(57)【要約】式Ｉ：ＣＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣ（Ｉ）（Ｘはシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。）で示されるアミノ酸配列を含むペプチド、及び式ＩＩ：ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ（ＩＩ）（Ｘは前記と同様である。）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを含み、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）：
ＣＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣ  （配列番号１）      （Ｉ）
（Ｘはシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドであって、
次式（ＩＩ）：
ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ  （配列番号２）      （ＩＩ）
（Ｘは前記と同様である。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドと二量体を形成することによりナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有する、
前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
次式（ＩＩ）：
ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ  （配列番号２）      （ＩＩ）
（Ｘはシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドであって、
次式（Ｉ）：
ＣＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣ  （配列番号１）      （Ｉ）
（Ｘは前記と同様である。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドと二量体を形成することによりナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有する、
前記式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項３】
次式（Ｉ）：
ＣＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣ  （配列番号１）      （Ｉ）
（Ｘはシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド、及び
次式（ＩＩ）：
ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ  （配列番号２）      （ＩＩ）
（Ｘは前記と同様である。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド
を含み、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチド。
【請求項４】
式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドが、
Ｘ１ＧＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＣＣＸ６Ｘ７ＧＣＸ８Ｘ９ＳＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｃ  （配列番号３）      （Ｉ−１）
（Ｘ１〜Ｘ１４はシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むものである請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘ１がグリシン残基、アルギニン残基、スレオニン残基、アラニン残基、プロリン残基、セリン残基若しくはアスパラギン残基を表し、
Ｘ２がイソロイシン残基若しくはメチオニン残基を表し、
Ｘ３がアラニン残基若しくはグリシン残基を表し、
Ｘ４がアルギニン残基、トリプトファン残基若しくはグルタミン残基を表し、
Ｘ５がアルギニン残基若しくはチロシン残基を表し、
Ｘ６がアラニン残基、セリン残基若しくはスレオニン残基を表し、
Ｘ７がセリン残基、スレオニン残基、イソロイシン残基、アラニン残基、アスパラギン残基若しくはヒスチジン残基を表し、
Ｘ８がセリン残基若しくはアラニン残基を表し、
Ｘ９がセリン残基、スレオニン残基、フェニルアラニン残基、アルギニン残基若しくはメチオニン残基を表し、
Ｘ１０がアスパラギン酸残基若しくはグルタミン酸残基を表し、
Ｘ１１がイソロイシン残基若しくはロイシン残基を表し、
Ｘ１２がアラニン残基若しくはセリン残基を表し、
Ｘ１３がリシン残基若しくはアルギニン残基を表し、及び／又は
Ｘ１４がロイシン残基若しくはイソロイシン残基を表す、
請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
式（Ｉ−１）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドが、
ＳＧＧＩＡＲＲＣＣＡＳＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号６）、
ＮＧＧＩＡＲＲＣＣＡＳＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号２４）、
ＳＧＧＩＡＲＲＣＣＳＳＧＣＳＴＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号２６）、
ＳＧＲＧＧＩＡＲＲＣＣＴＳＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号２８）、
ＳＧＲＧＧＩＡＲＲＣＣＴＳＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号３０）、
ＮＡＲＧＧＩＡＲＲＣＣＡＳＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号３２）、
ＮＡＨＲＧＩＡＲＲＣＣＳＴＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号３４）、
ＳＡＨＲＧＩＡＲＲＣＣＳＳＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号３６）、
ＶＴＲＳＴＧＩＡＲＲＣＣＳＴＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号３８）、
ＶＴＲＳＴＧＩＡＲＲＣＣＳＴＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号４０）、
ＶＴＲＳＴＧＩＡＲＲＣＣＳＴＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号４２）、
ＶＴＲＴＧＧＩＡＲＲＣＣＳＴＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号４４）、
ＶＴＲＴＧＧＩＡＲＲＣＣＳＩＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号４６）、
ＶＴＲＳＡＧＩＡＲＲＣＣＳＡＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号４８）、
ＶＴＲＳＡＧＩＡＲＲＣＣＳＡＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号５０）、
ＶＴＲＳＡＧＩＡＲＲＣＣＳＡＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号５２）、
ＶＳＲＧＴＧＩＡＲＲＣＣＳＮＧＣＳＦＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号５４）、
ＡＰＰＧＩＧＷＲＣＣＳＳＧＣＳＲＳＥＩＳＲＬＣ（配列番号５６）、
ＴＳＧＩＡＲＲＣＣＴＡＧＣＡＲＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号５８）、又は
ＳＹＮＧＭＡＱＹＣＣＳＨＧＣＳＭＳＥＬＡＲＩＣ（配列番号６０）
で示されるものである請求項４又は５に記載のペプチド。
【請求項７】
式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドが、
Ｘ２１ＬＣＧＸ２２Ｘ２３ＬＸ２４Ｘ２５ＡＸ２６ＹＸ２７Ｘ２８ＣＳＸ２９（配列番号４）      （ＩＩ−１）
（Ｘ２１〜Ｘ２９はシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むものである請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｘ２１がアルギニン残基若しくはリシン残基を表し、
Ｘ２２がアルギニン残基、アラニン残基、セリン残基、プロリン残基、ヒスチジン残基若しくはチロシン残基を表し、
Ｘ２３がグルタミン酸残基、アルパラギン酸残基若しくはアラニン残基を表し、
Ｘ２４がセリン残基若しくはスレオニン残基を表し、
Ｘ２５がアルギニン残基、リシン残基若しくはセリン残基を表し、
Ｘ２６がイソロイシン残基、バリン残基若しくはロイシン残基を表し、
Ｘ２７がアルギニン残基、セリン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、グルタミン酸残基若しくはアスパラギン残基を表し、
Ｘ２８がイソロイシン残基若しくはバリン残基を表し、及び／又は、
Ｘ２９がヒスチジン残基、チロシン残基若しくはフェニルアラニン残基を表す、
請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
式（ＩＩ−１）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドが、
ＴＲＬＣＧＲＥＬＳＲＡＩＹＲＩＣＳＨ（配列番号８）、
ＶＲＬＣＧＡＤＬＳＲＡＶＹＲＶＣＳＨ（配列番号２５）、
ＴＲＬＣＧＡＡＬＳＲＡＶＹＲＶＣＳＨ（配列番号２７）、
ＶＲＬＣＧＡＤＬＳＲＡＶＹＲＶＣＳＨ（配列番号２９）、
ＲＲＬＣＧＳＥＬＳＲＡＶＹＳＶＣＳＨ（配列番号３１）、
ＶＲＬＣＧＡＤＬＳＲＡＶＹＲＶＣＳＨ（配列番号３３）、
ＴＲＬＣＧＳＤＬＳＲＡＬＹＲＶＣＳＨ（配列番号３５）、
ＴＲＬＣＧＳＤＬＳＲＡＬＹＲＶＣＳＨ（配列番号３７）、
ＧＲＬＣＧＡＥＬＳＲＡＶＹＲＩＣＳＨ（配列番号３９）、
ＧＲＬＣＧＡＥＬＳＲＡＶＹＲＩＣＳＨ（配列番号４１）、
ＧＲＬＣＧＡＥＬＳＲＡＶＹＲＩＣＳＨ（配列番号４３）、
ＩＲＬＣＧＰＤＬＳＲＡＶＹＱＩＣＳＨ（配列番号４５）、
ＴＲＬＣＧＰＤＬＳＲＡＶＹＱＩＣＳＨ（配列番号４７）、
ＴＲＬＣＧＰＤＬＳＲＡＶＹＱＩＣＳＨ（配列番号４９）、
ＧＲＬＣＧＡＥＬＳＲＡＶＹＲＩＣＳＨ（配列番号５１）、
ＧＲＬＣＧＡＥＬＳＲＡＶＹＲＩＣＳＨ（配列番号５３）、
ＤＲＬＣＧＡＤＬＳＲＡＬＹＨＶＣＳＨ（配列番号５５）、
ＥＫＬＣＧＨＥＬＴＫＡＩＹＥＩＣＳＹ（配列番号５７）、
ＡＲＬＣＧＨＥＬＳＳＡＩＹＮＩＣＳＦ（配列番号５９）、又は
ＧＲＫＬＣＧＹＥＬＳＲＡＶＹＱＶＣＳＨ（配列番号６１）で示されるものである請求項７又は８に記載のペプチド。
【請求項１０】
以下の（ａ１）〜（ａ４）から選ばれるいずれかのヘテロ二量体ペプチド。
（ａ１）配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むヘテロ二量体ペプチド
（ａ２）配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列（システイン残基を除く）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチド
（ａ３）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むヘテロ二量体ペプチド
（ａ４）配列番号１０に示されるアミノ酸配列（システイン残基を除く）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチド
【請求項１１】
以下の（ａ１）〜（ａ４）から選ばれるいずれかのヘテロ二量体ペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ１）配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むヘテロ二量体ペプチド
（ａ２）配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列（システイン残基を除く）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチド
（ａ３）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むヘテロ二量体ペプチド
（ａ４）配列番号１０に示されるアミノ酸配列（システイン残基を除く）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチド
【請求項１２】
以下の（ｂ１）〜（ｂ４）から選ばれるいずれかのＤＮＡを含む遺伝子。
（ｂ１）配列番号５及び配列番号７に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ２）配列番号５及び配列番号７に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチドをコードするＤＮＡ
（ｂ３）配列番号９に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ４）配列番号９に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチドをコードするＤＮＡ
【請求項１３】
請求項３に記載のヘテロ二量体ペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子。
【請求項１４】
前記ＤＮＡは、
次式（Ｉ）：
ＣＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣ  （配列番号１）      （Ｉ）
（Ｘはシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡと、
次式（ＩＩ）：
ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ  （配列番号２）      （ＩＩ）
（Ｘは前記と同様である。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡと
を含むものである、請求項１３に記載の遺伝子。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１７】
請求項１６に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチドを採取することを特徴とする、当該ヘテロ二量体ペプチドの製造方法。
【請求項１８】
請求項３〜１０のいずれか１項に記載のヘテロ二量体ペプチドを含む、ナマコ綱に属する無脊椎動物の放卵又は放精誘起剤。
【請求項１９】
ナマコ綱に属する無脊椎動物に請求項３〜１０のいずれか１項に記載のヘテロ二量体ペプチドを投与することを特徴とする、前記動物に放卵又は放精を誘起させる方法。
【請求項２０】
ナマコ綱に属する無脊椎動物に請求項３〜１０のいずれか１項に記載のヘテロ二量体ペプチドを投与して前記動物に放卵又は放精を誘起させ、得られた卵及び精子を用いて人工授精させることを特徴とする、前記動物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナマコ綱に属する無脊椎動物、具体的にはナマコにおける放卵又は放精を誘起するペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
中国では食用ナマコ類を干して作られる干ナマコは、滋養強壮に富む高級食材として取引されてきた。近年の中国の経済発展に伴って国際的に干ナマコ需要が急増しており、２０１３年には年間４億米ドルの市場へと成長している。干ナマコは様々な種類の食用ナマコから製造されているが、なかでもマナマコから作られる干ナマコは最高級品として珍重され、江戸時代には日本からの重要な輸出海産物の一つとなっていた。マナマコは極東地域に局在する種であるが、中国沿岸での棲息数は既に激減しており、近年の漁獲は殆ど無い状態と思われる。日本での水揚げも天然資源の保護を考慮して採りすぎない漁業が行われている。こうした中、中国の旺盛な購買意欲は、熱帯地域に生息する食用ナマコ類の漁獲の急増が支えている。【０００３】
現在、３０種以上の熱帯性ナマコ類が食用とされていると考えられるが、その半数は世界自然保護連合により絶滅危惧種（ＥＮ（絶滅危機），ＶＵ（危急）区分）に指定されている（ＩＵＣＮ，２０１３）。マナマコも絶滅危機（ＥＮ）に指定されているが、日本国内では、厳格な漁業管理と共に、各地で稚ナマコの生産（種苗生産）と漁場への放流（種苗放流）が継続的に行われ天然資源の保護・育成が進められている。一方、熱帯圏では、多くの食用ナマコ種で天然資源の枯渇が懸念されているが、日本のような十分な天然資源の保護・育成事業は行われていない。【０００４】
種苗生産事業は受精卵を得ることから始まる。しかし、動物の卵は母個体から外科的に取りだした状態では受精能力を持たないことから、受精可能な卵を得るためには母個体の産卵を誘発する必要がある。これまでに動物種に応じて様々な産卵誘発技術が試みられてきたが、加温や干出等の物理化学的刺激を主体とした従来の方法では効果的な産卵誘発効果は得られなかった。マナマコにおいては、神経系に含まれる産卵誘発ホルモン「クビフリン」が解明され（特許文献１：特許第５４０１７３６号、非特許文献１〜４）、クビフリンを投与して産卵を誘発する技術は、今では全国の主なマナマコ種苗生産施設で欠かせない技術として利用されている。【０００５】
熱帯圏諸国においても、干ナマコ需要の増加に伴って漁獲が急増している熱帯性食用ナマコ類の天然資源の保護・育成が急務となっているが、漁業管理体制の構築や種苗生産・放流事業の活動は日本のように充分には行われてはいない。種苗生産においては効果的な産卵誘発技術が必要であるが、マナマコでのクビフリンの様な実用的な効果を持つ技術は開発されておらず（非特許文献５〜８）、やむを得ず従来の物理化学的刺激法が運用されている。マナマコクビフリンは極めて種特異性が高く、熱帯性ナマコ類には作用しないと考えられており、熱帯性ナマコ類における同様のホルモンの解明が期待されている。【０００６】
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５４０１７３６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｏｏｃｙｔｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇａｍｅｔｅ  ｓｐａｗｎｉｎｇ  ｏｆ  ｓｅａ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ，Ａｐｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａｓ．，Ｋａｔｏ  Ｓ．，Ｔｓｕｒｕｍａｒｕ  Ｓ．，Ｔａｇａ  Ｍ．，Ｙａｍａｎｅ  Ｔ．，Ｓｈｉｂａｔａ  Ｙ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ａ．，Ｙａｍａｎｏ  Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｋｕｎｉ  Ｍ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３２６，１６９−１７６，２００９．
【非特許文献２】Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｐａｗｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅａ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ  Ａｐｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ｃｕｂｉｆｒｉｎ．，Ｙａｍａｎｏ  Ｋ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ａ．，Ｙｏｓｈｉｋｕｎｉ  Ｍ．，日本水産学会誌，７９，７８２−７８４，２０１３．
【非特許文献３】Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｏｃｙｔｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｓｅａ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ  Ａｐｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａｓ  ｂｙ  ｃｕｂｉｆｒｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｇｇｓ．，Ｙａｍａｎｏ  Ｋ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ａ．，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ａ．，Ｙｏｓｈｉｋｕｎｉ  Ｍ．，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，７９，８２３−８３２，２０１３．
【非特許文献４】Ｓｐａｗｎｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｕｂｉｆｒｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｓｅａ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ  Ａｐｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａｓ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ａ．，Ｙａｍａｎｏ  Ｋ．，Ｏｈｎｏ  Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｋｕｎｉ  Ｍ．，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，７６，７９５−８０１，２０１０．
【非特許文献５】Ｇｏｎａｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ−ｌｉｋｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｒａｄｉａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅａ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ．，Ｋａｔｏｗ  ＨＪ．，Ｋａｔｏｗ  Ｔ．，Ｍｏｒｉｙａｍａ  Ａ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８３，４８３−４９１，２００９．
【非特許文献６】Ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｏｏｃｙｔｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｏｌｏｔｈｕｒｏｉｄｓ（Ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍａｔａ）．，Ｌｅｏｎｅｔ  Ａ．，Ｒａｓｏｌｏｆｏｎｉｒｉｎａ  Ｒ．，Ｗａｌｌｉｅｚ  Ｒ．，Ｊａｎｇｏｕｘ  Ｍ．，Ｅｅｃｈｈａｕｔ  Ｉ．，Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，５３，１３−２１，２００９．
【非特許文献７】Ｐｅｒｉｖｉｓｃｅｒａｌ  ｃｏｅｌｏｍｉｃ  ｆｌｕｉｄ  ａｓ  ａ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｓｐａｗｎｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒｏｐｉｃａｌ  ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａｎｓ．，Ｍｅｒｃｉｅｒ  Ａ．，Ｈａｍｅｌ  Ｊ．−Ｆ．，Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４１，２２３−２３４，２００２．
【非特許文献８】Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｎ  ｏｏｃｙｔｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｒａｄｉａｌ  ｎｅｒｖｅ．，Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｙ．Ｋ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，１６８，２４９−２６２，１９８５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するペプチドを提供することを目的とする。【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ナマコの周口組織から目的のペプチドを単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）次式（Ｉ）：
ＣＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣ  （配列番号１）      （Ｉ）
（Ｘはシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドであって、
次式（ＩＩ）：
ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ  （配列番号２）      （ＩＩ）
（Ｘは前記と同様である。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドと二量体を形成することによりナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有する、
前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（２）次式（ＩＩ）：
ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ  （配列番号２）      （ＩＩ）
（Ｘはシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドであって、
次式（Ｉ）：
ＣＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣ  （配列番号１）      （Ｉ）
（Ｘは前記と同様である。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドと二量体を形成することによりナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有する、
前記式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（３）次式（Ｉ）：
ＣＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣ  （配列番号１）      （Ｉ）
（Ｘはシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド、及び
次式（ＩＩ）：
ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ  （配列番号２）      （ＩＩ）
（Ｘは前記と同様である。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド
を含み、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチド。
（４）式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドが、
Ｘ１ＧＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＣＣＸ６Ｘ７ＧＣＸ８Ｘ９ＳＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｃ  （配列番号３）      （Ｉ−１）
（Ｘ１〜Ｘ１４はシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むものである（１）〜（３）のいずれか１項に記載のペプチド。
（５）Ｘ１がグリシン残基、アルギニン残基、スレオニン残基、アラニン残基、プロリン残基、セリン残基若しくはアスパラギン残基を表し、
Ｘ２がイソロイシン残基若しくはメチオニン残基を表し、
Ｘ３がアラニン残基若しくはグリシン残基を表し、
Ｘ４がアルギニン残基、トリプトファン残基若しくはグルタミン残基を表し、
Ｘ５がアルギニン残基若しくはチロシン残基を表し、
Ｘ６がアラニン残基、セリン残基若しくはスレオニン残基を表し、
Ｘ７がセリン残基、スレオニン残基、イソロイシン残基、アラニン残基、アスパラギン残基若しくはヒスチジン残基を表し、
Ｘ８がセリン残基若しくはアラニン残基を表し、
Ｘ９がセリン残基、スレオニン残基、フェニルアラニン残基、アルギニン残基若しくはメチオニン残基を表し、
Ｘ１０がアスパラギン酸残基若しくはグルタミン酸残基を表し、
Ｘ１１がイソロイシン残基若しくはロイシン残基を表し、
Ｘ１２がアラニン残基若しくはセリン残基を表し、
Ｘ１３がリシン残基若しくはアルギニン残基を表し、及び／又は
Ｘ１４がロイシン残基若しくはイソロイシン残基を表す、（４）に記載のペプチド。
（６）式（Ｉ−１）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドが、
ＳＧＧＩＡＲＲＣＣＡＳＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号６）、
ＮＧＧＩＡＲＲＣＣＡＳＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号２４）、
ＳＧＧＩＡＲＲＣＣＳＳＧＣＳＴＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号２６）、
ＳＧＲＧＧＩＡＲＲＣＣＴＳＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号２８）、
ＳＧＲＧＧＩＡＲＲＣＣＴＳＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号３０）、
ＮＡＲＧＧＩＡＲＲＣＣＡＳＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号３２）、
ＮＡＨＲＧＩＡＲＲＣＣＳＴＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号３４）、
ＳＡＨＲＧＩＡＲＲＣＣＳＳＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号３６）、
ＶＴＲＳＴＧＩＡＲＲＣＣＳＴＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号３８）、
ＶＴＲＳＴＧＩＡＲＲＣＣＳＴＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号４０）、
ＶＴＲＳＴＧＩＡＲＲＣＣＳＴＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号４２）、
ＶＴＲＴＧＧＩＡＲＲＣＣＳＴＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号４４）、
ＶＴＲＴＧＧＩＡＲＲＣＣＳＩＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号４６）、
ＶＴＲＳＡＧＩＡＲＲＣＣＳＡＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号４８）、
ＶＴＲＳＡＧＩＡＲＲＣＣＳＡＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号５０）、
ＶＴＲＳＡＧＩＡＲＲＣＣＳＡＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号５２）、
ＶＳＲＧＴＧＩＡＲＲＣＣＳＮＧＣＳＦＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号５４）、
ＡＰＰＧＩＧＷＲＣＣＳＳＧＣＳＲＳＥＩＳＲＬＣ（配列番号５６）、
ＴＳＧＩＡＲＲＣＣＴＡＧＣＡＲＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号５８）、又は
ＳＹＮＧＭＡＱＹＣＣＳＨＧＣＳＭＳＥＬＡＲＩＣ（配列番号６０）
で示されるものである（４）又は（５）に記載のペプチド。
（７）式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドが、
Ｘ２１ＬＣＧＸ２２Ｘ２３ＬＸ２４Ｘ２５ＡＸ２６ＹＸ２７Ｘ２８ＣＳＸ２９（配列番号４）      （ＩＩ−１）
（Ｘ２１〜Ｘ２９はシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むものである（１）〜（６）のいずれか１項に記載のペプチド。
（８）Ｘ２１がアルギニン残基若しくはリシン残基を表し、
Ｘ２２がアルギニン残基、アラニン残基、セリン残基、プロリン残基、ヒスチジン残基若しくはチロシン残基を表し、
Ｘ２３がグルタミン酸残基、アルパラギン酸残基若しくはアラニン残基を表し、
Ｘ２４がセリン残基若しくはスレオニン残基を表し、
Ｘ２５がアルギニン残基、リシン残基若しくはセリン残基を表し、
Ｘ２６がイソロイシン残基、バリン残基若しくはロイシン残基を表し、
Ｘ２７がアルギニン残基、セリン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、グルタミン酸残基若しくはアスパラギン残基を表し、
Ｘ２８がイソロイシン残基若しくはバリン残基を表し、及び／又は、
Ｘ２９がヒスチジン残基、チロシン残基若しくはフェニルアラニン残基を表す、（７）に記載のペプチド。
（９）式（ＩＩ−１）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドが、
ＴＲＬＣＧＲＥＬＳＲＡＩＹＲＩＣＳＨ（配列番号８）、
ＶＲＬＣＧＡＤＬＳＲＡＶＹＲＶＣＳＨ（配列番号２５）、
ＴＲＬＣＧＡＡＬＳＲＡＶＹＲＶＣＳＨ（配列番号２７）、
ＶＲＬＣＧＡＤＬＳＲＡＶＹＲＶＣＳＨ（配列番号２９）、
ＲＲＬＣＧＳＥＬＳＲＡＶＹＳＶＣＳＨ（配列番号３１）、
ＶＲＬＣＧＡＤＬＳＲＡＶＹＲＶＣＳＨ（配列番号３３）、
ＴＲＬＣＧＳＤＬＳＲＡＬＹＲＶＣＳＨ（配列番号３５）、
ＴＲＬＣＧＳＤＬＳＲＡＬＹＲＶＣＳＨ（配列番号３７）、
ＧＲＬＣＧＡＥＬＳＲＡＶＹＲＩＣＳＨ（配列番号３９）、
ＧＲＬＣＧＡＥＬＳＲＡＶＹＲＩＣＳＨ（配列番号４１）、
ＧＲＬＣＧＡＥＬＳＲＡＶＹＲＩＣＳＨ（配列番号４３）、
ＩＲＬＣＧＰＤＬＳＲＡＶＹＱＩＣＳＨ（配列番号４５）、
ＴＲＬＣＧＰＤＬＳＲＡＶＹＱＩＣＳＨ（配列番号４７）、
ＴＲＬＣＧＰＤＬＳＲＡＶＹＱＩＣＳＨ（配列番号４９）、
ＧＲＬＣＧＡＥＬＳＲＡＶＹＲＩＣＳＨ（配列番号５１）、
ＧＲＬＣＧＡＥＬＳＲＡＶＹＲＩＣＳＨ（配列番号５３）、
ＤＲＬＣＧＡＤＬＳＲＡＬＹＨＶＣＳＨ（配列番号５５）、
ＥＫＬＣＧＨＥＬＴＫＡＩＹＥＩＣＳＹ（配列番号５７）、
ＡＲＬＣＧＨＥＬＳＳＡＩＹＮＩＣＳＦ（配列番号５９）、又は
ＧＲＫＬＣＧＹＥＬＳＲＡＶＹＱＶＣＳＨ（配列番号６１）で示されるものである（７）又は（８）に記載のペプチド。
（１０）以下の（ａ１）〜（ａ４）から選ばれるいずれかのヘテロ二量体ペプチド。
（ａ１）配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むヘテロ二量体ペプチド
（ａ２）配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列（システイン残基を除く）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチド
（ａ３）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むヘテロ二量体ペプチド
（ａ４）配列番号１０に示されるアミノ酸配列（システイン残基を除く）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチド
（１１）以下の（ａ１）〜（ａ４）から選ばれるいずれかのヘテロ二量体ペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ１）配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むヘテロ二量体ペプチド
（ａ２）配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列（システイン残基を除く）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチド
（ａ３）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むヘテロ二量体ペプチド
（ａ４）配列番号１０に示されるアミノ酸配列（システイン残基を除く）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチド
（１２）以下の（ｂ１）〜（ｂ４）から選ばれるいずれかのＤＮＡを含む遺伝子。
（ｂ１）配列番号５及び配列番号７に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ２）配列番号５及び配列番号７に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチドをコードするＤＮＡ
（ｂ３）配列番号９に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ４）配列番号９に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチドをコードするＤＮＡ
（１３）前記（３）に記載のヘテロ二量体ペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子。
（１４）前記記ＤＮＡは、
次式（Ｉ）：
ＣＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣ  （配列番号１）      （Ｉ）
（Ｘはシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡと、
次式（ＩＩ）：
ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ  （配列番号２）      （ＩＩ）
（Ｘは前記と同様である。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡと
を含むものである、前記（１３）に記載の遺伝子。
（１５）前記（１１）〜（１４）のいずれか１つに記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（１６）前記（１５）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（１７）前記（１６）に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチドを採取することを特徴とする、当該ヘテロ二量体ペプチドの製造方法。
（１８）前記（３）〜（１０）のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ペプチドを含む、ナマコ綱に属する無脊椎動物の放卵又は放精誘起剤。
（１９）ナマコ綱に属する無脊椎動物に前記（３）〜（１０）のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ペプチドを投与することを特徴とする、前記動物に放卵又は放精を誘起させる方法。
（２０）ナマコ綱に属する無脊椎動物に前記（３）〜（１０）のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ペプチドを投与して前記動物に放卵又は放精を誘起させ、得られた卵及び精子を用いて人工授精させることを特徴とする、前記動物の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するペプチドが提供される。本発明のペプチドを用いることで、産卵期のナマコを用いて任意の時期に確実に放卵・放精を起こさせることが可能となるために、種苗生産現場での計画的で効率的な受精卵の生産が、安価で簡便で確実に実施することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】第１段目のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示した図である。図中マーカーで示した部分に生理活性を検出した。
【図２】第２段目の逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示した図である。図中マーカーで示した部分に生理活性を検出した。
【図３】第３段目の逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示した図である。図中マーカーで示した部分に生理活性を検出した。
【図４】第４段目の逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示した図である。図中マーカーで示した部分に生理活性を検出した。
【図５】第５段目の逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示した図である。図中マーカーで示した部分にに生理活性を検出した。
【図６】第５段目の副活性画分の逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示した図である。図中マーカーで示した部分に生理活性を検出した。
【図７】複数のナマコ類での相同アミノ酸配列を示す図である。
【図８】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの排卵の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１５】
１．本発明のペプチド
本発明者は、ナマコ綱に属する無脊椎動物（いわゆる、ナマコ類）の放卵又は放精活性を有するペプチドとして、種を超えて当該活性を有するヘテロ二量体ペプチドが存在することを見出した。具体的には、ナマコ類が有するインスリンスーパーファミリーのシステインモチーフを有するヘテロ二量体ペプチドが、上記放卵又は放精活性を有することを見出した。
【００１６】
本発明のペプチドは、ヘテロ二量体を形成するペプチドであり、その二量体を構成するペプチドは、次式（Ｉ）：
ＣＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣ      （Ｉ）
（Ｃはシステイン残基、Ｘはシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列（配列番号１）を含むペプチド、及び次式（ＩＩ）：
ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ      （ＩＩ）
（Ｃ及びＸは前記式（Ｉ）と同様である。）
で示されるアミノ酸配列（配列番号２）を含むペプチドである。
【００１７】
これらのペプチドが二量体を形成することで、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有することとなる。
従って、上記式（Ｉ）で示されるペプチドも、上記式（ＩＩ）で示されるペプチドとヘテロ二量体を形成して前記放卵又は放精誘起活性を有する限り、本発明に含まれる。同様に、上記式（ＩＩ）で示されるペプチドも、上記式（Ｉ）で示されるペプチドとヘテロ二量体を形成して前記放卵又は放精誘起活性を有する限り、本発明に含まれる。
【００１８】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列は、ナマコ類が有するインスリンスーパーファミリーのシステインモチーフである。本明細書において、式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を有するペプチドをＡ鎖、式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を有するペプチドをＢ鎖と呼ぶ。
Ａ鎖は、「ＣＣ（任意の３アミノ酸）Ｃ（任意の８アミノ酸）Ｃ」（計１５アミノ酸残基）を含むかたちで構成され、Ｂ鎖は「Ｃ（任意の１１アミノ酸）Ｃ」（計１３アミノ酸残基）を含むかたちで構成される。
【００１９】
本発明におけるヘテロ二量体ペプチド、すなわち、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチドは、前記Ａ鎖と、前記Ｂ鎖とを含むものである。限定はされないが、詳しくは、Ａ鎖とＢ鎖とにより形成されるヘテロ二量体ペプチドは、Ａ鎖とＢ鎖との間に２つのジスルフィド架橋を持つとともに、Ａ鎖内に１つのジスルフィド架橋を持つことを特徴とする。
【００２０】
本発明において、「ペプチド」とは、少なくとも２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合して構成されたものを意味し、オリゴペプチド、ポリペプチドなどが含まれる。さらに、ポリペプチドが一定の立体構造を形成したものはタンパク質と呼ばれるが、本発明においては、このようなタンパク質も上記「ペプチド」に含まれるものとする。従って、本発明のペプチドは、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質のいずれをも意味し得るものである。また、「任意の」とは、タンパク質を構成する２０種類のアミノ酸残基のいずれかの、という意味であり、アラニン（Ａ，Ａｌａ）、アルギニン（Ｒ，Ａｒｇ）、アスパラギン（Ｎ，Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ｄ，Ａｓｐ）、システイン（Ｃ，Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｑ，Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｅ，Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇ，Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈ，Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉ，Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ，Ｌｅｕ）、リシン（Ｋ，Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍ，Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ，Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐ，Ｐｒｏ）、セリン（Ｓ，Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔ，Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｗ，Ｔｒｐ）、チロシン（Ｙ，Ｔｙｒ）、バリン（Ｖ，Ｖａｌ）のいずれかを表す（カッコ内はアミノ酸の１文字及び３文字表記である。）。さらに、本発明においては、「任意のアミノ酸残基」としては、天然物由来のアミノ酸以外に、非天然アミノ酸（人工的に化学合成して得られたものなど）も採用することができ、具体的には、特に限定はされないが、例えば、ノルバリン、ノルロイシン、メチルロイシン、アリルグリシンなどが挙げられる。
【００２１】
Ａ鎖のペプチドとしては、具体的には、例えば、次式（Ｉ−１）：
Ｘ１ＧＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＣＣＸ６Ｘ７ＧＣＸ８Ｘ９ＳＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｃ（配列番号３）      （Ｉ−１）
（Ｘ１〜Ｘ１４はシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。
ここで、式（Ｉ−１）のアミノ酸配列において、Ｘ１〜Ｘ１４のアミノ酸残基は例えば以下の通りである。
Ｘ１：Ｇ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｐ、Ｓ又はＮ
Ｘ２：Ｉ又はＭ
Ｘ３：Ａ又はＧ
Ｘ４：Ｒ、Ｗ又はＱ
Ｘ５：Ｒ又はＹ
Ｘ６：Ａ、Ｓ又はＴ
Ｘ７：Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ａ、Ｎ又はＨ
Ｘ８：Ｓ又はＡ
Ｘ９：Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｒ又はＭ
Ｘ１０：Ｄ又はＥ
Ｘ１１：Ｉ又はＬ
Ｘ１２：Ａ又はＳ
Ｘ１３：Ｋ又はＲ
Ｘ１４：Ｌ又はＩ
Ｘ１〜Ｘ１４のすべてが上記例示列挙したアミノ酸残基であってもよいし、Ｘ１〜Ｘ１４のうちの一部が上記例示列挙したアミノ酸残基であってもよく、限定はされない。
また、Ａ鎖のペプチドとしては、後述の表１に示されるもの、例えば、
ＳＧＧＩＡＲＲＣＣＡＳＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ（配列番号６）
で示されるものが挙げられる。
【００２２】
他方、Ｂ鎖のペプチドとしては、例えば、次式（ＩＩ−１）：
Ｘ２１ＬＣＧＸ２２Ｘ２３ＬＸ２４Ｘ２５ＡＸ２６ＹＸ２７Ｘ２８ＣＳＸ２９（配列番号４）      （ＩＩ−１）
（Ｘ２１〜Ｘ２９はシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。
ここで、式（ＩＩ−１）のアミノ酸配列において、Ｘ２１〜Ｘ１４のアミノ酸残基は例えば以下の通りである。
Ｘ２１：Ｒ又はＫ
Ｘ２２：Ｒ、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｈ又はＹ
Ｘ２３：Ｅ、Ｄ又はＡ
Ｘ２４：Ｓ又はＴ
Ｘ２５：Ｒ、Ｋ又はＳ
Ｘ２６：Ｉ、Ｖ又はＬ
Ｘ２７：Ｒ、Ｓ、Ｑ、Ｈ、Ｅ又はＮ
Ｘ２８：Ｉ又はＶ
Ｘ２９：Ｈ、Ｙ又はＦ
Ｘ２１〜Ｘ２９のすべてが上記例示列挙したアミノ酸残基であってもよいし、Ｘ２１〜Ｘ２９のうちの一部が上記例示列挙したアミノ酸残基であってもよく、限定はされない。
また、Ｂ鎖のペプチドとしては、後述の表１に示されるもの、例えば、
ＴＲＬＣＧＲＥＬＳＲＡＩＹＲＩＣＳＨ（配列番号８）
で示されるものが挙げられる。
【００２３】
本発明においては、以上に述べたＡ鎖及びＢ鎖のペプチドは、限定はされないが、Ｃ末端がアミド化されているものであってもよいし（特にＢ鎖）、または当該ペプチドを構成するアミノ酸においてアミノ酸置換や化学修飾などがなされているものであってもよい。
【００２４】
ここで、本発明において解析された複数のナマコ類での相同アミノ酸配列を図７に示す。図７において、緑背景部分で示したアミノ酸（下線を付したアミノ酸）は、これまでに明らかになった相同遺伝子間で共通するアミノ酸を示す。Ａ鎖、Ｂ鎖中のＣ（システイン：点線で囲ったアミノ酸）の位置がインスリンスーパーファミリー（Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）ペプチドのモチーフとなっている。また、Ｂ鎖のＣ末端（右側）は、Ｇ（グリシン）またはアミド化されている。Ａ鎖のＮ末端側（左側）のアミノ酸数は種によって異なり、例えば、ニセクロナマコでは、ＳＧＧＩＡＲＲ（配列番号１１）のアミノ酸配列を有し、クロナマコでは、ＳＧＲＧＧＩＡＲＲ（配列番号１２）のアミノ酸配列を有し、マナマコでは、ＶＴＲＴＧＧＩＡＲＲ（配列番号１３）のアミノ酸配列を有する。上記ナマコ類におけるＡ鎖及びＢ鎖のアミノ酸配列の対応関係を表１に示す。
【表１】
2018079861.tif 000002
【００２５】
さらに、本発明は、以下の（ａ１）〜（ａ４）から選ばれるいずれかのヘテロ二量体ペプチドを提供する。
（ａ１）配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むヘテロ二量体ペプチド
（ａ２）配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列（システイン残基を除く）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチド
（ａ３）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むヘテロ二量体ペプチド
（ａ４）配列番号１０に示されるアミノ酸配列（システイン残基を除く）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチド
前記（ａ２）又は（ａ４）のヘテロ二量体ペプチドは、前記（ａ１）又は（ａ３）のヘテロ二量体ペプチドと機能的に同等なペプチドである。
本発明においては、上記（ａ１）及び（ａ２）における「配列番号６及び配列番号８」に代えて、配列番号２４及び配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７、配列番号２８及び配列番号２９、配列番号３０及び配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９、配列番号４０及び配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３、配列番号４４及び配列番号４５、配列番号４６及び配列番号４７、配列番号４８及び配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１、配列番号５２及び配列番号５３、配列番号５４及び配列番号５５、配列番号５６及び配列番号５７、配列番号５８及び配列番号５９、並びに配列番号６０及び配列番号６１の各組合せ（表１）のうちのいずれかを選択することもできる。
【００２６】
ここで、上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個のほか、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個又は１個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列が挙げられ、限定はされないが、当該欠失、置換又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。但し、Ｓ−Ｓ結合による二量体形成が妨げられないように、各単量体又は二量体ペプチドにおいてシステインモチーフを構成するシステイン残基は、欠失したり置換しないことが好ましい。
【００２７】
前記欠失、置換又は付加等の変異の導入は、ペプチドを遺伝子工学的に作製する場合には、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えば、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、及びＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、上記欠失、置換又は付加の変異が導入されたペプチドであるかどうかは、各種アミノ酸配列決定法、並びに質量分析等による構造解析法などを用いて確認することができる。
【００２８】
また、前記（ａ１）又は（ａ３）のヘテロ二量体ペプチドと機能的に同等なペプチドとしては、例えば、配列番号６及び配列番号８（あるいは、先に述べた他のアミノ酸配列の配列番号の組合せ（例えば、配列番号２４及び配列番号２５など））に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して、６５％以上の同一性（相同性）を有するアミノ酸配列を有し、かつナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するペプチドも挙げられる。さらにこのようなペプチドとしては、配列番号６及び配列番号８（あるいは、先に述べた他のアミノ酸配列の配列番号の組合せ（例えば、配列番号２４及び配列番号２５など））に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して、約６５％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性（相同性）を有するアミノ酸配列を有し、かつナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するペプチドが挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００２９】
本発明において、「放卵又は放精誘起活性」とは、配偶子の最終成熟の誘起活性、排卵・排精の誘起活性を意味し、当該活性は、例えば、配偶子の顕微鏡観察法、生殖腺からの排卵・排精の観察法、個体の放卵・放精行動の観察法等により測定することができる。
【００３０】
本発明においては、前記配列番号１〜４に示されるアミノ酸配列を含むペプチド、及び前記（ａ１）〜（ａ４）のペプチドは、天然物由来のペプチドであってもよいし、人工的に化学合成して得られたものであってもよく、限定はされない。
天然物由来のペプチドとしては、天然に存在するオリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質、又はこれらを断片化した状態のもの等が挙げられる。天然物由来のペプチドは、天然のナマコ綱に属する無脊椎動物から公知の回収法及び精製法により直接得てもよいし、又は、公知の遺伝子組換え技術（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２））により、当該ペプチドをコードする遺伝子を各種発現ベクター等に組込んで細胞に導入し、発現させた後、公知の回収法及び精製法により得てもよい。
【００３１】
あるいは、市販のキット、例えば、試薬キットＴＮＴＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、ＲＴＳ（フナコシ）等を用いた無細胞タンパク質合成系により当該ペプチドを産生し、公知の回収法及び精製法により得てもよく、限定はされない。
また、化学合成ペプチドは、公知のペプチド合成方法を用いて得ることができる。合成方法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法及び酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置を使用してもよい。合成反応後は、クロマトグラフィー等の公知の精製法を組み合わせてペプチドを精製することができる。
【００３２】
本発明においては、前記配列番号１〜４に示されるアミノ酸配列を含むペプチド、及び前記（ａ１）〜（ａ４）のペプチドは、当該ペプチドの誘導体の態様であってもよい。当該誘導体とは、当該ペプチドに由来して調製され得るものをすべて含む意味であり、例えば、構成アミノ酸の一部が非天然のアミノ酸に置換されたものや、構成アミノ酸の一部に化学修飾が施されたもの等が挙げられる。ここで、上記化学修飾としては、特に限定はされないが、例えば、アミド化やピルグルタミル化等の生体内で行われる生体による修飾、極性基や非極性基の付加等によるペプチドの物理化学的特性の変更を意図した修飾、ならびに、蛍光標識、酵素標識、放射線標識、その他のタグ付加等の利用目的による修飾など、様々な修飾が採用され得る。
【００３３】
本発明においては、前記配列番号１〜４に示されるアミノ酸配列を含むペプチド、及び前記（ａ１）〜（ａ４）のペプチド（上記誘導体の場合も含む）は、当該ペプチドの塩の態様であってもよい。塩としては、生理学的に許容される酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
【００３４】
塩は、塩酸などの適切な酸、又は水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用いて調製することができる。例えば、水中、又はメタノール、エタノール若しくはジオキサンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、標準的なプロトコルを用いて処理することにより調製することができる。
【００３５】
本発明においては、本発明のペプチドを用いるナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精の誘起方法も提供する。同様に、本発明のペプチドを用いるナマコ綱に属する無脊椎動物の製造方法を提供する。当該方法は、被験動物に対して本発明のペプチドを投与する工程を含む方法であり、それ以外にどのような工程を含むものであってもよく、限定はされない。被験動物としては、特に限定はされるものではなく、ナマコ綱に属する無脊椎動物が挙げられる。そのような動物としては、例えば、ニセクロナマコ、ハネジナマコ、イシナマコ、バイカナマコ、チブサナマコ、ヨコスジオオナマコ、トゲクリイロナマコ、クリイロナマコ、ヨコスジナマコ、シカクナマコ、アデヤカバイカナマコ、ジャノメナマコ、アカミシキリ、クロナマコ、マナマコ、ミツマタナマコ、オニイボナマコ等が挙げられ、その他にも、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｇｒａｂｅｒｒｉｍａ、Ｐａｒａｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｐａｒｖｉｍｅｎｓｉｓ、Ａｕｓｔｒａｌｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｍｏｌｌｉｓ、Ｃｕｃｕｍａｒｉａ  ｇｅｏｇｌａｎａ、Ａｂｙｓｓｏｃｕｃｕｍｉｓ  ａｌｂａｔｒｏｓｓｉ、Ｌｅｐｔｏｓｙｎａｐｔａ  ｔｅｎｕｉｓなどのナマコを用いることもできる。特に、本発明においては、公知の種々の食用ナマコ種を用いることができる。
本発明のペプチドの投与方法については、例えば、産卵期の成熟親個体の体内空間（体腔）内部への注射による投与方法等を適宜適用することができるが、この方法に限定されるものではない。本発明のペプチドの用法、用量については、体内での最終濃度は個体のホルモン感受性（性成熟度と理解してもよい）により有効濃度が決まるため、特に限定されるものではないが、例えば１０−８Ｍ程度の濃度で適宜投与すればよい。
【００３６】
なお、被験動物の生体内に本発明のペプチドを投与する場合は、本発明の誘起剤の有効成分である本発明のペプチド等を直接投与してもよいし、あるいは本発明のペプチドをコードするＤＮＡの状態で導入（遺伝子導入）してもよく、限定はされない。ＤＮＡの導入は、リポソーム法（リポプレックス法）、ポリプレックス法、ペプチド法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、及びウイルスベクター法などの公知の各種遺伝子導入方法を用いて行うことができる。
【００３７】
ここで、ナマコ類の放卵又は放精活性を有するペプチドの具体例として、ニセクロナマコ由来のペプチドのアミノ酸配列とそれをコードするｃＤＮＡの塩基配列を、以下に示す。
2018079861.tif 000003
上記アミノ酸配列中、「／」の表記は、「／」で区切られた各領域が、どのような役割等を有する部分であるかを説明するための便宜上の表記である。
まず、Ｎ末端側から説明すると、
「ＭＡＳＫＴＩＲＶＶＦＦＡＡＶＣＶＬＬＶＬＥＥＡＡＳ」（配列番号６３）の部分はシグナル配列であり（活性には不要な取り除かれる部分）、
「ＴＲＬＣＧＲＥＬＳＲＡＩＹＲＩＣＳＨ」（配列番号６５）の部分はＢ鎖に相当する部分であり、「ＧＫＲ」の部分はＢ鎖とＣ鎖の切断部分となる配列であり（活性には不要な取り除かれる部分；先頭にＧがあるので、直前のＢ鎖の末端のＨはアミド化される）、
「ＧＹＰＭＶＤＬＥＥＥＤＦＳＱＥＬＤＴＥＷＤＥＦＬＡＱＡＬＴＧＬＬＥＳＲＴＦＡＡＤＩＥＳＤＲＹＦＴＩＰＱ」（配列番号６７）はＣ鎖であり（活性には不要な取り除かれる部分）、
「ＲＦＲＲ」（配列番号６９）の部分はＣ鎖とＡ鎖の切断部分となる配列であり（活性には不要な取り除かれる部分）、
「ＳＧＧＩＡＲＲＣＣＡＳＧＣＳＳＳＤＩＡＫＬＣ」（配列番号７１）の部分はＡ鎖に相当する部分である。
【００３８】
2018079861.tif 000004
2018079861.tif 000005
上記塩基配列においても、「／」の表記は、上記アミノ酸配列と同様の意味の便宜上の表記である。
まず、５’末端側から説明すると、
「ＡＴＧＧＣＧＴＣＣＡＡＡＡＣＡＡＴＣＡＧＧＧＴＡＧＴＣＴＴＣＴＴＴＧＣＡＧＣＣＧＴＴＴＧＴＧＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＣＧＴＣＧ」（配列番号６２）の部分はシグナル配列をコードするｃＤＮＡであり、
「ＡＣＡＡＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＡＣＴＡＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＴＴＴＡＴＣＧＴＡＴＴＴＧＴＴＣＡＣＡＴ」（配列番号６４）の部分はＢ鎖に相当する部分をコードするｃＤＮＡであり、
「ＧＧＣＡＡＡＡＧＡ」の部分はＢ鎖とＣ鎖の切断部分となる配列をコードするｃＤＮＡであり、
「ＧＧＴＴＡＴＣＣＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＡＧＴＣＡＧＧＡＡＣＴＡＧＡＣＡＣＡＧＡＧＴＧＧＧＡＴＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＣＴＣＡＧＧＣＴＴＴＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＣＡＣＧＧＡＣＧＴＴＴＧＣＧＧＣＡＧＡＣＡＴＣＧＡＡＴＣＣＧＡＣＡＧＡＴＡＣＴＴＴＡＣＴＡＴＡＣＣＴＣＡＧ」（配列番号６６）はＣ鎖をコードするｃＤＮＡであり、
「ＡＧＡＴＴＣＡＧＡＣＧＡ」（配列番号６８）の部分はＣ鎖とＡ鎖の切断部分となる配列をコードするｃＤＮＡであり、
「  ＡＧＴＧＧＡＧＧＴＡＴＣＧＣＧＣＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＴＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＧＴＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＡＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡＴＴＡＴＧＣ  」（配列番号７０）の部分はＡ鎖に相当する部分をコードするｃＤＮＡである。
【００３９】
２．本発明のペプチドの採取
本発明のペプチドを、ナマコ綱に属する無脊椎動物から採取する方法を以下に説明する。
（１）ナマコ
ナマコは、棘皮動物門ナマコ綱に属する無脊椎動物であり、当該動物は、さらに、無足亜綱、楯手亜綱、樹手亜綱に区分される。このうち殆どの食用ナマコ類は、楯手亜綱に含まれ、楯手亜綱は、さらに、楯手目、板足目に区分される。そして、殆どの食用ナマコ類は、楯手目に含まれる。樹手亜綱には樹手目が含まれ、無足亜綱には無足目が含まれる。
本発明においては、楯手目内のクロナマコ科、シカクナマコ科に含まれる食用ナマコ類、及び樹手目キンコ科に含まれる食用ナマコ類が好ましい。
【００４０】
クロナマコ科には、クロナマコ属、クリイロナマコ属、ジャノメナマコ属などが含まれ、本発明においては、これらの属に属するナマコを使用することができる。
クロナマコ科に含まれ、本発明において使用可能な食用ナマコを以下に示す。
クロナマコ属：イシナマコ、ハネジナマコ、チブサナマコ、クロナマコ、クロホシアカナマコ、アカミシキリ、ニセトラフナマコ、ニセクロナマコ、テツイロナマコ、イソナマコ、トラフナマコ、エクレアナマコ、ミナミフジナマコ、イサミナマコなど
クリイロナマコ属：トゲクリイロナマコ、クリイロナマコ、ヨコスジナマコなど
ジャノメナマコ属：ジャノメナマコ、クロエリナマコ、チズナマコなど
【００４１】
シカクナマコ科には、シカクナマコ属、マナマコ属、バイカナマコ属などが含まれ、本発明においては、これらの属に属するナマコを使用することができる。
シカクナマコ科に含まれ、本発明において使用可能な食用ナマコを以下に示す。
シカクナマコ属：ヨコスジオオナマコ、シカクナマコ、タマナマコ、オニイボナマコなど
バイカナマコ属：バイカナマコ、アデヤカバイカナマコなど
マナマコ属：マナマコ
また、ミツマタナマコ科に属するナマコとして、ミツマタナマコなどが挙げられる。
さらに、循手目内に属するナマコとして、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｇｒａｂｅｒｒｉｍａ、Ｐａｒａｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｐａｒｖｉｍｅｎｓｉｓ、Ａｕｓｔｒａｌｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｍｏｌｌｉｓなどが挙げられる。
【００４２】
樹手目キンコ科には、キンコ属などが含まれ、本発明においては、これらの属に属するナマコを使用することができる。
キンコ科に含まれ、本発明において使用可能な食用ナマコを以下に示す。
キンコ属：キンコなど
また、樹手目には、Ｃｕｃｕｍａｒｉａ  ｇｅｏｇｌａｎａ、Ａｂｙｓｓｏｃｕｃｕｍｉｓ  ａｌｂａｔｒｏｓｓｉなどが含まれる。
さらに無足目には、Ｌｅｐｔｏｓｙｎａｐｔａ  ｔｅｎｕｉｓなどが含まれる。
（２）抽出
生きたナマコの口器部を含む頭部分を切断後、直ちに液体窒素で凍結し、予冷したアセトン液などの中に浸漬し、超低温冷凍庫（例えば−７５℃）で保存する。保存中に、凍結試料中の水分はアセトンに置換されるので、試料中の水分がなくなるまで適宜アセトンを交換する。試料中の水分が抜けた後、減圧乾燥機中でアセトンを気化させて除去する。生物組織を超低温下で凍結保存中に、アセトンのような非水性溶媒で水分を置換除去することで、その後の摘出操作中の核酸・ペプチドの分解を抑えることが出来る。
次に、解剖顕微鏡を用いて乾燥試料から神経組織（例えば放射神経組織）を摘出する。摘出した乾燥放射神経組織は、分解されていない無傷の核酸・ペプチドの抽出に使用することが可能である。神経組織試料に適量の酢酸を加えてホモゲナイズし、ホモゲナイズした試料液を超遠心分離操作し、その上清部分を得る。
得られた超遠心上清を限外ろ過装置で処理し、分子量１０，０００以下の画分を得て精製用試料とする。あるいは、超遠心上清をゲルろ過クロマトグラフィーで処理し、タンパク質・塩類を除去した画分を得て精製用試料とする。
【００４３】
（３）精製
本発明のペプチドの精製は、タンパク質精製に一般に使用される各種クロマトグラフィーを採用することができる。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーにより、精製用試料からタンパク質等の高分子成分を除去する。或いは、分画分子量１０，０００の限外ろ過により高分子成分を除去する。本発明のペプチド成分は、分子量１０，０００以下の画分（低分子活性画分）に回収される。
次に、高速液体クロマトグラフ装置を用いた高速液体クロマトグラフィーにより低分子活性画分を段階的に分離する。クロマトグラフィーで分画された画分について、放卵又は放精活性を測定し、活性が認められた画分について、精製工程を繰り返す。通常は、数回（２回〜５回）程度のクロマトグラフィーで相当程度に精製されたペプチド成分を得ることができる。クロマトグラフィーとしては、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等が挙げられ、これらを単独で、又は適宜組み合わせて利用することができる。
【００４４】
（３）本発明のペプチドの構造解析
本発明のペプチドの構造解析は、精製されたペプチド成分を、その存在量に応じて、プロテインシーケンサー若しくは質量分析装置、又はこれら二つの装置を併用して、アミノ酸配列構造を解析する。得られたアミノ酸配列情報を元に、材料となるペプチドを化学合成し、そのペプチドを用いて人工ホルモンを作製する。
【００４５】
３．ＤＮＡ、遺伝子、組換えベクター、形質転換体
（１）ＤＮＡ、遺伝子
本発明においては、前記（ａ１）〜（ａ４）のいずれかのペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡも包含される。
具体的には、以下の（ａ１）〜（ａ４）から選ばれるいずれかのヘテロ二量体ペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子も包含される。
（ａ１）配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むヘテロ二量体ペプチド
（ａ２）配列番号６及び配列番号８に示されるアミノ酸配列（システイン残基を除く）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチド
（ａ３）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むヘテロ二量体ペプチド
（ａ４）配列番号１０に示されるアミノ酸配列（システイン残基を除く）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチド
本発明においては、上記（ａ１）及び（ａ２）における「配列番号６及び配列番号８」に代えて、配列番号２４及び配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７、配列番号２８及び配列番号２９、配列番号３０及び配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９、配列番号４０及び配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３、配列番号４４及び配列番号４５、配列番号４６及び配列番号４７、配列番号４８及び配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１、配列番号５２及び配列番号５３、配列番号５４及び配列番号５５、配列番号５６及び配列番号５７、配列番号５８及び配列番号５９、並びに配列番号６０及び配列番号６１の各組合せ（表１）のうちのいずれかを選択することもできる。
【００４６】
また、本発明は、以下の（ｂ１）〜（ｂ４）から選ばれるいずれかのＤＮＡを含む遺伝子も包含される。
（ｂ１）配列番号５及び配列番号７に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ２）配列番号５及び配列番号７に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチドをコードするＤＮＡ
（ｂ３）配列番号９に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ４）配列番号９に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチドをコードするＤＮＡ
【００４７】
さらに、本発明においては、前述したヘテロ二量体ペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、すなわち、前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列（配列番号１）又はその具体例である前記式（Ｉ−１）で示されるアミノ酸配列（配列番号３）を含むペプチド、及び前記式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列（配列番号２）又はその具体例である前記式（ＩＩ−１）で示されるアミノ酸配列（配列番号４）を含むペプチドを含み、かつ、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起活性を有するヘテロ二量体ペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子も包含される。
当該ＤＮＡは、詳しくは、例えば、前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列（配列番号１）又はその具体例である前記式（Ｉ−１）で示されるアミノ酸配列（配列番号３）を含むペプチドをコードするＤＮＡと、前記式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列（配列番号２）又はその具体例である前記式（ＩＩ−１）で示されるアミノ酸配列（配列番号４）を含むペプチドをコードするＤＮＡとを含むものが挙げられる。
【００４８】
本発明において、前記ＤＮＡは、本発明のペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡであってもよいし、あるいは、当該塩基配列を一部に含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列（転写プロモーター、ＳＤ配列、Ｋｏｚａｋ配列、ターミネーター等）を含むＤＮＡであってもよく、限定はされない。なお、本発明のペプチドをコードする塩基配列では、コドンの種類は限定されず、例えば、転写後、ナマコ綱に属する無脊椎動物において一般的に使用されているコドンを用いたものであってもよいし、大腸菌や酵母等の微生物や、植物等において一般的に使用されているコドンを用いたものであってもよく、適宜選択又は設計することができる。
【００４９】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよく、「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５０】
上記以外にハイブリダイズが可能なＤＮＡとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号５及び配列番号７に示される塩基配列を含むＤＮＡ又は配列番号９に示される塩基配列を含むＤＮＡ、あるいは、配列番号６及び配列番号８（あるいは、先に述べた他のアミノ酸配列の配列番号の組合せ（例えば、配列番号２４及び配列番号２５など））に示されるアミノ酸配列を含むヘテロ二量体ペプチドをコードするＤＮＡ又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むヘテロ二量体ペプチドをコードするＤＮＡと、約５０％以上の相同性（同一性）を有するＤＮＡや、さらには約８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性（同一性）を有するＤＮＡを挙げることができる。
但し、前記ＤＮＡの塩基配列においては、Ｃｙｓモチーフを構成するシステイン残基をコードするコドンは、他のアミノ酸残基へのコドンに変異しないことが好ましい。
【００５１】
（２）組換えベクター
本発明においては、適当なベクターに上記本発明のＤＮＡを連結（挿入）することにより組換えベクターを得る。組換えベクターを得る方法は公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２））。本発明のＤＮＡを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ウイルス等が挙げられる。
【００５２】
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。またウイルスとしてはアデノウイルスやレトロウイルスなどが挙げられる。
本発明の組換えベクターには、プロモーター、本発明のＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子などを連結することができる。なお、選択マーカー遺伝子としては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。レポーター遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体（ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ等の蛍光タンパク質）、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、ＬａｃＺ等の遺伝子が挙げられる。
【００５３】
（３）形質転換体及び培養
本発明においては、上記本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入して得ることができる形質転換体も包含される。
形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。ヤギ等の哺乳動物を宿主として使用することも可能である。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２））。
【００５４】
細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列を含めることができる。細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などが挙げられる。プロモーターとしては、例えばｌａｃプロモーターなどが用いられる。細菌へのベクター導入法としては、公知の各種導入方法、例えばカルシウムイオン法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター等が挙げられる。酵母へのベクター導入法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
そして、前記形質転換体を培養し、その培養物から放卵または放精を誘起するペプチドを採取する。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
【００５５】
培養後、目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりペプチドを抽出する。また、目的ペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、ペプチドの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
【００５６】
４．ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起剤
本発明のペプチドは、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起のための有効成分として有用である。
【００５７】
（１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの排卵誘発
ナマコの産卵期において、性成熟した親個体から外科的に摘出した卵巣を海水または人工海水に浸し、合成ホルモンを加えて自然海水温程度の温度下で培養すると、１時間程度で卵巣からの排卵現象を誘起することができる。精巣の場合は、海水中で精巣組織上皮層に傷を付けるだけで傷口から精子が漏れ出してくる。海水に触れた精子は間もなく遊泳を開始する。
【００５８】
（２）ｉｎ  ｖｉｖｏでの放卵または放精の誘発
ナマコの産卵期において、性成熟した親個体に、本発明のペプチドを投与して海水中に静置すると、１時間程度で雄では放精行動、雌では放卵行動を誘起することができる。
本発明のペプチドは、種の違いを越えて広くナマコ類の産卵を誘発する生理作用を持つ。従って、採取されたペプチドが由来するナマコの種類に限定されず、他種のナマコにも適用することができる。
他種への適用として、例えばニセクロナマコ由来のペプチドを、クロナマコ、イシナマコ、マナマコなどに使用することができ、ハネジナマコ由来のペプチドを、ニセクロナマコ、イシナマコなどに使用することができる。
【００５９】
（３）用法
本発明の誘起剤の投与量は、被験動物（ナマコ綱に属する無脊椎動物）の年齢、性別、体重などにより異なっていてもよい。通常、成体一匹あたり、一回につき体内最終濃度として１０−１１Ｍ〜１０−８Ｍの範囲で投与することができるが、限定はされない。本発明においては、１０−８Ｍ程度でよい。
例えば注射剤により投与する場合は、ナマコ綱に属する無脊椎動物に対し、１回の投与において成体一匹（１０００ｇ体重あたり）、１０−８〜１０−５Ｍの濃度の注射用高濃度ペプチド溶液１ｍｌを投与することができる。投与は１回のみでもよい。投与の形態としては、体腔内注射、皮下注射などが挙げられるが、好ましくは体腔内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により無菌化することもできる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。すなわち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００６０】
５．ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起用キット
本発明においては、構成成分として本発明のペプチドを含むことを特徴とする、ナマコ綱に属する無脊椎動物における放卵又は放精誘起用キットも提供される。本発明のキットは、ナマコ綱に属する各動物の放卵又は放精の誘起を行うことが可能である。
本発明のキットは、本発明のペプチドの他に、各種バッファー、滅菌水、操作マニュアル（説明書）等を含んでいてもよく、限定はされない。
【００６１】
６．棘皮動物（ナマコ綱に属する無脊椎動物）の生産方法
本発明においては、ナマコ綱に属する無脊椎動物における産卵期において、性的に成熟した雄ナマコ、雌ナマコに本発明のペプチドを投与することで、放精・放卵を誘起することができる。得られた精子・卵を用いて人工授精させることで、受精卵の発生を開始させることができる。受精卵を飼育することにより、養殖用または種苗放流用の稚ナマコが得られる。
本発明のペプチドを摘出した生殖巣に作用させるには、産卵期に性成熟した親個体から摘出した卵巣を用いて、本発明のペプチドとともに培養する。これにより排卵を誘起することができる。排卵された卵に精子を人工授精することで、受精卵の発生を開始させることができる。上記と同様に受精卵を飼育して、養殖用または種苗放流用の稚ナマコを得ることができる。
【００６２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００６３】
ペプチドの単離・精製
以下の手順で、活性のあるペプチドを抽出、精製した。【００６４】
１．抽出
（ｉ）生きたナマコの口器部を含む頭部分を切断後、直ちに液体窒素で凍結し、−７５度で予冷した１００％アセトン液中に浸漬し、超低温冷凍庫（−７５度）で保存した。
（ｉｉ）試料中の水分がなくなるまで適宜アセトンを交換し、試料中の水分が抜けた後、減圧乾燥機中、アセトンを気化させて除去した。
（ｉｉｉ）解剖顕微鏡を用いて乾燥試料から神経組織を高純度に摘出した。
（ｉｖ）摘出した乾燥神経組織は、分解されていない無傷の核酸・ペプチドの抽出に使用した。（（ｉ）〜（ｉｖ）：有機溶媒置換凍結乾燥法）
（ｖ）神経組織試料に適量の２規定酢酸を加えてポリトロンなどの試料破砕装置を用いてホモゲナイズした。
（ｖｉ）ホモゲナイズした試料液を、超遠心分離操作（１００，０００×ｇ，１時間）の後、超遠心上清部分を得た。
（ｖｉｉ）超遠心上清を凍結乾燥し、神経抽出物乾燥標品として保存した。
（ｖｉｉｉ）神経抽出物乾燥標品を人工海水に溶解し、限外ろ過装置（ミリポア社など）で処理し、分子量１０，０００以下の画分を得て精製用試料とした。または、神経抽出物乾燥標品を人工海水に溶解し、ゲルろ過クロマトグラフィーで処理し、タンパク質・塩類を除去した画分を得て精製用試料とする。【００６５】
２．クロマトグラフィー精製
（ｉ）第１段ゲル濾過クロマトグラフィー：
人工海水で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ３０カラム（内径２６ｍｍ  ｘ  カラム長６００ｍｍ）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、精製用試料からタンパク質等の高分子成分を除去した。或いは、ザルトリウス社Ｖｉｖａｆｌｏｗ  ５０（分画分子量１０，０００）を用いた限外ろ過により高分子成分を除去した。本発明のペプチド成分は、分子量１０，０００以下の画分（低分子活性画分）に回収された。
（ｉｉ）第２段高速液体クロマトグラフィー：
ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８カラム（内径１０ｍｍ  ｘ  長さ２５０ｍｍ）を用いてアセトニトリルの直線濃度勾配（４−４０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸、流速毎分３ｍｌ）による逆相液体クロマトグラフィーによりホルモン活性画分を分離した。
（ｉｉｉ）第３段高速液体クロマトグラフィー：
ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８カラム（内径４．６ｍｍ  ｘ  長さ２５０ｍｍ）を用いてアセトニトリルの直線濃度勾配（４−３２％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸、流速毎分１ｍｌ）による逆相液体クロマトグラフィーによりホルモン活性画分を分離した。
（ｉｖ）第４段高速液体クロマトグラフィー：
Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ−ＡＲ−３カラム（内径４ｍｍ  ｘ  長さ１５０ｍｍ）を用いてアセトニトリルの直線濃度勾配（４−１６．８％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸、流速毎分０．６ｍｌ）による逆相液体クロマトグラフィーによりホルモン活性画分を分離した。
（ｖ）第５段高速液体クロマトグラフィー：
Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ−ＡＲ−３カラム（内径４ｍｍ  ｘ  長さ１５０ｍｍ）を用いてアセトニトリルの直線濃度勾配（４−２０．８％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸、流速毎分０．１ｍｌ）による逆相液体クロマトグラフィーにより主活性画分を分離した。
（ｖｉ）第６段高速液体クロマトグラフィー：
Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ−ＡＲ−３カラム（内径１．５ｍｍ  ｘ  長さ２５０ｍｍ）を用いてアセトニトリルの直線濃度勾配（Ｘ−ＸＸ％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸、流速毎分０．１ｍｌ）による逆相液体クロマトグラフィーにより副活性画分を分離した。
クロマトグラフィーの実施例を図１〜図６に示す。【００６６】
３．ホルモン成分の構造解析
（ｉ）逆相高速液体クロマトグラフィーにより得られた精製ホルモン成分を、プロテインシーケンサー（ＡＢＩ社Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９２ｃＬＣ）および質量分析装置（日立ＮａｎｏＦｒｏｎｔｉｅｒ  Ｌ、ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ  ＲＥＦＲＥＸ  ＩＩＩ）を用いて、そのアミノ酸配列構造を解析した。
（ｉｉ）得られたアミノ酸配列情報を元に、材料となるペプチドを化学合成し、そのペプチドを用いて人工ホルモンを作製した。
化学合成したニセクロナマコインスリン様ペプチドＡ鎖（ニセクロＡ鎖という）およびＢ鎖（ニセクロＢ鎖という）をそれぞれ２０ｍＭ酢酸で溶解し、５ｍＭペプチド溶液を調製した。二量体の形成には、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（２８９巻  ６３９−６４６頁）等の方法を参考にした。
５ｍＭニセクロＡ鎖溶液３２０μｌ（１．６μｍｏｌｅ）、５ｍＭニセクロＢ鎖溶液２４０μｌ（１．２μｍｏｌｅ）、１Ｍ  ジチオスレイトール水溶液１４４μｌ、水６６０μｌを５０ｍｌ遠沈管中で混ぜ合わせた後、１Ｍグリシンバッファ（ｐＨ１０．５）７２μｌを加えて溶液を塩基性として、４℃で１７日間、空気酸化を行なった。反応の進行をＨＰＬＣを用いて確認し、原料ペプチドピークが減少し、目的成分および副生成物のピークの出現が確認されたところで４Ｍ酢酸を加えて反応液を酸性として反応を停止した。反応物をＨＰＬＣにより精製し、合成ニセクロナマコインスリン様ペプチド０．６３ｍｇ（０．１５μｍｏｌｅ）を得た。
【実施例２】
【００６７】
卵巣に対する活性試験
産卵期のナマコ類の卵巣内部には、受精能を持たない未成熟の卵母細胞が、一つずつ個別に濾胞細胞層に包まれた状態で存在する。未成熟の卵母細胞内には、大きな１個の核（卵核胞）が存在する。これらの卵母細胞は、産卵誘発ホルモンの作用により受精可能な卵細胞へと変化すると同時に排卵される。この変化の過程を卵成熟と呼ぶ。このとき、核膜の消失により卵核胞が見えなくなる（卵核胞崩壊）。
産卵誘発ホルモン活性の有無は、未成熟な卵母細胞に排卵と卵核胞崩壊を誘起するか否かで判定することが出来る。【００６８】
１．方法
（ｉ）産卵期の性成熟した雌個体から、卵巣の一部または全部を外科的に摘出し、室温あるいは自然海水温度に調温した自然海水または人工海水中に保存した。
（ｉｉ）解剖鋏などを用いて、摘出した卵巣から実験目的に適した大きさの卵巣断片を調製した。血球凝集反応板（トミー精工）や２４穴マルチウェルプレート等を用いてホルモンとの培養試験を行う場合には、５ｍｍ長程度の卵巣片を調製する。
（ｉｉｉ）合成ホルモンを段階的に希釈して種々の濃度となるように海水または人工海水に溶かしたものを血球凝集反応板の各ウェルに２００マイクロリットル程度に満たし、卵巣片を浸して２時間培養した。ホルモン濃度は、１０−７Ｍ〜１０−１２Ｍ程度の範囲となるように調整した。培養温度は、産卵期の自然海水温度（２０℃）で行った。【００６９】
２．結果
（ｉ）合成ホルモンと共に培養することで、産卵期の発達した卵巣片に排卵現象を誘起できた。排卵現象は、濾胞細胞が離脱した裸の卵が卵巣片から絞り出されるか、または、こぼれ落ちて来ることで確認した。また、排卵された卵は卵核胞崩壊（核膜の消失）を起こしていることを確認した。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける合成ホルモンによる排卵の誘発試験の結果を、下記表に示した。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの排卵の写真を図８に示した。【００７０】
【表２】
2018079861.tif 000006
【００７１】
ここで、上記表中、「日付」欄は排卵誘発実験の実施日を示す。「ホルモン」欄は合成したニセクロナマコホルモン（表中では「ニセクロ」）、ハネジナマコホルモン（表中では「ハネジ」）を示す。「卵巣」欄は、排卵誘発試験に用いたナマコ種名を示し（表中、「クロ」はクロナマコ、「ニセクロ」はニセクロナマコ）、ナマコ種名の後のＡ〜Ｅは、ナマコ個体識別名を示す。
また、「ホルモン濃度」欄の各数値は、排卵度を、４（１００％排卵）〜０（０％排卵）の範囲で示したものであり、各行は同時に行った試験区（Ｎ＝３〜５）の排卵度の平均値である。その結果、ニセクロナマコ、ハネジナマコの合成ホルモンが、異なる種の卵巣に作用することが示された。
マナマコでは、排卵を誘発するクビフリンの有効濃度（ＥＤ５０など）は個体差が大きいことが知られている。これは同一時期であっても、個体間で卵巣の発達の程度が異なることに因ると思われる。ニセクロナマコでも同様の傾向が見られた。【００７２】
（ｉｉ）卵巣片中の全ての卵数に対する排卵された卵数の割合を排卵率と定義し、ホルモン濃度と排卵率との関係を検討した。次に、ホルモンのＥＤ５０（半数有効濃度）等の有効濃度の指標を求めた。
その結果、ホルモンに反応して排卵が起きる場合の、用いたホルモンの最高濃度はたかだか１０−８Ｍであった。よりホルモン感受性の高い卵巣では、１０−１２Ｍ以下のホルモン濃度でも排卵が誘起された。
【実施例３】
【００７３】
個体に対する活性試験
本実施例では、産卵期の性成熟した雄または雌個体の体腔内部に合成ホルモンを投与することで放精行動または放卵行動を誘起した。以後、これらのどちらかまたは両方を意味する場合に産卵行動と言う場合がある。
ニセクロナマコ、ハネジナマコ及びマナマコの合成ホルモンを作製し、様々な種のナマコに投与して産卵行動の誘発を試験した。合成ホルモンと試験に供するナマコの種の組み合わせを変えることで、合成ホルモンの汎用性と種毎の感受性を求めることができる。そこで本実施例では、ニセクロナマコ、ハネジナマコ及びマナマコ由来のホルモン（合成ペプチド）を用いて、他種ナマコの放精・放卵行動を誘起した。
なお、ニセクロナマコの合成ホルモンは、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むペプチドと、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むペプチドとを含む、ヘテロ二量体ペプチドであり、
ハネジナマコの合成ホルモンは、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含むペプチドと、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含むペプチドとを含む、ヘテロ二量体ペプチドであり、
マナマコの合成ホルモンは、配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含むペプチドと、配列番号４３で示されるアミノ酸配列を含むペプチドとを含む、ヘテロ二量体ペプチドである。【００７４】
１．方法
産卵期の性成熟した様々な種のナマコ個体（ニセクロナマコなど）の体腔内に、各種ナマコ（前述したニセクロナマコ、ハネジナマコ及びマナマコ）の合成ホルモンを溶かした海水（ホルモン液）を、注射法で投与した。また、体腔内での最終濃度を様々に変えて合成ホルモンを投与することで、ホルモンの有効投与量を求めることができる。ナマコの体重を測定し、同重量の水に対するホルモン量を定めることで、体液中のホルモン濃度を調整した。【００７５】
２．結果
（ｉ）体腔内のホルモンの最終濃度（体内最終濃度）は１０−９Ｍであり、たかだか１０−８Ｍ濃度を超えない濃度で人為的に産卵行動を誘起することができた。
（ｉｉ）合成ニセクロナマコホルモンで、ニセクロナマコ、イシナマコ、マナマコ、ヨコスジオオナマコ、トゲクリイロナマコの産卵行動を誘起することができた。
（ｉｉｉ）合成ハネジナマコホルモンで、ニセクロナマコ、イシナマコ、マナマコ、ヨコスジオオナマコ、トゲクリイロナマコの産卵行動を誘起することができた。
（ｉｖ）合成マナマコホルモンで、マナマコ、ヨコスジオオナマコ、トゲクリイロナマコの産卵行動を誘起することができた。
以上の結果をまとめたものを、下記表３に示した。【００７６】
【表３】
2018079861.tif 000007
【実施例４】
【００７７】
種苗生産
１．方法
（ｉ）産卵期に捕獲したニセクロナマコ個体から部分切開法により得た生殖腺の一部の顕微鏡観察により、精巣・卵巣の区別を行い雌雄判定を行った。
（ｉｉ）卵巣の場合は、卵巣内の卵母細胞の平均卵径を測定し、その大きさから卵巣の発達度を判定した。
（ｉｉｉ）精巣の場合は、精巣片の切断面から泳ぎ出す精子の有無及びその遊泳の程度から精巣の発達度を判定した。
（ｉｖ）発達度の高い生殖腺を持つ雌雄個体に、体重に合わせて適当量のホルモン液を投与することで、およそ１時間程度で産卵行動を誘起した。
（ｖ）雌雄の個体数を調整して、同時に同じ水槽内で産卵誘発を行うことができる。雄の個体数を調節することで至適な精子濃度に調整する事ができる。【００７８】
２．結果
雌雄を別々の水槽で産卵誘発を行い、雌が放卵した水槽内へ、雄が放精した水槽の海水（精子海水）を適当量混ぜることで、受精に至適な精子濃度を得た。
雌個体から外科的に摘出した卵巣をホルモン処理して排卵を誘発し、排卵された卵細胞に適当量の精子海水を加えることでｉｎ  ｖｉｔｒｏで人工授精することができた。
【実施例５】
【００７９】
ｃＤＮＡのクローニング
１．ニセクロナマコ神経ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出
１−１．ＲＮＡ抽出用ニセクロナマコ周口神経組織採集
採取後すみやかに液体窒素で凍結したニセクロナマコ頭部を冷却した（−７５℃）アセトンに１週間浸漬、冷却した（−７５℃）エタノールに１週間浸漬したのち、液中から取り出したニセクロナマコ頭部を凍結乾燥した。
乾燥したニセクロナマコ頭部から実体顕微鏡を用いて神経組織を採取した。【００８０】
１−２．ニセクロナマコ周口神経組織からｔｏｔａｌＲＮＡ抽出
前記１−１のニセクロナマコ神経組織にＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，現Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えてヒスコトロンにより破砕、クロロホルムを加えて激しく攪拌後、遠心分離により二層に分離し、上層のＲＮＡ含有画分を分画した。ＲＮＡ画分にイソプロパノールを加えてＲＮＡを沈殿させる。遠心分離により沈殿と上清に分画。上清を除去した後、７５％ＥｔＯＨで洗浄した。得られた沈殿をスピンカラム（ＡｌｌＰｒｅｐＤＮＡ／ＲＮＡ  ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）のＲＮＡ精製プロトコル）を用いて精製した。【００８１】
２．ニセクロナマコインスリン様ペプチドの遺伝子断片情報の取得
２−１．ニセクロナマコ周口神経組織ｍＲＮＡの逆転写
前記１−２で精製したニセクロナマコ周口神経由来ｔｏｔａｌＲＮＡ（０．１９μｇ／４μｌ）をＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ｔａｋａｒａ  ｂｉｏ）を用いて標準プロトコル１／２量で逆転写した。逆転写ｐｒｉｍｅｒとしてＯｌｉｇｏ  ｄＴ  Ｐｒｉｍｅｒを使用した。【００８２】
２−２．ニセクロナマコ周口神経ｃＤＮＡからインスリン様ペプチド部分配列のＰＣＲ増幅
ハネジナマコインスリン様ペプチド配列を元に作成したプライマーを用いてニセクロｃＤＮＡよりニセクロインスリン様ペプチドのクローニングを試みた。ＥＸＴａｑ（ｔａｋａｒａ  ｂｉｏ）を使用し反応系３０μｌ系，９４℃  ２ｍｉｎ（９８℃  １０ｓ，４５℃  ３０ｓ，７２℃  ３０ｓ，３０ｃｙｃｌｅｓ），７２℃  １０ｓで増幅した。ＰＣＲ増幅産物はスピンカラム（ＥＺ−１０  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）を用いて精製した。【００８３】
使用プライマー
Ｈｓ−Ｂ３４ｓ−Ｆ２２：  ＴＡＴＣＧＴＧＴＡＴＧＴＴＣＡＣＡＣＧＧＣＡ（配列番号１６）
Ｈｓ−Ａ４３ｓ−Ｒ２５：  ＡＧＣＡＴＡＡＴＴＴＧＧＣＡＡＴＡＴＣＴＧＡＧＧＡ（配列番号１７）【００８４】
２−３．カナマイシン耐性ベクターへの増幅断片へのライゲーションおよび形質転換
精製した増幅断片をＤｙｎａＥｘｐｒｅｓｓ  ＴＡ  ＰＣＲＣｌｏｎｉｎｎｇ  ｋｉｔ（ｐＴＡＫＮ−２）（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を利用し、カナマイシン耐性ベクターにライゲーションした。反応は標準プロトコルの１／２量の５μｌ系で行なった。１６℃  ３０ｍｉｎでインキュベートした後、ライゲーションにより得られたプラスミドの導入をヒートショックによる形質転換をコンピテントセル化した大腸菌（ＤＨ５α）（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行なった。形質転換した大腸菌をＬＢ寒天培地に播種したのち、３７℃一晩培養した。【００８５】
２−４．コロニーＰＣＲ
前項５．で３７℃一晩培養したＬＢ寒天培地から大腸菌コロニーをＴＥバッファ２０μｌに懸濁、９５℃  ３ｍｉｎ加熱処理した溶液を鋳型としてプラスミドベクター由来の配列のシーケンスプライマー（Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ）を用いてコロニーＰＣＲ（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒ（ｔａｋａｒａ  ｂｉｏ），反応系１００μｌ系，９８℃  １０ｓ，５５℃  ５ｓ，７２℃  ４０ｓ，３０ｃｙｃｌｅｓ）を行なった。目的のニセクロナマコ配列断片を含む増幅産物をスピンカラム（ＥＺ−１０  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）により精製した。【００８６】
２−５．ダイターミネーター法によるＤＮＡシークエンシング（ＢｉｇＤｙｅ反応）
前記２−４で精製したコロニーＰＣＲ産物の配列決定をダイターミネター法（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ）により行った。Ｍ１３ｐｒｉｍｅｒ（Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）をシーケンスプライマーとして反応系１０μｌ系（ＢｉｇＤｙｅの量標準の１／８量），９４℃  １ｍｉｎ，（９４℃  ５ｓ，５０℃  １０ｓ，７２℃  ３ｍｉｎ，３０ｃｙｃｌｅｓ）でシーケンス反応を行った。シーケンス反応後、エタノール沈殿による精製を行ない、キャピラリーＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ３５００ｘｌもしくはＡＢＩ３１３０ｘｌ）により、下記のとおり、ニセクロナマコインスリン様ペプチド遺伝子断片（配列番号１８）のＤＮＡ情報を得た。【００８７】
2018079861.tif 000008
【００８８】
３．ニセクロナマコインスリン様ペプチド遺伝子の５’ＲＡＣＥによる５’側配列の決定
３−１．ニセクロナマコ周口神経の５’ＲＡＣＥ  Ｌｉｂｒａｒｙの作成
ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ５’／３’ｋｉｔを使用してニセクロ周口神経５’ＲＡＣＥ  Ｌｉｂｒａｒｙを作成した。（標準プロトコルの１／２量）。作成した５’ＲＡＣＥ  Ｌｉｂｒａｒｙを５．５倍希釈して保存した。【００８９】
３−２．ニセクロナマコ周口神経５’ＲＡＣＥ  Ｌｉｂｒａｒｙからのインスリン様ペプチドの増幅
ニセクロナマコ周口神経５’ＲＡＣＥ  Ｌｉｂｒａｒｙから、ＳＭＡＲＴｅｒ付属ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘと前記２−５で決定した配列から設計した特異プライマーを用いたＰＣＲによりニセクロナマコインスリン様ペプチド遺伝子の増幅を試みた。ＰＣＲ酵素ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  反応系１０μｌ系，（９８℃  １０ｓ，５５℃  ５ｓ，７２℃  ８０ｓ，３０ｃｙｃｌｅｓ）で２回増幅したのち、ＥＸ  Ｔａｑ  反応系５０μｌ系，９４℃  ２ｍｉｎ，（９８℃  １０ｓ，５８．４℃  ３０ｓ，７２℃  ４５ｓ，３０ｃｙｃｌｅｓ），７２℃１０ｓで１回増幅の計３回増幅した。ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動後、約４００ｂｐのバンドを切り出し、スピンカラム（ＥＺ−１０  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  ＤＮＡ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）で精製した。【００９０】
ニセクロナマコ遺伝子断片の配列情報から設計したプライマー
ｎｉｓｅ−５’＿ＧＳＰＢ３８−Ｒ３０：  ＧＡＣＴＧＡＡＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡ（配列番号１９）【００９１】
３−３．カナマイシン耐性ベクターへの増幅断片へのライゲーションおよび形質転換
精製した増幅断片をＤｙｎａＥｘｐｒｅｓｓ  ＴＡ  ＰＣＲＣｌｏｎｉｎｎｇ  ｋｉｔ（ｐＴＡＫＮ−２）（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を利用し、カナマイシン耐性ベクターにライゲーションした。ライゲーション反応は標準プロトコルの１／２量の５μｌ系で行なった。１６℃３０ｍｉｎでインキュベートした後、ライゲーション反応により得られたプラスミドをコンピテントセル化した大腸菌（ＤＨ５α）（ＴＯＹＯＢＯ）に導入した。形質転換した大腸菌をＬＢ寒天培地に播種したのち、３７℃一晩培養した。【００９２】
３−４．コロニーＰＣＲ
前記３−３で３７℃一晩培養したＬＢ寒天培地から大腸菌コロニーをＴＥバッファ２０μｌに懸濁、９５℃  ３ｍｉｎ加熱した溶液をもちいてプラスミドベクター由来の配列のシーケンスプライマー（Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ）を用いてコロニーＰＣＲ（Ｅｍａｒｌｄ  ＭＡＸ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ｔａｋａｒａ  ｂｉｏ），反応系１０μｌ系，（９８℃  １０ｓ，５０℃  ３０ｓ，７２℃  ４５ｓ，３０ｃｙｃｌｅｓ））を行なった。目的のニセクロナマコ配列断片を含む増幅産物にＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）（標準プロトコルの１／１０希釈）を加え、３７℃  ９０ｍｉｎ，８０℃  １０ｍｉｎで未反応のプライマーおよびｄＮＴＰを除去した。【００９３】
３−５．ダイターミネーター法によるＤＮＡシークエンシング（ＢｉｇＤｙｅ反応）
前記３−４でＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ処理したコロニーＰＣＲ産物の配列決定をダイターミネター法（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ）により行った。Ｍ１３ｐｒｉｍｅｒ（Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）をシーケンスプライマーとして反応系１０μｌ系，９４℃  １ｍｉｎ，（９４℃  ５ｓ，５０℃  １０ｓ，７２℃  ３ｍｉｎ，３０ｃｙｃｌｅｓ）でシーケンス反応をおこなった。シーケンス反応後、エタノール沈殿による精製を行ない、キャピラリーＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ３５００ｘｌもしくはＡＢＩ３１３０ｘｌ）により、下記のとおり、ニセクロナマコインスリン様ペプチド５’ＲＡＣＥ遺伝子断片（配列番号２０）の情報を得た。【００９４】
2018079861.tif 000009
【００９５】
４．ニセクロナマコインスリン様ペプチド遺伝子の３’ＲＡＣＥによる３’側配列の決定
４−１．ニセクロナマコ周口神経の３’ＲＡＣＥ  Ｌｉｂｒａｒｙの作成
ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ５’／３’  ｋｉｔを使用してニセクロ周口神経３’ＲＡＣＥ  Ｌｉｂｒａｒｙを作成した。（標準プロトコルの１／２量）。作成した５’ＲＡＣＥ  Ｌｉｂｒａｒｙを４倍希釈して保存した。【００９６】
４−２．ニセクロナマコ周口神経５’ＲＡＣＥ  Ｌｉｂｒａｒｙからのインスリン様ペプチドの増幅
前記４−１で作成したニセクロナマコ周口神経５’ＲＡＣＥ  Ｌｉｂｒａｒｙから、ＳＭＡＲＴｅｒ付属ｐｒｉｍｅｒと１２．で決定した遺伝子配列から設計した特異プライマー（下記）を用いたＰＣＲによりニセクロナマコインスリン様ペプチド遺伝子の増幅を試みた。ＰＣＲ酵素ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  反応系１０μｌ系，（９８℃  １０ｓ，５４．９℃  ５ｓ，７２℃  ８０ｓ，３０ｃｙｃｌｅｓ）で２回増幅した。【００９７】
５’ＲＡＣＥの結果から作成（シグナルペプチドよりも５’側のプライマー）
ｎｉ３’−ＧＳＰ１２０−Ｆ２６：  ＧＧＧＡＴＡＴＡＣＧＴＧＣＡＴＣＴＴＴＡＣＡＧＧＣＴ（配列番号２１）【００９８】
４−３．ニセクロナマコ周口神経５’ＲＡＣＥ  Ｌｉｂｒａｒｙからのインスリン様ペプチドのｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ  （ＰＣＲ３回目）
前記４−２で増幅したＰＣＲで増幅したＰＣＲ産物をＳＭＡＲＴｅｒ付属ｐｒｉｍｅｒと上記１３で使用したプライマーよりも３’側の特異プライマーを使用してＮＥＳＴ  ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ酵素ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  反応系１０μｌ系，（９８℃  １０ｓ，５４．９℃  ５ｓ，７２℃  ８０ｓ，３０ｃｙｃｌｅｓ）で増幅した。【００９９】
ＰＣＲ産物のＮＥＳＴ  ＰＣＲ（Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ３回目）
ｎｉ３−ＧＳＰ２６９−Ｆ２８：  ＡＴＧＧＣＧＴＣＣＡＡＡＡＣＡＡＴＣＡＧＧＧＴＡＧＴＣＴ（配列番号２２）【０１００】
４−４．ニセクロナマコ周口神経５’ＲＡＣＥ  Ｌｉｂｒａｒｙからのインスリン様ペプチドの増幅ＰＣＲ４回目
前記４−２と同一プライマーセットを用いて、前項１５．のＰＣＲ産物の増幅を行なった。ＰＣＲ酵素ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  反応系５０μｌ系，（９８℃  １０ｓ，５４．９℃  ５ｓ，７２℃  ８０ｓ，３０ｃｙｃｌｅｓ）で増幅した。ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動後、約１．２ｋｂｐのバンドを切り出し、スピンカラム（ＥＺ−１０  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  ＤＮＡ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）で精製した。【０１０１】
４−５．ＰＣＲ産物への末端ｄＡ付加反応
Ｍｉｇｈｔｙ  ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｅｔ  ｆｏｒ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（ｔａｋａｒａ  ｂｉｏ）を用いて前記４−４で精製したＰＣＲ産物末端へのｄＡ付加反応をおこなった。反応後そのままベクターへのライゲーション反応をおこなった。【０１０２】
４−６．カナマイシン耐性ベクターへの増幅断片へのライゲーションおよび形質転換
精製した増幅断片をＤｙｎａＥｘｐｒｅｓｓ  ＴＡ  ＰＣＲＣｌｏｎｉｎｎｇ  ｋｉｔ（ｐＴＡＫＮ−２）（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を利用し、カナマイシン耐性ベクターにライゲーションした。反応は標準プロトコルの１／２量の５μｌ系で行なった。１６℃３０ｍｉｎでインキュベートした後、ライゲーションにより得られたプラスミドの導入ををコンピテントセル化した大腸菌（ＤｙｎａＥｘｐｒｅｓｓ  ｊｅｔ  ｃｏｍｐｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ＤＨ５α，ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて行なった。形質転換した大腸菌をＬＢ寒天培地に播種したのち、３７℃一晩培養した。【０１０３】
４−７．コロニーＰＣＲ
前記２−３で３７℃一晩培養したＬＢ寒天培地から大腸菌コロニーをＴＥバッファ２０μｌに懸濁、９５℃  ３ｍｉｎ加熱処理した溶液を鋳型としてプラスミドベクター由来の配列のシーケンスプライマー（Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ）を用いてコロニーＰＣＲ（Ｅｍａｒｌｄ  ＭＡＸ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ｔａｋａｒａ  ｂｉｏ），反応系１０μｌ系，（９８℃  １０ｓ，５０℃  ３０ｓ，７２℃  ４５ｓ，３０ｃｙｃｌｅｓ））を行なった。目的のニセクロナマコ配列断片を含む増幅産物にＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）（標準プロトコルの１／１０希釈）を加え、３７℃  ９０ｍｉｎ，８０℃  １０ｍｉｎで未反応のプライマーおよびｄＮＴＰを除去した。【０１０４】
４−８．ダイターミネーター法によるＤＮＡシークエンシング（ＢｉｇＤｙｅ反応）
前記３−４でＥｘｏＳＡＰ処理したコロニーＰＣＲ産物の配列決定をダイターミネター法（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ）により行った。Ｍ１３ｐｒｉｍｅｒ（Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）をシーケンスプライマーとして反応系１０μｌ系，９４℃  １ｍｉｎ，（９４℃  ５ｓ，５０℃  １０ｓ，７２℃  ３ｍｉｎ，３０ｃｙｃｌｅｓ）でシーケンス反応をおこなった。シーケンス反応後、エタノール沈殿による精製を行ない、キャピラリーＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ３５００ｘｌもしくはＡＢＩ３１３０ｘｌ）により、下記のとおり、ニセクロナマコインスリン様ペプチド遺伝子全長を含む３’ＲＡＣＥ遺伝子断片（配列番号２３）の情報を得た。【０１０５】
2018079861.tif 000010
2018079861.tif 000011
【配列表フリーテキスト】
【０１０６】
配列番号１：合成ペプチド
配列番号１：Ｘａａは任意のアミノ酸残基を表す（存在位置：３〜５、７〜１４）。
配列番号２：合成ペプチド
配列番号２：Ｘａａは任意のアミノ酸残基を表す（存在位置：２〜１２）。
配列番号３：合成ペプチド
配列番号３：Ｘａａは任意のアミノ酸残基を表す（存在位置：１、３〜６、９、１０、１３、１４、１６〜２０）。
配列番号４：合成ペプチド
配列番号４：Ｘａａは任意のアミノ酸残基を表す（存在位置：１、５、６、８、９、１１、１３〜１４、１７）。配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２１：合成ＤＮＡ
配列番号２２：合成ＤＮＡ
配列番号２３：ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔを表す（存在位置：８８１、８８２、９４２、９４５、９４６、９４８〜９５１、９５４〜９５７、９６３、９６４、９７３、９７９、９８０、９８５、１００２、１００４、１００５、１００７、１００９、１０１３、１０１４、１０１６〜１０１９、１０２２、１０２４、１０２５、１０２８〜１０３５、１０３７〜１０４９、１０５１〜１０５８、１０６２、１０６６〜１０７０、１０７３、１０７４、１０７７〜１０８８、１０９０、１０９２〜１０９７）。
［配列表］
2018079861.tif 000012
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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