(57)【要約】  本発明は、低侵襲性かつ低コストで実施することができる、前立腺癌の診断または治療のための各種の補助情報を取得する方法を提供する。  検体中の、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ：前立腺特異抗原）の含有量を測定し、その測定値と閾値とを比較することにより、（１）グリーソンスコア（プライマリーパターンおよびセカンダリーパターン）が所定の値以上または未満であると推定する方法、（２）病理病期分類（ｐＴ）が所定の値以上または未満であると推定する方法、および（３）生検時のＧＳよりも全摘時のＧＳの方が高いと予想されることから、診断または治療を積極的に行うべきであるとの判断情報を取得する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌の診断または治療のための補助情報として、前立腺癌の悪性度を表すグリーソンスコア（ＧＳ）を推定する方法であって、
検体中の、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ：前立腺特異抗原）の含有量を測定し、
その測定値が閾値以上であることをもってＧＳが４＋３以上であると推定する、または
その測定値が閾値よりも小さいことをもってＧＳが３＋４以下であると推定する方法。
【請求項２】
前立腺癌の診断または治療のための補助情報として、前立腺癌の進行度を表す病理病期分類（ｐＴ）を推定する方法であって、
検体中の、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ：前立腺特異抗原）の含有量を測定し、
その測定値が閾値以上であることをもってｐＴが３以上であると推定する、または
その測定値が閾値よりも小さいことをもってｐＴが２以下であると推定する方法。
【請求項３】
前立腺癌の診断または治療のための補助情報として、それらの必要性の程度を判断するための情報を取得する方法であって、
検体中の、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ：前立腺特異抗原）の含有量を測定し、
その測定値が閾値以上であることをもって、前立腺癌を診断するための検査を通常よりも精密なものとすべきである、または前立腺癌を治療するために積極的治療介入を行うべきである、と判断するための情報とする方法。
【請求項４】
前記ＰＳＡの定量を、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子を前記ＰＳＡに結合させる工程を含む方法によって行う、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子が、ノダフジレクチン（Ｗｉｓｔｅｒｉａ  ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ  Ｌｅｃｔｉｎ：ＷＦＡ）、ダイズ凝集素（Ｓｏｙｂｅａｎ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＳＢＡ）、カラスノエンドウレクチン（Ｖｉｃｉａ  Ｖｉｌｌｏｓａ  Ｌｅｃｔｉｎ：ＶＶＬ）またはキカラスウリレクチン−ＩＩ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ＩＩ：ＴＪＡ−ＩＩ）、あるいは抗β−Ｎ−アセチルガラクトサミン抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＳＡの定量を表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いて行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺癌の診断や治療のための指標として用いられている、グリーソンスコアおよび病期分類（ＴＮＭ分類）や、その他の補助情報に関する。より詳しくは、本発明は、前立腺組織以外の検体を用いてグリーソンスコアおよび病期分類を推定したり、診断等のための補助情報を取得したりするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、主に６０歳以上の男性に発病し、欧米諸国では男性の癌において肺癌に次ぐ死亡原因となっている。前立腺癌の治療方針を決める上で、がんの進行度（病期）および悪性度が重要な指標となる。このうち、前立腺癌の悪性度には幅広い分布があり、ほとんど増殖が認められず無治療経過観察が可能であるものから、骨やリンパ節に転移し抗ホルモン薬への抵抗性を示す増悪をきたすものまで様々であるため、前立腺癌の悪性度を正確に判断することが望まれている。【０００３】
前立腺癌の悪性度を示す分類として、がんの病理組織の診断結果を点数化した「グリーソンスコア」（ＧＳ）が広く用いられている。前立腺癌のがん組織は、その形態や浸潤増殖様式によってパターン１からパターン５の５段階に分類することができる（グリーソン分類）。グリーソンスコアは、ある病理組織を顕微鏡で観察したときに、最も大きな面積を占める組織像についてグリーソン分類に基づき付与されるパターン（プライマリーパターン）と、その次に大きな面積を占める組織像のパターン（セカンダリーパターン、プライマリーパターンと同じになる場合もある）を合計した値である。一般的に、ＧＳが２〜６の場合は悪性度が低い、７の場合は中程度、８〜１０の場合は悪性度が高いとされ、ＧＳが７以上であるかそうでないかが主要な目安となっている。また、２０１５年からはＧＳに代わってグレードグループ（ＧＧ）も悪性度の指標として用いられるようになっており、ＧＳが６以下はＧＧ１、ＧＳが３＋４はＧＧ２、ＧＳが４＋３はＧＧ３、ＧＳが８はＧＧ４、ＧＳが９または１０はＧＧ５、に対応している。【０００４】
一方、前立腺癌の進行度（病期）を示すために、ＴＮＭ分類（Ｔ：原発腫瘍、Ｎ：所属リンパ節、Ｍ：遠隔転移）も広く用いられている。病期分類には臨床分類（治療前臨床分類：ｃ）と病理分類（術後病理組織学的分類：ｐ）があり、前者は病期分類が治療開始前に得られた情報に基づいて行われる場合、後者は手術や病理組織学的検索で得られた知見に基づいて補足修正された場合のものである。例えば、原発腫瘍の病理病期分類（ｐＴ）については、臓器に限局している場合はｐＴ２、前立腺外に進展している場合はｐＴ３、膀胱、直腸へ浸潤している場合はｐＴ４と表される（ｐＴ１の分類は存在しない）。なお、所属リンパ節の病理病期分類については、陽性の所属リンパ節を認めない場合はｐＮ０、所属リンパ節（１個または複数）に転移を認める場合はｐＮ１と表される。また、遠隔転移については、遠隔転移を認めない場合はＭ０、遠隔転移を認める場合はＭ１に分類される。【０００５】
しかしながら、このようなＧＳ等を決定するための病理組織診断の際には、通常は合計８本以上もの針を直腸から刺して前立腺組織を採取すること（針生検）が必要である。針生検は患者にとって侵襲性が高く、感染症のリスクが高く、費用も高額である上、針が前立腺癌組織に当たらないと診断ができないという欠点もある。【０００６】
一方、前立腺癌および前立腺肥大症等の前立腺関連疾患について、患者の血液等の試料中に存在する、特定の糖鎖を有するＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ：前立腺特異抗原）との関係性に注目した研究が進められている。従来、試料中の全てのＰＳＡ（トータルＰＳＡ）を定量し、その値を閾値と比較すること、またはα１−アンチキモトリプシンと結合しない遊離型ＰＳＡ（フリーＰＳＡ）を定量し、全てのＰＳＡの量に対する遊離型ＰＳＡの量の比率（フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比）を閾値と比較することによって、前立腺癌に罹患しているか否かを診断する方法が知られていた。しかしながら近年では、患者が罹患している疾患によってＰＳＡが有する糖鎖の性状が変化すること、換言すれば特定の糖鎖を有するＰＳＡの量（割合）が変化することが分かってきており、そのことを利用して前立腺癌または前立腺肥大症疾患に罹患しているか否かを診断する方法がいくつか提案されている。【０００７】
たとえば、特許文献１（国際公開２０１０／０６４６８３号公報）には、被験者由来の試料中のＰＳＡの、ＬａｃｄｉＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｎ−アセチルグルコサミン）を有する糖鎖の量と、ＬａｃｄｉＮＡｃを持たないがＬａｃＮＡｃ（ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン）を有する糖鎖の量とを定量し、前者の量が後者の量の３０％を超える場合に前立腺癌であると判定する方法が開示されている。【０００８】
特許文献２（特開２０１１−１３７７５４号公報）には、被験者由来の試料中のＰＳＡの糖鎖構造を分析し、ＬａｃｄｉＮＡｃを有する３本鎖以上の糖鎖が存在するときに前立腺癌であると判定する方法が開示されている。【０００９】
特許文献３（国際公開２０１０／０９０２６４号公報）には、患者由来の試料（血清等）中のβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡおよび／またはフコースα（１，２）ガラクトース残基を有するＰＳＡを定量し、それらの絶対量および／またはＰＳＡ全体に対する割合を所定のカットオフ値より大きければ前立腺癌、そうでなければ前立腺肥大症と判定する方法が開示されている。β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡは、当該残基と親和性を有するレクチン、例えばＴＪＡ−ＩＩ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ＩＩ：キカラスウリレクチン−ＩＩ）またはＷＦＡ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ  ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ノダフジレクチン）を用いて定量で、フコースα（１，２）ガラクトース残基を有するＰＳＡは、当該残基と親和性を有するレクチン、例えばＵＥＡ−Ｉ（Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−Ｉ：ハリエニシダレクチン−Ｉ）またはＴＪＡ−ＩＩを用いて定量できると記載されている。また、前記所定の残基を有するＰＳＡは、例えば、担体にレクチンを結合させたカラム（レクチンアフィニティーカラム）を用いて吸着および溶出させることにより定量できると記載されている。【００１０】
特許文献４（特開２０１３−０７６６６６号公報）には、特許文献４と同じ特定の残基を有するＰＳＡを、当該ＰＳＡに対する固相一次抗体、および当該ＰＳＡが有する残基と高い親和性を有するレクチンを蛍光色素により標識化した二次捕捉分子を用いた、ＳＰＦＳ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）等のサンドイッチアッセイにより定量する方法が記載されている。【００１１】
しかしながら特許文献１〜４のいずれにも、それらに開示されている方法とグリーソンスコア等の前立腺癌の悪性度との相関性は記載されていない。特に、特許文献３の実施例１では、ＴＪＡ−ＩＩを用いて前記特定の糖鎖を有するＰＳＡを定量しており、前立腺肥大症患者と前立腺癌患者を区別することが可能であることが示されている一方、グリーソンスコアについては有意差が認められなかったと分析されている。また、特許文献３の実施例２では、ＷＦＡを用いて前記特定の糖鎖を有するＰＳＡを定量しており、ＴＪＡ−ＩＩと同様の傾向を示す（結合率はやや低いがほぼ相関している）こと、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基は有さずフコースα（１，２）ガラクトース残基のみを有するＰＳＡが存在する可能性があることなどが分析されているが、定量の対象としているのは前立腺癌患者由来の３検体のみであり、グリーソンスコアについては全く分析されていない。なお、特許文献３では、ＴＪＡ−ＩＩおよびＷＦＡはともに、糖鎖の非還元末端（タンパク質と結合している還元末端とは逆側の末端）に結合したβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有するレクチンとして例示されているが（段落［００２０］参照）、その他の残基に対する親和性においてこれらのレクチンには相違点がある。すなわち、ＴＪＡ−ＩＩは、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ；Ｒは糖鎖の他の残基またはタンパク質のアミノ酸残基を表す）およびフコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）の両方に強い親和性を有するレクチンである（段落［００２２］参照）。これに対して、ＷＦＡは、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）、例えばＧａｌＮＡｃ（β１→４）Ｇａｌ残基およびＧａｌＮＡｃ（β１→４）ＧｌｃＮＡｃ残基に強い親和性を有するものの、フコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）には親和性を有さない（段落［００２３］参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開２０１０／０６４０８３号公報
【特許文献２】特開２０１１−１３７７５４号公報
【特許文献３】国際公開２０１０／０９０２６４号公報
【特許文献４】特開２０１３−０７６６６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
前述したように、針生検を必要とする従来の病理組織診断は患者にとっての負担が大きい。前立腺癌の悪性度を表すグリーソンスコア（ＧＳ）のような前立腺癌の病理組織診断結果を、血液検査のように侵襲性が低く、コストも低い方法によって取得することができれば、患者にもたらされる利益は大きい。【００１４】
また、近年では世界的に前立腺癌患者の数が増加傾向にあり、悪性度の高い前立腺癌患者に対して優先的に、積極的に治療を進める必要がある。例えば、ＧＳが７であっても、４＋３であればグレードグループ（ＧＧ）が３、３＋４であればＧＧが２といったように悪性度の評価に差があり、前者の方が悪性度が高く、より積極的な治療が必要となると判断される。また、病期分類（Ｔ）は、仮に手術前に知ることができれば、治療方針を決定する上で極めて有用である。針生検によらずに、悪性度の識別ができるほど高い精度でＧＳ・ＧＧを推定したり、手術前に病理病期分類を推定したりすることができれば、前立腺癌の治療にもたらされる恩恵は多大である。【００１５】
ここで、本出願に係る発明者の一部は、血液から調製された検体に含まれるＰＳＡのうち、ＷＦＡと親和性を有するＰＳＡ、すなわちＮ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡの含有量について、“ＧＳが７以上”の前立腺癌患者に由来するサンプル群とそれ以外のサンプル群との間、および“ＧＳが６以下”の前立腺癌患者に由来するサンプル群とそれ以外のサンプル群との間、それぞれで統計学的に有意な差があり、適切な閾値を設定することにより、“ＧＳが７以上”または“ＧＳが６以下”であると、高い精度で推定することができることを見出している。本出願に係る出願人の一部は、そのような知見に基づくＧＳの推定方法に係る発明の特許出願をしている（ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０７５７７１、国際出願日（＝優先日）：２０１５年９月２８日、以下「先願」という）。しかしながら、先願にかかるＧＳの推定方法については、閾値の設定の仕方により、ＧＧの違いまたはプライマリーパターンおよびセカンダリーパターンの組み合わせの違い（例えばＧＳが４＋３のＧＧ３と、ＧＳが３＋４のＧＧ２）を識別することが可能であるということは開示されていない。先願の時点で、ＧＧの違い等を推定することのできる好適な方法は知られていなかった。【００１６】
本発明は、低侵襲性かつ低コストで実施することができる、前立腺癌の診断または治療のための各種の補助情報を取得する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、血液から調製された検体に含まれるＰＳＡのうち、ＷＦＡと親和性を有するＰＳＡ、すなわちＮ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ、より具体的にはＮ−アセチルガラクトサミン−Ｎ−アセチルグルコサミン（β−ＧａｌＮＡｃ（１→４）ＧｌｃＮＡｃ）残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ（本明細書において「ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ」とよぶ。）の含有量について、驚くべきことに、ＧＳのプライマリーパターンおよびセカンダリーパターンの組み合わせとの相関があること、例えばＧＳが４＋３以上の前立腺癌患者に由来するサンプル群と、ＧＳが３＋４以下の前立腺癌患者に由来するサンプル群との間には統計学的に有意な差があり、適切な閾値を設定することにより、あるサンプルを採取した前立腺癌患者のＧＳが４＋３以上か３＋４以下かを高い精度で推定することができることを見出した。【００１８】
また、本発明者らは、血液検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの含有量は、病理病期分類（ｐＴ）が３以上の前立腺癌患者と、２以下の前立腺癌患者との間にも統計学的な有意差があり、適切な閾値を設定することにより、あるサンプルを採取した前立腺癌患者のｐＴが３以上であるか２以下であるかを高い精度で推定することができることも見出した。【００１９】
さらに、本発明者らは、血液検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの含有量は、生検によるＧＳ等の病理診断に関する指標が過小に評価されるサンプル群とそれ以外のサンプル群、または過大に評価されるサンプル群とそれ以外の群の間にも統計学的な有意差があることを見出した。指標が過小に評価されるとは、生検で採取した組織のＧＳと、手術で全摘出した前立腺癌の組織の（いわば真の）ＧＳとを比較したとき、前者のＧＳの方が低い場合をいい、診断のための生検をより慎重に行ったり、生検によるＧＳから想定されるよりも積極的に治療を行ったりすることが望ましい状況を指す。【００２０】
このような知見に基づいてなされた本発明は、第１の側面において、「前立腺癌の診断または治療のための補助情報として、前立腺癌の悪性度を表すグリーソンスコア（ＧＳ）を推定する方法であって、検体中の、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡの含有量を測定し、その測定値が閾値以上であることをもってＧＳが４＋３以上であると推定する、またはその測定値が閾値よりも小さいことをもってＧＳが３＋４以下であると推定する方法」を提供する。本明細書において、当該方法を「グリーソンスコア（ＧＳ）の推定方法」と呼ぶことがある。【００２１】
本発明は、第２の側面において、「前立腺癌の診断または治療のための補助情報として、前立腺癌の進行度を表す病理病期分類（ｐＴ）を推定する方法であって、検体中の、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡの含有量を測定し、その測定値が閾値以上であることをもってｐＴが３以上であると推定する、またはその測定値が閾値よりも小さいことをもってｐＴが２以下であると推定する方法」を提供する。本明細書において、当該方法を「病期病理分類（ｐＴ）の推定方法」と呼ぶことがある。【００２２】
本発明は、第３の側面において、「前立腺癌の診断または治療のための補助情報として、それらの必要性の程度を判断するための情報を取得する方法であって、検体中の、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡの含有量を測定し、その測定値が閾値以上であることをもって、前立腺癌を診断するための検査を通常よりも精密なものとすべきである、または前立腺癌を治療するために積極的治療介入を行うべきである、と判断するための情報とする方法」を提供する。本明細書において、当該方法を「判断情報の取得方法」と呼ぶことがある。【００２３】
換言すれば、本発明は別の側面において、「検体中の、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡの含有量の測定方法であって、少なくとも、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子を前記ＰＳＡに結合させる工程を含む、測定方法」を提供する。この測定方法は、上述したような方法と同様のやり方で、ＧＳまたはｐＴを推定するために、あるいは判断情報を取得するために、利用することができる。【００２４】
なお、本発明の各方法で用いられる閾値は、従来技術における異なる目的のための閾値、例えば特許文献３に記載されている、前立腺癌か前立腺肥大症かを判定するための閾値や、前述した先願に記載されている、グリーソンスコアが７以上であると推定するための閾値およびグリーソンスコアが６以下であると推定するための閾値とは相違する。そのような観点から、本発明を従来技術や先願に係る発明と区別することが可能である。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の各方法は、出血、感染症などの重篤な有害事象を伴い、患者に重い負担を強いる組織生検ではなく、低侵襲性の血液検査によって実施することができるため、癌の経過観察も可能となり、患者のＱＯＬを向上させることができる。また、組織生検に比べて血液検査の方が費用も低く、医療費抑制にも効果がある。【００２６】
また、本発明の方法によって推定されるグリーソンスコアは、好ましくは本発明の方法によって推定される病理病期分類や、本発明の方法によって取得される補助情報と組み合わせることで、術前に前立腺癌の真の悪性度をより正確に判断することが可能となり、治療方針の変更、アクティブサーベイランスの適用判断など、様々な場面で利用されることが想定できる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ＳＰＦＳ測定部材１６を用いて検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ１００を定量する際の、流路３６内の測定領域３８で起きる反応の模式図である。［Ａ］支持体６２に担持された抗ＰＳＡ抗体６４に、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ１００を結合させるための捕捉工程における反応。［Ｂ］抗ＰＳＡ抗体６４に捕捉されたＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ１００に、蛍光標識β−ＧａｌＮＡｃ親和性分子８０を結合させるための標識工程における反応。
【図２】図２は、ＳＰＦＳシステム１の一般的な実施形態を示す模式図である。［Ａ］誘電体部材１２の上面に金属薄膜１４が直接形成されており、プラズモン励起センサ１６ａが、誘電体部材１２、金属薄膜１４および測定領域３８によって構成されている実施形態。［Ｂ］誘電体部材１２と分離可能な透明平面基板１３の上面に金属薄膜１４が形成されており、プラズモン励起センサ１６ａが、透明平面基板１３、金属薄膜１４および測定領域３８によって構成されている場合。
【図３】図３は、実施例において、摘出した前立腺組織についてのＧＳが３＋４以下である患者群と、４＋３以上である患者群で、［Ａ］血清検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度の分布を比較したときのボックスプロット、［Ｂ］血清検体中のトータルＰＳＡの濃度の分布を比較したときのボックスプロット、および［Ｃ］それらの結果から作成したＲＯＣ曲線である。Ｏｐｅ  ＧＳ：前立腺摘出術後のグリーソンスコア。ＰＳＡ−Ｇｉ：ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ。
【図４】図４は、実施例において、生検時のＧＳ（プライマリーパターンおよびセカンダリーパターンの組み合わせ）および全摘後のＧＳの推移によって患者を分類し、各患者群の血清検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度を比較したときのボックスプロットである。
【図５】図５は、実施例において、ｐＴが２以下の患者群と、３以上の患者群で、［Ａ］血清検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度の分布を比較したときのボックスプロット、［Ｂ］血清検体中のトータルＰＳＡの濃度の分布を比較したときのボックスプロット、および［Ｃ］それらの結果から作成したＲＯＣ曲線である。ＰＳＡ−Ｇｉ：ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ。
【図６】図６は、参考例において、生検時のＧＳ（プライマリーパターンおよびセカンダリーパターンの組み合わせ）によって患者を分類し、各患者群の血清検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度を比較したときのボックスプロットである。
【図７】図７は、前立腺癌患者の血清検体中に含まれるＰＳＡが有する糖鎖の推定構造式である。出典：Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０，  ４，  ４５２−４６０  （２０１０）
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明において定量の対象とする、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（β−ＧａｌＮＡｃ残基）を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡは、具体的には、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン−（１→４）−Ｎ−アセチルグルコサミン残基（ＧａｌＮＡｃ（β１→４）ＧｌｃＮＡｃ残基）を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡである。このような本発明の定量の対象とするＰＳＡを「ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ」と表記する。図７に、前立腺癌患者の血清検体中に含まれるＰＳＡが有する糖鎖の推定構造式を示す。本発明の定量の対象とするＰＳＡは、非還元末端においてＧａｌＮＡｃ残基がβ１→４結合でＧｌｃＮＡｃ残基に結合している糖鎖の他にも、末端がシアル化されている糖鎖や、末端がフコースである糖鎖を有しているものと推定されている。
【００２９】
本発明によるグリーソンスコア（ＧＳ）の推定方法は、検体中の、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ（ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ）の含有量を測定し、その測定値が閾値以上であることをもって、ＧＳが４＋３以上であると推定する、またはその測定値が閾値よりも小さいことをもってＧＳが３＋４以下であると推定する方法である。この方法によって推定されるＧＳは、手術により全摘出した前立腺組織のＧＳであり、手術前に生検により採取された組織のＧＳよりも、前立腺癌の実際の（真の）悪性度を反映しているといえる。ＧＳが４＋３以上であるとは、具体的には、ＧＳのプライマリーパターンおよびセカンダリーパターンの組み合わせが、４＋３、５＋３、４＋４、３＋５、５＋４、４＋５または５＋５であること、換言すれば、グレードグループ（ＧＧ）が３（ＧＳが４＋３）、４（ＧＳが８）または５（ＧＳが８または１０）であることを指す。ＧＳが３＋４以下であるとは、具体的には、ＧＳのプライマリーパターンおよびセカンダリーパターンの組み合わせが、３＋４、４＋２、３＋３または２＋４、あるいは稀ではあるが３＋２または２＋３であること、換言すれば、ＧＧが２（ＧＳが３＋４）または１（ＧＳが６以下）であることを指す。
【００３０】
本発明のＧＳの推定方法は、手術により全摘出した前立腺組織のＧＳが４＋３以上であるか否か、または４＋３以下であるか否かだけでなく、手術により全摘出した前立腺組織のＧＳまたは手術前に生検により採取された組織のＧＳについて、他のプライマリーパターンおよびセカンダリーパターンの組み合わせ以上であるか否か、または以下であるか否かを推定するよう改変することが可能である。ＧＳのプライマリーパターンおよびセカンダリーパターンの組み合わせは、悪性度の高い順に、５＋５、５＋４、４＋５、５＋３、４＋４、３＋５、４＋３、３＋４、４＋２、３＋３、２＋４、３＋２、２＋３のようになっている。例えば、ＧＳが「４＋５以上」といえば、４＋５およびそれよりも悪性度の高い組み合わせ、すなわち４＋５、５＋４および５＋５を指す。
【００３１】
さらに、本発明のＧＳの推定方法は、ＧＧの推定方法に変換ないし拡張することが可能である。すなわち、本発明のＧＧの推定方法は、検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの含有量を測定し、その測定値が閾値以上であることをもってＧＧが３以上であると推定する、またはその測定値が閾値よりも小さいことをもってＧＧが２以下であると推定する方法である。また、閾値を適宜設定することにより、本発明のＧＧの推定方法は、ＧＧが４以上である、またはＧＧが５であると推定するような実施形態とすることが可能である。
【００３２】
本発明による病期病理分類（ｐＴ）の推定方法は、検体中の、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ（ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ）の含有量を測定し、その測定値が閾値以上であることをもって、ｐＴが３以上であると推定する、またはその測定値が閾値よりも小さいことをもってｐＴが２以下であると推定する方法である。ｐＴは、ＧＳとの組み合わせにより、前立腺癌の再発に対するリスクを評価する指標として用いられており、それらの相関関係を確率で示した「ノモグラム」（代表的にはパーティン・ノモグラム）や、それをベースとした「リスク分類」が治療法の選択などに利用されている。
【００３３】
本発明による診断または治療のための判断情報の取得方法は、検体中の、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ（ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ）の含有量を測定し、その測定値が閾値以上であることをもって、前立腺癌を診断するための検査を通常よりも精密なものとすべきである、または前立腺癌を治療するために積極的治療介入を行うべきである、と判断するための情報とする方法である。検査を通常よりも精密なものとするとは、例えば、生検に用いる針の本数を増やす、または生検回数を増やす（再生検する）ことにより前立腺癌組織を採取できる可能性を高めたり、針生検以外の検査を組み合わせたりして、前立腺癌の見逃しや過小評価が起きにくくすることをいう。また、積極的治療介入とは、例えば、すでに化学療法（抗がん剤および／またはホルモンの投与）による治療を開始している患者に対して、さらに放射線治療を行ったり、手術療法により前立腺組織を全摘出したりすること、あるいは監視療法中の患者に対して、化学療法、放射線治療または手術療法を行ったりすることをいう。
本発明における、前立腺癌の診断または治療のための補助情報は、前立腺癌の診断に役立つものである。よって、本発明の方法は、機械または医師以外の者が、医師による診断に役立つデータを分類する方法とも表現できる。
【００３４】
上述したような本発明の３種類の方法は、１つの検体について、いずれか１種類の方法だけを実施してもよいし、２種類または３種類の方法を同時に実施してもよい。複数の種類の方法を同時に実施すれば、前立腺癌の診断または治療のための複合的な情報を取得することができるため好ましい。
【００３５】
「検体」は、本発明の各方法を適用する対象から採取される、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの含有量を測定するための材料であって、血液、尿、腹水など、非侵襲性ないし低侵襲性の手法によって採取することのできる液性の検体が挙げられる。たとえば、抗凝固処理された全血から調製された検体、好ましくは血清または血漿は、本発明における検体として好適である。ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量方法に応じて必要であれば、検体は希釈液、試薬等を添加して調製された試料であってもよい。
【００３６】
本発明の各方法の適用対象、すなわち検体を採取する対象は、典型的にはヒトであるが、ヒトの疾患のモデル動物など、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。ヒトの対象としては、典型的には前立腺癌であると確定診断された患者、または前立腺癌に罹患している可能性のある者であって、前立腺癌の悪性度を知る必要のある者が挙げられ、ヒト以外の哺乳動物の対象としては、前立腺癌を発症させたマウス、ラット等のモデル動物が挙げられる。
【００３７】
［定量方法］
検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの含有量を測定するための方法は、所定の閾値と比較することのできる精度を有する測定値が得られる限り、特に限定されるものではなく、様々な定量方法を用いることができる。
【００３８】
ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量方法としては、比較的簡便な手段によって実施することのできる、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子（β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子）をＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡに結合させる工程を含む方法が好ましいが、その他の方法、例えば質量分析法に基づく方法を用いることも可能である。
【００３９】
・β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子
β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子としては、β−ＧａｌＮＡｃ残基に対して親和性を有するレクチン（β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチン）またはβ−ＧａｌＮＡｃ残基をエピトープとする抗体（抗β−ＧａｌＮＡｃ抗体）を用いることができる。
【００４０】
・β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチン
レクチンは、特定の糖残基に対する親和性を有する、つまり特定の糖残基を認識してそこに結合するタンパク質であり、様々な生物に由来する多数の種類のレクチン（凝集素と呼ばれることもある）が知られている。レクチンの種類によって親和性を有する糖残基は様々であり、また多くのレクチンは、１種類の糖残基だけでなく複数の種類の糖残基と親和性を有する（ただし、特定の糖残基に対する親和性が強く、他の糖残基に対する親和性は弱い）。一般的に、抗β−ＧａｌＮＡｃ抗体のように、糖鎖中の特定の糖残基をエピトープとする抗体は作製しにくいのに対し、β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチンは、安価で大量に入手することができ、また安定性にも優れており長期間保存も可能であるため、β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子として好ましい。
【００４１】
β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチンとしては様々なものが公知であり、また今後も新たな生物から単離される可能性もある。本発明では、β−ＧａｌＮＡｃ残基に対して十分に強い親和性を有している限り、つまり、そのレクチンが、他の糖残基に対する親和性を有さないものであるか、他の糖残基と親和性を有するが、他の糖残基に対する親和性がＧａｌＮＡｃ残基に対する親和性よりも十分に小さく（例えば、結合定数が数オーダー低く）、十分な精度でＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量を行うことができる限り、どのようなレクチンを用いてもよい。
【００４２】
β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチンの具体例としては、ノダフジレクチン（Ｗｉｓｔｅｒｉａ  ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＷＦＡ）、ダイズ凝集素（Ｓｏｙｂｅａｎ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＳＢＡ）、カラスノエンドウレクチン（Ｖｉｃｉａ  Ｖｉｌｌｏｓａ  Ｌｅｃｔｉｎ：ＶＶＬ）およびキカラスウリレクチン−ＩＩ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ＩＩ：ＴＪＡ−ＩＩ）を挙げることができる。これらのレクチンは、それぞれが由来する生物体、例えば種子から分離（抽出）して精製することもできるし、商品としても市販されているものを入手することもできる。
【００４３】
ＷＦＡは、ＷＦＬ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ  ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ  Ｌｅｃｔｉｎ）と表記されることもある、ノダフジに由来するレクチン（凝集素）である。ＷＦＡは、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃ）、すなわちα−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（α−ＧａｌＮＡｃ）およびβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（β−ＧａｌＮＡｃ）の両方に親和性を有し、例えば糖鎖の非還元末端に位置するＧａｌＮＡｃ（α１→６）Ｇａｌ残基、ＧａｌＮＡｃ（α１→３）Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ残基、ＧａｌＮＡｃ（β１→４）Ｇａｌ残基、およびＧａｌＮＡｃ（β１→４）ＧｌｃＮＡｃ残基、ならびに糖鎖の還元末端に位置するＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（セリンまたはスレオニン）などに結合することができる。なお、ＷＦＡは、ラクトースおよびガラクトースに対しても比較的弱い親和性を有する。また、ＷＦＡおよび下記のその他のβ−ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチンが結合するβ−ＧａｌＮＡｃ残基は、シアル化等の修飾がされていないものである。
【００４４】
ＳＢＡは、ダイズに由来するレクチン（凝集素）である。ＳＢＡも、α−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（α−ＧａｌＮＡｃ）およびβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（β−ＧａｌＮＡｃ）の両方に親和性を有し（前者に対する親和性の方が後者に対する親和性よりもやや強い）、例えば糖鎖の非還元末端に位置するＧａｌＮＡｃ（α１→３）Ｇａｌ残基、ＧａｌＮＡｃ（β１→４）Ｇａｌ残基、およびＧａｌＮＡｃ（β１→４）ＧｌｃＮＡｃ残基に結合することができる。なお、ＳＢＡは、ガラクトースに対しても比較的弱い親和性も有する。
【００４５】
ＶＶＬは、ＶＶＡ（Ｖｉｃｉａ  ｖｉｌｌｏｓａ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）と表記されることもある、ヘアリーベッチに由来するレクチン（凝集素）である。ＶＶＬも、α−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（α−ＧａｌＮＡｃ）およびβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（β−ＧａｌＮＡｃ）の両方に対する親和性を有し、例えば糖鎖の非還元末端に位置するＧａｌＮＡｃ（α１→３）Ｇａｌ残基、ＧａｌＮＡｃ（β１→４）Ｇａｌ残基、およびＧａｌＮＡｃ（β１→４）ＧｌｃＮＡｃ残基に結合することができる。
【００４６】
ＴＪＡ−ＩＩは、キカラスウリに由来するレクチン（凝集素）の一つである。ＴＪＡ−ＩＩもβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（β−ＧａｌＮＡｃ）等のＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃ）に対する親和性を有し、例えば糖鎖の非還元末端に位置するＧａｌＮＡｃ（β１→４）ＧｌｃＮＡｃ残基に結合することができる。なお、ＴＪＡ−ＩＩはフコース（α１→２）ガラクトース残基に対しても比較的強い親和性を有する。
【００４７】
・ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量方法の実施形態
β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子をＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡに結合させる工程を含む、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量方法の代表的な実施形態（第１定量方法）としては、β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子と共に、これとは別のＰＳＡに特異的に結合する分子をＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡに結合させ、これら３分子からなるサンドイッチ型複合体を形成させることを含む方法が挙げられる。このサンドイッチ型複合体の具体例としては、支持体に担持された（固相化された）ＰＳＡタンパク質をエピトープとする抗ＰＳＡ抗体と、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡと、蛍光標識されたβ−ＧａｌＮＡｃ親和性レクチンまたは抗ＧａｌＮＡｃ抗体とからなるサンドイッチ型複合体が挙げられる。
【００４８】
「抗ＰＳＡ抗体」は、一般的な手法により作製することも可能であり、市販されているものを購入することも可能である。測定の安定性からポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体を用いることが好ましい。また、糖鎖中の特定の糖残基（本発明においてはβ−ＧａｌＮＡｃ）を蛍光標識レクチンが認識して結合することを妨げないよう、ＰＳＡの糖鎖ではなくタンパク質の部分をエピトープとする抗体が好ましい。そのようなＰＳＡタンパク質をエピトープとする抗ＰＳＡモノクローナル抗体としては、例えば、ＰＳ２、ＰＳ３、ＰＳ４、ＰＳ５、ＰＳ６、ＰＳ１５、２Ｈ９、３Ｂ４、５Ａ６、５Ｇ６、８Ｇ４、９Ａ８、９Ｇ２、ＰＳ１、８Ａ６、２Ｈ９、１Ｈ１２、Ｎｏ．７９などのクローンが公知であり、市販もされている。抗β−ＧａｌＮＡｃ抗体も同様にして作製することができ、例えば、１００−２Ｈ５−Ａ、１１４−２Ｈ１２−Ｃ、２５９−２Ａ１、２７３−３Ｆ２、９９−２Ａ５−Ｂ、ＳＭＬＤＮ１．１などのクローンが公知である。
【００４９】
蛍光標識されたβ−ＧａｌＮＡｃ親和性レクチンは、前述したようなβ−ＧａｌＮＡｃ親和性レクチンに一般的な手法を用いて所望の蛍光物質を結合させることにより作製することができ、その際には市販されている蛍光物質ラベリングキットなどを用いることもできる。蛍光物質は特に限定されるものではなく、ＳＰＦＳによって適切な蛍光を発することのできる蛍光色素などを用いることができる。蛍光標識された抗β−ＧａｌＮＡｃ抗体も同様にして作製することができる。
【００５０】
上記のようなβ−ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子を含むサンドイッチ型複合体の形成量、すなわち検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの含有量を定量するための方法としては、測定対象を高感度かつ高精度で定量することができる方法として知られている、ＳＰＦＳ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）が好適である。ＳＰＦＳによって測定される、サンドイッチ型複合体に含まれる蛍光物質から発せられる蛍光強度に基づいて、検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡを定量することができる。
【００５１】
β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子をＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡに結合させる工程を含む、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量方法の別の実施形態（第２定量方法）としては、β−ＧａｌＮＡｃ残基に対して親和性を有するレクチンが結合した担体を充填したカラム（レクチンアフィニティーカラム）を利用する方法が挙げられる。すなわち、上記レクチンアフィニティーカラムに検体をアプライしてＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡをそのレクチンに結合させ、次いでハプテン糖を含有する溶出用緩衝液をアプライしてＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡを解離させ、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡを含有する画分を回収した後、その画分のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの含有量を免疫測定法によって測定することができる。第２定量方法において、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ含有画分中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡを定量する際には、当該画分中のＰＳＡは実質的に全てβ−ＧａｌＮＡｃ残基を有するものになっているため、標識化されたβ−ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子（レクチン）を用いる必要は無く、ＰＳＡタンパク質をエピトープとする標識化された抗ＰＳＡ抗体を用いることができる。例えば、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子／ＰＳＡ／アルカリフォスファターゼ標識抗ＰＳＡ抗体からなる免疫複合体を形成したのち、化学発光基質を添加して発光強度を測定する化学発光酵素免疫測定法や、固相化抗ＰＳＡ抗体／ＰＳＡ／蛍光標識抗ＰＳＡ抗体からなる免疫複合体を形成したのち、ＳＰＦＳにより蛍光強度を測定するＳＰＦＳ法により、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ含有画分中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡを定量することができる。
【００５２】
・ＳＰＦＳ測定法
ＳＰＦＳは、誘電体部材の上面に形成された金属薄膜に裏面（誘電体部材と接触している側）から、全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で入射光を照射したときに、金属薄膜を透過して表面（測定領域が形成されている側）に生じるエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用し、その増強されたエバネッセント波を励起光として、測定領域に捕捉された測定対象物を標識している蛍光物質から効率的に蛍光を発生させる方法である。その蛍光の強度を測定することによって検体中の測定対象物を定量することができ、各検体についての測定値を、濃度が既知の標準試料を用いて測定したときの蛍光の強度の測定値と対比することにより、検体中の測定対象物の含有量（濃度）に換算することができる。このようにして行われるＳＰＦＳは、ＥＬＩＳＡのような従来の蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、検体中の測定対象物の濃度が極めて低い場合の定量法として好適である。
【００５３】
なお、本発明では、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの検体中の含有量（濃度）に基づいて各方法を実施するが、ＳＰＦＳ等の定量方法によって所定の測定プロトコールに従って得られた「測定値」を、ｎｇ／ｍＬ、Ｕ（ユニット）／ｍＬ等の所定の単位で表される「濃度」に換算しないまま、分析に用いることも可能である。たとえば、ＳＰＦＳでは通常、蛍光強度の測定値を任意単位（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔ：  ａ．ｕ．）で表すが、同一条件下において各検体について測定された任意単位で表される測定値に基づいて当該単位の閾値を設定し、同一条件下で測定された検体の測定値からグリーソンスコアの推定を行うようにしてもよい。
【００５４】
抗ＰＳＡ抗体／ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ／蛍光標識β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子からなるサンドイッチ型複合体を形成させたのち、その複合体（蛍光物質）から発せられる蛍光の強度をＳＰＦＳによって測定する際の一般的な実施形態を、図１に基づいて説明する。
【００５５】
ＳＰＦＳを実施する際に行われる工程は、「測定前段階」の工程と「測定段階」の工程に大別することができる。測定前段階の工程は、抗ＰＳＡ抗体／ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ／蛍光標識β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子からなるサンドイッチ型複合体を形成するまでの段階の工程であって、典型的には、図１［Ａ］に示されているような、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ１００を抗ＰＳＡ抗体６４に結合させて測定領域３８内に捕捉する工程（捕捉工程）、および図１［Ｂ］に示されているような、蛍光標識β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子８０をＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ１００に結合させて蛍光標識化する工程（標識工程）などを含む。一方、測定段階の工程は、金属薄膜１４の裏面に入射光を照射し、測定領域３８に形成された所定のサンドイッチ型複合体から発生する蛍光の強度を測定する工程（測定工程）などを含む。
【００５６】
ＳＰＦＳには、誘電体部材１２と、その上面に形成された金属薄膜１４と、その表面に形成された測定領域３８とを備えたプラズモン励起センサ１６ａが用いられる。測定領域３８は、所定のサンドイッチ型複合体を形成するための反応が行われる場であって、金属薄膜１４の表面に形成されたＳＡＭ６０と、そのＳＡＭ６０の表面に結合した支持体６２と、その支持体６２に結合（担持）された抗ＰＳＡ抗体６４とによって構成されることが好ましい。このようなプラズモン励起センサ１６ａは、捕捉工程に先だってあらかじめ作製しておくようにする。
【００５７】
ＳＡＭ（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：自己組織化単分子膜）６０は、支持体６２を金属薄膜１４の表面側に連結させる足場を提供するとともに、蛍光物質８４が金属薄膜１４と接触することにより励起光が照射されても蛍光を発しなくなる、金属消光を防止するために形成される。ＳＡＭ６０は、金属薄膜１４と直接的または間接的に反応可能な官能基、および支持体６２を構成する分子と直接的または間接的に反応可能な官能基を、両末端に有するシランカップリング剤で形成することが好ましい。
【００５８】
支持体６２は、測定領域３８内に抗ＰＳＡ抗体６４がより高密度で含まれるようにするために形成される。すなわち、ＳＡＭ６０に抗ＰＳＡ抗体６４を直接結合させる場合よりも、ＳＡＭ６０に支持体６２を結合させ、その支持体６２に抗ＰＳＡ抗体６４を結合させる場合の方が、支持体６２が高さ方向への空間的な広がりを持っているため、単位面積当たりの抗ＰＳＡ抗体６４の個数（つまり密度）を高めることができる。このような支持体６２としては、疎水結合が一因となっている非特異的吸着を抑制するとともに、抗ＰＳＡ抗体６４と反応可能な官能基を多数有する親水性高分子、例えばデキストランからなる主鎖にカルボキシル基が多数導入されたカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）が好ましい。
【００５９】
例えば、シランカップリング剤である１０−カルボキシ−１−デカンチオールを含有する溶液を、金属薄膜１４の表面に接触させることにより、当該分子からなるＳＡＭ６０を形成することができる。続いて、１０−カルボキシ−１−デカンチオールから形成されたＳＡＭ６０に、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）および水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を反応させることにより、ＳＡＭ６０の表面側に配向しているカルボキシル基を活性エステル化した後、ＣＭＤを含有する溶液を接触させることで、ＣＭＤからなる支持体６２を固相化することができる。さらに、ＣＭＤにＮＨＳおよびＷＳＣを反応させ、ＣＭＤが有するカルボキシル基を活性エステル化した後、抗ＰＳＡ抗体６４を含有する溶液を接触させることで、ＣＭＤからなる支持体６２に多数の抗ＰＳＡ抗体６４を担持させることができる。
【００６０】
捕捉工程では、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ１００および非ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ１１０を含有する検体を、流路３６に導入して測定領域３８に接触させるようにする。図１に示す実施形態においては、前述したようなレクチンアフィニティーカラムを用いた分画は事前に行われていないため、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ１００とともに非ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ１１０が検体中に含まれている。したがって、測定領域３８の抗ＰＳＡ抗体６４には、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ１００だけでなく非ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ１１０も結合して捕捉されることになる。
【００６１】
標識工程では、蛍光標識β−ＧａｌＮＡｃ親和性分子８０を含有する溶液を、流路３６に導入して測定領域３８に接触させるようにする。蛍光標識β−ＧａｌＮＡｃ親和性分子８０は、測定領域３８に捕捉されているＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ１０に結合して、所定のサンドイッチ型複合体が形成されるが、β−ＧａｌＮＡｃ残基を有さない非ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ１１０には（非特異的吸着によるやむを得ない結合を除いて）結合しない。
【００６２】
捕捉工程と標識工程の間、および標識工程の後には、流路３６に洗浄液（例えば界面活性剤を含有する緩衝液）を導入し、測定領域３８（支持体６２、抗ＰＳＡ抗体６４、ＳＡＭ６０など）に非特異的に吸着している、非ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ１１０や蛍光標識β−ＧａｌＮＡｃ親和性分子８０を除去するようにすることが好ましい。測定工程では、流路３６を洗浄液または緩衝液で満たした状態で、蛍光の強度を測定することが好ましい。
【００６３】
・ＳＰＦＳシステム
続いて、上記のようなＳＰＦＳを行うために好適なＳＰＦＳシステムの一実施形態を、図２に基づいて説明する。
ＳＰＦＳシステム１は、ＳＰＦＳ測定部材１６、ＳＰＦＳ測定装置１０、および制御演算装置４０によって構成されている。
【００６４】
図２［Ａ］は、誘電体部材１２の上面に直接金属薄膜１４が形成されている実施形態を表しており、プラズモン励起センサ１６ａは、誘電体部材１２、金属薄膜１４および測定領域３８からなる。図２［Ｂ］は、誘電体部材１２と分離可能な透明平面基板１３の上面に金属薄膜１４が形成されている実施形態を表しており、プラズモン励起センサ１６ａは、透明平面基板１３、金属薄膜１４および測定領域３８からなる。
【００６５】
ＳＰＦＳ測定部材１６はプラズモン励起センサ１６ａおよび流路部材１６ｂで構成されている。プラズモン励起センサ１６ａの上面の一部または全部、すなわち流路３６の底面の一部または全部において、支持体６２および抗ＰＳＡ抗体６４からなる層が形成されている領域が測定領域３８となる。測定領域３８の面積は通常、一般的にレーザー光として照射される入射光２２の照射面積と等しいかそれより広くなるよう調整され、たとえば、入射光２２のスポット径が１ｍｍφ程度であれば、測定領域３８は通常、少なくとも数ｍｍ四方の面積を有する。
【００６６】
流路部材１６ｂは、プラズモン励起センサ１６ａの上部に、両末端に開口を有する流路３６を形成するための部材であり、流路部材１６ｂの上部に設けられる蛍光検出手段３２によって蛍光３２の強度の測定が正確に行えるよう、無色透明な素材、例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）で作製されている。流路部材１６ｂは、プラズモン励起センサ１６ａ（図２［Ａ］では誘電体部材１２、図２［Ｂ］では透明平面基板１３）と圧着されており、必要に応じて接着剤、マッチングオイル、透明粘着シートなどを用いて、隙間からの溶液の漏出を防止するようにしてもよい。また、流路部材１６ｂは、側壁部（スペーサー）と天板部とを組みあわせることによって構成されていてもよい。この場合、側壁部としては、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製で、流路となる貫通穴を中央部に有するシート状の部材を用いることができる。天板部としては、例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）製の無色透明で、側壁部の貫通穴（流路）の両端に相当する位置に２つの貫通穴を有するプレート状の部材を用いることができる。
【００６７】
このような「流路型」のＳＰＦＳ測定部材１６では、検体、蛍光標識β−ＧａｌＮＡｃ親和性分子８０の溶液、洗浄液等の各種の溶液は、送液手段（図示せず）によって、両端に設けられている開口から流路３６に導入され、往復送液または循環送液される。
【００６８】
なお、溶液を往復送液または循環送液する必要がない場合、ＳＰＦＳ測定部材１６は溶液を貯留する「ウェル型」とすることができる。その場合、流路部材１６ｂの代わりに、プラズモン励起センサ１６ａの上面に流路よりも容積の大きいウェルを形成することのできる、ウェル部材を用いればよい。ウェルの上部は開放されていてよく、たとえばピペット状の器具を用いることにより、各種の液体をウェルに添加し、除去することができる。
【００６９】
ＳＰＦＳ測定装置１０は、基本的に、測定部材装填部１８、照射手段２０、受光手段２６および蛍光検出手段３２を備え、必要に応じてさらに、送液手段（図示せず）を備えていてもよい。
【００７０】
測定部材装填部（ステージ）１８には、ＳＰＦＳ測定部材１６が着脱可能になっている。図２［Ａ］に示すような、誘電体部材１２を含むプラズモン励起センサ１６ａの使用が想定される場合、測定部材装填部１８はプリズム形状の誘電体部材１２を設置できるようになっている。図２［Ｂ］に示すような、透明平面基板１３を含むプラズモン励起センサ１６ａの使用が想定される場合、測定部材装填部１８にはあらかじめプリズム形状の誘電体部材１２が設置されており、その上面に透明平面基板１３を密着して載置できるようになっている。
【００７１】
送液手段（図示せず）は、例えば、移動手段を備えたピペット状の器具によって構成することができる。試料、試薬等の各種の溶液の収容部（図示せず）においてそれらの溶液を吸引した後、流路型のＳＰＦＳ測定部材１６の流路３６の末端に設けられている開口において吸引されていた溶液を吐出することで、その溶液を流路３６に導入することができる。必要に応じて、その場で吸引および吐出を繰り返すことにより、溶液を流路３６内で往復送液させ、測定領域３８における反応を促進させることができる。ＳＰＦＳ測定部材１６がウェル型の場合は、そのウェル内に吸引されていた溶液を吐出すればよい。また、ＳＰＦＳ測定部材１６が流路型の場合は、送液手段は、外部流路およびポンプによって構成することもできる。外部流路は、ＳＰＦＳ測定部材１６の流路３６の両末端に設けられた開口とポンプとを連通させる部材である。ポンプは、この外部流路を介して、試料、試薬等の各種の溶液を流路３６に導入し、往復送液または循環送液させることができる。
【００７２】
照射手段２０は、光源および光源可動手段を備え、必要に応じてさらに、光源と誘電体部材１２との間に偏光フィルタおよび減光フィルタを備えていてもよい。光源は、蛍光標識レクチン８０が有する蛍光物質８４を励起させるのに適した波長および強度を有する入射光２２を照射するものであり、一般的にはレーザーダイオードである（つまり入射光２２はレーザー光である）。光源可動手段は、入射光２２が誘電体部材１２の入射側面１２ｂから金属薄膜１４の裏面に、所定の入射角α１で照射されるよう、光源を移動させる。偏光フィルタは、光源から照射される入射光２２を、金属薄膜１４が表面プラズモン共鳴を効率的に発生させることができるＰ偏光にするために用いられる。減光フィルタは、蛍光検出手段３２が適切な強度の信号値を取得できるよう、光源から照射される入射光２２の強度（フォトン量）を調整するために用いられる。
【００７３】
受光手段２６は、受光器および受光器可動手段を備える。受光器は、入射光２２が金属薄膜１４の裏面で反射された光である、反射光２４を受光し、その強度を測定することができる。受光器可動手段は、光源可動手段による入射光２２の入射角α１の変化と同期して、反射角が変化した反射光２４を確実に受光できるよう、受光器を移動させることができる。入射光２２の強度に対する反射光２４の強度の比率、すなわち反射率が最も低いときに、表面プラズモン共鳴による電場増強効果が最も高くなり、そのような入射角α１において蛍光３２の強度を測定する測定工程を行うことが好ましい。
【００７４】
蛍光検出手段３２は、検出器、集光レンズおよびフィルタを備える。検出器は、プラズモン励起センサ１６ａの表面から発せられる、すなわち測定領域３８に捕捉された蛍光標識レクチン８０が有する蛍光物質８４から発せられる蛍光３０を受光し、その強度を測定するためのものであり、例えば光電子倍増管（ＰＭＴ）を用いることができる。集光レンズは、蛍光３０を検出器に集中させてその強度を正確に測定できるようにするためのものであり、例えば顕微鏡と同様の対物レンズを用いることができる。フィルタは、蛍光３０を含む所定の範囲の波長の光のみを透過させて検出器に到達させるためのものであり、その範囲を外れる波長を有する、散乱光等のノイズとなる光を除去することができる。
【００７５】
なお、ＳＰＦＳ測定部材１６（プラズモン励起センサ１６ａ）、照射手段２０および受光手段２６からなる構成は、ＳＰＲ測定部２８と称されることがある。ＳＰＲ測定部２８は、蛍光３０を測定するのではなく、測定領域３８に目的物質が捕捉されることで反射光２４の強度が減衰することによって目的物質を定量する、ＳＰＲ法（表面プラズモン共鳴法）のための装置と基本的に共通する構成を有するためである。一方で、ＳＰＦＳ測定部材１６（プラズモン励起センサ１６ａ）、照射手段２０および蛍光検出手段３２からなる構成は、ＳＰＦＳ測定部３４と称されることがある。
【００７６】
制御演算装置４０は、照射手段２０、受光手段２６、蛍光検出手段３２、および必要に応じて備えられる送液手段（図示せず）と接続されており、各手段が備える部材の動作を制御することができるとともに、各手段で測定された情報を記録ないし記憶し演算することができるよう、信号が送受信される。制御演算装置４０は、所定の制御演算用のプログラムおよび情報を記憶することのできる、パーソナルコンピュータを用いて構成することができる。
【００７７】
制御演算装置４０は、たとえば、送液手段が所定の手順で、所定の量の試料や試薬等の溶液を送液し、測定領域３８に所定の複合体を形成させた後、照射手段２０が所定のタイミングおよび入射角で入射光２２を照射し、蛍光検出手段３２が測定領域３８で発生する蛍光３０の強度を測定するよう、プログラムに従って自動的にそれらの各手段を作動させることができる。また、制御演算装置４０は、検体ごとに測定される蛍光３０の強度のデータを蛍光検出手段３２から受信して記憶し、好ましくは直ちに、その測定値をあらかじめ記憶させておいた所定の閾値と対比して、推定されたグリーソンスコアまたは病理病期分類、あるいは取得された補助情報をさらに記憶するようにしてもよい。
【００７８】
［閾値］
測定された検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの含有量（濃度）から、本発明の各方法における推定または情報取得を行うために必要となる閾値（カットオフ値）は、公知の推定方法または情報取得方法と同様の一般的な手法によって、例えば診断マーカーまたは腫瘍マーカーについての閾値と同様にして、設定することができる。
【００７９】
たとえば、前立腺癌と診断され、前立腺を全摘出された複数の患者を対象として、手術前の血清検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度と、摘出された前立腺癌組織のグリーソンスコア（プライマリーパターンおよびセカンダリーパターン）を検査する。一般的に、グリーソンスコアが高いほど（プライマリーパターンおよびセカンダリーパターンの組み合わせによる悪性度が高いほど）、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度も高い傾向にある。グリーソンスコアとＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度の測定結果に基づいてボックスプロットまたはＲＯＣ曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ）を作成することにより、所望の精度の推定が行える閾値を設定することができる。例えば、本発明のグリーソンスコアの推定方法を実施する際に、ＧＳが４＋３以上であるか否かを推定するための閾値は、ＧＳが４＋３以上である群のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量値のうちその値より大きいものがなるべく多く（つまり感度が高く）、かつＧＳが４＋３未満の（３＋４以下である）群のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量値でその値より大きいものがなるべく少ない（つまり特異度が高い）値とすることが理想的である。一方、ＧＳが３＋４以下であるか否かを推定するための閾値は、ＧＳが３＋４以下である群のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量値のうちその値より小さいものがなるべく多く（つまり感度が高く）、かつＧＳが３＋４より大きい（４＋３以上である）群のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量値でその値より小さいものがなるべく少ない（つまり特異度が高い）値とすることが理想的である。
具体的には、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの量をＵ／ｍＬで表した場合に、ＧＳが４＋３以上であると推定するためのカットオフ値（閾値）は０．０５〜０．３１Ｕ／ｍＬに設定することが好ましい。なお、ＧＳが４＋３以上である前立腺癌の見逃しを防ぐためには、カットオフ値としては０．０５〜０．１Ｕ／ｍＬに設定することが好ましく、特にリスクの高いＧＳが４＋３以上である前立腺癌を優先的に発見、治療するためのカットオフ値としては０．１Ｕ／ｍＬを超えて０．３１Ｕ／ｍＬ以下に設定することが好ましい。
ＧＳが３＋４以下であると推定するためのカットオフ値は、０．０２〜０．３１Ｕ／ｍＬに設定することが好ましい。なお、ＧＳが３＋４以下である前立腺癌の確率が非常に高く、経過観察と診断するための補助情報を得ることが目的の場合、カットオフ値は０．０２〜０．１Ｕ／ｍＬに設定することが好ましい。
閾値を変えると感度および特異度も連動して変わるので、両方のバランスがとれるよう調整（最適化）することが望ましい。測定データの母集団であるサンプル数を多くするほど、信頼性の高い閾値を設定することが可能となる。このようにして設定される閾値と、ある検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの含有量（濃度）の測定値とを比較することによって、グリーソンスコアを推定するための補助情報を得ることができる。例えば、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの含有量（濃度）の測定値が閾値以上であればその検体を採取した前立腺癌患者はグリーソンスコアが４＋３以上である、または閾値未満であれば３＋４以下であると、所定の確率（感度および特異度）をもって推定するための補助情報を得ることができる。
【００８０】
上記と同様にして、本発明の病理病期分類（ｐＴ）の推定方法において、ｐＴが３以上と推定するための、またはｐＴが２以下であると推定するための閾値を設定することができる。
具体的には、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの量をＵ／ｍＬで表した場合に、ｐＴが３以上であると推定するためのカットオフ値は０．０６〜１．２４Ｕ／ｍＬに設定することが好ましい。なお、ｐＴが３以上である前立腺癌の見逃しを防ぐためには、カットオフ値としては０．０６〜０．１Ｕ／ｍＬに設定することが好ましく、特にリスクの高いｐＴが３以上である前立腺癌を優先的に発見、治療するためのカットオフ値としては０．２５〜１．２４Ｕ／ｍＬに設定することが好ましい。
ｐＴが２以下であると推定するためのカットオフ値は、０．０３〜０．２３Ｕ／ｍＬに設定することが好ましい。なお、ｐＴが２以下である前立腺癌の確率が非常に高く、手術適用の有無などを診断するための補助情報を得ることが目的の場合、カットオフ値は０．０３〜０．１２Ｕ／ｍＬが好ましい。一般的に、ｐＴが高いほど、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量値も高い傾向にある。
【００８１】
さらに、本発明の補助情報の取得方法における閾値も上記と同様にして設定することができる。一般的に、生検によるＧＳ等の病理診断に関する指標が過小に評価される（生検による指標よりも摘出した前立腺組織を用いた指標の方が大きくなる）場合は、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量値が高くなる傾向にある。
【００８２】
ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡのように特定の糖残基を含む糖鎖を有する糖タンパク質の定量方法、特にＳＰＦＳ法に基づく定量方法や、そのような含有量を所定の閾値を比較して診断等に用いることのできる特定の情報を得る方法に関して、本明細書に記載されている事項以外の一般的な事項や実施形態のバリエーションについては、例えば、国際公開２０１０／０９０２６４号公報（特許文献３）、特開２０１３−０７６６６６号公報（特許文献４）などを参照することができる。
【００８３】
−キット−
本発明の各方法を効率的に実施するために、必要な試薬類をまとめてキットを構成することができる。このようなキットは少なくとも、本発明の各方法において行われる、血清等の検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度を測定するための試薬類および器具類を含む。ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度を測定には、典型的にはＳＰＦＳやＥＬＩＳＡのようなサンドイッチ型アッセイに基づく定量方法が利用され、必要に応じてレクチンアフィニティーカラムによる分画法も併用される。したがってキットも、典型的にはそれらの方法に適したサンドイッチ型免疫複合体を形成するための試薬類、すなわち、固相化用の抗ＰＳＡ抗体、およびＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの検出用のβ−ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子（ＷＦＡ等の所定のレクチンまたは抗β−ＧａｌＮＡｃ抗体）を主要な構成物とし、必要に応じてレクチンアフィニティーカラムを作製するためのレクチンなども構成物とすることができる。
【００８４】
本発明の各方法を実施するためのキットは、必要に応じて、上記の試薬以外の試薬、器具、使用説明書等を含んでいてもよい。そのような試薬および器具としては、たとえば、所定の抗体をＳＰＦＳ用のセンサーチップやＥＬＩＳＡ用の基板の表面に固相化するための試薬、所定のレクチンまたは抗体に蛍光物質と結合させるための試薬、ＳＰＦＳ用のセンサーチップやＥＬＩＳＡ用の基板の表面の非特異的吸着を抑制するためのブロッキング液、ＳＰＦＳの各工程で血液検体や試薬を送液した後に送液するための洗浄液、レクチンアフィニティーカラムの担体に所定のレクチンを結合させるための試薬、レクチンアフィニティーカラム用の洗浄用もしくは溶出用緩衝液を調製するための試薬、血液検体用の処理液、これらの試薬を反応させるための器具、さらにＳＰＦＳ用のセンサーチップやＥＬＩＳＡ用の基板、レクチンアフィニティーカラムの担体などが挙げられる。また、使用説明書には、本発明の各方法を実施するために必要な情報、例えば、上記の試薬および器具の使用方法（プロトコール）や、各方法に対応した閾値などを記載しておくことができる。
【実施例】
【００８５】
（１）ＳＰＦＳ測定装置の構築
図２［Ｂ］に示す実施形態に準じたＳＰＦＳ測定装置を自作し、以下の実施例に使用した。照射手段２０の光源としては、波長６３５ｎｍの光を照射することができるレーザーダイオード（ＬＤ）を用い、光源と誘電体部材１２との間には、減光フィルタ（中性濃度フィルタ）を設けてフォトン量を調整できるようにした。誘電体部材１２としては、６０度のプリズム（シグマ光機（株））を用いた。この誘電体部材１２の上面に、次に述べるようにして作製した、透明平面基板１３を含むプラズモン励起センサ１６ａと流路部材１６ｂとからなる部材（センサーチップ）を固定することによって、測定部材１６を構成した。蛍光検出手段３２の光検出器としては、光電子倍増管（ＰＭＴ）を用い、集光レンズとして対物レンズを設けた。【００８６】
（２）流路型ＳＰＦＳ測定部材の作製
屈折率１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ「Ｓ−ＬＡＬ  １０」）をプラズマ洗浄し、この基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法によって形成した。その後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法によって形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。【００８７】
このようにして金薄膜が形成された基板を、１０−カルボキシ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の表面に当該分子からなるＳＡＭを形成した。基板をこの溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンを用いて乾燥した。【００８８】
この基板に、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）０．５ｍＭ、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）０．５ｍＭおよびカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）（名糖産業（株）「ＣＭＤ−５００−０６Ｉ４」、平均分子量５０万，置換度０．５１）１ｍｇ／ｍＬを含む２５ｍＭのＭＥＳ緩衝生理食塩水と、１０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）とを、それぞれ０．８ｍＬずつ滴下し、２０分間反応させてＳＡＭにＣＭＤを結合させることで、プラズモン励起センサの表面にＣＭＤ膜を形成した。【００８９】
ＣＭＤ膜が形成されたプラズモン励起センサ上に、幅２ｍｍ、長さ１４ｍｍの貫通穴を有する、厚さ０．５ｍｍのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製のスペーサーを積載した。さらにその上に、スペーサーの貫通穴の両端に対応する位置に貫通穴を有する、厚さ２ｍｍのポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の天板を積載した。プラズモン励起センサ、スペーサーおよび天板を圧着し、ビスで固定することで、天板の貫通穴を通じて試料、試薬等を送液することのできるスペーサーの貫通穴からなる流路を備えた、流路型ＳＰＦＳ測定部材を作製した。【００９０】
（３）抗体（抗ＰＳＡモノクローナル抗体）固相化基板の調製
上記のように作製した流路型ＳＰＦＳ測定部材に外部流路およびペリスタポンプを接続し、超純水を１０分間、その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２０分間、室温（２５℃）、流量５００μＬ／分の条件で循環送液させ、プラズモン励起センサの表面を平衡化した。【００９１】
続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭとを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５ｍＬを、２０分間循環送液した後、抗ＰＳＡモノクローナル抗体溶液２．５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＣＭＤに当該抗体を結合させ、抗ＰＳＡモノクローナル抗体固相化ＣＭＤ膜（測定領域）を調製した。
その後、１重量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を３０分間循環送液することによって、流路内の非特異吸着防止処理を行った。【００９２】
（４）蛍光標識レクチン（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識ＷＦＡ）の作製
標記の蛍光標識レクチンを、蛍光物質ラベリングキット「Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７  タンパク質ラベリングキット」（インビトロジェン社）を利用して作製した。ＷＦＡ（ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社「Ｌ−１３５０」）１００μｇ相当と、上記キットに含まれる０．１Ｍ重炭酸ナトリウムと、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｄｙｅとを混合し、室温で１時間反応させた後、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび限外濾過を行い、標識に利用されなかったＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｄｙｅを取り除いて、蛍光標識ＷＦＡレクチンを得た。その後、吸光度を測定して標記の蛍光標識レクチンの濃度を定量した。【００９３】
（５）血清検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量
前立腺癌と診断され、前立腺を全摘出された患者９２名を対象に、手術前の血清検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度およびトータルＰＳＡの濃度を定量した。患者背景を表１に示す。ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度の定量は、上記のようにして準備した抗ＰＳＡモノクローナル抗体固相化基板を備えた流路型ＳＰＦＳ測定部材および蛍光標識ＷＦＡを用いて、ＳＰＦＳにより行った。手順の詳細は以下の通りである。一方、トータルＰＳＡの濃度は、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴアナライザーｉ１０００ＳＲ」システムおよび前立腺特異抗原キット「トータルＰＳＡ・アボット」（アボットジャパン株式会社）を用いて、所定の方法により定量した。【００９４】
【表１】
2018101327.tif 000002
【００９５】
被験試料（血清検体）２０μＬに希釈溶液１００μＬを添加し、チューブ内でよく撹拌して混合液を調製した。この混合液１００μＬを流路に循環送液し、測定領域と６０分間反応させた。その後、「Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０」を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して、３分間洗浄した。続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識ＷＦＡ溶液（ＷＦＡ濃度：１０μｇ／ｍＬ）１００μＬを流路に循環送液し、測定領域と１０分間反応させた。その後再び、ＴＢＳ−Ｔを送液して、５分間洗浄した。そして、ＴＢＳ−Ｔで流路を満たした状態で励起光を照射し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７の蛍光強度（シグナル）をＳＰＦＳにより測定した。【００９６】
ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度が既知の調製試料を用いて作成した検量線に基づいて、各被験試料の蛍光強度の測定値を、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度に換算した。また、常法に従って、各被験試料の患者の生検時のグリーソンスコア（ＧＳ）の分類、ならびに各被験試料の患者の全摘後のグリーソンスコア（ＧＳ）および病理病期（ｐＴ）の分類も行った。【００９７】
（ｉ）摘出した前立腺組織についてのＧＳが３＋４以下である患者群と、４＋３以上である患者群で、血清検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡおよびトータルＰＳＡの濃度の分布を比較した。結果を図３［Ａ］および［Ｂ］に示す。ＧＳが３＋４以下である患者群に比べて、ＧＳが４＋３以上である患者群の方が、血清検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度が有意に高いことが示された（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、Ｐ＜０．０５）。一方、血清検体中のトータルＰＳＡの濃度については、両群間に有意差は認められな
かった。【００９８】
上記の結果に基づいて作成したＲＯＣ曲線を図３［Ｃ］に示し、そこから求められる、ＧＳが４＋３以上であること、およびＧＳが３＋４以下であることについての、血清検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度に関するカットオフ値と的中率（予測性能）を、それぞれ表２および表３にまとめて示す。このような結果に基づけば、当業者であれば適切な閾値を設定し、本発明のＧＳの推定方法を実施することが可能であることが理解される。【００９９】
【表２】
2018101327.tif 000003
【０１００】
【表３】
2018101327.tif 000004
【０１０１】
（ｉｉ）生検時のＧＳおよび全摘後のＧＳの推移によって患者を分類し、各患者群の血清検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度を比較した。結果を図４に示す。生検時のＧＳに比べて全摘後のＧＳの方が低い（ダウングレードした）症例を■印、生検時のＧＳに比べて全摘後のＧＳの方が高い（アップグレードした）症例を●印、両者に変化がなかった症例を▲印で表す。アップグレードした症例ではＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度が高い傾向にあり、ダウングレードした症例ではＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度が低い傾向にある。このような結果に基づけば、当業者であれば適切な閾値を設定し、本発明の補助情報の取得方法を実施することが可能であることが理解される。【０１０２】
（ｉｉｉ）ｐＴが２以下の患者群と、３以上の患者群で、血清検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度の分布を比較した。結果を図５［Ａ］および［Ｂ］に示す。ｐＴが２以下の患者群に比べて、ｐＴが３以上の患者群の方が、血清検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度およびトータルＰＳＡの濃度が有意に高いことが示された（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、Ｐ＜０．０５）。【０１０３】
上記の結果に基づいて作成したＲＯＣ曲線を図５［Ｃ］に示し、そこから求められる、ｐＴが３以上であること、およびｐＴが２以下であることについての、血清検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度に関するカットオフ値と的中率（予測性能）を、それぞれ表４および表５にまとめて示す。このような結果に基づけば、当業者であれば適切な閾値を設定し、本発明のｐＴの推定方法を実施することが可能であることが理解される。【０１０４】
【表４】
2018101327.tif 000005
【０１０５】
【表５】
2018101327.tif 000006
【０１０６】
［参考例］
前述したようにして測定された、前立腺癌と診断された患者１９１名の、生検前の血清検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度について、生検により採取された組織のＧＳ、それぞれのプライマリーパターンおよびセカンダリーパターンの組み合わせとの関連を調べた。結果を図６に示す。生検前の血清検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度が高いほど、プライマリーパターンおよびセカンダリーパターンの組み合わせによる悪性度も高くなる傾向が示されている。
【符号の説明】
【０１０７】
１            ＳＰＦＳシステム
１０          ＳＰＦＳ測定装置
１２          誘電体部材
１３          透明平面基板
１４          金属薄膜
１６          ＳＰＦＳ測定部材（流路型）
１６ａ      プラズモン励起センサ
１６ｂ      流路部材
１８          測定部材装填部
２０          照射手段
２２          入射光
２４          反射光
２６          受光手段
２８          ＳＰＲ測定部
３０          蛍光
３２          蛍光検出手段
３４          ＳＰＦＳ測定部
３６          流路
３８          測定領域
４０          制御演算装置
６０          ＳＡＭ
６２          支持体
６４          抗ＰＳＡ抗体
８０          蛍光標識β−ＧａｌＮＡｃ親和性分子
８２          β−ＧａｌＮＡｃ親和性分子
８４          蛍光物質
１００        ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ
１０２        ＰＳＡタンパク質
１０４        非還元末端にβ−ＧａｌＮＡｃ残基を有する糖鎖
１０４ａ    β−ＧａｌＮＡｃ
１１０        非ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ
１１４      非還元末端にβ−ＧａｌＮＡｃを有さない糖鎖
【図１】
2018101327.tif 000007
【図２】
2018101327.tif 000008
【図３】
2018101327.tif 000009
【図４】
2018101327.tif 000010
【図５】
2018101327.tif 000011
【図６】
2018101327.tif 000012
【図７】
2018101327.tif 000013
【国際調査報告】
2018101327.tif 000014
2018101327.tif 000015
2018101327.tif 000016
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