(57)【要約】目的細胞のみを次の工程で処理することができる細胞のスクリーニング方法を提供する。複数の細胞から目的細胞を、複数の容器１７が配列されたアレー状の第１のトレー１９に分取する工程と、容器１７に分取された細胞を撮像する工程と、撮像する工程により撮像された画像に基づいて、細胞が分取された容器１７を、第１のトレー１９から分離し第２のトレー１１９に再配置する工程と、を有する細胞のスクリーニング方法である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細胞から目的細胞を、複数の容器が配列されたアレー状の第１のトレーに分取する工程と、
前記容器に分取された細胞を撮像する工程と、
前記撮像する工程により撮像された画像に基づいて、前記細胞が分取された前記容器を、前記第１のトレーから分離し第２のトレーに再配置する工程と、を有する細胞のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記分取する工程は、１つの容器に１つの細胞を分取する請求項１に記載の細胞のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記分取する工程は、フローサイトメトリーにより行われる請求項１または２に記載の細胞のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記第１のトレーは、複数の容器と、前記容器を保持するプレートと、からなり、
前記プレートまたは前記容器の少なくともいずれか一方には、前記第１のトレーの配列情報が記載されている請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記配列情報は、前記プレートまたは前記容器の少なくともいずれか一方に文字を刻印する、または、２次元バーコードを印字することにより行われる請求項４に記載の細胞のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記プレートは、切断導入機構を有する請求項４または５に記載の細胞のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記容器を保護する保護シートを有し、前記保護シートに前記第１のトレーの配列情報を記載する請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記配列情報は、透明であり、かつ、紫外線により蛍光を発光するインクで刻印されている請求項７に記載の細胞のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記容器は配列情報を記憶したＲＦＩＤタグを有する請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記ＲＦＩＤタグのアンテナ部は、前記容器の外周にリング状に配置される請求項９に記載の細胞のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記容器は、底面が平坦であり、かつ、透明である請求項１から１０のいずれか１項に記載の細胞のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記容器は、ＰＣＲ用の容器である請求項１から１１のいずれか１項に記載の細胞のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞のスクリーニング方法に係り、特に、目的とする細胞を効率良く処理、解析することができる細胞のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複数の細胞から目的細胞を取得する方法として、複数の細胞をまとめてウエルスライド上に滴下し、微小なウエルに細胞を落とし、撮影、判断し、特定した目的細胞をキャピラリーで吸引し、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）プレートもしくはチューブに移す操作が行われている。しかしながら、この方法においては、キャピラリーの操作が難しい、時間がかかる、キャピラリーが高額などの問題があった。【０００３】
また、フローサイトメトリーにより、目的細胞を分取することが行われている。フローサイトメトリーは、微細な細胞を流体中に分散させ、その流体を細かく流して、個々の細胞を光学的に分析し、この分析結果に基づいて取得する細胞の判定、および、分取を行うものである。【０００４】
しかしながら、フローサイトメトリーにおいては、分取した細胞の中において、目的以外の細胞が混入するケースがあり、目的の細胞である割合は、数割程度である。そのため、フローサイトメトリーにより分取した細胞の全てに対して、解析、または解析のための前処理を行うことは非効率であった。【０００５】
例えば、下記の特許文献１には、マルチウエルプレートの列毎に切り取り線を設け、必要に応じて、プレートの列のウエルを切り離し、複数種類の試験を行うことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１４−０１１９８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１で用いられているマルチウエルプレートは、列毎または行毎に分離し、複数種類の試験を簡便に行うものであり、１つの列、または、１つの行の中において、目的細胞でない細胞を有する場合は分離することができず、効率良く解析を行うことはできていなかった。【０００８】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、目的細胞のみを次の工程において処理することができる細胞のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記目的を達成するために、複数の細胞から目的細胞を、複数の容器が配列されたアレー状の第１のトレーに分取する工程と、容器に分取された細胞を撮像する工程と、撮像する工程により撮像された画像に基づいて、細胞が分取された容器を、第１のトレーから分離し第２のトレーに再配置する工程と、を有する細胞のスクリーニング方法を提供する。【００１０】
本発明の細胞のスクリーニング方法によれば、第１のトレーに分取された細胞を撮像し、撮像された画像に基づいて、第１のトレーから第２のトレーに再配置することにより、第２のトレーには、目的細胞のみとすることができる。したがって、第２のトレーを用いて、解析、あるいは、その前処理を行うことにより、再配置する工程の前の第１のトレーを用いて解析、あるいは、その前処理を行う場合と比較し、時間を短縮することができ、効率良く目的細胞の解析を行うことができる。【００１１】
本発明の別の態様においては、分取する工程は、１つの容器に１つの細胞を分取することが好ましい。【００１２】
１つの容器に、核を有する複数の細胞が存在すると、その後の遺伝子解析が行えない場合があるため、この場合、画像により確認し、第２のトレーに再配置しないことになる。したがって、目的細胞が容器に分取されていても、再配置される工程において容器が選択されない。１つの容器に１つの細胞とすることで、目的細胞が分取された容器を再配置する工程において確実に選択することができる。【００１３】
本発明の別の態様においては、分取する工程は、フローサイトメトリーにより行われることが好ましい。【００１４】
この態様は、分取する工程の一例を示すものであり、分取する工程として、フローサイトメトリーを挙げることができる。【００１５】
本発明の別の態様においては、第１のトレーは、複数の容器と、容器を保持するプレートと、からなり、プレートまたは容器の少なくともいずれか一方には、第１のトレーの配列情報が記載されていることが好ましい。【００１６】
この態様によれば、プレートまたは容器の少なくともいずれか一方に、第１のトレーの配列情報を記載することにより、第２のトレーに再配置を行っても、第１のトレーにおける容器の位置を明確にしておくことができる。したがって、第１のトレー上の容器内の細胞の情報を管理することにより、容器の位置と細胞の情報とを関連付けることができる。【００１７】
本発明の別の態様においては、配列情報は、プレートまたは容器の少なくともいずれか一方に文字を刻印する、または、２次元バーコードを印字することにより行われることが好ましい。【００１８】
この態様は、第１のトレーの配列情報を記載する一例を示すものであり、プレートまたは容器の少なくともいずれか一方に文字を刻印する、または、２次元バーコードを印字することにより行うことができる。【００１９】
本発明の別の態様においては、プレートは、切断導入機構を有することが好ましい。【００２０】
この態様によれば、切断導入機構を設けることにより、再配置する工程において、プレートの切断を容易にすることができる。【００２１】
本発明の別の態様においては、容器を保護する保護シートを有し、保護シートに第１のトレーの配列情報を記載することが好ましい。【００２２】
この態様によれば、容器を保護する保護シートに、第１のトレーの配列情報を記載することにより、再配置後の細胞の情報を明確にしておくことができる。【００２３】
本発明の別の態様においては、配列情報は、透明であり、かつ、紫外線により蛍光を発光するインクにより刻印されていることが好ましい。【００２４】
この態様によれば、保護シートに記載される第１のトレーの配列情報を、透明インクを用いて行うことにより、保護シートに記載したインクが撮像した画像に影響を与えることを防止することができる。また、透明インクは、紫外線により蛍光を発光するインクとすることにより、その蛍光を読み取ることで情報を取得することができる。【００２５】
本発明の別の態様においては、容器は配列情報を記憶したＲＦＩＤタグを有することが好ましい。【００２６】
この態様によれば、容器に配列情報を記憶したＲＦＩＤタグを設けることにより、再配置後においても、細胞の情報を明確にしておくことができる。また、ＲＦＩＤタグを用いることにより、他の情報も記憶させることができる。【００２７】
本発明の別の態様においては、ＲＦＩＤタグのアンテナ部は、容器の外周にリング状に配置されることが好ましい。【００２８】
この態様によれば、ＲＦＩＤタグの電波を発するためのアンテナ部を容器の外周にリング状に配置することにより、再配置する際にアンテナ部が邪魔になることを防止することができる。【００２９】
本発明の別の態様においては、容器は、底面が平坦であり、かつ、透明であることが好ましい。【００３０】
この態様によれば、容器の形状を、底面を平坦とし、かつ、透明な容器とすることにより、撮像する工程において、良好な画像を撮像することができる。【００３１】
本発明の別の態様においては、容器は、ＰＣＲ用の容器であることが好ましい。【００３２】
この態様によれば、容器をＰＣＲ用の容器とすることにより、再配置した第２のトレーによりＰＣＲ処理を行うことができる。したがって、ＰＣＲ処理を行う際に、容器から細胞を取り出すことなく、ＰＣＲ処理を行うことができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の細胞のスクリーニング方法によれば、目的細胞の可能性の高い細胞を第１のトレーに分取した後、細胞を撮像することで、目的細胞の確認を行うことができる。そして、分取した細胞の確認をした後、目的細胞が分取された第１のトレー上の容器を第２のトレーに再配置することにより、第２のトレーには、目的細胞のみが分取されたトレーとすることができる。したがって、第２のトレーを用いて、解析、あるいは、その前処理を行うことにより、その後の工程を効率良く行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】細胞を撮像する装置の構成を示す概略構成図である。
【図２】容器の形状を示す断面図である。
【図３】再配置する工程の一態様を示す図である。
【図４】再配置する工程の他の実施形態を説明する図である。
【図５】図４に示す実施形態で用いられるトレーの断面図である。
【図６】配列情報が記載されたプレートの平面図である。
【図７】配列情報が記載されたプレートの他の実施形態を示す平面図である。
【図８】保護シートを有する容器の側面図である。
【図９】図８に示す容器の平面図である。
【図１０】ＲＦＩＤタグを有する容器の断面図である。
【図１１】図１０に示す容器の平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、添付図面に従って本発明に係る細胞のスクリーニング方法について説明する。なお、本明細書において「〜」とは、その前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。
【００３６】
本実施形態の細胞のスクリーニング方法によれば、複数の細胞から目的細胞を、複数の容器が配列されたアレー状の第１のトレーに分取する工程と、容器に分取された細胞を撮像する工程と、撮像する工程により撮像された画像に基づいて、細胞が分取された容器を、第１のトレーから分離し第２のトレーに再配置する工程と、を有する。以下、各工程について説明する。
【００３７】
≪分取する工程≫
複数の細胞から目的細胞を分取する工程としては、例えば、フローサイトメトリーにより行うことができる。フローサイトメトリーは、測定対象の細胞などの測定対象物質を含むサンプル液を、フローセルにおいてシース液の層流の中心側に流し、光学検出部においてレーザ光を測定対象物質に照射して、それによって生じる散乱光と蛍光を測定することにより、測定対象物質の大きさや構造などを測定するものである。光学検出部における測定のパラメータとしては、前方散乱光、側方散乱光および蛍光があるが、前方散乱光では測定対象物の大きさが、また側方散乱光および蛍光により、測定対象物質の構造などを測定することができる。
【００３８】
そして光学検出部における測定のパラメータを用いて、ソーティング系により、第１のトレー上の容器に目的細胞を分取する。フローサイトメトリーにおいては、サンプル／シース液は、上から下に流れていくように設計されており、層流のままフローセルの先端にあるノズルから飛び出し落下する。フローセルの外へ出たサンプル／シース液が、途中から液滴（ドロップ）になるように、トランスデューサ（振動子）を用いてフローセル全体またはフローセル内部に上下振動を与える。光学検出部における測定のパラメータを用いた分取条件に基づいて、分取する細胞かどうかを判別し、液滴になる直前に、サンプル／シース液全体に、＋または−の荷電をする。その後、液滴は２枚の偏向板の間を落下し、＋に荷電した液滴は−極板側に、−に荷電した液滴は＋極板側に引かれ、細胞捕集部にあるトレー（第１のトレー）上の各容器に細胞を分取することができる。
【００３９】
なお、フローサイトメトリーの方法としては、一例として上記の方法を記載したが、上記の方法に限定されず、一般的に行われている方法により行うことができる。また、分取する工程としては、フローサイトメトリーに限定されず、他の方法でも行うことができる。
【００４０】
しかしながら、分取する工程においては、目的細胞を高い精度で分取することは困難であり、例えば、フローサイトメトリーにおいては、容器に分取した細胞中において、目的細胞が得られる割合は、数割程度である。分取する工程において分取された細胞の全てを解析、あるいは、その前処理することは、非効率であり、本実施形態においては、分取する工程の次に、画像を撮像し、撮像された画像に基づいて、第１のトレーから第２のトレーに容器を再配置することにより、目的細胞以外の細胞を排除する。
【００４１】
≪撮像する工程≫
次に、容器に分取された細胞を撮像することにより、分取された細胞が目的細胞であるか確認する。
【００４２】
図１は、容器に分取された目的細胞の撮像や、細胞からの光学情報を取得する装置の構成を示す概略構成図である。好ましい態様として、抗原抗体反応などによって分取した細胞に標識した蛍光色素からの蛍光発光の情報の取得や、可視光による細胞の光透過画像の取得が可能な解析装置である。
【００４３】
図１に示す解析装置１０は、対象となる細胞の発する蛍光を測定するための光を照射する蛍光用励起光源装置１２、細胞の透過光を測定するための光（可視光）を照射する明視野用光源装置１４、撮像の対象となる細胞１６を収納する容器（ウエル）１７およびプレート１８からなるトレー（第１のトレー）１９、および、レンズ２０、励起フィルタ２２、ダイクロイックミラー２４および蛍光フィルタ２６を保持したフィルタ群（フィルタキューブ）２８、ならびに、細胞１６からの蛍光および透過光を撮像する撮像装置３０を備える。
【００４４】
蛍光用励起光源装置１２は、高圧水銀ランプ、高圧キセノンランプ、ＬＥＤ（light emitting diode）、または、ＬＡＳＥＲ（light amplification by stimulated emission of radiation）などを用いることができる。これらの光源を用いることにより、細胞１６に照射する照射光の波長領域を狭くすることにより、精度の高い分析を確実に行うことが可能となる。また、蛍光用励起光源装置１２としては、タングステンランプ、ハロゲンランプ、白色ＬＥＤなどを用いることができる。これらの光源を用いる場合でも、励起フィルタ２２で、目的の波長のみ透過させることにより、細胞１６に目的の波長の光を照射させることができる。なお、明視野用光源装置１４としても、蛍光用励起光源装置１２と同様の光源を用いることができる。
【００４５】
トレー１９は、分取した細胞１６を保持するサンプル台であり、細胞１６を収納する容器１７と、容器１７を保持するプレート１８と、からなる。分取する工程において、細胞１６は、培養液とともに、容器１７に供される。なお、図１においては、解析装置１０の説明のため、容器１７を簡略化して記載している。
【００４６】
レンズ２０は、蛍光用励起光源装置１２から出力された光により細胞１６が発した蛍光、および、明視野用光源装置１４から出力された光が細胞１６を透過した透過光を拡大する。レンズ２０は、光学測定に使用されるレンズを用いることができる。
【００４７】
フィルタ群２８は、励起フィルタ２２、ダイクロイックミラー２４、蛍光フィルタ２６を備える。このようなフィルタ群２８の具体例としては、フィルタキューブを用いることが好ましく、例えば、Zeiss Filter Set49 (DAPI)を用いることができる。蛍光用励起光源装置１２から照射された光は、励起フィルタ２２により、目的の波長領域の光のみを透過する。励起フィルタ２２を透過した光は、ダイクロイックミラー２４で、トレー１９の方向に反射する。蛍光用励起光源装置１２から出射した励起光により生じた、細胞１６からの蛍光発光は、レンズ２０、ダイクロイックミラー２４、蛍光フィルタ２６を経て撮像装置３０により撮像される。励起光により発光する蛍光は、励起光に比べてより長波長側の波長帯域を有するので、ダイクロイックミラー２４を使用することにより、蛍光発光のみを透過させることが可能となる。更に、励起光は透過させずに、蛍光のみを透過させる蛍光フィルタ２６を用いることにより、撮像装置３０において細胞１６からの蛍光発光のみの情報により撮像することが可能となる。したがって、撮像装置３０において撮像される画像が、励起光に影響されることなく、画像を取得することができ、蛍光発光情報による検査の精度を向上させることができる。
【００４８】
蛍光用励起光源装置１２から照射された光による蛍光撮影は、細胞の検査目的に応じて１つの細胞に対する複数の情報を取得するため、通常は複数種類の色素を用いて免疫染色がなされる。この場合、この免疫染色された細胞のそれぞれの色素からの蛍光に対して、それぞれの色素の蛍光波長に適した透過特性または反射特性を有するフィルタ群を用いて撮影することにより、異なる波長の光学的情報を得ることができる。なお、明視野用光源装置１４により細胞１６の透過光を撮像する場合は、フィルタ群２８を取り外した状態で撮像する。これにより、透過光を撮像装置３０で撮像することができる。
【００４９】
撮像装置３０としては、トレー１９上の容器１７内の細胞１６の蛍光または透過光を撮像することができれば特に限定されず、例えば、ＣＣＤ（charge-coupled device）カメラを用いることができる。
【００５０】
撮像する工程により得られた画像を用いて、目的細胞の確認を行う。画像による目的細胞の確認は、例えば、核の有無、核の大きさ、核の形状（細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、核の円形度合い）、細胞の形状（連続しているかギザギザしているか）、蛍光の輝度のピーク値、平均値、輝度分布(細胞膜均一に蛍光しているか、局所的に強く蛍光しているか)、特定の波長の透過光に対する吸収度合い（ヘモグロビンか、白血球かの判別）、ヘモグロビンの酸素親和性の違いに起因する分光特性（還元ヘモグロビン［Ｈｂ］と酸化ヘモグロビン［ＨｂＯ２］の波長に対する吸収係数）など、を用いて細胞を選別することにより行うことができる。具体的な選別としては、例えば、目的細胞と、選別からはずれる目的細胞とは異なる細胞とを選別する観点（細胞の形状、透過光の吸収等）を決定する。そして、その観点の度合いを数値化し、これらの測定した数値から、目的細胞である確からしさを表す数値範囲、及びその範囲を表す閾値を決定し、その閾値を、選別の基準値として決定する。このように選別すべき観点を複数、事前に決定しておき、それぞれの観点における閾値を求めて選別の基準値を決定する。こうして決定した複数の全ての基準値を満たす細胞を、目的細胞として選別することができる。例えば、目的細胞が有核赤血球等であれば国際公開ＷＯ２０１６０２１３０９号公報や国際公開ＷＯ２０１６０２１３１１号公報に記載の選別方法を用いることができる。
【００５１】
図２は、本実施形態に用いられる容器の好ましい形状を示す断面図である。図１に示す解析装置１０においては、容器１７の裏面側から励起光を照射し、容器１７を透過した、励起光により発光した細胞からの蛍光などの細胞からの情報を含む光を受光するため、容器１７の材料が透明であること、自家蛍光しないこと、散乱しないことなどの条件が必要となる。また、細胞１６を撮像するため、容器１７の底面１７ａは、平坦とすることが好ましい。容器１７の底面１７ａを平坦とすることにより、焦点を細胞１６に合わせることが可能となり、底面１７ａに存在する細胞１６の画像解析を精度良く行うことができる。
【００５２】
また、底面１７ａの形状は、円形または四角形以上の多角形であることが好ましい。また、底面１７ａの大きさは、底面１７ａ外接する円に近似した時、円の直径Ｌが０．０５ｍｍφ以上１ｍｍφ以下とすることが好ましく、０．２ｍｍφ以上０．５ｍｍφ以下とすることがより好ましい。なお、図２においては、底面１７ａを円形として記載する。底面１７ａの形状、大きさを上記の形状、サイズとすることにより、そして、５倍以上６３倍以下の倍率の対物レンズを用いることにより、好ましい細胞画像の大きさで、かつ１視野による撮影（ワンショット撮影）で、底面１７ａ全体を撮像することができる。撮像する工程においては、蛍光撮影は蛍光３色、および、明視野撮影を行うため、４色の画像を撮像する必要がある。さらに、１色について底面を複数枚撮像するとその枚数の倍数、撮像することになり、時間がかかる。ワンショット撮影とすることにより、効率良く画像の撮像、解析を行うことができる。
【００５３】
また、容器１７の側面１７ｂ、１７ｃは、底面から容器の開口部に向かって広がる方向に形成されていることが好ましい。容器１７の開口部を広くし、底面１７ａに向かって狭くすることにより、細胞１６を容器１７内に入りやすくすることができ、また、底面１７ａに導きやすくすることができる。
【００５４】
容器１７の側面において、底面１７ａに接している側面１７ｂは、底面１７ａと側面１７ｂとがなす角で側面側の角θＢの角度が５０°以上８０°以下であることが好ましい。底面１７ａと側面１７ｂとがなす角θＢの角度を上記範囲とすることにより、底面１７ａと側面１７ｂとにより形成される空間を狭くすることができ、少ない培養液の量で、細胞１６を培養液中に浸すことができる。また、容器１７内の培養液の深さが薄くなることを防止することができ、培養液、および、細胞１６が乾燥することを防止することができる。さらに、培養液中の気泡を抜きやすくすることができる。
【００５５】
側面は、図２に示すように、多段で屈曲していることが好ましい。多段で屈曲している場合、底面１７ａと接している側面１７ｂ以外の側面１７ｃは、それぞれの側面１７ｃと底面１７ａの平行線とがなす角で側面側の角θＣの角度が４０°以上９０°以下であることが好ましい。角度が４０°以上であると、側面１７ｃの傾斜に細胞がとどまることなく、細胞が底面までに確実に収納することが可能となる。また、角度が４０°以上であることにより、容器１７の開口部を狭くすることが可能となり、トレー１９の狭いスペースで容器を収納することが可能となるため好ましい。さらに、多段で屈曲している場合、底面１７ａに接している側面１７ｂを除き、開口部から底面１７ａに向かって、角θｃが、徐々に小さくなることが好ましい。このような構成とすることで、容器１７内に分取された細胞を底面１７ａに導きやすくすることが可能となる。
【００５６】
また、底面１７ａの中心（外接する円形に近似した時の円の中心）と開口部の端部とを結ぶ線が底面に対して垂直な直線となす角度の２倍の角である角θＡの角度が４５°未満であることが好ましい。角θＡの角度を４５°未満とすることにより、容器１７の開口部が広くなることを防止し、トレー１９のスペースを小さくすることが可能となる。
【００５７】
また、容器１７の底面１７ａの厚みｔは０．２ｍｍ以上１ｍｍ以下とすることが好ましい。撮像する工程においては、容器１７の底面１７ａ側から撮像するが、底面１７ａの厚みが１ｍｍ以内であれば、レンズ２０が細胞１６に接近することが可能となり好ましい。また、０．２ｍｍ以上であれば、焦点深度から、容器１７の外側のキズや付着したゴミ、汚れなどの焦点がずれて、撮像される画像に影響を及ぼさず、細胞の画像のみを撮像することが可能となるため好ましい。底面１７ａの厚みｔは、最も好ましくは、０．４ｍｍである。
【００５８】
容器１７の材質としては、撮像する工程において、光を透過しやすい材質とすることが好ましく、具体的には、アクリル樹脂、ポリプロピレン、または、ポリスチレンから選択される材料を用いることができる。これらの材料により製造された容器は、３５０ｎｍ以上８００ｎｍ以下の波長における透過率が６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましい。なお、本発明において、「透過率」とは、透過光を入射光で割った値（透過率＝透過光／入射光）であり、例えば１００の光束を入射させたときに透過した光束が６０であれば透過率は６０％と算出される。
【００５９】
容器１７の外形は、次工程の処理を行う装置への搭載を可能とすることが好ましく、例えば、ＰＣＲ用の容器とし、ＰＣＲ処理を行う装置、好ましくは、ＰＣＲサーマルサイクラーへの搭載を可能な形状とすることが好ましい。ＰＣＲ処理を行う装置に対応させることにより、次工程の再配置する工程により、目的細胞が分取された容器のみが配置された第２のトレーを用いてＰＣＲ処理を行うことができるので、専用のガラスキャピラリ―を用いることなく、ＰＣＲ処理を行うことができる。ＰＣＲサーマルサイクラーに搭載可能とする場合、装置と容器１７の外形の隙間が小さいことが好ましい。容器１７との隙間を小さくすることにより、ＰＣＲ処理する際に、温度を容器に効率良くかけることができる。また、上記材料を用いた容器１７は、耐熱性も優れており、ＰＣＲサーマルサイクラーに適用しても容器が劣化することなくＰＣＲ処理を行うことができる。
【００６０】
≪再配置する工程≫
次に、撮像された画像に基づいて、第１のトレー１９上の容器を、第２のトレー１１９上に再配置する。再配置することにより、遺伝子解析を行う細胞のみを、遺伝子解析または、その前処理を行うことにより、遺伝子解析の時間を短縮することができる。
【００６１】
図３は、再配置する工程の一態様を示す図である。第１のトレー１９のプレート１８に配置された容器１７には、分取する工程により、目的細胞と判断された細胞が分取されている。また、撮像する工程において得られた画像に基づいて、第２のトレー１１９に再配置される目的細胞が含まれる容器１７が決定される。容器１７は、プレート１８と接着しておらず、容器１７のみを、例えば、搬送機構４０により、プレート１１８に形成されたウエルホルダー１５０に搬送することにより、第２のトレー１１９に目的細胞を有する容器のみを配置することができる。
【００６２】
図４は、他の実施形態における再配置する工程を説明するプレートの平面図であり、図５は、図４に示す再配置する工程において用いられる第１のトレー２１９の断面図である。図４に示す再配置する工程では、第１のトレー２１９が、容器２１７とプレート２１８が一体となって形成されている点が、図３に示す再配置する工程と異なっている。
【００６３】
容器２１７とプレート２１８を一体で形成した場合は、プレート２１８に切断導入機構２５２を設けることが好ましい。切断導入機構２５２としては、プレート２１８に設けられた溝、切り取り線、または、印刷線とすることができる。切断導入機構２５２を設け、再配置する容器を決定した後、切断手段により、切断導入機構２５２に沿ってプレート２１８を切断することにより、第２のトレー３１９に、目的細胞を有する容器２１７を再配置することができる。
【００６４】
プレート２１８を切断して再配置する場合は、例えば、図４に示すように再配置することができる。５×６の容器（ウエル）を有するプレートＡにおいて、画像解析を行ったところ、目的細胞は５個であった。また、プレートＢについても、目的細胞は５個であった。プレートＡおよびプレートＢから、目的細胞を有する容器の周囲の切断導入機構２５２に沿ってプレート２１８を切断し、プレート３１８（プレートＣ）に再配置することで、プレート３１８を、目的細胞を有する容器のみとすることができる。
【００６５】
このように、プレートＣに目的細胞を有する容器を再配置することで、従来は、プレートＡ、プレートＢについて、それぞれ、解析、または、その前処理を行わなくてはならなかったが、プレートＣのみを解析、あるいは、その前処理を行うことで、時間を短縮することができる。また、プレートＣには、容器を配置することが可能であるため、他の第１のトレー（プレート）から目的細胞を有する容器を再配置することで、さらに、時間の短縮を行うことができる。
【００６６】
再配置する工程において、容器内に目的細胞以外に他の複数の細胞が含まれる場合、目的細胞ではないと判断し選択しない。核（ＤＮＡ）を有する細胞が複数含まれている容器中の細胞のＰＣＲ処理を行っても、複数の細胞のＤＮＡ断片を増幅することになり、遺伝子解析で正確な情報が得られなくなるからである。一方、他の細胞が含まれていても目的細胞の解析を阻害しないことが明らかな場合には選択するように判断することも可能である。一例を挙げると、核を持たない赤血球は含まれても良いが、核を有する白血球は選択しないという判断になる。したがって、分取する工程において、１容器に１細胞とすることで、目的細胞を含む容器を、再配置する工程において、確実に選択することができる。
【００６７】
［ＰＣＲ処理］
解析の前処理として、例えば、ＰＣＲ処理を挙げることができる。ＰＣＲ処理は、ＤＮＡ分子の特定の領域を増幅させる方法であり、例えば、次の方法により行うことができる。本例においては目的細胞内に存在する特定のＤＮＡ断片を増幅させるために行う。ただし、ＰＣＲ処理は以下の方法に限定されない。また、解析の前処理もＰＣＲ処理に限定されず、他の処理を行うこともできる。
【００６８】
（工程１）
目的細胞を破砕や溶解することにより得られる反応液（プレートごと）を９４℃程度に加熱し、３０秒から１分間温度を保ち、２本鎖ＤＮＡを１本鎖に分離する。
【００６９】
（工程２）
反応液を６０℃程度にまで急速冷却し、その一本鎖ＤＮＡとプライマーを所定の温度に加熱（アニーリング）し、一本鎖ＤＮＡとプライマーを加熱させる。
【００７０】
（工程３）
プライマーにＤＮＡポリメラーゼを反応させ、一本鎖ＤＮＡとプライマーの分離が起きず、ＤＮＡポリメラーゼ活性に適した温度（６０〜７２℃程度）まで、加熱する。ＤＮＡが合成されるのに必要な時間（増幅する長さによるが通常１〜２分）、この状態を継続する。
【００７１】
（工程４）
工程１から工程３を１サイクルとし、工程１から工程３までの手順を繰り返すことにより、特定のＤＮＡ断片を増幅することができる。一般的に、ＰＣＲ処理をｎ回のサイクル行うと、１つの２本鎖ＤＮＡから目的部分を２ｎ倍に増幅することができる。長いＤＮＡ鎖が最後まで残ってしまうが、通常２０サイクル程度行うことで、必要とする特定のＤＮＡ断片に比べ、ＤＮＡの量を無視できる程、少なくすることができる。
【００７２】
このように、ＰＣＲ処理においては、１サイクル内で温度の上昇、下降を行い、また、ＤＮＡの目的部分を増幅させるために、通常２０サイクル程度行う。したがって、１つのトレーに対して、処理時間が１時間以上かかる。本実施形態のように、目的細胞のみを第２のトレーに再配置し、目的細胞のみを有する第２のトレーを前処理することで、大幅に時間を短縮することができる。
【００７３】
再配置する工程後に、第１のトレーから第２のトレーに移動しても細胞の情報がわかるように、容器と容器内の細胞の情報を紐付けしておくことが好ましい。細胞の情報を容器と紐付ける方法として、例えば、図６に示すように、プレート２１８に容器２１７が配列される配列情報を文字で刻印し、刻印された情報とともに、第２のトレーに再配置することにより、細胞の情報を明確にしておくことができる。配列情報としては、「Ｃ４」であるならば、プレート２１８のＣ行の４列目、「Ｄ４」であるならばＤ行の４列目を意味する。また、細胞の情報を容器と紐づける方法としては、図７に示すように、プレート２１８に２次元バーコードとしてＱＲコード（登録商標）２５４を印字することにより行うことができる。また、図６、７は、プレート２１８に配列情報を刻印、または、ＱＲコードを印字する態様で説明したが、刻印または付与する場所は、プレート２１８に限定されず、容器２１７自体に刻印または印字してもよい。
【００７４】
図８、９は、容器と細胞の情報を紐付ける他の実施形態を説明する図であり、図８は容器１７の側面図、図９は容器１７の平面図である。図８に示すように、分取された容器１７の表面には、通常、保護シート２５６が被せられる。したがって、この保護シート２５６の印字面２５８に第１のトレーの配列情報を刻印することで、再配置する工程後においても、容器と細胞の情報とを紐付けることができる。細胞観察のための明視野撮影は、図１に示すように、容器１７の開口部側から光を照射する。そのため、保護シート２５６に、刻印を行うと、この刻印が光量減少、光ムラが発生する原因となる場合があり、明視野撮影で問題が生じる場合がある。したがって、保護シート２５６に刻印する場合は、可視光で透明であり、紫外線で蛍光発光する蛍光インクで刻印することが好ましい。この場合、紫外線を照射して目視で読み取ることができる。または、刻印を、赤で蛍光する蛍光インクを用いて、バーコードで行った場合、バーコードリーダーで紫外線を照射し、蛍光を読み取ることもできる。
【００７５】
図１０、１１は、容器と細胞の情報を紐付けるさらに、他の実施形態を説明する図であり、図１０は容器４１７の断面図、図１１は容器４１７の平面図である。図１０、１１に示すように、容器４１７に第１のトレーの配列情報を記憶したＲＦＩＤ（radio frequency identifier）タグ４６０を設けることで、容器４１７内の細胞の情報を明確にしておくことができる。ＲＦＩＤタグ４６０は、情報を保持するチップ部４６１と、電波を発するためのアンテナ部４６２とからなる。アンテナ部４６２は、容器４１７の外周にリング状に配置することが好ましい。アンテナ部４６２をリング状に配置することで、容器４１７を再配置するために搬送する際、アンテナ部４６２が容器４１７の搬送を邪魔することを防止することができる。また、アンテナ部４６２は、飛ばす電波の周波数に応じた長さが必要になるため、長くするために、容器４１７の周囲に螺旋状に巻回す、または、円を基線とした正弦波の形状とすることで、アンテナ部４６２を再配置する際の容器４１７の搬送の邪魔にならないようにすることができる。
【符号の説明】
【００７６】
１０  解析装置
１２  蛍光用励起光源装置
１４  明視野用光源装置
１６  細胞
１７、２１７、４１７  容器
１７ａ  底面
１７ｂ、１７ｃ  側面
１８、１１８、２１８、３１８  プレート
１９、２１９  第１のトレー
２０  レンズ
２２  励起フィルタ
２４  ダイクロイックミラー
２６  蛍光フィルタ
２８  フィルタ群（フィルタキューブ）
３０  撮像装置
４０  搬送機構
１１９、３１９  第２のトレー
２５２  切断導入機構
２５４  ＱＲコード
２５６  保護シート
２５８  印字面
４６０  ＲＦＩＤタグ
４６１  チップ部
４６２  アンテナ部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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