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　平成　５年特許願第５１０８４２号「アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノの２量体の製造方法」拒絶査定不服審判事件〔平成　５年　６月２４日国際公開、ＷＯ９３／１２１４３、平成　７年　３月３０日国内公表、特表平　７−５０２８９２〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．手続の経緯
　本願は、１９９２年１２月１１日（パリ条約による優先権主張外国庁受理１９９１年１２月１３日、スウェーデン）を国際出願日とする出願であって、その請求項１〜８に係る発明は、平成１５年１月２２日付け手続補正書によって補正された明細書の記載からみて、その特許請求の範囲の請求項１〜８に記載されたとおりのものと認められるところ、そのうちの請求項１に係る発明（以下、「本願発明１」という。）は次のとおりである。
　
「【請求項１】
　（ａ）組換え技術により大腸菌からアポリポ蛋白質Ａ１−ミラノを製造し、該アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノを分裂し、その後存在する単量体を２量体に変換させるか、または
　（ｂ）アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノ、単量体および２量体を大腸菌中の発現系統においてバクテリア培養媒体に分泌させる組換え技術によりアポリポ蛋白質Ａ１−ミラノを製造し、その後存在する単量体を２量体にさせるか、または
　（ｃ）アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノキャリヤから血漿を集め、単量体を純化し、その後その単量体を２量体に変換させ、
　そして２量体をほぼ純粋な形状に純化することにより製造することを特徴とするアポリポ蛋白質Ａ１−ミラノの２量体の製造方法。」
　　
２．引用例の記載
（ａ）原査定の拒絶理由に引用された、本願優先日前に頒布された特表平２−５００７９７号公報（以下、「引用例ａ」という。）には、以下の事項が記載されている。
（ａ１）「
アテローム性動脈硬化症及びその合併症
血漿コレステロール(CHL) レベルの上昇
　
（ａ２）「
HDL は特に末梢組織からCHL を除去しCHL 逆輸送(RCT) と指称されるメカニズムによって肝臓に逆輸送する機能
HDLの主なアポリポタンパク質はapoAＩ
高濃度HDL は
既存病巣の退行を促進
遊離CHL の流出を促進する
apoAＩがアテローム性動脈硬化の病巣形成に対する防御効果をもつ
　
（ａ３）「最初に発表された
ヒトapoAIの分子変異体はMilano（apoAI-MI）変異体
　
（ａ４）「実際、
罹患被験者は早期アテローム性動脈硬化の進行から明らかに保護されていた
ApoAＩ-MＩ中のアミノ酸置換は
脂質と会合する分子の脂質結合性を有意に変化
変異形の内部にシステイン残基が存在するので、apoAIIとの複合体及びapoAＩ二量体の形成が可能である。これらのタンパク質複合体が「罹患」被験者で観察された異常HDL 粒子の形成の主因であると推定される。ApoAＩ-MＩのこれらの特徴すべてがその異化作用促進及び組織脂質の有効吸収能に寄与すると考えられる
（ａ５）「
apoAＩまたはその遺伝変異体を含むタンパク質は治療効果をもつのでヒトまたは動物の体内治療に使用され得る。より詳細には、血漿コレステロール及び／またはトリグリセリドのレベルを低下させるために使用され得る。従って、このタンパク質は、アテローム性動脈硬化症及び冠性心疾患のごとき心血管疾患に対して使用され得る
　
（ａ６）「出願人等は、
apoAIまたはその遺伝変異体を含むタンパク質を産生するために組換えDNA技術の使用が有効
apoAI-MI
　
（ａ７）「好ましい実施態様によれば本発明は、(A)・・・
apoAI-MI
大腸菌（Escherichia coli, E.coli株）中での前記遺伝子の発現
　
（ａ８）「実施例３　ヒトapoAＩを前駆体即ち267 個のアミノ酸から成る pre-proapoAＩとして合成する。
18個のアミノ酸から成るプレペプチドを分泌中に開裂し
　
（ｂ）原査定の拒絶理由に引用された、本願優先日前に頒布された国際公開第９０／１２８７９号パンフレット（以下、「引用例ｂ」という。）には、以下の事項が記載されている。
（ｂ１）「Ａｐｏ ＡＩ−Ｍのもう１つの非常に特別な特徴は、両方の場合において、Ｃｙｓ残基の存在のため、それ自身でダイマーを形成し、Ａｐｏ ＡIIと複合体を形成するその能力である。
ダイマーおよび複合体の循環系における存在は、おそらくキャリアーにおけるこれらの排泄半減期の遅延の原因
　
（ｂ２）「より最近になって、実験動物中へのＨＤＬの
Ａｐｏ ＡＩ
アテローム性動脈硬化症損傷の程度および重症度を減少させる
Ａｐｏ ＡＩはかなりのフィブリン溶解活性を呈し得る
抽出Ａｐｏ ＡＩは
フィブリン溶解をかなり増大させる
　
（ｃ）原査定の拒絶理由に引用された、本願優先日前に頒布されたJ.Biol.Chem.Vol.265,No.21(1990)p.12224-12231（以下、「引用例ｃ」という。）には、以下の事項が記載されている。
　
（ｃ１）「アポリポ蛋白質ＡＩミラノ（apoAIM）変異体キャリアにおける高密度リポタンパク質(HDL）のインビトロメタボリズムを、全血漿と単離されたリポ蛋白質分画との培養期間中調査した。減少したコレステロールエステル化（16.5に対し、コントロールでは25.0％）と、減少したHDLと低密度リポ蛋白質間の脂質の交換が、AIM血漿との培養において（37℃で6時間）観察された。コントロールHDL3は、大きく、速い浮動性の粒子へと変換されるのに対し、AIMHDL3の分画のみは、同じ経路が続いた。脂質内部から単離されたトリグリセリドに富んだ粒子の存在下において、リポ蛋白質と劣化血漿分画と共に、コントロールとAIMキャリアからの混合HDL3による培養もまた実施された。AIMHDL3は、再び脂質の変換において減少した能力を示した。いくつかのHDL3粒子は、通常の変化である速い浮動性で、大きなHDLへ変換したが、小さいAIMHDL3は修飾されず、AIMHDL3は、代謝的に機能的な粒子と非機能的なものの混合物であることを示した。続いて、AIMHDL3の還元とカルボキサミドメチレーションにより、アポAIMのホモ及びヘテロ２量体を通常の対応物、すなわち、単量体のアポAI及びAIIへ変換すると、修飾されたHDL3は、リポ蛋白質と劣化血漿とトリグリセリドに富んだ粒子との培養において、コントロールHDL3と同じように行動した。
AI
M
２量体は、AI
M
キャリアにおけるHDL
3
安定性に寄与している可能性が高く、アポリポ蛋白質組成物は、HDL粒子の相互変換において大きな役割を担っている
　
（ｃ２）「
AI
M
キャリアにおいて、アポリポ蛋白質変異体のジスルフィド結合型は、HDL粒子の増加した代謝安定性に寄与している
　
（ｄ）原査定の拒絶理由に引用された、本願優先日前に頒布されたProc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.83,No.20(1986)p.7643-7647（以下、「引用例ｄ」という。）には、以下の事項が記載されている。
（ｄ１）「還元され、変性されたRNアーゼの再活性化において、チオレドキシンは、モデルであるジチオール、ジチオトレイトールよりもモル単位で1000倍効果的であり、
チオレドキシンは、ジスルフィド変換のための効果的な触媒として働く
　
（ｄ２）「実施における配慮として、チオレドキシンのジスルフィド異性化活性は、
細菌内で産生される組換え哺乳類蛋白質の再折り畳みに適用することができる。
大腸菌は、通常、蛋白質を分泌しないし、ジスルフィドを含むタンパク質を産生しない
　
（ｅ）原査定の拒絶理由に引用された、本願優先日前に頒布されたBiochim.Biophys.Acta,Vol.960,No.1(1988)p.73-82（以下、「引用例ｅ」という。）には、以下の事項が記載されている。
（ｅ１）「Lp(A-IIを含むA-I)とLp(A-IIを含まないA-I)の分画　透析の後、免疫親和性クロマトグラフィにより単離されたLp(A-IIを含むA-I)とLp(A-IIを含まないA-I)粒子は、分子量10000カットオフ透析膜（Biomolecular Dynamics,Beaverton,OR）を使用したMicro-Confilt濃縮器により、1-4mg/mlまで濃縮された。濃縮されたリポ蛋白質粒子の1又は2.0mlアリコートは、４℃で、6ml/Hの流速により、Ultogel AcA34（LKB,Bromma,Sweden）によるゲル濾過クロマトグラフィ（1.5×95cm）により分画された。ゲル濾過分画は、化学的架橋と蛋白質分析のために貯留する前に、勾配ゲル電気泳動により分析された。」（第75頁左欄22行〜下14行）
　
（ｆ）原査定の拒絶理由に引用された、本願優先日前に頒布されたJ.Clin.Invest.,Vol.66,No.5(1980)p.901-907（以下、「引用例ｆ」という。）には、以下の事項が記載されている。
（ｆ１）「通常のアポA-Iは、脱脂されたコントロールHDLから、4Mグアニジンと0.2Mトリス（pH8.0）で平衡化された3-mセファデックスG-200カラム（Pharmacia Fine Chemicals,Div. of Pharmacia Inc.,Piscataway,N.J.）を用いたゲル濾過により単離された。患者（D.V.)のHDLアポ蛋白質は、Stephens(17)により述べられた予備的なSDSゲル電気泳動により単離された。アポ（A-Icys-A-II）サブユニットは、錯体を還元し、アルキル化した後、予備的SDSゲル電気泳動により単離された。」（第902頁左欄下8行〜右欄2行）
　
　
３．当審の判断
（１）対比
　上記記載事項（ａ２）〜（ａ７）によると、引用例ａには、アポリポ蛋白質Ａ１は、末梢組織からコレステロールを除去する機能を担っており、既存のアテローム動脈硬化病巣の退行をも促進する作用が確認されているところ、その変異体としてアポリポ蛋白質Ａ１−ミラノが存在すること、そして、Ａ１−ミラノキャリア個体は、アテローム動脈硬化症になりにくいことが記載されている。さらに、Ａ１−ミラノの特徴として、脂質と会合しやすい構造となっていること、Cys残基が存在するため２量体を形成することが記載されており、これらの特徴すべてが組織脂質の有効吸収能に寄与していることが示唆されている。さらに、アポリポ蛋白質Ａ１の変異体を血漿コレステロールのレベルを低下させるための治療へ使用できることが記載されている。また、Ａ１−ミラノの製造方法として、DNA組換え技術により大腸菌中の発現系統を用いて製造することが記載されている。
　
　本願発明１と引用例ａに記載された技術的事項を対比すると、両者は、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノ２量体に関するものである点で一致するが、本願発明１は、(ｉ)アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノ２量体の製造方法であって、(ii)その製造方法は、請求項１に記載された（ａ）〜（ｃ）いずれかの方法により２量体を製造し、さらに、(iii)当該２量体をほぼ純粋な形状に純化するものであるのに対し、引用例ａには、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノを製造することは記載されているが、それを２量体へと変換することについては記載されていない点で相違する。
　
（２）判断
（ｉ）アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノの２量体を製造しようとする動機付けについて
　引用例ａには、遺伝子工学的にＡ１−ミラノを製造すること、そして、Ａ１−ミラノには、２量体の形態が存在することは記載されているが、遺伝子工学的に製造したＡ１−ミラノを積極的に２量体へと変換することは記載されていない。
　しかしながら、引用例ａには、Ａ１−ミラノは２量体で存在することができて、この特徴が組織脂質の有効な吸収能に寄与することが示唆されており（記載事項（ａ４））、引用例ｂには、Ａ１−ミラノは２量体となると、排泄半減期が延長されることにより、良好な動脈保護活性を有することが記載されており（記載事項（ｂ１））、また、引用例ｃには、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノの２量体の存在は、ＨＤＬ3の安定性を増大させること及び、代謝安定性を増加させることが記載されている（記載事項（ｃ１）及び（ｃ２））。
　このように、Ａ１−ミラノは、２量体の形態になると、半減期及び脂質の吸収能の点で優れた性質を有するものであることを考慮すれば、当業者であれば、血漿コレステロールのレベルを低下させるための治療に用いるアポリポ蛋白質としてアポリポ蛋白質Ａ１−ミラノの２量体の形態のものを製造しようとすることは、容易に想起することである。
　
（ii）アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノの２量体を製造する方法について
　次に、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノの２量体を製造する手法について検討する。
　ここで、本願発明１は、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノの２量体の製造方法について、発明の構成要件の一部が（ａ）〜（ｃ）の選択肢で記載されたものである。
　そこで、本願発明１のうちの（ｂ）の「アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノ、単量体および２量体を大腸菌中の発現系統においてバクテリア培養媒体に分泌させる組換え技術によりアポリポ蛋白質Ａ１−ミラノを製造し、その後存在する単量体を２量体にさせる」方法を選択した場合の発明（以下、「本願発明１’」という。）による製造方法について検討する。
　
　アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノの２量体は、生体内において産生したアポリポ蛋白質Ａ１−ミラノの一部が２量体化することにより生じているものであるから、これを人工的に多量に生産するに際し、遺伝子組換えの手法によりまず、Ａ１−ミラノを産生させ、これにより生じたＡ１−ミラノの単量体を２量体化することは、当業者がまず、自然に発想することである。
　そして、引用例ａには、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノの製造方法として、大腸菌中の発現系統を用いて製造することが記載されている。
　ところで、あるタンパク質を遺伝子工学的に製造する際に、培養上清中に目的タンパク質を分泌することができれば、精製を容易にすることができるため、目的タンパク質をコードする遺伝子の５’末端側に分泌シグナル配列を付加して、目的タンパク質を培養媒体に分泌させるようにすることは、例をあげるまでもなく、当該技術分野における周知技術である。そして、引用例ａの実施例には、proapoAIの大腸菌中での発現において、18個のアミノ酸からなるプレ配列をＮ末端側に付加することにより、分泌発現させる態様も記載されている（記載事項（ａ８））。
　これらの事項を考慮すれば、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノの２量体を製造するにあたり、その第一段階として、引用例ａに記載の大腸菌中の発現系統におけるアポリポ蛋白質Ａ１−ミラノの製造において、上記周知技術であるバクテリア培養媒体に分泌させる組換え技術を適用して、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノを培養媒体に分泌させて製造することは、当業者が容易に想到することである。
　
　そのようにして製造されたアポリポ蛋白質Ａ１−ミラノの形態は、通常、大腸菌により産生された蛋白質がジスルフィド結合を含まないことからみて（記載事項（ｄ２））、単量体を含むものであるといえる。
　そして、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノは、ジスルフィド結合を形成することができるアミノ酸残基であるCysを１つしか含まない（要すれば、The Journal of Biological Chemistry,Vol.258,No.4,1983,p.3508-3513、特に、表Ｉ参照）ものであるから、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノ単量体を２量体に変換する方法として、引用例ｄに記載されるような、蛋白質にジスルフィド結合を形成させる方法（記載事項（ｄ１））を適用して２量体化することは、当業者にとって格別な困難性を有するものとも認められない。
　
（iii）さらに２量体を純化する点について
　目的物質の純度をより高くしようとすることは、化学物質を扱う技術分野における一般的な課題であるから、２量体化したアポリポ蛋白質Ａ１−ミラノをさらに、純化しようとすることは、当業者にとって自然な発想である。その際、透析法、ゲル濾過クロマトグラフィ法、SDS電気泳動法などの分子量に基づく精製法を組み合わせて、アポリポＡ１を含むリポ蛋白質粒子を精製することは周知技術であること（記載事項（ｅ１）及び（ｆ１））を考慮すれば、２量体化したアポリポ蛋白質Ａ１−ミラノを、さらに上記周知技術により、ほぼ純粋な形状のアポリポ蛋白質Ａ１−ミラノの２量体とすることは、当業者が適宜なし得ることである。
　
　そして、本願発明１が、Ａ１−ミラノの２量体を製造する方法として、格別の効果を奏するものとも認められない。
　
　なお、審判請求人は、平成１８年４月２８日付け回答書において、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノ２量体自体の効果として、（イ）単量体より血漿半減期が長いこと、（ロ）繊維素溶解刺激特性を有することを主張しているが、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノ２量体自体が有する性質については、上記（ｉ）で述べたように、２量体を得ることが十分動機づけられる以上、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノ２量体の製造方法に係る本願発明１の容易性の判断に影響を与えないものである。
　
　念のため、審判請求人が主張する効果について付言しておくと、（イ）の半減期延長の効果については、引用例ｂには、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノを２量体とすることにより半減期が延長することが記載されていることからみれば（記載事項（ｂ１））、当業者が予測し得る範囲のものである。
　
　次に、効果（ロ）の点について検討する。
　アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノキャリア個体は、臨床的に、血管内での繊維素（「フィブリン」と同義）形成が原因であるアテローム性動脈硬化になりにくいことが知られていた（記載事項（ａ４））。
　そして、アポリポ蛋白質Ａ１の変異体であるＡ１−ミラノは、突然変異により脂質と結合しやすい構造となっていること、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノは血漿中で２量体での存在が可能であることが知られており、これらの特徴が、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノの組織の脂質の有効な吸収能に寄与していることが示唆されている（記載事項（ａ４））。
　さらに、本来、アポリポ蛋白質Ａ１は、末梢組織からのコレステロールを肝臓に逆輸送するだけではなく、高コレステロールが原因で形成される繊維素についても、その溶解作用を有することが知られていた（記載事項（ｂ２））。
　
　このように、そもそもアポリポ蛋白質Ａ１は繊維素溶解作用を有するところ、その変異体であるＡ１−ミラノキャリア個体は、アテローム性動脈硬化になりにくいという事実があること、さらに、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノは血漿中で２量体で存在しているということを考慮すれば、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノ２量体と繊維素溶解系に関連性があろうことは、当業者であれば、容易に推測できることである。実際に、本願明細書において、アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノ２量体が、プラスミノーゲンを活性化する性質を有すること（例８〜９）が確認されたとしても、それは単に、繊維素溶解系との関連が予測されるアポリポ蛋白質Ａ１−ミラノ２量体において、より具体的な作用・機能を観察したに留まると解すべきである。
　
　そうしてみると、請求人の主張するこれらの効果は、いずれも予測可能なものである。また、仮にこのような機能・性質を発見したことで、当該機能・性質に基づく新たな用途発明が成立する可能性はあるとしても（なお、用途が医薬の場合は、実施可能要件を満たすためには、明細書に薬理データ又はそれと同視すべき程度の記載をしてその用途の有用性を裏付ける必要があるところ、本願明細書には、そのような記載はない。）、このことをもって本願発明１の製造方法に係る発明における格別な効果として評価することはできない。
　
（３）小括
　したがって、本願発明１’は、引用例ａ〜ｆに記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものであり、それを選択肢として含む本願発明１も同様である。
　
４．むすび
　以上のとおり、本願発明１は、引用例ａ〜ｆに記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから、その余の本願請求項に係る発明について検討するまでもなく、本特許出願は拒絶すべきものである。
　
　よって、結論のとおり審決する。