(57)【要約】  目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞から、前記組換えタンパク質を精製する方法であって、無機塩添加若しくは無添加の第１の非プロトン性極性溶媒に宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが前記組換えタンパク質が溶解しない条件で前記組換え細胞を処理し、第１の可溶性画分を除去した後、得られた第１の不溶性画分を、無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒に前記組換えタンパク質が溶解する条件で処理することを特徴とする、組換えタンパク質の精製方法を開示する。
2018066558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞から、前記組換えタンパク質を精製する方法であって、
無機塩添加若しくは無添加の第１の非プロトン性極性溶媒に宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが前記組換えタンパク質が溶解しない条件で前記組換え細胞を処理し、第１の可溶性画分を除去した後、得られた第１の不溶性画分を、無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒に前記組換えタンパク質が溶解する条件で処理することを特徴とする、組換えタンパク質の精製方法。
【請求項２】
無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒に前記組換えタンパク質が溶解する条件で処理した後、第２の不溶性画分を除去し、組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を得ることをさらに含む、請求項１に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項３】
第２の不溶性画分を除去して得られた第２の可溶性画分を前記組換えタンパク質の貧溶媒を用いて処理し、前記組換えタンパク質を凝集させ、精製した組換えタンパク質を凝集体として得ることをさらに含む、請求項２に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項４】
以下（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含む、組換えタンパク質の精製方法。
（Ａ）目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞を、無機塩添加若しくは無添加の第１の非プロトン性極性溶媒を用いて、宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが前記組換えタンパク質が溶解しない条件で処理する工程、
（Ｂ）第１の可溶性画分を除去し、前記組換えタンパク質を含む第１の不溶性画分を回収する工程、
（Ｃ）回収した第１の不溶性画分を、無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒を用いて、前記組換えタンパク質が溶解する条件で処理する工程、
（Ｄ）第２の不溶性画分を除去し、前記組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を得る工程
【請求項５】
（Ｅ）第２の可溶性画分を前記組換えタンパク質の貧溶媒を用いて処理し、前記組換えタンパク質を凝集させ、精製した組換えタンパク質を凝集体として回収する工程、をさらに含む、請求項４に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項６】
前記条件が、温度条件であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項７】
前記第１又は第２の非プロトン性極性溶媒が、双極子モーメント３．０Ｄ以上である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項８】
前記無機塩が、アルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩及びチオシアン酸塩からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項９】
前記組換えタンパク質が構造タンパク質である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項１０】
前記構造タンパク質がコラ−ゲン、エラスチン、レシリン、カイコシルク及びスパイダーシルクからなる群から選択されるタンパク質に由来する、請求項９に記載の精製方法。
【請求項１１】
以下（Ａ）〜（Ｄ）及び（Ｆ）の工程を含む、人造ポリペプチド繊維の製造方法。
（Ａ）目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞を、無機塩添加若しくは無添加の第１の非プロトン性極性溶媒を用いて、宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが前記組換えタンパク質が溶解しない条件で処理する工程、
（Ｂ）第１の可溶性画分を除去し、前記組換えタンパク質を含む第１の不溶性画分を回収する工程、
（Ｃ）回収した第１の不溶性画分を、無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒を用いて、前記組換えタンパク質が溶解する条件で処理する工程、
（Ｄ）第２の不溶性画分を除去し、前記組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を得る工程、
（Ｆ）第２の可溶性画分を糸状の液体として凝固液に付与し、前記組換えタンパク質を糸状に凝固させて回収することにより未延伸糸を得る工程
【請求項１２】
以下（Ａ）〜（Ｄ）及び（Ｇ）の工程を含む、ポリペプチドフィルムの製造方法。
（Ａ）目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞を、無機塩添加若しくは無添加の第１の非プロトン性極性溶媒を用いて、宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが前記組換えタンパク質が溶解しない条件で処理する工程、
（Ｂ）第１の可溶性画分を除去し、前記組換えタンパク質を含む第１の不溶性画分を回収する工程、
（Ｃ）回収した第１の不溶性画分を、無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒を用いて、前記組換えタンパク質が溶解する条件で処理する工程、
（Ｄ）第２の不溶性画分を除去し、前記組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を得る工程、
（Ｇ）第２の非プロトン性極性溶媒に耐性のある平板上に、第２の可溶性画分を用いて所定の厚さの塗膜を形成させ、前記塗膜から第２の非プロトン性極性溶媒を除去することでポリペプチドフィルムを得る工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質を発現する組換え細胞から当該組換えタンパク質を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
目的とするタンパク質の工業規模での生産は、遺伝子組換え宿主細胞を利用して可能になっている。組換え細胞により生産された組換えタンパク質を単離、精製する方法も多数報告されている。【０００３】
不溶性の目的とするタンパク質を単離する方法としては、組換え細胞の懸濁液から水酸化ナトリウム等の金属水酸化物を利用する方法（特許文献１）、及びギ酸やプロピオン酸等の有機酸を利用する方法（特許文献２）等が報告されている。しかしながら、これらの方法によって不溶性の目的とするタンパク質を単離する場合には、目的とするタンパク質とともに存在する不純物を除去することが難しいため、単離された目的とするタンパク質の純度が高くないという問題があった。また、有機酸を使用する方法では、酸に対して耐性がないタンパク質は分解され易いことから、単離可能なタンパク質が限定されるという問題があった。【０００４】
目的とするタンパク質とともに存在する不純物を除去でき、有機酸を使用しない方法として、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性極性溶媒に溶解し、水等の溶媒を用いて不純物を除去し、目的とするタンパク質を精製する方法（特許文献３）等が報告されている。この方法によれば、約７０％まで目的とするタンパク質を精製することができるが、目的とするタンパク質が、ハイドロパシーインデックス（ＨＩ）が０以下の親水性組換えタンパク質に限定されるという問題があった。また、不純物を除去するために添加する水等の水系溶媒の影響でタンパク質によってはゲル化してしまう虞もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１３−５２３６６５号公報
【特許文献２】特表２００４一５０３２０４号公報
【特許文献３】国際公開第２０１４／１０３８４７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
工業規模の生産においては、依然として、目的とする組換えタンパク質を簡便に高い純度で精製する方法が望まれている。そこで本発明は、目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞から、当該組換えタンパク質を簡便に高い純度で精製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、非プロトン性極性溶媒を用いて、宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが目的とする組換えタンパク質が溶解しない条件で組換え細胞を処理することにより、目的とする組換えタンパク質を溶解させる前に宿主細胞由来のタンパク質を除去することで、水等の水系溶媒を添加することなく、簡便に高い純度で目的とする組換えタンパク質を精製できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞から、上記組換えタンパク質を精製する方法であって、
無機塩添加若しくは無添加の第１の非プロトン性極性溶媒に宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが上記組換えタンパク質が溶解しない条件で上記組換え細胞を処理し、第１の可溶性画分を除去した後、得られた第１の不溶性画分を、無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒に上記組換えタンパク質が溶解する条件で処理することを特徴とする、組換えタンパク質の精製方法。
［２］
無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒に上記組換えタンパク質が溶解する条件で処理した後、第２の不溶性画分を除去し、組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を得ることをさらに含む、［１］に記載の組換えタンパク質の精製方法。
［３］
第２の不溶性画分を除去して得られた第２の可溶性画分を上記組換えタンパク質の貧溶媒を用いて処理し、上記組換えタンパク質を凝集させ、精製した組換えタンパク質を凝集体として得ることをさらに含む、［２］に記載の組換えタンパク質の精製方法。
［４］
以下（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含む、組換えタンパク質の精製方法。
（Ａ）目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞を、無機塩添加若しくは無添加の第１の非プロトン性極性溶媒を用いて、宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが上記組換えタンパク質が溶解しない条件で処理する工程、
（Ｂ）第１の可溶性画分を除去し、上記組換えタンパク質を含む第１の不溶性画分を回収する工程、
（Ｃ）回収した第１の不溶性画分を、無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒を用いて、上記組換えタンパク質が溶解する条件で処理する工程、
（Ｄ）第２の不溶性画分を除去し、上記組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を得る工程
［５］
（Ｅ）第２の可溶性画分を上記組換えタンパク質の貧溶媒を用いて処理し、上記組換えタンパク質を凝集させ、精製した組換えタンパク質を凝集体として回収する工程、をさらに含む、［４］に記載の組換えタンパク質の精製方法。
［６］
上記条件が、温度条件であることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載の組換えタンパク質の精製方法。
［７］
上記第１又は第２の非プロトン性極性溶媒が、双極子モーメント３．０Ｄ以上である、［１］〜［６］のいずれかに記載の組換えタンパク質の精製方法。
［８］
上記無機塩が、アルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩及びチオシアン酸塩からなる群から選択される、［１］〜［７］のいずれかに記載の組換えタンパク質の精製方法。
［９］
上記組換えタンパク質が構造タンパク質である、［１］〜［８］のいずれかに記載の組換えタンパク質の精製方法。
［１０］
上記構造タンパク質がコラ−ゲン、エラスチン、レシリン、カイコシルク及びスパイダーシルクからなる群から選択されるタンパク質に由来する、［９］に記載の精製方法。
［１１］
以下（Ａ）〜（Ｄ）及び（Ｆ）の工程を含む、人造ポリペプチド繊維の製造方法。
（Ａ）目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞を、無機塩添加若しくは無添加の第１の非プロトン性極性溶媒を用いて、宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが上記組換えタンパク質が溶解しない条件で処理する工程、
（Ｂ）第１の可溶性画分を除去し、上記組換えタンパク質を含む第１の不溶性画分を回収する工程、
（Ｃ）回収した第１の不溶性画分を、無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒を用いて、上記組換えタンパク質が溶解する条件で処理する工程、
（Ｄ）第２の不溶性画分を除去し、上記組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を得る工程、
（Ｆ）第２の可溶性画分を糸状の液体として凝固液に付与し、上記組換えタンパク質を糸状に凝固させて回収することにより未延伸糸を得る工程
［１２］
以下（Ａ）〜（Ｄ）及び（Ｇ）の工程を含む、ポリペプチドフィルムの製造方法。
（Ａ）目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞を、無機塩添加若しくは無添加の第１の非プロトン性極性溶媒を用いて、宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが上記組換えタンパク質が溶解しない条件で処理する工程、
（Ｂ）第１の可溶性画分を除去し、上記組換えタンパク質を含む第１の不溶性画分を回収する工程、
（Ｃ）回収した第１の不溶性画分を、無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒を用いて、上記組換えタンパク質が溶解する条件で処理する工程、
（Ｄ）第２の不溶性画分を除去し、上記組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を得る工程、
（Ｇ）第２の非プロトン性極性溶媒に耐性のある平板上に、第２の可溶性画分を用いて所定の厚さの塗膜を形成させ、上記塗膜から第２の非プロトン性極性溶媒を除去することでポリペプチドフィルムを得る工程
【発明の効果】
【０００９】
本発明の組換えタンパク質の精製方法は、複雑な工程を含まず、工程数も少ない簡便な方法であるにも関わらず、得られる精製した組換えタンパク質の純度が高く、さらなる精製工程を経ることなく、例えば紡糸やフィルムの形成等の製造にそのまま利用することができる。
また、本発明の組換えタンパク質の精製方法は、酸を添加する工程を要さない。したがって、精製対象の組換えタンパク質が、酸に対して耐性のあるタンパク質に限定されない。
さらに、本発明の組換えタンパク質の精製方法は、組換えタンパク質を含む非プロトン性極性溶媒を水等の水系溶媒と置換する精製工程を要さない。したがって、精製対象の組換えタンパク質が、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性の組換えタンパク質に限定されない。また、水系溶媒の影響による当該組換えタンパク質のゲル化の心配もない。また、非プロトン性極性溶媒に水等の水系溶媒を添加しないため、当該非プロトン性極性溶媒を回収して再利用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例１で検討した、宿主細胞由来のタンパク質の除去に関する、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析の結果を示す写真である。
【図２】図２は、実施例２で検討した、宿主細胞由来のタンパク質の除去に関する、遠心分離により得られた上清画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【図３】図３は、実施例２で検討した、宿主細胞由来のタンパク質の除去に関する、遠心分離により得られた沈殿画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【図４】図４は、実施例３で検討した、宿主細胞由来のタンパク質の除去に関する、遠心分離により得られた上清画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【図５】図５は、実施例３で検討した、宿主細胞由来のタンパク質の除去に関する、遠心分離により得られた沈殿画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【図６】図６は、実施例４で検討した、目的とするタンパク質の精製に関する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【図７】図７は、実施例５で検討した、目的とするタンパク質の精製に関する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【図８】図８は、実施例６で検討した、目的とするタンパク質の精製に関する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【図９】図９は、実施例７で検討した、目的とするタンパク質の精製に関する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【図１０】図１０は、実施例８で検討した、精製タンパク質溶液を紡糸用のドープとして使用して糸を形成させたときの写真である。
【図１１】図１１は、実施例９で検討した、目的とするタンパク質のゲル化の状態を示す写真である。
【図１２】図１２は、実施例９で検討した、従来方法と本実施例の方法による目的とするタンパク質の精製に関する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
一実施形態に係る組換えタンパク質の精製方法は、目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞から、上記組換えタンパク質を精製する方法であって、無機塩添加若しくは無添加の第１の非プロトン性極性溶媒に宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが上記組換えタンパク質が溶解しない条件で上記組換え細胞を処理し、第１の可溶性画分を除去した後、得られた第１の不溶性画分を、無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒に上記組換えタンパク質が溶解する条件で処理することを特徴とする。無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒に上記組換えタンパク質が溶解する条件で処理した後、第２の不溶性画分を除去し、組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を得ることをさらに含むことが好ましい。第２の不溶性画分を除去して得られた第２の可溶性画分を上記組換えタンパク質の貧溶媒を用いて処理し、上記組換えタンパク質を凝集させ、精製した組換えタンパク質を凝集体として得ることをさらに含むことが好ましい。
【００１３】
一実施形態に係る組換えタンパク質の精製方法は、具体的には、以下（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含むことを特徴とする：
（Ａ）目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞を、無機塩添加若しくは無添加の第１の非プロトン性極性溶媒を用いて、宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが上記組換えタンパク質が溶解しない条件で処理する工程、
（Ｂ）第１の可溶性画分を除去し、上記組換えタンパク質を含む第１の不溶性画分を回収する工程、
（Ｃ）回収した第１の不溶性画分を、無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒を用いて、上記組換えタンパク質が溶解する条件で処理する工程、
（Ｄ）第２の不溶性画分を除去し、上記組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を得る工程
【００１４】
（組換えタンパク質）
本実施形態に係る目的とする組換えタンパク質（以下、「組換えタンパク質」又は「目的とするタンパク質」ということもある。）としては、工業規模での製造が好ましい任意のタンパク質を挙げることができ、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、構造タンパク質等を挙げることができる。工業用又は医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体を挙げることができる。構造タンパク質の具体例としては、スパイダーシルク、カイコシルク、コラ−ゲン、エラスチン及びレシリン、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。
【００１５】
フィブロイン様タンパク質であるスパイダーシルクあるいはカイコシルク由来のタンパク質として、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフは４〜２０アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは８〜３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には配列番号１（ＰＲＴ４６８）〜配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質等を挙げることができる。ＰＲＴ４６８（配列番号１）のハイドロパシーインデックスは、−０．５９、ＰＲＴ６９８（配列番号４）のハイドロパシーインデックスは０．４３である。ハイドロパシーインデックスの値は国際公開第２０１４／１０３８４６号に記載の方法に従って算出した値である。
【００１６】
コラーゲン由来のタンパク質として、例えば、式２：［ＲＥＰ２］oで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式２中、ｏは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ２はＧｌｙ−Ｘ−Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉ）を挙げることができる。配列番号５で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉのハイドロパシーインデックスは、−０．７５である。
【００１７】
レシリン由来のタンパク質として、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｐは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ−Ｊ−Ｊ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿６１１１５７．１、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉ（配列番号６）のハイドロパシーインデックスは、−１．２２である。
【００１８】
エラスチン由来のタンパク質として、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。ｅｌａｓｔｉｎ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（配列番号７）のハイドロパシーインデックスは、０．４２である。
【００１９】
（組換え細胞）
本実施形態に係る組換え細胞は、組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞であり、遺伝子工学的手法を用いた一般的な方法を用いて取得できる。
【００２０】
組換え細胞は、例えば、目的とするタンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで宿主（宿主細胞）を形質転換することにより得ることができる。
【００２１】
調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００２２】
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。例えば原核生物の好ましい例として、大腸菌、バチルス・ズブチリス、シュードモナス、コリネバクテリウム、ラクトコッカス等の細菌を挙げることができ、より好ましくは、大腸菌細胞を挙げることができる。
【００２３】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とするタンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
【００２４】
細菌等の原核生物を宿主として用いる場合は、本発明に係る発現ベクターは、原核生物細胞中で自立複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明に係る核酸配列及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子配列が含まれていてもよい。
【００２５】
プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
【００２６】
細菌等の原核生物の宿主としては、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。
【００２７】
エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ  ＢＬ２１（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ライフテクノロジーズ社）、エシェリヒア・コリ  ＢＬＲ（ＤＥ３）（メルクミリポア社）、エシェリヒア・コリ  ＤＨ１、エシェリヒア・コリ  ＧＩ６９８、エシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ  Ｋ５（ＡＴＣＣ  ２３５０６）、エシェリヒア・コリ  ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ  ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ  ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ  ４７０７６）、エシェリヒア・コリ  Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ  Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ  ＴＢ１、エシェリヒア・コリ  Ｔｕｎｅｒ（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ  Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）  （ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ  Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ等を挙げることができる。
【００２８】
ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ、ブレビバチルス・ボルステレンシス、ブレビバチルス・セントロポラスブレビバチルス・フォルモサス、ブレビバチルス・インボカツス、ブレビバチルス・ラチロスポラス、ブレビバチルス・リムノフィルス、ブレビバチルス・パラブレビス、ブレビバチルス・レウスゼリ、ブレビバチルス・サーモルバー、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２２３）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１６６４）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ（ＪＣＭ８９７５）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６２３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（Ｔａｋａｒａ社製）等を挙げることができる。
【００２９】
セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｃｅ）ＡＴＣＣ１４４６０、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンティコーラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・グリメシ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｇｒｉｍｅｓｉｉ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）、セラチア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、セラチア・ルビダエ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｒｕｂｉｄａｅａ）等を挙げることができる。
【００３０】
バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）等を挙げることができる。
【００３１】
ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム  ＡＴＣＣ１５３５４等を挙げることができる。
【００３２】
ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７）ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９）ＡＴＣＣ１３６６５、ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウムＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・チオゲニタリスＡＴＣＣ１９２４０、ブレビバクテリウム・アルバムＡＴＣＣ１５１１１、ブレビバクテリウム・セリヌムＡＴＣＣ１５１１２等を挙げることができる。
【００３３】
コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アルカノリティカムＡＴＣＣ２１５１１、コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０２０、ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０６０、コリネバクテリウム・リリウムＡＴＣＣ１５９９０、コリネバクテリウム・メラセコーラＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭＢＰ−１５３９）、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８等を挙げることができる。
【００３４】
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ブラシカセラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ）、シュードモナス・フルバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ）、及びシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｄ−０１１０等を挙げることができる。
【００３５】
上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９，２１１０  （１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、又はＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等を挙げることができる。
【００３６】
ブレビバチルス属に属する微生物の形質転換は、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８３，１５６：１１３０−１１３４）や、Ｔａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５３：３０９９−３１００）、又はＯｋａｍｏｔｏらの方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，６１：２０２−２０３）により実施することができる。
【００３７】
目的とするタンパク質をコードする核酸を導入するベクター（以下、単に「ベクター」という。）としては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等を挙げることができる。
【００３８】
宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを用いる場合は、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ等を好適なベクターとして挙げることができる。
【００３９】
ブレビバチルス属に属する微生物に好適なベクターの具体例として、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、又はｐＨＹ５００（特開平２−３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８７，１２３９−１２４５）、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌１９８７，６１：６６９−６７６）、ｐＮＵ１００（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８９，３０：７５−８０）、ｐＮＵ２１１（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，１１２：４８８−４９１）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７−１７０９８４号公報）、ｐＮＨ３０１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９２，５８：５２５−５３１）、ｐＮＨ３２６、ｐＮＨ４００（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：７４５−７４９）、ｐＨＴ２１０（特開平６−１３３７８２号公報）、ｐＨＴ１１０Ｒ２Ｌ５（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４，４２：３５８−３６３）、又は大腸菌とブレビバチルス属に属する微生物とのシャトルベクターであるｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
【００４０】
原核生物を宿主とした場合のプロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであれば制限されない。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の大腸菌又はファージ等に由来するプロモーターを挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。上記発現ベクターにおいて、上記核酸の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００４１】
真核生物の宿主としては、例えば、酵母、糸状真菌（カビ等）及び昆虫細胞を挙げることができる。
【００４２】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ヤロウィア属及びハンゼヌラ属等に属する酵母を挙げることができる。より具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ）、シワニオマイセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・ポリモルファ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等を挙げることができる。
【００４３】
酵母を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターは通常、複製起点（宿主における増幅が必要である場合）及び大腸菌中でのベクターの増殖のための選抜マーカー、酵母における組換えタンパク質発現のためのプロモーター及びターミネーター、並びに酵母のための選抜マーカーを含むことが好ましい。
【００４４】
発現ベクターが非組込みベクターの場合、さらに自己複製配列（ＡＲＳ）を含むことが好ましい。これにより細胞内における発現ベクターの安定性を向上させることができる（Ｍｙｅｒｓ、Ａ．Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４５：２９９−３１０）。
【００４５】
酵母を宿主として用いる場合のベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ＹＩｐ、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５、ｐＡ０８０４、ｐＨＩＬ３Ｏｌ、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣＺ  Ｂ等を挙げることができる。
【００４６】
酵母を宿主とした場合のプロモーターの具体例としては、酵母中で発現できるものであれば制限されない。例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１  プロモーター、ＣＵＰ  １プロモーター、ｐＧＡＰプロモーター、ｐＧＣＷ１４プロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＭＯＸプロモーター等を挙げることができる。
【００４７】
酵母への発現ベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０））、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３））、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等を挙げることができる。
【００４８】
糸状真菌としては、例えば、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ウスチラーゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ）属、ボトリティス（Ｂｏｔｒｙｔｓ）属、マグナポルサ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属、ムコア（Ｍｕｃｏｒ）属、メタリチウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、及びリゾムコア属に属する菌等を挙げることができる。
【００４９】
糸状真菌の具体例として、アクレモニウム・アラバメンゼ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌａｂａｍｅｎｓｅ）、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクレアツス（アキュレータス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・サケ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅ）、アスペルギルス・ゾジエ（ソーヤ）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・テュビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・パラシチクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・フィクム（フィキュウム）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ）、アスペルギルス・フェニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｈｏｅｉｃｕｓ）、アスペルギルス・フォエチズス（フェチダス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フラーブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ヤポニクス（ジャポニカス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ハージアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｅｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、スポロトリクム・セルロフィルム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｐｈｉｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、チラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、ノイロスポラ・クラザ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、フザリウム・オキシスポーラス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｓ）、フザリウム・グラミネルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ペニシリウム・クリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・カネセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム・エメルソニ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・グリゼオロゼウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｒｉｓｅｏｒｏｓｅｕｍ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌ���ｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・ロケフォルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、マイセリオフトラ・サーモフィルム（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔａｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ムコア・アンビグス（Ｍｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｕｓ）、ムコア・シイルシネロイデェス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、ムコア・フラギリス（Ｍｕｃｏｒ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ムコア・ヘマリス（Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ）、ムコア・イナエクイスポラス（Ｍｕｃｏｒ  ｉｎａｅｑｕｉｓｐｏｒｕｓ）、ムコア・オブロンジエリプティカス（Ｍｕｃｏｒ  ｏｂｌｏｎｇｉｅｌｌｉｐｔｉｃｕｓ）、ムコア・ラセモサス（Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）、ムコア・レクルバス（Ｍｕｃｏｒ  ｒｅｃｕｒｖｕｓ）、ムコア・サトゥルニナス（Ｍｏｃｏｒ  ｓａｔｕｒｎｉｎｕｓ）、ムコア・サブティリススミウス（Ｍｏｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｍｕｓ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、リゾムコア・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、リゾムコア・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、リゾプス・アルヒザス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）等を挙げることができる。
【００５０】
糸状真菌を宿主とした場合のプロモーターの具体例としては、解糖系に関する遺伝子、構成的発現に関する遺伝子、加水分解に関する酵素遺伝子等いずれであってもよく、具体的にはａｍｙＢ、ｇｌａＡ、ａｇｄＡ、ｇｌａＢ、ＴＥＦ１、ｘｙｎＦ１ｔａｎｎａｓｅｇｅｎｅ、Ｎｏ．８ＡＮ、ｇｐｄＡ、ｐｇｋＡ、ｅｎｏＡ、ｍｅｌＯ、ｓｏｄＭ、ｃａｔＡ、ｃａｔＢ等を挙げることができる。
【００５１】
糸状真菌への発現ベクターの導入は，従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎらの方法（塩化カルシウム法）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１（１９７９）］、コンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６：２０９（１９７１）］、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。
【００５２】
昆虫細胞として、例えば、鱗翅類の昆虫細胞が挙げられ、より具体的には、Ｓｆ９、及びＳｆ２１等のスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来の昆虫細胞、並びに、Ｈｉｇｈ  ５等のイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）由来の昆虫細胞等を挙げることができる。
【００５３】
昆虫細胞を宿主として用いる場合のベクターとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等のバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２））を挙げることができる。
【００５４】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。すなわち、組換え遺伝子導入ベクター及びバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルス（発現ベクター）を得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等を挙げることができる。
【００５５】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターとバキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７））等を挙げることができる。
【００５６】
上記組換えベクターは、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましい。例えば、大腸菌においては、選択マーカー遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。栄養要求性に関与する遺伝子変異を相補できる劣性の選択マーカーも使用できる。酵母においては、選択マーカー遺伝子として、ジェネティシンに対する耐性遺伝子を用いることができ、栄養要求性に関与する遺伝子変異を相補する遺伝子、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３等の選択マーカーも使用できる。糸状真菌においては、選択マーカー遺伝子として、ｎｉａＤ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１７９５−１７９７（１９９５））、ａｒｇＢ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌ，６，３８６−３８９，（１９８４）），ｓＣ（Ｇｅｎｅ，８４，３２９−３３４，（１９８９））、ｐｔｒＡ（ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，６４，１４１６−１４２１，（２０００））、ｐｙｒＧ（ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１１２，２８４−２８９，（１９８３）），ａｍｄＳ（Ｇｅｎｅ，２６，２０５−２２１，（１９８３））、オーレオバシジン耐性遺伝子（Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ，２６１，２９０−２９６，（１９９９））、ベノミル耐性遺伝子（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８３，４８６９−４８７３，（１９８６））及びハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｇｅｎｅ，５７，２１−２６，（１９８７））からなる群より選ばれるマーカー遺伝子、ロイシン要求性相補遺伝子等を挙げることができる。また、宿主が栄養要求性変異株の場合には、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。
【００５７】
上記発現ベクターで形質転換された宿主の選択は、上記核酸に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション及びコロニーハイブリダイゼーション等で行うことができる。当該プローブとしては、上記核酸の配列情報に基づき、ＰＣＲ法によって増幅した部分ＤＮＡ断片をラジオアイソトープ又はジゴキシゲニンで修飾したものを用いることができる。
【００５８】
（組換えタンパク質の生産）
組換えタンパク質は、上記発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養することにより生産することができる。上記宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
【００５９】
上記宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、該宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００６０】
炭素源としては、該宿主が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
【００６１】
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
【００６２】
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
【００６３】
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
【００６４】
また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００６５】
昆虫細胞の培養培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））等を用いることができる。
【００６６】
昆虫細胞の培養は、例えば、培養培地のｐＨ６〜７、培養温度２５〜３０℃等の条件下で、培養時間１〜５日間とすることができる。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。
【００６７】
宿主が植物細胞の場合、形質転換された植物細胞をそのまま培養してもよく、また植物の器官に分化させて培養することができる。該植物細胞を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、又はこれらの培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
【００６８】
動物細胞の培養は、例えば、培養培地のｐＨ５〜９、培養温度２０〜４０℃等の条件下で、培養時間３〜６０日間とすることができる。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６９】
上記方法により目的とするタンパク質を、不溶体として宿主細胞内において発現させることができる。
【００７０】
［工程（Ａ）］
工程（Ａ）は、目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞を、無機塩添加若しくは無添加の第１の非プロトン性極性溶媒を用いて、宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが上記組換えタンパク質が溶解しない条件で処理する工程である。
【００７１】
目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞に含まれる宿主細胞由来のタンパク質の一部は、無機塩を添加していない非プロトン性極性溶媒若しくは無機塩を添加した非プロトン性極性溶媒に効果的に溶解させることができる。第１の非プロトン性極性溶媒は、乾燥菌体等の乾燥させた組換え細胞に添加してもよく、組換え細胞の懸濁液等に添加してもよい。さらに宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが組換えタンパク質が溶解しない条件で処理することにより、宿主細胞由来のタンパク質が溶解して可溶性画分（第１の可溶性画分）に含まれ、組換えタンパク質が不溶性画分（第１の不溶性画分）に含まれることになる。後の工程（Ｂ）で第１の可溶性画分を除去することで、組換えタンパク質を宿主細胞由来のタンパク質から分離することができる。
【００７２】
宿主細胞由来のタンパク質を除去するときの組換え細胞は無傷の細胞であっても、破壊処理等の処理を行った後の細胞であってもよい。また、既に簡単な精製処理を行った細胞を用いて、残存した宿主細胞由来のタンパク質を除去するために本発明の方法を適用することもできる。
【００７３】
（第１の非プロトン性極性溶媒）
第１の非プロトン性極性溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリドン（ＤＭＩ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、アセトニトリル、アセトン、イソプ口パノ―ル、プロピレンカーボネート、ヘキサメチルフォスフォラミド、Ｎ−エチルピロリドン、ニトロベンゼン、フルフラール、γ−ブチロラクトン、エチレンスルファイト、スルホラン、スクシノニトリル、エチレンカーボネート等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これら非プロトン性極性溶媒において、双極子モーメントが３．０Ｄ以上のものが好ましく、例えば、ＤＭＳＯ、ＮＭＰ、ＤＭＩ、ＤＭＦ、ＤＭＡ及びアセトニトリルが好ましく、ＤＭＳＯ、ＮＭＰ、ＤＭＦ及びＤＭＡがより好ましい。
【００７４】
非プロトン性極性溶媒の純度は、特に限定されず、本工程においては高純度である必要はないが、純度８０％以上であることが好ましい。
【００７５】
第１の非プロトン性極性溶媒として、１種類の非プロトン性極性溶媒を単独で用いても、２種類以上の非プロトン性極性溶媒を適宜混合して用いてもよい。
【００７６】
タンパク質等の極性を持った化合物を溶解する場合には極性の大きな溶媒が有効であり、双極子モーメントが３．０Ｄ以上の分子は極性が強いとされている。表１に、溶剤ハンドブック（講談社サイエンティフィック社、２００７年）に基づく、有機化合物（有機溶剤）の双極子モーメントを記載する。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
組換え細胞に添加する第１の非プロトン性極性溶媒の添加容量は、宿主細胞を溶解できる量であればよいが、例えば、組換え細胞乾燥重量（ｗｔ）に対して、非プロトン性極性溶媒（ｖｏｌ）／組換え細胞乾燥重量（ｗｔ）比として、１０〜１００倍であってよく、１２〜５０倍であってよく、２０〜３５倍であってよい。ここで、組換え細胞乾燥重量とは、例えば、宿主が細菌である場合には、乾燥させた細菌の菌体の重量を意味する。
【００７９】
（無機塩）
第１の非プロトン性極性溶媒に無機塩を添加することにより、宿主細胞由来のタンパク質がより溶解しやすくなる。
【００８０】
第１の非プロトン性極性溶媒に添加する無機塩としては、アルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、チオシアン酸塩、過塩素酸塩等を挙げることができる。
【００８１】
アルカリ金属ハロゲン化物としては、例えば、臭化カリウム、臭化ナトリウム、臭化リチウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化セシウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化リチウム等を挙げることができる。
【００８２】
アルカリ土類金属ハロゲン化物としては、例えば塩化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、臭化カルシウム、ヨウ化マグネシウム、ヨウ化カルシウム等を挙げることができる。
【００８３】
アルカリ土類金属硝酸塩としては、例えば、硝酸カルシウム、硝酸マグネシウム、硝酸ストロンチウム、硝酸バリウム等を挙げることができる。
【００８４】
チオシアン酸塩としては、例えばチオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム、（グアニジニウムチオシアナート）等を挙げることができる。
【００８５】
過塩素酸塩としては、例えば過塩素酸アンモニウム、過塩素酸カリウム、過塩素酸カルシウム、過塩素酸銀、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸マグネシウム等を挙げることができる。
【００８６】
これらの無機塩は、１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。
【００８７】
好適な無機塩としてはアルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物が挙げられ、好適な無機塩の具体例としては、塩化リチウム、塩化カルシウム等を挙げることができる。
【００８８】
無機塩の添加量としては、使用する第１の非プロトン性極性溶媒に応じて最適量を決めればよいが、例えば第１の非プロトン性極性溶媒に対して０〜１．０Ｍの無機塩を添加できる。例えば、無機塩の添加量の上限値は、０．７Ｍ、０．６Ｍ又は０．５Ｍであってよく、無機塩の添加量の下限値は、０．０５Ｍ、０．１Ｍ又は０．２Ｍであってよい。
【００８９】
第１の非プロトン性極性溶媒としてＤＭＳＯを用いた場合には、無機塩の添加量は、０〜０．７Ｍが好ましく、０〜０．３Ｍがより好ましく、０〜０．１Ｍがさらに好ましい。
【００９０】
第１の非プロトン性極性溶媒としてＤＭＦ、ＤＭＡ、ＤＭＩ、ＮＭＰを用いた場合には、無機塩の添加量は、０〜０．７Ｍが好ましく、０〜０．６Ｍがより好ましく、０〜０．５Ｍがさらに好ましい。
【００９１】
第１の非プロトン性極性溶媒は、目的とするタンパク質の溶解を阻害する溶媒をさらに含むことができる。第１の非プロトン性極性溶媒に無機塩を添加することにより、宿主細胞由来のタンパク質がより溶解しやすくなるが、同時に目的とするタンパク質も溶解しやすくなる傾向がある。そこで、目的とするタンパク質の溶解を阻害する溶媒を第１の非プロトン性極性溶媒に添加することにより、目的とするタンパク質の溶解を防ぎつつ、効率的に宿主細胞由来のタンパク質を溶解させることができる。目的とするタンパク質の溶解を阻害する溶媒としては、環状構造を有する非プロトン性極性溶媒が好ましく、具体的には、環状ケトン類、含窒素複素環式化合物類、含酸素複素環式化合物類、含硫黄複素環式化合物類、並びに窒素、酸素及び硫黄のうち２種類以上の原子を持った複素環式化合物類等の溶媒を挙げることができる。
【００９２】
環状ケトン類の溶媒としては、例えば、シクロヘキサノン、シクロへキセノン、イソホロン、シクロペンタノン及びシクロペンテノン等を挙げることができ、シクロヘキサノン及びイソホロン等が好ましく、シクロヘキサノンがより好ましい。
【００９３】
含窒素複素環式化合物類の溶媒としては、例えば、ピリジン、ピペリジン、ピロリジン、ピコリン、キノリン、ＮＭＰ、２−ピロリドン、Ｎ−エチル−２−ピロリドン及びＤＭＩ等を挙げることができ、ピリジン、ＮＭＰ、２−ピロリドン及びＤＭＩが好ましく、ＮＭＰがより好ましい。
【００９４】
含酸素複素環式化合物類の溶媒としては、例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、フルフラール、ジオキソラン、炭酸エチレン、炭酸プロピレン、δ−バレロラクトン及びγ−ブチロラクトン等を挙げることができ、テトラヒドロフラン、炭酸エチレン、炭酸プロピレン、δ−バレロラクトン及びγ−ブチロラクトンが好ましく、テトラヒドロフランがより好ましい。
【００９５】
含硫黄複素環式化合物類の溶媒としては、例えば、スルホラン及びテトラヒドロチオフェン等が挙げられる。
【００９６】
窒素、酸素及び硫黄のうち2種類以上の原子を持った複素環式化合物類の溶媒としては、モルホリン、N−メチルモルホリン、チアゾール、イソチアゾール、オキサゾール及びベンゾオキサゾール等が挙げられる。
【００９７】
上記目的とするタンパク質の溶解を阻害する溶媒の第１の非プロトン性極性溶媒への添加量としては、添加する無機塩の量に応じて最適量を決めればよいが、例えば第１の非プロトン性極性溶媒に対して１０〜７５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）であってよく、１０〜５０％であってもよい。
【００９８】
宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが組換えタンパク質が溶解しない条件は、第１の非プロトン性極性溶媒に添加する無機塩の濃度及び目的とする組換えタンパク質等に応じて適宜設定できるが、温度条件であることが好ましい。宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが、目的とする組換えタンパク質が溶解しない温度まで加温して、所定時間維持することが好ましい。
【００９９】
溶解させるための温度は、第１の非プロトン性極性溶媒に添加する無機塩の濃度及び目的とする組換えタンパク質に応じて決めればよいが、例えば１０〜６０℃及び１０〜４０℃の温度を挙げることができる。例えば、溶解させるための温度の上限値は、７０℃、６０℃、５０℃又は４０℃であってよく、溶解させるための温度の下限値は１０℃、２０℃、２５℃又は３０℃であってよい。
【０１００】
溶解させるための時間は、宿主細胞由来のタンパク質が十分溶解し、且つ目的とする組換えタンパク質の溶解が少ない時間であれば、特に限定する必要はないが、工業的生産を考慮すると、１０〜１００分が好ましく、１０〜６０分がより好ましく、１０〜３０分がさらに好ましい。
【０１０１】
目的とする組換えタンパク質がスパイダーシルク、カイコシルク、コラ−ゲン、エラスチン及びレシリン等の構造タンパク質である場合には、例えば、以下の条件を挙げることができる。
【０１０２】
上記構造タンパク質を発現した宿主に添加する第１の非プロトン性極性溶媒の添加量は、組換え細胞乾燥重量（ｗｔ）当たり、非プロトン性極性溶媒（ｖｏｌ）／組換え細胞乾燥重量（ｗｔ）比として、１０〜１００倍が好ましく、１２〜５０倍がより好ましく、２０〜３５倍がさらに好ましい。第１の非プロトン性極性溶媒に添加する無機塩としては、塩化リチウム及び塩化カルシウムが好ましく、塩化リチウムがより好ましい。また、無機塩を添加する濃度は第１の非プロトン性極性溶媒に対して０〜１．０Ｍ以下が好ましく、０〜０．６Ｍ以下がより好ましく、０〜０．５Ｍ以下がさらに好ましい。上記の第１の非プロトン性極性溶媒を用いて、例えば１０〜５０℃、好ましくは１０〜４０℃で処理することにより、宿主細胞を構成するタンパク質を溶解することができる。溶解するための時間としては例えば２０〜６０分であってよく、２０〜４０分が好ましく、２０〜３０分がより好ましい。
【０１０３】
より具体的に、目的とする組換えタンパク質が配列番号１〜４のように、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフは４〜２０アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは８〜３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）であった場合には、例えば、以下の条件を挙げることができる。
【０１０４】
上記タンパク質を発現した宿主に添加する第１の非プロトン性極性溶媒の添加量は、組換え細胞乾燥重量（ｗｔ）当たり、非プロトン性極性溶媒（ｖｏｌ）／組換え細胞乾燥重量（ｗｔ）比として、１０〜１００倍が好ましく、１２〜５０倍がより好ましく、２０〜３５倍がさらに好ましい。第１の非プロトン性極性溶媒に添加する無機塩としては、塩化リチウム及び塩化カルシウムが好ましく、塩化リチウムがより好ましい。また、無機塩を添加する濃度は第１の非プロトン性極性溶媒に対して０〜１．０Ｍ以下が好ましく、０〜０．６Ｍ以下がより好ましく、０〜０．５Ｍ以下がさらに好ましい。上記の第１の非プロトン性極性溶媒を用いて、例えば１０〜５０℃、好ましくは１０〜４０℃で処理することにより、宿主細胞を構成するタンパク質を溶解することができる。溶解するための時間としては例えば２０〜６０分であってよく、２０〜４０分が好ましく、２０〜３０分がより好ましい。
【０１０５】
［工程（Ｂ）］
工程（Ｂ）は、第１の可溶性画分を除去し、上記組換えタンパク質を含む第１の不溶性画分を回収する工程である。
【０１０６】
工程（Ａ）で得られた溶液から、宿主細胞由来のタンパク質が溶解した第１の可溶性画分を除去することで、宿主細胞由来のタンパク質を除去することができる。第１の可溶性画分と第１の不溶性画分を分離し、宿主細胞由来のタンパク質が溶解した第１の可溶性画分を除去し、目的とする組換えタンパク質を含む第１の不溶性画分を回収する方法としては、遠心分離、ドラムフィルターやプレスフィルター等のフィルターろ過等、一般的な方法が挙げられる。フィルターろ過による場合、セライト、珪藻土等のろ過助剤及びプリコート剤等を併用することにより、目的とする組換えタンパク質を含む第１の不溶性画分をより効率的に回収することができる。
【０１０７】
この方法によれば、水等の水系溶媒を添加することなく、簡便な方法により可溶性画分と不溶性画分を分離することで、宿主細胞由来のタンパク質を除去できる。水系溶媒を添加しないため、使用した第１の非プロトン性極性溶媒は精製して、再度工程（Ａ）に利用することが可能であり、経済的である。
【０１０８】
［工程（Ｃ）］
工程（Ｃ）は、回収した第１の不溶性画分を、無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒を用いて、上記組換えタンパク質が溶解する条件で処理する工程である。
【０１０９】
工程（Ｂ）において回収した第１の不溶性画分に含まれる目的とする組換えタンパク質は、無機塩を添加した非プロトン性極性溶媒（第２の非プロトン性極性溶媒）を用いて効果的に溶解することができる。第２の非プロトン性極性溶媒を第１の不溶性画分に添加し、当該組換えタンパク質が溶解する条件で処理することにより、当該組換えタンパク質が溶解して可溶性画分（第２の可溶性画分）に含まれ、不溶性の夾雑物が不溶性画分（第２の不溶性画分）に含まれることになる。後の工程（Ｄ）で第２の不溶性画分を除去することで夾雑物を除去することができる。
【０１１０】
第２の非プロトン性極性溶媒としては、上記工程（Ａ）で記載した非プロトン性極性溶媒を用いることができるが、環状構造を有しない非プロトン性極性溶媒であることが好ましく、環状構造を有しない非プロトン性極性溶媒であって双極子モーメントが３．５Ｄ以上のものがより好ましい。
【０１１１】
第２の非プロトン性極性溶媒として、工程（Ａ）で用いた第１の非プロトン性極性溶媒と同じ非プロトン性極性溶媒を用いてもよく、第１の非プロトン性極性溶媒と異なる非プロトン性極性溶媒を用いてもよい。
【０１１２】
第２の非プロトン性極性溶媒の好ましい具体例として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＤＭ１及びＮＭＰが挙げられ、より好ましい具体例としてＤＭＳＯ、ＤＭＦ及びＤＭＡが挙げられる。
【０１１３】
第２の非プロトン性極性溶媒の純度は、特に限定されないが、夾雑物を低減するという観点から、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。
【０１１４】
第２の非プロトン性極性溶媒として、１種類の非プロトン性極性溶媒を単独で用いても、２種類以上の非プロトン性極性溶媒を適宜混合して用いてもよい。
【０１１５】
目的とする組換えタンパク質を含む第１の不溶性画分に添加する第２の非プロトン性極性溶媒の添加容量は、非プロトン性極性溶媒（ｖｏｌ）／組換え細胞乾燥重量（ｗｔ）比として、５〜５０倍が好ましく、６〜２５倍がより好ましく、８〜１６倍がさらに好ましい。
【０１１６】
第２の非プロトン性極性溶媒に添加する無機塩としては、上記工程（Ａ）で記載した無機塩を用いることができる。工程（Ａ）で無機塩添加の第１の非プロトン性極性溶媒を用いた場合には、その無機塩と同じ種類の無機塩を、第２の非プロトン性極性溶媒に添加する無機塩として用いてもよく、その無機塩とは異なる無機塩を用いてもよい。
【０１１７】
第２の非プロトン性極性溶媒に添加する無機塩として、１種類の無機塩を単独で用いても、２種類以上の無機塩を併用してもよい。
【０１１８】
第２の非プロトン性極性溶媒に添加する無機塩として、好適にはアルカリ金属ハロゲン化物及びアルカリ土類金属ハロゲン化物が挙げられ、具体的な好適例としては、塩化リチウム及び塩化カルシウム等を挙げることができる。
【０１１９】
第２の非プロトン性極性溶媒に添加する無機塩の添加量としては、使用する第２の非プロトン性極性溶媒により最適量を決めればよく、例えば、第２の非プロトン性極性溶媒に対して０．０１〜２．０Ｍの無機塩を添加することができる。
【０１２０】
第２の非プロトン性極性溶媒としてＤＭＳＯを用いた場合には、無機塩の添加量は、０．０１〜１．５Ｍが好ましく、０．５〜１．５Ｍがより好ましく、１〜１．５Ｍがさらに好ましい。
【０１２１】
第２の非プロトン性極性溶媒としてＤＭＦ、ＤＭＡ、ＤＭＩ、ＮＭＰを用いた場合には、無機塩の添加量は、０．０１〜２．０Ｍが好ましく、０．５〜２．０Ｍがより好ましく、１．０〜２．０Ｍがさらに好ましい。
【０１２２】
組換えタンパク質が溶解する条件は、第２の非プロトン性極性溶媒に添加する無機塩の濃度及び目的とする組換えタンパク質等に応じて適宜設定できるが、温度条件であることが好ましい。組換えタンパク質が溶解する温度まで加温して、所定時間維持することが好ましい。加温することにより目的とする組換えタンパク質を効率よく溶解させることができる。
【０１２３】
溶解させるための温度は、添加する無機塩の濃度及び目的とする組換えタンパク質に応じて決めればよいが、例えば１０〜９０℃、好ましくは３０〜８５℃、より好ましくは４０〜８０℃を挙げることができる。例えば、溶解させるため温度の上限値は、１００℃、９０℃、８５℃又は８０℃であってよく、溶解させるため温度の下限値は、５０℃、６０℃、６５℃又は７０℃であってよい。
【０１２４】
溶解させるための時間は、目的とする組換えタンパク質が十分溶解する時間であれば特に限定する必要はないが、工業的生産性及び収率を考慮すると、２０〜８０分が好ましく、２０〜７０分がより好ましく、２０〜６０分がさらに好ましい。
【０１２５】
［工程（Ｄ）］
工程（Ｄ）は、第２の不溶性画分を除去し、上記組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を得る工程である。
【０１２６】
工程（Ｃ）で得られた溶液から、不溶性の夾雑物を含む第２の不溶性画分を除去することで、夾雑物を除去することができる。第２の可溶性画分と第２の不溶性画分を分離し、不溶性の夾雑物を含む第２の不溶性画分を除去し、目的とする組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を回収する方法としては、遠心分離、ドラムフィルターやプレスフィルター等のフィルターろ過等、一般的な方法が挙げられる。フィルターろ過による場合、セライト、珪藻土等のろ過助剤及びプリコート剤等を併用することにより、目的とする組換えタンパク質の溶解した第２の可溶性画分をより効率的に回収することができる。
【０１２７】
［工程（Ｅ）］
本精製方法は、さらに、第２の可溶性画分を上記組換えタンパク質の貧溶媒を用いて処理し、上記組換えタンパク質を凝集させ、精製した組換えタンパク質を凝集体として回収する工程（Ｅ）を含むことができる。
【０１２８】
上記工程（Ｄ）で得られた目的とする組換えタンパク質が溶解した第２の可溶性画分に、当該組換えタンパク質が溶解しにくい溶媒（貧溶媒）を添加し、当該組換えタンパク質を凝集（貧溶媒添加凝集）させ、凝集体として回収することにより、さらに精製純度の高い組換えタンパク質を得ることができる。
【０１２９】
貧溶媒としては、目的とする組換えタンパク質が第２の非プロトン性極性溶媒に溶解しにくくなるような溶媒が好ましい。例えば、エステル類、ケトン類、アルコール類、ニトリル類、エーテル類及び芳香族炭化水素類の貧溶媒を挙げることができる。
【０１３０】
エステル類の貧溶媒としては、例えば、酢酸エチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸オクチル、ギ酸エチル、酪酸エチル、カプロン酸エチル、酢酸２−エトキシエチル、酪酸メチル及びサリチル酸メチル等を挙げることができ、酢酸エチル、ギ酸エチル、酪酸エチル及び酢酸２−エトキシエチルが好ましく、酢酸エチル及び酢酸２−エトキシエチルがより好ましい。
【０１３１】
ケトン類の貧溶媒としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン及びメチルイソブチルケトン等を挙げることができ、アセトン及びメチルエチルケトンが好ましく、アセトンがより好ましい。
【０１３２】
アルコール類の貧溶媒としては、飽和のものが好ましく、炭素数１〜５の１価アルコール、炭素数２〜５の２価アルコール及び炭素数３の３価アルコールがより好ましい。
【０１３３】
具体的には、１価のアルコールとしては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール及び３−ペンタノール等を挙げることができる。２価のアルコールとしては、１、２−エタンジオール、１、２−プロパンジオール、１、３−プロパンジオール、１、２−ブタンジオール、１、３−ブタンジオール、１、４−ブタンジオール、２、３−ブタンジオール及び１、５−ペンタンジオール等を挙げることができる。３価のアルコールとしては、グリセリン等を挙げることができる。
【０１３４】
ニトリル類の貧溶媒としては、飽和のものが好ましく、炭素数２〜８、特に炭素数２〜６がより好ましく、炭素数２〜４のものがさらに好ましい。具体的には、アセトニトリル、プロピオニトリル、スクシノニトリル、ブチロニトリル及びイソブチロニトリル等を挙げることができる。
【０１３５】
エーテル類の貧溶媒としては、飽和のものが好ましく用いられる。具体的には、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール、ジオキサン及びテトラヒドロフラン等を挙げることができる。
【０１３６】
芳香族炭化水素類の貧溶媒としては、ベンゼン及びトルエン等を挙げることができ、トルエンが好ましい。
【０１３７】
第２の可溶性画分に添加する貧溶媒の添加量としては、目的とする組換えタンパク質に応じて適時決めればよいが、通常、当該タンパク質の溶解している第２の可溶性画分と同量を添加すればよい。当該タンパク質の凝集の状況及び宿主細胞由来のタンパク質の混入の存在等に応じて添加量を適宜調整すればよい。
【０１３８】
凝集させた目的とする組換えタンパク質を凝集体として回収する方法としては、遠心分離、ドラムフィルターやプレスフィルター等のフィルターろ過等、一般的な方法が挙げられる。フィルターろ過による場合、セライト、珪藻土等のろ過助剤及びプリコート剤等を併用することにより、より効率的に目的とする組換えタンパク質を凝集体として回収することができる。
【０１３９】
この方法によれば、水等の水系溶媒を添加することなく、目的とする組換えタンパク質を精製できる。したがって、凝集体として当該組換えタンパク質を回収した後に、使用した第２の非プロトン性極性溶媒を精製して、再度利用することが可能であり、経済的である。
【０１４０】
［人造ポリペプチド繊維の製造方法］
目的とする組換えタンパク質が、ポリペプチド繊維の製造を目的として生産させた構造タンパク質、例えば、スパイダーシルク、カイコシルク等由来のタンパク質の場合、工程（Ｄ）で得られた組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を、ポリペプチド繊維の製造にそのまま用いることができる。ここで、そのまま用いるとは、さらなる精製工程を必要としないことを意味する。これは、工程（Ｄ）で得られた第２の可溶性画分に含まれる精製された組換えタンパク質の純度が紡糸に用いるのに十分高いことを示している。工程（Ａ）〜（Ｄ）の後、紡糸工程を行うことにより、湿式紡糸により人造ポリペプチド繊維を製造することができる。
【０１４１】
すなわち一実施形態に係る人造ポリペプチド繊維の製造方法は、以下（Ａ）〜（Ｄ）及び（Ｆ）の工程を含むことを特徴とする：
（Ａ）目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞を、無機塩添加若しくは無添加の第１の非プロトン性極性溶媒を用いて、宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが上記組換えタンパク質が溶解しない条件で処理する工程、
（Ｂ）第１の可溶性画分を除去し、上記組換えタンパク質を含む第１の不溶性画分を回収する工程、
（Ｃ）回収した第１の不溶性画分を、無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒を用いて、上記組換えタンパク質が溶解する条件で処理する工程、
（Ｄ）第２の不溶性画分を除去し、上記組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を得る工程、
（Ｆ）第２の可溶性画分を糸状の液体として凝固液に付与し、上記組換えタンパク質を糸状に凝固させて回収することにより未延伸糸を得る工程
【０１４２】
工程（Ａ）〜（Ｄ）については、上述した通りである。工程（Ｆ）は、第２の可溶性画分を糸状の液体として凝固液に付与し、上記組換えタンパク質を糸状に凝固させて回収することにより未延伸糸を得る工程である。
【０１４３】
工程（Ｄ）で得られた組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を凝固液に付与すると、組換えタンパク質が凝固する。この際、第２の可溶性画分を糸状の液体として凝固液に付与することで、組換えタンパク質が糸状に凝固し、糸（未延伸糸）が形成できる。未延伸糸の形成は、例えば特許第５５８４９３２号に記載されている方法に準じて行うことができる。
【０１４４】
（１）ポリペプチドの溶液（ドープ液）の調製  上述したように、工程（Ｄ）で得られた組換えタンパク質が溶解した第２の可溶性画分は、さらなる精製工程を必要とせず、いわゆるドープ液として工程（Ｅ）の紡糸に用いることができる。紡糸に適した粘度は一般に１０〜１０，０００ｃＰ（センチポイズ）であり、粘度は、例えば京都電子工業社製の商品名“ＥＭＳ粘度計”を使用して測定できる。工程（Ｄ）で得られた第２の可溶性画分の粘度が、１０〜１０，０００ｃＰ（センチポイズ）の範囲内にない場合には紡糸できる粘度に第２の可溶性画分の粘度を調整してもよい。粘度の調整には、工程（Ａ）の説明において好適な溶媒として例示した非プロトン性極性溶媒を用いることができる。非プロトン性極性溶媒は工程（Ａ）の説明において例示した好適な無機塩を含んでいてもよい。
【０１４５】
ドープ液として用いるために、粘度を調整する際に非プロトン性極性溶媒に添加する無機塩の濃度は、精製を目的とした場合より高くしてもよい。例えば、無機塩を、ドープ液に対して０．５〜２．０Ｍとなるように添加してもよい。
【０１４６】
第２の可溶性画分が、実際にドープ液として工程（Ｅ）における紡糸に、そのまま用いることが可能かについては、例えば以下の簡易法により確認することができる。即ち、内径０．１ｍｍの針を持ったシリンジに当該第２の可溶性画分を適当量入れ、３００ｍＬビーカー中のメタノール（凝固液に相当）に、針の先端をつけ、押し出す。組換えタンパク質がメタノール中で糸として凝固し、ピンセットで糸としてメタノールから取り出すことができる場合には、当該第２の可溶性画分はドープ液として紡糸に用いることができる。糸が形成されない場合は、粘度及び無機塩濃度等を見直し、微調整することによりドープ液として用いることができる。
【０１４７】
（２）ポリペプチドの溶液を用いたポリペプチドの重合
上記（１）で調製したポリペプチドの溶液（ドープ液）を１００℃以上に加熱する。当該加熱によりポリペプチド同士の脱水縮合が起こり、重合する。公知の脱水縮合触媒を併用することで、重合効率を飛躍的に高めることもできる。当該重合反応を行なったドープ液は、必要に応じてエチルアルコール、メチルアルコール又は水等を加えて希釈し、湿式紡糸の作製に用いることができる。
【０１４８】
（３）湿式紡糸−延伸
（ａ）湿式紡糸
加熱後の第２の可溶性画分（ドープ液）を、糸状の流体として凝固液に付与する。湿式紡糸に使用する凝固液は、脱溶媒できる溶液であればどのようなものでもよい。溶媒を脱離し、繊維形成させるための凝固液はメタノール、エタノール、２−プロパノールなどの炭素数１〜５の低級アルコール又はアセトンを使用するのが好ましい。適宜水を加えてもよい。凝固液の温度は紡糸の安定性の観点から、５〜３０℃が好ましい。
【０１４９】
第２の可溶性画分（ドープ液）を糸状の流体として付与する方法は、特に制限されないが、例えば紡糸用の口金から脱溶媒槽の凝固液に押し出す方法があげられる。組換えタンパク質が凝固することにより未延伸糸が得られる。第２の可溶性画分を凝固液に押し出す場合の押出し速度は、口金の直径及び第２の可溶性画分の粘度等に応じて適宜設定できるが、例えば、直径０．１〜０．６ｍｍのノズルを有するシリンジポンプの場合、紡糸の安定性の観点から、押し出し速度は１ホール当たり、０．２〜６．０ｍＬ／ｈが好ましく、１ホール当たり、１．４〜４．０ｍＬ／ｈがより好ましい。凝固液を入れる脱溶媒槽（凝固液槽）の長さは特に限定されないが、例えば長さは２００〜５００ｍｍであってよい。組換えタンパク質の凝固により形成された未延伸糸の引き取り速度は例えば１〜１４ｍ／ｍｉｎ、滞留時間は例えば０．０１〜０．１５ｍｉｎであってよい。未延伸糸の引き取り速度は、脱溶媒の効率の観点から、１〜３ｍ／ｍｉｎが好ましい。組換えタンパク質の凝固により形成された未延伸糸は、さらに凝固液において延伸（前延伸）をしてもよいが、凝固液に用いる低級アルコールの蒸発を抑える観点から、凝固液を低温に維持し、未延伸糸の状態で凝固液から引き取るのが好ましい。
【０１５０】
（ｂ）延伸
本実施形態に係る人造ポリペプチド繊維の製造方法は、工程（Ｅ）で得られた未延伸糸を、さらに延伸する工程を含むこともできる。延伸は一段延伸でもよいし、２段以上の多段延伸でもよい。多段で延伸すると、分子を多段で配向させ、トータル延伸倍率も高くすることができるため、タフネスの高い繊維の製造に適している。
【０１５１】
［ポリペプチドフィルムの製造方法］
目的とする組換えタンパク質が、ポリペプチドフィルムの製造を目的として生産させた構造タンパク質、例えば、スパイダーシルク、カイコシルク等由来のタンパク質の場合、工程（Ｄ）で得られた組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を、ポリペプチドフィルムの製造にそのまま用いることができる。ここで、そのまま用いるとは、さらなる精製工程を必要としないことを意味する。これは、工程（Ｄ）で得られた第２の可溶性画分に含まれる精製された組換えタンパク質の純度がポリペプチドフィルムの形成に用いるのに十分高いことを示している。工程（Ａ）〜（Ｄ）の後、フィルム形成工程を行うことにより、ポリペプチドフィルムを製造することができる。
【０１５２】
すなわち一実施形態に係るポリペプチドフィルムの製造方法は、以下（Ａ）〜（Ｄ）及び（Ｇ）の工程を含むことを特徴とする：
（Ａ）目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内において発現している組換え細胞を、無機塩添加若しくは無添加の第１の非プロトン性極性溶媒を用いて、宿主細胞由来のタンパク質が溶解するが上記組換えタンパク質が溶解しない条件で処理する工程、
（Ｂ）第１の可溶性画分を除去し、上記組換えタンパク質を含む第１の不溶性画分を回収する工程、
（Ｃ）回収した第１の不溶性画分を、無機塩添加の第２の非プロトン性極性溶媒を用いて、上記組換えタンパク質が溶解する条件で処理する工程、
（Ｄ）第２の不溶性画分を除去し、上記組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を得る工程、
（Ｇ）第２の非プロトン性極性溶媒に耐性のある平板上に、第２の可溶性画分を用いて所定の厚さの塗膜を形成させ、上記塗膜から第２の非プロトン性極性溶媒を除去することでポリペプチドフィルムを得る工程
【０１５３】
工程（Ａ）〜（Ｄ）については、上述した通りである。工程（Ｇ）は、第２の非プロトン性極性溶媒に耐性のある平板上に、第２の可溶性画分を用いて所定の厚さの塗膜を形成させ、上記塗膜から第２の非プロトン性極性溶媒を除去することでポリペプチドフィルムを得る工程である。
【０１５４】
工程（Ｄ）で得られた目的とする組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分を用いて塗膜を形成し、第２の可溶性画分に含まれる第２の非プロトン性極性溶媒を除去すると、組換えタンパク質のポリペプチドフィルムが形成される。
【０１５５】
塗膜を形成する平板としては、ガラス板等の、第２の非プロトン性極性溶媒に耐性のある平板が用いられる。塗膜の厚さは、特に限定されないが、例えば１〜１０００μｍであってよい。
【０１５６】
所定の厚さのポリペプチドフィルムを形成する方法としては、例えばキャスト法が挙げられる。キャスト法によりポリペプチドフィルムを形成する場合には、平板に、目的とする組換えタンパク質を含む第２の可溶性画分をドクターコート、ナイフコーターなどの冶具を用いて数ミクロン以上の厚さにキャストしてキャスト膜を形成し、その後減圧乾燥又は脱溶媒槽への浸漬により溶媒を脱離することによりポリペプチドフィルムを得ることができる。
【実施例】
【０１５７】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１５８】
（１）目的とするタンパク質発現株（組換え細胞）の作製
配列番号１（ＰＲＴ４６８）、配列番号２（ＰＲＴ６４７）、配列番号３（ＰＲＴ６９９）及び配列番号４（ＰＲＴ６９８）で示されるアミノ酸配列を有するクモ糸由来の配列を有するフィブロインをコードする核酸、ＧＥＮ５１４、ＧＥＮ７４０、ＧＥＮ７９７及び、ＧＥＮ７９６をそれぞれ合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。各タンパク質のハイドロパシーインデックス及び分子量は表２に示した通りである。【０１５９】
【表２】
2018066558.tif 000004
【０１６０】
これら４種類の核酸をそれぞれクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。当該４種類の核酸をそれぞれ組換えたｐＥＴ−２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）をそれぞれ形質転換して、目的とするタンパク質を発現する形質転換大腸菌（組換え細胞）を得た。【０１６１】
（２）目的とするタンパク質の発現
上記形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表３）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。【０１６２】
【表３】
2018066558.tif 000005
【０１６３】
５００ｍＬの生産培地（表４）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように当該シード培養液を添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。【０１６４】
【表４】
2018066558.tif 000006
【０１６５】
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、酵母エキス  １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持し、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現により、目的とするタンパク質が不溶体として発現されていることを確認した。【０１６６】
［実施例１  宿主細胞由来タンパク質の溶解工程における無機塩及び温度の影響］
宿主細胞由来のタンパク質を溶解する工程における、第１の非プロトン性極性溶媒への無機塩の添加及び添加濃度並びに温度の影響について調べた。ＰＲＴ４６８発現大腸菌の乾燥菌体５０ｍｇに０、０．１、０．２５及び０．５Ｍの塩化リチウムを含むＤＭＳＯを１ｍＬ加え、４０、４５、５０、５５及び６０℃の温度で３０分間処理した。室温まで冷やした後、１１，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離を行った。遠心分離により得られた上清（第１の可溶性画分）についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。結果を図１に示す。４０〜６０までの数字は、温度を示し、０〜０．５Ｍの表記はＤＭＳＯに含まれる塩化リチウムの濃度を示す。レーンＸＬは分子量マーカータンパク質を、レーンＣは精製済みＰＲＴ４６８をポジティブコントロールとして泳動したものである。【０１６７】
図１Ａ及びＣは、全てのタンパク質を染色可能なＯｒｉｏｌｅ（商標）蛍光ゲルステイン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で、図１Ｂ及びＤはＰＲＴ４６８のＨｉｓタグ領域に反応するＩｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｓタグ付きゲル内染色試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）でそれぞれ染色したものである。【０１６８】
いずれの条件においても宿主細胞由来のタンパク質のバンドが確認され、宿主細胞由来のタンパク質が第１の非プロトン性極性溶媒に溶解し、第１の可溶性画分に含まれていることが示された。しかしながら、０．２５Ｍ〜０．５Ｍと高濃度の塩化リチウムを含むＤＭＳＯを用いたサンプルでは、目的とするタンパク質であるＰＲＴ４６８も溶解し、第１の可溶性画分に含まれていた（図１Ｄ）。宿主細胞由来のタンパク質が溶解し、且つ最もＰＲＴ４６８の溶解が少ない条件は、０．１Ｍの塩化リチウムをＤＭＳＯに添加し、４０℃で処理した条件であった。【０１６９】
［実施例２  宿主細胞由来のタンパク質の溶解工程におけるシクロヘキサノン添加の効果その１］
実施例１において、高濃度の塩化リチウムを含むＤＭＳＯを第１の非プロトン性極性溶媒として用いた場合には、宿主細胞由来のタンパク質のみならず、目的とするタンパク質であるＰＲＴ４６８の溶解も認められた。そこで、高濃度の塩化リチウムを含むＤＭＳＯへシクロヘキサノンを添加することによる、ＰＲＴ４６８の溶解防止効果を検討した。【０１７０】
ＤＭＳＯ：シクロヘキサノン＝１００：０、５０：５０、２５：７５の３種類の混合比率の溶媒を調製し、これらの溶媒に０．１又は０．５Ｍとなるように塩化リチウムを添加し、計６種類の第１の非プロトン性極性溶媒を調製した（表５参照）。【０１７１】
【表５】
2018066558.tif 000007
【０１７２】
ＰＲＴ４６８発現大腸菌の乾燥菌体５０ｍｇに表５の第１の非プロトン性極性溶媒を１ｍＬ加え、６０℃で３０分間処理した。室温まで冷やした後、１１，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離した。遠心分離により得られた沈殿に、用いた処理溶媒０．５ｍＬをそれぞれ添加し、懸濁後、再度遠心分離し、沈殿画分の洗浄を行った。得られた上清画分（第１の可溶性画分）及び沈殿画分（第１の不溶性画分）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。上清画分の結果を図２に、沈殿画分の結果を図３示す。１〜６の数字は、表５のレーンＮｏ．に対応している。レーンＸＬは分子量マーカータンパク質を、レーンＣは精製済みＰＲＴ４６８をポジティブコントロールとして泳動したものである。【０１７３】
図２Ａ及び図３Ａは、全てのタンパク質を染色可能なＯｒｉｏｌｅ（商標）蛍光ゲルステインで、図２Ｂ及び図３ＢはＰＲＴ４６８のＨｉｓタグ領域に反応するＩｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｓタグ付きゲル内染色試薬でそれぞれ染色したものである。【０１７４】
シクロヘキサノンを添加していない０．５Ｍ塩化リチウム含有ＤＭＳＯを第１の非プロトン性極性溶媒とした場合には、ポジティブコントロールと同じ位置にバンドが確認され、ＰＲＴ４６８の溶解が認められた（図２Ａ及びＢのレーン４）。一方、シクロヘキサノンを添加した０．５Ｍ塩化リチウム含有ＤＭＳＯを第１の非プロトン性極性溶媒とした場合には、ＰＲＴ４６８のバンドは確認されなかった。（図２Ａ及びＢのレーン５及び６）。【０１７５】
０．５Ｍ塩化リチウム含有ＤＭＳＯを用いた場合には、０．１Ｍ塩化リチウム含有ＤＭＳＯを用いた場合（図３Ａ及びＢのレーン１）と比較して、沈殿画分に含まれるＰＲＴ４６８の減少が認められた（図３Ａ及びＢのレーン４）。しかしながら、シクロヘキサノンを添加した場合には、沈殿画分におけるＰＲＴ４６８の含量の低下は認められなかった（図３Ａ及びＢのレーン５及び６）。ただし、ＤＭＳＯ：シクロヘキサノンが２５：７５の第１の非プロトン性極性溶媒を用いた場合には、上清画分に含まれるＰＲＴ４６８は減少するが、上清画分に含まれる宿主細胞由来のタンパク質も減少してしまうため、宿主細胞由来のタンパク質がＰＲＴ４６８とともに多量に沈殿画分に残存する結果となり（図３Ａのレーン６）、ＰＲＴ４６８の精製には適した条件ではなかった。【０１７６】
これらの結果から、目的とするタンパク質の第１の非プロトン性極性溶媒への溶解性を確認した上で、当該タンパク質に応じてシクロヘキサノンを適切な濃度で添加することにより、高濃度の塩を添加することにより宿主細胞由来のタンパク質を第１の非プロトン性極性溶媒に溶解しやすくしつつ、目的とするタンパク質の第１の非プロトン性極性溶媒への溶解は防止することが可能であることが確認できた。これにより、宿主細胞由来のタンパク質を第１の可溶性画分に、目的とするタンパク質を第１の不溶性画分に効率よく分離することができる。【０１７７】
［実施例３  宿主細胞由来のタンパク質の溶解工程における非プロトン性極性溶媒の種類の影響］
第１の非プロトン性極性溶媒にＤＭＦを用いた場合にも、宿主細胞由来のタンパク質と目的とするタンパク質を効率よく分離できるかについて検討した。ＰＲＴ４６８発現大腸菌の乾燥菌体５０ｍｇに０、０．１、０．２５及び０．５Ｍの塩化リチウムを含むＤＭＦ（第１の非プロトン性極性溶媒）を１ｍＬ加え、６０℃の温度で３０分間処理した。室温まで冷やした後、１１，０００×ｇで５分間遠心分離した。遠心分離により得られた沈殿画分に、用いた上記第１の非プロトン性極性溶媒０．５ｍＬをそれぞれ添加し、懸濁後、再度遠心分離し、沈殿画分の洗浄を行った。得られた上清画分（第１の可溶性画分）及び沈殿画分（第１の不溶性画分）についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。上清画分における結果を図４に、沈殿画分における結果を図５に示す。レーン１〜４は、ＤＭＦに含まれる塩化リチウムの濃度が０（レーン１）、０．１（レーン２）、０．２５（レーン３）及び０．５Ｍ（レーン４）である結果を示す。レーンＸＬは分子量マーカータンパク質を、レーンＣは精製済みＰＲＴ４６８をポジティブコントロールとして泳動したものである。【０１７８】
図４Ａ及び図５Ａは、全てのタンパク質を染色可能なＯｒｉｏｌｅ（商標）蛍光ゲルステインで、図４Ｂ及び図５ＢはＰＲＴ４６８のＨｉｓタグ領域に反応するＩｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｓタグ付きゲル内染色試薬でそれぞれ染色したものである。【０１７９】
塩化リチウムを添加しないＤＭＦよりも塩化リチウムを添加したＤＭＦを第１の非プロトン性極性溶媒として用いた場合の方が、上清画分に宿主細胞由来のタンパク質が多く含まれていた。特に塩化リチウムを０．２５Ｍ以上含むＤＭＦを用いた場合に効果的に宿主細胞由来のタンパク質を溶解できたことが示された（図４Ａ）。いずれの場合においても上清画分にはほとんどＰＲＴ４６８は含まれていなかった（図４Ｂ）。【０１８０】
塩化リチウムを０．２５Ｍ以上含むＤＭＦを第１の非プロトン性極性溶媒として用いた場合には、塩化リチウムを０〜０．１含むＤＭＦを用いた場合と比較して、沈殿画分に含まれるＰＲＴ４６８以外のタンパク質が顕著に少なく、効果的に宿主細胞由来のタンパク質を除去できたことが示された（図５Ａ）。また、ＰＲＴ４６８の溶解も少なく、ロスすることなく回収できたことも示された（図５Ｂ）。これにより、ＤＭＳＯと同様に、塩化リチウムの濃度を最適化することにより、ＤＭＦも宿主細胞由来のタンパク質を除去するための第１の非プロトン性極性溶媒として利用できることが確認できた。【０１８１】
［実施例４  宿主細胞由来のタンパク質の除去及び目的とするタンパク質の精製］
ＰＲＴ４６８（配列番号１：分子量５０．１、ＨＩ：−０．５９）、ＰＲＴ６４７（配列番号２：分子量５４．１、ＨＩ：０．０４）、ＰＲＴ６９９（配列番号３：分子量４８．８、ＨＩ：０．１７）及びＰＲＴ６９８（配列番号４：分子量４８．５、ＨＩ：０．４３）をそれぞれ発現する形質転換大腸菌から、当該宿主細胞由来のタンパク質を除去し、目的とする組換えタンパク質の精製を行った。【０１８２】
上記４種類の目的とするタンパク質をそれぞれ発現した形質転換大腸菌の乾燥菌体５０ｍｇに０．１Ｍの塩化リチウムを含むＤＭＳＯ（第１の非プロトン性極性溶媒）を１ｍＬ加え、４０℃の温度で３０分間処理した。室温まで冷やした後、１１，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離を行い、沈殿画分（第１の不溶性画分）と上清画分（上清Ｉ：第１の可溶性画分）に分離した。沈殿画分については０．１Ｍの塩化リチウムを含むＤＭＳＯ  ０．５ｍＬを再度添加し、懸濁し、遠心分離により沈殿画分の洗浄を行った。当該洗浄後の沈殿画分に０．５Ｍの塩化リチウムを含むＤＭＳＯ（第２の非プロトン性極性溶媒）を０．５ｍＬ加え、８０℃で３０分間処理した。室温まで放冷した後、２０，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離を行い、目的とするタンパク質を含む上清画分（上清ＩＩ：第２の可溶性画分）を回収した。上清Ｉと上清ＩＩについてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。結果を図６に示す。レーン１〜４は、それぞれタンパク質濃度が１．５μｇになるように上清Ｉ及び上清ＩＩをアプライしたものであり、ＰＲＴ４６８（レーン１）、ＰＲＴ６４７（レーン２）、ＰＲＴ６９８（レーン３）及びＰＲＴ６９９（レーン４）の結果を示す。レーンＸＬは分子量マーカータンパク質を泳動したものである。【０１８３】
図６のＡは、全てのタンパク質を染色可能なＯｒｉｏｌｅ（商標）蛍光ゲルステインで、図６のＢは、目的とするタンパク質のＮ末端に付加している配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列）のＨｉｓタグ領域に反応するＩｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｓタグ付きゲル内染色試薬でそれぞれ染色した。【０１８４】
４種類のタンパク質のいずれにおいても効率よく宿主細胞由来のタンパク質が除去されており（図６Ａ）、目的とするタンパク質を精製可能であった（図６Ｂ）。【０１８５】
［実施例５  宿主細胞由来のタンパク質の溶解工程におけるシクロヘキサノン添加の効果その２］
宿主細胞由来のタンパク質を溶解するための温度を上昇させた場合にも、ＤＭＳＯへシクロヘキサノンを添加することにより、目的とするタンパク質の溶解防止効果が得られるかについて検討した。宿主細胞由来のタンパク質の溶解工程における温度を４０℃から６０℃とし、第１の非プロトン性極性溶媒として、ＤＭＳＯと同容量のシクロヘキサノン及び０．５Ｍの塩化リチウムを含む溶媒を使用する以外は、実施例４と同じ方法で宿主細胞由来のタンパク質を溶解し、沈殿画分（第１の不溶性画分）と上清画分（上清Ｉ：第１の可溶性画分）に分離した。さらに、実施例４と同じ方法で沈殿画分の洗浄を行い、続けて目的とするタンパク質を溶解し、目的とするタンパク質を含む上清画分（上清ＩＩ：第２の可溶性画分）を得た。結果を図７に示す。レーン１〜４は、それぞれタンパク質濃度が１．５μｇになるように上清Ｉ又は上清ＩＩをアプライしたものであり、ＰＲＴ４６８（レーン１）、ＰＲＴ６４７（レーン２）、ＰＲＴ６９８（レーン３）及びＰＲＴ６９９（レーン４）の結果を示す。レーンＸＬは分子量マーカータンパク質を泳動したものである。【０１８６】
宿主細胞由来のタンパク質を溶解するための温度を４０℃から６０℃に高めても、シクロヘキサノン添加により、目的とする４種類のタンパク質の溶解を抑えることができ、宿主細胞由来のタンパク質を効率よく除去できた（図７Ａ及びＢの上清Ｉ）。また、実施例４の結果と比較して目的とするタンパク質以外のバンドが少ない又は薄いことから、目的とするタンパク質が実施例４よりも高純度で精製できたことが示された（図７Ａの上清ＩＩ）。【０１８７】
［実施例６  貧溶媒を用いた精製の効果その１］
目的とするタンパク質を含む第２の可溶性画分を得た後、さらに貧溶媒を用いて精製した場合におけるその精製の効果を検討した。ＰＲＴ４６８を発現する形質転換大腸菌の乾燥菌体１０ｇに０．１Ｍの塩化リチウムを含むＤＭＳＯ（第１の非プロトン性極性溶媒）を２００ｍＬ加え、４０℃の温度で１時間処理した。処理した溶液にろ過助剤ラヂオライト＃９００を２ｇ加え、攪拌後、Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＤＰ−７（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）をセットしたブフナーロートを用いて減圧ろ過し、ろ液I（第１の可溶性画分）を得た。０．１Ｍ塩化リチウムを含むＤＭＳＯ  ４０ｍＬでろ別された残渣（第１の不溶性画分）を洗浄した。当該洗浄残渣に０．５Ｍの塩化リチウムを含むＤＭＳＯ（第２の非プロトン性極性溶媒）を２００ｍＬ加え、８０℃の温度で１時間処理し、ＰＲＴ４６８を溶解した。室温まで放冷した後、上記と同条件で減圧ろ過し、ＰＲＴ４６８を含むろ液ＩＩ（第２の可溶性画分）を得た。このろ液ＩＩを貧溶媒を用いて以下のようにさらに精製した。【０１８８】
１１３ｍＬのろ液ＩＩに当量の酢酸エチル（貧溶媒）を加え、ＰＲＴ４６８を凝集させた。１１，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離を行い、上清分画（遠心分離後の上清）と沈殿画分（凝集体）に分離した。沈殿画分を回収し、ＲＯ水２００ｍＬで３回洗浄した後、凍結乾燥し、２．５ｇの粉末（精製粉末）を取得した。それぞれの工程における精製状況をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。結果を図８に示す。レーン１は最終的に得られた精製粉末、レーン２はろ液Ｉ、レーン３はろ液ＩＩ、レーン４は遠心分離後の上清を、それぞれタンパク質濃度が１．５μｇになるようにアプライしたものである。レーンＸＬは分子量マーカータンパク質、レーンＣは精製済みＰＲＴ４６８をポジティブコントロールを泳動したものである。【０１８９】
宿主細胞由来のタンパク質を溶解した後のろ液Ｉには、宿主細胞由来のタンパク質が多量に溶解しており、効率よく当該タンパク質を含むろ別された残渣から分離できたことが確認された（図８Ａのレーン２）。また、酢酸エチル添加による精製を行う前のろ液ＩＩと、精製を行った後の精製粉末におけるＰＲＴ４６８量に差が見られないことから、酢酸エチル添加による精製によって、目的とするタンパク質ＰＲＴ４６８を、ほぼロスすることなく効果的に精製できたことが確認された（図８Ｂのレーン１及び３）。【０１９０】
［実施例７  貧溶媒を用いた精製の効果その２］
ＰＲＴ４６８（配列番号１）、ＰＲＴ６４７（配列番号２）、ＰＲＴ６９９（配列番号３）及びＰＲＴ６９８（配列番号４）をそれぞれ発現する形質転換大腸菌から目的とするタンパク質を精製する方法における、宿主細胞由来タンパク質の溶解条件と貧溶媒を用いた精製の組み合わせの効果について検討した。【０１９１】
上記４種類の目的とするタンパク質をそれぞれ発現した形質転換大腸菌を用いて、上記実施例４（４０℃）と同様の方法又は実施例５（６０℃−シクロヘキサノン添加）と同様の方法で宿主細胞由来のタンパク質の溶解処理を行った。その後、実施例４と同様に、遠心分離により得られた沈殿画分（第１の不溶性画分）に、０．１Ｍの塩化リチウムを含むＤＭＳＯ  ０．５ｍＬを添加し、懸濁して、遠心分離することにより沈殿画分の洗浄を行った。洗浄後の沈殿画分に０．５Ｍの塩化リチウムを含むＤＭＳＯ（第２の非プロトン性極性溶媒）を０．５ｍＬ加え、８０℃で３０分間処理し、目的とする４種類のタンパク質を溶解させた。室温まで放冷した後、２０，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離を行い、目的とするタンパク質を含む上清画分（第２の可溶性画分）を取得した。【０１９２】
当該上清画分３００μＬにイソプロパノール（貧溶媒）６００μＬを加え、３０分間転倒混和し、目的とするタンパク質を凝集させた。１１，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離を行い、上清画分（上清Ｉ）と沈殿画分（凝集体）に分離した。沈殿画分にＲＯ水１ｍＬを加え、洗浄した。１１，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離を行い、上清画分（上清ＩＩ）を除去した後、沈殿画分を凍結乾燥した。乾燥させた沈殿画分に０．５Ｍの塩化リチウムを含むＤＭＳＯを５００μＬ加え、８０℃の温度で３０分間処理し、目的とする４種類の精製タンパク質を含む溶液（精製タンパク質溶液）を得た。【０１９３】
目的とする４種類の精製タンパク質溶液、上清Ｉ及び上清ＩＩをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図９Ａ及びＢは、宿主細胞由来のタンパク質の溶解処理を実施例４（４０℃）と同様に行った結果、図９Ｃ及びＤは、宿主細胞由来のタンパク質の溶解処理を実施例５（６０℃−シクロヘキサノン添加）と同様に行った結果を示す。レーン１〜４は、それぞれタンパク質濃度が１．５μｇになるように精製タンパク質溶液、上清Ｉ又は上清ＩＩをアプライしたものであり、ＰＲＴ４６８（レーン１）、ＰＲＴ６４７（レーン２）、ＰＲＴ６９８（レーン３）及びＰＲＴ６９９（レーン４）の結果を示す。【０１９４】
図９のＡ及びＣは、全てのタンパク質を染色可能なＯｒｉｏｌｅ（商標）蛍光ゲルステインで、図９のＢ及びＤは、目的とするタンパク質のＮ末端に付加している配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列）のＨｉｓタグ領域に反応するＩｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｓタグ付きゲル内染色試薬でそれぞれ染色した。【０１９５】
４０℃の温度条件での宿主細胞由来のタンパク質の溶解及び貧溶媒イソプロパノールの添加による凝集化を組み合わせた場合と比較して、６０℃−シクロヘキサノン添加条件での宿主細胞由来のタンパク質の溶解及び貧溶媒イソプロパノールの添加による凝集化を組み合わせた場合の方が、いずれの目的とするタンパク質においても、精製後のタンパク質において目的とするタンパク質以外のバンドが減少しており、さらなる純度の向上が認められた（図９Ａ及びＣ「精製タンパク質」）。一方、精製ロスは４０℃の温度条件での処理と、６０℃−シクロヘキサノン添加条件とではほぼ同等であった（図９Ｂ及びＤ）。【０１９６】
［実施例８  第２可溶性画分のドープ液としての利用］
本精製方法により得られた精製タンパク質溶液を用いて紡糸が可能であるか検討した。【０１９７】
実施例２に記載した方法に準じて、以下のように宿主細胞由来タンパク質を除去した。ＰＲＴ４６８を発現した大腸菌の乾燥菌体１０ｇに、ＤＭＳＯ：シクロヘキサノン＝１：１の比率で混合した溶媒に０．５Ｍとなるように塩化リチウムを添加した第１の非プロトン性極性溶媒を２００ｍＬ加え、６０℃の温度で３０分間処理した。続けて１１，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離を行った。上清画分（第１の可溶性画分）を除去し、沈殿画分（第１の不溶性画分）を上記第１の非プロトン性極性溶媒１００ｍＬで洗浄した。【０１９８】
湿潤状態の沈殿画分５００ｍｇに、１．０Ｍの塩化リチウムを含むＤＭＳＯ（第２の非プロトン性極性溶媒）を５００μＬ加え、８０℃の温度で３０分間処理し、目的とするタンパク質を溶解した。室温まで放冷した後、２０，０００×ｇ、６０分間の条件で遠心分離を行い、沈殿画分（第２の不溶性画分）を除去し、ＰＲＴ４６８を含む上清画分（第２の可溶性画分）を精製タンパク質溶液として得た。当該精製タンパク質溶液が紡糸用のドープ液として利用可能か以下の方法で確認した。【０１９９】
上記のＰＲＴ４６８を含む精製タンパク質溶液８０μＬを内径０．１ｍｍの針を持ったシリンジに入れた。当該シリンジの針の先端を、３００ｍＬビーカー中のメタノール（凝固液）につけ、上記精製タンパク質溶液を押し出し、凝固液中に糸状のものが形成されることを確認した（図１０Ａ）。形成された糸状のものを凝固液からピンセットで取り出し、自然乾燥した（図１０Ａ及びＢ）。【０２００】
以上の結果、本精製方法により得られた精製タンパク質溶液は、さらなる精製工程を要することなく、そのまま紡糸用のドープ液として利用できる程、目的とするタンパク質の純度が高いことが確認できた。即ち、従来の組換えタンパク質を用いた紡糸用のドープ液の調製工程（凝集、洗浄、乾燥及び再溶解等）と比較し、極めて少ない工程で紡糸用のドープ液を調製できることがわかった。【０２０１】
［実施例９  本精製方法によるゲル化解消効果］
国際公開第２０１４／１０３８４７号に記載の方法（以下、従来方法と呼ぶ）は、ＤＭＳＯ等の非プロトン性極性溶媒に目的とするタンパク質を溶解し、水等の溶媒を加え不純物を除去し、精製する方法である。この従来方法は、優れた方法であるものの、目的とするタンパク質はハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質に限定され、タンパク質によってはゲル化する虞があった。【０２０２】
この従来方法でゲル化の起こるタンパク質（ＰＲＴ４６８（配列番号１）、ＨＩ：−０．５９）について、従来方法と本精製方法により精製を行い、比較した。【０２０３】
（従来方法）
従来方法に従って、ＰＲＴ４６８を発現した大腸菌の乾燥菌体５０ｍｇに０．５Ｍの塩化リチウムを含むＤＭＳＯ５００μＬを加え、８０℃の温度で３０分間加熱し、ＰＲＴ４６８を溶解した。室温まで放冷した後、ＲＯ水５００μＬを加えて攪拌した。当該溶液の一部をエッペンドルフチューブに分画し、分画直後、１時間後、３時間後及び２４時間後に逆さにし、ゲル化の状況を観察した。結果を図１１（左「従来」）に示す。従来方法においては、精製ＰＲＴ４６８は１時間後にはゲル化していた。ゲル化前のＰＲＴ４６８含有溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を、図１２のレーン１に示す。レーンＸＬは分子量マーカータンパク質を泳動したものである。【０２０４】
（本精製方法）
実施例２に記載した方法に準じて、以下のように宿主細胞由来タンパク質を除去した。ＰＲＴ４６８を発現した形質転換大腸菌の乾燥菌体５０ｍｇに、ＤＭＳＯ：シクロヘキサノン＝１：１の比率で混合した溶媒に０．５Ｍとなるように塩化リチウムを添加した第１の非プロトン性極性溶媒を１ｍＬ加え、６０℃の温度で３０分間処理した。１１，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離を行った。上清画分（第１の可溶性画分）を除去し、沈殿画分（第１の不溶性画分）を６０℃の上記第１の非プロトン性極性溶媒で洗浄した。【０２０５】
洗浄した沈殿画分に０．５Ｍ塩化リチウムを含むＤＭＳＯ溶媒（第２の非プロトン性極性溶媒）５００μＬを添加し、８０℃で３０分間処理し、ＰＲＴ４６８を溶解した。当該溶液の一部をエッペンドルフチューブに分画し、分画直後、１時間後、３時間後及び２４時間後に逆さにし、ゲル化の状況を観察した。結果を図１１（右「本実施例」）に示す。本精製方法によれば２４時間後であってもゲル化は起こらなかった。【０２０６】
上記溶液を１１，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離し、沈殿画分（第２の不溶性画分）を除去した。上清画分（第２の水溶性画分）３５０μＬにイソプロパノール（貧溶媒）７００μＬを加え、１時間転倒混和し、ＰＲＴ４６８を凝集させた。１１，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離を行い、沈殿画分（凝集体）をＲＯ水で洗浄した。洗浄した凝集体を凍結乾燥し、得られた粉体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。結果を図１２のレーン２に示す。【０２０７】
本精製方法と従来方法は、ともに非プロトン性極性溶媒を用いるという点で共通する。しかしながら、本精製方法によれば、従来方法ではゲル化が生じてしまう組換えタンパク質であっても、ゲル化を生じることなく、従来方法とほぼ同等の純度で取得することができることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018066558.tif 000021
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