(57)【要約】  本発明の課題は、同種造血幹細胞移植において、ドナーとレシピエントとのＨＬＡが一部ミスマッチの場合においても移植後の予後を予測する方法を提供することにある。  同種造血幹細胞移植におけるドナーとレシピエント間でＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の４座における８アリルのうち、１アリル又は２アリルがミスマッチで、かつレシピエントが悪性血液疾患（骨髄異形形成症候群（ＭＤＳ）を除く）の患者の場合において、ドナー若しくはレシピエントのＮＬＲＰ３遺伝子の配列番号１に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、若しくは配列番号２に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｃ又はＴ）における一塩基多型又はこれらの連鎖不平衡の関係にある一塩基多型、及びレシピエントの原疾患の種類を指標として移植後の予後の予測を補助する。
2018079499.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同種造血幹細胞移植におけるドナーとレシピエント間でＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の４座における８アリルのうち、１アリル又は２アリルがミスマッチで、かつレシピエントの原疾患が悪性血液疾患（骨髄異形形成症候群（ＭＤＳ）を除く）の場合において、ドナー若しくはレシピエントのＮＬＲＰ３遺伝子の配列番号１に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、若しくは配列番号２に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｃ又はＴ）における一塩基多型又はこれらと連鎖不平衡の関係にある一塩基多型、及びレシピエントの原疾患の種類を指標として移植後の予後の予測を補助する方法。
【請求項２】
同種造血幹細胞移植におけるドナーとレシピエント間でＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の３座における６アリルがマッチしていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
同種造血幹細胞移植が非血縁者間同種造血幹細胞移植であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
予後が、２−４級急性移植片対宿主病（２−４ＡＧｖＨＤ）発症、慢性移植片対宿主病（ＣＧｖＨＤ）発症、全生存率（ＯＳ）、又は非再発死亡（ＮＲＭ）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
悪性血液疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ系悪性腫瘍（ＬＭ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、形質細胞性腫瘍（ＰＣＤ）、又は固形腫瘍（ＳＴ）であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
悪性血液疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６記載の方法に使用する、同種造血幹細胞移植後の予後の予測用キットであって、以下の〔１〕又は〔２〕記載のプローブを含むことを特徴とするキット。
〔１〕ＮＬＲＰ３遺伝子において、配列番号１に示す２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型を含む連続する１５〜５０塩基からなる配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
〔２〕ＮＬＲＰ３遺伝子において、配列番号２に示す２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型を含む連続する１５〜５０塩基からなる配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
【請求項８】
ＨＬＡを測定するための試薬を含むことを特徴とする請求項７記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同種造血幹細胞移植後の予後の予測を補助する方法や、かかる方法に使用する、同種造血幹細胞移植後の予後の予測用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：以下、「同種移植」ともいう）とは自分以外の細胞をドナーとする造血幹細胞移植のことである。同種移植後の生存率は以前より改善されてはいるものの、５年生存率は４０−６０％にとどまっている。また急性移植片対宿主病（ａｃｕｔｅ  ｇｒａｆｔ―ｖｅｒｓｕｓ―ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＧｖＨＤ）や慢性移植片対宿主病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｇｒａｆｔ―ｖｅｒｓｕｓ―ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＧｖＨＤ）等の移植後の合併症を防ぐ手段は依然限られている。【０００３】
同種移植においては、投薬治療よりも最適なドナーの選択法を確立することによって死亡や合併症を予防することが望ましい。同種移植後の予後に影響を与える遺伝学的因子としてドナーとレシピエント間のＨＬＡ座における対立遺伝子（アリル）の適合度（マッチ／ミスマッチ）は良く知られており、同種移植の際にドナーとレシピエント間のＨＬＡアリルをマッチさせることが標準的に行われている。主要なＨＬＡ遺伝子はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１の６座からなり、２倍体であるヒトゲノムにおいて合計１２アリル存在する。ＨＬＡ遺伝子座は非常に多型的であるため、全てのレシピエントについて１２／１２アリルマッチするドナーを見つけることは極めて難しい。また、主要なＨＬＡがある程度以上マッチしていれば、１２／１２アリル全マッチと移植後の予後に大きな差はないという報告もある。これらの理由で、非血縁者間骨髄移植においては重要性の相対的に低いＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１は考慮せず、最低限ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の合計３座をマッチさせて、可能なレシピエントについてはさらにＨＬＡ−Ｃ座もマッチ（６／８−８／８アリルマッチ）させる方法が先進国では標準的である。【０００４】
同種移植後の予後をさらに改善する方法として、ＨＬＡ以外の遺伝子の多型を利用することが考えられる。実際、同種移植後の予後に影響する一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ―ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）等の遺伝的多型の探索が世界中で行われてきた。しかし、再現性があり臨床に影響を与えるような強い効果を持つ多型は見出されていない。【０００５】
同種移植後の予後に影響を与える数少ない非ＨＬＡのＳＮＰの候補としてはＫＩＲ（ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子ファミリーが提案されている（特許文献１、非特許文献１参照）。ＫＩＲは細胞表面でＨＬＡと直接物理的に結合する受容体タンパク質をコードする。しかし、かかる文献におけるＫＩＲ遺伝子とレシピエント側のＨＬＡ−Ｃアリル（ドナーとのミスマッチではない）の組み合わせが急性骨髄性白血病（Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｌｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＭＬ）患者に対する同種移植後の再発に影響を与えるという主要な結果の解釈に疑問が呈され（非特許文献２参照）、対する非特許文献１の著者の返答で交互作用は有意でない（Ｐ＝０．１４）ことが報告された（非特許文献３参照）。また、非特許文献１のＦｉｇｕｒｅ  ３Ｃには、ＫＩＲ遺伝子の再発予防効果がＨＬＡ−Ｃのミスマッチの存在に依存するという結果も報告されていたが、論文の遺伝子型解読結果が多くの誤りを含んでいたことが著者から後に報告されて、修正後のＦｉｇｕｒｅ  ３Ｃの解析結果は有意でない（Ｐ＝０．２４）ことが判明した（非特許文献４参照）。さらに同じグループからの追加研究では元の結果は再現されなかった（非特許文献５参照)。上記からＫＩＲ遺伝子とＨＬＡアリルの組み合わせの効果は世界的にも十分に確認されているとは言えない現状である。また、日本人等の集団ではそもそもＨＬＡ−ＣのＫＩＲタンパク質との結合に関与するアリルの多型の頻度が非常に低いため、臨床応用は難しいと思われる。【０００６】
一方、細胞内のＮＯＤ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙであるＮＬＲＰ３は、インフラマソーム形成によりＣａｓｐａｓｅ−１を活性化させるタンパク質である。かかるＮＬＲＰ３の一塩基多型は、家族性感冒自己炎症性症候群の発症原因やアレルギー疾患の劇症化等と関係していること（特許文献２、非特許文献６参照）や、同種造血細胞移植において、マウスのレシピエントＮＬＲＰ３遺伝子がＭＨＣミスマッチ移植におけるＡＧｖＨＤに関与すること（非特許文献７参照）や、ＨＬＡが完全に一致した兄弟姉妹間移植の同種造血細胞移植において、ドナーのＮＬＲＰ３の一塩基多型が再発、全生存率、移植関連死亡率、又はＧｖＨＤに関与すること（非特許文献８−１０参照）が開示されている。しかしながら、ＨＬＡミスマッチの同種造血細胞移植において、かかるＮＬＲＰ３の一塩基多型と前記移植における予後との関係は記載されておらず、またレシピエントの原疾患（underlying  disease）の種類も考慮されていない。【０００７】
このように、ＨＬＡの適合度以外には同種移植後の予後を予測する手段は実用化されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０１６−５１７０８８号公報
【特許文献２】特開２０１１−２４４７８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Venstrom  et  al.,  HLA-C-dependent  prevention  of  leukemia  relapse  by  donor  activating  KIR2DS1.  N.  Engl.  J.  Med.  367,  805-816（2012）
【非特許文献２】Fischer  &  Uhrberg.  Prevention  of  leukemia  relapse  by  donor  activating  KIR2DS1.  N.  Engl.  J.  Med.  367,  2054-2055(2012）
【非特許文献３】N.  Engl.  J.  Med.  367,  author  reply  2055.(2012）
【非特許文献４】Venstrom  et  al.,  Donor  activating  KIR2DS1  in  leukemia.  N.  Engl.  J.  Med.  371,  2042(2014)
【非特許文献５】Sobecks,  R.M.  et  al.  Impact  of  KIR  and  HLA  Genotypes  on  Outcomes  after  Reduced-Intensity  Conditioning  Hematopoietic  Cell  Transplantation.  Biol.  Blood  Marrow  Transplant.  21,  1589-159(2015)
【非特許文献６】Hitomi,  Y  et  al.  Associations  of  functional  NLRP3  polymorphisms  with  susceptibility  to  food-induced  anaphylaxis  and  aspirin-induced  asthma.  Journal  of  Allergy  and  Clinical  Immunology  Volume  124,  Issue  4,  Pages  779-785.e6(2009)
【非特許文献７】Jankovic,  D.  et  al.  The  Nlrp3  inflammasome  regulates  acute  graft-versus-host  disease.  J.  Exp.  Med.  210,  1899-1910(2013).
【非特許文献８】Granell  M.  et  al.  Common  variants  in  NLRP2  and  NLRP3  genes  are  strong  prognostic  factors  for  the  outcome  of  HLA-identical  sibling  allogeneic  stem  cell  transplantation.  Blood  15:4337-4342(2008)
【非特許文献９】Takami,  A.  et  al.  Association  of  Functional  Single  Nucleotide  Variation  in  the  NLRP3  Gene  with  Survival  Outcomes  After  Unrelated  Bone  Marrow  Transplantation.  Blood  120:3140(2012)
【非特許文献１０】Takami,  A.  et  al.  A  Single  Nucleotide  Polymorphism  in  the  NLRP3  Gene  Is  Associated  with  Acute  Graft-Versus-Host  Disease  After  HLA-Matched  Unrelated  Bone  Marrow  Transplantation.  Blood  118:4073(2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のように、これまでは同種移植後の予後予測に関する研究において、ＨＬＡが１２／１２アリルマッチした同種移植を対象にして、レシピエントの原疾患を区別せずに解析している例が多かった。しかしながら、ＨＬＡが１２／１２アリルマッチした同種移植は現在の臨床現場では少数に限られており、実際には多数の実施例を占めるＨＬＡが一部ミスマッチの場合において、原疾患ごとに移植後の予後を予測する方法が求められていた。そこで本発明の課題は、ＨＬＡが一部ミスマッチの場合においても原疾患ごとに移植後の予後を予測する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、まず骨髄移植後の予後に影響を与えるドナーとレシピエント側両方のＳＮＰの同定を試みた。対象者は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の合計３座６アリルを最低限マッチさせた非血縁骨髄移植を、日本骨髄バンクを介して２００６年１０月から２００９年４月に受けた９９９ペアのドナーとレシピエントである。ＨＬＡ−Ｃ座はマッチしているとは限らないので、ＨＬＡ座６／８−８／８アリルマッチといえる。日本骨髄バンクから提供されたこれら計１９９８の被験者のＤＮＡ検体を用いて、ＮＬＲＰ１、ＮＬＲＰ２、ＮＬＲＰ３、及びＣＡＲＤ８の一塩基多型（ＳＮＰ）を計５つ（ＮＬＲＰ３のみ２つずつで、他は１つずつ）の遺伝子型を決定した。そして、移植後の予後と、ドナー及び／又はレシピエントのＳＮＰの遺伝子型との関連について、被験者の臨床データを用いて統計解析を行った。その結果、移植後の予後に関してＨＬＡのミスマッチ（６／８、７／８アリルマッチ）とＮＬＲＰ３の一塩基多型であるｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６の発現型との間で統計的に有意な交互作用があることを見出し、本発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）同種造血幹細胞移植におけるドナーとレシピエント間でＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の４座における８アリルのうち、１アリル又は２アリルがミスマッチで、かつレシピエントの原疾患が悪性血液疾患（骨髄異形形成症候群（ＭＤＳ）を除く）の場合において、ドナー若しくはレシピエントのＮＬＲＰ３遺伝子の配列番号１に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、若しくは配列番号２に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｃ又はＴ）における一塩基多型又はこれらと連鎖不平衡の関係にある一塩基多型、及びレシピエントの原疾患の種類を指標として移植後の予後の予測を補助する方法。
（２）同種造血幹細胞移植におけるドナーとレシピエント間でＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の３座における６アリルがマッチしていることを特徴とする上記（１）記載の方法。
（３）同種造血幹細胞移植が非血縁者間同種造血幹細胞移植であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の方法。
（４）予後が、２−４級急性移植片対宿主病（２−４ＡＧｖＨＤ）発症、慢性移植片対宿主病（ＣＧｖＨＤ）発症、全生存率（ＯＳ）、又は非再発死亡（ＮＲＭ）であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の方法。
（５）悪性血液疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ系悪性腫瘍（ＬＭ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、形質細胞性腫瘍（ＰＣＤ）、又は固形腫瘍（ＳＴ）であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の方法。
（６）悪性血液疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）であることを特徴とする上記（５）記載の方法。
（７）上記（１）〜（６）記載の方法に使用する、同種造血幹細胞移植後の予後の予測用キットであって、以下の〔１〕又は〔２〕記載のプローブを含むことを特徴とするキット。
〔１〕ＮＬＲＰ３遺伝子において、配列番号１に示す２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型を含む連続する１５〜５０塩基からなる配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
〔２〕ＮＬＲＰ３遺伝子において、配列番号２に示す２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型を含む連続する１５〜５０塩基からなる配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
（８）ＨＬＡを測定するための試薬を含むことを特徴とする上記（７）記載のキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、ＨＬＡが一部ミスマッチ、すなわちＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の４座における８アリルのうち、１アリル又は２アリルがミスマッチの場合における同種移植後の予後を予測することが可能となる。かかる予後の予測を行うことで、ドナーを選択する際により合併症発症リスクや死亡リスクが少ないドナーを選択することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＳＮＰ遺伝子型の同定におけるＴａｑＭａｎアッセイのプローブ、ＰＣＲダイレクトシークエンスに用いたプライマーの配列、及びＳＮＰ近傍の配列を示す図である。
【図２Ａ】９９９ペアのレシピエントの臨床データを示す図である。
【図２Ｂ】９９９ペアのドナーの臨床データ（上）及び移植のデータ（下）を示す図である。
【図２Ｃ】９９９ペアのドナーとレシピエントにおけるＨＬＡや血液型のマッチングを示す図である。
【図３】実施例１において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく広範性ＣＧｖＨＤ（ＥｘＣＧｖＨＤ）の累積発生曲線（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｃｕｒｖｅｓ：ＣＩＣｓ）解析（未調整解析）結果を示す図である。レシピエントは図２Ａのグループ１に示す悪性疾患（Ｍａｌｉｇｎａｎｔ）患者（Ｎ＝８２２）である。初回移植症例のみを統計解析の対象とした（以下の図４Ａ−１４Ｂにおいて同様）。なお、図中、「ＨＬＡ−Ｃ  ＭＭ」はＨＬＡ−Ｃミスマッチを意味し、「ＨＬＡ−Ｃ  ＭＭ  ０」はＨＬＡ−Ｃミスマッチ無し（実線：ＨＬＡ−Ｃのアリルマッチ）、「ＨＬＡ−Ｃ  ＭＭ  １−２」はＨＬＡ−Ｃミスマッチが１又は２（破線：ＨＬＡ−Ｃの１又は２アリルミスマッチ）を示す。また、Ｎの数値は解析に用いたドナー・レシピエントのペアの数を示し（以下の図４Ａ−図１４Ｂにおいて同様）、Ｐ．ｐｍｔはパーミュテーションを用いたＧｒａｙのテストによる値を示す（以下の図４Ａ、Ｂ、図６Ｃ、図８において同様）。Ｐは通常のＧｒａｙのテストにより求めた値で（以下の図４Ａ〜Ｃ、図６Ａ〜Ｅ、図７Ａ、Ｂ、図８、図１０、及び図１４Ａ、ＢのＮＲＭとｒｅｌａｐｓｅにおいて同様）ある。
【図４Ａ】実施例１において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づくＥｘＣＧｖＨＤの累積発生曲線（ＣＩＣｓ）解析（未調整解析）結果（ＡＭＬ患者）を示す図である。横軸は移植後の年数、縦軸はＥｘＣＧｖＨＤの累積発生率（以下の図４Ｂ、４Ｃも同様）である。
【図４Ｂ】実施例１において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づくＥｘＣＧｖＨＤの累積発生曲線（ＣＩＣｓ）解析（未調整解析）結果（ＡＬＬ患者又は６ｏｔｈｅｒｓ患者（６ｏｔｈｅｒｓ患者：ＣＭＬ、その他の（ＡＭＬ・ＡＬＬ・ＣＭＬ以外の）白血病、ＬＭ、ＭＰＤ、ＰＣＤ、及びＳＴのいずれかの患者）を示す図である。
【図４Ｃ】実施例１において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づくＥｘＣＧｖＨＤの累積発生曲線（ＣＩＣｓ）解析（未調整解析）結果（ＭＤＳ患者）を示す図である。
【図５】実施例１において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの交互作用に基づくＦｉｎｅ−Ｇｒａｙ比例ハザード回帰による多変量解析（ＥｘＣＧｖＨＤの累積発生）結果を示す図である。また、ＨＬＡ−Ｃ  ＭＭはＨＬＡ−Ｃ  ミスマッチ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の合計３座６アリルがマッチで、ＨＬＡ−Ｃの２アリルのうち少なくとも１アリルがミスマッチ）の数（０、１、又は２）に基づく効果を示し（以下の図９、１２において同様）、Ｄｏｎｏｒ  ｒｓ１０９２５０２７（Ｔ−ａｄｄｉｔｉｖｅ）はＴアリルの数（０、１、又は２）に基づく効果を示し、ＨＬＡ−Ｃ  ＭＭ×Ｄｏｎｏｒ  ｒｓ１０９２５０２７はこれら２つの数の積の効果を示す。Ｐ及びＰ．ｘｔはＷａｌｄテストにより求めた値（以下の図９、１２において同様）である。
【図６Ａ】実施例２において、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく２−４ＡＧｖＨＤの累積発生曲線解析（未調整解析）結果（全悪性疾患（ｍａｌｉｇｎａｎｔ）患者）を示す図である。横軸は移植後の日数、縦軸は２−４ＡＧｖＨＤの累積発生率（以下の図６Ｂ〜６Ｅも同様）である。
【図６Ｂ】実施例２において、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく２−４ＡＧｖＨＤの累積発生曲線解析（未調整解析）結果（ＡＭＬ患者）を示す図である。
【図６Ｃ】実施例２において、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく２−４ＡＧｖＨＤの累積発生曲線解析（未調整解析）結果（ＡＬＬ患者）を示す図である。
【図６Ｄ】実施例２において、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく２−４ＡＧｖＨＤの累積発生曲線解析（未調整解析）結果（ＭＤＳ患者）を示す図である。
【図６Ｅ】実施例２において、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく２−４ＡＧｖＨＤの累積発生曲線解析（未調整解析）結果（６ｏｔｈｅｒｓ患者）を示す図である。
【図７Ａ】実施例３において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく非再発死亡（ＮＲＭ）の累積発生曲線解析（未調整解析）結果（ＡＭＬ患者）を示す図である。Ｐ（Ｔ-ｄｏｍｉ）は、Ｔ優性モデルの下で、通常のＧｒａｙのテストにより求めた値（以下の図７Ｂも同様）である。
【図７Ｂ】実施例３において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく非再発死亡（ＮＲＭ）の累積発生曲線解析（未調整解析）結果（ＡＬＬ患者）を示す図である。
【図８】実施例３において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく非再発死亡（ＮＲＭ）の累積発生曲線解析（未調整解析）結果を示す図である。図８（ａ）は６ｏｔｈｅｒｓ患者、図８（ｂ）はＣＭＬ患者又はその他の白血病患者、図８（ｃ）はＬＭ、ＰＣＤ、ＭＰＤ、ＳＴのいずれかの患者である。横軸は移植後の年数、縦軸は非再発死亡の累積発生率である。
【図９】実施例３において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの交互作用に基づく非再発死亡（ＮＲＭ）のＦｉｎｅ−Ｇｒａｙ比例ハザード回帰による多変量解析結果を示す図である。図９（ａ）はＨＬＡ−Ｃ  ＭＭの場合であり、追跡期間全体にわたる非再発死亡（ＮＲＭ）である。図９（ｂ）はＨＬＡ−Ｃ／Ｑ／Ｐ  ＭＭ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の合計３座６アリルがマッチで、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１の合計３座６アリルのうち少なくとも１アリルがミスマッチ）の場合であり、かつ１００以内の非再発死亡（ＮＲＭ）である。
【図１０】実施例４において、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく非再発死亡（ＮＲＭ）の累積発生曲線解析（未調整解析）結果を示す図である。患者の原疾患はＡＬＬである。横軸は移植後の年数、縦軸は非再発死亡の累積発生率である。
【図１１Ａ】実施例５において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく全生存率（ＯＳ）の単変量Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析結果（ＡＭＬ患者）を示す図である。Ｐは通常のｌｏｇ-ｒａｎｋテストにより求めた値である（以下の図１１Ｂ、１１Ｃ、図１３Ａ、１３Ｂ、並びに図１４Ａ，１４ＢのＯＳにおいて同様）。Ｐ（Ｔ-ｄｏｍｉ）は、Ｔ優性モデルの下で、通常のｌｏｇ-ｒａｎｋテストにより求めた値である（以下の図１３Ａにおいて同様）。横軸は移植後の年数、縦軸は全生存率（ＯＳ）（以下の図１１Ｂ、１１Ｃも同様）である。
【図１１Ｂ】実施例５において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく全生存率（ＯＳ）の単変量Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析結果（ＡＬＬ患者）を示す図である。Ｐ．ｐｍｔはパーミュテーションを用いたｌｏｇ-ｒａｎｋテストによる値（以下の図１１Ｃも同様）を示す。
【図１１Ｃ】実施例５において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく全生存率（ＯＳ）の単変量Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析結果（６ｏｔｈｅｒｓ患者）を示す図である。
【図１２】実施例５において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの交互作用に基づく全生存率（ＯＳ）のＣｏｘ比例ハザード回帰による多変量解析結果を示す図である。
【図１３Ａ】実施例６において、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく全生存率（ＯＳ）の単変量Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析結果（ＡＭＬ患者）を示す図である。横軸は移植後の年数、縦軸は全生存率（ＯＳ）（以下の図１３Ｂも同様）である。
【図１３Ｂ】実施例６において、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく全生存率（ＯＳ）の単変量Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析結果（ＡＬＬ患者）を示す図である。
【図１４Ａ】実施例７において、ＣＧｖＨＤの発症と非再発死亡、再発（ｒｅｌａｐｓｅ）、及び全生存率との関係についての解析結果（原疾患がＡＭＬ患者）を示す図である。図中、Ｌｉｍｔｅｄは限局的ＣＧｖＨＤを発症した場合、ＥｘｔｅｎｓｉｖｅはＥｘＣＧｖＨＤを発症した場合を示す。
【図１４Ｂ】実施例７において、ＣＧｖＨＤの発症と非再発死亡、再発（ｒｅｌａｐｓｅ）、及び全生存率との関係についての解析結果（原疾患が６ｏｔｈｅｒｓ患者）を示す図である。
【図１５】本発明を用いたドナー選択法の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の移植後の予後の予測を補助する方法としては、同種造血幹細胞移植におけるドナーとレシピエント間でＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の４座における８アリルのうち、１アリル又は２アリルがミスマッチで、かつレシピエントの原疾患が悪性血液疾患（骨髄異形形成症候群（ＭＤＳ）を除く）の場合において、ドナー若しくはレシピエントのＮＬＲＰ３遺伝子の配列番号１に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、若しくは配列番号２に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｃ又はＴ）における一塩基多型又はこれらの連鎖不平衡の関係にある一塩基多型、及びレシピエントの原疾患の種類を指標として移植後の予後の予測を補助する方法であれば特に制限されず、かかる方法は、医師による診断は含まれない。
【００１６】
同種造血幹細胞移植とは、自己以外の細胞をドナーとする造血幹細胞移植のことを意味する。かかる同種移植は悪性血液疾患の根治療法であり、幹細胞の由来組織によって骨髄移植、末梢血移植、又は臍帯血移植のいずれかに分類することができ、本発明の同種移植は上記いずれの移植でもよいが、骨髄移植であることが好ましい。また、同種造血幹細胞移植は、そのドナーによって血縁者間同種造血幹細胞移植と非血縁者間同種造血幹細胞移植に分類できるが、本発明においては非血縁者間同種造血幹細胞移植であることが好ましい。
【００１７】
本発明のレシピエント及び／又はドナーの人種は特に制限されず、日本人、東アジア人、西アジア人、北アメリカ人、南アメリカ人、欧州人、アフリカ人のいずれでもよいが、好ましくは東アジア人、より好ましくは日本人である。また、本発明を用いるレシピエントとしては、初回移植の患者であることが好ましい。
【００１８】
ドナーとレシピエント間でＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の４座における８アリルのうち、１アリル又は２アリルがミスマッチの場合とは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の４座における８アリル中１アリルがミスマッチで７アリルがマッチ（７／８）、又はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の４座における８アリル中２アリルがミスマッチで６アリルがマッチする場合を意味し、マッチするアリルは特に限定されないが、少なくともＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の３座における６アリルがマッチしていることが好ましい。
【００１９】
本発明において、悪性血液疾患（骨髄異形形成症候群（ＭＤＳ）を除く）とは、悪性血液疾患のうち、ＭＤＳ以外の疾患を意味する。かかるＭＤＳ以外の疾患としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、その他（ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＭＬ以外）の白血病（ＯＬ）、リンパ系悪性腫瘍（ＬＭ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、形質細胞性腫瘍（ＰＣＤ）、又は固形腫瘍（ＳＴ）を挙げることができ、ＡＬＬ又はＡＭＬを好適に挙げることができ、ＡＬＬをより好適に挙げることができる。
【００２０】
本発明において、ＮＬＲＰ３遺伝子の配列番号１に示す塩基配列の２６番目の塩基におけるＳＮＰ（ｒｓ４６１２６６６）は、日本人における食物誘因アナフィラキシーやアスピリン誘因喘息に対する感受性に関与するイントロンＳＮＰである。また、ＮＬＲＰ３遺伝子の配列番号２に示す塩基配列の２６番目の塩基におけるＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７）は、ＮＬＲＰ３とＯＲ２Ｂ１１遺伝子の両方の下流に位置しているＳＮＰである。ここで、ｒｓ番号は米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）におけるＳＮＰのリファレンス番号（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＳＮＰ  ＩＤ  ｎｕｍｂｅｒ）である。
【００２１】
本発明において、上記連鎖不平衡の関係とは、生物の集団において、複数の遺伝子座の対立遺伝子又は遺伝的マーカー（多型）の間にランダムでない相関がみられる、すなわちそれらの特定の組合せ（ハプロタイプ）の頻度が有意に高くなる集団遺伝学的な現象にある関係を意味し、連鎖不平衡係数ｒ２＞０．５、好ましくはｒ２＞０．６、より好ましくはｒ２＞０．６４の関係を満たす塩基を挙げることができる。具体的には、ｒｓ１０９２５０２７と連鎖不平衡（ｒ２＞０．６４）の関係にあるＳＮＰとしてはｒｓ１２１４３９６６、ｒｓ４９２５６５９、ｒｓ１１１３０７２６８、ｒｓ６０８２３５８３、ｒｓ１０１５９２３９、ｒｓ５６３８３８２９、ｒｓ６０８３１０２５、ｒｓ１０７５４５５８、ｒｓ３４６９１５３５、ｒｓ１０８０２５０２、ｒｓ４９２５５４７、ｒｓ１０７５４５５９、ｒｓ１０７３３１１１、ｒｓ１０７３３１１２、ｒｓ４９２５６６３を挙げることができ、ｒｓ４６１２６６６と連鎖不平衡（ｒ２＞０．６４）の関係にあるＳＮＰとしてはｒｓ３８０６２６５、ｒｓ３８３５３０４を挙げることができる。連鎖不平衡係数は、ＶＣＦｔｏｏｌｓのバージョン０．１．１１で算出することができる。
【００２２】
本発明における予後としては、同種造血幹細胞移植後に生じる合併症、生存率又は死亡であれば特に制限されないが、２−４級急性移植片対宿主病（２−４ＡＧｖＨＤ）発症、広範性慢性移植片対宿主病（ＥｘＣＧｖＨＤ）発症、全生存率（ＯＳ）、又は非再発死亡（原疾患の再発が起こっていない死亡：ＮＲＭ）を挙げることができる。
【００２３】
本発明により、移植後の予後の予測の補助は、１）ドナー若しくはレシピエントのＮＬＲＰ３遺伝子の配列番号１に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、若しくは配列番号２に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｃ又はＴ）における一塩基多型又はこれらの連鎖不平衡の関係にある一塩基多型、及び、２）レシピエントの原疾患、の１）及び２）の２種類を指標として行うことができる。従来、ドナーの選択については原疾患の種類が考慮されずにＨＬＡのマッチ／ミスマッチのみが指標として用いられており、移植後の予後については、よりＨＬＡがマッチした方がリスクが少ないという指標しかなく、ＨＬＡの一部ミスマッチの場合において、より詳細に予後のリスクを判断する指標はなかった。こうした中、本発明によりＨＬＡ−Ｃがミスマッチの場合において、レシピエントの原疾患の種類と、ドナー若しくはレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰとの組み合わせによって移植後の予後のリスクが異なることが明らかとなった。そのため、かかる組み合わせに基づき様々な予後リスクを予測することが可能となる。具体的には、例えば以下の表１に示すようにそれぞれの指標に基づいて、予後の予測を補助することができる。
【００２４】
【表１】
2018079499.tif 000003
【００２５】
本発明の同種造血幹細胞移植後の予後の予測用キットとしては、上記本発明の同種造血幹細胞移植における移植後の予後の予測を補助する方法に使用する、同種造血幹細胞移植後の予後の予測用キットであって、以下の（１）又は（２）のプローブを含む限り特に制限されず、かかるプローブを用いることによってそれぞれのＳＮＰを検出することが可能となる。
（１）ＮＬＲＰ３遺伝子において、配列番号１に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｔ又はＣ）における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型を含む連続する１５〜５０塩基からなる配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
（２）ＮＬＲＰ３遺伝子において、配列番号２に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｔ又はＣ）における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型を含む連続する１５〜５０塩基からなる配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
【００２６】
上記プローブとしては、１５〜５０塩基であればよいが、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基からなるプローブを挙げることができる。なお、プローブとしてＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）等の人工核酸を用いて合成したオリゴプローブを用いることで、短い塩基でも特異的にハイブリダイズするプローブとすることが可能となる。
【００２７】
上記ストリンジェントな条件下としては、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、６×ＳＳＣ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５Ｍ  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular  Biology,  John  Wiley  &  Sons,  N.  Y.  (1989),  6.3.1-6.3.6）や、３×ＳＳＣ／０．３×ＳＤＳを含む溶液中で５４℃にてハイブリッドを形成させた後、洗浄液Ａ（１０×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ溶液）、洗浄液Ｂ（２０×ＳＳＣ）及び洗浄液Ｃ（５×ＳＳＣ）で順次洗浄するような条件（特開２０１１−２５０７２６号公報参照）等を挙げることができる。
【００２８】
ＳＮＰは、公知のＳＮＰを分析する方法を用いることができ、リアルタイムＰＣＲ法、ダイレクトシーケンシング法、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲ法、インベーダー（登録商標）法、ルミネックス（登録商標）法、クエンチングプライマー／プローブ（ＱＰ）法、ＭＡＬＤＩ―ＴＯＦ法、分子ビーコン法等を挙げることができる。具体的には、ドナー又はレシピエントから採取した生体試料のゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応によって測定対象のＳＮＰ部位を含む核酸断片を、プライマーを用いてＰＣＲで増幅し、得られた核酸断片と、野生型及びバリアント型に対応する一対のプローブとのハイブリダイゼーションを検出する方法や、上記ＰＣＲ増幅過程において、当該ＳＮＰ部位に特異的なプローブを用いることで、野生型及びバリアント型を検出する方法を挙げることができる。
【００２９】
また、本発明のプローブは、担体上に固定して用いてもよく、担体としては、平面状の基板やビーズ状の球状担体を挙げることができ、具体的には、上記特開２０１１−２５０７２６号公報に記載された担体を挙げることができる。また、野生型を検出するプローブとバリアント型を検出するプローブとを同一の担体に固定してもよいし、異なる担体に固定してもよい。
【００３０】
上記プローブは、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、ＤＮＡシンセサイザー、全自動核酸合成装置等を使用することができる。
【００３１】
ＨＬＡを測定する方法としては特に制限されず、ＬＣＴ法、ＤＮＡタイピング法、蛍光ビーズ法等を挙げることができる。また、上記同種造血幹細胞移植後の予後の予測用キットには、上記それぞれのＨＬＡを測定する方法に応じたＨＬＡ測定用の試薬を含んでもよい。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、本発明の実施例において、ＳＮＰ遺伝子型の同定、ドナー・レシピエント、評価項目、統計解析については、次に示すとおりに行った。【００３３】
（ＳＮＰ遺伝子型の同定）
ドナー及びレシピエントそれぞれの末梢血２００μＬをＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてゲノムＤＮＡを精製し、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧｅｎｏｍｉＰｈｉＨＹ  ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で増幅した。ＳＮＰ遺伝子型の同定は、２０ｎｇの増幅したＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  及び  ＴａｑＭａｎ  ＳＮＰ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、７９００ＨＴ及び／又はＶｉｉＡ７  ｒｅａｌ―ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）装置でＰＣＲし、かかる装置に付属のソフトウェアを用いて行った。デフォルト閾値（ｑｕａｌｉｔｙ＝９５）を超えたシグナルだけを正しく遺伝子型判定されたものとした。遺伝子型判定されなかったサンプルや正しく遺伝子型判定されたサンプルの一部は、ＰＣＲ及びダイレクトサンガーシークエンスによって遺伝子型を同定した。【００３４】
ｒｓ１０９２５０２７、又はｒｓ４６１２６６６のＳＮＰをカバーする短鎖ゲノム領域は、それぞれ上記で得られた１０ｎｇのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＥｘＴａｑ  ＨＳ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いたＰＣＲによって増幅した。ＴａｑＭａｎアッセイのプローブ、上記ＰＣＲダイレクトシークエンスに用いたプライマーの配列、及びＳＮＰ近傍の配列を図１に示す。【００３５】
ＤＮＡシークエンス反応はプライマーとＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔを用いて行い、３７３０×ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によって解析した。それぞれのＳＮＰ塩基において、それぞれのクロマトグラム目視検査の後、シグナルの最も強い塩基及び二番目に強い塩基のピークの高さの比を算出した。ピークの比が３未満の場合、遺伝子型はヘテロ接合と判断し、３以上の場合にはシグナルの最も強い塩基のホモ接合と判断した。【００３６】
（ドナー・レシピエント）
被験者は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の合計３座６アリルを最低限マッチさせた非血縁骨髄移植を、公益財団法人日本骨髄バンクを介して２００６年１０月から２００９年４月に受けた次の４つの条件を満たす９９９ペアのドナー及びレシピエントである。４つの条件とは、日本人ペアであること、ドナー年齢が２０歳以上であること、患者の移植後の生存日数データが存在すること、ＨＬＡ１２座が遺伝子型再決定されて実際にＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の６アリルがマッチしていることが確認されたペアであること、である。ＨＬＡ−Ｃ座はマッチしているとは限らないので、ＨＬＡ座６／８、７／８、又は８／８アリルマッチといえる。上記ドナー及びレシピエントの臨床データ、移植のデータ及びマッチングを図２Ａ〜Ｃに示す。【００３７】
（評価項目）
移植後の予後の主要評価項目は移植後１００日以内の２−４級急性ＧｖＨＤ（２−４ＡＧｖＨＤ）、全生存率（ＯＳ）、慢性ＧｖＨＤ（ＣＧｖＨＤ）、非再発死亡（ＮＲＭ）、再発である。慢性ＧｖＨＤ（ＣＧｖＨＤ）としては、広範型慢性ＧｖＨＤ（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ＣＧｖＨＤ：ＥｘＣＧｖＨＤ）、限局的慢性ＧｖＨＤ（ｌｉｍｉｔｅｄ  ＣＧｖＨＤ）、広範型と限局型両方の慢性型ＧｖＨＤ（ｏｖｅｒａｌｌ  ＣＧｖＨＤ）のいずれかの項目とした。ＯＳとＮＲＭに対する主要イベントは、それぞれすべての要因による死、再発歴なし(ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｒｉｏｒ  ｒｅｌａｐｓｅ)による死と定義づけた。ＡＧｖＨＤは次の文献に記載の古典的な分類（Glucksberg,  H.  et  al.  Clinical  manifestations  of  graft-versus-host  disease  in  human  recipients  of  marrow  from  HL-A-matched  sibling  donors.  Transplantation  18,  295-304  (1974)、Przepiorka,  D.  et  al.  1994  Consensus  Conference  on  Acute  GVHD  Grading.  Bone  Marrow  Transplant.  15,  825-828  (1995)）に基づいて分類した。ＣＧｖＨＤは次の文献に記載のＳｅａｔｔｌｅ分類（Shulman,  H.M.  et  al.  Chronic  graft-versus-host  syndrome  in  man.  A  long-term  clinicopathologic  study  of  20  Seattle  patients.  Am.  J.  Med.  69,  204-217  (1980)）に基づき診断した。【００３８】
（統計解析）
全生存率の分析方法は、未調整解析としてＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法とＬｏｇ−ｒａｎｋテストを用い、多変量解析としてはＣｏｘ比例ハザード回帰を用いた。全生存率以外の指標の分析方法は、未調整解析として累積発生率とＧｒａｙのテストを用い、多変量解析としてＦｉｎｅ−Ｇｒａｙ比例ハザード回帰を用いた。これらの解析には統計ソフトＲ（ｖｅｒ．３．２．２）を用いた。多変量解析の調整因子は、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１のアリルマッチ度、性別、年齢、レシピエントの病期や状態、移植時の処置等である。尚、本研究の多変量解析では、変数選択を行ったあとに残った変数間の交互作用の項についても変数選択を再度行った。最終モデルに残った変数と変数間交互作用の両方について、移植後成績と有意に関連しているかどうかについてＷａｌｄテストを用いて検定した。【００３９】
統計解析ソフトとして、Ｒ言語環境（バージョン３．２．２）の以下のライブラリーを用いた。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線、Ｌｏｇ−ｒａｎｋテスト、累積発生曲線、及びＣｏｘ比例ハザード回帰にはｓｕｒｖｉｖａｌライブラリー（バージョン２．３８）を、Ｇｒａｙのテスト、及びＦｉｎｅ−Ｇｒａｙ比例ハザード回帰にはｃｍｐｒｓｋライブラリー（バージョン２．２）を、変数選択にはＭＡＳＳライブラリー（バージョン７．３）とｃｒｒｓｔｅｐ（バージョン２０１５−２）を、Ｗａｌｄテストにはａｏｄライブラリー（バージョン１．３）を用いた。パーミュテーションを用いたＬｏｇ−ｒａｎｋテストやＧｒａｙのテストは、ｃｌｉｎｆｕｎライブラリー（バージョン１．０）に含まれるｐｅｒｍｌｏｇｒａｎｋ関数と同様の方法で行った。【００４０】
＜実施例１＞広範性慢性ＧｖＨＤ（ＥｘＣＧｖＨＤ）に対するドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ−Ｃミスマッチの交互作用（組み合わせ）
上記の方法でドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づくＥｘＣＧｖＨＤの累積発生曲線（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｃｕｒｖｅｓ：ＣＩＣｓ）解析を行った。結果を図３、図４Ａ〜Ｃに示す。さらに、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの交互作用に基づくＦｉｎｅ−Ｇｒａｙ比例ハザード回帰による多変量解析を行った。結果を図５に示す。【００４１】
まず、図３に示すように、悪性（ｍａｌｉｇｎａｎｔ）疾患全体において、ＨＬＡ−Ｃがミスマッチであっても、ドナー側のＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）の遺伝子型が高発現型（ＣＣ）であれば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の８／８アリルマッチと同等レベルにＥｘＣＧｖＨＤの累積発生率が低く、低発現型（ＴＴ）であれば、ＥｘＣＧｖＨＤの累積発生率が高いことが明らかになった。そこでさらにレシピエントの原疾患ごとに分類して解析したところ、図４Ａ〜Ｃ、図５に示すように、ＭＤＳ患者以外で上記傾向があり、特にＡＬＬ患者において高値であることや、かかる傾向は、移植後４カ月以内の移植後初期に強く見られることが明らかとなった。すなわち、ＥｘＣＧｖＨＤはＨＬＡ−Ｃミスマッチ単独の存在でリスクが高くなるのではなく、ドナーのＮＬＲＰ３のｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６における低発現型（ＴＴ）と組み合わさった時に発症リスクが高くなること、上記傾向はすべての原疾患において同様ではなく、ＭＤＳ患者以外においてみられることが明らかとなった。【００４２】
＜実施例２＞２−４級急性ＧｖＨＤ（２−４ＡＧｖＨＤ）に対するレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ−Ｃミスマッチの交互作用
上記の方法でレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく２−４ＡＧｖＨＤの累積発生曲線解析を行った。結果を図６Ａ〜Ｅに示す。【００４３】
図６Ａに示すように、悪性（ｍａｌｉｇｎａｎｔ）疾患全体において、ＨＬＡ−Ｃ  ＭＭが０（８アリルマッチ）の場合には、レシピエント側のＮＬＲＰ３のＳＮＰの遺伝子型が高発現型（ＣＣ）であれば２−４ＡＧｖＨＤ累積発生率は低いが、ＨＬＡ−Ｃが１−２アリルミスマッチの場合、２−４ＡＧｖＨＤ累積発生率がむしろ高いことが明らかとなった。次に、図６Ｂ〜Ｅに示すように、レシピエントの原疾患ごとのサブグループ解析を行った。その結果、ＨＬＡ−Ｃが２アリルミスマッチかつレシピエント側のＮＬＲＰ３のＳＮＰの遺伝子型が高発現型（ＣＣ）の場合における上記２−４ＡＧｖＨＤ累積発生率は、ＡＭＬ又はＡＬＬ患者で高値であり、特にＡＬＬ患者において高値であった。上記結果から、ＨＬＡ−Ｃ座におけるアリルの適合度（マッチ／ミスマッチ）のみが２−４ＡＧｖＨＤ累積発生率に影響を与えるのではなく、ＨＬＡ−Ｃ座におけるアリルの適合度（マッチ／ミスマッチ）とＮＬＲＰ３のＳＮＰの遺伝子型の組み合わせが２−４ＡＧｖＨＤ累積発生率に影響を与えることが明らかとなった。換言すれば、２−４ＡＧｖＨＤ発症を予測する際には、ＨＬＡ−Ｃ座におけるアリルの適合度（マッチ／ミスマッチ）と共にＮＬＲＰ３のＳＮＰの遺伝子型も考慮する必要があることが明らかとなった。【００４４】
＜実施例３＞非再発死亡（ＮＲＭ）に対するドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせの影響
上記の方法でドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づくＮＲＭの累積発生曲線解析を行った。結果を図７Ａ、Ｂ、図８に示す。さらに、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの交互作用に基づくＦｉｎｅ−Ｇｒａｙ比例ハザード回帰による多変量解析を行った。結果を図９に示す。【００４５】
図７Ａ、Ｂ、図８に示すように、ＡＬＬ患者、及び６ｏｔｈｅｒｓ患者では、ＨＬＡ−Ｃがミスマッチでさらにドナー側のＮＬＲＰ３のＳＮＰが低発現型（ＣＴ又はＴＴ）であれば、ＮＲＭはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の８／８アリルマッチよりも累積発生率が高く、かかるリスクの傾向は、移植後４カ月以内の移植後初期に強く見られた。さらに、ＡＬＬ患者、及び６ｏｔｈｅｒｓ患者では、ＨＬＡ−Ｃがミスマッチでドナー側のＮＬＲＰ３のＳＮＰの遺伝子型が高発現型（ＣＣ）であれば予想外にもＮＲＭはＨＬＡ８／８アリルマッチよりも累積発生率はさらに低かった。上記結果から、ＨＬＡ−Ｃミスマッチ単独の存在でＮＲＭの発症リスクが高くなるのではなく、ドナーのＮＬＲＰ３のｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６におけるＳＮＰが低発現型（ＣＴ又はＴＴ）と組み合わさった時に発症リスクが高くなることが明らかとなった。なお、このＮＲＭの中で、移植後数か月以降の死についてはＥｘＧｖＨＤによる死亡と解釈できる。しかし、図７Ａ、Ｂ、図８、図９において、ドナー側のＮＬＲＰ３におけるＳＮＰが低発現型（ＣＴ又はＴＴ）であれば、移植後初期におけるＮＲＭ発症率の上昇が高いことから、数か月以降に加えて移植後初期のＮＲＭにもドナーのＮＬＲＰ３におけるＳＮＰとＨＬＡ−Ｃの交互作用が関与していることを示している。その詳細な機構は不明だが、例えば感染症による死亡に対するドナーのＮＬＲＰ３におけるＳＮＰとＨＬＡ−Ｃの特定の組み合わせによる防御作用等が考えられる。【００４６】
＜実施例４＞非再発死亡（ＮＲＭ）に対するレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせの影響
上記の方法でレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づくＮＲＭの累積発生曲線解析を行った。結果を図１０に示す。【００４７】
図１０に示すように、ＡＬＬ患者では、ＨＬＡ−Ｃがミスマッチでさらにレシピエント側のＮＬＲＰ３のＳＮＰが高発現型（ＣＣ）であればＮＲＭはＨＬＡ８／８アリルマッチよりもＮＲＭの累積発生リスクが高くなることが明らかとなった。かかるリスクの傾向は、移植後４カ月以内の移植後初期に見られたので、図６Ｃで示した急性ＧｖＨＤの影響と考えられる。【００４８】
＜実施例５＞全生存率（ＯＳ）に対するドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせの影響
上記の方法でドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づく全生存率のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線（ＫＭＣｓ）解析を行った。結果を図１１Ａ〜Ｃに示す。さらに、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの交互作用に基づくＣｏｘ比例ハザード回帰による多変量解析を行った。結果を図１２に示す。【００４９】
図１１Ａ〜Ｃ、１２に示すように、ＡＬＬ及び６ｐｔｈｅｒｓ患者では、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の８／８アリルマッチした場合、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰは低発現型（ＣＴ又はＴＴ）の方が高発現型（ＣＣ）よりもＯＳが高かった。ＨＬＡ−Ｃがミスマッチの場合では、移植後１．５年以内においてドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰは高発現型（ＣＣ）の方が低発現型（ＣＴ又はＴＴ）よりもＯＳが高かった。上記結果から、ＨＬＡ−Ｃ座におけるアリルの適合度（マッチ／ミスマッチ）のみがＯＳに影響を与えるのではなく、ＨＬＡ−Ｃ座におけるアリルの適合度（マッチ／ミスマッチ）とＮＬＲＰ３のＳＮＰの遺伝子型の組み合わせがＯＳに影響を与えることが明らかとなった。換言すれば、ＯＳを予測する際には、ＨＬＡ−Ｃ座におけるアリルの適合度（マッチ／ミスマッチ）と共にＮＬＲＰ３のＳＮＰの遺伝子型も考慮する必要があることが明らかとなった。一方、ＭＤＳ患者においてはＨＬＡ−Ｃ座におけるアリルの適合度（マッチ／ミスマッチ）とＮＬＲＰ３のＳＮＰの遺伝子型の組み合わせは全生存率に影響を与えなかった（図示せず）。なお、ＯＳは、ＮＲＭの影響に再発（による死亡）の影響を足し合わせる複合効果となり、再発はＮＲＭと反対の傾向を示したため（図示せず）、ＯＳはＮＲＭと比較して縦軸における差幅が小さくなった。【００５０】
＜実施例６＞全生存率（ＯＳ）へのレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせの影響
上記の方法でレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせに基づくＯＳのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線（ＫＭＣｓ）解析を行った。結果を図１３Ａ、Ｂに示す。【００５１】
上述の実施例２で示したようにＡＬＬの患者ではレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ−Ｃミスマッチの組み合わせが２−４ＡＧｖＨＤに強く影響する。この結果と一致して、図１３Ａ、Ｂに示すように、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰが高発現型（ＣＣ）でＨＬＡ−ＣがミスマッチであるＡＬＬ患者は移植直後の数か月のＯＳが低下した。また、ＡＭＬ患者の場合、高発現型（ＣＣ）でＡＧｖＨＤがやや上昇するが、ＯＳは高発現型（ＣＣ）と低発現型（ＣＴ＋ＴＴ）とで有意差は見られなかった。一方、ＭＤＳ患者においてはレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰによる影響は見られなかった（図示せず）。【００５２】
＜実施例７＞非再発死亡（ＮＲＭ）、再発、及び全生存率（ＯＳ）対するＣＧｖＨＤの影響
移植後１年以内のＣＧｖＨＤの発症の有無が、１年経過後のＮＲＭ、再発、及びＯＳにどのような影響を及ぼすかについて単変量解析を行った。結果を図１４Ａ、Ｂに示す。【００５３】
図１４Ａに示すように、ＡＭＬ患者の場合にはＣＧｖＨＤを発症した場合にはＮＲＭが起こりにくく、また、ＯＳが上昇していた。他方、図１４Ｂに示すように、ＡＬＬ又は６ｏｔｈｅｒｓ患者の場合には、ＣＧｖＨＤが発症した方がＮＲＭを起こしやすく、また、ＯＳが低下していた。この結果から、原疾患の種類によって、ＣＧｖＨＤ発症がその後のＮＲＭ、再発、及びＯＳへ及ぼす影響が異なることが明らかとなった。この結果は、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ−Ｃミスマッチの交互作用（組み合わせ）がＮＲＭやＯＳに対して有害な作用を示すのはＡＬＬ及び６ｏｔｈｅｒｓでありＡＭＬではないことをうまく説明する。【００５４】
＜実施例のまとめ＞
現在、同種造血幹細胞移植のドナー選択法は、ドナーとレシピエント間のＨＬＡのマッチングに基づいている。上記実施例により、ＭＤＳ以外の悪性血液疾患ではＨＬＡの適合度単独が重要なのではなく、ＨＬＡの適合度とＮＬＲＰ３のＳＮＰとの交互作用が重要であることが新たに判明した。すなわち、ＨＬＡ−ＣがミスマッチであってもＮＬＲＰ３のＳＮＰの適切な遺伝子型と組み合わされば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１完全マッチと同等もしくはそれ以上の良好な生存率若しくは合併症予防効果が得られることが明らかとなった。これらの結果をまとめて新しいドナー選択法の一例を図１５に示す。本発明の方法を用いて適切なドナーを選択することによって同種造血幹細胞移植における合併症が低減することが見込まれる。また、ＨＬＡの一部ミスマッチの場合でも適切なＳＮＰと組み合わせれば生存率がむしろ高くなることがあるという結果は意外であり、ＨＬＡの６／８−８／８アリルマッチを行っていない国、若しくは行うことができない国等では、今後ドナーの選択肢が広がることが期待される。また、ＧｖＨＤや死亡の起こる確率の高いＨＬＡとＮＬＲＰ３のＳＮＰの組み合わせをドナーとして選択せざると得ない場合においても、予後のハイリスク群として投薬等による予防や治療を考慮することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、同種造血幹細胞移植におけるドナーの選択において利用可能である。
【図１】
2018079499.tif 000004
【図２Ａ】
2018079499.tif 000005
【図２Ｂ】
2018079499.tif 000006
【図２Ｃ】
2018079499.tif 000007
【図３】
2018079499.tif 000008
【図４Ａ】
2018079499.tif 000009
【図４Ｂ】
2018079499.tif 000010
【図４Ｃ】
2018079499.tif 000011
【図５】
2018079499.tif 000012
【図６Ａ】
2018079499.tif 000013
【図６Ｂ】
2018079499.tif 000014
【図６Ｃ】
2018079499.tif 000015
【図６Ｄ】
2018079499.tif 000016
【図６Ｅ】
2018079499.tif 000017
【図７Ａ】
2018079499.tif 000018
【図７Ｂ】
2018079499.tif 000019
【図８】
2018079499.tif 000020
【図９】
2018079499.tif 000021
【図１０】
2018079499.tif 000022
【図１１Ａ】
2018079499.tif 000023
【図１１Ｂ】
2018079499.tif 000024
【図１１Ｃ】
2018079499.tif 000025
【図１２】
2018079499.tif 000026
【図１３Ａ】
2018079499.tif 000027
【図１３Ｂ】
2018079499.tif 000028
【図１４Ａ】
2018079499.tif 000029
【図１４Ｂ】
2018079499.tif 000030
【図１５】
2018079499.tif 000031
【配列表】
2018079499000001.app
【国際調査報告】
2018079499.tif 000032
2018079499.tif 000033
2018079499.tif 000034
2018079499.tif 000035