(57)【要約】  本発明は、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、以下のアミノ酸： 配列番号１記載のアミノ酸配列における１７５位のアミノ酸、配列番号１記載のアミノ酸配列における２１４位のアミノ酸 配列番号１記載のアミノ酸配列における１９２位のアミノ酸、配列番号１記載のアミノ酸配列における２１２位のアミノ酸、配列番号１記載のアミノ酸配列における２１８位のアミノ酸、及び／又は配列番号１記載のアミノ酸配列における２２６位のアミノ酸に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、熱安定性が向上していることを特徴とし、ただし、配列番号２８、３０又は３２で示されるアミノ酸配列からなるＦＡＤ−ＧＤＨを除くＦＡＤ−ＧＤＨに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、以下のアミノ酸：
配列番号１記載のアミノ酸配列における１７５位のアミノ酸、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１４位のアミノ酸、
配列番号１記載のアミノ酸配列における１９２位のアミノ酸、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１２位のアミノ酸、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１８位のアミノ酸、及び／又は
配列番号１記載のアミノ酸配列における２２６位のアミノ酸
に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、熱安定性が向上していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、
ただし、配列番号２８、３０又は３２で示されるアミノ酸配列からなるＦＡＤ−ＧＤＨを除く。
【請求項２】
配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、以下のアミノ酸：
配列番号１記載のアミノ酸配列における１７５位に対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１４位に対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における１９２位に対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１２位に対応する位置のアミノ酸がロイシン、メチオニンのいずれかである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１８位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、及び/又は
配列番号１記載のアミノ酸配列における２２６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニン、アスパラギン、アラニン、セリン、システイン、バリンのいずれかである
に対応する位置でアミノ酸置換を有することを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、
ただし、配列番号２８、３０又は３２で示されるアミノ酸配列からなるＦＡＤ−ＧＤＨを除く。
【請求項３】
配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１記載のアミノ酸配列における４６６位のアミノ酸に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、マルトースへの反応性が低減していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ。
【請求項４】
配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１記載のアミノ酸配列における４６６位のアミノ酸に対応する位置がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、スレオニン、システイン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシンに置換され、前記置換を行う前と比較して、マルトースへの反応性が低減していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ。
【請求項５】
配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個アミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列に対応する位置のアミノ酸が、以下：
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸である、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がリジンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がセリンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がグルタミンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がメチオニンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がバリンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がトリプトファンである、又は
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシンである
のいずれかに記載されるアミノ酸残基であるＦＡＤ−ＧＤＨ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子。
【請求項７】
請求項６に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組換え体ＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７記載の組換え体ＤＮＡが導入されている宿主細胞。
【請求項９】
ＦＡＤ−ＧＤＨを製造する方法であり、以下の工程を含む方法： 
請求項８に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を発現させる工程、及び 
前記培養物からＦＡＤ−ＧＤＨを単離する工程。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨを用いるグルコース測定方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱安定性に優れ、及び／又はマルトースへの反応性が低減したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、それを用いたグルコース測定方法およびフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中グルコース濃度（血糖値）は、糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病患者が自己の血糖値を管理するための装置としては、電気化学的バイオセンサを用いた自己血糖測定（Ｓｅｌｆ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＭＢＧ）機器が広く利用されている。ＳＭＢＧ機器に用いられるバイオセンサには、従来、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等のグルコースを基質とする酵素が利用されている。しかしながら、ＧＯＤは酸素を電子受容体とするという特性を備えているため、ＧＯＤを用いたＳＭＢＧ機器では、測定サンプル中の溶存酸素が測定値に影響を与え、正確な測定値が得られない場合が起こりうる。【０００３】
一方、グルコースを基質とするが、酸素を電子受容体としない別の酵素として、各種のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が知られている。具体的には、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）やニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするタイプのＧＤＨ（ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨ）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするＧＤＨ（ＰＱＱ−ＧＤＨ）が見出されており、ＳＭＢＧ機器のバイオセンサに使用されている。しかしながら、ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨは、酵素の安定性が乏しく、かつ、補酵素の添加が必要という問題を有し、また、ＰＱＱ−ＧＤＨは基質特異性が低く、測定対象であるグルコース以外にも、マルトース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−キシロースなどの糖化合物に対して作用してしまうため、測定サンプル中のグルコース以外の糖化合物が測定値に影響し、正確な測定値が得られないという問題点が存在する。【０００４】
近年、ＰＱＱ−ＧＤＨをバイオセンサとして用いたＳＭＢＧ機器を用いて、輸液投与を受けていた糖尿病患者の血糖値を測定する際に、ＰＱＱ−ＧＤＨが輸液中に含まれるマルトースにも作用して、実際の血糖値よりも高い測定値が得られ、この値に基づく処置が原因となって患者が低血糖等を発症した例が報告されている。また、同様の事象はガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者にも起こり得ることも判明している（例えば、非特許文献１参照）。これを受け、厚生労働省医薬食品局は、グルコース溶液に各糖類を添加した場合における血糖測定値への影響を調査する目的で交差反応性試験を行ったところ、６００ｍｇ／ｄＬのマルトース、３００ｍｇ／ｄＬのＤ−ガラクトース、あるいは、２００ｍｇ／ｄＬのＤ−キシロース添加を行った場合には、ＰＱＱ−ＧＤＨ法を用いた血糖測定キットの測定値は、実際のグルコース濃度より２．５〜３倍ほど高い値を示した。すなわち、測定試料中に存在し得るマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースにより測定値が不正確になることが判明し、このような測定誤差の原因となる糖化合物の影響を受けず、グルコースを特異的に測定可能な基質特異性の高いＧＤＨの開発が切に望まれている。【０００５】
上記のような背景の下、上記以外の補酵素を利用するタイプのＧＤＨが着目されるようになってきている。例えば、基質特異性に関する詳細な記載はないが、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のＧＤＨについての報告（例えば、非特許文献２〜５参照）が知られている。また、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）が開示されており（例えば、特許文献１〜３参照）、さらにＤ−キシロースに対する作用性を低減させたアスペルギルス属由来のＦＡＤ−ＧＤＨも開示されている（例えば、特許文献４参照）。【０００６】
しかし、上記の酵素は、Ｄ−グルコースではない１種又は数種の糖化合物に対して反応性が低いという特性を示すものの、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという特性を有してはいない。これらに対して、ケカビの一種であるムコール（Ｍｕｃｏｒ）属から見出されたＦＡＤ−ＧＤＨは、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという優れた特性を有することが示されている（例えば、特許文献５参照）。このＧＤＨを用いれば、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースが存在する条件下においても、それらの糖化合物による影響を受けることなくグルコース濃度を正確に測定することが可能であり（例えば、特許文献５参照）。このような優れた基質特異性は、ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの実用上の優位性を示す特徴のひとつである。さらに、特許文献５においては、ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの遺伝子配列、アミノ酸配列、ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの遺伝子配列を利用した大腸菌及び麹菌を宿主とする組換え発現についても開示されている。【０００７】
一方で、自己血糖測定における利便性をより向上させるために、測定感度のさらなる向上による測定時間短縮化や、測定系のさらなる小スケール化、必要とされる測定サンプルの少量化等が継続的に追求されている。例えば、測定感度を向上させるための一手段としては、グルコースセンサー上に搭載するグルコース測定酵素の量を増加させることも想定される。しかしながら、このような使用法において予測される、多量の酵素が存在する条件下では、前述のＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ−ＧＤＨを用いた場合においても、一定濃度以上で存在するマルトースやＤ−キシロースへの反応が若干ながら確認され、Ｄ−グルコース以外の糖化合物に対する反応性を低下させる取り組みにおいては、依然として改善の余地が存在する。【０００８】
ＦＡＤ−ＧＤＨの基質特異性を向上させることを目的として、既存のＦＡＤ−ＧＤＨを改変する試みとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来ＦＡＤ−ＧＤＨに対してアミノ酸置換を導入することによりＤ−キシロースに対する作用性が低減したＦＡＤ−ＧＤＨ改変体を得る方法が開示されている（例えば、特許文献４、６参照）。しかしながら、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来ＦＡＤ−ＧＤＨは、天然型のＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ−ＧＤＨと比べてＤ−キシロースへの反応性がかなり高く、これまでに開示されているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来ＦＡＤ−ＧＤＨ改変体をもってしても、その基質特異性は十分であるとは言い難い。また、特許文献７では、Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ−ＧＤＨに対してアミノ酸置換を導入することによりＤ−キシロース及びマルトースに対する作用性が低減したＦＡＤ−ＧＤＨ改変体を得る方法が開示されているが、さらなる高い特異性を付与する試みは継続的に求められている。【０００９】
また、ＦＡＤ−ＧＤＨの血糖センサーへの用途を考慮すると、センサーチップ作製時には酵素の加熱乾燥処理工程を含む場合があるため、耐熱性の高いＦＡＤ−ＧＤＨが求められる。特に、連続血糖測定装置に用いられているセンサーチップにはＧＯＤが用いられているが、その理由の１つとして熱安定性がＦＡＤ−ＧＤＨよりもＧＯＤの方が優れており、長期的測定に適していることが挙げられる。このような目的に関しては、特許文献４において、優れた基質特異性及び耐熱性を有するケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨ（チゴサッカロマイセス属の酵母で発現）等が見出されている。また、特許文献８は、部位特異的変異を導入することにより、ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性が向上することを開示している。
しかしながら、センサーチップの作製時における過酷な熱条件に供する可能性を想定すると、さらなる熱安定性を付与する試みが継続的に求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−２８９１４８号公報
【特許文献２】特許第４４９４９７８号公報
【特許文献３】国際公開第０７／１３９０１３号
【特許文献４】特開２００８−２３７２１０号公報
【特許文献５】特許第４６４８９９３号公報
【特許文献６】国際公開第０９／０８４６１６号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０３／０６５７７０号パンフレット
【特許文献８】国際公開第１２／１６９５１２号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】医薬品・医療用具等安全性情報２０６号（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓａｆｅｔｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｎｏ．２０６）、２００４年１０月、厚生労働省医薬食品局
【非特許文献２】Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ． Ｉ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｐ−ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ， Ｔ． Ｃ． Ｂａｋ， ａｎｄ Ｒ． Ｓａｔｏ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １３９， ２６５−２７６ （１９６７）．
【非特許文献３】Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ． ＩＩ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｔ．Ｃ． Ｂａｋ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １３９， ２７７−２９３ （１９６７）．
【非特許文献４】Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ． ＩＩＩ． Ｇｅｎｅｒａｌ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｔ．Ｃ． Ｂａｋ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １４６， ３１７−３２７ （１９６７）．
【非特許文献５】Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ． ＩＶ． Ｈｉｓｔｉｄｙｌ ｒｅｓｉｄｕｅ ａｓ ａｎ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ， Ｔ．Ｃ． Ｂａｋ， ａｎｄ Ｒ． Ｓａｔｏ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １４６， ３２８−３３５ （１９６７）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、熱安定性が優れ、及び／又はマルトースへの反応性が低減したＦＡＤ−ＧＤＨを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の課題を解決するために、本発明者は鋭意検討を重ね、熱安定性が向上したＦＡＤ−ＧＤＨを探索した結果、公知のＦＡＤ−ＧＤＨに変異を導入することにより、熱安定性が向上したＦＡＤ−ＧＤＨが得られることを見出した。また、マルトースへの作用が低減したＦＡＤ−ＧＤＨを探索した結果、公知のＦＡＤ−ＧＤＨに変異を導入することにより、マルトースへの反応性が低減したＦＡＤ−ＧＤＨが得られることを見出した。【００１４】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、以下のアミノ酸：
配列番号１記載のアミノ酸配列における１７５位のアミノ酸、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１４位のアミノ酸、
配列番号１記載のアミノ酸配列における１９２位のアミノ酸、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１２位のアミノ酸、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１８位のアミノ酸、及び／又は
配列番号１記載のアミノ酸配列における２２６位のアミノ酸
に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、熱安定性が向上していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、
ただし、配列番号２８、３０又は３２で示されるアミノ酸配列からなるＦＡＤ−ＧＤＨを除く。
（２）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、以下のアミノ酸：
配列番号１記載のアミノ酸配列における１７５位に対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１４位に対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における１９２位に対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１２位に対応する位置のアミノ酸がロイシン、メチオニンのいずれかである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１８位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、及び/又は
配列番号１記載のアミノ酸配列における２２６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニン、アスパラギン、アラニン、セリン、システイン、バリンのいずれかである
に対応する位置でアミノ酸置換を有することを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、
ただし、配列番号２８、３０又は３２で示されるアミノ酸配列からなるＦＡＤ−ＧＤＨを除く。
（３）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１記載のアミノ酸配列における４６６位のアミノ酸に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、マルトースへの反応性が低減していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ。
（４）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１記載のアミノ酸配列における４６６位のアミノ酸に対応する位置がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、スレオニン、システイン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシンに置換され、前記置換を行う前と比較して、マルトースへの反応性が低減していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ。
（５）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個アミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列に対応する位置のアミノ酸が、以下：
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸である、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニンである、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がリジンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がセリンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がグルタミンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がメチオニンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する 
位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がバリンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がトリプトファンである、又は 
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシンである
のいずれかに記載されるアミノ酸残基であるＦＡＤ−ＧＤＨ。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子。
（７）上記（６）に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組換え体ＤＮＡ。
（８）上記（７）記載の組換え体ＤＮＡが導入されている宿主細胞。
（９）ＦＡＤ−ＧＤＨを製造する方法であり、以下の工程を含む方法： 
上記（８）に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を発現させる工程、及び 
前記培養物からＦＡＤ−ＧＤＨを単離する工程。
（１０）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のＦＡＤ−ＧＤＨを用いるグルコース測定方法。
（１１）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
（１２）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースセンサー。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、熱安定性に優れ、及び／又はマルトースへの反応性が低いＦＡＤ−ＧＤＨを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】各種由来のＧＤＨのマルチプルアライメントを示す。ＭｐＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ由来ＧＤＨ（配列番号１）であり、ＭｈＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ由来ＧＤＨ（配列番号３０）であり、ＭｄｒＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ＲＤ０５６８６０由来ＧＤＨ（配列番号３２）であり、ＭｓＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ由来ＧＤＨ（配列番号９４）であり、ＭｇＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ由来ＧＤＨ（配列番号２８）であり、ＣｓＧＤＨはＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ由来ＧＤＨ（配列番号９５）であり、ＣｒＧＤＨはＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ属由来ＧＤＨ（配列番号９６）であり、ＭｃＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ由来ＧＤＨ（配列番号９７）である。
【図１−２】図１−１のつづきである。
【図１−３】図１−２のつづきである。
【図１−４】図１−３のつづきである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの作用原理および活性測定法） 
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−Δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）および２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の系を用いて測定することができる。
（反応１） Ｄ−グルコ−ス ＋ ＰＭＳ（酸化型） 
→ Ｄ−グルコノ−Δ−ラクトン ＋ ＰＭＳ（還元型） 
（反応２） ＰＭＳ（還元型） ＋ ＤＣＩＰ（酸化型） 
→ ＰＭＳ（酸化型） ＋ ＤＣＩＰ（還元型） 
【００１８】
（反応１）において、グルコースの酸化に伴い、ＰＭＳ（還元型）が生成する。続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳ（還元型）が酸化されるのに伴ってＤＣＩＰが還元される。この「ＤＣＩＰ（酸化型）」の消失度合を波長６００ｎｍにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定する。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） ２．０５ｍＬ、１Ｍ Ｄ−グルコース溶液 ０．６ｍＬおよび２ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、１５ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．１ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いＧＤＨ活性を算出する。この際、ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
【００１９】
【数１】
2017195765.tif 000002
【００２０】
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
【００２１】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列） 
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、配列番号１で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と同一性の高い、例えば、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１記載のアミノ酸配列における１７５位、２１４位、１９２位、２１２位、２１８位、２２６位、４６６位から選択されるアミノ酸に対応する位置で、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする。
好ましくは、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨにおける、上述の１７５位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の１７５位に対応する位置でのアミノ酸がシステインに置換される置換であり、２１４位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の２１４位に対応する位置でのアミノ酸がシステインに置換される置換であり、１９２位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の１９２位に対応する位置でのアミノ酸がプロリンに置換される置換であり、２１２位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の２１２位に対応する位置でのアミノ酸がロイシン、メチオニンに置換される置換であり、２１８位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の２１８位に対応する位置でのアミノ酸がヒスチジンに置換される置換であり、２２６位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の２２６位に対応する位置でのアミノ酸がスレオニン、アスパラギン、セリン、システイン、アラニン、バリンに置換される置換であり、４６６位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の４６６位に対応する位置でのアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、スレオニン、システイン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシンに置換される置換である。なお、配列番号１においては、本発明の置換を有さない１７５位のアミノ酸はアラニンであり、２１４位のアミノ酸はアスパラギンであり、１９２位のアミノ酸はセリンであり、２１２位のアミノ酸はイソロイシンであり、２１８位のアミノ酸はアラニンであり、２２６位のアミノ酸はイソロイシンであり、４６６位のアミノ酸はグリシンである。配列番号２８においては、本発明の置換を有さない配列番号１の１７５位に対応する位置は１７０位のスレオニンであり、配列番号１の２１４位に対応する位置は２０９位のアスパラギンであり、配列番号１の２１８位に対応する位置は２１３位のセリンであり、配列番号１の２２６位に対応する位置は２２１位のイソロイシンであり、配列番号１の４６６位に対応する位置は４６１位のグリシンである。配列番号３０においては、本発明の置換を有さない配列番号１の１７５位に対応する位置は１７２位のバリンであり、配列番号１の２１４位に対応する位置は２１１位のアスパラギンであり、配列番号１の４６６位に対応する位置は４６３位のグリシンである。配列番号３２においては、本発明の置換を有さない配列番号１の１７５位に対応する位置は１７１位のバリンであり、配列番号１の２１４位に対応する位置は２１０位のアスパラギン酸であり、配列番号１の４６６位に対応する位置は４６３位のグリシンである。
【００２２】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの中で、さらに好ましいものの例として、上記のような置換を複数組み合わせて有する多重変異体が挙げられる。上記のような置換を２箇所組み合わせて有する２重変異体、３箇所組み合わせて有する３重変異体等が本発明に包含される。このような変異の蓄積により、熱安定性がさらに向上し、マルトースへの反応性がさらに低減したＦＡＤ−ＧＤＨを作出することができる。
【００２３】
また、上記のような多重変異体を作出するにあたっては、上述の各種の置換以外の位置における置換を組み合わせることもできる。このような置換の位置は、単独で置換を導入した場合には、上述の置換部位におけるもののように顕著な効果を奏さないものであっても、上述の置換部位と組み合わせて導入することによって、相乗的に効果を奏するものであり得る。
【００２４】
また、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨには、上述のような、熱安定性を向上させる変異やマルトースへの反応性を低減させる変異のほかに、温度依存性を改善させる変異や、ｐＨや特定の物質などへの耐性を向上させる効果などのような、別種の効果を奏することを目的とした公知の変異を任意に組み合わせてもよい。このような別種の変異を組み合わせた場合であっても、本発明の効果を発揮し得るものである限り、それらのＦＡＤ−ＧＤＨは本発明に包含される。
【００２５】
後述のとおり、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、例えば、まず任意の方法で、配列番号１のアミノ酸配列に近いアミノ酸配列をコードする遺伝子を入手し、配列番号１の所定の位置と同等の位置におけるいずれかの位置においてアミノ酸置換を導入することにより得ることもできる。
目的とするアミノ酸置換導入方法としては、例えばランダムに変異を導入する方法あるいは想定した位置に部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。前者の方法としては、エラープローンＰＣＲ法（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１，１１−１５，（１９８９））や、増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こしやすく、改変を生じやすいＸＬ１−Ｒｅｄコンピテントセル（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いる方法等がある。また、後者の方法として、目的とするタンパク質の結晶構造解析により立体構造を構築し、その情報をもとに目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、市販のＱｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等により部位特異的変異を導入する方法がある。あるいは、後者の方法として、目的とするタンパク質と相同性の高い公知のタンパク質の立体構造を用いて、目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、部位特異的変異を導入する方法もある。
【００２６】
また、ここでいう、例えば、「配列番号１のアミノ酸配列に対応する位置」とは、配列番号１のアミノ酸配列と、配列番号１と同一性（好ましくは７０％以上、より好ましくは７３％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは７８％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上）を持つアミノ酸配列を有する他のＦＡＤ−ＧＤＨとをアラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。なお、アミノ酸配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１１（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、又はＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。
【００２７】
また、ここでいう、例えば、「配列番号１のアミノ酸配列に対応する位置」を特定する方法としては、例えば、リップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、同一性が７０％以上のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列を比較するならば、対応するアミノ酸残基の各ＦＡＤ−ＧＤＨ配列における配列中の位置を決めることが可能である。対応する位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるＦＡＤ−ＧＤＨの基質特異性に関して類似した効果を有することが推定できる。
（相同性領域について）
アミノ酸配列の同一性又は類似性は、ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１１（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のＧＤＨをアライメントしたときに、該２以上のＧＤＨにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
また、２以上のＧＤＨにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてＢｌｏｓｕｍ６２を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域（保存領域）を決定できる。
本明細書において「相同性領域」とは、２以上のＧＤＨをアライメントしたときに、ある基準となるＧＤＨと比較対象のＧＤＨの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図１では全長アミノ酸配列の配列同一性が７０％以上であるＧＤＨをアライメントした。このうち、配列番号１で示されるＭｕｃｏｒ属ＧＤＨを基準として第３１位〜４１位は同一アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号１で示されるＭｕｃｏｒ属ＧＤＨを基準として５８〜６２位、７１〜８５位、１０６〜１１６位、１１９〜１２７位、１３２〜１３４位、１３６〜１４４位、１５０〜１５３位、１６７〜１７１位、２１９〜２２５位、２５３〜２６２位、２７７〜２８１位、３０１〜３０３位、３０５〜３１２位、３１４〜３１９位、３２４〜３２６位、３３２〜３３７位、３３９〜３４６位、３４８〜３５４位、３８６〜３９４位、４１５〜４１７位、４５４〜４５９位、４７６〜４８４位、４８６〜４９１位、５０８〜５１１位、５１８〜５２０位、５２２〜５２４位、５２６〜５２８位、５６４〜５７９位、５８４〜５８６位、５９２〜５９５位、５９７〜５９９位、６０７〜６１７位、及び６２５〜６３０位は相同性領域に該当しうる。
本発明のＧＤＨは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＧＤＨとアライメントしたときに５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する。さらに、本発明のＧＤＨ変異体の相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号１における相同性領域のアミノ酸配列と８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有する。
また、相同性領域を基準に本発明の突然変異の位置を特定することができる。例えば、配列番号１の１７５位又はそれに対応する位置は、１６７〜１７１位の相同性領域からC末端方向に４アミノ酸離れた位置として特定することができる。
【００２８】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨには、上記の同一性の範囲内で各種のバリエーションが想定されるが、各種ＦＡＤ−ＧＤＨの酵素科学的性質が本明細書に記載する本発明のＦＡＤ―ＧＤＨと同様である限り、それらは全て本発明のＦＡＧ−ＧＤＨに含まれ得る。このようなアミノ酸配列を有するＦＡＤ−ＧＤＨは、基質特異性が高く、かつ、十分な熱安定性を有するＦＡＤ−ＧＤＨであり、産業上有用である。
【００２９】
また、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨにおいては、上述の１７５位に対応する位置でのアミノ酸がシステインであること、又は、２１４位に対応する位置でのアミノ酸がシステインであること、又は、１９２位に対応する位置でのアミノ酸がプロリンであること、又は、２１２位に対応する位置でのアミノ酸がロイシン、メチオニンであること、又は、２１８位に対応する位置でのアミノ酸がヒスチジンであること、又は、２２６位に対応する位置でのアミノ酸がスレオニン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、バリンであること、４６６位に対応する位置でのアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、スレオニン、システイン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシンであることが重要なのであって、それが人為的な置換操作によるものか否かは重要でない。例えば、配列番号１記載のタンパク質のように、上記の位置のアミノ酸が本発明で所望される残基とは元々異なっているタンパク質を出発物質として、そこに公知の技術を用いて所望の置換を導入していく場合であれば、これらの所望されるアミノ残基は置換により導入される。一方、公知のペプチド全合成により所望のタンパク質を入手する場合、又は、所望のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするように遺伝子配列を全合成し、これに基づき所望のタンパク質を入手する場合、あるいは、天然型として見出されたものの中に元々そのような配列を有するものがあった場合等には、人為的な置換という工程を経ることなく、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを得ることができる。
【００３０】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨにおける熱安定性の向上） 
本発明における耐熱性の向上は、本明細書中に記載の活性測定方法及び熱安定性測定方法に記載した条件において評価される。なお、本明細書における熱処理時のｐＨは７．０であるが、これは本発明のＦＡＤ−ＧＤＨが血液中のグルコース（血糖値）を測定する目的で開発されたものであり、血液のｐＨが中性付近であることによる。このように実用になるべく近い条件で評価を行うことによって、より有用な酵素の取得が可能となる。
【００３１】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、本明細書中に記載の活性測定方法および熱安定性測定方法に記載した反応条件下で、例えば、ｐＨ７．０、４５℃、１５分間熱処理後の残存活性が２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは３５％以上であることを特徴とし、例えば、ｐＨ７．０、４０℃、１５分間熱処理後の残存活性が１．３％以上、２％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは３５％以上であることを特徴とし、例えば、ｐＨ７．０、５０℃、１５分間熱処理後の残存活性が１．３％以上、２％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは３５％以上であることを特徴とし、例えば、ｐＨ７．０、５５℃、１５分間熱処理後の残存活性が１．３％以上、２％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは３５％以上であることを特徴とし、例えば、ｐＨ７．０、６０℃、１５分間熱処理後の残存活性が１．３％以上、２％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは３５％以上であることを特徴とする。
【００３２】
また、本発明の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨは、前述の活性測定方法に基づく反応条件下で、Ｄ−グルコースへの反応性に対する同モル濃度のマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））が、アミノ酸置換を導入する前と比較して低減している、好ましくは４％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上低減していることを特徴とする。つまりは、Ｄ−グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））が２％以下であることが好ましく、より好ましくは１．５％以下、より好ましくは１．０％以下、より好ましくは０．８％以下、より好ましくは０．７％以下、最も好ましくは０．６％以下であることが好ましい。
【００３３】
また、上述のように熱安定性が向上し、マルトースに対する基質特異性が改善されていることに加えて、その他の酵素諸性質に関しても、実用により適した性能を兼ね備えていることが好ましい。例えば、Ｄ−グルコースへの反応性に対するＤ−キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））が２％以下であることが好ましい。例えば、比活性は所定の変異を導入する前と比べて、６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上を維持していることが好ましい。例えば、Ｋｍ値は１１０ｍＭ以下であり、より好ましくは１００ｍＭ以下であることが好ましい。
【００３４】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子の取得） 
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを効率よく取得するためには、遺伝子工学的手法を利用するのが好ましい。本発明のＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子（以下、ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子）を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を用いればよい。例えば、公知のＦＡＤ−ＧＤＨを出発物質とし、それを改変することにより本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを取得するには、ＦＡＤ−ＧＤＨ生産能を有する公知の微生物菌体や種々の細胞から、常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＷＩＬＥＹ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００３５】
ついで、公知のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列情報に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーから基質特異性の高いＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、基質特異性の高いＦＡＤ−ＧＤＨをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
【００３６】
公知のＦＡＤ−ＧＤＨを出発物質として、本発明の熱安定性に優れたＦＡＤ−ＧＤＨを取得する方法として、出発物質であるＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子に変異を導入し、各種の変異遺伝子から発現されるＦＡＤ−ＧＤＨの酵素科学的性質を指標に選択を行う方法を採用し得る。
出発物質であるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４〜３０、１９８９年６月号）。
【００３７】
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法 （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社， ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製， Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の利用が挙げられる。
【００３８】
また、一般的なポリメラーゼチェインリアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９））。
なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望の熱安定性に優れた改変ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を合成することもできる。
【００３９】
上記のような任意の方法により選択された本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定又は確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いれば良い。
【００４０】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの由来となる天然型ＦＡＤ−ＧＤＨの例） 
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、公知のＦＡＤ−ＧＤＨを改変することにより取得することもできる。公知のＦＡＤ−ＧＤＨの由来微生物の好適な例としては、ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属由来のＦＡＤ−ＧＤＨ等が挙げられる。
Ｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｍｕｃｏｒ ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ． ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ ｆ． ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ、Ｍｕｃｏｒ ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ等が挙げられる。より具体的には、特許文献５に記載のＭｕｃｏｒ ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ． ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ ＮＢＲＣ９４０３、Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ ｆ． ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ ＮＢＲＣ６７５４、Ｍｕｃｏｒ ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ ＮＢＲＣ６３３８、Ｍｕｃｏｒ ＲＤ０５６８６０、Ｍｕｃｏｒ ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ ＮＢＲＣ５３９５等が挙げられる。Ａｂｓｉｄｉａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ａｂｓｉｄｉａ ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ、Ａｂｓｉｄｉａ ｈｙａｌｏｓｐｏｒａを挙げることができる。より具体的には、特許文献５に記載のＡｂｓｉｄｉａ ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ、Ａｂｓｉｄｉａ ｈｙａｌｏｓｐｏｒａを挙げることができる。Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ ｅｌｅｇａｎｓを挙げることができる。より具体的には、特許文献５に記載のＡｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ ｅｌｅｇａｎｓを挙げることができる。Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓｃａｅ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｒｉｇｉｄａ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａを挙げることができる。より具体的には、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｉｎｏｒ ＮＢＲＣ６４４８、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ ＮＢＲＣ４４５３、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓｃａｅ ＮＢＲＣ６４１０、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｒｉｇｉｄａ ＮＢＲＣ６４１１、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ ＮＢＲＣ６４１２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ４４５２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ ＮＢＲＣ５８４２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２３及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ＲＤ０５５４２２を挙げることができる。なお、ＮＢＲＣ菌株およびＲＤ菌株はＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター）の保管菌株である。
【００４１】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子が挿入されたベクターおよび宿主細胞） 
上述のように得られた本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
原核宿主細胞の一例としては、エシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌Ｋ−１２株、エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００等（いずれもタカラバイオ社製）が挙げられる。それらを形質転換し、又は、それらに形質導入して、ＤＮＡが導入された宿主細胞（形質転換体）を得る。こうした宿主細胞に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主細胞がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）；ニッポンジーン製）を用いても良い。
【００４２】
真核宿主細胞の一例としては、酵母が挙げられる。酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する酵母が挙げられる。挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター等が挙げられる。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法（ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ５， ２５５−２６９（１９９５））やエレクトロポレーション（Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５５ （２００３）４８１−４８４）等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えば良い。
【００４３】
真核宿主細胞の他の例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属やトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属のようなカビ細胞が挙げられる。挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター（例えばｔｅｆ１プロモーター）及びその他の制御配列（例えば、分泌シグナル配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。また、挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子、例えばｎｉａＤ、ｐｙｒＧが含まれていても良い。さらに、挿入遺伝子には、任意の染色体部位へ挿入するための相同組換え領域が含まれていても良い。糸状菌への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２１８， ９９−１０４（１９８９））を好適に用いることができる。
（ハイスループットスクリーニング） 
ＧＤＨはさらに、機能性ＧＤＨ変異体を取得するためにハイスループットスクリーニングに供することができる。例えば変異導入したＧＤＨ遺伝子を有する形質転換又は形質導入株のライブラリーを作製し、これをマイクロタイタープレートに基づくハイスループットスクリーニングに供してもよく、又は液滴型マイクロ流体に基づく超ハイスループットスクリーニングに供してもよい。例としてはバリアントをコードする変異遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築し、次いでファージディスプレイ（例えばChem. Rev. 105 (11): 4056-72, 2005）、イーストディスプレイ（例えばComb Chem High Throughput Screen. 2008;11(2): 127-34）、バクテリアルディスプレイ（例えばCurr Opin Struct Biol 17: 474-80, 2007）等を用いて、変異ＧＤＨの大きな集団をスクリーニングする方法が挙げられる。またAgresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (9): 4004-4009 (Mar, 2010)を参照のこと。GDHバリアントのスクリーニングに使用しうる超ハイスループットスクリーニング手法についての同文献の記載を参照により本明細書に組み入れる。例えばエラープローンＰＣＲ法によりライブラリーを構築することができる。また飽和突然変異誘発を用いて、本明細書に記載の領域や位置又はそれらに対応する領域や位置を標的として変異導入しライブラリーを構築してもよい。ライブラリーを用いて電気コンピテントＥＢＹ−１００細胞等の適当な細胞を形質転換し、約１０の７乗の変異体を取得しうる。該ライブラリーで形質転換した酵母細胞を次いでセルソーティングに供しうる。標準ソフトリトグラフィー法を用いて作製したポリジメトキシルシロキサン（ＰＤＭＳ）マイクロ流体デバイスを用いてもよい。フローフォーカスデバイスを用いて単分散の液滴を形成することができる。個別の変異体を含有する形成された液滴を適当なソーティングデバイスに供しうる。細胞を選別する際にはＧＤＨ活性の有無を利用しうる。これには例えば上記のＧＤＨが作用すれば発色する組成とした反応液を用いてもよい。例えばＤＣＩＰを用いる場合は、９６ウェルプレート、１９２ウェルプレート、３８４ウェルプレート、９６００ウェルプレート等及びプレートリーダーを用いて６００ｎｍの吸光度を測定してもよい。変異導入と選別は複数回反復してもよい。
【００４４】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの製造） 
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、上述のように取得した本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からＦＡＤ−ＧＤＨを単離することにより、製造すればよい。
上記宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
培地の初発ｐＨは、限定されないが、例えば、ｐＨ６〜９に調整することができる。
培養は、１０〜４２℃の培養温度、好ましくは２５℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは２５℃前後の培養温度で４〜８時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。
【００４５】
培養終了後、該培養物より本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを採取する。これには、通常の公知の酵素採取手段を用いればよい。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、もしくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、又はトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの粗酵素を得る。
【００４６】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの粗酵素を、公知の任意の手段を用いてさらに精製することもできる。精製された酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製された本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ酵素標品を得ることができる。
【００４７】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを用いたグルコース測定方法） 
本発明はまた、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを開示し、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを用いて血中のグルコース（血糖値）を測定することができる。
本発明のグルコースアッセイキットには、少なくとも１回のアッセイに十分な量の本発明に従う改変型ＦＡＤ−ＧＤＨを含む。典型的には、本発明のグルコースアッセイキットは、本発明の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含む。本発明のグルコース測定法やグルコースアッセイキットに用いる改変型ＦＡＤ−ＧＤＨは、種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、又は適切な保存溶液中に溶解されて提供することができる。
【００４８】
グルコース濃度の測定は、比色式グルコースアッセイキットの場合は、例えば、以下のよう行うことができる。グルコースアッセイキットの反応層にはＦＡＤ−ＧＤＨ、電子受容体、そして反応促進剤としてＮ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてｐＨ緩衝剤、発色試薬を添加する。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、還元により退色する電子受容体もしくは電子受容体より電子を受け取ることによって重合し生成する色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば、試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化から、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作成したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のグルコース濃度を算出することができる。
【００４９】
この方法において使用できるメディエーター及び発色試薬としては、例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）を電子受容体として添加し、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を、さらに発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。なお、いうまでもなく、使用する電子受容体および発色試薬はこれらに限定されない。
【００５０】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースセンサー） 
本発明はまた、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを用いるグルコースセンサーを開示する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＦＡＤ−ＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００５１】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作成したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００５２】
具体的な一例としては、グラッシーカーボン（ＧＣ）電極に本発明の１．５ＵのＦＡＤ−ＧＤＨを固定化し、グルコース濃度に対する応答電流値を測定する。電解セル中に、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．８ｍｌ、及び、１Ｍ ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（フェリシアン化カリウム）水溶液０．２ｍｌを添加する。ＧＣ電極をポテンショスタットＢＡＳ１００Ｂ／Ｗ（ＢＡＳ製）に接続し、３７℃で溶液を撹拌し、銀塩化銀（飽和ＫＣｌ）参照電極に対して＋５００ｍＶを印加する。これらの系に１Ｍ Ｄ−グルコース溶液を終濃度が１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭになるよう添加し、添加ごとに定常状態の電流値を測定する。この電流値を既知のグルコース濃度（１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ）に対してプロットし、検量線が作成する。これより本発明のＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素を使用した酵素固定化電極でグルコースの定量が可能となる。
【００５３】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００５４】
本発明において、改変型ＦＡＤ−ＧＤＨの熱安定性および基質特異性の評価は、特に記載がない限り、以下の試験例の方法に従い行った。
［試験例］
（１）各種の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨを発現する酵母形質転換体の作製 
特許文献８に記載の方法に準じ、配列番号２のＭｕｃｏｒ ｐｒａｉｎｉｉ由来ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子（野生型ＭｐＧＤＨ遺伝子）をコードする組換え体プラスミド（ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ（野生型））を取得した。
得られた組換え体プラスミドｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐを鋳型として、各アミノ酸置換導入用の合成ヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとして「反応液」を調製した。サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、調製した反応液を９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５５℃、３０秒」−「６８℃、８分」のサイクルを３０回繰り返した。【００５５】
上記処理後の反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約８ｋｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。増幅されたＤＮＡを、制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理後、添付のプロトコールに従って、大腸菌ＪＭ１０９株（ニッポンジーン社製）のコンピテントセルに混合することにより形質転換を行った。次いで、取得した形質転換体をそれぞれＬＢ−ａｍｐ寒天培地に塗布し、培養を行った。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ液体培地に接種して振とう培養し、ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ｓｉｇｍａ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って、約８ｋｂｐの増幅されたＤＮＡを含む各種のプラスミドＤＮＡ（例えば、実施例１におけるｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ等）を単離した。次いで、これらの各種プラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨ遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定し、それぞれの配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列における所定の位置のアミノ酸が置換されていることを確認した。このようにして、所定のアミノ酸が置換された改変型ＭｐＧＤＨをコードする酵母発現用ベクターｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ（改変型、例えば、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ等）を取得した。
その後、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ用形質転換キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ（野生型）、および各種変異が導入されたｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ（改変型、例えば、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ等）を用いてＩＮＶＳｃ１株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を形質転換することにより、野生型ＭｐＧＤＨを発現する酵母形質転換体Ｓｃ−Ｍｐ（野生型）株、および各種の改変型ＭｐＧＤＨを発現する酵母形質転換株Ｓｃ−Ｍｐ（改変型、例えば、Ｓｃ−Ｍｐ−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ等）株をそれぞれ取得した。【００５６】
（２）酵母発現ＦＡＤ−ＧＤＨの熱安定性評価 
酵母形質転換体Ｓｃ−Ｍｐ（野生型）、および、各種の酵母形質転換体Ｓｃ−Ｍｐ（改変型、例えば、Ｓｃ−Ｍｐ−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ等）を、各々、５ｍＬの前培養用液体培地[０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース（ＢＤ）、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物（ｓｉｇｍａ社製）、２．０％（ｗ／ｖ）ラフィノース]中で、３０℃にて２４時間培養した。その後、前培養液１ｍＬを４ｍＬの本培養用液体培地[０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物、２．５％（ｗ／ｖ）Ｄ−ガラクトース、０．７５％（ｗ／ｖ）ラフィノース]に加えて、３０℃で１６時間培養する。この培養液を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、３分間）により菌体と培養上清に分離し、培養上清液を熱安定性の評価に用いた。
ＦＡＤ−ＧＤＨの熱安定性評価は、まず、上述のように回収した評価対象のＦＡＤ−ＧＤＨを含む培養上清液を約１Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０））にて希釈する。そして、この酵素溶液（０．１ｍｌ）を２本用意し、そのうち１本は４℃で保存し、もう１本には、４５℃、１５分間の加温処理を施した。加温処理後、各サンプルのＦＡＤ−ＧＤＨ活性を測定し、４℃で保存したものの酵素活性を１００としたときの、４５℃、１５分間処理後の活性値を「活性残存率（％）」として算出した。この活性残存率（％）を、各種ＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性評価の指標とした。
野生型ＭｐＧＤＨを発現するＳｃ−Ｍｐ（野生型）株の培養上清を用いて、野生型ＭｐＧＤＨの熱安定性を評価した結果、野生型ＭｐＧＤＨの４５℃、１５分熱処理後の残存活性率は０％であった。よって、各種改変型ＭｐＧＤＨの熱処理後の残存活性率が０％より高かった場合に、ＭｐＧＤＨの熱安定性が向上していると判断することができる。【００５７】
（３）基質特異性評価 
基質特異性についても、熱安定性と同様に、上記（２）の方法に従って回収した各種酵母培養上清液を用いて評価を行った。まず、上述の活性測定法の基質をＤ−グルコースから同モル濃度のマルトースとした系に変えてそれぞれの基質に対する活性を測定した。そして、これらの値から、「Ｄ−グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））」を算出した。また、各種変異体における部位特異的変異導入前のＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ−ＧＤＨにおけるＭａｌ／Ｇｌｃ（％）の値を１００％とした時に部位特異的変異導入後の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨが示す相対的な基質特異性を表す「Ｍａｌ／Ｇｌｃ比率」を算出した。「Ｍａｌ／Ｇｌｃ比率が１００を下回る改変型ＦＡＤ−ＧＤＨにおいては、部位特異的変異導入前のＦＡＤ−ＧＤＨと比較して、マルトースへの反応性が低下し、基質特異性が高まっていることを示し、その度合は、数値が小さくなるほど大きい。
Ｓｃ−Ｍｐ（野生型）株にて発現させた野生型ＭｐＧＤＨの（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））は、０．８％であった。このような基質特異性は、従来知られたその他のＦＡＤ-ＧＤＨと比較しても非常に優れているが、多量の酵素が存在する条件下では、一定濃度以上で存在するマルトースへの反応性が若干ながら確認され、依然として改善の余地が存在する。
【実施例１】
【００５８】
（各種改変型ＭｐＧＤＨの調製と熱安定性評価） 
上記試験例で記述した方法に従って、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ（野生型）を鋳型プラスミドとして、表１、２に示した配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行った。次いで、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７５位のアラニンがシステイン及び２１４位のアスパラギンがシステインに、１９２位のセリンがプロリンに、２１２位のイソロイシンがロイシンに、２１８位のアラニンがヒスチジンに、２２６位のイソロイシンがスレオニン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、又はバリンに、４６６位のグリシンがアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、スレオニン、システイン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシンに置換された組換え体プラスミドであるｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｓ１９２Ｐ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ２１２Ｌ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ａ２１８Ｈ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ｔ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ｎ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ｓ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ａ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ｃ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ｖ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｄ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｅ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｒ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｋ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｈ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｎ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｓ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｑ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｔ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｃ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ａ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｙ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｆ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｍ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｖ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｌ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｗ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｉをそれぞれ取得した。【００５９】
次いで、部位特異的変異を導入した上述の各種改変型ＭｐＧＤＨをコードする組換え体プラスミドｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｓ１９２Ｐ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ２１２Ｌ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ａ２１８Ｈ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ｔ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ｎ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ｓ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ａ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ｃ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ｖ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｄ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｅ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｒ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｋ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｈ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｎ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｓ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｑ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｔ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｃ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ａ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｙ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｆ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｍ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｖ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｌ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｗ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｉを用いて、試験例（２）の項目に従ってＩＮＶＳｃ１株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ−Ｍｐ−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｓ１９２Ｐ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｉ２１２Ｌ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ａ２１８Ｈ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ｔ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ｎ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ｓ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ａ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ｃ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｉ２２６Ｖ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｄ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｅ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｒ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｋ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｈ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｎ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｓ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｑ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｔ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｃ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ａ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｙ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｆ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｍ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｖ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｌ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｗ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｇ４６６Ｉ株）の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。【００６０】
続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の各種変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（２）、（３）の項目の手順に基づき、４５℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）、Ｄ−グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））を測定し、野生型のＭａｌ／Ｇｌｃ（％）を１００とした際の各種変異体のＭａｌ／Ｇｌｃ比率（％）を算出した。また、４０℃の加熱処理については、野生型と変異体の性能差が観測されやすいよう、野生型の残存活性率が２５％以下となる加熱時間に設定し、変異体も同条件で評価を行った。【００６１】
なお、例えば、表１において、「Ａ１７５Ｃ」は１７５位のＡ（Ａｌａ）をＣ（Ｃｙｓ）に置換することを意味する。また、例えば、「Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ」は、１７５位のＡ（Ａｌａ）をＣ（Ｃｙｓ）、２１４位のＮ（Ａｓｎ）をＣ（Ｃｙｓ）にそれぞれ置換すること、「／」はその両方の置換を有することを意味する。【００６２】
【表１】
2017195765.tif 000003
【００６３】
【表２】
2017195765.tif 000004
【００６４】
表１に示すとおり、配列番号１の野生型ＭｐＧＤＨに対する１７５位、２１４位への部位特異的変異導入、具体的には、Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性が向上することが確認された。また、配列番号１の野生型ＭｐＧＤＨに対する１９２位、２１２位、２１８位、２２６位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｓ１９２Ｐ、Ｉ２１２Ｌ、Ａ２１８Ｈ、Ｉ２２６Ｔ、Ｉ２２６Ｎ、Ｉ２２６Ｓ、Ｉ２２６Ａ、Ｉ２２６Ｃ、Ｉ２２６Ｖの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性が向上することが確認された。
さらに、これらの熱安定性が向上しているＦＡＤ−ＧＤＨは、高い基質特異性も維持されていることがわかった。すなわち、表１に記載した本発明の熱安定性向上変異を有する改変型酵素は、野生型ＦＡＤ-ＧＤＨが有する基質特異性に対し負の影響をほとんど与えることなく、場合によっては、野生型酵素の基質特異性を上回るようなものも含み得ることがわかった。
また、表２に示すとおり、配列番号１の野生型ＭｐＧＤＨに対する４６６位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｇ４６６Ｄ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｒ、Ｇ４６６Ｋ、Ｇ４６６Ｎ、Ｇ４６６Ｑ、Ｇ４６６Ｔ、Ｇ４６６Ｃ、Ｇ４６６Ａ、Ｇ４６６Ｙ、Ｇ４６６Ｆ、Ｇ４６６Ｍ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６６Ｌ、Ｇ４６６Ｗ、Ｇ４６６Ｓ、Ｇ４６６Ｈ、Ｇ４６６Ｉの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨのＭａｌ／Ｇｌｃ（％）が低減されることが確認された。
【実施例２】
【００６５】
（変異の組み合わせ導入に関する検討） 
次に、実施例２に示すような変異を多重的に有する変異体を作製し、それらにおける熱安定性向上効果と基質特異性改善効果を検証した。具体的には、上記試験例で記述した方法に従って、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃを鋳型プラスミドとし、表２に記載の配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行った。次いで、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、１７５位のアラニンがシステインに置換され、２１４位のアスパラギンがシステインに置換されたことを特徴とし、さらに別のアミノ酸置換を兼ね備えた下記の多重変異体を作製した。具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７５位のアラニンがシステインに置換され、２１４位のアスパラギンがシステインに置換されかつ、４６６位のグリシンがグルタミン酸に置換された３重変異体をコードする組換え体プラスミドであるｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄを取得した。【００６６】
次いで、部位特異的変異を導入した上述の各種改変型ＭｐＧＤＨをコードする組換え体プラスミド（ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ）を用いて、試験例（２）の項目に従って、ＩＮＶＳｃ１株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ−Ｍｐ−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ株）の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。【００６７】
続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の多重変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（２）、（３）の項目の手順に基づき、４５℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）、およびＤ−グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））を測定した。【００６８】
【表３】
2017195765.tif 000005
【００６９】
表３に示すとおり、配列番号１のアミノ酸にＡ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃを導入した上に、さらにＧ４６６Ｄのアミノ酸置換を組み合わせることで、野生型より高い熱安定性を保持し、Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％）が低減されることが確認された。
【実施例３】
【００７０】
Ｍｕｃｏｒ属由来ＧＤＨ（ＭｐＧＤＨ、配列番号１）にＮ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ／Ｃ８８Ａ／Ｑ２３３Ｒ／Ｔ３８７Ｃ／Ｅ５５４Ｄ／Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋの各変異を導入した改変ＧＤＨ（以下、本明細書においてＭｐＧＤＨ−Ｍ１ということがある）をコードする遺伝子を取得した。ＭｐＧＤＨ−Ｍ１のアミノ酸配列は配列番号３に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号４に示す。ＭｐＧＤＨ−Ｍ１に対しても、実施例１、２の熱安定性向上変異と基質特異性改善変異が有効か検証した。
実施例１、２と同様の手法を用いて、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１を鋳型プラスミドとし、表４、５に記載の配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行った。次いで、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、１７５位のアラニンがシステインに置換され、かつ、２１４位のアスパラギンがシステインに置換された多重変異体をコードする組換え体プラスミドｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃを作製した。また、４６６位のグリシンがアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリンに置換された変異体をコードする組換え体プラスミドｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ｇ４６６Ｄ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ｇ４６６Ｅ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ｇ４６６Ｒ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ｇ４６６Ｋ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ｇ４６６Ｈ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ｇ４６６Ｎ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ｇ４６６Ｓを作製した。さらに、１７５位のアラニンがシステインに置換され、２１４位のアスパラギンがシステインに置換され、かつ、４６６位のグリシンがアスパラギン酸に置換された多重変異体をコードする組換え体プラスミドｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄを作製した。【００７１】
さらに、組換え体プラスミドｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄを鋳型プラスミドとし、表４、５に記載の配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行った。その結果、１９２位のセリンがプロリンに、２１２位のイソロイシンがロイシン、メチオニンに、２１８位のアラニンがヒスチジンに、２２６位のイソロイシンがスレオニン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、バリンに置換された変異体をコードする組換え体プラスミド、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｓ１９２Ｐ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２１２Ｌ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２１２Ｍ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ａ２１８Ｈ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２２６Ｔ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２２６Ｎ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２２６Ｓ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２２６Ａ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２２６Ｃ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２２６Ｖを得た。さらに、組換え体プラスミドｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２１２Ｌ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２１２Ｍを鋳型プラスミドとし、表４に記載の配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行った。その結果、２１８位のアラニンがヒスチジンに置換された変異体をコードする組換え体プラスミド、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２１２Ｌ／Ａ２１８Ｈ、ｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２１２Ｍ／Ａ２１８Ｈを得た。
次いで、部位特異的変異を導入した上述の各種改変型ＭｐＧＤＨ−Ｍ１をコードする組換え体プラスミドを用いて、試験例（２）の項目に従って、ＩＮＶＳｃ１株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｓ１９２Ｐ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２１２Ｌ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２１２Ｍ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ａ２１８Ｈ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２２６Ｔ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２２６Ｎ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２２６Ｓ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２２６Ａ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２２６Ｃ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２２６Ｖ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２１２Ｌ／Ａ２１８Ｈ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ／Ｉ２１２Ｍ／Ａ２１８Ｈ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ｇ４６６Ｄ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ｇ４６６Ｅ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ｇ４６６Ｒ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ｇ４６６Ｋ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ｇ４６６Ｈ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ｇ４６６Ｎ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ｇ４６６Ｓ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１−Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ株）の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。【００７２】
続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の多重変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（２）、（３）の項目の手順に基づき、５０℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）、５５℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）、６０℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）、およびＤ−グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））を測定した。【００７３】
【表４】
2017195765.tif 000006
【００７４】
【表５】
2017195765.tif 000007
表４に示すとおり、配列番号３のＭｐＧＤＨ−Ｍ１に対する１７５位、２１４位への部位特異的変異導入、具体的には、Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性が向上することが確認された。さらに、Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃの部位特異的変異を導入することにより、マルトースへの反応性が低減していることがわかった。また、配列番号３のＭｐＧＤＨ−Ｍ１にＡ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄが導入された多重変異体に対する１９２位、２１２位、２１８位、２２６位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｓ１９２Ｐ、Ｉ２１２Ｌ、Ｉ２１２Ｍ、Ａ２１８Ｈ、Ｉ２２６Ｔ、Ｉ２２６Ｎ、Ｉ２２６Ｓ、Ｉ２２６Ａ、Ｉ２２６Ｃ、Ｉ２２６Ｖの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性がさらに向上することが確認された。
また、表５に示すとおり、配列番号３のＭｐＧＤＨ−Ｍ１に対する４６６位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｇ４６６Ｄ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｒ、Ｇ４６６Ｋ、Ｇ４６６Ｈ、Ｇ４６６Ｎ、Ｇ４６６Ｓの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨのＭａｌ／Ｇｌｃ（％）が低減されることが確認された。さらに、表５に示すとおり、配列番号１のアミノ酸にＡ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃを導入した上に、さらにＧ４６６Ｄのアミノ酸置換を組み合わせることで、耐熱性が野生型より向上し、Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％）が大きく低減されることが確認された。
【実施例４】
【００７５】
（各種改変型ＭｇＧＤＨの調製と熱安定性、基質特異性評価）
特開２０１７−０００１３７号公報において、ＭｐＧＤＨと７８％の同一性を有する、配列番号２８のＭｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ由来のＧＤＨ（以下、ＭｇＧＤＨ）の配列情報が公開されている。そこで、実施例１で見出したアミノ酸置換をＭｇＧＤＨに対して導入することで、同様に熱安定性が向上する、又は、マルトースへの反応性が低減するかどうかを以下のように検証することにした。
ＭｇＧＤＨのアミノ酸配列は配列番号２８に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号２９に示す。実施例１と同様に、配列番号５２、５３、５４、５５の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応を行い、配列番号２８記載のアミノ酸配列の１７０位のスレオニンをシステインに、２０９位のアスパラギンをシステインに置換した変異体であるＭｇＧＤＨ／Ｔ１７０Ｃ／Ｎ２０９Ｃ、２２１位のイソロイシンをスレオニン、セリンに置換した変異体であるＭｇＧＤＨ／Ｉ２２１Ｔ、ＭｇＧＤＨ／Ｉ２２１Ｓ、２１３位のセリンをヒスチジンに置換した変異体であるＭｇＧＤＨ／Ｓ２１３ＨをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。続いて、実施例１と同様に、表６記載のプライマーを用いて目的遺伝子を作製し、ＭｇＧＤＨ及びＭｇＧＤＨ／Ｔ１７０Ｃ／Ｎ２０９Ｃ、ＭｇＧＤＨ／Ｉ２２１Ｔ、ＭｇＧＤＨ／Ｉ２２１Ｓ、ＭｇＧＤＨ／Ｓ２１３Ｈをコードする遺伝子が挿入された組換え体プラスミドｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｇ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｇ−Ｔ１７０Ｃ／Ｎ２０９Ｃ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｇ−Ｉ２２１Ｔ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｇ−Ｉ２２１Ｓ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｇ−Ｓ２１３Ｈを用いて、試験例（２）の項目に従って、ＩＮＶＳｃ１株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍｇ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍｇ−Ｔ１７０Ｃ／Ｎ２０９Ｃ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍｇ−Ｉ２２１Ｔ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍｇ−Ｉ２２１Ｓ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍｇ−Ｓ２１３Ｈ株）の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。同様にして、表７記載のプライマーを用いて目的遺伝子を作製し、配列番号２８記載のアミノ酸配列の４６１位のグリシンをアスパラギン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、セリンに置換した変異体であるＭｇＧＤＨ／Ｇ４６１Ｄ、ＭｇＧＤＨ／Ｇ４６１Ｒ、ＭｇＧＤＨ／Ｇ４６１Ｋ、ＭｇＧＤＨ／Ｇ４６１Ｈ、ＭｇＧＤＨ／Ｇ４６１Ｓについても形質転換及び取得された形質転換株の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。【００７６】
続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の多重変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（２）、（３）の項目の手順に基づき、４０℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）、５５℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）およびＤ−グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））を測定した。【００７７】
【表６】
2017195765.tif 000008
【表７】
2017195765.tif 000009
【００７８】
表６に示すとおり、配列番号２８のＭｇＧＤＨに対する１７０位、２０９位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｔ１７０Ｃ／Ｎ２０９Ｃの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性が向上することが確認された。また、配列番号２８のＭｇＧＤＨに対する２２１位および２１３位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｉ２２１Ｔ、I２２１ＳおよびＳ２１３Ｈの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性が向上することが確認された。
表７に示すとおり、配列番号２８のＭｇＧＤＨに対する４６１位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｇ４６１Ｄ、Ｇ４６１Ｒ、Ｇ４６１Ｋ、Ｇ４６１Ｈ、Ｇ４６１Ｓの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨのＭａｌ／Ｇｌｃ（％）が低減されることが確認された。
【実施例５】
【００７９】
（各種改変型ＭｈＧＤＨの調製と熱安定性、基質特異性評価）
特開２０１３−１１６１０２号公報において、ＭｐＧＤＨと７８％の同一性を有する、配列番号３０のＭｕｃｏｒ   ｈｉｅｍａｌｉｓ由来のＧＤＨ（以下、ＭｈＧＤＨ）の配列情報が公開されている。そこで、実施例１で見出したアミノ酸置換をＭｈＧＤＨに対して導入することで、同様に熱安定性が向上する、又は、マルトースへの反応性が低減するかどうかを以下のように検証することにした。
ＭｈＧＤＨのアミノ酸配列は配列番号３０に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号３１に示す。実施例１と同様に、配列番号５８、５９、６０、６１の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応を行い、配列番号３０記載のアミノ酸配列の１７２位のバリンをシステインに、２１１位のアスパラギンをシステインに置換した変異体であるＭｈＧＤＨ／Ｖ１７２Ｃ／Ｎ２１１ＣをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。続いて、実施例１と同様に、ＭｈＧＤＨ及びＭｈＧＤＨ／Ｖ１７２Ｃ／Ｎ２１１Ｃをコードする遺伝子が挿入された組換え体プラスミドｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｈ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｈ−Ｖ１７２Ｃ／Ｎ２１１Ｃを用いて、試験例（２）の項目に従って、ＩＮＶＳｃ１株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍｈ株、Ｓｃ−ＭｐＧＤＨ−Ｍｈ−Ｖ１７２Ｃ／Ｎ２１１Ｃ株）の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。同様にして、表９記載のプライマーを用いて目的遺伝子を作製し、配列番号３０記載のアミノ酸配列の４６３位のグリシンをアスパラギン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、セリンに置換した変異体であるＭｈＧＤＨ／Ｇ４６３Ｄ、ＭｈＧＤＨ／Ｇ４６３Ｒ、ＭｈＧＤＨ／Ｇ４６３Ｋ、ＭｈＧＤＨ／Ｇ４６３Ｈ、ＭｈＧＤＨ／Ｇ４６３Ｓについても形質転換及び取得された形質転換株の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。【００８０】
続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の多重変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（２）、（３）の項目の手順に基づき、５５℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）およびＤ−グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））を測定した。【００８１】
【表８】
2017195765.tif 000010
【００８２】
【表９】
2017195765.tif 000011
表８に示すとおり、配列番号３０のＭｈＧＤＨに対する１７２位、２１１位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｖ１７２Ｃ／Ｎ２１１Ｃの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性が向上することが確認された。
表９に示すとおり、配列番号３０のＭｈＧＤＨに対する４６３位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｇ４６３Ｄ、Ｇ４６３Ｒ、Ｇ４６３Ｋ、Ｇ４６３Ｈ、Ｇ４６３Ｓの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨのＭａｌ／Ｇｌｃ（％）が低減されることが確認された。
【実施例６】
【００８３】
（各種改変型ＭｒｄＧＤＨの調製と基質特異性評価）
特開２０１３−１７６３６３号公報において、ＭｐＧＤＨと７３％の同一性を有する、配列番号３２のＭｕｃｏｒ  ＲＤ０５６８６０由来のＧＤＨ（以下、ＭｒｄＧＤＨ）の配列情報が公開されている。そこで、実施例１で見出したアミノ酸置換をＭｒｄＧＤＨに導入することで、同様に熱安定性が向上する、又は、マルトースへの反応性が低減するかどうかを以下のように検証することにした。
ＭｒｄＧＤＨのアミノ酸配列は配列番号３２に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号３３に示す。実施例１と同様に、配列番号６２、６３、６４、６５の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応を行い、配列番号３２記載のアミノ酸配列の１７１位のバリンをシステインに、２１０位のアスパラギン酸をシステインに置換した変異体であるＭｒｄＧＤＨ／Ｖ１７１Ｃ／Ｄ２１０ＣをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。続いて、実施例１と同様に、ＭｒｄＧＤＨ及びＭｒｄＧＤＨ／Ｖ１７１Ｃ／Ｄ２１０Ｃをコードする遺伝子が挿入された組換え体プラスミドｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｒｄ、ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｒｄ−Ｖ１７１Ｃ／Ｄ２１０Ｃを用いて、試験例（２）の項目に従って、ＩＮＶＳｃ１株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ−Ｍｒｄ株、Ｓｃ−Ｍｒｄ−Ｖ１７１Ｃ／Ｄ２１０Ｃ株）の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。同様にして、表１１記載のプライマーを用いて目的遺伝子を作製し、配列番号３２記載のアミノ酸配列の４６３位のグリシンをアスパラギン酸、システイン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリンに置換した変異体であるＭｒｄＧＤＨ／Ｇ４６３Ｄ、ＭｒｄＧＤＨ／Ｇ４６３Ｃ、ＭｒｄＧＤＨ／Ｇ４６３Ｒ、ＭｒｄＧＤＨ／Ｇ４６３Ｋ、ＭｒｄＧＤＨ／Ｇ４６３Ｈ、ＭｒｄＧＤＨ／Ｇ４６３Ｎ、ＭｒｄＧＤＨ／Ｇ４６３Ｓについても形質転換及び取得された形質転換株の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。【００８４】
続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の多重変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（２）、（３）の項目の手順に基づき、５５℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）およびＤ−グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））を測定した。【００８５】
【表１０】
2017195765.tif 000012
【００８６】
【表１１】
2017195765.tif 000013
表１０に示すとおり、配列番号３２のＭｒｄＧＤＨに対する１７１位、２１０位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｖ１７１Ｃ／Ｄ２１０Ｃの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性が向上することが確認された。
表１１に示すとおり、配列番号３２のＭｇＧＤＨに対する４６３位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｇ４６３Ｄ、Ｇ４６３Ｃ、Ｇ４６３Ｒ、Ｇ４６３Ｋ、Ｇ４６３Ｈ、Ｇ４６３Ｎ、Ｇ４６３Ｓの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨのＭａｌ／Ｇｌｃ（％）が低減されることが確認された。【００８７】
以上のように、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、熱安定性に優れ、Ｄ−グルコースへの基質特異性が十分に高いため、マルトース等のＤ−グルコース以外の糖化合物を多量に含有する条件下で試料中のＤ−グルコースを測定する場合や、酵素濃度の濃い条件下においても、Ｄ−グルコース濃度を正確に測定ができ、例えば、グルコースセンサーへの応用等において、従来のＦＡＤ−ＧＤＨを用いた場合に比べて、より高精度かつ高感度な測定が可能になることが期待される。さらに、センサーチップ作製時において、従来のＦＡＤ−ＧＤＨを用いた場合に比べて、熱による活性低下を抑制でき、センサーチップの長期安定性に貢献されることが期待される。
【図１−１】
2017195765.tif 000014
【図１−２】
2017195765.tif 000015
【図１−３】
2017195765.tif 000016
【図１−４】
2017195765.tif 000017
【配列表】
2017195765000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月9日(2018.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)配列番号１または３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、以下のアミノ酸：
配列番号１記載のアミノ酸配列における１７５位のアミノ酸、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１４位のアミノ酸、
配列番号１記載のアミノ酸配列における１９２位のアミノ酸、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１２位のアミノ酸、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１８位のアミノ酸、及び／又は
配列番号１記載のアミノ酸配列における２２６位のアミノ酸
に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、熱安定性が向上していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、
(ii)配列番号２８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、以下のアミノ酸：
配列番号２８記載のアミノ酸配列における１７０位のアミノ酸、
配列番号２８記載のアミノ酸配列における２０９位のアミノ酸、
配列番号２８記載のアミノ酸配列における２１３位のアミノ酸、及び／又は
配列番号２８記載のアミノ酸配列における２２１位のアミノ酸
に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、熱安定性が向上していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、
(iii)配列番号３０で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、以下のアミノ酸：
配列番号３０記載のアミノ酸配列における１７２位のアミノ酸、及び／又は
配列番号３０記載のアミノ酸配列における２１１位のアミノ酸、
に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、熱安定性が向上していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、或いは
(iv)配列番号３２で示されるアミノ酸配列又は配列番号３２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、以下のアミノ酸：
配列番号３２記載のアミノ酸配列における１７１位のアミノ酸、及び／又は
配列番号３２記載のアミノ酸配列における２１０位のアミノ酸、
に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、熱安定性が向上していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、
ただし、配列番号２８、３０又は３２で示されるアミノ酸配列からなるＦＡＤ−ＧＤＨを除く。
【請求項２】
(i)配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、以下のアミノ酸：
配列番号１記載のアミノ酸配列における１７５位に対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１４位に対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における１９２位に対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１２位に対応する位置のアミノ酸がロイシン、メチオニンのいずれかである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２１８位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、及び/又は
配列番号１記載のアミノ酸配列における２２６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニン、アスパラギン、アラニン、セリン、システイン、バリンのいずれかであるアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、熱安定性が向上していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、
(ii)配列番号２８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、以下のアミノ酸：
配列番号２８記載のアミノ酸配列における１７０位に対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号２８記載のアミノ酸配列における２０９位に対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号２８記載のアミノ酸配列における２１３に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、及び／又は
配列番号２８記載のアミノ酸配列における２２１位に対応する位置のアミノ酸がスレオニン、アスパラギン、アラニン、セリン、システイン、バリンのいずれかである、
アミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、熱安定性が向上していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、
(iii)配列番号３０で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、以下のアミノ酸：
配列番号３０記載のアミノ酸配列における１７２位に対応する位置のアミノ酸がシステインである、及び／又は
配列番号３０記載のアミノ酸配列における２１１位に対応する位置のアミノ酸がシステインである、
アミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、熱安定性が向上していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、或いは
(iv)配列番号３２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、以下のアミノ酸：
配列番号３２記載のアミノ酸配列における１７１位に対応する位置のアミノ酸がシステインである、及び／又は
配列番号３２記載のアミノ酸配列における２１０位に対応する位置のアミノ酸がシステインである、
アミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、熱安定性が向上していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、
ただし、配列番号２８、３０又は３２で示されるアミノ酸配列からなるＦＡＤ−ＧＤＨを除く。
【請求項３】
(i)配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１記載のアミノ酸配列における４６６位のアミノ酸に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、マルトースへの反応性が低減していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、
(ii)配列番号２８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２８記載のアミノ酸配列における４６１位のアミノ酸に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、マルトースへの反応性が低減していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、
(iii) 配列番号３０で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３０記載のアミノ酸配列における４６３位のアミノ酸に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、マルトースへの反応性が低減していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、或いは
(iv) 配列番号３２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３２記載のアミノ酸配列における４６３位のアミノ酸に対応する位置でアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、マルトースへの反応性が低減していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ。
【請求項４】
(i)配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１記載のアミノ酸配列における４６６位のアミノ酸に対応する位置がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、スレオニン、システイン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシンに置換され、前記置換を行う前と比較して、マルトースへの反応性が低減していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、
(ii)配列番号２８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２８記載のアミノ酸配列における４６１位のアミノ酸に対応する位置がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、スレオニン、システイン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシンに置換され、前記置換を行う前と比較して、マルトースへの反応性が低減していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、
(iii)配列番号３０で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３０記載のアミノ酸配列における４６３位のアミノ酸に対応する位置がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、スレオニン、システイン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシンに置換され、前記置換を行う前と比較して、マルトースへの反応性が低減していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ、或いは
(iv)配列番号３２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３２記載のアミノ酸配列における４６３位のアミノ酸に対応する位置がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、スレオニン、システイン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシンに置換され、前記置換を行う前と比較して、マルトースへの反応性が低減していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ。
【請求項５】
配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号２８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３０で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号３２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、以下：
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸である、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がリジンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がセリンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がグルタミンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がシステインである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がメチオニンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がバリンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がトリプトファンである、又は
配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における１７５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における２１４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がシステインであり、かつ、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列における４６６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシンである
のいずれかに記載されるアミノ酸残基であるＦＡＤ−ＧＤＨ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子。
【請求項７】
請求項６に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組換え体ＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載の組換え体ＤＮＡが導入されている宿主細胞。
【請求項９】
ＦＡＤ−ＧＤＨを製造する方法であり、以下の工程を含む方法： 
請求項８に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を発現させる工程、及び 
前記培養物からＦＡＤ−ＧＤＨを単離する工程。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨを用いるグルコース測定方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースセンサー。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
【表５】
2017195765.tif 000018
表４に示すとおり、配列番号３のＭｐＧＤＨ−Ｍ１に対する１７５位、２１４位への部位特異的変異導入、具体的には、Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性が向上することが確認された。さらに、Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃの部位特異的変異を導入することにより、マルトースへの反応性が低減していることがわかった。また、配列番号３のＭｐＧＤＨ−Ｍ１にＡ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄが導入された多重変異体に対する１９２位、２１２位、２１８位、２２６位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｓ１９２Ｐ、Ｉ２１２Ｌ、Ｉ２１２Ｍ、Ａ２１８Ｈ、Ｉ２２６Ｔ、Ｉ２２６Ｎ、Ｉ２２６Ｓ、Ｉ２２６Ａ、Ｉ２２６Ｃ、Ｉ２２６Ｖの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性がさらに向上することが確認された。
また、表５に示すとおり、配列番号３のＭｐＧＤＨ−Ｍ１に対する４６６位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｇ４６６Ｄ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｒ、Ｇ４６６Ｋ、Ｇ４６６Ｈ、Ｇ４６６Ｎ、Ｇ４６６Ｓの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨのＭａｌ／Ｇｌｃ（％）が低減されることが確認された。
【国際調査報告】
2017195765.tif 000019
2017195765.tif 000020
2017195765.tif 000021
2017195765.tif 000022