(57)【要約】  本発明の体細胞のリプログラミングの解析方法は、体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の転写因子をコードする核酸と、前記複数種類の転写因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞の培養期間中に、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る発光画像を取得すること（Ｓ１２）と、前記発光画像に基づいて、前記発光の発光強度を定量すること（Ｓ１３）と、前記発光強度に基づいて、前記発光レポータータンパク質と共に発現する前記転写因子の発現状態を評価すること（Ｓ１４）とを含み、前記発現状態は、前記細胞のリプログミングの過程における多能性の獲得を評価する指標である。
2018092321.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の転写因子をコードする核酸と、前記複数種類の転写因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞の培養期間中に、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る発光画像を取得することと、
前記発光画像に基づいて前記発光の発光強度を定量することと、
前記発光強度に基づいて、前記発光レポータータンパク質と共に発現する前記転写因子の発現状態を評価することと
を含み、
前記発現状態は、前記細胞のリプログミングの過程における多能性の獲得を評価する指標である、体細胞のリプログラミングの解析方法。
【請求項２】
前記転写因子の発現状態を評価することは、前記発光強度の定量結果から前記転写因子の発現量を求めることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発光画像を取得することは、前記転写因子をコードする核酸を前記細胞に導入した後３週間以内に少なくとも１回は実施される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記発光画像を取得することは、前記転写因子をコードする核酸を前記細胞に導入した後１週間以内に少なくとも１回は実施される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記発光画像を取得することは、経時的に繰り返し実施され、
前記発現状態を評価することは、前記発光レポータータンパク質と共に発現する前記転写因子の発現状態の経時変化を評価することである、
請求項１乃至４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記発光レポータータンパク質と共に発現する前記転写因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｌ−ｍｙｃからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記複数種類の転写因子のうち、前記発光レポータータンパク質と共に発現する前記転写因子は２種類以上であり、
２種類以上の前記転写因子と共に発現する前記発光レポータータンパク質のそれぞれは、他の何れの発光レポータータンパク質とも識別可能に検出されることを可能にする発光特性を有する発光レポータータンパク質であり、
前記発光画像は、前記発光レポータータンパク質のそれぞれの発現に起因する発光の情報が、他の何れの発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の情報とも分別され得る画像であり、
前記発光強度を定量することは、前記発光画像に基づいて、前記発光レポータータンパク質のそれぞれの発現に起因する発光の発光強度を個別に定量することを含む、
請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記発現状態を評価することは、前記個別に定量された前記発光強度から前記転写因子の発現量を求めることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記発現状態を評価することは、前記個別に定量された前記発光強度から発光強度の比を求めることを含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞の明視野画像を取得し、前記細胞によるコロニー形成の評価を行うことをさらに含む、請求項１乃至９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記発光レポータータンパク質は生物発光レポータータンパク質である、請求項１乃至１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記発光レポータータンパク質はルシフェラーゼである、請求項１乃至１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記発光画像を取得することは遮光環境下で実施される、請求項１乃至１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記転写因子をコードする前記核酸と前記発光レポータータンパク質をコードする前記核酸とは、エピソーマルベクターの形態で前記細胞へ導入される、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１乃至１４の何れか１項に記載の方法を用いて、前記転写因子の発現状態の評価結果を得ることと、
前記細胞がリプログラミングされることで作製されたｉＰＳ細胞の品質を評価してｉＰＳ細胞の品質の評価結果を得ることと、
前記転写因子の発現状態の評価結果と前記ｉＰＳ細胞の品質の評価結果との関係に基づいて、ｉＰＳ細胞の品質評価基準を作成することと
を含むｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法。
【請求項１６】
前記ｉＰＳ細胞の品質を評価することは、前記細胞が形成するコロニーの形態を評価することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｉＰＳ細胞の品質を評価することは、アルカリフォスファターゼ活性の解析、核型解析、又は未分化マーカーの発現解析により前記細胞のリプログラミング状態を評価することを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｉＰＳ細胞の品質を評価することは、三胚葉への分化誘導後に、分化マーカーの発現解析により前記ｉＰＳ細胞の分化能を評価することを含む、請求項１５乃至１７の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体細胞のリプログラミングの解析方法とそれを用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞は、初期化因子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８又はＬ−ｍｙｃ）の体細胞への導入によるリプログラミングを経て樹立される。ｉＰＳ細胞の樹立効率は低く、初期化に必要な複数種類の転写因子を導入した細胞のうち、多分化能を有するｉＰＳ細胞、即ち、品質の良いｉＰＳ細胞になるのは１％以下であることが知られている。【０００３】
日本国特表２０１０−５３７６３４号公報には、品質の良いｉＰＳ細胞の評価方法として、コロニー形態の目視による評価方法が記載されている。この評価は、コロニーが十分に成長した後、すなわち、リプログラミングの誘導開始から３乃至４週間後に実施される。コロニーの形態が良いと評価されたものはその後も維持されるが、そのうち実際に多分化能を有するｉＰＳ細胞は２０乃至４０％である。ｉＰＳ細胞を樹立する際には、１ドナーから少なくとも３系統を得ることが求められていることを考慮すると、実際には、少なくとも１５乃至３０個のコロニーを維持し続けなければならない。このように、従来の品質評価方法では、ｉＰＳ細胞を効率良く選択することが難しいため、コストや手間がかかっている。【０００４】
Eirini P. Papapetrou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009 Aug; 106(31):12756-64. Stoichiometric and temporal requirements of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc expression for efficient human iPS induction and differentiation.では、蛍光タンパク質で標識した初期化因子を細胞内に発現させ、それらの発現量を解析している。しかしこの方法は、細胞に励起光を当てて蛍光シグナルを検出するため、特に長期に及ぶ観察の場合、光毒性によって様々なダメージが細胞に与えられる。光毒性による細胞へのダメージが、ｉＰＳ細胞の作製工程の最上流に位置するリプログラミング時に生じれば、その後のステップ全てに多大な影響を及ぼすおそれがある。
また、Eirini P. Papapetrou et al.は、初期化因子Ｏｃｔ４を含むベクターを、他の初期化因子Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃを含むベクターよりも多い量で細胞に導入して、Ｏｃｔ４を他の初期化因子よりも多量に発現させると、リプログラミング効率が向上することを報告する。【０００５】
細胞へのダメージが少ない遺伝子発現解析方法としては、例えば、発光レポーター遺伝子の発現に起因する発光シグナルを解析する方法が挙げられる。発光シグナルによる発現解析は、励起光を要さないため、光毒性の影響を受けることなく、また、自家蛍光の影響がない等、定量性に優れた遺伝子発現解析が可能である。【０００６】
日本国特開２０１４−１７６３６４号公報には、幹細胞の状態を発光によって評価する方法が記載されている。この文献には、細胞の分化マーカー遺伝子又は未分化マーカー遺伝子を標的としたプロモーターアッセイによって、ｉＰＳ細胞から各種臓器への分化誘導段階における分化状態を評価する方法が記載されている。プロモーターアッセイでは、内在性の転写因子の量を反映する発光量が定量される。
【発明の概要】
【０００７】
従来のコロニーの形態を評価するタイミングは、コロニーが十分に成長した後であり、形態的に成熟した後のｉＰＳ細胞を評価することに重点が置かれている。よって、リプログラミングの初期段階における転写因子の発現量を解析するための、細胞へのダメージが少なく、定量性が高い方法が求められている。  
また、コロニー形態の目視による品質評価方法に加えて、品質の良いｉＰＳ細胞を選択するための評価基準を作成する方法が求められている。
【０００８】
本発明は、低侵襲性および高定量性を有する体細胞のリプログラミングの解析方法、及びそれを用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明の一態様によれば、体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の転写因子をコードする核酸と、前記複数種類の転写因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞の培養期間中に、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る発光画像を取得することと、前記発光画像に基づいて前記発光の発光強度を定量することと、前記発光強度に基づいて、前記発光レポータータンパク質と共に発現する前記転写因子の発現状態を評価することとを含み、前記発現状態は、前記細胞のリプログミングの過程における多能性の獲得を評価する指標である、体細胞のリプログラミングの解析方法が提供される。
【００１０】
本発明の一態様によれば、上記の解析方法を用いて、前記転写因子の発現状態の評価結果を得ることと、前記細胞がリプログラミングされることで作製されたｉＰＳ細胞の品質を評価してｉＰＳ細胞の品質の評価結果を得ることと、前記転写因子の発現状態の評価結果と前記ｉＰＳ細胞の品質の評価結果との関係に基づいて、ｉＰＳ細胞の品質評価基準を作成することとを含む、ｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る体細胞のリプログラミングの解析方法の主な処理の流れを示した図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態に係るｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法の主な処理の流れを示した図である。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例にて使用したｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ＳｆＲＥ１ベクターの構成を示す模式図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例にて使用したｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ−ＯｋｉＭａｄｏベクターの構成を示す模式図である。
【図４】図４は、ベクター導入後１日目の細胞についての、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因する発光の発光画像と、ＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因する発光の発光画像と、それら発光画像と位相差観察画像とを重ね合わせた画像（Ｍｅｒｇｅ）とを示す図である。
【図５】図５は、ベクター導入後８日目のｉＰＳ様細胞コロニーについての、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因する発光の発光画像と、ＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因する発光の発光画像と、位相差観察画像とを示す図である。
【図６】図６は、図５中で図示した範囲を拡大し、発光画像と位相差観察画像とを重ね合わせた画像（Ｍｅｒｇｅ）である。
【図７】図７は、図４に示す発光画像で選択された各細胞におけるＳｆＲＥ１ルシフェラーゼの発現に起因する発光強度、及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼの発現に起因する発光強度を示すグラフである。
【図８】図８は、図６に示す発光画像で選択されたコロニー中の５部位におけるＳｆＲＥ１ルシフェラーゼの発現に起因する発光強度、及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼの発現に起因する発光強度を示すグラフである。
【図９】図９は、改変型ベクターを導入して８日後のアルカリフォスファターゼ染色したｉＰＳ様細胞コロニーの明視野画像である。
【図１０】図１０は、コントロールベクターを導入して８日後のアルカリフォスファターゼ染色したｉＰＳ様細胞コロニーの明視野画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の説明は、本発明を説明することを目的とし、本発明を限定することを意図しない。
≪体細胞のリプログラミングの解析方法≫
図１は、本発明の一実施形態に係る体細胞のリプログラミングの解析方法の主な処理の流れを示した図である。本発明の一実施形態に係る方法は、細胞を培養すること（Ｓ１１）と、発光画像を取得すること（Ｓ１２）と、発光強度を定量すること（Ｓ１３）と、転写因子の発現状態を評価すること（Ｓ１４）と、コロニー形成を評価すること（Ｓ１５）とを含む。「リプログラミング」は、分化細胞が多能性幹細胞に変わる現象を指す。
【００１３】
＜細胞の培養＞
体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の転写因子をコードする核酸と、前記複数種類の転写因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞を培養する（Ｓ１１）。以下の説明において、前者の核酸を「転写因子をコードする核酸」、後者の核酸を「発光レポータータンパク質をコードする核酸」ともいう。本明細書において、核酸は、遺伝子と同じ意味を有し、たとえばＤＮＡである。
「転写因子をコードする核酸」および「発光レポータータンパク質をコードする核酸」が導入される元の細胞は、体細胞であるが、これら核酸が導入された体細胞は、培養期間中にｉＰＳ細胞に変化し得る。培養は、既知の方法によって行うことができる。好ましくは、培地交換などの操作のための時間を除いて、顕微鏡上で培養を行う。体細胞としては、例えば、ヒト末梢血単核球細胞（以下、ＰＢＭＣという；ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）を用いることができるが、これに限定されるものではない。細胞の培養は、体細胞のリプログラミングの解析方法を実施している期間にわたって継続して行われる。
【００１４】
「転写因子をコードする核酸」および「発光レポータータンパク質をコードする核酸」が導入された体細胞は、培養期間中に、「転写因子をコードする核酸」を発現することで体細胞のリプログラミングが誘導される。
【００１５】
「転写因子をコードする核酸」および「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、宿主の染色体に組み込まれずに持続的に発現可能な形態で導入されることが好ましい。例えば、「転写因子をコードする核酸」および「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、エピソーマルベクターの形態で体細胞に導入されることが好ましい。この場合、エピソーマルベクターは、市販されているものを使用してもよいし、市販されているエピソーマルベクターに「発光レポータータンパク質をコードする核酸」を組み込むことにより改変ベクターを調製してこれを使用してもよい。市販されているエピソーマルベクターとしては、例えば、ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３−Ｆ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＣＸＬＥ−ｈＵＬ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いることができる。
【００１６】
「複数種類の転写因子をコードする核酸」は、各々個別のベクターに組み込まれていてもよいし、１つのベクターに組み込まれていてもよい。「複数種類の転写因子をコードする核酸」を１つのベクターに組み込む場合、例えば、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列やＩＲＥＳ配列などを介してポリシストロニックに連結して挿入することが好ましい。一例としては、１つのベクターに１種類、又は２Ａ配列を介して組み込まれる２種類の転写因子をコードする核酸を組み込んでなるベクターを複数種類作製し、それらを混合し、ｉＰＳ細胞の誘導に必要な全ての転写因子をコードする核酸を体細胞へ導入する。なお、遺伝子導入の操作は、既知の方法によって行うことができる。
「転写因子をコードする核酸」および「発光レポータータンパク質をコードする核酸」に加えて、「リプログラミング効率を高める追加の因子をコードする核酸」を体細胞に導入してもよい。「リプログラミング効率を高める追加の因子」としては、リプログラミング効率を高めることが知られている因子、例えば、ドミナントネガティブ変異を導入したマウスｐ５３、ＥＢＮＡ１を使用することができる。「リプログラミング効率を高める追加の因子」は、エピソーマルベクターの形態で体細胞に導入されることが好ましい。この場合、エピソーマルベクターは、市販されているもの、例えば、ｐＣＥ−ｍｐ５３ＤＤ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＣＸＢ−ＥＢＮＡ１（Ａｄｄｇｅｎｅ）を使用することができる。
【００１７】
「体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の転写因子」としては、体細胞のリプログラミングを誘導することが知られている転写因子の組み合わせを使用することができ、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８及びＬ−ｍｙｃの組み合わせ、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８及びＬ−ｍｙｃの組み合わせ、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２及びｃ−ｍｙｃの組み合わせ、またはＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４及びＳｏｘ２の組み合わせが挙げられる。体細胞のリプログラミングに必要な転写因子の数は、例えば３〜６種類である。
「転写因子をコードする核酸」は、一例としては、Ｏｃｔ３／４をコードする核酸を含む第１のベクター、Ｓｏｘ２をコードする核酸とＫｌｆ４をコードする核酸とを含む第２のベクター、およびＬ−ｍｙｃをコードする核酸とＬｉｎ２８をコードする核酸とを含む第３のベクターから構成されるベクターセットを用いて、体細胞に導入することができる。ここで、第１のベクター、第２のベクター、および第３のベクターの少なくとも一つは、ベクターに含まれる「転写因子をコードする核酸」と共に発現することが可能な位置で「発光レポータータンパク質をコードする核酸」を含む。また、上述の第１〜第３のベクターから構成されるベクターセットを用いて「転写因子をコードする核酸」を体細胞に導入する場合、ドミナントネガティブ変異を導入したマウスｐ５３をコードする核酸を含む第４のベクター、およびＥＢＮＡ１をコードする核酸を含む第５のベクターをベクターセットに組み込んでもよい。
【００１８】
「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、複数種類の転写因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成される。「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、例えば、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列やＩＲＥＳ配列などを介してポリシストロニックに「転写因子をコードする核酸」と連結されるように構成されることが好ましい。例えば、「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、２Ａ配列を介してポリシストロニックに「転写因子をコードする核酸」と連結されるように構成されることが好ましい。尚、「発光レポータータンパク質をコードする核酸」の位置は、転写因子と発光レポータータンパク質とが共に発現可能な位置であればよく、「転写因子をコードする核酸」の上流であってもよいし、下流であってもよい。
本明細書において「発光レポータータンパク質（luminescent reporter protein）」は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質と対比して用いられ、励起光を照射しないで光を発するように機能するタンパク質である。「発光レポータータンパク質」は、好ましくは生物発光タンパク質、たとえばルシフェラーゼである。生物発光は、生物反応が失われた死細胞では光らないので、アポトーシス等で培養期間中に失活した細胞を除いた生きた細胞を選択的に評価できる点で望ましい。
「発光レポータータンパク質」は、複数種類の転写因子の１種類と共に発現するように構成されていてもよいし、複数種類の転写因子の全種類と共に発現するように構成されていてもよい。発光レポータータンパク質と共に発現する転写因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｌ−ｍｙｃからなる群より選択される少なくとも１つである。
「発光レポータータンパク質」が、複数種類の転写因子の２種類以上と共に発現するように構成されている場合、２種類以上の転写因子の発現状態を評価することができる。これにより、体細胞のリプログラミングをより正確に解析することができる。
【００１９】
発光レポータータンパク質と共に発現する転写因子が２種類以上（たとえば、２〜６種類）である場合、２種類以上の転写因子と共に発現する発光レポータータンパク質のそれぞれは、他の何れの発光レポータータンパク質とも識別可能に検出されることを可能にする発光特性を有する。すなわち、２種類以上の発光レポータータンパク質は、互いに識別可能に検出されることを可能にする発光特性を有する。ここで発光特性は、例えば発光波長である。このように、２種類以上の発光レポータータンパク質は、互いに識別可能に検出されることを可能にする発光特性を有するため、後の工程で取得される発光画像において、発光レポータータンパク質のそれぞれの発現に起因する発光の情報は、他の何れの発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の情報とも分別される。また、後の定量工程では、かかる発光画像に基づいて、発光レポータータンパク質のそれぞれの発現に起因する発光の発光強度は、個別に（すなわち、発光レポータータンパク質の種類毎に）定量される。
【００２０】
互いに識別可能に検出されることを可能にする発光特性を有する２種類以上の発光レポータータンパク質としては、例えば、緑色の発光をもたらすＥｌｕｃルシフェラーゼ、赤色の発光をもたらすＣＲＢルシフェラーゼ、青色の発光をもたらすウミシイタケルシフェラーゼといった市販されるものを使用することができる。
【００２１】
また、発光レポータータンパク質として使用されるルシフェラーゼは、高い発光強度を有するように改変された改変体ルシフェラーゼであってもよい。改変体ルシフェラーゼとしては、例えば、ＳｆＲＥ１  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号１）、ＯｋｉＭａｄｏ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号２）などを使用することができる。なお、転写因子とルシフェラーゼとの組合せは特に限定されない。
【００２２】
発光レポータータンパク質は転写因子と共に発現されるため、発光レポータータンパク質をコードする遺伝子の発現のタイミング及び発現量等は、転写因子のそれらに対応しているとみなすことができる。発光レポータータンパク質としてルシフェラーゼを使用した場合、ルシフェラーゼ遺伝子の発現によって細胞内に生じたルシフェラーゼタンパク質は、細胞に対して提供されたルシフェリンを触媒し、その結果ルシフェリンが発光する。したがって、発光に基づいて、転写因子の発現状態等を推定することができる。
【００２３】
＜発光画像の取得＞
発光レポータータンパク質の発現に起因する発光を撮像し、発光画像を取得する（Ｓ１２）。  
発光画像を取得することは、培養処理（Ｓ１１）の期間（培養期間）中に実施され、好ましくは、リプログラミングの初期段階において実施する。ここで、リプログラミングの初期段階とは、細胞が主に二次元的な増殖に留まる、コロニー形成前の段階を含むことができる。また、リプログラミングの初期段階とは、細胞が群集化することで三次元的に隆起が始まる、コロニー形成開始段階を含むことができる。発光画像を取得することは、例えば、リプログラミングが完了する前の時期であって、従来のコロニーの形態を評価するタイミングよりも早い時期に、具体的には「転写因子をコードする核酸」を導入してから（すなわち、リプログラミングの誘導を開始してから）３週間以内に、少なくとも１回は実施される。より具体的には、発光画像を取得することは、「転写因子をコードする核酸」を導入した日〜３週間後までの期間に、少なくとも１回は実施される。
また、発光画像を取得することは、好ましくは、コロニーが形成される前に、具体的には、「転写因子をコードする核酸」を導入してから１週間以内に、少なくとも１回は実施される。より具体的には、発光画像を取得することは、「転写因子をコードする核酸」を導入した日〜１週間後までの期間に、少なくとも１回は実施される。
【００２４】
発光画像を取得することは、好ましくは経時的に繰り返し実施される。撮像は、任意の間隔で連続的に行なわれる。撮像は、一般的には１０〜３０分の間隔、例えば１０分の間隔で実施される。また、１回の撮像の時間は任意に設定される。１回の撮像のカメラ露出時間は、例えば３乃至５分間とするが、十分な発光シグナルを検出できるように適宜調整することができる。撮像する間隔は、発光画像が撮像素子により解析可能な程度の画像を生じるための露光時間より長い任意の時間間隔である。一方、リプログラミングの過程は週単位なので、１日おき、または１週間おきに１枚づつ撮像したとしても、ｉＰＳ細胞に成熟する前の細胞を有効に評価することが可能である。
【００２５】
発光画像の取得可能期間は、「転写因子をコードする核酸」および「発光レポータータンパク質をコードする核酸」が細胞内に維持される期間に限定される。「転写因子をコードする核酸」および「発光レポータータンパク質をコードする核酸」をエピソーマルベクターの形態で細胞に導入した場合、発光の撮像は、リプログラミング誘導開始直後、すなわち、エピソーマルベクターを導入してから、エピソーマルベクターが細胞外へ放出されるまで継続することができる。
【００２６】
発光画像を取得することは、遮光環境下において実施されることが好ましい。より具体的には、発光画像を取得することは、生物発光を撮像するための遮光環境下において、外部からの影響が少ない方法で実施されることが好ましい。発光画像は、遮光環境下で適宜フィルターを使用して取得することができる。なお、検出する発光レポータータンパク質が１種類である場合には、発光画像は、遮光環境下でフィルターを使用せずに取得してもよい。検出する発光レポータータンパク質が複数種類である場合には、発光画像は、遮光環境下で、適宜フィルターを使用して分光した後に取得することが好ましい。なお、発光画像は、フィルターで分光せず、複数種類の発光レポータータンパク質の発現に起因する発光が重なり合った画像として取得することも可能である。また、発光画像は、カラーＣＣＤカメラまたはカラーＣＭＯＳカメラを用いて、カラー画像として取得することも可能である。
【００２７】
発光画像は、発光イメージング装置を用いて、例えば、発光に応じた特定の波長を有した光を主に通過させるフィルターと、フィルターを透過した光を電気信号に変換する撮像素子と、電気信号から発光画像を作り出す処理部とを含む発光イメージング装置を用いて、取得することができる。発光イメージング装置としては、培養機能と撮像機能の両方を備えた発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス）を使用することができる。培養機能を実行している間に撮像機能を所望のタイミングで実行することで、リプログラミングの全ての過程において発光画像を取得することができる。したがって、全過程で時系列的に発光画像を取得した後に、リプログラミングの初期段階に撮像した発光画像を含む複数の発光画像の中から、解析に適している画像を選別することができる。また、同じ培養チャンバー内で同時に培養を開始した複数のコロニーについて、異なる経過時刻の発光画像を選別することで、成長速度が異なるコロニー間で成長度合いが同等のコロニー同士を評価することが可能である。
【００２８】
好ましくは、発光画像とともに明視野画像を取得する。より好ましくは、発光画像の取得とほぼ同じタイミングで明視野画像を取得する。明視野画像とは、発光に基づくことなく、照明光を用いて取得される画像であり、細胞又はコロニーの位置及び形態等を観察することができる画像である。明視野画像は、位相差観察画像や微分干渉（ＤＩＣ）観察画像を含む。明視野画像は、発光画像の取得とほぼ同じタイミングで取得してもよいし、発光画像の取得からは独立して任意のタイミングで取得してもよい。上記発光イメージングシステム（ＬＶ２００）のような自動化されたシステムにおいては、十分な遮光条件下で、発光画像と明視野画像の両方の撮像機能を、予め指定したタイミングで切り替えながら実行することも可能である。
【００２９】
＜発光強度の定量＞
取得された発光画像に基づいて、発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の発光強度を定量する（Ｓ１３）。  
検出する発光レポータータンパク質が１種類である場合、発光レポータータンパク質の発光の波長域で検出される発光強度をそのまま定量することができる。
【００３０】
検出する発光レポータータンパク質が２種類以上である場合には、好ましくは、まず、フィルターで分光し、所定の波長域毎に発光画像を取得する。その後、好ましくは、得られた発光画像に対してアンミキシング処理を行い、複数種類の発光レポータータンパク質の発光の波長域が重なり合う部分を排除した上で、複数種類の発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の発光強度を各々分別して定量することができる。後の評価工程において、上記で得られた個々の発光レポータータンパク質の発現に起因する発光強度の定量結果から、発光強度の比を算出することも可能である。
【００３１】
なお、発光強度は、複数種類の発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の発光強度の合計値として定量してもよい。この場合、複数種類の発光レポータータンパク質の全体の発現量に関する情報を得ることができる。
また、検出する発光レポータータンパク質が２種類以上である場合には、カラー画像に基づいて複数種類の発光レポータータンパク質の発現に起因する発光を色分離した後に、それぞれの発光の情報を分別して発光強度を定量することも可能である。
【００３２】
発光画像を取得することが、経時的に繰り返し実施された場合、発光強度の定量は、好ましくは経時的に繰り返し行われる。この場合も、後の評価工程において、発光強度の定量が行われた各時点において発光強度の比を算出することが可能である。なお、発光強度の定量及び発光強度の比の算出は自動化してもよい。
【００３３】
＜転写因子の発現状態の評価＞
定量された発光強度に基づいて、発光レポータータンパク質と共に発現する転写因子の発現状態を評価する（Ｓ１４）。転写因子の発現状態の評価は、好ましくは、発光強度の定量結果から転写因子の発現量を求めることを含む。
【００３４】
使用した発光レポータータンパク質が１種類である場合には、発光レポータータンパク質の発現に起因する発光強度をそのまま、発光レポータータンパク質と共に発現する転写因子の発現量に換算することができる。
【００３５】
使用した発光レポータータンパク質が複数種類である場合には、転写因子の発現状態の評価は、個別に（すなわち、発光レポータータンパク質の種類毎に）定量された発光強度から転写因子の発現量を求めることを含んでいてもよい。この場合、特定の転写因子の発現量と複数種類のルシフェラーゼの各々の発光強度との関係を予め求めておき、共発現する発光レポータータンパク質を変更しても、転写因子の発現量を補正できるようにしておくことが好ましい。
【００３６】
複数種類の発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の発光強度を、それらの合計値として定量した場合には、転写因子の発現量についても同様に、複数種類の転写因子の全体の発現量として定量される。
【００３７】
転写因子の発現状態の評価は、好ましくはリプログラミングの初期段階の細胞に対して、より好ましくは「転写因子をコードする核酸」を導入してから３週間以内の細胞に対して、さらに好ましくは「転写因子をコードする核酸」を導入してから１週間以内の細胞に対して、実施する。なお、転写因子の発現状態の評価は、発光画像を取得してすぐに実施してもよいし、事前に取得した発光画像に対して実施してもよい。
【００３８】
さらに、使用した発光レポータータンパク質が複数種類である場合には、転写因子の発現状態の評価は、個別に（すなわち、発光レポータータンパク質の種類毎に）定量された発光強度から発光強度の比を求めることを含んでいてもよい。
転写因子の発現状態の評価は、一時点における発光強度の定量結果について実施してもよい。あるいは、発光画像の取得が、経時的に繰り返し実施された場合、転写因子の発現状態の評価は、発光レポータータンパク質と共に発現する転写因子の発現状態の経時変化を評価することにより行われてもよい。
したがって、転写因子の発現状態の評価は、リプログラミングの進行に伴う、特定の転写因子の発現強度の経時変化及び／又は複数種類の転写因子の発現強度の比の経時変化を評価することにより行うことが可能である。転写因子の発現状態は、細胞のリプログミングの過程における多能性の獲得を評価する指標である。ここで「多能性の獲得」は、品質の良いｉＰＳ細胞の樹立を意味する。多能性の獲得を評価することで、品質の良い細胞を早期に分別できるので、ｉＰＳ細胞の生産効率を飛躍的に向上させる。
【００３９】
＜コロニー形成の評価＞
上記の転写因子の発現状態の評価（Ｓ１４）に加えて、コロニー形成の評価（Ｓ１５）を行なってもよい。コロニー形成の評価（Ｓ１５）は、コロニー形成が起こっているか否かを目視で確認することにより行うことができる。コロニー形成の評価（Ｓ１５）においてコロニー形成が確認された場合、これは、「転写因子をコードする核酸」が細胞に導入され、発現していることを表す。また、コロニー形成の評価（Ｓ１５）は、明視野画像から行うことが好ましい。明視野画像は、コロニー形成を観察できれば特に限定されない。明視野画像は、例えば位相差観察画像又は微分干渉（ＤＩＣ）観察画像である。
コロニー形成の評価は、「転写因子をコードする核酸」を細胞に導入してから（すなわち、リプログラミングの誘導を開始してから）７日目以降に行うことができる。
【００４０】
≪体細胞のリプログラミングの解析方法を用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法≫
図２は、本発明の一実施形態に係るｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法の主な処理の流れを示した図である。本発明の一実施形態に係る方法は、上述の体細胞のリプログラミングの解析方法を用いて、転写因子の発現状態を評価すること（Ｓ１４）と、ｉＰＳ細胞の品質を評価すること（Ｓ２１およびＳ２２）と、転写因子の発現状態の評価結果とｉＰＳ細胞の品質の評価結果との関係に基づいて、ｉＰＳ細胞の品質評価基準を作成すること（Ｓ２３）とを含む。
転写因子の発現状態を評価すること（Ｓ１４）は、上述のとおり、「転写因子をコードする核酸」を細胞に導入してから、好ましくは３週間以内の細胞に対して、より好ましくは１週間以内の細胞に対して、行うことができる。ｉＰＳ細胞の品質を評価すること（Ｓ２１およびＳ２２）は、好ましくは「転写因子をコードする核酸」を細胞に導入してから３乃至４週間後に行うことができる。
【００４１】
＜ｉＰＳ細胞の品質評価＞
体細胞のリプログラミングの解析を行ったコロニーのなかから、転写因子のさまざまな発現状態を示すコロニーを選択し、ｉＰＳ細胞の品質の評価として慣用的に使用されている評価を行い（Ｓ２１）、その結果を元に、ｉＰＳ細胞の品質を総合評価する（Ｓ２２）。
ｉＰＳ細胞の品質の評価（Ｓ２１およびＳ２２）を行うためには、転写因子のさまざまな発現状態（すなわち、発現パターン）を示すコロニーが選択され、例えば、発現パターンＡ、Ｂ、Ｃを示すコロニーが選択される。「発現パターン」は、特定の時点における一種類または複数種類の転写因子の発現パターンであってもよいし、一種類または複数種類の転写因子の経時的な発現変化のパターンであってもよい。特定の発現パターン（例えば、所定の閾値を超える転写因子の発現量を示す発現パターン）を示すコロニーについて、複数個（たとえば１０〜１００個）のコロニーを選択することにより、後の工程で、転写因子の発現状態の評価（Ｓ１４）の結果とｉＰＳ細胞の品質の評価（Ｓ２１およびＳ２２）の結果との関連付けの精度が高くなり、これにより、作成されるｉＰＳ細胞の品質評価基準の精度も高くなる。
【００４２】
ｉＰＳ細胞の品質評価は、ｉＰＳ細胞の品質の評価のために通常行われている公知の評価方法と同様の手法に従って行うことができる。例えば、ｉＰＳ細胞の品質評価（Ｓ２１およびＳ２２）は、コロニーの形態の評価（Ｓ２１１）、リプログラミング状態の評価（Ｓ２１２）、分化能の評価（Ｓ２１３）からなる群から選択される少なくとも１つを含む。ｉＰＳ細胞の品質評価は、好ましくは、コロニーの形態の評価、リプログラミング状態の評価、分化能の評価からなる群から選択される２つ以上を含み、より好ましくは、全てを含む。複数の評価を行った場合には、ｉＰＳ細胞の品質評価は、複数の評価結果を総合評価することを含む。例えば、複数の評価の少なくとも一つの評価結果が良くなかった場合、ｉＰＳ細胞の品質が良くないと総合的に評価することができる。
【００４３】
（コロニーの形態の評価）
コロニーの形態の評価は、例えば、コロニーの真円度の評価、コロニーの大きさの評価、及びコロニーの輪郭の明瞭度の評価からなる群から選択される少なくとも１つにより実施することができる。コロニーの形態の評価は、目視によって行なってもよいし、任意の判断基準に基づいて数値化してもよく、前記数値化の工程は自動化してもよい。コロニーの形態に基づき、成熟したｉＰＳ細胞をスクリーニングしたり、成熟後のｉＰＳ細胞の中で明らかに異常な形態を示すものを除いたりすることができる。
【００４４】
（リプログラミング状態の評価）
リプログラミング状態の評価は、例えば、アルカリフォスファターゼ活性の解析、核型解析、または未分化マーカーの発現解析により実施することができる。このリプログラミング状態の評価は、とくにコロニー内の多数の細胞がｉＰＳ細胞として成熟しているかどうかを俯瞰するのに適しており、リプログラミングが終了していることを確認するために利用することもできる。
【００４５】
アルカリフォスファターゼは、多能性幹細胞で高発現するため、未分化状態のマーカーの一つである。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば、公知の手法に従ってアルカリフォスファターゼ染色を行うことにより解析することができる。この解析は、アルカリフォスファターゼ染色により、アルカリフォスファターゼ活性の有無を判定してもよいしアルカリフォスファターゼ活性を定量化してもよい。アルカリフォスファターゼ染色は、例えば、ホルマリン固定後に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルりん酸（ＢＣＩＰ）とニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）の混合液からなる基質液を加えて、アルカリフォスファターゼの活性に伴う反応産物を顕微鏡により検出することにより行うことができる。
【００４６】
核型解析は、例えば、Ｇ−ｂａｎｄ解析により染色体の数や構造の変化を解析することにより行うことができる。
【００４７】
未分化マーカーの発現解析は、未分化マーカー遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲや未分化マーカータンパク質の免疫染色により行うことができる。未分化マーカーとしては、例えば、ＮａｎｏｇやＯｃｔ３／４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１を用いることができる。
【００４８】
（分化能の評価）
ｉＰＳ細胞の分化能の評価は、例えば、三胚葉細胞への分化を誘導した後の、三胚葉分化マーカーの発現解析によって行うことができる。
【００４９】
分化マーカーの発現解析は、分化マーカーのＲＴ−ｑＰＣＲや分化マーカータンパク質の免疫染色により行うことができる。分化マーカーとしては、例えば、外胚葉マーカー（ＰＡＸ６、ＭＡＰ２）、中胚葉マーカー（α−ＳＭＡ、Ｂｒａｎｃｈｙｕｒｙ）、内胚葉マーカー（ＳＯＸ１７、ＡＦＰ）を用いることができる。
【００５０】
＜転写因子の発現状態の評価結果とｉＰＳ細胞の品質の評価結果との対応付け＞
上述の体細胞のリプログラミングの解析方法によって得られた転写因子の発現状態の評価結果と、上述のｉＰＳ細胞の品質評価によって得られたｉＰＳ細胞の品質の評価結果との対応付けを行う。後者の評価結果は、公知技術に基づくものであるため、この対応付けにより、リプログラミングの初期段階（例えば、リプログラミングの誘導開始から３週間以内）における転写因子の発現状態を、品質の良いｉＰＳ細胞と関連づけることができる。このような関連付けは、たとえば１または２以上の転写因子の発現量が所定の閾値に到達するか否かによって行うことができる。
【００５１】
品質の良いｉＰＳ細胞と、それらのリプログラミングの初期における転写因子の発現状態とを対応付けた結果に基づいて、ｉＰＳ細胞の品質を評価するための基準を作成することができる。具体的には、転写因子が特定の発現パターン（例えば、所定の閾値を超える転写因子の発現量を示す発現パターン）を示す複数個のコロニーと、慣用的な品質評価方法で特定された品質の良いｉＰＳ細胞とが関連付けられた場合、この特定の発現パターンをｉＰＳ細胞の品質評価基準として採用することができる。これにより、リプログラミングの初期における転写因子の発現状態から、品質の良いｉＰＳ細胞を選択するための品質評価を行うことが可能になる。また、これにより、コロニーの形態に基づく従来の評価と比較して早い段階で、数値データに裏付けられた客観的なｉＰＳ細胞の品質評価が可能になる。上述の「体細胞のリプログラミングの解析方法による評価」に加えて、「コロニーの形態の評価」と「未分化マーカー及び／又は分化マーカーの発現確認によるｉＰＳ細胞の品質評価」とのうち少なくとも一方を行なうことにより、より正確に、品質の良いｉＰＳ細胞を選抜することが可能になる。
【００５２】
≪効果≫
以上説明したように、一実施形態にかかる解析方法によれば、リプログラミングの初期段階、例えば、体細胞への転写因子の導入（すなわち、リプログラミングの誘導開始）時点から３週間以内の期間において、細胞にダメージをほとんど与えることなく定量的に体細胞のリプログラミングを解析することができる。
【００５３】
従来のリプログラミング状態の評価は、リプログラミングの誘導開始から３乃至４週間後にコロニー形態を目視で評価するのみであった。このような目視による評価に先駆けて、本実施形態の解析方法を用いると、転写因子の発現状態を評価することが可能になる。また、転写因子の発現状態の評価が可能になることで、リプログラミングの初期段階（例えば、リプログラミングの誘導開始から３週間以内）、好ましくはリプログラミングの最初期段階（例えば、リプログラミングの誘導開始から１週間以内）における細胞の状態を把握することができる。さらに、これらの評価結果に基づいて、リプログラミングの初期段階における初期スクリーニングを実施することが可能になる。
【００５４】
また、一実施形態に係る解析方法によれば、励起光を使用しないため、蛍光による解析方法と比較して、細胞に対して低侵襲な方法で転写因子の発現強度を定量することができる。さらに、この解析方法は、蛍光による解析方法と比較して、定量性にも優れている。具体的には、励起光を使用しない発光による発現量の解析は、以下の点で蛍光よりも優れている。
【００５５】
（ｉ）低侵襲性
蛍光タンパク質の検出には、励起光の照射が必要である。励起光の照射は、細胞に光毒性をもたらすことが知られている。例えば、励起光は活性酸素種の生成に関与するため、活性酸素種による酸化的なＤＮＡへの損傷要因となる。また、ＧＦＰに代表される蛍光タンパク質の励起波長では、ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｌｅｂｓ（膜の水泡）や細胞分裂異常が発生する。さらに、蛍光タンパク質の発現自体が細胞死誘導の原因となる。  
一方、励起光を使用しない発光による発現量の解析は、長期間の観察であっても細胞へのダメージは殆どない。また、発光レポータータンパク質の発現は細胞に対して無害である。
【００５６】
（ｉｉ）高定量性
定量性に影響を与える要素として、自家蛍光の有無やタンパク質の細胞内半減期の長さ、そしてタンパク質の成熟に要する時間の長さが挙げられる。
【００５７】
例えば、蛍光タンパク質の検出時には、多くの場合、自家蛍光が観察される。  
一方で、発光レポータータンパク質の検出時には、自家蛍光によるバックグラウンドが観察されないため、定量性に優れている。
【００５８】
また、蛍光タンパク質の細胞内半減期は長く、例えば、２０時間程度要する。そのため、発現量が低下するタイミングを正確に検出することが困難である。  
一方で、発光レポータータンパク質の細胞内半減期は、例えば、３時間程度である。このため、蛍光タンパク質を用いた解析と比較して発現量の変化の追従性に優れている。
【００５９】
さらに、蛍光タンパク質の成熟には、最短でも３時間、最長では２０時間を要する。特に、赤色蛍光は、成熟過程で緑色蛍光を経てから赤色に成熟するため、成熟過程で緑色蛍光との区別が困難となる。  
一方で、ルシフェラーゼなどの発光レポータータンパク質は、発現が誘導され次第即座に成熟する。そのため、発光による検出は、リプログラミングの初期段階のモニタリングに適している。
【００６０】
以上のように、本実施形態に係る解析方法は、侵襲性に優れているだけでなく、定量性にも優れている。そのため、本実施形態にかかる解析方法を、ｉＰＳ細胞の作製工程の最上流であるリプログラミングの初期段階において実施すると、転写因子の発現量の微量な変動を、細胞にダメージを与えることなく解析することができる。また、発光による発現状態の評価は、従来の評価方法、すなわち目視によるコロニーの形態評価などの技術者の感覚的な基準による方法と比較して、定量的且つ客観的な方法である点で優れている。
【００６１】
また、一実施形態に係る解析方法によれば、リプログラミングを誘導する目的で細胞に導入した外来性の転写因子のいくつかは発光レポータータンパク質と共に発現するため、転写因子の発現量を発光強度によって直接的に解析することができる。そのため、従来のプロモーターアッセイによる間接的な発現量評価と比較して、実際の発現量を把握することが可能になる。
【００６２】
一実施形態に係る解析方法によると、例えば、コロニーを形成する細胞集団における転写因子の発現分布を発光画像から解析することが可能となる。当該技術分野では、ｉＰＳ細胞を樹立する際に、ｉＰＳ細胞の作製効率の観点から、コロニーの中心の一部の細胞のみを物理的に分取するように選択することが一般に行われている。したがって、コロニーを形成する細胞集団における転写因子の発現分布を解析することにより、細胞を分取することなく、コロニーの中心部に存在する細胞集団のなかから、転写因子が適切に発現している細胞を、画像解析またはディスプレー等の表示手段に表示された画像に基づき選抜することが可能となる。コロニーの中心部と中心部からみて複数の方角に相当するコロニーの周辺部のそれぞれにおける発光強度および／または発光量の増加率から、細胞ごとのｉＰＳ細胞樹立過程、すなわち多能性の獲得状態を把握することができる。さらに、明視野観察、このましくは位相差観察のための公知の光学系を用いて明視野画像を取得し、この明視野画像を発光画像と重ね合わせることで、リプログラミングの過程における細胞の形態的な変化と関連付けたｉＰＳ細胞の品質評価の指標を提供できる。とくに位相差観察画像と発光画像の両方をリプログラミングの異なる過程で繰り返し取得することで、コロニーの厚みの変化と遺伝子発現量とを関連付けたｉＰＳ細胞の品質評価が可能となる点で好ましい。
【００６３】
さらに、一実施形態に係る解析方法を用いたｉＰＳ細胞の品質評価基準の作成方法によれば、従来の評価法に基づいて選抜された品質の良いｉＰＳ細胞と、リプログラミングの初期（例えば、リプログラミングの誘導開始から３週間以内）、好ましくはリプログラミングの最初期（例えば、リプログラミングの誘導開始から１週間以内）における転写因子の発現状態の評価結果とが対応付けられるため、これまでにない新たなｉＰＳ細胞の品質評価基準を作成することが可能になる。また、これによって基準が作成されれば、品質の良いｉＰＳ細胞に将来なることが予想される細胞をリプログラミングの初期段階でスクリーニングすることができ、品質の良いｉＰＳ細胞の樹立効率を高めることが可能になる。
【実施例】
【００６４】
以下に、本発明の実施例を記載する。本実施例では、リプログラミングの誘導因子として、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ−ｍｙｃ及びＬｉｎ２８を使用した。これらの誘導因子のうちＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４のそれぞれに、発光レポータータンパク質としてルシフェラーゼを連結し、各誘導因子の発現状態を発光画像から評価した。【００６５】
＜１．方法＞
（１−１．ベクターの作成）
リプログラミングの誘導のために、以下の５種類のエピソーマルベクターを準備した。
（１）Ｏｃｔ３／４及びＳｆＲＥ１ルシフェラーゼを発現するベクター（ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３−ＳｆＲＥ１）
（２）Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼを発現するベクター（ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ−ＯｋｉＭａｄｏ）
（３）Ｌ−ｍｙｃ及びＬｉｎ２８を発現するベクター（ｐＣＸＬＥ−ｈＵＬ）
（４）マウスｐ５３のドミナントネガティブ変異体を発現するベクター（ｐＣＥ−ｍｐ５３ＤＤ）
（５）ＥＢＮＡ１を発現するベクター（ｐＣＸＢ−ＥＢＮＡ１）【００６６】
これら５種類のベクターを「改変型ベクターセット」という。転写因子については、Okita K, et al., Nat. Methods 2011 May; 8(5):409-412. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.を元に選択した。【００６７】
以下に、（１）〜（５）の発現ベクターの詳細を記す。
（１）ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３−ＳｆＲＥ１
ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３−ＳｆＲＥ１は、Ｏｃｔ３／４と共に、発光レポータータンパク質としてＳｆＲＥ１ルシフェラーゼが発現するように調製した。  
具体的には、ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３（Ａｄｄｇｅｎｅ）をＫｐｎ  Ｉ及びＢｇｌ  ＩＩで消化し、図３Ａに示すように、ｈＯＣＴ３／４の下流に、２Ａ配列を介してＳｆＲＥ１  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号１）を組み込むことにより、発現ベクターを調製した。【００６８】
（２）ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ−ＯｋｉＭａｄｏ
ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ−ＯｋｉＭａｄｏは、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４と共に、発光レポータータンパク質としてＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼが発現するように調製した。  
具体的には、ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ（Ａｄｄｇｅｎｅ）をＳｐｈＩ及びＢｇｌ  ＩＩで消化し、図３Ｂに示すように、ＫＬＦ４の下流に、２Ａ配列を介してＯｋｉＭａｄｏ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号２）を組み込むことにより、発現ベクターを調製した。なお、図３Ｂに示されるＫｐｎＩのサイトに関しては、ＫＬＦ４の内部からＫｐｎＩサイトを含む、ストップコドンを削除した配列を人工合成して挿入した。【００６９】
（３）ｐＣＸＬＥ−ｈＵＬ
ｐＣＸＬＥ−ｈＵＬは、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した。【００７０】
（４）ｐＣＥ−ｍｐ５３ＤＤ
ｐＣＥ−ｍｐ５３ＤＤは、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した。【００７１】
（５）ｐＣＸＢ−ＥＢＮＡ１
ｐＣＸＢ−ＥＢＮＡ１は、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した。【００７２】
比較対象としてのリプログラミングの誘導については、上記（３）乃至（５）のベクターに加えて、以下の（６）及び（７）のベクターを用いた。これら５種類のベクターを「コントロールベクターセット」という。【００７３】
（６）ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３
ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３は、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した。
（７）ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ
ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫは、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した。【００７４】
以下に、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼおよびＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼの塩基配列を記載する。【００７５】
【表１】
2018092321.tif 000003
【００７６】
【表２】
2018092321.tif 000004
【００７７】
（１−２．遺伝子導入および細胞の培養）
ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄより入手）を解凍し、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌｉｇａｎｄ及びＣＳＦを添加した培地（ＡＫ０２、味の素）で培養した。細胞の培養には２４ｗｅｌｌ培養プレートを使用した。細胞を密度２．５×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、培地交換を行なわずに、３７℃、５％  ＣＯ２の環境下において７日間培養した。【００７８】
７日間の培養後、ＰＢＭＣに「改変型ベクターセット」を、Ａｍａｘａ（Ｌｏｎｚａ）を用いたエレクトロポレーションにより導入した。コントロールとして、ＰＢＭＣに「コントロールベクターセット」を同様の手法で導入した。【００７９】
その後、事前にコーティング剤（ｉＭａｔｒｉｘ、ニッピ）でコートした６ｗｅｌｌ培養プレートに、ベクターを導入したＰＢＭＣを播種し、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌｉｇａｎｄ及びＣＳＦを添加した培地（ＡＫ０２、味の素）で、３７℃、５％  ＣＯ２の環境下において一晩培養した。なお、播種密度は２×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとした。【００８０】
翌日以降、すなわち、ベクター導入後の翌々日以降については、１．５ｍＬの培地（ＡＫ０２、味の素）を一日毎に加えて培養を継続した。ベクター導入後８日目に、ｉＰＳ細胞様コロニーが形成された後、２ｍＬの培地（ＡＫ０２、味の素）に交換して培養を行った。【００８１】
（１−３．発光画像の取得）
「改変型ベクターセット」を細胞に導入し、翌日から、ｉＰＳ細胞コロニーが形成され始めると予想される８日後まで、発光画像の取得を行なった。【００８２】
ルシフェラーゼの触媒作用による発光については、培地中にルシフェリンを終濃度１ｍＭで添加することで観察した。  
発光画像の取得については、発光顕微鏡ＬＶ２００（オリンパス）を用い、ＣＣＤカメラにはＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス）を用いた。撮像の条件としては、ｂｉｎｎｉｎｇを１×１とし、ＥＭ−ｇａｉｎを１２００とした。ベクター導入後１日目の細胞の発光については×２０の倍率の対物レンズを使用し、カメラの露出時間を３分として撮像し、発光画像を取得した。８日目のコロニーの発光については、×４又は×２０の倍率の対物レンズを使用し、カメラの露出時間を５分として撮像し、発光画像を取得した。【００８３】
ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼの発現に起因する発光については、５１５−５６０ＨＱのフィルターを使用して分光した。ＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼの発現に起因する発光については、６１０ＡＬＰフィルターを使用して分光した。【００８４】
（１−４．発光強度の定量）
ベクター導入後１日目の細胞及び８日目のｉＰＳ様細胞コロニーを撮像した発光画像のそれぞれについて、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光の有する波長域の発光強度、及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光の有する波長域の発光強度を定量した。定量については、画像解析ソフト（セルセンス（オリンパス））を用いた。このとき、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼ及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼの波長域が重複する部分をアンミキシング処理により排除した。
アンミキシング処理に先立ち、ＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼおよびＳｆＲＥ１ルシフェラーゼをそれぞれ単独で導入したＰＢＭＣの発光イメージングを行い、各ルシフェラーゼのフィルター透過率を算出した。発光成分ＯｋｉＭａｄｏについて、フィルターを使用しないときの発光イメージング結果の輝度値に対するフィルター５１５−５６０ＨＱ、６１０ＡＬＰを使用したときの発光イメージング結果の輝度値からフィルター透過率「T1o」、「T2o」を決定した。同様に、発光成分ＳｆＲＥ１についてもフィルター透過率「T1s」、「T2s」を決定した。フィルター５１５−５６０ＨＱ、６１０ＡＬＰを用いて測定されるシグナル値を「F1」、「F2」とした。各フィルター測定値は、各発光成分に対し当該フィルターを用いて計測される割合（透過率）を掛け合わせた和として表される。このことから、以下の連立方程式：
F1 = T1o・OkiMado  + T1s・SfRE1
F2 = T2o・OkiMado  + T2s・SfRE1
を解くことで、ＯｋｉＭａｄｏおよびＳｆＲＥ１のそれぞれの発光成分を求めることが出来る。【００８５】
（１−５．アルカリフォスファターゼ活性の評価）
「改変型ベクターセット」を導入して８日目であり、且つ発光が確認されたｉＰＳ様細胞コロニーと、「コントロールベクターセット」を導入して８日目のｉＰＳ様細胞コロニーとを、ホルマリン固定後、市販のキットを用いてアルカリフォスファターゼ染色により処理した。【００８６】
＜２．結果及び考察＞
（２−１．ベクター導入後１日目の細胞の発光画像の取得）
「改変型ベクターセット」を導入した翌日のＰＢＭＣにおける発光を観察し、図４の発光画像を取得した。【００８７】
図４の中央図は、５１５−５６０ＨＱフィルターで分光した、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光画像を示す。  
図４の下図は、６１０ＡＬＰフィルターで分光した、ＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光画像を示す。【００８８】
図４の上図は、図４の中央図と下図と位相差観察画像とを重ね合わせた画像を示す。【００８９】
図４に示すように、ベクター導入後１日目から、Ｏｃｔ３／４の発現を示すＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光と、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の発現を示すＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光とが確認された。これらの画像から明らかなように、発光は、ベクターが導入された細胞と推定される一部の細胞でのみ認められた。【００９０】
これらの結果から、互いに異なる波長域を有するルシフェラーゼであれば、同一の細胞内で複数のルシフェラーゼによる発光を分光して観察可能であること、そして、転写因子と共に発光レポータータンパク質が発現するように構成されたベクターを用いることで、転写因子の発現を発光画像から確認可能であることが示された。【００９１】
また、播種したＰＢＭＣ全体の中で、Ｏｃｔ３／４と、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４とを発現している細胞の位置を目視により観察可能となるため、細胞の位置情報を記録しておくことで、以降の経時的な解析においても、同一の細胞を追跡可能であることが示唆された。【００９２】
（２−２．ベクター導入後８日目のｉＰＳ様細胞コロニーの発光画像の取得）
「改変型ベクターセット」を導入後８日目のｉＰＳ様細胞コロニーにおける発光を観察し、図５及び図６に示す発光画像を取得した。【００９３】
図５は、×４の倍率の対物レンズで撮像した画像である。  
図５の上図は位相差観察画像（ｂｒｉｇｈｔ  ｆｉｅｌｄ）を示す。  
図５の中央図は、５１５−５６０ＨＱフィルターで分光した、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光画像を示す。  
図５の下図は、６１０ＡＬＰフィルターで分光した、ＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光画像を示す。【００９４】
図５の上図の位相差観察画像に示すように、コロニーの形成を観察することができた。このことは、位相差観察画像の取得によってコロニー形成の評価が可能であることを示している。【００９５】
図５の中央図の発光画像に示すように、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光がコロニー内に広く認められた。このことは、コロニーを形成する多くの細胞で、Ｏｃｔ３／４が発現していることを示している。【００９６】
図５の下図の発光画像に示すように、ＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光がコロニー内に広く認められた。このことは、コロニーを形成する多くの細胞で、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４が発現していることを示している。【００９７】
図５の上図に白四角形で図示した範囲について、×２０の倍率の対物レンズで撮像した結果を図６に示す。図６は、５１５−５６０ＨＱフィルターで分光したＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光画像と、６１０ＡＬＰフィルターで分光したＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光画像と、位相差観察画像とを重ね合わせた画像を示す。【００９８】
図５及び図６の結果から、ベクターが正常に導入された細胞が増殖し、コロニーを形成したことが示された。また、ベクター導入後、８日経っても発光画像を取得できたことから、転写因子の発現に伴うＳｆＲＥ１ルシフェラーゼ及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼの発現は、一過的なものではなく、コロニーを形成した後にも発現が持続する長期的なものであることが示された。これらの結果から、経時的な発光画像の取得が可能であることが示唆された。【００９９】
さらに、コロニーの部位ごとの観察が可能であるため、コロニー内の各部位における転写因子の発現状態を観察することができ、コロニー内における各転写因子の発現量の均質性を視覚的に確認可能であることが明らかになった。このことは、従来のＲＴ−ｑＰＣＲによる転写因子の発現量の解析がコロニー全体に対してのみ可能であったのに対し、より高精度の解析が可能となることを示唆している。【０１００】
（２−３．発光強度の定量）
発光画像から、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因する発光の発光強度、及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因する発光の発光強度を定量した。【０１０１】
図４の上図の画像に図示した領域ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅは、発光画像から、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因する発光及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因する発光が確認できた細胞を含むように任意に選択したものである。これらの領域について、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光の有する波長域の発光強度、及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光の有する波長域の発光強度をそれぞれ定量し、グラフ化した結果を図７に示す。【０１０２】
図７のグラフに示すように、領域ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅに含まれる細胞において、Ｏｃｔ３／４と共に発現したＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光の発光強度と、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４と共に発現したＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光の発光強度とを各々独立に定量した結果が得られた。【０１０３】
この結果から、転写因子の発現に伴うルシフェラーゼの発現に起因した発光の発光強度は、各々の細胞について定量可能であることが明らかとなった。【０１０４】
図６に図示した領域ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊは、ｉＰＳ様細胞コロニーの発光画像から、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因する発光及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因する発光が確認できた部位を任意に選択したものである。これらの領域について、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光の有する波長域、及びＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光の有する波長域の発光強度をそれぞれ定量し、グラフ化した結果を図８に示す。【０１０５】
図８のグラフに示すように、領域ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊにおいて、Ｏｃｔ３／４と共に発現したＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因した発光の発光強度と、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４と共に発現したＯｋｉＭａｄｏルシフェラーゼに起因した発光の発光強度とを各々独立に定量した結果が得られた。【０１０６】
この結果から、転写因子の発現に伴うルシフェラーゼの発現に起因した発光の発光強度は、コロニーを形成した状態の細胞についても定量が可能であることが明らかとなった。また、図７及び図８の結果から、ベクターの導入後１日目及び８日目で全ての転写因子に関する遺伝子発現が上昇しており、且つ定量が可能であったことから、発光強度を定量する工程は経時的に繰り返し実施することが可能であることが示された。【０１０７】
また、発光強度は、数値データとして取得されるため、複数のルシフェラーゼの発現に起因した発光の発光強度の比をとることも可能であることが示された。【０１０８】
さらに、ルシフェラーゼの発現は、その上流に２Ａ配列を介して連結される転写因子の発現に伴うことから、定量された発光強度は、転写因子の発現量を反映している。そのため、ルシフェラーゼの発光強度とＲＴ−ｑＰＣＲなどの手法を用いて定量され得る転写因子の発現量との関係を予め求めておくことで、発光強度の定量から転写因子の発現量を算出することも可能であることが示唆された。このように、発光画像に基づいて転写因子の発現状態を評価することが可能であることが示された。【０１０９】
（２−４．リプログラミング状態の評価）
「改変型ベクターセット」を導入したＰＢＭＣ、及び「コントロールベクターセット」を導入したＰＢＭＣにおいて、導入後８日目のリプログラミング状態を、多能性マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性の評価によって評価した。【０１１０】
図９は、改変型ベクターセットを導入して８日目のＰＢＭＣのアルカリフォスファターゼ活性を検出した明視野画像である。  
図１０は、コントロールベクターセットを導入して８日目のＰＢＭＣのアルカリフォスファターゼ活性を検出した明視野画像である。【０１１１】
図９に示すように、改変型ベクターを導入して得られたｉＰＳ様細胞コロニーは染色されており、アルカリフォスファターゼ活性が陽性であった。【０１１２】
この結果は、図１０に示すコントロールベクターセットを導入して得られたｉＰＳ様細胞コロニーの染色結果と同程度であった。【０１１３】
これらの結果から、改変型ベクターセットを導入してｉＰＳ細胞を誘導した場合にも、コントロールベクターセットを導入してｉＰＳ細胞を誘導した場合と同程度に、良好にリプログラミングが進行することが示唆された。このことは、転写因子と共にルシフェラーゼが発現するように改変したベクターを使用しても、体細胞のリプログラミングを評価可能であることを示している。このことは、ｉＰＳ細胞の誘導に使用する転写因子とルシフェラーゼとの組合せを変更しても同様であると予想される。【０１１４】
また、図５及び図６からｉＰＳ様細胞コロニーを形成する細胞の多くで発光が認められ、そのｉＰＳ様細胞コロニーはアルカリフォスファターゼ活性が陽性であったことから、発光が、リプログラミング状態と関連することが示された。また、図６のように、位相差画像を併用することで、ｉＰＳ様に成長した状態のコロニーかどうかを試薬を用いずに確認することができた。とくに、位相差画像と発光画像とを重ね合わせた場合には、コロニー内の厚みが異なる部位同士で発光強度を比較することが可能であり、総合判定の精度を高めることが示唆された。本発明の方法によれば、リプログラミング過程の転写因子の発現を発光画像から観察し、定量することが可能となる。また、その結果を、ｉＰＳ細胞の品質評価結果と対応付けることで、品質の良いｉＰＳ細胞が初期化過程で示す転写因子の発現状態の基準を作成することが可能となることが示唆される。また、そのようにしてｉＰＳ細胞の品質評価基準が作成されれば、品質の良いｉＰＳ細胞コロニーをリプログラミングの初期の段階で細胞に低侵襲且つ定量的な方法で選択可能であることが示唆された。さらに、ｉＰＳ細胞の成長に最適な転写因子を探索するための評価方法としても利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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