【手続補正書】
【提出日】平成30年12月27日(2018.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バーコード化核酸分子を調製する方法であって、
（ａ）鋳型核酸分子、デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）、デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）、ランダムプライマー、ポリメラーゼ、ウラシルを除去可能な酵素、およびビーズに付着した複数のオリゴヌクレオチドバーコード分子を含むビーズを提供する工程と、
（ｂ）第１の鎖を含む二本鎖核酸分子を合成するのに十分な条件下に前記鋳型核酸分子、前記ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ｄＵＴＰおよび前記ランダムプライマーを通す工程であって、前記第１の鎖はウラシルを含む工程と、
（ｃ）前記酵素で前記二本鎖核酸分子から前記ウラシルを除去し、前記二本鎖核酸分子内にニックをもたらす工程と、
（ｄ）複数の一本鎖核酸分子を得るのに十分な条件下で前記二本鎖核酸分子を核酸伸長反応に通す工程と、
（ｅ）前記複数のオリゴヌクレオチドバーコード分子のオリゴヌクレオチドバーコード分子を使用して前記複数の一本鎖核酸分子またはその相補鎖の一本鎖核酸分子の配列を含むバーコード化核酸分子を生成する工程と
を含む方法。
【請求項２】
（ｅ）が、前記一本鎖核酸分子および前記オリゴヌクレオチドバーコード分子を使用して前記バーコード化核酸分子を生成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｄ）の後に、（ｉ）前記複数の一本鎖核酸分子の一本鎖核酸分子を使用して追加の二本鎖核酸分子を生成すること、および（ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドバーコード分子を前記追加の二本鎖核酸分子の末端にライゲーションして前記バーコード化核酸分子を生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バーコード化核酸分子が二本鎖である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）〜（ｅ）が、単一の反応体積中で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ビーズ、前記鋳型核酸分子、ｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、前記ランダムプライマー、前記ポリメラーゼ、及び前記酵素が、分画で提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記分画が、エマルション中の液滴である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記分画が、ウェルである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ビーズが、化学分解可能なビーズ、光分解可能なビーズ、及び熱分解可能なビーズからなる群から選択される分解可能なビーズである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ビーズが化学分解可能なビーズであり、前記化学分解可能なビーズが化学還元可能な架橋剤を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化学還元可能な架橋剤が、ジスルフィド結合を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ｅ）において、前記バーコード化核酸分子が、ライゲーション酵素、ポリメラーゼ酵素、またはトポイソメラーゼの使用を介して生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数のオリゴヌクレオチドバーコード分子のそれぞれが、少なくとも４ヌクレオチド長であるバーコード配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ビーズが、それに付着した少なくとも１，０００，０００オリゴヌクレオチドバーコード分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数のオリゴヌクレオチドバーコード分子のそれぞれが、１つまたは複数の機能性配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つまたは複数の機能性配列が、アダプター配列、プライマー配列、プライマーアニーリング配列、付着配列、及び配列決定プライマー配列から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数のオリゴヌクレオチドバーコード分子のそれぞれがプライマー配列を含み、（ｅ）において、前記バーコード化核酸分子が、前記プライマー配列の核酸伸長によって生成される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つまたは複数の機能性配列が、５〜１００ヌクレオチド長のランダムＮ量体配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ランダムＮ量体配列が、５〜２５ヌクレオチド長である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記複数のオリゴヌクレオチドバーコード分子のオリゴヌクレオチドバーコード分子が、前記ビーズに分離可能に付着されている．請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記複数のオリゴヌクレオチドバーコード分子のオリゴヌクレオチドバーコード分子を前記ビーズから分離することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記分離することが、前記ビーズを分解することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記分離することが、還元剤を使用して前記複数のオリゴヌクレオチドバーコード分子と前記ビーズとの間のジスルフィド結合を切断することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）において、ｄＮＴＰが、ｄＵＴＰの濃度より高い濃度で提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記バーコード化核酸分子またはその由来物を配列決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
（ｂ）が、（ｉ）前記ランダムプライマーを前記鋳型核酸分子に結合すること、および（ｉｉ）前記ランダムプライマーを伸長して前記ウラシルを含む前記第１の鎖を合成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
（ｄ）において、前記ポリメラーゼが、前記ニックで前記二本鎖核酸分子に係合し、前記核酸伸長反応がプライマーとは無関係な伸長プロセスを含み、前記ポリメラーゼが鎖置換活性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記複数のバーコードオリゴヌクレオチド分子のそれぞれが、不安定な結合を介して前記ビーズに分離可能に付着している、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記不安定な結合が、熱で切断可能な結合、化学的に不安定な結合、および感光性結合からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記不安定な結合が、エステル結合、隣接ジオール結合、ディールス−アルダー結合、スルホン結合、シリルエーテル結合、グリコシド結合、ペプチド結合、およびホスホジエステル結合からなる群から選択される結合を含む、請求項２９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本明細書にて言及される全ての出版物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の出版物、特許、または特許出願が参照により援用されることを明確にかつ個別に指示したかのごとく、参考として同程度に本明細書に組み込まれる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
（ａ）鋳型核酸配列、ｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、プライマー、ポリメラーゼ、ｄＵＴＰ除去酵素、及び、オリゴヌクレオチドアダプター配列セグメントを含む複数のビーズを提供する工程と、
（ｂ）前記鋳型核酸を、前記ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ及びランダム六量体で増幅して、場合によりｄＵＴＰを含む相補性核酸配列を提供する工程と、
（ｃ）前記組み込まれたｄＵＴＰを、ｄＵＴＰ除去酵素で除去し、前記相補性核酸配列内にニックをもたらして配列決定ライブラリーを提供する工程と、
を含む、配列決定ライブラリーの作製方法。
（項目２）
前記ニックを有する相補性核酸配列を増幅する工程（ｄ）と、核酸伸長法を用いて、前記増幅核酸配列の前記配列を伸長する工程（ｅ）と、を更に含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記工程は単一の反応で実施する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記複数のビーズはプールされたビーズの母集団である、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目５）
前記プールされたビーズの母集団の前記ビーズが、工程（ａ）に記載した前記構成成分の１つ以上と共に分画され、前記分画が所望により、エマルション中に液滴を含む、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記ビーズは、化学分解可能なビーズ、光分解可能なビーズ、及び熱分解可能なビーズから選択される分解可能なビーズを含む、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記ビーズは化学還元可能な架橋剤を含む、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記化学還元可能な架橋剤はジスルフィド結合を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
工程（ｂ）での前記増幅は等温である、項目１〜８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記ポリメラーゼはｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼである、項目１〜９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記核酸伸長法は、ライゲーション酵素、核酸伸長酵素及びトランスポーゼースからなる群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目１２）
前記増幅核酸配列のライブラリーは一本鎖ＤＮＡを含み、前記ライゲーション酵素はＡＴＰ非依存性酵素を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＡＴＰ非依存性酵素は熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ライゲーション酵素はトポイソメラーゼを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記トポイソメラーゼはトポイソメラーゼＩである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ライゲーション酵素はＴ４  ＤＮＡリガーゼを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
（ａ）鋳型核酸、ｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、プライマー、ポリメラーゼ、ｄＵＴＰ除去酵素、核酸伸長法、及び、オリゴヌクレオチドバーコード配列セグメントを含む複数のビーズを提供することと、
（ｂ）前記鋳型核酸を、前記ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ及びランダム六量体で増幅して、場合によりｄＵＴＰを含む相補性核酸配列を提供する工程と、
（ｃ）前記組み込んだｄＵＴＰをｄＵＴＰ除去酵素で除去し、前記相補性核酸配列内にニックを提供することと、
（ｄ）前記ニックを有する相補性核酸配列を増幅して、増幅核酸配列のライブラリーを提供することと、
（ｅ）前記バーコード配列セグメントを前記プールされたビーズの母集団から分離することと、
（ｆ）前記バーコード配列セグメント及び核酸伸長法を使用して前記増幅核酸配列の配列を伸長し、バーコードライブラリーを提供するか、あるいは、核酸ライゲーション酵素を使用して、前記バーコード配列セグメントを増幅核酸配列のライブラリーにライゲーションし、バーコードライブラリーを提供することと、
を含む、バーコード配列決定ライブラリーの作製方法。
（項目１８）
前記工程は単一の反応で実施する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記複数のビーズはプールされたビーズの母集団である、項目１７または１８に記載の方法。
（項目２０）
前記プールされたビーズの母集団の前記ビーズが、工程（ａ）に記載した前記構成成分の１つ以上と共に分画され、前記分画が所望により、エマルション中に液滴を含む、項目１７〜１９のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
前記ビーズは、化学分解可能なビーズ、光分解可能なビーズ、及び熱分解可能なビーズから選択される分解可能なビーズを含む、項目１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記ビーズは化学還元可能な架橋剤を含む、項目１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記化学還元可能な架橋剤はジスルフィド結合を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
工程（ｂ）での前記増幅は等温である、項目１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記ポリメラーゼはｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼである、項目１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記核酸伸長法は、ライゲーション酵素、核酸伸長酵素及びトランスポーゼースからなる群から選択される、項目１７〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記増幅核酸配列のライブラリーは一本鎖ＤＮＡを含み、前記ライゲーション酵素はＡＴＰ非依存性酵素を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記ＡＴＰ非依存性酵素は熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼを含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記ライゲーション酵素はトポイソメラーゼを含む、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
前記トポイソメラーゼはトポイソメラーゼＩである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ライゲーション酵素はＴ４  ＤＮＡリガーゼを含む、項目２６に記載の方法。
（項目３２）
前記バーコード配列セグメントは、少なくとも４個のヌクレオチド、少なくとも１０個のヌクレオチド、または少なくとも２０個のヌクレオチドを含む、項目１７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記バーコード配列セグメントは、少なくとも１０００個の異なるバーコード配列セグメントを含む、項目１７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
少なくとも１，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子が各ビーズに結合している、項目１７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記プールされたビーズの母集団は少なくとも１０個の異なるビーズの母集団を含む、項目１９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記プールされたビーズの母集団は少なくとも１００個の異なるビーズの母集団を含む、項目１９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記プールされたビーズの母集団は少なくとも５００個の異なるビーズの母集団を含む、項目１９〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記オリゴヌクレオチドバーコード配列セグメントは少なくとも１個の機能性配列を含む、項目１７〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記機能性配列は、アダプター、プライマー配列、プライマーアニーリング配列、付着配列、及び配列決定プライマー配列から選択される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記機能性配列は封鎖され、加熱及び化学的切断からなる一覧から選択される刺激を含む分離工程において分離可能である、項目３８または３９に記載の方法。
（項目４１）
前記分離工程は、オリゴヌクレオチドバーコード配列セグメントを含む前記ビーズの母集団の前記ビーズの少なくとも一部を分解することを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ビーズを分解することは、前記バーコード配列セグメントと前記ビーズとの間のジスルフィド架橋結合を含む化学結合を切断することを含み、前記分離工程は、前記ビーズを還元剤にさらすことを含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記還元剤は、ＤＴＴ及びＴＣＥＰからなる群から選択される還元剤を含む、項目４２に記載の方法。