(57)【要約】  本発明は、細胞の調製方法であって、細胞をポリイミド多孔質膜に適用し、培養する工程を含み、ここで前記ポリイミド多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、以下の工程：（１）ポリアミック酸と有機極性溶媒とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する工程、及び（２）前記工程（１）で得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化する工程を含む方法で製造されるポリイミド多孔質膜である、細胞の調製方法に関する。
2018021366.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の調製方法であって、
細胞をポリイミド多孔質膜に適用し、培養する工程を含み、
ここで前記ポリイミド多孔質膜は、
複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、
ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、
前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、そして
マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、マクロボイド同士を連通する１つ又は複数の孔を有し、
以下の工程：
（１）ポリアミック酸と有機極性溶媒とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する工程、及び
（２）前記工程（１）で得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化する工程
を含む方法で製造されるポリイミド多孔質膜である、細胞の調製方法。
【請求項２】
前記ポリイミド多孔質膜が、
（１）ポリアミック酸と有機極性溶媒とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する工程、
（２）前記工程（１）で得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化する工程、及び
（３）前記工程（２）で得られたポリイミド多孔質膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施す工程
を含む方法で製造される、請求項１に記載の細胞の調製方法。
【請求項３】
前記ポリアミック酸が、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸二無水物と、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンとから得られる、請求項１又は２に記載の細胞の調製方法。
【請求項４】
細胞を前記ポリイミド多孔質膜の表面に播種する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリイミド多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せ、
前記ポリイミド多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリイミド多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記ポリイミド多孔質膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリイミド多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養培地又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリイミド多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記ポリイミド多孔質膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
生細胞が前記ポリイミド多孔質膜内に留まり、死細胞は水分とともに流出する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記滅菌された液体が、滅菌水若しくは滅菌された緩衝液である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び１又はそれ以上の前記ポリイミド多孔質膜を入れる、ここにおいて、ポリイミド多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である、ことを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
２以上の前記ポリイミド多孔質膜の小片を用いることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、前記ポリイミド多孔質膜に自発的に接着する、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリイミド多孔質膜を
ｉ）折り畳んで、
ｉｉ）ロール状に巻き込んで、
ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
ｉｖ）縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、前記ポリイミド多孔質膜に自発的に接着する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
２以上のポリイミド多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いることを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項４〜１４のいずれか１項に記載の方法の２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
細胞がポリイミド多孔質膜の表面及び内部に生育し増殖する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
動物細胞が、脊椎動物門に属する動物由来の細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
細菌が、乳酸菌、大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリアからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
細胞が、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞及び生殖細胞からなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞が、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ポリイミド多孔質膜を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の細胞の調製方法に使用するための細胞培養装置。
【請求項２３】
２以上のポリイミド多孔質膜が、上下又は左右に積層している、請求項２２に記載の細胞培養装置。
【請求項２４】
ポリイミド多孔質膜を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の細胞の調製方法に使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の調製方法、細胞培養装置及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞をポリイミド多孔質膜に適用して培養することを含む、細胞の培養方法が報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０１２４１５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１では、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理する事により得られる着色したポリイミド多孔質膜を使用して細胞を培養したことが報告されているのみである。ここで着色前駆体とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体であり、例えば石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。このようにして製造されるポリイミド多孔質膜は褐色であり、細胞の播種や生着挙動などを目視で確認することは困難であった。【０００５】
従って本発明は、より視認性の優れたポリイミド多孔質膜を用いて、細胞を簡便に、効率よく、かつ安定して培養を行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、着色前駆体を使用しない方法で製造される視認性の高いポリイミド多孔質膜が細胞培養に使用できることを見出し、本発明に至った。【０００７】
すなわち本発明は、以下の態様を有する。
［１］
細胞の調製方法であって、
細胞をポリイミド多孔質膜に適用し、培養する工程を含み、
ここで前記ポリイミド多孔質膜は、
複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、
ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、
前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、そして
マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、マクロボイド同士を連通する１つ又は複数の孔を有し、
以下の工程：
（１）ポリアミック酸と有機極性溶媒とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する工程、及び
（２）前記工程（１）で得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化する工程
を含む方法で製造されるポリイミド多孔質膜である、細胞の調製方法。
［２］
前記ポリイミド多孔質膜が、
（１）ポリアミック酸と有機極性溶媒とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する工程、
（２）前記工程（１）で得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化する工程、及び
（３）前記工程（２）で得られたポリイミド多孔質膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施す工程
を含む方法で製造される、［１］に記載の細胞の調製方法。
［３］
前記ポリアミック酸が、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸二無水物と、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンとから得られる、［１］又は［２］に記載の細胞の調製方法。
［４］
細胞を前記ポリイミド多孔質膜の表面に播種する工程を含む、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］
前記ポリイミド多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せ、
前記ポリイミド多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリイミド多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記ポリイミド多孔質膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
［６］
前記ポリイミド多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養培地又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリイミド多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記ポリイミド多孔質膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
［７］
生細胞が前記ポリイミド多孔質膜内に留まり、死細胞は水分とともに流出する、［６］に記載の方法。
［８］
前記滅菌された液体が、滅菌水若しくは滅菌された緩衝液である、［６］又は［７］に記載の方法。
［９］
細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び１又はそれ以上の前記ポリイミド多孔質膜を入れる、ここにおいて、ポリイミド多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である、ことを含む、［１］〜［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］
２以上の前記ポリイミド多孔質膜の小片を用いることを特徴とする、［９］に記載の方法。
［１１］
細胞が、前記ポリイミド多孔質膜に自発的に接着する、［９］又は［１０］に記載の方法。
［１２］
前記ポリイミド多孔質膜を
ｉ）折り畳んで、
ｉｉ）ロール状に巻き込んで、
ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
ｉｖ）縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させる、［１］〜［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１３］
細胞が、前記ポリイミド多孔質膜に自発的に接着する、［１２］に記載の方法。
［１４］
２以上のポリイミド多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いることを含む、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
［１５］
［４］〜［１４］のいずれか１つに記載の方法の２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いる、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
［１６］
細胞がポリイミド多孔質膜の表面及び内部に生育し増殖する、［１］〜［１５］のいずれか１つに記載の方法。
［１７］
細胞が、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される、［１］〜［１６］のいずれか１つに記載の方法。
［１８］
動物細胞が、脊椎動物門に属する動物由来の細胞である、［１７］に記載の方法。
［１９］
細菌が、乳酸菌、大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリアからなる群から選択される、［１７］に記載の方法。
［２０］
細胞が、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞及び生殖細胞からなる群から選択される、［１］〜［１６］のいずれか１つに記載の方法。
［２１］
細胞が、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択される、［１］〜［１６］のいずれか１つに記載の方法。
［２２］
ポリイミド多孔質膜を含む、［１］〜［２１］のいずれか１つに記載の細胞の調製方法に使用するための細胞培養装置。
［２３］
２以上のポリイミド多孔質膜が、上下又は左右に積層している、［２２］に記載の細胞培養装置。
［２４］
ポリイミド多孔質膜を含む、［１］〜［２１］のいずれか１つに記載の細胞の調製方法に使用するためのキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、細胞を簡便に、効率よく、かつ安定して培養することができる。特に、細胞の播種や生着挙動などを目視で確認することができる。また、使用されるポリイミド多孔質膜は着色度が低いことから、意匠性に優れている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ポリイミド多孔質膜を用いて培養されたヒト皮膚線維芽細胞の細胞数の経時変化を示す。
【図２】図２は、ポリイミド多孔質膜を用いて培養されたＣＨＯ  ＤＰ−１２細胞の細胞数の経時変化を示す。
【図３】図３は、ポリイミド多孔質膜を用いて培養されたヒト間葉系幹細胞の細胞数の経時変化を示す。
【図４】図４は、ポリイミド多孔質膜を用いて培養されたヒト間葉系幹細胞の細胞数の経時変化を示す。
【図５】図５は、ポリイミド多孔質膜上で培養されたヒト間葉系幹細胞の顕微鏡観察結果を示す。
【図６】図６は、ポリイミド多孔質膜上で培養されたヒト間葉系幹細胞を骨芽細胞へ誘導し、さらに石灰化誘導した後の光学顕微鏡画像を示す。
【図７】図７は、ポリイミド多孔質膜上で培養されたヒト間葉系幹細胞を脂肪細胞へ誘導した後の顕微鏡観察結果を示す。
【図８】図８は、ヒト間葉系幹細胞をポリイミド多孔質膜で長期培養した後の遺伝子解析結果を示す。
【図９】図９は、ポリイミド多孔質膜を用いて長期培養されたヒト皮膚線維芽細胞の細胞数の経時変化を示す。
【図１０】図１０は、ポリイミド多孔質膜を用いて長期間培養されたヒト皮膚線維芽細胞からのフィブロネクチンの産生量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．本発明で使用されるポリイミド多孔質膜について
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜中の表面層Ａ（以下で、「Ａ面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、０．０１〜５０μｍ、０．０１μｍ〜４０μｍ、０．０１μｍ〜３０μｍ、０．０１μｍ〜２０μｍ、又は０．０１μｍ〜１５μｍであり、好ましくは、０．０１μｍ〜１５μｍである。
【００１１】
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜中の表面層Ｂ（以下で、「Ｂ面」又は「大穴面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、表面層Ａに存在する孔の平均孔径よりも大きい限り特に限定されないが、例えば、２０μｍ〜１００μｍ、３０μｍ〜１００μｍ、４０μｍ〜１００μｍ、５０μｍ〜１００μｍ、又は６０μｍ〜１００μｍであり、好ましくは、２０μｍ〜１００μｍである。
【００１２】
ポリイミド多孔質膜表面の平均孔径は、多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真より、２００点以上の開孔部について孔面積を測定し、該孔面積の平均値から下式（１）に従って孔の形状が真円であるとした際の平均直径を計算より求めることができる。
【数１】
2018021366.tif 000003
（式中、Ｓａは孔面積の平均値を意味する。）
【００１３】
表面層Ａ及びＢの厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは０．０１〜２０μｍである。
【００１４】
ポリイミド多孔質膜におけるマクロボイド層中のマクロボイドの膜平面方向の平均孔径は、特に限定されないが、例えば１０〜５００μｍであり、好ましくは１０〜１００μｍであり、より好ましくは１０〜８０μｍである。また、当該マクロボイド層中の隔壁の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは、０．０１〜２０μｍである。当該マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する１つ又は複数の孔を有する。当該孔の平均孔径は、好ましくは平均孔径０．０１〜１００μｍであり、より好ましくは０．０１〜５０μｍである。
【００１５】
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜の総膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５〜５００μｍであり、より好ましくは２５〜７５μｍである。
【００１６】
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜の膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。
【００１７】
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜の空孔率は特に限定されないが、例えば、４０％以上９５％未満である。
【００１８】
本発明において用いられるポリイミド多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式（２）に従って求めることができる。
【数２】
2018021366.tif 000004
（式中、Ｓは多孔質フィルムの面積、ｄは総膜厚、ｗは測定した質量、Ｄはポリイミドの密度をそれぞれ意味する。ポリイミドの密度は１．３４ｇ／ｃｍ3とする。）
【００１９】
本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。
【００２０】
本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。ここで、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの１つ又は複数の孔を有する。
【００２１】
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを主たる成分とするポリイミド多孔質膜であり、好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。
【００２２】
テトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ−ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ−フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ−ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ｐ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、１，３−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２−ビス〔（３，４−ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’−（２，２−ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００２３】
これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。
【００２４】
ジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
【００２５】
１）１，４−ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６−ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン、
【００２６】
２）４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ビス（トリフルオロメチル）−４，４’−ジアミノビフェニル、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジカルボキシ−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’−テトラメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、ビス（４−アミノフェニル）スルフィド、４，４’−ジアミノベンズアニリド、３，３’−ジクロロベンジジン、３，３’−ジメチルベンジジン、２，２’−ジメチルベンジジン、３，３’−ジメトキシベンジジン、２，２’−ジメトキシベンジジン、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，３’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’−ジアミノジフェニルスルホン、３，４’−ジアミノジフェニルスルホン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、３，３’−ジアミノベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジクロロベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノジフェニルメタン、３，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、３，３’−ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’−ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン、
【００２７】
３）１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェノキシ）−４−トリフルオロメチルベンゼン、３，３’−ジアミノ−４−（４−フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジ（４−フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（３−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン、
【００２８】
４）３，３’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。
【００２９】
これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。
【００３０】
これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。
【００３１】
ポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。
【００３２】
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、（ii）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、及び／又は、（iii）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
【００３３】
２．本発明で使用されるポリイミド多孔質膜の製造方法について
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜は、
（１）ポリアミック酸と有機極性溶媒とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する工程、及び
（２）前記工程（１）で得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化する工程
を含む方法で製造される。
【００３４】
ポリアミック酸とは、テトラカルボン酸単位及びジアミン単位からなり、ポリイミド前駆体或いはその部分的にイミド化したポリイミド前駆体である。ポリアミック酸は、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとを重合することで得ることができる。ポリアミック酸を熱イミド化若しくは化学イミド化することにより、閉環してポリイミドとすることができる。本発明で使用されるポリアミック酸は、熱イミド化により作製することが好ましい。また、イミド化率が約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上であることが好ましい。
【００３５】
テトラカルボン酸二無水物及びジアミンは、上記の１．で挙げたものを用いることができる。発明で使用されるポリイミド多孔質膜の製造方法で使用されるポリアミック酸は、好ましくは、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸二無水物と、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンとから得られる。
【００３６】
ポリアミック酸を重合するための溶媒としては任意の有機極性溶媒を用いることができ、ｐ−クロロフェノール、ｏ−クロルフェノール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラメチル尿素、フェノール、クレゾールなどの有機極性溶媒などを用いることができ、特にＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）を好ましく用いることができる。
【００３７】
ポリアミック酸は、テトラカルボン酸二無水物、ジアミン、及び上記の有機極性溶媒などを用いて任意の方法で製造することができる。例えば、テトラカルボン酸二無水物とジアミンと略等モルで、好ましくは約１００℃以下、より好ましくは８０℃以下、更に好ましくは０〜６０℃、特に好ましくは２０〜６０℃の温度で、好ましくは約０．２時間以上、より好ましくは０．３〜６０時間反応させることで、ポリアミック酸溶液を製造することができる。
【００３８】
ポリアミック酸溶液を製造するときに、分子量を調整する目的で、任意の分子量調整成分を反応溶液に加えてもよい。
【００３９】
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜の製造方法で使用されるポリアミック酸の極限粘度数は、好ましくは１．０〜３．０であり、より好ましくは１．３〜２．８であり、特に好ましくは１．４〜２．６である。
【００４０】
ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。
【００４１】
ポリアミック酸溶液におけるポリアミック酸の含有量は、好ましくは３〜６０重量％であり、より好ましくは４〜４０質量％、更に好ましくは５〜２０質量％、特に好ましくは６〜１０質量％である。
【００４２】
ポリアミック酸溶液は、有機極性溶媒の存在下でテトラカルボン酸二無水物とジアミンを重合反応させて得られる溶液であってもよく、ポリアミック酸を有機極性溶媒に溶解させて得られる溶液であってもよい。
【００４３】
また、ポリアミック酸溶液の溶液粘度は、流延のしやすさ及びフィルム強度の観点から、好ましくは１０〜１００００ポアズ（１〜１０００Ｐａ・ｓ）、より好ましくは１００〜３０００ポアズ（１０〜３００Ｐａ・ｓ）、更に好ましくは２００〜２０００ポアズ（２０〜２００Ｐａ・ｓ）、特に好ましくは３００〜１０００ポアズ（３０〜１００Ｐａ・ｓ）である。
【００４４】
（流延）
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜の製造方法では、まず、ポリアミック酸溶液を、フィルム状に流延する。流延方法は特に限定されず、例えば、ポリアミック酸溶液をドープ液として使用し、ブレードやＴダイなどを用いてガラス板やステンレス板等の上に、ポリアミック酸溶液をフィルム状に流延することができる。また、連続の可動式のベルト又はドラム上に、ポリアミック酸溶液をフィルム状に断続的又は連続的に流延して、連続的に個片又は長尺状の流延物を製造することができる。ベルト又はドラムは、ポリアミック酸溶液及び凝固溶液に影響を受けないものであればよく、ステンレスなどの金属製、ポリテトラフルオロエチレンなどの樹脂製を用いることができる。また、Ｔダイからフィルム状に成形したポリアミック酸溶液をそのまま凝固浴に投入することもできる。また、必要に応じて流延物の片面又は両面を、水蒸気などを含むガス（空気、不活性ガスなど）と接触させてもよい。
【００４５】
（ポリアミック酸の多孔質膜の作製）
次に、流延物を、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸を析出させて多孔質化を行うことで、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する。得られたポリアミック酸の多孔質膜は、必要に応じて洗浄及び／又は乾燥を行う。
【００４６】
水を必須成分とする凝固溶媒は、好ましくは、水であるか、又は５質量％以上１００質量％未満の水と０質量％を超え９５質量％以下の有機極性溶媒との混合液である。火災などの安全面、製造原価、及び得られる膜の均質性の確保の観点から、水と有機極性溶媒とを含む凝固溶媒を用いることがより好ましい。凝固溶媒に含有してもよい有機極性溶媒としては、ポリアミック酸の貧溶媒であるエタノール、メタノール等のアルコ−ル類、アセトン等が挙げられる。また、ポリマーを析出可能な範囲でポリアミック酸の良溶媒を加えても良い。具体的には、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加えても良い。
【００４７】
凝固溶媒が水と有機極性溶媒との混合液である場合、凝固溶媒１００質量％中の水の含有量は、好ましくは５質量％以上１００質量％未満、より好ましくは２０質量％以上１００質量％未満、更に好ましくは３０〜９５質量％、特に好ましくは４５〜９０質量％である。凝固溶媒１００質量％中の有機極性溶媒の含有量は、好ましくは０質量％を超え９５質量％以下、より好ましくは０質量％を超え８０質量％以下、更に好ましくは５〜７０質量％、特に好ましくは１０〜５５質量％である。
【００４８】
凝固溶媒の温度は、目的に応じて適宜選択して用いればよく、例えば−３０〜７０℃、好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは１０〜５０℃の範囲で行うことが好ましい。
【００４９】
（熱イミド化処理）
次に、得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化してポリイミド多孔質膜を製造する。熱イミド化処理は、特に限定されないが、好ましくは当該処理後の膜の縦方向（長手方向）及び横方向の収縮率をそれぞれ、４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは１５％以下、一層好ましくは８％以下、特に好ましくは５％以下に抑制するように行われる。特に限定されないが、例えば、ポリアミック酸の多孔質膜を、ピン、チャック若しくはピンチロールなどを用いて支持体に固定し、大気中にて加熱することにより行うことができる。反応条件は、例えば２８０〜６００℃、好ましくは３００〜５５０℃の加熱温度で、１〜１２０分間、好ましくは２〜１２０分間、より好ましくは３〜９０分間、さらに好ましくは５〜３０分の加熱時間から適宜選択して行うことが好ましい。
【００５０】
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜の製造方法では、熱イミド化処理において２００℃以上の温度域での昇温速度が、特に限定されないが、例えば１℃／分以上であり、好ましくは、５℃／分以上、１０℃／分以上、１５℃／分以上又は２０℃／分以上であり、より好ましくは２５℃／分以上であり、特に好ましくは５０℃／分以上であり、昇温速度の上限値は特に限定する必要はないが、昇温速度の上限値を設定する場合は、例えば１〜５００℃／分であり、好ましくは、５〜４００／分、５〜３００℃／分又は５〜２００℃／分であり、より好ましくは５０〜５００℃／分であり、さらに好ましくは５０〜４００／分であり、一層好ましくは７０〜３００℃／分であり、特に好ましくは１２０〜２００℃／分である。
【００５１】
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜は、用いるポリマーの種類、ポリマー溶液のポリマー濃度、粘度、有機溶液など、凝固条件（溶媒置換速度調整層の種類、温度、凝固溶媒など）などを適宜選択することにより、空孔率、膜厚、表面の平均孔径、最大孔径、中央部の平均孔径などを適宜設計することができる。
【００５２】
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜の製造方法において、上記のイミド化工程で得られたポリイミド多孔質膜に対して、目的に応じて、少なくとも片面をコロナ放電処理、低温プラズマ放電或いは常圧プラズマ放電などのプラズマ放電処理、化学エッチングなどを施すことにより、膜の表面処理を行ってもよい。また、表面層（ａ）及び／又は（ｂ）を面削りして用いてもよい。これらの処理は、当業者に周知の方法に従って行うことができる。表面開口径、表面開口率、及び親水性を向上させるために、ポリイミド多孔質膜の少なくとも片面にプラズマ放電処理を施すことが好ましい。
【００５３】
好ましい実施形態において、本発明で使用されるポリイミド多孔質膜の製造方法は、
（１）テトラカルボン酸単位及びジアミン単位からなる極限粘度数が１．０〜３．０であるポリアミック酸３〜６０質量％と有機極性溶媒４０〜９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する工程、及び
（２）前記工程で得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化する工程、ここで、熱処理後の膜の縦方向及び横方向の収縮率をそれぞれ８％以下に抑制して、かつ前記熱処理において２００℃以上の温度域での昇温速度が２５℃／分以上である、
を含む。
【００５４】
好ましい別の実施形態において、本発明で使用されるポリイミド多孔質膜の製造方法は、
（１）テトラカルボン酸単位及びジアミン単位からなる極限粘度数が１．０〜３．０であるポリアミック酸３〜６０質量％と有機極性溶媒４０〜９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する工程、
（２）前記工程で得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化する工程、及び、
（３）前記工程（２）で得られたポリイミド多孔質膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施す工程
を含む。
【００５５】
３．本発明の細胞の調製方法について
本発明の細胞の調製方法は、細胞をポリイミド多孔質膜に適用し、培養することを含む。本発明の方法は、ポリイミド多孔質膜に細胞を適用し、ポリイミド膜の表面又は内部で細胞を培養することを含むことを特徴とするものである。
【００５６】
（１）細胞のポリイミド多孔質膜への適用
細胞のポリイミド多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、細胞のポリイミド多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
（Ａ）細胞を前記ポリイミド多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様；
（Ｂ）前記ポリイミド多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せ、
放置するか、あるいは前記ポリイミド多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記ポリイミド多孔質膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様；並びに、
（Ｃ）前記ポリイミド多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリイミド多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記ポリイミド多孔質膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
【００５７】
（Ａ）の態様は、ポリイミド多孔質膜の表面に細胞、細胞塊を直接播種することを含む。あるいは、ポリイミド多孔質膜を細胞縣濁液中に入れて、膜の表面から細胞培養液を浸潤させる態様も含む。
【００５８】
ポリイミド多孔質膜の表面に播種された細胞は、ポリイミド多孔質膜に接着し、多孔の内部に入り込んでいく。好ましくは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞はポリイミド多孔質膜に自発的に接着する。ポリイミド多孔質膜の表面に播種された細胞は、膜の表面及び／又は内部において安定して生育・増殖することが可能である。細胞は生育・増殖する膜の位置に応じて、種々の異なる形態をとりうる。
【００５９】
（Ｂ）の態様において、ポリイミド多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せる。ポリイミド多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリイミド多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませることにより、細胞縣濁液が膜中に浸透する。理論に縛られるわけではないが、これはポリイミド多孔質膜の各表面形状等に由来する性質によるものであると考えられる。本態様により、膜の細胞縣濁液が装填された箇所に細胞が吸い込まれて播種される。
【００６０】
あるいは、（Ｃ）の態様のように、前記ポリイミド多孔質膜の片面又は両面の部分又は全体を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤してから、湿潤したポリイミド多孔質膜に細胞縣濁液を装填してもよい。この場合、細胞懸濁液の通過速度は大きく向上する。
【００６１】
例えば、膜の飛散防止を主目的として膜極一部を湿潤させる方法（以後、これを「一点ウェット法」と記載する）を用いることができる。一点ウェット法は、実質上は膜を湿潤させないドライ法（（Ｂ）の態様）にほぼ近いものである。ただし、湿潤させた小部分については、細胞液の膜透過が迅速になると考えられる。また、ポリイミド多孔質膜の片面又は両面の全体を十分に湿潤させたもの（以後、これを「ウェット膜」と記載する）に細胞懸濁液を装填する方法も用いることができる（以後、これを「ウェット膜法」と記載する）。この場合、ポリイミド多孔質膜の全体において、細胞懸濁液の通過速度が大きく向上する。
【００６２】
（Ｂ）及び（Ｃ）の態様において、細胞縣濁液中の細胞を前記ポリイミド多孔質膜内に留め、水分は流出させる。これにより細胞縣濁液中の細胞の濃度を濃縮する、細胞以外の不要な成分を水分とともに流出させる、などの処理も可能になる。
【００６３】
（Ａ）の態様を「自然播種」（Ｂ）及び（Ｃ）の態様を「吸込み播種」と呼称する場合がある。
【００６４】
限定されるわけではないが、好ましくは、ポリイミド多孔質膜には生細胞が選択的に留まる。よって、本発明の好ましい態様において、生細胞が前記ポリイミド多孔質膜内に留まり、死細胞は優先的に水分とともに流出する。
【００６５】
態様（Ｃ）において用いる滅菌された液体は特に限定されないが、滅菌された緩衝液若しくは滅菌水である。緩衝液は、例えば、（＋）及び（-）Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ、（＋）及び（-）Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ等である。緩衝液の例を以下の表１に示す。
【００６６】
【表１】
2018021366.tif 000005
【００６７】
さらに、本発明の方法において、細胞のポリイミド多孔質膜への適用は、浮遊状態にある接着性細胞をポリイミド多孔質膜と縣濁的に共存させることにより細胞を膜に付着させる態様（絡め取り）も含む。例えば、本発明の細胞の培養方法において、細胞をポリイミド多孔質膜に適用するために、細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び１又はそれ以上の前記ポリイミド多孔質膜を入れてもよい。細胞培養培地が液体の場合ポリイミド多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である。ポリイミド多孔質膜の性質から、細胞はポリイミド多孔質膜に接着しうる。よって、生来浮遊培養に適さない細胞であっても、ポリイミド多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態で培養することが可能である。好ましくは、細胞は、ポリイミド多孔質膜に自発的に接着する。「自発的に接着する」とは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞がポリイミド多孔質膜の表面又は内部に留まることを意味する。
【００６８】
細胞培養は、細胞培養における存在形態により培養細胞は接着培養系細胞と浮遊培養系細胞に分類することができる。接着培養系細胞は培養容器に付着し増殖する培養細胞であり、継代には培地交換を行う。浮遊培養系細胞は培地中において浮遊状態で増殖する培養細胞であり、一般的には継代の際には培地交換は行わず、希釈培養を行う。浮遊培養は、浮遊状態、即ち液体中での培養が可能なため、大量培養が可能であり、培養容器表面にのみ生育する付着細胞と比較すると、立体的な培養である為に、単位空間当りの培養可能細胞数は多いという利点がある。
【００６９】
本発明により、概念的には、細胞の種類に限定されずに浮遊培養と類似した形態で細胞を育成する事が可能になったことにより、大量の細胞を簡便に培養する方法が提供された。本発明の細胞培養方法において、ポリイミド多孔質膜を細胞培養培地中に浮遊した状態で用いる場合、２以上の前記ポリイミド多孔質膜の小片を用いてもよい。ポリイミド多孔質膜はフレキシブルな薄膜であるため、例えばその小片を培養液中に浮遊させて用いることにより、一定容量の細胞培養培地中に多くの表面積を有するポリイミド多孔質膜を持ち込むことが可能となる。通常培養の場合、容器底面積が細胞培養可能な面積の上限となるが、本発明のポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養では、先の持ち込まれたポリイミド多孔質膜の大表面積の全てが細胞培養可能な面積となる。ポリイミド多孔質膜は細胞培養液を通過させるので、例えば折りたたまれた膜内にも栄養や酸素等の供給が可能となる。
【００７０】
ポリイミド多孔質膜の小片の大きさ、形状は、特に限定されない。形状は、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など任意の形をとりうる。例えば、一辺の長さが約０．１ｍｍ〜約２０ｍｍ、好ましくは約０．２ｍｍ〜約１０ｍｍの、より好ましくは、約１ｍｍ〜約５ｍｍの四角形（正方形、長方形等）、三角形などが含まれる。あるいは、例えば、好ましくは、直径が約０．１ｍｍ〜約２０ｍｍ、より好ましくは約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍの円形でもよい。これらの小片を液中に分散させることにより、浮遊培養と近似の形態が形成されることになる。
【００７１】
本発明のポリイミド多孔質膜は柔軟性があるため形状を変化させて用いることができる。ポリイミド多孔質膜を平面状ではなく、立体状に形状を加工して用いてもよい。例えば、ポリイミド多孔質膜を、ｉ）折り畳んで、ｉｉ）ロール状に巻き込んで、ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、ｉｖ）縄状に結んで、細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させてもよい。ｉ）-ｉｖ）のように形状を加工することにより、小片を用いる場合と同様に、一定容量の細胞培養培地中に多くのポリイミド多孔質膜を入れることができる。さらに、各小片を集合体として取り扱うことができるため、細胞体を集合化して移動させることが可能となり、総合的な応用性が高い。
【００７２】
小片集合体と同様の考え方として、２以上のポリイミド多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いてもよい。積層とは、ポリイミド多孔質膜が一部重なる態様も含む。積層培養により、狭いスペースで高密度に細胞を培養することが可能になる。既に細胞が育成している膜上にさらに膜を積層させて設置して別種細胞との多層系を形成することも可能である。さらに、立体環境下での細胞間相互作用検証や、ストレスのない細胞培養方法など、創薬への利用も可能である。積層するポリイミド多孔質膜の数は特に限定されない。
【００７３】
上述した本発明の細胞の培養方法を、２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いてもよい。例えば、態様（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの方法を用いて先ずポリイミド多孔質膜に細胞を適用し、次いで、細胞が接着したポリイミド多孔質膜を浮遊培養してもよい。あるいは、ポリイミド多孔質膜に適用する工程として、上記態様（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの方法を２種類又はそれより多くを組み合わせて用いてもよい。
【００７４】
本発明の方法において、好ましくは、細胞はポリイミド多孔質膜の表面及び内部に生育し増殖する。細胞が立体構造体の内部に生育して増殖することを示した報告例はない。本発明においてポリイミド多孔質膜の利用により、細胞の継続的な三次元培養が可能になった。限定されるわけではないが、本発明の方法により、細胞は２日以上、より好ましくは４日以上、さらに好ましくは６日以上増殖し続ける。
【００７５】
（２）本発明で使用され得る細胞
本発明の方法に利用し得る細胞の種類は特に限定されず、任意の細胞の増殖に利用可能である。
【００７６】
例えば、細胞は、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される。動物細胞は、脊椎動物門に属する動物由来の細胞と無脊椎動物（脊椎動物門に属する動物以外の動物）由来の細胞とに大別される。本明細書における、動物細胞の由来は特に限定されない。好ましくは、脊椎動物門に属する動物由来の細胞を意味する。脊椎動物門は、無顎上綱と顎口上綱を含み、顎口上綱は、哺乳綱、鳥綱、両生綱、爬虫綱などを含む。好ましくは、一般に、哺乳動物と言われる哺乳綱に属する動物由来の細胞である。哺乳動物は、特に限定されないが、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどを含む。
【００７７】
本明細書における植物細胞の由来は特に限定されない。コケ植物、シダ植物、種子植物を含む植物の細胞が対象となる。
【００７８】
種子植物細胞が由来する植物は、単子葉植物、双子葉植物のいずれも含まれる。限定されるわけではないが、単子葉植物には、ラン科植物、イネ科植物（イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、ソルガム等）、カヤツリグサ科植物などが含まれる。双子葉植物には、キク亜綱、モクレン亜綱、バラ亜綱など多くの亜綱に属する植物が含まれる。
【００７９】
藻類も、細胞由来生物として見なす事が出来る。真正細菌であるシアノバクテリア（藍藻）から、真核生物で単細胞生物であるもの（珪藻、黄緑藻、渦鞭毛藻など）及び多細胞生物である海藻類（紅藻、褐藻、緑藻）などの異なるグループを含む。
【００８０】
本明細書における古細菌及び細菌の種類も特に限定されない。古細菌は、メタン菌・高度好塩菌・好熱好酸菌・超好熱菌等からなる群から構成される。細菌は、例えば、乳酸菌、大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリアなどからなる群から選択される。
【００８１】
本発明の方法に利用しうる動物細胞又は植物細胞の種類は、限定されるわけではないが、好ましくは、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、及び生殖細胞からなる群から選択される。
【００８２】
本発明において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。限定されるわけではないが、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等を含む。好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開ＷＯ２００９／１２３３４９（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５７０４１）に記載の多能性幹細胞を使用可能である。
【００８３】
「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味する。例えば骨髄中の造血幹細胞は血球のもととなり、神経幹細胞は神経細胞へと分化する。このほかにも肝臓をつくる肝幹細胞、皮膚組織になる皮膚幹細胞などさまざまな種類がある。好ましくは、組織幹細胞は、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択される。
【００８４】
「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞のことを言う。有性生殖においては次世代へは受け継がれない。好ましくは、体細胞は、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される。
【００８５】
「生殖細胞」は、生殖において遺伝情報を次世代へ伝える役割を持つ細胞を意味する。例えば、有性生殖のための配偶子、即ち卵子、卵細胞、精子、精細胞、無性生殖のための胞子などを含む。
【００８６】
細胞は、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択してもよい。「肉腫」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血液等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する癌で、軟部肉腫、悪性骨腫瘍などを含む。肉腫細胞は、肉腫に由来する細胞である。「株化細胞」とは、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもつに至り、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞を意味する。ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ-６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来）などヒトを含む様々な生物種の様々な組織に由来する細胞株が存在する。「形質転換細胞」は、細胞外部から核酸（ＤＮＡ等）を導入し、遺伝的性質を変化させた細胞を意味する。動物細胞、植物細胞、細菌の形質転換については、各々適した方法が公知である。
【００８７】
（３）細胞の培養システム及び細胞培養条件
本発明の方法において、細胞の培養システム及び培養条件は、細胞の種類等に応じて適宜決定することができる。動物細胞、植物細胞、及び細菌の各細胞に適した培養方法が公知であり、当業者は任意の公知の方法を用いてポリイミド多孔質膜に細胞を培養することができる。細胞培養培地も細胞の種類に応じて適宜調製することができる。
【００８８】
動物細胞の細胞培養方法、細胞培養培地は、例えば、ロンザ社の細胞培養培地カタログに記載されている。植物細胞の細胞培養方法、細胞培養培地は、例えば、ＷＡＫＯ社の植物組織培地シリーズ等に記載されている。細菌の細胞培養方法、細胞培養培地は、例えば、ＢＤ社の一般細菌用培地カタログに記載されている。本発明の方法に用いることの細胞培養培地は、液体培地、半固形培地、固形培地等のいずれの形態であってもよい。また、液滴状とした液体培地を細胞培養容器中に噴霧することにより、細胞を担持したポリイミド多孔質膜に培地が接触するようにしてもよい。
【００８９】
ポリイミド多孔質膜を用いる細胞の培養に関して、マイクロキャリアやセルローススポンジ等、他の浮遊型培養担体と共存させることもできる。
【００９０】
本発明の方法において、培養に用いるシステムの形状、規模などは特に限定されず、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ  セルファクトリー等が含まれる。なお、本発明においてポリイミド多孔質膜を用いることにより、生来浮遊培養が可能でなかった細胞についても浮遊培養向け装置にて、浮遊培養類似状態での培養を行うことが可能になった。浮遊培養用の装置としては、例えば、コーニング社製のスピナーフラスコや回転培養等が使用可能である。また、同様の機能を実現出来る環境として、ＶＥＲＩＴＡＳ社のＦｉｂｅｒＣｅｌｌ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍの様な中空糸培養も使用することが可能である。
【００９１】
本発明の方法における培養は、ポリイミド多孔質膜上に連続的に培地を添加し回収するような連続循環もしくは開放型の装置を用いて、空気中にポリイミド多孔質膜シートを露出させるような型式で実行することも可能である。
【００９２】
本発明において、細胞の培養は、細胞培養容器外に設置された細胞培養培地供給手段から連続的又は間歇的に細胞培養培地が細胞培養容器中に供給される系で行ってもよい。その際、細胞培養培地が細胞培養培地供給手段と細胞培養容器との間を循環する系であることができる。
【００９３】
細胞の培養を、細胞培養容器外に設置された細胞培養培地供給手段から連続的又は間歇的に細胞培養培地が細胞培養容器中に供給される系で行う場合、その系は、細胞培養容器である培養ユニットと細胞培養培地供給手段である培地供給ユニットとを含む細胞培養装置であってよく、ここで
培養ユニットは細胞を担持するための１又は複数のポリイミド多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットであり、
培地供給ユニットは培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して連続的又は間歇的に培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットである
細胞培養装置であってよい。
【００９４】
また、上記細胞培養装置において、培養ユニットは空気供給口、空気排出口、及び酸素交換膜を備えない培養ユニットであってよく、また、空気供給口及び空気排出口、又は酸素交換膜を備えた培養ユニットであってよい。培養ユニットは空気供給口及び空気排出口、並びに酸素交換膜を備えないものであっても、細胞の培養に必要な酸素等が培地を通じて十分に細胞に供給される。さらに、上記細胞培養装置において、培養ユニットが培地排出ラインをさらに備え、ここで培地排出ラインの第一の端部は培地収納容器に接続し、培地排出ラインの第二の端部は培養ユニットの培地排出口を介して培養ユニット内に連通し、培地が培地供給ユニットと培養ユニットとを循環可能であってよい。
【００９５】
４．本発明の細胞培養装置について
本発明はまた、ポリイミド多孔質膜を含む、本発明の調製方法に使用するための細胞培養装置に関する。本発明の細胞培養装置において、ポリイミド多孔質膜は固定されて用いられても良く、あるいは細胞培養培地中に浮遊して用いられても良い。細胞培養装置において、２以上のポリイミド多孔質膜が、上下又は左右に積層してもよい。
【００９６】
５．本発明のキットについて
本発明はさらに、ポリイミド多孔質膜を含む、細胞の調製方法に使用するためのキットに関する。
【００９７】
本発明のキットは、ポリイミド多孔質膜の他に、細胞培養に必要な構成要素を適宜含みうる。例えば、ポリイミド多孔質膜に適用する細胞、細胞培養培地、細胞培養装置、キットの取り扱い説明書などが含まれる。
【００９８】
限定されるわけではないが、一態様として、透明なパウチ内に滅菌されたポリイミド多孔質膜が単独で又は複数枚保存され、そのままで細胞培養に使用可能な形態を含むパッケージや、あるいは、同パウチ内にポリイミド多孔質膜と共に滅菌液体が封入されており、効率的吸込み播種が可能になっている膜・液体の一体型形態のキットを含む。
【実施例】
【００９９】
以下に示す実施例を参照して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されるものでないことは言うまでもない。【０１００】
実施例１
ポリイミド多孔質膜を用いて培養されたヒト皮膚線維芽細胞の細胞数の経時変化【０１０１】
１．ポリイミド多孔質膜１及び３の調製
（１）ポリアミック酸溶液組成物Ａの調製
５００ｍｌのセパラブルフラスコに、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）を溶媒として用いて、酸無水物として３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）を、ジアミンとして４，４’−ジアミノジフェニルエーテルを、酸無水物／ジアミンのモル比０．９９４、ポリマー濃度が８質量％になる量を測り取って投入した。その後、撹拌羽、窒素導入管、排気管を取り付けたセパラブルカバーで蓋をし、撹拌操作を３０時間継続した。撹拌を終了し、フラスコ内のドープを加圧ろ過器（濾紙：アドバンテック東洋（株）製：粘稠液用濾紙Ｎｏ．６０）でろ過して、ポリアミック酸溶液組成物Ａを得た。溶液組成物Ａは粘稠な液体であり粘度は３２０ポイズであった。また、極限粘度数は１．６であった。【０１０２】
（２）ポリイミド多孔質膜１及び３の調製
室温下で、卓上の自動コーターを用いて、表面に鏡面研磨を施したステンレス製の２０ｃｍ角の基板上に、ポリアミック酸溶液組成物Ａを厚さ約１００〜３００μｍの範囲の厚みで均一に流延塗布した。その後、９０秒間、温度２３℃、湿度４０％の大気中に放置し、その後、凝固浴（水８０質量部／ＮＭＰ２０質量部、室温）中に基板全体を投入した。投入後、８分間静置し、基板上にポリアミック酸膜を析出させた。その後、基板を浴中から取りだし、基板上に析出したポリアミック酸膜を剥離した後に、純水中に３分間浸漬し、ポリアミック酸膜を得た。このポリアミック酸膜を温度２３℃、湿度４０％の大気中で乾燥させた後、１０ｃｍ角のピンテンタ−に張りつけて四辺を拘束した。電気炉内にセットして約１０℃／分の昇温速度で１５０℃まで加熱し、その後は最高温度３４０℃となるまで加熱し、そのまま３分間保持する温度プロファイルで熱処理を行い、厚みの異なるポリイミド多孔質膜１（２５μｍ）ポリイミド多孔質膜３（４８μｍ）を調製した。ポリイミド多孔質膜１及び３を、それぞれ以下で「膜１」及び「膜３」とも呼ぶ。いずれも、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であった。【０１０３】
膜１の表面層Ａに存在する孔の平均孔径は２１μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は３２μｍであり、空孔率が７３％であった。【０１０４】
膜３の表面層Ａに存在する孔の平均孔径は１８μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２８μｍであり、空孔率が７６％であった。【０１０５】
２．ポリイミド多孔質膜２、４の調製
（１）ポリアミック酸溶液組成物Ｂの調製
５００ｍｌのセパラブルフラスコに、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）を溶媒として用いて、酸無水物として３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）を、ジアミンとして４，４’−ジアミノジフェニルエーテルを、酸無水物／ジアミンのモル比０．９９６、ポリマー濃度が８質量％になる量を測り取って投入した。その後、撹拌羽、窒素導入管、排気管を取り付けたセパラブルカバーで蓋をし、撹拌操作を３０時間継続した。撹拌を終了し、フラスコ内のドープを加圧ろ過器（濾紙：アドバンテック東洋（株）製：粘稠液用濾紙Ｎｏ．６０）でろ過して、ポリアミック酸溶液組成物を得た。溶液組成物は粘稠な液体であり粘度は４５２ポイズであった。また、極限粘度数は２．４であった。【０１０６】
（２）ポリイミド多孔質膜２及び４の調製
室温下で、卓上の自動コーターを用いて、表面に鏡面研磨を施したステンレス製の２０ｃｍ角の基板上に、ポリアミック酸溶液組成物Ｂを厚さ約１００〜２００μｍで、均一に流延塗布した。その後、９０秒間、温度２３℃、湿度４０％の大気中に放置し、その後、凝固浴（水８０質量部／ＮＭＰ２０質量部、室温）中に基板全体を投入した。投入後、８分間静置し、基板上にポリアミック酸膜を析出させた。その後、基板を浴中から取りだし、基板上に析出したポリアミック酸膜を剥離した後に、純水中に３分間浸漬し、ポリアミック酸膜を得た。このポリアミック酸膜を温度２３℃、湿度４０％の大気中で乾燥させた後、１０ｃｍ角のピンテンタ−に張りつけて四辺を拘束した。電気炉内にセットして約１０℃／分の昇温速度で１５０℃まで加熱し、その後に最高温度３４０となるまで加熱し、そのまま３分間保持する温度プロファイルで熱処理を行い、ポリイミド多孔質膜を得た。
その後、得られたポリイミド多孔質膜の片面に常圧プラズマ処理を６０秒間施し、ポリイミド多孔質膜２、４を得た。以下で「膜２」及び「膜４」とも呼ぶ。いずれの膜も、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であった。【０１０７】
膜２の表面層Ａに存在する孔の平均孔径は９μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は３３μｍであり、厚みが２５μｍ、空孔率が７４％であった。【０１０８】
膜４の表面層Ａに存在する孔の平均孔径は８μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は３５μｍであり、厚みが４８μｍ、空孔率が７８．９％であった。【０１０９】
膜１〜４のポリイミド多孔質膜の特徴を以下の表に示す。
【表２】
2018021366.tif 000006
【０１１０】
３．膜１〜４を用いた、ヒト皮膚線維芽細胞の培養
２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific社 cat.103）にヒト線維芽細胞用培地（LONZA社、CC-3132）１ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形の膜１〜膜４を、メッシュ構造のＡ面もしくは大穴構造のＢ面を上にして静置した。１枚のシートあたり４×１０4個のヒト皮膚線維芽細胞（LONZA社、CC-2511）を播種し、ＣＯ2インキュベータ内で培養を継続的に行った。週２回培地（１ｍｌ）交換を行った。培養開始後、５日、７日、１２日、１９日、２７日後にCell Counting Kit-8（同仁化学研究所製、以下で「ＣＣＫ８」と呼ぶ）を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図１に示す。膜１〜４において、同程度の数の細胞を安定に培養できることが確認された。【０１１１】
実施例２
ポリイミド多孔質膜を用いて培養されたＣＨＯ  ＤＰ−１２細胞の細胞数の経時変化
２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific社、cat.103）に細胞培養培地（和光純薬工業株式会社  ＩＭＤＭ  ０９８−０６４６５）０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形の膜１〜膜４（実施例１で調製されたもの）を、メッシュ構造のＡ面を上に据え、１枚のシートあたり４×１０4個の、抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ  ＤＰ−１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を播種した。ＣＯ2インキュベータ内で培養を継続し、週２回定期的に培地を交換した。培養開始後、３日間、７日間、１５間、２２日間、２９間後にＣＣＫ８を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図２に示す。安定した細胞の生育が観測された。膜１〜４において、同程度の数の細胞を安定に培養できることが確認された。【０１１２】
実施例３
ポリイミド多孔質膜を用いて培養されたヒト間葉系幹細胞の細胞数の経時変化
２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific社、cat.103）に間葉系幹細胞培養培地（LONZA社製、MSCBM）０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形の膜１〜膜４（実施例１で調製されたもの）を、メッシュ構造のＡ面を上に据え、１枚のシートあたり４×１０4個のヒト間葉系幹細胞を播種した。ＣＯ2インキュベータ内で培養を継続し、週２回定期的に培地を交換する。培養開始後、３日間、７日間、１５間、２２日間、２９間後にＣＣＫ８を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図３に示す。膜１〜４において、同程度の数の細胞を安定に培養できることが確認された。【０１１３】
実施例４
ポリイミド多孔質膜上でのヒト間葉系幹細胞の長期培養
ヒト間葉系幹細胞を口内径６ｃｍのタイプＩコラーゲンコートディッシュ（IWAKI製）に播種して培養後、トリプシン処理により剥離し、細胞懸濁液を調製した。２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific社、 cat.103）に細胞培養培地（GIBCO製、DMEM+FBS10%）０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜１及び２（実施例１で調製されたもの）を、メッシュ構造のＡ面を上にして容器に据え、１枚のポリイミド多孔質膜あたり４×１０4個のヒト間葉系幹細胞をポリイミド多孔膜上部に添加した。ＣＯ2インキュベータ内で培養を継続し、週２回培地を交換した。培養開始後、定期的にＣＣＫ８を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察しつつ培養した。１０６日間までの培養細胞数推移を図４に示す。安定した細胞の生育が観察された。ポリイミド多孔質膜を使用した上記培養を以下で「部材培養」と呼び、得られた細胞サンプルを「部材培養細胞サンプル」と呼ぶ。【０１１４】
培養開始後１２０日目における、細胞の生着したポリイミド多孔質膜２をホルマリン固定後、Alexa Fluor（登録商標）488ファロイジン、CellMask Orange Plasma Membrane Stain、及びDAPIで染色した。光学観察、並びに共焦点レーザー顕微鏡による同視野の光学及び蛍光観察の結果を図５に示す。黄白色ポリイミド多孔質膜上での細胞の生育状態が光学的にもある程度観察可能であった。黄白色ポリイミド多孔質膜の高視認性が、観察性の向上に寄与している。【０１１５】
実施例５
ポリイミド多孔質膜上で培養されたヒト間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導
実施例４の培養開始後１２０日目における、細胞の生着したポリイミド多孔質膜１を、骨芽細胞分化誘導培地（PromoCell社製、C-28013）に移し、２２日間骨芽細胞に誘導（週２回培地交換）した後、更に骨芽細胞石灰化培地（PromoCell社製、C-28020）に移して１４日間培養した。石灰化染色キット（コスモバイオ社製）にて染色した。光学顕微鏡観察を行い、石灰化部位の観察を行なった。顕著な赤変部位が観察され、石灰化の進行が確認された（図６）。間葉系幹細胞の持つ幹細胞特性の維持が確認された。【０１１６】
実施例６
ポリイミド多孔質膜上で培養されたヒト間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導
実施例４の培養開始後１２７日目における、細胞の生着したポリイミド多孔質膜２を、脂肪細胞誘導培地（PromoCell社製、C-28016）に移して、１５日間培養した。その後、細胞が生着したポリイミド多孔質膜をホルマリン固定し、脂肪細胞の油滴をＢＯＤＩＰＹにて蛍光染色した。光学観察、並びに共焦点レーザー顕微鏡による同視野の光学及び蛍光観察の結果を図７に示す。黄白色ポリイミド多孔質膜の有する高視認性により、蛍光染色のみならず、光学観察においても、油滴の存在が観察された。間葉系幹細胞の持つ幹細胞特性の維持が確認された。【０１１７】
実施例７
ポリイミド多孔質膜上で長期培養されたヒト間葉系幹細胞の遺伝子解析
１．サンプルの調製
実施例４の培養開始後１５４日目における膜１の部材培養細胞サンプルを遺伝子解析用サンプルとして使用した。また、ポリイミド多孔質膜を使用しないこと以外は実施例４と同様の条件で、タイプＩコラーゲンコートディッシュ（IWAKI製）中でヒト間葉系幹細胞を７日間培養した。培養された細胞を遺伝子解析用サンプルとして使用した。ポリイミド多孔質膜を使用しなかった上記培養を以下で「通常培養」と呼び、得られた細胞サンプルを「通常培養細胞サンプル」と呼ぶ。【０１１８】
２．遺伝子解析
得られたサンプルに関し、以下の手順で遺伝子解析を行なった。
（１）RNA抽出
RNeasy Plus micro Kit（Qiagen）を用いて付属のプロトコール通りにRNAの抽出を行った。RNAは30μLのNuclease Free Waterで抽出し、その後、TURBO DNA free Kit（Life Technologies）を用いてDNaseによるゲノムDNAの分解処理を行った。分解処理後、RNA 溶液の濃度をNano Drop 2000（ThermoFishier Scientific）で測定した。
（２）cDNA合成
濃度測定後のRNA 溶液を12.5ng/μLに調製し、100ngをテンプレートとしてcDNA合成を行った。合成にはSuperScript（商標） III First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Life Technologies）を使用した。cDNA 溶液の濃度をNano Drop 2000で測定した。
（３）q-PCR 反応
cDNA 溶液を200ng/μLに調製し、200ngをテンプレートとしてとしてリアルタイムPCRによる測定を行った。PCRはCFX connect(Bio-Rad)で行い、試薬はSsoAdvanced（商標） Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad）を使用した。間葉系幹細胞陽性マーカー（CD166、CD44、CD105、CD146、CD90、CD106、CD29、CD71）、間葉系幹細胞陰性マーカー（CD19、CD45、CD31、CD18、CD56、CD34、CD14、CD80、CD40、CD86）について、発現量を測定し、内部標準遺伝子としてはbeta-Actinを使用した。
（４）測定データ解析
測定で求められた各遺伝子のCt値を、内部標準遺伝子として測定したbeta-ActinのCt値で引いた値から、相対発現量を算出して比較した。また、通常培養サンプルと部材培養サンプルで遺伝子発現の経時変化を比較するために、７日間通常培養したサンプルの発現量を１とした場合の変化をそれぞれ算出して比較した。陽性マーカーに関する結果を図８に示す。なお、陰性マーカーの発現量は全て低値であることを確認した。遺伝子発現量の結果から、実施例１で調製された膜を用いて長期培養した後であっても、幹細胞特性が維持されることが確認された。【０１１９】
実施例８
ポリイミド多孔質膜を用いた、ヒト皮膚線維芽細胞の長期培養
実施例１にて実施した実験を更に継続し、約１年間の長期培養を実施した。培地交換は、週２回継続的に実施し、適宜、ＣＣＫ８を用いて生育細胞数の測定を行った。結果を図９に示す。長期間培養した場合であっても、ヒト皮膚線維芽細胞の安定した増殖及び生育が観察された。【０１２０】
実施例９
ポリイミド多孔質膜を用いて培養されたヒト皮膚線維芽細胞からの物質産生
実施例８の培養開始後３９７日目における部材培養細胞サンプルからのフィブロネクチン産生を、ヒトフィブロネクチン測定用ＥＬＩＳＡキット（タカラバイオ製、Cat# MK115）を用いて測定した。結果を図１０に示す。なお、コントロールサンプルとして、ポリイミド多孔質膜を使用しないこと以外は実施例８と同様の条件で、細胞培養用シャーレ（住友ベークライト製）中で８日間培養したヒト皮膚線維芽細胞を用いて、当該細胞のフィブロネクチン産生を測定した（図中のＤｉｓｈ１及び２）。長期培養後においても、安定したフィブロネクチン産生が確認され、ヒト皮膚線維芽細胞の特性が維持されていることを確認した。ポリイミド多孔質膜で培養された細胞からの物質産生の効率は、通常培養で培養された細胞からの物質産生の効率と比較して非常に高いことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明の方法は、細胞を簡便に、効率よく、かつ安定して培養するために好適に利用することができる。特に、細胞の播種や生着挙動などを目視で確認することができる点で有用である。また、使用されるポリイミド多孔質膜は着色度が低いことから、意匠性に優れている点も有用である。
【図１】
2018021366.tif 000007
【図２】
2018021366.tif 000008
【図３】
2018021366.tif 000009
【図４】
2018021366.tif 000010
【図５】
2018021366.tif 000011
【図６】
2018021366.tif 000012
【図７】
2018021366.tif 000013
【図８】
2018021366.tif 000014
【図９】
2018021366.tif 000015
【図１０】
2018021366.tif 000016
【国際調査報告】
2018021366.tif 000017
2018021366.tif 000018
2018021366.tif 000019
2018021366.tif 000020
2018021366.tif 000021