０〜３２５である。
【００８３】本発明のポリペプチドの好適な一態様  本発明のポリペプチドの好適な一態様として、具体的には、下記（１）〜（４）に示すポリペプチドが挙げられる。（１）配列番号１に示すアミノ酸配列において、２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、２４〜２６位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３２〜２３４位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、（３）配列番号３に示すアミノ酸配列において、２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、（４）配列番号４に示すアミノ酸配列において、２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００８４】  配列番号１に示すアミノ酸配列は、バークホルデリア・セパシア由来の野生型リパーゼのアミノ酸配列である。配列番号２に示すアミノ酸配列は、シュードモナス・グルマエ由来の野生型リパーゼのアミノ酸配列である。配列番号３に示すアミノ酸配列は、シュードモナス・フルオレセンス由来の野生型リパーゼのアミノ酸配列である。配列番号４に示すアミノ酸配列は、シュードモナス・エルギノーサの野生型リパーゼのアミノ酸配列である。なお、本発明においては、前記（１）〜（４）のポリペプチドには、人為的に置換して得られるポリペプチドのみならず、そのようなアミノ酸配列を元々有するポリペプチドも含まれる。
【００８５】  前記（１）〜（４）のポリペプチドにおいて、所定部位に置換される表Ｉ及びＩＩに示すアミノ酸残基の内、好ましいものについては、前述する通りである。
【００８６】  また、本発明のポリペプチドの他の好適な態様として、下記（５）〜（１２）に示すポリペプチドが挙げられる。（５）配列番号１に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（６）配列番号２に示すアミノ酸配列における２４〜２６位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３２〜２３４位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（７）配列番号３に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（８）配列番号４に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（９）配列番号１に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（１０）配列番号２に示すアミノ酸配列における２４〜２６位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３２〜２���４位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（１１）配列番号３に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド、（１２）配列番号４に示すアミノ酸配列における２５〜２７位のアミノ酸残基が表ＩのＮｏ．１〜１２５に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されている、及び／又は２３３〜２３５位のアミノ酸残基が表ＩＩのＮｏ．１〜１５０に示すいずれかのアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、リパーゼ活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド。
【００８７】  なお、本発明において、前記（５）〜（１２）のポリペプチドには、人為的に置換して得られるポリペプチドのみならず、そのようなアミノ酸配列を元々有するポリペプチドも含まれる。
【００８８】  以下、前記（５）〜（１２）のポリペプチドにおいて、前記表I及びＩＩに示すアミノ酸残基による置換がされているアミノ酸残基以外を「任意相違部位」と表記することもある。本明細書において、用語「任意相違部位」とは、ポリペプチドの特性に大きく影響しない限り、相違が許容される部位である。また、本明細書において、前記（１）〜（４）のポリペプチドと比較して、任意相違部位においてアミノ酸配列に相違がみられるものの、前記（１）〜（４）のポリペプチドと同程度又はそれ以上のリパーゼ活性を有し、かつ、前記（１）〜（４）のポリペプチドと同程度又はそれ以上の熱安定性を有しているものを、前記（１）〜（４）のポリペプチドの相違体という。また、前記ポリペプチドの相違体は、前記（１）〜（４）のポリペプチドと比較して、任意相違部位においてアミノ酸配列に相違がみられるものの、当該ポリペプチドの特性が実質的に同一であることが好ましい。なお、「実質的に同一」とは、前記（１）〜（４）のポリペプチドと同程度のリパーゼ活性及び熱安定性を有しているものをいう。
【００８９】  前記（５）及び（９）のポリペプチドは、前記（１）のポリペプチドの相違体である。前記（６）及び（１０）のポリペプチドは、前記（２）のポリペプチドの相違体である。前記（７）及び（１１）のポリペプチドは、前記（３）のポリペプチドの相違体である。前記（８）及び（１２）のポリペプチドは、前記（４）のポリペプチドの相違体である。
【００９０】  前記（５）〜（８）のポリペプチドにおけるアミノ酸の相違は、置換、付加、挿入、および欠失の中から１種類の相違（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の相違（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。前記（５）〜（８）のポリペプチドにおいて、任意相違部位におけるアミノ酸の相違は、１個若しくは数個であればよく、例えば１〜５０個、好ましくは１〜２０個、１〜１０個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、又は１〜４個、更に好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
【００９１】  また、前記（９）〜（１２）のポリペプチドにおいて、配列番号１〜４に示す各アミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換がされた部位を除いた配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは８５％以上又は９０％以上、更に好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、又は９８％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。
【００９２】  ここで、前記（９）〜（１２）のポリペプチドにおいて、配列番号１〜４に示す各アミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換がされた部位を除いた配列同一性とは、配列番号１〜４に示す各アミノ酸配列から前記任意相違部位のみを抜き出して、当該任意相違部位のみを比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ  ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２  ｂｉｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７−２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
【００９３】  また、前記（５）〜（１２）のポリペプチドの任意相違部位に導入されるアミノ酸置換の他の態様として、保存的置換が挙げられる。即ち、前記任意相違部位における置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
【００９４】  前記（５）のポリペプチドにおいて、「リパーゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチド」とは、リパーゼ活性があり、且つ下記条件で測定した残存活性が、同条件で測定した配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの残存活性よりも高いことを意味する。具体的には、下記条件で測定したポリペプチドの残存活性が、同条件で測定した配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの残存活性に比べて１．５倍以上、好ましくは２倍以上、更に好ましくは３倍以上高いことを意味する。なお、前記（６）〜（１２）のポリペプチドも、同様である。なお、「残存活性」とは、熱処理後に残存するリパーゼ活性であり、ポリペプチドの熱処理前のリパーゼ活性値に対する熱処理後のリパーゼ活性値を百分率で示したものである。（測定条件）  熱処理：６０℃、３０分  活性値の測定：Ｌｉｐａｓｅ  Ｋｉｔ  Ｓ（ＤＳ  ファーマバイオメディカル）を使用して、３７℃、２０分反応させた後、ＰｏｗｅｒＳｃａｎＨＴ（ＤＳ  ファーマバイオメディカル）にて測定した吸光値（４１２ｎｍ）から算出する。  残存活性（残存率）（％）：［活性値（熱処理サンプル）／活性値（未処理サンプル）×１００］
【００９５】前記ポリペプチドをコードしているＤＮＡ  本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」と表記することもある）は、例えば、野生型リパーゼのアミノ酸配列（配列番号１〜４）をコードしているＤＮＡに前記アミノ酸変異を導入することにより得ることができる。また、本発明のＤＮＡは、遺伝子の全合成法によって人工合成することもできる。
【００９６】  配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡは、例えば、配列番号９に示される塩基配列として知られており、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）のＭ−１２−３３株のゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いた定法により単離することができる。
【００９７】  配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡは、例えば、配列番号１０に示される塩基配列として知られており、シュードモナス・グルマエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｌｕｍａｅ）のＰＧ１株のゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いた定法により単離することができる。
【００９８】  配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡは、例えば、配列番号１１に示される塩基配列として知られており、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）のＡＫ１０２株のゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いた定法により単離することができる。
【００９９】  配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡは、例えば、配列番号１２に示される塩基配列として知られており、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＴＥ３２８５株のゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いた定法により単離することができる。
【０１００】  塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する方法は公知であり、例えばＤＮＡの部位特異的変異導入法等が利用できる。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ：東洋紡製など）の利用等が挙げられる。
【０１０１】  塩基配列に変異を導入したＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、又は当該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
【０１０２】  また、部位特異的突然変異誘発法等によって前記ペプチドをコードするＤＮＡの変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。なお、前記ペプチドをコードするＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、メガプライマーＰＣＲ法等の公知の手法によって行うことができる。
【０１０３】  本発明のＤＮＡは、コドン利用頻度を宿主に最適化したものが好ましく、コドン利用頻度を大腸菌に最適化させたＤＮＡがより好ましい。
【０１０４】  コドン利用頻度を表す指標として、各コドンの宿主最適コドン利用頻度の総計を採択すればよい。最適コドンとは、同じアミノ酸に対応するコドンのうち利用頻度が最も高いコドンと定義される。コドン利用頻度は、宿主に最適化したものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌の最適コドンの一例として以下のものが挙げられる。Ｆ：フェニルアラニン（ｔｔｔ）、Ｌ：ロイシン（ｃｔｇ）、Ｉ：イソロイシン（ａｔｔ）、Ｍ：メチオニン（ａｔｇ）、Ｖ：バリン（ｇｔｇ）、Ｙ：チロシン（ｔａｔ）、終止コドン（ｔａａ）、Ｈ：ヒスチジン（ｃａｔ）、Ｑ：グルタミン（ｃａｇ）、Ｎ：アスパラギン（ａａｔ）、Ｋ：リジン（ａａａ）、Ｄ：アスパラギン酸（ｇａｔ）、Ｅ：グルタミン酸（ｇａａ）、Ｓ：セリン（ａｇｃ）、Ｐ：プロリン（ｃｃｇ）、Ｔ：スレオニン（ａｃｃ）、Ａ：アラニン（ｇｃｇ）、Ｃ：システイン（ｔｇｃ）、Ｗ：トリプトファン（ｔｇｇ）、Ｒ：アルギニン（ｃｇｃ）、Ｇ：グリシン（ｇｇｃ）。
【０１０５】  本発明のＤＮＡの具体的態様として、配列番号９〜１３に示す塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。配列番号９又は１３に示される塩基配列からなるＤＮＡは、前記（１）のポリペプチドであって、２５〜２７位に表Ｉに示されるアミノ酸残基、２３３〜２３５位に表ＩＩに示されるアミノ酸残基が導入されたポリペプチドをコードしている。配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡは、前記（２）のポリペプチドであって、２４〜２６位に表Ｉに示されるアミノ酸残基、２３２〜２３４位に表ＩＩに示されるアミノ酸残基が導入されたポリペプチドをコードしている。配列番号１１に示される塩基配列からなるＤＮＡは、前記（３）のポリペプチドであって、２５〜２７位に表Ｉに示されるアミノ酸残基、２３３〜２３５位に表ＩＩに示されるアミノ酸残基が導入されたポリペプチドをコードしている。配列番号１２に示される塩基配列からなるＤＮＡは、前記（４）のポリペプチドであって、２５〜２７位に表Ｉに示されるアミノ酸残基、２３３〜２３５位に表ＩＩに示されるアミノ酸残基が導入されたポリペプチドをコードしている。
【０１０６】  また、本発明のＤＮＡには、（ｉ）リパーゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチドをコードし、配列番号９又は１３に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、（ｉｉ）リパーゼ活性を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチドをコードし、配列番号１０に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、（ｉｉｉ）リパーゼ活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチドをコードし、配列番号１１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、（ｉｖ）リパーゼ活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチドをコードし、配列番号１２に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、が包含される。
【０１０７】  ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一晩保温する条件をいう。
【０１０８】  ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。
【０１０９】  更に、本発明のＤＮＡには、（ｖ）リパーゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ配列番号９に示す塩基配列からなるＤＮＡに８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、（ｖｉ）リパーゼ活性を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ配列番号１０に示す塩基配列からなるＤＮＡに８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、（ｖｉｉ）リパーゼ活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ配列番号１１に示す塩基配列からなるＤＮＡに８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、並びに（ｖｉｉｉ）リパーゼ活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比して熱安定性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ配列番号１２に示す塩基配列からなるＤＮＡに８０％以上の相同性を有するＤＮＡも包含される。当該相同性として、好ましくは８５％以上又は９０％以上、更に好ましくは９５％以上、９６％以上、又は９７％以上、特に好ましくは９８％以上又は９９％以上が挙げられる。
【０１１０】  ここで、ＤＮＡの「相同性」は、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウェアを用いて計算される。具体的には、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）等を用いることができ、これらはデフォルトパラメーターに設定して使用すればよい。
【０１１１】組換えベクター  本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクター（以下、「本発明の組換えベクター」と表記することもある）は、発現ベクターに本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
【０１１２】  本発明の組換えベクターには、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーター等の制御因子が含まれる。制御因子としては、代表的にはプロモーターが挙げられるが、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。また、作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
【０１１３】  発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。このような発現ベクターは公知であり、例えば、商業的に入手可能な発現ベクターとしては、ｐＱＥ系ベクター（株式会社キアゲン）、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク株式会社）等が挙げられる。発現ベクターは、宿主細胞との適切な組み合わせを選んで使用すればよく、例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、ｐＥＴ系ベクターとＤＨ５α大腸菌株の組み合わせ、ｐＥＴ系ベクターとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせ、又はｐＤＲ５４０ベクターとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせ等が好ましく挙げられる。
【０１１４】形質転換体  本発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」と表記することもある）が得られる。
【０１１５】  形質転換体の製造に使用される宿主としては、組換えベクターが安定であり、且つ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌；酵母等が好適な例として挙げられるが、その他、動物細胞、昆虫細胞、植物等であってもよい。これらの中でも大腸菌が特に好ましい。
【０１１６】  本発明の形質転換体は、宿主に本発明の組換えベクターを導入することによって得ることができ、宿主に組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、及びＰＥＧ法等が挙げられる。
【０１１７】  本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、及びノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。
【０１１８】  ＰＣＲ法よって本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かを確認する場合、例えば、形質転換体から組換えベクターを分離・精製すればよい。
【０１１９】  組換えベクターの分離・精製は、例えば、宿主が細菌の場合、細菌を溶菌して得られる溶菌物に基づいて行われる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームなどの溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼ、及び他の酵素並びにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。
【０１２０】  更に、凍結融解およびフレンチプレス処理のような物理的破砕方法を組み合わせてもよい。溶菌物からのＤＮＡの分離・精製は、例えば、フェノール処理およびプロテアーゼ処理による除蛋白処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理並びに市販のキットを適宜組み合わせることにより行うことができる。
【０１２１】  ＤＮＡの切断は、常法に従い、例えば制限酵素処理を用いて行うことができる。制限酵素としては、例えば特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素を用いる。ＤＮＡと発現ベクターとの結合は、例えばＤＮＡリガーゼを用いて行う。
【０１２２】  その後、分離・精製したＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲにより得られた増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。
【０１２３】  また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光および酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
【０１２４】ポリペプチドの製造  本発明のポリペプチドは、本発明の形質転換体を培養することによって製造することができる。
【０１２５】  形質転換体の培養条件は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。また、工業的製造を行う場合であれば、通気攪拌培養が好ましい。
【０１２６】  培地の栄養源としては、形質転換体の生育に必要とされるものが使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸等が挙げられる。
【０１２７】  窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物が挙げられる。
【０１２８】  炭素源及び窒素源の他に、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガンおよび亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸並びに特定のビタミンなどを必要に応じて使用してもよい。
【０１２９】  培養温度は、本発明の形質転換体が生育可能であり、且つ本発明の形質転換体が本発明のポリペプチドを産生する範囲で適宜設定し得るが、好ましくは１５〜３７℃程度である。培養は、本発明のポリペプチドが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２〜４８時間程度である。
【０１３０】  本発明の形質転換体を培養し、培養液を遠心分離などの方法により培養上清または菌体を回収し、菌体は超音波およびフレンチプレスといった機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、本発明のポリペプチドを含む水溶性画分を得ることができる。
【０１３１】  また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した本発明のポリペプチドを培養液中に分泌させることもできる。
【０１３２】  上記のようにして得られた本発明のポリペプチドを含む水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、該水溶性画分中の本発明のポリペプチドを濃縮した後に精製処理に供してもよい。
【０１３３】  濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。
【０１３４】  本発明のポリペプチドの精製処理は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
【０１３５】  前記精製処理は既に公知であり、適当な文献、雑誌および教科書等を参照することで進めることができる。このようにして精製された本発明のポリペプチドは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化して市場に流通させることができる。
【０１３６】組成物  本発明のポリペプチドは、例えば組成物の形態で提供されてもよい。前記組成物は、本発明のポリペプチドを有効成分として含む。前記組成物の精製の程度は特に限定されないが、前記組成物は、本発明の効果に影響を与えない程度に、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、培地由来の成分や夾雑タンパク質等が挙げられる。
【０１３７】  前記組成物はまた、他の酵素を含んでいてもよい。他の酵素としては、例えば、アミラーゼ（α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ）、グルコシダーゼ（α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ）、ガラクトシダーゼ（α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ）、プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ）、ペプチダーゼ（ロイシンペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ）、リパーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、ホスファターゼ（酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ）、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、グルタミナーゼ、ペクチナーゼ、カタラーゼ、デキストラナーゼ、トランスグルタミナーゼ、蛋白質脱アミド酵素、プルラナーゼ等が挙げられる。
【０１３８】  前記組成物における本発明のポリペプチドの含有量としては、特に限定されないが、好ましくは前記組成物の全タンパク質中１０質量％以上、より好ましくは３０質量％以上が挙げられる。前記組成物の形態は、特に限定されないが、例えば、液体、粉末、顆粒等が挙げられる。前記組成物は、一般的に公知の方法で調製することができる。
【０１３９】酵素剤  本発明のポリペプチド、又は本発明のポリペプチドを含む組成物は、例えば酵素剤の形態で提供されてもよい。酵素剤は、本発明のポリペプチド、又は前記組成物の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、Ｄ−グルコース、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。前記酵素剤における前記ポリペプチドの含有量としては、前記ポリペプチドの効果が発揮される範囲で適宜設定される。
【０１４０】用途本発明のポリペプチドは、リパーゼ活性を有し熱安定性に優れる。そのため、本発明のポリペプチドは、リパーゼによる酵素処理が必要とされる用途、例えば、油脂（トリグリセリド）の処理（分解、エステル交換）が要求される用途に利用することができる。リパーゼによる酵素処理が必要とされる用途が要求される用途としては、例えば、油脂の精製、食品又は食品素材の製造、消化酵素剤等の医薬品、化粧品添加剤、食品工場等の排水処理、医薬中間体製造、ファインケミカル素材製造、機能代替油脂製造、等の用途が挙げられ、好ましくは排水処理用途が挙げられる。本発明のポリペプチド、又は本発明のポリペプチドを含む前述の酵素剤は、油脂に作用させることにより、油脂処理することができる。そのような油脂処理方法も本発明の一つである。
【０１４１】  また、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドを含む前述の酵素剤を、油脂を含む排水に作用させることにより、排水を処理することができる。排水としては、特に限定されず、家庭用排水、工業用排水、農業用排水等が挙げられるが、なかでも油脂を多く含む排水の処理に適用することが好ましい。そのような排水処理方法も本発明の一つである。
【０１４２】  また、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドを含む前述の酵素剤を医薬中間体原料に作用させることにより、医薬中間体を製造することができる。医薬中間体原料としては、例えばコレステロール脂肪酸エステル、モノアシルグリセロール、グリシッド酸エステル類、ベンゾチアゼピン類化合物等が挙げられる。そのような医薬中間体の製造方法も本発明の一つである。
【０１４３】  更に、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドを含む前述の酵素剤をファインケミカル素材原料に作用させることにより、ファインケミカル素材を製造することができる。ファインケミカル素材としては、例えば香料（乳フレーバー、大環状ラクトン、フェネチルアルコール配糖体等）、化粧品原料、乳化剤等が挙げられる。そのようなファインケミカル素材の製造方法も本発明の一つである。
【実施例】
【０１４４】以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。【０１４５】＜実験例１＞Ｅ．ｃｏｌｉ  発現用プラスミドの構築  Ｅ．ｃｏｌｉ発現系を構築するにあたり、Ｂ．ｃｅｐａｃｉａ  Ｍ１２−３３  の各遺伝子（Ｌｉｐ  Ａ（配列番号９）、Ｌｉｐ  Ｘ（配列番号１４））をＥ．ｃｏｌｉ  発現用にコドン最適化した遺伝子を全合成した。全合成した構造遺伝子（Ｌｉｐ  Ａ；配列番号１３）を鋳型としたＰＣＲ増幅（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＴａＫａＲａ））、プライマー（フォワードプライマー：５’−ＴＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＴＴＣＴＡＴＧＣＧＴＴＣＴＣＧ−３’、リバースプライマー：５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＡＡＣＡＣＣＣＧＣＣＡＧＴＴＴＣＡＧＡＣＧＧ−３’））にてリンカー配列（Ｎｃｏ  Ｉ，  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）を付加した後、精製（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  （ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ））して遺伝子断片（ＢＣＬ−ＬｉｐＡ）を取得した。【０１４６】  遺伝子断片（ＢＣＬ−ＬｉｐＡ）、及びｐＥＴＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ）は、制限酵素（Ｎｃｏ  Ｉ（ＴａＫａＲａ），Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ（ＴａＫａＲａ））で処理した後、ライゲーション（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ））して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  （ＴａＫａＲａ）に形質転換することで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＣＬ−ＬｉｐＡを取得した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＣＬ−ＬｉｐＡからのプラスミド抽出は、ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ  Ｂａｓｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋  Ａｍｐ  ：  １００μｇ／ｍＬ：５ｍＬに植菌して振とう培養（３７℃、１６ｈ、１４０ｒｐｍ）した後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＥａｓｙＰｕｒｅ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて抽出して、プラスミド（ｐＥＴＢＣＬ−ＬｉｐＡ）を取得した。【０１４７】  シャペロン遺伝子（Ｌｉｐ  Ｘ）についても、同様の操作を行った。すなわち、全合成したシャペロン遺伝子（Ｌｉｐ  Ｘ；配列番号１５）を鋳型としてＰＣＲ増幅（プライマー（フォワードプライマー：５’−ＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＡＣＣＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＣＧＣ−３’、リバースプライマー：５’−ＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＣＧ−３’）にてリンカー配列（Ｎｄｅ  Ｉ，Ｘｈｏ  Ｉ）を付加した後、精製（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  （ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ））して遺伝子断片（ＢＣＬ−ＬｉｐＸ）を取得した。【０１４８】  遺伝子断片（ＢＣＬ−ＬｉｐＸ）、及びｐＥＴＢＣＬ−ＬｉｐＡを制限酵素（ＮｄｅＩ（ＴａＫａＲａ），Ｘｈｏ  Ｉ（ＴａＫａＲａ））で処理した後、ライゲーションしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換することで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＣＬ−ＬｉｐＡＸを取得した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＣＬ−ＬｉｐＡＸからのプラスミド抽出は、ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ  Ｂａｓｅ  ＋  Ａｍｐ  ：  １００μｇ／ｍＬ：５ｍＬに植菌して振とう培養（３７℃、１６ｈ、１４０ｒｐｍ）した後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＥａｓｙＰｕｒｅ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−��ＡＧＥＬ）を用いて抽出して、Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミド（ｐＥＴＢＣＬ−ＬｉｐＡＸ）を取得した。【０１４９】Ｅ．ｃｏｌｉ  発現系の構築  取得したＥ．ｃｏｌｉ発現プラスミド（ｐＥＴＢＣＬ−ＬｉｐＡＸ）をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  （Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）に形質転換して、Ｅ．ｃｏｌｉ  発現菌株：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＢＣＬ−ＬｉｐＡＸ）を取得した。【０１５０】変異株のシークエンス確認  構築したプラスミド（ｐＥＴＢＣＬ−ＬｉｐＡ、ｐＥＴＢＣＬ−ＬｉｐＡＸ）のシークエンス確認は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（ｐＥＴ  Ｕｐｓｔｒｅａｍ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣＧＴＡＧＡ−３’、ＤｕｅｔＤＯＷＮ１  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＡＴＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＣＡＡ−３’、ＤｕｅｔＵＰ２  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＴＧＴＡＣＡＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＡＴＣ−３’、Ｔ７  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ−３’）を用いて行った。【０１５１】＜実験例２＞Ｌｉｐａｓｅ  （ＢＣＬ）の変異導入点の選定、及びランダム変異ライブラリーの作製（Ｌｉｐａｓｅ（ＢＣＬ）の変異導入点の選定）  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ由来Ｌｉｐａｓｅの立体構造情報〔１〕、〔２〕を参考にして、１２箇所の変異導入点（Ｌ１〜Ｌ１２）を選定した。＊〔１〕Ｋｉｍ，Ｋ．Ｋ．；Ｓｏｎｇ，Ｈ．Ｋ．；Ｓｈｉｎ，Ｄ．Ｈ．；Ｓｕｈ，Ｓ．Ｗ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．１９９７，５，１７３−１８５、＊〔２〕Ｌａｎｇ，Ｄ．Ａ．；Ｍａｎｎｅｓｓｅ，Ｍ．Ｌ．Ｍ．；Ｄｅ  Ｈａ  ａｓ，Ｇ．；Ｖｅｒｈｅｉｊ，  Ｈ．Ｍ．；Ｄｉｊｋｓｔｒａ，Ｂ．Ｗ．Ｅ  ｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，２５４，３３３−３４０【０１５２】（ランダム変異株の作製）  選定した１２箇所の変異導入点についてランダム変異ライブラリーを作製するため、ランダムＰｒｉｍｅｒを設計した。【０１５３】・Ｌ１（Ａ７４Ｘ／Ａ７５Ｘ／Ｔ７６Ｘ）：（フォワードプライマー：  ５’−ＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＧＣＧＣＡＡＣＣＡＡＡＧＴＴＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧ−３’、リバースプライマー：  ５’−ＣＡＧＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＡＣＡＴＡＣＧＣＣＡＧＣ−３’）・Ｌ２（Ｖ１９９Ｘ／Ｇ２００Ｘ／Ｇ２０Ｘ）：（フォワードプライマー：  ５’−ＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＡＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＣＴＴＧＧＧＣ−３’、リバースプライマー：  ５’−ＡＧＴＣＴＣＧＧＴＣＧＧＣＧＣＡＣＣ−３’）・Ｌ３（Ｌ１２７Ｘ／Ａ１２８Ｘ／Ｙ１２９Ｘ）：（フォワードプライマー：  ５’−ＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＡＣＣＣＧＡＣＴＧＧＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＡＣＣ−３’、リバースプライマー：  ５’−ＡＡＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＣＣＧＣＧ−３’）・Ｌ４（Ｐ２１６Ｘ／Ｔ２１７Ｘ／Ｉ２１８Ｘ）：（フォワードプライマー：  ５’−ＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＣＴＧＴＴＴＴＣＧＧＴＧＴＴＡＣＴＧＧＴＧＣＧＡＣ−３’、リバースプライマー：  ５’−ＣＴＧＧＡＴＣＧＣＡＧＴＡＣＣＣＧＣＣＣＡＡＧ−３’）・Ｌ５（Ｓ２１９Ｘ／Ｖ２２０Ｘ／Ｆ２２１Ｘ）：（フォワードプライマー：  ５’−ＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＧＴＧＴＴＡＣＴＧＧＴＧＣＧＡＣＴＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＣ��３’、リバースプライマー：  ５’−ＧＡＴＧＧＴＣＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＣＡＧＴＡＣ−３’）・Ｌ６（Ｇ２２２Ｘ／Ｖ２２３Ｘ／Ｔ２２４Ｘ）：（フォワードプライマー：  ５’−ＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＧＴＧＣＧＡＣＴＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＣＴＡＴＣＣＣＧＣ−３’、リバースプライマー：  ５’−ＧＡＡＡＡＣＡＧＡＧＡＴＧＧＴＣＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＣ−３’）・Ｌ７（Ｐ２３３Ｘ／Ｌ２３４Ｘ／Ｖ２３５Ｘ）：（フォワードプライマー：  ５’−ＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＧＣＡＣＴＧＧＡＣＣ−３’、リバースプライマー：  ５’−ＧＡＴＡＧＴＡＧＡＧＧＴＡＴＣＡＧＴＣＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＣ−３’）・Ｌ８（Ｒ２５８Ｘ／Ｇ２５９Ｘ／Ｓ２６０Ｘ）：（フォワードプライマー：  ５’−ＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＧＴＣＡＧＡＡＣＧＡＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＴＣＴＡＡＧＴＧ−３’、リバースプライマー：  ５’−ＧＴＴＣＡＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＧＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＡＣ−３’）・Ｌ９（Ｑ２９２Ｘ／Ｌ２９３Ｘ／Ｌ２９４Ｘ）：（フォワードプライマー：  ５’−ＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＧＴＧＴＴＣＧＴＧＧＴＧＣＴＡＡＣＧＣＧＧＡＡＧＡＴＣ−３’、リバースプライマー：  ５’−ＧＴＴＧＡＴＣＴＣＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＴＴＣＣＡＴＴＴＧＴＡＡＧＡＧ−３’）・Ｌ１０（Ｇ２５Ｘ／Ｖ２６Ｘ／Ｌ２７Ｘ）：（フォワードプライマー：  ５’−ＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＡＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＧＧＴＡＴＴＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣ−３’、リバースプライマー：  ５’−ＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡＴＣＧＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＣＣＡＴＧ−３’）・Ｌ１１（Ｐ５８Ｘ／Ｎ５９Ｘ／Ｇ６０Ｘ）：（フォワードプライマー：  ５’−ＮＮＫＮＮＫＮＮＫＣＧＣＧＧＣＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＡＡＡＣ−３’、リバースプライマー：  ５’−ＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧＧＡＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣ−３’）・Ｌ１２（Ｑ３９Ｘ／Ｒ４０Ｘ／Ｇ４１Ｘ）：（フォワードプライマー：  ５’−ＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＣＧＡＣＴＧＴＴＴＡＣＧＴＴＧＣＧＡＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＴＴＣ−３’、リバースプライマー：  ５’−ＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＣＣＧＴＡＣＣＡＧＴＡＣＴＣ−３’）【０１５４】  各変異導入点へのランダム変異導入は、プラスミド（ｐＥＴＢＣＬ−ＬｉｐＡＸ）を鋳型として、ランダムＰｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲ増幅（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＴａＫａＲａ））にて行った。ＰＣＲ増幅後、Ｄｐｎ  Ｉ（ＴａＫａＲａ）を用いた鋳型プラスミドの処理（３７℃、１６ｈ）、及びＴ４  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｔｏｙｏｂｏ）、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  （Ｔｏｙｏｂｏ）を用いたライゲーション反応（１６℃、ｏ／ｎ）をした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して、各変異導入点にランダム変異導入されたランダム変異株（  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＢＣＬ−Ｒａｎ  Ｌ１  〜  ＢＣＬ−Ｒａｎ  Ｌ１２））を取得した。【０１５５】  （ランダム変異ライブラリーの作製）  ランダム変異株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＢＣＬ−Ｒａｎ  Ｌ１  〜  ＢＣＬ−Ｒａｎ  Ｌ１２））を用いたランダム変異ライブラリーの作製は、２段階にて行った。【０１５��】１．ＬＢ  Ａｇａｒ  ＋  ０．１％  Ｔｒｉｂｕｔｙｒｉｎ（Ａｍｐ：１００μｇ／ｍＬ）プレートを用いたプレートアッセイ  ランダム変異株から加水分解活性を有した変異株を選抜するため、ＬＢ  Ａｇａｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  ＋  ０．１％  Ｔｒｉｂｕｔｙｒｉｎ（ｗａｋｏ）（Ａｍｐ  ：  １００  μｇ／ｍＬ）を用いたプレートアッセイを行った。ランダム変異株を上記のプレート培地に植菌して培養（３７℃、２４ｈ）した後、クリアハロー形成が認められた変異株を選抜した。【０１５７】２．Ｔｅｒｉｆｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（Ａｍｐ：１００μｇ／ｍＬ）を用いたランダム変異ライブラリーの作製  各変異導入点についてランダム変異ライブラリーを作製するため、上記で選抜した変異株を９６穴Ｄｅｅｐ  Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ（Ｃｏａｓｔａｒ）に分注したＴｅｒｉｆｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ａｍｐ  ：  １００  μｇ／ｍＬ）：１ｍＬ  に植菌（１８０株／変異導入点）後、振とう培養機（Ｔａｉｔｅｃ）にて培養（３３℃、４８ｈ、１，０００ｒｐｍ）した。酵素発現の誘導は、培養：２４ｈ時点で終濃度０．１  ｍＭとなるようにＩＰＴＧを培養液に添加して行った。培養後、遠心分離（３，３００  ｇ  ×１５ｍｉｎ、４℃）にて菌体を回収した後、Ｂ−ＰＥＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いた溶菌処理（２５℃、１，０００ｒｐｍ）にて酵素抽出液を取得した。酵素抽出液を遠心分離（３，３００ｇ×１５ｍｉｎ、４℃）した後、上清を回収して、各変異導入点のランダム変異ライブラリーとした。※ランダム変異ライブラリーを用いて、検討した菌株数１つの変異導入点について、１８０株を培養・評価（概算合計：２１６０株（内訳：１８０株／変異点×１２箇所＝２１６０株））  ＢＣＬのランダム変異ライブラリーの評価にて、Ｌ７（Ｐ２３３／Ｌ２３４／Ｖ２３５）、及びＬ１０（Ｇ２５／Ｖ２６／Ｌ２７）への変異導入により、安定性の向上が確認された。【０１５８】＜実験例３＞ＢＣＬ（Ｇ２５、Ｖ２６、Ｌ２７、Ｐ２３３、Ｌ２３４、Ｖ２３５）−飽和変異ライブラリーの作製  （ＢＣＬ（Ｇ２５、Ｖ２６、Ｌ２７、Ｐ２３３、Ｌ２３４、Ｖ２３５）−飽和変異Ｐｒｉｍｅｒの設計）  各変異点を構成するアミノ酸の飽和変異ライブラリーを作製して、安定性の向上に寄与する置換アミノ酸を検討した。  各変異点の飽和変異ライブラリーを作製するため、飽和変異プライマーを設計した。表５〜１０にプライマーを示す。【０１５９】
【表５】
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【０１６０】
【表６】
2018021324.tif 000007
【０１６１】
【表７】
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【０１６２】
【表８】
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【０１６３】
【表９】
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【０１６４】
【表１０】
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【０１６５】ＢＣＬ（Ｇ２５、Ｖ２６、Ｌ２７、Ｐ２３３、Ｌ２３４、Ｖ２３５）−飽和変異プラスミドの作製  各変異点への飽和変異導入は、プラスミド（ｐＥＴＢＣＬ−ＬｉｐＡＸ）を鋳型として、飽和変異Ｐｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲ増幅（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＴａＫａＲａ））にて行った。  ＰＣＲ増幅後、Ｄｐｎ  Ｉ（ＴａＫａＲａ）を用いた鋳型プラスミドの処理（３７℃、１６ｈ）、及びＴ４  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｔｏｙｏｂｏ）、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  （Ｔｏｙｏｂｏ）を用いたライゲーション反応（１６℃、ｏ／ｎ）をした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換して、各変異点について飽和変異株（  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ＢＣＬ−Ｇ２５Ａ〜Ｇ２５Ｙ、ＢＣＬ−Ｖ２６Ａ〜Ｖ２６Ｙ、ＢＣＬ−Ｌ２７Ａ〜Ｌ２７Ｙ、ＢＣＬ−Ｐ２３３Ａ〜Ｐ２３３Ｙ、  ＢＣＬ−Ｌ２３４Ａ〜Ｌ２３４Ｙ、ＢＣＬ−Ｖ２３５Ａ〜Ｖ２３５Ｙ））を取得した。  各飽和変異株からのプラスミド抽出は、ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ  Ｂａｓｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋Ａｍｐ：１００μｇ／ｍＬで振とう培養（３７℃、１６ｈ、１４０ｒｐｍ）した後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＥａｓｙＰｕｒｅ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて抽出して、飽和変異プラスミド（ｐＥＴＢＣＬ−Ｇ２５Ａ〜Ｇ２５Ｙ、ｐＥＴＢＣＬ−Ｖ２６Ａ〜Ｖ２６Ｙ、ｐＥＴＢＣＬ−Ｌ２７Ａ〜Ｌ２７Ｙ、ｐＥＴＢＣＬ−Ｐ２３３Ａ〜Ｐ２３３Ｙ、ｐＥＴＢＣＬ−Ｌ２３４Ａ〜Ｌ２３４Ｙ、ｐＥＴＢＣＬ−Ｖ２３５Ａ〜Ｖ２３５Ｙ）を取得した。  取得したプラスミドのシークエンス確認は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（ｐＥＴ  Ｕｐｓｔｒｅａｍ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣＧＴＡＧＡ−３’、  ＤｕｅｔＤＯＷＮ１  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＡＴＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＣＡＡ−３’）を用いて行った。【０１６６】  （ＢＣＬ（Ｇ２５、Ｖ２６、Ｌ２７、Ｐ２３３、Ｌ２３４、Ｖ２３５）−  Ｅ．ｃｏｌｉ  発現菌株の作製）  取得した飽和変異プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  （Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）に形質転換して、Ｅ．ｃｏｌｉ  発現菌株：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＢＣＬ−Ｇ２５Ａ〜Ｇ２５Ｙ、ＢＣＬ−Ｖ２６Ａ〜Ｖ２６Ｙ、ＢＣＬ−Ｌ２７Ａ〜Ｌ２７Ｙ、ＢＣＬ−Ｐ２３３Ａ〜Ｐ２３３Ｙ、  ＢＣＬ−Ｌ２３４Ａ〜Ｌ２３４Ｙ、ＢＣＬ−Ｖ２３５Ａ〜Ｖ２３５Ｙ））を取得した。【０１６７】  （ＢＣＬ（Ｇ２５、Ｖ２６、Ｌ２７、Ｐ２３３、Ｌ２３４、Ｖ２３５）−飽和変異ライブラリーの作製）  各変異点の飽和変異ライブラリーを作製するため、上記で作製したＥ．ｃｏｌｉ発現菌株を９６穴Ｄｅｅｐ  Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ（Ｃｏａｓｔａｒ）に分注したＴｅｒｉｆｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ａｍｐ：１００μｇ／ｍＬ）：  １ｍＬ  に植菌（１８０株／変異導入点）後、振とう培養機（ＴＡＩＴＥＣ）にて培養（３３℃、４８ｈ、１，０００ｒｐｍ）した。酵素発現の誘導は、培養：２４ｈ時点で終濃度０．１  ｍＭとなるようにＩＰＴＧを培養液に添加して行った。培養後、遠心分離（３，３００ｇ×１５ｍｉｎ、４℃）にて菌体を回収した後、Ｂ−ＰＥＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いた溶菌処理（２５℃、１，０００ｒｐｍ）にて酵素抽出液を取得した。酵素抽出液を遠心分離（３，３００ｇ×１５ｍｉｎ、４℃）した後、上清を回収して、各変異点の飽和変異ライブラリーとした。【０１６８】＜実験例４＞活性測定法、及び各ポリペプチド変異ライブラリーの評価（熱安定性）（活性測定法）  リパーゼ（ＢＣＬ）、実験例２で調製したランダム変異ライブラリー（Ｌ７、Ｌ１０）及び実験例３で調製した各変異点の飽和変異ライブラリーの活性値は、Ｌｉｐａｓｅ  Ｋｉｔ  Ｓ（ＤＳ  ファーマバイオメディカル）を使用して、３７℃、２０分反応させた後、ＰｏｗｅｒＳｃａｎＨＴ（ＤＳ  ファーマバイオメディカル）にて測定した吸光値（４１２ｎｍ）から算出した。測定サンプルの希釈は、２０ｍＭ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．０を用いた。【０１６９】（各変異ライブラリーの評価（熱安定性））  各変異ライブラリーの熱安定性の評価は、熱処理（６０℃、３０分）したサンプルの活性の残存率（活性値（熱処理サンプル）／活性値（未処理サンプル）×  １００）で比較した。活性測定は、Ｌｉｐａｓｅ  Ｋｉｔ  Ｓ（ＤＳ  ファーマバイオメディカル）を使用した。【０１７０】（ＰＣＲ条件）  なお、ＢＣＬのＥ．ｃｏｌｉ発現系の構築、及び変異導入株の作製は、全ての検討において  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＴａＫａＲａ）を使用した。反応組成は、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  Ｂｕｆｆｅｒ：１０μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ）：４μｌ、フォワードプライマー：１０ｐｍｏｌ、リバースプライマー：１０  ｐｍｏｌ、Ｔｅｍｐｌａｔｅ：１０ｎｇ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：１μｌ、滅菌蒸留水：ｕｐ  ｔｏ  ５０μｌ  である。反応条件は、９８℃：１０ｓｅｃ、６０℃：３０ｓｅｃ、６８℃：１．５ｍｉｎ  を３０ｃｙｃｌｅ  である。【０１７１】各ポリペプチド変異ライブラリーの熱安定性の評価結果を表１１、及び表１２に示す。【０１７２】
【表１１】
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【０１７３】
【表１２】
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【０１７４】  表１１によれば、表１１に示すＮｏ．１〜１２５のいずれかのアミノ酸配列の変異が導入されたポリペプチドは、熱処理後のリパーゼ活性の残存率が、野生型よりも高いことが示された。また、表１１に示すＮｏ．１〜６８のいずれかのアミノ酸配列の変異が導入されたポリペプチドは、熱処理後のリパーゼ活性の残存率が、野生型よりも２倍以上高く、更に、Ｎｏ．１〜４０のいずれかのアミノ酸配列の変異が導入されたポリペプチドは、野生型よりも３倍以上高いことが示された。また、表１２によれば、表１２に示すＮｏ．１〜１５０のいずれかのアミノ酸配列の変異が導入されたポリペプチドは、熱処理後のリパーゼ活性の残存率が、野生型よりも高いことが示された。また、表１２に示すＮｏ．１〜８８のいずれかのアミノ酸配列の変異が導入されたポリペプチドは、熱処理後のリパーゼ活性の存存率が、野生型よりも４倍以上高く、更に、Ｎｏ．１〜５５のいずれかのアミノ酸配列の変異が導入されたポリペプチドは、野生型よりも６倍以上高いことが示された。【０１７５】＜実験例５＞（三重変異体の評価（ｐＨ安定性））  三重変異体（Ｐ２３３Ｇ／Ｌ２３４Ｅ／Ｖ２３５Ｍ、表１２のＮｏ．８１）のｐＨ安定性を評価した。サンプルは実験例２で調製したランダム変異ライブラリーを用いた。ｐＨ安定性の評価は、ｐＨ２〜１２の各ｐＨで処理した野生型（表１２のＮｏ．１５１）と三重変異体の活性の残存率（活性値（ｐＨ処理サンプル）／活性値（未処理サンプル）×１００）で比較した。ｐＨ２〜４処理は０．１ｍｏｌ／Ｌ  グリシン緩衝液、ｐＨ５〜７処理は０．１ｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８〜９処理は０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ１０〜１２処理は０．１ｍｏｌ／Ｌ  グリシン緩衝液を用いた。サンプルの酵素液１０μＬを前述の緩衝液９０μＬと混合後、３７℃、１時間静置することにより処理した。処理後、１ｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を等量加えてｐＨ７．０に戻してから活性測定した。活性測定は、Ｌｉｐａｓｅ  Ｋｉｔ  Ｓ（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用して行った。【０１７６】  三重変異体（Ｐ２３３Ｇ／Ｌ２３４Ｅ／Ｖ２３５Ｍ）と野生型のｐＨ安定性の評価結果を表１３及び図８に示す。【０１７７】
【表１３】
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【０１７８】  表１３及び図８によれば、三重変異体（Ｐ２３３Ｇ／Ｌ２３４Ｅ／Ｖ２３５Ｍ）は、ｐＨ３及び１２におけるｐＨ処理後のリパーゼ活性の残存率が、野生型よりも高いことが示された。【０１７９】（三重変異体の評価（有機溶媒安定性））  三重変異体（Ｐ２３３Ｇ／Ｌ２３４Ｅ／Ｖ２３５Ｍ）の有機溶媒安定性を評価した。サンプルは実験例２で調製したランダム変異ライブラリーを用いた。有機溶媒安定性の評価は、野生型と三重変異体のサンプルをそれぞれ水とアセトンで０〜５０ｖ／ｖ％アセトン濃度になるように希釈し、３７℃、１時間処理したときの水処理サンプルに対する各濃度のアセトン処理サンプルの相対活性（活性値（水処理サンプル）／活性値（アセトン処理サンプル）×  １００）で比較した。活性測定は、Ｌｉｐａｓｅ  Ｋｉｔ  Ｓ（ＤＳ  ファーマバイオメディカル）を使用して行った。【０１８０】  三重変異体（Ｐ２３３Ｇ／Ｌ２３４Ｅ／Ｖ２３５Ｍ）の溶媒安定性の評価結果を表１４及び図９に示す。【０１８１】
【表１４】
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【０１８２】  表１４及び図９によれば、三重変異体（Ｐ２３３Ｇ／Ｌ２３４Ｅ／Ｖ２３５Ｍ）は、１０〜５０ｖ／ｖ％アセトン溶液中におけるリパーゼ活性の残存率が、野生型よりも高いことが示された。【０１８３】  以上の結果から、本発明における熱安定性が向上したポリペプチドは、ｐＨ安定性や有機溶媒安定性も向上することが示唆された。
【配列表フリーテキスト】
【０１８４】配列番号１は、バークホルデリア・セパシア由来リパーゼ（成熟体）のアミノ酸配列である。配列番号２は、シュードモナス・グルマエ由来リパーゼ（成熟体）のアミノ酸配列である。配列番号３は、シュードモナス・フルオレセンス由来リパーゼ（成熟体）のアミノ酸配列である。配列番号４は、シュードモナス・エルギノーサ由来リパーゼ（成熟体）のアミノ酸配列である。配列番号５は、バークホルデリア・セパシア由来リパーゼ（全長）のアミノ酸配列である。配列番号６は、シュードモナス・グルマエ由来リパーゼ（全長）のアミノ酸配列である。配列番号７は、シュードモナス・フルオレセンス由来リパーゼ（全長）のアミノ酸配列である。配列番号８は、シュードモナス・エルギノーサ由来リパーゼ（全長）のアミノ酸配列である。配列番号９は、バークホルデリア・セパシア由来リパーゼ（野生型）の塩基配列である。配列番号１０は、シュードモナス・グルマエ由来リパーゼ（野生型）の塩基配列である。配列番号１１は、シュードモナス・フルオレセンス由来リパーゼ（野生型）の塩基配列である。配列番号１２は、シュードモナス・エルギノーサ由来リパーゼ（野生型）の塩基配列である。配列番号１３は、バークホルデリア・セパシア由来リパーゼＬｉｐＡ（Ｅ．ｃｏｌｉコドン最適化）の塩基配列である。配列番号１４は、バークホルデリア・セパシア由来のシャペロン遺伝子（ＬｉｐＸ）野生型の塩基配列である。配列番号１５は、バークホルデリア・セパシア由来シャペロン遺伝子ＬｉｐＸ（Ｅ．ｃｏｌｉコドン最適化）の塩基配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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