(57)【要約】末梢神経の再生を促進することで、末梢神経障害を治療及び／又は予防する手段が提供される。具体的には、一般式（Ｉ）：2017204166.tif 000081〔式中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式（ＩＩａ）2017204166.tif 000082（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基を示す。Ｒ２はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。Ｒ３は低級アルキル基（ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい）、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。〕で表される化合物を含有する、末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物が提供される。
2017204166.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2017204166.tif 000077
〔式中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式（ＩＩａ）
【化２】
2017204166.tif 000078
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基を示す。Ｒ２はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。Ｒ３は低級アルキル基（ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい）、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。〕で表される化合物を含有する、末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物。
【請求項２】
Ｒ１が、式（ＩＩａ）
【化３】
2017204166.tif 000079
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ１が、式（ＩＩｂ）
【化４】
2017204166.tif 000080
（式中、ｎは１〜６の整数を示す。）で示される基である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ１で示される低級アルキル基上に置換した複素環基が、低級アルキル基を有していてもよいピリジルである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
Ｒ１で示される複素環基のヘテロ原子が酸素原子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
Ｒ３で示される低級アルキル基がシクロプロピル基である、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル、
((１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルエステル、又は
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（ピリジン−２−イル）エチルエステルである、
請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
経口剤、注射剤、又は点滴剤である、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、末梢神経障害の患者に対して１日あたり０．１〜２０００ｍｇ投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
末梢神経障害が、機械的神経障害もしくは絞扼性神経障害、代謝性ニューロパチー、感染性ニューロパチー、及び薬剤による末梢神経障害からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
末梢神経障害（ニューロパシー）は、神経叢または神経根よりも遠位部にある脊髄神経の機能障害である。例えば、種々の程度の感覚障害、疼痛、筋力低下及び萎縮、深部腱反射低下、並びに血管運動神経症状等の症状が単独で、又は２以上組み合わさって現れる。【０００３】
末梢神経障害は、単一の神経を侵すこともあれば（モノニューロパシー）、多数の神経を同時に侵す（多発ニューロパシー）こともある。治療は基本的には神経を障害している原因を軽減又は除去することに重点が置かれる。しかし、その原因特定や原因除去は難しいことが多く、また、たとえ除去できたとしても障害を受けた神経細胞が回復することが難しい場合も多い。  もし、末梢神経の再生を促すことができれば、神経障害の原因を特定する前に治療を開始できる可能性が高まるうえ、障害を受けた神経細胞の機能が回復することで症状の一層の緩和が期待できる。さらには、末梢神経障害の予防にも有効であると考えられる。よって、末梢神経の再生を促進する方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−７６９８９号
【特許文献２】ＷＯ２０１２／０７４１２０
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｉｎ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｍａｃｋｉｎｎｏｎ，  Ｓ．Ｅ．，  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ，  Ｄ．Ａ．  （１９８９）．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｃｉａｔｉｃ，  ｐｅｒｏｎｅａｌ，  ａｎｄ  ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｔｉｂｉａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．  Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ８３，  １２９−１３８．
【非特許文献２】Ｂｅｎｎｅｔｔ，  Ｇ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｘｉｅ，  Ｙ．Ｋ．  （１９８８）．  Ａ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｍｏｎｏｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｐａｉｎ  ｓｅｎｓａｔｉｏｎ  ｌｉｋｅ  ｔｈｏｓｅ  ｓｅｅｎ  ｉｎ  ｍａｎ．  Ｐａｉｎ  ３３，  ８７−１０７．
【非特許文献３】Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ，  Ｂ．Ｂ．，  Ｎａｈｉｎ，  Ｂ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｏ'Ｌｅａｒｙ，  Ｄ．Ｄ．  （１９８７）．  Ａ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｐｏｓｔｍａｍｉｌｌａｒｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｆｏｒｎｉｘ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍａｔｕｒｅ  ａｘｏｎａｌ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ：  ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７，  ３３５０−３３６１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、末梢神経障害を治療及び／又は予防することを課題とする。特に、末梢神経の再生を促進することで、末梢神経障害を治療及び／又は予防することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、特定の化合物を用いることで、末梢神経の軸索伸展を促進させること、さらには損傷した末梢神経を再生させること、が可能であることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。  すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
一般式（Ｉ）【０００８】
【化１】
2017204166.tif 000003
〔式中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式（ＩＩａ）【０００９】
【化２】
2017204166.tif 000004
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基を示す。Ｒ２はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。Ｒ３は低級アルキル基（ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい）、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。〕で表される化合物を含有する、末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物。
項２．
Ｒ１が、式（ＩＩａ）【００１０】
【化３】
2017204166.tif 000005
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基である、項１に記載の組成物。
項３．
Ｒ１が、式（ＩＩｂ）【００１１】
【化４】
2017204166.tif 000006
（式中、ｎは１〜６の整数を示す。）で示される基である、項１に記載の組成物。
項４．
Ｒ１で示される低級アルキル基上に置換した複素環基が、低級アルキル基を有していてもよいピリジルである、項１に記載の組成物。
項５．
Ｒ１で示される複素環基のヘテロ原子が酸素原子である、項１に記載の組成物。
項６．
Ｒ３で示される低級アルキル基がシクロプロピル基である、項１〜５のいずれかに記載の組成物。
項７．
一般式（Ｉ）で表される化合物が、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル、
((１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルエステル、又は
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（ピリジン−２−イル）エチルエステルである、
項１に記載の組成物。
項８．
経口剤、注射剤、又は点滴剤である、項１〜７のいずれかに記載の組成物。
項９．
一般式（Ｉ）で表される化合物が、末梢神経障害の患者に対して１日あたり０．１〜２０００ｍｇ投与されるように用いられることを特徴とする、項１〜８のいずれかに記載の組成物。
項１０．
末梢神経障害が、機械的神経障害もしくは絞扼性神経障害、代謝性ニューロパチー、感染性ニューロパチー、及び薬剤による末梢神経障害からなる群から選択される少なくとも１種である、項１〜９のいずれかに記載の組成物。
項１１．
一般式（Ｉ）【００１２】
【化５】
2017204166.tif 000007
〔式中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式（ＩＩａ）【００１３】
【化６】
2017204166.tif 000008
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基を示す。Ｒ２はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。Ｒ３は低級アルキル基（ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい）、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。〕で表される化合物を、末梢神経障害患者へ投与する工程を含む末梢神経障害治療方法。
項１２．
Ｒ１が、式（ＩＩｂ）【００１４】
【化７】
2017204166.tif 000009
（式中、ｎは１〜６の整数を示す。）で示される基である項１１に記載の治療方法。
項１３．【００１５】
末梢神経障害の治療又は予防における使用のための、一般式（Ｉ）【００１６】
【化８】
2017204166.tif 000010
〔式中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式（ＩＩａ）【００１７】
【化９】
2017204166.tif 000011
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基を示す。Ｒ２はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。Ｒ３は低級アルキル基（ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい）、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。〕で表される化合物、又は該化合物を含む医薬組成物。
項１４．
Ｒ１が、式（ＩＩｂ）【００１８】
【化１０】
2017204166.tif 000012
（式中、ｎは１〜６の整数を示す。）で示される基である項１３に記載の化合物、又は医薬組成物。
項１５．
末梢神経障害の治療又は予防のための医薬の製造における、一般式（Ｉ）【００１９】
【化１１】
2017204166.tif 000013
〔式中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式（ＩＩａ）【００２０】
【化１２】
2017204166.tif 000014
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基を示す。Ｒ２はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。Ｒ３は低級アルキル基（ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい）、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。〕で表される化合物の使用。
項１６．
Ｒ１が、式（ＩＩｂ）【００２１】
【化１３】
2017204166.tif 000015
（式中、ｎは１〜６の整数を示す。）で示される基である項１５に記載の使用。 
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係る末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物により、末梢神経障害を治療及び／又は予防することができる。本明細書において「治療」とは、障害又は罹患した疾患及び／又はそれに伴う症状を緩和又は除去することをいう。また本明細書において「予防」とは、障害の発生又は疾患の罹患を防ぐことをいう。  また、当該組成物（及びその有効成分である化合物）は末梢神経の伸展や再生を促進することができる。このため、当該組成物は末梢神経伸展用組成物又は末梢神経再生用組成物ということもできる。なお、ここでの末梢神経再生とは、外的要因又は内的要因により傷ついた末梢神経が標的細胞へ伸展することをいい、好ましくは神経回路を再構築できることをいう。【００２３】
また、一般に、末梢神経障害の発症機序は、病理組織学的障害による分類にて、軸索障害（ａｘｏｎｏｐａｔｈｙ）、神経細胞体障害（ｎｅｕｒｏｎｏｐａｔｈｙ）、ミエリン障害（ｍｙｅｌｉｎｏｐａｔｈｙ）に分けられるところ、上記式（Ｉ）の化合物は、特に軸索伸展及びミエリン回復促進効果に優れるため、本発明に係る末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物は、軸索障害及びミエリン障害を主原因とする末梢神経障害の治療及び／又は予防に、特に好ましい。【００２４】
さらには、上記式（Ｉ）の化合物は、再生能が著しく低下した末梢神経であっても、顕著にその再生能を促進することができる。またさらに、上記式（Ｉ）の化合物は、完全損傷した（切断した）末梢神経や、損傷後時間が経過して変性した末梢神経であっても、再生することが可能である。このため、子供はもちろんのこと、成人、中年、初老、又は老年の患者であっても効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】右側に、軸索再生検討結果を示すグラフを示す。当該グラフでは、縦軸が軸索長（μｍ）を示し、横軸がインキュベーション時間（時）を示す。また、右側に、生後３日（Ｐ３）、１０日（Ｐ１０）、１５日（Ｐ１５）又は生後３日のＬＩＳ１ヘテロマウス（Ｐ３  Ｌｉｓ１（＋／−））のマウスから得た後根神経節細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す。白バーは２０μｍを示す。なお、＊はｐ＜０．０５を、＊＊はｐ＜０．０１を、＊＊＊はｐ＜０．００１を示し、これは以下の図でも同様である。
【図２】左側に、生後３日又は１５日のマウスから後根神経節細胞で発現しているＬＩＳ１タンパク質の発現量を、ウエスタンブロティングによって解析した結果を示す。なお、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素）は、ポジティブコントロールとして検出した。また、右側に、ウエスタンブロティングによって検出されたバンドの濃さに基づいてＬＩＳ１タンパク質量の発現量比を解析した結果を示す。
【図３】右側に、生後３日又は１５日のマウスから単離した後根神経節細胞を用いて、Ｌｉｓ１遺伝子発現亢進と軸索の長さの相関を検討した結果を示す。また、右側に、各後根神経節細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す。青はＤＡＰＩ、赤はＴｕｊ１、緑はｅＧＦＰが検出されたことを示す。なお、各検討結果において、一番上から順にＴｕｊ１、ｅＧＦＰ、ＤＡＰＩ、これらのＭｅｒｇｅ、の結果を示す。白バーは２０μｍを示す。
【図４】右側に、生後３日のマウスから単離した後根神経節細胞を用いて、ＳＮＪ１９４５の添加有無と軸索の長さの相関を検討した結果を示す。また、左側に、各後根神経節細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す。白バーは２０μｍを示す。
【図５】生後３日又は１５日のマウスから単離した後根神経節細胞で発現しているＬＩＳ１タンパク質の発現量が、ＳＮＪ１９４５の添加有無により変化するかを検討した結果を示す。
【図６】ＬＩＳ１遺伝子の転写調節領域の特定のための、ルシフェラーゼレポーターアッセイに用いた、各プラスミドに導入されたレポーター遺伝子の構造を左に示す。当該レポーター遺伝子は、より詳細には、上流とｉｎｔｒｏｎ１を一部欠損させたＬＩＳ１遺伝子の３’末端側にルシフェラーゼ遺伝子が接合された構造を有する。赤四角がＬＩＳ１遺伝子のｅｘｏｎを表し、青四角がルシフェラーゼ遺伝子を表す。さらに、右側に、それぞれのレポーター遺伝子によるルシフェラーゼアッセイの結果（ルシフェラーゼ活性相対値）を示す。
【図７】後根神経節細胞において、発現ベクターを用いてＣＴＣＦを発現させＬＩＳ１の発現量をウエスタンブロッティングで解析した結果をＡに示す。また、後根神経節細胞において、ｓｉＲＮＡを用いてＣＴＣＦをノックダウンしＬＩＳ１の発現量をウエスタンブロッティングで解析した結果をＢに示す。
【図８】生後３日目（Ｐ３）と生後１５日目（Ｐ１５）の後根神経節細胞において、発現ベクターを用いてＣＴＣＦを強制発現させ、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した結果を示す。
【図９】生後３日目（Ｐ３）と生後１５日目（Ｐ１５）の後根神経節細胞において、ｓｉＲＮＡを用いてＣＴＣＦをノックダウンさせ、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した結果を示す。
【図１０】マウス中枢神経系におけるＬＩＳ１の発現量をウエスタンブロッティングで解析した結果を示す。
【図１１】ＣＡＧプロモーターを利用して蛍光タンパンク質のｔｄ−ｔｏｍａｔｏを発現させ、マウス胎児（１２．５日）神経回路の可視化を行った結果を示す。
【図１２】ＣＡＧプロモーターを利用してＬＩＳ１及び蛍光タンパンク質のｔｄ−ｔｏｍａｔｏを発現させ、マウス胎児（１２．５日）の神経回路の可視化を行った結果を示す。
【図１３】ＣＡＧプロモーターを利用してＣＴＣＦのｓｈＲＮＡと蛍光タンパンク質のｔｄ−ｔｏｍａｔｏを発現させ、マウス胎児（１２．５日）の神経回路の可視化を行った結果を示す。
【図１４】ＣＡＧプロモーター及びＣＭＶプロモーターを利用してＣＴＣＦと蛍光タンパンク質のｔｄ−ｔｏｍａｔｏを発現させ、マウス胎児（１２．５日）の神経回路の可視化を行った結果を示す。
【図１５】マウス脳における乳頭体と神経繊維のオリエンテーションを示す。
【図１６】図１５に記載されたスケールを用いて、各検討結果における刈り込みの程度を定量化した結果を示す。
【図１７】正常型（ＬＩＳ１ホモ）とＬＩＳ１のヘテロ変異体の後根神経節細胞を抗ＧＳＫ３β抗体を用いて染めた結果を示す。
【図１８】後根神経節細胞におけるＧＳＫ３βの移動をライブセルイメージングで解析した結果を示す。
【図１９】後根神経節細胞におけるＧＳＫ３βの移動をライブセルイメージングで観察し、ＧＳＫ３βの移動速度を解析した結果を示す。
【図２０】正常型とＬＩＳ１のヘテロ変異体の後根神経節細胞におけるＧＳＫ３βの移動をライブセルイメージングで観察し、移動頻度を解析した結果を示す。
【図２１】正常型とＬＩＳ１のヘテロ変異体の後根神経節細胞におけるＧＳＫ３βの活性化を２１６チロシンのリン酸化特異的抗体を用いて解析した結果を示す。
【図２２】マウス坐骨神経損傷モデル作製時において、実際には坐骨神経損傷を施さなかったマウスをＳｈａｍ群とし、当該Ｓｈａｍ群の坐骨神経部分を顕微鏡で解析した結果を示す。４枚の写真の内訳は次の通りである。上左〔１〕：弱拡大、上右〔２〕：強拡大)と電子顕微鏡写真(下左〔３〕：弱拡大、下右〔４〕：強拡大。なお、この写真の並びは、以下の坐骨神経顕微鏡観察結果を示す図面全てで共通である。
【図２３】完全神経損傷モデルと対照群の坐骨神経部分を顕微鏡で解析した結果を示す。１Ｗは処置から１週間後、１Ｍは処置から1ヶ月後、６Ｍは処置から６ヶ月後を示す。
【図２４】図２３の画像から、回復が認められたミエリンを数えてグラフ化した図を示す。
【図２５】完全神経損傷モデルに対し、坐骨神経切断後１週間の期間をおいてＳＮＪ１９４５投与を開始し、神経再生の活性化を切断から１ヶ月後に坐骨神経部分を顕微鏡で解析した結果を示す。
【図２６】Ｓｈａｍ処置マウス（左）と完全損傷モデルマウス（右）の歩行足跡を示す。
【図２７】右側の坐骨神経を切断した完全損傷モデルマウスに対し上述のようにＳＮＪ１９４５投与し１ヶ月経過した際の足の様子を示す。
【図２８】坐骨神経損傷モデルマウスの運動機能を、Ｆｏｏｔｐｒｉｎｔを用いｓｃｉａｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ  （ＳＦＩ）、ｐｒｉｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＰＬＩ）にて評価した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、又は複素環基で置換された低級アルキル基であり得る。つまり、Ｒ１は、低級アルキル基を示し得、ここで当該低級アルキル基は低級アルコキシ基又は複素環基で置換されている。当該低級アルキル基としては、炭素数１〜６（１、２、３、４、５又は６）の直鎖状又は分枝状アルキル基が好ましく、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，２−ジメチルプロピル、ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１−エチル−２−メチルプロピル又は１，１，２−トリメチルプロピル等が例示できる。より好ましくは炭素数２又は３の直鎖状又は分枝状アルキル基である。とりわけエチルが好ましい。
【００２７】
Ｒ１で示される低級アルキル基上に置換する低級アルコキシ基としては、炭素数１〜６（１、２、３、４、５又は６）の低級アルコキシ基が好ましい。すなわち、Ｒ１で示される、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基としては、炭素数１〜６の低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基が好ましい。当該炭素数１〜６の低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、１−メチルブトキシ、２−メチルブトキシ、１，２−ジメチルプロポキシ、ヘキシルオキシ、１−メチルペンチルオキシ、２−メチルペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、４−メチルペンチルオキシ、１，１−ジメチルブトキシ、１，２−ジメチルブトキシ、１，３−ジメチルブトキシ、２，２−ジメチルブトキシ、２，３−ジメチルブトキシ、３，３−ジメチルブトキシ、１−エチルブトキシ、２−エチルブトキシ、１−エチル−２−メチルプロポキシ又は１，１，２−トリメチルプロポキシ等が例示でき、なかでもメトキシ、エトキシが好ましい。
【００２８】
アルコキシ基は、更にアルコキシ基を構成する炭素原子上に低級アルコキシ基が置換されていてもよく、さらに後者の低級アルコキシ基に低級アルコキシ基が置換されていてもよい。当該置換は、数回繰り返されていてもよい。すなわち、Ｒ１は、式（ＩＩａ）
【００２９】
【化１４】
2017204166.tif 000016
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基でもあり得る。  また、さらに好ましい基として、式（ＩＩｂ）
【００３０】
【化１５】
2017204166.tif 000017
（ｎは１〜６の整数を示す。）で示される基が挙げられる。
【００３１】
上記式（ＩＩａ）のＲ４で示される低級アルキル基は、炭素数１〜６（１、２、３、４、５又は６）の直鎖状又は分枝状アルキル基が好ましく、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチル等が例示できる。好ましくはメチル、イソプロピル又はｔｅｒｔ−ブチルであり、より好ましくはメチルである。
【００３２】
上記式（ＩＩａ）のＲ５で示される低級アルキレン基としては、炭素数１〜４（１、２、３又は４）のアルキレン基が好ましく、具体的にはメチレン、エチレン、トリメチレン又はテトラメチレンが例示できる。より好ましくはエチレンである。Ｒ５で示される低級アルキレン基は置換基を有していてもよい。該置換基としては、低級アルキル基（特に炭素数１〜６の直鎖状又は分枝状アルキル基）が挙げられ、例えばメチル又はエチル等が例示できる。
【００３３】
上記式（ＩＩａ）のｍは、１〜６の整数（１、２、３、４、５又は６）であり、好ましくは２〜５の整数である。上記式（ＩＩｂ）のｎは、１〜６の整数（１、２、３、４、５又は６）であり、好ましくは１〜５の整数であり、より好ましくは２〜５の整数である。
【００３４】
上記Ｒ１で示される低級アルキル基上に置換する複素環基としては、低級アルキル基を有していてもよい（すなわち、低級アルキル基で置換されていてもよい）ピリジルが好ましい。すなわち、上記Ｒ１で示される、複素環基で置換された低級アルキル基としては、低級アルキル基を有していてもよいピリジルで置換された低級アルキル基が好ましい。ピリジルとしては、例えば２−ピリジル、３−ピリジル又は４−ピリジルが挙げられる。該ピリジルが有していてもよい低級アルキル基としては、炭素数１〜３の低級アルキル基が好ましく、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルが挙げられる。特に制限されないが、該ピリジルが該低級アルキル基を有する場合、該ピリジルの５位又は６位に該低級アルキル基を有する（即ち、該ピリジルの５位又は６位の水素原子が該低級アルキル基で置換されている）のが好ましい。
【００３５】
Ｒ１は、また、複素環基であり得る。Ｒ１で示される複素環基は、例えば、硫黄原子、酸素原子及び窒素原子からなる群より選択される原子を１〜３個含む５〜７員芳香族、又は部分若しくは完全還元型の飽和複素環基を示し、例えば、フリル、チエニル、ピロリル、アゼピニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、ピラニル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル又はテトラヒドロチオフェニル等であり、好ましくは、飽和複素環基であり、更に好ましくは、酸素原子を含む５乃至６員飽和複素環基であり、更により好ましくは１，２若しくは３−テトラヒドロフラニル又は１，２，３若しくは４−テトラヒドロピラニルであり、特に好ましくは３−テトラヒドロフラニル又は４−テトラヒドロピラニルである。
【００３６】
Ｒ２で示される低級アルキル基としては、上記したＲ１で示される低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基又は複素環基で置換された低級アルキル基における、低級アルキル基と同様のものが例示されるが、好ましくは、メチル、エチル又はイソブチルである。Ｒ２で示される低級アルキル基は、フェニル基で置換されていることが好ましい。Ｒ２で示されるフェニル基で置換された低級アルキル基の好ましい例は、ベンジル又はフェニルエチルである。
【００３７】
Ｒ３で示される低級アルキル基としては、炭素数１〜６（１、２、３、４、５又は６）の直鎖状又は分枝状アルキル基が好ましく、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，２−ジメチルプロピル、ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１−エチル−２−メチルプロピル又は１，１，２−トリメチルプロピル等が例示できる。より好ましくは炭素数２又は３の直鎖状又は分枝状アルキル基である。また、Ｒ３で示される低級アルキル基は、シクロアルキル基であってもよい。シクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシル等が例示でき、好ましくはシクロプロピル又はシクロブチルである。
【００３８】
該低級アルキル基が置換されてもよいハロゲンとしては、フッ素、塩素又は臭素等が挙げられ、好ましくはフッ素である。該低級アルキル基がハロゲンにより置換されている場合、Ｒ３は好ましくはトリフルオロメチル又は２，２，２−トリフルオロエチルである。
【００３９】
Ｒ３で示される、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基は、Ｒ１で述べた低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基と同様である。なかでもメトキシ基又はエトキシ基で置換された炭素数１〜６（１、２、３、４、５又は６）の低級アルコキシ基が好ましい。また、Ｒ３で示される、フェニル基で置換された低級アルキル基は、Ｒ２で述べたフェニル基で置換された低級アルキル基と同様である。
【００４０】
Ｒ３で示される縮合多環式炭化水素基としては、例えばインダニル、インデニル、ナフチル、アントラニル、ペンタレニル又はアズレニル等が挙げられるが、インダニルが好ましい。
【００４１】
さらに、本発明の末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物が含有する化合物は、上記化合物の各種の溶媒和や結晶多形の物質ならびにプロドラッグであってもよい。
【００４２】
上記化合物は、例えば以下の方法で合成できる。また、上記化合物のうちいくつかの化合物は公知である（上記特許文献１参照）。
【００４３】
【化１６】
2017204166.tif 000018
（式中Ｒは保護基を、その他の基は前記と同意義を示す。）
工程ａは、式（ＩＩＩ）で示されるアミノ酸のアミノ基に保護基を付加し、これを混合酸無水物とした後、還元剤で還元し、式（Ｖ）で示される化合物〔以下、化合物（Ｖ）という。〕を得る工程である。上記保護基の付加、除去は公知の手段により行うことができる。上記保護基としては、例えば、ホルミル又はそれぞれ置換基を有していてもよいＣ1-6アルキルカルボニル（例えば、アセチル、プロピオニル等）、フェニルカルボニル、Ｃ1-6アルキル−オキシカルボニル（例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル等）、フェニルオキシカルボニル又はＣ７−１０アラルキルオキシカルボニル（例えば、ベンジルオキシカルボニル等のフェニル−Ｃ１−４アルキルオキシカルボニル等）などが用いられる。これらの置換基としては、ハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等）又はニトロ基等が用いられ、置換基の数は１〜３個程度である。当該保護基として最も好ましくは、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）である。
【００４４】
上記反応で用いられる還元剤としては例えば水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム又は水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム等が挙げられる。好ましくは水素化ホウ素ナトリウムである。反応温度は−４０℃から３０℃、好ましくは−２０℃から０℃である。
【００４５】
化合物（Ｖ）は、式（ＩＶ）で示されるアミノアルコールに、上記アミノ基の保護基を同様に付加することによって得ることもできる（工程ａ’）。
【００４６】
工程ｂは、化合物（Ｖ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の活性化剤存在下、ＤＭＳＯ酸化することにより、式（ＶＩ）で示される化合物〔以下、化合物（ＶＩ）という。〕を得る工程である。ＤＭＳＯ酸化は、公知の方法により行うことができ、例えばＤＭＳＯ単独、あるいはＤＭＳＯと酸化反応を阻害しない溶媒（例えばテトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン、エーテル等）の混合溶媒に溶解し、化合物（Ｖ）１モルに対し通常約１〜約１０倍モルのジイソプロピルエチルアミンを添加する。上記におけるＤＭＳＯの使用量は、化合物（Ｖ）１ｇに対し約１〜約２０ｍＬである。上記ＤＭＳＯの活性化剤としては、例えば三酸化硫黄ピリジン錯体、オキサリルクロリド、ジシクロヘキシルカルボジイミド又は無水酢酸等が有利に使用でき、特に三酸化硫黄ピリジン錯体が好適である。
【００４７】
工程ｃは、化合物（ＶＩ）を亜硫酸水素ナトリウムで処理した後、シアン化ナトリウムと反応させてシアノヒドリン体とし、このものを精製することなく酸又はアルカリ触媒存在下で加水分解し、α−ヒドロキシ−β−アミノ酸をジアステレオマーの混合物とし、次いで、このα−ヒドロキシ−β−アミノ酸のアミノ基に上記したアミノ基の保護基を再度同様に付加し、式（ＶＩＩ）で示される化合物〔以下、化合物（ＶＩＩ）という。〕をジアステレオマーの混合物として得る工程である。
【００４８】
この加水分解は、酸（塩酸、硫酸、酢酸、ギ酸等）又はアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム等）と共に加熱又は、加熱還流下で行う。加熱温度は、約５０〜約１００℃程度である。溶媒は、有機溶媒（例えばジオキサン、テトラヒドロフラン等）と水の混合溶媒を好ましく用いることができる。
【００４９】
工程ｄは、化合物（ＶＩＩ）を様々なアミンと縮合させて式（ＶＩＩＩ）で示される化合物〔以下、化合物（ＶＩＩＩ）という。〕を得る工程である。  アミンとしては、目的とする化合物に即して適宜好ましいアミンを選択すればよく、例えばエチルアミン、プロピルアミン、シクロプロピルアミン、ブチルアミン、シクロブチルアミン、メトキシエチルアミン、２−フェノキシエチルアミン、２−アミノインダン又は２，２，２−トリフルオロエチルアミン等が挙げられる。
【００５０】
上記縮合は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド等の脱水縮合剤の存在下で行うことが好ましい。縮合反応に使用される有機溶媒としてはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、酢酸エチル又はこれらの混合溶媒等が挙げられるが、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドである。反応温度は、氷冷下から室温の範囲である。
【００５１】
工程ｅは、化合物（ＶＩＩＩ）を塩酸酸性下でアミノ保護基の脱離反応により式（ＩＸ）で示されるアミン塩酸塩〔以下、化合物（ＩＸ）という。〕を得る工程である。アミノ保護基の脱離反応は、公知の方法により行い得る。例えば、通常使用される有機溶媒に溶解し、酸の存在下攪拌するという方法によりアミノ保護基を脱離することができる。酸としては塩酸、トリフルオロ酢酸又はｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられる。また、市販されている塩酸の酢酸エチル溶液もしくはジオキサン溶液等を用いて脱離することもできる。反応温度は、氷冷下から室温の範囲である。  工程ｆは、化合物（ＩＸ）と式（Ｘ）で示される化合物〔以下、化合物（Ｘ）という。〕をトリエチルアミン存在下に縮合することにより式（ＸＩ）で示される化合物〔以下、化合物（ＸＩ）という。〕を得る工程である。
【００５２】
上記化合物（Ｘ）は、例えば、下記の一般的な反応ルートに従い製造することができる。
【００５３】
【化１７】
2017204166.tif 000019
式（ＸＩＩＩ）で示されるアルコール〔以下、化合物（ＸＩＩＩ）という。〕と炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）とを反応させることにより式（ＸＩＶ）で示される混合炭酸エステル体とし、これをトリエチルアミン存在下、Ｌ−ロイシンエチルエステル塩酸塩と縮合すると、式（ＸＶ）で示される化合物が得られる。この化合物をアルカリでケン化することによって式（ＸＶＩ）で示される化合物〔以下、化合物（ＸＶＩ）という。〕が得られる。また、化合物（ＸＶＩ）は、Ｌ−ロイシンとクロロギ酸エステルを直接反応させることによって得ることもできる。得られた化合物（ＸＶＩ）はヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）と反応させ式（Ｘ）で示されるスクシンイミドエステル体〔以下、化合物（Ｘ）という。〕が製造できる。
【００５４】
工程ｇは、化合物（ＸＩ）を酸化することによって式（ＸＩＩ）で示される化合物〔以下、化合物（ＸＩＩ）という。〕を得る工程である。該酸化方法としては、例えばクロム酸酸化に分類される二クロム酸ピリジニウム（ＰＤＣ）酸化、クロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）酸化、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）酸化、コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）酸化、又はＤＭＳＯ酸化に分類されるスワン（Ｓｗｅｒｎ）酸化、ＤＭＳＯ−三酸化硫黄ピリジン錯体による酸化、ＤＭＳＯ−ジシクロヘキシルカルボジイミドによる酸化、ＤＭＳＯ−塩化オキサリルによる酸化、又はデス−マーチン試薬（Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ）を用いるデス−マーチン酸化、次亜ハロゲン酸による酸化、Ｎ−ハロゲノカルボン酸アミドによる酸化等、公知の方法を使用することができるが、とりわけデス−マーチン酸化が好ましい。デス−マーチン酸化を用いて酸化する場合は、化合物（ＸＩ）を通常使用される有機溶媒に溶解し、デス−マーチン試薬を加えることで行うことができる。通常使用される有機溶媒としては、例えばジクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン又は酢酸エチル等のような反応に悪影響をおよぼさない慣用の溶媒又はそれらの混合溶媒が挙げられるが、好ましくはジクロロメタンである。デス−マーチン試薬の使用量は化合物（ＸＩ）に対して約１〜約２０倍モル当量で、好ましくは約１〜約３倍モル当量である。反応温度は、特に限定されず、氷冷下から室温付近である。このようにして得られる化合物（ＸＩＩ）は、例えば濃縮、減圧濃縮、溶媒抽出、晶出、再結晶、転溶又はクロマトグラフィー等により公知の手段により単離精製することができる。化合物（ＸＩＩ）は、一般式（Ｉ）で表される化合物である。
【００５５】
上記、各工程は、通常使用される反応に悪影響を与えない慣用の溶媒又はそれらの混合溶媒の存在下で行われる。反応に悪影響を与えない溶媒としては、例えばジクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン又は酢酸エチルが挙げられる。
【００５６】
上記方法によって製造される一般式（Ｉ）で表される化合物のなかで、本発明の末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物に含まれる好ましい化合物としては、例えば（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（エチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１）、（構造式を下に示す）、
【００５７】
【化１８】
2017204166.tif 000020
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（エチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステル（化合物２）、（構造式を下に示す）、
【００５８】
【化１９】
2017204166.tif 000021
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（エチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルエステル（化合物３）、（構造式を下に示す）、
【００５９】
【化２０】
2017204166.tif 000022
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物４）、（構造式を下に示す）、
【００６０】
【化２１】
2017204166.tif 000023
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステル（化合物５）、（構造式を下に示す）、
【００６１】
【化２２】
2017204166.tif 000024
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルエステル（化合物６）、（構造式を下に示す）、
【００６２】
【化２３】
2017204166.tif 000025
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（プロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物７）、（構造式を下に示す）、
【００６３】
【化２４】
2017204166.tif 000026
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロブチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物８）、（構造式を下に示す）、
【００６４】
【化２５】
2017204166.tif 000027
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−ブチルアミノ−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物９）、（構造式を下に示す）、
【００６５】
【化２６】
2017204166.tif 000028
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１０）、（構造式を下に示す）、
【００６６】
【化２７】
2017204166.tif 000029
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（２−インダニルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１１）、（構造式を下に示す）、
【００６７】
【化２８】
2017204166.tif 000030
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（２−メトキシエチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１２）、（構造式を下に示す）、
【００６８】
【化２９】
2017204166.tif 000031
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−３−エチルアミノ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１３）、（構造式を下に示す）、
【００６９】
【化３０】
2017204166.tif 000032
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−３−エチルアミノ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステル（化合物１４）、（構造式を下に示す）、
【００７０】
【化３１】
2017204166.tif 000033
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−３−シクロプロピルアミノ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１５）、（構造式を下に示す）、
【００７１】
【化３２】
2017204166.tif 000034
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−３−シクロプロピルアミノ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステル（化合物１６）、（構造式を下に示す）、
【００７２】
【化３３】
2017204166.tif 000035
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル（化合物１７）、（構造式を下に示す）、
【００７３】
【化３４】
2017204166.tif 000036
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルエステル（化合物１８）、（構造式を下に示す）、
【００７４】
【化３５】
2017204166.tif 000037
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルエステル（化合物１９）、（構造式を下に示す）、
【００７５】
【化３６】
2017204166.tif 000038
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルエステル（化合物２０）、（構造式を下に示す）、
【００７６】
【化３７】
2017204166.tif 000039
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−１−（２−メチルプロピル）−３−（２−フェノキシエチル）アミノプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物２１）、（構造式を下に示す）、
【００７７】
【化３８】
2017204166.tif 000040
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−１−（２−メチルプロピル）−３−（２−フェノキシエチル）アミノプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル（化合物２２）、（構造式を下に示す）、
【００７８】
【化３９】
2017204166.tif 000041
（（１Ｓ）−１−（（（（１ＲＳ）−３−アミノ−１−ベンジル−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル（化合物２３）、（構造式を下に示す）、
【００７９】
【化４０】
2017204166.tif 000042
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（ピリジン−２−イル）エチルエステル（化合物２４）、（構造式を下に示す）、
【００８０】
【化４１】
2017204166.tif 000043
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルエステル（化合物２５）、（構造式を下に示す）、
【００８１】
【化４２】
2017204166.tif 000044
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルエステル（化合物２６）、（構造式を下に示す）、
【００８２】
【化４３】
2017204166.tif 000045
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−ｔｅｒｔ-ブトキシエチルエステル（化合物２７）、（構造式を下に示す）、及び
【００８３】
【化４４】
2017204166.tif 000046
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−イソプロポキシエチルエステル（化合物２８）、（構造式を下に示す）
【００８４】
【化４５】
2017204166.tif 000047
等が挙げられる。より好ましくは、化合物４、化合物１７、化合物１８、化合物１９、又は化合物２４であり、さらに好ましくは化合物１７である。
【００８５】
なお、上記化合物１〜２８については、上記特許文献１（特開２００６−７６９８９号）に具体的な製造方法及び物性値が記載されている。
【００８６】
これらの化合物は特許文献１に示されるように、優れたカルパイン阻害活性を有しており、本発明の末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物の有効成分として好ましく用いることができる。
【００８７】
本発明の末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物は、ヒトのみならず、ヒト以外の哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等）に対しても用いることができる。  また、上記化合物は組織移行性及び吸収性に優れ、かつ毒性も非常に低く安全性にも優れているので、末梢神経障害の治療又は予防にとって有利であり、よって当該化合物を含有する本発明の末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物は有利である。本発明の末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物は全身的又は局所的に投与され得る。全身的には経口投与の他、例えば静脈内注射、皮下注射又は筋肉内注射等非経口的にも投与され得る。局所的には、例えば皮膚、粘膜、鼻又は眼等に投与され得る。
【００８８】
本発明の末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物は、当該化合物と薬学上許容される担体又は添加剤等とが配合された組成物（特に医薬組成物）であることが好ましい。当該組成物には、本発明の効果が損なわれない程度において、他の薬理活性物質や薬学上許容される任意成分が配合されていてもよい。このような担体、添加剤、任意成分、他の薬理活性物質等は、当業者が目的に応じて適宜選択することができ、また、添加量等の条件も適宜設定することができる。
【００８９】
本発明の末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物が医薬組成物の場合、その製剤形態は、特に制限されないが、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は坐剤等の固形剤、及びシロップ剤、注射剤、点滴剤、点眼剤又は点鼻剤等の液剤等が例示できる。これらのなかでも、経口投与できる剤（経口剤）、注射剤、点滴剤が好ましい。これらは、公知の方法により製造することができる。
【００９０】
例えば、顆粒剤及び錠剤として製造する場合には、薬学上許容される添加剤、例えば、賦形剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム等）、崩壊剤（デンプン、カルメロースナトリウム、炭酸カルシウム等）又は結合剤（デンプン糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、カルメロース液、アラビアゴム液、ゼラチン液、アルギン酸ナトリウム液等）などを用いることにより任意の剤形を製造することができる。また、顆粒剤及び錠剤には、適当なコーティング剤（ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウ等）又は腸溶性コーティング剤（例えば、酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース等）などで剤皮を施してもよい。
【００９１】
カプセル剤として製造する場合には、公知の賦形剤、例えば、流動性及び滑沢性を向上させるためのステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク又は軽質無水ケイ酸、加圧流動性のための結晶セルロースもしくは乳糖、或いは上記崩壊剤等を適宜選択し、本発明化合物と均等に混和又は粒状、もしくは粒状としたものに適当なコーティング剤で剤皮を施したものをカプセルに充填するか、適当なカプセル基剤（ゼラチン等）に必要に応じてグリセリン又はソルビトール等を加えて塑性を増したカプセル基剤で被包成形してもよい。これらカプセル剤には必要に応じて、着色剤、保存剤［例えば、二酸化イオウ、パラベン類（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等）］等を加えることができる。カプセル剤は、通常のカプセル剤の他、腸溶性コーティングカプセル剤、胃内抵抗性カプセル剤又は放出制御カプセル剤とすることもできる。腸溶性カプセル剤とする場合、腸溶性コーティング剤でコーティングした本発明化合物又は本発明化合物に上記の適当な賦形剤を添加したものを通常のカプセルに充填することができる。あるいは、腸溶性コーティング剤でコーティングしたカプセル、もしくは腸溶性高分子を基剤として成形したカプセルに本発明化合物又は本発明化合物に上記の適当な賦形剤を添加したものを充填することができる。
【００９２】
坐剤として製造する場合には、坐剤基剤（例えば、カカオ脂、マクロゴール等）を適宜選択して使用することができる。
【００９３】
シロップ剤として製造する場合には、例えば、安定剤（エデト酸ナトリウム等）、懸濁化剤（アラビアゴム、カルメロース等）、矯味剤（単シロップ、ブドウ糖等）又は芳香剤等を適宜選択して使用することができる。このような任意成分は、当業者が目的に応じて適宜選択することができ、また、添加量等の条件も適宜設定することができる。
【００９４】
注射剤、点滴剤、点眼剤又は点鼻剤として製造する場合、薬学上許容される添加剤、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）又はｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等）などを適宜添加した溶液に、上記化合物を溶解又は分散することによって製造することができる。このような薬学上許容される添加剤は、当業者が目的に応じて適宜選択することができ、また、添加量等の条件も適宜設定することができる。
【００９５】
注射剤、点眼剤又は点鼻剤における添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途等によって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよい。
【００９６】
本発明の末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物の投与量は、対象となる末梢神経障害患者の疾患進行度合、年齢、投与方法等により異なるが、当該組成物に含まれる有効成分である上記化合物量が、１日あたり約０．１〜約２０００ｍｇ、好ましくは約１〜約１５００ｍｇを例示できる。特に経口投与又は経血管（好ましくは経静脈）投与する場合は、１日あたり約１０〜約１５００ｍｇ、好ましくは約２０〜約１５００ｍｇ、より好ましくは約５０〜約１２００ｍｇ、さらに好ましくは約１００〜約１０００ｍｇを例示できる。投与は、例えば１日数回（好ましくは１、２、又は３回）に分けて行うことができる。
【００９７】
また、本発明の末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物に含まれる有効成分である上記化合物量は、特に制限されない。例えば、当該組成物全体に対して、０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜９９重量％、上記化合物が含まれ得る。
【００９８】
本発明の末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物の治療及び／又は予防対象疾患としては、末梢神経障害であれば特に制限はされないが、例えば、機械的神経障害もしくは絞扼性神経障害、代謝性ニューロパチー、感染性ニューロパチー、及び薬剤による末梢神経障害などが挙げられる。機械的神経障害もしくは絞扼性神経障害としては、具体的には、手根管症候群、肘部管症候群、坐骨神経麻痺、腓骨神経麻痺、足根管症候群、その他外傷による神経切断などが例示できる。代謝性ニューロパチーとしては、具体的には、糖尿病性ニューロパチー、尿毒症性ニューロパチー、ビタミン欠乏によるニューロパチーなどが例示できる。感染性ニューロパチーとしては、具体的には、帯状疱疹の後遺症としての神経障害などが例示できる。薬剤による末梢神経障害としては、具体的には、タキサン系薬剤（例えばパクリタキセル、デセタキセルなど）や微小管重合阻害剤による神経障害などが例示できる。また、制限はされないが、物理的に末梢神経を損傷した場合の治療において、本発明の末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物は特に有効である。また、末梢神経障害の中でも、例えば坐骨神経の障害に対して好ましく用いることができる。
【００９９】
さらにまた、当該組成物は、胎児期に母胎又は胎児に投与することにより、胎児の神経細胞ネットワーク構築に寄与することができる。よって、当該組成物は、胎児期の神経細胞ネットワーク構築障害を治療及び／又は予防することもできる。つまり、当該組成物は、胎児期の神経細胞ネットワーク構築障害を治療及び／又は予防用組成物としても有用である。
【０１００】
胎児期の神経細胞ネットワーク構築障害としては、例えば、Genetic disorders of midline crossing、Genetic disorders of neuron migration、Autism spectrum disorders and epilepsy等が挙げられる。Genetic disorders of midline crossingとしては、具体的には、Congenital mirror movements、Horizontal gaze palsy with progressive scoliosis、Dyslexiaなどが例示できる。Genetic disorders of neuron migrationとしては、具体的には、Kallmann's syndrome、Hirschsprung's diseaseなどが例示できる。Autism spectrum disorders and epilepsyとしては、具体的には、Autism spectrum disorders、Epilepsy、Fragile X syndromeなどが例示できる。
【０１０１】
なお、本発明の末梢神経障害の治療及び／又は予防用組成物に含有される上記化合物は、他のカルパイン阻害剤に比べ毒性が特に低く、副作用が比較的低減されている点でも有利である。また、他のカルパイン阻害剤よりも、末梢神経再生促進効果が高く、特に再生能が著しく低下した末梢神経であっても顕著に再生を促すことができる。
【実施例】
【０１０２】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。また、以下の検討では、基本的な操作等については、当該分野で著名な教科書（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、共焦点顕微鏡活用プロトコール（羊土社）、タンパク質実験ハンドブック（羊土社）、脳・神経研究の進めかた（羊土社）等）を適宜参考にすることができる。
各化合物の合成
上記引用文献１に記載の方法に従って、上記化合物１〜２８を合成し、結晶を得た。  具体的には、次のようにして合成した。なお、以下の化合物の分析値において、融点はＹａｎａｃｏ社製ＭＰ−５００Ｖ型（補正なし）を用いて測定した。核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）はＶａｒｉａｎ製Ｇｅｍｉｎｉ２０００型（３００ＭＨｚ）を用いて測定した。マトリックス支援イオン化−飛行時間型マススペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）
は、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社製Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ質量分析装置を用いて測定し、質量数は標準物質（α―シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）で補正した。比は容積比を示す。【０１０３】
〔参考例１〕
Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１）Ｌ−ロイシン（２５ｇ，０．１９ｍｏｌ）を２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．１２Ｌ）に溶解し、この溶液にクロロギ酸２−メトキシエチルエステル（３０ｇ，０．２２ｍｏｌ）と１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を氷冷条件下で同時にゆっくりと加えた。この溶液を室温で１８時間攪拌した後、水（６００ｍＬ）を加え希釈し、ジエチルエーテル（２×２００ｍＬ）で洗浄した。水層をアイスバスで冷却し、６Ｍ塩酸を加えることでｐＨ３に調整した。この溶液を酢酸エチル（５×１５０ｍＬ）で抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮しＮ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシン（４１ｇ，９２％）を無色オイル状物として得た。
（２） Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシン（２０ｇ，８６ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（１３ｇ，０．１１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２００ｍＬ）に溶解し、そこへ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２１ｇ，０．１１ｍｏｌ）のジクロロメタン（２００ｍＬ）懸濁液を加えた。この溶液を室温で１８時間攪拌後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル（３００ｍＬ）で溶解し、この溶液を１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮し表題化合物（２７ｇ，９５％）を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６），０．９３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６），１．５７−１．８４（ｍ，３Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），３．５１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．７），４．１０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．７），４．４０（ｍ，１Ｈ），８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１）．【０１０４】
〔参考例２〕
Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１）（Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフラン（１．０ｇ，１１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（５０ｍＬ）溶液を攪拌しながら、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナート（４．３ｇ，１７ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（４．４ｇ，１７ｍｍｏｌ，４．８ｍＬ）を室温で加えた。この溶液を室温で１８時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２００ｍＬ）で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮しＮ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナート（２．６ｇ）を定量的に褐色オイル状物として得た。
（２） Ｌ−ロイシンエチルエステル塩酸塩（２．７ｇ，１４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２．９ｇ，２８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）にＮ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナート（２．６ｇ，１１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液を加えた。この反応液を室温で１８時間攪拌し、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル（２００ｍＬ）で溶解し、この溶液を１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。残渣をヘキサンで洗浄しＮ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステル（３．１ｇ，９８％）を白色固体として得た。
（３） Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステル（２．９ｇ，１１ｍｍｏｌ）のエタノール（１００ｍＬ）溶液に１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（３３ｍＬ）を加えた。この溶液を氷冷下で３時間攪拌した後、塩酸を加えることでｐＨ３に調整した。エタノールを減圧留去し、酢酸エチルで抽出した。有機層を１Ｍ塩酸及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル／ヘキサン混液で結晶化しＮ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシン（２．６ｇ，８５％）を無色結晶として得た。融点：９４．９−９６．０°Ｃ．
（４） Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．０），０．９２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），１．５５−１．８２（ｍ，３Ｈ），１．８８（ｍ，１Ｈ），２．１２（ｍ，１Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），３．６４−３．８４（ｍ，４Ｈ），４．３９（ｍ，１Ｈ），５．１５（ｍ，１Ｈ），８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．【０１０５】
〔参考例３〕
Ｎ−（（テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１） （Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりに４−ヒドロキシテトラヒドロ−４Ｈ−ピランを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、Ｎ−スクシンイミジルテトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルカルボナートを褐色オイル状物として得た。
（２） Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにＮ−スクシンイミジルテトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色固体として得た。
（３） Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色固体として得た。
（４） Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．０），０．９２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），１．４３−１．９３（ｍ，７Ｈ），２．８０（ｓ，４Ｈ），３．４２（ｍ，２Ｈ），３．７８−３．８２（ｍ，２Ｈ），４．３９（ｍ，１Ｈ），４．７２（ｍ，１Ｈ），７．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．【０１０６】
〔参考例４〕
Ｎ−（（５−メトキシ−３−オキサペンチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１） （Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにジエチレングリコールモノメチルエーテルを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、５−メトキシ−３−オキサペンチルＮ−スクシンイミジルカルボナートを無色オイル状物として得た。
（２） Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりに５−メトキシ−３−オキサペンチルＮ−スクシンイミジルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（５−メトキシ−３−オキサペンチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３） Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（５−メトキシ−３−オキサペンチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（５−メトキシ−３−オキサペンチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色オイル状物として得た。
（４） Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（５−メトキシ−３−オキサペンチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．９０（ｄｄ，６Ｈ，Ｊ＝９．５，６．５），１．５６−１．８０（ｍ，３Ｈ），２．８０（ｓ，４Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４１−３．４６（ｍ，２Ｈ），３．５０−３．５４（ｍ，２Ｈ），３．５６−３．６０（ｍ，２Ｈ），４．０８−４．１１（ｍ，２Ｈ），４．３９（ｍ，１Ｈ），８．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．【０１０７】
〔参考例５〕
Ｎ−（（８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１） （Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにトリエチレングリコールモノメチルエーテルを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルＮ−スクシンイミジルカルボナートを無色オイル状物として得た。
（２） Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりに８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルＮ−スクシンイミジルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３） Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色オイル状物として得た。
（４） Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），０．９２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），１．５６−１．８２（ｍ，３Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４３（ｍ，２Ｈ），３．５２（ｍ，６Ｈ），３．５９（ｍ，２Ｈ），４．１０（ｍ，２Ｈ），４．４０（ｍ，１Ｈ），８．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．【０１０８】
〔参考例６〕
Ｎ−（（１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１） （Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにテトラエチレングリコールモノメチルエーテルを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルＮ−スクシンイミジルカルボナートを無色オイル状物として得た。
（２） Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりに１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルＮ−スクシンイミジルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３） Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色オイル状物として得た。
（４） Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．９１（ｄｄ，６Ｈ，Ｊ＝９．３，６．３），１．５６−１．７７（ｍ，３Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４１−３．４４（ｍ，２Ｈ），３．４９−３．５２（ｍ，１０Ｈ），３．５９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．７），４．０８−４．１１（ｍ，２Ｈ），４．３８（ｍ，１Ｈ），８．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．【０１０９】
〔参考例７〕
Ｎ−（（１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１） （Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにペンタエチレングリコールモノメチルエーテルを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルＮ−スクシンイミジルカルボナートを無色オイル状物として得た。
（２） Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりに１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルＮ−スクシンイミジルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３） Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色オイル状物として得た。
（４） Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６），０．９２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），１．５７−１．８２（ｍ，３Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４３（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｍ，１４Ｈ），３．５９（ｍ，２Ｈ），４．１０（ｍ，２Ｈ），４．４０（ｍ，１Ｈ），８．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．【０１１０】
〔参考例８〕
（３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−エチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタナミド塩酸塩
（１） Ｌ−フェニルアラニノール（５０ｇ，６６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１．３Ｌ）と水（６３０ｍＬ）の溶液にジ−ｔ−ブチルジカルボナート（１４０ｇ，０．６７ｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５００ｍＬ）溶液と１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６６０ｍＬ）を氷冷条件下で同時にゆっくりと加えた。この溶液を室温で１８時間攪拌し、有機溶媒を減圧留去した後、酢酸エチル（１Ｌ）を加えた。この溶液を１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。得られた白色固体を酢酸エチル／ヘキサン（１：１０）混液から再結晶しＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニノール（７０ｇ，８４％）を無色結晶として得た。
（２） Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニノール（６９ｇ，０．２８ｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２８０ｍＬ）とジクロロメタン（１４０ ｍＬ）に溶解し、この溶液をアイスバスで冷却した。そこへ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１０ｇ，０．８２ｍｏｌ）と精製した三酸化イオウピリジン錯体の（１３０ｇ，０．８２ｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１００ｍＬ）懸濁液を加えた。この溶液を氷冷下で１時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで（１．５Ｌ）で希釈し、１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル／ヘキサン混液から結晶化しＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニナール（５３ｇ，７７％）を無色結晶として得た。
（３） Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニナール（１７ｇ，６７ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍＬ）に溶解し、この溶液を５°Ｃに冷却した。亜硫酸水素ナトリウム（７．０ｇ，６７ｍｍｏｌ）を水（１５０ｍＬ）に溶解し、５°Ｃに冷却した。この溶液をアルデヒド溶液に加え５°Ｃで１８時間撹拌した。青酸ナトリウム（４．０ｇ，８１ｍｍｏｌ）を水（１００ｍＬ）に溶かし、酢酸エチル（３００ｍＬ）とともに上記の反応液へ加えた。この反応液を室温で５時間撹拌した。有機層を分離し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮し、シアノヒドリン体を無色オイル状物として得た。このシアノヒドリン体をジオキサン（２５０ｍＬ）と濃塩酸（２５０ｍＬ）に溶解し、これにアニソール（１０ｍＬ）を加えた。この溶液を１８時間緩やかに還流した。この反応液を室温に冷却後、減圧濃縮し褐色半固状物質を得た。これを水（１００ｍＬ）に溶解し、ジエチルエーテル（３×５０ｍＬ）で洗浄した。水層をＤｏｗｅｘ ５０Ｘ８カラム（１００−２００ｍｅｓｈ，Ｈ＋型；２５×１．８ｃｍ）に付し、ｐＨ５．５になるまで水で洗浄し、２Ｍアンモニウム水（約１．５Ｌ）で溶出した。溶出したアンモニウム水を減圧濃縮して（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸（１２ｇ，８８％）を白色固体として得た。
（４） （３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸（１１ｇ，５６．３４ｍｍｏｌ）を１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（７０ｍＬ）に溶解し、この溶液にジ−ｔ−ブチルジカルボナート（１２ｇ，５７ｍｍｏｌ）のジオキサン（７０ｍＬ）溶液を加えた。この溶液を、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を適宜加えることでｐＨ１０〜１１に保持しながら、室温で１８時間攪拌した。そこへ、水（６００ｍＬ）を加え希釈し、ジエチルエーテル（２×２００ｍＬ）で洗浄した。この水層をアイスバスで冷却しながら、１Ｍ塩酸を加えることによりｐＨ２に調整し、ジエチルエーテル（３×２５０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水後、濃縮し（３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸（１２ｇ，７２％）を無色固体のジアステレオマーの混合物として得た。
（５） （３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸（６．３ｇ，２１ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．０ｇ，２２．４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４５ｍＬ）に溶解し、アイスバスで冷却した。そこへ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（４．６ｇ，２４ｍｍｏｌ）を加えた後、さらにエチルアミン水溶液（３．０ｍＬ）を加えた。この溶液を１８時間攪拌した。この溶液を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈した後、１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮し（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステル（５．８ｇ，８４％）を白色固体として得た。
（６） （（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステル（５．５ｇ，１７ｍｍｏｌ）を４Ｎ塩酸／ジオキサン溶液（６５ｍＬ）に溶解し、この溶液を室温で３時間攪拌した。この溶液を減圧濃縮して表題化合物（４．４ｇ）を定量的に白色固体として得た。
融点：１６２．８−１６３．３°Ｃ．（Ｍａｊｏｒ），１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．０２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２），２．９３（ｍ，２Ｈ），３．０５−３．２０（ｍ，２Ｈ），３．６０（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｍ，１Ｈ），６．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０），７．１９−７．３７（ｍ，５Ｈ），８．０８（ｍ，１Ｈ），８．１７（ｂｒ ｓ，３Ｈ）．（Ｍｉｎｏｒ），１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ
６）δ０．９７（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．４），２．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．９），３．００（ｍ，２Ｈ），３．６９（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｍ，１Ｈ），６．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４），７．１９−７．３７（ｍ，５Ｈ），８．０３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７），８．１７（ｂｒ ｓ，３Ｈ）．【０１１１】
〔参考例９〕
（３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−シクロプロピル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタナミド塩酸塩 
エチルアミン水溶液の代わりにシクロプロピルアミンを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。
融点：１６２．９−１６３．３℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．４４（ｍ，２Ｈ），０．５７（ｍ，２Ｈ），２．５０（ｍ，０．５Ｈ），２．６５（ｍ，０．５Ｈ），２．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），２．９４（ｍ，１Ｈ），３．６０（ｍ，０．５Ｈ），３．７０（ｍ，０．５Ｈ），３．８７（ｍ，０．５Ｈ），４．２６（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝２．４），６．４５（ｂｒ ｓ，０．５Ｈ），６．６９（ｂｒ ｓ，０．５Ｈ），７．２３−７．３５（ｍ，５Ｈ），７．９９（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝４．２），８．０８（ｂｒ ｓ，１．５Ｈ），８．０９（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝４．５），８．２３（ｂｒ ｓ，１．５Ｈ）．【０１１２】
〔参考例１０〕
（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニル−Ｎ−プロピルブタナミド塩酸塩エチルアミン水溶液の代わりにプロピルアミンを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−３−（プロピルアミノ）プロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。 （（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−３−（プロピルアミノ）プロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。
融点：１２７．８−１２９．５℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８２（ｍ，３Ｈ），１．３５−１．４７（ｍ，２Ｈ），２．８２（ｍ，０．５Ｈ），２．９５（ｍ，３Ｈ），３．０９（ｍ，０．５Ｈ），３．５８（ｍ，０．５Ｈ），３．７０（ｍ，０．５Ｈ），３．９２（ｍ，０．５Ｈ），４．３１（ｍ，０．５Ｈ），６．５５（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝４．８），６．７７（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝６．６），７．２１−７．３６（ｍ，５Ｈ），７．９８−８．１５（ｍ，２．５Ｈ），８．２４（ｂｒ ｓ，１．５
Ｈ）．【０１１３】
〔参考例１１〕
（３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−シクロブチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタナミド塩酸塩
エチルアミン水溶液の代わりにシクロブチルアミンを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロブチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロブチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。
融点：１６２．５−１６３．７℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．５９（ｍ，２Ｈ），１．８８−２．１８（ｍ，４Ｈ），２．８０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），２．９１（ｍ，１Ｈ），３．５８（ｍ，０．５Ｈ），３．６９（ｍ，０．５Ｈ），３．８７（ｍ，０．５Ｈ），４．０８（ｍ，０．５Ｈ），４．１６−４．２４（ｍ，１Ｈ），６．５０（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．４），６．７２（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝６．０），７．２１−７．３３（ｍ，５Ｈ），８．０５（ｂｒ ｓ，１．５Ｈ），８．１９（ｄ，０
．５Ｈ，Ｊ＝７．８），８．２０（ｂｒ ｓ，１．５Ｈ），８．２９（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝８．１）．【０１１４】
〔参考例１２〕
（３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−ブチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタナミド塩酸塩
エチルアミン水溶液の代わりにブチルアミンを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−ブチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−ブチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。
融点：１４１．０−１４１．４℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８６（ｍ，３Ｈ），１．１６−１．４７（ｍ，４Ｈ），２．８０（ｍ，０．５Ｈ），２．９９（ｍ，３Ｈ），３．１３（ｍ，０．５Ｈ），３．５７（ｍ，０．５Ｈ），３．７０（ｍ，０．５Ｈ），３．９２（ｍ，０．５Ｈ），４．３０（ｍ，０．５Ｈ），６．５３（ｂｒ ｓ，０．５Ｈ），６．７７（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝６．６），７．１９−７．３９（
ｍ，５Ｈ），７．９７−８．１５（ｍ，２．５Ｈ），８．２２（ｓ，１．５Ｈ）．【０１１５】
〔参考例１３〕
（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニル−Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）ブタナミド塩酸塩
エチルアミン水溶液の代わりに２，２，２−トリフルオロエチルアミンを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−３−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）プロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−３−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）プロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニル−Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）ブタナミド塩酸塩を白色固体として得た。
融点：１０３．０−１０８．５℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２．７１−２．８５（ｍ，１Ｈ），２．８８−２．９７（ｍ，１Ｈ），３．６０−３．８２（ｍ，２．５Ｈ），３．９１−４．０５（ｍ，１Ｈ），４．４５（ｍ，０．５Ｈ），６．７５（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．７），６．９８（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝６．３），７．２０−７．３５（ｍ，５Ｈ），８．１２（ｂｒ ｓ，１．５Ｈ），８．２５（ｂｒ ｓ，１．５Ｈ），８．７０（ｍ，１Ｈ）．【０１１６】
〔参考例１４〕
（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−インダニル）−４−フェニルブタナミド塩酸塩
エチルアミン水溶液の代わりに２−アミノインダンを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（２−インダニルアミノ）−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。
（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（２−インダニルアミノ）−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−インダニル）−４−フェニルブタナミド塩酸塩を白色固体として得た。
融点：１８３．０−１８４．８℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２．７６−２．９６（ｍ，４Ｈ），３．０１−３．１８（ｍ，２Ｈ），３．６２（ｍ，０．５Ｈ），３．７４（ｍ，０．５Ｈ），３．９２（ｍ，０．５Ｈ），４．２５−４．３９（ｍ，１Ｈ），４．４９（ｍ，０．５Ｈ），６．４８（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．７），６．７２（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．７），７．１３−７．３５（ｍ，９Ｈ），８．１５（ｍ，３．５Ｈ），８．２６（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．２）．【０１１７】
〔参考例１５〕
（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−メトキシエチル）−４−フェニルブタナミド塩酸塩
エチルアミン水溶液の代わりにメトキシエチルアミンを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−（２−メトキシエチル）−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。
（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−（２−メトキシエチル）−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−メトキシエチル）−４−フェニルブタナミド塩酸塩を白色固体として得た。
融点：１１３．９−１１７．７℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），２．９５（ｍ，１Ｈ），３．１０−３．１９（ｍ，２Ｈ），３．２２（ｓ，１．５Ｈ），３．２３（ｓ，１．５Ｈ），３．２８−３．３４（ｍ，２Ｈ），３．５７（ｍ，０．５Ｈ），３．７０（ｍ，０．５Ｈ），３．９２（ｍ，０．５Ｈ），４．３２（ｍ，０．５Ｈ），６．５９（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝４．５），６．８７（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝６．０），７．２２−７．３６（ｍ，５Ｈ），７．９２（ｔ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．７），７．９８（ｔ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．１），８．０９（ｂｒ ｓ，１．５Ｈ），８．２４（ｂｒ ｓ，１．５Ｈ）．【０１１８】
〔参考例１６〕
（３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−エチル−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタナミド塩酸塩（１） Ｂｏｃ−Ｌ−ホモフェニルアラニン（２０ｇ，７２ｍｍｏｌ）のジメトキシエタン（１００ｍＬ）溶液にＮ−メチルモルホリン（７．２ｇ，７２ｍｍｏｌ）とクロロギ酸イソブチル（９．８ｇ，７２ｍｍｏｌ）を氷冷条件下で加えた。攪拌１時間後、反応液をろ過し、ろ液をアイスバスで冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（４．１ｇ，１０７ｍｍｏｌ）の水溶液（１０ｍＬ）を加え、さらに水（３００ｍＬ）を加えた。生じた沈殿物をろ取して、これを水及びメタノールで洗浄しＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ホモフェニルアラニノール（１５ｇ，７９％）を無色結晶として得た。
（２） Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニノールの代わりにＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ホモフェニルアラニノールを用いて参考例８（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ホモフェニルアラニナールを無色オイル状物として得た。
（３） Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニナールの代わりにＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ホモフェニルアラニナールを用いて参考例８（３）と同様の反応を行い、（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸を白色固体として得た。
（４） （３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の代わりに（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸を用いて参考例８（４）と同様の反応を行い、（３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸を無色オイル状物として得た。
（５） （３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の代わりに（３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸を用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソ−１−（フェニルエチル）プロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。
（６） （（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソ−１−（フェニルエチル）プロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、（３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−エチル−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタナミド塩酸塩を白色固体として得た。
融点：１３４．４−１３４．９℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．９９−１．０６（ｍ，３Ｈ），１．６５−１．９６（ｍ，２Ｈ），２．５４−２．７６（ｍ，２Ｈ），３．０７−３．２３（ｍ，２Ｈ），４．１５（ｂｒ ｓ，０．５Ｈ），４．２５（ｂｒ ｓ，０．５Ｈ），６．４４（ｂｒ ｓ，０．５Ｈ），６．５５（ｂｒ ｓ，０．５Ｈ），７．１７−７．３３（ｍ，５Ｈ），７．９９（ｂｒ ｓ，１．５Ｈ），８．１５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．２），８．２３（ｂｒ ｓ，１．５Ｈ）．【０１１９】
〔参考例１７〕
（３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−シクロプロピル−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタナミド塩酸塩
エチルアミン水溶液の代わりにシクロプロピルアミンを用いて参考例１６（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソ−１−（フェニルエチル）プロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。
（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソ−１−（フェニルエチル）プロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例１６（６）と同様の反応を行い、（３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−シクロプロピル−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタナミド塩酸塩を白色固体として得た。
融点：１４０．２−１４１．３℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．４６−０．６４（ｍ，４Ｈ），１．６４−１．９９（ｍ，２Ｈ），２．５４−２．７８（ｍ，３Ｈ），３．３５（ｍ，１Ｈ），４．１３（ｂｒ ｓ，０．５Ｈ），４．２６（ｂｒ ｓ，０．５Ｈ），６．３７（ｂｒ ｓ，０．５Ｈ），６．５１（ｂｒ ｓ，０．５Ｈ），７．１７−７．３３（ｍ，５Ｈ），８．０５（ｂｒ ｓ，１．５Ｈ），８．１５（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝４．５），８．２０（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝４．８），８．２７（ｂｒ ｓ，１．５Ｈ）．【０１２０】
〔参考例１８〕
（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−メチル−Ｎ−（２−フェノキシエチル）ヘキサナミド塩酸塩
（１） Ｌ−フェニルアラニノールの代わりにＬ−ロイシノールを用いて、参考例８（１）と同様の反応を行い、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシノール（７０ｇ，８４％）を無色オイル状物として得た。
（２） Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニノールの代わりにＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシノールを用いて参考例８（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシナールを無色オイル状物として得た。
（３） Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニナールの代わりにＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシナールを用いて参考例８（３），（４）と同様の反応を行い、（３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸を無色オイル状物として得た。
（４） （３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の代わりに（３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸を用い、エチルアミン水溶液の代わりに２−フェノキシエチルアミンを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−（２−メチルプロピル）−３−オキソ−３−（２−フェノキシエチル）アミノプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（５） （（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−（２−メチルプロピル）−３−オキソ−３−（２−フェノキシエチル）アミノプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。
融点：９３．６−９６．２℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．７１−０．８９（ｍ，６Ｈ），１．３５−１．４７（ｍ，２Ｈ），１．７２（ｍ，１Ｈ），３．４８−３．５４（ｍ，４Ｈ），４．００−４．０７（ｍ，２Ｈ），４．１２（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝３．６），４．３３（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝１．８），６．９１−６．９６（ｍ，３Ｈ），７．２７−７．３２（ｍ，２Ｈ），７．９５（ｂｒ ｓ，１．５Ｈ），８．
１９−８．２９（ｍ，２．５Ｈ）．【０１２１】
〔参考例１９〕
３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタナミド塩酸塩 
エチルアミン水溶液の代わりにアンモニアガスを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（１−ベンジル−３−アミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（１−ベンジル−３−アミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２．８２（ｍ，１Ｈ），２．９３（ｍ，１Ｈ），３．６１（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，０．５Ｈ），４．２６（ｍ，０．５Ｈ），６．４８（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝４．８），６．７５（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．７），７．２４−７．３５（ｍ，５Ｈ），７．５２（ｍ，２Ｈ），８．０４（ｂｒｓ，１．５Ｈ），８．１７（ｂｒｓ，１．５Ｈ）．【０１２２】
〔参考例２０〕
Ｎ−（（２−（ピリジン−２−イル）エチル）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１） （Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりに（２−ピリジル）エタノールを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、Ｎ−スクシンイミジル２−（ピリジン−２−イル）エチルカルボナートを褐色オイル状物として得た。
（２） Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにＮ−スクシンイミジル２−（ピリジン−２−イル）エチルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−（ピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３） Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（２−（ピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−（ピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを白色固体として得た。
（４） Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（２−（ピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８２−０．９１（ｍ，６Ｈ），１．４２−１．７６（ｍ，３Ｈ），２．７６−２．８１（ｍ，４Ｈ），３．００−３．０６（ｍ，２Ｈ），４．３０−４．４０（ｍ，３Ｈ），７．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１，５．３），７．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８），７．７１（ｍ，１Ｈ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１），８．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５）．【０１２３】
〔参考例２１〕
Ｎ−（（２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１） （Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりに２−（６−メチル−２−ピリジル）エタノールを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、Ｎ−スクシンイミジル２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルカルボナートを褐色オイル状物として得た。
（２） Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにＮ−スクシンイミジル２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３） Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色オイル状物として得た。
（４） Ｎ−（（２−メトキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８３−０．９２（ｍ，６Ｈ），１．４９−１．７７（ｍ，３Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），２．９９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．５），４．２９−４．４２（ｍ，３Ｈ），７．０７−７．０９（ｍ，２Ｈ），７．５８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．７），７．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４）．【０１２４】
〔参考例２２〕
Ｎ−（（２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１） （Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりに（５−エチルピリジン−２−イル）エタノールを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、Ｎ−スクシンイミジル２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルカルボナートを褐色オイル状物として得た。
（２） Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにＮ−スクシンイミジル２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３） Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色オイル状物として得た。
（４） Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．７５−０．９２（ｍ，６Ｈ），１．１２−１．２５（ｍ，３Ｈ），１．３６−１．７２（ｍ，３Ｈ），２．５４−２．６３（ｍ，２Ｈ），２．８１−２．８３（ｍ，４Ｈ），２．９６−３．０２（ｍ，２Ｈ），４．０４（ｍ，１Ｈ），４．２９−４．３７（ｍ，２Ｈ），７．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８），７．５３（ｍ，１Ｈ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８），８．３４（ｍ，１Ｈ）．【０１２５】
〔参考例２３〕
Ｎ−（（２−ｔｅｒｔ-ブトキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１） （Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにエチレングリコールｔｅｒｔ-ブチルエーテルを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、Ｎ−スクシンイミジル２−ｔｅｒｔ-ブトキシエチルカルボナートを無色オイル状物として得た。
（２） Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにＮ−スクシンイミジル２−ｔｅｒｔ-ブトキシエチルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−ｔｅｒｔ-ブトキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３） Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（２−ｔｅｒｔ-ブトキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−ｔｅｒｔ-ブトキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色オイル状物として得た。
（４） Ｎ−（（２−メトキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（２−ｔｅｒｔ-ブトキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），０．９２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），１．１３（ｓ，９Ｈ），１．６１（ｍ，１Ｈ），１．７４ （ｍ，２Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），３．４８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．７），４．０４（ｍ，２Ｈ），４．４０（ｍ，１Ｈ），８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．【０１２６】
〔参考例２４〕
Ｎ−（（２−イソプロポキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１） （Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにエチレングリコールイソプロピルエーテルを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、Ｎ−スクシンイミジル２−イソプロポキシエチルカルボナートを無色オイル状物として得た。
（２） Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにＮ−スクシンイミジル２−イソプロポキシエチルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−イソプロポキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３） Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（２−イソプロポキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−イソプロポキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色オイル状物として得た。
（４） Ｎ−（（２−メトキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（２−イソプロポキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６），０．９２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），１．０８（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．３），１．６１（ｍ，１Ｈ），１．７４（ｍ，２Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），３．５３（ｍ，２Ｈ），３．５７（ｍ，１Ｈ），４．０７（ｍ ２Ｈ），４．４０（ｍ，１Ｈ），８．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．【０１２７】
〔製造例１〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（エチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１）【０１２８】
【化４６】
2017204166.tif 000048
参考例１の化合物（１．２ｇ，３．６ｍｍｏｌ）と参考例８の化合物（１．０ｇ，４．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液にトリエチルアミン（１．１ｇ，１１ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で１８時間攪拌し、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルで溶解し、この溶液を１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。得られた固体を酢酸エチル／ヘキサン（１：９）混液で洗浄し（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（０．７５ｇ，４７％）を白色固体として得た。（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（０．７ｇ，１．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（７０ｍＬ）溶液にデス・マーチン試薬（１．０ｇ，２．４ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で１８時間攪拌した。そこへ、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液（３５ｍＬ）と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３５ｍＬ）を加え、この溶液を室温で３０分攪拌した。有機層を分離し、これを１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル／ヘキサン混液で結晶化し表題化合物（０．６２ｇ，８８％）を無色結晶として得た。
融点：１３８．０−１３８．３°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．５），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２），１．０４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５６（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｍ，１Ｈ），３．１４（ｍ，３Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．５），４．０４（ｍ，３Ｈ），５．１９（ｍ，１Ｈ），７．１６−７．３３（ｍ，６Ｈ），８．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），８．７０（ｍ，１Ｈ）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２２Ｈ３３Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｎａ）＋，４５８．２２６７，実測値，４５８．２３６１．【０１２９】
〔製造例２〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（エチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステル（化合物２）【０１３０】
【化４７】
2017204166.tif 000049
参考例１の化合物の代わりに参考例２の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１５８．９−１６０．７°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），１．０４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｍ，１Ｈ），１．８３（ｍ，１Ｈ），２．０８（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｍ，１Ｈ），３．１４（ｍ，３Ｈ），３．６１−３．７８（ｍ，４Ｈ），４．０１（ｍ，１Ｈ），５．０７（ｍ，１Ｈ），５．１９（ｍ，１Ｈ），７．１７−７．３３（ｍ，６Ｈ），８．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），８．６９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２３Ｈ３３Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４４８．２４４７，実測値，４４８．２５０９．【０１３１】
〔製造例３〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（エチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルエステル（化合物３）【０１３２】
【化４８】
2017204166.tif 000050
参考例１の化合物の代わりに参考例３の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１４０．０−１４１．８°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８４（ｍ，６Ｈ），１．０４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｍ，３Ｈ），１．７９（ｍ，２Ｈ），２．８２（ｍ，１Ｈ），３．１４（ｍ，３Ｈ），３．４１（ｍ，２Ｈ），３．７８（ｍ，２Ｈ），４．０２（ｍ，１Ｈ），４．６６（ｍ，１Ｈ），５．１９（ｍ，１Ｈ），７．１５−７．３３（ｍ，６Ｈ），８．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），８．６９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２４Ｈ３５Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｎａ）＋，４８４．２４２４，実測値，４８４．２４８６．【０１３３】
〔製造例４〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物４）【０１３４】
【化４９】
2017204166.tif 000051
参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１１２．４−１１３．５°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８（ｍ，２Ｈ），０．６５（ｍ，２Ｈ），０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５６（ｍ，１Ｈ），２．６８−２．８８（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｍ，１Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．５），４．０４（ｍ，３Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．１７−７．３４（ｍ，６Ｈ），８．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），８．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２３Ｈ３３Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｎａ）＋，４７０．２２６７，実測値，４７０．２４４１．［α］Ｄ２５＋６．３°（ｃ０．２０，ＤＭＳＯ）【０１３５】
〔製造例５〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステル（化合物５）【０１３６】
【化５０】
2017204166.tif 000052
参考例１の化合物の代わりに参考例２の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１６９．２−１７０．５°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８（ｍ，２Ｈ），０．６５（ｍ，２Ｈ），０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝８．１），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），１．３４（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｍ，１Ｈ），１．８３（ｍ，１Ｈ），２．０８（ｍ，１Ｈ），２．７９（ｍ，２Ｈ），３．１２（ｍ，１Ｈ），３．６１−３．８０（ｍ，４Ｈ），４．０２（ｍ，１Ｈ），５．０８（ｍ，１Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．２２−７．３５（ｍ，６Ｈ），８．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），８．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２４Ｈ３３Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｎａ）＋，４８２．２２６７，実測値，４８２．２５８６．【０１３７】
〔製造例６〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルエステル（化合物６）【０１３８】
【化５１】
2017204166.tif 000053
参考例１の化合物の代わりに参考例３の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１３７．０−１３８．２°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８（ｍ，２Ｈ），０．６５（ｍ，２Ｈ），０．８４（ｍ，６Ｈ），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｍ，３Ｈ），１．８０（ｍ，２Ｈ），２．７９（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｍ，１Ｈ），３．４１（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｍ，２Ｈ），４．０３（ｍ，１Ｈ），４．６５（ｍ，１Ｈ），５．１８（ｍ，１Ｈ），７．１５−７．３０（ｍ，６Ｈ），８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２５Ｈ３５Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４７４．２６０４，実測値，４７４．２６４３．【０１３９】
〔製造例７〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（プロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物７）【０１４０】
【化５２】
2017204166.tif 000054
参考例８の化合物の代わりに参考例１０の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−３−（プロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１０８．８−１０９．９°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８３（ｍ，９Ｈ），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．４６（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｍ，１Ｈ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０，９．２），３．０８（ｍ，３Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．４），４．０４（ｍ，３Ｈ），５．１９（ｍ，１Ｈ），７．２２−７．２８（ｍ，６Ｈ），８．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．６８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２３Ｈ３５Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４５０．２６０４，実測値，４５０．２８３２．【０１４１】
〔製造例８〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロブチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物８）【０１４２】
【化５３】
2017204166.tif 000055
参考例８の化合物の代わりに参考例１１の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロブチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１１４．２−１１５．３°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８４（ｍ，６Ｈ），１．３４（ｍ，２Ｈ），１．４９−１．７２（ｍ，３Ｈ），２．１０（ｍ，４Ｈ），２．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．８，９．３），３．１０（ｍ，１Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４７（ｍ，２Ｈ），４．０３（ｍ，３Ｈ），４．２２（ｍ，１Ｈ），５．１５（ｍ，１Ｈ），７．２４（ｍ，６Ｈ），８．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），８．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２４Ｈ３５Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｎａ）＋，４８４．２４２４，実測値，４８４．２４００．【０１４３】
〔製造例９〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−ブチルアミノ−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物９）【０１４４】
【化５４】
2017204166.tif 000056
参考例８の化合物の代わりに参考例１２の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−ブチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：９４．０−９５．２°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８５（ｍ，９Ｈ），１．２５（ｍ，２Ｈ），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｍ，２Ｈ），１．５６（ｍ，１Ｈ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．８，９．０），３．１０
（ｍ，３Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．５），４．０４（ｍ，３Ｈ），５．１８（ｍ，１Ｈ），７．２１−７．２９（ｍ，６Ｈ），８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），８．６７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．０）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２４Ｈ３７Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４６４．２７６０，実測値，４６４．２８７０．【０１４５】
〔製造例１０〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１０）【０１４６】
【化５５】
2017204166.tif 000057
参考例８の化合物の代わりに参考例１３の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−３−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１５２．５−１５３．９°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８４（ｍ，６Ｈ），１．３４（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｍ，１Ｈ），２．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０，８．６），３．１０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．１，４．８），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．７），３．９０（ｍ，２Ｈ），４．０４（ｍ，３Ｈ），５．１４（ｍ，１Ｈ），７．２１−７．３１（ｍ，６Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），９．２９（ｍ，１Ｈ）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２２Ｈ３０Ｆ３Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４９０．２１６５，実測値，４９０．２４３４．【０１４７】
〔製造例１１〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（２−インダニルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１１）【０１４８】
【化５６】
2017204166.tif 000058
参考例８の化合物の代わりに参考例１４の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−（２−インダニルアミノ）−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１４１．９−１４３．５°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），０．８６（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），１．３６（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，１Ｈ），２．８０−２．９６（ｍ，３Ｈ），３．１０−３．１８（ｍ，３Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．７），４．０４（ｍ，３Ｈ），４．５０（ｍ，１Ｈ），５．１９（ｍ，１Ｈ），７．１３−７．３０（ｍ，１０Ｈ），８．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２９Ｈ３７Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，５２４．２７６０，実測値，５２４．２８１０．【０１４９】
〔製造例１２〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（２−メトキシエチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１２）【０１５０】
【化５７】
2017204166.tif 000059
参考例８の化合物の代わりに参考例１５の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−（２−メトキシエチルアミノ）−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１２７．０−１２７．９°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），０．８６（ｄ，３，Ｊ＝６．９），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５６（ｍ，１Ｈ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．８，９．０），３．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０，４．４），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．１６−３．３４（ｍ，２Ｈ），３．３９（ｍ，２Ｈ），３．４８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．５），４．０４（ｍ，３Ｈ），５．２０（ｍ，１Ｈ），７．１８−７．３０（ｍ，６Ｈ），８．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．６６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２３Ｈ３５Ｎ３Ｏ７（Ｍ＋Ｎａ）＋，４８８．２３７３，実測値，４８８．２６８０．【０１５１】
〔製造例１３〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−３−エチルアミノ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１３）【０１５２】
【化５８】
2017204166.tif 000060
参考例８の化合物の代わりに参考例１６の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１１９．１−１２０．４°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．３），１．０３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２），１．４３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２），１．６１−１．８５（ｍ，２Ｈ），２．０７（ｍ，１Ｈ），２．５６−２．７４（ｍ，２Ｈ），３．０７−３．１７（ｍ，２Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．７），４．０５−４．１４（ｍ，３Ｈ），４．８９（ｍ，１Ｈ），７．１６−７．３６（ｍ，５Ｈ），７．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４），８．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．６５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．９）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２３Ｈ３５Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４５０．２６０４，実測値，４５０．２７０１．【０１５３】
〔製造例１４〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−３−エチルアミノ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステル（化合物１４）【０１５４】
【化５９】
2017204166.tif 000061
参考例１の化合物の代わりに参考例２の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例１６の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１１１．９−１１４．５°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．３），１．０３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２），１．４３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４），１．６０−１．９１（ｍ，３Ｈ），２．０９（ｍ，２Ｈ），２．５６−２．７６（ｍ，２Ｈ），３．０７−３．１７（ｍ，２Ｈ），３．６３−３．８２（ｍ，４Ｈ），４．０２−４．１３（ｍ，１Ｈ），４．８８（ｍ，１Ｈ），５．０９−５．１３（ｍ，１Ｈ），７．１６−７．３１（ｍ，５Ｈ），７．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．６６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２４Ｈ３５Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４６２．２６０４，実測値，４６２．２８７０．【０１５５】
〔製造例１５〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−３−シクロプロピルアミノ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１５）【０１５６】
【化６０】
2017204166.tif 000062
参考例８の化合物の代わりに参考例１７の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１０９．７−１１１．１°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５３−０．６８（ｍ，４Ｈ），０．８７−０．９１（ｍ，６Ｈ），１．４３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２），１．５９−１．８５（ｍ，２Ｈ），２．０１−２．１３（ｍ，１Ｈ），２．５６−２．７４（ｍ，３Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４８−３．５１（ｍ，２Ｈ），４．０５−４．１４（ｍ，３Ｈ），４．８７（ｍ，１Ｈ），７．１７−７．３６（ｍ，６Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），８．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２４Ｈ３５Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４６２．２６０４，実測値，４６２．２７４２．【０１５７】
〔製造例１６〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−３−シクロプロピルアミノ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステル（化合物１６）【０１５８】
【化６１】
2017204166.tif 000063
参考例１の化合物の代わりに参考例２の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例１７の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１１５．８−１１６．２°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５６−０．５９（ｍ，４Ｈ），０．８８（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．３），１．４２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４），１．６０−１．９１（ｍ，３Ｈ），２．０９（ｍ，２Ｈ），２．５６−２．７６（ｍ，３Ｈ），３．６３−３．８１（ｍ，４Ｈ），４．０５−４．１３（ｍ，１Ｈ），４．８７（ｍ，１Ｈ），５．０９−５．１３（ｍ，１Ｈ），７．２０−７．３５（ｍ，６Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２５Ｈ３５Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４７４．２６０４，実測値，４７４．２５９８．【０１５９】
〔製造例１７〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル（化合物１７）【０１６０】
【化６２】
2017204166.tif 000064
参考例１の化合物の代わりに参考例４の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１２７．９−１２８．７°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５４−０．６６（ｍ，４Ｈ），０．８１−０．８６（ｍ，６Ｈ），１．３０−１．４２（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，１Ｈ），２．７３（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．３，９．２），３．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．８，４．２），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４２−３．４４（ｍ，２Ｈ），３．５０−３．５７（ｍ，４Ｈ），３．９９−４．０４（ｍ，３Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．２２−７．３０（ｍ，６Ｈ），８．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２５Ｈ３７Ｎ３Ｏ７（Ｍ＋Ｎａ）＋，５１４．２５３０，実測値，５１４．２９４４．［α］Ｄ２５＋１３．９°（ｃ０．２０，ＤＭＳＯ）【０１６１】
〔製造例１８〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルエステル（化合物１８）【０１６２】
【化６３】
2017204166.tif 000065
参考例１の化合物の代わりに参考例５の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１１６．０−１１７．２°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８（ｍ，２Ｈ），０．６５（ｍ，２Ｈ），０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．８），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，１Ｈ），２．７３−２．８６（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｍ，１Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４４（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｍ，６Ｈ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．７），４．０４（ｍ，３Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．２２−７．３１（ｍ，６Ｈ），８．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２７Ｈ４１Ｎ３Ｏ８（Ｍ＋Ｎａ）＋，５５８．２７９２，実測値，５５８．２７１７．［α］Ｄ２５＋２．５°（ｃ０．２０，ＤＭＳＯ）【０１６３】
〔製造例１９〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルエステル（化合物１９）【０１６４】
【化６４】
2017204166.tif 000066
参考例１の化合物の代わりに参考例６の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：９７．５−９８．５°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５４−０．６６（ｍ，４Ｈ），０．８１−０．８６（ｍ，６Ｈ），１．３２−１．３７（ｍ，２Ｈ），１．５６（ｍ，１Ｈ），２．７３（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０，９．２），３．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．１，４．２），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４１−３．４４（ｍ，２Ｈ），３．５０−３．５１（ｍ，１０Ｈ），３．５４−３．５７（ｍ，２Ｈ），３．９９−４．０８（ｍ，３Ｈ），５．１６（ｍ，１Ｈ），７．２２−７．３１（ｍ，６Ｈ），８．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），８．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２９Ｈ４５Ｎ３Ｏ９（Ｍ＋Ｎａ）＋，６０２．３０５４，実測値，６０２．３４２７．［α］Ｄ２５＋６．９°（ｃ０．２０，ＤＭＳＯ）【０１６５】
〔製造例２０〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルエステル（化合物２０）【０１６６】
【化６５】
2017204166.tif 000067
参考例１の化合物の代わりに参考例７の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：９８．５−９９．９°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８（ｍ，２Ｈ），０．６５（ｍ，２Ｈ），０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．８），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，１Ｈ），２．７３−２．８６（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｍ，１Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４２（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｍ，１４Ｈ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝３．３），４．０４（ｍ
，３Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．２２−７．３０（ｍ，６Ｈ），８．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ３１Ｈ４９Ｎ３Ｏ１０（Ｍ＋Ｎａ）＋，６４６．３３１６，実測値，６４６．３４０４．【０１６７】
〔製造例２１〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−１−（２−メチルプロピル）−３−（２−フェノキシエチル）アミノプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物２１）【０１６８】
【化６６】
2017204166.tif 000068
参考例８の化合物の代わりに参考例１８の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−（２−メチルプロピル）−３−オキソ−３−（２−フェノキシエチル）アミノプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：９９．７−１００．５°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８８（ｄｄ，１２Ｈ，Ｊ＝１２．０，６．３），１．３５−１．５４（ｍ，４Ｈ），１．５８−１．７５（ｍ，２Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４６−３．５３（ｍ，４Ｈ），４．０３−４．０７（ｍ，５Ｈ），５．０６（ｍ，１Ｈ），６．９１−６．９５（ｍ，３Ｈ），７．２６−７．３１（ｍ，３Ｈ），８．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），８．８１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．９）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２５Ｈ３９Ｎ３Ｏ７（Ｍ＋Ｈ）＋，４９４．２８６６，実測値，４９４．２９６７．【０１６９】
〔製造例２２〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−１−（２−メチルプロピル）−３−（２−フェノキシエチル）アミノプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル（化合物２２）【０１７０】
【化６７】
2017204166.tif 000069
参考例１の化合物の代わりに参考例４の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例１８の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−（２−メチルプロピル）−３−オキソ−３−（２−フェノキシエチル）アミノプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：５３．３−５４．１°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８７（ｄｄ，１２Ｈ，Ｊ＝１２．２，６．５），１．３５−１．５４（ｍ，４Ｈ），１．５８−１．７５（ｍ，２Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４１−３．４５（ｍ，２Ｈ），３．４７−３．５７（ｍ，６Ｈ），４．０３−４．０７（ｍ，５Ｈ），５．０６（ｍ，１Ｈ），６．９１−６．９６（ｍ，３Ｈ），７．２６−７．３１（ｍ，３Ｈ），８．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．８３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２７Ｈ４３Ｎ３Ｏ８（Ｍ＋Ｈ）＋，５３８．３１２８，実測値，５３８．３１４０．【０１７１】
〔製造例２３〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１ＲＳ）−３−アミノ−１−ベンジル−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル（化合物２３）【０１７２】
【化６８】
2017204166.tif 000070
参考例１の化合物の代わりに参考例４の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例１９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１ＲＳ）−３−アミノ−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．７７（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），０．８３（ｄ，１．５Ｈ，Ｊ＝６．６），０．８６（ｄ，１．５Ｈ，Ｊ＝６．９），１．０５−１．６３（ｍ，３Ｈ），２．６８−２．８５（ｍ，１Ｈ），３．１２（ｍ，１Ｈ），３．２３（ｓ，３Ｈ），３．４２（ｍ，２Ｈ），３．５１−３．５６（ｍ，４Ｈ），４．０３（ｍ，３Ｈ），５．２２（ｍ，１Ｈ），７．２１−７．３１（ｍ，６Ｈ），７．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４），８．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１８），８．１９（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝６．９），８．２６（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．５）．【０１７３】
〔製造例２４〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（ピリジン−２−イル）エチルエステル（化合物２４）【０１７４】
【化６９】
2017204166.tif 000071
参考例１の化合物の代わりに参考例２０の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（ピリジン−２−イル）エチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８−０．６６（ｍ，４Ｈ），０．８３（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝７．１），１．３１−１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５３（ｍ，１Ｈ），２．７４（ｍ，１Ｈ），２．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．１，９．３），３．０２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３），３．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０，４．１），４．０１（ｍ，１Ｈ），４．２８−４．３２（ｍ，２Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．１４−７．３４（ｍ，８Ｈ），７．７５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．８），８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝ ７．２）， ８．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２），８．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５）．【０１７５】
〔製造例２５〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルエステル（化合物２５）【０１７６】
【化７０】
2017204166.tif 000072
参考例１の化合物の代わりに参考例２１の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１６２．０−１６３．６℃． 
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５４−０．６６（ｍ，４Ｈ），０．７６−０．８６（ｍ，６Ｈ），１．５４（ｍ，１Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ），２．７３−２．８６（ｍ，２Ｈ），２．９６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．５），３．１１（ｍ，１Ｈ），４．０３（ｍ，１Ｈ），４．２１−４．３４（ｍ，２Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．０７−７．３０（ｍ，８Ｈ），７．５８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．７），８．２３（ｄ，１
Ｈ，Ｊ＝６．９），８．７２ （ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８）． 【０１７７】
〔製造例２６〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルエステル（化合物２６）【０１７８】
【化７１】
2017204166.tif 000073
参考例１の化合物の代わりに参考例２２の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１１９．９−１２１．０℃． 
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８−０．６６（ｍ，４Ｈ），０．７５−０．８５（ｍ，６Ｈ），１．１７（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．７），１．３３−１．３６（ｍ，２Ｈ），１．５３（ｍ，１Ｈ），２．５８（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１５．５，８．３），２．７４−２．８５（ｍ，２Ｈ），２．９４−２．９８（ｍ，２Ｈ），３．１２（ｍ，１Ｈ），４．０４（ｍ，１Ｈ），４．２８−４．２９（ｍ，２Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．１３−７．２６（ｍ，７Ｈ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１），８．２２−８．３５（ｍ，２Ｈ），８．７５（ｍ，１Ｈ）．【０１７９】
〔製造例２７〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−ｔｅｒｔ-ブトキシエチルエステル（化合物２７）【０１８０】
【化７２】
2017204166.tif 000074
参考例１の化合物の代わりに参考例２３の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−ｔｅｒｔ-ブトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８（ｍ，２Ｈ），０．６５（ｍ，２Ｈ），０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．５），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），１．１２（ｓ，９Ｈ），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，１Ｈ），２．７４（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｍ，１Ｈ），３．１１（ｍ，１Ｈ），３．４５（ｍ，２Ｈ），３．９８（ｍ，３Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．２４（ｍ，６Ｈ），８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），８．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８）．【０１８１】
〔製造例２８〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−イソプロポキシエチルエステル（化合物２８）【０１８２】
【化７３】
2017204166.tif 000075
参考例１の化合物の代わりに参考例２４の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−イソプロポキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８（ｍ，２Ｈ），０．６５（ｍ，２Ｈ），０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），１．０７（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝５．７），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，１Ｈ），２．７４（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｍ，１Ｈ），３．１２（ｍ，１Ｈ），３．５０（ｍ，２Ｈ），３．５５（ｍ，１Ｈ），４．０１（ｍ，３Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．２４（ｍ，６Ｈ），８．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６）．【０１８３】
μ−カルパイン及びｍ−カルパイン阻害活性の測定
μ−及びｍ−カルパインの阻害活性を文献（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３年、第２０８巻，ｐ．３８７−３９２）に記載された方法に準じて測定した。すなわち、種々の濃度の被験化合物を含むＤＭＳＯ溶液（２．５μＬ）に、０．５ｍｇ／ｍＬのカゼイン、５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２０ｍＭのジチオスレイトール及び１．０ｎｍｏｌのμ−カルパイン（ヒト赤血球由来、コスモ・バイオ株式会社製）又はｍ−カルパイン（ブタ腎臓由来、コスモ・バイオ株式会社製）を含む反応液（２００μＬ）を９６穴プレート上で加えた。そこへ、２０ｍＭの塩化カルシウム水溶液（５０μＬ）を加え、３０℃で６０分間反応させた。この反応液（１００μＬ）を別の９６穴プレートに移し、精製水（５０μＬ）と５０％のＰｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（バイオラド社製；カタログＮｏ．５００−０００６）水溶液（１００μＬ）を加えて室温で１５分間放置した後、５９５ｎＭで吸光度を測定した。被験化合物を含まず同様に処理したものをコントロール値、２０ｍＭ塩化カルシウム水溶液の代わりに１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液（５０μＬ）を加え同様に処理したものをブランク値とし、下記の式より算出される阻害率を計算し、５０％阻害に必要な濃度（ＩＣ５０）を求めた。
阻害率（％）＝｛１−（測定値−ブランク値）／（コントロール値−ブランク値）｝×１００
当該濃度（ＩＣ５０）を酵素（カルパイン）阻害活性（μＭ）として、表１に示した。各化合物はμ−カルパイン及びｍ−カルパインの活性を阻害した。【０１８４】
【表１】
2017204166.tif 000076
これらの化合物のうち、化合物１７を以下の検討に用いた。化合物１７はＳＮＪ−１９４５である。以下、化合物１７をＳＮＪ−１９４５とも表記する。【０１８５】
なお、以下の検討において用いた実験動物や実験細胞は、基本的に上記非特許文献１（Ｍａｓａｍｉ  Ｙａｍａｄａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １５，１２０２−１２０７（２００９））と同様にして調製した。また、実験動物を死亡させる場合には、まず致死量のエーテルを用いて麻酔を施し、安楽死させた。
後根神経節細胞（dorsal root ganglina neuron: DRG neuron）を用いた軸索再生実験 
外傷などにより切断された神経細胞の軸索が標的細胞へ向かって伸展し、神経回路を再構築することがある。これを軸索再生と呼ぶ。末梢神経軸索は、損傷領域を超えて再生する可能性を有するが、その再生能力は年齢とともに低下する。マウス後根神経節細胞を用いて年齢と軸索再生の相関を検討するため、以下の実験を行った。なお、後根神経節細胞は軸索のみを伸展させるので軸索再生の観察に適している。【０１８６】
生後のマウス（生後３、１０又は１５日後）から実体顕微鏡下で後根神経節を無菌的に摘出し、軽くピペッティングにより組織片を破砕した後、終濃度０．０２５％トリプシン／０．００１３％ＤＮａｓｅＩで３７℃、２０分間処理した。遠心後、１０％ウマ血清を含むＢＭＥ培養液（Ｇｉｂｃｏ）を加えて洗浄し、酵素反応を停止させた後、終濃度０．００５２％ＤＮａｓｅＩ／１０％ウマ血清を含むＢＭＥ培養液を加えてピペッティングし、細胞用メッシュ  （Ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ，  径７０μｍ；  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通過させた後、６穴プレート（Ｎｕｎｃ）中に、ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）とラミニン（Ｓｉｇｍａ）で処理したカバーガラス（２４ｘ２４  ｍｍ；  松浪硝子）を敷き、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｎ−２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎ；  Ｇｉｂｃｏ）を含むＢＭＥ培養液中に移し、２４−４８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、４％パラホルムアルデヒドで固定し（室温、１５分間）、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理後（室温、１０分間）、軸索解析のために抗ニューロン特異的β−ＩＩＩチューブリン  モノクローナル抗体であるＴｕｊ１抗体（マウス・モノクローナル抗体  ａｂ１４５４５：アブカム）を、核染色の為に、最終濃度が０．２μＭになるようにＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を添加し、さらに室温で１５分間インキュベーションした後、繰り返しよく洗浄し、凝集塊が壊れないように丁寧に蛍光顕微鏡観察用グリセロール（Ｍｅｒｃｋ）を用いて包埋した。共焦点レーザー顕微鏡（ＴＣＳ−ＳＰ５，Ｌｅｉｃａ）にて観察を行った。同様にして、ＬＩＳ１ヘテロマウス（生後３日）からも後根神経節細胞を単離し、解析した。【０１８７】
生後３日のマウスから単離した後根神経節細胞は２４時間で長い軸索を伸展させるのに対して、生後１０日及び生後１５日のマウスから単離した後根神経節細胞は軸索伸展が有意に低下していることが分かった。また、ＬＩＳ１ヘテロマウス（生後３日）から単離した後根神経節細胞では、軸索伸展は不良であった（図１）。【０１８８】
後根神経節細胞におけるＬＩＳ１タンパク質の発現量の解析
後根神経節細胞をマウス（生後３日又は１５日）から単離し、培養開始からの時系列をおってＬＩＳ１タンパク質の発現量を検討した。タンパンク質の抽出は、後根神経節細胞５Ｘ１０４個当たりに１００μｌのタンパク質溶解液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ．  ６．８，  １．５％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  （ＳＤＳ），  ０．３％  ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ  （ＢＰＢ），  ０．３％  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏ−ｅｔｈａｎｏｌ  （２−ＭＥ），  １５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加え、さらに超音波処理によって完全に可溶化させることで行った。９５℃、５分間の熱処理の後、得られたタンパク質溶解液１μｌを１２．５％のＳＤＳ−アクリルアミド電気泳動によって分離し、抗ＬＩＳ１抗体を用いたウエスタンブロティングによってＬＩＳタンパク質を検出した（図２左側）。また、検出されたバンドの濃さを解析（ＧＡＰＤＨのバンドの濃さで補正）してＬＩＳタンパク質の発現量比を求めた（図２右側）。その結果、ＬＩＳ１は後根神経節細胞が軸索を伸展させる際に強く誘導されることが分かった。一方で、ＬＩＳ１の誘導は軸索伸展能と高い相関が見られ、生後３日のマウスから単離した後根神経節細胞では生後１５日のマウスから単離した後根神経節細胞と比較して高い発現量が見られることが分かった。【０１８９】
マウス後根神経節細胞の軸索伸展に対するＬｉｓ１遺伝子発現亢進の効果の解析
マウス後根神経節細胞の軸索伸展にＬＩＳ１が関与することが示唆されたため、ＬＩＳ１タンパンク質を増幅させる効果のあるＳＮＪ１９４５と軸索伸展の関係について検討した。なお、ＳＮＪ１９４５は、その優れたカルパイン阻害活性により、ＬＩＳ１タンパンク質を増幅させる効果を有することが、ＷＯ２０１２／０７４１２０号パンフレットに記載されている。【０１９０】
後根神経節細胞は生後のマウス（生後３又は１５日）から実体顕微鏡下で後根神経節を無菌的に摘出し、軽くピペッティングにより組織片を破砕した後、終濃度０．０２５％トリプシン／０．００１３％ＤＮａｓｅＩで３７℃、２０分間処理した。遠心後、１０％ウマ血清を含むＢＭＥ培養液（Ｇｉｂｃｏ）を加えて洗浄し、酵素反応を停止させた後、終濃度０．００５２％ＤＮａｓｅＩ／１０％ウマ血清を含むＢＭＥ培養液を加えてピペッティングし、細胞用メッシュ  （Ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ，  径７０μｍ；  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通過させた後、１０００回転／分で遠心分離した。ＬＩＳ１の発現ベクターは、ｐＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）のクローニング部位にマウスＬＩＳ１のｃＤＮＡ（アクセッションＮｏ．Ｍｍ．３９７１１１）を連結して作製した。エレクトロポレーション装置・ＮＥＯＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  社）を用いて１Ｘ１０６個の後根神経節細胞に対してＬＩＳ１を組み込んだｐＥＧＦＰベクター１μｇを導入し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間又は４８時間インキュベーションし、ＬＩＳ１を発現させた。単なるｐＥＧＦＰベクター１μｇを導入した後根神経節細胞をコントロールとした。各細胞を、上記軸索再生実験で行ったのと同様にして、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。【０１９１】
生後３日のマウスから単離した後根神経節細胞は上記検討結果と同様に顕著な軸索伸展を見せた。ただ、Ｌｉｓ１遺伝子発現亢進による軸索伸展促進効果は見られるものの、もともとの軸索伸展能が高く、有意差は認められなかった。一方、生後１５日のマウスから単離した後根神経節細胞は軸索伸展の能力は低かった。この生後１５日のマウスから単離した後根神経節細胞ではＬｉｓ１遺伝子発現亢進により顕著に軸索伸展が促進されることが分かった（図３）。【０１９２】
マウス後根神経節細胞の軸索伸展に対するＳＮＪ１９４５の効果の解析
後根神経節細胞を生後３日又は１５日のマウスから単離し、ＳＮＪ１９４５の添加有無と軸索の長さの相関を検討した。最終濃度が２００μＭになるようにＳＮＪ１９４５を単離した後根神経節細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間又は４８時間インキュベーションした。対照実験として１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をＳＮＪ１９４５の代わりに添加し同様にインキュベーションした。そして、上記軸索再生実験で行ったのと同様にして、共焦点レーザー顕微鏡による観察を行った。【０１９３】
生後３日のマウスから単離した後根神経節細胞は上記検討結果と同様に軸索伸展能を有していた。さらに、ＳＮＪ１９４５の添加による促進効果も見られた。生後１５日のマウスから単離した後根神経節細胞は軸索伸展の能力は低く、またＬＩＳ１の発現量も低かった（図４のｃ）。この生後１５日のマウスから単離した後根神経節細胞ではＳＮＪ１９４５は顕著な軸索伸展を促進する効果があることが分かった（図４）。【０１９４】
また、上記インキュベーション後に、上記「後根神経節細胞におけるＬＩＳ１タンパク質の発現量の解析」で行った操作と同様にして、ウエスタンブロティングによってＬＩＳタンパク質を検出した（図５左側）。また、検出されたバンドの濃さを解析してＬＩＳタンパク質の発現量比を求めた（図５右側）。その結果、生後３日のマウスから単離した後根神経節細胞ではＬＩＳ１の発現量がもともと高く、ＳＮＪ１９４５を添加しても発現量を大きく増やすことはできなかったが、生後１５日のマウスから単離した後根神経節細胞ではＬＩＳ１の発現量が低く、ＳＮＪ１９４５を添加することで発現量を有意に増やすことができた（図５）。【０１９５】
ＬＩＳ１遺伝子の発現調節領域の決定
ＬＩＳ１遺伝子の転写調節領域の同定のために、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。ルシフェラーゼ遺伝子を、転写調節領域を含むＤＮＡ断片の３’末端側に接合したプラスミド（ｐＧＶ３レポーター遺伝子ベクター）を構築し、マウスから単離した根神経節細胞に導入した。詳細には、生後３後あるいは生後１５日後のマウスから単離した後根神経節細胞にエレクトロポレーション装置・ＮＥＯＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  社）を用いて１Ｘ１０６個の後根神経節細胞に対して当該プラスミドを導入した。なお、ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターｐＲＬＳＶ４０ベクターを同様に細胞導入し内部標準とした。【０１９６】
なお、当該実験で構築したプラスミドは、より詳細には、ＬＩＳ１遺伝子のｅｘｏｎ２に対してルシフェラーゼ遺伝子を連結したＬＩＳ１レポーター遺伝子が組み込まれた構造を有している。ＬＩＳ１転写調節領域のより詳細な同定のために、当該プラスミドを利用して、ＬＩＳ１遺伝子の上流とｉｎｔｒｏｎ１を一部欠損させたレポーター遺伝子を組み込まれた構造を有するプラスミドも作製した（図６）。上記と同様にして、これらのプラスミドを用いたルシフェラーゼレポーターアッセイも行った。【０１９７】
さまざまな欠損領域を持たせたＬＩＳ１レポーター遺伝子（図６）のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果、ｅｘｏｎ１から３ｋｂｐ−１５ｋｂｐを欠損させた場合にＬＩＳ１の発現量が大きく増加した（図６Ａ）。このことからｅｘｏｎ１から３ｋｂｐ−１５ｋｂｐの領域にＬＩＳ１遺伝子の発現を抑制する領域が存在することが明らかとなった。さらに詳細に発現調節領域を解析したところ、ｅｘｏｎ１から５ｋｂｐ−９ｋｂｐの領域にＬＩＳ１遺伝子の発現を抑制する領域が存在することが明らかとなった（図６Ｂ）。当該領域のＤＮＡ塩基配列から、遺伝子発現を抑制する制御因子・ＣＴＣＦ（ＣＣＣＴＣ−  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）の結合領域が当該領域に存在することが示唆された。【０１９８】
マウス後根神経節細胞の軸索伸展に対するＣＴＣＦ発現の効果の解析
ＣＴＣＦがＬＩＳ１発現を抑制するかを調べるために、マウス後根神経節細胞を用いて、ＣＴＣＦの発現実験、及びｓｉＲＮＡを用いたノックダウン実験を行った。当該ＣＴＣＦ発現実験ではマウス後根神経節細胞としてＰ３細胞を、当該ｓｉＲＮＡ使用ノックダウン実験ではマウス後根神経節細胞としてＰ１５細胞を、それぞれ用いた。【０１９９】
ＣＴＣＦの発現実験においては、ＣＴＣＦの発現ベクターは、ｐＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社：ＣＡＧ−ＧＦＰ）のクローニング部位にマウスＣＴＣＦのｃＤＮＡ（アクセッションＮｏ．Ｍｍ．２６９４７４）を連結して作製した。エレクトロポレーション装置・ＮＥＯＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  社）を用いて１Ｘ１０６個の後根神経節細胞に対してＣＴＣＦを組み込んだｐＥＧＦＰベクター１μｇを導入し、ＣＴＣＦを発現させた。単なるｐＥＧＦＰベクターを導入した後根神経節細胞を対照群とした。【０２００】
ウエスタンブロッティングには、抗ＣＴＣＦ抗体、抗ｅＧＦＰ抗体、抗Ｌｉｓ１抗体、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いた。【０２０１】
結果、ＥＧＦＰ−ＣＴＣＦの発現で後根神経節細胞の神経突起伸展は有意に抑制された（図７Ａ）。【０２０２】
ｓｉＲＮＡによるノックダウン実験では、ＣＴＣＦのｓｉＲＮＡとして、塩基配列；ＵＵＡＡＧＧＵＧＡＵＵＣＣＵＣＡＧＧＡＧＧＧＵＧＡのｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１００ｐｍｏｌ  ＮＥＯＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  社）を用いて１Ｘ１０６個の後根神経節細胞に対して導入した。ＣＴＣＦのｓｉＲＮＡ代わりにｐＧＬ２のｓｉＲＮＡ
を導入した細胞を対照群とした。【０２０３】
ウエスタンブロッティングには、抗ＣＴＣＦ抗体、抗ｅＧＦＰ抗体、抗Ｌｉｓ１抗体、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いた。【０２０４】
結果、ＣＴＣＦノックダウンによって後根神経節細胞の軸索伸展の促進効果が認められた（図７Ｂ）。【０２０５】
さらに、各細胞を、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。生後３日目（Ｐ３）と生後１５日目（Ｐ１５）の後根神経節細胞に発現ベクターを用いてＣＴＣＦを強制発現させた結果、生後３日目（Ｐ３）では有意に軸索伸展を抑制した。また、生後１５日目（Ｐ１５）の後根神経節細胞では有意な軸索伸展の抑制効果が認められた。さらに、生後３日目（Ｐ３）の後根神経節細胞にＣＴＣＦとＬＩＳ１を強制発現させたところ、軸索伸展能が回復することが分かった。このことからＣＴＣＦはＬＩＳ１の発現抑制を介して軸索伸展に対してネガティブに制御することが明らかとなった（図８）。なお、ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏは非常に明るい赤色蛍光タンパク質（二量体）であり、当該タンパク質遺伝子とＬｉｓ１遺伝子をタンデムにつないで細胞中で発現させた結果をｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ−Ｌｉｓ１として示している。【０２０６】
また、生後３日目（Ｐ３）と生後１５日目（Ｐ１５）の後根神経節細胞においてｓｉＲＮＡを用いてＣＴＣＦをノックダウンさせた結果、生後３日目（Ｐ３）では軸索伸展に対して有意な効果は見られなかったが、生後１５日目（Ｐ１５）の後根神経節細胞では有意な軸索伸展の促進効果が認められた。このことから、ＣＴＣＦの抑制はＬＩＳ１の発現増強を介して軸索伸展に対してポジティブに効果があることが分かった（図９）。【０２０７】
神経ネットワーク成熟過程におけるＬＩＳ１の役割の解明
マウス中枢神経系におけるＬＩＳ１の発現量をウエスタンブロッティングで解析した。具体的には、上記「後根神経節細胞におけるＬＩＳ１タンパク質の発現量の解析」で行った操作と同様にして、生後３日目（Ｐ３）、生後１５日（Ｐ１５）、生後６０日（Ｐ６０）のマウスの脳組織由来タンパク質溶解液を用いて、ＬＩＳ１の発現量をウエスタンブロッティングで解析した。結果を図１に示す。ＬＩＳ１の発現量は中枢神経系においても生後徐々に低下することが分かった。  【０２０８】
生後間もない動物の脳には過剰な神経結合（シナプス）が存在するが、生後の発達過程において、必要な結合だけが強められ、不要な結合は除去されて、成熟した機能的な神経回路が完成する。この過程は「シナプス刈り込み」と呼ばれており、生後発達期の神経回路に見られる普遍的な現象であると考えられている。「シナプス刈り込み」と同時期に樹状突起、神経突起の再生能力は低下しており、不要となった神経回路が再生するのを防いでいると考えられている。ＬＩＳ１の発現低下はまさにこの時期に始まっており、よって成熟した機能的な神経回路の完成と関連していることが示唆される。そこで、神経ネットワークの刈り込みモデルとして一般に利用されているマウスの乳頭体を用いた検討を行った。【０２０９】
マウス胎児１２．５日の段階でマウス脳室内に発現ベクターを注入し、エレクトロポレーションで細胞内に導入した。解析には、マウス胎児受精後１２．５日（Ｅ１２．５）の妊娠マウスを用いた。当該妊娠マウスを麻酔後、片方の子宮角を露出させた。子宮壁を通してＦａｓｔ  Ｇｒｅｅｎで着色したプラスミド溶液（ＤＮＡ濃度２〜５μｇ／μｌ）をインジェクション針に吸引して、これを側脳室の片側に注入した後、ＰＢＳで子宮をよく濡らし、ピンセット型の電極で胎仔の頭部をはさみ電気パルスを与えた。その後、出産させ、子マウスの解析を行った。ＣＡＧ（ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏｖｉｒｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｃｈｉｃｋｅｎ  ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｒａｂｂｉｔ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｐｏｌｙＡ）プロモーターを利用して蛍光タンパンク質のｔｄ−ｔｏｍａｔｏを発現させ神経回路の可視化を行った結果、乳頭体に向かう神経線維は生後１８日（ｐ１８）までに刈り込みが進み、生後２１日（ｐ２１）では全く見られなくなることが分かった（図１１）。なお、併せてＦｅｚｆ２−ｅＧＦＰ発現ベクター（Ｆｅｚｆ２遺伝子をｅＧＦＰ遺伝子に置き換えて発現するベクター）を同様に細胞内へ導入した結果、及びこれらの結果の合成写真（Ｍｅｒｇｅｄ）も図１１に示す。【０２１０】
同様にして、ＣＡＧプロモーターを利用してＬＩＳ１及び蛍光タンパンク質のｔｄ−ｔｏｍａｔｏを発現させ、マウス胎児（１２．５日）の神経回路の可視化を行った結果、ＬＩＳ１の発現によって神経線維の刈り込みが有意に抑制され、生後２１日（ｐ２１）でも残っていることが分かった（図１２）。【０２１１】
さらに同様にして、ＣＡＧプロモーターを利用してＣＴＣＦのｓｈＲＮＡと蛍光タンパンク質のｔｄ−ｔｏｍａｔｏを発現させ、マウス胎児（１２．５日）の神経回路の可視化を行った結果、ＣＴＣＦのノックダウンによって神経線維の刈り込みが有意に抑制され、生後２１日（ｐ２１）でも残っていることが分かった。このことからＣＴＣＦの抑制はＬＩＳ１の増強と同様の効果があることが分かった（図１３）。【０２１２】
さらに同様にして、ＣＡＧプロモーター及びＣＭＶプロモーターを利用してＣＴＣＦと蛍光タンパンク質のｔｄ−ｔｏｍａｔｏを発現させ、マウス胎児（１２．５日）の神経回路の可視化を行った結果、ＣＴＣＦの強制発現によって神経線維の刈り込みが有意に促進され、生後１５日（ｐ１５）でもすでに刈り込みが終了していることが分かった。このことからＣＴＣＦの発現の促進はＬＩＳ１の抑制と同様の効果があることが分かった（図１４）。【０２１３】
なお、マウス脳における乳頭体と神経繊維のオリエンテーションを図１５に示す。図１５に記載されたスケールを用いて、各検討結果における刈り込みの程度を定量化した。具体的には、当該スケールで１に該当する部分の蛍光強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を１．０として、当該スケールで２〜３０に該当する各部分の蛍光強度を相対値で表した。結果を図１６に示す。【０２１４】
ＧＳＫ３βとＬＩＳ１との関係の検討
ＧＳＫ３βは軸索伸展に深く関与するタンパンク質であることが知られている。特に、ＧＳＫ３βの活性化が軸索伸展をネガティブに制御していると考えられている。正常型（ＬＩＳ１ホモ）とＬＩＳ１のヘテロ変異体の後根神経節細胞を抗ＧＳＫ３β抗体を用いて染めた結果、ＬＩＳ１へテロ変異体で神経突起の先端に高いＧＳＫ３βの集積を認めた（図１７）。【０２１５】
後根神経節細胞におけるＧＳＫ３βの移動をライブセルイメージングで解析した結果、ＧＳＫ３βはダイナミックに後根神経節細胞の軸索を移動していることが分かった（図１８）。一方で、軸索内のＧＳＫ３βの移動速度は正常型とＬＩＳ１のヘテロ変異体の後根神経節細胞で差がないことが分かった（図１９）。【０２１６】
正常型とＬＩＳ１のヘテロ変異体の後根神経節細胞におけるＧＳＫ３βの移動をライブセルイメージングで観察し、移動頻度を解析した。その結果、ＬＩＳ１のヘテロ変異体の後根神経節細胞におけるＧＳＫ３βの移動は正常型に比較して逆行性の移動が有意に低下していることが分かった（図２０）。このことはＬＩＳ１のヘテロ変異体の後根神経節細胞では細胞質ダイニンによる逆行性のＧＳＫ３βの移動が傷害されていることを示している。【０２１７】
ＧＳＫ３βは活性化すると２１６チロシンがリン酸化されることが知られている。正常型とＬＩＳ１のヘテロ変異体の後根神経節細胞におけるＧＳＫ３βの活性化を２１６チロシンのリン酸化特異的抗体を用いて解析した。その結果、ＬＩＳ１へテロ変異体では末端のＧＳＫ３βは有意に活性化されており（図２１）、このことがＬＩＳ１へテロ変異体での軸索伸展の低下に関与していることが示された。【０２１８】
坐骨神経損傷モデルにおける坐骨神経の組織学的解析
ＳＮＪ１９４５の末梢神経の再生促進効果を調べるためにマウス坐骨神経損傷モデルを作製し、組織学的に解析した。Wall等の方法（Wall，  1979）に従って作製した神経損傷モデルマウスとして用いた。具体的には、次のようにしてモデルマウスを作製した。生後４週間の雌マウスをセボフルラン吸入麻酔液（マイラン製薬）にて全身麻酔をかけ、うつぶせにし、大腿骨上の皮膚を切開し、坐骨神経に傷を付けないように慎重かつ迅速に筋層を剥離し、大腿中央部で末梢から40ｍｍ間隔で1箇所、切断（完全神経損傷）した。その後、筋膜と皮膚を縫合し消毒を施した。当該マウスを、完全神経損傷モデルマウスとして用いた。ＳＮＪ１９４５の投与は食餌（ＣＥ−２、日本クレア）にＳＮＪ−１９４５を混ぜ、ＳＮＪ−１９４５投与量が２００μｇ／体重ｇ／日になるように継続的に各マウスに経口投与した。対照群としては、同様の完全神経損傷を施しＳＮＪ１９４５を含まない食餌（ＣＥ−２、日本クレア）を与えて飼育したマウスを用いた。【０２１９】
組織学的解析のため、各マウスを頸椎脱臼によって死亡させた後、坐骨神経を取り出し、４％パラフォルムアルデヒドで２４時間固定し、ＰＢＳに置換後、パラフィン包埋を行った。組織ブロックを５μｍ厚の切片にし、スライドグラスの上に接着させた。マトキシリンエオジン染色として１）脱パラフィン、２）水洗、３）マイヤーまたはカラッチのヘマトキシリン、４）軽く流水水洗、５）色出し、６）エオジン液  １分、７）脱水・透徹・封入、を施し、光学顕微鏡で形態観察を行った。【０２２０】
電子顕微鏡で観察するための試料は、次のようにして作製した。上記のようにして坐骨神経を取り出し、すぐに固定液（２．５％グルタールアルデヒド溶液）に入れた。固定液に入れて１０分後に採取し、あらかじめ厚手のプラスチックシートの上に数滴たらしておいた固定液中に入れて細切りにした。後固定は四酸化オスミウム水溶液を使用した。次に組織内に入っている自由水をエチルアルコールに置換した。超薄切片を作るためにエポキシ樹脂に包埋し、ウルトラミクロトームで切片を作製した。観察には透過型電子顕微鏡（日立：Ｈ−７５００）を用いた。【０２２１】
なお、上記と同様の処置を行いつつ実際には神経損傷を施さなかったマウスをＳｈａｍ処置群として用いた。Ｓｈａｍ処置群の顕微鏡解析結果を図２２に示す。【０２２２】
マトキシリンエオジン染色による解析において、完全神経損傷モデルでは対照群と比較して、ＳＮＪ１９４５の投与１週間後から坐骨神経の有意な回復が認められた（図２３）。電子顕微鏡による解析でも、完全神経損傷モデルでは対照群と比較して、ＳＮＪ１９４５の投与１週間後からミエリンの回復が認められた（図２３）。なお、画像から回復が認められたミエリンを数えてグラフ化した図を図２４に示す。対照群に対してＳＮＪ１９４５投与群では坐骨神経内のミエリンの再生が有意に高く、坐骨神経の再生が促進されていることが分かった。【０２２３】
また、完全神経損傷モデルに対し、坐骨神経切断後１週間の期間をおいてＳＮＪ１９４５投与を開始し、神経再生の活性化を切断から１ヶ月後に解析した。当該解析により、この１週間の期間で神経細胞の変性を完成させた後の神経再生に対するＳＮＪ１９４５の効果を解析することができる。その結果、神経細胞の変性が完成した後でもＳＮＪ１９４５の投与群では坐骨神経内のミエリンの再生が有意に高く坐骨神経の再生が促進されていることが分かった（図２５）。【０２２４】
坐骨神経損傷モデルにおける坐骨神経の機能的解析
図２６にＳｈａｍ処置マウス（左）と完全損傷モデルマウス（右）の歩行足跡を示す。当該検討において完全損傷モデルは左側の坐骨神経が切断されており、そのために左足の踏ん張りが利かず大きな足紋となった。【０２２５】
図２７に、右側の坐骨神経を切断した完全損傷モデルマウスに対し上述のようにＳＮＪ１９４５投与し１ヶ月経過した際の足の様子を示す。対照群マウス（左）の左足は垂れ下がっているのに対し、ＳＮＪ１９４５投与マウスの左足はケージをつかめるまでに回復していることが分かる。【０２２６】
ＳＮＪ１９４５の末梢神経の再生促進効果をさらに検討するために、坐骨神経損傷モデルマウスの運動機能を、Ｆｏｏｔｐｒｉｎｔを用いｓｃｉａｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ  （ＳＦＩ）、ｐｒｉｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＰＬＩ）にて評価した（Ｂａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）。【０２２７】
完全神経損傷モデルへＳＮＪ１９４５を上記のように投与することによって、坐骨神経が有意に回復したと考えられた（図２８）。継続したＳＮＪ１９４５の投与によって、完全神経損傷モデルでの回復はさらに促進された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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