【手続補正書】
【提出日】平成31年4月24日(2019.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
KDが約300nM以下である親和性でCD137に結合する能力を有するリポカリンムテイン。
【請求項２】
成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の配列位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、請求項1記載のムテイン。
【請求項３】
ムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）と比較して以下の変異アミノ酸残基のうちの少なくとも1つを含む、請求項2記載のムテイン:
2018515084.tif 000001
。
【請求項４】
ムテインが、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）と比較して、以下の変異アミノ酸の組のうちの1組を含む、請求項2または3記載のムテイン:
(a)Arg 26 → Glu, Glu 27 → Gly, Phe 28 → Cys, Pro 29 → Arg, Glu 30 → Pro, Met 31 → Trp, Leu 33 → Ile, Glu 34 → Phe, Leu 56 → Ala, Ser 58 → Asp, Arg 60 → Pro, Cys 61 → Ala, Cys 101 → Ser, Glu 104 → Val, Leu 105 → Cys, His 106 → Asp, Lys 108 → Ser, Arg 111 → Pro, Lys 114 → Trp, およびCys 153 → Ser; 
(b)Ala 5 → Thr, Arg 26 → Glu, Glu 27 → Gly, Phe 28 → Cys, Pro 29 → Arg, Glu 30 → Pro, Met 31 → Trp, Leu 33 → Ile, Glu 34 → Phe, Leu 56 → Ala, Ser 58 → Asp, Arg 60 → Pro, Cys 61 → Ala, Lys 65 → Arg, Val 85 → Asp, Cys 101 → Ser, Glu 104 → Val, Leu 105 → Cys, His 106 → Asp, Lys 108 → Ser, Arg 111 → Pro, Lys 114 → Trp, Lys 121 → Glu, Ala 133 → Thr, および Cys 153 → Ser;
(c)Arg 26 → Glu, Glu 27 → Gly, Phe 28 → Cys, Pro 29 → Arg, Glu 30 → Pro, Met 31 → Trp, Leu 33 → Ile, Glu 34 → Phe, Leu 56 → Ala, Ser 58 → Asp, Arg 60 → Pro, Cys 61 → Ala, Lys 65 → Asn, Lys 94 → Arg, Cys 101 → Ser, Glu 104 → Val, Leu 105 → Cys, His 106 → Asp, Lys 108 → Ser, Arg 111 → Pro, Lys 114 → Trp, Lys 121 → Glu, Ala 133 → ThrおよびCys 153 → Ser; 
(d)Ala 5 → Val, Arg 26 → Glu, Glu 27 → Gly, Phe 28 → Cys, Pro 29 → Arg, Glu 30 → Pro, Met 31 → Trp, Leu 33 → Ile, Glu 34 → Phe, Leu 56 → Ala, Ser 58 → Asp, Arg 60 → Pro, Cys 61 → Ala, Lys 65 → Arg, Lys 94 → Glu, Cys 101 → Ser, Glu 104 → Val, Leu 105 → Cys, His 106 → Asp, Lys 108 → Ser, Arg 111 → Pro, Lys 114 → Trp, Lys 121 → Glu, Ala 133 → ThrおよびCys 153 → Ser; 
(e)Arg 26 → Glu, Glu 27 → Gly, Phe 28 → Cys, Pro 29 → Arg, Glu 30 → Pro, Met 31 → Trp, Leu 33 → Ile, Glu 34 → Phe, Thr 42 → Ser, Leu 56 → Ala, Ser 58 → Asp, Arg 60 → Pro, Cys 61 → Ala, Cys 101 → Ser, Glu 104 → Val, Leu 105 → Cys, His 106 → Asp, Lys 108 → Ser, Arg 111 → Pro, Lys 114 → Trp, Ser 150 → IleおよびCys 153 → Ser; 
(f)Arg 26 → Glu, Glu 27 → Gly, Phe 28 → Cys, Pro 29 → Arg, Glu 30 → Pro, Met 31 → Trp, Leu 33 → Ile, Glu 34 → Phe, Lys 52 → Glu, Leu 56 → Ala, Ser 58 → Asp, Arg 60 → Pro, Cys 61 → Ala, Thr 71 → Ala, Cys 101 → Ser, Glu 104 → Val, Leu 105 → Cys, His 106 → Asp, Lys 108 → Ser, Arg 111 → Pro, Lys 114 → Trp, Ala 133 → Thr, Arg 148 → Ser, Ser 150 → Ile, およびCys 153 → Ser;または
(g) Ala 5 → Thr, Arg 26 → Glu, Glu 27 → Gly, Phe 28 → Cys, Pro 29 → Arg, Glu 30 → Pro, Met 31 → Trp, Leu 33 → Ile, Glu 34 → Phe, Gly 46 → Asp, Leu 56 → Ala, Ser 58 → Asp, Arg 60 → Pro, Cys 61 → Ala, Thr 71 → Ala, Cys 101 → Ser, Glu 104 → Val, Leu 105 → Cys, His 106 → Asp, Lys 108 → Ser, Arg 111 → Pro, Lys 114 → Trp, Ser 150 → IleおよびCys 153 → Ser。
【請求項５】
CD137へのCD137Lの結合を妨害する能力を有する、請求項2〜4のいずれか一項記載のムテイン。
【請求項６】
SEQ ID NO:5〜11からなる群またはそれらのフラグメントもしくは変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または
SEQ ID NO:5〜11からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項2〜5のいずれか一項記載のムテイン。
【請求項７】
成熟ヒトリポカリン2の直鎖ポリペプチド配列（hNGAL、SEQ ID NO:2）の配列位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、請求項1記載のムテイン。
【請求項８】
ムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）と比較して、以下の変異アミノ酸残基のうちの少なくとも1つを含む、請求項7記載のムテイン:
2018515084.tif 000002
。
【請求項９】
SEQ ID NO:4の陰性対照と比較して、より高いIL-2およびIFN-γ増殖を誘発する能力を有する、請求項7または8のいずれか一項記載のムテイン。
【請求項１０】
ムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）と比較して、以下の変異アミノ酸の組のうちの1組を含む、請求項7〜9のいずれか一項記載のムテイン:
(a)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Lys, Gln 49 → Asn, Tyr 52 → Met, Ser 68 → Gly, Leu 70 → Thr, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Thr, Trp 79 → Ala, Arg 81 → Ser, Cys 87 → Ser, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr; 
(b)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Arg, Gln 49 → Ile, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Met, Leu 70 → Lys, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Met, Trp 79 → Asp, Arg 81 → Trp, Cys 87 → Ser, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr; 
(c)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Arg, Gln 49 → Asn, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Ala, Leu 70 → Ala, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Thr, Trp 79 → Asp, Arg 81 → Trp, Cys 87 → Ser, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr; 
(d)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Lys, Gln 49 → Asn, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Ala, Leu 70 → Ala, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Thr, Trp 79 → Asp, Arg 81 → Trp, Cys 87 → Ser, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr; 
(e)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Lys, Gln 49 → Ser, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Gly, Leu 70 → Ser, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Thr, Trp 79 → Ala, Arg 81 → Met, Cys 87 → Ser, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr; 
(f)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Lys, Gln 49 → Val, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Gly, Leu 70 → Thr, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Arg, Trp 79 → Asp, Arg 81 → Ser, Cys 87 → Ser, Leu 94 → Phe, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr; 
(g)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Arg, Gln 49 → His, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Gly, Leu 70 → Thr, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Thr, Trp 79 → Ala, Arg 81 → Ser, Cys 87 → Ser, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr; 
(h)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Lys, Gln 49 → Asn, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Gly, Leu 70 → Thr, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Thr, Trp 79 → Ala, Arg 81 → Ser, Phe 83 → Leu, Cys 87 → Ser, Leu 94 → Phe, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr; または
(i)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Arg, Gln 49 → Ser, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Ala, Leu 70 → Thr, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Asn, Trp 79 → Ala, Arg 81 → Ser, Cys 87 → Ser, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr。
【請求項１１】
CD137へのCD137Lの結合を妨害しない、請求項7〜10のいずれか一項記載のムテイン。
【請求項１２】
SEQ ID NO:12〜20からなる群またはそれらのフラグメントもしくは変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または
SEQ ID NO:12〜20からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項7〜11のいずれか一項記載のムテイン。
【請求項１３】
有機分子、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、細胞分裂阻害剤、毒素、金属錯体、金属、およびコロイド金からなる群より選択される化合物にコンジュゲートされている、請求項1〜12のいずれか一項記載のムテイン。
【請求項１４】
N末および/またはC末において、タンパク質またはタンパク質ドメインもしくはペプチドである融合パートナーに融合されている、請求項1〜12のいずれか一項記載のムテイン。
【請求項１５】
ポリアルキレングリコール分子、ポリエチレングリコール(PEG)分子、ヒドロキシエチルデンプン、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、およびアルブミン結合タンパク質からなる群より選択されるムテインの血清中半減期を延ばす化合物にコンジュゲートされている、請求項1〜12のいずれか一項記載のムテイン。
【請求項１６】
請求項1〜15のいずれか一項記載のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１７】
請求項16記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
【請求項１８】
ムテインをコードする核酸から出発して遺伝子工学の方法を使ってムテインが生産される、請求項1〜15のいずれか一項記載のムテインを生産する方法。
【請求項１９】
CD137の結合に使用するための、請求項1〜15のいずれか一項記載の1つもしくは複数のリポカリンムテインまたはそのようなムテインを含む1つもしくは複数の組成物。
【請求項２０】
CD137の下流シグナリング経路活性化に使用するための、請求項1〜15のいずれか一項記載の1つもしくは複数のリポカリンムテインまたはそのようなムテインを含む1つもしくは複数の組成物。
【請求項２１】
Tリンパ球増殖の誘発に使用するための、請求項1〜15のいずれか一項記載の1つもしくは複数のリポカリンムテインまたはそのようなムテインを含む1つもしくは複数の組成物。
【請求項２２】
CD137へのCD137Lの結合妨害に使用するための、請求項1〜15のいずれか一項記載の1つもしくは複数のリポカリンムテインまたはそのようなムテインを含む1つもしくは複数の組成物。
【請求項２３】
炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの生産の低減に使用するための、請求項1〜15のいずれか一項記載の1つもしくは複数のリポカリンムテインまたはそのようなムテインを含む1つもしくは複数の組成物。
【請求項２４】
がん、感染性疾患、または自己免疫疾患の治療に使用するための、請求項1〜15のいずれか一項記載の1つもしくは複数のリポカリンムテインまたはそのようなムテインを含む1つもしくは複数の組成物。
【請求項２５】
請求項1〜15のいずれか一項記載のリポカリンムテインを含む、薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
「試料」は、任意の対象から採取された生物学的試料と定義される。生物学的試料には、血液、血清、尿、糞便、精液、または組織が包含されるが、それらに限定されるわけではない。
[本発明1001]
KDが約300nM以下である親和性でCD137に結合する能力を有するリポカリンムテイン。
[本発明1002]
成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の配列位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、本発明1001のムテイン。
[本発明1003]
ムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）と比較して以下の変異アミノ酸残基のうちの少なくとも1つを含む、本発明1002のムテイン:
2018515084.tif 000003
。
[本発明1004]
本質的に実施例4に記載するように表面プラズモン共鳴（SPR）分析によって測定した場合に、KDが約270nM以下である親和性でCD137に結合する、本発明1002または1003のいずれかのムテイン。
[本発明1005]
本質的に実施例6に記載するようにFACS分析によって測定した場合に、約250nM以下のEC50値でCD137に結合する、本発明1002または1003のいずれかのムテイン。
[本発明1006]
ムテインのアミノ酸配列が以下の組のアミノ酸置換のうちの1組を含む、本発明1002〜1005のいずれかのムテイン:
2018515084.tif 000004
2018515084.tif 000005
。
[本発明1007]
本質的に実施例5に記載するように表面プラズモン共鳴（SPR）アッセイにおいて測定した場合に、CD137へのCD137Lの結合を妨害する能力を有する、本発明1002または1003のいずれかのムテイン。
[本発明1008]
SEQ ID NO:5〜11からなる群またはそれらのフラグメントもしくは変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1005のいずれかのムテイン。
[本発明1009]
SEQ ID NO:5〜11からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有する、本発明1002〜1005のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1010]
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、本発明1001のムテイン。
[本発明1011]
ムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）と比較して、以下の変異アミノ酸残基のうちの少なくとも1つを含む、本発明1010のムテイン:
2018515084.tif 000006
。
[本発明1012]
本質的に実施例4に記載するように表面プラズモン共鳴（SPR）分析によって測定した場合に、KDが約150nM以下である親和性でCD137に結合する、本発明1010または1011のいずれかのムテイン。
[本発明1013]
本質的に実施例6に記載するようにFACS分析によって測定した場合に、約18nM以下のEC50値でCD137に結合する、本発明1010または1011のいずれかのムテイン。
[本発明1014]
本質的に実施例7に記載するように機能的T細胞活性化アッセイにおいて測定した場合に、SEQ ID NO:4の陰性対照と比較して、より高いIL-2濃度を誘導する能力を有する、本発明1010または1011のいずれかのムテイン。
[本発明1015]
本質的に実施例8に記載するように機能的T細胞活性化アッセイにおいて測定した場合に、SEQ ID NO:4の陰性対照と比較して、より高いIL-2濃度をもたらさない、本発明1010または1011のいずれかのムテイン。
[本発明1016]
本質的に実施例9に記載するように機能的T細胞活性化アッセイにおいて測定した場合に、SEQ ID NO:4の陰性対照と比較して、より高いIL-2およびIFN-γ増殖を誘発する能力を有する、本発明1010または1011のいずれかのムテイン。
[本発明1017]
ムテインのアミノ酸配列が、以下の組のアミノ酸置換のうちの1組を含む、本発明1010〜1016のいずれかのムテイン:
2018515084.tif 000007
2018515084.tif 000008
2018515084.tif 000009
。
[本発明1018]
本質的に実施例5に記載するように表面プラズモン共鳴（SPR）アッセイにおいて測定した場合に、CD137へのCD137Lの結合を妨害しない、本発明1010または1011のいずれかのムテイン。
[本発明1019]
SEQ ID NO:12〜20からなる群またはそれらのフラグメントもしくは変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1010〜1016のいずれかのムテイン。
[本発明1020]
SEQ ID NO:12〜20からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有する、本発明1010〜1016のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1021]
有機分子、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、細胞分裂阻害剤、毒素、金属錯体、金属、およびコロイド金からなる群より選択される化合物にコンジュゲートされている、本発明1001〜1020のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1022]
N末および/またはC末において、タンパク質またはタンパク質ドメインもしくはペプチドである融合パートナーに融合されている、本発明1001〜1020のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1023]
ムテインの血清中半減期を延ばす化合物にコンジュゲートされている、本発明1001〜1020のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1024]
血清中半減期を延ばす化合物が、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロエチルデンプン（hydroethylstarch）、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、およびアルブミン結合タンパク質からなる群より選択される、本発明1001〜1020のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1025]
ポリアルキレングリコールがポリエチレン（PEG）またはその活性化誘導体である、本発明1024のリポカリンムテイン。
[本発明1026]
本発明1001〜1025のいずれかのムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
[本発明1027]
本発明1026の核酸分子を含有する宿主細胞。
[本発明1028]
ムテインをコードする核酸から出発して遺伝子工学の方法を使ってムテインが生産される、本発明1001〜1025のいずれかのムテインを生産する方法。
[本発明1029]
本発明1001〜1025のいずれかの1つもしくは複数のリポカリンムテインまたはそのようなムテインを含む1つもしくは複数の組成物を適用する工程を含む、CD37の結合方法。
[本発明1030]
本発明1001〜1025のいずれかの1つもしくは複数のリポカリンムテインまたはそのようなムテインを含む1つもしくは複数の組成物を適用する工程を含む、CD137の下流シグナリング経路を活性化する方法。
[本発明1031]
本発明1001〜1025のいずれかの1つもしくは複数のリポカリンムテインまたはそのようなムテインを含む1つもしくは複数の組成物を適用する工程を含む、Tリンパ球増殖を誘発する方法。
[本発明1032]
本発明1007の1つもしくは複数のリポカリンムテインまたはそのようなムテインを含む1つもしくは複数の組成物を適用する工程を含む、CD137へのCD137Lの結合を妨害する方法。
[本発明1033]
本発明1007の1つもしくは複数のリポカリンムテインまたはそのようなムテインを含む1つもしくは複数の組成物を適用する工程を含む、炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの生産を低減する方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2018515084000001.app