(57)【要約】本発明は、ヒトに対して安全に投与可能なＰｏｌｙＱ病の治療に有効な医薬用組成物を提供する。本発明は、アルギニン若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とし、ＰｏｌｙＱ病の治療又は予防に用いられる、医薬用組成物、及び前記ＰｏｌｙＱ病が、ハンチントン病、遺伝性脊髄小脳失調症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、又は球脊髄性筋萎縮症である、前記記載の医薬用組成物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニン若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とし、ＰｏｌｙＱ病の治療又は予防に用いられる、医薬用組成物。
【請求項２】
前記ＰｏｌｙＱ病が、ハンチントン病、遺伝性脊髄小脳失調症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、又は球脊髄性筋萎縮症である、請求項１に記載の医薬用組成物。
【請求項３】
前記ＰｏｌｙＱ病が、遺伝性脊髄小脳失調症１型、遺伝性脊髄小脳失調症３型、又は球脊髄性筋萎縮症である、請求項１に記載の医薬用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハンチントン病や種々の遺伝性脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症等の神経変性疾患ポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）病に対する治療剤として有効であり、かつヒトに対して安全に投与可能な医薬用組成物に関する。
本願は、２０１６年６月２３日に、日本に出願された特願２０１６−１２４９９２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
人口高齢化に伴い、加齢に伴って発症する神経変性疾患は増加の一途をたどっており、有効な治療法がないために深刻な社会問題となっている。このため、これらの神経変性疾患に対する有効な医薬品の開発が求められている。【０００３】
加齢に伴って発症する神経変性疾患の一つにＰｏｌｙＱ病がある。ＰｏｌｙＱ病は、ハンチントン病、種々の脊髄小脳失調症等の、原因蛋白質内のＰｏｌｙＱ鎖の異常伸長（＞４０アミノ酸）により発症する９つの遺伝性神経変性疾患の総称である。日本では約７０００〜８０００人の罹患者がいると推定されているが、未だ有効な治療法がない難病である。ＰｏｌｙＱ病では、ＰｏｌｙＱ鎖の異常伸長により原因蛋白質がミスフォールディング・凝集を生じ、その結果神経変性を引き起こすと考えられている。【０００４】
化学シャペロンは、蛋白質を天然のコンフォメーションで安定化し、蛋白質フォールディング反応の速度又は忠実度に影響を与えることにより、抗凝集性を発揮する。アルギニンは、大腸菌で発現させた様々なリコンビナント蛋白質の凝集を阻害して可溶性を増大させるために、最も一般的に使用される添加剤の一つである（非特許文献１）。この非特異的な抗凝集効果から、アルギニンは、アルツハイマー病やパーキンソン病等の蛋白質のミスフォールディングによる疾患に対する治療に有効である可能性がある。実際に、アルギニンが、アミロイドβペプチド（１−４２）の凝集を防止することが報告されている（非特許文献２）。【０００５】
アルギニンは、ヒトをはじめとする生物を構成するアミノ酸の１種であり、ヒト等の動物に安全に投与することができる。アルギニンは、ＰｏｌｙＱ病以外の他の疾患に対する臨床試験において、安全性が確立されている（非特許文献３、４）。また、アルギニンは、血液脳関門（ＢＢＢ）を透過することが知られている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Arakawa et al.，Biochemical and Biophysical Research Communications，2003，vol.304(1)，p.148-152.
【非特許文献２】Das et al.，PLoS One，November 2007，Issue 11，e1176.
【非特許文献３】Koga et al.，Neurology，2002，vol.58(5)，p.827.
【非特許文献４】Boenzi et al.，Journal of Inherited Metabolic Disease，2012，vol.35(4)，p.647-653.
【非特許文献５】Pardridge，Physiological Reviews，1983，vol.63(4)，p.1481-1535.
【非特許文献６】Nagai et al.，JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，2000，vol.275(14)，p.10437-10442.
【非特許文献７】Nagai et al.，Nature Structural & Molecular Biology，2007，vol.14(4)，p.332-340.
【非特許文献８】Jarrett and Lansbury，Cell，1993，vol.73(6)，p.1055-1058.
【非特許文献９】Williams and Paulson，Trends in Neurosciences，2008，vol.31(10)，p.521-528.
【非特許文献１０】Takahashi et al.，Human Molecular Genetics，2008，vol.17(3)，p.345-356.
【非特許文献１１】Takahashi et al.，JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，2007，vol.282(33)，p.24039-24048.
【非特許文献１２】Warrick et al.，Cell，1998，vol.93(6)，p.939-949.
【非特許文献１３】Nagai et al.，Human Molecular Genetics，2003，vol.12(11), p.1253-1260.
【非特許文献１４】Satyal et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，vol.97(11)，p.5750-5755.
【非特許文献１５】Watase et al.，Neuron，2002，vol.34(6)，p.905-919.
【非特許文献１６】Hamase et al.，Journal of Chromatography A，2010，vol.1217(7)，p.1056-1062.
【非特許文献１７】Popiel et al.，PLoS One，2012，vol.7(11)，e51069．
【非特許文献１８】Katsuno et al.，Neuron，2002, vol.35(5)，p.843-854.
【非特許文献１９】Katsuno et al.，Nature Medicine，2003, vol.9(6)，p.768-773.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒトに対して安全に投与可能であり、かつＰｏｌｙＱ病の治療に有効な医薬用組成物を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、これまでに変性蛋白質のミスフォールディング・凝集を標的とした共通の治療薬開発を目指して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイ系を用いてＰｏｌｙＱ凝集阻害化合物のスクリーニングを行い、ＢＢＢ透過性・安全性の高いＰｏｌｙＱ凝集阻害化合物としてアルギニンを同定した。さらに、本発明者らは、アルギニンが、培養細胞モデルのみならずＰｏｌｙＱ病モデルショウジョウバエ、マウスにおいても、ＰｏｌｙＱ凝集体形成及び神経変性を抑制することを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
本発明に係る医薬用組成物は、下記［１］〜［３］である。
［１］  アルギニン若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とし、ＰｏｌｙＱ病の治療又は予防に用いられる、医薬用組成物。
［２］  前記ＰｏｌｙＱ病が、ハンチントン病、遺伝性脊髄小脳失調症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、又は球脊髄性筋萎縮症である、前記［１］の医薬用組成物。
［３］  前記ＰｏｌｙＱ病が、遺伝性脊髄小脳失調症１型、遺伝性脊髄小脳失調症３型、又は球脊髄性筋萎縮症である、前記［１］の医薬用組成物。
【発明の効果】
【００１０】
アルギニンは、ヒトへの安全性が確認されており、かつＢＢＢ透過性が高い生理活性物質である。このため、アルギニンを有効成分とする本発明に係る医薬用組成物は、ヒトをはじめとする各種動物に対するＰｏｌｙＱ病の治療に非常に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１において、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質をアルギニンの存在下（黒丸）又は非存在下（白丸）で５日間インキュベートした場合の濁度を経時的に測定した結果を示した図である。
【図２】図２は、実施例１において、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質をアルギニン又はプロリン存在下で５日間インキュベートした後の各溶液の相対濁度（％）（Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質のみを含む溶液の濁度を１００％とする。）を示した図である。
【図３】図３は、実施例１において、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質のみを含む溶液、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質にシードのみを添加した溶液、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質にシードとアルギニンを添加した溶液、及びＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質にシードとプロリンを添加した溶液の濁度を経時的に測定した結果を示した図である。
【図４】図４は、実施例２において、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質のみを含む溶液を５日間インキュベートした後の各溶液のＣＤスペクトラムである。
【図５】図５は、実施例２において、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質をアルギニンの存在下又は非存在下で５日間インキュベートした後にネイティブＰＡＧＥしたもののＣＢＢ染色像である。
【図６】図６は、実施例２において、Ｑ５６−ＣＦＰとＱ５６−ＹＦＰを同時に発現させた細胞をインキュベートした後のＦＲＥＴポジティブ細胞の割合を測定した結果を示した図である。
【図７】図７は、実施例２において、Ｑ４５−ＧＦＰを発現させた細胞の細胞ライセートをＦＣＳ解析して得られたＣＰＰの測定結果を示した図である。
【図８】図８は、実施例２において、Ｑ４５−ＧＦＰを発現させた細胞の細胞ライセートをＦＣＳ解析して得られたＤＴ１の測定結果を示した図である。
【図９】図９は、実施例３において、野生型ハエ及びＭＪＤｔｒ−Ｑ７８（Ｓ）ハエの外部複眼の代表的な光学顕微鏡画像である。
【図１０】図１０は、実施例３において、ＭＪＤｔｒ−Ｑ７８（Ｓ）ハエの幼虫の眼板の抗赤血球凝集素抗体による免疫染色像である。
【図１１】図１１は、実施例３において、線虫のＰｏｌｙＱ病モデル系統に対してなされたテールフリックテストから得られた、１分間当たりの尾の動き（ｃｏｕｎｔ／ｍｉｎ）の測定結果を示した図である。
【図１２】図１２は、実施例３において、線虫のＰｏｌｙＱ病モデル系統の生存率の経時的変化を示した図である。
【図１３】図１３は、実施例３において、線虫ライセートの免疫ブロットにより得られたＳＤＤ−ＡＧＥ画像である。
【図１４】図１４は、図１５のＳＤＤ−ＡＧＥ画像におけるスミア強度の測定結果を示した図である。
【図１５】図１５は、実施例４において、ＳＣＡ１マウスの大脳中のＬ−アルギニン量の測定結果を示した図である。
【図１６】図１６は、実施例４において、ＳＣＡ１マウスの血清中のＬ−アルギニン量の測定結果を示した図である。
【図１７】図１７は、実施例４のロータロッド試験において、野生型マウス及びＳＣＡ１マウスの回転棒から落下せずに歩くことができる時間（Ｌａｔｅｎｃｙ）の経時的変化を示した図である。
【図１８】図１８は、実施例４のロータロッド試験において、各マウスの１日の飲料水の摂取量の経時的変化を示した図である。
【図１９】図１９は、実施例４のバランスビーム試験において、２８週齢の野生型マウス及びＳＣＡ１マウスがビームの横断に要する時間（Ｌａｔｅｎｃｙ）の測定結果を示した図である。
【図２０】図２０は、実施例４の免疫組織化学的分析において、ＳＣＡ１マウスの大脳皮質及び海馬における封入体が形成されている細胞の割合（％）を測定した結果を示した図である。
【図２１】図２１は、実施例５のロータロッド試験において、野生型マウス及びＳＣＡ１マウスの回転棒から落下せずに歩くことができる時間（Ｌａｔｅｎｃｙ）の経時的変化を示した図である。
【図２２】図２２は、実施例５において、野生型マウス及びＳＢＭＡマウスの水平行動の観察結果を示した図である。
【図２３】図２３は、実施例５において、野生型マウス及びＳＢＭＡマウスの立ち上がりの挙動の観察結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に係る医薬用組成物は、ＰｏｌｙＱ病の治療又は予防に用いられるものであって、アルギニンを有効成分とする。アルギニンは、異常伸長ＰｏｌｙＱ鎖を持つＰｏｌｙＱ病の原因蛋白質の凝集阻害作用（ＰｏｌｙＱ凝集阻害作用）を有しており、当該作用によって、ＰｏｌｙＱ凝集体形成及び神経変性を抑制する効果を奏する。また、アルギニンは、ヒトへの安全性が確立されており、かつＢＢＢに対する透過性が高い。このため、本発明に係る医薬用組成物は、中枢神経系におけるＰｏｌｙＱ凝集体形成抑制等を、安全にかつ効率よく阻害することができる。
【００１３】
本発明に係る医薬用組成物に含まれる有効成分としては、アルギニンの生理学的に許容される塩であってもよい。アルギニンは塩基性アミノ酸であるため、アルギニンの生理学的に許容される塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸の塩；メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸塩、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、サリチル酸等の有機酸との塩；又はアスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との塩が挙げられる。
【００１４】
本発明に係る医薬用組成物に含まれる有効成分としては、アルギニン又はその生理学的に許容される塩の溶媒和物であってもよい。当該溶媒和物を形成する溶媒としては、水、エタノール等が挙げられる。
【００１５】
本発明に係る医薬用組成物に含まれる有効成分は、遊離形態のアルギニンのみであってもよく、遊離形態のアルギニンとその生理学的に許容される塩との両方であってもよく、遊離形態のアルギニンとその溶媒和物の両方であってもよく、アルギニンの生理学的に許容される塩とその溶媒和物の両方であってもよく、遊離形態のアルギニンとその生理学的に許容される塩とそれらの溶媒和物の全てであってもよい。
【００１６】
本発明に係る医薬用組成物は、有効成分であるアルギニン若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物（以下、「アルギニン等」ということがある。）のみからなるものであってもよく、アルギニン等のＰｏｌｙＱ凝集阻害作用を損なわない限度において、各種添加剤を含有していてもよい。当該添加剤としては、賦形剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、溶剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤等が挙げられる。これらの添加剤としては、薬学上許容される物質であって、医薬の製剤化に使用されているものの中から適宜選択して使用することができる。
【００１７】
本発明に係る医薬用組成物は、アルギニン等のＰｏｌｙＱ凝集阻害作用を損なわない限度において、その他の有効成分を含有していてもよい。当該他の有効成分としては、他のＰｏｌｙＱ病の治療剤の有効成分等が挙げられる。
【００１８】
本発明に係る医薬用組成物は、ＰｏｌｙＱ病、すなわち、異常伸長ＰｏｌｙＱ鎖を持つ蛋白質の凝集に起因する疾患に対する治療のための医薬の成分として非常に有効である。また、アルギニンは非常に安全性が高いため、本発明に係る医薬用組成物は、ＰｏｌｙＱ病の予防のための医薬の成分としても有効である。
【００１９】
ＰｏｌｙＱ病としては、現在のところ、ハンチントン病、遺伝性脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、及び球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）の９つの神経変性疾患が知られている。本発明に係る医薬用組成物は、これらの９疾患のいずれの治療剤としても有効であり、特に、ＳＣＡ１、ＳＣＡ３、又はＳＢＭＡの治療又は予防のための医薬の成分として有用である。
【００２０】
なお、脊髄小脳変性症は、孤発性又は遺伝性であって、運動失調を主要症候とする神経変性疾患の総称であり、臨床的には、小脳性若しくは後索性の運動失調又は痙性対麻痺を主要症候とし、小脳や脳幹の萎縮を認めることが多く、大脳基底核病変や大脳皮質の萎縮などを認めることもあるなどの特徴を有する。ハンチントン病は、ハンチントン病遺伝子において異常伸長ＰｏｌｙＱ鎖をコードするＣＡＧリピートの伸長による常染色体優性遺伝病であり、主に、舞踏運動（コレア）を中心とした不随意運動と運動持続障害があり、尾状核萎縮を伴う両側の側脳室拡大が観察される。また、易怒性、無頓着、攻撃性などの性格変化・精神症状や、記銘力低下、判断力低下などの知的障害（認知症）が見られることもある。球脊髄性筋萎縮症は、アンドロゲン受容体遺伝子において異常伸長ＰｏｌｙＱ鎖をコードするＣＡＧリピートの伸長による遺伝性疾患であり、球症状、下位運動ニューロン徴候、手指振戦、四肢腱反射低下といった神経所見が観察され、アンドロゲン不全症候や神経原性変化が観察されることもある。
【００２１】
また、アルギニンは、蛋白質のフォールディングに作用する化学シャペロンである。このため、本発明に係る医薬用組成物は、ＰｏｌｙＱ病のみならず、異常蛋白質の凝集により発症する神経変性疾患に対する治療又は予防のための医薬の成分としても有効である。当該神経変性疾患としては、アミロイドβやタウの凝集が生じるアルツハイマー病、αシヌクレインの凝集が生じるパーキンソン病、ＴＤＰ−４３（TAR DNA-binding protein of 43kD）の凝集が生じる筋委縮性側索硬化症、ＴＤＰ−４３やタウの凝集が生じる前頭側頭葉変性症等が挙げられる。実際に、アルギニンは、アルツハイマー病の原因蛋白質であるアミロイドβの凝集に対する阻害作用を有する。
【００２２】
本発明に係る医薬用組成物は、ヒトやヒト以外の動物に投与されることが好ましい。ヒト以外の動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。本発明に係る医薬用組成物は、ハエや線虫等の無脊椎動物に投与されてもよく、培養細胞、酵母、糸状菌等に摂取させてもよい。
【００２３】
本発明に係る医薬用組成物の動物への投与方法は、特に限定されるものではなく、その剤型も特に限定されるものではない。経口投与に適する剤型としては、例えば、カプセル剤、散剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、乳剤、シロップ剤、溶液剤、懸濁剤等を挙げることができ、非経口投与に適する剤型としては、例えば、吸入剤、噴霧剤、直腸内投与剤、注射剤、点滴剤、軟膏、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、テープ剤、貼付剤等を挙げることができる。
【００２４】
経口投与に適する医薬用組成物のうち、例えばカプセル剤、錠剤、散剤、及び顆粒剤等の固形製剤は、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニット等の賦形剤；澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤等を用いて製造することができる。また、乳剤及びシロップ剤等の液体製剤は、水；蔗糖、ソルビット、果糖等の糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類；ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等の製剤用添加物を用いて製造することができる。
【００２５】
非経口投与に適する医薬用組成物のうち、注射剤、点滴剤、点眼剤等の液体製剤は、好ましくは滅菌された等張の液体製剤として調製することができる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、又は塩水とブドウ糖溶液との混合物からなる水性媒体を用いて調製することができる。
【００２６】
本発明に係る医薬用組成物の投与量及び投与回数は特に限定されず、アルギニン等のＰｏｌｙＱ凝集阻害作用効果が充分に発揮されるように、異常伸長ＰｏｌｙＱ鎖を持つ原因蛋白質の種類や発現量、投与対象の生物種、性別、年齢、体重、基礎疾患の有無、投与の形態等に応じて、適宜設定することができる。例えば、経口投与又は経静脈投与の場合、成人に対する有効成分の１日当たりの投与量は、アルギニンとして０．１〜１０ｇ／ｋｇ（体重）が好ましく、０．２５〜５．０ｇ／ｋｇ（体重）がより好ましく、０．５〜５．０ｇ／ｋｇ（体重）がさらに好ましく、１．０〜５．０ｇ／ｋｇ（体重）がよりさらに好ましい。このような投与量を１回又は数回に分けて投与することができる。例えば、アルギニンを有効成分とする経口投与剤を、１日当たりのアルギニンの総投与量が０．２５〜５．０ｇ／ｋｇ（体重）となるように、１日３回（朝、昼、晩）に分けて投与することができる。
【００２７】
ＰｏｌｙＱ病は、徐々に発病し、経過は緩徐進行性である。本発明に係る医薬用組成物を摂取することによってＰｏｌｙＱの凝集が抑制される結果、ＰｏｌｙＱ病に由来する各種症状の進行が遅くなる。つまり、症状の進行や発症を抑えるためにはＰｏｌｙＱの凝集阻害剤の継続的な服用が必要であり、長期間安定的に摂取しても安全であるアルギニンを有効成分とする本発明に係る医薬用組成物は、ＰｏｌｙＱ病患者に対する治療薬として好ましい。本発明に係る医薬用組成物は、重症度が低い、すなわちＰｏｌｙＱの凝集による神経変性があまり進行していない早期のＰｏｌｙＱ病患者への治療や、ＰｏｌｙＱ病の原因遺伝子内に異常伸長ＣＡＧリピートを保有するが未発症の患者（ＰｏｌｙＱ病未発症患者）に対するＰｏｌｙＱ病発症前の予防に特に有効である。比較的軽症のＰｏｌｙＱ病患者やＰｏｌｙＱ病未発症患者が本発明に係る医薬用組成物を継続的に服用することにより、発症や症状の進行を効果的に抑制することができ、ＱＯＬを改善することができる。
【００２８】
なお、ＰｏｌｙＱ病を含む脊髄小脳失調症の重症度は、例えば、ｍＲＳ（modified Rankin Scale）により評価できる。ｍＲＳにおいては、まったく症候がない状態を０、症候はあっても明らかな障害はない状態、より具体的には自覚症状及び他覚徴候はあるが、日常生活に支障のない状態を１、軽度の障害のある状態、すなわち、発症以前から行っていた仕事や活動に制限はあるが、日常生活は自立している状態を２、中等度の障害のある状態、すなわち、何らかの介助を必要とするが、歩行、食事、排せつには介助を必要としない状態を３、中等度から重度の障害のある状態、すなわち、歩行や身体的要求には介助が必要であるが、持続的な介護は必要としない状態を４、重度の障害のある状態、すなわち、寝たきりなど常に介護と見守りを必要とする状態を５、死亡した状態を６、とそれぞれ評価する。本発明に係る医薬用組成物は、ｍＲＳが２以下、好ましくはｍＲＳが０又は１の脊髄小脳失調症患者に、継続的に経口投与されることが好ましい。
【００２９】
脊髄小脳失調症の重症度は、例えば、ＳＡＲＡ（The Scale for the Assessment and Rating of Ataxia）（Schmitz-Hubsch, et al., Neurology, 2006, vol.66(11), p.1717-1720.）によっても評価することができる。本発明に係る医薬用組成物は、好ましくはＳＡＲＡが２０以下、より好ましくは１５以下の脊髄小脳失調症患者に、継続的に経口投与されることが好ましい。
【実施例】
【００３０】
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等に限定されるものではない。【００３１】
＜蛋白質凝集濁度アッセイ＞
以降の実験において、蛋白質凝集濁度アッセイは、非特許文献６に記載の方法で行った。具体的には次のようにして行った。
異常伸長ＰｏｌｙＱ蛋白質をＰＢＳ（リン酸生理食塩水）に溶解させた溶液を測定試料とし、当該溶液を３７℃でインキュベートし、２４時間ごとに４０５ｎｍにおける濁度をマイクロプレートリーダー「Spectramax Plus plate reader」（Molecular Devices社製）を用いて測定した。【００３２】
＜統計処理＞
濁度、ＦＲＥＴ、及びマウス脳アルギニン濃度については、個々のグループ間の有意差を評価するため、一元配置分散分析（One-way analyses of variance；ＡＮＯＶＡ）とそれに続くTukeyの多重比較検定により分析した。ＦＣＳ測定、テールフリックテストの尾の動きと線虫モデルにおけるオリゴマーの相対量、及びアルギニン処理又は未処理のマウスの脳におけるＰｏｌｙＱ封入体を有する細胞の割合は、スチューデントt検定によって分析した。日々の水又は６質量％のアルギニン水溶液の接種量、ロータロッド試験、オープンフィールド行動、立ち上がり（rearing）、及びバランスビームデータは、二元配置分散分析（two-way ANOVA）とそれに続くTukeyの多重比較検定により分析した。生存データは、ログランク検定を用いて分析した。２グループ間の分析のためには、スチューデントt検定が用いられた。全ての分析は、Ｐ＜０．０５はグループ間で統計的に有意な差を示すとした。統計分析には、ソフトウェア「GraphPad Prism」（GraphPad Software社製）を用いた。【００３３】
＜動物実験＞
以降において行った全ての動物実験は、日本の国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター、神経研究所の小型実験動物倫理問題検討委員会のガイドラインに従って行った。
マウスは、餌と水を自由摂取させ、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。各マウスは、３週齢又は５週齢で離乳させ、かつ水、２質量％Ｌ−アルギニン水溶液、又は６質量％Ｌ−アルギニン水溶液を充填した給水ボトルを備えたケージで維持した。【００３４】
［実施例１］
本発明者らは、濁度法により異常伸長ＰｏｌｙＱ蛋白質の凝集を簡便に評価できるｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイ系を樹立した（米国特許第６，６３２，６１６号明細書）。さらに、本発明者らが、この異常伸長ＰｏｌｙＱ蛋白質凝集アッセイ系を用いてＰｏｌｙＱ凝集阻害化合物のスクリーニングを行った結果、アルギニンがＰｏｌｙＱ凝集阻害活性を有することがわかった。
そこで、アルギニンのＰｏｌｙＱ凝集阻害活性をより詳細に調べた。異常伸長ＰｏｌｙＱ蛋白質として、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎと６２個のグルタミンからなるＰｏｌｙＱ鎖との融合蛋白質Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−Ｑ６２（Ｔｈｉｏ−Ｑ６２）を用いた。【００３５】
＜Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質の調製＞
Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質の調製は非特許文献７に記載の方法で行った。具体的には次のようにして行った。
まず、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質を、大腸菌ＤＨ５α内で発現させた後、ニッケルカラム「nickel-chelating ProBond Resin columns 」(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて精製した。精製されたＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質を、カラム「HiTrap Q Sepharose column」 (GE Healthcare Life Sciences社製)を搭載したＨＰＬＣ装置「Akta Explore HPLC」(GE Healthcare Life Sciences社製)を用いたアニオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。精製したＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質の最終濃度は、「DC protein assay kit」 (Bio-Rad Laboratories社製)を用いたＬｏｗｒｙ法により測定した。この精製したＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質を、以降の実験に用いた。【００３６】
＜蛋白質凝集速度に対するアルギニンの影響＞
８．２μＭのＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質を、６００ｍＭのアルギニンと共にＰＢＳ中、３７℃でインキュベートし、２４時間ごとに濁度を測定した。対照として、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質のみで同様にインキュベートし、２４時間ごとに濁度を測定した。測定結果を図１に示す。図中、白丸がＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質のみを含む溶液の濁度であり、黒丸がＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質とアルギニンを含む溶液の濁度である。Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質のみの溶液の結果が示すように、通常、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質の濁度は、短いラグ期があり、次いで凝集期において急速に上昇し、やがてプラトーに達するというように、経時的に増大する。これに対して、中性ｐＨ中でアルギニンと共にインキュベートしたＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質では、ラグ期が延び、凝集の速度が遅くなった。【００３７】
＜アルギニンのＰｏｌｙＱ凝集阻害活性の濃度依存性＞
１０μＭのＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質を、１００、２００、又は４００ｍＭのアルギニンと共にＰＢＳ中、３７℃でインキュベートし、５日経過後に濁度を測定した。対照として、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質のみを含む溶液、又はＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質と４００ｍＭプロリンを含む溶液を、それぞれ同様にインキュベートし、５日経過後に濁度を測定した。なお、プロリンは、前記異常伸長ＰｏｌｙＱ蛋白質凝集アッセイにおいて、ＰｏｌｙＱ凝集阻害活性を有さないことが確認された物質である。各溶液について、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質のみを含む溶液の濁度を１００％とした相対濁度（％）を測定した。測定結果を図２に示す。図の値は、平均値±標準誤差（ｎ＝３）を示し、「*」は「ｐ＜０．０５」を、「***」は「ｐ＜０．００１」を、「ｎ．ｓ．」は有意差がなかったことを、それぞれ示す。プロリンは全くＰｏｌｙＱ凝集阻害活性を示さなかったのに対して、アルギニンを添加した溶液ではアルギニン濃度が高いほど相対濁度が小さく、アルギニンのＰｏｌｙＱ凝集阻害活性が濃度依存的に高くなることがわかった。【００３８】
＜シード誘導ＰｏｌｙＱ凝集に対するアルギニンの影響＞
ＰｏｌｙＱをはじめとするアミロイドを生成する蛋白質では、既に形成された凝集体が、可溶性のモノマー蛋白質の凝集のトリガーとなり、ラグ期が短縮されることが知られており、この効果はシード効果と呼ばれる（非特許文献７、８）。そこで、このシード効果に対するアルギニンの影響を調べた。【００３９】
（シードの調製）
シードとするＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質凝集体は、次のようにして調製した。まず、精製したＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質溶液（１０μＭ）は、液体窒素中で急速凍結した後、使用時まで−８０℃で保存した。凍結されたＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質溶液を急速解凍した後、室温、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理した。得られた上清を、３７℃で６日間、濁度がプラトーに達するまでインキュベートした後、氷上で３０秒間の超音波処理と６０秒間のインターバルを繰り返す超音波処理を６回行い、シードとするＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質凝集体を形成した。得られた超音波処理済溶液を、シード溶液として以降の実験に用いた。【００４０】
（シード誘導ＰｏｌｙＱ凝集反応）
１０μＭの可溶性Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質溶液に、シード、アルギニン、及びプロリンを図３に示すように添加し、３７℃で７日間インキュベートし、２４時間ごとに濁度を測定した。シードは、前述の通りに予め形成されたシード溶液を、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質溶液２００μＬ当たり２０μＬ添加した。また、アルギニンとプロリンは、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質溶液２００μＬ当たりそれぞれ４００ｍＭとなるように添加した。各溶液の濁度の経時的変化を図３に示す。この結果、可溶性Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質のみを含む溶液（図中、「Ｔｈｉｏ−Ｑ６２」）に比べて、可溶性Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質にシードのみを添加した溶液（図中、「Ｔｈｉｏ−Ｑ６２＋ｓｅｅｄｓ」）では、ラグ期が消失し、１日目から濁度の急劇な上昇が観察されており、シード効果が観察された。また、可溶性Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質にシードとアルギニンを添加した溶液（図中、「Ｔｈｉｏ−Ｑ６２＋ｓｅｅｄｓ＋Ａｒｇ」）では、シードに誘導された濁度増大の速度が顕著に低下していたが、シードとプロリンを添加した溶液（図中、「Ｔｈｉｏ−Ｑ６２＋ｓｅｅｄｓ＋Ｐｒｏ」）ではアルギニンのような効果は得られなかった。これらの結果から、アルギニンがシード誘導ＰｏｌｙＱ凝集を緩和し、凝集プロセスの開始後にＰｏｌｙＱ蛋白質の凝集を減速できることが示唆された。【００４１】
［実施例２］
凝集しやすい蛋白質（凝集性蛋白質）は、モノマー蛋白質のミスフォールディング及びβシートコンフォメーション転移、並びにモノマーのオリゴマーへの集合等の多段階のプロセスを経て不溶性の凝集体を形成する。最近の研究で、異常伸長ＰｏｌｙＱ鎖を有する蛋白質を含む凝集性蛋白質は、不溶性凝集体を形成する前に、蛋白質は、βシートリッチな構造へのコンフォメーション変移を起こし、可溶性のオリゴマーに統合されると、細胞内毒性を発揮することが報告されている（非特許文献９）。つまり、凝集性蛋白質では、不溶性の凝集体よりもむしろミスフォールドのオリゴマー化した可溶性蛋白質種のほうが、細胞や脳内において毒性を発揮する場合がある。【００４２】
アルギニンは、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質溶液のラグ期を延ばすことから（実施例１）、不溶性凝集体形成前の初期のプロセスに影響を与えることが示唆された。このため、アルギニンがこれらの可溶性であるが毒性のある蛋白質種の形成を変更するかどうかを調べた。具体的には、ＰｏｌｙＱ蛋白質のコンフォメーション変移とオリゴマー形成に対するアルギニンの影響を調べた。【００４３】
＜ＣＤ（円偏光二色性）解析＞
Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質は、モノマーの状態でαへリックス構造からβシートリッチな構造へコンフォメーション変移を起こし、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質のβシートモノマーは細胞毒性を示す（非特許文献７）。このコンフォメーション変移をＣＤスペクトラム解析によって確認した。具体的には、８．２μＭのＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質をＰＢＳ（ｐＨ７．５）中、３７℃で５日間インキュベートした。インキュベート開始前（０日）とインキュベート後（５日）に、それぞれＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質のＣＤスペクトラムを、スペクトロメーター「Model J-820」（Jasco社製）を用いて非特許文献７に記載の方法で測定した。測定結果を図４に示す。図４のスペクトラムは、速度が５０ｎｍ／ｍｉｎ、解像度が１ｎｍで記録された１０スキャンの平均で表した。データは、モル残基楕円率(θ)として表した。インキュベート開始前のＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質のＣＤスペクトルは、１９６ｎｍ付近に大きな正の極大を、２０７ｎｍ付近と２２２ｎｍ付近にそれぞれ負の極大を持っており（図中、「Ｄａｙ ０」）、αへリックス構造をとっていることが確認された。インキュベート後のＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質のＣＤスペクトルは、１９７ｎｍ付近に正の極大を、２１６ｎｍ付近に負の極大を持っており（図中、「Ｄａｙ ５」）、βシート構造をとっていることが確認された。【００４４】
＜ネイティブＰＡＧＥと濁度測定＞
ネイティブＰＡＧＥ（非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質のβシートへのコンフォメーション変移に対するアルギニンの影響を調べた。具体的には、８．２μＭのＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質を、６００ｍＭのアルギニンと共にＰＢＳ中、３７℃で５日間インキュベートし、インキュベート開始前とインキュベート開始後２４時間ごとにネイティブＰＡＧＥのためのサンプリングと濁度測定を行った。対照として、Ｔｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質のみで同様にインキュベートし、サンプリングと濁度測定を行った。サンプリングした溶液について、ＳＤＳを含まず変性させない条件下で１０％（ｗ／ｖ）ＰＡＧＥを行い、各溶液に含まれている蛋白質を分離し、ＣＢＢ（Coomassie brilliant blue）染色した。【００４５】
ＣＢＢ染色結果を図５に示す。この結果、アルギニン非存在下では、インキュベーション時間が長くなるにつれてβシートリッチモノマーのバンドが徐々に現れ、αヘリックスリッチモノマーのバンドは徐々に消失した。これに対して、アルギニン存在下では、充分な時間インキュベーションしても、βシートリッチモノマーのバンドは現れず、アルギニンがＴｈｉｏ−Ｑ６２蛋白質の毒性のあるβシートへのコンフォメーション変移を抑制していることが示唆された。【００４６】
アルギニン非存在下でインキュベーションした場合、濁度は、インキュベーション開始から２日目に急激に上昇した（図１）。これに対して、インキュベーション開始から１日目には、βシートリッチモノマーのバンドが確認されている（図５）が、濁度の上昇はみられなかった。【００４７】
＜ＦＲＥＴ解析＞
培養細胞内における、ＰｏｌｙＱオリゴマー形成に対するアルギニンの影響をＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）解析で調べた。蛍光蛋白質ＣＦＰ融合ＰｏｌｙＱ蛋白質と蛍光蛋白質ＹＦＰ融合ＰｏｌｙＱ蛋白質は細胞内で共に可溶性オリゴマーを形成し、このＰｏｌｙＱ鎖同士の直接的な相互作用によりＣＦＰとＹＦＰが近接してポジティブＦＲＥＴシグナルが生じる。つまり、ポジティブＦＲＥＴシグナルにより、生細胞内で可溶性オリゴマーの形成を検出できる。【００４８】
細胞培養とＦＲＥＴ解析は、非特許文献１０に記載の方法で行った。具体的には、まず、ＣＦＰとＹＦＰを各々融合した５６個のグルタミンからなるＰｏｌｙＱ鎖を有する蛋白質（Ｑ５６−ＣＦＰ又はＱ５６−ＹＦＰ）を同時に発現させたＣＯＳ７細胞を調製した。蛍光蛋白質融合ＰｏｌｙＱ蛋白質を発現させたＣＯＳ７細胞は、各蛋白質の発現ベクターを「lipofectamine 2000」 (Life Technologies社製)を用いたトランスフェクションにより導入して調製した。トランスフェクション後４８時間経過後の細胞を、ＦＲＥＴ解析に用いた。【００４９】
Ｑ５６−ＣＦＰとＱ５６−ＹＦＰを同時に発現させた細胞を、０〜５０ｍＭのアルギニンを含む培地でインキュベートし、４８時間経過後のＦＲＥＴシグナル強度の平均値を求めた。ＦＲＥＴシグナル強度の数値のカットオフ値は、Ｑ５６−ＣＦＰとＱ５６−ＹＦＰを共発現させたＣＯＳ７細胞のＦＲＥＴシグナル強度の平均値と９５％信頼区間に基づいて算出した。ＦＲＥＴシグナル強度がカットオフ値を超える細胞を、ＦＲＥＴポジティブ細胞とした。１５０細胞のＦＲＥＴシグナル強度の平均値を解析した。結果の統計解析は、ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの事後検定法を用いて行った。結果を図６に示す。２０ｍＭ又は５０ｍＭのアルギニンを含む培地では、ＦＲＥＴポジティブ細胞の割合（％）が顕著に減少していた。低濃度のアルギニンを含む培地ではＦＲＥＴポジティブ細胞の割合に影響がなかった。これらの結果により、アルギニンは、培養細胞内において濃度依存的に、オリゴマー形成におけるＰｏｌｙＱ蛋白質同士の相互作用を阻害することが示された。【００５０】
＜ＦＣＳ解析＞
ＦＲＥＴ解析の結果を確認するために、ＦＣＳ（Fluorescence Correlation Spectroscopy）解析により、ＰｏｌｙＱオリゴマー形成に対するアルギニンの効果を定量的に評価した。ＰｏｌｙＱオリゴマーの形成には、４５個のグルタミンからなるＰｏｌｙＱ鎖を有するＰｏｌｙＱ融合蛍光蛋白質ＧＦＰ（Ｑ４５−ＧＦＰ）をモノマーとして用いた。ＰｏｌｙＱオリゴマーのプロパティを評価するためにＦＣＳ測定から得られる２つのインデックス、すなわち、ＣＰＰ（counts per particle）とＤＴ１（the diffusion time of the fast components）を使用した（非特許文献１１）。ＣＰＰは、測定された蛍光粒子の平均蛍光強度であるため、直接オリゴマー当たりのＱ４５−ＧＦＰのモノマーの数を反映している。ＤＴ１は、Ｑ４５−ＧＦＰのオリゴマーのサイズを反映している。【００５１】
ＦＣＳ解析は、非特許文献１１に記載の方法で行った。具体的には、まず、ＣＯＳ７細胞に、Ｑ４５−ＧＦＰの発現ベクターをトランスフェクションし、アルギニン濃度が０又は２５ｍＭの培地中で４８時間培養した後、可溶化した。得られた細胞ライセートを、穏やかに超音波処理した後、遠心分離処理して不溶性のＱ４５−ＧＦＰ封入体を除去した。得られた視認可能な封入体を含まない上清に対して、ＦＣＳ解析を行った。得られた測定値から、蛍光粒子が検出領域を横切るために要する平均拡散時間に対応する拡散時間と、粒子当たりの蛍光分子の数を直接反映するＣＰＰとを算出した。ＣＰＰの結果を図７に、ＤＴ１の結果を図８に、それぞれ示す。アルギニン処理した細胞では、未処理の細胞よりも、ＣＰＰとＤＴ１が減少していた。これらの結果からも、アルギニンが細胞内においてＰｏｌｙＱ蛋白質のオリゴマー形成を阻害することが示唆された。【００５２】
ＦＲＥＴ解析とＦＣＳ解析の結果をまとめると、アルギニンは、ＰｏｌｙＱ蛋白質の有毒なβシートコンフォメーション変移とオリゴマー形成を阻害すること、したがってアルギニンは、ミスフォールドＰｏｌｙＱ蛋白質が神経毒性を発揮するＰｏｌｙＱ蛋白質凝集の初期プロセスを妨害する能力を有していることが示唆された。つまり、アルギニンは、ＰｏｌｙＱ病の治療剤の有効成分として非常に有望である。【００５３】
［実施例３］
ＰｏｌｙＱ病の動物モデルにおけるアルギニンの治療効果を調べた。動物モデルとして、よく確立された２種の無脊椎動物のモデルである、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のモデルと線虫（Caenorhabditis elegans）のモデルを用いた。【００５４】
＜キイロショウジョウバエのＰｏｌｙＱ病モデルに対するアルギニンの影響＞
使用したキイロショウジョウバエのモデルは、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３／ ＭＪＤ）疾患モデルであり、７８個のグルタミンからなる異常伸長ＰｏｌｙＱ鎖を有する蛋白質ＭＪＤの切断型（ＭＪＤｔｒ−Ｑ７８）が複眼で発現している（非特許文献１２）。ＭＪＤｔｒ−Ｑ７８により誘導される複眼の重篤な変性は、光学顕微鏡下で容易に検出できる。【００５５】
ハエの飼育及び交配は、２５℃の標準的な条件で行った。ＭＪＤｔｒ−Ｑ７８を発現するためのＵＡＳ−ＭＪＤｔｒ−Ｑ７８導入遺伝子を保有するＭＪＤｔｒ−Ｑ７８（Ｓ）トランスジェニックハエ系統は、非特許文献１２に記載のものを用いた。ｇｍｒ−ＧＡＬ４導入遺伝子を保有するハエ系統は、日本の京都工芸繊維大学のショウジョウバエ遺伝資源センターから入手した。ハエを、１〜１００ｍＭのアルギニンを含有させた培地「Instant Drosophila Medium」（Carolina Biological Supply Company社製）で培養することによって、アルギニンを摂取させた。複眼変性の評価のために、立体顕微鏡モデル「SZX9」（オリンパス社製）を用いて複眼の光学顕微鏡像を撮像した。３齢幼虫の眼の成虫原基中のＭＪＤｔｒ−Ｑ７８蛋白質の検出のために、抗赤血球凝集素抗体（クローン３Ｆ１０、Roche社製）を用いた免疫染色を、非特許文献１３に記載の方法に準じて行った。蛍光顕微鏡画像は、共焦点レーザー走査顕微鏡モデル「ＬＳＭ５１０」（Carl Zeiss社製）を用いて撮像した。【００５６】
野生型ハエ及びＭＪＤｔｒ−Ｑ７８（Ｓ）ハエの外部複眼の代表的な光顕微鏡画像を図９に示す。図中、「ＷＴ」は野生型ハエの複眼を示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はアルギニン非投与のＭＪＤｔｒ−Ｑ７８（Ｓ）ハエの複眼を示し、「Ａｒｇ」は１００ｍＭのアルギニン投与のＭＪＤｔｒ−Ｑ７８（Ｓ）ハエの複眼を示す。ＭＪＤｔｒ−Ｑ７８（Ｓ）ハエで観察された複眼の変性は、２５、５０、及び１００ｍＭのアルギニンを含む餌を摂取させることにより顕著に改善された。【００５７】
ＭＪＤｔｒ−Ｑ７８（Ｓ）ハエの幼虫の眼の成虫原基の抗赤血球凝集素抗体による免疫染色像を図１０に示す。この免疫染色像は、共焦点顕微鏡により撮像した。図中の矢頭で示した抗赤血球凝集素抗体によって染色された部分は、眼の成虫原基中に形成された封入体を示す。図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はアルギニン非投与のＭＪＤｔｒ−Ｑ７８（Ｓ）ハエの画像を示し、「Ａｒｇ」は１００ｍＭのアルギニン投与のＭＪＤｔｒ−Ｑ７８（Ｓ）ハエの画像を示す。ＭＪＤｔｒ−Ｑ７８（Ｓ）ハエの幼虫の眼の成虫原基に形成された封入体は、アルギニンを含む餌を摂取させることにより減少した。これらの結果から、アルギニン投与によりＰｏｌｙＱを含む封入体の形成が抑制されることが示唆された。【００５８】
＜線虫のＰｏｌｙＱ病モデルに対するアルギニンの影響＞
線虫のＰｏｌｙＱ病モデルとしては、４０個のグルタミンからなるＰｏｌｙＱ鎖を有するＧＦＰ（Ｑ４０−ＧＦＰ）を発現する線虫系統（Ｑ４０−ＧＦＰ発現線虫系統）（非特許文献１４）を用いた。このＱ４０−ＧＦＰ発現線虫系統は、テールフリックテストによって評価される運動機能障害と短命化を呈する。【００５９】
線虫は、大腸菌ＯＰ５０と共に、線虫増殖培地（ＮＧＭ）プレート上で、２０℃で生育させた。Ｑ４０−ＧＦＰ発現線虫系統は、Ｑ４０−ＧＦＰをコードするプラスミドを野生型系統Ｎ２に導入して調製した。【００６０】
Ｑ４０−ＧＦＰ発現線虫系統の運動機能障害に対するアルギニンの影響を調べるために、テールフリックテストを行った。テールフリックテストは、同調培養した日齢６日の線虫を用いて２０℃で行った。まず、線虫を一匹ずつ別のプレートに移して、Ｓ−ｂａｓａｌ液を１滴滴下し、回復のために５分間待った後、虫体の尾の動きの回数を１分間測定した。線虫の虫体の中央部分の曲げ方向が変化する回数を、尾の動きの回数と定義した。【００６１】
テールフリックテストから得られた、１分間当たりの尾の動き（ｃｏｕｎｔ／ｍｉｎ）の測定結果を図１１に示す。図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はアルギニンを含まない培地上で飼育したＱ４０−ＧＦＰ発現線虫系統の結果を示し、「Ａｒｇ」は１０ｍＭのアルギニンを含む培地上で飼育したＱ４０−ＧＦＰ発現線虫系統の結果を示す。図の値は、平均値±標準誤差（ｎ＝４８）を示し、「**」は「ｐ＜０．０１」を示す。Ｑ４０−ＧＦＰ発現線虫系統の尾の動きは、１０ｍＭのアルギニン投与によって明らかに改善された。【００６２】
Ｑ４０−ＧＦＰ発現線虫系統の短命化に対するアルギニンの影響を調べるために、寿命分析を行った。寿命分析は、線虫をＯＰ５０菌上で培養し、生命の徴候について毎日検査することにより行った。積極的な刺激の後に移動しなかった線虫は、死んだとみなした。生存率の経時的変化を図１２に示す。図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はアルギニンを含まない培地上で飼育したＱ４０−ＧＦＰ発現線虫系統の結果を示し、「Ａｒｇ」は１０ｍＭのアルギニンを含む培地上で飼育したＱ４０−ＧＦＰ発現線虫系統の結果を示す（ログランク検定：ｐ＜０．０１）。Ｑ４０−ＧＦＰ発現線虫系統の生存率は、１０ｍＭのアルギニン投与によって明らかに改善された。【００６３】
Ｑ４０−ＧＦＰ発現線虫系統におけるＰｏｌｙＱ蛋白質のオリゴマー形成に対するアルギニンの影響を調べるために、ＳＤＤ−ＡＧＥ（semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis）による凝集解析を行った。ＳＤＤ−ＡＧＥは、以下のようにして行った。まず、線虫を抽出／溶解バッファー（0.5% SDS, 0.5% NP-40, 50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 5mM EDTA, protease inhibitor cocktail）で可溶化し、得られたライセートを０．０１％のＳＤＳを含有する１％アガロースゲル上で、０．０１％のＳＤＳを含有するＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅランニングバッファー中で泳動し、ニトロセルロース膜上に一晩転写させた。続くウェスタンブロット解析のために、この膜を、一次抗体として１０，０００倍希釈した抗ＧＦＰ抗体で一晩インキュベートし、次いで二次抗体として２０，０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体でインキュベートした。免疫ブロットは、ルミノ・イメージアナライザーシステム「ImageQuant LAS 4000」 (GE Healthcare Life Sciences社製)を用いて画像化し、イメージ解析ソフトウェア「ImageQuantTL」(GE Healthcare Life Sciences社製)を使用して分析した。【００６４】
免疫ブロットにより得られたＳＤＤ−ＡＧＥ画像を図１３に、当該ＳＤＤ−ＡＧＥ画像におけるスミア強度の測定結果を図１４に、それぞれ示す。図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はアルギニンを含まない培地上で飼育したＱ４０−ＧＦＰ発現線虫系統の結果を示し、「Ａｒｇ」は１０ｍＭのアルギニンを含む培地上で飼育したＱ４０−ＧＦＰ発現線虫系統の結果を示す。また、図１４の値は、平均値±標準誤差（ｎ＝５）を示し、「**」は「ｐ＜０．０１」を示す。アルギニンを摂取させていないＰｏｌｙＱ病線虫（Ｑ４０−ＧＦＰ発現線虫系統）では、膜上にＱ４０−ＧＦＰのオリゴマーのスメアが観察されたのに対して、アルギニンを摂取させたＰｏｌｙＱ病線虫では、スメアがより軽く、ブロードの程度が小さくなっており（図１３）、画像解析により測定されたスメア強度も小さくなっていた（図１４）。これらの結果から、ＰｏｌｙＱ病線虫にアルギニンを経口摂取させることによって、ＰｏｌｙＱ蛋白質のオリゴマー形成を抑制できることが示唆された。【００６５】
ハエと線虫のＰｏｌｙＱ病モデルにアルギニンを摂取させた結果から、アルギニンは、ＰｏｌｙＱ蛋白質のオリゴマー化及び凝集を阻害することによって、ＰｏｌｙＱ病の無脊椎動物モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの治療効果を発揮することが明らかである。【００６６】
［実施例４］
哺乳動物におけるアルギニンの治療効果を確認するため、マウスの脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）モデルであるＳＣＡ１１５４Ｑ／２Ｑノックインマウス（以下、単に「ＳＣＡ１マウス」という。）（非特許文献１５）を用いた。ＳＣＡ１マウスは、異常伸長ＰｏｌｙＱ蛋白質（１５４個のグルタミンからなるＰｏｌｙＱ鎖を有するアタキシン１の変異体）が、内因性レベルであり、かつ正確な時間的・空間的なパターンで発現しているノックインマウスであり、進行性の運動障害を含むヒト疾患の多くの側面を再現している。本実験で使用したＳＣＡ１マウスは、日本の国立大学法人東京医科歯科大学の渡瀬啓博士から供与された。【００６７】
＜アルギニンのＢＢＢ透過性＞
アルギニンのＢＢＢ透過性を確認するために、野生型マウス及びＳＣＡ１マウスにアルギニンを経口投与し、脳と血清中のアルギニン量を測定した。【００６８】
具体的には、まず、野生型マウス又はＳＣＡ１マウスに、ゾンデを用いて９時間、２００μＬの水、５質量％Ｌ−アルギニン水溶液、又は１５質量％Ｌ−アルギニン水溶液を１時間に１回経口投与した。この期間内に投与されたＬ−アルギニンの総量は、それぞれ、２質量％Ｌ−アルギニン水溶液又は６質量％Ｌ−アルギニン水溶液を自由摂取させたマウスの１日当たりのＬ−アルギニンの総摂取量と等しかった（図示せず。）。マウスは、最終投与後から１時間経過後に、ペントバルビタールで麻酔し、腹部大動脈からの放血により安楽死させた。血液は血清を得るために１時間室温で静置した後に遠心分離処理した。脳は、１０ｍＬの生理食塩水で灌流した後に切除し、大脳半球に切断した。血清及び大脳は急速冷凍し、使用時まで−８０℃で保存し、Ｌ−アルギニンの検出に供した。Ｌ−アルギニンの検出は、非特許文献１６に記載されている二次元ＨＰＬＣシステムを用いた方法に準じて行った。【００６９】
ＳＣＡ１マウスの大脳中のＬ−アルギニン量の測定結果を図１５に、ＳＣＡ１マウスの血清中のＬ−アルギニン量の測定結果を図１６に、それぞれ示す。図中、「Ｗａｔｅｒ」は水を摂取させたマウスの結果を、「２％」は５質量％Ｌ−アルギニン水溶液を摂取させたマウスの結果を、「６％」は１５質量％Ｌ−アルギニン水溶液を摂取させたマウスの結果を、それぞれ示す。両図の値は、平均値±標準誤差（ｎ＝３）を示し、「**」は「ｐ＜０．０１」を、「***」は「ｐ＜０．００１」を、それぞれ示す。マウスの血清及び大脳中のＬ−アルギニン量は、経口摂取させたＬ−アルギニンの量依存的に高くなっており（図１５及び１６）、経口摂取されたＬ−アルギニンがＢＢＢを透過し、脳内のＬ−アルギニン量を増大させられることが確認された。【００７０】
＜ＳＣＡ１マウスの機能に対するアルギニンの影響＞
ＳＣＡ１マウスに、３週齢から継続的に、飲料水に入れて６質量％のアルギニンを投与し（アルギニン処理）、ロータロッド試験、バランスビーム解析、及び脳内のＰｏｌｙＱ封入体解析を行い、アルギニンの治療効果を調べた。対照として、アルギニンを含まない水を飲料水としてＳＣＡ１マウスに与えた（アルギニン未処理）。【００７１】
（１）ロータロッド試験
ロータロッド試験は、ＳＣＡ１マウスの運動機能の評価のために従来から利用されてきた（非特許文献１５）。ＳＣＡ１マウスでは、４週齢で明らかな運動障害が観察され、この障害は、解析終了時の３６週齢まで徐々に進行した。【００７２】
ロータロッド試験は、マウスを、加速ロータロッド装置（Ugo Basile社製）にのせ、非特許文献１７に記載されている方法に準じて行った。各マウスの回転棒から落下せずに歩くことができる時間（Ｌａｔｅｎｃｙ）を経時的に測定した結果を図１７に示す。図中、「ＷＴ  Ｗａｔｅｒ」はアルギニンを含まない水を摂取させた野生型マウスの結果を示し、「ＷＴ  Ａｒｇ」はアルギニンを含む水を摂取させた野生型マウスの結果を示し、「ＳＣＡ１  Ｗａｔｅｒ」はアルギニンを含まない水を摂取させたＳＣＡ１マウスの結果を示し、「ＳＣＡ１  Ａｒｇ」はアルギニンを含む水を摂取させたＳＣＡ１マウスの結果を示す。図の値は、平均値±標準誤差（ｎ＝１６〜１８）を示し、「**」は「ｐ＜０．０１」を、「***」は「ｐ＜０．００１」を、それぞれ示す。【００７３】
図１７に示すように、野生型マウスにアルギニンを投与しても、明らかな効果は発揮されなかったのに対して、６質量％アルギニンで処理したＳＣＡ１マウスの運動機能は、４週齢から１２週齢において、未処理マウスよりも有意に改善されており、野生型の対照マウスに匹敵した。アルギニンの治療効果は、２８週齢まで有意であった。なお、全てのマウスグループが同等量の液体を摂取したことが確認されており（図１８）、飲料水中に含まれている６質量％のアルギニンは、野生型マウスとＳＣＡ１マウスの飲料水の自由摂取活動に対して影響を与えなかった。【００７４】
（２）バランスビーム解析
運動協調性を評価するために、ＳＣＡ１マウスにバランスビーム試験を行った。バランスビーム解析は、マウスを、直径１５ｍｍ、長さ１ｍのビームを渡るために要する時間を測定することにより行った。ビームは、地上約５０ｃｍに設置されており、出発地点は明るい光があり、遠端が暗箱内にある。マウスは、最初の連続した３日間、それぞれ２回訓練され、落下したり戻ったりすることなくビームを横断することを学習した。テストの日には、マウスがビームを横断するのに要する時間を記録した。マウスが横断するのに６０秒間以上必要だった場合には、スコアは６０秒としてカウントした。各マウスについて２回の試行を行い、より速い横断時間を解析に供した。【００７５】
図１９に、２８週齢のマウスがビームの横断に要する時間（Ｌａｔｅｎｃｙ）の測定結果を示す。図中、「ＷＴ  Ｗａｔｅｒ」、「ＷＴ  Ａｒｇ」、「ＳＣＡ１  Ｗａｔｅｒ」、及び「ＳＣＡ１  Ａｒｇ」は図１７と同じである。図の値は、平均値±標準誤差（ｎ＝１６〜１８）を示し、「**」は「ｐ＜０．０１」を、「***」は「ｐ＜０．００１」を、それぞれ示す。ＳＣＡ１マウスでは、バランスビーム上での障害は、ロータロッドの障害と比較してより高齢でも観察された。２８週齢では、未処理のＳＣＡ１マウスは、ビームを横断するために、未処理の野生型マウスと比較して２倍以上の時間が必要であった。アルギニン処理したＳＣＡ１マウスは、未処理のＳＣＡ１マウスと比較して有意に短時間で、ビームを横断することができた。これらの結果から、アルギニンを経口摂取させることによって、ＰｏｌｙＱ病の動物の運動機能障害を改善することができた。【００７６】
（３）封入体形成に対する影響
ＳＣＡ１マウスの脳の封入体形成に対するアルギニンの効果を分析した。ＳＣＡ１マウスでは、４週齢頃から神経内にＰｏｌｙＱ封入体（ＰｏｌｙＱ蛋白質の凝集体）が形成されることが、大脳皮質及び海馬で明らかにされている（非特許文献１５）。【００７７】
脳切片中のＰｏｌｙＱ封入体は、免疫組織化学的分析により検出した。まず、非特許文献１７に記載の方法に準じて、１２週齢のＳＣＡ１マウスの脳の１０μｍの厚さの凍結切片を作製した。当該切片を、５％ヤギ血清と０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中で、室温、１時間ブロッキングした後、ウサギ抗ユビキチン抗体（ＦＫ２クローン）と４℃で一晩インキュベートし、次いでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：１，０００、Life Technologies社製）と室温で１時間インキュベートした。その後、当該切片を、退色防止用封入剤「Slowfade Gold antifade reagent with DAPI」（Life Technologies社製）でマウントし、共焦点レーザー走査顕微鏡「FV1000」（オリンパス社製）を用いて観察した。【００７８】
共焦点レーザー走査顕微鏡により、抗ユビキチン抗体で染色された封入体が視認できる。そこで、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて観察し、視野に含まれている細胞をカウントし、全細胞数に対する封入体が形成されている細胞の割合（％）を測定した。なお、マウス１匹当たり平均３視野を観察し、かつ１視野当たり、大脳皮質では１３０個以上、海馬では７０個以上の細胞をカウントした。測定結果を図２０に示す。図中、「Ｗａｔｅｒ」はアルギニンを含まない水を摂取させたＳＣＡ１マウスの結果を示し、「Ａｒｇ」はアルギニンを含む水を摂取させたＳＣＡ１マウスの結果を示す。図の値は、平均値±標準誤差（ｎ＝３又は４）を示し、「*」は「ｐ＜０．０５」を示す。１２週齢のＳＣＡ１マウスの脳切片の免疫組織化学的分析では、大脳皮質及び海馬において、ＰｏｌｙＱ封入体の形成が確認された。アルギニン処理マウスでは、両領域において、封入体が形成されている細胞の割合が有意に少なくなっていた。【００７９】
すなわち、ＳＣＡ１マウスにアルギニンを経口投与することにより、運動機能障害が改善され、脳内のＰｏｌｙＱ封入体の形成が抑制される。これらの結果から、アルギニンはＰｏｌｙＱ病に対する治療効果があることが明らかである。【００８０】
［実施例５］
＜運動機能障害発症後のＳＣＡ１マウスに対するアルギニンの影響＞
ＰｏｌｙＱ病を含む神経変性疾患のための治療法を開発する上で考慮すべき重要な要因は、病理学的プロセスがすでに進行しており症状がでている時期に、治療効果を発揮するかどうかである。現在まで、ほとんどの前臨床試験において、治療剤候補物質は、ＰｏｌｙＱ病マウスに対して、症状がでる前に予防的に投与されている。アルギニン投与が、症状がでている時期にも有効かどうかを評価するため、既に運動機能障害がみられる５週齢のＳＣＡ１マウスにアルギニンを投与した。【００８１】
具体的には、ＳＣＡ１マウスに、５週齢から継続的に、飲料水に入れて６質量％のアルギニンを投与し、ロータロッド試験を行い、アルギニンの治療効果を調べた。ロータロッド試験は、実施例４と同様にして行った。各マウスの回転棒から落下せずに歩くことができる時間（Ｌａｔｅｎｃｙ）の測定結果を図２１に示す。図２１は、各マウスの回転棒から落下せずに歩くことができる時間の経時的変化を示した図である。図中、「ＷＴ  Ｗａｔｅｒ」、「ＷＴ  Ａｒｇ」、「ＳＣＡ１  Ｗａｔｅｒ」、及び「ＳＣＡ１  Ａｒｇ」は図１７と同じである。図の値は、平均値±標準誤差（ｎ＝２３〜２５）を示し、「*」は「ｐ＜０．０５」を示す。【００８２】
図２１に示すように、アルギニン処理前の５週齢のＳＣＡ１マウスは、野生型マウスと比較して回転棒から落下せずに歩くことができる時間が有意に短く、運動機能障害が観察された。その後、アルギニン処理を行ったＳＣＡ１マウスは、７週齢から１９週齢までの間、未処理のＳＣＡ１マウスよりも回転棒から落下せずに歩くことができる時間が長く、運動機能障害が軽減されたことが示された。実際に、１５週齢と１９週齢では、アルギニン処理を行ったＳＣＡ１マウスと未処理のＳＣＡ１マウスの運動機能の差は、統計的有意に達していた（図２１）。これらの結果から、アルギニンは、運動症状の発症後に投与を開始した場合でも、ＰｏｌｙＱ病の神経学的表現型に対する治療効果を発揮すること、及びアルギニンがＰｏｌｙＱ病に対して予防のみならず治療剤としても非常に有望であることが明らかである。【００８３】
＜ＳＢＭＡマウスの機能に対するアルギニンの影響＞
全てのＰｏｌｙＱ病はそれぞれの原因蛋白質におけるＰｏｌｙＱ鎖の異常伸長から生じること、及び異常伸長ＰｏｌｙＱ鎖自体に対するアルギニンの阻害効果から、アルギニンは、別のＰｏｌｙＱ病モデルマウスに対しても有効であるかを調べた。【００８４】
別のＰｏｌｙＱ病モデルマウスとして、ＳＢＭＡマウス（非特許文献１８）を用いた。ＳＢＭＡマウスは、９７個のグルタミンからなる異常伸長ＰｏｌｙＱ鎖を有するヒトアンドロゲン受容体の全長蛋白質が発現しており、進行性運動障害を示す。この運動障害は、薬物治療で戻すことができる（非特許文献１９）。なお、本実験で使用したＳＢＭＡマウスは、日本の国立大学法人名古屋大学の祖父江元博士から供与された。【００８５】
ＳＢＭＡマウスの運動障害は、自発的な運動行動における障害として、ケージ内における水平行動や立ち上がりの挙動を測定することによりモニターできる（非特許文献１８）。そこで、ＳＢＭＡマウスに、３週齢から継続的に、飲料水に入れて６質量％のアルギニンを投与し（アルギニン処理）、１２週齢の時点で水平行動や立ち上がりの挙動を観察し、アルギニンの治療効果を調べた。対照として、アルギニンを含まない水を飲料水としてＳＢＭＡマウスに与えた（アルギニン未処理）。【００８６】
マウスの水平行動及び立ち上がりの挙動は、自発運動モニター「Supermex」（室町機械社製）を用いて、非特許文献１８に記載の方法に準じて行った。具体的には、ケージ内に赤外線ビームが投射されている測定用ケージにマウスを入れて自由に行動させた。マウスが測定用ケージ内を移動すると、赤外線ビームが遮られて、受光部で赤外線を感知できなくなる（ビームブレイク）。このビームブレイクの回数を測定し、１分間当たりのビームブレイクの回数（ｃｏｕｎｔｓ／ｍｉｎ）を求めた。水平方向の動きを検知する場合には、垂直方向に投射された赤外線ビームのビームブレイクの回数をカウントした。また、垂直方向の動き（マウスが後肢で立ち上がる動き）を検知する場合には、使用するマウスが四つ這いの姿勢では赤外線ビームが遮られず、立ち上がると遮られる高さで水平方向にビームを投射し、ビームブレイクの回数をカウントした。【００８７】
水平行動の観察結果を図２２に、立ち上がりの挙動の観察結果を図２３に、それぞれ示す。図２２〜２３中、「ＷＴ  Ｗａｔｅｒ」はアルギニンを含まない水を摂取させた野生型マウスの結果を示し、「ＷＴ  Ａｒｇ」はアルギニンを含む水を摂取させた野生型マウスの結果を示し、「ＳＢＭＡ  Ｗａｔｅｒ」はアルギニンを含まない水を摂取させたＳＢＭＡマウスの結果を示し、「ＳＢＭＡ  Ａｒｇ」はアルギニンを含む水を摂取させたＳＢＭＡマウスの結果を示す。図の値は、平均値±標準誤差（ｎ＝２３〜２５）を示し、「**」は「ｐ＜０．０１」を示す。【００８８】
この結果、ＳＢＭＡマウスをアルギニン処理することにより、水平行動と立ち上がりのいずれも、未処理の野生型マウスに匹敵したレベルにまで改善された。また、野生型マウスへのアルギニン処理は、効果は限定的であった。これらの結果から、アルギニンは、多数のＰｏｌｙＱ病モデルマウスに対して有効であり、さらに、ＰｏｌｙＱ病一般に対する治療用分子として有効である可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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