(57)【要約】  本発明は、組換えタンパク質の還元が抑制された細胞株を選抜する方法を提供することを目的とする。本発明は、第１工程：配列番号１〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子の細胞内の当該遺伝子の発現レベルを測定する工程、および第２工程：前記第１工程において測定した前記遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づき、組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルを評価する工程を含む、細胞を選抜する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の第１工程および第２工程を含む、細胞を選抜する方法。
第１工程：配列番号１〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子について、細胞内の当該遺伝子の発現レベルを測定する工程
第２工程：前記第１工程において測定した前記遺伝子の発現レベルを、対照細胞における前記遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づき、組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルを評価する工程
【請求項２】
以下の第１工程および第２工程を含む、細胞を選抜する方法。
第１工程：配列番号１〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを測定する工程
第２工程：前記第１工程において測定した前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを、対照細胞における前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づき、組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルを評価する工程
【請求項３】
以下の第１工程および第２工程を含む、細胞を選抜する方法。
第１工程：配列番号１〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子について、細胞内の当該遺伝子の発現レベルを測定する工程
第２工程：以下に示す（ａ）〜（ｄ）の手順に相対発現量を算出及び比較し、細胞を選抜する工程；
（ａ）第１工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子の発現レベルを、当該被験細胞中の標準遺伝子の発現レベルで除した相対定量値を算出する。
相対定量値＝（第１工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子の発現レベル）／（標準遺伝子の発現レベル）
（ｂ）対照細胞についての前記遺伝子の発現レベルを、当該対照細胞における標準遺伝子の発現レベルを除して対照値を算出する。
対照値＝（対照細胞についての前記遺伝子の発現レベル）／（標準遺伝子の発現レベル）
（ｃ）（ａ）において算出した被験細胞についての相対定量値を、（ｂ）において算出した対照値で除した相対発現量を算出する。
相対発現量＝［（ａ）において算出した被験細胞についての相対定量値］／［（ｂ）において算出した対照値］
（ｄ）各被験細胞間において、（ａ）で算出した相対定量値、又は（ｃ）で算出した相対発現量、を比較することにより、それぞれの値が高い又は低い細胞を選抜する。
【請求項４】
第２工程（ｄ）において、相対定量値若しくは相対発現量が高い細胞としては、その相対定量値若しくは相対発現量が対照値の２倍以上の細胞であり、又は、相対定量値若しくは相対発現量が低い細胞としては、その相対定量値若しくは相対発現量が対照値の１／２倍以下の細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１工程の前に、配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を細胞でノックダウン又はノックアウトする工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第１工程の前に、組換えタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入し、形質転換する工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により細胞を選抜する工程を含む、組換えタンパク質を生産する細胞を取得する方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により選抜または取得された細胞または細胞を用いて組換えタンパク質を生産する方法。
【請求項９】
前記細胞が哺乳類動物細胞由来の細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子がＰｌｅｔ１遺伝子である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換えタンパク質が抗体である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子がノックダウン又はノックアウトされた、組換えタンパク質の還元を抑制し得る細胞。
【請求項１３】
配列番号１〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を指標とすることにより、組換えタンパク質の還元を抑制し得る細胞の取得確率を上げる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を選抜する方法に関し、より詳しくは組換えタンパク質の還元を抑制し得る細胞を選抜する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子組換え技術の発展に伴い、抗体を初めとするバイオ医薬品が広く供給されるようになっている。これらバイオ医薬品は、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞などの宿主細胞に、組換えタンパク質（以下、同じ細胞から内在性遺伝子に基づき翻訳され分泌されるタンパク質と区別するために、「目的タンパク質」とも言う）をコードする塩基配列を含む発現ベクターを導入することにより作製された生産細胞を用いて製造される。【０００３】
バイオ医薬品（タンパク質医薬品）の製造工程として、一般的に用いられている工程では、まず、生産細胞を適切な条件で培養し、培養液中に目的タンパク質を分泌させる。目的タンパク質を含む培養液は、不要となった生産細胞が除去された後、精製に供される。【０００４】
しかし、精製前の当該培養液中には、目的タンパク質以外にも生産細胞由来の様々な酵素活性を持つタンパク質が多数存在するため、それらの活性により、目的タンパク質が分解又は変性する場合がある。また、目的タンパク質を含む培養液を精製したとしても、その精製度によっては、生産細胞由来のタンパク質が残存することで、目的タンパク質が分解又は変性することがある。【０００５】
目的タンパク質が分解又は変性する原因の一つとして、生産細胞に内在するチオレドキシンレダクターゼなどの還元作用が知られている。具体的には、タンパク質に含まれるジスルフィド結合がチオレドキシンレダクターゼに還元されることにより、当該タンパク質の活性の発現に必要な高次構造が失われることが挙げられる（非特許文献１）。【０００６】
目的タンパク質の分解又は変性を引き起こす、この還元作用を抑制するため、培養液へのチオレドキシンレダクターゼ阻害剤又は酸化剤の添加、培養液に対する空気散布等を製造工程に組み込むことが試みられている（特許文献１、非特許文献２、３）。【０００７】
また、還元作用が抑制された生産細胞の樹立を目的に、チオレドキシンレダクターゼ遺伝子をノックダウンした細胞を用いたタンパク質の生産が試みられている。しかしながら、当該遺伝子に着目した生産細胞の樹立は、ノックダウンにより生産細胞の生育が著しく低下するなどの問題があり実用化には至っていない（非特許文献４）。【０００８】
さらに、還元作用が抑制された生産細胞を選抜する場合、現状では、製造工程を模した還元作用の評価（非特許文献１）以外の方法は知られておらず、多数の細胞を評価し、選抜するのは容易ではない。  【０００９】
以上のように、目的タンパク質の分解又は変性を引き起こす、還元作用を抑制するため、培養以降の製造工程を対象とした手法が多く提案されている一方で、宿主細胞や遺伝子組換え細胞の改良又は選抜などの生産細胞自体の樹立工程に着目した手法は、現状では僅少である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】日本国特開２０１４−１２９３５８号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６２２−６３２，７（４），２０１０
【００１２】
【非特許文献２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４５２−４６１，１０６（３），２０１０
【００１３】
【非特許文献３】Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７３４−７４２，１１２（４），２０１５
【００１４】
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２６１−２６７，１５７，２０１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述したように、組換え宿主細胞を用いてタンパク質を生産するには、目的タンパク質の分解や変性が起こらない細胞、その中でも特に、目的タンパク質の還元が起こらない細胞を生産に使用することが望まれている。【００１６】
したがって、本発明は、組換えタンパク質（目的タンパク質）に対する還元作用が抑制された細胞を選抜する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、驚くべきことに、目的タンパク質の分解又は変性を引き起こす還元作用は、細胞ごとに強さが異なることを見出した。そして、これまで、この還元作用との関連が全く示唆されていなかった遺伝子群を特定し、当該遺伝子の発現量と細胞の還元作用の間に相関を見出した。さらに、当該遺伝子の発現又は当該遺伝子がコードするタンパク質の発現量を指標に、細胞を選抜することで、その細胞を用いて目的タンパク質を生産したときに、その目的タンパク質に対する還元作用を抑制し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１８】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１５］に関する。
［１］以下の第１工程および第２工程を含む、細胞を選抜する方法。
第１工程：配列番号１〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子について、細胞内の当該遺伝子の発現レベルを測定する工程
第２工程：前記第１工程において測定した前記遺伝子の発現レベルを、対照細胞における前記遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、又は、それぞれの細胞における前記遺伝子の発現レベルを比較し、その差異に基づき、組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルを評価する工程
［２］以下の第１工程および第２工程を含む、細胞を選抜する方法。
第１工程：配列番号１〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを測定する工程
第２工程：前記第１工程において測定した前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを、対照細胞における前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルの対照値と比較し、又は、それぞれの細胞における前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを比較し、その差異に基づき、組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルを評価する工程
［３］以下の第１工程および第２工程を含む、細胞を選抜する方法。
第１工程：配列番号１〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子について、細胞内の当該遺伝子の発現レベルを測定する工程
第２工程：以下に示す（ａ）〜（ｄ）の手順に相対発現量を算出及び比較し、細胞を選抜する工程；
（ａ）第１工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子の発現レベルを、当該被験細胞中の標準遺伝子の発現レベルで除した相対定量値を算出する。
相対定量値＝（第１工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子の発現レベル）／（標準遺伝子の発現レベル）
（ｂ）対照細胞についての前記遺伝子の発現レベルを、当該対照細胞における標準遺伝子の発現レベルを除して対照値を算出する。
対照値＝（対照細胞についての前記遺伝子の発現レベル）／（標準遺伝子の発現レベル）
（ｃ）（ａ）において算出した被験細胞についての相対定量値を、（ｂ）において算出した対照値で除した相対発現量を算出する。
相対発現量＝［（ａ）において算出した被験細胞についての相対定量値］／［（ｂ）において算出した対照値］
（ｄ）各被験細胞間において、（ａ）で算出した相対定量値、又は（ｃ）で算出した相対発現量、を比較することにより、それぞれの値が高い又は低い細胞を選抜する。
［４］第２工程（ｄ）において、相対定量値若しくは相対発現量が高い細胞としては、その相対定量値若しくは相対発現量が対照値の２倍以上の細胞であり、又は、相対定量値若しくは相対発現量が低い細胞としては、その相対定量値若しくは相対発現量が対照値の１／２倍以下の細胞である、［３］に記載の方法。
［５］第１工程の前に、配列番号１〜９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を細胞に導入し、形質転換する工程を含む、［１］〜［４］のいずれか１に記載の方法。
［６］第１工程の前に、配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を細胞でノックダウン又はノックアウトする工程を含む、［１］〜［５］のいずれか１に記載の方法。
［７］第１工程の前に、組換えタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入し、形質転換する工程を含む、［１］〜［６］のいずれか１に記載の方法。
［８］［１］〜［７］のいずれか１に記載の方法により細胞を選抜する工程を含む、組換えタンパク質を生産する細胞を取得する方法。
［９］［１］〜［８］のいずれか１に記載の方法により選抜または取得された細胞または細胞を用いて組換えタンパク質を生産する方法。
［１０］前記細胞が哺乳類動物細胞由来の細胞である、［１］〜［９］のいずれか１に記載の方法。
［１１］前記遺伝子がＰｌｅｔ１遺伝子である、［１］〜［１０］のいずれか１に記載の方法。
［１２］前記組換えタンパク質が抗体である［１］〜［１１］のいずれか１に記載の方法。
［１３］配列番号１〜９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子が導入されて形質転換された、組換えタンパク質の還元を抑制し得る細胞。
［１４］配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子がノックダウン又はノックアウトされた、組換えタンパク質の還元を抑制し得る細胞。
［１５］配列番号１〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を指標とすることにより、組換えタンパク質の還元を抑制し得る細胞の取得確率を上げる方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法によれば、遺伝子組換えを行った細胞集団の中から、目的タンパク質に対する還元作用が抑制された細胞を高い確率で、かつ容易に選抜することが出来る。タンパク質の生産性など還元感受性以外の指標の評価と組み合わせることにより、医薬品を製造する上で望ましい特性を備えた遺伝子組換えタンパク質の生産細胞を、効率的に選抜することが出来る。【００２０】
さらに、本発明の方法によれば、目的タンパク質に対する還元作用が抑制された細胞を得ることができる。この細胞を使用すれば、目的タンパク質に対する還元作用が抑制された、目的タンパク質の生産細胞を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、Ａ＃１株が生産する抗体が還元せずｗｈｏｌｅの抗体のまま安定に存在すること、及び、Ａ＃２株が生産する抗体が還元により経時的に分解されていることを示すキャピラリー電気泳動の結果を示す図である。
【図２】図２は、抗体Ｃ生産細胞の８０日間の継代培養期間におけるＰｌｅｔ１遺伝子の相対発現量の推移を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の第１実施形態は、以下の第１工程および第２工程を含む、組換えタンパク質（目的タンパク質）に対する還元作用が抑制された細胞を選抜する方法である。
第１工程：配列番号１〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子について、細胞内の当該遺伝子の発現レベルを測定する工程
第２工程：前記第１工程において測定した前記遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づき、組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルを評価する工程
【００２３】
本発明者らは、抗体を産生する細胞において、抗体が還元されにくい細胞と抗体が還元されやすい細胞とをマイクロアレイを用いた遺伝子発現差解析により比較し、細胞内における配列番号１〜１６に示す塩基配列を有する遺伝子の発現量が、抗体が還元されにくい細胞と還元されやすい細胞で大きく異なることを見出した。
【００２４】
配列番号１〜１６に示される塩基配列は、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ、又はＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に登録されている塩基配列であり、これらのいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子は、ＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘのＷｅｂページ（https://www.affymetrix.com/analysis/netaffx/xmlquery_ex.affx?netaffx=wtgene_transcript）、又はＮＣＢＩのＷｅｂページ（URL;http://www.ncbi.nlm.nih.gov）から、遺伝子名や部分配列を元にデータベースを検索することによって入手することができる。ＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘのＷｅｂページでは、ＩＤ：１８０８３２３９として登録されている。なお、「オーソログな遺伝子」とは、異なる生物に存在する相同な機能を有するタンパク質をコードする類縁遺伝子をいう。
【００２５】
配列番号１、４、７、８および１０〜１６に示される塩基配列は、それぞれＰｌｅｔ１遺伝子、マトリリン４遺伝子、Ｇタンパク質結合受容体１３３遺伝子、テナスシンＣ遺伝子、コラーゲンアルファ１（ＩＩＩ）鎖遺伝子、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼアルファ−３遺伝子、カルシウム／カルモジュリン依存３’，５’環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ１Ｃ遺伝子、炭疽毒素受容体１遺伝子、ガストロキン１遺伝子、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー９遺伝子又はＶＩ型コラーゲンα２遺伝子の塩基配列である。
【００２６】
「Ｐｌｅｔ１遺伝子」とは、Ｐｌｅｔ１をコードする遺伝子を意味する。Ｐｌｅｔ１は、胎盤で発現するｐｌａｃｅｎｔａ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  １  ｐｒｏｔｅｉｎであり、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。Ｐｌｅｔ１は各種の哺乳類動物に存在しており、種々の哺乳類動物由来のＰｌｅｔ１をコードする遺伝子を使用することができるが、宿主細胞として用いる細胞が由来する哺乳類動物のものを使用することが好ましい。Ｐｌｅｔ１遺伝子としては、例えば、配列番号１に示される塩基配列を有するチャイニーズハムスターのＰｌｅｔ１遺伝子が挙げられる。
【００２７】
「マトリリン４遺伝子」とは、ｍａｔｒｉｌｉｎ  ４（Ｍａｔｎ４）をコードする遺伝子を意味する。マトリリン４は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。マトリリン４は各種の哺乳類動物に存在しており、種々の哺乳類動物由来のマトリリン４をコードする遺伝子を使用することができるが、宿主細胞として用いる細胞が由来する哺乳類動物のものを使用することが好ましい。マトリリン４遺伝子としては、例えば、配列番号４に示される塩基配列を有するチャイニーズハムスターのマトリリン４遺伝子が挙げられる。
【００２８】
「Ｇタンパク質結合受容体１３３遺伝子」とは、Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １３３をコードする遺伝子を意味する。Ｇタンパク質結合受容体１３３遺伝子は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。Ｇタンパク質結合受容体１３３遺伝子は各種の哺乳類動物に存在しており、種々の哺乳類動物由来のＧタンパク質結合受容体１３３遺伝子をコードする遺伝子を使用することができるが、宿主細胞として用いる細胞が由来する哺乳類動物のものを使用することが好ましい。Ｇタンパク質結合受容体１３３遺伝子としては、例えば、配列番号７に示される塩基配列を有するチャイニーズハムスターのＧタンパク質結合受容体１３３遺伝子が挙げられる。
【００２９】
「テナスシンＣ遺伝子」とは、ｔｅｎａｓｃｉｎ  Ｃをコードする遺伝子を意味する。テナスシンＣは、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。テナスシンＣは各種の哺乳類動物に存在しており、種々の哺乳類動物由来のテナスシンＣをコードする遺伝子を使用することができるが、宿主細胞として用いる細胞が由来する哺乳類動物のものを使用することが好ましい。テナスシンＣ遺伝子としては、例えば、配列番号８に示される塩基配列を有するチャイニーズハムスターのテナスシンＣ遺伝子が挙げられる。
【００３０】
「コラーゲンアルファ−１（ＩＩＩ）鎖遺伝子」とは、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｌｐｈａ−１（ＩＩＩ）  ｃｈａｉｎをコードする遺伝子を意味する。コラーゲンアルファ−１（ＩＩＩ）鎖は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。コラーゲンアルファ−１（ＩＩＩ）は各種の哺乳類動物に存在しており、種々の哺乳類動物由来のコラーゲンアルファ−１（ＩＩＩ）をコードする遺伝子を使用することができるが、宿主細胞として用いる細胞が由来する哺乳類動物のものを使用することが好ましい。コラーゲンアルファ−１（ＩＩＩ）鎖遺伝子としては、例えば、配列番号１０に示される塩基配列を有するチャイニーズハムスターのコラーゲンアルファ−１（ＩＩＩ）鎖遺伝子が挙げられる。
【００３１】
「グルタチオンＳ−トランスフェラーゼアルファ−３遺伝子」とは、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｌｐｈａ−３をコードする遺伝子を意味する。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼアルファ−３は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼアルファ−３は各種の哺乳類動物に存在しており、種々の哺乳類動物由来のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼアルファ−３をコードする遺伝子を使用することができるが、宿主細胞として用いる細胞が由来する哺乳類動物のものを使用することが好ましい。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼアルファ−３遺伝子としては、例えば、配列番号１１に示される塩基配列を有するチャイニーズハムスターのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼアルファ−３遺伝子が挙げられる。
【００３２】
「カルシウム／カルモジュリン依存３’，５’環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ１Ｃ遺伝子」とは、ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  １Ｃをコードする遺伝子を意味する。カルシウム／カルモジュリン依存３’，５’環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ１Ｃは、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。カルシウム／カルモジュリン依存３’，５’環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ１Ｃは各種の哺乳類動物に存在しており、種々の哺乳類動物由来のカルシウム／カルモジュリン依存３’，５’環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ１Ｃをコードする遺伝子を使用することができるが、宿主細胞として用いる細胞が由来する哺乳類動物のものを使用することが好ましい。カルシウム／カルモジュリン依存３’，５’環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ１Ｃ遺伝子としては、例えば、配列番号１２に示される塩基配列を有するチャイニーズハムスターのカルシウム／カルモジュリン依存３’，５’環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ１Ｃ遺伝子が挙げられる。
【００３３】
「炭疽毒素受容体１遺伝子」とは、ａｎｔｈｒａｘ  ｔｏｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １をコードする遺伝子を意味する。炭疽毒素受容体１は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。炭疽毒素受容体１は各種の哺乳類動物に存在しており、種々の哺乳類動物由来の炭疽毒素受容体１をコードする遺伝子を使用することができるが、宿主細胞として用いる細胞が由来する哺乳類動物のものを使用することが好ましい。炭疽毒素受容体１遺伝子としては、例えば、配列番号１３に示される塩基配列を有するチャイニーズハムスターの炭疽毒素受容体１遺伝子が挙げられる。
【００３４】
「ガストロキン１遺伝子」とは、ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ−１をコードする遺伝子を意味する。ガストロキン１は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ガストロキン１は各種の哺乳類動物に存在しており、種々の哺乳類動物由来のガストロキン１をコードする遺伝子を使用することができるが、宿主細胞として用いる細胞が由来する哺乳類動物のものを使用することが好ましい。ガストロキン１遺伝子としては、例えば、配列番号１４に示される塩基配列を有するチャイニーズハムスターのガストロキン１遺伝子が挙げられる。
【００３５】
「腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー９遺伝子」とは、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ９をコードする遺伝子を意味する。腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー９は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー９は各種の哺乳類動物に存在しており、種々の哺乳類動物由来の腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー９をコードする遺伝子を使用することができるが、宿主細胞として用いる細胞が由来する哺乳類動物のものを使用することが好ましい。腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー９遺伝子としては、例えば、配列番号１５に示される塩基配列を有するチャイニーズハムスターの腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー９遺伝子が挙げられる。
【００３６】
「ＶＩ型コラーゲンα２遺伝子」とは、ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  ＶＩ，ａｌｐｈａ２をコードする遺伝子を意味する。ＶＩ型コラーゲンα２は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＶＩ型コラーゲンα２は各種の哺乳類動物に存在しており、種々の哺乳類動物由来のＶＩ型コラーゲンα２をコードする遺伝子を使用することができるが、宿主細胞として用いる細胞が由来する哺乳類動物のものを使用することが好ましい。ＶＩ型コラーゲンα２遺伝子としては、例えば、配列番号１６に示される塩基配列を有するチャイニーズハムスターのＶＩ型コラーゲンα２遺伝子が挙げられる。
【００３７】
上記遺伝子の中でも、本発明においては、Ｐｌｅｔ１［Ｐｌａｃｅｎｔａ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｒｉｐｔ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＤ：１８０８３２３９）］遺伝子の発現レベルの差異を指標として用いて、組換えタンパク質の還元を抑制し得る該細胞の能力を評価することが好ましい。なお、本明細書において、「ＩＤ」はＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社のＷｅｂページ（https://www.affymetrix.com/analysis/netaffx/xmlquery_ex.affx?netaffx=wtgene_transcript）における登録番号を示す。
【００３８】
以下、本明細書においては、上記遺伝子のうち、主にＰｌｅｔ１遺伝子を用いて本発明を説明するが、本発明は、Ｐｌｅｔ１遺伝子を用いるものに限定されず、上記の遺伝子のいずれも使用可能である。また、表２に列挙したように、ＩＤがそれぞれ１７９５２７９３、１７９５２７９５、１７９５７３１４、１７９５８２０７、及び１８０２４９６２に相当する、配列番号２、３、５、６及び９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子も使用可能である。
【００３９】
本発明において、タンパク質の分解・変性とは、タンパク質の構造が化学的にまたは酵素的に影響を受け、共有結合や非共有結合が切断され、タンパク質を構成するサブユニット、タンパク質断片、ポリペプチド断片、アミノ酸等に分離することや、タンパク質の二次構造、三次構造、四次構造が天然に存在する状態から変化すること、会合・凝集や解離を生じることである。
【００４０】
本発明において、還元とは、タンパク質の分解又は変性を引き起こす原因の一つであり、例えば、タンパク質の分子内若しくは分子間に架橋されている複数のあるいは１か所以上のジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）が乖離し、遊離したスルフヒドリル基（−ＳＨ基）が複数あるいは１か所以上生じることをいう。
【００４１】
タンパク質の還元は、例えば、細胞内に存在するオキシドレダクターゼが細胞から遊離するなどしてタンパク質を還元させることにより生じる。オキシドレダクターゼとしては、例えば、デヒドロゲナーゼ類、シトクロム類、カタラーゼ類、オキシダーゼ類、オキシゲナーゼ類、脂肪酸不飽和化酵素類などが挙げられる。その中でもチオレドキシンレダクターゼはタンパク質の還元による分解に大きく関与していると考えられる。
【００４２】
本発明は特に、タンパク質の分子内若しくは分子間にジスルフィド結合を有するタンパク質に適用することができる。当該ジスルフィド結合はタンパク質の分子内若しくは分子間に１か所以上あればよい。また、分子間のジスルフィド結合の場合、結合されるタンパク質は同じでも異なっていてもよい。
【００４３】
ジスルフィド結合を分子内及び分子間に保有するタンパク質としては、例えば、抗体（例えば、ＩｇＧ１〜４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ）、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等が挙げられる。
【００４４】
本発明において、還元又は還元作用の抑制とは、上述のタンパク質の還元を抑制することをいう。特に、組換えタンパク質においては、細胞により生産された組換えタンパク質をＮａｔｉｖｅな形態、例えば、ジスルフィド結合が適正な部位に形成された状態で維持することをいう。
【００４５】
本発明において、タンパク質の還元されやすさは、目的とするタンパク質の生産細胞を破砕し、無酸素条件下でインキュベートした細胞破砕液から経時的に溶液を採取し、次いで、採取した破砕液中に含まれる生産されたタンパク質の分子量を電気泳動、キャピラリー電気泳動、ゲルろ過ＨＰＬＣ、ペプチドマップなどにより測定することにより決定することができる。すなわち、生産されたタンパク質が分解されやすい場合は、タンパク質の分子量が小さくなるので、これを電気泳動等の理化学的な手法により測定し、還元されやすさの指標とすることができる。
【００４６】
なお、抗体のように立体構造を有するタンパク質は還元しても立体構造が維持されるため、通常のゲルろ過ＨＰＬＣ等の分析方法では還元による分解を検出できない。このような場合は、還元により遊離したチオール基についてアルキル化等の処理を行い、タンパク質を変性したうえで上記分析にかけることで、還元を検出することができる。
【００４７】
本発明で用いられる細胞としては、組換えタンパク質を発現する能力を有する細胞であれば特に限定されない。例えば、組換えタンパク質の産生に一般的に用いられるチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ベビーハムスターキドニー細胞（ＢＨＫ）、ヒト細胞（ＨＴ１０８０繊維肉腫細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６）、マウスミエローマ細胞（ＮＳ０、ＳＰ２／０）、または、イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来細胞（ＭＤＣＫ）のような哺乳類由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サルまたはブタなどの動物由来の細胞を使用してもよい。また、ＣＨＯ細胞としては、ＣＨＯ−Ｋ１株、ＣＨＯ−ＤＧ４４株、ＣＨＯ−Ｓ株、ＤＵＫＸ−Ｂ１１株などの亜株を用いてもよい。
【００４８】
本発明において、「組換えタンパク質」とは、当該組換えタンパク質をコードする遺伝子を組換えＤＮＡ技術によって適切な発現ベクターに挿入し、これを用いて細胞を形質転換して得るためのタンパク質を意味する。本発明において用いられる組換えタンパク質としては、例えば、抗体、既に医薬品として使用又は開発されている様々なペプチドやタンパク質、または、サイトカイン等が挙げられる。
【００４９】
前記細胞及び形質転換して得られた細胞を培養するための培地としては、上述したような細胞及び形質転換して得られた細胞を培養するために通常に用いられる培地が用いられる。このような培地としては、例えば、ＩＭＤＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地、ＥＸ−ＣＥＬＬシリーズ培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯシリーズ培地（ＪＸ）、その他の動物細胞用に開発された市販培地または特注培地が挙げられる。
【００５０】
前記培地には、ウシ胎仔血清が添加してもよいが、無血清培地を使用することもできる。ウシ胎仔血清を添加する場合、その濃度は５〜２０％程度であることが好ましい。また、前記培地にはアミノ酸、ビタミン類、糖類、大豆加水分解物、酵母抽出物、微量金属など様々な成分を適当な割合で混合して使用することができる。
【００５１】
第１実施形態では、第１工程において、被験細胞内の前記遺伝子（配列番号１〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子）の発現レベルを測定する。発現レベルを測定する遺伝子として、好ましくはＰｌｅｔ１である。
【００５２】
前記遺伝子の発現レベルの測定方法としては特に限定されないが、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）法、ＮＧＳを用いたＲＮＡ−ｓｅｑによる発現差解析、ＤＮＡマイクロアレイを用いた発現差解析、ノーザンブロッティングまたはＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）等の方法が挙げられる。これらの中でも、ＲＴ−ｑＰＣＲ法は、迅速に測定できることから好ましい。ＲＴ−ｑＰＣＲ法については実施例の項で詳細に説明する。
【００５３】
第１実施形態では、第２工程において、前記第１工程において測定した前記遺伝子の発現レベルを、（ｉ）対照細胞における前記遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、又は、（ｉｉ）それぞれの細胞における前記遺伝子の発現レベルを比較し、その差異に基づき、組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルを評価する。
【００５４】
第１実施形態の第２工程における組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルの評価は、具体的には、例えば、以下に示す（ａ）〜（ｄ）の手順により行うことが好ましい。
（ａ）第１工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子の発現レベルを、当該被験細胞中の標準遺伝子の発現レベルで除した相対定量値を算出する。
相対定量値＝（第１工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子の発現レベル）／（標準遺伝子の発現レベル）
（ｂ）対照細胞についての前記遺伝子の発現レベルを、当該対照細胞における標準遺伝子の発現レベルを除して対照値を算出する。
対照値＝（対照細胞についての前記遺伝子の発現レベル）／（標準遺伝子の発現レベル）
（ｃ）（ａ）において算出した被験細胞についての相対定量値を、（ｂ）において算出した対照値で除した相対発現量を算出する。
相対発現量＝［（ａ）において算出した被験細胞についての相対定量値］／［（ｂ）において算出した対照値］
（ｄ）各被験細胞間において、（ａ）で算出した相対定量値、又は（ｃ）で算出した相対発現量、を比較することにより、それぞれの値が高い又は低い細胞を選抜する。
【００５５】
前記（ｄ）の手順は、以下に示す（ｄ−１）又は（ｄ−２）の手順により行うことがより好ましい。
（ｄ−１）各被験細胞間で（ａ）で算出した相対定量値を比較することにより、値が高い（配列番号１〜９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を用いた場合）又は低い（配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を用いた場合）細胞を選抜する。
（ｄ−２）各被験細胞間で（ｃ）で算出した相対発現量を比較することにより、値が高い（配列番号１〜９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を用いた場合）又は低い（配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を用いた場合）細胞を選抜する。
【００５６】
前記相対定量値の高い細胞としては、その相対定量値が、被験細胞の中で最も小さい値を示した細胞（対照細胞）の相対定量値（対照値ともいう）の２倍以上である細胞が挙げられ、例えば、５倍以上、７倍以上、１０倍以上、２０倍以上、２５倍以上、３０倍以上、５０倍以上、又は１００倍以上である細胞が挙げられる。
【００５７】
特に、前記相対定量値の高い細胞としては、その相対定量値が、前記対照値の好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは２０倍以上、さらにより好ましくは２５倍以上、一層より好ましくは３０倍以上、５０倍以上、最も好ましくは１００倍以上である細胞が挙げられる。
【００５８】
前記相対定量値の低い細胞としては、その相対定量値が、被験細胞の中で最も大きい値を示したもの（対照細胞）の相対定量値（対照値ともいう）の１／２倍以下である細胞が挙げられ、好ましくは１／５倍以下、より好ましくは１／１０倍以下、さらに好ましくは１／２０倍以下である細胞が挙げられる。
【００５９】
前記相対発現量の高い細胞としては、その相対発現量が、被験細胞の中で最も小さい値を示した細胞の相対発現量と比べて、２倍以上である細胞が挙げられ、例えば、５倍以上、７倍以上、１０倍以上、２０倍以上、２５倍以上、３０倍以上、５０倍以上、又は１００倍以上である細胞が挙げられる。
【００６０】
特に、前記相対発現量の高い細胞としては、その相対発現量が、被験細胞の中で最も小さい値を示した細胞の相対発現量と比べて、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは２０倍以上、さらにより好ましくは２５倍以上、一層より好ましくは３０倍以上、さらにより一層好ましくは５０倍以上、最も好ましくは１００倍以上である細胞が挙げられる。
【００６１】
前記相対発現量の低い細胞としては、その相対発現量が、被験細胞の中で最も大きい値を示した細胞の相対発現量の１／２倍以下である細胞が挙げられ、好ましくは１／５倍以下、より好ましくは１／１０倍以下、さらに好ましくは１／２０倍以下である細胞が挙げられる。
【００６２】
また、第１実施形態の第２工程における組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルの評価として、以下に示す（ｅ）〜（ｇ）の手順により行うこともできる。
（ｅ）第１工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子の発現レベルを、当該被験細胞中の標準遺伝子の発現レベルで除した相対定量値を算出する。
相対定量値＝（第１工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子の発現レベル）／（標準遺伝子の発現レベル）
（ｆ）（ｅ）において算出した被験細胞についての相対定量値を、他の細胞で同様に算出した相対定量値と比較する。
（ｇ）各被験細胞間で（ｅ）で算出した相対定量値を比較することにより、値が高い（配列番号１〜９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を用いた場合）又は低い（配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を用いた場合）細胞を選抜する。
【００６３】
前記標準遺伝子としては、細胞内で一般的に発現している遺伝子であれば特に制限なく使用でき、例えば、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ベータアクチン、ベータ２−マイクログロブリン、ＨＰＲＴ１（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １）、グロブリン、または、ユビキチン等が挙げられる。また、標準遺伝子の発現レベルの測定は、前記遺伝子の発現レベルと同様、ＲＴ−ｑＰＣＲ法等により実施することができる［Genome Biol.,1-11,3(7),2002］。好ましくはＧＡＰＤＨである。
【００６４】
前記対照細胞としては、例えば、組換えタンパク質が還元されやすい細胞が挙げられる。対照細胞は、第１工程において前記遺伝子の発現レベルを測定する細胞とサンプリング時点が異なる同じ細胞由来の試料を用いてもよいし、由来となる細胞が異なるものでもよい。また、対照細胞は、被験細胞の中から一つ選んでもよく、その場合、各被験細胞のうち、どれを選んでもよい。
【００６５】
具体的には、例えば、配列番号１〜９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を用いて評価する場合は、測定した各被験細胞の値の中で最も低い相対定量値を示した細胞を対照細胞とすれば、選抜すべき被験細胞との差異が大きくなることから、結果の解析が容易になる。
【００６６】
一方、配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を用いて評価する場合は、最も高い相対定量値を示した細胞を対照細胞とすれば、選抜すべき被験細胞との差異が大きくなることから、結果の解析が容易になる。
【００６７】
すなわち、前記対照細胞として好ましくは、配列番号１〜９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を用いる場合には相対定量値が最も低い細胞であり、配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を用いる場合には相対定量値が最も高い細胞である。
【００６８】
本発明の第２実施形態は、以下の第１工程および第２工程を含む、組換えタンパク質に対する還元作用が抑制された細胞を選抜する方法である。
第１工程：配列番号１〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを測定する工程
第２工程：前記第１工程において測定した前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを、対照細胞における前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルの対照値と比較し、又は、それぞれの細胞における前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを比較し、その差異に基づき、組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルを評価する工程
【００６９】
第２実施形態では、第１工程において、被験細胞において発現される、前記遺伝子（配列番号１〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子）がコードするタンパク質の発現レベルを測定する。発現レベルを測定するタンパク質として、好ましくはＰｌｅｔ１である。
【００７０】
前記タンパク質の発現レベルの測定方法としては特に限定されないが、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）またはＬＣ−ＭＳ等の方法が挙げられる。これらの中でも、ＥＬＩＳＡ法は、迅速に測定できることから好ましい。
【００７１】
第２実施形態では、第２工程において、前記第１工程において測定した前記遺伝子（配列番号１〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子）がコードするタンパク質の発現レベルを、（ｉ）対照細胞における前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルの対照値と比較し、又は、（ｉｉ）それぞれの細胞における前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを比較し、その差異に基づき、組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルを評価する。
【００７２】
第２実施形態の第２工程における評価は、具体的には、例えば、以下に示す（ａ）〜（ｄ）の手順により行うことが好ましい。
（ａ）第１工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを、当該被験細胞中の標準遺伝子がコードするタンパク質（標準タンパク質）の発現レベルで除した相対定量値を算出する。
相対定量値＝（第１工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベル）／（標準タンパク質の発現レベル）
（ｂ）対照細胞についての前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを、当該対照細胞における標準タンパク質の発現レベルを除して対照値を算出する。
対照値＝（対照細胞についての前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベル）／（標準タンパク質の発現レベル）
（ｃ）（ａ）において算出した被験細胞についての相対定量値を、（ｂ）において算出した対照値で除した相対発現量を算出する。
相対発現量＝［（ａ）において算出した被験細胞についての相対定量値］／［（ｂ）において算出した対照値］
（ｄ）各被験細胞間において、（ａ）で算出した相対定量値、又は（ｃ）で算出した相対発現量、を比較することにより、それぞれの値が高い又は低い細胞を選抜する。
【００７３】
前記（ｄ）の手順は、以下に示す（ｄ−１）又は（ｄ−２）の手順により行うことがより好ましい。
（ｄ−１）各被験細胞間で（ａ）で算出した相対定量値を比較することにより、値が高い（配列番号１〜９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子がコードするタンパク質を用いた場合）又は低い（配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子がコードするタンパク質を用いた場合）細胞を選抜する。
（ｄ−２）各被験細胞間で（ｃ）で算出した相対発現量を比較することにより、値が高い（配列番号１〜９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子がコードするタンパク質を用いた場合）又は低い（配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子がコードするタンパク質を用いた場合）細胞を選抜する。
【００７４】
前記相対定量値の高い細胞としては、その相対定量値が、被験細胞の中で最も小さい値を示した細胞（対照細胞）の相対定量値（対照値ともいう）の２倍以上である細胞が挙げられ、例えば、５倍以上、７倍以上、１０倍以上、２０倍以上、２５倍以上、３０倍以上、５０倍以上、又は１００倍以上である細胞が挙げられる。
【００７５】
特に、前記相対定量値の高い細胞としては、その相対定量値が、前記対照値の好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは２０倍以上、さらに好ましくは２５倍以上、一層より好ましくは３０倍以上、さらにより一層好ましくは５０倍以上、最も好ましくは１００倍以上である細胞が挙げられる。
【００７６】
前記相対定量値の低い細胞としては、その相対定量値が、被験細胞の中で最も大きい値を示したもの（対照細胞）の相対定量値（対照値ともいう）の１／２倍以下である細胞が挙げられ、好ましくは１／５倍以下、より好ましくは１／１０倍以下、さらに好ましくは１／２０倍以下である細胞が挙げられる。
【００７７】
前記相対発現量の高い細胞としては、その相対発現量が、被験細胞の中で最も小さい値を示した細胞の相対発現量と比べて、２倍以上である細胞が挙げられ、例えば、５倍以上、７倍以上、１０倍以上、２０倍以上、２５倍以上、３０倍以上、５０倍以上、又は１００倍以上である細胞が挙げられる。
【００７８】
特に、前記相対発現量の高い細胞としては、その相対発現量が、被験細胞の中で最も小さい値を示した細胞の相対発現量と比べて、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは２０倍以上、さらにより好ましくは２５倍以上、一層より好ましくは３０倍以上、さらにより一層好ましくは５０倍以上、最も好ましくは１００倍以上である細胞が挙げられる。
【００７９】
前記相対発現量の低い細胞としては、その相対発現量が、被験細胞の中で最も大きい値を示した細胞の相対発現量の１／２倍以下である細胞が挙げられ、好ましくは１／５倍以下、より好ましくは１／１０倍以下、さらに好ましくは１／２０倍以下である細胞が挙げられる。
【００８０】
また、第２実施形態の第２工程における組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルの評価として、以下に示す（ｅ）〜（ｇ）の手順により行うこともできる。
（ｅ）第１工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを、当該被験細胞中の標準遺伝子がコードするタンパク質（標準タンパク質）の発現レベルで除した相対定量値を算出する。
相対定量値＝（第１工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベル）／（標準タンパク質の発現レベル）
（ｆ）（ｅ）において算出した被験細胞についての相対定量値を、他の細胞で同様に算出した相対定量値と比較する。
（ｇ）各被験細胞間で（ｅ）で算出した相対定量値を比較することにより、値が高い（配列番号１〜９で表わされる遺伝子を用いた場合）又は低い（配列番号１０〜１６で表わされる遺伝子を用いた場合）細胞を選抜する。
【００８１】
前記標準タンパク質としては、細胞内で一般的に発現しているタンパク質であれば特に制限なく使用でき、例えばＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ベータアクチン、ベータ２−マイクログロブリン、ＨＰＲＴ１（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １）、グロブリン、または、ユビキチン等が挙げられる。
【００８２】
また、前記標準タンパク質の発現レベルの測定は、前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルと同様、ＥＬＩＳＡ法等により実施することができる。好ましくはＧＡＰＤＨである。
【００８３】
前記対照細胞としては、例えば、組換えタンパク質が還元されやすい細胞が挙げられる。対照細胞は、第１工程において前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを測定する細胞とサンプリング時点が異なる同じ細胞由来の試料を用いてもよいし、由来となる細胞が異なるものでもよい。また、対照細胞は、被験細胞の中から一つ選んでもよく、その場合、各被験細胞のうち、どれを選んでもよい。
【００８４】
具体的には、例えば、配列番号１〜９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子がコードするタンパク質を用いて評価する場合は、測定した各被験細胞の値の中で最も低い相対定量値を示した細胞を対照細胞とすれば、選抜すべき被験細胞との差異が大きくなることから、結果の解析が容易になる。
【００８５】
一方、配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子がコードするタンパク質を用いて評価する場合は、最も高い相対定量値を示した細胞を対照細胞とすれば、選抜すべき被験細胞との差異が大きくなることから、結果の解析が容易になる。
【００８６】
すなわち、前記対照細胞として好ましくは、配列番号１〜９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子がコードするタンパク質を用いる場合には相対定量値が最も低い細胞であり、配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子がコードするタンパク質を用いる場合には相対定量値が最も高い細胞である。
【００８７】
第１実施形態又は第２実施形態では、第１工程の前に配列番号１〜９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子、を細胞に導入し形質転換する工程を含んでもよい。
【００８８】
本発明において、「遺伝子を導入する」とは、目的遺伝子が細胞内に存在していることを意味する。例えば、目的遺伝子が細胞の染色体、又は細胞内に存在するベクター上に目的の遺伝子を有していることを意味する。目的遺伝子としては、細胞に生産される組換えタンパク質の遺伝子及び/又は配列番号１〜９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子が挙げられる。
【００８９】
第１実施形態又は第２実施形態では、第１工程の前に、配列番号１〜９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を細胞に導入し形質転換する工程、及び、組換えタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入し形質転換する工程を含んでもよい。これらの工程はどちらが先でもよく、同時でもよい。細胞に導入し形質転換する方法としては、上述した方法が挙げられる。
【００９０】
目的遺伝子の細胞への導入は、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の周知の方法を用いることができる。宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、例えば、発現ベクターに目的遺伝子を導入し、これをリポフェクション法等でＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、これを培養して遺伝子導入されたＣＨＯ細胞を得ることができる。
【００９１】
細胞に目的遺伝子を導入する方法としては細胞に応じて適したものを用いることができ、例えば、発現ベクターを用いる方法が挙げられる。発現ベクターとしては特に限定されないが、プラスミドベクターを用いることが好ましい。その他、例えば、ウイルスベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）及び他の非プラスミドベクターを使用してもよい。これらのベクターとしては市販のものを使用することもできる。なお、細胞として哺乳類動物由来の細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する発現ベクターを用いることが好ましい。
【００９２】
さらに、第１実施形態又は第２実施形態では、第１工程の前に配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を、当該細胞からノックダウン又はノックアウトし、当該遺伝子の発現量を下方制御する工程を含んでもよい。
【００９３】
本発明において、「ノックダウン又はノックアウト」するとは、目的遺伝子の転写または翻訳が阻害され、通常よりも低下していることを意味する。これにより、目的遺伝子の機能が失われるか減弱する。
【００９４】
遺伝子のノックダウン若しくはノックアウトは、遺伝子の機能を抑制または消失することが可能であればいずれの技術も用いることができる。例えば、アンチセンスＲＮＡを細胞に導入する方法、ｓｉＲＮＡやｍｉｃｒｏＲＮＡなどを用いたＲＮＡｉ法などを用いて、該当遺伝子の発現量を抑制することができる。また、ＴＡＬＥＮやＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９などのゲノム編集技術を用いて遺伝子をノックアウトする方法も利用できる。
【００９５】
第１実施形態又は第２実施形態では、第１工程の前に、配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を細胞でノックダウン又はノックアウトする工程、及び、組換えタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入し形質転換する工程を含んでもよい。これらの工程はどちらが先でもよく、同時でもよい。遺伝子をノックダウン又はノックアウトする方法、細胞に導入し形質転換する方法としては、上述した方法が挙げられる。
【００９６】
前述のようにして選抜された細胞は、目的とする組換えタンパク質の還元を抑制する能力を有している可能性が高く、該細胞を宿主細胞として用いることで、いかなる組換えタンパク質を生産する細胞をも取得することができる。本発明の選抜方法により得られた細胞（生産細胞）により生産される組換えタンパク質は、還元により分解又は変性することなく単離することができる。
【００９７】
タンパク質の生産細胞を樹立する場合、数十から数千以上の細胞の集団を樹立し、その中から組換えタンパク質の生産に適切な細胞を選抜する場合が多い。本発明の方法に基づき取得された生産細胞は、組換えタンパク質の還元を抑制する性質を有している。少なくとも、本発明の方法に基づき取得された生産細胞は、組換えタンパク質の還元を抑制する性質を有している確率が高い。すなわち、本発明により、組換えタンパク質の還元を抑制しうる細胞の取得確率を従来の方法よりも上げることができる。
【００９８】
本発明の選抜方法は、生産性、高発現、及び、品質等、他の指標に基づく生産細胞の選抜方法を組み合わせることができる。従って、本発明は、組換えタンパク質を高生産又は高発現する細胞を取得する方法を提供する。
【００９９】
本発明の第３実施形態は、配列番号１〜９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を細胞に導入し形質転換することを含む、組換えタンパク質の還元を抑制し得る細胞とその取得である。
【０１００】
本発明の第４実施形態は、配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子がノックダウン又はノックアウトされた、組換えタンパク質の還元を抑制し得る細胞とその取得である。
【０１０１】
配列番号１〜９に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子を導入した細胞、又は、配列番号１０〜１６に示される塩基配列のいずれか１を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも１の遺伝子がノックダウン又はノックアウトされた細胞を宿主細胞として用いることにより、当該細胞から生産される組換えタンパク質の還元、及びそれに伴う分解又は変性を抑制することができる。これにより、組換えタンパク質の活性が低下又は消失することが抑制された生産細胞を取得することが可能となる。
【０１０２】
本発明により得られた細胞は、通常の培養を行うことで、目的タンパク質をＮａｔｉｖｅな形態、すなわち、ジスルフィド結合が適正な部位に形成された形態で生産させることができる。細胞の培養方法としては、バッチ培養、フェドバッチ培養、潅流培養など、タンパク質の生産によく知られた方法を利用することができる。得られた培養液は、細胞分離工程を経た後に精製に供される。細胞分離工程は、連続遠心分離、バッチ遠心分離、ろ過、潅流等の方法により行われる。
【０１０３】
細胞から組換えタンパク質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。具体的には、例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１０４】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。【０１０５】
［実施例１］
マイクロアレイ解析を用いた抗体生産細胞の遺伝子発現差解析
生産されるタンパク質（抗体）の還元されやすさの違いと相関して発現する遺伝子（ｍＲＮＡ）を特定する目的でＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現差解析を行った。【０１０６】
生産される抗体が還元されにくい細胞［ＩｇＧ４型モノクローナル抗体（以下、抗体Ａという）を生産するＣＨＯ細胞＃１（以下Ａ＃１株と略す）、抗体Ａと異なる抗原に対する抗体であるＩｇＧ１／ＩｇＧ３キメラ型モノクローナル抗体（以下、抗体Ｂという）を生産するＣＨＯ細胞＃１（以下Ｂ＃１株と略す）］及び還元されやすい細胞［抗体Ａを生産するＣＨＯ細胞＃２（以下Ａ＃２株と略す）、抗体Ｂを生産するＣＨＯ細胞＃２（以下Ｂ＃２株と略す）］を評価に用いた。それぞれの細胞の還元されやすさの大小を表１に示す。なお、還元されやすさの評価は以下のように行った。【０１０７】
すなわち、２５０ｍＬ三角フラスコに細胞を播種し、ＣＯ２インキュベーター内で１３日間培養した。培養期間中、適宜フィード培地の添加を行なうとともにサンプリングを実施した。生細胞密度及び生存率は生死細胞オートアナライザー（Ｖｉ−ＣＥＬＬ  ＸＲ）を用いて測定し、抗体濃度の測定はＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰＬＣを用いて測定した。【０１０８】
培養１３日目の細胞を、超音波破砕機（ＶＰ−３００、ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて破砕し、細胞破砕液を無酸素条件下でインキュベートした。経時的に溶液をサンプリングし、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いてキャピラリー電気泳動を行い、生産されたタンパク質の分解状態を評価した。Ａ＃１株及びＡ＃２株について結果を図１に示す。【０１０９】
図１に示すように、Ａ＃１株及びＡ＃２株が生産した抗体の構造変化を観察したところ、Ａ＃１株では目的物のバンド（Ｗｈｏｌｅ抗体、１５０ｋＤａ付近）が変化しなかったのに対し、Ａ＃２株では還元反応の進行により低分子量の分解物（２８〜９５ｋＤａ）が経時的に増加することを確認した。【０１１０】
【表１】
2018124189.tif 000002
【０１１１】
これらの細胞を２５０ｍＬ容量の三角フラスコを用いてＣＯ２インキュベーター内で１４日間培養した。培養期間中、適宜フィード培地の添加及びサンプリングを実施した。培養３日目及び９日目に各細胞培養液をサンプリングし、約１×１０７個の各細胞からＩＳＯＧＥＮ（（株）ニッポンジーン製）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。【０１１２】
得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡのうち５０μｇを用いてＤＮａｓｅ処理を実施し、フェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿を行った後、各１μｇ以上のｔｏｔａｌ  ＲＮＡを含む溶液からＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＣＨＯ  Ｇｅｎｅ  ２．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いてマイクロアレイ解析を実施した（タカラバイオ（株）製）。【０１１３】
ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いてデータ解析を行い、数値補正法はＲＭＡ法またはＰＬＩＥＲ法（Yi Qu et al. BMC Bioinformatics,211,11,2010）で行った。【０１１４】
解析結果により、発現量に差のある２９７００遺伝子が確認された。各補正法で作成したデータから、抗体が還元されにくい株と還元されやすい株で２倍以上発現レベルの差がある１６遺伝子を特定した。１６遺伝子のリストを表２に示す。【０１１５】
【表２】
2018124189.tif 000003
【０１１６】
表２に示す特定された遺伝子の発現量またはそのタンパク質の生産量を指標とすることで、抗体をはじめとする目的タンパク質に対する還元作用が異なる細胞を特定することができると考えられる。【０１１７】
［実施例２］
ＲＴ−ｑＰＣＲ法を用いたｐｌａｃｅｎｔａ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、Ｐｌｅｔ１という）遺伝子発現差解析による生産細胞の還元されやすさの判定
実施例１において見出された遺伝子のうち、生産されるタンパク質が還元されにくい生産株で高発現していることが明らかになったＰｌｅｔ１遺伝子を一例として以下の解析を行った。【０１１８】
実施例１で調製し、マイクロアレイ解析に用いた４種類の細胞（表１）から得たｔｏｔａｌ  ＲＮＡに対して、ＲＴ−ｑＰＣＲ法を用いて以下の手法により遺伝子の発現量を解析した。まず、チャイニーズハムスターのＰｌｅｔ１遺伝子の塩基配列情報を元にＲＴ−ｑＰＣＲ法に用いるプローブ及びプライマーを設計した（表３、配列番号３〜５）。【０１１９】
反応液は１反応あたりＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｖｉｒｕｓ  １−Ｓｔｅｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５μＬ含み、上記プローブを２００ｎＭ（終濃度）、プライマーを終濃度５００ｎＭ、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを１０ｎｇ用い、２０μＬの反応系とした。反応は５０°Ｃ、５分間→９５°Ｃ、２０秒間の前反応の後、「９５°Ｃ、３秒間→６０°Ｃ、３０秒間」を４０サイクル繰り返すスケジュールでリアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。【０１２０】
細胞間におけるＰｌｅｔ１の遺伝子発現量は、相対発現量を用いて比較した。具体的には、まず、Ｐｌｅｔ１の遺伝子発現量をＧＡＰＤＨの遺伝子発現量で除して補正した相対定量値を算出した。次に、相対定量値が最も低い細胞を対照細胞とし、その他の細胞の相対定量値を対照細胞の相対定量値（対照値）で除して相対発現量を算出した。なお、ここで使用したＧＡＰＤＨは細胞に一般的に発現しているハウスキーピング遺伝子の一例である。評価結果を表４に示す。【０１２１】
【表３】
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【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
表４に示すように、抗体が還元されやすい細胞（Ａ＃２株、Ｂ＃２株）と比較して還元されにくい細胞（Ａ＃１株、Ｂ＃１株）はＰｌｅｔ１の遺伝子の相対発現量が５２〜２０８倍高いことが確認された。【０１２４】
この結果により、ＲＴ−ｑＰＣＲ法等の定量的遺伝子解析法を用いてＰｌｅｔ１遺伝子ｍＲＮＡ発現量を定量することで、目的タンパク質が還元されにくい生産細胞を容易に特定することができると考えられる。【０１２５】
［実施例３］
Ｐｌｅｔ１遺伝子の発現差解析によるタンパク質が還元されにくい生産細胞の選抜
チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ細胞）を無血清培地へ馴化して宿主細胞Ｘを取得した。米国特許第６９４６２９２号明細書に記載の方法を用いて、フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）を欠損させたＣＨＯ細胞を取得し、宿主細胞Ｙとした。【０１２６】
次いで、宿主細胞ＹをＰＢＳに懸濁し、抗体Ａ又は抗体Ｂと異なる抗原に対する抗体であるＩｇＧ１型モノクローナル抗体（以下、抗体Ｃという）遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用いて行った。【０１２７】
エレクトロポレーションによる遺伝子導入後、キュベット内の細胞を培地に懸濁して９６ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーター内で数日間培養した。次に、遺伝子導入から数日後にシクロヘキシミドを含む培地に交換し１週間毎に培地交換を行いながら、４週間培養した。その間、プレートのサイズを適宜変更しながら、最終的に１２５ｍＬ容量の三角フラスコのスケールまで細胞を増殖させた。培養上清をサンプリングし、抗体の生産量の多い細胞を選定し、シングルセルクローニングに供した。【０１２８】
次に、取得した細胞をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ、ベクトン・ディッキンソン社製）または限界希釈法を用いて３８４ウェルプレートに播種した。培養を継続し、シングルコロニーを生じたウェルから細胞を取得し、１２５ｍＬ容量三角フラスコのスケールまで細胞を拡大培養した。【０１２９】
これらの細胞から抗体の生産性を指標に細胞を選定し、４６種類の細胞を取得し、４６株の抗体Ｃ生産細胞を調製した。４６株の抗体Ｃ生産細胞を、それぞれ抗体Ｃ生産株＃１〜＃４６と命名した。細胞は各々１ｍＬのバイアルに分注し凍結保存した。【０１３０】
次いで、各細胞を２５０ｍＬ容量の三角フラスコを用いてＣＯ２インキュベーター内で１４日間培養した。培養期間中、適宜フィード培地の添加を行なうとともにサンプリングを実施した。培養３日目に各細胞培養液を１ｍＬずつサンプリングし、遠心により回収した細胞ペレット（約３×１０６個の細胞）にＩＳＯＧＥＮを５００μＬ加えて溶解した後、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを取得した。【０１３１】
次に、これを用いて実施例２と同様にＲＴ−ｑＰＣＲ法によりＰｌｅｔ１の遺伝子発現量を測定した。その際、標準遺伝子の一例としてＧＡＰＤＨを選択し、ＧＡＰＤＨの発現量に対する各々の抗体Ｃ生産株の相対定量値を算出した。また、一例として抗体Ｃ生産株＃５を対照細胞とした。抗体Ｃ生産株＃５のＰｌｅｔ１の相対定量値を１．０として、各々の細胞のＰｌｅｔ１の相対発現量を算出した。また、培養１４日目に実施例１と同様の方法で、生産される抗体の還元されやすさを各々の細胞について評価した。結果を表５に示す。【０１３２】
【表５】
2018124189.tif 000006
【０１３３】
抗体Ｃ生産株４６細胞の内、抗体が還元しなかった細胞は１１株（２４％）であった（＃１１、＃１２、＃２１、＃２３、＃３８、＃３９、＃４２、＃４３、＃４４、＃４５、＃４６）。一方、抗体Ｃ生産株＃５と比較して、Ｐｌｅｔ１の相対発現量が５倍以上高い生産株は１８株存在し（＃１、＃１１、＃１２、＃１５、＃１８、＃２０〜＃２５、＃３３、＃４１〜＃４６）、このうち抗体が還元しなかった生産株は１０株（５６％）存在した（＃１１、＃１２、＃２１、＃２３、＃４１〜＃４６）。抗体Ｃ生産株＃５と比較して、Ｐｌｅｔ１の相対発現量が１０倍以上高い生産細胞は１３株存在し（＃１、＃１１、＃１２、＃１８、＃２１〜＃２４、＃４２〜＃４６）、このうち抗体が還元しなかった細胞は９株（６９％）存在した。【０１３４】
また、抗体Ｃ生産株＃５と比較して、Ｐｌｅｔ１の相対発現量が１５倍以上高い生産細胞は１１株存在し、このうち抗体が還元しなかった細胞は９株（８２％）存在した（＃１１、＃１２、＃２１、＃２３、＃４２〜＃４６）。さらに、抗体Ｃ生産株＃５と比較して、Ｐｌｅｔ１の相対発現量が１００倍以上高い生産細胞は６株存在し（＃１１、＃１２、＃２２、＃４２、＃４３、＃４６）、このうち抗体が還元しなかった細胞は５株（８３％）存在した（＃１１、＃１２、＃４２、＃４３、＃４６）。【０１３５】
この結果から、ＲＴ−ｑＰＣＲ法を用いてＰｌｅｔ１遺伝子の発現量が高い細胞を選抜することで、目的タンパク質が還元されない細胞を高確率で取得できることが確認された。なお、対照値と比較して、Ｐｌｅｔ１遺伝子の相対発現量を５倍から１００倍のように任意に上げることによって、目的タンパク質が還元されない確率を高められることも示された。【０１３６】
［実施例４］
Ｐｌｅｔ１遺伝子の発現差解析による目的タンパク質が還元されにくい生産細胞選抜の汎用性確認
Ｐｌｅｔ１遺伝子の発現差解析により目的タンパク質が還元されにくい生産株を特定する方法の汎用性を確認する目的で、抗体Ｄ生産細胞を用いた検討を行った。
実施例３に示す方法に従い、抗体Ａ、抗体Ｂ又は抗体Ｃと異なる抗原に対する抗体であるＩｇＧ４型モノクローナル抗体（以下、抗体Ｄという）の遺伝子をＣＨＯ細胞に導入後、シングルセルクローニングし、６株の抗体Ｄ生産細胞を調製し、それぞれ抗体Ｄ生産株＃１〜＃６とした。【０１３７】
各細胞を２５０ｍＬ容量の三角フラスコを用いてＣＯ２インキュベーター内で１４日間培養した。培養期間中、適宜フィード培地の添加を行なうとともにサンプリングを実施した。培養１４日目に全て実施例１と同様の方法により、生産される抗体の還元されやすさを評価した。次に、各細胞の継代培養中に作製された凍結細胞ストックを解凍し、遠心により回収した細胞ペレット（約３×１０６個の細胞）にＩＳＯＧＥＮを５００μＬ加えて溶解後、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを取得した。【０１３８】
これを用いて実施例２と同様にＲＴ−ｑＰＣＲ法によりＰｌｅｔ１の遺伝子発現量を測定した。標準遺伝子の一例としてＧＡＰＤＨを選択し、Ｐｌｅｔ１の遺伝子発現量をＧＡＰＤＨの遺伝子発現量で除して補正した相対定量値を算出した。更に１つの細胞（抗体Ｄ生産株＃５）を対照細胞として選定し、当株（抗体Ｄ生産株＃５）の相対定量値を対照値として、他の細胞におけるＰｌｅｔ１の相対発現量を算出した。抗体Ｄ生産株におけるＰｌｅｔ１遺伝子発現量と抗体還元評価の結果を比較した。結果を表６に示す。【０１３９】
【表６】
2018124189.tif 000007
【０１４０】
表６に示すように、抗体Ｄ生産株６株の内、抗体が還元しなかった細胞は３株（５０％）であった（＃１、＃２、＃６）。抗体Ｄ生産株＃５と比較して、Ｐｌｅｔ１遺伝子の相対発現量が５倍以上高い生産細胞は４株存在し（＃１、＃２、＃４、＃６）、このうち抗体が還元しなかった細胞は３株（７５％）存在した（＃１、＃２、＃６）。以上の通り、抗体や生産株の種類によらず、Ｐｌｅｔ１の遺伝子発現量を解析することで、還元されにくい生産株を取得できることが確認された。【０１４１】
［実施例５］
継代培養中の細胞を用いたＰｌｅｔ１遺伝子の発現解析
実施例３で評価を行った抗体Ｃ生産株４６細胞のうち、Ｐｌｅｔ１遺伝子発現量の異なる９細胞に対して８０日間の継代培養を行い、Ｐｌｅｔ１遺伝子の相対発現量を解析した。結果を図２に示す。【０１４２】
図２に示すように、８０日間の継代培養期間において、Ｐｌｅｔ１遺伝子の発現量は安定的であった。以上のように、細胞の世代数が変わってもＰｌｅｔ１遺伝子の発現量は一定であったことから、世代数などの細胞の状態に依存せずＰｌｅｔ１を指標に還元されやすさの異なる細胞を選抜可能であることが確認された。【０１４３】
［実施例６］
組換えタンパク質が還元されにくい宿主細胞（ＣＨＯ細胞Ｘ’、Ｙ’）の取得
実施例３で取得した２種類の宿主細胞（Ｘ、Ｙ）を用いて以下の方法でシングルセルクローニングを実施し、サブクローニング株を作製した。【０１４４】
各々の細胞（Ｘ又はＹ）を１２５ｍＬ三角フラスコのスケールまで拡大培養した。次いで、Ｖｉ−ＣＥＬＬを用いて生細胞密度を計測し、１００ウェルあたり細胞が約１６個含まれるように細胞液を調製した。３８４ウェルプレートに細胞液を５０μＬずつ播種し培養した。シングルコロニーを生じたウェルの細胞を１２５ｍＬ容量の三角フラスコのスケールまで培養し細胞を増殖させた後、１ｍＬずつ細胞を分注して凍結した。【０１４５】
上記の過程で培養中に取得した細胞を用い、実施例２と同様にＲＴ−ｑＰＣＲ法により、Ｐｌｅｔ１遺伝子の発現解析を実施した。宿主細胞Ｘ及びＹのサブクローニング株各々４０株ずつに対してＰｌｅｔ１遺伝子発現量が最も低い株を対照細胞として、上述の実施例と同様に相対発現量を算出した。【０１４６】
Ｐｌｅｔ１の遺伝子発現量が高い株を１６株ずつ取得した（Ｘ’株、Ｙ’株）。また、比較対象として、Ｐｌｅｔ１の相対発現量が低い株を対照細胞として２株ずつ（Ｘｃ株、Ｙｃ株）取得した。結果を表７に示す。【０１４７】
【表７】
2018124189.tif 000008
【０１４８】
表７に示すように、Ｘ’株ではＰｌｅｔ１遺伝子の相対発現量が、Ｘｃ＃１株と比較して、３０倍以上高い株は９株（Ｘ’＃２、Ｘ’＃５、Ｘ’＃６、Ｘ’＃７、Ｘ’＃９、Ｘ’＃１２〜Ｘ’＃１５）、５０倍以上高い株は７株存在した（Ｘ’＃２、Ｘ’＃５、Ｘ’＃６、Ｘ’＃７、Ｘ’＃１３〜Ｘ’＃１５）。Ｙ’株では、Ｐｌｅｔ１遺伝子の相対発現量が、Ｙｃ＃１株およびＹｃ＃２株と比較して、１０倍以上高い株は１１株（Ｙ’＃２、Ｙ’＃５〜Ｙ’＃８、Ｙ’＃１０〜Ｙ’＃１３、Ｙ’＃１５、Ｙ’＃１６）、２０倍以上高い株は５株存在した（Ｙ’＃５、Ｙ’＃６、Ｙ’＃８、Ｙ’＃１０、Ｙ’＃１３）。選抜した株はさらに１２５ｍＬ容量三角フラスコにスケールアップした後、分注し凍結保存した。【０１４９】
当該実施例で取得された宿主細胞のように、宿主細胞自体のＰｌｅｔ１遺伝子の相対発現量を高めることができれば、組換えタンパク質が還元されにくい生産細胞を容易に取得することができると考えられる。【０１５０】
［実施例７］
Ｐｌｅｔ１高発現の宿主細胞を使った生産株が還元されていない抗体を生産できることの確認
Ｐｌｅｔ１遺伝子発現量を高めた宿主細胞を用いることで、還元されにくいタンパク質の生産細胞を調製することができると考え、以下の試験を実施した。【０１５１】
実施例６で取得したＰｌｅｔ１発現量の高い宿主細胞（Ｘ’＃５、Ｘ’＃６、Ｘ’＃１３、Ｙ’＃１０）について、実施例３に示す方法にしたがって抗体Ｂを導入した抗体生産株を取得した（ＢＸ’＃１、ＢＸ’＃２、ＢＸ’＃３、ＢＹ’＃１）。【０１５２】
また、これらの抗体生産株の還元されにくさを確認するために、比較対象としてＰｌｅｔ１の発現量が低い宿主細胞（Ｘｃ＃２、Ｙｃ＃１）についても同様の操作を行い、抗体Ｂ生産株ＢＸｃ＃１、ＢＹｃ＃１を取得した。【０１５３】
前記株について、１２５ｍＬ容量の三角フラスコを用いてＣＯ２インキュベーター内で１３日間培養した。培養期間中、適宜フィード培地を添加した。ＲＮＡの抽出は、培養液６日目の培養液５０μＬずつに対しｍＲＮＡ  ｃａｔｃｈｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて実施した。【０１５４】
取得したｍＲＮＡに対し、実施例２と同様にＲＴ−ｑＰＣＲ法を用いてＰｌｅｔ１の遺伝子発現量を測定した。ＢＸ’株及びＢＹ’株の各々３株について、Ｐｌｅｔ１遺伝子発現量が最も低いＢＸｃ＃１、ＢＹｃ＃１を対照細胞として相対発現量（Ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を算出した。また、培養１３日目に、実施例１と同様の方法により、抗体の還元感受性を評価した。【０１５５】
結果を表８及び表９に示す。【０１５６】
【表８】
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【０１５７】
【表９】
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【０１５８】
表８に示すように、Ｐｌｅｔ１の相対発現量の高い宿主細胞Ｘ’株から調製した３株（ＢＸ’＃１、ＢＸ’＃２、ＢＸ’＃３）は全ての抗体生産株で還元が認められなかった。一方、Ｐｌｅｔ１の相対発現量の低いＸｃ株から調製した１株（ＢＸｃ＃１）では抗体の還元が確認された。【０１５９】
同様に、表９に示すように、Ｐｌｅｔ１の相対発現量が高い宿主細胞ＢＹ’＃１０株から調製したＢＹ’＃１株についても抗体の還元は認められなかった。一方、Ｐｌｅｔ１の相対発現量が低いＹｃ株から調製した１株（ＢＹｃ＃１）については抗体の還元が確認された。【０１６０】
以上の結果から、Ｐｌｅｔ1遺伝子の相対発現量を高めた宿主細胞を用いることで、低還元性の抗体を生産する細胞を高い確率で取得できることが示された。【０１６１】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１６年１２月２８日付けで出願された日本特許出願（特願２０１６−２５６２７９号）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【図１】
2018124189.tif 000011
【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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