【手続補正書】
【提出日】平成31年4月26日(2019.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液は、トレハロース由来実験緩衝液（Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）（ＤＴＥＢ）またはミトコンドリア実験緩衝液（ＭＥＢ）に由来する。一部の実施形態では、細胞は、ＢＨ３ドメインペプチドとの接触の後、前、または同時に透過化される。一部の実施形態では、ＢＨ３プロファイリング緩衝液に、透過化剤が補充される。一部の実施形態では、透過化剤はジギトニンまたはサポニンである。
本明細書は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
毒性を決定するために複数の作用因子をスクリーニングする方法であって、
ａ）複数の作用因子を提供するステップ；
ｂ）細胞の試料を提供するステップであって、前記細胞が非がん性細胞である、ステップ；
ｃ）前記複数の作用因子のそれぞれについて前記細胞の試料の試験アリコートを提供するステップ；
ｄ）各試験アリコートをそのそれぞれの作用因子と個別に接触させるステップ；
ｅ）前記細胞の試料の対照アリコートを提供するステップであって、前記対照アリコートが前記複数の作用因子のいずれとも接触していない、ステップ；
ｆ）各アリコート中の前記細胞を透過化するステップ；
ｇ）透過化された前記細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；
ｈ）前記試験アリコートのそれぞれの中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）パーセントの値を決定するステップ；
ｉ）前記対照アリコート中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；および
ｊ）前記試験アリコートのそれぞれについてデルタパーセントプライミングの値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、（ｈ）で決定されたＭＯＭＰパーセントの値と（ｉ）で決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップ
を含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、前記試験アリコート中の前記細胞と接触した前記作用因子が、前記細胞に有毒であることを示す、方法。
（項目２）
前記デルタパーセントプライミングが、２０パーセントもしくはそれ未満、１８パーセントもしくはそれ未満、１６パーセントもしくはそれ未満、１４パーセントもしくはそれ未満、１２パーセントもしくはそれ未満、１０パーセントもしくはそれ未満、８パーセントもしくはそれ未満、６パーセントもしくはそれ未満、４パーセントもしくはそれ未満、２パーセントもしくはそれ未満、または１パーセントもしくはそれ未満ならば、前記作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記非がん性細胞が健康な細胞である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
ｋ）細胞の試料を提供するステップであって、前記細胞が、がん性細胞である、ステップ；
ｌ）前記複数の作用因子のそれぞれについて前記がん性細胞の試料の試験アリコートを提供するステップ；
ｍ）各試験アリコートをそのそれぞれの作用因子と個別に接触させるステップ；
ｎ）前記がん性細胞の試料の対照アリコートを提供するステップであって、前記対照アリコートが前記複数の作用因子のいずれとも接触していない、ステップ；
ｏ）各アリコート中の前記がん性細胞を透過化するステップ；
ｐ）透過化された前記がん性細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；
ｑ）前記試験アリコートのそれぞれの中の前記がん性細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；
ｒ）前記対照アリコート中の前記がん性細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；および
ｓ）前記試験アリコートのそれぞれについてデルタパーセントプライミングの値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、（ｑ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値と（ｒ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップ
をさらに含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、前記試験アリコート中の前記がん性細胞と接触した前記作用因子が、前記がん性細胞に対して有毒であることを示す、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記がん性細胞における前記デルタパーセントプライミングが、２０パーセントを超える、３０パーセントを超える、４０パーセントを超える、５０パーセントを超える、６０パーセントを超える、７０パーセントを超える、８０パーセントを超える、９０パーセントを超える、９５パーセントを超える、または１００パーセントならば、前記作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記がん性細胞における前記デルタパーセントプライミングが、前記非がん性細胞における前記デルタパーセントプライミングよりも大きいならば、前記作用因子を用いてｉｎ
ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記がん性細胞における前記デルタパーセントプライミングが、前記非がん性細胞における前記デルタパーセントプライミングよりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、または少なくとも２００％大きいならば、前記作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む、項目４に記載の方法。
（項目８）
前記がん性細胞における前記デルタパーセントプライミングが、前記非がん性細胞における前記デルタパーセントプライミングよりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍大きいならば、前記作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む、項目４に記載の方法。
（項目９）
前記がん性細胞が初代ヒト腫瘍細胞である、項目４から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記がん性細胞が、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）から得られる、項目４から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記複数の作用因子が、２０種またはそれ超の作用因子を含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記複数の作用因子が、１００種またはそれ超の作用因子を含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記各試験アリコートが、そのそれぞれの作用因子と２４時間またはそれ未満接触する、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
透過化された前記細胞が、前記アポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと３時間またはそれ未満接触する、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記試験アリコートのそれぞれの中の前記細胞が、ジギトニンまたはサポニンを用いて透過化される、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントが、
ｉ）前記細胞を電位差測定用色素と接触させ、前記電位差測定用色素の発光を測定すること；
ｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出を測定すること；および
ｉｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の保留を測定すること
のうち１つまたは複数によって決定される、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記電位差測定用色素が、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド（ＪＣ−１）、ジヒドロローダミン１２３、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）、またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
ミトコンドリア膜間腔からの分子が、チトクロームｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２、またはアポトーシス誘導因子である、項目１４または１５に記載の方法。
（項目１９）
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する、項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、配列番号１〜１６からなる群より選択される、項目１から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記複数の作用因子からの作用因子が、１種または複数の化合物を含む、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記複数の作用因子からの作用因子が抗がん剤である、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記複数の作用因子からの作用因子が化学療法剤である、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記複数の作用因子のうち１種または複数が、小型有機分子、小型無機分子、ペプチド、タンパク質、タンパク質類似体、酵素、核酸、核酸類似体、抗体、抗原、ホルモン、脂質、多糖、増殖因子、ウイルス、細胞、生物活性剤、医薬製剤、ならびにそれらの組合せおよびプロドラッグから選択される、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記複数の作用因子のうち１種または複数が、ガス、微粒子、放射線、電磁放射線、およびエアロゾルから選択される、項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
組織に対する作用因子の毒性を予測する方法であって、
ａ）作用因子を提供するステップ；
ｂ）非がん性細胞を含む複数の細胞試料を提供するステップであって、各細胞試料が組織から得られる、ステップ；
ｃ）前記複数の細胞試料のそれぞれの試験アリコートを提供するステップ；
ｄ）各試験アリコートを前記作用因子と個別に接触させるステップ；
ｅ）前記複数の細胞試料のそれぞれの対照アリコートを提供するステップであって、前記対照アリコートが前記作用因子と接触していない、ステップ；
ｆ）各試験アリコートおよび対照アリコート中の前記細胞を透過化するステップ；
ｇ）透過化された前記細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；
ｈ）各試験アリコート中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；
ｉ）各対照アリコート中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；ならびに
ｊ）各試験アリコートについてデルタパーセントプライミングの値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、（ｈ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値と（ｉ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップ
を含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、前記細胞が得られた前記組織に対して前記作用因子が有毒であることを示す、方法。
（項目２７）
前記デルタパーセントプライミングが、２０パーセントもしくはそれ未満、１８パーセントもしくはそれ未満、１６パーセントもしくはそれ未満、１４パーセントもしくはそれ未満、１２パーセントもしくはそれ未満、１０パーセントもしくはそれ未満、８パーセントもしくはそれ未満、６パーセントもしくはそれ未満、４パーセントもしくはそれ未満、２パーセントもしくはそれ未満、または１パーセントもしくはそれ未満ならば、前記作用因子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験を行うステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記非がん性細胞が健康な細胞である、項目２６または２７に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞が哺乳動物細胞である、項目２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記細胞が、動物の生検または剖検によって得られた試料に由来する、項目２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
各試験アリコート中の前記細胞が、前記作用因子と２４時間またはそれ未満接触する、項目２６から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
透過化された前記細胞が、前記アポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと３時間またはそれ未満接触する、項目２６から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞が、ジギトニンまたはサポニンを用いて透過化される、項目２６から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントが、
ｉ）前記細胞を電位差測定用色素と接触させ、前記電位差測定用色素の発光を測定すること；
ｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出を測定すること；および
ｉｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の保留を測定すること
のうち１つまたは複数によって決定される、項目２６から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記電位差測定用色素が、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド（ＪＣ−１）、ジヒドロローダミン１２３、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）、またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記ミトコンドリア膜間腔からの前記分子が、チトクロームｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２、またはアポトーシス誘導因子である、項目３４または３５に記載の方法。
（項目３７）
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する、項目２６から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、配列番号１〜１６からなる群より選択される、項目２６から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記作用因子が、１種または複数の化合物を含む、項目２６から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記作用因子が抗がん剤である、項目２６から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記作用因子が化学療法剤である、項目２６から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記作用因子が、小型有機分子、小型無機分子、ペプチド、タンパク質、タンパク質類似体、酵素、核酸、核酸類似体、抗体、抗原、ホルモン、脂質、多糖、増殖因子、ウイルス、細胞、生物活性剤、医薬製剤、またはそれらの一部の組合せもしくはプロドラッグである、項目２６から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記作用因子が、ガス、微粒子、放射線、電磁放射線、またはエアロゾルである、項目２６から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
作用因子の毒性を予測する方法であって、
ａ）非ヒト動物を致死量以下の用量の作用因子と接触させるステップ；
ｂ）前記動物を屠殺するステップ；
ｃ）１つまたは複数の細胞試料を提供するステップであって、各細胞試料が前記動物からの組織から得られる、ステップ；
ｄ）前記１つまたは複数の細胞試料のそれぞれの試験アリコートを提供するステップ；
ｅ）各試験アリコートを前記作用因子と個別に接触させるステップ；
ｆ）前記１つまたは複数の細胞試料のそれぞれの対照アリコートを提供するステップであって、前記対照アリコートが前記作用因子と接触していない、ステップ；
ｇ）各アリコート中の前記細胞を透過化するステップ；
ｈ）透過化された前記細胞をアポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；
ｉ）前記試験アリコート中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；
ｊ）前記対照アリコート中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；および
ｋ）前記試験アリコートについてのデルタパーセントプライミングの値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、（ｉ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値と（ｊ）において決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップを含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、前記細胞が得られた前記動物の前記組織に対して前記作用因子が有毒であることを示す、方法。
（項目４５）
前記動物が哺乳動物である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記哺乳動物が、非ヒト霊長類または齧歯類である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記動物が、注射、吸入、局所投与、または経口投与によって前記作用因子と接触する、項目４４から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記動物が、前記作用因子と２４時間またはそれ未満接触する、項目４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
透過化された前記細胞が、前記アポトーシス促進性ＢＨ３ドメインペプチドと３時間またはそれ未満接触する、項目４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記細胞が、ジギトニンまたはサポニンを用いて透過化される、項目４４から４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントが、
ｉ）前記細胞を電位差測定用色素と接触させ、前記電位差測定用色素の発光を測定すること；
ｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出を測定すること；および
ｉｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の保留を測定すること
のうち１つまたは複数によって決定される、項目４４から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記電位差測定用色素が、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド（ＪＣ−１）、ジヒドロローダミン１２３、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）、またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記ミトコンドリア膜間腔からの前記分子が、チトクロームｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２、またはアポトーシス誘導因子である、項目５１または５２に記載の方法。
（項目５４）
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する、項目４４から５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、配列番号１〜１６からなる群より選択される、項目４４から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記作用因子が、１種または複数の化合物を含む、項目４４から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記作用因子が抗がん剤である、項目４４から５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記作用因子が化学療法剤である、項目４４から５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記作用因子が、小型有機分子、小型無機分子、ペプチド、タンパク質、タンパク質類似体、酵素、核酸、核酸類似体、抗体、抗原、ホルモン、脂質、多糖、増殖因子、ウイルス、細胞、生物活性剤、医薬製剤、またはそれらの一部の組合せもしくはプロドラッグである、項目４４から５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記作用因子が、ガス、微粒子、放射線、電磁放射線、またはエアロゾルである、項目４４から５９のいずれか一項に記載の方法。