(57)【要約】  下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法、並びに  下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を含んでなる、形質転換体。（Ａ）配列番号１の２３位〜１４６位までのアミノ酸配列からなるタンパク質。（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１の２３位〜１４６位までのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１の２３位〜１４６位までのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
【請求項３】
下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される全脂肪酸に占める長鎖脂肪酸の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法。
（Ａ）配列番号１の２３位〜１４６位までのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質（Ｃ）が下記タンパク質（Ｃ１）である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
（Ｃ１）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、宿主の細胞内で機能する葉緑体移行シグナルペプチドを付加したタンパク質。
【請求項５】
前記形質転換体において、デサチュラーゼ遺伝子の発現を促進させた、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記デサチュラーゼが、Δ12-デサチュラーゼ、Δ6-デサチュラーゼ、ω3-デサチュラーゼ、及びΔ9-デサチュラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１つのデサチュラーゼである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記Δ12-デサチュラーゼが、配列番号３９若しくは４９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３９若しくは４９で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記Δ6-デサチュラーゼが、配列番号４１若しくは５１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４１若しくは５１で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記ω3-デサチュラーゼが、配列番号４３若しくは５３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４３若しくは５３で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつω3-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記Δ9-デサチュラーゼが、配列番号４７若しくは５７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４７若しくは５７で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記形質転換体が、微生物の形質転換体である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が微細藻類である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記脂肪酸又は脂質が長鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）、並びに（Ｃ１）。
（Ａ）配列番号１の２３位〜１４６位までのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
（Ｃ１）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、宿主の細胞内で機能する葉緑体移行シグナルペプチドを付加したタンパク質。
【請求項１６】
請求項１５記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１７】
請求項１６記載の遺伝子を含有する、組換えベクター又はＤＮＡカセット。
【請求項１８】
請求項１６又は１７記載の遺伝子、組換えベクター又はＤＮＡカセットを含んでなる、形質転換体。
【請求項１９】
デサチュラーゼ遺伝子の発現を促進させた、請求項１８記載の形質転換体。
【請求項２０】
前記デサチュラーゼが、Δ12-デサチュラーゼ、Δ6-デサチュラーゼ、ω3-デサチュラーゼ、及びΔ9-デサチュラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１つのデサチュラーゼである、請求項１９記載の形質転換体。
【請求項２１】
前記Δ12-デサチュラーゼが、配列番号３９若しくは４９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３９若しくは４９で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項１９記載の形質転換体。
【請求項２２】
前記Δ6-デサチュラーゼが、配列番号４１若しくは５１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４１若しくは５１で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項１９記載の形質転換体。
【請求項２３】
前記ω3-デサチュラーゼが、配列番号４３若しくは５３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４３若しくは５３で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつω3-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項１９記載の形質転換体。
【請求項２４】
前記Δ9-デサチュラーゼが、配列番号４７若しくは５７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４７若しくは５７で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項１９記載の形質転換体。
【請求項２５】
前記形質転換体が、微生物の形質転換体である、請求項１８〜２４のいずれか１項記載の形質転換体。
【請求項２６】
前記微生物が微細藻類である、請求項２５記載の形質転換体。
【請求項２７】
前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項２６記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質の製造方法に関する。また、本発明は当該方法に用いる形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素原子数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤や殺菌剤等に利用されている。同じ高級アルコールの誘導体であるアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤、毛髪リンス剤、殺菌剤等に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤等に日常的に利用されている。さらに、植物由来の油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
また、炭素原子数が１８以上の長鎖脂肪酸は不飽和度によって化学的性質が異なり、様々な用途に用いられている。例えば、エイコサペンタエン酸といった多価不飽和脂肪酸（以下、「ＰＵＦＡ」ともいう）の多くは、動物の生体内では合成できない必須脂肪酸であることが知られている。よってＰＵＦＡは栄養学的用途に特に有用であり、機能性食品などに用いられている。
このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたる。そのため、植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素原子数（鎖長）や不飽和結合数（不飽和度）に依存するため、脂肪酸の炭素原子数や不飽和結合数を制御する試みも行われている。【０００３】
近年、持続可能な社会の実現に向けて再生可能エネルギーに関する研究、開発が推し進められている。特に光合成微生物は、二酸化炭素の削減効果に加えて、穀物と競合しないバイオ燃料生物として期待されている。
特に近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産できる。そして、藻類のうち微細藻類は食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産能力、脂質蓄積能力を有するとの報告もある。藻類の脂質合成や蓄積のメカニズムやそれを応用した生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多い。【０００４】
一般に、植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在する。葉緑体ではアセチル−アシルキャリアープロテイン（acyl carrier protein、以下「ACP」ともいう）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数１８程度の脂肪酸が合成される。この脂肪酸の合成経路においてACPは、脂肪酸の担体としての機能を果たしている。
これまでに、脂肪酸の生合成において、脂肪酸の炭素原子数（鎖長）の制御にACPを利用する方法が提案されている。例えば、タバコの葉緑体ゲノム又は核ゲノムに導入した、オリーブ由来のACPをコードする遺伝子を過剰発現させることで、炭素原子数１８の不飽和脂肪酸の生産性を向上させる方法が非特許文献１に記載されている。また、ナズナ（Arabidopsis）由来のACPをコードする遺伝子をナズナで過剰に発現させることで、炭素原子数１８の不飽和脂肪酸の１種であるα−リノレン酸の生産性を向上させる方法が、非特許文献２に記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Transgenic  Research，2016，vol．25(1)，p．45-61
【非特許文献２】Plant  Physiol.，2001，vol．127(1)，p．222-229
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
（Ａ）配列番号１の２３位〜１４６位までのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
【０００７】
また本発明は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法に関する。
また本発明は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される全脂肪酸に占める長鎖脂肪酸の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法に関する。
【０００８】
また本発明は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）に関する。
また本発明は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）をコードする遺伝子に関する。
さらに本発明は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）をコードする遺伝子を含んでなる、形質転換体に関する。
【０００９】
本発明の上記及び他の特徴及び利点は、下記の記載からより明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法を提供する。
また本発明は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させた形質転換体を提供する。
【００１１】
本発明者は上記点について、鋭意検討を行った。
本発明者はまず、脂肪酸の合成に関与するタンパク質として、藻類の１種であるナンノクロロプシス属の藻類から、ACPを新たに同定した。そして、新たに同定したACPをコードする遺伝子の発現を促進することで、生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上することを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１２】
本発明の脂質の製造方法によれば、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
また本発明の形質転換体は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
【００１３】
本明細書における「脂質」は、中性脂質（モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸（遊離脂肪酸）、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
一般に誘導脂質に分類される脂肪酸は、脂肪酸そのものを指し、「遊離脂肪酸」を意味する。本発明では単純脂質及び複合脂質分子中の脂肪酸部分又はアシル基の部分を「脂肪酸残基」と表記する。そして、特に断りのない限り、「脂肪酸」は「遊離脂肪酸」と「脂肪酸残基」の総称として用いる。
また本明細書において、「脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質」は、「遊離脂肪酸」と「当該脂肪酸残基を有する脂質」を総称して用いる。更に本明細書において、「脂肪酸組成」とは、前記遊離脂肪酸と脂肪酸残基を脂肪酸と見做して合計した全脂肪酸（総脂肪酸）の重量に対する各脂肪酸の重量割合を意味する。脂肪酸の重量（生産量）や脂肪酸組成は、実施例で用いた方法により測定できる。
【００１４】
また本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Cx:y」とあるのは、炭素原子数xで二重結合の数がyであることを表す。「Cx」は炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
さらに本明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
【００１５】
前述のように本発明者は、ナンノクロロプシス属の藻類から、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をACPとして新たに同定した。配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）NIES2145株由来のタンパク質である。ACPは脂肪酸の生合成反応（脂肪酸の伸長反応）の足場（担体）として機能する。脂肪酸のアシル基は、ACPのセリン残基に結合したホスホパンテテイン基とチオエステル結合を形成する。この状態で脂肪酸が伸長される。
しかし、後述の実施例で示すように、ナンノクロロプシス属の藻類において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の発現を単に強化しただけでは、長鎖脂肪酸の生産性の変化は確認できなかった。
そこで、細胞内局在予測サイトTargetP（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）を利用して、新たに同定したACPの局在部位の検討を行った。その結果、配列番号１で表されるアミノ酸配列にはミトコンドリア局在シグナルが含まれ、配列番号１の１位〜２２位のアミノ酸配列が、ミトコンドリア局在シグナルのアミノ酸配列であると推定された。このことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシスの主要な脂肪酸合成の場である葉緑体に局在しないため、脂肪酸の生産性に影響を与えないと推定された。そこで、配列番号１で表されるアミノ酸配列から、ミトコンドリア局在シグナルを削除し、Ｎ末端側にナンノクロロプシス内で機能する葉緑体移行シグナル配列を付加したACPの部分配列をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を作製した。その結果、作製した形質転換体が生産する長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上することを見出した。
【００１６】
本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質の発現、又は前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子の発現が促進されている。本発明の形質転換体を培養することで、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が向上する。
本発明の形質転換体は、野生株自体に比べ、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性、特に、生産される全脂肪酸中又は全脂質中に占める長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の割合が有意に向上する。またその結果、本発明の形質転換体では、生産される脂質中の脂肪酸組成が改変される。そのため、本発明の形質転換体は、特定の炭素原子数の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、特に長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくはオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサテトラエン酸、アラキドン酸、若しくはエイコサペンタエン酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくはオレイン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくはアラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はこれを構成成分とする脂質、の生産に好適に用いることができる。
以下、本明細書において、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質の発現、又はこれをコードする遺伝子の発現を促進させたものを「形質転換体」ともいう。これに対して、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質の発現、又はこれをコードする遺伝子の発現を促進させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
なお、本明細書において「長鎖」とは、アシル基の炭素原子数が１８以上、好ましくは炭素原子数が１８又は２０であることをいう。また、形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
【００１７】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）（以下、「ACP1」又は「NoACP1」ともいう）はいずれも、アシルキャリアープロテイン活性（以下、「ACP活性」ともいう）を有する。本明細書において「ACP活性」とは、脂肪酸のアシル基とチオエステル結合を形成することで脂肪酸の伸長反応の足場として機能する活性を意味する。
後述の実施例で実証されているように、少なくとも配列番号１の２３位〜１４６位までのアミノ酸配列を含んでなる組換えタンパク質は、ACPとして機能する。すなわち、配列番号１のアミノ酸配列において、２３位〜１４６位までの領域がACP活性にとって十分な領域であると考えられる。
【００１８】
前記タンパク質（Ｂ）において、ACP活性の点から、前記タンパク質（Ａ）（以下、「ACP1(Δ1-22)」、又は「NoACP1(Δ1-22)」ともいう）のアミノ酸配列との同一性は７５％以上が好ましく、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９４％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がより好ましい。
また、前記タンパク質（Ｂ）として、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上３８個以下、好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１９個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１個以上２個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつACP活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００１９】
前記タンパク質（Ｃ）は、そのアミノ酸配列の一部として前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を含んでおり、かつACP活性を示す。
前記タンパク質（Ｃ）を構成するアミノ酸配列中、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列以外の配列としては、本発明の効果を損なわない範囲で適宜選択することができる。例えば、配列番号１の１位〜２２位の任意のアミノ酸配列、又はこのアミノ配列に１個又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下）の変異が導入されたアミノ酸配列、等が挙げられる。変異としては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加が挙げられる。これらの配列は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列のＮ末端側に付加されることが好ましい。
あるいは、前記タンパク質（Ｃ）として、配列番号１に示すアミノ酸配列において、配列番号１の１位〜２２位の任意の位置でＮ末端側が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。また、前記タンパク質（Ｃ）として、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列に、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドが付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も好ましい。
【００２０】
前記タンパク質（Ｃ）として、下記タンパク質（Ｃ１）が好ましい。本発明の形質転換体の宿主が微細藻類などの場合、脂肪酸合成の場である葉緑体に前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）を移行させ、局在させることで、葉緑体における前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の濃度が、宿主との比較で増加し、長鎖脂肪酸の生産性が向上する。
（Ｃ１）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、宿主の細胞内で機能する葉緑体移行シグナルペプチドを付加したタンパク質。
【００２１】
本発明で用いることができる葉緑体移行シグナルペプチドは、通常の葉緑体移行シグナルペプチドより適宜選択することができる。具体例としては、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質（配列番号２９、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号３０）の葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のACP2（前記NoACPとは別種のACP）（配列番号３１、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号３２）の葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のβ-ケトアシル-ACPシンターゼIII（以下、「NoKASIII」ともいう）（配列番号３３、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号３４）の葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のβ-ケトアシル-ACPシンターゼII（以下、「NoKASII」ともいう）（配列番号２７、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号２８）の葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のβ-ケトアシル-ACPシンターゼIV（以下、「NoKASIV」ともいう）（配列番号３５、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号３６）の葉緑体移行シグナル配列、及びナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のアシル-ACPチオエステラーゼ（以下、「NoTE2」ともいう）（配列番号３７、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号３８）の葉緑体移行シグナル配列、並びにこれらいずれか１つの葉緑体移行シグナル配列に１個若しくは数個（好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上６個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上２個以下）の変異が導入されたアミノ酸配列からなるペプチド、が挙げられる。変異としては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加が挙げられる。
なお、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質のＮ末端側１位〜３３位のアミノ酸配列、ACP2のＮ末端側１位〜４４位のアミノ酸配列、NoKASIIIのＮ末端側１位〜７０位のアミノ酸配列、NoKASIIのＮ末端側１位〜３３位のアミノ酸配列、NoKASIVのＮ末端側１位〜２８位のアミノ酸配列、NoTE2のＮ末端側１位〜７３位のアミノ酸配列がそれぞれ、葉緑体移行シグナルであると推定される。さらに、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質のＮ末端側１位〜３３位のアミノ酸配列、ACP2のＮ末端側１位〜７０位のアミノ酸配列、NoKASIIIのＮ末端側１位〜７０位のアミノ酸配列、NoKASIIのＮ末端側１位〜７０位のアミノ酸配列、NoKASIVのＮ末端側１位〜７０位のアミノ酸配列、NoTE2のＮ末端側１位〜７３位のアミノ酸配列がそれぞれ、ナンノクロロプシス属に属する藻類を宿主として用いた場合、宿主細胞内で葉緑体移行シグナルとして機能するのに十分な配列であることは、本発明者により確認されている。
【００２２】
前記タンパク質がACP活性を有することは、例えば、ACP遺伝子欠損株に、宿主内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを導入し、脂肪酸合成能を相補させることで確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液中の脂肪酸の生産量や組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、前記タンパク質を、Biochemistry, 2011, vol. 50(25), p. 5704-5717等の文献を参考にして、補酵素A（CoA）と適当なACPシンターゼ（ACP synthase）（ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（phosphopantetheinyl transferase））と反応させ、ホスホパンテテイン基が結合したholo-ACPを形成させることで確認することができる。あるいは、The Journal of Biological Chemistry, 1979, vol. 254(15), p. 7123-7128等の文献を参考にして、前記holo-ACPを脂肪酸及び適当なアシル-ACPシンセターゼ（acyl-ACP synthetase）と反応させ、アシル基が結合したacyl-ACPを形成させることで確認することができる。
【００２３】
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このように所望の活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質を用いることができる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、SOE-PCRを利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００２４】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号１に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ））を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するアシルキャリアープロテイン遺伝子を用いることができる。
なお、ナンノクロロプシス・オキュラータ等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株は、国立環境研究所（NIES）から入手することができる。
【００２５】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子（以下、「ACP1遺伝子」又は「NoACP1遺伝子」ともいう）の一例として、下記ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号２の６７位〜４３８位の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有し、かつACP活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２６】
前記ＤＮＡ（ａ）からなる遺伝子（以下、「NoACP1(Δ1-22)遺伝子」ともいう）は、前記タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子である。なお、前述のミトコンドリア局在シグナル（配列番号１の１〜２２位のアミノ酸配列）をコードする塩基配列は、配列番号２の１〜６６位に相当する。
【００２７】
前記ＤＮＡ（ｂ）において、ACP活性の点から、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列との同一性は７５％以上が好ましく、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９４％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がより好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上１１２個以下、好ましくは１個以上９３個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上５６個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１９個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上４個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつACP活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつACP活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡも好ましい。
【００２８】
前記ＤＮＡ（ｃ）は、その塩基配列の一部として前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を含んでおり、かつACP活性を示すタンパク質をコードする。
前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列中、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列以外の塩基配列としては、本発明の効果を損なわない範囲で適宜選択することができる。例えば、配列番号２の１位〜６６位の任意の塩基配列、又はこの塩基配列に１又は数個（好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上９個以下）の変異が導入された塩基配列、等が挙げられる。変異としては、塩基の欠失、置換、挿入又は付加が挙げられる。これらの配列は、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列の5'末端側に付加されることが好ましい。
あるいは、前記ＤＮＡ（ｃ）として、配列番号２に示す塩基配列において、配列番号２の１位〜６６位の任意の位置で5'末端側が欠失した塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。また、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドをコードする塩基配列が、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列の5'末端側に付加されることが好ましい。
【００２９】
前記ＤＮＡ（ｃ）として、下記ＤＮＡ（ｃ１）が好ましい。本発明の形質転換体の宿主が微細藻類などの場合、脂肪酸合成の場である葉緑体に前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）を移行させ、局在させることで、葉緑体における前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の濃度が、宿主との比較で増加し、長鎖脂肪酸の生産性が向上する。
（ｃ１）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列の5'末端側に、宿主細胞内で機能する葉緑体移行シグナルペプチドをコードする塩基配列を連結したＤＮＡ。
【００３０】
本発明で用いることができる葉緑体移行シグナルペプチドをコードする塩基配列は、通常の葉緑体移行シグナルペプチドをコードする塩基配列より適宜選択することができる。具体例としては、前述の葉緑体移行シグナルペプチドをコードする塩基配列が挙げられる。
【００３１】
NoACP1の発現を促進する方法としては、常法より適宜選択することができ、NoACP1遺伝子の発現を促進する方法が好ましい。具体的な方法としては、NoACP1遺伝子を宿主に導入する方法、が挙げられる。また、葉緑体ゲノムを有する宿主においては、葉緑体ゲノムにNoACP1遺伝子を導入する方法（中国特許出願公開第103834640号明細書参照）、も好ましい。
【００３２】
NoACP1遺伝子を宿主に導入してNoACP1遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
NoACP1遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいてNoACP1遺伝子を、人工的に合成できる。本発明において、葉緑体移行シグナルをコードする塩基配列の下流にNoACP1遺伝子を作動可能に連結させて作製した、NoACP1遺伝子発現用プラスミド又はカセットを用いることが好ましい。
NoACP1遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ナンノクロロプシス・オキュラータからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。また、実施例で用いたナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145は、国立環境研究所(NIES)より入手することができる。
【００３３】
前記NoACP1遺伝子を常法により宿主に導入することで、本発明の形質転換体を作製することができる。具体的には、前記NoACP1遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる組換えベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
【００３４】
形質転換体の宿主としては通常用いられるものより適宜選択することができる。本発明で用いることができる宿主としては、微生物（藻類や微細藻類を含む）、植物体、及び動物体が挙げられる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物が好ましく、微細藻類がより好ましい。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属の微生物やバシラス（Bacillus）属の微生物、シネコシスティス（Synechocystis）属の微生物、シネココッカス（Synechococcus）属の微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、又はモルチエレラ・エスピー（Mortierella sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類、クロレラ（Chlorella）属の藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属の藻類、又はナンノクロロプシス属の藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属の藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis sp．）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、西洋アブラナ（Brassica napus）、アブラナ（Brassica rapa）、ココヤシ（Cocos nucifera）、パーム（Elaeis guineensis）、クフェア、ダイズ（Glycine max）、トウモロコシ（Zea mays）、イネ（Oryza sativa）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、クスノキ（Cinnamomum camphora）、又はヤトロファ（Jatropha curcas）が好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
【００３５】
遺伝子発現用プラスミド又は遺伝子発現用カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で目的の遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、使用する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS） II SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（1986，Plasmid 15（2），p．93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、及びpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript II SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
藻類又は微細藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas Center）、P-322（Chlamydomonas Center）、pPha-T1（Journal of Basic Microbiology, 2011, vol. 51, p. 666-672参照）、及びpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)の記載の方法を参考にして、目的の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、及びIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
このＤＮＡ断片としては、例えば、PCR法により増幅したDNA断片や制限酵素で切断したDNA断片が挙げられる。目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
【００３６】
また、前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaAB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)）、及びナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ(lipid droplet surface protein)遺伝子のプロモーター（PLOS Genetics, 2012;8(11):e1003064. doi: 10.1371）が挙げられる。本発明で宿主としてナンノクロロプシスを用いる場合、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターや、ナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ遺伝子のプロモーターを好ましく用いることができる。
また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
【００３７】
形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。宿主としてナンノクロロプシス属の藻類を用いる場合、Nature Communications, DOI:10.1038/ncomms1688, 2012等に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
【００３８】
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的DNA断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたPCR法等によって、目的DNA断片の導入を確認することもできる。
【００３９】
本発明の形質転換体は、β-ケトアシル-ACPシンターゼ（β-Ketoacyl-ACP  synthase、以下「KAS」ともいう）をコードする遺伝子の発現も促進されていることが好ましい。
KASは、アシル-ACPとマロニルACPとの縮合反応を触媒し、アシル−ACPの合成に関与する脂肪酸合成酵素の１種である。葉緑体では、アセチル-ACP（又はアセチル-CoA）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数１６又は１８のアシル-ACPが合成される。次いで、アシル-ACPチオエステラーゼ（以下、単に「TE」ともいう）の作用によってアシル-ACPのチオエステル結合が加水分解され、遊離の脂肪酸が生成する。
脂肪酸合成の第一段階では、アセチル-ACP（又はアセチル-CoA）とマロニルACPとの縮合反応により、アセトアセチルACPが生成する。この反応をKASが触媒する。次いで、β-ケトアシル-ACPレダクターゼによりアセトアセチルACPのケト基が還元されてヒドロキシブチリルACPが生成する。続いて、β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼによりヒドロキシブチリルACPが脱水され、クロトニルACPが生成する。最後に、エノイル-ACPレダクターゼによりクロトニルACPが還元されて、ブチリルACPが生成する。これら一連の反応により、アセチル-ACPからアシル基の炭素鎖が２個伸長されたブチリルACPが生成する。以下、同様の反応を繰り返すことで、アシル-ACPの炭素鎖が伸長し、最終的に炭素原子数１６又は１８のアシル-ACPが合成される。
そのため、KASをコードする遺伝子（以下単に、「KAS遺伝子」ともいう）の発現を促進することで、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
【００４０】
本発明で好ましく用いることができるKASは、β-ケトアシル-ACPシンターゼ活性（以下、「KAS活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「KAS活性」とは、アセチル-ACPやアシル-ACPとマロニルACPとの縮合反応を触媒する活性をいう。
タンパク質がKAS活性を有することは、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、各種アシル-ACPを基質とした鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
【００４１】
KASはその基質特異性によって、KAS I、KAS II、KAS III、又はKAS IVに分類される。例えば、KAS IIIは、炭素原子数２のアセチル-ACP（又はアセチル-CoA）を基質とし、炭素原子数２から４の伸長反応を触媒する。KAS Iは、主に炭素原子数４から１６の伸長反応を触媒し、炭素原子数１６のパルミトイル-ACPを合成する。KAS IIは、主に炭素原子数１８以上の長鎖アシル基への伸長反応を触媒し、長鎖アシル-ACPを合成する。KAS IVは主に炭素原子数６から１４の伸長反応を触媒し、中鎖アシル-ACPを合成する。
そのため、KAS IIをコードする遺伝子の発現を促進することで、長鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
【００４２】
本発明で好ましく用いることができるKASは、通常のKASや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、前述のNoKASII（配列番号２７、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号２８）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、前記NoKASIIのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質も用いることができる。
【００４３】
さらに本発明の形質転換体は、デサチュラーゼをコードする遺伝子（以下、「デサチュラーゼ遺伝子」ともいう）、及びエロンガーゼをコードする遺伝子（以下、「エロンガーゼ遺伝子」ともいう）からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子の発現も促進されていることが好ましい。
炭素原子数１８以上の長鎖脂肪酸、特に長鎖のＰＵＦＡは、小胞体など、葉緑体外にて多数のデサチュラーゼやエロンガーゼによって合成されることが知られている。そのため、デサチュラーゼやエロンガーゼをコードする遺伝子の発現を促進することでも、長鎖脂肪酸、特に長鎖のＰＵＦＡの生産性を一層向上させることができる。
本発明で好ましく用いることができるデサチュラーゼやエロンガーゼは、通常のデサチュラーゼやエロンガーゼや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、国際公開第２０１２／１４９４５７号、米国特許出願公開第２０１２／０２７７４１８号明細書記載のナンノクロロプシス由来デサチュラーゼ、エロンガーゼを好ましく用いることができる。
【００４４】
本発明で用いることができるデサチュラーゼとしては、Δ12-デサチュラーゼ（以下、「Δ12-DES」ともいう）、Δ6-デサチュラーゼ（以下、「Δ6-DES」ともいう）、ω3-デサチュラーゼ（以下、「ω3-DES」ともいう）、Δ5-デサチュラーゼ（以下、「Δ5-DES」ともいう）、Δ9-デサチュラーゼ（以下、「Δ9-DES」ともいう）が挙げられる。
なお本発明において、これらのデサチュラーゼを単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００４５】
本明細書において「Δ12-DES」とは、オレイン酸のΔ12位に不飽和結合を導入し、リノール酸（以下、「C18:2(Δ9,12)」とも表記する）を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において「Δ12-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ12-DES活性」ともいう）」とは、オレイン酸（以下、「C18:1(Δ9)」とも表記する）のΔ12位に不飽和結合を導入する活性を意味する。タンパク質がΔ12-DES活性を有することは、例えば、Δ12-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ12-DES合成遺伝子欠損株に導入し、リノール酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ12-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、オレイン酸、オレオイルＣｏＡ、オレイン酸とグリセロールのエステル化合物などを含む反応液と反応させ、常法に従いオレイン酸量の減少又はリノール酸量の増加を測定することで確認できる。
後述の実施例でも示すように、本発明の形質転換体においてΔ12-DESの発現を促進させることで、全脂肪酸量に占めるC18:2(Δ9,12)などのＰＵＦＡの量の割合がより一層向上する。
【００４６】
本発明で好ましく用いることができるΔ12-DESは、通常のΔ12-DESや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のΔ12-DES（以下、「NoΔ12-DES」ともいう）（配列番号３９）やナンノクロロプシス・ガディタナ由来のΔ12-DES（以下、「NgΔ12-DES」ともいう）（配列番号４９）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、NoΔ12-DESやNgΔ12-DESのアミノ酸配列との同一性が６０％以上（好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。
また、配列番号３９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１７６個以下、好ましくは１個以上１５４個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１１０個以下、より好ましくは１個以上８８個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上４４個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。あるいは、配列番号４９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１８１個以下、好ましくは１個以上１５９個以下、より好ましくは１個以上１３６個以下、より好ましくは１個以上１１３個以下、より好ましくは１個以上９１個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上３７個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。
【００４７】
NoΔ12-DESをコードする遺伝子としては、配列番号４０で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４０で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。NgΔ12-DESをコードする遺伝子としては、配列番号５０で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号５０で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
また、配列番号４０で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上５２７個以下、好ましくは１個以上４６１個以下、より好ましくは１個以上３９６個以下、より好ましくは１個以上３３０個以下、より好ましくは１個以上２６４個以下、より好ましくは１個以上１９８個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上１４個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も用いることができる。あるいは、配列番号５０で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上５４４個以下、好ましくは１個以上４７６個以下、より好ましくは１個以上４０８個以下、より好ましくは１個以上３４０個以下、より好ましくは１個以上２７２個以下、より好ましくは１個以上２０４個以下、より好ましくは１個以上１３６個以下、より好ましくは１個以上１０９個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１４個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も用いることができる。
さらに、配列番号４０又は５０で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も用いることができる。
【００４８】
本明細書において「Δ6-DES」とは、リノール酸（以下、「C18:2Δ9,12」とも表記する）のΔ6位に不飽和結合を導入し、γ-リノレン酸（以下、「C18:3Δ6,9,12」とも表記する）を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「Δ6-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ6-DES活性」ともいう）」とは、リノール酸のΔ6位に不飽和結合を導入する活性を意味する。タンパク質がΔ6-DES活性を有することは、例えば、Δ6-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ6-DES合成遺伝子欠損株に導入し、γ-リノレン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ6-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、リノール酸、リノレオイルＣｏＡ、リノール酸とグリセロールのエステル化合物などを含む反応液と反応させ、常法に従いリノール酸量の減少又はγ-リノレン酸量の増加を測定することで確認できる。
後述の実施例でも示すように、本発明の形質転換体において前述のΔ12-DESとともにΔ6-DESの発現を促進させることで、全脂肪酸量に占めるC18:3(Δ6,9,12)、ジホモ-γ-リノレン酸（以下、「C20:3(Δ8,11,14)」とも表記する）及びアラキドン酸（以下、「C20:4(Δ5,8,11,14)」とも表記する」）などのＰＵＦＡの量の割合がより一層向上する。
【００４９】
本発明で好ましく用いることができるΔ6-DESは、通常のΔ6-DESや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のΔ6-DES（以下、「NoΔ6-DES」ともいう）（配列番号４１）やナンノクロロプシス・ガディタナ由来のΔ6-DES（以下、「NgΔ6-DES」ともいう）（配列番号５１）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、NoΔ6-DESやNgΔ6-DESのアミノ酸配列との同一性が６０％以上（好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。
また、配列番号４１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１９０個以下、好ましくは１個以上１６６個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上４８個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。あるいは、配列番号５１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１９０個以下、好ましくは１個以上１６６個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上４８個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。
【００５０】
NoΔ6-DESをコードする遺伝子としては、配列番号４２で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４２で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。NgΔ6-DESをコードする遺伝子としては、配列番号５２で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号５２で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
また配列番号４２で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上５７０個以下、好ましくは１個以上４９９個以下、より好ましくは１個以上４２８個以下、より好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８５個以下、より好ましくは１個以上２１４個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１４個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１５個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も用いることができる。あるいは、配列番号５２で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上５７２個以下、好ましくは１個以上５００個以下、より好ましくは１個以上４２９個以下、より好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８６個以下、より好ましくは１個以上２１５個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１５個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も用いることができる。
さらに、配列番号４２又は５２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も用いることができる。
【００５１】
本明細書において「ω3-DES」とは、アラキドン酸のω3位に不飽和結合を導入し、エイコサペンタエン酸（以下、「EPA」又は「C20:5(Δ5,8,11,14,17)」とも表記する）を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「ω3-デサチュラーゼ活性（以下、「ω3-DES活性」ともいう」」とは、アラキドン酸のω3位に不飽和結合を導入する活性を意味する。タンパク質がω3-DES活性を有することは、例えば、ω3-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをω3-DES合成遺伝子欠損株に導入し、EPAの生成を検討することで確認できる。あるいは、ω3-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、アラキドン酸誘導体（ＣｏＡとのチオエステル化合物、グリセロールとのエステル化合物など）を含む反応液と反応させ、常法に従いアラキドン酸量の減少又はEPA量の増加を測定することで確認できる。
後述の実施例でも示すように、本発明の形質転換体においてω3-DESの発現を促進させることで、全脂肪酸量に占めるC20:5(Δ5,8,11,14,17)などのＰＵＦＡの量の割合がより一層向上する。また、前述のΔ12-DESとともにω3-DESの発現を促進させることで、全脂肪酸量に占めるC20:5(Δ5,8,11,14,17)などのＰＵＦＡの量の割合がより一層向上する。
【００５２】
本発明で好ましく用いることができるω3-DESは、通常のω3-DESや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のω3-DES（以下、「Noω3-DES」ともいう）（配列番号４３）やナンノクロロプシス・ガディタナ由来のω3-DES（以下、「Ngω3-DES」ともいう）（配列番号５３）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、Noω3-DESやNgω3-DESのアミノ酸配列との同一性が６０％以上（好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）のアミノ酸配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。
また、配列番号４３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１６４個以下、好ましくは１個以上１４４個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上３３個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつω3-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。あるいは、配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１６３個以下、好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上３３個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつω3-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。
【００５３】
Noω3-DESをコードする遺伝子としては、配列番号４４で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４４で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。Ngω3-DESをコードする遺伝子としては、配列番号５４で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号５４で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
また配列番号４４で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４９４個以下、好ましくは１個以上４３２個以下、より好ましくは１個以上３７０個以下、より好ましくは１個以上３０９個以下、より好ましくは１個以上２４７個以下、より好ましくは１個以上１８５個以下、より好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上９９個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１３個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も用いることができる。あるいは、配列番号５４で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４９０個以下、好ましくは１個以上４２９個以下、より好ましくは１個以上３６８個以下、より好ましくは１個以上３０６個以下、より好ましくは１個以上２４５個以下、より好ましくは１個以上１８４個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上９８個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１３個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も用いることができる。
さらに、配列番号４４又は５４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も好ましい。
【００５４】
本明細書において「Δ5-DES」とは、ジホモ-γ-リノレン酸のΔ5位に不飽和結合を導入し、アラキドン酸を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「Δ5-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ5-DES活性」ともいう」」とは、ジホモ-γ-リノレン酸のΔ5位に不飽和結合を導入する活性を意味する。タンパク質がΔ5-DES活性を有することは、例えば、Δ5-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ5-DES合成遺伝子欠損株に導入し、アラキドン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ5-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、ジホモ-γ-リノレン酸誘導体（ＣｏＡとのチオエステル化合物、グリセロールとのエステル化合物など）を含む反応液と反応させ、常法に従いジホモ-γ-リノレン酸量の減少又はアラキドン酸量の増加を測定することで確認できる。
【００５５】
本発明で好ましく用いることができるΔ5-DESは、通常のΔ5-DESや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のΔ5-DES（以下、「NoΔ5-DES」ともいう）（配列番号４５）やナンノクロロプシス・ガディタナ由来のΔ5-DES（以下、「NgΔ5-DES」ともいう）（配列番号５５）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、NoΔ5-DESやNgΔ5-DESのアミノ酸配列との同一性が６０％以上（好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。
また、配列番号４５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上２１１個以下、好ましくは１個以上１８５個以下、より好ましくは１個以上１５８個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上７９個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上４３個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、より好ましくは１個以上６個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。あるいは、配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上２０６個以下、好ましくは１個以上１８１個以下、より好ましくは１個以上１５５個以下、より好ましくは１個以上１２９個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、より好ましくは１個以上６個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。
【００５６】
NoΔ5-DESをコードする遺伝子としては、配列番号４６で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４６で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。NgΔ5-DESをコードする遺伝子としては、配列番号５６で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号５６で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
また配列番号４６で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上６３３個以下、好ましくは１個以上５５４個以下、より好ましくは１個以上４７５個以下、より好ましくは１個以上３９６個以下、より好ましくは１個以上３１７個以下、より好ましくは１個以上２３８個以下、より好ましくは１個以上１５９個以下、より好ましくは１個以上１２７個以下、より好ましくは１個以上８０個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上１６個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も用いることができる。あるいは、配列番号５６で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上６２０個以下、好ましくは１個以上５４２個以下、より好ましくは１個以上４６５個以下、より好ましくは１個以上３８７個以下、より好ましくは１個以上３１０個以下、より好ましくは１個以上２３３個以下、より好ましくは１個以上１５５個以下、より好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上１６個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も用いることができる。
さらに、配列番号４６又は５６で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も好ましい。
【００５７】
本明細書において「Δ9-DES」とは、ステアリン酸（以下、「C18:0」とも表記する）のΔ9位に不飽和結合を導入し、オレイン酸（以下、「C18:1(Δ9)」とも表記する）を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「Δ9-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ9-DES活性」ともいう」」とは、ステアリン酸のΔ9位に不飽和結合を導入する活性を意味する。タンパク質がΔ9-DES活性を有することは、例えば、Δ9-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ9-DES合成遺伝子欠損株に導入し、オレイン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ9-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、ステアリン酸、ステアロイルＣｏＡなどを含む反応液と反応させ、常法に従いステアリン酸量の減少又はオレイン量の増加を測定することで確認できる。
後述の実施例でも示すように、本発明の形質転換体においてΔ9-DESの発現を促進させることで、全脂肪酸量に占めるC18:1(Δ9)などの長鎖脂肪酸の量の割合がより一層向上する。また、前述のΔ12-DESとともにΔ9-DESの発現を促進させることで、全脂肪酸量に占めるリノール酸（以下、「C18:2Δ9,12」とも表記する）などの長鎖脂肪酸の量の割合がより一層向上する。
【００５８】
本発明で好ましく用いることができるΔ9-DESは、通常のΔ9-DESや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のΔ9-DES（以下、「NoΔ9-DES」ともいう）（配列番号４７）やナンノクロロプシス・ガディタナ由来のΔ9-DES（以下、「NgΔ9-DES」ともいう）（配列番号５７）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、NoΔ9-DESやNgΔ9-DESのアミノ酸配列との同一性が６０％以上（好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。
また、配列番号４７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１４４個以下、好ましくは１個以上１２６個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。あるいは、配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１３６個以下、好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上８５個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上５１個以下、より好ましくは１個以上３４個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。
【００５９】
NoΔ9-DESをコードする遺伝子としては、配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４８で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。NgΔ9-DESをコードする遺伝子としては、配列番号５８で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号５８で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
また配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４３２個以下、好ましくは１個以上３７８個以下、より好ましくは１個以上３２４個以下、より好ましくは１個以上２７０個以下、より好ましくは１個以上２１６個以下、より好ましくは１個以上１６２個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上８７個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上１１個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も用いることができる。あるいは、配列番号５８で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４１０個以下、好ましくは１個以上３５９個以下、より好ましくは１個以上３０７個以下、より好ましくは１個以上２５６個以下、より好ましくは１個以上２０５個以下、より好ましくは１個以上１５４個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１１個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も用いることができる。
さらに、配列番号４８又は５８で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も好ましい。
【００６０】
本発明の形質転換体は、長鎖脂肪酸の生産性を一層向上させる観点から、Δ12-DES、Δ6-DES、ω3-DES及びΔ9-DESからなる群より選ばれる１つ以上の酵素の発現が促進されていることがより好ましく、Δ12-DES、Δ6-DES、ω3-DES及びΔ9-DESからなる群より選ばれる２つ以上の酵素の発現が促進されていることがさらに好ましい。
【００６１】
さらに本発明の形質転換体は、TEの発現が促進されていることが好ましく、TEをコードする遺伝子（以下単に、「TE遺伝子」ともいう）の発現も促進されていることが好ましい。
前述したように、TEは、KAS等の脂肪酸合成酵素によって合成されたアシル−ACPのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。TEの作用によってACP上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はＰＵＦＡの合成やトリアシルグリセロール等の合成に供される。そのため、TEの発現を促進することで、好ましくはTE遺伝子の発現を促進することで、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
本発明で用いることができるTEは、アシル-ACPチオエステラーゼ活性（以下、「TE活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「TE活性」とは、アシル-ACPのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
【００６２】
TEは、基質であるアシル-ACPを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のTEが存在していることが知られている。よってTEは、生体内での脂肪酸組成を決定する重要なファクターであると考えられている。また、TEをコードする遺伝子を元来有していない宿主を用いる場合、TEをコードする遺伝子、好ましくは長鎖アシル-ACPに対する基質特異性を有するTEをコードする遺伝子の導入が効果的である。このような遺伝子を導入することで、ＰＵＦＡの生産性を一層向上させることができる。
【００６３】
本発明で用いることができるTEは、通常のTEや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・ガディタナ由来TE（配列番号５９）、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来TE（配列番号６０又は３７）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ由来TE（配列番号６１）などを用いることができる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、前記TEのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質も用いることができる。
【００６４】
前述のKAS、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、及びTEのアミノ酸配列情報、並びにこれらをコードする遺伝子の配列情報等は、例えば、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information, NCBI）などから入手することができる。
また、KAS遺伝子、デサチュラーゼ遺伝子、エロンガーゼ遺伝子、及びTE遺伝子の発現を促進させた形質転換体は、常法により作製できる。例えば、前述のNoACP1遺伝子の発現を促進させる方法と同様に、前記各種遺伝子を宿主に導入する方法、前記各種遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域（プロモーター、ターミネーター等）を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。
【００６５】
本発明の形質転換体は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）の発現が促進されていない宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物又は生育物から長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を効率よく製造することができる。ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいい、「生育物」とは生育した後の形質転換体をいう。
本発明の形質転換体の培養条件は、宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。また脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はグルコース等を添加してもよい。
【００６６】
宿主として大腸菌を用いる場合、大腸菌の培養は、例えば、ＬＢ培地又はOvernight Express Instant TB Medium（Novagen社）で、３０〜３７℃、０．５〜１日間培養することができる。
また、宿主としてシロイヌナズナを用いる場合、シロイヌナズナの培養は、例えば、土壌で温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間栽培することができる。
【００６７】
宿主として藻類を用いる場合、培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する藻類の量は適宜選択することができ、生育性の点から、培地当り１％（vol/vol）以上が好ましい。また、その上限値は５０％（vol/vol）以下が好ましく、１０％（vol/vol）以下がより好ましい。接種する藻類の量の数値範囲は、１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、１０℃以上が好ましく、１５℃以上がより好ましい。またその上限値は３５℃以下が好ましく、３０℃以下がより好ましい。培養温度の数値範囲は、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、１００ルクス以上が好ましく、３００ルクス以上がより好ましく、１０００ルクス以上がさらに好ましい。またその上限値は、５００００ルクス以下が好ましく、１００００ルクス以下がより好ましく、６０００ルクス以下がさらに好ましい。光照射時の照度の数値範囲は、好ましくは１００〜５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００〜１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期は８時間以上が好ましく、１０時間以上がより好ましい。またその上限値は、２４時間以下が好ましく、１８時間以下がより好ましい。明期の数値範囲は、好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３％（大気条件と同程度）以上が好ましく、０．０５％以上がより好ましく、０．１％以上がさらに好ましく、０．３％以上がよりさらに好ましい。またその上限値は、１０％以下が好ましく、５％以下がより好ましく、３％以下がさらに好ましく、１％以下がよりさらに好ましい。二酸化炭素の濃度の数値範囲は、０．０３〜１０％が好ましく、０．０５〜５％がより好ましく、０．１〜３％がさらに好ましく、０．３〜１％がよりさらに好ましい。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１質量％以上が好ましく、０．０５質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましい。またその上限値は、５質量％以下が好ましく、２質量％以下がより好ましく、１質量％以下がさらに好ましい。炭酸水素ナトリウムの濃度の数値範囲は、０．０１〜５質量％が好ましく、０．０５〜２質量％がより好ましく、０．１〜１質量％がさらに好ましい。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。３日以上が好ましく、７日以上がより好ましい。またその上限値は、９０日以下が好ましく、３０日以下がより好ましい。培養期間の数値範囲は、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは３〜３０日間、さらに好ましくは７〜３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、通気撹拌培養又は振とう培養が好ましく、通気撹拌培養がより好ましい。
【００６８】
培養物又は生育物から脂質を採取する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物又は生育物から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物又は生育物より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
【００６９】
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。前記脂肪酸エステル化合物は、ＭＡＧ、ＤＡＧ及びＴＡＧからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、ＴＡＧがより好ましい。
脂質中に含まれる脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物は、界面活性剤等への利用性や栄養学的観点から、長鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物が好ましい。具体的には、炭素原子数１８以上の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物が好ましく、炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサテトラエン酸、アラキドン酸、若しくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、オレイン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましい。
脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、トリアシルグリセロールがさらにより好ましい。
【００７０】
本発明の製造方法により得られる脂質は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
【００７１】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、生産される脂質の脂肪酸組成を改変する方法、タンパク質、遺伝子、組換えベクター若しくはＤＮＡカセット、並びに形質転換体及びその作製方法を開示する。
【００７２】
＜１＞下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１の２３位〜１４６位までのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつACP活性を有するタンパク質。
【００７３】
＜２＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法。
＜３＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される全脂肪酸に占める長鎖脂肪酸の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法。
【００７４】
＜４＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
＜５＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法。
＜６＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される全脂肪酸に占める長鎖脂肪酸の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法。
＜７＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入し、遺伝子の発現を促進させる、前記＜４＞〜＜６＞のいずれか１項記載の方法。
【００７５】
＜８＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子が、形質転換体の葉緑体ゲノムに組み込まれている、前記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の方法。
＜９＞前記形質転換体における、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質の細胞内の濃度が、宿主との比較で増加している、前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１項記載の方法。
＜１０＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１９個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１個以上２個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞前記タンパク質（Ｃ）が下記タンパク質（Ｃ１）である、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｃ１）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、宿主の細胞内で機能する葉緑体移行シグナルペプチドを付加したタンパク質。
＜１２＞前記葉緑体移行シグナルペプチドが、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のVCP1の葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のACPの葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のβ-ケトアシル-ACPシンターゼIIIの葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のβ-ケトアシル-ACPシンターゼIIの葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のβ-ケトアシル-ACPシンターゼIVの葉緑体移行シグナル配列、若しくはナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のアシル-ACPチオエステラーゼの葉緑体移行シグナル配列、又はこれらいずれか１つの葉緑体移行シグナル配列に１個若しくは数個、好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上６個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上２個以下、の変異が導入されたアミノ酸配列からなるペプチドである、前記＜１１＞項記載の方法。
【００７６】
＜１３＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つからなる遺伝子である、前記＜１＞〜＜１２＞のいずれか１項記載の方法。
（ａ）配列番号２の６７位〜４３８位の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の塩基配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有し、かつACP活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１４＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上１１２個以下、より好ましくは１個以上９３個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上５６個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１９個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上４個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつACP活性を有する前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつACP活性を有する前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードするＤＮＡ、である、前記＜１３＞項記載の方法。
＜１５＞前記遺伝子（ｃ）が下記ＤＮＡ（ｃ１）からなる遺伝子である、前記＜１３＞又は＜１４＞項記載の方法。
（ｃ１）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列の5'末端側に、宿主細胞内で機能する葉緑体移行シグナルペプチドをコードする塩基配列を連結したＤＮＡ。
＜１６＞前記葉緑体移行シグナルペプチドをコードする塩基配列が、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のVCP1の葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のACPの葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のβ-ケトアシル-ACPシンターゼIIIの葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のβ-ケトアシル-ACPシンターゼIIの葉緑体移行シグナル配列、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のβ-ケトアシル-ACPシンターゼIVの葉緑体移行シグナル配列、又はナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のアシル-ACPチオエステラーゼの葉緑体移行シグナル配列をコードする塩基配列である、前記＜１５＞項記載の方法。
【００７７】
＜１７＞前記形質転換体が、微生物の形質転換体である、前記＜１＞〜＜１６＞のいずれか１項記載の方法。
＜１８＞前記微生物が微細藻類である、前記＜１７＞項記載の方法。
＜１９＞前記微細藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類である、前記＜１８＞項記載の方法。
＜２０＞前記微細藻類が、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・アトムス、ナンノクロロプシス・マキュラタ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、及びナンノクロロプシス・エスピーからなる群より選ばれる、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、及びナンノクロロプシス・ガディタナからなる群より選ばれる、より好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータである、前記＜１８＞又は＜１９＞項記載の方法。
＜２１＞前記微生物が大腸菌である、前記＜１７＞項記載の方法。
【００７８】
＜２２＞前記形質転換体において、KAS遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の方法。
＜２３＞前記KASが、配列番号２７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質である、前記＜２２＞項記載の方法。
＜２４＞前記形質転換体において、デサチュラーゼ遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜２３＞のいずれか１項記載の方法。
＜２５＞前記デサチュラーゼが、Δ12-DES、Δ6-DES、ω3-DES、Δ5-DES、及びΔ9-DESからなる群より選ばれる少なくとも１つのデサチュラーゼ、好ましくはΔ12-DES、Δ6-DES、ω3-DES、及びΔ9-DESからなる群より選ばれる少なくとも１つのデサチュラーゼ、より好ましくはΔ12-DES、Δ6-DES、ω3-DES、及びΔ9-DESからなる群より選ばれる２つ以上のデサチュラーゼ、である、前記＜２４＞項記載の方法。
＜２６＞前記Δ12-DESが、配列番号３９若しくは４９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号３９若しくは４９で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質、配列番号３９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１若しくは複数個（例えば１個以上１７６個以下、好ましくは１個以上１５４個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１１０個以下、より好ましくは１個以上８８個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上４４個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質、又は配列番号４９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１若しくは複数個（例えば１個以上１８１個以下、好ましくは１個以上１５９個以下、より好ましくは１個以上１３６個以下、より好ましくは１個以上１１３個以下、より好ましくは１個以上９１個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上３７個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質、である、前記＜２５＞項記載の方法。
＜２７＞前記Δ12-DESをコードする遺伝子が、配列番号４０若しくは５０で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、配列番号４０若しくは５０で表される塩基配列との同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、配列番号４０で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１若しくは複数個（例えば１個以上５２７個以下、好ましくは１個以上４６１個以下、より好ましくは１個以上３９６個以下、より好ましくは１個以上３３０個以下、より好ましくは１個以上２６４個以下、より好ましくは１個以上１９８個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上１４個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、配列番号５０で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１若しくは複数個（例えば１個以上５４４個以下、好ましくは１個以上４７６個以下、より好ましくは１個以上４０８個以下、より好ましくは１個以上３４０個以下、より好ましくは１個以上２７２個以下、より好ましくは１個以上２０４個以下、より好ましくは１個以上１３６個以下、より好ましくは１個以上１０９個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１４個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、又は、配列番号４０若しくは５０で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、である、前記＜２５＞又は＜２６＞項記載の方法。
＜２８＞前記Δ6-DESが、配列番号４１若しくは５１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４１若しくは５１で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質、配列番号４１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１若しくは複数個（例えば１個以上１９０個以下、好ましくは１個以上１６６個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上４８個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質、又は配列番号５１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１若しくは複数個（例えば１個以上１９０個以下、好ましくは１個以上１６６個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上４８個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質、である、前記＜２５＞〜＜２７＞のいずれか１項記載の方法。
＜２９＞前記Δ6-DESをコードする遺伝子が、配列番号４２若しくは５２で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、配列番号４２若しくは５２で表される塩基配列との同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、配列番号４２で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１若しくは複数個（例えば１個以上５７０個以下、好ましくは１個以上４９９個以下、より好ましくは１個以上４２８個以下、より好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８５個以下、より好ましくは１個以上２１４個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１４個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１５個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、配列番号５２で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１若しくは複数個（例えば１個以上５７２個以下、好ましくは１個以上５００個以下、より好ましくは１個以上４２９個以下、より好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８６個以下、より好ましくは１個以上２１５個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１５個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、又は、配列番号４２若しくは５２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、である、前記＜２５＞〜＜２８＞のいずれか１項記載の方法。
＜３０＞前記ω3-DESが、配列番号４３若しくは５３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４３若しくは５３で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質、配列番号４３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１若しくは複数個（例えば１個以上１６４個以下、好ましくは１個以上１４４個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上３３個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつω3-DES活性を有するタンパク質、又は配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１若しくは複数個（例えば１個以上１６３個以下、好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上３３個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつω3-DES活性を有するタンパク質、である、前記＜２５＞〜＜２９＞のいずれか１項記載の方法。
＜３１＞前記ω3-DESをコードする遺伝子が、配列番号４４若しくは５４で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、配列番号４４若しくは５４で表される塩基配列との同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、配列番号４４で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１若しくは複数個（例えば１個以上４９４個以下、好ましくは１個以上４３２個以下、より好ましくは１個以上３７０個以下、より好ましくは１個以上３０９個以下、より好ましくは１個以上２４７個以下、より好ましくは１個以上１８５個以下、より好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上９９個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１３個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、配列番号５４で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１若しくは複数個（例えば１個以上４９０個以下、好ましくは１個以上４２９個以下、より好ましくは１個以上３６８個以下、より好ましくは１個以上３０６個以下、より好ましくは１個以上２４５個以下、より好ましくは１個以上１８４個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上９８個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１３個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、又は、配列番号４４若しくは５４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、である、前記＜２５＞〜＜３０＞のいずれか１項記載の方法。
＜３２＞前記Δ5-DESが、配列番号４５若しくは５５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４５若しくは５５で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質、配列番号４５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１若しくは複数個（例えば１個以上２１１個以下、好ましくは１個以上１８５個以下、より好ましくは１個以上１５８個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上７９個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上４３個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、より好ましくは１個以上６個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質、又は配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１若しくは複数個（例えば１個以上２０６個以下、好ましくは１個以上１８１個以下、より好ましくは１個以上１５５個以下、より好ましくは１個以上１２９個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、より好ましくは１個以上６個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質、である、前記＜２５＞〜＜３１＞のいずれか１項記載の方法。
＜３３＞前記Δ5-DESをコードする遺伝子が、配列番号４６若しくは５６で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、配列番号４６若しくは５６で表される塩基配列との同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、配列番号４６で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１若しくは複数個（例えば１個以上６３３個以下、好ましくは１個以上５５４個以下、より好ましくは１個以上４７５個以下、より好ましくは１個以上３９６個以下、より好ましくは１個以上３１７個以下、より好ましくは１個以上２３８個以下、より好ましくは１個以上１５９個以下、より好ましくは１個以上１２７個以下、より好ましくは１個以上８０個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上１６個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、配列番号５６で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１若しくは複数個（例えば１個以上６２０個以下、好ましくは１個以上５４２個以下、より好ましくは１個以上４６５個以下、より好ましくは１個以上３８７個以下、より好ましくは１個以上３１０個以下、より好ましくは１個以上２３３個以下、より好ましくは１個以上１５５個以下、より好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上１６個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、又は、配列番号４６若しくは５６で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、である、前記＜２５＞〜＜３２＞のいずれか１項記載の方法。
＜３４＞前記Δ9-DESが、配列番号４７若しくは５７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号４７若しくは５７で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質、配列番号４７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１若しくは複数個（例えば１個以上１４４個以下、好ましくは１個以上１２６個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質、又は配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列に、１若しくは複数個（例えば１個以上１３６個以下、好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上８５個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上５１個以下、より好ましくは１個以上３４個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入若しくは付加し、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質、である、前記＜２５＞〜＜３３＞のいずれか１項記載の方法。
＜３５＞前記Δ9-DESをコードする遺伝子が、配列番号４８若しくは５８で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、配列番号４８若しくは５８で表される塩基配列との同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１若しくは複数個（例えば１個以上４３２個以下、好ましくは１個以上３７８個以下、より好ましくは１個以上３２４個以下、より好ましくは１個以上２７０個以下、より好ましくは１個以上２１６個以下、より好ましくは１個以上１６２個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上８７個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上１１個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、配列番号５８で表される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列において１若しくは複数個（例えば１個以上４１０個以下、好ましくは１個以上３５９個以下、より好ましくは１個以上３０７個以下、より好ましくは１個以上２５６個以下、より好ましくは１個以上２０５個以下、より好ましくは１個以上１５４個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１１個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、又は、配列番号４８若しくは５８で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、である、前記＜２５＞〜＜３４＞のいずれか１項記載の方法。
＜３６＞前記形質転換体において、エロンガーゼ遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜３５＞のいずれか１項記載の方法。
＜３７＞前記形質転換体において、TE遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜３６＞のいずれか１項記載の方法。
＜３８＞前記TEが、配列番号３７及び５９〜６１のいずれか１つに示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質である、前記＜３７＞項記載の方法。
【００７９】
＜３９＞前記脂肪酸又は脂質が、長鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサテトラエン酸、アラキドン酸、若しくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはオレイン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはアラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜１＞〜＜３８＞のいずれか１項記載の方法。
＜４０＞ｆ／２培地を用いて前記藻類を培養する、前記＜１＞〜＜３９＞のいずれか１項記載の方法。
【００８０】
＜４１＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）、並びに（Ｃ１）。
＜４２＞前記＜４１＞項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜４３＞前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）、並びに（ｃ１）のいずれか１つからなる遺伝子。
＜４４＞前記＜４２＞又は＜４３＞項記載の遺伝子を含有する、組換えベクター又はＤＮＡカセット。
【００８１】
＜４５＞前記＜４２＞〜＜４４＞のいずれか１項記載の遺伝子、組換えベクター又はＤＮＡカセットを含んでなる、形質転換体。
＜４６＞前記＜４２＞又は＜４３＞項記載の遺伝子の発現を促進させた、形質転換体。
＜４７＞前記KAS遺伝子の発現を促進させた、前記＜４５＞又は＜４６＞項記載の形質転換体。
＜４８＞前記デサチュラーゼ遺伝子の発現を促進させた、前記＜４５＞〜＜４７＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜４９＞前記エロンガーゼ遺伝子の発現を促進させた、前記＜４５＞〜＜４８＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜５０＞前記TE遺伝子の発現を促進させた、前記＜４５＞〜＜４９＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜５１＞前記＜４２＞〜＜４４＞のいずれか１項記載の遺伝子、組換えベクター又はＤＮＡカセットを導入する、形質転換体の作製方法。
＜５２＞前記KAS遺伝子を導入する、前記＜５１＞項記載の形質転換体の作製方法。
＜５３＞前記デサチュラーゼ遺伝子を導入する、前記＜５１＞又は＜５２＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜５４＞前記エロンガーゼ遺伝子を導入する、前記＜５１＞〜＜５３＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜５５＞前記TE遺伝子を導入する、前記＜５１＞〜＜５４＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜５６＞前記形質転換体が、微生物の形質転換体である、前記＜４５＞〜＜５５＞のいずれか１項記載の形質転換体、又はその作製方法。
＜５７＞前記微生物が微細藻類である、前記＜５６＞項記載の形質転換体、又はその作製方法。
＜５８＞前記微細藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類である、前記＜５７＞項記載の形質転換体、又はその作製方法。
＜５９＞前記微細藻類が、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・アトムス、ナンノクロロプシス・マキュラタ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、及びナンノクロロプシス・エスピーからなる群より選ばれる、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、及びナンノクロロプシス・ガディタナからなる群より選ばれる、より好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータである、前記＜５７＞又は＜５８＞項記載の藻類又はその作製方法。
＜６０＞前記微生物が大腸菌である、前記＜５６＞項記載の形質転換体、又はその作製方法。
【００８２】
＜６１＞脂質を製造するための、前記＜４１＞〜＜６０＞のいずれか１項記載のタンパク質、遺伝子、組換えベクター若しくはＤＮＡカセット、形質転換体、又は形質転換体の作製方法により得られた形質転換体の使用。
＜６２＞前記脂質が、長鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサテトラエン酸、アラキドン酸、若しくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはオレイン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはアラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜６１＞項記載の使用。
【実施例】
【００８３】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１に示す。【００８４】
【表１】
2018062015.tif 000002
【００８５】
比較例  NoACP1遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータへ導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂質の製造
（１）ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
ゼオシン耐性遺伝子（配列番号３）、及び文献（Nature Communications, DOI:10.1038/ncomms1688, 2012）に記載されている、ナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来チューブリンプロモーター配列（配列番号４）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示す５及び配列番号６のプライマー対、配列番号７及び配列番号８のプライマー対を用いてPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ増幅した。
また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（独立行政法人国立環境研究所(NIES)より入手）のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号９及びプライマー番号１０のプライマー対を用いてPCRを行い、ヒートショックプロテインターミネーター配列（配列番号１１）を増幅した。
さらに、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示すプライマー番号１２及びプライマー番号１３のプライマー対を用いてPCRを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。【００８６】
これら４つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）にて処理し、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製)を用いて精製した。その後、得られた４つの断片をIn-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
なお、本発現プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。【００８７】
（２）NoACP1遺伝子の取得、及びNoACP1遺伝子発現用プラスミドの構築
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株の全ＲＮＡを抽出し、SuperScript（商標）III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（invitrogen社製）を用いて逆転写を行ってcDNAを得た。このcDNAを鋳型として、表１に示すプライマー番号１４及びプライマー番号１５のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２の塩基配列からなる遺伝子断片（NoACP1遺伝子）を取得した。
また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対、並びにプライマー番号１８及びプライマー番号１９のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、LDSPプロモーター配列（配列番号２０）及びVCP1ターミネーター配列（配列番号２１）を取得した。
さらに、前記ゼオシン耐性遺伝子発現プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号２２及びプライマー番号１３のプライマー対を用いてPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）及びpUC19配列からなる断片を増幅した。【００８８】
NoACP1遺伝子断片を、LDSPプロモーター断片、VCP1ターミネーター断片、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット及びpUC19配列からなる断片と混和した。そして、これら４つの増幅断片を、前述の方法と同様の方法にて融合し、NoACP1遺伝子発現用プラスミドを構築した。
なお、本発現プラスミドはLDSPプロモーター配列、NoACP1遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。【００８９】
（３）NoACP1遺伝子発現用カセットのナンノクロロプシス・オキュラータへの導入
前記NoACP1遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１０及びプライマー番号１６のプライマー対を用いてPCRを行い、NoACP1遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、NoACP1遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるDNA断片）を増幅した。
増幅したDNA断片を、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。【００９０】
約1×109細胞のナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株を、384mMのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したNoACP1遺伝子発現カセット約500ngを宿主細胞と混和し、50μF、500Ω、2,200v/2mmの条件でエレクトロポレーションを行った。
ｆ／２液体培地（NaNO3 75mg、NaH2PO4・2H2O 6mg、ビタミンB12 0.5μg、ビオチン 0.5μg、チアミン 100μg、Na2SiO3・9H2O 10mg、Na2EDTA・2H2O 4.4mg、FeCl3・6H2O 3.16mg、FeCl3・6H2O 12μg、ZnSO4・7H2O 21μg、MnCl2・4H2O 180μg、CuSO4・5H2O 7μg、Na2MoO4・2H2O 7μg／人工海水1L）にて２４時間回復培養を行った。その後、2μg/mLのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、NoACP1遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株をPCR法により選抜した。【００９１】
（４）NoACP1遺伝子を含んでなる形質転換体による脂肪酸の生産
選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を１５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、「Ｎ１５Ｐ５培地」という）20mLに播種し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３〜４週間振盪培養し、前培養液とした。それぞれ独立した３ラインの藻類の前培養液を、ｆ／２培地の窒素濃度を３０倍、リン濃度を３０倍に増強した培地（以下、「Ｎ３０Ｐ３０培地」という）に植継ぎ（１０％植継ぎ）、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて１１日間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株についても同様に実験を行った。【００９２】
（５）脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
培養液0.5mLに、内部標準として1mg/mLのトリヘプタデカン酸グリセリル（Glyceryl triheptadecanoate、シグマアルドリッチ製）クロロホルム溶液を50μL添加後、クロロホルム0.5mL及びのメタノール1mLを培養液に添加して激しく攪拌、10分間放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%KCl 0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて5分間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、0.5N水酸化カリウム（メタノール溶液）0.7mLを添加し、80℃にて30分間恒温した。さらに、14%三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）1mLを添加し、80℃にて10分間恒温した。その後、ヘキサン0.5mL、及び飽和食塩水1mLを添加し激しく撹拌し、室温にて10分間放置し、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。【００９３】
下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
分析装置：7890A（Agilent technology社製）
キャピラリーカラム：DB-1 MS（30m×200μm×0.25μm、J&W Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
オーブン温度：150℃保持0.5分→150〜220℃（40℃/min昇温）→220〜320℃（20℃/min昇温）→320℃保持2分（ポストラン2分）
注入口温度：300℃
注入方法：スプリット注入（スプリット比：７５：１）
注入量：1μL
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出方法：ＦＩＤ
検出器温度：300℃【００９４】
脂肪酸エステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準であるトリヘプタデカン酸グリセリル由来のC17脂肪酸メチルエステルのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液1Lあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。
その結果を表２に示す。なお、以下の表において、「TFA」は総脂肪酸量を、「脂肪酸組成(%TFA)」は総脂肪酸の重量に対する各脂肪酸の重量の割合を示す。また、「n」は０〜５の整数であり、例えば「C18:n」と記載した場合には、組成がC18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C18:4及びC18:5の脂肪酸を表す。【００９５】
【表２】
2018062015.tif 000003
【００９６】
表２から明らかなように、NoACP1遺伝子発現カセットを導入した藻類（NoACP1遺伝子導入株）は、野生株（NIES2145）と比較して、長鎖脂肪酸量、総脂肪酸量、脂肪酸組成ともに大きな変化は見られなかった。【００９７】
実施例１  葉緑体移行シグナルを連結したNoACP1(Δ1-22)遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータへ導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂質の製造
（１）NoACP1の細胞内局在の予測
細胞内局在予測サイトTargetPを利用し、NoACP1が細胞内でどの部位に局在するを予測した。
その結果、NoACP1は高いスコア（0.943）でミトコンドリアに局在することが示唆された。そして、配列番号１の１〜２２位のアミノ酸配列が、ミトコンドリア局在シグナルのアミノ酸配列であると推定された。【００９８】
（２）葉緑体移行シグナルを連結したNoACP1(Δ1-22)遺伝子発現用プラスミドの構築
比較例で作製したナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のcDNAを鋳型として、表１に示すプライマー番号２３及びプライマー番号２４に示すプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２５の塩基配列からなるVCP1葉緑体移行シグナル断片を取得した。
また、比較例で作製したNoACP1遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号２６及び表１に示すプライマー番号１７のプライマー対を用いてPCRを行い、ミトコンドリア局在シグナルを削除したNoACP1(Δ1-22)遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列、LDSPプロモーター配列からなるDNA断片を得た。
得られたDNA断片とVCP1葉緑体移行シグナル断片を比較例と同様の方法にて連結し、葉緑体移行シグナルを連結したNoACP1(Δ1-22)遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドは、LDSPプロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、ミトコンドリア局在シグナルを削除したNoACP1(Δ1-22)遺伝子（配列番号２の６７〜４４１位の塩基配列）、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
なお、VCP1葉緑体移行シグナルがナンノクロロプシスの細胞内でタンパク質を葉緑体に局在化させられることは、Protist.，2015, vol. 166(1), p. 161-171に示されている。【００９９】
（３）葉緑体移行シグナルを連結したNoACP1(Δ1-22)遺伝子発現用カセットのナンノクロロプシス・オキュラータへの導入
構築した葉緑体移行シグナル連結NoACP1(Δ1-22)遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１０及びプライマー番号１６のプライマー対を用いてPCRを行い、葉緑体移行シグナルを連結したNoACP1(Δ1-22)遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、ミトコンドリア局在シグナルを削除したNoACP1(Δ1-22)遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるDNA断片）を増幅した。増幅した断片を比較例と同様の方法にて精製し、生成した断片を用いて、比較例と同様にナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株の形質転換を行った。【０１００】
（４）葉緑体移行シグナルを連結したNoACP1(Δ1-22)遺伝子を導入した形質転換体による脂肪酸の生産、脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
得られた藻類を、ｆ／２培地の窒素濃度を５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、「Ｎ５Ｐ５培地」という）に播種し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３週間振盪培養し、前培養液とした。得られた前培養液をＮ５Ｐ５培地に植継ぎ（１０％植継ぎ）、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて１４日間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株についても同様に試験を行った。
得られた培養液を用いて、比較例と同様の方法にて脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析を行った。結果を表３に示す。【０１０１】
【表３】
2018062015.tif 000004
【０１０２】
表３に示すように、葉緑体移行シグナルを連結したNoACP1(Δ1-22)遺伝子発現用カセットを導入した形質転換体（Svcp1-NoACP1(Δ1-22)）は、野生株（NIES2145）と比較して、脂肪酸組成に大きな変化が確認できた。具体的には、中鎖脂肪酸、特にＣ１４：０及びＣ１６：１の割合が大きく減少した。そして、長鎖脂肪酸（Ｃ１８：ｎ及びＣ２０：ｎ）量の割合が顕著に増加した。【０１０３】
（５）葉緑体移行シグナルを連結したNoACP1(Δ1-22)遺伝子を導入した形質転換体が生産する脂肪酸の詳細な分析
葉緑体移行シグナルを連結したNoACP1(Δ1-22)遺伝子を導入した形質転換体と野生株（NIES2145）を前述の条件と同じ条件下で１４日間培養し、脂質抽出を行った。そして、下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。その結果を表４に示す。なお、表４において「Ｃ２０：ｎ」はＣ２０：３、Ｃ２０：４、及びＣ２０：５脂肪酸の割合の総和を示す。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
分析装置：7890A（Agilent technology社製）
キャピラリーカラム：DB-WAX（10m×100μm×0.10μm、J＆W Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
オーブン温度：100℃保持0.5分→100〜250℃（20℃/min昇温）→250℃保持3分（ポストラン：1分）
注入口温度：300℃
注入方法：スプリット注入（スプリット比：５０：１）
注入量：5μＬ
洗浄バイアル：メタノール
検出方法：ＦＩＤ
検出器温度：350℃【０１０４】
【表４】
2018062015.tif 000005
【０１０５】
表４に示すように、葉緑体移行シグナルを連結したNoACP1(Δ1-22)遺伝子発現用カセットを導入した形質転換体（Svcp1-NoACP1(Δ1-22)）は、野生株（NIES2145）と比較して、全脂肪酸に占める長鎖脂肪酸量の割合と、長鎖脂肪酸の生産量が増加した。中でも特に、C18:1(Δ9)（オレイン酸）量、C20:4(Δ5,8,11,14)（アラキドン酸）量、及びC20:5(Δ5,8,11,14,17)（エイコサペンタエン酸）量の割合が顕著に増加していた。【０１０６】
実施例２  NoACP1(Δ1-22)遺伝子とデサチュラーゼ遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータへ導入した形質転換体の作製、並びに形質転換体による脂質の製造
（１）デサチュラーゼ遺伝子の取得
比較例で作製したナンノクロロプシス・オキュラータＮＩＥＳ２１４５株のｃＤＮＡを鋳型として、表１に示す配列番号６２及び配列番号６３のプライマー対、配列番号６４及び配列番号６５のプライマー対、配列番号６６及び配列番号６７のプライマー対、並びに配列番号６８及び配列番号６９のプライマー対を用いてPCRを行い、Δ9-DES遺伝子（配列番号４８）、Δ12-DES遺伝子（配列番号４０）、Δ6-DES遺伝子（配列番号４２）、並びにω3-DES遺伝子（配列番号４４）をそれぞれ増幅した。得られた断片をそれぞれ比較例と同様の方法でプラスミドベクターpUC19に連結し、デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミドを構築した。
なお、これら発現用プラスミドはLDSPプロモーター配列、各種デサチュラーゼ（Δ9-DES、Δ12-DES、Δ6-DES、ω3-DES）遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。【０１０７】
（２）デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）の構築
人工合成したパロモマイシン耐性遺伝子（配列番号７０）を鋳型とし、表１に示す配列番号７１及び配列番号７２のプライマー対を用いてPCRを行い、パロモマイシン耐性遺伝子断片を取得した。
また、前記デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミドをそれぞれ鋳型とし、表１に示す配列番号７３及び配列番号７４のプライマー対を用いてPCRを行った。得られたそれぞれの断片と、パロモマイシン耐性遺伝子断片とを比較例と同様の方法で融合し、各種デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）を構築した。
なお、これら発現用プラスミドはLDSPプロモーター配列、各種デサチュラーゼ（Δ9-DES、Δ12-DES、Δ6-DES、ω3-DES）遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。【０１０８】
（３）２種類のデサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）の構築
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示す配列番号７５及び配列番号７６のプライマー対、並びに配列番号７７及び配列番号７８のプライマー対を用いてPCRを行い、グルタミン合成酵素プロモーター（配列番号７９）断片、及びLDSPターミネーター（配列番号８０）断片をそれぞれ増幅した。
また、前記Δ9-DES遺伝子発現用プラスミド、ω3-DES遺伝子発現用プラスミド、及びΔ6-DES遺伝子発現用プラスミドをそれぞれ鋳型として、表１に示す配列番号８２及び配列番号８３のプライマー対、配列番号８４及び配列番号８５のプライマー対、並びに配列番号８６及び配列番号８７のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、Δ9-DES遺伝子断片、ω3-DES遺伝子断片、及びΔ6-DES遺伝子断片をそれぞれ取得した。
さらに、前記Δ12-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）を鋳型として、表１に示す配列番号８１及び配列番号１３のプライマー対を用いてPCRを行った。得られた増幅断片、グルタミン合成酵素プロモーター断片、LDSPターミネーター断片、及びデサチュラーゼ遺伝子断片（Δ9-DES遺伝子断片、ω3-DES遺伝子断片、Δ6-DES遺伝子断片）とそれぞれ融合し、２種類のデサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）を構築した。
なお、これらのプラスミドは、グルタミン合成酵素プロモーター配列、各種デサチュラーゼ（Δ9-DES、ω3-DES、Δ6-DES）遺伝子、LDSPターミネーター配列、LDSPプロモーター配列、Δ12-DES遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。【０１０９】
（４）デサチュラーゼ遺伝子を用いたSvcp1-NoACP1(Δ1-22)株の形質転換
構築したデサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）を鋳型として、表１に示すプライマー番号１０及びプライマー番号１６のプライマー対を用いてPCRを行い、デサチュラーゼ遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、デサチュラーゼ（Δ9-DES、Δ12-DES、ω3-DES）遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるDNA断片）を増幅した。
増幅した断片を比較例と同様の方法にて精製し、精製した断片を用いて、比較例と同様の方法で、実施例１で作製したSvcp1-NoACP1(Δ1-22)株の形質転換を行った。【０１１０】
また、構築した２種類のデサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）を鋳型として、表１に示すプライマー番号１０及びプライマー番号８８のプライマー対を用いてPCRを行い、２種類のデサチュラーゼ遺伝子発現カセット（グルタミン合成酵素プロモーター配列、デサチュラーゼ（Δ9-DES、ω3-DES、Δ6-DES）遺伝子、LDSPターミネーター配列、LDSPプロモーター配列、Δ12-DES遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるDNA断片）を増幅した。
増幅した断片を比較例と同様の方法にて精製し、精製した断片を用いて、比較例と同様の方法で、実施例１で作製したSvcp1-NoACP1(Δ1-22)株の形質転換を行った。【０１１１】
比較例と同様の方法にて形質転換体の回復培養を行った後、2μg/mLゼオシン及び100μg/mLパロモマイシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、各種デサチュラーゼ遺伝子発現カセットを含む形質転換体をそれぞれ３〜４ラインずつ選抜した。以下、取得した形質転換体をそれぞれSvcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びΔ9-DES遺伝子を導入した株(Svcp1-NoACP1(Δ1-22) + delta9 DES)、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びΔ12-DES遺伝子を導入した株(Svcp1-NoACP1(Δ1-22) + delta12 DES)、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びω3-DES遺伝子を導入した株(Svcp1-NoACP1(Δ1-22) + omega3 DES)、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子、Δ12-DES遺伝子及びΔ9-DES遺伝子を導入した株(Svcp1-NoACP1(Δ1-22) + delta12 DES + delta9 DES)、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子、Δ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子を導入した株(Svcp1-NoACP1(Δ1-22) + delta12 DES + delta6 DES)、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子、Δ12-DES遺伝子及びω3-DES遺伝子を導入した株(Svcp1-NoACP1(Δ1-22) + delta12 DES + omega3 DES)、とも記載する。【０１１２】
（５）形質転換体の培養、脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
選抜した形質転換体を、Ｎ１５Ｐ５培地4mL（組織培養用マイクロプレート、IWAKI）に播種し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３〜４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液0.4mLをＮ５Ｐ５培地4mL（組織培養用マイクロプレート、IWAKI）に植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３週間振盪培養した。なお、比較対照として、野生株及びSvcp1-NoACP1(Δ1-22)株についても同様の実験を行った。
得られた培養液を用いて、比較例と同様の方法にて脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析を行った。３週目の総脂肪酸の生産量及び脂肪酸組成の結果を表５に示す。なお、各形質転換体につき独立した３〜４ラインの評価を行ったので、表５にはその平均値及び標準誤差を「平均値±標準誤差」の形で示す。【０１１３】
【表５】
2018062015.tif 000006
【０１１４】
表５に示すように、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びΔ9-DES遺伝子を導入した株は、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)株と比較して、C18:1(Δ9)量の割合がより一層増加した。
また、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びΔ12-DES遺伝子を導入した株は、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)株と比較して、C18:2(Δ9,12)量の割合がより一層向上した。
また、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びω3-DES遺伝子を導入した株は、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)株と比較して、C20:5(Δ5,8,11,14,17)量の割合がより一層増加した。
また、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子、Δ12-DES遺伝子及びΔ9-DES遺伝子を導入した株は、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)株やSvcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びΔ9-DES遺伝子を導入した株、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びΔ12-DES遺伝子を導入した株と比較して、C18:2(Δ9,12)量の割合がさらにより一層向上した。
また、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子、Δ12-DES遺伝子及びω3-DES遺伝子を導入した株は、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)株やSvcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びΔ12-DES遺伝子を導入した株、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びω3-DES遺伝子を導入した株と比較して、C20:5(Δ5,8,11,14,17)量及びC20:n量の割合がさらにより一層向上した。
さらに、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子、Δ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子を導入した株は、Svcp1-NoACP1(Δ1-22)株やSvcp1-NoACP1(Δ1-22)遺伝子及びΔ12-DES遺伝子を導入した株と比較して、C18:3(Δ6,9,12)量やC20:n（特にC20:3(Δ8,11,14)及びC20:4(Δ5,8,11,14)）量の割合がより一層向上した。【０１１５】
このように、本発明で規定するNoACP1遺伝子に加えて適切なデサチュラーゼ遺伝子の発現を強化することにより、所望の長鎖不飽和脂肪酸の割合や生産性を向上させることが明らかになった。【０１１６】
以上のように、本発明で規定するACPをコードする遺伝子を宿主に導入することで、長鎖脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、長鎖脂肪酸の生産性を向上させることができる。【０１１７】
本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。【０１１８】
本願は、2016年9月27日に日本国で特許出願された特願2016-188294に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。
【配列表】
2018062015000001.app
【国際調査報告】
2018062015.tif 000007
2018062015.tif 000008
2018062015.tif 000009
2018062015.tif 000010