(57)【要約】  ペントラキシン４の作用を阻害する候補薬物の能力を指標として用いる、肥満関連疾患を治療するための薬物のスクリーニング方法およびペントラキシン４阻害剤を有効成分として含む肥満関連疾患を治療するための医薬組成物が開示される。前記方法によりスクリーニングされた薬物および前記医薬組成物は、肥満関連疾患、特に非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を治療するために有用である。
2017195901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肥満関連疾患を治療するための薬物をスクリーニングする方法であって、ペントラキシン４の作用を阻害する候補薬物の能力を指標として用い、該能力を有する候補薬物を肥満関連疾患を治療するための薬物として特定することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記指標が、ペントラキシン４遺伝子の発現を阻害する能力である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記指標が、ペントラキシン４遺伝子のｍＲＮＡの転写開始を阻害する能力、ペントラキシン４遺伝子のｍＲＮＡを分解する能力、または該ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害する能力である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ペントラキシン４遺伝子の転写調節領域を含んでなるＤＮＡ断片とレポーター遺伝子を含んでなるＤＮＡ断片が作動可能なように連結された核酸分子を用いることを特徴とする、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記指標が、ペントラキシン４タンパク質の機能を阻害する能力である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記指標が、ペントラキシン４タンパク質の細胞外分泌を阻害する能力、神経細胞への移行を阻害する能力またはシグナル伝達機能を阻害する能力である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ペントラキシン４タンパク質に特異的に結合する物質を一次候補物質として選抜する工程を含むことを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
スクリーニングされる薬物が、脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、または肝抗線維化のための薬物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
肥満関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または糖尿病である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ペントラキシン４阻害剤を含んでなる、肥満関連疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項１１】
ペントラキシン４阻害剤が、ペントラキシン４遺伝子の発現を特異的に阻害するＲＮＡiメディエーターである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ペントラキシン４阻害剤が、ペントラキシン４遺伝子の発現を特異的に阻害するＲＮＡiメディエーターを発現するベクターである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ペントラキシン４阻害剤が、ペントラキシン４タンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ペントラキシン４阻害剤が、配列番号４に記載されたペプチドを認識する抗体である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、または肝抗線維化のための、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
肥満関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または糖尿病である、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
療法に使用するための、ペントラキシン４阻害剤。
【請求項１９】
肥満関連疾患の治療において使用するための、ペントラキシン４阻害剤。
【請求項２０】
肥満関連疾患の治療を目的とする薬剤の製造のための、ペントラキシン４阻害剤の使用。
【請求項２１】
治療上有効量のペントラキシン４阻害剤を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、肥満関連疾患を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願２０１６−０９７２３３号（出願日：２０１６年５月１３日）に基づく優先権の主張を伴うものである。この先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、肝分泌型代謝制御因子阻害作用による肥満関連疾患治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
現代社会において、肥満およびこれと併発するメタボリックシンドロームは国民衛生上の一大問題となっている。この症候群においては、動脈硬化のリスクファクターがクラスター化することが本質的に重要な点であり、分子生物学的な病態解明と基礎的知見に立脚する新規治療戦略を構築することが急務である。メタボリックシンドロームの病態を考える上で、インスリン抵抗性の発症メカニズムを理解することが重要であるが、未だその全容は明らかになっていない。【０００４】
本発明者らは、インスリン抵抗性のメカニズムとして、エネルギー代謝において、脂質の同化に比し、糖・炭水化物同化が過少となること、つまり糖/脂質バランスの崩れ（Carbohydrate-lipid imbalance）が重要であることを提唱してきた（非特許文献１）。この代謝制御による糖/脂質調節機構（Carbohydrate-lipid   balance）を明らかにすることで、各代謝臓器の各論的な側面では語ることのできなかった統合的な制御機構が明らかになると考えられる。このような発想のもとに、本発明者らは、飢餓時における肝臓内のグリコーゲン消費に応じて、肝臓迷走神経の神経性代謝情報が生理的な脂肪分解を引き起こすことを明らかにした（非特許文献２）。また、これらの制御機構を規定する肝臓内の代謝基盤として、グリコーゲン消費を感知する未知の“グリコーゲン・センサー”が存在することを明らかにした（非特許文献２）。さらに、この代謝制御性神経回路は、肝臓から迷走神経を介して中枢神経系へ送られ、そこから交感神経遠心路を通じて脂肪組織が刺激されて脂肪分解が生じることを明らかにした（非特許文献２）。【０００５】
しかしながら、この代謝制御性神経回路の存在自体は、既に東北大学の片桐らによって２００６年に世界に先駆けて日本から初めて報告され、注目されていたものの（非特許文献３）、肝からの代謝関連情報がどのようにして神経情報へ翻訳されるのか、このメカニズムは未解決のままであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｄｅ  Ｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌ  ２００４  Ａｐｒ；６（４）：３５１−７
【非特許文献２】Ｉｚｕｍｉｄａ  Ｙ．  Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎ ４：２３１６，２０１３
【非特許文献３】Ｕｎｏ  Ｋ，Ｋａｔａｇｉｒｉ  Ｈ，  ｅｔ．ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ. １６；３１２（５７８０）：１６５６−９，  ２００６
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、肝臓の代謝パターンを神経系共通情報として翻訳するメカニズムの探求を通して、神経系代謝制御に介入しエネルギーホメオシターシスを制御する基盤となるメカニズムの解明に鋭意取り組んだ結果、肝から生合成される分子であるペントラキシン４（Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ４）を阻害することにより、肝細胞内のエネルギー基質として、糖質であるグリコーゲンと比して中性脂肪を優先的に燃焼させると同時に、脂肪組織内の脂肪分解を促進して脂肪量を減少させ、その脂肪組織を褐色脂肪組織化することができ、これらメカニズムの総和として肝臓内のβ酸化亢進と炎症抑制、酸化ストレスの軽減に繋がることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００８】
よって、本発明によれば、肥満関連疾患を治療するための薬物のスクリーニング方法、ならびに肥満関連疾患を治療するための医薬組成物が提供される。
【０００９】
本発明は以下の発明を包含する。
（１）肥満関連疾患を治療するための薬物をスクリーニングする方法であって、ペントラキシン４の作用を阻害する候補薬物の能力を指標として用い、該能力を有する候補薬物を肥満関連疾患を治療するための薬物として特定することを特徴とする、方法。
（２）前記指標が、ペントラキシン４遺伝子の発現を阻害する能力である、（１）に記載の方法。
（３）前記指標が、ペントラキシン４遺伝子のｍＲＮＡの転写開始を阻害する能力、ペントラキシン４遺伝子のｍＲＮＡを分解する能力、または該ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害する能力である、（２）に記載の方法。
（４）ペントラキシン４遺伝子の転写調節領域を含んでなるＤＮＡ断片とレポーター遺伝子を含んでなるＤＮＡ断片が作動可能なように連結された核酸分子を用いることを特徴とする、（２）または（３）に記載の方法。
（５）前記指標が、ペントラキシン４タンパク質の機能を阻害する能力である、（１）に記載の方法。
（６）前記指標が、ペントラキシン４タンパク質の細胞外分泌を阻害する能力、神経細胞への移行を阻害する能力またはシグナル伝達機能を阻害する能力である、（５）に記載の方法。
（７）ペントラキシン４タンパク質に特異的に結合する物質を一次候補物質として選抜する工程を含むことを特徴とする、（５）または（６）に記載の方法。
（８）スクリーニングされる薬物が、脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、または肝抗線維化のための薬物である、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）肥満関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または糖尿病である、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）ペントラキシン４阻害剤を含んでなる、肥満関連疾患を治療するための医薬組成物。
（１１）ペントラキシン４阻害剤が、ペントラキシン４遺伝子の発現を特異的に阻害するＲＮＡiメディエーターである、（１０）に記載の医薬組成物。
（１２）ペントラキシン４阻害剤が、ペントラキシン４遺伝子の発現を特異的に阻害するＲＮＡiメディエーターを発現するベクターである、（１０）に記載の医薬組成物。
（１３）ペントラキシン４阻害剤が、ペントラキシン４タンパク質に特異的に結合する抗体である、（１０）に記載の医薬組成物。
（１４）ペントラキシン４阻害剤が、配列番号４に記載されたペプチドを認識する抗体である、（１０）に記載の医薬組成物。
（１５）前記抗体がモノクローナル抗体である、（１３）または（１４）に記載の医薬組成物。
（１６）脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、または肝抗線維化のための、（１０）〜（１５）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１７）肥満関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または糖尿病である、（１０）〜（１６）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１８）療法に使用するための、ペントラキシン４阻害剤。
（１９）肥満関連疾患の治療において使用するための、ペントラキシン４阻害剤。
（２０）肥満関連疾患の治療を目的とする薬剤の製造のための、ペントラキシン４阻害剤の使用。
（２１）治療上有効量のペントラキシン４阻害剤を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、肥満関連疾患を治療する方法。
【００１０】
本発明によれば、神経系制御による糖/脂質調節機構を人為的に修正することにより、エネルギー代謝制御の適正化を図ることが可能となる。例えば、本発明によれば、脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、または熱産生亢進による基礎代謝の亢進が可能となる。また、本発明によれば、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、または肝抗線維化などの効果を得ることが可能となる。また、本発明によれば、非アルコール性脂肪肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis：ＮＡＳＨ）や糖尿病等の肥満関連疾患に対する新規治療薬を提供することが可能となる。つまり、本発明によれば、代謝制御性神経回路による糖/脂質調節機構に対して人為的に介入することにより、エネルギー代謝制御の適正化を図ることで、肥満を基盤とした中性脂肪蓄積過多により発症する非アルコール性脂肪性肝炎、そして糖尿病などの肥満関連疾患の新規治療薬を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】野生型マウスの肝臓組織ホモジネート懸濁液の外観を示す。懸濁液上清の浮遊物が脂質成分、懸濁液の沈殿物がグリコーゲンなどの糖化物質である。
【図２】野生型マウスの肝臓組織中のグリコーゲンおよびトリグリセリドの含有量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。
【図３】野生型マウスの精巣上脂肪組織の外観を示す。上がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）であり、白色様色調を示す。下がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）であり、赤褐色を示す。スケールバーは５ｍｍである。
【図４】野生型マウスの体重、精巣上脂肪組織の重量、および褐色脂肪組織の重量を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。精巣上脂肪組織の重量の棒グラフ中の縦軸ＷＡＴ（％）は、精巣上脂肪組織の重量（％）を表す。褐色脂肪組織の重量の棒グラフ中の縦軸ＢＡＴ（％）は、褐色脂肪組織の重量（％）を表す。
【図５】高脂肪食肥満モデルマウスの白色脂肪組織中のメッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。
【図６】非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスの精巣上脂肪組織中のメッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。
【図７】糖質および脂質の代謝に関する遺伝子、炎症に関する遺伝子、およびベータ酸化に関連する遺伝子の、野生型マウスの肝臓におけるメッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。縦軸はコントロール群の発現量を１とした場合のＰｔｘ４阻害群の発現量の比を示す。
【図８】野生型マウスの肝臓におけるメッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。
【図９】野生型マウスの血漿中のグルコースおよび脂質含有量を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。
【図１０】野生型マウスの肝臓におけるインスリンシグナル関連タンパク質のウェスタンブロット法による発現量の比較を示す。左側がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、右側がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。
【図１１】レプチン遺伝子欠損モデルマウスの肝臓組織切片のＰＡＳ染色の写真を示す。左側がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、右側がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）であり、上側が拡大４０倍、下側が拡大２００倍の写真である。アスタリスクは中心静脈を示し、横長で右向きに細くなる三角形はその先に脂肪滴が見られることを示す。
【図１２】レプチン遺伝子欠損モデルマウスの肝臓組織中のグリコーゲンおよびトリグリセリドの含有量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。
【図１３】糖質および脂質の代謝に関連する遺伝子、炎症に関連する遺伝子およびベータ酸化に関連する遺伝子の、レプチン遺伝子欠損モデルマウスの肝臓におけるメッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。縦軸はコントロール群の発現量を１とした場合のＰｔｘ４阻害群の発現量の比を示す。
【図１４】酸化ストレスに関連する遺伝子の、レプチン遺伝子欠損モデルマウスの肝臓におけるメッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。縦軸はＳｏｄ２遺伝子の発現量の３６ｂ４遺伝子の発現量に対する比を示す。
【図１５】脂質代謝に関連する遺伝子、炎症に関連する遺伝子、ベータ酸化に関連する遺伝子および酸化ストレスに関連する遺伝子の、高脂肪食肥満モデルマウスの肝臓におけるメッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。酸化ストレスに関連する遺伝子についてのグラフの縦軸は、Ｓｏｄ２遺伝子の発現量の３６ｂ４遺伝子の発現量に対する比を示す。
【図１６】高脂肪食肥満モデルマウスにおける血糖値および血漿インスリン濃度の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。
【図１７】非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスの肝臓組織中のグリコーゲンおよびトリグリセリドの含有量を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。
【図１８】非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスの肝臓組織切片のＨＥ染色の写真を示す。左側がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、右側がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）において、門脈周囲(ＰＶ)に白く抜けた領域の面積の減少(脂肪滴の減少)が認められる。
【図１９】繊維化に関連する遺伝子、酸化ストレスに関連する遺伝子、糖質および脂質の代謝に関連する遺伝子、炎症に関連する遺伝子およびベータ酸化に関連する遺伝子の、非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスの肝臓におけるメッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。酸化ストレスに関連する遺伝子についてのグラフの縦軸は、Ｓｏｄ２遺伝子の発現量の３６ｂ４遺伝子の発現量に対する比を示す。また、繊維化に関連する遺伝子ｃｏｌｌａｇｅｎ３ａについてのグラフの縦軸は、ｃｏｌｌａｇｅｎ３ａ遺伝子の発現量の３６ｂ４遺伝子の発現量に対する比を示す。
【図２０】レプチン遺伝子欠損モデルマウスの体重の変化と経口摂食量の比較を示す。体重の変化のグラフにおいて、横軸はＰｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ−Ｐｔｘ４i）を投与した日を０日とした場合の経過日数を示し、縦軸は０日における体重を１００％とした場合の体重の変化率を示す。体重の変化のグラフにおいて黒丸がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、白三角がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。経口摂食量のグラフにおいて、縦軸はＰｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ−Ｐｔｘ４i）を投与した日から７日経過した際のマウス１匹あたり１日あたりの飼料の経口摂食量（ｇ）である。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。
【図２１】野生型マウスの呼吸代謝ケージ分析の結果を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。
【図２２】レプチン遺伝子欠損モデルマウスの直腸温と肝臓におけるＵＣＰ２遺伝子の発現メッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）である。ＵＣＰ２遺伝子の発現メッセンジャーＲＮＡの発現量のグラフにおいて、縦軸はコントロール群の発現量を１とした場合のＰｔｘ４阻害群の発現量の比を示す。
【図２３】野生型マウスの累積摂餌量の比較を示す。白丸がコントロール群（ウサギＩｇＧ抗体投与）、黒丸が抗ペントラキシン４ウサギＩｇＧポリクローナル抗体投与群である。
【図２４】野生型マウスの精巣上体周囲脂肪細胞重量の比較を示す。白棒がコントロール群（ウサギＩｇＧ抗体投与）、黒棒が抗ペントラキシン４ウサギＩｇＧポリクローナル抗体投与群である。
【発明の具体的説明】
【００１２】
本発明者らは、肝グリコーゲン消費に相関して肝分泌調節される分子を規定する遺伝子としてペントラキシン４（Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ４）を同定するとともに、この新規肝分泌型代謝調節因子が細胞内シグナル伝達および細胞外シグナル伝達に関与し、肝細胞内代謝調節のみならず、脂肪組織における脂肪分解と褐色脂肪化を引き起こすことを見出した。この新規肝分泌型代謝調節因子によるグリコーゲン・センシングメカニズムにより、脂肪分解、エネルギー消費ならびに摂食行動が強力に調節される。よって、ペントラキシン４の機能阻害により、肥満関連疾患の治療が可能となる。
【００１３】
ペントラキシン４は、そのＣ末端側に保存された８アミノ酸からなる共通配列を含むペントラキシンドメインを有することを特徴とする、多機能性タンパク質ペントラキシンスーパーファミリーの一員である。ヒトのペントラキシン４遺伝子の情報は、そのゲノム配列、ｍＲＮＡ配列およびこれによりコードされるアミノ酸配列を含め、ＮＣＢＩデータベースにＧｅｎｅ  ＩＤ：３９０６６７として登録されている。ここに登録されているｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の配列を配列番号２６に、コードされるアミノ酸配列を配列番号２７に示す。本明細書では、ペントラキシン４遺伝子を「Ｐｔｘ４遺伝子」、ペントラキシン４タンパク質を「Ｐｔｘ４タンパク質」と略記する場合がある。
【００１４】
本発明において、肥満関連疾患としては、糖質であるグリコーゲンと比して中性脂肪を優先的に燃焼させることにより治療効果が見込まれる疾患が挙げられ、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および糖尿病が挙げられる。また、本発明において肥満関連疾患の治療には、その疾患の根治のみならず、症状の改善も含まれ、例えば、脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、および熱産生亢進による基礎代謝の亢進が挙げられる。また、他の実施態様によれば、本発明における肥満関連疾患の治療には、脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、および肝抗線維化が挙げられる。
【００１５】
本発明によれば、肥満関連疾患を治療するための薬物をスクリーニングする方法が提供される。この方法では、ペントラキシン４の作用を阻害する候補薬物の能力が指標として用いられ、この能力を有する候補薬物が肥満関連疾患を治療するための薬物として特定される。ここで、ペントラキシン４の作用の阻害は、ペントラキシン４遺伝子の発現の阻害およびペントラキシン４タンパク質の機能の阻害のいずれであってもよい。
【００１６】
本発明の一つの実施態様によれば、上記の薬物は、ペントラキシン４遺伝子の発現を阻害する能力を指標としてスクリーニングされる。このような能力としては、ペントラキシン４遺伝子のｍＲＮＡの転写開始を阻害する能力、ペントラキシン４遺伝子のｍＲＮＡを分解する能力、該ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害する能力などが挙げられる。
【００１７】
本発明の他の実施態様によれば、上記の薬物は、ペントラキシン４タンパク質の機能を阻害する能力を指標としてスクリーニングされる。このような能力としては、ペントラキシン４タンパク質の細胞外分泌を阻害する能力、神経細胞への移行を阻害する能力、シグナル伝達機能を阻害する能力などが挙げられる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法は、薬物選定のために使用する指標に応じて、当業者であれば適切に実施することができる。例えば、肝細胞や、遺伝子導入によりペントラキシン４遺伝子が発現するように操作された細胞など、ヒト体内と同じ環境下でペントラキシン４遺伝子を発現する細胞を用意し、候補薬物の存在下および不在下において発現試験を行い、ペントラキシン４のｍＲＮＡ量またはタンパク質量を比較することにより、候補薬物のペントラキシン４遺伝子発現阻害能を測定することができる。また、同様に、ヒト体内と同じ環境下でペントラキシン４タンパク質が作用するアッセイ系を用意し、候補薬物の存在下および不在下において試験を行い、ペントラキシン４タンパク質の機能（細胞外分泌、神経細胞への移行、シグナル伝達機能など）を比較することにより、候補薬物のペントラキシン４タンパク質機能阻害能を測定することができる。本発明の一つの実施態様によれば、Stromal cell line にリポポリサッカライド（LPS）を投与し、ペントラキシン４の転写促進（Martinez de la Torre Y et al., J. Immunol. 184 (9), 5055-5064. 2010）および／または細胞外分泌が惹起される際に流入する細胞内カルシウムイオン濃度を、カルシウムイオン蛍光標識試薬による蛍光強度の変化として測定する。このアッセイ系を用いて、ペントラキシン４阻害作用をもつ候補薬物を選抜し、肥満関連疾患を治療するための薬物として特定することにより、肥満関連疾患を治療するための薬物をスクリーニングすることができる。
【００１９】
また、ペントラキシン４遺伝子の発現を阻害する能力を指標として、肥満関連疾患を治療するための薬物をスクリーニングするにあたり、たとえば、ペントラキシン４遺伝子の転写調節領域を含んでなるＤＮＡ断片とレポーター遺伝子を含んでなるＤＮＡ断片が作動可能なように連結された核酸分子を用いることが好ましい。ここで、ヒトペントラキシン４遺伝子の転写調節領域の塩基配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ  ＩＤ：３９０６６７に登録された情報より入手することができる。また、マウスヒトペントラキシン４遺伝子の転写調節領域の塩基配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ  ＩＤ：６８５０９に登録された情報より入手することができる。また、レポーター遺伝子としては、該遺伝子の発現産物の検出方法が知られているものであればよく、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子などの発光タンパク質遺伝子、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)遺伝子などの酵素遺伝子、ヒトアザミグリーン(ＨｍＡＧ)蛍光タンパク質遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子および赤色蛍光タンパク質（ＤＳ-ＲＥＤ）遺伝子などの蛍光タンパク質遺伝子などを使用することができる。この中では、発光タンパク質遺伝子を用いることがより好ましく、その中ではルシフェラーゼ遺伝子を用いることがさらにより好ましい。また、「作動可能なように連結」とは、転写調節領域の上流（５’側）又は下流（３’側）に連結された遺伝子が、当該転写調節領域による転写促進作用又は転写抑制作用を受けるように連結されていることを意味する。候補薬剤のペントラキシン４遺伝子の発現を阻害する能力を検出評価するにあたっては、前記核酸分子を導入したイン  ビトロの転写活性評価系、あるいは、前記核酸分子により形質転換された細胞を用いることができる。当該細胞としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、大腸菌などが挙げられるが、好ましくは哺乳動物細胞である。前記核酸分子を導入したイン  ビトロの転写活性評価系、あるいは、前記核酸分子により形質転換された細胞と候補薬剤とを接触させた際に、レポーター遺伝子の発現に基づきペントラキシン４遺伝子の発現を阻害する能力を検出・評価することができる。これらに関連する遺伝子操作、レポーター遺伝子発現の検出および候補薬物のスクリーニングの一般的な手法については、当業者によく知られた手法を用いることができる。
【００２０】
また、候補薬物をペントラキシン４タンパク質の機能を阻害する能力を指標としてスクリーニングするにあたり、ペントラキシン４タンパク質に特異的に結合する物質を一次候補物質として選抜する工程を含むことが好ましい。ここで、ペントラキシン４タンパク質は、固定化されていることがより好ましい。このような選抜工程は当業者に一般に知られたいずれの手法をも用いることができ、たとえば、被験物質が環状ペプチドの場合、TRAP display法（T. Ishizawa,T. Kawakami, P. C. Reid, H. Murakami (2013) J. Am. Chem. Soc. 135, 5433-5440）、あるいは、特開２０１４−１２７３５２、特開２０１３−０４６６３７、ＷＯ２０１４／１１９６００、ＷＯ２０１１／０４９１５７に記載の方法に従って行ってもよい。このような選抜方法で得られた一次候補物質を、本明細書に記載された肥満関連疾患を評価する系に投与して評価することにより、候補薬物をスクリーニングすることができる。
【００２１】
本発明のスクリーニング方法では、小分子、低分子物質、高分子物質、核酸分子、タンパク質、ペプチド（環状ペプチドを含む）など、様々なタイプの物質を候補薬物とすることができる。
【００２２】
さらに、本発明によれば、ペントラキシン４阻害剤を含んでなる、肥満関連疾患を治療するための医薬組成物が提供される。また、本発明によれば、治療上有効な量のペントラキシン４阻害剤を、それを必要とする被検体に投与することを含んでなる、肥満関連疾患を治療または予防する方法が提供される。さらに、本発明によれば、肥満関連疾患を治療するための薬剤の製造における、ペントラキシン４阻害剤の使用が提供される。また、本発明によれば、肥満関連疾患を治療するためのペントラキシン４阻害剤が提供される。ペントラキシン４阻害剤としては、小分子、低分子物質、高分子物質、核酸分子、タンパク質、ペプチド（環状ペプチドを含む）など、様々なタイプの物質を用いることができる。
【００２３】
治療または予防の対象となる被検体は、好ましくは哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物とされる。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様によれば、ペントラキシン４阻害剤は、ペントラキシン４遺伝子の発現を特異的に阻害するＲＮＡiメディエーターとされる。本明細書において、「ＲＮＡiメディエーター」とは、ｓｉＲＮＡそのものだけでなく、標的細胞中にｓｉＲＮＡを導入しうる、より長い二本鎖ＲＮＡ分子をも意味する。ＲＮＡiメディエーターは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって特定遺伝子の発現を阻害することができる、周知のツールである（Elbashir, S.M. et al., Nature 411, 494-498, 2001）。ｓｉＲＮＡは、典型的には、標的遺伝子のｍＲＮＡに特異的な配列に相同な、１９〜２１塩基対のヌクレオチド配列を含んでなる。上記の二本鎖ＲＮＡ分子は、典型的には、ｓｉＲＮＡに相当する二本鎖部分を有するより長いヌクレオチド配列を含んでなる。また、この二本鎖ＲＮＡ分子は、ヘアピン構造を有するものとしてもよい。このようなＲＮＡiメディエーターは、発現を抑制したい遺伝子の配列に基づいて、当業者であれば容易に設計することができる。
【００２５】
さらに、前記ＲＮＡiメディエーターは、細胞中に送達された適切なベクターによって発現させることもできる。従って、ペントラキシン４阻害剤は、ペントラキシン４遺伝子の発現を特異的に阻害するＲＮＡiメディエーターを発現するベクターとしてもよい。このようなベクターは、当技術分野において周知の標準的な手順により、容易に構築することができる（Bass, B.L., Cell 101, 235-238, 2000；Tavernarakis, N. et al., Nat. Genet. 24, 180-183, 2000；Malagon, F. et al., Mol. Gen. Genet. 259, 639-644, 1998；Parrish, S. et al., Mol. Cell 6, 1077-1087, 2000）。
【００２６】
本発明に用いられるペントラキシン４阻害作用をもつＲＮＡiメディエーターの塩基配列の例（ＲＮＡｉ塩基配列１）を以下の表１に示す。
【表１】
2017195901.tif 000003
【００２７】
上述のＲＮＡｉ塩基配列１に示す塩基配列のほか、ペントラキシン４遺伝子の発現阻害作用を有する限りにおいて、この塩基配列は、ヌクレオチド残基の挿入、欠失または置換などの変異を有していてもよい。このような変異の位置は特に制限されるものではない。
また、このような変異の数は特に制限されるものではないが、例えば１〜数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１または２個、さらに好ましくは１個とされる。さらに、この変異は、挿入、欠失および置換のいずれか一つまたは複数の組み合わせであってよいが、好ましくは置換とされる。
【００２８】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、ペントラキシン４阻害剤は、ペントラキシン４タンパク質の全部またはその部分ペプチドを認識する抗体とされる。より好ましくはペントラキシン４タンパク質に特異的に結合する抗体とされる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体とされる。また、この抗体は、ペントラキシン４タンパク質に特異的に結合するとともに、該タンパク質の機能を阻害するものであることが好ましい。
【００２９】
本発明に用いられる抗体を作製するための抗原ペプチドのアミノ酸配列の例を以下の表２に示す（アミノ酸配列１〜３）。アミノ酸配列１は、マウスペントラキシン４タンパク質の２２１〜２３４番目のアミノ酸残基を包含する。アミノ酸配列２は、マウスペントラキシン４タンパク質の４０６〜４１８番目のアミノ酸残基を包含する。アミノ酸配列３は、マウスペントラキシン４タンパク質の４０６〜４１８番目のアミノ酸残基に相当するヒトペントラキシン４タンパク質のアミノ酸残基を包含する。アミノ酸配列２とアミノ酸配列３とは高い相同性をもち、アミノ酸配列２を持つ抗原ペプチドを用いて作成された抗体はヒトペントラキシン４タンパク質と交叉反応を示す可能性が高い。
【表２】
2017195901.tif 000004
【００３０】
上述のアミノ酸配列１〜３に示すアミノ酸配列のほか、ペントラキシン４阻害作用を有する抗体を産生することができる限りにおいて、このアミノ酸配列は、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換などの変異を有していてもよい。このような変異の位置は特に制限されるものではない。また、このような変異の数は特に制限されるものではないが、例えば１〜数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１または２個、さらに好ましくは１個とされる。さらに、この変異は、挿入、欠失および置換のいずれか一つまたは複数の組み合わせであってよいが、好ましくは置換とされ、より好ましくは保存的置換（あるアミノ酸残基を類似の性質を有する他のアミノ酸残基に置換すること）とされる。
【００３１】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、ペントラキシン４阻害剤は小分子とされる。このような小分子は、本発明のスクリーニング方法によって得ることができる。
【００３２】
ペントラキシン４阻害剤は、局所、静脈内、皮下、筋肉内、経口、直腸、粘膜など、適切な経路で投与することができる。また、その治療上の有効量は、症状の重篤度、被検者の年齢、用いられる具体的な薬物の有効性、投与経路、投与の頻度などに従って、医師または獣医によって適宜決定される。一般的には、前記治療上有効量は、一日当たり、約０．００１〜約１０００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは約０．０１〜約１０ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜約１ｍｇ／体重ｋｇである。
【００３３】
ペントラキシン４阻害剤は、肥満関連疾患を治療するためのペントラキシン４阻害剤以外の薬剤と組み合わせて投与することができる。ここで、「組み合わせて投与する」には、（ｉ）ペントラキシン４阻害剤およびのペントラキシン４阻害剤以外の薬剤を同じ製剤に混合して投与する、（ｉｉ）ペントラキシン４阻害剤およびのペントラキシン４阻害剤以外の薬剤を別々の製剤として調製し、同時に投与する、（ｉｉｉ）ペントラキシン４阻害剤およびのペントラキシン４阻害剤以外の薬剤を別々の製剤として調製し、それぞれ別々のタイミングで投与する、のいずれでもよい。投与されるペントラキシン４阻害剤および当該他の薬剤の用法、用量、投与タイミングや投与間隔等は、それぞれ、当業者に知られた技術常識により決定される。
【００３４】
ペントラキシン４阻害剤は、薬学的に許容可能な担体とともに投与することができる。従って、本発明によれば、ペントラキシン４阻害剤および薬学的に許容可能な担体を含んでなる、肥満関連疾患を治療するための医薬組成物が提供される。
【００３５】
薬学的に許容可能な担体、例えば、ベヒクル、賦形剤、希釈剤等は、投与経路、用いられる具体的な薬物の性質などに応じて、当業者により適宜選択される。
【実施例】
【００３６】
以下の例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。【００３７】
実施例Ａ．方法
実施例Ａ（１）動物
オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（週齢７）はＪａｐａｎ  ＣＲＥＡ、三協ラボから購入した。レプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）は、Ｊａｐａｎ  ＣＲＥＡから入手した。マウスはケージに入れて、後に別の温度管理条件を明記する場合を除き常温（２４℃）の温度管理の下、１２時間の明暗サイクルで飼育した。【００３８】
高脂肪食肥満（ＤＩＯ(Diet induced obesity)）モデルマウス、および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウス作出目的を除くすべての実験において、飼料として、２５．６％（ｗｔ／ｗｔ）の蛋白質、３．８％の繊維質、６．９％の灰分、５０．５％炭水化物、４％の脂肪及び、９．２％の水分の組成の標準飼料を使用した。一方で、高脂肪食肥満（ＤＩＯ(Diet induced obesity)モデルマウスを作出するために、オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（週齢７）に、高脂肪飼料（６０％脂肪含有量、ラード使用）を給餌した。また、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウスを作出するために、オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（週齢７）にＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ社より販売されている超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料（ＣＤＡＨＦＤ、Ａ０６０７１３０２）を３週間給餌した。【００３９】
実施例Ａ（２）Ｐｔｘ４ＲＮＡｉアデノウイルスベクターの作製
ペントラキシン４遺伝子の発現を特異的に抑制するＲＮＡiメディエーターを発現するベクターを作製するために、ＨＥＫ２９３細胞株に対するＲＮＡｉ塩基配列１オリゴマー（その塩基配列は表１に記載されている）をエントリーベクターｐＥＮＴＲ／Ｕ６に挿入し、組換体をアデノウイルスベクター ｐＡｄ−ＤＥＳＴおよびＧａｔｅｗａｙ  ＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に混合し、ＤＨ５α大腸菌株に導入し、アデノウイルス組換体ＤＮＡ（ｓｈＰｔｘ４アデノウイルスベクター;ｐＡｄ−Ｐｔｘ４ｉ）を得た。上記で得られたＰｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ−Ｐｔｘ４i）をＨＥＫ２９３細胞株へトランスフェクションに供し増幅し、ＰＤ−１０  ｃｏｌｕｍｎ（ＢＤ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ）を用いて１−５ｘ１０１１ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ （ｐ．ｆ．ｕ．）／ｍｌに濃縮精製した。【００４０】
実施例Ａ（３）Ｐｔｘ４ＲＮＡｉアデノウイルスベクターのマウスへの導入と各組織試料の調製
Ｐｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ−Ｐｔｘ４ｉ）を、２−８ｘ１０８Ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ  （ｐ．ｆ．ｕ．）／ｂｏｄｙの投与量で、マウスに静脈注射した。各タイムポイントでマウスの精巣上脂肪組織と肝を速やかに切除し液体窒素中で凍結した。また組織学的検索試料として、４％ＰＦＡに浸し固定した。【００４１】
実施例Ｂ．解析
実施例Ｂ（１）肝脂肪含有量分析
液体窒素中に保存された０．２ｇの肝臓組織試料を破砕装置で均一にホモジェナイズし、マイクロチューブにて試料を秤量した。このホモジェナイズされた組織試料から２００ｍｇサンプリングし、これに２ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）を添加して、肝含有脂質を４８時間４℃で有機溶媒中に抽出した。その後、得られた抽出液をガラス管中に１００μｌ注入し乾燥させ有機溶媒抽出液中の有機溶媒を自然乾燥させ除去した。ペレットとなった抽出物をイソプロパノールで溶解し、酵素法（ワコーＴＧ測定キット）による脂質測定を行った。反応液の吸光度を測定し、肝臓組織１ｇ当たりの脂質量（ｍｇ）を算出した。【００４２】
実施例Ｂ（２）肝グリコーゲン含有量分析
肝重量に対して５倍量の０．６Ｎ過塩素酸を加え、破砕装置で均一にホモジェナイズし、このホモジェナイズされた組織試料０．１ｇに３０％水酸化カリウム溶液２５０μｌを加え５分煮沸撹拌し氷冷した。その後、２％硫酸化ナトリウム５０μｌと６６％エタノール８００μｌを加え撹拌し、再度６６％エタノールでペレットを洗浄し３ｍｌ蒸留水に懸濁した。アミログルコシダーゼ溶液を加え、５５℃温浴槽で３０分煮沸撹拌した。得られた上清中のグリコーゲンを５７０ｎｍの吸光度によりグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）色素法で測定した。得られた吸光度から、肝臓組織１ｇ当たりのグリコーゲン質量（ｍｇ）を算出した。【００４３】
実施例Ｂ（３）血漿生化学的解析
血漿中解析において、マウスの血漿中のインスリン量はマウス高感度インスリン測定キット（モリナガ）を用いて測定した。マウスの血漿中の血漿中性脂肪量、グルコース量、遊離脂肪酸量は、それぞれワコー  トリグリセリドテストワコー、グルコースＣＩＩテストワコー、ＮＥＦＡ  Ｃ−テストワコー  （Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて測定した。【００４４】
実施例Ｂ（４）組織の遺伝子発現量解析
ＲＮＡ発現量の測定
ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１．５ｍｌ中に肝臓１片を入れ、破砕装置で均一に、即座にホモジナイズした。このホモジナイズ溶液を遠心分離（１５０００r.p.m、５分間）して上清を採取し、０．３ｍｌのクロロホルムを添加し、攪拌後に再度遠心分離を行い（１５０００r.p.m、１５分間）、上層を回収した。得られた上層に０．７５ｍｌのイソプロパノールを加えて遠心分離（１５０００r.p.m、１５分間）を行いｍＲＮＡを沈殿させた。ｍＲＮＡ含有沈殿物を８０％エタノールで２回洗浄し、０．５ｍｌの蒸留水に溶解してｍＲＮＡ量の測定に供した。ｍＲＮＡを一定量に合わせ、逆転写酵素（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ ;Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡと標的遺伝子のプライマーを用いて定量ＲＴ−ＰＣＲ法(ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｄｙｅ; Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ)で遺伝子発現量を測定した。遺伝子発現量の測定のために使用した標的遺伝子とプライマーデザインは以下に示す（表３および表４）。【００４５】
【表３】
2017195901.tif 000005
【００４６】
【表４】
2017195901.tif 000006
【００４７】
実施例Ｂ（５）肝臓組織のＰＡＳ染色
４％ＰＦＡ固定肝組織を脱パラフィン処理し、１％過ヨウ素酸水溶液にて１０％反応させ、流水で５分洗浄した。シッフ試薬にて１０分反応させ、次いで０．５％重亜硫酸水溶液にて反応させた後、流水で洗浄５分した。マイヤー・ヘマトキシリン液にて核染色して再度流水で洗浄し、９５％アルコール、次いで１００％アルコールにより脱水して透徹・封入した。【００４８】
実施例Ｂ（６）肝臓組織のＨＥ染色
４％ＰＦＡ固定肝組織を脱パラフィン処理し、ヘマトキシリン液の入った染色瓶に浸漬し、１〜５分反応させた。その後５分間流水で水洗した後、エオジン溶液と５〜１０分間反応させ、水でリンスした。その後、９０％エタノール、次いで９５％エタノール、次いで無水エタノールに浸漬し、脱水し、キシレンに浸漬した後、封入した。【００４９】
実施例Ｂ（７）ウェスタンブロッティング
インスリンシグナルタンパク質（ｐ−ＩＲ、p−Ａｋｔ、ｐ−Ｓ６Ｋ、ｐ−ＧＳ、ｐ−Ｆｏｘｏ）の１次抗体として、それぞれＣｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒβ（Ｔｙｒ１３６１）（８４Ｂ２）Ｒａｂｂｉｔ  ｍＡｂ＃３０２３、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）Ａｎｔｉｂｏｄｙ＃９２７１、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ７０Ｓ６Ｋｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ３８９）Ａｎｔｉｂｏｄｙ＃９２０５、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＧｌｙｃｏｇｅｎＳｙｎｔｈａｓｅ（Ｓｅｒ６４１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ＃３８９１、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＦｏｘＯ１（Ｔｈｒ２４）／ＦｏｘＯ３ａ（Ｔｈｒ３２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ＃９４６４を入手して使用し、そのキットに添付されたプロトコールに従って、実施した。【００５０】
実施例Ｂ（８）呼吸代謝ケージ分析
アルコシステム社製の呼吸代謝ケージ（ＡＲＣＯ−２０００シリーズ）を用い、至適環境下で、呼吸代謝ケージ分析を実施した。【００５１】
実施例Ｃ . 結果
実施例Ｃ（１）糖/脂質バランスの崩れ（Carbohydrate-lipid imbalance）の改善
肥満患者において糖/脂質バランスが破綻し、糖質に比して脂肪合成が有意になり、これを発露としたインスリン抵抗性を基盤とする疾病発症を説明する病態メカニズムが存在し（Ide T. Nature cell biol 2004 Apr;6(4):351-7）、この糖/脂質バランスの崩れ（Carbohydrate-lipid imbalance）の改善が根源的な治療基盤となる。本発明者らはＰｔｘ４遺伝子の機能に着目し、Ｐｔｘ４遺伝子をＰｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ−Ｐｔｘ４i）で転写阻害したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝臓内のグリコーゲン含有量と中性脂肪含有量を測定した結果、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝臓内において、糖質/脂質比率が増加し、脂質合成と比較して糖質合成が増強されることを見出した。【００５２】
まず、０．６Ｎ過塩素酸にて加熱処理した肝臓抽出液を静置すると、コントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）では上清に脂質成分が多量に浮遊していたのに対して、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）では、浮遊している脂質成分は認められなかった。また、コントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）の沈殿層にはわずかな量の白色沈殿が確認されるのみであったが、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）では沈殿層に多量の白色沈殿が存在することが確認された（図１）。次に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝臓内のグリコーゲン量と中性脂肪量を測定すると、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）では、コントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）と比較して、グリコーゲン含有量が約１．６倍に増加し、中性脂肪含量が約０．６８倍に低下することが見出された（図２）。【００５３】
この結果によると、通常の生理的な飢餓状態では、まず最初に炭水化物系の糖質エネルギー（グリコーゲン）が利用されたのち、脂肪酸系エネルギーとして脂肪組織から脂肪分解された中性脂肪が基質として利用されるが、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害した場合には、まず脂肪組織からあるいは肝細胞内の中性脂肪を基質として最初に利用したのち、炭水化物系の糖質エネルギーを利用するという、生体のエネルギー利用におけるパラダイム・シフトが惹起されることが明らかになった。以上により、肥満患者が示すような糖質合成と比較して脂質合成が優位である糖／脂質代謝バランス異常が、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより、改善されることが期待される。【００５４】
実施例Ｃ（２）脂肪組織の脂肪分解作用促進とベージュ様脂肪細胞（Ｂｅｉｇｅ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）への形質転換
脂肪組織は、一定の条件の下で、易熱産生能をもつ赤褐色のベージュ脂肪細胞（Ｂｅｉｇｅ−ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）へ形質転換する事が知られている。また、ベージュ様脂肪細胞ではＵＣＰ１の遺伝子発現が亢進し、これが熱産生性に寄与することで、エネルギー燃焼を亢進することが報告されている（Lowell, B.B.,et al. Nature404, 652-660.2000）。そこで、発明者らは、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、このような脂肪組織の変化が起るかどうかを観察した。【００５５】
まず、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの精巣上脂肪組織の色調は赤褐色を示し、コントロール（ＬａｃＺ−ｉ）群の精巣上脂肪組織が示す白色様色調（これはマウスの精巣上脂肪組織に通常見られる色調である）とは明らかに異なるものであった（図３）。次に、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、コントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）と比較して体重の減少が認められた（図４）。また、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、コントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）と比較して精巣上脂肪組織（これはヒトにおける内臓脂肪に相当する）の重量が約５０％減少していることが認められた（図４）。さらに、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脂肪組織の発現遺伝子を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定したところ、ベージュ様脂肪細胞において遺伝子発現が亢進するとされるＵＣＰ１の遺伝子発現が有意に上昇していることが明らかとなった（ｐ＜０．０５）。【００５６】
また、１９℃の飼育温度条件下の高脂肪食肥満（ＤＩＯ(Diet induced obesity)）モデルマウス、および１９℃の飼育温度条件下の非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウスにおいても、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）で同様にベージュ脂肪細胞化することが確認された（図５、図６）。【００５７】
以上の結果により、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、肝臓とは異なる組織である脂肪組織において脂肪分解が促進されること、および、脂肪組織での中性脂肪が分解・利用しやすい性質をもつベージュ脂肪細胞様の性質をもつ脂肪細胞へ形質転換することが明らかになった。これは、寒冷刺激などの交感神経系に賦活化によるノルエピネフリンによる刺激によって、ｐ３８、ＭＡＰＫ、ＰＧＣ１αのシグナル・カスケードが亢進し、その結果、熱産生性を亢進させる性質を持つ褐色脂肪細胞やベージュ脂肪細胞への形質転換が促される現象（Cao, W.et al. Mol. Cell. Biol.24,3057-3067. 2004.）に類似のメカニズムが予想される。そして、肝臓内の中性脂肪合成の基質として、脂肪組織から遊離される脂肪酸とグリセロールが凡そ６０％と最も寄与度が高く（Browning JD et al. J Clin Invest. 2004 ;114(2):147-52.）、肝臓内の中性脂肪制御において重要な制御要素であるため、脂肪組織の脂肪分解制御がＰｔｘ４遺伝子の機能の阻害によりもたらされることは、この制御系への大きなインパクトを持つことが理解される。以上により、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより、肝細胞内への中性脂肪滴蓄積を阻害する効果、脂肪分解を増加させる効果、並びに抗肥満効果が発揮されることが期待される。【００５８】
実施例Ｃ（３）肝臓組織内の転写制御による糖/脂質バランスの改善と（ＳＲＥＢＰ１、ＳＲＥＢＰ２発現減少とＧｙｓ２発現亢進あるいはｐｙｇｌ発現抑制）、抗炎症作用
肝臓内のグリコーゲン含有量の増加と中性脂肪含有量の低下に伴い、インスリン抵抗性の改善が報告されている（Nakagawa Y  et al. Nat Med. 2006 Jan;12(1):107-13.）。そこで、発明者らは、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、このような肝臓内のインスリン感受性の亢進につながる肝臓組織内の転写制御が起るかどうかを観察した。【００５９】
まず、肝臓組織内でのｄｅ  ｎｏｖｏの脂肪合成系（中性脂肪・コレステロール合成系）遺伝子であるＳＲＥＢＰ−１ｃおよびＳＲＥＢＰ−２は、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、転写レベルでも抑制されることが見出された(図７ａ）。一方で、肝臓組織内でのグリコーゲン合成遺伝子であるＧｙｓ２は、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、転写レベルでその遺伝子発現が亢進されることが見出された(図７ａ）。また、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、肝臓内のＣＰＴ−１ａの遺伝子発現が増加し（図７ｃ）、ベータ酸化が亢進していることが推認された。さらに、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、上述の事象と一貫性をもって、炎症惹起性転写因子であるＩＫＫ−β、ＮＦκＢの遺伝子発現量の低下と炎症性サイトカインＩＬ−１β遺伝子発現量の低下が見出された（図７ｂ）。さらに１９℃の飼育温度条件下において、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）では酸化ストレスマーカーであるＳｏｄ２の発現も低下し、肝細胞内の酸化ストレスも減少していることが確認された。（図８）なお、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害しても、随時血漿中の血糖値、インスリン値、中性脂肪、遊離脂肪酸については特に有意変動は見られない（図９）。【００６０】
また、１９℃の飼育温度条件下において、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）にＰｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ−Ｐｔｘ４i）を投与し、１週間後に解剖し、肝臓からタンパク質を抽出し、インスリンシグナル関連タンパク質の発現についてウェスタンブロット法を用いて解析を行った。Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）でインスリンシグナルの改善が見られ、肝臓におけるインスリン感受性の亢進が示唆され、Ｐｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ−Ｐｔｘ４i）を投与することにより、インスリン抵抗性（肥満関連炎症性変化）を改善する効果が確認された（図１０）。【００６１】
実施例Ｃ（４）肥満病態モデルにおける糖／脂質バランスの崩れ（Carbohydrate-lipid imbalance）の改善効果による脂肪肝改善およびその炎症抑制作用
上述した（１）〜（３）の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでの解析結果から、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより、１）肝臓での糖／脂質バランスにおいて、脂肪酸優位に利用亢進（β酸化亢進）、２）ｄｅ  ｎｏｖｏ脂肪合成系遺伝子発現の低下、３）抗炎症作用の惹起、４）酸化ストレスの減少等が見出されたが、これらと同様の作用効果が、治療効果として肥満病態モデルにおいても発揮されるか確認を行った。肥満病態モデルとして、高脂肪食肥満（ＤＩＯ(Diet induced obesity)）モデルマウス、レプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）を用いて解析を進めた。【００６２】
まず、レプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）にＰｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ−Ｐｔｘ４i）を静脈注射により投与した。肝臓組織化学的解析としてＰＡＳ染色を行った（図１１）。図１１において、アスタリスクは中心静脈を示し、横長で右向きに細くなる三角形はその先に脂肪滴が見られることを示す。コントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）のレプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）では、門脈・中心静脈を中心に多数の大きな脂肪滴が貯留しているのが確認されたが、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）のレプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）では、著しく脂肪滴数が減少し、さらに脂肪滴径の低下が確認された（図１１）。また、コントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）のレプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）では、ＰＡＳ染色されるグリコーゲンを代表とする糖鎖をもつ各種多糖類が増加することが確認されたが、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）のレプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）では、より著しく青紫色に強染色されたＰＡＳ陽性細胞数が増加した（図１１）。これを定量化すると、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの解析と同様に、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより、肝臓内グリコーゲン量の増加と、中性脂肪含量の低下が確認された（図１２）。【００６３】
これらにより、レプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）においても、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより、糖／脂質バランスの崩れ（Carbohydrate-lipid imbalance）の改善効果が発揮されることが見出された。【００６４】
次に、レプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）の脂肪肝組織内においてもｄｅ  ｎｏｖｏの脂肪合成系遺伝子（ＳＲＥＢＰ−１ｃおよびＳＲＥＢＰ−２）の遺伝子発現は、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより、転写レベルでも抑制され、一方で、脂肪肝組織内でのグリコーゲン合成遺伝子であるＧｙｓ２は、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、転写レベルでその遺伝子発現が亢進されることが見出された(図１３ａ）。また、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、脂肪肝組織内のＣＰＴ−１ａの遺伝子発現が増加し（図１３ｃ）、ベータ酸化が亢進していることが推認された。さらに、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、炎症惹起性転写因子であるＩＫＫ−β、ＮＦκＢの遺伝子発現量の低下と炎症性サイトカインＩＬ−１β遺伝子発現量の低下が見出された（図１３ｂ）。さらに１９℃の飼育温度条件下において、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）では酸化ストレスマーカーであるＳｏｄ２の発現も低下し、肝細胞内の酸化ストレスも減少していることが確認された（図１４）。【００６５】
また、１９℃の飼育温度条件下の高脂肪食肥満（ＤＩＯ(Diet induced obesity)）モデルマウスにおいても同様な遺伝子発現が肝臓内で確認され、肥満モデルにおけるＰｔｘ４遺伝子の阻害効果が一貫して確認された（図１５）。【００６６】
また、１９℃の飼育温度条件下の高脂肪食肥満（ＤＩＯ(Diet induced obesity)）モデルマウスに、Ｐｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ−Ｐｔｘ４i）を投与し、１週間後の全血を用いた随時血糖値、更に血漿インスリン濃度をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。その結果、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）では血糖値の顕著な低下及び、血中のインスリン値の低下傾向が観察された（図１６）。【００６７】
実施例Ｃ（５）非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）治療剤のＰｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ
これらにより、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、中性脂肪蓄積に伴う非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の発症予防、治療効果が発揮されることが期待された。そこで、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料（ＣＤＡＨＦＤ）を３週間給餌し、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウス（ＣＤＡＨＦＤ  ＮＡＳＨモデル）を作出した。その後Ｐｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ−Ｐｔｘ４i）を投与し、１週間後の肝臓中の中性脂肪(Triglyceride)及びグリコーゲン含有量を測定した。飼育温度条件はすべて１９℃であった。その結果、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウス（ＣＤＡＨＦＤ  ＮＡＳＨモデル）において、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）では、肝臓中グリコーゲン含有量の増加傾向及び、中性脂肪含有量の低下傾向が観察された（図１７）。【００６８】
また、上述した１９℃の飼育温度条件下におけるアルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウスに、Ｐｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ−Ｐｔｘ４i）を投与し、その投与１週間後における肝臓の組織学的評価を行った。その結果、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）において、門脈周囲（ＰＶ）に白く抜けた領域の面積の減少(脂肪滴の減少)が認められ、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の病態の一つの指標である脂肪肝の改善が示唆された（図１８）。【００６９】
次に、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することによる、各モデルマウスにおける抗酸化作用を検討することを目的として、肝臓における高酸化ストレスの指標の一つであるスーパーオキシドジスムターゼ２（Ｓｏｄ２）のｍＲＮＡ発現量を検討した。その結果、野生型マウス、高脂肪食肥満（ＤＩＯ(Diet induced obesity)）モデルマウス、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウス（ＣＤＡＨＦＤ  ＮＡＳＨモデル）の各群において、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）では、Ｓｏｄ２ｍＲＮＡ発現量の有意な低下及び、低下傾向が観察された（図８、図１５および図１９）。このことからＰｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ−Ｐｔｘ４i）の投与によって、肝臓内での非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルにおける酸化ストレスが軽減し、ｍＲＮＡ発現量の低下に結びついたことが示唆された。【００７０】
さらに、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することによる、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の肝線維化に対する効果として、肝臓内のCollagen1a, Collagen3a ｍＲＮＡ発現量を確認したところ、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）では各線維化マーカーの減少が認められ、Ｐｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ−Ｐｔｘ４i）の投与により非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の肝線維化増悪を改善させる働きがあることが確認された（図１９）【００７１】
以上の結果はＦＤＡ（米国食品医薬局）の定める非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）治療剤のＰｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔにおけるＰｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓである、（ｉ）肝脂肪含量の低下、および（ｉｉ）細胞障害マーカー（炎症・酸化ストレスマーカー・線維化マーカー）発現量の低減のすべての基準をクリアする治療成績を示している。【００７２】
肝臓内の含有脂肪の基質は、ｉ）脂肪組織からの遊離脂肪酸が６０％、ｉｉ）ｄｅ  ｎｏｖｏ脂肪合成が２６％、それからｉｉｉ）摂食されるグルコースや脂肪からが１４％である(Kerry L. et al. J Clin Invest. 2005;115(5):1343-1351. doi:10.1172/JCI23621)。そこで、発明者らは、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、摂食されるグルコースや脂肪の量が減少するかどうかをレプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）で確認した。【００７３】
その結果、レプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）において、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、経口摂食量の低下と体重の減少が確認された（図２０）。【００７４】
以上の結果により、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することによる摂食量の低下と体重の減少効果が、病態としての肥満に対しても有効であることが明らかになった。既存の非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）治療薬の有効成分としては、ＰＰＡＲγアゴニストやビタミンＥ等が知られているが（Hardy T. et al. Current opinion in Gastroenterology 31(3): 175-183. 2015）、肝臓内の中性脂肪蓄積に関与する流入経路であるｉ）〜ｉｉｉ）の三系統とも制御可能なメカニズムをもつ有効成分は、現在までに発見されていない。したがって、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）をターゲットにした新しい効果を発揮する新規薬剤としての臨床的効果が期待される。【００７５】
実施例Ｃ（６）疑似冬眠状態における代謝制御による臓器保護、疾病予防効果
１９℃の飼育温度条件下において、野生型マウス(Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ)にＰｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ−Ｐｔｘ４i）を投与し、その後２４時間の酸素消費量（ＶＯ２）及び呼吸商（ＲＱ）を呼吸代謝ケージを用いて測定した。得られた結果からグラフを作成し、曲線下面積(Area Under the Curve: AUC)を求めた。その結果、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）の野生型マウスにて（Ｃ５７ＢＬ６/Ｊ）、酸素消費量（ＶＯ２）が有意に低下し生体代謝反応を低下させるとともに、呼吸商（ＲＱ）が低下することが確認された（図２１）。【００７６】
また、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４−ｉ）のレプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）では、コントロール群（ＬａｃＺ−ｉ）のレプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）と比較して、直腸温（深部体温）が約０．９℃低下することが観察され、肝臓のＵＣＰ２遺伝子発現が低下することが認められた（図２２）。【００７７】
この現象を説明できるメカニズムは詳細には明らかにされていないが、生理的な代謝レベルを低下させること、あるいは体温を低下させる生理的な条件として明らかになっているものとしては冬眠（Ｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ）、休眠（Ｔｏｒｐｏｒ）が知られている。また、肝臓から分泌される分子が直接脳に働きかけ冬眠を引き起こすｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＰ）が報告されている（Kondo N et al. Cell. 2006 Apr 7;125(1):161-72.）。【００７８】
冬眠により惹起される所見と、本発明においてＰｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより惹起される所見との共通点として、基礎代謝を低下させること、体温が低下すること、および脂肪酸系エネルギーの優位性が挙げられる。この一致した生理学的所見は、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、生体は疑似冬眠代謝状態に移行すると推認され、Ｐｔｘ４遺伝子がコードする遺伝子産物であるペントラキシン４（Ｐｔｘ４）タンパク質の本質的な生理作用を説明する切り口として重要であると考えられる。【００７９】
また、冬眠における代謝状態の特徴として、低体温の維持(Hochachk et al. Science, 231 (1986), 234-241)、虚血からの防護（K.U. Frerichs. et al. J. Cereb. Blood Flow Metab., 18 (1998), pp. 168-175）、筋萎縮保護（H.J. Harlow  et al. Nature, 409 (2001), p. 997）、細菌感染の抑制（V.M. Sharapov. et al. Mycopathologia, 84 (1983), pp. 77-80）、腫瘍形成の抑制（G.B. Kemper et al. Comp. Biochem. Physiol., 73C (1982), pp. 445-450）等の、種々の有害事象から惹起される傷害や疾病から臓器を保護する効果を持つことが報告されている。【００８０】
したがって、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより引き起こされると考えられる疑似冬眠代謝状態は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などによる肝硬変化や癌化、あるいは糖尿病による合併症などから臓器保護効果を発揮することが期待される。さらに、基礎代謝を軽減し、放射線暴露による細胞障害も軽減することから、長期間にわたる宇宙線からの防御反応を期待され宇宙事業開発への応用も期待される（Cerri M et al. Life Sci Space Res., 90(4)(2016) pp.445-452）。【００８１】
実施例Ｄ（１）ペントラキシン４タンパク質を認識する抗体の調製
ペントラキシン４タンパク質を認識する抗体を調製するために、表２に記載されたアミノ酸配列２（配列番号４）のペプチドを用いて、ユーロフィンジェノミクス株式会社の抗体作製サービスにより、抗ペントラキシン４ウサギＩｇＧポリクローナル抗体を調製した。【００８２】
実施例Ｄ（２）ペントラキシン４タンパク質を認識する抗体のペントラキシン４タンパク質の機能の阻害効果
生体内における、抗ペントラキシン４ウサギＩｇＧポリクローナル抗体の、ペントラキシン４タンパク質の機能の阻害効果について検討した。抗ペントラキシン４ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（５０μｇ／ｂｏｄｙ）およびコントロールとしてのウサギＩｇＧ抗体（５０μｇ／ｂｏｄｙ）を、それぞれ、１９℃の飼育温度条件下において、野生型マウス(Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ)に静脈注射により投与し、その後７日間、当該抗体によるペントラキシン４タンパク質の機能の阻害効果を観察した。その結果、抗ペントラキシン４ウサギＩｇＧポリクローナル抗体投与群において、投与後から累積摂餌量低下が観察された（図２３）。また、抗ペントラキシン４ウサギＩｇＧポリクローナル抗体投与群において、鼠径部脂肪細胞重量と比較して精巣上体周囲脂肪細胞重量の強い低下傾向が惹起され、インスリン抵抗性が改善されたことが示された（図２４）。これらの結果から、当該抗体の投与により、Ｐｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ−Ｐｔｘ４i）を投与した場合に観察された結果と同様の、食欲の減少および精巣上体周囲脂肪細胞重量の強い低下傾向が認められ、ペントラキシン４タンパク質の機能の阻害効果が確認された。以上のことから、ペントラキシン４タンパク質を認識する抗体の投与により、肥満関連疾患の病態改善効果が発揮されることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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