(57)【要約】  単純な培養操作で、容易に特定の幹細胞を選択的に分離培養する。幹細胞を含む組織由来細胞群を、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される細胞培養容器で培養する、幹細胞の分離方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を含む組織由来細胞群を、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される細胞培養容器で培養する、幹細胞の分離方法。
【請求項２】
組織由来細胞群が、脂肪組織由来である請求項１記載の幹細胞の分離方法。
【請求項３】
幹細胞を含む組織由来細胞群から幹細胞を分離するための、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される細胞培養容器の使用。
【請求項４】
幹細胞を、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される細胞培養容器で培養する、幹細胞の分化誘導方法。
【請求項５】
幹細胞が脂肪幹細胞である請求項４記載の幹細胞の分化誘導方法。
【請求項６】
幹細胞を分化誘導するための、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される細胞培養容器の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞を含む細胞群から幹細胞を分離する幹細胞の分離方法、及び分離された幹細胞を分化誘導する方法に関する。また、本発明は、これらの方法を実施するためのノルボルネン系重合体で構成される細胞培養容器の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、幹細胞又は幹細胞から派生した細胞を用いて、ダメージを受けた患者の細胞や組織を修復したり再生したりする幹細胞治療の開発が進んでいる。例えば、特許文献１には、患者から脂肪組織を取得し、濃縮処理により濃縮された幹細胞を患者へ投与する閉鎖系の治療システムが提案されている。【０００３】
こうした幹細胞は、脂肪吸引手術により取得された脂肪組織細胞群などから調製される。採取された脂肪組織細胞群から幹細胞を取得するためには、通常、遠心分離処理やコラゲナーゼ等の酵素による処理を行い、脂肪幹細胞や繊維芽細胞や血管内皮細胞や血管平滑筋様細胞などの脂肪組織由来細胞と血液由来細胞とその他の細胞とからなる間質血管細胞群を得る（例えば、特許文献２参照）。
このようにして得られた細胞群にも様々な細胞が含まれており、この中から幹細胞を効率よく単離することが求められている。
例えば、特許文献３では、酵素処理の後、不織布や多孔質フィルタを用いて細胞を濾過する方法が提案され、特許文献４では、脂肪組織由来細胞を特殊環境で培養することが提案されている。
しかしながら、いずれの方法も煩雑な単離操作を必要とするものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０３／０５３３４６号
【特許文献２】国際公開第２００５／０４２７３０号
【特許文献３】特開２００７−２８９０７６号公報
【特許文献４】特表２０１６−５１９９３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、これまでにも組織由来細胞群から幹細胞を分離する技術は開発されてきたものの、これらは十分なものとはいえず、さらなる技術開発が必要な状況にあった。
本発明は、かかる従来技術の実情に鑑みてなされたものであり、単純な培養操作で、容易に特定の幹細胞を選択的に分離培養することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、組織由来細胞群からの幹細胞の分離方法について鋭意検討を行った。
その結果、少なくとも細胞を培養する面（培養面）がノルボルネン系重合体で構成される細胞培養容器で、脂肪組織由来細胞群を培養すると、脂肪幹細胞のみが容器に接着するため、脂肪幹細胞を選択的に分離培養することができることを見出し、以下の発明を完成するに至った。また、上記細胞培養容器の培養面で脂肪幹細胞を脂肪細胞へと分化誘導すると、脂肪細胞へと分化したことから、上記細胞培養容器で培養した脂肪幹細胞は分化能を保持していた。【０００７】
かくして本発明によれば、下記（１）、（２）の幹細胞の分離方法、（３）、（６）の細胞培養容器の使用、（４）、（５）の幹細胞の分化誘導方法が提供される。
（１）幹細胞を含む組織由来細胞群を、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される細胞培養容器で培養する、幹細胞の分離方法。
（２）組織由来細胞群が、脂肪組織由来である前記幹細胞の分離方法。
（３）幹細胞を含む組織由来細胞群から幹細胞を分離するための、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される細胞培養容器の使用。
（４）幹細胞を、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される細胞培養容器で培養する、幹細胞の分化誘導方法。
（５）幹細胞が脂肪幹細胞である前記幹細胞の分化誘導方法。
（６）幹細胞を分化誘導するための、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される細胞培養容器の使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、単純な培養操作で、容易に特定の幹細胞を選択的に分離培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、実施例３におけるゼオノアディッシュで培養された細胞の位相差顕微鏡写真である。
【図２】図２は、実施例３におけるゼオノアディッシュで培養された細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図３】図３は、比較例１におけるコーニングディッシュで培養された細胞の位相差顕微鏡写真である。
【図４】図４は、比較例１におけるコーニングディッシュで培養された細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図５】図５は、実施例４における脂肪細胞が染色された顕微鏡写真である。
【図６】図６は、実施例６におけるゼオノアディッシュで培養された細胞の位相差顕微鏡写真である。
【図７】図７は、実施例６におけるゼオノアディッシュで培養された細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図８】図８は、比較例２におけるコーニングディッシュで培養された細胞の位相差顕微鏡写真である。
【図９】図９は、比較例２におけるコーニングディッシュで培養された細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明に用いる細胞培養容器は、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成されるものである。
本発明に用いる細胞培養容器は、通常、細胞を培養するのに用いられる様々な容器の形状であることができる。具体的な形状としては、チューブ状、ボトル状、カップ状、ディッシュ状、チップ状、バッグ状、パウチ状などが挙げられる。
【００１１】
本発明の細胞培養容器において、「少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される」とは、細胞を培養する面（細胞と接触する部分、例えば、容器底面）の樹脂成分が、ノルボルネン系重合体であることを意味する。なお、培養面がノルボルネン系重合体のみからなることとしてもよい。
本発明に用いる細胞培養容器は、上記のように、少なくとも細胞と接触する部分の樹脂成分がノルボルネン系重合体を含んでいればよい。したがって、容器内部であっても、培地と接しない部分については、ノルボルネン系重合体以外の材料で構成されていてもよい。
【００１２】
本発明に用いる細胞培養容器としては、ノルボルネン系重合体を成形材料として用いて得られる樹脂成形体（容器）、ノルボルネン系重合体以外の重合体やガラスなどの材料で構成された容器の内表面を、ノルボルネン系重合体を含有する塗工液を用いてコーティングして得られる容器、ノルボルネン系重合体以外の重合体やガラスなどの材料で構成された容器の内表面に、ノルボルネン系重合体製のシートをラミネートして得られる容器等が挙げられる。
【００１３】
ノルボルネン系重合体は、ノルボルネン骨格を有する単量体単位を、ノルボルネン系重合体を構成する全単量体単位に対して５０質量％以上、好ましくは６０質量％以上含む重合体である。より具体的には、ノルボルネン系重合体は、ノルボルネン骨格を有する単量体であるノルボルネン系単量体を重合してなるものであり、開環重合によって得られるものと、付加重合によって得られるものに大別される。
【００１４】
開環重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の開環重合体、ノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体、及び、これらの水素化物などが挙げられる。
付加重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の付加重合体及びノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体などが挙げられる。
これらの中でも、本願発明の効果がより得られ易いことから、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物が好ましい。これらの、各種ノルボルネン系重合体としては、市販の各種重合体や、ノルボルネン系単量体と任意のその他の単量体とを重合させて得た各種重合体が挙げられる。
【００１５】
ノルボルネン系重合体の合成に使用可能なノルボルネン系単量体としては、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン（慣用名ノルボルネン）、５−メチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５，５−ジメチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−エチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−エチリデン−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−ビニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−プロペニルビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−メトキシカルボニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−シアノビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−メチル−５−メトキシカルボニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン等の２環式単量体；
トリシクロ［４．３．０1,6．１2,5］デカ−３，７−ジエン（慣用名ジシクロペンタジエン）、２−メチルジシクロペンタジエン、２，３−ジメチルジシクロペンタジエン、２，３−ジヒドロキシジシクロペンタジエン等の３環式単量体；
テトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］−３−ドデセン（テトラシクロドデセン）、テトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］−３−ドデセン、８−メチルテトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］−３−ドデセン、８−エチルテトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］−３−ドデセン、８−エチリデンテトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］−３−ドデセン、８，９−ジメチルテトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］−３−ドデセン、８−エチル−９−メチルテトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］−３−ドデセン、８−エチリデン−９−メチルテトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］−３−ドデセン、８−メチル−８−カルボキシメチルテトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］−３−ドデセン、
７，８−ベンゾトリシクロ［４．３．０．１2,5］デカ−３−エン（慣用名メタノテトラヒドロフルオレン：１，４−メタノ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレンともいう）、１，４−メタノ−８−メチル−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン、１，４−メタノ−８−クロロ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン、１，４−メタノ−８−ブロモ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン等の４環式単量体；等が挙げられる。
これらのノルボルネン系単量体は、置換基を１種又は２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
【００１６】
ノルボルネン系単量体と開環共重合可能なその他の単量体としては、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテン、１，４−シクロヘキサジエン、１，５−シクロオクタジエン、１，５−シクロデカジエン、１，５，９−シクロドデカトリエン、１，５，９，１３−シクロヘキサデカテトラエン等の単環のシクロオレフィン系単量体が挙げられる。
【００１７】
ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、エチレン、プロピレン、１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン等の炭素数２〜２０のα−オレフィン系単量体；シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロオクテン、テトラシクロ［９．２．１．０2,10．０3,8］テトラデカ−３，５，７，１２−テトラエン（３ａ，５，６，７ａ−テトラヒドロ−４，７−メタノ−１Ｈ−インデンとも言う）等のシクロオレフィン系単量体；１，４−ヘキサジエン、４−メチル−１，４−ヘキサジエン、５−メチル−１，４−ヘキサジエン、１，７−オクタジエン等の非共役ジエン系単量体；等が挙げられる。
これらの中でも、ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、α−オレフィン系単量体が好ましく、エチレンがより好ましい。
これらのその他の単量体は、置換基を１種又は２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
【００１８】
ノルボルネン系単量体の開環重合体、又はノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体は、単量体成分を、公知の開環重合触媒の存在下で重合して得ることができる。
開環重合触媒としては、例えば、ルテニウム、オスミウムなどの金属のハロゲン化物と、硝酸塩又はアセチルアセトン化合物、及び還元剤とからなる触媒、あるいは、チタン、ジルコニウム、タングステン、モリブデンなどの金属のハロゲン化物又はアセチルアセトン化合物と、有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物は、通常、上記開環重合体の重合溶液に、ニッケル、パラジウムなどの遷移金属を含む公知の水素化触媒を添加し、炭素−炭素不飽和結合を水素化することにより得ることができる。
【００１９】
ノルボルネン系単量体の付加重合体、又はノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体は、単量体成分を、公知の付加重合触媒の存在下で重合して得ることができる。
付加重合触媒としては、例えば、チタン、ジルコニウム又はバナジウム化合物と有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
【００２０】
ノルボルネン系重合体の分子量に格別な制限はないが、シクロヘキサン溶液（重合体が溶解しない場合はトルエン溶液）のゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレン換算の重量平均分子量で、通常５，０００以上であり、好ましくは５，０００〜５００，０００、より好ましくは８，０００〜２００，０００、特に好ましくは１０，０００〜１００，０００である。重量平均分子量がこの範囲内であるときに、機械的強度と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
【００２１】
ノルボルネン系重合体のガラス転移温度は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常５０〜３００℃、好ましくは１００〜２８０℃、特に好ましくは１１５〜２５０℃、さらに好ましくは１３０〜２００℃である。ガラス転移温度がこの範囲内であるときに、耐熱性と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
本発明においてガラス転移温度は、ＪＩＳ  Ｋ  ７１２１に基づいて測定されたものである。
【００２２】
ノルボルネン系重合体は、それぞれ単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
また、少なくとも培養面を構成する樹脂成分として、ノルボルネン系重合体に加えて、任意で、熱可塑性樹脂材料で通常用いられている配合剤、例えば、軟質重合体、酸化防止剤、紫外線吸収剤、光安定剤、近赤外線吸収剤、離型剤、染料や顔料などの着色剤、可塑剤、帯電防止剤、蛍光増白剤などの配合剤を、通常採用される量、添加することができる。ここで、ノルボルネン系重合体に対して軟質重合体を混合して用いる場合には、ノルボルネン系重合体である脂環構造含有重合体１００質量部に対して、通常０．０１〜２０質量部、好ましくは０．０５〜１０質量部、より好ましくは０．０５〜５質量部である。
【００２３】
また、少なくとも培養面を構成する樹脂成分として、ノルボルネン系重合体、及び上述した配合剤の一つである軟質重合体以外に、その他の重合体（以下、単に「その他の重合体」という）を混合しても良い。ノルボルネン系重合体に混合されるその他の重合体の量は、ノルボルネン系重合体１００質量部に対して、通常２００質量部以下、好ましくは１５０質量部以下、より好ましくは１００質量部以下である。
ノルボルネン系重合体に対して配合する各種配合剤やその他の重合体の割合が多すぎると細胞が浮遊し難くなるため、いずれもノルボルネン系重合体の性質を損なわない範囲で配合することが好ましい。
【００２４】
ノルボルネン系重合体と、配合剤やその他の重合体との混合方法は、ポリマー中に配合剤が十分に分散する方法であれば、特に限定されない。また、配合の順番に格別な制限はない。配合方法としては、例えば、ミキサー、一軸混練機、二軸混練機、ロール、ブラベンダー、押出機などを用いて樹脂を溶融状態で混練する方法、適当な溶剤に溶解して分散させた後、凝固法、キャスト法、又は直接乾燥法により溶剤を除去する方法などが挙げられる。
二軸混練機を用いる場合、混練後は、通常は溶融状態で棒状に押出し、ストランドカッターで適当な長さに切り、ペレット化して用いられることが多い。
【００２５】
ノルボルネン系重合体で培養容器本体を成形する場合、培養容器の形状に応じて任意の成形方法を選択すればよい。例えば、一般的なチューブ状の成形体であれば、射出成形法、押出成形法、ブロー成形法、真空成形法、プレス成形法、圧縮成形法、回転成形法等が採用される。
また、このほか、押出成形法やキャスト成形法などにより、ノルボルネン系重合体をフィルム状や板状の成形体を得、これをノルボルネン系重合体以外の材料で成形された培養容器の培養部分に配置することもできる。
【００２６】
本発明に用いる細胞培養容器は、通常、滅菌処理して用いられる。滅菌処理の方法に格別な制限はなく、高圧蒸気法や乾熱法などの加熱法；γ線や電子線などの放射線を照射する放射線法；高周波を照射する照射法；酸化エチレンガス（ＥＯＧ）などのガスを接触させるガス法；滅菌フィルタを用いる濾過法；など、医療分野で一般的に採用される方法から、成形体の形状や用いる細胞に応じて、選択することができる。
【００２７】
本発明に用いる細胞培養容器で培養される幹細胞を含む組織由来細胞群は、幹細胞を含む複数種類の細胞を含む組織由来の細胞群であれば、特に限定されない。例えば、細胞治療に供する間葉系血管細胞群、脂肪由来細胞群、骨髄由来細胞群などが挙げられ、また、これらの細胞群から、一部の細胞が既に分離されたものであっても良い。
【００２８】
かかる細胞培養容器を用いて、組織由来細胞群より幹細胞を分離するための培地は、分離対象となる幹細胞を増殖させることのできる培地を用いれば良く、特に未分化性を維持したまま増殖させることのできる培地を用いるのが好ましい。このような培地は市販されており、例えば、脂肪由来幹細胞であれば、コージンバイオ社製のＫＢＭ  ＡＤＳＣシリーズなどが挙げられ、骨髄由来幹細胞であれば、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製のＳｔｅｍｌｉｎｅ、間葉系幹細胞増殖培地シリーズなどが挙げられる。
【００２９】
培地には、添加剤を配合することもできる。添加剤としては、タンパク質等の誘導因子、ミネラル、金属、ビタミン成分等が挙げられる。
これらの添加剤は一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３０】
細胞の培養条件は特に限定されず、用いる細胞や目的に応じて適宜決定することができる。
例えば、二酸化炭素濃度が５％程度で、温度が２０℃〜３７℃の範囲で一定に維持された、加湿された恒温器を用いて細胞を培養することができる。
【００３１】
本発明は、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される細胞培養容器で、組織由来細胞群を培養すると、脂肪幹細胞のみが接着して培養することができ、結果として、脂肪幹細胞を分離することができるというものである。
【００３２】
分離された幹細胞は、幹細胞治療用途に用いるほか、更に分化誘導培地にて培養することにより分化細胞を得、創薬用途や医療用途に利用することができる。
本発明の幹細胞を分化誘導する方法において、用いられる細胞は、本発明の方法により分離された幹細胞であってもよく、他の方法により分離された幹細胞や、多能性幹細胞から分化誘導された幹細胞であってもよい。例えば、少なくとも培養面がノルボルネン系重合体で構成される細胞培養容器で脂肪幹細胞を培養することにより、このものを脂肪細胞に分化させることができる。
【００３３】
本発明の幹細胞を分化誘導する方法において、用いられる培地は、幹細胞の分化誘導に適した培地を用いれば良く、基礎培地に分化誘導するための添加剤を加えた培地や、市販の分化誘導培地を用いることができる。
分化誘導するための添加剤としては、細胞表面の受容体に作用する、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；核内受容体の、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；コラーゲンやファイブネクチンなどの細胞外マトリックス；細胞外マトリックスの一部分あるいは、模擬した化合物；細胞内の情報伝達経路に関わるタンパク質に作用する成分；細胞内の１次代謝又は２次代謝の酵素に作用する成分；細胞内の核内又はミトコンドリア内の遺伝子の発現に影響を与える成分；ウィルスベクターなどと組み合わせて細胞内に導入することができるＤＮＡやＲＮＡ；等が挙げられる。
これらの添加剤は、一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。
市販の分化誘導培地としては、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製「Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｋｉｔｓ」などが挙げられる。
【００３４】
細胞の培養条件は特に限定されず、用いる細胞や目的に応じて適宜決定することができる。
例えば、二酸化炭素濃度が５％程度で、温度が２０℃〜３７℃の範囲で一定に維持された、加湿された恒温器を用いて細胞を培養することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を、実施例によりさらに詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。【００３６】
［実施例１］
＜培養細胞および培地＞
ヒト脂肪由来幹細胞（以下、「ＡＳＣ」という）と骨髄由来幹細胞（以下、「ＭＳＣ」という）とを、ＫＢＭ  ＡＳＤＣ−２培地（コージンバイオ社製）を用いて培養し、細胞を増殖させた。ヒト正常線維芽細胞（以下、「Ｆｉｂｒｏｂｒａｓｔ」という）を、１０％ウシ胎児血清含有添加ＩＭＤＭ（ナカライテスク社製）を用いて培養した。ヒト臍帯静脈平滑筋細胞（コスモバイオ社製；以下、「ＨＤＭＥ」という）と正常ヒト新生児包皮微小血管内皮細胞（ＫＵＲＡＢＯ社製；以下、「ＨＶＳＭ」という）とを、製造元が推奨する専用培地にて培養した。
培養により各細胞を増殖させた後、間葉系幹細胞増殖培地（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）；シグマアルドリッチ社製）に各細胞を２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁し、以下の各培養ディッシュに、それぞれ２ｍｌ／ディッシュとなるように播種した。【００３７】
＜ノルボルネン系重合体製ディッシュ＞
・ゼオノア（登録商標）１０６０Ｒ（日本ゼオン社製）を射出成形した直径３５ｍｍの培養ディッシュ（以下、「ゼオノアディッシュ」という）
・アートン（登録商標）Ｄ４５４０（ＪＳＲ社製）を射出成形した直径３５ｍｍの培養ディッシュ（以下、「アートンディッシュ」という）
・ゼオネックス（登録商標）７９０Ｒ（日本ゼオン社製）を射出成形して得られた直径３５ｍｍの培養ディッシュ（以下、「ゼオネックスディッシュ」という）
＜ポリスチレン製ディッシュ＞
・ファルコン社製型番「３５３００１」（以下、「ファルコンディッシュ」という）
・コーニング社製型番「４３０１６５」（以下、「コーニングディッシュ」という）【００３８】
各細胞を、上記５種類のディッシュに別々に播種後、５％ＣＯ2雰囲気３７℃の条件で２日間、培養したところ、ＡＳＣとＭＳＣは全５種類のディッシュに接着したが、線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｒａｓｔ）、ＨＤＭＥおよびＨＶＳＭは、２種類のポリスチレン製ディッシュには、いずれも接着したものの、３種類のノルボルネン系重合体製ディッシュのいずれにも接着しなかった。【００３９】
［実施例２］
＜蛍光標識したＡＳＣの細胞接着性＞
ＡＳＣをＰＢＳ（−）（カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水）に、１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁し、得られた懸濁液の半分体積量の、ＰＢＳ（−）で５００倍に希釈したＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（同人化学社製）を添加後、５％ＣＯ2雰囲気３７℃の条件で１５分間培養し、蛍光標識ＡＳＣを得た。この蛍光標識ＡＳＣを用いて実施例１のＡＳＣと同様に培養したところ、実施例１のＡＳＣ（未標識ＡＳＣ）と同様に、上記の５種類全てのディッシュに接着した。【００４０】
［実施例３］、［比較例１］
＜細胞群からのＡＳＣの分離培養＞
それぞれの専用培地で培養された線維芽細胞、ＨＤＭＥ及びＨＶＳＭを、間葉系幹細胞増殖培地に、それぞれ１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁した。これとは別に、ＡＳＣについては、実施例２と同様の方法により蛍光標識してから、間葉系幹細胞増殖培地に、１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁した。得られた各細胞懸濁液を、全て混合し、細胞混合懸濁液を得た。
得られた細胞混合懸濁液を、実施例１で用いた、３種類のノルボルネン系重合体製ディッシュ（実施例３）及び２種類のポリスチレン製ディッシュ（比較例１）に、それぞれ２ｍＬ／ディッシュとなるように播種し、その後、５％ＣＯ2雰囲気３７℃の条件で２日間培養した。
２日間の培養の後、ピペッティングして浮遊細胞と培地とを除去し、培地を２％ウシ胎児血清含有間葉系幹細胞増殖培地に変更して、５％ＣＯ2雰囲気３７℃の条件で４日間培養した。【００４１】
位相差蛍光顕微鏡にて、この培養ディッシュの同じ場所の位相差顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真（いずれも倍率６４倍）とを撮影した。得られた撮像から、ノルボルネン系重合体製ディッシュ上に接着した細胞は蛍光標識ＡＳＣのみである一方、２種類のポリスチレン製ディッシュには全ての細胞が同様に接着していることを確認した。
代表として、ゼオノアディッシュの位相差顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真を図１及び図２にそれぞれ示す。また、コーニングディッシュの位相差顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真を図３及び図４にそれぞれ示す。
また、これらを、画像処理ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ）により、位相差顕微鏡写真から細胞の接着面積を、蛍光顕微鏡写真から蛍光発色面積を、それぞれ数値化し、細胞接着面積に対する蛍光標識ＡＳＣの発色率を算出した。
その結果、ゼオノアディッシュの細胞接着面積（位相差）は２８．３９２、発色面積（蛍光）は２７．７３１、発色率は９７．６％と算出された。
一方、コーニングディッシュの細胞接着面積（位相差）は６３．６９１、発色面積（蛍光）は６．７８６、発色率は１０．７％と算出された。
この結果から、ノルボルネン系重合体製ディッシュを用いることで、脂肪組織から得られる間質血管細胞群のような細胞群から、ＡＳＣを分離させることができることが分かる。【００４２】
［実施例４］
実施例３において、顕微鏡観察に付したゼオノアディッシュの培地を、脂肪細胞分化誘導培地、ＤＳファーマバイオメディカル社製（品番Ｆ−ＤＭ−２）に変えた以外は、実施例３と同様にして、５％ＣＯ2雰囲気３７℃の条件で１４日間培養した。
培養後、オイルレッドＯ（ＷＡＬＤＥＣＫ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ  ＫＧ，  ＤＩＶＩＳＩＯＮ  ＣＨＲＯＭＡ社製、品番  ＩＥ２４２；終濃度０．１８％）で脂肪細胞を赤く染色し、残りの細胞をチュルク染色液（ナカライテスク社製、品番  ３７２１２−７４  原液で使用）で青く染色し、顕微鏡観察された画像写真（図５）から、画像処理ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ）により、赤く染色された脂肪細胞の面積と青く染色された脂肪細胞以外の有核細胞の面積とを算出した。
総細胞面積（青＋赤）は５８．２５５、脂肪細胞面積（赤）は３０．０５９、脂肪細胞以外の面積（青）＝総細胞面積−脂肪面積＝５８．２５５−３０．０５９＝２８．１９６と算出され、脂肪細胞：脂肪細胞以外の細胞＝３０：２８であった。
この結果から、ゼオノアディッシュにて分離されたＡＳＣは分化能を有することが確認された。【００４３】
［実施例５］
＜蛍光標識したＦｉｂｒｏｂｒａｓｔの細胞接着性＞
実施例１と同様に培養した１×１０6ｃｅｌｌｓのＦｉｂｒｏｂｒａｓｔをＩＭＤＭに懸濁し、遠心して得た細胞ペレットを２５μＬ以下となるように調製した。このＭＳＣに、ＭＩＮＩ２６−１ＫＴ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）のＤｉｌｕｅｎｔ  Ｃ、１ｍＬを添加してピペッティングし、直ちにＤｉｌｕｅｎｔ  Ｃ、１ｍＬで希釈した４×１０-4Ｍ  ＰＫＨ２６を添加して、ピペッティングして３分間反応させた。その後、２ｍＬの間葉系幹細胞増殖培地を添加して、１分間放置して反応を停止させ、同培地で３回洗浄した。得られた蛍光標識Ｆｉｂｒｏｂｒａｓｔを用いて実施例１のＡＳＣと同様に培養したところ、実施例１の未標識Ｆｉｂｒｏｂｒａｓｔと同様に２種類のポリスチレン製ディッシュには、いずれも接着したものの、３種類のノルボルネン系重合体製ディッシュのいずれにも接着しなかった。【００４４】
［実施例６］、［比較例２］
＜ＭＳＣの細胞接着性＞
実施例１と同様に培養したＭＳＣを間葉系幹細胞増殖培地で１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁した。これとは別に、Ｆｉｂｒｏｂｒａｓｔについては、実施例５と同様の方法により蛍光標識してから間葉系幹細胞増殖培地に、１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁した。得られた各細胞懸濁液を等量混合し、細胞混合懸濁液を得た。
得られた細胞混合懸濁液を、実施例１で用いた３種類のノルボルネン系重合体製ディッシュ（実施例６）、及び２種類のポリスチレン製ディッシュ（比較例２）に、それぞれ２ｍＬ／ディッシュとなるように播種し、その後、５％ＣＯ2雰囲気３７℃の条件で１日間、培養した。
１日間の培養の後、ピペッティングして浮遊細胞と培地とを除去し、培地を２％ウシ胎児血清含有間葉系幹細胞増殖培地に変更して、５％ＣＯ2雰囲気３７℃の条件で更に１日間培養した。【００４５】
位相差蛍光顕微鏡にて、この培養ディッシュの同じ場所の位相差顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真（いずれも倍率６４倍）とを撮影した。得られた撮像から、ノルボルネン系重合体製ディッシュ上に接着し増殖した細胞は非蛍光標識ＭＳＣのみである一方、２種類のポリスチレン製ディッシュには、いずれの細胞も接着し、蛍光標識したＦｉｂｒｏｂｒａｓｔが接着して増殖していることを確認した。
代表として、ゼオノアディッシュの位相差顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真を図６及び図７にそれぞれ示す。また、コーニングディッシュの位相差顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真を図８及び図９にそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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