(57)【要約】  水に対する溶解度が高く、非経口投与することにより血中の遊離型クルクミンの濃度を十分に高く維持することができ、クルクミンの薬理作用を効果的に得ることができ、安全性も高いクルクミン製剤の提供。  クルクミンの水溶性物質抱合体を有効成分とする非経口投与用医薬組成物。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クルクミンの水溶性物質抱合体を有効成分とする非経口投与用医薬組成物。
【請求項２】
前記水溶性物質が、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン及びアミノ酸から選ばれる１種以上である請求項１記載の非経口投与用医薬組成物。
【請求項３】
前記水溶性物質が、グルクロン酸及び硫酸から選ばれる１種以上である請求項１又は２記載の非経口投与用医薬組成物。
【請求項４】
抗がん薬、抗炎症薬、コレステロール低下薬、抗アレルギー薬、認知機能改善薬及び心疾患予防治療薬から選ばれる医薬組成物である請求項１〜３のいずれか１項記載の非経口投与用医薬組成物。
【請求項５】
静脈内投与用医薬組成物である請求項１〜４のいずれか１項記載の非経口投与用医薬組成物。
【請求項６】
非経口投与用医薬組成物製造のための、クルクミンの水溶性物質抱合体の使用。
【請求項７】
前記水溶性物質が、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン及びアミノ酸から選ばれる１種以上である請求項６記載の使用。
【請求項８】
前記水溶性物質が、グルクロン酸及び硫酸から選ばれる１種以上である請求項６又は７記載の使用。
【請求項９】
非経口投与用医薬組成物が、抗がん薬、抗炎症薬、コレステロール低下薬、抗アレルギー薬、認知機能改善薬及び心疾患予防治療薬から選ばれる非経口投与用医薬組成物である請求項６〜８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
静脈内投与用医薬組成物製造のための使用である請求項６〜９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
非経口投与用医薬として使用するための、クルクミンの水溶性物質抱合体。
【請求項１２】
前記水溶性物質が、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン及びアミノ酸から選ばれる１種以上である請求項１１記載の化合物。
【請求項１３】
前記水溶性物質が、グルクロン酸及び硫酸から選ばれる１種以上である請求項１１又は１２記載の化合物。
【請求項１４】
非経口投与用医薬が、抗がん薬、抗炎症薬、コレステロール低下薬、抗アレルギー薬、認知機能改善薬及び心疾患予防治療薬から選ばれる非経口投与用医薬である請求項１１〜１３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１５】
非経口投与用医薬が、静脈内投与用医薬である請求項１１〜１４のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１６】
クルクミンの水溶性物質抱合体を非経口投与することを特徴とするクルクミン療法。
【請求項１７】
前記水溶性物質が、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン及びアミノ酸から選ばれる１種以上である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記水溶性物質が、グルクロン酸及び硫酸から選ばれる１種以上である請求項１６又は１７記載の方法。
【請求項１９】
クルクミン療法が、がん治療、抗炎症療法、コレステロール低下療法、抗アレルギー療法、認知機能改善療法及び心疾患予防治療から選ばれる療法である請求項１６〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
非経口投与が、静脈内投与である請求項１６〜１９のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、静脈内投与に代表される非経口投与用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
クルクミンは、近年、腫瘍形成阻害作用、抗酸化作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、抗アレルギー作用、脳疾患予防作用、心疾患予防治療作用等の薬理作用を有することが明らかとなり、食品（例えば、機能性食品など）、医薬品や化粧品等への利用が検討されている。
しかし、クルクミンは、水にほとんど溶けないため、クルクミンをそのまま経口摂取しても体内にほとんど吸収されないことが知られている。また、経口摂取によってわずかに吸収されたクルクミンの大部分は、グルクロン酸及び／又は硫酸によって抱合化されたクルクミン抱合体として血中に存在し、遊離型のクルクミンは血中にわずかにしか存在していないことが示されている（非特許文献１）。【０００３】
一般に、異物が体内に吸収される場合、抱合化などの生体内代謝によってその多くが不活性化されることがよく知られている。Ａ．Ｐａｌらは、クルクミン抱合体が薬理作用を有するかどうかを評価するため、インビトロで、クルクミン抱合体のＫＢＭ−５、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｕ２６６およびＡ５４９細胞株に対する細胞増殖抑制効果について調べ、遊離型クルクミンではこれら細胞の増殖を抑制する効果（抗癌作用）を認め、一方でクルクミン抱合体（クルクミンモノグルクロニド及びクルクミンジグルクロニド）では、このような効果がないことを示した（非特許文献２）。また、Ｓｈｏｊｉらは、経口投与で、クルクミン抱合体のヒト肝細胞癌細胞株（ＨｅｐＧ２細胞）に対する増殖抑制効果や遺伝子発現に及ぼす影響を調べたところ、遊離型クルクミンでは細胞増殖抑制効果を認めたが、クルクミン抱合体（クルクミンモノグルクロニド）では、その効果が認められず、また、遺伝子発現に及ぼす影響についても遊離型クルクミンと比べ、クルクミン抱合体（クルクミンモノグルクロニド）ではその作用が非常に低いことを示した（非特許文献３）。このように、クルクミンもまた、抱合化されることでクルクミンが有する薬理作用が不活性化されると考えられている。【０００４】
このため、期待されるクルクミンの薬理作用を十分に得るためには、血中の遊離型クルクミンの濃度を十分に高める必要がある。しかしながら、上述の理由から、経口的にクルクミンを摂取しても血中の遊離型クルクミンの濃度を高めることは非常に難しい。【０００５】
そこで、クルクミンを非経口的に体内に投与することが考えられるが、クルクミンは水にほとんど溶けないため、クルクミン自体を非経口的に投与することができない。そのため、クルクミンのような難水溶性化合物の溶解性を高める処理を行い、非経口的に投与する方法などが提案されている（特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平５−１７８７６５号公報
【特許文献２】特開２００６−１１１５３４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】惠ら，臨床化学，２００９，３８：５９−６８
【非特許文献２】A. Pal et al., Bioorg Med Chem., 2014, 22(1), 435-439
【非特許文献３】M. Shoji et al., Food Chemistry, 2014, 151, 126-132
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、クルクミンをシクロデキストリンで包接してクルクミン水溶液を得るには、クルクミンに対して１００〜１０００倍のシクロデキストリンを必要とし（特許文献２）、非経口投与用として使用できるものではなかった。
従って、本発明の課題は、水に対する溶解度が高く、非経口投与することにより血中の遊離型クルクミンの濃度を十分に高く維持することができ、クルクミンの薬理作用を効果的に得ることができ、安全性も高いクルクミン製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで本発明者らは、上記問題点を解決するために鋭意研究を行ったところ、驚くべきことにクルクミンの水溶性物質抱合体を非経口的に投与すると、遊離型クルクミンの血中濃度を高い値で維持することができ、これにより、クルクミンが有する薬理作用が十分に得られることが分かった。また、該非経口投与用医薬組成物に含有されるクルクミン抱合体は、クルクミンの生体内代謝産物であることから、非常に高い安全性を有する。【００１０】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔２０〕を提供するものである。【００１１】
〔１〕クルクミンの水溶性物質抱合体を有効成分とする非経口投与用医薬組成物。
〔２〕前記水溶性物質が、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン及びアミノ酸から選ばれる１種以上である〔１〕記載の非経口投与用医薬組成物。
〔３〕前記水溶性物質が、グルクロン酸及び硫酸から選ばれる１種以上である〔１〕又は〔２〕記載の非経口投与用医薬組成物。
〔４〕抗がん薬、抗炎症薬、コレステロール低下薬、抗アレルギー薬、認知機能改善薬及び心疾患予防治療薬から選ばれる医薬組成物である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の非経口投与用医薬組成物。
〔５〕静脈内投与用医薬組成物である〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の非経口投与用医薬組成物。
〔６〕非経口投与用医薬組成物製造のための、クルクミンの水溶性物質抱合体の使用。
〔７〕前記水溶性物質が、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン及びアミノ酸から選ばれる１種以上である〔６〕記載の使用。
〔８〕前記水溶性物質が、グルクロン酸及び硫酸から選ばれる１種以上である〔６〕又は〔７〕記載の使用。
〔９〕非経口投与用医薬組成物が、抗がん薬、抗炎症薬、コレステロール低下薬、抗アレルギー薬、認知機能改善薬及び心疾患予防治療薬から選ばれる非経口投与用医薬組成物である〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の使用。
〔１０〕静脈内投与用医薬組成物製造のための使用である〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載の使用。
〔１１〕非経口投与用医薬として使用するための、クルクミンの水溶性物質抱合体。
〔１２〕前記水溶性物質が、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン及びアミノ酸から選ばれる１種以上である〔１１〕記載の化合物。
〔１３〕前記水溶性物質が、グルクロン酸及び硫酸から選ばれる１種以上である〔１１〕又は〔１２〕記載の化合物。
〔１４〕非経口投与用医薬が、抗がん薬、抗炎症薬、コレステロール低下薬、抗アレルギー薬、認知機能改善薬及び心疾患予防治療薬から選ばれる非経口投与用医薬である〔１１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の化合物。
〔１５〕非経口投与用医薬が、静脈内投与用医薬である〔１１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の化合物。
〔１６〕クルクミンの水溶性物質抱合体を非経口投与することを特徴とするクルクミン療法。
〔１７〕前記水溶性物質が、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン及びアミノ酸から選ばれる１種以上である〔１６〕記載の方法。
〔１８〕前記水溶性物質が、グルクロン酸及び硫酸から選ばれる１種以上である〔１６〕又は〔１７〕記載の方法。
〔１９〕クルクミン療法が、がん治療、抗炎症療法、コレステロール低下療法、抗アレルギー療法、認知機能改善療法及び心疾患予防治療から選ばれる療法である〔１６〕〜〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕非経口投与が、静脈内投与である〔１６〕〜〔１９〕のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のクルクミンの水溶性物質抱合体を有効成分とする非経口投与用医薬組成物は、非経口的に投与することによって遊離型クルクミンの血中濃度を高い値に長時間維持することができ、これにより、クルクミンが有する薬理作用（例えば、抗腫瘍作用）を効果的に得ることができる。また、該非経口投与用医薬組成物は、有効成分がクルクミンの生体内代謝産物であるクルクミンの水溶性物質抱合体であることから、非常に高い安全性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】クルクミン抱合体を静脈内投与後の抱合体及び遊離型クルクミンの血中濃度変化を示す。
【図２】クルクミン抱合体（３０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内投与による抗腫瘍効果を示す。
【図３】クルクミン抱合体（９０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内投与による抗腫瘍効果を示す。
【図４】クルクミン抱合体単回投与の体重に及ぼす影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の非経口投与用医薬組成物は、クルクミンの水溶性物質抱合体を有効成分として含有する。
【００１５】
（Ａ）クルクミンは、ウコン色素に含まれるクルクミノイドの主成分であり、下記構造式（１）で表される化合物である。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
本発明においてクルクミンは、化学合成されたクルクミンを用いてもよいし、ウコン色素として流通しているものを用いてもよい。ウコン色素としては、ショウガ科ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ  ＬＩＮＮＥ）の根茎の乾燥物を粉末にしたウコン末、該ウコン末を適当な溶媒（例えば、エタノール、油脂、プロピレングリコール、ヘキサン、アセトンなど）を用いて抽出して得られる粗製クルクミン或いはオレオレジン（ターメリックオレオレジン）、および精製したクルクミンを挙げることができる。
なお、クルクミンには、互変異性体であるケト型及びエノール型のいずれも含まれる。
【００１８】
クルクミンと抱合体を形成する水溶性物質としては、通常生体内に存在する水溶性物質が挙げられ、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン及びアミノ酸から選ばれる１種以上が好ましく、グルクロン酸及び硫酸から選ばれる１種以上がより好ましい。
ここで、アミノ酸としては、生体内に存在するアミノ酸、例えば必須アミノ酸が挙げられる。
【００１９】
クルクミン抱合体におけるクルクミンと前記水溶性物質との結合モル比は、クルクミン：水溶性物質＝１：１〜１：３であるのが好ましく、１：１〜１：２がより好ましく、１：１がさらに好ましい。
【００２０】
クルクミンと前記水溶性物質の抱合形態（結合形態）は、例えば次の式（２）の形態である。
【００２１】
【化２】
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【００２２】
（式中、Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方は前記水溶性物質の残基であり、残余は水素原子である。）
【００２３】
前記式（２）中、Ｒ1及びＲ2の一方又は両方はグルクロン酸残基又は硫酸残基が好ましく、残余は水素原子が好ましい。
【００２４】
クルクミンの水溶性物質抱合体は、前記非特許文献２又は３記載の方法によって製造することができる。
【００２５】
クルクミンの水溶性物質抱合体を含有する非経口投与用医薬組成物の形態としては、非経口的に投与されるものであれば限定されないが、特に注射用組成物（注射剤）が好ましい。注射用組成物としては、静脈内投与用組成物、皮下投与用組成物が挙げられるが、静脈内投与用組成物がより好ましい。
【００２６】
本発明の非経口投与用医薬組成物中のクルクミンの水溶性物質抱合体の含有量は、特に制限されず、１〜１００質量％が好ましく、５〜１００質量％がより好ましく、１０〜１００質量％がさらに好ましい。
【００２７】
本発明の非経口投与用組成物には、前記有効成分の他、水、生理食塩水、ｐＨ調整剤、糖類、酸、アルカリ、緩衝剤、等張化剤、安定剤、無痛化剤、防腐剤等を配合することができる。
【００２８】
ここで糖類としては、単糖類、二糖類、三糖類、多糖類、糖アルコール等が挙げられる。酸、アルカリとしては、水溶性無機酸、水溶性無機酸塩、水溶性有機酸、水溶性有機酸塩、アミノ酸、アミノ酸塩等が挙げられる。
【００２９】
また、本発明の非経口投与用組成物の形態は、用時溶解型の粉末充填剤（結晶又は凍結乾燥品）でもよいし、水溶液の形態でもよい。
【００３０】
本発明の非経口投与用組成物は、後記実施例に示すように、例えば静脈内投与により、長時間に渡って薬理作用を有する遊離型クルクミンの高い血中濃度を維持できる。また、非経口投与、例えば静脈内投与により優れた薬理作用（例えば、抗腫瘍効果）を示すので、特に抗がん薬、抗炎症薬、コレステロール低下薬、抗アレルギー薬、認知機能改善薬、心疾患予防治療薬として有用であり、特に抗がん薬として有用である。
【実施例】
【００３１】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。【００３２】
製造例１
（クルクミン抱合体（クルクミンモノグルクロニド）の調製方法）
（１）アセトブロモ−α−Ｄ−グルクロン酸メチルエステル（化合物ａ）１．０ｇ（２．５２ｍｍｏｌ）およびバニリン（化合物ｂ）３２６．０ｍｇ（２．１５ｍｍｏｌ）をキノリン８．７ｍＬに溶解させ、氷冷下、酸化銀５２２．０ｍｇを加え３０分撹拌後、室温に昇温し９０分撹拌した。酢酸２６．０ｍＬを加えた後に蒸留水２６０．０ｍＬに移し、セライト濾過を行った。得られた水層を酢酸エチルで二回抽出し、有機層を合わせてｂｒｉｎｅ洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をＳｉＯ２  ｆｌａｓｈ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＡｃＯＥｔ／ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝３０：７０ｔｈｅｎ  ８０：２０）にて精製し、化合物ｃを４９１．８ｍｇ（４９％）得た。【００３３】
【化３】
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【００３４】
（２）２，４−ペンタンジオン３．３ｍＬ（３２．０７ｍｍｏｌ）および三酸化二ホウ素２．０ｇ（２８．７ｍｍｏｌ）を酢酸エチル３０．０ｍＬに溶解させ、８０ｏＣで３０分撹拌した。ここに酢酸エチル４０．０ｍＬに溶解させたバニリン（化合物ｂ）２．２ｇ（１４．４ｍｍｏｌ）と、ホウ酸トリブチル１．６ｍＬ（５．９６ｍｍｏｌ）を加え８５℃で３０分撹拌した後、ｎ−ブチルアミン０．５ｍＬ（５．０４ｍｍｏｌ）を滴下し、１０５℃に昇温し１．５時間撹拌した。１Ｎ塩酸１０ｍＬを加え５０℃で１時間撹拌した後に室温に戻し、酢酸エチルで二回抽出、有機層を合わせてｂｒｉｎｅ洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し溶媒を減圧留去した。得られた残渣をＮＨ−ＳｉＯ２（ＣＨＲＯＭＡＴＯＲＥＸ，富士シリシア化学）ｏｐｅｎ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３＝１：３０）にて精製し、化合物ｄを１．３１ｇ（３９％）得た。【００３５】
【化４】
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【００３６】
（３）上記化合物ｄ：４８３．０ｍｇ（２．０６ｍｍｏｌ）および三酸化二ホウ素２１４．９ｍｇ（３．０８ｍｍｏｌ）を酢酸エチル５．０ｍＬに溶解させ、８５℃で３０分撹拌した。ここに酢酸エチル１０．０ｍＬに溶解させた上記化合物ｃ：８０５．０ｍｇ（１．７２ｍｍｏｌ）と、ホウ酸トリブチル０．８２ｍＬ（３．０５ｍｍｏｌ）を加え８５℃で１時間撹拌した後、ピペリジン７１μＬ（０．７２ｍｍｏｌ）を滴下し、さらに３０分撹拌した。０．５Ｎ塩酸７．０ｍＬを加え５０℃で１時間撹拌した後に室温に戻し、酢酸エチルで二回抽出、有機層を合わせてｂｒｉｎｅ洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し溶媒を減圧留去した。得られた残渣をＳｉＯ２  ｆｌａｓｈ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＡｃＯＥｔ／ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝６０：４０）にて精製し、化合物ｅを９１７．７ｍｇ（７８％）得た。【００３７】
【化５】
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【００３８】
（４）上記化合物ｅ：８７５．１ｍｇ（１．２９ｍｍｏｌ）をメタノール２４．５ｍＬに溶解させ、氷冷下１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２４．５ｍＬを滴下し５０℃で１時間撹拌した。５０％ギ酸を用いてｐＨ３−４にし、析出した固体を濾取した。得られた固体をＨＰＬＣ（ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ  ＳＰ１００，φ２０×２５０ｍｍ，ｅｌｕｅｎｔ：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＝４５：５５，０．１％  ＴＦＡ）にて精製し、クルクミンモノグルクロニド（化合物ｆ）を２５３．１ｍｇ（３６％）得た。【００３９】
【化６】
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【００４０】
試験例１
（静脈内投与試験）
（１）供試動物
供試動物は、９週齢のＳＤラット（雄性、体重３３０〜３６０ｇ、日本チャールス・リバー社）を用いた。【００４１】
（２）静脈内投与方法
静脈内投与は、投与前１２時間以上絶食させた供試動物（ｎ＝５）に、製造例１で調製したクルクミンモノグルクロニドを３０ｍｇ／ｋｇとなるように所定量を注射用水に溶解させ、供試動物の大腿動脈に留置したカテーテルを介して行った。なお、前記カテーテルは、投与採血当日にイソフラン麻酔下で大腿動脈に留置した。【００４２】
（３）採血及び血漿採取方法
無麻酔ボールマンケージ拘束条件下で供試動物の大腿動脈からカテーテルを介してヘパリン処理したシリンジを用いて採血を行った。なお、静脈内投与開始１、３、５、１０、１５、３０、６０、１２０、２４０、４８０分後にそれぞれ約０．６ｍＬを採血し、これら採取した血液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）することで血漿を得た。【００４３】
（４）血漿中のクルクミン抱合体及び遊離型クルクミン濃度の分別定量
血漿中のクルクミン抱合体及び遊離型クルクミン濃度は、以下の方法によってそれぞれ求めた。【００４４】
ａ．前処理
採血した血漿２０μＬに０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１００μＬとβ−グルクロニダーゼ溶液（約６８，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）又は蒸留水１０μＬとを加え、３７℃で１時間保持し、ここに内部標準液であるメプロニル２０ｎｇ／ｍＬが含まれる５０％（ｖ／ｖ）メタノール１０μＬを添加した。次いで、クロロホルム０．５ｍＬを加え、これをボルテックスミキサーで１分間撹拌した後、超音波発生装置を用いて１５分間処理したものを遠心分離（１３，０００×ｇ、５分間、室温）することでクロロホルム層と水層とに分画した。また、この分画操作を２回繰り返した。その後、該クロロホルム層を採取し、これを減圧遠心濃縮機によって溶媒を留去することで乾固させ、ここに５０％（ｖ／ｖ）メタノール１００μＬを添加した後、遠心分離（１３，０００×ｇ、５分間、室温）して上清液を回収した。
なお、β−グルクロニダーゼ溶液を用いて調製した上清液を酵素処理サンプル、β−グルクロニダーゼ溶液の代わりに蒸留水を用いて調製した上清液を酵素非処理サンプルとして、以下の試験に用いた。【００４５】
ｂ．測定方法
上記ａ．で調製した酵素処理サンプル又は酵素非処理サンプル２μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（島津社製）を用いてそれぞれ分析を行うことで血漿中のクルクミン抱合体及び遊離型クルクミン濃度をそれぞれ求めた。
すなわち、β−グルクロニダーゼで処理して得た酵素処理サンプル中に含まれるクルクミン濃度を測定することで血漿中の総クルクミン濃度を測定した。
一方、β−グルクロニダーゼで処理していない酵素非処理サンプル中のクルクミン濃度を測定することで血漿中の遊離型クルクミン濃度を測定した。
また、前記総クルクミン濃度から前記遊離型クルクミン濃度を減ずることで血漿中に含まれるクルクミン抱合体濃度を算出した。
なお、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析条件は、ＬＣカラムがＡｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３（２．１×１５０ｍｍ，３μｍ，Ｗａｔｅｒｓ社製）、カラム温度が４０℃、流速が０．２ｍＬ／ｍｉｎ、移動相がＡ：０．１％ギ酸水溶液、Ｂ：０．１％ギ酸／アセトニトリルとし、以下の（表１）の条件でグラジェント溶出を行った。また、ＭＳ分析条件は、イオン化モードがＥｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｒａｙ  ｔｈｅｒｍｏ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ、測定モードがＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＭＲＭ）とし、クルクミン３６９．１→１７７．２（ｍ／ｚ）、メプロニル２７０→１１９（ｍ／ｚ）で評価した。
また、クルクミンを定量するために使用する検量線の作成は、クルクミンが１．０、２．０、３．９、７．８、１５．６、３１．３、６２．５、１２５又は２５０ｎｇ／ｍＬを含む５０％（ｖ／ｖ）メタノール溶液（クルクミン標準液）９０μＬにメプロニル２０ｎｇ／ｍＬを含む５０％エタノール溶液１０μＬを添加することで調製した各種標準溶液（クルクミン濃度０．９〜２２５ｎｇ／ｍＬ）を用いて上記同様の条件で測定することで行った。【００４６】
【表１】
2018003857.tif 000009
【００４７】
（５）結果
クルクミン抱合体を静脈内投与した場合のクルクミン抱合体および遊離型クルクミンの血漿中の濃度をそれぞれ調べた（図１）。
血漿中のクルクミン抱合体濃度は、静脈内投与１分後では１６０４９２±１９１５６ｎｇ／ｍＬであり、静脈内投与３分後では７７８０３±６４４２ｎｇ／ｍＬ、静脈内投与５分後では８０４８９±７１６１ｎｇ／ｍＬ、静脈内投与１０分後では４６８５３±１０７００ｎｇ／ｍＬ、静脈内投与１５分後では２２９１８±５２７１ｎｇ／ｍＬ、静脈内投与３０分後では１０１９１±３５０２ｎｇ／ｍＬ、静脈内投与１時間後では４３６３±１３５４ｎｇ／ｍＬ、静脈内投与２時間後では１４９３±３７１ｎｇ／ｍＬ、静脈内投与４時間後では４０３±１２０ｎｇ／ｍＬ、投与８時間後では７８±３９ｎｇ／ｍＬと、時間の経過に伴って減少していった。なお、この時のＡＵＣ０．０２−８ｈ（ｎｇ・ｈ／ｍＬ）は２８３８７±５０９３ｎｇ／ｍＬ、Ｃｍａｘ（ｎｇ／ｍＬ）は１６０４９２±１９１５６ｎｇ／ｍＬであった。
一方、血漿中の遊離型クルクミン濃度は、クルクミン抱合体を静脈内に投与する前には認められないが、クルクミン抱合体を静脈内への投与した１分後では１０１４３±３８３２ｎｇ／ｍＬと、血漿中に高濃度で存在することが分かった。また、静脈内投与３分後では７５６２±２９０３ｎｇ／ｍＬ、静脈内投与５分後では５７０７±２５３９ｎｇ／ｍＬ、静脈内投与１０分後では３５９６±１２３３ｎｇ／ｍＬ、静脈内投与１５分後では２７６４±７９６ｎｇ／ｍＬ、静脈内投与３０分後では１６０５±５９２ｎｇ／ｍＬ、静脈内投与１時間後では５６８±１９７ｎｇ／ｍＬ、静脈内投与２時間後では１１７±３９ｎｇ／ｍＬ、静脈内投与４時間後では１６±５ｎｇ／ｍＬ、静脈内投与８時間後では６±１４ｎｇ／ｍＬと、遊離型クルクミンが高濃度で血漿中に長時間維持されることが分かった。なお、この時のＡＵＣ０．０２−８ｈ（ｎｇ・ｈ／ｍＬ）は２７７８±９６２ｎｇ／ｍＬ、Ｃｍａｘ（ｎｇ／ｍＬ）は１０１４３±３８３２ｎｇ／ｍＬであった。
このように、クルクミン抱合体を非経口的に投与することによって長期にわたって薬理作用を有する遊離型クルクミンの血中濃度を高い値に維持できることが分かった。【００４８】
試験例２
（各種投与量におけるクルクミン抱合体の静脈内投与による抗腫瘍効果）
（１）供試動物
供試動物は、５週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮｃｒ  ｊ−ｎｕ／ｎｕ（ホモ）マウス（雌性、体重約１５〜１９ｇ、日本チャールス・リバー社）を購入し、約１０日環境馴化させたものを用いた。【００４９】
（２）移植方法
成人男性ヒト結腸由来結腸直腸癌細胞ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２４７）１×１０７個又は４×１０６個を供試動物の側腹部の皮下に２７Ｇ注射針を用いて移植した。【００５０】
（３）投与方法
前記癌細胞（ＨＣＴ１１６）が接種されたマウス（ｎ＝５又は８）に、接種開始０、２、４、６及び８日後又は０、３、５、７、１０、１２、１４、１７、１９及び２１日後、上記製造例１で調製したクルクミンモノグルクロニドを注射用水に溶解して調製した注射剤１５０〜２３０μＬ（体重１ｋｇあたりクルクミンモノグルクロニドが３０ｍｇ又は９０ｍｇ投与されるように調製したもの）を静脈内に注射針を用いて投与するとともに、経日的にマウスの腫瘍サイズを調べた。なお、対照群は、クルクミンモノグルクロニドを除いた注射用水を静脈内に投与したものとした。【００５１】
（４）腫瘍サイズの評価
腫瘍サイズは、摂取開始０、４、７、１１及び１４日後又は０、４、７、１１、１４、１８及び２１日後にノギスを用いて腫瘍の長さ、幅及び高さを測定し、次式によって算出した。
腫瘍サイズ（ｍｍ３）＝長さ×幅×高さ×０．５【００５２】
（５）腫瘍組織中のクルクミン抱合体及び遊離型クルクミン濃度
前記癌細胞（ＨＣＴ１１６）４×１０６個が接種されたマウス（ｎ＝８）について、接種開始２１日後におけるクルクミンモノグルクロニド（９０ｍｇ／ｋｇ）静脈内投与２時間後の腫瘍をマウスから摘出し、この摘出した腫瘍を生理食塩水で濯いだ後、直ちに液体窒素で凍結して−８０℃の超低温槽で保管した。
この凍結保管した腫瘍を氷冷下で解凍し、適量の生理食塩水を加えてガラスホモジナイザーでホモジナイズを行い、これによって得られた腫瘍粉砕物中のクルクミン抱合体及び遊離型クルクミン濃度を測定することで、腫瘍組織中に含まれるクルクミン抱合体及び遊離型クルクミン濃度を調べた。【００５３】
（６）結果
（投与量３０ｍｇ／ｋｇ−マウスの場合）
マウスの体重１ｋｇあたりクルクミン抱合体（クルクミンモノグルクロニド）３０ｍｇを非経口的に投与した場合の抗腫瘍効果について調べた（図２）。
クルクミン抱合体（クルクミンモノグルクロニド）を非経口的に投与した場合（３０ｍｇ／ｋｇ−マウス）、腫瘍サイズが投与開始０日後では１４２．９±４５．５ｍｍ３、投与開始４日後では２７５．１±８８．１ｍｍ３、投与開始７日後では３２６．１±１１０．７ｍｍ３、投与開始１１日後では４８９．４±１４７．８ｍｍ３、投与開始１４日後の５８１．２±１９７．４ｍｍ３であった。
一方、対照群の場合、腫瘍サイズが投与開始０日後では１４２．５±３９．９ｍｍ３、投与開始４日後では２９７．０±８２．９ｍｍ３、投与開始７日後では４３５．１±１３８．６ｍｍ３、投与開始１１日後では６５３．３±２３９．７ｍｍ３、投与開始１４日後の８２５．９±２７１．３ｍｍ３と、クルクミン抱合体（クルクミンモノグルクロニド）を非経口的に投与した場合と比べて、いずれの時期においても大きい値を示した。
なお、投与開始１４日後の採血で得られた血清を用いた生化学検査をオリエンタル酵母工業株式会社に委託（生化学検査セット（肝・胆疾患セット）２１項目）したところ、検査値に異常は認められなかった。【００５４】
（投与量９０ｍｇ／ｋｇ−マウスの場合）
マウスの体重１ｋｇあたりクルクミン抱合体（クルクミンモノグルクロニド）９０ｍｇを非経口的に投与した場合の抗腫瘍効果について調べた（図３）。
クルクミン抱合体（クルクミンモノグルクロニド）を非経口的に投与した場合（９０ｍｇ／ｋｇ−マウス）、腫瘍サイズが投与開始０日後では１７．４±３．２ｍｍ３、投与開始４日後では２３．６±８．４ｍｍ３、投与開始７日後では４２．６±１６．６ｍｍ３、投与開始１１日後では７７．５±２８．９ｍｍ３、投与開始１４日後の１２２．９±４２．６ｍｍ３、投与開始１８日後の２０４．４±７６．２ｍｍ３、投与開始２１日後の１９０．２±７０．１ｍｍ３であった。
一方、対照群の場合、腫瘍サイズが投与開始０日後では１７．６±２．９ｍｍ３、投与開始４日後では２９．７±５．９ｍｍ３、投与開始７日後では６１．８±１４．９ｍｍ３、投与開始１１日後では１０６．３±２２．０ｍｍ３、投与開始１４日後の１７９．８±２９．５ｍｍ３、投与開始１８日後の３７６．４±８１．７ｍｍ３、投与開始２１日後の５０５．６±１００．４ｍｍ３と、クルクミン抱合体（クルクミンモノグルクロニド）を非経口的に投与した場合と比べて、いずれの時期においても大きい値を示した。【００５５】
また、腫瘍組織中に含まれるクルクミン抱合体及び遊離型クルクミン濃度についてもそれぞれ調べたところ、腫瘍組織中のクルクミン抱合体濃度は、６０５．４±４６５．５ｎｇ／ｇ、腫瘍組織中の遊離型クルクミン濃度は、１４６４．５±８４０．９ｎｇ／ｇであった。【００５６】
これらの結果から、クルクミン抱合体を非経口的に投与することによって腫瘍の増殖を有意に抑制する効果があることが分かった。また、薬理作用を有する遊離型クルクミンが腫瘍中に高濃度で存在していることが認められ、腫瘍増殖抑制効果は遊離型クルクミンによるものと推察された。【００５７】
試験例３
（単回投与毒性試験）
マウスにクルクミンモノグルクロニドを１２５、２５０、５００及び１０００ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に単回投与し、その毒性を評価した。なお、各群のマウス数はｎ＝５とした。
（１）供試動物
供試動物は、６週齢のＳｌｃ：ＩＣＲマウス（雄性、体重約２７〜３１ｇ、日本エスエルシー株式会社）を購入し、約６日環境馴化させたものを用いた。【００５８】
（２）投与方法
上記製造例１で調製したクルクミンモノグルクロニドを生理食塩水（１２５、２５０及び５００ｍｇ／ｋｇの場合）又は注射用水（１０００ｍｇ／ｋｇの場合）に溶解して調製した溶液３２０〜３７０μＬ（体重１ｋｇあたりクルクミングルモノクロニドが１２５ｍｇ、２５０ｍｇ、５００ｍｇ又は１０００ｍｇ投与されるように調製したもの）をマウス（ｎ＝５）の静脈内に注射針を用いて投与した。【００５９】
（３）状態観察
マウスの状態観察は、肉眼的に観察されたすべての毒性徴候の種類、程度、発現時期、回復時期及び死亡（死亡発見）時期を記録することで行った。【００６０】
（４）観察時期
観察時期は、投与直後、投与開始３０分、１、２、４、６時間後及び投与翌日以降１日１回（投与開始１４日後まで）とした。なお、１０００ｍｇ／ｋｇ投与群については、投与直後から急性の症状が認められたため、投与開始１時間後までは頻回行った。【００６１】
（５）体重測定
体重測定は、投与直前、投与開始１、３、７、１０及び１４日後に電子天秤（ＵＷ４２００Ｓ、株式会社島津製作所）を用いて測定した。【００６２】
（６）血液生化学的検査
血液生化学的検査は、以下の方法によって行った。すなわち、マウス観察期間終了後（投与開始１４日後）にマウスを４時間以上絶食させ、このマウスをペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与による麻酔下で開腹し、腹大動脈から採血（採血量は０．６ｍＬ以上）した。次いで、この採血した血液をヘパリンナトリウムによって抗凝固処理した後、遠心分離（４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間）することで得た血漿について、該血漿中に含まれるトランスアミナーゼ（ＡＳＴ及びＡＬＴ）を測定することで行った。【００６３】
（７）剖検方法
剖検は、観察期間終了後（投与開始１４日後）、マウスをペントバルビタールナトリウム麻酔下で採血した後に腹大動脈及び後大静脈を切断して放血致死させ、このマウスを病理学的手技に従って解剖し、その頭蓋並びに胸腔内器官、腹腔内器官及びそれらの組織を肉眼的に観察することで行った。【００６４】
（８）結果
（肉眼観察によるマウスの状態）
各投与群におけるマウスの状態について、１２５ｍｇ／ｋｇ投与群では、観察期間を通して、すべてのマウス（ｎ＝５）の状態に異常は認められなかった。
２５０ｍｇ／ｋｇ投与群では、投与開始１時間後に１例（ｎ＝１）で立毛が認められたが、その後回復した。
５００ｍｇ／ｋｇ投与群では、投与直後から４時間後までにすべてのマウス（ｎ＝５）で自発運動の減少が、投与開始３０分から１時間後までに全例（ｎ＝５）で軟便が、投与開始３０分から４時間後までに３例（ｎ＝３）で立毛が認められたが、いずれの症状もその後回復した。
１０００ｍｇ／ｋｇ投与群では、投与直後から投与開始３０分までにすべてのマウス（ｎ＝５）で腹臥位及び自発運動の減少が認められた。また、投与直後に２例（ｎ＝２）、投与開始３０分後に１例（ｎ＝１）で呼吸緩徐が認められた。さらに、投与開始３０分以内に２例（ｎ＝２）で呼吸困難が認められた。さらにまた、投与開始３０分以内に２例（ｎ＝２）、投与開始３０分後から１時間までに１例（ｎ＝１）で麻痺性歩行が認められた。また、投与開始３０分以内に４例（ｎ＝４）、投与開始３０分から１時間以内に１例（ｎ＝１）が死亡した。
これらの結果から、単回投与量５００ｍｇ／ｋｇ以下では安全であり、半数致死量（ＬＤ５０）は５００ｍｇ／ｋｇから１０００ｍｇ／ｋｇの間にあることが分かった。【００６５】
（体重の推移）
各群のマウスの体重の推移を図４に示した。１２５ｍｇ／ｋｇ投与群では、いずれの動物も投与開始１４日後まで順調な体重増加を示した。２５０ｍｇ／ｋｇ投与群では投与開始１日後に１例（ｎ＝１）、５００ｍｇ／ｋｇ投与群では投与開始１日後に３例（ｎ＝３）でわずかな体重減少が認められたものの、いずれの動物も投与開始１４日後まで順調に体重が増加した。【００６６】
（血液生化学的検査）
各群（１２５、２５０及び５００ｍｇ／ｋｇ投与群）のマウスの血液生化学的検査について、１２５、２５０及び５００ｍｇ／ｋｇ投与群におけるＡＳＴ値は、それぞれ３７±４、３４±３及び３７±３ＩＵ／Ｌであり、１２５、２５０及び５００ｍｇ／ｋｇ投与群におけるＡＬＴ値は、それぞれ２４±６、２５±４及び３４±５ＩＵ／Ｌと、それぞれ正常な値を示した。なお、１０００ｍｇ／ｋｇ投与群については、すべて死亡したため、本検査は行わなかった。【００６７】
（剖検）
各群（１２５、２５０及び５００ｍｇ／ｋｇ投与群）の剖検を行ったところ、いずれの投与群においても、異常は認められなかった。なお、１０００ｍｇ／ｋｇ投与群については、すべて死亡したため、剖検は行わなかった。
これらの結果から、単回投与量が５００ｍｇ／ｋｇまでは異常が認められず、安全であることが分かった。【００６８】
試験例４
（β−グルクロニダーゼによるクルクミンジグルクロニドの脱抱合化）
クルクミンジグルクロニド（ＳｙｎＩｎｎｏｖａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）がβ−グルクロニダーゼで脱抱合化するかどうかを調べた。なお、対照として、クルクミンモノグルクロニドを用いて検討した。【００６９】
（１）供試試料
クルクミンモノグルクロニドは、上記製造例１で調製したものを使用した。また、クルクミンジグルクロニドは、市販のクルクミンジグルクロニド（ＳｙｎＩｎｎｏｖａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を使用した。
（２）前処理
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１００μＬとβ−グルクロニダーゼ溶液（約６８，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）１０μＬにクルクミンモノグルクロニド（２．８１μｇ／ｍＬ、ｎ＝３）１０μＬ又はクルクミンジグルクロニド（２．４５μｇ／ｍＬ、ｎ＝３）１０μＬを加え、３７℃で１時間保持し、ここに内部標準液であるメプロニル２０ｎｇ／ｍＬを含む５０％（ｖ／ｖ）メタノール１０μＬを添加した。次いで、ここにクロロホルム０．５ｍＬを加え、これをボルテックスミキサーで１分間撹拌した後、超音波発生装置を用いて１５分間処理したものを遠心分離（１０，０００×ｇ、５分間、室温）することでクロロホルム層と水層とに分画した。また、この分画操作を２回繰り返した。その後、該クロロホルム層を採取し、これを減圧遠心濃縮機によって溶媒を留去することで乾固させ、ここに５０％（ｖ／ｖ）メタノール１００μＬを添加した後、遠心分離（１０，０００×ｇ、５分間、室温）して上清液を回収したものを酵素処理サンプルとした。【００７０】
（３）測定方法
上記（２）で調製した酵素処理サンプル２μＬを前記試験例１（４）ｂ．測定方法に記載の方法によって遊離型クルクミンを測定した。
なお、クルクミンを定量するために使用する検量線の作成は、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１００μＬとβ−グルクロニダーゼ溶液（約６８，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）１０μＬに、クルクミンが４．１、１６．３、６５．４又は２６１．５ｎｇ／ｍＬを含む５０％（ｖ／ｖ）メタノール溶液（クルクミン標準液）１００μＬとメプロニル２０ｎｇ／ｍＬを含む５０％エタノール溶液１０μＬを加え、上記（２）と同様のクロロホルムによる処理及び減圧遠心濃縮機による溶媒留去を行った後、ここに５０％（ｖ／ｖ）メタノール１００μＬを添加した後、遠心分離（１０，０００×ｇ、５分間、室温）した上清液（クルクミン濃度４．１〜２６１．５ｎｇ／ｍＬ）を用いて上記同様の条件で測定することで行った。【００７１】
（４）結果
クルクミンモノグルクロニドをβ−グルクロニダーゼで酵素処理して得た酵素処理サンプル中に含まれるクルクミン濃度は、１５９．１±６．１ｎｇ／ｍＬであった。
一方、クルクミンジグルクロニドをβ−グルクロニダーゼで処理して得た酵素処理サンプル中に含まれるクルクミン濃度は、８２．４±０．８ｎｇ／ｍＬであった。
以上の結果から、クルクミンモノグルクロニドと同様に、クルクミンジグルクロニドもβ−グルクロニダーゼ処理することによって遊離型クルクミンが認められたことから、クルクミンジグルクロニドはβ−グルクロニダーゼによって脱抱合化されることが分かった。このため、クルクミンジグルクロニドを非経口的に投与した場合においても、クルクミンモノグルクロニドと同様の効果が得られると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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