(57)【要約】本発明は、新規リン脂質であるリゾホスファチジルイノシトールリン酸塩およびその利用を提供する。本発明はまた、リン脂質のリン酸基結合位置を分離して分析する方法を提供する。詳細には、本発明は、試料中のリン脂質を測定、検出または同定する方法であって、該方法はＡ）該試料を液体カラムクロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）またはイオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）に適用する工程；およびＢ）該ＬＣ−ＭＳにおけるピークの溶出位置により該リン脂質のリン酸基の位置を特定する工程を包含する、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸である化合物。
【請求項２】
１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール三リン酸、または２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール三リン酸である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３−一リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−４−一リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−５−一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３−一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−４−一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−５−一リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３．４−二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３．５−二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−４．５−二リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３，５−二リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸、または２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸である請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール三リン酸または２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール三リン酸である請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
１−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；および
２−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸
からなる群より選択される、
請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
疾患マーカーとして使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物を含む組成物。
【請求項７】
前記疾患マーカーが、炎症マーカーまたはがんマーカーである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記がんは前立腺がんを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸をアルキルアミンに接触させることで脱アシル化する工程を包含する、請求項１に記載の化合物の製造方法。
【請求項１０】
前記アルキルアミンは、メチルアミンである、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記脱アシル化は、脱ジアシル化する条件より緩和な条件である、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記緩和な条件は、脱ジアシル化する条件のうち反応時間の短縮、前記アルキルアミンの濃度の低減、反応温度、またはその組み合わせで達成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記緩和な条件は、アルキルアミンとしてメチルアミンを用い、１０分間以下の反応時間または該メチルアミンの濃度が約１１％以下、反応温度が５３℃以下あるいは該反応時間および該濃度および該反応温度の組み合わせである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
（Ａ）  １位と２位とに異なる質量のアシル基を有するホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸を提供する工程であって、所望の質量を有するアシル基が１位または２位から選択される所望の位置に存在する、工程；
（Ｂ）  該ホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸を、アルキルアミンに接触させることで脱アシル化する工程、および
（Ｃ）  必要に応じて、所望の質量のアシル基を有するリゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸を取り出す工程
を包含する、所望の位置に所望のアシル基を有するリゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸を製造する方法。
【請求項１５】
試料を、陰イオン交換樹脂に接触させることによりリン脂質を濃縮する工程；
該酸性リン脂質中のリン酸基を保護基で保護する工程；および
質量分析法により、該リン脂質中のリゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を検出、同定または定量する工程、
を包含する、リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を検出、同定または定量する方法。
【請求項１６】
さらに前記リン脂質中のホスファチジルイノシトールリン酸塩も検出、同定または定量する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記保護基はアルキル基を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記保護基はメチル基を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記質量分析法は三連四重極質量分析計による選択反応モニタリング法（ＳＲＭ）を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、液体カラムクロマトグラフィーまたはイオンモビリティ分離を用いて前記リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩の脂肪酸側鎖および／またはリン酸基の検出、同定または定量を行う工程を包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
さらにリン酸基の位置を特定する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記質量分析法において、アシルグリセロールをプロダクトイオン（フラグメントイオン）として選択して前記脂肪酸側鎖および／またはリン酸基の検出、同定または定量を行う、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の検出、同定または定量により、がんの診断を行う方法。
【請求項２４】
試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを測定、検出または同定する方法であって、該方法は
Ａ）該試料を質量分析（ＭＳ）に適用する工程；および
Ｂ）該ＭＳにおけるピークの溶出位置により該ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する工程
を包含する、方法。
【請求項２５】
前記Ａ）工程において、前記試料をさらにクロマトグラフィーに適用することを包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記質量分析が液体カラムクロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）であり、
前記特定する工程Ｂ）が、該ＬＣ−ＭＳにおけるピークの溶出位置により該ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する工程である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記特定する工程において前記ホスファチジルイノシトールホスフェートに含まれるアシル基の分子量の合計も特定される、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記特定する工程において前記ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートに含まれるアシル基の種類も特定される、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
同一のランにおいて前記ホスファチジルイノシトールホスフェートおよびリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記測定、検出または同定は、ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを他のイノシトール含有リン脂質から区別して行うことを特徴とする、請求項２４〜２９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料は、ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で調製されたものである、請求項２４〜３０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
前記条件は脱アシル化処理を行わないことを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記液体カラムクロマトグラフィーは、キラルカラム、逆相カラム、親水基および疎水基を分離するカラムクロマトグラフィーからなる群より選択される、請求項２６〜３２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３４】
前記液体カラムクロマトグラフィーは、イオンモビリティ分離と組み合わせられる、請求項２４〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを定量する工程をさらに包含する、請求項２４〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料はインタクトな試料である、請求項２４〜３５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３７】
前記特定は試料を標識せずに行われる、請求項２４〜３６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３８】
前記質量分析がイオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）であり、
前記特定する工程Ｂ）が、該ＩＭＳ−ＭＳにおけるピークの溶出位置により該ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する工程である、
請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
請求項２７〜３３、３５〜３７のいずれかまたは複数の特徴を備える請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのアシル基およびリン酸基の位置を測定、検出または同定する装置であって、質量分析（ＭＳ）と、ホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該ＭＳに該試料を適用する適用部とを含む装置。
【請求項４１】
さらにクロマトグラフィー用の装置を含む請求項４０に記載の装置。
【請求項４２】
前記質量分析が液体カラムクロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）であり、前記適用部がホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該ＬＣ−ＭＳに該試料を適用する適用部である、請求項４０に記載の装置。
【請求項４３】
前記液体カラムクロマトグラフィーは、キラルカラム、逆相カラムなど親水基、疎水基を分離するすべてのカラムクロマトグラフィーからなる群より選択される、請求項４２に記載の装置。
【請求項４４】
前記ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを検知または定量する手段をさらに含む、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項４５】
前記質量分析がイオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）であり、前記適用部がホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該ＩＭＳ−ＭＳに該試料を適用する適用部である、請求項４０に記載の装置。
【請求項４６】
試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを、アシル基を保持しつつ、リン酸基の位置に応じて分離または精製する方法であって、該方法は
Ａ）該試料を液体カラムクロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）またはイオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）に適用する工程；および
Ｂ）該ＬＣ−ＭＳまたはＩＭＳ−ＭＳにおけるＬＣまたはＩＭＳの溶出物から、ピークの溶出位置により特定された目的の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを収集する工程を包含する、方法。
【請求項４７】
ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置について２以上存在する混合物から、該混合物に含まれるホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の種類の数より少ない種類の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを含む試料を生産する方法であって、
Ａ）該試料を液体カラムクロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）またはイオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）に適用する工程；および
Ｂ）該ＬＣ−ＭＳまたはＩＭＳ−ＭＳにおけるＬＣまたはＩＭＳの溶出物から、ピークの溶出位置により特定された目的の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを含む画分を収集する工程
を包含する、方法。
【請求項４８】
前記混合物に含まれるホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の種類の数より少ない種類は一種類である、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規リン脂質およびその利用に関する。さらに、本発明は、リン脂質分離測定法に関する。より特定すると、アシル基をインタクトな状態で保持しつつホスファチジルイシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する技術に関する。詳細には、本発明は、質量分析（ＭＳ）を必要に応じてクロマトグラフィーまたはイオンモビリティ分離（ＩＭＳ）と組み合わせて用いるリン脂質分離測定法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
脂質は膜構成因子、エネルギー源、シグナル伝達分子として、生命に必須の成分である。脂質の中でも特にリン脂質は、細胞内タンパク質を細胞膜や細胞内小器官へとターゲットし、その場所で活性を制御する時空間的レギュレータとして、多様な細胞機能の調節を司る重要な分子群である。しかし、水に難溶性であることや遺伝子の支配を直接受けないことから、解析には限界があり、研究の進んでない生化学の研究分野となっている。【０００３】
本発明者らはこのような未開拓の分野に、リン脂質代謝酵素やリン脂質結合ドメインの遺伝子改変マウスの作製という新しい技法を用いてチャレンジした。本発明者らの研究が世界的な先駆けとなり、細胞内リン脂質による生体機能調節機構の解明は、新たな研究分野と捉え直すことができるほどの展開をみせている。すなわち、種々の癌、アレルギー、肝脂肪化・線維化、心機能不全、神経変性、腸炎など多様な病態と個々のリン脂質の代謝酵素異常との関連を次々と見出され、新しい医薬開発にもつながる基礎研究成果として今後の発展が大きく期待される状況にある（非特許文献１）。【０００４】
一方、これまでの研究では、遺伝学的手法を適用できる代謝酵素が解析対象の中心となっており、リン脂質そのものの変動についての研究はほとんど進んでいない（非特許文献１）。これは、脂質の検出、同定、定量の方法が未開発であることに起因する。遺伝子とは異なり、現在においても、生体を構成する脂質の種類、数は未確定であり、多くの未知の脂質が発見されずに眠っていると考えられる。【０００５】
また、リン脂質代謝酵素の発現異常が癌やメタボリックシンドローム等の病態に関連することが知られているが、その分子メカニズムの詳細は不明である。多くの疾患に関与するホスホイノシタイド（ホスファチジルイノシトールホスフェート、ホスファチジルイノシトールリン酸（塩）などともいう）には、８クラス(ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトール−３−一リン酸、ホスファチジルイノシトール−４−一リン酸、ホスファチジルイノシトール−５−一リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，５−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸)存在する。これら脂質または代謝産物は、各々のクラスが互いに異なった役割や機能を有し得、同様にその代謝酵素や受容体などは、多様な疾患治療薬の標的として、また、疾患マーカーとしての意義をもつ可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓａｓａｋｉ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ．  Ｐｒｏｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２００９  Ｎｏｖ；４８（６）：３０７−４３，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｌｉｐｒｅｓ．２００９．０６．００１
【非特許文献２】Ｋｉｅｌｋｏｗｓｋａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．    Ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．  Ａｄｖ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｑｕｌ  ５４，  １３１−１４１  （２０１４）．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以上に鑑み、本発明者らは、質量分析を基盤とした、新しい脂質解析方法の開発に乗り出した。質量分析法を用いるメリットは、これまで解析対象のラジオアイソトープラベルを使用しなければ分析が不可能であった生体試料（ヒト臨床検体等）を解析することが可能となる点、また、アシル基の組成を判別することができる点（よって本発明にあるリゾリン脂質を発見できる）である。生体内の存在量が微量であること、また、多価のリン酸化を受けることで特に測定が困難なホスファチジルイノシトールリン酸群（本明細書において「ＰＩＰｓ」とも称する）の新しい測定方法を確立した。そして、この技術を用いることで、これまでに同定することが不可能であった未知のリゾホスファチジルイノシトールリン酸群（本明細書において「ＬＰＩＰｓ」とも称する）を発見するに至った。ＬＰＩＰｓは、その同定方法や検出方法も、合成法も本発明の開示まで存在していなかったため、本発明による開示がＬＰＩＰｓの物質としての最初の報告である。【０００８】
また、本発明の測定法は、クロマトグラフィー−質量分析法により、ホスホイノシタイドおよびリゾホスホイノシタイド（リゾホスファチジルイノシトールホスフェート、リゾホスファチジルイノシトールリン酸（塩）などともいう）をアシル基を有した状態（本明細書において「インタクトな状態」ともいう。）で、そのリン酸基の位置を特定して測定、検出、同定することができることを予想外に見出したことによって、完成させた。特に、本発明は、アシル基（脂肪酸側鎖）の情報を有したホスホイノシタイド全８クラスおよびリゾホスホイノシタイド全８クラスを液体カラムクロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）またはイオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）で検出・同定した方法を初めて提供するものである。ここで使用されるカラムはキラルカラム、疎水性カラムなどを挙げることができるがこれらに限定されず、親水基、疎水基を分離する任意のクロマトグラフィーが利用可能であり得る。【０００９】
したがって、本発明は以下を提供する。
（項目１Ａ）
リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸である化合物。
（項目２Ａ）
１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール三リン酸、または２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール三リン酸である項目１Ａに記載の化合物。
（項目３Ａ）
１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３−一リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−４−一リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−５−一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３−一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−４−一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−５−一リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３．４−二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３．５−二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−４．５−二リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３，５−二リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸、または２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸である項目１Ａまたは２Ａに記載の化合物。
（項目４Ａ）
２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール三リン酸または２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール三リン酸である項目１Ａ〜３Ａのいずれか１項に記載の化合物。
（項目５Ａ）
１−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；および
２−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸
からなる群より選択される、
項目１Ａ〜４Ａのいずれか１項に記載の化合物。
（項目６Ａ）
疾患マーカーとして使用するための、項目１Ａ〜５Ａのいずれか１項に記載の化合物を含む組成物。
（項目７Ａ）
前記疾患マーカーが、炎症マーカーまたはがんマーカーである、項目６Ａに記載の組成物。
（項目８Ａ）
前記がんは前立腺がんを含む、項目７Ａに記載の組成物。
（項目９Ａ）
ホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸をアルキルアミンに接触させることで脱アシル化する工程を包含する、項目１Ａ〜５Ａのいずれか１項に記載の化合物の製造方法。
（項目１０Ａ）
前記アルキルアミンは、メチルアミンである、項目９Ａに記載の製造方法。
（項目１１Ａ）
前記脱アシル化は、脱ジアシル化する条件より緩和な条件である、項目９Ａまたは１０Ａに記載の製造方法。
（項目１２Ａ）
前記緩和な条件は、脱ジアシル化する条件のうち反応時間の短縮、前記アルキルアミンの濃度の低減、反応温度、またはその組み合わせで達成される、項目１１Ａに記載の方法。
（項目１３Ａ）
前記緩和な条件は、アルキルアミンとしてメチルアミンを用い、１０分間以下の反応時間または該メチルアミンの濃度が約１１％以下、反応温度が５３℃以下あるいは該反応時間および該濃度および該反応温度の組み合わせである、項目１１Ａまたは１２Ａに記載の方法。
（項目１４Ａ）
（Ａ）  １位と２位とに異なる質量のアシル基を有するホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸を提供する工程であって、所望の質量を有するアシル基が１位または２位から選択される所望の位置に存在する、工程；
（Ｂ）  該ホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸を、アルキルアミンに接触させることで脱アシル化する工程、および
（Ｃ）  必要に応じて、所望の質量のアシル基を有するリゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸を取り出す工程
を包含する、所望の位置に所望のアシル基を有するリゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸を製造する方法。
（項目１５Ａ）
試料を、陰イオン交換樹脂に接触させることによりリン脂質を濃縮する工程；
該酸性リン脂質中のリン酸基を保護基で保護する工程；および
質量分析法により、該リン脂質中のリゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を検出、同定または定量する工程、
を包含する、リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を検出、同定または定量する方法。
（項目１６Ａ）
さらに前記リン脂質中のホスファチジルイノシトールリン酸塩も検出、同定または定量する、項目１５Ａに記載の方法。
（項目１７Ａ）
前記保護基はアルキル基を含む、項目１５Ａまたは１６Ａに記載の方法。
（項目１８Ａ）
前記保護基はメチル基を含む、項目１５Ａ〜１７Ａのいずれか１項に記載の方法。
（項目１９Ａ）
前記質量分析法は三連四重極質量分析計による選択反応モニタリング法（ＳＲＭ）を含む、項目１５Ａ〜１８Ａのいずれか１項に記載の方法。
（項目２０Ａ）
さらに、液体カラムクロマトグラフィーまたはイオンモビリティ分離を用いて前記リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩の脂肪酸側鎖および／またはリン酸基の検出、同定または定量を行う工程を包含する、項目１５Ａ〜１９Ａのいずれか１項に記載の方法。
（項目２１Ａ）
さらにリン酸基の位置を特定する、項目１５Ａ〜２０Ａのいずれか１項に記載の方法。
（項目２２Ａ）
前記質量分析法において、アシルグリセロールをプロダクトイオン（フラグメントイオン）として選択して前記脂肪酸側鎖および／またはリン酸基の検出、同定または定量を行う、項目１５Ａ〜２１Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目２３Ａ）
項目１５Ａ〜２２Ａのいずれか一項に記載の検出、同定または定量により、がんの診断を行う方法。
（項目２４Ａ）
試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを測定、検出または同定する方法であって、該方法は
Ａ）該試料を質量分析（ＭＳ）に適用する工程；および
Ｂ）該ＭＳにおけるピークの溶出位置により該ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する工程
を包含する、方法。
（項目２５Ａ）
前記Ａ）工程において、前記試料をさらにクロマトグラフィーに適用することを包含する、項目２４Ａに記載の方法。
（項目２６Ａ）
前記質量分析が液体カラムクロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）であり、
前記特定する工程Ｂ）が、該ＬＣ−ＭＳにおけるピークの溶出位置により該ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する工程である、項目２４Ａまたは２５Ａに記載の方法。
（項目２７Ａ）
前記特定する工程において前記ホスファチジルイノシトールホスフェートに含まれるアシル基の分子量の合計も特定される、項目２４Ａ〜２６Ａのいずれか１項に記載の方法。
（項目２８Ａ）
前記特定する工程において前記ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートに含まれるアシル基の種類も特定される、項目２４Ａ〜２７Ａのいずれか１項に記載の方法。
（項目２９Ａ）
同一のランにおいて前記ホスファチジルイノシトールホスフェートおよびリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する、項目２４Ａ〜２８Ａのいずれか１項に記載の方法。
（項目３０Ａ）
前記測定、検出または同定は、ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを他のイノシトール含有リン脂質から区別して行うことを特徴とする、項目２４Ａ〜２９Ａのいずれか1項に記載の方法。
（項目３１Ａ）
前記試料は、ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で調製されたものである、項目２４Ａ〜３０Ａのいずれか1項に記載の方法。
（項目３２Ａ）
前記条件は脱アシル化処理を行わないことを含む、項目３１Ａに記載の方法。
（項目３３Ａ）
前記液体カラムクロマトグラフィーは、キラルカラム、逆相カラム、親水基および疎水基を分離するカラムクロマトグラフィーからなる群より選択される、項目２６Ａ〜３２Ａのいずれか1項に記載の方法。
（項目３４Ａ）
前記液体カラムクロマトグラフィーは、イオンモビリティ分離と組み合わせられる、項目２４Ａ〜３３Ａのいずれか１項に記載の方法。
（項目３５Ａ）
前記ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを定量する工程をさらに包含する、項目２４Ａ〜３４Ａのいずれか１項に記載の方法。
（項目３６Ａ）
前記試料はインタクトな試料である、項目２４Ａ〜３５Ａのいずれか1項に記載の方法。
（項目３７Ａ）
前記特定は試料を標識せずに行われる、項目２４Ａ〜３６Ａのいずれか1項に記載の方法。
（項目３８Ａ）
前記質量分析がイオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）であり、
前記特定する工程Ｂ）が、該ＩＭＳ−ＭＳにおけるピークの溶出位置により該ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する工程である、
項目２４Ａ〜３７Ａのいずれか１項に記載の方法。
（項目３９Ａ）
項目２５Ａ〜３３Ａ、３５Ａ〜３７Ａのいずれかまたは複数の特徴を備える項目３８Ａに記載の方法。
（項目４０Ａ）
試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのアシル基およびリン酸基の位置を測定、検出または同定する装置であって、質量分析（ＭＳ）と、ホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該ＭＳに該試料を適用する適用部とを含む装置。
（項目４１Ａ）
さらにクロマトグラフィー用の装置を含む項目４０Ａに記載の装置。
（項目４２Ａ）
前記質量分析が液体カラムクロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）であり、前記適用部がホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該ＬＣ−ＭＳに該試料を適用する適用部である、項目４０Ａまたは４１Ａに記載の装置。
（項目４３Ａ）
前記液体カラムクロマトグラフィーは、キラルカラム、逆相カラムなど親水基、疎水基を分離するすべてのカラムクロマトグラフィーからなる群より選択される、項目４２Ａに記載の装置。
（項目４４Ａ）
前記ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを検知または定量する手段をさらに含む、項目４０Ａ〜４３Ａのいずれか１項に記載の装置。
（項目４５Ａ）
前記質量分析がイオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）であり、前記適用部がホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該ＩＭＳ−ＭＳに該試料を適用する適用部である、項目４０Ａ〜４４Ａのいずれか１項に記載の装置。
（項目４６Ａ）
試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを、アシル基を保持しつつ、リン酸基の位置に応じて分離または精製する方法であって、該方法は
Ａ）該試料を液体カラムクロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）またはイオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）に適用する工程；および
Ｂ）該ＬＣ−ＭＳまたはＩＭＳ−ＭＳにおけるＬＣまたはＩＭＳの溶出物から、ピークの溶出位置により特定された目的の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを収集する工程を包含する、方法。
（項目４７Ａ）
ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置について２以上存在する混合物から、該混合物に含まれるホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の種類の数より少ない種類の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを含む試料を生産する方法であって、
Ａ）該試料を液体カラムクロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）またはイオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）に適用する工程；および
Ｂ）該ＬＣ−ＭＳまたはＩＭＳ−ＭＳにおけるＬＣまたはＩＭＳの溶出物から、ピークの溶出位置により特定された目的の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを含む画分を収集する工程
を包含する、方法。
（項目４８Ａ）
前記混合物に含まれるホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の種類の数より少ない種類は一種類である、項目４７Ａに記載の方法。【００１０】
さらに、本発明は以下を提供する。
（１Ｂ）試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートを測定、検出または同定する方法であって、該方法は
Ａ）該試料を液体カラムクロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）に適用する工程；および
Ｂ）該ＬＣ−ＭＳにおけるピークの溶出位置により該ホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する工程
を包含する、方法。
（２Ｂ）前記特定する工程において前記ホスファチジルイノシトールホスフェートに含まれるアシル基の有無も特定される、項目１Ｂに記載の方法。
（３Ｂ）前記特定する工程において前記ホスファチジルイノシトールホスフェートに含まれるアシル基の分子量の合計も特定される、項目１Ｂまたは２Ｂに記載の方法。
（４Ｂ）前記特定する工程において前記ホスファチジルイノシトールホスフェートに含まれるアシル基の種類も特定される、項目１Ｂ〜３Ｂのいずれか1項に記載の方法。
（５Ｂ）前記測定、検出または同定は、ホスファチジルイノシトールホスフェートを他のイノシトール含有リン脂質から区別して行うことを特徴とする、項目１Ｂ〜４Ｂのいずれか1項に記載の方法。
（６Ｂ）前記試料は、ホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で調製されたものである、項目１Ｂ〜５Ｂのいずれか1項に記載の方法。
（７Ｂ）前記条件は脱アシル化処理を行わないことを含む、項目６Ｂに記載の方法。
（８Ｂ）前記液体カラムクロマトグラフィーは、キラルカラム、逆相カラム、親水基および疎水基を分離するカラムクロマトグラフィーからなる群より選択される、項目１Ｂ〜７Ｂのいずれか1項に記載の方法。
（９Ｂ）前記液体カラムクロマトグラフィーは、イオンモビリティ分離と組み合わせられる、項目１Ｂ〜８Ｂのいずれか１項に記載の方法。
（１０Ｂ）前記ホスファチジルイノシトールホスフェートを定量する工程をさらに包含する、項目１Ｂ〜９Ｂのいずれか１項に記載の方法。
（１１Ｂ）前記試料はインタクトな試料である、項目１Ｂ〜１０Ｂのいずれか1項に記載の方法。
（１２Ｂ）前記特定は試料を標識せずに行われる、項目１Ｂ〜１１Ｂのいずれか1項に記載の方
法。
（１３Ｂ）試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートを測定、検出または同定する方法であって、該方法は
Ａ）該試料をイオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）に適用する工程；およびＢ）該ＩＭＳ−ＭＳにおけるピークの溶出位置により該ホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する工程
を包含する、方法。
（１４Ｂ）項目２Ｂ〜８Ｂ、１０Ｂ〜１２Ｂのいずれかまたは複数の特徴を備える項目１３Ｂに記載の方法。
（１５Ｂ）試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートのアシル基およびリン酸基の位置を測定、検出または同定する装置であって、液体カラムクロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）と、ホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該ＬＣ−ＭＳに該試料を適用する適用部とを含む装置。
（１６Ｂ）前記液体カラムクロマトグラフィーは、キラルカラム、逆相カラムなど親水基、疎水基を分離するすべてのカラムクロマトグラフィーからなる群より選択される、項目１５Ｂに記載の装置。
（１７Ｂ）前記ホスファチジルイノシトールホスフェートを検知または定量する手段をさらに含む、項目１５Ｂまたは１６Ｂに記載の装置。
（１７Ｂ２）項目２Ｂ〜１２Ｂのいずれかまたは複数の特徴を備える項目１５Ｂ〜１７Ｂのいずれか1項に記載の装置。
（１８Ｂ）試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートのアシル基およびリン酸基の位置を測定、検出または同定する装置であって、イオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）と、ホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該ＩＭＳ−ＭＳに該試料を適用する適用部とを含む装置。
（１８Ｂ２）項目２Ｂ〜１２Ｂのいずれかまたは複数の特徴を備える項目１８Ｂに記載の装置。
（１９Ｂ）試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートを、アシル基を保持しつつ、リン酸基の位置に応じて分離または精製する方法であって、該方法は
Ａ）該試料を液体カラムクロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）またはイオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）に適用する工程；および
Ｂ）該ＬＣ−ＭＳまたはＩＭＳ−ＭＳの溶出物から、ピークの溶出位置により特定された目的の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートを収集する工程を包含する、方法。
（１９Ｂ２）項目２Ｂ〜１２Ｂのいずれかまたは複数の特徴を備える項目１９Ｂに記載の方法。
（２０Ｂ）ホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置について２以上存在する混合物から、該混合物に含まれるホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の種類の数より少ない種類の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートを含む試料を生産する方法であって、
Ａ）該試料を液体カラムクロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）またはイオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）に適用する工程；および
Ｂ）該ＬＣ−ＭＳまたはＩＭＳ−ＭＳの溶出物から、ピークの溶出位置により特定された目的の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートを含む画分を収集する工程
を包含する、方法。
（２１Ｂ）前記混合物に含まれるホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の種類の数より少ない種類は一種類である、項目２０Ｂに記載の方法。
（２１Ｂ２）項目２Ｂ〜１２Ｂのいずれかまたは複数の特徴を備える項目２０Ｂまたは２１Ｂに記載の方法。【００１１】
これまでの分析方法はリン酸化の位置異性体を分離することができず3つのアイソマーの総和で測定していたが、質量分析法（ＭＳ）を必要に応じてクロマトグラフィーまたはイオンモビリティ分離（ＩＭＳ）と組み合わせて用いることでアイソマーを分離して測定できる方法を開発した。１つの実施形態では、本発明は、キラルカラムを用いることで８種類のＰＩＰｓおよびＬＰＩＰｓアイソマーをインタクトな状態で分離して測定できる分析法に関する。例示的な分析にはｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒａｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒによるＭＲＭ/ＳＲＭが用いられる。Ｑ１はインタクトなプレカーサーイオンを設定し、Ｑ３にはイノシトールホスフェートが脱離したＤＡＧもしくはＭＡＧをプロダクトイオンとして設定される。【００１２】
本発明はまた、以下を提供する。
（１Ｃ）リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸である化合物。
（２Ｃ）１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール三リン酸、または２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール三リン酸である項目１Ｃに記載の化合物。
（３Ｃ）１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３−一リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−４−一リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−５−一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３−一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−４−一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−５−一リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３．４−二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３．５−二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−４．５−二リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３，５−二リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸、または２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸である項目１Ｃまたは２Ｃに記載の化合物。
（４Ｃ）２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール三リン酸または２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール三リン酸である項目１Ｃ〜３Ｃのいずれか一項に記載の化合物。
（５Ｃ）１−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；および
２−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸
からなる群より選択される、
項目１Ｃ〜４Ｃのいずれか一項に記載の化合物。
（６Ｃ）がんマーカーとして使用するための、項目１Ｃ〜５Ｃのいずれか１項に記載の化合物を含む組成物。
（７Ｃ）前記がんは前立腺がんを含む、項目６Ｃに記載の組成物。
（８Ｃ）ホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸をアルキルアミンに接触させることで脱アシル化する工程を包含する、項目１Ｃ〜５Ｃのいずれか一項に記載の化合物または項目６Ｃまたは７Ｃに記載の組成物の製造方法。
（９Ｃ）前記アルキルアミンは、メチルアミンである、項目８Ｃに記載の製造方法。
（１０Ｃ）  前記脱アシル化は、脱ジアシル化する条件より緩和な条件である、項目８Ｃまたは９Ｃに記載の製造方法。
（１１Ｃ）前記緩和な条件は、脱ジアシル化する条件のうち反応時間の短縮、前記アルキルアミンの濃度の低減、反応温度、またはその組み合わせで達成される、項目１０Ｃに記載の方法。
（１２Ｃ）前記緩和な条件は、アルキルアミンとしてメチルアミンを用い、１０分間以下の反応時間または該メチルアミンの濃度が約１１％以下、反応温度が５３℃以下あるいは該反応時間および該濃度および該反応温度の組み合わせである、項目１０Ｃまたは１１Ｃに記載の方法。
（１３Ｃ）（Ａ）１位と２位とに異なる質量のアシル基を有するホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸を提供する工程であって、所望の質量を有するアシル基が１位または２位から選択される所望の位置に存在する、工程；（Ｂ）該ホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸を、アルキルアミンに接触させることで脱アシル化する工程、および（Ｃ）必要に応じて、所望の質量のアシル基を有するリゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸を取り出す工程を包含する、所望の位置に所望のアシル基を有するリゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸を製造する方法。
（１４Ｃ）（Ａ）試料を、陰イオン交樹脂に接触させることによりリン脂質を濃縮する工程；（Ｂ）該酸性リン脂質中のリン酸基を保護基で保護する工程；および（Ｃ）質量分析法により、該リン脂質中にリゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を検出、同定または定量する工程、を包含する、リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を検出、同定または定量する方法。
（１５Ｃ）前記保護基はアルキル基を含む、項目１４Ｃに記載の方法。
（１６Ｃ）前記保護基はメチル基を含む、項目１４Ｃまたは１５Ｃに記載の方法。
（１７Ｃ）前記質量分析法は三連四重極質量分析計による選択反応モニタリング法（ＳＲＭ）を含む、項目１４Ｃ〜１６Ｃのいずれか一項に記載の方法。
（１８Ｃ）さらに、逆相カラムクロマトグラフィーを用いて前記リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩の脂肪酸側鎖および／またはリン酸基の検出、同定または定量を行う工程を包含する、項目１４Ｃ〜１７Ｃのいずれか一項に記載の方法。
（１９Ｃ）前記逆相カラムクロマトグラフィーにおいて、ジアシルグリセロールをプロダクトイオン（フラグメントイオン）として選択して前記脂肪酸側鎖および／またはリン酸基の検出、同定または定量を行う、項目１８Ｃに記載の方法。
（２０Ｃ）項目１４Ｃ〜１９Ｃのいずれか一項に記載の検出、同定または定量により、がんの診断を行う方法。【００１３】
本発明において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、新しい脂質を提供することで、これらの脂質の生命機能を解明し、医療応用を図ることができる。また、新しい創薬標的を提示することができる。また、本発明は、新しい測定法を提供することによって、新たな診断、検出法を提供することができる。【００１５】
また、本発明を用いると、インタクトの状態で、ホスホイノシタイドおよび／またはリゾホスホイノシタイドを、リン酸基の位置で分離して、測定、検出または同定することができることから、生体内の詳細な分析を行うことができる。このような情報は生体の情報、薬理情報、医薬品の開発、治療、診断等において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａは、「三連四重極質量分析計でのＳＲＭによる測定および検出方法」の原理を説明する模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の化合物の合成の条件検討のための実験結果を示す。従来の脱アシル化反応条件では生成されず、反応時間の短縮（上段）やメチルアミン濃度の低下（下段）によってＬＰＩＰ１が得られることを示す例である。縦軸は反応生成物の収率（％）を示し、横軸は時間（分）を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは反応温度の検討結果を示す。原料として１７：０／２０：４  ＰＩ４Ｐを用いた。生成物は１７：０  ＬＰＩＰ１と２０：４  ＬＰＩＰ１である。縦軸はＬＰＩＰ１生成物の収率（％）を示す。
【図２Ａ】図２Ａから２Ｇは、リン酸化パターンが異なる７種類のＬＰＩＰｓを、図１に示す緩和な条件での脱アシル化反応により合成できることを示すものである。いずれの場合においても、アシル基が異なるＬＰＩＰｓを合成することができることを、１７：０、２０：４をもつＬＰＩＰｓの生成により例示している。図２Ａは本発明の化合物の合成品の同定データを示す。原料：１７：０／２０：４  ＰＩ３Ｐ、目的生成物：１７：０  ＬＰＩ３Ｐ（上）：ms1=754.390、ms2=327.290；２０：４  ＬＰＩ３Ｐ（下）：ms1=788.370、ms2=361.270。縦軸は相対的存在量を示し、横軸は時間（分）を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは本発明の化合物の合成品の同定データを示す。原料：１７：０／２０：４  ＰＩ４Ｐ、目的生成物：１７：０  ＬＰＩ４Ｐ（上）：ms1=754.390、ms2=327.290；２０：４  ＬＰＩ４Ｐ（下）：ms1=788.370、ms2=361.270。縦軸は相対的存在量を示し、横軸は時間（分）を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは本発明の化合物の合成品の同定データを示す。原料：１７：０／２０：４  ＰＩ５Ｐ、目的生成物：１７：０  ＬＰＩ５Ｐ（上）：ms1=754.390、ms2=327.290；２０：４  ＬＰＩ５Ｐ（下）：ms1=788.370、ms2=361.270。縦軸は相対的存在量を示し、横軸は時間（分）を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは本発明の化合物の合成品の同定データを示す。原料：１７：０／２０：４  ＰＩ（３，４）Ｐ２、目的生成物：１７：０  ＬＰＩ（３，４）Ｐ２（上）：ms1=862.390、ms2=327.290；２０：４  ＬＰＩ（３，４）Ｐ２（下）：ms1=896.370、ms2=361.270。縦軸は相対的存在量を示し、横軸は時間（分）を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは本発明の化合物の合成品の同定データを示す。原料：１７：０／２０：４  ＰＩ（３，５）Ｐ２、目的生成物：１７：０  ＬＰＩ（３，５）Ｐ２（上）：ms1=862.390、ms2=327.290；２０：４  ＬＰＩ（３，５）Ｐ２（下）：ms1=896.370,ms2=361.270。縦軸は相対的存在量を示し、横軸は時間（分）を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは本発明の化合物の合成品の同定データを示す。原料：１７：０／２０：４  ＰＩ（４，５）Ｐ２、目的生成物：Ｌ１７：０  ＰＩ（４，５）Ｐ２（上）：ms1=862.390、ms2=327.290；２０：４  ＬＰＩ（４，５）Ｐ２（下）：ms1=896.370、ms2=361.270。縦軸は相対的存在量を示し、横軸は時間（分）を示す。
【図２Ｇ】図２Ｇは本発明の化合物の合成品の同定データを示す。原料：１７：０／２０：４  ＰＩ（３，４，５）Ｐ３、目的生成物：１７：０  ＬＰＩ（３，４，５）Ｐ３（上）：ms1=970.390、ms2=327.290；２０：４  ＬＰＩ（３，４，５）Ｐ３（下）：ms1=1004.370、ms2=361.270。縦軸は相対的存在量を示し、横軸は時間（分）を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｆにおいて、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃTM  Ｑ  ＥｘａｃｔｉｖｅTM  ｐｌｕｓ（ハイブリッド四重極−オービトラップ質量分析計）を用いて精密質量を測定することで、本発明の構造の同定（ＬＰＩＰ１、ＬＰＩＰ２、およびＬＰＩＰ３の構造確認）を行った結果を示す。図３Ａは、３７：４  ＰＩ（４）Ｐ（ｓｎ−１  １７：０、ｓｎ−２  ２０：４  ＰＩ（４）Ｐ）の緩和な脱アシル化反応（図１参照）によって生ずる二種のＬＰＩ（４）Ｐについて、ＬＰＩ（４）ＰならびにＬＰＩ（４）Ｐに由来するフラグメントの精密質量分析を行った結果を示す。縦軸は相対的存在量を示し、横軸は時間（分）を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、３７：４  ＰＩ（４）Ｐ、脱アシル化反応後の生成物とそのフラグメントの構造式を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、３７：４  ＰＩ（４，５）Ｐ２（ｓｎ−１  １７：０、ｓｎ−２  ２０：４  ＰＩ（４，５）Ｐ２）の緩和な脱アシル化反応によって生ずる二種のＬＰＩ（４，５）Ｐ２について、ＬＰＩ（４，５）Ｐ２ならびにＬＰＩ（４，５）Ｐ２に由来するフラグメントの精密質量分析を行った結果を示す。縦軸は相対的存在量を示し、横軸は時間（分）を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、３７：４  ＰＩ（４，５）Ｐ２、脱アシル化反応後の生成物とそのフラグメントの構造式を示す
【図３Ｅ】図３Ｅは、３７：４  ＰＩ（３，４，５）Ｐ３（ｓｎ−１  １７：０、ｓｎ−２  ２０：４  ＰＩ（３，４，５）Ｐ３）の緩和な脱アシル化反応によって生ずる二種のＬＰＩ（３，４，５）Ｐ３について、ＬＰＩ（３，４，５）Ｐ３ならびにＬＰＩ（３，４，５）Ｐ３に由来するフラグメントの精密質量分析を行った結果を示す。縦軸は相対的存在量を示し、横軸は時間（分）を示す。
【図３Ｆ】図３Ｆは、３７：４  ＰＩ（３，４，５）Ｐ３、脱アシル化反応後の生成物とそのフラグメントの構造式を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、イノシトールリン脂質のスピン系の概要を表す。実線で囲った箇所は連続した３Ｊカップリングで連結している１Ｈ核の集団を示し、破線で囲った箇所は１Ｈ核と３１Ｐ核が３Ｊカップリングしている箇所を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｂｒａｉｎ  ＰＩ４Ｐ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、アラバマ、米国）のＮＭＲスペクトルから観察された化学構造を示す。１−ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオ−イノシトール−４’−モノホスフェート）の構造式および１Ｈ−１Ｄ、ＴＯＣＳＹスペクトルのシグナルから観察された化学構造を示す。脂肪酸、グリセロールおよびイノシトールのシグナルが一通り観測された。Ｃ１のＣＨ２は磁気的非等価であった。アラキドン酸のａＣＨ２、ｂＣＨ２およびｇＣＨ２は分離して観測された。
【図４Ｃ】図４Ｃは、実施例1の試料１（１６：０  ＬＰＩ４Ｐ）の１Ｈ−１Ｄ、ＴＯＣＳＹ  スペクトルから観察された化学構造を示す。１６：０  ＬＰＩ４Ｐの構造式および１Ｈ−１Ｄ、ＴＯＣＳＹスペクトルから観察された化学構造を示す。脂肪酸、グリセロール骨格のＣ１およびＣ３のシグナルが観測された。４ｐｐｍ前後の領域に、イノシトール環と考えられるシグナルが、弱く観測された。多価不飽和脂肪酸のシグナルは観測されなかった。
【図４Ｄ】図４Ｄは、実施例1の試料２（１７：０  ＬＰＩ（４，５）Ｐ２）の１Ｈ−１Ｄ、ＴＯＣＳＹスペクトルから観察された化学構造を示す。１７：０  ＬＰＩ（４，５）Ｐ２の構造式および１Ｈ−１Ｄ、ＴＯＣＳＹスペクトルのシグナルから観察された化学構造を示す。脂肪酸、グリセロール骨格のＣ１およびＣ３のシグナルが観測された。Ｃ１、Ｃ３、ａＣＨ２（およびｂＣＨ２）のマイナーシグナルが観測された。４ｐｐｍ前後の領域に、イノシトール環と考えられるシグナルが、弱く観測された。
【図４Ｅ】図４Ｅは、実施例1の試料３（１８：０  ＬＰＩ（４，５）Ｐ２）の１Ｈ−１Ｄ、ＴＯＣＳＹスペクトルから観察された化学構造を示す。１８：０  ＬＰＩ（４，５）Ｐ２の構造式および１Ｈ−１Ｄ、ＴＯＣＳＹスペクトルのシグナルから観察された化学構造を示す。脂肪酸、グリセロール骨格のＣ１およびＣ３のシグナルが観測された。Ｃ１、Ｃ３、ａＣＨ２（およびｂＣＨ２）のマイナーシグナルが観測され、これは、試料１および２よりも弱かった。４ｐｐｍ前後の領域に、イノシトール環と考えられるシグナルが、弱く観測された。
【図４Ｆ】図４Ｆは、実施例1の試料５（１７：０／２０：４  ＰＩ（４，５）Ｐ２）の１Ｈ−１Ｄ、ＴＯＣＳＹスペクトルから観察された化学構造を示す。１７：０／２０：４  ＰＩ（４，５）Ｐ２の構造式および１Ｈ−１Ｄ、ＴＯＣＳＹスペクトルのシグナルから観察された化学構造を示す。脂肪酸、グリセロール骨格のＣ１、Ｃ２、Ｃ３のシグナルが観測された。アラキドン酸のａＣＨ２、ｂＣＨ２、ｇＣＨ２が、分離して観測された。多価不飽和脂肪酸（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−）のシグナルはほとんど観測されなかった。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｄにおいて、本発明の化合物について、生物試料（培養癌細胞株）における存在に関するデータを示す。図５ＡはＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＬＰＩＰｓが存在することを示す。縦軸はホスファチジルセリン（ＰＳ）１ｎｍｏｌに対する化合物の存在量（ｐｍｏｌ）を表し、横軸は、分子種を表す。
【図５Ｂ】図５ＢはＪｕｒｋａｔ細胞にＬＰＩＰｓが存在することを示す。縦軸はホスファチジルセリン（ＰＳ）１ｎｍｏｌに対する化合物の存在量（ｐｍｏｌ）を表し、横軸は、分子種を表す。
【図５Ｃ】図５ＣはＨＥＫ２９３Ｔ細胞に存在するＬＰＩＰ３とそのフラグメントの精密質量測定結果を示す。縦軸は相対的存在量を示し、横軸はｍ／ｚ（質量／電荷数）を示す。
【図５Ｄ】図５ＤはＨＥＫ２９３Ｔ細胞に存在するＬＰＩＰ３とそのフラグメントの溶出時間の一致を示す。縦軸は相対的存在量を示し、横軸は時間（分）を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｄにおいて、本発明の化合物について、生物試料（マウス、ヒト）における存在に関するデータを示す。図６Ａはマウス心臓、大腸、肝臓、脳（全脳）、脾臓にＬＰＩＰｓが存在することを示す。縦軸はホスファチジルセリン（ＰＳ）１ｎｍｏｌに対する化合物の存在量（ｐｍｏｌ）を表し、横軸は細胞の種類を表す。
【図６Ｂ】図６Ｂはマウス血清にＬＰＩＰｓが存在することを示す。縦軸は血清１μＬに対する化合物の存在量（ｆｍｏｌ）を表し、横軸は、分子種を表す。
【図６Ｃ】図６Ｃはマウス血漿にＬＰＩＰｓが存在することを示す。縦軸は血漿１μＬに対する化合物の存在量（ｆｍｏｌ）を表し、横軸は、分子種を表す。
【図６Ｄ】図６Ｄはヒト血清にＬＰＩＰｓが存在することを示す。縦軸は血清１μＬに対する化合物の存在量（ｆｍｏｌ）を表し、横軸は、分子種を表す。
【図７Ａ】図７Ａは上段にマウス前立腺重量（縦軸は、重量（ｍｇ）を示し、横軸は、組織の種類を表す。）、下段に前立腺ＨＥ染色像を示しており、Ｐｔｅｎを欠損するマウスが前立腺癌を発症することを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、前立腺癌の発症に伴い、前立腺におけるＬＰＩＰｓレベルが上昇することを示す。縦軸はホスファチジルセリン（ＰＳ）１ｎｍｏｌに対するＬＰＩＰｓレベル（Ａ．Ｕ．（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔ））を表し、横軸のＣｔｒｌは、正常マウスを指し、ＰＴＥＮ  ＫＯは、がん抑制遺伝子Ｐｔｅｎを前立腺特異的に欠損するマウスを指す。
【図８】図８は、起炎性物質である補体成分５ａによる刺激に伴い、骨髄球でＬＰＩＰ３が生成されることを示す。縦軸は、１０６個の細胞に対するＬＰＩＰ３の存在量（ｐｍｏｌ）を示し、横軸の「−」は、補体成分５ａによる刺激がされていないことを指し、「＋」は、補体成分５ａによる刺激がされていることを指す。
【図９Ａ】図９Ａおよび図９Ｂは、キラルカラムによる１７：０／２０：４ホスホイノシタイドの分離を示す図である。各グラフは表示されるリン酸基のホスホイノシタイド試料を質量分析計で測定した場合のクロマトグラムであり、横軸は保持時間（分）を表し、縦軸はピークトップのシグナル強度（ｃｐｓ）を１００％としたときの相対的なシグナル強度を表す。図９Ａの左欄はＰＩ、中央の欄は、上から、ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）ＰおよびＰＩ（５）Ｐをそれぞれ示し、右欄はそれらの混合物（ＰＩＰ１ｍｉｘ）を示す。右から２番目の欄は、ＰＩ（３，５）Ｐ，ＰＩ（３，４）Ｐ２ＰＩ（４，５）Ｐ２およびそれらの混合物をそれぞれ示す。図９Ｂの左欄は、上からＰＩ（３，５）Ｐ２、ＰＩ（３，４）Ｐ２およびＰＩ（４，５）Ｐ２をそれぞれ示し、中央はそれらの混合物（ＰＩＰ２ｍｉｘ）を示し、右欄はＰＩ（３，４，５）Ｐ３を示す。
【図９Ｂ】図９Ａおよび図９Ｂは、キラルカラムによる１７：０／２０：４ホスホイノシタイドの分離を示す図である。各グラフは表示されるリン酸基のホスホイノシタイド試料を質量分析計で測定した場合のクロマトグラムであり、横軸は保持時間（分）を表し、縦軸はピークトップのシグナル強度（ｃｐｓ）を１００％としたときの相対的なシグナル強度を表す。図９Ａの左欄はＰＩ、中央の欄は、上から、ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）ＰおよびＰＩ（５）Ｐをそれぞれ示し、右欄はそれらの混合物（ＰＩＰ１ｍｉｘ）を示す。右から２番目の欄は、ＰＩ（３，５）Ｐ，ＰＩ（３，４）Ｐ２ＰＩ（４，５）Ｐ２およびそれらの混合物をそれぞれ示す。図９Ｂの左欄は、上からＰＩ（３，５）Ｐ２、ＰＩ（３，４）Ｐ２およびＰＩ（４，５）Ｐ２をそれぞれ示し、中央はそれらの混合物（ＰＩＰ２ｍｉｘ）を示し、右欄はＰＩ（３，４，５）Ｐ３を示す。
【図１０】図１０は、７種類の量（０．０２、０．０５、０．１、０．２、５、１０、５０ｐｍｏｌ）の表示されるリン酸基の１７：０／２０：４ホスホイノシタイドを、質量分析計で測定したとき（各注入量で４回繰り返し測定）のシグナル強度（ピーク面積）から作成した検量線を示す。４回繰り返し測定の平均を黒点で表し、標準偏差をエラーバーで表す。上段は左からＰＩ、ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐを示し、中段は左からＰＩ（５）Ｐ，ＰＩ（３，５）Ｐ，ＰＩ（３，４）Ｐ２を示し、下段は左より、ＰＩ（４，５）Ｐ２，ＰＩ（３，４，５），Ｐ３を示す。
【図１１】図１１は、表示されるリン酸基の１７：０／２０：４ホスホイノシタイド１０ｐｍｏｌを質量分析計で５０回繰り返し測定したときのシグナル強度（ｃｐｓ）の変動を示す。縦軸はシグナル強度（ｃｐｓ）を、横軸は注入回数を表す。１０回目の注入において、ＰＩ（３）Ｐは１番目に強いシグナル強度を与え、ＰＩ（４）Ｐは２番目に強いシグナル強度を与え、ＰＩ（５）Ｐは３番目に強いシグナル強度を与え、ＰＩ（３、４）Ｐ２は４番目に強いシグナル強度を与え、ＰＩ（３、５）Ｐ２は５番目に強いシグナル強度を与え、ＰＩは６番目に強いシグナル強度を与え、ＰＩ（４，５）Ｐ２は７番目に強いシグナル強度を与え、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３は最も弱いシグナル強度を与えた。
【図１２】図１２は、イオンモビリティによる１７：０／２０：４各ホスホイノシタイド（ＰＩ（３，４）Ｐ２、ＰＩ（３，５）Ｐ２、ＰＩ（４，５）Ｐ２）の分離を示す。横軸は補償電圧（ＣＯＶ、Ｖ）を表し、縦軸はシグナル強度（ｃｐｓ）を表す。それぞれのホスホイノシタイドの測定結果を重ね合わせて示している。
【図１３】図１３は、細胞をＨ２Ｏ２処理した場合の細胞のホスホイノシタイド組成の変化を、キラルカラムと質量分析計とを組み合わせて測定した結果として示す。各グラフにおいて、横軸は保持時間を表し、縦軸はピークトップのシグナル強度（ｃｐｓ）を１００％としたときの相対的なシグナル強度を表す。グラフは、上段から、Ｈ２Ｏ２処理０分時点、２分時点、５分時点、１５分時点の結果を表し、左から、ＰＩ、ＰＩＰ、ＰＩＰ２およびＰＩＰ３に相当する質量についての結果を表す。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜Ｄは、細胞をＨ２Ｏ２処理した場合の細胞のそれぞれのジアシルグリセロールごとのホスホイノシタイド組成の変化および各ホスホイノシタイド総量を、キラルカラム−質量分析計の測定結果から計算した定量値として示す。左欄のグラフにおいて、横軸はホスホイノシタイド中のジアシルグリセロールの種類を表し、縦軸は４回測定の平均として算出された細胞１０６個に含まれる各ホスホイノシタイドの量（ｐｍｏｌ）を標準偏差とともに表す。各ジアシルグリセロールの種類について、左からＨ２Ｏ２処理０分時点、２分時点、５分時点、１５分時点の結果を表す。右欄のグラフにおいて、縦軸は４回測定の平均として算出された細胞１０６個に含まれる同じリン酸置換を有するホスホイノシタイドの合計量（ｐｍｏｌ）を標準偏差とともに表し、横軸は左からＨ２Ｏ２処理０分時点、２分時点、５分時点、１５分時点の結果を表す。４回繰り返し測定の結果であり、繰り返し測定の平均を、標準偏差（エラーバー）とともに示す。一元配置分散分析、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いて統計処理した場合に、＊＊＊はｐ＜０．００１であることを、＊＊はｐ＜０．０１であることを、＊はｐ＜０．０５であることをそれぞれ表す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜Ｄは、細胞をＨ２Ｏ２処理した場合の細胞のそれぞれのジアシルグリセロールごとのホスホイノシタイド組成の変化および各ホスホイノシタイド総量を、キラルカラム−質量分析計の測定結果から計算した定量値として示す。左欄のグラフにおいて、横軸はホスホイノシタイド中のジアシルグリセロールの種類を表し、縦軸は４回測定の平均として算出された細胞１０６個に含まれる各ホスホイノシタイドの量（ｐｍｏｌ）を標準偏差とともに表す。各ジアシルグリセロールの種類について、左からＨ２Ｏ２処理０分時点、２分時点、５分時点、１５分時点の結果を表す。右欄のグラフにおいて、縦軸は４回測定の平均として算出された細胞１０６個に含まれる同じリン酸置換を有するホスホイノシタイドの合計量（ｐｍｏｌ）を標準偏差とともに表し、横軸は左からＨ２Ｏ２処理０分時点、２分時点、５分時点、１５分時点の結果を表す。４回繰り返し測定の結果であり、繰り返し測定の平均を、標準偏差（エラーバー）とともに示す。一元配置分散分析、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いて統計処理した場合に、＊＊＊はｐ＜０．００１であることを、＊＊はｐ＜０．０１であることを、＊はｐ＜０．０５であることをそれぞれ表す。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜Ｄは、細胞をＨ２Ｏ２処理した場合の細胞のそれぞれのジアシルグリセロールごとのホスホイノシタイド組成の変化および各ホスホイノシタイド総量を、キラルカラム−質量分析計の測定結果から計算した定量値として示す。左欄のグラフにおいて、横軸はホスホイノシタイド中のジアシルグリセロールの種類を表し、縦軸は４回測定の平均として算出された細胞１０６個に含まれる各ホスホイノシタイドの量（ｐｍｏｌ）を標準偏差とともに表す。各ジアシルグリセロールの種類について、左からＨ２Ｏ２処理０分時点、２分時点、５分時点、１５分時点の結果を表す。右欄のグラフにおいて、縦軸は４回測定の平均として算出された細胞１０６個に含まれる同じリン酸置換を有するホスホイノシタイドの合計量（ｐｍｏｌ）を標準偏差とともに表し、横軸は左からＨ２Ｏ２処理０分時点、２分時点、５分時点、１５分時点の結果を表す。４回繰り返し測定の結果であり、繰り返し測定の平均を、標準偏差（エラーバー）とともに示す。一元配置分散分析、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いて統計処理した場合に、＊＊＊はｐ＜０．００１であることを、＊＊はｐ＜０．０１であることを、＊はｐ＜０．０５であることをそれぞれ表す。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜Ｄは、細胞をＨ２Ｏ２処理した場合の細胞のそれぞれのジアシルグリセロールごとのホスホイノシタイド組成の変化および各ホスホイノシタイド総量を、キラルカラム−質量分析計の測定結果から計算した定量値として示す。左欄のグラフにおいて、横軸はホスホイノシタイド中のジアシルグリセロールの種類を表し、縦軸は４回測定の平均として算出された細胞１０６個に含まれる各ホスホイノシタイドの量（ｐｍｏｌ）を標準偏差とともに表す。各ジアシルグリセロールの種類について、左からＨ２Ｏ２処理０分時点、２分時点、５分時点、１５分時点の結果を表す。右欄のグラフにおいて、縦軸は４回測定の平均として算出された細胞１０６個に含まれる同じリン酸置換を有するホスホイノシタイドの合計量（ｐｍｏｌ）を標準偏差とともに表し、横軸は左からＨ２Ｏ２処理０分時点、２分時点、５分時点、１５分時点の結果を表す。４回繰り返し測定の結果であり、繰り返し測定の平均を、標準偏差（エラーバー）とともに示す。一元配置分散分析、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いて統計処理した場合に、＊＊＊はｐ＜０．００１であることを、＊＊はｐ＜０．０１であることを、＊はｐ＜０．０５であることをそれぞれ表す。
【図１５】図１５は、マウスを遺伝子改変した場合のマウスの甲状腺（臓器）におけるホスホイノシタイド組成の変化を、キラルカラムと質量分析計とを組み合わせて測定した結果として示す。各グラフにおいて、横軸は保持時間を表し、縦軸はピークトップのシグナル強度（ｃｐｓ）を１００％としたときの相対的なシグナル強度を表す。グラフは、上段から、野生型、ＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）、ＰＴＥＮ（＋／−）、およびＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）ＰＴＥＮ（＋／−）のマウスについての結果を表し、左から、ＰＩ、ＰＩＰ、ＰＩＰ２およびＰＩＰ３に相当する質量についての結果を表す。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜Ｃは、マウスを遺伝子改変した場合のマウスの甲状腺（臓器）におけるそれぞれのジアシルグリセロールごとのホスホイノシタイド組成の変化および各ホスホイノシタイド総量を、キラルカラム−質量分析計の測定結果から計算した定量値として示す。図１６ＡおよびＢのグラフにおいて、横軸はホスホイノシタイド中のジアシルグリセロールの種類を表し、縦軸は３回（野生型）、４回（ＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）、ＰＴＥＮ（＋／−）、およびＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）ＰＴＥＮ（＋／−））測定の平均として算出された組織１ｍｇに含まれる各ホスホイノシタイドの量（ｐｍｏｌ）を標準偏差とともに表す。各ジアシルグリセロールの種類について、左から野生型、ＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）、ＰＴＥＮ（＋／−）、およびＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）ＰＴＥＮ（＋／−）のマウスについての結果を表す。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜Ｃは、マウスを遺伝子改変した場合のマウスの甲状腺（臓器）におけるそれぞれのジアシルグリセロールごとのホスホイノシタイド組成の変化および各ホスホイノシタイド総量を、キラルカラム−質量分析計の測定結果から計算した定量値として示す。図１６ＡおよびＢのグラフにおいて、横軸はホスホイノシタイド中のジアシルグリセロールの種類を表し、縦軸は３回（野生型）、４回（ＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）、ＰＴＥＮ（＋／−）、およびＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）ＰＴＥＮ（＋／−））測定の平均として算出された組織１ｍｇに含まれる各ホスホイノシタイドの量（ｐｍｏｌ）を標準偏差とともに表す。各ジアシルグリセロールの種類について、左から野生型、ＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）、ＰＴＥＮ（＋／−）、およびＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）ＰＴＥＮ（＋／−）のマウスについての結果を表す。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜Ｃは、マウスを遺伝子改変した場合のマウスの甲状腺（臓器）におけるそれぞれのジアシルグリセロールごとのホスホイノシタイド組成の変化および各ホスホイノシタイド総量を、キラルカラム−質量分析計の測定結果から計算した定量値として示す。図１６Ｃのグラフにおいて、縦軸は３回（野生型）、４回（ＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）、ＰＴＥＮ（＋／−）、およびＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）ＰＴＥＮ（＋／−））測定の平均として算出された組織１ｍｇに含まれる同じリン酸置換を有するホスホイノシタイドの合計量（ｐｍｏｌ）を標準偏差とともに表し、横軸は左から野生型、ＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）、ＰＴＥＮ（＋／−）、およびＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）ＰＴＥＮ（＋／−）のマウスについての結果を表す。３回（野生型）、４回（ＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）、ＰＴＥＮ（＋／−）、およびＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）ＰＴＥＮ（＋／−））繰り返し測定の結果であり、繰り返し測定の平均を、標準偏差（エラーバー）とともに示す。一元配置分散分析、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いて統計処理した場合に、＊＊＊はｐ＜０．００１であることを、＊＊はｐ＜０．０１であることを、＊はｐ＜０．０５であることをそれぞれ表す。
【図１７】図１７は、カラムクロマトグラフィーによるリゾリン脂質のリン酸位置異性体の分離が可能であることを示す図である。各グラフにおいて、横軸は保持時間を表し、縦軸はピークトップのシグナル強度（ｃｐｓ）を１００％としたときの相対的なシグナル強度を表す。左欄は、上から、１７：０のリゾＰＩ（３）Ｐ、リゾＰＩ（４）Ｐ、リゾＰＩ（５）Ｐの結果を示す。右欄は、上から、１７：０のリゾＰＩ（３，５）Ｐ２、リゾＰＩ（３，４）Ｐ２、リゾＰＩ（４，５）Ｐ２の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１８】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【００１９】
（リン脂質）
本発明は、新規リン脂質、ならびにリン脂質であるホスホイノシタイドおよびリゾホスホイノシタイドをサブクラスで分離して測定、検出または同定する技術を提供する。
【００２０】
本明細書において、「ホスファチジルイノシトールリン酸」または「ホスファチジルイノシトールホスフェート」とは、交換可能に用いられ、グリセリン（プロパン-1,2,3-トリオール、グリセロールとも称する）のｓｎ−１位およびｓｎ−２位にアシル基が結合し、ｓｎ−３位に結合したイノシトールがＸ個リン酸化されているものをいう。リン酸基は１個、２個または３個結合することができ、この場合、「ホスファチジルイノシトールＸリン酸」（Ｘは一、二または三）と称する。本明細書では、各種ホスファチジルイノシトールＸリン酸を総称して「ホスホイノシタイド」、「ホスファチジルイノシトールリン酸類」または「ＰＩＰｓ」ともいう。リン酸基は、イノシトール上の位置で示すことができ、例えば、ホスファチジルイノシトール−３−一リン酸、ホスファチジルイノシトール−４−一リン酸、ホスファチジルイノシトール−５−一リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，５−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸などと表記する。
【００２１】
本発明において初めて、アシル基を保持したまま、このＰＩＰｓのリン酸基の位置を同定する方法が提供された。本発明において、本発明が提供する同定方法を用いることによって、生体中のＰＩＰｓのリン酸基の詳細な情報を理解することができることが示された。特に、アシル基を保持したままＰＩＰｓのリン酸基の情報を分析することができることから、真の意味で生体中の情報を分析できるという意味で本発明は従来技術では分析できなかった詳細な情報を提供する可能性を有する。なお、本発明では、特に断らない限り、イノシトールはｍｙｏイノシトールであり、脂肪酸の結合型はエステル型である。任意のアシル基およびリン酸基の位置（イノシトール上）を有するＰＩＰを製造することができ、例えば、Stuart  J．  Conway  et  al．，  Org．  Biomol．  Chem．，  2010，  ８，  ６６〜７６により任意の種類のＰＩＰを製造することができる。これまでホスホイノシタイドはRI-labelないしnon-labelの脱アシル化されたグリセロホスホイノシタイドの分離、もしくは特異的結合タンパク質による分子プローブ、抗体を用いることで分析されてきた。そういった意味では、インタクトなホスホイノシタイドを測定できる分析方法はいまだにない。従来ホスホイノシタイドの一種であるPIP3に関してはRPLC-MS/MSを用いた分析法が報告されているが、この分析法では3つのアイソマーが存在するPIP1とPIP2は分離することができず3アイソマーの総和で測定されている。
【００２２】
本明細書において、「リゾホスファチジルイノシトールリン酸」または「リゾホスファチジルイノシトールホスフェート」とは、交換可能に用いられ、ホスファチジルイノシトールから１個のアシル基が除去され、ｓｎ−３位に結合したイノシトールがＸ個リン酸化されているものをいう。リン酸基は１個、２個または３個結合することができ、この場合、「リゾホスファチジルイノシトールＸリン酸」（Ｘは一、二または三）と称する。本明細書では、各種リゾホスファチジルイノシトールＸリン酸を総称して「リゾホスホイノシタイド」、「リゾホスファチジルイノシトールリン酸類」または「ＬＰＩＰｓ」ともいう。リン酸基は、イノシトール上の位置で示すことができ、例えば、リゾホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸などと表記する。本発明において初めて、このＬＰＩＰｓを同定する方法が提供され、また、合成する方法も提供された。本発明において、本発明が提供する同定方法を用いることによって、生体にもＬＰＩＰｓが存在していることも示された。また、ＰＩＰｓと同様に、ＬＰＩＰｓについてもリン酸基の位置を同定することができた。なお、本発明では、特に断らない限り、イノシトールはｍｙｏイノシトールであり、脂肪酸の結合型はエステル型である。
【００２３】
本明細書において用語「ｓｎ−」は、Stereospecifically  Numberedの略で、グリセリン誘導体の炭素原子を立体特異的番号付けで表記したときに用いる。グリセリン誘導体がラセミ体のときはrac-をつけ、立体化学が不明のときはX-をつける。ＬＰＩＰｓは、そのアシル基の結合位置の相違により、ｓｎ−１−ＬＰＩＰｓあるいはｓｎ−２−ＬＰＩＰｓの２種類が存在する。実際の表示については、アシル基の位置をそのまま使用し、１−アシル−ホスファチジルイノシトールＸリン酸、２−アシル−ホスファチジルイノシトールＸリン酸のように使用する。本明細書においてｓｎに関する情報がない場合は、特に区別しないで説明するか総称（上位概念）として用いる場合である。
【００２４】
所望の脂肪酸さえ入手できれば、これを用いて対応するＰＩＰｓを製造し本発明の合成法に適用し所望の脂肪酸基を有するＬＰＩＰｓを製造することができる。
【００２５】
本発明において具体的な実施形態としては、以下を挙げることができる。
・一リン酸、sｎ−１位のもの
１−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸＜パルミチル＞；
１−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸＜パルミトレニイニル＞；
１−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸＜ステアリル＞；
１−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸＜オレイニル＞；
１−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸＜リノール酸＞；
１−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸＜γリノレン酸＞；
１−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸＜アラキドン酸＞；
１−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
１−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
・一リン酸、sｎ−２位のもの
２−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸＜パルミチル＞；
２−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸＜パルミトレニイニル＞；
２−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸＜ステアリル＞；
２−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸＜オレイニル＞；
２−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸＜リノール酸＞；
２−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸＜γリノレン酸＞；
２−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸＜アラキドン酸＞；
２−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
２−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール４−一リン酸；
・二リン酸、sｎ−１位のもの
１−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸＜パルミチル＞；
１−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸＜パルミトレニイニル＞；
１−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸＜ステアリル＞；
１−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸＜オレイニル＞；
１−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸＜リノール酸＞；
１−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸＜γリノレン酸＞；
１−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸＜アラキドン酸＞；
１−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
１−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
・二リン酸、sｎ−２位のもの
２−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸＜パルミチル＞；
２−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸＜パルミトレニイニル＞；
２−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸＜ステアリル＞；
２−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸＜オレイニル＞；
２−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸＜リノール酸＞；
２−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸＜γリノレン酸＞；
２−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸＜アラキドン酸＞；
２−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
２−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸；
・三リン酸、sｎ−１位のもの
１−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸＜パルミチル＞；
１−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸＜パルミトレニイニル＞；
１−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸＜ステアリル＞；
１−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸＜オレイニル＞；
１−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸＜リノール酸＞；
１−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸＜γリノレン酸＞；
１−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸＜アラキドン酸＞；
１−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
１−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
・三リン酸、sｎ−２位のもの
２−ブタニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−ヘキサニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−オクタニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−ヘキサデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸＜パルミチル＞；
２−９Ｚ−ヘキサデセニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸＜パルミトレニイニル＞；
２−ヘプタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−オクタデカニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸＜ステアリル＞；
２−９Ｚ−オクタデセニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸＜オレイニル＞；
２−９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸＜リノール酸＞；
２−６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカンジエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸＜γリノレン酸＞；
２−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサトリエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−イコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸＜アラキドン酸＞；
２−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサテトラエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸；
２−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエニル−リゾホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸
これらの脂肪酸または脂肪酸に基づくアシル基は、本発明の開示に基づいて、本発明のリゾホスファチジルイノシトールリン酸類においてｓｎ−１位またはｓｎ−２位のいずれにおいても結合した形式で入手可能であることが理解される。
【００２６】
本明細書において「アシル（基）」とは、当該分野において通常の意味で使用され、有機酸（カルボン酸；脂肪酸）からヒドロキシル基が除去されてつくられる基をいう。広義には、ホルミル基ＨＣＯ−，アセチル基ＣＨ３ＣＯ−，マロニル基−ＣＯＣＨ２ＣＯ−，ベンゾイル基Ｃ６Ｈ５ＣＯ−，シンナモイル基Ｃ６Ｈ５ＣＨ＝ＣＨＣＯ−などが含まれ、ケトン誘導体なども挙げられる。ホスファチジルイノシトールリン酸およびリゾホスファチジルイノシトールリン酸類に含まれるアシル基は、好ましい実施形態では、脂肪酸を形成することから脂肪酸基とも称される。本明細書では、脂肪酸は、その炭素数と二重結合の数で表すことができ、例えば、アラキドン酸は（２０：４）と表され得る。二重結合の位置をさらに特定する場合は、ｃｉｓやｔｒａｎｓの表示、またはＥまたはＺの表示について、すべての位置を特定するか、またはω３系、ω６系等の系統で表示することができる。
【００２７】
本明細書では一般に以下の脂肪酸およびそれに基づくアシル基が使用されるが、これらに限定されず、任意の鎖長、任意の二重結合を有する脂肪酸を使用することができることが理解される。例えば、炭素数について言えば、１以上、代表的には１〜３０、通常は４〜３０の範囲のものが挙げられ、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個等を挙げることができるが、これらに限定されない。また二重結合の個数は０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個等炭素数に応じて許容し得る任意の数を採用することができる。二重結合の位置は、ω−３系、ω−６系、ω−９系等が代表的であり、このほか、ω−５系や、ω−７系なども確認されており、これらの任意の入手可能なものを利用することができる。脂肪酸には三重結合が含まれていてもよく、その個数は０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個等炭素数に応じて許容し得る任意の数を採用することができる。
【００２８】
【表１】
2018016645.tif 000002
【００２９】
（分離技術：クロマトグラフィー、質量分析、イオンモビリティ分離）
本明細書において「クロマトグラフィー」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、媒体が物質のカラムまたはキャピラリー通路を均一に通過（浸透）するときに、媒体中の１種または複数の成分が選択的に遅延するプロセスを意味する。遅延は、バルク媒体（すなわち、移動相）が固定相（複数可）に対して移動するとき、１つまたは複数の固定相とこの媒体の間の混合物成分の分布によって生じる。「クロマトグラフィー」の例には、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、およびガスクロマトグラフィー（ＧＣ）が含まれる。１つの実施形態では、クロマトグラフィーを用いて、リン酸基の結合位置が識別され得る。
【００３０】
本明細書において「ガスクロマトグラフィー」または「ＧＣ」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、気体が物質のカラムまたはキャピラリー通路を均一に通過（浸透）するときに、気体中の１種または複数の成分が選択的に遅延するプロセスを意味する。遅延は、バルク気体（すなわち、移動相）が固定相（複数可）に対して移動するとき、１つまたは複数の固定相とこの気体の間の混合物成分の分布によって生じる。
【００３１】
本明細書において「液体クロマトグラフィー」または「ＬＣ」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、流体が物質のカラムまたはキャピラリー通路を均一に通過（浸透）するときに、流体溶液の１種または複数の成分が選択的に遅延するプロセスを意味する。遅延は、バルク流体（すなわち、移動相）が固定相（複数可）に対して移動するとき、１つまたは複数の固定相とこの流体の間の混合物成分の分布によって生じる。「液体クロマトグラフィー」の例には、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、イオンクロマトグラフィー（ＩＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）（高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）またはハイスループット液体クロマトグラフィーとも称される）が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「高速液体クロマトグラフィー」または「ＨＰＬＣ」（「高圧液体クロマトグラフィー」とも称される）は、固定相、典型的には高密度充填カラムを通して、加圧下で移動相を押し出すことにより分離度が向上する液体クロマトグラフィーを指す。好ましい実施形態では、ＨＰＬＣが利用される。充填剤の分離モードには、順相、逆相、分配、キラル、イオン交換、分子ふるい、アフィニティーカラム等が挙げられ、親水基、疎水基を分離する任意のカラムクロマトグラフィーが利用され得るが、中でも、キラル、逆相、順相、イオン交換カラムが好ましい。１つの好ましい実施形態では、キラルカラムを用いると、他のカラムを用いずにリン酸基の結合位置をすべて識別することができることが本発明において示されている。
【００３２】
キラルカラムとしては、例えば、多糖誘導体キラルカラム、タンパク質結合型キラルカラム、化学結合型光学活性クラウンエーテル型キラルカラム、クラウンエーテル型キラルカラム、両性イオン分子型カラムカラム、アニオン交換型キラルカラム、配位子交換型キラルカラム、ポリメタクリレート型キラルカラム、多糖誘導体キラルカラム（例えば、株式会社ダイセル（大阪、日本）から販売されるもの）を挙げることができるがそれらに限定されない。
【００３３】
液体クロマトグラフィーでの分析において、試料または試料の成分は、入口でＬＣカラムに適用され、溶媒または溶媒混合物と共に溶出され、および出口で排出されてもよい。種々の溶媒モードが、目的とする分析物（複数可）を溶出するために選択され得る。例えば、液体クロマトグラフィーは、勾配モード、アイソクラチックモード、または多型（すなわち混合）モードを用いて行ってもよい。クロマトグラフィー中、材料の分離は、溶離液（「移動相」ともいう）、溶出モード、勾配条件、温度等の選択などの変数により影響される。
【００３４】
本明細書において「イオンモビリティ分離（ＩＭＳ）」とは、イオン化された化合物を、その嵩高さ（衝突断面積）によって分離する手法であり、単独でまたは質量分析またはクロマトグラフィーなどと組み合わせて用いられる。1950年代に開発された移動度によりイオンを分離する技術であり、爆発物の検出などに広く用いられている。ＩＭＳでは、代表的に、比較的高圧（大気圧から数ｍｂａｒ）のガスセル内を、電場によりイオンが移動する際に、イオンと中性ガス分子が衝突することにより決定される移動度に応じて分離を行う。例示として、DMS型（Differential  ion  Mobility  Spectrometry）も利用され得る。例示的な実施形態では、気体状のイオンがＮ２ガスで満たされたＩＭＳセルを通過する際、嵩高い化合物ほどN2分子との衝突が頻繁に起こり、移動度が低下する。それにより生じる通過時間（Drift  Time）の差により化合物を分離することができる。質量分析（MS）と組み合わせることで、分子量が同一の成分の分離分析や、イオンの立体構造の解析を行うことができる。
【００３５】
本明細書において「質量分析」または「ＭＳ」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、化合物をその質量により同定するための分析手法を指し、原子、分子、クラスター等の粒子を何らかの方法で気体状のイオンとし（イオン化）、真空中で運動させ電磁気力等を用いて、あるいは飛行時間差等によりそれらイオンを質量電荷比に応じて分離・検出する技術をいう。ＭＳは、イオンをこの質量対電荷比、すなわち「ｍ／ｚ」に基づきフィルタし、検出し、および測定する方法を指す。近年の検出感度や質量分解能の飛躍的な向上に伴い、益々その応用範囲が広がり、多くの分野で活用されている。代表的には、Clark  J  et  al.，  Nat  Methods.  2011  March  ;  8(3):  267-272.doi:10.1038/nmeth.1564.に例示される方法を用いることができる。ＭＳ技術は、一般には、（１）化合物をイオン化して荷電化合物を形成するステップ：および（２）荷電化合物の分子量を検出し、質量対電荷比を計算するステップを含む。化合物は、適切な手段によりイオン化および検出し得る。「質量分析計」は、一般には、イオン化装置、質量分析器およびイオン検出器を含む。一般に、目的とする１つまたは複数の分子がイオン化され、イオンはこの後、質量分析機器に導入され、ここでイオンは、磁場および電場の組み合わせのために、質量（「ｍ」）および電荷（「ｚ」）に依存する空間中の経路を辿る。質量分析計についての総説は、例えば、Jurgen  H、「マススペクトロメトリー」、丸善出版（２０１４）を参照のこと。質量分析計には、例えば、磁場型、四重極型、飛行時間型等が挙げられるが、定量性が良く、ダイナミックレンジが広く直線性が良好な四重極型を使用することが好ましい。定量におけるイオンの検出は、目的とするイオンのみを選択的に検出する、選択イオンモニタリングや、１つ目の質量分析部で精製したイオン種のうち１つを前駆イオンとして選択し、２つ目の質量分析部で、その前駆イオンの開裂によって生じるプロダクトイオンを検出する、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）等が挙げられる。ＳＲＭでは、選択性が増し、ノイズが減ることによってシグナル／ノイズ比が向上する。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、用語「分解能」または「分解能（ＦＷＨＭ）」（「ｍ／Δｍ50%」としても当技術分野で公知の）は、最大高さの５０％での質量ピークの幅（全幅半値、「ＦＷＨＭ」）で除した観察された質量対電荷比を指す。本発明でも、分解能が高い分析器を用いることが好ましい。分解能が高くなるほど、定性性および定量性が良くなり得る。
【００３７】
実際の配置では、バルブおよびコネクター配管の慎重な選択により、２つ以上のクロマトグラフィーカラムは、いずれの手動ステップも必要とすることなく材料が次から次へと通過するように、必要に応じて接続されてもよい。好ましい実施形態において、バルブおよび配管の選択は、必要なステップを実行するように予めプログラムされたコンピュータにより制御される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムはまた、このようなオンライン方式で検出システム、例えば、ＭＳシステムにも接続される。故に、オペレーターは、試料のトレーをオートサンプラーに入れ得、残りのオペレーションはコンピュータ制御下で行われ、選択された全ての試料の精製および分析をもたらす。
【００３８】
本明細書において、「クロマトグラフィー−質量分析（Ｃ−ＭＳ）」とは、クロマトグラフ（例えば、ガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフなど）と質量分析計とを組み合わせた装置を用いて行う分析方法を意味する。例えば、質量分析部が複数結合したタンデム型の質量分析（Ｃ−ＭＳ／ＭＳ）等も用いることもできる。Ｃ−ＭＳにおけるイオン化を行う場合、例えば、大気圧化学イオン化法、ＥＳＩ、大気圧光イオン化法等を利用することができる。
【００３９】
本明細書において、「液体カラムクロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）」とは、液体クロマトグラフと質量分析計とを組み合わせた装置を用いて行う分析方法を意味する。例えば、質量分析部が複数結合したタンデム型の質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）等も用いることもできる。ＬＣ−ＭＳにおけるイオン化を行う場合、例えば、大気圧化学イオン化法、ＥＳＩ、大気圧光イオン化法等を利用することができる。
【００４０】
本明細書において、「イオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）」とはイオンモビリティ分離（ＩＭＳ）と質量分析計とを組み合わせた装置を用いて行う分析方法を意味する。例えば、質量分析部が複数結合したタンデム型の質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ／ＭＳ）等も用いることもできる。ＩＭＳ−ＭＳにおけるイオン化を行う場合、例えば、大気圧化学イオン化法、ＥＳＩ、大気圧光イオン化法等を利用することができる。ＩＭＳ−ＭＳは、質量分析計だけでは不可能なｍ／ｚが同一の妨害成分の分離や、イオンの立体構造解析を可能とし、より特異的で詳細な情報を科学者にもたらすことができる。
【００４１】
本明細書において、「測定」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、ある対象について、量がどれほどか測って求めることをいう。本明細書において「検出」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、物質や成分等を検査して見つけだすことをいい、「同定」とは、ある対象について、そのものにかかわる既存の分類のなかからそれの帰属先をさがす行為をいい、化学分野において使用される場合、対象となる物質の化学物質としての同一性を決定する（例えば、化学構造を決定する）ことをいい、「定量」とは、対象となる物質の存在する量を決定することをいう。
【００４２】
本明細書において、「ラン」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、質量分析、クロマトグラフィーおよびイオンモビリティ分離などの分離手段において試料をローディングし、試料中の成分を分離し、必要に応じて洗浄するまでの一連の工程を指す。通常、異なる試料は、混同を避けるために異なるランにおいて測定される。測定対象が複数存在する場合、同一のランにおいて全ての測定対象を測定できることが有利であるが、試料中の測定対象ごとの測定系に対する適応性、ダイナミックレンジおよび分離度などを考慮してランは複数に分割してもよい。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、体液試料中の分析物の「量」は、一般には、試料の体積中で検出し得る分析物の質量を反映する絶対値を指す。しかし、量は、別の分析物量と比較した相対量も企図する。例えば、試料中の分析物の量は、試料中に通常存在する分析物の対照レベルまたは正常レベルより大きい量であってもよい。
【００４４】
用語「約」は、イオンの質量の測定を含まない定量的測定に関連して本明細書で使用されるとき、示された値プラスまたはマイナス１０％を指す。質量分析機器は、所与の分析物の質量の決定においてわずかに異なり得る。イオンの質量またはイオンの質量／電荷比との関連において用語「約」は、＋／−０．５原子質量単位を指す。
【００４５】
本明細書において「アルキルアミン」とは、アミン（ＮＨ２−）基が結合したアルキル基をいう。代表的には、メチルアミン、エチルアミン、プロパンアミン等を挙げることができるがこれらに限定されない。脂肪族アミンまたはアミノアルカンともいう。
【００４６】
本明細書において「陰イオン交換樹脂」とは、当該分野において通常の意味で用いられ、代表的には樹脂の表面に塩基性の基が結合され、陰イオンと結合する性質を有するため陰イオンの濃縮等をすることができる。
【００４７】
本明細書において「酸性リン脂質」とは、リン脂質のうち、リン酸基の陰性電荷が塩基によって打ち消されていないリン脂質をいい、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）などが該当する。
【００４８】
本明細書において、リン酸基の「保護基」とは、当該分野において使用される任意の物を使用することができる。保護基については、例えば、Clark  J  et  al，  Nat  Methods.  2011  March;8(3):267-272.doi:10.1038/nmeth.1564.に例示されており、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などを挙げることができる。
【００４９】
本明細書において「ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび/またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件」とは、ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートからアシル基などの構成要素が分解し、脱離しない条件をいう。「ホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件」は、ホスファチジルイノシトールホスフェートからアシル基などの構成要素が分解し、脱離しない条件であり、「リゾホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件」は、リゾホスファチジルイノシトールホスフェートからアシル基などの構成要素が分解し、脱離しない条件であり、「ホスファチジルイノシトールホスフェートおよびリゾホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件」とは、ホスファチジルイノシトールホスフェートおよびリゾホスファチジルイノシトールホスフェートからアシル基などの構成要素が分解し、脱離しない条件である。このような条件は、試料をそのままクロマトグラフィー、イオンモビリティ分離またはＭＳに適用することのほか、脱アシル化処理を含まない条件で他の処理を行ってクロマトグラフィー、イオンモビリティ分離またはＭＳに適用できる試料を調製することを含み、このほか、例えば、試料を変性させる処理を行わないこと、リン酸基に保護基を導入する処理を行うことが含まれる。
【００５０】
本明細書において「脱アシル化処理を行わない」とは、脱アシル化、例えば、ホスホリパーゼＡ類（ホスホリパーゼＡ１、Ａ２等）による処理、メチルアミン等のアルキルアミンの存在下での処理（脱ジアシル化条件を開示するSerunian,  et  al.,  Methods  in  Enzymol.  Vol.,  198,  1991,  pp.  78-87、特にpp.82-83、およびFujii  et  al.  Folia  Pharmacol  Jpn.  Vol.  142,  2013,  pp.  236-240、特にpp.238-239を参照のこと）を行わないことを言う。
【００５１】
本明細書において、「インタクトな（試料）」とは、分析対象となる試料を想定した場合、その試料を変性させないことをいう。試料の変性として、加熱による変性、空気中の酸素、湿気、熱、光、金属イオン、微生物または酵素などの作用による酸化、水系溶媒中における加水分解等が挙げられる。インタクトな状態であるためには、例えば、試料を調製後速やかに凍らせてその後の操作を行うまで−８０℃で保管することなどが挙げられる。
【００５２】
本明細書において、「標識しない」、「標識せずに」とは、分析対象となる試料に標識を付さないことを言う。本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（例えば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。本発明のマーカーまたはそれを捕捉する因子または手段を複数、蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
【００５３】
本明細書において「診断」とは、被験体における疾患、障害、状態（例えば、脂質メディエーターに起因する疾患、障害、状態等）などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「早期診断」、「予測診断」、「事前診断」等を含む。本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。本発明の技術は、このような診断技術に応用可能である。本発明の技術を用いてホスホイノシタイドおよび／またはリゾホスホイノシタイドの存在またはそのリン酸基の位置を特定して、このような各種診断に応用することができる。
【００５４】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害（例えば、がん等の障害、脂質メディエーターに起因する疾患、障害等）について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいい、患者の疾患、もしくは疾患に伴う1つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。事前に診断を行って適切な治療を行うことは「コンパニオン治療」といい、そのための診断薬を「コンパニオン診断薬」ということがある。本発明の技術を用いてホスホイノシタイドおよび／またはリゾホスホイノシタイドの存在またはそのリン酸基の結合位置を特定できると、特定の疾患状態と関連づけられ得ることからこのようなコンパニオン治療またはコンパニオン診断において有用であり得る。
【００５５】
本明細書において「予防」とは、ある疾患または障害（例えば、がん、脂質メディエーターに関連する疾患や障害など）について、そのような状態になる前に、そのような状態にならないようにすることをいう。本発明のＰＩＰｓおよび／またはＬＰＩＰｓを用いて、診断を行い、必要に応じて本発明の薬剤を用いて例えば、疾患等の予防をするか、あるいは予防のための対策を講じることができる可能性が有る。本明細書において「予防薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、がん、脂質メディエーターに関連する疾患や障害など）を予防できるあらゆる薬剤をいう。
【００５６】
本明細書において「予後」という用語は、がん等の障害、脂質メディエーターに起因する疾患、障害などに起因する死亡または進行が起こる可能性を予測することを意味する。予後因子とは疾患の自然経過に関する変数のことであり、これらは、いったん疾患を発症した患者の再発率等に影響を及ぼす。予後の悪化に関連した臨床的指標には、例えば、本発明で使用される任意の細胞指標が含まれる。予後因子は、しばしば、患者を異なった病態をもつサブグループに分類するために用いられる。本発明の技術を用いてホスファチジルイノシトールおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールの存在またはそのリン酸基の結合位置を特定できると、特定の疾患状態と関連づけられ得ることから予後因子を提供する技術として有用であり得る。
【００５７】
本明細書において「検出機器（機）（器）」とは、広義には、目的の対象を検出または検査することができるあらゆる機器をいう。本発明では、クロマトグラフィー、イオンモビリティ分離装置および質量分析器なども検出機器に含まれる。
【００５８】
本明細書において「診断機器（機）（器）」とは、広義には、目的の状態（例えば、がん、脂質メディエーターに関連する疾患や障害など）を診断できるあらゆる薬剤をいう。
【００５９】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではagentに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質（抗体等も含む）、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。
【００６０】
本明細書において「検出薬（剤）」または「検査薬（剤）」とは、広義には、目的の対象を検出または検査することができるあらゆる薬剤をいう。
【００６１】
本明細書において「診断薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、がん、脂質メディエーターに関連する疾患や障害など）を診断できるあらゆる薬剤をいう。
【００６２】
本明細書において「治療薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、がん、脂質メディエーターに関連する疾患や障害など）を治療できるあらゆる薬剤をいう。
【００６３】
本明細書において「がん」とは、本発明のマーカーで検出可能な任意のがんをいい、例えば、肝細胞がん、食道扁平上皮がん、乳がん、膵がん、頭頸部の扁平細胞がんまたは腺がん、結腸直腸がん、腎がん、脳がん（腫瘍）、前立腺がん、小細胞および非小細胞肺がん、膀胱がん、骨または関節がん、子宮がん、子宮頸がん、多発性骨髄腫、造血器悪性腫瘍、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚がん、メラノーマ、扁平細胞がん、白血病、肺がん、卵巣がん、胃がん、カポジ肉腫、喉頭がん、内分泌がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、下垂体がん、副腎がん、胆管細胞がん、子宮内膜症、食道がん、肝がん、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵がん、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬが含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
本明細書において「炎症」とは、本発明のマーカーで検出可能な任意の炎症をいい、マクロファージ等炎症に関連する血液細胞の活性化（炎症細胞の走化性、活性酸素産生、貪食、酵素分泌反応など）を伴い得る。例示的な炎症として、例えば、関節炎、腱炎、滑液包炎、乾癬、嚢胞性線維症、シェーグレン症候群、巨細胞性動脈炎、進行性全身性硬化症（強皮症）、脊椎炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、天疱瘡、類天疱瘡、橋本甲状腺炎、胆管炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎）、大腸炎、炎症性皮膚疾患、肺炎、石綿肺、珪肺、気管支拡張症、滑石肺、塵肺、サルコイドーシス、遅延型過敏反応（例えば、ツタウルシ皮膚炎）、気道の炎症、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、脳炎、即時型過敏反応、喘息、花粉症、アレルギー、急性アナフィラキシー、再灌流傷害、関節リウマチ、糸球体腎炎、腎盂腎炎、蜂巣炎、膀胱炎、胆嚢炎、同種移植片拒絶反応、宿主対移植片拒絶、虫垂炎、動脈炎、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、子宮頸管炎、胆管炎、絨毛羊膜炎、結膜炎、涙腺炎、皮膚筋炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、全腸炎、上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、回腸炎、虹彩炎、喉頭炎、脊髄炎、心筋炎、腎炎、臍炎、卵巣炎、精巣炎、骨炎、中耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、肺炎、直腸炎、前立腺炎、鼻炎、卵管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜炎、睾丸炎、扁桃炎、尿道炎、膀胱炎、ブドウ膜炎、膣炎、血管炎、外陰炎、外陰膣炎、血管炎、骨髄炎、視神経炎、脊髄炎、および筋膜炎などの、急性または慢性の炎症を伴う疾患または障害が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書において「がんマーカー」とは、腫瘍マーカーとも称され、がんの診断や治療後の経過観察、再発や転移の発見に有効な生体物質または生体において見出される物質をいう。代表的には血中の物質を測定することで、がんの診断等を行うことができることができる。この場合その血中の物質ががんマーカーに該当する。
【００６６】
本明細書において「マーカー」とは、ある状態（例えば、機能性、形質転換状態、疾患状態、障害状態、あるいは増殖能、分化状態のレベル、有無等）にあるかまたはその危険性があるかどうかを追跡する示標となる物質をいう。本明細書において「疾患マーカー」とは、疾患状態にあるかまたはその危険性があるかどうかを追跡する示標となる物質をいう。本発明において、ある状態（例えば、疾患状態、健康状態、細胞または組織の分化障害などの疾患）についての検出、診断、予備的検出、予測または事前診断は、本発明が提供する検出方法の他、マーカーに特異的な薬剤、剤、因子または手段、あるいはそれらを含む組成物、キットまたはシステム等を用いて実現することができる。
【００６７】
本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、ＤＮＡワクチン、核酸構築物、プラスミドＤＮＡなどの核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも85重量％、よりさらに好ましくは少なくとも95重量％、そして最も好ましくは少なくとも98重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質または生物学的因子は、好ましくは「精製された」物質である。本明細書で使用される「単離された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子が実質的に除去されたものをいう。本明細書中で使用される用語「単離された」は、その目的に応じて変動するため、必ずしも純度で表示される必要はないが、必要な場合、好ましくは少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも85重量％、よりさらに好ましくは少なくとも95重量％、そして最も好ましくは少なくとも98重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質は、好ましくは「単離された」物質または生物学的因子である。
【００６８】
一般的に、本発明の組成物、医薬、剤（治療剤、予防剤等）等は、治療有効量の医薬または有効成分、および薬学的に許容しうるキャリアもしくは賦形剤を含む。本明細書において「薬学的に許容しうる」は、動物、そしてより詳細にはヒトにおける使用のため、政府の監督官庁に認可されたか、あるいは薬局方または他の一般的に認められる薬局方に列挙されていることを意味する。
【００６９】
本発明の一実施形態において「患者」は、ヒトが主に想定されるが、適用可能である限りヒトを除く哺乳動物であってもよい。
【００７０】
本明細書において「被験体（者）」とは、本発明の予防、治療等の対象となる対象をいい、ヒト、またはヒトを除く哺乳動物（例えば、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、またはチンパンジー等の1種以上）を含む。
【００７１】
本明細書において「キット」とは、通常2つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、試薬、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、試薬、標識などをどのように使用するか、あるいは、どのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、検査薬、診断薬、治療薬、試薬、標識等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。検査機器、診断機器等を組み合わせる場合は、「キット」は「システム」として提供され得る。
【００７２】
本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、マーカーの検出および判断する方法を指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（package  insert）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【００７３】
（好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
【００７４】
＜リゾホスファチジルイノシトールリン酸類（ＬＰＩＰｓ）＞
１つの局面において、本発明は、リゾホスファチジルイノシトール一リン酸（lyso-phosphatidylinositol  monophosphate(ＬＰＩＰ１)）、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸（lyso-phosphatidylinositol  bisphosphate(ＬＰＩＰ２)）またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸（lyso-phosphatidylinositol  trisphosphate(ＬＰＩＰ３)）である化合物を提供する。ホスファチジルイノシトールリン酸類の研究は比較的早期からなされており、近年では相当程度の内容が判明するに至っている（佐々木ら、医学のあゆみ  Vol.  248,  No.  13,  (2014)pp.1039-1049）。ホスホイノシタイド／イノシ卜ールリン脂質（ＰＩＰｓ）は形質膜，オルガネラ膜を構成するといわれており、そのヘッドグループは炭素６員環と多価のリン酸基により他のグリセロリン脂質と比較してきわだって大きく、また、電荷に富むＰＩＰｓ代謝系は増殖、分化、運動、老化、死といった幅広い生命現象に関与するとされている。したがって、本発明において初めて同定された本発明の脂質（ＬＰＩＰｓ）そのものや、その代謝酵素や受容体などは、多様な疾患治療薬の標的として、また、疾患マーカーとして有用であり得る。また、脂質代謝は重要な研究対象の一つであるため試薬として、これらの脂質が実験用試薬として利用される。
【００７５】
ＰＩＰｓのリゾ体（ＬＰＩＰｓ）については、従来測定が不可能であったことから、同定された報告はない。本発明において、本発明者らは、ＤＥＡＥ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ等の陰イオン交換樹脂による酸性リン脂質の濃縮、次いでＴＭＳジアゾメタンによるリン酸基の保護、次いで三連四重極質量分析計でのＳＲＭ法の組合せによる解析方法を開発した。この方法を用いることで、既知のイノシトールリン脂質とは異なる構造体である本発明のＬＰＩＰ１、ＬＰＩＰ２、ＬＰＩＰ３を見出すことに成功した。また、ＬＰＩＰｓについては、合成法も知られていなかったことから、製造することもできなかった。したがって、一般的な化学物質の命名規則で記載はできるものの、ＬＰＩＰｓは物質として存在が確認されておらず、知られていなかったといえる。本発明では、ＬＰＩＰｓを検出し同定することができる技術を開発することによって、生体内においてＬＰＩＰｓが存在すること（ここで、生体内に存在するものは「天然型ＬＰＩＰｓ」ともいう。）を見出し、また、合成法も開発することができ、生体内に存在するＬＰＩＰｓの提供の他、合成することによって「非天然型」ＬＰＩＰｓを含むＬＰＩＰｓについても提供することができるようになった。
【００７６】
ＬＰＩＰｓは、生体内に存在することも本発明において示された。例えば、実施例において示されるように、種々の哺乳動物培養細胞株やマウス前立腺癌組織において見出され、ＬＰＩＰ３等の特定の分子種ではがん細胞において優先的に発現しているようであることも明らかになった。また、見出されたＬＰＩＰｓの何種類かは、がんに特異的にまたは優先的に発現していることが見出された。ＬＰＩＰｓと類似の構造を有するＰＩＰｓについては、従来解析が進んでおり、例えば、がん抑制遺伝子ＰＴＥＮの変異や発現低下は、ヒト癌の約半数に認められる頻度の高い異常であることが知られている。現在のところ、ＰＴＥＮが分解する（ＰＴＥＮの基質である）ＰＩＰ３の変動が発癌、進展と関連あると考えられているが、実際にＰＩＰ３の変動を示した報告はほとんど存在せず（Thanh-Trang  T.  Vo  and  David  A.  Fruman,  Cancer  Discov;  5(7);  697-700,  2015;  Kofuji  et  al.,  Cancer  Discov;  5(7);  730-9.  2015）、本発明のＬＰＩＰｓが、がんの脂質メディエーターとして働いている可能性も考えることができる。また、高感度測定によって、ＬＰＩＰｓは細胞内のみならず細胞外にも存在することが分かった。血液や尿など採取が比較的容易な検体でこれらの脂質を測定することは、検査医学的にも有用である。
【００７７】
ＰＩＰｓの変動（例えば、代謝、分解等）については、測定技術が未熟であったことから、未解明のままであるものが多い。本発明において新規の物質としてＬＰＩＰｓが見出され、かつ、ＬＰＩＰｓにおいてがんに優先的に発現するものがあることが判明したことから、がんまたはその他の脂質メディエーターが関連する疾患において血液、尿等の検体を用いて医療検査や診断に応用することができる。一般にリン脂質の対応するリゾ体への代謝にはホスホリパーゼＡ類（ホスホリパーゼＡ１、Ａ２等）が関与することが知られているが、ホスホリパーゼＡ１、Ａ２は基質特異性がきわめて高く、異なる型のリン脂質には反応しない。例えば、ホスファチジルコリンを基質とするサブタイプのものはホスファチジルセリンには反応しないとされている。また、ＰＩＰｓを基質とするものは知られていない。本発明により、リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、およびリゾホスファチジルイノシトール三リン酸が見出された。生体内に見いだされた「リゾホスファチジルイノシトール一リン酸」については、リン酸基は４位であり、ｓｎ−１位またはｓｎ−２位に以下の脂肪酸が結合している種が見出された：１６：０、１６：１（９Ｚ）、１８：０、１８：１（９Ｚ）、１８：２（９Ｚ，１２Ｚ）、２０：３（８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）、２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）、２２：４（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ）、２２：５（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）、２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）。生体内に見いだされた「リゾホスファチジルイノシトール二リン酸」については、リン酸基は４，５位であり、ｓｎ−１位またはｓｎ−２位に以下の脂肪酸が結合している種が見出された：１６：０、１６：１（９Ｚ）、１８：０、１８：１（９Ｚ）、１８：２（９Ｚ，１２Ｚ）、１８：３（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）、２０：３（８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）、２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）。生体内に見いだされた「リゾホスファチジルイノシトール三リン酸」については、ｓｎ−１位またはｓｎ−２位に以下の脂肪酸が結合している種が見出された：１６：０、１６：１（９Ｚ）、１８：０、１８：１（９Ｚ）、２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）。これらの分子種は、ＰＩＰｓにおいて見出される脂肪酸種と類似していることから、ホスファチジルイノシトールリン酸塩に対して特異性を有する、従来知られていないホスホリパーゼＡ１またはホスホリパーゼＡ２の存在が示唆される。上記脂肪酸の分子種については、存在量の多寡はあるものの生体内においてｓｎ−１およびｓｎ−２のいずれにも見出されるようである。
【００７８】
１つの実施形態において、本発明は、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール三リン酸、または２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール三リン酸である化合物を提供する。アシル基としては、対応する脂肪酸が入手可能である限り、どのような種類のアシル基でもよい。本発明のリゾホスファチジルイノシトールリン酸類は、ホスファチジルイノシトールリン酸類を出発材料として製造することができることが本発明において見出されている。したがって、本明細書において引用したＣｏｎｗａｙの方法をもとに、入手した脂肪酸をホスファチジルイノシトールリン酸類に導入することによって、本発明のリゾホスファチジルイノシトールリン酸類の製造法の出発材料として用いることができる。
【００７９】
１つの好ましい実施形態では、本発明は、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール三リン酸または２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール三リン酸である化合物を提供する。
【００８０】
本発明の化合物は、リゾホスファチジルイノシトールリン酸類においてリン酸基はイノシトールにおける任意の場所に結合したものを利用することができ、好ましくは、３位、４位および５位のうち１つ、２つまたは３つの位置に結合したものを用いることができる。したがって、３−一リン酸型、４−一リン酸型、５−一リン酸型、３，４−二リン酸型、３，５−二リン酸型、４，５−二リン酸型、３，４，５−三リン酸型が好ましい例として例示される。１つの実施形態では、本発明は、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３−一リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−４−一リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−５−一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３−一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−４−一リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−５−一リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３．４−二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３．５−二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−４．５−二リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３，５−二リン酸、２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸、１−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸、または２−アシル−リゾホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸である化合物を提供する。
【００８１】
具体的な実施形態では、本発明は、例示的に、以下の化合物を提供するが、本発明の具体的化合物は、以下に限定されるものではない。
【００８２】
(化１)
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【００８３】
【化２】
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【００８４】
【化３】
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【００８５】
【化４】
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【００８６】
【化５】
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【００８７】
【化６】
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【００８８】
＜ＬＰＩＰｓの用途＞
別の局面において、本発明は、本発明の化合物（リゾホスファチジルイノシトールリン酸類等）を含む疾患マーカーとして使用するための組成物を提供する。このような化合物としては、本明細書中の＜リゾホスファチジルイノシトールリン酸類（ＬＰＩＰｓ）＞に記載される任意の実施形態を１つまたは複数組み合わせて採用され得ることが理解される。そのような例としては、例えば、リゾホスファチジルイノシトール一リン酸（ＬＰＩＰ１）、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸（ＬＰＩＰ２）またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸（ＬＰＩＰ３）、それらの組合せを挙げることができ、特に、ＬＰＩＰ３について、がん組織において、その発現レベルが有意に上昇したことが示されており、本発明の化合物は、特に生体内に存在する物質の場合は、炎症マーカーまたはがんマーカーとして使用することができ、合成品についても、炎症マーカーまたはがんマーカーの検出の際の対照または標準品として有用であることが理解される。
【００８９】
本発明の化合物ががんマーカーとして使用される場合、対象となるがんに制限はないが、例えば、肝細胞がん、食道扁平上皮がん、乳がん、膵がん、頭頸部の扁平細胞がんまたは腺がん、結腸直腸がん、腎がん、脳がん（腫瘍）、前立腺がん、小細胞および非小細胞肺がん、膀胱がん、骨または関節がん、子宮がん、子宮頸がん、多発性骨髄腫、造血器悪性腫瘍、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚がん、メラノーマ、扁平細胞がん、白血病、肺がん、卵巣がん、胃がん、カポジ肉腫、喉頭がん、内分泌がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、下垂体がん、副腎がん、胆管細胞がん、子宮内膜症、食道がん、肝がん、ＮＳＣＬＣ、骨肉腫、膵がん、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、ＡＭＬ、およびＣＭＬが含まれるが、これらに限定されず、また好ましくは、前立腺がん等が包含されることが理解される。
【００９０】
本発明の化合物が炎症マーカーとして使用される場合、対象となる炎症に制限はないが、例えば、関節炎、腱炎、滑液包炎、乾癬、嚢胞性線維症、シェーグレン症候群、巨細胞性動脈炎、進行性全身性硬化症（強皮症）、脊椎炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、天疱瘡、類天疱瘡、橋本甲状腺炎、胆管炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎）、大腸炎、炎症性皮膚疾患、肺炎、石綿肺、珪肺、気管支拡張症、滑石肺、塵肺、サルコイドーシス、遅延型過敏反応（例えば、ツタウルシ皮膚炎）、気道の炎症、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、脳炎、即時型過敏反応、喘息、花粉症、アレルギー、急性アナフィラキシー、再灌流傷害、関節リウマチ、糸球体腎炎、腎盂腎炎、蜂巣炎、膀胱炎、胆嚢炎、同種移植片拒絶反応、宿主対移植片拒絶、虫垂炎、動脈炎、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、子宮頸管炎、胆管炎、絨毛羊膜炎、結膜炎、涙腺炎、皮膚筋炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、全腸炎、上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、回腸炎、虹彩炎、喉頭炎、脊髄炎、心筋炎、腎炎、臍炎、卵巣炎、精巣炎、骨炎、中耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、肺炎、直腸炎、前立腺炎、鼻炎、卵管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜炎、睾丸炎、扁桃炎、尿道炎、膀胱炎、ブドウ膜炎、膣炎、血管炎、外陰炎、外陰膣炎、血管炎、骨髄炎、視神経炎、脊髄炎、および筋膜炎などの、急性または慢性の炎症を伴う疾患または障害が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
炎症マーカーまたはがんマーカー等の疾患マーカーとして使用する場合、本発明のＬＰＩＰｓは、本明細書において開示した検出方法また他の方法（例えば、免疫学的手法、放射性物質を用いる細胞学的手法等）を用いることができる。放射性物質を使用する場合、ＰＩＰｓの手法（佐々木ら、医学のあゆみVol.  248,  No.  13,  (2014)  pp.1039-1049参照）に倣い、放射性同位体（ＲＩ）により標識した細胞内ＬＰＩＰｓを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離し放射活性を得ることが想定される。
【００９２】
本発明のＬＰＩＰｓの検出、同定、品質管理等は、本発明に記載の検出方法を用いるほか、マーカーとなるＬＰＩＰｓに結合する物質や相互作用分子を用いることによって実現することができる。本発明の関連において、マーカーとなる物質に「結合する物質」または「相互作用分子」は、少なくとも一時的にマーカーとなる物質（例えば、ＬＰＩＰｓ）等の分子に結合し、そして好ましくは、結合したことを表示しうる（例えば標識されるか標識可能な状態である）、分子または物質である。ＬＰＩＰｓ等の分子に結合する物質はＬＰＩＰｓ等の分子の受容体や転移酵素（判明した場合）であってもよく、その他の例としては、抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、低分子量分子（ＬＭＷ）、結合性ペプチド、アプタマー、リボザイムおよびペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）等を挙げることができ、例えばＬＰＩＰｓ等の分子に対して特異的な結合性タンパク質も含まれる。本明細書において、ＬＰＩＰｓ等の分子について「結合性タンパク質」とは、ＬＰＩＰｓ等の分子に（好ましくは、特異的に）結合する種類のタンパク質を指し、そしてＬＰＩＰｓ等の分子に対して惹起されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体等の抗体、抗体フラグメントおよびタンパク質骨格を含むがこれらに限定されない。このようなタンパク質の代表例としては抗体があり、このような抗体は当該分野において公知の手法を用いて実施することができる。
【００９３】
＜ＬＰＩＰｓの製造法＞
別の局面において、本発明は、ホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸をアルキルアミンに接触させることで脱アシル化する工程を包含する本発明の化合物（リゾホスファチジルイノシトールリン酸類）の製造方法。
【００９４】
好ましい実施形態では、前記アルキルアミンは、メチルアミンである。
【００９５】
さらに好ましい実施形態では、前記脱アシル化は、適切な濃度（例えば、１０．７％以下）のメチルアミン等のアルキルアミンの存在下で、脱アシル化が促進する温度（例えば、室温〜約８０℃等を挙げることができ、代表的には約５３℃が使用され得る。）にて、適宜の時間インキュベートする（参考文献として、脱ジアシル化条件を開示するSerunian,  et  al.,  Methods  in  Enzymol.  Vol.,  198,  1991,  pp.  78-87、特にpp.82-83参照、Fujii  et  al.  Folia  Pharmacol  Jpn.  Vol.  142,  2013,  pp.  236-240、特にpp.238-239参照。これらの文献ではｓｎ−１およびｓｎ−２の両方のアシル基が切断される条件のみを開示しており、本明細書では「脱ジアシル化」と称することがある。）。例えば、これらの条件では、メチルアミンの濃度を約１０．７％とし５０〜１２０分間の条件で反応がなされている。本発明では、SerunianやFujiiの条件（脱ジアシル化条件）を緩和する方向に変更することで、予想外にもｓｎ−１あるいはｓｎ−２の一方のアシル基のみが切断される（本明細書で「脱モノアシル」と称する）条件を見出した。本発明では、SerunianやFujiiの条件と同じメチルアミン濃度１０．７％であれば、約３０分間以下等の短時間の期間に供することで、予想外にもモノアシルのみが切断され、ｓｎ−１  ＬＰＩＰｓまたはｓｎ−２  ＬＰＩＰｓが生成することを見出した。あるいは、メチルアミンの濃度を２．１３％にした場合に、１２０分間の反応条件で予想外にもモノアシルのみが切断され、ＬＰＩＰが生成することを見出した。
【００９６】
本明細書において、「脱アシル化」とは、ホスファチジルイノシトールリン酸（一リン酸、二リン酸、三リン酸であり得る。ＰＩＰｓともいう。）における１位および／または２位の脂肪酸結合が切断されアシル基が切断（脱離）することをいう。本明細書で特に言及しない場合は、「脱アシル化」は１つのアシル基が切断（脱離）する「脱モノアシル化」と２つのアシル基が切断（脱離）する「脱ジアシル化」の両方の反応を含みうる。本明細書で通常使用される場合、「脱モノアシル化」を含む。「脱モノアシル化」は、ｓｎ−１位のものおよびｓｎ−２のもののいずれかであり得る。
【００９７】
１つの具体的な実施形態では、乾固したＰＩＰｓにメチルアミン／Ｈ２Ｏ／メタノール／ｎ−ブタノール＝１．９２／３８．０８／４０／１０（脱アシル化反応液）を添加し、５３℃で５分間インキュベートする。氷冷した脱アシル化反応液を加え反応を停止する（氷上に１分静置の後、乾固し、生成物の測定を行った例示的な結果を図１で示す）。溶媒の組成、反応温度、反応時間、触媒（代表的には、メチルアミン）の濃度等の各種条件の一つまたは複数（全部であってもよい）は、脱モノアシル化が生じる限り、適宜変更することができる。好ましい実施形態では、メチルアミンの量は、１〜３％とすれば、本発明の目的を達成し得ることが理解される。
【００９８】
本発明の製造方法における使用される出発物質である、ホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸は、当該分野において公知の方法で製造することができるか、市販のものを使用することができる。例えば、Stuart  J.  Conway  et  al.,  Org.  Biomol.  Chem.,  2010,  8,  66-76により任意の種類のＰＩＰを製造することができる。
【００９９】
また、原料を作り分けることで、所望の位置に所望のアシル基を有するリゾ体を簡便に分離する方法も提供される。別の局面において、本発明は、（Ａ）１位と２位とに異なる質量のアシル基を有するホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸を提供する工程であって、所望の質量を有するアシル基が所望の位置（１位または２位）に存在する、工程；（Ｂ）該ホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸を、アルキルアミンに接触させることで脱アシル化する工程（通常、本明細書に記載される脱モノアシル化条件で行われる。）、および（Ｃ）所望の質量のアシル基を有するリゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸を取り出す工程を包含する、所望の位置に所望のアシル基を有するリゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸を製造する方法（作り分け方法）を提供する。
【０１００】
本発明の作り分け方法において、１位と２位とに異なる質量のアシル基を有するホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸またはホスファチジルイノシトール三リン酸は、Stuart  J.  Conway  et  al.,  Org.  Biomol.  Chem.,  2010,  8,  66~76を参考にして、製造することができ、以下に詳述される。脱アシル化は、上述した条件を適宜適用することができる。所望のリゾホスファチジルイノシトール一リン酸、リゾホスファチジルイノシトール二リン酸またはリゾホスファチジルイノシトール三リン酸の取り出しは、質量、疎水性等の差異で分離することができる任意の手段を用いることができる。例えば、クロマトグラフィーなどを用いることができる。もちろん、精製しないで使用することができる場合は、精製工程は必須ではない。
【０１０１】
以下に、所望の脂肪酸基およびリン酸基を有する出発物質（ＰＩＰｓ等）の一般製造スキームを示す。出発物質（ＰＩＰｓ等）はStuart  J.  Conway  et  al.,  Org.  Biomol.  Chem.,  2010,  8,  66〜76に網羅的に製造例が記載されており、ホスホロアミダイト前駆体（ジアシルグリセロールリン酸誘導体）等から製造することができる。
【０１０２】
（ホスホロアミダイト前駆体の一般製造例）
【０１０３】
【化７】
2018016645.tif 000009
【０１０４】
（ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して任意の脂肪酸残基であり、ＲＢおよびＲＣはそれぞれ独立して水素またはアルキル基（例えば、メチル、エチル等の炭素数１〜１２等のアルキル基）であり、ＰＧＡ、ＰＧＰ１およびＰＧＰ２は、それぞれ独立して保護基である。保護基としては例えば、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等を挙げることができるがこれらに限定されない。ベンジル基を用いる場合は脱離する際に水素添加をするため二重結合を含む脂肪酸残基を導入する場合には使用しないことが好ましい。）
化合物Ｐ−１（たとえば（＋）−１−Ｏ−（４−メトキシベンジル）−２−Ｏ−メトキシメチル−グリセロール）とカルボン酸ハロゲン化物を適切な条件下に付すことで（たとえばＰ−１のジクロロメタン溶液にジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）および塩化アセチルを０℃で添加し、室温で撹拌することで）化合物Ｐ−２を得る。化合物Ｐ−２を適切な条件下に付すことで（たとえばトリフルオロ酢酸を用いることで）ヒドロキシ基の保護基ＰＧＰ１（たとえばメトキシメチル基）を脱保護して化合物Ｐ−３を得る。化合物Ｐ−３とカルボン酸ハロゲン化物とを適切な条件下に付すことで（たとえば化合物Ｐ−３のジクロロメタン溶液にジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）および塩化オクタデカノイルを０℃で添加し、室温で撹拌することで）化合物Ｐ−４を得る。化合物Ｐ−４を適切な条件下に付すことで（たとえば２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノン（ＤＤＱ）やヘキサニトラセリウム（ＩＶ）酸アンモニウム（ＣＡＮ）を用いることで）ヒドロキシ基の保護基ＰＧＰ２（たとえば４−メトキシベンジル基）を脱保護して化合物Ｐ−５を得る。化合物Ｐ−５とアミノホスフィン（たとえば（４−メトキシベンジルオキシ）ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスフィン）とを適切な条件下に付すことで（たとえばジクロロメタン溶液中室温で１Ｈ−テトラゾールを添加し、撹拌させることで）ホスホロアミダイトＰ−６を得る。
【０１０５】
（イノシトール前駆体の一般製造例）
【０１０６】
【化８】
2018016645.tif 000010
【０１０７】
（ＰＧ１、ＰＧＡ、およびＰＧ２は、それぞれ独立して保護基である。保護基としては例えば、メトキシベンジル等を挙げることができるがこれらに限定されない。）
化合物Ｉ−１を適切な条件に付すことで（たとえば化合物Ｉ−１のＤＭＦ溶液に４−メトキシベンジルクロリドと水素化ナトリウムとを０℃で添加し、室温で撹拌することで）保護基ＰＧＡ（たとえば４−メトキシベンジル基）を導入した化合物Ｉ−２を得る。化合物Ｉ−２を適切な条件に付すことで（たとえば化合物Ｉ−２のＤＭＦ溶液にクロロメチルメチルエーテルと水素化ナトリウムとを０℃で添加し、室温で撹拌することで）保護基ＰＧ１（たとえばメトキシメチル基）を導入した化合物Ｉ−３を得る。化合物Ｉ−３を適切な条件に付すことで（たとえば化合物Ｉ−３のジクロロメタン／ヘキサン溶液に水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ）を０℃で添加し、室温で撹拌することで）化合物Ｉ−４を得る。化合物Ｉ−４を適切な条件に付すことで（たとえば化合物Ｉ−４のＤＭＦ溶液に４−メトキシベンジルクロリドと水素化ナトリウムとを０℃で添加し、室温で撹拌することで）保護基ＰＧ２（たとえば４−メトキシベンジル基）を導入した化合物Ｉ−５を得る。化合物Ｉ−５を適切な条件に付すことで（たとえば化合物Ｉ−５のメタノール溶液に塩酸を添加し、還流させることで）化合物Ｉ−６を得る。化合物Ｉ−６を適切な条件に付すことで（たとえば化合物Ｉ−６のジクロロメタン溶液にトルエンスルホン酸一水和物と
【０１０８】
【化９】
2018016645.tif 000011
【０１０９】
を添加して還流後、光学分割を行い、次いで、光学分割後得られた化合物のジクロロメタン溶液にトルエンスルホン酸一水和物と
【０１１０】
【化１０】
2018016645.tif 000012
【０１１１】
を添加し反応させることにより、化合物Ｉ−７（たとえば
【０１１２】
【化１１】
2018016645.tif 000013
【０１１３】
）を得る。化合物Ｉ−７を適切な条件に付すことで、ヒドロキシ基１個、保護基ＰＧ１で保護されたヒドロキシ基ｍ個、ＰＧ２で保護されたヒドロキシ基ｎ個を有する化合物Ｉ−８（ｌ、ｍ、ｎは０以上６以下の整数であり、ｌ、ｍ、ｎの合計は６である）を得る。
【０１１４】
（ホスファチジルイノシトールの一般製造例）
【０１１５】
【化１２】
2018016645.tif 000014
【０１１６】
（式中、ｌ、ｍ、ｎは０以上６以下の整数であり、ｌ、ｍ、ｎの合計は６である）
イノシトール前駆体ＰＩ−１（たとえば１Ｄ−２，３，４，５，６−ペンタ−Ｏ−（４’−メトキシベンジル）−１−Ｏ−（メトキシメチル）−ｍｙｏ−イノシトール）のヒドロキシ基に適切なリン試薬（たとえばビス（４−メトキシベンジルオキシ）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスフィン）を用い、適切な条件下に付すことで（たとえばＰＩ−１のジクロロメタン溶液に１Ｈ−テトラゾールを添加し、室温で１０〜１４時間撹拌を行うことで）リン酸基で修飾されたＰＩ−２（たとえば１Ｄ−２，３，４，５，６−ペンタ−Ｏ−（４’−メトキシベンジル）−１−Ｏ−（メトキシメチル）−ｍｙｏ−イノシトール−４−（ビス（４−メトキシベンジルオキシ）ホスフェート））を得る。ＰＩ−２を適切な条件に付すことで（たとえばトリフルオロ酢酸を用いることで）保護基ＰＧ１（たとえばメトキシメチル基）を脱保護したＰＩ−３（たとえば１Ｄ−２，３，４，５，６−ペンタ−Ｏ−（４’−メトキシベンジル）−ｍｙｏ−イノシトール−４−（ビス（４−メトキシベンジルオキシ）ホスフェート））を得る。ＰＩ−３とホスホロアミダイト前駆体（たとえば（１−アセチルオキシ−２’−オクタデカノイルオキシプロピル）（４−メトキシベンジル）ジイソプロピルホスホロアミダイト）とを適切な条件に付すことで（たとえばＰＩ−３のジクロロメタン溶液に１Ｈ−テトラゾールおよび（１−アセチルオキシ−２−オクタデカノイルオキシプロピル）（４−メトキシベンジル）ジイソプロピルホスホロアミダイト）を添加して室温で１０〜１４時間撹拌後、メタクロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）を−７８℃で添加し、室温で２０分撹拌することで）ＰＩ−４を得る。ＰＩ−４を適切な条件（たとえばＰＩ−４のアセトニトリル溶液にヘキサニトラセリウム（ＩＶ）酸アンモニウム（ＣＡＮ）を添加し、室温で４５分間撹拌を行うことで）保護基ＰＧ２（たとえば４−ベンジル基）を脱保護したＰＩ−５（たとえば１Ｄ−ｍｙｏ−イノシトール−１−（１’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−オクタデカノイル−ｓｎ−グリセラ−３−イルホスフェート））を得る。
【０１１７】
上記製造法により製造されるホスファチジルイノシトールリン酸にはたとえば以下の式
【０１１８】
【化１３】
2018016645.tif 000015
【０１１９】
に表されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２０】
（Ｌｙｓｏ−ホスファチジルイノシトールリン酸の一般製造例）
【０１２１】
【化１４】
2018016645.tif 000016
【０１２２】
ホスファチジルイノシトール１（たとえば１Ｄ−ｍｙｏ−イノシトール−１−（１’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−オクタデカノイル−ｓｎ−グリセラ−３−イルホスフェート）の溶液（たとえば、クロロホルム／メタノール（９／１）溶液が挙げられるが、溶液調製のための溶媒の比率は適宜変更することができ、また、反応を促進する限り別の溶媒を用いることもできる。）をＮ２等の不活性ガスで乾固の後に適切な試薬（たとえばメチルアミン溶液（例示的な溶媒としてメチルアミン／水／メタノール／１−ブタノール（４．８／３５．２／４０／１０）が挙げられるがこれに限定されない。溶液調製のための溶媒およびメチルアミンの比率は適宜変更することができ、また、反応を促進する限り別の溶媒を用いることもできる。）を適切な温度（たとえば５３℃）で添加して、適切な時間（たとえば、５分間を例示できるが、これより長くても短くても脱モノアシル化が達成される限り伸縮可能である。例えば、１分間や３０秒間でも脱モノアシル化が生じることが観察されている。）で適切な温度（たとえば５３℃が例示されるが、これより高くても低くても脱モノアシル化が達成される限り上下可能である。）で撹拌し、（例えば、氷冷により）反応をクエンチし、後処理を適切に行い、目的とするＬｙｓｏ−ホスファチジルイノシトールを得る。ここでもしアシル基の脱離反応が位置選択的に進行しなかったとしても、ホスファチジルイノシトール１に導入されているアシル基ＣＯＲ１とＣＯＲ２が異なっている場合（たとえばＣＯＲ１がアセチル基であり、ＣＯＲ２がオクタデカノイル基である場合）、アシル基が１個のみ脱離した化合物である２と３は、分子量が異なることから、それぞれの化合物を分離・精製することが可能である。
【０１２３】
＜検出方法＞
別の局面では、本発明は、リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を検出、同定または定量する方法であって、（Ａ）試料を、陰イオン交樹脂に接触させることによりリン脂質を濃縮する工程；（Ｂ）該リン脂質中のリン酸基を保護基で保護する工程；および（Ｃ）質量分析により、該リン脂質中にリゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を検出、同定または定量する工程を包含する、酸性リン脂質を検出、同定または定量する方法を提供する。リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を含むホスホイノシタイドは、多くのリン酸基をもつことや、（生体脂質抽出物中の存在量が）微量であるために試料中の他の脂質によるイオンサプレッションを受けることなどから、従来は不可能とされている解析が最も困難な膜リン脂質となっているが、本発明の方法を用いれば、リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩を検出、同定および定量することができるようになった。本発明の方法は、数百ａｍｏｌ〜数ｆｍｏｌを定量下限とすることができ、生体内で存在するか不明であった、多種類のＬＰＩＰｓを測定することができた。このように様々な生体微量サンプルでの絶対定量が可能な、質量分析をベースとした方法が本発明により提供される。
【０１２４】
従来の測定技術では、ＰＩＰｓ類は測定することが可能となっていたが、リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩類を識別し、検出することができることが本発明において見出された。したがって、本発明は、リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩類をも識別して検出する技術を史上初めて提供するものである。
【０１２５】
好ましくは、本発明のリン酸基の保護基としては、保護することができる限り、どのようなものでも用いることができるが、好ましくは質量分析において障害とならないか質量分析前に脱離させることができるものがよく、例えば、アルキル基（例えば、メチル基）等を挙げることができる。好ましくは、前記保護基はアルキル基を含み、さらに好ましくはメチル基を含む。
【０１２６】
本発明で使用される質量分析法は、任意の技術を使用することができるが、好ましくは、三連四重極質量分析計による選択反応モニタリング法（ＳＲＭ）を含む。
【０１２７】
本発明で用いられるＳＲＭにおいては、さらに、逆相カラムクロマトグラフィーを用いて前記リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩の脂肪酸側鎖および／またはリン酸基の検出、同定または定量を行う工程を包含する。
【０１２８】
好ましくは、前記逆相カラムクロマトグラフィーにおいて、ジアシルグリセロールをプロダクトイオン（フラグメントイオン）として選択して前記脂肪酸側鎖および／またはリン酸基の検出、同定または定量を行うことができる。
【０１２９】
具体的なホスホイノシタイド測定技術については、以下が例示される。
【０１３０】
この方法を検討した結果、ＬＰＩＰｓも測定することができることが判明した。
【０１３１】
一つの局面において、ＰＩＰ１、ＰＩＰ２については各々３種類のアイソマー（リン酸化された水酸基の位置が違う構造異性体）の総和としての定量を行う。以下、その手順を概説する。
【０１３２】
１  生体内のリゾホスファチジルイノシトールリン酸塩類等のホスホイノシタイドの高回収Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法により得られた総脂質画分をさらに陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥセルロースカラム）を用いて分画する。各リン脂質極性部位のイオン交換能の違いによって徐々に分離・溶出し、ホスホイノシタイドを多く含んだ画分を高回収することができ、リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩類もまた同様に高回収することができる。
【０１３３】
２  分子の安定化
イノシトール環に多くのリン酸基をもつホスホイノシタイドは、不安定かつ金属をはじめとする多くの材質に吸着しやすい性質をもつため、リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩類もまたも同様の性質を有すると考えられる。そのためホスホイノシタイドは回収後から測定までの待機時間の間に分析用バイアル中で急速に損なわれ、検出した溶出ピークにはテーリングがみられる。本発明者らはホスホイノシタイドを高回収後、リン酸基にメチル化を施すことで分解・吸着を抑えた安定誘導体を作製し堅牢な分析を行う。このような手法は、リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩類にも応用可能である。
【０１３４】
３  高感度分析法
ホスホイノシタイドおよびリゾホスファチジルイノシトールリン酸塩類の測定には、高感度かつ定量性に優れた分析法である三連四重極質量分析計による選択反応モニタリング法（ＳＲＭ）を用いる。ホスホイノシタイドはその構造から負イオンとして検出しやすいが、本発明の分析法ではリン酸基にメチル化等の保護化を施しているため正イオンとして検出しやすくなる。リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩類もまた同様の性状を示す。各分子種はジアシルグリセロール（ＤＧ）を特徴的なフラグメントイオンとして選択する。分析は逆相カラム（Ｃ８）により脂肪酸側鎖の疎水性の違いを利用して各分子種ごとに分離・溶出する。同じ分子種の各ホスホイノシタイドはリン酸基の数の違いによりＰＩＰ３、ＰＩＰ２、ＰＩＰ１の順に溶出するため、この溶出時間の相違を利用して分析する。定量解析はＧａｕｓｓｉａｎ法によりスムージングを行った各分子種のクロマトグラムのピーク面積を数値化し、それを生体内にほとんど存在しない各種１７：０／２０：４合成品を用いて作製した検量線に当てはめて算出する。本発明のこの分析法は、高感度かつ定量性に優れ、培養細胞以外にもヒト臨床検体や動物組織由来試料での解析が可能である。リゾホスファチジルイノシトールリン酸塩類についても、同様の分析が可能であり、分子量の相違はもとより、ＬＰＩＰ３、ＬＰＩＰ２、ＬＰＩＰ１の順に溶出するため、この溶出時間の相違を利用して分析し、適宜Ｇａｕｓｓｉａｎ法によりスムージングを行った各分子種のクロマトグラムのピーク面積を数値化し、標準品と対比し、作製した検量線に当てはめて算出することができる。
【０１３５】
本発明は、疾患マーカーでもあり得るリゾホスファチジルイノシトールリン酸塩類を他の物質から区別して検出する技術を提供するものであるため、これにより、がんの診断を行うこともできる。
【０１３６】
ＬＰＩＰｓの前駆体と考えられるジアシル型のイノシトールリン脂質（ＰＩＰｓ）の代謝異常は、種々の病態に関連することが知られており、治療標的、診断マーカーとしての有用性が見出されている。したがって、ジアシル型のイノシトールリン脂質（ＰＩＰｓ）と構造的に密接な関連のある本発明のＬＰＩＰｓもまた、種々の病態に関連することが知られており、治療標的、診断マーカーとしての有用性を有することが期待される。具体的には以下のような用途が想定される。また、生化学第８３巻第６号，ｐｐ．５２５―５３５，２０１で説明されているように、脂質メディエーターとしてのリゾホスファチジルイノシトールとその受容体ＧＰＲ５５のようなＧタンパク質レセプター等を含め種々の活性があることが知られている。したがって、リゾホスファチジルイノシトールが様々な形でリン酸化された本発明の化合物は、リゾホスファチジルイノシトールやその受容体との関係でも、直接的または間接的に種々の生理学的用途と関連することが期待される。また、Fujii  et  al.  Folia  Pharmacol  Jpn.  Vol.  142,  2013,  pp.  236-240で説明されているように、ホスホリパーゼCの作用でPIPsから生じるイノシトールポリリン酸群は細胞内のカルシウム動態などを制御しており、カルシウム動態の異常は精神疾患、筋疾患、心疾患をはじめ多岐にわたる病態に関連している。したがって、イノシトールポリリン酸群と構造的に密接な関連のある本発明のＬＰＩＰｓもまた、治療標的、診断マーカーとしての有用性を有することが期待される。
【０１３７】
（ホスファチジルイノシトールホスフェートおよびリゾホスファチジルイノシトールホスフェートの測定、検出および同定）
１つの局面において、本発明は、試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを測定、検出または同定する方法を提供する。この方法はＡ）該試料を質量分析（ＭＳ）に適用する工程；およびＢ）該ＭＳにおけるピークの溶出位置により該ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する工程を包含する。一つの実施形態では、試料はさらにクロマトグラフィーに適用される。一つの実施形態では、試料はさらにイオンモビリティ分離（ＩＭＳ）に適用される。
【０１３８】
本発明におけるホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の特定は、一つの実施形態では、標準品との比較によって行うことができる。あるいは、あらかじめ標準品での溶出位置や溶出時間を算出し設定しておくことにより、それと比較することで、特定を行うことができる。また、ＰＩＰｓおよびＬＰＩＰｓであることを同定する方法として、例えば、リン酸やイノシトールの安定同位体（１３Ｃや重水素）をあらかじめ試料に添加することで天然のものと置き換えることができるかどうかを調べる方法が挙げられる。
【０１３９】
別の局面において、本発明は、試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを測定、検出または同定する方法を提供する。この方法はＡ）該試料をイオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）に適用する工程；およびＢ）該ＩＭＳ−ＭＳにおけるピークの溶出位置により該ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置を特定する工程を包含する。
【０１４０】
１つの実施形態では、本発明における特定する工程において前記ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートに含まれるアシル基の有無も特定されることが特徴である。試料中のリン脂質類には、アシル基がないものも存在するが、本発明の測定では脱アシル化されないことから、インタクトの状態で測定が可能であり、それゆえ、アシル基の有無も特定することができる。
【０１４１】
１つの実施形態では、本発明における特定する工程において前記ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートに含まれるアシル基の分子量の合計も特定される。本発明の測定では、質量分析によって、分子量が特定される。従って、いったんホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートであることが特定されるとその分子量から結合しているアシル基の分子量の合計が特定されることとなる。
【０１４２】
好ましい実施形態では、本発明における特定する工程において前記ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートに含まれるアシル基の種類も特定される。本発明の測定では、質量分析によって、分子量が特定される。従って、いったんホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートであることが特定されるとその分子量から結合しているアシル基の分子量の合計が特定され、さらにホスファチジルイノシトールホスフェートの場合モノアシル体が質量分析で特定されるため、アシル基の一方の分子量が特定される。一方の分子量が特定されると他方の分子量も特定され、分子量からアシル基の種類が特定されることとなる。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳによる測定の結果に基づいて分子量からアシル基の種類を特定する方法は、例えば、Ｃｌａｒｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２０１１  Ｍａｒ；８（３）：２６７−７２．  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈを参考にすることができる。
【０１４３】
１つの実施形態では、本発明における測定、検出または同定は、ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを他のイノシトール含有リン脂質から区別して行うことを特徴とする。このようなことができるのは、本発明の測定、検出または同定の方法において、アシル基を保持したまま測定等ができるからであり、より具体的に説明すると、ホスファチジルホスフェートと、リゾホスファチジルイノシトールホスフェートと、グリセロホスホイノシトールなどのイノシトール含有リン酸とは、アシル基が保持される測定を行うことでアシル基の分子量の分が相違として区別することができる。
【０１４４】
１つの実施形態では、本発明の測定対象である試料は、ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で調製されたものである。
【０１４５】
したがって、本発明の測定、検出または同定において、ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件は、分解がなされない任意の条件を挙げることができ、特に、脱アシル化処理を行わないことを含み、このほか、試料を変性させる処理を行わないこと、リン酸基に保護基を導入する処理を行うことなどの条件を挙げることができる。
【０１４６】
本発明で使用される液体カラムクロマトグラフィーは、キラルカラム、逆相カラム、順相カラム、イオン交換カラム等を用いることができ、親水基、疎水基を分離する任意のカラムクロマトグラフィーを用いることができる。
【０１４７】
本発明で使用される場合、クロマトグラフィー（ガスクロマトグラフィーまたは液体カラムクロマトグラフィー）は、イオンモビリティ分離と組み合わせられ得る。理論に束縛されることを望まないが、本発明では、イオンモビリティ分離により、より明確に、ホスホイノシタイドおよび／またはリゾホスホイノシタイドのリン酸基の位置を分離することができることが示されており、任意のクロマトグラフィー（例えば、液体カラムクロマトグラフィー）をイオンモビリティ分離と組み合わせ、さらに質量分析を行うことで、アシル基を保持したままホスホイノシタイドおよび／またはリゾホスホイノシタイドのリン酸基の位置を分離して測定、検出または同定することができる。あるいは、イオンモビリティ分離を利用しない場合でも、質量分析（ＭＳ）を用いることによってアシル基を保持したままホスホイノシタイドのリン酸基の位置を分離して測定、検出または同定することができ、また、さらにキラルカラムを用いた液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーと組み合わせてリン酸基の位置を分離して測定、検出または同定することができる。あるいは、イオンモビリティ分離を用いる場合は、クロマトグラフィーを使用せずそのまま質量分析と組わせてもよい。
【０１４８】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法は、ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを定量する工程をさらに包含する。
【０１４９】
１つの実施形態では、本発明で使用される試料は、インタクトな試料である。ここで、試料がインタクトであるとは、ホスホイノシタイドおよびリゾホスホイノシタイドのアシル基が保持される条件を含み、例えば、加熱による変性、空気中の酸素、湿気、熱、光、金属イオン、微生物あるいは酵素などの作用による酸化、水系溶媒中における加水分解、メチルアミン等のアルキルアミン存在下での脱アシル化等を受けていない状態などを挙げることができるがこれらに限定されない。
【０１５０】
１つの実施形態では、本発明において、ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の特定は、試料を標識せずに行われる。蛍光標識や放射性同位体での標識を行うことが必要でないことから、生体内の試料について生体のそのままの状況またはそれに類似する条件下での分析を行うことができ、より生体の情報を反映した解析を行うことができる。
【０１５１】
（測定、検出または同定装置）
１つの局面において、本発明は、試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのアシル基およびリン酸基の位置を測定、検出または同定する装置を提供する。ここで、この装置は、質量分析装置を含み、好ましくはさらにクロマトグラフィー用の装置またはイオンモビリティ分離用の装置を含み、例えば、クロマトグラフィー用の装置はガスクロマトグラフィーおよび液体クロマトグラフィー用の少なくとも１つの装置を含みうる。理論に束縛されることを望まないが、本明細書において液体カラムクロマトグラフィーと質量分析装置を用いてホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを測定することができていることから、ガスクロマトグラフィーにおいても同様に分離可能であり測定することができると理解される。リン酸位置異性体間の分離をより正確に行う場合は、クロマトグラフィー用の装置またはイオンモビリティ分離用の装置と組み合わせることが好ましい。具体的な実施形態としては、本発明は、質量分析（ＭＳ）装置と、ホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該ＭＳに該試料を適用する適用部とを含む。より具体的な実施形態としては、本発明は、液体カラムクロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）装置と、ホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該ＬＣ−ＭＳに該試料を適用する適用部とを含む。
【０１５２】
別の局面において、本発明は、試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのアシル基およびリン酸基の位置を測定、検出または同定する装置を提供する。ここで、この装置は、イオンモビリティ分離−質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）装置と、ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートの分解がなされない条件で該ＩＭＳ−ＭＳに該試料を適用する適用部とを含む。
【０１５３】
本発明において、ＬＣ−ＭＳを用いる場合、必要に応じて、イオンモビリティ分離を行う手段を含んでいてもよい。
【０１５４】
本明細書において使用される液体カラムクロマトグラフィーは、キラルカラム、逆相カラム、順相カラム、イオン交換カラム、親水基、疎水基を分離するカラムからなる群より選択される。
【０１５５】
１つの実施形態では、前記ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを検知または定量する手段をさらに含む。このような見地または定量する手段としては、例えば、得られた検出ピークを内部標準と比較して計算して定量する方法などが挙げられる。
【０１５６】
（ホスホイノシタイドおよび／またはリゾホスホイノシタイドの分離・精製および純品生産）
１つの局面において、本発明は、試料中のホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを、アシル基を保持しつつ、リン酸基の位置に応じて分離または精製する方法を提供する。この方法はＡ）該試料を質量分析（ＭＳ）に適用する工程；およびＢ）該ＭＳの溶出物から、ピークの溶出位置により特定された目的の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを収集する工程を包含する。１つの実施形態では、試料はさらにクロマトグラフィーまたはイオンモビリティ分離（ＩＭＳ）に適用される。
【０１５７】
１つの局面において、本発明は、ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置について２以上存在する混合物から、該混合物に含まれるホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の種類の数より少ない種類（例えば、１種類）の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを含む試料を生産する方法を提供する。この方法は、Ａ）該試料をクロマトグラフィー、イオンモビリティ分離（ＩＭＳ）または質量分析（ＭＳ）に適用する工程；およびＢ）該クロマトグラフィー、ＩＭＳまたはＭＳの溶出物から、ピークの溶出位置により特定された目的の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを含む画分を収集する工程を包含する。１つの実施形態では、試料はクロマトグラフィー、イオンモビリティ分離および質量分析の任意の組み合わせに適用される。
【０１５８】
本発明において、ピークの溶出位置により特定された目的の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを収集する技術は、当該分野で知られる任意の技術を用いることができ、例えば、オートサンプラーなどの適宜の機器を用いることができ、あるいは手動で収集してもよい。
【０１５９】
ここで、ホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置について２以上存在する混合物としては、生体試料、食品、代謝物や他の任意のホスホイノシタイドおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを含むまたは含むと推定される任意の試料を挙げることができる。特に、本発明において、混合物は、一リン酸体のホスファチジルイノシトール（ホスファチジルイノシトール−３−一リン酸、ホスファチジルイノシトール−４−一リン酸、ホスファチジルイノシトール−５−一リン酸）の３つのアイソマーのうちの２つまたは３つのアイソマーを含み得、同様に一リン酸体のリゾホスファチジルイノシトールの３つのアイソマーのうちの２つまたは３つのアイソマーを含み得、二リン酸体のホスファチジルイノシトール（ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，５−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸）のうちの２つまたは３つのアイソマーを含み得、同様に二リン酸体のリゾホスファチジルイノシトールの３つのアイソマーのうちの２つまたは３つのアイソマーを含み得、これらを分離して、該混合物に含まれるホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の種類の数より少ない種類（例えば、１種類）の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートを含む試料が生成され得る。本明細書では、１種類の位置にリン酸基を有するホスファチジルイノシトールホスフェートおよび１種類の位置にリン酸基を有するリゾホスファチジルイノシトールホスフェートは、それぞれ、７つの種類のリン酸基の結合パターンがある任意のアイソマーであり得、これらは、ホスファチジルイノシトール−３−一リン酸、ホスファチジルイノシトール−４−一リン酸、ホスファチジルイノシトール−５−一リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，５−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸、およびこれらのリゾ体である。混合物からその一部での分離することができる技術も本発明の対象である。
【０１６０】
本明細書において「混合物に含まれるホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の種類の数より少ない種類」とは、混合物に含まれるホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の種類の数をｎとした場合、ｎ−１以下であることを意味する。好ましくは、混合物に含まれるホスファチジルイノシトールホスフェートおよび／またはリゾホスファチジルイノシトールホスフェートのリン酸基の位置の種類の数より少ない種類は１であるが、それに限定されず、１種類、２種類、３種類、４種類などでもよい。特に、一リン酸体のホスファチジルイノシトール（ホスファチジルイノシトール−３−一リン酸、ホスファチジルイノシトール−４−一リン酸、ホスファチジルイノシトール−５−一リン酸）の３つのアイソマー、一リン酸体のリゾホスファチジルイノシトールの３つのアイソマー、二リン酸体のホスファチジルイノシトール（ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，５−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸）の３つのアイソマー、または二リン酸体のリゾホスファチジルイノシトールの３つのアイソマーを分離することができることが有利であり得る。
【０１６１】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook  J.  et  al.(1989).  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harborおよびその3rd  Ed.(2001);  Ausubel,  F.M.(1987).Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Ausubel,  F.M.(1989).  Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Innis,  M.A.(1990).PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications,  Academic  Press;  Ausubel,  F.M.(1992).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Ausubel,  F.M.  (1995).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Innis,  M.A.  et  al.(1995).PCR  Strategies,  Academic  Press;  Ausubel,  F.M.(1999).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Wiley,  and  annual  updates;  Sninsky,  J.J.  et  al.(1999).  PCR  Applications:  Protocols  for  Functional  Genomics,  Academic  Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１６２】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのDNA合成技術および核酸化学については、例えば、Gait,  M.J.(1985).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Gait,  M.J.(1990).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Eckstein,  F.(1991).  Oligonucleotides  and  Analogues:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Adams,  R.L.  et  al.(1992).  The  Biochemistry  of  the  Nucleic  Acids,  Chapman  &H  all;  Shabarova,  Z.  et  al.(1994).Advanced  Organic  Chemistry  of  Nucleic  Acids,  Weinheim;  Blackburn,  G.M.  et  al.(1996).  Nucleic  Acids  in  Chemistry  and  Biology,  Oxford  University  Press;  Hermanson,  G.T.(I996).  Bioconjugate  Techniques,  Academic  Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１６３】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。
【０１６４】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１６５】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１６６】
以下に実施例を記載する。ホスホイノシタイドの一つの構造特性であるグリセロールのsn-1,2位水酸基に結合する脂肪酸鎖の多様性（分子種）に着目した研究はほとんどなされていない。細胞内ホスホイノシタイドレベルの測定法としては、放射性同位元素によって標識された脱アシル化ホスホイノシタイドを分析するHPLC法が主流である。しかし、この半定量分析手法は対象試料に制限があり（vivoでは困難）、何より分子種レベルの測定はできない。そこで発明者らは、LC-MS/MSを用いて、定量性に優れた新規分析手法を確立した。この分析手法は幅広い生体試料を対象とした、分子種レベルでのホスホイノシタイド分析が可能である。【０１６７】
必要な場合、以下の実施例で用いる動物の取り扱いは、全ての動物実験（生体試料の調製等）は、秋田大学の動物実験ガイドラインに従って実施した。また、ヒトを対象とする場合には、ヘルシンキ宣言に基づいて行った。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Sigma−Aldrich、和光純薬、ナカライ、R&D  Systems、USCN  Life  Science  INC等）の同等品でも代用可能である。【０１６８】
（略号）
本明細書において説明した略称の他、以下の略称も用いる。【０１６９】
ＰＩ：ホスファチジルイノシトール
ＰＩ３ＰまたはＰＩ（３）Ｐ：ホスファチジルイノシトール−３−一リン酸
ＰＩ４ＰまたはＰＩ（４）Ｐ：ホスファチジルイノシトール−４−一リン酸
ＰＩ５ＰまたはＰＩ（５）Ｐ：ホスファチジルイノシトール−５−一リン酸
（ＰＩ３ＰまたはＰＩ４ＰまたはＰＩ５ＰをＰＩＰ１と表記する）
ＰＩ（３，４）Ｐ２：ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸
ＰＩ（３，５）Ｐ２：ホスファチジルイノシトール−３，５−二リン酸
ＰＩ（４，５）Ｐ２：ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸
（ＰＩ（３，４）Ｐ２またはＰＩ（３，５）Ｐ２またはＰＩ（４，５）Ｐ２をＰＩＰ２と表記する）
ＰＩ（３，４，５）Ｐ３：ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸
（ＰＩ（３，４，５）Ｐ３をＰＩＰ３と表記する）
ＰＩＰ１，ＰＩＰ２，ＰＩＰ３をＰＩＰｓと総称する。【０１７０】
ＰＩＰｓのグリセロールのｓｎ−１水酸基またはｓｎ−２水酸基のいずれか一方のみを介して脂肪酸もしくは炭化水素と結合した構造物をＬＰＩＰｓと総称する。【０１７１】
（実施例１：リゾホスファチジルイノシトールリン酸類の製造および同定）
本実施例では、リゾホスファチジルイノシトールリン酸類の製造を行い、その新規物質の新規同定法も開発した。【０１７２】
（化学物質）
以下の試料を標準試料および出発原料として用いた。【０１７３】
（材料および方法）
（使用材料）
出発原料として用いるホスファチジルイノシトールリン酸である１７：０／２０：４−ＰＩ３Ｐ、１７：０／２０：４−ＰＩ４Ｐ、１７：０／２０：４−ＰＩ５Ｐ、１７：０／２０：４−ＰＩ（３，４）Ｐ２、１７：０／２０：４−ＰＩ（３，５）Ｐ２、１７：０／２０：４−ＰＩ（４，５）Ｐ２、１７：０／２０：４−ＰＩ（３，４，５）Ｐ３およびその他のグリセロリン脂質標準合成品は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）から購入した。トリメチルシリルジアゾメタン（ＴＭＳ−ジアゾメタン）は、東京化成から購入した。超純水はＫａｎｔｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から入手した。他のすべての溶媒は、ＨＰＬＣまたはＬＣ−ＭＳグレードであり、他の化学試薬は分析グレードであった。これらは、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓより入手した。【０１７４】
（合成方法）
出発原料としてホスファチジルイノシトールリン酸（一リン酸、二リン酸および三リン酸）を用いて、メチルアミンとのO→Nトランスアシレーション反応による脱アシル化を行った。脱アシル化は、１つのアシルのみが脱アシル化できるように、以下の条件を設定した：【０１７５】
【化１５】
2018016645.tif 000017
【０１７６】
(実験条件)
クロロホルム/メタノール（１／１）に溶解した１００ｐｍｏｌの１−ヘプタデカノイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−１’−ｍｙｏ−イノシトール−４’一リン酸（1-heptadecanoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phospho-1'-myo-inositol-4'-monophosphate）（１７：０／２０：４−ＰＩ４Ｐ）をＮ２ガスで乾固し、０．３ｍＬの２．１３％メチルアミン溶液（メチルアミン／水／メタノール／１−ブタノール（１．９２／３８．０８／４０／１０））あるいは１０．７％メチルアミン溶液（メチルアミン／水／メタノール／１−ブタノール（９．６／３０．４／４０／１０））を５３℃あるいは３７℃で添加して、撹拌後５３℃あるいは３７℃で０，５，１０，３０，６０，１２０分間静置し、氷冷メタノール溶液を加えることにより反応をクエンチした。反応物をＮ２ガスで乾固し、目的とするリゾホスファチジルイノシトール一リン酸（ＬＰＩＰ１：収率約０〜４０％）を、リン酸基のメチル化保護を行い、三連四重極質量分析計による以下の方法で測定した。【０１７７】
（測定および検出）
「三連四重極質量分析計でのＳＲＭによる測定および検出方法」を以下に記す。【０１７８】
ＬＰＩＰｓリン酸基のメチル化反応：質量分析計での高感度測定のために、ＬＰＩＰｓリン酸基のメチル化保護反応を行った。ＬＰＩＰｓを含む検体をクロロホルム／メタノール（１／１）  ８００μＬに溶解しトリメチルシリルジアゾメタン１５０μＬを加え室温で５分間反応させた。反応を氷酢酸１０μＬを加えクエンチした。メタノール／水／クロロホルム（４８：４７：３）８００μＬとクロロホルム４００μＬを加え撹拌後、有機層をＮ２ガスで乾固させた。メタノール／７０％エチルアミン（１：０．１３％）、ｖ／ｖ）２７μＬと水９μＬを加え、撹拌した。【０１７９】
ＬＣ−ＥＳＩＭＳ／ＭＳ系：ＬＣ−ＥＳＩＭＳ／ＭＳ分析を、非金属インジェクター部分および２５μＬ  ＰＥＥＫチューブのサンプルループを備えるＨＴＣ  ＰＡＬオートサンプラー（ＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｚｗｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と結合した、ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）とともにＴＳＱ−Ｖａｎｔａｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いることで行った。ＰＩＰｓ画分を移動相Ａ（アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝４／１，０．１３％エチルアミン（７０％溶液），ｖ／ｖ））／移動相Ｂ（２−プロパノール／アセトニトリル＝４／１，０．１３％エチルアミン（７０％溶液），ｖ／ｖ））比を７０％／３０％（０〜１分）、１〜３分にかけて１０％／９０％のグラジエントをかけ、引き続き１０％／９０％（３〜７．５分）、７０％／３０％（７．５〜１３分）を用いたグラジエントによって分離した。流速は、２２０μＬ／分であり、クロマトグラフィーを６０℃でＧＬ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  Ｂｉｏ  Ｃ１８  １５０×１．０（粒子径１．９μｍ）カラムを用いて行った。典型的には、試料１０μＬを注入した。【０１８０】
質量分析の条件
イオンスプレー電圧を３．０ｋＶに設定した。加熱されたキャピラリー温度を２７０°Ｃに設定した。他のパラメータを製造者の推奨にしたがって設定した。ＭＳ系をＸｃａｌｉｂｕｒソフトウェアを用いて調整した。ポジティブイオンモードにおける選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法によってＬＰＩＰｓを測定した。ＳＲＭモードにおける個々のＬＰＩＰｓの測定条件を表２にまとめた。ＬＰＩＰ１、ＬＰＩＰ２、およびＬＰＩＰ３を親イオンのｍ／ｚ値（Ｑ１）と娘イオンとして測定するモノアシルグリセロールのｍ／ｚ値（Ｑ２）の組合せによって同定した。その模式図を図１−１に示す。【０１８１】
【表２】
2018016645.tif 000018
【０１８２】
（結果）
横軸に反応時間を、縦軸に１７：０  ＬＰＩＰ１あるいは２０：４  ＬＰＩＰ１の生成量（クロマトグラム上の原料と反応生成物のピーク面積比から得た収率）を図１−１示す。従来法（メチルアミン濃度１０．７％による１２０分間インキュベーション）では、ＬＰＩＰ１は検出されず、これは反応時間を６０分に短縮しても同様であった。反応時間をさらに短縮して５，１０，３０分とすることによってはじめて、ＬＰＩＰ１が検出された。１７：０  ＬＰＩＰ１と２０：４  ＬＰＩＰ１の両者が生成された。従来法より低いメチルアミン濃度２．１４％による反応でも同様の反応時間依存性の傾向が認められた。この場合、反応時間６０分、１２０分でも少量のＬＰＩＰ１が検出され、５，１０，３０分ではより多くのＬＰＩＰ１が検出された。【０１８３】
図１−２に示すように、反応は温度に依存しており、１０．７％メチルアミン、３７℃、１０分間インキュベーションでは、５３℃での反応より高い収率でＬＰＩＰ１が得られた。【０１８４】
（考察）
メチルアミンを用いたこの方法は従来、イノシトールリン脂質を含むリン脂質の親水基には影響を与えず、二つのアシル基を完全に脱アシル化する目的で汎用されているように、イノシトールに結合するリン酸の位置が変更しないことが知られており（Serunian  LA,  et  al.  Methods  Enzymol.  1991;198:78-87,  Fujii  et  al.  Folia  Pharmacol  Jpn.  2013;  142:  236-240）、それより緩和な条件であれば、リン酸基の位置や数は変更しない。反応時間の短縮、メチルアミン濃度の低減、反応温度の低下、その組合せによって、脱アシル化の程度を調節することにより、１つのアシルのみを脱アシル化でき、出発物質として用いるジアシル型ＰＩＰｓに対応したＬＰＩＰｓを合成できる。次に、表３に、本実施例で市販のＰＩＰｓ合成品を原材料として合成することができるＬＰＩＰｓの例を示し、表４には、リン酸基の位置まで確定することができる例を示す。表中の数字は、炭素数と二重結合の数を示す。二重結合があるものについては、１６：１＝９−ヘキサデセン酸（パルミトレイン酸）；１８：１＝ｃｉｓ−９−オクタデセン酸（オレイン酸）；２０：４＝５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸（アラキドン酸）；２２：６＝４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸である。【０１８５】
【表３】
2018016645.tif 000019
【０１８６】
【表４】
2018016645.tif 000020
【０１８７】
図２（図２Ａ〜図２Ｇ）において、リン酸化パターンが異なる７種類のＰＩＰｓ原料（アシル基は１７：０、２０：４）から製造したそれぞれのＬＰＩＰｓの結果を図示する。出発原料として１７：０／２０：４−ＰＩ３Ｐ、１７：０／２０：４−ＰＩ４Ｐ、１７：０／２０：４−ＰＩ５Ｐ、１７：０／２０：４−ＰＩ（３，４）Ｐ２、１７：０／２０：４−ＰＩ（３，５）Ｐ２、１７：０／２０：４−ＰＩ（４，５）Ｐ２、１７：０／２０：４−ＰＩ（３，４，５）Ｐ３を用い、１０．７％メチルアミン存在下５３℃、１０分間インキュベーションの後に、氷冷メタノール溶液を加えることにより反応をクエンチした。反応物をＮ２ガスで乾固し、目的とするＬＰＩＰｓのリン酸基のメチル化保護を行い、三連四重極質量分析計による上記の方法で測定した。いずれのＰＩＰｓを原料としても、上記メチルアミン反応でＬＰＩＰｓの生成が認められた。【０１８８】
（化合物の同定）
本発明の化合物を同定するために、ＬＰＩＰｓの構造を裏付ける特異的フラグメントの精密質量測定を行った。「ハイブリッド四重極−オービトラップ質量分析計を用いた測定および検出方法」を以下に記す。使用した機器は、上述の三連四重極質量分析計よりも高い質量精度をもつＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓであり、その使用条件は以下のとおりである。【０１８９】
ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ系：ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ分析を、Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）とともにＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）を用いることで行った。ＰＩＰｓ画分を移動相Ａ（アセトニトリル／Ｈ２Ｏ＝４／１，０．１３％エチルアミン（７０％溶液），ｖ／ｖ））／移動相Ｂ（２−プロパノール／アセトニトリル＝４／１，０．１３％エチルアミン（７０％溶液），ｖ／ｖ））比を７０％／３０％（０〜１分）、１〜３分にかけて１０％／９０％のグラジエントをかけ、引き続き１０％／９０％（３〜７．５分）、７０％／３０％（７．５〜１３分）を用いたグラジエントによって分離した。流速は、２２０μＬ／分であり、クロマトグラフィーを６０℃でＧＬ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  Ｂｉｏ  Ｃ１８  １５０×１．０（粒子径１．９μｍ）カラムを用いて行った。【０１９０】
なお、図５Ｃおよび図５Ｄの分析については、代替的に以下の条件で行った。ＰＩＰｓ画分を移動相Ａ（メタノール／Ｈ２Ｏ／７０％エチルアミン（２０：８０：０．１３，ｖ／ｖ））／移動相Ｂ（メタノール／Ｈ２Ｏ／２−プロパノール／７０％エチルアミン（５：５：９０：０．１３、ｖ／ｖ））比を９０％／１０％（０〜０．１分）、０．１〜３分にかけて７０％／３０％のグラジエントをかけ、引き続き１０％／９０％（３〜１５分）を用いたグラジエントによって分離した。流速は、３０μＬ／分であり、クロマトグラフィーを３０°ＣでＷａｔｅｒｓ  Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ８（３．５ｍｍ、１．０ｘ１５０ｍｍ）カラムを用いて行った。
典型的には、試料１０μＬを注入した。質量分析の条件としては、イオンスプレー電圧を３．０ｋＶに設定した。加熱されたキャピラリー温度を２５０℃に設定した。他のパラメータを製造者の推奨にしたがって設定した。ＭＳ系をＸｃａｌｉｂｕｒソフトウェアを用いて調整した。ポジティブイオンモードにおける選択イオンモニタリング法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；ＳＩＭ）および並列反応モニタリング法（Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；ＰＲＭ）によってＬＰＩＰｓを測定した。【０１９１】
１７：０／２０：４−ＰＩ４Ｐ、１７：０／２０：４−ＰＩ（４，５）Ｐ２、１７：０／２０：４−ＰＩ（３，４，５）Ｐ３合成品を上述のように１０．７％メチルアミン存在下５３℃、１０分間インキュベーションすることにより調製したＬＰＩＰｓを試料として、本発明の化合物が合成されていることを確認した。ＬＰＩＰ１,ＬＰＩＰ２,ＬＰＩＰ３について特異的フラグメントの同定により、本発明の構造が同定できたといえる理論は以下のとおりである。【０１９２】
図３Ａのクロマトグラムおよび図３Ｂの出発物質、生成物質、フラグメントの構造式を参照しながらＬＰＩＰ１の同定について説明する。３７：４  ＰＩ（４）Ｐ（ｓｎ−１  １７：０、ｓｎ−２  ２０：４  ＰＩ（４）Ｐ）の緩和な脱アシル化反応（図１参照）によって生ずる二種のＬＰＩ（４）Ｐについて、ＬＰＩ（４）ＰならびにＬＰＩ（４）Ｐに由来するフラグメントの精密質量分析を行った結果を、ＬＰＩＰ１合成反応の代表例として示す。図３Ａに１７：０  ＬＰＩＰ１（一段目）とそのフラグメントイオン（二段目）、２０：４  ＬＰＩＰ１（三段目）とそのフラグメントイオン（四段目）の精密質量測定結果を、決定された分子式とともに示す。【０１９３】
反応生成物中にｍ／ｚ＝７５４．３９０２の物質（一段目）、ならびに、ｍ／ｚ＝７８８．３７４９の物質（三段目）が検出された。これらと、１７：０  ＬＰＩＰ１（３メチル化体、エチルアミン付加体）、ならびに、２０：４  ＬＰＩＰ１（３メチル化体、エチルアミン付加）の分子式から求められるｍ／ｚ理論値との誤差は０．０３ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）、ならびに、０．４７ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）であったことから、１７：０  ＬＰＩＰ１ならびに２０：４  ＬＰＩＰ１と同じ組成式をもつ物質が、上記脱アシル化反応により生成されたことが明らかとなった。【０１９４】
次に、一段目に検出される物質を含むｍ／ｚ＝７５４．３９０２±１．０の範囲で検出されうる物質を分解して生じる物質（フラグメントイオン）を検出した結果を二段目に示し、三段目に検出される物質を含むｍ／ｚ＝７８８．３７４９±１．０の範囲で検出されうる物質のフラグメントイオン
を四段目に示す。【０１９５】
一段目に示した物質ｍ／ｚ＝７５４．３９０２は、その部分構造として二段目に検出されるｍ／ｚ３２７．２８９２とｍ／ｚ３８３．０５０７をもつ。ｍ／ｚ３２７．２８９２は１７：０モノアシルグリセロール（１７：０  ＭＧ）（水酸基が一つ抜けた１価プラスイオン）の分子式から求められるｍ／ｚ理論値との誤差が０．４８ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）であり、ｍ／ｚ３８３．０５０７はイノシトール二リン酸（３メチル化体、プロトン付加体として検出）の分子式から求められるｍ／ｚ理論値との誤差が１．１６ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）であった。よって、一段目の物質の構造式が確定され、ｍ／ｚ＝７５４．３９０２は１７：０  ＬＰＩＰ１（３メチル化体、エチルアミン付加体として検出）であることが確認された。【０１９６】
一方、三段目に示した物質ｍ／ｚ＝７８８．３７４９は、その部分構造として四段目に検出されるｍ／ｚ３６１．２７３６とｍ／ｚ３８３．０５１１をもつ。ｍ／ｚ３６１．２７３６は２０：４モノアシルグリセロール（２０：４  ＭＧ）（水酸基が一つ抜けた１価プラスイオン）の分子式から求められるｍ／ｚ理論値との誤差が０．４５ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）であり、ｍ／ｚ３８３．０５１１はイノシトール二リン酸（３メチル化体、プロトン付加体として検出）の分子式から求められるｍ／ｚ理論値との誤差が２．１８ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）であった。よって、三段目の物質の構造式が確定され、ｍ／ｚ＝７８８．３７４９は２０：４  ＬＰＩＰ１（３メチル化体、エチルアミン付加体として検出）であることが確認された。【０１９７】
図３Ｃのクロマトグラムおよび図３Ｄの反応出発物質、生成物質、フラグメントの構造式を参照しながらＬＰＩＰ２の同定について説明する。図３Ｃは、３７：４  ＰＩ（４，５）Ｐ２（ｓｎ−１  １７：０、ｓｎ−２  ２０：４  ＰＩ（４，５）Ｐ２）の緩和な脱アシル化反応によって生ずる二種のＬＰＩ（４，５）Ｐ２について、ＬＰＩ（４，５）Ｐ２ならびにＬＰＩ（４，５）Ｐ２に由来するフラグメントの精密質量分析を行った結果を、ＬＰＩＰ２合成反応の代表例として示す。１７：０  ＬＰＩＰ２（一段目）とそのフラグメントイオン（二段目）、２０：４  ＬＰＩＰ２（三段目）とそのフラグメントイオン（四段目）の精密質量測定結果を、決定された分子式とともに示す。【０１９８】
反応生成物中にｍ／ｚ＝８６２．３９１６の物質（一段目）、ならびに、ｍ／ｚ＝８９６．３６９５の物質（三段目）が検出された。これらと、１７：０  ＬＰＩＰ２（５メチル化体、エチルアミン付加体）、ならびに、２０：４  ＬＰＩＰ２（５メチル化体、エチルアミン付加体として検出）の分子式から求められるｍ／ｚ理論値との誤差は４．３５ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）、ならびに、３．００ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）であったことから、１７：０  ＬＰＩＰ２ならびに２０：４  ＬＰＩＰ２と同じ組成式をもつ物質が、上記反応により生成されたことが明らかとなった。【０１９９】
次に、一段目に検出される物質を含むｍ／ｚ＝８６２．３９１６±１．０の範囲で検出されうる物質を分解して生じる物質（フラグメントイオン）を検出した結果を二段目に示し、三段目に検出される物質を含むｍ／ｚ＝８９６．３６９５±１．０の範囲で検出されうる物質のフラグメントイオン
を四段目に示す。【０２００】
一段目に示した物質ｍ／ｚ＝８６２．３９１６は、その部分構造として二段目に検出されるｍ／ｚ＝３２７．２８９４とｍ／ｚ＝４９１．０４８７をもつ。ｍ／ｚ＝３２７．２８９４は１７：０  モノアシルグリセロール（１７：０  ＭＧ）（水酸基が一つ抜けた１価プラスイオン）の分子式から求められるｍ／ｚ理論値との誤差が０．０１ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）であり、ｍ／ｚ＝４９１．０４８７はイノシトール三リン酸（５メチル化体、プロトン付加体として検出）の分子式から求められるｍ／ｚ理論値との誤差が１．６９ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）であった。よって、一段目の物質の構造式が確定され、ｍ／ｚ＝８６２．３９１６は１７：０  ＬＰＩＰ２（５メチル化体、エチルアミン付加体として検出）であることが確認された。【０２０１】
一方、三段目に示した物質ｍ／ｚ＝８９６．３６９５は、その部分構造として四段目に検出されるｍ／ｚ＝３６１．２７３７とｍ／ｚ＝４９１．０４８８をもつ。ｍ／ｚ＝３６１．２７３７は２０：４  モノアシルグリセロール（２０：４  ＭＧ）（水酸基が一つ抜けた１価プラスイオン）の分子式から求められるｍ／ｚ理論値との誤差が０．１１ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）であり、ｍ／ｚ＝４９１．０４８８はイノシトール三リン酸（５メチル化体、プロトン付加体として検出）の分子式から求められるｍ／ｚ理論値との誤差が１．８８ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）であった。よって、三段目の物質の構造式が確定され、ｍ／ｚ＝８９６．３６９５は２０：４  ＬＰＩＰ２（３メチル化体、エチルアミン付加体として検出）であることが確認された。【０２０２】
図３Ｅのクロマトグラムおよび図３Ｆの反応出発物質、生成物質、フラグメントの構造式を参照しながらＬＰＩＰ３の同定について説明する。図３Ｅは、３７：４  ＰＩ（３，４，５）Ｐ３（ｓｎ−１  １７：０、ｓｎ−２  ２０：４  ＰＩ（３，４，５）Ｐ３）の緩和な脱アシル化反応によって生ずる二種のＬＰＩ（３，４，５）Ｐ３について、ＬＰＩ（３，４，５）Ｐ３ならびにＬＰＩ（３，４，５）Ｐ３に由来するフラグメントの精密質量分析を行った結果を示す。１７：０  ＬＰＩＰ３（一段目）とそのフラグメントイオン（二段目）、２０：４  ＬＰＩＰ３（三段目）とそのフラグメントイオン（四段目）の精密質量測定結果を、決定された分子式とともに示す。反応生成物中にｍ／ｚ＝９７０．３８４３の物質（一段目）、ならびに、ｍ／ｚ＝１００４．３７２６の物質（三段目）が検出された。これらと、１７：０  ＬＰＩＰ３（７メチル化体、エチルアミン付加体）、ならびに、２０：４  ＬＰＩＰ３（７メチル化体、エチルアミン付加体）の分子式から求められるｍ／ｚ理論値との誤差は１．１８ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）、ならびに、２．７２ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）であったことから、１７：０  ＬＰＩＰ３ならびに２０：４  ＬＰＩＰ３と同じ組成式をもつ物質が、上記反応により生成されたことが明らかとなった。【０２０３】
次に、一段目に検出される物質を含むｍ／ｚ＝９７０．３８４３±１．０の範囲で検出されうる物質を分解して生じる物質（フラグメントイオン）を検出した結果を二段目に示し、三段目に検出される物質を含むｍ／ｚ＝１００４．３７２６±１．０の範囲で検出されうる物質のフラグメントイオンを四段目に示す。【０２０４】
一段目に示した物質ｍ／ｚ＝９７０．３８４３は、その部分構造として二段目に検出されるｍ／ｚ＝３２７．２８９１とｍ／ｚ＝５９９．０４５５をもつ。ｍ／ｚ＝３２７．２８９４は１７：０モノアシルグリセロール（１７：０  ＭＧ）（水酸基が一つ抜けた１価プラスイオン）の分子式から求められるｍ／ｚ理論値との誤差が０．８５ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）であり、ｍ／ｚ＝５９９．０４５５はイノシトール四リン酸（７メチル化体、プロトン付加体として検出）の分子式から求められるｍ／ｚ理論値との誤差が０．０１ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）であった。よって、一段目の物質の構造式が確定され、ｍ／ｚ＝９７０．３８４３は１７：０ＬＰＩＰ３（７メチル化体、エチルアミン付加体として検出）であることが確認された。【０２０５】
他方、三段目に示した物質ｍ／ｚ＝１００４．３７２６は、その部分構造として四段目に検出されるｍ／ｚ＝３６１．２７３５とｍ／ｚ＝５９９．０４４４をもつ。ｍ／ｚ＝３６１．２７３５は２０：４モノアシルグリセロール（２０：４  ＭＧ）（水酸基が一つ抜けた１価プラスイオンとして検出）の分子式から求められるｍ／ｚ理論値との誤差が０．６２ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）であり、ｍ／ｚ＝５９９．０４４４はイノシトール四リン酸（７メチル化体、プロトン付加体として検出）の分子式から求められるｍ／ｚ理論値との誤差が１．９４ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）であった。よって、三段目の物質の構造式が確定され、ｍ／ｚ＝１００４．３７２６は２０：４ＬＰＩＰ３（７メチル化体、エチルアミン付加体として検出）であることが確認された。【０２０６】
以上図３Ａ〜図３Ｆが、精密質量測定によるＬＰＩＰｓの同定の証明になる。【０２０７】
（考察）
生成物と生成物由来フラグメントの構造（フラグメント）の精密質量の決定によって、上記結果に記すように生成物の構造が一義的に決定された。「ハイブリッド四重極−オービトラップ質量分析計用いた測定および検出方法」によって得られた結果は、「三連四重極質量分析計でのＳＲＭによる測定および検出方法」と同様に、ＰＩＰｓの適切なメチルアミン処理によってＬＰＩＰｓが生じることを示しており、二つの測定法は共に、ＬＰＩＰｓの検出と測定に適していると考えられた。【０２０８】
（ＬＰＩＰｓのＮＭＲ解析）
合成したＬＰＩＰｓについてＮＭＲによって構造を決定した。ＮＭＲによる脂質の構造決定について、当業者は適切に構造決定を行うことができ、例えば、１Ｈ化学シフトは、Ｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｓｙｓ．（２００９）５，２８８−２９８などに記載されているものを参照することができる。【０２０９】
グリセロール骨格において、１位は約３．７ｐｐｍ、２位は約５．２ｐｐｍ、３位は約４．１ｐｐｍの化学シフトを与えるため、ｓｎ−１とｓｎ−２の区別が可能である。【０２１０】
脂肪酸のａ位、ｂ位について、ａＣＨ２は約２．３ｐｐｍ、ｂＣＨ３は約１．６ｐｐｍの化学シフトを与えるため、ｓｎ−１とｓｎ−２の区別が可能である。【０２１１】
多価不飽和脂肪酸の多価不飽和部分は、約２．８ｐｐｍ、約５．３ｐｐｍの化学シフトを与えるため、リゾリン脂質中の脂肪酸の種類の推定に利用可能である。【０２１２】
リン原子は、０〜２ｐｐｍ（３１Ｐ、リゾリン脂質化に伴い約０．５ｐｐｍ低磁場シフト）の化学シフトを与えるため、反応進行度の調査等に利用可能である。【０２１３】
例えば、図４Ａに示すようにＮＭＲから脂質の構造を決定することができる。【０２１４】
以下の試料についてＮＭＲ測定を行った。また、Ｂｒａｉｎ  ＰＩ４Ｐ  （Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、アラバマ、米国）１ｍｇのＮＭＲ測定も行った。
・試料１）  １６：０  ＬＰＩ４Ｐ  ５〜７ｎｍｏｌ
・試料２）  １７：０  ＬＰＩ（４，５）Ｐ２  ４〜６ｎｍｏｌ
・試料３）  １８：０  ＬＰＩ（４，５）Ｐ２  ４〜６ｎｍｏｌ
・試料４）  ３２：０（１６：０／１６：０）  ＰＩ４Ｐ  １０ｎｍｏｌ
・試料５）  ３７：４  （１７：０／２０：４）  ＰＩ（４，５）Ｐ２  １０ｎｍｏｌ
・試料６）  Ｂｒａｉｎ  ＰＩ（４，５）Ｐ２（大部分が３８：４（１８：０／２０：４））  １０ｎｍｏｌ
試料１〜３は、上記の実施例に従って調製した。試料４〜６は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（アラバマ、米国）から購入した。【０２１５】
試料１〜６に、それぞれ約５００ｍＬのＣＤＣｌ３：ＣＤ３ＯＤ＝１：１を添加して、Ｖｏｒｔｅｘで溶解させた。１Ｈ−１Ｄ、ＴＯＣＳＹスペクトルを測定した（３７℃、約半日）。ｐＨ＝６．０のＤ２Ｏ中ＥＤＴＡ−２Ｃｓ溶液１００ｍＬを添加した（Ｊ．  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （１９８８）  ２９、６７９−６８９）。３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルを測定した（３７℃、約２日）。ここで、試料６のみ、１Ｈ−１Ｄ、ＴＯＣＳＹスペクトルの測定を２５℃で行った。Ｂｒａｉｎ  ＰＩ４Ｐ  １ｍｇのＮＭＲ測定時間は、他の試料の約１／１０であり、３１Ｐ−１Ｄでは約１／１００であった。【０２１６】
イノシトール炭素位置の帰属のためＢｒａｉｎ  ＰＩ４ＰについてＮＭＲ解析を行ったところ、イノシトール炭素位置を帰属させることができた。【０２１７】
試料４（３２：０  ＰＩ４Ｐ）では、脂肪酸、グリセロール骨格のＣ１、Ｃ２、Ｃ３のシグナルが観測され、多価不飽和脂肪酸のシグナルは観測されなかった。【０２１８】
試料６（Ｂｒａｉｎ  ＰＩ（４，５）Ｐ２）では、脂肪酸、グリセロール骨格のＣ１、Ｃ２、Ｃ３のシグナルが観測され、多価不飽和脂肪酸のシグナルはほとんど観測されなかった。【０２１９】
測定の結果、大部分は目的の化合物由来のシグナルであることが確認された。試料１〜３および５について、ＮＭＲから確認された構造を図４Ｂ〜４Ｆに示す。
（結論）
ＮＭＲにおいて、約５〜１０ｎｍｏｌの試料量で、リゾリン脂質の脂肪酸およびグリセロール骨格の少なくとも一部のシグナルを観測することが可能であり、リゾリン脂質の構造を決定することができた。また、約５０ｎｍｏｌの試料量があれば、全ての水素原子およびリン原子のシグナルを観測することが可能である。【０２２０】
（実施例２：生物試料における分析およびＬＰＩＰｓの分離（培養細胞））
本実施例では、生物試料におけるＬＰＩＰｓの分離および分析についての実験を行った。生物試料としてはヒト培養細胞株を利用した。【０２２１】
（材料および方法）
（培養細胞株）ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胎児由来腎臓上皮細胞株、Ｏｐｅｎ  ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓカタログ番号ＨＣＬ４５１７）、Ｊｕｒｋａｔ（ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞由来細胞株、ＡＴＣＣカタログ番号ＴＩＢ−１５２）は提供元の推奨する条件で培養、維持した。【０２２２】
（リン脂質の抽出）脂質の抽出は、Ｂｌｉｇｈ  ＆  Ｄｙｅｒ法（EG  Bligh  et  al,  Canadian  Journal  of  Biochemistry  and  Physiology,  1959,  37(8):  911-917,  10.1139/o59-099）に基づいて行った。【０２２３】
ＰＩＰｓの分析のために、培養細胞およびマウス組織を氷冷メタノール１．５ｍＬによりセルスクレイパーで削り取るかまたは均質化し、吸着防止剤として１ｎｍｏｌ／μＬ  ８：０／８：０−ＰＩ（４，５）Ｐ２（２μＬ）を添加した。次いで、２００ｆｍｏｌ／μＬ  １７：０／２０：４−ＰＩ４Ｐ，１７：０／２０：４−ＰＩ（４，５）Ｐ２、１７：０／２０：４−ＰＩ（３，４，５）Ｐ３、１７：０／２０：４−ＰＩ、１７：１−ＬＰＩおよび１７：０／２０：４−ＰＳ ５０μＬを内部標準として添加し、２Ｎ  ＨＣｌ（０．７５ｍＬ）、水（０．７５ｍＬ）、１Ｍ  ＮａＣｌ（０．２ｍＬ）およびクロロホルム（３ｍＬ）を添加し、次いで撹拌、遠心分離した。遠心分離後、下層を収集した。【０２２４】
（ＤＥＡＥセルロースによる分離）
上述の手法で抽出したリン脂質をＤＥＡＥ−セルロースカラムに加える前に、メタノール１．５ｍＬを各サンプルに添加した。カラムに吸着した脂質は、クロロホルム／メタノール（１：１，ｖ／ｖ）（３ｍＬ）およびクロロホルム／メタノール／２８％アンモニア水／酢酸（２００：１００：３：０．９，ｖ／ｖ）（３ｍＬ）を用いて順次洗浄した。次いでLPIPsを含む高度酸性脂質を、クロロホルム／メタノール／ＨＣｌ／水（１２：１２：１：１，ｖ／ｖ）（１．５ｍＬ）により溶出した。水（０．７５ｍＬ）および１Ｍ  ＮａＣｌ（０．１ｍＬ）の添加後、溶液を、撹拌、遠心分離し下層を収集した。【０２２５】
（リン酸基のメチル化）
０．６ＭのＴＭＳ−ジアゾメタンのヘキサン溶液（１５０μＬ）の添加後、試料を室温で１０分間インキュベートした（Nature  Methods  8,  267-272（2011））。次いで、氷酢酸（１５μＬ）および洗浄液（クロロホルム／メタノール／水（３：４８：４７，ｖ／ｖ）０．７ｍＬ）を各溶液に添加した。溶液を、撹拌、遠心分離し下層を収集した。各サンプルを窒素ガス下、乾燥させ、メタノール／７０％エチルアミン（１００：０．０６５、ｖ／ｖ）２４μＬに再溶解させ、水８μＬを添加した。得られたＬＰＩＰｓを含む酸性リン脂質が豊富な画分を、調製してから１日以内で分析した。【０２２６】
（分析手法）
定量性に優れた「三連四重極質量分析計でのＳＲＭによる測定および検出方法」により行った。ジアシル型であるＰＩＰｓの分子種解析に基づいて、生体試料に含まれると予想されるＬＰＩＰｓ分子種について、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を行った。ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅを用い、Ｑ１：親イオンのｍ／ｚおよびＱ３：プロダクトイオンであるモノアシルグリセロールのｍ／ｚとした。質量分析データはピーク面積を定量し、各々の分子種の存在量を内部標準物質として添加したＬＰＩを基に算出した。付加物イオンは、［Ｍ＋ＣＨ３ＣＨ２ＮＨ３］＋である。本実施例で各ＬＰＩＰｓの検出に用いたＱ１、Ｑ３で指定するｍ／ｚ値のリストを表５に示す。【０２２７】
【表５】
2018016645.tif 000021
【０２２８】
（分析結果）
図５ＡにＨＥＫ２９３Ｔ細胞、図５ＢにＪｕｒｋａｔ細胞での、ＬＰＩＰ１、ＬＰＩＰ２、ＬＰＩＰ３の存在を示す。横軸は脂肪酸構成が異なる分子種、縦軸はＰＳ  １ｎｍｏｌを含む細胞由来リン脂質中での存在量を示す。炭素数１６〜２２、二重結合が０〜６の多様なアシル基をもつＬＰＩＰｓが細胞内に見出された。ＬＰＩＰ１、ＬＰＩＰ２はＰＳの数百分の１から数十分の１程度、ＬＰＩＰ３は数百分の１から数千分の１程度のレベルで存在する微量リン脂質であった。【０２２９】
またＨＥＫ２９３Ｔ細胞の脂質抽出物の「ハイブリッド四重極−オービトラップ質量分析計を用いた測定および検出方法」による解析で、１８：０  ＬＰＩＰ３とその特異的フラグメントを検出した結果を図５Ｃ、図５Ｄに示す。【０２３０】
図５Ｃの上段に示すように、ｍ／ｚ＝９８４．４０２４のピークを検出し、これは１８：０  ＬＰＩＰ３（７メチル化体、メチルアミン付加）のｍ／ｚ理論値（９８４．４０１２）との誤差は１．２６７３ｐｐｍ（５ｐｐｍ以下）であったことから、１８：０  ＬＰＩＰ３と同じ組成式をもつ物質が、ＨＥＫ２９３細胞の脂質抽出液に含まれることが明らかとなった。図５Ｄ下段に示すように、ｍ／ｚ＝９８４．４０２４±０．２の範囲で検出されるイオンのフラグメントとしてｍ／ｚ３４１．３０４７とｍ／ｚ５９９．０４４９のピークが検出された。前者は１８：０  モノアシルグリセロール（水酸基が一つ抜けた１価プラスイオン）、後者はイノシトール四リン酸（７メチル化体、プロトン付加）のｍ／ｚと一致するもので、共に理論値からの誤差が５ｐｐｍ以下（１．０４６０と１．０５３９）であった（（図３Ｅ参照）後者のピークについては、ＬＰＩＰ３合成品から生じるフラグメントイオンと同一のイオンである）。図５Ｃの下段のｍ／ｚ３４１．３０４７とｍ／ｚ５９９．０４４９が、図５Ｄの上段のｍ／ｚ＝９８４．４０２４由来のイオン断片であるならば、これらピークが検出される時間は一致する。図５Ｄにｍ／ｚ＝９８４．４０２４の溶出時間に一致して、ｍ／ｚ３４１．３０４７とｍ／ｚ５９９．０４４９が検出されることを示す。【０２３１】
ＣＨ３ＣＨ２ＮＨ３＋付加体を以下に示す。
2018016645.tif 000022
【０２３２】
付加前は以下のとおりである。【０２３３】
【化１７Ａ】
2018016645.tif 000023
【０２３４】
脱水酸基体を以下に示す。【０２３５】
【化１８】
2018016645.tif 000024
【０２３６】
脱水酸化前を以下に示す。【０２３７】
【化１８Ａ】
2018016645.tif 000025
【０２３８】
Ｈ＋付加体を以下に示す。【０２３９】
【化１９】
2018016645.tif 000026
【０２４０】
付加前は以下のとおりである。【０２４１】
【化１９Ａ】
2018016645.tif 000027
【０２４２】
（実施例３：生物試料における分析およびＬＰＩＰｓの分離（マウス組織およびヒト血液試料）
次に、本実施例では、生物試料におけるＬＰＩＰｓの分離および分析についての実験を別の試料を用いて行った。生物試料としてはマウスあるいはヒトの組織あるいは血清あるいは血漿でのＬＰＩＰｓを利用した。【０２４３】
マウス：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ＜日本クレア株式会社から購入＞、１２−１６週齢臓器／組織：脳、心臓、肝臓、大腸の調製は以下の通り行った。マウスを頸椎脱臼し、仰向けに固定した後に開腹した。ＰＢＳで灌流脱血後に単離した臓器を、速やかに液体窒素で凍結した。脂質抽出直前に解凍し、ホモジナイザーで均一化した。リン脂質の抽出およびＤＥＡＥセルロースによる分離およびメチル化反応は、実施例２に準じて行った。分析も実施例２と同様に「三連四重極質量分析計でのＳＲＭによる測定および検出方法」で行った。血清：麻酔薬（ケタミン）を腹腔投与３分後に開腹し、心臓より血液を採取した。採取した血液を室温で１５分静置した後に、４℃にて１２時間静置した。遠心（６００ｇ、３０分）で血餅を取り除き、血清を調製した。リン脂質の抽出およびＤＥＡＥセルロースによる分離およびメチル化反応は、実施例２に準じて行った。分析も実施例２と同様に「三連四重極質量分析計でのＳＲＭによる測定および検出方法」で行った。【０２４４】
血漿：麻酔薬（ケタミン）を腹腔投与３分後に開腹し、下腹部大動脈より血液０．５ｍｌを採取した。採取した血液を氷冷した２ｍｇ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ入りの１．５ｍＬチューブに回収し、撹拌および遠心（６００ｇ、３０分）後の上清を血漿試料を調製した。リン脂質の抽出およびＤＥＡＥセルロースによる分離およびメチル化反応は、実施例２に準じて行った。分析も実施例２と同様に「三連四重極質量分析計でのＳＲＭによる測定および検出方法」で行った。【０２４５】
ヒト血清：末梢静脈から試験管に採血を行い、採取した血液を室温で１５分静置した後に、４℃にて１２時間静置した。遠心（６００ｇ、３０分）で血餅を取り除き、血清を調製した。リン脂質の抽出およびＤＥＡＥセルロースによる分離およびメチル化反応は、実施例３と同様に行った。分析は実施例２と同様に「三連四重極質量分析計でのＳＲＭによる測定および検出方法」で行った。【０２４６】
（結果）
図６Ａに示すように、マウス組織にＬＰＩＰｓが存在することが明らかとなった。さらに、図６Ｂに示す血清、図６Ｃに示す血漿など、生体内の液性成分としてＬＰＩＰｓが存在することから、細胞で産生されたＬＰＩＰｓが分泌されたり、あるいは、ＬＰＩＰｓの生成や分解（例えばＬＰＩＰ１のリン酸化によるＬＰＩＰ２の生成など）が細胞外でも起こることが示唆された。図６Ｄに示すようにヒト血清にもＬＰＩＰｓが存在した。【０２４７】
（考察）
マウス、ヒト由来の試料に加え、別の実験から、酵母、ショウジョウバエにもＬＰＩＰｓは存在することなどを見出しており、多くの生物種において、細胞内、細胞外にＬＰＩＰｓが存在することが判明した。【０２４８】
（実施例４：がんマーカーとしての利用）
本実施例では、新規ＬＰＩＰｓの有用性について検討した。【０２４９】
（材料および方法）
ＰＴＥＮｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス（対象マウス）ならびにＰＢ−Ｃｒｅ４：ＰＴＥＮｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス（前立腺特異的Ｐｔｅｎ欠損マウス）♂、１６ｗｋ
臓器：前立腺
試料の調製は以下の通り行った。マウスを頸椎脱臼し、仰向けに固定した後に開腹し、実体顕微鏡下で単離した前立腺を、速やかに液体窒素で凍結した。脂質抽出直前に解凍し、ホモジナイザーで均一化した。リン脂質の抽出およびＤＥＡＥセルロースによる分離およびメチル化反応は、実施例２に準じて行った。分析も実施例２と同様に「三連四重極質量分析計でのＳＲＭによる測定および検出方法」で行った。【０２５０】
（結果）
図７Ａに、正常マウス（Ｃｔｒｌ）あるいはがん抑制遺伝子Ｐｔｅｎを前立腺特異的に欠損するマウス（ＰＴＥＮ  ＫＯ）の前立腺について、上段に組織重量を、下段にＨＥ染色による組織像を表す。Ｐｔｅｎ欠損は前立腺がんを発症することがわかる。図７Ｂに示すように、対照となる正常前立腺と比して、前立腺がん組織で１６：０ＬＰＩＰｓが上昇していることが明らかとなった。特にＬＰＩＰ３においては、正常組織では検出限界以下であるところ、腫瘍形成に伴って顕著な上昇が見出された。ＬＰＩＰｓの変動は発がんと相関することから、がんの治療標的やがんを反映するバイオマーカーとしてのＬＰＩＰｓの有用性が期待される。【０２５１】
（実施例５：炎症マーカーとしての利用）
（材料および方法）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ＜日本クレア株式会社から購入＞、１２−１６週齢
マウスを頸椎脱臼した後に解剖し、足部大腿骨を得た。得られた大腿骨より骨髄球、好中球を回収し、起炎症性物質である補体成分Ｃ５ａにより刺激した。リン脂質の抽出およびＤＥＡＥセルロースによる分離およびメチル化反応は、実施例２と同様に行った。分析も実施例２と同様に「三連四重極質量分析計でのＳＲＭによる測定および検出方法」で行った。【０２５２】
（結果）
図８に示すように、好中球、マクロファージ等炎症に関連する血液細胞の活性化に関与する補体成分Ｃ５ａ刺激に伴い、１８：０  ＬＰＩＰ３が上昇する。ＬＰＩＰ３が炎症細胞の走化性、活性酸素産生、貪食、酵素分泌反応などに関与する可能性が提示され、炎症の治療標的としての有用性を期待することができる。【０２５３】
（実施例６）カラムによるホスホイノシタイドの分離
本実施例では、ＬＣ−ＭＳでのホスホイノシタイド（ＰＩＰｓ）のリン酸基の位置による分離が可能であることを実証した。【０２５４】
（材料および方法）
（使用材料）
以下の分析対象の試料として用いたホスファチジルイノシトールリン酸（ホスホイノシタイド）をＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（アラバマ州、米国）から購入した。
１７：０−２０：４  ＰＩ（３）Ｐ（ＬＭ−１９００）
１７：０−２０：４  ＰＩ（４）Ｐ（ＬＭ−１９０１）
１７：０−２０：４  ＰＩ（５）Ｐ（ＬＭ−１９０２）
１７：０−２０：４  ＰＩ（３，４）Ｐ２（ＬＭ−１９０３）
１７：０−２０：４  ＰＩ（４，５）Ｐ２（ＬＭ−１９０４）
１７：０−２０：４  ＰＩ（３，５）Ｐ２（ＬＭ−１９０５）
１７：０−２０：４  ＰＩ（３，４，５）Ｐ３（ＬＭ−１９０６）
１７：０−２０：４  ＰＩ（ＬＭ−１５０２）
その他のグリセロリン脂質標準合成品
利用したすべての溶媒は、ＨＰＬＣまたはＬＣ−ＭＳグレードであり、他の化学試薬は分析グレードであった。トリメチルシリルジアゾメタン（ＴＭＳ−ジアゾメタン）は、東京化成から購入した。超純水はＫａｎｔｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から入手した。【０２５５】
それぞれのホスホイノシタイドを、ガラスバイアル（４ｍＬサイズ）中で１００μＭ濃度になるようにクロロホルム：メタノール＝１：１に溶解し、−３０℃の冷凍庫内で保存した。【０２５６】
この保存溶液から以下の試料を調製した。【０２５７】
各ホスホイノシタイド単独（１００μＭ  １μＬ）
ＰＩ（３）Ｐ＋ＰＩ（４）Ｐ＋ＰＩ（５）Ｐ（それぞれ、１００μＭ  １μＬずつ）
ＰＩ（３，４）Ｐ２＋ＰＩ（４，５）Ｐ２＋ＰＩ（３，５）Ｐ２（それぞれ、１００μＭ  １μＬずつ）
各試料をＴＭＳジアゾメタンで処理して、リン酸基を保護した。具体的には、各試料を０．６Ｍ  ＴＭＳジアゾメタン１５０μＬで処理（２２〜２５℃）し、５分後に氷酢酸１５μＬを添加してメチル化反応を止めた。その後、それぞれの試料に対してクロロホルム：メタノール：水（３：４８：４７）混合液を７００μＬ加え、遠心分離後、有機層（下層）をスピッツ試験管に分注し、窒素ガス濃縮器により蒸発乾固させて、それぞれ、アセトニトリル１００μＬに再溶解してＬＣ−ＭＳ測定用の試料とした。【０２５８】
（測定条件）
ＬＣ−ＭＳによる測定は以下の条件で行った。【０２５９】
（使用機器）
質量分析装置：ＱＴＲＡＰ６５００  ｗｉｔｈ  ＳｅｌｅｘＩＯＮ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＳｃｉｅｘ、東京、日本）
ポンプ：Ｎｅｘｅｒａ  Ｘ２  ｓｙｓｔｅｍ（島津製作所、京都、日本）
オートサンプラー：ＰＡＬ  ＨＴＣ−ｘｔ（ＡＭＲ、東京、日本）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＩＣ−３、２．１ｍｍ  ｘ  ２５０ｍｍ、粒径３μｍ（ＤＡＩＣＥＬ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、大阪、日本）
流速：０．１ｍＬ／分
注入試料量：１０μＬ
（クロマトグラフィー条件）
移動相Ａ：アセトニトリル＋５ｍＭ酢酸アンモニウム
移動相Ｂ：メタノール＋５ｍＭ酢酸アンモニウム
＊これらの試薬は、全て和光純薬（東京、日本）から購入したＬＣ−ＭＳ用グレードのものを使用した。【０２６０】
グラジエント条件（リニアグラジエント）
０分、移動相Ｂ＝４０％
１分、移動相Ｂ＝４０％
３分、移動相Ｂ＝８５％
１４分、移動相Ｂ＝８５％
１５分、移動相Ｂ＝４０％
２０分、移動相Ｂ＝４０％
・質量分析計条件
イオン化法：エレクトロスプレー（正イオンモード）
測定メソッド：多重反応モニタリング（ＭＲＭ）
制御ソフトウェア：Ａｎａｌｙｓｔ  １．６．２（Ｓｃｉｅｘ、東京、日本）
測定メソッドは以下のものを用いた。【０２６１】
ソフトウェア：Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ：Ａｎａｌｙｓｔ  １．６．２  図１は、内部サロゲート標準としてＣ１７：０／Ｃ２０：４−ＰＩ（３）Ｐ、−ＰＩ（４）Ｐ、−ＰＩ（５）Ｐを測定したクロマトグラムとＣ１７：０／Ｃ２０：４−ＰＩ（３，５）Ｐ２、−ＰＩ（３，４）Ｐ２、−ＰＩ（４，５）Ｐ２を測定したクロマトグラムのデータを示す。ＰＩＰ１の３つのアイソマーはＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐの順に溶出され分離した。ＰＩＰ２の３つのアイソマーはＰＩ（３，５）Ｐ２、ＰＩ（３，４）Ｐ２、ＰＩ（４，５）Ｐ２の順に溶出され分離した。【０２６２】
以下に使用したＱ１のプレカーサーイオンと、Ｑ３のプロダクトイオンとの組み合わせを示す。【０２６３】
【表６−１】
2018016645.tif 000028
【０２６４】
【表６−２】
2018016645.tif 000029
【０２６５】
【表６−３】
2018016645.tif 000030
【０２６６】
＜質量分析の測定条件＞
Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ｔａｂｌｅ（Ｐｅｒｉｏｄ１  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ１）
ＣＵＲ：２０．００
ＣＡＤ：９．００
ＩＳ：５５００．００
ＴＥＭ：１００．００
ＧＳ１：５０．００
ＧＳ２：５０．００
ＤＰ  １００．００
ＥＰ  １０．００
ＣＸＰ  １２．００
Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔａｂｌｅｓ
Ｑｕａｄ１  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｕｎｉｔ  Ｓｃａｎ  Ｓｐｅｅｄ＝１０Ｄａ／ｓ
（キャリブレーション条件）
ポリプロピレングリコール(PPG)をキャリブレーション用の試薬として用いたところ以下の結果となった。
ＩＥ１  １．８００
Ｍａｓｓ（Ｄａ）  Ｏｆｆｓｅｔ  Ｖａｌｕｅ
５９．０５０    ０．０１０
１７５．１３３  −０．０３５
５００．３８０  −０．１９４
６１６．４６４  −０．２６８
９０６．６７３  −０．４２１
１２５４．９２５  −０．６１７
１５４５．１３４  −０．７８２
１９５２．４２７  −１．０１３
Ｑｕａｄ３  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｕｎｉｔ  Ｓｃａｎ  Ｓｐｅｅｄ＝１０Ｄａ／ｓ
ＩＥ３  １．０００
Ｍａｓｓ（Ｄａ）  Ｏｆｆｓｅｔ  Ｖａｌｕｅ
５９．０５０      ０．００５
１７５．１３３    −０．０１２
５００．３８０    −０．０８５
６１６．４６４    −０．１０５
９０６．６７３    −０．１８３
１２５４．９２５    −０．２７０
１５４５．１３４    −０．３２９
１９５２．４２７    −０．４２９
Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｔａｂｌｅｓ
Ｑｕａｄ１  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｕｎｉｔ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｃａｎ  Ｓｐｅｅｄ＝１０Ｄａ／ｓ
Ｍａｓｓ（Ｄａ）  Ｄａｃ  Ｖａｌｕｅ
１７５．１３３  １８６８２
５００．３８０  ５３６７８
６１６．４６４  ６６１６２
９０６．６７３  ９７３９３
１２５４．９２５  １３４８６８
１５４５．１３４  １６６０９９
１９５２．４２７  ２０９９３３
Ｑｕａｄ３  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｕｎｉｔ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｃａｎ  Ｓｐｅｅｄ＝１０Ｄａ／ｓ
Ｍａｓｓ（Ｄａ）  Ｄａｃ  Ｖａｌｕｅ
５９．０５０  ６１８９
１７５．１３３  １８６３７
５００．３８０  ５３５６４
６１６．４６４  ６６０２８
９０６．６７３  ９７１９５
１２５４．９２５  １３４６０３
１５４５．１３４  １６５７５９
１９５２．４２７  ２０９４９０
（装置パラメータ）
Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：
ＣＥＭ  １８００．０
（ソフトウェアバージョン）
ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ：Ａｎａｌｙｓｔ  １．６．２
以上のように、取得したデータは、Ａｎａｌｙｓｔ（Ｓｃｉｅｘ、東京、日本）またはＭｕｌｔｉ  Ｑｕａｎｔ（Ｓｃｉｅｘ、東京、日本）を使用して解析した。【０２６７】
１７：０／２０：４合成品を用いたアイソマー分離の結果を図１に示す。リン酸基の数が異なるホスホイノシタイドは異なる保持時間で溶出された。リン酸基の位置のみが異なる３種類の異性体を混合した場合でも（ＰＩＰまたはＰＩＰ２の混合物）、カラムにより２０分の測定メソッドで良好に分離することができた。このようにホスホイノシタイドのリン酸基位置異性体による分離によって、位置異性体特異的な分析が可能となる。【０２６８】
また、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳの測定結果を利用することで、ホスホイノシタイドのアシル基の種類の組み合わせを特定することも可能であることが確かめられた（アシル基の種類の特定については、Ｃｌａｒｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２０１１  Ｍａｒ；８（３）：２６７−７２．  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈも参照可能である）。そのため、本発明の方法を用いて、ホスホイノシタイドのリン酸基の位置およびアシル基の種類を特定することができる。【０２６９】
（実施例７）ホスホイノシタイドの定量
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるホスホイノシタイドの定量の精度を調べるために種々の試料量、および反復測定による影響を試験した。【０２７０】
試料調製
実施例６と同様に、合成１７：０／２０：４ホスホイノシタイド試料を調製した。【０２７１】
この試料に、以下のメチル化処理を施した。試料を、０．６Ｍ  ＴＭＳジアゾメタン１５０μＬで処理（２２〜２５℃）し、５分後に氷酢酸１５μＬを添加してメチル化反応を止めた。その後、それぞれの試料に対してクロロホルム：メタノール：水（３：４８：４７）混合液を７００μＬ加え、遠心分離後、有機層（下層）をスピッツ試験管に分注し、窒素ガス濃縮器により蒸発乾固させて、それぞれ、アセトニトリル１００μＬに再溶解してＬＣ−ＭＳ測定用の試料とした。【０２７２】
８種類の１７：０／２０：４ホスホイノシタイド（ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐ、ＰＩ（３，４）Ｐ２、ＰＩ（４，５）Ｐ２、ＰＩ（３，５）Ｐ２、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３およびＰＩ）について、それぞれ、０．０２、０．０５、０．１、０．２、５、１０および５０ｐｍｏｌ（各注入量で４回繰り返し測定）を注入してＬＣ−ＭＳ測定した場合のシグナル強度（ピーク面積）を比較した。検量線の結果を図２に示す。【０２７３】
また、各検量線の計算式等を以下の表に示す。【０２７４】
【表７】
2018016645.tif 000031
【０２７５】
Ｃ１７：０／Ｃ２０：４−ＰＩＰｓのキャリブレーション曲線の結果、０．００２ｐｍｏｌから５０ｐｍｏｌの範囲で線形性が得られた。検出限界（ＬＯＤ）は０．００５〜０．０３３ｐｍｏｌであり、定量限界（ＬＯＱ）は０．０１４〜０．０９９ｐｍｏｌであった。【０２７６】
これらの結果から、ｐｍｏｌレベルまたはさらにそれ未満の微量のホスホイノシタイドについても、良好な定量結果が得られることが確かめられた。【０２７７】
また、同様にそれぞれのホスホイノシタイドについて測定ラン間のばらつきを調べるために、それぞれの試料について５０回の反復測定（注入試料量１０ｐｍｏｌ）を行った結果を図３に示す。分散係数は、８．４〜１２．０％であり、測定ラン間のばらつきは小さいことが示された。【０２７８】
調製した試料中でホスホイノシタイドは安定しており、試料間の測定タイミングの差による定量結果への影響は小さいことが予測される。すなわち、これらの結果は、開発した分析法は定量性と再現性に優れていることを示している。【０２７９】
（実施例８）イオンモビリティ分離によるホスホイノシタイドの分離
実施例８は、イオンモビリティ分離によるホスホイノシタイドのリン酸基の位置による分離が可能であることを実証する。【０２８０】
キラルカラム以外の方法（質量分析装置のみ）でＰＩＰ２アイソマーを分離した。イオンモビリティを用いることでインタクトなＰＩＰ２（Ｃ１７：０／Ｃ２０：４−ＰＩ（３，５）Ｐ２、−ＰＩ（３，４）Ｐ２および−ＰＩ（４，５）Ｐ２）の分離を試みた。以下に詳細を示す。【０２８１】
Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（アラバマ州、米国）から購入した以下のホスホイノシタイド；
１７：０−２０：４  ＰＩ（３，４）Ｐ２（ＬＭ−１９０３）
１７：０−２０：４  ＰＩ（４，５）Ｐ２（ＬＭ−１９０４）
１７：０−２０：４  ＰＩ（３，５）Ｐ２（ＬＭ−１９０５）
から、実施例６と同様に、ＭＳ分析用の試料を調製した。【０２８２】
測定は以下の条件で行った。
ＭＳ：
装置：Ｑ  ＴＲＡＰ  ６５００、ＳｅｌｅｘＩＯＮシステム（ＡＢＳｃｉｅｘ、東京、日本）
制御ソフト：Ａｎａｌｙｓｔ１．６．２、ＰｅａｋＶｉｅｗ（Ｓｃｉｅｘ、東京、日本）
イオン化／イオン源：ＥＳＩ／ＩｏｎＤｒｉｖｅ（Ｓｃｉｅｘ、東京、日本）
シリンジポンプ：７μＬ／分
イオン源パラメータ：
カーテンガス：２０
コリジョンガス：Ｍｅｄｉｕｍ
イオンスプレー電圧：５５００Ｖ（正イオンモード）
温度：５００℃
イオン源ガス１：７０ｐｓｉ
イオン源ガス２：５０ｐｓｉ
結果を図１２に示す。図１２に示すように、補償電圧（ＣＯＶ）の違いによりＰＩ（４，５）Ｐ２を、ＰＩ（３，５）Ｐ２およびＰＩ（３，４）Ｐ２から分離することができた。このようにカラムを用いなくてもホスホイノシタイドの位置異性体を分離できることが示された。なお、測定に用いたＣ１７：０／Ｃ２０：４−ＰＩＰ２はメチル化していないものであった。【０２８３】
また、イオンモビリティをＬＣと組み合わせたさらなる実験を行ったところ、ホスホイノシタイドをより選択性高く検出することができた。【０２８４】
（実施例９：ホスホイノシタイド組成の変化の評価の分析）
本実施例では、本発明の方法を使用することで、薬剤処理した細胞におけるホスホイノシタイド組成の変化を評価することができることを示す。実施例６と同様に、それぞれのジアシルグリセロール種について、リン酸基の位置異性体の溶出順序を事前に確認した。【０２８５】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト胎児由来腎臓上皮細胞株、Ｏｐｅｎ  ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ（コロラド、米国）カタログ番号ＨＣＬ４５１７）を、提供元の推奨する条件で１Ｘ１０６細胞／１０ｃｍディッシュになるまで培養した（０日目）。２日目に最終濃度１０ｍＭとなるように培養培地にＨ２Ｏ２を添加し、それぞれ、０分後、２分後、５分後および１５分後にセルスクレイパーで細胞を削りとり収集し、８００ｇ、３分間の遠心分離後ペレットを回収し、さらにＰＢＳ（−）で洗浄して細胞を回収した。【０２８６】
その後、以下の脂質抽出およびメチル化処理を行い、キラルＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定した。
リン脂質の抽出
ＰＩＰｓ分析のために、細胞試料に、５０μＬの０．２ｐｍｏｌ／μＬ  １７：０／２０：４−ＰＩ３Ｐ、１７：０／２０：４−ＰＩ４Ｐ、１７：０／２０：４−ＰＩ５Ｐ、１７：０／２０：４−ＰＩ（３，５）Ｐ２、１７：０／２０：４−ＰＩ（３，４）Ｐ２、１７：０／２０：４−ＰＩ（４，５）Ｐ２、１７：０／２０：４−ＰＩ（３，４，５）Ｐ３、２ｐｍｏｌ／μＬ  １７：０／２０：４−ＰＩ、および１７：０／２０：４−ＰＳを添加し、これらを内部サロゲート標準とした。次に、２μＬの１ｎｍｏｌ／μＬ  ８：０／８：０−ＰＩ（４，５）Ｐ２（吸着防止剤として）、０．７５ｍＬの２Ｎ  ＨＣｌ、０．７５ｍＬの水、０．２ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌおよび３ｍＬのクロロホルムを添加し、振り混ぜた。遠心分離した後、下層を収集し、１．５ｍＬのメタノールを各試料に添加した後、ＤＥＡＥセルロースカラム（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、テキサス、米国）にアプライした。カラムに吸着された脂質を、クロロホルム：メタノール（１：１、ｖ／ｖ）（３ｍＬ）およびクロロホルム：メタノール：２８％アンモニア水溶液：酢酸（２００：１００：３：０．９、ｖ／ｖ）（３ｍＬ）で順次洗浄した。次に、ＰＩＰｓ、ＰＩおよびＰＳを含む高度酸性脂質をクロロホルム：メタノール：ＨＣｌ：水（１２：１２：１：１、ｖ／ｖ）（１．５ｍＬ）で溶離させた。０．７５ｍＬの水および０．１ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌを添加した後、溶液を振り混ぜ、遠心分離し、下層を収集した。１５０μＬの０．６Ｍ  ＴＭＳ−ジアゾメタン（ヘキサン中）を添加した後、試料を１０分間室温でインキュベートした（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）。次に、２０μＬの氷酢酸および０．７ｍＬの洗浄溶液（クロロホルム：メタノール：水（３：４８：４７、ｖ／ｖ））をそれぞれの溶液に添加した。溶液を振り混ぜ、遠心分離し、下層を収集した。各試料を窒素ガス下で乾燥させ、アセトニトリルに再溶解させた。得られたＰＩＰｓ濃縮分画を調製から１日以内に分析した。【０２８７】
メチル化処理は、実施例６と同様に、各試料をＴＭＳジアゾメタンで処理することによって行った。
ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳシステム
試料の分析は、実施例６と同様に以下の条件で行った。
質量分析装置：ＱＴＲＡＰ  ６５００（ＡＢＳｃｉｅｘ、東京、日本）
ポンプ：Ｎｅｘｅｒａ  Ｘ２  ｓｙｓｔｅｍ（島津製作所、京都、日本）
オートサンプラー：ＰＡＬ  ＨＴＣ（ＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｚｗｉｎｇｅｎ，スイス）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＩＣ−３、２．１ｍｍ  ｘ  ２５０ｍｍ、粒径３μｍ（ＤＡＩＣＥＬ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、大阪、日本）
インジェクタ：非金属インジェクタユニット
サンプルループ：２５μＬ  ＰＥＥＫチューブ
流速：０．１ｍＬ／分
注入試料量：１０μＬ
温度：室温
（クロマトグラフィー条件）
移動相Ａ：アセトニトリル＋５ｍＭ酢酸アンモニウム
移動相Ｂ：メタノール＋５ｍＭ酢酸アンモニウム
＊これらの試薬は、全て和光純薬（東京、日本）から購入したＬＣ−ＭＳ用グレードのものを使用した。【０２８８】
グラジエント条件（リニアグラジエント）
０分、移動相Ｂ＝４０％
１分、移動相Ｂ＝４０％
３分、移動相Ｂ＝８５％
１４分、移動相Ｂ＝８５％
１５分、移動相Ｂ＝４０％
２０分、移動相Ｂ＝４０％
・質量分析計条件
イオン化法：エレクトロスプレー（正イオンモード）
測定メソッド：多重反応モニタリング（ＭＲＭ）
測定結果を図１３および図１４に示す。【０２８９】
図１３の結果は、３８：４のホスホイノシタイドの抽出イオンクロマトグラムを示す。Ｈ２Ｏ２処理時間が増加するほど、ＰＩ（４，５）Ｐ２が減少し、ＰＩ（３，４）Ｐ２が増大することが示される。【０２９０】
図１４Ａ〜Ｄの結果は、異なるジアシルグリセロールを有するＰＩＰｓがＨ２Ｏ２処理によってどのように変化するかを示す。統計処理は、一元配置分散分析、Tukeyの多重比較検定を用いた。異なるジアシルグリセロールを有するＰＩＰｓについても、Ｈ２Ｏ２処理時間が増加するほど、ＰＩ（４，５）Ｐ２が減少し、ＰＩ（３，４）Ｐ２が増大することが示された。【０２９１】
このように、本発明の方法を使用することで、薬剤処理した細胞におけるホスホイノシタイド組成（ジアシルグリセロールの種類、ＰＩＰｓにおけるリン酸基の数および位置）の変化を詳細に観察することができる。【０２９２】
（実施例１０：遺伝子操作したマウスにおけるホスホイノシタイド組成の変化の評価）
本実施例では、本発明の方法を使用することで、遺伝子操作したマウスにおけるホスホイノシタイド組成の変化を評価することができることを示す。実施例６と同様に、それぞれのジアシルグリセロール種について、リン酸基の位置異性体の溶出順序を事前に確認した。【０２９３】
ホスホイノシタイドの代謝に関わる２つの遺伝子（ＩＮＰＰ４ＢおよびＰＴＥＮ）を操作した場合のホスホイノシタイド組成の変化を観察した。【０２９４】
ＩＮＰＰ４Ｂは、以下の脱リン化反応
ＰＩ（３，４，５）Ｐ３→ＰＩ（３，４）Ｐ２→ＰＩ（３）Ｐ
を促進し、ＰＴＥＮは以下の脱リン化反応
ＰＩ（３，４，５）Ｐ３→ＰＩ（４，５）Ｐ２
を促進することが報告されている（Ｋｏｆｕｊｉ  Ｓ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１５  Ｊｕｌ；５（７）：７３０−９、Ｌｉ  Ｃｈｅｗ  Ｃ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１５  Ｊｕｌ；５（７）：７４０−５１およびＶｏ  ＴＴ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１５  Ｊｕｌ；５（７）：６９７−７００）。【０２９５】
以前の論文（Ｋｏｆｕｊｉ  Ｓ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１５  Ｊｕｌ；５（７）：７３０−９）に従って作製したマウスを実験に使用した。具体的には、マウスは以下の通りに作製した。コンディショナル標的化ベクターを構築し、マウスＩｎｐｐ４ｂ遺伝子の２１番目のコーディングエクソンを含む遺伝子断片を相同組み換えによって削除した。１つのｌｏｘＰ部位をイントロン２０に導入し、２つのｌｏｘＰ部位をイントロン２１に導入した。ＬａｃＺ−ＰＧＫ−Ｎｅｏｒカセットを、イントロン２１内の２つのｌｏｘ部位の間にＩｎｐｐ４ｂの転写に対してアンチセンス方向で挿入した。直鎖の構築物を１×１０７個のＥ１４Ｋマウス胚性幹（ＥＳ）細胞にエレクトロポレーションによって導入した（Ｓａｓａｋｉ  Ｔ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００；２８７：１０４０−６）。Ｇ４１８（０．３ｍｇ／ｍＬ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に抵抗性のＥＳ細胞コロニーを、標準的なＰＣＲによってスクリーニングして相同組み換えを起こしたコロニーを選択した。組み換えクローンは、５９０ｂｐのプローブを使用したＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡ断片の標準的なサザンブロットによって確認した。標的化したＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの胚盤胞（日本クレア株式会社、東京、日本）に注入した。キメラ雄性マウスをＣ５７ＢＬ／６ＪＪ雌性マウスと交配させて生殖系列の遺伝を達成した。ＭｅｕＣｒｅ４０遺伝子導入マウス（Ｌｅｎｅｕｖｅ  Ｐ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００３；３１：ｅ２１）と交配させることで選択カセットを削除したＩｎｐｐ４ｂ＋／ｆｌｏｘマウスを作製した。同様に、Ｉｎｐｐ４ｂ＋／ｆｌｏｘマウスをＭｅｕＣｒｅ４０マウスと交配させることでＩｎｐｐ４ｂ＋／Δマウスを作製した。ＰＣＲによって、Ｉｎｐｐ４ｂΔ／Δマウスが、Ｉｎｐｐ４ｂ＋／ΔマウスおよびＩｎｐｐ４ｂ＋／＋マウスと異なることを確認した。Ｉｎｐｐ４Ａ＋対立遺伝子およびＩｎｐｐ４ＡΔ対立遺伝子に共通のオリゴプライマー（５’−ＣＣＴＧＣＣＡＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＴ−３’）、Ｉｎｐｐ４Ａ＋対立遺伝子（５’−ＧＴＴＴＡＣＡＴＴＴＧＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’）に特異的なプライマー、およびＩｎｐｐ４ＡΔ対立遺伝子（５’−ＴＧＣＴＧＴＣＧＣＣＧＡＡＧＡＡＧＴＴＡ−３’）に特異的なプライマーを同一のＰＣＲ反応において組み合わせた。Ｉｎｐｐ４ｂ＋／ΔＰｔｅｎ＋／−マウスは、Ｉｎｐｐ４ｂ＋／ΔマウスをＰｔｅｎ＋／−マウスと交配させることで作製した（Ｓｕｚｕｋｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １９９８；８：１１６９−７８）。Ｉｎｐｐ４ｂΔ／ΔＰｔｅｎ＋／−マウスを作製するために、Ｉｎｐｐ４ｂ＋／ΔＰｔｅｎ＋／−マウスをＩｎｐｐ４ｂ＋／Δマウスと交配させた。Ｉｎｐｐ４ｂ＋／ΔＰｔｅｎ＋／−マウスをＡｋｔ１−／−マウスまたはＡｋｔ２−／−マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）と交配させることで三重変異体を作製した。全ての動物実験は、秋田大学動物実験委員会のレビューおよび承認を得て行った。【０２９６】
このように作製したマウスのうち以下のマウスから取得した甲状腺を試料として使用した。
・Ｃ５７／Ｂ６Ｊマウス（雄性または雌性、５〜６月齢）（Ｎ＝３）
・ＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）マウス（雄性または雌性、５〜８月齢）（Ｎ＝４）
・ＰＴＥＮ（＋／−）マウス（雄性または雌性、５〜７月齢）（Ｎ＝４）
・ＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）ＰＴＥＮ（＋／−）マウス（雄性または雌性、５〜７月齢）（Ｎ＝４）
それぞれの試料に対して、以下の脂質抽出およびメチル化処理を行い、キラルＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定した。
リン脂質の抽出
ＰＩＰｓ分析のために、それぞれのマウス組織を１．５ｍＬの氷冷メタノールとともにホモジネートし、５０μＬの０．２ｐｍｏｌ／μＬ  １７：０／２０：４−ＰＩ３Ｐ、１７：０／２０：４−ＰＩ４Ｐ、１７：０／２０：４−ＰＩ５Ｐ、１７：０／２０：４−ＰＩ（３，５）Ｐ２、１７：０／２０：４−ＰＩ（３，４）Ｐ２、１７：０／２０：４−ＰＩ（４，５）Ｐ２、１７：０／２０：４−ＰＩ（３，４，５）Ｐ３、２ｐｍｏｌ／μＬ  １７：０／２０：４−ＰＩ、および１７：０／２０：４−ＰＳを添加し、これらを内部サロゲート標準とした。次に、２μＬの１ｎｍｏｌ／μＬ  ８：０／８：０−ＰＩ（４，５）Ｐ２（吸着防止剤として）、０．７５ｍＬの２Ｎ  ＨＣｌ、０．７５ｍＬの水、０．２ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌおよび３ｍＬのクロロホルムを添加し、振り混ぜた。遠心分離した後、下層を収集し、１．５ｍＬのメタノールを各試料に添加した後、ＤＥＡＥセルロースカラム（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、テキサス、米国）にアプライした。カラムに吸着された脂質を、クロロホルム：メタノール（１：１、ｖ／ｖ）（３ｍＬ）およびクロロホルム：メタノール：２８％アンモニア水溶液：酢酸（２００：１００：３：０．９、ｖ／ｖ）（３ｍＬ）で順次洗浄した。次に、ＰＩＰｓ、ＰＩおよびＰＳを含む高度酸性脂質をクロロホルム：メタノール：ＨＣｌ：水（１２：１２：１：１、ｖ／ｖ）（１．５ｍＬ）で溶離させた。０．７５ｍＬの水および０．１ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌを添加した後、溶液を振り混ぜ、遠心分離し、下層を収集した。１５０μＬの０．６Ｍ  ＴＭＳ−ジアゾメタン（ヘキサン中）を添加した後、試料を１０分間室温でインキュベートした（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）。次に、２０μＬの氷酢酸および０．７ｍＬの洗浄溶液（クロロホルム：メタノール：水（３：４８：４７、ｖ／ｖ））をそれぞれの溶液に添加した。溶液を振り混ぜ、遠心分離し、下層を収集した。各試料を窒素ガス下で乾燥させ、アセトニトリルに再溶解させた。得られたＰＩＰｓ濃縮分画を調製から１日以内に分析した。【０２９７】
メチル化処理は、実施例６と同様に、各試料をＴＭＳジアゾメタンで処理することによって行った。
ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳシステム
試料の分析は、実施例６と同様に以下の条件で行った。
質量分析装置：ＱＴＲＡＰ  ６５００（ＡＢＳｃｉｅｘ、東京、日本）
ポンプ：Ｎｅｘｅｒａ  Ｘ２  ｓｙｓｔｅｍ（島津製作所、京都、日本）
オートサンプラー：ＰＡＬ  ＨＴＣ（ＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｚｗｉｎｇｅｎ、スイス）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＩＣ−３、２．１ｍｍ  ｘ  ２５０ｍｍ、粒径３μｍ（ＤＡＩＣＥＬ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、大阪、日本）
インジェクタ：非金属インジェクタユニット
サンプルループ：２５mＬ  ＰＥＥＫチューブ
流速：０．１ｍＬ／分
注入試料量：１０μＬ
温度：室温
（クロマトグラフィー条件）
移動相Ａ：アセトニトリル＋５ｍＭ酢酸アンモニウム
移動相Ｂ：メタノール＋５ｍＭ酢酸アンモニウム
＊これらの試薬は、全て和光純薬（東京、日本）から購入したＬＣ−ＭＳ用グレードのものを使用した。【０２９８】
グラジエント条件（リニアグラジエント）
０分、移動相Ｂ＝４０％
１分、移動相Ｂ＝４０％
３分、移動相Ｂ＝８５％
１４分、移動相Ｂ＝８５％
１５分、移動相Ｂ＝４０％
２０分、移動相Ｂ＝４０％
・質量分析計条件
イオン化法：エレクトロスプレー（正イオンモード）
測定メソッド：多重反応モニタリング（ＭＲＭ）
測定結果を図１５および図１６に示す。【０２９９】
図１５の結果は３８：４のホスホイノシタイドの抽出イオンクロマトグラムを示す。ＰＩ（３，４）Ｐ２は、野生型およびＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）マウスでは観察されなかったが、ＰＴＥＮ（＋／−）マウスにおいて産生が観察され、ＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）ＰＴＥＮ（＋／−）マウスではさらに産生の増強が観察された。この結果は、報告されているＰＴＥＮの活性と矛盾しない。【０３００】
図１６Ａ〜Ｄの結果は、異なるジアシルグリセロールを有するＰＩＰｓが遺伝子操作によってどのように変化するかを示す。統計処理は、一元配置分散分析、Tukeyの多重比較検
定を用いた。ＰＩＰ３の分解を促進する遺伝子をノックアウトしたマウスでは予想通りＰＩＰ３の量が大きく増えたがＰＩＰ２およびＰＩＰの減少は観察されなかった。ＰＩ（３，４）Ｐ２は、野生型およびＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）マウスでは観察されなかったが、ＰＴＥＮ（＋／−）マウスにおいて産生が観察され、ＩＮＰＰ４Ｂ（−／−）ＰＴＥＮ（＋／−）マウスではさらに産生の増強が観察された。【０３０１】
このように、本発明の方法を使用することで、遺伝子操作したマウスにおけるホスホイノシタイド組成（ジアシルグリセロールの種類、ＰＩＰｓにおけるリン酸基の数および位置）の変化を詳細に観察することができる。【０３０２】
（実施例１１：ＬＰＩＰｓのリン酸位置異性体の分離および定量）
本実施例は、ＬＰＩＰｓのリン酸位置異性体を分離および定量可能であることを示す。【０３０３】
１７：０／２０：４  ＰＩＰｓ合成品を出発材料として使用して、実施例１の方法に従い、１７：０のリゾＰＩ（３）Ｐ、リゾＰＩ（４）Ｐ、リゾＰＩ（５）Ｐ、リゾＰＩ（３，５）Ｐ２、リゾＰＩ（３，４）Ｐ２、リゾＰＩ（４，５）Ｐ２をそれぞれ調製した。【０３０４】
測定条件は、Ｑ１のプレカーサーイオンと、Ｑ３のプロダクトイオンとの組み合わせを以下のように設定した以外は実施例６と同様であった。
１７：０  リゾＰＩＰ１
Ｑ１：７２６．５（Ｄａ）  Ｑ３：３２７．３（Ｄａ）
１７：０  リゾＰＩＰ２
Ｑ１：８３４．５（Ｄａ）  Ｑ３：３２７．３（Ｄａ）
実施例６と同様に分析した結果を図１７に示す。リン酸基の位置のみが異なる３種類の異性体は異なる保持時間で観察された。このことから、リゾホスホイノシタイドのリン酸基位置異性体による分離によって、定量的な位置異性体特異的な分析が可能となる。そのため、本発明の方法を用いて、リゾホスホイノシタイドについても、リン酸基の位置およびアシル基の種類の解析が可能となる。【０３０５】
（注記）
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。なお、本出願は、日本国特許庁に２０１６年７月２２日に出願された特願２０１６−１４４１７７および２０１７年３月１６日に出願された特願２０１７−５１３５４に対して優先権主張をするものであり、これらの出願のその全体が、本明細書において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０３０６】
本発明は、医薬品およびその開発に利用可能である。
【図１Ａ】
2018016645.tif 000032
【図１Ｂ】
2018016645.tif 000033
【図１Ｃ】
2018016645.tif 000034
【図２Ａ】
2018016645.tif 000035
【図２Ｂ】
2018016645.tif 000036
【図２Ｃ】
2018016645.tif 000037
【図２Ｄ】
2018016645.tif 000038
【図２Ｅ】
2018016645.tif 000039
【図２Ｆ】
2018016645.tif 000040
【図２Ｇ】
2018016645.tif 000041
【図３Ａ】
2018016645.tif 000042
【図３Ｂ】
2018016645.tif 000043
【図３Ｃ】
2018016645.tif 000044
【図３Ｄ】
2018016645.tif 000045
【図３Ｅ】
2018016645.tif 000046
【図３Ｆ】
2018016645.tif 000047
【図４Ａ】
2018016645.tif 000048
【図４Ｂ】
2018016645.tif 000049
【図４Ｃ】
2018016645.tif 000050
【図４Ｄ】
2018016645.tif 000051
【図４Ｅ】
2018016645.tif 000052
【図４Ｆ】
2018016645.tif 000053
【図５Ａ】
2018016645.tif 000054
【図５Ｂ】
2018016645.tif 000055
【図５Ｃ】
2018016645.tif 000056
【図５Ｄ】
2018016645.tif 000057
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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