(57)【要約】  光学異性体を含む試料のより正確な分析方法及びシステムの提供を目的とする。クロマトグラフィーの結果を参照し、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までにおいて、他の１又は複数の成分に対応するクロマトピークからの完全分離が達成された画分を別々に逐次分取し、単一の成分について完全分離が達成されない場合には、分取画分を更なるクロマトグラフィーに供し、完全分離が達成された場合に、分取画分をキラルクロマトグラフィーに供することを特徴とする。
2018092818.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィーによる試料中の複数の成分の光学異性体の分析方法であって、
（i)  複数成分を含む試料を、カラム及び移動相を用いてクロマトグラフィーにより分離及び検出して、クロマトグラムを得る工程、
（ii)  １又は複数のクロマトピークについてベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時を決定する工程、
（iii)  ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分を別々に逐次分取する工程、
（iv)  ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークが単一ピークからなる場合、次の工程に進み、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分が、複数のピークを含む場合、工程(i)〜工程（iv)を繰り返す工程、
（v)  ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークが単一ピークに対応する画分に対し、キラルカラムクロマトグラフィーにより各光学異性体を分離及び検出して、クロマトグラムを得る工程
を含み、
ここで、工程(i)〜工程（iv)が繰り返される場合、これまで使用したカラム及び移動相とは異なるカラム及び移動相を用いてクロマトグラフィーを行う、前記分析方法。
【請求項２】
ベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時が、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までの１又は複数のピークと、他のピークとの間で完全分離が達成された時点である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
完全分離が、分離度が1.5以上という基準に基づき判定される、請求項２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記クロマトグラフィーが、高速液体クロマトグラフィーである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項５】
標準品について予め取得されたクロマトピークにおいて、ベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時が決定され、当該開始時及び復帰終了時において画分が取得される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項６】
前記カラムが、逆相カラム、順相カラム、陽イオン交換カラム、陰イオン交換カラム、キラルカラム、及びそれらのミックスモードカラムからなる群から選ばれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項７】
前記分析方法が、さらに以下の：
（vi) 各光学異性体のクロマトグラムから、各成分の各光学異性体を定量する工程
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項８】
試料が、生物学的試料である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項９】
分析される成分が、タンパク質を構成するアミノ酸及びその光学異性体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１０】
カラム、移動相導入部、及び検出部を備える１又は複数のクロマトグラフィーユニットと、キラルカラム、移動相導入部、及び検出部を備えるキラルクロマトグラフィーユニットと、流路と、流路切り替えユニットと、１又は複数の貯液部と、制御部とを備えた、複数成分を分析するシステムであって、
（ｉ）  制御部が、クロマトグラフィーユニットを駆動することにより、試料中の複数の成分を分離及び検出してクロマトグラムを取得し；
（ii)  制御部が、クロマトグラムにおける１又は複数の成分に対応するクロマトピークについてベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時を決定し；
（iii）  制御部が、流路切り替えユニットを駆動することにより、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分を１又は複数の貯液部に逐次導入し；
（iv)   ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークが、単一ピークからなる場合、次の工程に進み、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークが、複数のピークを含む場合、制御部が、流路切り替えユニットを駆動することにより、１の貯液部から、これまでに用いられたクロマトグラフィーユニットとは異なるクロマトグラフィーユニットに導入し、そして工程(i)〜（iv)を繰り返す工程、
（v)  制御部が、流路切り替えユニットを駆動することにより、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までの単一ピークに対応する画分をキラルクロマトグラフィーユニットに導入し；
（vi) 制御部が、キラルクロマトグラフィーユニットを駆動することにより、単一成分の完全分離が達成された画分について、光学異性体を分離・検出して、クロマトグラムを取得する、
前記システム。
【請求項１１】
ベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時が、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークと、他のピークとの間で完全分離が達成された時点である、請求項１０に記載の分析システム。
【請求項１２】
完全分離が、分離度が１．５以上という基準に基づき判定される、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
標準品について予め取得されたクロマトピークにおいて、ベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時が決定され、当該開始時及び復帰終了時において画分が取得される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１４】
前記工程（ii)において、制御部が、流路切り替えユニットを駆動し、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークに対応する画分をマルチループのループに導入する代わりに、工程（iii)の異なるクロマトグラフィーユニットに導入する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１５】
貯液部が、ループである、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１６】
これまでに用いられたクロマトグラフィーユニットとは異なるクロマトグラフィーユニットが、これまでに用いられたクロマトグラフィーユニットのカラムと同一カラムを有するが、これまでに用いられたクロマトグラフィーユニットの移動相とは異なる移動相を有する、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記クロマトグラフィーが、高速液体クロマトグラフィーである、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１８】
前記カラムが、逆送カラム、順相カラム陽イオン交換カラム、陰イオン交換カラム、キラルカラム、及びそれらのミックスモードカラムからなる群から選ばれる、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１９】
さらに（ｖｉｉｉ）制御部が、各光学異性体のクロマトグラムから各光学異性体を定量する、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２０】
試料が、生物学的試料である、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２１】
分析される成分が、タンパク質を構成するアミノ酸及びその光学異性体である、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィーによる試料中の複数の成分の光学異性体の分析方法、及びこの分析方法を実行する分析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーは、分析系内に導入される移動相と、カラム等に保持される固定相とを用い、分析系内に移動相とともに複数の成分を含む試料を導入し、移動相内の各成分と固定相との物理・化学的相互作用の差を利用して複数の成分を分離・検出する手法である。【０００３】
しかしながら、物理・化学的性質が近似する複数の成分を分析しようとすると、固定相との相互作用によって十分に分離されることなく溶出し、クロマトピークに重なりが生じてしまう。その結果、単一の分離系では、試料に含まれる複数の成分を精密に分離できない場合があった。【０００４】
このため、クロマトグラフィーにより分離、分画した成分を、さらに別の移動相と固定相からなるもう一つのクロマトグラフィーにより分離する分析方法が広く採用されている。以下、これを２次元クロマトグラフィー分析方法という。【０００５】
２次元クロマトグラフィー分析方法として、一般的には、１次元目クロマトグラフィーにより分離された目的成分を含むクロマトピーク分画を分取し、２次元目クロマトグラフィーに導入して目的成分を精密に分離する。この場合、一連の装置でカラムを切り替える方法（オンラインカラムスイッチング法）と、分析系外に一旦分画を分取して別の装置系に導入する方法（オフラインカラムスイッチング法）とがある。【０００６】
これらの方法では一分析系列で一つの目的成分しか分離できないため、複数の成分を対象とする場合にはその数に応じて分析系列・分析回数を増やさなければならず、目的成分数が多いほど手間と時間を要していた。また、生体試料のように量が限られた試料では、分析回数にも限界が生じ、目的成分の全てを分析することが不可能な状況が生じていた。【０００７】
こうした問題点を解決するために、２つのカラムと、分離された画分を個別に保持するマルチループとを組み合わせて、複数の成分の分析を同時・一斉・自動で行うことのできる２次元液体クロマトグラフィー方法及びシステムが開発されている（特許文献１）。また、１次元目のクロマトグラフィーにより分離された各成分のピークのベースラインからの立ち上がり開始時から、ベースラインへの復帰終了時までの間の時間に分画された成分を保持部へと逐次分取し、分取が完了した成分を２次元目のクロマトグラフィー分析に供する液体クロマトグラフィーシステムが開発されている（特許文献２）。【０００８】
ここで、特許文献１及び２は１次元のクロマトグラフィーでは分離が困難な光学異性体を、２次元目のクロマトグラフィーで分離することを意図していた。特許文献２には、各成分のピークのベースラインからの立ち上がり開始時から、ベースラインへの復帰終了時までの間の時間に分画された成分を保持部へと逐次分取することについて開示はあるものの、これは、分析目的の各成分が、相互に光学異性体以外の成分とピークの重なりを有さないことを前提とするものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第４２９１６２８号公報
【特許文献２】特許第４９８０７４０号公報
【特許文献３】特開２０１５−４８３３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の２次元クロマトグラフィーにより、複数の成分の光学異性体を分離して定量することが可能になっていた。しかしながら、たとえば生体中の試料中に含まれるアミノ酸のように、多量で複雑なマトリクス成分が存在する上に、一方の光学異性体が、他の光学異性体に比較して存在量が大きく異なる場合や温度等の条件差によるわずかな保持時間のゆらぎ等で生じるクロマトピークの重なりが、相対的に少ない方の光学異性体の測定値の変動を引き起こすことがあるという課題を本発明者らは見いだした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そこで、本発明者らが、そのような課題を解決すべく原因を追及したところ、１次元
目のクロマトグラフィーで分離されたピークのわずかな重なりにより、２次元目のキラルクロマトグラフィーにおける分離結果に大きく影響を及ぼすことがわかった。そこで、本発明者らが、クロマトグラフィーのシステムについてさらなる検討を行った結果、１次元のクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムにおいて、ベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時を厳密に判定し、ベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時に複数のピークが含まれる場合、即ちピークの重なりが観察される場合は、その複数成分が含まれる画分を次のクロマトグラフィーに供して、単一成分について完全分離を達成するまでクロマトグラフィー分析を繰り返し行うというシステムを考案した。こうして、目的の分離が達成されたピークに対応する画分を逐次光学異性体の分離を意図したクロマトグラフィー分析（キラルクロマトグラフィー分析）に供することで、生体試料のような複雑なマトリクス中の微量な光学異性体についても精度良く測定することが可能になり、本発明に至った。【００１２】
したがって、本発明は以下の発明に関する：
[１]  クロマトグラフィーによる試料中の複数の成分の光学異性体の分析方法であって、
（i)  複数成分を含む試料を、カラム及び移動相を用いてクロマトグラフィーにより分離及び検出して、クロマトグラムを得る工程、
（ii)  １又は複数のクロマトピークについてベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時を決定する工程、
（iii)  ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分を別々に逐次分取する工程、
（iv)  ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークが単一ピークからなる場合、次の工程に進み、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分が、複数のピークを含む場合、工程(i)〜工程（iv)を繰り返す工程、
（v)  ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークが単一ピークに対応する画分に対し、キラルカラムクロマトグラフィーにより各光学異性体を分離及び検出して、クロマトグラムを得る工程を含み、
ここで、工程(i)〜工程（iv)が繰り返される場合、これまで使用したカラム及び移動相とは異なるカラム及び移動相を用いてクロマトグラフィーを行う、前記分析方法。
[２]  ベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時が、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までの１又は複数のピークと、他のピークとの間で完全分離が達成された時点である、項目１に記載の分析方法。
[３]  完全分離が、分離度が1.5以上という基準に基づき判定される、項目２に記載の分析方法。
[４]  前記クロマトグラフィーが、高速液体クロマトグラフィーである、項目１〜３のいずれか一項に記載の分析方法。
[５]  標準品について予め取得されたクロマトピークにおいて、ベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時が決定され、当該開始時及び復帰終了時において画分が取得される、項目１〜４のいずれか一項に記載の分析方法。
[６]  前記カラムが、逆相カラム、順相カラム、陽イオン交換カラム、陰イオン交換カラム、キラルカラム、及びそれらのミックスモードカラムからなる群から選ばれる、項目１〜５のいずれか一項に記載の分析方法。
[７]  前記分析方法が、さらに以下の：
（vi) 各光学異性体のクロマトグラムから、各成分の各光学異性体を定量する工程
を含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の分析方法。
[８]  試料が、生物学的試料である、項目１〜７のいずれか一項に記載の分析方法。
[９]  分析される成分が、タンパク質を構成するアミノ酸及びその光学異性体である、項目１〜８のいずれか一項に記載の分析方法。
[１０]  カラム、移動相導入部、及び検出部を備える１又は複数のクロマトグラフィーユニットと、キラルカラム、移動相導入部、及び検出部を備えるキラルクロマトグラフィーユニットと、流路と、流路切り替えユニットと、１又は複数の貯液部と、制御部とを備えた、複数成分を分析するシステムであって、
（ｉ）  制御部が、クロマトグラフィーユニットを駆動することにより、試料中の複数の成分を分離及び検出してクロマトグラムを取得し；
（ii)  制御部が、クロマトグラムにおける１又は複数の成分に対応するクロマトピークについてベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時を決定し；
（iii）  制御部が、流路切り替えユニットを駆動することにより、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分を１又は複数の貯液部に逐次導入し；
（iv)   ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークが、単一ピークからなる場合、次の工程に進み、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークが、複数のピークを含む場合、制御部が、流路切り替えユニットを駆動することにより、１の貯液部から、これまでに用いられたクロマトグラフィーユニットとは異なるクロマトグラフィーユニットに導入し、そして工程(i)〜（iv)を繰り返す工程、
（v)  制御部が、流路切り替えユニットを駆動することにより、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までの単一ピークに対応する画分をキラルクロマトグラフィーユニットに導入し；
（vi) 制御部が、キラルクロマトグラフィーユニットを駆動することにより、単一成分の完全分離が達成された画分について、光学異性体を分離・検出して、クロマトグラムを取得する、前記システム。
[１１]  ベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時が、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークと、他のピークとの間で完全分離が達成された時点である、項目１０に記載の分析システム。
[１２]  完全分離が、分離度が１．５以上という基準に基づき判定される、項目１１に記載のシステム。
[１３]  標準品について予め取得されたクロマトピークにおいて、ベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時が決定され、当該開始時及び復帰終了時において画分が取得される、項目１０〜１２のいずれか一項に記載の分析方法。
[１４]  前記工程（ii)において、制御部が、流路切り替えユニットを駆動し、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークに対応する画分をマルチループのループに導入する代わりに、工程（iii)の異なるクロマトグラフィーユニットに導入する、項目１０〜１３のいずれか一項に記載のシステム。
[１５]  貯液部が、ループである、項目１０〜１４のいずれか一項に記載のシステム。
[１６]  これまでに用いられたクロマトグラフィーユニットとは異なるクロマトグラフィーユニットが、これまでに用いられたクロマトグラフィーユニットのカラムと同一カラムを有するが、これまでに用いられたクロマトグラフィーユニットの移動相とは異なる移動相を有する、項目１０〜１５のいずれか一項に記載のシステム。
[１７]  前記クロマトグラフィーが、高速液体クロマトグラフィーである、項目１０〜１６のいずれか一項に記載のシステム。
[１８]  前記カラムが、逆送カラム、順相カラム陽イオン交換カラム、陰イオン交換カラム、キラルカラム、及びそれらのミックスモードカラムからなる群から選ばれる、項目１０〜１７のいずれか一項に記載のシステム。
[１９]  さらに（ｖｉｉｉ）制御部が、各光学異性体のクロマトグラムから各光学異性体を定量する、項目１０〜１８のいずれか一項に記載のシステム。
[２０]  試料が、生物学的試料である、項目１０〜１９のいずれか一項に記載のシステム。
[２１]  分析される成分が、タンパク質を構成するアミノ酸及びその光学異性体である、項目１０〜２０のいずれか一項に記載のシステム。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、試料中の目的の成分の光学異性体を精度よく分離し、定量することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明のクロマトグラフィー分析方法を行うための分析システムのブロック図の例を示す。
【図２】図２は、本発明のクロマトグラフィー分析方法を行うための分析システムの構成図の例を示す
【図３】図３は、移動相導入部１０の詳細を示す構成図の例である。
【図４】図４は、流路切り替えユニット４と、貯液部５０／マルチループユニット５５をさらに詳細に示した構成図の例である。
【図５】図５は、本発明に従い行われたクロマトグラフィー分析方法により得られたクロマトグラムを示す。３次元のクロマトグラフィーが行われた。図５Ａは、１次元目のクロマトグラムを示す。グルタミンとセリンは、１次元では、単一成分について完全分離を達成できていなかった。図５Ｂは、２次元目のクロマトグラムを示す。２次元目においてピークの完全分離を達成した。図５Ｃは、完全分離を達成した分取画分をキラルクロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムを示す。
【図６】図６は、従来の２次元クロマトグラフィー分析方法により得られたクロマトグラムを示す。図６Ａは、１次元のクロマトグラムを示す。グルタミンとセリンは、１次元目では、単一成分について完全分離を達成できていなかったが、ガウス分布に基づいて推定された分離時間において画分を分取した。図６Ｂは、分取された画分をキラルクロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムを示す。
【図７】図７は、本発明に従い行われたクロマトグラフィー分析方法により得られたクロマトグラムを示す。３次元のクロマトグラフィーが行われた。図７Ａは、１次元目のクロマトグラムを示す。グルタミンとセリンは、１次元目では、単一成分について完全分離を達成できていなかった。図７Ｂは、２次元目のクロマトグラムを示す。２次元目においてピークの完全分離を達成した。図７Ｃは、完全分離を達成した分取画分をキラルクロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムを示す。
【図８】図８は、従来の２次元クロマトグラフィー分析方法により得られたクロマトグラムを示す。（Ａ）グルタミンとセリンは、１次元目では、ピークの完全分離を達成できていなかったが、ガウス分布に基づいて推定された分離時間において画分を分取した。（Ｂ）分取された画分をキラルクロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムを示す。
【図９】図９は、ヒト尿を試料として従来の２次元クロマトグラフィー分析により得られたクロマトグラムを示す。アスパラギン（Ａ）、セリン（Ｂ）、アラニン（Ｃ）、及びプロリン（Ｄ）のクロマトグラムをそれぞれ示す。
【図１０】図１０は、アスパラギン、セリン、アラニン、及びプロリンを分離することを目的として、ヒト尿を試料とした３次元クロマトグラフィー分析により得られたクロマトグラムを示す。図１０Ａは、１次元目のクロマトグラムであり、図１０Ｂは２次元目のクロマトグラムであり、そして図１０Ｃは３次元目のクロマトグラムを表す。
【図１１】図１１は、マウス尿を試料とした２次元クロマトグラフィー分析により得られたクロマトグラムを示す。図１１Ａは、１次元目のクロマトグラムであり、図１１Ｂは、２次元目のクロマトグラムである。
【図１２】図１２は、マウス尿を試料とした３次元クロマトグラフィー分析により得られたクロマトグラムを示す。図１２Ａは、１次元目のクロマトグラムであり、図１２Ｂは２次元目のクロマトグラムであり、そして図１２Ｃは３次元目のクロマトグラムを表す。
【図１３】図１３は、ラット尿を試料とした３次元クロマトグラフィー分析により得られたクロマトグラムを示す。図１３Ａは、１次元目のクロマトグラムであり、図１３Ｂは２次元目のクロマトグラムであり、そして図１３Ｃは３次元目のクロマトグラムを表す。
【図１４】図１４は、ヒト尿を試料とした３次元クロマトグラフィー分析により得られたクロマトグラムを示す。図１４Ａは、１次元目のクロマトグラムであり、図１４Ｂは２次元目のクロマトグラムであり、そして図１４Ｃは３次元目のクロマトグラムを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、クロマトグラフィーによる試料中の複数の成分の光学異性体の分析方法に関する。より具体的に本発明は、下記の工程：
（i)  複数成分を含む試料を、カラム及び移動相を用いてクロマトグラフィーにより分離及び検出して、クロマトグラムを得る工程、
（ii)  分析目的の１又は複数成分のクロマトピークについてマトリクス成分を除きベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時を決定する工程、
（iii)  マトリクス成分を除きベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分を別々に逐次分取する工程、
（iv)  ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークが単一ピークからなる場合、光学異性体分離の工程に進み、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分が、複数のピークを含む場合、工程(i)〜工程（iv)を繰り返す工程、
（v)マトリクス成分を除きベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までの単一ピークに対応する画分に対し、キラルクロマトグラフィーにより各光学異性体を分離及び検出して、クロマトグラムを得る工程
を含む。ここで、工程(i)及び工程（ii)が繰り返される場合、これまで使用したカラム及び/又は移動相の組合せとは異なるカラム及び/又は移動相の組合せを用いてクロマトグラフィーを行われることが好ましい。
【００１６】
別の態様では、本発明は、カラム、移動相導入部、及び検出部を備える１又は複数のクロマトグラフィーユニットと、キラルカラム、移動相タンク、ポンプ、及び検出部を備えるキラルクロマトグラフィーユニットと、流路と、流路切り替えユニットと、１又は複数の貯液部と、制御部とを備えた、複数成分を分析するシステムに関する。本発明のシステムは、下記の工程：
（ｉ）  制御部が、クロマトグラフィーユニットを駆動することにより、試料中の複数の成分を分離及び検出してクロマトグラムを取得し；
（ii)  制御部が、クロマトグラムにおける１又は複数のクロマトピークについてベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時を決定し；
（iii）  制御部が、流路切り替えユニットを駆動することにより、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分を１又は複数の貯液部に逐次導入し；
（iv)   ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークが、単一ピークからなる場合、次の工程に進み、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークが、複数のピークを含む場合、制御部が、流路切り替えユニットを駆動することにより、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークに対応する画分を、該画分を含む貯液部から、これまでに用いられたクロマトグラフィーユニットとは異なるクロマトグラフィーユニットに導入し、そして工程(i)〜（iv)を繰り返す工程、
（v)  制御部が、流路切り替えユニットを駆動することにより、貯液部からベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までの単一ピークに対応する画分をキラルクロマトグラフィーユニットに導入し；
（vi) 制御部が、キラルクロマトグラフィーユニットを駆動することにより、単一成分を含む画分について、光学異性体を分離・検出して、クロマトグラムを取得する
を実行する。
【００１７】
本発明においてクロマトグラフィーは、任意のクロマトグラフィー、例えば液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーが使用されうる。液体クロマトグラフィーは、分析系内に導入される液体を移動相とするとともにカラム等を固定相として、分析系内に複数の成分を含む試料を導入し、移動相内の各成分と固定相との物理・化学的相互作用の差を利用して複数の成分を分離・検出する手法である。
【００１８】
本発明のクロマトグラフィー分析法は、多次元のクロマトグラフィーを行うことに関する。以下、Ｎ次元クロマトグラフィーとして概説する。（Ｎは２以上の整数を指し、３次元、４次元、５次元、又はそれ以上の次元のクロマトグラフィーが実現できる）。Ｎ次元のクロマトグラフィー分析を行うためのシステム１を、図面の記載を元に説明する。本発明のシステム１は、制御部２と、クロマトグラフィーユニット３と、流路切り替えユニット４と、流路５とを含み、制御部２がこれらのクロマトグラフィーユニット３と、流路切り替えユニット４とを制御する。クロマトグラフィーユニット３と、流路切り替えユニット４とは流路５を介して繋がっている。第一のクロマトグラフィーユニット３−（１）に導入された試料は、繰り返しクロマトグラフィーユニット３−（ｎ）でｎ回繰り返し導入され（ｎは０以上の整数を指す）、最後のキラルクロマトグラフィーユニット３−（ｆ）に導入されることで分析される。ここで繰り返し数ｎは（Ｎ−２）で表される。各クロマトグラフィー分析の後に光学異性体のみを含む単一成分の完全分離が達成されるまで、繰り返しが行われる。光学異性体のみを含む単一成分の完全分離が達成された場合には、更なる繰り返しを行わずに、最後のキラルクロマトグラフィーユニット３−（ｆ）に供される。使用されるクロマトグラフィーユニットは、それ以前に使用されたカラム３０及び／又は移動相の点で異なるクロマトグラフィーユニットを用いることが好ましい。これまでに用いられたクロマトグラフィーユニットとは異なるクロマトグラフィーユニットとは、これまでに用いられたカラムと移動相との組合せとは異なるカラムと移動相との組合せのクロマトグラフィーを用いることをいう。したがって、カラムは同一である一方で、移動相のみが異なるクロマトグラフィーユニットを用いることもできる。その場合、以前用いたカラムを使用し、移動相のみが異なるようにして方法が実施される。クロマトグラフィーユニット３は、通常、移動相導入部１０、試料導入部２０、カラム３０、及び検出器４０を含んでいる。液体クロマトグラフィー分析ユニットの検出器の測定値からクロマトグラムが作成されて、記録計４５に記録されうる。カラム３０には、カラム温度調節器３５が取り付けられていてもよい。移動相導入部１０には、移動相タンク１１、ポンプ１２が連結されており移動相が導入される。導入される移動相は２以上の溶媒の組合せであってよく、その場合には移動相混合ユニット１３を用いて、濃度勾配を経時的に変更して使用することもでき、複数のポンプで移動相を送液し混合することもできる。ポンプ１２によってくみ上げられた移動相に含まれる気体は固定相との相互作用に影響を与えたりノイズの原因となるため、脱気装置１４がさらに設置されていてもよい。移動相導入部１０から導入された移動相は、試料導入部２０を経て、カラム３０へと送られる。試料導入部２０からは、試料が注入されうる。試料は前処理がされていてもよいし、そのまま試料が用いられてもよい。２次元以降のクロマトグラフィーでは、試料導入部２０の代わりに、貯液部５０から、貯液部５０に一時的に貯蔵された試料が導入される。試料中に含まれる各成分は、カラム等の固定相と、導入される移動相との組合せにより分離され、保持の小さい成分から順に溶出された成分が検出器によって検出される。検出器で検出された試料の成分の信号は、記録計に送られて記録され、保持時間に対する検出された試料の成分の量に関するクロマトグラムを得ることができる。
【００１９】
本発明のクロマトグラフィー分析法では、マトリクス成分を除き目的の光学異性体のみを含む成分について完全分離が達成されるまで、それ以前に使用されたカラム３０及び移動相の点で異なるクロマトグラフィーユニット３を用いた分離・分析が繰り返される。したがって、第一クロマトグラフィーユニット３−（１）に加え、繰り返される回数の分だけ繰り返しクロマトグラフィーユニット３−（ｎ）が設けられる。そして最後にキラルクロマトグラフィーユニット３−（ｆ）に接続される。クロマトグラフィーカラムを通過し、分離された成分は、流路切り替えユニット４-（ｎ）により流路を切り替えられて貯液部５０-（ｎ）に一時的に貯蔵されうる。貯液部５０-（ｎ）は、一例として、複数のループ５６から構成されるマルチループユニット５５である。
【００２０】
流路切り替えユニット４は、例えば図４の六方切り替え弁を制御することで実現できる。一例として、スイッチ位置Ｓ１では、カラムからの溶出液は排液タンクへと繋がれており、検出器４５が分取すべき画分を検出した際に、スイッチ位置Ｓ２に切り替えられる。スイッチ位置Ｓ２では、カラムからの溶出液は貯液部５０/マルチループユニット５５に連結されており、貯液部５０／マルチループユニット５５の切り替え手段５７ａ及び５７ｂにより、貯蔵先が決定される。
【００２１】
マルチループユニット５５は、複数のループ５６と、複数のループ５６のうち選択された１のループを流路５ａ及び５ｂ接続する切り替え手段５７ａ及び５７ｂを有する。このようなマルチループユニット５５を用いることで、カラム３０で分離された試料の成分の各々を、それぞれ、個別にループ５６に保持することができる。すなわち、検出器における試料の成分の検出に合わせて、流路切り替えユニット４のスイッチ位置をＳ１からＳ２に切り替え、さらに切り替え手段５７ａ及び５７ｂを接続するループ５６に応じて切替えれば、各々のループ５６ごとに、試料の成分の各々を保持することができる。全ての試料の成分を個別に複数のループ５６に保持した後、流路切り替えユニット４におけるスイッチ位置を再度Ｓ１に切替えると同時に、次のカラムユニットの移動相導入部１０を駆動することで、分取画分を保持したループ５６を、次のクロマトグラフィーユニットに導入することができる。
【００２２】
すなわち、この本発明による液体クロマトグラフ装置では、第一の液体に対する一回の試料の注入で、１又は複数回のクロマトグラフィー分析ユニットを用いることで、マトリクス成分を除き試料の光学異性体のみを含む各成分を完全に分離し、全ての目的の成分について最後にキラルカラムクロマトグラフィー分析ユニットを用いて、光学分割してＤ体及びＬ体を分離し、定量することができる。よって、本発明による液体クロマトグラフ装置を使用すれば、一回の試料の注入の後、オンラインで複数の試料の成分について光学分割及び検出を行うことができるので、従来のカラムスイッチングキラルＨＰＬＣをオフラインで複数回繰り返して実施する方法と比較して、廃棄する試料の量が少なく、試料の量は少量でよく、また、試料の成分における光学異性体に関する分析を迅速に行うことができる。
【００２３】
本発明のシステムに含まれる制御部２は、クロマトグラフィーユニット３、流路切り替えユニット４をそれぞれ制御することができる。より具体的に、制御部２は、クロマトグラフィーユニット３が備える移動相導入部１０、試料導入部２０、カラム３０、カラム温度調節部３５、検出器４０、及び記録計４５をそれぞれ制御することで、クロマトグラフィーユニットを駆動することができる。そして、制御部２は、記録部３５に記録されたクロマトグラムを元に、流路切り替えユニット４を切り替えることができる。より具体的に、制御部２は、クロマトグラムにおける１又は複数の成分に対応するクロマトピークについて、マトリクス成分を除きベースラインからの立ち上がり開始時からマトリクス成分を除きベースラインへの復帰終了時を決定する。制御部２は、流路切り替えユニット４を制御して、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分を１又は複数の貯液部に逐次導入することができる。制御部２は、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分が、光学異性体のみを含む単一成分に由来するクロマトピークに対応するか否かを判定する。この判定は、クロマトグラム上で単一ピークか、複数のピークであるかを判定することで行われる。制御部２は、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分が、光学異性体のみを含む単一成分に由来するクロマトピークに対応する場合、最後のキラルクロマトグラフィーユニットに導入し、 制御部が、キラルクロマトグラフィーユニットを駆動することにより、単一成分の完全分離が達成された画分について、光学異性体を分離・検出して、クロマトグラムを取得する。ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分が、光学異性体のみを含む単一成分に由来するクロマトピークに対応しない（すなわち、光学異性体以外の複数の成分に由来するクロマトピークに対応する）と判定した場合、制御部が、流路切り替えユニットを駆動することにより、１の貯液部から、これまでに用いられたクロマトグラフィーユニットとは異なるクロマトグラフィーユニットに導入し、そして該異なるクロマトグラフィーユニットを駆動する。これまでに用いられたクロマトグラフィーユニットとは異なるクロマトグラフィーユニットとは、これまでに用いられたカラムと移動相との組合せとは異なるカラムと移動相との組合せのクロマトグラフィーを用いることをいう。したがって、カラムは同一である一方で、移動相のみが異なるクロマトグラフィーユニットを用いることができる。その場合、以前用いたカラムを使用し、移動相のみが異なるようにシステムを構成することもできる。
【００２４】
本発明において使用するクロマトグラフィーカラムは特に限定されないが、例えば逆相カラム、順相カラム、陽イオン交換カラム、陰イオン交換カラム、キラルカラム、またはそれらのミックスモードカラムなどを用いることができる。これらのカラムに用いる充填剤や移動相は、当業者であれば適宜選択することができる。
【００２５】
なお、本発明による液体クロマトグラフ装置を、以下の株式会社資生堂社製ナノスペースシリーズの機器を使用して構成することができる。ポンプ１２には、３３０１を、カラム３としてはＭＬ−１０００（０．５３ｍｍ ｉ．ｄ． × １０００ｍｍ）、ＭＬ−ＫＳＡＡＡＸ−０００１５２５０−００３（１．５ｍｍ ｉ．ｄ． × ２５０ｍｍ）、最終キラルカラム３−（ｆ）としてはＫＳＡＡＣＳＰ−００１Ｓ１５２５０−０７０（１．５ｍｍ  ｉ．ｄ．  ×  ２５０ｍｍ）を、試料注入部２０には、オートサンプラー３０３３を、移動相混合ユニット１３には、ＭＰＶを、脱気装置１４には、３０１０を、カラム選択ユニット４には、３０１１を使用することができる。また、マルチループユニット５５は、例えば、ＭＬＶに、内径０．８ｍｍ×長さ８０ｃｍ（容積４００μＬ）のループ５６を１０本接続して作製することができる。その他、検出器４０としての蛍光検出器には、３０１３を、記録計４５には、３７５０を使用することができる。
【００２６】
本発明による液体クロマトグラフ装置の一例として、３次元のクロマトグラフィー分析ユニットを有するシステムを作成した。このシステムにおいて、それぞれ移動相、カラム、カラムの温度、移動相の流速などのパラメータを適切に選択すれば、２０種類のアミノ酸光学異性体及び/又はその誘導体の光学分割検出を高い精度で行うことが可能となる。実施例では、グルタミン（Ｇｌｎ）とセリン（Ｓｅｒ）の光学異性体について、光学分割の好適な条件について検討した。ついで、生体試料として、血漿試料や尿試料におけるアミノ酸の光学異性体について、光学分割の好適な条件が検討された。
【００２７】
光学分割のために、各成分を含む試料は、予め又はキラルクロマトグラフィーでの分析前に、光学分割用試薬と反応することができる。光学分割用試薬としては、２，５−ジオキソピロリジン-１-イル（２-(６-メトキシ-４-オキソキノリン-１（４Ｈ）-イル）エチル炭酸塩などの化合物を含む試薬を用いることができる。光学分割用試薬及び当該試薬との反応方法、並びにキラルクロマトグラフィーカラムでの分離条件については、特許文献３（特開２０１５−４８３３３２号公報）に記載される方法を用いることができるが、これらの試薬を用いることを意図するものではない。
【００２８】
クロマトグラムにおいて、各成分について分離が達成されると、１の成分に対応する１つのピークが得られる。ベースラインからの立ち上がり開始時とは、マトリクス成分を除き目的成分の１又は複数のピークを含むピーク群が存在することにより、ベースラインから立ち上がった最初の時点のことを言う。同様にベースラインへの復帰終了時とは、ある１又は複数のピークを含むピーク群が存在することにより立ち上がっていたピークがマトリクス成分を除きベースラインへと初めて復帰した時点をいう。したがって、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までには、１又は複数のピークが含まれているものの、その他目的成分のピークとは重なり合いが存在していないことを意味する。したがって、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに含まれる目的成分の１又は複数のピークからなるピーク群と、その他目的成分のピークとは、完全分離が達成されている。したがって、ベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時は、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに含まれるピークと、他のピークとの間で完全分離が達成された時点ということもできる。ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分とは、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに含まれる１又は複数のピークに対応している画分をいうが、他の成分に対応するピークが含まれない限りにおいて、ベースラインからの立ち上がり開始時前の画分や、ベースラインへの復帰終了時後の画分が含まれていてもよい。
【００２９】
完全分離とは、日本薬局方においてピーク、「分離度１．５以上を意味する」とされている。本発明では、好ましくは１．２以上、より好ましくは１．５以上を指す。本発明においては、ベースラインからの立ち上がり開始時と、ベースラインへの復帰終了時とを判定するために、完全分離の定義が用いられる。したがって、必ずしも単一のピークが分離されることを必要とするものではない。重なりを有する１以上のピークを含むピーク群と、他のピークとの間において完全分離が達成された場合に、このピーク群に対応する分取試料は、次のクロマトグラフィー分析ユニットに供される。ベースラインからの立ち上がり開始時から、ベースラインへの復帰終了時までに、単一のピークのみが含まれるまで、すなわち対応する画分がマトリクス成分を除き目的成分単一になるまで、カラムクロマトグラフィーが繰り返し行われる。ここで、クロマトグラフィーユニット３−１及び繰り返しクロマトグラフィーユニット３−（ｎ）は、光学異性体を分離できず、得られた単一ピークには、光学異性体が含まれうる。したがって、本発明で言う単一成分は、光学異性体が含まれていてもよい。また、本発明は、最後の工程（v)において、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークが単一ピークに対応する画分に対し、キラルカラムクロマトグラフィーにより各光学異性体を分離及び検出して、クロマトグラムを得る工程を含んでおり、当該工程で得られたクロマトグラムに基づき、特定成分の光学異性体の量又は濃度が測定される。したがって、特定成分の光学異性体の量又は濃度の定量に影響を及ぼさない限りにおいて、最後の工程（ｖ）における「単一ピーク」に不所望のピークが含まれることも許容されうる。
【００３０】
生体試料について、クロマトグラフィーを行うと、目的の成分のクロマトピークの他に、生体試料の種類に特有のマトリクス成分が含まれた形でクロマトグラムが取得される。したがって、生体試料について分析をする場合に、マトリクス成分によるバックグランドのため、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時を決定できない場合がある。そうした場合、目的の複数の成分を含む標準品で予め、ベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時を決定しておき、生体試料のクロマトグラフィーを行う場合に、決定された開始時及び復帰終了時において、画分を取得することができる。これらの時間は、試料導入時を基準にしてもよいし、早い時間に溶出する基準成分を試料に添加しておき、かかる基準成分のピークを基準にしてもよい。標準品とは、目的とする成分を添加して調製された試料をいう。一例として、２０種類のアミノ酸について、光学異性体を分けて検出する場合、グリシンを除く各アミノ酸のＤ体及びＬ体を等量添加した試料を標準品として用いることができる。
【００３１】
標準品のクロマトグラムを用いる場合、本発明の分析方法のうち、工程（ii)の又は複数のクロマトピークについてベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時を決定する工程が、標準品のクロマトグラムに基づいて行われる。そして、この工程により決定されたベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する時間で、工程（iii）において画分を別々に逐次分取される。
【００３２】
少なくとも１回の繰り返しが行われる形態では、本発明の分析方法は、下記の工程を含んでいてもよい：
（i)  複数成分を含む試料を、カラム及び移動相を用いてクロマトグラフィーにより分離及び検出して、クロマトグラムを得る工程、
（ii)  １又は複数のクロマトピークについてベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時を決定する工程、
（iii)  ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分を別々に逐次分取する工程、
（iv)  ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分を、これまで使用されたカラムと移動相との組合せとは異なるカラムと移動相との組合せを用いてクロマトグラフィーにより分離して、クロマトグラムを得る工程、
（v)  （iv）のクロマトグラム上で１又は複数のクロマトピークについてベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時を決定する工程、
（vi)  ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分を別々に逐次分取する工程、
（vii)  ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークが、単一ピークからなる場合、次の工程に進み、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークが、複数のピークを含む場合、工程(iv)〜工程（vii)を繰り返す工程、
（viii)   ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までの単一ピークに対応する画分に対し、キラルカラムクロマトグラフィーにより各光学異性体を分離及び検出して、クロマトグラムを得る工程
ここで、工程(iv)〜工程（vi)が繰り返される場合、これまで使用したカラム及び移動相とは異なるカラム及び移動相を用いてクロマトグラフィーが行われる。
【００３３】
少なくとも１回の繰り返しが行われる形態では、本発明の分析システムは、カラム、移動相タンク、ポンプ、及び検出部から構成される複数のクロマトグラフィーユニットと、キラルカラム、移動相タンク、ポンプ、及び検出部から構成されるキラルクロマトグラフィーユニットと、流路と、流路切り替えユニットと、１又は複数の貯液部と、制御部とを備え、下記：
（ｉ）  制御部が、クロマトグラフィーユニットを駆動することにより、試料中の複数の成分を分離及び検出してクロマトグラムを取得し；
（ii)  制御部が、クロマトグラムにおける１又は複数のクロマトピークについてベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時を決定し；
（iii）  制御部が、流路切り替えユニットを駆動することにより、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分を１又は複数の貯液部に逐次導入し；
（iｖ)  制御部が、流路切り替えユニットを駆動することにより、１の貯液部から、これまでに用いられたクロマトグラフィーユニットとは異なるクロマトグラフィーユニットに導入し；
（v)  制御部が、当該異なるクロマトグラフィーユニットを駆動することにより、１の貯液部に導入された画分をさらに分離・検出してクロマトグラムを取得し；
（vi)  制御部が、クロマトグラムにおける１又は複数のクロマトピークについてベースラインからの立ち上がり開始時及びベースラインへの復帰終了時を決定し；
（vii）  制御部が、流路切り替えユニットを駆動することにより、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する画分を１又は複数の貯液部に逐次導入し；
(viii) ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークが、単一ピークからなる場合、次の工程に進み、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークが、複数のピークを含む場合、制御部が、流路切り替えユニットを駆動することにより、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までのピークに対応する画分を、該画分を含む貯液部から、これまでに用いられたクロマトグラフィーユニットとは異なるクロマトグラフィーユニットに導入し、工程(v)〜（viii)を繰り返す工程、
（ix)  制御部が、流路切り替えユニットを駆動することにより、単一成分を含む画分をキラルクロマトグラフィーユニットに導入し；
（x) 制御部が、キラルクロマトグラフィーユニットを駆動することにより、単一成分を含む画分について、光学異性体を分離・検出して、クロマトグラムを取得する
を実行する。
【００３４】
１次元目のクロマトグラフィーは、例えば下記の条件で行うことができる：
カラム：ＭＬ−１０００（０．５３ｍｍ ｉ．ｄ． × １０００ｍｍ）
流速：２５μＬ/分
温度：４５℃
移動相：５％ＭｅＣＮ、０．０５％ＴＦＡ水溶液
【００３５】
２次元目のクロマトグラフィーは、例えば下記の条件で行うことができる：
カラム：ＭＬ−ＫＳＡＡＡＸ−０００１５２５０−００３（１．５ｍｍ ｉ．ｄ． × ２５０ｍｍ）
流速：１５０μＬ/分
温度：１０℃
移動相：０．１５％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（８５／１５）
【００３６】
３次元目のキラルクロマトグラフィーは、例えば下記の条件で行うことができる：
カラム：ＫＳＡＡＣＳＰ−００１Ｓ１５２５０−０７０（１．５ｍｍ ｉ．ｄ． x ２５０ｍｍ）
流速：１５０μＬ/分
温度：２５℃
移動相：グルタミン分析用：０．５％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（５０／５０）
セリン分析用：０．６％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（４０／６０）
【００３７】
本発明の分析方法は、目的の成分標準品の分析により、予め得られたクロマトグラムにおいて、立ち上がり開始時、及びベースラインへの復帰終了時を決定していてもよい。本発明の別の態様では、リアルタイムでクロマトグラムを生成し、そのクロマトグラムから、立ち上がり開始時、及びベースラインへの復帰終了時を決定していてもよい。
【００３８】
本発明において複数成分を含む試料は、化学的試料、生物学的試料など任意の試料であってよい。試料は、好ましくは生物学的試料であり、例えば血液、血漿、血清、腹水、羊水、リンパ液、唾液、精液、尿等の体液と、糞便、汗、鼻汁等の排泄物と、体毛、爪、皮膚組織、内臓組織等の体組織などが含まれうる。さらに、培養細胞から得られた培地、細胞破砕物なども生物学的試料として用いられうる。本発明の試料は、不溶性画分の除去、分離能を向上などの目的のために、試料の種類や分離対象の成分に応じて適切に前処理が行われうる。このような前処理は、当業者であれば任意に選択することができる。一例として、血液を試料とする場合、下記の工程：
血漿・血清分離工程；
徐タンパク工程；及び
蛍光誘導体化工程
を含む前処理が行われうる。
【００３９】
本発明において、分析される成分は、光学異性体を有する任意の成分、例えばアミノ酸、乳酸、リンゴ酸などの生体内代謝物であってよい。１の実施形態では、アミノ酸、特にタンパク質構成アミノ酸である。タンパク質構成アミノ酸以外のアミノ酸として、一例としてシトルリン、オルニチン、キヌレニン、ヒドロキシプロリン、ＤＯＰＡなどが挙げられる。また、タンパク質構成アミノ酸は、２０種類が知られており、グリシンを除いて光学異性体（Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸）が存在する。これらの光学異性体のうち、生体には、Ｌ−アミノ酸が主に存在している一方で、少量のＤ−アミノ酸が、生体で機能を有していることが近年知られてきており、Ｄ−アミノ酸量を正確に測定することが望まれている。Ｄ−アミノ酸が、種々の既知又は未知の作用を有しており、また生体における疾患マーカーとしての機能を有することが明らかにされている（ＷＯ２０１３／１４０７８５）。これらのＤ−アミノ酸は、生体中ではＬ−アミノ酸と比較して存在量が極めて少ない場合が多い。本発明によりその正確な定量分析が可能になり、生理機能の解析や診断用途の点で非常に有用である。
【００４０】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例】
【００４１】
実施例１
本実施例では、本発明の分析方法及びシステムの精度を確認することを目的として、試料として、Ｄ：Ｌ＝１：１のセリン、グルタミンを含む混合水溶液を試料として用いた。
前処理として、この試料に対し、ＮＢＤ−Ｆによる蛍光誘導体化処理を行った。【００４２】
前処理を行った試料を下記の条件でクロマトグラフィーに供した。
１次元目のクロマトグラフィーは、例えば下記の条件で行った：
カラム：ＭＬ−１０００（０．５３ｍｍ ｉ．ｄ． × １０００ｍｍ）
流速：２５μＬ/分
温度：４５℃
移動相：５％ＭｅＣＮ、０．０５％ＴＦＡ水溶液
得られたクロマトグラムを図５Ａに示す。【００４３】
１次元目のクロマトグラフィーから得られたクロマトグラムでは、Ｄ，Ｌ−セリンとＤ，Ｌ−グルタミンのピークが重なっていた。その分離度は１未満であった。そこで、Ｄ，Ｌ−セリンのピークとＤ，Ｌ−グルタミンのピークとを含むピーク群について、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する試料を分取した。【００４４】
分取された試料を、２次元目のクロマトグラフィーに供した。２次元目のクロマトグラフィーを、下記の条件で行った：
カラム：ＭＬ−ＫＳＡＡＡＸ−０００１５２５０−００３（１．５ｍｍ ｉ．ｄ． × ２５０ｍｍ）
流速：１５０μＬ/分
温度：１０℃
移動相：０．１５％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（８５／１５）。
得られたクロマトグラムを図５Ｂに示す。【００４５】
１次元目のクロマトグラフィーから得られたクロマトグラムでは、Ｄ，Ｌ−セリンとＤ，Ｌ−グルタミンのピークが分離できた。その分離度は１．５であり、完全分離を達成した。そこで、Ｄ，Ｌ−セリンのピークと、Ｄ，Ｌ−グルタミンのピークについて、それぞれベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する試料を分取した。【００４６】
３次元目のキラルクロマトグラフィーは、例えば下記の条件で行った：
カラム：ＫＳＡＡＣＳＰ−００１Ｓ１５２５０−０７０（１．５ｍｍ  ｉ．ｄ． × ２５０ｍｍ）
流速：１５０μＬ/分
温度：２５℃
移動相：グルタミン分析用：０．５％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（５０／５０）
セリン分析用：０．６％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（４０／６０）
得られたクロマトグラムを図５Ｃに示す。【００４７】
同一試料に対するクロマトグラフィー分析を５回繰り返した。各クロマトグラフィー工程にいて得られたクロマトグラムを図６Ａ〜Ｃに示す。【００４８】
比較例１
比較例として、逆相クロマトグラフィーと、キラルクロマトグラフィーとを組み合わせた２次元クロマトグラフィーを行った。使用したクロマトグラフィー条件は下記の通りである：【００４９】
１次元目のクロマトグラフィーは、例えば下記の条件で行った：
カラム：ＭＬ−１０００（０．５３ｍｍ ｉ．ｄ． × １０００ｍｍ）
流速：２５μＬ/分
温度：４５℃
移動相：５％ＭｅＣＮ、０．０５％ＴＦＡ水溶液
得られたクロマトグラムを図６Ａに示す。【００５０】
２次元目のキラルクロマトグラフィーは、例えば下記の条件で行った：
カラム：ＫＳＡＡＣＳＰ−００１Ｓ１５２５０−０７０（１．５ｍｍ ｉ．ｄ． × ２５０ｍｍ）
流速：１５０μＬ/分
温度：２５℃
移動相：グルタミン分析用：０．５％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（５０／５０）
セリン分析用：０．６％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（４０／６０）
得られたクロマトグラムを図６Ｂに示す。【００５１】
同一試料に対するクロマトグラフィー分析を５回繰り返した。各クロマトグラフィー工程にいて得られたクロマトグラムを図６に示す。【００５２】
５回の試行における３次元クロマトグラフィーと２次元クロマトグラフィーにおけるＤ−グルタミン、Ｌ−グルタミン、Ｄ−セリン、及びＬ−セリンの測定値は以下の表の通りである。
【表１】
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【００５３】
図５Ａ及び６Ａに示されるように１次元目のクロマトグラムでは、セリンとグルタミンのピークは一部重なりを有しており、完全分離を達成できていなかった。このような分画を分取して、キラルカラムクロマトグラフィーに供すると、図６Ｂに示すとおり、５回の試行間でピークのばらつきが生じる。このようなピークのばらつきは、定量精度に関わっており、同一試料を用いた分析であってもピーク高さ（試料濃度）に差が生じ、その相対標準偏差（ＲＳＤ）が大きかった（３．９〜５．２）。一方で、完全分離を達成できなかった画分をカラムと移動相の異なる２次元目のクロマトグラフィーに供して得たクロマトグラムでは、図５Ｂに示すとおり完全分離を達成しており、各画分をキラルカラムクロマトグラフィーに供すると、図５Ｃに示すとおり５回の試行間でピークのばらつきを抑えることができた。３次元クロマトグラフィーで得られたピーク高さ（試料濃度）では、相対標準偏差（ＲＳＤ）が２次元クロマトグラフィーのそれより小さかった（１．５〜２．４）。【００５４】
実施例２
本実施例では、ヒト血漿中におけるＤ−セリン及びＬ−セリン、並びにＤ−グルタミン及びＬ−グルタミンの分離分析を行った。前処理として、血漿試料に対し、徐タンパクおよび蛍光誘導体化処理を行った。【００５５】
１次元目のクロマトグラフィーは、例えば下記の条件で行った：
カラム：ＭＬ−１０００（０．５３ｍｍ ｉ．ｄ． × １０００ｍｍ）
流速：２５μＬ/分
温度：４５℃
移動相：５％ＭｅＣＮ、０．０５％ＴＦＡ水溶液
得られたクロマトグラムを図７Ａに示す。【００５６】
実施例1の条件に基づいてＤ，Ｌ−セリンのピークとＤ，Ｌ−グルタミンのピークとを含むピーク群について、ベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する試料を分取した。【００５７】
分取された試料を、２次元目のクロマトグラフィーに供した。２次元目のクロマトグラフィーを下記の条件で行った：
カラム：ＭＬ−ＫＳＡＡＡＸ−０００１５２５０−００３（１．５ｍｍ ｉ．ｄ． × ２５０ｍｍ）
流速：１５０μＬ/分
温度：１０℃
移動相：０．１５％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（８５／１５）。
得られたクロマトグラムを図７Ｂに示す。【００５８】
２次元目のクロマトグラフィーから得られたクロマトグラムでは、血漿マトリクス成分を除きＤ，Ｌ−セリンとＤ，Ｌ−グルタミンのピークが分離できた。その分離度は１．５であり、完全分離を達成した。そこで、Ｄ，Ｌ−セリンのピークと、Ｄ，Ｌ−グルタミンのピークについて、それぞれベースラインからの立ち上がり開始時からベースラインへの復帰終了時までに対応する試料を分取した。【００５９】
分取された分取試料を、３次元目のキラルクロマトグラフィーに供した。３次元目のキラルクロマトグラフィーを下記の条件で行った：
カラム：ＫＳＡＡＣＳＰ−００１Ｓ１５２５０−０７０（１．５ｍｍ ｉ．ｄ． × ２５０ｍｍ）
流速：１５０μＬ/分
温度：２５℃
移動相：グルタミン分析用：０．５％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（５０／５０）
セリン分析用：０．６％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（４０／６０）
得られたクロマトグラムを図７Ｃに示す。【００６０】
比較例２
比較例として、逆相クロマトグラフィーと、キラルクロマトグラフィーとを組み合わせた２次元クロマトグラフィーを行った。使用したクロマトグラフィー条件は下記の通りである：【００６１】
１次元目のクロマトグラフィーは、例えば下記の条件で行った：
カラム：ＭＬ−１０００（０．５３ｍｍ ｉ．ｄ． × １０００ｍｍ）
流速：２５μＬ/分
温度：４５℃
移動相：５％ＭｅＣＮ、０．０５％ＴＦＡ水溶液
得られたクロマトグラムを図８Ａに示す。【００６２】
２次元目のキラルクロマトグラフィーは、例えば下記の条件で行った：
カラム：ＫＳＡＡＣＳＰ−００１Ｓ１５２５０−０７０（１．５ｍｍ ｉ．ｄ． × ２５０ｍｍ）
流速：１５０μＬ/分
温度：２５℃
移動相：グルタミン分析用：０．５％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（５０／５０）
セリン分析用：０．６％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（４０／６０）
得られたクロマトグラムを図８Ｂに示す。グルタミン、セリンの光学異性体の単一ピークは得られなかった。【００６３】
２次元クロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムでは、Ｌ-グルタミンが溶出する時間のピークは、単一成分のガウス分布を示す形状ではなく複数の成分が含まれることが推測された。また、Ｌ-グルタミンのピークの直前にＤ-グルタミンは溶出するが、Ｄ−グルタミンとマトリクス成分との分離が十分ではなく、Ｄ-グルタミンのピークは、判別できなかった（図８Ｂ）。さらにセリンでは、Ｌ−セリンのピーク直前に、Ｄ−セリンが溶出しピークが判別されるものの、さらにＤ−セリンのピークの直前にマトリクス由来と考えられるピークが分離されない形で存在し、Ｄ−セリンの定量値の精度が低下した。生体試料では、一般的にＤ-アミノ酸の存在量は、極めて小さいため、比較的大量に存在するＬ体アミノ酸やマトリクス成分との完全分離が困難な場合が多い。３次元クロマトグラフィーでは、Ｄ-アミノ酸のピークと、Ｌ-アミノ酸及びマトリクス成分のピークとが十分分離できており、定量値の誤差が小さくなった。【００６４】
比較例３
比較例として、ヒト尿を試料として、逆相クロマトグラフィーと、キラルクロマトグラフィーとを組み合わせた２次元クロマトグラフィーを行った。前処理として、尿試料に対し、徐タンパクおよび蛍光誘導体化処理を行った。尿試料に２０倍量のメタノールを加え、メタノールホモジネートから得た１０μＬの上清を減圧下で乾燥し、２０μＬの２００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）及び５μＬの蛍光誘導試薬（４０ｍＭの４-フルオロ-７-ニトロ２，１，３-ベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）の無水ＭｅＣＮ溶液）を加え、６０℃で２分間加熱した。さらに０．１％ＴＦＡ水溶液（７５μＬ）を加え、ＨＰＬＣに供した。
使用したクロマトグラフィー条件は下記の通りである：【００６５】
１次元目のクロマトグラフィー分離を下記の条件で行った：
カラム：ＭＬ−１０００（０．５３ｍｍ ｉ．ｄ． × １０００ｍｍ）
流速：２５μＬ/分
温度：４５℃
移動相：５％ＭｅＣＮ、０．０５％ＴＦＡ水溶液【００６６】
２次元目のキラルクロマトグラフィー分離を下記の条件で行った：
カラム：ＫＳＡＡＣＳＰ−００１Ｓ（１．５ｍｍ  ｉ．ｄ． × ２５０ｍｍ）
流速：２５０μＬ／分
温度：２５℃
移動相：０．２％ギ酸  メタノール／アセトニトリル（９０／１０）
得られたクロマトグラムを図９に示す。
図９Ａは、Ｄ体及びＬ体のアスパラギンの分離を示すクロマトグラムであり、図９Ｂは、Ｄ体及びＬ体のセリンの分離を示すクロマトグラムであり、図９Ｃは、Ｄ体及びＬ体のアラニンの分離を示すクロマトグラムであり、及び図９Ｄは、Ｄ体及びＬ体のプロリンの分離を示すクロマトグラムである。アスパラギン、プロリンは生体試料由来と考えられる夾雑成分との分離が不十分である。【００６７】
実施例３
本実施例では、ヒト尿を試料としてとして用いた。
比較例３と同様な前処理を実施し、試料をＨＰＬＣに供した。一次元目で得られたクロマトグラムを図１０Ａに示し、２次元目で得られたクロマトグラムを図１０Ｂに示し、そして３次元目で得られたクロマトグラムを図１０Ｃに示す。プロリンについては、存在量が少ないため、ピークを１００倍にして表示したピークを併せて示した。
１次元目のクロマトグラフィー分離を下記の条件で行った：
カラム：ＡＣＲ−ＨＴ（１．５ｍｍ ｉ．ｄ． × ５００ｍｍ）
流速：７５μＬ／分
温度：４５℃
移動相：１５％ＭｅＣＮ、０．０５％ＴＦＡ水溶液
得られたクロマトグラムを図１０Ａに示す。【００６８】
１次元目のクロマトグラフィーから得られたクロマトグラムにおいてアスパラギン、セリン、アラニン、及びプロリンを含む分画を分取した。【００６９】
分取された試料を、２次元目のクロマトグラフィーに供した。２次元目のクロマトグラフィーを、下記の条件で行った：
カラム：ＭＬ−ＫＳＡＡＡＸ−００２（１．０ｍｍ ｉ．ｄ． × １５０ｍｍ）
流速：１００μＬ／分
温度：２５℃
移動相：０．１５％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（８０／２０）。
得られたクロマトグラムを図１０Ｂに示す。【００７０】
２次元目のクロマトグラフィーから得られたクロマトグラムにおいてアスパラギン、セリン、アラニン、及びプロリンを含む分画を分取した。【００７１】
分取された試料を、３次元目のクロマトグラフィーに供した。３次元目のキラルクロマトグラフィーは、例えば下記の条件で行った：
カラム：ＫＳＡＡＣＳＰ−００１Ｓ（１．５ｍｍ ｉ．ｄ． × ２５０ｍｍ）
流速：１５０μＬ/分
温度：２５℃
移動相：０．１％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（９０／１０）
得られたクロマトグラムを図１０Ｃに示す。【００７２】
比較例４
本実施例では、タンパク質構成アミノ酸以外のアミノ酸であるシトルリンについてのＤ体とＬ体の分離及び分析方法を実施する。
マウス（Ｃ５７ＢＬ）の尿試料を採取し、比較例３と同様な前処理を実施し、試料をＨＰＬＣに供した。使用したクロマトグラフィー条件は下記の通りである：【００７３】
１次元目のクロマトグラフィー分離を下記の条件で行った：
カラム：ＭＬ−１０００（０．５３ｍｍ ｉ．ｄ． × １０００ｍｍ）
流速：２５μＬ/分
温度：４５℃
移動相：５-２５％ＭｅＣＮ、０．０５％ＴＦＡ水溶液
得られたクロマトグラムを図１１Ａに示す。【００７４】
２次元目のキラルクロマトグラフィー分離を下記の条件で行った：
カラム：ＫＳＡＡＣＳＰ−１０５S（１．５ｍｍ ｉ．ｄ． × ２５０ｍｍ）
流速：２５０μＬ／分
温度：２５℃
移動相：０．１％ギ酸  メタノール／アセトニトリル（９０／１０）
得られたクロマトグラムを図１１Ｂに示す。
Ｄ体及びＬ体のシトルリンのピーク近傍に夾雑成分が存在し、分離不十分であった。【００７５】
実施例５
本実施例では、タンパク質構成アミノ酸以外のアミノ酸であるシトルリンについてのＤ体とＬ体の分離及び分析方法を実施する。マウス（Ｃ５７ＢＬ）の尿試料、ラット（Ｗｉｓｔａｒ）尿試料、及びヒト尿試料をそれぞれ採取し、比較例３と同様な前処理を実施し、試料をＨＰＬＣに供した。使用したクロマトグラフィー条件は下記の通りである：【００７６】
１次元目のクロマトグラフィー分離を下記の条件で行った：
カラム：ＭＬ−１０００（０．５３ｍｍ ｉ．ｄ． × １０００ｍｍ）
流速：２５μＬ/分
温度：４５℃
移動相：５％ＭｅＣＮ、０．０５％ＴＦＡ水溶液
得られたクロマトグラムを図１２Ａ（マウス）、図１３Ａ（ラット）、及び図１４Ａ（ヒト）に示す。【００７７】
１次元目のクロマトグラフィーから得られたクロマトグラムにおいて、シトルリンを含む分画を分取した。【００７８】
分取された試料を、２次元目のクロマトグラフィーに供した。２次元目のクロマトグラフィーを、下記の条件で行った：
カラム：ＫＳＡＡＡＸ−０００（１．５ｍｍ ｉ．ｄ． × ２５０ｍｍ）
流速：１５０μＬ／分
温度：１０℃
移動相：０．０５％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（９０／１０）。
得られたクロマトグラムを図１２Ｂ（マウス）、図１３Ｂ（ラット）、及び図１４Ｂ（ヒト）に示す。【００７９】
２次元目のクロマトグラフィーから得られたクロマトグラムにおいて、シトルリンを含む分画を分取した。
分取された試料を、３次元目のクロマトグラフィーに供した。３次元目のクロマトグラフィーを、下記の条件で行った：
カラム：ＫＳＡＡＣＳＰ−００１Ｓ（１．５ｍｍ ｉ．ｄ． × ２５０ｍｍ）
流速：２００μＬ/分
温度：２５℃
移動相：０．１％ギ酸  メタノール/アセトニトリル（９０／１０）
得られたクロマトグラムを図１２Ｃ（マウス）、図１３Ｃ（ラット）、及び図１４Ｃ（ヒト）に示す。それぞれの対象において、Ｄ体とＬ体のシトルリンについて分離度１．５以上で完全分離を達成した。【００８０】
符号の説明
１                          分析システム
２                          制御部
３                          クロマトグラフィーユニット
３−（１）                  第一クロマトグラフィーユニット
３−（ｎ）                  繰り返しクロマトグラフィーユニット
３−（ｆ）                  最終キラルクロマトグラフィーユニット
４                          流路切り替えユニット
４−（ｎ）                  繰り返し流路切り替えユニット
４−（ｆ）                  最終流路切り替えユニット
５                          流路
５ａ，ｂ                    流路
１０                        移動相導入部
１０−（１）                第一移動相導入部
１０−（ｎ）                繰り返し移動相導入部
１０−（ｆ）                最終移動相導入部
１１                        移動相タンク
１２                        ポンプ
１３                        勾配形成ユニット
１４                        脱気装置
２０                        試料導入部
３０                        カラム
３０−（１）                第一カラム
３０−（ｎ）                繰り返しカラム
３０−（ｆ）                最終キラルカラム
３５                        カラム温度調節器
３５−（１）                第一カラム温度調節器
３５−（ｎ）                繰り返しカラム温度調節器
３５−（ｆ）                最終キラルカラム温度調節器
４０                        検出器
４０−（１）                第一検出器
４０−（ｎ）                繰り返し検出器
４０−（ｆ）                最終検出器
４５                        記録計
４５−（１）                第一記録計
４５−（ｎ）                繰り返し記録計
４５−（ｆ）                最終記録計
５０                        貯液部
５０−（ｎ）／２０−（ｎ）  繰り返し貯液部
５０−（ｆ）／２０−（ｆ）  最終貯液部
５５                        マルチループユニット
５６                        ループ
５７ａ，ｂ                  切り替え手段
Ｓ１                        スイッチ位置
Ｓ２                        スイッチ位置
【図１】
2018092818.tif 000004
【図２】
2018092818.tif 000005
【図３】
2018092818.tif 000006
【図４】
2018092818.tif 000007
【図５】
2018092818.tif 000008
【図６】
2018092818.tif 000009
【図７】
2018092818.tif 000010
【図８】
2018092818.tif 000011
【図９】
2018092818.tif 000012
【図１０】
2018092818.tif 000013
【図１１】
2018092818.tif 000014
【図１２】
2018092818.tif 000015
【図１３】
2018092818.tif 000016
【図１４】
2018092818.tif 000017
【国際調査報告】
2018092818.tif 000018
2018092818.tif 000019
2018092818.tif 000020
2018092818.tif 000021