(57)【要約】  本発明は、生分解性プラスチック分解酵素及びそれを含む微生物の培養物の新規用途を提供することを目的としている。エステラーゼ及び／又はキシラナーゼにより、植物の病害抵抗性を増強又は植物の病害を防除することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エステラーゼ及び／又はキシラナーゼを含む、植物の病害抵抗性増強用又は植物病害防除用組成物。
【請求項２】
前記エステラーゼが、生分解性プラスチック分解酵素を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記生分解性プラスチック分解酵素が、クチナーゼ及びクチナーゼ様酵素から成る群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記エステラーゼ及び／又は前記キシラナーゼが、微生物培養液又は抽出液である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記微生物が、シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属、パラフォーマ（Ｐａｒａｐｈｏｍａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、テルモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、トルラ（Ｔｏｒｕｌａ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、マルブランケア（Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ）属、アルタナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ぺニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ペキロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、及び、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属から成る群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記エステラーゼの濃度が、０．００５〜０．５Ｕ／ｍＬである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記エステラーゼ及び前記キシラナーゼの両方を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記植物が、クチクラ層を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記植物が、高等植物である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物によって植物を処理する工程を含む、植物の病害抵抗性を増強又は植物の病害を防除する方法。
【請求項１１】
前記処理工程が、前記組成物を前記植物に噴霧する工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記噴霧工程が、前記組成物を前記植物の葉１枚あたり０．１〜１ｍＬ噴霧する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エステラーゼ及び／又はキシラナーゼを使用することで、植物の病害抵抗性を増強又は植物の病害を防除する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
植物には動物の免疫に準じるような生体防御システムが備わっており、この機能が発動すると、植物は、様々な防御システムを作動し、発病しにくい植物体となる。最近、殺菌剤の開発においては、環境保全や薬剤耐性菌回避の観点から、それらの防御システムを利用して病気を抑えようとする薬剤の探索が盛んに行われている。これらの薬剤には、（１）複数の病原菌に対して予防的な効果がある（作用スペクトルが広い）、（２）耐性菌の出現率が極めて低い、（３）防除効果が長期間持続する、（４）生態系自体への直接の影響は少ないという特徴を有している。一方で、こうした活性を持つ化合物の探索や評価が、殺菌性の農薬と比較して困難なため、実用化に至った化合物は限られている。また、国内で市販されている薬剤は、全てイネを対象としているが、様々な作物でも同様な薬剤が必要とされている。【０００３】
また、植物の表層は、外界からのストレス、特に蒸散や降雨によって引き起こされる浸透圧ストレス、病原菌の侵入、害虫による食害から身を守るために、クチクラ層とワックスで覆われている。このクチクラ層に含まれるクチン（脂肪酸ポリエステル）を加水分解する酵素はクチナーゼと呼ばれている。【０００４】
最近、植物常在性の酵母や糸状菌から得た酵素により、生分解性プラスチック製農業資材を使用後に速やかに分解させるための技術が開発されている（特許文献１及び２）。また、複数の酵素を大量生産する技術も開発されており（特許文献３及び４、非特許文献１）、安価な酵素液が市場で大量に入手可能になる見込みがある。そして、これら糸状菌や酵母由来の生分解性プラスチック分解酵素を高濃度で含む培養ろ液を植物に処理すると、植物が枯れる現象が見出されている。このとき、クチクラ層は薄くなっており、植物病原菌に感染しやすくなることから、生分解性プラスチック分解酵素のようなクチクラ層の一部を分解し得る酵素は、除草剤として有害植物の駆除に用いることができる（特許文献５）。また、酵母Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来の生分解性プラスチック分解酵素を含む培養液には、キシラナーゼ（ヘミセルロース分解酵素）も含まれていることが見出されている（非特許文献２）。しかしながら、酵母由来の生分解性プラスチック分解酵素で、実際にクチン分解活性を有するものは確認されていなかった。また、生分解性プラスチック分解酵素で、植物の病害抵抗性を増強し、植物の病害を防除する方法も知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４９１５５９３号
【特許文献２】特許第５０８２１２５号
【特許文献３】特許第５８４９２９７号
【特許文献４】国際公開第２０１４／１０９３６０号
【特許文献５】特開２０１４−１２９２８７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｌｅｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１６）、６５（３）２５７−２６２
【非特許文献２】ＡＭＢ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（２０１５）、５：３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまで、生分解性プラスチック分解酵素及びそれを含む糸状菌又は酵母などの微生物の培養物の応用範囲は限られており、その酵素及び培養物の潜在能力を十分に生かし切れていなかった。本発明は、生分解性プラスチック分解酵素及びそれを含む微生物の培養物の新規用途を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、意外なことに、生分解性プラスチック分解酵素として用いられていた微生物の培養物が、その中に含まれているエステラーゼ及び／又はキシラナーゼの作用を介して、病原菌の感染抑制作用及び病原菌発芽抑制作用を奏すること、並びに、植物のストレス抵抗性遺伝子の発現を上昇させることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下に示す植物の病害抵抗性増強用又は植物病害防除用組成物、及び、それらを用いた植物の病害抵抗性を増強又は植物の病害を防除する方法を提供するものである。
〔１〕エステラーゼ及び／又はキシラナーゼを含む、植物の病害抵抗性増強用又は植物病害防除用組成物。
〔２〕前記エステラーゼが、生分解性プラスチック分解酵素を含む、前記〔１〕に記載の組成物。
〔３〕前記生分解性プラスチック分解酵素が、クチナーゼ及びクチナーゼ様酵素から成る群から選択される、前記〔２〕に記載の組成物。
〔４〕前記エステラーゼ及び／又は前記キシラナーゼが、微生物培養液又は抽出液である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔５〕前記微生物が、シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属、パラフォーマ（Ｐａｒａｐｈｏｍａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、テルモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、トルラ（Ｔｏｒｕｌａ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、マルブランケア（Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ）属、アルタナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ぺニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ペキロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、及び、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属から成る群から選択される、前記〔４〕に記載の組成物。
〔６〕前記エステラーゼの濃度が、０．００５〜０．５Ｕ／ｍＬである、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔７〕前記エステラーゼ及び前記キシラナーゼの両方を含む、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔８〕前記植物が、クチクラ層を有する、前記〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔９〕前記植物が、高等植物である、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔１０〕前記〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の組成物によって植物を処理する工程を含む、植物の病害抵抗性を増強又は植物の病害を防除する方法。
〔１１〕前記処理工程が、前記組成物を前記植物に噴霧する工程を含む、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記噴霧工程が、前記組成物を前記植物の葉１枚あたり０．１〜１ｍＬ噴霧する工程を含む、前記〔１１〕に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に従えば、微生物の培養物中に含まれている生分解性プラスチック分解酵素であるエステラーゼ、及び／又は、同培養物中に含まれているキシラナーゼにより、植物の病害抵抗性を増強又は植物の病害を防除することができる。植物の病害抵抗性増強剤は、古くから研究されているが、現在国内で製品になったものは、イネを対象とする３種の薬剤しか知られていない。しかしながら、本発明のエステラーゼ及び／又はキシラナーゼによる病害抵抗性増強作用又は病害防除作用は、イネ科植物だけではなく、トマト、シロイナズナ、及びタバコなどの幅広い作物種で利用できるものであり、汎用性が高い。また、本発明の有効成分であるエステラーゼ及びキシラナーゼは、従来の病害抵抗性増強剤として知られていたような低分子化合物ではなく、タンパク質であるので、これは自然界で容易に分解され、低分子化合物などで起こる環境中への残存性はなく、環境負荷が低い。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】葉の病徴変化を示す写真。
【図１Ｂ】葉の病徴変化を示すグラフ。
【図２Ａ】病原菌胞子の顕微鏡写真。
【図２Ｂ】病原菌胞子の発芽率のグラフ。
【図３】病原菌由来のＤＮＡ量のグラフ。
【図４】病原菌を含む葉の顕微鏡写真。
【図５】植物のストレス抵抗性遺伝子のグラフ。
【図６】植物の活性酸素種応答遺伝子のグラフ。
【図７Ａ】葉の写真。
【図７Ｂ】発病度のグラフ。
【図８Ａ】葉の写真。
【図８Ｂ】発病度のグラフ。
【図９Ａ】葉の写真。
【図９Ｂ】病斑直径のグラフ。
【図１０Ａ】葉の写真。
【図１０Ｂ】発病度のグラフ。
【図１１Ａ】葉の写真。
【図１１Ｂ】発病度のグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、エステラーゼ及び／又はキシラナーゼを含む、植物の病害抵抗性増強用又は植物病害防除用組成物に関するものである。
本明細書に記載の「エステラーゼ」とは、エステルを水との化学反応で酸とアルコールに分解する加水分解酵素のことをいう。本発明のエステラーゼとしては、クチクラ層の一部を分解する活性を有しているものであれば、種々のエステラーゼを制限なく使用することができ、例えば、生分解性プラスチック分解酵素として利用されている酵素を採用してもよい。
【００１２】
本明細書に記載の「生分解性プラスチック分解酵素」とは、生分解性プラスチックを分解する活性を有する酵素のことをいう。本発明の組成物には、生分解性プラスチックを分解する活性を有する酵素であれば、種々の酵素を制限なく使用することができ、例えば、クチナーゼ又はクチナーゼ様酵素を採用してもよい。前記生分解性プラスチックを分解する活性は、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート（ＰＢＳＡ）エマルジョンの分解活性を測定することにより、あるいは、ＰＢＳＡ、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンアジペートテレフタレート、及びポリ乳酸などの生分解性プラスチックフィルムの分解活性を測定することにより、決定することができる。
【００１３】
本明細書に記載の「キシラナーゼ」とは、キシランをキシロースに分解する活性を有する酵素のことをいい、植物細胞壁中のヘミセルロースを分解することができる。本発明の組成物には、ヘミセルロースを分解する活性を有する酵素であれば、種々のキシラナーゼを制限なく使用することができる。
【００１４】
前記エステラーゼ及び前記キシラナーゼは、微生物によって産生され得る。本発明の組成物には、当該微生物から単離精製したエステラーゼ及び／又はキシラナーゼを使用してもよく、当該微生物の培養液（培養ろ液）又は抽出液をエステラーゼ及び／又はキシラナーゼとして使用してもよい。前記エステラーゼ及び／又は前記キシラナーゼを産生する微生物は、特に限定されるものではないが、例えば、シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属、パラフォーマ（Ｐａｒａｐｈｏｍａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、テルモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、トルラ（Ｔｏｒｕｌａ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、マルブランケア（Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ）属、アルタナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ぺニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ペキロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、及び、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属から成る群から選択される微生物であってもよい。
【００１５】
前記エステラーゼとしての生分解性プラスチック分解酵素は、好ましくは、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ（例えば、ＧＢ−４（１）Ｗ株、ＧＢ−４（０）−ＨＰＭ７株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された酵母；受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２３８）及びＯＭＭ６２−２株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された酵母；受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２３９）など）により産生されるエステラーゼ（ＰａＥ）、Ｐａｒａｐｈｏｍａ属類縁菌クチナーゼ様酵素（ＰＣＬＥ）、又は、クチナーゼ様酵素１（ＣｍＣｕｔ１）である。ＰＣＬＥは、Ｐａｒａｐｈｏｍａ属類縁菌Ｂ４７−９株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された糸状菌；受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５７３；要すれば特許第５０８２１２５号参照）などのＰａｒａｐｈｏｍａ属類縁菌により産生される酵素であり、ＣｍＣｕｔ１は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ類縁菌ＢＰＤ１Ａ株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された酵母；受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１３４）などのＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ又はその類縁菌により産生される酵素である。
【００１６】
本発明の組成物中における前記エステラーゼの濃度は、適用対象の植物の種類及びその病原菌の種類に応じて適宜調整され得る。前記エステラーゼの濃度は、例えば０．００５〜０．５Ｕ／ｍＬであってもよく、好ましくは０．００６〜０．２Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは０．００７〜０．０７Ｕ／ｍＬである。
なお、ここで示すエステラーゼの力価は、生分解性プラスチックであるポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート（ＰＢＳＡ）エマルジョン（昭和電工株式会社、ＥＭ−３０１）の濁度の減少量を測定することで決定されたものである。ＯＤ６６０ｎｍの値を１分間に１低下させるときの力価を１Ｕと定義した。酵素活性測定時の緩衝液としては、例えば、トリス塩酸緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、塩化カルシウム（２ｍＭ）なし又はあり）を使用してもよい。
【００１７】
本発明の組成物中における前記キシラナーゼの濃度は、適用対象の植物の種類及びその病原菌の種類に応じて適宜調整され得る。前記キシラナーゼの濃度は、例えば０．００１〜５．０Ｕ／ｍＬであってもよく、好ましくは０．００５〜１．０Ｕ／ｍＬである。
なお、ここで示すキシラナーゼの力価は、キシランを分解したときに生じるキシロースの量を、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）、４４（１２）、２９４３−２９４９に示されているようなソモギ−ネルソン法の改良法によって測定されたものである。１分間に１μｍｏｌのキシロースを生成する力価を１Ｕと定義した。
【００１８】
本発明の組成物には、前記エステラーゼ又は前記キシラナーゼを単独で使用してもよいが、両者を併せて使用してもよい。作用機序の異なる両酵素を併用することで、相乗的な植物の病害抵抗性増強作用及び／又は植物病害防除作用が奏される。前記エステラーゼ及び前記キシラナーゼを併用する際には、それぞれ単離精製したエステラーゼ及びキシラナーゼを同じ組成物中に配合してもよいが、これらの酵素を始めから含んでいる微生物培養液又は抽出液を使用すると簡便である。あるいは、前記エステラーゼのみ含む組成物及び前記キシラナーゼのみを含む組成物を、同時又は連続的に使用してもよい。
【００１９】
本明細書に記載の「植物の病害抵抗性増強」とは、当該植物に任意の病原体が接触しても感染が成立しないもしくは病徴が軽減されるような状況が誘導されることを指す。「植物の病害抵抗性増強」は、例えば、ＰＩＮ２（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ２）及びＬａｐＡ１（ｌｅｕｃｉｎｅ  ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ａ１）などの傷害応答遺伝子の上昇、ＰＲ４（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ４）及びＰＲＢ１ｂなどの病害応答遺伝子の上昇、並びに、活性酸素種の放出のように、病害に対する植物の生理的な応答の増強が指標となる場合もある。また、本明細書に記載の「植物病害防除」とは、作用機序に関わらず、結果として植物における病徴変化を抑制することをいう。植物病害防除の作用機序としては、例えば、上述のような植物の生理的な応答の変化、共生微生物叢の変化、又は、病原菌の弱毒化などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明の組成物は、植物の種類や病害の種類によらず、非特異的に植物の病害抵抗性増強作用及び植物病害防除作用を奏するので、種々の植物に対して使用することができる。本発明の組成物は、例えば、クチクラ層を有する植物、又は、種子植物（裸子植物又は被子植物）及びシダ植物などの高等植物に対して使用してもよい。また、本発明の組成物は、種々の農作物、例えば、アオイ科、アカザ科、アブラナ科、アヤメ科、イソマツ科、イネ科、イワタバコ科、ウコギ科、ウリ科、カキノキ科、キク科、クルミ科、クワ科、ケシ科、ゴマノハグサ科、サクラソウ科、サトイモ科、サボテン科、シソ科、シュウカイドウ科、ショウガ科、スイレン科、スミレ科、セリ科、センリョウ科、ツツジ科、ツバキ科、トウダイグサ科、ナス科、ナデシコ科、バラ科、ヒガンバナ科、ヒルガオ科、フウロソウ科、ブドウ科、ブナ科、ボタン科、マタタビ科、マメ科、ミカン科、ヤマノイモ科、ユキノシタ科、ユリ科、ラン科、リュウゼツラン科、及び、リンドウ科から成る群から選択される科に属する農作物に対して使用してもよい。そして、本発明の組成物は、例えば、カビ病、バクテリア病、及び、ウイルス病などの種々の病害に対する抵抗性を増強又はそのような種々の病害を防除することができる。
【００２１】
本発明の組成物は、その植物の病害抵抗性増強作用又は植物病害防除作用を阻害しない限り、他の任意の成分をさらに含んでもよい。また、本発明の組成物は、その植物の病害抵抗性増強作用又は植物病害防除作用をより高めるために、他の有効成分をさらに含んでもよい。
【００２２】
ある態様では、本発明は、植物の病害抵抗性増強用組成物又は植物病害防除用組成物によって植物を処理する工程を含む、植物の病害抵抗性を増強又は植物の病害を防除する方法にも関する。当該処理の方法としては、結果として植物の病害抵抗性を増強又は植物の病害を防除するような方法であれば、種々の方法を制限なく使用することができる。例えば、前記処理工程は、前記組成物を前記植物に噴霧する工程を含んでもよい。前記組成物の適用部位は、特に限定されないが、例えば、前記植物の葉、茎、又は、果実などであってもよい。前記組成物の適用量は、適用方法及び適用部位に応じて適宜調整され得るが、例えば、前記植物の葉１枚あたり０．１〜１ｍＬ噴霧してもよい。
【００２３】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
＜実施例１＞
（１）Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ（Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）の培養ろ液の調製
Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ（ＧＢ−４（１）Ｗ株）を表１に示すＹＭ培地（ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｍａｌｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｍｅｄｉｕｍ）で前培養した。
2017204288.tif 000003
【００２５】
５Ｌ容のジャーファーメンターに、表２に示した組成の培地３Ｌを加え、上記Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａの前培養液を３０ｍＬ接種して、これを３０℃、撹拌速度５００ｒｐｍ、通気量８ＬＰＭで培養した。
2017204288.tif 000004
【００２６】
高泡形成による培養液の流出を防止するため、消泡剤（商品名「信越シリコーンＫＭ−７２Ｆ」、信越化学工業株式会社製）の５０倍希釈液を、消泡センサーを利用して断続的に自動滴下し、培養開始後７２時間までにおおよそ４０ｍＬ添加した。
また、培地中のアンモニウムイオンの消費によるｐＨの低下をセンサーで感知し、窒素源の追加とｐＨの調整のため、培地にアンモニア水をアルカリ調整溶液として自動滴下してｐＨを６．０に調整した。培養開始２４時間後から、表３に示した組成の流加培地を０．５Ｌ／ｄの速度で流加した。最終的に７２時間培養したときの培養液を孔径０．４５μｍのＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＡＣＥＴＡＴＥろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）でろ過して、培養ろ液を調製した。この培養ろ液を、以下の各試験で使用した。なお、Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａの別の菌株（ＧＢ−４（０）−ＨＰＭ７株又はＯＭＭ６２−２株）を用いても、ＧＢ−４（１）Ｗ株を用いた場合と同様の方法で培養ろ液を調製することができ、かつ同様に使用することができた。
2017204288.tif 000005
【００２７】
（２）切り取り葉への噴霧処理
Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａの培養ろ液（エステラーゼの力価：８．０Ｕ／ｍＬ）を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）で希釈し、０．０１Ｕ／ｍＬ、０．１Ｕ／ｍＬ、１．０Ｕ／ｍＬの溶液を調製した。矮性のトマト（ＭｉｃｒｏＴｏｍ）から切り取った葉１枚に対して、０．０１Ｕ／ｍＬ〜８．０Ｕ／ｍＬの各溶液を０．６ｍＬずつ噴霧し、密閉容器の中で保湿しつつ保温した（湿度１００％、温度２２℃）。対照区には、オートクレーブ処理で酵素を失活させた培養ろ液を噴霧した。噴霧７２時間後（３日後）に、それぞれの切り取り葉に病原性糸状菌（灰色カビ病菌（ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、Ｂ．ｃ．））の胞子（５×１０4胞子／ｍＬ）を０．６ｍＬずつ噴霧した。各処理区につき５枚の切り取り葉を用い、酵素処理１０日目すなわち胞子処理７日後に、葉の様子を観察した。褐色の病斑を形成する状態（カビに覆われることもある）を病徴、明らかな病徴は見られないが葉の緑色が褪色している状態を黄化、病徴も黄化も見られなかった状態を無変化、として評価をした。図１Ａに、各酵素処理の後、病原菌胞子の噴霧処理を行った切り取り葉の写真を示し、図１Ｂに、観察した切り取り葉の状態（無変化、黄化、又は病徴）の割合についてのグラフを示す。これらの図から理解できるように、１．０Ｕ／ｍＬ及び８．０Ｕ／ｍＬ処理区では、感染効率が促進され病徴が助長されたが、０．１Ｕ／ｍＬ処理区では、対照区と同程度の病徴であり、０．０１Ｕ／ｍＬ処理区では、１０日目の病徴が対照区に比べて軽減されていた。【００２８】
（３）病原菌の発芽率
病原菌（Ｂ．ｃ．）の胞子接種後２日目の葉表面のカビ胞子及び菌糸は、トリパンブルーで染色した。各処理区につき４枚の切り取り葉を用い、顕微鏡で観察した。図２Ａに、各酵素処理後、病原菌胞子を噴霧した２日後の葉表面のカビ胞子の光学顕微鏡観察写真を示し、図２Ｂに、観察したカビ胞子の発芽率の平均値のグラフ（誤差範囲は４回の試験から算出した標準誤差）を示す。ここで、図２Ｂの異なるアルファベット（ａ、ｂ、及びｃ）は、テューキーの検定によって有意水準０．０５で有意差検定を行った結果、各処理区の間で発芽率が有意に異なっていることを示しており、同じアルファベットは、各処理区の間で発芽率に有意差がないことを示している。具体的には、０．０１Ｕ／ｍＬ、０．１Ｕ／ｍＬ、１．０Ｕ／ｍＬ処理区ではいずれも、対照区及び８．０Ｕ／ｍＬ処理区に比べて病原菌胞子の発芽が有意に抑えられていた（図２Ａ及び２Ｂ）。対照区及び８．０Ｕ／ｍＬ処理区では、病原菌胞子が発芽し、その発芽管が葉表面に広がっている様子が観察された。特に８．０Ｕ／ｍＬ処理区では、発芽率が対照区よりも有意に高かった。【００２９】
（４）葉における病原菌の存在量
病原菌（Ｂ．ｃ．）の胞子接種後３日目の葉からＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲで病原菌のＤＮＡ量を定量した。各処理区につき５枚の切り取り葉を用いた。図３に、灰色カビ病菌β−チューブリン遺伝子を指標にした解析結果、すなわちトマトのＡｃｔｉｎ遺伝子量で補正に対するβ−チューブリン遺伝子量の相対値の平均値（誤差範囲は５回の試験から算出した標準誤差）を示す。その結果、病原菌の量は、１．０Ｕ／ｍＬや８．０Ｕ／ｍＬ処理区で顕著に高く、病原菌に感染していることが確認できる。一方で、０．０１Ｕ／ｍＬ、０．１Ｕ／ｍＬ処理区では、対照区に比べて病原菌が明らかに少なく抑えられていることが確認できた。【００３０】
また、葉の断面における病原菌の存在を調べるために各処理区につき４枚の切り取り葉をパラフィンに包埋し、葉の切片（厚さ１０μｍ）を作製して、チオニン・オレンジＧで染色した。カビ胞子及び菌糸は、チオニンで暗紫色に、植物細胞壁は、オレンジＧで橙色に染色され得る。作製した葉切片を光学顕微鏡で観察した結果、１．０Ｕ／ｍＬや８．０Ｕ／ｍＬ酵素処理区では、病原菌が葉内部に侵入している様子が観察されたが、０．０１Ｕ／ｍＬ、０．１Ｕ／ｍＬ処理区では、病原菌の侵入は対照区と同程度であった（図４）。【００３１】
（５）植物の応答解析
病原菌（Ｂ．ｃ．）の胞子接種後３日目の葉からＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲで植物の各種ストレス抵抗性関連遺伝子（傷害応答遺伝子であるＰＩＮ２及びＬａｐＡ並びに病害応答遺伝子であるＰＲ４及びＰＲＢ１ｂ）の発現量を調べた（トマトのＡｃｔｉｎ遺伝子量で補正）。各処理区につき３枚の切り取り葉を用いた。図５に、トマトのＡｃｔｉｎ遺伝子に対する各種ストレス抵抗性関連遺伝子の相対的発現量の平均値（誤差範囲は３回の試験から算出した標準誤差）を示す。その結果、培養ろ液処理濃度に応じて、前記ストレス抵抗性関連遺伝子の発現が上昇していることが確認された。【００３２】
植物は、クチクラ層の破壊やエリシターなどを検知すると、活性酸素を放出するので、ストレス抵抗性関連遺伝子だけでなく、活性酸素種応答遺伝子も発現することが知られている。抽出したＲＮＡを用いたｑＲＴ−ＰＣＲで活性酸素種応答遺伝子の発現量の変化を調べたところ、特に０．０１Ｕ／ｍＬの培養ろ液処理で、トマトのＡｃｔｉｎ遺伝子に対するペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）やスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）の相対的発現量の平均値（誤差範囲は３回の試験から算出した標準誤差）が上昇することが確認された（図６）。【００３３】
（６）クチンの分解活性
植物の葉をＰ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａの培養ろ液で処理すると、クチクラ層から炭素鎖長１６や１８の脂肪酸が抽出されることが確認されている（Ｕｅｄａら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｏｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１５）。そこで、植物表層のクチクラ層を構成する成分のうちクチン（脂肪酸ポリエステル）に関して、Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａの培養ろ液による分解性を調べた。トマト果皮から調製したクチンを当該培養ろ液で処理すると、反応溶液中に、クチンの分解物であるωヒドロキシヘキサデカン酸が検出された。このことから、Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａの培養ろ液に、植物からクチンモノマーを遊離させる活性があることがわかった。【００３４】
＜実施例２＞
（１）単子葉植物とその病原菌に対する効果
Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａの培養ろ液を実施例１と同様に希釈した。エステラーゼの力価で０．０１Ｕ／ｍＬの溶液を、イネ科植物であるエンバクの葉に対して０．６ｍＬ噴霧し、密閉容器の中で保湿しつつ保温した（湿度１００％、温度２２℃）。対照区には、オートクレーブ処理で酵素を失活させた培養ろ液を噴霧した。噴霧７２時間後に、単子葉植物であるエンバクに感染する病原性細菌のすじ枯病菌の培養液（ＯＤ６１０：０．６５）に浸漬接種した。各処理区につき４枚の切り取り葉を用い、同じ試験を２回反復した。楕円状の褐色斑（病斑）が縦に広がって形成される状態を病徴として観察した。また、病斑面積を観察し、以下の式に基づいて、発病度を計算した（発病度の計算方法については「イネ・ムギ等殺菌剤圃場試験法」（社団法人日本植物防疫協会、平成１６年３月発行）を参照）。
発病度＝100×(0×n0＋0.5×n1＋1×n2＋2×n3＋3×n4＋4×n5)／4N
n0：病斑がない葉の数
n1：病斑が葉の１／８以下である葉の数
n2：病斑が葉の１／４前後である葉の数
n3：病斑が葉の１／２前後である葉の数
n4：病斑が葉の３／４前後である葉の数
n5：病斑が葉の７／８以上である葉の数
N：調査した葉の総数
図７Ａに、各酵素処理の後、病原性細菌接種後３日目の写真を示し、図７Ｂに、病原性細菌接種後３日目に観察した病斑から算出した発病度のグラフを示す。これらの図から理解できるように、０．０１Ｕ／ｍＬ処理区では、接種３日目の病徴が対照区に比べて軽減され、発病度が低下した。【００３５】
（２）アブラナ科植物とその病原菌に対する効果
Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａの培養ろ液を実施例１と同様に希釈した。エステラーゼの力価で０．０１Ｕ／ｍＬの溶液を、アブラナ科植物であるシロイヌナズナのロゼット葉に対して０．６ｍＬ噴霧し、密閉容器の中で保湿しつつ保温した（湿度１００％、温度２２℃）。対照区には、オートクレーブ処理で酵素を失活させた培養ろ液を噴霧した。噴霧７２時間後に、病原性糸状菌（灰色カビ病菌）の胞子（５×１０4胞子／ｍＬ）を噴霧した。各処理区につき８枚の切り取ったロゼット葉を用い、同じ試験を２回反復した。褐色の病斑が形成される状態を病徴として観察し、以下の式に基づいて、発病度を計算した（発病度の計算方法については「新農薬実用化試験実施の手引き」（社団法人日本植物防疫協会、平成１５年２月発行）を参照）。
発病度＝100×(0×n0＋1×n1＋2×n2＋3×n3＋4×n4)／4N
n0：病斑がない葉の数
n1：病斑がわずか（数個）である葉の数
n2：病斑が葉の１／４未満である葉の数
n3：病斑が葉の１／４〜１／２未満である葉の数
n4：病斑が葉の１／２以上である葉の数
N：調査した葉の総数
図８Ａに、各酵素処理の後、病原菌胞子噴霧後３日目の写真を示し、図８Ｂに、病原菌胞子噴霧後３日目に観察した病斑から算出した発病度のグラフを示す。これらの図から理解できるように、０．０１Ｕ／ｍＬ処理区では、胞子噴霧後７日目の病徴が対照区に比べて軽減され、発病度が低下した。【００３６】
（３）植物病害ウイルスに対する効果
Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａの培養ろ液を実施例１と同様に希釈した。エステラーゼの力価で０．０１Ｕ／ｍＬの溶液を、ナス科植物であるタバコ（Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ）の葉に対して０．６ｍＬ噴霧し、密閉容器の中で保湿しつつ保温した（湿度１００％、温度２０℃）。対照区には、オートクレーブ処理で酵素を失活させた培養ろ液を噴霧した。噴霧７２時間後に、植物病害ウイルスのタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ−ＯＭ株）溶液（４μｇ／ｍＬ）を、カーボランダムを用いて機械接種した。植物がウイルスの拡がりを抑えるために、植物自身が壊死することで形成された病斑を観察し、葉１枚につき少なくとも５７個の病斑直径を計測して、その平均直径を求めた。各処理区につき３枚の切り取り葉を用いた。
図９Ａに、ウイルス接種後５日目の病斑を示す写真を示し、図９Ｂに、ウイルス接種後５日目に計測した３枚の葉それぞれにおける病斑の平均直径（ｍｍ）の平均値のグラフ（誤差範囲は３回の試験から算出した標準誤差）を示す。ここで、図９Ｂのアスタリスクは、ｔ検定によって有意水準０．０１で有意差検定を行った結果、対照区に対して有意に病斑が小さくなったことを示している。すなわち、０．０１Ｕ／ｍＬ処理区では、接種５日後の病斑の大きさが対照区に比べて有意に小さくなっていた（図９Ａ及び９Ｂ）。
以上の結果から、本発明の植物の病害抵抗性増強用又は植物病害防除用組成物は、カビ病、バクテリア病、及びウイルス病などの種々の病害に対して、非特異的に抵抗性増強作用及び防除作用を奏することがわかった。【００３７】
＜実施例３＞
Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａの培養ろ液中に含まれる成分のうち、何が植物の病害抵抗性増強作用及び植物病害防除作用に寄与しているのかを確認するため、Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａの培養ろ液から、エステラーゼであるＰａＥ、及び、キシラナーゼを分離精製した（後述の調製方法を参照）。ＰａＥは、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）を用いて、エステラーゼの力価で０．０１Ｕ／ｍＬに希釈した。キシラナーゼは、Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａの培養ろ液を使用した試験結果を考慮して、植物の病害抵抗性増強又は植物病害防除に有効と考えられる濃度範囲になるように、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）を用いて、キシラナーゼの力価で０．０１Ｕ／ｍＬに希釈した。また、糸状菌であるＰａｒａｐｈｏｍａ属類縁菌Ｂ４７−９株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５７３）由来のクチナーゼ様酵素であるＰＣＬＥも用意し（後述の調製方法を参照）エステラーゼの力価で０．０１Ｕ／ｍＬに調製した。なお、ＰＣＬＥは、ポリエステルであるＰＢＳＡを基質に用いた場合に、塩化カルシウム存在下で基質の分解活性が高くなることが知られている。そこで、溶液中に２ｍＭ塩化カルシウムあり又はなしの場合で試験を行った。対照区としては、希釈に用いた緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８）を使用した。【００３８】
調製した各酵素溶液を、イネ科植物であるエンバクの葉に対して０．６ｍＬ噴霧し、密閉容器の中で保湿しつつ保温した（湿度１００％、温度２２℃）。噴霧７２時間後に、単子葉植物に感染するすじ枯病菌の培養液（ＯＤ６１０：０．６５）に浸漬接種した。各処理区につき６枚の切り取り葉を用いた。図１０Ａに、各種酵素処理における、病原性細菌接種後４日目の写真を示し、図１０Ｂに、病原性細菌接種後４日目に観察した病斑から算出した発病度のグラフを示す。これらの図から理解できるように、ＰａＥ処理区、キシラナーゼ処理区、及びＰＣＬＥ（カルシウムあり）処理区では、接種４日目の病徴が対照区に比べて軽減されていた。一方、ＰＣＬＥ（カルシウムなし）処理区では、病徴の軽減効果は確認できなかった（図１０Ａ及び１０Ｂ）。
これらの結果より、エステラーゼ及びキシラナーゼのそれぞれが、病害抵抗性増強作用及び植物病害防除作用に寄与していることがわかった。【００３９】
（ＰａＥの精製）
Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａの培養ろ液から、「独立行政法人農業環境技術研究所  平成２４年度研究成果情報（第２９集）」に掲載されている「酵素と基質の親和性を利用した簡単な生分解性プラスチック分解酵素精製法」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉａｅｓ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｓｉｎｆｏ／ｒｅｓｕｌｔ／ｒｅｓｕｌｔ２９／ｒｅｓｕｌｔ２９＿４２．ｈｔｍｌ）に従って、ＰａＥを精製した。
（キシラナーゼの精製）
Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａの培養ろ液を限外濾過で濃縮しつつ、１．２Ｍ硫酸アンモニウム／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に置換した。この溶液をブチルセファロース４ＦＦ（ＧＥヘルスケア）カラムに通して、ＰａＥ及びキシラナーゼをカラムに吸着させた。緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を徐々に下げて、キシラナーゼだけをカラムから溶出させて（ＰａＥはまだカラムに吸着されている）、ＰａＥ活性画分を含まないキシラナーゼを得た。
（ＰＣＬＥの精製）
Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ液体培地に、唯一の炭素源としてＰＢＳＡエマルジョン（昭和電工株式会社、ＥＭ−３０１）を加え、Ｐａｒａｐｈｏｍａ属類縁菌Ｂ４７−９株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−５７３）を振とう培養した。培養液から糸状菌の菌体を除去して、培養ろ液を調製した。当該培養ろ液から、「独立行政法人農業環境技術研究所  平成２４年度研究成果情報（第２９集）」に掲載されている「酵素と基質の親和性を利用した簡単な生分解性プラスチック分解酵素精製法」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉａｅｓ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｓｉｎｆｏ／ｒｅｓｕｌｔ／ｒｅｓｕｌｔ２９／ｒｅｓｕｌｔ２９＿４２．ｈｔｍｌ）に従って、ＰＣＬＥを精製した。【００４０】
＜実施例４＞
担子菌であるＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ類縁菌ＢＰＤ１Ａ株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１３４）の培養ろ液から、クチナーゼ様酵素であるＣｍＣｕｔ１を分離精製した（後述の調製方法を参照）。ＣｍＣｕｔ１は、緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、塩化カルシウム（２ｍＭ））を用いて、エステラーゼの力価で０．０１Ｕ／ｍＬに調製した。対照区としては、希釈に用いた緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、塩化カルシウム（２ｍＭ））を使用した。
調製した酵素溶液を、ナス科植物である矮性トマト（ＭｉｃｒｏＴｏｍ）の葉に対して０．６ｍＬ噴霧し、密閉容器の中で保湿しつつ保温した（湿度１００％、温度２２℃）。噴霧７２時間後に、それぞれの切り取り葉に病原性糸状菌（Ｂ．ｃ．）の胞子（５×１０4胞子／ｍＬ）を０．６ｍＬずつ噴霧した。褐色の病斑が形成される状態（カビに覆われることもある）を病徴として観察し、以下の式に基づいて、発病度を計算した（発病度の計算方法については「新農薬実用化試験実施の手引き」（社団法人日本植物防疫協会、平成１５年２月発行）を参照）。各試験区につき５枚の切り取り葉を用い、各試験を２回反復した。
発病度＝100×(0×n0＋1×n1＋2×n2＋3×n3＋4×n4)／4N
n0：病斑がない葉の数
n1：病斑がわずか（数個）である葉の数
n2：病斑が葉の１／４未満である葉の数
n3：病斑が葉の１／４〜１／２未満である葉の数
n4：病斑が葉の１／２以上である葉の数
N：調査した葉の総数
図１１Ａに、緩衝液又はＣｍＣｕｔ１溶液を噴霧処理した後、病原菌胞子噴霧後７日目の写真。図１１Ｂは、病原菌胞子噴霧後７日目に観察した病斑から算出した発病度のグラフを示す。これらの図から理解できるように、０．０１Ｕ／ｍＬ処理区では、胞子噴霧後７日目の病徴が対照区に比べて軽減され、発病度が低下した。【００４１】
（ＣｍＣｕｔ１の精製）
Ｃｕｒｙｐｔｃｏｃｃｕｓ属類縁菌ｍａｇｎｕｓ株を、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１３）、９７：７６７９−７６８８に記載された方法に従って培養し、得られた培養液を、７０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、菌体を除去した。得られた培養上清を、孔径０．４５μｍのろ紙（製品名：Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｃｅｔａｔｅ  Ｃ０４５Ａ０９０Ｃ、アドバンテック株式会社製）を使用してフィルターろ過した。そして、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）、９８：４４５７−４４６５に従ってＰＢＳＡエマルジョンに対するアフィニティークロマトグラフィーを行い、生分解性プラスチック分解酵素であるＣｍＣｕｔ１を精製した。精製ＣｍＣｕｔ１については、ＳＤＳゲル電気泳動後の銀染色で単一バンドを示すまで精製されていることを確認した。【００４２】
以上より、従来生分解性プラスチック分解酵素源として知られていた微生物の培養物は、少なくとも、その中に含まれているエステラーゼ及びキシラナーゼの活性を介して、植物の病害抵抗性を増強又は植物の病害を防除することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明で使用されたエステラーゼ及びキシラナーゼは、圃場に張った農業用生分解性マルチフィルムの分解促進のために生産性が向上されている微生物培養液から調製され得るものであり、安価に大量生産することができるものである。また、エステラーゼ及びキシラナーゼは、自然界で容易に分解され、低分子化合物などで起こる環境中への残存性はなく、環境負荷が低い。さらに、本発明の植物の病害抵抗性増強用又は植物病害防除用組成物は、種々の植物又は種々の病害に対して適用できるものであり、汎用性が高い。したがって、本発明は産業上の利用可能性が高い。
【受託番号】
【００４４】
2017204288.tif 000006
【図１Ａ】
2017204288.tif 000007
【図１Ｂ】
2017204288.tif 000008
【図２Ａ】
2017204288.tif 000009
【図２Ｂ】
2017204288.tif 000010
【図３】
2017204288.tif 000011
【図４】
2017204288.tif 000012
【図５】
2017204288.tif 000013
【図６】
2017204288.tif 000014
【図７Ａ】
2017204288.tif 000015
【図７Ｂ】
2017204288.tif 000016
【図８Ａ】
2017204288.tif 000017
【図８Ｂ】
2017204288.tif 000018
【図９Ａ】
2017204288.tif 000019
【図９Ｂ】
2017204288.tif 000020
【図１０Ａ】
2017204288.tif 000021
【図１０Ｂ】
2017204288.tif 000022
【図１１Ａ】
2017204288.tif 000023
【図１１Ｂ】
2017204288.tif 000024
【国際調査報告】
2017204288.tif 000025
2017204288.tif 000026
2017204288.tif 000027
2017204288.tif 000028
2017204288.tif 000029
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