(57)【要約】本発明は、多能性幹細胞からの骨格筋細胞の製造方法に関する。より詳細には、多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地、ＡＬＫ阻害剤を含む培地、ｃＡＭＰ誘導剤を含む培地で培養して骨格筋前駆細胞に分化誘導する方法、得られた骨格筋前駆細胞を、増殖因子を含む培地及び／又は増殖因子を含まない培地で培養し、骨格筋細胞に分化誘導する方法、及び得られた骨格筋前駆細胞を含む凍結細胞調製物に関する。
2017188458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、骨格筋前駆細胞の製造方法：
（１）多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程、
（２）工程（１）で得られる細胞を、ＡＬＫ阻害剤を含む培地で培養する工程、
（３）工程（２）で得られる細胞を、ｃＡＭＰ誘導剤を含む培地で培養する工程。
【請求項２】
工程（２）の培地がＡＭＰキナーゼ阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（１）〜（３）の培地が増殖因子を含まない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
骨格筋前駆細胞がＣＤ５６及び／又はＰＡＸ７陽性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
骨格筋前駆細胞がＣＤ２９及び／又はＰＡＸ７陽性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＣＤ５６陽性細胞を純化する工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＣＤ２９陽性細胞を純化する工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって得られる骨格筋前駆細胞を含む、凍結細胞調製物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって得られる骨格筋前駆細胞を細胞分散液中に含む高純度な凍結細胞調製物。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって得られる骨格筋前駆細胞を細胞分散液中にフローサイトメトリーによって測定される細胞の割合として３０％以上含む凍結細胞調製物。
【請求項１１】
（ｉ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって得られる骨格筋前駆細胞、又は
（ｉｉ）請求項８〜１０のいずれか１項に記載の凍結細胞調製物を融解して得られる骨格筋前駆細胞を
ｃＡＭＰ誘導剤を含む培地で培養して骨格筋細胞に分化誘導する、骨格筋細胞の製造方法。
【請求項１２】
（ｉ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって得られる骨格筋前駆細胞、又は
（ｉｉ）請求項８〜１０のいずれか１項に記載の凍結細胞調製物を融解して得られる骨格筋前駆細胞を
増殖因子を含む培地で培養して筋管細胞に分化誘導する、筋管細胞の製造方法。
【請求項１３】
増殖因子を含む培地がさらにｃＡＭＰ誘導剤を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
増殖因子がＦＧＦ２、ＦＧＦ１、ＨＧＦ、ＥＧＦ及びＩＧＦ１からなる群より選ばれるいずれか１又は２以上である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法で得られた筋管細胞を、増殖因子を含まない培地で培養して骨格筋細胞に分化誘導する、骨格筋細胞の製造方法。
【請求項１６】
以下の工程を含む、骨格筋細胞の製造方法：
（Ｉ）骨格筋前駆細胞を、増殖因子を含む培地で培養する工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた細胞を、増殖因子を含まない培地で培養する工程。
【請求項１７】
前記工程（Ｉ）の培地に含まれる増殖因子がＦＧＦ２、ＦＧＦ１、ＨＧＦ、ＥＧＦ及びＩＧＦ１からなる群より選ばれるいずれか１又は２以上である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
多能性幹細胞から誘導されたＣＤ５６及び／又はＰＡＸ７陽性骨格筋前駆細胞を細胞分散液中に分散して含む凍結細胞調製物であって、前記骨格筋前駆細胞をフローサイトメトリーによって測定される細胞の割合として３０％以上含む、凍結細胞調製物。
【請求項１９】
多能性幹細胞から誘導されたＣＤ２９及び／又はＰＡＸ７陽性骨格筋前駆細胞を細胞分散液中に分散して含む凍結細胞調製物であって、前記骨格筋前駆細胞をフローサイトメトリーによって測定される細胞の割合として３０％以上含む、凍結細胞調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１６−０８９１７７号（２０１６年４月２７日出願）及び特願２０１６−０９８０３７号（２０１６年５月１６日出願）の明細書に記載された内容を包含する。
［技術分野］
本発明は、多能性幹細胞からの骨格筋細胞の製造方法に関する。より詳細には、多能性幹細胞から誘導した骨格筋前駆細胞を、骨格筋細胞に分化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞から骨格筋細胞を分化誘導し、筋ジストロフィー等の治療に応用する研究が進められている。【０００３】
Ｃｈａｌらは、ＲＯＣＫ阻害剤存在下で１日培養したヒトｉＰＳ細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤とＡＬＫ２、３、６阻害剤を含む培地で培養後、ＦＧＦ２を加え、６日目にＨＧＦ、ＩＧＦ１、ＦＧＦ２及びＡＬＫ２、３、６阻害剤を含む培地で２日間、ＩＧＦ１を補充してさらに４日間、次いでＨＧＦとＩＧＦ１を含む培地で培養することにより、骨格筋細胞を分化誘導する方法を報告している（非特許文献１）。【０００４】
Ｓｈｅｌｔｏｎらは、ＲＯＣＫ阻害剤存在下で一晩培養したヒトＥＳ細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤存在下で２日間培養し（０−７日目ＧＳＫ３βと合わせて、あるいは２日間のＧＳＫ３β処理後７日目まで、フォスルコリンとＦＧＦ２を作用させ）、骨格筋細胞を分化誘導する方法を報告している（非特許文献２）。【０００５】
これらの既存の方法は、いずれも早い段階から増殖因子を作用させることで、誘導されてきた骨格筋前駆細胞を増殖させると同時に骨格筋細胞へと分化誘導させる。このように、多能性幹細胞を一気に骨格筋細胞まで分化させる方法では、骨格筋細胞を得るために１．５〜２か月の分化培養が常に必要となり、骨格筋細胞の安定的な提供を実現することが難しいという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５  Ｓｅｐ；３３（９）：９６２−９，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｍｕｓｃｌｅ  ｆｉｂｅｒ  ｔｏ  ｍｏｄｅｌ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．
【非特許文献２】Ｓｈｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１４  Ｓｅｐ  ９；３（３）：５１６−２９．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ＰＡＸ７−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、多能性幹細胞由来の骨格筋細胞を安定的に提供するための新規な方法を提供することにある。また、別の観点では、本発明の課題は、多能性幹細胞から純度の高い骨格筋細胞を誘導する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、ＧＳＫ３β阻害剤、ＡＬＫ（アクチビン様受容体キナーゼ）阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤を用いて、多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞を分化誘導した。得られた骨格筋前駆細胞は純度が高く、効率よく骨格筋細胞に分化した。また、骨格筋前駆細胞は凍結保存することが可能であり、この凍結細胞調製物を用いて、必要なときに短期間に安定的に骨格筋細胞を分化誘導することが可能となる。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１９］を提供する。
［１］  以下の工程を含む、骨格筋前駆細胞の製造方法：
（１）多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程、
（２）工程（１）で得られる細胞を、ＡＬＫ阻害剤を含む培地で培養する工程、
（３）工程（２）で得られる細胞を、ｃＡＭＰ誘導剤を含む培地で培養する工程。
［２］  工程（２）の培地がＡＭＰキナーゼ阻害剤を含む、上記［１］に記載の方法。なお、培地はＡＭＰキナーゼ阻害剤に代えて又は加えて、ＢＭＰシグナル阻害剤を含んでいてもよい。
［３］  工程（１）〜（３）の培地が増殖因子を含まない、上記［１］又は［２］に記載の方法。
［４］  骨格筋前駆細胞がＣＤ５６及び／又はＰＡＸ７陽性である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］  骨格筋前駆細胞がＣＤ２９及び／又はＰＡＸ７陽性である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］  ＣＤ５６陽性細胞を純化する工程を含む、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］  ＣＤ２９陽性細胞を純化する工程を含む、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］  上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法によって得られる骨格筋前駆細胞を含む、凍結細胞調製物。なお、骨格筋前駆細胞は、分散されて含まれることが好ましい。
［９］  上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法によって得られる骨格筋前駆細胞を細胞分散液中に含む高純度な凍結細胞調製物。なお、骨格筋前駆細胞は、分散されて含まれることが好ましい。
［１０］  上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法によって得られる骨格筋前駆細胞を細胞分散液中にフローサイトメトリーによって測定される細胞の割合として３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上含む凍結細胞調製物。
［１１］  （ｉ）上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法によって得られる骨格筋前駆細胞、又は
（ｉｉ）上記［８］〜［１０］のいずれかに記載の凍結細胞調製物を融解して得られる骨格筋前駆細胞を
ｃＡＭＰ誘導剤を含む培地で培養して骨格筋細胞に分化誘導する、骨格筋細胞の製造方法。
［１２］  （ｉ）上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法によって得られる骨格筋前駆細胞、又は
（ｉｉ）上記［８］〜［１０］のいずれかにに記載の凍結細胞調製物を融解して得られる骨格筋前駆細胞を
増殖因子を含む培地で培養して筋管細胞に分化誘導する、筋管細胞の製造方法。
［１３］  増殖因子を含む培地がさらにｃＡＭＰ誘導剤を含む、上記［１２］に記載の製造方法。
［１４］  増殖因子がＦＧＦ２、ＦＧＦ１、ＨＧＦ、ＥＧＦ及びＩＧＦ１からなる群より選ばれるいずれか１又は２以上である、上記［１２］に記載の方法。
［１５］  上記［１２］〜［１４］のいずれかに記載の方法で得られた筋管細胞を、増殖因子を含まない培地で培養して骨格筋細胞に分化誘導する、骨格筋細胞の製造方法。
［１６］  以下の工程を含む、骨格筋細胞の製造方法：
（Ｉ）骨格筋前駆細胞を、増殖因子を含む培地で培養する工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた細胞を、増殖因子を含まない培地で培養する工程。
［１７］  前記工程（Ｉ）の培地に含まれる増殖因子がＦＧＦ２、ＦＧＦ１、ＨＧＦ、ＥＧＦ及びＩＧＦ１からなる群より選ばれるいずれか１又は２以上である、上記［１６］に記載の方法。
［１８］  多能性幹細胞から誘導されたＣＤ５６及び／又はＰＡＸ７陽性骨格筋前駆細胞を細胞分散液中に分散して含む凍結細胞調製物であって、前記骨格筋前駆細胞をフローサイトメトリーによって測定される細胞の割合として３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上含む、凍結細胞調製物。
［１９］  多能性幹細胞から誘導されたＣＤ２９及び／又はＰＡＸ７陽性骨格筋前駆細胞を細胞分散液中に分散して含む凍結細胞調製物であって、前記骨格筋前駆細胞をフローサイトメトリーによって測定される細胞の割合として３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上含む、凍結細胞調製物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、凍結保存が可能な純度の高い多能性幹細胞由来の骨格筋前駆細胞を含む凍結細胞調製物が得られる。また、凍結細胞調製物を用いることにより、多能性幹細胞由来の骨格筋細胞を安定して提供することができる。本発明の方法で得られる骨格筋細胞調製物は純度が高く、細胞医薬や医薬のスクリーニングとしての利用価値が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１ａ】図１ａは、ｉＰＳ細胞から体節中胚葉への分化誘導スキーム（実施例１）を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、分化２日目の汎中胚葉マーカーであるＢＲＡＣＨＹＵＲＹ及びＴＢＸ６の発現量を示す。
【図１ｃ】図１ｃは、分化７日目の体節中胚葉マーカーであるＰＡＸ３及びＰＡＸ７の発現量を示す。
【図２ａ】図２ａは、ｉＰＳ細胞から体節中胚葉を経由した骨格筋細胞への分化誘導スキーム（実施例２）を示す。
【図２ｂ】図２ｂは、分化６週目での骨格筋マーカーであるＭＹＨ３、ＭＹＨ７、ＭＹＨ８、ＡＣＴＡ１、ＭＹＯＧ及びＭＹＯＤ１の発現量を示す。
【図３ａ】図３ａは、ｉＰＳ細胞から誘導した骨格筋前駆細胞の分散／播種、及び分散後凍結保存を経由した、骨格筋細胞への分化誘導スキーム（実施例３）を示す。
【図３ｂ】図３ｂは、分化４週目での骨格筋細胞マーカーであるＭＹＨ３、ＭＹＨ７、ＭＹＨ８、ＡＣＴＮ２、ＭＹＯＤ１、ＭＹＦ５、ＭＹＯＧ及び骨格筋前駆細胞マーカーであるＰＡＸ７の発現量を示す。
【図３ｃ】図３ｃは、分化３週目で凍結保存した細胞を融解後、増殖因子及び／又はＦＳＫを添加又は非添加で２週間培養後の、骨格筋前駆細胞マーカーＰＡＸ７、骨格筋細胞マーカーＭＹＨ３、ＭＹＨ８及びＭＹＯＤ１の発現量を示す。
【図３ｄ】図３ｄは、ｉＰＳ細胞から分化３週目で分散／播種後４週目（分化７週目）の細胞の蛍光免疫染色を行った結果を示す。
【図３ｅ】図３ｅは、ｉＰＳ細胞から分化３週目で分散後凍結保存した細胞を融解し、２日間培養後固定して、ヒトサテライト細胞マーカーの発現を蛍光免疫染色で検出した結果を示す。
【図３ｆ】図３ｆは、ｉＰＳ細胞から分化３週目で分散後凍結保存した細胞を融解して得られた骨格筋前駆細胞から誘導された筋管細胞の蛍光免疫染色を行った結果を示す。
【図３ｇ】図３ｇは、分化３週目で分散後凍結保存した細胞を融解して、増殖因子及びＦＳＫを添加して２週間培養後、増殖因子及びＦＳＫ非添加で２週間培養後固定して、ヒト骨格筋細胞マーカーの発現を蛍光免疫染色で検出した結果を示す。
【図４ａ】図４ａは、ｉＰＳ細胞から分化誘導した骨格筋前駆細胞の純化、及び純化した骨格筋前駆細胞の骨格筋細胞への分化誘導スキーム、又は純化した骨格筋前駆細胞の凍結保存スキームを示す。
【図４ｂ】図４ｂは、骨格筋前駆細胞の段階で純化したＣＤ５６陽性細胞から誘導した骨格筋細胞の、蛍光免疫染色を行った結果を示す。
【図４ｃ】図４ｃは、骨格筋前駆細胞の段階で純化したＣＤ５６陽性細胞を、２日間培養後分散して凍結保存し、融解後播種して誘導した骨格筋細胞の、蛍光免疫染色を行った結果を示す。
【図５】図５は、基準とした培養条件での細胞の蛍光免疫染色の結果を示す。増殖因子及びＦＳＫを含む培地で２週間培養後の細胞（左）、培養２週目から増殖因子及びＦＳＫを含まない培地に交換し、培養４週目の細胞（右）。
【図６】図６は、フィブロネクチンでコートした容器で培養した細胞の蛍光免疫染色の結果を示す。培養２週目の筋管細胞（左）、培養４週目の骨格筋細胞（右）。
【図７ａ−ｃ】図７は、試薬を代えて培養した細胞の蛍光免疫染色の結果を示す。図７ａはＳＢに代えて１μＭ  Ａ８３−０１ＳＢを使用した細胞、図７ｂは、ＳＢとＤＭに代えて１μＭ  Ａ８３−０１と０．１μＭ  ＬＤＮ１９３１８９を使用した細胞、図７ｃは、ＦＳＫに代えて５０μＭ  ｄｂｃＡＭＰを使用した細胞。
【図８ａ−ｄ】図８は、試薬を代えて培養した細胞の蛍光免疫染色の結果を示す。図８ａはＣＨＩＲに代えて０．５μＭ  ＢＩＯを使用した細胞。図８ｂはＣＨＩＲに代えて１０μＭ  ＳＢ２１６７６３を使用した細胞。図８ｃは、ＣＨＩＲに代えて０．５μＭ  ＢＩＯを添加した培地で分化を開始し、分化２日目でＳＢに代えて１μＭ  Ａ８３−０１を使用した細胞。図８ｄは、ＳＢとＤＭに代えて１μＭ  Ａ８３−０１とＤ０．１μＭ  ＬＤＮ１９３１８９を使用した細胞。
【図８ｅ−ｈ】図８ｅは、ＣＨＩＲに代えて１０μＭ  ＳＢ２１６７６３を使用して分化を開始し、分化２日目でＳＢに代えて１μＭ  Ａ８３−０１を使用した細胞。図８ｆは、ＣＨＩＲに代えて１０μＭ  ＳＢ２１６７６３を使用して分化を開始し、分化２日目でＳＢ及びＤＭを添加した培地で交換し、分化４日目以降ＦＳＫに代えて５０μＭ  ｄｂｃＡＭＰを使用した細胞。図８ｇは、分化２日目でＳＢに代えて１μＭ  Ａ８３−０１を使用した細胞。図８ｈは、ＳＢとＤＭに代えて１μＭ  Ａ８３−０１と０．１μＭ  ＬＤＮ１９３１８９を使用した細胞。
【図８ｉ−ｊ】図８ｉは、分化４日目からＦＳＫに代えて５０μＭ  ｄｂｃＡＭＰを添加した細胞。図８ｊは、分化４日目からＦＳＫを添加しなかった細胞。
【図９】図９は、２５３Ｇ１細胞に代えて２０１Ｂ７細胞を用いた場合の蛍光免疫染色の結果を示す。
【図１０】図１０は、純化前及び純化後の抗ＣＤ５６抗体で染色された細胞のＦＡＣＳの結果及び蛍光顕微鏡での観察結果を示す。縦軸はＰＥ、横軸はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ４８８の蛍光強度。
【図１１】図１１は、純化前及び純化後の抗ＣＤ５６抗体で染色された細胞のＦＡＣＳの結果及び蛍光顕微鏡での観察結果を示す。縦軸はＰＥ、横軸はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ４８８の蛍光強度。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．用語
「多能性幹細胞」
本発明にかかる「多能性幹細胞」とは、ＥＳ細胞及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。「多能性幹細胞」は、多能性細胞で特異的に発現する転写因子であるＯｃｔ３／４及びＮａｎｏｇの発現によって特徴づけられる。
【００１３】
ＥＳ細胞は、例えばマウスＥＳ細胞であれば、ｉｎＧｅｎｉｏｕｓ社、Ｒｉｋｅｎ（ＡＥＳ００１Ｈ−１株）等の各種マウスＥＳ細胞株が利用可能であり、ヒトＥＳ細胞であれば、ＮＩＨ、京都大学、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社の各種ヒトＥＳ細胞株が利用可能である。
【００１４】
ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有する細胞の例としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、ｉＰＳ細胞と称することがある）が挙げられる。ｉＰＳ細胞とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４・ｃ−Ｍｙｃの４因子を導入することにより、樹立されたｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３−６７６）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１−８７２．）、上記４因子導入後、Ｎａｎｏｇの発現を指標として選別し、樹立したＮａｎｏｇ−ｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ  ４４８，３１３−３１７．）、ｃ−Ｍｙｃを含まない方法で作製されたｉＰＳ細胞（Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１−１０６）も用いることができる。また、Ｔｈｏｍｓｏｎらにより作製されたＯＣＴ３／４・ＳＯＸ２・ＮＡＮＯＧ・ＬＩＮ２８の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Ｙｕ  Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７−１９２０．）、Ｄａｌｅｙらにより作製された人工多能性幹細胞（Ｐａｒｋ  ＩＨ，Ｄａｌｅｙ  ＧＱ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１：１４１−１４６）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開２００８−３０７００７号）等も用いることができる。
【００１５】
このほか、公開されているすべての論文（例えば、Ｓｈｉ  Ｙ．，Ｄｉｎｇ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ３，Ｉｓｓｕｅ  ５，５６８−５７４；、Ｋｉｍ  ＪＢ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ  ＨＲ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６−６５０；Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，Ｎｏ７，７９５−７９７）、あるいは特許（例えば、特開２００８−３０７００７号、特開２００８−２８３９７２号、ＵＳ２００８−２３３６６１０、ＵＳ２００９−０４７２６３、ＷＯ２００７−０６９６６６、ＷＯ２００８−１１８２２０、ＷＯ２００８−１２４１３３、ＷＯ２００８−１５１０５８、ＷＯ２００９−００６９３０、ＷＯ２００９−００６９９７、ＷＯ２００９−００７８５２）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
本明細書における多能性幹細胞としては、人工多能性幹細胞が好ましく、なかでもヒト人工多能性幹細胞がより好ましく、ヒト人工多能性幹細胞２５３Ｇ１株及び２０１Ｂ７株が特に好ましい。
【００１６】
「中胚葉」
「中胚葉」とは、外胚葉と内胚葉の間を埋めるように発達する細胞群で、汎中胚葉マーカーであるＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＴＢＸ６の発現によって特徴づけられる。中胚葉は、骨、軟骨、真皮、骨格筋等を作る体節中胚葉、腎臓、副腎、生殖腺等を作る中間中胚葉、心臓・血管・血球等を作る側板中胚葉へと分化する。骨格筋前駆細胞・骨格筋細胞へと分化する体節中胚葉は、ＰＡＸ３及びＰＡＸ７の発現によって特徴づけられる。
【００１７】
「骨格筋前駆細胞」
本発明にかかる「骨格筋前駆細胞」は、特に断りのない限り、多能性幹細胞から誘導された骨格筋細胞へと分化しうる未分化細胞で、表面マーカーＣＤ５６及び／又は転写因子ＰＡＸ７の発現、あるいはＣＤ２９及び／又は転写因子ＰＡＸ７の発現によって特徴づけられる。特に本発明の方法の過程でＣＤ５６（ＮＣＡＭ１）又はＣＤ２９（ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｕｂｕｎｉｔ  β１）等を用いて純化して得られる骨格筋前駆細胞調製物は、純度・濃度が高い。
【００１８】
「筋管細胞」
本発明にかかる「筋管細胞」は、特に断りのない限り、多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞を経て誘導される細胞で、骨格筋前駆細胞が細胞融合を始めた初期の細胞であって複数の核を有し、また、収縮能に必要な筋節構造を形成していない段階の細胞を指す。上記「筋管細胞」は、骨格筋細胞へと分化しうる細胞である。
【００１９】
「骨格筋細胞」
本発明にかかる「骨格筋細胞」は、特に断りのない限り、多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞を経て誘導される細胞で、骨格筋細胞マーカーであるＭＹＯＤ、ＭＹＯＧ、ＭＹＨ３、ＭＹＨ７、ＭＹＨ８、ＡＣＴＡ１、ＡＣＴＮ２、ＭＹＯＤ１、ＭＹＦ５等の発現によって特徴づけられる。特に本発明の方法では、高純度・高濃度に骨格筋細胞調製物を得ることができる。
【００２０】
「ＧＳＫ３β阻害剤」
「ＧＳＫ３β阻害剤」とは、ＧＳＫ３β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β）に対する阻害活性を有する物質である。ＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼの一種であり、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。ＧＳＫ３にはαとβの２つのアイソフォームが存在する。本発明で用いられる「ＧＳＫ３β阻害剤」は、ＧＳＫ３β阻害活性を有すれば特に限定されず、ＧＳＫ３β阻害活性と合わせてＧＳＫ３α阻害活性を併せ持つ物質であってもよい。
【００２１】
ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９８０１４（２−［［２−［（５−ニトロ−６−アミノピリジン−２−イル）アミノ］エチル］アミノ］−４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ピリミジン）、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）、ケンパウロン、ＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＴＤＺＤ−８（４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、ＢＩＯ（６−ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３−ｏｘｉｍｅ）、ＴＷＳ−１１９（３−［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ］フェノール）及びＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）が例示される。また、ＧＳＫ３βのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ等もＧＳＫ３β阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
【００２２】
ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＢＩＯが好ましく、ＣＨＩＲ９９０２１（本明細書中、ＣＨＩＲと称することがある）又はそれらの塩がより好ましい。
【００２３】
「ＡＬＫ阻害剤」
「ＡＬＫ阻害剤」は、セリンスレオニンキナーゼであるＡＬＫに対する阻害活性を有する物質である。「ＡＬＫ阻害剤」としては、ＡＬＫ４，５，７阻害剤であるＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンザミド）、Ａ８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）、ＡＬＫ２，３，６阻害剤であるＬＤＮ１９３１８９（４−［６−（４−ピペラジン−１−イル−フェニル）−ピラゾロ［１，５−α］ピリミジン−３−イル］−キノリン  ハイドロクロライド、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン、ＡＬＫ５阻害剤であるＷｎｔ３ａ／ＢＩＯ、ＢＭＰ４、ＧＷ７８８３８８（−｛４−［３−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン−２−イル｝−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）ベンズアミド）、ＳＭ１６、ＩＮ−１１３０（３−（（５−（６−メチルピリジン−２−イル）−４−（キノキサリン−６−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）ベンズアミド）、ＧＷ６６０４（２−フェニル−４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン）、ＳＢ５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソル−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジンヒドロクロリド）を挙げることができる。ＡＬＫ阻害剤には、ＡＬＫに対する抗体やアンチセンス核酸も含まれる。
【００２４】
ＡＬＫ阻害剤としては、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３−０１が好ましく、ＳＢ４３１５４２（本明細書中、ＳＢと称することがある）又はそれらの塩がより好ましい。
【００２５】
「ｃＡＭＰ誘導剤」
「ｃＡＭＰ誘導剤」とは、ｃＡＭＰ（環状アデノシンモノリン酸）の細胞内濃度を上昇させる物質あるいはｃＡＭＰシグナルを活性化させる物質を意味する。ｃＡＭＰ誘導剤としては、例えば、（ｉ）アデニル酸シクラーゼ活性化剤（例：フォルスコリン（（３Ｒ）−（６ＡαＨ）ドデカヒドロ−６β，１０α，１０ｂα−トリヒドロキシ−３β，４ａβ，７，７，１０Ａβ−ペンタメチル−１−オキソ−３−ビニル−１Ｈ−ナフト［２，１−ｂ］ピラン−５β−イルアセタート）、フォルスコリン誘導体、コレラトキシン）；（ｉｉ）ｃＡＭＰ誘導体（例：ｃＡＭＰの膜透過性アナログ（例：８−ブロモ−ｃＡＭＰ（８−ブロモアデノシン−３’，５’−環状一リン酸））；ｃＡＭＰの非加水分解性アナログ（例：ｄｂｃＡＭＰ（ジブチリルｃＡＭＰ））、Ｓｐ−ｃＡＭＰ（ｃＡＭＰチオリン酸アイソマー）、３−イソブチル−１−メチルキサンチン；その他のｃＡＭＰ誘導体；（ｉｉｉ）ＰＤＥ阻害剤（例：３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、ペントキシフィリン、ロリプラム、ＣＰ８０６３３、ＣＰ１０２９９５、ＣＰ７６５９３、Ｒｏ−２０−１７２４（４−［３−ブトキシ−４−メトキシベンジル］−２−イミダゾリジノン）、テオフィリン、デンブフィリン）等を挙げることができる。
ｃＡＭＰ誘導剤としては、フォルスコリン又はその誘導体、ｄｂｃＡＭＰが好ましく、フォルスコリン（本明細書中、ＦＳＫと称することがある）又はそれらの塩がより好ましい。
【００２６】
「ＡＭＰキナーゼ阻害剤」
ＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ）は、セリン・スレオニンキナーゼの一種で、細胞内のエネルギーのセンサーとして重要な役割を担っている。「ＡＭＰキナーゼ阻害剤」とは、このＡＭＰキナーゼの阻害剤で、例えば、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（６−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ、Ａ−７６９６６２、ＡＩＣＡＲ（Ａｃａｄｅｓｉｎｅ）、Ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ  ＨＣｌ、ＧＳＫ６２１、ＷＺ４００３、ＨＴＨ−０１−０１５等が知られている。
ＡＭＰキナーゼ阻害剤としては、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（本明細書中、ＤＭと称することがある）が好ましい。
【００２７】
「ＢＭＰシグナル阻害剤」
ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）シグナルは、発生の過程で重要な役割を担っている。「ＢＭＰシグナル阻害剤」とは、このＢＭＰシグナルの阻害剤で、例えば、ＤＭ、ＤＭＨ１、ＤＭＨ２、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ１９３１８９、ＬＤＮ２１２８５４、ＬＤＮ２１４１１７、ＬＤＮ１９３７１９が知られている。
ＢＭＰシグナル阻害剤としては、ＬＤＮ１９３７１９が好ましい。
【００２８】
「増殖因子」
「増殖因子」は特定の細胞の分化及び／又は増殖を促す内因性タンパク質である。本発明で用いられる増殖因子は、骨格筋細胞への分化及び／又は増殖を促すものであれば特に限定されず、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インターロイキン６（ＩＬ６）、及びこれらの混合物等を挙げることができる。
培地に包含・添加される「増殖因子」としては、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１、ＨＧＦ、ＥＧＦ又はＩＧＦ１が好ましく、ＦＧＦ２及びＦＧＦ１がより好ましく、ＦＧＦ２がさらに好ましい。
本発明の特定の工程においては、「増殖因子を含まない」培地を使用する。ここで、「増殖因子を含まない」とは分化誘導に積極的な機能を発揮する量の増殖因子の包含・添加がないことを意味する。増殖因子としては、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１、ＨＧＦ、ＥＧＦ又はＩＧＦ１を挙げることができる。
【００２９】
「ＲＯＣＫ阻害剤」
「ＲＯＣＫ阻害剤」とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ：Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）を阻害する物質を意味し、ＲＯＣＫ  ＩとＲＯＣＫ  ＩＩのいずれを阻害する物質であってもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、上記の機能を有する限り特に限定されず、例えば、Ｎ−（４−ピリジニル）−４β−［（Ｒ）−１−アミノエチル］シクロヘキサン−１α−カルボアミド（本明細書中、Ｙ−２７６３２と称することもある）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、（２Ｓ）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル］スルホニル］ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピン（Ｈ−１１５２）、４β−［（１Ｒ）−１−アミノエチル］−Ｎ−（４−ピリジル）ベンゼン−１ゼンカルボアミド（Ｗｆ−５３６）、Ｎ−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４ＰＥＲ（Ｒ）−１−アミノエチル］シクロヘキサン−１ロヘカルボアミド（Ｙ−３０１４１）、Ｎ−（３−｛［２−（４−アミノ−１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）−１−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル］オキシ｝フェニル）−４−｛［２−（４−モルホリニル）エチル］−オキシ｝ベンズアミド（ＧＳＫ２６９９６２Ａ）、Ｎ−（６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−６−メチル−２−オキソ−４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−ピリジン−５−カルボキサミド（ＧＳＫ４２９２８６Ａ）；ＲＯＣＫに対する抗体（機能的断片含む）、アンチセンス核酸、及びｓｉＲＮＡ；ＲＯＣＫのアンタゴニスト、ドミナントネガティブ型；その他公知のＲＯＣＫ阻害剤を利用できる。
ＲＯＣＫ阻害剤はとしては、Ｙ−２７６３２が好ましい。
【００３０】
「血清代替物」
本発明では、血清に代えて「血清代替物」を使用することが好ましい。「血清代替物」としては、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｗａｋｏ）、インスリン不含Ｂ−２７サプリメント、Ｎ２−サプリメント、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、インスリン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン（例えば、亜セレン酸ナトリウム））、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール又はこれらの混合物（例えば、ＩＴＳ−Ｇ）が挙げられる。
血清代替物としては、インスリン不含Ｂ−２７サプリメント、ＫＳＲ、ＳｔｅｍＳｕｒｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＩＴＳ−Ｇが好ましい。培地に血清代替物を添加する場合の培地中の濃度は０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜２重量％である。
【００３１】
「培地」
本発明で使用する培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  ＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｌｏｗ  ｇｌｕｃｏｓｅ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地が挙げられる。
本発明で使用する培地には、上記した成分のほか、必要に応じて、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（製品名）、非必須アミノ酸、ビタミン、抗生物質（例えば、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（本明細書中、ＡＡと称することがある）、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物）、抗菌剤（例えば、アンホテリシンＢ）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を添加してもよい。培地に抗生物質を添加する場合には、その培地中の濃度は通常０．０１〜２０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％である。
【００３２】
培養容器及び培養条件
本発明における細胞培養は、フィーダー細胞を使用せず、接着培養にて行うことが好ましい。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（製品名）（Ｎｕｎｃ社）等の細胞培養シートなどの培養容器が使用される。培養容器は、細胞との接着性（親水性）を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル（例：ＢＤマトリゲル（日本ベクトン・デッキンソン社））、ビトロネクチンなどの細胞接着用基質でコーティングされていることが好ましい。培養容器としては、Ｔｙｐｅ  Ｉ−ｃｏｌｌａｇｅｎ、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチン又はポリ−Ｄ−リジンなどでコートされた培養容器が好ましく、マトリゲル又はポリ−Ｄ−リジンでコートされた培養容器がより好ましい。
【００３３】
多能性幹細胞の維持培養又は分化誘導時の培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
【００３４】
２．骨格筋前駆細胞の製造方法（分化誘導）
本発明は、多能性細胞から骨格筋前駆細胞を製造する方法を提供する。前記方法は、例えば、以下の工程を含む。
（１）多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程、
（２）工程（１）で得られた細胞を、ＡＬＫ阻害剤を含む培地で培養する工程、
（３）工程（２）で得られた細胞を、ｃＡＭＰ誘導剤を含む培地で培養する工程。
【００３５】
多能性幹細胞は、分化培養に先だって、常法にしたがい、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ−２７６３２）等を含む培地で予め１日あるいは一晩培養してもよい。これにより、分化培養時の細胞死を抑制することができる。
【００３６】
工程（１）
多能性幹細胞は、まずＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する。培養開始時の細胞数としては、特に限定されず、２２０００〜１５００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、好ましくは２２０００〜５００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、より好ましくは２２０００〜４２０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である。培養期間は１日〜４日、好ましくは１日〜３日、特に好ましくは２日である。
【００３７】
本工程で用いる培地としては、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地が好ましく、ＲＰＭＩ  １６４０培地がより好ましい。
【００３８】
本工程で使用する培地には、血清代替物（例えば、インスリン不含Ｂ−２７サプリメント、ＩＴＳ−Ｇ）及び抗生物質（例えば、ＡＡ、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物）を添加することが好ましい。
【００３９】
工程（１）で使用される培養容器としては、マトリゲルコートされたものが好ましい。
【００４０】
ＧＳＫ３β阻害剤の培地中の濃度は、用いるＧＳＫ３β阻害剤の種類によって適宜設定されるが、ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲを使用する場合の濃度は、通常２〜１０μＭ、好ましくは２〜８μＭ、特に好ましくは５〜７μＭである。ＢＩＯを使用する場合の濃度は、通常０．２〜０．８μＭ、好ましくは０．３〜０．７μＭ、特に好ましくは０．５μＭである。ＳＢ２１６７６３を使用する場合の濃度は、通常６〜１４μＭ、好ましくは８〜１２μＭ、特に好ましくは８〜１０μＭである。
【００４１】
工程（２）
工程（１）で得られた細胞を、さらにＡＬＫ阻害剤を含む培地で培養する。培養期間は１日〜３日、好ましくは２日である。
【００４２】
本工程で使用する培地としては、抗生物質（例えば、ＡＡ、ペニシリン、ストレプトマイシン）及びインスリン不含Ｂ−２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地が好ましい。（本明細書中、インスリン不含Ｂ−２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地を「Ｂ−２７培地」と称することがある。）
ＡＬＫ阻害剤の培地中の濃度は、用いるＡＬＫ阻害剤の種類によって適宜設定されるが、ＡＬＫ阻害剤としてＳＢを使用する場合の濃度は、通常０．３〜３０μＭ、好ましくは３〜３０μＭである。Ａ８３−０１を使用する場合の濃度は、通常１〜５μＭ、好ましくは１〜３μＭ、特に好ましくは１μＭである。
【００４３】
工程（２）における培地にＡＭＰキナーゼ阻害剤（例えば、ＤＭ）をさらに添加することにより、骨格筋前駆細胞をより高純度・高濃度に誘導することが可能となる。添加するＡＭＰキナーゼ阻害剤の量は適宜設定できるが、ＡＭＰキナーゼ阻害剤としてＤＭを使用する場合の濃度としては０．３〜１μＭが好ましい。
また、本工程では、ＡＭＰキナーゼ阻害剤に代えて又は加えて、ＢＭＰシグナル阻害剤を使用することもできる。ＢＭＰシグナル阻害剤としてＬＤＮ１９３１８９を使用する場合の濃度は、通常０．１〜０．８μＭ、好ましくは０．１〜０．５μＭ、特に好ましくは０．１μＭである。工程（２）においてさらに添加する。
【００４４】
工程（３）
工程（２）で得られた細胞を、さらにｃＡＭＰ誘導剤を含む培地で培養し、骨格筋前駆細胞に分化させる。培養期間は９日〜２６日、好ましくは１０日〜２５日である。
ｃＡＭＰ誘導剤の培地中の濃度は、用いるｃＡＭＰ誘導剤の種類によって適宜設定されるが、通常０．１〜１０００μＭの濃度で使用される。
【００４５】
ｃＡＭＰ誘導剤としてはＦＳＫが好ましく、その培地中の濃度は、通常１〜５０μＭ、好ましくは２〜５０μＭである。
【００４６】
工程（１）〜（３）において使用する培地には、本発明の目的に反しない範囲で適宜他の成分を添加してもよいが、増殖因子は添加しないことが好ましい。特に、骨格筋細胞への分化誘導を促す増殖因子の工程（１）〜（３）での添加は、骨格筋前駆細胞の段階を超えて一気に骨格筋細胞への分化誘導を促すため、細胞の純度や分化効率に負の影響を及ぼす可能性があるからである。
【００４７】
工程（３）は、さらに２つの工程に分けることができる。以下、これらの工程（３）−１及び工程（３）−２について説明する。
【００４８】
工程（３）−１
工程（３）−１では、工程（２）で得られた細胞を、ｃＡＭＰ誘導剤を含む培地で培養し、体節中胚葉に分化させる。培養期間は２〜５日、好ましくは３〜４日である。
【００４９】
本工程で使用する培地としては、Ｂ−２７培地が好ましい。
ｃＡＭＰ誘導剤の培地中の濃度は、用いるｃＡＭＰ誘導剤の種類によって適宜設定されるが、通常０．１〜１０００μＭの濃度で使用される。
【００５０】
ｃＡＭＰ誘導剤としてはＦＳＫが好ましく、その培地中の濃度は、通常１〜５０μＭ、好ましくは２〜５０μＭである。
【００５１】
工程（３）−２
工程（３）−２では、工程（３）−１で得られた細胞を、ｃＡＭＰ誘導剤を含む培地でさらに培養し、骨格筋前駆細胞に分化させる。培養期間は好ましくは７日〜２１日であり、培養後約３週間程度で、ＣＤ５６及び／又はＰａｘ７陽性、あるいはＣＤ２９及び／又はＰａｘ７陽性の骨格筋前駆細胞が誘導される。
【００５２】
本工程で使用する培地は、工程（３）−１で使用した培地と比べて栄養価が同等又は高い培地であることが好ましく、例えば培地に含まれるグルコース濃度が同等又は高い培地が好ましい。例えば、工程（３）−１でＲＰＭＩ  １６４０培地又はＢ−２７培地を使用した場合には、工程（３）−２において使用する培地としてＤＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）が好ましい。工程（３）−２で使用する培地に含まれるグルコース濃度は、２０００ｍｇ／Ｌ〜１００００ｍｇ／Ｌであることが好ましく、３０００ｍｇ／Ｌ〜１００００ｍｇ／Ｌであることがより好ましく、４０００ｍｇ／Ｌ〜１００００ｍｇ／Ｌであることが特に好ましい。本工程で使用する培地には、抗生物質（例えば、ＡＡ、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物）を添加することが好ましい。
ｃＡＭＰ誘導剤の培地中の濃度は、用いるｃＡＭＰ誘導剤の種類によって適宜設定されるが、通常０．１〜１０００μＭの濃度で使用される。
【００５３】
ｃＡＭＰ誘導剤としてはＦＳＫが好ましく、その培地中の濃度は、通常１〜５０μＭ、好ましくは２〜５０μＭである。
【００５４】
工程（３）−２で得られた細胞がＣＤ５６及び／又はＰａｘ７陽性、あるいはＣＤ２９及び／又はＰａｘ７であるか否かは、免疫染色法やリアルタイムＰＣＲ法（本明細書中、ＲＴ−ＰＣＲ法と称することがある。）といった自体公知の方法で確認することができる。
【００５５】
３．骨格筋前駆細胞の純化
得られた骨格筋前駆細胞は、表面マーカーであるＣＤ５６（ＮＣＡＭ１）又はＣＤ２９（ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｕｂｕｎｉｔ  β１）を利用して、純化することができる。上記純化は自体公知の方法、例えば、抗ＣＤ５６抗体を固定化したビーズを用いて行うことができる。上記抗ＣＤ５６抗体を固定化したビーズは市販品として入手可能である（例：ＣＤ５６ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社））。また、抗体を固定化したビーズは、ＥａｓｙＳｅｐ（商品名）  Ｈｕｍａｎ  ＰＥ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて作成することもできる。
【００５６】
骨格筋前駆細胞は、ＣＤ５６及びＣＤ２９のほか、ＣＤＨ１５（Ｍ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＣＤ８２、ＣＤ３４、ＭＥＴ、ＣＸＣＲ４、ＩＴＧＡ７（ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｕｂｕｎｉｔ  α７）による純化も可能であり、さらに、Ｃａｖｅｏｌｉｎ−１、ＣＴＲ、ＥｒｂＢ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｎｅｃｄｉｎ、Ｍｅｇｆ１０、ｐ７５ＮＴＲ／ＢＤＮＦｃ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ、Ｓｙｎｄｅｃａｎ  ３／４、ＶＣＡＭ−１、Ｎｅｓｔｉｎを用いて純化することも可能である。
【００５７】
４．骨格筋前駆細胞の分散・凍結保存
本発明の方法によれば、純度の高い骨格筋前駆細胞調製物（培養物）が得られる。工程（３）で得られた細胞又は調製物を凍結することにより、骨格筋前駆細胞を含む凍結細胞調製物とすることができる。
また、得られた細胞又は調製物は、酵素処理することにより容易に分散させる（シングルセルの状態で分散させる）ことができる。分散には、市販の細胞分散用試薬や細胞分散液（例えば、ＡＣＣＵＭＡＸ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ともに、Ｉｎｎｏｖａ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用することができる。上記分散は、自体公知の方法、例えば、培養容器に市販の細胞分散用試薬や細胞分散液を添加して一定時間反応させたのち、培養液等を添加し、培養液を何度かピペッティングすることで行うことができる。
なお、本明細書における「分散液」とは、これらの細胞分散用試薬、細胞分散液等を意味する。骨格筋前駆細胞を分散液中に含む調製物（培養物）も、凍結保存することができる。
また本明細書における「酵素処理」に使用する酵素としては、細胞用及び／又はタンパク質切断用の酵素を使用することができ、例えば、Ｃｅｌａｓｅ、ＤｅｔａｃｈＫｉｔ、Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ａｃｃｕｔａｓｅ  ＬＺ、Ａｃｃｕｍａｘ、Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＳＴＥＭｘｙｍｅ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ、Ｎｅｕｔｒａｌ、Ｅｌａｓｔａｓｅ、Ｐａｐａｉｎ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＦＡＣＳｍａｘ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｄｅｔａｃｈｉｎ、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ及びＩＶ、Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｄｉｓｐａｓｅ  Ｉ及びＩＩ等の市販の酵素を使用することができる。
【００５８】
本発明のある実施形態は、本明細書中に記載される方法によって得られる細胞調製物（培養物）に関する。細胞調製物（培養物）における、目的とする細胞の純度は、自体公知の方法によって評価することができる。例えば、フローサイトメトリーや細胞イメージングなどの解析により、細胞調製物（培養物）中の目的とする細胞の割合を評価することができる。また、細胞調製物（培養物）中のそれぞれの１細胞について遺伝子発現プロファイルの解析を行い、目的とする遺伝子を発現する細胞の割合を評価することができる。
フローサイトメトリーとは、適当な標識で標識化した細胞のを含む流体分散液をキャピラリー中に細く流して、標識による検出強度を測定して目的とする細胞を計数個々の細胞を光学的に分析する技術である。その測定装置はフローサイトメーターと呼ばれ、例えばベクトンディッキンソン（ＢＤ）社のＦＡＣＳＡｒｉａ等を用いれば、蛍光抗体で染色した細胞を液流に乗せて流し、レーザー光の焦点を通過させ、個々の細胞が発する蛍光を測定することによって細胞表面にある抗原量を定量的に測定することができる。同時に複数の細胞の形態と機能に関係する散乱光や蛍光色素を検出することができるため、複数の細胞集団を含んでいても複数のパラメーターを用いることで、ヘテロな細胞集団に含まれる特定のマーカータンパク質または遺伝子を発現する細胞の割合を算出することができる。
細胞イメージングは、培養プレートやスライドグラスから、例えばＧＥヘルスケア社のＩｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ６００などの装置で細胞イメージを取得しコンピューター解析する手法で、細胞集団中のそれぞれの細胞について客観的かつ大量の情報を得ることができ、特定の性状を持つ細胞の割合を算出することができる。
１細胞解析は、様々な解析装置との組み合わせで様々な解析が行える。Ｆｌｕｉｄｉｕｍ社のＣ１で不均一な細胞集団を１細胞に分離し、解析装置としてＦｌｕｉｄｉｕｍ社のＢｉｏＭａｒｋをやＡＢＩ７９００などのリアルタイムＰＣＲシステムを用いれば選択した遺伝子のｑＰＣＲ解析を行うことができる。または次世代シーケンサーであるＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎを用いれば遺伝子発現量を網羅的に計測することが出来る。１細胞での遺伝子発現プロファイルが取得できるため、不均一な細胞集団中の特定の遺伝子を発現する細胞の割合を算出することができる。
【００５９】
本明細書中に記載された方法によって得られる細胞調製物（培養物）は、目的とする細胞（例えば、骨格筋前駆細胞、骨格筋細胞）を少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８９％、少なくとも約８８％、少なくとも約８７％、少なくとも約８６％、少なくとも約８５％、少なくとも約８４％、少なくとも約８３％、少なくとも約８２％、少なくとも約８１％、少なくとも約８０％、少なくとも約７９％、少なくとも約７８％、少なくとも約７７％、少なくとも約７６％、少なくとも約７５％、少なくとも約７４％、少なくとも約７３％、少なくとも約７２％、少なくとも約７１％、少なくとも約７０％、少なくとも約６９％、少なくとも約６８％、少なくとも約６７％、少なくとも約６６％、少なくとも約６５％、少なくとも約６４％、少なくとも約６３％、少なくとも約６２％、少なくとも約６１％、少なくとも約６０％、少なくとも約５９％、少なくとも約５８％、少なくとも約５７％、少なくとも約５６％、少なくとも約５５％、少なくとも約５４％、少なくとも約５３％、少なくとも約５２％、少なくとも約５１％、又は少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２９％、少なくとも約２８％、少なくとも約２７％、少なくとも約２６％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％、又は少なくとも約１％含み、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上含む。本発明のある実施形態において、細胞調製物（培養物）の純度は、細胞調製物（培養物）中に残存するフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
【００６０】
本発明の凍結細胞調製物は、本発明の方法によって得られた骨格筋前駆細胞を含む凍結細胞調製物である。
【００６１】
本発明の凍結細胞調製物は、本発明の方法によって得られた骨格筋前駆細胞を分散液中に含む、凍結細胞調製物である。
【００６２】
本発明の凍結細胞調製物は、多能性幹細胞から誘導されたＣＤ５６及び／又はＰＡＸ７陽性である骨格筋前駆細胞を分散液中に含む凍結細胞調製物であって、前記骨格筋前駆細胞をフローサイトメトリーによって測定される細胞の割合として３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上含む、凍結細胞調製物である。
【００６３】
あるいは、本発明の凍結細胞調製物は、多能性幹細胞から誘導されたＣＤ２９及び／又はＰＡＸ７陽性である骨格筋前駆細胞を分散液中に含む凍結細胞調製物であって、前記骨格筋前駆細胞をフローサイトメトリーによって測定される細胞の割合として３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上含む、凍結細胞調製物である。
【００６４】
本発明の凍結細胞調製物は、必要に応じて融解して骨格筋細胞の製造に使用することができる。具体的には、凍結した調製物を融解して得られる細胞を後述する方法（２−１）などに付すことにより骨格筋細胞を誘導することができる。本発明はそのような骨格筋前駆細胞を含む凍結細胞調製物も提供する。
【００６５】
骨格筋前駆細胞を含む凍結細胞調製物は、本発明の方法によって得られた骨格筋前駆細胞調製物（培養物）を酵素処理して分散させたもの、好ましくはシングルセルの状態で分散させたものを凍結して調製されたものが好ましい。上記調製は、自体公知の方法、例えば、分散させた骨格筋前駆細胞を、Ｃｅｌｌｂａｎｋｅｒ２（日本全薬工業）を用いて再懸濁した溶液を凍結することにより行うことができる。
【００６６】
５．骨格筋細胞の製造方法（分化誘導）
本発明は、工程（３）で得られた骨格筋前駆細胞又は前記凍結細胞調製物を融解して得られる骨格筋前駆細胞を、骨格筋細胞に分化誘導する、骨格筋細胞の製造方法も提供する。骨格筋前駆細胞から骨格筋細胞へ分化誘導する方法は、以下の２つの方法が挙げられる。
【００６７】
骨格筋前駆細胞から骨格筋細胞への分化誘導方法１（方法１）
方法１では、工程（３）で得られた骨格筋前駆細胞又は前記凍結細胞調製物を融解して得られる骨格筋前駆細胞を、ｃＡＭＰ誘導剤を含む培地で培養し、骨格筋細胞に分化させる。培養期間は４週以上とすることができ、通常４週〜６ヶ月、好ましくは４週〜２ヶ月、より好ましくは４週〜６週である。
【００６８】
骨格筋前駆細胞はあらかじめ分散させてから培地に播種することが好ましい。これにより、純度の高い骨格筋細胞を得ることができる。
【００６９】
本方法で使用できる好ましい培地は、工程（３）−２に例示されたものと同様である。本方法で使用する培地としては、ＤＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）が好ましい。本工程で使用する培地には、ｃＡＭＰ誘導剤（例えば、ＦＳＫ、ｄｂｃＡＭＰ）、血清代替物（例えば、ＫＳＲ、ＩＴＳ−Ｇ）及び抗生物質（例えば、ＡＡ、ペニシリン、ストレプトマイシン）を添加することが好ましい。
ｃＡＭＰ誘導剤の培地中の濃度は、用いるｃＡＭＰ誘導剤の種類によって適宜設定されるが、通常０．１〜１０００μＭの濃度で使用される。
【００７０】
ｃＡＭＰ誘導剤としてはＦＳＫ又はｄｂｃＡＭＰが好ましく、その培地中の濃度は、通常１〜５０μＭ、好ましくは２〜５０μＭである。
【００７１】
本方法における培養容器としては、マトリゲル、フィブロネクチン又はポリ−Ｄ−リジンでコートされたものが好ましい。
【００７２】
骨格筋前駆細胞から骨格筋細胞への分化誘導方法２（方法２）
方法２は、骨格筋前駆細胞から筋管細胞を製造する方法（方法２−１）及び筋管細胞から骨格筋細胞を製造する方法（方法２−２）を含む。
【００７３】
骨格筋前駆細胞から筋管細胞を製造する方法（方法２−１）
方法２−１は、工程（３）で得られた骨格筋前駆細胞又は前記凍結細胞調製物を融解して得られた骨格筋前駆細胞を、増殖因子を含む培地で培養して筋管細胞に分化誘導する、筋管細胞の製造方法である。培養期間は、７日〜２０日、好ましくは１０〜１４日である。上記培養は２〜３日ごとに培地を交換しながら行うことが好ましい。
【００７４】
骨格筋前駆細胞はあらかじめ分散させてから培地に播種することが好ましい。これにより、純度の高い骨格筋細胞を得ることができる。
【００７５】
本方法で使用する増殖因子としては、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１、ＨＧＦ、ＥＧＦ又はＩＧＦ１が好ましく、ＦＧＦ１又はＦＧＦ２がより好ましく、ＦＧＦ２がさらに好ましい。
【００７６】
本方法で使用できる好ましい培地は、工程（３）−２で例示されたものと同様である。本方法で使用する培地としては、ＤＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｌｏｗ  ｇｌｕｃｏｓｅ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地が好ましく、ＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地がより好ましい。本工程で使用する培地には、ｃＡＭＰ誘導剤（例えば、ＦＳＫ）、血清代替物（例えば、ＫＳＲ、ＩＴＳ−Ｇ）及び抗生物質（例えば、ＡＡ、ペニシリン、ストレプトマイシン）を添加することが好ましい。
【００７７】
増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜３２０ｎＭ）、好ましくは約５〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約１．６〜１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１又はＦＧＦ２の場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３〜１１６ｎＭ）、好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）である。
増殖因子の培地中の濃度は、例えば、ＦＧＦ１を使用する場合は５０ｎｇ／ｍＬ、ＦＧＦ２を使用する場合は１０ｎｇ／ｍＬ、ＥＧＦを使用する場合は５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＧＦ１を使用する場合は５０ｎｇ／ｍＬ、ＨＧＦを使用する場合は５０ｎｇ／ｍＬとすることが特に好ましい。
【００７８】
培地はｃＡＭＰ誘導剤をさらに含むことが好ましい。ｃＡＭＰ誘導剤の添加により、骨格筋細胞への分化誘導が促進される。ｃＡＭＰ誘導剤の培地中の濃度は、用いるｃＡＭＰ誘導剤の種類によって適宜設定されるが、通常０．１〜１０００μＭの濃度で使用される。
【００７９】
ｃＡＭＰ誘導剤としてはＦＳＫ又はｄｂｃＡＭＰが好ましく、その培地中の濃度は、ＦＳＫの場合、通常１〜５０μＭ、好ましくは２〜５０μＭであり、ｄｂｃＡＭＰの場合、通常１０〜１００μＭ、好ましくは１０〜５０μＭでる。
【００８０】
本方法で使用される培養容器としては、マトリゲル、ラミニン又はフィブロネクチンコートされたものが好ましい。
【００８１】
前記方法１および上記方法２−１において前記凍結細胞調製物を融解して骨格筋前駆細胞を得る場合、融解後の最初の培地には、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ−２７６３２）を添加することが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤の培地中の濃度は、用いるＲＯＣＫ阻害剤の種類によって適宜設定されるが、ＲＯＣＫ阻害剤としてＹ−２７６３２を使用する場合の濃度は、通常０．１μＭ〜１０００μＭ、好ましくは１μＭ〜１００μＭ、より好ましくは０．３μＭ〜３０μＭである。
【００８２】
筋管細胞から骨格筋細胞を製造する方法（方法２−２）
方法２−２は、方法２−１によって得られた筋管細胞を、増殖因子を含まない培地で培養して骨格筋細胞に分化誘導する、骨格筋細胞の製造方法である。培地は、増殖因子を含まないことを除けば、方法２−１で使用する培地と基本的に同じでよい。なお、「増殖因子を含まない」とは、前述のとおり、分化誘導に積極的な機能を発揮する量の増殖因子の包含・添加がないことを意味する。培養期間は特に限定されないが、培養期間は２週間以上とすることができ、通常２週〜６ヶ月、好ましくは２週〜６週である。上記培養は２〜３日ごとに培地を交換しながら行うことが好ましい。
【００８３】
上記方法２に記載の方法によれば、工程（３）で得られる骨格筋前駆細胞及び上記の凍結細胞調製物を融解して得られる骨格筋前駆細胞に限定されない骨格筋前駆細胞から、骨格筋細胞を製造することもできる。すなわち、本発明は、（Ｉ）骨格筋前駆細胞を、増殖因子を含む培地で培養する工程及び（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた細胞を、増殖因子を含まない培地で培養する工程を含む骨格筋細胞の製造方法を提供する。
【００８４】
多能性幹細胞から骨格筋細胞を製造する方法としてはより具体的には以下の方法が挙げられる。
多能性幹細胞から骨格筋細胞の製造方法Ａ（方法Ａ）
（Ａ１）多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤（特に、ＣＨＩＲ、ＳＢ２１６７６３、ＢＩＯ）を含む培地で培養する工程
（Ａ２）工程（Ａ１）で得られた細胞を、ＡＬＫ阻害剤（特に、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３−０１）を含む培地で培養する工程、
（Ａ３）工程（Ａ２）で得られた細胞を、ｃＡＭＰ誘導剤（特に、フォルスコリン、ｄｂｃＡＭＰ）を含む培地で培養する工程、
（Ａ４）工程（Ａ３）で得られた骨格筋前駆細胞を、ｃＡＭＰ誘導剤（特に、フォルスコリン）を含む培地で培養して骨格筋細胞に分化誘導する工程。
分化開始からの日数は、一例として、工程（Ａ１）：分化開始日から０−２日目／工程（Ａ２）：２〜４日目／工程（Ａ３）：４〜２１日目／工程（Ａ４）：工程（Ａ３）以降、となる。ここで、工程（Ａ４）は、方法１に対応する。
多能性幹細胞から骨格筋細胞の製造方法Ｂ（方法Ｂ）
（Ｂ１）多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤（特に、ＣＨＩＲ、ＳＢ２１６７６３、ＢＩＯ）を含む培地で培養する工程
（Ｂ２）工程（Ｂ１）で得られた細胞を、ＡＬＫ阻害剤（特に、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３−０１）を含む培地で培養する工程、
（Ｂ３）工程（Ｂ２）で得られた細胞を、ｃＡＭＰ誘導剤（特に、フォルスコリン、ｄｂｃＡＭＰ）を含む培地で培養する工程、
（Ｂ４）工程（Ｂ３）で得られた骨格筋前駆細胞を、増殖因子（特に、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、ＩＧＦ１、ＨＧＦ（好ましくは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２であり、より好ましくは、ＦＧＦ２である））を含む培地で培養して筋管細胞に分化誘導する工程、
（Ｂ５）工程（Ｂ４）で得られた筋管細胞を、増殖因子を含まない培地で培養して骨格筋細胞に分化誘導する工程。
分化開始からの日数は、一例として、工程（Ｂ１）：分化開始日から０〜２日目／工程（Ｂ２）：２〜４日目／工程（Ｂ３）：４〜２１日目／工程（Ｂ４）：２１〜３５日目／工程（Ｂ５）：工程（Ｂ４）以降、となる。ここで、（Ｂ４）及び（Ｂ５）はそれぞれ方法２−１及び方法２−２に対応する。
【００８５】
工程（Ａ３）及び（Ｂ３）はそれぞれ上記工程（３）に対応するものであり、それぞれ上記工程（３）−１及び（３）−２に対応するよう２つの工程に分けることができる。２つの工程に分けた場合、それぞれの工程の日数は、一例として工程（３）−１に対応する工程：分化開始日から４〜７日目／工程（３）−２に対応する工程：７〜２１日目となる。
【００８６】
また、方法Ａ及びＢのいずれにおいても、それぞれ工程（Ａ４）及び（Ｂ４）の前に、それぞれ工程（Ａ３）及び（Ｂ３）で得られた骨格筋前駆細胞を凍結することにより、骨格筋前駆細胞を含む凍結細胞調製物とすることができる。また、工程（Ａ３）及び（Ｂ３）で得られた細胞又は調製物は、酵素処理することにより容易に分散させる（シングルセルの状態で分散させる）ことができる。分散させる方法は前記の通りである。工程（Ａ４）及び（Ｂ４）に用いる骨格筋前駆細胞又は調製物は、本発明の方法によって得られた骨格筋前駆細胞調製物（培養物）を酵素処理して分散させたもの、好ましくはシングルセルの状態で分散させたものを凍結して調製されたものが好ましい。工程（Ａ３）及び（Ｂ３）で得られた骨格筋前駆細胞を分散させ、あるいはさらに凍結することにより凍結細胞調製物とした場合であっても、凍結細胞調製物を融解させる操作を除き、培養方法及び培養期間は、上記工程（Ａ４）、（Ｂ４）及び（Ｂ５）と同様にして、骨格筋細胞を製造することができる。
【００８７】
本発明の方法で得られる骨格筋前駆細胞及び骨格筋細胞は、純度が高く、再生医療用の細胞調製物として有用である。また、各種薬剤のスクリーニングに有用である。再生医療用の細胞調製物として用いる場合には、全身性投与、筋組織又は皮下組織等の適切な組織への局所投与等の投与方法が挙げられる。投与剤形としては、注射剤を代表とする液剤、塗布剤、さらにはこれらを薬剤放出デバイス等に封入した剤形等が挙げられる。各種薬剤のスクリーニングとしては、骨格筋細胞への有用な分化誘導試薬等のスクリーニングが挙げられる。また、遺伝子改変した多能性幹細胞からの疾患モデル細胞の作製により、各種疾患治療薬剤のスクリーニング又は活性評価、薬効評価及び毒性評価等に用いることができる。スクリーニング等の対象とできる各種疾患治療薬剤には、低分子有機化合物のみならず、ペプチド、タンパク、抗体（全体、部分及びそれらの組合せを含む）、核酸、改良抗体、細胞、遺伝子改変が可能な核酸、タンパク又はこれらの組み合わせ等、様々な薬剤が含まれる。対象となり得る疾患としては、各種筋ジストロフィー、各種ミオパチー、ミトコンドリア病、糖原病等の筋原生疾患、加齢性の筋萎縮（サルコペニア）、慢性疾患・癌悪液質による筋力低下（カケキシア）、寝たきりや骨折に伴う筋活動の低下による筋萎縮等が考えられる。さらに、乳児性脊髄性筋萎縮症、シャルコ・マリー・ツース病、先天性ミエリン形成不全症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経原性疾患についても対象に含まれると考えられる。
【実施例】
【００８８】
以下、参考例及び実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。【００８９】
参考例１：ヒトｉＰＳ細胞２５３Ｇ１細胞の維持培養
ヒトｉＰＳ細胞は２５３Ｇ１細胞（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６，１０１−１０６）を使用した。
２５３Ｇ１細胞の維持培養には、培地として１％  ＡＡ又は０．５％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；本明細書中、Ｅ８培地と称することがある）を使用し、培養容器としてビトロネクチン（ＶＴＮ−Ｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコートしたものを用いた。
以下に示す実施例を含め、細胞の培養は３７℃、５％ＣＯ２下で行った。
以下の実施例に示す分化誘導に供する細胞を調製するため、維持培養した２５３Ｇ１細胞を０．５ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸−リン酸緩衝生理食塩水で分散させた後、１０μＭ  Ｙ−２７６３２（Ｗａｋｏ）を添加したＥ８培地でマトリゲルコートした９６穴、４８穴、２４穴、１２穴、又は６穴プレートに播種した。上記播種の翌日にＥ８培地で培地交換した。【００９０】
実施例１：ヒトｉＰＳ細胞から体節中胚葉への分化誘導
図１ａに、実施例１に示す未分化ｉＰＳ細胞から体節中胚葉への分化誘導法の概略を示した。本分化誘導法を用いることで、未分化ｉＰＳ細胞から中胚葉を経由して体節中胚葉が誘導される。【００９１】
＜１−１．ヒトｉＰＳ細胞から中胚葉への分化誘導＞
参考例１にしたがってマトリゲルコートした培養容器に２５３Ｇ１細胞を播種したあと２日目に、培地をＥ８培地から、１〜６μＭ  ＣＨＩＲ及び１％  ＡＡを添加したＢ−２７培地に交換して、分化を開始した（分化開始日を分化０日目（ｄａｙ０）とした）。【００９２】
分化２日目（ｄａｙ２）に、汎中胚葉マーカー遺伝子であるＢＲＡＣＨＹＵＲＹ及びＴＢＸ６の発現変動を調べた。上記遺伝子発現の変動は以下の手順によって解析した。すなわち、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ９６  Ｋｉｔ又はＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製したあと、全ＲＮＡから逆転写酵素（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ，Ｔａｋａｒａ）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをＴａｑｍａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたリアルタイムＰＣＲに供した。分化開始前の２５３Ｇ１細胞から調製したサンプルを基準サンプルとして比較Ｃｔ法にてＢＲＡＣＨＹＵＲＹ及びＴＢＸ６の遺伝子発現量を算出した。
その結果、図１ｂに示すように、分化２日目には１〜６μＭの範囲内においてＣＨＩＲ濃度依存的にＢＲＡＣＨＹＵＲＹ及びＴＢＸ６発現が増加することが判明した。なお、図１ｂでは、分化２日目におけるＢＲＡＣＨＹＵＲＹとＴＢＸ６の遺伝子発現量を、未分化ｉＰＳ細胞における発現量を１とした場合の比率として示す。【００９３】
＜１−２．中胚葉から体節中胚葉への分化誘導＞
分化２日目に、１％  ＡＡ、１０μＭ  ＳＢ（及び、０．３〜１μＭ  ＤＭ）を添加したＢ−２７培地へ培地を交換し、さらに分化４日目（ｄａｙ４）で１％  ＡＡおよび１０μＭ  ＦＳＫを添加したＢ−２７培地へと培地を交換して、分化７日目（ｄａｙ７）まで培養を継続した。【００９４】
分化７日目に、体節中胚葉マーカー遺伝子ＰＡＸ３及びＰＡＸ７の発現量を測定した。その結果、図１ｃに示すように、分化０〜２日目にＣＨＩＲを２〜４μＭ含む培地で培養したあと、分化２〜４日目にＳＢ（及び、ＤＭ）を含む培地で培養し、さらに分化４〜７日目にＦＳＫを含む培地で培養した場合に体節中胚葉マーカー遺伝子が高い発現を示すことが判明した。なお、図１ｃでは、分化７日目におけるＰＡＸ３とＰＡＸ７の遺伝子発現量を、分化開始前の２５３Ｇ１細胞での発現を１とした場合の比率として示す。【００９５】
実施例２：体節中胚葉からの骨格筋分化
図２ａに、未分化ｉＰＳ細胞から、中胚葉、体節中胚葉を経由した骨格筋細胞への分化誘導法の概略を示した。本誘導法を用いることで、未分化ｉＰＳ細胞から骨格筋細胞への分化が誘導される。【００９６】
＜体節中胚葉から骨格筋細胞への分化誘導＞
分化７日目（ｄａｙ７）に、体節中胚葉へ分化した細胞の培地を１０μＭ  ＦＳＫ、５％ＫＳＲ、１％  ＡＡ及び１％  ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地に交換し、２〜３日ごとに培地交換しながら培養を継続すると、骨格筋細胞への分化が誘導され、分化５週ころから自発的に収縮する細胞が誘導された。分化６週目に骨格筋細胞マーカーの発現量をリアルタイムＰＣＲで測定した。その結果、図２ｂに示すように、分化６週目には骨格筋細胞マーカー（具体的には、胎児型骨格筋ミオシン重鎖（ＭＹＨ３、ＭＹＨ８）、βミオシン重鎖（ＭＹＨ７）、骨格筋アクチン（ＡＣＴＡ１）、骨格筋転写因子（ＭＹＯＧ、ＭＹＯＤ１））の遺伝子発現量が増加することが判明した。なお、図２ｂでは、骨格筋細胞マーカーの遺伝子発現量を、分化開始前の２５３Ｇ１細胞での発現を１とした場合の比率として示す。【００９７】
実施例３：ｉＰＳ細胞から誘導した骨格筋前駆細胞の骨格筋分化と凍結ストック調製
図３ａに、未分化ｉＰＳ細胞から誘導した骨格筋前駆細胞の分散／播種、及び分散後凍結保存を経由した、骨格筋細胞への分化誘導法の概略を示した。本分化誘導法を用いることで、未分化ｉＰＳ細胞から分化誘導した骨格筋前駆細胞を、骨格筋前駆細胞を誘導した培養器とは別の培養器で骨格筋を分化誘導すること、凍結保存した骨格筋前駆細胞から骨格筋細胞を誘導することが可能となる。【００９８】
＜３−１．分化４週目の細胞における骨格筋前駆細胞及び骨格筋細胞マーカーの発現＞
実施例２記載の方法と同様の方法で培養した分化４週目における細胞における骨格筋前駆細胞マーカー（ＰＡＸ７）及び骨格筋マーカー（ＭＹＨ３、ＭＹＨ７、ＭＹＨ８、ＡＣＴＮ２、ＭＹＯＤ１、ＭＹＦ５及びＭＹＯＧ）の発現量を測定した。図３ｂに示すように、分化４週目における細胞では、骨格筋前駆細胞マーカーに加え、骨格筋マーカーが発現していることが判明した。このことから、分化４週目において、骨格筋系譜への細胞へと分化したことが判明した。なお、図３ｂでは、骨格筋前駆細胞マーカー又は骨格筋細胞マーカーの遺伝子発現量を、分化開始前の２５３Ｇ１細胞での発現を１とした場合の比率として示す。【００９９】
＜３−２．骨格筋前駆細胞の分散／播種＞
分化７日目以降、分化３〜５週までの間に、細胞を分散して別の新しい培養器に播種することが可能か検討した。具体的には、実施例２記載の方法と同様の方法で培養した分化３、４、５週目の細胞を分散／播種し、播種したあとの細胞から骨格筋細胞が誘導可能であるか否かについて検討を行った。その結果、分化３、４、５週目において細胞を分散／播種した場合であっても、分散／播種後に骨格筋細胞への分化誘導が可能であった。このことから、分化３〜５週目の細胞を分散して別の新しい培養器に播種した場合にも骨格筋細胞へ分化しうる骨格筋前駆細胞を得ることが可能であることが分かった。培養期間が長くなるに伴い細胞が分泌する成分で細胞間が酵素消化を受けにくく分散し難くなるため、分散液として酵素液を使う場合、分化３〜４週目が分散／播種に適していた。【０１００】
＜３−３．骨格筋前駆細胞の凍結保存＞
実施例２記載の方法と同様の方法で培養した分化３〜４週目の細胞を凍結保存することが可能であるか検討するため、分化３又は４週目の細胞をＡＣＣＵＭＡＸで分散して、Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋｅｒ２（日本全薬工業）を用いて凍結し、凍結細胞調製物を作成した。凍結細胞調製物から骨格筋前駆細胞が得られるか確認するため、凍結細胞調製物を３７℃のウォーターバス上で迅速に融解した後、１０μＭ  Ｙ−２７６３２、５％ＫＳＲ、１％  ＡＡ及び１％  ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地でポリ−Ｄ−リジンコートプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、２日間培養した。上記培養後、蛍光免疫染色法で骨格筋前駆細胞マーカーであるＰＡＸ７とＣＤ５６の発現を、抗ＰＡＸ７抗体（ａｂｃａｍ社製抗体）又は抗ＣＤ５６抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社製抗体）を用いた免疫染色法により確認した。その結果、図３ｅに示すように、小型の細胞がＰＡＸ７及び／又はＣＤ５６陽性であった。また、ＣＤ５６（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社製抗体）と、骨格筋前駆細胞として知られている別のマーカーＭ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社製抗体を使用）、またＣＤ５６（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社製抗体を使用）とＣＤ２９（ａｂｃａｍ社製抗体を使用）の発現を同様に調べたところ、Ｍ−ＣａｄｈｅｒｉｎやＣＤ２９も小型の細胞で発現し、少なくとも一部はＣＤ５６と一緒に発現していることが判明した。このことから、凍結細胞調製物から骨格筋前駆細胞を得ることが可能であることが判明した。【０１０１】
＜３−４．凍結細胞調製物から得た骨格筋前駆細胞から筋管細胞への分化＞
凍結細胞調製物から得た骨格筋前駆細胞から筋管細胞を誘導することが可能か否か検討するため、上述のように凍結細胞調製物を３７℃のウォーターバス上で迅速に融解した後、１０μｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、１０μＭ  ＦＳＫ、１０μＭ  Ｙ−２７６３２、５％ＫＳＲ、１％  ＡＡ及び１％ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地でマトリゲルコートしたプレートに播種し、２日間培養し、１０μＭ  ＦＳＫ、１０ｎｇ／ｍＬＦＧＦ２、１％  ＡＡ、５％ＫＳＲ及び１％ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地で培地交換した。上記播種後、２〜３日ごとに培地交換しながら２週間培養した。２週間培養後の細胞におけるヒト骨格筋細胞マーカーの発現を、蛍光免疫染色で検出した。蛍光免疫染色には、骨格筋マーカーとして全てのミオシン重鎖サブタイプを認識する抗体（ＭＹＨ  ｃｌｏｎｅＭＦ２０：図中、緑色で示される）及び、サテライト細胞からの分化初期から発現が確認されているＤｅｓｍｉｎ（図中、赤色で示される）に対する抗体を用いた。さらに、核はＤＡＰＩ（図中、青色で示される）で染色した。その結果、播種時には小型で球状の形態であった細胞が、図３ｆに示すように、分化に伴い細長い形態へと変化し、さらにそれぞれの細胞が複数の核を持つことが明らかとなった。これにより、凍結細胞調製物から得た骨格筋前駆細胞から筋管細胞を誘導することが可能であることが明らかになった。【０１０２】
＜３−５．筋管細胞から骨格筋細胞への分化＞
凍結細胞調製物を３７℃のウォーターバス上で迅速に融解した後、１０μＭ  Ｙ−２７６３２、１０μＭ  ＦＳＫ、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ１、５％ＫＳＲ、１％  ＡＡ及び１％ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地でマトリゲルコートしたプレートに播種し、１日間培養し、１０μＭ  ＦＳＫ、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ１、５％ＫＳＲ、１％  ＡＡ及び１％ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地で２〜３日ごとに培地交換しながら２週間培養して筋管細胞を得た。骨格筋細胞へ分化誘導することが可能か否か検討するため、上記筋管細胞を５％ＫＳＲ、１％  ＡＡ及び１％ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地（ただし、増殖因子及びＦＳＫを含まない）で、２〜３日ごとに培地交換しながら、さらに２週間培養を継続した。凍結細胞調製物を融解してから４週間後（分化７週目）の細胞における骨格筋タンパク質の発現を蛍光免疫染色法で調べた結果、図３ｇに示すように、骨格筋の筋節に発現するα−Ａｃｔｉｎｉｎ（図中、緑色で示される）は横紋状に発現、Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ（図中、赤色で示される）は細胞膜付近から細胞全体に発現、Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎと細胞内で結合する繊維状Ａｃｔｉｎ（Ｆ−ａｃｔｉｎ：図中、青色で示される）は細胞内で繊維状に存在することが確認できた。これらのことから、本発明の方法によれば天然の骨格筋細胞とその形態が類似する骨格筋細胞を誘導できることが明らかになった。【０１０３】
＜３−６．凍結細胞調製物から得た骨格筋前駆細胞から筋管細胞への分化（増殖因子の種類の検討）＞
実施例２記載の方法と同様の方法で培養した分化３週目の細胞の培養上清を除き、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、ＡＣＣＵＭＡＸ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して細胞を分散し、Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋｅｒ２（日本全薬工業）を用いて凍結保存し、凍結細胞調製物を作製した。凍結細胞調製物から得た骨格筋前駆細胞のさらなる分化誘導に対し、培地へ添加する増殖因子の種類及びＦＳＫの添加有無が与える影響を検討するため、図３ｃに示す組合せでこれら因子を添加した培地を用いて分化誘導を行った。具体的には、凍結細胞調製物を３７℃のウォーターバス上で迅速に融解した後、１０μＭ  Ｙ−２７６３２、５％ＫＳＲ、１％  ＡＡ及び１％ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地で必要に応じて増殖因子（５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ１、１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ１又は５０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ）及び１０μＭ  ＦＳＫを添加又は非添加でマトリゲルコートしたプレートに播種し、１日間培養した。上記培養後、必要に応じて増殖因子（５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ１、１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ１又は５０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ）及び１０μＭ  ＦＳＫを添加又は非添加であって、５％ＫＳＲ、１％  ＡＡ及び１％ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地を用いて２〜３日ごとに培地交換しながら２週間培養した。
播種から２週間後（分化５週目）、細胞を回収し、実施例１記載の方法と同様の方法で、骨格筋前駆細胞マーカー（ＰＡＸ７）、骨格筋マーカー（ＭＹＨ３、ＭＹＨ８、ＭＹＯＤ１）の遺伝子発現量を測定した。その結果、図３ｃに示すように、播種から２週間後（分化５週目に相当）の細胞は、ＰＡＸ７及びＭＹＨ３、ＭＹＨ８、ＭＹＯＤ１を発現していることが判明した。なお、図３ｃは、増殖因子非添加群を基準サンプルとして、相対的な変動量として算出した。それぞれの増殖因子を含む培地で培養することにより、ＰＡＸ７及び３種類の骨格筋マーカーの発現量が誘導され、さらに培地中にＦＳＫを同時に添加することによりこれらマーカーの発現量は相乗的に亢進した。【０１０４】
＜３−７．骨格筋前駆細胞から骨格筋細胞への分化＞
分化３週目の細胞の培養上清を除き、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、ＡＣＣＵＭＡＸ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で細胞を分散し、凍結保存することなく、１０μＭ  ＦＳＫ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、５％ＫＳＲ、１％  ＡＡ、１％ＩＴＳ−Ｇ及び１０μＭ  Ｙ−２７６３２（播種時のみ添加）を含むＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）を用いてマトリゲルコートした別のプレートに播種し、その後２週間、１０μＭ  ＦＳＫ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、５％ＫＳＲ、１％  ＡＡ及び１％ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地を用いて２〜３日ごとに培地交換しながら培養した。上記培養後、分散／播種２週目〜４週目（分化５週目〜７週目）に５％ＫＳＲ、１％  ＡＡ及び１％ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地（ただし、増殖因子及びＦＳＫを含まない）で培養を継続した。
上記分化７週目の細胞を免疫染色してその形態の観察を行った。免疫染色は以下の方法で行った。すなわち、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定後、０．３％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００で可溶化してから、抗α−ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  Ａｃｔｉｎｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ）、抗Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ抗体（ａｂｃａｍ）又は抗β−Ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）を含む一次抗体溶液と反応させ、さらにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８又は５６８で標識した二次抗体溶液と反応させた。Ｆ−ＡｃｔｉｎはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０で標識したｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、核はＤＡＰＩ（Ｗａｋｏ）を用いてそれぞれ染色した。
蛍光免疫染色法で細胞での骨格筋マーカー蛋白質の発現を調べたところ、図３ｄ（上図）に示すように、細胞は細長い形態を示し、α−ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  Ａｃｔｉｎｉｎ（図中、赤色で示される）は細胞内で横紋状に局在、Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ（図中、緑色で示される）は細胞膜上もしくは細胞全体に観察された。また、図３ｄ（下図）に示すように、Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ（図中、赤色で示される）と複合体を形成する膜蛋白質β−Ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ（図中、緑色で示される）は同様の局在を示し、Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎと細胞内で結合しているＦ−Ａｃｔｉｎ（図中、青色で示される）は細胞内に豊富に存在することが分かった（図３ｄ（下））。これらのことから、本発明の方法で誘導される骨格筋細胞は天然の骨格筋細胞とその形態が類似することが明らかになった。【０１０５】
実施例４：ｉＰＳ細胞から誘導した骨格筋前駆細胞の純化
分化３週目に、ＡＣＣＵＭＡＸを用いて分散した細胞から、フィコエリスリン（ＰＥ）で標識したＣＤ５６に対する抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）及び磁気ビーズ（ＥａｓｙＳｅｐＴＭ  Ｈｕｍａｎ  ＰＥ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて、ＣＤ５６陽性細胞を純化した。純化したＣＤ５６陽性細胞から骨格筋前駆細胞を誘導することが可能であるか否かを検討するため、純化したＣＤ５６陽性細胞をマトリゲルコートしたプレートに播種し、１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、１０μＭ  ＦＳＫ、５％ＫＳＲ、１％  ＡＡ及び１％  ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地で２〜３日ごとに培地を交換しながら２週間培養した。上記培養後、さらに２週間、５％ＫＳＲ、１％  ＡＡ及び１％  ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地（ただし、増殖因子及びＦＳＫを含まない）で２〜３日ごとに培地を交換しながら培養した（ヒトｉＰＳ細胞から誘導した骨格筋前駆細胞の純化、及び純化した骨格筋前駆細胞の骨格筋への分化誘導法、又は純化した骨格筋前駆細胞の凍結保存の概略を図４ａに示す。）。その結果、図４ｂに示すように、培養後の細胞は細長い形態を示し、Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ（図中、緑色で示される）と、β−Ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ（図中、赤色で示される）とＦ−Ａｃｔｉｎ（図中、青色で示される）は細胞全体で観察された（図４ｂ、上図）。筋節Ｚ膜上に発現するα−ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  Ａｃｔｉｎｉｎは長い細胞の内部で縦方向に局在し、核は赤で発色している骨格筋特異的転写因子ＭＹＯＤを発現していた（図４ｂ、下図）。このことから、ＣＤ５６で純化した骨格筋前駆細胞からも骨格筋細胞を誘導することができることが判明した。【０１０６】
＜純化した細胞の凍結及び凍結細胞調製物から得られた細胞の骨格筋細胞への分化＞
ＣＤ５６で純化した骨格筋前駆細胞も凍結保存することが可能であるか否かを検討するため、以下の検討を行った。すなわち、ＣＤ５６で純化した細胞を１０μＭ  ＦＳＫ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、５％ＫＳＲ、１％  ＡＡ及び１％  ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地でマトリゲルコートしたプレートに播種し、２日間培養した。上記培養後、ＡＣＣＵＭＡＸを用いて分散し、得られた細胞をＣｅｌｌｂａｎｋｅｒ２（日本全薬工業）で凍結保存して凍結細胞調製物を作成した。凍結細胞調製物を３７℃のウォーターバス上で迅速に融解した後、１０μＭ  Ｙ−２７６３２、１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、１０μＭ  ＦＳＫ、５％ＫＳＲ、１％  ＡＡ及び１％ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地でマトリゲルコートしたプレートに播種し、１日間培養した。上記培養後、１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、１０μＭ  ＦＳＫ、５％ＫＳＲ、１％  ＡＡ及び１％ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地で２〜３日ごとに培地交換しながら、２週間培養した。その後さらに、５％ＫＳＲ、１％  ＩＴＳ−Ｇ、１％  ＡＡを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地（ただし、増殖因子及びＦＳＫを含まない）で２〜３日ごとに培地を交換しながら２週間培養した。培養した細胞におけるＤｙｓｔｒｏｐｈｉｎ、β−Ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ及びＭＹＯＤの発現を蛍光免疫染色法で観察した。その結果、図４ｃに示すように、Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ（図中、緑色で示される）が細胞膜に、Ｆ−ａｃｔｉｎ（図中、青色で示される）が細胞内部に存在することが判明した（図４ｃ、上図）。また、α−ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  Ａｃｔｉｎｉｎ（図中、緑色で示される）は長い細胞の内部で横紋状に発現し、一本の繊維が複数のＭＹＯＤ陽性の核（図中、赤色で示される）を含むことが明らかになった（図４ｃ、下図）。このことから、純化した細胞から製造した凍結細胞調製物からも骨格筋細胞を誘導することができることが判明した。このことから、ＣＤ５６で純化した細胞から製造した凍結細胞調製物からも骨格筋細胞を誘導することができることが判明した。【０１０７】
実施例５：培養条件の検討
＜５−１：基準とした培養条件＞
参考例１にしたがって、マトリゲルコートした培養容器に２５３Ｇ１細胞を播種したあと２日目に、培地をＥ８培地から、５μＭ  ＣＨＩＲ及び１％  ＡＡを添加したＢ−２７培地に交換して、分化を開始した（分化開始日を分化０日目（ｄａｙ０）とした）。
分化２日目（ｄａｙ２）に１％ＡＡ、１０μＭ  ＳＢ及び０．５μＭ  ＤＭを添加したＢ−２７培地へ交換し、さらに分化４日目（ｄａｙ４）で１％ＡＡ及び１０μＭ  ＦＳＫを添加したＢ−２７培地へと交換して、分化７日目（ｄａｙ７）まで培養を継続した。
分化７日目（ｄａｙ７）に、培地を１０μＭ  ＦＳＫ、５％ＳｔｅｍＳｕｒｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１％ＡＡ及び１％  ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地に交換し、２〜３日ごとに培地交換しながら培養を継続した。【０１０８】
分化３週目の細胞（骨格筋前駆細胞）を実施例３記載の方法と同様の方法で凍結保存した。凍結保存した細胞は、実施例３記載の方法と同様の方法で融解し、播種し、２日間培養した。その後、培地を１０μｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、１０μＭ  ＦＳＫ、１％ＡＡ、５％ＳｔｅｍＳｕｒｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ及び１％ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地に交換し、２〜３日ごとに培地交換しながら２週間培養を継続した。【０１０９】
２週間培養後の細胞を、ミオシン重鎖を認識する抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、クローンナンバー：ＭＦ２０）、Ｄｅｓｍｉｎを認識する抗体（Ａｂｃａｍ）及び核を染色するＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同人化学）を用いて蛍光免疫染色すると、多核であり、両方の抗体で共染色された筋管細胞が確認された（図５（左））。【０１１０】
培養２週目から、培地を増殖因子及びＦＳＫを含まない１％ＡＡ、５％ＳｔｅｍＳｕｒｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ及び１％ＩＴＳ−Ｇを添加したＤＭＥＭ（ｌｏｗ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地に交換し、培地交換しながら培養を継続し、培養４週目でα−Ａｃｔｉｎｉｎを認識する抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎを認識する抗体（Ａｂｃａｍ）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて蛍光免疫染色すると、多核の骨格筋細胞が染色された（図５（右））。【０１１１】
上記の実験を基準として、様々な条件の変更を検討し、凍結細胞の培養２週目と４週目で同様の蛍光免役染色を実施して評価した。【０１１２】
＜５−２：コーティングの検討＞
マトリゲルに代えてフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）コートした培養容器を用いたこと以外は前記「５−１」に記載した方法と同様の方法で細胞を得た。融解後培養２週目で筋管細胞（図６（左））、４週目で骨格筋細胞（図６（右））がそれぞれ確認された。【０１１３】
＜５−３：添加試薬の検討１＞
前記「５−２」と同様の方法において、ＳＢに代えて１μＭ  Ａ８３−０１を使用すること（図７ａ）、及び、ＳＢとＤＭに代えて１μＭ  Ａ８３−０１と０．１μＭ  ＬＤＮ１９３１８９（図７ｂ）を使用することが可能であった。
また、前記「５−２」と同様の方法において、ＦＳＫに代えて５０μＭ  ｄｂｃＡＭＰの使用が可能であった（図７ｃ）。【０１１４】
＜５−４：添加試薬の検討２＞
前記「５−１」と同様の方法において、ＣＨＩＲに代えて０．５μＭ  ＢＩＯ（図８ａ）又は１０μＭ  ＳＢ２１６７６３（図８ｂ）を使用することは可能であった。
前記「５−１」と同様の方法において、ＣＨＩＲに代えて０．５μＭ  ＢＩＯを添加した培地で分化を開始し、分化２日目でＳＢに代えて１μＭ  Ａ８３−０１を使用すること（図８ｃ）、及び、ＳＢとＤＭに代えて１μＭ  Ａ８３−０１とＤ０．１μＭ  ＬＤＮ１９３１８９（図８ｄ）を使用することが可能であった。
前記「５−１」と同様の方法において、ＣＨＩＲに代えて１０μＭ  ＳＢ２１６７６３を使用して分化を開始し、分化２日目でＳＢに代えて１μＭ  Ａ８３−０１（図８ｅ）を使用することは可能であった。
前記「５−１」と同様の方法において、ＣＨＩＲに代えて１０μＭ  ＳＢ２１６７６３を使用して分化を開始し、分化２日目でＳＢ及びＤＭを添加した培地で交換し、分化４日目以降ＦＳＫに代えて５０μＭ  ｄｂｃＡＭＰの使用は可能であった（図８ｆ）。
前記「５−１」と同様の方法において、分化２日目でＳＢに代えて１μＭ  Ａ８３−０１を使用すること（図８ｇ）、及び、ＳＢとＤＭに代えて１μＭ  Ａ８３−０１と０．１μＭ  ＬＤＮ１９３１８９（図８ｈ）を使用することが可能であった。
前記「５−１」と同様の方法において、分化４日目からＦＳＫに代えて５０μＭ  ｄｂｃＡＭＰを添加した場合（図８ｉ）、及び分化４日目からＦＳＫを添加しなかった場合のいずれにおいても骨格筋前駆細胞への分化誘導は可能であった（図８ｊ）。【０１１５】
＜５−５：細胞株の検討＞
前記「５−１」と同様の方法において、２５３Ｇ１細胞に代えて２０１Ｂ７細胞を用いた場合でも、骨格筋前駆細胞への分化誘導は可能であった（図９）。【０１１６】
各図面の細胞株と培養条件を表１にまとめて示す。
【表１】
2017188458.tif 000003
【０１１７】
試験例１：純化操作前と操作後の純度
１．フローサイトメトリーによる細胞調製物における骨格筋前駆細胞の純度の測定
２種類の骨格筋前駆細胞マーカーで染色し、両方の抗体で染色された（両陽性）細胞の割合を純度としてフローサイトメトリーで算出した。【０１１８】
（１）純化操作前の純度
実施例２記載の方法と同様の方法で培養した分化３週目の細胞をＡＣＣＵＴＡＳＥで分散した。分散した細胞に対し、蛍光色素ＰＥで標識した抗ＣＤ５６抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）またはＰＥで標識した抗ＣＤ２９抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で染色した。次いでそれぞれをＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔ（ＢＤ）を用いて固定し、蛍光色素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ  ４８８で標識した抗Ｐａｘ７抗体（Ｎｏｖｕｓ日本）で染色した。コントロールは、分散した細胞を、ＰＥで標識したアイトタイプ・コントロール抗体（ＢＤ）で染色後、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔ（ＢＤ）を用いて固定し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ  ４８８で標識したアイソタイプ・コントロール抗体（Ｎｏｖｕｓ日本）で染色した。蛍光色素で染色された細胞の割合はＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ）で測定した。【０１１９】
（２）純化操作後の純度
実施例４、試験例１で記載した方法で、ＰＥで標識した抗ＣＤ５６抗体またはＰＥで標識した抗ＣＤ２９抗体で染色した細胞を、実施例４で記載した方法で純化した。次いで、試験例１で記載した方法で固定、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ  ４８８で標識した抗Ｐａｘ７抗体で染色し、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩで測定して純度を算出した。【０１２０】
２．結果
図１０及び１１にＦＡＣＳの結果及び蛍光顕微鏡での観察結果を示す。縦軸はＰＥ（抗ＣＤ２９抗体または抗ＣＤ５６抗体で染色された細胞を示す）、横軸はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ  ４８８（抗Ｐａｘ７抗体で染色された細胞を示す）の蛍光強度を示す。純化前の細胞（上段）では、ＣＤ２９／Ｐａｘ７両陽性率両陽性率は８６．５％、ＣＤ５６／Ｐａｘ７両陽性率は６９．０％であった。一方、純化操作後の細胞（下段）においては、ＣＤ２９／Ｐａｘ７両陽性率は８９．０％、ＣＤ２９／Ｐａｘ７両陽性率は７７．１％であり、純化操作前より純度が上昇した。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明によれば、凍結保存が可能な純度の高い多能性幹細胞由来の骨格筋前駆細胞調製物、及び、これを利用した迅速かつ安定した骨格筋細胞の提供が可能になる。得られる骨格筋細胞調製物は、細胞医薬として有用であるほか、医薬のスクリーニングを可能とする有用なものである。【０１２２】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図１ａ】
2017188458.tif 000004
【図１ｂ】
2017188458.tif 000005
【図１ｃ】
2017188458.tif 000006
【図２ａ】
2017188458.tif 000007
【図２ｂ】
2017188458.tif 000008
【図３ａ】
2017188458.tif 000009
【図３ｂ】
2017188458.tif 000010
【図３ｃ】
2017188458.tif 000011
【図３ｄ】
2017188458.tif 000012
【図３ｅ】
2017188458.tif 000013
【図３ｆ】
2017188458.tif 000014
【図３ｇ】
2017188458.tif 000015
【図４ａ】
2017188458.tif 000016
【図４ｂ】
2017188458.tif 000017
【図４ｃ】
2017188458.tif 000018
【図５】
2017188458.tif 000019
【図６】
2017188458.tif 000020
【図７ａ−ｃ】
2017188458.tif 000021
【図８ａ−ｄ】
2017188458.tif 000022
【図８ｅ−ｈ】
2017188458.tif 000023
【図８ｉ−ｊ】
2017188458.tif 000024
【図９】
2017188458.tif 000025
【図１０】
2017188458.tif 000026
【図１１】
2017188458.tif 000027
【国際調査報告】
2017188458.tif 000028
2017188458.tif 000029
2017188458.tif 000030
2017188458.tif 000031