【手続補正書】
【提出日】平成30年11月22日(2018.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え融合タンパク質であって、
（ｉ）完全長のＰ．  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＤｎａＪ様タンパク質；完全長のＰ．  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＦｋｌＢタンパク質またはそのＣ末端切断；完全長のＰ．  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＦｒｎＥタンパク質またはそのＣ末端切断；完全長のＰ．  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＦｋｂＰタンパク質またはそのＣ末端切断；および完全長のＰ．  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＥｃｐＤタンパク質またはそのＣ末端切断から選択される、Ｎ末端融合パートナーと、
（ｉｉ）対象のポリペプチドと、
（ｉｉｉ）Ｎ末端融合パートナーと対象のポリペプチドとの間の切断部位を含むリンカーと
を含む、組み換え融合タンパク質。
【請求項２】
Ｎ末端融合パートナーは、完全長のＰ．  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＦｋｌＢタンパク質がＣ末端から１〜２００のアミノ酸を取り除くために切断したＰ．  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＦｋｌＢタンパク質、完全長のＰ．  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＥｃｐＤタンパク質がＣ末端から１〜２００のアミノ酸を取り除くために切断したＰ．  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＥｃｐＤタンパク質、または完全長のＰ．  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＦｒｎＥタンパク質がＣ末端から１〜１８０のアミノ酸を取り除くために切断したＰ．  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＦｒｎＥタンパク質である、請求項１に記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項３】
対象のポリペプチドは、小ペプチドまたは急速に分解するペプチドと、容易に分解するＮ末端を備えたタンパク質と、典型的には不溶性形態の細菌発現系で発現するタンパク質とから選択される、発現することが困難なタンパク質である、請求項１または２に記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項４】
対象のポリペプチドは小ペプチドまたは急速に分解するペプチドであり、ここで、対象のポリペプチドは、ｈＰＴＨ１−３４、Ｇｌｐ１、Ｇｌｐ２、ＩＧＦ−１  エキセナチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、テデュグルチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、プラムリンチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ジコノチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ベカプレルミン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、エンフビルチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ネシリチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）から選択される、請求項１−３のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項５】
対象のポリペプチドは容易に分解するＮ末端を備えたタンパク質であり、ここで、対象のポリペプチドはＮ−ｍｅｔ−ＧＣＳＦまたはＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  スポロゾイト周囲タンパクである、請求項１−３のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項６】
対象のポリペプチドは、非可溶性タンパク質として細菌発現系で一般的に発現されるタンパク質であり、ここで、対象のポリペプチドは、インスリンまたはインスリンアナログ、Ｎ−ｍｅｔ−ＧＣＳＦ、ＧＣＳＦ、またはＩＦＮ−βへとプロセシングされるプロインスリンである、請求項１−３のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項７】
対象のポリペプチドはプロインスリンであり、プロインスリンはインスリンまたはインスリンアナログへとプロセシングされ、プロインスリンはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９；または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００から選択されるアミノ酸配列を有するＣペプチドを含む、請求項６に記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項８】
インスリンアナログは、インスリングラルギン、インスリンアスパルト、リスプロ、グルリジン、デテミル、またはデグルデクである、請求項６または７に記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項９】
Ｎ末端融合パートナーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で説明されるアミノ酸配列を有するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＤｎａＪ様タンパク質である、請求項１に記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項１０】
Ｎ末端融合パートナーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２で説明されるアミノ酸配列を有するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＦｋｌＢタンパク質である、請求項１に記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項１１】
Ｎ末端融合パートナーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４で説明されるアミノ酸配列を有するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＦｒｎＥタンパク質である、請求項１に記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項１２】
Ｎ末端融合パートナーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７で説明されるアミノ酸配列を有するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＥｃｐＤタンパク質である、請求項１に記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項１３】
切断部位は、エンテロキナーゼ、トリプシン、因子Ｘａ、および、フューリンからなる群の中の切断酵素によって認識される、請求項１−１２のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項１４】
リンカーはアフィニティータグを含む、請求項１−１３のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項１５】
リンカーは、
ａ．（Ｇ４Ｓ）１、（Ｇ４Ｓ）２、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）４、および（Ｇ４Ｓ）５から選択されるスペーサー；
ｂ．マルトース結合タンパク質タグ、ポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、およびＮｕｓタグから選択されるアフィニティータグ；および
ｃ．エンテロキナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、因子Ｘａ、およびフューリンから選択されるプロテアーゼ切断部位
を含む、請求項１−１４のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項１６】
リンカーは、Ｎ末端からＣ末端に、（Ｇ４Ｓ）２スペーサー配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ヘキサヒスチジンアフィニティータグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２）、およびプロテアーゼ切断部位ＤＤＤＤＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；Ｎ末端からＣ末端に、（Ｇ４Ｓ）２スペーサー配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ヘキサヒスチジンアフィニティータグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２）、およびプロテアーゼ切断部位ＲＫＲ；Ｎ末端からＣ末端に、（Ｇ４Ｓ）２スペーサー配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ヘキサヒスチジンアフィニティータグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２）、およびプロテアーゼ切断部位ＲＲＲ；Ｎ末端からＣ末端に、（Ｇ４Ｓ）２スペーサー配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ヘキサヒスチジンアフィニティータグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２）、およびプロテアーゼ切断部位ＬＶＰＲ；および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２６から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１−１５のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項１７】
対象のポリペプチドはｈＰＴＨ１−３４であり、組み換え融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１、１３、１４、１５、または１６のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１−１７のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質の発現のための発現ベクターであって、前記組み換え融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項１９】
対象のポリペプチドを産生する方法であって、
前記方法は、
（ｉ）発現構築物を含む発現ベクターを用いて形質転換された微生物の宿主細胞を培養する工程であって、ここで、発現構築物は請求項１−１７のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、工程と、
（ｉｉ）組み換え融合タンパク質を発現するために工程（ｉ）の宿主細胞を誘導する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の誘導された宿主細胞中で発現した組み換え融合タンパク質を精製する工程と、
（ｉｖ）対象のポリペプチドを放出するためにリンカー中の切断部位を認識する切断酵素を用いるインキュベーションによって工程（ｉｉｉ）の精製された組み換え融合タンパク質を切断する工程であって、それによって対象のポリペプチドを得る工程、
を含む、方法。
【請求項２０】
工程（ｉｉ）で発現した組み換え融合タンパク質の発現レベルを測定する工程、工程（ｉｉｉ）で精製された組み換え融合タンパク質の量を測定する工程、または適切に放出された工程（ｉｖ）で得られた対象のポリペプチドの量を測定する工程、あるいはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｉｉｉ）または工程（ｉｖ）で得られた対象のポリペプチドの量は、約０．１ｇ／Ｌから約２５ｇ／Ｌである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
得られた適切に放出された対象のポリペプチドは溶解可能であり、無傷であり、またはその両方である、請求項２１に記載の方法。