【手続補正書】
【提出日】令和1年6月20日(2019.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における膀胱がんの診断を補助する方法であって、以下：
(a)  個体に由来する試料からDNAを提供すること；
(b)  配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPを含むパネルから選択されるMVPのグループであって、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25を含むグループのうちの各1がメチル化されているかを決定すること；及び
(c)  (b)のグループのMVPの少なくとも25がメチル化されているとき、個体における膀胱がんの診断を補助すること、
を含む、方法。
【請求項２】
MVPのグループが配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも40、少なくとも50、少なくとも100又は150全てを含み：
(a)  配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの少なくとも25がメチル化されているとき、又は
(b)  配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPから選択されるMVPの少なくとも40がメチル化されているとき、又は
(c)  配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPから選択されるMVPの少なくとも50がメチル化されているとき、又は
(d)  該MVPの少なくとも100がメチル化されているとき、又は
(e)  全150MVPがメチル化されているとき、
膀胱がんの診断が補助される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
メチル化されていると決定した前記MVPが、配列番号1〜3において特定され[CG]で表示されるMVPを含む、又は配列番号1〜5において特定され[CG]で表示されるMVPを含む、又は配列番号1〜10において特定され[CG]で表示されるMVPを含む、又は配列番号1〜40において特定され[CG]で表示されるMVPを含む、請求項１、又は請求項２(a)〜請求項２(d)に記載の方法。
【請求項４】
前記MVPのグループが配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPの150全てを含み、配列番号1〜150において特定され[CG]で表示されるMVPから選択されるMVPの少なくとも40がメチル化されているとき、個体における膀胱がんの診断が補助され、メチル化されていると決定したMVPが、配列番号1〜10において特定され[CG]で表示されるMVPを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
(a)前記MVPの各1がメチル化されているかを決定する工程が、重亜硫酸塩でDNAを変換することを含む；及び／又は
(b)前記MVPの各1がメチル化されているかを決定する工程が、以下：
i）MVPの配列を決定するために、シーケンシング工程を実施すること；
ii）MVPのメチル化形態と非メチル化形態とを判別することができるプローブを含むアレイにDNAをハイブリダイズし、及びMVPのメチル化形態と非メチル化形態とを判別するためのアレイに検出システムを適用すること；又は
iii）メチル化特異的プライマーを使用する増幅工程を実施することであって、メチル化されているか又はメチル化されていないかのMVPの状態が、増幅産物の存在又は非存在によって決定されること
を含む、
上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
シーケンシング又はハイブリダイゼーション工程の前に、増幅工程が実施され、各MVPを含むローカスが増幅され、任意で、増幅工程がPCRによって実施される、請求項５(b)i)又は５(b)iii)に記載の方法。
【請求項７】
シーケンシング又はハイブリダイゼーション工程の前に、キャプチャリング工程が実施され、該キャプチャリング工程が、MVPローカスを含むポリヌクレオチドを、MVPローカスに特異的な結合分子に結合させること、並びにMVPローカス及び結合分子を含む複合体を回収することを含み；及びここで：
i  重亜硫酸塩でDNAを変換する工程の前に、前記キャプチャリング工程が存在する；
ii  重亜硫酸塩でDNAを変換する工程の後であるが、増幅又はハイブリダイゼーション工程の前に、前記キャプチャリング工程が存在する；又は
iii  重亜硫酸塩でDNAを変換する工程の後であって、増幅工程の後に、キャプチャリング工程が存在する；
任意で、前記結合分子が、各MVPに特異的なオリゴヌクレオチド、好ましくは対応するMVPに相補的である配列を各々有するDNA又はRNA分子である、例えば、
前記結合分子が、精製のための成分に結合している、
任意で、前記精製のための成分が、第一の精製のための成分を含み、MVPローカス及び結合分子を含む複合体を回収する前記工程が、前記第一の精製のための成分を、第二の精製のための成分を含む基質に結合することを含み、第一及び第二の精製のための成分が相互作用複合体を形成する、
任意で、前記第一の精製のための成分がビオチンであり、前記第二の精製のための成分がストレプトアビジンである；又は前記第一の精製のための成分がストレプトアビジンであり、前記第二の精製のための成分がビオチンである、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
MVPを含むローカスを増幅する前記工程が、MVPのメチル化状態に依存しないプライマーの使用を含む、請求項６又は請求項７に記載の方法。
【請求項９】
MVPを含むローカスを増幅する前記工程が、マイクロドロップレットPCR増幅により実施される、請求項５(b)(iii)〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
個体から採取された前記生体試料が、尿、血液、血清、血漿又は無細胞DNAの試料である、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、95%以上のROC感度及び90%以上のROC特異度；好ましくは96%のROC感度及び97%のROC特異度を達成するか；又は、前記方法が、95%以上、好ましくは98%のROC AUCを達成するか；又は、前記方法が、95%以上、好ましくは97%の陰性的中率 (NPV)を達成する、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
個体における膀胱がんの診断を補助する前記工程が、更に以下：
I.  腫瘍の悪性度を階層化すること；及び／又は
II.  腫瘍の再発リスクを決定すること；及び／又は
III.  非筋肉浸潤性疾患の進行リスクを決定すること；及び／又は
IV.  治療療法に対し予想される応答を決定すること、
を含む、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記がんが非筋肉浸潤性膀胱がん (NMIBC)であるか；又は前記がんが筋肉浸潤性膀胱がん (MIBC)である、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
MVPのメチル化形態と非メチル化形態とを判別することができるアレイであって、MVPパネルにおける各MVPのメチル化形態に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブ、及び前記パネルにおいて各MVPの非メチル化形態に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブを含み；前記パネルが、配列番号1〜150において特定されるMVPから選択される少なくとも25MVPから成り、好ましくは、前記パネルが、配列番号1〜150において特定されるMVPから選択される少なくとも40MVP；好ましくは少なくとも50MVP、少なくとも60MVP、少なくとも70MVP、少なくとも80MVP、少なくとも90MVP、少なくとも100MVP、少なくとも110MVP、少なくとも120MVP、少なくとも130MVP、少なくとも140MVP、少なくとも145MVP、又は配列番号1〜150において特定される150MVP全てからなる、アレイ；及び／又は
MVPジヌクレオチドにおける非メチル化シトシンを修飾することができるが、MVPジヌクレオチドにおけるメチル化シトシンを修飾することができないDNA修飾剤、任意で前記ジヌクレオチドがCpGであり、好ましくは前記DNA修飾剤が重亜硫酸塩剤である、DNA修飾剤；及び／又は
MVPを増幅するためのプライマーであって、前記プライマーはMVPパネルにおける各MVPの増幅用であり、前記パネルが、配列番号1〜150において特定されるMVPから選択される少なくとも25MVP、配列番号1〜150において特定されるMVPから選択される少なくとも40MVP；好ましくは少なくとも50MVP、少なくとも60MVP、少なくとも70MVP、少なくとも80MVP、少なくとも90MVP、少なくとも100MVP、少なくとも110MVP、少なくとも120MVP、少なくとも130MVP、少なくとも140MVP、少なくとも145MVP、又は配列番号1〜150において特定される150MVP全てからなる、プライマー
を含む、キット。