(57)【要約】  下記一般式（Ｉ）で示される複素環式化合物もしくはその代謝物、又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする免疫療法剤。【化１】2018131659.tif 000009
2018131659.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2018131659.tif 000008
［式中、Ｘは窒素原子又はＣＨ；Ｒ１、Ｒ２は共に、或いはいずれかが水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン、アミノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、シアノ基、tert-ブチルジメチルシリルオキシ基、ニトロ基；Ｒ３は水素原子、ジフルオロメチル基、アミノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ基、メチル基、又はヒドロキシメチル基；Ｒ４、Ｒ５はそれぞれ水素原子、ヒドロキシル基、Ｃ１−Ｃ６アルキル基；Ｒ６はモルホリノ（１〜２個のＣ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシル基で置換されてもよい）、ピロリジニル（ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル基で置換されていてもよい）、ピペリジノ（１〜２個の酸素原子、ヒドロキシル基、ホルミル、Ｃ１−Ｃ６アルキル基で置換されていてもよい）、ピペラジニル（環が１〜２個の酸素原子で置換されていてもよく、４位の窒素が、ホルミル、ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、オキソＣ１−Ｃ６アルキル、芳香族カルボニル、ベンジルカルボニル、置換カルバモイルからなる群から選択される置換基で置換されていてもよい）、１，４−ジアゼパノ（環が１〜２個の酸素原子で置換されていてもよく、４位の窒素が、ホルミル、ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、オキソＣ１−Ｃ６アルキル、芳香族カルボニル、ベンジルカルボニル、置換カルバモイルからなる群から選択される置換基で置換されていても良い）、式−ＮＲ７Ｒ８（Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル基、又はカルボキシＣ１−Ｃ６アルキル基を表す）を表す］で示される複素環式化合物もしくはその代謝物、又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする免疫療法剤。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２は共に、或いはいずれかが水素原子又はヒドロキシル基であり、Ｒ３がジフルオロメチル基であり、Ｒ６はモルホリノ（１〜２個のＣ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシル基で置換されてもよい）、又は式−ＮＲ７Ｒ８（Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル基、又はカルボキシＣ１−Ｃ６アルキル基を表す）である、請求項１に記載の免疫療法剤。
【請求項３】
２−（２−ジフルオロメチルベンズイミダゾール−１−イル)−４，６−ジモルホリノ−１，３，５−トリアジン、２−（２−ジフルオロメチルベンズイミダゾール−１−イル）−４−Ｎ，Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエチル）アミノ−６−モルホリノ−１，３，５−トリアジン、２−（２−ジフルオロメチル−５−ヒドロキシベンズイミダゾール−１−イル）−４，６−ジモルホリノ−１，３，５−トリアジン、２−（２−ジフルオロメチルベンズイミダゾール−１−イル）−４−（２−ヒドロキシモルホリノ）−６−モルホリノ−１，３，５−トリアジン、２−（２−ジフルオロメチルベンズイミダゾール−１−イル）−４−モルホリノ−６−（４−オキソピペリジノ）−１，３，５−トリアジン、２−（２−ジフルオロメチル−４−ヒドロキシベンズイミダゾール−１−イル）−４−（２−ヒドロキシメチルピロリジン−１−イル）−６−モルホリノ−１，３，５−トリアジン、２−（２−ジフルオロメチル−４−ヒドロキシベンズイミダゾール−１−イル）−４−（３，３−ジメチルモルホリノ）−６−モルホリノピリミジンの少なくともいずれかを有効成分とする免疫療法剤。
【請求項４】
免疫調節剤、免疫細胞療法剤又はワクチン療法剤と組み合わせて使用される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物もしくはその薬学的に許容される塩を含む免疫療法剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物もしくはその代謝物、又はその薬学的に許容される塩と、免疫調節剤とを、同時に又は別々に、もしくは経時的に投与するよう組み合わされた免疫療法剤。
【請求項６】
前記免疫調節剤が、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-３抗体、抗OX-40抗体、抗TIGIT抗体、抗4-1BB抗体、抗KIR抗体、抗GITR抗体、抗CD27抗体、抗TIM3抗体、抗ICOS抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗VISTA抗体、抗BTLA抗体、抗HVEM抗体、抗CD28抗体、抗CD30抗体のいずれかから選択される、請求項４に記載の免疫療法剤。
【請求項７】
前記免疫調節剤が、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-３抗体、抗OX-40抗体、抗TIGIT抗体、抗4-1BB抗体、抗KIR抗体、抗GITR抗体、抗CD27抗体、抗TIM3抗体、抗ICOS抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗VISTA抗体、抗BTLA抗体、抗HVEM抗体、抗CD28抗体、抗CD30抗体のいずれかから選択される、請求項５に記載の免疫療法剤。
【請求項８】
前記免疫調節剤が抗PD-1抗体、抗LAG-３抗体又は抗GITR抗体である、請求項５に記載の免疫療法剤。
【請求項９】
前記免疫調節剤が抗PD-1抗体、抗LAG-３抗体又は抗GITR抗体である、請求項５に記載の免疫療法剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は生命の恒常性を維持するためのシステムの一つであり、自己と非自己を区別して非自己を攻撃し、排除する仕組みである。免疫反応は基本的に「自己と非自己の識別」に始まり、「非自己への特異的反応」、「非自己の排除と記憶」の順に進む。免疫系を構成するリンパ球は、一旦非自己を認識して活性化すると増殖し、非自己の排除に向かう集団（エフェクター機構）と、非自己を記憶する集団（記憶応答）へと分化する。後者の記憶応答に関わる細胞は、将来、記憶した非自己に遭遇すると迅速に再活性化し非自己を排除する。このように、非自己の排除は免疫系の第一義と言えるが、同時に、自己の細胞や抗原に対する応答が適正に抑制されていないと、却って生命の恒常性を損うことになる。そこで免疫系には、自己に対する応答を抑制する自己免疫寛容と呼ばれる機構が備わっている。すなわち、免疫系は、アクセルとしての応答と、ブレーキとしての自己免疫寛容との適正なバランスにより恒常性を維持しており、非自己に対する免疫系の活性が低下すれば微生物の感染等に対する防御が弱体化する一方、自己免疫寛容システムの機能が低下すれば、自己免疫疾患を発症してしまうことになる。【０００３】
がん細胞やウイルス感染細胞といった異常な細胞は、元々は自己の細胞であるが、同時に異常抗原（非自己抗原）であるがん抗原やウイルス抗原を発現しており、免疫による排除の対象となる。しかし、これらの細胞は同時に、自己免疫寛容システムの機能を利用して、細胞自身を攻撃する免疫応答を抑制していることが判明している。【０００４】
こういった異常な細胞に対しては、非自己抗原に対する免疫応答を増強し、あるいは免疫応答の抑制を解除するアプローチが治療に有効な場合があり、そのようなアプローチの一例として、自己免疫寛容の機構に関与する細胞の一つである制御性Ｔ細胞（Regulatory T Cell；Treg）を介した方法が挙げられる。【０００５】
自己免疫寛容には、胸腺にて分化・成熟したＴ細胞のうち自己反応性のＴ細胞が排除される機構（負の選択）があるが、この際、自己反応性のＴ細胞が全て排除されるわけではなく、一部のＴ細胞はアポトーシスを逃れて末梢免疫系に生存する。Tregは、こうした負の選択を逃れた細胞の活性化や増殖を抑制している。【０００６】
種々の動物実験やヒトでの試験から、TregはCD4陽性CD25陽性Foxp3陽性細胞として同定されており、腫瘍免疫を含む様々な免疫応答を抑制していることが明らかになってきている。例えば、下記非特許文献１、２には、Tregが喘息や自己免疫疾患の治療の過程で重要な役割を果たすこと、また、移植片対宿主病（GVHD）を治療し、移植免疫寛容を誘導し得ること等が報告されている。【０００７】
Tregは、自己反応性Ｔ細胞や腫瘍反応性Ｔ細胞の活性化や増殖を抑制することで、自己免疫寛容を能動的に維持する機能を担っていると考えられている。例えば、ウイルス感染細胞やがん細胞といった異常な細胞は、非自己抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（Cytotoxic T Lymphocyte；CTL）によって認識・攻撃されるが、このCTLの働きは、Tregが標的細胞の周辺に集積することで抑制されてしまう（上述した異常な細胞自身による免疫応答の抑制の一例である）。したがって、ウイルス感染患者やがん患者等においては、Tregの機能を抑制することにより、標的細胞（ウイルス感染細胞やがん細胞といった異常な細胞）を攻撃するCTLの抑制を解除し、免疫応答を増強することが可能である。【０００８】
このように、異常な細胞を直接攻撃するのではなく、免疫機能を補助し、標的細胞への攻撃を増強することで間接的に治療を行う方法は免疫療法と呼ばれている。【０００９】
ヒトの腫瘍組織中には、多数のTregが集積しており、これらのTregとしては、抗原刺激により活性化される前のナイーブ制御性Ｔ細胞（Naive Treg）や、抗原刺激により活性化された後のエフェクターTreg（eTreg）と呼ばれる細胞等、種々のTregが存在することが報告されている。これらのTregは、CD45RAとFoxp3の二重染色パターンによって３つのサブタイプ（フラクションI、II、III）に分類することができる（下記非特許文献３参照）。eTreg（CD45RA-Foxp3highTreg）はこのうちフラクションIIに該当し、特に強い免疫抑制作用を有している（eTregと呼ばれるのは、この強力な活性のためである）。eTregでは、CTLA-4やPD-1といった免疫チェックポイント分子が高発現しており、これらの分子によるシグナル伝達を介して抗腫瘍免疫応答を抑制している。【００１０】
最近の研究では、eTregがCCR4を高発現しているとの報告もあり（下記非特許文献４参照）、抗CCR4抗体を用いてCCR4陽性eTregを選択的に除去すれば、抗腫瘍免疫応答の抑制が解除されて腫瘍細胞を排除できると理論上は考えられる。しかも、この際、血中やリンパ組織内に存在するCCR4陰性Tregは維持されるので、自己免疫反応は阻止し得るとも期待できる。【００１１】
また、細胞の増殖や分化を制御するシグナル伝達を担う分子であるPI3キナーゼ（Phosphoinositide 3-kinase；PI3K）の働きを阻害することによっても、Tregの機能を抑制できる可能性が示されている。下記非特許文献５には、PI3Kを構成する触媒サブユニットの一種であるPI3Kδの阻害剤が、Tregの抑制剤として有望であることが開示されている。【００１２】
ただし、非特許文献５に示されているデータは、あくまでマウスを用いた実験であり、PI3Kδ阻害剤のヒトeTregに対する抑制効果までは明らかになっておらず、ヒトeTregに対し特異的な効果を有するPI3Kδ阻害剤等の発見には至っていない。また、実際には、PI3Kδ阻害作用を示す薬剤の全てが必ずしもTregの抑制剤として有効であるわけでもない。【００１３】
その他、がん免疫療法の可能性は多くの機関で研究されており、抗腫瘍免疫応答の活性化剤として使用し得る薬剤も種々開発されている。【００１４】
しかしながら、こうした抗腫瘍免疫応答の活性化剤は、多くが限定的な臨床効果を有するに留まっている。また、免疫療法剤としての使用にあたっては、例えばCD8陽性Ｔ細胞やCTLの機能などを増強する対象を患部に限定したり、あるいはCTLとTregの機能的なバランスを考慮する必要があるなど、解決すべき問題点は多い。【００１５】
さらに、長期的な効果を得るためには、広範な抗原に対してＴ細胞の免疫記憶を司るメモリーＴ細胞を誘導することが有効と考えられるが、そのような療法ないし療法剤についての研究も未だ発展の途上にある。このように、自己免疫疾患を伴うことなく、標的細胞に対する免疫応答を効果的に誘導し得る免疫療法剤の開発は依然として強く望まれており、それと共に、記憶応答をも誘導し得る療法や療法剤の開発も求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特許第３８３６４３６号公報
【特許文献２】特許第４７３３０２１号公報
【特許文献３】特許第５０８９３７７号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】がんと免疫  2015(株)南山堂
【非特許文献２】Transplantation. 2005 May 27; 79(10):1310-16
【非特許文献３】PLoS One. 2012;7(4):e34662. doi: 10.1371/journal.pone.0034662.
【非特許文献４】PNAS 110, no. 44, 17945-17950
【非特許文献５】Nature 510, 407-411
【非特許文献６】BLOOD 117, no.2, 591-594
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、種々の疾患に対し効果を有する免疫療法剤を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、以下の一般式（Ｉ）にて示される複素環式化合物若しくはその代謝物を有効成分とする免疫療法剤にかかるものである。
【化１】
2018131659.tif 000003
【００２０】
この一般式（Ｉ）中の各記号の定義に使用する語句の意味と例を以下に説明する。【００２１】
Ｘは窒素原子又はＣＨを表す。【００２２】
Ｒ１、Ｒ２は共に、或いはいずれかが水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン、アミノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、シアノ基、tert-ブチルジメチルシリルオキシ基、ニトロ基 を表す。【００２３】
Ｒ３は水素原子、ジフルオロメチル基、アミノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ基、メチル基、又はヒドロキシメチル基を表す。【００２４】
Ｒ４、Ｒ５はそれぞれ水素原子、ヒドロキシル基、又はＣ１−Ｃ６アルキル基を表す。【００２５】
Ｒ６はモルホリノ（１〜２個のＣ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシル基で置換されてもよい）、ピロリジニル（ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル基で置換されていてもよい）、ピペリジノ（１〜２個の酸素原子、ヒドロキシル基、ホルミル、又はＣ１−Ｃ６アルキル基で置換されていてもよい）、ピペラジニル（環が１〜２個の酸素原子で置換されていてもよく、４位の窒素が、ホルミル、ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、オキソＣ１−Ｃ６アルキル、芳香族カルボニル、ベンジルカルボニル、置換カルバモイルからなる群から選択される置換基で置換されていてもよい）、１，４−ジアゼパノ（環が１〜２個の酸素原子で置換されていてもよく、４位の窒素が、ホルミル、ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、オキソＣ１−Ｃ６アルキル、芳香族カルボニル、ベンジルカルボニル、置換カルバモイルからなる群から選択される置換基で置換されていてもよい）、式−ＮＲ７Ｒ８（Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル基、又はカルボキシＣ１−Ｃ６アルキル基を表す）を表す。【００２６】
「Ｃ１−Ｃ６」とは限定がなければ炭素数１〜６個を有する基を意味する。【００２７】
「Ｃ１−Ｃ６アルキル」としてはメチル、エチル、n-プロピル、iso-プロピル、n-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル等の直鎖又は分枝鎖状のアルキル基が挙げられる。【００２８】
「ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル」とは、上記「Ｃ１−Ｃ６アルキル」で定義される基のいずれかの炭素原子にヒドロキシ基が結合した基を意味する。【００２９】
「Ｃ１−Ｃ６アルコキシ」としてはメトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、iso-プロポキシ、n-ブトキシ、tert-ブトキシ、n-ペンチルオキシ、n-ヘキシルオキシ等の直鎖又は分枝鎖状のアルコキシ基が挙げられる。【００３０】
「オキソＣ１−Ｃ６アルキル」とは、上記「Ｃ１−Ｃ６アルキル」で定義される基の何れかの炭素原子にオキソ基が結合した基を意味する。【００３１】
「Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ」とは、アミノ基に上記「Ｃ１−Ｃ６アルキル」で定義される基の何れかが結合した基を意味する。【００３２】
「Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル」とは、カルボニル基に上記「Ｃ１−Ｃ６アルコキシ」で定義される基の何れかが結合した基を意味する。【００３３】
「芳香族カルボニル」とは、カルボニル基に任意の芳香族（例えば、フェニル、チエニル、フリル等）基が結合した基を意味する。【００３４】
「置換カルバモイル」とは、メチルカルバモイル、フェニルカルバモイル等の、アルキル（例えば、上述のＣ１−Ｃ６アルキルなど）又は芳香族基で置換されたカルバ
モイル基を意味する。【００３５】
「カルボキシＣ１−Ｃ６アルキル」とは、上記「Ｃ１−Ｃ６アルキル」で定義される基の何れかの炭素原子にカルボキシ基が結合した基を意味する。【００３６】
尚、上述の化合物は、その構造中に不斉炭素原子を有する場合、不斉炭素原子由来の異性体及びそれらの混合物（ラセミ体）が存在するが、それらはいずれも本発明の有効成分とする化合物に含むものとする。【００３７】
また、上述の化合物若しくはその代謝物は、薬学的に許容される塩として酸付加塩の形態をとってもよい。適当な酸付加塩としては、無機酸塩では例えば塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等、有機酸塩では例えば酢酸塩、シュウ酸塩、プロピオン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ピルビン酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、桂皮酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩等が用いられる。【００３８】
尚、本発明の複素環式化合物は、上記特許文献１〜３に記載の化合物と同様の方法により製造することができる。【００３９】
また、本発明は、上記式（Ｉ）で示される化合物若しくはその代謝物、又はその薬学的に許容される塩と、１又は２以上の免疫調節剤、免疫細胞療法剤又はワクチン療法剤を同時に、別々に、又は経時的に投与するよう組み合わされた免疫療法剤にかかるものである。【００４０】
尚、ここでいう「免疫療法」とは、免疫機能を補助し、標的細胞への攻撃を増強することで間接的に治療する療法を指し、より詳しくは、CTLの機能に対する抑制を解除し、CTLを増強することで免疫機能を増強し、各種ウイルスによる感染症或いはがんといった疾患を治療する療法を指す。また、「免疫療法剤」とは、CTLの機能を増強する薬剤、CTLの機能の抑制（CTLの標的であるウイルス感染細胞やがん細胞等の異常な細胞による抑制や、Treg等による抑制）を解除する薬剤、及びその両方の作用を有する薬剤を指す。また、「免疫調節剤」とは、共抑制分子（PD-1、PD-L1、LAG-3等、免疫応答を抑制方向に誘導する分子）や共刺激分子（OX40等、免疫応答を活性化方向に誘導する分子）を阻害或いは刺激することで、免疫機能に対し影響を与える薬剤を指す。【００４１】
「免疫細胞療法」とは、患者から採取したリンパ球や樹状細胞を体外で増殖、活性化させ、再び患者に移入することでウイルスによる感染症やがんなどの疾患を治療する治療法を指し、「免疫細胞療法剤」とは、免疫細胞療法において患者から採取され、患者に移入するために増殖、活性化されたリンパ球や樹状細胞を指す。【００４２】
「ワクチン療法剤」とは、がんやウイルスなどの抗原をワクチンとして用いた薬剤であり、これらの抗原をがんやウイルス感染症患者に投与することで、免疫系によるプロセッシングと抗原提示を経て、Ｔ細胞の抗原特異的な活性と増殖を促す薬剤を指す。【００４３】
「eTreg」 とは、ヒトのTregをCD45RAとFoxp3の二重染色パターンに基づいて分類したFoxp3陽性細胞集団の３つのサブタイプ（フラクションI：CD45RA+Foxp3low、フラクションII：CD45RA-Foxp3high、フラクションIII：CD45RA-Foxp3low）のうち、フラクションIIに相当するTregを指す。尚、＋は陽性、−は陰性を指す。highとlowはいずれも陽性を指すが、highはlowと比較してより強くタンパク質が発現している状態を指す。【００４４】
適当な免疫調節剤としては、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗OX-40抗体、抗TIGIT抗体、抗4-1BB抗体、抗KIR抗体、抗GITR抗体、抗CD27抗体、抗TIM3抗体、抗ICOS抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗VISTA抗体、抗BTLA抗体、抗HVEM抗体、抗CD28抗体、抗CD30抗体が例として挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではなく、対象となる疾患等に応じて種々の免疫調節剤を使用し得る。
［製造工程］【００４５】
上記一般式（Ｉ）で表される複素環式化合物は、下記反応式に示されるように塩化シアヌル又は2,4,6-トリクロロピリミジン(化合物II)を出発原料としてベンズイミダゾール化合物(化合物Ｖ)、モルホリン化合物(化合物VI)及びＲ６Ｈ(化合物VII)を順次反応させることにより製造することができる。
［反応式］
【化２】
2018131659.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｘは前記定義に同じ）【００４６】
以下に各々の製造工程を説明する。【００４７】
１）中間体IIIの製造工程（ｉ）
【化３】
2018131659.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘは前記定義に同じ）【００４８】
溶媒中、塩化水素捕捉剤の存在下で、塩化シアヌル又は2,4,6-トリクロロピリミジン(化合物II)とベンズイミダゾール化合物(化合物Ｖ)を反応させることにより中間体IIIが得られる。【００４９】
この反応で用いる塩化水素捕捉剤としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン又はピリジン等が挙げられ、溶媒としてはアセトン、トルエン、ヘキサン、キシレン、ジオキサン、テトラヒドロフラン又はジクロロエタン、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)等が挙げられる。【００５０】
この反応においては、化合物II１モルに対して0.5〜1.2モルの化合物Ｖを0.5〜2モルの塩化水素捕捉剤の存在下で-15℃〜-5℃の温度で0.5〜2時間、更に室温で5〜50時間反応させる。【００５１】
尚、化合物Ｖを塩化水素捕捉剤として用いることもできる。【００５２】
２）中間体IVの製造工程（ｉｉ）
【化４】
2018131659.tif 000006
（式中、Ｒ1、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘは前記定義に同じ）
【００５３】
溶媒中、塩化水素捕捉剤の存在下で、前記製造工程(i)で得られた中間体IIIとモルホリン化合物(化合物VI)を反応させることにより中間体IVが得られる。この反応で用いる塩化水素捕捉剤としては、前記製造工程(i)の塩化水素捕捉剤と同じものが挙げられ、溶媒としてはDMF、アセトン、トルエン、キシレン、ジクロロエタン、ジクロロメタン等が挙げられる。【００５４】
この反応においては、中間体III１モルに対して0.5〜1.2モルの化合物VIを0.5〜3モルの塩化水素捕捉剤の存在下で-5℃〜0℃の温度で0.5〜3時間、更に室温で5〜50時間反応させる。【００５５】
尚、化合物VIを塩化水素捕捉剤として用いることもできる。【００５６】
３）化合物(I)の製造工程（ｉｉｉ）
【化５】
2018131659.tif 000007
（式中、Ｒ1、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｘは前記定義に同じ）【００５７】
溶媒中、前記製造工程(ii)で得られた中間体IVに塩化水素捕捉剤の存在下、Ｒ６Ｈ(化合物VII)を反応させることにより、本発明の化合物(I)が得られる。【００５８】
この反応で用いる塩化水素捕捉剤としては、前記製造工程(i)の塩化水素捕捉剤と同じものが挙げられ、溶媒としてはDMF、ジメチルスルホキシド(DMSO)、キシレン、ジクロロエタン等が挙げられる。【００５９】
この反応においては、中間体IV１モルに対して1〜5モルのＲ６Ｈ(化合物VII)を室温〜140℃で0.1〜16時間反応させる。尚、塩化水素捕捉剤の存在下で反応させる場合は、中間体IV１モルに対して1〜5モルの塩化水素捕捉剤を用いる。尚、化合物VIIを塩化水素捕捉剤として用いることもできる。【００６０】
ただし、化合物(I)の製造に当たって化合物VIと化合物VIIが同一の場合は、製造工程(ii)、(iii)を一段階で行い化合物(I)を得ることができる。その場合は、化合物III１モルに対して2〜10モルの化合物VI又はVIIを用いて-10℃〜5℃で0.1〜5時間反応させ、さらに室温〜120℃で3〜50時間反応させる以外は前記製造工程(ii)の反応条件に従う。【００６１】
また、製造工程(i)、(ii)、(iii)において用いられる化合物Ｖ、VI又はVIIの反応性が低い場合は、水素化ナトリウムで処理した後に各工程の反応を進めることが好ましい。水素化ナトリウムを使用する場合は、各工程の出発物質（化合物II、III又はIV）１モルに対して1.0〜1.2モルの水素化ナトリウムを用いる。【００６２】
尚、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のいずれかがtert-ブチルジメチルシリルオキシである場合は、更に常法に従い酸により脱保護し水酸基に変換することができる。また、Ｒ１、Ｒ２のいずれかがニトロ基の場合は、還元することによりアミノ基に変換することができる。【００６３】
また、前記製造工程(i)、(ii)、(iii)は、順序が入れ替わることも可能であり、その際の反応条件の変更は当業者にとって自明な範囲で行うことができる。【００６４】
尚、上記各工程で得られる生成物は必要に応じて通常の方法、例えば抽出、濃縮、中和、濾過、再結晶、カラムクロマトグラフィー等で分離精製することができる。【００６５】
本発明の有効成分とする一般式（Ｉ）の化合物の酸付加塩は、当該技術分野で周知の各種の方法によって製造することができる。用いる適当な酸としては、無機酸では例えば塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸等、有機酸では例えば酢酸、シュウ酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等が挙げられる。
【発明の効果】
【００６６】
本発明の免疫療法剤は、例えばがんや各種ウイルスによる感染症等、免疫療法の対象となり得る広範な疾患に対して使用することができる。【００６７】
本発明の免疫療法剤が対象とし得るがんとしては、例えば肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌等、大腸癌、盲腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、頭頚部癌、脳腫瘍、膠芽腫、神経膠腫、神経鞘腫、下垂体腺種、ぶどう膜悪性黒色腫、髄膜腫、咽頭癌、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌、喉頭癌、舌癌、食道癌、甲状腺癌、胃癌、胸腺腫、胸腺癌、中皮腫、肝臓癌、GIST（消化管間質腫瘍）、胆管癌、胆嚢癌、膵内分泌腫瘍、膵臓癌、膵臓腺癌、腎癌、腎盂・尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮体癌（子宮内膜癌）、乳癌、卵巣癌、精巣（睾丸）腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、絨毛性疾患、陰茎癌、膣癌、外陰癌、皮膚癌、悪性黒色腫、乳房外パジェット病、中皮腫、メルケル細胞癌、有棘細胞癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、子宮肉腫、カポジ肉腫、軟部肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、悪性骨腫瘍、口腔癌など、肉腫および癌腫を含む固形腫瘍もしくは線維症、さらに、白血病（急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人T細胞白血病等）、悪性リンパ腫（ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫等）、小リンパ球性リンパ腫、骨髄異型性症候群、骨髄増殖性腫瘍、多発性骨髄腫などの血液腫瘍等が挙げられる。ただし、これに限定されるものではない。【００６８】
また、本発明の免疫療法剤が対象とし得る感染症としては、例えばインフルエンザ、サイトメガロウイルス感染症、エプスタインバーウイルス感染症、ＨＩＶ感染症、リケッチア感染症、クラミジア感染症、ファイトプラズマ感染症、コクシエラ感染症、トキソプラズマ感染症、リーシュマニア感染症等が挙げられるが、これに限定されるものではない。【００６９】
本発明の免疫療法剤は、免疫療法の対象となり得る広範な抗原に対して使用することができる。代表的な例として、病原性生物由来、腫瘍細胞由来の抗原が挙げられ、病原性生物としては、例えばサイトメガロウイルス、エプスタイン・バールウイルス、肝炎ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒトパピローマウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、インフルエンザウイルス、Neisseria meningitidis、百日咳菌、Haemophilus influenzae b型、HIV、単純ヘルペスウイルス2型、ジフテリア菌、破傷風菌、H.pylori、Streptococcus pneumoniae、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、髄膜炎菌等が挙げられる。ただし、これらに限定されるものではない【００７０】
以下、上記一般式（Ｉ）で表される複素環式化合物を有効成分とする免疫療法剤の効果について説明する。尚、以下の各試験では本発明の対象の一例として主にインフルエンザ、サイトメガロウイルス感染症、エプスタインバーウイルス感染症、がんを取り扱っているが、本発明の治療対象はこれに限定されるものではなく、免疫療法の対象となり得る種々の疾患に使用し得る。また、各試験例中、試薬等添加した際の濃度の記載は全て終濃度を示す。
［試験１］【００７１】
上記一般式（Ｉ）で表される複素環式化合物のうち、以下の化合物１のPI3Kδに対する阻害活性を測定した。
・化合物１：２−（２−ジフルオロメチルベンズイミダゾール−１−イル）−４，６−ジモルホリノ−１，３，５−トリアジン【００７２】
PI3-KinaseヒトHTRF Assay Kit（Millipore社より購入）を使用し、化合物１のPI3K各アイソフォームに対する阻害活性を決定した。３８４ウェルプレート（Perkin Elmer社より購入）の各ウェルに、ＤＭＳＯ、又は化合物１を０．１〜３０００［ｎＭ］含むＤＭＳＯを０．５［μＬ］と、酵素と基質の混合溶液（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、１３．８μＭ  ＰＩＰ２、及びそれぞれ最適濃度として定めた濃度のPI3Kα（最終濃度４０［ｎｇ／ｍＬ］）、β（最終濃度７０［ｎｇ／ｍＬ］）、γ（最終濃度６００［ｎｇ／ｍＬ］）又はδ（最終濃度３０［ｎｇ／ｍＬ］））を１４．５［μＬ］ずつ分注し、室温で１０分間インキュベートした。さらに、５［μＬ］のＡＴＰ溶液（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、８０μＭ  ＡＴＰ）を加えて室温で３０分間インキュベートし、反応停止溶液（PI3-KinaseヒトHTRF Assay Kit内に含まれる）を５［μＬ］添加して反応を終了させた。検出溶液（PI3-KinaseヒトHTRF Assay Kit内に含まれる）を各ウェルに５［μＬ］ずつ添加し、約１８時間後、各ウェルの蛍光を測定した（励起波長３３０［ｎｍ］、測定波長６２０［ｎｍ］及び６６５［ｎｍ］）。測定波長６６５［ｎｍ］で得た測定値を、測定波長６２０［ｎｍ］で得た測定値で除した値をＨＴＲＦ比とした。化合物非存在下におけるＨＴＲＦ比を１００％活性、PI3K各アイソフォーム非存在下におけるＨＴＲＦ比を０％活性として酵素活性率を算出し、５０％酵素阻害濃度（IC50値）を決定した。【００７３】
その結果、化合物１のヒトのPI3KのサブユニットPI3Kδに関するIC50値は６．７１［ｎＭ］であり、化合物１は、ヒトのPI3KのサブユニットPI3Kδに対して高い阻害活性を有していることが確認された。
［試験２］【００７４】
次に、上記化合物１の投与が免疫系細胞に与える影響を検討した。この試験２では、ヒトの末梢血単核細胞（PBMC）から選別したＴ細胞サブセットのうち、CD4陽性CD25陽性細胞、CD4陽性CD25陰性細胞、及びCD8陽性T細胞に関して化合物１の影響を分析した。CD25はTregのマーカーとして一般に知られており、この試験２では、CD4陽性CD25陽性細胞をTregとして扱っている。【００７５】
選別した細胞に、CD3/CD28刺激ビーズ及びIL-2と共に化合物１を添加して培養した後、フローサイトメトリーを用いて各Ｔ細胞サブセットにおける増殖性細胞の割合を測定した。また、CD4陽性CD25陽性細胞を培養した実験群に関しては、CD4陽性Foxp3陽性Tregに対するeTregの割合を測定した（図１Ａ、図１Ｂ参照）。上述の通り、eTregは免疫反応に対して強い抑制活性を有しており、免疫系の働きを評価する際には、eTregの数や割合を指標として用いることができる。【００７６】
ヒトPBMC（Cellular Technology Limited社より購入）の懸濁液に抗FcγR抗体（eBioscience社より購入）を５倍希釈にて添加し、４℃で１０分間反応させた後、さらにCD3、CD4、CD8、CD45RA、CD25に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。ＰＢＳ（２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む）で洗浄、懸濁し、セルソーター（BD FACSAriaTM Fusion、BD Bioscience社製）を用いてＴ細胞サブセット中のCD4陽性CD25陽性細胞、CD4陽性CD25陰性細胞及びCD8陽性T細胞を選別した。これに細胞増殖の指標としてCFSE（CellTraceTM CFSE Cell Proliferation Kit、Lifetechnologies社より購入）を取り込ませ、RPMI1640培地（細胞科学研究所より購入、１０％ヒトＡＢ型血清、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ  L-グルタミンを含む）に懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり５×１０４個の細胞を播種した。各ウェルに、最終濃度１０［ＩＵ／ｍＬ］となる量のIL-2、及び２［μＬ／ウェル］のCD3/CD28抗体コート磁気ビーズ（Dynabeads (R) Human T-Activator CD3/CD28、Lifetechnologies社より購入）、化合物１（最終濃度１又は４［μＭ］）を添加し、１ウェルあたりの液量を０．２［ｍＬ］として二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で４日間培養した。【００７７】
培養した細胞をピペッティングにより各ウェルから剥がし、プレートを遠心して２％  ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した。抗FcγR抗体（eBioscience社より購入）を５倍希釈にて添加し、４℃で１０分間反応させた後、CD3、CD4、CD8、CD45RAに対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄した後、細胞固定液（eBioscience社より購入）に懸濁して４℃で６０分間反応させた。固定細胞用洗浄液（eBioscience社より購入）で細胞を洗浄してFoxp3に対する抗体を５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターにて測定を行った。【００７８】
図１Ａに示す如く、化合物１の添加により、CD4陽性CD25陽性細胞の増殖が強く抑制された。化合物１を４［μＭ］添加した群では、１［μＭ］添加した群と比較してより強い増殖の抑制が見られた。一方、CD4陽性CD25陰性細胞とCD8陽性T細胞については、増殖の抑制は観察されなかった。化合物１は、Ｔ細胞サブセットのうち、Tregの増殖を選択的に抑制することが確認された。【００７９】
さらに、増殖抑制が観察されたCD4陽性CD25陽性細胞においては、図１Ｂに示す如く、TregにおけるeTregの割合も減少していたが、このeTregの減少についても化合物１の濃度への依存が見られ、化合物１を４［μＭ］添加した群においては、１［μＭ］添加した群と比較してeTregの割合が大きく減少していた。以上より、化合物１は、Tregの中でも特にeTregの活性化と増殖を抑制することが示された。
［試験３］【００８０】
上記試験２と同じ実験系を用いて、化合物１と他のPI3Kδ阻害剤のTregに対する増殖抑制効果を比較した。この試験３では、ヒトPBMCから選別したＴ細胞サブセット中のCD4陽性CD25陽性細胞に、CD3/CD28刺激ビーズ及びIL-2と共に化合物１をはじめとする各種のPI3Kδ阻害剤（被験物質）をそれぞれ添加して培養した後、フローサイトメトリーを用いてTregに対するeTregの割合を測定した（図２参照）。【００８１】
ヒトPBMC（Cellular Technology Limited社より購入）の懸濁液に抗FcγR抗体（eBioscience社より購入）を５倍希釈にて添加し、４℃で１０分間反応させた後、さらにCD3、CD4、CD8、CD45RA、CD25に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。ＰＢＳ（２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む）で洗浄、懸濁し、セルソーター（BD FACSAriaTM Fusion、BD Bioscience社製）を用いてCD4陽性CD25陽性Ｔ細胞を選別した。これをRPMI1640培地（細胞科学研究所より購入、１０％ヒトＡＢ型血清、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ  L-グルタミンを含む）に懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり５×１０４個の細胞を播種した。各ウェルに、最終濃度１０［ＩＵ／ｍＬ］となる量のIL-2、２［μＬ／ウェル］のCD3/CD28抗体コート磁気ビーズ（Dynabeads (R) Human T-Activator CD3/CD28、Lifetechnologies社より購入）、最終濃度４［μＭ］となる量の各被験物質を添加し、１ウェルあたりの液量を０．２［ｍＬ］として二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で４日間培養した。【００８２】
培養した細胞をピペッティングにより各ウェルから剥がし、プレートを遠心して２％  ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した。抗FcγR抗体（eBioscience社より購入）を５倍希釈にて添加し、４℃で１０分間反応させた後、CD3、CD4、CD8、CD45RAに対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄した後、細胞固定液（eBioscience社より購入）に懸濁して４℃で６０分間反応させた。固定細胞用洗浄液（eBioscience社より購入）で細胞を洗浄してFoxp3に対する抗体を５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターにて測定を行った。【００８３】
図２に示す如く、PI3Kδ阻害剤として公知の物質であるCAL101、PIK293、PIK294、AMG319、PI3065、IC87114と比較して、化合物１がeTregに対し有意に強い抑制効果を示すことが確認された。このように、化合物１のもつeTreg抑制効果は、PI3Kδ阻害剤一般の中でも特に強いことが確認された。【００８４】
ここで、非特許文献６によれば、本試験２にて化合物１との比較対象としたPI3Kδ阻害剤のうち、CAL101のPI3Kδに関するIC50は２．５［ｎＭ］であり、一方、上述の試験１によれば、化合物１のPI3Kδに関するIC50は６．７１［ｎＭ］である。つまり、PI3Kδ阻害剤としての活性はCAL101と比較して化合物１のほうが低いにもかかわらず、化合物１にCAL101よりも有意に強いeTreg抑制効果が認められた。eTreg抑制効果の強さは、PI3Kδ阻害活性の強さに必ずしも依存しないことを示すものであり、これは上記非特許文献５に開示されている知見等を鑑みて予想外の結果と言える。
［試験４］【００８５】
次に、上記一般式（Ｉ）で表される複素環式化合物の類縁体である以下の化合物２〜７に関し、eTregに対する増殖抑制効果を検討した。この試験４で用いた実験系は、用いる化合物の種類のほかは、上記試験３と同じとした。
・化合物２：２−（２−ジフルオロメチルベンズイミダゾール−１−イル）−４−Ｎ，Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエチル）アミノ−６−モルホリノ−１，３，５−トリアジン
・化合物３：２−（２−ジフルオロメチル−５−ヒドロキシベンズイミダゾール−１−イル）−４，６−ジモルホリノ−１，３，５−トリアジン
・化合物４：２−（２−ジフルオロメチルベンズイミダゾール−１−イル）−４−（２−ヒドロキシモルホリノ）−６−モルホリノ−１，３，５−トリアジン・化合物５：２−（２−ジフルオロメチルベンズイミダゾール−１−イル）−４−モルホリノ−６−（４−オキソピペリジノ）−１，３，５−トリアジン
・化合物６：２−（２−ジフルオロメチル−４−ヒドロキシベンズイミダゾール−１−イル）−４−（２−ヒドロキシメチルピロリジン−１−イル）−６−モルホリノ−１，３，５−トリアジン
・化合物７：２−（２−ジフルオロメチル−４−ヒドロキシベンズイミダゾール−１−イル）−４−（３，３−ジメチルモルホリノ）−６−モルホリノピリミジン【００８６】
試験４では、ヒトPBMCから選別したＴ細胞サブセット中のCD4陽性CD25陽性細胞に、CD3/CD28刺激ビーズ及びIL-2と共に化合物２〜７をそれぞれ添加して培養した後、フローサイトメトリーを用いてTregに対するeTregの割合を測定した（図３Ａ、図３Ｂ参照）。【００８７】
図３Ａ、図３Ｂに示す如く、化合物２〜７の添加により、TregにおけるeTregの割合が顕著に減少した。このことから、化合物２〜７は、化合物１と同様、eTregの増殖を抑制する効果を有することが確認された。
［試験５］【００８８】
次に、化合物１の投与による抗原特異的免疫応答の増強効果を検討した。がんや感染症の発症に際しては、がん細胞やウイルス感染細胞が発現する抗原に特異的なCTL（抗原特異的CTL）が誘導されるが、このときにTregが共存していると、CTLの増殖が阻害されたり、機能が抑制されたりすることが知られている。したがって、上記試験３にて確認されたように、化合物１によりeTregが抑制されるとすれば、化合物１の投与によって抗原特異的CTLの数や機能が増大することが期待できる。この試験５では、ヒトPBMCにIL-2、IL-7及び抗原ペプチドと共に化合物１を添加して培養した後、フローサイトメトリーを用いてCTLとeTregの数を計測し、CTL/eTreg比を算出した（図４参照）。CTL/Treg比はCTLによる抗原特異的免疫応答とTregによる免疫抑制反応のバランスを評価する指標として一般的に用いられているものである。したがって、この試験５において、化合物１の投与によりCTL/eTreg比が上昇すれば、化合物１の作用により抗原特異的免疫応答が増強されていると解釈することができる。【００８９】
ヒトPBMC（国立がん研究センター内で採取された健常人血液より調製、或いはCellular Technology Limited社より購入）をRPMI1640培地（細胞科学研究所より購入、１０％ヒトAB型血清、２５ｍＭ  HEPES、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む）に懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０６個の細胞を播種した。各ウェルに段階的に希釈した化合物１（最終濃度０．００８〜２μＭ）、IL-2（最終濃度１０［Ｕ／ｍＬ］）、IL-7（最終濃度２０［ｎｇ／ｍＬ］）及び下記各種抗原ペプチド（最終濃度１０［μＭ］）を添加し、１ウェルあたりの液量を０．２［ｍＬ］として二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で８日間培養した。培養期間中は、２〜３日毎に１００［μＬ］の培養上清を除き、化合物１、IL-2、IL-7を同上の最終濃度で含有する新たなRPMI1640培地（同上）を１００［μＬ］添加した。【００９０】
抗原ペプチドとしては、がん細胞又はウイルス感染細胞の細胞表面上に発現しており、且つ健常人のPBMC中に、当該抗原に対し一定の頻度で反応するＴ細胞クローンが存在することが知られていることを条件に、以下の各抗原を選択した。各抗原ペプチドは、ユーロフィンジェノミクス株式会社等より入手した。また、入手した各抗原ペプチドに関し、３ロット以上のヒトPBMCの反応性を事前に試験し、最も反応性の高いロットを本試験に使用した。
・改変Melan-A：悪性黒色腫細胞が発現するがん抗原（遺伝子改変型）
・CMV：サイトメガロウイルス（CMV）感染細胞が発現するウイルス抗原
・EBNA：エプスタイン・バールウイルス（EBV）感染細胞が発現するウイルス抗原
・Flu：インフルエンザ感染細胞が発現するウイルス抗原【００９１】
培養後の各ウェル内の細胞をピペッティングして剥がし、プレートを遠心して２％  ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した。抗FcγR抗体（eBioscience社より購入）を１００倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた後、細胞懸濁液をeTreg測定用とCTL測定用に２等分した。【００９２】
eTreg測定用のサンプルについては、細胞懸濁液にCD3、CD4、CD8、CD45RAに対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄し、細胞固定液（eBioscience社より購入）に懸濁して４℃で６０分間反応させた後、固定細胞用洗浄液（eBioscience社より購入）で細胞を洗浄してFoxp3に対する抗体を５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターにて測定を行った。【００９３】
CTL測定用のサンプルについては、細胞懸濁液に抗原ペプチド特異的TCR検出用MHC-Tetramer（TC Metrix社より購入）を５０倍希釈にて添加し、３７℃で１５分間反応させた。続いてCD3、CD4、CD8に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄し、細胞固定液（BD社より購入）に懸濁して室温で２０分間反応させた後、固定細胞用洗浄液（BD社より購入）で細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターにて測定を行った。【００９４】
上記手順により測定したeTregとCTLの数の比を図４に示す。使用した抗原ペプチドやPBMCドナーの違いにより、反応性や至適濃度は異なるものの、抗原ペプチドの種類にかかわらず、化合物１による処理濃度に依存してCTL/eTreg比が増加する傾向が認められ、いずれも最終濃度では対照区と比較して２倍以上増加した。以上から、化合物１により、感染症やがん等に対する抗原特異的免疫応答が増強される可能性が示された。
［試験６］【００９５】
続いて、上記試験５と同じ実験系を用い、化合物１によるCTLの活性化について検討した。この試験６は、化合物１によるCTLの増加を検証するための試験である。具体的な手順としては、ヒトPBMCからCD3陰性細胞とCD8陽性T細胞を選別し、これらの細胞の共培養系にIL-2、IL-7及び抗原ペプチドと共に化合物１を添加して培養した後、フローサイトメトリーを用いて抗原特異的なCTLの数を計測した（図５参照）。抗原提示細胞であるCD3陰性細胞とCD8陽性T細胞のみの共培養系（すなわち、Tregの存在しない条件下）において、化合物１の投与により抗原特異的なCTLの増強が確認されれば、化合物１はTregを抑制するのみならず、抗原提示とCTL活性化の段階をも直接的に増強していると推定することができる。【００９６】
ヒトPBMC（国立がん研究センター内で取得された健常人血液より調製）の懸濁液に抗FcγR抗体（eBioscience社より購入）を５倍希釈にて添加し、４℃で１０分間反応させた後、さらにCD3、CD4、CD8に対する各抗体のカクテルをそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。ＰＢＳ（２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む）で洗浄、懸濁し、セルソーター（BD FACSAriaTM Fusion、BD Bioscience社製）を用いてCD3陰性細胞及びCD8陽性T細胞を選別した。両細胞をRPM11640培地（細胞科学研究所より購入、１０％ヒトAB型血清、２５ｍＭ  HEPES、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む）に懸濁し、９６ウェルプレートの同一ウェルに対して、CD3陰性細胞を１ウェルあたり１×１０6個、CD8陽性T細胞を１ウェルあたり２×１０５個を播種した。各ウェルに段階的に希釈した化合物１（最終濃度０．０３〜２μＭ）、IL-2（最終濃度１０［Ｕ／ｍＬ］）、IL-7（最終濃度２０［ｎｇ／ｍＬ］）及び抗原ペプチド（最終濃度１０［μＭ］）を添加し、１ウェルあたりの液量を０．２［ｍＬ］として二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で８日間培養した。培養期間中は、２〜３日毎に１００［μＬ］の培養上清を除き、化合物１、IL-2、IL-7を同上の最終濃度で含有する新たなRPMI1640培地（同上）を１００［μＬ］添加した。【００９７】
培養後の各ウェル内の細胞をピペッティングして剥がし、プレートを遠心して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した。抗FcγR抗体（eBioscience社より購入）を１００倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた後、EBNA特異的TCR検出用MHC-Tetramer（TC Metrix社より購入）を添加し（５０倍希釈）、３７℃で１５分間反応させた。続いてCD3、CD4、CD8に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄し、細胞固定液（BD社より購入）に懸濁して室温で２０分間反応させた後、固定細胞用洗浄液（BD社より購入）で細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターにて測定を行った。【００９８】
上記手順により測定したEBNA特異的CTLの数を図５に示す。化合物１の処理濃度に依存してEBNA特異的CTLの数が増加し、本試験中の最高濃度である２［μＭ］の化合物１で処理した群では、対照区と比較してEBNA特異的CTLは３倍以上に増加した。すなわち、化合物１は、Treg抑制を通じて免疫応答を増強するのみならず、Tregを介さない別の機構によっても、抗原特異的免疫応答を増強していることを示すものである。
［試験７］【００９９】
さらに、がん患者における抗原特異的免疫応答に対し、化合物１が与える影響を検討した。がん患者の体内では、がん抗原に対する免疫寛容が成立しているため、がん患者のがん抗原に対する免疫反応と、健常人の外来抗原に対する免疫反応は異なるものと考えられる。したがって、がん抗原への免疫反応に対する作用を検討するにあたっては、健常人由来のサンプルの他に、がん患者由来のサンプルを用いた解析をも行う必要がある。そこで、この試験７では、がん抗原に対する免疫応答が認められた胃がん患者末梢血からPBMCを採取し、これを上記試験６における健常人血液由来のPBMCの代わりに用いて化合物１の影響を検討した（図６Ａ〜図６Ｄ参照）。【０１００】
国立がん研究センター内で取得した胃がん患者の末梢血よりPBMCを調製し、抗CD8抗体を結合した磁気ビーズ（miltenyi社より購入）を用いてCD8陽性T細胞を単離した。そのネガティブフラクション（CD8-PBMC）から、さらに抗CD4抗体を結合した磁気ビーズ（miltenyi社より購入）を用いてCD4陽性T細胞を除去し、残った細胞（CD8-CD4-PBMC）を抗原提示細胞（APC）とした。APCをX-VIVO培地（LONZA社より購入）に懸濁し、２ｍＬチューブに１本あたり３×１０５〜１×１０６個となるよう播種した。各種抗原ペプチド（MAGE-A3、MAGE-A4、NYESO-1、WT-1）を１チューブあたりの液量が０．２５［ｍＬ］となるよう、最終濃度１０［μＭ］にて添加し、二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で１日間培養し、APCに抗原ペプチドをパルスした。一方、単離したCD8陽性T細胞は、RPMI1640培地（細胞科学研究所より購入、１０％ヒトAB型血清、２５ｍＭ  HEPES、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む）に懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０5〜２×１０5個となるよう播種し、二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で１日間培養した。抗原ペプチドをパルスしたAPCに３５Gyの放射線を照射して不活化し、CD8陽性T細胞を播種済みの９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０５〜５×１０５個となるよう播種し、CD8陽性T細胞と混合した。各ウェルに段階的に希釈した化合物１（最終濃度０．２５〜１μＭ）、IL-2（最終濃度１０［Ｕ／ｍＬ］）及びIL-7（最終濃度２０［ｎｇ／ｍＬ］）を添加し、１ウェルあたりの液量を０．２［ｍＬ］として二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で８日間培養した。培養期間中は、２〜３日毎に１００［μＬ］の培養上清を除き、化合物１、IL-2、IL-7を同じ最終濃度で含有する新たなRPMI1640培地を１００［μＬ］添加した。【０１０１】
続いて、各抗原ペプチドで処理した細胞群に関し、上記試験６と同様の手順によりフローサイトメーターによる測定を行った。培養後の細胞を２％  ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、抗FcγR抗体を添加して反応させた後、各抗原ペプチドに特異的なTCR検出用MHC-Tetramerを添加して反応させた。続いてCD3、CD4、CD8に対する各抗体を添加して反応させ、細胞固定液にて固定して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメトリーに供した。【０１０２】
上記手順により測定したCD8陽性T細胞におけるがん抗原特異的CTLの割合を図６Ａ〜図６Ｄに示す。いずれの抗原を添加した細胞群においても、化合物１の処理濃度に依存して抗原特異的CTLの割合が増加したことから、化合物１は健常人の血液のみならず、がん患者の末梢血においてもがん抗原特異的免疫応答を増強することが示唆された。
［試験８］【０１０３】
次に、この化合物１がin vivoにてCD8陽性Ｔ細胞とTregの細胞数比に対して与える影響を検討した。この試験８では、担がんマウスに化合物１を投与し、末梢リンパ節（PLN）、脾臓（Spleen）及び腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の各々についてフローサイトメトリーを用いてCD8陽性T細胞とTregの比を計測した（図７Ａ〜図７Ｅ参照）。【０１０４】
７週齢のBALB/c系雌性マウス（日本クレア社より購入）の腰部を剃毛し、マウス線維肉腫細胞株CMS5aを皮下移植した。腫瘍径が４〜６ｍｍに達した時点で群分けを行い、２．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）に懸濁した化合物１の投与を開始した。対照区として、培地のみを皮下移植した７週齢のBALB/cマウスを使用した（図７Ａ〜図７Ｅ中ではcontと表示）。【０１０５】
化合物１は、経口投与により連日投与した。１回あたりの投与量は０，１０，３０，１００［ｍｇ／ｋｇ］とし、化合物１を投与しない群（投与量０［ｍｇ／ｋｇ］）には溶媒のみを投与した。投与は１日１回とし、投与期間は８日間、１５日間、２２日間の三通りとした。【０１０６】
初回投与前（Day 0）、及び各投与期間における最終投与の翌日（Day 8，Day 15，Day 22）に各組織を回収し、末梢リンパ節および脾臓については氷冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ中で、がん組織については氷冷したＰＢＳ（２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む）でそれぞれホモジナイズし、組織片のろ過と細胞の洗浄を経て、細胞懸濁液を調製した。９６ウェルプレートに１ウェルあたり約１×１０６個の細胞を播種した。抗CD16/32抗体（BDより購入）を１００倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた後、CD3、CD4、CD8に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄した後、細胞固定液（eBioscience社より購入）に懸濁して４℃で６０分間反応させた。固定細胞用洗浄液（eBioscience社より購入）で細胞を洗浄してFoxp3に対する抗体を５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、セルカウント用ビーズ（eBioscience社より購入）と共にフローサイトメーターにて測定を行った。各組織についてCD8陽性Ｔ細胞及びTregの細胞数を測定し、CD8陽性Ｔ細胞/Treg比を算出した。【０１０７】
図７Ａに示す如く、担がんマウスの末梢リンパ節や脾臓におけるCD8陽性Ｔ細胞/Treg比は、Day 0においては対照群と差が認められなかったが、図７Ｂ〜図７Ｄに示す如く、Day 8以降、腫瘍細胞の増殖と共にCD8陽性Ｔ細胞/Treg比は低下した（PLN（cont）、Spleen（cont）及びPLN（tumor + vehicle）、Spleen（tumor + vehicle）参照）。そして、化合物１を連続投与すると、図７Ｂ〜図７Ｄに示す如く、末梢リンパ節や脾臓におけるCD8陽性Ｔ細胞/Treg比に関し、化合物１の投与量依存的に上昇する傾向が見られた（PLN（tumor + 10 mg）、PLN（tumor + 30 mg）、PLN（tumor + 100 mg）、Spleen（tumor + 10 mg）、Spleen（tumor + 30 mg）、Spleen（tumor + 100 mg）参照）。以上より、化合物１を投与することで、in vivoにおいて免疫応答を増強し得ることが確認された。【０１０８】
また、図７Ｅに示す如く、がん組織内のTILに関しても、Day 8において化合物１の投与量依存的にCD8陽性Ｔ細胞/Treg比の上昇が認められ、化合物１が免疫応答を増強し得ることが示された。
［試験９］【０１０９】
次に、化合物１が異常な細胞を排除する免疫応答の機能を増強することをin vivoにて確認する試験を行った。この試験９では、抗CD8抗体又は抗CD4抗体を担がんマウスに投与してCD8陽性Ｔ細胞又はCD4陽性Ｔ細胞を除去した場合の化合物１投与による抗腫瘍効果を検討した。【０１１０】
７週齢のBALB／c系雌マウス（日本クレア社より購入）の腰部を剃毛し、ヒトがん抗原NY-ESO-1の遺伝子を導入したマウス線維肉腫細胞株CMS5aを皮下移植した。腫瘍径が４〜６ｍｍに達した時点（Day -1）で群分けを行い、一部のマウスに対して５００μｇの抗CD8抗体又は抗CD4抗体を腹腔内投与し、翌日（Day 0）から溶媒又は２．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）に懸濁した化合物１の投与を開始した。化合物１の１回あたりの投与量は１００［ｍｇ／ｋｇ］とし、実験終了日（Day 17）まで連日経口投与し、Day 6に２５０μｇの抗CD8抗体又は抗CD4抗体を再び腹腔内投与した。【０１１１】
図８Ａ、図８ＢはDay 17における各群の平均腫瘍体積を示している。図８Ａに示す如く、化合物１を含まない溶媒を投与したマウスにおいては、抗体非投与群（vehicle）及び抗CD4抗体投与群（CD4 depletion）における腫瘍体積が平均約３０００［ｍｍ３］であるのに対し、抗CD8抗体投与群（CD8 depletion）における腫瘍体積は平均約６０００［ｍｍ３］に達した。CD8陽性Ｔ細胞の存在が腫瘍増殖に大きく関与していることがわかる。【０１１２】
一方、図８Ｂに示す如く、化合物１を投与したマウスにおいては、抗体非投与群（化合物（１））における腫瘍体積が平均１０００［ｍｍ３］程度に抑えられたのに対して、抗CD8抗体（化合物（１）CD8 depletion）及び抗CD4抗体投与群（化合物（１）CD4 depletion）における腫瘍体積は平均２０００［ｍｍ３］以上に達した。このように、化合物１による抗腫瘍効果は、CD8陽性Ｔ細胞やCD4陽性Ｔ細胞の除去により半減した。化合物１が、CD8陽性Ｔ細胞やCD4陽性Ｔ細胞の機能の増強を介して免疫応答を高め、抗腫瘍効果を発揮することを示すものであり、化合物１を新たな免疫療法剤として利用し得ることが期待される。
［試験１０］【０１１３】
次に、化合物１と免疫調節剤の併用による免疫増強の効果について検討した。この試験１０では、免疫調節剤として抗PD-1抗体を使用した。担がんマウスに化合物１と抗PD-1抗体を併用投与し、各群５匹ずつのマウスからがん組織を回収し、CD8陽性T細胞とTregの数をフローサイトメトリーにより計測し、CD8陽性Ｔ細胞/Treg比を算出した（図９Ａ参照）。また同様に、NY-ESO-1抗原特異的CD8陽性Ｔ細胞（CTL）の数を計測し、CTL/Treg比を算出した（図９Ｂ参照）。【０１１４】
７週齢のBALB/c系雌性マウス（日本クレア社より購入）の腰部を剃毛し、ヒトがん抗原NY-ESO-1の遺伝子を導入したマウス線維肉腫細胞株CMS5aを皮下移植した。腫瘍径が４〜６ｍｍに達した時点で群分けを行い、２．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）に懸濁した化合物１又は抗PD-1抗体（In VivoMab anti-mouse PD-1 (CD279)clone: RMP1-14、Bio X Cell社より購入）、もしくはその両方の投与を開始した。対照区として、培地のみを皮下移植した７週齢のBALB/cマウスを使用した。化合物１は経口投与により連日投与し、抗PD-1抗体は合計３回、腹腔内に投与した。【０１１５】
担がんマウスの各群における各剤の投与のタイミングは以下の通りである。
・溶媒のみを１０日間、１日１回投与（vehicle）。
・化合物１を１０日間、１日１回、１００［ｍｇ／ｋｇ］投与（化合物（１））。
・抗PD-1抗体を、１日目、４日目及び８日目に２５０［μｇ／head］投与（anti-PD-1 Ab）。
・化合物１を１０日間、１日１回、１００［ｍｇ／ｋｇ］投与し、且つ抗PD-1抗体を１日目、４日目及び８日目に２５０［μｇ／head］投与（anti-PD-1 Ab + 化合物（１））。【０１１６】
投与開始より１０日後（Day 10）にがん組織を回収し、氷冷したＰＢＳ（２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む）中でホモジナイズし、組織片のろ過と細胞の洗浄を経て細胞懸濁液を調製した。９６ウェルプレートに１ウェルあたり約１×１０６個の細胞を播種した。抗CD16/32抗体（BDより購入）を１００倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた後、細胞懸濁液をTreg測定用とCTL測定用に２等分した。【０１１７】
Treg測定用のサンプルについては、細胞懸濁液にCD3、CD4、CD8に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄し、細胞固定液（eBioscience社より購入）に懸濁して４℃で６０分間反応させた後、固定細胞用洗浄液（eBioscience社より購入）で細胞を洗浄してFoxp3に対する抗体を５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターにて測定を行った。【０１１８】
CTL測定用のサンプルについては、細胞懸濁液にNY-ESO-1特異的TCR検出用MHC-Tetramer（TC Metrix社より購入）を添加し（５０倍希釈）、３７℃で１５分間反応させた。続いてCD3、CD4、CD8に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄し、細胞固定液（BD社より購入）に懸濁して室温で２０分間反応させた後、固定細胞用洗浄液（BD社より購入）で細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、セルカウント用ビーズ（eBioscience社より購入）と共にフローサイトメーターにて測定を行った。【０１１９】
図９Ａに示す如く、化合物１の単剤投与によりCD8陽性Ｔ細胞/Treg比が上昇し、化合物１と抗PD-1抗体との併用によりCD8陽性Ｔ細胞/Treg比はさらに上昇した。【０１２０】
NY-ESO-1抗原特異的CTLのTregに対する比についても、CD8陽性Ｔ細胞/Treg比と同様の傾向が見られた。図９Ｂに示す如く、がん組織において化合物１の投与によりCTL/Treg比が上昇した。この効果は、抗体との併用によって更に増強された。【０１２１】
以上より、化合物１を免疫調節剤と併用することで、効果的に免疫応答を誘導する免疫療法となり得ることが示された。
［試験１１］【０１２２】
上記試験１０にて用いた抗PD-1抗体とは別の免疫調節剤に関しても、化合物１との併用による効果を検討した。この試験１１では、免疫調節剤として抗LAG-3抗体を用いた。担がんマウスとしては、マウス黒色腫細胞株を移植したマウスを各群３匹ずつ用いた。【０１２３】
担がんマウスに化合物１と抗LAG-3抗体を投与し、脾臓及びがん組織におけるCD8陽性T細胞及びTregの数をフローサイトメトリーにて計測し、CD8陽性Ｔ細胞/Tregの比を算出した（図１０Ａ、図１０Ｂ参照）。【０１２４】
７週齢のC57BL/6系雌性マウス（日本クレア社より購入）の腰部を剃毛し、マウス黒色腫細胞株B16-F0を皮下移植した。腫瘍径が４〜６ｍｍに達した時点で群分けを行い、２．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）に懸濁した化合物１又は抗LAG-3抗体（In VivoMab anti-mouse LAG-3、clone: C9B7W、Bio X Cell社より購入）、もしくはその両方の投与を開始した。対照区として、培地のみを皮下移植した７週齢のC57BL/6マウスを使用した。化合物１は経口投与により連日投与し、抗LAG-3抗体は合計２回、腹腔内に投与した。【０１２５】
担がんマウスの各群における各剤の投与のタイミングは以下の通りである。
・溶媒のみを７日間、１日１回投与（vehicle）。
・化合物１を７日間、１日１回、６０［ｍｇ／ｋｇ］投与（化合物（１））。
・抗LAG-3抗体を、１日目及び５日目に２５０［μｇ／head］投与（anti-LAG-3 Ab）。
・化合物１を７日間、１日１回、６０［ｍｇ／ｋｇ］投与し、且つ抗LAG-3抗体を１日目及び５日目に２５０［μｇ／head］投与（anti-LAG-3 Ab + 化合物（１））。【０１２６】
投与開始より７日後（Day 7）に脾臓とがん組織を回収し、氷冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ、又は氷冷したＰＢＳ（２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む）中でホモジナイズし、組織片のろ過と細胞の洗浄を経て、細胞懸濁液を調製した。９６ウェルプレートに１ウェルあたり約１×１０６個の細胞を播種した。抗CD16/32抗体（BDより購入）を１００倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。【０１２７】
続いて、CD3、CD4、CD8に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄した後、細胞固定液（eBioscience社より購入）に懸濁して４℃で６０分間反応させた。固定細胞用洗浄液（eBioscience社より購入）で細胞を洗浄してFoxp3に対する抗体を添加し（５０倍希釈）、４℃で１５分間反応させた。細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、セルカウント用ビーズ（eBioscience社より購入）と共にフローサイトメーターにて測定を行った。【０１２８】
図１０Ａに示す如く、脾臓においては、化合物１の単剤投与によりCD8陽性Ｔ細胞/Treg比が上昇した。さらに、化合物１の投与に抗LAG-3抗体を併用すると、CD8陽性Ｔ細胞/Treg比は一層上昇した。一方、がん組織においても、図１０Ｂに示す如く、化合物１に抗LAG-3抗体を併用した群において、化合物１を単剤投与した場合と比較してCD8陽性Ｔ細胞/Treg比がさらに大きく上昇した。
［試験１２］【０１２９】
さらに別の免疫調節剤に関し、化合物１との併用による効果を検討した。この試験１２では、T細胞の活性化分子であるGITRを刺激する抗GITR抗体を免疫調節剤として用いた。免疫調節剤以外の条件は上記試験１１と同じとした。【０１３０】
担がんマウスとしてマウス黒色腫細胞株を移植したマウスを各群３匹ずつ用い、各担がんマウスに化合物１と抗GITR抗体を投与し、脾臓及びがん組織におけるCD8陽性T細胞及びTregの数をフローサイトメトリーにて計測し、CD8陽性Ｔ細胞/Tregの比を算出した（図１１Ａ、図１１Ｂ参照）。【０１３１】
７週齢のC57BL/6系雌性マウス（日本クレア社より購入）の腰部を剃毛し、マウス黒色腫細胞株B16-F0を皮下移植した。腫瘍径が４〜６ｍｍに達した時点で群分けを行い、２．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）に懸濁した化合物１又は抗GITR抗体（In VivoMab anti-mouse GITR、clone: DTA-1、Bio X Cell社より購入）、もしくはその両方の投与を開始した。対照区として、培地のみを皮下移植した７週齢のC57BL/6マウスを使用した。化合物１は経口投与により連日投与し、抗GITR抗体は合計３回、腹腔内に投与した。【０１３２】
担がんマウスの各群における各剤の投与のタイミングは以下の通りである。
・溶媒のみを７日間、１日１回投与（vehicle）。
・化合物１を７日間、１日１回、５０［ｍｇ／ｋｇ］投与（化合物（１））。
・抗GITR抗体を、１日目、４日目および７日目に１０［ｍｇ／ｋｇ］投与（anti-GITR Ab）。
・化合物１を７日間、１日１回、５０［ｍｇ／ｋｇ］投与し、且つ抗GITR抗体を１日目、４日目および７日目に１０［ｍｇ／ｋｇ］投与（anti-GITR Ab + 化合物（１））。【０１３３】
投与開始より８日後（Day 8）に脾臓とがん組織を回収し、氷冷した２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ、又は氷冷したＰＢＳ（２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む）中でホモジナイズし、組織片のろ過と細胞の洗浄を経て、細胞懸濁液を調製した。９６ウェルプレートに１ウェルあたり約１×１０６個の細胞を播種した。抗CD16/32抗体（BDより購入）を１００倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。【０１３４】
続いて、上記試験１１と同様の手順により、フローサイトメーターを用いて測定を行った。細胞にCD3、CD4、CD8に対する各抗体を添加して反応させ、洗浄した後、細胞固定液に懸濁して固定した。固定細胞用洗浄液で細胞を洗浄し、Foxp3に対する抗体を添加して反応させた後、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁してセルカウント用ビーズと共にフローサイトメトリーに供した。【０１３５】
図１１Ａに示す如く、脾臓においては、化合物１の単剤投与によりCD8陽性Ｔ細胞/Treg比が上昇したが、化合物１の投与に抗GITR抗体を併用すると、CD8陽性Ｔ細胞/Treg比はさらに上昇した。がん組織においても、図１１Ｂに示す如く、化合物１に抗GITR抗体を併用した群において、化合物１を単剤投与した場合と比較してCD8陽性Ｔ細胞/Treg比がさらに大きく上昇した。【０１３６】
以上の試験１０〜１２より、化合物１と種々の免疫調節剤を組み合わせることで、それぞれを単剤投与する場合と比較して効果的に免疫反応を増強し得ることが確認された。
［試験１３］【０１３７】
さらに本発明者らは、化合物１の投与による効果が免疫記憶を介して長期的に維持されることを見出した。本試験１３では、化合物１の単剤投与、および化合物１と免疫調節剤との併用投与により活性化されたがん免疫応答の機能が、免疫記憶により長期に維持されることをin vivoにて確認した。免疫調節剤としては抗PD-1抗体を用いた。【０１３８】
上記試験１０において、化合物１単剤投与、抗PD-1抗体単剤投与または化合物１と抗PD-1抗体の併用投与により腫瘍が消失したマウスを対象に腫瘍を再度移植し、該腫瘍が増殖するか拒絶されるかを調べた。再移植された腫瘍が拒絶されれば、そのマウスでは腫瘍に対する免疫機能が免疫記憶により維持されていると考えることができる。【０１３９】
図１２Ａ〜１２Ｃに一点鎖線にて示す如く、試験１０において腫瘍を移植された各群のマウスのうち一部の個体で、薬剤の投与の結果、腫瘍（CMS5a-NYESO1細胞）の消失が確認された。腫瘍が消失した個体は、化合物１の単剤投与群において１匹、抗PD-1抗体の単剤投与群において３匹、両剤併用群において５匹であった。投与開始から６９日目、腫瘍の消失が見られた各群のマウスに対し、抗原性を高めるためNY-ESO-1遺伝子を導入したCMS5a細胞（CMS5a-NYESO1）を右腰に、NY-ESO-1遺伝子を導入していないCMS5a細胞（CMS5a）を左腰に、それぞれ皮下移植した。移植個数は、CMS5a-NYESO1細胞については一匹あたり２×１０7個、CMS5a細胞については一匹あたり２×１０6個とした。移植後、経日的に腫瘍径を計測した。【０１４０】
図１２Ａ〜図１２Ｃはそれぞれ、化合物１の単剤投与群、抗PD-1抗体の単剤投与群、両剤併用群における結果を示しており、６９日目以降の破線はCMS5a-NYESO1細胞の腫瘍体積、実線はCMS5a細胞の腫瘍体積をそれぞれ表している。再移植を行った全ての個体において、抗原性の高いCMS5a-NYESO1細胞は拒絶された（図１２Ａ〜図１２Ｃ、破線参照）。これに対し、NY-ESO-1遺伝子を導入していないCMS5a細胞については、抗PD-1抗体の単剤投与群では全個体で顕著な増殖が認められたが（図１２Ｂ、実線参照）、化合物１の単剤投与群では1匹中1匹、化合物１と抗PD-1抗体の両剤併用群では5匹中4匹で腫瘍が拒絶された（図１２Ａ及び図１２Ｃ、実線参照）。【０１４１】
このように、CMS5a-NYESO1細胞に対する免疫応答については、化合物１の単剤、抗PD-1抗体単剤および両剤併用の全ての場合において長期に記憶され得ることが確認された。一方、CMS5a細胞に対する反応は投与群によって異なり、抗PD-1抗体の単剤投与群では、CMS5a-NYESO1細胞は拒絶されたものの、CMS5a細胞は拒絶されなかった。抗PD-1抗体を単剤投与したマウスでは、CMS5a-NYESO1細胞が過剰発現しているNY-ESO-1への免疫のみが記憶されていると考えられる。これに対し、化合物１の単剤投与群および抗PD-1抗体との両剤併用群では、CMS5a-NYESO1細胞だけでなく、相対的に抗原性の低いCMS5a細胞も拒絶された。化合物１を単剤投与あるいは抗PD-1抗体と併用投与されたマウスでは、NY-ESO-1だけでなく、CMS5a細胞がもともと発現している抗原性の低い抗原に対する免疫も広範に記憶されていると考えられる。
［試験１４］【０１４２】
試験１３において化合物１の免疫記憶に対する増強作用が示唆されたことから、次に化合物１によるメモリーＴ細胞の誘導作用について検討した。Ｔ細胞の免疫記憶を司るメモリーＴ細胞は、活性化したＴ細胞の一部から前駆細胞であるMPEC（memory precursor effector cell）を経て分化誘導されることが知られている。この試験１４では、ヒトCD8陽性Ｔ細胞を化合物１存在下でCMV、Melan-A、改変Melan-Aペプチドで刺激し、抗原特異的CD8陽性Ｔ細胞におけるMPEC（memory precursor effector cell）の割合をフローサイトメトリーにて測定した。【０１４３】
凍結ヒトPBMC（Cellular Technology Limited）を融解して２ ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中に懸濁し、抗CD8抗体を結合した磁気ビーズ（miltenyi社より購入）を用いてCD8陽性Ｔ細胞を単離した。そのネガティブフラクション（CD8陰性PBMC）から抗CD4抗体を結合した磁気ビーズ（miltenyi社より購入）を用いてCD4陽性Ｔ細胞を除去し、残りの細胞（CD8陰性CD4陰性PBMC）を抗原提示細胞（APC）とした。APCをX-VIVO培地（LONZA社より購入）に懸濁し、２ｍＬチューブに1本あたり１×１０６〜３×１０６個となるよう播種した。各種抗原ペプチド（CMV 、Melan-A、改変Melan-A）を１チューブあたりの液量が０．２５［ｍＬ］、最終濃度が１０μＭとなるよう添加し、二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で１日間培養することでAPCに抗原ペプチドをパルスした。【０１４４】
一方、単離したCD8陽性Ｔ細胞はRPMI1640培地（細胞科学研究所より購入、１０％ヒトAB型血清、２５ｍＭ  HEPES、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む）に懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０5〜２×１０5個となるよう播種し、二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で１日間培養した。【０１４５】
抗原ペプチドをパルスしたAPCを、３５Gyの放射線を照射して不活化した。CD8陽性Ｔ細胞を播種済みの９６ウェルプレートに、APCを１ウェルあたり約１×１０５〜５ ×１０５個となるよう播種し、CD8陽性Ｔ細胞と混合した。各ウェルにIL-2（最終濃度１０[ＩＵ／ｍＬ]）、IL-7（最終濃度２０ ｎｇ／ｍＬ）および段階的に希釈した化合物１（最終濃度０．２５〜１ μＭ）を総液量が１ウェルあたり０．２ ｍＬとなるよう添加して二酸化炭素５％（雰囲気中の濃度）、温度３７℃の条件で８日間培養した。培養期間中は、２〜３日毎に１００ μＬの培養上清を除き、化合物１、IL-2、IL-7を同上の最終濃度で含有する新たなRPMI1640培地を１００ μＬ添加した。【０１４６】
培養後、各ウェル内の細胞をピペッティングにより剥がし、プレートを遠心して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに縣濁した。抗Fc?R抗体（eBioscience社より購入）を５倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた後、抗原ペプチド特異的TCR検出用MHC-Tetramer（TC Metrix社より購入）を添加し（５０倍希釈）、３７℃で１５分間反応させた。続いてCD3、CD4、CD8、KLRG1、CD127（IL-7R）に対する各抗体をそれぞれ５０倍希釈にて添加し、４℃で１５分間反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで細胞を洗浄し、細胞固定液（BD社より購入）に懸濁して室温で２０分間反応させた後、固定細胞用洗浄液（BD社より購入）で細胞を洗浄して２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターにて各がん抗原特異的CD8陽性Ｔ細胞におけるMPECの割合を測定した。MPECは、活性化初期のＴ細胞中において、KLRG1陰性CD127（IL-7R）陽性細胞として検出することが出来る。【０１４７】
図１３Ａ〜１３Ｃは、それぞれCMV 、Melan-Aおよび改変Melan-Aにて処理した細胞群における各抗原に特異的なCD8陽性Ｔ細胞中のMPECの割合を示している。各抗原に特異的なCD8陽性Ｔ細胞におけるMPECの割合は、化合物１の処理濃度が高いほど上がる傾向が見られた。以上より、化合物１の投与は免疫記憶を司るメモリーＴ細胞を増加させ得ることが示された。【０１４８】
以上の試験１３、試験１４より、化合物１は広範な抗原に対してメモリーCD8陽性Ｔ細胞を増加させ、免疫記憶を増強させる作用を有するものと考えられる。このように、化合物１は腫瘍に対してＴ細胞による免疫応答を誘導すると共に、それに続く記憶応答をも誘導し得る。こうした結果は、免疫療法剤としての化合物１の長期的な臨床効果を示唆するものであり、ひいてはがん患者の長期生存を可能にすることが期待される。【０１４９】
次に、本発明の免疫療法剤を哺乳類、とりわけヒトに適用する場合の投与方法、剤型、投与量について説明する。【０１５０】
本発明の有効成分とする化合物は経口的又は非経口的に投与可能であり、経口投与の剤型としては錠剤、コーティング錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、シロップ剤が、又非経口投与の剤型としては注射剤（用時溶解して用いる注射用凍結乾燥剤を含む）、坐剤等が使用できる。これらの剤型の調製は薬学的に許容される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、懸濁化剤、乳化剤、防腐剤、安定化剤及び分散剤、例えば乳糖、白糖、澱粉、デキストリン、結晶セルロース、カオリン、炭酸カルシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、蒸溜水又は生理食塩水を用いて行われる。【０１５１】
投与量は患者の症状、年齢、体重等に応じて異なるが、成人に対する一日量として１〜１，０００［ｍｇ］を２〜３回に分けて投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１Ａ】本発明の免疫療法剤（化合物１）による免疫細胞への影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、CD4陽性CD25陽性細胞、CD4陽性CD25陰性細胞及びCD8陽性Ｔ細胞を培養した後の各Ｔ細胞サブセットにおける増殖性細胞の割合を示している。
【図１Ｂ】本発明の免疫療法剤（化合物１）による免疫細胞への影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、CD4陽性CD25陽性細胞を培養した後のCD4陽性Foxp3陽性TregにおけるeTregの割合を示している。
【図２】本発明の免疫療法剤（化合物１）によるPI3Kδ阻害の効果を他のPI3Kδ阻害剤と比較した試験の結果を示すグラフであり、CD4陽性CD25陽性細胞を各PI3Kδ阻害剤存在下で培養した後のCD4陽性Foxp3陽性TregにおけるeTregの割合を示している。
【図３Ａ】本発明の免疫療法剤（化合物２〜４）によるeTregの増殖抑制効果を検討した試験の結果を示すグラフであり、CD4陽性CD25陽性細胞を各化合物存在下で培養した後のCD4陽性Foxp3陽性TregにおけるeTregの割合を示している。
【図３Ｂ】本発明の免疫療法剤（化合物５〜７）によるeTregの増殖抑制効果を検討した試験の結果を示すグラフであり、CD4陽性CD25陽性細胞を各化合物存在下で培養した後のCD4陽性Foxp3陽性TregにおけるeTregの割合を示している。
【図４】本発明の免疫療法剤（化合物１）が抗原特異的免疫応答に与える影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、各種の抗原ペプチドの存在下にて培養したPBMCにおける抗原特異的CTL/eTreg比を示している。
【図５】本発明の免疫療法剤（化合物１）が抗原特異的免疫応答に与える影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、健常人由来のCD3陰性細胞とCD8陽性T細胞を抗原ペプチドの存在下にて共培養した系における抗原特異的CTLの細胞数を示している。
【図６Ａ】本発明の免疫療法剤（化合物１）が抗原特異的免疫応答に与える影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、胃がん患者末梢血由来のPBMCを抗原ペプチド（MAGE-A3）の存在下にて培養した系におけるがん抗原特異的CTL/CD8陽性T細胞比を示している。
【図６Ｂ】本発明の免疫療法剤（化合物１）が抗原特異的免疫応答に与える影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、胃がん患者末梢血由来のPBMCを抗原ペプチド（MAGE-A4）の存在下にて培養した系におけるがん抗原特異的CTL/CD8陽性T細胞比を示している。
【図６Ｃ】本発明の免疫療法剤（化合物１）が抗原特異的免疫応答に与える影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、胃がん患者末梢血由来のPBMCを抗原ペプチド（NYESO-1）の存在下にて培養した系におけるがん抗原特異的CTL/CD8陽性T細胞比を示している。
【図６Ｄ】本発明の免疫療法剤（化合物１）が抗原特異的免疫応答に与える影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、胃がん患者末梢血由来のPBMCを抗原ペプチド（WT-1）の存在下にて培養した系におけるがん抗原特異的CTL/CD8陽性T細胞比を示している。
【図７Ａ】本発明の免疫療法剤（化合物１）のin vivoにおける免疫細胞への影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、初回投与前の末梢リンパ節（PLN）、脾臓（Spleen）におけるCD8陽性T細胞/Treg比を示している。
【図７Ｂ】本発明の免疫療法剤（化合物１）のin vivoにおける免疫細胞への影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、８日目の末梢リンパ節（PLN）、脾臓（Spleen）におけるCD8陽性T細胞/Treg比を示している。
【図７Ｃ】本発明の免疫療法剤（化合物１）のin vivoにおける免疫細胞への影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、１５日目の末梢リンパ節（PLN）、脾臓（Spleen）におけるCD8陽性T細胞/Treg比を示している。
【図７Ｄ】本発明の免疫療法剤（化合物１）のin vivoにおける免疫細胞への影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、２２日目の末梢リンパ節（PLN）、脾臓（Spleen）におけるCD8陽性T細胞/Treg比を示している。
【図７Ｅ】本発明の免疫療法剤（化合物１）のin vivoにおける免疫細胞への影響を解析した試験の結果を示すグラフであり、８日目のがん組織（TIL）におけるCD8陽性T細胞/Treg比を示している。
【図８Ａ】本発明の免疫療法剤（化合物１）のin vivoでの腫瘍増殖への影響、及びこれに対する免疫系細胞の関与を解析した試験の結果を示すグラフであり、本発明の免疫療法剤を投与しない群における実験終了時の腫瘍体積を示している。
【図８Ｂ】本発明の免疫療法剤（化合物１）のin vivoでの腫瘍増殖への影響、及びこれに対する免疫系細胞の関与を解析した試験の結果を示すグラフであり、本発明の免疫療法剤を投与した群における実験終了時の腫瘍体積を示している。
【図９Ａ】本発明の免疫療法剤（化合物１）と免疫調節剤（抗PD-1抗体）の併用による効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、がん組織（TIL）中のCD8陽性T細胞/Treg比を示している。
【図９Ｂ】本発明の免疫療法剤（化合物１）と免疫調節剤（抗PD-1抗体）の併用による効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、がん組織（TIL）中の抗原特異的CTL/Treg比を示している。
【図１０Ａ】本発明の免疫療法剤（化合物１）と免疫調節剤（抗LAG-3抗体）の併用による効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、脾臓（Spleen）中のCD8陽性T細胞/Treg比を示している。
【図１０Ｂ】本発明の免疫療法剤（化合物１）と免疫調節剤（抗LAG-3抗体）の併用による効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、がん組織（TIL）中のCD8陽性T細胞/Treg比を示している。
【図１１Ａ】本発明の免疫療法剤（化合物１）と免疫調節剤（抗GITR抗体）の併用による効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、脾臓（Spleen）中のCD8陽性T細胞/Treg比を示している。
【図１１Ｂ】本発明の免疫療法剤（化合物１）と免疫調節剤（抗GITR抗体）の併用による効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、がん組織（TIL）中のCD8陽性T細胞/Treg比を示している。
【図１２Ａ】本発明の免疫療法剤（化合物１）の単剤投与および免疫調節剤（抗PD-1抗体）との併用投与の免疫記憶に対する効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、化合物１の単剤投与群に関する結果を示している。
【図１２Ｂ】本発明の免疫療法剤（化合物１）の単剤投与および免疫調節剤（抗PD-1抗体）との併用投与の免疫記憶に対する効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、抗PD-1抗体の単剤投与群に関する結果を示している。
【図１２Ｃ】本発明の免疫療法剤（化合物１）の単剤投与および免疫調節剤（抗PD-1抗体）との併用投与の免疫記憶に対する効果を解析した試験の結果を示すグラフであり、化合物１と抗PD-1抗体の両剤併用群に関する結果を示している。
【図１３Ａ】本発明の免疫療法剤（化合物１）のメモリーＴ細胞（MPEC）誘導作用を検討した試験の結果を示すグラフであり、抗原としてCMVを加えた細胞群における抗原特異的なCD8陽性Ｔ細胞中のMPECの割合を示している。
【図１３Ｂ】本発明の免疫療法剤（化合物１）のメモリーＴ細胞（MPEC）誘導作用を検討した試験の結果を示すグラフであり、抗原としてMelan-Aを加えた細胞群における抗原特異的なCD8陽性Ｔ細胞中のMPECの割合を示している。
【図１３Ｃ】本発明の免疫療法剤（化合物１）のメモリーＴ細胞（MPEC）誘導作用を検討した試験の結果を示すグラフであり、抗原として改変Melan-Aを加えた細胞群における抗原特異的なCD8陽性Ｔ細胞中のMPECの割合を示している。
【発明を実施するための形態】
【０１５３】
次に、特許文献１〜３に記載の方法を用いて製造した、一般式(Ｉ)で示される複素環式化合物の一例を以下に示すが、本発明の有効成分はこれに限定されるものではない。
［実施例１］
・２−（２−ジフルオロメチルベンズイミダゾール−１−イル）−４，６−ジモルホリノ−１，３，５−トリアジン （化合物１）
(１)o-フェニレンジアミン（216.3ｇ, 2.00mol）とジフルオロ酢酸(201.7g, 2.10mol)を、2規定塩酸2.0L中で4時間加熱還流した。冷後、20Lの容器に移し、無水炭酸ナトリウムで中和すると、2-ジフルオロメチル-1H-ベンズイミダゾールが結晶として析出した。得た結晶を吸引ろ過し、水2Lで水洗し、風乾し、２−ジフルオロメチル-1H-ベンズイミダゾールを無色結晶として296.5g(1.76mol, 収率：88％, mp 127-130℃)得た。
MSｍ/ｚ：168（M+）
1H-MNR(CDCl3)δ:6.91(1H,t,J=54Hz),7.36-7.53(2H,m),7.56(1H,d,J=7Hz),7.86(1H,d, J=7Hz)
(２) 塩化シアヌル(230.5g, 1.25mol)をアセトン2.25Lに溶解した溶液に、モルホリン(98.0g, 1.13mol)とトリエチルアミン(113.0g, 1.13mol)をアセトン2.25Lに溶解させた混液を、内温5-10℃の反応温度を保つように滴下した。滴下終了後、反応溶液を氷水20Lに注ぎ込み、析出した結晶を吸引ロ過した。得た結晶をメタノール1.0Lでリスラリー洗浄を0.5時間行い吸引ろ過し、200mLのメタノールで洗浄した。減圧下デシケータ内で乾燥して２,4-ジクロロ-6-モルホリノ-1,3,5トリアジンを無色結晶として238.1ｇ(1.01mol, 収率：90％, mp 145-147℃)得た。
MSｍ/ｚ： 234（M+）
1H-MNR(CDCl3)δ:3.75(4H,t,J=4Hz),3.87(4H,t,J=4Hz )
(３) 2-ジフルオロメチル-1H-ベンズイミダゾール(168.1g, 1.00mol)と、２,4-ジクロロ-6-モルホリノ-1,3,5トリアジン(235.1g, 1.00mol)をDMF（4.0 L）中、無水炭酸カリウム(138.2 g, 1.00mol)存在下、室温で4時間撹拌した。反応溶液を水6Lに注ぎ込み、析出した結晶を吸引ロ過した。得た結晶をDMF1.0Lに分散させ、リスラリー洗浄を0.5時間行い、吸引ロ過し、DMF0.5L、続いてアセトン1.0Lで結晶を洗浄した。減圧下デシケータ内で乾燥して1-(4-クロロ-6-モルホリノ-1,3,5トリアジン-2-イル)-2-ジフルオロメチル)-1H-ベンズイミダゾールを無色結晶として300.2ｇ(0.82mol, 収率：82％, mp 245-246℃)得た。
MSｍ/ｚ：366（M+）
1H-MNR(CDCl3)δ:3.80-3.87(4H,m),3.94-4.01(4H,m),7.38-7.53(2H,m), 7.58(1H,t,J=54Hz), 7.90(1H,d, J=7Hz), 8.42(1H,d, J=7Hz)
(４) 1-(4-クロロ-6-モルホリノ-1,3,5トリアジン-2-イル)-2-ジフルオロメチル)-1H-ベンズイミダゾール(293.4g,  0.80mol)を、モルホリン1742gに溶解し、80℃で3時間撹拌した。ロ液を水6Lに注ぎ込み、晶析した結晶を吸引ろ過した。結晶をエタノール1.0L用いてリスラリー洗浄を0.5時間行い、吸引ろ過した。
得た結晶をアセトン-エタノール（1：1(v/v)）8.0L中に加熱（内温63度）溶解し、溶液をろ紙を用いて自然ろ過した。ろ液を約1/2量まで減圧濃縮し、析出した結晶を吸引ろ過し、さらにエタノール0.5Lで洗浄した。減圧下デシケータ内で乾燥し、２−（２−ジフルオロメチルベンズイミダゾール−１−イル）−４，６−ジモルホリノ−１，３，５−トリアジンを無色結晶として290.0ｇ (0.69mol,  収率：86％,  mp 209-210℃)得た。
NMR(CD Cl3)δ：3.79(8H, t, J=4Hz), 3.88(8H, t, J=4Hz), 7.3-7.4(2H, m), 7.56(1H, t, J=53Hz), 7.88(1H, d, J=7Hz), 8.32(1H, d, J=7Hz)
MS m/z: 417(M+)
［実施例２］
【０１５４】
上記実施例の記載及び特許文献１〜３に記載の方法に従い、相当する出発原料から下記化合物を合成した。
・２−（２−ジフルオロメチルベンズイミダゾール−１−イル）−４−Ｎ，Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエチル）アミノ−６−モルホリノ−１，３，５−トリアジン（化合物２）
NMR(DMSO-d6)δ：3.67-3.82(16H,m), 4.78-4.87(2H,m), 7.42-7.48(2H,m), 7.83(1H, t, J=7Hz), 7.84(1H, d, J=7Hz), 8.37(1H,d, J=7Hz) 
MS m/z：436[M+H]+ 
［実施例３］
【０１５５】
上記実施例の記載及び特許文献１〜３に記載の方法に従い、相当する出発原料から下記化合物を合成した。
・２−（２−ジフルオロメチル−５−ヒドロキシベンズイミダゾール−１−イル）−４，６−ジモルホリノ−１，３，５−トリアジン（化合物３）
NMR(CDC13)δ：3.7-3.9(16H, m), 7.26-7.29(2H, m), 7.54(1H, t, J=54Hz), 8.20(1H, d, 8Hz)
MS m/z：433(M+)
[実施例４]
【０１５６】
上記実施例の記載及び特許文献１〜３に記載の方法に従い、相当する出発原料から下記化合物を合成した。
・２−（２−ジフルオロメチルベンズイミダゾール−１−イル）−４−（２−ヒドロキシモルホリノ）−６−モルホリノ−１，３，５−トリアジン（化合物４）
NMR(CDCl3 )δ ：3.05(1H,brs), 3.72-4.10(13H,m), 4.13-4.19(1H,m), 5.10(1H,brd), 7.36-7.44(2H,m), 7.54(1H,t,J=54Hz), 7.87(1H,d、J=7Hz), 8.31(1H,d、J=7Hz) 
MS m/z：434[M+H]+ 
[実施例５]
【０１５７】
上記実施例の記載及び特許文献１〜３に記載の方法に従い、相当する出発原料から下記化合物を合成した。
・２−（２−ジフルオロメチルベンズイミダゾール−１−イル）−４−モルホリノ−６−（４−オキソピペリジノ）−１，３，５−トリアジン（化合物５）
NMR(CDCl3 )δ ：2.5-2.65(4H, m), 3.80-3.90(8H, m), 4.10-4.20(4H,m),7.27-7.45(2H,m), 7.56(1H, t, J=54Hz), 7.89(1H, d, J=7Hz),8.34(1H, d, J=7Hz) 
MS m/z：430[M+H]+
[実施例６]
【０１５８】
上記実施例の記載及び特許文献１〜３に記載の方法に従い、相当する出発原料から下記化合物を合成した。
・２−（２−ジフルオロメチル−４−ヒドロキシベンズイミダゾール−１−イル）−４−（２−ヒドロキシメチルピロリジン−１−イル）−６−モルホリノ−１，３，５−トリアジン（化合物６）
NMR(CDCl3 )δ ： 1.9-2.1(4H,m), 3.5-4.0(12H, m), 4.7-4.8(1H,m), 5.1-5.3(1H,m), 6.89(1H, d, J=9Hz), 7.30(1H, t, J=9Hz), 7.50(1H,brs), 7.55(1H, t, J=54Hz), 7.83(1H, d, J=9Hz) 
MS m/z：447
[実施例７]
【０１５９】
上記実施例の記載及び特許文献１〜３に記載の方法に従い、相当する出発原料から下記化合物を合成した。
・２−（２−ジフルオロメチル−４−ヒドロキシベンズイミダゾール−１−イル）−４−（３，３−ジメチルモルホリノ）−６−モルホリノピリミジン（化合物７）
融点：204-206℃
NMR(CDCl3 )δ ：1.48(6H,s),3.05(1H, s), 3.6-3.8(6H,m), 3.8-4.0(6H,m), 5.76(1H,s), 6.68(1H,d,J=7Hz),7.29(1H,t,J=7Hz), 7.49(1H,t,J=54Hz), 7.66(1H,dJ=7Hz), 
MS m/z:460(M+)
【産業上の利用可能性】
【０１６０】
本発明の免疫療法剤は、がんや感染症といった種々の疾患を対象とした免疫療法に利用することができる。
【図１Ａ】
2018131659.tif 000010
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2018131659.tif 000014
【図４】
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【図５】
2018131659.tif 000016
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2018131659.tif 000018
【図６Ｃ】
2018131659.tif 000019
【図６Ｄ】
2018131659.tif 000020
【図７Ａ】
2018131659.tif 000021
【図７Ｂ】
2018131659.tif 000022
【図７Ｃ】
2018131659.tif 000023
【図７Ｄ】
2018131659.tif 000024
【図７Ｅ】
2018131659.tif 000025
【図８Ａ】
2018131659.tif 000026
【図８Ｂ】
2018131659.tif 000027
【図９Ａ】
2018131659.tif 000028
【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
2018131659.tif 000030
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
2018131659.tif 000032
【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
2018131659.tif 000036
【図１３Ａ】
2018131659.tif 000037
【図１３Ｂ】
2018131659.tif 000038
【図１３Ｃ】
2018131659.tif 000039
【国際調査報告】
2018131659.tif 000040
2018131659.tif 000041
2018131659.tif 000042
2018131659.tif 000043