(57)【要約】  本発明の課題は、補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液から微生物由来の不純物を効率的に除去して、補酵素Ｑ１０の製造工程を簡潔かつ安定的に操作運転するための補酵素Ｑ１０製造方法を提供することにある。  本発明は、補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液を、ケイ酸アルミニウムを主成分とする吸着剤（Ａ）と接触させる補酵素Ｑ１０の製造方法に特徴を有する。さらに、前記吸着剤（Ａ）と、それとは異なる吸着剤（Ｂ）を併用する上記製造方法が好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液を、ケイ酸アルミニウムを主成分とする吸着剤（Ａ）と接触させる補酵素Ｑ１０の製造方法。
【請求項２】
前記吸着剤（Ａ）が、５０％以上のケイ酸アルミニウムを含有するものである請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記吸着剤（Ａ）と、それとは異なる吸着剤（Ｂ）を併用する請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記吸着剤（Ｂ）が、活性炭、活性炭を主成分とする吸着剤、スチレンとジビニルベンゼンを共重合させた合成吸着剤、フェノールホルムアルデヒド系吸着樹脂、アルデヒド系吸着剤、ケイ酸マグネシウム、水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、珪藻土、活性アルミナ、シリカゲル、シリカマグネシアゲル、無機単体にアルキル基またはアリル基を化学結合させた吸着剤、芳香族系吸着剤、メタクリル酸エステル吸着剤、合成ゼオライト、及びパーライト系濾過剤からなる群から選択される１つ以上である請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記吸着剤（Ａ）と接触させた補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液を、該吸着剤（Ａ）と分離し、分離した抽出液をさらに処理する工程を有する請求項１〜４いずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
前記処理工程が、濃縮、溶媒置換、酸化、還元、カラムクロマトグラフィー、及び晶析から選択される１以上の工程である請求項５記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は補酵素Ｑ１０の製造方法に関する。さらに詳しくは、吸着剤を用いて、補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液より不純物を除去する補酵素Ｑ１０の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
補酵素Ｑは、細菌から哺乳動物まで広く生体に分布する必須成分であり、生体内の細胞中におけるミトコンドリアの電子伝達系構成成分として知られている。補酵素Ｑは、ミトコンドリア内で酸化と還元を繰り返すことで、電子伝達系における伝達成分としての機能を担っているほか、還元型補酵素Ｑは抗酸化作用を持つことが知られている。ヒトの補酵素Ｑは、補酵素Ｑの側鎖に、繰り返し構造を１０個持つ補酵素Ｑ１０が主成分であり、生体内においては、通常、４０〜９０％程度が還元型として存在している。補酵素Ｑの生理的作用としては、ミトコンドリア賦活作用によるエネルギー生産の活性化、心機能の活性化、細胞膜の安定化効果、抗酸化作用による細胞の保護効果等が挙げられている。【０００３】
現在製造・販売されている補酵素Ｑ１０の多くは酸化型であるが、近年では、酸化型補酵素Ｑ１０に比べて高い経口吸収性を示す還元型補酵素Ｑ１０も市場に登場し、広く用いられるようになってきている。【０００４】
補酵素Ｑ１０を製造するには、いくつかの方法が知られている。例えば、特許文献１には、還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液より、冷却晶析、貧溶媒晶析または冷却晶析と他の晶析方法を組み合わせた方法で還元型補酵素Ｑ１０を結晶化する還元型補酵素Ｑ１０の製造方法が記載されている。【０００５】
さらに、特許文献２には、親水性溶媒と補酵素Ｑ含有物を水の存在下で接触させる抽出処理および、該抽出処理で得られた補酵素Ｑ抽出液中の補酵素Ｑを疎水性吸着剤に吸着させる吸着処理とを繰り返す補酵素Ｑの製造法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−１３１７６６号公報
【特許文献２】特開昭５９−１７３０８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記従来の方法では、安定的かつ安価に、補酵素Ｑ１０を簡便で大量生産するには、まだ改善の余地がある。【０００８】
例えば、特許文献１の方法では、補酵素Ｑ１０生産微生物からの抽出液など、不純物が多く共存する場合には、晶析だけでは純度の高い補酵素Ｑ１０を得ることは難しく、可能な場合でも晶析の操作温度等の操作条件を厳密に制御する必要や、結晶化の工程に要する時間が長くなるなどの問題点がある。また、特許文献２の吸着方法では、補酵素Ｑ１０自体を吸着剤に吸着することを目的としており、補酵素Ｑ１０を得るためには、吸着処理後、さらに脱着用の溶媒を用いて吸着剤より補酵素Ｑを脱着溶出させる工程が必要となる。【０００９】
本発明は、上記のような課題を解決し、補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液から微生物由来の不純物を効率的に除去して、補酵素Ｑ１０の製造工程を簡潔かつ安定的に操作運転するための補酵素Ｑ１０製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前述の課題解決のために鋭意検討を行った結果、特定の吸着剤が、補酵素Ｑ１０そのものをほとんど吸着することなく、補酵素Ｑ１０生産微生物中の補酵素Ｑ１０以外の細胞由来成分を選択的に吸着することから、効率よく補酵素Ｑ１０を精製するのに利用できるということを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液を、ケイ酸アルミニウムを主成分とする吸着剤（Ａ）と接触させる補酵素Ｑ１０の製造方法に関する。好ましくは、前記吸着剤（Ａ）が、５０％以上のケイ酸アルミニウムを含有するものである上記製造方法に関する。また好ましくは、前記吸着剤（Ａ）と、それとは異なる吸着剤（Ｂ）を併用する上記製造方法に関する。さらに好ましくは、上記吸着剤（Ｂ）が、活性炭、活性炭を主成分とする吸着剤、スチレンとジビニルベンゼンを共重合させた合成吸着剤、フェノールホルムアルデヒド系吸着樹脂、アルデヒド系吸着剤、ケイ酸マグネシウム、水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、シリカゲル、シリカマグネシアゲル、無機単体にアルキル基またはアリル基を化学結合させた吸着剤、珪藻土、活性アルミナ、芳香族系吸着剤、メタクリル酸エステル吸着剤、合成ゼオライト、及びパーライト系濾過剤からなる群から選択される１つ以上である上記製造方法に関する。またより好ましくは、前記吸着剤（Ａ）と接触させた補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液を、該吸着剤（Ａ）と分離し、分離した抽出液をさらに処理する工程を有する上記製造方法に関する。更に好ましくは、前記処理工程が、濃縮、溶媒置換、酸化、還元、カラムクロマトグラフィー、及び晶析から選択される１以上の工程である上記製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、補酵素Ｑ１０を含有する溶液をケイ酸アルミニウムを主成分とする吸着剤（Ａ）と接触させるだけで、補酵素Ｑ１０の吸着を避ける一方で、不純物を簡便に吸着除去でき、高品質の補酵素Ｑ１０を作業性および経済性の面で良好に得ることができる。【００１２】
また、上記吸着剤（Ａ）と、それとは異なる吸着剤（Ｂ）を併用することにより、不純物の除去効率がさらに向上できる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に本発明の補酵素Ｑ１０の製造方法の一形態について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１４】
本発明の製造方法においては、補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液を、ケイ酸アルミニウムを主成分とする吸着剤（Ａ）と接触させることを特徴とする。
【００１５】
補酵素Ｑ１０には、酸化型と還元型が存在する。本発明は、補酵素Ｑ１０として、酸化型補酵素Ｑ１０、還元型補酵素Ｑ１０のいずれをも対象とし、還元型補酵素Ｑ１０と酸化型補酵素Ｑ１０の混合物である補酵素Ｑ１０もその対象である。補酵素Ｑ１０が還元型補酵素Ｑ１０と酸化型補酵素Ｑ１０の混合物である場合の還元型補酵素Ｑ１０含有比率も特に限定されない。
【００１６】
なお、本明細書において、補酵素Ｑ１０とのみ記載した場合は、酸化型補酵素Ｑ１０、還元型補酵素Ｑ１０を問わず、両者が混在する場合には混合物全体も表すものである。
【００１７】
本発明で用いる補酵素Ｑ１０生産微生物としては、補酵素Ｑ１０を菌体内に生産する微生物であれば、細菌、酵母、カビのいずれも制限無く使用することができる。上記微生物としては、具体的には、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、アセトバクター（Acetobacter）属、アミノバクター（Aminobacter）属、アグロモナス（Agromonas）属、アシドフィラス（Acidiphilium）属、ブレロミセス（Bulleromyces）属、ブレラ（Bullera）属、ブレブンジモナス（Brevundimonas）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、キオノスファエラ（Chionosphaera）属、カンジタ（Candida）属、セリノステルス（Cerinosterus）属、エキソフィアラ（Exisophiala）属、エキソバシジウム（Exobasidium）属、フィロミセス（Fellomyces）属、フィロバシジエラ（Filobasidiella）属、フィロバシジウム（Filobasidium）属、ゲオトリカム（Geotrichum）属、グラフィオラ（Graphiola）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、コッコバエラ（Kockovaella）属、クルツマノミセス（Kurtzmanomyces）属、ララリア（Lalaria）属、ロイコスポリジウム（Leucosporidium）属、レギオネラ（Legionella）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、ミコプラナ（Mycoplana）属、オースポリジウム（Oosporidium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、シュドジマ（Psedozyma）属、パラコッカス（Paracoccus）属、ペトロミセス（Petromyc）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属、リゾモナス（Rhizomonas）属、ロドビウム（Rhodobium）属、ロドプラネス（Rhodoplanes）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、スポロボロミセス（Sporobolomyces）属、スポリジオボラス（Sporidiobolus）属、サイトエラ（Saitoella）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、スポトリクム（Sporotrichum）属、シンポジオミコプシス（Sympodiomycopsis）属、ステリグマトスポリジウム（Sterigmatosporidium）属、タファリナ（Tapharina）属、トレメラ（Tremella）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、チレチアリア（Tilletiaria）属、チレチア（Tilletia）属、トリポスポリウム（Tolyposporium）属、チレチオプシス（Tilletiopsis）属、ウスチラゴ（Ustilago）属、ウデニオミセス（Udeniomyce）属、キサントフィロミセス（Xanthophllomyces）属、キサントバクテリウム（Xanthobacter）属、ペキロマイセス（Paecilomyces）属、アクレモニウム（Acremonium）属、ハイホモナス（Hyhomonus）属、リゾビウム（Rhizobium）属、ファフィア（Phaffia）属、ヘマトコッカス（Haematococcus）属等の微生物を挙げることができる。培養の容易さや生産性の観点からは、細菌または酵母が好ましく、細菌では非光合成細菌がより好ましく、さらには、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属等が、酵母ではシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、サイトエラ（Saitoella）属、ファフィア（Phaffia）属等が特に好ましい例として挙げられる。なお、補酵素Ｑ１０として、還元型補酵素Ｑ１０を製造する目的においては、生産される補酵素Ｑ１０中の還元型補酵素Ｑ１０含有比率の高い微生物を用いることが好ましく、例えば培養後の還元型補酵素Ｑ１０含有比率（重量％基準）として好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上となる微生物を用いることがより好ましい。
【００１８】
補酵素Ｑ１０生産微生物としては、上記微生物の野生株のみならず、例えば、上記の微生物の目的とする補酵素Ｑ１０の生合成に関与する遺伝子の転写及び翻訳活性、或いは発現蛋白質の酵素活性を、改変或いは改良した変異体や組換え体も使用することができる。
【００１９】
上記微生物を培養することで、補酵素Ｑ１０を含有する微生物細胞を得ることができる。培養方法は特に限定されず、対象となる微生物に適した、あるいは目的とする補酵素Ｑ１０の生産に適した培養方法が適宜選択しうる。培養期間も特に限定されず、微生物細胞中に目的とする補酵素Ｑ１０が所望の量蓄積される期間であればよい。
【００２０】
本発明の製造方法においては、上記微生物細胞から補酵素Ｑ１０を抽出する方法として、微生物細胞から直接抽出することもできるが、前記微生物細胞を破砕して微生物細胞破砕物又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液とし、該破砕物又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液から抽出することもできる。あるいは、微生物細胞を乾燥させて、該乾燥微生物細胞から抽出することもできる。なお、本発明の「破砕」においては、目的とする補酵素Ｑ１０の抽出が可能となる程度に細胞壁等の表面構造が損傷を受ければよい。
【００２１】
破砕方法としては、例えば、物理的処理、化学的処理等を挙げることができる。
【００２２】
上記物理的処理としては、例えば、高圧ホモジナイザー、回転刃式ホモジナイザー、超音波ホモジナイザー、フレンチプレス、ボールミル等の使用、あるいは、これらの組み合わせを挙げることができる。
【００２３】
上記化学的処理としては、例えば、塩酸、硫酸等の酸（好ましくは強酸）を用いる処理、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等の塩基（好ましくは強塩基）を用いる処理等や、これらの組み合わせを挙げることができる。
【００２４】
本発明において、補酵素Ｑ１０の抽出・回収の前処理としての細胞破砕方法としては、上記破砕方法の中でも、破砕効率の点から物理的処理がより好ましい。
【００２５】
上記の細胞破砕に用いる微生物細胞の形態は、培養液、培養液を濃縮したもの、培養液から微生物細胞を湿菌体として採取したもの、これらを洗浄したもの、湿菌体を溶剤（例えば、水、生理食塩水、緩衝液等も含む）に懸濁したもの等であってよいが、好ましくは微生物細胞の水性懸濁液であり、操作性等の面から、より好ましくは、培養液、培養液を濃縮したものや、これらを洗浄したものである。
【００２６】
微生物細胞破砕物の水性懸濁液中の菌体濃度は、特に制限されないが、菌体の乾燥重量に換算して通常１〜２５重量％の範囲であり、経済的には１０〜２０重量％の範囲で実施するのが好ましい。
【００２７】
一方、微生物細胞を乾燥させて、該乾燥微生物細胞から補酵素Ｑ１０を抽出する場合の微生物細胞を乾燥させる乾燥機としては、例えば、流動層乾燥機、噴霧乾燥機、箱型乾燥機、円錐型乾燥機、円筒振動式乾燥機、円筒撹拌式乾燥機、逆円錐型乾燥機、ろ過乾燥機、凍結乾燥機等を使用、あるいはこれらの組み合わせを挙げることができる。
【００２８】
乾燥させた微生物細胞内の水分濃度は、０〜５０重量％の範囲になることが好ましい。また、乾燥微生物細胞をさらに上記のような破砕方法で破砕処理するか、上記微生物細胞破砕物を乾燥して得られる、乾燥微生物細胞破砕物を用いることも出来る。
【００２９】
本発明の製造方法において、抽出に用いる有機溶媒としては、特に限定されないが、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、アルコール類、脂肪酸類、ケトン類、窒素化合物類（ニトリル類、アミド類を含む）、硫黄化合物類等を挙げることができる。
【００３０】
炭化水素類としては、特に制限されないが、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。このなかでも脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素が好ましく、脂肪族炭化水素がより好ましい。
【００３１】
脂肪族炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数５〜１２、より好ましくは炭素数５〜８のものが用いられる。具体例としては、例えば、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプタン異性体（例えば、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン）、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、２−ペンテン、１−ヘキセン、１−ヘプテン、１−オクテン、１−ノネン、１−デセン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ−メンタン、シクロヘキセン等を挙げることができる。好ましくは、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ−メンタン等である。より好ましくは、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン等であり、さらに好ましくは、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン等であり、特に好ましくは、酸化からの防護効果が特に高いという点から、ヘプタン、メチルシクロヘキサンであり、最も好ましくはヘプタンである。
【００３２】
芳香族炭化水素としては、特に制限されないが、通常、炭素数６〜２０、好ましくは炭素数６〜１２、より好ましくは炭素数７〜１０のものが用いられる。具体例としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベンゼン、ドデシルベンゼン、スチレン等を挙げることができる。好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン等である。より好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、クメン、テトラリン等である。最も好ましくは、クメンである。
【００３３】
ハロゲン化炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、非環状のものが好ましく用いられる。より好ましくは塩素化炭化水素、フッ素化炭化水素であり、さらに好ましくは塩素化炭化水素である。また、炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜４、より好ましくは炭素数１〜２のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１，１，２−テトラクロロエタン、１，１，２，２−テトラクロロエタン、ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，２−ジクロロプロパン、１，２，３−トリクロロプロパン、クロロベンゼン，１，１，１，２−テトラフルオロエタン等を挙げることができる。好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等である。より好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等である。
【００３４】
脂肪酸エステル類としては、特に制限されないが、例えば、プロピオン酸エステル、酢酸エステル、ギ酸エステル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸エステル、ギ酸エステルであり、より好ましくは酢酸エステルである。エステル基としては、特に制限されないが、通常、炭素数１〜８のアルキルエステル、炭素数７〜１２のアラルキルエステルが、好ましくは炭素数１〜６のアルキルエステルが、より好ましくは炭素数１〜４のアルキルエステルが用いられる。
【００３５】
プロピオン酸エステルの具体例としては、例えば、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソペンチル等を挙げることができる。好ましくはプロピオン酸エチル等である。
【００３６】
酢酸エステルの具体例としては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル等である。より好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル等であり、最も好ましくは、酢酸エチルである。
【００３７】
ギ酸エステルの具体例としては、例えば、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ｓｅｃ−ブチル、ギ酸ペンチル等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ペンチル等である。最も好ましくは、ギ酸エチルである。
【００３８】
エーテル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数４〜１２、より好ましくは炭素数４〜８のものが用いられる。具体例としては、例えば、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、フラン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。より好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。さらに好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール等であり、最も好ましくは、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルである。
【００３９】
アルコール類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１２、より好ましくは炭素数１〜６である。なかでも、炭素数１〜５の１価アルコール、炭素数２〜５の２価アルコール、炭素数３の３価アルコールが好ましい。
【００４０】
これらアルコール類の具体例としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、アリルアルコール、プロパルギルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等の１価アルコール；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール等の２価アルコール；グリセリン等の３価アルコールを挙げることができる。
【００４１】
１価アルコールとしては、好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等である。より好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、シクロヘキサノール等である。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール等である。特に好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール等であり、最も好ましくは、２−プロパノールである。
【００４２】
２価アルコールとしては、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール等が好ましく、１，２−エタンジオールが最も好ましい。３価アルコールとしては、グリセリンが好ましい。
【００４３】
脂肪酸類としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸、酢酸であり、最も好ましくは酢酸である。
【００４４】
ケトン類としては、特に制限されず、炭素数３〜６のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン等を挙げることができる。好ましくは、アセトン、メチルエチルケトンであり、最も好ましくはアセトンである。
【００４５】
ニトリル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数２〜２０、好ましくは炭素数２〜１２、より好ましくは炭素数２〜８のものが用いられる。
【００４６】
具体例としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、マロノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、スクシノニトリル、バレロニトリル、グルタロニトリル、ヘキサンニトリル、ヘプチルシアニド、オクチルシアニド、ウンデカンニトリル、ドデカンニトリル、トリデカンニトリル、ペンタデカンニトリル、ステアロニトリル、クロロアセトニトリル、ブロモアセトニトリル、クロロプロピオニトリル、ブロモプロピオニトリル、メトキシアセトニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、トルニトリル、ベンゾニトリル、クロロベンゾニトリル、ブロモベンゾニトリル、シアノ安息香酸、ニトロベンゾニトリル、アニソニトリル、フタロニトリル、ブロモトルニトリル、メチルシアノベンゾエート、メトキシベンゾニトリル、アセチルベンゾニトリル、ナフトニトリル、ビフェニルカルボニトリル、フェニルプロピオニトリル、フェニルブチロニトリル、メチルフェニルアセトニトリル、ジフェニルアセトニトリル、ナフチルアセトニトリル、ニトロフェニルアセトニトリル、クロロベンジルシアニド、シクロプロパンカルボニトリル、シクロヘキサンカルボニトリル、シクロヘプタンカルボニトリル、フェニルシクロヘキサンカルボニトリル、トリルシクロヘキサンカルボニトリル等を挙げることができる。
【００４７】
好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、スクシノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレロニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、ベンゾニトリル、トルニトリル、クロロプロピオニトリルであり、より好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリルであり、最も好ましくは、アセトニトリルである。
【００４８】
ニトリル類を除く窒素化合物類としては、例えば、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類やニトロメタン、トリエチルアミン、ピリジン等を挙げることができる。
【００４９】
硫黄化合物類としては、例えば、ジメチルスルホキシド、スルホラン等を挙げることができる。
【００５０】
上記有機溶媒の中でも、沸点、融点、粘性等の性質を考慮して選定するのが好ましい。例えば、沸点としては、溶解度を高めるための適度な加温ができ、且つ、湿体からの溶媒の乾燥除去や晶析濾液等からの溶媒回収の行いやすいという観点から、１気圧下、約３０〜１５０℃の範囲であるのが好ましく、融点としては、室温での取り扱い時及び室温以下に冷却した時も固化しにくいという観点から、約０℃以上、好ましくは約１０℃以上、より好ましくは約２０℃以上であり、粘性は２０℃において約１０ｃｐ以下と低い方が好ましい。
【００５１】
上記有機溶媒のうち、本発明の製造方法においては、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液から、補酵素Ｑ１０を抽出する場合には、抽出溶媒として疎水性有機溶媒または疎水性有機溶媒を含有するものを用いるのが好ましい。また、疎水性有機溶媒に少量の親水性有機溶媒（例えばイソプロパノールなどのアルコール類）や、界面活性剤を混合して使用することで、より抽出効率を高めることも出来る。
【００５２】
この場合に使用される疎水性有機溶媒としては、特に制限されず、上述の有機溶媒のうち疎水性のものを使用できるが、好ましくは、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類等の疎水性有機溶媒であり、さらに好ましくは脂肪酸エステル類又は炭化水素類、より好ましくは脂肪族の炭化水素類を用いることができる。脂肪族炭化水素類のなかでも、炭素数５〜８のものが好適に用いられる。上記炭素数５〜８の脂肪族炭化水素類の具体例としては、例えば、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン等を挙げることができる。特に好ましくは、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサンであり、最も好ましくは、ヘキサンである。また脂肪酸エステル類としては、酢酸エチルが好ましく用いられる。
【００５３】
一方、乾燥微生物細胞から補酵素Ｑ１０を抽出する場合の抽出溶媒としても、上記疎水性有機溶媒または疎水性有機溶媒を含有するものが好ましく用いられるが、親水性の有機溶媒も使用することもできる。親水性の有機溶媒としては特に限定されないが、上述したようなアルコール類やケトン類がより好ましい。アルコール類としては特に限定されないが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、グリセリンなどが、ケトン類としてはアセトンが好ましく、これらのなかでもエタノールが最も好ましい。
【００５４】
本発明の製造方法において、抽出溶媒の使用量としては、特に制限はされないが、抽出時の濃度として、全溶液の容量に対して、２５〜８０容量％の範囲で使用するのが好ましく、５０〜７５容量％の範囲で使用するのがより好ましい。本発明の製造方法において、抽出時の温度は、特に制限されないが、通常０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃の範囲で実施できる。
【００５５】
抽出方法としては、回分抽出、連続抽出のどちらの方法でも行うことができるが、工業的には連続抽出が生産性の面で好ましく、連続抽出の中でも向流多段抽出が特に好ましい。回分抽出の場合の撹拌時間は、特に制限されないが、通常５分以上であり、連続抽出の場合の平均滞留時間は、特に制限されないが、通常１０分以上である。
【００５６】
本発明の製造方法においては、上記のようにして得られる補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液をそのまま、あるいは適宜濃縮や希釈、もしくは他の溶媒に置換するなどして、補酵素Ｑ１０溶液とし、これを、補酵素Ｑ１０をほとんど吸着しない一方で、不純物を吸着しうる特定の吸着剤として、ケイ酸アルミニウムを主成分とする吸着剤（Ａ）と接触させることで、不純物を選択的に吸着除去する。
【００５７】
本発明の製造方法において用いられる吸着剤（Ａ）としては、ケイ酸アルミニウムを主成分とする吸着剤であれば特に限定されず、天然ケイ酸アルミニウム、合成ケイ酸アルミニウムのいずれでもよく、ケイ酸アルミニウムのみからなる吸着剤であってもよいし、ケイ酸アルミニウムを主成分とし、他の成分を含有する吸着剤であってもよい。その場合、吸着剤（Ａ）としては、重量基準で、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは６５％以上のケイ酸アルミニウムを含有するものが好ましい。また、上記ケイ酸アルミニウムを複数種類混合して使用しても良い。本発明の製造方法において用いられる吸着剤（Ａ）としては、上記ケイ酸アルミニウムのなかでも、非晶質の合成ケイ酸アルミニウムが好ましく、その化学組成としてケイ酸アルミニウム中の二酸化ケイ素割合が５０〜７０％、さらには５５〜６５％のケイ酸アルミニウムがより好ましい。また、ケイ酸アルミニウム中に多少の結晶水が存在しているものが好ましく、例えば乾燥減量として５％以上、２０％以下のものが好ましく、８％以上のものがより好ましい。またその構造中に固体酸（Ｈ＋）を有しているもの方が好ましい。上記吸着剤（Ａ）の具体例としては、協和化学工業株式会社製の「キョーワード（登録商標）７００」や東新化成株式会社製の「ニッカゲルＳ」があげられる。
【００５８】
上記吸着剤（Ａ）の形状は特に限定されず、粉末状、粒状、シート状、繊維状のいずれでもよい。また吸着剤（Ａ）の使用量は吸着する不純物の量および溶液中の補酵素Ｑ１０の含量と吸着剤の吸着容量との関係や処理方法によって決められるため、一概に制限されないが、使用する補酵素Ｑ１０含有溶液の容量に対して通常重量基準で０．０１〜７０％であり、好ましくは０．１〜１０％であり、あるいは処理対象の補酵素Ｑ１０重量に対して通常１〜２００％、好ましくは３〜１００％、より好ましくは５〜７５％の範囲で使用できる。また吸着剤（Ａ）の使用量は、回分式の場合で、処理対象の補酵素Ｑ１０重量に対して、例えば、１０〜２００％、好ましくは２０〜１００％、より好ましくは３０〜７５％の範囲とすることも推奨される。一方、カラムなどの連続処理の場合、吸着剤（Ａ）の使用量はより少なくても同様の効果を得ることがもでき、処理対象の補酵素Ｑ１０重量に対して、例えば、１〜１００％、好ましくは１〜７５％、より好ましくは３〜５０％の範囲とすることも可能である。
【００５９】
本発明においては、上記吸着剤（Ａ）だけを使用しても十分な効果が得られるが、吸着剤（Ａ）と、該吸着剤（Ａ）とは異なる吸着剤（Ｂ）を併用することでより効率的に補酵素Ｑ１０の精製を行うことが出来好ましい。この場合に用いられるケイ酸アルミニウムを主成分とする吸着剤以外の吸着剤（Ｂ）としては、特に限定されず、一般的な吸着剤が適宜選択される。また、吸着性能の有無に関係なく濾過剤も本発明の吸着剤（Ｂ）として併用できる。本発明の吸着剤（Ｂ）として、好ましくは、活性炭あるいは活性炭を主成分とする吸着剤、スチレンとジビニルベンゼンを共重合させた合成吸着剤、フェノールホルムアルデヒド系樹脂等の吸着樹脂、アルデヒド系吸着剤、ケイ酸マグネシウム、水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化アルミニウムと酸化マグネシウムの固溶体、珪藻土、活性アルミナ、シリカゲル、シリカマグネシアゲル、あるいはシリカゲル等の無機単体にアルキル基またはアリル基を化学結合させた吸着剤、芳香族系吸着剤、メタクリル酸エステル吸着剤、合成ゼオライト、パーライト系濾過剤等が挙げられる。またこれら吸着剤を複数種類混合して使用しても良い。これらのなかでも、シリカゲル、シリカマグネシアゲル、水酸化アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化アルミニウムと酸化マグネシウムの固溶体、パーライト系濾過剤やそれらの組み合わせが好ましく、水酸化アルミニウム、酸化アルミニウムと酸化マグネシウムの固溶体、またはパーライト系濾過剤がより好ましい。
【００６０】
上記吸着剤（Ｂ）の形状は特に限定されず、粉末状、粒状、シート状、繊維状、ゲル状のいずれでもよい。また吸着剤（Ｂ）の使用量は吸着する不純物の量および溶液中の補酵素Ｑ１０の含量と吸着剤の吸着容量とによって決められるため、一概に制限されないが、使用する補酵素Ｑ１０含有溶液の容量に対して通常重量基準で、０．０１〜７０％、好ましくは０．１〜１０％、あるいは処理対象の補酵素Ｑ１０重量に対して通常１〜２００％、好ましくは２〜１００％、より好ましくは３〜７５％の範囲で使用できる。
【００６１】
吸着剤（Ａ）と吸着剤（Ｂ）の使用量の比率は、例えば、吸着剤（Ａ）：吸着剤（Ｂ）（重量基準）で、例えば、５：９５〜１００：０、好ましくは１０：９０〜９０：１０、より好ましくは３０：７０〜７０：３０、更に好ましくは４０：６０〜６０：４０である。吸着剤（Ａ）と吸着剤（Ｂ）の使用量の比率を前記範囲に調整することで、不純物の除去率が高く、収率及び純度に優れた補酵素Ｑ１０を得ることができる。
【００６２】
本発明の製造方法において、吸着処理の方法としては、回分式、半回分式、連続式、流動床式、固定床式のいずれの方法でも行うことができる。例えば、吸着剤（Ａ）、あるいは吸着剤（Ａ）と吸着剤（Ｂ）の混合物を、補酵素Ｑ１０溶液に添加して攪拌することで接触させる方法、補酵素Ｑ１０溶液に、上記吸着剤（Ａ）あるいは吸着剤（Ａ）と吸着剤（Ｂ）の混合物を原料とするシートを浸漬させて接触させる方法、上記吸着剤（Ａ）あるいは吸着剤（Ａ）と吸着剤（Ｂ）の混合物を筒状のカラムに充填し、補酵素Ｑ１０を含有する抽出溶液を該カラムに通液接触させる方法などで、吸着処理を行うことができる。さらに吸着剤（Ａ）と吸着剤（Ｂ）を併用する場合には、吸着剤（Ａ）もしくは吸着剤（Ｂ）のいずれかを補酵素Ｑ１０溶液に添加して吸着処理した後に、他方の吸着剤（Ｂ）もしくは吸着剤（Ａ）を添加して吸着処理をしても良いし、吸着剤（Ａ）および吸着剤（Ｂ）を筒状のカラムに２層に分けて充填するか、別々のカラムにそれぞれ充填し、補酵素Ｑ１０を含有する抽出溶液を該カラムに通液接触させることで、吸着処理を行ってもよい。工業的には、上記のようにカラムに吸着剤（Ａ）あるいは吸着剤（Ａ）と吸着剤（Ｂ）の混合物を充填し、補酵素Ｑ１０を含有する抽出溶液を該カラムに連続的に通液して、接触させる方法が、その後の吸着剤との分離が容易な点や、処理対象の補酵素Ｑ１０に対する吸着剤の使用量を少なく出来る点などから、好ましい。いずれの方法においても、吸着剤と補酵素Ｑ１０溶液の接触時間は、特に制限されないが、通常５分以上、好ましくは１０分以上、より好ましくは１５分以上であり、上限は特に限定されないが、例えば１２時間もあれば十分である。
【００６３】
本発明の製造方法において、吸着処理時の温度としては、特に制限されないが、通常−２０℃〜８０℃の範囲で実施し、好ましくは−１０〜６０℃、より好ましくは０〜３０℃の範囲で実施する。
【００６４】
本発明の製造方法において、吸着処理時の補酵素Ｑ１０溶液の溶媒としては、補酵素Ｑ１０を溶解しうる有機溶媒であれば特に限定されないが、補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液をそのままあるいはその濃縮物を吸着処理する場合には、抽出に用いた有機溶媒から選択されうる。もちろん、補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液に別の有機溶媒を添加混合しても良いし、別の有機溶媒で溶媒置換して、補酵素Ｑ１０溶液を調製しそれを吸着処理しても良い。あるいは補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液から、別の方法で不純物をある程度除去したものを用いることも出来る。吸着処理時の補酵素Ｑ１０溶液の溶媒として、具体的には、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、アルコール類、脂肪酸類、ケトン類、窒素化合物類（ニトリル類、アミド類を含む）、硫黄化合物類等を挙げることができる。
【００６５】
炭化水素類としては、特に制限されないが、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。これらのなかでも脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素が好ましく、脂肪族炭化水素がより好ましい。
【００６６】
脂肪族炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数５〜１２、より好ましくは炭素数５〜８のものが用いられる。具体例としては、例えば、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプタン異性体（例えば、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン）、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、２−ペンテン、１−ヘキセン、１−ヘプテン、１−オクテン、１−ノネン、１−デセン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ−メンタン、シクロヘキセン等を挙げることができる。好ましくは、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ−メンタン等である。より好ましくは、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン等であり、さらに好ましくは、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン等であり、特に好ましくは、ヘキサン、ヘプタン、又はメチルシクロヘキサンである。
【００６７】
芳香族炭化水素としては、特に制限されないが、通常、炭素数６〜２０、好ましくは炭素数６〜１２、より好ましくは炭素数７〜１０のものが用いられる。具体例としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベンゼン、ドデシルベンゼン、スチレン等を挙げることができる。好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン等である。より好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、クメン、テトラリン等である。最も好ましくは、クメンである。
【００６８】
ハロゲン化炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、非環状のものが好ましく用いられる。より好ましくは塩素化炭化水素、フッ素化炭化水素であり、さらに好ましくは塩素化炭化水素である。また、炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜４、より好ましくは炭素数１〜２のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１，１，２−テトラクロロエタン、１，１，２，２−テトラクロロエタン、ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，２−ジクロロプロパン、１，２，３−トリクロロプロパン、クロロベンゼン，１，１，１，２−テトラフルオロエタン等を挙げることができる。好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等である。より好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等である。
【００６９】
脂肪酸エステル類としては、特に制限されないが、例えば、プロピオン酸エステル、酢酸エステル、ギ酸エステル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸エステル、ギ酸エステルであり、より好ましくは酢酸エステルである。エステル基としては、特に制限されないが、通常、炭素数１〜８のアルキルエステル、炭素数７〜１２のアラルキルエステルが、好ましくは炭素数１〜６のアルキルエステルが、より好ましくは炭素数１〜４のアルキルエステルが用いられる。
【００７０】
プロピオン酸エステルの具体例としては、例えば、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソペンチル等を挙げることができる。好ましくはプロピオン酸エチル等である。
【００７１】
酢酸エステルの具体例としては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル等である。より好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル等であり、最も好ましくは、酢酸エチルである。
【００７２】
ギ酸エステルの具体例としては、例えば、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ｓｅｃ−ブチル、ギ酸ペンチル等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ペンチル等である。最も好ましくは、ギ酸エチルである。
【００７３】
エーテル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数４〜１２、より好ましくは炭素数４〜８のものが用いられる。具体例としては、例えば、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、フラン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。より好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。さらに好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール等であり、最も好ましくは、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルである。
【００７４】
アルコール類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１２、より好ましくは炭素数１〜６である。なかでも、炭素数１〜５の１価アルコール、炭素数２〜５の２価アルコール、炭素数３の３価アルコールが好ましい。
【００７５】
これらアルコール類の具体例としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、アリルアルコール、プロパルギルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等の１価アルコール；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール等の２価アルコール；グリセリン等の３価アルコールを挙げることができる。
【００７６】
１価アルコールとしては、好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等である。より好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、シクロヘキサノール等である。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール等である。特に好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール等であり、最も好ましくは、２−プロパノールである。
【００７７】
２価アルコールとしては、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール等が好ましく、１，２−エタンジオールが最も好ましい。３価アルコールとしては、グリセリンが好ましい。
【００７８】
脂肪酸類としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸、酢酸であり、最も好ましくは酢酸である。
【００７９】
ケトン類としては、特に制限されず、炭素数３〜６のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン等を挙げることができる。好ましくは、アセトン、メチルエチルケトンであり、最も好ましくはアセトンである。
【００８０】
ニトリル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数２〜２０、好ましくは炭素数２〜１２、より好ましくは炭素数２〜８のものが用いられる。
【００８１】
具体例としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、マロノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、スクシノニトリル、バレロニトリル、グルタロニトリル、ヘキサンニトリル、ヘプチルシアニド、オクチルシアニド、ウンデカンニトリル、ドデカンニトリル、トリデカンニトリル、ペンタデカンニトリル、ステアロニトリル、クロロアセトニトリル、ブロモアセトニトリル、クロロプロピオニトリル、ブロモプロピオニトリル、メトキシアセトニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、トルニトリル、ベンゾニトリル、クロロベンゾニトリル、ブロモベンゾニトリル、シアノ安息香酸、ニトロベンゾニトリル、アニソニトリル、フタロニトリル、ブロモトルニトリル、メチルシアノベンゾエート、メトキシベンゾニトリル、アセチルベンゾニトリル、ナフトニトリル、ビフェニルカルボニトリル、フェニルプロピオニトリル、フェニルブチロニトリル、メチルフェニルアセトニトリル、ジフェニルアセトニトリル、ナフチルアセトニトリル、ニトロフェニルアセトニトリル、クロロベンジルシアニド、シクロプロパンカルボニトリル、シクロヘキサンカルボニトリル、シクロヘプタンカルボニトリル、フェニルシクロヘキサンカルボニトリル、トリルシクロヘキサンカルボニトリル等を挙げることができる。
【００８２】
好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、スクシノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレロニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、ベンゾニトリル、トルニトリル、クロロプロピオニトリルであり、より好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリルであり、最も好ましくは、アセトニトリルである。
【００８３】
ニトリル類を除く窒素化合物類としては、例えば、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類やニトロメタン、トリエチルアミン、ピリジン等を挙げることができる。
【００８４】
硫黄化合物類としては、例えば、ジメチルスルホキシド、スルホラン等を挙げることができる。
【００８５】
上記有機溶媒の中でも、沸点、融点、粘性等の性質を考慮して選定するのが好ましい。例えば、沸点としては、湿体からの溶媒の乾燥除去や晶析濾液等からの溶媒回収の行いやすいという観点から、１気圧下、約３０〜１５０℃の範囲であるのが好ましく、融点としては、室温での取り扱い時及び室温以下に冷却した時も固化しにくいという観点から、約０℃以上、好ましくは約１０℃以上、より好ましくは約２０℃以上であり、粘性は製品のロス削減やハンドリング面を考慮して、２０℃において約１０ｃｐ以下と低い方が好ましい。
【００８６】
上記有機溶媒のうち、補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液から、不純物を効率的に除去するという目的においては、疎水性有機溶媒または疎水性有機溶媒を含有するものを用いるのが好ましい。また、使用する溶媒は多量の水分を含まない方が吸着剤への補酵素Ｑ１０の吸着を抑制することが出来るため好ましく、使用する溶媒に含まれる水分量としては重量基準で最大でも１５％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは６％以下である。
【００８７】
この場合に使用される疎水性有機溶媒としては、特に制限されず、上述の有機溶媒のうち疎水性のものを使用できるが、好ましくは、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類等の疎水性有機溶媒であり、さらに好ましくは脂肪酸エステル類又は炭化水素類、より好ましくは脂肪族の炭化水素類を用いることができる。脂肪族炭化水素類のなかでも、炭素数５〜８のものが好適に用いられる。上記炭素数５〜８の脂肪族炭化水素類の具体例としては、例えば、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン等を挙げることができる。特に好ましくは、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサンであり、最も好ましくは、ヘキサンである。また脂肪酸エステル類としては、酢酸エチルが好ましく用いられる。
【００８８】
本発明の製造方法においては、上記のようにして補酵素Ｑ１０溶液と吸着剤（Ａ）とを接触させることで、吸着剤（Ａ）に選択的に不純物を吸着させ、その後、不純物を吸着した吸着剤（Ａ）を補酵素Ｑ１０溶液から分離除去することで、純度の高められた補酵素Ｑ１０を得ることができる。もちろん、吸着剤（Ａ）と吸着剤（Ｂ）とを併用して使用した場合には、その併用形態に応じ、吸着剤（Ａ）と吸着剤（Ｂ）をそれぞれ個別に、あるいは吸着剤（Ａ）と吸着剤（Ｂ）の混合物を、補酵素Ｑ１０溶液から分離除去すれば良い。吸着処理後の吸着剤（Ａ）、吸着剤（Ｂ）あるいは吸着剤（Ａ）と吸着剤（Ｂ）の混合物（以下単に「吸着剤」ともいう）を、補酵素Ｑ１０溶液から分離する方法は特に限定されないが、遠心分離、自然濾過、減圧濾過、加圧濾過、遠心濾過が挙げられる。また、上記カラムに吸着剤を充填して使用する場合などは、特段分離除去操作を行うことなく、カラムから流出された補酵素Ｑ１０溶液をそのまま次の工程に使用することも出来る。
使用後の吸着剤は、毎回処理ごとに破棄しても良いし、吸着能力が残っている間は再度利用しても良い。例えばカラムに充填して使用する場合は、目的とする不純物の除去効果が得られる限り、連続して使用することも出来る。もちろん、一部を破棄し、使用後の吸着剤と新しい吸着剤とを混合して使用することも出来る。また、ヘキサンや酢酸エチル、イソプロピルアルコールなどやこれらの混合溶媒による溶媒洗浄を行って、吸着剤を再生処理し再利用することも出来る。
【００８９】
本発明の製造方法で上記吸着処理により除去される不純物としては、補酵素Ｑ１０生産微生物由来の成分として、主にステロール誘導体が挙げられる。
【００９０】
ここで、ステロール誘導体としては特に限定されないが、コレステロール、カンペステロール、デスモステロール、ブラシカステロール、スチグマステロール、α−シトステロール、β−シトステロール、ジヒドロ−β−シトステロール、γ−シトステロール、７−デヒドロコレステロール、エルゴステロール、２２−ジヒドロエルゴステロール等が挙げられる。また、これらのステロール誘導体の末端にエステル結合したステロールエステル類も含まれる。これらのうち、２種類以上を吸着除去することもできる。本発明においては、植物体または酵母等を培養した後の培養生産物などに多く含まれ、晶析法など他の方法では分離、除去が困難であるということから、ステロール脂肪酸エステルに属するもの、より具体的にはエルゴステロールを選択的に吸着するのが好ましい。
【００９１】
本発明の製造方法においては、吸着処理前の溶液と比較して、吸着処理後の溶液中の補酵素Ｑ１０の収率は通常８５％以上、好ましくは９０％以上となる。なお該収率は、９９％以下でもよい。
また、純度向上パーセントポイントは、通常２パーセントポイント以上、好ましくは２．５パーセントポイント以上であり、例えば、１０パーセントポイント以下、特に７パーセントポイント以下でもよい。なお、上記純度向上パーセントポイントは、吸着処理前の溶液と吸着処理後の溶液を乾燥させて、その二つの不揮発性成分中のＱ１０重量パーセントの差を示すものである。
さらに上記吸着処理により除去されるエルゴステロールの除去率は、通常２％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、好ましくは１００％以下、通常９０％以下となり、６０％以下でもよい。
【００９２】
本発明の製造方法においては、以上の操作によって、補酵素Ｑ１０を含有する微生物細胞、微生物細胞破砕物又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液、乾燥微生物細胞又は乾燥微生物細胞破砕物から、有機溶媒中に補酵素Ｑ１０を抽出し、それを吸着処理することで、精製された、あるいは純度の向上した補酵素Ｑ１０を単離・回収できる。吸着処理後の補酵素Ｑ１０溶液は、そのまま利用することもできるし、吸着剤から分離した補酵素Ｑ１０抽出液をさらに処理してより好ましい形態あるいは純度の補酵素Ｑ１０含有組成物や補酵素Ｑ１０結晶としても良い。そのような処理工程としては、濃縮、溶媒置換、酸化、還元、カラムクロマトグラフィー、晶析などが挙げられ、もちろんこれらを組み合わせても良い。例えば、吸着剤から分離した補酵素Ｑ１０抽出液から溶媒を留去して（濃縮）、補酵素Ｑ１０を含む精製物とする、あるいは必要に応じてさらにシリカゲルなどのカラムクロマトグラフィーなどで精製した後、有機溶媒を留去して、補酵素Ｑ１０を含む精製物とすることもできる。またさらに晶析操作などで目的とする補酵素Ｑ１０を結晶体として得ることもできる。上記カラムクロマトグラフィー、酸化、還元、晶析の前に、必要に応じて、さらに溶媒置換を行っても良い。例えば、補酵素Ｑ１０生産微生物から有機溶媒中に補酵素Ｑ１０を抽出し、得られた補酵素Ｑ１０を含有する抽出液を、本発明の製造方法によって、吸着処理により精製し、その前後で必要に応じて酸化または還元処理を行い、さらに晶析操作を用いて、高純度の補酵素Ｑ１０の結晶として取得することもできる。
【００９３】
なお、本発明の製造方法において、補酵素Ｑ１０として還元型補酵素Ｑ１０単独あるいは還元型補酵素Ｑ１０比率の高い補酵素Ｑ１０を製造する目的においては、補酵素Ｑ１０生産微生物として、生産される補酵素Ｑ１０中の還元型補酵素Ｑ１０含有比率の高い微生物を用い、酸化を防ぐ雰囲気下（たとえば窒素ガスなどの不活性雰囲気下）で、上記抽出や吸着処理を行うことで、還元型補酵素Ｑ１０単独あるいは還元型補酵素Ｑ１０比率の高い補酵素Ｑ１０を特段の処理を行うことなく得ることも可能である。もちろん、このようにして得られた還元型補酵素Ｑ１０比率の高い補酵素Ｑ１０をさらに還元することで還元型比率をより高めることも可能であり、また、補酵素Ｑ１０含有抽出液を特に酸化を防ぐ手段を施すことなく、あるいは、空気中の酸素や酸化剤により酸化させて還元型補酵素Ｑ１０比率の比較的低いもの（例えば、５０ｍｏｌ％以下、あるいは３０ｍｏｌ％以下）を、本発明の製造方法で吸着処理し、その後、還元反応を実施することで、還元型補酵素Ｑ１０比率の高い補酵素Ｑ１０を製造することも可能である。還元型補酵素Ｑ１０を製造する目的においては、製造の最終工程あるいは最終製品としての還元型補酵素Ｑ１０含有比率は高い方が好ましく、補酵素Ｑ１０の総量１００ｍｏｌ％中、還元型補酵素Ｑ１０は、例えば７０ｍｏｌ％以上、好ましくは８０ｍｏｌ％以上、より好ましくは９０ｍｏｌ％以上、さらにより好ましくは９６ｍｏｌ％以上であるのが良い。
より具体的な一態様としては、補酵素Ｑ１０生産微生物から有機溶媒中に補酵素Ｑ１０を抽出し、得られた補酵素Ｑ１０を含有する抽出液を、本発明の製造方法によって、吸着処理し、カラムクロマトグラフィーを用いてさらに精製した後、還元処理を行い、晶析操作を用いて、高純度の還元型補酵素Ｑ１０の結晶として取得することもできる。
【００９４】
一方、本発明の製造方法は酸化型補酵素Ｑ１０の製造にも利用できる。その場合、補酵素Ｑ１０を含有する微生物細胞、微生物細胞破砕物又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液、乾燥微生物細胞又は乾燥微生物細胞破砕物から、有機溶媒中に補酵素Ｑ１０を抽出し、吸着処理の前又はその後に酸化剤による酸化処理を行っても良いし、単に空気中などで、抽出、吸着、その他精製や後処理等を行ったり、抽出前に菌体を空気中で乾燥することで、自然酸化により酸化型補酵素Ｑ１０比率の高い補酵素Ｑ１０を簡便な操作で得ることも可能である。
より具体的な一態様としては、補酵素Ｑ１０生産微生物から、有機溶媒中に補酵素Ｑ１０を抽出し、得られた補酵素Ｑ１０を含有する抽出液を、本発明の製造方法によって吸着処理し、溶媒置換後、カラムクロマトグラフィーを用いてさらに精製した後、酸化処理を行い、晶析操作を用いて、高純度の酸化型補酵素Ｑ１０の結晶として取得することもできる。
【００９５】
本願は、２０１６年７月１日に出願された日本国特許出願第２０１６−１３１８１７号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１６年７月１日に出願された日本国特許出願第２０１６−１３１８１７号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００９６】
以下に実施例、比較例をあげて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。また、実施例、比較例中の補酵素Ｑ１０の収率および補酵素Ｑ１０の純度は、本発明における限界値を規定するものではなく、その上限値を規定するものでもない。
補酵素Ｑ１０の収率は、吸着処理前と吸着処理後の溶液中の補酵素Ｑ１０濃度を分析して算出した。補酵素Ｑ１０の濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（ＳＨＩＭＡＤＺＵ製）を使用し、下記の条件で測定した。【００９７】
（ＨＰＬＣ測定条件）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ（ＹＭＣ社製）
オーブン温度：３０℃
移動相：メタノール／ヘキサン＝８５／１５（容積比）
送液速度：１．０  ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２７５ｎｍ
補酵素Ｑ１０の純度向上パーセントポイントは、吸着処理前の溶液と吸着処理後の溶液を乾燥させて、それぞれの不揮発性成分中のＱ１０の重量パーセントの差として算出した。【００９８】
エルゴステロール除去率は、吸着処理前と吸着処理後の溶液中のエルゴステロール濃度（ＥＲＧ濃度）を分析し、下記式により算出した。エルゴステロールの濃度は、ＨＰＬＣを用いて上記補酵素Ｑ１０濃度の測定と同条件で分析した。
エルゴステロール除去率
＝｛（吸着処理前ＥＲＧ濃度−吸着処理後ＥＲＧ濃度）／（吸着処理前ＥＲＧ濃度）｝×１００
【実施例１】
【００９９】
補酵素Ｑ１０を産生するサイトエラ・コンプリカタ（Saitoella complicata）ＩＦＯ１０７４８株を、培地（ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、マルトエキス３ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．０）を用いて、好気的に２５℃で１６０時間培養した。得られた補酵素Ｑ１０を含む微生物培養液を遠心分離により濃縮し、微生物菌体をスプレードライヤーで乾燥させた。得られた乾燥微生物に、ヘキサンを遠心分離前の培養液の体積の１．５倍に相当する量添加し、５０℃で１時間撹拌し、補酵素Ｑ１０を抽出した。該補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液を濃縮し、補酵素Ｑ１０濃度を２５ｇ／Ｌとした。なお、濃縮液中の還元型補酵素Ｑ１０比率（総補酵素Ｑ１０中の還元型補酵素Ｑ１０の割合）は約５重量％であった。当該抽出濃縮液に、吸着剤（Ａ）として合成ケイ酸アルミニウムのキョーワード７００（協和化学工業株式会社製、ＫＷ７００ＳＮ）と、吸着剤（Ｂ）として水酸化アルミニウムからなるキョーワード２００（協和化学工業株式会社製、ＫＷ２００）を、補酵素Ｑ１０の重量％に対してそれぞれ５０ｗｔ％ずつ添加した。室温で１時間撹拌したのち、溶液をろ過した。ろ液を分析した結果、補酵素Ｑ１０の収率は９８．４１％、その純度は３．４パーセントポイント向上し、エルゴステロール除去率は４９．７％であることが確認された。
【実施例２】
【０１００】
実施例１と同様にして得られた補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出濃縮液に、吸着剤（Ａ）としてキョーワード７００（協和化学工業株式会社製、ＫＷ７００ＳＮ）と、吸着剤（Ｂ）としてパーライト系濾過剤であるロカヘルプ（三井金属鉱業社製）を、補酵素Ｑ１０の重量％に対してそれぞれ５０ｗｔ％ずつ添加し、実施例１と同様の操作条件で吸着処理を行った。その結果、補酵素Ｑ１０の収率は９８．９７％、その純度は２．８パーセントポイント向上し、エルゴステロール除去率は５４．７％であった。
【実施例３】
【０１０１】
実施例１と同様にして得られた補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出濃縮液に、吸着剤（Ａ）としてキョーワード７００（協和化学工業株式会社製、ＫＷ７００ＳＮ）と、吸着剤（Ｂ）として酸化アルミニウムと酸化マグネシウムの固溶体であるキョーワード２０００（協和化学工業株式会社製、ＫＷ２０００）を、補酵素Ｑ１０の重量％に対してそれぞれ５０ｗｔ％ずつ添加し、実施例１と同様の操作条件で吸着処理を行った。その結果、補酵素Ｑ１０の収率は９６．２６％、その純度は４．４パーセントポイント向上し、エルゴステロール除去率は３７．６％であった。
【実施例４】
【０１０２】
実施例１と同様に培養して得られた補酵素Ｑ１０を含む微生物培養液を遠心分離により濃縮し、上清を分離し除去し、得られた重液を約１００ＭＰａで圧力破砕して微生物培養濃縮液とし、それに、抽出溶媒のヘキサンとイソプロパノールを添加し、補酵素Ｑ１０を抽出した。該補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液を濃縮し、補酵素Ｑ１０濃度を２５ｇ／Ｌとした。濃縮液に吸着剤（Ａ）としてキョーワード７００（協和化学工業株式会社製、ＫＷ７００ＳＮ）を、補酵素Ｑ１０の重量％に対して９ｗｔ％添加した。室温で１時間撹拌した後、溶液をろ過した。ろ液を分析した結果、補酵素Ｑ１０の収率は９３．８３％、その純度は３．３パーセントポイント向上し、エルゴステロール除去率は２．８％であった。
【実施例５】
【０１０３】
実施例１と同様にして得られた補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出濃縮液に、吸着剤（Ａ）としてキョーワード７００（協和化学工業株式会社製、ＫＷ７００ＳＮ）と、同じく合成ケイ酸アルミニウムのニッカゲルＳ（東新化成株式会社製）を、補酵素Ｑ１０の重量％に対してそれぞれ５０ｗｔ％ずつ添加し、実施例１と同様の操作条件で吸着処理を行った結果、補酵素Ｑ１０の収率は９５．１７％、その純度は２．９パーセントポイント向上し、エルゴステロール除去率は３９．４％であった。
【実施例６】
【０１０４】
補酵素Ｑ１０を産生するサイトエラ・コンプリカタ（Saitoella complicata）ＩＦＯ１０７４８株を、培地（ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、マルトエキス３ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．０）を用いて、好気的に２５℃で１６０時間培養した。得られた補酵素Ｑ１０を含む微生物培養液を遠心分離により濃縮し、微生物菌体をスプレードライヤーで乾燥させた。得られた乾燥微生物に、酢酸エチルを遠心分離前の培養液の体積の１．０倍添加し、５０℃で１時間撹拌し、補酵素Ｑ１０を抽出した。該補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出液を濃縮し、補酵素Ｑ１０濃度を２５ｇ／Ｌとした。なお、濃縮液中の還元型補酵素Ｑ１０比率は約５重量％であった。濃縮液に吸着剤（Ａ）としてキョーワード７００（協和化学工業株式会社製、ＫＷ７００ＳＮ）と、吸着剤（Ｂ）としてロカヘルプ（三井金属鉱業社製）を、補酵素Ｑ１０の重量％に対してそれぞれ５０ｗｔ％ずつ添加した。室温で１時間撹拌したのち、溶液をろ過した。ろ液を分析した結果、補酵素Ｑ１０の収率は９４．１１％、その純度は５．４パーセントポイント向上し、エルゴステロール除去率は３８．２％であることが確認された。【０１０５】
（比較例１）
実施例１と同様にして得られた補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出濃縮液に、キョーワード２００（協和化学工業株式会社製、ＫＷ２００）とロカヘルプ（三井金属鉱業社製）を、補酵素Ｑ１０の重量％に対してそれぞれ５０ｗｔ％ずつ添加し、実施例１と同様の操作条件で吸着処理を行った結果、補酵素Ｑ１０の収率は９６．４６％、その純度は１．５パーセントポイントのみ向上し、エルゴステロール除去率は１０．７％であることが確認された。【０１０６】
（比較例２）
実施例１と同様にして得られた補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出濃縮液に、ロカヘルプ（三井金属鉱業社製）を補酵素Ｑ１０の重量％に対して５０ｗｔ％添加した。実施例１と同様の操作条件で吸着処理を行った。その結果、補酵素Ｑ１０の収率は９４．０５％、その純度の向上は０パーセントポイントで、エルゴステロール除去率は２．０％となった。【０１０７】
（比較例３）
実施例１と同様にして得られた補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出濃縮液に、キョーワード２０００（協和化学工業株式会社製、ＫＷ２０００）とロカヘルプ（三井金属鉱業社製）を、補酵素Ｑ１０の重量％に対してそれぞれ５０ｗｔ％ずつ添加した。実施例１と同様の操作条件で吸着処理を行った結果、補酵素Ｑ１０の収率は８２．８２％、その純度は１．８パーセントポイントのみ向上し、エルゴステロール除去率は４．１％であることが確認された。【０１０８】
（比較例４）
実施例１と同様にして得られた補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出濃縮液に、ケイ酸マグネシウムであるキョーワード６００（協和化学工業株式会社製、ＫＷ６００）とロカヘルプ（三井金属鉱業社製）を、補酵素Ｑ１０の重量％に対してそれぞれ５０ｗｔ％ずつ添加した。実施例１と同様の操作条件で吸着処理を行った結果、補酵素Ｑ１０の収率は９６．２９％、その純度は１．３パーセントポイントのみ向上し、エルゴステロール除去率は４．２％であることが確認された。【０１０９】
（比較例５）
実施例１と同様にして得られた補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出濃縮液に、活性炭とロカヘルプ（三井金属鉱業社製）を、補酵素Ｑ１０の重量％に対してそれぞれ５０ｗｔ％ずつ添加した。実施例１と同様の操作条件で吸着処理を行った結果、補酵素Ｑ１０の収率は８９．９９％、その純度は０．３パーセントポイントのみ向上し、エルゴステロール除去率は２９．７％であることが確認された。【０１１０】
（比較例６）
実施例１と同様にして得られた補酵素Ｑ１０生産微生物の抽出濃縮液に、活性アルミナ３００（ナカライテスク社製）とロカヘルプ（三井金属鉱業社製）を、補酵素Ｑ１０の重量％に対してそれぞれ５０ｗｔ％ずつ添加した。実施例１と同様の操作条件で吸着処理を行った結果、補酵素Ｑ１０の収率は９６．７８％、その純度は１．６パーセントポイントのみ向上し、エルゴステロール除去率は１．１％であることが確認された。【０１１１】
【表１】
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【国際調査報告】
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