【手続補正書】
【提出日】令和1年5月23日(2019.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の抗菌剤非感受性微生物に抗菌剤抵抗性のメカニズムが存在するか不在であるかを決定する方法であって、
−  注目の微生物を含むサンプルを提供し；
−  前記サンプルの少なくとも一部を、前記微生物内で非感受性を与えるメカニズムを抑制する阻害剤と接触させ；
−  前記サンプルで前記阻害剤を含む部分を、１種類以上の微生物を殺すか、その増殖を抑制するか、あるいはその生存可能性を損なう化合物である抗菌剤と接触させ；
−  前記サンプルの部分を、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと接触させ；
−  前記サンプルの部分からの信号の存在または不在を検出することを含み、前記信号の存在が、前記阻害剤によって抑制される抗菌剤抵抗性のメカニズムが前記微生物に存在していないことを示し、前記信号の不在が、前記阻害剤によって抑制される抗菌剤抵抗性のメカニズムが前記微生物に存在していることを示す、方法。
【請求項２】
サンプル中の微生物に抗菌剤抵抗性メカニズムが存在するか不在であるかを決定する方法であって、
−  注目の微生物を含むサンプルを提供し；
−  前記サンプルの第１の部分を、１種類以上の微生物を殺すか、その増殖を抑制するか、あるいはその生存可能性を損なう化合物である抗菌剤と接触させ；
−  前記サンプルのその第１の部分を、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと接触させ；
−  前記サンプルで前記抗菌剤と前記生存細胞レポーターを含むその第１の部分からの信号の存在または不在を検出し（前記信号の不在は、前記微生物が前記抗菌剤に感受性であることを示し、前記信号の存在は、前記微生物が前記抗菌剤に非感受性であることを示す）；
−  前記サンプルの第２の部分を、前記微生物内で前記抗菌剤に対する非感受性を与えるメカニズムを抑制する阻害剤と接触させ；
−  前記サンプルで前記阻害剤を含むその第２の部分を前記抗菌剤と接触させ；
−  前記サンプルのその第２の部分を、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと接触させ；
−  前記サンプルのその第２の部分からの信号の存在または不在を検出することを含み、前記信号の存在が、前記阻害剤によって抑制される抗菌剤抵抗性のメカニズムが前記微生物に存在しないことを示し、前記信号の不在が、前記阻害剤によって抑制される抗菌剤抵抗性のメカニズムが前記微生物に存在することを示す、方法。
【請求項３】
サンプル中の微生物に抗菌剤抵抗性メカニズムが存在するか不在であるかを決定する方法であって、
−  注目の微生物を含むサンプルを提供し；
−  前記サンプルの第１の部分を、１種類以上の微生物を殺すか、その増殖を抑制するか、あるいはその生存可能性を損なう化合物である抗菌剤と、ある基質が存在しているときに検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターとに接触させ；
−  前記サンプルの第２の部分を、前記抗菌剤に対する非感受性表現型に関係するメカニズムによって非ケージ化されるケージ化基質と、検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターとに接触させ；
−  前記第１の部分と前記第２の部分からの信号の存在または不在を検出することを含み、前記第１の部分からの前記信号の不在が、前記微生物が前記抗菌剤に対して感受性であることを示し、前記第１の部分からの前記信号の存在が、前記微生物が前記抗菌剤に対して非感受性であることを示し、前記第２の部分からの前記信号の存在が、前記抗菌剤に対する前記非感受性表現型に関係する前記メカニズムの存在を示し、前記第２の部分からの前記信号の不在が、前記抗菌剤に対する前記非感受性表現型に関係する前記メカニズムの不在を示す、方法。
【請求項４】
−  前記サンプルの第３の部分を、前記抗菌剤に対する非感受性表現型に関係するメカニズムによって非ケージ化されるケージ化基質が存在しているときに検出可能な信号を発生させることのできる生存細胞レポーターと接触させ；
−  前記サンプルのその第３の部分からの信号の存在または不在を検出することをさらに含み、前記信号の存在が、前記抗菌剤に対する前記非感受性表現型に関係する前記メカニズムが前記微生物に存在することを示し、前記信号の不在が、前記抗菌剤に対する前記非感受性表現型に関係する前記メカニズムが前記微生物に不在であることを示す、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害剤が金属キレート剤またはβ−ラクタマーゼ阻害剤を含む、請求項１及び２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ケージ化基質が脂肪アルデヒドを含む、請求項３及び４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ケージ化基質が、抗菌剤をベースとした分子によってケージ化にされる脂肪アルデヒドを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記脂肪アルデヒドが、前記ケージ化分子と反応する酵素と接触したときに非ケージ化されることで前記レポーター分子と相互作用することが可能になり、前記信号が発生する、請求項６及び７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルを前記生存細胞レポーターに接触させる工程が、
−  前記サンプルに、レポーター分子をコードしているレポーター遺伝子を含むとともにバクテリオファージゲノムが欠けている非複製形質導入粒子を、前記非複製形質導入粒子が前記微生物に形質導入をすることが可能で、前記レポーター遺伝子を前記微生物の中で発現させることができる条件下で導入し；
−  前記レポーター分子を活性化する条件を用意することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記レポーター遺伝子が、ルミネセンス反応を媒介する酵素をコードしている遺伝子、比色反応を媒介する酵素をコードしている遺伝子、蛍光タンパク質をコードしている遺伝子、選択可能なマーカーをコードしている遺伝子、アフィニティペプチドをコードしている核酸分子からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ルミネセンス反応を媒介する酵素をコードしている前記遺伝子が、１種類以上のルシフェラーゼをコードしている遺伝子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗菌剤が、β−ラクタム、基質特異性拡張型β−ラクタム、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、任意の世代のセファロスポリン、グリコペプチド、リンコサミド、リポペプチド、マクロライド、モノバクタム、ニトロフラン、オキサゾリドノン、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、フルオロキノロン、ストレプトグラミン、スルホンアミド、テトラサイクリン、リファムピシン、マイコバクテリア抗生剤、クロラムフェニコール、ムピロシンからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物が原核生物または真核生物である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物が、ブドウ球菌属、腸内細菌、エンテロコッカス属、レンサ球菌属、アシネトバクター属、シュードモナス属、ステノトロフォモナス属、マイコバクテリウム属、カンジダ属のいずれかである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
抗菌剤抵抗性の前記メカニズムが、β−ラクタマーゼ活性またはカルバペネマーゼ活性を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗菌剤抵抗性がカルバペネムに対する抵抗性を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。