(57)【要約】【課題】本発明は、簡便かつ正確にNK細胞機能を検査する方法を提供することを課題とする。【解決手段】複数の提供動物から採取された試料について測定された、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択される３以上の有限個のパラメーターを用いて算出したNINKスコアをナチュラルキラー細胞機能の指標とすることを特徴とする、ナチュラルキラー細胞機能の検査方法。（ａ）末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率；（ｂ）ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のmRNA発現量；（ｃ）ナチュラルキラー細胞のサイトカインのmRNA発現量；（ｄ）ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のmRNA発現量。【選択図】図３
2017213249.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）の工程を含む、又は（２）〜（３）の工程を含む、被験動物から採取された試料のナチュラルキラー細胞機能の検査方法：
（１）被験動物から採取された前記試料中の末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率を測定する工程；
（２）前記被験動物から採取された前記試料中の
ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のmRNA発現量、
ナチュラルキラー細胞のサイトカインのmRNA発現量、及び
ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のmRNA発現量
からなる群から選択される少なくとも２つのmRNA発現量を測定する工程；
（３）（１）及び（２）の工程、若しくは（２）の工程で得られた、少なくとも３つの測定値を用いてNINKスコアを算出する工程であって、該NINKスコアは、複数の提供動物から採取された試料について測定された、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択される３以上の有限個のパラメーターを独立変数として重回帰分析して得られた数式により算出される、工程：
（ａ）末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率；
（ｂ）ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のmRNA発現量；
（ｃ）ナチュラルキラー細胞のサイトカインのmRNA発現量；
（ｄ）ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のmRNA発現量。
【請求項２】
前記（ｂ）がナチュラルキラー細胞のNKp46のmRNA発現量を含み、
前記（ｃ）がナチュラルキラー細胞のIFN-γのmRNA発現量及びTNF-αのmRNA発現量を含み、
前記（ｄ）がナチュラルキラー細胞のGranzyme  BのmRNA発現量及びFasLのmRNA発現量を含む、
請求項１に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
【請求項３】
前記３以上の有限個のパラメーターが、以下の（ａ１）〜（ｃ１）のパラメーターを含む、請求項１又は２に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法：
（ａ１）末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率；
（ｂ１）ナチュラルキラー細胞のNKp46のmRNA発現量；
（ｃ１）ナチュラルキラー細胞のIFN-γのmRNA発現量。
【請求項４】
NINKスコアが以下の数式１により算出されるものである、請求項１〜３のいずれか１に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法：
（数式１）NINKスコア＝ｄ＋ａ×[NK細胞比率（％）]＋ｂ×[NKp46mRNAレベル]＋ｃ×[IFN-γmRNAレベル]
〔ただし、数式１におけるａ，ｂ，ｃ，ｄはゼロでない任意の実数であり、[NK細胞比率（％）]は末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率、[NKp46mRNAレベル]はナチュラルキラー細胞のNKp46のmRNA発現量、[IFN-γmRNAレベル]はナチュラルキラー細胞のIFN-γのmRNA発現量である。〕
【請求項５】
前記数式が、予め作成されている数式の独立変数に、被験動物より採取された試料より得られた測定値を加えて重回帰分析される、更新される数式である、請求項１〜４のいずれか１に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
【請求項６】
前記（１）〜（３）の工程を含む、請求項１〜５のいずれか１に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
【請求項７】
前記（１）及び（２）の工程における前記ナチュラルキラー細胞が、分離された後、保存されたものである、請求項６に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
【請求項８】
前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されたものである、請求項７に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
【請求項９】
被験動物および提供動物がヒトである、請求項１〜８のいずれか１に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
【請求項１０】
NINKスコア算出手段としてコンピューターを機能させる、ナチュラルキラー細胞機能の検査用プログラムであって、NINKスコア算出手段が、複数の提供動物から採取された試料について測定された、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択される３以上の有限個のパラメーターを独立変数として重回帰分析して得られた数式により算出するものである、ナチュラルキラー細胞機能の検査用プログラム：
（ａ）末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率；
（ｂ）ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のmRNA発現量；
（ｃ）ナチュラルキラー細胞のサイトカインのmRNA発現量；
（ｄ）ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のmRNA発現量。
【請求項１１】
NINKスコア算出手段を備えた、ナチュラルキラー細胞機能の検査用装置であって、NINKスコア算出手段が、複数の提供動物から採取された試料について測定された、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択される３以上の有限個のパラメーターを独立変数として重回帰分析して得られた数式により算出するものである、ナチュラルキラー細胞機能の検査用装置：
（ａ）末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率；
（ｂ）ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のmRNA発現量；
（ｃ）ナチュラルキラー細胞のサイトカインのmRNA発現量；
（ｄ）ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のmRNA発現量。
【請求項１２】
被験動物から採取された試料について、以下の（１１）及び（１２）の測定値を取得するための少なくとも３種以上の試薬を含む、NINKスコアを指標とするナチュラルキラー細胞機能の検査用試薬キット：
（１１）末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率；
（１２）ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のmRNA発現量、
ナチュラルキラー細胞のサイトカインのmRNA発現量、及び
ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のmRNA発現量
からなる群から選択される少なくとも２つのmRNA発現量。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかに記載の検査方法により得られたNINKスコアをNK活性に換算する方法であり、予め作成された、末梢血単核細胞とナチュラルキラー細胞の標的細胞を用いて測定されたNK活性とNINKスコアとを変数とする回帰直線式に、被験動物について得られたNINKスコアを代入することによりNK活性を算出することを含む、NINKスコアをNK活性に換算する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験動物から採取された試料のナチュラルキラー細胞（以下「NK細胞」と称する）機能を検査する方法、NK細胞機能の検査用試薬キット、NK細胞機能の検査を行うための検査用プログラム、および検査用装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
NK細胞は生体内の自然免疫において重要な役割を担う大型のリンパ球であり、細胞傷害性を有する細胞である。生体内においてNK細胞は、腫瘍細胞やウイルス感染細胞などの異常細胞を、相手を選ばず攻撃することができる。これまでにNK細胞の機能の低下が、癌疾患の発症率を高めること（Lancet  2000;  356:1795-9）等が報告されており、NK細胞機能は、広く健康状態を知る目的で測定され利用されている。【０００３】
NK細胞は末梢血単核細胞（PBMC）に含まれる。NK細胞機能の指標としては、血中のNK細胞の細胞傷害活性であるNK活性が一般的に用いられている。血中NK細胞のNK活性は、PBMCなどの細胞（エフェクター細胞）を、K562細胞などの標的細胞（ターゲット細胞）と共培養し、ターゲット細胞の死細胞率を測定することで算出される。血中以外の組織より単離された免疫担当細胞に含まれるNK細胞機能を測る場合も同様に算出される。死細胞率は、放射性同位元素や蛍光色素を用いて測定をすることができる。放射性同位元素を用いる場合は、ターゲット細胞を放射性クロム（51Cr）で標識する。エフェクター細胞との共培養によりターゲット細胞が傷害されると、ターゲット細胞から培養上清中に51Crが溶出する。溶出した51Crに由来する放射活性をガンマーカウンターにより測定することにより、死細胞率を測定し、死細胞率をNK活性とすることができる。蛍光色素を用いる場合は、ターゲット細胞を蛍光標識し、死細胞をヨウ化プロピディウム（PI）などの死細胞特異的な色素で染色して、死細胞率を測定し、死細胞率をNK活性とすることができる。【０００４】
上記細胞培養によるNK活性測定方法は、１）細胞培養操作を伴い、２）ターゲット細胞の慎重な維持・管理が求められる。細胞培養には細胞培養機器（CO2インキュベーター）や細胞培養操作に関わる機器（クリーンベンチ）等が必要となる。また、NK細胞の細胞傷害性に対する感度が一定となるように、ターゲット細胞を培養・維持するとともに、予備培養を行って活性測定に備えておく必要がある。細胞培養によるNK活性測定はNK細胞機能測定の標準法とされているものの、培養操作が必須であるという敷居の高さと、バイオアッセイに立脚する故の質の担保の困難性（測定間誤差）という２つの問題点を本質的に抱えている。【０００５】
特許文献１（特開2010-22339号）には、株化NK細胞の細胞傷害活性を間接的に評価する方法として、株化NK細胞をターゲット細胞に作用させる工程を行わず、代わりに、株化NK細胞中において細胞傷害活性に依存して増減するIFN-γ等の遺伝子発現量を測定する方法が開示されている。また特許文献１には、株化NK細胞によるターゲット細胞に対する細胞傷害活性が強いほど、株化NK細胞中のINF-γの遺伝子発現量が多い傾向があること、NK細胞株であるKHYG-1細胞と、ターゲット細胞であるK562細胞とを共培養して測定したNK細胞の細胞傷害活性と、RT-PCRにより測定されるKHYG-1細胞のIFN-γ遺伝子発現量との間に相関があることが開示されている。しかしながら、非特許文献１（Cooper MA, et al., Blood 2001; 97(10):3146-51）には細胞傷害性の低いNK細胞のIFN-γ産生量が高く、一方細胞傷害性の高いNK細胞のIFN-γ産生量が低いことが報告されている。上述のNK活性とIFN-γとの相関を血中NK細胞のような不均質なNK細胞に当てはめることは必ずしも適切ではない。【０００６】
非特許文献２（西村泰光ほか、日本免疫毒性学会第16回学術大会発表要旨：http://www.immunotox.org/immunotoxletter/encourage_award/encourage16.html）には、健常人、石綿曝露に伴う胸膜プラーク陽性者および悪性中皮腫患者からなる集団を解析した結果が開示されている。非特許文献２では、末梢血NK細胞のNKp46タンパク質発現量、K562細胞への細胞傷害性をNK細胞の比率で除したlysis/NK値（NK細胞あたりの細胞傷害性）等が確認されており、NKp46タンパク質発現量と、lysis/NK値が正の相関性を示すことが開示されている。また非特許文献３及び非特許文献４において、単離したNK細胞の細胞傷害活性と、NKp46タンパク質発現量との関連性が報告されている。非特許文献２のLysis/NK値は非特許文献３〜４の単離したNK細胞の細胞傷害活性に近い値であり、これらは測定試料中のNK細胞の量的・質的細胞傷害活性を包含した値、即ちNK活性とは異なるものである。【０００７】
簡便にNK細胞機能を検査する方法についての検討が進められているものの、細胞培養を用いた検査方法によるNK活性値以外には、NK活性を反映し得る指標と検査方法は未だ確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2010-22339号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Cooper MA, et al., Blood 2001; 97(10):3146-51
【非特許文献２】西村泰光ほか、日本免疫毒性学会第16回学術大会発表要旨：http://www.immunotox.org/immunotoxletter/encourage_award/encourage16.html
【非特許文献３】Nishimura Y, et al., Biomed Res Int. 2015;2015:238431. doi: 10.1155/2015/238431. Epub 2015 Jun 16.
【非特許文献４】西村泰光ほか、臨床免疫・アレルギー科 61(6);585-591, 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、簡便かつ高い測定精度でNK細胞機能を検査する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、被験動物より採取された試料のNK細胞機能を簡便かつ高い測定精度で検査することができることを見出し、本発明を完成した。【００１２】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．以下の（１）〜（３）の工程を含む、又は（２）〜（３）の工程を含む、被験動物から採取された試料のナチュラルキラー細胞機能の検査方法：
（１）被験動物から採取された前記試料中の末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率を測定する工程；
（２）前記被験動物から採取された前記試料中の
ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のmRNA発現量、ナチュラルキラー細胞のサイトカインのmRNA発現量、及び
ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のmRNA発現量
からなる群から選択される少なくとも２つのmRNA発現量を測定する工程；
（３）（１）及び（２）の工程、若しくは（２）の工程で得られた、少なくとも３つの測定値を用いてNINKスコアを算出する工程であって、該NINKスコアは、複数の提供動物から採取された試料について測定された、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択される３以上の有限個のパラメーターを独立変数として重回帰分析して得られた数式により算出される、工程：
（ａ）末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率；
（ｂ）ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のmRNA発現量；
（ｃ）ナチュラルキラー細胞のサイトカインのmRNA発現量；
（ｄ）ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のmRNA発現量。
２．前記（ｂ）がナチュラルキラー細胞のNKp46のmRNA発現量を含み、
前記（ｃ）がナチュラルキラー細胞のIFN-γのmRNA発現量及びTNF-αのmRNA発現量を含み、
前記（ｄ）がナチュラルキラー細胞のGranzyme  BのmRNA発現量及びFasLのmRNA発現量を含む、
前項１に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
３．前記３以上の有限個のパラメーターが、以下の（ａ１）〜（ｃ１）のパラメーターを含む、前項１又は２に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法：
（ａ１）末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率；
（ｂ１）ナチュラルキラー細胞のNKp46のmRNA発現量；
（ｃ１）ナチュラルキラー細胞のIFN-γのmRNA発現量。
４．NINKスコアが以下の数式１により算出されるものである、前項１〜３のいずれか１に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法：
（数式１）NINKスコア＝ｄ＋ａ×[NK細胞比率（％）]＋ｂ×[NKp46mRNAレベル]＋ｃ×[IFN-γmRNAレベル]
〔ただし、数式１におけるａ，ｂ，ｃ，ｄはゼロでない任意の実数であり、[NK細胞比率（％）]は末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率、[NKp46mRNAレベル]はナチュラルキラー細胞のNKp46のmRNA発現量、[IFN-γmRNAレベル]はナチュラルキラー細胞のIFN-γのmRNA発現量である。〕
５．前記数式が、予め作成されている数式の独立変数に、被験動物より採取された試料より得られた測定値を加えて重回帰分析される、更新される数式である、前項１〜４のいずれか１に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
６．前記（１）〜（３）の工程を含む、前項１〜５のいずれか１に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
７．前記（１）及び（２）の工程における前記ナチュラルキラー細胞が、分離された後、保存されたものである、前項６に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
８．前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されたものである、前項７に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
９．被験動物および提供動物がヒトである、前項１〜８のいずれか１に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
１０．NINKスコア算出手段としてコンピューターを機能させる、ナチュラルキラー細胞機能の検査用プログラムであって、NINKスコア算出手段が、複数の提供動物から採取された試料について測定された、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択される３以上の有限個のパラメーターを独立変数として重回帰分析して得られた数式により算出するものである、ナチュラルキラー細胞機能の検査用プログラム：
（ａ）末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率；
（ｂ）ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のmRNA発現量；
（ｃ）ナチュラルキラー細胞のサイトカインのmRNA発現量；
（ｄ）ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のmRNA発現量。
１１．NINKスコア算出手段を備えた、ナチュラルキラー細胞機能の検査用装置であって、NINKスコア算出手段が、複数の提供動物から採取された試料について測定された、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択される３以上の有限個のパラメーターを独立変数として重回帰分析して得られた数式により算出するものである、ナチュラルキラー細胞機能の検査用装置：
（ａ）末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率；
（ｂ）ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のmRNA発現量；
（ｃ）ナチュラルキラー細胞のサイトカインのmRNA発現量；
（ｄ）ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のmRNA発現量。
１２．被験動物から採取された試料について、以下の（１１）及び（１２）の測定値を取得するための少なくとも３種以上の試薬を含む、NINKスコアを指標とするナチュラルキラー細胞機能の検査用試薬キット：
（１１）末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率；
（１２）ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のmRNA発現量、
ナチュラルキラー細胞のサイトカインのmRNA発現量、及び
ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のmRNA発現量
からなる群から選択される少なくとも２つのmRNA発現量。
１３．前項１〜９のいずれかに記載の検査方法により得られたNINKスコアをNK活性に換算する方法であり、予め作成された、末梢血単核細胞とナチュラルキラー細胞の標的細胞を用いて測定されたNK活性とNINKスコアとを変数とする回帰直線式に、被験動物について得られたNINKスコアを代入することによりNK活性を算出することを含む、NINKスコアをNK活性に換算する方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の検査方法により、被験動物から採取された試料のNK細胞機能を簡便に検査することができる。また本発明の検査方法は細胞の培養工程を必要としないことから、短時間かつ安価に検査を行うことができ、さらには測定間誤差が少なく測定精度の高い方法である。本発明の検査方法は、被験動物から採取された試料や試料から分離したNK細胞を用いる検査方法であり、凍結保存したNK細胞を用いて検査することも可能である。よって、被験動物から末梢血等の試料を採取する場所や、測定値を取得するタイミング等を柔軟に選択することができるようになり、広くNK細胞機能評価を行うことが可能となる。
また、標的細胞とする細胞が特定されていない等の理由で細胞培養によるNK活性が測定できない動物についても、本発明の検査方法によりNK細胞機能を検査することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】各被験者群から採取されたNK細胞のNKp46タンパク質発現量を確認した結果を示す図である。（参考例１）
【図２】提供者から採取された血液中のPBMC数に対するNK細胞数の比率、NKp46 mRNA発現量及びIFN-γ mRNA発現量をパラメーターとして重回帰分析した結果を示す図である。（実施例２）
【図３】NINKスコアと、NINKスコアを算出する各パラメーターについて、細胞培養によるNK活性との相関性を確認した結果を示す図である。（実施例２）
【図４】健常人、石綿曝露非担癌者、悪性中皮腫患者について、NINKスコアと細胞培養によるNK活性との関係を解析した結果を示す図である。（実施例２）
【図５】NK細胞内で発現しているmRNA量について、PCR法とQGP法による測定値の検量線を作成した結果を示す図である。（実施例３）
【図６】QGP法による測定値を用いる場合の、NINKスコアを算出する数式の構築の流れを示す図である。（実施例３）
【図７】QGP理論値を用いて算出したNINKスコアと、細胞培養によるNK活性との相関性を確認した結果を示す図である。（実施例３）
【図８】NK細胞のNKp46タンパク質発現量と、細胞培養によるNK活性との相関性を確認した結果を示す図である。（比較例１）
【図９】PBMCサンプルのNK活性を従来の生物学的手法により測定した場合の、同一サンプル間での測定誤差を検証した結果を示す図である。（比較例２）
【図１０】NINKスコアの同一サンプル間での再現性を、生物学的手法により測定したNK活性の値と比較して示す図である（実施例４）
【発明を実施するための形態】
【００１５】
NK細胞機能は、NK細胞数に代表される量的要素や、細胞死誘導に関わる多くの遺伝子産物の機能等の質的要素など多様な要素が複雑に関係していると考えられる。本発明はかかるNK細胞機能の検査が、３以上の有限個のパラメーターを用いて算出したNINKスコア（Non-Incubating  Natural  Killer  score）を指標とすることにより評価できることを見出したことに基づくものである。
【００１６】
本発明の検査方法、検査用プログラム、検査用装置および検査用試薬キットは、NINKスコアをNK細胞機能の指標（NK活性の指標）とする。NINKスコアは、複数の提供動物から採取された試料について測定された、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択される３以上の有限個のパラメーターを独立変数として重回帰分析して得られた数式により算出する。
（ａ）PBMC数に対するNK細胞数の比率
（ｂ）NK細胞のNK細胞活性化受容体のmRNA発現量
（ｃ）NK細胞のサイトカインのmRNA発現量
（ｄ）NK細胞の細胞死誘導因子のmRNA発現量
NINKスコアは、NK細胞あたりの機能を示す指標ではなく、試料全体のNK細胞機能を示す指標であり、NK細胞機能の量的要素と質的要素の両者を包含し、NINKスコアは被験動物が保持するNKの活性を反映する。
【００１７】
指標となるNINKスコアを算出する数式は、複数の提供動物から採取された試料中のPBMCについての測定値から導き出される。
本明細書において提供動物は、いかなる動物であってもよい。好ましくは、ヒトを含む哺乳動物である。ヒト以外の動物としては、例えば、ペット動物、動物園で飼育する動物、実験動物、家畜などが挙げられ、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等が挙げられる。より好ましくはヒトである。提供動物は、健常動物、健康診断受診動物（ヒトの場合人間ドック受診者であってもよい）、癌や感染症等の疾患の検査の対象動物であってもよい。また、癌や感染症等の疾患の有無の検査の対象動物、早期診断のための検査の対象動物、あるいは疾患のステージ、悪性度、治療効果の判定、予後診断などの検査の対象動物であってもよい。また、提供動物は被験動物であってもよい。
【００１８】
本明細書において試料とは、PBMCが含まれている試料である。例えば、血液、検査のために取得された組織、摘出された組織等が挙げられ、さらに血液や組織を処理または分画して得た試料（例えばPBMC）も本発明における試料に含まれる。試料からPBMCを調製する方法は、自体公知の方法によることができ、特に限定されない。例えば、血液から、密度勾配遠心分離法によりPBMC分離することができる。密度勾配遠心分離法ではリンパ球比重分離液（Ficoll-Paque）を用いることができる。
【００１９】
本明細書において、PBMC数に対するNK細胞数の比率とは、採取された試料中に含まれるPBMC数に対するNK細胞数の比率である。いかなる手法によって測定してもよいが、PBMCの細胞数とNK細胞数を計測することにより行われる。PBMCの細胞数の計測は、公知の手法により行うことができ、例えばフローサイトメーターを用いる方法、血球計算盤を用いる方法、自動セルカウンターを用いる方法が挙げられる。また、NK細胞数の計測は、PBMCからNK細胞を分離した後でも、分離する前でも行うことができる。NK細胞数の計測は、蛍光物質でNK細胞を染色して測定する方法、血球計算盤を用いる方法、自動セルカウンターを用いる方法によって計測することが可能である。蛍光物質を用いる場合は、蛍光標識した抗体とフローサイトメーターを用いて行うことができる。NK細胞を染色する抗体は、CD3、CD4、CD8、CD56等の細胞表面抗原を認識する抗体を使用することができる。一般的には、CD3抗原とCD56抗原に対する蛍光標識抗体での二重染色により、CD3陰性CD56陽性細胞（CD3-CD56+細胞）として区別することにより、NK細胞を検出することができる。PBMC中のNK細胞の比率としての測定値は百分率（%）で表され、NK細胞数／PBMC細胞数×100により算出することができる。より具体的には、PBMC中のNK細胞の比率は、PBMC中のCD3-CD56+細胞の百分率として表されることができる。また、PBMC中のNK細胞の比率は、フローサイトメーターを用いることにより、直接測定値を得ることも可能である。
【００２０】
NK細胞の分離（単離）は、いかなる方法によって行ってもよいが、NK細胞数の計測と同様にして、蛍光標識した抗体によりPBMCを染色して、フローサイトメーターを用いて分離することができる。その他、磁気細胞分離の手法を用いて、PBMCからNK細胞を迅速に分離することもできる。磁気細胞分離の手法は磁気ビーズを用いるものであり、例えばMACSシリーズ（Mitenyi Biotec, Inc.）やEasySepシリーズ（StemCell Technologies, Inc.）を用いることができる。NK細胞は、CD3、CD4、CD8、CD16、CD56等の細胞表面抗原に基づき分離されることが好ましく、具体的にはCD4-CD8-CD56+細胞として分離されたものを例示することができる。
【００２１】
本明細書において、NK細胞のNK細胞活性化受容体とは、NK細胞が産生するNK細胞活性受容体である。NK細胞活性化受容体は、NK細胞の細胞傷害活性を誘導する、NK細胞表面上に発現する受容体であればよい。例えば、NKG2 family、signaling lymphocytic activating molecule (SLAM) family、natural cytotoxicity receptor (NCR) family等が挙げられる。好ましいNK細胞の活性化受容体としては、natural cytotoxicity receptor （NCR）ファミリーに含まれる受容体が挙げられ、例えば、NKp46, NKp44 NKp30 である。さらに好ましくは、NKp46である。
【００２２】
本明細書において、NK細胞のサイトカインとは、NK細胞が産生するサイトカインであり、腫瘍細胞等の異常細胞の増殖を抑制し、炎症を惹起させる作用を有する。また前記サイトカインは、NK細胞の細胞傷害性を増強させるというポジティブフィードバック作用も有する。本発明において、NK細胞のサイトカインとしては、IFN-γやTNF-αが例示されるが、好ましくはIFN-γである。
【００２３】
本明細書において、NK細胞の細胞死誘導因子とは、NK細胞が産生する細胞死誘導因子であり、ターゲット細胞を直接攻撃し、アポトーシス等の細胞死を誘導する因子である。細胞死誘導因子としては、Granzyme  B、FasL及びパーフォリンが例示される。Granzyme  Bはセリンエステラーゼであり、パーフォリンが標的細胞に開けた穴からGranzyme  Bが標的細胞に侵入し、様々なプロカスパーゼを切断・活性化し、アポトーシスを誘導する。FasLはアポトーシスを誘導する因子として知られている。本発明において、NK細胞の細胞死誘導因子としては、Granzyme  B及びFasLが好ましく、Granzyme  Bがより好ましい。
【００２４】
NK細胞が産生する各NK活性関連分子のmRNA発現量は、好ましくは、分離されたNK細胞中（NK分画中）のmRNA量を測定する。本明細書において、NK活性関連分子とは、NK細胞のNK細胞活性化受容体、NK細胞のサイトカイン、又はNK細胞の細胞死誘導因子である。
NK活性関連分子のうち、NKp46を例に挙げると、タンパク質発現量はNK活性と負の相関を示しており（比較例１）、mRNA量とは異なる挙動を示す。本明細書においてmRNA発現量は、NK細胞の遺伝子の転写産物であるmRNA量を意味し、当業者に公知の任意の方法により測定することができる。NK細胞からのRNAの抽出は、当該技術分野において通常用いられる手法を用いて行えばよい。またmRNA量の測定は、公知の方法から適宜選択して用いることができ、RT-PCR法、リアルタイムRT-PCR法、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、RNアーゼプロテクションアッセイ法、QuantiGene Plex法（QGP法）等が挙げられる。QGP法であれば、mRNAをNK細胞から抽出せずに、細胞を可溶化するだけでmRNAを簡単に定量することができる。mRNA発現量の測定値は、内部標準遺伝子のmRNA発現量に対する各NK活性関連分子遺伝子のmRNA発現量（相対的発現量：例えば、リアルタイムPCR法ではdCT値）として得ることができる。また、かかる相対的発現量を対数変換した値（log10変換値）を測定値として用いることができる。
【００２５】
NINKスコアを算出するためには、上記（ａ）〜（ｄ）から選択される３以上の有限個のパラメーターを用いる。（ｂ）〜（ｄ）に含まれるNK活性関連分子は数多く存在し、パラメーターの個数は、感度および特異度を上げるために３個以上選択されることが好ましい。また、検査の煩雑さと感度および特異度の観点から、パラメーターの個数は、１０個以下が好ましく、８個以下がより好ましく、６個以下がさらに好ましく、５個以下であることがさらに好ましい。
【００２６】
NINKスコアは、上記の（ａ）〜（ｄ）から選択される３以上の有限個のパラメーターを独立変数として、従来の細胞培養により計測されるNK活性を従属変数として、重回帰分析して得られる数式により算出される。前記数式は、フリーのソフトウェアや市販されているソフトウェアを用いて式を作成することができる。
【００２７】
従属変数として用いられる従来の細胞培養によるNK活性は、エフェクター細胞であるPBMCとターゲット細胞とを共培養して、ターゲット細胞の損傷により生じる変化を細胞傷害活性として測定する方法であれば、いかなる手法によって測定したものであってもよい。ターゲット細胞の損傷により生じる変化としては、ターゲット細胞によるL-乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出や、51Cr放出が挙げられる。LDH量による細胞傷害活性の評価はLDHアッセイとして知られている。51Cr放出法は、ターゲット細胞を予めクロミウム（Na251CrO4）で標識しておき、エフェクター細胞と共培養後に、培養上清中に放出された遊離のクロミウムの放射活性をガンマーカウンターで測定する方法である。また、予め特定の蛍光物質を取り込ませて標識したターゲット細胞に、エフェクター細胞を加えて共培養を行い、その後死細胞に取り込まれる蛍光標識により染色を行い、フローサイトメトリーによって死細胞数を測定することにより、細胞傷害活性を測定する方法を用いることができる。
【００２８】
細胞培養によるNK活性の測定にて用いられるターゲット細胞は、特に限定されないが、K562細胞、HL-60細胞、Daudi細胞等が挙げられる。例えば、K562細胞（RCB0027）はヒト白血病細胞で、Lozzio CB.らによって樹立され（Blood. 1975;45:321-334）、RIKEN CELL BANKにて入手可能である。HL-60細胞（CCL-240）は急性前骨髄球性白血病患者由来の細胞株でありATCCにて入手可能である。Daudi細胞（RCB1640）は、ヒトバーキットリンパ腫由来の細胞株であり、RIKEN CELL BANKにて入手可能である。また、マウスのNK活性の測定方法としては、例えば、ターゲット細胞としてYAC-1細胞を用い、エフェクター細胞としてマウス脾臓細胞を用いる方法が挙げられる。また、エフェクター細胞とターゲット細胞との比（E:T比）は特に限定されないが、３：１〜４０：１（E/T比は３〜４０に相当）が例示される。共培養は２〜８時間行うことが好ましい。
【００２９】
また、重回帰分析に用いるパラメーターは次のようにして選別することができる。まず、従来の細胞培養によるNK活性が高い値を示す提供動物もしくは高い値を示すと予測される提供動物（以下単に「NK活性が高い提供動物」と称する）、及び、低い値を示す提供動物もしくは低い値を示すと予測される提供動物（以下単に「NK活性が低い提供動物」と称する）を含む提供動物群を構築する。NK活性が高い提供動物は、例えば健常人や自己免疫性疾患患者が例示される。NK活性が低い提供動物は、例えば癌患者や高齢者等が例示される。NK活性が高い提供動物及びNK活性が低い提供動物を含む被験動物群から採取した末梢血について、細胞培養によるNK活性を測定するとともに、上記（ａ）〜（ｄ）の測定値を取得する。NK活性を従属変数とし、各種測定値を独立変数として重回帰分析を行うことにより、各パラメーターのNK活性への影響度を算出し、影響度の高い独立変数をパラメーターとして選択し、及び、それらの組み合わせを選択する。また、選択したパラメーターについて、数式（以下、重回帰式ともいう）における係数および決定項（定数）を設定することができる。また、重回帰式により得られるNINKスコアについて、カットオフ値を設定することもできる。設定したカットオフ値を用いて、例えば健常人被験者群を高NINKスコア群と低NINKスコア群に群分けし、後者を低NK細胞機能保持者として判別することもできる。
【００３０】
NINKスコアを算出するための好ましいパラメーターとしては、少なくとも上記（ａ）のパラメーターを含む。さらに好ましくは、少なくとも上記（ａ）及び上記（ｂ）のパラメーターを含む。より好ましくは、少なくとも上記（ａ）〜上記（ｃ）のパラメーターを含む。
さらに好ましいパラメーターは、少なくとも以下の（ａ１）及び（ｂ１）のを含む。より好ましいパラメーターは、少なくとも以下の（ａ１）〜（ｃ１）を含む。
（ａ１）PBMC数に対するNK細胞数の比率
（ｂ１）NK細胞のNKp46のmRNA発現量
（ｃ１）NK細胞のIFN-γのmRNA発現量
【００３１】
NINKスコアを算出するための数式（重回帰式）は、以下の数式１に示されるものが好ましい。
（数式１）NINKスコア＝ｄ＋ａ×[NK細胞比率（％）]＋ｂ×[NKp46mRNAレベル]＋ｃ×[IFN-γmRNAレベル]
〔ただし、数式１におけるａ，ｂ，ｃ，ｄはゼロでない任意の実数であり、[NK細胞比率（％）]はPBMC数に対するNK細胞数の比率、[NKp46mRNAレベル]はNK細胞のNKp46のmRNA発現量、[IFN-γmRNAレベル]はNK細胞のIFN-γのmRNA発現量である。〕
【００３２】
数式１におけるａ，ｂ，ｃ，ｄの具体的な値は、重回帰分析により設定されたものであればよい。例えば、以下の数式２の値が例示される。
（数式２）NINKスコア=52.278+0.852×[NK細胞比率（％）]+15.072×[NKp46 mRNAレベル]+9.585×[IFN-γmRNAレベル]
なお上記ａ，ｂ，ｃ，ｄのうち、ｄは各パラメーターの具体的な測定方法や、測定値の表現方法により、変動すると考えられる。例えば、NK細胞内のmRNAの発現量として、リアルタイムRT-PCR法ではなく、QGP法を用いた場合は、以下の数式３を用いることができる。
（数式３）NINKスコア=-22.362+0.852×[NK細胞比率（％）]+15.072×[NKp46 mRNAレベル]+9.585×[IFN-γmRNAレベル]
【００３３】
本発明の検査方法は、被験動物から採取された試料のNK細胞機能の検査方法であって、以下の（１）〜（３）の工程、または、（２）〜（３）の工程を含む。
（１）被験動物から採取された試料中のPBMC数に対するNK細胞数の比率を測定する工程；
（２）前記被験動物から採取された前記試料中の
NK細胞のNK細胞活性化受容体のmRNA発現量、
NK細胞のサイトカインのmRNA発現量、及び
NK細胞の細胞死誘導因子のmRNA発現量
からなる群から選択される少なくとも２つのmRNA発現量を測定する工程；
（３）（１）及び（２）から選択される少なくとも１つの工程で得られた少なくとも３つの測定値を用いてNINKスコアを算出する工程
【００３４】
本明細書において被験動物は、検査対象となる動物であればいかなる動物であってもよい。好ましくは、ヒトを含む哺乳動物である。ヒト以外の動物としては、例えば、ペット動物、動物園で飼育する動物、実験動物、家畜などが挙げられ、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等が挙げられる。より好ましくはヒトである。被験動物は健常動物、健康診断受診動物（ヒトの場合人間ドック受診者であってもよい）、癌や感染症等の疾患の検査の対象動物であってもよい。また、癌や感染症等の疾患の有無の検査の対象動物、早期診断のための検査の対象動物、あるいは疾患のステージ、悪性度、治療効果の判定、予後診断などの検査の対象動物であってもよい。
また、被験動物と前記提供動物とは異なる動物種であっていてもよい。標的細胞とする細胞が特定されていない等の理由で細胞培養によるNK活性が測定できない動物については、ヒトや実験動物で得られたNINKスコアを算出する数式を外挿して、NINKスコアを推定することができる。
【００３５】
本発明では、被験動物から採取された試料を検査の対象とする。試料としてはPBMCが含まれている試料であればよい。例えば、血液、検査のために取得された組織、摘出された組織等が挙げられ、さらに血液や組織を処理または分画して得た試料も本発明における試料に含まれる。
被験動物から採取した試料からPBMCを調製する方法は、上述の提供動物から採取された試料からPBMCを調製する方法と同様である。
また、被験動物から採取した試料からNK細胞を分離する方法も、上述の提供動物から採取された試料からPBMCを調製する方法と同様である。
【００３６】
試料から分離されたNK細胞を用いて比率又はmRNA発現量を測定する場合、分離された直後のNK細胞が用いられてもよく、また、分離された後保存されたNK細胞が用いられてもよい。NK細胞の保存方法は、mRNA発現量の確認が可能な保存方法であればいかなる手法であってもよく、好ましくは凍結保存である。
【００３７】
本発明の検査方法の工程（１）のPBMC数に対するNK細胞数の比率を測定する工程は、被験動物から採取された試料中に含まれるPBMC数に対するNK細胞数の比率を測定する工程である。比率の測定方法は上述した通りである。
【００３８】
本発明の検査方法の工程（２）では、
NK細胞のNK細胞活性化受容体のmRNA発現量、
NK細胞のサイトカインのmRNA発現量、及び
NK細胞の細胞死誘導因子のmRNA発現量
からなる群から選択される少なくとも２つのmRNA発現量を測定する。
【００３９】
本発明の検査方法におけるNK細胞のNK細胞活性化受容体、NK細胞のサイトカイン、及びNK細胞の細胞死誘導因子については、上述した通りである。
【００４０】
本発明の検査方法におけるmRNA発現量についても上述した通りであり、mRNA発現量の測定方法も上述した通りである。
【００４１】
本発明の検査方法の工程（３）では、（１）及び（２）から選択される少なくとも１つの工程で得られた少なくとも３つの測定値を用いてNINKスコアを算出する。
本発明の検査方法に工程（１）を含む場合は、工程（１）で得られる測定値は１つであるので、工程（２）から少なくとも２つの測定値を得てNINKスコアを算出する。
本発明の検査方法に工程（１）を含まない場合、工程（２）から少なくとも３つの測定値を得てNINKスコアを算出する。
NINKスコアを算出する数式が予め設定されている場合には、該数式のパラメーターに合致させて、測定対象を選択することができる。
NINKスコアを算出する数式を被験動物の測定値により更新する場合には、少なくとも３つの測定値を得る。検査の煩雑さと、感度および特異度の観点から３〜１０の測定値を得ることが好ましく、８以下がより好ましく、６以下がさらに好ましく、５以下であることがさらに好ましい。
【００４２】
本発明の検査方法は、好ましくは（１）の工程を含む。より好ましくは、NK細胞のNK細胞活性化受容体のmRNA発現量を測定する工程をさらに含む。さらに好ましくは、NK細胞のサイトカインのmRNA発現量を測定する工程をさらに含む。
また、本発明検査方法は、好ましくは、少なくとも以下の（１１）及び（２１）の工程を含む。さらに好ましくは、少なくとも以下の（１１）（２１）及び（２２）の工程を含む。
（１１）被験動物から採取された試料中のPBMC数に対するNK細胞数の比率を測定する工程
（２１）被験動物から採取された試料中のNK細胞のNKp46のmRNA発現量を測定する工程
（２２）被験動物から採取された試料中のNK細胞のIFN-γのmRNA発現量を測定する工程
【００４３】
本発明の検査方法のNINKスコアを算出するための数式（重回帰式）は、予め作成されている数式の独立変数に、被験動物より採取された試料より得られた測定値を加えて重回帰分析される、更新される数式であってもよい。このとき、該被験動物は、被験動物であり提供動物でもある。
一旦数式が作成されたとしても、追加で、被験動物から採取されたPBMCを用いて、細胞培養によりNK活性を測定し、さらに、各パラメーターに対応する測定値を取得し、取得された測定値を含めて重回帰分析を行うことにより、パラメーターの選択、重回帰式における係数や決定項の設定、カットオフ値を随時更新し、NINKスコアを算出するための数式を更新することができる。更新は、被験動物から採取された試料の検査を行うときに、同時に行っても良い。
【００４４】
本発明のNK細胞機能の検査用試薬キットは、被験動物から採取された試料中のPBMCについて、以下の（１３）及び（２３）の測定値を取得するための少なくとも３種以上の試薬を含む。
（１３）末梢血単核細胞数に対するNK細胞数の比率；
（２３）NK細胞のNK細胞活性化受容体のmRNA発現量、NK細胞サイトカインのmRNA発現量、及び、NK細胞の細胞死誘導因子のmRNA発現量からなる群から選択される少なくとも２つのmRNA発現量。
前記少なくとも３種以上の試薬により、PBMCについての３以上のパラメーターに対応する測定値を取得することができる。前記少なくとも３種以上の試薬は、PBMCの細胞数を計測するための試薬、NK細胞の細胞数を計測するための試薬、NK細胞活性化受容体のmRNA検出用試薬、NK細胞のサイトカインのmRNA検出用試薬、NK細胞の細胞死誘導因子のmRNA検出用試薬から選択される。
【００４５】
PBMCの細胞数を計測するための試薬、又は、NK細胞の細胞数を計測するための試薬は、各細胞の細胞表面抗原に結合し得る抗体を含むものである。細胞表面マーカーに結合し得る抗体は、自体公知の抗体であってもよいし、既存の一般的な製造方法によって製造した抗体や市販の抗体を用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。抗体は、標識物質により標識されていてもよい。標識物質は、具体的には、酵素、放射性同位元素、蛍光色素、ビオチン、染料ゾルおよび金コロイドやラテックス粒子等の不溶性担体を用いることができる。また、標識は公知の方法で行うことができるが、標識物質は抗体に結合させていてもよい。上記抗体は試薬（試薬組成物）として本発明の検出用試薬キットに含まれる。抗体を含む試薬は、生理食塩水、緩衝液等で希釈した状態、又は凍結乾燥形態等の長期間保存可能な試薬が例示される。抗体に、添加剤（例えば担体、賦形剤、希釈剤等）、安定化剤等を含有する溶液に溶解した後、凍結乾燥されて試薬が調製されていてもよい。安定化剤としては、グルコース等の単糖類、サッカロース、マルトース等の二糖類、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール、塩化ナトリウム等の中性塩、グリシン等のアミノ酸、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（プルロニック）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（トゥイーン）等の非イオン系界面活性剤、ヒトアルブミン等が例示され、1〜10w/v%程度が添加されていることが好ましい。また本発明の検出用試薬キットには、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液等が含まれていてもよい。また、PBMCの細胞数を計測するための試薬、又は、NK細胞の細胞数を計測するための試薬は、血液から各種表面抗原の発現に基づき、PBMCやNK細胞を分離するために用いることもできる。
【００４６】
NK細胞のNK細胞活性化受容体のmRNA検出用試薬、NK細胞のサイトカインのmRNA検出用試薬、又は、NK細胞の細胞死誘導因子のmRNA検出用試薬は、各種遺伝子の発現を検出し得るポリヌクレオチドを含むものである。本明細書において、ポリヌクレオチドは塩基・糖・リン酸からなるヌクレオチドが２以上リン酸エステル結合した生体高分子を指し、DNAおよびRNA等の核酸を含む。本発明のポリヌクレオチドは、8ヌクレオチド（塩基）以上、10ヌクレオチド（塩基）以上、15ヌクレオチド（塩基）以上、17ヌクレオチド（塩基）以上、又は20ヌクレオチド（塩基）以上の長さを有するものである。当該ポリヌクレオチドは特定のmRNAに特異的にハイブリダイズし得るプローブ、特定のmRNAに特異的にアニーリングし得るプライマー、当該プライマーと対になって核酸断片を増幅し得るプライマーとして機能するものである。当該ポリヌクレオチドの塩基配列は、発現を検出する遺伝子の塩基配列に100%相補的な配列である必要はなく、１塩基〜５塩基ほど（好ましくは１〜４塩基ほど、より好ましくは１〜２塩基ほど）欠失していてもよいし、相補的でない塩基が置換、挿入又は付加されていてもよい。また、ポリヌクレオチドがプライマーである場合は17〜25ヌクレオチド程度とすることが好ましく、プローブである場合は8〜40ヌクレオチド程度とすることが好ましく、10〜30ヌクレオチド程度とすることがより好ましい。プライマーは、一対のプライマーセットとして本発明の検出用試薬キットに含まれてもよい。
【００４７】
プライマー及びプローブは、公知のプライマー又はプローブ設計ソフトウェアを用いて設計することができる。公知のソフトウェアとしては例えば、OLIGO  Primer  Analysis  Software（Molecular  Biology  Insights社）、Beacon  Designer（PREMIER  Biosoft社）、Primer  Expressソフトウェア（ライフテクノロジーズ社）、Primer3web version 4.0.0 Pick primers from a DNA sequence（http://bioinfo.ut.ee/primer3/）等を利用することができる。またポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるDNA自動合成装置を利用して合成することができる。上記ポリヌクレオチドは、乾燥した状態もしくはアルコール沈澱の状態で、固体の試薬として、又は、水、生理食塩水、もしくは適当な緩衝液（例：TE緩衝液等）中に溶解した状態の試薬として本発明の検出用試薬キットに含まれることもできる。試薬には、添加剤（例えば担体、賦形剤、希釈剤等）、安定化剤等が含有されていてもよい。安定化剤の具体例は上述の通りである。また、本発明の検査用試薬キットには、核酸増幅反応に必要な試薬、例えば、DNA合成酵素、緩衝液、dNTPミックスや、インターカレーター、塩化マグネシウム等が含まれていてもよい。インターカレーターは、PCR法等の核酸増幅反応による増幅産物を染色することにより、増幅産物の有無を検出することができる。インターカレーターとしては、エチジウムブロマイド、Sybergreenなどが例示される。またリアルタイムPCRによる増幅産物の検出のために、蛍光物質等で標識されたポリヌクレオチドが本発明の検査用試薬キットに含まれていてもよい。
【００４８】
各種抗体又はポリヌクレオチドの具体例は、後述する実施例に記載のものが挙げられる。
【００４９】
本発明のNK細胞機能の検査用プログラムは、NINKスコア算出手段としてコンピューターを機能させる。当該NINKスコアは、複数の提供動物から採取された試料について測定された、上記（ａ）〜（ｄ）から選択された３以上の有限個のパラメーターを独立変数として重回帰分析して得られた数式により算出される。本発明のプログラムには、提供動物から採取したPBMCについての測定値を解析するデータ解析手段を有していてもよい。また本発明の検査用プログラムは、測定値を記憶させるための記憶手段を有していてもよい。また、提供動物から採取したPBMCを用いて取得された各種測定値を分析することにより、重回帰式にて独立変数として使用する３以上の有限個のパラメーターを選別する選別手段を有していてもよい。さらに、被験動物より採取された試料より得られた測定値を、記憶されている提供動物からの測定値に加えて重回帰分析の独立変数とし、数式（重回帰式）を作成もしくは更新する、作成手段もしくは更新手段を有していてもよい。さらに、数式（重回帰式）を用いて得られた結果とカットオフ値に基づき、NINKスコアの高低を判定するための判定手段を有していてもよい。
【００５０】
本発明のNK細胞機能の検査用装置は、NINKスコア算出手段を備える。NINKスコア算出手段は、複数の提供動物から採取された試料について測定された、上記（ａ）〜（ｄ）から選択された３以上の有限個のパラメーターを独立変数として重回帰分析して得られた数式により算出する。本発明の検査装置には、提供動物から採取したPBMCについての測定値を解析するデータ解析手段を備えていてもよい。また本発明の検査用装置は、被験動物から採取された試料について、以下の（１）または（２）を測定するための測定手段を備えていてもよい。
（１）被験動物から採取された試料中の末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率；
（２）被験動物から採取された試料中の
ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のmRNA発現量、ナチュラルキラー細胞のサイトカインのmRNA発現量、及び
ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のmRNA発現量。
さらに、得られた測定値を入力するための入力手段、測定値を記憶させるための記憶手段を備えていてもよい。また、重回帰式にて独立変数として使用する３以上の有限個のパラメーターを選別する選別手段を備えていてもよい。さらに、被験動物より採取された試料より得られた測定値を、記憶されている提供動物からの測定値に加えて重回帰分析の独立変数とし、数式（重回帰式）を作成もしくは更新する、作成手段もしくは更新手段を備えていてもよい。さらに、数式（重回帰式）を用いて得られた結果とカットオフ値に基づき、NINKスコアの高低を判定するための判定手段、又は、上記判定手段に基づく判定結果を示すための表示手段を備えていてもよい。さらに、得られたNINKスコアからNK活性を算出する手段、NK活性を表示する手段を備えていてもよい。
【００５１】
本発明の検査方法、検査用試薬、検査用プログラム、および検査用装置は、１つのバイオマーカーによるものではなく、マルチマーカーによる検査を主体としたものであり、被験動物のNK細胞機能を高い測定精度で良好に反映することができる。これにより、被験動物について、各種疾患の発症・進展の危険度、治療効果の判定、予後診断などを行うことができる。本発明のNINKスコアは、NK細胞の細胞傷害性以外の抗がん免疫に寄与する因子であるサイトカイン遺伝子発現レベルを内包しており、NK細胞機能を適切に表していると考えられる。さらに、本発明のNINKスコアは、加齢と負の相関性を示すことが確認されている。NK細胞機能の老化指標は未だ確立されていないが（Immun  Ageing  2013;  10  (1):  19）、本発明のNINKスコアによれば、疾患に限らず加齢によるものも含めてNK細胞機能を検査できるという利点を有する。
【００５２】
なお、本発明のNINKスコアは、標的細胞を用いて測定する従来のNK活性と高い相関性を有しているので、被験動物について得られたNINKスコアをNK活性に換算することも有利に実施することができる。例えば、後述の実施例２で示すように複数のPBMCサンプル（標品）を用いて得られたNINKスコアと標的細胞を用いて得られるNK活性とを変数として相関係数を計算し、計算した相関係数を用いて、常法により、予め回帰直線式を作成しておき、被験動物のPBMCサンプルを用いて得られたNINKスコアを該回帰直線式に代入し、NK活性に換算することができる。従って、本発明のNINKスコアは、高い測定精度を示すだけでなく、回帰直線式から得たNK活性換算値をNINKスコアに基づくNK活性の代替指標とすることが可能であり、より正確なNK細胞機能指標として各種疾患の発症・進展の危険度、治療効果の判定、予後診断などを行うためのツールとして用いることができる。
【実施例】
【００５３】
本発明の理解を助けるために以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものでない。【００５４】
（参考例１）
川崎医科大学・同附属病院、岡山労災病院および兵庫医科大学病院の倫理委員会の承認を得て、合計79例（健常人（HV）20名、石綿曝露非担癌者（PL）13名、悪性中皮腫患者（MM）24名、強皮症患者（SSc）22名）から、血液を採取した。採取した血液を用いて、PBMCをFicoll密度勾配遠心分離法によって単離した。なお、石綿曝露非担癌者とは、石綿曝露が確認されているが、腫瘍形成が確認されていない者である。【００５５】
得られたPBMCを、常法に従って抗体により染色した後、フローサイトメーター（FACS Calibur、BD Biosciences社製）にて蛍光強度を測定して、CD3-CD56+細胞（NK細胞）について、細胞表面マーカー（Cell  surface  markers（Surface  molecules））であるNKp46のタンパク質発現を確認した。【００５６】
CD56陽性の確認には、CD56に対するモノクローナル抗体を用いて染色してNK細胞を分画した。用いた抗体は以下の通りである。
＜抗体リスト＞
BD Pharmingen    FITC Mouse Anti-Human CD3（抗CD3抗体）
BD Pharmingen    PE-Cy5 Mouse Anti-Human CD56（抗CD56抗体）
BECKMAN COULTER    Anti-CD335 (NKp46) (Human) mAb-PE（抗NKp46抗体）【００５７】
結果を図１に示す。健常者と強皮症患者においては、NKp46のタンパク質発現量が高く、石綿曝露非担癌者、悪性中皮腫患者では発現量が低い傾向が確認された。【００５８】
（実施例１）  各種パラメーターの測定値の取得
参考例１と同様に岡山労災病院および兵庫医科大学病院の倫理委員会の承認を得て、健常者群20名、胸膜プラーク患者群13名、悪性中皮腫患者群24名、その他の疾患患者（強皮症患者及び珪肺患者）群42名の計４群から血液を採取し、以下に示すパラメーターについて、測定値を取得し、解析を行った。
・PBMC中のNK細胞比率（％）
・NKp46 mRNA レベル
・Granzyme B mRNA レベル
・FasL mRNA レベル
・TNF-α mRNA レベル
・IFN-γ mRNA レベル【００５９】
また同じ血液を用いて、末梢血単核細胞（PBMC）をFicoll密度勾配遠心分離法によって単離した。得られたPBMCを、常法に従って抗体により染色した後、フローサイトメーター（FACS Calibur、BD Biosciences社製）にてPBMC中のCD3-CD56+細胞（NK細胞）を検出し、PBMC中のNK細胞比率（％NK細胞）を計測した。【００６０】
また同様にして得られたPBMCについて、抗体により染色した後、フローサイトメーター（FACS Aria、BD Biosciences社製）にて蛍光強度を測定して、CD4-CD8-CD56+細胞（NK細胞）を分画し、細胞数を計測した。分画したNK細胞群について、各種mRNA発現量を測定した。mRNA発現量の測定はリアルタイムPCRを用いて常法に従って行った。【００６１】
CD3陰性、CD4陽性、CD8陽性、及びCD56陽性の確認には、それぞれCD3、CD4、CD8及びCD56に対するモノクローナル抗体を用いた。RNAの抽出にはRNA抽出キットとしてRNeasy mini Kit（Qiagen）を用い、cDNAの合成にはcDNA合成キットであるPrime Script(R)II 1st strand cDNA Synthesis kit（TaKaRa）を用い、遺伝子発現を観察した。膜表面分子の検出に用いた抗体は以下の通りである。
＜抗体リスト＞
BD Pharmingen    FITC Mouse Anti-Human CD3（抗CD3抗体）
BD Pharmingen    PE Mouse Anti-Human CD56（抗CD56抗体）
BD Pharmingen    Anti-CD4 (Human) mAb-FITC（抗CD4抗体）
BECKMAN COULTER    Anti-CD8beta (Human) mAb-PC5（抗CD8抗体）【００６２】
mRNA発現量の測定は、Sybergreen を用いてMx3000P QPCR System（Agilent Technologies, Inc.）によりリアルタイムPCR法を用いて行った。リアルタイムPCR法にて用いたプライマーは、オープンソースのネットサービス：Primer3web version 4.0.0 Pick primers from a DNA sequence（http://bioinfo.ut.ee/primer3/）を利用して設計し、北海道システム・サイエンス社に委託して調製した。用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
NKp46         F(5'- 3')  CAGTGAAGCTCCTGGTCACA（配列番号１）
R(5'- 3')  CTTCCCAAGTGGAAGCTCTG（配列番号２）
Granzyme B    F(5'- 3')  TCCCTGTGAAAAGACCCATC（配列番号３）
R(5'- 3')  TTCGCACTTTCGATCTTCCT（配列番号４）
IFN-γ         F(5'- 3')  TGACCAGAGCATCCAAAAGA（配列番号５）
R(5'- 3')  CTCTTCGACCTCGAAACAGC（配列番号６）
TNF-α         F(5'- 3')  TGTTCCTCAGCCTCTTCTCC（配列番号７）
R(5'- 3')  TTATCTCTCAGCTCCACGCC（配列番号８）
FasL          F(5'- 3')  CTGGTTGCCTTGGTAGGATT（配列番号９）
R(5'- 3')  TTCATTGATCACAAGGCCAC（配列番号１０）
なお、mRNAレベルは、GAPDH  mRNAの発現量を対照とした相対的発現量（dCT値）のlog10変換値にて表した。【００６３】
（実施例２）  各種パラメーターについての重回帰分析
実施例１により得られたNK活性関連分子の測定値について、網羅的に重回帰分析を行った。重回帰分析はSPSS version 22（IBM社）を用いて行った。被験者群から取得した測定値を用いて、NK活性を算出するための解析を行った。【００６４】
（１）細胞培養を用いたNK活性の測定
NK活性は、株式会社エスアールエルに測定を依頼した。得られた測定結果は、エスアールエル指定の容器に採血した末梢血よりリンパ球比重液で分離したPBMCをエフェクターとし、E/T比を20でK562細胞を標的細胞とし、51Cr遊離法で測定した結果である。【００６５】
（２）上記（１）にて取得したNK活性を従属変数とし、実施例１にて取得した各種パラメーターの測定値を独立変数として、重回帰分析をステップワイズ法により実行した。３項目を独立変数として選択し、以下の数式２をNK活性スコアを算出する式（重回帰式）として構築した（図２）。
〔数式２〕NINK score=52.278＋0.852×[NK細胞比率（％）]＋15.072×[NKp46  mRNAレベル]＋9.585×[IFN-γ  mRNAレベル]【００６６】
各パラメーター及びNINKスコアと、細胞培養によるNK活性との相関係数を表１に示す。これらの結果をグラフに表したものを、図３に示す。
【表１】
2017213249.tif 000003
なお表１及び図３中、「NK」はNK細胞比率（％）、「NK_NKp46」はNKp46  mRNAレベル、「NK_IFNg」はIFN-γ  mRNAレベル、「ET20_NK」は細胞培養によるNK活性、「PCR_NINK」はNINKスコアを意味する。【００６７】
本数式２により算出されるNINKスコアは、NK活性と正の相関性（相関係数：0.668、有意確率＜0.001）を示し、その相関性はNINKスコアに包含される各パラメーターの測定値とNK活性との相関性よりも高値であった（NK細胞%：0.341、NKp46mRNA量：0.405、IFN-γmRNA量：0.240）。
また悪性中皮腫患者のNINKスコアが低く、逆に石綿曝露非担癌者が高いNINKスコアを示した（図４）。NINKスコアは年齢と負の相関性（相関係数：-0.233、有意確率＜0.05）を示し、NINKスコアに包含される各パラメーターは年齢との相関性が見られなかった。【００６８】
（実施例３）  各種パラメーターについての重回帰分析２
NK細胞内のmRNA量の測定に、QuantiGene  Plex（QGP法）（Affymetrix eBioscience）を用いた場合でも、NINKスコアの算出が可能であるか、検討した。【００６９】
まず、QGP法の測定値とリアルタイムPCR法による発現量の測定値とが一致するか否かを確認するために、検量線を作成した。検量線の作成のために、健常人末梢血由来PBMCより単離したCD4+CD8-細胞、CD4-CD8+細胞、及びCD4-CD8-CD56+細胞、並びにPMAとionomycin刺激下で１日培養した前述の３細胞を用いて、QGP法及びリアルタイムPCR法を用いてmRNAの発現量を解析し測定値を得た。リアルタイムPCR法は、実施例２と同様の手法により行い、dCT値を測定値とした。QGP法ではGAPDHを内部標準とし測定された各遺伝子mRNA量に由来する蛍光強度から標準化後蛍光強度を算出し、これを測定値とした。なおQGP法には、Affimetrix eBioscience Inc.の製品コード  QGP-390000-109、製品名QuantiGene Plex 2.0 Plex Set (MAG), 9 plexを用いた。また、リアルタイムPCR法は、実施例２と同様の方法で行った。リアルタイムPCR法に用いたPRF1プライマーは、以下の通りである。
PRF1          F(5'- 3')  CAACTTTGCAGCCCAGAAGA（配列番号１１）
R(5'- 3')  GGGTGCCGTAGTTGGAGATA（配列番号１２）【００７０】
QGP法及びリアルタイムPCR法による測定値を用いて検量線を作成したところ、良好に検量線を作成することができ、両者の結果が一致することがわかった（図５）。なお、図５中「IFNG」と示すグラフはIFN-γ、「GZMB」と示すグラフはGranzyme  B、「PRF1」と示すグラフはパーフォリンの検量線を示す。図５にて作成した検量線を用いて、実施例２にてリアルタイムPCR法により得られたdCT値から、被験者由来のNK細胞の各パラメーターのQGP測定値の理論値（QGP理論値）を算出した。得られたQGP理論値を用いてNINKスコアを算出するための数式の構築を試みた（図６）。QGP理論値は、実施例２にて得たPCRのdCT値より算出し、QGP理論値のlog10変換値をNINKスコアの算出に用いた。その結果、決定項を調整することにより、QGP理論値を代入してNINKスコアを算出可能であることがわかった。決定項を調整した数式３を以下に示す。
（数式３）NINK score=-22.362+0.852×[NK細胞比率（％）]+15.072×[NKp46 mRNAレベル]+9.585×[IFN-γmRNAレベル]【００７１】
数式３に、PBMCのQGP理論値を代入して得られるNINKスコアを算出したところ、図７及び下記の表２に示すように、リアルタイムPCR法を用いた場合と同様に、細胞培養によるNK活性と良好に相関することがわかった。
【表２】
2017213249.tif 000004
なお図７中、「ET20_NK」は細胞培養によるNK活性、「QGP_NINK」は決定項を調整した数式３にQGP理論値を代入して算出したNINKスコアを意味する。【００７２】
（比較例１）  NKp46タンパク質の細胞表面発現量の確認
実施例１と同様にして得たPBMCを、常法に従って抗体により染色した後、フローサイトメーター（FACS Calibur、BD Biosciences社製）にて蛍光強度を測定して、CD3-CD56+細胞（NK細胞）について、細胞表面マーカー（Cell  surface  markers（Surface  molecules））のNKp46タンパク質発現量を確認した。用いた抗体は以下の通りである。
＜抗体リスト＞
BD Pharmingen    FITC Mouse Anti-Human CD3（抗CD3抗体）
BD Pharmingen    PE Mouse Anti-Human CD56（抗CD56抗体）
BECKMAN COULTER    Anti-CD335 (NKp46) (Human) mAb-PE（抗NKp46抗体）【００７３】
NK細胞のNKp46タンパク質発現量と、NK活性との相関を確認した結果を図８に示す。NK活性は、実施例２（１）にて株式会社エスアールエルに依頼をして測定した結果である。図８に示すとおり、両者は負の相関係数を示すことがわかった。【００７４】
（比較例２）  ターゲット細胞を用いて測定したNK活性の測定誤差の検証
健常人末梢血より末梢血単核球（PBMC）を分離し細胞濃度を調整した上で、４つのチューブに均等に分け、PBMCサンプルを調製した（PBMCチューブID：Tube-1, Tube-2, Tube-3, Tube-4）。PBMCサンプルをエフェクター（E）としてターゲット細胞（T）であるK562細胞とE/T比を20, 10, 5として混合した。96 well U底培養プレートで5%CO2濃度、37℃で4時間インキュベートした。なお、K562細胞は同一ディッシュより維持培養系列を2系統作製し、さらに直前の予備培養時細胞濃度を2種類作製することでディッシュを4種類（K562細胞予備培養ID：K562-1, K562-2, K562-3, K562-4）準備した。４つのチューブのPBMCサンプルとのインキュベーションに用いた。またK562細胞は蛍光色素DiOで染色しインキュベーションに用いた。4時間後、細胞を回収し、ヨウ化プロピディウム（PI）を加え混合し、フローサイトメーターを用いてDiO陽性細胞中のPI陽性細胞をK562死細胞と判定し比率を測定した。測定結果を下式に代入しPBMCにより殺傷されたK562細胞比率（％）、即ちNK活性を算出した。
NK活性（％）=（[K562細胞死細胞率]-[K562細胞単独死細胞率]）／（100-[K562細胞単独死細胞率]）×100
K562細胞死細胞率：各wellのDiO陽性細胞中のPI陽性細胞率
K562細胞単独死細胞率：K562細胞を単独でインキュベートした時のDiO陽性細胞中のPI陽性細胞率【００７５】
各E/T比条件を3 wellずつ準備し、3 wellのNK活性の平均値を各E/T比条件のNK活性値と評価した。結果を図９に示す。図９中、エラーバーは標準偏差である。同一のPBMCサンプルにも関わらず、Tube-1からTube-4は異なるNK活性値を示した。実験条件の違いはK562細胞の予備培養条件の違いのみである。従って、従来の生物学的測定法で測定されるNK活性は、ターゲット細胞の調製条件の相違だけで測定誤差が生じてしまい、同一検体であっても異なる数値として評価される可能性があることが明白に示された。【００７６】
（実施例４）  NINKスコアの算出
上記比較例２にて用いた、PBMCサンプルのTube-2からTube-4のPBMCを用いて、実施例１〜３と同様にして、各種パラメーターの測定値を得、NINKスコアを算出した。具体的には、CD3-CD56+NK細胞比率（％）をフローサイトメーターで測定し、PBMCサンプルより磁気ビーズを用いてNK細胞を分取し、細胞中のIFN-γおよびNKp46 mRNA量をQGP法で測定した。得られた測定値を、実施例３にて作製した数式３に代入し、NINKスコアを算出した。【００７７】
結果を図１０に示す。図１０の右図に、本実施例にて算出したNINKスコアのグラフを示す。対比のため、図１０の左図に、比較例２のE/T比=10の時のTube-2からTube-4のNK活性の値を示す。比較例２のNK活性は、同一サンプルのであるにも関わらずターゲット細胞の状態だけで値が変動してしまうのに対し、NINKスコアは同一サンプル間の差が僅かであり、ほぼ同じ値を示し、再現性に優れていることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、NINKスコア算出の元となる各パラメーターの測定に細胞培養機器およびターゲット細胞を必要としないことから、従来技術の細胞培養によるNK活性測定の問題点を解決できるものである。すなわち、本発明は、簡便・短時間かつ安価にNK細胞機能の測定を可能にする。加えて、NINKスコアは細胞培養によるNK活性と良好な正の相関性を示し、異なる測定間においても測定誤差を少なく押さえることができ、NK細胞機能を高い精度で検査することができる。NINKスコアはNK細胞機能の新規評価方法として有望であり、今後ビッグデータを用いた健康解析での活用にも好適である。また、免疫担当細胞のうち、T細胞機能の亢進や減弱は一概に健康増進の善し悪しに結び付くとは考えられていないが、NK細胞機能の亢進は原則的に健康増進の改善と理解することができる。本発明のNINKスコアは加齢に伴い低下することも確認されており、NK細胞機能の老化や健康減退と関連するとも考えられ、簡便な免疫健康指標として利用されることが期待される。
【図１】
2017213249.tif 000005
【図２】
2017213249.tif 000006
【図３】
2017213249.tif 000007
【図４】
2017213249.tif 000008
【図５】
2017213249.tif 000009
【図６】
2017213249.tif 000010
【図７】
2017213249.tif 000011
【図８】
2017213249.tif 000012
【図９】
2017213249.tif 000013
【図１０】
2017213249.tif 000014
【配列表】
2017213249000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年1月9日(2018.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）の工程を含む被験動物から採取された試料のナチュラルキラー細胞機能の検査方法：
（１）被験動物から採取された前記試料中の末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率を測定する工程；
（２）前記被験動物から採取された前記試料中のナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のｍＲＮＡ発現量、
ナチュラルキラー細胞のサイトカインのｍＲＮＡ発現量、及び
ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のｍＲＮＡ発現量
からなる群から選択される少なくとも２つのｍＲＮＡ発現量を測定する工程；
（３）（１）の工程で得られた測定値、及び（２）の工程で得られた少なくとも２つの測定値を用いてＮＩＮＫスコアを算出する工程であって、該ＮＩＮＫスコアは、複数の提供動物から採取された試料について測定された、以下の（ａ）のパラメーター、及び（ｂ）〜（ｄ）から選択される２以上の有限個のパラメーターを独立変数として重回帰分析して得られた数式により算出される、工程：
（ａ）末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率；
（ｂ）ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のｍＲＮＡ発現量；
（ｃ）ナチュラルキラー細胞のサイトカインのｍＲＮＡ発現量；
（ｄ）ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のｍＲＮＡ発現量。
【請求項２】
前記（ｂ）がナチュラルキラー細胞のＮＫｐ４６のｍＲＮＡ発現量を含み、
前記（ｃ）がナチュラルキラー細胞のＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現量及びＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現量を含み、
前記（ｄ）がナチュラルキラー細胞のＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢのｍＲＮＡ発現量及びＦａｓＬのｍＲＮＡ発現量を含む、
請求項１に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
【請求項３】
前記２以上の有限個のパラメーターが、以下の（ｂ１）及び（ｃ１）のパラメーターを含む、請求項１又は２に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法：
（ｂ１）ナチュラルキラー細胞のＮＫｐ４６のｍＲＮＡ発現量；
（ｃ１）ナチュラルキラー細胞のＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現量。
【請求項４】
ＮＩＮＫスコアが以下の数式１により算出されるものである、請求項１〜３のいずれか１に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法：
（数式１）ＮＩＮＫスコア＝ｄ＋ａ×［ＮＫ細胞比率（％）］＋ｂ×
［ＮＫｐ４６ｍＲＮＡレベル］＋ｃ×［ＩＦＮ−γｍＲＮＡレベル］
〔ただし、数式１におけるａ，ｂ，ｃ，ｄはゼロでない任意の実数であり、［ＮＫ細胞比率（％）］は末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率、［ＮＫｐ４６ｍＲＮＡレベル］はナチュラルキラー細胞のＮＫｐ４６のｍＲＮＡ発現量、［ＩＦＮ−γｍＲＮＡレベル］はナチュラルキラー細胞のＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現量である。〕
【請求項５】
前記数式が、予め作成されていろ数式の独立変数に、被験動物より採取された試料より得られた測定値を加えて重回帰分析される、更新される数式である、請求項１〜４のいずれか１に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
前記（１）及び（２）の工程における前記ナチュラルキラー細胞が、分離された後、保存されたものである、請求項１〜５のいずれか１に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
【請求項８】
前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されたものである、請求項７に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
【請求項９】
被験動物および提供動物がヒトである、請求項１〜８のいずれか１に記載のナチュラルキラー細胞機能の検査方法。
【請求項１０】
ＮＩＮＫスコア算出手段としてコンピューターを機能させる、ナチュラルキラー細胞機能の検査用プログラムであって、ＮＩＮＫスコア算出手段が、複数の提供動物から採取された試料について測定された、以下の（ａ）のパラメーター、及び（ｂ）〜（ｄ）から選択される２以上の有限個のパラメーターを独立変数として重回帰分析して得られた数式により算出するものである、ナチュラルキラー細胞機能の検査用プログラム：
（ａ）末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率；
（ｂ）ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のｍＲＮＡ発現量；
（ｃ）ナチュラルキラー細胞のサイトカインのｍＲＮＡ発現量；
（ｄ）ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のｍＲＮＡ発現量。
【請求項１１】
ＮＩＮＫスコア算出手段を備えた、ナチュラルキラー細胞機能の検査用装置であって、ＮＩＮＫスコア算出手段が、複数の提供動物から採取された試料について測定された、以下の（ａ）のパラメーター、及び（ｂ）〜（ｄ）から選択される２以上の有限個のパラメーターを独立変数として重回帰分析して得られた数式により算出するものである、ナチュラルキラー細胞機能の検査用装置：
（ａ）末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率；
（ｂ）ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のｍＲＮＡ発現量；
（ｃ）ナチュラルキラー細胞のサイトカインのｍＲＮＡ発現量；
（ｄ）ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のｍＲＮＡ発現量。
【請求項１２】
被験動物から採取された試料について、以下の（１１）及び（１２）の測定値を取得するための少なくとも３種以上の試薬を含む、ＮＩＮＫスコアを指標とするナチュラルキラー細胞機能の検査用試薬キット：
（１１）末梢血単核細胞数に対するナチュラルキラー細胞数の比率；
（１２）ナチュラルキラー細胞のナチュラルキラー細胞活性化受容体のｍＲＮＡ発現量、
ナチュラルキラー細胞のサイトカインのｍＲＮＡ発現量、及び
ナチュラルキラー細胞の細胞死誘導因子のｍＲＮＡ発現量
からなる群から選択される少なくとも２つのｍＲＮＡ発現量。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかに記載の検査方法により得られたＮＩＮＫスコアをＮＫ活性に換算する方法であり、予め作成された、末梢血単核細胞とナチュラルキラー細胞の標的細胞を用いて測定されたＮＫ活性とＮＩＮＫスコアとを変数とする回帰直線式に、被験動物について得られたＮＩＮＫスコアを代入することによりＮＫ活性を算出することを含む、ＮＩＮＫスコアをＮＫ活性に換算する方法。
【国際調査報告】
2017213249.tif 000015
2017213249.tif 000016
2017213249.tif 000017
2017213249.tif 000018