(57)【要約】  培地成分を適切にすることで、より効率的な培養を達成することを課題とする。有用物質生産性である微細藻類の培養方法であって、培養容器内において、硝酸イオンのリン酸イオンに対するモル濃度比（Ｎ／Ｐ比）が０．７〜４．０であり、かつ硝酸イオン量が培養面積当たり０．２ｍｏｌ／ｍ2以上である培地中で微細藻類を培養し、培地の液面にバイオフィルムを形成させる工程を含む、微細藻類の培養方法による。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有用物質生産性である微細藻類の培養方法であって、
硝酸イオンのリン酸イオンに対するモル濃度比（Ｎ／Ｐ比）が０．７〜４．０であり、かつ培養面積当たりの硝酸イオン量が０．２ｍｏｌ／ｍ2以上である培地中で微細藻類を培養し、培地の液面にバイオフィルムを形成させる工程
を含む、微細藻類の培養方法。
【請求項２】
前記Ｎ／Ｐ比が１．０〜４．０であり、前記培養面積当たりの硝酸イオン量が０．２ｍｏｌ／ｍ2〜１．５ｍｏｌ／ｍ2である、請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記培養が、静置培養により行われる、請求項１又は２に記載の培養方法。
【請求項４】
前記バイオフィルムが三次元構造を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項５】
培地交換を行わない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項６】
前記微細藻類が緑藻である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項７】
前記微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄ  ｓｐ．、Ｔｅｔｒａｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｃｈａｒａｃｉｕｍ  ｓｐ．又はＰｒｏｔｏｓｉｐｈｏｎ  ｓｐ．に属するものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項８】
前記微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２０、又はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．  ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２６２と同じ種に属するものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の培養方法を含む培養工程；及び
形成された前記バイオフィルムを回収する工程；
を含む、藻類バイオマスの製造方法。
【請求項１０】
前記藻類バイオマスが、オイルである、請求項９に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用物質生産性の微細藻類の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類による、油、油脂、脂質、燃料等の有用物質の生産は、石油化学燃料由来のＣＯ2発生量削減、これに伴う地球温暖化の防止等の観点から期待されているが、まだ従来の石油化学燃料と比較してコストが高いという問題がある。コスト高となる原因の一つは、微細藻類の効率的な回収方法がないことである。具体的には、微細藻類は通常、液中に浮遊しながら生育させるため、微細藻類をバイオマスとして利用するには、非常に希薄な濃度の微細藻類を大量の液中から回収しなければならない。加えて、微細藻類の生育には光エネルギーが必要であり、液中に存在する微細藻類に十分な光の照射を確保するためには、微細藻類の培養密度には限界がある。結果として、有用物質を得るために液中の微細藻類を回収するには、多量の水をろ別する必要があるが、微細藻類のサイズは一般的に小さく、ろ過操作自体が容易ではなかった。このような問題を解決するための回収方法の検討として、沈殿剤を用いる方法、遠心分離機を用いる方法、微細藻類をより大型の生物の餌とした後に、該大型の生物を回収する方法等が試みられたものの、いずれの方法も根本的な解決には至らなかった。【０００３】
微細藻類を簡便かつ低コストで回収するために、有用物質生産性の微細藻類を液面上で浮遊培養し、バイオフィルムを形成させることが提案されている（例えば、特許文献１）。この培養方法によれば、微細藻類を回収する段階では、微細藻類の集合体から構成されたバイオフィルムが液面上に浮かんでおり、そのバイオフィルムを回収対象としているため、バイオフィルムと培地との分別が容易である。また従来のように大量の培地中に分散した微細藻類を回収する必要はなく、また液面上のバイオフィルムの含水率が比較的低いために、大量の液体をハンドリングする必要がなく、また回収物の乾燥コストも抑えられる。【０００４】
一方、効率的な有用物質の生産を行うため、培養条件に関する検討もなされている。例えば特許文献２は、微細藻ユーグレナを好気的に培養する第１の工程と、前記微細藻ユーグレナが培養されている培地を窒素飢餓状態としてさらに培養する第２の工程と、細胞を嫌気状態下に保持する第３の工程とから成るワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法を提案する。この方法において窒素飢餓状態は、培地を窒素欠乏培地に置換することにより創出される。【０００５】
また特許文献３は、有用物質生産性である微細藻類の培養方法であって、培養容器内の培地中で微細藻類を培養し、培地の液面にバイオフィルムを形成させる工程；及び培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程を含み、成分の濃度を変化させることにより微細藻類の産生する有用物質を増加させるものである、微細藻類の培養方法を提案する。この方法において、培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程は、好ましくは窒素又はリンを含む成分の濃度を低減させることによる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１３−２２６０６３号公報
【特許文献２】特開２０１２−２３９７７号公報
【特許文献３】特開２０１５−１９２６４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
微細藻類の培養に用いられる培地は、通常、硝酸イオン（窒素成分）を含むが、硝酸イオン量を低減することで微細藻類における含油率が向上しうる。しかしながら、硝酸イオンの削減は含油率を向上させることができても、藻体生産性が低下してしまうために、油生産性（即ち、藻体生産性×含油率）の向上には直ちには結び付かないという問題がある。【０００８】
また特許文献２の方法は、好気的な条件から嫌気的な条件への切り替えを含み、元々の培養工程が複雑であることに加えて、培養の途中で窒素欠乏培地に置換するという更なる操作を要する。そしてこのような工程・操作を経ても油生産性の向上倍率は１．２倍には満たない。【０００９】
さらに特許文献３の方法では、培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程を実施するために、培養途中で生成しつつある藻体に影響を与えないように配慮しながら、培地の少なくとも一部を交換し、あるいは低栄養の培地を追加するという特別な操作を要する。そしてこのような特別な操作を実施しても、特に窒素を含む成分の濃度を低減させても、油生産性の向上倍率は１．２倍以下である。【００１０】
本発明は、上記の従来技術の方法より高い油生産性が得られ、又は操作をより単純にする、微細藻類の培養方法、並びにこれを用いる、藻類バイオマスの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、微細藻類の液面浮遊培養について鋭意検討してきた。そして今般、培地成分のうち、硝酸イオンのみではなく、リン酸イオンにも着目し、硝酸イオンのリン酸イオンに対するモル濃度比（Ｎ／Ｐ比）が０．７〜４．０であり、かつ培養面積当たりの硝酸イオン量が０．２ｍｏｌ／ｍ2以上であることにより、従来のような培養途中での培地の交換、追加等の煩雑な工程を要さず、高い有用物質生産性が維持できる培地組成を見出した。また上記培地成分を用いることにより。特別な操作を要することなく、硝酸イオンの低減のみに着目した従来技術よりも高い倍率で油生産性を向上できることも見出した。このような知見に基づき、本発明を完成した。【００１２】
本発明は、以下を提供する。
［１］有用物質生産性である微細藻類の培養方法であって、
硝酸イオンのリン酸イオンに対するモル濃度比（Ｎ／Ｐ比）が０．７〜４．０  であり、かつ培養面積当たりの硝酸イオン量が０．２ｍｏｌ／ｍ2以上である培地中で微細藻類を培養し、培地の液面にバイオフィルムを形成させる工程
を含む、微細藻類の培養方法。
［２］上記Ｎ／Ｐ比が１．０〜４．０であり、上記培養面積当たりの硝酸イオン量が０．２ｍｏｌ／ｍ２〜１．５ｍｏｌ／ｍ2である、［１］に記載の培養方法。
［３］上記培養が、静置培養により行われる、［１］又は［２］に記載の培養方法。
［４］上記バイオフィルムが三次元構造を有する、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の培養方法。
［５］培地交換を行わない、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の培養方法。
［６］上記微細藻類が緑藻である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の培養方法。
［７］上記微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄ  ｓｐ．、Ｔｅｔｒａｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｃｈａｒａｃｉｕｍ  ｓｐ．又はＰｒｏｔｏｓｉｐｈｏｎ  ｓｐ．に属するものである、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の培養方法。
［８］微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２０、又はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．  ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２６２と同じ種に属するものである、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の培養方法。
［９］［１］〜［８］のいずれか１項の培養方法を含む培養工程；及び
形成された上記バイオフィルムを回収する工程；
を含む、藻類バイオマスの製造方法。
［１０］上記藻類バイオマスが、オイルである、［９］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、高い油生産性が得られ、又は操作をより単純にする、微細藻類の培養方法、並びにこれを用いる、藻類バイオマスの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】微細藻類の培養方法の一例を示す模式図である。
【図２】実施例及び比較例における硝酸イオンとリン酸イオンとのモル濃度比（Ｎ／Ｐ比）に対し、培養面積あたりの硝酸イオン量（ＮＯ3- ｍｏｌ／ｍ2）をプロットしたグラフ。それぞれ比較対象に対する油生産性が、白菱形：１．４倍以上、白丸：１．３倍以上１．４倍未満、白三角：１．２倍以上１．３倍未満、黒三角：１．１倍以上１．２倍未満、Ｘ印：１．１倍未満
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明による微細藻類の培養方法の好ましい実施の形態について詳細に説明する。なお、「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【００１６】
［培養方法］
本発明の基本的な培養方法を図１に示した。なお、本模式図は、本発明を説明するためのものであることから、簡略化して表記されている部分がある。
（培養）
図１の（ａ）に示した様に、まず初めに、微細藻類の懸濁溶液又は分散溶液を調製する。次に、培養容器を静置状態にしておくと、通常は、図１の（ｂ）に示したように、微細藻類の種類に応じて、数秒から数十分で微細藻類は底面に沈む。この状態で、微細藻類をしばらく培養すると、図１の（ｃ）に示した様に、液面上に微細藻類から構成されたバイオフィルムが形成される。なお、通常は図１の（ｃ）に示した様に、培養容器底面にも微細藻類は存在し、図には記載していないが、培養容器側面にも存在している。
本発明では、培養の際に培養容器を静置状態にしておくことが好ましいが、激しく攪拌しない限り、振盪培養を行っても本発明と同様の培養を行うことは可能である。しかし、液面上に形成されるバイオフィルム中の藻体数が多くなることから、静置状態での培養が好ましい。また、微細藻類が培養容器の底面に沈むとは、微細藻類の大部分が底面に沈むことをいい、液面上や液中から完全に微細藻類が存在しなくなる状態を言うものではない。例えば、振盪培養を行うと、静置培養を行った場合と比べて、振盪条件の強弱にも依存するが一例としては、液面浮遊藻体は静置培養の約１／６、培地中の藻体は静置培養の約３．５倍、底面上の藻体は静置培養の約１．４倍となり、振盪培養することにより、液面上に存在する藻体の割合が減り、培地中及び底面上に存在する藻体の割合が増える。
【００１７】
（回収）
この液面上に形成されたバイオフィルムに対して、図１の（ｄ）の様に、第一の基板を接触させ、第一の基板の表面にバイオフィルムを付着させて（図１の（ｅ））回収することができる（以下、“転写による回収”ともいう）。図１では、培養容器の液面全面に対して基板を接触させているが、部分的に接触させても良いし、全面若しくは部分的な接触を複数回繰り返しても良い。この様に、複数回接触させることで、液面上の微細藻類の回収効率が向上する。上記において、第一の基板の表面に、フィルム状の構造物又は三次元状の構造物を重ねるようにして転写することもできる。この中で、１ｍ2未満の培養面積の場合には、一回の転写で、１ｍ2以上の培養面積の場合には複数回の転写で行うことが好ましい。なお、フィルム状の構造物及び三次元状の構造物の詳細は後述する通りである。
【００１８】
以下に、転写による回収について、より詳細に説明する。
まず、第一の基板として、液面上のバイオフィルムを付着させる転写材料を準備する。
ここで第一の基板とは、図１の（ｄ）で使用する液面上の微細藻類から構成されたフィルム状の構造物又は三次元状の構造物を転写し、回収するために使用する基板のことである。第一の基板は、図では培養容器の培地の液面全体を覆う基板が使用されているが、この様に培養容器の培地の液面全体を覆う基板を使用しても良いし、培養容器の培地液面の一部のみを覆うことのできる第一の基板を使用しても良い。
転写材料としては、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリスチレン、塩化ビニル、ポリエステル等が使用可能であるがこれらに限定されるものではない。転写材料は、培養容器の液面面積よりも小さくなるように、必要によりはさみ等で切断できることが好ましい。例えば、培養容器が６穴プレートの場合には、直径約３．５ｃｍの円形状に材料を切断することが好ましい。切断した転写材料は、表面のゴミを除去するために洗浄した後に、第一の基板として使用することが好ましい。なお、採取したバイオフィルムを次の培養に使用する場合には、さらに転写材料を消毒用エタノールに浸漬し、表面を乾燥させた後に第一の基板として使用することが好ましい。
【００１９】
次に、第一の基板を培養容器が形成する液面に対して、平行、もしくは、それに近い角度になるように静かに挿入し、液面上の微細藻類を第一の基板に付着させる。なお、挿入を行う際、第一の基板を液面に対して若干斜めに挿入し、最終的に液面に対して平行にするようにすると、多くの液面のバイオフィルムを少ない転写回数で回収できることから好ましい。液面上のバイオフィルムが付着した第一の基板を静かに引き上げることで、培養容器の液面上からバイオフィルムを第一の基板に転写することができる。第一の基板による液面上のバイオフィルムの転写は、複数回行っても良い。複数回行うことによって、より転写率が向上するからである。
【００２０】
培養の状態によっては、培養容器内の液面上で増殖している微細藻類のバイオフィルムは、フィルム状から、ひだ状に培養培地内で成長することがある。この場合には、ピペットを用いてひだ状になったバイオフィルムを採取することもできる。
【００２１】
次に、転写による回収とは別の回収方法について説明する。
図１の（ｆ）に示したように、液面上のバイオフィルムを第二の基板を用いてかき集めるように回収することも可能である（以下、“堆積による回収”ともいう）。ここで第二の基板とは、図１の（ｆ）で使用する液面上の微細藻類から構成されたフィルム状の構造物若しくは三次元状の構造物を回収するために使用する基板のことである。
図では、図の右側から左側に基板を移動させている。第二の基板の移動方向は、逆（すなわち、図の左側から右側への基板の移動）でも良いし、複数回回収しても良い。複数回回収を行うことによって、回収率が向上するからである。複数回回収する場合には、バイオフィルムを付着させたままの第二の基板を用いても良いし、前述の第一の基板の表面からバイオフィルムを全部もしくは部分的に除去した後の基板を第二の基板として用いても良いし、新しい基板を用いても良い。また、図１では１枚の第二の基板しか記していないが、複数枚の第二の基板を同時に用いても良い。これにより、回収率が向上する。なお、この中で第二の基板の強度が許す限り、一枚の第二の基板を用い、回収したバイオフィルムを除去した後、同一の第二の基板を用いて回収を再開することが、回収装置の設置コストの面等から好ましい。また、第二の基板の大きさ、液面に対する第二の基板の角度や移動速度等は目的に応じて自由に設定することができる。なお、図１の（ｇ）は、第二の基板上にバイオフィルムが回収された状態である。
【００２２】
以下に、第二の基板による回収について、より詳細に説明する。
第二の基板による回収は、図１の（ｆ）から（ｇ）への工程に相当する。また、スライドガラスの他に、ナイロンフィルム等の他の材料も第二の基板として用いることができる。また、第二の基板のサイズは、培養容器のサイズに応じて適宜変更できるが、第二の基板は、培養容器の表面積よりも小さな基板を用いる方が好ましい。これにより、第二の基板を移動している時に、培養容器の内壁に対して不必要な接触を避けることができるとともに、液面上の微細藻類バイオフィルムが、培養容器と第二の基板との間の隙間を通ることによる回収漏れが発生しにくくなるためである。
【００２３】
また、培養の状態によっては、培養容器内の液面上で増殖している微細藻類のバイオフィルムは、フィルム状から、ひだ状に培養培地内で成長することがある。この場合には、第二の基板の液中への挿入深度を深くすることによって、ひだ状になったバイオフィルムを採取することもできる。
【００２４】
液面上のバイオフィルムを回収した後の状態が、図１の（ｈ）である。培養容器の底面には、微細藻類が付着又は沈積している。なお、本発明の模式図では液面上への微細藻類の供給が底面から行われるように記されているが、実際には、液面及び底面以外の培地中にも微細藻類が低濃度ながら存在している。また、液面及び底面から微細藻類が液中へと供給されている状態でも、本発明では、培養容器底面から液面上へと微細藻類が供給されていると記すものとする。また、培養容器底面から液面上への微細藻類の供給とは、実際に底面における微細藻類の増殖を伴わずに液面上に移動する場合と、微細藻類が底面から液面上に移動しながら増殖する場合との両方がある。
【００２５】
なお、本発明では図１の（ｃ）の状態のように、液面上で微細藻類を培養する培養方法を液面浮遊培養と呼ぶものとする。すなわち、微細藻類を液中及び液の底面のいずれか一方のみ、又は、両方のみで培養する培養方法は液面浮遊培養には含まれない。
なお本発明における液面とは、典型的には後述する液体培地の液面であり、通常、液体培地と空気との界面である。
さらに、図１の（ｃ）の状態のような液面浮遊培養を、静置状態にして行うことを、本発明では静置培養による液面浮遊培養と呼ぶものとする。
【００２６】
（脱着）
図１の模式図では、基板を培養容器外へと取り出してから、微細藻類バイオフィルムを脱着しているが、培養容器の中で脱着してもかまわない。
基板上の微細藻類バイオフィルムを脱着する方法としては、基板上から微細藻類を剥がすことのできる方法であればいかなる方法を用いても良いが、水流を加えたり、基板を入れた容器を超音波処理したり、基板を入れた容器の蓋を閉めた後、激しく振ったり、高速振盪処理を行ったり、セルスクレーバーのようなものを用いたりすることで微細藻類バイオフィルムを基板から剥ぎ取ることができる。このうち、基板を傷つけない素材が使用されている治具、例えば、セルスクレーバーのようなものを用いて基板から微細藻類バイオフィルムを剥ぎ取る方法が好ましい。さらに、基板を傾けるだけで、基板上から微細藻類バイオフィルムを剥がすこともできる。本方法は、簡便であることから、最も好ましい方法である。また、基板は、何度でも再利用してもかまわない。
【００２７】
［培地（液体培地）］
本発明に用いることができる培地（液体培地）は、微細藻類を培養でき、かつ後述のように硝酸イオンのリン酸イオンに対するモル濃度比（Ｎ／Ｐ比）が０．７〜４．０  であり、かつ培養容器における培養面積当たりの硝酸イオン量が０．２ｍｏｌ／ｍ2以上である限り、特に限定されない。本発明に用いる培地は、従来の培地において所定の成分を増減することにより、調製することができる。従来の培地として、ＡＦ−６培地、Ａｌｌｅｎ培地、ＢＢＭ培地、Ｃ培地、ＣＡ培地、ＣＡＭ培地、ＣＢ培地、ＣＣ培地、ＣＨＵ培地、ＣＳｉ培地、ＣＴ培地、ＣＹＴ培地、Ｄ培地、ＥＳＭ培地、ｆ／２培地、ＨＵＴ培地、Ｍ−１１培地、ＭＡ培地、ＭＡＦ−６培地、ＭＦ培地、ＭＤＭ培地、ＭＧ培地、ＭＧＭ培地、ＭＫＭ培地、ＭＮＫ培地、ＭＷ培地、Ｐ３５培地、ＵＲＯ培地、ＶＴ培地、ＶＴＡＣ培地、ＶＴＹＴ培地、Ｗ培地、ＷＥＳＭ培地、ＳＷ培地、ＳＯＴ培地等を挙げることができる。このうち淡水性のものはＡＦ−６培地、Ａｌｌｅｎ培地、ＢＢＭ培地、Ｃ培地、ＣＡ培地、ＣＡＭ培地、ＣＢ培地、ＣＣ培地、ＣＨＵ培地、ＣＳｉ培地、ＣＴ培地、ＣＹＴ培地、Ｄ培地、ＨＵＴ培地、Ｍ−１１培地、ＭＡ培地、ＭＡＦ−６培地、ＭＤＭ培地、ＭＧ培地、ＭＧＭ培地、ＭＷ培地、Ｐ３５培地、ＵＲＯ培地、ＶＴ培地、ＶＴＡＣ培地、ＶＴＹＴ培地、Ｗ培地、ＳＷ培地、ＳＯＴ培地である。ＡＶＦＦ００７株を培養する培地としては、Ｃ培地、ＣＳｉ培地、ＣＨＵ培地、及びこれら培地の混合物が好ましい。なお培地は、培養する微細藻類の種類に応じて選択することが好ましい。
【００２８】
培地は、紫外線滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌しても良く、しなくても良い。
【００２９】
培地は、前培養工程と本培養工程で異なる培地を使用しても良い。また、培養工程の途中で異なる培地に変更しても良い。
【００３０】
（硝酸イオンのリン酸イオンに対するモル濃度比（Ｎ／Ｐ比））
本発明においては、硝酸イオンのリン酸イオンに対するモル濃度比が、有用物質の生産性の向上の観点から有効な範囲に設定された培地を用いる。Ｎ／Ｐ比は、式：（培地中の硝酸イオンのモル濃度）／（培地中のリン酸イオンのモル濃度）で求められる。硝酸イオンとは、培地中に含まれるＮＯ3-で表される成分を指す。硝酸イオンは、培地成分のうちの、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム等に由来する。リン酸イオンとは、培地中に含まれるＨ2ＰＯ4ー、ＨＰＯ42-及びＰＯ43-で表される成分を指す。リン酸イオンのモル数は、これらのイオンの総和のモル数を指す。リン酸イオンは、培地成分のうちのリン酸水素二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）、リン酸二水素カリウム（Ｈ2ＫＰＯ4）、リン酸二水素ナトリウム（Ｈ2ＮａＰＯ4）等に由来する。
【００３１】
Ｎ／Ｐ比は、０．７以上であることが好ましい。この値以上であれば、有用物質の生産性の向上率を１．１以上とできるからである。Ｎ／Ｐ比は、１．０以上であることがより好ましい。この値以上であれば、有用物質の生産性の向上率を１．２以上とできるからである。有用物質の生産性の向上率をさらに高めるとの観点からは、Ｎ／Ｐ比は、１．５以上であることがさらに好ましい。Ｎ／Ｐ比の上限値は、Ｎ／Ｐ比の下限値がいずれの場合であっても４．０以下であることが好ましい。この値超える場合には、藻体の増殖が進み、藻体生産性は向上するものの、藻体あたりの有用物質の含有率が下がり、有用物質の生産性としては劣ることになるからである。
【００３２】
（培養面積当たりの硝酸イオン量）
本発明においては、Ｎ／Ｐ比のみならず、培養面積当たりの硝酸イオン量（ｍｏｌ／ｍ2）が、有用物質の生産性の向上の観点から有効な範囲に設定された培地を用いる。培養面積当たりの硝酸イオン量は、式：（培地中の硝酸イオンのモル）／（培養面積）で求められる。培養面積は、培養系における液面の面積であり、液面にバイオフィルムを形成させる本発明の培養においては重要なパラメーターの一つである。
【００３３】
培養面積当たりの硝酸イオン量は、０．２ｍｏｌ／ｍ2以上であることが好ましい。この値以上であれば、有用物質の生産性の向上率を１．１以上とできるからである。培養面積当たりの硝酸イオン量は、０．２６ｍｏｌ／ｍ2以上であることがより好ましい。この値以上であれば、有用物質の生産性の向上率を１．２以上とできるからである。有用物質の生産性の向上率をさらに高めるとの観点からは、培養面積当たりの硝酸イオン量は、０．２８ｍｏｌ／ｍ2以上であることがさらに好ましい。培養面積当たりの硝酸イオン量の上限値は、培養面積当たりの硝酸イオン量の下限値がいずれの場合であっても１．５ｍｏｌ／ｍ2以下であることが好ましく、１．２ｍｏｌ／ｍ2以下であることがより好ましい。この値を超える場合には、藻体の増殖が進み、藻体生産性は向上するものの、藻体あたりの有用物質の含有率が下がり、有用物質の生産性としては劣ることになるからである。
【００３４】
（他の成分）
培地は、炭素源として、微細藻類が資化可能な糖を含んでいてもよい。糖を含む培地を用いることで、光と二酸化炭素を用いた場合と比べて、好適に増殖速度を向上させることが可能な場合がある。また、オイル含有量も高くなる傾向がある。
本発明で用いることのできる微細藻類が資化可能な糖とは、単糖、二糖、三糖もしくは多糖の少なくとも一つを含むものである。単糖としては、公知のいかなるものも用いることができるが、ガラクトース、マンノース、タロース、リボース、キシロース、アラビノース、エリトロース、トレオース、グリセルアルデヒド、フルクトース、キシルロース、エリトルロース等を用いることができる。二糖としては、公知のいかなるものも使用することができるが、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、マルトース、イソマルトース等を用いることができる。また、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖、七炭糖のいずれも用いることができる。多糖としては、デンプン、アミロース、グリコヘゲン、セルロース等を用いることができ、その他、オリゴ糖として、ガラクトオリゴ糖やデオキシリボース、グルクロン酸、グルコサミン、グリセリン、キシリトール等を用いることができる。
培地中の糖の濃度としては、０．１μｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、１ｍｇ／ｍＬ以上が最も好ましい。０．１μｇ／ｍＬ以上であると、微細藻類の増殖速度を好適に向上させることができることから好ましい。また、上限は特に設けないが、好ましくは、溶解度以下、より好ましくは、溶解度の半分以下、さらに好ましくは、溶解度の１／１０濃度である。より具体的には、糖としてグルコースを用いる場合、３０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができ、１０ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、５ｍｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。なお、糖の濃度とは、培養を開始する直前の濃度（初濃度）のことであり、培養中の糖の濃度は、継続的に変化することが多い。
糖としては、単一種の糖を用いても良いし、二種以上の糖を用いても良い。
【００３５】
［培地交換］
本発明においては、培地中のＮ／Ｐ比及び、かつ培養面積当たりの硝酸イオン量を規定することにより、培養操作がより単純になる。培養操作が単純になることには培養途中で培地交換を行わなくてもよいことが含まれる。培地交換を行わないことには、培地の全部又は一部の置換を行わないこと、培地、培地成分及び水からなる群より選択されるいずれも追加せず、また除去しないことが含まれる。通常、培地交換は、培養途中で生成しつつある藻体の成長状態を観察・測定し、その成長状態に応じた培地を、生成しつつある藻体に影響を与えないように配慮しながら行う必要があるが、本発明によれば、そのような配慮を要する操作は要さないという従来技術では達成しえなかったメリットがある。また本発明によれば、好気的な条件から嫌気的な条件への切り替えも要しない。
【００３６】
［有用物質の生産性］
本発明においては、培地中のＮ／Ｐ比及び、かつ培養面積当たりの硝酸イオン量を規定することにより、有用物質の生産性を向上させることができる。有用物質の生産性（ｇ／ｍ2・日）は、  先に求めた藻体生産性（ｇ／ｍ2・日）に藻体重量当たりの有用物質の含有率を乗じることによって求められる。有用物質の生産性の向上率は、目的の培養系における有用物質の生産性の、比較対照となる培養系における有用物質の生産性に対する倍率として計算される。比較対照となる培養系は、目的の培養系とは培地中の硝酸イオン量及びリン酸イオン量が異なるが、それ以外の培養条件が同じである培養系である。それ以外の培養条件とは、培養開始時の藻体量（初期藻体量ということもある。）、培養日数、培養面積、培地の深さ（水深）、及び光量等である。
【００３７】
本発明においては、培地中のＮ／Ｐ比及び、かつ培養面積当たりの硝酸イオン量を規定することにより、培地交換を行わなくても、有用物質の生産性の向上率を従来技術と同程度、すなわち少なくとも１．１倍とすることができる。本発明の好ましい態様においては、有用物質の生産性の向上率を、１．２倍以上とすることができる。このように高い向上率は、硝酸イオン（窒素成分）のみに着目した従来技術の培養条件では達成しえなかった。また本発明のより好ましい態様においては、有用物質の生産性の向上率を、１．３倍以上とすることができ、さらに好ましい態様においては、有用物質の生産性の向上率を１．４倍以上とすることができる。
【００３８】
［微細藻類］
微細藻類とは、人の肉眼では、個々の存在が識別できないような微小な藻類を指す。本発明には、微細藻類として、有用物質生産性であり、かつ液面上においてバイオフィルムを形成する能力を有するものであれば特に制限はない。
【００３９】
本発明に用いられる微細藻類は有用物質生産性であり、特に、医薬品、化粧品、健康食品の中間体や最終生成物、合成化学で使用する原料、炭化水素化合物やトリグリセリド、脂肪酸化合物のようなオイル状物、水素のような気体等を生成する微細藻類が好ましい。微細藻類はまた、液面上での培養及び液面からの回収が良好であること、高い増殖速度を持つこと、高い有用物質含有率を有しうること、少なくとも培養中は臭いが殆どなく、有毒物質の発生も確認されていないこと、のいずれかを満たすことが好ましい。
【００４０】
本発明では、液面上でバイオフィルムが形成可能な微細藻類を用いる。そのような微細藻類は、例えば、藍色植物門、灰色植物門、紅色植物門、緑色植物門、クリプト植物門、ハプト植物門、不等毛植物門、渦鞭毛植物門、ユーグレナ植物門、クロララクニオン植物門等に属する微細藻類であり得る。これらの中でも、緑色植物門に属するものであることが好ましく、緑藻であることがより好ましい。
【００４１】
バイオマスの産生性が高いとの観点からは、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）属、クロロコッカム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．）属、ボツリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）属のいずれかに属するものが好ましい。より好ましい例は、ボツリオコッカス  スデティクス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ）やクロロコッカム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）属に属するものである。具体例として、ボツリオコッカス  スデティクス  ＡＶＦＦ００７株（以下、ＡＶＦＦ００７株と略称する。）やＦＦＧ０３９株をあげることができる。
【００４２】
［ＡＶＦＦ００７株］
ＡＶＦＦ００７株は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２０として、２０１１年（平成２３年）９月２８日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にブタベスト条約の下で、富士フイルム株式会社（日本国東京都港区西麻布２丁目２６番３０号）により、国際寄託されている。なお、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターの業務は、２０１２年（平成２４年）４月１日より、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に引き継がれている。
【００４３】
ＡＶＦＦ００７株は、本発明者らが、日本国京都府の淡水池から単離した淡水微細藻類の新規株である。ＡＶＦＦ００７株は、その１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部を国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のデータに基づき、ＢＬＡＳＴで解析した結果、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＵＴＥＸ２６２９（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ）株に近縁の微細藻類であると同定された（ＵＴＥＸ２６２９株側の１１１８塩基中、ＡＶＦＦ００７株側の１１０９塩基が同一であった。）。ＡＶＦＦ００７株は、Ｃｈａｒａｃｉｏｐｏｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｍａｒｙ  ９／２１  Ｔ−３ｗとも近縁の微細藻類であり、今後、Ｃｈａｒａｃｉｏｐｏｄｉｕｍ属に変更される可能性もある。その場合、ＡＶＦＦ００７株の名称は変更されるものとし、また、Ｃｈａｒａｃｉｏｐｏｄｉｕｍ属以外に変更された場合にも、ＡＶＦＦ００７株の名称は変更されるものとする。
【００４４】
本発明には、ＡＶＦＦ００７株と分類学的に同一の性質を有する株を用いることができる。ＡＶＦＦ００７株の分類学的性質を以下に示す。
【００４５】
ＡＶＦＦ００７株の分類学的性質
１．形態的性質
緑色円形状である。浮遊性であり、液面及び底面で増殖することができる。サイズは４〜３０μｍである（液面上のものは比較的大きく、底面上のものは比較的小さい。）。液面上で増殖し、フィルム状構造体を形成する。増殖に伴って、液面上に気泡を発生し、これらが重なり合って液面上に三次元構造体を形成する。また、オイルを生産する。
２．培養的性質（培養方法）
（１）培地：ＣＳｉＦＦ０４（ＣＳｉ培地を改良したもの。）ＮａＯＨもしくはＨＣｌにてｐＨ  ６．０に調整する。培地は、１２１℃、１０分で滅菌することができる。）
（２）培養温度：好適温度は２３℃であり、３７℃以下であれば培養できる。
（３）培養期間（概ね定常期に達するまでの期間）は、初期使用藻体量によるが、２週間〜１ヶ月である。通常、１×１０5個／ｍＬで培養することができる。
（４）培養方法：好気培養、静置培養が適する。
（５）光要求性：要。光強度：４０００〜１５０００ルクス、明暗周期：明期時間１２時間／暗期時間１２時間。継代培養の際は、４０００ルクスで培養することができる。
【００４６】
なお、ＡＶＦＦ００７株は、上記の培養的性質（培養方法）にしたがった継代培養により、保管することができる。植え継ぎは、液面上に浮いている微細藻類を採取し、ピペッティング等の分散を行った後、新しい培地に分散させることにより、行うことができる。なお、継代直後は、培養容器底面に沈んでいるが、１週間程度で液面上にバイオフィルムを形成し始める。継代直後から液面上に存在させても、増殖することができる。植え継ぎ間隔は、約１ヶ月である。なお黄色味を帯びてきたら、継代する。
【００４７】
ＡＶＦＦ００７株と分類学的に同一の性質を有する株には、微細藻類であって、その１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が、前掲特許文献３の配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９５．０％、好ましくは９８．０％、より好ましくは９９．０％、さらに好ましくは９９．５％、最も好ましくは９９．９％の配列同一性を有するものが含まれる。
【００４８】
本発明で塩基配列について配列同一性というときは、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、整列した領域内の２つの配列間で共有する一致した塩基の数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した塩基の数／塩基の全数）×１００で算出でき、市販もしくは一般に公開されているアルゴリズムを用いて計算することができる。塩基配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズム又はプログラムにより行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者にはよく知られている。
【００４９】
［ＦＦＧ０３９株］
本明細書の実施例で使用した微細藻類、ＦＦＧ０３９株は、本発明者らが日本国奈良県において採取したものである。ＡＶＦＦ００７株に比較して、増殖性が良く、オイル生産性に優れる。また、バイオフィルムの構造が壊れにくく、回収が容易であるという特徴を有する。
【００５０】
ＦＦＧ０３９株は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２６２として、２０１４年（平成２６年）２月６日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）にブタベスト条約の下で、富士フイルム株式会社（日本国東京都港区西麻布２丁目２６番３０号）により、国際寄託されている。
【００５１】
本発明には、ＦＦＧ０３９株と分類学的に同一の性質を有する株を用いることができる。ＦＦＧ０３９株の分類学的性質を以下に示す。
【００５２】
ＦＦＧ０３９株の分類学的性質
１．形態的性質
円状である。静置培養を行うと、液面上にフィルム状の構造物を形成する。オイルを生産する。
２．培養的性質（培養方法）
（１）培地：ＣＳｉＦＦ０４培地又はＣＳｉ改良培地（Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ  １５０  ｍｇ／Ｌ、ＫＮＯ3  １００  ｍｇ／Ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4  ２８．４  ｍｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4  ２２．２  ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ４０  ｍｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ  ５８８  ｕｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ  １０８  ｕｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ６６  ｕｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ  １２  ｕｇ／Ｌ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ  ７．５  ｕｇ／Ｌ、Ｎａ2ＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ  ３  ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  ０．１  ｕｇ／Ｌ、Ｂｉｏｔｉｎ  ０．１  ｕｇ／Ｌ、チアミン・ＨＣｌ  １０  ｕｇ／Ｌ、ｐＨ  ７．０）
（２）培養温度：１５〜２５℃で培養できる。
（３）培養期間：２〜４週間
（４）培養方法：静置培養が適する。
（５）光要求性：要。光強度：４０００〜１５０００ルクス、明暗周期：明期時間１２時間／暗期時間１２時間。
ＦＦＧ０３９株と分類学的に同一の性質を有する微細藻類には、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．属に属する微細藻類であって、その１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が、前掲特許文献３の配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９９．９４％の配列同一性を有するものが含まれる。
【００５３】
微細藻類を入手する方法には、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、自然界より採取する方法、市販品を用いる方法、保存機関や寄託機関から入手する方法等があげられる。なお、本発明には、一種類の微細藻類を用いてもよく、複数の種類の微細藻類を用いてもよい。また、純化工程を経た微細藻類を用いてもよい。純化工程とは、微細藻類を単一の種類にする目的で行う工程であり、必ずしも完全に単独の微細藻類のみにすることをいうものではない。
【００５４】
［微細藻類の存在状態］
本発明においては、有用物質生産性であり、かつ液面上にバイオフィルムを形成可能な微細藻類であって、培養容器内の培地中で培養した際に、下記（１）〜（８）からなる群より選択される少なくとも一つの特徴を有する、微細藻類を用いてもよい。このような微細藻類を用いることにより、培地置換、バイオフィルムの回収、培養の再開等の操作がより容易となり、より低コストである本発明の実施が期待できる。
（１）液面上及び液面下１ｃｍから液面までの領域に存在する微細藻類の藻体量と培養容器の底面上の微細藻類の藻体量との合計が、培養容器内のそれ以外の領域に存在する藻体量の１０倍以上、好ましくは２０倍以上、より好ましくは３０倍以上である。ここでいう培養容器内のそれ以外の領域とは、液面上と液面近傍、すなわち液面下１ｃｍから液面までの領域、及び底面を除いた領域を指す。培養容器の側面、及び培養をモニターするセンサー等の培養容器内に設置する各種構造物の表面に微細藻類が付着することがあるが、そのような微細藻類はどちらの領域にも含めなくてよい。藻体量は、培養容器の底面積当たりの藻体重量として表すことができる。
（２）液面上の微細藻類の比重が、培養容器の底面上の微細藻類の比重より小さい。微細藻類の比重は、公知の方法、例えば濃度勾配法により求めることができる。底面上の微細藻類の比重を１としたときの液面上の微細藻類の比重は、微細藻類の種類にも拠るが、例えば０．９９以下であり、好ましくは０．９８以下であり、より好ましくは０．９６以下である。下限値には特に制限はないが、上限値がいずれの場合であっても例えば０．７５以上であり、好ましくは０．７７以上であり、より好ましくは０．７９以上である。
（３）液面上の微細藻類の比重が、水の比重より大きい。
（４）液面上の微細藻類のオイル含有量が、底面上の微細藻類のオイル含有量より高い。底面上の微細藻類のオイル含有量を１としたときに、液面上の微細藻類のオイル含有量は、例えば１．１以上であり、好ましくは１．２以上であり、より好ましくは１．３以上である。上限値には特に制限はないが、下限値がいずれの場合であっても、例えば３．０以下であり、好ましくは２．５以下であり、より好ましくは２．０以下である。
（５）液面上の微細藻類のサイズ（直径）が、底面上の微細藻類のサイズより大きい。微細藻類のサイズは、公知の方法により求めることができる。底面上の微細藻類のサイズを１としたときに、液面上の微細藻類のサイズは、例えば１．５以上であり、好ましくは１．８以上であり、より好ましくは２．０以上である。上限値には特に制限はないが、下限値がいずれの場合であっても、例えば４．０以下であり、好ましくは３．５以下であり、より好ましくは３．０以下である。
（６）形成されるバイオフィルムが、フィルム状の外側の層と複数の泡沫状の構造物を有する内側の層とを含み、外側の層が内側の層より厚い。層の厚みは、公知の方法により求めることができる。内側の層の厚みを１としたときに、外側の層の厚みは、例えば２．０以上であり、好ましくは３．０以上であり、より好ましくは５．０以上である。上限値には特に制限はないが、下限値がいずれの場合であっても、例えば１８．０以下であり、好ましくは１４．０以下であり、より好ましくは１０．０以下である。形成されるバイオフィルムはまた、外側の層だけの場合もある。従って、形成されるバイオフィルムが、フィルム状の外側の層と複数の泡沫状の構造物を有する内側の層とのいずれか一方を有することも、本発明の微細藻類が有する特徴の一つということができる。
（７）形成されるバイオフィルムの一部が培地中でひだ状の構造をとる。
（８）形成されたバイオフィルムを回収し、懸濁処理することにより得られた微細藻類を培地の液面上に播種した場合、培地中に沈降しうる。通常、液面上に形成されたバイオフィルムは、回収後、懸濁処理せずにそのまま液面上に注意深くアプライすることにより、液面に浮かせることができる。しかしながら、懸濁処理することにより、液面に浮きにくくなり、沈降することが多くなる。
なお、本発明でいう液面上にバイオフィルムを形成可能な微細藻類であって、培養容器内の培地中で培養した際に、上記（１）〜（８）からなる群より選択される少なくとも一つの特徴を有する微細藻類とは、上記（１）〜（８）からなる群より選択される少なくとも一つの特徴によって他の藻類の集合と区別することができ、かつ、その少なくとも一つの特徴を保持しつつ繁殖させることができる微細藻類の集合をいう。上記の（３）（４）（５）に関しては、対象となる微細藻類の平均の比重、オイル含有量又はサイズを求めて判断することができる。
【００５５】
［バイオフィルム］
一般に見られるバイオフィルムは、微生物が岩等の固体の表面に付着して形成される薄膜状（略二次元構造）であるが、本発明において微細藻類により形成されるバイオフィルムは、一般のバイオフィルムとは異なり、固体の表面に付着して存在することを要さず、液面のような流動性のある表面にフィルム状の構造を維持したまま存在することができる。また微細藻類により形成されるフィルム状の構造は、ある程度の厚みのある三次元構造を有する場合がある。
【００５６】
より具体的には、本発明における微細藻類から形成されるバイオフィルムは、培養過程で発生する気体（光合成の結果として生じる酸素等）が透過できない程度のガスバリア性を有することがあり、発生した気体を気泡として内部に保持できる。気泡サイズはｍｍスケールであり、目視で確認できる。また本発明における微細藻類から形成されるバイオフィルムは、ある程度の強度を有し、上述のように発生した期待によって破られずに気泡を保持できるほか、弱い水流の動き程度では微細藻類同士がばらばらになり難い。バイオフィルムの面積は、ｃｍ2スケール以上になり得、単なるコロニーとは異なる。
【００５７】
また本発明における微細藻類から形成されるバイオフィルムは、培養の進行によって、シワ状の構造物やカーテン状の構造物を形成することがある。このような構造体の形成は、培養容器という限られた液面一杯にバイオフィルムが形成された後も微細藻類の増殖が進行することにより、バイオフィルムが湾曲しつつ成長することを示している。
【００５８】
［静置培養］
本発明での本培養工程では、静置培養を行うことが好ましい。静置培養とは、培養中に意図的に培地を撹拌も振盪もしない培養法のことである。
【００５９】
［液面浮遊培養］
液面上で微細藻類を培養する培養方法のことを液面浮遊培養という。なお、培養容器底面、側面、その他表面上や培地中等に微細藻類が同時に存在していても、主たる目的が液面上での培養である場合には、液面浮遊培養という。また液面上にはバイオフィルムとともに泡沫がたくさん存在し、液面がどの位置か必ずしも明確でない場合があり、またバイオフィルムが自重によって液面下に多少沈んでいる場合があるが、本発明で液面上というときは、完全な液面のみならず、このような場合も含む。ただし、微細藻類を液中、培養容器の底面のいずれか一方のみ、又は、両方のみで培養する培養方法は液面浮遊培養には含まれない。
【００６０】
なお本発明における液面とは、典型的には後述する液体培地の液面であり、通常、液体培地と空気との界面である。また、水が主成分となる場合は、水面のことである。また、本発明での液面浮遊培養を行っていると、液面上バイオフィルムからひだ状の構造体が液中へと侵入する現象が見られることがある。本発明では、この様な状況での培養も液面浮遊培養に含むものとしている。
【００６１】
［前培養工程］
本発明の培養を行う前に、前培養工程を実施してもよい。前培養工程とは、保存用微細藻類を増殖させ、本培養を行えるまで微細藻類の数を増やす工程のことである。前培養工程の培養法は、公知のいかなる培養方法でも選択可能である。例えば、分散培養法や付着培養法、本発明者らにより開発された液面浮遊培養や本発明の培養法等を行うことも可能である。また、本培養が行える規模まで微細藻類を増殖させるために、前培養を数回行っても良い。また、前培養工程では、目的に応じて静置培養を行っても良いし、振盪培養等の非静置培養を行っても良い。
また、一般的には、１ｃｍ2〜１ｍ2以下の表面積を持つ培養容器を使用し、屋内外いずれでも培養可能である。
【００６２】
［本培養工程］
本培養工程とは、前培養工程を行った後の、有用物質生産を目的とする培養工程をいう。本培養工程は、液面上にバイオフィルムが十分な量形成されたときに終了することができる。本培養工程は、例えば、数日〜数週間で、より特定すると、５日〜４週間で終了することができる。また、本培養工程は、複数回行っても良いものとする。
【００６３】
また、本培養工程は、一般的には、１００ｃｍ2以上の表面積を持つ培養容器（屋外で更に大規模で行う場合は培養容器のことを培養槽と呼ぶこともある）を使用して比較的大規模に行うことができ、屋内外いずれでも実施可能である。
【００６４】
［種藻］
本発明での種藻とは、前培養工程や本培養工程の開始時に使用する微細藻類のことを指し、前培養工程や本培養工程における微細藻類の培養の元となる微細藻類のことをいう。
また、液面に微細藻類バイオフィルムを浮かせた状態や底面に微細藻類が存在している状態で培養を開始することもでき、それらの場合にも、これらの微細藻類を種藻として利用することができる。さらに、底面や培養容器のその他の場所、培養を構成するその他の治具等に付着存在している微細藻類も、種藻として利用することができる。
また、回収工程の後に、液面上に残存している微細藻類を種藻として用いて、培養を再開することもできる。
【００６５】
［懸濁処理］
本発明では、懸濁処理した微細藻類試料を種藻として用いても良い。懸濁処理を行うことで、溶液中の微細藻類が均一化し、培養後の膜厚が均一化する結果、培養面積あたりの微細藻類量が増加する場合があるからである。懸濁処理としては、公知のいかなる方法でも用いることができるが、ピペッティングや容器内に入れた微細藻類溶液を手で振る処理、スターラーチップや攪拌棒による処理等の弱い処理、超音波処理や高速振盪処理等の強い処理、細胞間マトリックスのような接着物質を分解する酵素等の物質を用いる方法等をあげることができる。
【００６６】
［培養容器］
本発明に用いることのできる培養容器（培養槽）の形状は、培地を保持できる限り、公知のいかなる形状でも用いることができる。例えば、円柱状、方形状、球状、板状、チューブ状、プラスチックバッグ等の不定形状のものを使用することができる。また、オープンポンド（開放池）型、レースウェイ型、チューブ型（Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ９２，  １１３，  ２００１）等様々な公知の方式を用いることができる。培養容器として使用することの可能な形状は、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７０  （１９９９）  ３１３−３２１，  Ｅｎｇ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ９，  １６５−１７７  （２００９）．  に記載の培養容器をあげることができる。これらの中で、オープンポンド型もしくはレースウェイ型を用いることが、コスト面からは好ましい。
【００６７】
本発明で使用可能な培養容器は、開放型、閉鎖型のいずれでも使用することができるが、大気中よりも高い二酸化炭素濃度を使用した際の、培養容器外への二酸化炭素の拡散を防ぐために、閉鎖型の培養容器を用いる方が好ましい。閉鎖型の培養容器を用いることで、培養目的外微生物やゴミの混入防止、培地の蒸発抑制、風によるバイオフィルム構造体への影響等を最小限にすることができる。しかし、商業生産を行う場合には、建設コストが安価である等の観点から、開放系での培養が好ましい。またこれらの外部影響の低減と建設コストの安価化を両立させるために、完全に閉鎖をしないものの培地液面に形成されるバイオフィルムを風雨等の外部からの影響から保護する目的で少なくとも培地液面の一部の鉛直方向にカバーを設けることがより好ましい。
【００６８】
［基板］
本発明での基板とは、図１の（ｄ）や（ｆ）で使用される固体状物のことである。基板の形状は、フィルム状、板状、繊維状、多孔質状、凸状、波状等いかなる形状のものでも良いが、転写のしやすさ、及び基板からの微細藻類の回収のしやすさから、フィルム状又は板状であることが好ましい。
［素材］
本発明で使用可能な培養容器及び基板の素材は、特に限定することはなく、公知のものを使用することができる。例えば、有機高分子化合物や無機化合物、金属、それらの複合体から構成された素材を使用することができる。また、それらの混合物を用いることも可能である。
【００６９】
有機高分子化合物としては、ポリエチレン誘導体、ポリ塩化ビニル誘導体、ポリエステル誘導体、ポリアミド誘導体、ポリスチレン誘導体、ポリプロピレン誘導体、ポリアクリル誘導体、ポリエチレンテレフタレート誘導体、ポリブチレンテレフタレート誘導体、ナイロン誘導体、ポリエチレンナフタレート誘導体、ポリカーボネート誘導体、ポリ塩化ビニリデン誘導体、ポリアクリロニトリル誘導体、ポリビニルアルコール誘導体、ポリエーテルスルホン誘導体、ポリアリレート誘導体、アリルジグリコールカーボネート誘導体、エチレン−酢酸ビニル共重合体誘導体、フッ素樹脂誘導体、ポリ乳酸誘導体、アクリル樹脂誘導体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体等を用いることができる。
【００７０】
無機化合物としては、ガラス、セラミックス、コンクリート等を用いることができる。
【００７１】
金属化合物としては、鉄、アルミニウム、銅やステンレス等の合金を用いることができる。
【００７２】
上記の中でも、基板や培養容器の素材の一部は、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリスチレン、塩化ビニル、ポリエステルの中から選ばれる少なくとも一つから構成されていることが好ましい。
【００７３】
また、培養容器、基板、貫通状構造体の素材が同一であっても良く、異なっていても良い。
【００７４】
また、閉鎖型の培養容器を用いる場合には、受光面の少なくとも一部は、光の少なくとも一部が透過する素材であることが好ましく、透明材料であることがより好ましい。
【００７５】
［二酸化炭素］
多くの微細藻類の培養には、二酸化炭素の供給が必要である。
【００７６】
前培養工程で分散培養を行った場合には、従来法のようにバブリングによって二酸化炭素を培地中に供給しても良いが、液面浮遊培養を行った場合には、二酸化炭素を気相中から供給した方が好ましい。これは、培地中に二酸化炭素をバブリング等の方法で供給すると液面上の微細藻類バイオフィルムの構造が破壊され、藻体量の斑が発生し、回収工程で基板上へのバイオフィルム回収効率が悪く、回収藻体量が減少する可能性があるからである。
【００７７】
本発明では、大気中の二酸化炭素の利用も可能であるが、大気濃度よりも高濃度の二酸化炭素を利用することもできる。この場合には、拡散による二酸化炭素の損失を防ぐために、閉鎖型の培養容器又は農業用フィルム等の被覆物で覆った培養容器中で培養することが好ましい。この場合の二酸化炭素の濃度は本発明の効果が達成できる限り特に限定しないが、好ましくは大気濃度以上、２０体積％未満であり、好ましくは０．０１〜１５体積％であり、より好ましくは０．１〜１０体積％である。また、二酸化炭素は、燃焼装置によって排出された二酸化炭素であってもよい。また、試薬によって二酸化炭素を発生させてもよい。
【００７８】
［光源及び光量］
本発明で用いることのできる光源は、公知のいかなる光源も用いることができるが、太陽光、ＬＥＤ光、蛍光燈、白熱球、キセノンランプ光、ハロゲンランプ等を用いることができ、この中でも、自然エネルギーである太陽光、発光効率の良いＬＥＤ、簡便に使用することのできる蛍光燈を用いることが好ましい。
【００７９】
光量は、１０００ルクス以上３０万ルクス以下であることが好ましく、２０００ルクス以上１５万ルクス以下がさらに好ましい。最も好ましい光量は、１００００ルクス以上１０万ルクス以下である。光量が２０００ルクス以上であると、微細藻類の培養が十分な速度で可能であり、１５万ルクス以下であると、光障害による培養への悪影響が少ない。
【００８０】
光は、連続照射、ある一定の時間間隔で照射と非照射を繰り返す方法のいずれでもかまわないが、屋外での太陽光での培養に準じて、例えば１日間の内の１２時間間隔で光をＯＮ、ＯＦＦすることが好ましい。
【００８１】
光の波長は、光合成が行える波長であれば、どの様な波長でも用いることができ、その制限を設けないが、好ましい波長は、太陽光もしくは太陽光に類似の波長である。単一の波長を照射することで光合成生物の育成速度が向上する例も報告されており、本発明でもこの様な照射方法を用いることもできる。
［その他の培養条件］
本発明では、前培養工程や本培養工程で使用する液体培地（以下、液体培地のことを培地ともいう）のｐＨは、１〜１３の範囲内であることが好ましく、３〜１１の範囲内であることがより好ましく、５〜９の範囲内であることがさらに好ましく、６〜８の範囲内であることが最も好ましい。
【００８２】
また、微細藻類の種類に応じて、好適なｐＨは変化することから、微細藻類の種類に応じたｐＨを選択することが好ましい。なお、液体培地のｐＨとは、培養開始時のｐＨのことである。また、培養工程内のｐＨとは、培養に伴って変化する場合があることから、培養工程内でｐＨは変化しても良い。
【００８３】
本発明では、培地中のｐＨを一定に保つ緩衝作用を持った物質を培地中に添加することができる。これにより、微細藻類の培養の進行とともに培地中のｐＨが変化する問題を抑制することや、培地中への二酸化炭素の供給でｐＨが変化する現象を抑制できる場合がある。緩衝作用を持った物質としては、公知の物質を使用することができ、その使用には制限がないが、４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）や、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液等を好適に用いることができる。これら、緩衝物質の濃度や種類は、微細藻類の種類や培養環境に応じて決めることができる。
【００８４】
分散培養を行う場合、液体培地の水深が深いと、光が届かず、攪拌効率が悪くなる問題があり、限度があった。しかし、液面浮遊培養の場合には、液面上に高密度に微細藻類が増殖していることから、培養容器深部に対して光を供給する必要がなく、基本的には攪拌も行わないことから、その水深は、浅くすることができる。これにより、水の使用量が少なく、ハンドリング効率が良くなることから、水深を浅くすることは好ましい。水深は０．４ｃｍ以上が好ましく、１ｃｍ〜１０ｍがより好ましく、２ｃｍ〜１ｍがさらに好ましく、４ｃｍ〜３０ｃｍが最も好ましい。水深が０．４ｃｍ以上であるとバイオフィルムの形成が可能となり、水深が１０ｍ以下であると、ハンドリングが容易である。水深が４ｃｍ〜３０ｃｍであると、水分の蒸発による影響が最小限であり、培地や微細藻類を含む溶液のハンドリングが容易である。
【００８５】
培養温度は、微細藻類の種類に応じて選択することができ、特に限定はしないが、０℃以上９０℃以下であることが好ましく、１５℃以上５０℃以下がより好ましく、２０℃以上４０℃未満が最も好ましい。培養温度が２０℃以上４０℃未満であると、微細藻類を好適に増殖させることができる。
【００８６】
培養開始時に使用する微細藻類量は、細胞数としては培養範囲内において１個あれば、時間をかけさえすれば増殖は可能であるため、その制限は特に設けないが、好ましくは１個／ｃｍ3以上であり、より好ましくは１０００個／ｃｍ3以上であり、さらに好ましくは１×１０4個／ｃｍ3以上である。あるいは単位面積当たりの微細藻類重量で使用量を規定することもできる。この場合も時間をかけさえすれば増殖は可能であるため、同様に特に制限はないが、生産性の観点から好ましくは０．０５ｇ／ｍ2以上であり、より好ましくは０．１ｇ／ｍ2以上であり、さらに好ましくは１ｇ／ｍ2以上である。
【００８７】
本発明での前培養期間、本培養期間は、微細藻類の種類に応じて選択することができ、特に限定はしないが、１日以上１００日以下が好ましく、３日以上５０日以下がより好ましく、７日以上３１日以下がさらに好ましい。
【００８８】
［液面上に形成された微細藻類バイオフィルムの大きさと増殖速度］
微細藻類バイオフィルムの大きさは０．１ｃｍ2以上であることが好ましく、１ｃｍ2以上がより好ましく、１０ｃｍ2以上がさらに好ましく、培養容器の液面面積と等しいことが最も好ましい。０．１ｃｍ2以上であれば、培養開始時の微細藻類量に対する培養終了時の微細藻類量との比を短時間で大きくすることができることから好ましい。
また、微細藻類バイオフィルムは、培養領域内で複数個存在していても良い。
微細藻類バイオフィルムの厚さは、１μｍ〜１００００μｍの範囲であることが好ましく、１μｍ〜１０００μｍの範囲であることがより好ましく、１０μｍ〜１０００μｍの範囲であることが最も好ましい。１０μｍ〜１０００μｍの範囲であると、強度が高く、十分な量のバイオフィルムを収穫することができる。
【００８９】
本発明に係るバイオフィルムが、フィルム状構造体の一部又は複数の部分で気泡状に盛り上がることで形成された立体的な三次元状構造体である場合、培地の液面を基準とした該三次元状構造体の一般的な高さは、０．０１ｍｍ〜１００ｍｍの範囲であることが好ましく、０．１ｍｍ〜２０ｍｍの範囲であることがより好ましく、５ｍｍ〜２０ｍｍの範囲であることが最も好ましい。５ｍｍ〜２０ｍｍの範囲であると、含水率を十分に下げることができ、培養容器の高さを低く抑えることができる。
また本発明にかかる微細藻類は、液面上における増殖速度が大きいことが好ましく、対数増殖期における増殖速度（すなわち、対数増殖期の期間における一日あたりの平均増殖速度）が、乾燥重量で０．１ｇ／ｍ2／日以上であることが好ましく、０．５ｇ／ｍ2／日以上であることがより好ましく、１ｇ／ｍ2／日以上であることがさらに好ましく、３ｇ／ｍ2／日以上であることが最も好ましい。微細藻類の対数増殖期における増殖速度は、乾燥重量で一般的に１０〜３０ｇ／ｍ2／日以下である。
【００９０】
本発明に係るバイオフィルムの単位面積あたりの乾燥藻体重量は、０．０１ｇ／ｍ2以上であることが好ましく、１ｇ／ｍ2以上であることがより好ましく、１０ｇ／ｍ2以上であることが特に好ましい。最も好ましくは、５０ｇ／ｍ2以上である。単位面積あたりの乾燥藻体重量が大きい方が、得られるオイル等のバイオマスの量が大きくなることが見込まれるからである。バイオフィルムの単位面積あたりの乾燥藻体重量は通常２０〜３００ｇ／ｍ2である。
【００９１】
また本発明の微細藻類としては、上記の構造や、上記範囲の面積、厚さ、高さ、増殖速度、単位面積あたりの乾燥藻体重量を有するバイオフィルムを液面上に形成可能な微細藻類であることが、上記と同様の理由で好ましい。
【００９２】
［回収］
液面上の微細藻類バイオフィルムの回収は、培養容器内の液面がバイオフィルムで部分的に覆われている状態で実施することも可能であるが、微細藻類の藻体量が多いことから、培養容器内の液面が全てバイオフィルムで覆われてから実施することが好ましい。また、バイオフィルムが液面を全て覆いつくした後に、しばらく培養を継続してから回収を行っても良い。
【００９３】
特に、液面上に三次元の構造体が形成された後に回収することが好ましい。三次元状構造体は、フィルム状構造体がさらに増殖した時に見られる構造であり、二次元的なフィルム状構造体と比較して、回収可能な微細藻類の量が多いこと、及び含水率がより低いことから好ましい。また、液面上のバイオフィルムのみ回収しても良いし、液面上のバイオフィルム、及び底面上の微細藻類の少なくとも一部の両方を回収しても良い。これは、液面上の微細藻類も底面上の微細藻類もバイオマスとして利用が可能だからである。ただし、一般的には、有用物質としてオイルを考慮すると、液面上の微細藻類の方が底面上の微細藻類よりもオイル含有量は高くなる。従って、底面藻を回収することは可能な限り避けた方が良い。
【００９４】
上述の回収方法は、液面上に形成されたバイオフィルムの７０％以上を回収することが好ましく、より好ましくは８０％以上を回収することであり、さらに好ましくは９０％以上を回収することであり、最も好ましくは１００％回収することである。液面上に形成されたバイオフィルムの回収率は、例えば、目視で確認することができる。
【００９５】
［乾燥藻体］
本発明における乾燥藻体は、本発明によって得られた微細藻類回収物を乾燥させたものである。
当該微細藻類回収物を乾燥させる方法としては、微細藻類回収物中の水分を減らすことができる方法であれば、いかなる公知の方法を用いることができ、特に制限されない。例えば、微細藻類回収物を天日干しにする方法、微細藻類回収物を加熱乾燥させる方法、微細藻類回収物を凍結乾燥（フリーズドライ）する方法、微細藻類回収物に乾燥空気を吹き付ける方法等があげられる。これらのうち、微細藻類回収物に含まれる成分の分解を抑制できる観点から凍結乾燥、短時間で効率的に乾燥できる観点から加熱乾燥又は天日干しする方法が好ましい。
【００９６】
［含水率］
本発明での含水率とは、回収物中に含まれる水分の重量を、回収物の重量で割って、１００を掛けたものである。本発明での微細藻類バイオフィルムの含水率は、９９〜６０％が好ましく、９５〜８０％がさらに好ましく、９０〜８５％が最も好ましい。なお、貫通状構造体を用いて培養した場合には、この限りではない。
分散培養で培養し、遠心分離機を用いて微細藻類を回収した場合の含水率は、一般的に９０％程度とされ、本発明での培養法によって得られた液面上バイオフィルムの含水率は、それよりも低く、従来法と比べて優れている点である。なお、フィルム状構造体よりも三次元状構造体の方が含水率は低い。これは、三次元状構造体の方が液面から離れており、かつ、光源に近く、ある程度の乾燥が進行していることが原因と推定している。
【００９７】
［有用物質］
本発明での有用物質とは、微細藻類由来のバイオマスの一種で、バイオマスから抽出工程、精製工程等の工程を経由することによって得られた産業にとって有益な物質の総称である。この様な物質として、医薬品や化粧品や健康食品等の最終生成物や中間物や原料、化学合成物の原料、中間物や最終生成物、炭化水素化合物、さらにはオイル、アルコール化合物、水素やメタン等のエネルギー代替物質、酵素、タンパク、核酸、糖やＤＨＡ等の脂質化合物、アスタキサンチン等を含む。有用物質は、有用物質蓄積工程によって、微細藻類中に蓄積させることもできる。
【００９８】
［バイオマス及びオイル］
本発明でのバイオマスとは、化石資源を除いた再生可能な生物由来の有機性資源をいい、例えば、生物由来の物質、食料、資材、燃料、資源等をあげることができる。藻類バイオマスには、微細藻類自体（バイオフィルム状であってもよい。）、有用物質を採取した後の微細藻類残滓が含まれる。
本発明でのオイルとは、可燃性の流動性物質のことであり、主として、炭素、水素から構成された化合物のことであり、場合によっては、酸素原子、窒素原子等を含む物質のことである。オイルは、一般的に混合物であり、ヘキサンやアセトン等の低極性溶媒を用いて抽出される物質である。その組成は、炭化水素化合物や脂肪酸、トリグリセリド等から構成される場合や、これらから選ばれる複数種の組成から構成されている場合もある。また、エステル化して、バイオディーゼルとして使用することもできる。
【００９９】
微細藻類回収物中に含まれる有用物質やオイルを採取する方法としては、本発明の効果を損なうものでなければ特に制限されない。
【０１００】
オイルの一般的な抽出方法は、最終回収物を加熱乾燥させて、乾燥藻体を得た後、細胞破砕を行い、有機溶媒を用いてオイルを抽出する。抽出したオイルは、一般的に、クロロフィル等の不純物を含むため精製を行う。精製は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによるもの、蒸留（例えば、特表２０１０−５３９３００に記載の蒸留方法）によるもの等がある。本発明でもこの様な方法を用いることができる。
【０１０１】
また、超音波処理によって微細藻類を破砕したり、プロテアーゼや酵素等によって微細藻類を溶解したりした後、有機溶媒を用いて藻体内のオイルを抽出する方法もある（例えば、特表２０１０−５３０７４１に記載の方法）。本発明でもこの様な方法を用いることができる。
【０１０２】
また本発明に係るバイオフィルムは、バイオマスとしての有用性の観点から、オイル含有量が高いことが好ましい。具体的には、バイオフィルムの乾燥藻体あたりのオイル含有量が５質量％以上であることが好ましく、１０質量％以上であることがより好ましく、１５質量％以上であることが特に好ましい。バイオフィルムの乾燥藻体あたりのオイル含有量は通常８０質量％以下である。
【実施例】
【０１０３】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。【０１０４】
［実施例１］
（第１の前培養）
第１の前培養として、ＰＳ製ケース２８号（アズワン株式会社、４−５６０５−０５）にＣＳｉＦＦ０４培地（組成を下表に示す。本実施例において、以下、単に「培地」という場合がある。）４０ｍＬとクロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）ｓｐ．ＦＦＧ０３９株（ＦＥＲＭＢＰ−２２２６２株）との混合物を入れ（藻体濃度１．２ｍｇ／ｍＬの分散液１ｍL）、１５０００ルクスの蛍光灯照射下（１２時間ごとに光照射ＯＮ−ＯＦＦ）、２３℃、二酸化炭素濃度５％で静置培養を行った。なお、培養温度の制御は、２３℃に設定したエアコンを用いて行った。１４日後、ＰＳ製ケース２８号の短径と同じ長さのナイロンフィルム（厚さ１ｍｍ）を用いて、液面上の微細藻類バイオフィルムを回収した。【０１０５】
（第２の前培養）
第１の前培養で得た微細藻類を用いて、第１の前培養と同様にして、第２の前培養を行った。ただし、培養容器としては、３０ｃｍ×２３ｃｍ×７ｃｍのプラスチック製バットを用い、２８００ｍＬの培地に第一培養で回収した藻の半分量を添加して、第２の培養を行った。１４日後、液面上の微細藻類バイオフィルムを回収し、ＣＳｉＦＦ０４培地が３００ｍｌ入った５００ｍｌプラスチック製容器に移し、プラスチック容器を手で振った後、超音波処理を５分間行い、種藻分散液を得た。この種藻分散液５ｍｌをろ過、乾燥（１３０℃、１時間）して藻体重量を求め、ここから分散液中の種藻濃度（ｍｇ／ｍｌ）を算出した。【０１０６】
（本培養）
前記プラスチック製バットに、２．８ＬのＣＳｉＦＦ０４培地のＮＯ3イオン濃度を１／２倍にした培地（ｂ）（組成を下表に示す。）を水深５ｃｍになるように入れた。藻体量が０．１７ｇ／ｍ2になるように、第２の前培養によって準備した種藻分散液を添加した。１５０００ルクスの蛍光灯照射下（１２時間ごとに光照射ＯＮ−ＯＦＦ）、２３℃、二酸化炭素濃度５％で静置培養を行った。培養日数は３１日とした。なお、本培養の開始時の藻体量（ｇ／ｍ2）を初期藻体量という（以下の実施例、比較例において同じ。）。【０１０７】
【表１】
2017169713.tif 000002
【０１０８】
（バイオフィルムの回収）
図１の工程の第二の基板として容器の大きさに合わせたプラスチック板を用意し、このプラスチック板を培養容器の端からバイオフィルムの下まで挿入し、該プラスチック板を容器の反対側に寄せていくことで形成されたバイオフィルムを第二の基板上に堆積させることで、培地水面に形成されたバイオフィルムを全量すくい取った。このバイオフィルムを定温乾燥機中１３０℃で３時間乾燥させ、その重量を測定することで藻体量（ｇ）を求めた。これの重量を容器面積（ｍ2）及び培養日数で割った値を藻体生産性（ｇ／ｍ2・日）とした。【０１０９】
（含油率・油生産性）
前記回収工程で得られた乾燥藻体約５０ｍｇを精秤し、これを乳鉢、乳棒を用いて５分間かけて十分にすり潰した。これをメタノール（１ｍｌを２回）、クロロホルム（４ｍｌを１回）で洗浄して、これを集め、遠心分離処理を行った。得られた上澄みの溶媒を揮発させ、残存物の重量を精秤し、これと処理前の乾燥藻体重量から含油率（ｇ／ｇ乾燥重量  ｄｒｙ％）を求めた。【０１１０】
先に求めた藻体生産性（ｇ／ｍ2・日）に含油率を乗じることによって、油生産性（ｇ／ｍ2・日）を算出した。【０１１１】
（評価）
油生産性は培養条件によっても変化するため、同一の培養条件（初期藻体量、培養日数、水深、及び光量が同じであることをいう。）の比較例との間で油生産性を比較した。比較例に対して、油生産性が１．１倍未満のものを（Ｅ）、１．１倍以上１．２倍未満のものを（Ｄ）、１．２倍以上１．３倍未満のものを（Ｃ）、１．３倍以上１．４倍未満のものを（Ｂ）、１．４倍以上のものを（Ａ）として評価した。【０１１２】
同一の培養条件の比較例１と比べて、藻体生産性、含油率、及び油生産性において顕著な向上効果が認められた。【０１１３】
［実施例２］
実施例１と同様の第１の前培養、及び第２の前培養を行った。【０１１４】
（本培養）
直径１３．４ｃｍ、高さ２１ｃｍの円柱のプラスチック容器に２．７ＬのＣＳｉＦＦ０４培地のＮＯ3イオン濃度を１／４倍にした培地（ｃ）を入れ（水深２０ｃｍ）、藻体量が４ｇ／ｍ2になるように第２の前培養によって準備した種藻分散液を添加した。２２０００ルクスの蛍光灯照射下（１２時間ごとに光照射ＯＮ−ＯＦＦ）、２３℃、二酸化炭素濃度５％で静置培養を行った。培養日数は１４日とした。これを実施例１と同様の培養・回収・評価を行った。【０１１５】
［実施例３］
実施例２の本培養の培地をＣＳｉＦＦ０４培地のＮＯ3イオン濃度を１／２倍にした培地（ｂ）に変更した以外は、実施例２と同様の培養を行った。【０１１６】
実施例２、実施例３は同一培養条件の比較例６と比べて藻体生産性、含油率、油生産性ともに大きな向上効果が認められた。【０１１７】
［実施例４］
実施例２の本培養において、初期藻体量を２ｇ／ｍ2に変更し、培地としてＣＳｉＦＦ０４培地のＮＯ3イオン濃度を１／４倍に変更し、かつリン酸イオン濃度を１／２倍に変更したものを用い、かつ光量を１９０００ルクスに変更した以外は、実施例２と同様の培養を行った。
同一の培養条件の比較例７〜比較例１０と比べて、藻体生産性、含油率、及び油生産性において向上効果が認められた。【０１１８】
［実施例５］
実施例４の本培養において、初期藻体量を４ｇ／ｍ2に変更し、光量を２００００ルクスに変更し、培養日数を２１日とした以外は、実施例４と同様の培養を行った。【０１１９】
［実施例６］
実施例５の本培養において、培地としてＣＳｉＦＦ０４培地のＮＯ3イオン濃度を０．１１倍に変更したものを用いた以外は、実施例５と同様の培養を行った。【０１２０】
［実施例７］
実施例５の本培養において、培地としてＣＳｉＦＦ０４培地のＮＯ3イオン濃度を１／４倍に変更した培地（ｃ）を用いた以外は、実施例５と同様の培養を行った。【０１２１】
［実施例８］
実施例５の本培養において、培地としてＣＳｉＦＦ０４培地のＮＯ3イオン濃度を１／２倍に変更した培地（ｂ）を用いた以外は、実施例５と同様の培養を行った。【０１２２】
実施例５、７及び８は、同一培養条件の比較例１４、比較例１５と比べて藻体生産性、含油率、油生産性ともに大きな向上効果が認められた。
実施例６は、同一培養条件の比較例１４、比較例１５と比べて、含油率に大きな向上効果が認められた。【０１２３】
［比較例１］
実施例１の本培養の培地を、ＣＳｉＦＦ０４培地（ａ）に変更する以外は実施例１と同様の培養・回収・評価を行った。【０１２４】
［比較例２］
実施例１の本培養において、初期藻体量を４ｇ／ｍ2に変更し、培地をＣＳｉＦＦ０４培地のＮＯ3イオン濃度を０．８５倍にしたものに変更し、光量を１３０００ルクスに変更し、かつ培養日数を１４日に変更する以外は実施例１と同様の培養・回収・評価を行った。【０１２５】
［比較例３］
実施例１の本培養において、初期藻体量を４ｇ／ｍ2に変更し、培地をＣＳｉＦＦ０４培地のＮＯ3イオン濃度を０．８５倍にしたものに変更し、光量を１３０００ルクスに変更し、かつ培養日数を１４日に変更する以外は実施例１と同様の培養・回収・評価を行った。【０１２６】
［比較例４］
実施例２の本培養において、培地をＣＳｉＦＦ０４培地のＮＯ3イオン濃度を０．７倍にしたものに変更し、水深を１５ｃｍに変更し、光量を２００００ルクスに変更する以外は実施例２と同様の培養・回収・評価を行った。【０１２７】
比較例２〜比較例４は何れも類似条件の実施例１、実施例３、実施例４に対して、油生産性が低かった。【０１２８】
［比較例５］
実施例２の本培養において、培地をＣＳｉＦＦ０４培地（ａ）に変更し、水深を１５ｃｍに変更し、光量を２００００ルクスに変更する以外は実施例２と同様の培養・回収・評価を行った。
［比較例６］
実施例２の本培養の培地をＣＳｉＦＦ０４培地（ａ）に変更する以外は、実施例２と同様の培養を行った。【０１２９】
［比較例７］
実施例４において、本培養の培地をＣＳｉＦＦ０４培地のＮＯ3イオン濃度を０．８５倍にしたものに変更する以外は実施例４と同様の培養・回収・評価を行った。【０１３０】
［比較例８］
実施例４において、本培養の培地をＣＳｉＦＦ０４培地のＮＯ3イオン濃度を０．７倍にしたものに変更する以外は実施例４と同様の培養・回収・評価を行った。
［比較例９］
実施例４において、本培養の培地をＣＳｉＦＦ０４培地のＮＯ3イオン濃度を０．４５倍、リン酸イオン濃度を４．５倍にしたものに変更する以外は実施例４と同様の培養・回収・評価を行った。【０１３１】
［比較例１０］
実施例４において、本培養の培地をＣＳｉＦＦ０４培地（ａ）に変更する以外は実施例４と同様の培養・回収・評価を行った。【０１３２】
［比較例１１］
実施例５の本培養において、培地をＣＳｉＦＦ０４培地のＮＯ3イオン濃度を１／８倍にしたものに変更し、かつ培養日数を１４日とする以外は実施例５と同様の培養・回収・評価を行った。
［比較例１２］
実施例５の本培養において、培地をＣＳｉＦＦ０４培地のＮＯ3イオン濃度を１／８倍、リン酸イオン濃度を１／４倍にしたものに変更し、かつ培養日数を１４日とする以外は実施例５と同様の培養・回収・評価を行った。【０１３３】
［比較例１３］
実施例５の本培養において、培地をＣＳｉＦＦ０４培地（ａ）に変更し、かつ培養日数を１４日とする以外は実施例５と同様の培養・回収・評価を行った。【０１３４】
［比較例１４］
実施例５において、本培養の培地をＣＳｉＦＦ０４培地のＮＯ3イオン濃度を０．７倍にしたものに変更する以外は実施例５と同様の培養・回収・評価を行った。【０１３５】
［比較例１５］
実施例５において、本培養の培地をＣＳｉＦＦ０４培地（ａ）に変更する以外は実施例５と同様の培養・回収・評価を行った。【０１３６】
実施例及び比較例の結果を下表及び図２に示した。【０１３７】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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