【手続補正書】
【提出日】令和1年7月16日(2019.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１０％の妊娠率をもたらすインビトロ産生胚を調製する方法であって、
未成熟卵母細胞を第１の培養条件下でインビトロで培養して成熟卵母細胞を得るステップと、
前記成熟卵母細胞を受精させて、接合子を産生するステップと、
前記接合子を剥離するステップと、
前記接合子を、５％酸素（Ｏ２）および５％二酸化炭素（ＣＯ２）の雰囲気を含む第２の培養条件で培養して、前記インビトロ産生胚を調製するステップと、
を含み、
前記インビトロ産生胚は、レシピエント有蹄動物宿主に移植された場合に少なくとも１０％の妊娠率を達成する、方法。
【請求項２】
雌において排卵を誘発し、前記未成熟卵母細胞を前記雌の生殖器から吸引するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記未成熟卵母細胞を前記第１の培養条件においてインビトロで培養する前記ステップが、前記未成熟卵母細胞を３〜９％ＣＯ２および飽和湿度の存在下で３５〜４０℃でインキュベートすることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記成熟卵母細胞を受精するステップが、２０〜２４時間の時間にわたる、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記成熟卵母細胞を受精させる前記ステップが、５％Ｏ２の存在下においてである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記接合子の培養ステップが、５〜９日間にわたり、前記第２の培養条件が、鉱物油下、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が補充された培地を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記培地が、Ｃ４培地、合成卵管流体（ＳＯＦ）培地、ＳＯＦａａ培地、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（１）胚を、１．０〜４Ｍのエチレングリコールからなる凍結溶液中で、５〜３０分間にわたって、１０℃〜３８℃の第１の温度でインキュベートするステップと、
（２）前記胚を容器に装填するステップと、
（３）前記胚を、−２〜−１０℃の温度に、１分間〜６０分間の期間にわたって曝露するステップと、
（４）前記温度を、−３０〜−３６℃の第２の温度に到達するまで、毎分−０．２〜−０．８℃の速度で低下させるステップと、
（５）前記胚を保存のために液体窒素中に浸漬させるステップと、
を含む前記インビトロ産生胚を凍結するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記エチレングリコールが、０．２〜１．３モルの最終濃度で存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記インビトロ産生胚が、桑実胚、初期胚盤胞、胚盤胞、および拡張胚盤胞からなる群から選択される発生段階にある、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記インビトロ産生胚または未成熟卵母細胞が、ボス・タウラス（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ）、ボス・インディカス（Ｂｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ）、および交雑種ボス・インディカス−タウラス（Ｂｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ−ｔａｕｒｕｓ）からなる群から選択される有蹄動物の胚または卵母細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に従って調製された少なくとも１０％の妊娠率をもたらすインビトロ産生胚を含むデバイスであって、
容器と、
前記容器の第１の領域内に位置付けられた凍結溶液中の凍結胚と、を備えるデバイスであって、
前記第１の領域の横に、各々空気を含有する、第２および第３の領域が配置されており、
前記第２および第３の領域の横に、各々解凍溶液を含有する、第４および第５の領域が配置されており、
前記第４および第５の領域の横に、各々空気を含有する、第６および第７の領域が配置されており、
前記第６および第７の領域の横に、各々解凍溶液を含有する、第８および第９の領域が配置されている、デバイス。
【請求項１３】
前記凍結溶液中で前記インビトロ産生胚をインキュベートする前記ステップが、３５℃で１０分間にわたり、
前記容器は、前記凍結溶液中の前記胚がそれらの間に空気のカラムによって交互配置される解凍溶液（ＳＤ）の４つのカラムに取り囲まれるように、ストローのように外形形成されており、前記解凍溶液が０．７５Ｍのエチレングリコールを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
凍結溶液中の凍結胚を収容する容器を、第１の解凍温度の第１の解凍環境に、第１の期間にわたって曝露することであって、
前記凍結溶液中の前記凍結胚が、前記容器の第１の領域内に位置付けられており、
前記第１の領域の横に、各々空気を含有する、第２および第３の領域が配置されており、
前記第２および第３の領域の横に、各々解凍溶液を含有する、第４および第５の領域が配置されており、
前記第４および第５の領域の横に、各々空気を含有する、第６および第７の領域が配置されており、
前記第６および第７の領域の横に、第８および第９の領域が配置されており、前記第１の期間は、前記解凍溶液を解凍するのに十分である、曝露することと、
前記容器を、１０℃〜３８℃の第２の解凍温度の第２の解凍環境に、前記凍結溶液を解凍するのに十分な第２の期間にわたって曝露することと、
前記容器内で前記解凍溶液、前記凍結溶液、および前記胚を混合することと、
を含む、少なくとも１０％の妊娠率をもたらす前記凍結されたインビトロ産生胚を解凍するステップをさらに含む、請求項８、９および１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の解凍温度が１０℃〜３８℃である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の解凍温度が２０℃〜３８℃である、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記解凍環境が液体浴を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記混合ステップが、前記容器の穏やかな撹拌により達成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記胚を容器にローディングする前記ステップが、
（１）第１の解凍溶液を前記容器に添加することと、
（２）第１の気泡および第２の解凍溶液を添加することであって、前記第１の気泡は、前記第１および第２の解凍溶液を分離することと、
（３）第２の気泡および凍結溶液中の前記インビトロ産生胚を添加することであって、前記第２の気泡が、前記第２の解凍溶液および凍結溶液中の前記インビトロ産生胚を分離することと、
（４）第３の気泡を添加することと、
（５）第３の解凍溶液を添加することであって、前記第３の気泡が、凍結溶液中の前記インビトロ産生胚および前記第３の解凍溶液を分離することと、
（６）第４の気泡を添加することと、
（７）第４の解凍溶液を添加することであって、前記第４の気泡が、前記第３および第４の解凍溶液を分離し、前記第１、第２、第３および第４の解凍溶液は、等張希釈培地中にエチレングリコールを含むことと、
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１、第２、第３および第４の解凍溶液が同じである、請求項１９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
いくつかの実施形態では、本発明は、凍結保存胚を解凍する方法であって、容器の第１の領域内に位置付けられた凍結保存溶液中の凍結保存胚を収容する容器を、室温空気に、凍結胚の解凍を開始するのに十分な第１の期間にわたって曝露することであって、その第１の領域の横に、各々空気を含有する、第２および第３の領域が配置されており、その第２および第３の領域の横に、各々解凍溶液を含有する、第４および第５の領域が配置されており、その第４および第５の領域の横に、各々空気を含有する、第６および第７の領域が配置されており、その第６および第７の領域の横に、各々解凍溶液を含有する、第８および第９の領域が配置されている、曝露することと、容器を、室温空気に、凍結胚の解凍を開始するのに十分な第１の期間にわたって曝露することと、容器を、約１０℃〜約３８℃の範囲内の解凍温度を特徴とする解凍環境に、凍結溶液を解凍するのに十分な第２の期間にわたって曝露することと、容器内で解凍溶液、凍結溶液、および胚を混合することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、第１の期間は約１０℃〜約３８℃の範囲内である。いくつかの実施形態では、第２の期間は約２０℃〜約３８℃の範囲内である。いくつかの実施形態では、解凍環境は液体浴であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、解凍温度は約１０℃〜約３８℃の範囲内である。いくつかの実施形態では、混合ステップは、容器の穏やかな撹拌により達成される。いくつかの実施形態では、解凍方法は、胚をレシピエント有蹄動物に移植するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、移植は、曝露ステップもしくは混合ステップと同時に、またはその後に行われる。いくつかの実施形態では、移植ステップは、胚をレシピエント有蹄動物の子宮角に移植することを含む。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
インビトロ産生（ＩＶＰ）有蹄動物胚を得るステップと、
前記胚を凍結保存するステップと、
レシピエント有蹄動物における着床のために胚を移植するステップと、を含む、方法であって、前記凍結保存および前記移植が、少なくとも約１０％の妊娠率が達成されるように行われる、方法。
（項目２）
インビトロ産生胚を得る前記ステップが、
雌から卵母細胞を回収するステップと、
卵母細胞をインビトロで成熟させるステップと、
接合子が産生されるように成熟卵母細胞を精液で受精させるステップと、
前記接合子を剥離および培養するステップと、を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記精液が性選別されている、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記精液が性選別されていない、項目２に記載の方法。
（項目５）
卵母細胞をインビトロで成熟させる前記ステップが、
卵母細胞を、温度、気体の存在または量、湿度、ｐＨ、オスモル濃度、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの条件について、生理学的に適切な範囲内でインキュベートすることを含む、項目２に記載の方法。
（項目６）
気体の前記存在または前記量がＯ２およびＣＯ２からなる群から選択される、項目５に記載の方法。
（項目７）
卵母細胞をインビトロで成熟させる前記ステップが、卵母細胞を３５〜４０℃、３〜９％ＣＯ２、および飽和湿度でインキュベートすることを含む、項目２に記載の方法。
（項目８）
接合子を剥離および培養する前記ステップが、前記接合子を３５〜４０℃、空気中５％ＣＯ２、および飽和湿度でインキュベートすることを含む、項目２に記載の方法。
（項目９）
接合子を剥離および培養する前記ステップが、前記接合子を５％Ｏ２でインキュベートすることをさらに含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
胚を凍結保存する前記ステップが、
胚を、凍結保護剤を含む溶液中でインキュベートするステップと、
前記胚を液体窒素中に浸漬させるステップと、を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記胚を凍結保存する前記ステップが、
胚を、１．０〜４Ｍのエチレングリコールからなる凍結溶液中で、５〜３０分間にわたって、約１０℃〜約３８℃の範囲内の第１の温度でインキュベートするステップと、
前記胚を容器に装填するステップであって、気泡が、胚を、等張希釈剤培地中のエチレングリコールを含む解凍溶液から分離する、装填するステップと、
前記胚を、約−２〜約−１０℃の範囲内の温度に、約１分間〜約６０分間の範囲内の期間にわたって曝露するステップと、
前記温度を、約−３０〜約−３６℃の範囲内の第２の温度に到達するまで、毎分約−０．２〜約−０．８℃の範囲内の速度で低下させるステップと、
前記胚を保存のために液体窒素中に浸漬させるステップと、を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記エチレングリコールが、約０．２〜約１．３モルの範囲内の最終濃度で存在する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
胚がレシピエント雌への直接移植のために凍結保存される、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
胚を移植することが、
胚を、鉱物油下、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が補充された培地中で、約５〜約９日間の範囲内の期間にわたって培養するステップと、
前記胚をレシピエント有蹄動物に移植するステップと、を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記培地が、Ｃ４培地、ＳＯＦ培地、ＳＯＦａａ培地、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記胚が、桑実胚、初期胚盤胞、胚盤胞、および拡張胚盤胞からなる群から選択される発生段階にある、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記レシピエント有蹄動物が同期化される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記レシピエント有蹄動物が自然発情期にある、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記胚が新鮮なもの、ガラス化されたもの、または凍結されたものである、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記有蹄動物がウシである、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記胚が、ボス・タウラス（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ）、ボス・インディカス（Ｂｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ）、および交雑種ボス・インディカス−タウラス（Ｂｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ−ｔａｕｒｕｓ）を含むウシの種から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
凍結保存胚であって、
インビトロ産生（ＩＶＰ）有蹄動物胚を得るステップと、
前記胚を、前記凍結保存胚がレシピエント有蹄動物に移植される場合、少なくとも約１０％の妊娠率が達成されるような条件下で凍結保存するステップと、を含む、方法により産生される、凍結保存胚。
（項目２３）
インビトロ産生胚を得ることが、
雌から卵母細胞を回収するステップと、
卵母細胞をインビトロで成熟させるステップと、
成熟卵母細胞を精液で受精させるステップと、
接合子を剥離および培養するステップと、を含む、項目２２に記載の胚。
（項目２４）
卵母細胞をインビトロで成熟させることが、卵母細胞を、温度、気体の存在または量、湿度、ｐＨ、オスモル濃度、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの条件について、生理学的に適切な範囲内でインキュベートすることを含む、項目２３に記載の胚。
（項目２５）
胚を移植することが、
胚を、鉱物油下、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が補充された培地中で、約５〜約９日間の範囲内の期間にわたって培養するステップと、
前記胚をレシピエント有蹄動物に移植するステップと、を含む、項目２２に記載の胚。
（項目２６）
前記培地が、Ｃ４培地、ＳＯＦ培地、ＳＯＦａａ培地、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目２５に記載の胚。
（項目２７）
前記胚が、桑実胚、初期胚盤胞、胚盤胞、および拡張胚盤胞からなる群から選択される発生段階にある、項目２５に記載の胚。
（項目２８）
容器を含むデバイスであって、
容器と、
前記容器の第１の領域内に位置付けられた凍結保存溶液中の凍結保存胚と、を備えるデバイスであって、
前記第１の領域の横に、各々空気を含有する、第２および第３の領域が配置されており、
前記第２および第３の領域の横に、各々解凍溶液を含有する、第４および第５の領域が配置されており、
前記第４および第５の領域の横に、各々空気を含有する、第６および第７の領域が配置されており、
前記第６および第７の領域の横に、各々解凍溶液を含有する、第８および第９の領域が配置されている、デバイス。
（項目２９）
前記領域のうちの１つ以上がチャンバであり、前記チャンバが、前記チャンバと少なくとも１つの隣接する他の領域との間に障壁を提供する物理的区画実体により画定される、項目２８に記載のデバイス。
（項目３０）
複数の項目２８に記載のデバイス。
（項目３１）
複数の有蹄動物胚を凍結保存するステップと、
前記複数の胚をレシピエント有蹄動物に移植するステップと、を含む方法であって、前記凍結保存および前記移植が、少なくとも３０％の受胎率が達成されるように行われる、方法。
（項目３２）
前記凍結保存ステップが、容器の第１の領域内に凍結保存溶液中の各胚を位置付け、
前記第１の領域の横に、各々空気を含有する、第２および第３の領域が配置されており、
前記第２および第３の領域の横に、各々解凍溶液を含有する、第４および第５の領域が配置されており、
前記第４および第５の領域の横に、  各々空気を含有する、第６および第７の領域が配置されており、
前記第６および第７の領域の横に、  各々解凍溶液を含有する、第８および第９の領域が配置されている、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
胚を凍結する方法であって、
有蹄動物胚を、１．０〜４Ｍのエチレングリコールからなる凍結溶液（ＳＣ）に、１０分間にわたって３５℃で曝露することと、
解凍溶液（ＳＤ）の４つのカラムに取り囲まれた凍結溶液中の各胚がそれらの間に空気のカラムによって交互配置されるように、凍結溶液（ＳＣ）中の前記胚を、ストローのように外形形成された容器内に位置付けることであって、前記解凍溶液が０．７５Ｍのエチレングリコールを含む、位置付けることと、
前記容器を、約０℃〜約−１０℃の範囲内の温度で安定した温度条件に曝露することと、
前記胚の上および下の前記カラムを、前記凍結装置内に設置された２分後に結晶化することと、
前記胚を、１〜６０分間にわたって、約０℃〜約−１０℃の範囲内の温度で維持することと、
前記温度を、約−３０〜約−３６℃の範囲内の第２の温度に到達するまで、毎分約−０．２〜約−０．８℃の範囲内の速度で低下させることと、
前記凍結胚を液体窒素中に浸漬させることと、を含む、方法。
（項目３４）
胚を解凍する方法であって、
容器の第１の領域内に位置付けられた凍結保存溶液中の凍結保存胚を収容する前記容器を、室温空気に、前記凍結胚の解凍を開始するのに十分な第１の期間にわたって曝露することであって、
前記第１の領域の横に、各々空気を含有する、第２および第３の領域が配置されており、
前記第２および第３の領域の横に、各々解凍溶液を含有する、第４および第５の領域が配置されており、
前記第４および第５の領域の横に、各々空気を含有する、第６および第７の領域が配置されており、
前記第６および第７の領域の横に、各々解凍溶液を含有する、第８および第９の領域が配置されている、曝露することと、
前記容器を、約１０℃〜約３８℃の範囲内の解凍温度を特徴とする解凍環境に、前記凍結溶液を解凍するのに十分な第２の期間にわたって曝露することと、
前記容器内で前記解凍溶液、前記凍結溶液、および前記胚を混合することと、を含む、方法。
（項目３５）
前記第１の期間が約１０℃〜約３８℃の範囲内である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記第２の期間が約２０℃〜約３８℃の範囲内である、項目３４または項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記解凍環境が液体浴であるか、またはそれを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
前記解凍温度が約１０℃〜約３８℃の範囲内である、項目３４に記載の方法。
（項目３９）
前記混合ステップが、前記容器の穏やかな撹拌により達成される、項目３４に記載の方法。
（項目４０）
前記胚をレシピエント有蹄動物に移植するステップをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目４１）
前記移植が、前記曝露ステップもしくは前記混合ステップと同時に、またはその後に行われる、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記移植ステップが、前記レシピエント有蹄動物の子宮角を移植することを含む、項目４０に記載の方法。