(57)【要約】本発明は、診断感度と特異度に優れ、かつ簡便なＭＤＳの診断方法に関する。具体的には、被験者から単離された骨髄液における、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比を指標として、前記被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する方法、ならびに前記評価方法のためのキット等に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から単離された骨髄液における、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比を指標として、前記被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する方法。
【請求項２】
顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がカットオフ値未満である場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とする、請求項１に記載の方法であって、前記カットオフ値が１．５〜３．５である方法。
【請求項３】
さらに、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率、ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率、顆粒球のＳＳＣ、及びＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現から選ばれるいずれか１又は２以上を指標として、骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がカットオフ値未満であり、かつ、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率、ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率、顆粒球のＳＳＣ、及びＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現のうち２つ以上の指標に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とし、前記カットオフ値が１．５〜３．５である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がカットオフ値未満であり、かつ、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率及び／又は顆粒球のＳＳＣの指標に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とし、前記カットオフ値が１．５〜３．５である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１）「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」がカットオフ値未満である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は１．５〜３．５である；
２）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」がカットオフ値以上である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は２〜３である；
３）「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」が第１のカットオフ値未満である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は１〜３であり、前記第２のカットオフ値は４〜８である；
４）「顆粒球のＳＳＣ」がカットオフ値未満である場合に２ポイント、但し前記カットオフ値は６〜７である；
５）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」が第１のカットオフ値以上である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は６〜８であり、前記第２のカットオフ値は４〜６である；
とした場合に、その総計が７ポイント以上か、総計が５〜６ポイントでＣＤ３４陽性骨髄芽球比率あるいは顆粒球のＳＳＣに異常が認められるか、あるいは総計が４ポイント以下で顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
フローサイトメトリー又はイメージングサイトメトリーを用いて各指標の測定が行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３３抗体、及び抗ＣＤ４５抗体を含む、骨髄異形成症候群の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、日本特許出願２０１６−１４１９９６（２０１６年７月２０日出願）に基づく優先権を主張しており、この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
［技術分野］
本発明は、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比を指標とした骨髄異形成症候群の診断方法、前記診断方法のためのキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ［ＭＤＳ］）は、高齢者に多発する造血細胞の悪性腫瘍である。その特徴として、１）血球減少（好中球が減少することによる白血球減少、貧血、血小板減少）を起こし、２）顕微鏡検査を行うと、末梢血や骨髄の細胞に形の異常（形態異常＝異形成）があり、３）しばしば、特に病後期に、芽球と呼ばれる未熟な細胞が骨髄中で２０％以上に増加し、検査上では急性骨髄性白血病と区別できない状態となる（これを「白血病化」と言う）。【０００３】
ＭＤＳを診断するためには、血球減少を示す患者に骨髄検査（骨髄細胞の採取）を行い、骨髄細胞における異形成を証明した上で、他の異形成を起こしうる疾患（ビタミンＢ１２欠乏やアルコール性造血障害など）を除外する必要がある。しかしながら、異形成の証明は観察者の主観に左右され、再現性に乏しいという欠点がある。また、正常高齢者にも一定の異形成を認めることがあり、診断に苦慮することが多い。【０００４】
ＭＤＳの検査所見は多様である。骨髄で芽球が５％を超えている場合や、環状鉄芽球と呼ばれる特徴的な細胞が骨髄で証明できる場合は、診断は容易である。しかしＭＤＳの半数前後は、芽球が５％未満（以下、「低グレードＭＤＳ」と言う）であり、さらに環状鉄芽球も認めない。また、Ｇ分染法による骨髄細胞の染色体分析（以下、「染色体分析」と言う）で、ＭＤＳに特徴的な異常を認める場合も診断は容易であるが、こうした異常は低グレードＭＤＳの３０％前後の患者に見られるにすぎない。【０００５】
フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）は、細胞の表面蛋白の発現などの特徴を解析する方法であり、急性白血病や悪性リンパ腫などの診断に用いられている。本発明者を含むいくつかのグループが、ＦＣＭをＭＤＳの診断に用いる試みを行っている（特許文献１及び２、非特許文献１及び２）。しかしＦＣＭを用いる場合でも、芽球が多いＭＤＳであれば診断は容易であるが、低グレードＭＤＳの場合は確度の高い診断は難しい。既知のＦＣＭパラメーターでは、単独では診断感度が低く、一方、数多くのＦＣＭパラメーターを併用すると特異度が低下するという欠点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−３７３４３号
【特許文献２】特開２００５−２２１３２３号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｏｒｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ  １００，５３４−５４０，１９９３
【非特許文献２】Ｏｇａｔａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．９４（８），１０６６−１０７４，２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、診断感度と特異度に優れ、かつ簡便なＭＤＳの新規な診断方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために鋭意検討し、発明者らは、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がＭＤＳ診断の新規なパラメーターとして有用であることを見出した。さらに、このパラメーターを既知のパラメーターと組み合わせることで、より感度の高い診断が可能となることを見出した。【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）に関する。
（１）被験者から単離された骨髄液における、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比を指標として、前記被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する方法。
（２）顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がカットオフ値未満である場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とする、（１）に記載の方法であって、前記カットオフ値が１．５〜３．５である方法。
（３）さらに、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率、ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率、顆粒球のＳＳＣ、及びＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現から選ばれるいずれか１又は２以上を指標として、骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価することを特徴とする、（１）に記載の方法。
（４）顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がカットオフ値未満であり、かつ、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率、ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率、顆粒球のＳＳＣ、及びＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現のうち２つ以上の指標に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とし、前記カットオフ値が１．５〜３．５である、（１）に記載の方法。
（５）顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がカットオフ値未満であり、かつ、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率及び／又は顆粒球のＳＳＣの指標に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とし、前記カットオフ値が１．５〜３．５である、（１）に記載の方法。
（６）顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率、ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率、顆粒球のＳＳＣ、及びＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現をそれぞれ点数化し、その合計値によって被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する（１）に記載の方法：例えば、
１）「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」がカットオフ値未満である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は１．５〜３．５である；
２）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」がカットオフ値以上である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は２〜３である；
３）「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」が第１のカットオフ値未満である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は１〜３であり、前記第２のカットオフ値は４〜８である；
４）「顆粒球のＳＳＣ」がカットオフ値未満である場合に２ポイント、但し前記カットオフ値は６〜７である；
５）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」が第１のカットオフ値以上である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は６〜８であり、前記第２のカットオフ値は４〜６である；
とした場合に、その総計が７ポイント以上か、総計が５〜６ポイントでＣＤ３４陽性骨髄芽球比率あるいは顆粒球のＳＳＣに異常が認められるか、あるいは総計が４ポイント以下で顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とする、（１）に記載の方法。
（７）フローサイトメトリー又はイメージングサイトメトリーを用いて各指標の測定が行われる、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３３抗体、及び抗ＣＤ４５抗体を含む、骨髄異形成症候群の診断用キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法は、診断感度と特異度に優れ、４つのパラメーターを用いた従来の診断方法よりも簡便にＭＤＳを鑑別診断することができる。また、本発明の方法は、従来のパラメーターと組合せることで、より高い特異度でＭＤＳを鑑別診断することができ、それゆえ従来診断が困難であった低グレードのＭＤＳの診断にも適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】図１−１は、骨髄細胞集団のゲーティングの概略を示す。
【図１−２】図１−２は、骨髄細胞集団のゲーティングの概略を示す。
【図１−３】図１−３は、骨髄細胞集団のゲーティングの概略を示す。
【図１−４】図１−４は、骨髄細胞集団のゲーティングの概略を示す。
【図１−５】図１−５は、骨髄細胞集団のゲーティングの概略を示す。
【図１−６】図１−６は、骨髄細胞集団のゲーティングの概略を示す。
【図２】図２は、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」をパラメーターに用いた場合のＭＤＳと良性血球減少の鑑別結果を示す。図中、縦軸は「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を示す（左：ＭＤＳ、右：Ｎｏｎ−ｃｌｏｎａｌ  ｃｙｔｏｐｅｉａ（良性血球減少））。
【図３】図３は、従来の４つのパラメーターを用いた場合のＭＤＳと良性血球減少の鑑別結果を示す。図中、縦軸は「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」、数字は異常値を示した数／母集団数を示す（左：ＭＤＳ、右：Ｎｏｎ−ｃｌｏｎａｌ  ｃｙｔｏｐｅｉａ（良性血球減少））。
【図４】図４は、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」及び「顆粒球のＳＳＣ」をパラメーターに用いた場合のＭＤＳと良性血球減少の鑑別結果を示す。図中、縦軸は２つのパラメーターによるスコア、数字はスコア２以上を示した数／母集団数を示す（左：ＭＤＳ、右：Ｎｏｎ−ｃｌｏｎａｌ  ｃｙｔｏｐｅｉａ（良性血球減少））。
【図５】図５は、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」と、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」及び「顆粒球のＳＳＣ」をパラメーターに用いた場合のＭＤＳと良性血球減少の鑑別結果を示す。図中、縦軸は３つのパラメーターによるスコア、数字はスコア２以上を示した数／母集団数を示す（左：ＭＤＳ、右：Ｎｏｎ−ｃｌｏｎａｌ  ｃｙｔｏｐｅｉａ（良性血球減少））。
【図６】図６は、本発明のスコアリング（実施例（Ｖ）の方法）によるＭＤＳと良性血球減少の鑑別結果を示す。
【図７】図７は、本発明のスコアリング（実施例（Ｖ）の方法）によるＭＤＳと良性血球減少の鑑別結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．骨髄異形成症候群
本発明の診断対象となる「骨髄異形成症候群」とは、腫瘍化した造血細胞が骨髄中で増殖する、造血器悪性腫瘍の一つであり、血球形成の異常（異形成）と血球減少を認めることからこの名称が用いられる。ＭＤＳはしばしば急性骨髄性白血病に移行する（骨髄芽球が２０％を超えると急性骨髄性白血病と診断されることが提案されている）ため、前白血病状態と呼ばれることもある。
【００１４】
ＭＤＳは、骨髄と芽球の割合等により、不応性貧血、鉄芽球性不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、多血球異形成を伴う鉄芽球性不応性貧血、芽球増加型不応性貧血、５ｑ−症候群、分類不能型骨髄異形成症候群に分類することができる。特記しない限り、本発明においてＭＤＳと言う場合にはこれらのすべてが含まれる。
【００１５】
骨髄異形症候群の診断には、末梢血と骨髄の芽球比率、骨髄細胞の異形成のほか、遺伝子異常、ゲノム解析、フローサイトメトリーによる診断が利用されているが、従来の方法では、ＭＤＳ、とくに芽球が５％未満の低グレードＭＤＳを、良性血球減少等と高い感度と特異性で鑑別診断することは困難である。
【００１６】
２  検体・試料（骨髄液、骨髄細胞）
本発明で使用される検体（試料）は、被験者、すなわち骨髄異形成症候群の罹患可能性がある対象の骨髄液である。骨髄液は、常法にしたがい骨髄穿刺により採取し、必要であれば適当量の抗凝固剤を加え、緩衝液あるいは培地で希釈する。１回の測定に必要な骨髄液は、少なくとも０．５〜１ｍｌ、好ましくは１ｍｌ〜２ｍｌである。採取した骨髄液は、有核細胞の数をカウントし、好ましくは１試験管あたり１０〜５０万個となるように測定用サンプルを調製する。
【００１７】
３  測定対象・測定方法
３．１  新規パラメーター
本発明では、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を指標（パラメーター）とすることで、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を診断する。
【００１８】
「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」は、たとえば、以下の手順で測定することができる（図１）。
１）骨髄液サンプルから細胞の破片を除いた全有核細胞をＦＳＣとＳＳＣで展開し、この細胞全体をゲーティングする（Ｇａｔｅ  １）。ここで、ＦＳＣ（前方散乱：Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ）は細胞の大きさを、ＳＳＣ（側方散乱：Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ）は細胞内の複雑さを示す。
２）（Ｇａｔｅ  １）の細胞のうち、ＳＳＣ低値の細胞群をゲーティングする（Ｇａｔｅ  ２）。
３）（Ｇａｔｅ  ２）の細胞をＣＤ４５とＣＤ３４で展開し、ＣＤ３４陽性細胞画分をゲーティングする（Ｇａｔｅ  ３）。ＣＤ３４陽性細胞は、コントロール染色を用いるなどして、特定することができる。
４）（Ｇａｔｅ  ３）の細胞のＣＤ３３発現を解析し、ＣＤ３３発現が０未満のもの（細胞ではない小粒子）を除外し、細胞のみをゲーティングする（Ｇａｔｅ  ４）。
５）（Ｇａｔｅ  ４）の細胞をＣＤ３３発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３３陰性細胞をゲーティングする（Ｇａｔｅ  ５）。
６）（Ｇａｔｅ  ４）の細胞（赤）と（Ｇａｔｅ  ５）の細胞（青）を重ねて表示し、ＳＳＣ低値かつＣＤ４５比較的低値の細胞集団をゲーティングする（Ｇａｔｅ  ６）。
７）（Ｇａｔｅ  ４）の細胞から（Ｇａｔｅ  ６）の細胞を除いた細胞集団をゲーティングする（Ｇａｔｅ  ７）。
８）（Ｇａｔｅ  １）の細胞をＣＤ４５発現とＳＳＣで展開し、リンパ球集団をゲーティングする（Ｇａｔｅ  ８）。
９）（Ｇａｔｅ  ８）の細胞をＣＤ３３発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３３陰性の集団をケーティングする（Ｇａｔｅ  ９）。
１０）（Ｇａｔｅ  １）の細胞をＣＤ４５発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３４陽性細胞（Ｇａｔｅ  ４）をバックゲートし、これを参考にしながら、未熟細胞が混入しないように、成熟顆粒球をゲーティングする（Ｇａｔｅ  １０）。
１１）（Ｇａｔｅ  １０）の細胞のＳＳＣのＭｏｄｅ値を求め、このＭｏｄｅ値以下のＳＳＣを示す顆粒球をゲーティングする（Ｇａｔｅ  １１）。なお、Ｍｏｄｅ値とは、データの中でもっとも多く存在する値で、通常のＦＣＭ解析プログラムを用いて求めることができる。フローサイトメトリーの場合、Ｍｏｄｅ値はピーク値を示し、平均値より異常データの影響を受けない。
【００１９】
「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」は、たとえば、上記のようにゲーティングされた細胞から、「（Ｇａｔｅ  １１）細胞のＣＤ３３発現量÷（Ｇａｔｅ  ４）細胞のＣＤ３３発現量」として求めることができる（発現量は幾何平均）。
【００２０】
３．２  従来のパラメーター
従来のＭＤＳの診断方法では、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」、「顆粒球のＳＳＣ」、及び「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」を指標（パラメーター）として診断を行う。本発明はこれらのパラメーターに、新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を組み合せて用いることで、さらにその感度と特異性を向上させることができる。
【００２１】
上記各パラメーターは、たとえば、上述のようにゲーティングされた細胞から、次のようにして求めることができる。
「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」は、「（Ｇａｔｅ  ７）細胞数／（Ｇａｔｅ  １）細胞数」として求めることができる。
「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」は、「（Ｇａｔｅ  ６）細胞数／（Ｇａｔｅ  ４）細胞」として求めることができる。
「顆粒球のＳＳＣ」は、「（Ｇａｔｅ  １０）の細胞のＭｏｄｅ値／（Ｇａｔｅ  ９）細胞のＭｏｄｅ値」として求めることができる。
「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」は、「（Ｇａｔｅ  ９）細胞のＣＤ４５発現量／（Ｇａｔｅ  ７）細胞のＣＤ４５発現量」として求めることができる（発現量は幾何平均）。
【００２２】
３．３  測定手段
本発明において、各種パラメーターの測定は、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３３抗原に特異的な抗体を使用して、フローサイトメトリーにより測定することができる。フローサイトメトリーは、流体に懸濁させた細胞を１個ずつセンシングゾーンに導き、その単一の流れにおいて、蛍光や散乱光を測定することで、多量の細胞を短時間に１個ずつ定量解析できる細胞測定法である。
【００２３】
フローサイトメトリーに代えて、イメージングサイトメトリーを用いて測定することもできる。イメージングサイトメトリーは、マルチウェルプレートやスライドグラス上の細胞を、レーザー走査して、その蛍光イメージや散乱光・透過光イメージを取得し、画像処理することにより、多量の細胞を短時間に１個ずつ定量解析できる細胞測定法である。
【００２４】
４．診断方法（罹患可能性の評価方法）
本発明では、新規パラメーターを用いた４つの診断方法（ＭＤＳの罹患可能性の評価方法）を提供する。
（１）方法１：新規パラメーターによる診断
方法１では、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を指標として被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する。
例えば、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」の値がカットオフ値未満である場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価する。カットオフ値は、目的とする感度と特異度によって設定できるが、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」の場合、通常１．５〜３．５の範囲にある（すなわち１．５〜３．５以上を正常と判断する）。後述する実施例では、前記カットオフ値を２．２として評価を行った。
【００２５】
（２）方法２：新規パラメーターと従来のパラメーターの併用による診断（１）
方法２では、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」、「顆粒球のＳＳＣ」、及び「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」から選ばれるいずれか１又は２以上と組み合わせて被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する。これにより、感度、診断特異度を向上させることができる。
【００２６】
たとえば、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」がカットオフ値未満であり、かつ、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」、「顆粒球のＳＳＣ」、及び「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」の２つ以上に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価する。
【００２７】
ここで、「異常が認められる」とは、各パラメーターがカットオフ値を逸脱した値を示すことを意味する（Ｏｇａｔａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．９４（８），１０６６−１０７４，２００９参照）。カットオフ値は、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」の場合、通常２〜３の範囲にあり（２〜３未満を正常とする）、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」の場合は通常５〜８の範囲にある（５〜８以上を正常とする）。後者の場合、さらに厳しいカットオフ値は通常１〜３であり、この厳しいカットオフ値は、骨髄異形成症候群の罹患可能性の評価をする上で、より特異性が高いが、逆に感度は低くなる。「顆粒球のＳＳＣ」の場合、通常６〜７の範囲にあり（６〜７以上を正常とする）、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」の場合、通常４〜８の範囲にある（このパラメーターについては、この範囲内を正常とする）。
【００２８】
たとえば、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」であれば、２．３以上を示す場合、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」であれば、５未満を示す場合、「顆粒球のＳＳＣ」であれば、７未満を示す場合、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」であれば、７．７以上あるいは５未満を示す場合には、「異常が認められる」と判断できる。
【００２９】
（３）方法３：新規パラメーターと従来のパラメーターの併用による診断（２）
方法３では、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」及び／又は「顆粒球のＳＳＣ」と組み合わせて被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する。
例えば、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」がカットオフ値未満であり、かつ、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」及び／又は「顆粒球のＳＳＣ」に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価する。なお、「異常が認められる」とは、上記（２）に記載したとおりの意味である。
【００３０】
（４）方法４：新規パラメーターと従来のパラメーターの併用による診断（３）
方法４では、新規パラメーターと従来のパラメーターをそれぞれ測定し、その結果を点数化したうえで、被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する。
【００３１】
点数化は、前記カットオフ値からの逸脱と骨髄異形成症候群との相関を加味して、たとえば次のように決定される。したがって、骨髄異形成症候群との相関による重みづけとの関係で、下記のカットオフ値は前述した正常値を示すカットオフ値とは完全に一致してはいない。
１）「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」がカットオフ値未満である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は１．５〜３．５である；
２）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」がカットオフ値以上である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は２〜３である；
３）「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」が第１のカットオフ値未満である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は１〜３であり、前記第２のカットオフ値は４〜８である；
４）「顆粒球のＳＳＣ」がカットオフ値未満である場合に２ポイント、但し前記カットオフ値は６〜７である；
５）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」が第１のカットオフ値以上である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は６〜８であり、前記第２のカットオフ値は４〜６である。
【００３２】
一例として、後述する実施例で使用した点数化を以下に示す。
１）「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」が２．２未満である場合に３ポイント、
２）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」が２．３以上である場合に３ポイント、
３）「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」が２未満である場合に２ポイント、５未満である場合に１ポイント、
４）「顆粒球のＳＳＣ」が７未満である場合に２ポイント、
５）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」が７．７以上である場合に２ポイント、５未満である場合に１ポイント。
【００３３】
骨髄異形成症候群の罹患可能性は、たとえば、上記点数の総計が７ポイント以上か、総計が５〜６ポイントでＣＤ３４陽性骨髄芽球比率あるいは顆粒球のＳＳＣに異常が認められるか、あるいは総計が４ポイント以下で顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価する。
【００３４】
５．診断用試薬・キット
本発明は、上記した骨髄異形成症候群の診断用キットも提供する。本発明のキットは、（ｉ）抗ＣＤ４５抗体、（ｉｉ）抗ＣＤ３３抗体、及び（ｉｉｉ）ＣＤ３４抗体を必須の構成要素とする。これらの抗体は適当な蛍光色素等で標識されていてもよい。
【００３５】
また、本発明のキットは、上記した構成要素のほか、測定に必要な各種試薬、二次抗体、基質溶液、説明書等を含んでいてもよい。
【００３６】
６．診断システム、解析ソフト
本発明の診断方法は、その全部または一部を自動化することが可能であり、本発明は、そのような骨髄異形成症候群の診断システム、前記システムのための診断解析ソフトも提供する。
【００３７】
本発明の診断システムは、骨髄異形成症候群の診断用システムであって、フローサイトメトリー及びコンピュータを含み、下記の１）〜１２）の手段、あるいは所望によりさらに１３）の手段を実行する。
１）骨髄液サンプルから細胞の破片を除いた全有核細胞をＦＳＣとＳＳＣで展開し、この細胞全体をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ  １）。
２）（Ｇａｔｅ  １）の細胞のうち、ＳＳＣ低値の細胞群をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ  ２）。
３）（Ｇａｔｅ  ２）の細胞をＣＤ４５とＣＤ３４で展開し、ＣＤ３４陽性細胞画分をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ  ３）。
４）（Ｇａｔｅ  ３）の細胞のＣＤ３３発現を解析し、ＣＤ３３発現が０未満のもの（細胞ではない小粒子）を除外し、細胞のみをゲーティングする手段（Ｇａｔｅ  ４）。
５）（Ｇａｔｅ  ４）の細胞をＣＤ３３発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３３陰性細胞をケーティングする手段（Ｇａｔｅ  ５）。
６）（Ｇａｔｅ  ４）の細胞（赤）と（Ｇａｔｅ  ５）の細胞（青）から、ＳＳＣ低値かつＣＤ４５比較的低値の細胞集団をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ  ６）。
７）（Ｇａｔｅ  ４）の細胞から（Ｇａｔｅ  ６）の細胞を除いた細胞集団をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ  ７）。
８）（Ｇａｔｅ  １）の細胞をＣＤ４５発現とＳＳＣで展開し、リンパ球集団をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ  ８）。
９）（Ｇａｔｅ  ８）の細胞をＣＤ３３発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３３陰性の集団をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ  ９）。
１０）（Ｇａｔｅ  １）の細胞をＣＤ４５発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３４陽性細胞（Ｇａｔｅ  ４）をバックゲートし、これを参考にしながら、未熟細胞が混入しないように、成熟顆粒球をケーティングする手段（Ｇａｔｅ  １０）。
１１）（Ｇａｔｅ  １０）の細胞のＳＳＣのＭｏｄｅ値を求め、このＭｏｄｅ値以下のＳＳＣを示す顆粒球をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ  １１）。
１２）「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を「（Ｇａｔｅ  １１）細胞のＣＤ３３発現量／（Ｇａｔｅ  ４）細胞のＣＤ３３発現量」として計算する手段。
１３）所望により、さらに「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」＝「（Ｇａｔｅ  ７）細胞数／（Ｇａｔｅ  １）細胞数」、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」＝「（Ｇａｔｅ  ６）細胞数／（Ｇａｔｅ  ４）細胞数」、「顆粒球のＳＳＣ」＝「（Ｇａｔｅ  １０）の細胞のＭｏｄｅ値／（Ｇａｔｅ  ９）細胞のＭｏｄｅ値」、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」＝「（Ｇａｔｅ  ９）細胞のＣＤ４５発現量／（Ｇａｔｅ  ７）細胞のＣＤ４５発現量」のうち１又は２以上を計算する手段（発現量は幾何平均）。
【００３８】
本発明の解析ソフトウェアは、本発明のシステム（フローサイトメトリー及びコンピュータ）に、上記１）〜１２）の手段、あるいは所望によりさらに１３）の手段を実行させるためのプログラムを含む。
【００３９】
７．骨髄異形成症候群の治療戦略
本発明は、ＭＤＳの診断、とくに低グレードのＭＤＳと良性血球減少等との鑑別診断を可能とする。本発明は、ＭＤＳの診断に加えて、ＭＤＳの予後予測、治療の効果予測、治療効果の判定等にも利用できる。
【００４０】
本発明の方法（診断方法）、キット、あるいはシステム（解析ソフト）を使用することで、被験者のＭＤＳの罹患可能性を評価し、被験者がＭＤＳである可能性が高いと判定された被験者には、適切な治療方法を決定し、その治療効果や予後を判定・予測することができるという一連の治療戦略が提供される。そのような、診断を含むＭＤＳの治療方法も、本発明の対象である。
【００４１】
ＭＤＳの治療方法としては、エリスロポイエチン、アザシチジン（ビターザ）、レナリドミド（レブラリド）の投与のほか、シタラビンなどの抗がん剤投与、シクロスポリンなどの免疫抑制剤投与、あるいは造血幹細胞移植が挙げられる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４３】
１．方法と材料
（Ｉ）細胞の準備
１）骨髄穿刺で、ヘパリン入りのシリンジに骨髄液を吸引する。
２）有核細胞をカウントし、試験管あたり１０−５０万個の細胞を、２本の試験管に分注する。
３）ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ，ＣＤ３３−ＰＥ，ＣＤ３４−ＡＰＣ（それぞれ、蛍光標識されたヒトＣＤ４５、ヒトＣＤ３３、ヒトＣＤ３４に対するモノクローナル抗体）で１５−３０分間染色する。
４）溶血剤を作用させ、赤血球を溶血させる。
５）リン酸緩衝液に浮遊させる。
６）フローサイトメトリー（ＦＣＭ）で解析する。【００４４】
（ＩＩ）ＦＣＭ解析
１）細胞集団のゲーティング
ＦＣＭ解析では、細胞集団をゲーティングして抗原発現などのパラメーターを解析する。本実施例では、図１に示した方法で１１種類の細胞集団をゲーティングした。また解析の再現性を確保するため、ゲーティングにも特別な工夫を行った。【００４５】
本発明のパラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」では、顆粒球を確実にゲーティングする必要がある。このゲーティングには、ＳＳＣとＣＤ４５発現で展開した細胞プロットを用いるが、ＳＳＣを対数目盛でプロットすると、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞などの未熟細胞との分離が困難となるため、等分目盛でプロットする。一方、等分目盛でプロットした場合、ＳＳＣ高値の顆粒球に、ＳＳＣ高値の非細胞成分が混入し、ＣＤ３３発現量の平均値は不正確となる。これを回避するため、ＳＳＣ低値顆粒球（Ｇａｔｅ  １１）に限定したゲーティングを行った。そして、ＳＳＣ低値を「ＳＳＣ  ｍｏｄｅ値以下」と定義することで、ゲーティングの再現性を担保した。【００４６】
また、ＣＤ３４陽性細胞（Ｇａｔｅ  ３）のＣＤ３３発現を表示した場合、ＣＤ３３発現が０以下の粒子が認められる。ＣＤ３４陽性細胞にこれらの粒子が混在したままでは、ＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量の平均値は誤って低値となる。そこで、この粒子を除外したＧａｔｅ  ４を設定することで、ＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量を正確に定量した。【００４７】
ゲーティングした１１種類の細胞集団の中で、パラメーターの計算に用いるものは、全有核細胞（Ｇａｔｅ  １）、ＣＤ３４陽性細胞（Ｇａｔｅ  ４）、ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞（Ｇａｔｅ  ６）、ＣＤ３４陽性骨髄系未熟細胞（（Ｇａｔｅ  ７）骨髄芽球が主な構成成分であり、便宜上ＣＤ３４陽性骨髄芽球と呼ぶ）、リンパ球（Ｇａｔｅ  ９）、顆粒球（Ｇａｔｅ  １０）、ＳＳＣ低値顆粒球（Ｇａｔｅ  １１）、である。【００４８】
２）パラメーターの算出
今回発明したパラメーター
パラメーター名：顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比
算出法：Ｇａｔｅ  １１細胞のＣＤ３３発現量＊÷Ｇａｔｅ  ４細胞のＣＤ３３発現量＊
＊発現量は幾何平均［ＧｅｏＭｅａｎ］を用いる
併用する既知のパラメーター例
パラメーター名：ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率
算出法：Ｇａｔｅ  ７細胞数÷Ｇａｔｅ  １細胞数
パラメーター名：ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率
算出法：Ｇａｔｅ  ６細胞数÷Ｇａｔｅ  ４細胞数
パラメーター名：顆粒球のＳＳＣ
算出法：Ｇａｔｅ  １０細胞のｍｏｄｅ値÷Ｇａｔｅ  ９細胞のｍｏｄｅ値
パラメーター名：ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現
算出法：Ｇａｔｅ  ９細胞のＣＤ４５発現量＊÷Ｇａｔｅ  ７細胞のＣＤ４５発現量＊
＊発現量は幾何平均［ＧｅｏＭｅａｎ］を用いる【００４９】
（ＩＩＩ）被験者
１）低グレードＭＤＳ患者３４例（ＲＡＲＳ、ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ＭＤＳは除いた）
２）臨床現場でＭＤＳと鑑別が必要である、血球減少を来す良性疾患の患者（以降、良性血球減少と表記）３７例【００５０】
２．結果と考察
（Ｉ）新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」の値について、２．２未満をカットオフポイントにすることで、ＭＤＳと良性血球減少の鑑別が可能であった。このパラメーターを用いた場合、２６例が陽性（２．２未満）で、その内訳はＭＤＳ２２例、良性血球減少４例であった。すなわち診断感度は６４．７％、診断特異度は８４．６％であった（図２）。
（ＩＩ）既知の方法（４つのパラメーターを用い、２つ以上が陽性であった場合ＭＤＳと判断する方法、所謂Ｏｇａｔａ  ｓｃｏｒｅ）を用いた場合、３３例が陽性で、その内訳はＭＤＳ  ２６例、良性血球減少７例であった。すなわち診断感度は７６．５％，診断特異度は７８．８％であった（図３）。【００５１】
以上から、新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」は単独で、従来の方法（Ｏｇａｔａ  ｓｃｏｒｅ）と同等の診断価値があると考えられる。【００５２】
考察１：
上記（Ｉ）（ＩＩ）の方法では、診断特異度８０％前後であるため、これをさらに向上させるため、特異性の高いパラメーターに限定して再度診断価値を検討した。【００５３】
（ＩＩＩ）上記（ＩＩ）の４つのパラメーターの中で、特異度の高いパラメーターは「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」と「顆粒球のＳＳＣ」である。この２つが陽性を示したのは８例で、その内訳はＭＤＳ８例、良性血球減少０例であった。すなわち診断感度は２３．５％，診断特異度は１００％であった（図４）。【００５４】
（ＩＶ）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」と「顆粒球のＳＳＣ」に新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を加えた場合、いずれか２つが陽性を示したのは２０例で、その内訳はＭＤＳ  ２０例、良性血球減少０例であった。すなわち診断感度は５８．８％，診断特異度は１００％であった（図５）。【００５５】
考察２
新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を従来のパラメーターと併用することで、従来の方法より診断的価値の高いＦＣＭ診断検査を構築することが可能である。【００５６】
（Ｖ）新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を従来のパラメーターと併用する上で、（ＩＶ）とは異なった方法の例を示す。
各パラメーターが異常値を示した場合、以下の様にポイントを付与し、各患者ｄａｔａのスコアを計算する。「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」が２．３以上に３ポイント、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」が２未満に２ポイント、５未満に１ポイント、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」が７．７以上に２ポイント、５未満に１ポイント、「顆粒球のＳＳＣ」が７未満に２ポイント、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」が２．２未満に３ポイント。【００５７】
図６にこのスコアを用いた診断手順と鑑別結果を記載した。１４例が７ポイント以上を示し、その全てがＭＤＳであった。１８例が５−６ポイントを示し、うち１０例が「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」あるいは「顆粒球のＳＳＣ」に異常があり、その全てがＭＤＳであった。３９例が４ポイント以下であり、うち５例が「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」に異常があり、その内訳はＭＤＳ４例、良性血球減少１例であった。【００５８】
すなわち、「７ポイント以上」、「５−６ポイントを示し、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率あるいは顆粒球のＳＳＣに異常がある」、あるいは「４ポイント以下で、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比に異常がある」を用いた場合、診断感度は８２．４％，診断特異度は９６．６％であった。【００５９】
さらに、異なった被験者群を用いて、（Ｖ）の方法でＭＤＳの診断を行った。図７に異なった被験者群を用いた診断手順と鑑別結果をまとめて示す。被験者は低グレードＭＤＳ患者２３例（ＲＡＲＳ、ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ＭＤＳは除いた）、良性血球減少２３例である。これらの被験者の中で９例が７ポイント以上を示し、その全てがＭＤＳであった。また、８例が５−６ポイントを示し、その全例が「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」あるいは「顆粒球のＳＳＣ」に異常があり、その全てがＭＤＳであった。２９例が４ポイント以下であり、うち３例が「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」に異常があり、その内訳はＭＤＳ３例、良性血球減少０例であった。【００６０】
すなわち、この異なった被験者群を用いた解析では、「７ポイント以上」、「５−６ポイントを示し、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率あるいは顆粒球のＳＳＣに異常がある」、あるいは「４ポイント以下で、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比に異常がある」を用いた場合、診断感度は８７．０％、診断特異度は１００％であった。【００６１】
考察３：
新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を従来のＦＣＭパラメーターと併用することで、ＭＤＳを診断する上で、従来以上に実用的なレベルの感度、特異度を持つ検査を構築することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、ＭＤＳの診断、とくに低グレードのＭＤＳと良性血球減少とを鑑別診断することができる。それゆえ本発明は、ＭＤＳの診断及び治療に有用である。【００６３】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図１−１】
2018016656.tif 000003
【図１−２】
2018016656.tif 000004
【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2018016656.tif 000013
【図７】
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【国際調査報告】
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