(57)【要約】ステビオール配糖体およびステビオールの新たな製造方法が求められていた。本発明は、ステビオール配糖体の１３位グルコシド結合、１９位グルコシルエステル結合および／または側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）を切断する工程を含む、ステビオール配糖体および／またはステビオールの製造方法を提供する。
2017204284.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質と、第１のステビオール配糖体を反応させて、前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合、のうち少なくとも１つを加水分解する工程を含む、ステビオールおよび／または第２のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第１及び第２のステビオール配糖体は互いに異なる、前記方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記第１のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールモノグルコシルエステル、ルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドＢ，レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦおよびレバウジオシドＭ、ズルコシドＡ、ステビオール配糖体Ｂ、ステビオール配糖体Ｃ、ステビオール配糖体Ｄからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドＢ、ステビオール配糖体Ａ、ステビオール配糖体Ｂ、ステビオール配糖体Ｃ、ステビオール配糖体Ｄからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のステビオール配糖体を反応させる工程が有機溶媒の存在下で行われる請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記有機溶媒がアセトニトリルである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合または１３位の側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）より１９位のグルコシルエステル結合または１９位の側鎖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）を優先して切断する工程を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記第１のステビオール配糖体が、１３位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシド結合し、および／または、１９位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシルエステル結合したものであり、かつ、前記第１のステビオール配糖体を加水分解工程は、下記（１）〜（５）から成る群より選択されるいずれか１つ以上の工程を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法、
（１）分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合を優先して切断する工程；
（２）アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースを優先して切断する工程；
（３）１３位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）よりも、１９位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）を優先して切断する工程；
（４）１３位の二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）よりも、１９位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）および１９位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合を優先して切断する工程；
（５）１３位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、１９位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合を優先して切断する工程。
【請求項８】
宿主細胞に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素を、前記第１のステビオール配糖体と接触させて、前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および／または側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）を加水分解する工程を含む、ステビオールおよび／または第２のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第１及び第２のステビオール配糖体は互いに異なる、前記方法：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記形質転換細胞が、形質転換麹菌、形質転換酵母、形質転換細菌または形質転換植物である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールモノグルコシルエステル、ルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦおよびレバウジオシドＭ、ズルコシドＡ、ステビオール配糖体Ｂ、ステビオール配糖体Ｃ、ステビオール配糖体Ｄからなる群より選択される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドＢ、ステビオール配糖体Ａ、ステビオール配糖体Ｂ、ステビオール配糖体Ｃ、ステビオール配糖体Ｄからなる群より選択される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のステビオール配糖体を反応させる工程が有機溶媒の存在下で行われる、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記有機溶媒がアセトニトリルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のステビオール配糖体が、１３位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシド結合し、および／または、１９位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシルエステル結合したものであり、かつ、前記第１のステビオール配糖体を加水分解する工程は、下記（１）〜（５）から成る群より選択されるいずれか１つ以上の工程を含む、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の製造方法、
（１）分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合を優先して切断する工程；
（２）アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースを優先して切断する工程；
（３）１３位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）よりも、１９位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）を優先して切断する工程；
（４）１３位の二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）よりも、１９位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）および１９位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合を優先して切断する工程；
（５）１３位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、１９位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合を優先して切断する工程。
【請求項１６】
以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体の製造方法
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記形質転換体が、形質転換麹菌、形質転換酵母、形質転換細菌または形質転換植物である、請求項１６または１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステビオールおよびステビオール配糖体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キク科ステビア（Stevia rebaudiana）の葉にはジテルペノイドの一種であるステビオール（Ｓｔｅｖｉｏｌ）とよばれる二次代謝産物が含まれており、ステビオールに糖が付加したステビオール配糖体の中には砂糖の約３００倍もの甘味を呈するものがあり、それらはカロリーレスの甘味料として食品産業に利用されている。肥満が深刻な社会問題として国際的に発展しており、健康増進および医療費削減の観点からもカロリーレスの甘味料の要望は日々大きくなっている。現在では人工的に合成されたアミノ酸誘導体のアスパルテーム（Ａｓｐａｒｔａｍｅ）やアセスルファムカリウム（Ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ）が人工甘味料として利用されているが、ステビオール配糖体のように天然に存在するカロリーレス甘味料がより安全で消費者理解（Ｐｕｂｌｉｃ  Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ）が得られやすいと期待される。【０００３】
ステビオール配糖体のうちステビオシド（ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ：ｓｔｅｖ）は、ステビオールに３つのグルコースが付加した化合物で、一般的なステビアの葉にもっとも多く含まれている。ステビオシド（ｓｔｖ）は、ショ糖のおよそ３００倍の甘味度を有するが若干の苦味を呈する。ステビオール配糖体のレバウジオシドＡ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ  Ａ；ｒｅｂＡ）は、ステビオールに４つのグルコースが付加された化合物で、ショ糖のおよそ４００倍の甘味度を有する。ステビオシドとレバウジオシドＡがステビアの甘味の中心的な物質である。また、ステビオールにグルコースが５つ付加したレバウジオシドＤ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ  Ｄ；ｒｅｂＤ）、グルコースが６つ付加したレバウジオシドＭ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ  Ｍ；ｒｅｂＭ）といった配糖体も知られている。また、甜茶には、ステビオールの１３位と１９位にそれぞれグルコースが１つずつ付加されたルブソシド（ｒｕｂ）が含まれており、これが甜茶の主な甘味成分であることが知られている。これら以外に、反応中間体と思われる配糖体や糖の種類の違う類縁体の存在が知られている（図１）。
また、ステビオールについては、認知機能の改善効果などが知られている。【０００４】
ステビオール配糖体のうち、特定のグリコシド結合にのみ作用する酵素を利用することができれば、特定の配糖体を選択的に生産したり、不要な配糖体を除去したりすることが可能になり、ステビア抽出物の味質の改善や特定のステビオール配糖体の精製が容易になるなどのメリットが大きい。
さらに、酵母等を利用して、ステビオールを出発物質とし、ステビオールを配糖化してステビオール配糖体を得る工程においても、ステビオールは有用である。培地中にステビオールを添加すれは、酵母は菌体内に取り込むことが可能であるため、ステビオール配糖化酵素遺伝子を菌体内に発現させた酵母を、ステビオールを含む培地で培養すると、当該酵母は菌体内にステビオールを取り込んで配糖化することができる。一方、ステビオール配糖体を培地中に添加しても酵母は菌体内に取り込むことができず、さらなる配糖化はできないことが分かっている。このように、酵母細胞内への取り込みに際しては、ステビオール配糖体よりステビオールの方が望ましく、ステビオールの需要がある。【０００５】
ステビオール配糖体を加水分解する酵素活性については、いくつかの生物種において報告されている。その中でも、アスペルギルス属糸状菌がステビオール配糖体加水分解酵素を生成することに関して、生醤油中には、ステビオシドをルブソシドに加水分解する活性があること（非特許文献１）、Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ酵素剤やＨｅｓｐｅｒｉｄｉｎａｓｅ酵素剤、Ｔａｋａｄｉａｓｔａｓｅ酵素剤中に、ステビオシドをステビオールに加水分解する活性があることが報告されている（非特許文献２−４）。また、アスペルギルス属糸状菌由来のペクチナーゼ酵素剤とカタツムリ（Helix pomatia）由来の酵素剤を組み合わせて使用することで、ステビオシドからステビオールを製造する方法が報告されている（特許文献１）。Aspergillus aculeatus  由来酵素剤  Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ  Ｌ（ｎｏｖｏｚｙｍｅ）には、ステビオシド→ルブソシド→ステビオールモノグリコシルエステルに加水分解する活性があることが記載されている（非特許文献５）。また、Aspergillus aculeatusの個体培養抽出物にステビオシドをステビオールに変換する活性があることが記載されている（非特許文献６）。
以上のように、麹菌を含むアスペルギルス属糸状菌はステビオール配糖体加水分解活性を有する酵素遺伝子を有していることが示唆されてはいたものの、酵素活性を担う酵素やそれをコードする遺伝子についての報告はない。【０００６】
また、麹菌のAO090009000356遺伝子にコードされるグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）３ファミリーのβ−グルコシダーゼは、β−グルコシド結合を有する二糖類を加水分解するとの報告がある（非特許文献７）。具体的には、β−１，３結合を有するラミナリビオース、β−１，６結合を有するβ−ゲンチオビオース、β−１，４結合を有するセロビオース、β−１，２結合を有するソホロースの順に加水分解の特異性が高い。しかし、ステビオール配糖体をはじめとするテルペン配糖体を加水分解する活性があるかどうかは報告されていない。
それ以外の生物でも、ステビオール配糖体を加水分解する活性を有することが報告されている。例えば、クラビバクター属細菌が、ルブソシドの１９位グルコシルエステル結合を分解するが１３位グルコシド結合は分解しない酵素を有することが開示されている（特許文献２）。また、Flavobacterium johnsonae由来のβ−グルコシダーゼに、ステビオール配糖体を分解する活性（１３位β−グルコシド結合と１９位グルコシルエステル結合を加水分解する活性）があることが報告されている（非特許文献８）。
また、Penicillium decumbens由来のナリンゲナーゼに、ステビオシドからルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオールモノグルコシドを経てステビオールに加水分解する酵素があり、この酵素は分子量１２１ｋＤａのタンパク質でｐＨ２．３−６．０、温度４０−６０℃で安定な酵素であることが報告されている（非特許文献９）。
しかしながら、これらはいずれもステビオール配糖体を加水分解する活性を見出してはいるものの、その活性を担う遺伝子については特定されていない。
さらに、麹菌には、β−グルコシダーゼ様活性を有するＧＨ３ファミリー酵素やＧＨ５ファミリー酵素をコードすると考えられる遺伝子が多数存在しており、酵素活性が検出できても、どの遺伝子がその活性を担っているかを特定するのは容易ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2013-516963
【特許文献２】特開平10-276775
【特許文献３】特開平10-276775
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日本食品工業学会誌  第37巻  第5号  369-374(1990)
【非特許文献２】Phytochemistry,6,1107(1967)
【非特許文献３】薬誌，95,1507(1975)
【非特許文献４】日化誌，1981,726(1981)
【非特許文献５】J.Agric.FoodChem.,60,6210-6216(2012)
【非特許文献６】Wei Sheng Wu Xue Bao,54(1),62-68(2014)
【非特許文献７】Biochim Biophys Acta.,1764 972-978(2006)
【非特許文献８】Biosci. Biotechnol. Biochem.,64(2), 333-340, 2000
【非特許文献９】Appl. Microbiol. Biotechnol., 97, 8151-8161
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のような状況の下、ステビオールおよびステビオール配糖体の新たな生産方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＡＯＢＧＬ１１遺伝子またはそのホモログ遺伝子にコードされる麹菌Aspergillus oryzae var.Brunneus由来のグリコシドヒドロラーゼホモログ（ＧＨ３ファミリー）タンパク質ＡＯＢＧＬ１１ｐが、ステビオール配糖体を加水分解する活性を有することを見出した。さらに、タンパク質ＡＯＢＧＬ１１ｐは、ステビオール配糖体のグルコシド結合およびグルコシルエステル結合を切断することを見出した。すなわち、ＡＯＢＧＬ１１ｐは、ステビオール配糖体のステビオールと糖の結合部位である１３位のＯ−グルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、ならびに側鎖内のグリコシド結合を単糖ごとに切断する活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
さらに、反応条件を選択することで、ステビオール配糖体のうち、１３位に結合した分岐三糖またはソホロースの加水分解反応や、１９位に結合した分岐三糖の加水分解反応が抑制されることを見出した。また、１３位のグルコシド結合よりも、１９位のグルコシルエステル結合を優先して切断することを見出した。【００１１】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質と、第１のステビオール配糖体を反応させて、前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合、のうち少なくとも１つを加水分解する工程を含む、ステビオールおよび／または第２のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第１及び第２のステビオール配糖体は互いに異なる、前記方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質。
［２］
前記第１のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールモノグルコシルエステル、ルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドＢ，レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦおよびレバウジオシドＭ、ズルコシドＡ、ステビオール配糖体Ｂ、ステビオール配糖体Ｃ、ステビオール配糖体Ｄからなる群より選択される、前記［１］に記載の方法。
［３］
前記第２のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドＢ、ステビオール配糖体Ａ、ステビオール配糖体Ｂ、ステビオール配糖体Ｃ、ステビオール配糖体Ｄからなる群より選択される、前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］
前記第１のステビオール配糖体を反応させる工程が有機溶媒の存在下で行われる前記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
前記有機溶媒がアセトニトリルである、前記［４］に記載の方法。
［６］
前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合または13位の側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）より１９位のグルコシルエステル結合または19位の側鎖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）を優先して切断する工程を含む、前記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の製造方法。
［７］
前記第１のステビオール配糖体が、１３位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシド結合し、および／または、１９位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシルエステル結合したものであり、かつ、前記第１のステビオール配糖体を加水分解工程は、下記（１）〜（５）から成る群より選択されるいずれか１つ以上の工程を含む、前記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の製造方法、
（１）分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合を優先して切断する工程；
（２）アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースを優先して切断する工程；
（３）１３位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）よりも、１９位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）を優先して切断する工程；
（４）１３位の二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）よりも、１９位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）および19位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合を優先して切断する工程；
（５）１３位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、１９位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合を優先して切断する工程。
［８］
宿主細胞に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素を、前記第１のステビオール配糖体と接触させて、前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および／または側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）を加水分解する工程を含む、ステビオールおよび／または第２のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第１及び第２のステビオール配糖体は互いに異なる、前記方法：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［９］
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記［８］に記載の方法。
［１０］
前記形質転換細胞が、形質転換麹菌、形質転換酵母、形質転換細菌または形質転換植物である、前記［８］または［９］に記載の方法。
［１１］
前記第１のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールモノグルコシルエステル、ルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦおよびレバウジオシドＭ、ズルコシドＡ、ステビオール配糖体Ｂ、ステビオール配糖体Ｃ、ステビオール配糖体Ｄからなる群より選択される、前記［８］〜［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］
前記第２のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドＢ、ステビオール配糖体Ａ、ステビオール配糖体Ｂ、ステビオール配糖体Ｃ、ステビオール配糖体Ｄからなる群より選択される、前記［８］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］
前記第１のステビオール配糖体を反応させる工程が有機溶媒の存在下で行われる、前記［８］〜［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］
前記有機溶媒がアセトニトリルである、前記［１３］に記載の方法。
［１５］
前記第１のステビオール配糖体が、１３位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシド結合し、および／または、１９位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシルエステル結合したものであり、かつ、前記第１のステビオール配糖体を加水分解する工程は、下記（１）〜（５）から成る群より選択されるいずれか１つ以上の工程を含む、前記［８］〜［１４］のいずれか一項に記載の製造方法、
（１）分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合を優先して切断する工程；
（２）アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースを優先して切断する工程；
（３）１３位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）よりも、１９位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）を優先して切断する工程；
（４）１３位の二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）よりも、１９位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）および19位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合を優先して切断する工程；
（５）１３位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、１９位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合を優先して切断する工程。
［１６］
以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体の製造方法
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１７］
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記［１６］に記載の方法。
［１８］
前記形質転換体が、形質転換麹菌、形質転換酵母、形質転換細菌または形質転換植物である、前記［１６］または［１７］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法により、ステビオールおよびステビオール配糖体の新たな製造方法が提供される。本発明の方法により、ステビオールを製造することができる。【００１３】
また、反応条件を選択することで、ステビオール配糖体を製造することができる。具体的には、反応条件を選択することで、１３位に結合した分岐三糖またはソホロースや、１９位に結合した分岐三糖の加水分解反応を抑え、これらの糖鎖を有するステビオール配糖体を製造することができる。ここで、分岐三糖とは、アグリコンであるステビオールと結合している１つのグルコースに更に２つのグルコースが結合したものであって、一方の結合がβ２→１であり、もう一方はβ３→１であるものをいう。
具体的には、レバウジオシドＢ（ｒｅｂＢ）やステビオールビオシド（ｓｔｅＢ）、ステビオールモノシド（ｓｔｅＭ）を生成することができる。
さらに、本発明の方法ではラムノシド結合を加水分解しないので、ステビオール配糖体の混合物に本酵素を作用させることで、ラムノシドを有する配糖体を特異的に得ることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】Ａ：反応液に有機溶媒が含まれていないときの反応経路。
【図１Ｂ】Ｂ：反応液にアセトニトリルが含まれているときの反応経路。
【図２】Ａ：ｐＮＰ−β−Ｇｌｃを基質とした、ＡＯＢＧＬ１１ｐの至適ｐＨ。Ｂ：ｐＮＰ−β−Ｇｌｃを基質とした、ＡＯＢＧＬ１１ｐの至適温度。Ｃ：ｐＮＰ−β−Ｇｌｃを基質とした、ＡＯＢＧＬ１１ｐのｐＨ安定性。Ｄ：ｐＮＰ−β−Ｇｌｃを基質とした、ＡＯＢＧＬ１１ｐの熱安定性。
【図３】ｒｅｂＭ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を基質としたＢＧＬ１１粗酵素液による生成物のＬＣ−ＭＳ分析。Ａ：基質のみ。Ｂ：アセトニトリル添加なし。  Ｃ：アセトニトリル  ８％。
【図４】ｒｅｂＤ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を基質としたＢＧＬ１１粗酵素液による生成物のＨＰＬＣ分析。Ａ：アセトニトリル添加なし。Ｂ：アセトニトリル  ８％。
【図５】ｒｅｂＡ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を基質としたＢＧＬ１１粗酵素液による生成物のＨＰＬＣ分析。Ａ：アセトニトリル添加なし。Ｂ：アセトニトリル  ８％。
【図６】Ａ：レバウディオＪＭのＨＰＬＣ分析。Ｂ：ステビロン  Ｓ−１００ＨＰＬＣ分析。
【図７】レバウディオＪＭ（１ｍｇ／ｍｌ）の加水分解物のＨＰＬＣ分析。Ａ：アセトニトリル添加なし。Ｂ：アセトニトリル  ４％。Ｃ：アセトニトリル  ８％。
【図８】レバウディオＪＭ（１０ｍｇ／ｍｌ）の加水分解物のＨＰＬＣ分析。Ａ：アセトニトリル添加なし。Ｂ：アセトニトリル  ４％。Ｃ：アセトニトリル  ８％。
【図９】ステビロン  Ｓ−１００（１ｍｇ／ｍｌ）の加水分解物の分析結果。Ａ：アセトニトリル添加なし。Ｂ：アセトニトリル  ４％。Ｃ：アセトニトリル  ８％。
【図１０Ａ】ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡ配列（ＡＯＢＧＬ１１Ｇ）とｃＤＮＡ配列（ＡＯＢＧＬ１１ＣＤＳ）の比較。
【図１０Ｂ】ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡ配列（ＡＯＢＧＬ１１Ｇ）とｃＤＮＡ配列（ＡＯＢＧＬ１１ＣＤＳ）の比較（図１０Ａの続き）。
【図１１Ａ】ＡＯＢＧＬ１１ｐ（アミノ酸配列：配列番号２）、ＡＯＢＧＬ３ｐ（アミノ酸配列：配列番号５）およびＡＯＢＧＬ１ｐ（アミノ酸配列：配列番号６）のアミノ酸配列の比較。
【図１１Ｂ】ＡＯＢＧＬ１１ｐ（アミノ酸配列：配列番号２）、ＡＯＢＧＬ３ｐ（アミノ酸配列：配列番号５）およびＡＯＢＧＬ１ｐ（アミノ酸配列：配列番号６）のアミノ酸配列の比較（図１１Ａの続き）。
【図１２】レバウジオシドＣ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を基質としたＢＧＬ１１粗酵素液による生成物のＨＰＬＣ分析。反応時間は２４時間。図１２Ａは基質のみのデータであり、図１２Ｂ、Ｃ、Ｄはそれぞれ、本発明のタンパク質の濃度の違いである（Ｂ:１/１０００希釈、Ｃ:原液、Ｄ:２０倍濃縮)。
【図１３】レバウジオシドＦ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を基質としたＢＧＬ１１粗酵素液による生成物のＨＰＬＣ分析。図１３Ａは基質のみのデータであり、図１３Ｂ及びＣはそれぞれ反応時間の違いである（Ｂ:１時間、Ｃ:２４時間)。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2016年5 月25日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願2016-104404号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００１６】
「ＡＯＢＧＬ１１」は、麹菌Aspergillus oryzae由来のβ−グルコシダーゼであり、そのＣＤＳ配列（配列番号１）、アミノ酸配列（配列番号２）、ＯＲＦ配列（配列番号３）およびゲノムＤＮＡ配列（配列番号４）は、添付の配列表にそれぞれ示される。
【００１７】
１．ステビオールおよび／またはステビオール配糖体の製造方法
本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」という）と、１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有する第１のステビオール配糖体を反応させて、当該第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する工程を含む、ステビオールおよび／または第２のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第１及び第２のステビオール配糖体は互いに異なる、方法を提供する。一実施形態において、ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合より１９位のグルコシルエステル結合が優先的に切断される。また、一実施形態において、本発明は反応液に有機溶媒を含むステビオールおよび／またはステビオール配糖体の製造方法を提供する。また、一実施形態において、本発明は反応液にアセトニトリルを含むステビオールおよび／またはステビオール配糖体の製造方法を提供する。
【００１８】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質
【００１９】
上記（ｂ）または（ｃ）に記載のタンパク質は、代表的には、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体であるが、例えば、”Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Vol.4,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012”、”Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons 1987-1997”、”Nuc.Acids.Res.,10,6487(1982)”、”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)”、”Gene,34,315(1985)”、”Nuc.Acids.Res.,13,4431(1985)”、”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
【００２０】
「配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質」としては、配列番号２のアミノ酸配列において、例えば、１〜８３個、１〜８０個、１〜７５個、１〜７０個、１〜６５個、１〜６０個、１〜５５個、１〜５０個、１〜４９個、１〜４８個、１〜４７個、１〜４６個、１〜４５個、１〜４４個、１〜４３個、１〜４２個、１〜４１個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個（１〜数個）、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
【００２１】
また、このようなタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００２２】
ここで、「ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを加水分解する活性」とは、アグリコンであるステビオールに糖が結合した配糖体であるステビオール配糖体において、ステビオールの１３位のＯ−グルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを切断（加水分解）する活性を意味する。ある実施形態において、すべてのグルコシド結合（ラムノシド結合を除く）、グルコシルエステル結合が加水分解され、ステビオール配糖体からステビオールを生じる。別の実施形態では、第１のステビオール配糖体は１３位に分岐三糖、二糖またはグルコースが結合し、かつ１９位に分岐三糖、二糖またはグルコースが結合したものであり、当該第１のステビオール配糖体の１３位に結合した分岐三糖または二糖や、１９位に結合した分岐三糖の加水分解反応が抑制され、１３位のグルコシド結合や１９位の二糖内のグルコシド結合やグルコシルエステル結合が優先的に加水分解される。さらに、別の実施態様では、ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合よりも１９位のグルコシルエステル結合が優先して切断される。このように、一部の加水分解反応を抑制することで、一部の糖のみ切断されたステビオール配糖体を生じる。
ここで、グリコシド結合とは糖と糖または糖と別の有機化合物が脱水縮合して形成する共有結合のことを意味し、グリコシド結合のなかでもグルコースの1位の炭素との結合をグルコシド結合、ラムノースの1位の炭素との結合をラムノシド結合、キシロースの1位の炭素との結合をキシロシド結合という。
【００２３】
本発明のタンパク質は、ステビオール配糖体のステビオール（アグリコン）と糖との間の結合（１３位グルコシド結合、１９位グルコシルエステル結合）、および、側鎖内の分グリコシド結合を切断するが、その際に切断される結合からラムノシド結合は除かれる。
ある実施態様では、前記第１のステビオール配糖体が、１３位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシド結合し、および／または、１９位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシルエステル結合したものであり、かつ、本願発明は、下記（１）〜（５）から成る群より選択されるいずれか１つ以上の切断を行うことができる。
（１）分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合に対する優先的な切断；
（２）アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースに優先的な切断；
（３）１３位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）よりも、１９位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）に対する優先的な切断；
（４）１３位の二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）よりも、１９位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）および１９位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合に対する優先的な切断；
（５）１３位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、１９位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合に対する優先的な切断
【００２４】
ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）の少なくとも１つを加水分解する活性は、本発明のタンパク質と、たとえばステビオールモノシド、ステビオールモノグルコシルエステル、ルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥおよびレバウジオシドＦ、レバウジオシドＭなどの、ステビオール配糖体を反応させて、得られた反応生成物を精製し、精製したものを液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＬＣ）等の公知の手法により分析することで確認することができる。
【００２５】
「配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加された」とは、同一配列中の任意かつ１〜８３個のアミノ酸配列中の位置において、１〜８３個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
【００２６】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
【００２７】
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
【００２８】
本発明のタンパク質は、これをコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を適切な宿主細胞内で発現させることなどにより得ることができるが、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、ＡＡＰＰＴｅｃ  ＬＬＣ製、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．製、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．製、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００２９】
本発明において、「ステビオール配糖体」とは、アグリコンであるステビオールに糖が結合した配糖体である。ステビオールおよびステビオール配糖体の例は、下記一般式（Ｉ）で示される。
【化１】
2017204284.tif 000003
【００３０】
【表１】
2017204284.tif 000004
【００３１】
上記表において、ステビオール配糖体ＡおよびＣは、レバウジオシドＣと本発明のタンパク質とを反応させることにより得られる生成物であり、また、ステビオール配糖体ＢおよびＤはレバウジオシドＦと本発明のタンパク質とを反応させることにより得られる生成物である。ステビオール配糖体Ａ〜Ｄに該当する化合物には公称名が存在しないため、本願では仮の名称として「ステビオール配糖体Ａ〜Ｄ」と称する。
上記表において、「Ｇｌｃ」はグルコースを示し、「Ｇｌｃ−」は、モノグルコシド結合（Ｒ１位）またはモノグルコシルエステル結合（Ｒ２位）を含むことを示す。「Ｒｈａ」および「Ｘｙｌ」はそれぞれラムノースおよびキシロースを表す。Ｒ１位またはＲ２位に結合している糖鎖が分岐三糖の場合、アグリコンであるステビオールと結合している１つのグルコースに更に２つのグルコースが結合しており、一方の結合がβ１，２結合であり、もう一方はこれに分岐してβ１，３結合していることを表す。また、「側鎖」とはステビオールに結合した糖または糖鎖を意味する。
【００３２】
本発明に係るステビオール配糖体および／またはステビオールの製造方法によって、ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つが加水分解される。その例を図に示した（図１）。表２に反応液中に有機溶媒を含まないときの基質と生成物、表３に反応液中にアセトニトリルを添加した場合の基質と生成物をそれぞれまとめた。
【００３３】
【表２】
2017204284.tif 000005
【００３４】
【表３】
2017204284.tif 000006
【００３５】
本発明の酵素を使用した場合、反応液に有機溶媒を含まない場合は、ステビオール配糖体のすべてのグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、グルコシルエステル結合が加水分解されステビオールが生じる。
【００３６】
また、本発明の酵素活性は、たとえばアセトニトリルなどの溶媒を反応液中に加える等の方法で一部のグリコシド結合やグルコシルエステル結合の加水分解活性を抑制することができる。すなわち、アセトニトリルなどの有機溶媒を反応液中に加えることで、１３位に結合した分岐三糖または二糖の側鎖内のグリコシド結合や、１９位に結合した分岐三糖グリコシド結合の加水分解反応を抑制し、ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合や１９位の二糖内のグリコシド結合や、１９位のグルコシルエステル結合が優先的に切断される。これにより、例えば、レバウジオシドＤやレバウジオシドＡからレバウジオシドＢを、ステビオシドからステビオールビオシドを得ることができる。また、ステビオール配糖体の混合物から、例えばレバウジオシドＭやレバウジオシドＢ、ステビオールビオシド以外のステビオール配糖体をステビオールに加水分解することで、これらのステビオール配糖体の精製を容易にすることも可能である。
【００３７】
本願において、「ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合より１９位のグルコシルエステル結合が優先的に切断される」とは、ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合より１９位のグルコシルエステル結合を選択的に好んで加水分解することである。例えば、ルブソシドやステビオシドを基質とした場合は、ステビオールやステビオールモノグルコシルエステルよりもステビオールモノシドやステビオールビオシドが優先的に生成し、レバウジオシドＤやレバウジオシドＡを基質とした場合は、ステビオールよりもレバウジオシドＢが優先的に生成する。
【００３８】
本願において、「分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合を優先して切断する工程」では、基質が１３位または１９位に分岐三糖が結合している場合と、基質が二糖やグルコース単糖が結合している場合、基質の二糖内の結合やグルコース単糖とアグリコンとの結合が優先的に加水分解されることになる。例えば、ステビオール配糖体の混合物を基質とした場合は、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢの側鎖の分岐三糖は殆ど加水分解されず、１９位の側鎖内に二糖のグルコシド結合や１９位にグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体が有する１９位の側鎖内の二糖のグルコシド結合や１９位のグルコシルエステル結合が好んで加水分解されることになる。
【００３９】
また、「アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースを優先して切断する工程」では、例えば、ステビオール１３位にグルコースが結合し、そのグルコースにさらにキシロース（β１，２結合）とグルコース（β１，３結合）したステビオール配糖体を本発明の酵素と接触させた場合、グルコースとのβ１，３結合が優先的に加水分解される。この工程によりレバウジオシドＦを加水分解すると１９位のグルコシルエステルが優先的に加水分解され、次いで１３位の分岐三糖のグルコース（β１，３）結合が加水分解される。
【００４０】
「１３位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）よりも、１９位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）を優先して切断する工程」において、例えば、レバウジオシドＭを本発明の酵素と接触させると中間産物としてレバウジオシドＢが生じ、次いで最終分解物としてステビオールが生じる。
【００４１】
「１３位の二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）よりも、１９位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）および１９位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合を優先して切断する工程」において、例えば、アセトニトリルなどの有機溶媒を反応液中に加えることで加水分解反応を反応を抑制した条件下でレバウジオシドＭを加水分解することにより、１９位の分岐三糖が加水分解されてレバウジオシドＢが生じるという点で、１９位の分岐三糖は１３位の分岐三糖に比べ優先的に加水分解されることになる。別の例としてはステビオシドを加水分解した際に、１３位の二糖の加水分解と比べて優先的に１９位のグルコース単糖とのグルコシルエステル結合が切断され、ステビオールビオシドが生じることになる。
【００４２】
「１３位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、１９位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合を優先して切断する工程」では、例えば、ルブソシドを本発明の酵素で加水分解すると、優先的に１９位のグルコース単糖とのグルコシルエステル結合が切断され中間体としてステビオールモノシドが生じることになる。
【００４３】
本発明のステビオール配糖体および／またはステビオールの製造方法において、出発物質となる１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体は、ステビアやテンチャ（Rubus suauissimus）から適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルやその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、超高性能液体クロマトグラフィー  （Ｕｌｔｒａ  （Ｈｉｇｈ）  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＰＬＣ）  等の公知の方法によって抽出し、精製することによって入手することができる。あるいは、出発物質となる１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体は、市販のものでもよい。
【００４４】
本発明に係るステビオール配糖体および／またはステビオールの製造方法は、本発明のタンパク質と、１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体を反応させて、１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する工程を含む。本発明の方法は、さらに、前記工程で生成した本発明のステビオールおよび／または第２のステビオール配糖体を精製する工程を含んでいてもよい。
ステビオールおよび／または本発明のステビオール配糖体は、適切な溶媒（水等の水性溶媒、またはアルコール、エーテル、アセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルやその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ  （Ｈｉｇｈ）  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＰＬＣ）等の公知の方法によって精製することができる。
【００４５】
本発明に係るステビオール配糖体および／またはステビオールの製造方法は、基質を含む反応液に有機溶媒を添加した条件下で行うことができる。有機溶媒は、反応液全量に対し１％〜２０％の範囲とすることができ、好ましくは５％〜１５％、６〜１２％、より好ましくは８％である。有機溶媒は、一般的に入手可能なものでよく、好ましくは水と任意の割合で混合するものがよく、アセトニトリルを用いることが出来る。有機溶媒は、反応液に予め添加してもよく、また反応の途中段階で添加してもよい。
【００４６】
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
【００４７】
配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４８】
「配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質」としては、前述のものが挙げられる。
【００４９】
「配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質」としては、前述のものが挙げられる。
【００５０】
本明細書中、「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、”Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Vol. 4,Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2012”、”Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons 1987-1997”などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書中、「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６２℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５１】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５〜６０℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。あるいは、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列、または配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列の全部または一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００５２】
上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＢＬＡＳＴの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１の塩基配列のＤＮＡ、または配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと６０％以上、６１％以上、６２％以上、６３％以上、６４％以上、６５％以上、６６％以上、６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００５３】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268,1990;Proc Natl Acad Sci USA 90:5873,1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００５４】
上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法または公知の合成手法によって取得することが可能である。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチドは、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの５’末端に含まれる。分泌シグナルペプチドおよびそれをコードする塩基配列からポリヌクレオチドは、前記と同様である。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。
【００５７】
適切な発現ベクターは、通常、
（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
【００５８】
発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージまたはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００５９】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００６０】
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーターおよび／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターの例としては、ｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ（ＭＭＴＶ）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネインプロモーター及びヒートショックプロテインプロモーター等が挙げられる。
【００６１】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ｕｒａ５、ｎｉａＤ）、薬剤耐性マーカー（ハイグロマイシン、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Marin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA,vol. 81,p.337,1984）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，  ＰＤＲ４）（それぞれ、猪腰淳嗣ら，生化学，vol.64, p.660, 1992; Hussain et al.,Gene,vol.101,p.149,1991）などが利用可能である。
【００６２】
本発明の形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。形質転換の対象となる細胞または生物としては、従来公知の各種細胞または生物を好適に用いることができる。形質転換の対象となる細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、糸状菌（麹菌Aspergillus oryzae、Aspergillus sojae）、植物細胞、ヒトを除く動物細胞等が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も、特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物または植物またはヒトを除く動物が挙げられる。形質転換体は、好ましくは、酵母または植物である。
形質転換で用いられる宿主は、１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体を生成するものであれば好ましい。ステビアやテンチャのように、元来少なくとも１つの１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合および／または側鎖内のグリコシド結合を有するステビオール配糖体を生成する植物だけではなく、本来１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合および／または側鎖内のグリコシド結合を有するステビオール配糖体を生成しない細胞または生物に少なくとも１つの１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合および／または側鎖内のグリコシド結合を有するステビオール配糖体の生成に必要な遺伝子を導入したものを宿主として用いることができる。「１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体の生成に必要な遺伝子」は、例えば、WO2011/093509などに記載のステビオールやステビオール配糖体合成活性を有する遺伝子が挙げられる。
【００６３】
宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Mackenxie,D.A.et al., Appl. Environ. Microbiol., vol.66, p.4655-4661, 2000）、パーティクルデリバリー法（特開2005-287403「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.75,p.1929,1978）、酢酸リチウム法（J.Bacteriology,vol.153,p.163,1983）、Methods in yeast genetics,2000 Edition:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。また、植物、もしくは植物に由来する組織や細胞への遺伝子導入の際には、例えばアグロバクテリウム法（Plant Molecular Biology Mannual, Gelvin, S.B.et al., Academic Press Publishers）、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポーレーション法などを適宜選択して用いることができる。
【００６４】
形質転換体が、酵母または麹菌である場合、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された酵母または麹菌は、野生型と比べて本発明のタンパク質を多く発現する。このため、発現した本発明のタンパク質が、酵母または麹菌で生成された１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有する第１のステビオール配糖体と反応し、当該第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つが切断され、ステビオールおよび／または第２のステビオール配糖体が酵母または麹菌の細胞内または培養液中、好ましくは、培養液中に生成される。
【００６５】
形質転換体が、植物である場合、本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。本発明のポリヌクレオチドが植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物（以下、「本発明の植物」）は、その野生型と比べて本発明のタンパク質を多く含む。このため、このため、本発明のタンパク質が、本発明の植物で生成された１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体と反応し、ステビオールが植物中に生成する。また、植物体のなかの環境が加水分解反応に最適でない場合は、１３位に結合した分岐三糖または二糖や、１９位に結合した分岐三糖の加水分解反応は抑制され、１３位のモノグルコシド結合や１９位に結合した二糖内のグリコシド結合や１９位のグルコシルエステル結合が切断されたステビオール配糖体が生成する。
【００６６】
ある実施態様において、本発明の形質転換体またはその培養液は、その野生型と比べて本発明のステビオール配糖体の含有量が高く、その抽出物または培養液には、本発明のステビオール配糖体が高濃度で含まれる。本発明の形質転換体の抽出物は、形質転換体をガラスビーズ、ホモジェナイザーまたはソニケーター等を用いて破砕し、当該破砕物を遠心処理し、その上清を回収することにより、得ることができる。本発明のステビオール配糖体が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により形質転換体と培養上清とを分離することにより、本発明のステビオール配糖体を含む培養上清を得ることができる。
【００６７】
このようにして得られた抽出液もしくは培養上清は、さらに精製工程に供してもよい。本発明のステビオール配糖体の精製は、通常の分離および精製方法に従って行うことができる。具体的な方法は、前記と同様である。
【００６８】
非ヒト形質転換細胞に由来する酵素を用いた本発明のステビオール配糖体および／またはステビオールの製造方法
本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させ、細胞を破砕することにより本発明のタンパク質を得ることができる。本発明のタンパク質を作用させることで、本発明のステビオール配糖体および／またはステビオールを生成することもできる。
具体的には、本発明の形質転換細胞に由来する酵素を、１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体と接触させることによりステビオールを生成することができる。また、反応液中にアセトニトリルのような有機溶媒を添加することで、１３位に結合した分岐三糖または二糖や、１９位に結合した分岐三糖の加水分解反応は抑制され、優先して１３位のモノグルコシド結合や１９位のに結合した二糖内のグリコシド結合や１９位のグルコシルエステル結合やが切断されたステビオール配糖体が生成する。本発明のタンパク質は、酵母で発現させた場合にも麹菌で発現させた場合と同等の活性を示すことが実施例においても確認されている。
「形質転換細胞に由来する酵素」は、形質転換細胞を用いて調製され、本発明のタンパク質を含むものであれば限定されないが、例えば、形質転換細胞自体、形質転換細胞の粉砕物自体、形質転換細胞の培養上清自体、およびこれらの精製物である。そこで、本発明は、宿主細胞に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素を、１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有する第１のステビオール配糖体と接触させて、当該第１ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する工程を含むステビオールおよび／または第２のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第１及び第２のステビオール配糖体は互いに異なる、方法を提供する。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシドの結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００６９】
上記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドであり、前記と同様である。
【００７０】
「接触」とは、本発明の形質転換細胞に由来する酵素と１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体とを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、本発明の形質転換細胞に由来する酵素を含む容器に１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体を添加すること、本発明の形質転換細胞に由来する酵素と１３位のグリコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体とを混合すること、本発明の形質転換細胞に由来する酵素を１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体を含む容器に添加することが含まれる。
【００７１】
「ステビオール配糖体」、「１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体」、及び「ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する活性」は、前記と同様である。
【００７２】
その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、”Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Vol.4, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012”、”Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor,NY）”等を参照することができる。
【００７３】
このようにして得られた本発明のステビオール配糖体は、常法に従って、例えば、飲食品、甘味料、香料、医薬品、工業原料（化粧料、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。
【００７４】
本発明において、「飲食品」には固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、経口摂食可能なものの総称である。本発明の飲食品の例としては、栄養補助飲食品、健康飲食品、機能性飲食品、幼児用飲食品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人用飲食品等が挙げられる。
【００７５】
栄養補助飲食品とは、特定の栄養成分が強化されている飲食品をいう。健康飲食品とは、健康的な又は健康によいとされる飲食品をいい、栄養補助飲食品、自然飲食品、ダイエット飲食品等を含む。機能性飲食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための飲食品をいい、特定保健用途食品と同義である。幼児用飲食品とは、約6歳までの子供に与えるための飲食品をいう。老人用飲食品とは、無処理の飲食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された飲食品をいう。乳児用調製乳とは、約1歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約6ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
【００７６】
本願において、「少なくとも」との文言は、特定の項目の数が、挙げられた数以上であってよいことを意味する。また、本願内において、「約」との文言は、主体が「約」に続く数値の±２５％、±１０％、±５％、±３％、±２％または±１％の範囲に存在することを意味する。例えば「約１０」は、７．５〜１２．５の範囲を意味する。
【００７７】
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。【００７９】
麹菌のβ‐グルコシダーゼ遺伝子の探索
麹菌ゲノムデータ（PRJNA28175）より、β−グルコシダーゼホモログを探索し、菌体内β‐グルコシダーゼのホモログであるAO090701000244（ＣＤＳ配列：配列番号１、推定アミノ酸配列：配列番号２、ＯＲＦ配列：配列番号３、ゲノムＤＮＡ配列：配列番号４）を見出した。これをＡＯＢＧＬ１１としてクローン化することにした。【００８０】
ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡのクローニング
ＡＯＢＧＬ１１をクローニングするために、以下のプライマーを設計した。
ＡＯＢＧＬ１１−Ｆ：
５´‐ＡＴＧＣＣＴＣＧＴＣＴＡＧＡＣＧＴＣＧＡＧＡＡ‐３´（配列番号７）
ＡＯＢＧＬ１１−Ｒ：
５´‐ＴＣＡＣＡＧＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＡＧＣＧＡ‐３´（配列番号８）【００８１】
麹菌  Aspergillus oryzae var.Brunneus（ＩＦＯ３０１０２）の分生子を液体培地（１Ｌあたり、グルコース  ２０ｇ、バクトトリプトン  １ｇ、酵母エキス  ５ｇ、ＮａＮＯ３  １ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ）１０ｍｌに植菌し、３０℃で１日間培養した。ろ過により菌体を集め、液体窒素中ですりつぶしたあと、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ゲノムＤＮＡを調製した。
ゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＡＯＢＧＬ１１−ＦとＡＯＢＧＬ１１−Ｒを用いて、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡）でＰＣＲを行った。得られた約２．５７ｋｂｐのＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン）を使ってクローン化し、プラスミドｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ１１ｇを得た。【００８２】
麹菌発現用ベクターの構築
麹菌用ベクターｐＵＮＡ（酒類総合研究所）を制限酵素ＳｍａＩで消化して得られたＤＮＡ断片と、プラスミドｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ１１ｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し末端をＢｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）によって平滑化して得られた約２．５７ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＵＮＡ−ＡＯＢＧＬ１１ｇを得た。【００８３】
麹菌の形質転換
麹菌の形質転換は以下のとおり実施した。
宿主として、Aspergillus oryzae ｎｉａＤ３００株（酒類総合研究所）を使用した。宿主株をＰＤＡプレートに植菌し、３０℃でおよそ１週間培養した。分生子懸濁液を得るために、０．１％  ｔｗｅｅｎ８０，  ０．８％  ＮａＣｌを加え、分生子を懸濁した。ミラクロスでろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、０．１％  ｔｗｅｅｎ８０，  ０．８％  ＮａＣｌで洗浄し、滅菌水に懸濁した。
分生子をＣＤプレート（１Ｌあたり、ＮａＮＯ３  ６ｇ、ＫＣｌ  ０．５２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １．５２ｇ、グルコース  １０ｇ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  ２ｍｌ、Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１Ｌあたり、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ８．８ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．４ｇ、ＮａＢ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ  ０．０５ｇ  ）  １ｍｌ、アガー  ２０ｇ（ｐＨ６．５））に塗布し、パーティクルデリバリー法により、ＤＮＡの導入を行った。ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（バイオラッド）を使って、パーティクル：タングステンＭ−１０、ラプチャーディスク：１１００ｐｓｉ、距離：３ｃｍとした。形質転換株として、ＣＤプレートで生育するものを選抜した。プラスミドｐＵＮＡ−ＡＯＢＧＬ１１ｇにより形質転換して得られた形質転換株をＢＧＬ１１−１株、コントロールベクターｐＵＮＡにより形質転換して得られた形質転換株をＣ−１株とした。【００８４】
麹菌によるＡＯＢＧＬ１１ｐの生産
ＢＧＬ１１−１株またはＣ−１株をＣＤプレートに植菌し、３０℃で７日間培養し、分生子を形成させた。分生子懸濁液を得るために、０．１％  ｔｗｅｅｎ８０，  ０．８％  ＮａＣｌを加え、分生子を懸濁した。ミラクロスでろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、０．１％  ｔｗｅｅｎ８０，  ０．８％  ＮａＣｌで洗浄し、滅菌水に懸濁し、分生子懸濁液としたこの分生子懸濁液を酵素生産用液体培地（１Ｌあたり、マルトース  １００ｇ、バクトトリプトン  １ｇ、酵母エキス  ５ｇ、ＮａＮＯ３  １ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ）  に植菌し、３０℃で２日間振とう培養を行った。ミラクロスによりろ過して菌体を集めた。得られた湿菌体  約４ｇを液体窒素で凍結し、乳鉢ですりつぶした。すりつぶした菌体を５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、よく混合した後、遠心分離した。得られた上清を、アミコンウルトラ−１５  ５０ｋ（メルク）で、限外ろ過により濃縮し、０．１％  ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０（バッファーＡ）で置換することにより、約１ｍｌの粗酵素液を得た。【００８５】
タンパク質濃度の測定
粗酵素液のタンパク質濃度は、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（５倍濃縮）（ナカライテスク）を用いて定量した。その結果、ＢＧＬ１１−１粗酵素液  ６．４６ｍｇ／ｍｌ、Ｃ−１粗酵素液４ｍｇ／ｍｌであった。【００８６】
ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ分解活性
ｐＮＰ−β−Ｇｌｃの分解活性を検討した。粗酵素液１０μＬ、０．２Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）５０μＬ、２０ｍＭ  ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ水溶液  ５０μＬ、水を加えてトータル２００μＬとし、３７℃で反応させた。なお、ＢＧＬ１１−１粗酵素液は活性が高かったため、粗酵素液を０．１％  ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）バッファーで１００倍に希釈したものを用いた。ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ  が加水分解して遊離したｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）に基づく１分間あたりの４０５ｎｍの吸光度変化（Δ４０５）は、ＢＧＬ１１−１粗酵素液で０．２４４、Ｃ−１粗酵素液で０．０００であった。
以上のことからも、ＡＯＢＧＬ１１ｐがβ−グルコシダーゼ活性を担っていることが示唆された。【００８７】
ｐＮＰ−β−Ｇｌｃを基質として、ＡＯＢＧＬ１１ｐの至適温度、至適ｐＨおよび熱安定性、ｐＨ安定性を調べた（図２）。
なお、ＢＧＬ１１−１粗酵素液はバッファーＡで５０００倍希釈したもの（タンパク質濃度  １．３μｇ／ｍｌ）を使用した。【００８８】
至適温度：反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）  ２０μｌ、０．２Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）  １００μｌ、２０ｍＭ  ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ、水を加えてトータル４００μｌとし、反応開始から１５分、３０分、４５分に１００μｌをサンプリングして１００μｌ  ０．２Ｍ  炭酸ナトリウム溶液と混合してから、４０５ｎｍの吸光度を測定し、Δ４０５を求めた。Δ４０５が最大となった４５℃を１として、各温度で反応させたときのΔ４０５の比率を図２Ｂに示した。これにより、４５−５０℃が反応至適温度であることが分かった。【００８９】
至適ｐＨ：反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）  ２０μｌ、０．２Ｍ  バッファー  １００μｌ、２０ｍＭ  ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ、水を加えてトータル４００μｌとした。バッファーは、ｐＨ４．０−６．０のとき酢酸ナトリウムバッファーを、ｐＨ６．０−８．０のときリン酸ナトリウムバッファーを用いた。上記と同様にサンプリング、測定を行い、Δ４０５の最大値に対する各ｐＨで反応させたときのΔ４０５の比率を図２Ａに示した。これにより、ｐＨ６．０−７．０が反応至適ｐＨであることが分かった。【００９０】
熱安定性：５０００倍希釈した粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）を３０℃、３７℃、４５℃、５０℃でそれぞれ１０分間保持したあと氷冷した。反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）  ５μｌ、０．２Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）  １００μｌ、２０ｍＭ  ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ、水を加えてトータル１００μｌとし、３７℃で４５分間反応させたあと、０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液  １００μｌを添加し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。熱処理しなかった酵素液による４５分後の４０５ｎｍの吸光度に対する各温度で処理したときの比率を求め、図２Ｄに示した。ＡＯＢＧＬ１１ｐは、１０分間の処理では３７℃まで安定であるが、４５℃での処理で約半分にまで失活し、５０℃の処理では、活性がほぼ失われることが分かった。【００９１】
ｐＨ安定性：粗酵素液を、ｐＨ４．５、５．０、５．５、６．０（０．２Ｍ酢酸バッファー）、ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０（０．２Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー）の各バッファーで５０００倍希釈し、３７℃で１時間保持したあと氷冷した。反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）  ５μｌ、０．２Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）  １００μｌ、２０ｍＭ  ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ、水を加えてトータル１００μｌとし、３７℃で４５分間反応させたあと、０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液  １００μｌを添加し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。活性のもっとも高かったｐＨ６．５で保持したときの吸光度に対する各ｐＨで保持したときの吸光度の比率を求め、図２Ｃに示した。ＡＯＢＧＬ１１ｐは、ｐＨ６．５付近で最も安定であることがわかった。【００９２】
ステビオール配糖体加水分解活性
基質として、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＡ、ステビオシド、ルブソシドを用いた。
ステビオール配糖体はＨＰＬＣまたはＬＣ−ＭＳで分析した。
ＨＰＬＣの分析条件は以下のとおりである。
カラム：コスモシール５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ  ４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５０ｍｍ（ナカライテスク）
移動相：Ａ；アセトニトリル、Ｂ；  １０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ２．６）
Ｂ  ｃｏｎｃ．７０％→３０％  ４０分  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ
流速：１ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：ＵＶ  ２１０ｎｍ【００９３】
ＬＣ−ＭＳ（ＩＴ−ＴＯＦ）の分析条件は以下のとおりである。
カラム：ｍｔａｋｔ  ＳＭ−Ｃ１８    ４．６  ｘ  ２５０  ｍｍ
移動相：Ａ；０．５％  酢酸、Ｂ；  メタノール
Ｂ  ｃｏｎｃ．  １０％（０分−５分）→７０％（２０分）→１００％（２５分−３０分）→１０％（３１分―４０分）
流速：０．４ｍｌ／分【００９４】
反応条件（１）〜反応液に有機溶媒を含まない〜
基質  ５０μｇ／ｍｌ、ＢＧＬ１１粗酵素液（タンパク質濃度６．５ｍｇ／ｍｌ）  ２０μｌ、  ５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、全量を１００μｌとし、３７℃で２４時間反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したＳｅｐ−ＰａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ）に供し、続いて２０％アセトニトリルで洗浄したあと、５０％アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、１００μＬの水で再溶解し、ＨＰＬＣに供した。基質がｒｅｂＭの場合はＬＣ−ＭＳにも供した。
ｒｅｂＭを基質とした場合には、主な生成物としてステビオールが検出され、中間体としてｒｅｂＤ、ｓｔｖ、ｒｅｂＢが検出された（図３  Ａ）。ｒｅｂＤ（図４  Ａ）、ｒｅｂＡ（図５  Ａ）、ｓｔｖ、ｒｕｂを基質とした場合にも主な生成物はステビオールであった。
なお、コントロールとしてＣ−１粗酵素液でも同様の反応を行ったがいずれの基質も加水分解されず、生成物は検出できなかったことから、上記ステビオール配糖体加水分解活性はＡＯＢＧＬ１１ｐによるものであると考えられた。【００９５】
反応条件（２）〜反応液にアセトニトリルを含む〜  
基質  ５０μｇ／ｍｌ、酵素液  ２０μｌ、  ５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、０％または８％アセトニトリル、全量を１００μｌとし、３７℃で２４時間反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したＳｅｐ−ＰａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ）に供し、続いて２０％アセトニトリルで洗浄したあと、５０％アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、１００μＬの水で再溶解し、ＨＰＬＣに供した。
ｒｅｂＭは、反応液中に８％アセトニトリルを添加した場合、ほとんど分解されなかった（図３  Ｃ）。
ｒｅｂＤとｒｅｂＡは、８％アセトニトリルを添加した場合でも、加水分解されｒｅｂＢを生じたが、ステビオールは検出されなかった（図４Ｂ、図５Ｂ）。
ｓｔｖは８％アセトニトリルを添加した場合でも、加水分解されｓｔｅＢを生じ、２４時間の反応で基質は検出できなかった。ｓｔｅＢは、さらにステビオールにまで加水分解されていたが、その量はわずかであった。
Ｒｕｂは２４時間の反応で加水分解され、ステビオールを生じた。２４時間反応で基質は検出できなかった。【００９６】
反応条件（３）
基質  ５０μｇ／ｍｌ、ＢＧＬ１１粗酵素液（タンパク質濃度６．５ｍｇ／ｍｌ）  ２０μｌ、  ５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、全量を１００μｌとし、５０℃で２４時間反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したＳｅｐ−ＰａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ）に供し、続いて２０％アセトニトリルで洗浄したあと、５０％アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、１００μＬの水で再溶解し、ＨＰＬＣに供した。
ｒｅｂＭは加水分解されなかった。
ｒｅｂＤとｒｅｂＡは一部加水分解され、ｒｅｂＢを生じたが、さらに加水分解された生成物は検出されなかった。
Ｓｔｖは一部加水分解され、ｓｔｅＢが生成したが、さらに加水分解された生成物は検出できなかった。
Ｒｕｂは一部加水分解され、ｓｔｅＭとステビオールが生成した。【００９７】
以上の結果より、ＡＯＢＧＬ１１ｐによる加水分解反応は以下のとおりであると考えられた。
（１）ステビオール配糖体をステビオールに加水分解する。中間生成物の存在から、糖を１つずつ加水分解すると考えられる。
（２）ステビオール１９位に付加された糖をステビオール１３位に付加された糖よりも優先して加水分解する。
（３）分岐三糖は反応条件によっては加水分解されない。【００９８】
ステビア抽出物の加水分解
レバウディオ  ＪＭ（守田化学工業株式会社、図６Ａ）とステビロンＳ−１００（守田化学工業株式会社、図６Ｂ）をＡＯＢＧＬ１１ｐで加水分解した。
反応条件は、レバウディオ  ＪＭ  １ｍｇ／ｍｌ（図８）または１０ｍｇ／ｍｌ（図７）、またはとステビロンＳ−１００  １ｍｇ／ｍｌ（図９）、酵素液  ２０μｌ、  ５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、０％、４％または８％アセトニトリル、全量を１００μｌとし、３７℃で２４時間反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したＳｅｐ−ＰａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ）に供し、続いて２０％アセトニトリルで洗浄したあと、５０％アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、１００μＬの水で再溶解し、ＨＰＬＣに供した。【００９９】
ＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡのクローニング
ＢＧＬ１１−１株を酵素生産用培地１０ｍｌで培養し、ろ過により菌体を集めた。菌体を液体窒素で凍結し、乳鉢で菌体をすりつぶしてから、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ）でトータルＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ）により、ｃＤＮＡを合成した。これを鋳型として、プライマーＡＯＢＧＬ１１−ＦとＡＯＢＧＬ１１−Ｒを用いて、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡）でＰＣＲを行った。得られた約２．５２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン）を使ってＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡをクローン化し、プラスミドｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ１１ｃＤＮＡを得た。塩基配列を確認したところ、ＣＤＳ配列は配列番号１の通りであった。ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡ配列とＣＤＳ配列を比較したものを図１０に示す。【０１００】
酵母用発現ベクターの構築と酵母の形質転換
プラスミドｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ１１  ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して得られた約２．５２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、酵母発現ベクターｐＹＥ２２ｍ（Biosci.Biotech.Biochem.,59,1221-1228,1995）のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ＡＯＢＧＬ１１がベクターｐＹＥ２２ｍのＧＡＰＤＨプロモーターから発現する向きに挿入されたものを選抜し、ｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ３ｃとした。形質転換の親株として、S.cerevisiaeのＥＨ１３−１５株（ｔｒｐ１，ＭＡＴα）（Appl.Microbiol.Biotechnol.,30,515-520,1989）を用いた。
プラスミドｐＹＥ２２ｍ（コントロール）、ｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ１１（ＡＯＢＧＬ１１発現用）をそれぞれ用いて酢酸リチウム法により、ＥＨ１３−１５株を形質転換した。形質転換株は、ＳＣ−Ｔｒｐ（１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、およびアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇを含む）寒天培地（２％アガー）上で生育するものを選抜した。【０１０１】
プラスミドｐＹＥ２２ｍで形質転換して得られた株をＣ−Ｙ株、プラスミドｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ１１で形質転換して得られた株をＡＯＢＧＬ１１−Ｙ株とした。
選抜したＣ−Ｙ株とＡＯＢＧＬ１１−Ｙ株を、１Ｍリン酸カリウムバッファーを１／１０量添加したＳＣ−Ｔｒｐ液体培地１０ｍＬに１白金耳植菌し、３０℃、１２５ｒｐｍで２日間振とう培養した。得られた培養物を遠心分離により、培養上清と菌体に分けた。培養上清は、アミコンウルトラ−１５  ５０ｋ（メルク）で限界ろ過に濃縮して０．１％  ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）でバッファー置換し、約１ｍｌの培養上清濃縮液を得た。
菌体は、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．１％ＣＨＡＰＳ溶液  １ｍｌに懸濁して、ガラスビーズにて菌体を破砕し、遠心分離して得られた上清を菌体破砕液とした。
培養上清濃縮液または菌体破砕液を２０μｌとり、２％  Ｘ‐β‐Ｇｌｃ／ＤＭＦ溶液を１μｌ添加し、室温で５分間反応させたところ、ＡＯＢＧＬ１１−Ｙ株由来の菌体破砕液のみ青色を呈し、Ｘ−β−Ｇｌｃ活性を有することが示唆された。【０１０２】
ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ活性測定
ｐＮＰ−β−Ｇｌｃの分解活性を検討した。粗酵素液１０μＬ、０．２Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）５０μＬ、２０ｍＭ  ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ水溶液  ５０μＬ、水を加えてトータル２００μＬとし、３７℃で反応させた。なお、ＢＧＬ１１−１粗酵素液は活性が高かったため、粗酵素液を０．１％  ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）バッファーで１００倍に希釈したものを用いた。ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ  が加水分解して遊離したｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）に基づく１分間あたりの４０５ｎｍの吸光度変化（Δ４０５）は、ＡＯＢＧＬ１１−Ｙ粗酵素液で０．０６８、Ｃ−Ｙ粗酵素液で０．０００であった。【０１０３】
ステビオール配糖体の加水分解活性
Ｃ−Ｙ株とＡＯＢＧＬ１１−Ｙ株の菌体破砕液のステビオール配糖体の加水分解活性を検討した。
基質  ５０μｇ／ｍｌ、酵素液  ２０μｌ、  ５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）、全量を１００μｌとし、５０℃で反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄後、水で平衡化したＳｅｐ−ＰａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ）に供し、続いて２０％アセトニトリルで洗浄したあと、５０％アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、１００μＬの水で再溶解し、ＨＰＬＣに供した。【０１０４】
Ｃ−Ｙ株由来の菌体破砕液で反応した場合、いずれのステビオール配糖体でも生成物を検出することはできなかった。
一方、ＡＯＢＧＬ１１−Ｙ株由来の菌体破砕液で反応した場合、以下の表に示す基質と生成物が得られた。
【表４】
2017204284.tif 000007
一方、反応液中に８％アセトニトリルを添加すると以下の表に示す基質と生成物が得られた。。
【表５】
2017204284.tif 000008
このように、ＡＯＢＧＬ１１は、酵母で発現させた場合にも麹菌で発現させた場合と同等の活性を示すことがわかった。【０１０５】
レバウジオシドＣ（ラムノースを含むステビオール配糖体）の加水分解
レバウジオシドＣ（ｒｅｂＣ）  ５０μｇ/ｍｌ、ＢＧＬ１１粗酵素液  ２０μｌ、  ５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.５）、全量を１００μｌとし、３７℃で２４時間反応させた。粗酵素液は、タンパク質濃度６.５ｍｇ/ｍｌのもの（原液、Ｃ）、１/１０００希釈したもの（Ｂ）、限外ろ過により約２０倍濃縮したもの（Ｃ）をそれぞれ用いた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したＳｅｐ-ＰａｋＣ１８(Ｗａｔｅｒｓ)に供し、続いて２０％アセトニトリルで洗浄したあと、５０％アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、１００μＬの水で再溶解し、ＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳに供した。結果を図１２に示す。【０１０６】
レバウジオシドＣを基質とした場合、加水分解産物として、ＲＴ１６．２分、ＲＴ１７．５分の２つのピークが認められた。酵素量と生成物の関係から、まずＲＴ１６．２分の産物が生成し、それがさらに加水分解されてＲＴ１７．５分の産物が生成すると考えられた。ＬＣ−ＭＳ分析の結果を合わせると、ＲＴ１６．２分のピークは、ｍ/ｚ ７８７.４、ステビオール配糖体（２Ｇｌｃ  ＋  Ｒｈａ）ではあるが、ズルコシドＡとはＲＴが一致しなかった。ＢＧＬ１１が１９位に付加された糖を優先的に加水分解するという性質からも、ステビオール配糖体Ｃ（１３位：Ｒｈａα１，２(Ｇｌｕβ１，３)Ｇｌｃβ１-、１９位：Ｈ）であると推察された。一方、ＲＴ１７．５分のピークはｍ/ｚ   ６２５.３、ステビオール配糖体（Ｇｌｃ  ＋  Ｒｈａ）であり、ステビオール配糖体Ｃの加水分解物だと考えられるので、ステビオール配糖体Ａ（１３位：Ｒｈａα１，２Ｇｌｃβ１-、１９位：Ｈ）とであると推察された。ステビオールにグルコース１個が付加されたｓｔｅＭやｓｔｅＥ、アグリコンであるステビオールを検出できなかったことから、ＢＧＬ１１は、ラムノシド結合を加水分解できないことが示唆された。【０１０７】
レバウジオシドＦ（キシロースを含むステビオール配糖体）の加水分解
レバウジオシドＦ（ｒｅｂＦ）５０μｇ/ｍｌ、ＢＧＬ１１粗酵素液(タンパク質濃度６．５ｍｇ/ｍｌ)  ２０μｌ、  ５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.５）、全量を１００μｌとし、３７℃で１時間（図１３Ｂ）または２４時間（図１３Ｃ）反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したＳｅｐ-ＰａｋＣ１８(Ｗａｔｅｒｓ)に供し、続いて２０％アセトニトリルで洗浄したあと、５０％アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、１００μＬの水で再溶解し、ＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳに供した。結果を図１３および以下の表に示す。
【表６】
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【０１０８】
基質のみを分析した結果、ｒｅｂＦに加えてｒｅｂＣが混合していることがわかった。反応１時間では、主な加水分解産物として、１６．２分、１６．７分のピーク（図１３Ｂ）が認められた。２４時間の反応では、さらに加水分解反応が進んで、上記ピークに加え、１７．５分、１８．５分（図１３Ｃ）のピークの生成、アグリコンであるステビオールの生成も認められた。ＬＣ−ＭＳの結果、ｒｅｂＣの加水分解の結果と合わせると、ＲＴ１６．２分、ＲＴ１７．５分のピークはそれぞれ、ステビオール配糖体Ｃ（１３位：Ｒｈａα１，２(Ｇｌｕβ１，３)Ｇｌｃβ１-、１９位：Ｈ）、ステビオール配糖体Ａ（１３位：Ｒｈａα１，２Ｇｌｃβ１-、１９位：Ｈ）であると推察された。また、１６．７分のピークは、ｍ/ｚ  ７７３．４、ステビオール配糖体（２Ｇｌｃ  ＋  Ｘｌｙ）であった。ＢＧＬ１１が１９位に付加された糖を優先的に加水分解することから、これは、ステビオール配糖体Ｄ（１３位：Ｘｙｌβ１，２(Ｇｌｕβ１，３)Ｇｌｃβ１-、１９位：Ｈ）であると推察された。一方、１８．５分のピークは、ｍ/ｚ  ６１１．３（Ｇｌｃ  ＋  Ｘｌｙ）であり、ステビオール配糖体Ｄの加水分解産物であると考えられたので、ステビオール配糖体Ｂ（１３位：Ｘｙｌβ１，２Ｇｌｃβ１-、１９位：Ｈ）であると推察された。上述したとおり、ステビオールの生成も認められた。本加水分解実験により、ＢＧＬ１１は、ｒｅｂＣをアグリコンであるステビオールに加水分解できなかったことから、ＢＧＬ１１は、ｒｅｂＦをアグリコンであるステビオールにまで加水分解したと考えられた。すなわち、ＢＧＬ１１はキシロシド結合を加水分解できることが示唆された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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