(57)【要約】  ビフィドバクテリウム属細菌中で、遺伝子を効率よく発現することができるプロモーターを提供することを課題とし、ＴＴＧＮＮＮモチーフと、該ＴＴＧＮＮＮモチーフの下流に配置されたＴＡＴＡＮＴモチーフとを含むプロモーター、好ましくは、ＴＴＧＴＧＣモチーフと、該ＴＴＧＴＧＣモチーフの下流１１又は１７塩基長の位置に配置されたＴＡＴＡＡＴモチーフを含むプロモーターを、ビフィドバクテリウム属細菌の遺伝子発現用プロモーターとして用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌の遺伝子発現用プロモーターであって、
ＴＴＧＮＮＮモチーフと、
該ＴＴＧＮＮＮモチーフの下流に配置されたＴＡＴＡＮＴモチーフと
を含む、前記プロモーター。
【請求項２】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）であることを特徴とする請求項１に記載のプロモーター。
【請求項３】
ＴＴＧＮＮＮモチーフが、ＴＴＧＴＧＣモチーフであり、
ＴＡＴＡＮＴモチーフが、ＴＡＴＡＡＴモチーフであることを特徴とする請求項１又は２に記載のプロモーター。
【請求項４】
ＴＴＧＮＮＮモチーフと、ＴＡＴＡＮＴモチーフとの間の長さが、１１又は１７塩基長であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のプロモーター。
【請求項５】
配列番号１４に示されるヌクレオチド配列の６１〜９７番目のヌクレオチド残基、配列番号２０に示されるヌクレオチド配列の６１〜９１番目のヌクレオチド残基、又は配列番号２１に示されるヌクレオチド配列の６１〜９７番目のヌクレオチド残基を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のプロモーター。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のプロモーターと、該プロモーターの下流に作動可能に連結された遺伝子とを含むベクターを用いて、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌を形質転換する工程を含むことを特徴とする、前記遺伝子を発現するビフィドバクテリウム属細菌を作製する方法。
【請求項７】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＴＧＮＮＮモチーフと、該ＴＴＧＮＮＮモチーフの下流に配置されたＴＡＴＡＮＴモチーフとを含む、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌の遺伝子発現用プロモーターや、前記プロモーターと、前記プロモーターの下流に作動可能に連結された遺伝子とを含むベクターを用いて、ビフィドバクテリウム属細菌を形質転換する工程を含む、前記遺伝子を発現するビフィドバクテリウム属細菌を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィドバクテリウム属細菌は、腸内、膣、口腔等の組織に生息する偏性嫌気性細菌の一種である。ビフィドバクテリウム属細菌は、嫌気性細菌であるため、低酸素部位の１つである癌組織においても生存・増殖する。この性質を利用して、シトシン・デアミナーゼ（ＣＤ）を発現するベクターを、ビフィドバクテリウム属細菌に形質転換し、かかる形質転換株と、５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を用いて癌を治療できることが報告されている（特許文献１、非特許文献１、２）。５−ＦＣ自体は、哺乳類の生体内では利用されないため、毒性は低いものの、癌組織中の形質転換株から発現するＣＤ、すなわち、抗腫瘍活性を有する５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のプロドラッグ（前駆体）である５−ＦＣを５−ＦＵに変換する酵素により、５−ＦＵに変換されると、癌細胞のタンパク質合成やＤＮＡ合成が阻害される。【０００３】
このような形質転換株を用いた治療において、目的のタンパク質（ＣＤ）を効率よく発現させることが、癌治療効果を高める上でも重要である。目的のタンパク質の発現効率を高める手段の１つとして、プロモーターを改変し、プロモーター活性、すなわち、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの転写活性を高めることがある。実際に、様々な細菌種において、プロモーターの改良が行われている（特許文献２〜４）。しかしながら、ビフィドバクテリウム属細菌において、プロモーター活性を向上させたプロモーターについては、これまで報告されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−９７１４４号公報
【特許文献２】特開２０１１−１０３８７５号公報
【特許文献３】特開２００８−２１２１５７号公報
【特許文献４】特表２０１５−５０６６９３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nakamura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 2362-2366(2002)
【非特許文献２】Fujimori et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 5, 200-203(2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ビフィドバクテリウム属細菌中で、遺伝子を効率よく発現することができるプロモーターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）中で効率よく発現する遺伝子のプロモーターに着目し、かかるプロモーターの２種類のコンセンサス配列（コンセンサス配列１「ＴＴＧＴＧＣ」、及びコンセンサス配列２「ＴＡＣＡＡＴ」）を見いだした。【０００８】
また、かかるコンセンサス配列に塩基置換を導入した場合に、プロモーターによる転写活性（プロモーター活性）にどのような影響を及ぼすかについて解析したところ、コンセンサス配列１（ＴＴＧＴＧＣ）の１番目のヌクレオチド残基（Ｔ）、２番目のヌクレオチド残基（Ｔ）、及び３番目のヌクレオチド残基（Ｇ）、並びに、コンセンサス配列２（ＴＡＣＡＡＴ）の１番目のヌクレオチド残基（Ｔ）、２番目のヌクレオチド残基（Ａ）、４番目のヌクレオチド残基（Ａ）、及び６番目のヌクレオチド残基（Ｔ）は、特にプロモーター活性向上に必要であることを示すとともに、コンセンサス配列２の３番目のヌクレオチド残基（Ｃ）については、Ｔに置換した方がプロモーター活性は向上することも見いだした。【０００９】
さらに、上記知見に基づき、天然のプロモーター（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のＨＵ遺伝子プロモーター）を改変して最適化すると、プロモーター活性が向上するかどうかを解析したところ、「ＴＴＧＮＮＮ」モチーフと、当該モチーフと下流に「ＴＡＴＡＮＴ」モチーフを有するプロモーターは、ビフィドバクテリウム属細菌中で高いプロモーター活性（転写活性）を有することや、両モチーフ間の塩基長が、約１１塩基長又は１７塩基長である場合、特に約１７塩基長のときに、プロモーター活性はより高くなることを確認し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌の遺伝子発現用プロモーターであって、ＴＴＧＮＮＮモチーフと、該ＴＴＧＮＮＮモチーフの下流に配置されたＴＡＴＡＮＴモチーフとを含む、前記プロモーター。
〔２〕ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）であることを特徴とする上記〔１〕に記載のプロモーター。
〔３〕ＴＴＧＮＮＮモチーフが、ＴＴＧＴＧＣモチーフであり、ＴＡＴＡＮＴモチーフが、ＴＡＴＡＡＴモチーフであることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載のプロモーター。
〔４〕ＴＴＧＮＮＮモチーフと、ＴＡＴＡＮＴモチーフとの間の長さが、１１又は１７塩基長であることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のプロモーター。
〔５〕配列番号１４に示されるヌクレオチド配列の６１〜９７番目のヌクレオチド残基、配列番号２０に示されるヌクレオチド配列の６１〜９１番目のヌクレオチド残基、又は配列番号２１に示されるヌクレオチド配列の６１〜９７番目のヌクレオチド残基を含むことを特徴とする上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のプロモーター。
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のプロモーターと、該プロモーターの下流に作動可能に連結された遺伝子とを含むベクターを用いて、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌を形質転換する工程を含むことを特徴とする、前記遺伝子を発現するビフィドバクテリウム属細菌を作製する方法。
〔７〕ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）であることを特徴とする上記〔６〕に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、ビフィドバクテリウム属細菌中で、遺伝子を効率よく発現することができるため、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌を、固形腫瘍等の嫌気的疾患治療用遺伝子輸送担体として使用し、ミサイル療法を行うときに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａは、転写開始点（ＴＳＳ；Transcriptional Start Sites）におけるヌクレオチド残基（Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ）の出現頻度を解析した結果を示す図である。図１Ｂ及びＣは、ＴＳＳと開始コドンの間の長さ（塩基長）を解析した結果を示す図である。
【図２】図２Ａは、推定上のビフィドバクテリウム属細菌プロモーターの−３５領域及び−１０領域を示す図である。図２Ｂは、ビフィドバクテリウム属細菌プロモーターの−３５領域における６塩基長のヌクレオチド残基（図中の１〜６）の出現頻度を解析した結果を示す図である。図２Ｃは、ビフィドバクテリウム属細菌プロモーターの−１０領域における６塩基長のヌクレオチド残基（図中の７〜１２）の出現頻度を解析した結果を示す図である。図２Ｄは、プロモーターのコンセンサス配列について、ビフィドバクテリウム属細菌（B. longum）と大腸菌（E. coli）との間で比較した結果を示す図である。
【図３】図３Ａは、プラスミドｐＫＯ４０３−ＴＰＣＴｃｏｎの模式図である。図３Ｂは、ｐＫＯ４０３−ＴＰＣＴｃｏｎのプロモーター領域における２つのコンセンサス配列（「ＴＴＧＴＧＣ」［コンセンサス配列１］及び「ＴＡＣＡＡＴ」［コンセンサス配列２］）に、１塩基置換を導入した場合のプロモーター活性を測定した結果（平均値±２×標準偏差、ｎ＝３）を示す図である。図中の「置換部位１〜６」の結果は、図２Ａに対応する部位、すなわち、コンセンサス配列１の１〜６番目のヌクレオチド残基（Ｔ、Ｔ、Ｇ、Ｔ、Ｇ、及びＣ）を、それぞれＡ、Ｃ、Ｃ、Ａ、Ｃ、及びＡに置換したときの結果を示す。また、図中の「置換部位７〜１２」の結果は、図２Ａに対応する部位、すなわち、コンセンサス配列２の１〜６番目のヌクレオチド残基（Ｔ、Ａ、Ｃ、Ａ、Ａ、及びＴ）を、それぞれＧ、Ｔ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及びＡに置換したときの結果を示す。図中の「＊」及び「＊＊」は、それぞれ統計学的に有意差（ｐ＜０．０５、及びｐ＜０．０１）があることを示す。
【図４】図４Ａは、スペーサー長の解析に用いたモチーフ２種（「ＴＴＧＮＮＮ」、及び「ＴＡＮＮＮＴ」）の模式図である。図４Ｂは、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来の遺伝子１３０種のプロモーターにおける上記モチーフ２種間のスペーサー長を解析した結果を示す図である。図４Ｃは、１７種類のビフィドバクテリウム属細菌由来のプロモーターにおける、上記モチーフ２種間のスペーサー長を解析した結果（平均値±２×標準偏差、ｎ＝１７）を示す図である。図中の「＊＊」は、統計学的に有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。図４Ｄは、ビフィドバクテリウム・ロンガム（各黒色の棒グラフ）及び大腸菌（E. coli）Ｋ−１２株（各灰色の棒グラフ）由来のプロモーターにおける上記モチーフ２種間のスペーサー長を解析した結果を示す図である。
【図５】ＨＵ遺伝子プロモーター中の２つのモチーフ（「ＴＴＣＧＣＡ」及び「ＴＡＧＴＡＴ」）や、両モチーフ間のスペーサー長を改変したときのプロモーター活性を測定した結果（平均値±２×標準偏差、ｎ＝３）を示す図である。縦軸の「プロモーター活性レベル」は、改変前のＨＵ遺伝子プロモーター（「hup-original」）活性を１としたときの相対値として示す。
【図６】ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のＨＵ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡ領域（配列番号１８に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ領域［Ｈｕ１］）の下流に、作動可能に連結したマウスインターフェロン（ｍＩＦＮ）−γ遺伝子を含むプラスミドベクター（pmIFNg33TL-Hu1）の作製方法を模式的に示す図である。
【図７】上記ＨＵ遺伝子プロモーターの改変型を含むＤＮＡ領域（配列番号１４に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ領域［Ｈｕ２］）の下流に、作動可能に連結したｍＩＦＮ−γ遺伝子を含むプラスミドベクター（pmIFNg33TL-Hu2）の作製方法を模式的に示す図である。
【図８】プラスミドベクター（pBEshuttle-Hu2a）の作製方法を模式的に示す図である。
【図９−１】プラスミドベクター（pmIFNg）の作製方法を模式的に示す図である。
【図９−２】プラスミドベクター（pmIFNg33）の作製方法を模式的に示す図である。
【図９−３】プラスミドベクター（pmIFNg33-B）の作製方法を模式的に示す図である。
【図９−４】プラスミドベクター（pmIFNg33TL-B）の作製方法を模式的に示す図である。
【図１０】mIFNg33TL-Hu1形質転換株及びmIFNg33TL-Hu2形質転換株を０〜１８時間培養したときの生菌数（図１０Ａ）と、培養液中に分泌されたｍＩＦＮ−γ濃度（図１０Ｂ）を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のプロモーターは、「ビフィドバクテリウム属細菌中で遺伝子を発現するため」という用途が限定された、ＴＴＧＮＮＮモチーフ（配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるモチーフ）（以下、「本件モチーフ１」ということがある）と、本件モチーフ１の下流に配置されたＴＡＴＡＮＴモチーフ（配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるモチーフ）（以下、「本件モチーフ２」ということがある）とを含むプロモーター（以下、「本件プロモーター」ということがある）である。
【００１４】
本明細書において、「遺伝子を発現する」とは、遺伝子のｍＲＮＡの発現や、遺伝子のｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現を意味する。
【００１５】
本明細書において、「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼ（好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ及び基本転写因子）が結合し、その下流に位置する遺伝子がコードするｍＲＮＡの転写を開始させる領域を意味する。本件プロモーターには、通常転写開始点（ＴＳＳ）が含まれる。
【００１６】
本明細書において、「下流」とは、遺伝子を作動可能となるように本件プロモーターに連結したときに、遺伝子により近い側を意味し、また「上流」とは、遺伝子により遠い側を意味する。
【００１７】
本明細書において、「Ａ」はアデニン残基、「Ｔ」はチミン残基、「Ｇ」はグアニン残基、及び「Ｃ」はシトシン残基をそれぞれ意味し、また、「Ｎ」は、「Ａ」、「Ｔ」、「Ｇ」、及び「Ｃ」のうち、任意のヌクレオチド残基を意味する。
【００１８】
本件プロモーターの長さとしては、ＲＮＡポリメラーゼ（好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ及び基本転写因子）が結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を開始させるのに十分な長さであればよく、通常２０塩基長以上であり、好ましくは２２塩基長以上、より好ましくは２４塩基長以上、さらに好ましくは２６塩基長以上、さらにより好ましくは２８塩基長以上、特に好ましくは２９塩基長以上、最も好ましくは３０塩基長以上である。また、本件プロモーターをベクターにクローニングする場合を考慮すると、本件プロモーターの長さは、通常３００塩基長以内であり、好ましくは２００塩基長以内、より好ましくは１００塩基長以内、さらに好ましくは９０塩基長以内、さらにより好ましくは８０塩基長以内、特に好ましくは７０塩基長以内、特により好ましくは６０塩基長以内、最も好ましくは５０塩基長以内である。
【００１９】
本件モチーフ１としては、配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるモチーフ、すなわち、プロモーターの上流から順に、Ｔ、Ｔ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、及びＮ（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ）のヌクレオチド配列からなるモチーフであれば特に制限されず、例えば、ＴＴＧＡＧＣモチーフ、ＴＴＧＴＣＣモチーフ、ＴＴＧＴＧＡモチーフ、ＴＴＧＴＧＣモチーフ等であってもよいが、ＴＴＧＴＧＣモチーフ（配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるもの）が好ましい。
【００２０】
本件プロモーターに含まれる（配置される）本件モチーフ１の位置（領域）としては、本件モチーフ２の上流であれば特に制限されないが、−３５領域が好ましい。ここで「−３５領域」とは、通常転写開始点から上流２５〜５５塩基長の範囲内（好ましくは２５〜５０塩基長の範囲内、より好ましくは２５〜４５塩基長の範囲内、さらに好ましくは２５〜４０塩基長の範囲内、最も好ましくは３０〜４０塩基長の範囲内）の部位を意味する。本明細書において、「本件モチーフ１が−３５領域に配置される」とは、本件モチーフ１における１〜６番目のヌクレオチド残基、すなわち、Ｔ、Ｔ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、及びＮのヌクレオチド残基のいずれかが、−３５領域に相当する部位に配置されることを意味する。
【００２１】
本件モチーフ２としては、配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるモチーフ、すなわち、プロモーターの上流から順に、Ｔ、Ａ、Ｔ、Ａ、Ｎ、及びＴ（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ）のヌクレオチド配列からなるモチーフであれば特に制限されず、例えば、ＴＡＴＡＡＴモチーフ、ＴＡＴＡＴＴモチーフ、ＴＡＴＡＧＴモチーフ、ＴＡＴＡＣＴモチーフであってもよいが、ＴＡＴＡＡＴモチーフ（配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなるもの）が好ましい。
【００２２】
本件プロモーターに含まれる（配置される）本件モチーフ２の位置（領域）としては、本件モチーフ１の下流であれば特に制限されないが、−１０領域が好ましい。ここで「−１０領域」とは、通常転写開始点から上流１〜３０塩基長の範囲内（好ましくは３〜２４塩基長の範囲内、より好ましくは４〜２０塩基長の範囲内、さらに好ましくは６〜１６塩基長の範囲内、最も好ましくは８〜１３塩基長の範囲内）の部位を意味する。本明細書において、「本件モチーフ２が−１０領域に配置される」とは、本件モチーフ２における１〜６番目のヌクレオチド残基、すなわち、Ｔ、Ａ、Ｔ、Ａ、Ｎ、及びＴのヌクレオチド残基のいずれかが、−１０領域に相当する部位に配置されることを意味する。
【００２３】
本件モチーフ１と、本件モチーフ２との間の長さとしては、ＲＮＡポリメラーゼ（好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ及び基本転写因子）の本件プロモーターへの結合能や、転写開始に悪影響を及ぼさなければよく、通常１０〜２０塩基長の範囲内であり、好ましくは１０〜１４塩基長、又は１６〜２０塩基長、より好ましくは１０〜１３塩基長、又は１６〜１９塩基長、さらに好ましくは１１〜１２塩基長、又は１６〜１８塩基長、さらにより好ましくは１１〜１２塩基長、又は１７〜１８塩基長である。本明細書において、「本件モチーフ１と、本件モチーフ２との間の長さ」とは、本件モチーフ１における６番目のヌクレオチド残基（Ｎ）と、本件モチーフ２における１番目のヌクレオチド残基（Ｔ）との間の長さを意味する。例えば、本件モチーフ１と本件モチーフ２との間にヌクレオチド残基が存在しない場合、両モチーフ間の長さは０塩基長である。
【００２４】
本件プロモーターとしては、具体的に、配列番号１４に示されるヌクレオチド配列の６１〜９７番目のヌクレオチド残基、配列番号２０に示されるヌクレオチド配列の６１〜９１番目のヌクレオチド残基、又は配列番号２１に示されるヌクレオチド配列の６１〜９７番目のヌクレオチド残基を含むプロモーターを挙げることができる。
【００２５】
本件プロモーターと、本件プロモーターの下流に作動可能に連結された遺伝子とを含むベクター（以下、「本件ベクター」ということがある）を用いて、ビフィドバクテリウム属細菌を形質転換すると、前記遺伝子を発現するビフィドバクテリウム属細菌を作製することができる。
【００２６】
上記ビフィドバクテリウム属細菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム（Bifidobacterium thermophilum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）を挙げることができ、ビフィドバクテリウム・ロンガムが好ましい。
【００２７】
上記「本件プロモーターの下流に作動可能に連結された遺伝子」としては、ビフィドバクテリウム属細菌に由来する遺伝子であっても、ビフィドバクテリウム属細菌以外の生物種に由来する遺伝子であってもよい。かかるビフィドバクテリウム属細菌以外の生物種に由来する遺伝子としては、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、β、γ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、リンホトキシン（ＬＴ）−β、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）等のサイトカイン（免疫系細胞から分泌されるタンパク質）をコードする遺伝子；エンドスタチン、アンジオスタチン等の血管新生抑制物質をコードする遺伝子；５−フルオロウラシルのプロドラッグである５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換する酵素であるシトシン・デアミナーゼをコードする遺伝子；抗体をコードする遺伝子；などを挙げることができる。これら遺伝子には、遺伝子がコードするタンパク質の単離処理等における便宜のため、ヒスチジンタグ等のアフィニティタグをコードするヌクレオチド配列や、遺伝子がコードするタンパク質のビフィドバクテリウム属細菌外への分泌を促進させるため、分泌シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を適宜付加することもできる。
【００２８】
本件ベクターとしては、遺伝子発現効率をさらに高めるために、エンハンサー領域やリボソーム結合領域（ＲＢＳ；ribosome binding site）の塩基配列（例えば、「ＡＡＧＧＡＧ」モチーフ、「ＡＡＧＡＡＧＧＡＴＧＣＴＴＴ」モチーフ）をさらに含むものや、形質転換株のスクリーニングのために、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子（選択マーカー遺伝子）をさらに含むものが好ましい。エンハンサー領域は、通常本件プロモーターの上流に配置され、ＲＢＳは、通常本件プロモーターと遺伝子の間に配置される。
【００２９】
形質転換する方法としては、特に制限されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法を挙げることができる。
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
１．ビフィドバクテリウム属細菌のプロモーター解析
１−１  材料と方法
［培養条件］
ビフィドバクテリウム・ロンガムの培養は、ＭＲＳ（Lactobacilli MRS Broth、Difco社製）培養液中又はＭＲＳ寒天培地上、３７℃嫌気条件下で行った。【００３２】
［全ＲＮＡの調製及びＲＮＡ−ｓｅｑ解析］
ビフィドバクテリウム・ロンガム由来の全ＲＮＡの調製と、全ＲＮＡを用いたＲＮＡ−ｓｅｑは、以下の手順〔１〕〜〔８〕にしたがって行った。
〔１〕ビフィドバクテリウム・ロンガムを含む培養液４８ｍＬを遠心処理（６，５００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清（培養液）を除いた後、５００μＬ ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、１ｍＬ ＲＮａｓｅ阻害剤（RNA protect bacteria reagent、Qiagen社製）を加えた。
〔２〕遠心処理（５，０００×ｇ、１０分、室温）し、上清を除いた後、２ｍｇ 細胞壁溶解酵素（Labiase）を溶解した１０ｍＭ クエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．０）１ｍＬと、１ｍｇ プロテアーゼＫ（和光純薬工業社製）を溶解した１００μＬ ＴＥ緩衝液とを加え、１０分間室温でインキュベートした。
〔３〕１ｍＬ TRIzol試薬（Thermo Fisher Scientific社製）を加え、１分間ボルテックスした後、室温で３分間インキュベートした。
〔４〕遠心処理（１２，０００×ｇ、１５分、４℃）し、上清を回収した後、２００μＬクロロホルムを加え、１５秒間ボルテックスし、室温で５分間インキュベートした。
〔５〕遠心処理（１２，０００×ｇ、１５分、４℃）し、上清を回収した後、０．５ｍＬイソプロパノールを加え、室温で１０分間インキュベートした。
〔６〕遠心処理（１２，０００×ｇ、１０分、４℃）し、上清を除いた後、７５％ エタノールを加え、遠心処理（７，５００×ｇ、５分、４℃）し、上清を除いた後、ＲＮａｓｅ不含の水５０μＬに懸濁した。
〔７〕転写開始点（ＴＳＳ）を同定するために、Ribo-Zero rRNA Removal Kit（Illumina社製）を用いて、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を分解・除去し、全ＲＮＡを調製した。
〔８〕全ＲＮＡを用いたＲＮＡ−ｓｅｑ解析は、MiSeq Sequencing System（Illumina社製）により使用説明書にしたがって行った。【００３３】
［プラスミド］
ＣＡＴ（chloramphenicol acetyltransferase）アッセイに用いる１３種類のプラスミドは、Golden Gate法を用いて構築した。具体的には、プロモーターの−３５領域及び−１０領域に、２つのコンセンサス配列（−３５領域における「ＴＴＧＴＧＣ」モチーフ［以下、便宜上「コンセンサス配列１」ということがある］、及び、−１０領域における「ＴＡＣＡＡＴ」モチーフ［以下、便宜上「コンセンサス配列２」ということがある］）を含み、かつ、コンセンサス配列１及び２の間に、１７塩基長のスペーサー配列（ＴＣＡＣＴＡＣＡＧＡＧＴＣＧＧＡＣ）を含むプロモーター（配列番号５に示されるヌクレオチド配列の６１〜９７番目のヌクレオチド残基からなるプロモーター）と、かかるプロモーターの下流に、ＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコール耐性遺伝子）が挿入されたＤＮＡ断片とを含むプラスミドｐＫＯ４０３−ＴＰＣＴｃｏｎ（表１、図３Ａ）や、ｐＫＯ４０３−ＴＰＣＴｃｏｎを基にして、コンセンサス配列１及び２に、１塩基置換を導入した１２種類のプロモーター（配列番号６〜１７に示されるヌクレオチド配列の６１〜９７番目のヌクレオチド残基からなるプロモーター）を含むプラスミド（ｐＫＯ４０３−ＴＰＣＴ１〜１２、表１）を構築した。なお、これらプラスミドには、形質転換株のスクリーニング用として、スペクチノマイシン（Ｓｐ）耐性遺伝子が挿入されている（図３Ａ）。【００３４】
【表１−１】
2018062225.tif 000002
【表１−２】
2018062225.tif 000003
表中のヌクレオチド配列は、上流から下流方向のリーディング鎖を示す。ヌクレオチド配列中の２つの下線部は、それぞれプロモーターの−３５領域及び−１０領域を示す。ヌクレオチド配列中の二重線部は、ＲＢＳを示す。ヌクレオチド配列中の四角で囲った部分は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列に、１塩基置換を導入した箇所を示す。ヌクレオチド配列中の二重四角で囲った部分は、ＴＳＳを示す。【００３５】
［ＣＡＴアッセイ］
形質転換株中の各種プラスミドにおけるＣＡＴ活性（プロモーター活性）は、各種プラスミドから発現したＣＡＴが、アセチルＣｏＡのアセチル基をクロラムフェニコールに転移した結果生じるＨＳ−ＣｏＡを定量することにより、測定した。ここで、ＨＳ−ＣｏＡの定量には、5, 5’-Dithiobis（ＤＴＮＢ）（λmax＝３２５ｎｍ）を用い、ＨＳ−ＣｏＡのチオール基により還元されたＤＴＮＢ（5-Mercapto-2-nitrobenzoic acid；ＴＮＢ）（λmax＝４１２ｎｍ）の濃度を、波長４１２ｎｍにおける吸光度（Ａ４１２）を測定することによりＨＳ−ＣｏＡを定量した。具体的な手順〔１〕〜〔５〕を、以下に示す。
〔１〕ビフィドバクテリウム・ロンガムと、各種プラスミド１００ｎｇとの混合液５０μＬを、２ｍｍギャップキュベットに入れ、２．１ｋＶ、２５μＦ、２００Ω条件下で、エレクトロポレーション（MicroPulser、Bio-Rad社製）を行い、ビフィドバクテリウム・ロンガムにプラスミドを形質転換させた。
〔２〕形質転換株を、７５μｇ／ｍＬ スペクチノマイシンを含有するＭＲＳ寒天培地上で選択培養した。
〔３〕選択された形質転換株のコロニーを単離し、波長４１２ｎｍにおける吸光度が０．６になるまでＭＲＳ培養液中で培養した。
〔４〕ＰＢＳ溶液で２回洗浄し、２分間超音波破砕処理を行った後、遠心処理（１３，０００ｒｐｍ、５分、４℃）し、上清５μＬを回収した。
〔５〕回収した上清と、ＣＡＴアッセイ溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、２．５ｍＭ ＤＴＮＢ、５ｍＭ アセチルＣｏＡ、及び０．３％［ｗ／ｖ］ クロラムフェニコール）とを９６ウェルプレート中で混合し、３７℃で５分間インキュベートした後、Ａ４１２を測定した。なお、コントロールとして、形質転換していない野生株（ビフィドバクテリウム・ロンガム）（図３Ｂの「ＷＴ」）についても同様にＡ４１２を測定した。プロモーター活性は、ｐＫＯ４０３−ＴＰＣＴｃｏｎの形質転換株（図３Ｂの「ＰＣ」）から得られたＡ４１２に対する相対値（図３Ｂの縦軸）として算出した。【００３６】
１−２  結果
[転写開始点のグローバルな解析]
ビフィドバクテリウム属細菌のプロモーターモチーフを解析する前に、まず転写開始点（ＴＳＳ）を同定することを試みた。上記［全ＲＮＡの調製及びＲＮＡ−ｓｅｑ解析］の項目に記載の方法にしたがってＲＮＡ配列を読み、ビフィドバクテリウム・ロンガムのゲノムＤＮＡ上にマッピングした。その結果、２６９種類の遺伝子は高い発現が認められた（＞７００ＲＰＫＭ［Reads Per Kilobase of exon per Million mapped reads］）。そのうち、特に顕著な変動が認められた１３０種類の遺伝子について、ＴＳＳを同定したところ、主にアデニン残基（Ａ）又はグアニン残基（Ｇ）であることが示された（図１Ａ）。また、かかる１３０種類のＴＳＳのうち、６７％（２／３）は、開始コドン（ＡＴＧ）から上流１００塩基長以内に配置されており（図１Ｂ）、４６％は、開始コドン（ＡＴＧ）から上流４０塩基長以内に配置されていた（図１Ｃ）。【００３７】
［プロモーターモチーフの同定］
続いて、高発現する遺伝子由来の上記１３０種類のＴＳＳを基に、プロモーターの−３５領域（ＴＳＳから上流２５〜５５塩基長の範囲内）及び−１０領域（ＴＳＳから上流１〜３０塩基長の範囲内）（図２Ａ）におけるモチーフ解析を行った。具体的には、CLC Genomics Workbench（ver. 5.1）（Qiagen社製）のパターン検索機能を用い、上記１３０種類のＴＳＳの上流５５塩基長のＤＮＡ領域に対して、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ；hidden Markov model）を適用したところ、−３５領域及び−１０領域それぞれについて、出現頻度の高い６塩基長のヌクレオチド配列からなるコンセンサス配列（−３５領域における「ＴＴＧＴＧＣ」モチーフ［コンセンサス配列１］、及び、−１０領域における「ＴＡＣＡＡＴ」モチーフ［コンセンサス配列２］）が同定された（図２Ｂ〜Ｄ）。【００３８】
［プロモーター活性の測定］
コンセンサス配列１又は２に１塩基置換を導入した場合に、プロモーターによる転写活性、すなわち、プロモーター活性にどのような影響を及ぼすかについて、ＣＡＴアッセイにより解析した。その結果、コンセンサス配列１（ＴＴＧＴＧＣ）の１〜３番目のヌクレオチド残基、並びに、コンセンサス配列２（ＴＡＣＡＡＴ）の１、２、４、及び６番目のヌクレオチド残基を置換した場合、置換しなかった場合と比べ、プロモーター活性は大幅に低下し、特にコンセンサス配列２の６番目のヌクレオチド残基を置換した場合、バックグランドレベル（図３Ｂの「ＷＴ」）まで低下した（図３Ｂ）。一方、コンセンサス配列１（ＴＴＧＴＧＣ）の４〜６番目のヌクレオチド残基、及びコンセンサス配列２の５番目のヌクレオチド残基を置換した場合、置換しなかった場合と比べ、プロモーター活性はそれほど低下しなかった（図３Ｂ）。さらに、コンセンサス配列２（ＴＡＣＡＡＴ）の３番目のヌクレオチド残基（Ｃ）をＴ（チミン）に置換した場合、置換しなかった場合と比べ、プロモーター活性は大幅に上昇した（図３Ｂ）。これらの結果は、コンセンサス配列１（ＴＴＧＴＧＣ）の１番目のヌクレオチド残基（Ｔ）、２番目のヌクレオチド残基（Ｔ）、及び３番目のヌクレオチド残基（Ｇ）、並びに、コンセンサス配列２（ＴＡＣＡＡＴ）の１番目のヌクレオチド残基（Ｔ）、２番目のヌクレオチド残基（Ａ）、４番目のヌクレオチド残基（Ａ）、及び６番目のヌクレオチド残基（Ｔ）は、特にプロモーター活性向上に必要であることを示すとともに、コンセンサス配列２の３番目のヌクレオチド残基（Ｃ）については、Ｔに置換した方がプロモーター活性は向上することを示している。
【実施例２】
【００３９】
２．プロモーターにおけるモチーフ間のスペーサー解析
実施例１で同定したコンセンサス配列間のスペーサー長を解析した。完全なコンセンサス配列、すなわち、コンセンサス配列１及び２を含むプロモーターは、数が少ないことが予想されたので、プロモーター活性の解析結果を基に、プロモーター活性に特に重要なヌクレオチド残基を含む２種類のモチーフ（「ＴＴＧＮＮＮ」、及び「ＴＡＮＮＮＴ」）（図４Ａ）について、CLC Genomics Workbench（ver. 5.1）（Qiagen社製）を用い、モチーフ間のスペーサーの長さ（塩基長）を解析した。その結果、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来の遺伝子１３０種のプロモーターのうち、４６％（６０／１３０）は、上記２種類のモチーフ間のスペーサーが、１１又は１７塩基長のものであることが示された（図４Ｂ）。また、１７種類のビフィドバクテリウム属細菌について、スペーサーの長さを解析したところ、同様に１１又は１７塩基長のスペーサーが主流であることが示された（図４Ｃ）。次に、ビフィドバクテリウム・ロンガム及び大腸菌（E. coli）の全遺伝子について、ＴＳＳの上流１５０塩基長のＤＮＡ領域のスペーサーの長さを調べたところ、スペーサーは、ビフィドバクテリウム・ロンガムにおいては、１１又は１７塩基長のものが主流であるのに対して、大腸菌においては、１７塩基長のもののみが主流であることがわかった（図４Ｄ）。
【実施例３】
【００４０】
３．改変したプロモーターの解析
上記実施例１及び２で得られた知見を基に、天然のプロモーターを改変して最適化すると、プロモーター活性が向上するかどうかをＣＡＴアッセイにより解析した。ＣＡＴアッセイに用いるプラスミドは、実施例１の［プラスミド］の項目に記載の方法にしたがって構築した。【００４１】
具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のＨＵ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡ領域（配列番号１８に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ領域、表１）におけるＲＢＳを最適化したもの（配列番号１９に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ領域、表１）を作製した後、ＨＵ遺伝子プロモーターの下流に、ＣＡＴ遺伝子が挿入されたＤＮＡ断片とを含むプラスミド「hup-original」（表１）や、プラスミド「hup-original」を基にして、上記ＨＵ遺伝子プロモーターの−３５領域における「ＴＴＣＧＣＡ」モチーフを、コンセンサス配列１（「ＴＴＧＴＧＣ」モチーフ）に置換し、かつ−１０領域における「ＴＡＧＴＡＴ」モチーフを、コンセンサス配列２（ＴＡＣＡＡＴ）を最適化したモチーフ（「ＴＡＴＡＡＴ」モチーフ）に置換したプロモーター（配列番号２０に示されるヌクレオチド配列の６１〜９１番目のヌクレオチド残基からなるプロモーター）を含むプラスミド「hup-optimal-11bp」（表１）や、かかるプラスミド「hup-optimal-11bp」の−３５領域及び−１０領域間のスペーサーの長さ（１１塩基長）を、１７塩基長に伸長したプロモーター（配列番号２１に示されるヌクレオチド配列の６１〜９７番目のヌクレオチド残基からなるプロモーター）を含むプラスミド「hup-optimal-17bp」（表１）を構築した。これら３種プラスミドを用い、実施例１の［ＣＡＴアッセイ］の項目に記載の方法にしたがってプロモーター活性を測定した。【００４２】
その結果、ＨＵ遺伝子プロモーター中の２つのモチーフ（「ＴＴＣＧＣＡ」及び「ＴＡＧＴＡＴ」）を、それぞれ「ＴＴＧＴＧＣ」及び「ＴＡＴＡＡＴ」へ改変すると、天然のＨＵ遺伝子プロモーターと比べ、プロモーター活性が１．８７倍上昇することが示された（図５）。また、かかるモチーフの改変に加え、さらに、ＨＵ遺伝子プロモーターの−３５領域及び−１０領域間のスペーサーの長さ（１１塩基長）を、１７塩基長に伸長させると、天然のＨＵ遺伝子プロモーターと比べ、プロモーター活性が３．２２倍上昇することが示された（図５）。これらの結果は、ＨＵ遺伝子プロモーターの−３５領域における「ＴＴＣＧＣＡ」モチーフの３〜６番目のヌクレオチド残基を、「ＧＴＧＣ」へ置換し、かつ、−１０領域における「ＴＡＧＴＡＴ」モチーフの３及び４番目のヌクレオチド残基を、それぞれ「Ｔ」及び「Ａ」へ置換すると、プロモーター活性が上昇することを示すとともに、ＨＵ遺伝子プロモーターの−３５領域及び−１０領域間のスペーサーの長さ（１１塩基長）を、１７塩基長に伸長させると、プロモーター活性が上昇することを示している。【００４３】
実施例１〜３の結果をまとめると、本件プロモーター、すなわち、「ＴＴＧＮＮＮ」モチーフと、当該モチーフと下流に「ＴＡＴＡＮＴ」モチーフを有するプロモーターは、ビフィドバクテリウム属細菌中で高いプロモーター活性（転写活性）を有することを示している。さらに、両モチーフ間の塩基長が、約１１塩基長又は１７塩基長である場合、特に約１７塩基長のときに、プロモーター活性はより高くなることも示している。
【実施例４】
【００４４】
４．分泌タンパク質の発現解析
本件プロモーターが、ビフィドバクテリウム属細菌において、分泌タンパク質を効率よく発現させるものであることを確認するために、本件プロモーターの下流にｍＩＦＮ−γ遺伝子を挿入したｍＩＦＮ−γ分泌用プラスミドベクターを用いて解析を行った。かかるｍＩＦＮ−γ分泌用のプラスミドベクターとして、２種類（pmIFNg33TL-Hu1及びpmIFNg33TL-Hu2）を作製した。pmIFNg33TL-Hu1は、Ｈｕ１（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のＨＵ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡ領域［配列番号１８のヌクレオチド配列；表１］）の下流にｍＩＦＮ−γ遺伝子を挿入した大腸菌−ビフィズス菌シャトルプラスミドベクターである（図６）。一方、pmIFNg33TL-Hu2は、Ｈｕ２（上記ＨＵ遺伝子プロモーターの改変型［配列番号１４のヌクレオチド配列；表１］）の下流に、ｍＩＦＮ−γ遺伝子を挿入した大腸菌−ビフィズス菌シャトルプラスミドベクターである（図７）。【００４５】
４−１  材料と方法
［pBEshuttle-Hu2aの作製］
pmIFNg33TL-Hu2の作製に用いたpBEshuttle-Hu2aは、野生型Ｈｕプロモーター及びＲＢＳ領域を含むビフィズス菌・大腸菌シャトルプラスミドベクターであるpBEshuttle（国際公開２０１１／０９３４６５号パンフレットの参考例４）を用いて、２段階に分けて作製した。概要を図８に示す。まず、第１段階では、プラスミドベクターpBEshuttleを基に、pBEshuttleに含まれるＨＵ遺伝子の上流断片３６１塩基長のプロモーター領域及びＲＢＳ領域配列を、ＨＵ遺伝子の上流側２１８塩基長とＨｕ２とからなるＤＮＡ断片に置換し、pBEshuttle-Hu2を作製した。次に、第２段階では、pBEshuttle-Hu2から、ＨＵ遺伝子の上流側２１８塩基長のＤＮＡ断片を除去し、pBEshuttle-Hu2aを作製した。これら第１段階及び第２段階のより詳細な操作手順を、以下に示す。【００４６】
［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］
＜ＰＣＲ増幅＞
ＰＣＲ産物（ＰＣＲ−Ａ３及びＰＣＲ−Ｂ３；表２）の調製は、表２及び１０に示す鋳型ＤＮＡとプライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を使用して行った。具体的には、ＰＣＲ用の０．２ｍＬチューブに、鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、２．５μＭのプライマー（フォワードプライマー及びリバースプライマー）各１．６μＬ、及びPrimeSTAR HS（Premix）（タカラバイオ社製）１０μＬを加え、０．１×ＴＥ緩衝液（１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）にて２０μＬに調整した。なお、各プライマーは、ＰＣＲ産物の末端１５塩基長が、次工程のIn-Fusion反応において連結する隣接ＰＣＲ産物の末端１５塩基長と同配列になるよう設計した。ＰＣＲ条件は、PrimeSTAR HS（Premix）の製品説明書に従った。伸長反応時間は、１０００塩基長あたり１分を目安とした。ＰＣＲ産物（ＰＣＲ−Ａ３及びＰＣＲ−Ｂ３）の一部を、適切な濃度のアガロースゲルにて、１００Ｖで電気泳動し、予想サイズ（それぞれ８８及び３８０９塩基長）であることを確認するとともに、その濃度を見積った。【００４７】
【表２】
2018062225.tif 000004
【００４８】
＜In-Fusion反応＞
ＰＣＲ産物ＰＣＲ−Ａ３とＰＣＲ−Ｂ３とを、In-Fusion反応により結合させ、In-Fusion反応液１とした。具体的には、０．２ｍＬチューブに、ＰＣＲ産物（ＰＣＲ−Ａ３及びＰＣＲ−Ｂ３）、５×In-Fusion HD Emzyme Premix（タカラバイオ社製）２μＬ、及びCloning Enhancer（タカラバイオ社製）１μＬを加え、０．１×ＴＥ緩衝液にて１０μＬに調整し、３７℃にて１５分後、５０℃で１５分間の反応処理を、サーマルサイクラ―を用いて行った。【００４９】
＜大腸菌の形質転換＞
In-Fusion反応液１の一部を用いて、大腸菌HST16CRコンピテントセル（タカラバイオ社製）の形質転換を行った。形質転換方法は、大腸菌HST16CRコンピテントセルの製品説明書に従った。形質転換後の大腸菌懸濁液を、７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて一晩静置培養してコロニー（形質転換体１）を形成させた。【００５０】
＜プラスミドベクターの抽出及びヌクレオチド配列の確認＞
上記形質転換体１のコロニーを、７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＬＢ液体培地に植菌し、３７℃にて一晩振とう培養した。この培養液よりQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン社製）を使用してプラスミドベクターを抽出した。抽出したプラスミドベクター（pBEshuttle-Hu2）の一部を用いて全長ヌクレオチド配列を決定し、デザインした配列と一致することを確認した。【００５１】
［第２段階；pBEshuttle-Hu2aの作製］
＜ＰＣＲ増幅＞
ＰＣＲ産物（ＰＣＲ−Ａ４及びＰＣＲ−Ｂ４；表３）の調製は、表３及び１０に示す鋳型ＤＮＡとプライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を使用して、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。【００５２】
【表３】
2018062225.tif 000005
【００５３】
＜In-Fusion反応＞
ＰＣＲ産物ＰＣＲ−Ａ４とＰＣＲ−Ｂ４とを、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って結合させ、In-Fusion反応液２とした。【００５４】
＜大腸菌の形質転換＞
In-Fusion反応液２の一部を用いた大腸菌HST16CRの形質転換体（形質転換体２）の作製は、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。【００５５】
＜プラスミドベクターの抽出及びヌクレオチド配列の確認＞
上記形質転換体２の培養、並びに上記形質転換体２からのプラスミドベクター（pBEshuttle-Hu2a）の抽出、及びかかるプラスミドベクターの全長ヌクレオチド配列の確認は、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。【００５６】
［pmIFNg33TL-Bの作製］
pmIFNg33TL-Hu1及びpmIFNg33TL-Hu2の作製に用いたpmIFNg33TL-Bは、４段階に分けて作製した。概要を図９−１〜図９−４に示す。まず、第１段階では、pBEshuttleに、ヒスチジンが６つ連なったタグ（Ｈｉｓ×６；以下、単に「ヒスチジンタグ」ということがある）が融合したｍＩＦＮ−γをコードするヌクレオチド配列を挿入し、pmIFNgを作製した（図９−１）。次に、第２段階では、pmIFNgに、ビフィズス菌での分泌用シグナル配列（SP/Linker）を挿入し、pmIFNg33を作製した（図９−２）。次いで、第３段階では、pmIFNg33のＨｕプロモーターを、Ｐ３０プロモーターに変更し、pmIFNg33-Bを作製した（図９−３）。続いて、第４段階では、pmIFNg33-Bよりヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列を除去し、pmIFNg33TL-Bを作製した（図９−４）。これら第１〜４段階のより詳細な操作手順を、以下に示す。【００５７】
［第１段階；pmIFNgの作製］
＜ＰＣＲ増幅＞
ｍＩＦＮ−γ（NCBI Reference Sequence：NP_032363）の成熟タンパク質である２３番目のヒスチジン残基（Ｈｉｓ）〜１５３番目のセリン残基（Ｓｅｒ）からなるアミノ酸配列（His23-Ser153）をコードするヌクレオチド配列を、ビフィドバクテリウム・ロンガムのコドンに最適化し、さらに、His23-Ser153のカルボキシル（Ｃ）末端にヒスチジンタグが融合するように、ヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列を付加し、ＤＮＡ断片（mIFNg in pUC57）を合成した（GenScript社に受託）。【００５８】
ＰＣＲ産物（ベクター１及びインサート１；表４）の調製は、表４及び１０に示す鋳型ＤＮＡとプライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を使用して、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。【００５９】
【表４】
2018062225.tif 000006
【００６０】
＜In-Fusion反応＞
ＰＣＲ産物ベクター１とインサート１とを、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って結合させ、In-Fusion反応液３とした。【００６１】
＜大腸菌の形質転換＞
In-Fusion反応液３の一部を用いた大腸菌HST16CRの形質転換体（形質転換体３）の作製は、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。【００６２】
＜プラスミドベクターの抽出及びヌクレオチド配列の確認＞
上記形質転換体３の培養、並びに上記形質転換体３からのプラスミドベクター（pmIFNg）の抽出、及びかかるプラスミドベクターの全長ヌクレオチド配列の確認は、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。【００６３】
［第２段階；pmIFNg33の作製］
＜ＰＣＲ増幅＞
ＰＣＲ産物（ベクター２及びインサート２；表５）の作製は、表５及び１０に示す鋳型ＤＮＡとプライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を使用して、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。【００６４】
【表５】
2018062225.tif 000007
【００６５】
＜In-Fusion反応＞
ＰＣＲ産物ベクター２とインサート２とを、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って結合させ、In-Fusion反応液４とした。【００６６】
＜大腸菌の形質転換＞
In-Fusion反応液４の一部を用いた大腸菌HST16CRの形質転換体（形質転換体４）の作製は、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。【００６７】
＜プラスミドベクターの抽出及びヌクレオチド配列の確認＞
上記形質転換体４の培養、並びに上記形質転換体４からのプラスミドベクター（pmIFNg33）の抽出、及びかかるプラスミドベクターのヌクレオチド配列の確認は、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。なお、pmIFNg33のヌクレオチド配列の確認は、ｍＩＦＮ−γ発現カセット領域についてのみ実施した。【００６８】
［第３段階；pmIFNg33-Bの作製］
＜ＰＣＲ増幅＞
ＰＣＲ産物（ベクター３及びインサート３；表６）の調製は、表６及び１０に示す鋳型ＤＮＡとプライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を使用して、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。【００６９】
【表６】
2018062225.tif 000008
【００７０】
＜In-Fusion反応＞
ＰＣＲ産物ベクター３とインサート３とを、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って結合させ、In-Fusion反応液５とした。【００７１】
＜大腸菌の形質転換＞
In-Fusion反応液５の一部を用いた大腸菌HST16CRの形質転換体（形質転換体５）の作製は、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。【００７２】
＜プラスミドベクターの抽出及びヌクレオチド配列の確認＞
上記形質転換体５の培養、並びに上記形質転換体５からのプラスミドベクター（pmIFNg33-B）の抽出、及びかかるプラスミドベクターのヌクレオチド配列の確認は、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。なお、pmIFNg33-Bのヌクレオチド配列の確認は、ｍＩＦＮ−γ発現カセット領域についてのみ実施した。【００７３】
［第４段階；pmIFNg33TL-Bの作製］
＜ＰＣＲ増幅＞
ＰＣＲ産物（ＰＣＲ−Ａ及びＰＣＲ−Ｂ；表７）の調製は、表７及び１０に示す鋳型ＤＮＡとプライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を使用して、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。【００７４】
【表７】
2018062225.tif 000009
【００７５】
＜In-Fusion反応＞
ＰＣＲ産物ＰＣＲ−ＡとＰＣＲ−Ｂとを、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って結合させ、In-Fusion反応液６とした。【００７６】
＜大腸菌の形質転換＞
In-Fusion反応液６の一部を用いた大腸菌HST16CRの形質転換体（形質転換体６）の作製は、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。【００７７】
＜プラスミドベクターの抽出及びヌクレオチド配列の確認＞
上記形質転換体６の培養、並びに上記形質転換体６からのプラスミドベクター（pmIFNg33TL-B）の抽出、及びかかるプラスミドベクターのヌクレオチド配列の確認は、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。なお、pmIFNg33TL-Bのヌクレオチド配列の確認は、ｍＩＦＮ−γ発現カセット領域についてのみ実施した。【００７８】
［pmIFNg33TL-Hu1の作製］
＜ＰＣＲ増幅＞
ＰＣＲ産物（ＰＣＲ−Ａ１及びＰＣＲ−Ｂ１；表８）の調製は、表８及び１０に示す鋳型ＤＮＡとプライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を使用して、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。【００７９】
【表８】
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【００８０】
＜In-Fusion反応＞
ＰＣＲ産物ＰＣＲ−Ａ１とＰＣＲ−Ｂ１とを、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って結合させ、In-Fusion反応液７とした。【００８１】
＜大腸菌の形質転換＞
In-Fusion反応液７の一部を用いた大腸菌HST16CRの形質転換体（形質転換体７）の作製は、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。【００８２】
＜プラスミドベクターの抽出及びヌクレオチド配列の確認＞
上記形質転換体７の培養、並びに上記形質転換体７からのプラスミドベクター（pmIFNg33TL-Hu1）の抽出、及びかかるプラスミドベクターのヌクレオチド配列の確認は、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。なお、pmIFNg33TL-Hu1のヌクレオチド配列の確認は、ｍＩＦＮ−γ発現カセット領域についてのみ実施した。【００８３】
［pmIFNg33TL-Hu2の作製］
＜ＰＣＲ増幅＞
ＰＣＲ産物（ＰＣＲ−Ａ２及びＰＣＲ−Ｂ２；表９）の調製は、表９及び１０に示す鋳型ＤＮＡとプライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を使用して、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。【００８４】
【表９】
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【００８５】
＜In-Fusion反応＞
ＰＣＲ産物ＰＣＲ−Ａ２とＰＣＲ−Ｂ２とを、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って結合させ、In-Fusion反応液８とした。【００８６】
＜大腸菌の形質転換＞
In-Fusion反応液８の一部を用いた大腸菌HST16CRの形質転換体（形質転換体８）の作製は、上記［第１段階；pBEshuttle-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って行った。なお、コロニー形成させる条件は、３７℃にて一晩を、３０℃にて２日間にかえて行った。【００８７】
＜プラスミドベクターの抽出及びヌクレオチド配列の確認＞
上記形質転換体８のコロニーを、７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＬＢ液体培地に植菌し、３０℃にて一晩静置培養した。この培養液よりQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン社製）を使用してプラスミドベクターを抽出した。抽出したプラスミドベクターを含む溶液１μＬを鋳型として、プライマーセット（Primer 11及びPrimer 20；表１０）及びPrimeSTAR HS（Premix）（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲを行い、ｍＩＦＮ−γ発現カセット領域を増幅した。ＰＣＲ条件は、PrimeSTAR HS（Premix）の製品説明書に従った。得られたＰＣＲ産物５μＬに、ExoSAP-IT（Thermo Fisher Scientific社製）２μＬを添加、混合し、３７℃にて１５分間反応後、８０℃にて１５分間反応させた。この反応液を鋳型として、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）にてシーケンス反応を行い、ｍＩＦＮ−γ発現カセット領域のヌクレオチド配列を確認した。【００８８】
【表１０】
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【００８９】
［ビフィドバクテリウム・ロンガムへの形質転換法］
上記［pmIFNg33TL-Hu1の作製］及び［pmIFNg33TL-Hu2の作製］の項目に記載の方法に従って作製したプラスミドベクター（pmIFNg33TL-Hu1及びpmIFNg33TL-Hu2）を、ビフィドバクテリウム・ロンガムにそれぞれ形質転換し、mIFNg33TL-Hu1形質転換株及びmIFNg33TL-Hu2形質転換株を作製した。具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガムのコンピテントセル８０μＬに、上記プラスミドベクターを氷上にて適量加え混合した後、ＢＭキュベット（２ｍｍギャップ、BM機器社製）に移した。これをエレクトロポレーション装置（ジーンパルサーII、Bio-Rad社製）にセットし、２ｋＶ、２５μＦ、２００Ω条件下で、エレクトロポレーションを行った。その後、予め３７℃にて温めたＩＭＲ調整培地（ＩＭＲ液体培地８００μＬ及びアスコルビン酸・システイン液［財団法人日本ビフィズス菌センター、光岡  知足、ビフィズス菌の研究、５４頁］５０μLの混合液、用時調製）８５０μＬを、エレクトロポレーション後のキュベット内に即座に添加し、ネジ蓋付マイクロチューブに回収した。チューブの蓋を緩めた状態で脱酸素・炭酸ガス発生剤（アネロパック・ケンキ、三菱ガス化学社製、以下同様）とともに密閉容器に入れ、３７℃にて約３．５時間保温した後、７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＩＭＲ寒天培地に塗布し、脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて２〜３日間培養してコロニー（mIFNg33TL-Hu1形質転換株及びmIFNg33TL-Hu2形質転換株）を形成させた。【００９０】
［ビフィドバクテリウム・ロンガムにおけるｍＩＦＮ−γ分泌レベルの評価］
＜培養方法＞
細胞培養用フラスコ（フィルターキャップ付、２５ｃｍ２、Thermo Scientific社製）に、ＭＲＳ培地（ベクトンディッキンソン社製）１０ｍＬ、アスコルビン酸・システイン液１００μＬ、及び７５ｍｇ／ｍＬスペクチノマイシン溶液１０μＬを添加し、７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＭＲＳＣ液体培地を調製した。かかる液体培地に、mIFNg33TL-Hu1形質転換株及びmIFNg33TL-Hu2形質転換株をそれぞれ植菌し、脱酸素・炭酸ガス発生剤（アネロパック・ケンキ、三菱ガス化学社製）とともに密閉容器に入れ、３７℃で２４時間、前培養した。本培養用培地は、ＤＭＥＭ培地１８ｍＬ(Ref: 12320-032、Thermo Fisher Scientific社製)、ＭＲＳ培地２ｍＬ、及びアスコルビン酸・システイン液１００μＬを混合した培地を３７℃で一晩保温し、使用直前に、７５ｍｇ／ｍＬスペクチノマイシン溶液２０μＬを添加することにより調製した。各形質転換株を含む前培養液１００μＬを、調製した本培養用培地に植菌し、脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃で本培養した。本培養開始後、８時間、１０時間、１２時間、及び１８時間が同時となるように、前培養の開始時間を調整した。【００９１】
＜ｍＩＦＮ−γ濃度及び生菌数の測定＞
各時間培養後の本培養液の一部を用いて、培養上清中のｍＩＦＮ−γ濃度と、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生菌数を測定した。ｍＩＦＮ−γ濃度は、本培養液の一部を、マイクロチューブ（タンパク質低吸着性、住友ベークライト社製）に移し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清を回収後、Mouse IFN-γ Quantikine ELISA Kit（R&D Systems社製）を用いて測定した（図１０Ｂ）。生菌数測定は、各時間培養後の本培養液を、嫌気性希釈液（財団法人日本ビフィズス菌センター、光岡  知足、ビフィズス菌の研究、３０８頁）にて適宜希釈した後、ＢＬ寒天培地３枚に１００μＬずつ塗布した。これら寒天培地を、脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて３日間培養し、コロニーを形成させた。コロニー数を計測し、式（生菌数［ＣＦＵ／ｍＬ］＝平均コロニー数×希釈率×１０［１ｍＬあたりに換算］）を基に、生菌数を算出した（図１０Ａ）。【００９２】
４−２  結果
各培養時間におけるmIFNg33TL-Hu1形質転換株及びmIFNg33TL-Hu2形質転換株の生育性は、ほぼ同等であり、培養１０〜１２時間で定常期となった（図１０Ａ）。一方、各形質転換株が定常期となった培養１２時間後のｍＩＦＮ−γ濃度を測定すると、mIFNg33TL-Hu2形質転換株におけるｍＩＦＮ−γ濃度は、２１７ｎｇ／ｍＬであり、mIFNg33TL-Hu1形質転換株におけるｍＩＦＮ−γ濃度（７０ｎｇ／ｍＬ）と比べ、３．１倍高かった（図１０Ｂ）。同様に、培養１８時間後のｍＩＦＮ−γ濃度を測定すると、mIFNg33TL-Hu2形質転換株におけるｍＩＦＮ−γ濃度は、２３５ｎｇ／ｍＬであり、mIFNg33TL-Hu1形質転換株におけるｍＩＦＮ−γ濃度（７３ｎｇ／ｍＬ）と比べ、約３．２倍高かった（図１０Ｂ）。これらの結果は、ビフィドバクテリウム属細菌において、Ｈｕ２、すなわち、野生型ＨＵ遺伝子プロモーターの改変型である本件プロモーターは、野生型ＨＵ遺伝子プロモーターと比べ、分泌タンパク質（ｍＩＦＮ−γ）の発現効率が少なくとも３倍以上高いことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明は、癌に対するミサイル療法に資するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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