(57)【要約】  本発明の液体クロマトグラフィー充填剤は、架橋重合体粒子を用いた液体クロマトグラフィー充填剤であって、前記架橋重合体粒子の体積平均粒子径が２μｍ以上、１０μｍ以下であり、架橋重合体粒子ののうち、粒子径が１μｍ以下の微細粒子の含有量が１体積％未満であり、粒度分布における均一係数が１．１５以下であることを特徴とする。
2017204292.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋重合体粒子を用いた液体クロマトグラフィー充填剤であって、
前記架橋重合体粒子の体積平均粒子径が２μｍ以上、１０μｍ以下であり、
架橋重合体粒子のうち、粒子径が１μｍ以下の微細粒子の含有量が１体積％未満であり、
粒度分布における均一係数（粒子全体体積の７５％／２５％比）が１．１５以下であることを特徴とする液体クロマトグラフィー充填剤。
【請求項２】
前記架橋重合体粒子の平均細孔径が１ｎｍ以上、６０ｎｍ以下である請求項１に記載の液体クロマトグラフィー充填剤。
【請求項３】
前記架橋重合体粒子がスチレン−ジビニルベンゼン共重合体である請求項１または２のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー充填剤。
【請求項４】
前記請求項１〜３のいずれか１項に記載の充填剤を液体クロマトグラフィー用ハウジングに充填した液体クロマトグラフィー充填カラム。
【請求項５】
前記液体クロマトグラフィー充填カラムのハウジングが内径８．０ｍｍ以下、長さ３００ｍｍ以下である請求項４に記載の液体クロマトグラフィー充填カラム。
【請求項６】
前記請求項４または５のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー充填カラムを用いた液体クロマトグラフィー分析方法。
【請求項７】
前記液体クロマトグラフィー分析方法の分離モードが高分子試料分析用のサイズ排除クロマトグラフィーである請求項６に記載の液体クロマトグラフィー分析方法。
【請求項８】
前記液体クロマトグラフィー分析方法による、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、分析対象の高分子試料の分子量範囲が１００以上、５００００００以下（ポリスチレン換算）である請求項６または７のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー分析方法。
【請求項９】
前記液体クロマトグラフィー分析方法による、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、高分子試料を含む移動相の溶出容量（高分子試料の保持時間（単位は分）と移動相の流量（単位は、ｍｌ／分）の積）がカラム１本あたり２．０ｍｌ以下であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー分析方法。
【請求項１０】
前記液体クロマトグラフィー分析方法による、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、移動相がテトラヒドロフラン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、ｏ-ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドンからなる群から選ばれた少なくとも１種を用いる請求項６〜９のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー分析方法。
【請求項１１】
前記液体クロマトグラフィー分析方法による、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、移動相の流量が０．３〜３．０ｍｌ／ｍｉｎである請求項６〜１０のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー分析方法。
【請求項１２】
前記粒度分布における均一係数が、
架橋重合体粒子を粒度分布測定装置で撮像して得られた二次元の粒子像から各粒子の円相当径を得て、その円相当径から各粒子の体積を算出し、
算出に使用した全架橋重合体粒子を、体積の小さい方から並べたときの、
２５体積％に相当する架橋重合体粒子の円相当径に対する、７５体積％に相当する架橋重合体粒子の円相当径の比である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー充填剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィー充填剤、液体クロマトグラフィー充填カラム、及び、液体クロマトグラフィー分析方法に関する。
本願は、２０１６年５月２５日に、日本に出願された特願２０１６−１０４４８２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
近年、液体クロマトグラフィーの耐圧、耐流速性を向上させて、分析時間を大幅に短縮させた、超高速液体クロマトグラフィー分析装置が普及している。
超高速液体クロマトグラフィー分析装置向けの充填剤、及びその充填カラムとしては、１〜５μｍのシリカゲル系の多孔質型もしくはコアシェル構造型の充填剤と、これを充填した充填カラムを用いた方法が知られている。前記充填剤を用いた、各種充填カラムが市販されている。【０００３】
一方、汎用の高速液体クロマトグラフィー分析装置を用いたサイズ排除クロマトグラフィー分析方法としては、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン系架橋重合体粒子、メタクリレート系架橋重合体粒子、又はポリビニルアルコール系架橋重合体粒子などの多孔質の架橋重合体粒子を充填剤とし、その充填剤を充填カラムに用いた分析方法が、以前より広く知られている（例えば、非特許文献１参照）。架橋重合体粒子に関しては、架橋性モノマーを用いて懸濁重合法により重合され得ることができる。測定対象の高分子試料の分子量に応じて、溶出及び分離がなされるように、モノマーや希釈剤の種類、比率、及び重合条件などによって、架橋重合体粒子の細孔径はコントロールされている。【０００４】
近年では、サイズ排除クロマトグラフィー用に最適化されたシリカゲル系充填剤を充填した分析カラムを用いる、サイズ排除クロマトグラフィー分析方法も提案されている（例えば、特許文献１参照）。
サイズ排除クロマトグラフィーは、分析対象を、溶液中の成分の分子サイズに基づいて分離する手法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１３−５１４５３８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃ．Ｓ．Ｗｕ，Ｃｏｌｕｍｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｆｏｒ  Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ,１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、超高速液体クロマトグラフィー分析装置向けのシリカゲル系充填カラムのほとんどは、オクタデシル基を導入したＯＤＳカラムと呼ばれるカラムに代表される、主に低分子試料を分析対象とした、逆相クロマトグラフィーおよび親水性相互作用クロマトグラフィー用途のカラムであった。従って、例えば工業用ポリマー素材、高分子添加剤、及び、生体高分子などの、分子量が２０００以上の高分子試料を分析対象とした、サイズ排除クロマトグラフィーには適用できなかった。【０００８】
一方、汎用の高速液体クロマトグラフィー分析装置を用いたサイズ排除クロマトグラフィー分析方法において、充填剤として用いられる上記架橋重合体粒子は、高速性の他に理論段数などのカラム性能が不十分であった。【０００９】
また、サイズ排除クロマトグラフィー用に最適化されたシリカゲル系充填剤の欠点としては高分子試料の測定範囲が狭いことが挙げられる。そのため、例えば分子量が広範囲な高分子試料を測定する場合には、排除限界分子量の異なる複数のカラムを連結するなどの作業が必要であった。また、高分子試料分析用に使用するため粒子の細孔径を大きくする場合、これの耐圧的な強度が低下するため、移動相の流量にも制約があるなどの課題が挙げられる。【００１０】
本発明は、かかる状況に鑑みてなされたものであり、架橋重合体充填剤の特徴である、分子量測定の広範囲性、化学的安定性、及び高い理論段数とを兼ね備え、さらには高速分析も可能とする、架橋重合体粒子を用いた液体クロマトグラフィー充填剤、特にサイズ排除クロマトグラフィー充填剤、液体クロマトグラフィー充填カラム、特にサイズ排除クロマトグラフィー充填カラム、及び、液体クロマトグラフィー分析方法、を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、以下を見出した。すなわち、体積平均粒子径を２μｍ以上、１０μｍ以下とし、粒子径が１μｍ以下の微細粒子の含有量が１体積％未満であり、また粒度分布における均一係数（粒子全体体積の７５％／２５％比）が１．１５以下にされた架橋重合体粒子を、液体クロマトグラフィー充填剤として用いた場合、前記充填剤を用いた充填カラムおよび分析方法において、特にサイズ排除クロマトグラフィーにおいて、高速液体クロマトグラフィー装置にて、１つのカラムを用いて、広範囲の分子量を有する高分子試料を、高い理論段数で分析でき、さらには高速分析も可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
本発明は、上記課題を解決するために、以下第一の態様を供する。【００１３】
本発明の第一の態様は、以下の充填剤である。
（１）  架橋重合体粒子を用いた液体クロマトグラフィー充填剤であって、前記架橋重合体粒子の体積平均粒子径が２μｍ以上、１０μｍ以下であり、架橋重合体粒子のうち、粒子径が１μｍ以下の微細粒子の含有量が１体積％未満であり、粒度分布における均一係数（粒子全体体積の７５％／２５％比）が１．１５以下であることを特徴とする液体クロマトグラフィー充填剤。【００１４】
第一の態様である上記充填剤は、以下の特徴（２）、（３）、又は（１２）を好ましく有する。これら特徴は互いに好ましく組み合わせることができる。
（２）  前記架橋重合体粒子の平均細孔径が１ｎｍ以上、６０ｎｍ以下である。【００１５】
（３）（１）または（２）のいずれかに記載の前記架橋重合体粒子が、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体である。【００１６】
本発明の第二の態様は、以下の液体クロマトグラフィー充填カラムである。
（４）（１）〜（３）、及び（１２）のいずれか１項に記載の充填剤を、液体クロマトグラフィー用ハウジングに充填した、液体クロマトグラフィー充填カラム。【００１７】
第二の態様である上記カラム剤は、以下の特徴（５）を好ましく有する。
（５）（４）に記載の前記液体クロマトグラフィー充填カラムのハウジングが、内径８．０ｍｍ以下、長さ３００ｍｍ以下である。【００１８】
本発明の第三の態様は、以下の液体クロマトグラフィー分析方法である。
（６）（４）または（５）のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー充填カラムを用いた、液体クロマトグラフィー分析方法。【００１９】
第三の態様である上記液体クロマトグラフィー分析方法は、以下の特徴（７）〜（１１）を好ましく有する。（７）〜（１１）の特徴は、単独で有されても、互いに組み合わされても良い。
（７）（６）に記載の前記液体クロマトグラフィー分析方法の分離モードが、高分子試料分析用のサイズ排除クロマトグラフィーである。【００２０】
（８）（６）または（７）に記載の前記液体クロマトグラフィー分析方法による分離モードが、サイズ排除クロマトグラフィーであり、前記サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、分析対象の高分子試料の分子量範囲が１００以上、５００００００以下（ポリスチレン換算）である。【００２１】
（９）（６）〜（８）のいずれか１つに記載の前記液体クロマトグラフィー分析方法による分離モードが、サイズ排除クロマトグラフィーであり、前記サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、高分子試料を含む移動相の溶出容量（高分子試料の保持時間（単位は分）と移動相の流量（単位は、ｍｌ／分）の積）が、カラム１本あたり２．０ｍｌ以下である。【００２２】
（１０）（６）〜（９）のいずれか１つに記載の前記液体クロマトグラフィー分析方法による分離モードが、サイズ排除クロマトグラフィーであり、前記サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、移動相がテトラヒドロフラン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、ｏ-ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドンからなる群から選ばれた少なくとも１種を用いる。【００２３】
（１１）（６）〜（１０）のいずれか１つに記載の前記液体クロマトグラフィー分析方法による分離モードが、サイズ排除クロマトグラフィーであり、前記サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、移動相の流量が０．３〜３．０ｍｌ／ｍｉｎである。
（１２）（１）〜（３）のいずれか１つに記載の液体クロマトグラフィー充填剤において、
前記粒度分布における均一係数が、
架橋重合体粒子を粒度分布測定装置で撮像して得られた二次元の粒子像から各粒子の円相当径を得て、その円相当径から各粒子の体積を算出し、
算出に使用した全架橋重合体粒子を、体積の小さい方から並べたときの、
２５体積％に相当する架橋重合体粒子の円相当径に対する、７５体積％に相当する架橋重合体粒子の円相当径の比である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、分子量測定の高範囲性、および高い理論段数を兼ね備え、さらには高速分析も可能にする、液体クロマトグラフィー充填剤、液体クロマトグラフィー充填カラム、及び、液体クロマトグラフィー分析方法を提供できる。
本発明の液体クロマトグラフィー充填剤に用いる架橋重合体粒子は、超高速液体クロマトグラフィー分析装置においても十分なカラム性能を得ることができるように、架橋重合体粒子の平均粒子径および微細粒子の含有量の制御がされた粒子となっている。カラム性能としては、例えば理論段数（半値幅法、Ｎ）が挙げられ、Ｎ＝５．５４×（ピークの溶出時間／ピーク高さの５０％におけるピーク幅）２の計算式にて算出することができる（日本薬局方）。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】高分子試料の較正曲線の例である。
【図２】実施例５の充填カラムを用いて流量１．５ｍｌ／ｍｉｎでポリスチレン標準液７種を測定したクロマトグラム（重ね書き）である。
【図３】実施例５の較正曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を適用した液体クロマトグラフィー充填剤、液体クロマトグラフィー充填カラム、及び、液体クロマトグラフィー分析方法について、その構成を説明する。なお、本発明は、以下に説明した具体的構成に限定されるものではなく、その効果を奏する範囲で適宜変更して実施することが可能である。また以下の例は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。発明を逸脱しない範囲で、数値や種類や大きさや特性などについて、変更や省略や追加をする事ができる。また、問題の無い限り、互いの特徴や好ましい例を、組み合わせて良い。
【００２７】
本発明の液体クロマトグラフィー充填剤は、架橋重合体粒子を用いた充填剤であって、前記架橋重合体粒子の体積平均粒子径が２μｍ以上、１０μｍ以下であり、架橋重合体粒子のうち、粒子径が１μｍ以下の微細粒子の含有量が１体積％未満であり、粒度分布における均一係数（粒子全体体積の７５％／２５％比）が１．１５以下である。
なお本発明の液体クロマトグラフィー充填剤は、前記架橋重合体粒子のみからなることが好ましい。
ここで、本明細書において架橋重合体粒子の体積平均粒子径とは、以下の粒子径を意味する。すなわち、２０００個以上の架橋重合体粒子を粒度分布測定装置で撮像し、得られた二次元の粒子像（静止画像が好ましい）から、各粒子の円相当径（粒子像の投影面積と同じ面積を持つ円の直径）を得る。その円相当径から各粒子の体積を算出して、算出された体積を基準に、平均化して得た粒子径である。このとき、各粒子は、上記の円相当径と同一の直径を有する球体とみなす。また２０００個以上の測定は、平均値を得るために十分な測定数であると判断される。測定数の具体例を挙げれば、例えば６５００個などが挙げられる。また前記粒子径は、懸濁液などの液体中に含まれた状態で測定された値であっても良い。
また、本明細書において、粒子径が１μｍ以下の微細粒子の含有量とは、以下の割合をいう。すなわち、上記と同様の方法で各粒子の体積を算出し、更にこれらを合計した全体積を算出し、架橋重合体粒子の全体積のうち、円相当径が１μｍ以下の微細粒子の、全粒子の体積に対する割合をいう。
また、本明細書において均一係数（粒子全体体積の７５％／２５％比）とは、上記と同様の方法で各粒子の体積を算出し、算出に使用した全ての架橋重合体粒子を、体積の小さい方から順に並べたとき、２５体積％に相当する架橋重合体粒子の円相当径（２５％）に対する、７５体積％に相当する架橋重合体粒子の円相当径（７５％）の比をいう。すなわち、（その粒子径以下の存在比率が７５体積％となる粒子径）／（その粒子径以下の存在比率が２５体積％となる粒子径）である。
【００２８】
架橋重合体粒子の平均粒子径、及び微細粒子の含有量は、上述のように粒度分布測定装置を用いて測定することができる。十分なカラム性能を得るために、架橋重合体粒子の平均粒子径は２．０μｍ以上、１０．０μｍ以下であり、２．０μｍ以上、７．０μｍ以下であることが好ましく、２．０μｍ以上、５．０μｍ以下であることがより好ましい。２．０μｍ以上であれば、カラムの圧力上昇が回避され易くなる。また、１０μｍを越えると、カラム性能が低下する傾向にある。
【００２９】
また、微細粒子の含有量は、１μｍ以下の微細粒子が１体積％未満であり、１μｍ以下の粒子が０．５体積％以下であることがより好ましい。１μｍ以下の粒子が１％体積未満であれば、圧力上昇によるカラムへの細密充填の困難性が回避され、また、理論段数が良好となり、高速分析も可能となる。
【００３０】
また、架橋重合体粒子の粒子径は、優れた均一性を有する。均一性は、例えば均一係数（体積換算）で表すことができる。均一係数（体積換算）は、前述の方法によって算出される。本発明による架橋重合体粒子の均一係数（体積換算）は１．１５以下であり、１．１０以下であることが好ましい。１．１５以下であれば、カラム性能が低下するのを回避できる。なお均一係数の下限値は、定義により、１．００である。
【００３１】
本発明の液体クロマトグラフィー充填剤をサイズ排除クロマトグラフィーに用いる場合には、架橋重合体粒子の細孔径が高分子試料の分離に影響を与える。架橋重合体粒子の細孔径は、重合時のモノマーおよび希釈剤の種類や仕込み比率、濃度などによってコントロールすることができる。
本発明における架橋重合体粒子の平均細孔径は、測定する高分子試料の分子量範囲によっても異なるが、１ｎｍ以上、６０ｎｍ以下であることが好ましく、５ｎｍ以上、５０ｎｍ以下であることがより好ましい。１ｎｍ以上であれば、高分子試料は分子量範囲に関わらず充填剤とのサイズ排除効果を奏し、６０ｎｍ以下であれば、充填剤の物理的強度が低下するのを回避できる。
上記の架橋重合体粒子は、測定する高分子試料の分子量範囲により１種類で用いてもよいし、２種以上を混合して使用してもよい。
また、本明細書において平均細孔径とは、窒素吸着測定を行い、窒素吸着等温線からＢＪＨ法により求めたものをいう。より具体的には、架橋重合体粒子０．２ｇを窒素吸着させて測定を行い、体積平均で算出したものである。
【００３２】
本発明の液体クロマトグラフィー充填剤に用いる架橋重合体粒子は、液体クロマトグラフィーに用いられる材料であれば、その種類自体の制約はない。しかしながら、前記粒子は、各種溶媒に対して化学的および物理的に安定で、分解・変質を起こさないこと、圧力に対しての機械的強度の安定性も有することが好ましい。
本発明における架橋重合体粒子としては、例えば、少なくとも１種の架橋性単量体を重合した架橋重合体粒子、又は、少なくとも１種の架橋性単量体及び少なくとも１種の非架橋性単量体を共重合した架橋重合体粒子を使用できる。架橋性単量体としては、例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類、芳香族系架橋性単量体類等が挙げられる。非架橋性単量体としては、（メタ）アクリル酸アルキル類、芳香族系非架橋性単量体等が挙げられる。
具体的には、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体粒子、架橋型ポリヒドロキシ（メ）アクリレート粒子、及び架橋型ポリビニルアルコール粒子などを用いることができる。特にサイズ排除クロマトグラフィーでの高速分析においては化学的、物理的ならびに機械的強度が安定であり、また十分なカラム性能を得るために、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体粒子が好ましく用いることができる。
【００３３】
本発明に用いる架橋重合体粒子の重合方法（形成方法）については特に制約はない。例えば、懸濁重合法のほか、例えば、細孔径が制御されたシラス多孔質ガラス（ＳＰＧ）膜と内圧式マイクロキットＭＮ−２０（ＳＧＰテクノ株式会社製）等を用いた、ＳＰＧ膜乳化重合法や、マイクロチャネル乳化装置（イーピーテック製）等を用いた、マイクロチャネル乳化重合法により、重合することができる。なお、ＰＧ膜乳化重合法やマイクロチャネル乳化重合法等に使用される条件は、任意に選択できる。例えば、所定の多数の細孔が形成された膜や基板を用いて、油相を前記膜や基板を通過させ、通過させた先で、分散の為に使用される液体中で液滴を得ることで、乳化をおこなってもよい。この場合、前記膜や基板の各種条件、例えば細孔の径等は任意に選択してよい。このような乳化重合においては、必要が無ければ、通常の乳化重合に使用される強い機械的撹拌は行わなくても良い。また前記乳化の後で、ほぼ均一な径を持って得られた液滴を、任意で加熱処理等を行っても良い。ただし本発明はこれらの方法や装置の例のみに限定されない。
また、重合後に篩や分級装置（例えば半自由渦式分級機エアロファインクラシファイアＡＣ（日清エンジニアリングイーピーテック株式会社製）など）を使用した分級を行い、平均粒子径、粒子の均一性および微細粒子の含有量を調節することもできる。
【００３４】
本発明に用いる架橋重合体粒子に関して、重合時に使用する油層（油相、モノマーおよび希釈剤の混合溶液）、分散剤、及び重合開始剤については、その種類自体に特に制約はなく、特に問題のない限り任意に選択できる。油層に用いるモノマーは、造粒される架橋重合体粒子に対応したモノマーが用いられる。例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体粒子が製造される場合には、スチレン系モノマーとしてはスチレン、２−メチルスチレン、３−メチルスチレン、４−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、２、５−ジメチルスチレン、３，５−ジメチルスチレンおよび２、４，６−トリメチルスチレンなどを用いることができる。また、ジビニルベンゼンモノマーとしてはｏ−ジビニルベンゼン、ｍ−ジビニルベンゼン、ｐ−ジビニルベンゼンを用いることができる。スチレン系モノマーとジビニルベンゼンモノマーの重合比率は任意にコントロールすることができる。サイズ排除クロマトグラフィー用途に好ましいように、粒子の十分な強度および性能を得るためには、スチレン系モノマーの比率は３０質量％以上、７０質量％以下であることが好ましく、４０質量％以上、７０質量％以下であることがより好ましく、５０〜６５質量％がさらに好ましい。スチレン系モノマーの比率が３０質量％以上、７０質量％以下であれば、いずれもサイズ排除クロマトグラフィー用途で十分な強度および性能が得られる。
【００３５】
また、油層にてモノマーを希釈するために用いられる希釈剤は、その種類については特に制約はない。例えばトルエン、エチルベンゼン、ｏ−キシレン、クロロベンゼン、ヘキサン、シクロヘキサン、イソオクタンなどの有機溶媒を用いることができる。油層を作製する際に希釈剤とモノマーの親和性の差や比率を調節することで、架橋重合体粒子の細孔径をコントロールすることができる。
重合において粒子を形成する液滴の分散に用いられる分散剤には、界面活性剤の水溶液が好ましく用いられる。本発明においてはポリビニルアルコールの水溶液が特に好ましく用いられる。分散剤中の界面活性剤の濃度や分散剤の添加量により、架橋重合体粒子の収率や粒度分布などに影響を与えることができる。
重合開始剤にはその種類については特に制約はない。例えば、アゾ系重合開始剤（例えば２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）など）、有機過酸化物（例えば過酸化ベンゾイル、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドなど）のラジカル開始剤が好ましく用いられる。
【００３６】
本発明の液体クロマトグラフィー充填カラムとしては、平均粒子径および微細粒子の含有量をコントロールした架橋重合体粒子を液体クロマトグラフィー用ハウジングに充填したものが用いられる。液体クロマトグラフィー用ハウジングの材質には制約はない。各種溶媒に対する化学的安定性や高速分析時の耐圧性を得るために、ステンレス管またはＰＥＥＫ管を使用することが好ましく、ステンレス管を使用することがより好ましい。ステンレス管としては、その内面を有機ポリマーで被覆したものを使用することもできる。
また、ハウジングの耐圧については４０ＭＰａ以上であることが好ましく、６０ＭＰａ以上であることがより好ましく、７５ＭＰａ以上であることがさらに好ましい。
【００３７】
本発明の液体クロマトグラフィー用ハウジングはサイズの制約はない。高速分析時にカラム性能を十分に得るために、内径は０．５〜８．０ｍｍであることが好ましく、１．０〜６．０ｍｍであることがさらに好ましく、２．０〜４．６ｍｍであることが特に好ましい。０．５ｍｍ以上であると、架橋重合体粒子の充填が困難とならない。また８．０ｍｍ以下であると、高速分析時にカラム性能が十分得られる。
また、長さについては１０〜３００ｍｍであることが好ましく、５０〜１５０ｍｍであることが特に好ましい。１０ｍｍ以上であると、測定する試料が十分にカラム内に保持、分離できる。また３００ｍｍ以下であると、試料の溶出時間が著しく遅くなることがなく、カラム圧力も大きくならないことから、高速分析での使用に適当である。
【００３８】
本発明による液体クロマトグラフィー充填剤および充填カラムは、超高速液体クロマトグラフィー装置を含む一般的な液体クロマトグラフィー装置であれば、制限なく使用することができる。
液体クロマトグラフィーにおける分離モードには、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィーなどが挙げられる。この中でも、分子量２０００以上の高分子試料を測定対象としたサイズ排除クロマトグラフィーにおいて、好ましく用いることができる。
さらに、本発明の液体クロマトグラフィー分析方法では、高分子試料を短時間で測定できる。サイズ排除クロマトグラフィーでは、高分子試料の保持時間（分）と移動相の流量（ｍｌ／分）の積である溶出容量（ｍｌ）によって、高分子試料の分子量を測定することができる。本発明では、高分子試料の溶出容量がカラム１本あたり２．０ｍｌ以下の条件で、好適に分析を行うことができる。
【００３９】
本発明による液体クロマトグラフィー分析方法では、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、各種分子量を持つ高分子試料の分子量を測定することができる。この分子量を測定するには、以下の方法を用いることができる。まず、分子量が既知のポリマー標準試料を用いて、横軸に溶出容量（ｍｌ）、縦軸に分子量の対数目盛からなる較正曲線を作製する。この較正曲線を用いて、分子量が不明である高分子試料の分子量を、ポリマー標準試料の分子量から換算して求めることができる。較正曲線の直線性（相関係数の２乗値（Ｒ２乗数値））が良好な範囲を、分析対象である高分子試料の分子量範囲（分子量を確認する範囲）として表すことができる。Ｒ２乗数値は１に近いほど良好であり、０．９９以上が好ましい（図１と図３を参照。）。
【００４０】
サイズ排除クロマトグラフィーでは、細孔を有する充填剤を用い、試料中の成分の分子量により細孔中に入ることができる程度が異なることを利用する。すなわち、分子量が小さいものは細孔の奥深くまで入ることができるが、分子量が大きいものは細孔に入ることができず、その中間の分子量のものは細孔の途中まで入ることができる。孔の奥に入ることができる成分はそれだけカラムの中に留まる時間が長くなるので、カラムから出てくる順序は、分子量が大きいもの、中間のもの、小さいものの順となる。このようにして、試料中の各成分の分子量の順に分離させる。
【００４１】
高分子試料の較正曲線の例を図１に示す。排除限界分子量を越える分子量の成分は全て同じ時間に出てくる。較正曲線には、直線性のある部分と、直線性のない部分とがあり、分子量分布を求めるためには較正曲線の直線性のある部分だけが使用できる。「排除限界分子量」とは、孔の中に入ることのできない最も小さい分子量のものである。カラムの排除限界分子量を越えた分子量の成分同士は、それらの分子量に差がある場合でも、同時にカラムから出てくるため、分離することができない。
分子量が既知のポリマー標準試料としてはポリスチレンなどが挙げられる。
【００４２】
本発明を用いた高分子試料の分子量測定は、架橋重合体粒子の種類（細孔径）にもよるが、１００以上、５００００００以下（ポリスチレン換算）の分子量範囲において好ましく測定することができ、１００以上、２００００００以下の分子量範囲においてより好ましく測定することができる。５００００００以下であれば、高分子試料が架橋重合体粒子の細孔内に入ることができないためにカラムに保持されずに溶出されてしまうことが回避される。１００以上であれば、検量線の直線性が得られないため正しい分子量を測定することが困難になることが回避される。
【００４３】
本発明の高速分析向け液体クロマトグラフィー分析方法は、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、特に移動相に各種有機溶媒を用いる有機溶媒系サイズ排除クロマトグラフィー（ゲル浸透クロマトグラフィー：ＧＰＣ）において好ましく用いることができる。
有機溶媒系サイズ排除クロマトグラフィーでは、移動相の有機溶媒として、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、ｏ-ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン、アセトン、メチルエチルケトン、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドンなどが好ましく用いられる。本発明における高速分析向け液体クロマトグラフィー分析方法では、前記溶媒群からなる少なくとも１種を用いることができ、２種以上の溶媒を混合して使用することも可能である。
【００４４】
本発明の液体クロマトグラフィー分析方法では、サイズ排除クロマトグラフィーにより高分子試料を高速分析することが可能である。通常の流量でも使用できるが、より高速に分析を行うために、移動相の流量を上げることも可能である。通常の測定では、流量は０．３ｍｌ／ｍｉｎ以上、３．０ｍｌ／ｍｉｎ以下が好ましく用いられる。高速で分析を行う場合、その流量は０．５ｍｌ／ｍｉｎ以上であることが好ましく、１．１ｍｌ／ｍｉｎ以上であることがより好ましく、１．５ｍｌ／ｍｉｎ以上であることがさらに好ましい。また、上限は３．０ｍｌ／ｍｉｎ以下であることが好ましい。３．０ｍｌ／ｍｉｎ以下であれば、高分子試料の分子鎖切断を生じて正しい分子量を測定できないことが回避される。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。【００４６】
以下の実施例における、架橋重合体粒子の粒子径が１μｍ以下の微細粒子の含有量、体積平均粒子径、及び均一係数（いずれも体積換算）は、上述した測定方法に基づいて、フロー式粒子像分析装置ＦＰＩＡ−３０００（商品名。シスメックス（株）製）によって得られた値である。測定粒子数は、約６５００であった。また、細孔径は、上述した測定方法（ＢＪＨ法）に基づいて、ＡＳＡＰ ２０２０（商品名。マイクロメリティックス社製）によって得られたものである。【００４７】
（実施例１）
モノマーとして４−メチルスチレンとｐ−ジビニルベンゼンを５４：４６の比率で用いて、さらに希釈剤としてトルエンとイソオクタンの混合液（トルエン：イソオクタン＝７８：２２）を前記モノマーに対して４２質量％添加して、油層（油相、モノマーおよび希釈剤の混合溶液）を作製した。２質量％ポリビニルアルコール水溶液を分散剤として用いて、前記油層を用いてマイクロチャネル法（乳化重合法）により重合を行った。マイクロチャネル法においては、マイクロチャネル乳化装置（イーピーテック製）を用いた。その結果、体積平均粒子径２．４μｍ、均一係数１．０５、粒子径が１μｍ以下の微細粒子が測定限界（０．０５体積％）以下であり、平均細孔径４ｎｍである、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体（粒子）を得た。
得られたスチレン−ジビニルベンゼン共重合体を用いて、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレス製ハウジング（株式会社杉山商事製）に、充填圧力４０ＭＰａにて、トルエン：メタノール＝８０：２０（質量比）混合溶液を通液して充填を行った。【００４８】
（実施例２）
実施例１と同じ油層および分散剤を用いて、実施例１の前記装置の異なる条件を用いて、マイクロチャネル法により重合を行うことで、体積平均粒子径３．４μｍ、均一係数１．０５、粒子径が１μｍ以下の微細粒子が測定限界（０．０５体積％）以下であり、細孔径４ｎｍであるスチレン−ジビニルベンゼン共重合体（粒子）を得た。
得られたスチレン−ジビニルベンゼン共重合体を用いて、実施例１と同じハウジングに、充填圧力３０ＭＰａにてトルエン：メタノール＝８０：２０（質量比）混合溶液を通液して充填を行った。【００４９】
（実施例３）
モノマーとして４−メチルスチレンとｐ−ジビニルベンゼンを５４：４６（質量比）の比率で用いて、希釈剤としてトルエンとイソオクタンの混合液をモノマーに対して５１質量％添加して油層を作製した。２質量％ポリビニルアルコール水溶液を分散剤に用いて、実施例１と同様にしてマイクロチャネル法により重合を行うことで、体積平均粒子径３．４μｍ、均一係数１．０５、粒子径が１μｍ以下の微細粒子が測定限界（０．０５体積％）以下であり、平均細孔径５０ｎｍであるスチレン−ジビニルベンゼン共重合体（粒子）を得た。
得られたスチレン−ジビニルベンゼン共重合体を用いて、実施例２と同じハウジング、充填条件にて充填を行った。【００５０】
（実施例４）
架橋重合体粒子として、実施例２および３で用いたスチレン−ジビニルベンゼン共重合体をそれぞれ実施例２の粒子４０質量％、実施例３の粒子６０質量％用いてミックス粒子として、実施例２と同じハウジング、充填条件にて充填を行った。【００５１】
（比較例１）
モノマーとして４−メチルスチレンとｐ−ジビニルベンゼンを５４：４６（質量比）の比率で用いて、希釈剤としてトルエンとイソオクタンの混合液をモノマーに対して４２質量％添加して油層を作製した。実施例１で用いた油層や分散液と同じ量を使用して、２質量％ポリビニルアルコール水溶液を分散剤に用いて、前記油層を用いた懸濁重合法による重合を行った。この後に、更に分級を行うことで、体積平均粒子径３．４μｍ、均一係数１．１８、粒子径が１μｍ以下の微細粒子が１体積％含まれており、平均細孔径５０ｎｍである、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体（粒子）を得た。
得られたスチレン−ジビニルベンゼン共重合体を用いて、実施例２と同じハウジング、充填条件にて充填を行った。【００５２】
（比較例２）
モノマーとして４−メチルスチレンとｐ−ジビニルベンゼンを５４：４６（質量比）の比率で用いて、希釈剤としてトルエンとイソオクタンの混合液をモノマーに対して４２質量％添加して油層を作製した。実施例１で用いた油層や分散液と同じ量を使用して、２質量％ポリビニルアルコール水溶液を分散剤に用いて、前記油層を用いた懸濁重合法による重合を行った。この後、分級は行わず、体積平均粒子径３．４μｍ、均一係数１．２５、粒子径が１μｍ以下の微細粒子が５体積％含まれており、平均細孔径５０ｎｍであるスチレン−ジビニルベンゼン共重合体（粒子）を得た。
得られたスチレン−ジビニルベンゼン共重合体を用いて、実施例２と同じハウジング、充填条件にて充填を行った。【００５３】
（充填カラムの評価）
実施例および比較例で得られた充填カラムについて、高速液体クロマトグラフ分析装置Ｎｅｘｅｒａ−ｉ（株式会社島津製作所製）を用い、検出器には紫外検出器（ＵＶ、波長：２５４ｎｍ）を用いて、カラム評価を行った。移動相にはテトラヒドロフランを用いて、流量を０．３ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を４０℃とした。測定試料には、架橋重合体粒子の充填性能評価（理論段数）にはフタル酸ジシクロへキシルを用いて、高分子試料の分離評価（高分子試料の測定可能な分子量範囲および較正曲線の直線性）には、実施例１および２：ポリスチレン標準液４種（分子量５００、１３００、２９００、１万）、実施例３および比較例１：ポリスチレン標準液５種（分子量１万、５．１万、１２．７万、７８万、１６３万）、実施例４：ポリスチレン標準液６種（分子量５００、２９００、１万、５．１万、１２．７万、１６３万）を用いた。【００５４】
実施例および比較例の充填カラムを評価した結果、それらのカラム圧力、フタル酸ジシクロへキシルにいたるまでのカラム１本あたりの溶出容量、測定できる分子量範囲、較正曲線の直線性（Ｒ２乗数値）、フタル酸ジシクロへキシルの理論段数を表１に示す。【００５５】
【表１】
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【００５６】
表１の結果からわかるように、実施例１〜４のいずれの充填カラムもフタル酸ジシクロへキシルが溶出するまでのカラム１本あたりの溶出容量は２．０ｍｌ以下であり、カラム１本で広範囲の分子量を有する高分子試料の測定ができた。また、高分子試料の測定可能な分子量範囲における較正曲線の直線性（Ｒ２乗数値）も０．９９以上であり良好であった。また理論段数（Ｎ）も９８００段／本以上であった。【００５７】
一方、比較例１の充填カラムを評価した結果では、フタル酸ジシクロへキシルが溶出するまでのカラム１本あたりの溶出容量は２．０ｍｌ以下であり、高分子試料の測定可能な分子量範囲における較正曲線の直線性（Ｒ２乗数値）も０．９９以上と良好な結果が得られた。しかしながら、理論段数（Ｎ）は５５０２段／本と低下がみられた。理論段数の低下は高分子試料のピーク形状の悪化および分離の悪化にも影響を及ぼすため、高速分析を行うには好ましくない。
また、比較例２はハウジングへの充填を試みたが、圧力負荷が高いためトルエン：メタノール＝８０：２０（質量比）混合溶液を通液することができず充填することは不可能であった。【００５８】
（実施例５）
（高速分析の評価）
実施例４の充填カラムを用いて、流量のみ１．５ｍｌ／ｍｉｎに変更して、ポリスチレン標準液７種（分子量５００、１３００、２９００、１万、１２．７万、７８万、１６３万）を測定した。
これらのクロマトグラム（重ね書き）を図２に示す。ポリスチレン標準液が１．２分以内に良好に溶出されることが確認できた。
また、これらの較正曲線を図３に示す。較正曲線の直線性（Ｒ２乗数値）も０．９９５６であり良好であった。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、分子量の高範囲性、化学的安定性、小粒径性、均一粒径性を兼ね備えた架橋重合体粒子を用いた液体クロマトグラフィー充填剤を提供できる。
本発明の液体クロマトグラフィー充填剤、液体クロマトグラフィー充填カラム、及び、液体クロマトグラフィー分析方法は、特にサイズ排除クロマトグラフィーを利用する超高速液体クロマトグラフィー装置にて、分離性能、耐圧および耐流速性に優れている。このため、工業用ポリマー素材、高分子添加剤、生体高分子などの高分子試料を分析する分野に有用である。
【符号の説明】
【００６０】
１  分子量１６３万のポリスチレンのピーク
２  分子量７８万のポリスチレンのピーク
３  分子量１２．７万のポリスチレンのピーク
４  分子量１万のポリスチレンのピーク
５  分子量２９００のポリスチレンのピーク
６  分子量１３００のポリスチレンのピーク
７  分子量５００のポリスチレンのピーク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2017204292.tif 000008
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