(57)【要約】【課題】培養細胞の状態を定量的に評価することが可能な細胞観察装置を提供する。【解決手段】細胞観察装置は、第１撮影条件に従って培地を撮影した第１写真を取得する第１撮影処理（Ｓ１１）と、第２撮影条件に従って培地を撮影した第２写真を取得する第２撮影処理（Ｓ１２）と、第１写真内において培養細胞が存在する領域と推定される細胞領域を特定する第１特定処理（Ｓ１４、Ｓ１５）と、第２写真内において培養細胞の細胞核の位置と推定される細胞位置を特定する第２特定処理（Ｓ１７〜Ｓ２０）と、第２特定処理で特定された細胞位置のうち、第１特定処理で特定された細胞領域内に位置する細胞位置の数を、培養細胞の細胞数としてカウントするカウント処理（Ｓ２１）とを実行する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
写真を撮影する撮影部と、
制御部と、を備えており、
上記制御部は、
培養細胞を含む培地を第１撮影条件に従って上記撮影部に撮影させることによって、第１写真を取得する第１撮影処理と、
上記培地を上記第１撮影条件と異なる第２撮影条件に従って上記撮影部に撮影させることによって、第２写真を取得する第２撮影処理と、
上記第１写真内において、上記培養細胞が存在する領域と推定される細胞領域を特定する第１特定処理と、
上記第２写真内において、上記培養細胞の細胞核の位置と推定される細胞位置を特定する第２特定処理と、
上記第２特定処理で特定された上記細胞位置のうち、上記第１特定処理で特定された上記細胞領域内に位置する上記細胞位置の数を、上記培養細胞の細胞数としてカウントするカウント処理と、を実行する細胞観察装置。
【請求項２】
上記制御部は、上記第１特定処理において、
上記第１写真を示す第１写真データのうち、第１閾値未満の画素値を第１値に置換し、上記第１閾値以上の画素値を第２値に置換した二値画像データを生成する生成処理と、
上記二値画像データで示される二値画像のうち、上記第１値の画素の領域を上記細胞領域として特定する領域特定処理と、を実行する請求項１に記載の細胞観察装置。
【請求項３】
上記制御部は、上記領域特定処理において、上記第１値の画素が閾値数以上連続する領域を上記細胞領域として特定する請求項２に記載の細胞観察装置。
【請求項４】
上記制御部は、上記第２特定処理において、
上記第２写真を示す第２写真データから特定周波数成分を抽出する抽出処理と、
上記特定周波数成分が抽出された上記第２写真の画素値を走査したときに、画素値の変化が減少及び増加の一方から他方に転じる境界の画素位置を上記細胞位置として特定する位置特定処理と、を実行する請求項１から３のいずれかに記載の細胞観察装置。
【請求項５】
上記制御部は、上記抽出処理において、
上記第２写真データをＦＦＴ変換する変換処理と、
上記変換処理後の上記第２写真データに上記特定周波数成分を通過させるフィルタを適用するフィルタ処理と、
上記フィルタ処理後の上記第２写真データをＦＦＴ逆変換する逆変換処理と、を実行する請求項４に記載の細胞観察装置。
【請求項６】
上記制御部は、上記第１特定処理で特定された上記細胞領域の面積を算出する算出処理を実行する請求項１から５のいずれかに記載の細胞観察装置。
【請求項７】
出力部をさらに備えており、
上記制御部は、上記カウント処理でカウントされた細胞数を上記出力部に出力させる出力処理を実行する請求項１から６のいずれかに記載の細胞観察装置。
【請求項８】
該細胞観察装置は、上記培地へ光を照射する照射部を備えており、
上記第１撮影条件は、上記照射部によって照射された光のうち、上記培地から出力された第１波長の光で上記第１写真を撮影することを示し、
上記第２撮影条件は、上記培地から出力された上記第１波長より長い第２波長の光で上記第２写真を撮影することを示す請求項１から７のいずれかに記載の細胞観察装置。
【請求項９】
上記第１波長は、４００ｎｍ以上で７００ｎｍ以下であり、
上記第２波長は、７００ｎｍ以上であり、且つ上記第１波長より長い請求項８に記載の細胞観察装置。
【請求項１０】
上記撮影部は、焦点の位置を調整する調整手段を備えており、
上記第１撮影条件は、上記培養細胞の輪郭に焦点を合わせた状態で上記第１写真を撮影することを示し、
上記第２撮影条件は、上記第１撮影条件より上記撮影部に近い位置に焦点を合わせた状態で第３写真を撮影し、且つ上記第１撮影条件より上記撮影部から離れた位置に焦点を合わせた状態で第４写真を撮影することを示し、
上記制御部は、上記第２撮影処理において、上記第３写真及び上記第４写真の画素値の差を、上記第２写真として取得する請求項１から９のいずれかに記載の細胞観察装置。
【請求項１１】
写真を撮影する撮影部と、
制御部と、を備えており、
上記制御部は、
培養細胞を含む培地を第１撮影条件に従って上記撮影部に撮影させることによって、第１写真を取得する第１撮影処理と、
上記培地を上記第１撮影条件と異なる第２撮影条件に従って上記撮影部に撮影させることによって、第２写真を取得する第２撮影処理と、
上記第１写真内において、上記培養細胞が存在する領域と推定される細胞領域を特定する第１特定処理と、
上記第１特定処理で特定された上記細胞領域の面積を算出する算出処理と、を実行する細胞観察装置。
【請求項１２】
コンピュータによって実行可能なプログラムであって、
培養細胞を含む培地を第１撮影条件に従って撮影した第１写真、及び上記培地を上記第１撮影条件と異なる第２撮影条件に従って撮影した第２写真を示す写真データを取得する取得処理と、
上記第１写真内において、上記培養細胞が存在する領域と推定される細胞領域を特定する第１特定処理と、
上記第２写真内において、上記培養細胞の細胞核の位置と推定される細胞位置を特定する第２特定処理と、
上記第１特定処理で特定された上記細胞領域及び上記第２特定処理で特定された上記細胞位置の少なくとも一方に基づいて、上記培養細胞の細胞数或いは上記細胞領域の面積を算出する算出処理と、を上記コンピュータに実行させるプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培地内の細胞の状態を観察する細胞観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、病気の治療或いは医薬品の生産や評価のために、細胞の培養が行われている。細胞の培養は、無菌室内に設置されたインキュベータ内において、温度及び湿度等を一定に保った状態で行われる。また、細胞の培養を行う作業者は、例えば継代のタイミングを見極めること等を目的として、培養中の細胞の状態を定期的に観察する必要がある。【０００３】
ここで、培養細胞の状態を観察する度にインキュベータからシャーレを取り出さなければならないとすると、培養細胞にダメージを与える可能性がある。そこで、例えば特許文献１には、培養細胞を撮影するためにインキュベータ内に設置された撮影手段と、撮影手段で撮影された培養細胞の画像を表示するためにインキュベータの外面に設置された表示手段とを備えるインキュベータが開示されている。これにより、インキュベータから培養細胞を取り出さずに観察することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−６５５６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
培養細胞を観察する作業者は、例えば、シャーレ内における培養細胞の数、シャーレ内において培養細胞が占める面積等を割り出すことによって、継代のタイミングを判断する。しかしながら、特許文献１に記載のインキュベータでは、撮影手段で撮影された画像から培養細胞の状態を判断しなければならないので、その判断には熟練を要するという課題がある。【０００６】
本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、培養細胞の状態を定量的に評価することが可能な細胞観察装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
(1)  本発明の一形態に係る細胞観察装置は、写真を撮影する撮影部と、制御部とを備える。上記制御部は、培養細胞を含む培地を第１撮影条件に従って上記撮影部に撮影させることによって、第１写真を取得する第１撮影処理と、上記培地を上記第１撮影条件と異なる第２撮影条件に従って上記撮影部に撮影させることによって、第２写真を取得する第２撮影処理と、上記第１写真内において、上記培養細胞が存在する領域と推定される細胞領域を特定する第１特定処理と、上記第２写真内において、上記培養細胞の細胞核の位置と推定される細胞位置を特定する第２特定処理と、上記第２特定処理で特定された上記細胞位置のうち、上記第１特定処理で特定された上記細胞領域内に位置する上記細胞位置の数を、上記培養細胞の細胞数としてカウントするカウント処理とを実行する。【０００８】
上記構成のように、培養細胞の細胞数をカウントすることによって、当該培養細胞の状態を定量的に評価することができる。その結果、培養細胞の状態の判断に熟練していない作業者であっても、例えば、継代のタイミングを適切に判断することができる。【０００９】
(2)  好ましくは、上記制御部は、上記第１特定処理において、上記第１写真を示す第１写真データのうち、第１閾値未満の画素値を第１値に置換し、上記第１閾値以上の画素値を第２値に置換した二値画像データを生成する生成処理と、上記二値画像データで示される二値画像のうち、上記第１値の画素の領域を上記細胞領域として特定する領域特定処理とを実行する。【００１０】
上記構成によれば、画素値（典型的には、輝度値）の違いによって、培養細胞が存在する領域と、培地の領域とを区別することができる。【００１１】
(3)  好ましくは、上記制御部は、上記領域特定処理において、上記第１値の画素が閾値数以上連続する領域を上記細胞領域として特定する。【００１２】
生成処理によって、第１写真に含まれるノイズの位置に第１値が割り当てられる可能性がある。しかしながら、ノイズは細胞と比較して小さいので、第１値の画素が閾値数以上連続する領域を細胞領域とすることによって、ノイズの影響を低減することができる。【００１３】
(4)  好ましくは、上記制御部は、上記第２特定処理において、上記第２写真を示す第２写真データから特定周波数成分を抽出する抽出処理と、上記特定周波数成分が抽出された上記第２写真の画素値を走査したときに、画素値の変化が減少及び増加の一方から他方に転じる境界の画素位置を上記細胞位置として特定する位置特定処理とを実行する。【００１４】
特定周波数成分より周波数の高い成分は、例えば、細胞の輪郭、カメラの熱雑音によるノイズ、或いは小さなゴミ等の画像に対応する。一方、特定周波数成分より周波数の低い成分は、例えば、細胞質及び培地の領域の画像に対応する。そこで、これらを第２写真データから除去することによって、細胞核の画像を抽出することができるので、細胞数を正確にカウントすることができる。【００１５】
(5)  好ましくは、上記制御部は、上記抽出処理において、上記第２写真データをＦＦＴ変換する変換処理と、上記変換処理後の上記第２写真データに上記特定周波数成分を通過させるフィルタを適用するフィルタ処理と、上記フィルタ処理後の上記第２写真データをＦＦＴ逆変換する逆変換処理とを実行する。【００１６】
上記構成のように、ＦＦＴ（Ｆａｓｔ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）変換、バンドパスフィルタ、及びＦＦＴ逆変換を用いることにより、細胞核の画像を簡単且つ正確に抽出することができる。【００１７】
(6)  好ましくは、上記制御部は、上記第１特定処理で特定された上記細胞領域の面積を算出する算出処理を実行する。【００１８】
上記構成のように、細胞領域の面積を算出することによって、培養細胞の状態をさらに定量的に評価することができる。なお、算出処理で算出された面積は、シャーレ内において培養細胞が占める割合を評価するために用いてもよいし、当該面積を細胞数で除すことによって培養細胞の大きさの評価に用いてもよい。【００１９】
(7)  好ましくは、該細胞観察装置は、出力部をさらに備える。上記制御部は、上記カウント処理でカウントされた細胞数を上記出力部に出力させる出力処理を実行する。【００２０】
出力処理の具体例は特に限定されないが、例えば、細胞数を表示部に表示させてもよいし、細胞数をプリンタに印字させてもよい。また、出力対象は細胞数のみに限定されず、算出処理で算出される細胞領域の面積がさらに出力されてもよい。【００２１】
(8)  一例として、該細胞観察装置は、上記培地へ光を照射する照射部を備える。上記第１撮影条件は、上記照射部によって照射された光のうち、上記培地から出力された第１波長の光で上記第１写真を撮影することを示す。上記第２撮影条件は、上記培地から出力された上記第１波長より長い第２波長の光で上記第２写真を撮影することを示す。【００２２】
(9)  例えば、上記第１波長は、４００ｎｍ以上で７００ｎｍ以下である。また、上記第２波長は、７００ｎｍ以上であり、且つ上記第１波長より長い。【００２３】
(10)  他の例として、上記撮影部は、焦点の位置を調整する調整手段を備える。上記第１撮影条件は、上記培養細胞の輪郭に焦点を合わせた状態で上記第１写真を撮影することを示す。上記第２撮影条件は、上記第１撮影条件より上記撮影部に近い位置に焦点を合わせた状態で第３写真を撮影し、且つ上記第１撮影条件より上記撮影部から離れた位置に焦点を合わせた状態で第４写真を撮影することを示す。そして、上記制御部は、上記第２撮影処理において、上記第３写真及び上記第４写真の画素値の差を、上記第２写真として取得する。【００２４】
(11)  本発明の他の形態に係る細胞観察装置は、写真を撮影する撮影部と、制御部とを備える。上記制御部は、培養細胞を含む培地を第１撮影条件に従って上記撮影部に撮影させることによって、第１写真を取得する第１撮影処理と、上記培地を上記第１撮影条件と異なる第２撮影条件に従って上記撮影部に撮影させることによって、第２写真を取得する第２撮影処理と、上記第１写真内において、上記培養細胞が存在する領域と推定される細胞領域を特定する第１特定処理と、上記第１特定処理で特定された上記細胞領域の面積を算出する算出処理とを実行する。【００２５】
(12)  本発明に係るプログラムは、コンピュータによって実行可能である。該プログラムは、培養細胞を含む培地を第１撮影条件に従って撮影した第１写真、及び上記培地を上記第１撮影条件と異なる第２撮影条件に従って撮影した第２写真を示す写真データを取得する取得処理と、上記第１写真内において、上記培養細胞が存在する領域と推定される細胞領域を特定する第１特定処理と、上記第２写真内において、上記培養細胞の細胞核の位置と推定される細胞位置を特定する第２特定処理と、上記第１特定処理で特定された上記細胞領域及び上記第２特定処理で特定された上記細胞位置の少なくとも一方に基づいて、上記培養細胞の細胞数或いは上記細胞領域の面積を算出する算出処理とを上記コンピュータに実行させる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、培養細胞の細胞数をカウントすることによって、当該培養細胞の状態を定量的に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、本実施形態に係る細胞観察装置１０の機能ブロック図である。
【図２】図２は、本実施形態に係る細胞観察処理のフローチャートである。
【図３】図３は、ステップＳ１１、Ｓ１２で撮影された第１写真及び第２写真の一例を示す図である。
【図４】図４は、ステップＳ１４で生成された二値画像の一例である。
【図５】図５は、ステップＳ１５でノイズ３４が除去された二値画像の一例である。
【図６】図６は、ステップＳ１７〜Ｓ１９で細胞核３１及びノイズ３４が抽出された第２画像の一例である。
【図７】図７は、ＦＦＴ変換後の第２写真内において一列に並んだ画素の輝度値の変化を模式的に表した図である。
【図８】図８は、ステップＳ２０でプロット５０が設定された第２画像の一例である。
【図９】図９は、図５に示される二値画像にプロット５０を重ねた画像の一例である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。なお、本実施形態は本発明の一実施態様にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で実施態様を変更できることは言うまでもない。
【００２９】
本実施形態に係る細胞観察装置１０は、図１に示されるように、照射部１１と、第１偏光板１２Ａ及び第２偏光板１２Ｂ（これらを総称して、「偏光板１２」と表記することがある。）と、撮影部１３と、制御部１４と、表示部１５とを主に備える。また、照射部１１から偏光板１２を経て撮影部１３に至る光路上には、図示しないコリメートレンズや結像レンズ等の光学系が適宜配置される。図１において、破線の矢印は光の進行方向を示し、実線の矢印は信号の進行方向を示す。
【００３０】
照射部１１は、第１波長及び第１波長より長い第２波長の光を少なくとも含む白色光を出力する。照射部１１の具体例は特に限定されないが、例えば、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）等を用いることができる。第１波長は、例えば、４００ｎｍ以上で７００ｎｍ以下の中から選択される。望ましくは、第１波長は、５００ｎｍ以上で５５０ｎｍ以下の中から選択される。第２波長は、例えば、７００ｎｍ以上で且つ第１波長より長い波長が選択される。望ましくは、第２波長は、７００ｎｍ以上で９００ｎｍ以下の中から選択される。
【００３１】
第１偏光板１２Ａは、照射部１１から照射された白色光のうちの第１波長の光のみを通過させ、その他の波長の光を遮断する。第２偏光板１２Ｂは、照射部１１から照射された白色光のうちの第２波長の光のみを通過させ、その他の波長の光を遮断する。偏光板１２の具体的な構造は特に限定されないが、例えば、ポリビニルアルコール主体にヨウ素化合物分子を吸着配向させた一般的な偏光フィルムを用いることができる。
【００３２】
撮影部１３は、照射部１１から照射され且つ偏光板１２を通過した光で写真を撮影する。より詳細には、撮影部１３は、偏光板１２を通過した光を受光し、光電変換によって写真データを生成する。そして、撮影部１３は、生成した写真データを制御部１４に出力する。撮影部１３の具体例は特に限定されないが、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）等の撮像素子と、焦点の位置を調整するレンズユニット（調整手段の一例）とを備えるカメラである。また、本実施形態に係る撮影部１３は、カラーの写真を撮影することができるものとする。
【００３３】
制御部１４は、照射部１１、偏光板１２、撮影部１３、及び表示部１５の動作を制御すると共に、撮影部１３から取得した写真データに対する画像処理を実行する。制御部１４の動作は、図２を参照して後述される。制御部１４は、例えば、プログラムを記憶する記憶部と、記憶部からプログラムを読み出して実行するＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）とで構成される。
【００３４】
表示部１５は、制御部１４の制御に従って情報を表示する。表示部１５の具体的な構成は特に限定されないが、例えば、液晶ディスプレイ（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙの略）、有機ＥＬディスプレイ（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙの略）等を採用することができる。表示部１５は、出力部の一例である。
【００３５】
［細胞観察処理］
図２〜図８を参照して、細胞観察処理を説明する。なお、以下の各処理は、ＣＰＵが実行するプログラムによって実現されてもよいし、制御部１４に搭載されたハードウェア回路によって実現されてもよいし、これらを組み合わせて実現されてもよい。
【００３６】
まず、細胞観察装置１０の照射部１１から撮影部１３に至る光路上に、細胞を培養するための培地２１を含むシャーレ２０が配置される。これにより、照射部１１から照射された光の一部は、培地２１を透過して撮影部１３に到達する。なお、シャーレ２０は、作業者によって細胞観察装置１０にセットされてもよい。または、インキュベータに組み込まれた細胞観察装置１０の照射部１１及び撮影部１３が、シャーレ２０の載置部を挟んで対向配置されていてもよい。
【００３７】
制御部１４は、照射部１１に白色光を照射させ、撮影部１３に第１写真を撮影させる（Ｓ１１）。第１写真は、培地２１を透過した光のうち、第１偏光板１２Ａを通過した第１波長の光で撮影部１３が撮影した写真である。すなわち、ステップＳ１１において、照射部１１から撮影部１３に至る光路上には、第１偏光板１２Ａが配置される。そして、制御部１４は、当該第１写真を示す第１写真データを撮影部１３から取得する。ステップＳ１１は、第１撮影処理及び取得処理の一例である。また、ステップＳ１１において撮影部１３に入射させる光の波長は、第１撮影条件の一例である。
【００３８】
次に、制御部１４は、照射部１１に白色光を照射させ、撮影部１３に第２写真を撮影させる（Ｓ１２）。第２写真は、培地２１を透過した光のうち、第２偏光板１２Ｂを通過した第２波長の光で撮影部１３が撮影した写真である。すなわち、ステップＳ１２において、照射部１１から撮影部１３に至る光路上には、第２偏光板１２Ｂが配置される。そして、制御部１４は、当該第２写真を示す第２写真データを撮影部１３から取得する。ステップＳ１２は、第２撮影処理及び取得処理の一例である。また、ステップＳ１２において撮影部１３に入射させる光の波長は、第２撮影条件の一例である。
【００３９】
図３は、ステップＳ１１、Ｓ１２で撮影された第１写真及び第２写真の一例である。第１写真及び第２写真は、視野、画角、及び倍率等の撮影条件は同一であり、撮影時に撮影部１３に到達する光の波長が異なる。第１写真及び第２写真には、培地２１内で培養された細胞３０が写っている。細胞３０は、細胞核３１と、細胞核３１の周りを囲む細胞質３２と、細胞３０の輪郭を形成する細胞壁３３とで構成される。また、第１写真及び第２写真には、ノイズ３４が含まれている。ノイズ３４の原因は特に限定されないが、例えば、撮影部１３の熱雑音によるノイズ、撮影部１３のレンズ等に付着した小さなゴミによるノイズ等が考えられる。
【００４０】
次に、制御部１４は、カラーの第１写真データ及び第２写真データ（以下、これらを総称して、「写真データ」と表記することがある。）を、グレースケールの写真データに変換する（Ｓ１３）。なお、ステップＳ１３で生成される写真データは、各画素が輝度値の大小を表すものであればグレースケールに限定されない。例えば、写真データをＲＧＢ色空間からＹＵＶ色空間に変換し、輝度信号のみを抽出した輝度画像であってもよい。また、ステップＳ１１、Ｓ１２において、撮影部１３がグレースケールの写真データを生成する場合、ステップＳ１３は省略することができる。
【００４１】
次に、制御部１４は、グレースケールの第１写真データから二値画像データを生成する（Ｓ１４）。具体的には、制御部１４は、グレースケールの第１写真データのうち、第１閾値未満の画素値を第１値（例えば、“０”）４１に置換し、第１閾値以上の画素値を第２値（例えば、“１”）４２に置換することによって、二値画像データを生成する。ステップＳ１４の処理は、生成処理の一例である。
【００４２】
図４は、ステップＳ１４で生成される二値画像データで示される二値画像の一例である。図４に示される二値画像は、第１写真の細胞３０及びノイズ３４の位置に対応する画素値が第１値（図４における白色の領域）４１となり、培地２１の位置に対応する画素値が第２値（図４における黒色の領域）４２となる。すなわち、図４に示される二値画像では、培地２１及び細胞３０が区別され、細胞核３１、細胞質３２、及び細胞壁３３が区別されない。
【００４３】
なお、本実施形態では、細胞３０及びノイズ３４の画素が培地２１の画素より画素値が小さいことを前提としている。しかしながら、この画素値の関係が逆転する場合、制御部１４は、ステップＳ１４において、第１閾値以上の画素値を第１値に置換し、第１閾値未満の画素値を第２値に置換すればよい。
【００４４】
次に、制御部１４は、ステップＳ１４で生成された二値画像データからノイズ３４を除去する（Ｓ１５）。具体的には、制御部１４は、連続する第１値の画素が閾値数未満であることに応じて、当該画素の画素値を第１値４１から第２値４２に変更する。換言すれば、制御部１４は、細胞３０の一般的な大きさより充分に小さい第１値４１の画素の塊を第２値４２の画素に置換する。
【００４５】
図５は、ノイズ３４に対応する画素に第２値４２が設定された二値画像の一例である。図５に示される二値画像は、ノイズ３４の位置の画素に第２値４２が設定されている点において、図４に示される二値画像と相違する。そして、制御部１４は、図５に示される二値画像のうち、第１値４１が設定された画素の領域を、細胞３０が存在すると推定される領域（以下、「細胞領域」と表記する。）として特定する。ステップＳ１５の処理は、領域特定処理の一例である。ステップＳ１４、Ｓ１５は、第１特定処理の一例である。
【００４６】
次に、制御部１４は、図５に示される二値画像のうち、第１値４１の画素の面積を算出する（Ｓ１６）。具体的には、制御部１４は、二値画像に含まれる第１値４１の画素数をカウントし、当該画素数に１画素の面積を乗じることによって、第１値４１の画素の面積を算出する。ステップＳ１６で算出された面積は、第１写真に含まれる細胞領域の面積に相当する。ステップＳ１６の処理は、算出処理の一例である。
【００４７】
次に、制御部１４は、グレースケールの第２写真データをＦＦＴ（Ｆａｓｔ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）変換する（Ｓ１７）。すなわち、制御部１４は、空間領域の第２写真データを、周波数領域の第２写真データに変換する。ステップＳ１７の処理は、変換処理の一例である。なお、ステップＳ１７で第２写真データに適用される処理の具体例はＦＦＴに限定されず、例えば、離散コサイン変換（Ｄｉｓｃｒｅｔｅ  Ｃｏｓｉｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）等であってもよい。
【００４８】
次に、制御部１４は、ＦＦＴ変換された第２写真データにバンドパスフィルタを適用する（Ｓ１８）。バンドパスフィルタは、変換処理後の第２写真データの周波数成分のうち、特定周波数成分を通過させ、特定周波数成分より高い周波数成分（以下、「高周波数成分」と表記する。）及び特定周波数成分より低い周波数成分（以下、「低周波数成分」と表記する。）を遮断（減衰）するフィルタである。ステップＳ１８の処理は、フィルタ処理の一例である。
【００４９】
なお、特定周波数成分とは、例えば、細胞核３１を表す画像の複雑さに対応する予め定められた範囲の周波数である。また、高周波成分は、例えば、細胞３０の輪郭（すなわち、細胞壁３３）及びノイズ３４等を表す画像の複雑さに対応する。さらに、低周波成分は、例えば、培地２１、細胞質３２、及び照射部１１から照射される光の偏りによる輝度ムラ等を表す画像の複雑さに対応する。
【００５０】
次に、制御部１４は、バンドパスフィルタが適用された第２写真データをＦＦＴ逆変換する（Ｓ１９）。すなわち、制御部１４は、周波数領域の第２写真データを、空間領域の第２写真データに変換する。但し、ステップＳ１７で第２写真データが離散コサイン変換された場合、ステップＳ１９で第２写真データが離散コサイン逆変換される。ステップＳ１９の処理は、逆変換処理の一例である。ステップＳ１７〜Ｓ１９の処理は、第２写真データから特定周波数成分を抽出する抽出処理の一例である。
【００５１】
図６は、抽出処理後の第２写真データで示される第２写真の一例である。図６に示される第２写真は、培地２１、細胞質３２、細胞壁３３、及びノイズ３４の一部を示す画像を、図３に示される第２写真から除去したものに相当する。但し、図６に示される第２写真には、ノイズ３４の一部が未だ含まれている可能性がある。また、図６に示される第２写真において、細胞核３１及びノイズ３４の位置の画素は、その他の位置の画素より画素値が小さい。
【００５２】
次に、制御部１４は、ＦＦＴ逆変換後の第２写真内において、極値画素の画素位置にプロット５０を設定する（Ｓ２０）。極値画素は、例えば、第２写真の画素を左右方向（或いは、上下方向）に走査したときに、輝度値の変化が減少及び増加の一方から他方に転じる境界の画素を指す。例えば図７に示されるように、細胞核３１及びノイズ３４の位置の画素がその他の位置の画素より画素値が小さい場合の極値画素は、輝度値の変化が減少から増加に転じる境界の画素（すなわち、画素値が極小となる極小画素）を指す。一方、細胞核３１及びノイズ３４の位置の画素がその他の位置の画素より画素値が大きい場合の極値画素は、輝度値の変化が増加から減少に転じる境界の画素（すなわち、画素値が極大となる極大画素）を指す。
【００５３】
図７は、ＦＦＴ変換後の第２写真内において一列に並んだ画素の輝度値の変化を模式的に表した図である。制御部１４は、ステップＳ２０において、図７に示される画素のうちの輝度値が第２閾値未満の画素（実線部分）のみを走査対象にする。そして、制御部１４は、連続する走査対象画素列Ａのうちの輝度値が最小になる極小画素Ａ１の画素位置にプロット５０を設定する。また、制御部１４は、連続する走査対象画素列Ｂに極大画素Ｂ１が存在する場合、極大画素Ｂ１より走査方向の一方側において輝度値が最小となる極小画素Ｂ２の画素位置と、極大画素Ｂ１より走査方向の他方側において輝度値が最小となる極小画素Ｂ３の画素位置とに、プロット５０を設定する。
【００５４】
図８は、プロット５０が設定された第２写真の一例である。図８に示される第２写真には、図６に示される第２写真に含まれる細胞核３１及びノイズ３４の位置に、プロット５０が設定される。また、図８では、細胞核３１及びノイズ３４の図示は省略されている。ステップＳ２０の処理は、位置特定処理の一例である。ステップＳ１７〜Ｓ２０の処理は、細胞核３１の位置と推定される位置（以下、「細胞位置」と表記する。）を特定する第２特定処理の一例である。すなわち、プロット５０の位置が細胞位置に相当する。
【００５５】
次に、制御部１４は、図９に示されるように、図４に示される第１写真に図８に示されるプロット５０を重ねる。そして、制御部１４は、図９に示される画像において、第１値４１の領域に重なるプロット５０の数を、細胞３０の数（以下、「細胞数」と表記する。）としてカウントする（Ｓ２１）。すなわち、制御部１４は、図９に示される画像において、第１値４１の領域に重なるプロット５０は細胞核３１の位置を示し、第２値４２の領域に重なるプロット５０はノイズ３４の位置を示していると判断する。ステップＳ２１は、カウント処理の一例である。
【００５６】
次に、制御部１４は、ステップＳ１６で算出した細胞領域の面積と、ステップＳ２１でカウントした細胞数とを表示部１５に表示させる（Ｓ２２）。また、制御部１４は、細胞領域の面積を細胞数で除した細胞３０の面積の平均値を、表示部１５にさらに表示させてもよい。ステップＳ２２の処理は、出力処理の一例である。
【００５７】
［本実施形態の作用効果］
上記の実施形態のように、波長が異なる２つ光を用いて撮影した第１写真及び第２写真を画像処理することによって、細胞領域の面積を算出し、細胞３０の細胞数をカウントすることができる。その結果、熟練した作業者でなくても当該細胞３０の状態を定量的に評価することができるので、例えば、継代のタイミングや当該培地の倍加時間を適切に判断することができる。なお、上記の実施形態では、面積の算出及び細胞数のカウントの両方を実行する例を説明したが、いずれか一方のみが実行されてもよい。細胞数のカウントを省略する場合、ステップＳ１７〜Ｓ２１の処理が省略される。
【００５８】
なお、継代のタイミングや倍加時間の判断は、作業者にではなく、制御部１４に実行させてもよい。一般的に、細胞の数が所定の数に達したことによって継代が行われる。また、細胞の面積が大きいほど倍加時間が長くなり、細胞の面積が小さいほど倍加時間が短くなる傾向がある。そこで、継代を実行するときの細胞の数や、細胞の面積と倍加時間との関係等をデータベースとして制御部１４に予め与えておくことによって、培養のスケジュールを制御部１４に立案させることができる。そして、立案されたスケジュールは、ステップＳ２２において、表示部１５に表示されてもよい。
【００５９】
また、上記の実施形態によれば、第１写真内における画素値の違いによって培地２１と細胞３０とが区別され（Ｓ１４）、第１値４１の画素の塊の大きさによって細胞３０とノイズ３４とが区別される（Ｓ１５）。これにより、第１写真内における細胞領域を適切に特定することができる。
【００６０】
また、上記の実施形態によれば、バンドパスフィルタによって第１写真から特定周波数成分（すなわち、細胞核３１を示す画像）が抽出され（Ｓ１７〜Ｓ１９）、二値画像と重ね合わせることによってノイズ３４が除去される（Ｓ２１）。これにより、第２写真内における細胞位置を適切に特定することができる。
【００６１】
なお、上記の実施形態に係る細胞観察処理は、シャーレ２０上の複数の箇所それぞれに対して実行されてもよい。より詳細には、制御部１４は、シャーレ２０上の互いに異なる撮影範囲に対してステップＳ１１〜Ｓ２１の処理を実行してもよい。そして、制御部１４は、ステップＳ２２において、ステップＳ１６で算出された面積の合計値（或いは、平均値）と、ステップＳ２１でカウントされた細胞数の合計値（或いは、平均値）とを、表示部１５に表示させてもよい。
【００６２】
また、図１に示される細胞観察装置１０の具体的な構成は、前述の例に限定されない。例えば、照射部１１は、制御部１４の制御に従って、第１波長の単色光と、第２波長の単色光とを選択的に出力してもよい。この場合、偏光板１２は省略することができる。また、照射部１１から培地２１を経由して撮影部１３に到達する光は、培地２１を透過することに限定されず、培地２１で反射されたものであってもよい。また、出力部の具体例は表示部１５に限定されず、情報をシートに記録するプリンタ等であってもよい。
【００６３】
また、ステップＳ１１、Ｓ１２における撮影条件は、撮影部１３に入射させる光の波長が異なることに限定されず、焦点の位置が異なることであってもよい。焦点の位置は、レンズユニットを操作することによって変更される。レンズユニットは、細胞観察装置１０の作業者によって手動で操作されてもよいし、制御部１４によって制御される不図示のアクチュエータによって操作されてもよい。さらに他の例として、ステップＳ１１、Ｓ１２において、光の波長及び焦点の位置の両方が異なる撮影条件を採用してもよい。なお、ステップＳ１３以降の処理は、前述の例と共通する。
【００６４】
より詳細には、制御部１４は、ステップＳ１１において、細胞３０の輪郭に焦点を合わせた状態で、撮影部１３に第１写真を撮影させてもよい。このときの焦点の位置（以下、「第１焦点位置」と表記する。）は、第１撮影条件の一例である。この場合の第１写真は、細胞３０の輪郭が鮮明に写った写真となる。
【００６５】
一方、制御部１４は、ステップＳ１２において、第１焦点位置より撮影部１３に近い位置（以下、「第２焦点位置」と表記する。）に焦点を合わせた状態で、撮影部１３に第３写真を撮影させ、且つ第１焦点位置より撮影部１３から離れた位置（以下、「第３焦点位置」と表記する。）に焦点を合わせた状態で、撮影部１３に第４写真を撮影させてもよい。このときの焦点の位置は、第２撮影条件の一例である。すなわち、第１焦点位置は、第２焦点位置及び第３焦点位置の間に位置する。第１焦点位置及び第２焦点位置の距離、及び第１焦点位置及び第３焦点位置の距離は、例えば、１０μｍ〜３０μｍである。
【００６６】
第３写真及び第４写真を比較すると、細胞核３１の位置のコントラストが相対的に高く、細胞核３１と異なる位置のコントラストが相対的に低くなる。そこで、制御部１４は、ステップＳ１２において、第３写真及び第４写真の画素値の差を、第２写真として取得してもよい。より詳細には、制御部１４は、第３写真及び第４写真の同一の位置（例えば、左端）の画素値の差を、第２写真における当該位置（例えば、左端）の画素値とすればよい。この場合の第２写真は、細胞核３１がはっきり写った写真となる。
【００６７】
また、上記の実施形態に係る細胞観察装置１０は、図１に示される全ての構成要素を一体化したものに限定されない。細胞観察装置１０は、例えば、照射部１１、偏光板１２、及び撮影部１３を備える撮影装置と、制御部１４及び表示部１５を備える画像処理装置とが通信ネットワークを通じて接続されていてもよい。この場合の画像処理装置は、例えば、一般的なＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）であってもよい。
【００６８】
さらに、細胞観察処理の各ステップの実行順序は、図２の例に限定されない。例えば、ステップＳ１２の処理は、ステップＳ１６、Ｓ１７の間で実行されてもよい。但し、ステップＳ１１、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｓ１６はこの順に実行され、ステップＳ１２、Ｓ１３、Ｓ１７、Ｓ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｓ２１はこの順に実行される。
【符号の説明】
【００６９】
１０・・・細胞観察装置
１１・・・照射部
１２Ａ，１２Ｂ・・・偏光板
１３・・・撮影部
１４・・・制御部
１５・・・表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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