(57)【要約】  アミノ酸配列のレベルまで実体が解明された新規なＰＶＡ分解酵素を提供するとともに、その製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡ、これを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体を提供することを課題とし、下記（１）乃至（３）の特徴を有するポリビニルアルコール分解酵素、その製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡ、これを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体を提供することにより上記課題を解決する：（１）ポリビニルアルコールを酸化し、過酸化水素を生成する活性を有する。（２）β−ジケトンを加水分解する活性を有する。（３）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量１００，０００±２０，０００を示す。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）乃至（３）の特徴を有するポリビニルアルコール分解酵素：
（１）ポリビニルアルコールを酸化し、過酸化水素を生成する活性を有する；
（２）β−ジケトンを加水分解する活性を有する；及び
（３）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量１００，０００±２０，０００を示す。
【請求項２】
さらに、ポリビニルアルコール酸化活性が、下記（４）乃至（７）の特徴を有する請求項１記載のポリビニルアルコール分解酵素：
（４）至適温度
ｐＨ７．０、６０分間反応の条件下で、３５乃至４０℃；
（５）至適ｐＨ
２７℃、６０分間反応の条件下で、ｐＨ６．５乃至８．０；
（６）温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持の条件下で、４５℃まで安定；及び
（７）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ４．５乃至１０．５で安定。
【請求項３】
さらに、下記（８）の特徴を有する請求項１又は２記載のポリビニルアルコール分解酵素：
（８）Ｎ末端アミノ酸配列として、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。
【請求項４】
配列表における配列番号２又は３で示されるアミノ酸配列か、又は、それらアミノ酸配列において、ポリビニルアルコール分解酵素の活性を保持する範囲で１個以上のアミノ酸残基が欠失、付加若しくは置換したアミノ酸配列であって、且つ、配列表における配列番号２又は３で示されるアミノ酸配列との相同性（配列同一性）が８４％以上であるアミノ酸配列を有する請求項１乃至３のいずれかに記載のポリビニルアルコール分解酵素。
【請求項５】
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物由来の酵素である請求項１乃至３のいずれかに記載のポリビニルアルコール分解酵素。
【請求項６】
請求項４記載のポリビニルアルコール分解酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
配列表における配列番号４又は５で示される塩基配列か、若しくは、それらの塩基配列において、コードするポリビニルアルコール分解酵素の活性を保持する範囲で１個以上の塩基が欠失、付加若しくは置換した塩基配列であって、且つ、配列表における配列番号４又は５で示される塩基配列との相同性（配列同一性）が８２％以上である塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項６記載のＤＮＡ。
【請求項８】
遺伝子コードの縮重に基づき、コードするアミノ酸配列を変えることなく、配列表における配列番号４又は５で示される塩基配列における塩基の１個以上を他の塩基で置換した請求項６又は７記載のＤＮＡ。
【請求項９】
請求項６乃至８のいずれかに記載のＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９記載の組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項１１】
請求項１乃至５のいずれかに記載のポリビニルアルコール分解酵素の産生能を有する微生物を栄養培地で培養する工程、及び得られる培養物から、請求項１乃至５のいずれかに記載のポリビニルアルコール分解酵素を採取する工程を含むことを特徴とするポリビニルアルコール分解酵素の製造方法。  
【請求項１２】
微生物が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物である請求項１１記載のポリビニルアルコール分解酵素の製造方法。  
【請求項１３】
請求項１０記載の形質転換体を培養し、培養物から組換え型ポリビニルアルコール分解酵素を採取することを特徴とする組換え型ポリビニルアルコール分解酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリビニルアルコール分解酵素とその製造方法に関し、詳細には、新規ポリビニルアルコール分解酵素とその製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ、及び、形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリビニルアルコール（以下、「ＰＶＡ」と略称する。）は、酢酸ビニルのモノマーを重合させて得られるポリマーであるポリ酢酸ビニルを、鹸化（アルカリ加水分解）することにより得られる水溶性のポリマーであって、接着性、粘結性、造膜性、被膜性、界面活性に優れるとともに高い化学安定性を備えていることから、ビニロン繊維、繊維糊剤、紙加工剤、接着剤、フィルム、及び重合助剤等の原料として工業的に広く用いられている。ただし、繊維糊剤などの用途では、使用後にＰＶＡを除去する必要があり、ＰＶＡの除去には大量の水や、薬剤などが用いられることから、コストに及ぼす影響や環境への負荷が大きい。ＰＶＡは合成高分子であるが故に自然界にて分解され難いという不都合を有している。【０００３】
ＰＶＡを分解する手段としては、ＰＶＡを含む工場廃液を処理するための活性汚泥からＰＶＡ分解能を有する微生物を単離し、当該微生物を用いてＰＶＡを分解する試みが数多く報告されている。ＰＶＡ分解能を有する微生物として、特許文献１乃至５などには、シュードモナス、アシネトバクター、スフィンゴピクシス（以前はスフィンゴモナス、シュードモナスに分類）、コマモナス（紅色細菌、光合成細菌）、ミクロバクテリウム、エンテロバクター、コリネバクテリウム、ロドコッカス、カセオバクター、キサントモナス、ナイセリア、バチルス、ブレビバクテリウム、エッシェリヒア、アエロバクター、アルカリゲネス、アグロバクテリウム、アルスロバクター、パエニバチラス、カルディオバクテリウム、ストレプトマイセス、ポヴァリバクター（以前はステロイドバクターに分類）、サラッソスピラなどの細菌が開示されており、また、ペニシリウム、ゲオトリカムなどのカビ類、担子菌類も開示されている。【０００４】
微生物によるＰＶＡの分解は、一般に、ＰＶＡを酸化する酵素と酸化されたＰＶＡを加水分解する酵素との共同作用により行われることが報告されている（非特許文献１）。図１にＰＶＡの酵素分解メカニズムを模式的に示した。図１に見られるとおり、ＰＶＡを酸化する酵素としては、ＰＶＡ酸化酵素（ＰＶＡオキシダーゼ、「第二級アルコールオキシダーゼ（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ）」とも呼称される。）と、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするＰＶＡ脱水素酵素（ＰＶＡデヒドロゲナーゼ，ＰＶＡＤＨ）の２種類が知られており、一方、酸化されたＰＶＡを加水分解する酵素としては、酸化ＰＶＡ加水分解酵素（酸化ＰＶＡヒドロラーゼ（Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＰＶＡ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ、ＯＰＨ）、「β−ジケトン加水分解酵素」とも呼称される。）が知られている。【０００５】
シュードモナス属微生物由来の第二級アルコールオキシダーゼ（ＰＶＡ酸化酵素）及び酸化ＰＶＡ加水分解酵素については、１９７０年代後半から１９８０年代前半にかけて、酵素の精製とその性質がそれぞれ報告されており（非特許文献２及び３）、ＰＶＡ酸化酵素は分子量約５０，０００の単一ポリペプチドとして、また、酸化ＰＶＡ加水分解酵素は分子量約３８，０００の単一ポリペプチドとして、それぞれ特徴付けられている。さらに、特定のクロマトグラフィー用担体を用いてＰＶＡ酸化酵素と酸化ＰＶＡ加水分解酵素を効率的に分離精製する方法も報告されている（非特許文献４）。また、特許文献６には、シュードモナス属微生物の培養液から調製された「酵素組成物」が開示され、ＰＶＡを酸化可能な酵素と、酸化されたＰＶＡを加水分解可能な酵素とを含む当該「酵素組成物」が、ＰＶＡを含む文化財を修復する際のＰＶＡの除去に利用できることが記載されている。ＰＱＱを補酵素とするＰＶＡ脱水素酵素については、複数の微生物由来の酵素についてそのアミノ酸配列が明らかにされており（特許文献７、非特許文献５）、酸化ＰＶＡ加水分解酵素については、シュードモナス属微生物由来の酵素のアミノ酸配列（特許文献３を参照）や、その立体構造までが既に明らかにされている（非特許文献６）。その一方で、ＰＶＡ酸化酵素をポリペプチドとして単一なレベルまで精製し、理化学的性質を明らかにした報告例は数少なく、また、具体的なアミノ酸配列などは一切報告されていない。このためＰＶＡの分解にかかわる従来公知の酵素又は酵素群の実体には不明な点が多く、ＰＶＡの分解を産業的規模で安定的に、かつ効率良く行う上で十分なレベルにまでその実体が解明されたＰＶＡ分解酵素は未だ知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−０００２５９号公報
【特許文献２】特開２００５−２７８６３９号公報
【特許文献３】特開２００６−０４２６１１号公報
【特許文献４】特開２００６−０４２６１２号公報
【特許文献５】特開２００６−１８０７０６号公報
【特許文献６】特許第５８９１４７８号公報
【特許文献７】特開平０９−２０６０７９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍａｔｓｕｍｕｒａら、『マクロモレキュールズ（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）』、３２巻、７７５３−７７６１頁（１９９９年）
【非特許文献２】Ｍｏｒｉｔａら、『アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）』，第４３巻、１２２５−１２３５頁（１９７９年）
【非特許文献３】Ｓａｋａｉら、『アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）』，第４５巻、６３−７１頁（１９８１年）
【非特許文献４】Ｓａｋａｉら、『アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）』，第４７巻、１５３−１５５頁（１９８３年）
【非特許文献５】Ｓｈｉｍａｏら、『Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．』、６０巻、１０５６−１０６２頁（１９９６年）
【非特許文献６】Ｙａｎｇら、『Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．』、１５巻，１８８２−１８８６頁（２０１４年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、そのアミノ酸配列のレベルまで実体が解明された新規なＰＶＡ分解酵素を提供するとともに、その製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡ、これを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体を提供することにあり、以て、ＰＶＡの産業的規模での安定的かつ高効率の分解に資することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決するために、新規なＰＶＡ分解酵素に期待を込めて、ＰＶＡの分解に関与する酵素を産生する微生物について検討を重ねてきた。その過程で、従来よりＰＶＡ酸化酵素や酸化ＰＶＡ加水分解酵素を産生することが知られていたシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）  ＶＴ１Ｂ株（ＮＢＲＣ１１０４７８）が、意外にも、ＰＶＡ酸化活性と酸化ＰＶＡ加水分解活性の両方を併せ持ち、双頭酵素として単独でＰＶＡを分解できる、全く新規なＰＶＡ分解酵素を産生することを見出した。そして、当該ＰＶＡ分解酵素のアミノ酸配列並びに諸性質を明らかにするとともに、その製造方法を確立し、また、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体を確立して本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は、下記（１）乃至（３）の特徴を有する新規なＰＶＡ分解酵素を提供するとともに、その製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体を提供することによって上記課題を解決するものである：
（１）ＰＶＡを酸化し、過酸化水素を生成する活性を有する；
（２）β−ジケトンを加水分解する活性を有する；及び
（３）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量１００，０００±２０，０００を示す。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、その実体がアミノ酸配列レベル並びにＤＮＡレベルで解明された新規なＰＶＡ分解酵素とその製造方法を提供することができるので、分解酵素の産生も含めて、ＰＶＡの分解を工業的又は産業的規模で、より効率良く安定的に実行することが可能になるという利点が得られる。また、当該ＰＶＡ分解酵素は、ＰＶＡ酸化活性と酸化ＰＶＡ加水分解活性の両方を併せ持つ双頭酵素であり、他の酵素と併用する必要がなく、それ単独でＰＶＡを効率よく酸化及び分解することができるので、使い勝手が良いという利点を有している。このため、本発明が提供する新規なＰＶＡ分解酵素は、ＰＶＡの分解のみでなく、ＰＶＡ含有製品の改質、改良など、ＰＶＡが関与する幅広い分野に有利に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＰＶＡ酸化酵素と酸化ＰＶＡ加水分解酵素の共同作用によるＰＶＡの分解メカニズムを模式的に示した図である。
【図２】ＰＶＡ分解酵素の精製標品のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。
【図３】ＰＶＡ分解酵素の精製標品ＰＶＡ−ＡのＰＶＡ酸化活性の至適温度を示した図である。
【図４】ＰＶＡ分解酵素の精製標品ＰＶＡ−ＡのＰＶＡ酸化活性の至適ｐＨを示した図である。
【図５】ＰＶＡ分解酵素の精製標品ＰＶＡ−ＡのＰＶＡ酸化活性の温度安定性を示した図である。
【図６】ＰＶＡ分解酵素の精製標品ＰＶＡ−ＡのＰＶＡ酸化活性のｐＨ安定性を示した図である。
【図７】本発明のＰＶＡ分解酵素のＮ末端側前半部のアミノ酸配列と、公知のＰＶＡ脱水素酵素との相同性を調べた結果を示す図である。
【図８】本発明のＰＶＡ分解酵素のＣ末端側後半部のアミノ酸配列と、公知の酸化ＰＶＡ加水分解酵素との相同性を調べた結果を示す図である。
【図９】ＰＶＡ分解酵素、ＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ-Ｂの構造を模式的に示した図である。
【図１０】ＰＶＡ分解酵素ＰＶＡ−ＡをコードするＤＮＡを含む自律複製可能な組換えＤＮＡ「ｐＲＳＥＴ  Ａ−ＰＶＡ−Ａ」の構造を示す模式図である。
【図１１】基質ＰＶＡにＰＶＡ分解酵素ＰＶＡ−Ａを作用させて得られたＰＶＡ分解物のゲル濾過クロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、下記（１）乃至（３）の特徴を有する新規なＰＶＡ分解酵素に係るものである：
（１）ＰＶＡを酸化し、過酸化水素を生成する活性を有する；
（２）β−ジケトンを加水分解する活性を有する；及び
（３）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量１００，０００±２０，０００を示す。
【００１４】
本発明のＰＶＡ分解酵素は、上記（１）に示されるとおり、基質としてのＰＶＡを酸化するとともに過酸化水素を生成する反応を触媒する活性、すなわち、ＰＶＡ酸化活性を有している。ＰＶＡ酸化活性は、例えば、以下の方法により測定することができる。
【００１５】
＜ＰＶＡ酸化活性の測定方法＞
ＰＶＡ（試薬級ポリビニルアルコール、重合度２，０００、ナカライテスク株式会社販売）を２％（ｗ／ｖ）の濃度になるよう１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した基質溶液０．５ｍＬに、２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム溶液を１５μＬ添加し、これに酵素液０．５ｍＬを添加し２７℃で６０分間振トウしながら反応させる。反応後、反応液０．３２ｍＬをチタニウム試薬０．８ｍＬと混合して反応を停止させ、酵素反応により生成した過酸化水素とチタニウム試薬が反応して生ずる黄色い呈色を４１０ｎｍの吸光度（Ａ４１０）を指標に測定する。別途、基質溶液に酵素液を添加し、直ちにチタニウム試薬と混合し同様に測定した値を反応０分の値とし、以下に示す式に基づき生成した過酸化水素の量を求めＰＶＡ酸化活性を算出する。因みに、過酸化水素が３．６５μモル／ｍＬ生成すると、４１０ｎｍの吸光度（Ａ４１０）は「１」変化することが分かっているので、下記式１においては、吸光度の変化量に「３．６５」の係数が乗算されている。ＰＶＡ酸化活性１単位は、上記条件下で１分間に１μモルの過酸化水素を生成する酵素量と定義する。なお、チタニウム試薬は、硫酸チタン（ＩＶ）溶液（５％、ナカライテスク株式会社販売）を１０％（ｗ／ｗ）硫酸にて２５倍希釈して調製する。
【００１６】
式１：
【数１】
2018159497.tif 000003
【００１７】
また、本発明のＰＶＡ分解酵素は、上記（２）に示されるとおり、β−ジケトンを加水分解する活性、すなわち、β−ジケトン加水分解活性を有している。β−ジケトン加水分解活性を有する酵素はβ−ジケトン構造を有する酸化されたＰＶＡ（酸化ＰＶＡ）を加水分解することができる。β−ジケトン加水分解活性は、β−ジケトン構造を有する酸化ＰＶＡのモデル化合物である２，４−ペンタンジオンの加水分解を調べることで確認できる。ＰＶＡ分解酵素が２，４−ペンタンジオンを加水分解するとアセトンと酢酸を生成する。したがって、β−ジケトン加水分解活性は、２，４−ペンタンジオンを基質として用い、例えば、下記の方法で確認することができる。
【００１８】
＜β−ジケトン加水分解活性の確認方法＞
２，４−ペンタンジオン（試薬、和光純薬工業株式会社販売）を０．２％（ｗ／ｖ）の濃度になるように調製した５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬを基質溶液とし、これに酵素液０．２ｍＬ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．８ｍＬを添加し、２７℃で３時間振トウして反応させる。反応後、２ｍＬの反応液をガラスバイアルに分注、密閉し、９５℃、４０分間加熱し、バイアル中の気体１ｍＬを採取して下記のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析に供することにより、２，４−ペンタンジオンの加水分解産物であるアセトンを検出する。アセトンの生成が認められた酵素液を「β−ジケトン加水分解活性あり」と判定する。
【００１９】
（ＧＣ条件）
装置：ＧＣ−２０１０  Ｐｌｕｓ（株式会社島津製作所製）
カラム：ＤＢ−５（Ｐａｒｔ  ｎｕｍｂｅｒ．１２２−５０３２）（アジレント・テクノロジー株式会社製）
気化室温度：１５０℃；                注入モード：スプリット；
キャリアガス：ヘリウム；
制御モード：線速度                  圧力：１１４．６ｋＰａ
全流量：１２．６ｍＬ／分            カラム流量：１．６ｍＬ／分
線速度：３５．０ｃｍ／秒            パージ流量：３．０ｍＬ／分
スプリット比：５．０
カラム温度：４０℃；                  平衡時間：１．０分；
カラム温度プログラム：カラム温度４０℃で５分間保持した後、１２分かけて１００℃まで５℃／分で昇温し、次いで、１５分かけて２５０℃まで１０℃／分で昇温した後、２５０℃で３分間保持
検出器：ＦＩＤ；                      検出器温度：２６０℃；
【００２０】
本発明のＰＶＡ分解酵素は、上述したＰＶＡ酸化活性（特徴（１））とβ−ジケトン加水分解活性（特徴（２））とを併せ持つことによって、ＰＶＡ分解活性を有し、単独でＰＶＡ分解酵素として機能するものであるが、ＰＶＡ分解酵素としての活性は、例えば、下記の方法でＰＶＡの分解にともなうＰＶＡ溶液の粘度低減を指標として測定することができる。
【００２１】
＜ＰＶＡ分解活性（粘度低減活性）の測定方法＞
ＰＶＡ（試薬級ポリビニルアルコール、重合度２，０００、ナカライテスク株式会社販売）を２％（ｗ／ｖ）の濃度になるよう１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した基質溶液０．５ｍＬに、２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム溶液を１５μＬ添加し、これに酵素液０．５ｍＬを添加し２７℃で６０分間振トウしながら反応させる。反応後、反応液０．６ｍＬを用い、コーンプレート型粘度計（商品名『ＤＶ−ＩＩ＋Ｐｒｏ』、ブルックフィールド社製）を使用して、３０℃で粘度を測定する。別途、基質溶液に酵素液を添加し、直ちに測定した粘度を反応０分の粘度とし、下記式に基づきＰＶＡ分解活性を算出する。ＰＶＡ分解活性１単位は、上記条件下、１分間に１０％の相対粘度の低減を引き起こす酵素量と定義する。
【００２２】
式２：
【数２】
2018159497.tif 000004
【００２３】
さらに、本発明のＰＶＡ分解酵素は、通常、上記（３）に示される特徴、すなわち、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、１００，０００±２０，０００の分子量を示すという特徴を有する。
【００２４】
また、本発明のＰＶＡ分解酵素の好適な一態様としては、ＰＶＡ酸化活性に関し、下記（４）乃至（７）の酵素学的性質を有する酵素が挙げられる：
（４）至適温度
ｐＨ７．０、６０分間反応の条件下で、３５乃至４０℃；
（５）至適ｐＨ
２７℃、６０分間反応の条件下で、ｐＨ６．５乃至８．０；
（６）温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持の条件下で、４５℃まで安定；及び
（７）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ４．５乃至１０．５で安定。
【００２５】
さらに、本発明のＰＶＡ分解酵素のより好適な一態様としては、下記（８）の特徴をさらに有する酵素が挙げられる：
（８）Ｎ末端アミノ酸配列として、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。
【００２６】
本発明のＰＶＡ分解酵素は、通常、ポリペプチドとして所定のアミノ酸配列を有しており、その好適な例としては、例えば、配列表における配列番号２又は３で示されるアミノ酸配列、又は、それらに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列番号２又は３で示されるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する酵素としては、ＰＶＡを酸化し過酸化水素を生成する活性、及び、β−ジケトンを分解する活性を保持する範囲で、配列番号２又は３で示されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有するものが挙げられ、配列表における配列番号２又は３で示されるアミノ酸配列に対し、通常、８４％以上、望ましくは、９０％以上、さらに望ましくは、９５％以上の相同性（配列同一性）を有するアミノ酸配列を有するものが好適である。
【００２７】
本発明のＰＶＡ分解酵素のアミノ酸配列として例示される、配列表における配列番号２又は３で示されるアミノ酸配列は、実験の項で後述するように、いずれもアミノ酸配列のＮ末端側前半部に公知のＰＶＡ脱水素酵素と相同性を示す領域が、また、Ｃ末端側後半部に公知の酸化ＰＶＡ加水分解酵素と相同性を示す領域がそれぞれ存在するという、特徴的な構造を有するアミノ酸配列である。このような特徴的なアミノ酸配列を有しているという知見は、本発明のＰＶＡ分解酵素が双頭酵素として、そのポリペプチドのＮ末端側前半部でＰＶＡを酸化し、Ｃ末端側後半部で酸化ＰＶＡを加水分解している可能性を示唆している。
【００２８】
なお、後述する実験の項でも示すとおり、ポリペプチドのＮ末端側前半部に由来するＰＶＡ酸化酵素フラグメントと、ポリペプチドのＣ末端側後半部に由来する酸化ＰＶＡ加水分解酵素フラグメントが、シュードモナス・スピーシーズ  ＶＴ１Ｂ株の培養液中に実際に認められたことから、本発明のＰＶＡ分解酵素が双頭酵素として機能しており、当該Ｎ末端側前半部と当該Ｃ末端側後半部とにそれぞれＰＶＡ酸化酵素と酸化ＰＶＡ加水分解酵素が存在していることが実証された。このことは、必要に応じ、本発明のＰＶＡ分解酵素を人為的にプロテアーゼなどで限定分解することにより、ＰＶＡ酸化酵素と酸化ＰＶＡ加水分解酵素とを別々に調製できることを物語るものである。
【００２９】
本発明のＰＶＡ分解酵素はその給源によって制限されないものの、好ましい給源として、シュードモナス属に属する微生物が挙げられ、本発明者らが見出した微生物、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＶＴ１Ｂ株又はその変異株が好適に用いられる。
【００３０】
本発明のＤＮＡとは、前述した本発明のＰＶＡ分解酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ全般を意味する。本発明のＤＮＡは、本発明のＰＶＡ分解酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するものである限り、それが天然由来のものであっても、人為的に合成されたものであってもよい。天然の給源としては、例えば、シュードモナス・スピーシーズ  ＶＴ１Ｂ株を含むシュードモナス属の微生物が挙げられ、これらの菌体から本発明のＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを得ることができる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で約５乃至１０日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを菌体外に溶出させる。このとき、プロテアーゼなどの蛋白質分解酵素を併用したり、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理などの常法を適用すれば目的のゲノムＤＮＡが得られる。本発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号２又は３で示されるアミノ酸配列に基づいて化学合成すればよい。また、当該ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーとなる化学合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ合成することも有利に実施できる。
【００３１】
本発明のＤＮＡは、通常、所定の塩基配列を有しており、その一例としては、配列表における配列番号４又は５で示される塩基配列、又はそれらに相同的な塩基配列、さらには、それらの塩基配列に相補的な塩基配列が挙げられる。配列表における配列番号４又は５で示される塩基配列に相同的な塩基配列を有するＤＮＡとしては、コードするＰＶＡ分解酵素の活性を保持する範囲で、配列番号４又は５で示される塩基配列において１個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列を有するものが挙げられ、配列番号４又は５で示される塩基配列に対し、通常、８２％以上、望ましくは、８５％以上、さらに望ましくは、９０％以上、またさらに望ましくは９５％以上の相同性（配列同一性）を有する塩基配列を有するものが好適である。また、これらＰＶＡ分解酵素をコードするＤＮＡにおいて、遺伝子コードの縮重に基づき、それぞれがコードするＰＶＡ分解酵素のアミノ酸配列を変えることなく塩基の１個又は２個以上を他の塩基に置換したものも当然、本発明のＤＮＡに包含される。
【００３２】
本発明のＤＮＡを、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとすることも有利に実施できる。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなり、ＤＮＡが入手できれば、常法の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、プラスミド、ファージ又はコスミド等を用いることができ、導入される細胞又は導入方法に応じて適宜選択できる。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。宿主細胞の種類に応じて、確実に上記遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。かかる発現ベクターとしては、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウィルスベクター、レトロウィルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクター及びウィルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント及びウィルス（例えば、バキュロウィルス、パポバウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、トリポックスウィルス、仮性狂犬病ウィルス、ヘルペスウィルス、レンチウィルス及びレトロウィルス））並びにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミド及びファージミド）を利用可能である。
【００３３】
細菌における使用に好ましいベクターとしては、例えば、ｐＱＥ−７０、ｐＱＥ−６０、ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ６ａ、ｐＮＨ１８Ａ及びｐＮＨ４６Ａ；並びにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０及びｐＲＩＴ５などが挙げられる。また、真核生物における使用に好ましいベクターとしては、ｐＷＬＮＥ０、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ；並びにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬなどが挙げられる。
【００３４】
本発明のＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、まず、目的とするＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製することができる。
【００３５】
このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母をはじめとする適宜の宿主微生物に導入することができる。形質転換体を取得するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、栄養培地で培養し、ＰＶＡ分解酵素を産生するものを選択すればよい。
【００３６】
本発明のＰＶＡ分解酵素は、ＰＶＡ酸化活性と酸化ＰＶＡ加水分解活性とを併せ持ち、さらに、実験の項で後述するように、酵素ポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端側前半部に公知のＰＶＡ脱水素酵素のアミノ酸配列と低いながらも相同性を示す領域を有し、また、Ｃ末端側後半部に公知の酸化ＰＶＡ加水分解酵素のアミノ酸配列と比較的高い相同性を示す領域を有する。この知見に基づいて、本発明のＤＮＡ、すなわち、本発明のＰＶＡ分解酵素をコードするＤＮＡの中間部に終始コドン、ターミネーター配列などを挿入することにより、ＰＶＡ分解酵素のＮ末端側前半部のみのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを人為的に創出し、組換えＤＮＡ技術を用いて適宜の宿主微生物中でその改変遺伝子を発現させることにより、ＰＶＡ酸化活性のみを有するポリペプチド（酵素）を創出でき、これを組換え型ＰＶＡ酸化酵素として製造及び利用できる。
【００３７】
本発明のＰＶＡ分解酵素のアミノ酸配列として例示した配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列と、同じく配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列とは、実験の項で後述するとおり、アミノ酸配列全体では相同性（配列同一性）が約８４％を示すものの、公知のＰＶＡ脱水素酵素のアミノ酸配列との相同性を有するＮ末端側前半部約４５０アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の領域に限定すれば、その相同性（配列同一性）は約９０％となる。このことから、上記で創出されるＰＶＡ酸化活性のみを有する酵素としては、配列表における配列番号２又は３で示されるアミノ酸配列のＮ末端側前半部約４５０アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するか、又は、当該アミノ酸配列において、約９０％の相同性（配列同一性）を維持する範囲内で１個以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換した変異体酵素を挙げることができる。
【００３８】
一方、同様に上述した知見に基づいて、本発明のＤＮＡ、すなわち、本発明のＰＶＡ分解酵素をコードするＤＮＡの中間部にプロモーター配列、開始コドン、分泌シグナル配列をコードする塩基配列などを挿入することにより、本発明のＰＶＡ分解酵素のＣ末端側後半部のみのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを人為的に創出し、同様に発現させることにより、酸化ＰＶＡ加水分解活性のみを有するポリペプチド（酵素）を創出でき、これを組換え型酸化ＰＶＡ加水分解酵素として利用できる。
【００３９】
また、上記のとおり、本発明のＰＶＡ分解酵素のアミノ酸配列として例示した配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列と、同じく配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列とは、アミノ酸配列全体では相同性（配列同一性）が約８４％を示すものの、公知の酸化ＰＶＡ加水分解酵素のアミノ酸配列との相同性を有するＣ末端側後半部約３４０アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の領域に限定すれば、その相同性（配列同一性）は約８５％となる。このことから、上記で創出される酸化ＰＶＡ加水分解活性のみを有する酵素としては、配列表における配列番号２又は３で示されるアミノ酸配列のＣ末端側後半部約３４０アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するか、又は、当該アミノ酸配列において、約８５％の相同性（配列同一性）を維持する範囲内で１個以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換した変異体酵素を挙げることができる。
【００４０】
さらに、本発明のＰＶＡ分解酵素のアミノ酸配列として例示した配列表における配列番号２及び３で示されるアミノ酸配列は、そのいずれにおいても、Ｎ末端側前半部のＰＶＡ脱水素酵素のアミノ酸配列と相同性を示す領域とＣ末端側後半部の酸化ＰＶＡ加水分解酵素のアミノ酸配列と相同性を示す領域との間に、約９０乃至１００アミノ酸残基の配列からなるリンカー部を有している。本発明のＰＶＡ分解酵素がＮ末端側前半部のみでＰＶＡ酸化酵素の機能を有し、Ｃ末端側後半部のみで酸化ＰＶＡ加水分解酵素の機能を有しているのであれば、当該リンカーが２種類の酵素活性に悪影響を及ぼすことなく、双頭酵素の構成に役立っていると考えられる。当該リンカー部は、本発明のＰＶＡ分解酵素のみでなく、他の適宜の２種類の酵素を連結し双頭酵素とするために利用できる可能性がある。
【００４１】
本発明のＰＶＡ分解酵素産生能を有する微生物(形質転換体を含む）の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、ＰＶＡ分解酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地及び天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が生育に利用できる物であればよく、例えば、グリセリン、エチレングリコール、ＰＶＡなどのポリアルコール類、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これらの部分分解物やグルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択できる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、及び、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。
【００４２】
微生物の培養は、通常、温度１５乃至３７℃でｐＨ５．５乃至１０の範囲、好ましくは温度２０乃至３４℃でｐＨ５．５乃至８．５の範囲から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は当該微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは５日間乃至１０日間である。また、培養条件における培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したりするなどの手段を適宜採用する。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい。
【００４３】
このようにして微生物を培養した後、本発明のＰＶＡ分解酵素を含む培養物を回収する。ＰＶＡ分解酵素の活性は、主に培養物から菌体を除去して得られる培養上清に認められ、培養上清を粗酵素液として採取することも、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去するには公知の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。培養上清をそのまま粗酵素液として用いることができるものの、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空膜などを用いた膜濃縮法などを採用することができる。
【００４４】
上記のように本発明のＰＶＡ分解酵素は、粗酵素液をそのまま又は濃縮して用いることができるものの、必要に応じて、公知の方法によって、さらに分離・精製して利用することもできる。例えば、実験の項で後述するように、培養液の処理物を硫安塩析して濃縮した部分精製酵素を透析後、『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｓ』を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、『ＣＭ−トヨパール６５０Ｓ』を用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて精製することにより、本発明のＰＶＡ分解酵素を電気泳動的に単一な酵素として得ることができる。また、ＰＶＡ分解酵素の精製には、その他、疎水カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、調製用等電点電気泳動などの適宜の精製方法が有利に利用できる。
【００４５】
ＰＶＡ分解酵素が組換え型酵素である場合には、宿主の種類によっては菌体内に酵素が蓄積することがある。このような場合には、菌体又は培養物をそのまま使用することも可能であるものの、通常は使用に先立ち、必要に応じて、浸透圧ショックや界面活性剤により菌体から抽出した後、又は、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより組換え型酵素を菌体又は菌体破砕物から分離して用いることも有利に実施できる。
【００４６】
本発明のＰＶＡ分解酵素の基質としてのＰＶＡは、その分子量（又は重合度）、鹸化度により、特に限定されるものではないが、一般的には、分子量は１５，０００〜２００，０００（重合度は４００〜３，９００）、鹸化度は７０〜９９モル％等のものが挙げられる。
【００４７】
本発明のＰＶＡ分解酵素を基質であるＰＶＡに作用させるに際しては、その基質濃度は特に限定されず、例えば、基質濃度０．１％（ｗ／ｖ）の比較的低濃度の溶液を用いた場合でも、本発明のＰＶＡ分解酵素の反応は進行してＰＶＡを分解する。工業的には、基質濃度１％（ｗ／ｖ）以上が好適であり、この条件でＰＶＡを有利に分解できる。反応温度は反応が進行する温度、即ち５５℃付近までで行えばよい。好ましくは２５乃至５０℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通常、４．５乃至８．０の範囲、好ましくはｐＨ５．０乃至７．５の範囲に調整するのがよい。酵素の使用量と反応時間とは密接に関係しており目的とする酵素反応の進行により適宜選択すればよい。
【００４８】
以下、実験により本発明を詳細に説明する。
【００４９】
＜実験１：シュードモナス・スピーシーズ  ＶＴ１Ｂ株（ＮＢＲＣ１１０４７８）の培養と粗酵素剤の調製＞
ＰＶＡ（試薬級ポリビニルアルコール、重合度５００、ナカライテスク株式会社販売）１ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム０．３ｇ／Ｌ、リン酸一カリウム１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム１ｇ／Ｌ及び水からなる液体培地をｐＨ７．０に調整後オートクレーブ（１２１℃、２０分間）にて滅菌し、この滅菌培地に、別途ろ過滅菌した硫酸マグネシウム・７水和物、塩化カルシウム・２水和物及び硫酸第二鉄・７水和物をそれぞれ終濃度０．５ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ及び０．０２ｇ／Ｌとなるように添加し、さらに、ろ過滅菌した塩酸チアミン及びピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）をそれぞれ終濃度０．０１ｇ／Ｌ及び１０μｇ／Ｌとなるように添加して得られる液体培地を培養に用いた。
【００５０】
平板寒天培地にて継代培養したシュードモナス・スピーシーズ  ＶＴ１Ｂ株（ＮＢＲＣ１１０４７８）を白金耳でかきとり、滅菌した０．８５％食塩水（約２ｍＬ）に懸濁した。懸濁液の濁度（波長６６０ｎｍの吸光度、Ａ６６０）を０．５に調整し、上記液体培地３ｍＬを入れた試験管に６０μＬ植菌し、２７℃、２４０ｒｐｍで５日間振トウ培養してシード培養とした。
【００５１】
さらに消泡剤（アデカノールＬＧ−１２６）を終濃度０．２ｇ／Ｌとなるように添加した以外は上記液体培地と同じものを２００ｍＬずつ２０本の５００ｍＬ容三角フラスコに分注し、それぞれに、上記で得たシード培養液を２％（ｖ／ｖ）ずつ植菌し、２７℃、２４０ｒｐｍで１０日間振トウ培養し、メイン培養とした。培養後、培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清約４Ｌを粗酵素液として得た。粗酵素液のＰＶＡ酸化活性は、全活性として約１３９単位であった。
【００５２】
＜実験２：ＰＶＡ分解酵素の精製＞
実験１で得た培養上清４Ｌに、終濃度６０％飽和となるように硫安を添加し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。生成した塩析沈殿物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、硫安塩析透析液として約４５ｍＬを得た。この硫安塩析透析液を『ＤＥＡＥ−トヨパール  ６５０Ｓ』ゲル（東ソー株式会社製）を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量２４ｍＬ）に供した。ＰＶＡ酸化活性は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したカラムに吸着することなく非吸着画分に溶出する活性画分と、カラムに吸着し同緩衝液の食塩濃度を０Ｍから０．５Ｍまで直線的に上昇させるグラジエント溶出にて溶出する活性画分とに分かれた。『ＤＥＡＥ−トヨパール  ６５０Ｓ』ゲルに吸着し食塩で溶出させた活性画分を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析してＰＶＡ分解酵素精製標品（ＰＶＡ−Ｂ）とした。
【００５３】
次いで、『ＤＥＡＥ−トヨパール  ６５０Ｓ』を用いた陰イオン交換カラムに非吸着であった活性画分を『ＣＭ−トヨパール  ６５０Ｓ』ゲル（東ソー株式会社製）を用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量２３ｍＬ）に供した。ＰＶＡ酸化活性は『ＣＭ−トヨパール  ６５０Ｓ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．０８Ｍ付近に溶出した。活性画分を回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析してＰＶＡ分解酵素精製標品（ＰＶＡ−Ａ）とした。
【００５４】
上記精製工程の各段階におけるＰＶＡ分解酵素の、ＰＶＡ酸化活性としての全活性、全蛋白、比活性及び収率を表１にまとめた。また、別途、培養上清（粗酵素）と精製酵素標品について定性的に確認した２，４−ペンタンジオン分解活性と、ＰＶＡ酸化活性の測定と併せて精製工程の各段階で測定したＰＶＡ分解活性について、それぞれ表１に併記した。なお、表１における２，４−ペンタンジオン分解活性についての表記「○」は、２，４−ペンタンジオンの加水分解産物であるアセトンが検出されたことを意味する。
【００５５】
【表１】
2018159497.tif 000005
【００５６】
表１に見られるとおり、ＰＶＡを酸化して過酸化水素を生成するＰＶＡ酸化活性とβ−ジケトンである２，４−ペンタンジオンを加水分解する活性、さらには、ＰＶＡ分解活性（粘度低減活性）のいずれをも有する２種類の精製酵素標品「ＰＶＡ−Ａ」及び「ＰＶＡ−Ｂ」が得られた。
【００５７】
ＰＶＡ分解酵素精製標品としてのＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂを、それぞれＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（８乃至１６ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、純度を検定したところ、いずれも単一な蛋白バンドを示し、純度の高い標品であることが判明した。
【００５８】
＜実験３：ＰＶＡ分解酵素の性質＞
＜実験３−１：分子量＞
実験２で得たＰＶＡ分解酵素精製標品、すなわち、ＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂを、それぞれＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（８乃至１６ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（商品名『プレシジョンＰｌｕｓプロテイン未着色スタンダード』、日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社販売）と比較して分子量を測定した。結果を図２に示す。なお、図２において、符号Ｍは、同時に電気泳動した分子量マーカーを、符号Ａ及びＢは、それぞれＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂを意味する。図２に見られるとおり、ＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂはいずれもほぼ単一な蛋白バンドを示し、また、分子量マーカーとの対比により、ほぼ同等の分子量、１００，０００±２０，０００を有することが判明した。
【００５９】
＜実験３−２：至適温度及び至適ｐＨ＞
実験２で得たＰＶＡ分解酵素精製標品の内、ＰＶＡ−Ａを用い、ＰＶＡ酸化活性を指標として、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定法に準じ調べた。これらの結果を図３（至適温度）、図４（至適ｐＨ）に示した。なお、図４中の符号●、■及び▲は、それぞれ、ｐＨコントロールに酢酸緩衝液、リン酸緩衝液及びグリシン−ＮａＯＨ緩衝液を用いて測定した値を意味する。ＰＶＡ酸化活性の至適温度は、ｐＨ７．０、６０分間反応の条件下で、３５乃至４０℃であり、至適ｐＨは、２７℃、６０分間反応の条件下で６．５乃至８．０であることが判明した。また、詳細なデータは省略するものの、ＰＶＡ−ＢもＰＶＡ−Ａとほぼ同じ至適温度及び至適ｐＨを示した。
【００６０】
＜実験３−３：温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験２の方法で得たＰＶＡ分解酵素精製標品の内、ＰＶＡ−Ａを用い、ＰＶＡ酸化活性を指標として、温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、酵素溶液を各ｐＨの１００ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを７．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図５（温度安定性）、図６（ｐＨ安定性）に示した。なお、図６中の符号●、■、▲及び◆は、それぞれ、ｐＨコントロールに酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液及び塩化カリウム−ＮａＯＨ緩衝液を用いて得た値を意味する。図５から明らかなように、ＰＶＡ酸化活性の温度安定性は４５℃までであることが判明した。また、図６から明らかなように、ＰＶＡ酸化活性のｐＨ安定性はｐＨ４．５乃至１０．５の範囲であることが判明した。また、詳細なデータは省略するものの、ＰＶＡ−ＢもＰＶＡ−Ａとほぼ同じ温度安定性及びｐＨ安定性を示した。
【００６１】
＜実験３−４：ＰＶＡ酸化活性に及ぼす各種金属塩の影響＞
実験２の方法で得たＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂの精製酵素標品を用い、ＰＶＡ酸化活性を指標として、各種金属塩が酵素活性に及ぼす影響を濃度１ｍＭの金属塩の存在下で活性測定方法に準じて調べた。結果を表２に示した。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
表２に見られるとおり、ＰＶＡ酸化活性に及ぼす金属塩の影響においてＰＶＡ−ＡとＰＶＡ−Ｂとの間に大きな差は認められず、Ｈｇ２＋、Ｆｅ３＋イオンで著しく阻害され、また、ＥＤＴＡによっても阻害されることが判明した。
【００６４】
＜実験３−５：ＰＶＡ酸化活性についての基質特異性＞
実験２の方法で得たＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂの精製酵素標品を用い、基質として各種の第二級アルコール、第一級アルコール、他に作用させ、ＰＶＡ酸化活性についての基質特異性を調べた。すなわち、鎖長の異なる第一級アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、デカノール）、第二級アルコール（２−プロパノール、２−ペンタノール、２−ヘキサノール、４−ヘプタノール、２−オクタノール、４−デカノール、２，４−ペンタンジオール）、第三級アルコール（ｔｅｒｔ−ブタノール）に対する酵素活性を測定した。基質濃度は１％（ｖ／ｖ）とし、水に溶解しないものは懸濁し飽和濃度とした。結果を表３に示した。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
表３に見られるとおり、ＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−ＢはＰＶＡに対する酸化活性を１００％とした場合の相対活性で、第二級アルコールである４−ヘプタノールに対して１２乃至２１％と弱く作用し、同じく第二級アルコールである２−ヘキサノール、２−オクタノールに対して３乃至８％と僅かに作用した以外は、他の第二級アルコール、第一級アルコール、第三級アルコール（ｔｅｒｔ−ブタノール）、ジオールにはほとんど作用しなかった。
【００６７】
＜実験３−６：Ｎ末端アミノ酸配列＞
実験２で得たＰＶＡ分解酵素の精製標品、すなわち、ＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−ＢをそれぞれＮ末端アミノ酸配列分析に供し、Ｎ末端から２０残基までのアミノ酸配列を解析した。なお、Ｎ末端アミノ酸配列分析は、ペプチドシーケンサー（装置名『ＰＰＳＱ−３１Ａ』、島津製作所製）を用いて実施した。その結果、ＰＶＡ−Ａは、配列表における配列番号１１で示されるアミノ酸配列、すなわち、アラニン−グルタミン酸−アスパラギン−トリプトファン−プロリン−メチオニン−フェニルアラニン−グリシン−リジン−アスパラギン−チロシン−グルタミン酸−アスパラギン−スレオニン−アルギニン−アラニン−スレオニン−セリン−アスパラギン酸−スレオニン；のアミノ酸配列を、また、ＰＶＡ−Ｂは、配列表における配列番号１２で示されるアミノ酸配列、すなわち、アラニン−グルタミン酸−アスパラギン−トリプトファン−プロリン−メチオニン−フェニルアラニン−グリシン−リジン−アスパラギン−チロシン−グルタミン酸−アスパラギン−セリン−アルギニン−アラニン−スレオニン−アラニン−アスパラギン酸−スレオニン;のアミノ酸配列を、それぞれ有していることが判明した。さらに、両者は、Ｎ末端から１３残基までは同一のアミノ酸配列、すなわち、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列を共通して有していることが判明した。
【００６８】
＜実験４：シュードモナス・スピーシーズ  ＶＴ１Ｂ株（ＮＢＲＣ１１０４７８）の全ゲノム解析＞
本発明のＰＶＡ分解酵素をコードするＤＮＡの塩基配列並びにＰＶＡ分解酵素のアミノ酸配列を決定するため、同酵素を産生するシュードモナス・スピーシーズ  ＶＴ１Ｂ株（ＮＢＲＣ１１０４７８）の全ゲノム解析を行った。
【００６９】
＜実験４−１：ゲノムＤＮＡの調製＞
平板寒天培地にて継代培養したシュードモナス・スピーシーズ  ＶＴ１Ｂ株（ＮＢＲＣ１１０４７８）を一白金耳かきとり、実験１で用いた液体培地３ｍＬを入れた試験管に植菌し、２７℃、２４０ｒｐｍで５日間振トウ培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して回収した菌体より、市販の全ＤＮＡ精製キット（商品名『ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ』，ＱＩＡＧＥＮ社販売）を用いて、常法によりゲノムＤＮＡを調製した。
【００７０】
＜実験４−２：次世代シーケンサーを用いた全ゲノム塩基配列の決定＞
実験４−１で得たゲノムＤＮＡを市販のキット(商品名『Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ』、イルミナ社販売)を用いて酵素的に断片化し、断片化したＤＮＡの末端の平滑化処理とＤＮＡ末端へのアダプター配列の付加を行うことによりＤＮＡ断片をライブラリー化し、さらにＰＣＲで増幅した後、市販のＤＮＡ精製キット（商品名『ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ』、ベックマン・コールター社販売）を用いて精製した。次いで、ライブラリー化したＤＮＡ断片の塩基配列を次世代シーケンサー（装置名『ＭｉＳｅｑ』、イルミナ社製）を用いて決定し、決定した各ＤＮＡ断片の塩基配列（コンティグ配列）をコンピュータ上で統合することにより、全ゲノムＤＮＡの塩基配列を得た。
【００７１】
次いで、遺伝子領域予測ソフトウェア（『Ｇｌｉｍｍｅｒ』）を用いて全ゲノムＤＮＡの塩基配列を解析し、蛋白質をコードしていると推定されるオープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ：推定遺伝子領域）を予測したところ、シュードモナス・スピーシーズ  ＶＴ１Ｂ株（ＮＢＲＣ１１０４７８）の全ゲノムＤＮＡには、ＯＲＦが４，７４９個あることが判明した。
【００７２】
＜実験４−３：ＰＶＡ分解酵素をコードするＯＲＦの同定＞
実験４−２の全ゲノム解析において認められた４，７４９個のＯＲＦを対象とし、実験３−２で決定した２種のＰＶＡ分解酵素ＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−ＢのＮ末端アミノ酸配列と一致するアミノ酸配列をコードするＯＲＦを検索したところ、ＰＶＡ−ＡのＮ末端アミノ酸配列と完全に一致するアミノ酸配列がＯＲＦ３２８６にコードされており、また、ＰＶＡ−ＢのＮ末端アミノ酸配列と完全に一致するアミノ酸配列がＯＲＦ３２８３にコードされていることが判明した。この結果から、ＯＲＦ３２８６の塩基配列、すなわち配列表における配列番号４で示される塩基配列がＰＶＡ−Ａの構造遺伝子ＤＮＡであり、ＰＶＡ−Ａは、配列表における配列番号４で示される塩基配列に併記されたアミノ酸配列から、分泌シグナル配列と推定されるＮ末端部分の２６アミノ酸残基が除去されたアミノ酸配列、すなわち、配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列からなることが判明した。また、同様に、ＯＲＦ３２８３の塩基配列、すなわち配列表における配列番号５で示される塩基配列がＰＶＡ−Ｂの構造遺伝子ＤＮＡであり、ＰＶＡ−Ｂは、配列表における配列番号５で示される塩基配列に併記されたアミノ酸配列から、分泌シグナル配列と推定されるＮ末端部分の２６アミノ酸残基が除去されたアミノ酸配列、すなわち、配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列からなることが判明した。
【００７３】
因みに、配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＰＶＡ−Ａの分子量は１０１，４２６と、また、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＰＶＡ−Ｂの分子量は１０９，６７９と算出され、これら両者の分子量はいずれも、前記実験３−１においてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより求めた分子量１００，０００±２０，０００とよく一致した。配列表における配列番号２で示されるＰＶＡ−Ａのアミノ酸配列と、配列表における配列番号３で示されるＰＶＡ−Ｂのアミノ酸配列との相同性（配列同一性）を市販の遺伝情報処理ソフトウェア（『ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１３』、株式会社ゼネティックス販売）を用いて調べたところ、８４％と算出された。また同様に、それぞれの酵素をコードする配列表における配列番号４で示される塩基配列と配列番号５で示される塩基配列との相同性（配列同一性）は８２％と算出された。
【００７４】
＜実験５：ＰＶＡ分解酵素のアミノ酸配列に基づく相同性探索＞
実験４で得たＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂのアミノ酸配列、すなわち、配列表における配列番号２又は３で示されるアミノ酸配列に基づき、配列データベースＧｅｎＢａｎｋを対象にＢＬＡＳＴ検索したところ、全く意外なことにＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＰＶＡ脱水素酵素のアミノ酸配列、及びこれと触媒する反応が全く異なる酸化ＰＶＡ加水分解酵素のアミノ酸配列の双方と相同性を示すことが判明し、さらにこれらＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂのアミノ酸配列は、ＰＶＡ脱水素酵素と相同性を示すＮ末端側前半部と、酸化ＰＶＡ加水分解酵素と相同性を示すＣ末端側後半部がリンカーと予測される相同性が比較的低いアミノ酸配列を介して連結していることが判明した。
【００７５】
上記ＢＬＡＳＴ検索において本発明のＰＶＡ分解酵素と相同性を有することが判明した公知の酵素群のアミノ酸配列の内、ＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−ＢのＮ末端側前半部のアミノ酸配列と比較的高い相同性を有する酵素のアミノ酸配列として、シュードモナス・スピーシーズ  ＶＭ１５Ｃ株由来のＰＶＡ脱水素酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションＮｏ．ＢＡＡ９４１９３．１）と、スフィンゴピクシス・スピーシーズ（Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ  ｓｐ．）  １１３Ｐ３株由来のＰＶＡ脱水素酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションＮｏ．ＢＡＤ９５５４３．３）の２つのアミノ酸配列を選択し、その相同性を遺伝情報処理ソフトウェア（『ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１３』、株式会社ゼネティックス販売）を用いて調べた。
【００７６】
その結果、ＰＶＡ−Ａのアミノ酸配列、すなわち配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末端側前半部（１乃至４４２残基）は、シュードモナス・スピーシーズ  ＶＭ１５Ｃ株由来ＰＶＡ脱水素酵素のアミノ酸配列（１４４乃至６２７残基）と約２４％の相同性（配列同一性）を、また、同Ｎ末端側前半部（１乃至４２９残基）は、スフィンゴピクシス・スピーシーズ  １１３Ｐ３株由来のＰＶＡ脱水素酵素のアミノ酸配列（１５１乃至６２７残基）と約２６％の相同性（配列同一性）を示した。
【００７７】
一方、ＰＶＡ−Ｂのアミノ酸配列、すなわち配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列のＮ末端側前半部（１乃至４４５残基）は、シュードモナス・スピーシーズ  ＶＭ１５Ｃ株由来ＰＶＡ脱水素酵素のアミノ酸配列（１４４乃至６３０残基）と約２３％の相同性（配列同一性）を、また、同Ｎ末端側前半部（１乃至４２９残基）は、スフィンゴピクシス・スピーシーズ  １１３Ｐ３株由来のＰＶＡ脱水素酵素のアミノ酸配列（１５１乃至６２７残基）と約２５％の相同性（配列同一性）を示した。
【００７８】
ＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ-ＢのＮ末端側前半部のアミノ酸配列と、シュードモナス・スピーシーズ  ＶＭ１５Ｃ株由来、及び、スフィンゴピクシス・スピーシーズ  １１３Ｐ３株由来ＰＶＡ脱水素酵素のアミノ酸配列の計４種のアミノ酸配列の多重シークエンスアラインメントを図７に示した。ＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂのアミノ酸配列のＮ末端側前半部が、それぞれシュードモナス・スピーシーズ  ＶＭ１５Ｃ株由来、又は、スフィンゴピクシス・スピーシーズ  １１３Ｐ３株由来のＰＶＡ脱水素酵素のアミノ酸配列と低いながらも相同性を示すことは、図７からも視覚的に見て取れる。これらの結果は、本発明のＰＶＡ分解酵素のアミノ酸配列のＮ末端側前半部が、ＰＶＡ分解酵素が有する２つの活性の内、ＰＶＡを酸化する活性を有するドメインを形成していることを示唆するものである。
【００７９】
また、Ｎ末端前半部のアミノ酸配列について調べたのと同様に、上記ＢＬＡＳＴ検索において本発明のＰＶＡ分解酵素と相同性を有することが判明した公知の酵素群のアミノ酸配列の中から、ＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−ＢのＣ末端側後半部のアミノ酸配列と比較的高い相同性を有する酵素のアミノ酸配列として、シュードモナス・スピーシーズ  ＶＭ１５Ｃ株由来の酸化ＰＶＡ加水分解酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションＮｏ．ＢＡＡ９４１９２．１）と、スフィンゴピクシス・スピーシーズ  １１３Ｐ３株由来の酸化ＰＶＡ加水分解酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションＮｏ．ＢＡＤ９５５４２．３）の２つのアミノ酸配列を選択し、その相同性を同様に調べた。
【００８０】
その結果、ＰＶＡ−Ａのアミノ酸配列、すなわち配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列におけるＣ末端側後半部（６２５乃至９７３残基）は、シュードモナス・スピーシーズ  ＶＭ１５Ｃ株由来酸化ＰＶＡ加水分解酵素アミノ酸配列（３４乃至３７９残基）と約５４％の相同性（配列同一性）を、また、同Ｃ末端側後半部（６４３乃至９７３残基）は、スフィンゴピクシス・スピーシーズ  １１３Ｐ３株由来の酸化ＰＶＡ加水分解酵素のアミノ酸配列（３９乃至３６３残基）と約５５％の相同性（配列同一性）を示した。
【００８１】
一方、ＰＶＡ−Ｂのアミノ酸配列、すなわち配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列におけるＣ末端後半部（５８６乃至９６３残基）は、シュードモナス・スピーシーズ  ＶＭ１５Ｃ株由来酸化ＰＶＡ加水分解酵素のアミノ酸配列（３乃至３７９残基）と約５０％の相同性（配列同一性）を、また、同Ｃ末端側後半部（６１９乃至９６３残基）は、スフィンゴピクシス・スピーシーズ  １１３Ｐ３株由来の酸化ＰＶＡ加水分解酵素のアミノ酸配列（２４乃至３６３残基）と約５１％の相同性（配列同一性）を示した。
【００８２】
ＰＶＡ−ＡとＰＶＡ−ＢのＣ末端側後半部のアミノ酸配列と、シュードモナス・スピーシーズ  ＶＭ１５Ｃ株由来、及び、スフィンゴピクシス・スピーシーズ  １１３Ｐ３株由来酸化ＰＶＡ加水分解酵素のアミノ酸配列の計４種のアミノ酸配列の多重シークエンスアラインメントを図８に示した。ＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂのアミノ酸配列のＣ末端側後半部が、シュードモナス・スピーシーズ  ＶＭ１５Ｃ株由来、又は、スフィンゴピクシス・スピーシーズ  １１３Ｐ３株由来の酸化ＰＶＡ加水分解酵素と比較的高い相同性を示すことは、図８からも視覚的に見て取れる。これらの結果は、本発明のＰＶＡ分解酵素のアミノ酸配列のＣ末端側後半部が、ＰＶＡ分解酵素が有する２つの活性の内、酸化ＰＶＡ加水分解活性を有するドメインを形成していることを示唆するものである。
【００８３】
上記の知見をまとめ、ＰＶＡ分解酵素としてのＰＶＡ−ＡとＰＶＡ−Ｂの構造を図９にそれぞれ模式的に示した。図９に見られるとおり、ＰＶＡ−Ａのアミノ酸配列（配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列）の内、４４２番目のアミノ酸残基までのＮ末端側前半部は、公知のＰＶＡ脱水素酵素のアミノ酸配列と相同性を示すＰＶＡの酸化を触媒するドメインを形成しており、アミノ酸残基約９０残基の長さのリンカー配列を介して、６３３番目のアミノ酸残基から９６３番目のアミノ酸残基までのＣ末端側後半部は、公知の酸化ＰＶＡ加水分解酵素のアミノ酸配列と相同性を示す酸化ＰＶＡの加水分解を触媒するドメインを形成していることとなる。ＰＶＡ−Ｂのアミノ酸配列（配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列）の場合もほぼ同様である。
【００８４】
＜実験９：ＰＶＡ分解酵素をコードするＤＮＡのクローニングと組換えＤＮＡの調製＞
ＯＲＦ３２８６とＯＲＦ３２８３がそれぞれコードするＰＶＡ分解酵素の分泌シグナル配列と推定される部分を欠損させたＤＮＡをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応させることによって、ＰＶＡ−Ａ又はＰＶＡ−ＢをコードするＤＮＡのクローニングを行った。
【００８５】
＜実験９−１：ＰＶＡ分解酵素をコードするＤＮＡのクローニングと組換えＤＮＡの調製＞
まず、プラスミドベクターｐＲＳＥＴ  Ａを鋳型とし、配列表における配列番号６及び７で示される塩基配列をそれぞれ有するプライマー１及びプライマー２を用いてＰＣＲを行い、直鎖状のｐＲＳＥＴ  Ａを作製した。次いで、ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列表における配列番号８及び９で示される塩基配列をそれぞれ有するプライマー３及びプライマー４を用いてＰＣＲを行い、ＯＲＦ３２８６がコードするアミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、すなわちＰＶＡ−ＡをコードするＤＮＡを増幅した。また、同様に、ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列表における配列番号８及び１０で示される塩基配列をそれぞれ有するプライマー３及びプライマー５を用いてＰＣＲを行い、ＯＲＦ３２８３がコードするアミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、すなわちＰＶＡ−ＢをコードするＤＮＡを増幅した。
【００８６】
上記で作製した直鎖状プラスミドとＰＶＡ−Ａ遺伝子又はＰＶＡ−Ｂ遺伝子を市販のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングキット（商品名『Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ』、タカラバイオ株式会社販売）を用いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応させることにより、それぞれ組換えプラスミドを作製し、それぞれ「ｐＲＳＥＴ  Ａ−ＰＶＡ−Ａ」及び「ｐＲＳＥＴ  Ａ−ＰＶＡ−Ｂ」と名付けた。上記の方法で得られた、ＰＶＡ−Ａをコードする組換えＤＮＡである「ｐＲＳＥＴ  Ａ−ＰＶＡ−Ａ」の構造を模式的に図１０に示した。
【００８７】
＜実験９−２：形質転換体の調製とＰＶＡ分解酵素蛋白の発現＞
実験９−１で得たＰＶＡ−Ａをコードする組換えＤＮＡ、「ｐＲＳＥＴ  Ａ−ＰＶＡ−Ａ」を用い、常法に従い大腸菌ＨＳＴ０８を形質転換して組換えＤＮＡを大量調製した後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換して組換え酵素の発現を試みたところ、組換えＤＮＡの発現にともなう発現蛋白の生成が認められた。
【００８８】
＜実験１０：ＰＶＡ分解酵素によるＰＶＡの分解＞
実験２の方法で得たＰＶＡ−Ａ精製酵素標品を用い、ＰＶＡ濃度を変えた基質溶液に酵素作用量を変えて作用させ、溶液の粘度低下を指標としてＰＶＡの分解を経時的に調べた。
【００８９】
基質としてのＰＶＡ（試薬級ポリビニルアルコール、重合度２，０００、ナカライテスク株式会社販売）、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、及び、同緩衝液に溶解したＰＶＡ−Ａの精製酵素液を混合し、ＰＶＡの終濃度が１％、４％又は１０％（ｗ／ｖ）、ＰＶＡ−Ａの酵素作用量がＰＶＡ１ｇ当たりＰＶＡ酸化活性として１（又は１．２５）、５又は１０単位となる反応液（反応液量各１ｍＬ）を調製し、プラスチックチューブ内で３５℃で１、４又は２０時間、１６０ｒｐｍで振トウしながら反応させた。なお、各ＰＶＡ濃度において、酵素液に替えて５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加えたものを対照（酵素作用量０単位）とした。各条件下で反応させることにより得た反応液０．６ｍＬをコーンプレート型粘度計（商品名『ＤＶ−ＩＩ＋Ｐｒｏ』、ブルックフィールド社製）を用いた粘度測定に供した。各反応条件における反応液の粘度を表４に纏めた。
【００９０】
【表４】
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【００９１】
表４に見られるとおり、いずれのＰＶＡ濃度においても、ＰＶＡ１ｇ当たりＰＶＡ酸化活性として１単位以上のＰＶＡ分解酵素を作用させた場合、ＰＶＡ溶液の粘度低下が観察された。濃度１％（ｗ／ｖ）のＰＶＡ溶液を基質とした反応では、反応開始時の溶液の粘度が２．７ｍＰａ・ｓであったものが、酵素作用量１０単位で２０時間作用させた反応液では粘度は１．２ｍＰａ・ｓまで低下した（因みに、同一条件での粘度測定において、精製水の粘度は約１．０ｍＰａ・ｓである。）。また、濃度４％（ｗ／ｖ）のＰＶＡ溶液を基質とした反応では、反応開始時の溶液の粘度が約３６ｍＰａ・ｓであったものが、酵素作用量５単位で２０時間作用させた反応液では粘度は約１／１０の３．７ｍＰａ・ｓまで低下した。さらに、ＰＶＡ分解酵素ＰＶＡ−Ａは１０％（ｗ／ｖ）と比較的高濃度の基質溶液であっても良く作用し、ＰＶＡ１ｇ当たり５単位の酵素作用量で２０時間作用させると、反応液の粘度が反応開始時の２，４３０ｍＰａ・ｓから約１／１０の２３１ｍＰａ・ｓまで低下した。
【００９２】
一方、ＰＶＡ濃度１％（ｗ／ｖ）、酵素作用量１０単位で２０時間作用させて得た反応液について、ＰＶＡ分解物の分子量を常法のゲル濾過ＨＰＬＣ法にて分析した。ゲル濾過ＨＰＬＣは、カラムに『ＴＳＫｇｅｌ  α−４０００』（東ソー株式会社製）を２本連結したものを用い、溶離液に５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、カラム温度４０℃、流速０．５ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩＤ−２０Ａ（株式会社島津製作所製造）を用いて行った。なお、ＰＶＡ及びＰＶＡ分解物の分子量は、分子量測定用プルラン標準品（株式会社林原販売）を同様にゲル濾過ＨＰＬＣに供して作成した分子量の検量線に基づきそれぞれ算出した。図１１に反応液のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム（図１１における符号ｂ）を、基質として用いたＰＶＡのそれ（図１１における符号ａ）と比較しつつ示した。
【００９３】
図１１に見られるとおり、基質として用いたＰＶＡ（符号ａ）は保持時間３０．６分にピークトップを示し、その重量平均分子量（Ｍｗ）は約１０．６×１０４と算出された。一方、ＰＶＡ濃度１％（ｗ／ｖ）、酵素作用量１０単位で２０時間作用させて得たＰＶＡ分解反応液（符号ｂ）では、分解物が保持時間４０．４分にピークトップを示し、その重量平均分子量（Ｍｗ）は約４，４００と算出された。この結果から、ＰＶＡ分解反応液において基質としたＰＶＡはＰＶＡ−Ａにより低分子まで分解されていることが分かった。
【００９４】
上記のとおり、本願のＰＶＡ分解酵素は単独で効率よくＰＶＡを分解することができる。このことは、本願のＰＶＡ分解酵素が、ＰＶＡ酸化活性と酸化ＰＶＡ加水分解活性の両方を有する双頭酵素であって初めて可能なことである。
【００９５】
＜実験１１：ＰＶＡ酸化酵素フラグメントと酸化ＰＶＡ加水分解酵素フラグメントの検出＞
実験２のＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂの精製工程におけるＣＭ−トヨパール６５０Ｓカラムクロマトグラフィーにより得られたフラクションには、ＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂ以外にもＰＶＡ酸化活性を示す画分が認められ、同画分を実験３と同様のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、ＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂよりも低分子の分子量約５０，０００の蛋白質バンドが検出された。この蛋白質について実験３−６と同様の方法でＮ末端アミノ酸配列をＮ末端から２０残基調べたところ、ＰＶＡ−ＡのＮ末端アミノ酸配列と全く同一のアミノ酸配列、すなわち、アラニン−グルタミン酸−アスパラギン−トリプトファン−プロリン−メチオニン−フェニルアラニン−グリシン−リジン−アスパラギン−チロシン−グルタミン酸−アスパラギン−スレオニン−アルギニン−アラニン−スレオニン−セリン−アスパラギン酸−スレオニン；が認められた。また、詳細なデータは省略するものの、ＰＶＡ酸化活性を示す同画分には、酸化ＰＶＡを加水分解する活性は認められなかった。この結果は、同画分に存在するＰＶＡ酸化活性を有する酵素が、ＰＶＡ−Ａに由来するＰＶＡ酸化活性のみを有するＰＶＡ酸化酵素フラグメントであることを物語っている。
【００９６】
また、同様に、実験２のＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂの精製工程におけるＣＭ−トヨパール６５０Ｓカラムクロマトグラフィーにより得られたフラクションには、ＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂとは異なり、且つ、酸化ＰＶＡ加水分解活性を有する画分も見出された。同画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、ＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂよりも低分子の分子量約３５，０００の蛋白質バンドが検出された。この蛋白質について実験３−６と同様の方法でＮ末端アミノ酸配列を調べたところ、５アミノ酸残基が判明し、バリン−セリン−グリシン−グリシン−スレオニン；が認められた。このアミノ酸配列は、ＰＶＡ−Ａのアミノ酸配列、すなわち、配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列の６２３残基から６２７残基までのアミノ酸配列と完全に一致した。ＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂのアミノ酸配列と公知の酸化ＰＶＡ加水分解酵素のアミノ酸配列とを比較した図８、及び、ＰＶＡ−ＡとＰＶＡ−Ｂの構造を模式的に表わした図９、に示した知見と考え合わせると、このＰＶＡ−Ａのアミノ酸配列の６２３残基から６２７残基までのアミノ酸配列をＮ末端アミノ酸配列として有する分子量約３５，０００の蛋白質は、ＰＶＡ−Ａに由来する酸化ＰＶＡ加水分解活性のみを有する酸化ＰＶＡ加水分解酵素フラグメントであると考えられた。
【００９７】
上記結果は、シュードモナス・スピーシーズ  ＶＴ１Ｂ株（ＮＢＲＣ１１０４７８）の培養液において、ＰＶＡ酸化活性と酸化ＰＶＡ加水分解活性の両方を併せ持つ双頭酵素として産生されたＰＶＡ分解酵素の内、少なくともＰＶＡ−Ａが部分分解を受け、ＰＶＡ酸化酵素フラグメントと酸化ＰＶＡ加水分解酵素フラグメントとが生成していることを物語るものである。このことから、双頭酵素であるＰＶＡ−Ａ及びＰＶＡ−Ｂをプロテアーゼで人為的に限定分解することで、ＰＶＡ酸化酵素と酸化ＰＶＡ加水分解酵素とを別々に調製することも可能と考えられる。
【００９８】
以下、実施例によりさらに詳細に本発明を説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００９９】
＜ＰＶＡ分解酵素の調製＞
ＰＶＡ（試薬級ポリビニルアルコール、重合度５００、ナカライテスク株式会社販売）１ｇ／Ｌ、リン酸一カリウム１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム４ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．５ｇ／Ｌ、酵母エキス（酵母エキスＤ−３Ｈ、日本製薬株式会社製）０．５ｇ／Ｌ及び水からなる液体培地をｐＨ７．０に調整後オートクレーブ（１２１℃、２０分間）にて滅菌し、さらに、ろ過滅菌したピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を終濃度１０μｇ／Ｌとなるように添加して得られる液体培地を培養に用いた。【０１００】
シュードモナス・スピーシーズ  ＶＴ１Ｂ株を実験１と同じ方法でシード培養し、上記液体培地５０ｍＬを５００ｍＬ容三角フラスコに分注したものに、シード培養液を１％（ｗ／ｖ）植菌し、２７℃、２４０ｒｐｍで５日間振トウ培養した。培養後に得られた培養上清のＰＶＡ分解酵素の活性は、ＰＶＡ酸化活性として０．０３４単位／ｍＬであった。また、本培養上清を２，４−ペンタンジオンに作用させたところ、加水分解産物であるアセトンが検出され、β−ジケトン加水分解活性、すわなち、酸化ＰＶＡ加水分解活性をも有していることが確認された。本培養上清は、ＰＶＡ分解酵素の粗酵素として有利に利用することができる。
【実施例２】
【０１０１】
＜ＰＶＡ分解酵素剤＞
実施例１の方法で得たシュードモナス・スピーシーズ  ＶＴ１Ｂ株の培養液約１Ｌを遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分）し、得られた培養上清約９６０ｍＬ（ＰＶＡ酸化活性約３２単位）に２５％飽和となるように硫安を添加、溶解し、冷室にて一夜放置した。得られた塩析物を遠心分離にて回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。得られた透析液について実験３−１の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分子量１００，０００±２０，０００を示す蛋白バンドのみが検出され、培養上清中に認められた夾雑蛋白はほぼ除去されていた。この精製手段によって、ＰＶＡ分解酵素が効率よく精製できることが分かった。得られた部分精製ＰＶＡ分解酵素には、ＰＶＡ酸化活性とともにβ−ジケトン加水分解活性、すわなち、酸化ＰＶＡ加水分解活性が確認されたことから、ＰＶＡ分解酵素剤として有利に利用することができる。
【実施例３】
【０１０２】
＜ＰＶＡ分解酵素剤＞
実験１の方法で得たシュードモナス・スピーシーズ  ＶＴ１Ｂ株の培養液約６００ｍＬを遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分）し、得られた培養上清約５６０ｍＬ（ＰＶＡ酸化活性１９．１単位）に６０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、冷室にて一夜放置した。得られた塩析物を遠心分離にて回収し、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。得られた透析液を同リン酸緩衝液で平衡化した『トヨパール  ＡＦ−Ｂｌｕｅ  ＨＣ−６５０Ｍ』（官能基として「Ｃｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  Ｆ３ＧＡ」を有する担体）を充填したカラムを用いた液体クロマトグラフィーに供し、塩化カリウム０Ｍから１Ｍのリニアーグラジエントにより溶出した。ＰＶＡ分解酵素は、塩化カリウム濃度約０．２Ｍで溶出したため、活性画分を回収しＰＶＡ分解酵素部分精製品とした。本品は、ＰＶＡ酸化活性とともにβ−ジケトン加水分解活性、すわなち、酸化ＰＶＡ加水分解活性をも有することが確認されたことから、ＰＶＡ分解酵素剤として有利に利用することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明によれば、従来未知であった、ＰＶＡ酸化活性と酸化ＰＶＡ加水分解活性の両方を併せ持つ、全く新規な双頭酵素としてのＰＶＡ分解酵素を大量に製造し、提供することが可能となる。全く新規なＰＶＡ分解酵素の提供を可能とする本発明は、ＰＶＡの分解、除去などが求められる種々の利用分野に貢献することとなり、その産業的意義はきわめて大きい。
【符号の説明】
【０１０４】
図２において、
Ｍ：分子量マーカー
Ａ：ＰＶＡ分解酵素精製標品ＰＶＡ-Ａ
Ｂ：ＰＶＡ分解酵素精製標品ＰＶＡ-Ｂ
図４及び図６において、
●：酢酸緩衝液
■：リン酸緩衝液
▲：グリシン−ＮａＯＨ緩衝液
◆：塩化カリウム−ＮａＯＨ緩衝液
図７及び図８において、
アミノ酸残基は一文字表記で示し、灰色で網掛けしたアミノ酸残基は比較した４種アミノ酸配列の内３種で一致しているアミノ酸残基を意味し、黒色で網掛けしたアミノ酸残基は４種アミノ酸配列の全てで一致しているアミノ酸残基を意味する。
ＰＶＡ−Ａ：ＰＶＡ−Ａのアミノ酸配列（配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列）
ＰＶＡ−Ｂ：ＰＶＡ−Ｂのアミノ酸配列（配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列）
ＰＶＡＤＨ＿ＶＭ１５Ｃ：シュードモナス・スピーシーズ  ＶＭ１５Ｃ株由来ＰＶＡ脱水素酵素のアミノ酸配列
ＰＶＡＤＨ＿１１３Ｐ３：スフィンゴピクシス・スピーシーズ  １１３Ｐ３株由来ＰＶＡ脱水素酵素のアミノ酸配列
ＯＰＨ＿ＶＭ１５Ｃ：シュードモナス・スピーシーズ  ＶＭ１５Ｃ株由来酸化ＰＶＡ加水分解酵素のアミノ酸配列
ＯＰＨ＿１１３Ｐ３：スフィンゴピクシス・スピーシーズ  １１３Ｐ３株由来酸化ＰＶＡ加水分解酵素のアミノ酸配列
図９において、数字はアミノ酸残基番号を示し、ＮはＮ末端、ＣはＣ末端を意味する。
図１０において、
ｆ１  ｏｒｉ：ｆ１ファージ複製起点
Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ：アンピシリン耐性遺伝子
ｐＵＣ  ｏｒｉ：ｐＵＣ複製起点
ＰＶＡ−Ａ：ＰＶＡ−Ａ遺伝子
図１１において、
ａ：基質としたＰＶＡのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：ＰＶＡ分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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