(57)【要約】  本発明は、アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸、及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の水溶性修飾ヒアルロン酸と、周期律表の第３周期から第６周期かつ第２族から第１２族に属する元素からなる群より選択される少なくとも１種の元素のイオンと、を含有する、ゲル組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸、及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の水溶性修飾ヒアルロン酸と、
周期律表の第３周期から第６周期かつ第２族から第１２族に属する元素からなる群より選択される少なくとも１種の元素のイオンと、
を含有する、
ゲル組成物。
【請求項２】
請求項１に記載のゲル組成物において、
水に不溶である、
ゲル組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のゲル組成物において、
テクスチャーアナライザーを使用した測定による荷重最大値が３００Ｎ／ｍ２以上である、
ゲル組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のゲル組成物において、
前記イオンが、周期律表の第４周期かつ第３族から第１２族に属する元素からなる群より選択される少なくとも１種の元素のイオンである、
ゲル組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のゲル組成物において、
前記イオンが、Ｆｅ３＋又はＣｕ２＋である、
ゲル組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のゲル組成物において、
前記アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸の修飾率が２５％以上である、
ゲル組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のゲル組成物において、
前記アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸の平均分子量が１０ｋＤａ以上である、
ゲル組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のゲル組成物において、
前記アニオン性修飾基が、カルボキシアルキル基である、
ゲル組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のゲル組成物において、
ゲル化時に成形性を有するゲルである、
ゲル組成物。
【請求項１０】
周期律表の第３周期から第６周期かつ第２族から第１２族に属する元素からなる群より選択される少なくとも１種の元素のイオンを含有する溶液と、
アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸、及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の水溶性修飾ヒアルロン酸と、
を混合する工程を含む、ゲル組成物の製造方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の製造方法において、
前記溶液が、Ｆｅ３＋及びＣｕ２＋からなる群より選択される少なくとも１種の金属イオンを含有する、
製造方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の製造方法において、
前記溶液が、Ｆｅ３＋を０．５ｍＭ以上含有する、
製造方法。
【請求項１３】
請求項１０又は１１に記載の製造方法において、
前記溶液が、Ｃｕ２＋を１０ｍＭ以上含有する、
製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲル組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動植物及び微生物等に由来する天然高分子である多糖類は、その多くがハイドロゲルを形成する。ハイドロゲルを形成する多糖類としては、寒天の原料であるアガロース、ペクチン、ジェランガム、カラギーナン、タマリンドシードガム、アルギン酸ナトリウム等がある。これらの多糖類から形成されるハイドロゲルは、弾力のあるしなやかな物性を有しているため、これらの多糖類は、食品の他、化成品、化粧品、医療機器及び医薬品等の様々な産業分野で活用されている。【０００３】
多糖類の一つであるヒアルロン酸は、水溶性、保水性、弾力性等の物性を活かし、特に化粧品及び医療機器分野で広く使用されている。一方、ヒアルロン酸は、ゲル化が困難な多糖類としても知られている。【０００４】
ヒアルロン酸のゲル化には、従来、化学架橋剤によるゲル化（特許文献１）、紫外線光架橋によるゲル化（特許文献２）、有機溶媒存在下での酸処理又はアルカリ処理によるゲル化（特許文献３）等が行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−１４０２０１号公報
【特許文献２】特表平１１−５１２７７８号公報
【特許文献３】特表２０１０−５０９４２５号公報
【特許文献４】特開２０１６−１１３１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１〜３に開示される方法では、ゲル化及び精錬に時間を要すること、及び相当な設備を要すること等から、生産上及び産業利用上の課題が多い。また、特許文献１〜３に開示される方法で得られるゲルは、弾力性は有するものの、寒天又はアルギン酸のような造形性を有するものではない。【０００７】
特許文献４には、保持ビヒクルポリマーと、対象においてインサイチュで保持ビヒクルポリマーを架橋させるための制御放出性架橋剤と、を含む組成物が開示され、１〜２重量％のヒアルロン酸及び１〜２ｍＭの金属塩（Ｆｅ２＋及びＣｕ２＋）を含む水性組成物中でヒアルロン酸が架橋されゲルを形成したことが開示されている。しかしながら、本発明者らが追試を行ったところ、組成物全体の弾力性がやや向上する程度であり、造形性を有するゲルは得られなかった。【０００８】
本発明は、上述した従来技術の課題に鑑み、短時間でかつ簡便な操作でゲル化可能な組成物を提供することを目的とする。本発明はまた、当該組成物の製造方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸、又はその塩に遷移金属イオン（例えば、Ｆｅ３＋及びＣｕ２＋）を添加することで、即時にゲル化することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
（１）アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸、及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の水溶性修飾ヒアルロン酸と、
周期律表の第３周期から第６周期かつ第２族から第１２族に属する元素からなる群より選択される少なくとも１種の元素のイオンと、
を含有する、
ゲル組成物。
（２）水に不溶である、（１）のゲル組成物。
（３）テクスチャーアナライザーを使用した測定による荷重最大値が３００Ｎ／ｍ２以上である、（１）又は（２）のゲル組成物。
（４）イオンが、周期律表の第４周期かつ第３族から第１２族に属する元素からなる群より選択される少なくとも１種の元素のイオンである、（１）〜（３）いずれかのゲル組成物。
（５）イオンが、Ｆｅ３＋又はＣｕ２＋である、（１）〜（４）いずれかのゲル組成物。
（６）アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸の修飾率が２５％以上である、（１）〜（５）いずれかのゲル組成物。
（７）アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸の平均分子量が１０ｋＤａ以上である、（１）〜（６）いずれかのゲル組成物。
（８）アニオン性修飾基が、カルボキシアルキル基である、（１）〜（７）いずれかのゲル組成物。
（９）ゲル化時に成形性を有するゲルである、（１）〜（８）いずれかのゲル組成物。
（１０）周期律表の第３周期から第６周期かつ第２族から第１２族に属する元素からなる群より選択される少なくとも１種の元素のイオンを含有する溶液と、
アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸、及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の水溶性修飾ヒアルロン酸と、
を混合する工程を含む、ゲル組成物の製造方法。
（１１）溶液が、Ｆｅ３＋及びＣｕ２＋からなる群より選択される少なくとも１種の金属イオンを含有する、（１０）の製造方法。
（１２）溶液が、Ｆｅ３＋を０．５ｍＭ以上含有する、（１０）又は（１１）の製造方法。
（１３）溶液が、Ｃｕ２＋を１０ｍＭ以上含有する、（１０）又は（１１）の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、短時間でかつ簡便な操作でゲル化可能なゲル組成物及び当該ゲル組成物の製造方法が提供される。本発明のゲル組成物は、有機溶媒の非存在下でゲル化することができるため、精錬のための時間及び設備を大幅に低減することができる。【００１２】
本発明の好適な実施形態においては、ヒアルロン酸が本来有する保水性及び弾力性等の特性に加え、ゲル化時に任意の形状に造形することができる成形性を有し、かつ水中でもその形状を維持できる新しいハイドロゲル材料が提供される。本発明のゲル組成物は、様々な産業分野において利用することができる。また、ヒアルロン酸は、抗原性が低く生体適合性の点でコラーゲン及びアルギン酸より優れているため、特に医療機器及び医薬品分野での有効活用が期待される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１４】
＜本発明の特徴＞
本発明は、アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸、及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の水溶性修飾ヒアルロン酸と、周期律表の第３周期から第６周期かつ第２族から第１２族に属する元素からなる群より選択される少なくとも１種の元素のイオンと、を含有する、ゲル組成物を提供することに特徴を有する。
【００１５】
本発明はまた、周期律表の第３周期から第６周期かつ第２族から第１２族に属する元素からなる群より選択される少なくとも１種の元素のイオンを含有する溶液と、アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸、及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の水溶性修飾ヒアルロン酸と、を混合する工程を含む、ゲル組成物の製造方法を提供することに特徴を有する。
【００１６】
＜アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸＞
本明細書において、「ヒアルロン酸」とは、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとの二糖からなる繰り返し構成単位を１以上有する多糖類をいう。ヒアルロン酸は、基本的にはβ−Ｄ−グルクロン酸の１位とβ−Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミンの３位とが結合した２糖単位を少なくとも１個含む２糖以上のものでかつβ−Ｄ−グルクロン酸とβ−Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミンとから基本的に構成され、２糖単位が複数個結合したものである。該糖は不飽和糖であってもよく、不飽和糖としては、非還元末端糖、通常、グルクロン酸の４，５位炭素間が不飽和のもの等が挙げられる。
【００１７】
アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸は、少なくとも一部にアニオン性修飾基（官能基）が導入されているヒアルロン酸である。具体的には、例えば、ヒアルロン酸を構成する水酸基（ヒアルロン酸を構成するＮ−アセチルグルコサミンのＣ−４位及びＣ−６位、並びにヒアルロン酸を構成するグルクロン酸のＣ−２位及びＣ−３位）の少なくとも一部の水酸基の水素原子が、アニオン性修飾基に置換されたものが挙げられる。
【００１８】
アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸としては、例えば、下記式で表されるものが挙げられる。
【化１】
2018079812.tif 000002
式中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立に、水素原子、又は−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ、−Ｃ（−ＣＨ２ＣＯＯＨ）２（−ＣＯＯＨ）、−ＣＨ（−ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、−ＣＨ（−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）２若しくは−ＳＯ３Ｈ等のアニオン性修飾基を示す。ただし、Ｒ１〜Ｒ４がいずれも水素原子を表す場合を除く。ｍは、１以上１２以下の自然数を示す。Ｒ５は、水素原子を示す。
【００１９】
＜アニオン性修飾基＞
アニオン性修飾基は、水に溶解したときに負電荷を帯びる官能基である。アニオン性修飾基としては、例えば、カルボキシメチル基（−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）及びカルボキシエチル基（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）等のカルボキシアルキル基（−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）、トリカルボキシプロピル基（−Ｃ（−ＣＨ２ＣＯＯＨ）２（−ＣＯＯＨ））、ジカルボキシプロピル基（−ＣＨ（−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）２）及びジカルボキシエチル基（−ＣＨ（−ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）等のカルボキシ基を有する官能基、硫酸基（−ＳＯ３Ｈ）並びにフェノール性水酸基が挙げられる。
【００２０】
本発明による効果をより顕著に奏することから、アニオン性修飾基は、カルボキシアルキル基（−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）及び硫酸基（−ＳＯ３Ｈ）であることが好ましく、カルボキシアルキル基であることがより好ましい。また、ｍは、１以上１２以下の自然数であってよく、１以上８以下の自然数であることが好ましい。
【００２１】
アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸に含まれるアニオン性修飾基は、１種のみであってもよく、２種以上であってもよい。
【００２２】
＜修飾率＞
本明細書において、「アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸の修飾率」（以下、単に「修飾率」ともいう。）とは、ヒアルロン酸を構成する、隣り合って結合する２糖（グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミン）を１単位（２糖単位）としたとき、当該２糖単位の単位数に対するアニオン性修飾基の数の割合（％）を意味する。
【００２３】
修飾率は、ゲル組成物の使用用途に応じて、適宜設定することができる。例えば、ゲル化時の成形性に優れ、ゲル強度の高いゲル組成物とする場合、修飾率が特定の範囲であると、ゲル化時の成形性がより優れたものとなり、またゲル強度が高くなることから、修飾率は２５％以上８５％以下であることが好ましく、３０％以上７０％以下であることがより好ましい。
【００２４】
＜平均分子量＞
アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸の平均分子量は、ゲル組成物の使用用途に応じて、適宜設定することができる。例えば、ゲル化時の成形性に優れ、ゲル強度の高いゲル組成物とする場合、平均分子量が大きくなる程、ゲル化時の成形性がより優れたものとなり、またゲル強度が高くなることから、平均分子量は１０ｋＤａ以上であることが好ましく、５０ｋＤａ以上であることがより好ましく、１００ｋＤａ以上であることが更に好ましく、３００ｋＤａ以上であることが更により好ましく、５００ｋＤａ以上であることが更によりまた好ましい。アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸の平均分子量は、後述の実施例に記載の方法によって測定することができる。
【００２５】
＜アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸の塩＞
アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸の塩は、本発明のゲル組成物を使用する用途に応じて適宜選択することができ、特に限定されるものではない。例えば、本発明のゲル組成物を食品、化粧品、医療機器及び医薬品分野において使用する場合、アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸の塩は、食品又は薬学上許容される塩であることが好ましく、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩及びアンモニウム塩等が挙げられる。
【００２６】
＜アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩の製造方法＞
アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩は、原料となるヒアルロン酸（未修飾）及び／又はその塩にアニオン性修飾基を導入することで製造することができる。
【００２７】
（アニオン性修飾基が、カルボキシ基を有する官能基である場合）
アニオン性修飾基が、カルボキシ基を有する官能基である場合、温度が３０℃以下の含水溶媒中で、溶解した原料ヒアルロン酸及び／又はその塩を、炭素鎖にハロゲンを有するアニオン性修飾基の前駆体（例えば、ハロ酢酸、ハロプロピオン酸、クロロコハク酸、クロログルタル酸、クロロプロパントリカルボン酸）と反応させることにより、アニオン性修飾基を導入することができる。ここで、含水溶媒は、水、又は水溶性有機溶媒と水との混合液であり、混合液中における水溶性有機溶媒の割合は６０ｖ／ｖ％以下である。アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩の修飾率は、前駆体の添加量及び反応時間を変更することにより、制御することができる。
【００２８】
（アニオン性修飾基が、硫酸基である場合）
アニオン性修飾基が、硫酸基である場合、例えば、公知の硫酸化法により、アニオン性修飾基を導入することができる。具体的には、硫酸化剤として硫酸・トリメチルアミン複合体を使用するのが好ましい。反応条件としては、例えば、非プロトン性極性溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド）中、温度５０〜６０℃、反応時間数１０時間から数日の条件で設定することができる。生成したアニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩は、必要に応じて、ゲル濾過、アセトンによる分別沈殿処理等により精製してもよい。アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩の修飾率は、硫酸化剤の添加量を変更することにより、制御することができる。
【００２９】
＜原料ヒアルロン酸及び／又はその塩＞
アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩の製造に用いられる原料であるヒアルロン酸及び／又はその塩は、動物等の天然物（例えば、鶏冠、さい帯、皮膚、関節液等の生体組織等）から抽出されたものであってもよく、微生物、動物細胞又は植物細胞を培養して得られたもの（例えば、ストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法）であってもよく、化学的又は酵素的に合成されたものであってもよい。原料であるヒアルロン酸の塩としては、例えば、アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸の塩として例示したものと同じものが挙げられる。
【００３０】
＜ゲル組成物中のアニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩の含有量＞
本発明のゲル組成物中のアニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩の含有量は、ゲル組成物の使用用途に応じて、適宜設定することができる。アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩の含有量が多い程、ゲル化時の成形性がより優れたものとなり、またゲル強度が高くなる。アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩の含有量は、通常０．０５ｗ／ｖ％以上５ｗ／ｖ％以下であり、０．１ｗ／ｖ％以上２ｗ／ｖ％以下であることがより好ましく、０．２５ｗ／ｖ％以上１ｗ／ｖ％以下であることが更に好ましい。
【００３１】
＜イオン＞
本発明のゲル組成物は、周期律表の第３周期から第６周期かつ第２族から第１２族に属する元素からなる群より選択される少なくとも１種の元素のイオンを含有する。本発明のゲル組成物は、当該イオンの対イオンを更に含有するものであってもよい。
【００３２】
＜イオンの種類＞
本発明のゲル組成物に含有されるイオンは、本発明による効果をより顕著に奏することから、周期律表の第４周期かつ第３族から第１２族に属する元素からなる群より選択される少なくとも１種の元素のイオンであることが好ましく、Ｆｅ３＋又はＣｕ２＋であることがより好ましい。
【００３３】
＜イオン源＞
本発明のゲル組成物に含有されるイオンのイオン源（元素の塩）としては、上述したイオンを生じるものであれば特に制限されない。イオン源の具体例としては、例えば、ＣｕＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＮｉＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＳＯ４、ＦｅＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＣｏＳＯ４、ＮｉＳＯ４、ＺｎＳＯ４、Ｃｕ３（ＰＯ４）２、Ｆｅ３（ＰＯ４）２、ＦｅＰＯ４、Ｃｕ（ＮＯ３）２、Ｆｅ（ＮＯ３）２、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｍｇ（ＮＯ３）２、Ｃｏ（ＮＯ３）２、Ｎｉ（ＮＯ３）２、Ｚｎ（ＮＯ３）２、Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、Ｍｇ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、Ｃｏ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、Ｎｉ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、Ｃａ（ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯ）２、Ｍｇ（ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯ）２、Ｃａ（ＣＨ２ＯＨ（ＣＨＯＨ）４（ＣＯＯ））２、及びＭｇ（ＣＨ２ＯＨ（ＣＨＯＨ）４（ＣＯＯ））２等の金属塩並びにこれらの水和物が挙げられる。本発明のゲル組成物は、これらのイオン源の１種又は２種以上を含むものであってもよい。
【００３４】
＜イオンの濃度＞
本発明のゲル組成物中のイオンの濃度は、ゲル組成物の使用用途に応じて、適宜設定することができる。例えば、イオンがＦｅ３＋の場合、イオン濃度は、１ｍＭ以上３００ｍＭ以下であってよく、ゲル化時の成形性がより優れたものとなり、かつゲル強度がより高くなるという観点から、５ｍＭ以上２００ｍＭ以下であることが好ましい。また例えば、イオンがＣｕ２＋の場合、イオン濃度は、１０ｍＭ以上５００ｍＭ以下であってよく、ゲル化時の成形性がより優れたものとなり、かつゲル強度がより高くなるという観点から、５０ｍＭ以上２５０ｍＭ以下であることが好ましい。
【００３５】
＜組成物の提供態様＞
本発明のゲル組成物は、アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の水溶性修飾ヒアルロン酸とイオン（又はイオン源）とが未混合の状態で提供されてもよく、アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の水溶性修飾ヒアルロン酸とイオン（又はイオン源）とが混合された状態（ゲル化した状態）で提供されてもよい。未混合の状態で提供される場合は、使用時に水溶性修飾ヒアルロン酸とイオン（又はイオン源）とを混合してイオン結合を形成させることによりゲル化させることができる。
【００３６】
＜組成物の形状＞
一実施形態に係るゲル組成物は、アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の水溶性修飾ヒアルロン酸とイオン（又はイオン源）とが混合された状態（ゲル化した状態）では、水に不溶である。また、一実施形態に係るゲル組成物は、アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の水溶性修飾ヒアルロン酸とイオン（又はイオン源）とが混合された状態（ゲル化した状態）では、保形性を有するゲルである。当該実施形態におけるゲル組成物は、アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の水溶性修飾ヒアルロン酸の溶液とイオンの溶液を接触させると即時に水に不溶なゲル、又は任意の形状に成形されたゲルを形成させることができる。
【００３７】
一実施形態に係るゲル組成物の形状としては、これに限られるものではないが、例えば、ファイバー（太さは任意である。構造は、例えば、中空構造、その他の特殊構造）、シート、フィルム、不織布、不定形ゲル、カプセル等の粒子状等が挙げられる。
【００３８】
＜成型方法＞
一実施形態に係るゲル組成物を上記の形状に成形する方法としては、例えば、所望の形状部分が空洞になった型を用意し、当該空洞部分にアニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の水溶性修飾ヒアルロン酸の溶液を注入し、そこにイオンの溶液を添加して混合することで所望の形状を有するゲル組成物を得ることができる。
【００３９】
他の実施形態に係るゲル組成物を上記の形状に成形する方法としては、例えば、シリンジ等、押出吐出が可能な容器にアニオン性修飾基を有するヒアルロン酸及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の水溶性修飾ヒアルロン酸の溶液を注入し、当該容器からイオンの溶液中に水溶性修飾ヒアルロン酸の溶液を吐出して接触させることで所望の形状を有するゲル組成物を得ることができる。
【００４０】
＜組成物の物性（荷重最大値）＞
本発明のゲル組成物は、テクスチャーアナライザーを使用した測定による荷重最大値が３００Ｎ／ｍ２以上であってもよい。当該荷重最大値は、以下の方法により測定されるものであり、ゲル強度（硬さ）の指標となる。ゲル組成物の荷重最大値は、後述の実施例に記載の方法によって測定することができる。
【００４１】
＜組成物の用途＞
本実施形態に係るゲル組成物は、ヒアルロン酸が本来有する保水性及び弾力性等の特性に加え、ゲル化時に任意の形状に造形することができる成形性を有し、かつ水中でもその形状を維持できることから、様々な用途に応用することができる。当該用途としては、例えば、人工硬膜、人工角膜、人工水晶体、人工硝子体、人工食道、人工気道、人工血管、人工赤血球、人工血小板、人工軟骨、人工皮膚及び末梢神経再生誘導管等の臓器代替・生体再生誘導機器、手術用縫合糸、生体吸収性ステント、人工繊維布、心臓修復用パッチ、心膜用シート、癒着防止材、創傷被覆材、褥瘡シート、パップ材、生体組織接着材、止血材、粘膜下層充填材、関節用注射材、美容医療用注射材、マイクロニードル、涙点プラグ、眼科手術用助材、臓器保護材、粘膜保護材、手指消毒剤及び医薬品徐放性担体等の医療機器、創傷治癒促進材、点眼材、生理活性物質・細胞・微生物等の内包カプセル剤及び鉄剤等の医薬品又はサプリメント、ゲル状調味料、服薬ゼリー及びグミ等の食品、ヘアケア剤、クレンジング剤、保湿剤及びパック剤等の化粧品、３Ｄプリンタ用基材、細胞足場材、細胞培地、カプセル材、体内埋込型バイオセンサー、体内埋込型イメージング剤、コーティング剤、おむつ等の衛生品、緑化用保水材、肥料、土壌改良剤並びに種子被覆材が挙げられる。
【００４２】
＜ゲル組成物の製造方法＞
本発明のゲル組成物は、例えば、周期律表の第３周期から第６周期かつ第２族から第１２族に属する元素からなる群より選択される少なくとも１種の元素のイオンを含有する溶液と、アニオン性修飾基を有するヒアルロン酸、及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種の水溶性修飾ヒアルロン酸と、を混合する工程を含む方法により製造することができる。各種成分、条件等の態様は上述したとおりである。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例等に基づいて、本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４４】
［試験方法］
＜アニオン性修飾基（カルボキシメチル基）を有するヒアルロン酸の調製方法１＞
３０ｍＬのサンプル瓶に水酸化ナトリウム１．０４ｇを秤り取った後、水８ｍＬを添加して溶解させた。次に、ヒアルロン酸２．０ｇを添加し溶解させた後、モノクロロ酢酸ナトリウム１．５２ｇを添加して溶解させて、室温で４８時間静置した。反応液のｐＨは１３であった。その後、２００ｍＬビーカーにエタノール８０ｍＬを入れ、反応液を撹拌しながら添加し、カルボキシメチル基を有するヒアルロン酸を沈殿させた。その後、４００メッシュのろ布で沈殿を２００ｍＬビーカーに回収した後、１０％塩化ナトリウム水溶液４０ｍＬを添加して沈殿を溶解させた。さらに、８％塩酸水溶液でｐＨを調製した後、溶解液に撹拌しながらエタノール８０ｍＬを入れ、再度カルボキシメチル基を有するヒアルロン酸を沈殿させた。８０％含水エタノール１００ｍＬで３回洗浄した後、減圧濾過し、５５℃で３時間減圧乾燥することにより、カルボキシメチル基を有するヒアルロン酸を得た。【００４５】
＜アニオン性修飾基（カルボキシメチル基）を有するヒアルロン酸の調製方法２＞
３０ｍＬのサンプル瓶に水酸化ナトリウム１．０４ｇを秤り取った後、水８ｍＬを添加して溶解させた。次に、ヒアルロン酸２．０ｇを添加し溶解させた後、モノブロモ酢酸ナトリウム１．５２ｇを添加して溶解させて、４℃で４８時間静置した。反応液のｐＨは１３であった。その後、２００ｍＬビーカーにエタノール８０ｍＬを入れ、反応液を撹拌しながら添加し、カルボキシメチル基を有するヒアルロン酸を沈殿させた。その後、４００メッシュのろ布で沈殿を２００ｍＬビーカーに回収した後、１０％塩化ナトリウム水溶液４０ｍＬを添加して沈殿を溶解させた。さらに、８％塩酸水溶液でｐＨを調製した後、溶解液に撹拌しながらエタノール８０ｍＬを入れ、再度カルボキシメチル基を有するヒアルロン酸を沈殿させた。８０％含水エタノール１００ｍＬで３回洗浄した後、減圧濾過し、５５℃で３時間減圧乾燥することにより、カルボキシメチル基を有するヒアルロン酸を得た。【００４６】
上記調製方法に準じて、原料となるヒアルロン酸の平均分子量、及びハロ酢酸（モノクロロ酢酸ナトリウム又はモノブロモ酢酸ナトリウム）の使用量を変えることにより、種々の平均分子量及び修飾率のカルボキシメチル基を有するヒアルロン酸を得た。【００４７】
＜カルボキシメチル基を有するヒアルロン酸の修飾率の測定＞
カルボキシメチル基を有するヒアルロン酸の修飾率は、以下の方法にて１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積算値より求めた。【００４８】
（試料調製）
試料７ｍｇと内部標準物質４，４−ジメチル−４−シラペンタンスルホン酸ナトリウム（ＤＳＳ）１ｍｇを重水０．７ｍＬに溶かし、ＮＭＲ試料管に移し入れ、キャップした。【００４９】
（測定条件）
装置：Ｖａｒｉａｎ  ＮＭＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ４００ＮＢ型（バリアンテクノロジーズジャパンリミテッド）
観測周波数：４００ＭＨｚ
温度：３０℃
基準：ＤＳＳ（０ｐｐｍ）
積算回数：６４回【００５０】
（解析方法）
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの２．０ｐｐｍ付近に現れるヒアルロン酸のＮ−アセチル基（ＣＨ３）のピークと、３．８ｐｐｍ以上４．２ｐｐｍ以下の範囲に現れるカルボキシメチル基のメチレン基（−ＣＨ２−）のピークを積分した。積分値から下記の式より、修飾率を求めた。
修飾率＝｛（３．８ｐｐｍ以上４．２ｐｐｍ以下の範囲に現れるピーク積分値／２）／（２．０ｐｐｍのピーク積分値／３）｝×１００（％）【００５１】
＜平均分子量の測定＞
カルボキシメチル基を有するヒアルロン酸及びヒアルロン酸の平均分子量は、以下の方法により測定した。【００５２】
（ヒアルロン酸の平均分子量）
約０．０５ｇのヒアルロン酸を精密に量り、０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液に溶かし、正確に１００ｍＬとした溶液及びこの溶液８ｍＬ、１２ｍＬ並びに１６ｍＬを正確に量り、それぞれに０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液を加えて正確に２０ｍＬとした溶液を試料溶液とした。この試料溶液および０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液につき、日本薬局方（第十六改正）一般試験法の粘度測定法（第１法毛細管粘度測定法）により３０．０±０．１℃で比粘度を測定し（式（Ａ））、各濃度における還元粘度を算出した（式（Ｂ））。還元粘度を縦軸に、本品の換算した乾燥物に対する濃度（ｇ／１００ｍＬ）を横軸にとってグラフを描き、各点を結ぶ直線と縦軸との交点から極限粘度を求めた。求めた極限粘度をＬａｕｒｅｎｔの式（式（Ｃ））に代入し、平均分子量を算出した（Ｔｏｒｖａｒｄ  Ｃ  Ｌａｕｒｅｎｔ，ＭａｒｉｏｎＲｙａｎ，ａｎｄ  Ａｄｏｌｐｈ  Ｐｉｅｔｒｕｓｚｋｉｅｗｉｃｚ，”Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｃｔａ．，４２，４７６−４８５（１９６０）、四方田千佳子、「ヒアルロン酸ナトリウム製剤のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量評価」、国立衛研報、第１２１号，０３０−０３３（２００３））。
（式Ａ）比粘度＝｛試料溶液の所要流下秒数｝／（０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液の所要流下秒数）｝−１
（式Ｂ）還元粘度（ｄＬ／ｇ）＝比粘度／（本品の換算した乾燥物に対する濃度ｇ／１００ｍＬ））
（式Ｃ）極限粘度（ｄＬ／ｇ）＝３．６×１０−４Ｍ０．７８
Ｍ：平均分子量【００５３】
（カルボキシメチル基を有するヒアルロン酸の平均分子量）
ゲル濾過カラムを用いて、上記方法により平均分子量を求めた複数の（精製）ヒアルロン酸（基準物質）を液体クロマトグラフィー分析し、それらの保持時間より検量線を作成した。同様に、測定対象であるカルボキシメチル基を有するヒアルロン酸を液体クロマトグラフィー分析し、それらの保持時間から検量線を用いてカルボキシメチル基を有するヒアルロン酸の平均分子量を求めた。【００５４】
＜金属イオン溶液＞
ＣｕＣｌ２、ＦｅＣｌ２及びＦｅＣｌ３をそれぞれ水に溶解し、金属イオン溶液を得た。【００５５】
＜テクスチャーアナライザーを使用した硬さ測定＞
直径１５ｍｍ、深さ１９ｍｍの容器にカルボキシメチル基を有するヒアルロン酸又は未修飾ヒアルロン酸水溶液２ｍＬを添加し、これに金属イオン溶液１ｍＬをマイクロピペットを用いて添加した後、５分間静置した。テクスチャーアナライザーを使用して下記条件で測定を行った。プランジャーを下降スピード１ｍｍ／秒で容器の底から３０ｍｍの高さから２８ｍｍ進入させて荷重をかけたときの荷重最大値（最大試験力）の値（単位：Ｎ／ｍ２）を測定試料の硬さとした。
（測定条件）
・測定装置：テクスチャーアナライザー（Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｘｅｒ  ＴＡ．  ＸＴ．）
・プランジャー：Ｐ／６  直径６ｍｍ  ＤＩＡ  ＣＹＬＩＮＤＥＲ  ＳＴＡＩＮＬＥＳＳ
・アダプター：ＡＤ／１０（１００ｍｍ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｄａｐｔｏｒ）
・レンジ幅：０〜１ｋｇ
・プランジャーの下降スピード：１ｍｍ／秒
・モード：Ｄｉｓｔａｎｃｅ
・接触荷重：３０ｇ
・試料への進入距離：２８ｍｍ
・試料へ進入後のプランジャーの上昇スピード：１０ｍｍ／秒
・測定温度：２５℃【００５６】
［試験例１：ゲル形成試験（ヒアルロン酸濃度、修飾率及び金属イオン濃度の影響）］
表１〜表３に示す濃度のＦｅＣｌ３水溶液を２４穴プレート（住友ベークライト（株）製）の各ウェルに１ｍＬずつ添加した。これにカルボキシメチル基を有するヒアルロン酸（修飾率３２％、５８％又は８３％）を表１〜表３に示す濃度（ＨＡ濃度）で含有する水溶液をマイクロピペットを使用して滴下（３滴）し、直ちにゲル化の様子を目視で評価した。カルボキシメチル基を有するヒアルロン酸の平均分子量は、いずれも１０００ｋＤａである。結果を表１〜表３に併せて示す。表１〜表３中、形を保ったゲルが確認された場合を「◎」、形が保たれにくい不定形ゲルが確認された場合を「○」、ゲル形成が確認されなかった場合を「×」としている。「◎」又は「○」と評価されるものは、成形性を有するといえる。【００５７】
【表１】
2018079812.tif 000003
【００５８】
【表２】
2018079812.tif 000004
【００５９】
【表３】
2018079812.tif 000005
【００６０】
アニオン性修飾基（カルボキシメチル基）を有するヒアルロン酸と金属イオン（Ｆｅ３＋）とが接触することにより、直ちにゲルの形成が確認された。「◎」と評価された測定試料では、形成されたゲルは、形をしっかりと保っており、また弾力性のあるものであった。「○」と評価された測定試料では、形成されたゲルは形が保たれにくく、不定形であった。「×」と評価された測定試料では、振動を与える等によって、ゲルの形が見えなくなった。アニオン性修飾基（カルボキシメチル基）を有するヒアルロン酸の修飾率が高い程、及び水溶液中の濃度が高い程、また金属イオン（Ｆｅ３＋）濃度が高い程、形を保ったゲルを形成し易い傾向にあった。【００６１】
［試験例２：ゲル形成試験（ヒアルロン酸濃度、修飾率及び金属イオン濃度の影響）］
表４〜表５に示す濃度のＣｕＣｌ２水溶液を２４穴プレート（住友ベークライト（株）製）の各ウェルに１ｍＬずつ添加した。これにカルボキシメチル基を有するヒアルロン酸（修飾率５８％又は８３％）を表４〜表５に示す濃度（ＨＡ濃度）で含有する水溶液をマイクロピペットを使用して滴下（３滴）し、直ちにゲル化の様子を目視で評価した。カルボキシメチル基を有するヒアルロン酸の平均分子量は、いずれも１０００ｋＤａである。結果を表４〜表５に併せて示す。表４〜表５中、形を保ったゲルが確認された場合を「◎」、形が保たれにくい不定形ゲルが確認された場合を「○」、ゲル形成が確認されなかった場合を「×」としている。「◎」又は「○」と評価されるものは、成形性を有するといえる。【００６２】
【表４】
2018079812.tif 000006
【００６３】
【表５】
2018079812.tif 000007
【００６４】
アニオン性修飾基（カルボキシメチル基）を有するヒアルロン酸と金属イオン（Ｃｕ２＋）とが接触することにより、直ちにゲルの形成が確認された。「◎」と評価された測定試料では、形成されたゲルは、形をしっかりと保っており、また弾力性のあるものであった。「○」と評価された測定試料では、形成されたゲルは形が保たれにくく、不定形であった。「×」と評価された測定試料では、振動を与える等によって、ゲルの形が見えなくなった。アニオン性修飾基（カルボキシメチル基）を有するヒアルロン酸の修飾率が高い程、及び水溶液中の濃度が高い程、また金属イオン（Ｃｕ２＋）濃度が高い程、形を保ったゲルを形成し易い傾向にあった。【００６５】
［試験例３：ゲル形成試験（平均分子量の影響）］
５ｍＭのＦｅＣｌ３水溶液を２４穴プレート（住友ベークライト（株）製）の各ウェルに１ｍＬずつ添加した。これに表６に示す平均分子量及び修飾率のカルボキシメチル基を有するヒアルロン酸を、表６に示す濃度（ＨＡ濃度）で含有する水溶液をマイクロピペットを使用して滴下（３滴）し、直ちにゲル化の様子を目視で評価した。結果を表６に併せて示す。表６中、形を保ったゲルが確認された場合を「◎」、形が保たれにくい不定形ゲルが確認された場合を「○」、ゲル形成が確認されなかった場合を「×」としている。「◎」又は「○」と評価されるものは、成形性を有するといえる。【００６６】
【表６】
2018079812.tif 000008
【００６７】
アニオン性修飾基（カルボキシメチル基）を有するヒアルロン酸と金属イオン（Ｆｅ３＋）とが接触することにより、直ちにゲルの形成が確認された。「◎」と評価された測定試料では、形成されたゲルは、形をしっかりと保っており、また弾力性のあるものであった。「○」と評価された測定試料では、形成されたゲルは形が保たれにくく、不定形であった。「×」と評価された測定試料では、振動を与える等によって、ゲルの形が見えなくなった。アニオン性修飾基（カルボキシメチル基）を有するヒアルロン酸の平均分子量が大きい程、また水溶液中の濃度が高い程、形を保ったゲルを形成し易い傾向にあった。【００６８】
［試験例４：ゲル強度試験（アニオン性修飾基の影響）］
カルボキシメチル基を有するヒアルロン酸（平均分子量１０００ｋＤａ、修飾率５８％）を１ｗ／ｖ％で含有する水溶液と、２ｍＭのＦｅＣｌ３水溶液とを用い、上述した方法に従って、テクスチャーアナライザーを使用した硬さ測定を実施し、荷重最大値の値（単位：Ｎ／ｍ２）を測定した。対照として、未修飾のヒアルロン酸（平均分子量１０００ｋＤａ）を１ｗ／ｖ％で含有する水溶液と、２ｍＭのＦｅＣｌ３水溶液とを用い、同様に荷重最大値の値（単位：Ｎ／ｍ２）を測定した。同じ測定試料に対して２回測定を行い、得られた荷重最大値の値（単位：Ｎ／ｍ２）の平均値を測定試料の硬さとした。【００６９】
結果を表７に示す。
【表７】
2018079812.tif 000009
【００７０】
未修飾のヒアルロン酸は、金属イオン（Ｆｅ３＋）と接触させても形を保ったゲルを形成しなかった。一方、アニオン性修飾基（カルボキシメチル基）を有するヒアルロン酸は、金属イオン（Ｆｅ３＋）と接触すると直ちに形を保ったゲルを形成した。また形成されたゲルは、充分なゲル強度を有していた。【００７１】
［試験例５：ゲル強度試験（修飾率及び金属イオン濃度の影響）］
カルボキシメチル基を有するヒアルロン酸（平均分子量１０００ｋＤａ、修飾率３２％、５８％又は８３％）を１ｗ／ｖ％で含有する水溶液と、表８に示す濃度のＦｅＣｌ３水溶液又はＣｕＣｌ２水溶液とを用い、上述した方法に従って、テクスチャーアナライザーを使用した硬さ測定を実施し、荷重最大値の値（単位：Ｎ／ｍ２）を測定した。同じ測定試料に対して２回測定を行い、得られた荷重最大値の値（単位：Ｎ／ｍ２）の平均値を測定試料の硬さとした。【００７２】
結果を表８に示す。
【表８】
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【００７３】
いずれの測定試料も金属イオン（Ｆｅ３＋又はＣｕ２＋）を添加すると直ちに形を保ったゲルを形成した。金属イオンがＦｅ３＋の場合は、Ｃｕ２＋の場合より、ゲル強度が高い傾向にあった。
【国際調査報告】
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