(57)【要約】  第１の流入管路１１と第２の流入管路１２とが合流して流出管路１３となる構造を有する合流管路構造１０を用い、特定化合物を含有する第１の液体１を第１の流入管路１１に流し、連結物質を含有する第２の液体２を第２の流入管路１２に流し、両液体の流れを合流させ、それにより両液体を混合し、特定化合物が連結物質を介して結びついてなる構造体が分散した液状の培地組成物３を流出管路１３中の流れとして形成する。
2018016622.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液状の培地組成物の製造方法であって、
第１の流入管路と第２の流入管路とが合流して流出管路となる構造を有する合流管路構造を用い、
下記（ｉ）の特定化合物を含有する第１の液体を前記第１の流入管路に流し、かつ、下記（ｉｉ）の連結物質を含有する第２の液体を前記第２の流入管路に流し、両液体の流れを合流させ、それにより両液体を混合し、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体が分散した液状の培地組成物を、流出管路中を流れる状態にて形成する工程を有することを特徴とする、
前記液状の培地組成物の製造方法。
（ｉ）２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物。
（ｉｉ）２価金属カチオンである連結物質。
【請求項２】
前記（ｉ）の特定化合物が脱アシル化ジェランガムであり、第１の液体が該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液であり、
前記（ｉｉ）の連結物質が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方であり、第２の液体が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方を含有する液体培地であるか、または、該液体培地の濃縮液である、
請求項１に記載の液状の培地組成物の製造方法。
【請求項３】
前記液状の培地組成物中の、脱アシル化ジェランガムの濃度が、０．００１％（ｗ／ｖ）〜１．０％（ｗ／ｖ）である、請求項２に記載の培地組成物の製造方法。
【請求項４】
前記合流管路構造において、
（ａ）第１の液体と第２の液体とが互いに正反対の方向を向いて衝突するように、第１の流入管路と第２の流入管路とが一直線に位置合せされており、かつ、流出管路が、第１の流入管路および第２の流入管路に直角に延びているか、または、
（ｂ）第１の液体と第２の液体とが互いにＶ形をなして衝突するように、第１の流入管路と第２の流入管路とがＶ形に位置合せされており、かつ、流出管路が、合流部分から、該Ｖ字の内角を２等分する方向に延びている、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の培地組成物の製造方法。
【請求項５】
液状の培地組成物を製造するための製造装置であって、当該製造装置は、
第１の流入管路と第２の流入管路とが合流して流出管路となる構造を有する合流管路構造を有し、
下記（ｉ）の特定化合物を含有する第１の液体を供給するよう、前記第１の流入管路に接続された第１の液体供給源を有し、かつ、
下記（ｉｉ）の連結物質を含有する第２の液体を供給するよう、前記第２の流入管路に接続された第２の液体供給源を有し、
前記合流管路構造において、第１の流入管路に供給される第１の液体と、第２の流入管路に供給される第２の液体とが合流し、それにより両液体が混合され、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体が分散した液状の培地組成物が流出管路中を流れる状態にて形成される、
前記製造装置。
（ｉ）２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物。
（ｉｉ）２価金属カチオンである連結物質。
【請求項６】
前記（ｉ）の特定化合物が脱アシル化ジェランガムであり、第１の液体が該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液であり、
前記（ｉｉ）の連結物質が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方であり、第２の液体が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方を含有する液体培地であるか、または、該液体培地の濃縮液である、
請求項５に記載の製造装置。
【請求項７】
前記液状の培地組成物中の、脱アシル化ジェランガムの濃度が、０．００１％（ｗ／ｖ）〜１．０％（ｗ／ｖ）である、請求項６に記載の製造装置。
【請求項８】
前記合流管路構造において、
（ａ）第１の液体と第２の液体とが互いに正反対の方向を向いて衝突するように、第１の流入管路と第２の流入管路とが一直線に位置合せされており、かつ、流出管路が、第１の流入管路および第２の流入管路に直角に延びているか、または、
（ｂ）第１の液体と第２の液体とが互いにＶ字をなして衝突するように、第１の流入管路と第２の流入管路とがＶ字状に位置合せされており、かつ、流出管路が、合流部分から、該Ｖ字の内角を２等分する方向に延びている、
請求項５〜７のいずれか１項に記載の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液状の培地組成物の製造方法および製造装置に関するものである。より詳細には、本発明は、前記培地組成物を形成するために混合すべき少なくとも２種類の液体（特定の化合物を含有する第１の液体、および、該特定の化合物同士を結びつけて構造体を形成する物質を含有する第２の液体）を適切に混合し、前記構造体が適切に分散した培地組成物を製造し得る製造方法と製造装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、動物や植物体内で異なった役割を果たしている様々な器官、組織、及び細胞を生体外にて増殖或いは維持させるための技術が発展してきている。これらの器官、組織を生体外にて増殖或いは維持することは、それぞれ器官培養、組織培養と呼ばれており、器官、組織から分離された細胞を生体外にて増殖、分化或いは維持することは細胞培養と呼ばれている。
細胞培養は、分離した細胞を培地中で生体外にて増殖、分化或いは維持する技術であり、生体内の各種器官、組織、細胞の機能及び構造を詳細に解析するために不可欠なものとなっている。
また、当該技術により培養された細胞及び／又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療、植物の品種改良、遺伝子組み換え作物の作成等様々な分野で利用されている。【０００３】
細胞等（器官、組織、細胞）を培養するための培地の１つとして、液体培地が挙げられ、本発明者らは、細胞等を浮遊状態で培養することが可能な液状の培地組成物の開発に成功した（特許文献１及び２）。
特許文献１に記載された液状の培地組成物は、特定の化合物（特に、アニオン性官能基を有する高分子化合物）が２価金属カチオン等を介して集合し不定形の構造体となり、該構造体が液体培地中に分散して浮遊した状態となっているものである。以下、アニオン性官能基を有する高分子化合物などといった上記特定の化合物を「特定化合物」ともいい、該特定化合物同士を結びつける２価金属カチオン等の物質を「連結物質」ともいう。
該培地組成物は、細胞等の障害や機能喪失を引き起こすリスクのある振とうや回転等の操作を伴わずに、細胞等を浮遊状態にて培養することができる好ましい液状の培地となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０１７５１３号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１４／０１０６３４８ Ａ１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記特許文献１に記載された液状の培地組成物の本来意図された好ましい状態は、特定化合物同士が２価金属カチオン等の連結物質を介して連結することにより形成された構造体が液体培地中に均一に分散した状態である。
しかしながら、本発明者らが、該液状の培地組成物の実際の作製工程を詳細に検討したところ、そのような好ましい状態を得るためには、構造体が培地組成物中の局所に偏在して形成されないように、混合方法や混合条件に留意しなければならないことがわかった。【０００６】
例えば、特定化合物が脱アシル化ジェランガムの場合、該脱アシル化ジェランガムは、液体培地と混合した際に、液体培地中の連結物質（例えば、カルシウムイオン）を介して不定形な構造体を形成し、これが細胞等を浮遊させるための担体となる。
しかし、特許文献１および２に記載されている方法を用いて培地組成物の大量製造を試みたところ、連結物質を含んだ液体培地に、高濃度の特定化合物を含んだ液体を注ぎ入れるといった混合方法では、両液が接触した瞬間に特定化合物が連結物質と接して構造体となり、よって該構造体は、混合液中に紐状に長く連なって浮遊する状態（または、紐状の構造体が塊状に絡み合った状態）となり、本来意図された均一な分散状態にはならない場合があることがわかった。また、そのような状態は、比較的高速で攪拌を行なったとしても発生することがわかった。また、液体培地中にそのような紐状の構造体がいったん形成されると、分子鎖が形成するダブルへリックスがお互いに連結物質（例えば、カルシウムイオン）を介して強固な三次元ネットワークを形成しているという該構造体の性質上、それを細かく切断して母材中に分散させることは容易ではないこともわかった。
よって、目的の構造体が好ましく分散した混合液を得るためには、両液を高速で接触させ得るような特殊な撹拌装置が必要となるが、そのような特殊な撹拌装置の撹拌作用は、一般に、１Ｌ（Ｌはリットルを表す）以下程度の少量の液体に対して有効となるような限られたものである場合が多く、上記の構造体が好ましく分散した混合液を大量（例えば、５Ｌ以上など）に製造するのには適していないこともわかった。さらに、上記の特殊な撹拌装置は、密閉状態での混合が不可能な仕様であることから、一連の混合過程において無菌状態を保つことが難しく、外気による培地組成物の汚染を招く可能性が高いこともわかった。【０００７】
本発明の目的は、上記の問題を解決し、２価金属カチオンなどの連結物質を含んだ任意の液体と、特定化合物を含んだ液体とを、連続的かつ無菌的に、任意の割合で混合することができ、微細な構造体が分散した液状の培地組成物を大量に得ることができる製造方法および製造装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成し得る本発明の主たる構成は、以下のとおりである。
〔１〕液状の培地組成物の製造方法であって、
第１の流入管路と第２の流入管路とが合流して流出管路となる構造を有する合流管路構造を用い、
下記（ｉ）の特定化合物を含有する第１の液体を前記第１の流入管路に流し、かつ、下記（ｉｉ）の連結物質を含有する第２の液体を前記第２の流入管路に流し、両液体の流れを合流させ、それにより両液体を混合し、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体が分散した液状の培地組成物を、流出管路中を流れる状態にて形成する工程を有することを特徴とする、
前記液状の培地組成物の製造方法。
（ｉ）２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物。
（ｉｉ）２価金属カチオンである連結物質。
〔２〕前記（ｉ）の特定化合物が脱アシル化ジェランガムであり、第１の液体が該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液であり、
前記（ｉｉ）の連結物質が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方であり、第２の液体が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方を含有する液体培地であるか、または、該液体培地の濃縮液である、
前記〔１〕に記載の液状の培地組成物の製造方法。
〔３〕前記液状の培地組成物中の、脱アシル化ジェランガムの濃度が、０．００１％（ｗ／ｖ）〜１．０％（ｗ／ｖ）である、前記〔２〕に記載の培地組成物の製造方法。
〔４〕前記合流管路構造において、
（ａ）第１の液体と第２の液体とが互いに正反対の方向を向いて衝突するように、第１の流入管路と第２の流入管路とが一直線に位置合せされており、かつ、流出管路が、第１の流入管路および第２の流入管路に直角に延びているか、または、
（ｂ）第１の液体と第２の液体とが互いにＶ形をなして衝突するように、第１の流入管路と第２の流入管路とがＶ形に位置合せされており、かつ、流出管路が、合流部分から、該Ｖ字の内角を２等分する方向に延びている、
前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の培地組成物の製造方法。
〔５〕液状の培地組成物を製造するための製造装置であって、当該製造装置は、
第１の流入管路と第２の流入管路とが合流して流出管路となる構造を有する合流管路構造を有し、
下記（ｉ）の特定化合物を含有する第１の液体を供給するよう、前記第１の流入管路に接続された第１の液体供給源を有し、かつ、
下記（ｉｉ）の連結物質を含有する第２の液体を供給するよう、前記第２の流入管路に接続された第２の液体供給源を有し、
前記合流管路構造において、第１の流入管路に供給される第１の液体と、第２の流入管路に供給される第２の液体とが合流し、それにより両液体が混合され、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体が分散した液状の培地組成物が流出管路中を流れる状態にて形成される、
前記製造装置。
（ｉ）２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物。
（ｉｉ）２価金属カチオンである連結物質。
〔６〕前記（ｉ）の特定化合物が脱アシル化ジェランガムであり、第１の液体が該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液であり、
前記（ｉｉ）の連結物質が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方であり、第２の液体が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方を含有する液体培地であるか、または、該液体培地の濃縮液である、
前記〔５〕に記載の製造装置。
〔７〕前記液状の培地組成物中の、脱アシル化ジェランガムの濃度が、０．００１％（ｗ／ｖ）〜１．０％（ｗ／ｖ）である、前記〔６〕に記載の製造装置。
〔８〕前記合流管路構造において、
（ａ）第１の液体と第２の液体とが互いに正反対の方向を向いて衝突するように、第１の流入管路と第２の流入管路とが一直線に位置合せされており、かつ、流出管路が、第１の流入管路および第２の流入管路に直角に延びているか、または、
（ｂ）第１の液体と第２の液体とが互いにＶ字をなして衝突するように、第１の流入管路と第２の流入管路とがＶ字状に位置合せされており、かつ、流出管路が、合流部分から、該Ｖ字の内角を２等分する方向に延びている、
前記〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の製造装置。
【発明の効果】
【０００９】
以下の説明では、第１の液体と第２の液体との混合液の混合状態を、該混合液中に形成される構造体の分散状態に応じて「好ましい混合状態」または「好ましくない混合状態」と呼ぶ。「好ましい混合状態」とは、第１の液体と第２の液体との混合液中に構造体が均一に分散して浮遊し続ける状態である。逆に「好ましくない混合状態」とは、前記のように構造体が混合液中に均一に分散しておらず、局所的に偏って存在する状態であって、例えば、混合液中に構造体が紐状に長く連なって浮遊または沈降する状態や紐状の構造体が局所的に絡み合って浮遊または沈降する状態である。
構造体の分散状態は、好ましい混合状態から好ましくない混合状態まで、無段階的に変化する種々の状態となり得る。好ましい混合状態と好ましくない混合状態との間の境界の状態（即ち、好ましい混合状態の下限）は、後述する評価方法等によって、使用目的に応じて適宜定めてよい。【００１０】
本発明の製造方法および製造装置によれば、第１の液体と第２の液体が、両方共にそれぞれの管路（第１の流入管路と第２の流入管路）内を流動し、合流管路構造において合流し、互いに衝突し、混合液となって流出管路内を流れる。この合流の作用により、混合用の撹拌子（外部動力で駆動される可動部材）を用いることなく、液体の送り力と合流管路構造の合流構造とにより、好ましい混合状態の液状の培地組成物を流出管路中の流れとして形成することができる。よって、本発明によれば、例えば、実験用の少量の培地組成物から、産業用の大型培養槽を満たすような大量の培地組成物まで、両液体を供給した量だけ、意図した量の液状の培地組成物を流出管路から連続的に得ることができる。
特定化合物が連結物質を介して結びついてなる構造体が混合液中に形成されるような２つの液体に関して、前記のような合流による混合によって好ましい混合状態が得られることを示したのは、本発明が初めてである。このような混合方法は、第１の液体が該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液であり、第２の液体がカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方を含有する液体培地である場合に、その有用性が特に顕著になる。【００１１】
また、本発明の製造方法および製造装置では、第１の液体と第２の液体が、合流時に共に流れていることが重要である。この特徴により、たとえ両液体の濃度に差異があっても、両液体の流量の比率や流速の比率を調整することで、両液体を好ましく合流させて混合することができる。例えば、第１の液体の特定化合物の濃度が低く、第２の液体が一般的な液体培地であるような場合には、第１の液体と第２の液体の流量や流速の比率を同程度として、両液体を合流させることで、両液体を好ましく混合することができる。また、第１の液体の特定化合物の濃度が高く、第２の液体が一般的な液体培地であるような場合には、例えば、第１の管路の断面積を調節して、両液体を高速で衝突させながらも、第２の液体の流量に対する第１の液体の流量の比率を小さくして、両液体を合流させることで、両液体を好ましく混合することができる。このように、第１の液体における特定化合物の濃度と、第２の液体における連結物質の濃度が広範囲に変動しても、流量や流速の比率（とりわけ、流量の比率）を変えることで、両液体を好ましく混合することができる。【００１２】
また、本発明の製造方法および製造装置では、合流管路構造の後段にスタティックミキサー（市販の部材、または、それと同等の流路構造）を加えることで、両液体をより好ましく混合することができる。【００１３】
また、本発明の製造方法および製造装置によれば、図１に示すように、第１の液体と第２の液体とが、それぞれの供給源から、外気などの汚染源に接触させることなしに、かつ、不必要な部材に接触させることなしに、移動し、合流し、互いに混合され、目的の容器等に無菌的に供給され得る。
また、第１の液体と第２の液体をそれぞれに送るためのポンプとして蠕動ポンプを用いれば、接続用の管路や合流管路構造は、使い捨てが可能であり、管路内の洗浄などのメンテナンスが不要となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の製造方法および製造装置の構成を概略的に示す図である。同図では、説明のために、合流管路構造内の流路だけを断面図として示している。
【図２】図２は、本発明における合流管路構造の、好ましい態様例を示す断面図である。
【図３】図３は、本発明における合流管路構造の、他の好ましい態様例を示す断面図である。
【図４】図４は、本発明における合流管路構造内での、第１、第２の液体の好ましい衝突状態を例示する模式図である。
【図５】図５は、本発明における合流管路構造の、他の好ましい態様例を示す断面図である。
【図６】図６は、本発明における合流管路構造の合流部分の好ましい態様例を示す断面図である。
【図７】図７は、本発明の実施例４のＲｕｎ １とＲｕｎ ２における、コニカルチューブ底部（白い円で囲んだ部分）のビーズの分散の様子を示す写真図である。
【図８】図８は、本発明の実施例５のＲｕｎ ２とＲｕｎ ５における、コニカルチューブ底部のビーズの分散の様子を示す写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の製造方法を詳細に説明しながら、本発明の製造装置に言及し、該製造装置の構造をも詳細に説明する。
当該製造方法は、下記（ｉ）の特定化合物を含有する第１の液体と、下記（ｉｉ）の連結物質を含有する第２の液体とを混合して、液状の培地組成物を製造する方法である。
（ｉ）２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物。
（ｉｉ）２価金属カチオンである連結物質。
特定化合物、連結物質、および、それぞれを含有する第１の液体、第２の液体、それらの混合液である液状の培地組成物の詳細については後述する。
当該製造方法は、図１に例示するように、第１の流入管路１１と第２の流入管路１２とが合流し流出管路１３となる構造を有する合流管路構造１０を用いる。合流管路構造１０は、後述のとおり、種々の構造を有するものであってよい。よって、図１では、合流管路構造１０を全体的に一点鎖線で表し、内部の流路構造（合流構造）を、代表的に単純なＴ字形の合流管路として描いている。各液体の流れの方向は、説明のためのものであり、図中の流れ方向（水平方向や垂直方向）に限定されることはない（他の図も同様である）。当該製造方法では、前記（ｉ）の特定化合物を含有する第１の液体１を、第１の流入管路１１に送り込んで流し、かつ、前記（ｉｉ）の連結物質を含有する第２の液体２を、第２の流入管路１２に送り込んで流し、両液体の流れを合流させて、流出管路１３中において両液体が混合された混合液（即ち、製造目的の液状の培地組成物）３を形成する。これによって、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体が分散した、好ましい混合状態の液状の培地組成物が、流出管路１３中の流れとして得られる。
【００１６】
また、本発明による製造装置は、図１に例示するように、本発明の製造方法を実施し、好ましい混合状態の液状の培地組成物を製造し得る装置である。当該製造装置は、図１に例示するように、上記した合流管路構造１０を有し、さらに、第１の液体供給源Ｓ１と第２の液体供給源Ｓ２とを有する。
第１の液体供給源Ｓ１は、上記第１の液体１を供給するよう構成された装置であって、図１の例では、第１の液体１を収容する容器と、該第１の液体１を送り出すための装置とを少なくとも有する。図１では、第１の液体供給源Ｓ１を単純な容器のように描いており、液体を送り出すための装置の図示を省略している。第１の液体供給源Ｓ１は、合流管路構造１０の第１の流入管路１１に対して、例示的に、接続管Ｃ１を介して接続されている。同様に、第２の液体供給源Ｓ２は、上記第２の液体２を供給するよう構成された装置である。図１の例では、第２の液体供給源Ｓ２は、第２の液体２を収容する容器と、該第２の液体２を送り出すための装置とを少なくとも有し（液体を送り出すための装置の図示を省略している）、合流管路構造１０の第２の流入管路１２に対して、例示的に、接続管Ｃ２を介して接続されている。
合流管路構造１０の流出管路１３に接続された供給管Ｃ３は、製造された液状の培地組成物３を容器等に供給するための管路を示唆しており、必須ではない。製造された液状の培地組成物３は、流出管路１３の出口から直接的に使用目的の容器等に供給されてもよい。
以上の構成により、当該製造装置の作動時には、第１の液体供給源Ｓ１から第１の流入管路１１に供給される第１の液体１と、第２の液体供給源Ｓ２から第２の流入管路１２に供給される第２の液体２とが合流し、混合され、それにより、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体が分散した液状の培地組成物３が形成され、流出管路１３から流出する。よって、第１、第２の液体供給源の両液体１、２は、外気などの汚染源に接触することなく、必要な量だけ、かつ、好ましい混合状態で、液状の培地組成物３となって供給される。
【００１７】
先ず、前記（ｉ）の特定化合物を含有する第１の液体１、前記（ｉｉ）の連結物質を含有する第２の液体２、および、これらの液体の混合によって形成される液状の培地組成物（特定化合物が連結物質を介して結びついてなる構造体が分散している液体）３を、詳細に説明する。
【００１８】
〔第１の液体〕
第１の液体は、特定化合物として、２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物を含有する。
アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。本発明に用いられる高分子化合物には、前記アニオン性の官能基の群より選択される１種又は２種以上が含まれていてもよい。
【００１９】
本発明に用いられる高分子化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が１０個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。ここにいう酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類、構造中の一部に硫酸基又はリン酸基を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム（以下、ＤＡＧという場合もある）、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群より１種又は２種以上から構成される多糖類が例示される。多糖類は、好ましくは、ヒアルロン酸、ＤＡＧ、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン又はそれらの塩であり、より好ましくは、ＤＡＧ又はその塩である。ＤＡＧはリン酸化したものを使用することもできる。当該リン酸化は公知の手法で行うことができる。
ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、銅、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。
【００２０】
これらの高分子化合物（多糖類等）の重量平均分子量は、好ましくは１０，０００乃至５０，０００，０００であり、より好ましくは１００，０００乃至２０，０００，０００、更に好ましくは１，０００，０００乃至１０，０００，０００である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるプルラン換算で測定できる。
【００２１】
本発明においては、上記アニオン性の官能基を有する多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用することができる。アニオン性の官能基を有する多糖類とアニオン性の官能基を有さない多糖類とを組み合わせてもよい。多糖類の組み合わせの種類は、２価金属カチオンを介して結びつくことにより上述の構造体を液体培地中に形成することができれば特に限定されないが、好ましくは、当該組合せは少なくともＤＡＧ又はその塩を含む。即ち、好適な多糖類の組合せには、ＤＡＧ又はその塩、及びＤＡＧ又はその塩以外の多糖類（例、キサンタンガム、アルギン酸、カラギーナン、ダイユータンガム、メチルセルロース、ローカストビーンガム又はそれらの塩）が含まれる。具体的な多糖類の組み合わせとしては、ＤＡＧとラムザンガム、ＤＡＧとダイユータンガム、ＤＡＧとキサンタンガム、ＤＡＧとカラギーナン、ＤＡＧとザンタンガム、ＤＡＧとローカストビーンガム、ＤＡＧとκ−カラギーナン、ＤＡＧとアルギン酸ナトリウム、ＤＡＧとメチルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
脱アシル化ジェランガムとは、１−３結合したグルコース、１−４結合したグルクロン酸、１−４結合したグルコース及び１−４結合したラムノースの４分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、以下の一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２が共に水素原子であり、ｎは２以上の整数で表わされる多糖類である。ただし、Ｒ１がグリセリル基を、Ｒ２がアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下である。
【００２３】
【化１】
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【００２４】
特定化合物は、化学合成法で得られたものであってもよいが、当該特定化合物が天然物である場合は、当該化合物を含有している各種植物、各種動物、各種微生物から慣用技術を用いて抽出及び分離精製することにより得られたものであってもよい。例えば、ジェランガムは、発酵培地で生産微生物を培養し、菌体外に生産された粘膜物を通常の精製方法にて回収し、乾燥、粉砕等の工程後、粉末状にすることにより製造することができる。また、脱アシル化ジェランガムの場合は、粘膜物を回収する際にアルカリ処理を施し、１−３結合したグルコース残基に結合したグリセリル基とアセチル基を脱アシル化した後に回収すればよい。ジェランガムの生産微生物の例としては、これに限定されるものではないが、スフィンゴモナス・エロディア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅａ）及び当該微生物の遺伝子を改変した微生物が挙げられる。
脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三晶株式会社製「ＫＥＬＣＯＧＥＬ（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＣＧ−ＬＡ」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）」等を使用することができる。また、ネイティブ型ジェランガムとして、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＨＴ」等を使用することができる。
【００２５】
第１の液体は、通常、特定化合物の溶液である。当該溶液のための溶媒は、特定化合物を溶解可能なものである限り、特に限定されないが、通常、水又は親水性溶媒であり、好ましくは水である。即ち、好ましい態様において第１の液体は、特定化合物の水溶液である。
【００２６】
第１の液体中に含有される特定化合物の濃度は、第２の液体と混合した際に、混合液中で、特定化合物が２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成し、且つ該構造体が混合液中に均一に分散し、更に、最終的に得られる液状の培地組成物が、当該構造体を含むことにより細胞又は組織を浮遊培養可能である限り、特に限定されない。下に詳述した、細胞又は組織を浮遊培養可能な培地組成物中の特定化合物の濃度と、最終産物で得られる培地組成物の体積に対する、第１の液体の体積の比率から、第１の液体中の特定化合物の濃度を算出することが可能である。例えば、体積Ｖ１の第１の液体と、体積Ｖ２の第２の液体とを混合して、体積Ｖ１＋Ｖ２の液状の培地組成物を最終的に得る場合、当該液状の培地組成物中の特定化合物の濃度をＣ％（ｗ／ｖ）とするためには、第１の液体中の特定化合物の濃度を、Ｃ×（Ｖ１＋Ｖ２）／Ｖ１％（ｗ／ｖ）とすればよい。
【００２７】
第１の液体中の２価金属カチオン濃度は、第１の液体中の特定化合物が、構造体を形成する濃度を下回る必要がある。２価金属カチオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、マンガンイオン、鉄イオン、銅イオン等が挙げられる。特に、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方（以下、「カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオン」とも表現する）が、ＤＡＧ等の特定化合物の構造体形成に寄与する。
【００２８】
第１の液体には、特定化合物、溶媒以外の因子が含まれていてもよい。該因子としては、生理的に許容可能な緩衝剤、塩、等張剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
第１の液体の調製は、特定化合物を上記溶媒（例、水）に添加し、当該特定化合物が溶解可能な温度（例えば、６０℃以上、８０℃以上、９０℃以上）にて攪拌し、透明な状態になるまで溶解することにより行うことができる。脱２価金属カチオン処理をした特定化合物（ＤＡＧ等）を用いると、加熱を要することなく水に溶解するので、溶解操作が容易である。必要であれば、得られた特定化合物の溶液を、脱２価金属カチオン処理に付し、溶液中の２価金属カチオン濃度が構造体形成濃度を下回るようにする。必要に応じて、溶媒中に予め特定化合物以外の因子を加えておいてもよいし、得られた特定化合物の溶液に特定化合物以外の因子を加えてもよい。第１の液体は滅菌処理されていることが好ましい。滅菌処理の方法としては、オートクレーブ、ろ過滅菌等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００３０】
〔第２の液体〕
第２の液体は、連結物質として２価金属カチオンを含有する。２価金属カチオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、マンガンイオン、鉄イオン、銅イオン等が挙げられる。２価金属カチオンの種類は、第１の液体中に含まれる特定化合物が、当該２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することが可能であれば特に限定されないが、好ましくはカルシウムイオンである。
【００３１】
第２の液体は、通常、連結物質（即ち、２価金属カチオン）の溶液である。当該溶液のための溶媒は、特定化合物を溶解可能なものである限り、特に限定されないが、通常、水又は親水性溶媒であり、好ましくは水である。即ち、好ましい態様において第２の液体は、連結物質（即ち、２価金属カチオン）の水溶液である。
【００３２】
第２の液体には、第１の液体と第２の液体とを混合し、最終的に得られる液状の培地組成物中の２価金属カチオン濃度が、第１の液体中の特定化合物が構造体を形成するのに十分となる量の２価金属カチオンが含まれる。
第２の液体中の２価金属カチオン濃度は、最終的に得られる液状の培地組成物中の２価金属カチオン濃度と、第１の液体と第２の液体との混合比から算出することができる。
【００３３】
第２の液体には、連結物質（即ち、２価金属カチオン）、溶媒以外の因子が含まれていてもよい。該因子としては、意図した細胞を培養するのに適した培地構成成分が挙げられる。当該培地構成成分としては、緩衝剤（炭酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ＨＥＰＥＳ等）、無機塩（ＮａＣｌ等）、各種アミノ酸、各種ビタミン（コリン、葉酸等）、糖類（グルコース等）、抗酸化剤（モノチオグリセロール等）、ピルビン酸、脂肪酸、血清、抗生物質、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックス等を挙げることができるが、これらに限定されない。第２の液体は滅菌処理されていることが好ましい。滅菌処理の方法としては、オートクレーブ、ろ過滅菌等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００３４】
好ましい態様において、第２の液体は、構造体形成濃度の２価金属カチオン（好ましくは、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオン）を含有する液体培地であるか、または、該液体培地の濃縮液である。
本発明によれば、たとえ第１の液体の特定化合物濃度が高くても（即ち、第１の液体に含まれる溶媒（水）の量が少なくでも）、第１の液体と第２の液体とを好ましく混合することが可能である。よって、第１の液体の特定化合物濃度が高く、第１の液体が少量である場合には、第１の液体による第２の液体（液体培地）の希釈を無視することができるから、第２の液体は、濃縮液ではなく、薄めずそのまま使用できる液体培地であってよい。
一方、第１の液体の特定化合物濃度が比較的低い方が（即ち、第１の液体に含まれる溶媒（水）の量が比較的多い方が）、第１の液体と第２の液体とは容易に好ましく混ざり合う傾向にあり、構造体は好ましく分散し得る。よって、第１の液体の特定化合物濃度が低い場合（溶媒（水）の量が第２の液体にとって無視できない場合）には、第２の液体（液体培地）は、第１の液体によって希釈されることを考慮して、混合後に好ましい液体培地となるような濃縮液であることが好ましい。
第２の液体は、２価金属カチオン（好ましくは、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオン）及び水に加えて、意図した細胞を培養するのに適した培地構成成分を含有する。一般的に使用される細胞培養用液体培地中のカルシウムイオン濃度の範囲は０．１〜２．０ｍＭ程度、マグネシウムイオン濃度は０．１〜１．０ｍＭ程度であるので、ＤＡＧ等の特定化合物による構造体形成に十分である。第２の液体における、２価金属カチオン（好ましくは、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオン）の濃度は、第１の液体との混合比を考慮し、最終的に得られる液状の培地組成物中の２価金属カチオン濃度が、構造体形成濃度となるように調整される。他の連結物質についても同様である。また、第２の液体における、意図した細胞を培養するのに適した培地構成成分の濃度は、第１の液体との混合比を考慮し、最終的に得られる液状の培地組成物中の培地構成成分の濃度が、意図した細胞を培養するのに適した濃度範囲内となるように調整される。例えば、体積Ｖ１の第１の液体と、体積Ｖ２の第２の液体とを混合して、体積Ｖ１＋Ｖ２の液状の培地組成物を最終的に得る場合、当該液状の培地組成物中の２価金属カチオンの濃度をＣｉとするためには、第２の液体中の２価金属カチオンの濃度を、Ｃｉ×（Ｖ１＋Ｖ２）／Ｖ２とすればよい。他の連結物質についても同様である。同様に、体積Ｖ１の第１の液体と、体積Ｖ２の第２の液体とを混合して、体積Ｖ１＋Ｖ２の液状の培地組成物を最終的に得る場合、当該液状の培地組成物中の培地構成成分の濃度をＣｍとするためには、第２の液体中の培地構成成分の濃度を、Ｃｍ×（Ｖ１＋Ｖ２）／Ｖ２とすればよい。
本態様においては、本発明の製造方法により、第１の液体と第２の液体を混合することにより、第１の液体に含まれていた特定化合物が第２の液体に含まれていた連結物質を介して結びついてなる構造体を含む、目的とする液状の培地組成物を直ちに得ることができる。
【００３５】
尤も、第２の液体には、上述の細胞培養用培地構成成分の一部又は全部が含まれていなくてもよい。その場合、本発明の製造方法において、第１の液体と第２の液体を混合し、第１の液体に含まれていた特定化合物が第２の液体に含まれていた連結物質を介して結びついてなる構造体を含む混合液を得て、当該混合液中に、上記細胞培養用液体培地構成成分の一部又は全部を加えることにより、目的とする液状の培地組成物を得ることができる。
【００３６】
第１の液体と第２の液体の体積混合比は、第１の液体の体積１００に対して、第２の液体の体積が、例えば１０〜９９００、好ましくは１００〜４９００である。
【００３７】
好適な態様において、本発明の製造方法により製造される液状の培地組成物中に含有される特定化合物の９０モル％以上（好ましくは、９５モル％以上、より好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％）は、第１の液体に由来し、該培地組成物中に含有される２価金属カチオンの９０モル％以上（好ましくは、９５モル％以上、より好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％）は、第２の液体に由来する。
【００３８】
〔液状の培地組成物〕
本発明の製造方法により得ることができる液状の培地組成物は、第１の液体に含まれていた特定化合物が第２の液体に含まれていた連結物質（即ち、２価金属カチオン）を介して結びついてなる構造体を含有し、且つ該培地組成物中に該構造体が均一に分散されているので、当該培地組成物を用いると、浮遊状態を維持したまま、細胞や組織を培養することが可能である。
【００３９】
培養の対象となる細胞や組織が由来する生物の種類は、特に限定されず、動物（昆虫、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等）のみならず、植物も含まれる。
【００４０】
一態様において、培養の対象となる細胞は、足場依存性の細胞である。本発明の製造方法により得ることができる液状の培地組成物を用いると、足場依存性の細胞を、足場となる担体を用いることなく、浮遊状態を維持したまま、培養することが可能である。
【００４１】
本発明において、細胞及び／又は組織の浮遊とは、培養容器に対して細胞及び／又は組織が底面に対し接触はし得るが付着しない状態（非接着）であることをいう。更に、本発明において、細胞及び／又は組織を増殖、分化或いは維持させる際、液体の培地組成物に対する外部からの圧力や振動或いは当該組成物中での振とう、回転操作等を伴わずに細胞及び／又は組織が当該液状の培地組成物中で均一に分散しなおかつ浮遊状態にある状態を「浮遊静置」といい、当該状態で細胞及び／又は組織を培養することを「浮遊静置培養」という。また、「浮遊静置」において浮遊させることのできる期間としては、５分以上、１時間以上、２４時間以上、４８時間以上、７日以上等が含まれるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。
【００４２】
本発明の製造方法により得ることができる液状の培地組成物は、細胞や組織の維持や培養が可能な温度範囲（例えば、０〜４０℃）の少なくとも１点において、細胞及び／又は組織の浮遊静置が可能である。本発明により得ることができる液状の培地組成物は、好ましくは２５〜３７℃の温度範囲の少なくとも１点において、最も好ましくは３７℃において、細胞及び／又は組織の浮遊静置が可能である。
【００４３】
浮遊静置が可能か否かは、例えば、培養対象の細胞を、２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で、評価対象の培地組成物中に均一に分散させ、１５ｍＬコニカルチューブ中に１０ｍＬ注入し、少なくとも５分以上（例、１時間以上、２４時間以上、４８時間以上、７日以上）、４℃〜１０℃程度の温度下で静置し、当該細胞の浮遊状態が維持されるか否かを観察することにより、評価することができる。全細胞のうちの７０％以上が浮遊状態の場合、浮遊状態が維持されたと結論できる。細胞に代えて、ポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ  ５００−６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．製）に代替して評価してもよい。
【００４４】
好ましい態様において、本発明の製造方法により得ることができる液状の培地組成物は、上記構造体を含むことによって、その粘度が実質的に高められていない。「液体の粘度を実質的に高めない」とは、液体の粘度が８ｍＰａ・ｓを上回らないことを意味する。この際の当該液体の粘度（すなわち、本発明の製造方法により得ることができる液状の培地組成物の粘度）は、３７℃において、８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以下である。構造体を含む液体の粘度は、３７℃条件下でＥ型粘度計（東機産業株式会社製、ＴＶ−２２型粘度計、機種：ＴＶＥ−２２Ｌ、コーンロータ：標準ロータ  １°３４´×Ｒ２４、回転数１００ｒｐｍ）を用いて測定することができる。
【００４５】
本発明の製造方法により得ることができる液状の培地組成物中の特定化合物の濃度は、特定化合物の種類に依存し、特定化合物が上述の構造体を液状の培地組成物中に形成し、（好ましくは、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く）細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、ＤＡＧの場合、０．００１％乃至１．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００３％乃至０．５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００５％乃至０．３％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．０１％乃至０．０５％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．０３％（ｗ／ｖ）である。キサンタンガムの場合、０．００１％乃至５．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１％乃至１．０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０５％乃至０．５％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは、０．１％乃至０．２％（ｗ／ｖ）である。κ−カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、両化合物の総和として、０．００１％乃至５．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００５％乃至１．０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１％乃至０．１％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは、０．０３％乃至０．０５％（ｗ／ｖ）である。ネイティブ型ジェランガムの場合、０．０５％乃至１．０％(ｗ／ｖ)、好ましくは、０．０５％乃至０．１％(ｗ／ｖ)である。
【００４６】
特定化合物として上記多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用する場合、当該多糖類の濃度は、当該多糖類の組み合わせが上述の構造体を液状の培地組成物中に形成し、（好ましくは、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く）細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、ＤＡＧ又はその塩と、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類との組合せを用いる場合、ＤＡＧ又はその塩の濃度としては０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜０．０２％（ｗ／ｖ）が例示され、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類の濃度としては、０．０００１〜０．４％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００５〜０．４％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．１〜０．４％（ｗ／ｖ）が例示される。具体的な濃度範囲の組合せとしては、以下が例示される。
ＤＡＧ又はその塩：０．００５〜０．０２％（好ましくは０．０１〜０．０２％）（ｗ／ｖ）
ＤＡＧ以外の多糖類
キサンタンガム：０．１〜０．４％（ｗ／ｖ）
アルギン酸ナトリウム：０．０００１〜０．４％（ｗ／ｖ）（好ましくは、０．１〜０．４％（ｗ／ｖ））
ネイティブジェランガム：０．０００１〜０．４％（ｗ／ｖ）
ローカトビーンガム：０．１〜０．４％（ｗ／ｖ）
メチルセルロース：０．１〜０．４％（ｗ／ｖ）（好ましくは０．２〜０．４％（ｗ／ｖ））
カラギーナン：０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）
ダイユータンガム：０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）
【００４７】
一態様において、脱アシル化ジェランガム又はその塩と、二価金属カチオン媒体中でランダムコイル状態を維持し、かつ二価金属イオンを介して架橋できる酸性多糖類又はその塩を、組み合わせて、特定化合物として用いる。該酸性多糖類は、好ましくは、アルギン酸、ペクチン及びペクチン酸からなる群から選択されるいずれかであり、より好ましくはアルギン酸である。塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩；カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩；アルミニウム、亜鉛、銅、鉄等の塩；アンモニウム塩等が挙げられるが、好ましくはナトリウム塩である。該酸性多糖類又はその塩としては、アルギン酸ナトリウムが好適に用いられる。本態様において、本発明の製造方法により得ることができる液状の培地組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度は、例えば０．００２〜０．０１（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．００２〜０．００９（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．００３〜０．００９（ｗ／ｖ）％であり、前記酸性多糖類又はその塩（例、アルギン酸ナトリウム）の濃度は、例えば、０．００４〜０．１（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．００４〜０．０２（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．００４〜０．０１５（ｗ／ｖ）％であり、更に好ましくは０．００５〜０．０１５（ｗ／ｖ）％である。
【００４８】
なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度［％（ｗ／ｖ）］＝特定化合物の重量（ｇ）／培地組成物の体積（ｍＬ）×１００
【００４９】
好ましい態様において、特定化合物としてＤＡＧ又はその塩を用い、連結物質としてカルシウムイオンを用いる。第１の液体は、ＤＡＧ又はその塩の水溶液である。第２の液体は、カルシウムイオンを含有する液体培地の濃縮液である。第１の液体と第２の液体の体積混合比は、上記したとおり、第１の液体の体積（Ｖ１）１００に対して、第２の液体の体積（Ｖ２）が１０〜９９００、好ましくは１００〜４９００である。混合の結果として得られる液状の培地組成物中のＤＡＧ濃度は、好ましくは０．０１％〜０．０５％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは、０．０１％〜０．０３％（ｗ／ｖ）である。混合の結果として得られる液状の培地組成物中のカルシウムイオン濃度は、ＤＡＧが構造体を形成する濃度であり、通常、０．１〜２．０ｍＭ程度である。混合の結果として得られる液状の培地組成物中の培地構成成分の濃度は、意図した細胞（例、哺乳動物細胞）を培養するのに適した濃度範囲内である。
第１の液体中のＤＡＧ濃度は、上述の混合の結果として得られる液状の培地組成物中のＤＡＧ濃度に、（Ｖ１＋Ｖ２）／Ｖ１（即ち、１１０／１００〜１００００／１００、好ましくは、２００／１００〜５０００／１００）を乗じて得られる濃度である。
第２の液体中のカルシウムイオン濃度は、上述の混合の結果として得られる液状の培地組成物中のカルシウムイオン濃度に、（Ｖ１＋Ｖ２）／Ｖ２（即ち、１１０／１０〜１００００／９９００、好ましくは、２００／１００〜５０００／４９００）を乗じて得られる濃度である。
第２の液体中の培地構成成分の濃度は、上述の混合の結果として得られる液状の培地組成物中の培地構成成分の濃度に、（Ｖ１＋Ｖ２）／Ｖ２（即ち、１１０／１０〜１００００／９９００、好ましくは、２００／１００〜５０００／４９００）を乗じて得られる濃度である。
該液状の培地組成物には、ＤＡＧがカルシウムイオンを介して結びついてなる構造体が均一に分散して含まれることにより、粘度が実質的に高められること無く、細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことができる。
本発明の製造方法により得られる液状の培地組成物を用いると、細胞や組織の障害や機能喪失を引き起こすリスクのある振とうや回転等の操作を伴わずに細胞及び／又は組織を浮遊状態にて培養することができる。更に、当該培地組成物を用いると、培養の際、容易に培地を交換することができる上に、培養した細胞及び／又は組織を容易に回収することもできる。当該培地組成物を用いると、従来プレート上で単層で、細胞容器に接着した状態での培養を要していた細胞を、浮遊状態にて培養することができるので、接着性の細胞をその機能を損なうことなく効率的に大量に調製することができる。
【００５０】
第１の液体と第２の液体との混合液は、それ自体が、製造目的の培地組成物であってもよいが、該混合液に添加物をさらに加えることで製造目的の培地組成物となるものであってもよい。
【００５１】
次に、本発明の製造方法および製造装置における合流管路構造を詳細に説明する。該合流管路構造は、図１に示すように、第１の流入管路１１と第２の流入管路１２とが合流して流出管路１３となる構造を有し、第１の液体１と第２の液体２とが合流によって混合されるように構成されたものが利用され得る。合流管路構造は、Ｔ字形管やＹ字管などのように、２つの流入管路が単純に合流する流路構造であってもよいし、第１の流入管路と第２の流入管路のうちの一方または両方が複数であり、それら第１の流入管路と第２の流入管路とが一点で合流し、それぞれの流入管路から流入した第１の液体１と第２の液体２とが一点で衝突し、混合液として流出管路へ流出する構造（即ち、中心衝突型ミキサー）であってもよい。また、合流管路構造は、可動の撹拌子を用いることなく、流路の構造だけによって、両液体をより高い混合度となるように合流させ得る構造を有するものであってもよく、また、第１の液体と第２の液体のみならず、必要に応じて、他の液体をも合流させて混合し得る、他の流入管路を有する流路構造を有していてもよい。
【００５２】
図２は、２つの流入管路が単純に合流する合流管路構造を例示する断面図である。図２（ａ）、（ｂ）は、Ｔ形の合流管路構造１０の断面を単純化して示した図であり、図２（ｃ）は、Ｙ形の合流管路構造の断面を単純化して示した図である。外部の管と接続するための継ぎ手の構造（ネジやカップリングなど）は、適宜付与されてよい。図に示した管路の各部の姿勢は、説明のためのものである。
図２（ａ）の態様では、図１の模式図と同様、図中のＴ形の上部に位置する１つの水平方向の管路が２つの流入管路１１、１２からなり、中央の合流部から下方に延びる管路が流出管路１３となっている。流入管路１１、１２にそれぞれ流入する第１の液体１と第２の液体２は、中央の合流部で合流して互いに混ざり合い、混合液（製造すべき液状の培地組成物）３となって流出管路１３中を流れ、供給のために吐出される。この態様では、第１の液体１と第２の液体２とが互いに正反対の方向を向いて衝突するように、第１の流入管路１１と第２の流入管路１２とが一直線に位置合せされており、かつ、流出管路１３が、第１の流入管路１１および第２の流入管路１２に対して直角に延びている。これにより、両液体１、２は、互いに激しく衝突して混ざり合う。また、両液体が層流になって流出管路１３に流れこむといった現象が生じることもない。
図２（ｂ）の態様は、図２（ａ）に示すＴ形の流路構造の変形態様であって、図２（ａ）に示すＴ形の上部に位置する水平方向の管路１１、１２が、図２（ｂ）では、垂直方向の管路として用いられて、流入管路１１、流出管路１３となっている。また、図２（ａ）のＴ形の垂直方向の管路１３が、図２（ｂ）では、水平方向の流入管路１２となっている。
図２（ｃ）の態様では、Ｙ形の上部に位置する２つの斜め方向の管路が第１、第２の流入管路１１、１２となっており、これらが合流し、下方に延びる流出管路１３となっている。
【００５３】
図３は、合流管路構造１０の他の態様を例示する断面図である。
図３の態様では、第１の液体１と第２の液体２とがＶ形をなして（即ち、所定の内角θにて）互いに衝突するように、第１の流入管路１１と第２の流入管路１２とがＶ形に位置合せされている。両液体１、２が角度をなして衝突する点では、図２（ｃ）のＹ形の合流管路構造と同様である。しかし、図３の態様では、Ｙ形の合流管路構造とは逆に、流出管路１３が合流部分からＶ形の内角θの範囲内にあるように延びており、より好ましい態様ではＶ形の内角θを２等分する方向に延びている。これにより、両液体１、２は、図２（ａ）のＴ形の合流管路構造と同様に、互いに激しく衝突して混ざり合う。また、流出管路１３が第１の流入管路１１と第２の流入管路１２との間の内角θの側に位置しているので、両液体１、２が層流になって流出管路１３に流れこむといった現象が生じることもない。
【００５４】
図２（ａ）〜（ｃ）、および、図３に例示するように、２つの管路が単純に合流する流路構造であっても、両方の液体が衝突することで乱流が生じる合流であれば、第１の液体と第２の液体とは好ましい混合状態となって混合され得る。これらの流路構造は、あくまでも合流の代表的な例であって、合流する管路の数や互いの間の角度はこれらの例には限定されず、第１の液体と第２の液体とが好ましい混合状態となって混合されるように選択することが好ましい。
図４は、本発明における合流管路構造内での、第１、第２の液体の好ましい衝突状態を例示する模式図である。図４（ａ）は、図２（ａ）に対応し、図４（ｂ）は、図３に対応する。両液体の好ましい混合状態を得るためには、図４（ａ）に示すように、第１の液体１と第２の液体２とが互いに正反対の方向を向いて衝突するか、または、図４（ｂ）に示すように、互いにＶ形をなして衝突することが好ましい。いずれの場合も、第１の液体１の流れと混合液３の流れがなす角度θ１、および、第２の液体２の流れと混合液３の流れがなす角度θ２は、それぞれ、３０度〜９０度が好ましい。例えば、図４（ａ）のＴ形流路では、角度θ１、θ２は、９０度が好ましい。図４（ｂ）のＶ形流路では、Ｖ形の内角は、θ１とθ２の和であり、θ１、θ２は、１０度〜６０度が好ましく、θ１＝θ２が好ましい。
図２（ｃ）に示すＹ形の流路構造のように、角度θ１、θ２が９０度を超えると、両液体は、互いにスムーズに合流して層流となり易く、よって、好ましい混合状態とならない場合がある。
【００５５】
合流管路構造は、第１、第２の流入管路から流入する両液体１、２を、旋回流が発生するように合流させて混合する構造を有するものでもよい（図示せず）。
例えば、流出管路内において、該一方の液体が、中心を流れる他方の液体を周囲で取り巻く旋回流となるように、一方の液体を他方の液体に合流させれば、２つの液体は効果的に混合され、好ましい混合状態となり得る。代替的には、合流管路構造は、２つの液体が互いに対等の角度で合流して両方の液体が２重螺旋のように、旋回流を形成するように構成されていてもよい。また、複数の第１の流入管路と、複数の第２の流入管路とが１つに合流し、旋回流を発生させる構造であってもよい。
旋回流を発生させる場合の、第１、第２の液体の流速や流量の比率は、第１の液体の特定化合物の濃度、第２の液体の連結物質の濃度に応じて、好ましい混合状態が得られるように適宜に決定すれことができる。
【００５６】
図５は、合流管路構造の他の態様を例示する断面図であって、２つの流入管路が２重管路として合流する例を示している。図５の態様では、第１の液体１が中央の流れとなり、第２の液体２が前記中央の流れを同心状に取り囲む外側の流れとなるように、両方の液体を合流させるように構成されている。この態様では、両液体の流れの方向は、互いに同じである。中央の流れは、第１の液体と第２の液体のうちの一方の液体であってよく、他方の液体が外側の流れであってよい。
このような同心状の合流であっても、両液体の速度の差異を大きくすることや、乱流を生じさせる部材を流路内に配置するなど、両方の液体が層流のままとなることを妨げることによって、好ましい混合状態を得ることが可能である。
【００５７】
本発明の特殊な態様では、一方の流入管路の先端の合流部分（開口端部）をノズル状に狭くし、それにより、一方の液体を、他方の流入管路中を流れる他方の液体に対して、高速で射出することで、両液体を合流させて混合させてもよい。例えば、図５に示す合流管路構造において、第１の流入管路１の先端の流出口をノズル状に狭くする。それにより、第１の液体は、第２の液体２の流速の２〜５０倍程度の極めて高い流速の流れでありかつ細く適正な比率の流量の流れとして、第２の液体の流れの中に同方向に突入して、両液体が合流する。このような大きい速度差で両液体が互いに衝撃的に接触することによっても、両液体は流出管路１３で合流しながら好ましく混合される。流出管路の長さは、合流によって十分な混合が得られ、かつ、安定した流れとなり得るような、十分な長さとすればよい。
例えば、図５に示す合流管路構造において、第１の液体の流量が０．５ｍＬ／分〜１０Ｌ／分程度であり、第２の液体の流量が１０ｍＬ／分〜１０Ｌ／分程度である場合、上記のような大きい流速差にて両液体を合流させるには、ノズル部の断面積（ノズル部の中心軸線（流れ方向の軸線）に垂直に切断したときの流路の断面の面積）は、流量に応じて決定すればよく、例えば、０．０１ｍｍ２〜５．００ｍｍ２程度、好ましくは０．０５ｍｍ２〜２．００ｍｍ２程度、より好ましくは０．１０ｍｍ２〜０．７０ｍｍ２程度が挙げられる。ノズル部の断面とは、該ノズル部の中心軸線に垂直に切断したときの断面である。ノズル部の出口を通過する液体の流量Ｑと、ノズル部の断面積Ｓと、ノズル部を通過する液体の流速Ｖとの間には、Ｑ＝Ｓ×Ｖの関係がある。
前記のような大きい流速差で合流させる特殊な態様においても、第１の液体の特定化合物の濃度、および、第２の液体の連結物質の濃度は、特に限定はされず、上記した範囲であってよい。
【００５８】
第１、第２の流入管路、および、流出管路は、液体が外気に接触することなく流れることができる流路であることが好ましい。第１、第２の流入管路、および、流出管路は、図２（ａ）〜（ｃ）、および、図３に例示したような、パイプの態様だけではなく、部分的に大きい空間を含んだ態様であってもよく、また、構造用の材料からなる塊状物中に形成された流路であってもよい。
合流管路構造の材料としては、金属、ガラス（ケイ酸塩ガラスなど）、プラスチックなど、耐食性を有し、かつ、両液体に影響を及ぼさない、構造用の材料が利用可能である。
【００５９】
両液体を合流させることによって混合する場合、混合液が好ましい混合状態となり易いように、第１の液体における特定化合物の濃度、第２の液体における連結物質の濃度、両液体の流量の比率、流速の比率を適宜選択することが好ましい。
以下、説明のために、上記（ｉ）の特定化合物がＤＡＧであり、第１の液体が該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液であり、上記（ｉｉ）の連結物質が、カルシウムイオンであり、第２の液体が、カルシウムイオンを含有する液体培地である場合について、両液体の濃度、流量、流速の好ましい組合せを例示する。
【００６０】
先ず、混合によって形成される液状の培地組成物中のＤＡＧの濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．０５％（ｗ／ｖ）程度が好ましく、０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．０３％（ｗ／ｖ）がより好ましい。混合の結果として得られる液状の培地組成物中のカルシウムイオン濃度は、ＤＡＧが構造体を形成する濃度であり、通常、０．１〜２．０ｍＭ程度である。
第１の液体と第２の液体の体積混合比は、上記した特定化合物の濃度と連結物質の濃度に応じて、目的の液状の培地組成物中のＤＡＧの濃度が得られるように、適宜決定すればよい。本発明では、両方の液体は、流れながら混合されるので、体積混合比は流量（単位時間当たりに流れる液体の体積）の比率としても表わすことができる。
例えば、第１の液体の流量（ＦＶ１）を１００とした場合の、それに対する第２の液体の流量（ＦＶ２）の比は、通常１０〜９９００、好ましくは１００〜４９００である。
第１の液体中のＤＡＧ濃度は、上述の混合の結果として得られる液状の培地組成物中のＤＡＧ濃度に、（ＦＶ１＋ＦＶ２）／ＦＶ１（即ち、１１０／１００〜１００００／１００、好ましくは、２００／１００〜５０００／１００）を乗じて得られる濃度である。
第２の液体中のカルシウムイオン濃度は、上述の混合の結果として得られる液状の培地組成物中のカルシウムイオン濃度に、（ＦＶ１＋ＦＶ２）／ＦＶ２（即ち、１１０／１０〜１００００／９９００、好ましくは、２００／１００〜５０００／４９００）を乗じて得られる濃度である。
【００６１】
第１、第２の流入管路、流出管路のそれぞれの断面積（各管路の中心軸線（流れ方向の軸線）に垂直に切断したときの該管路（流路）の断面の面積）、第１、第２の液体の流量と流速、混合液の流速は、特に限定はされず、実験用の少量から、産業用（大容量の容器に液状の培地組成物を充填して販売する場合や、商業的な細胞培養の現場において、大容量の培養容器に液状の培地組成物をその場で形成して供給する用途など）の大量まで、液状の培地組成物の必要量に応じて適宜決定すればよい。
汎用的な具体例を挙げる。第１、第２の流入管路の各断面積は、０．００７５ｍｍ２〜２０ｍｍ２程度（断面形状が円形の場合には、内径が０．１ｍｍ〜５ｍｍ程度）、第１の液体の流量は、０．５ｍＬ／分〜１０Ｌ／分程度、第２の液体の流量は、１０ｍＬ／分〜１０Ｌ／分程度である。流出管路の断面積は、前記第１、第２の流入管路の断面積に応じて決定することができ、０．００７５ｍｍ２〜４００ｍｍ２程度（断面形状が円形の場合には、内径が０．１ｍｍ〜２００ｍｍ程度）であり、混合液の流量は、前記した第１、第２の液体の各流量の合計である。各液体の流量は、各液体を送り出す各ポンプの能力（吐出量）に応じて決定してもよい。また、複数のポンプを並列的に用いて流量を高めてもよい。
前記した第１、第２の流入管路、流出管路のそれぞれの断面積は、全般的かつ平均的な値であって、局所的に流速を高くし、または、低くする必要がある場合には、その部分の管路の断面積を適宜変化させてもよい。
第１、第２の液体、混合液のそれぞれの流速は、上記した各管路を流れる液体の流量と各管路の断面積とによって決定される（流速＝流量／断面積）。本願発明では、第１、第２の液体が、流れながら合流して互いに混ざり合うので、ある程度の高い流速が必要である。そのような高い流速は、例えば、第１の液体の流量が０．５ｍＬ／分〜１０Ｌ／分程度であり、第２の液体の各流量が１０ｍＬ／分〜１０Ｌ／分程度である場合には、第１、第２の流入管路の各断面積を、０．０１ｍｍ２〜１．０ｍｍ２程度とすることで、達成可能である。このようにして得られる高い流速により、両液体は好ましく互いに衝突して混ざり合う。
図６に示す態様では、図２（ａ）に示したＴ形の合流管路構造１０における、第１の管路１１、第２の管路１２、流出管路１３のそれぞれの合流部分の管路（１１ａ、１２ａ、１３ａ）の断面積を小さくし、両液体１、２が高速で衝突しかつ高速で流出管路１３に流出するように構成されている。このような態様は、図３に示したＶ形の合流管路構造１０などにも適用可能である。このような態様により、両液体１、２は、激しく衝突して混合され、好ましい混合状態の混合液３となる。
尚、合流直前の両液体の流速の比は、第１の液体の流速を１００とすると、それに対する第２の液体の流速は、１００〜１００００程度であってよい。また、合流後の流出管路中の混合液の流速は、合流管路構造のそれぞれの流路構造に応じて、適宜決定することができる。
【００６２】
両液体をより高い混合度となるように合流させ得る構造として、スタティックミキサー（可動の撹拌子を持たず、流路構造によって液体を混合するよう構成されたミキサー。フローミキサー、フローリアクター、マイクロリアクターとも呼ばれる）を利用してもよい。スタティックミキサーは、合流管路構造自体であってもよく、合流管路構造の後段に追加的に設けられてもよい。流入管路と流出管路とが合流する部分は、第１、第２の流入管路と流出管路のどれに属するかが明確でない過渡的な部分となっていてもよい。
【００６３】
図５の例では、第１の液体１と第２の液体２と合流した後に（即ち、流出管路１３中に）、合流した液体３の混合度をより高めるように、スタティックミキサーエレメント２０が配置されており、流出管路１３自体がスタティックミキサーとなっている（即ち、合流管路構造がスタティックミキサーを含んでいる）。代替的には、流出管路１３の後段にスタティックミキサーを接続してもよい。そのような代替的な態様では、スタティックミキサーを流出管路であると解することもできる。図５に示すように、合流した液体（混合液）３が、スタティックミキサーエレメント２０を通過することで、該混合液３は、その流路構造に起因して好ましい混合状態となり得る。
尚、図５に示すような同軸状の合流は、スタティックミキサーエレメントにとって、両液体が偏在しない好ましい入力流となり得る。よって、スタティックミキサーエレメントを合流部の後段で用いる場合には、図２、図３に示す流路構造を適宜選択することが好ましい。
【００６４】
スタティックミキサーエレメントまたはスタティックミキサーの混合原理、混合のための流路構造それ自体は、従来公知の種々の構造を参照してもよい。
例えば、特開２０１０−２６４３４８号公報などに記載された「混合羽根部材」は、流れの分断と合流とを繰り返して混合する典型的なスタティックミキサーエレメントであり、混合液をさらに十分に混合するために好ましく利用することができる。また、混合液の流れを細分化し合流させて混合するスタティックミキサーエレメントとして、ＭＳＥ(Multi Stacked Element)と呼ばれる多層構造が挙げられる。
【００６５】
合流管路構造は、上記したスタティックミキサーエレメントまたはスタティックミキサーの流路構造のように、次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の構造を少なくとも１つ有してよい。
（ｉ）第１の流入管路と第２の流入管路との合流によって混合された第１の液体と第２の液体との混合液の流れが、流出管路において、分割と合流を１回以上経るように構成されている構造。
（ｉｉ）第１の流入管路と第２の流入管路との合流によって混合された第１の液体と第２の液体との混合液の流れが、第１の流入管路と第２の流入管路との合流部分において、乱流または旋回流となるように構成されている構造。
（ｉｉｉ）第１の流入管路と第２の流入管路がそれぞれに合流前に２以上に分岐しており、分岐した各第１の流入管路と分岐した各第２の流入管路とが互いに合流し、最終的に１つの流出管路となるまで順次合流するよう構成されている構造。このような構造は、２つの液体が合流前に細かく分けられ、分けられた微量の２つの液体同士が多数の合流部において合流することで、混合度を高めるものである。細かい多数の合流が、どれだけの数の合流を繰り返して１つの流出管路となるかは、適宜決定すればよい。このような構造としては、例えば、特開２００７−２９６４５２号公報に記載されたマイクロミキサーが挙げられる。
【００６６】
その他、第１の液体と第２の液体とを、少量だけ好ましく混合し得るスタティックミキサーとしては、公知のマイクロリアクター用ミキサー（例えば、株式会社ワイエムシィ社製、Ｙ字型、Ｈｅｌｉｘ型、Ｓｔａｔｉｃ型など）が挙げられる。これらのマイクロリアクター用ミキサーは、管路が基板中に形成されており、コンパクトである。
【００６７】
第１の液体供給源は、第１の液体が収容された容器を少なくとも有し、同様に、第２の液体供給源もまた、第２の液体が収容された容器を少なくとも有する。容器は、第１、第２の液体をそれぞれ適切に収容し得るものであればよく、それぞれの液体を適切に収容し得る材料からなる、剛性を有するタンクや柔軟なバッグなどが例示される。第１の液体供給源および第２の液体供給源は、それぞれ、液体を送り出すためのポンプを有することが好ましい。ポンプは、当該製造装置の作動時にのみ装着され得る送り装置であってもよい。
ポンプは、公知の液体送り装置を利用し得く、例えば、ピストンとシリンダを用いたポンプ（シリンジポンプや、ボルメトリックポンプなど）や蠕動ポンプなど、流量、流速、送り圧などを精度良くコントロールできる装置が好ましい。ポンプの能力（吐出量、吐出圧力など）は、上記した両液体の混合に応じて適宜選択してよい。
蠕動ポンプを用いれば、それぞれの管路内の液体を外気に接触させることがなくなり、また、蠕動ポンプ自体には管路が無く、洗浄が不要であるから、使用後の管路を廃棄すれば、管路内の洗浄などのメンテナンスが不要となる。蠕動ポンプは、チューブポンプ（ローラーポンプとも呼ばれる）に代表されるように、弾性および柔軟性を持ったポンピングチューブを押しつぶす位置を、送り方向に移動させることで、該管路内の液体を移動させる作用を持ったポンプである。
蠕動ポンプの送り能力（チューブ内を移動する液体の毎分の流量）は、市販のものでは、微小流量から大流量まで幅広く、０．０１（ｍＬ／分）〜１０（Ｌ／分）程度が例示される。蠕動ポンプの送り能力は、実験用から産業用まで、合流させる各液体の流量に応じて決定してよい。蠕動ポンプは本発明の製造装置の一部を構成するものであってもよいし、本発明の装置にとって、利用すべき外部装置であってもよい。
また、蠕動ポンプを利用する場合、図１に示す製造装置における接続管Ｃ１、Ｃ２（第１、第２の液体供給源Ｓ１、Ｓ２の各容器と、合流管路構造１０とをそれぞれ接続する管路）は、蠕動ポンプにポンピングチューブとして装着され得、かつ、ポンピングチューブとして機能・作動し得る形状と柔軟性とを持った部分を有するチューブであることが好ましい。そのようなチューブは、使用される蠕動ポンプに適合するチューブの内径、外形、および、長さを持ち、蠕動ポンプのアクチュエーター（ローラーなど）に押圧されて潰れる軟らかさ、該アクチュエーターによる押圧から解放されたときに原形に復帰し得る弾性を持つことが好ましい。該接続管Ｃ１、Ｃ２は、全体がポンピングチューブとなり得るものであってもよいし、蠕動ポンプに装着される部分だけがポンピングチューブとなり得るものであってもよい。
【実施例】
【００６８】
実施例１
図１に示した製造装置を用い、本発明の製造方法を実施することによって、第１、第２の液体を、種々の濃度、および、種々の流速にて混合し、得られる培地組成物の混合状態（２液の混合によって形成される構造体の分散状態）を評価した。【００６９】
〔製造装置の構成〕
第１、第２の液体供給源Ｓ１、Ｓ２のポンプとしてプランジャーポンプ（図示せず）を用い、ＰＴＦＥ製チューブ（内径１．０ｍｍ、外径１．６ｍｍ、長さ３００ｍｍ）を用いて、各プランジャーポンプを、合流管路構造１０の第１、第２の流入管路１１、１２に接続した。流出管路１３の出口には、ＰＴＦＥ製チューブ（内径１．０ｍｍ、外径１．６ｍｍ、長さ５００ｍｍ）を接続した。
合流管路構造には、図６に示すＴ形の流路構造として、(株)三幸精機工業製のＴ形ミキサー（ステンレス製、合流部分の第１、第２の流入管路の断面積は、いずれも０．２０ｍｍ２である）を使用し、第１、第２の液体とが、一線上で互いに真逆の方向に衝突するように設置した。【００７０】
〔第１の液体、第２の液体の調整〕
第１の液体として、脱アシル化ジェランガムの水溶液を５００ｍＬ調製した。第２の液体として、ＤＭＥＭ液体培地（連結物質としてのカルシウムイオンを含有する液体培地）の濃縮液を５００ｍL調製した。第１の液体における脱アシル化ジェランガム濃度、及び第２の液体におけるＤＭＥＭ液体培地の濃縮率を表１に示す。【００７１】
〔混合〕
第１、第２の液体を、それぞれ所定の流量（ｍＬ／分）で合流管路構造内に送り、混合し、得られた混合液を５０ｍＬコニカルチューブ（住友ベークライト製）に分注した。なお、合流管路構造および合流管路構造に接続した流路については、２５℃の恒温槽に浸し温度を調整した。
得られた混合液（液状の培地組成物）における構造体の分散の状態は、ポリスチレンビーズの浮遊性により評価した。【００７２】
下記表１に、第１の液体と第２の液体の体積混合比、第１の液体のＤＡＧ濃度（％（Ｗ／ｖ）、第２の液体である液体培地の濃度、両液体の体積混合比、両液体の混合時の流量を示す。表では、第１の液体をＡ、第２の液体をＢとして示している。
尚、第２の液体の濃度は、標準の濃度を１倍とし、「×２」（２倍の濃度）のように、濃度の倍率を示している。【００７３】
【表１】
2018016622.tif 000004
【００７４】
上記試料１は、低濃度の第１の液体と高濃度の第２の液体との合流の例、上記試料２は、中濃度の第１の液体と中濃度の第２の液体との合流の例、上記試料３、４は、高濃度の第１の液体と標準程度の濃度の第２の液体との合流の例である。いずれも、両液体の合計は、１０００ｍＬである。
本実施例では、混合された各液の体積（即ち、混合体積比）が明らかになるよう、第１供給源、第２供給源のそれぞれの容器に、所定量の第１、第２液体を収容しておき（Ａ：Ｂ＝５００：５００、２５０：７５０、１００：９００）、各容器が空になるまで、プランジャーポンプで各液体を送る構成とした。【００７５】
〔混合状態の評価〕
浮遊性：両液体の混合直後に、ポリスチレンビーズ（直径６００μｍ、Polysciences社製）１０ｍｇを、コニカルチューブ中の培地組成物中に入れて転倒混和し、該転倒混和を終了した直後の浮遊状態と、該転倒混和を終了した後、２４時間経過した後に、再び転倒混和し、該転倒混和を終了した直後の浮遊状態を調べた。
浮遊状態の評価の基準は、次のとおりである。
×：全てのビーズが沈降している。
△：全てのビーズが浮いているが、全体的に液面から下方に沈降している。
○：全てのビーズが浮遊しており、下方に沈降する傾向がない。
視認性：混合後、１日後における光透過率を調べ、視認性とした。
混合時の温度、混合後の浮遊性、視認性を下記表２に示す。【００７６】
【表２】
2018016622.tif 000005
【００７７】
表２の結果において、試料１の混合直後における浮遊性が良好でないのは、構造体の形成に時間を要したからであると考えられる。しかし、時間の経過と共に、利用可能な液状の培地組成物となることがわかった。
また、表２の結果から、第１の液体を高濃度として、両液体の体積の差異（流量の差異）を大きくした場合でも、好ましく混合された液状の培地組成物を、安定して調製可能であることがわかった。【００７８】
実施例２
本実施例では、第１の液体にメチルセルロース（純性化学社製）をさらに加えたこと以外は、上記実施例１と同様に混合を行い、得られる培地組成物の浮遊性と視認性を上記実施例１と同様に評価した。
第１の液体としては、脱アシル化ジェランガム０．０４ｗｔ％、メチルセルロース０．６３ｗｔ％を含有する水溶液を５００ｍＬ調製した。
下記表３に、第１の液体と第２の液体の体積混合比、第１の液体におけるＤＡＧ濃度（％（Ｗ／ｖ）／メチルセルロース濃度（ＭＣ濃度（％（Ｗ／ｖ）））、第２の液体である液体培地の濃度、両液体の体積混合比、両液体の混合時の流量を示す。表３では、表１と同様に、第１の液体をＡ、第２の液体をＢとして示している。また、第２の液体の濃度は、標準の濃度を１倍とし、「×２」（２倍の濃度）のように、濃度の倍率を示している。【００７９】
【表３】
2018016622.tif 000006
【００８０】
混合時の温度、混合後の浮遊性、視認性を下記表４に示す。【００８１】
【表４】
2018016622.tif 000007
【００８２】
表４の結果から、第１の液体にメチルセルロースがさらに加えられていても、好ましく混合された液状の培地組成物を、調製可能であることがわかった。【００８３】
以下の実施例３〜５では、上記実施例１と同様の製造装置を用い、かつ、同様の第１、第２の液体を用い、培地の浮遊性に影響を与える因子のなかでも重要な、第１、第２の液体の体積混合比と流量を種々の値に変えて混合を行い、結果得られる液状の培地組成物の浮遊性および視認性を確認した。
浮遊性に関しては、実施例１と同様、ポリスチレンビーズ（直径６００μｍ、Polysciences社製）を用いて評価を行った。
視認性に関しては、２液の混合によって形成される構造体が培地組成物中に均一に分散した状態であるかどうかを目視によって判定した。以下、該構造体が培地組成物中において局所的に集まり、目視で確認できる状態となったものを、「ゲル様体」と呼ぶ。
第２の液体の濃度は、標準の濃度を１倍とし、「２倍」の濃度といったように、濃度の倍率を示している。
以下の実施例３〜５では、製造すべき液状の培地組成物１００ｍＬを得るのに必要な時間を、「回収時間」と呼ぶ。【００８４】
実施例３
本実施例では、最も容易に好ましい混合状態となり得ると考えられる体積混合比１：１について、流量を変えた場合の混合状態を調べた。
第１の液体と第２の液体の体積混合比を１：１に保ちながら（即ち、第１の液体と第２の液体の流量を互いに同じに保ちながら）、２液の流量を５０ｍＬ／分（Ｒｕｎ １）、１ｍＬ／分（Ｒｕｎ ２）、０．１ｍＬ／分（Ｒｕｎ ３）に変更し、混合を行った。混合された液状の培地組成物の浮遊性と視認性を下記表５に示す。【００８５】
【表５】
2018016622.tif 000008
【００８６】
上記表５のとおり、第１の液体と第２の液体の体積混合比を１：１に固定した場合には、２液の流量を５０ｍＬ、１ｍＬ、０．１ｍＬ／分に変更しても、ゲル様体は確認されず、ビーズの浮遊性の悪化も確認されなかった。尚、Ｒｕｎ１〜３では、いずれも、ビーズは、混合直後では、若干沈降したが、２４時間経過後の転倒混和の後では、良好な分散状態となった。【００８７】
実施例４
本実施例では、比較的、ゲル様体が発生し易いと考えられる体積混合比〔（第１の液体：第２の液体）＝（１：１９）〕について、流量を変えた場合の混合状態を調べた。
第１の液体と第２の液体の体積混合比が１：１９に保たれるように、２液の各流量（ｍＬ／分）を、２．６／５０（Ｒｕｎ １）、０．１／１．９（Ｒｕｎ ２）、０．４／７．６（Ｒｕｎ ３）、０．８／１５．２（Ｒｕｎ ４）、０．５／９．５（Ｒｕｎ ５）、０．６／１１．４（Ｒｕｎ ６）、０．７／１３．３（Ｒｕｎ ７）に変更し、混合を行った。混合された液状の培地組成物の浮遊性と視認性を下記表６に示す。また、Ｒｕｎ １とＲｕｎ ２における、コニカルチューブ底部のビーズの分散の様子を、図７の写真図に示す。【００８８】
【表６】
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【００８９】
上記表６のとおり、第１の液体と第２の液体の体積混合比を１：１９に固定した場合、ゲル様体は、全ての条件で確認されなかったが、Ｒｕｎ ２〜Ｒｕｎ ３では、液状培地全体が少し不透明であった。浮遊性については、Ｒｕｎ ２、Ｒｕｎ ３、Ｒｕｎ ５、Ｒｕｎ ６において、評価が「△」であり、ビーズは全体的に液面から下方に沈降する傾向が見られた。Ｒｕｎ ２、Ｒｕｎ ３では、ビーズはＲｕｎ ５、Ｒｕｎ ６よりも沈降する傾向を示した。Ｒｕｎ ２は、Ｒｕｎ ３よりも沈降する傾向を示した。【００９０】
実施例５
本実施例では、混合される第１の液体と第２の液体の合計流量を、２．０ｍＬ／分に固定し、体積混合比を１：２〜１：９に変えた場合の混合状態を調べた。本発明による２液の混合では、合計流量に占めるＤＡＧの割合を下げ、液体培地の割合を上げれば上げるほど、混合された液状培地組成物の浮遊性が悪化することが考えられるので、本実施例では、ビーズの沈降と浮遊の境界を調べた。混合された液状の培地組成物の浮遊性と視認性を下記表７に示す。また、Ｒｕｎ ２とＲｕｎ ５における、コニカルチューブ底部のビーズの分散の様子を、図８の写真図に示す。【００９１】
【表７】
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【００９２】
上記表７のとおり、Ｒｕｎ １〜３の体積混合比においてビーズが沈降する傾向を示し、Ｒｕｎ ４、５の体積混合比においてビーズが浮遊することがわかった。本実施例の結果から、合計流量が２.０ｍＬ／分の場合には、体積混合比１：４と１：３との間が、ビーズの沈降と浮遊の境界であることが明らかとなった。【００９３】
上記実施例３〜５から明らかなとおり、明らかなゲル様体は全ての条件で確認されなかった。一方で、体積混合比を１：１９に固定した場合には、流量０．１／１．９〜０．６／１１．４（ｍＬ／分）の範囲で、ビーズの浮遊性の悪化（評価△）が確認され、合計流量を２．０ｍＬ／分に固定した場合には、体積混合比１：４と１：３との間に、ビーズの浮遊性の良否（評価○と評価△）の境界があることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明の製造方法および製造装置によって、２価金属カチオンなどの連結物質を含んだ任意の液体に対して、特定化合物を含んだ液体を無菌的にかつ簡単にかつ好ましく混合し得、微細な構造体が分散した液状の培地組成物を安価にかつ大量に得ることができるようになった。【００９５】
本出願は、日本で出願された特願２０１６−１４４９５３（出願日：２０１６年７月２２日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含される。
【符号の説明】
【００９６】
１        第１の液体
２        第２の液体
３        混合液（液状の培地組成物）
１０      合流管路構造
１１      第１の流入管路
１２      第２の流入管路
１３      流出管路
Ｓ１      第１の液体供給源
Ｓ２      第２の液体供給源
Ｃ１      接続管
Ｃ２      接続管
Ｃ３      供給管
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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