(57)【要約】  リムルス・ポリフェムスの凝固メカニズムに関与するすべての完全長の組換え蛋白質、これらをコードするｃＤＮＡ、これらの用途を提供する。配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質、配列番号６、８、１０、または１２で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質、配列番号１４、１６、１８、２０、または２２で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質、それらのバリアント、それらをコードするｃＤＮＡ、それらの利用。
2018074498.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれかである組換え蛋白質。
（Ａ）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
（Ｂ）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｃ因子活性を有する組換え蛋白質。
（Ｃ）配列番号１または３で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｃ因子活性を有する組換え蛋白質。
（Ｄ）配列番号１または３で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｃ因子活性を有する組換え蛋白質。
【請求項２】
以下の蛋白質を活性化するための、請求項１に記載の組換え蛋白質の使用。
（Ａ）配列番号６、８、１０、または１２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（Ｂ）配列番号６、８、１０、または１２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｂ因子活性を有する蛋白質。
（Ｃ）配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｂ因子活性を有する蛋白質。
（Ｄ）配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｂ因子活性を有する蛋白質。
【請求項３】
請求項１に記載の組換え蛋白質を検体と接触させるステップを含む、検体中のエンドトキシンの検出方法。
【請求項４】
請求項１に記載の組換え蛋白質を含む、エンドトキシン検出剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リムルス属由来の組換え蛋白質、これをコードするＤＮＡ及びこれらの利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カブトガニは「生きた化石」と言われており、地球上に２属４種しか存在しない。属としては、北米大陸東海岸のみに生息する「リムルス（Limulus）属」と、アジア東南海域のみに生息する「タキプレウス（Tachypleus）属」のみである。【０００３】
一つの生物群が遠く離れた地域に分かれて分布することを不連続分布といい、カブトガニのように地球上の２つの地域に分かれた生物は大変珍しい。【０００４】
リムルス属に属する生物はリムルス・ポリフェムス（Limulus polyphemus）の１種のみであり、タキプレウス属に属する生物はタキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）、タキプレウス・ギガス（Tachypleus gigas）、タキプレウス・ロツンディカウダ（Tachypleus rotundicauda。カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Carcinoscorpius rotundicauda）とも言われる）の３種のみである。【０００５】
この生物の血中に存在するアメボサイト（amoebocyte）の抽出物（アメボサイト・ライセート。amoebocyte lysate）がエンドトキシンに接触すると、凝固することが知られている。この性質を利用して、アメボサイト・ライセートはエンドトキシンを高感度に検出する試薬として医薬品の品質管理等に広く使用されている。【０００６】
この試薬は「ライセート試薬」と呼ばれている。またエンドトキシンによって凝固が生じる性質は、最初にリムルス・ポリフェムスで発見されたことから、この試薬は「リムルス試薬」や「LAL（Limulus amoebocyte lysate）試薬」と呼ばれることもある。タキプレウス属のアメボサイト・ライセートを用いた試薬であっても、慣習上「リムルス試薬」や「LAL試薬」と呼ばれている。【０００７】
現在、日米欧の医薬品メーカーが使用しているライセート試薬（リムルス試薬、LAL試薬）は、リムルス・ポリフェムスを原料としている。リムルス・ポリフェムスは絶滅の懸念から捕獲数が厳しく制限されているが、依然固体数が減少しているとの報告もある。【０００８】
カブトガニを保護するため、アメボサイト・ライセート中の蛋白質を組換え技術で人工的に製造し、試薬を作製する思想がある（特許文献１〜８）。そして実際に、組換え蛋白質を利用して、PyroGene（商標）（Lonza）、EndoZyme（商標）(Hyglos)、PyroSmart（商標）（生化学工業）といった製品が上市されている。【０００９】
しかし、これらはいずれもタキプレウス属の生物に由来する組換え蛋白質を用いたものであり、ライセート試薬として広く普及しているリムルス・ポリフェムスに由来する組換え蛋白質を用いた試薬は報告されていない。【００１０】
その理由は、リムルス・ポリフェムスでは、エンドトキシンによって凝固が生じるメカニズムに関与する蛋白質及びその遺伝子が、構造的にも機能的にも完全には同定されていないからである。【００１１】
タキプレウス属では、例えば、凝固メカニズムに関与する１つの蛋白質であるＣ因子については、1991年にタキプレウス・トリデンタツス由来の完全な遺伝子配列及びアミノ酸配列が（非特許文献１）、1995年にはタキプレウス・ロツンディカウダ（カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ）由来の完全な遺伝子配列及びアミノ酸配列が（非特許文献２）それぞれ報告されている。【００１２】
しかし、リムルス・ポリフェムスでは、前記タキプレウス属における報告から20年以上経過してもなお、これらの蛋白質及び遺伝子の構造及び機能の両面における完全な同定には成功していない。カブトガニの属や種の相違による生体分子の種々の相違や多様性等に起因して、一般的な手法ではこれらの蛋白質及び遺伝子の全長配列構造の正確な決定、発現、および機能解明ができなかったからである。【００１３】
現に、次世代シーケンサーを使った無脊椎動物ゲノムプロジェクトの一環として、リムルス・ポリフェムスの遺伝子の網羅的な解析が行われているが（http://genome.wustl.edu/genomes/detail/limulus-polyphemus/）、リムルス・ポリフェムスの凝固メカニズムに関与する全ての蛋白質及び遺伝子の全長配列の解明には至っていない。この事実も、リムルス・ポリフェムスにおけるこれらの蛋白質及び遺伝子の全長配列構造の正確な決定の困難性を裏付けている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５，７１２，１４４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７１６，８３４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８５８，７０６号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９８５，５９０号明細書
【特許文献５】米国特許第６，６４５，７２４号明細書
【特許文献６】国際公開第２００８／００４６７４号
【特許文献７】特表２０１４−５１０８９８号公報
【特許文献８】国際公開第２０１４／０９２０７９号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Muta T et al., Journal of Biological Chemistry, 266, 6554-6561 (1991)
【非特許文献２】Ding JL et al., Molecular Marine Biology and Biotechnology, 4(1), 90-103 (1995)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、リムルス・ポリフェムスの凝固メカニズムに関与するすべての完全長の組換え蛋白質、これらをコードするｃＤＮＡ、これらの用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、長年誰も成功しなかったリムルス・ポリフェムスの凝固メカニズムに関与するすべての蛋白質因子をコードする完全長のｃＤＮＡの取得、及びそのすべての組換え蛋白質の発現に成功し、更にこれらが各種用途に利用できることを見出し、本発明を完成させた。【００１８】
すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
[１]
以下のいずれかである組換え蛋白質等の組換え第１蛋白質。
（Ａ）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
（Ｂ）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｃ因子活性を有する組換え蛋白質。
（Ｃ）配列番号１または３で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｃ因子活性を有する組換え蛋白質。
（Ｄ）配列番号１または３で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｃ因子活性を有する組換え蛋白質。
[２]
以下のいずれかである組換え蛋白質等の組換え第２蛋白質。
（Ａ）配列番号６、８、１０、または１２で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
（Ｂ）配列番号６、８、１０、または１２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｂ因子活性を有する組換え蛋白質。
（Ｃ）配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｂ因子活性を有する組換え蛋白質。
（Ｄ）配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｂ因子活性を有する組換え蛋白質。
[３]
以下のいずれかである組換え蛋白質等の組換え第３蛋白質。
（Ａ）配列番号１４、１６、１８、２０、または２２で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
（Ｂ）配列番号１４、１６、１８、２０、または２２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
（Ｃ）配列番号１３、１５、１７、１９、または２１で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
（Ｄ）配列番号１３、１５、１７、１９、または２１で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
[１−１]
Ｂ因子活性を有する蛋白質（例えば以下の蛋白質等の第２蛋白質）を活性化するための、組換え第１蛋白質の使用。
（Ａ）配列番号６、８、１０、または１２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（Ｂ）配列番号６、８、１０、または１２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｂ因子活性を有する蛋白質。
（Ｃ）配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｂ因子活性を有する蛋白質。
（Ｄ）配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｂ因子活性を有する蛋白質。
[１−１−１]
第２蛋白質が、組換え第２蛋白質である、[１−１]記載の使用。
[２−１]
プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質（例えば以下の蛋白質等の第３蛋白質）を活性化するための、組換え第２蛋白質の使用。
（Ａ）配列番号１４、１６、１８、２０、または２２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（Ｂ）配列番号１４、１６、１８、２０、または２２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
（Ｃ）配列番号１３、１５、１７、１９、または２１で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
（Ｄ）配列番号１３、１５、１７、１９、または２１で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
[２−１−１]
第３蛋白質が、組換え第３蛋白質である、[２−１]記載の使用。
[３−１]
基質を切断するための、組換え第３蛋白質の使用。
[３−１−１]
基質が、合成基質である、[３−１]記載の使用。
[１−２]
組換え第１蛋白質を検体と接触させるステップを含む、検体中のエンドトキシンの検出方法。
[１−２−１]
検体と接触した組換え第１蛋白質を、第２蛋白質等のＢ因子活性を有する蛋白質と接触させるステップを更に含む、[１−２]記載の方法。
[１−２−１−１]
第２蛋白質が、組換え第２蛋白質である、[１−２−１]記載の方法。
[１−２−２]
「検体と接触した組換え第１蛋白質」と接触したＢ因子活性を有する蛋白質を、第３蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質と接触させるステップを更に含む、[１−２−１]又は[１−２−１−１]記載の方法。
[１−２−２−１]
第３蛋白質が、組換え第３蛋白質である、[１−２−２]記載の方法。
[１−２−３]
「検体と接触した組換え第１蛋白質と接触したＢ因子活性を有する蛋白質」と接触したプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を、検出用基質と接触させるステップを更に含む、[１−２−２]又は[１−２−２−１]記載の方法。
[１−３]
組換え第１蛋白質を含む、エンドトキシン検出剤。
[１−３−１]
第２蛋白質等のＢ因子活性を有する蛋白質を更に含む、[１−３]記載の剤。
[１−３−１−１]
第２蛋白質が、組換え第２蛋白質である、[１−３−１]記載の剤。
[１−３−２]
第３蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を更に含む、[１−３−１]又は[１−３−１−１]記載の剤。
[１−３−２−１]
第３蛋白質が、組換え第３蛋白質である、[１−３−２]記載の剤。
[１−４]
以下のいずれかであるｃＤＮＡ（以下「第１ｃＤＮＡ」ともいう）。
（Ａ）配列番号１または３で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１または３で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、Ｃ因子活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１または３で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、Ｃ因子活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｃ因子活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
[１−４−１]
第１ｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。
[１−４−２]
[１−４−１]記載のＤＮＡ構築物で形質転換されて組換え第１蛋白質を発現する細胞。
[１−４−３]
[１−４−２]記載の細胞を培養するステップを含む、組換え第１蛋白質の生産方法。
[２−４]
以下のいずれかであるｃＤＮＡ（以下「第２ｃＤＮＡ」ともいう）。
（Ａ）配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、Ｂ因子活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、Ｂ因子活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号６、８、１０、または１２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号６、８、１０、または１２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｂ因子活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
[２−４−１]
第２ｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。
[２−４−２]
[２−４−１]記載のＤＮＡ構築物で形質転換されて組換え第２蛋白質を発現する細胞。
[２−４−３]
[２−４−２]記載の細胞を培養するステップを含む、組換え第２蛋白質の生産方法。
[３−４]
以下のいずれかであるｃＤＮＡ（以下「第３ｃＤＮＡ」ともいう）。
（Ａ）配列番号１３、１５、１７、１９、または２１で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１３、１５、１７、１９、または２１で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１３、１５、１７、１９、または２１で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号１４、１６、１８、２０、または２２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号１４、１６、１８、２０、または２２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
[３−４−１]
第３ｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。
[３−４−２]
[３−４−１]記載のＤＮＡ構築物で形質転換されて組換え第３蛋白質を発現する細胞。
[３−４−３]
[３−４−２]記載の細胞を培養するステップを含む、組換え第３蛋白質の生産方法。
[１−５]
第１ｃＤＮＡを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを含む、エンドトキシン検出剤の製造方法。
[１−５−１]
第２ｃＤＮＡを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを更に含む、[１−５]記載の製造方法。
[１−５−２]
第３ｃＤＮＡを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを更に含む、[１−５−１]記載の製造方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】リムルス・ポリフェムスのＣ因子活性を有する蛋白質のｃＤＮＡ取得過程におけるＰＣＲ産物の電気泳動写真である。
【図２】リムルス・ポリフェムスのＣ因子活性を有する蛋白質のｃＤＮＡ取得過程におけるＰＣＲ産物の電気泳動写真である。
【図３】各組換え蛋白質の単品または各種混合物とエンドトキシンとの接触による、合成基質の切断活性を示す図である。
【図４】３種の組換え蛋白質の混合物を用いたエンドトキシンの検量線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
＜１＞組換え第１蛋白質及びその製法
（１）組換え第１蛋白質
組換え第１蛋白質は、Ｃ因子活性を有する組換え蛋白質である。
【００２１】
組換え第１蛋白質は、具体的には、以下のいずれかである組換え蛋白質である。
（Ｉ）リムルス・ポリフェムスのＣ因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
（ＩＩ）前記（Ｉ）のバリアントであって、Ｃ因子活性を有する組換え蛋白質。
【００２２】
リムルス・ポリフェムスのＣ因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列としては、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列が挙げられる。また、そのようなアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号１または３で表される塩基配列が挙げられる。
【００２３】
組換え第１蛋白質は、より具体的には、以下のいずれかである組換え蛋白質であってよい。
（Ａ）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
（Ｂ）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｃ因子活性を有する組換え蛋白質。
（Ｃ）配列番号１または３で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｃ因子活性を有する組換え蛋白質。
（Ｄ）配列番号１または３で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｃ因子活性を有する組換え蛋白質。
【００２４】
なお、「アミノ酸配列を含む」または「塩基配列を含む」という表現は、当該「アミノ酸配列からなる」場合または当該「塩基配列からなる」場合も包含する。
【００２５】
この蛋白質は、本明細書の実施例に開示された方法により世界で初めて取得され、その全長の配列構造及び機能が初めて明らかにされたものである。その機能は、エンドトキシンの存在下で活性型となり、後述する第２蛋白質等のＢ因子活性を有する蛋白質を活性型に変化させる機能（本出願書類において「Ｃ因子活性」という）である。組換え第１蛋白質は、少なくとも組換え第２蛋白質等の第２蛋白質との組み合わせにおいて、Ｃ因子活性を示すものであってよい。
【００２６】
Ｃ因子活性を有することは、対象となる組換え蛋白質を、第２蛋白質（活性型になっていないもの。以下「非活性型」という）等のＢ因子活性を有する蛋白質（非活性型）、第３蛋白質（非活性型）等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質（非活性型）、及び検出用基質と組み合わせた際に、エンドトキシンの存在下でのカスケード反応の進行を検出することにより確認できる。
【００２７】
「カスケード反応」とは、エンドトキシンによりＣ因子活性を有する蛋白質（非活性型）が活性化され、Ｃ因子活性を有する蛋白質（活性型）によりＢ因子活性を有する蛋白質（非活性型）が活性化され、Ｂ因子活性を有する蛋白質（活性型）によりプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質（非活性型）が活性化される一連の反応をいう。カスケード反応の進行は、検出用基質の切断によって検出できる。
【００２８】
組換え第１蛋白質のうち、最も好ましいのは前記（Ａ）の組換え蛋白質等の前記（Ｉ）の組換え蛋白質であるが、Ｃ因子活性を有する限り、それらのバリアントであってもよい。
【００２９】
バリアントは、例えば、上記のような組換え第１蛋白質のアミノ酸配列（例えば配列番号２または４で表されるアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｃ因子活性を有する組換え蛋白質であってよい。前記「１若しくは数個」とは、例えば、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、または１〜３個であってよい。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加は、蛋白質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、例えば、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
【００３０】
また、バリアントは、例えば、上記のような組換え第１蛋白質のアミノ酸配列（例えば配列番号２または４で表されるアミノ酸配列）に対して、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｃ因子活性を有する組換え蛋白質であってもよい。
【００３１】
また、バリアントは、例えば、上記のような組換え第１蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（例えば配列番号１または３で表される塩基配列）に対して、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｃ因子活性を有する組換え蛋白質であってもよい。
【００３２】
また、バリアントは、例えば、上記のような組換え第１蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（例えば配列番号１または３で表される塩基配列）の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｃ因子活性を有する組換え蛋白質であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、T. Maniatisら編、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratoryなどに記載の通常のハイブリダイゼーション操作で、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件」とは、具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。
【００３３】
バリアントとして具体的には、前記（Ｂ）〜（Ｄ）の組換え蛋白質が好ましい。前記（Ｂ）及び（Ｃ）における「９５％以上」は、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上である。
【００３４】
また、組換え第１蛋白質は、Ｃ因子活性を有する限り、Ｈｉｓタグ、Ｖタグ等の任意のペプチド等が付加されていてもよい。
【００３５】
また、本出願書類において「組換え蛋白質」とは、蛋白質をコードする遺伝子を人工的にカブトガニ以外の宿主細胞に導入し、発現させることにより得られた蛋白質をいう。したがって、天然のカブトガニから取得された蛋白質そのものは、本出願書類における「組換え蛋白質」には該当しない。
【００３６】
（２）組換え第１蛋白質の製法
組換え第１蛋白質は、その完全なアミノ酸配列が本発明によって初めて開示されたので、例えば、この配列をコードするＤＮＡを用いて、遺伝子工学的手法により製造することができる。組換え第１蛋白質を遺伝子工学的手法により製造する方法は特に制限されず、例えば、蛋白質を遺伝子工学的手法により製造する通常の方法を採用できる。組換え第１蛋白質は、例えば、異種発現系や無細胞蛋白質合成系を利用して製造することができる。
【００３７】
例えば、後述する第１ｃＤＮＡを人工的にカブトガニ以外の宿主細胞に導入し、このｃＤＮＡから蛋白質を発現させることによって組換え第１蛋白質を製造することができる。本発明は、このような組換え第１蛋白質の製造方法をも提供する。
【００３８】
宿主細胞に人工的にＤＮＡを導入する際、当該ＤＮＡが人工的に組み込まれたＤＮＡ構築物（ベクターなど）を用いてもよい。このような人工のＤＮＡ構築物としては、例えば第１ｃＤＮＡが組み込まれたＤＮＡ構築物が例示できる。このような人工のＤＮＡ構築物については後述する。
【００３９】
カブトガニ以外の宿主細胞は、第１ｃＤＮＡから蛋白質を機能的に（functionally）発現させることができる限りにおいて特に限定されない。カブトガニ以外の宿主細胞としては、例えば、哺乳類細胞や昆虫細胞が挙げられる。哺乳類としては、げっ歯類や霊長類が挙げられる。げっ歯類としては、チャイニーズハムスター、ハムスター、マウス、ラット、モルモットが挙げられる。チャイニーズハムスターの細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（ＣＨＯ）が挙げられる。ＣＨＯとしては、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＳやＣＨＯ  Ｋ１が挙げられる。霊長類としては、特に制限されないが、ヒト、サル、チンパンジーが挙げられる。ヒトの細胞としては、ヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ）が挙げられる。ＨＥＫとしては、ＨＥＫ２９３が挙げられる。
【００４０】
「機能的に発現する」とは、発現された組換え第１蛋白質が、Ｃ因子活性を示すことをいう。Ｃ因子活性を示すことは、後述の実施例に記載の方法により確認することができる。また、発現された蛋白質が前記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの構造等の目的のアミノ酸配列を含むか否かは、発現された蛋白質のアミノ酸配列を分析し、これを目的のアミノ酸配列と比較することにより確認することができる。
【００４１】
第１ｃＤＮＡを人工的に宿主細胞に導入する手法も、当該ｃＤＮＡが宿主細胞内で発現可能に保持される状態となる限りにおいて特に制限されない。第１ｃＤＮＡが人工的に導入された宿主細胞を生育させることで、組換え第１蛋白質を発現させることができる。
【００４２】
形質転換された宿主細胞の生育は、例えば当該細胞を培養することにより行うことができる。その際の培養条件も、当該細胞が生育や増殖できる限り特に限定されず、当該細胞の培養に通常用いられる条件を、必要により適宜修正して用いることができる。例えば、宿主細胞が哺乳類細胞の場合には、哺乳類細胞の培養に通常用いられる培地を用いることができる。このような培地として、例えばRPMI1640培地（Sigma社）、DMEM培地（Sigma社）やExpiCHOTM Expression Medium（Thermo Fisher Scientific）などを用いることができる。培養は、例えば、３６℃〜３８℃で、５％〜８％ＣＯ２供給下で、静置培養あるいは浮遊培養などにより行うことができる。蛋白質発現専用のキットを用いてもよい。
【００４３】
発現した組換え第１蛋白質は、これを含有する溶液画分として回収して、後述する各種用途に利用できる。
【００４４】
組換え第１蛋白質を含有する溶液画分は、例えば、培養液、培養上清、細胞破砕抽出物、またはそれらの混合物等でありうる。組換え第１蛋白質は、所望の程度に精製して用いてもよく、精製せずそのまま用いてもよい。
【００４５】
精製は、蛋白質の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等が挙げられる。
【００４６】
本発明により、組換え第１蛋白質の人工的、かつ機能的な発現が初めて可能になった。このようにして製造された組換え第１蛋白質は、例えば後述する用途に使用することができる。
【００４７】
＜２＞組換え第２蛋白質及びその製法
組換え第２蛋白質は、Ｂ因子活性を有する組換え蛋白質である。
【００４８】
組換え第２蛋白質は、具体的には、以下のいずれかである組換え蛋白質である。
（Ｉ）リムルス・ポリフェムスのＢ因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
（ＩＩ）前記（Ｉ）のバリアントであって、Ｂ因子活性を有する組換え蛋白質。
【００４９】
リムルス・ポリフェムスのＢ因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列としては、配列番号６、８、１０、または１２で表されるアミノ酸配列が挙げられる。また、そのようなアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列が挙げられる。
【００５０】
組換え第２蛋白質は、より具体的には、以下のいずれかである組換え蛋白質であってよい。
（Ａ）配列番号６、８、１０、または１２で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
（Ｂ）配列番号６、８、１０、または１２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｂ因子活性を有する組換え蛋白質。
（Ｃ）配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｂ因子活性を有する組換え蛋白質。
（Ｄ）配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｂ因子活性を有する組換え蛋白質。
【００５１】
この蛋白質の機能は、活性型となった第１蛋白質等のＣ因子活性を有する蛋白質（活性型）によって活性型となり、後述する第３蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を活性型に変化させる機能（本出願書類において「Ｂ因子活性」という）である。組換え第２蛋白質は、少なくとも組換え第１蛋白質等の第１蛋白質及び組換え第３蛋白質等の第３蛋白質との組み合わせにおいて、Ｂ因子活性を示すものであってよい。
【００５２】
Ｂ因子活性を有することは、対象となる組換え蛋白質を、第１蛋白質（活性型）等のＣ因子活性を有する蛋白質（活性型）、第３蛋白質（非活性型）等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質（非活性型）、及び検出用基質を組み合わせた際に、カスケード反応の進行を検出することにより確認できる。この系には、Ｃ因子活性を有する蛋白質（非活性型）を活性型に変化させるためのエンドトキシンがさらに存在していてもよい。
【００５３】
その他の説明は、前記＜１＞の説明を準用できる。すなわち、例えば、前記＜１＞における「配列番号１または３」を「配列番号５、７、９、または１１」、「配列番号２または４」を「配列番号６、８、１０、または１２」、「（組換え）第１蛋白質」を「（組換え）第２蛋白質」、「第１ｃＤＮＡ」を「第２ｃＤＮＡ」、「Ｃ因子」を「Ｂ因子」などとそれぞれ読み替えればよい。
【００５４】
＜３＞組換え第３蛋白質及びその製法
組換え第３蛋白質は、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質である。
【００５５】
組換え第３蛋白質は、具体的には、以下のいずれかである組換え蛋白質である。
（Ｉ）リムルス・ポリフェムスのプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
（ＩＩ）前記（Ｉ）のバリアントであって、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
【００５６】
リムルス・ポリフェムスのプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のアミノ酸配列としては、配列番号１４、１６、１８、２０、または２２で表されるアミノ酸配列が挙げられる。また、そのようなアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号１３、１５、１７、１９、または２１で表される塩基配列が挙げられる。
【００５７】
組換え第３蛋白質は、より具体的には、以下のいずれかである組換え蛋白質であってよい。
（Ａ）配列番号１４、１６、１８、２０、または２２で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
（Ｂ）配列番号１４、１６、１８、２０、または２２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
（Ｃ）配列番号１３、１５、１７、１９、または２１で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
（Ｄ）配列番号１３、１５、１７、１９、または２１で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
【００５８】
この蛋白質の機能は、活性型となった第２蛋白質等のＢ因子活性を有する蛋白質（活性型）によって活性型となり、後述する基質（蛋白質またはペプチド）を切断する機能（本出願書類において「プロクロッティングエンザイム活性」という）である。組換え第３蛋白質は、少なくとも組換え第２蛋白質等の第２蛋白質との組み合わせにおいて、プロクロッティングエンザイム活性を示すものであってよい。
【００５９】
プロクロッティングエンザイム活性を有することは、対象となる組換え蛋白質を、第２蛋白質（活性型）等のＢ因子活性を有する蛋白質（活性型）及び検出用基質と組み合わせた際に、カスケード反応の進行を検出することにより確認できる。この系には、Ｂ因子活性を有する蛋白質（非活性型）を活性型に変化させるためのＣ因子活性を有する蛋白質（活性型）がさらに存在していてもよい。また、この系には、Ｃ因子活性を有する蛋白質（非活性型）を活性型に変化させるためのエンドトキシンがさらに存在していてもよい。
【００６０】
その他の説明は、前記＜１＞の説明を準用できる。すなわち、例えば、前記＜１＞における「配列番号１または３」を「配列番号１３、１５、１７、１９、または２１」、「配列番号２または４」を「配列番号１４、１６、１８、２０、または２２」、「（組換え）第１蛋白質」を「（組換え）第３蛋白質」、「第１ｃＤＮＡ」を「第３ｃＤＮＡ」、「Ｃ因子」を「プロクロッティングエンザイム」などとそれぞれ読み替えればよい。
【００６１】
＜４＞組換え第１蛋白質の使用
組換え第１蛋白質は、第２蛋白質等のＢ因子活性を有する蛋白質を活性化するために使用することができる。換言すれば、本発明は、組換え第１蛋白質をＢ因子活性を有する蛋白質と接触させるステップを含む、Ｂ因子活性を有する蛋白質の活性化方法を包含する。
【００６２】
Ｂ因子活性を有する蛋白質としては、第２蛋白質が挙げられる。
【００６３】
第２蛋白質は、具体的には、以下のいずれかである蛋白質である。
（Ｉ）リムルス・ポリフェムスのＢ因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ＩＩ）前記（Ｉ）のバリアントであって、Ｂ因子活性を有する蛋白質。
【００６４】
第２蛋白質は、より具体的には、以下のいずれかである蛋白質であってよい。
（Ａ）配列番号６、８、１０、または１２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（Ｂ）配列番号６、８、１０、または１２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｂ因子活性を有する蛋白質。
（Ｃ）配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｂ因子活性を有する蛋白質。
（Ｄ）配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｂ因子活性を有する蛋白質。
【００６５】
また、Ｂ因子活性を有する蛋白質としては、以下の蛋白質も挙げられる。
（ＩＩＩ）リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニのＢ因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ＩＶ）前記（ＩＩＩ）のバリアントであって、Ｂ因子活性を有する蛋白質。
【００６６】
Ｂ因子活性を有する蛋白質の説明は、前記＜２＞の説明を準用できる。
【００６７】
本発明により、組換え第１蛋白質の（Ａ）の蛋白質がＣ因子活性を保持していることが初めて明らかにされた。このような機能をもつ（Ａ）の蛋白質及びそのバリアントを、Ｂ因子活性を有する蛋白質の活性化に応用したものである。
【００６８】
ここで用いるＢ因子活性を有する蛋白質は、上記の構造及び機能を有する限り、天然物から取得したものでも、人工的に製造されたもの（例えば、組換え第２蛋白質）でもよい。本発明により、組換え第２蛋白質の人工的かつ機能的な発現が初めて可能になり、第２蛋白質を天然のリムルス・ポリフェムスから取得することなく一定の品質で安定的に製造することができるようになったことから、Ｂ因子活性を有する蛋白質は、組換え第２蛋白質であることが好ましい。
【００６９】
組換え第１蛋白質を用いたＢ因子活性を有する蛋白質の活性化は、組換え第１蛋白質（活性型）分子とＢ因子活性を有する蛋白質（非活性型）分子とを接触させることにより行うことができる。なお、組換え第１蛋白質を活性型に変化させるために、エンドトキシン存在下で組換え第１蛋白質（非活性型）とＢ因子活性を有する蛋白質（非活性型）とを接触させてもよい。
【００７０】
この接触時の条件は、組換え第１蛋白質（活性型）がＣ因子活性を発揮してＢ因子活性を有する蛋白質を活性化できる条件（エンドトキシン存在下で行う場合には、さらにエンドトキシンが組換え第１蛋白質を活性化できる条件）である限りにおいて特に限定されない。例えば、公知のライセート試薬における反応条件を採用することができる。
【００７１】
Ｂ因子活性を有する蛋白質が活性化されたことは、後述の実施例に記載の方法で確認することができる。
【００７２】
＜５＞組換え第２蛋白質の使用
組換え第２蛋白質は、第３蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を活性化するために使用することができる。換言すれば、本発明は、組換え第２蛋白質をプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質と接触させるステップを含む、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質の活性化方法を包含する。
【００７３】
プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質としては、第３蛋白質が挙げられる。
【００７４】
第３蛋白質は、具体的には、以下のいずれかである蛋白質である。
（Ｉ）リムルス・ポリフェムスのプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ＩＩ）前記（Ｉ）のバリアントであって、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
【００７５】
第３蛋白質は、より具体的には、以下のいずれかである蛋白質であってよい。
（Ａ）配列番号１４、１６、１８、２０、または２２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（Ｂ）配列番号１４、１６、１８、２０、または２２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
（Ｃ）配列番号１３、１５、１７、１９、または２１で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
（Ｄ）配列番号１３、１５、１７、１９、または２１で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
【００７６】
また、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質としては、以下の蛋白質も挙げられる。
（ＩＩＩ）リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニのプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ＩＶ）前記（ＩＩＩ）のバリアントであって、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
【００７７】
プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質の説明は、前記＜３＞の説明を準用できる。
【００７８】
ここで用いるプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質は、上記の構造及び機能を有する限り、天然物から取得したものでも、人工的に製造されたもの（例えば、組換え第３蛋白質）でもよい。
【００７９】
組換え第２蛋白質を用いたプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質の活性化は、組換え第２蛋白質（活性型）分子とプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質（非活性型）分子とを接触させることにより行うことができる。なお、組換え第２蛋白質を活性型に変化させるために、Ｃ因子活性を有する蛋白質（活性型）の存在下で、組換え第２蛋白質（非活性型）とプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質（非活性型）とを接触させてもよい。さらに、このＣ因子活性を有する蛋白質を活性化するために、エンドトキシン存在下でＣ因子活性を有する蛋白質（非活性型）、組換え第２蛋白質（非活性型）、及びプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質（非活性型）を接触させてもよい。
【００８０】
この接触時の条件は、組換え第２蛋白質（活性型）がＢ因子活性を発揮してプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を活性化できる条件（Ｃ因子活性を有する蛋白質（活性型）の存在下で行う場合には、さらにＣ因子活性を有する蛋白質（活性型）がＣ因子活性を発揮して組換え第２蛋白質を活性化できる条件。エンドトキシン存在下で行う場合には、さらにエンドトキシンがＣ因子活性を有する蛋白質を活性化できる条件）である限りにおいて特に限定されない。例えば、公知のライセート試薬における反応条件を採用することができる。
【００８１】
第３蛋白質が活性化されたことは、後述の実施例に記載の方法により確認することができる。
【００８２】
Ｃ因子活性を有する蛋白質としては、第１蛋白質が挙げられる。
【００８３】
第１蛋白質は、具体的には、以下のいずれかである蛋白質である。
（Ｉ）リムルス・ポリフェムスのＣ因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ＩＩ）前記（Ｉ）のバリアントであって、Ｃ因子活性を有する蛋白質。
【００８４】
第１蛋白質は、より具体的には、以下のいずれかである蛋白質であってよい。
（Ａ）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（Ｂ）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｃ因子活性を有する蛋白質。
（Ｃ）配列番号１または３で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｃ因子活性を有する蛋白質。
（Ｄ）配列番号１または３で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、Ｃ因子活性を有する蛋白質。
【００８５】
また、Ｃ因子活性を有する蛋白質としては、以下の蛋白質も挙げられる。
（ＩＩＩ）リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニのＣ因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ＩＶ）前記（ＩＩＩ）のバリアントであって、Ｃ因子活性を有する蛋白質。
【００８６】
Ｃ因子活性を有する蛋白質の説明は、前記＜１＞の説明を準用できる。
【００８７】
ここで用いるＣ因子活性を有する蛋白質は、上記の構造及び機能を有する限り、天然物から取得したものでも、人工的に製造されたもの（例えば、組換え第１蛋白質）でもよい。
【００８８】
その他の説明は、前記＜４＞の説明を準用できる。
【００８９】
＜６＞組換え第３蛋白質の使用
組換え第３蛋白質は、基質を切断するために使用することができる。換言すれば、本発明は、組換え第３蛋白質を基質と接触させるステップを含む、基質の切断方法を包含する。
【００９０】
この基質は、前記の「検出用基質」としても用いることができ、天然由来の基質であっても、合成基質であってもよい。このような基質は、第３蛋白質（活性型）等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質（活性型）が有するプロクロッティングエンザイム活性によって切断されるものであれば特に限定されない。
【００９１】
プロクロッティングエンザイム活性によって切断されるものとしては、例えば、コアギュローゲンなどの蛋白質や、一般式Ｘ−Ｙ−Ｚ（式中、Ｘ−はＹと共有結合した保護基、Ｙはペプチド残基、−ＺはＹとアミド結合したシグナル物質である）で表される合成基質が挙げられる。
【００９２】
保護基Ｘは特に限定されず、ペプチドの公知の保護基を用いることができる。そのような保護基としては、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基やベンゾイル基が挙げられる。
【００９３】
ペプチド残基Ｙも特に限定されず、例えば、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＬＧＲ）やＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＩＥＧＲ）（配列番号２３）が挙げられる。
【００９４】
シグナル物質Ｚも特に限定されず、例えば、可視光下で検出される色素や蛍光色素が挙げられる。このような色素としては、例えば、ｐＮＡ（パラニトロアニリン）、ＭＣＡ（７−メトキシクマリン−４−酢酸）、ＤＮＰ（２，４−ジニトロアニリン）、Ｄａｎｓｙｌ（ダンシル）系色素が挙げられる。
【００９５】
これらのなかでも、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（ｔ−ブトキシカルボニル−ロイシル−グリシル−アルギニル−パラニトロアニリン。Ｂｏｃ−ＬＧＲ−ｐＮＡ）が好ましい。
【００９６】
基質がプロクロッティングエンザイム活性によって切断されたことは、例えば、基質としてコアギュローゲンを用いた場合には、「ゲル化」を検知することにより検出することができる。ゲル化は、例えば、流動性が低下したことを目視などで検知することにより検出することができる。
【００９７】
また、基質がプロクロッティングエンザイム活性によって切断されたことは、例えば、前記のような合成基質を用いた場合には、Ｙ−Ｚ間のアミド結合が切断されることによりシグナルＺが遊離して発色や蛍光などのシグナルを発するので、このシグナルを検知することにより検出することができる。シグナルの検知は、そのシグナルの種類に応じた手法により行えばよい。例えば、ｐＮＡのシグナルは、吸光度（４０５ｎｍ）によって検知することができる。
【００９８】
組換え第３蛋白質を用いた基質の切断は、組換え第３蛋白質（活性型）分子と基質分子とを接触させることにより行うことができる。なお、組換え第３蛋白質を活性型に変化させるために、Ｂ因子活性を有する蛋白質（活性型）の存在下で、組換え第３蛋白質（非活性型）と基質とを接触させてもよい。さらに、このＢ因子活性を有する蛋白質を活性型に変化させるために、Ｃ因子活性を有する蛋白質（活性型）の存在下で、Ｂ因子活性を有する蛋白質（非活性型）、組換え第３蛋白質（非活性型）、及び基質を接触させてもよい。さらに、このＣ因子活性を有する蛋白質を活性型に変化させるために、エンドトキシン存在下でＣ因子活性を有する蛋白質（非活性型）、Ｂ因子活性を有する蛋白質（非活性型）、組換え第３蛋白質（非活性型）、及び基質を接触させてもよい。
【００９９】
この接触時の条件は、組換え第３蛋白質（活性型）がプロクロッティングエンザイム活性を発揮して基質を切断できる条件（Ｂ因子活性を有する蛋白質（活性型）の存在下で行う場合には、さらにＢ因子活性を有する蛋白質（活性型）がＢ因子活性を発揮して組換え第３蛋白質を活性化できる条件。Ｃ因子活性を有する蛋白質（活性型）の存在下で行う場合には、さらにＣ因子活性を有する蛋白質（活性型）がＣ因子活性を発揮して第２蛋白質を活性化できる条件。エンドトキシン存在下で行う場合には、さらにエンドトキシンがＣ因子活性を有する蛋白質を活性化できる条件）である限りにおいて特に限定されない。例えば、公知のライセート試薬における反応条件を採用することができる。
【０１００】
その他の説明は、前記＜４＞の説明を準用できる。
【０１０１】
＜７＞エンドトキシンの検出方法
本発明のエンドトキシンンの検出方法は、組換え第１蛋白質を検体と接触させるステップを含む、検体中のエンドトキシンの検出方法である。
【０１０２】
この方法は、検体と接触した組換え第１蛋白質を、第２蛋白質等のＢ因子活性を有する蛋白質と接触させるステップを更に含んでいてよい。このＢ因子活性を有する蛋白質は、組換え第２蛋白質であってよい。
【０１０３】
また、この方法は、「検体と接触した組換え第１蛋白質」と接触したＢ因子活性を有する蛋白質を、第３蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質と接触させるステップを更に含んでいてよい。このプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質は、組換え第３蛋白質であってよい。
【０１０４】
検体中のエンドトキシンの検出は、検体と接触した組換え第１蛋白質の活性化を検知することにより行うことができる。組換え第１蛋白質が活性化されたことは、後述の実施例に記載の方法により確認することができる。また、組換え第１蛋白質の活性化は、基質（検出用基質）を利用して直接検知することもできる。すなわち、検出用基質として、活性化された組換え第１蛋白質のＣ因子活性により切断されシグナルを発するものを利用することにより、組換え第１蛋白質の活性化を直接検知することができる。よって、この方法は、「検体と接触した組換え第１蛋白質」と検出用基質を接触させるステップを更に含んでいてもよい。
【０１０５】
更にＢ因子活性を有する蛋白質と接触させるステップを含む場合には、前記＜４＞に記載の方法でＢ因子活性を有する蛋白質の活性化を検知することにより行うことができる。また、Ｂ因子活性を有する蛋白質の活性化は、基質（検出用基質）を利用して直接検知することもできる。すなわち、検出用基質として、活性化されたＢ因子活性を有する蛋白質のＢ因子活性により切断されシグナルを発するものを利用することにより、Ｂ因子活性を有する蛋白質の活性化を直接検知することができる。よって、この方法は、「組換え第１蛋白質と接触したＢ因子活性を有する蛋白質」と検出用基質を接触させるステップを更に含んでいてもよい。
【０１０６】
更にプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質と接触させるステップを含む場合には、前記＜５＞に記載の方法でプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質の活性化（前記＜６＞に記載の方法による基質の切断）を検知することにより行うことができる。よって、この方法は、「Ｂ因子活性を有する蛋白質と接触したプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質」と基質（検出用基質）を接触させるステップを更に含んでいてもよい。プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質の活性化を検知できる検出用基質としては、前記＜６＞に例示したものが挙げられる。
【０１０７】
これらのステップは、順次行ってもよく、同時に行ってもよい。例えば、これらのステップを同時に行う場合には、検体、組換え第１蛋白質（非活性型）、Ｂ因子活性を有する蛋白質（非活性型）、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質（非活性型）、検出用基質を同時に同じ系のなかで接触させてもよい。
【０１０８】
これらの接触の条件は、前記＜４＞〜＜６＞に記載した条件と同様である。例えば、組換え第１蛋白質と検体との接触は、検体中のエンドトキシンが組換え第１蛋白質を活性化できる条件である限りにおいて特に限定されない。接触の条件は、例えば公知のライセート試薬における反応条件を採用することができる。例えば、反応液のｐＨとしては、ｐＨ５〜１０、好ましくは７〜８．５を採用できる。反応温度としては、１０℃〜８０℃、好ましくは２０℃〜５０℃、さらに好ましくは３０℃〜４０℃を採用することができる。反応温度としては、例えば、３７℃が例示される。反応時間も特に限定されず、諸条件に応じて適宜設定すればよい。反応時間は、例えば、５分〜２時間、好ましくは１５分〜９０分、より好ましくは３０分〜４０分であってよい。
【０１０９】
検体も、エンドトキシンの検出が必要な試料である限りにおいて特に限定されない。検体としては、例えば、医療用水、医薬品、輸液、血液製剤、医療機器、医療器具、化粧品、飲食品、環境試料、生体成分、天然の蛋白質、組換え蛋白質、核酸、糖質が挙げられる。検体は、それ自体を、あるいはその抽出物や洗浄液を反応系に混合、分散、又は溶解し、エンドトキシンの検出に供することができる。
【０１１０】
エンドトキシンの検出は、定性的な検出でも、定量的な検出でもよい。定量的な検出は、例えば、エンドトキシン量（濃度）が異なる複数の標準品を用いて、その量（濃度）と、基質の種類に応じた検出レベル（例えば、基質としてコアギュローゲンを用いた場合には「ゲル化」の程度、合成基質を用いた場合にはシグナルの程度）との関係を、例えば検量線や関係式を用いて予め関連付けておき、実際の検体を用いた場合の検出レベルから、エンドトキシン量（濃度）を換算することにより行うことができる。
【０１１１】
＜８＞エンドトキシン検出剤
本発明のエンドトキシン検出剤は、組換え第１蛋白質を含む、エンドトキシン検出剤である。
【０１１２】
この検出剤は、第２蛋白質等のＢ因子活性を有する蛋白質を更に含んでいてよい。このＢ因子活性を有する蛋白質は、組換え第２蛋白質であってよい。
【０１１３】
この検出剤は、第３蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を更に含んでいてよい。このプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質は、組換え第３蛋白質であってよい。
【０１１４】
これらの蛋白質は、前記＜１＞〜＜３＞に説明したとおり、例えば、培養液、培養上清、細胞破砕抽出物、またはそれらの混合物等の中に存在する形態でありうる。これらの蛋白質は、所望の程度に精製して用いてもよく、精製せずそのまま用いてもよい。例えば、これらの蛋白質が培養上清中に含有されている場合には、その培地成分を含んだまま用いてもよい。
【０１１５】
この検出剤中の組換え第１蛋白質、Ｂ因子活性を有する蛋白質、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質の各量は、各蛋白質の活性等に応じ適宜設定できるが、例えば、検体と混合した状態の反応液中の各蛋白質の終濃度として、15〜30μg/mLを例示することができる。
【０１１６】
この検出剤は、更に基質（検出用基質）を含んでいてよい。
【０１１７】
この検出剤は、これらの物を構成成分として含ませることにより製造することができる。この検出剤は、それ以外に賦形剤、安定化剤、緩衝剤などの添加剤を更に含んでいてもよい。また、この検出剤の形状も特に限定されず、固体状（例えば凍結乾燥形態）、液体状等の任意の形態で製剤化できる。
【０１１８】
この検出剤では、これらの物が、まとめて一体の容器内に構成成分として収められていてもよく、別体の容器内に収められていてもよい。
【０１１９】
また、この検出剤は、溶解用の緩衝液、エンドトキシン標準品、反応用容器（例えば、チューブやマイクロプレート）などを更に含んでいてもよい。この検出剤は、キットの形態をも包含する。
【０１２０】
この検出剤は、例えば前記＜７＞に説明した方法で使用することができる。
【０１２１】
＜９＞第１ｃＤＮＡ及びその利用
（１）第１ｃＤＮＡ
第１ｃＤＮＡは、以下のいずれかであるｃＤＮＡである。
（Ａ）配列番号１または３で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１または３で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、Ｃ因子活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１または３で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、Ｃ因子活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｃ因子活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
【０１２２】
このｃＤＮＡは、本明細書の実施例に開示された方法によって世界で初めて取得され、その全長の配列構造及びこれによってコードされる蛋白質の機能が初めて明らかにされたものである。その機能は「Ｃ因子活性」である。
【０１２３】
第１ｃＤＮＡのうち、最も好ましいのは前記（Ａ）のｃＤＮＡであるが、これによってコードされる蛋白質がＣ因子活性を有する限り、それらのバリアントであってもよい。
【０１２４】
バリアントとして具体的には、前記（Ｂ）〜（Ｅ）のｃＤＮＡが好ましい。前記（Ｂ）、（Ｃ）、及び（Ｅ）における「９５％以上」は、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上である。
【０１２５】
また、「ストリンジェントな条件」の意義及びその他の説明は、前記＜１＞の説明を準用できる。
【０１２６】
また、第１ｃＤＮＡは、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、前記（Ａ）のｃＤＮＡにおいて任意のコドンをそれと等価のコドンに置換してなるｃＤＮＡは、前記（Ｄ）に包含される。
【０１２７】
第１ｃＤＮＡは、その完全な塩基配列が本発明によって開示されたので、この配列情報を用いて、公知のＤＮＡ合成手法ないし遺伝子工学的手法により製造することができる。第１ｃＤＮＡは、後述の実施例に記載の方法によって初めて取得されたものであるが、その塩基配列が本発明で開示された以上、実施例記載の方法以外の方法によっても製造することができる。
【０１２８】
（２）第１ｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物、形質転換細胞、これを用いた組換え第１蛋白質の生産方法
本発明は、第１ｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を提供する。このような人工のＤＮＡ構築物としては、例えば、ベクターを例示することができる。ベクターとしては、組換えＤＮＡの増幅、維持、導入、ライブラリー作製、クローニング、蛋白質翻訳（蛋白質発現）などの目的に応じて、プラスミド、ウイルス、その他の公知のベクターを適宜選択することができる。このようなベクター等に第１ｃＤＮＡを導入することにより、第１ｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を製造することができる。
【０１２９】
また、本発明は、第１ｃＤＮＡを含む細胞を提供する。このような細胞は、例えば、このようなＤＮＡ構築物で形質転換されて組換え第１蛋白質を発現する細胞であってよい。また、本発明は、このような細胞を培養するステップを含む、組換え第１蛋白質の生産方法を提供する。
【０１３０】
ＤＮＡ構築物で細胞（宿主細胞）を形質転換する方法、これを培養して組換え第１蛋白質を生産する方法は、前記＜１＞（２）における説明を準用できる。
【０１３１】
＜１０＞第２ｃＤＮＡ
（１）第２ｃＤＮＡ
第２ｃＤＮＡは、以下のいずれかであるｃＤＮＡである。
（Ａ）配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、Ｂ因子活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号５、７、９、または１１で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、Ｂ因子活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号６、８、１０、または１２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号６、８、１０、または１２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｂ因子活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
【０１３２】
その他の説明は、前記の＜９＞（１）の説明を準用できる。すなわち、例えば、前記＜９＞（１）の「Ｃ因子」を「Ｂ因子」、「第１ｃＤＮＡ」を「第２ｃＤＮＡ」などとそれぞれ読み替えればよい。
【０１３３】
（２）第２ｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物、形質転換細胞、これを用いた組換え第２蛋白質の生産方法
本発明は、第２ｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を提供する。また本発明は、このようなＤＮＡ構築物で形質転換されて組換え第２蛋白質を発現する細胞等の第２ｃＤＮＡを含む細胞を提供する。また本発明は、このような細胞を培養するステップを含む、組換え第２蛋白質の生産方法を提供する。
【０１３４】
その他の説明は、前記＜９＞（２）の説明を準用できる。
【０１３５】
＜１１＞第３ｃＤＮＡ
（１）第３ｃＤＮＡ
第３ｃＤＮＡは、以下のいずれかである第３ｃＤＮＡである。
（Ａ）配列番号１３、１５、１７、１９、または２１で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１３、１５、１７、１９、または２１で表される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１３、１５、１７、１９、または２１で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号１４、１６、１８、２０、または２２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号１４、１６、１８、２０、または２２で表されるアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡ。
【０１３６】
その他の説明は、前記の＜９＞（１）の説明を準用できる。すなわち、例えば、前記＜９＞（１）の「Ｃ因子」を「プロクロッティングエンザイム」、「第１ｃＤＮＡ」を「第３ｃＤＮＡ」などとそれぞれ読み替えればよい。
【０１３７】
（２）第３ｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物、形質転換細胞、これを用いた組換え第３蛋白質の生産方法
本発明は、第３ｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を提供する。また本発明は、このようなＤＮＡ構築物で形質転換されて組換え第３蛋白質を発現する細胞等の第３ｃＤＮＡを含む細胞を提供する。また本発明は、このような細胞を培養するステップを含む、組換え第３蛋白質の生産方法を提供する。
【０１３８】
その他の説明は、前記＜９＞（２）の説明を準用できる。
【０１３９】
＜１２＞エンドトキシン検出剤の製造方法
本発明は、第１ｃＤＮＡを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを含む、エンドトキシン検出剤の製造方法も提供する。
【０１４０】
この方法は、第２ｃＤＮＡを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを更に含んでいてよい。また、第３ｃＤＮＡを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを更に含んでいてよい。
【０１４１】
これらのｃＤＮＡを用いて人工的に蛋白質を発現させる方法も特に限定されないが、例えば、前記＜９＞（２）、＜１０＞（２）、＜１１＞（２）に記載された方法を用いることができる。
【０１４２】
このような方法で、第１ｃＤＮＡを用いて人工的に発現させることにより組換え第１蛋白質が発現される。同様に、更に第２ｃＤＮＡを用いて人工的に発現させることで組換え第２蛋白質が、第３ｃＤＮＡを用いて人工的に発現させることで組換え第３蛋白質がそれぞれ発現される。
【０１４３】
発現された蛋白質は、前記＜１＞〜＜３＞に説明したとおり、例えば、培養液、培養上清、細胞破砕抽出物、またはそれらの混合物等の中に存在する形態でありうる。これらの蛋白質は、所望の程度に精製して用いてもよく、精製せずそのまま用いてもよい。例えば、これらの蛋白質が培養上清中に含有されている場合には、その培地成分を含んだまま用いてもよい。
【０１４４】
その他の説明は、前記＜８＞の説明を準用できる。したがって、本発明のエンドトキシン検出剤の製造方法は、キットの製造方法をも包含する。
【０１４５】
なお、本発明では、第２蛋白質（組換え第２蛋白質など）及び第３蛋白質（組換え第３蛋白質など）のいずれか一方又は双方を、リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニに由来するこれらの対応物にそれぞれ置き換えてもよい。第２ｃＤＮＡ及び第３ｃＤＮＡについても同様である。リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニとしては、タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）、タキプレウス・ギガス（Tachypleus gigas）、タキプレウス・ロツンディカウダ（Tachypleus rotundicauda）等のタキプレウス属に属する生物が挙げられる。
【０１４６】
すなわち、第２蛋白質（組換え第２蛋白質など）に代えてリムルス・ポリフェムス以外のカブトガニ（タキプレウス・トリデンタツスなど）由来のＢ因子（組換えＢ因子など）を、第３蛋白質（組換え第３蛋白質など）に代えて同生物由来のプロクロッティングエンザイム（組換えプロクロッティングエンザイムなど）を、第２ｃＤＮＡに代えて同生物由来のＢ因子遺伝子（ｃＤＮＡなど）を、第３ｃＤＮＡに代えて同生物由来のプロクロッティングエンザイム遺伝子（ｃＤＮＡなど）をそれぞれ用いてもよい。
【０１４７】
これらの蛋白質や遺伝子は、いずれも、リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニに実際に見出されるアミノ酸配列又は塩基配列を含むものであってもよいし、それらのバリアントであってもよい。バリアントについては、前記＜１＞〜＜１１＞におけるバリアントの説明を準用できる。また、これらの蛋白質や遺伝子は、リムルス・ポリフェムス以外の同一のカブトガニに由来するものであってもよく、そうでなくてもよい。
【０１４８】
そして、前記の説明からも明らかなとおり、本発明のエンドトキシン検出剤の製造方法には、第１ｃＤＮＡ、第２ｃＤＮＡ、及び第３ｃＤＮＡ（第２ｃＤＮＡ及び第３ｃＤＮＡについては、そのいずれか一方又は双方をリムルス・ポリフェムス以外のカブトガニ（タキプレウス・トリデンタツスなど）由来の遺伝子に置き換えてもよい）のそれぞれを人工的にカブトガニ以外の宿主細胞に導入し、これら各々のｃＤＮＡから各々の組換え蛋白質（計３種類）を発現させ、次いで、前記＜８＞のとおり、これらの発現された各々の組換え蛋白質を構成成分として含ませる態様も包含される。
【実施例】
【０１４９】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の例示であり、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。【０１５０】
（１）プライマーの合成
リムルス・ポリフェムスにおけるＣ因子活性を有する蛋白質のクローニングを試みるため、下記の各プライマーを合成した。【０１５１】
＜Ｃ因子活性を有する蛋白質のクローニングに用いたプライマー＞
SK15-dT20：  CTGCAGGAATTCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT（配列番号２４）
SK15-FC-S：  ATCGATAAGCTTGATGATCTGGGCTTGTGTGATGA（配列番号２５）
SK15-As：  CTGCAGGAATTCGAT（配列番号２６）
LFC-5race：  CTACACCAAGTTCCA（配列番号２７）
LFC-1st-S：  GTAAACCATGTGACAAACTGGAGGC（配列番号２８）
LFC-1st-As：  AATAAGGCCTCCATCGATAGAAGTA（配列番号２９）
LFC-EcoRI-kozak-S：  GGGGAATTCAAGCTTGCCACCATGGTACTAGCGTCGTTC（配列番号３０）
LFC-XhoI-stop-As：  GGGCTCGAGTCAAATGAACTGCCGAATCCACGATA（配列番号３１）【０１５２】
また、Ｂ因子活性を有する蛋白質及びプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質の各クローニングを試みるため、下記の各プライマーを合成した。【０１５３】
＜Ｂ因子活性を有する蛋白質及びプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のクローニングに用いたプライマー＞
SK15-FB-S：  ATCGATAAGCTTGATCACATGCAAGGAAAAGTTCT（配列番号３２）
SK15-FB-As：  CTGCAGGAATTCGATCACTGTTTAAACAAACTGAA（配列番号３３）
SK15-PCE-S：  ATCGATAAGCTTGATAGACCAGAGTGGTCTTTCTG（配列番号３４）
SK15-As：  CTGCAGGAATTCGAT（配列番号２６）【０１５４】
（２）リムルス・ポリフェムスの血球細胞からのトータルRNAの調製
トータルRNAの調製は、PureLink（登録商標） RNA Mini KitとPureLink（登録商標） DNase kit （Thermo Fisher Scientific）を使用し、基本的操作は添付の説明書に従った。リムルス・ポリフェムスの血球細胞プール2.23ｇにTRIzol溶液を添加して細胞を破砕した。その後、これにクロロホルムを添加して遠心分離し、水層を得た。得られた水層にエタノールを添加した後、これをキットに添付のシリカ膜カートリッジに通すことで、核酸成分をシリカ膜に結合させた。このシリカ膜にキット添付のDNase Iを加えてDNAを分解し、カートリッジを洗浄後、溶出バッファーを添加して、トータルRNA（1.3mg）を回収した。【０１５５】
（３）リムルス・ポリフェムスのＣ因子活性を有する蛋白質のcDNA（第１ｃＤＮＡ）の取得
（３−１）第１ステップ
前記（２）で回収したトータルRNAを鋳型として、SK15-d20（配列番号２４）をプライマーとして用いた逆転写反応を行い、cDNAを得た。本プライマーはmRNAのポリA配列に選択的に結合するように設計され、更にその外側にポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）に利用可能な付加配列を有している。本反応では逆転写酵素としてSuperScript III Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific) を用い、反応条件は添付の説明書に従った。【０１５６】
（３−２）第２ステップ
得られたcDNAを鋳型とし、センスプライマーとしてSK15-FC-S（配列番号２５）、アンチセンスプライマーとしてSK15-As（配列番号２６）、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase（タカラバイオ）を用いてPCRを行った。【０１５７】
PCR産物をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、目的としたDNA（LpFC1）はほとんど検知できず、非特異的なDNA増幅が検知された（図１Ａ）。そこで、以下のステップを試すこととした。なお、図１Ａ中の「１」のレーンはサイズマーカー、「２」のレーンがPCR産物である。また三角印はLpFC1の存在が予想される部分である。【０１５８】
（３−３）第３ステップ
LpFC1の存在が予想された部分をゲルから切り出して、DNAを抽出、精製した。これを鋳型として、センスプライマーとしてSK15-FC-S（配列番号２５）、アンチセンスプライマーとしてSK15-As（配列番号２６）、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase（タカラバイオ）を用いてPCRを行った。【０１５９】
PCR産物をアガロースゲル電気泳動した結果、驚くべきことに目的としたDNA（LpFC1）が著しく増幅していた（図１Ｂ）。このLpFC1をゲルから切り出して抽出、精製した。これにより、リムルス・ポリフェムスのＣ因子活性を有する蛋白質をコードしている可能性があるDNAの部分断片（LpFC1）の取得に成功した。なお、図１Ｂ中の「１」のレーンはサイズマーカー、「２」のレーンがPCR産物である。また、三角印はLpFC1の位置である。【０１６０】
（３−４）第４ステップ
LpFC1をEcoRV酵素処理したpBluescript II SK (+) と混合し、In-Fusion HD Enzyme premix（タカラバイオ）を用いて組換え反応によりベクターへの導入を行った。反応物をE. coli DH5α competent cellに形質転換し、X-Gal、IPTGを含むアンピシリンLB培地プレートに塗布して、ブルーホワイトスクリーニングによるコロニーの選定を行った。【０１６１】
その後、候補のコロニーに対するコロニーPCRでDNA増幅を行った。この際、センスプライマーとしてM13-20 Primer、アンチセンスプライマーとしてM13 Reverse Primer、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase（タカラバイオ）を用いた。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動後、ゲルから切り出して抽出、精製したDNA（LpFC1）を鋳型として、シークエンスPCRにより配列を確認した。これにより、LpFC1のDNA配列が判明した。【０１６２】
（３−５）第５ステップ
LpFC1の配列情報を参考に作製した合成DNA LFC-5race（配列番号２７）の5’末端を、ATP存在下でT4 Polynucleotide Kinase（タカラバイオ）によりリン酸化した。前記のトータルＲＮＡを鋳型とし、得られたリン酸化プライマーと逆転写酵素SuperScript III Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific) を用いた逆転写反応により、目的とするDNA（LpFC2）を得た。これにより、リムルス・ポリフェムスのＣ因子活性を有する蛋白質の一部分を含むアミノ酸配列をコードしている可能性があるDNAの部分断片（LpFC2）を得た。【０１６３】
LpFC2をRNase A存在下で高温処理（95℃、2分間）したのち、エタノール沈殿を行った。その後、T4 RNA Ligase（New England Biolabs）で処理した結果、LpFC2が連続的に結合したコンカテマー化DNA（LpFC3）が得られた。これにより、リムルス・ポリフェムスのＣ因子活性を有する蛋白質の一部分を含むアミノ酸配列をコードしている可能性があるDNAの部分断片（LpFC3）を得た。【０１６４】
LpFC3を鋳型に、センスプライマーとしてLFC-1st-S（配列番号２８）、アンチセンスプライマーとしてLFC-1st-As（配列番号２９）、Tks Gflex DNA polymerase（タカラバイオ）を用いたPCRを行い、目的とするDNA（LpFC4）を増幅した。【０１６５】
PCR産物をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、目的としたDNA（LpFC4）はほとんど検知できず、非特異的なDNA増幅が検知された（図２Ａ）。そこで、以下のステップを試すこととした。なお、図２Ａ中の「１」のレーンはサイズマーカー、「２」のレーンがPCR産物である。また、三角印はLpFC4の位置である。【０１６６】
（３−６）第６ステップ
LpFC4の存在が予想される部分をゲルから切り出して、DNAを抽出、精製した。これを鋳型として、センスプライマーとしてLFC-1st-S（配列番号２８）、アンチセンスプライマーとしてLFC-1st-As（配列番号２９）、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase（タカラバイオ）を用いてPCRを行った。【０１６７】
PCR産物をアガロースゲル電気泳動した結果、驚くべきことに目的としたDNA（LpFC4）が著しく増幅し、非常に高濃度で検出された（図２Ｂ）。このLpFC4をゲルから切り出して抽出、精製した。これにより、リムルス・ポリフェムスのＣ因子活性を有する蛋白質の一部分を含むアミノ酸配列をコードしている可能性があるDNAの部分断片（LpFC4）の取得に成功した。なお、図２Ｂ中の「１」のレーンはサイズマーカー、「２」のレーンがPCR産物である。また、三角印はLpFC4の存在が予想される部分である。【０１６８】
LpFC4を鋳型とし、シークエンスPCRによりLpFC4の配列を解析した。これにより、目的蛋白質の5’側のDNA配列が判明した。【０１６９】
（３−７）第７ステップ
前記（３−１）で得たcDNAを鋳型とし、センスプライマーとしてLFC-EcoRI-kozak-S（配列番号３０）、アンチセンスプライマーとしてLFC-XhoI-stop-As（配列番号３１）、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase（タカラバイオ）を用いてPCRを行った。【０１７０】
PCR産物をフェノールクロロフォルム抽出、エタノール沈殿によって精製後、EcoRI酵素とXhoI酵素で処理した。制限酵素処理産物をアガロースゲル電気泳動してゲルから切り出し、DNAを抽出、精製して目的DNA（LpFC5）を得た。【０１７１】
LpFC5をEcoRI酵素とXhoI酵素で処理した発現ベクターpCA7（Takeda et al., 2005, J virol 79:14346-14354）と混合し、Ligation Mix（タカラバイオ）を用いてライゲーション反応を行った。反応物をE. coli DH5α competent cellに形質転換し、アンピシリン含有LB培地プレートに塗布した。得られたコロニーからコロニーPCRによる選定を行った後、アンピシリン含有LB培地に植菌した。【０１７２】
培養後、NucleoSpin（登録商標） Plasmid Easy Pure（マッハライ・ナーゲル）によるプラスミド精製を行った。得られた２種のクローンのプラスミドを鋳型とし、シークエンスPCRにより各々の塩基配列を解析した。【０１７３】
これにより、リムルス・ポリフェムスのＣ因子活性を有する可能性がある蛋白質をコードするcDNAの全長配列（配列番号１、配列番号３）と、その蛋白質のアミノ酸の全長配列（配列番号２、配列番号４）の解明に初めて成功した。配列番号１と３（配列番号２と４）はバリアントの関係にあり、個体間の多型に基づくと考えられる。この蛋白質の発現及び活性解析については後述する。【０１７４】
（４）リムルス・ポリフェムスのＢ因子活性を有する蛋白質のcDNA（第２ｃＤＮＡ）の取得
前記（３−１）で得たcDNAを鋳型とし、センスプライマーとしてSK15-FB-S（配列番号３２）、アンチセンスプライマーとしてSK15-FB-As（配列番号３３）、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase（タカラバイオ）を用いてPCRを行った。増幅した断片を前記（３−４）と同じ手順でクローニングし、得られた４種のクローンについて各々の塩基配列を解析した。【０１７５】
これにより、リムルス・ポリフェムスのＢ因子活性を有する可能性がある蛋白質をコードするcDNAの全長配列（配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１）と、その蛋白質のアミノ酸の全長配列（配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２）を解明した。配列番号５、７、９および１１（配列番号６、８、１０および１２）はバリアントの関係にあり、個体間の多型に基づくと考えられる。この蛋白質の発現及び活性解析については後述する。【０１７６】
（５）リムルス・ポリフェムスのプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のcDNA（第３ｃＤＮＡ）の取得
前記（３−１）で得たcDNAを鋳型とし、センスプライマーとしてSK15-PCE-S（配列番号３４）、アンチセンスプライマーとしてSK15-As（配列番号２６）、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase（タカラバイオ）を用いてPCRを行った。増幅した断片を前記（３−４）と同じ手順でクローニングし、得られた５種のクローンについて各々の塩基配列を解析した。【０１７７】
これにより、リムルス・ポリフェムスのプロクロッティングエンザイム活性を有する可能性がある蛋白質をコードするcDNAの全長配列（配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１）と、その蛋白質のアミノ酸の全長配列（配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２）を解明した。配列番号１３、１５、１７、１９および２１（配列番号１４、１６、１８、２０および２２）はバリアントの関係にあり、個体間の多型に基づくと考えられる。この蛋白質の発現及び活性解析については後述する。【０１７８】
（６）組換え蛋白質の発現
前記（５）で得たcDNA（配列番号１３）を、哺乳類細胞での蛋白質発現用ベクターpCA7につなぎ、発現プラスミドを得た。前記（４）で得たcDNA（配列番号５）は、文献（Kobayashi et al., 2015, J Biol Chem, 290:19379-19386）に従い、蛋白質発現用ベクターpCA7につなぎ、発現プラスミドを得た。これらの発現プラスミドおよび前記（３−７）で得られた発現プラスミド（配列番号１のcDNAが組み込まれたもの）と、ExpiCHOTM Expression System（Thermo Fisher Scientific）を使い、培養上清画分として各々の組換え蛋白質を得た。【０１７９】
細胞への発現プラスミドのトランスフェクションと組換え蛋白質の回収は、添付の説明書に従った。【０１８０】
これにより、リムルス・ポリフェムスの、Ｃ因子活性を有する可能性がある蛋白質（配列番号２）、Ｂ因子活性を有する可能性がある蛋白質（配列番号６）、プロクロッティングエンザイム活性を有する可能性がある蛋白質（配列番号１４）の発現及び取得に初めて成功した。これら蛋白質の活性解析については後述する。【０１８１】
（７）活性測定
50mMトリス緩衝液（pH8.0）、合成基質（Boc-LGR-pNA）の存在下で、前記（６）で得た３種類の組換え蛋白質の種々の組合せについて、米国薬局方標準エンドトキシン（USP-RSE。生化学工業株式会社）（0EU/mL、0.05EU/mL。EUはエンドトキシン単位）を検体として、エンドトキシンに依存した３種の組換え蛋白質の活性化を調べた。この反応は３７℃で３０分間行った。【０１８２】
このアッセイ系でカスケード反応が進行すれば、エンドトキシンによりＣ因子活性を有する蛋白質が活性化され、この活性化されたＣ因子活性を有する蛋白質によりＢ因子活性を有する蛋白質が活性化され、この活性化されたＢ因子活性を有する蛋白質によりプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質が活性化され、この活性化されたプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質により合成基質Boc-LGR-pNAが切断され、これによりpNAが遊離する。pNAの遊離は、吸光度（A405nm）の変化を測定することで検知した。その結果、３種の組換え蛋白質が揃った場合に合成基質の切断がみられた（図３）。なお、図３中、FCは前記（３−７）で得たcDNAから発現させた蛋白質、FBは前記（４）で得たcDNAから発現させた蛋白質、PCEは前記（５）で得たcDNAから発現させた蛋白質である。エンドトキシン検体と混合した状態の反応液（100μL）中の蛋白質終濃度は、FCが22.8μg/mL、FBが20.0μg/mL、PCEが23.5μg/mLであった。各アッセイはＮ＝３で行い、標準偏差をエラーバーとして図中に併記した。【０１８３】
このことから、発現されたＣ因子活性を有する可能性がある蛋白質、Ｂ因子活性を有する可能性がある蛋白質、プロクロッティングエンザイム活性を有する可能性がある蛋白質は、それぞれＣ因子活性、Ｂ因子活性、プロクロッティングエンザイム活性を有し、エンドトキシンと接触することによってカスケード反応が生じることが初めて示された。またこれらの組換え蛋白質を利用して、エンドトキシンを検出できることが初めて示された。【０１８４】
更に、この条件下でエンドトキシンの濃度依存性を調べ、検量線を作成したところ、0.001 から0.1 EU/mLの濃度範囲で良好な直線性を示した（図４）。各エンドトキシン濃度におけるアッセイはＮ＝３で行い、標準偏差をエラーバーとして図中に併記した。【０１８５】
以上の結果から、前記の３種類の各組換え蛋白質を用いることで、エンドトキシンの定量的な高感度かつ高精度での検出も可能であることが初めて示された。【０１８６】
（８）タキプレウス属由来の組換えＣ因子との活性比較
リムルス・ポリフェムス由来の組換えＣ因子（以下「LFC」）と、タキプレウス属由来の組換えＣ因子（以下「TFC」）との活性を比較した。【０１８７】
LFCは、配列番号１のcDNAを前記（６）と同様に発現させ、培養上清画分として得た。TFCは、タキプレウス・トリデンタツスのＣ因子遺伝子（WO2014/092079の配列番号１）を同文献の実施例１．（２）に記載の方法によって前記（６）と同様に発現させ、培養上清画分として得た。ここでは、蛋白質発現用ベクターとして、いずれもpCI-neo（Promega）を用いた。【０１８８】
試験に付するLFCとTFCについて、Ｃ因子特異的なモノクローナル抗体（2C12；Yoshiki Miura, et al., J. Biochem. 112: 476-481 (1992)）を用いたウェスタンブロットを行った。等しい容量のサンプル（各3μL）をアプライしてバンドの強度を光学的に測定した結果、LFCは18036、TFCは24516であった。すなわち、等容量のサンプル中の組換えＣ因子の相対量（TFC／LFC）は1.4であった。【０１８９】
次に、カスケード反応系（Ｃ因子、Ｂ因子、及びプロクロッティングエンザイムを含有する系）における各組換えＣ因子の活性を比較した。Ｂ因子及びプロクロッティングエンザイムは、いずれもタキプレウス属由来の組換え蛋白質を用いた。前者は、タキプレウス・トリデンタツスのＢ因子遺伝子（WO2014/092079の配列番号５）を、後者は同生物のプロクロッティングエンザイム遺伝子（同文献の配列番号７）を、それぞれ同文献に記載の方法（実施例  ２．組換えファクターＢと組換えプロクロッティングエンザイムの調製）で発現させ、培養上清画分として得たものを用いた。【０１９０】
組換えＣ因子（LFC又はTFC）の各サンプル（いずれも同容量）、並びに前記のタキプレウス・トリデンタツス由来の組換えＢ因子（TFB）及び同由来の組換えプロクロッティングエンザイム（TPCE）を用いて、前記（７）に記載の方法で活性を測定した。用いる組換えＣ因子以外の条件は同一とした。【０１９１】
各カスケード反応系における、0EU/mL（ブランク）及び0.05EU/mLの各エンドトキシン濃度における吸光度の変化（mAbs/min）は、LFCの系で0.53及び14.27、TFCの系で0.51、9.15であった。すなわちこの系において、LFCはTFCの約1.6倍（前記の蛋白量の相違を考慮すれば約2.2倍）の活性を示した。【０１９２】
日本国特許出願第２０１６−２０４７２９号（出願日：２０１６年１０月１８日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。【０１９３】
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１９４】
本発明によれば、リムルス・ポリフェムスの凝固メカニズムに関与するすべての完全長の組換え蛋白質、これらをコードするｃＤＮＡ、これらの用途を提供できる。本発明は、特に、エンドトキシンの検出に有用である。【０１９５】
〔配列表の説明〕
配列番号１：第１ｃＤＮＡの塩基配列
配列番号２：第１蛋白質のアミノ酸配列
配列番号３：第１ｃＤＮＡ−バリアント１の塩基配列
配列番号４：第１蛋白質−バリアント１のアミノ酸配列
配列番号５：第２ｃＤＮＡの塩基配列
配列番号６：第２蛋白質のアミノ酸配列
配列番号７：第２ｃＤＮＡ−バリアント１の塩基配列
配列番号８：第２蛋白質−バリアント１のアミノ酸配列
配列番号９：第２ｃＤＮＡ−バリアント２の塩基配列
配列番号１０：第２蛋白質−バリアント２のアミノ酸配列
配列番号１１：第２ｃＤＮＡ−バリアント３の塩基配列
配列番号１２：第２蛋白質−バリアント３のアミノ酸配列
配列番号１３：第３ｃＤＮＡの塩基配列
配列番号１４：第３蛋白質のアミノ酸配列
配列番号１５：第３ｃＤＮＡ−バリアント１の塩基配列
配列番号１６：第３蛋白質−バリアント１のアミノ酸配列
配列番号１７：第３ｃＤＮＡ−バリアント２の塩基配列
配列番号１８：第３蛋白質−バリアント２のアミノ酸配列
配列番号１９：第３ｃＤＮＡ−バリアント３の塩基配列
配列番号２０：第３蛋白質−バリアント３のアミノ酸配列
配列番号２１：第３ｃＤＮＡ−バリアント４の塩基配列
配列番号２２：第３蛋白質−バリアント４のアミノ酸配列
配列番号２３：合成基質ペプチドIEGR
配列番号２４〜３４：プライマー
【図１】
2018074498.tif 000003
【図２】
2018074498.tif 000004
【図３】
2018074498.tif 000005
【図４】
2018074498.tif 000006
【配列表】
2018074498000001.app
【国際調査報告】
2018074498.tif 000007
2018074498.tif 000008
2018074498.tif 000009
2018074498.tif 000010