(57)【要約】本発明は、培養液中に含まれる微生物により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、微生物がＯｇａｔａｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属及びＣａｎｄｉｄａ属からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、培養液がアニオン界面活性剤（Ａ１）、カチオン界面活性剤（Ａ２）、及び両性界面活性剤（Ａ３）からなる群から選ばれる１種以上の界面活性剤（Ａ）を含有する有用物質の生産方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液中に含まれる微生物により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、微生物がＯｇａｔａｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属及びＣａｎｄｉｄａ属からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、培養液がアニオン界面活性剤（Ａ１）、カチオン界面活性剤（Ａ２）、及び両性界面活性剤（Ａ３）からなる群から選ばれる１種以上の界面活性剤（Ａ）を含有する有用物質の生産方法。
【請求項２】
培養液中の界面活性剤（Ａ）の含有量が、培養液の重量に基づいて、０．０００１〜２０重量％である請求項１に記載の有用物質の生産方法。
【請求項３】
有用物質がタンパク質である請求項１又は２に記載の有用物質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用物質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、アミノ酸やタンパク質等の有用物質を生産するために広く利用されている。特に近年は、医薬上・産業上有用なタンパク質の遺伝子を酵母に導入することで形質転換した酵母によってタンパク質を効率的に生産する技術が知られるようになっている。【０００３】
有用物質生産に用いる細菌として大腸菌を用いる場合は、大腸菌体内には糖鎖合成酵素が存在しないため、糖の付いていないタンパク質の生産に限定される。一方で、有用物質生産に酵母を用いると、酵母が発現するタンパク質は糖鎖合成酵素によって糖鎖付加などの翻訳後修飾を受けた後に菌体外へ分泌されるため、糖の付いたタンパク質生産が可能である。【０００４】
しかし、酵母によるタンパク質生産方法では、大腸菌と比較し、タンパク質生産能力が低いという課題があった。その課題を解決するために、酵母の細胞壁を薄くすることを目的として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのＰＭＲ１遺伝子破壊株を用いることで、タンパク質分泌量を増加させる技術が報告された（非特許文献１）。しかし、この方法でも、タンパク質の生産能力が依然として低いという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９８ ｖｏｌ．１８０ ｎｏ．２４ ６７３６−６７４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は微生物により有用物質を効率よく分泌生産することができる有用物質の生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、これらの問題点を解決するべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。
すなわち本発明は、培養液中に含まれる微生物により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、微生物がＯｇａｔａｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属及びＣａｎｄｉｄａ属からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、培養液がアニオン界面活性剤（Ａ１）、カチオン界面活性剤（Ａ２）、及び両性界面活性剤（Ａ３）からなる群から選ばれる１種以上の界面活性剤（Ａ）を含有する有用物質の生産方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の有用物質の生産方法は、微生物により有用物質を効率よく分泌生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の有用物質の生産方法は、培養液中に含まれる微生物により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、微生物がＯｇａｔａｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属及びＣａｎｄｉｄａ属からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、培養液がアニオン界面活性剤（Ａ１）、カチオン界面活性剤（Ａ２）、及び両性界面活性剤（Ａ３）からなる群から選ばれる１種以上の界面活性剤（Ａ）を含有する、有用物質の生産方法である。
【００１０】
本発明の生産方法に用いる培養液としては、当技術分野で一般的に用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができ、炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００１１】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。
【００１２】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸あるいは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー等が挙げられる。
【００１３】
その他の必須栄養素としては、無機塩類が挙げられ、無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００１４】
本発明における微生物は、有用物質生産の観点から、Ｏｇａｔａｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属及びＣａｎｄｉｄａ属からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、最も好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属及びＣａｎｄｉｄａ属からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
【００１５】
本発明において、培養液中にはアニオン界面活性剤（Ａ１）、カチオン界面活性剤（Ａ２）、及び両性界面活性剤（Ａ３）からなる群から選ばれる１種以上の界面活性剤（Ａ）を含有する。
アニオン界面活性剤（Ａ１）、カチオン界面活性剤（Ａ２）、及び両性界面活性剤（Ａ３）は、ノニオン性の界面活性剤とは異なり、イオン性の界面活性剤であるといえる。
すなわち、本発明における界面活性剤（Ａ）はイオン性の界面活性剤である。
【００１６】
これらの界面活性剤（Ａ）としては、有用物質の分泌効率の観点から、界面活性剤（Ａ）中のイオン性基の水中でのｐＫａが１〜５及び／又は８〜１４であることが好ましく、さらに好ましくは１〜４及び／又は９〜１４である。イオン性基の水中でのｐＫａは２５℃で定めた値である。
ｐＫａが１〜５のイオン性基として具体的には、カルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、硫酸基（−ＯＳＯ３Ｈ）、スルホ基（−ＳＯ３Ｈ）、スルフィノ基（−ＳＯ２Ｈ）、スルフェノ基（−ＳＯＨ）、リン酸基｛−ＯＰ（＝Ｏ）（−ＯＨ）２｝等の酸性基及びその塩の基が挙げられる。
ｐＫａが８〜１４のイオン性基として具体的には、第４級アンモニオ基、第１級〜第３級アミノ基等及びその塩の基が挙げられる。
（Ａ）がイオン性基を複数有する場合は、（Ａ）中のイオン性基のうち、有用物質の分泌効率の観点から、いずれか１つのｐＫａが上記範囲であることが好ましく、さらに好ましくはすべてのイオン性基のｐＫａが上記範囲であることである。
【００１７】
アニオン界面活性剤（Ａ１）としては、エーテルカルボン酸（Ａ１１）及びその塩、硫酸エステル（Ａ１２）又はその塩、エーテル硫酸エステル（Ａ１３）及びその塩、スルホン酸塩（Ａ１４）、スルホコハク酸塩（Ａ１５）、リン酸エステル（Ａ１６）及びその塩、エーテルリン酸エステル（Ａ１７）及びその塩、脂肪酸塩（Ａ１８）、アシル化アミノ酸塩並びに天然由来のカルボン酸及びその塩（ケノデオキシコール酸及びコール酸及びデオキシコール酸等）等が挙げられる。
【００１８】
エーテルカルボン酸（Ａ１１）及びその塩としては炭化水素基（炭素数８〜２４）を有するエーテルカルボン酸及びその塩が含まれる。
エーテルとしては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、アルキレンオキサイド付加物が好ましく、さらに好ましくはエチレンオキサイド及びプロピレンオキサイドの１種又は２種の付加物であり、特に好ましくはエチレンオキサイド付加物である。
アルキレンオキサイドの重合度としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、１〜１０が好ましい。
エーテルカルボン酸（Ａ１１）及びその塩として具体的には、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム塩、ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム塩、ポリオキシエチレンオクチルエーテル酢酸ナトリウム塩及びラウリルグリコール酢酸ナトリウム塩等が挙げられる。
【００１９】
硫酸エステル（Ａ１２）及びその塩としては、炭化水素基（炭素数８〜２４）を有する硫酸エステル及びその塩が含まれる。硫酸エステル（Ａ１２）及びその塩として具体的には、ラウリル硫酸ナトリウム塩及びラウリル硫酸トリエタノールアミン塩等が挙げられる。
【００２０】
エーテル硫酸エステル（Ａ１３）及びその塩としては、炭化水素基（炭素数８〜２４）を有するエーテル硫酸エステル及びその塩が含まれる。
エーテルとしては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、アルキレンオキサイド付加物が好ましく、さらに好ましくはエチレンオキサイド及びプロピレンオキサイドの１種又は２種の付加物であり、特に好ましくはエチレンオキサイド付加物である。
アルキレンオキサイドの重合度としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、１〜１０が好ましい。
エーテル硫酸エステル（Ａ１３）及びその塩として具体的には、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩及びポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン塩等が挙げられる。
【００２１】
スルホン酸塩（Ａ１４）としては、ドデシルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩及びナフタレンスルホン酸ナトリウム塩等が挙げられる。
【００２２】
スルホコハク酸塩（Ａ１５）としては、ポリオキシエチレンラウリルスルホコハク酸二ナトリウム塩、スルホコハク酸ラウリル二ナトリウム塩及びスルホコハク酸ポリオキシエチレンラウロイルエタノールアミド二ナトリウム塩等が挙げられる。
【００２３】
リン酸エステル（Ａ１６）及びその塩としては、オクチルリン酸二ナトリウム塩及びラウリルリン酸二ナトリウム塩等が挙げられる。
【００２４】
エーテルリン酸エステル（Ａ１７）及びその塩としては、ポリオキシエチレンオクチルエーテルリン酸二ナトリウム塩及びポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸二ナトリウム塩等が挙げられる。
【００２５】
脂肪酸塩（Ａ１８）としては、オクチル酸ナトリウム塩、ラウリル酸ナトリウム塩及びステアリン酸ナトリウム塩等が挙げられる。
【００２６】
アニオン界面活性剤（Ａ１）としては、下記一般式（１）で表される化合物が好ましい。
【００２７】
【化１】
2018159655.tif 000002
【００２８】
一般式（１）中、Ｒ１は炭素数１〜３０の一価の炭化水素基を表し、（ＯＡ）はオキシアルキレン基（例えば、オキシエチレン、オキシプロピレン及びオキシブチレン等）を表し、ｓは１以上の整数であり、Ｑはスルホン酸（塩）基、カルボン酸（塩）基又はリン酸（塩）基を表す。
なお、スルホン酸（塩）は、スルホン酸及び／又はスルホン酸塩を意味し、カルボン酸（塩）は、カルボン酸及び／又はカルボン酸塩を意味し、リン酸（塩）は、リン酸及び/又はリン酸塩を意味する。塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩及びカリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩及びマグネシウム塩等）及びオニウムカチオン塩（アンモニウムカチオン、第４級アンモニウムカチオン、第３級スルホニウムカチオン、第４級ホスホニウムカチオン及び第３級オキソニウムカチオン等）等を含む。
【００２９】
一般式（１）においてＲ１は、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、炭素数８〜２２の一価の炭化水素基であることが好ましく、さらに好ましくは炭素数１０〜１８の１価の炭化水素基である。
炭化水素基としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくは０〜３個の不飽和結合を有する直鎖及び／又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、特に好ましくはアルキル基及び不飽和結合を１〜３個有するアルケニル基である。
オキシアルキレン基としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、オキシエチレン基が好ましい。
ｓは、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、１〜１０の整数が好ましく、さらに好ましくは１〜５の整数である。
【００３０】
一般式（１）で表されるものとしては、ポリオキシエチレン（平均２．５モル付加物）ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（平均３モル付加物）ラウリルエーテル酢酸ナトリウム等が挙げられる。
【００３１】
カチオン界面活性剤（Ａ２）としては、アミン塩型カチオン界面活性剤（Ａ２１）及び第４級アンモニウム塩型カチオン界面活性剤（Ａ２２）等が含まれる。
【００３２】
アミン塩型カチオン界面活性剤（Ａ２１）としては、１〜３級アミンを無機酸（塩酸、硝酸、硫酸、ヨウ化水素酸など）または有機酸（酢酸、ギ酸、蓚酸、乳酸、グルコン酸、アジピン酸、アルキル燐酸など）で中和したものが含まれる。例えば、第１級アミン塩型のものとしては、脂肪族高級アミン（ラウリルアミン、ステアリルアミン、セチルアミン、硬化牛脂アミン、ロジンアミンなどの高級アミン）の無機酸塩または有機酸塩；低級アミン類の高級脂肪酸（ステアリン酸、オレイン酸など）塩などが挙げられる。第２級アミン塩型のものとしては、例えば脂肪族アミンのエチレンオキサイド付加物などの無機酸塩または有機酸塩が挙げられる。また、第３級アミン塩型のものとしては、例えば、脂肪族アミン（トリエチルアミン、エチルジメチルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンなど）、脂肪族アミンのエチレンオキサイド（２モル以上）付加物、脂環式アミン（Ｎ−メチルピロリジン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルヘキサメチレンイミン、Ｎ−メチルモルホリン、１，８−ジアザビシクロ（５，４，０）−７−ウンデセンなど）、含窒素ヘテロ環芳香族アミン（４−ジメチルアミノピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール、４，４’−ジピリジルなど）の無機酸塩または有機酸塩；トリエタノールアミンモノステアレート、ステアラミドエチルジエチルメチルエタノールアミンなどの３級アミン類の無機酸塩または有機酸塩などが挙げられる。
【００３３】
第４級アンモニウム塩型カチオン界面活性剤（Ａ２２）としては、３級アミン類と４級化剤（メチルクロライド、メチルブロマイド、エチルクロライド、ベンジルクロライド、ジメチル硫酸などのアルキル化剤；エチレンオキサイド等）との反応で得られるものが含まれる。例えば、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、ジオクチルジメチルアンモニウムブロマイド、ステアリルトリメチルアンモニウムブロマイド、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド（塩化ベンザルコニウム）、セチルピリジニウムクロライド、ポリオキシエチレントリメチルアンモニウムクロライド、ステアラミドエチルジエチルメチルアンモニウムメトサルフェート等が挙げられる。
【００３４】
第４級アンモニウム塩型カチオン界面活性剤（Ａ２２）としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、下記一般式（２）で表される化合物が好ましい。
【００３５】
【化２】
2018159655.tif 000003
一般式（２）中、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5はそれぞれ炭素数１〜３０の一価の炭化水素基を表し、Ｚ−はカウンターアニオンを表す。
一般式（２）において、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうち少なくとも１つは炭素数８〜２２の一価の炭化水素基であることが好ましく、さらに好ましくはＲ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうち少なくとも１つは炭素数１０〜１８の一価の炭化水素基である。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５において、炭化水素基としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくは０〜３個の不飽和結合を有する直鎖及び／又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、特に好ましくはアルキル基及び不飽和結合を１〜３個有するアルケニル基である。
また、Ｚ−としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、ハロゲンイオンが好ましく、さらに好ましくは塩化物イオンである。
また、一般式（２）において、炭化水素基は、炭化水素基のいずれかの位置に、水酸基、エーテル基、カルボニル基及びエステル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基を有していてもよい。
【００３６】
両性界面活性剤（Ａ３）としては、カルボン酸塩型両性界面活性剤（Ａ３１）、硫酸エステル塩型両性界面活性剤（Ａ３２）、スルホン酸塩型両性界面活性剤（Ａ３３）及びリン酸エステル塩型両性界面活性剤（Ａ３４）等が含まれる。
【００３７】
カルボン酸塩型両性界面活性剤（Ａ３１）としては、アミノ酸型両性界面活性剤（Ａ３１１）、ベタイン型両性界面活性剤（Ａ３１２）及びイミダゾリン型両性界面活性剤（Ａ３１３）等が挙げられる。
【００３８】
アミノ酸型両性界面活性剤（Ａ３１１）としては、分子内にアミノ基とカルボキシル基を有する両性界面活性剤であり、下記一般式（３）で示される化合物等が挙げられる。
【００３９】
【化３】
2018159655.tif 000004
一般式（３）中、Ｒ６は炭素数１〜３０の一価の炭化水素基である。ｎは１以上の整数である。ｍは１以上の整数である。Ｍはプロトン、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム（アミン及びアルカノールアミン等由来のカチオンを含む）及び第４級アンモニウム等の１価又は２価のカチオンである。
Ｒ６において、炭化水素基の炭素数は、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、８〜２２が好ましく、さらに好ましくは１０〜１８である。
Ｒ６において、炭化水素基としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくは０〜３個の不飽和結合を有する直鎖又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、特に好ましくはアルキル基及び不飽和結合を１〜３個有するアルケニル基である。
また、アミノ酸型両性界面活性剤（Ａ３１１）として具体的には、アルキルアミノプロピオン酸型両性界面活性剤（ドデシル−β−アミノプロピオン酸ナトリウム、コカミノプロピオン酸ナトリウム、ステアリルアミノプロピオン酸ナトリウム及びラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等）；アルキルアミノ酢酸型両性界面活性剤（ラウリルアミノ酢酸ナトリウム等）及びＮ−ラウロイル−Ｎ’−カルボキシメチル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が挙げられる。
【００４０】
ベタイン型両性界面活性剤（Ａ３１２）は、分子内に第４級アンモニウム塩型のカチオン部分とカルボン酸型のアニオン部分を持っている両性界面活性剤である。ベタイン型両性界面活性剤（Ａ３１２）は下記一般式（４）で示される化合物が挙げられる。
【００４１】
【化４】
2018159655.tif 000005
【００４２】
一般式（４）中、Ｒ７は炭素数１〜３０の一価の炭化水素基である。Ｒ７において、炭化水素基の炭素数は、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、８〜２２が好ましく、さらに好ましくは１０〜１８である。
Ｒ７において、炭化水素基としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくは０〜３個の不飽和結合を有する直鎖及び／又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、特に好ましくはアルキル基及び不飽和結合を１〜３個有するアルケニル基である。
【００４３】
ベタイン型両性界面活性剤（Ａ３１２）として具体的には、アルキルジメチルベタイン（ステアリルジメチルアミノ酢酸ベタイン及びラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン等）、アミドベタイン｛ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン等（ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン等）及びラウリン酸アミドプロピルベタイン等｝及びアルキルジヒドロキシアルキルベタイン（ラウリルジヒドロキシエチルベタイン等）、硬化ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン等が挙げられる。
【００４４】
イミダゾリン型両性界面活性剤（Ａ３１３）としては、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等が挙げられる。
【００４５】
その他の両性界面活性剤としては、ナトリウムラウロイルグリシン、ナトリウムラウリルジアミノエチルグリシン、ラウリルジアミノエチルグリシン塩酸塩及びジオクチルジアミノエチルグリシン塩酸塩等のグリシン型両性界面活性剤；ペンタデシルスルホタウリン等のスルホベタイン型両性界面活性剤；コールアミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、コールアミドプロピルジメチルアンモニオ２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）；ラウリルジメチルアミンオキサイド等のアルキルアミンオキサイド型両性界面活性剤等が含まれる。
【００４６】
両性界面活性剤（Ａ３）としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、下記一般式（５）〜（７）で表される化合物が好ましい。
【００４７】
【化５】
2018159655.tif 000006
【化６】
2018159655.tif 000007
【化７】
2018159655.tif 000008
【００４８】
一般式（５）中、Ｒ８、Ｒ９及びＲ1０はそれぞれ炭素数１〜３０の一価の炭化水素基を表し、ｐは１以上の整数であり、Ｘはスルホネートアニオン、カルボキシレートアニオン又はホスホネートアニオンを表す。
一般式（６）中、Ｒ１１及びＲ１２はそれぞれ炭素数１〜３０の一価の炭化水素基を表し、ｑは１以上の整数であり、Ｙはスルホン酸（塩）基、カルボン酸（塩）基又はリン酸（塩）基を表す。
一般式（７）中、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６はそれぞれ炭素数１〜３０の一価の炭化水素基を表し、ｒは１以上の整数である。
【００４９】
なお、スルホン酸（塩）は、スルホン酸及び／又はスルホン酸塩を意味し、カルボン酸（塩）は、カルボン酸及び／又はカルボン酸塩を意味し、リン酸（塩）は、リン酸及び/又はリン酸塩を意味する。塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩及びカリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩及びマグネシウム塩等）及びオニウムカチオン塩（アンモニウムカチオン、第４級アンモニウムカチオン、第３級スルホニウムカチオン、第４級ホスホニウムカチオン及び第３級オキソニウムカチオン等）等を含む。
【００５０】
また、一般式（５）〜（７）において、炭化水素基は、炭化水素基のいずれかの位置に、水酸基、エーテル基、カルボニル基及びエステル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基を有していてもよい。
【００５１】
一般式（５）において、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、Ｒ８、Ｒ９及びＲ1０のうち少なくとも１つは炭素数８〜２２の一価の炭化水素基であることが好ましく、さらに好ましくはＲ８、Ｒ９及びＲ1０のうち少なくとも１つは炭素数１０〜１８の１価の炭化水素基である。
Ｒ８、Ｒ９及びＲ1０において、炭化水素基としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくは０〜３個の不飽和結合を有する直鎖及び／又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、特に好ましくはアルキル基及び不飽和結合を１〜３個有するアルケニル基である。
また、ｐは、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、１〜１０の整数であることが好ましく、さらに好ましくは１〜５の整数である。
【００５２】
一般式（６）において、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、Ｒ１１及びＲ１２のうち少なくとも１つは炭素数８〜２２の一価の炭化水素基であることが好ましく、さらに好ましくはＲ１１及びＲ１２のうち少なくとも１つは炭素数１０〜１８の一価の炭化水素基である。
Ｒ１１及びＲ１２において、炭化水素基としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくは０〜３個の不飽和結合を有する直鎖及び／又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、特に好ましくはアルキル基及び不飽和結合を１〜３個有するアルケニル基である。
ｑは、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、１〜１０の整数であることが好ましく、さらに好ましくは１〜５の整数である。
塩としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、アルカリ金属塩が好ましく、さらに好ましくはナトリウム塩である。
【００５３】
一般式（７）において、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６のうち少なくとも１つは炭素数８〜２０の一価の炭化水素基であることが好ましく、さらに好ましくはＲ１３、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６のうち少なくとも１つは炭素数１０〜１８の一価の炭化水素基である。
Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６において、炭化水素基としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくは０〜３個の不飽和結合を有する直鎖及び／又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、特に好ましくはアルキル基及び不飽和結合を１〜３個有するアルケニル基である。
また、ｒは、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、１〜１０の整数であることが好ましく、さらに好ましくは１〜５の整数である。
【００５４】
一般式（５）で表される化合物として具体的には、Ｘがスルホネートアニオンであるもの｛ドデシルジメチル（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド、３−［テトラデシルジメチルアンモニオ］プロパン−１−スルホナート及びアラキジルジメチル（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド等｝、Ｘがカルボキシレートアニオンであるもの｛ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン及びステアリルジメチルアミノ酢酸ベタイン等｝、Ｘがホスホネートアニオンであるもの｛ドデシルジメチル（３−ホスホプロピル）アンモニウムヒドロキシド｝等が挙げられる。
【００５５】
一般式（６）で表される化合物として具体的には、Ｙがスルホン酸（塩）であるもの｛（２−ドデシルアミノ）エタンスルホン酸ナトリウム、２−［（１−オキソドデシル）アミノ］エタンスルホン酸ナトリウム及び２−（Ｎ−メチル−Ｎ−パルミトイルアミノ）エタンスルホン酸ナトリウム等｝、Ｙがカルボン酸（塩）であるもの｛３−（ドデシルアミノ）プロパン酸ナトリウム及びドデシル−β−アミノプロピオン酸ナトリウム等｝、Ｙがリン酸（塩）であるもの｛（２−ドデシルアミノ）エタンリン酸ナトリウム｝等が挙げられる。
【００５６】
一般式（７）で表される化合物として具体的には、ミルテホシン、ドデシルホスホリルコリン、ヘキサデシルホスホリルコリン、１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン等が挙げられる。
【００５７】
界面活性剤（Ａ）としては、有用物質の分泌効率及び細胞毒性の観点から、好ましくは一般式（１）、（２）、（５）〜（７）で表される化合物である。
さらに好ましくは一般式（１）、（２）、（５）〜（７）で表される化合物のうち炭素数８〜２２の脂肪族炭化水素基を有する化合物であり、特に好ましくは一般式（１）、（２）、（５）〜（７）で表される化合物のうち炭素数１０〜１８の脂肪族炭化水素基を有する化合物である。
【００５８】
本発明において界面活性剤（Ａ）は、そのまま使用してもよいし、必要により水と混合して、水性希釈液（水溶液状又は水分散液状）として用いてもよい。
水性希釈液における、界面活性剤（Ａ）の合計濃度（重量％）は、対象となる微生物、生理活性物質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、有用物質の分泌効率及びハンドリング性の観点から、水性希釈液の重量を基準として、０．１〜９９重量％が好ましく、より好ましくは１〜５０重量％である。
【００５９】
本発明の有用物質の生産方法で使用される界面活性剤（Ａ）の使用量（重量％）は、対象となる微生物、生産される有用物質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、培養液の重量を基準として、細胞毒性、有用物質の分泌効率及びタンパク質の変性のさせにくさの観点から、０．０００１〜２０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜１０重量％であり、次にさらに好ましくは０．００５〜５重量％であり、特に好ましくは０．０１〜２．５重量％である。
【００６０】
本発明の有用物質の製造方法で製造される有用物質としては、タンパク質（酵素、ホルモンタンパク質、抗体及びペプチド等）、多糖、オリゴ糖及び核酸等が挙げられる。
【００６１】
タンパク質としては、酵素｛酸化還元酵素（コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等）、加水分解酵素（リゾチーム、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及びグルコアミラーゼ等）、異性化酵素（グルコースイソメラーゼ等）、転移酵素（アシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ等）、合成酵素（脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ及びクエン酸シンターゼ等）及び脱離酵素（ペクチンリアーゼ等）等｝、ホルモンタンパク質｛骨形成因子（ＢＭＰ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン及びカルシトニン等｝、抗体、抗原タンパク質｛Ｂ型肝炎表面抗原等｝、機能性タンパク質｛プロネクチン（登録商標）｝、不凍ペプチド、抗菌ペプチド等｝、蛍光タンパク質（ＧＦＰ等）、発光タンパク質（ルシェラーゼ等）及びペプチド（特にアミノ酸組成を限定するものではなく、オリゴペプチド、ジペプチド及びトリペプチド等）等が挙げられる。
【００６２】
多糖としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キサンタン及びセルロース等が挙げられる。
【００６３】
オリゴ糖としては、スクロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、ラフィノース、パノース、シクロデキストリン、ガラクトオリゴ糖及びフラクトオリゴ糖等が挙げられる。
【００６４】
核酸としては、イノシン一リン酸、アデノシン一リン酸及びグアノシン一リン酸等が挙げられる。
【００６５】
これらのうち、有用物質の分泌生産性の観点からタンパク質が好ましい。
【００６６】
培養工程は、以下の有用物質の生産に用いる培養液についてオートクレーブ滅菌（好ましくは１２０℃、２０分間）を行い、ここに前培養した組み換え微生物を本培養する。微生物の培養の温度は、好ましくは１５〜３２℃であり、さらに好ましくは２５〜３０℃である。
培地のｐＨは、４〜７に調整するのが好ましい。
培養工程では、本培養開始から６〜８００時間後に培養温度を維持したまま界面活性剤（Ａ）を添加し、本培養開始から２０〜１０００時間培養を継続することが好ましい。
培養中の培養液は公知の撹拌装置（撹拌羽根及びマグネティックスターラー等）を用いて撹拌することが好ましい。
培養工程に用いる装置としては、公知の培養装置を用いることができるが、例えば試験管、ディープウェルプレート（例えば、ビーエム機器株式会社製品等）、微生物培養装置（例えば、エイブル社製等）等が挙げられる。
【００６７】
なお、培養工程で用いる前培養した微生物として組み換え微生物を用いる場合、前培養は微生物を発現ベクターで形質転換して組み換え微生物を作製し、組み換え微生物を前培養する。前培養は寒天培地上で１５〜３２℃で３〜７２時間行うことが好ましい。
【００６８】
精製工程は、培養液中に分泌された有用物質（タンパク質等）を分離する工程であり、遠心分離、中空糸分離、ろ過、溶剤による沈殿処理及びカラム処理（イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、疎水カラム、アフィニティカラム及び限外カラム等）等の公知の分離方法で微生物及び微生物残さと分離することで行うことができる。
溶剤による沈殿処理としては、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理が挙げられる。
【００６９】
精製工程においてカラム処理を行う場合、カラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としては、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド及びビニルポリマー等が挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等が挙げられる。
【００７０】
精製工程で分離された微生物は、その後、新たに培養液を供給することにより、さらに培養することができる。その培養液等をさらに精製工程に供して精製、培養を繰り返すことにより、有用物質の連続生産を行うことができる。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００７２】
＜実施例１〜１１＞
独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンターより分譲していただいたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いて形質転換を行うことにより、ルシフェラーゼ発現微生物を作製した。ｐＹＥＳ２ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ社製）をＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切断し、人工合成（Ｔｈｅｒｍｏ社で委託合成）した両端にＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ切断部位を持つαファクター−ルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ。αファクター−ルシフェラーゼ遺伝子組み込みｐＹＥＳ２ベクターの微生物への形質転換は、ｐＹＥＳ２ベクター取り扱い説明書に記載の方法で行った。当該ルシフェラーゼ発現微生物をＹＰＤ培養液（Ｄｉｆｃｏ社製Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １ｗｔ％、Ｄｉｆｃｏ社製Ｂａｃｔｏ  ｐｅｐｔｏｎｅ  ２ｗｔ％、グルコース２ｗｔ％）に白金耳を用いて植菌して３０℃で１５時間、２００ｒｐｍで振とう培養して作製した培養液を最終濁度（以下ＯＤと略記することがある）が０．１ＯＤ／ｍｌとなるように、１２５ｍｌＹＰＤ培養液（１００ｍＭリン酸水素カリウム緩衝液含有  ｐＨ６）に再懸濁した。
なお、培養液の濁度は、後述の「培養液の濁度の測定方法」と同様の条件で測定した。
更に、その再懸濁液を、３０℃で約１７時間、１１００ｒｐｍでＯＤが２０〜３０となるまで攪拌培養を続けた。ＯＤが２０〜３０となった時点で培養液を遠心（１５００ｇ、１０分）し、１２５ｍｌのガラクトース誘導培養液（前記のＹＰＤ培養液に１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液含有し、グルコースの代わりに２％ガラクトースを含む、ｐＨ６）に再懸濁し、３０℃、１１００ｒｐｍで２時間培養した。
その後、表１に記載の界面活性剤を表１に記載の重量％となるように添加し、８時間３０℃、１１００ｒｐｍで培養した。その後、濁度（培養終了時の濁度）測定用、分泌効率測定用にサンプリングし、遠心分離機によって、培養液から菌体と培養上清を分離し、培養上清と菌体を回収した。【００７３】
＜比較例１＞
実施例１において、界面活性剤の代わりに純水を添加する以外は同様にして実施し、培養上清と菌体を回収した。【００７４】
＜実施例１２〜２２＞
独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンターより分譲していただいたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを用いて形質転換を行うことにより、ルシフェラーゼ発現微生物を作製した。ｐＰＩＣＺαベクター（Ｔｈｅｒｍｏ社製）をＸｈｏＩとＸｂａＩで切断し、人工合成（Ｔｈｅｒｍｏ社で委託合成）した両端にＸｈｏＩとＸｂａＩ切断部位を持つルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ。ルシフェラーゼ遺伝子組み込みｐＰＩＣＺαベクターの微生物への形質転換は、ｐＰＩＣＺα」ベクター取り扱い説明書に記載の方法で行った。当該ルシフェラーゼ発現微生物をＢＭＧＹ培養液に白金耳を用いて植菌して３０℃で１５時間、２００ｒｐｍで振とう培養して作製した培養液を最終ＯＤが０．１ＯＤ／ｍｌとなるように、１２５ｍｌＢＭＧＹ培養液（Ｄｉｆｃｏ社製Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １ｗｔ％、Ｄｉｆｃｏ社製Ｂａｃｔｏ  ｐｅｐｔｏｎｅ  ２ｗｔ％、Ｄｉｆｃｏ社製Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  １．３４ｗｔ％、グルコース２ｗｔ％、１００ｍＭリン酸水素カリウム、ｐＨ６．０）に再懸濁した。さらに、その再懸濁液を、３０℃で約１７時間、１１００ｒｐｍでＯＤが２０〜３０となるまで攪拌培養を続けた。ＯＤが２０〜３０となった時点で培養液を遠心（１５００ｇ、１０分）し、１２５ｍｌＢＭＭＹ培養液に再懸濁し、３０℃、１１００ｒｐｍで２時間培養した。
２時間経過後、表２に記載の界面活性剤を表２に記載の重量％となるように添加し、８時間３０℃、１１００ｒｐｍで培養した。その後、濁度（培養終了時の濁度）測定用、分泌効率測定用にサンプリングし、遠心分離機によって、培養液から菌体と培養上清を分離し、培養上清と菌体を回収した。【００７５】
＜比較例２＞
実施例１２において、界面活性剤の代わりに純水を添加する以外は同様にして実施し、培養上清と菌体を回収した。【００７６】
＜実施例２３〜３３＞
公知文献（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｙｅａｓｔ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ，  Ｈ．  Ｙｕｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  １４９３，  ２０００，  ５６−６３）に記載の方法に基づき、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉを形質転換し、酸性ホスファターゼ発現微生物を作製した。当該酸性ホスファターゼ発現微生物をＢＭＧＹ培養液に白金耳を用いて植菌して３０℃で１５時間、２００ｒｐｍで振とう培養して作製した培養液を最終ＯＤが０．１ＯＤ／ｍｌとなるように、１２５ｍｌＢＭＧＹ培養液に再懸濁した。さらに、その再懸濁液を、３０℃で約１７時間、１１００ｒｐｍでＯＤが２〜５となるまで攪拌培養を続けた。ＯＤが２〜５となった時点で２ｖ／ｖ％となるようにメタノールを添加し、３０℃、１１００ｒｐｍで２時間培養した。
２時間経過後、表３に記載の界面活性剤を表３に記載の重量で添加し、８時間３０℃、１１００ｒｐｍで培養した。８時間後、濁度（培養終了時の濁度）測定用にサンプリングし、遠心分離機によって、培養液から菌体と培養上清を分離し、培養上清と菌体を回収した。
菌体に５０ｍＭ  酢酸ＮａＢｆ（ｐＨ４．０）を加え、遠心することで菌体を洗浄した。洗浄した菌体に、５０ｍＭ  酢酸ＮａＢｆ（ｐＨ４．０）で再懸濁し、菌体表面の酸性ホスファターゼ活性測定サンプルとした。【００７７】
＜比較例３＞
実施例２３において、界面活性剤の代わりに純水を添加する以外は同様にして実施し、培養上清と菌体を回収した。【００７８】
【表１】
2018159655.tif 000009
【００７９】
【表２】
2018159655.tif 000010
【００８０】
【表３】
2018159655.tif 000011
【００８１】
なお、表１〜３中、界面活性剤は下記を使用した。
界面活性剤（Ａ１−１）：ポリオキシエチレン（平均２．５モル付加物）ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、イオン性基の２５℃水中でのｐＫａが２．０
界面活性剤（Ａ１−２）：ポリオキシエチレン（平均３モル付加物）ラウリルエーテル酢酸ナトリウム、イオン性基の２５℃水中でのｐＫａが３．６
界面活性剤（Ａ２−１）：ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、イオン性基の２５℃水中でのｐＫａが１４
界面活性剤（Ａ３−１）：２−（ドデシルアミノ）エタンスルホン酸ナトリウム、イオン性基の２５℃水中でのｐＫａが２．０と１０．８
界面活性剤（Ａ３−２）：ドデシル−β−アミノプロピオン酸ナトリウム、イオン性基の２５℃水中でのｐＫａが３．６と１０．８
界面活性剤（Ａ３−３）：ドデシルジメチル（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド［ラウリルスルホベタイン］、イオン性基の２５℃水中でのｐＫａが２．０と１４
界面活性剤（Ａ３−４）：ミルテホシン、イオン性基の２５℃水中でのｐＫａが２．２と１４
界面活性剤（Ａ３−５）：ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、イオン性基の２５℃水中でのｐＫａが３．６と１４
表１〜３中の数値は、培養液の重量に基づく、培養液中の界面活性剤の含有量（重量％）である。【００８２】
実施例１〜３３及び比較例１〜３で得た培養液の有用物質の分泌効率の評価を下記に記載の通り行った。結果を表１〜３に記載する。【００８３】
＜培養液の濁度の測定方法＞
サンプリングで回収した微生物を含む培養液を用いて、濁度計［（株）島津製作所社製、ＵＶ−１７００］を用いて、光路長１ｃｍの石英セルを用いて濁度の測定を行った。
培養液は、１５００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心し、上清を破棄した。沈澱をサンプル液量と同量の生理食塩水で再懸濁し、適切な吸光度（０．１〜０．８）になるように生理食塩水で希釈して６００ｎｍの吸光度を測定した。培養液の濁度は下記（数式１）によって算出した。
培養液の濁度（ＯＤ）＝（希釈した培養液の６００ｎｍの吸光度）×培養液の希釈倍率  （数式１）【００８４】
＜有用物質の分泌効率の評価＞
○分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性測定
実施例１〜２２及び比較例１〜２で得た各培養液を０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．４）で１０〜１０００倍希釈したもの２０μｌに、下記のルシフェリン溶液６０μｌ添加した混合液を試料として、ルミノメーターを用いて以下の条件で測定した発光強度を、下記式に当てはめて得られた値を分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性とした。
ルミノメーター：プロメガ株式会社製の「Ｇｌｏｍａｘ  Ｎａｖｉｇａｔｏｒ」
ルシフェリン溶液：ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製品 
測定温度：２５℃
検出装置：発光検出器
検出波長：３５０〜７００ｎｍ
〔分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性〕＝〔発光強度〕×希釈倍率／〔培養終了時の濁度〕【００８５】
○菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性測定
実施例１〜２２及び比較例１〜２で得た菌体に、除去した上清と同量の０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．４）２００μｌを加え、遠心することで菌体を洗浄した。洗浄した菌体に、洗浄した上清と同量の０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．４）２００μｌで再懸濁し、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．４）で１０〜１０００倍希釈したものを菌体表面のルシフェラーゼ活性測定用サンプルとした。
この菌体表面のルシフェラーゼ活性測定用サンプル２０μｌに上記のルシフェリン溶液６０μｌ添加した混合液を試料として、「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性測定」と同様の条件で発光強度を測定し、測定した発光強度を、下記式に当てはめて得られた値を菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性とした。
〔菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性〕＝〔発光値〕×希釈倍率／〔培養終了時の濁度〕【００８６】
○分泌効率
実施例１〜２２及び比較例１〜２で得た各培養上清と菌体を用いて、上記により求めた「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性」及び「菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性」から、各実施例における分泌効率を下記式により算出した。結果を表１及び２に示す。
分泌効率（％）＝１００×「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性」／「ルシフェラーゼ活性合計」
ルシフェラーゼ活性合計は、「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性」＋「菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性」を意味する。【００８７】
＜タンパク質量の測定：酸性ホスファターゼ活性測定＞
実施例２３〜３３及び比較例３で得た各培養上清に１／４０量の２Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）５μｌを添加した。緩衝液を添加した培養上清又は実施例２３〜３３で得た各菌体表面測定サンプルに基質溶液（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ０．６４ｍｇ／ｍｌ含有  ５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０）を容量比＝１：１で混合し、３５℃で１０分間反応した。
反応後、反応液と等量の１０％トリクロロ酢酸溶液を添加し反応停止をした。反応停止をした溶液に、炭酸ナトリウム飽和溶液を反応液全体と等量加え、発色させた。発色させた液は、１５００×ｇ、５分で不溶画分を除去し、（Ｂｉｏｔｅｋ社製マイクロプレートリーダーＰｏｗｅｒＷａｖｅ）を用いて４２０ｎｍの吸光度を測定した。参照波長には６３０ｎｍを測定した。
培養上清、菌体表面測定サンプルそれぞれについて、下記の式より算出した値を酸性ホスファターゼ活性とした。得られた培養上清の酸性ホスファターゼ活性を「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」とし、菌体表面測定サンプルの酸性ホスファターゼ活性を「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」とした。
酸性ホスファターゼ活性＝｛（Ａｂｓ４２０ｎｍ）−（Ａｂｓ６３０ｎｍ）｝／（培養終了時の濁度）【００８８】
＜分泌効率の評価＞
実施例２３〜３３及び比較例３で得た「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」及び「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」の値を用いて、下記数式より分泌効率を算出した。結果を表３に示す。
分泌効率（％）＝１００×「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」／「酸性ホスファターゼ活性合計」
なお、酸性ホスファターゼ活性合計は、「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」＋「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」を意味する。【００８９】
表１〜３から、培養液中に界面活性剤（Ａ）を含有することで、分泌効率が高くなっており、有用物質の微生物外への分泌効率が上昇していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明の有用物質の生産方法は、バイオ医薬品製造に用いる上で有用である。
【国際調査報告】
2018159655.tif 000012
2018159655.tif 000013
2018159655.tif 000014
2018159655.tif 000015
2018159655.tif 000016