(57)【要約】  本発明は、有機セレン化合物であるセレノネインの生理活性を検証し、その新たな用途を見出すことを目的とする。本発明によれば、上記課題を解決するために、有機セレン化合物を有効成分として含有する組成物、該組成物を含む食品、食品組成物、医薬組成物が提供される。本発明の組成物等を摂取することにより、酸化ストレス低減、酸化脂質抑制、虚血性疾患予防、メタボリックシンドローム改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、血管内皮障害抑制、動脈硬化抑制、認知症予防、脳機能改善、角膜上皮細胞保護、ドライアイ改善、または炎症抑制に対して顕著な効果が期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2018066676.tif 000022
［式中、
Ｒは、水素、エルゴチオニル基、グルタチオニル基、またはシステイニル基である］
で表される有機セレン化合物を有効成分として含有する、酸化ストレス低減、酸化脂質抑制、虚血性疾患予防、メタボリックシンドローム改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、血管内皮障害抑制、動脈硬化抑制、認知症予防、脳機能改善、角膜上皮細胞保護、ドライアイ改善、または炎症抑制のための組成物。
【請求項２】
有機セレン化合物が、式ＩＩ：
【化２】
2018066676.tif 000023
で表される３−（２−ヒドロセレノ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）−２−（トリメチルアンモニオ）プロパノエートである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
式ＩＩＩ：
【化３】
2018066676.tif 000024
で表される有機セレン化合物を有効成分として含有する、酸化ストレス低減、酸化脂質抑制、虚血性疾患予防、メタボリックシンドローム改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、血管内皮障害抑制、動脈硬化抑制、認知症予防、脳機能改善、角膜上皮細胞保護、ドライアイ改善、または炎症抑制のための組成物。
【請求項４】
式ＩＶ：
【化４】
2018066676.tif 000025
で表される有機セレン化合物を有効成分として含有する、酸化ストレス低減、酸化脂質抑制、虚血性疾患予防、メタボリックシンドローム改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、血管内皮障害抑制、動脈硬化抑制、認知症予防、脳機能改善、角膜上皮細胞保護、ドライアイ改善、または炎症抑制のための組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物を含む、酸化ストレス低減、酸化脂質抑制、虚血性疾患予防、メタボリックシンドローム改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、血管内皮障害抑制、動脈硬化抑制、認知症予防、脳機能改善、角膜上皮細胞保護、ドライアイ改善、または炎症抑制のための食品組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物を含む食品。
【請求項７】
式Ｉ：
【化５】
2018066676.tif 000026
［式中、
Ｒは、水素、エルゴチオニル基、グルタチオニル基、又はシステイニル基である］
で表される有機セレン化合物を有効成分として含有する、酸化ストレス低減、酸化脂質抑制、虚血性疾患予防、メタボリックシンドローム改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、血管内皮障害抑制、動脈硬化抑制、認知症予防、脳機能改善、角膜上皮細胞保護、ドライアイ改善、または炎症抑制のための医薬組成物。
【請求項８】
有機セレン化合物が、式ＩＩ：
【化６】
2018066676.tif 000027
で表される３−（２−ヒドロセレノ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）−２−（トリメチルアンモニオ）プロパノエートである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
式ＩＩＩ：
【化７】
2018066676.tif 000028
で表される有機セレン化合物を有効成分として含有する、酸化ストレス低減、酸化脂質抑制、虚血性疾患予防、メタボリックシンドローム改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、血管内皮障害抑制、動脈硬化抑制、認知症予防、脳機能改善、角膜上皮細胞保護、ドライアイ改善、または炎症抑制のための医薬組成物。
【請求項１０】
式ＩＶ：
【化８】
2018066676.tif 000029
で表される有機セレン化合物を有効成分として含有する、酸化ストレス低減、酸化脂質抑制、虚血性疾患予防、メタボリックシンドローム改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、血管内皮障害抑制、動脈硬化抑制、認知症予防、脳機能改善、角膜上皮細胞保護、ドライアイ改善、または炎症抑制のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機セレン化合物を有効成分として含有する組成物に関する。より具体的には、本発明は、酸化ストレス低減と虚血性疾患予防、脂肪肝改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドローム改善、メタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、動脈硬化抑制、認知症予防と脳機能改善、角膜上皮細胞保護とドライアイ改善、および／または炎症抑制のための組成物、食品、食品組成物、および医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機セレン化合物であるセレノネインは、強い抗酸化能（ラジカル消去活性）を有し、ヒト細胞に対して生体抗酸化作用を示すことが見出されている（特許文献１）。抗酸化作用を有する物質は、生体内の活性酸素種を除去し、様々な生理活性を示す。セレンは人体にとって必須な微量元素であることから、魚介類由来の有機セレンであるセレノネインの摂取によって、食事からのセレンの摂取不足を補うことができる。そのため、セレノネインを有効成分とする機能性食品への応用が期待されている。【０００３】
魚食には、がんや糖尿病などの生活習慣病に対する予防効果やアンチエイジングの効果が知られていることから、セレノネインがこのような生活習慣病予防やアンチエイジングに対して寄与することが考えられるが、セレノネインによる生活習慣病予防効果やその分子機序、セレノネインと他の生体分子との相互作用については検証されていなかった。特に、セレノネインの摂取により、人体や動物細胞に取り込まれたセレノネインによってラジカル消去活性など抗酸化能が向上して健康機能性が増進する効果は、これまで調べられていない。そのため、生体分子や、モデル細胞、生体に対するセレノネインの生理活性を検証し、セレノネインの新たな用途の開発と実用化のための幅広い有効性の検証が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５６６９０５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、有機セレン化合物であるセレノネインの健康機能性研究として、哺乳類細胞およびげっ歯類を用いて実際の生体への有効性を解析し、抗メタボリックシンドローム、発がん予防、虚血性疾患防御、認知症予防、ドライアイ改善、炎症抑制などの生体内で生じる酸化ストレス障害の改善やストレスの軽減効果を実証することを目的とする。それにより、セレノネインを含有する抗メタボリックシンドローム作用などの新規食品機能性を有するセレン化合物含有組成物を提供する。【０００６】
酸化ストレスとは、活性酸素、活性窒素種やフリーラジカルが引き起こす生体の酸化反応と抗酸化反応のバランスが崩れ、生体にとって好ましくない状態を示すものと定義されるが、活性酸素やフリーラジカルの発生と酸化ストレスは、炎症、動脈硬化、がん、老化、脳神経疾患、呼吸器疾患、白内障、皮膚疾患、消化器疾患、心疾患、高血圧など、多岐にわたる疾病に関与し、多くの疾患の発症、病態形成に中心的な役割を果たしていることが知られている。強力なラジカル消去活性を有するセレノネインは、生体内で発生する活性酸素やフリーラジカル、酸化ストレスを低減し、これら酸化ストレスが原因となる疾病の予防効果を検証することによって、セレノネインを有効成分とする新規食品を開発することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、セレノネインの健康機能性を生化学的に解析したところ、セレン化合物含有組成物の摂取が、脳虚血に起因する脳障害から保護するストレス軽減とストレスによる障害の予防効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］式Ｉ：【０００９】
【化１】
2018066676.tif 000002
【００１０】
［式中、
Ｒは、水素、エルゴチオニル基、グルタチオニル基、またはシステイニル基である］
で表される有機セレン化合物を有効成分として含有する、酸化ストレス低減、酸化脂質抑制、虚血性疾患予防、メタボリックシンドローム改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、血管内皮障害抑制、動脈硬化抑制、認知症予防、脳機能改善、角膜上皮細胞保護、ドライアイ改善、または炎症抑制のための組成物。【００１１】
［２］有機セレン化合物が、式ＩＩ：【００１２】
【化２】
2018066676.tif 000003
【００１３】
で表される３−（２−ヒドロセレノ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）−２−（トリメチルアンモニオ）プロパノエートである、上記［１］に記載の組成物。【００１４】
［３］式ＩＩＩ：【００１５】
【化３】
2018066676.tif 000004
【００１６】
で表される有機セレン化合物を有効成分として含有する、酸化ストレス低減、酸化脂質抑制、虚血性疾患予防、メタボリックシンドローム改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、血管内皮障害抑制、動脈硬化抑制、認知症予防、脳機能改善、角膜上皮細胞保護、ドライアイ改善、または炎症抑制のための組成物。【００１７】
［４］式ＩＶ：【００１８】
【化４】
2018066676.tif 000005
【００１９】
で表される有機セレン化合物を有効成分として含有する、酸化ストレス低減、酸化脂質抑制、虚血性疾患予防、メタボリックシンドローム改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、血管内皮障害抑制、動脈硬化抑制、認知症予防、脳機能改善、角膜上皮細胞保護、ドライアイ改善、または炎症抑制のための組成物。【００２０】
［５］上記［１］〜［４］のいずれかに記載の組成物を含む、酸化ストレス低減、酸化脂質抑制、虚血性疾患予防、メタボリックシンドローム改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、血管内皮障害抑制、動脈硬化抑制、認知症予防、脳機能改善、角膜上皮細胞保護、ドライアイ改善、または炎症抑制のための食品組成物。
［６］上記［１］〜［４］のいずれかに記載の組成物を含む食品。【００２１】
［７］式Ｉ：【００２２】
【化５】
2018066676.tif 000006
【００２３】
［式中、
Ｒは、水素、エルゴチオニル基、グルタチオニル基、又はシステイニル基である］
で表される有機セレン化合物を有効成分として含有する、酸化ストレス低減、酸化脂質抑制、虚血性疾患予防、メタボリックシンドローム改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、血管内皮障害抑制、動脈硬化抑制、認知症予防、脳機能改善、角膜上皮細胞保護、ドライアイ改善、または炎症抑制のための医薬組成物。【００２４】
［８］有機セレン化合物が、式ＩＩ：【００２５】
【化６】
2018066676.tif 000007
【００２６】
で表される３−（２−ヒドロセレノ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）−２−（トリメチルアンモニオ）プロパノエートである、請求項７に記載の医薬組成物。【００２７】
［９］式ＩＩＩ：【００２８】
【化７】
2018066676.tif 000008
【００２９】
で表される有機セレン化合物を有効成分として含有する、酸化ストレス低減、酸化脂質抑制、虚血性疾患予防、メタボリックシンドローム改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、血管内皮障害抑制、動脈硬化抑制、認知症予防、脳機能改善、角膜上皮細胞保護、ドライアイ改善、または炎症抑制のための医薬組成物。【００３０】
［１０］式ＩＶ：【００３１】
【化８】
2018066676.tif 000009
【００３２】
で表される有機セレン化合物を有効成分として含有する、酸化ストレス低減、酸化脂質抑制、虚血性疾患予防、メタボリックシンドローム改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、血管内皮障害抑制、動脈硬化抑制、認知症予防、脳機能改善、角膜上皮細胞保護、ドライアイ改善、または炎症抑制のための医薬組成物。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の有機セレン化合物は、従来、ラジカル消去活性に基づく抗酸化剤としての過酸化物やラジカルの発生を抑制する抗酸化能が知られているが、これまでに哺乳類の生体を用いた有効性の実証は公表されていなかった。ヒト細胞や生体への投与による有効性試験により抗がん、抗動脈硬化などが実証されつつあり、生活習慣病や老化による疾患の予防および改善などの新規用途に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】セレノネイン標準品のセレン８２のクロマトグラム（Ａ）及び実施例１で得られたセレノネイン含有魚エキスのクロマトグラム（Ｂ）を示す。
【図２】スナネズミに虚血ストレスを負荷後、自発運動量測定を行い、脳虚血再灌流の影響を検討し、このモデルにおける被験物質のセレン含有組成物（セレノネイン含有魚エキス）の効果を評価した図である。
【図３】スナネズミに脳虚血再灌流を負荷後、Ｙ字迷路試験を行い、脳虚血再灌流（７日目）の影響を検討し、このモデルにおける被験物質のセレン含有組成物（セレノネイン含有魚エキス）の効果を評価した図である。
【図４】スナネズミに脳虚血再灌流を負荷後、Ｙ字迷路試験を行い、脳虚血再灌流（１４日目）の影響を検討し、このモデルにおける被験物質（のセレン含有組成物セレノネイン含有魚エキス）の効果を評価した図である。
【図５】糖代謝異常のマウスにおけるセレン含有組成物の摂取によるメタボリックシンドロームの改善効果を検討した図である。
【図６】糖代謝異常のマウスにおけるセレン含有組成物の摂取によるメタボリックシンドロームに伴う傷害からの改善効果を検討した図である。
【図７】大腸がん原発巣モデルを用いたセレン含有組成物の摂取による抗がんおよび全身免疫能低下抑制の効果を検討した図である。
【図８】大腸がん原発巣モデルを用いたセレン含有組成物の摂取による全身免疫能低下抑制の効果を検討した図である。
【図９】Ｔｒｅｇ細胞の抑制に基づく、セレン含有組成物の摂取によるがんの再発を予防する効果を検討した図である。
【図１０】平滑筋細胞の遊走性の抑制に基づく、セレン含有組成物の摂取によるアテローム性動脈硬化の促進を抑制する効果を検討した図である。
【図１１】アミロイドβの毒性から細胞を防御するセレン含有組成物の摂取による効果を検討した図である。
【図１２】セレン含有組成物の摂取による乾燥ストレス後の生細胞数の変化を検討した図である。
【図１３】セレン含有組成物の摂取によるムチン遺伝子発現の変化を検討した図である。
【図１４】セレン含有組成物の摂取によるＮＦκ−Ｂ活性化を抑制する効果を検討した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、有機セレン化合物を有効成分として含有するメタボリックシンドローム改善等のためのセレン含有組成物に関する。
【００３６】
（１）有機セレン化合物
本発明のセレン含有組成物は、例えば、特許第５６６９０５６号公報に記載の方法に従って得ることができる。本明細書において別段の指示がない限り、「有機セレン化合物」は、化学式ＩＩに表されるセレノネイン単量体および化学式ＩＩＩに表されるその互変異性体、化学式ＩＶに表されるセレノネイン酸化二量体および化学式Ｉに表されるセレノネイン化学修飾物を示し、これら化合物を含有する「セレン含有組成物」を含み得ることが意図される。ここで、有機セレン化合物は、魚類等の生物由来の試料を水系溶媒または有機溶媒で抽出することによりセレン濃縮物を得た後、クロマトグラフィーによって分離・精製することによって得ることができる。ここで、「セレン濃縮物」とは、本発明の化学式Ｉ〜ＩＶに表される有機セレン化合物（後述）を含むセレン濃縮物を指し、試料を有機溶媒または水で抽出した後、ロータリーエバポレーター等で濃縮して得られるもの等が挙げられる。セレン濃縮物は、溶液状である場合には、本発明の有機セレン化合物を５μｇ／ｍＬ以上を含有しているものであることが好ましく、減圧濃縮によって乾固した乾燥粉末がより好ましい。
【００３７】
本発明の対象となる有機セレン化合物は、式Ｉ〜ＩＶの化合物に限定される。式Ｉ：
【００３８】
【化９】
2018066676.tif 000010
【００３９】
で表される化合物であり、置換基Ｒが、水素、エルゴチオネイン、グルタチオン、システイン、アセチルシステイン、ホモシステイン、メチル水銀、生体内で生成されると推定されるチオール化合物と結合した「有機セレン化合物」であり、また、「有機セレン化合物」がセレノール基を介して結合した金属や高分子材料も含まれる。
【００４０】
一実施形態において、本発明の有機セレン化合物には、式ＩＩ：
【００４１】
【化１０】
2018066676.tif 000011
【００４２】
で表される３−（２−ヒドロセレノ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）−２−（トリメチルアンモニオ）プロパノエート、および式ＩＩＩ：
【００４３】
【化１１】
2018066676.tif 000012
【００４４】
で表される３−（２−セレノキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−２−（トリメチルアンモニオ）プロパノエートが挙げられる。上記の通り、式ＩＩおよび式ＩＩＩで表される有機セレン化合物はいずれも有機セレン化合物の単量体である。式ＩＩの有機セレン化合物は、イミダゾール環の２位の炭素原子にセレノール基が結合した分子構造を有しており、セレノール基はセレノケトン基との平衡状態にある互変異性体を形成することから、溶液状態では溶媒の条件によって、セレノ−ル型（式ＩＩ）とセレノケトン型（式ＩＩＩ）の２つの化学形態を有している。セレノール型異性体に平衡が傾く非極性溶媒存在下では、容易に酸化型二量体が形成される一方、極性溶媒中ではセレノケトン型異性体に化学平衡が片寄り、主に単量体として存在する性質がある。
【００４５】
さらに、本発明の有機セレン化合物には、式ＩＶ：
【００４６】
【化１２】
2018066676.tif 000013
【００４７】
で表される酸化型二量体（３，３’−（２，２’−ジセランジイルビス（１Ｈ−イミダゾール−５，２−ジイル））ビス（２−（トリメチルアンモニオ）プロパノエート））のイミダゾール環にセレノール基とトリメチルアンモニウム基が結合した分子構造を持つ化合物を基本単位として、この化合物がセレノール基を介してジセレニドを形成した二量体も含まれる。
【００４８】
本発明によれば、セレン含有組成物に含まれるセレン含量は、２，３−ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）を用いる蛍光法（例えば、Ｊ．  Ｈ．  Ｗａｔｋｉｎｓｏｎ，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ３８，  ９２−９７  （１９６６）参照）、またはＧＰＣカラムを用いるＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳ分析法（例えば、Ｈ．  Ｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ３３，  ２７９−２８１  （１９９６）参照）により測定することができる。
【００４９】
別の実施形態において、本発明のセレン含有組成物は、例えば、式ＩＩで表される化合物（「セレノネイン」）を含有する組成物の形態で提供されてもよい。本発明のセレノネインを含有する組成物は、限定されないが、セレノネイン濃縮物、その乾固物またはセレノネイン精製品をセレンとして０．１〜１００μｇを含有する錠剤、ペーストまたは飲料の形状であってもよい。サプリメント剤や飲料など食品として利用する場合は、１日あたりのセレンの必要量を服用するのに適した形状に成形するのが望ましい。他の食品素材や甘味料、香料、賦形剤、増粘剤、保存料などの食品添加物を含んでいてもよい。
【００５０】
本発明の有機セレン化合物の典型例としてのセレノネインの由来原料としては、例えば、マグロ類（クロマグロ、ミナミマグロ、キハダ、メバチ、ビンナガ）、カジキ類（メカジキ、マカジキ、バショウカジキ、クロカジキ）、カツオ類（カツオ、マルソウダガツオ、ヒラソウダガツオ、ハガツオ、スマ）、サバ類（マサバ、ゴマサバ、ノルウェーサバ、ニジョウサバ、グルクマ）、ブリ類、アジ類（マアジ）、イワシ類（マイワシ、カタクチイワシ）、タイ類（マダイ）を含む魚類、ハクジラ類を含む海洋性哺乳類、酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の微生物が挙げられる（「水産物のメチル水銀とセレン」化学と生物  ５０（１１），  ８０７−８１７，  ２０１２−１１−０１；  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｒｇｏｔｈｉｏｎｅｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｎｏｎｅｉｎｅ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｉｓｓｉｏｎ  Ｙｅａｓｔ，  Ｓ．  ｐｏｍｂｅ，  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．，  ２０１４  Ｊｕｌｙ  ３１；  ９（７）：  ｅ１０５１７７参照）。
【００５１】
（２）セレン含有組成物
本発明は、上記の有機セレン化合物を有効成分として含有するセレン含有組成物を提供するものである。本発明の組成物に含まれる有機セレン化合物の含有量は、組成物全重量に対して、０．０００００１〜９９重量％であってよく、当業者であれば、所望の効果を得るために有機セレン化合物の含有量を適宜調整することができる。また、セレン含有組成物を有効成分とする場合は、上記の通り、セレンとして０．１〜１００μｇを含有する形態をとることができる。また、該組成物の原料については、セレノネインを含有するものであれば特に限定されず、例えば、上記魚類、海洋性哺乳類、酵母等の微生物の他、菌糸類、植物、海藻、藻類、化学合成品も原料となり得る。
【００５２】
本発明の有機セレン化合物はまた、有効成分である有機セレン化合物以外に、目的に応じて他の成分を含有してもよい。本発明のセレン含有組成物に含有され得る他の成分としては、限定されないが、水；アルコール；食肉加工品；米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、コンブ、ワカメ、テングサなどの一般食品材料およびそれらの粉末；デンプン、水飴、乳糖、グルコース、果糖、スクロース、マンニトールなどの糖類；魚肉粉末、卵白・乾燥全卵、魚卵、魚肉タンパク質、植物タンパク質、コラーゲン，ミオシン、グルテンなどのタンパク質；香辛料、甘味料、食用油、ビタミン類などの一般的な食品添加物；界面活性剤；賦形剤；着色料；保存料；コーティング助剤；ラクトース；デキストリン；コーンスターチ；ソルビトール；結晶性セルロース；ポリビニルピロリドン；油分；保湿剤；増粘剤；防腐剤；香料；ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。本発明の組成物は、さらに、必要に応じて他の薬剤を含有してもよい。このような他の成分および／または他の薬剤の含有量は、特に限定されず、当業者によって適宜選択され得る。
【００５３】
（３）セレン含有組成物を含む食品、食品組成物および医薬組成物
本発明によれば、上記本発明の組成物を含む食品、食品組成物および医薬組成物が提供される。本発明の組成物を食品および食品組成物として使用する場合、所望の製品形態に応じた食品として許容され得る担体や、他の添加剤を含んでもよい。このような担体および添加剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、崩壊剤、滑沢剤、防腐剤等が挙げられる。本発明の医薬組成物は、経口用の形態としては、例えば、食品、食品添加剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤などの固形製剤、溶液、懸濁液、乳濁液などの液状製剤の形態が挙げられる。これらは、当該技術分野で通常行われている手法により、必要に応じて担体や添加剤とともに、製剤化もしくは製品化することができる。
【００５４】
（４）用途
本発明のセレン化合物式Ｉ〜ＩＶを有効成分とするセレン含有組成物、並びに該組成物を含む食品および食品組成物は、酸化ストレス低減、酸化脂質抑制、虚血性疾患予防、メタボリックシンドローム改善、耐糖能異常改善、脂質代謝異常を含むメタボリックシンドロームに伴う障害の保護改善、発がん抑制、全身免疫能低下抑制、血管内皮障害抑制、動脈硬化抑制、認知症予防、脳機能改善、角膜上皮細胞保護、ドライアイ改善の効果および炎症抑制が期待される。なお、食品としての使用における態様では、限定されないが、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品、機能性表示食品、飲料等の形態であってもよい。本明細書において使用するとき、「改善」とは、疾患、症状若しくは状態の好転若しくは緩和、疾患、症状若しくは状態悪化の防止、もしくは遅延、又は疾患、症状若しくは状態の進行の逆転、防止若しくは遅延をいう。「低減」とは、疾患、症状又は状態の出現の遅延、頻度の減少、重症度の低下をいい、「改善」と同義に使用されてもよい。また、「阻害」とは、疾患、症状又は状態を完全に又は部分的に抑制することをいう。本明細書において、上記の「改善」、「低減」、及び「阻害」は、互いに同義として使用され得る。一方、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止若しくは遅延、又は個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。「保護」とは、各種臨床症状の発症を引き起こさないことをいい、「予防」を含むものと理解してよい。
【００５５】
本発明のセレン含有組成物において、上記した所望の効果を得るためには、有効成分である有機セレン化合物は、成人一人の体重１ｋｇあたり０．１ｎｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは１ｎｇ〜５ｍｇ、さらに好ましくは２ｎｇ〜３ｍｇ、さらにより好ましくは３ｎｇ〜１ｍｇ、さらになお好ましくは５ｎｇ〜５００μｇ、さらになおより好ましくは５ｎｇ〜１００μｇ、最も好ましくは１０ｎｇ〜５０μｇとなるように含有させるとよい。より具体的には、１日に２ｎｇ〜２５５０μｇ投与または摂取することが好ましく、より好ましくは５ｎｇ〜４７μｇであり、さらに好ましくは１０ｎｇ〜１４．５μｇである。また、本発明においては、この量の有効成分を１日１〜数回に分けて、該化合物そのままの形態で、または食品、組成物、医薬、飲食品等の所望の形態とした上で、投与または摂取すればよい。
【００５６】
ａ．虚血性疾患の予防効果および酸化ストレス低減効果
虚血では血液の再灌流の際に活性酸素が多量に生成され、障害が生じることが知られている。本発明のセレン含有組成物の摂取によって、生体抗酸化作用が強化され、脳での酸化ストレスが軽減され、虚血性脳疾患を予防することができる。このような虚血性疾患の予防効果および酸化ストレス低減効果は、例えば、セレン含有組成物を投与後、スナネズミを用いた脳虚血再灌流モデル試験により、虚血再灌流障害の軽減効果を確認することができる。より具体的には、スナネズミにセレン含有組成物（例えば、セレノネイン含有魚エキス）を２週間投与し、両側総頸動脈の血流を５分間止めた後に再灌流を行う。その後、有機セレン化合物の投与を２週間継続し、自発運動量と作業記憶能力を検査して評価することができる（後述する実施例２参照）。さらに、屠殺後脳および心臓を摘出し、虚血部位を生化学的に確認してもよい。本発明のセレン含有組成物は、酸欠による酸化ストレスの軽減、虚血性心疾患、脳梗塞等による障害から防御する食品原料および組成物の有効成分などに利用可能である。
【００５７】
ｂ．メタボリックシンドロームおよびそれに伴う障害からの保護改善効果
アルコール多量摂取、ウイルス等による肝炎だけでなく、非アルコール性肝炎の患者が近年増加している。本発明のセレン含有組成物の摂取によって過酸化脂質（酸化ＬＤＬ）の抑制、非アルコール性肝炎、脂肪肝、耐糖能異常、メタボリックシンドロームおよびそれらに伴う糖尿病の発症を予防することができる。動物モデルとして、ストレプトゾトシンと高脂肪食を投与することにより糖尿病を背景とした非アルコール性肝炎モデルマウスを作製し、本発明のセレン含有組成物を食餌に混合して投与することによって非アルコール性肝炎に伴う肝臓における酸化ストレスおよび肝臓障害に対する予防効果を確認することができる。例えば、本発明のセレン含有組成物であるセレノネイン含有魚エキスと高脂肪食を摂取させ、４週間後に肝臓を摘出し、肝炎スコア等を測定することにより、本発明のセレン含有組成物による酸化ストレスの軽減効果、肝臓中の脂肪蓄積量の減少、肝炎およびメタボリックシンドロームの発症、それに伴う障害からの保護改善効果を評価することができる（後述する実施例３参照）。
【００５８】
ｃ．発がん予防効果および全身免疫能低下の抑制効果
本発明のセレン含有組成物の摂取によって、がん増殖、転移および発がんに対する抑制効果および全身免疫能の低下抑制効果を増強することができる。動物モデルを用いることによって発がん予防効果および全身免疫能低下の抑制効果を確認することができる。がん細胞の増殖抑制効果は、マウスにがん細胞を移植し、例えば、本発明のセレン含有組成物を含む飼料（例えば、セレン濃度３ｍｇ／ｋｇ）を投与した時の腫瘍部の減少を測定することによって確認することができる。
【００５９】
本発明のセレン含有組成物による変異原性の抑制効果は、細菌を用いた復帰突然変異試験によって確認することができる。また、より生体に近い条件では、哺乳類由来細胞（例えば、Ｂｈａｓ４２細胞）を用いて、本発明のセレン含有組成物による形質転換抑制効果を確認することができる。本法は、（一財）食品薬品センターで確立された発がん物質の検出に用いられる試験法であり、発がんのイニシエーション活性、プロモーション活性を区別して検出することもできる。細胞を播種した１日後に形質転換誘導剤３−メチルコラントレンを培地に添加し、３日間処理する。セレノネイン含有魚エキス添加培地に交換し、細胞播種後２１日目まで培養した後、形質転換巣を数える。がんのイニシエーション、プロモーション、プログレッションの各段階別に効果を確認することができるため、がんの予防効果をもつ食品原料として利用可能であるかどうかを評価することができる（後述する実施例４参照）。
【００６０】
また、胆がんマウスに対して、本発明のセレン含有組成物を投与し、全身の免疫能改善効果を確認してもよい。全身免疫能低下抑制については、免疫抑制機能を有し、腫瘍成長を促進する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を分析することによって、セレン含有組成物の発がん抑制効果を検証することができる（後述する実施例４参照）。本発明のセレン含有組成物の摂取によって、疾患対象の免疫能が改善され、がんの成長が抑制され、またはがんの再発を予防することができる。
【００６１】
ｄ．動脈硬化の抑制効果
酸化ＬＤＬは動脈硬化進展の機序の一部として考えられており、酸化ＬＤＬにより平滑筋細胞が遊走されることが報告されている。本発明のセレン含有組成物は、動脈硬化の進展時に狭窄が生じる原因となる平滑筋細胞の脱分化と血管内腔への遊走を阻止する動脈硬化予防効果を有することが見出された。本発明のセレン含有組成物を平滑筋細胞に投与して、平滑筋細胞の遊走を阻止し、動脈硬化を抑制する作用を確認することができる。例えば、ヒト大動脈平滑筋細胞をセレン含有組成物を添加した培地で培養し、遊走した細胞数を測定することにより、動脈硬化予防効果をもつ食品原料として利用可能であるかどうかを評価することができる（後述する実施例５参照）。本発明によれば、平滑筋細胞の遊走性を抑制することができ、例えば、アテローム性動脈硬化の促進を抑制することができる。また、動脈硬化に関連した血管内皮障害を改善することができる。
【００６２】
ｅ．脳機能改善効果
アルツハイマーのリスク要因として、加齢、遺伝的素因、生活習慣病（糖尿病など）が知られている。本発明のセレン含有組成物は、加齢や糖尿病等による活性酸素種の発生を軽減し、認知症の発症を予防する脳機能改善効果を有することが見出された。なお、本明細書において、「認知症」とは、アルツハイマー型認知症、レビー小体型認知症、脳血管性認知症、前頭側頭型認知症などを意味する。また、「脳機能」とは、記憶機能（例えば、作業記憶、短期記憶）、情動、言語機能、認知機能、運動機能、学習機能、注意機能などを意味する。このように脳機能は多岐に亘り、虚血再灌流障害や脳神経を保護することで機能低下を抑制することができる。また、糖尿病に起因してうつ病リスクが高まるということが知られており、糖尿病性障害による脳機能低下から保護することにより認知症のみならずうつ病も予防することができる。上記のような脳機能改善効果は、例えば、ストレプトゾトシン投与によりアルツハイマーの病態モデルマウスを作製し、本発明のセレン含有組成物（例えば、セレノネイン含有魚エキス）の投与によるアルツハイマー進展低減効果を確認することができる。脳内にストレプトゾトシンを直接投与することにより脳内酸化ストレスが増大し、アミロイドβ、タウタンパク質の蓄積が起こり、アルツハイマー病と同様の病態になることが知られている。モデル作製には、本発明のセレン含有組成物を１週間摂取させた後にストレプトゾトシン投与する。その後、２週間、セレン含有組成物を摂取させ、作業記憶および脳組織を検査することにより評価することができる。さらに、細胞を用いた試験によりアミロイドβ蓄積抑制作用を生化学的に確認することができる。脳機能低下予防改善効果を有するセレン含有組成物およびそれを原料とする食品の摂取は、病者だけでなく健康な高齢者に対しても脳機能保護効果をもつことが期待できる（後述する実施例６参照）。
【００６３】
ｆ．ドライアイ改善効果
セレン含有組成物を摂取することよって、角膜上皮細胞の乾燥および酸化ストレスが軽減および保護され、ドライアイの予防効果を得ることができる。ドライアイ患者は日本に約８００万〜２２００万人いると言われている。炎症や持続的な酸化ストレスはドライアイを悪化させ、ムチンの低下や、ドライアイモデルマウスではミトコンドリアの形成異常が見られることが報告されている（Ｋａｗａｉ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ．  Ｒｅｐ．，  ｖｏｌ．３，  ２４５５  （２０１３））。ヒト不死化角膜上皮細胞を用いて、有機セレン化合物（例えば、セレノネイン含有魚エキス）を添加した培地で培養し、ムチンの産生等を測定することにより評価することができる。ドライアイは大きな疾患ではないため見過ごされがちであるが、ドライアイ改善は患者のＱＯＬ改善に非常に重要であり、ドライアイ改善食品原料として利用可能であるかどうかを評価することができる（後述する実施例７参照）。本発明のセレン含有組成物を用いることによって、角膜細胞の乾燥ストレスを保護し、ドライアイを予防および改善することができる。
【００６４】
ｇ．炎症抑制効果
本発明のセレン含有組成物の摂取によって、炎症に伴う発赤、腫脹、発熱、疼痛および機能障害を抑制し、炎症に起因する関節リウマチ、溶血性貧血および重症筋無力症を予防することができる。正常人においては免疫調節機構がバランスよく機能しているが、何らかの原因により宿主の免疫調節機構に異常が発生した場合、自己の生体成分を抗原として認識する自己抗体が産生され、種々の免疫反応を引き起こし、線維障害、機能障害が生じている。このような自己免疫疾患としては、関節リウマチ、溶血性貧血、重症筋無力症等が挙げられる。このような自己免疫疾患の治療薬としてアザチオプリン、サイクロフォスファマイド、ピンクリスチン等の免疫抑制剤が用いられるが、これら薬剤投与に伴う副作用も多岐にわたることが知られている。しかしながら、直接患部に塗布する外用性炎症治療剤はステロイド系のものがほとんどでその副作用のため、服用が限られていた。本発明の有機セレン化合物は食品としても使用することができ、副作用もなく、各種炎症反応の抑制に期待される。本発明のセレン含有組成物の摂取による炎症抑制効果の対象は、特にＮＦκ−Ｂ活性化に起因するものであり、例えば、アレルギー疾患、抗がん、関節炎、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、セリアック病に対して有効である（後述する実施例８参照）。
【００６５】
以下の実施例は、本開示の様々な態様を例証する。材料と方法の両方に対する多数の修飾は、本開示の範囲から逸脱せずに実施されてもよいことは当業者に明らかである。市販品供給業者から購入される全ての試薬および溶媒は、混入している過酸化物やラジカル類を除去するため、さらに蒸留、再結晶、ろ過などの方法によって精製して用いることが望ましい。
【実施例】
【００６６】
実施例１：有機セレン化合物の調製
有機セレン化合物は、既報の特許第５６６９０５６号公報（特許文献１）に記載の方法に準じて、マグロ血合肉さらし水からセレノネインを含む抽出液を得て、Ｂｒｉｘ５５まで濃縮し、セレノネイン含有魚エキスを得た。【００６７】
セレノネイン含有量の分析
実施例１で得られたセレノネイン含有魚エキス（Ｂｒｉｘ５５）のセレノネインの含有量は、以下のＬＣ−ＩＣＰＭＳで得た測定値に基づきセレン当量（μｇＳｅ／ｇ）として算出した。【００６８】
（１）装置構成
分離用カラム          ：Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ  １２０  （Ｗａｔｅｒｓ）
ＬＣポンプ            ：Ｐｕ７１２（ＧＬサイエンス株式会社）
サンプルインジェクター：９７２５ｉ（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ）
ＩＣＰＭＳ            ：ＥＬＡＮ  ＤＲＣ  ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）【００６９】
（２）ＬＣ測定条件
移動層：０．１％ＩＧＥＰＡＬ−ＣＡ６３、０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．３）
流速          ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
サンプル注入量：０．０１ｍＬ【００７０】
（３）ＩＣＰ−ＭＳ測定条件
測定元素                            ：Ｓｅ
質量数                              ：８２
ＲＦ出力（Ｗ）                      ：１２００
ネブライザーガス（Ａｒ，Ｌ／ｍｉｎ）：１．０
補助ガス（Ａｒ，Ｌ／ｍｉｎ）        ：１．３
プラズマガス（Ａｒ，Ｌ／ｍｉｎ）    ：１７
メイクアップガス（Ａｒ，Ｌ／ｍｉｎ）：０
反応ガス（Ａｒ，Ｌ／ｍｉｎ）        ：０
パルスステージ電圧（ｅＶ）          ：１０５０
ＲＰｑ                              ：２．５
滞在時間（ｓｅｃ／ａｍｕ）          ：０．４【００７１】
（４）試料の調製
実施例１で得られたセレノネイン含有魚エキスを２０μＬに対し１９倍容（３８０μＬ）の超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｅｌｅｍｅｎｔ、ミリポア社）を加えて混和し、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心した上清をＨＰＬＣ−ＩＣＰＭＳ分析に使用した。【００７２】
（５）セレノネイン標準品の調製
セレノネイン標準品は以下の方法でメカジキ血合筋から精製して得たものを使用した：
（５−１）冷凍メカジキフィレーを５℃で一晩解凍して血合筋を切り取って集めたものを用いた。【００７３】
（５−２）血合筋１００ｇに０．１ｇシステイン塩酸塩（和光純薬工業株式会社）を加え、１０倍容量のアセトニトリル（和光純薬工業社）中でポリトロンホモジナイザー（ＰＴ  ＭＲ  ６０００，ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ）６８００ｒｐｍで１５秒間、氷水で冷却しながら粉砕した。【００７４】
（５−３）粉砕物を６０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を減圧下ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液１を得た。【００７５】
（５−４）濃縮液１にアセトニトリル：テトラヒドロフラン（和光純薬工業社）（１：１、ｖ／ｖ）混合溶液を加えて濃縮液を２層に分離した。【００７６】
（５−５）分離した２層のうち、アセトニトリル層を分離し、減圧下ロータリーエバポレーターで濃縮した濃縮液２を得た。【００７７】
（５−６）濃縮液２に冷却水５ｍｌを加え、０．１％酢酸で平衡化したＡｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）ｄＣ１８３００オングストロームカラム（１９×１５０ｍｍ、日本ウオーターズ社）に供し、０−５０％直線アセトニトリルグラジエント下、溶出量４０ｍｌから５０ｍｌまでの画分１を回収した。【００７８】
（５−７）画分１を減圧下ロータリーエバポレーターで濃縮して濃縮液３を得た。【００７９】
（５−８）濃縮液３を０．１％酢酸３０％アセトニトリルで平衡化したＵｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）１２０カラム（７．８×３００ｍｍ日本ウオーターズ社）に供し、排出量７．５ｍｌから９．０ｍｌまでのセレノネインを含む画分を集めて画分２を得た。【００８０】
（５−９）画分２を０．１％酢酸で平衡化したＵｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）１２０カラム（７．８×３００ｍｍ日本ウオーターズ社）に通し、セレノネインを含む画分を集めて減圧下ロータリーエバポレーターで濃縮してセレノネイン標準品を得た。【００８１】
（５−１０）セレノネイン標準品の中の総セレン含有量は後述する蛍光法で測定し、０．４７６μｇ／ｍＬであった。【００８２】
なお、上記（５−１）〜（５−９）で得られたセレノネイン標準品には、式（１）〜（４）で示される化合物が含まれており、式（２）で示される化合物が主成分であることが知られている（東京大学博士（農学）論文ｐｐ１７−１９（山下由美子、２０１２年））。【００８３】
（６）セレノネインの同定と定量
（４）の試料およびセレノネイン標準品について、（１）〜（３）で述べたＬＣ−ＩＣＰＭＳ装置でセレン８２を測定してクロマトグラムを得、これらを用いてセレノネインの同定および含有量を決定した。【００８４】
（６−１）セレノネイン標準品は溶離時間１０．３分付近にピークが検出される。そのほかにも未同定のセレン化合物のシグナルが検出されるセレノネイン標準品は６−１１分のすべてのセレンシグナルの積分値を計測し、後述する蛍光法で定量した総セレン注入量に対応するピーク面積と見なした。【００８５】
（６−２）得られたクロマトグラムにおける溶離時間１０．３分付近のピーク面積をセレノネインと同定し、ソフトウエア（ＴｏｔａｌＣｈｒｏｍ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて読み取った。【００８６】
（６−３）下記式（５）：
Ｘ＝（Ａ／Ｂ）×（１０００／Ｃ）×Ｄ／１０００            式（５）
（ここで、
Ｘ：試料中のセレノネイン含有量（μｇＳｅ／ｇ）
Ａ：試料の１０．３分のピーク面積。
Ｂ：セレノネイン標準品の注入セレン重量あたりの検出面積（／ｎｇＳｅ）
Ｃ：ＬＣ−ＩＣＰＭＳにおいて注入した試料のマイクロＬ量（今回はＣ＝５）
Ｄ：試料を調製した際の超純水による希釈倍率（今回はＤ＝２０）。【００８７】
（６−４）セレノネイン標準品１０マイクロＬをＬＣ−ＩＣＰＭＳ装置に注入し、６−１１分のすべてのセレンシグナルの積分値を計測し、積分値を注入したセレン量（今回は４．７６ｎｇ）で除した数値をセレン重量あたりの検出面積とした（式（５）における係数Ｃ）【００８８】
（６−５）測定結果
図１に、セレノネイン標準品のセレン８２のクロマトグラム（Ａ）及び実施例１で得られたセレノネイン含有魚エキスのクロマトグラム（Ｂ）を示す。【００８９】
（６−６）クロマトグラム（Ｂ）には、保持時間１０．６分にセレノネイン２量体（式ＩＶ）に相当するピーク（矢印）が、主要なセレン化合物として観察された。
従って、実施例１で得られたセレノネイン含有魚エキスに含まれるセレン化合物の多くは式ＩＶで表される化合物が主成分であることがわかった。実施例１で得られたセレノネイン含有魚エキスについて、算出されたセレノネイン含有量は３２．５ｍｇＳｅ／Ｌであった。【００９０】
（７）総セレン含有量
実施例１で得られたセレノネイン含有魚エキス、（５−１）〜（５−９）で得られたセレノネイン標準品を文献（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｅｎｉｕｍ  ｉｎ  ｎａｎｏｇｒａｍ  ａｍｏｕｎｔｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ２，  ３−ｄｉａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ．  Ｒ．  Ｈａｓｕｎｕｍａ，  Ｔ．  Ｏｇａｗａ，  Ｙ．  Ｋａｗａｎｉｓｈｉ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９８２），１２６：２４２−２４５）記載の方法で湿式分解し、セレン化合物をすべて無機態とした後、２，３−ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）と反応させ、Ｓｅ（ＩＶ）との錯体形成反応により生じる４，５−ベンゾピアセレノール（Ｓｅ−ＤＡＮ）の蛍光を測定することによって定量した。得られた測定値に基づき試料重量あたりのセレン重量（ｍｇ／ｋｇ）として算出した。具体的には、以下の条件で測定した。【００９１】
（７−１）実施例１で得られたセレノネイン含有魚エキスを１０ｍｇ  秤量し、試験管中で、混酸（硝酸：過塩素酸＝２：１）１．５ｍＬとともに２１０℃で二時間湿式灰化した溶液に飽和シュウ酸アンモニウム水溶液０．２５ｍＬを加え１００℃の水浴中で５分間加熱した。【００９２】
（７−２）（７−１）で得られた試料を水冷した後、６Ｍ塩酸０．２５ｍＬを加え１００℃の水浴中で３０分間加熱し、水冷後０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩を０．２５ｍＬ加え、６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ１．０〜１．５に調整した。【００９３】
（７−３）（７−２）で得られた試料に０．１Ｍ塩酸に溶解させた１ｍｇ／ｍＬのＤＡＮを１ｍＬ添加し、５０℃２０分加温した。水冷後、シクロヘキサン１ｍＬと振とうしてシクロヘキサン層の蛍光を励起光３７９ｎｍ蛍光波長５２１ｎｍで測定した。【００９４】
（７−４）試料と併行して試料を入れない操作ブランクおよび１ｍｇ／Ｌセレン標準液を５、１０、５０、１００μＬ入れた試験管を用いて検量線を作成し、試料中の総セレン含有量を算出した。【００９５】
実施例１で得られたセレノネイン含有魚エキスの総セレン含量は９５．３ｍｇ／ｋｇだった。【００９６】
実施例２：虚血再灌流障害低減効果の検討
スナネズミに脳虚血再灌流を負荷後、自発運動量測定およびＹ字迷路試験を行い、脳虚血再灌流の影響を検討するとともに、このモデルにおける被験物質（セレノネイン含有魚エキス）の効果を評価した。【００９７】
１．試験系
７週齢スナネズミ（ＭＯＮ／Ｊｍｓ／Ｇｂｓ  Ｓｌｃ、雄）を日本エスエルシー株式会社より購入し、５日間馴化した後、体重測定を行い、群分けした。試験期間中は通常飼料（ＣＲＦ−１、オリエンタル酵母工業株式会社）と水を自由摂取させた。試験群として以下の６群に分けた。【００９８】
【表１】
2018066676.tif 000014
【００９９】
被験物質の投与開始日をＤａｙ  ０として、Ｄａｙ  １４にイソフルラン麻酔下で虚血前日に総頸動脈に糸を掛けて切開部を縫合した。翌日、体温を３７℃に維持するため４０℃±３℃に設定したホットプレート上に寝かせて切開部の糸を切り、両側総頸動脈を引っ張り、該動脈をクレンメで５分間止血した。その後、クレンメを外して再灌流を行い、切開部を縫合した。正常群では、イソフルラン麻酔下で両側総頚動脈を露出させ、処理せずに皮膚切開部を縫合した。被験物質の投与群には、試験期間中毎日ポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒および胃ゾンデを用いて被験物質を６．２ｍＬ／ｋｇ強制投与した。正常群およびコントロール群には水を６．２ｍＬ／Ｋｇ同様に投与した。強制投与は、１日１回の頻度で２２日間または２９日間行われた。虚血再灌流を行うと海馬細胞死により行動異常（自発運動亢進）や学習記憶障害等が起こる。被験物質が虚血再灌流により起こる脳障害の防御効果の評価として自発運動量測定とＹ迷路試験を行った。【０１００】
（１）自発運動量測定
被験物質投与開始日をＤａｙ  ０として、Ｄａｙ  ６、１３、１５、１７、１９、２１および２７（Ｄａｙ  ２７は第２クールのみ）に、各１時間の自発運動量測定を行った。測定には、マルチチャンネル型自発運動量測定システム・スーパーメックス（室町機械株式会社）を使用した。
（２）Ｙ迷路試験
Ｙ字型の迷路試験はＤａｙ  ２１（第１クール）およびＤａｙ  ２８（第２クール）に動物を入れて６分間自由に行動させ、新しいアームを選択した割合を測定することで記憶学習行動の評価を行った。
（３）セレノネイン測定
第一クール終了時、１群、２群、および３群の生残した試験体から２．５％イソフルラン吸入麻酔下で動物の腹部大動脈からヘパリン入りシリンジで全採血することで放血安楽死させた。採血した血液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分、４℃）して血漿と血餅を分けて採取した。血餅中のセレノネイン含量を実施例１の方法に準じて分析した。【０１０１】
【表２】
2018066676.tif 000015
【０１０２】
２．結果
虚血再灌流処置から１日後では、コントロール群の２群（図２中、「コントロール２２日群」）と５群（図２中、「コントロール２９日群」）では自発運動量が増加していたが、被験物質投与群である３群（図２中、「セレノネイン含有魚エキス投与２２日群」）と６群（図２中、「セレノネイン含有魚エキス投与２９日群」）では有意に抑制されていた（図２）。一方、Ｙ迷路試験を処置から７日後および１４日後に行った結果、それぞれコントロール群では正答率が低下するが、セレノネイン含有魚エキス投与群では有意に低下が抑制され、これは「正常群」（無処置）と同程度であり、被験物質は虚血再灌流による脳障害から保護する効果があることが確認された（図３と４）。【０１０３】
血餅中のセレンタンパク質含量は１群、２群、３群の間に有意差は認められなかったが、セレノネイン含量は１群および２群において検出限界（０．０１μｇ／ｇ）未満であったのに対し、３群ではセレンあたり０．９５±０．２４μｇ／ｇ検出され、セレノネイン含量は有意に増大した（ｐ＜０．０５）。この結果から、被験物質の２２日間投与によって、スナネズミの血球中にセレノネインが蓄積したことが示された。【０１０４】
実施例３：メタボリックシンドロームおよびそれに伴う障害からの保護改善効果の検討
（１）メタボリックシンドロームの改善効果
ストレプトゾトシン投与により、Ｉ型糖尿病と同様に糖代謝異常を起こしているマウスに高脂肪食を摂取させた。所定期間後、肝臓の脂肪蓄積等について総合して評価可能な方法であるＮＡＦＬＤ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅを用いて、セレノネイン含有魚エキス投与による非アルコール性肝炎抑制効果を検証した。【０１０５】
より具体的には、ＳＰＦマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、日本エスエルシー）の雌１０匹を妊娠１４日で購入し、馴化飼育を行った。全動物を自然分娩させ、出生した雄性マウスをモデル動物作製に使用した。なお、離乳は生後４週齢とした。【０１０６】
出生児の観察：８：００の分娩観察時に出産が観察されたマウスについては観察日前日を出生日とし、２０：００の分娩観察時に出産が観察されたマウスについては観察日当日を出生日とし、生後０日から起算した。２日齢時の雄性マウスにストレプトゾトシン（シグマアルドリッチジャパン株式会社）を生理食塩液（日本薬局方、株式会社大塚製薬工場）にて、１０ｍｇ／ｍＬ濃度とし、２０μＬ／頭（２００μｇ／頭）で背部皮下に１回投与した。その後は離乳まで母動物に哺育させた。生後２８±２日齢時に離乳させ、それ以降は、高脂肪食〔Ｈｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ  ３２（放射線滅菌、日本クレア株式会社）〕で飼育した。【０１０７】
動物入荷日から離乳までは、母児ともに固形飼料ＣＥ−２（放射線滅菌、日本クレア株式会社）を自由に摂取させた。離乳以降は、ストレプトゾトシンを投与した動物については、高脂肪食Ｈｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ  ３２（放射線滅菌）（日本クレア株式会社）を自由に摂取させた。【０１０８】
１回の投与量は、セレノネイン含有魚エキスを１５ｍｇ／ｋｇ体重とした。投与容量を１０ｍＬ／ｋｇ体重とし、経口ゾンデを用いて強制経口投与した。コントロール群は、１０ｍＬ／ｋｇ体重で同様に投与した。個体ごとの投与液量は当日朝の体重を基準に算出した（単位：０．０１ｍＬ）。期間は生後５週齢からの１日１回、２８日間とした。投与終了後、腹部大動脈切断により放血死させ、肝臓を摘出し、外側左葉を６等分し、２片をヘマトキシリンエオシン染色し、ＮＡＦＬＤ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅを算出した。【０１０９】
ＮＡＦＬＤ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅは、肝臓の脂肪化、肝実質の炎症、肝細胞の障害（風船様変性）の程度をスコア化したものであり、非アルコール性肝炎の病理診断に用いられる。コントロール群では、肝細胞の風船様変性、大滴性および小滴性の脂肪滴の沈着、リンパ球および好中球を含む炎症性細胞浸潤像が認められた。ＮＡＦＬＤ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅは、セレノネイン含有魚エキス投与群において、コントロール群と比較して有意に低値を示した。セレノネインはメタボリックシンドロームによる代謝異常による脂肪蓄積などを予防および改善することが示唆され、メタボリックシンドロームの予防および改善効果が考えられた（図５、表３）。【０１１０】
【表３】
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【０１１１】
（２）メタボリックシンドロームに伴う障害からの改善効果
ｉｃｖ−ＳＴＺ誘導性アルツハイマー型認知症モデルは、脳内インスリンシグナルを障害することで生じる、糖尿病様背景をもったアルツハイマー型認知症のモデル動物であり、遺伝要因を第一要因としないモデルである。したがって、本モデルは孤発性アルツハイマー型認知症に対する治療効果の検討に有用である。本実施例においては、被験物質であるセレノネイン含有魚エキスのアルツハイマー型認知症に対する効果を検討することを目的として、ｉｃｖ−ＳＴＺ誘導性アルツハイマー型認知症モデルマウスにモデル誘導開始の７日前からモデル誘導開始後１４日までの２１日間強制経口投与を行った。モデル誘導開始後１３日目に行動解析を行い、モデル誘導開始後１４日目に屠殺し、解析を行った。溶媒投与群（ＲＯ水、コントロール投与群）とセレノネイン含有魚エキス投与群との比較により、セレノネイン含有魚エキスのｉｃｖ−ＳＴＺ誘導性アルツハイマー型認知症モデルにおけるアルツハイマー型認知症に対する効果を検討した。【０１１２】
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、入荷時６週齢雄、日本エスエルシー株式会社）に、ストレプトゾトシン（シグマアルドリッチジャパン株式会社）を生理食塩液（日本薬局方、株式会社大塚製薬工場）にて２０ｍｇ／ｍＬ濃度とし、側脳室内に投与した。モデル誘導開始日に３μＬを左側脳室に１回投与し、モデル誘導開始後２日目に３μＬを右側脳室に１回投与することによって、ｉｃｖ−ＳＴＺ誘導性アルツハイマー型認知症モデル動物を作製した。試験期間中は固形飼料ＣＥ−２（放射線滅菌、日本クレア株式会社）を自由に摂取させ、投与開始日の前日に、雄性マウス２０匹を平均体重が均等になるように体重層別化無作為抽出法によって、ｉｃｖ−ＳＴＺ＋コントロール群およびｉｃｖ−ＳＴＺ＋セレノネイン含有魚エキス投与群に群分けを行った（１０匹／群）。被験物質の投与容量は６．２ｍＬ／ｋｇ体重とし、経口ゾンデを用いて２１日間、１日１回強制経口投与した。コントロール群は、ＲＯ水を６．２ｍＬ／ｋｇ体重で同様に投与した。個体ごとの投与液量は当日朝の体重を基準に算出した（単位：０．０１ｍＬ）。【０１１３】
投与期間終了後に、Ｙ迷路による自発的交替行動の解析を行った。投与終了１日前にマウスを迷路の中心へ置き、５分間自由に探索させた。５分経過した後、マウスをホームケージに戻し、５０％エタノールでＹ迷路を消毒し、続いて、次のマウスの行動試験を行った。投与終了当日に、３方向のアームのうち２つの入り口を壁で仕切り、マウスを迷路の中心へ置いた。開放されたアームへマウスが侵入した後、残る２方向のアーム入り口に設置した壁を取り去り、８分間自由に探索させた。この間、マウスがアームへ侵入した全ての回数、およびアームへ進入した順番を全て記録した。８分経過した後、マウスをホームケージに戻し、５０％エタノールでＹ迷路を消毒し、続いて、次のマウスの試験を行った。ＳＡＢの指標として交替行動率（％）を用いた。交替行動率は、次の式で計算した（図５、表４）。
交替行動率＝１００×（３回続けて異なるアームへ進入した回数）／（アームへ進入した全回数−２）
結果、コントロールと比較してセレノネイン含有魚エキス群は有意に交替行動率が高かった（Ｐ＜０．０５）。セレノネイン摂取により糖尿病による脳機能低下から保護されることが示唆された。【０１１４】
【表４】
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【０１１５】
実施例４：抗がん効果または全身免疫能低下抑制効果の検討
（１）大腸がん原発巣モデルを用いた抗がん効果および全身免疫能低下抑制効果の検証
セレノネイン含有魚エキスが、がん患者の腫瘍成長や全身免疫能に及ぼす影響をがんモデル動物を用いて検討した。各群とも１日あたり、１．７３〜２．６５ｇの間の摂餌で推移した。セレノネイン含有魚エキス飼料から得られるセレノネイン含有魚エキス摂取量は、１日あたり８１．４８〜１２５．８２ｍｇで推移した。大腸がん原発巣モデルを用いた結果、原発巣腫瘍成長が抑制される傾向があり、胆がん動物でみられるＩＬ−１０産生能の顕著な減弱がセレノネイン投与群では観察されず、調節性免疫能が増強される可能性が示された。また、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞がセレノネイン投与によって減少しており、Ｔｒｅｇ細胞による抗腫瘍免疫能調節は改善される可能性が示唆された。すなわち、セレノネインはがん患者の全身免疫能の改善および腫瘍の成長を抑制する効果があることが示唆された（図７と８）。【０１１６】
ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス由来大腸がん細胞Ｃｏｌｏｎ  Ｔｕｍｏｒ  ２６（ＣＴ−２６）株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−２６３８）を１０％ウシ胎児血清（１７１０１２、Ｎｉｃｈｉｒｅｉ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｒ８７５８、シグマ−アルドリッチ社）で培養した。また、マウス脾細胞を１０％ウシ胎児血清および５０μＭの２−メルカプトエタノール（２１４１７−５２、ナカライテスク社）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。ウォータージャケットインキュベーター（ＡＰＣ−３０Ｄ、アステック社）を用い、３７℃、５％ＣＯ2、湿度１００％条件下で細胞を培養した。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ雌、チャールズリバー社）は５週齢より８週齢までセレノネイン含有飼料またはコントロール飼料を摂取させた（下記表５参照）。１週間馴化後（６週齢）にマウス１匹辺りＣＴ２６株５０万細胞を皮下に移植した。移植１４日後（８週齢）のマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、腫瘍容積を測定した。腫瘍容積（ｍｍ3）は幅（ｍｍ）の２乗×長さ（ｍｍ）×０．５の定式により算出した。また、脾臓を摘出し、脾細胞中のＣＤ４陽性Ｆｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のサブセットを蛍光染色細胞解析装置（ＡｃｃｕｒｉＣ６、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）とＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ社）を用いたフローサイトメトリーにより測定した。脾細胞の培養上清中ＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。【０１１７】
【表５】
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ＡＩＮ−９３Ｍおよびセレノネイン含有飼料の魚エキス以外の原料はオリエンタル酵母より購入した。【０１１８】
制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は免疫抑制機能を有し、腫瘍成長を促進するが、セレノネイン含有食摂取により胆がんマウスのＴｒｅｇ細胞が抑制できる可能性が強く示唆された。また、調節性免疫能により抗腫瘍活性の調節を担うＩＬ−１０産生能が胆がんマウスでは有意に減弱していたが、セレノネイン含有食摂取群では減弱しなかった。腫瘍成長も抑制されることが示唆された。これにより、セレノネインにより全身の免疫能が改善され、がんの成長を抑制する効果が示唆された。Ｔｒｅｇ細胞の抑制により、がんの再発を予防する効果も考えられた（図９）。【０１１９】
（２）Ｂｈａｓ  ４２細胞を用いた発がん抑制効果の検証
Ｂｈａｓ  ４２細胞を用いた形質転換試験を実施することにより、セレノネイン精製品の主成分であるセレノネインについて、インビトロでの発がん抑制作用の有無を検討した。用量設定試験において、Ｂｈａｓ  ４２細胞をセレノネイン精製品（０．３１、０．６３、１．３、２．５、５．０、１０μＭ）で処理したところ、細胞毒性作用は見られなかった（データ示さず）。そこで、この結果および他の実験でのデータを元に、形質転換試験における濃度を１μＭに設定した。形質転換試験では、１μｇ／ｍＬの３−メチルコラントレン（ＭＣＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により誘発される形質転換巣の数が、１μＭのセレノネイン精製品により低下するか調べた。すなわち、ＭＣＡ＋超純水群とＭＣＡ＋セレノネイン精製品群における形質転換率（形質転換巣数／ウェル）を比較した。その結果、それぞれの形質転換率は１５．８および１０．２となり、形質転換巣数の有意な低下が認められた。以上の結果から、セレノネインはインビトロで発がん抑制作用を有することが示唆された。【０１２０】
Ｂｈａｓ  ４２細胞（マウス全胎児由来ＢＡＬＢ／ｃ  ３Ｔ３  Ａ３１−１−１にｖ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子を導入した細胞、一般財団法人食品薬品安全センター）を０．２５％トリプシンを用いて剥離した後、細胞濃度２０００個／ｍＬの懸濁液とした。この細胞懸濁液２ｍＬ（４０００個）をプレートに分注し（６ウェル／群）、１日間培養した。播種１日後にＭＣＡ調製液を添加し、３日間処理した。セレノネイン精製品およびＲＡ（レチノイン酸，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の処理は、播種してから４日後、７日後、１１日後に培養液を交換（１ウェルあたり２ｍＬ）することで実施した。播種１４日後に新鮮培地と交換し（１０日間処理）、さらに７日間培養した。形質転換試験用のプレートについては、播種２１日後にメタノールで固定後、５ｖｏｌ％ギムザ液で染色し、ウェルあたりの形質転換巣を数えた。【０１２１】
ＭＣＡ＋セレノネイン精製品群の形質転換率（１５．８個／ウェル）は、ＭＣＡ＋超純水群の形質転換率（１０．２個／ウェル）と比較して約２／３に減少し、有意な低下を示した。この結果から、セレノネイン精製品の主成分であるセレノネインは、発がん抑制作用を有することが示唆された。【０１２２】
実施例５：動脈硬化抑制効果の検討
ヒト大動脈平滑筋細胞を用いて被験物質の細胞遊走性に及ぼす影響を検討した。その結果、コラーゲン存在下において２ｍｇ／ｍｌセレノネイン含有魚エキスおよび１００ｎＭ精製セレノネインは遊走性を抑制した。【０１２３】
ＡｏＳＭＣ細胞（大動脈平滑筋細胞）（ＬＯＮＺＡ，ＣＣ−２５７１）を専用培地（ＳｍＧＭ−２  Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔ（ＬＯＮＺＡ，ＣＣ−３１８２））にて必要細胞数まで調整した。細胞遊走アッセイキット（ＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔTM  ９６−ｗｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（８μｍ），Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ、コスモ・バイオ、ＣＢＡ−１０６）を用い、ＡｏＳＭＣ細胞を１×１０5細胞／０．１ｍＬ／ウェルにて、細胞遊走アッセイキット付属のトランスウェル上室に播種し、下室に被験物質（２ｍｇ／ｍｌセレノネイン含有魚エキスまたは１００ｎＭ精製セレノネイン）と３００μｇ／ｍＬコラーゲンペプチドを含む試験培地を添加後、４８時間培養した。その後、細胞遊走アッセイキット付属のＣｙＱｕａｎｔ  ＧＲ  Ｄｙｅにてトランスウェル膜から細胞を剥離・溶解し遊走した細胞を測定した。【０１２４】
精製セレノネイン、セレノネイン含有魚エキスの添加により、細胞遊走性を有意に抑制することができた。平滑筋細胞の遊走性の抑制により、アテローム性動脈硬化の促進を抑制できることが示唆された（図１０）。【０１２５】
実施例６：脳機能改善効果の検討
アルツハイマーの原因の一つと考えられているアミロイドβタンパクは神経細胞毒性を有する。アミロイドβの毒性から細胞を防御することで認知症を予防する効果が期待される。本実施例では、ＰＣ−１２細胞を用いてアミロイドβの毒性を被験物質によって保護できるのかを検証した。【０１２６】
ＰＣ−１２細胞（理研バイオリソースセンター、ＲＣＢ０００９，Ｌｏｔ  Ｎｏ．５２，５３，５４）は、１０％ＦＢＳ、Ｈｏｒｓｅ  Ｓｅｒｕｍ添加ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培地（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０８４５６−６５）３９５ｍｌに、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液５ｍｌとＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ１８２０，Ｌｏｔ  Ｎｏ．５１６５３６）５０ｍｌ、Ｈｏｒｓｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＧＩＢＣＯ，１６０５０−１２２）５０ｍＬを加えて調製した）を用い、ＣＯ2インキュベーター（５％ＣＯ2、３７℃）内で培養した。培地交換を一日おきに行った。細胞の剥離には０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液を用いた。【０１２７】
神経細胞（ＰＣ−１２）を２×１０3細胞／１００μＬ／ウェルで、９６穴プレート（コラーゲンコート）に上記ＤＭＥＭ培地にて播種し、ＣＯ2インキュベーター内（５％ＣＯ2、３７℃）で培養し、翌日、被験物質を含む培地（１％ＦＢＳ，１０ｎｇ／ｍＬ  ＮＧＦ（Ａｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ、ＰＲＯＤＵＣＴ＃Ｎ−１００）を含む）に交換した。２４時間培養後に終濃度２μＭとなるようにアミロイドβ（１−４０）（ＳＩＧＭＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１０７５−．１ＭＧ）（ＰＢＳ（日水製薬株式会社、Ｃｏｄｅ  ０５９１３）に終濃度１ｍＭとなるように溶解し、３７℃下で３日間加温処理することで溶解液を作製した）を追加添加（５０μＬ／ウェル）し、さらに２４時間培養した。培養終了後の各ウェルから培養上清を除去後、１０％生細胞数測定試薬（ＷＳＴ−８）（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０７５５３−４４）を含む試験培地１００μＬ（ウェルあたり）に交換し、３０分間および９０分間培養した。次に、マイクロプレートリーダー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ））にて各ウェルの吸光度（吸収波長４５０ｎｍ、参照波長６３０ｎｍ）を測定し、両値から１時間あたりの吸光度変化量を算出し、生細胞数として求め、細胞の生存性を測定した。本実施例では、被験物質（終濃度）として、セレノネイン含有魚エキス：２ｍｇ／ｍＬ、セレノネイン：１００ｎＭを用いた。【０１２８】
アミロイドβ添加により無添加区の約７０％の生細胞数を示した。これらの条件下で各被験物質を処理したところ、セレノレイン含有魚エキスにおいてアミロイドβ添加コントロールと比較して有意に細胞の生存率の向上が認められた（図１１）。【０１２９】
実施例７：ドライアイ改善効果の検討
ＨＣＥ−Ｔ細胞（ヒト不死化角膜上皮細胞）（理研バイオリソースセンター、ＲＣＢ２２８０）は、試験培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１３３０−０３２）（１：１）、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ１８２０，Ｌｏｔ  Ｎｏ．５１６５３６）、１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１１４０−０５０）、１％抗生物質（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２６２５３−８４））を用いて、Ｔ７５フラスコにてＣＯ2インキュベーター（５％ＣＯ2、３７℃）内で必要細胞数に達するまで前培養した。細胞の継代にはトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３２７７７−４４）を用いて細胞をフラスコから剥離し、試験培地でトリプシンを中和後、遠心分離して細胞を回収した。その後、再び試験培地に細胞を再懸濁し、細胞懸濁液として使用した。【０１３０】
セレノネイン含有魚エキスは水溶性であり、培地に直接溶解させ、ストック溶液を作製し、使用した。【０１３１】
（１）角膜上皮細胞における乾燥ストレス（ドライアイ）回避試験
ＨＣＥ−Ｔを２．５×１０4細胞／０．１ｍＬ／ウェルで、９６ウェルプレートに播種し、ＣＯ2インキュベーター内（５％ＣＯ2、３７℃）で５時間培養後、細胞がプレート底面に接着したことを確認し、被験物質を含む試験培地に交換した。その後、１日間培養した。続いて、培養上清を除去し、乾燥状態に細胞を曝した（乾燥ストレス処理時間：１０分間）。その後、専用培地を添加し、再び、ＣＯ2インキュベーター内（５％ＣＯ2、３７℃）で３時間培養した。細胞の増殖性を生細胞数測定試薬ＳＦ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０７５５３−４４）（ＷＳＴ−８）を用いて測定した。【０１３２】
（２）ムチン遺伝子発現解析試験
ＨＣＥ−Ｔを６×１０4細胞／０．５ｍＬ／ウェルで、４８ウェルプレートに播種し、ＣＯ2インキュベーター内（５％ＣＯ2、３７℃）で１日間培養後、被験物質を含む試験培地に交換した。被験物質を添加してから５時間後、細胞から総ＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡ化後にリアルタイムＰＣＲ（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ））によりムチン遺伝子発現解析を行った。解析対象遺伝子：膜結合型ムチン遺伝子ＭＵＣ１、内部標準遺伝子：ＧＡＰＤＨとした。【０１３３】
コントロールと比較してセレノネイン含有魚エキスを添加することにより、乾燥ストレス後の生細胞数とムチン遺伝子発現が有意に増加したため、本発明のセレン含有組成物は角膜細胞の乾燥ストレスを保護し、ドライアイを予防、改善する効果を示した（図１２と１３）。【０１３４】
実施例８：炎症抑制効果
様々な炎症応答には「ＮＦκＢ」と呼ばれる転写因子が関与しており、ＴＮＦ−α等のサイトカインによって細胞が刺激を受けると、不活性型のＮＦκＢは活性化されて炎症反応が誘導される。ＮＦκ−Ｂの発現は、アレルギー性疾患やがんを始め多くの疾患で亢進していることが報告されている（化学と生物、Ｖｏｌ．４７、Ｎｏ．９、Ｐ．６０２−６０４（２００９））。被験物質は、ＴＮＦ−αで誘導されるＮＦκ−Ｂの活性を抑制することで炎症抑制効果を確認した。ＮＦκ−Ｂ活性測定系は、目的細胞にレポーター遺伝子を導入し、ＴＮＦα刺激によるＮＦκＢ転写活性をルシフェラーゼ活性にて測定した。被験物質の終濃度は、セレノネイン（粗精製）：０．４ｍｇ／ｍＬ（ＨＥＫ２９３細胞）、セレノネイン（精製）：１００ｎＭとした。【０１３５】
ＨＥＫ２９３細胞（理研バイオリソースセンター、ＲＢＣ１６３７、Ｌｏｔ．２０）は、基礎培地（ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ、抗生物質含（（ＭＥＭ  ＮＥＡＡ：Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１１４０−０５０、ＦＢＳ：Ｂｉｏｗｅｓｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ１８２０，Ｌｏｔ  Ｎｏ．５１６５３６、抗生物質：Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２６２５３−８４）を用いて、Ｔ７５フラスコにてＣＯ2インキュベーター（５％ＣＯ2、３７℃）内で必要細胞数に達するまで前培養した。細胞の継代にはトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３２７７７−４４）を用いて細胞をフラスコから剥離し、試験培地でトリプシンを中和後に遠心分離により細胞を回収した。その後、再び試験培地に細胞を再懸濁し、細胞懸濁液として使用した。【０１３６】
ＨＥＫ２９３細胞を１．５×１０4細胞／０．１ｍＬ／ウェルで、９６ウェルプレートに播種し、ＣＯ2インキュベーター内（５％ＣＯ2、３７℃）で１日間培養した。その後、ＤＮＡベクター（ｐＧＬ４．３２［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦ−ｋＢ−ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ８４９１））をトラスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０６３６６２４４００１）を用いて細胞へ導入し、翌日、被験物質（セレノネイン含有魚エキス終濃度：０．４ｍｇ／ｍＬ、またはセレノネイン終濃度：１００ｎＭ）を添加した試験培地（０．１ｍＬ／ウェル）に置換後、３７℃、５％ＣＯ2で２時間培養した。５μＬ（ウェルあたり）の２００ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α培地（１０μＬ／ｍＬ  ＴＮＦ−α（ＳＩＧＭＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｔ０１５７−１０ＵＧ）ストックを試験培地に添加し調製した）を添加し、ＴＮＦ−α終濃度：１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ2で５時間培養し、ＴＮＦ−α刺激によりＮＦ−κＢを活性化させ、ルシフェラーゼ遺伝子の誘導を促進させた。５時間培養後に各ウェルから３０μＬの培養上清を抜き取った。各ウェルに７０μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ２６１０）を添加（合計１５０μＬの培養上清）し、緩やかに混和後、２分間静置した。その後、発光測定用プレートリーダー（ルミノメーター：サーモフィッシャーサイエンティフィック社、Ｖａｒｉｏｓｃａｎ  Ｆｌａｓｈ、型番５２５００４０）にて各ウェルの相対発光度（ＲＬＵ：Ｒｅｌａｔｉｃｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔｓ）を測定した。陽性対照として２００ｍＭアンモニウムピロリジンジチオカルバメート（ＡＰＤＣ）（ＳＩＧＭＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ８７６５−１Ｇ）を用いた。【０１３７】
セレノネイン、セレノネイン含有魚エキスともに、ＴＮＦ−α添加によるＮＦκ−Ｂ活性化を有意に抑制した。アレルギー、関節炎、リウマチ、がん等種々の疾患や慢性炎症状態に関与する炎症反応を抑制した（図１４）。【０１３８】
【表６】
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【０１３９】
上記から、本開示の具体的な実施形態は本明細書において例示を目的として記載されているが、様々な修正が本開示の精神と範囲から逸脱することなく行われてもよいことを理解されたい。従って、本開示は、添付の特許請求の範囲による場合を別として、限定されない。さらに、特許請求の範囲は、その全範囲および同等物に権利を有する。【０１４０】
実施例９：耐糖能異常改善効果の検討
従来、ヒト肝臓においてセレノプロテインＰ（ＳＥＬＥＮＯＰ）遺伝子の発現量がインスリン抵抗性と相関すること、精製したＳＥＬＥＮＯＰで肝細胞と筋細胞を処理するとインスリンシグナルを障害し、糖代謝の異常を誘導すること、それとは反対に、ＳＥＬＥＮＯＰ遺伝子のノックアウトおよびＲＮＡｉによるノックダウンにより、マウスにおいて全身のインスリン感受性と耐糖能を改善することが報告されている（Ｍｉｓｕ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１２，４８３−４９５（２０１０））。また、６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビホスファターゼ３（ＰＦＫＦＢ３）は解糖系とインスリンシグナル伝達系の正の調節因子であり、ＰＦＫＦＢ３を阻害剤で阻害すると、インスリンで刺激されるグルコースの取込みとグルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ４）の細胞膜へのトランスロケーション、Ａｋｔシグナル伝達系が阻害されること、反対にＰＦＫＦＢ３遺伝子を過剰発現した細胞では、Ａｋｔシグナル伝達系が活性化することが報告されている（Ｔｒｅｆｅｌｙ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２９０，２５８３４−２５８４６（２０１５））。【０１４１】
本実施例では、セレノネイン含有魚エキスのＳＥＬＥＮＯＰ遺伝子とＰＦＫＦＢ３遺伝子の発現量に及ぼす影響を検証した。正常ヒト線維芽細胞（クラボウ、ＫＦ−４１０９）を専用培地［ＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０８４５６−６５）、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ１８２０，Ｌｏｔ  Ｎｏ．５１６５３６）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  Ｍｉｘｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２６２５３−８４）］を用いてＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）内で使用細胞数まで増やし、直径８ｃｍのシャーレに８×１０５細胞／１５ｍＬで細胞を播種後、培養した。翌日（８０％コンフルエント）、セレノネイン含有魚エキスを含む（１ｍｇ／ｍＬ）又は含まない１５ｍＬ培地に交換し、２４時間培養した。培養終了後、細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ溶液（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３２７７７−４４）を用いてウェルから細胞を剥離した。具体的には、各ウェルの培養上清を除去し、１×ＰＢＳ（日水製薬株式会社、Ｃｏｄｅ  ０５９１３）を０．３ｍＬ／ウェル添加し、細胞を洗浄し、ＰＢＳを除去後に５０μＬの２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ溶液を添加し、３７℃で反応させた。その後、各ウェルに４５０μＬの１０％ＦＢＳを含むＰＢＳを添加し、トリプシン反応を停止させた。細胞剥離液を回収し、５００×ｇで１０分間、室温にて遠心し、上清を除去し、細胞（沈殿）を回収した。細胞からのトータルＲＮＡの回収は、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｏ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ．Ｎｏ．７４００４）にて行い、ＲＮＡ濃度、精製度は分光光度計とバイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００）により測定した。その後の操作は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＷＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ＫｉｔなどのＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社の製品を用いて、それらの取扱説明書に従ってトータルＲＮＡサンプルの増幅、蛍光標識、品質チェックを行った。次に、調整されたサンプルは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ）を用いて、ＤＮＡマイクロアレイ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ，ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ）にハイブリダイズさせ、洗浄および染色を行い、ハイブリダイゼーション後のＤＮＡマイクロアレイをスキャニングし、画像ファイルを数値データに変換し、バックグラウンド減算、ノーマライズ、発現比の算出などの処理を行った。【０１４２】
セレノネイン含有魚エキスは、無添加（コントロール）と比べて、ＳＥＬＥＮＯＰ遺伝子の発現量を１／３以下に抑え、反対にＰＦＫＦＢ３遺伝子の発現量を２倍以上に増やしたため、本発明のセレン含有組成物には耐糖能異常改善効果があることが示された（表７）。【０１４３】
【表７】
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【０１４４】
実施例１０：脂質代謝異常改善効果の検討
２７−ヒドロキシコレステロール（２７ＨＣ）は血中に豊富に存在するコレステロールの代謝産物であり、動脈硬化の進展を促進し、血管における炎症を惹起する。体内の２７ＨＣは、シトクロームＰ４５０ファミリー７  サブファミリーＢメンバー１（ＣＹＰ７Ｂ１）によって異化される（Ｕｍｅｔａｎｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２０，１７２−１８２（２０１４））。実際に、ＣＹＰ７Ｂ１遺伝子をノックアウトしたマウスでは、野生型と比べると、血中および組織中の２７ＨＣ濃度は４〜５倍上昇する（Ｕｍｅｔａｎｉ  Ｍ．，前掲）。本実施例では、セレノネイン含有魚エキスのＣＹＰ７Ｂ１遺伝子の発現量に及ぼす影響を検証した。実施例９と同じ方法で細胞およびサンプルを調整し、データを収集および解析した。セレノネイン含有魚エキスは、無添加（コントロール）と比べて、ＣＹＰ７Ｂ１遺伝子の発現量を８倍以上に増やしたため、本発明のセレン含有組成物には脂質代謝異常改善効果があることが示された（表８）。【０１４５】
【表８】
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【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明のセレン含有組成物は、虚血再灌流障害低減、抗メタボリックシンドローム剤等として新たな利用可能である。水産加工残滓から抽出されたセレノネイン濃縮物の新たな用途が見出され、低未利用水産物の高付加価値化に貢献することができる。消費者の健康志向に対応する新たな食材や機能性素材を商品化することができる。【０１４７】
本明細書に引用する全ての刊行物および特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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