(57)【要約】軟骨組織の分析装置（１００）は、レーザ光源（１）からのレーザ光を射出面から射出する照明ファイバ（６）と、射出面からの距離が互いに異なる受光面において散乱光をそれぞれ受光する２つの集光ファイバ（７１，７２）と、集光ファイバ（７１，７２）によって受光された散乱光の各々からラマンスペクトルを検出する検出部（３，５）と、２つのラマンスペクトルの各々から軟骨組織および骨組織にそれぞれ由来する２つのラマンバンドの強度比を演算する演算部（１０）と、強度比が所定の範囲内であるラマンスペクトルを２つのラマンスペクトルの中から選択し、選択されたラマンスペクトルを解析する評価部（１０）とを備える。
2018134980.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を出力するレーザ光源と、
先端に射出面を有し、前記レーザ光源から入射されたレーザ光を前記射出面から軟骨組織を含む生体組織に向けて射出する照明ファイバと、
先端に受光面を各々有し、前記生体組織からの散乱光を前記受光面においてそれぞれ受光する第１の集光ファイバおよび第２の集光ファイバと、
前記第１の集光ファイバによって受光された前記散乱光から第１のラマンスペクトルを検出するとともに、前記第２の集光ファイバによって受光された前記散乱光から第２のラマンスペクトルを検出する検出部と、
該検出部によって検出された前記第１のラマンスペクトルおよび前記第２のラマンスペクトルの各々から、前記軟骨組織に由来するラマンバンドと骨組織に由来するラマンバンドとの強度比を演算する強度比演算部と、
該強度比演算部によって算出された前記強度比が所定の範囲内であるラマンスペクトルを前記第１のラマンスペクトルおよび前記第２のラマンスペクトルの中から選択し、選択されたラマンスペクトルを解析して前記軟骨組織の状態を評価する評価部とを備え、
前記第１の集光ファイバの前記受光面の前記射出面からの距離と、前記第２の集光ファイバの前記受光面の前記射出面からの距離とが、互いに異なる軟骨組織の分析装置。
【請求項２】
前記強度比演算部が、前記強度比の演算に、前記軟骨組織に由来するラマンバンドとしてＩＩ型コラーゲンのラマンバンド強度を用い、前記骨組織に由来するラマンバンドとしてヒドロキシアパタイトのラマンバンド強度を用いる請求項１に記載の軟骨組織の分析装置。
【請求項３】
前記強度比演算部が、前記強度比の演算に、前記軟骨組織に由来するラマンバンドとしてグリコサミノグリカンのラマンバンド強度を用い、前記骨組織に由来するラマンバンドとしてヒドロキシアパタイトのラマンバンド強度を用いる請求項１に記載の軟骨組織の分析装置。
【請求項４】
前記評価部が、前記選択されたラマンスペクトルにおける前記軟骨組織に由来する、ラマンシフトが互いに異なる２種類のラマンバンドの強度比を算出し、算出された強度比に基づいて前記軟骨組織の状態を評価する請求項１から請求項３のいずれかに記載の軟骨組織の分析装置。
【請求項５】
前記２種類のラマンバンドが、コラーゲンのラマンバンドとグリコサミノグリカンのラマンバンドである請求項４に記載の軟骨組織の分析装置。
【請求項６】
前記２種類のラマンバンドが、タンパク質に含まれるアミノ酸のラマンバンドとグリコサミノグリカンのラマンバンドである請求項４に記載の軟骨組織の分析装置。
【請求項７】
前記２種類のラマンバンドが、タンパク質に含まれるアミノ酸のラマンバンドとコラーゲンのラマンバンドである請求項４に記載の軟骨組織の分析装置。
【請求項８】
前記２種類のラマンバンドが、メチレン基のラマンバンドとメチル基のラマンバンドである請求項４に記載の軟骨組織の分析装置。
【請求項９】
前記２種類のラマンバンドが、コラーゲンのアミドＩＩＩバンドである請求項４に記載の軟骨組織の分析装置。
【請求項１０】
前記評価部が、前記選択されたラマンスペクトルを多変量解析することによって前記軟骨組織に含まれるグリコサミノグリカンの量を推定するか、グリコサミノグリカン量と相関するラマンスペクトルの特徴量を算出し、得られた前記グリコサミノグリカンの量または前記ラマンスペクトルの特徴量に基づいて前記軟骨組織の状態を評価する請求項１から請求項９のいずれかに記載の軟骨組織の分析装置。
【請求項１１】
前記評価部が、前記選択されたラマンスペクトルを多変量解析することによって前記軟骨組織に含まれるコラーゲンの量を推定するか、コラーゲンの量と相関するラマンスペクトルの特徴量を算出し、得られた前記コラーゲンの量または前記ラマンスペクトルの特徴量に基づいて前記軟骨組織の状態を評価する請求項１から請求項１０のいずれかに記載の軟骨組織の分析装置。
【請求項１２】
前記評価部が、前記選択されたラマンスペクトルを多変量解析することによって前記軟骨組織に含まれる細胞の量を推定するか、細胞の量と相関するラマンスペクトルの特徴量を算出し、得られた前記細胞の量または前記ラマンスペクトルの特徴量に基づいて前記軟骨組織の状態を評価する請求項１から請求項１１のいずれかに記載の軟骨組織の分析装置。
【請求項１３】
前記評価部が、前記第１のラマンスペクトルおよび前記第２のラマンスペクトルの各々から、前記軟骨組織に由来するラマンバンドと前記骨組織に由来するラマンバンドとの強度比を演算し、算出された２つの強度比に基づいて前記軟骨組織の厚みを推定する請求項１から請求項１２のいずれかに記載の軟骨組織の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨組織の分析装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
関節軟骨の病変である変形性関節症（ＯＡ：Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）や外傷による軟骨損傷の診断、あるいは培養軟骨細胞移植による再生治療後の再生軟骨診断においては、従来、Ｘ線画像や核磁気共鳴画像、および関節鏡視に基づく診断が行われている。近年、細径の光ファイバプローブ下で、近赤外光の拡散反射法やラマン散乱法等の分光測定を実施することにより、コラーゲンやグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）等の関節軟骨基質の変化の情報を取得して、光学的にその軟骨状態を評価する方法が提案されている。（例えば、非特許文献１、非特許文献２および特許文献１参照。）。【０００３】
関節骨は、骨表面を覆う軟骨組織と該軟骨組織の下層に存在する骨組織から構成されている。軟骨組織は硝子軟骨であり、その主成分は、ＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、および水である。また、骨組織の主成分は、Ｉ型コラーゲン、ヒドロキシアパタイト等のリン酸カルシウム、および炭酸カルシウムである。ヒト軟骨組織の厚みは、正常軟骨では約２〜４ｍｍ程度であり、変形性関節症等の病変進行に伴ってより薄くなる傾向を有することが知られている。従来提案されている軟骨性状の光学評価法は、上記関節骨端において軟骨組織および骨組織に由来する分光スペクトルを測定する。例えば、特許文献１の装置では、関節骨の軟骨組織および骨組織に由来するラマンスペクトルを測定し、該ラマンスペクトルにおける特定ラマンバンドの情報に基づいて軟骨組織の状態を評価している。【０００４】
例えば、特許文献１の図８には、骨組織に含まれるリン酸カルシウムと炭酸カルシウムのラマンバンドの強度比に基づいて変形性関節症（ＯＡ）を診断する方法が記載されている。また、特許文献１の図９には、炭酸カルシウムおよびリン酸カルシウムのラマンバンドと、さらに蛋白質に由来するＣＨ基由来のラマンバンドとの強度比に基づいて変形性膝関節症（ＯＡ）を診断する方法が記載されている。またさらに、特許文献１の図１９には、コラーゲンの分子構造変化、すなわちコラーゲン変性と相関することが知られている１２４０ｃｍ−１および１２７０ｃｍ−１における２つのアミドＩＩＩバンドの強度比に基づいてＯＡを診断する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Karen  A.  Esmonde-White、外３名、“Fiber-optic  Raman  Spectroscopy  of  Joint  Tissues”、Analyst、2011年4月、Vol.136、p.1675-1685
【非特許文献２】I.  Afara、外４名、“Non-destructive  evaluation  of  articular  cartilage  defects  using  near-infrared  spectroscopy  in  osteoarthriticrat  models  and  its  direct  relation  to  Mankin  score”、Osteoartthritis  and  Cartilage、2012年11月、Vol.20、p.1367-1373
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第７７２９７４９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に開示される測定方法では、軟骨組織のラマンスペクトルと骨組織のラマンスペクトルとが重畳されたラマンスペクトルを取得している。この場合、ヒドロキシアパタイト等のリン酸カルシウムや炭酸カルシウム、およびＩ型コラーゲン等の骨組織成分のラマンスペクトル強度が、ＩＩ型コラーゲンやグリコサミノグリカン等の軟骨組織成分のラマンスペクトル強度と比較して著しく強いため、関節骨表層の軟骨組織のみに由来するラマンスペクトルの情報は、関節骨深層の骨組織に由来するラマンスペクトルの情報に覆い隠されて、軟骨組織を選択して観測することが困難であることが記載されている。【０００８】
変形性関節症（ＯＡ）では、一般に早期には軟骨組織表層付近において病変が生じ、さらに深部の軟骨組織や骨組織へ病変が拡大することが知られている。したがって、特許文献１の方法では、骨組織まで進行した変形性関節症（ＯＡ）病変であれば診断することができるが、軟骨組織における早期の変形性関節症（ＯＡ）病変を検出することが難しいという問題がある。また、培養軟骨細胞移植による軟骨再生治療においては、細胞移植される軟骨欠損部位において、軟骨組織が硝子軟骨へと再生していることを評価することが必要である。しかし、特許文献１で開示される測定方法では、そのラマンスペクトルから、軟骨組織の固有成分であるＩＩ型コラーゲンやコンドロイチン硫酸をはじめとするグリコサミノグリカン等の軟骨組織の基質成分を検出することが難しく、軟骨組織の再生状態の良悪を評価することが難しいという問題がある。【０００９】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、関節骨のラマンスペクトルから軟骨組織選択的にラマンスペクトルを取得し、軟骨組織の状態を精度良く評価することができる軟骨組織の分析装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、レーザ光を出力するレーザ光源と、先端に射出面を有し、前記レーザ光源から入射されたレーザ光を前記射出面から軟骨組織を含む生体組織に向けて射出する照明ファイバと、先端に受光面を各々有し、前記生体組織からの散乱光を前記受光面においてそれぞれ受光する第１の集光ファイバおよび第２の集光ファイバと、前記第１の集光ファイバによって受光された前記散乱光から第１のラマンスペクトルを検出するとともに、前記第２の集光ファイバによって受光された前記散乱光から第２のラマンスペクトルを検出する検出部と、該検出部によって検出された前記第１のラマンスペクトルおよび前記第２のラマンスペクトルの各々から、軟骨組織に由来するラマンバンドと骨組織に由来するラマンバンドとの強度比を演算する強度比演算部と、該強度比演算部によって算出された強度比が所定の範囲内であるラマンスペクトルを前記第１のラマンスペクトルおよび前記第２のラマンスペクトルの中から選択し、選択されたラマンスペクトルを解析して前記軟骨組織の状態を評価する評価部とを備え、前記第１の集光ファイバの前記受光面の前記射出面からの距離と、前記第２の集光ファイバの前記受光面の前記射出面からの距離とが、互いに異なる軟骨組織の分析装置である。【００１１】
本態様によれば、レーザ光源から照明ファイバにレーザ光が供給されて射出面から生体組織にレーザ光が照射されると、レーザ光の照明領域内で発生した生体組織の散乱光が第１および第２の集光ファイバによって受光され、第１および第２の集光ファイバによって受光された散乱光から第１および第２のラマンスペクトルがそれぞれ検出部によって取得される。このときに、第１および第２のラマンスペクトルは、関節骨表層に位置する軟骨組織のラマンスペクトルのみ、あるいは、軟骨組織と該軟骨組織の下に位置する骨組織の両方のラマンスペクトルを含む。【００１２】
この場合に、第１の集光ファイバの受光面と第２の集光ファイバの受光面は、照明ファイバの射出面からの距離が互いに異なる位置に配置されているので、第１の集光ファイバおよび第２の集光ファイバは、レーザ光の照明領域の内、深さ方向（レーザ光の照射方向）に互いに異なる範囲からの散乱光を受光する。したがって、第１のラマンスペクトルにおいて軟骨組織が該ラマンスペクトルへ寄与する割合と、第２のラマンスペクトルにおいて軟骨組織が該ラマンスペクトルへ寄与する割合は、互いに異なり得る。【００１３】
ここで、軟骨組織成分由来のラマンバンドと骨組織成分由来のラマンバンドとの強度比を、第１のラマンスペクトルと第２のラマンスペクトルの各ラマンスペクトルについて算出することによって、該各ラマンスペクトルにおける軟骨組織のラマンスペクトルの寄与の割合を見積もることが可能である。したがって、算出された強度比に基づいて、第１および第２のラマンスペクトルから、軟骨組織のラマンスペクトルのみを含むラマンスペクトル、あるいは、軟骨組織のラマンスペクトルの寄与が大きいラマンスペクトルを選択することができる。そして、選択されたラマンスペクトルを用いて、骨組織由来のラマンスペクトルの情報を可能な限り排除して軟骨組織の状態を精度良く評価することができる。【００１４】
上記態様においては、前記強度比演算部が強度比の演算に、前記軟骨組織に由来するラマンバンドとしてＩＩ型コラーゲンのラマンバンド強度を用い、前記骨組織に由来するラマンバンドとしてヒドロキシアパタイトのラマンバンド強度を用いてもよい。あるいは、上記態様においては、前記強度比演算部が強度比演算に、前記軟骨組織に由来するラマンバンドとしてグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンド強度を用い、前記骨組織に由来するラマンバンドとしてヒドロキシアパタイトのラマンバンド強度を用いてもよい。
このようにすることで、第１および第２のラマンスペクトルにおける、軟骨組織のラマンスペクトルおよび骨組織のラマンスペクトルの寄与の割合を精度良く算出することができる。【００１５】
上記態様においては、前記評価部が、前記選択されたラマンスペクトルにおける前記軟骨組織に由来する、ラマンシフトが互いに異なる２種類のラマンバンドの強度比を算出し、算出された強度比に基づいて前記軟骨組織の状態を評価してもよい。
軟骨組織に含有される各成分のラマンバンド強度は、該成分の含有量に比例するため、異なる２種類の成分のラマンバンド強度比は、異なる２種類の成分の相対量を反映する。あるいは所定成分において、ラマンシフトが互いに異なる２種類のラマンバンドの強度比が、該成分の分子構造を反映することが知られている。
したがって、算出されたラマンバンドの強度比から、軟骨組織に含有される成分について、該成分の相対量や分子構造の変化、すなわち軟骨基質分子の変性についての情報を得ることができる。このような情報に基づいて、変形性関節症（ＯＡ）をはじめとする軟骨病変や再生軟骨の成熟度などの軟骨組織の生化学的状態を評価することができる。【００１６】
上記態様においては、前記２種類のラマンバンドが、コラーゲンのラマンバンドとグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドであってもよい。このグリコサミノグリカンは、軟骨組織に含有される主たるグリコサミノグリカンである、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸等の硫酸化グリコサミノグリカンである。
ここで、コラーゲンのラマンバンドとグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドとの強度比は、軟骨組織に含まれるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の、コラーゲンに対する相対量を反映する。
したがって、算出された強度比に基づいて、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）量の変化を特徴とする軟骨組織の病変を評価することができる。また、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は硝子軟骨において多く含まれ、線維軟骨においてはほとんど含まれないことから、再生途上の軟骨組織において、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）量は、軟骨組織が硝子軟骨であるか、線維軟骨であるか、あるいは硝子軟骨と線維軟骨との混合であるかによって変動する。したがって、軟骨組織中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量に基づいて、再生途上にある軟骨組織の成熟状態を評価することができる。【００１７】
上記態様においては、前記２種類のラマンバンドが、コラーゲンやプロテオグリカン等の細胞外基質および軟骨細胞中のタンパク質に含まれるアミノ酸のラマンバンドと、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドであってもよい。
タンパク質のアミノ酸のラマンバンドとグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドとの強度比は、軟骨組織の全タンパク質の量に対するグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の相対量を反映する。したがって、算出された強度比に基づいて、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量の変化を特徴とする軟骨組織の病変を評価することができる。また、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）量に基づいて、再生途上にある軟骨の成熟状態を評価することができる。【００１８】
上記態様においては、前記２種類のラマンバンドが、コラーゲンやプロテオグリカン等の細胞外基質および軟骨細胞中のタンパク質に含まれるアミノ酸のラマンバンドと、コラーゲンのラマンバンドであってもよい。
タンパク質のアミノ酸のラマンバンドとコラーゲンのラマンバンドとの強度比は、軟骨組織において、全タンパク質の量に対するコラーゲンの相対量を反映する。したがって、算出された強度比に基づいて、コラーゲン量の変化を伴う軟骨組織の病変を評価することができる。また、再生過程にある軟骨組織のコラーゲンのうち、ＩＩ型コラーゲン量は、軟骨組織が正常な硝子軟骨であるか、再生軟骨としては不良な線維軟骨であるか、または再生途中の軟骨であるかによって変動する。したがって、コラーゲン量に基づいて、再生途上にある軟骨の成熟状態を評価することができる。【００１９】
上記態様においては、前記２種類のラマンバンドが、コラーゲンやプロテオグリカン等の細胞外基質および軟骨細胞中のタンパク質、あるいは脂質に含まれるメチレン基のラマンバンドとメチル基のラマンバンドであってもよい。
メチレン基のラマンバンドとメチル基のラマンバンドとの強度比は、軟骨組織に含まれる細胞の相対量と相関する。したがって、算出された強度比に基づいて、再生途上にある軟骨の成熟状態を評価することができる。【００２０】
上記態様においては、前記２種類のラマンバンドが、コラーゲンのアミドＩＩＩバンドであってもよい。
コラーゲンのアミドＩＩＩバンドは、１２３０〜１２８０ｃｍ−１のラマンシフト範囲において、１２４０ｃｍ−１近傍の低波数および１２６０ｃｍ−１近傍の高波数に２つのピークを有するラマンバンドとして観測される。このアミドＩＩＩバンドの低波数側のラマンバンドと高波数側のラマンバンドの２つのラマンバンドの強度比は、軟骨組織中のコラーゲンの二次構造に特徴づけられる分子構造の変化を反映することが知られている。変形性関節症などの軟骨組織病変は、軟骨組織中のＩＩ型コラーゲンの変性、すなわち分子構造変化を特徴とすることが知られている。したがって、算出されたアミドＩＩＩラマンバンドの強度比に基づいて、変形性関節症のようなコラーゲン変性を特徴とする軟骨組織の病変を評価することができる。【００２１】
上記態様においては、前記評価部が、前記選択されたラマンスペクトルを主成分分析（ＰＣＡ）、主成分回帰分析（ＰＣＲ）、または部分最小二乗分析（ＰＬＳ）等の多変量解析することによって、前記軟骨組織に含まれるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、コラーゲンまたは細胞の量と相関するラマンスペクトルの特徴量を算出するか、あるいはそれら成分量を推定し、得られたラマンスペクトルの特徴量、あるいは前記グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、コラーゲンまたは細胞の成分量に基づいて前記軟骨組織の状態を評価してもよい。
このようにすることで、再生軟骨の成長の度合いや、変形性関節症等のグリコサミノグリカン量の変化、もしくはコラーゲン変性を主とした組織変性を特徴とする軟骨組織の病変を評価することができる。【００２２】
上記態様においては、前記評価部が、前記第１のラマンスペクトルおよび前記第２のラマンスペクトルの各々から、前記軟骨組織に由来するラマンバンドと前記骨組織に由来するラマンバンドとの強度比を演算し、算出された２つの強度比、および、前記軟骨組織と前記骨組織のラマンバンドの強度比と前記軟骨組織の厚みとを相関づける予め準備された検量線または統計的推定法に基づいて前記軟骨組織の厚みを推定してもよい。
このようにすることで、算出された軟骨組織のラマンバンドと骨組織のラマンバンドの２つのラマンバンドの強度比に基づいて、軟骨組織の厚みを評価することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、軟骨組織と骨組織からなる関節骨のラマンスペクトルから軟骨組織由来のラマンスペクトルと骨組織由来のラマンスペクトルを分離して軟骨組織由来のラマンスペクトルを選択的に取得し、該軟骨組織由来のラマンスペクトルを解析することにより、関節骨表層に存在する軟骨組織の状態を精度良く評価することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の一実施形態に係る軟骨組織の分析装置の全体構成図である。
【図２】図１の光学プローブの先端部の横断面図である。
【図３】図２の光学プローブのＩ−Ｉ線における縦断面図である。
【図４】図２の光学プローブのＩＩ−ＩＩ線における縦断面図である。
【図５】照明ファイバから射出されるレーザ光の照明領域と、第１の集光ファイバによって散乱光が集められる第１の集光領域との位置関係を説明する図である。
【図６】照明ファイバから射出されるレーザ光の照明領域と、第２の集光ファイバによって散乱光が集められる第２の集光領域との位置関係を説明する図である。
【図７】図１の光学プローブの基端部の横断面図である。
【図８】図１の光検出器の受光面上に結像される第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルを模式的に示す図である。
【図９】軟骨組織が厚い関節骨から得られた第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルの一例である。
【図１０】軟骨組織が薄い関節骨から得られた第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルの一例である。
【図１１Ａ】観察範囲に対して軟骨組織の組織厚みが十分に厚い場合における、軟骨組織と観察範囲との位置関係を説明する図である。
【図１１Ｂ】観察範囲に対して軟骨組織が十分に厚い関節骨から得られた第１のラマンスペクトルと第２のラマンスペクトルの一例である。
【図１２Ａ】観察範囲に対して軟骨組織の組織厚みが十分に薄い場合における、軟骨組織と観察範囲との位置関係を説明する図である。
【図１２Ｂ】観察範囲に対して軟骨組織の組織厚みが十分に薄い関節骨から得られた第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルの一例である。
【図１３Ａ】観察範囲に対する軟骨組織の組織厚みが、図１１Ａおよび図１２Ａの場合の中間的な場合における、軟骨組織と観察範囲との位置関係を説明する図である。
【図１３Ｂ】観察範囲に対する軟骨組織の組織厚みが図１３Ａの場合において、関節骨から得られた第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルの一例である。
【図１４】正常軟骨組織のラマンスペクトル（実線）と、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が欠損した病変軟骨組織のラマンスペクトル（破線）を示す図である。
【図１５Ａ】硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（１０６３ｃｍ−１）およびコラーゲンのラマンバンドの強度比と、軟骨組織中の硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量との相関関係を示すグラフである。
【図１５Ｂ】硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（１３８０ｃｍ−１）およびコラーゲンのラマンバンドの強度比と、軟骨組織中の硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量との相関関係を示すグラフである。
【図１６】図１の軟骨組織の分析装置の動作を説明するフローチャートである。
【図１７Ａ】図２の光学プローブの先端部の変形例の横断面図である。
【図１７Ｂ】図１７Ａの光学プローブの縦断面図である。
【図１７Ｃ】図１７Ａの光学プローブの他の例の縦断面図である。
【図１８】軟骨組織のラマンスペクトル群を示す図である。
【図１９】軟骨組織のラマンスペクトル群における、メチル基およびメチレン基のラマンバンドの強度比と、軟骨組織中のＤＮＡ量との相関関係を示すグラフである。
【図２０Ａ】軟骨組織のラマンスペクトル群を示す図である。
【図２０Ｂ】図２０Ａのラマンスペクトル群を主成分分析して得られた第１主成分のローディングスペクトルを示す図である。
【図２１】第１主成分スコアと軟骨組織中の硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量との相関関係を示すグラフである。
【図２２Ａ】軟骨組織のラマンスペクトル群を示す図である。
【図２２Ｂ】図２２Ａの軟骨組織のラマンスペクトル群を主成分分析して得られた第１主成分のローディングスペクトルを示す図である。
【図２３】第１主成分スコアと軟骨組織中のＤＮＡ量との相関関係を示すグラフである。
【図２４】様々な軟骨組織の厚さと、第１および第２のラマンスペクトルにおける、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）とコラーゲン（Ｃｏｌ）のラマンバンドの強度比ＨＡＰ／Ｃｏｌとの関係を示すグラフである。
【図２５】軟骨組織Ｂの厚みを推定するための教師データの作成方法を説明する図であり、図２４のグラフのＹ切片Ｙおよび傾きＡと、軟骨組織の厚みとを軸とする３次元座標系を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に、本発明の一実施形態に係る軟骨組織の分析装置１００について図面を参照して説明する。
本実施形態に係る軟骨組織の分析装置１００は、図１に示されるように、レーザ光源１と、該レーザ光源１からのレーザ光を関節骨（生体組織）Ａに照射するとともに関節骨Ａからのラマン散乱光を受光する光学プローブ２と、該光学プローブ２によって受光されたラマン散乱光を分光する分光器（検出部）３と、光学プローブ２と分光器３との間に配置された結合光学系４と、分光器３によって分光された光を検出してラマンスペクトルを取得する光検出器（検出部）５とを備えている。
【００２６】
レーザ光源１は、７８５ｎｍの波長を有する近赤外のレーザ光を出力する半導体レーザである。レーザ光源１の波長は、７８５ｎｍ以外の波長であってもよい。
光学プローブ２は、レーザ光源１からのレーザ光を導光する照明ファイバ６と、ラマン散乱光を受光および導光する第１の集光ファイバ７１および第２の集光ファイバ７２とを備えている。照明ファイバ６および集光ファイバ７１，７２は先端側において１本に束ねられ、光学プローブ２の先端部のプローブヘッド２ａ内に照明ファイバ６の先端部および集光ファイバ７１，７２の先端部が収容されている。照明ファイバ６と集光ファイバ７１，７２は、長手方向の途中位置において互いに分岐し、照明ファイバ６の基端はレーザ光源１に接続され、集光ファイバ７１，７２の基端は結合光学系４を介して分光器３と光学的に結合されている。
【００２７】
レーザ光源１から照明ファイバ６に入射したレーザ光は、照明ファイバ６を導光し、プローブヘッド２ａから関節骨Ａに向けて射出されるようになっている。また、レーザ光の照射によって関節骨Ａにおいて励起されたラマン散乱光は、集光ファイバ７１，７２によって集められ、該集光ファイバ７１，７２および結合光学系４を導光し、分光器３に入射するようになっている。
【００２８】
結合光学系４は、集光ファイバ７１，７２の基端から発散光束として射出される光を平行光束に変換するレンズ４ａと、該レンズ４ａによって形成された平行光束を分光器３の入口スリットの位置に結像させるレンズ４ｂとの組み合わせからなるコリメート光学系である。レンズ４ａ，４ｂの間には、レーザ光Ｌの反射光を遮断し、レーザ光の波長よりも波長の長いラマン散乱光を透過させる光学フィルタ４ｃが設けられている。
分光器３は、結合光学系４を介して集光ファイバ７１，７２から入射した光を波長毎に空間的に分離し、得られたスペクトルを光検出器５の受光面上に再結像する。
【００２９】
光検出器５は、例えば、ＣＣＤ素子のような光電変換素子が２次元的に配列する撮像素子を備えるカメラであり、分光器３に取り付けられている。光検出器５は、分光器３から受光面に入射した光を光電変換素子によって電気信号へ変換してラマンスペクトルのデータを取得する。
【００３０】
次に、光学プローブ２の詳細な構成について説明する。
光学プローブ２は、図２から図４に示されるように、１本の照明ファイバ６と、複数本の第１の集光ファイバ７１と、複数本の第２の集光ファイバ７２とを備えている。図２は、プローブヘッド２ａの横断面（光学プローブ２の長手方向に垂直な断面）を示し、図３および図４は、図２のＩ−Ｉ線およびＩＩ−ＩＩ線におけるプローブヘッド２ａの縦断面（光学プローブ２の長手方向の断面）をそれぞれ示している。
【００３１】
照明ファイバ６および集光ファイバ７１，７２は、例えば、１０５μｍまたは２００μｍのコア径と１２５μｍｍまたは２４０μｍのクラッド径とを有し、水酸基の含有量が少ないシリカ製の光ファイバである。照明ファイバ６の開口数ＮＡは０．２２以上であることが好ましく、集光ファイバ７１，７２の開口数ＮＡは０．２２以下であることが好ましい。
【００３２】
図２に示されるように、プローブヘッド２ａにおいて、照明ファイバ６および集光ファイバ７１，７２は、プローブヘッド２ａの長手方向に沿って互いに平行に配列している。第１の集光ファイバ７１および第２の集光ファイバ７２は、照明ファイバ６を中心とする同心円状に配列され、第１の集光ファイバが径方向内側に、第２の集光ファイバ７２が径方向外側に配置されている。したがって、照明ファイバ６の先端面（射出面）から各第１の集光ファイバ７１の先端面（受光面）までの径方向の距離は、照明ファイバ６の先端面から各第２の集光ファイバ７２の先端面（受光面）までの径方向の距離よりも短くなっている。
【００３３】
図３および図４に示されるように、照明ファイバ６の先端面は、プローブヘッド２ａの長手方向に対して垂直である。したがって、照明ファイバ６の先端面から所定の開口数で射出されたレーザ光は、図５および図６に示されるように、プローブヘッド２ａの先端前方の円錐状の照明領域Ｄに照射され、照明領域Ｄにおいてラマン散乱光が発生する。
【００３４】
一方、集光ファイバ７１，７２の先端面は、図３および図４に示されるように、照明ファイバ６および集光ファイバ７１，７２に対して平行であるプローブヘッド２ａの長軸について、この長軸に垂直な面に対して所定角δだけ傾斜しており、斜め外方を向いている。これにより、集光ファイバ７１，７２は、図５および図６に示されるように、照明ファイバ６側から各々の長手軸に対して斜め方向に入射する光を集めるので、集光ファイバ７１，７２の先端面をプローブヘッド２ａの長軸に垂直に形成した場合と比べて、集光ファイバ７１，７２によって光が集められる集光領域Ｅ１，Ｅ２と照明領域Ｄとが重なり合う範囲（観察範囲）Ｆ１，Ｆ２の体積が増大する。集光ファイバ７１，７２によるラマン散乱光の受光量は、観察範囲Ｆ１，Ｆ２の体積が大きい程、増大するので、集光ファイバ７１，７２の先端面を傾斜させることによって、関節骨Ａの表層付近において発生したラマン散乱光を効果的に集光し、信号対雑音比の高い関節骨Ａのラマンスペクトルを取得することができる。
【００３５】
所定角δは集光ファイバ７１，７２の開口数ＮＡの大きさに依存して決められる角度であって、集光ファイバ７１，７２の開口数ＮＡが小さい程、所定角δを大きく設定することが可能であり、関節骨Ａにおいて、より表層部から発せられるラマン散乱光を集めることができる。例えば、照明ファイバ６のコア径が２００μｍかつ開口数ＮＡが０．２２であり、集光ファイバ７１，７２のコア径が２００μｍかつ開口数ＮＡが０．１５であるとき、所定角δを３０度以上３７度以下に含まれる所定の角度に設定することにより、関節骨Ａのうち、表面からの厚みが１乃至２ｍｍ程度の軟骨組織Ｂに由来するラマンスペクトルを選択的に観測することができる。また、照明ファイバ６および集光ファイバ７１，７２のコア径を更に小さくすることによって、より薄い軟骨組織に由来するラマンスペクトルを選択的に観測することもできる。
【００３６】
また、プローブヘッド２ａの先端面において、照明ファイバ６の断面（先端面）と接するように合成石英またはサファイア製の窓材が配置されていて、該窓材を含む平面とδの角を成す集光ファイバ７１，７２の先端面と、該窓材との間に空隙が設けられるようにしても良い。関節骨を測定するにおいて、灌流液によって集光ファイバ７１，７２が水浸される場合には、集光ファイバ７１，７２の構成材の屈折率と水の屈折率との屈折率差が該構成材と空気との屈折率差よりも小さくなるために、集光領域Ｅ１およびＥ２と照明領域Ｄとの重なりが小さくなり、関節骨Ａの表層付近の観察に不利である。そこで、上記のように空隙を設けることで集光領域Ｅ１およびＥ２と照明領域Ｄとの重なりを大きく保ち、水浸環境でも関節骨Ａの表層付近にある軟骨組織Ｂを選択的に観測できる効果がある。
【００３７】
ここで、第１の集光ファイバ７１は、第２の集光ファイバ７２よりも照明ファイバ６の近くに位置しているため、第１の集光領域Ｅ１と照明領域Ｄとが重なり合う第１の観察範囲Ｆ１は、第２の集光領域Ｅ２と照明領域Ｄとが重なり合う第２の観察範囲Ｆ２よりも、プローブヘッド２ａの先端部に近くなる。したがって、第１の集光ファイバ７１は、関節骨Ａの相対的に浅い位置からのラマン散乱光を集め、第２の集光ファイバ７２は、関節骨Ａの相対的に深い位置からのラマン散乱光を集める。すなわち、第１の集光ファイバ７１によって集められるラマン散乱光には、第２の集光ファイバ７２によって集められるラマン散乱光に比べて、関節骨Ａの表層部を覆う軟骨組織Ｂのラマン散乱光がより多く含まれる。
【００３８】
図７は、光学プローブ２の基端部の横断面図である。図７に示されるように、光学プローブ２の基端部において、第１の集光ファイバ７１および第２の集光ファイバ７２は、一側に第１の集光ファイバ７１が集まり、他側に第２の集光ファイバ７２が集まるように、一列に配列されている。したがって、図８に示されるように、第１の集光ファイバ７１から射出されるラマン散乱光は、受光面２５上の第１の受光領域Ｇ１に再結像し、第２の集光ファイバ７２から射出されるラマン散乱光は、受光面２５上の第１の受光領域Ｇ１とは異なる第２の受光領域Ｇ２に再結像する。これにより、第１の観察範囲Ｆ１の第１のラマンスペクトルと、第２の観察範囲Ｆ２の第２のラマンスペクトルとが、分離して取得されるようになっている。
【００３９】
図９は、軟骨組織Ｂが十分に厚い関節骨Ａから得られた第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルの一部を示し、図１０は、軟骨組織Ｂが薄い関節骨Ａから得られた第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルの一部を示している。
【００４０】
軟骨組織Ｂに含まれる主な成分は、水、コラーゲン（ＩＩ型コラーゲン）、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）とタンパク質との複合体であるプロテオグリカン、および、軟骨細胞である。骨組織Ｃに含まれる主な成分は、コラーゲン（Ｉ型コラーゲン）、リン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト）、および炭酸カルシウムである。図９および図１０のラマンスペクトルにおいて、９２１ｃｍ−１近傍にピークを有するラマンバンドは、軟骨組織中のＩＩ型コラーゲンに含まれるアミノ酸であるプロリン由来であり、９５８ｃｍ−１近傍にピークを有するラマンバンドは、軟骨組織中のＩＩ型コラーゲンのラマンバンドと骨組織中のリン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト）のリン酸基のラマンバンドとが重畳されたバンドである。
【００４１】
図９および図１０に示される９２１ｃｍ−１および９５８ｃｍ−１における２つのラマンバンドの強度に着目すると、図９の第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルにおける９２１ｃｍ−１のラマンバンドと９５８ｃｍ−１のラマンバンドの強度比はほとんど変化しない一方、図１０の第１のラマンスペクトルと第２のラマンスペクトルにおいては、第２のラマンスペクトルにおける９５８ｃｍ−１のラマンバンド強度は９２１ｃｍ−１のラマンバンド強度より大きくなっている。これは、図９の第２のラマンスペクトルに対し、図１０の第２のラマンスペクトルには、骨組織の成分であるヒドロキシアパタイトに由来するラマンスペクトルの寄与がより多く含まれることを意味している。このように、図９の第１および第２のラマンスペクトルに含まれる信号のほとんどは、軟骨組織Ｂからの信号であるのに対し、図１０の第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルには、軟骨組織Ｂの成分由来の信号と骨組織Ｃの成分由来の信号の両方が含まれることが分かる。
【００４２】
また、軟骨組織の分析装置１００は、図１に示されるように、制御部８、記憶部９、演算部（強度比演算部、評価部）１０および表示部１１をさらに備えている。
制御部８は、レーザ光源１から出射されるレーザ光の出力強度および出力タイミングを制御することによって、レーザ光の照射強度および照射タイミングを制御する。また、制御部８は、分光器３の中心波長、光検出器５による光の検出条件（例えば、露光時間およびゲイン）を制御する。
【００４３】
記憶部９は、光検出器５によって取得された第１および第２のラマンスペクトルのデータと、演算部１０による演算結果（後述）とを記憶する。
表示部１１は、記憶部９に記憶されているラマンスペクトルおよび演算部１０による演算結果を表示する。
【００４４】
演算部１０は、記憶部９から第１および第２のラマンスペクトルのデータを読み出し、第１および第２のラマンスペクトルを解析して関節骨Ａに含まれる軟骨組織Ｂの状態を評価するための以下の第１および第２の処理を実行する。
【００４５】
第１の処理において、演算部１０は、第１および第２のラマンスペクトルのうち、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルであるものを選択する。具体的には、演算部１０は、下式に定義されるように、第１のラマンスペクトルにおける軟骨組織Ｂ由来のラマンバンドおよび骨組織Ｃ由来のラマンバンドの強度比（第１のバンド強度比）を算出する。
バンド強度比＝軟骨組織由来のラマンバンドの強度÷骨組織由来のラマンバンドの強度
同様にして、演算部１０は、第２のラマンスペクトルにおける軟骨組織Ｂ由来のラマンバンドおよび骨組織Ｃ由来のラマンバンドの強度比（第２のバンド強度比）を算出する。
【００４６】
軟骨組織Ｂ由来のラマンバンドは、例えば、ＩＩ型コラーゲンのラマンバンドであって、アミノ酸（プロリン）の９２１ｃｍ−１のラマンバンド、コラーゲンのポリペプチド骨格の８１５ｃｍ−１のラマンバンドを用いることができる。骨組織Ｃ由来のラマンバンドは、例えば、９５８ｃｍ−１におけるヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）に含まれるリン酸イオンのラマンバンドである。各ラマンバンド強度は、バンドのピーク値および面積強度のいずれであってもよい。
続いて、演算部１０は、第１のバンド強度比および第２のバンド強度比をそれぞれ所定の閾値と比較し、バンド強度比が所定の閾値よりも大きいラマンスペクトルを軟骨組織Ｂのラマンスペクトルとして選択する。
【００４７】
ここで、軟骨組織Ｂの厚みとラマンバンド強度比との関係および所定の閾値について説明する。
図１１Ａに示すのは、観察範囲Ｆ１および観察範囲Ｆ２を含む程度に軟骨組織Ｂが十分厚い場合における、観察範囲Ｆ１および観察範囲Ｆ２と関節骨Ａとの関係を図示するものである。この場合において、集光ファイバ７１で取得される第１のラマンスペクトルおよび集光ファイバ７２で取得される第２のラマンスペクトルは、図１１Ｂに示されるように、ほぼ軟骨組織Ｂのラマンスペクトルに因るものである。このときの９２１ｃｍ−１にピークを有するコラーゲンのラマンバンド強度と、９５８ｃｍ−１にピークを有するヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）のラマンバンド強度は略等しくなる。
【００４８】
図１２Ａに示すのは、観察範囲Ｆ１および観察範囲Ｆ２をほとんど含まない程度に軟骨組織Ｂが十分薄いか、軟骨組織Ｂが存在しない場合における、観察範囲Ｆ１および観察範囲Ｆ２と関節骨Ａとの関係を図示するものである。この場合において、集光ファイバ７１で取得される第１のラマンスペクトルおよび集光ファイバ７２で取得される第２のラマンスペクトルは、図１２Ｂに示されるように、ほぼ骨組織Ｃのラマンスペクトルに因るものである。このときの９５８ｃｍ−１にピークを有するヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）のラマンバンド強度は、９２１ｃｍ−１にピークを有するコラーゲンのラマンバンド強度の１０倍以上となる。
【００４９】
図１３Ａに示すのは、軟骨組織Ｂの厚みが図１１Ａの場合と図１２Ａの場合の中間的な場合を図示するものである。この場合、図１３Ｂに示されるように、集光ファイバ７１で取得される第１のラマンスペクトルおよび集光ファイバ７２で取得される第２のラマンスペクトルにおいて、９２１ｃｍ−１にピークを有するコラーゲンのラマンバンド強度と、９５８ｃｍ−１にピークを有するヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）のラマンバンドの強度の強度比は、観察範囲Ｆ１および観察範囲Ｆ２に含まれる軟骨組織Ｂと骨組織Ｃの割合によって変化する。
【００５０】
このように、９２１ｃｍ−１にピークを有するコラーゲンのラマンバンドと９５８cm−１にピークを有するヒドロキシアパタイトのラマンバンドのバンド強度比は、関節骨Ａにおける軟骨組織Ｂの厚みに応じて異なり、第１および第２のラマンスペクトルにおける軟骨組織Ｂのラマンスペクトルの寄与の割合に依存して変化する。したがって、バンド強度比に基づいて、骨組織Ｃのラマンスペクトルの寄与が小さく軟骨組織Ｂのラマンスペクトルの寄与が大きいものを、第１および第２のラマンスペクトルの中から選択することができる。
【００５１】
軟骨組織Ｂのラマンスペクトルの選択の基準となる所定の閾値は実験的に決定される。
例えば、観察範囲Ｆ１に対して軟骨組織が十分に厚いブタ関節骨（サンプル数ｎ＝２０）のラマンスペクトルを測定して、９２１ｃｍ−１と９５８ｃｍ−１のラマンバンドのバンド強度比を計算した結果、バンド強度比は、０．８０以上１．２５以下であった。したがって、所定の閾値を当該範囲の最小値以上の値に設定することによって、関節骨Ａのラマンスペクトルから、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを選択的に観測することができる。
【００５２】
例えば、所定の閾値は、０．８に設定される。図９に示される第１および第２のラマンスペクトルの場合、バンド強度比はそれぞれ１．１５および１．０である。したがって、第１および第２のラマンスペクトルの両方が、軟骨組織のラマンスペクトルとして選択される。このような場合には、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルとして、第１のラマンスペクトルのみを、この後の第２の処理に用いても良いし、第１のラマンスペクトルと第２のラマンスペクトルとの和を、この後の第２の処理に用いてもよい。図１０に示される第１および第２のラマンスペクトルの場合、バンド強度比はそれぞれ０．９５および０．５６である。したがって、第１のラマンスペクトルのみが、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルとして選択される。
【００５３】
次に、第２の処理において、演算部１０は、選択された軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを解析して軟骨組織Ｂに含まれるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量を算出し、算出されたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量に基づいて軟骨組織Ｂの状態を評価する。具体的には、演算部１０は、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルからコラーゲンのラマンバンドの強度およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドの強度を算出する。コラーゲンのラマンバンドとしては、例えば、９２１ｃｍ−１におけるプロリン残基のラマンバンド、または、８１５ｃｍ−１におけるコラーゲンのラマンバンドが選択される。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドとして、例えば、１０６３ｃｍ−１における硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の硫酸基のラマンバンド、または、１３８０ｃｍ−１のラマンバンドが選択される。各ラマンバンド強度は、バンドのピーク値および面積強度のいずれであってもよい。
【００５４】
図１４は、図１に示す分析装置１００において関節骨Ａのラマンスペクトルを取得した後に、第１の処理において選択された軟骨組織Ｂのラマンスペクトルの一例を示している。図１４において、実線は、正常な関節骨Ａにおける軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを示し、破線は、正常な関節骨Ａをプロテオグリカン分解酵素（トリプシン）に浸漬してグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を一部欠失させた病変モデルの関節骨Ａにおける軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを示している。２つのラマンスペクトルを比較すると、９２１ｃｍ−１のコラーゲンのラマンバンドの強度は変化していないのに対し、１０６３ｃｍ−１近傍および１３８０ｃｍ−１近傍の硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドの強度には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を欠損させた軟骨組織のラマンスペクトルにおいて減少が見られる。
【００５５】
続いて、演算部１０は、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドとコラーゲンのラマンバンドの強度比（ＧＡＧのラマンバンドの強度÷コラーゲンのラマンバンドの強度）ＧＡＧ／Ｃｏｌを算出する。硫酸化グリコサミノグリカンのラマンバンドとしては、１０６３ｃｍ−１近傍または１３８０ｃｍ−１近傍に強度ピークを有するラマンバンドを用い、コラーゲンのラマンバンドとしては９２１ｃｍ−１近傍または９４０ｃｍ−１近傍に強度ピークを有するラマンバンドを用いることができる。
【００５６】
図１５Ａおよび図１５Ｂは、ラマンバンドの強度比ＧＡＧ／Ｃｏｌと、生化学分析によって得られた軟骨組織中における、単位湿重量当たりの硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の重量との相関関係を示している。硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドとして１０６３ｃｍ−１近傍および１３８０ｃｍ−１近傍のいずれのラマンバンドを用いた場合にも、強度比ＧＡＧ／Ｃｏｌは、軟骨組織中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量に対して相関係数０．９以上の高い相関を示した。再生途中にあって硝子軟骨として成熟していない再生軟骨や、線維性軟骨や、変形性関節症の軟骨組織においては、正常な軟骨組織に比べてコンドロイチン硫酸等のＧＡＧの量が減少することが知られている。演算部１０は、ラマンバンドの強度比ＧＡＧ／Ｃｏｌに基づいて、軟骨組織Ｂ中のＧＡＧの量を推定し、再生軟骨や変形性関節症等の軟骨組織Ｂの状態を評価する。
【００５７】
演算部１０によって得られたＧＡＧの量、評価結果等の解析結果は、記憶部９に記憶されるとともに、表示部１１に表示される。
【００５８】
次に、このように構成された軟骨組織の分析装置１００の作用について説明する。
図１６に示されるように、レーザ光源１から出力されたレーザ光は、光学プローブ２の照明ファイバ６によって導光され、プローブヘッド２ａから関節骨Ａへ照射される（ステップＳ１）。関節骨Ａの照明領域Ｄにおいては、レーザ光の照射によって関節骨Ａの成分由来のラマン散乱光が発生し、ラマン散乱光（非弾性散乱光）とレーザ光の散乱光（弾性散乱光）が関節骨Ａから拡散反射される。関節骨Ａから拡散反射された散乱光のうち、第１の観察範囲Ｆ１からの散乱光は第１の集光ファイバ７１によって受光され、第２の観察範囲Ｆ２からの散乱光は第２の集光ファイバ７２によって受光される（ステップＳ２）。
【００５９】
第１の集光ファイバ７１および第２の集光ファイバ７２によって受光された散乱光はそれぞれ、結合光学系４を介して分光器３に導光され、分光器３によって波長毎に空間的に分離され、光検出器５によって検出される。これにより、第１の観察範囲Ｆ１の第１のラマンスペクトルと第２の観察範囲Ｆ２の第２のラマンスペクトルが取得される（ステップＳ３）。取得されたラマンスペクトルは、記憶部９に記憶されるとともに演算部１０に送信される。
【００６０】
次に、演算部１０において、第１のラマンスペクトル内の軟骨組織Ｂのラマンバンドおよび骨組織Ｃのラマンバンドの強度から、第１のバンド強度比が算出される（ステップＳ４）。同様に、第２のラマンスペクトル内の軟骨組織Ｂのラマンバンドおよび骨組織Ｃのラマンバンドの強度から、第２のバンド強度比が算出される（ステップＳ５）。次に、第１および第２のラマンスペクトルの中から、所定の閾値よりも大きなバンド強度比を与えるラマンスペクトルが軟骨組織Ｂのラマンスペクトルとして選択される（ステップＳ６，Ｓ７）。
【００６１】
次に、演算部１０において、選択された軟骨組織Ｂのラマンスペクトル内のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびコラーゲンのラマンバンドの強度比ＧＡＧ／Ｃｏｌが算出され（ステップＳ８）、算出された強度比ＧＡＧ／Ｃｏｌに基づいて軟骨組織Ｂの状態が評価される（ステップＳ９）。評価結果は、表示部１１に表示される。表示部１１に表示される軟骨組織Ｂの評価結果は、例えば、軟骨組織Ｂ中におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の推定量である。あるいは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ)の推定量と相関するように段階付けされている、軟骨組織Ｂの状態を示す分類指標であってもよい。
【００６２】
このように、本実施形態によれば、照明ファイバ６の先端面から互いに異なる距離に先端面が配置された第１の集光ファイバ７１および第２の集光ファイバ７２によって、関節骨Ａの異なる深さの観察範囲Ｆ１，Ｆ２の２つのラマンスペクトルが取得される。そして、各ラマンスペクトルから算出された軟骨組織Ｂ由来のラマンバンドと骨組織Ｃ由来のラマンバンドとのラマンバンド強度比に基づいて、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを選択することにより、骨組織Ｃ由来の信号の影響を極力排除した上で、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを評価に用いることができる。これにより、関節骨Ａの表層に存在する軟骨組織Ｂにおいて再生途上にある再生軟骨の状態や、関節骨Ａ表層に存在する軟骨組織Ｂのみに異常を伴う早期の変形性関節症等における軟骨組織Ｂの状態を、精度良く評価することができるという利点がある。
【００６３】
本実施形態においては、複数の第１の集光ファイバ７１と複数の第２の集光ファイバ７２が同心円状に配列されていることとしたが、第１の集光ファイバ７１および第２の集光ファイバ７２の数および配列はこれに限定されるものではない。
例えば、図１７Ａから図１７Ｃに示されるように、第１の集光ファイバ７１および第２の集光ファイバ７２が、それぞれ１本のみ設けられ、照明ファイバ６、第１の集光ファイバ７１および第２の集光ファイバ７２が径方向に一列に配列されていてもよい。この場合も、照明ファイバ６の先端面から第１の集光ファイバ７１の先端面までの距離と、照明ファイバ６の先端面から第２の集光ファイバの先端面までの距離とが互いに異なるように、光ファイバ６，７１，７２は配列される。
【００６４】
図１７Ｃに示されるように、集光ファイバ７１，７２の先端面はプローブヘッド２ａの長軸方向に垂直な平面に対して所定角δ２だけ傾斜している。あるいは、図１７Ｂに示されるように、集光ファイバ７１，７２の先端面がプローブヘッド２ａの長軸方向に垂直な平面に対して所定角δ２だけ傾斜しているのみならず、照明ファイバ６の先端面も、プローブヘッド２ａの長軸方向に垂直な平面に対して所定角δ１だけ傾斜していてもよい。このようにすることで、照明ファイバ６が形成する照明領域Ｄと、集光ファイバ７１，７２が形成する集光領域Ｅ１およびＥ２が重なりあう範囲として形成される観察範囲Ｆ１とＦ２が、プローブヘッド２ａ先端により近い位置に形成されるため、関節骨Ａ表層に存在する軟骨組織Ｂを観察するにおいて、図１７Ｃに示される構造よりもさらに効果的である。
【００６５】
本実施形態においては、第１および第２のバンド強度比の算出にコラーゲンとＨＡＰのラマンバンドを用いることとしたが、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は軟骨組織Ｂのみに含まれ、骨組織Ｃには含まれないため、軟骨組織Ｂ由来のラマンバンドとして、コラーゲンに代えてグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドを用いてもよい。
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）とヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）のラマンバンドの強度比も、第１および第２のラマンスペクトルにおける軟骨組織Ｂのラマンスペクトルの寄与の割合を反映したものとなる。したがって、当該強度比に基づいて、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを選択することができる。
【００６６】
本実施形態においては、軟骨組織Ｂの状態を評価するために、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）とコラーゲンのラマンバンドの強度比ＧＡＧ／Ｃｏｌを算出することとしたが、これに代えて、またはこれに加えて、軟骨組織Ｂに含まれる他の２種類のラマンバンドの強度比を算出してもよい。
【００６７】
２種類のラマンバンドの第１の例として、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）とタンパク質のラマンバンドが用いられる。タンパク質のラマンバンドとしては、例えば、図１４に示されるように、１００３ｃｍ−１近傍にピークを有するタンパク質のフェニルアラニン残基のラマンバンドが選択される。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドは、例えば図１４に示される、１０６３ｃｍ−１近傍もしくは１３８０ｃｍ−１近傍にピークを有する硫酸化グリコサミノグリカンのラマンバンドを選択することができる。そして、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドとタンパク質のラマンバンドの強度比（ＧＡＧのラマンバンドの強度÷タンパク質のラマンバンドの強度）ＧＡＧ／Ｐｒｏｔｅｉｎが算出される。
【００６８】
再生途中にあって硝子軟骨として成熟していない再生軟骨や、線維性軟骨や、変形性関節症の軟骨組織においては、軟骨組織Ｂの全タンパク質の量に対してグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量が低下する。したがって、軟骨組織Ｂ中の全タンパク質とグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の相対量に比例する強度比ＧＡＧ／Ｐｒｏｔｅｉｎに基づいて、軟骨組織Ｂの状態を評価することができる。
【００６９】
２種類のラマンバンドの第２の例として、コラーゲンとタンパク質のラマンバンドが用いられる。コラーゲンのラマンバンドとしては、上述した９２１ｃｍ−１および８１５ｃｍ−１のラマンバンドの他に、図１４に示されるように、１２３０ｃｍ−１〜１２４０ｃｍ−１のコラーゲンのアミドＩＩＩバンド、または、１６５０ｃｍ−１近傍のコラーゲンのアミドＩバンドを選択してもよい。タンパク質のラマンバンドとしては、１００３ｃｍ−１近傍にピークを有するタンパク質のフェニルアラニン残基のラマンバンドが選択される。そして、コラーゲンのラマンバンドとタンパク質のラマンバンドの強度比（コラーゲンのラマンバンドの強度÷タンパク質のラマンバンドの強度）Ｃｏｌ／Ｐｒｏｔｅｉｎが算出される。このように取得された軟骨組織Ｂ中の全タンパク質量に対するコラーゲンの相対量に比例する強度比Ｃｏｌ／Ｐｒｏｔｅｉｎを用いることによっても、軟骨組織Ｂの状態を評価することができる。
【００７０】
２種類のラマンバンドの第３の例として、軟骨組織Ｂ中のタンパク質や脂質に由来するメチル基（ＣＨ３）とメチレン基（ＣＨ２）のラマンバンドを用いることができる。図１８は、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルの内、メチル基およびメチレン基のラマンバンドが観測される２８３０ｃｍ−１から３０５０ｃｍ−１のラマンシフト範囲を示している。
図１８に示されるように、メチル基のラマンバンドとしては、２９４０〜２９５０ｃｍ−１のバンドが選択され、メチレン基のラマンバンドとしては、２８５５ｃｍ−１近傍または２８８５ｃｍ−１近傍にピークを有するラマンバンドが選択される。そして、メチレン基のラマンバンドとメチル基のラマンバンドの強度比（メチレン基のラマンバンド強度÷メチル基のラマンバンド強度）ＣＨ2／ＣＨ3が算出される。
【００７１】
図１９は、メチレン基とメチル基のラマンバンドの強度比ＣＨ２／ＣＨ３と、軟骨組織中のＤＮＡ量（１ｍｇの軟骨組織における乾燥重量）との相関関係を示している。図１９に示されるように、強度比ＣＨ２／ＣＨ３は、軟骨組織中のＤＮＡ量に対して相関係数０．８以上の強い相関を有することから、メチレン基のラマンバンドは、細胞中の脂質に由来することが示唆された。
したがって、メチレン基とメチル基のラマンバンドの強度比ＣＨ２／ＣＨ３に基づいて軟骨組織Ｂ中の細胞量を推定し、細胞量に基づいて再生途上にある軟骨または変形性関節症軟骨の状態を評価することができる。
【００７２】
２種類のラマンバンドの第４の例として、１２４０ｃｍ−１近傍および１２７０ｃｍ−１近傍にピークを有する２つに分裂したアミドＩＩＩバンドが用いられる。この２つに分裂したコラーゲンのアミドＩＩＩバンドの強度比は、軟骨組織Ｂ中のコラーゲンの分子構造を反映し、コラーゲンの変性に伴って変化することが知られている。変形性関節症の軟骨においては、硝子軟骨中のＩＩ型コラーゲンの変性を示すことが知られており、２つのアミドＩＩＩバンドの強度比に基づいて変形性関節症のような軟骨組織のＩＩ型コラーゲンの変性を伴う病変の程度を評価することができる。
【００７３】
本実施形態においては、演算部１０が、ステップＳ７において選択された軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを多変量解析することで、軟骨組織Ｂ中に含まれる所定の成分量を反映するラマンスペクトルの特徴量を算出するか、あるいは所定の成分そのものの定量を実行することで、軟骨組織の状態を評価してもよい。
多変量解析の第１の例において、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルから、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンド（１０６３ｃｍ−１）を含む任意のラマンシフト範囲を選択し、選択された範囲のラマンスペクトルを多変量解析する。多変量解析としては、例えば、主成分分析（ＰＣＡ）、主成分回帰分析（ＰＣＲ）、部分最小二乗分析（ＰＬＳ）、あるいは古典最小二乗分析（ＣＬＳ）法が用いられる。
【００７４】
ここで、様々な状態にある軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを多変量解析した例として、主成分分析を実施した例について説明する。図２０Ａは、ステップＳ７において選択された様々な状態にある軟骨組織Ｂのラマンスペクトル群を示し、図２０Ｂは、図２０Ａのラマンスペクトル群を主成分分析した結果得られた第１主成分のローディングスペクトル（第１主成分波形）を示している。第１主成分のローディングスペクトルは、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドのピークに相当する１０６３ｃｍ−１近傍のラマンシフト値に強い正のピークを有するため硫酸化グリコサミノグリカンに由来する信号である。図２１に示すように、この第１主成分のローディングスペクトルへ図２０Ａのラマンスペクトル群を射影した第１主成分のスコア（第１主成分スコア）の大きさと硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量との間には正の相関が存在する。
【００７５】
図２１は、主成分分析により得られた第１主成分スコアと軟骨組織において単位乾燥重量中に含まれる硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量との相関関係を示している。図２１から分かるように、第１主成分スコアと硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量との間には、相関係数が０．８６の強い相関が認められた。このように、軟骨組織Ｂ中の硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量と相関するラマンスペクトル特徴量として主成分分析の第１主成分スコアを計算することで、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量に基づいて軟骨組織Ｂの状態を評価することができる。
【００７６】
主成分分析に代えて、他の多変量解析によるラマンスペクトル分析法を用いてもよい。
例えば、軟骨組織Ｂの主成分である硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびコラーゲン（ＩＩ型コラーゲン）の単離品から、成分比の異なる多数の混合サンプルを調整した上で、各混合サンプルのラマンスペクトルを測定し、混合サンプル毎の成分比とラマンスペクトルとを対応付けたデータを作成する。そして、当該データに基づき、ＰＬＳ（部分最小二乗回帰）分析法またはＰＣＲ（主成分回帰）等の回帰分析法によって硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）やＩＩ型コラーゲンの検量線を作成し、該検量線のデータを記憶部９に記憶しておく。このようにすることで、未知の軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを測定することで、該検量線を用いて硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）やＩＩ型コラーゲンの相対量を推定することができる。
【００７７】
多変量解析の第２の例において、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルから、メチレン基のラマンバンド（２８５５ｃｍ−１近傍および２８８５ｃｍ−１近傍）を含む任意のラマンシフト範囲を選択し、選択された範囲のラマンスペクトルを多変量解析する。多変量解析としては、例えば、主成分分析が用いられる。
【００７８】
図２２Ａは、ステップＳ７において選択された軟骨組織Ｂのラマンスペクトル群を示し、図２２Ｂは、図２２Ａのラマンスペクトル群を主成分分析して得られた第１主成分のローディングスペクトル（第１主成分波形）を示している。第１主成分のローディングスペクトルは、メチレン基のラマンバンドのピークに相当する２８５５ｃｍ−１および２８８５ｃｍ−１のラマンシフト値に強い正のピークを有するために、軟骨組織Ｂに含まれる脂質の寄与を含むスペクトルであることが示唆された。図２３に示すように、この第１主成分のローディングスペクトルへ図２２Ａのラマンスペクトル群を射影した第１主成分スコアの大きさと軟骨組織Ｂ中のＤＮＡ量との間には正の相関が存在することが明らかにされ、このメチレン基のラマンバンドは、軟骨細胞Ｂ中の脂質に由来すると考えられる。
【００７９】
図２３は、主成分分析により得られた第１主成分スコアと軟骨組織Ｂ中のＤＮＡ量（１ミリグラムの軟骨組織におけるＤＮＡ乾燥重量）との相関関係を示している。主成分分析の第１主成分スコアと軟骨組織Ｂ中のＤＮＡの量との間には、相関係数０．８２の強い相関が認められる。このように、軟骨組織Ｂ中の細胞の量と相関するラマンスペクトルの特徴量として主成分分析の第１主成分スコアを計算することで、細胞の量に基づいて、軟骨組織Ｂにおいて再生途上にある軟骨または変形性関節症の軟骨の状態を評価することができる。
【００８０】
本実施形態においては、演算部１０が、第１および第２のラマンスペクトルに基づいて、軟骨組織Ｂの厚みをさらに推定してもよい。
具体的には、演算部１０は、下式に定義されるように、第１および第２のラマンスペクトルの各々における軟骨組織Ｂ由来のラマンバンドおよび骨組織Ｃ由来のラマンバンドの強度比を算出する。
強度比＝骨組織由来のラマンバンドの強度÷軟骨組織由来のラマンバンドの強度
ここで、骨組織Ｃ由来のラマンバンドとしては、ラマンシフト値が９５８ｃｍ−１近傍にピークを有するヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）のラマンバンドを用い、軟骨組織Ｂ由来のラマンバンドとしては、ラマンシフト値が９２１ｃｍ−１近傍または８１５ｃｍ−１近傍にピークを有するＩＩ型コラーゲンのラマンバンドを用いることができる。
【００８１】
図２４は、様々な厚みの軟骨組織についてラマンスペクトルを取得し、第１のラマンスペクトルから算出された強度比と第２のラマンスペクトルから算出された強度比とをプロットした図である。演算部１０はさらに、第１のラマンスペクトルの強度比と第２のラマンスペクトルの強度比を示す２つのプロットを通る直線のＹ切片の値Ｙおよび直線の傾きＡを算出する。
【００８２】
ここで、図１１Ａに示すように、軟骨組織Ｂの厚みが、観察範囲Ｆ１と観察範囲Ｆ２を含む程度に十分厚い場合（図２４の丸いプロット参照。）、Ｙおよび傾きＡは共に小さくなる。また、図１２Ａに示すように、軟骨組織Ｂの厚みが、観察範囲Ｆ１と観察範囲Ｆ２をほとんど含まない程度に十分薄い場合（図２４の三角のプロット参照。）、Ｙは大きくなり、傾きＡは小さくなる。また、軟骨組織Ｂの厚みが上記の中間的な厚みである場合（図２４の四角のプロット参照。）、Ｙは小さくなり、傾きＡは大きくなる。
【００８３】
このように、観察範囲Ｆ１と観察範囲Ｆ２に関する軟骨組織Ｂの相対的な厚みに応じて（Ｙ，Ａ）の値が異なる。したがって、軟骨組織Ｂの実際の厚みと（Ｙ，Ａ）の値との関係を計測したデータベースを記憶部９に記憶した上で、演算部１０が記憶部９から当該データベースを読み出し、データベースに基づいて、未知の関節骨の第１および第２のラマンスペクトルから算出された２つのラマンバンドの強度比から（Ｙ，Ａ）を求め、求められた（Ｙ，Ａ）の値から軟骨組織Ｂの厚みを推定することができる。
【００８４】
軟骨組織Ｂの厚み推定は、次のようにして実施することができる。
様々な軟骨について第１および第２のラマンスペクトルの強度比を求め、さらに図２４に示すプロットを実施することによって（Ｙ，Ａ）を求める。また同時に軟骨組織の厚みＺを計測し、図２５に示すような、Ｙ切片の値Ｙと、傾きＡと、軟骨組織の厚みＺを座標軸にとった３次元座標系における座標点（Ｙ，Ａ，Ｚ）をプロットする。例えば、組織厚みが異なる３種類の軟骨組織について、（Ｙ１，Ａ１，Ｚ１）、（Ｙ２，Ａ２，Ｚ２）、および（Ｙ３，Ａ３，Ｚ３）の３点を３次元空間にプロットすることができる。このような座標点を多数の軟骨組織について教師データとして取得した上で、任意の（Ｙ，Ａ）に対する軟骨組織厚みＺを推定できるように、空間補間計算により厚み推定面（平面または曲面）を算出しておけばよい。このような厚み推定面を算出しておけば、未知の関節骨のラマンスペクトルを測定し、第１および第２のラマンスペクトルから（Ｙ，Ａ）を計算しさえすれば、観察点における軟骨厚みを推定することが可能である。このような空間補間による推定法としては、クリギング補間などの空間統計法を使用すればよい。
【００８５】
再生途上にある再生軟骨の成熟度や変形性関節症の進行度によって軟骨組織Ｂの厚みは変化し得るので、軟骨組織Ｂの厚みを推定することにより、再生軟骨や変形性関節症の軟骨組織の状態について知ることができる。上記方法で推定された軟骨組織Ｂの厚みが表示部１１に表示されるか、軟骨組織Ｂの厚みと相関するように段階付けされている、軟骨組織Ｂの状態を表す分類指標が表示部１１に表示されてもよい。
【００８６】
多数の関節骨Ａから（Ｙ，Ａ）のデータ群を得て、得られたデータ群に基づいて主成分回帰法（ＰＣＲ）や部分最小二乗法（ＰＬＳ）等の回帰分析法により、軟骨組織Ｂの厚みとＹ切片および傾きＡとを相関付ける検量線を予め作成しておき、該検量線を用いて未知の関節骨のラマンスペクルデータから軟骨組織Ｂの厚みを推定してもよい。
【００８７】
あるいは、ラマンスペクトルの多変量解析によって軟骨組織Ｂの厚みを推定してもよい。具体的には、軟骨組織Ｂの厚みが異なる多数の関節骨Ａサンプルについて、ラマンシフト値が９５８ｃｍ−１近傍のヒドロキシアパタイトのラマンバンドと、９２１ｃｍ−１近傍のＩＩ型コラーゲンのラマンバンドとを含む範囲において、第１および第２のラマンスペクトルを取得し、ステップＳ４，Ｓ５と同様にして第１および第２のラマンスペクトルの各々からコラーゲンのラマンバンドとヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）のラマンバンドの強度比を算出する。さらに、第１のラマンスペクトルにおけるラマンバンド強度比と第２のラマンスペクトルにおけるラマンバンド強度比との和を算出し、該ラマンバンド強度比の和と、実際の軟骨組織の厚みとを対応付けたデータを作成する。そして、当該データに基づき、ＰＬＳ分析法またはＰＣＲ分析法等の回帰分析法によって軟骨組織の厚みの検量線を作成し、検量線を記憶部９に記憶しておく。
このようにすることで、未知の関節骨の第１および第２のラマンスペクトルから軟骨組織の厚みを推定することができる。
【００８８】
上述した軟骨組織の分析装置１００の制御部８および演算部１０は、例えば、ＣＰＵ（中央演算処理装置）と、上述した制御部８および演算部１０の処理をＣＰＵに実行させるための制御プログラムおよび演算プログラムを格納するＨＤＤのような補助記憶装置と、ＣＰＵの作業領域として機能するＲＡＭまたはＲＯＭのような主記憶装置とを備えるコンピュータによって実現される。記憶部９は、例えば、主記憶装置によって実現される。
【符号の説明】
【００８９】
１  レーザ光源
３  分光器（検出部）
５  光検出器（検出部）
６  照明ファイバ
７１  第１の集光ファイバ
７２  第２の集光ファイバ
１０  演算部（強度比演算部、評価部）
１００  軟骨組織の分析装置
Ａ  関節骨
Ｂ  軟骨組織
Ｃ  骨組織
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2018134980.tif 000012
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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