(57)【要約】  天然物由来の有効成分を含む、高活性な皮脂量増加剤およびヒアルロン酸産生促進剤を提供する。本発明は、阿膠を有効成分として含む、皮脂量増加剤およびヒアルロン酸産生促進剤である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
阿膠を有効成分として含む、皮脂量増加剤。
【請求項２】
ロバ（Ｅｑｕｕｓ  ａｓｉｎｕｓ  Ｌ．）の皮の熱水抽出物を得ること、および
真空乾燥により前記熱水抽出物の乾燥物を得ることを含む、皮脂量増加剤の製造方法。
【請求項３】
阿膠を有効成分として含む、ヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項４】
前記阿膠が、ヒアルロニダーゼ処理物である、請求項３に記載のヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項５】
ロバ（Ｅｑｕｕｓ  ａｓｉｎｕｓ  Ｌ．）の皮の熱水抽出物を得ること、および
スプレードライにより前記熱水抽出物の乾燥物を得ることを含む、ヒアルロン酸産生促進剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、阿膠を有効成分として含む、皮脂量増加剤およびヒアルロン酸産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は生体の最外郭に位置する器官であり、生体防御、感覚、体温調節および排泄作用などの重要な生理機能を担っている。また、このような機能は、皮膚の主構成である表皮や線維芽細胞のみならず、脂腺（皮脂腺）などの皮膚付属器官により調節されている。すなわち、表皮、真皮および脂腺などの機能を統合的に調節し、かつ維持することが皮膚の構造的および機能的バリアーの構築に必須であると考えられる。【０００３】
脂腺から分泌される皮脂の主成分は、脂腺細胞で合成されるトリアシルグリセロールであり、その他にワックスエステル、スクワレン等の脂腺特有の脂質が含まれている。脂腺から排出された皮脂は、皮膚からの水分蒸散を抑えて皮膚の恒常性を維持するほか、皮脂中のトリアシルグリセロールが分解されて生じる遊離脂肪酸の存在によって表皮を低ｐＨに保持し、弱酸性の脂質膜が有害物質に対する緩衝作用や生体防御機能をも果たしている。したがって、皮脂合成や産生が不十分であると、生体防御機構が十分に機能し得ず、また、アレルギー症状の憎悪化等も誘発しかねない。【０００４】
皮脂産生促進成分として、安全性の高い天然物由来の有効成分の開発が求められている。特許文献１には、発芽ブロッコリー由来成分を有効成分とすることを特徴とする皮脂産生促進剤にかかる発明が記載されている。【０００５】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、コラーゲン、エラスチン等のタンパク質とともに細胞外マトリックスを構成する、グリコサミノグリカンの一種である。ヒアルロン酸は保水力に優れるため、皮膚の保湿に寄与していると考えられている。【０００６】
皮膚組織におけるヒアルロン酸の産生は、主として線維芽細胞が担っていると考えられている。ヒアルロン酸は、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとを構成単位とし、生体内においてはヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ）によって合成され、ヒアルロニダーゼ等の分解酵素によって分解される。一方、加齢により線維芽細胞の増殖能が低下したりヒアルロン酸合成能が低下したりすると、皮膚組織中のヒアルロン酸量は低下する。これにより、皮膚の保湿性や弾力性が損なわれ、加齢に伴うシワの発生や肌荒れの原因となっていると考えられている。【０００７】
ヒアルロン酸産生促進成分として、安全性の高い天然物由来の有効成分の開発が求められている。特許文献２には、コラーゲンペプチドのヒアルロン酸産生促進剤にかかる発明が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−１１４１５２号公報
【特許文献２】特開２０１４−２１０７６６号公報
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、天然物由来の有効成分を含む、高活性な皮脂量増加剤およびヒアルロン酸産生促進剤を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、阿膠を有効成分として含む剤によって上記課題が解決されることを見出し、本発明の完成に至った。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、阿膠（真空）、スプレー阿膠、魚由来ペプチド（ペプチドＦＰＣ）、ブタ由来ペプチド（ＰＲＡ−ＰＣ）または変性コラーゲン（ゼラチン）を含む培地で３日毎に処理をして６日間培養したハムスター脂腺細胞における、細胞内のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量を示す（図中、「＊＊」（ｐ＜０．０１）および「＊＊＊」（ｐ＜０．００１）は対照群（Ｃｏｎｔ）に対して統計的に有意であることを示す。）。
【図２】図２は、インスリン（陽性対照）、阿膠（真空）またはスプレー阿膠を含む培地で３日毎に処理をして６日間培養したハムスター脂腺細胞の、オイルレッドＯ染色像である。
【図３】図３は、阿膠（真空）またはスプレー阿膠を含む培地でヒト表皮細胞を２４時間培養した後における、培地中のヒアルロン酸（ＨＡ）量を示す（図中、「＊」（ｐ＜０．０５）および「＊＊＊」（ｐ＜０．００１）は対照群（Ｃｏｎｔ）に対して統計的に有意であること、ならびに「＃」（ｐ＜０．０５）、「＃＃」（ｐ＜０．０１）および「＃＃＃」（ｐ＜０．００１）はＩＬ−１α処理細胞に対して統計的に有意であることを示す。）。
【図４】図４は、阿膠（真空）またはスプレー阿膠を含む培地で２４時間培養したヒト表皮細胞における、ヒアルロン酸合成酵素−２（ＨＡＳ−２）ｍＲＮＡの相対発現量を示す（図中、「＊」（ｐ＜０．０５）は対照群（Ｃｏｎｔ）に対して有意であること、および「＃＃」（ｐ＜０．０１）はＩＬ−１α処理細胞に対して統計的に有意であることを示す。）。
【図５】図５は、阿膠（真空）またはスプレー阿膠を添加した新鮮培地中のヒアルロン酸（ＨＡ）量（図５Ａ）、およびヒアルロニダーゼ存在下または非存在下にて前処理したスプレー阿膠を添加した培地中のヒアルロン酸（ＨＡ）量（図５Ｂ）を示す。
【図６】図６は、ヒアルロニダーゼ存在下または非存在下にて前処理したスプレー阿膠を含む培地で２４時間培養したヒト表皮細胞における、ＨＡＳ−２  ｍＲＮＡの相対発現量を示す（図中、「＊」（ｐ＜０．０５）および「＊＊」（ｐ＜０．０１）は対照群（Ｃｏｎｔ）に対して統計的に有意であることを示す。）。
【図７】図７は、スプレー阿膠を含む培地でヒト表皮細胞を２４時間培養後、紫外線（ＵＶＢ、０．６ｋＪ／ｍ２）を照射し、さらに２４時間培養した後における、培地中のヒアルロン酸（ＨＡ）量を示す（図中、「＊＊＊」（ｐ＜０．００１）は紫外線未照射（Ｎｏｎｅ）に対して統計的に有意であること、および「＃＃＃」（ｐ＜０．００１）は対照群（Ｃｏｎｔ）に対して統計的に有意であることを示す。）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
【００１３】
本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で行う。
【００１４】
本発明の一形態は、阿膠を有効成分として含む、皮脂量増加剤である。当該形態の別の側面は、皮脂量増加剤の製造における阿膠の使用に関する。当該形態のさらなる側面は、皮脂量増加のための阿膠に関する。
【００１５】
本発明の別の形態は、阿膠を有効成分として含む、ヒアルロン酸産生促進剤である。当該形態の別の側面は、ヒアルロン酸産生促進剤の製造における阿膠の使用に関する。当該形態のさらなる側面は、ヒアルロン酸産生促進のための阿膠に関する。
【００１６】
本発明によれば、天然物由来の有効成分を含む、高活性な皮脂量増加剤およびヒアルロン酸産生促進剤を提供することができる。
【００１７】
阿膠は日本薬局方外生薬規格に掲載される生薬であり、ウマ科の動物であるロバ（Ｅｑｕｕｓ  ａｓｉｎｕｓ  Ｌ．）の皮の抽出物である。阿膠には補血、止血等の作用があるといわれており、美白化粧品の有効成分として利用が検討されている。なお、本明細書において用いられる「阿膠」には、ロバの皮の熱水抽出物（煎出物）をさらに精製した精製物、任意の分解酵素等で処理した酵素処理物等の加工品も、所望の効果が得られる限りにおいて、含まれ得る。
【００１８】
本発明の一実施形態では、ヒアルロン酸産生促進剤に有効成分として含まれる阿膠は、ヒアルロニダーゼ処理物である。阿膠のヒアルロニダーゼ処理物としては、後述の方法によりロバの皮から得られた抽出物を、必要に応じて任意の溶媒で任意の濃度、例えば０．０１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させ、ヒアルロニダーゼによりヒアルロン酸を酵素分解することにより得られる。かような溶媒としては、水、ｐＨ５〜８程度のリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ等のグッドバッファー等の緩衝液、生理食塩水等を用いればよい。ヒアルロニダーゼの添加量は抽出物の量によって任意に調整できるが、例えば１０〜１０００ＲＴＵ／ｍｌとなる濃度である。ヒアルロニダーゼ処理の反応温度や時間も特に制限されないが、例えば３０〜４５℃で１〜１００時間程度、好ましくは１０〜３０時間である。反応後は加熱等により酵素の失活処理を行うことが好ましい。その後、必要に応じて後述の手段により粉砕、乾燥することにより、ヒアルロニダーゼ処理物としての阿膠を得ることができる。ヒアルロニダーゼ処理物に含まれるヒアルロン酸量は、例えば、実施例に記載されるようなＥＬＩＳＡ法等の従来公知の方法により確認することができる。
【００１９】
本明細書において「有効成分として含む」とは、皮脂量増加剤またはヒアルロン酸産生促進剤として有効である程度に含むことを意味し、製薬上許容される担体等のその他の成分を含むことは妨げられない。
【００２０】
本発明に係る皮脂量増加剤およびヒアルロン酸産生促進剤の製造方法は、本発明の所望の効果が達成される限りにおいて特に制限されない。以下、皮脂量増加剤およびヒアルロン酸産生促進剤の好ましい製造方法について説明する。
【００２１】
皮脂量増加剤は、真空乾燥によりロバ（Ｅｑｕｕｓ  ａｓｉｎｕｓ  Ｌ．）の皮の熱水抽出物の乾燥物を得ることを含む製造方法により製造されることが好ましい。すなわち、本発明の一実施形態では、ロバ（Ｅｑｕｕｓ  ａｓｉｎｕｓ  Ｌ．）の皮の熱水抽出物を得ること、および真空乾燥により前記熱水抽出物の乾燥物を得ることを含む、皮脂量増加剤の製造方法が提供される。かような製造方法により製造された皮脂量増加剤は、皮脂量増加効果に特に優れたものとなる。
【００２２】
また、ヒアルロン酸産生促進剤は、スプレードライによりロバ（Ｅｑｕｕｓ  ａｓｉｎｕｓ  Ｌ．）の皮の熱水抽出物の乾燥物を得ることを含む製造方法により製造されることが好ましい。すなわち、本発明の別の実施形態では、ロバ（Ｅｑｕｕｓ  ａｓｉｎｕｓ  Ｌ．）の皮の熱水抽出物を得ること、およびスプレードライにより前記熱水抽出物の乾燥物を得ることを含む、ヒアルロン酸産生促進剤の製造方法が提供される。かような製造方法により製造されたヒアルロン酸産生促進剤は、ヒアルロン酸産生促進効果に特に優れたものとなる。
【００２３】
上記の皮脂量増加剤やヒアルロン酸産生促進剤の製造における熱水抽出の条件は、特に制限されないが、例えば、ロバの皮１ｇに対して３〜１０ｍｌ、好ましくは３〜５ｍｌとなる量の熱水中で行う。抽出温度（熱水の温度）は、例えば７０〜１００℃、好ましくは９０〜１００℃である。抽出時間も特に制限されないが、例えば５〜１２時間、好ましくは６〜１２時間である。抽出は複数回行ってもよい。かような手法により調製した抽出液を、必要に応じて遠心濃縮機等を用いて濃縮してもよい。濃縮の際は、蒸気圧を高めて濃縮を促進する目的で、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等の低級アルコール等を抽出液に任意に添加してもよい。
【００２４】
また、熱水抽出物には、任意に、従来公知の賦形剤等の製剤化のための添加剤を加えてもよい。賦形剤としては、特に限定されないが、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、セルロース、マンニトールのような糖類や糖アルコール；コムギデンプン、バレイショデンプン、コーンスターチなどのデンプン；シクロデキストリンなどのデキストリン；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体；ポリビニルピロリドンなどの合成高分子化合物等が例示できる。さらに、オリーブ油、大豆油、綿実油、カカオ脂、スクワラン、セラック、セタノール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、レシチン等の親油性成分を、製剤化のための添加剤として抽出液に添加してもよい。上記添加剤の量は、熱水抽出物に対して、例えば０．１〜５重量％となる量である。
【００２５】
上記のように調製した熱水抽出物を、好ましくは以下の手法により乾燥を行う。
【００２６】
ある好ましい実施形態では、熱水抽出物の乾燥は、真空乾燥により行う。真空乾燥の条件は、例えば、０．１〜１ｋＰａ、好ましくは０．５〜０．８ｋＰａで行う。乾燥時の温度は、例えば８０〜１００℃、好ましくは８０〜８５℃である。また、乾燥時間は、例えば、水分含量が４〜８重量％、好ましくは４〜６重量％となる時間である。真空乾燥は、皮脂量増加剤の製造において特に好ましく用いられる。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、熱水抽出物の乾燥は、スプレードライにより行う。スプレードライにより乾燥する場合は、乾燥入口温度（吸気温度）が例えば１２０〜１９０℃、好ましくは１４０〜１７０℃で行う。また、スプレードライ時の乾燥出口温度（排気温度）は、例えば７０〜１００℃、好ましくは８０〜９０℃で行う。スプレードライ後の水分含量は、例えば４〜８重量％であり、好ましくは４〜６重量％である。スプレードライは、ヒアルロン酸産生促進剤の製造において特に好ましく用いられる。
【００２８】
乾燥物は、任意に、ハンマーミル、ジェットミル、ピンミル、ビーズミル、マスコロイダー、ミキサー、ホモジナイザー等の公知の手段により、粉砕を行ってもよい。
【００２９】
乾燥物の平均粒径（粉砕を行う場合は、粉砕後の平均粒径）は、例えば１２０〜２０００μｍであり、好ましくは１８０〜１５００μｍである。なお、当該平均粒径は粒度分析器によって測定した値である。篩等により、所望の粒径の画分を回収してもよい。
【００３０】
本発明にかかる皮脂量増加剤およびヒアルロン酸産生促進剤は、有効成分である阿膠を、薬学的に許容される他の成分とともに製剤化してもよい。薬学的に許容される他の成分としては、例えば、上記の賦形剤のほか、担体、希釈剤、増量剤、乳化剤、増粘剤、崩壊剤、溶解補助剤、安定化剤、保存剤、緩衝剤、滑沢剤、結着剤、ｐＨ調整剤、紫外線吸収剤、等張化剤、酸化防止剤、防腐剤、界面活性剤、着色剤、香料、甘味料などが例示できる。剤形も特に制限されず、経口または非経口の任意の形態に製剤化され得るが、例えば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、溶液剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、乳剤、シロップ剤、注射剤、外用剤（例えば、軟膏、クリーム剤、ゲル、噴霧剤、貼付剤、ローションなど）、坐剤等が例示できる。投与経路も特に制限されず、経口、経腸経鼻、経皮投与、注射投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉投与、腹腔内投与など）等を含む全ての投与経路が利用できる。このほか、洗顔料、シャンプー、リンス、化粧料等の形態でもよい。製剤中の有効成分の含量は、例えば、０．０１〜９０重量％であり、好ましくは１〜１０重量％である。
【００３１】
皮脂量増加剤およびヒアルロン酸産生促進剤の最適な投与量は患者の年齢、体重、性別、症状、投与方法等に応じて異なるが、例えば、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、０．１μｇ〜１０００ｍｇの割合で、好ましくは１０μｇ〜５０ｍｇの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。固体状、半固体状、液状、懸濁液状、ゲル状、糊状、粉末状、顆粒状等、公知の形態の食品に有効成分を配合して投与してもよい。
【００３２】
本発明にかかる皮脂量増加剤およびヒアルロン酸産生促進剤が投与される対象は、ヒトまたは非ヒト動物のいずれであってもよく、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、ヒツジを含む哺乳動物、鳥類であるが、好ましくはヒトである。
【実施例】
【００３３】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。【００３４】
＜製造例１：阿膠（真空）＞
ロバの皮を水で洗浄した後に剃毛し、ロバの皮５０ｇに対して２００ｍｌの熱水（９５℃）中で８時間抽出した。熱水抽出は３回繰り返した。抽出液をフイルタでろ過した後、合一し、１００ｍｌの抽出液に対して０．２ｍｌの０．４重量％エタノール水溶液、０．２ｇのショ糖、および０．２ｇの大豆油を添加し、遠心濃縮機にて２〜３倍程度まで濃縮して、ロバの皮の熱水抽出物を得た。その後、９５℃で３０分間加熱殺菌した熱水抽出物を真空乾燥機（機種名ＢＶＤ２０５、温州金榜社製、真空度０．６ｋＰａ、乾燥温度８５℃）にて水分含量５．５重量％まで乾燥させた。乾燥物を粉砕機にて粒径１０００μｍ以下に粉砕し、試料（阿膠（真空））とした。【００３５】
＜製造例２：スプレー阿膠＞
上記と同様に加熱殺菌した熱水抽出物を、スプレードライ装置（機種名ＬＰＧ−２００、河南新郷社製、乾燥入口温度（吸気温度）１５０℃、乾燥出口温度（排気温度）８５℃）にて乾燥し、平均粒径５００μｍ、水分含量４．５重量％の乾燥物として、試料（スプレー阿膠）を得た。なお、平均粒径は粒度分析器にて測定した。【００３６】
＜実施例１：皮脂量増加剤＞
上記の製造例１および２で調製した試料を用いて、皮脂量増加効果を検証した。【００３７】
（実験方法）
ハムスター脂腺細胞を、阿膠（真空）（０．５〜５ｍｇ／ｍｌ）、スプレー阿膠（０．５〜５ｍｇ／ｍｌ）、インスリン（１０ｎＭ、陽性対照）、魚由来ペプチド（ペプチドＦＰＣ、株式会社ニッピより購入）（０．５〜５ｍｇ／ｍｌ）、ブタ由来ペプチド（ＰＲＡ−ＰＣ、株式会社ニッピより購入）（０．５〜５ｍｇ／ｍｌ）または変性コラーゲン（ゼラチン、ＢＤバイオサイエンス社）（０．５〜１ｍｇ／ｍｌ）の存在下で３日ごとに培地交換を行い、６日間培養した。なお、ハムスター脂腺細胞の培養は、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００１：  １１７：  ９６５−９７０．に記載の方法に従い、ＳＥＢ培地（ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ１２（１：１（ｖ／ｖ））（インビトロジェン）、６％（ｖ／ｖ）熱変性ウシ胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス）、２％（ｖ／ｖ）ヒト血清（ＩＣＮバイオケミカルズ）、０．６８ｍＭ  Ｌ−グルタミン（インビトロジェン））を用い、試料の終濃度が上記となるように培地に添加し、３７℃にて行った。なお、細胞の培養はＣＯ２インキュベーター（５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２）内で行った。【００３８】
培養後、細胞内に蓄積したトリアシルグリセロール（ＴＧ）をアクアオートカイノスＴＧ−ＩＩ（株式会社カイノス）によって測定した。別途、ＴＧの蓄積量の測定に用いた細胞ライセート中のＤＮＡ量を、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９８２：  １６２：  ３３８−３４４．（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｉｎｔ  Ｂ，  Ｈｏｌｌｉｓ  Ｓ．  Ａ  ｒａｐｉｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｍｂｅｒ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８２：  １２２（２）：  ３３８−３４４．）に記載の方法によって求め、単位ＤＮＡ量当たりの細胞内ＴＧ量を算出した。【００３９】
（結果）
図１に示す通り、阿膠（真空）（０．５〜５ｍｇ／ｍｌ）およびスプレー阿膠（０．５〜５ｍｇ／ｍｌ）は、濃度依存的にＴＧ合成を促進した。また、阿膠によるＴＧ合成促進作用は、スプレー阿膠よりも阿膠（真空）の方が強かった。【００４０】
一方、魚もしくはブタ由来ペプチド、または変性コラーゲン（ゼラチン）には、ＴＧ合成促進作用は認められなかった（図１）。したがって、阿膠によるＴＧ合成促進は、コラーゲンペプチドや変性コラーゲンとは異なる成分による作用であるものと推測される。【００４１】
培養後のハムスター脂腺細胞を、オイルレッドＯにより細胞内に蓄積した中性脂肪を染色した。図２に示す通り、阿膠（真空）（０．５〜５ｍｇ／ｍｌ）およびスプレー阿膠（０．５〜５ｍｇ／ｍｌ）で処理したハムスター脂腺細胞において、オイルレッドＯ染色陽性の細胞数が、阿膠の濃度依存的に増加した。【００４２】
＜実施例２：ヒアルロン酸産生促進剤＞
上記の製造例１および２で調製した試料を用いて、ヒアルロン酸産生促進効果を検証した。【００４３】
（実験方法）
正常ヒト表皮角化細胞（新生児由来、クラボウ社）を２４ウェルプレートにてコンフルエントまで培養後、阿膠（真空）（０．１〜１ｍｇ／ｍｌ）またはスプレー阿膠（０．５〜５ｍｇ／ｍｌ）の存在下で２４時間培養した。なお、ヒト表皮細胞の培養には、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（クラボウ社）を用い、ＣＯ２インキュベーター（５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２）内で３７℃で行った。また、紫外線照射試験は、細胞にＵＶＢ（３１３ｎｍ、Ｔｏｓｈｉｂａ  ＦＬ  ２０Ｓ蛍光ランプ、０．６ｋＪ／ｍ２）を照射した後に、スプレー阿膠（５ｍｇ／ｍｌ）存在下で２４時間培養した。【００４４】
培養後の培地を回収し、Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  ＥＬＩＳＡ  Ａｓｓａｙキット（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｔｒａｄｉｎｇ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ社）により培地に含まれるヒアルロン酸（ＨＡ）含量を測定した。【００４５】
培養後に回収した細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン）を用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡを試料として、定量ＰＣＲ法（測定機器名：Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＤｉｃｅＴＭ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，タカラバイオ株式会社）によりヒアルロン酸合成酵素−２（ＨＡＳ−２）ｍＲＮＡの発現量を測定した。なお、定量ＰＣＲ法によるｍＲＮＡの測定には、測定試薬としてＰｒｉｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社），２  ｘ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （キアゲン社）を用いて行った。ＨＡＳ−２  ｍＲＮＡの発現量は、内部標準遺伝子のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの発現量により補正した相対値として算出した。【００４６】
（結果）
図３に示す通り、阿膠（真空）（０．１〜１ｍｇ／ｍｌ）およびスプレー阿膠（０．５〜５ｍｇ／ｍｌ）は、濃度依存的にＨＡ産生を促進した。阿膠によるＨＡ産生促進効果は、より生体に近いＩＬ−１α（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下でも確認され、阿膠（真空）よりもスプレー阿膠の方がヒアルロン酸分泌量は多かった。また、図４に示す通り、スプレー阿膠により、ヒト表皮細胞におけるＨＡＳ−２  ｍＲＮＡの発現が促進された。したがって、阿膠によるＨＡ産生の促進の一因としては、ＨＡＳ−２  ｍＲＮＡの発現増加を介して行われると推測される。【００４７】
阿膠はロバの皮の熱水抽出物（煎出物）であるため、ヒアルロン酸を含有する。阿膠（真空）またはスプレー阿膠を溶解させた新鮮培地にもＨＡが存在していた（図５Ａ）。図３および４における効果が阿膠に内在するＨＡによるものであるかを検討するため、スプレー阿膠溶液（５ｍｇ／ｍｌ、  ５０ｍＭ酢酸／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ６）で溶解）をヒアルロニダーゼ（１００ＲＴＵ／ｍｌ）にて３７℃で一晩酵素処理した。酵素処理後、１００℃の沸騰水浴において３０分間加熱して酵素を失活させた。ヒアルロニダーゼ処理したスプレー阿膠溶液では、ＨＡは検出されなかった（図５Ｂ）。なお、対照群としては、ヒアルロニダーゼ溶液に代えて同容量の溶媒（ｄＨ２Ｏ）またはバッファー（５０ｍＭ酢酸／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ６））を添加して同様に処理し、ＨＡを測定した（図５Ｂ）。【００４８】
上記のように調製したスプレー阿膠のヒアルロニダーゼ処理物を含む培地にて、ヒト表皮細胞を２４時間培養した。培養後のヒト表皮細胞におけるＨＡＳ−２  ｍＲＮＡの発現量を測定した。その結果、ヒアルロニダーゼ処理物も、ＨＡＳ−２  ｍＲＮＡの発現促進作用を有していた（図６）。【００４９】
紫外線照射によりダメージを与えたヒト表皮細胞に対する阿膠の効果を確認した（図７）。ＵＶＢ（０．６ｋＪ／ｍ２）照射によりＨＡ産生量が低下したが、スプレー阿膠処理によってＨＡ産生が促進された。【００５０】
本出願は、２０１６年７月２１日に出願された日本国特許出願第２０１６−１４３３８２号に基づいており、その開示内容は、参照により全体として引用されている。
【図１】
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【図２】
2018016631.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2018016631.tif 000011
2018016631.tif 000012
2018016631.tif 000013