(57)【要約】  標的細胞の免疫を容易に行うことができる、皮下、皮内、経皮又は筋肉内投与用のノロウイルス用のコンポーネントワクチンを提供すること、及び、その有効成分となる分子ニードルの会合体とその製造方法提供することを課題とし、その検討の結果、下記式（１）の分子ニードルの三量体２分子が結合した、六量体を含む会合体を有効成分とする、ノロウイルス用のコンポーネントワクチンを提供することを見出した。  Ｗ−Ｌ1−Ｘn−Ｙ      （１）  ［式中、Ｗは免疫原であるノロウイルスのキャプシド蛋白質のＰドメインのアミノ酸配列を示し、Ｌ1はアミノ酸数が０−１００の第１のリンカー配列を示し、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは細胞導入領域のアミノ酸配列を示し、ｎは１−３の整数である。］【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）のアミノ酸配列：
Ｗ−Ｌ1−Ｘn−Ｙ      （１）
［式中、Ｗは免疫原であるウイルスの構造蛋白質の一部又は全部のアミノ酸配列を示し、Ｌ1はアミノ酸数が０−１００の第１のリンカー配列を示し、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは細胞導入領域のアミノ酸配列を示し、Ｘの繰り返し数であるｎは１−３の整数である。］
であって、
当該細胞導入領域Ｙのアミノ酸配列は、下記式（２）：
Ｙ1−Ｌ2−Ｙ2−Ｙ3      （２）
［式中、Ｙ1は配列番号２−５からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を示し、Ｙ2は配列番号６−９からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を示し、Ｌ2はアミノ酸数が０−３０の第２のリンカー配列を示し、Ｙ3は修飾用のアミノ酸配列を示し、Ｙ2又はＹ3は存在しない場合もある。］
で表される、複合ポリペプチド。
【請求項２】
リンカー配列であるＬ1は、配列番号１４を含む、請求項１に記載の複合ポリペプチド。
【請求項３】
上記式（１）の、Ｘn、Ｙ1、又は、Ｙ2で示されるアミノ酸配列のうち、１個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された改変アミノ酸配列に係わる、請求項１又は２に記載の複合ポリペプチド。
【請求項４】
上記式（１）の、Ｘn、Ｙ1、又は、Ｙ2で示されるアミノ酸配列のうち、１個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された改変アミノ酸配列における、各々のアミノ酸配列におけるアミノ酸改変は、Ｘnが８ｎ個以内、Ｙ1が３０個以内、及びＹ2が１５個以内である、請求項３に記載の複合ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１−４のいずれか１項記載の、同一又は異なる複合ポリペプチドを単量体蛋白質としてなる、三量体蛋白質。
【請求項６】
請求項１−４のいずれか１項記載の、同一又は異なる複合ポリペプチド３分子のＸn及びＹ1において、互いのＸn及びＹ1を組織化する平行βシート構造、及び、当該平行βシート構造自身のらせん構造が認められることを特徴とする、請求項５に記載の三量体蛋白質。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の三量体蛋白質２分子が会合してなる、六量体蛋白質。
【請求項８】
請求項７に記載の六量体蛋白質を有効成分とする、皮下、皮内、経皮又は筋肉内投与用のコンポーネントワクチンであって、免疫原であるウイルスの構造蛋白質の一部又は全部のアミノ酸配列であるＷは、ノロウイルスのキャプシド蛋白質のＰドメインの一部又は全部である、コンポーネントワクチン。
【請求項９】
請求項１−４のいずれか１項に記載の複合ポリペプチドを、水性液体を介して接触させることにより、当該複合ポリペプチド同士を会合させて、三量体及び六量体の形成を行い、当該三量体又は六量体を選択的に分離・採取する、複合ポリペプチド会合体の生産方法。
【請求項１０】
請求項１−４のいずれか１項に記載の複合ポリペプチドをコードする核酸を導入した形質転換体を、液体培地で培養して当該複合ポリペプチドを発現させ、自発的な会合によって産生される、当該複合ポリペプチドを単量体とする三量体及び六量体を含む会合体の混合物を得て、さらに当該混合物から当該三量体又は六量体を選択的に分離・採取する、請求項９に記載の複合ポリペプチド会合体の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性ポリペプチドとこれを用いる皮下、皮内、経皮又は筋肉内投与用コンポーネントワクチンについての発明であり、さらに具体的には、免疫原と分子針との複合ポリペプチドを単量体とする、細胞浸透機能を有する当該複合ポリペプチド単量体の会合体、及び、当該会合体を有効成分（感染防御抗原）とする、皮下、皮内、経皮又は筋肉内投与用ノロウイルスコンポーネントワクチンに関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
エドワード・ジェンナーの天然痘ワクチンの発明と、ルイ・パスツールによる理論的な裏付けがなされて以来、様々な感染症に対するワクチンが提供されている。【０００３】
ワクチンは、毒性を弱めたウイルス等の病原微生物を感染防御抗原として用いる「生ワクチン」、殺傷した病原微生物の全部又は一部を感染防御抗原として用いる「コンポーネントワクチン」、変性させた病原体の産生する毒素を感染防御抗原として用いる「トキソイド」、に大別されている。【０００４】
現状におけるワクチンの接種方法は、一部を除き、皮下注射又は筋肉注射である。【０００５】
一方、バクテリオファージの優れた細胞への遺伝子導入機能に着目して発明された「分子針」についての技術が提供されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−１６３０５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ワクチンに関しては、様々な疾病への応用が期待されている反面、問題点も指摘されている。【０００８】
ワクチンは、病原微生物等の感染標的組織の細胞における感染を、種々の感染防御抗原を用いることにより擬似的に再現しすることにより免疫反応のみを惹起させることを目的とするものである。皮下注射や筋肉内注射による血中へのワクチン投与は、標的組織の細胞への無作為な供給が生体機能によりなされることを期待して行われるものである。しかしながら、感染防御抗原の標的組織の細胞への導入を効率良く行うことが現状では困難である。そのため、本来免疫反応を引き起こすための必要量よりも多量の感染防御抗原を用いなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題の解決のために、本発明者の一人が発明を主導した、上記の「分子針」に着目した。【００１０】
すなわち、当該分子針に免疫原としてウイルスの構造蛋白を担持することで、当該分子針の優れた細胞導入機能により、皮下、皮内、経皮又は筋肉内投与による、当該免疫原が担持された分子針の標的組織の細胞内への高い効率の導入と、所望の免疫反応が惹起され、当該分子針を感染防御抗原として用いる可能性を想定して本発明を完成した。【００１１】
そして、その一例として、ノロウイルスのキャプシド蛋白質のＰドメインを免疫原として用いたところ、下記の通り本発明の会合体のうち、六量体が感染防御抗原として優れたウイルスの免疫原性を示すことが明らかになった。ただし、生体反応は多様であり、他の免疫原を用いた場合に、本発明の会合体がどのような免疫現象を示すのかは、現時点では明らかではない。【００１２】
本発明が提供する主題は、（１）分子針に免疫原を担持させた「複合ポリペプチド」（以下、本発明の複合ポリペプチドともいう）、（２）当該複合ポリペプチドを単量体としてなる「会合体」（以下、本発明の会合体と総称する）、（３）当該会合体を有効成分（感染防御抗原）とする「皮下、皮内、経皮又は筋肉内投与用ノロウイルスコンポーネントワクチン」（以下、本発明のノロウイルスワクチンともいう）、（４）当該会合体の生産方法（以下、本発明の生産方法ともいう）、に大別される。【００１３】
「コンポーネントワクチン」は、免疫感染抗原を必要とする成分ワクチンであり、これから、弱毒生菌ワクチン、トキソイドは除外され、本発明のノロウイルスワクチンの免疫感染抗原は、感染防御抗原としての本発明の会合体（六量体）である。【００１４】
（１）本発明の複合ポリペプチド
本発明の複合ポリペプチドは、下記式（１）のアミノ酸配列の複合ポリペプチドである。なお、下記式（１）、（２）における所定のアミノ酸配列同士を結ぶ「−」は、Ｗ、Ｌ1、Ｘn、Ｙ等の概念的に纏まったアミノ酸配列同士の区別を明確にするための、単純な分子結合（実質的にはペプチド結合）の表示である。【００１５】
Ｗ−Ｌ1−Ｘn−Ｙ      （１）
［式中、Ｗは免疫原であるウイルスの構造蛋白質の一部又は全部のアミノ酸配列を示し、Ｌ1はアミノ酸数が０−１００の第１のリンカー配列を示し、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは細胞導入領域のアミノ酸配列を示し、Ｘの繰り返し数ｎは１−３の整数である。］
であって、
当該細胞導入領域Ｙのアミノ酸配列は、下記式（２）：
Ｙ1−Ｌ2−Ｙ2−Ｙ3      （２）
［式中、Ｙ1は配列番号２−５からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を示し、Ｙ2は配列番号６−９からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を示し、Ｌ2はアミノ酸数が０−３０の第２のリンカー配列を示し、Ｙ3は修飾用のアミノ酸配列を示し、Ｙ2又はＹ3は存在しない場合もある。］
で表される、複合ポリペプチド。【００１６】
上記Ｘnにおけるアミノ酸配列Ｘの繰り返し数であるｎは、１であることが好適であるが、２又は３であってもよい。【００１７】
上記式（１）において、Ｘn、Ｙ1、又は、Ｙ2で示されるアミノ酸配列のうち、１個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された改変アミノ酸配列が上記式（１）に含まれる。「欠失」とは、上記式（１）において定義されている各配列番号のアミノ酸配列におけるいずれかのアミノ酸残基が欠失しており、当該欠失したアミノ酸残基のＮ末端側（前）とＣ末端側（後）のアミノ酸残基がペプチド結合で結ばれた状態であり（Ｎ末端アミノ酸残基とＣ末端アミノ酸残基の欠失の場合は、当該アミノ酸残基が単に欠失した状態である）、当該欠失残基の個数が「アミノ酸欠失の個数」として数えられる。「置換」とは、上記式（１）において定義されている各配列番号のアミノ酸配列におけるいずれかのアミノ酸残基が「他のアミノ酸残基」に入れ替わっており、当該入れ替わったアミノ酸残基が、Ｎ末端側（前）とＣ末端側（後）の各アミノ酸残基とペプチド結合で結ばれた状態であり（Ｎ末端アミノ酸残基の置換の場合はＣ末端側のアミノ酸残基とのペプチド結合のみであり、Ｃ末端アミノ酸残基の置換の場合はＮ末端側のアミノ酸残基とのペプチド結合のみである）、当該置換残基の個数が「アミノ酸置換の個数」として数えられる。「付加」とは、上記式（１）において定義されている各配列番号のアミノ酸配列における、いずれか１箇所以上のペプチド結合の位置に、各々１個以上の新たなアミノ酸残基が挿入された状態で新たなペプチド結合が形成された状態である。これらのアミノ酸残基の改変の内容と個数は、上記式（１）に係わるアミノ酸配列と、改変に係わるアミノ酸配列のアライメントを、人力又はアミノ酸配列の解析が可能なソフトウエアを用いてコンピュータ上で行うことにより、明らかにすることができる。【００１８】
また、上記式（１）で定義されたリンカー配列Ｌ1又はＬ2、あるいは、修飾用のアミノ酸配列Ｙ3は、上記定義されたアミノ酸残基数の範囲内において、必要に応じて任意の配列を選択することができる。【００１９】
そして、当該改変アミノ酸配列の改変複合ポリペプチドの六量体（下記）が、上記式（１）の複合ポリペプチドの六量体と、実質的に同等の免疫賦活活性を有することが好ましい。「実質的に同等」とは、「中和試験」等の免疫賦活活性の確認について確立している手法を用いた場合に、アミノ酸配列の非改変複合ポリペプチドとの免疫賦活活性の有意差が、５％以内の有意水準において認められない程度の同等性である。【００２０】
上記式（１）の、Ｘn、Ｙ1、又は、Ｙ2で示されるアミノ酸配列のうち、１個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された改変アミノ酸配列における、各々のアミノ酸配列におけるアミノ酸改変の数は、Ｘnが８ｎ個以内、好ましくは４ｎ個以内、さらに好ましくは２ｎ個以内；Ｙ1が３０個以内、好ましくは２０個以内、さらに好ましくは１０個以内；及びＹ2が１５個以内、好ましくは１０個以内、さらに好ましくは５個以内；であることが好適である。【００２１】
（２）本発明の会合体
本発明の会合体は、上記の本発明の複合ポリペプチドを単量体とする会合体であり、実質的には、三量体（以下、本発明の三量体ともいう）、又は、六量体（以下、本発明の六量体ともいう）である。本発明の会合体は、それ自身が細胞内に浸透する作用を発揮することができる。【００２２】
本発明の三量体は、同一又は異なる本発明の複合ポリペプチドを単量体蛋白質としてなる、三量体蛋白質であり、本発明の六量体は、当該三量体蛋白質２分子が会合してなる、六量体蛋白質である。【００２３】
（３）本発明のノロウイルスワクチン
本発明のノロウイルスワクチンは、上記の本発明の六量体、を有効成分（感染防御抗原）とするワクチンであり、ノロウイルスの感染に対する、皮下、皮内、経皮又は筋肉内投与用のコンポーネントワクチンである。免疫原であるウイルスの構造蛋白質の一部又は全部のアミノ酸配列であるＷは、ノロウイルスのキャプシド蛋白質のＰドメインの一部又は全部である。【００２４】
（４）本発明の生産方法
本発明の生産方法は、上述の本発明の複合ポリペプチドの３分子以上を、水性液体を介して接触させることにより、当該複合ポリペプチド同士を単量体として会合させて、三量体及び六量体の形成を行い、さらに当該三量体又は六量体を選択的に分離・採取する、複合ポリペプチド会合体の生産方法、である。【００２５】
本発明の複合ポリペプチド自体は、当該複合ポリペプチドをコードする核酸を、遺伝子工学的な手法により発現させる、又は、ペプチド合成技術により合成する、ことにより生産することができる。当該複合ポリペプチド同士を、水性液体中で接触させることにより、自発的に複合ポリペプチドの三量体、及び、六量体が構築され、三量体と六量体を含有する混合物が形成される。そして、さらに当該三量体又は六量体を選択的に分離・採取することにより、所望の本発明の複合ポリペプチド（三量体又は六量体）を生産することができる。【００２６】
「水性液体」に関しては、特に、本発明の複合ポリペプチドを遺伝子工学的な手法により生産する場合は、当該複合ポリペプチドを生物学的に発現させて、例えば、発現細胞の収集、破砕又は溶解等による当該複合ポリペプチドの露出、さらに公知の分離方法による当該複合ポリペプチドの分離の工程を行う過程において用いる水や各種緩衝液等の水性液体中において、自発的に会合が起こり、本発明の会合体である三量体と六量体を含む混合物を得ることができる。また、例えば、全化学合成や、パーツ毎の分割合成を行って化学修飾法により結合することにより製造した本発明の複合ポリペプチドを、水や各種緩衝液等の水性液体中に懸濁することで自発的に会合させて、本発明の会合体である三量体と六量体を含む混合物を得ることができる。【００２７】
上記の三量体と六量体を含む混合物から分離・採取する方法は、特に限定されず、公知の分子量による分別方法、例えば、ゲル電気泳動法、アフィニティークロマトグラフィー、分子排斥クロマトグラフィー等の分子篩、イオン交換クロマトグラフィー等が挙げられる。【００２８】
従って、本発明の生産方法の最も好適な態様の一つとして、「本発明の複合ポリペプチドをコードする核酸を導入した形質転換体を、液体培地で培養して当該複合ポリペプチドを発現させ、自発的な会合によって産生される、当該複合ポリペプチドを単量体とする三量体及び六量体を含む混合物を得て、当該混合物からさらに当該三量体又は六量体を選択的に分離・採取する、複合ポリペプチド会合体の生産方法。」が挙げられる。【００２９】
このようにして生産される本発明の会合体（三量体又は六量体）は、公知の方法により精製されて、ワクチンの有効成分として用いることができると考えられる。その一例として、上記の本発明のノロウイルスワクチンが提供された。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により、（１）皮下、皮内、経皮又は筋肉内投与により標的組織の細胞に免疫原であるウイルスの構造蛋白質を効率的に導入するコンポーネントワクチンの有効成分（感染防御抗原）の基本単位として用いられることが期待される、分子針に免疫原であるウイルスの構造蛋白質を担持させた複合ポリペプチド（単量体）、（２）当該有効成分（感染防御抗原）として用いられることが期待される、当該複合ポリペプチドが三量体又は六量体としてなる会合体とその生産方法が、提供される。そして、当該コンポーネントワクチンの一例として、（３）免疫原であるノロウイルスのキャプシド蛋白質のＰドメインを担持した、当該複合ポリペプチドの六量体を、感染防御抗原として、皮下、皮内、経皮又は筋肉内投与により標的組織の細胞に効率的に導入して、所望の免疫反応を惹起することが可能な、ノロウイルスコンポーネントワクチンが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の複合ポリペプチドを基にした、本発明の会合体である三量体と六量体の構築過程を示した図面である。
【図２】本発明の会合体としての「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」のサイズ排除カラムによる分析結果を示す図面である。
【図３】本発明の会合体（六量体）を分離するためのゲル濾過クロマトグラフィーのチャートを示す図面である。
【図４】本発明のノロウイルスワクチンの有用性を示す、皮下投与によるインビボの抗体価上昇試験の結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（１）本発明の複合ポリペプチド
本発明の複合ポリペプチドを表すアミノ酸配列式である式（１）：
Ｗ−Ｌ1−Ｘn−Ｙ      （１）
［式中、Ｗは免疫原であるウイルスの構造蛋白質の一部又は全部のアミノ酸配列を示し、Ｌ1はアミノ酸数が０−１００の第１のリンカー配列を示し、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは細胞導入領域のアミノ酸配列を示し、ｎは１−３の整数である。］
において、
免疫原であるＷは、上記のようにウイルスの構造蛋白質の一部又は全部のペプチド構成に基づくアミノ酸配列が挙げられる。ここで「基づく」とは、オリジナルのペプチド構成そのものだけではなく、アミノ酸配列が改変されて無毒化されたアミノ酸配列等も改変アミノ酸配列を含む概念である。
【００３３】
これらのウイルスの構造蛋白質の一部又は全部は、抗原提示部分を含めた表層部分の一部又は全部を選択することが好適である。本発明のノロウイルスワクチンにおける免疫原として用いられる、キャプシド蛋白質のＰドメインの一部又は全部がこれに該当する。
【００３４】
第１のリンカー配列を示すＬ1は、免疫原Ｗと分子針部分Ｙの距離を適度に保って立体障害を抑制するために必要であり、このアミノ酸残基の個数は、免疫原であるＷの分子量が大きくなれば多くなることが好適になる傾向があるが、上記の通りにアミノ酸残基数は０−１００個であり、好適には１０−４０個である。
【００３５】
Ｘは、配列番号１のアミノ酸からなる、アミノ酸配列ＸnにおけるＸのｎ回（整数回）の繰り返し単位の配列である。繰り返しの形式は、直列の繰り返しであり、例えば、Ｘ2であれば、「Ｘ−Ｘ」（「−」は模式化したペプチド結合）である。また、繰り返し配列Ｘnにおいては、上述したアミノ酸配列の改変が許容される。ここでｎは、上述のように１−３の整数であり、１が好適であるが、２又は３であってもよい。繰り返し配列Ｘnが２又は３である場合は、免疫原Ｗの大きさや特性に応じて、分子針Ｙの距離を安定して適切な距離に保つことが主要な目的となる。
【００３６】
細胞導入領域Ｙは、分子針の基礎構造に該当し、バクテリオファージの尾（Ｔａｉｌ）の針部分（細胞内導入部）に基づいたものであり、式（２）：
Ｙ1−Ｌ2−Ｙ2−Ｙ3      （２）
［式中、Ｙ1は配列番号２−５からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｙ2は配列番号６−９からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｌ2はアミノ酸数が０−３０の第２のリンカー配列を示し、Ｙ3は所定の修飾用のアミノ酸配列を示し、Ｙ2又はＹ3は存在しない場合もある。］
で表されるポリペプチドである。
【００３７】
式（２）のＹ1のうち、Ｎ末端側３２アミノ酸（３２Ｌｅｕ）までが、バクテリオファージＴ４の三重らせんβシート構造の部分のアミノ酸配列である。なお、少なくともＮ末端のアミノ酸であるバリン（１Ｖａｌ）は、ロイシン（１Ｌｅｕ）であってもよい。残りのＣ末端側は、バクテリオファージのニードル蛋白質のＣ末端部分のアミノ酸配列である。このＹ1のＣ末端側に使用可能なアミノ酸配列としては、例えば、バクテリオファージＴ４のｇｐ５のアミノ酸配列、バクテリオファージＰ２のｇｐＶのアミノ酸配列、バクテリオファージＭｕのｇｐ４５のアミノ酸配列、バクテリオファージφ９２のｇｐ１３８のアミノ酸配列等が挙げられる。より具体的には、バクテリオファージＴ４のｇｐ５のアミノ酸配列をＣ末端側に有するＹ1として配列番号２のアミノ酸配列が、バクテリオファージＰ２のｇｐＶのアミノ酸配列をＣ末端側に有するＹ1として配列番号３のアミノ酸配列が、バクテリオファージＭｕのｇｐ４５のアミノ酸配列をＣ末端側に有するＹ1として配列番号４のアミノ酸配列が、バクテリオファージφ９２のｇｐ１３８のアミノ酸配列をＣ末端側に有するＹ1として配列番号５のアミノ酸配列が挙げられる。このＹ1のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、アミノ酸と核酸塩基の公知の関係に従って選択することができる。
【００３８】
式（２）中、Ｙ2はバクテリオファージＴ４のｆｏｌｄｏｎと呼ばれる領域のアミノ酸配列、又は、バクテリオファージＰ２若しくはバクテリオファージＭｕ若しくはバクテリオファージφ９２のｔｉｐと呼ばれる領域のアミノ酸配列である。ｆｏｌｄｏｎ又はｔｉｐは、バクテリオファージのフィブリチンと呼ばれる分子針構造の先端部を構成する領域である。式（２）においてＹ2が存在することは必須とはいえないが、このｆｏｌｄｏｎ又はｔｉｐのアミノ酸配列を有することにより、細胞膜への分子針の取り込み効率を向上させることができるので、Ｙ2を伴っていることが好適である。 バクテリオファージＴ４のｆｏｌｄｏｎのアミノ酸配列を配列番号６に示す。このアミノ酸配列をコードする核酸配列は、アミノ酸と核酸塩基の公知の関係に従って選択することができる。
【００３９】
バクテリオファージＰ２のｔｉｐのアミノ酸配列を配列番号７に示す。このアミノ酸配列をコードする核酸配列は、アミノ酸と核酸塩基の公知の関係に従って選択することができる。バクテリオファージＭｕのｔｉｐのアミノ酸配列を配列番号８に示す。このアミノ酸配列をコードする核酸配列は、アミノ酸と核酸塩基の公知の関係に従って選択することができる。バクテリオファージφ９２のｔｉｐのアミノ酸配列を配列番号９に示す。このアミノ酸配列をコードする核酸配列は、アミノ酸と核酸塩基の公知の関係に従って選択することができる。
【００４０】
Ｌ2は、前記Ｙ1とＹ2の間に介在する第２のリンカーである。リンカーＬ2のアミノ酸数は０−３０個であり、好適には０−５個である。リンカーのアミノ酸数が０個とは、第２のリンカーＬ2は存在しないことを示すものである。
【００４１】
Ｙ3は、修飾用のアミノ酸配列であり、Ｙにおいて選択的に付加して用いることができる。当該修飾用のアミノ酸配列は、蛋白質精製や保護の目的等で付加するものであり、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ等のタグ蛋白質等が挙げられる。Ｙ3には、適宜リンカー配列を加えることが可能であり、このようなリンカー配列自体もＹ3のアミノ酸配列の構成要素となり得る。
【００４２】
本発明の複合ポリペプチドは、公知の方法、具体的には、遺伝子工学的手法、又は、化学合成法により生産することができる。また、本発明の複合ポリペプチド全てを一緒に生産することも可能であり、パーツ毎に生産して当該パーツ同士を化学修飾法により事後的に結合させることにより生産することも可能である。リンカー（Ｌ1又はＬ2等）を介したポリペプチド同士の結合は、互いのポリペプチドにおけるリシン残基又はシステイン残基同士を、スクシンイミド基又はマレイミド基を有するリンカーにより結合させる等が可能である。
【００４３】
遺伝子工学的手法では、生産対象の本発明の複合ポリペプチドの全部又は一部をコードする核酸を、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等の宿主細胞内で、あるいは大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等の無細胞発現系で発現させることができる。これらの核酸の発現用ベクターとしては、各発現系に応じたものを用いることができ、例えば大腸菌発現用のｐＥＴ、酵母発現用のｐＡＵＲ、昆虫細胞発現用のｐＩＥｘ−１、動物細胞発現用のｐＢＡｐｏ−ＣＭＶ、小麦胚芽抽出液発現用のｐＦ３Ａ等が挙げられる。
【００４４】
化学合成法は、公知のペプチドの化学合成法を用いることが可能である。すなわち、常法として確立している液相ペプチド合成法、又は、固相ペプチド合成法を用いて、本発明の複合ポリペプチドの全部又は一部を製造することが可能である。そして、一般的に好適な化学合成法として認識されている固相ペプチド合成法も、Ｂｏｃ固相法又はＦｍｏｃ固相法を用いることが可能であり、上述のように、必要に応じてライゲーション法を用いることも可能である。また、個々のアミノ酸は、公知の方法により製造可能であり、市販品を用いることも可能である。
【００４５】
（２）本発明の会合体
図１に、本発明の複合ポリペプチドを基にした、本発明の会合体である三量体と六量体の構築過程を示す。図１において、１０は、単量体としての本発明の複合ポリペプチドであり、２０は、本発明の三量体であり、３０は、本発明の六量体である。
【００４６】
本発明の複合ポリペプチド１０は、「式（２）のＸnとＹ1に該当する基本部分１３１」と「式（２）のＹ2に該当するｆｏｌｄｏｎ１３２」が結合した「式（１）のＹに該当する分子針領域１３」、及び、「式（１）のＷに該当する免疫原１１」が、「式（１）のＬ1に該当するリンカー１２」を介して結合して構成されている。リンカー１２以外のリンカーと、式（２）のＹ3に相当する修飾配列については、図示を省略した。本発明複合ポリペプチド１０自体には、標的組織の細胞の細胞膜を通過する機能は実質的に認められない。
【００４７】
三量体３０は、上記の複合ポリペプチド１０が、３個の単量体として自発的に会合してなる三量体である。三量体３０は、上記の分子針領域１３が３個纏まり互いのＣ末端同士で会合することによって、三量体平行βシート構造、及び、当該βシート構造自身によるらせん構造（三重らせんβシート構造）と呼ばれる針状構造が形成され、分子針１３×３が形成されている。分子針１３×３は、基本部分１３１×３と、ｆｏｌｄｏｎ集合体１３２×３で構成されている。このように三量体化と自己組織化により標的組織の細胞の細胞膜を通過する機能を有する「分子針」が形成され、それぞれの単量体に由来するリンカー３本（１２1、１２2、１２3）と、これらのリンカーにそれぞれ結合している免疫原３個（１１1、１１2、１１3）が、この分子針１３×３の外側に存在している。
【００４８】
六量体６０は、２単位の上記三量体３０が、互いの分子針の基本部分（（１３×３）1と（１３×３）2）のＮ末端において結合して構成される六量体であり、当該六量体６０もまた、標的組織の細胞の細胞膜通過機能を有している。それぞれの三量体に由来するリンカー６本（１２1、１２2、１２3、及び、１２5、１２6：１２4は図示せず）と、これらのリンカーにそれぞれ結合している免疫原６個（１１1、１１2、１１3、及び、１１5、１１6：１１4は図示せず）が、２本の分子針（１３×３）1と（１３×３）2の外側に存在している。
【００４９】
本発明の複合ポリペプチド１０から、三量体３０への三量体化、及び、当該三量体３０から六量体６０へのマクロ的な２量体化は、水性液体中において自発的に進行し、三量体又は六量体として安定して存在する。この三量体又は六量体の安定性は極めて強いものであり、例えば、温度１００℃の水性液体環境下、さらにｐＨ２−１１の水性液体環境下、さらに有機溶媒を５０−７０容量％含む水性液体環境下であっても安定であり、その上、安全性にも優れている。水性液体から単離して乾燥させた状態でも、当該三量体又は六量体には優れた安定性と細胞膜透過性が認められる。
【００５０】
上記のように、本発明の複合ポリペプチドから会合体への移行は、自発的に進行し、通常は大部分が最終形態である六量体化するが、一部は三量体として残る。
【００５１】
（３）本発明のノロウイルスワクチン
本発明のノロウイルスワクチンは、その有効成分である本発明の会合体（六量体）の優れた細胞透過性と免疫原性により、標的組織の細胞に、皮下投与、皮内投与、経皮投与又は筋肉内投与を介して免疫原であるノロウイルスのキャプシド蛋白質のＰドメインの一部又は全部を効率よく移行させ、免疫を行うことが可能であり、これにより、皮下投与、皮内投与、経皮投与又は筋肉内投与による、ノロウイルスのコンポーネントワクチンの有効性と安全性を向上させることが期待される。
【００５２】
本発明のノロウイルスワクチンは、上述した本発明の会合体のうち、「Ｗとして、ノロウイルスのキャプシド蛋白質のＰドメインを担持した六量体」を有効成分（感染防御抗原）として含有する、皮下投与、皮内投与、経皮投与又は筋肉内投与用の医薬品組成物（液剤）として提供される。本発明の会合体（六量体）による直接投与の場合も、当該会合体を緩衝液等において用時懸濁混合した液剤として、皮下投与、皮内投与、経皮投与又は筋肉内投与がなされるので、この形態も医薬品組成物に含まれる。
【００５３】
本発明のノロウイルスワクチンは、有効成分（感染防御抗原）である本発明の会合体（六量体）、及び必要に応じてアジュバンドと共に、さらに必要に応じて適切な医薬製剤担体を配合して製剤組成物の形態に調製される。当該製剤担体としては、使用形態に応じて選択することが可能であり、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、界面活性剤等の賦形剤ないし希釈剤を使用することができる。組成物の形態は、上記のように基本的には液剤であるが、用時液体希釈用の乾燥剤、粉末剤、顆粒剤等とすることも可能である。
【００５４】
本発明のノロウイルスワクチン中の本発明の会合体（六量体）の量は、適宜選択され一定ではないが、通常、本発明の会合体（六量体）を、投与時に１−１０質量％含有する液剤として用いるのが好適である。適切な投与（接種）量は、1回成人1人当たり０．０１μｇ−１０ｍｇ程度であり、必要に応じて初回接種と追加接種を適宜組み合わせて、１回又は２回以上の投与（接種）を行うことが可能である。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明の実施例を開示する。【００５６】
［実施例１］  本発明の会合体の調製
（１）本発明の複合ポリペプチドの調製
本実施例では、遺伝子工学的手法を用いて、担持する免疫原を異にする４種類の本発明の複合ポリペプチド（免疫原は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ））を調製した。【００５７】
（ａ）  ＭＮＶ−ＰＦ：  マウスノロウイルスの「ＶＰ−１領域」のＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ領域、Ｓｈｅｌｌ領域を除いた「Ｐ  ｄｏｍａｉｎ  Ｆｕｌｌ：ＰＦ領域」の一単位全体を免疫原として用いた本発明の複合ポリペプチド（以下、「ＭＮＶ  ＰＦ」とも記載する）であり、本実施例において用いた免疫原のアミノ酸配列は、配列番号１０の通りである。これをコードする核酸配列は、アミノ酸と核酸塩基の公知の関係に従って選択することができる。【００５８】
（ｂ）マウスノロウイルスの「ＶＰ−１領域」のＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ領域、Ｓｈｅｌｌ領域を除いた「ＰＦ領域」（Ｐ  ｄｏｍａｉｎ  Ｆｕｌｌ：ＰＦ）の一単位を構成する外殻内側の「Ｐ１領域」と外殻外側の「Ｐ２領域」のうち、「Ｐ２領域」のみを免疫原として用いた本発明の複合ポリペプチド（以下、「ＭＮＶ−Ｐ２」とも記載する）であり、本実施例において用いた当該感染防御抗原のアミノ酸配列は、配列番号１１の通りである。これをコードする核酸配列は、アミノ酸と核酸塩基の公知の関係に従って選択することができる。【００５９】
（ｃ）ヒトノロウイルスの外殻抗原の一つである「Ｐ領域」（Ｐ  ｄｏｍａｉｎ  Ｆｕｌｌ：ＰＦ）の一単位全体を免疫原として用いた本発明の複合ポリペプチド（以下、「Ｓａｇａ  ＰＦ」とも記載する）であり、本実施例において用いた当該免疫原のアミノ酸配列は、配列番号１２の通りである。これをコードする核酸配列は、アミノ酸と核酸塩基の公知の関係に従って選択することができる。【００６０】
（ｄ）ヒトノロウイルスの外殻抗原の一つである「Ｐ領域」（Ｐ  ｄｏｍａｉｎ  Ｆｕｌｌ：ＰＦ）の一単位を構成する外殻内側の「Ｐ１領域」と外殻外側の「Ｐ２領域」のうち、「Ｐ２領域」のみを免疫原として用いた本発明の複合ポリペプチド（以下、「Ｓａｇａ  Ｐ２」とも記載する）であり、本実施例において用いた当該免疫原のアミノ酸配列は、配列番号１３の通りである。これをコードする核酸配列は、アミノ酸と核酸塩基の公知の関係に従って選択することができる。【００６１】
＜「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」発現用プラスミドの作製＞
ここで「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」とは、上述した式（１）：
Ｗ−Ｌ1−Ｘn−Ｙ      （１）
と、式（１）の細胞導入領域Ｙを表す式（２）：
Ｙ1−Ｌ2−Ｙ2−Ｙ3      （２）
において、
免疫原Ｗが、配列番号１３のアミノ酸配列で表される「Ｓａｇａ  ＰＦ」であり；第１のリンカーＬ1が、配列番号１５のアミノ酸配列であり；繰り返し配列Ｘnの繰り返し単位が、配列番号１のアミノ酸配列であり、繰り返し数ｎは１であり；分子針の本体部分Ｙ1のアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列であり；第２のリンカーＬ2が「ＳＶＥ」であり；フォールドンＹ2のアミノ酸配列が、配列番号６のアミノ酸配列であり；修飾配列Ｙ3のアミノ酸配列が、配列番号１６（ＶＥＨＨＨＨＨＨ）である、複合ポリペプチドである。【００６２】
なお下記のように、上記式（１）、（２）において、免疫原Ｗを、試験的にＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質：配列番号１７）に代えてなる複合ポリペプチド発現させるための発現プラスミド「プラスミドｐＫＮ１−１」を作製し、このプラスミドｐＫＮ１−１を基にして、所望の本発明の複合ポリペプチド発現プラスミドを作製した。【００６３】
すなわち「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」発現用プラスミドは、以下のように作製した。【００６４】
まず、Ｔ４ファージのｗａｃ蛋白質の４６１から４８４残基目に対応する遺伝子をＴ４ファージゲノムよりＰＣＲで増幅してｐＵＣ１８にクローニングし、ｆｏｌｄｏｎをコードする遺伝子を得た。続いて、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断し、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理したプラスミドｐＥＴ２９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入し、プラスミドｐＭＴｆ１−３を得た。また、Ｔ４ファージのｇｐ５の４７４から５７５残基目に対応する遺伝子をＴ４ファージゲノムよりＰＣＲにより増幅してｐＵＣ１８にクローニングし、ｇｐ５をコードする遺伝子を得た。続いて、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断し、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理した上述のプラスミドｐＭＴｆ１−３に挿入し、プラスミドｐＫＡ１７６を得た。また、群馬大・高橋より提供されたＧＦＰ発現ベクターを制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、ＧＦＰをコードする遺伝子を得、制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで処理した上述のプラスミドｐＫＡ１７６に組み込み、プラスミドｐＫＮ１−１（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ発現用プラスミド）を得た。【００６５】
このＧＦＰ−ｇｐ５ｆ発現用プラスミドであるｐＫＮ１−１をベースにして、「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ発現プラスミド」である「プラスミドｐＫＮ１−ＳａｇａＰＦ（又は、単に「ｐＫＮ１−ＳａｇａＰＦ」）の作製を、プラスミドｐＫＮ１−１のＧＦＰ遺伝子挿入部分をカセットに見立て、ＧＦＰの遺伝子部分とＳａｇａＰＦの遺伝子との入れ替えを行うことにより実行した。【００６６】
具体的には、まず、プラスミドｐＫＮ１−１のＧＦＰ遺伝子を除いた直鎖状プラスミド断片（受け側プラスミド）を作成するため、ＧＦＰ遺伝子直上流にインバーテッドＰＣＲ用のアンチセンスプライマー（配列番号１８）を合成し、さらに、ＧＦＰ蛋白質（配列番号１７）のＣ末端に付加されて存在するリンカー配列Ｌ1（配列番号１５）の「ＭＤＥＬＹＫＥ」（配列番号１４）部分の遺伝子配列に相補的なセンスプライマー（配列番号１９）を合成した。次に、上記アンチセンスプライマーとセンスプライマーを用いて、プラスミドｐＫＮ１−１を鋳型として、インバーテッドＰＣＲを行うことで、ＧＦＰを含まない直鎖状プラスミド断片を、ＰＣＲ増幅産物として得た（第１のＰＣＲ増幅産物）。【００６７】
次に、Ｓａｇａ  ＰＦ部分を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングキットにて、Ｓａｇａ  ＰＦをカセットのように上記の要領で増幅した直鎖状プラスミド断片に組み込むため、以下のＰＣＲを行った。【００６８】
すなわち、直鎖状ベクター５’側１５塩基のセンス鎖核酸配列＋ＳａｇａＰＦ遺伝子のセンス鎖５’側２０塩基の核酸配列となる様、３５塩基のセンスプライマーを合成し（配列番号２０）、さらに、「ＳａｇａＰＦ遺伝子３’末端（上記のリンカー配列（配列番号１４）を除いた配列番号１０のアミノ酸配列Ｃ末７アミノ酸部分に相当）＋当該リンカー配列ＭＤＥＬＹＫＥのＭＤＥＬＹに相当する核酸配列」となる様、３５塩基のアンチセンスプライマー（配列番号２１）を合成した。次に、上記アンチセンスプライマーとセンスプライマーを用いて、ＳａｐａＰＦ部分をｐＨｕＮｏＶ−Ｓａｇａ１Ｆ（ヒトノロウイルスＧＩＩ．４  Ｓａｇａ−１株全長クローン）を鋳型として増幅して、ＰＣＲ増幅産物（第２のＰＣＲ増幅産物）を得た。このＰＣＲ産物のセンスプライマー側（配列番号２２）が直鎖状ベクターＰＣＲ産物のアンチセンスプライマー側配列とオーバーラップしている。アンチセンスプライマー側配列（配列番号２３）が直鎖状ベクターＰＣＲ産物のセンスプライマー側配列とオーターラップしている。以下、インサートカセット側には直鎖状ベクター配列と両末端がオーバーラップするようにプライマーがデザインされ、このオーバーラップ配列を用いて方向性を維持した状態でベクターにＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングキット融合され、その結果として接合される。【００６９】
最後に、上記の第１のＰＣＲ増幅産物と第２のＰＣＲ増幅産物を、ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングキットにより互いのオーバーラップ配列を融合することで接合し、ｐＫＮ１−ＳａｇａＰＦを得た。【００７０】
上記のように作製した「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」の発現用プラスミドである「ｐＫＮ１−ＳａｇａＰＦ」を大腸菌に導入して大量に「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」を発現させて精製し、以下の実験に用いた。【００７１】
＜「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」の超遠心分析＞
上述のようにして調製した「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」の超遠心分析を行った。より具体的には、１．２μＭの「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析し、Ｏｐｔｉｍａｌ ＸＬ−Ｉ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ （Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて５００，０００ｒｐｍ、２０℃で超遠心分析を行った。【００７２】
図２に、「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」の分析結果（サイズ排除カラム）を示す。その結果、複合ポリペプチド「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」は、そのほとんどが自然に自己会合して、「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」の三量体が２個会合した六量体の形態及び当該三量体の形態で存在していることが確認された。【００７３】
［実施例２］  「ＰＮ−Ｓａｇａ  Ｐ２」を用いた細胞導入試験
「ＰＮ−Ｓａｇａ  Ｐ２」発現用プラスミド（ｐＫＮ１−ＳａｇａＰ２）の作製は、免疫原Ｗが、配列番号１３のアミノ酸配列で表される「Ｓａｇａ  Ｐ２」である他は、上記の「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」の発現用プラスミドと同様に行い、「ＰＮ−Ｓａｇａ  Ｐ２」の発現及び精製工程、並びに、超遠心分析も「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」と同様に行った。ＧＦＰ遺伝子との入れ替えのためのＰＣＲ用のセンスプライマーとして配列番号２４、アンチセンスプライマーとして配列番号２５を用いた。得られたＰＣＲ産物は、上記と同様に発現用ベクターのＰＣＲ産物にＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングキットで組み込んだ。【００７４】
その結果、複合ポリペプチド「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」も、そのほとんどが自然に自己会合して、「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」の三量体が２個会合した六量体の形態及び当該三量体の形態で存在していることが確認された。【００７５】
そこで、次に、ＰＮ−Ｓａｇａ  Ｐ２をＨｅＬａ細胞培養上清に添加し、ＰＮ−Ｓａｇａ  Ｐ２がＳａｇａＰ２領域を含めて細胞内に導入可能であるか調べた。Ｐ２の検出には、抗Ｓａｇａ−１  ＶＬＰ抗体を用いた免疫蛍光抗体法を用いて実施した。【００７６】
その結果、ＨａＬａ細胞内に導入されたＳａｇａ  Ｐ２蛋白質が緑色の蛍光シグナルとして多数確認され、ＰＮ−Ｓａｇａ  Ｐ２が予測通りに機能していることが確認された（図示せず、ただし、必要に応じて写真の提出をする用意あり）。【００７７】
［実施例３］  「ＰＮ−ＭＮＶ」についての検討
「ＰＮ−ＭＮＶ  ＰＦ」の発現プラスミド（ｐＫＮ１−ＭＮＶＰＦ）と「ＰＮ−ＭＮＶ  Ｐ２」発現用プラスミド（ｐＫＮ１−ＭＮＶＰ２）の作製は、免疫原Ｗが、配列番号１０のアミノ酸配列で表される「ＭＮＶ  ＰＦ」、又は、配列番号１１のアミノ酸配列で表される「ＭＮＶ  Ｐ２」である他は、上記の「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」の発現用プラスミドと同様に行い、「ＰＮ−ＭＮＶ  ＰＦ」又は「ＰＮ−ＭＮＶ  Ｐ２」の発現及び精製工程、並びに、超遠心分析も「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」と同様に行った。ＰドメインのＦｕｌｌ遺伝子とＧＦＰ遺伝子との入れ替えのためのＰＣＲ用のセンスプライマーとして配列番号２６、アンチセンスプライマーとして配列番号２７を用いた。また、ＰドメインのＰ２遺伝子とＧＦＰ遺伝子との入れ替えのためのＰＣＲ用のセンスプライマーとして配列番号２８、アンチセンスプライマーとして配列番号２９を用いた。【００７８】
その結果、「ＰＮ−ＭＮＶ  ＰＦ」も、「ＰＮ−ＭＮＶ  Ｐ２」も、上記の「ＰＮ−Ｓａｇａ  ＰＦ」と同様に、それぞれ、そのほとんどが自然に自己会合して、三量体が２個会合した六量体の形態及び当該三量体の形態で存在していることが確認された。【００７９】
そこで、次に、標的細胞をＨｅＬＡ細胞として、本発明の会合体として、上記の「ＰＮ−ＭＮＶ  Ｐ２」の会合体（ここでは、「ＰＭＮＶＰ２会合体」という）の導入を行い、その結果を共焦点顕微鏡により確認した。【００８０】
まず、蛍光色素であるＡＴＴＯ５２０をＰＭＮＶＰ２会合体への担持を行った。７．５μＭのＰＭＮＶＰ２会合体の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）懸濁液と、３００μＭ  ＡＴＴＯのＤＭＳＯ溶液を、容量比２：１で、反応総量が４５０μＬとなるように常温下で混合して、常温下で担持反応を行った。担持反応終了後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎを用いて、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。【００８１】
ＨｅＬａ細胞は、５．０×１０4  ｃｅｌｌｓ／１００μＬ（ＤＭＥＭ）で、３７℃・５％ＣＯ2下で前培養を行い、次いで、ＤＭＥＭ（ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ（−））と０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）の容量比２：１の培養液を全量９０μＬとして、上記の前培養培地と交換して、さらに上記のＡＴＴＯ５２０を担持させたＰＭＮＶＰ２会合体総量が５μＭとなるように本培養系への添加を行って、上記の培養条件と同様の条件で３０分間培養を行い、ＰＭＮＶＰ２会合体のＨｅＬａ細胞への導入を試みた。【００８２】
ＰＮＭＶＰ２会合体のＨｅＬａ細胞への取り込みは、共焦点顕微鏡（共焦点レーザー顕微鏡Ａ１（Ｎｉｋｏｎ））を用いて、下記の条件で観察を行った。
（１）レーザー光の波長：
励起：４０５ｎｍ  ｌａｓｅｒ／観察（ａ４５０ｎｍ／５０ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ）かつ、
励起：４８８ｎｍ  ｌａｓｅｒ／観察（ａ５２５ｎｍ／５０ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ）
（２）レーザーパワー
レーザーパワー：４０５ｎｍ：１．４、４８８ｎｍ：０．４、で観察した。【００８３】
その結果、蛍光色素が担持されたＰＮＭＶＰ２会合体が、暗い細胞核の周りの多数の細かく明るい部分として認められ、３０分間という短時間のインキュベート時間にも拘わらず、ＨｅＬａ細胞内に導入されていることが認められた（図示せず、ただし、必要に応じて写真の提出をする用意あり）。【００８４】
［実施例４］  マウスへの免疫試験
（１）材料
「ＰＮ−ＭＮＶ  ＰＦ」の会合体（ＰＮＶＰＦ会合体）
実施例３において用いた、「ＰＮ−ＭＮＶ  ＰＦ」の発現プラスミド（ｐＫＮ１−ＭＮＶＰＦ）で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、２００ｍｌ  ＬＢ培地（カナマイシン濃度３０μｇ／ｍｌ）において６時間３７℃で培養した。その後これらの培養液３０ｍｌを３Ｌ  ＬＢ培地（カナマイシン３０μｇ／ｍｌ）に添加し３７℃で培養した。濁度ＯＤ６００が０．８以上になったことを確認し、ＩＰＴＧ溶液を終濃度１ｍＭになるように添加した。その後２０℃において一晩インキュベートした。遠心機を用いて４℃，８０００ｒｐｍで集菌を行い、液体窒素で瞬間冷凍し−８０℃で保存した。【００８５】
氷上において、ＢｕｆｆｅｒＡ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ８），  ０．５Ｍ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＤＴＴ，５ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）にｃｏｍｐｌｅｔｅＥＤＴＡ  ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ）を１錠溶かした溶液に、上記菌体２２．４ｇを懸濁し、超音波破砕によって菌体を溶解させた。これを１７５００ｒｐｍ，４℃で５０分遠心し、上清を０．８μｍフィルターを通した。その上清をＮｉカラム［ＨｉｓＴｒａｐＴＭＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）］を利用し、４℃においてＮｉアフィニティ精製をした。溶出の際はＢｕｆｆｅｒＡとＢｕｆｆｅｒＢ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ８），０．５Ｍ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＤＴＴ，５００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を用いて５−５００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅのリニアグラジエントで行った。サンプルは２８０ｎｍ波長で追跡し、画分を回収した。【００８６】
上記のＮｉアフィニティ精製で回収したサンプルを１０ｍｌほどに濃縮し０．２μｍフィルターを通したのち、ＨｉＬｏａｄ２６／６０  ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてゲルろ過精製を行った。溶出はＢｕｆｆｅｒ  Ｃ  （２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＴＣＥＰ）で行った。そのチャートを図３に示す。【００８７】
図３の各フラクションの番号（横軸に沿ったカラムで区切られた各番号）ごとにＮａｔｉｖｅＳＤＳＰＡＧＥで分子量を確認し（図示せず）、六量体とほぼ同じ分子量３０万Ｄａ程度に位置するバンドが認められる画分として、最も明確なバンドが認められた３６番の画分を選択して、ＰＮＶＰＦ会合体（六量体）として用いた。三量体は、その半分程度の分子量が認められた３８−４０番の画分をさらに常法、例えば、イオンクロマトグラフィー等による精製を行うことにより容易に分離することができる。【００８８】
マウスノロウイルスのキャプシド蛋白質のＰドメイン（ＭＮＶＰＦ）は、その公知の遺伝子配列に基づいて、大腸菌を宿主として用いる組換え蛋白質として、常法に従い調製した。すなわち、マウスノロウイルスのＰＦ領域のＮ末端側に発現ベクターｐＥＴ６ｘＨＮのクローニングサイト上流に１５塩基のオーバーラップをもつセンスプライマーを、Ｃ末端領域にｐＥＴ６ｘＨＮのクローニングサイト下流に１５塩基のオーバーラップをもつアンチセンスプライマーをＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングキットのプロトコールに従って、合成した。これらのプライマーでＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物は、ｐＥＴ６ｘＨＮにＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングキットによってクローニングされ、ｐＥＴ６ｘＨＮ−ＭＮＶＰＦを得た。大腸菌ＢＬ２１にｐＥＴ６ｘＨＮ−ＭＮＶＰＦを導入し、ＭＮＶＰＦの発現を定法に従って行った。大腸菌を破砕した後、グアニジンによるそう蛋白質の可溶化を実施し、全ての蛋白質を直鎖状にした。可溶化したそう蛋白質に含まれるＭＮＶＰＦに付加された６個のＨＮタグを利用して、タロン樹脂カラムに、タロン樹脂のマニュアルに従って結合させた。その後ＭＮＶＰＦをＰＢＳ（−）に透析し、溶媒を完全にＰＢＳ（−）に交換した。これを精製ＭＮＶＰＦ溶液として、濃度調整し、下記の様にマウスに免疫を行った。【００８９】
その他、ＰＢＳ、２６Ｇ注射針付１ｍｌシリンジ（テルモ社製）、マウス（日本ＳＬＣ社  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ，６週齢、雌）を準備した。【００９０】
（２）方法
下記の２通りの感染防御抗原を用いた試験系を構築した。
（ａ）ＭＮＶＰＦ投与の系（３．１２μｇ／２００μｌ  ＰＢＳ）
（ｂ）六量体投与の系（１３．２μｇ／２００μｌ  ＰＢＳ）【００９１】
これらの希釈液を、それぞれマウスの背中５か所に２６Ｇ注射針付シリンジを用いて４０μｌずつ計２００μｌ皮下注射した。その３週間後にマウスの尻尾から採血を行った（１次免疫血清）。さらに再度、同量の上記希釈液をマウスの背中に皮下注射した。その２週間後にマウスの尻尾から採血を行った（２次免疫血清）。【００９２】
＜採取した血液からの血清サンプルの調製＞
上記の採血した血液を、各々卓上遠心機で１５０００ｒｐｍ  ｘ１分間遠心を行い、上清を新しいエッペンチューブに移し、再度、卓上遠心機で１５０００ｒｐｍ  ｘ１分間の遠心を行い、上清をさらに新しいエッペンチューブに移し、これをＥＬＩＳＡ用サンプルとして用いた。ＥＬＩＳＡは以下のように施行した。【００９３】
＜ＥＬＩＳＡの内容＞
（ａ）材料
・マウスノロウイルスのウイルス様中空粒子（ＶＬＰ）
・マウス血清
・抗ノロウイルスモノクローナル抗体（Ｇ３Ｂ９λｍＩｇＧ２ａ，陽性対照）
・ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅ  （Ｆ９６  ＭＡＸＩ  ＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ，ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）
・希釈用９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ  （９６ｗｅｌｌ  Ｒｏｕｎｄ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｎｏｎ−Ｔｒｅａｔｅｄ，ＣＯＲＮＩＮＧ）
・Ｔｗｅｅｎ２０
・ＢＳＡ
・ＰＢＳ
・ＰＢＳＴ（０．１％ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ）
・ＰＢＳＢ（１％  ＢＳＡ添加ＰＢＳ）
・ＰＢＳＴＢ（１％  ＢＳＡ、０．１％ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ）
・Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＨＲＰ標識（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）
・ＯＰＤ基質（Ｓｉｇｍａ，１０ｍｇ  ｔａｂｌｅｔ  ｏｆ  ｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
・Ｈ2Ｏ2
・ＯＰＤバッファー（３６ｇ  Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ＋９．６ｇ  ｃｉｔｒａｔｅ（クエン酸）＋１Ｌ  Ｄ2Ｗ，ｐＨ５．０））
・２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4
・プレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ  ｉＭａｒｋ）【００９４】
（ｂ）方法
マウスノロウイルスＶＬＰを、ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに調製し、これをＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅに５０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、１晩４℃で静置した。このＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅをＰＢＳＴで４回洗浄し、最後にＰＢＳＴを完全に拭きとり、ＰＢＳＢを８０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、室温で２時間静置した。これとは別に、希釈用プレートを用いてマウス血清をＰＢＳＢで２０倍希釈し、そこから３倍ずつの段階希釈を計８系統造った。上記の２時間静置後、ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅからＰＢＳＢを捨て、希釈した血清をＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅに５０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、室温で４時間静置し、ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅから希釈血清を捨て、ＰＢＳＴで４回洗浄し最後にＰＢＳＴを完全に拭いた。次に、ＰＢＳＴＢで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を５０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、室温で２時間静置した。その後、ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅからＨＲＰ標識抗体を捨て、ＰＢＳＴで５回洗浄し最後にＰＢＳＴを完全に拭いた。そして、ＯＰＤ基質（１０ｍｇ）を２０ｍｌのＯＰＤバッファーに溶解し、１０μｌのＨ2Ｏ2を添加し転倒混和し、ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅに上記ＯＰＤ基質溶解液を５０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、室温で静置し発色を行い、その後２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4を５０μｌ／ｗｅｌｌで添加して発色を止め、プレートリーダーでＯＤ４９０を測定し、陽性対照と比較して濃度計算を行った。【００９５】
（３）結果
上記の初回接種のＥＬＩＳＡの結果を、図４に示す。図４の縦軸はＩｇＧの抗体価（Ｕ／ｍｌ）である。図４に示すように、接種の結果、ＰＭＮＶＰＦ会合体（六量体）において抗体価が有意に上昇した個体が認められた。残りの３個体の内２個体においても、抗体価の上昇傾向を示していた。対照のＭＮＶＰＦの抗体価は殆ど上昇していなかった。【００９６】
すなわち、ＭＮＶＰＦを免疫原として担持した本発明の会合体（六量体）が、感染防御抗原として、非常に優れていることが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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