【手続補正書】
【提出日】令和1年8月2日(2019.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明は、治療上有効な量の組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片を、必要とする患者に投与することによって、神経系の疾患または障害を治療または修正する方法を提供する。変更形態において、組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、リピートＲ３からＲ５によって形成されるリーリン断片（Ｒ３−Ｒ５）、リーリン断片リピートＲ５に結合したリーリン断片リピートＲ３（Ｒ３＋Ｒ５）、リーリン断片リピートＲ３、リピートＲ３からＲ６によって形成されるリーリン断片（Ｒ３−Ｒ６）、リーリン断片リピートＲ６に結合したリーリン断片リピートＲ３（Ｒ３＋Ｒ６）であり、ここで、Ｒ３は全長リーリンのリピート領域３であり、Ｒ４は全長リーリンのリピート領域４であり、Ｒ５は全長リーリンのリピート領域５であり、Ｒ６は全長リーリンのリピート領域６である。オプションとして、リーリンスプライス断片がR３＋R５である場合、二つのリピート領域、即ちＲ３とＲ５は、リピート領域３ループ、リピート領域５ループ、またはそれらの組み合わせによって結合される。または、リーリンスプライス断片がR３＋R６である場合、二つのリピート領域、即ちＲ３とＲ６は、リピート領域３ループ、リピート領域６ループ、またはそれらの組み合わせによって結合される。具体例として、組換えリーリン断片またはリーリンスプライス断片は、リーリン断片リピートR３、リーリン断片リピートR４、リーリン断片リピートR５、リーリン断片リピートR６、リーリン断片リピートR３からR４、リーリン断片リピートR３からR５、リーリン断片リピートR３からリピート領域R６、リーリン断片リピートR４からR５、リーリン断片リピートR５からR６、リーリン断片リピートR５に結合したリーリン断片リピートR３、リーリン断片リピートR６に結合したリーリン断片リピートR３、リピートR６に結合したリーリン断片リピートR４、または、前記リーリン断片若しくはリーリンスプライス断片の組み合わせである。本発明の変更形態において、神経系の疾患または障害は、神経変性疾患、神経傷害（neuronal insult）、神経障害または卒中である。具体例として、神経障害は、脆弱Ｘ症候群、ウィリアムズ症候群、レット症候群、ダウン症候群、アンジェルマン症候群、自閉症、リーリン欠損症、双極性障害、鬱病、統合失調症からなるグループから選択される。または、神経系の疾患または障害は、神経傷害またはアルツハイマー病である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
オプションとして、リーリン断片またはリーリンスプライス断片は、非経口注射によって投与される。具体例として、リーリン断片またはリーリンスプライス断片は、動脈内、静脈内、脳内または脳室内に注射される。本発明の具体例として、リーリン断片またはリーリンスプライス断片は、患者の脳室内に両側注射される。変更形態において、リーリン断片またはリーリンスプライス断片は、約１０μＭ から約５ｎＭのＣＮＳ液内リーリン濃度を得るように投与される。オプションとしての濃度には、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、１００μＭ、１１０μＭ、１２０μＭ、１３０μＭ、１４０μＭ、１５０μＭ、１６０μＭ、１７０μＭ、１８０μＭ、１９０μＭ、２００μＭ、２２０μＭ、２２５μＭ、２４０μＭ、２５０μＭ、２７０μＭ、２７５μＭ、２８０μＭ、３００μＭ、３２０μＭ、３２５μＭ、３４０μＭ、３５０μＭ、３７０μＭ、３７５μＭ、３８０μＭ、４００μＭ、４２０μＭ、４２５μＭ、４４０μＭ、４５０μＭ、４７０μＭ、４７５μＭ、４８０μＭ、５００μＭ、５２０μＭ、５２５μＭ、５４０μＭ、５５０μＭ、５７０μＭ、５７５μＭ、５８０μＭ、６００μＭ、６２０μＭ、６２５μＭ、６４０μＭ、６５０μＭ、６７０μＭ、６７５μＭ、６８０μＭ、７００μＭ、７２０μＭ、７２５μＭ、７４０μＭ、７５０μＭ、７７０μＭ、７７５μＭ、７８０μＭ、８００μＭ、８２０μＭ、８２５μＭ、８４０μＭ、８５０μＭ、８７０μＭ、８７５μＭ、８８０μＭ、９００μＭ、９２０μＭ、９２５μＭ、９４０μＭ、９５０μＭ、９７０μＭ、９７５μＭ、９８０μＭ、１ｎＭ、１．１ｎＭ、１．２ｎＭ、１．３ｎＭ、１．４ｎＭ、１．５ｎＭ、１.６ｎＭ、１．７ｎＭ、１．８ｎＭ、１．９ｎＭ、２．０ｎＭ、２．１ｎＭ、２．２ｎＭ、２．３ｎＭ、２．４ｎＭ、２．５ｎＭ、２．６ｎＭ、２．７ｎＭ、２．８ｎＭ、２．９ｎＭ、３．０ｎＭ、３．１ｎＭ、３．２ｎＭ、３．３ｎＭ、３．４ｎＭ、３．５ｎＭ、３．６ｎＭ、３．７ｎＭ、３．８ｎＭ、３．９ｎＭ、４．０ｎＭ、４.１ｎＭ、４．２ｎＭ、４．３ｎＭ、４．４ｎＭ、４．５ｎＭ、４．６ｎＭ、４．７ｎＭ、４．８ｎＭ、４．９ｎＭおよび ５．０ｎＭを含む。例えば、治療濃度は、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満または約５ｎＭである。用量は、動物体内のタンパク質分布と血液脳関門を通じたアクセスに基づいて計算することができる。非限定的例として、リーリンは、患者の体重３０〜３６ｇごとに、５ｎＭの組成物を、１μｌで投与される。更に、治療は継続的でもよく、または、治療計画が、１年未満、６か月未満、３か月未満、１か月未満、１週間未満または約１日の間、継続してもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
【図１】成体のシナプス可塑性におけるリーリン経路の説明図である。
【図２】成体の脳におけるリーリンタンパク質分解を示す説明図である。成体の脳においては、全長リーリンは、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンによって、細胞外間隙に放出される。この全長リーリンが、上皮増殖因子（ＥＧＦ）リピート２−３（Ｒ２−Ｒ３）および６−７（Ｒ６−Ｒ７）の間（点線で示されている）で、様々な酵素により、酵素的に切断される。例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、メプリンαおよびβは、リーリンをＲ６とＲ７の間で切断することが示されており（Kohno, et al., Mechanism and significance of specific proteolytic cleavage of Reelin. Biochem. Biophys. Res.Commun. 2009;380: 93-97、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献２３）、一方、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−９は、リーリンをＲ２とＲ３の間で切断する（非特許文献１６）。ＡＤＡＭＴＳ ４および５は、リーリンを両方の部位で切断することが示されている（非特許文献１６、非特許文献２１）。他の、未特定のプロテアーゼも、リーリンプロセシングに関与している可能性がある。
【図３】全長リーリン（４５０ｋＤａ）と、様々な酵素による切断で形成されて３７０〜８０ｋＤａの範囲の５種類の断片を生成したリーリン断片を示す、説明図である。Ｒ３−Ｒ６断片（全長リーリン（４５０ｋＤａ）、３７０ｋＤａ、１９０ｋＤＡおよび２７０ｋＤＡの断片に含まれている）は、リポタンパク質受容体であるＡｐｏＥＲ２およびＶＬＤＬＲに結合することが示されている（非特許文献１４）。Ｎ−Ｒ２断片（１８０ｋＤａ）は、α３β１−インテグリンに結合することが示されており（Dulabon, et al., Reelin binds alpha3beta1 integrin and inhibits neuronal migration. Neuron. 2000;27:33-44）、ニューロンの移動は、生体内で、ＣＲ−５０抗体によって妨げられることが示されている（Nakajima, et al., Disruption of hippocampal development in vivo by CR-50 mAb against reelin. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1997;94:8196-8201）。Ｃ末端領域（Ｒ７−Ｃ；８０ｋＤａ）は、リーリンの分泌と、その固有のフォールディング（de Bergeyck, et al., A truncated Reelin protein is produced but not secreted in the ’Orleans’ reeler mutation (Reln[rl-Orl]). Brain Res. Mol. Brain Res. 1997;50:85-90、非特許文献１４）、および下流のシグナル伝達の有効性（非特許文献２０）に関与していることが示されている。
【図４】θバースト刺激に対するＬＴＰを示すグラフである。
【図５】全長リーリンの配列である。エンドヌクレアーゼの認識部位が、それぞれの配列の上に示されている。リピート配列は左側にラベルが付され、リピート領域がハイライトされている。各リピート領域の間には、ハイライトされていない融合ループがある。
【図６】リーリン依存ＡｐｏＥＲ２受容体の説明図であり、活性化されていない受容体と、活性化されて蛍光を発する、二量体化された受容体を示している。このシステムは、受容体活性化ルシフェラーゼアッセイで用いられる。
【図７】様々な酵素によって切断されて形成され、様々な断片を形成する、リーリン断片を示す説明図である。Ｒ３−Ｒ６断片が、第３スプライス領域のみを含むリーリン断片Ｒ３、スプライス領域Ｒ３およびＲ４をスプライシングされて共に含むＲ３−４、リピート領域Ｒ３、Ｒ４およびＲ５をスプライシングされて共に含むＲ３−Ｒ５、領域Ｒ６にスプライシングされた領域Ｒ５を含むＲ５−Ｒ６断片と比較されている。さらに、それぞれＲ５領域またはＲ６領域にスプライシングされたＲ３領域を含む、断片Ｒ３＋Ｒ５、および、Ｒ３＋Ｒ６が示されている。
【図８】３＋６リーリン断片の配列である。この断片は、３−４ループを５−６ループに結合させ、これによってリピート３をリピート６に連結させることにより形成された。シグナルペプチド領域が、中間の灰色でハイライトされ、薄い灰色でハイライトされたリピート領域３が、これに続いている。３−４のための結合ループ領域が濃い灰色でハイライトされ、これに続いて、５−６のための結合ループ領域とリピート領域６が中間の薄い灰色でハイライトされている。
【図９】３＋５リーリン断片の配列である。この断片は、３−４ループを４−５ループに結合させ、これによってリピート３をリピート５に連結させることにより形成された。シグナルペプチド領域は、中間の灰色でハイライトされ、薄い灰色でハイライトされたリピート領域３が、これに続いている。３−４のための結合ループ領域が中間の濃い灰色でハイライトされ、これに続いて、４−５のための結合ループ領域とリピート領域５が中間の薄い灰色でハイライトされている。
【図１０】マウスのリーリン断片を用いた、ＡｐｏＥＲ２ルシフェラーゼアッセイを示すグラフである。
【図１１】ヒトのリーリン断片を用いた、ＡｐｏＥＲ２ルシフェラーゼアッセイを示すグラフである。
【図１２】マウスのリーリン断片とヒトのリーリン断片のＡｐｏＥＲ２ルシフェラーゼアッセイを比較するグラフである。
【図１３（Ａ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リピート３−６（Ｒ３−６））で処理され、リーリン処理後、所定時間（０、１０、３０、６０、１２０または２４０分）で溶解された、一次ニューロン培養物を示すブロットである。ＡｐｏＥＲ２と、ＡＫＴおよびＥＲＫの活性とリン酸化状態を示す、代表的なウェスタンブロットである。ＥＲＫのリン酸化は、ＥＲＫの活性を直接的に検出するものであり、上流のシグナル伝達経路の活性化を示している。
【図１３（Ｂ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リピート３−６（Ｒ３−６））で処理され、リーリン処理後、所定時間（０、１０、３０、６０、１２０または２４０分）で溶解された、一次ニューロン培養物を示すグラフである。ＡｐｏＥＲ２の活性を、複数の時点で測定し、アクチンで規格化した。全てのグラフは、平均値±S.E.M.（平均値の標準誤差）を示す。標本サイズは５〜６である。
【図１３（Ｃ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リピート３−６（Ｒ３−６））で処理され、リーリン処理後、所定時間（０、１０、３０、６０、１２０または２４０分）で溶解された、一次ニューロン培養物を示すグラフである。ＡＫＴのリン酸化レベルを、複数の時点で測定し、アクチンで規格化した。全てのグラフは、平均値±S.E.M.を示す。標本サイズは５〜６である。
【図１３（Ｄ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リピート３−６（Ｒ３−６））で処理され、リーリン処理後、所定時間（０、１０、３０、６０、１２０または２４０分）で溶解された、一次ニューロン培養物を示すグラフである。全ＡＫＴレベルを、複数の時点で測定し、アクチンで規格化した。全てのグラフは、平均値±S.E.M.を示す。標本サイズは５〜６である。
【図１３（Ｅ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リピート３−６（Ｒ３−６））で処理され、リーリン処理後、所定時間（０、１０、３０、６０、１２０または２４０分）で溶解された、一次ニューロン培養物を示すグラフである。細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化レベルを、複数の時点で測定し、アクチンで規格化した。全てのグラフは、平均値±S.E.M.を示す。標本サイズは５〜６である。
【図１３（Ｆ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リピート３−６（Ｒ３−６））で処理され、リーリン処理後、所定時間（０、１０、３０、６０、１２０または２４０分）で溶解された、一次ニューロン培養物を示すグラフである。全細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）レベルを、複数の時点で測定し、アクチンで規格化した。全てのグラフは、平均値±S.E.M.を示す。標本サイズは５〜６である。
【図１３（Ｇ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リピート３−６（Ｒ３−６））で処理され、リーリン処理後、所定時間（０、１０、３０、６０、１２０または２４０分）で溶解された、一次ニューロン培養物を示すグラフである。全細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）に対するリン酸化された細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）の比率を決定し、無処理（時間０）で規格化した。ＥＲＫのリン酸化状態は、ＥＲＫの活性を直接的に検出するものであり、上流のシグナル伝達経路の活性化を示している。全てのグラフは、平均値±S.E.M.を示す。標本サイズは５〜６である。
【図１４（Ａ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リーリンリピートヒト配列Ｒ３およびＲ５（ｈＲ３＋５）、ヒトリピートＲ３からＲ６（ｈＲ３−６）、マウスリーリンリピートＲ３から６（Ｒ３−６）、マウスＮ末端からＲ２（ＮＲ２）および、全長配列と全ての自然に発生した断片からなる全長リーリン（ＦＲ））で処理された、一次ニューロン培養物を示すブロットである。対照（ｃｔｌ）は、無処理の細胞からなる。６０分間、細胞上でリーリンをインキュベートした後、細胞を溶解した。全細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）およびリン酸化された細胞外調節キナーゼに対して、代表的なウェスタンブロットが実施された。
【図１４（Ｂ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リーリンリピートヒト配列Ｒ３およびＲ５（ｈＲ３＋５）、ヒトリピートＲ３からＲ６（ｈＲ３−６）、マウスリーリンリピートＲ３から６（Ｒ３−６）、マウスＮ末端からＲ２（ＮＲ２）および、全長配列と全ての自然に発生した断片からなる全長リーリン（ＦＲ））で処理された、一次ニューロン培養物を示すグラフである。対照（ｃｔｌ）は、無処理の細胞からなる。６０分間、細胞上でリーリンをインキュベートした後、細胞を溶解した。リン酸化された細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）のレベルを、複数の時点で測定し、アクチンで規格化した。全てのグラフは、平均値±S.E.M.を示す。標本サイズは４である。
【図１４（Ｃ）】２００μＭの精製されたリーリン断片（リーリンリピートヒト配列Ｒ３およびＲ５（ｈＲ３＋５）、ヒトリピートＲ３からＲ６（ｈＲ３−６）、マウスリーリンリピートＲ３から６（Ｒ３−６）、マウスＮ末端からＲ２（ＮＲ２）および、全長配列と全ての自然に発生した断片からなる全長リーリン（ＦＲ））で処理された、一次ニューロン培養物を示すグラフである。対照（ｃｔｌ）は、無処理の細胞からなる。６０分間、細胞上でリーリンをインキュベートした後、細胞を溶解した。全細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）のレベルを、複数の時点で測定し、アクチンで規格化した。全てのグラフは、平均値±S.E.M.を示す。標本サイズは４である。
【図１５】全長リーリンを用いたＤａｂ−１リン酸化アッセイを示すグラフである。
【図１６】全長リーリンに曝露された後のＤａｂ−１リン酸化の経時変化を示す折れ線グラフである。
【図１７】Ｒ３−６リーリン断片を用いたＤａｂ−１リン酸化アッセイを示すグラフである。
【図１８】Ｒ３−６リーリン断片に曝露された後のＤａｂ−１リン酸化の経時変化を示す折れ線グラフである。
【図１９】Ｆｃ−ＲＡＰで灌流することにより、海馬のＬＴＰ誘導が高められる。海馬のスライスをＦｃ−ＲＡＰ（１０μｇ／ｍｌ）、Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）または対照媒質で灌流した。ベースラインのシナプス応答（†）と、ＨＦＳ直後（‡）からＨＦＳ後６０分（*）までにわたる増強を記録した。矢印の頭は、２０秒間隔で２回行われた、１００Ｈｚ、１秒間の刺激によって誘導されたＬＴＰを示している。水平な線は、Ｆｃ−ＲＡＰ、Ｆｃまたは対照媒質の適用を示している。結果は、平均値±平均値の標準誤差で示されている。ｆＥＰＳＰは、興奮性シナプス後場電位、Ｓｔｒａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ ２００４。
【図２０（Ａ）】リーリンがシナプス後メカニズムを通じてＮＭＤＡＲ電流を高めることを示す電位図である。ＥＰＳＣＮＭＤＡの測定値が示されている。三本のラインは、無処理、モック（擬似試料）処理およびリーリン処理のものであり、リーリン処理は、カルシウム伝導により、ＮＭＤＡ受容体の機能を高めることを示している。
【図２０（Ｂ）】リーリンがシナプス後メカニズムを通じてＮＭＤＡＲ電流を高めることを示す電位図である。ＡＰ５を加えた場合のＥＰＳＣＮＭＤＡの測定値が示されている。三本のラインは、無処理、モック処理およびリーリン処理のものであり、リーリン処理は、カルシウム伝導により、ＮＭＤＡ受容体の機能を高めることを示している。
【図２１（Ａ）】ＥＰＳＣＮＭＤＡの測定値を示すグラフである。濃い灰色の軌跡が、ｍＥＰＳＣＮＭＤＡである。
【図２１（Ｂ）】リーリン処理がｍＥＰＳＣＮＭＤＡ振幅を有意に増加させたことを示すグラフである（黒丸はリーリン処理前、白丸はリーリン処理後、**＊ｐ ＜ ０．００１、ｎ＝１８、対応ｔ検定）。モック処理は効果がなかった（黒丸はモック処理前、白丸はモック処理後、有意差なし（ｎｓ）、ｐ ＞０．０５、ｎ＝１３、対応ｔ検定）。
【図２１（Ｃ）】リーリン処理なし、リーリン処理、および、両者を比較する合成グラフ、の３つの時点でのシナプス伝達を示すグラフである。
【図２１（Ｄ）】９つの細胞の記録に基づいて明らかにされた、１／ＣＶ２率と平均ＥＰＳＣＮＭＤＡ率（リーリン処理の前後）との相関がないことを示すグラフである（ｒ ＝ ０．３１、ｐ ＝ ０．４、スピアマン検定）。
【図２２（Ａ）】リーリンシグナル伝達が、グルタミン酸受容体サブユニットの表面発現と全レベルを変化させることを示すウェスタンブロットである。代表的ブロットにより、ＧｌｕＲ１、ＮＲ１、ＮＲ２ＡおよびＮＲ２Ｂの表面レベルと全レベルの両方が示されている。
【図２２（Ｂ）】ウェスタンブロットの４つの実験から収集された、表面グルタミン酸受容体サブユニットの定量結果である。持続的なリーリン処理後は、モック処理グループと比べて、表面ＧｌｕＲ１およびＮＲ２Ａはいずれも有意に増加し（ＧｌｕＲ１：Ｆ（２，１１） ＝ １５．５６、＊＊＊Ｐ ＜ ０．００１；ＮＲ２Ａ： Ｆ（２，１１） ＝ ４４．９、 ＊＊＊Ｐ ＜ ０．００１）、表面ＮＲ２Ｂレベルは有意に減少した（Ｆ（２，１１） ＝ ２２．６、 ＊＊＊Ｐ ＜ ０．００１）。
【図２２（Ｃ）】ウェスタンブロットの４つの実験から収集された、全タンパク質レベルの定量結果である。リーリン処理は、全ＧｌｕＲ１（Ｆ（２，１１） ＝ １１．２、＊＊Ｐ ＜ ０．０１）、 全ＮＲ２Ａ（Ｆ（２，１４） ＝ ９．７５、＊＊Ｐ ＜ ０．０１）のレベルを有意に増加させ、全ＮＲ２Ｂレベル（Ｆ（２，１１） ＝ ４．１、＊Ｐ ＜ ０．０５）を有意に減少させた。これとは対照的に、ＮＲ１の全レベルも（Ｂにおける）表面レベルも変化が観察されなかった。
【図２３（Ａ）】樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を示すグラフである。リーリンは、樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を調べるため、一次海馬ニューロン培養物に持続的に適用された。
【図２３（Ｂ）】樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を示す画像である。リーリンは、樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を調べるため、一次海馬ニューロン培養物に持続的に適用された。樹状突起スパインは、ＨＲＭでは、ＷＴマウスに比べて減少していたが、リーリン処理後は、スパイン密度が回復している。樹状突起スパインは、一次樹状突起からの全ての突起のうち、全ての二次樹状突起を除いたものとして定義された。樹状突起スパインは、樹状突起５０μｍごとに、カウントされ、測定された。リーリン処理された細胞（ｎ＝３）においては、モック処理された細胞（ｎ＝３）と比べて、スパインの有意な増加が見られる。
【図２３（Ｃ）】樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を示す画像である。リーリンは、樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を調べるため、一次海馬ニューロン培養物に持続的に適用された。樹状突起スパインは、ＨＲＭでは、ＷＴマウスに比べて減少していたが、リーリン処理後は、スパイン密度が回復している。樹状突起スパインは、一次樹状突起からの全ての突起のうち、全ての二次樹状突起を除いたものとして定義された。樹状突起スパインは、樹状突起５０μｍごとに、カウントされ、測定された。リーリン処理された細胞（ｎ＝３）においては、モック処理された細胞（ｎ＝３）と比べて、スパインの有意な増加が見られる。
【図２３（Ｄ）】樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を示す画像である。リーリンは、樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を調べるため、一次海馬ニューロン培養物に持続的に適用された。樹状突起スパインは、ノックアウトリーリンマウスでは、非常にまばらであったが、リーリン処理後は、スパイン密度の欠陥が回復している。樹状突起スパインは、一次樹状突起からの全ての突起のうち、全ての二次樹状突起を除いたものとして定義された。樹状突起スパインは、樹状突起５０μｍごとに、カウントされ、測定された。リーリン処理された細胞（ｎ＝３）においては、モック処理された細胞（ｎ＝３）と比べて、スパインの有意な増加が見られる。ＷＴ（野生型）ニューロン上の樹状突起スパインが、代表的な一次樹状突起の拡大写真に示されている。
【図２３（Ｅ）】樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を示す画像である。リーリンは、樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を調べるため、一次海馬ニューロン培養物に持続的に適用された。樹状突起スパインは、ノックアウトリーリンマウスでは、非常にまばらであったが、リーリン処理後は、スパイン密度の欠陥が回復している。樹状突起スパインは、一次樹状突起からの全ての突起のうち、全ての二次樹状突起を除いたものとして定義された。樹状突起スパインは、樹状突起５０μｍごとに、カウントされ、測定された。リーリン処理された細胞（ｎ＝３）においては、モック処理された細胞（ｎ＝３）と比べて、スパインの有意な増加が見られる。
【図２３（Ｆ）】樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を示す画像である。リーリンは、樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を調べるため、一次海馬ニューロン培養物に持続的に適用された。樹状突起スパインは、共焦点顕微鏡を用いて定量化された。樹状突起スパインは、一次樹状突起からの全ての突起のうち、全ての二次樹状突起を除いたものとして定義された。樹状突起スパインは、樹状突起５０μｍごとに、カウントされ、測定された。リーリン処理された細胞（ｎ＝３）においては、モック処理された細胞（ｎ＝３）と比べて、スパインの有意な増加が見られる。
【図２４（Ａ）】ＭＭＰ−９がリーリンのプロセシングを調節することを示すブロットである。リーリンのプロセシングに対するＭＭＰ−９（活性、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、ＰＦ１４０）の影響能力を、リーリン（５０ｎＭ）と様々な濃度のＭＭＰ−９（１〜４μｇ/ｍｌ）とをＰＢＳ内で３７℃で３時間反応させることにより、決定した。ＥＤＴＡはＭＭＰ９の活性をブロックするため、陰性対照として、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を入れた。ウェスタンブロットは、反応の１：１０に実施され、抗リーリン抗体（Ｇ１０）でプローブされた。
【図２４（Ｂ）】ＭＭＰ−９がリーリンのプロセシングを調節することを示すブロットである。一次皮質ニューロンにおける、リーリンのプロセシングに対するＭＭＰ−９（２５０ｎＭ）の影響能力を、２４時間後に、上澄みから抽出されたタンパク質で決定した。細胞タンパク質抽出物をウェスタン分析し、Ｇ１０で検出した。
【図２４（Ｃ）】ＭＭＰ−９がリーリンのプロセシングを調節することを示すブロットである。一次皮質ニューロンにおける、リーリンのプロセシングに対するＭＭＰ−９（２５０ｎＭ）の影響能力を、２４時間後に、上澄みから抽出されたタンパク質で決定した。上澄みタンパク質抽出物をウェスタン分析し、Ｇ１０で検出した。
【図２４（Ｄ）】ＭＭＰ−９がリーリンのプロセシングを調節することを示すブロットである。一次皮質ニューロンにおける、リーリンのプロセシングに対するＭＭＰ−９阻害剤（２５ｎＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、４４４２７８）の影響能力を、２４時間後に、上澄みから抽出されたタンパク質で決定した。細胞タンパク質抽出物をウェスタン分析し、Ｇ１０で検出した。
【図２４（Ｅ）】ＭＭＰ−９がリーリンのプロセシングを調節することを示すブロットである。一次皮質ニューロンにおける、リーリンのプロセシングに対するＭＭＰ−９阻害剤（２５ｎＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、４４４２７８）の影響能力を、２４時間後に、上澄みから抽出されたタンパク質で決定した。上澄みタンパク質抽出物をウェスタン分析し、Ｇ１０で検出した。
【図２５】リーリンが樹状突起スパイン密度に影響を及ぼすことを示すブロットである。樹状突起スパイン密度に対するリーリンの効果を調べるため、リーリンを、持続的に、一次海馬ニューロン培養物に適用した。培養物内におけるリーリンのレベルをウェスタンブロットで決定した。生体外におけるリーリンの劣化のレベルを決定するため、０、６、１２、２４、４８、７２、９６時間の時点で、培養物からサンプルを採取した。最後の列のリーリンは、培養物に投与された濃度の未劣化のものを表している。リーリンは、培養物への導入後９６時間まで存在し、また、７２時間までは劣化が始まらなかった。
【図２６（Ａ）】リーリンの補給が、連合学習と空間学習を向上させることを示すグラフである。野生型のマウスに対し、恐怖条件付けを行う３時間前に、５ｎＭのＲＡＰまたは５ｎＭのリーリンを、脳室内に、両側注射した。訓練の２４時間後に、マウスを文脈内に置き、すくみを測定した。リーリンが向上を生じさせたのに対し、ＲＡＰは学習と記憶を阻害するのが見られた（ＲＡＰ  ｎ＝９、ショックなし  ｎ＝５、処理なし  ｎ＝７、リーリン  ｎ＝５、ｐ＞０．０５）。
【図２６（Ｂ）】リーリンの補給が、連合学習と空間学習を向上させることを示すグラフである。モーリス水迷路により、野生型のマウスに、隠れたプラットホームを見つける訓練を行った。マウスには、５ｎＭのリーリン（赤丸、ｎ＝４）または溶媒（白丸、ｎ＝６）を単一注射した。５日目に、プローブ試験を行い、その後、６日目に、マウスに対して、新たなプラットホームの位置を見つける訓練を行った。マウスには、５ｎＭのリーリン（ｎ＝４）または溶媒（ｎ＝６）を単一注射した。
【図２６（Ｃ）】リーリンの補給が、連合学習と空間学習を向上させることを示すグラフである。モーリス水迷路により、野生型のマウスに、隠れたプラットホームを見つける訓練を行った。マウスには、５ｎＭのリーリン（赤丸、ｎ＝４）または溶媒（白丸、ｎ＝６）を単一注射した。１日目における個々の試行の潜時の試験である。（＊＝ｐ＞０．０５）。マウスには、５ｎＭのリーリン（ｎ＝４）または溶媒（ｎ＝６）を単一注射した。
【図２７（Ａ）】文脈的恐怖条件付けが、リーリンレベルを変化させることを示すブロットである。野生型マウスを、３ショックの文脈的恐怖条件付けプロトコル（ＣＦＣ）で訓練した。ショックを与えられていないマウス（ＣＳ）を陰性対照として用いた。ショックを与えられて文脈に晒されたマウス（ＣＳ／ＵＳ）の海馬を、訓練後、１分、５分、１５分、３０分、１８０分および１８時間で取り出した（ｎ＝４、時点ごと）。リーリンを、海馬のホモジネートにおいて、抗リーリン抗体（Ｇ１０）を用いて検出した。
【図２７（Ｂ）】文脈的恐怖条件付けが、リーリンレベルを変化させることを示すグラフである。野生型マウスを、３ショックの文脈的恐怖条件付けプロトコル（ＣＦＣ）で訓練した。ショックを与えられていないマウス（ＣＳ）を陰性対照として用いた。ショックを与えられて文脈に晒されたマウス（ＣＳ／ＵＳ）の海馬を、訓練後、１分、５分、１５分、３０分、１８０分および１８時間で取り出した（ｎ＝４、時点ごと）。全長リーリンのリーリンレベルを定量化した。アスタリスクは、両側t検定に基づく統計的有意性を示す（p ＜ ０．５）。
【図２８（Ａ）】リーリンシグナル伝達が、ＡＤマウスモデルにおいて変化させられていることを示すブロットである。月齢１４か月の野生型、Ｔｇ２５７６ （ＳｗｅＡＰＰ）、ＰＳ１−ＦＡＤ （Ｍ１４６Ｌ）および ２Ｘ （ＳｗｅＡＰＰ ｘ Ｍ１４６Ｌ）から取り出された皮質のウェスタンブロットの分析を行った（ｎ＝４）。Ｔｇ２５７６対野生型では、リーリンの４５０、１９０および１８０ｋＤａの生成物に、有意な差は検出されなかったが、Ｔｇ２５７６および２Ｘマウスにおいては、Ｇ１０によって認識される未特定のＮ末端種が、有意に増加していた。これとは対照的に、リーリンの４５０および１８０ｋＤａ生成物は、ＰＳ１−ＦＡＤおよび２Ｘマウスにおいて、有意に増加していた（ｐ ＜ ０．０５）。
【図２８（Ｂ）】リーリンシグナル伝達が、ＡＤマウスモデルにおいて変化させられていることを示すブロットである。月齢１４か月の野生型、ＰＳ１−ＦＡＤ （Ｍ１４６Ｌ）および ２Ｘ （ＳｗｅＡＰＰ ｘ Ｍ１４６Ｌ）から取り出された皮質のウェスタンブロットの分析を行った（ｎ＝４）。Ｔｇ２５７６マウスにおけるＤａｂ１−ｐＴｙｒ２２０の有意な減少と、ＰＳ１−ＦＡＤ および ２Ｘマウスの両方における有意な増加があった。
【図２８（Ｃ）】リーリンシグナル伝達が、ＡＤマウスモデルにおいて変化させられていることを示すグラフである。刺激前のリーリン（５ｎＭ）適用により、Ｔｇ２５７６マウスのＣＡ１領域におけるＨＦＳ刺激によるＬＴＰの欠陥を回復させることができた。
【図２９（Ａ）】リーリンシグナル伝達が、ＡＤマウスモデルにおいて変化させられていることを示す画像である。月齢１４か月のＴｇ２５７６水平断面に対し、生体内におけるリーリンプロセシングをマッピングするための３−エピトープ法を用いた。リーリン−ＣＴ（Ｇ２０）は、６Ｅ１０（抗Ａβ抗体）で検出された有芯プラークの芯に隔離された、Ｒ７−８を含むリーリン断片を検出した。
【図２９（Ｂ）】リーリンシグナル伝達が、ＡＤマウスモデルにおいて変化させられていることを示す画像である。月齢１４か月のＴｇ２５７６水平断面に対し、生体内におけるリーリンプロセシングをマッピングするための３−エピトープ法を用いた。リーリン−ＮＴは、６Ｅ１０（抗Ａβ抗体）で検出された有芯プラークの芯に隔離された、Ｎ−Ｒ２を含むリーリン断片を検出した。
【図２９（Ｃ）】リーリンシグナル伝達が、ＡＤマウスモデルにおいて変化させられていることを示す画像である。月齢１４か月のＴｇ２５７６水平断面に対し、生体内におけるリーリンプロセシングをマッピングするための３−エピトープ法を用いた。リーリン−ＭＴ（AF３８２０）は、６Ｅ１０（抗Ａβ抗体）で検出された有芯プラークの芯に隔離された、Ｒ３−６を含むリーリン断片を検出した。
【図２９（Ｄ）】リーリンシグナル伝達が、ＡＤマウスモデルにおいて変化させられていることを示す画像である。月齢１４か月のＴｇ２５７６の免疫蛍光画像は、水平断面に対し、リーリン−ＣＴ（Ｇ２０）およびリーリン−ＭＴ（ＡＦ３８２０）が組み合わせられて、６Ｅ１０（抗Ａβ抗体）で検出された有芯プラークの芯に隔離された状態で示される。
【図２９（Ｅ）】リーリンシグナル伝達が、ＡＤマウスモデルにおいて変化させられていることを示す画像である。拡大された月齢１４か月のＴｇ２５７６の免疫蛍光画像は、リーリン−ＮＴ断片（Ｎ−Ｒ２）が、ｔｇ２５７６マウスモデル内のプラークの芯を取り囲んでいたことを示している。スケールバー＝１５μｍ。
【図３０】標準的な、２連の、１００ＨｚのＨＦＳを用いたＬＴＰ誘導を、月齢１２か月のＴｇ２５７６マウスから採取した海馬スライスに与えた。１組のスライスを５ｎＭのリーリンで灌流した。リーリン処理されたスライスは、野生型のレベルまで、ＬＴＰ誘導が上昇した。
【図３１】リーリン処理が慢性的ＴＢＩにおいて機能回復効果を発揮することを示すグラフである。皮質衝撃装置による外傷性脳損傷後、持ち上げボディスイング試験で、ベースラインに対するスイング偏向を示したが、リーリンで緩和された。
【図３２】リーリン処理が慢性的ＴＢＩにおいて機能回復効果を発揮することを示すグラフである。皮質衝撃装置による外傷性脳損傷後、肢無動試験で、ベースラインに対する肢の自発性の喪失を示したが、リーリンで緩和された。
【図３３】リーリン処理が慢性的ＴＢＩにおいて機能回復効果を発揮することを示すグラフである。皮質衝撃装置による外傷性脳損傷後、肢握力試験で、ベースラインに対する肢の強さの喪失を示した。
【図３４】ＳＡ２、ＳＡ３およびリーリン切断部位に使用されるいくつかのコンストラクトの説明図である。ＭＭＰ−９は、領域２と領域３の間で切断することができるが、生体外での反応の間にだけ、領域７で切断することが示されている。ｔＰＡは、領域６と７の間で切断することができる。提案されたコンストラクトは、生体外におけるＭＭＰ−９結合部位がなく、ＣおよびＮ末端の両方にタグがあるように作られる。Ｒｌｎ−Ｒｅｓ＝リーリン切断抵抗性、Ｒｌｎ−Ｌａｂ＝リーリン不安定。
【図３５（Ａ）】ｔＰＡがリーリンプロセシングを調節することを示すブロットである。リーリンプロセシングに対するｔＰＡ／プラスミノーゲンの影響能力を、リーリン（５０ｎＭ）をｔＰＡ（６０μｇ／ｍｌ）、不活性プラスミノーゲン（１８μｇ／ｍｌ）、ｔＰＡおよびプラスミノーゲン、プラスミノーゲン（活性、０．５μｇ／ｍｌ）とともに、ＰＢＳ中で、４５分間、３７℃で反応させることによって、決定した。反応は、抗リーリン抗体（Ｎ−Ｒ２認識抗体であるＧ１０）および抗リーリン抗体（Ｒ７−８認識抗体である、Ａｂ１４）をプローブとして、ウェスタンブロット（１：１０）にかけた。
【図３５（Ｂ）】ｔＰＡがリーリンプロセシングを調節することを示すブロットである。一次皮質ニューロンにおけるリーリン代謝に対するｔＰＡの影響能力を、細胞を新鮮な上澄み内で７０ｎＭのｔＰＡとともに２４時間インキュベートすることにより、決定した。細胞のタンパク質抽出物をウェスタン分析し、Ｇ１０で検出した。
【図３５（Ｃ）】ｔＰＡがリーリンプロセシングを調節することを示すブロットである。一次皮質ニューロンにおけるリーリン代謝に対するｔＰＡの影響能力を、細胞を新鮮な上澄み内で７０ｎＭのｔＰＡとともに２４時間インキュベートすることにより、決定した。上澄みのタンパク質抽出物をウェスタン分析し、Ｇ１０で検出した。
【図３６（Ａ）】３−エピトープマッピングの説明図である。リーリンは、Ｎ末端領域と、それに続くＣＲ−５０静電領域（明るい灰色）、Ｆ−スポンジン領域（Ｈ）、および８つの連続するＥＦＧ様リピートからなる。様々な抗体と、それぞれの抗体のための、リーリン構造のエピトープ領域を示している。
【図３６（Ｂ）】３−エピトープマッピングの説明図である。全長リーリンおよびその主要な断片の分布を決定するために、リーリンのＮ−Ｒ２、Ｒ３−Ｒ６およびＲ７−Ｒ８領域を区別して認識する抗体を使用することができる。
【図３７】リーリンおよびＡｐｏＥＲ２発現に対するＲＡＰの影響を示すグラフである。ＡｐｏＥＲ２発現の減少が、海馬、前頭前皮質および頭頂葉皮質内へのＧＳＴ−ＲＡＰ（全てのリポタンパク質受容体に結合する、受容体関連タンパク質）の適用と関連付けられている。
【図３８（Ａ）】ｈＲ３−６の適用が、一次ニューロン培養物におけるＡｐｏＥｒ２発現を増加させることを示すブロットである。ニューロン（Ｅ１７、ＤＩＶ８）は、ｈＲ３−６で１時間処理され、ＡｐｏＥｒ２を認識する抗体３３２６でプローブされた。Ｎ＝３〜４。
【図３８（Ｂ）】ｈＲ３−６の適用が、一次ニューロン培養物におけるＡｐｏＥｒ２発現を増加させることを示すグラフである。ＡｐｏＥｒ２レベルはアクチンで規格化され、ウェスタンブロットから定量された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
本明細書において、「リーリンの断片リピートから形成されたコンストラクト」とは、リーリンのリピート領域を組み合わせて得られた断片から作り出された人工タンパク質のことを言う。明細書に記載のように、全長リーリンは、図３のアミノ酸配列に示されたように、領域Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のようなリピートと呼ばれるＤＮＡまたは（タンパク質のための）アミノ酸の領域で構成される。ループ領域は、これらのリピート領域の間に位置し、２つのリピート領域を結合させるのに用いられる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
４８時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。リーリンＲ３−６断片は、対照として使用するため、１００℃で１０分間煮沸した。ルシフェラーゼ基質をルシフェラーゼ緩衝液に溶解し（１：１）、遺伝導入された各プレートに、ルシフェラーゼを１：１の割合で加えた（即ち、遺伝子導入溶液５０μＬに対し、ルシフェラーゼ５０μＬ）。混合物を１０分間振とうし、発光を検出した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
海馬の樹状突起に対するリーリンの効果を分析した。海馬細胞は、日齢６〜７日の野生型、ＨＲＭおよびリーリン欠損マウスから培養され、、５ｎｍのリーリンで、２１日間、処理された。器官型培養物の処理は、非遺伝子導入ＨＥＫ細胞培地上で、２１日間にわたる３日ごとの５ｎＭのリーリン適用を繰り返した。細胞を、上記のように培養し、ホールセルパッチクランプ電流を流すことによって蛍光色素をニューロン細胞内に注入し、固定後、共焦点顕微鏡下で可視化した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
培養された海馬ニューロンは、樹状突起スパインが有意に少なく、外来性の組換えリーリンを培養物に加えることにより回復することのできる表現型であった。リーリン処理したＨＲＭ細胞は、２１日後、図２３（Ｃ）に示されるように、日齢の合う野生型培養物のニューロンと比べて、樹状突起スパイン密度が増加した。これとは対照的に、モック処理（非安定遺伝子導入細胞の条件培地）では、図２３（Ｂ）に示されるように、スパイン密度に何の変化も見られなかった。図２３（Ｅ）および（Ｆ）に示されるように、リーリンノックアウトマウスでの同じ試験も、リーリンの適用が、やはり、モック処理の対照と比較して、樹状突起スパイン密度を回復させることを示した。リーリン処理された細胞は、両方とも、図２３（Ｄ）に示されたＷＴ細胞に見られる樹状突起スパインと形態が似ており、定量化すると、リーリン処理されたＨＲＭ培養物では、モック処理された対照と比較して樹状突起スパインが有意に増加し、図２３（Ｄ）に示された野生型培養物で観察されたスパイン密度レベルと同等であった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
週齢１０週のＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝５５、雄）を、通常の条件（２０℃、相対湿度５０％、１２時間の明暗サイクル）の下で飼育し、水と餌を自由に与えた。この環境に標準化した後、制御式皮質衝撃装置（ＣＣＩ；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ペンシルバニア州ピッツバーグ）を使用して、マウスにＴＢＩを被らせた。実験手順は、実験動物委員会の承認を受けた。マウスを、偽手術（ＴＢＩなし）をして注射なしのグループ、ＴＢＩありで注射なしのグループ、ＴＢＩありで生理食塩水のモック処理を行っグループ、ＴＢＩありでリーリン処理したグループに分けた。リーリン処理された動物は、全長の組換え精製リーリンタンパク質を５ｎＭの濃度で２μｌ注射された。偽手術された動物は、麻酔されて外科手術を受けたが、皮質衝撃は受けなかった。全ての行動試験は、いずれの試験日も、明サイクルの間の同じ時間に行った。実験の間、動物の痛みと苦痛を減少させるために必要な予防措置をとった。全ての実験は、処理条件を知らない人員によって、盲検として行われた。処理時、マウスの重量は、１２〜４５ｇであった。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
３７０ｋＤａの生成物を生成させることの有効性は、リーリン切断酵素の候補であるｔＰＡに一部依存する。この潜在的調節メカニズムは、このシグナル伝達システムがどのようにニューロンの調節の既知のメカニズムに統合され、学習や記憶といった生理的プロセスに加わるようにコーディネートされるのかに、深く関わっている。しかし、リーリンは、特定の部位で切断されて、ウェスタンブロット分析で容易に定量可能な、リーリン断片の安定なパターンを生じさせる。これらの断片は、全長リーリンとは異なる特有の性質を有するシグナル伝達分子である可能性がある。安定的に遺伝子導入されたＨＥＫ２９３細胞から精製された組換えリーリンは、海馬で見られる主要な断片と同じサイズの断片を含む。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
リーリンは、ｔＰＡおよびＭＭＰ−９の両方でプロセシングされることにより、図３５（Ａ）〜（Ｃ）に示されるように、生体内で見られる主要なリーリン断片生成物を生じる。図３５（Ａ）に示されるように、ｔＰＡは３７０ｋＤａ（Ｎ−Ｒ６）と８０ｋＤａ（Ｒ７−８）の断片をセルフリー条件下で増加させており、図３４に示されるように、ｔＰＡがリーリンをＲ６−Ｒ７の間で切断することを示している。プラスミンによるリーリンの切断により、従来未特定の様々な生成物と、特有の保有率の１８０ｋＤａ断片が生じる。組換えｔＰＡを一次ニューロンに適用することにより、全長から３７０および１８０ｋＤａの形への細胞外リーリンの完全な転換と、細胞内の１８０ｋＤａリーリンの減少が生じた。更に、ＭＭＰ−９は、図２４（Ｂ）および（Ｃ）に示されるように、３７０ｋＤａ（Ｎ−Ｒ６）および１８０ｋＤａ（Ｎ−Ｒ２）断片、さらに、よく知られた１８０ｋＤａ断片のすぐ下に見られる断片を増加させ、また、これらは、図２４（Ｄ）および（Ｅ）に示されるように、ＭＭＰ−９の阻害によって確認された。セルフリー条件下でのこれらの結果は、ＭＭＰ−９がリーリンをＲ２−３およびＲ６−７の両方の切断部位で切断可能であることを裏付けているが、一方で、一次ニューロンへのＭＭＰ−９の適用は、細胞内における１８０ｋＤａ断片の特有の蓄積を生じさせ、２４時間のＭＭＰ−９阻害は、劇的な全長リーリンの増加と細胞の１８０ｋＤａリーリンの減少を生じさせた。これらの結果は、正常な状態においては、ＭＭＰ−９は、図３４の断片マップに示されたように、リーリンをＲ２−Ｒ３の間で切断する原因となることを示唆している。これらの予備データをまとめて考慮すると、ＭＭＰ−９とｔＰＡが、生体内で見られる主要なリーリン断片を生成するために、十分であることを示唆している。図３６（Ａ）および（Ｂ）に示されたように、構造の分析により、リーリンの様々な断片を検出することのできる抗体が特定された。