(57)【要約】フローサイトメトリー法を利用した信頼性の高い遺伝子解析方法を提供する。遺伝子解析方法は、細胞を染色する染色工程と、フローサイトメトリー法により試料液の細胞由来の第１情報を取得し、決定された抽出条件に従って第１情報を分析し、分析の結果から目的の細胞を、複数のウェルが配列された容器に分取する分取工程と、容器に分取された細胞のＤＮＡを増幅する増幅工程と、増幅されたＤＮＡを遺伝子解析する解析工程と、増幅工程において取得された第２情報、及び解析工程において取得された第３情報の少なくとも一つの情報に基づいて、抽出条件を再決定する条件決定工程と、を備える。
2017169240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を染色する染色工程と、
フローサイトメトリー法により試料液の細胞由来の第１情報を取得し、決定された抽出条件に従って前記第１情報を分析し、該分析の結果から目的の細胞を、複数のウェルが配列された容器に分取する分取工程と、
前記容器に分取された細胞のＤＮＡを増幅する増幅工程と、
増幅された前記ＤＮＡを遺伝子解析する解析工程と、
前記増幅工程において取得された第２情報、及び前記解析工程において取得された第３情報の少なくとも一つの情報に基づいて、前記抽出条件を再決定する条件決定工程と、
を備える遺伝子解析方法。
【請求項２】
前記細胞の染色は、抗原抗体反応による免疫染色である請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項３】
前記第１情報は、前記免疫染色による蛍光発光、前方散乱光、及び側方散乱光のうちの少なくとも１つの情報である請求項２に記載の遺伝子解析方法。
【請求項４】
前記分取工程と前記増幅工程との間に、前記容器に分取された細胞を撮像する撮像工程とを備え、前記撮像工程において取得された第４情報に基づいて、前記抽出条件を再決定する請求項１から３の何れか一項に記載の遺伝子解析方法。
【請求項５】
前記第４情報は前記細胞の蛍光強度、形状、色、及び大きさの少なくとも一つを含む請求項４に記載の遺伝子解析方法。
【請求項６】
前記第２情報は前記ＤＮＡの増幅の有無を含み、前記第３情報は目的の細胞の有無を含む請求項１から５の何れか一項に記載の遺伝子解析方法。
【請求項７】
前記増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を含む請求項１から６の何れか一項に記載の遺伝子解析方法。
【請求項８】
前記遺伝子解析が、ＤＮＡマイクロアレイ法、デジタルＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、シークエンサー法及びその組合せよりなる群から選択される請求項１から７の何れか一項に記載の遺伝子解析方法。
【請求項９】
前記染色工程の前に、前記細胞の溶媒中の濃度を高める濃縮工程を備える請求項１から８の何れか一項に記載の遺伝子解析方法。
【請求項１０】
細胞を染色する工程と、
フローサイトメトリー法により試料液の細胞由来の第１情報を取得し、決定された抽出条件に従って前記第１情報を分析し、該分析の結果から目的の細胞を、複数のウェルが配列された容器に分取する分取工程と、
前記容器に分取された細胞を撮像する撮像工程と、
前記容器に分取された細胞のＤＮＡを増幅する増幅工程と、
増幅された前記ＤＮＡを遺伝子解析する解析工程と、
前記増幅工程において取得された第２情報、前記解析工程において取得された第３情報、及び前記撮像工程において取得された第４情報の少なくとも一つの情報に基づいて、前記抽出条件を再決定する条件決定工程と、
を備える遺伝子解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料液から目的の細胞を、フローサイトメトリー法を利用することにより、分離し分取することが知られている。【０００３】
例えば、特許文献１には、染色体異常に起因して生じる、細胞の一部が分離した微小な細胞（小核）を、フローサイトメータ（フローサイトメトリー法に用いられる装置）のソーティング機能を用いて、主核（親核）と小核に分離して回収することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−１５７２９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
フローサイトメトリー法では、細胞から前方散乱光、側方散乱光、及び蛍光強度の情報を取得することにより細胞を選別し、目的の細胞を複数のウェルを有する容器に、１ウェルに１細胞を分取することが行われている。細胞が分取された容器が、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）装置にセットされ、ＤＮＡ（Deoxyribonucleic Acid）が増幅され、遺伝子解析が行われる。【０００６】
しかしながら、フローサイトメトリー法では、蛍光強度の情報に基づいて、目的の細胞を選別しているため、染色の非特異性により誤選別される場合がある。また、細胞が分取する際に死細胞を選別できない場合がある。また、フローサイトメトリー法の蛍光強度の情報のみでは選別が難しい場合もある。例えば、フローサイトメトリー法では有核赤血球を選別可能な一方で、有核赤血球を、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別することは困難であった。【０００７】
上述したように、フローサイトメトリー法において目的の細胞を正確に選別できない場合、その後の遺伝子解析の結果に対する信頼性が低下し、誤った判断を下す問題を含んでいる。【０００８】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、フローサイトメトリー法を利用した信頼性の高い遺伝子解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様によると、遺伝子解析方法は、細胞を染色する染色工程と、フローサイトメトリー法により試料液の細胞由来の第１情報を取得し、決定された抽出条件に従って第１情報を分析し、分析の結果から目的の細胞を、複数のウェルが配列された容器に分取する分取工程と、容器に分取された細胞のＤＮＡを増幅する増幅工程と、増幅されたＤＮＡを遺伝子解析する解析工程と、増幅工程において取得された第２情報、及び解析工程において取得された第３情報の少なくとも一つの情報に基づいて、抽出条件を再決定する条件決定工程と、を備える。【００１０】
好ましくは、細胞の染色は、抗原抗体反応による免疫染色である。【００１１】
好ましくは、第１情報は、免疫染色による蛍光発光、前方散乱光、及び側方散乱光のうちの少なくとも１つの情報である。【００１２】
好ましくは、分取工程と増幅工程との間に、容器に分取された細胞を撮像する撮像工程とを備え、撮像工程において取得された第４情報に基づいて、抽出条件を再決定する。【００１３】
好ましくは、第４情報は細胞の蛍光強度、形状、色、及び大きさの少なくとも一つを含む。【００１４】
好ましくは、第２情報はＤＮＡの増幅の有無を含み、第３情報は目的の細胞の有無を含む。【００１５】
好ましくは、増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を含む。【００１６】
好ましくは、遺伝子解析が、ＤＮＡマイクロアレイ法、デジタルＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、シークエンサー法及びその組合せよりなる群から選択される。【００１７】
好ましくは、染色工程の前に、溶媒中の細胞の濃度を高める濃縮工程を備える。【００１８】
本発明の別の態様によると、遺伝子解析方法は、細胞を染色する工程と、フローサイトメトリー法により試料液の細胞由来の第１情報を取得し、決定された抽出条件に従って第１情報を分析し、分析の結果から目的の細胞を、複数のウェルが配列された容器に分取する分取工程と、容器に分取された細胞を撮像する撮像工程と、容器に分取された細胞のＤＮＡを増幅する増幅工程と、増幅されたＤＮＡを遺伝子解析する解析工程と、増幅工程において取得された第２情報、解析工程において取得された第３情報、及び撮像工程において取得された第４情報の少なくとも一つの情報に基づいて、抽出条件を再決定する条件決定工程と、を備える。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の遺伝子解析方法によれば、フローサイトメトリー法を利用した信頼性の高い遺伝子解析を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】第１実施形態の遺伝子解析方法の手順を示したフローチャートである。
【図２】フローサイトメータの概念図である。
【図３】有核赤血球を含む領域を選択したスキャッタグラムである。
【図４】赤血球が出現すると考えられる領域を選択したスキャッタグラムである。
【図５】有核赤血球が出現すると考えられる領域を選択したスキャッタグラムである。
【図６】容器の斜視図である。
【図７】容器の斜視図である。
【図８】図５のスキャッタグラムに対し、増幅工程の第２情報に基づいて抽出条件を再決定した後のスキャッタグラムである。
【図９】図８のスキャッタグラムに対し、解析工程の第３情報に基づいて抽出条件を再決定した後のスキャッタグラムである。
【図１０】第２実施形態の遺伝子解析方法の手順を示したフローチャートである。
【図１１】画像撮像装置の概略構成図である。
【図１２】図５のスキャッタグラムに対し、撮像工程の第４情報に基づいて抽出条件を再決定した後のスキャッタグラムである。
【図１３】図１２のスキャッタグラムに対し、増幅工程の第２情報に基づいて抽出条件を再決定した後のスキャッタグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、添付図面にしたがって本発明の好ましい実施形態について説明する。本発明は以下の好ましい実施形態により説明される。本発明の範囲を逸脱すること無く、多くの手法により変更を行うことができ、実施形態以外の他の実施形態を利用することができる。したがって、本発明の範囲内における全ての変更が特許請求の範囲に含まれる。
【００２２】
ここで、図中、同一の記号により示される部分は、同様の機能を有する同様の要素である。また、本明細書中で、数値範囲を“  〜  ”を用いて表す場合は、“  〜  ”により示される上限、下限の数値も数値範囲に含むものとする。
【００２３】
＜遺伝子解析方法＞
（第１実施形態）
第１実施形態の遺伝子解析方法について、図面を参照して説明する。なお、本実施形態では、試料液に血球細胞が含まれる場合であって、目的の細胞が胎児由来の有核赤血球である場合を例示して説明する。
【００２４】
図１は、第１実施形態の遺伝子解析方法のフローチャートである。図１に示されるように、遺伝子解析方法は、染色工程（ステップＳ１）、分取工程（ステップＳ２）、増幅工程（ステップＳ３）、解析工程（ステップＳ４）、及び条件決定工程（ステップＳ５）を、少なくとも備える。
【００２５】
染色工程（ステップＳ１）では、細胞を染色する。分取工程（ステップＳ２）では、フローサイトメトリー法により試料液の細胞由来の第１情報を取得し、決定された抽出条件に従って第１情報を分析し、分析の結果から目的の細胞を、複数のウェルが配列された容器に分取する。増幅工程（ステップＳ３）では、容器に分取された細胞のＤＮＡを増幅する。解析工程（ステップＳ４）では、増幅されたＤＮＡを遺伝子解析する。条件決定工程（ステップＳ５）では、増幅工程において取得された第２情報、及び解析工程において取得された第３情報の少なくとも一つの情報に基づいて、抽出条件を再決定する。以下、各工程について説明する。
【００２６】
＜染色工程（ステップＳ１）＞
本実施形態では、細胞を染色する工程を有している。細胞を染色することにより、後述するフローサイトメトリー法において、試料液の細胞由来の第１情報を取得することが可能になる。
【００２７】
細胞の染色は、抗原抗体反応による免疫染色であることが好ましい。抗原抗体反応とは、抗体が相補的な構造を持つ抗原と特異的に結合することをいい、免疫染色とは、細胞に存在する抗原に、蛍光色素を連結した抗体を結合させることを意味する。
【００２８】
免疫染色には、直接法と間接法とがあり、直接法は、蛍光色素を直接抗体に連結し、抗原と反応させる方法である。一方、間接法は、検出すべき抗原に特異的に結合できる抗体（１次抗体）には蛍光色素を連結せず、その１次抗体に特異的に結合できる抗体（２次抗体）に蛍光色素を連結して検出する方法である。
【００２９】
細胞を抗原抗体反応により免疫染色するものとして、例えば、抗ヒトＣＤ抗体として、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ７１抗体、及び抗ＣＤ１２７抗体等を例示することができ、蛍光色素として、４’，６−ジアミジン−２’−フェニルインドールジハイドロクロライド（ＤＡＰＩ：4',6-diamidino-2-phenylindole）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ：Propidium Iodide）、ピロニンＹ（Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ：fluorescein isothiocyanate）、フィコエリスリン（ＰＥ：phycoerythrin）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ：allophicocyanin）、テキサスレッド（ＴＲ（登録商標））、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）、２‘−デオキシシチジン５’−三リン酸（Ｃｙ３）、スルホインドシアニンスクシンイミジルエステル（Ｃｙ５）、ＤＲＡＱ５（登録商標）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ５７０、及びＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１等を挙げることができる。
【００３０】
試料液は、次のように調製される。まず、目的の細胞を含む分析対象試料を準備する。分析対象試料に、例えば、免疫染色に用いる蛍光色素された抗体を混合し、インキュベーションすることにより、細胞が免疫染色される。抗原抗体反応による免疫染色された細胞を含む試料液が調製される。
【００３１】
＜分取工程（ステップＳ２）＞
分取工程では、フローサイトメトリー法を実現するフローサイトメータ１０が用いられ、試料液の細胞由来の第１情報が取得され、決定された抽出条件に従って第１情報が分析され、分析の結果から目的の細胞が、複数のウェルが配列された容器に分取される。
【００３２】
抽出条件は、例えば、スキャッタグラムの分布を見て、過去の知見に基づいて決定される。
【００３３】
図２は、フローサイトメータ１０の概念図である。試料液Ｓには、抗原抗体反応による免疫染色された細胞Ｃを含む血球細胞が含まれている。
【００３４】
試料液Ｓがノズル１０２からフローセル１０４に導入される。シース液Ｌがフローセル１０４に導入される。フローセル１０４内においてシース液Ｌにより試料液Ｓが絞られる。試料液Ｓが絞られることにより、細胞Ｃが一列に配列される。
【００３５】
細胞Ｃに光源１０６から、例えばレーザ光が照射される。レーザ光の照射により細胞Ｃの免疫染色が励起され、細胞Ｃは免疫染色による蛍光を発光する。この蛍光発光の蛍光強度が検知器１０８により検知される。検知器１０８により検知された、細胞Ｃの蛍光発光が、細胞由来の第１情報として取得され、制御部１２０に入力、及び記憶される。制御部１２０は、各種の処理を行う演算部、各種プログラム、及びデータ等が格納された記憶部等を備える。
【００３６】
光源１０６からレーザ光が照射され、免疫染色による細胞Ｃからの前方散乱光、側方散乱光が検知器１１０により検知される。検知器１１０により検知された細胞Ｃからの前方散乱光、側方散乱光よる蛍光強度が、細胞由来の第１情報として取得され、制御部１２０に入力、及び記憶される。
【００３７】
第１情報として、免疫染色による蛍光発光、前方散乱光、及び側方散乱光の情報を取得する場合を例示したが、第１情報として、免疫染色による蛍光発光、前方散乱光、及び側方散乱光の少なくとも一つの情報を取得すれば良い。
【００３８】
なお、第１情報として取得された前方散乱光により測定対象の細胞の大きさが、また側方散乱光、及び蛍光発光により、測定対象物の細胞の構造などが測定される。
【００３９】
フローセル１０４には超音波が印加され、細胞Ｃを含む液滴が形成される。制御部１２０は、上記の検出結果に基づいて、液滴をプラス、又はマイナスに荷電する。制御部１２０は、廃棄する液滴については荷電しない。偏向電極板１１２、１１４を通過する際、荷電された液滴を何れかの偏向電極板１１２、１１４に引き寄せることにより、基本的には、容器２０の１個のウェルに１個の細胞が分取される。
【００４０】
免疫染色を励起させる光源１０６として、波長の異なる複数のレーザ光源を使用することが好ましい。例えば、４０５ｎｍの波長を持つレーザ光源と、４８８ｎｍの波長を持つレーザ光源と、５６１ｎｍの波長を持つレーザ光源と、６８３ｎｍの波長を持つレーザ光源と、を備えることが好ましい。波長の異なる複数のレーザ光源を使用することにより、細胞由来の第１情報として、複数の蛍光強度を得ることができる。
【００４１】
また、同時に蛍光強度を検出するためレーザ光源の励起光をカットし、免疫染色による蛍光色素の発光の波長を選択的に透過させる蛍光フィルタを使用することが好ましい。
【００４２】
フローサイトメータ１０の制御部１２０には、細胞由来の第１情報（免疫染色による蛍光発光、前方散乱光、及び側方散乱光）に基づいて、検出結果を解析するための解析プログラムが記憶されている。制御部１２０は、細胞由来の第１情報を取得し、決定された抽出条件に従って第１情報を分析する。
【００４３】
例えば、制御部１２０は、例えば、細胞由来の第１情報に基づいて、蛍光発光、前方散乱光、及び側方散乱光の何れかを縦軸又は横軸とする、スキャッタグラム（散布図）を作成することができる。細胞由来の第１情報からスキャッタグラムを作成することにより、目的の細胞を分取するため、検知された全数の細胞を複数の集団に分離することができる。また、第１情報から作成されたスキャッタグラム上において、領域を指定する（いわゆるゲーティング）、又は領域を指定外とする（いわゆる、ゲートアウト）することにより、グラフ上の全数、又は集団から別の集団を分離することができ、目的の細胞が含まれる集団に絞り込みを実施することができる。
【００４４】
本実施形態においては、第１情報の分析は、細胞由来の第１情報から目的の細胞が含まれる集団に絞り込むまでの一連の処理を含み、抽出条件はスキャッタグラムを作成するための縦軸又は横軸の選択や、集団から別の集団を分離するためのゲーティング、ゲートアウトなどを適宜組み合わせて決定することが可能である。
【００４５】
図３から図５は、決定された抽出条件に従って第１情報を分析する場合の一例を示している。図３は有核赤血球を含む領域を選択したスキャッタグラムである。図４は赤血球が出現する領域を選択したスキャッタグラムである。図５は有核赤血球が出現する領域を選択したスキャッタグラムである。
【００４６】
図３は、側方散乱光の蛍光強度を縦軸、前方散乱光の蛍光強度を横軸とするスキャッタグラムである。図３のスキャッタグラムには、フローセルを通過し、第１情報が取得された全数の細胞が表示されている。図３においては、ゲーティングにより有核赤血球を含むと考えられる領域Ｗ１が選択され、一方、血小板は領域Ｗ１から除外されている。このゲーティングにより、全数の細胞から、有核赤血球を含む領域Ｗ１の集団が分離される。
【００４７】
次に、図４は、図３において選択された領域Ｗ１の集団を対象とした、前方散乱光の蛍光強度を縦軸、ＣＤ４５：Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１の蛍光強度を横軸とするスキャッタグラムである。ＣＤ４５は白血球共通抗原であり、白血球はＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１により免疫染色されている。したがって、ＣＤ４５陰性をゲーティングすることにより、赤血球が出現すると考えられる領域Ｗ２が選択される。赤血球が出現すると考えられる集団が、他の集団から分離される。なお、領域Ｗ３は顆粒球が出現すると考えられる集団であり、領域Ｗ４はリンパ球と単球とが出現すると考えられる集団である。
【００４８】
次に、図５は、図４において選択された領域Ｗ２の集団を対象とした、ＣＤ７１：ＦＩＴＣの蛍光強度を縦軸、ＤＲＡＱ５：ＡＰＣの蛍光強度を横軸とするスキャッタグラムである。ＣＤ７１：ＦＩＴＣの蛍光強度は赤血球の幼弱性に関連し、ＤＲＡＱ５：ＡＰＣの蛍光強度は核に関連する。したがって、ＤＲＡＱ５：ＡＰＣ陽性をゲーティングすることにより、有核赤血球が出現すると考えられる領域Ｗ５が選択される。有核赤血球が出現すると考えられる集団が、他の集団から分離される。
【００４９】
本実施形態では、上述の分析の結果から領域Ｗ５により選択された有核赤血球が出現すると考えられる集団がフローサイトメータ１０により容器２０に分取される。
【００５０】
次に、細胞が分取される容器２０について説明する。図６、及び図７は容器２０の斜視図である。
【００５１】
図６に示されるように、容器２０は、複数の細胞を回収するため、開口と底面とを有する複数のウェル２０２と、複数のウェル２０２と一体構造の側壁２０４と、を有している。複数のウェル２０２は行と列とに配置される。各々のウェル２０２の位置を特定するために、行を示す数値、及び列を示す英字が容器２０のウェル２０２の開口側に表示されている。図６に示される容器２０では、各々のウェル２０２に細胞が回収される。容器２０を特定するため、容器２０の側壁には、例えば、バーコード等の識別標識２０６が表示される。
【００５２】
図７に示されるように、図６とは別の形態の容器２０は、複数の細胞を回収するための開口と底面とを有する複数のチューブ２０８と、複数のチューブ２０８を保持するための複数の孔２１２を備える支持部材２１０と、を有している。図７に示されるように容器２０では、チューブ２０８がウェルの機能を果たしている。細胞を収納するための開口と底面とを有していれば、ウェルの形状等は限定されない。
【００５３】
複数の孔２１２は行と列とに形成される。各々の孔２１２の位置を特定するために、行を示す数値、及び列を示す英字が、容器２０の孔２１２の形成される側に表示されている。図７に示される容器２０では、支持部材２１０に保持された各々のチューブ２０８に細胞が回収される。さらに、容器２０を特定するため、支持部材２１０の側壁には、例えば、バーコード等の識別標識２０６が表示される。なお、チューブ２０８は、例えば、１個単位のチューブであっても良いし、複数個が連結されたチューブであっても良い。また、チューブ２０８はキャップ（不図示）を有するチューブであっても良い。
【００５４】
上述したように、フローサイトメータ１０により、選択された領域Ｗ５の細胞が、目的の細胞として、容器２０のウェル２０２、又は容器２０のチューブ２０８に基本的には細胞１個単位で分取される。
【００５５】
制御部１２０は、好ましくは、細胞が収容された容器２０の位置（ウェル２０２又はチューブ２０８）と、その細胞由来の第１情報とを、関連付けて記憶する。細胞が収容された容器２０の位置は、容器２０に表示された行と列、及び識別標識２０６とにより、好ましくは、特定される。
【００５６】
＜増幅工程（ステップＳ３）＞
増幅工程では容器に分取された細胞のＤＮＡが増幅される。増幅工程はポリメラーゼ連鎖反応を含むことが好ましい。以下、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）を例に増幅工程を説明する。
【００５７】
分取された細胞を含む容器２０が、ＰＣＲ装置にセットされる。ＰＣＲ装置にセットされる容器は、フローサイトメータ１０で使用された細胞が分取された容器２０であっても良いし、又は容器２０から細胞を移動させたＰＣＲ用の容器であっても良い。容器に分取された細胞とは、分取工程において容器に分取された細胞を意味し、増幅工程においてその細胞が増幅されれば良く、分取工程の容器を使用することを意味するものではない。但し、ＰＣＲ装置にセットされる容器が、フローサイトメータ１０で使用された容器２０と異なる場合、分取工程での細胞由来の第１情報と細胞が分取された容器２０の位置情報とは、ＰＣＲ装置にセットされる容器に関連付けて、例えば、制御部１２０に記憶される。
【００５８】
ＰＣＲ装置において、第１に、反応液を９４℃程度に加熱し、３０秒から１分間温度を保ち、２本鎖ＤＮＡを１本鎖に分離する。第２に、反応液を６０℃程度にまで急速冷却し、その一本鎖ＤＮＡとプライマーを所定の温度に加熱（アニーリング）し、一本鎖ＤＮＡとプライマーとを加熱する。第３に、プライマーにＤＮＡポリメラーゼを反応させ、一本鎖ＤＮＡとプライマーの分離が起きず、ＤＮＡポリメラーゼ活性に適した温度（６０〜７２℃程度）まで、加熱する。ＤＮＡが合成されるのに必要な時間（増幅する長さによるが通常１〜２分）、この状態を継続する。
【００５９】
第１から第３までを１サイクルとして、複数サイクル、例えば２０サイクルを実行することにより特定のＤＮＡ断片を増幅することができる。一般的に、ＰＣＲ処理をｎ回のサイクル行うと、１つの２本鎖ＤＮＡから目的部分を２ｎ倍に増幅することができる。
【００６０】
なお、上述の増幅手順はポリメラーゼ連鎖反応の一例を示したのであって、これ限定されることはない。
【００６１】
増幅工程において、増幅の結果に関連する第２情報が取得される。例えば、第２情報として、目的の細胞のＤＮＡが増幅されたか否か、つまり増幅の有無が第２情報として、好ましくは、取得される。増幅の有無に基づいて、分取された細胞が生細胞か死細胞かを判断することができる。細胞由来の第１情報と増幅工程において取得された第２情報とは関連付けられ、例えば、制御部１２０に入力、及び記憶される。
【００６２】
ＤＮＡ増幅の有無に関する第２情報は、好ましくは、ＤＮＡ断片に対してアガロースゲルを用いた電気泳動を行うことにより取得することができる。電気泳動によりＤＮＡの有無、又はＤＮＡサイズからＤＮＡ増幅の有無を確認することができる。
【００６３】
＜解析工程（ステップＳ４）＞
解析工程では、増幅されたＤＮＡを遺伝子解析する。遺伝子解析は、ＤＮＡマイクロアレイ法、デジタルＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、シークエンサー法及びその組合せよりなる群から好ましくは、選択される。遺伝子解析として、特に限定されないが、さらに、ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ社）を用いることが可能である。本実施形態においては、解析の精度、及び速さ、１度に処理可能な試料数の多さ等の点でいわゆる次世代シークエンサー法を用いることが好ましい。
【００６４】
ＤＮＡマイクロアレイ法は、基板上に細胞のＤＮＡ断片を高密度に配置し、板上のＤＮＡ配列に対して、ハイブリダイゼーションすることによって、細胞内において発現している遺伝子情報を分析する方法である。
【００６５】
デジタルＰＣＲ法は、対象のサンプルを複数のウェルに分配し、個別にＰＣＲを並行して実行し、増幅の終了時に陽性反応の数をカウントする方法である。
【００６６】
本実施形態において次世代シークエンサーは、サンガー法を利用したキャピラリーシークエンサー（第一世代シークエンサーと呼ばれる）に対比して分類されるシークエンサーを意味する。次世代シークエンサーは、第二世代、第三世代、第四世代を含む。現時点で最も普及している次世代シークエンサーは、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成又はＤＮＡリガーゼによる相補鎖結合に連動した蛍光又は発光をとらえ塩基配列を決定する原理のシークエンサーである。具体的には、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、ＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、ＨｉＳｅｑは登録商標）、Ｒｏｃｈｅ４５４（Ｒｏｃｈｅ社）などが挙げられる。
【００６７】
増幅工程で得られたＤＮＡの増幅産物を次世代シークエンサーにより解析する場合、全ゲノムシークエンス、エキソームシークエンス、アンプリコンシークエンスを用いることが可能である。
【００６８】
次世代シークエンサーにより得られた配列データをアライメントする手段としては、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）が挙げられ、ＢＷＡによって既知のヒトゲノム配列へ配列データをマッピングすることが好ましい。遺伝子を解析する手段としては、ＳＡＭｔｏｏｌｓ及びＢＥＤｔｏｏｌｓが挙げられ、これらの解析手段により遺伝子多型、遺伝子変異、及び染色体数を解析することが好ましい。
【００６９】
増幅されたＤＮＡを遺伝子解析することにより、遺伝子解析の結果に関連する第３情報が取得される。例えば、第３情報として、分取された細胞が目的の細胞であるか否か、つまり目的の細胞の有無が第３情報として、好ましくは、取得される。細胞由来の第１情報と、解析工程において取得された第３情報とは、例えば、関連付けて制御部１２０に入力、及び記憶される。
【００７０】
＜条件決定工程（ステップＳ５）＞
条件決定工程では、増幅工程において取得された第２情報、及び解析工程において取得された第３情報の少なくとも一つの情報に基づいて、分取工程における抽出条件を再決定する。
【００７１】
抽出条件の再決定は、分取工程において決定された抽出条件を改めて決定することであり、分取工程において決定された抽出条件を変更する場合、及び分取工程において決定された抽出条件を変更しない場合を含む。抽出条件には、スキャッタグラムを作成するための縦軸又は横軸の選択や、集団から別の集団を分離するためのゲーティング、ゲートアウトなどを適宜組み合わせることが含まれる。
【００７２】
分取工程では、例えば、免疫染色による蛍光発光、前方散乱光、及び側方散乱光を少なくとも一つを含む第１情報を取得し、決定された抽出条件に従って第１情報を分析し、分析の結果から目的の細胞と考えられる細胞を分取している。そのため、通常の第１情報のみからでは、目的とされない細胞（例えば、死細胞）を分離した分取、及び複数の集団に分離することが難しい細胞等の分取は困難であった。
【００７３】
本実施形態では、分取工程の後、第１情報と関連付けて、増幅工程、及び解析工程において第２情報、及び第３情報を少なくとも一つを取得する。増幅工程、及び解析工程を経ることにより、分取された細胞が、目的の細胞であるか否かを判断できる。好ましくは、第２情報は遺伝子の増幅の有無の情報を含んでいるので、分取された細胞が生細胞、又は死細胞であるかを判断できる。また、第３情報は遺伝子情報を含んでいるので、分取された細胞が目的の細胞であるかを判断できる。
【００７４】
第２情報、及び第３情報の少なくとも一つが、第１情報と関連付けられているので、第２情報、及び第３情報に基づいて、分取工程において決定された抽出条件にフィードバックすることができる。したがって、より高い確率で目的の細胞を分取することが可能な抽出条件を再決定することができる。
【００７５】
図８は、図５のスキャッタグラムに対し、増幅工程の第２情報に基づいて抽出条件を再決定した後のスキャッタグラムである。増幅工程において取得された第２情報に関連付けされた第１情報が、例えば、フローサイトメータ１０の制御部１２０にフィードバックされる。制御部１２０は、フィードバックされた第２情報に基づいて、抽出条件を再決定することができる。
【００７６】
再決定された抽出条件に基づいて第１情報を分析した結果、新たに領域Ｗ６が選択される。領域Ｗ５の中の第２情報に基づく結果が反映された領域Ｗ６は、増幅しなかった細胞（死細胞）が多く出現する領域であると推定される。領域Ｗ６をゲートアウトすることにより、新たな領域Ｗ７が選択される。領域Ｗ７には有核赤血球であって生細胞が多く出現すると推定される。
【００７７】
第２情報に基づいて抽出条件を再決定することにより、有核赤血球であって生細胞が多く出現する領域Ｗ７を、他の集団から高い確率で分離することが可能になることが理解できる。
【００７８】
図９は、図８のスキャッタグラムに対し、解析工程の第３情報に基づいて抽出条件を再決定した後のスキャッタグラムである。解析工程において取得された第３情報に関連付けされる第１情報が、例えば、フローサイトメータ１０の制御部１２０にフィードバックされる。制御部１２０は、フィードバックされた第３情報に基づいて、抽出条件を再決定することができる。
【００７９】
再決定された抽出条件に基づいて第１情報を分析した結果、新たに領域Ｗ８、領域Ｗ９が選択される。領域Ｗ７の中の第３情報に基づく結果が反映された領域Ｗ８は母体由来の有核赤血球が多く出現する領域であり、領域Ｗ９は胎児由来の有核赤血球が多く出現する領域であると推定される。第３情報に基づいて抽出条件を再決定することにより、目的の細胞（胎児由来の有核赤血球である場合）が多く出現する領域Ｗ９を他の集団から高い確率で分離することが可能となることが理解できる。
【００８０】
本実施形態では、第２情報、及び第３情報に基づいて、抽出条件を再決定する場合について説明したが、第２情報、及び第３情報の少なくとも一つの情報に基づいて、抽出条件を再決定する場合でも良い。少なくとも一つの情報に基づいて、抽出条件を再決定することにより、目的の細胞をより高い確率で分取できるので、信頼性の高い遺伝子解析方法を実現することができる。
【００８１】
（第２実施形態）
次に、第２実施形態の遺伝子解析方法について、図面を参照して説明する。なお、本実施形態では、試料液に血球細胞が含まれる場合であって、目的の細胞が胎児由来の有核赤血球である場合を例示して説明する。
【００８２】
図１０は、第２実施形態の遺伝子解析方法のフローチャートである。図１０に示されるように、遺伝子解析方法は、染色工程（ステップＳ２１）、分取工程（ステップＳ２２）、撮像工程（ステップＳ２３）、増幅工程（ステップＳ２４）、解析工程（ステップＳ２５）、及び条件決定工程（ステップＳ２６）を、少なくとも備える。
【００８３】
染色工程（ステップＳ２１）では、細胞を染色する。分取工程（ステップＳ２２）では、フローサイトメトリー法により試料液の細胞由来の第１情報を取得し、決定された抽出条件に従って第１情報を分析し、分析の結果から目的の細胞を、複数のウェルが配列された容器に分取する。撮像工程（ステップＳ２３）では、容器に分取された細胞を撮像する。増幅工程（ステップＳ２４）では、容器に分取された細胞のＤＮＡを増幅する。解析工程（ステップＳ２５）では、増幅されたＤＮＡを遺伝子解析する。条件決定工程（ステップＳ２６）では、増幅工程において取得された第２情報、解析工程において取得された第３情報、及び撮像工程において取得された第４情報の少なくとも一つの情報に基づいて、抽出条件を再決定する。
【００８４】
以下、各工程について説明する。なお、第１実施形態と同様の工程については、その説明を省略する場合がある。
【００８５】
第２実施形態の遺伝子解析方法の染色工程（ステップ２１）、及び分取工程（ステップＳ２２）について、第１実施形態と同様の染色工程（ステップＳ１）、及び分取工程（ステップＳ２）を実施することができる。次に撮像工程（ステップＳ２３）について説明する。
【００８６】
＜撮像工程（ステップＳ２３）＞
撮像工程では、容器に分取された細胞を撮像する。細胞を撮像するとは、細胞を対象として撮像する意味であって、目的の細胞、目的外の細胞、細胞ではない異物（ゴミ、細胞破片）を撮像する場合を含んでいる。撮像工程では、容器２０に分取された細部を撮像するため画像撮像装置３０を用いることが好ましい。画像撮像装置３０として、撮像装置を備える蛍光顕微鏡を挙げることができる。
【００８７】
図１１は画像撮像装置３０の概略構成図である。画像撮像装置３０は、容器２０に回収された細胞Ｃを撮像することができる。画像撮像装置３０は、細胞Ｃを撮像することにより、細胞由来の第４情報を得ることができるように構成されている。ここで、細胞由来の第４情報には、細胞からの蛍光強度、細胞の形状、色、及び大きさの少なくとも一つが含まれている。蛍光強度とは、励起光により励起された免疫染色による蛍光色素の蛍光発光を意味する。細胞の形状とは、細胞の外部、及び内部の形態を含む。細胞の色とは、細胞自身の色を意味する。細胞の大きさとは、細胞を二次元的に見た面積、細胞を三次元的に見た体積等を含む。
【００８８】
本実施形態では、撮像工程において、容器２０に分取された細胞を、容器２０のウェル２０２の開口と反対の側（すなわち裏面）から細胞を撮像する場合について説明する。
【００８９】
画像撮像装置３０は、細胞Ｃの蛍光を測定するための励起用の第１光源３０２と、容器２０を載置するためのテーブル３０４と、テーブル３０４から離間して容器２０の反対側に配置されたレンズ３０６と、励起フィルタ３０８、ダイクロイックミラー３１０及び蛍光フィルタ３１２とから構成されるフィルタ群と、容器２０のウェル２０２の側に配置され、透過光を測定するための光を容器２０に照射する第２光源３１４と、細胞Ｃを撮像する撮像装置３１６と、を備えている。
【００９０】
なお、撮像装置３１６は、容器２０に分取された細胞Ｃを容器２０のウェル２０２の開口（表面）と反対の側に配置されている。すなわち、撮像装置３１６は、容器２０の裏面から細胞Ｃを撮像することができる。第１光源３０２からの励起光は、容器２０の裏面からウェル２０２に照射され、第２光源３１４からの光は、容器２０の表面からウェル２０２に照射される。
【００９１】
容器２０の裏面側から励起光を照射、又は容器２０を透過して細胞からの蛍光、及び、透過光を受光するため、容器２０の材料が透明であること、自家蛍光しないこと、散乱しないことが好ましい。
【００９２】
画像撮像装置３０は、好ましくは、蛍光発光する細胞Ｃを撮像した画像、及び明視野による細胞Ｃを撮像した画像を取得することができる。
【００９３】
第１光源３０２として、例えば、高圧水銀ランプ、高圧キセノンランプ、発光ダイオード、レーザダイオード、タングステンランプ、ハロゲンランプ、白色発光ダイオードなどを用いることができる。これらの光源を用いても励起フィルタ３０８により、目的の波長のみ透過させることができる。免疫染色された細胞Ｃの蛍光色素に対して、目的の励起波長の光を照射させることができる。なお、第２光源３１４として、第１光源３０２と同様の光源を用いることができる。
【００９４】
細胞Ｃの免疫染色による蛍光強度を撮像装置３１６により画像を取得する場合について説明する。第１光源３０２から照射された光は、励起フィルタ３０８により、目的とされる波長領域の光のみ透過される。励起フィルタ３０８を透過した光は、ダイクロイックミラー３１０により、容器２０の方向に反射される。ダイクロイックミラー３１０により反射された光は、レンズ３０６を透過し、ウェル２０２に回収された細胞Ｃに照射される。細胞Ｃに照射される光は、免疫染色された細胞Ｃの蛍光色素を励起する波長領域とされている。免疫染色された細胞Ｃは励起光により励起され、照射された励起波長とは異なる波長の蛍光を発光する。細胞Ｃの免疫染色による蛍光は、レンズ３０６、ダイクロイックミラー３１０、及び蛍光フィルタ３１２を経て撮像装置３１６で撮像され、画像が取得される。励起光とその励起光により発する蛍光と比較すると、蛍光の波長が励起光の波長より長くなるので、ダイクロイックミラー３１０により、励起光の波長に光を容器２０の側に反射させ、蛍光の波長の光を撮像装置３１６の側に透過させることができる。また、蛍光フィルタ３１２は、励起光を透過させず、蛍光のみを透過させることができる。したがって、撮像装置３１６において、免疫染色による蛍光発光する細胞Ｃを撮像することができる。蛍光フィルタ３１２により、蛍光のみを透過させることにより、撮像装置３１６で撮像される画像が励起光に影響されることがないので、正確な画像を取得することができる。
【００９５】
本実施形態の画像撮像装置３０は、容器２０を任意の位置に移動（例えば、Ｘ方向、Ｙ方向、及びＺ方向）させるため、テーブル３０４と駆動装置（不図示）とを備えている。テーブル３０４と駆動装置とにより、容器２０の特定のウェル２０２を、観察位置に移動させることができる。駆動装置は、テーブル３０４を、Ｘ方向、Ｙ方向、及びＺ方向に移動できることが好ましい。
【００９６】
細胞Ｃが複数の蛍光色素により免疫染色されている場合、異なるフィルタ群（励起フィルタ３０８、ダイクロイックミラー３１０及び蛍光フィルタ３１２）に切り替えることで、異なる蛍光発光する細胞Ｃを撮像でき、細胞Ｃの画像を取得することができる。
【００９７】
撮像装置３１６としては、容器２０のウェル２０２内の細胞の蛍光または透過光を撮像することができれば特に限定されず、例えば、ＣＣＤ（charge-coupled device）カメラを用いることができる。
【００９８】
本実施形態では、撮像装置３１６と第１光源３０２とフィルタ群とが容器２０の裏面側に配置され、第２光源３１４が容器の表面側に配置されている画像撮像装置３０について説明した。これに限定されず、撮像装置３１６と第１光源３０２とフィルタ群とが容器２０の表面側に配置され、第２光源３１４が容器の裏面側に配置される画像撮像装置３０を使用することもできる。
【００９９】
撮像工程において細胞を撮像することにより取得された第４情報は、細胞由来の第１情報と関連付けて、例えばフローサイトメータ１０の制御部１２０に入力、及び記憶される。撮像工程では細胞Ｃが撮像した画像が取得されているので、画像から第４情報として、細胞の蛍光強度、形状、色、及び大きさの少なくとも一つを含む情報を取得することができる。撮像工程では直接細胞を観察して第４情報を取得しているので、分取された細胞が、目的の細胞、目的外の細胞、ゴミ、又は細胞破片であるか否かを判断することが可能になる。
【０１００】
本実施形態では、図６に示される容器２０を使用した場合を説明したが、これに限定されず、図７に示される容器２０を使用して細胞を撮像することができる。
【０１０１】
第２実施形態の遺伝子解析方法の増幅工程（ステップＳ２４）、及び解析工程（ステップＳ２５）について、第１実施形態と同様の増幅工程（ステップＳ３）、及び解析工程（ステップＳ４）を実施することができる。次に条件決定工程（ステップＳ２６）について説明する。
【０１０２】
＜条件決定工程（ステップＳ２６）＞
条件決定工程では、増幅工程において取得された第２情報、解析工程において取得された第３情報、及び撮像工程において取得された第４情報の少なくとも一つの情報に基づいて、分取工程における抽出条件を再決定する。
【０１０３】
本実施形態では、分取工程の後、第１情報と関連付けて、増幅工程、解析工程、及び撮像工程において、第２情報、第３情報、及び第４情報を少なくとも一つを取得する。増幅工程、解析工程、及び撮像工程を経ることにより、分取された細胞が、目的の細胞であるか否かを判断できる。好ましくは、第２情報は遺伝子の増幅の有無を含んでいるので、分取された細胞が生細胞、死細胞であるかを判断できる。また、第３情報は遺伝子情報を含んでいるので、分取された細胞が目的の細胞であるかを判断できる。また、第４情報は細胞の蛍光強度等を含んでいるので、撮像した画像から目的の細胞であるかを判断できる。
【０１０４】
第２情報、第３情報、及び第４情報の少なくとも一つが、第１情報と関連付けられているので、第２情報、第３情報、及び第４情報に基づいて、分取工程における抽出条件にフィードバックすることができる。したがって、より高い確率で目的の細胞を分取することが可能な抽出条件を再決定することができる。
【０１０５】
図１２は、図５のスキャッタグラムに対し、撮像工程の第４情報に基づいて抽出条件を再決定した後のスキャッタグラムである。撮像工程で取得された第４情報に関連付けされた第１情報が、例えば、フローサイトメータ１０の制御部１２０にフィードバックされる。制御部１２０は、フィードバックされた第４情報に基づいて、抽出条件を再決定することができる。
【０１０６】
再決定された抽出条件に基づいて第１情報を分析した結果、新たに領域Ｗ１０が選択される。領域Ｗ５の中の第４情報に基づく結果が反映された領域Ｗ１０は、ゴミ又は細胞破片が多く出現する領域であると推定される。領域Ｗ１０をゲートアウトすることにより、新たな領域Ｗ１１が選択される。領域Ｗ１１にはゴミ又は細胞破片を除く有核赤血球が多く出現すると推定される。
【０１０７】
第４情報に基づいて抽出条件を再決定することにより、ゴミ又は細胞破片等を除く目的の細胞が多く出現する領域Ｗ１１を、他の集団から高い確率で分離することが可能になることが理解できる。
【０１０８】
図１３は、図１２のスキャッタグラムに対し、増幅工程の第２情報に基づいて抽出条件を再決定した後のスキャッタグラムである。増幅工程において取得された第２情報に関連付けされる第１情報が、例えば、フローサイトメータ１０の制御部１２０にフィードバックされる。制御部１２０は、フィードバックされた第２情報に基づいて、抽出条件を再決定することができる。
【０１０９】
再決定された抽出条件に基づいて第１情報を分析した結果、新たに領域Ｗ６が選択される。領域Ｗ１１の中の第２情報に基づく結果が反映された領域Ｗ６は、増幅しなかった細胞（死細胞）が多く出現する領域であると推定される。領域Ｗ６をゲートアウトすることにより、領域Ｗ１１の中に新たな領域Ｗ７が選択される。領域Ｗ７には有核赤血球であって生細胞が多く出現すると推定される。
【０１１０】
第２情報に基づいて抽出条件を再決定することにより、有核赤血球であって生細胞が多く出現する領域Ｗ７を、他の集団から高い確率で分離することが可能になることが理解できる。
【０１１１】
さらに、解析工程において取得された第３情報に関連付けされる第１情報が、例えば、フローサイトメータ１０の制御部１２０にフィードバックされる。制御部１２０は、フィードバックされた第３情報に基づいて、抽出条件を再決定することができる。
【０１１２】
その結果、図９のスキャッタグラムに示されるように、再決定された抽出条件に基づいて第１情報を分析した結果、新たに領域Ｗ８、領域Ｗ９が選択される。
【０１１３】
領域Ｗ７の中の第３情報に基づく結果が反映された領域Ｗ８は母体由来の有核赤血球が多く出現する領域であり、領域Ｗ９は胎児由来の有核赤血球が多く出現する領域であると推定される。第３情報に基づいて抽出条件を再決定することにより、目的の細胞（胎児由来の有核赤血球である場合）が多く出現する領域Ｗ９を他の集団から高い確率で分離することが可能となることが理解できる。
【０１１４】
本実施形態では、第２情報、第３情報、及び第４情報に基づいて、抽出条件を再決定する場合について説明したが、第２情報、第３情報、及び第４情報の少なくとも一つの情報に基づいて、抽出条件を再決定する場合でも良い。少なくとも一つの情報に基づいて、抽出条件を再決定することにより、目的の細胞をより高い確率で分取できるので、信頼性の高い遺伝子解析方法を実現することができる。
【０１１５】
なお、本実施形態において、染色工程の前に、目的とする細胞の溶媒中の濃度を高める濃縮工程を備えることが好ましい。濃縮工程について、一例として母体血中の有核赤血球を濃縮する場合について説明する。
【０１１６】
＜濃縮工程＞
染色工程より前に母体血中の有核赤血球の濃縮を行い、有核赤血球の密度を高めることが好ましい。濃縮工程としては、公知の方法、例えば、密度勾配遠心分離法、ＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）法、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）法、レクチン法、あるいは、フィルタ濾過法などを用いることができる。なかでも、血球細胞の特性を利用し、簡便な濃縮方法として、密度勾配遠心分離法により濃縮を行うことが好ましい。濃縮工程の一例として、以下に、密度勾配遠心分離法について説明する。
【０１１７】
〔密度勾配遠心分離法〕
密度勾配遠心分離法は、血液中の成分の密度の差を利用して分離する方法である。密度勾配遠心分離法は、分離用媒体を使用しない方法、また、１種の分離用媒体を使用してその分離用媒体の上下で分離する方法、あるいは、２種の分離用媒体を使用して目的の成分の密度領域を分離用媒体の間に挟み込むように分離する方法等を利用して、目的の成分（本実施形態においては有核赤血球）を集めることができる。そして、目的の成分を含む画分を採取することにより、母体血から有核赤血球を濃縮することができる。
【０１１８】
分離用媒体を使用しない方法としては、血液試料である母体の末梢血（希釈液により希釈されていてもよい）を遠心管に充填し、遠心分離を行った後に、目的の成分を採取することにより有核赤血球の濃縮を行うことができる。
【０１１９】
１種の分離用媒体を使用する方法としては、遠心管の底部に分離用媒体を注入し、分離用媒体の上に血液試料である母体の末梢血（希釈液により希釈されていてもよい）を積層した後に遠心分離を行い、遠心分離後の分離用媒体の上部（分離用媒体の一部を含んでもよい）を採取することにより有核赤血球の濃縮を行うことができる。
【０１２０】
２種の分離用媒体を使用する方法では、遠心管の底部に第１の分離用媒体を注入し、第１の分離用媒体の上に第２の分離用媒体を積層し、第２の分離用媒体の上に血液試料である母体の末梢血（希釈液により希釈されていてもよい）を積層した後に遠心分離にかけ、遠心分離後の第１の分離用媒体と第２の分離用媒体の間の層（第１の分離用媒体及び第２の分離用媒体のそれぞれの一部、あるいはどちらかの一部を含んでもよい）を採取することにより有核赤血球の濃縮を行うことができる。なお、第１の分離用媒体を積層した遠心管を第２の分離用媒体を積層する前に冷却すると、第１と第２の分離用媒体の境界領域での混合を抑制できる。
【０１２１】
国際公開ＷＯ２０１２／０２３２９８号公報には、胎児の有核赤血球を含めた母体の血液の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度、母体の血球の密度は、赤血球が１．０７０〜１．１２０ｇ／ｍＬ程度、好酸球は１．０９０〜１．１１０ｇ／ｍＬ程度、好中球は１．０７５〜１．１００ｇ／ｍＬ程度、好塩基球が１．０７０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度、リンパ球が１．０６０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度、単核球が１．０６０〜１．０７０ｇ／ｍＬ程度である。
【０１２２】
積層する分離用媒体の密度は、密度が１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度の胎児由来の有核赤血球を、母体中の他の血球成分と分離するために設定される。例えば、２種の分離用媒体を使用する方法では、胎児由来の有核赤血球の中心の密度は、１．０８０ｇ／ｍＬ程度であるため、この密度を挟む２つの異なる密度の分離用媒体を作成し、隣接して重層することにより、その界面に所望の胎児由来の有核赤血球を集めることが可能となる。好ましくは、第１の分離用媒体の密度を１．０８ｇ／ｍＬ以上１．１０ｇ／ｍＬ以下、第２の分離用媒体の密度は１．０６ｇ／ｍＬ以上１．０８ｇ／ｍＬ以下として設定することが好ましい。さらに好ましくは、第１の分離用媒体の密度を１．０８ｇ／ｍＬ以上１．０９ｇ／ｍＬ以下、第２の分離用媒体の密度を１．０６５ｇ／ｍＬ以上１．０８ｇ／ｍＬ以下である。具体的な例としては、第１の分離用媒体の密度を１．０８５ｇ／ｍＬ、第２の分離用媒体の密度を１．０７５ｇ／ｍＬに設定することにより、血漿成分、好酸球及び単核球を、回収する所望の画分から分離することが可能となる。また、赤血球、好中球、リンパ球の一部も分離することが可能となる。本実施形態では、第１の分離用媒体と、第２の分離用媒体は同じ種類でも、異なる種類でも、本発明の効果を実現できる限りにおいて制限はないが、同じ種類の媒体を用いることが好ましい態様である。
【０１２３】
濃縮工程で用いられる密度勾配遠心分離用の分離用媒体としては、ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムを含む溶液であるＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）、非透析性ポリビニルピロリドンをコーティングした直径１５〜３０ｎｍのシリカゾルを含む溶液であるＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマー溶液であるＦｉｃｏｌｌ（登録商標）−Ｐａｑｕｅなどの分離用媒体を使用することができる。本実施形態では、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ及びＰｅｒｃｏｌｌを使用することが好ましい。
【０１２４】
密度勾配遠心分離の分離用媒体は、希釈液あるいは密度（比重）の異なる分離用媒体の混合により所望の密度に調製することが可能である。例えば、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）は、市販されている密度１．０７７の媒体と、密度１．１１９の媒体を用いて、第１の分離用媒体及び第２の分離用媒体を所望の密度に調整することが可能である。また、これらの密度勾配遠心分離用媒体は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）などの添加により浸透圧を調節することができる。
【符号の説明】
【０１２５】
１０  フローサイトメータ
２０  容器
３０  画像撮像装置
１０２  ノズル
１０４  フローセル
１０６  光源
１０８、１１０  検知器
１１２、１１４  偏向電極板
１２０  制御部
２０２  ウェル
２０４  側壁
２０６  識別標識
２０８  チューブ
２１０  支持部材
２１２  孔
３０２  第１光源
３０４  テーブル
３０６  レンズ
３０８  励起フィルタ
３１０  ダイクロイックミラー
３１２  蛍光フィルタ
３１４  第２光源
３１６  撮像装置
Ｃ  細胞
Ｌ  シース液
Ｓ  試料液
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５、Ｗ６、Ｗ７、Ｗ８、Ｗ９、Ｗ１０、Ｗ１１  領域
【図１】
2017169240.tif 000003
【図２】
2017169240.tif 000004
【図３】
2017169240.tif 000005
【図４】
2017169240.tif 000006
【図５】
2017169240.tif 000007
【図６】
2017169240.tif 000008
【図７】
2017169240.tif 000009
【図８】
2017169240.tif 000010
【図９】
2017169240.tif 000011
【図１０】
2017169240.tif 000012
【図１１】
2017169240.tif 000013
【図１２】
2017169240.tif 000014
【図１３】
2017169240.tif 000015
【国際調査報告】
2017169240.tif 000016
2017169240.tif 000017
2017169240.tif 000018
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