(57)【要約】  ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、もしくはラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌またはそれらの処理物を含有する、腸管のイオン経細胞輸送体への作用剤を提供する（ただし、イオン輸送体がクロライドチャネルであり、作用が抑制である場合、イオン輸送体がＮａ＋Ｋ＋Ｃｌ−共輸送体（ＮＫＣＣ１）であり、作用が抑制である場合、菌がビフィドバクテリウム  インファンティス  ３５６２４（Bifidobacterium infantis 35624）である場合、及び菌がラクトバチルス  サリバリウス  ＵＣＣ１１８（Lactobacillus salivarius UCC118）である場合を除く）。本発明の剤は、クロライドチャネルの活性化、腎疾患の予防または治療、および／または排便促進に有用であり、医薬、サプリメント等として使用され得る。
2018074514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、もしくはラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌またはそれらの処理物を含有する、腸管のイオン経細胞輸送体への作用剤（ただし、イオン輸送体がクロライドチャネルであり、作用が抑制である場合、イオン輸送体がＮａ＋Ｋ＋Ｃｌ−共輸送体（ＮＫＣＣ１）であり、作用が抑制である場合、菌がビフィドバクテリウム  インファンティス  ３５６２４（Bifidobacterium infantis 35624）である場合、及び菌がラクトバチルス  サリバリウス  ＵＣＣ１１８（Lactobacillus salivarius UCC118）である場合を除く）。
【請求項２】
イオン経細胞輸送体への作用がクロライドチャネルの活性化である、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
排便促進剤である、請求項１又は２に記載の剤。
【請求項４】
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、もしくはラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌またはそれらの処理物を含有し、菌処理物が菌発酵代謝物を含まない処理物であり、投与対象からイヌ又はネコが除かれる腎疾患の予防または治療剤。
【請求項５】
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌が、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム  ブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム  アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム  インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム  シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）、又はビフィドバクテリウム  サーモフィラム（Bifidobacterium thermophilum）である、請求項１〜４のいずれかに記載の剤。
【請求項６】
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌が、ビフィドバクテリウム  ロンガム  ＣＬＡ８０１３菌株（Bifidobacterium longum CLA8013、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３５２）又はビフィドバクテリウム  ロンガム  ＭＭ−２菌株（Bifidobacterium longum MM-2、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８１８）である、請求項１〜５のいずれかに記載の剤。
【請求項７】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌が、ラクトバチルス  アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス  ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス  ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス  カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス  プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス  デルブリュッキイ  サブスピーシーズ  ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス  デルブリュッキイ  サブスピーシーズ  ラクティス（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis）、ラクトバチルス  ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス  ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス  パラカゼイ  サブスピーシーズ  パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）、ラクトバチルス  ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス  ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス  サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、又はラクトバチルス  ブレビス（Lactobacillus brevis）である、請求項１〜６のいずれかに記載の剤。
【請求項８】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌が、ラクトバチルス  アシドフィルス  ＪＣＭ１１３２株（Lactobacillus acidophilus JCM1132）、ラクトバチルス  ジョンソニイ  ＪＣＭ２０１２株（Lactobacillus johnsonii JCM2012）またはラクトバチルス  ガセリ  ＪＣＭ５８１３（Lactobacillus gasseri JCM5813）である、請求項１〜６のいずれかに記載の剤。
【請求項９】
ビフィドバクテリウム  ロンガム  ＣＬＡ８０１３菌株（Bifidobacterium longum CLA8013、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３５２）。
【請求項１０】
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属またはラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌処理物の製造方法であって、
糖を含まない溶媒（但し、精製水及び生理食塩水を除く）、又はＤＭＥＭ及びＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２を含む溶媒に菌を懸濁して、菌懸濁液を得る工程と、
菌懸濁液を嫌気下にて放置する工程と、
放置した菌懸濁液の上清をフィルターで濾過して濾液を処理物として得る工程
を含み、発酵工程を含まないことを特徴とする菌処理物の製造方法。
【請求項１１】
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属またはラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌、及び糖を含まない溶媒（但し、精製水及び生理食塩水を除く）、又はＤＭＥＭ及びＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２を含む溶媒を含有する懸濁液、の上清（但し、上清はビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属またはラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌を含まない）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の菌またはそれらの処理物を含有する腸管のイオン経細胞輸送体への作用剤、クロライドチャネル活性化剤、腎疾患の予防もしくは治療剤、または排便促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロライドイオン（Ｃｌ−）、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）、カリウムイオン（Ｋ＋）等は、水／電解質輸送、分泌、又は細胞容積の調節等を司るのみならず、細胞応答を左右する因子として重要な役割を演じることが知られている。例えば、クロライドチャネルは、クロライドイオンを輸送するイオントランスポート膜タンパク質である。様々な種類のイオン経細胞輸送体が神経、筋、上皮などの細胞膜に存在し、様々な生理機能や細胞防御機構に関与していることが報告されている。【０００３】
腸管においては、クロライドイオンが下痢や便秘等の病態と深く関わっており、クロライドイオンのバランスの異常による疾患として、難治性の便秘、筋緊張性萎縮症、腎結石など高カルシウム尿症を呈する疾患、不安、不眠症、嚢胞性繊維症、てんかん、無感覚症、喘息、気管支炎、神経障害などが知られている（特許文献１）。【０００４】
一方、ラクトバチルス  ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）の菌体、その菌体処理物、或いはそれらの混合物が、大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制し、その結果、腸管の水分量を減少させる作用を有することが知られている（特許文献２）。しかし、これまでに、クロライドチャネルを活性化する菌等については報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４７８６８６６号
【特許文献２】特開第２０１４−１０１２８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、新規な腸管のイオン経細胞輸送体への作用剤、クロライドチャネル活性化剤、腎疾患の予防もしくは治療剤、または排便促進剤を提供することである。さらに本発明の目的は、腸管のイオン経細胞輸送体への作用能、クロライドチャネル活性化能、腎疾患の予防もしくは治療効果、または排便促進能を有する新規な菌処理物及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために検討した結果、特定の菌またはそれらの処理物が腸管のイオン経細胞輸送体へ作用し、クロライドチャネルを活性化し、腎疾患の予防または治療に有効であり、又は排便促進作用を有することを見出し、さらに検討を重ねて、種々の新知見を得て、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明に関する。
［１］ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、もしくはラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌またはそれらの処理物を含有する、腸管のイオン経細胞輸送体への作用剤（ただし、イオン輸送体がクロライドチャネルであり、作用が抑制である場合、イオン輸送体がＮａ＋Ｋ＋Ｃｌ−共輸送体（ＮＫＣＣ１）であり、作用が抑制である場合、菌がビフィドバクテリウム  インファンティス  ３５６２４（Bifidobacterium infantis 35624）である場合、及び菌がラクトバチルス  サリバリウス  ＵＣＣ１１８（Lactobacillus salivarius UCC118）である場合を除く）。
［２］イオン経細胞輸送体への作用がクロライドチャネルの活性化である、前記［１］に記載の剤。
［３］排便促進剤である、前記［１］又は［２］に記載の剤。
［４］ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、もしくはラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌またはそれらの処理物を含有し、菌処理物が菌発酵代謝物を含まない処理物であり、投与対象からイヌ又はネコが除かれる腎疾患の予防または治療剤。
［５］ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌が、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム  ブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム  アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム  インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム  シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）、又はビフィドバクテリウム  サーモフィラム（Bifidobacterium thermophilum）である、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の剤。
［６］ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌が、ビフィドバクテリウム  ロンガム  ＣＬＡ８０１３菌株（Bifidobacterium longum CLA8013、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３５２）又はビフィドバクテリウム  ロンガム  ＭＭ−２菌株（Bifidobacterium longum MM-2、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８１８）である、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の剤。
［７］ラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌が、ラクトバチルス  アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス  ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス  ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス  カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス  プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス  デルブリュッキイ  サブスピーシーズ  ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス  デルブリュッキイ  サブスピーシーズ  ラクティス（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis）、ラクトバチルス  ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス  ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス  パラカゼイ  サブスピーシーズ  パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）、ラクトバチルス  ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス  ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス  サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、又はラクトバチルス  ブレビス（Lactobacillus brevis）である、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の剤。
［８］ラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌が、ラクトバチルス  アシドフィルス  ＪＣＭ１１３２株（Lactobacillus acidophilus JCM1132）、ラクトバチルス  ジョンソニイ  ＪＣＭ２０１２株（Lactobacillus johnsonii JCM2012）またはラクトバチルス  ガセリ  ＪＣＭ５８１３株（Lactobacillus gasseri JCM5813）である、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の剤。
［９］ビフィドバクテリウム  ロンガム  ＣＬＡ８０１３菌株（Bifidobacterium longum CLA8013、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３５２）。
［１０］ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属またはラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌処理物の製造方法であって、
糖を含まない溶媒（但し、精製水及び生理食塩水を除く）、又はＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）及びＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２を含む溶媒に菌を懸濁して、菌懸濁液を得る工程と、
菌懸濁液を嫌気下にて放置する工程と、
放置した菌懸濁液の上清をフィルターで濾過して濾液を処理物として得る工程
を含み、発酵工程を含まないことを特徴とする菌処理物の製造方法。
［１１］ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属またはラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌、及び糖を含まない溶媒（但し、精製水及び生理食塩水を除く）、又はＤＭＥＭ及びＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２を含む溶媒を含有する懸濁液、の上清（但し、上清はビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属またはラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌を含まない）。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、新規な腸管のイオン経細胞輸送体への作用剤を提供することができる。本発明の剤は、クロライドチャネルの活性化、腎疾患の予防または治療が可能である点、又は排便促進作用を有する点において、特に顕著な効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する菌の処理物による腸管上皮細胞（Ｔ８４）における短絡電流変化を示す図である。
【図２】図２は、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する菌の処理物による腸管上皮細胞（Ｔ８４）における短絡電流変化を示す図である。
【図３】図３は、血清ＢＵＮ（尿素窒素）測定までの試験スケジュールを示す図である。
【図４】図４は、血清ＢＵＮ値の測定結果を示す図である。
【図５】図５は、赤色糞便排出時間の測定結果を示す図である。
【図６】図６は、各溶媒（精製水、生理食塩水、ＤＭＥＭ/Ｆ-１２、又はＰＢＳ(−)）により処理した８０１３Ｅの腸管上皮細胞（Ｔ８４）における短絡電流変化を示す図である。
【図７】図７は、血清ＢＵＮ値の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、もしくはラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する菌、またはそれらの処理物を含有する腸管のイオン経細胞輸送体への作用剤を提供する。具体的には、例えば、クロライドチャネル活性化剤、腎疾患の予防もしくは治療剤、又は排便促進剤を提供する。本発明の剤は、上記乳酸菌、またはその処理物を含有していればよく、さらに他の成分を含有していてもよい。上記菌は、１種単独で使用してもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００１１】
本発明の剤は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、またはラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する菌を含有する。ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する乳酸菌としては、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム  ブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム  アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム  インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム  シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）、ビフィドバクテリウム  サーモフィラム（Bifidobacterium thermophilum）等が好ましく、中でもビフィドバクテリウム  ロンガム（Bifidobacterium longum）、又はビフィドバクテリウム  ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）がより好ましい。ビフィドバクテリウム  ロンガム（Bifidobacterium longum）、又はビフィドバクテリウム  ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）としては、ビフィドバクテリウム  ロンガム  ＣＬＡ８０１３（Bifidobacterium longum CLA8013、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３５２）、ビフィドバクテリウム  ロンガム  ＩＤ８００９（Bifidobacterium longum ID8009）、ビフィドバクテリウム  ロンガム  ＩＤ１１６３（Bifidobacterium longum ID1163）、ビフィドバクテリウム  ロンガム  ＭＭ−２（Bifidobacterium longum MM-2：ＩＤ１００１、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８１８）、またはビフィドバクテリウム  ビフィダム  ＩＤ８００５（Bifidobacterium bifidum ID8005）が好ましく、ビフィドバクテリウム  ロンガム  ＣＬＡ８０１３（Bifidobacterium longum CLA8013、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３５２）、またはビフィドバクテリウム  ロンガム  ＭＭ−２（Bifidobacterium longum MM-2：ＩＤ１００１、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８１８）がさらに好ましい。ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌としては、ラクトバチルス  アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス  ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス  ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス  カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス  プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス  デルブリュッキイ  サブスピーシーズ  ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス  デルブリュッキイ  サブスピーシーズ  ラクティス（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis）、ラクトバチルス  ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス  ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス  パラカゼイ  サブスピーシーズ  パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）、ラクトバチルス  ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス  ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス  サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス  ブレビス（Lactobacillus brevis）等が好ましく、中でもラクトバチルス  アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス  ガセリ（Lactobacillus gasseri）、又はラクトバチルス  ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）がより好ましい。ラクトバチルス  アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス  ガセリ（Lactobacillus gasseri）、又はラクトバチルス  ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）としては、ラクトバチルス  アシドフィルス  ＪＣＭ１１３２（Lactobacillus acidophilus JCM1132；ID2152T）、ラクトバチルス  ガセリ  ＪＣＭ５８１３（Lactobacillus gasseri JCM5813；ID2145）、ラクトバチルス  ジョンソニイ  ＪＣＭ２０１２（Lactobacillus johnsonii JCM2012；ID2153T）がより好ましく、ラクトバチルス  アシドフィルス  ＪＣＭ１１３２（Lactobacillus acidophilus JCM1132；ID2152T）がさらに好ましい。
これらの菌体は、例えばＡＴＣＣ又はＩＦＯ等の機関や財団法人  日本ビフィズス菌センターなどから容易に入手することができる。なお、ビフィドバクテリウム  ロンガム  ＣＬＡ８０１３及びビフィドバクテリウム  ロンガム  ＭＭ−２は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室、郵便番号２９２−０８１８）に下記受託番号のもとで寄託されている。また、市販されているものを適宜使用することもできる。
ビフィドバクテリウム  ロンガム  ＣＬＡ８０１３（受託日：２０１６年９月２１日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３５２、識別の表示：Bifidobacterium longum CLA8013）
ビフィドバクテリウム  ロンガム  ＭＭ−２（受託日：２００９年９月１７日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８１８、識別の表示：Bifidobacterium longum MM-2）
本発明の剤は、ビフィドバクテリウム  インファンティス  ３５６２４（Bifidobacterium infantis 35624）、及びラクトバチルス  サリバリウス  ＵＣＣ１１８（Lactobacillus salivarius UCC118）を含まない。
【００１２】
本発明の効果を奏する限り、上記乳酸菌以外の有用菌を含んでもよい。例えば、Bacillus subtilis 129 BIO H(α)等のBacillus subtilis、Bacillus mesentericus、Bacillus polyfermenticus等の糖化菌；例えば、Bacillus coagulans等の有胞子性乳酸菌； Bacillus toyoi、Bacillus licheniformis、Clostridium butyricum等の酪酸菌；Leuconostoc mesenteroides等のリューコノストック（Leuconostoc）属、Lactococcus lactis、Lactococcus cremoris等のラクトコッカス（Lactococcus）属、Tetragenococcus halophilus等のテトラジェノコッカス（Tetragenococcus）属、Pediococcus acidilactici、Pediococcus pentosaceus等のペディオコッカス（Pediococcus）属、Oenococcus oeni等のオエノコッカス（Oenococcus）属等の乳酸球菌；その他の有用菌が挙げられる。
これらの菌体は、例えばＡＴＣＣ又はＩＦＯなどの機関から容易に入手することができる。また、市販されているものを適宜使用することもできる。
【００１３】
上記菌体は、公知の条件又はそれに準じる条件で培養することにより得ることができる。例えば、通常、グルコ−ス、酵母エキス、ペプトン等を含む液体培地で上記乳酸菌の１種又は２種以上を通常約２５〜４５℃程度で約４〜７２時間程度、好気又は嫌気培養し、培養液から菌体を集菌し、洗浄し、湿菌体を得ることができる。
【００１４】
本発明において用いる菌は、生菌が好ましいが、乾燥物（菌体乾燥物）等を含む死菌であってもよく、生菌と死菌を混合したもの等であってもよい。菌体乾燥物としては、シングルミクロンの菌体乾燥物が好ましい。菌体乾燥物とは、通常は乾燥された個々の菌体又は乾燥された菌体の集合物をいう。また、シングルミクロンとは、小数第１位を四捨五入して１〜１０μｍをいう。
【００１５】
本発明において、菌の処理物は、菌に何らかの処理を加えたものをいい、その処理は特に限定されるものではない。菌の処理物としては、例えば、該菌体と溶媒の混合液、その上清又は遠心上清などであってもよく、それらをフィルターなどで濾過した濾液などであってもよい。前記の菌体と溶媒の混合液は、菌体と溶媒を混合したものであれば、懸濁液であってもよい。菌体と溶媒の混合液としては、例えば、約２５〜４５℃程度で約３０分〜３日間程度、好気又は嫌気条件下で放置したものを用いてもよいし、混合したものをそのまま用いてもよい。また菌の処理物は、菌の処理物から抽出した抽出物などであってもよい。本発明では、これらを単に抽出物と書く場合もある。また菌の処理物は、例えば、濾液や抽出物、混合液を公知技術に従って、濃縮、粉末化、凍結乾燥したもの等であってもよい。なお、本発明における菌の処理物には、菌発酵代謝物を含まない。溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）等を含む糖を含まない溶媒、又はＤＭＥＭ／Ｆ−１２等の培養液などが挙げられる。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）は、カルシウム塩及びマグネシウム塩添加リン酸緩衝液（ＰＢＳ（＋））を用いてもよいし、カルシウム塩及びマグネシウム塩無添加リン酸緩衝液（ＰＢＳ（―））を用いてもよい。遠心の条件は、特に限定されないが、遠心力は２，５００〜１０，０００×Ｇであってもよい。フィルターの目の大きさは、菌を濾過できる目の大きさのフィルターであればよいが、例えば、市販の０．１μｍ〜１μｍ（例えば、０．２２μｍ）の濾過フィルターを用いることができる。ＤＭＥＭ／Ｆ−１２等の培養液は、糖を含んでいてもよいし、糖を含んでいなくてもよい。なお、本発明における溶媒は、精製水及び生理食塩水を含まない。
【００１６】
本発明において、菌発酵代謝物とは、例えば、脱脂粉乳、乳糖、ブドウ糖、ペプトン、酵母エキスなどを含む菌増殖培地に菌を播種し、一定温度（例えば、２０℃〜４０℃）で、一定時間（例えば、２〜６０時間）培養した後の菌発酵代謝液等をいう。
【００１７】
本発明における菌の処理物は、菌を含有していてもよく、含有していなくてもよいが、含有していないことが好ましい。ただし、本発明における菌の処理物において、発酵していない菌を含有する場合は、前記の限りではない。
【００１８】
本発明において、腸管とは、例えば、十二指腸、空腸、回腸などの小腸、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ状結腸、直腸などの大腸等であってもよい。さらに本発明において、腸管は体内にある状態でもよいし、腸管を体外に切り出してもよいし、または腹部を切開して腸管の一部を生体から取り出してもよい。
【００１９】
本発明において、イオン経細胞輸送体とは、細胞を介したイオン輸送体であり、経細胞イオン輸送体と表現される場合もある。イオン輸送体としては、例えば、イオンチャネル、イオン共輸送体、イオン交換輸送体等が挙げられる。イオンチャネルとしては、例えば、クロライドチャネル、カルシウムチャネル、ナトリウムチャネル、カリウムチャネル、陽イオンチャネル等が挙げられる。クロライドチャネルとしては、例えば、ＣＦＴＲクロライドチャネル等が挙げられる。イオン共輸送体としては、例えば、Ｎａ＋Ｋ＋Ｃｌ−共輸送体（ＮＫＣＣ１）等が挙げられる。イオン交換輸送体としては、例えば、Ｃｌ−／ＨＣＯ３−交換輸送体（ＤＲＡ）等が挙げられる。
【００２０】
本発明において、イオン経細胞輸送体に作用するとは、例えば、イオン経細胞輸送体の機能を活性、抑制させる等して、その機能を変化させること等をいう。具体的には、例えば、クロライドチャネルを活性化させる、カルシウムチャネルを活性化させる、ナトリウムチャネルを活性化させる、カリウムチャネルを活性化させる、陽イオンチャネルを活性化させる、Ｎａ＋Ｋ＋Ｃｌ−共輸送体（ＮＫＣＣ１）を活性化させる、Ｃｌ−／ＨＣＯ３−交換輸送体（ＤＲＡ）を活性化させるなどである。また具体的には、例えば、カルシウムチャネルを抑制化させる、ナトリウムチャネルを抑制化させる、カリウムチャネルを抑制化させる、陽イオンチャネルを抑制化させる、Ｃｌ−／ＨＣＯ３−交換輸送体（ＤＲＡ）を抑制化させるなどである。
【００２１】
ただし、本発明において、
イオン輸送体がクロライドチャネルであり、作用が抑制である場合、
イオン輸送体がＮａ＋Ｋ＋Ｃｌ−共輸送体（ＮＫＣＣ１）であり、作用が抑制である場合、菌がビフィドバクテリウム  インファンティス  ３５６２４（Bifidobacterium infantis 35624）である場合、及び
菌がラクトバチルス  サリバリウス  ＵＣＣ１１８（Lactobacillus salivarius UCC118）である場合
は含まない。
【００２２】
以下に本発明の腸管のイオン経細胞輸送体への作用剤について、各態様ごとに説明する。具体的には、クロライドチャネルの活性化剤、腎疾患の予防または治療剤、及び排便促進剤について説明する。
【００２３】
本発明の一態様として、例えば、クロライドチャネルの活性化剤が挙げられる。本発明において、クロライドチャネルを活性化することは、例えば、本発明の剤投与前の状態と比べ、イオンの経細胞輸送能が大きくなること等をいう。イオンの経細胞輸送能は、例えば、短絡電流法（唐木晋一郎、桑原 厚和、日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）123，２１１〜２１８（２００４）上皮膜における電解質輸送の電気生理学的測定法：短絡電流法）により測定することができる。
【００２４】
本発明の一態様として、例えば、腎疾患の予防又は治療剤が挙げられる。本発明において、腎疾患の予防又は治療剤は、腎疾患の予防または治療に有用である。本発明において、腎疾患の「予防」とは、例えば、腸管のイオン細胞経輸送体、例えば、イオンチャネルに作用して腎疾患の発症を阻止することをいい、腎疾患の「治療」とは、例えば、腎疾患による症状の緩解、又は完治させることをいう。腎疾患としては、例えば、腎不全、尿毒症、糖尿病性腎症、慢性糸球体腎炎などが挙げられる。腎疾患は、例えば、慢性的なものであってもよいし、急性的なものであってもよい。慢性腎疾患としては、例えば、慢性腎不全、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群等が挙げられる。急性腎疾患としては、例えば、急性糸球体腎炎、急性腎不全、溶血性尿毒症症候群等が挙げられる。
【００２５】
本発明において、腎疾患が改善したことを判断する方法は、特に限定されるものでなく、公知の方法等により判断してもよい。本発明における菌又はその処理物、もしくは本発明の剤を投与したことにより、腎疾患が改善したことを判断するための方法としては、例えば、血清中ＢＵＮ（尿素窒素）を測定する方法等が挙げられる。血清中ＢＵＮを測定する方法を用いる場合には、例えば、菌又は菌処理物、もしくは剤の投与により、それらを投与する前よりもＢＵＮの値が下がった際に、腎疾患に対して改善効果があるとする等して判断してもよい。
【００２６】
本発明の一態様として、例えば、排便促進剤が挙げられる。これは本発明の剤が、クロライドチャネル活性化作用を有し、その結果、腸管の水分量を増加させ、排便促進作用を得ることができること等によるものである。
【００２７】
本発明において、排便促進剤は、例えば、生理的な排便を促進させること、または食事から排便までの時間を短縮させることができる。
【００２８】
本発明において、排便促進効果を判断する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、排便回数、食事から排便までの時間、糞便に含まれる水分量等から判断する方法が挙げられる。
【００２９】
本発明の剤は、菌またはその処理物を単独で使用またはこれと他の成分を混合することにより、医薬品、医薬部外品、飲食品、食品添加物、飼料等の製造に用いられる原料として；又はそのまま、医薬品、医薬部外品、飲食品、食品添加物、飼料等の形態として用いることができる。本発明の組成物は、コエンザイムＱ１０を含んでいなくてもよい。すなわち、本発明の一態様として、医薬品組成物、医薬部外品組成物、飲食品組成物、食品添加物組成物、飼料組成物等が挙げられる。このような、本発明の剤を含む医薬品組成物も、本発明の好ましい実施態様の１つである。
【００３０】
本発明の医薬品組成物の剤型は、それぞれの成分の物理化学的性質、生物学的性質等を考慮して投与に好適な剤型とすればよい。経口投与に適しており、内服剤とすることが好ましい。また、本発明の医薬品組成物の剤型は、非経口剤であってもよい。内服剤の剤型としては、例えば、錠剤（糖衣錠を含む）、ペレット、細粒剤、散剤、顆粒剤、丸剤、チュアブル剤、トローチ剤、カプセル剤等の固形剤；水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等の液剤；ゼリー状製剤等の半固形製剤等が挙げられる。中でも、錠剤、散剤、液剤又は懸濁剤が好ましい。さらに、本発明の医薬品組成物は、乳酸菌の他に、賦形剤（例えば、白糖、乳糖、デンプン、結晶セルロース、リン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、ペクチン、デキストリン、トラガント等）、結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、カルメロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ペクチン、トラガント等）、崩壊剤（例えばデンプン、カルメロースナトリウム、トラガント等）、滑沢剤（例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、マクロゴール、ショ糖脂肪酸エステル等）、安定剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）、増粘剤（ナトリウムカルボキシメチルセルロース等）、担体（低融点ワックス、カカオバター等）、着色剤、賦香剤（香料）、光沢剤、希釈剤、緩衝剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤、吸収促進剤、嬌味剤等、当業界で使用される公知の添加剤等を適宜含有していてもよい。製剤中に含まれる菌又はその処理物の合計量は、通常、最終製剤全体に対して約０．０００００１〜９９質量％の範囲から適宜選択して決定することができる。中でも、約０．０５〜約５０質量％含むことが好ましく、約０．１〜約２５質量％含むことがより好ましい。
【００３１】
本発明において、経口用の固形剤（錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等）が好ましく、有効成分を例えば賦形剤（ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、デンプン等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グリコール酸カルシウム等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム等）、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸等）等の添加剤と混合し、常法に従って製剤化することができる。必要に応じて、さらにコーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。
【００３２】
本発明における剤を固形製剤の形態で使用する場合、乾燥方法によっては、単に粉末同士を混合してもよいし、またその粉末を圧縮して顆粒にしたり、錠剤にしたりしてもよい。湿式法により顆粒、錠剤を製造する場合は、結合剤の水溶液を用いて練合、乾燥し、目的の固形剤とすることができる。さらに、この様にして得られた粉末又は顆粒をカプセルに充填して、カプセル剤とすることもできる。
【００３３】
例えば、錠剤を製造する場合は、公知の打錠機を用いるとよい。該打錠機としては、例えば単発式打錠機又はロータリー型打錠機等が挙げられる。また、丸剤、チュアブル剤又はトローチ剤の製造方法は、公知の方法に従って行われてよく、例えば錠剤を製造するのと同じ手段で作ることができる。
【００３４】
微量の有効成分（菌又はその処理物）を大量の他の粉末と混合し均一な混合物を得るためには、いわゆる段階的混合法を採用するのがよい。例えば、有効成分をその１００〜２００容量倍の粉末と混合して均一な粉末を得、これを残りの粉末と混合すると均一に希釈された粉末を得ることができる。
含水物からの乾燥には、噴霧乾燥、Ｌ−乾燥、凍結乾燥などの手段をとることができる。
【００３５】
本発明において、経口用の液剤（水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等）は、有効成分を一般的に用いられる希釈剤（精製水、エタノール又はそれらの混液等）に溶解、懸濁又は乳化して製剤化される。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤等を含有していてもよい。
【００３６】
非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）等が挙げられる。これらの製剤は、当該分野で通常行われている手法により、前述した薬学上許容される添加剤を用いて製剤化することができる。製剤中に含まれる菌又はその処理物の合計量は、通常、最終製剤全体に対して約０．０００００１〜９９質量％の範囲から適宜選択して決定することができる。中でも、約０．０５〜約５０質量％含むことが好ましく、約０．１〜約２５質量％含むことがより好ましい。
【００３７】
本発明において、非経口剤としては例えば、注射剤が挙げられる。注射剤は、溶液、懸濁液、乳濁液、及び用時に溶解又は懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。注射剤は、有効成分を溶剤に溶解、懸濁又は乳化して製剤化される。溶剤として、例えば注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールのようなアルコール類等及びそれらの組み合わせが用いられる。さらにこの注射剤は、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリソルベート８０（登録商標）等）、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤等を含んでいてもよい。これらは最終工程において滅菌するか無菌操作法によって製造される。また注射剤は、無菌の固形剤、例えば凍結乾燥品を製造し、これを使用前に無菌化又は無菌の注射用蒸留水又は他の溶剤に溶解して製造することもできる。
【００３８】
さらに非経口剤としては例えば、坐剤が挙げられる。この組成物は通常使用される方法に従って製造することができる。
【００３９】
本発明で使用される菌は、一般に嫌気性で、乾燥状態では空気又は酸素に対して弱く、また、高温と湿気に弱いため、組成物の製剤化に際してはできるだけ、不活性ガスの存在下又は真空、低温下で、処理することが好ましい。組成物の製剤化における温度は、本発明の効果が奏される限り特に限定されるものでなく、公知の方法に従って決定することができる。
【００４０】
本発明において、ヒトを含む動物に対する菌の投与量は、約１×１０３〜１×１０１１個／大人／回が好ましく、約１×１０６〜１×１０１１個／大人／回がより好ましく、約１×１０９〜１×１０１１個／大人／回がさらに好ましい。
【００４１】
本発明において、ヒトを含む動物に対する菌処理物の投与量は、菌約１×１０３〜１×１０１４個の処理物／大人／回が好ましく、菌約１×１０６〜１×１０１４個の処理物／大人／回がより好ましく、菌約１×１０９〜１×１０１４個の処理物／大人／回がさらに好ましい。
【００４２】
本発明において、組成物の使用間隔は、対象（例えば、ラット）、ルート（例えば、経口投与）、形態（例えば、液剤）等にもよるが、例えば、本発明の組成物を１日に１〜５回使用してもよいし、１週間に１〜５回使用してもよいし、１ヶ月に１〜５回使用等してもよい。
【００４３】
本発明において、組成物の使用期間は、対象（例えば、マウス）、ルート（例えば、経口投与）、形態（例えば、液剤）、使用間隔等にもよるが、例えば、１日〜６日であってもよいし、１週間〜４週間であってもよいし、１ヶ月〜１２ヶ月であってもよい。また、例えば、組成物を継続的に使用し続ける等であってもよい。
【００４４】
本発明において、剤の投与対象は、例えば、動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。
本発明において、腎疾患の予防または治療剤の投与対象は、イヌ及びネコが除かれる動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル等）であることが好ましい。
【００４５】
本発明の医薬品組成物の適用疾患としては、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸結核、感染性腸炎、非感染性腸炎、急性腸炎、急性胃腸炎、慢性腸炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、大腸がん、腸閉塞、便秘、腎炎、腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、腎臓結石、多発性のう胞腎、腎性貧血、腎硬化症、水腎症等が挙げられる。
【００４６】
本発明の剤は、医薬品組成物以外のその他の組成物の原料として、例えば上記菌又はその処理物を使用し、公知の方法に従って、その他の組成物を製造することができる。医薬品組成物以外のその他の組成物に対する菌又はその処理物の含有量は、例えば、組成物全体に対して約０．０００００１〜９９質量％の範囲から適宜選択して決定することができる。
【００４７】
本発明において、飲食品としては、例えば、清涼飲料、乳性飲料、発酵乳、ヨーグルト、乳酸菌飲料、サプリメント等が挙げられる。
【００４８】
本発明は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属またはラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌処理物の製造方法であって、
糖を含まない溶媒（但し、精製水及び生理食塩水を除く）、又はＤＭＥＭ及びＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２を含む溶媒に菌を懸濁して、菌懸濁液を得る工程と、
菌懸濁液を嫌気下にて放置する工程と、
放置した菌懸濁液の上清をフィルターで濾過して濾液を処理物として得る工程
を含み、発酵工程を含まないことを特徴とする菌処理物の製造方法を包含する。
【００４９】
本発明において、糖を含まない溶媒としては、例えば、リン酸を含む溶液、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）などが挙げられるが、本発明は精製水及び生理食塩水は含まない。リン酸を含む溶液は、少なくともリン酸を含んだ溶液であればよい。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）は、カルシウム塩及びマグネシウム塩添加リン酸緩衝液（ＰＢＳ（＋））を用いてもよいし、カルシウム塩及びマグネシウム塩無添加リン酸緩衝液（ＰＢＳ（―））を用いてもよい。イオン経細胞輸送能が高い点で、ＰＢＳ（―）を用いるのが好ましい。糖としては、例えば、乳糖、ショ糖、オリゴ糖、糖アルコールなどが挙げられる。
【００５０】
本発明において、ＤＭＥＭは、例えば、グリシン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−シスチン二塩酸塩、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム水和物、Ｌ−バリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、無水塩化カルシウム、硝酸鉄九水和物、無水硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、無水リン酸二水素ナトリウム、Ｄ−グルコース、フェノールレッド等を含んだもの等を使用してもよい。
本発明において、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２は、例えば、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−アスパラギン一水和物、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム水和物、Ｌ−バリン、ビオチン、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ビタミンＢ１２、ｉ−イノシトール、無水塩化カルシウム、硫酸銅五水和物、硫酸鉄七水和物、塩化カリウム、無水塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、無水リン酸二水素ナトリウム、硫酸亜鉛七水和物、Ｄ−グルコース、ヒポキサンチン、リノール酸、リポ酸、プトレシンニ二塩酸塩、チミジン、フェノールレッド、ピルビン酸ナトリウム等を含んだもの等を使用してもよい。
【００５１】
本発明において、ＤＭＥＭ及びＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２を含む溶媒としては、例えば、ＤＭＥＭ及びＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２を混合した溶媒、ＤＭＥＭ及びＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２を含む溶液、ＤＭＥＭ及びＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２を含む培地などが挙げられる。
本発明において、ＤＭＥＭ及びＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２を含む培地は、例えば、市販品等を混合して使用してもよいし、既に混合された市販品等（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（サーモフィッシャー  サイエンティフィック社製））を使用してもよいし、糖を含んでいない市販品等を使用してもよい。
【００５２】
本発明において用いられるＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地は、例えば、市販品等に含まれるぞれぞれの成分（Ｌ−グルタミン、フェノールレッド、ピルビン酸ナトリウム、無水塩化カルシウム、塩化カリウム、無水塩化マグネシウム、無水硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、無水リン酸水素二ナトリウム、無水リン酸二水素ナトリウム、硫酸銅五水和物、硝酸鉄九水和物、硫酸鉄七水和物、硫酸亜鉛七水和物、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−アスパラギン一水和物、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン二塩酸塩、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム水和物、Ｌ−バリン、Ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ビタミンＢ１２、Ｄ−グルコース、ヒポキサンチン、リノール酸、リポ酸、プトレシンニ二塩酸塩、チミジン等）を混合して作製されたもの等を使用してもよい。簡便性の点から、市販品のＤＭＥＭ／Ｆ−１２を用いるのが好ましい。
【００５３】
本発明において、嫌気下に放置するとは、例えば、好ましくは窒素置換を行ってヘッドスペース中の酸素濃度をゼロにする、あるいは培養タンクを使用する場合は、菌懸濁液中のＤ．Ｏ．値（溶存酸素濃度）を１．０ｐｐｍ以下で放置することを言い、特に好ましい方法として、例えば、菌懸濁液を窒素ガスで置換することにより、Ｄ．Ｏ．値（溶存酸素濃度）を０．５ｐｐｍ以下に調節して嫌気的条件下で放置する方法等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５４】
本発明において、菌懸濁液を放置するとは、例えば、菌と、糖を含まない溶媒（但し、精製水及び生理食塩水を除く）又はＤＭＥＭ及びＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２を含む溶媒を混合した後、菌懸濁液及び／又は菌懸濁液を入れた容器に対して、何の操作もせず、静置することをいう。静置する時間は、特に限定されないが、例えば、３０分以上、１時間以上、６時間以上等であってもよく、２４時間以下、３日間以下等であってもよい。また、菌懸濁液を静置する際の温度は、特に限定されないが、例えば菌が生育できる温度であればよい。菌懸濁液を静置する際の条件は、菌の性質等にもよるが、例えば、好気的条件下であってもよく、嫌気的条件下等であってもよい。
【００５５】
本発明において、フィルターは、菌を濾過できる目の大きさのフィルターであればよいが、例えば、市販の０．１μｍ〜１μｍ（例えば、０．２２μｍ）の濾過フィルターを用いることができる。
【００５６】
本発明において、例えば、濾液の処理物を、濃縮、粉末化、凍結乾燥等する工程をさらに含んでいてもよい。
【００５７】
本発明において、発酵工程を含まないとは、例えば、乳酸菌が発酵を行わないこと、製造方法における全ての工程後に得られた処理物中に、乳酸菌による発酵後の代謝物が含まれないこと等をいう。
本発明において、乳酸菌による発酵の有無を判断する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、菌懸濁液を作製し、その後に菌懸濁液を放置する工程の前後において、菌懸濁液のｐＨを測定し、ｐＨの値が放置前よりも放置後のｐＨの値が下がる（酸性側にｐＨの値が変化する）場合を、発酵有りと判断し、本発明には含まれないものとする。
【００５８】
本発明は、動物にビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、もしくはラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌またはそれらの処理物を投与するクロライドチャネルを活性化させる方法、腎疾患を予防もしくは治療する方法、又は排便を促進させる方法を包含する。
本発明はまた、クロライドチャネルの活性化剤、腎疾患の予防もしくは治療薬、又は排便促進剤製造のための、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、もしくはラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌またはそれらの処理物の使用を包含する。
本発明はさらに、クロライドチャネルの活性化、腎疾患の予防もしくは治療、又は排便の促進に使用するための、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、もしくはラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌またはそれらの処理物を包含する。
本発明はまた動物においてクロライドチャネルの活性化、腎疾患の予防もしくは治療、又は排便の促進のための、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、もしくはラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌またはそれらの処理物の使用を包含する。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、これらの実施例は本発明の一例であり、本発明の技術的範囲はこれらに限定されるものではなく、多くの変形が本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有するものにより可能である。【００６０】
［実施例１］（菌処理物の調製）
Bifidobacterium属またはLactobacillus属に属する菌として、
ビフィドバクテリウム  ロンガム（B. longum）：
ID1001（MM-2、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８１８）、JCM1217（ID1100T）、ID1163、ID1164、ID1165、ID1166、ID1167、ID1168、ID1170、ID8009、CLA8013（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３５２）、
ビフィドバクテリウム  ビフィダム（B. bifidum）：
ID1000、ID1077、ID1078、JCM1255 （ID1079T）、ID1080、ID1127、ID1129、ID1130、ID1131、ID1188、ID1189、ID8005、ID8007、
ラクトバチルス  ガセリ（L. gasseri）：
ID2000、JCM1131 （ID2151T）、ID2089、ID2092、ID2093、ID2100、ID2101、ID2124、ID2144、JCM5813（ID2145）、ID2146、
ラクトバチルス  ジョンソニイ（L. johnsonii）：
JCM2012 （ID2153T）、ID2091、ID2095、ID2096、ID2126、ID2142、ID2143、ID2154、
ラクトバチルス  アシドフィルス（L. acidophilus）：
JCM1132（ID2152T）、ID2073、ID2107、ID2109、ID2110、
ラクトバチルス  パラカゼイ  サブスピーシーズ  パラカゼイ（L. paracasei subsp. paracasei）：
JCM8130（ID2148T）、ID2003、ID2004 ID2005、ID2012、ID2013、ID2014、ID2019、ID2031、ID2032、ID2033
を用いた。B. longum JCM1217（ID1100T）、B. bifidum JCM1255（ID1079T）、L. gasseri JCM5813（ID2145）、L. gasseri JCM1131（ID2151T）、L. johnsonii JCM2012（ID2153T）、L. acidophilus JCM1132（ID2152T）、L. paracasei subsp. paracasei JCM8130（ID2148T）は、各菌種の標準株である。
各菌株の凍結保存菌株（約１×１０６〜１×１０８個）を１％グルコース、０．１％ポリソルベート８０含有ＧＡＭ（日水製薬株式会社）培地１０ｍＬを用いて３７℃で１８〜３０時間嫌気培養した。培養後、遠心（３,０００×Ｇ、１０ｍｉｎ．、Ｒ．Ｔ．）して上清を廃棄し、ＰＢＳ(−)により洗浄後、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（サーモフィッシャー  サイエンティフィック社製）１０ｍＬに再懸濁し、３７℃、２４時間嫌気下にて放置後、遠心上清をフィルター（０.２２μｍ）濾過し、濾液を菌処理物（Ｅｘｔｒａｃｔ：以下単にＥと略することがある）として調製した。【００６１】
（細胞培養）
１０％ＦＢＳ、ペニシリン・ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２にて株化ヒト結腸上皮細胞Ｔ８４を培養し、４×１０４ｃeｌｌｓ／ｃｍ2で播種して５〜７日毎に継代培養を行った。フィルタースナップウェル（ｓｎａｐｗｅｌｌ）（ｃｏｒｎｉｎｇ，ｃｏｓｔａｒ、１.１３ｃｍ2）に５×１０5ｃeｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して３日毎に培地を交換し、５〜７日培養したものを試験に用いた。【００６２】
（短絡電流法）
短絡電流法は、ウッシングチャンバーシステム（Ｕｓｓｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて測定した。単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）となったＴ８４細胞をスナップウェル（ｓｎａｐｗｅｌｌ）ごとウッシングチャンバー（Ｕｓｓｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒ）に垂直にセットし、Ｔ８４細胞が接着したスナップウェルの左右を３７℃に保温したクレブスリンガー液（Ｋｒｅｂｓ-Ｒｉｎｇｅｒ液）５ｍＬで満たし、２０分以上放置し、Ｔ８４細胞膜を介した電流の値（Ｉｓｃ）が安定したのち、試験を開始した。菌処理物１００μＬをＴ８４細胞の粘膜側にあたる上側（スナップウェルに対して細胞が接着した面の逆側）に添加し、その後のＩｓｃの変化（ΔＩｓｃ）を観察し、経細胞イオン分泌の変化を比較した。ΔＩｓｃは検体添加後、最も変化したＩｓｃの値と検体添加時（０時間）のＩｓｃの値との差とした。【００６３】
（菌処理物のイオン経細胞輸送能）
腸内の水分量は、内容物の硬さや腸内移動に影響を及ぼし、便秘又は下痢の原因の一つとなっている。腸管における水の分泌吸収は、腸管上皮に存在するクロライドチャネルを介したクロライドイオンの移動と並行して起こるため、クロライドイオンの移動は水の移動の指標となる。そこで、腸管上皮細胞(Ｔ８４細胞)を用いて、菌におけるイオンの経細胞輸送能を、Ｕｓｓｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒを用いた短絡電流法により検討した。Ｔ８４細胞を用いた短絡電流法により、各菌処理物によるイオンの経細胞輸送能を測定した結果を図１(Bifidobacterium）、図２(Lactobacillus）に示す。B. longum ＣＬＡ８０１３の菌処理物において最も大きいΔＩｓｃを示した。【００６４】
また、クロライドチャネルインヒビターであるＣＦＴＲｉｎｈ１７２（Ｓｉｇｍａ  Ｃ９９２−２５ＭＧ）１０ ｍＭ（ＤＭＳＯ溶解）を５μＬ／５ｍＬ  Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ液（終濃度１０μＭ）となるようにＴ８４細胞の粘膜側に処置し、２分後にB. longum ＣＬＡ８０１３の菌処理物１００μＬをＴ８４細胞の粘膜側に添加した。ＣＦＴＲｉｎｈ１７２無処置（ＤＭＳＯ処置）時のB. longum ＣＬＡ８０１３の菌処理物のΔＩｓｃは１１．３８μＡであったのに対し、ＣＦＴＲｉｎｈ１７２処置時のB. longum ＣＬＡ８０１３の菌処理物のΔＩｓｃは３．５０μＡであり、クロライドチャネルインヒビターにより、B. longum ＣＬＡ８０１３の菌処理物の作用は低下した。この結果より、B. longum ＣＬＡ８０１３の菌処理物は、腸管においてクロライドチャネルを活性化することが示された。したがって、菌処理物は、クロライドチャネル活性化作用を有することから、水の分泌を促進することによる排便促進作用を有することが分かる。【００６５】
［実施例２］（菌処理物の調製）
菌（Bifidobacterium longum ＣＬＡ８０１３）処理物の調製方法
菌株B. longum ＣＬＡ８０１３の凍結保存菌株（約１×１０８個）を１％グルコース、０．１％ポリソルベート８０含有ＧＡＭ（日水製薬株式会社）培地１０ｍＬを用いて、３７℃、 ３０時間嫌気培養した。培養後、遠心（３,０００×Ｇ、１０ｍｉｎ．、Ｒ．Ｔ．）して上清を廃棄し、ＰＢＳ(−)により洗浄後、ＰＢＳ(−)１０ｍＬに再懸濁し、３７℃、２４時間嫌気下にて放置後、遠心上清をフィルター（０.２２μｍ）濾過し、濾液を菌（B. longum ＣＬＡ８０１３）処理物（８０１３Ｅ）として得た。
８０１３Ｅを吸光度２６０ｎｍ：３３となるようにＰＢＳ(−)で希釈したものを８０１３Ｅ（１０）、吸光度２６０ｎｍ：３．３となるようにＰＢＳ(−)を希釈したものを８０１３Ｅ（１）とした。【００６６】
（菌（B. longum ＣＬＡ８０１３）処理物の慢性腎臓病モデルマウスへの改善作用）
１．慢性腎臓病モデルマウスへの菌処理物の投与
図３に示すスケジュールにて試験を実施した。オスのＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア株式会社）を、６週齢まで通常飼料（ＣＥ-２、日本クレア社製）にて飼育した。７週齢時に、通常飼料にて飼育した通常飼料群（Ｎｏｒｍａｌ）と、０．２％アデニン（和光社製）を含む通常飼料（アデニン食）にて飼育したアデニン食飼料群に分けて飼育した。６週間後、Ｎｏｒｍａｌ群はＰＢＳ(−)０．２ｍＬ/匹を１日１回、１２日間ゾンデにて強制経口投与した。
アデニン食飼育群は、６週間のアデニン食飼育後、通常飼料に戻し、ＰＢＳ(−)投与群（ＲＦ）、菌（B. longum ＣＬＡ８０１３）処理物投与群（ＲＦ+８０１３Ｅ（１）、ＲＦ+８０１３Ｅ（１０））に分け、ＲＦ群はＰＢＳ（−）、ＲＦ+８０１３Ｅ（１）及びＲＦ+８０１３Ｅ（１０）群は８０１３Ｅ（１）、８０１３Ｅ（１０）０．２ｍＬ/匹をそれぞれ１日１回、１２日間ゾンデにて強制経口投与した。
最終投与１８時間後に解剖した。
２．血清ＢＵＮの測定
各群のマウス血清中ＢＵＮ（尿素窒素）をＤｅｔｅｃｔＸ  Ｕｒｅａ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＡＲＢＯＲ  ＡＳＳＡＹＳ社製）を用いて測定した結果を図４に示す。各群それぞれ５匹又は６匹測定した。得られた結果は、ｍｅａｎ±Ｓ.Ｄ.で示した（＊：p<0.05vs Normal,#：p<0.05vsRF, Steel-Dwass法）。Ｎｏｒｍａｌ群と比較してＲＦ群では、腎機能の指標となる血清ＢＵＮ濃度の上昇が確認された。ＲＦ+８０１３Ｅ（１）およびＲＦ+８０１３Ｅ（１０）群はＲＦ群と比較して血清ＢＵＮ濃度が低下しており、８０１３Ｅの用量依存的な効果が確認でき、ＲＦ+８０１３Ｅ（１０）群はＲＦ群に対して有意差が認められた。この結果より、８０１３Ｅは、腎機能を改善することが示された。なお、試験期間中の体重は、アデニン食飼育により減少が認められ、被検薬投与開始時に飼料を通常飼料に戻すことで回復したが、８０１３Ｅを投与しても体重回復に影響は認められず、ＲＦ群と同じ傾向を示した。【００６７】
［実施例３］（菌処理物の調製）
菌（Bifidobacterium longum ＣＬＡ８０１３）処理物の調製方法
菌株B. longum ＣＬＡ８０１３の凍結保存菌株（約１×１０８個）を１％グルコース、０．１％ポリソルベート８０含有ＧＡＭ（日水製薬株式会社）培地１０ｍＬを用いて、３７℃、 ３０時間嫌気培養した。培養後、遠心（３,０００×Ｇ、１０ｍｉｎ．、Ｒ．Ｔ．）して上清を廃棄し、ＰＢＳ(−)により洗浄後、ＰＢＳ(−)１０ｍＬに再懸濁し、３７℃、２４時間嫌気下にて放置後、遠心上清をフィルター（０.２２μｍ）濾過し、濾液を菌（B. longum ＣＬＡ８０１３）処理物（８０１３Ｅ）として得た。【００６８】
（菌処理物の全腸管輸送能）
１．ＳＤラットへの菌（B. longum ＣＬＡ８０１３）処理物の投与
オスの６週齢ＳＤラット（日本ＳＬＣ製）を個別で１週間予備飼育した。予備飼育後、Ｎｏｒｍａｌ群と８０１３Ｅ群に群分した。Ｎｏｒｍａｌ群はＰＢＳ（−）を、８０１３Ｅ群は８０１３Ｅを０．５ｍＬ/匹の用量で１回、強制経口投与した。投与終了後に、カルミン｛（Carmine） (WAKO) 3g/50 mL (0.5%carboxymethylcellulose)｝水溶液を1 mL/匹の用量で１回、強制経口投与した。
２．ラット全腸管輸送能の測定（図５）
Carmine溶液投与後、赤色に染色された糞便が排出される時間を各群８匹ずつ測定した（*：p＜0.05 vs control(Mann-Whitney’s U test)）。得られた結果は、ｍｅａｎ±Ｓ.Ｄ.で示した。８０１３Ｅ群は、Ｎｏｒｍａｌ群よりも有意に赤色糞便排出時間が短く、８０１３Ｅによる排便促進効果が認められた。【００６９】
［実施例４］（溶媒の種類のイオン経細胞輸送能への影響）
（菌処理物の調製）
菌（Bifidobacterium longum ＣＬＡ８０１３）処理物の調製方法
菌株B. longum ＣＬＡ８０１３の凍結保存菌株を１％グルコース、０．１％ポリソルベート８０含有ＧＡＭ（日水製薬株式会社）培地１０ｍＬを用いて、３７℃、 ３０時間嫌気培養した。培養後、遠心（３,０００×Ｇ、１０ｍｉｎ．、Ｒ．Ｔ．）して上清を廃棄し、ＰＢＳ(−)により洗浄後、各溶媒（精製水、生理食塩水、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、又はＰＢＳ(−)）１０ｍＬに再懸濁し、３７℃、２４時間嫌気下にて放置後、遠心上清をフィルター（０.２２μｍ）濾過し、濾液を菌（B. longum ＣＬＡ８０１３）処理物（８０１３Ｅ）として調製した。【００７０】
（細胞培養）
株化ヒト結腸上皮細胞Ｔ８４を１０％ＦＢＳ、ペニシリン・ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２にて培養し、４×１０４ｃeｌｌｓ／ｃｍ2で播種して５〜７日毎に継代培養を行った。ｓｎａｐｗｅｌｌ（ｃｏｓｔａｒ、１.１３ｃｍ2）に５×１０5ｃeｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して３日毎に培地を交換し、５〜７日培養したものを試験に用いた。【００７１】
（短絡電流法）
実施例１の短絡電流法と同じ方法でΔＩｓｃを求めた。【００７２】
（菌（B. longum ＣＬＡ８０１３）処理物のイオン経細胞輸送能）
結果を図６に示す。菌処理物製造に用いる溶媒が、ＰＢＳ(−)である場合の菌処理物のイオン経細胞輸送能が最も高く、次にＤＭＥＭ／Ｆ−１２である場合の菌処理物のイオン経細胞輸送能が高かった。これらの結果より、菌体をＰＢＳ(−)に懸濁させることにより、より効果の高い処理物の調製が可能であることが認められた。また、菌体をＤＭＥＭ／Ｆ−１２に懸濁し、放置した際に、ｐＨが変化しなかった。この結果から、菌処理物によるイオン経細胞輸送能の増加に菌体による発酵は関係しないことが明らかになった。【００７３】
糖を含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２に懸濁した場合にも、菌処理物のイオン経細胞輸送能が高くなることを確認した。【００７４】
［実施例５］（菌の調製）
菌（B. longum ＭＭ−２：ＩＤ１００１）の調製方法
実施例２と同様の方法により、菌（B. longum ＭＭ−２）を１２〜１８時間嫌気培養した。その後回収した菌体は、ＰＢＳ(−)を用いて菌数５×１０９個／ｍＬになるように調製して使用した。【００７５】
（菌体（B. longum ＭＭ−２）の慢性腎臓病モデルマウスへの改善作用）
実施例２と同様のスケジュール及び方法により、調製後の菌体を菌数１×１０９個／０．２ｍＬ／匹の用量でマウスに投与し、最終投与の１８時間後に解剖した。その後、実施例２に記載の方法と同様の方法により、血清ＢＵＮを、各群それぞれ５匹又は１０匹測定した。測定結果を図７に示す。得られた結果は、ｍｅａｎ±Ｓ.Ｄ.で示した（＊＊：ｐ<０．０１vs Ｎｏｒｍａｌ,#：ｐ<０．０５ｖｓＲＦ）。Ｎｏｒｍａｌ群と比較してＲＦ群では、腎機能の指標となる血清ＢＵＮ濃度の上昇が確認された。ＲＦ+ＭＭ−２群はＲＦ群と比較して血清ＢＵＮ濃度が低下した。この結果より、ＭＭ−２菌体は、腎機能を改善することが示された。なお、試験期間中の体重は、アデニン食飼育により減少が認められ、被検薬投与開始時に飼料を通常飼料に戻すことで回復したが、ＭＭ−２菌体を投与しても体重回復に影響は認められず、ＲＦ群と同じ傾向を示した。【００７６】
本発明において、例えば、投与される菌またはその処理物が、ビフィドバクテリウム  ロンガム  ＭＭ−２菌株が有する程度のイオン経細胞輸送能を有していれば、当該菌又はその処理物を投与することによって、腎機能を改善することができる可能性が考えられる。【００７７】
本発明において、例えば、発酵していない菌を用いる場合は、菌を含有する処理物として投与しても、腎機能を改善することができると示唆される。【００７８】
以下、本発明の腸管のイオン経細胞輸送体への作用剤、クロライドチャネル活性化剤、腎疾患の予防もしくは治療剤、および／または排便促進剤を配合した医薬品、飲食品、および飼料の具体的処方を例示する。各処方例の右端の数値は各含有成分の質量％を意味する。【００７９】
処方例１：医薬品（錠剤）
トウモロコシデンプン                                  ２１．７％
アメ粉                                                ２７．１％
デキストリン                                          ２９．４％
沈降炭酸カルシウム                                    １３．４％
タルク                                                  ３．０％
白糖                                                    ２．２％
ステアリン酸マグネシウム                                ０．５％
菌（Bifidobacterium longum ＣＬＡ８０１３）処理物       ２．７％【００８０】
処方例３：飲食品（ドリンク剤）
砂糖                                                  １３．３％
クエン酸                                                ０．１％
ビタミン類                                              １．０％
香料                                                    ０．２％
菌（Bifidobacterium longum ＣＬＡ８０１３）処理物     １４．８％
水                                                    ７０．６％【００８１】
処方例６：飼料（家畜用飼料）
配合飼料                                              ９７．５％
菌（Bifidobacterium longum ＣＬＡ８０１３）処理物       ２．５％
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の剤は、クロライドチャネルの活性化、腎疾患の予防または治療、及び／または排便促進に有用であり、医薬、サプリメント等として使用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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