【事件の表示】
　平成　７年特許願第５０３５９８号「プロウロキナーゼ変異種」拒絶査定不服審判事件〔平成　７年　１月１２日国際公開、ＷＯ９５／０１４２７、平成　８年１２月１７日国内公表、特表平　８−５１１９５３〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．手続の経緯・本願発明 
　本願は、１９９４年６月２８日（パリ条約による優先権主張１９９３年７月２日、米国）を国際出願日とする出願であって、その請求項１に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、平成１６年１月２０日付けの手続補正書により補正された明細書及び図面の記載からみて、以下のとおりのものである。
　
「ネイティブなプロ−ウロキナーゼ（ｐｒｏ−ＵＫ）のアミノ酸配列を必須としてなる血栓融解活性のあるｐｒｏ−ＵＫ変異種であって、位置３００のリジンがヒスチジンになっており、患者に投与された場合にネイティブなｐｒｏ−ＵＫよりもフィブリノーゲン溶解及び非特異的プラスミノーゲン活性化を誘導しないものであるｐｒｏ−ＵＫ変異種。」
　
　なお、以下においてもプロ−ウロキナーゼをｐｒｏ−ＵＫとする。
　
２．引用例
　原査定の拒絶の理由に引用された、本願優先日前に頒布された刊行物であるProtein Engineering,Vol.6 Suppl.(1993.Mar.)p.45（以下、「引用例」という。）の上段には、
　イントロダクションの項に「ｐｒｏ−ＵＫは現在臨床試験にあるフィブリン特効薬プラスミノゲン・アクチベータである。結果は、ｐｒｏ−ＵＫが例外的に低い再閉塞割合で、高い冠状動脈開放を引き起こすことを示している。しかしながら、いくつかの系統の結果は組織プラスミノゲン活性化因子で遭遇したものに似ているように見られた。これは出血しやすい体質にして、安全に処理することができる服用量を制限する。この非特異的な影響は、キモトリプシノゲンのようなセリン・プロテアーゼ・ファミリーの典型的なzymogenよりはるかに高いｐｒｏ−ＵＫの本来的な活性と関係がある(1)。さらに、フィブリン断片E2がある状態で、ｐｒｏ−ＵＫは、ＵＫへの活性化なしにプラスミノゲンに対して完全に活性なことを示した(2)。この研究は、ｐｒｏ−ＵＫの本来的な活性の構造決定要素の特性化に向けられている。」と記載され、
　実験方法の項に「ｐｒｏ−ＵＫのプロテアーゼ領域の3Dモデルは、互いに45%以上同族であるので、エラスターゼとトリプシノゲンで補われたキモトリプシノゲンの空間の座標から、PolygenとCHARMMを使用して開発されている。このモデルに基づいて、活性化領域の一部として「柔軟なループ」(297-313)と呼ばれるドメインは特徴づけられた。それは、トリプシノゲンとキモトリプシノゲンにおいて高度に柔軟だが、ループ中にそのε-アミノ基によって活性部位Ser355に隣接しているAsp354とともに弱い塩ブリッジを形成する単一のリジン300があるので、恐らくｐｒｏ−ＵＫ中でより固定される。これは、Ser355を活性位置の近くに引っぱって、ｐｒｏ−ＵＫのより高い本来的な活性を引き起こしているかもしれない。この仮説をテストするために、サイトダイレクト突然変異体(Lys300→Ala)が構築され、大腸菌で発現され、リフォールディングした後にS-Sepharose、proZorbおよびSephadexG-25カラムによるクロマトグラフィーによって精製した。突然変異体は、プラスミノゲン活性化の動力学的分析によって、血漿周囲における安定性とプラスミン活性化への感度が特徴づけられた。」と記載され、
　結果と議論の項に、結果を示す表１とともに「Ala300ｐｒｏ−ＵＫは、ほとんど測定可能なアミド分解活性(S2444に対する)を持っておらず、ｐｒｏ−ＵＫが血漿・フィブリノーゲンの50%の分解をインビトロで引き起こしたのに対し、10倍以上の濃度でもフィブリノーゲン分解を引き起こさず、血漿において非常に安定していた。ｐｒｏ−ＵＫと比較して、それはプラスミン活性化に対して1.56倍の高感度を持っていたが、2本鎖誘導体(AIa300ＵＫ)の酵素活性は、kcatの大きな減少により、フィブリン断片E2により促進と同じように著しく減じられた(ＵＫのそれの33%)。対照的にAla300 - ＵＫによるプラスミノゲン活性化のKMはＵＫのそれより5.8倍小さかった(表I)。これから、Lys300が、zymogen(ｐｒｏ−ＵＫ)の本来的活性の構造的決定要素であるだけでなく、酵素の十分な活性(ＵＫあるいは断片E2に促進されたｐｒｏ−ＵＫと同様に)を保持するのに重要であることが示唆される。ネガティブコントロールとして、Ser303がGluに変更された突然変異体も構築され、発現し、上に記述されるように精製し、特徴づけをなした。この突然変異体は特性をＵＫ/ｐｒｏ−ＵＫのものと比較した。結論として、ｐｒｏ−ＵＫの位置300でのε-アミノ基の除去は、zymogen(ｐｒｏ−ＵＫ)の本来的な活性を事実上除去しただけでなく、その特性化がセリン・プロテアーゼとそれらのzymogens中の柔軟なループの機能についての一層の理解に役立つかもしれないメカニズムによってその潜在している酵素活性に影響した。」と記載されている。
　
３．対比
　本願発明と上記引用例に記載された発明（Ala300ｐｒｏ−ＵＫ）を対比する。
　　引用例のAla300ｐｒｏ−ＵＫは、ｐｒｏ−ＵＫのサイトダイレクト突然変異体(Lys300→Ala)であり、ほとんど測定可能なアミド分解活性(S2444に対する)を持っておらず、ｐｒｏ−ＵＫが血漿・フィブリノーゲンの50%の分解をインビトロで引き起こしたのに対し、10倍以上の濃度でもフィブリノーゲン分解を引き起こさず、血漿において非常に安定したものであるから、両者ともネイティブなｐｒｏ−ＵＫの位置３００で変異させたアミノ酸配列を必須としてなる血栓融解活性のあるｐｒｏ−ＵＫ変異種であって、患者に投与された場合にネイティブなｐｒｏ−ＵＫよりもフィブリノーゲン溶解及び非特異的プラスミノーゲン活性化を誘導しないｐｒｏ−ＵＫ変異種である点で一致しているが、
　本願発明においては、位置３００のリジンがヒスチジンになっているのに対し、引用例に記載されるものは、位置３００のリジンがアラニンになっている点において相違している。
　
４．判断
　上記相違点について検討する。
　
　ある有用な生理活性等の性質を有するタンパク質が知られている場合に、当該タンパク質と化学構造が類似するタンパク質の中に、当該生理活性等の性質が同等ないしより優れたものがあること、あるいは付随する有用な性質を有するものがあることを期待し、これを得ようとすることは、本願優先日当時には当業者が通常行うことである。そして、そのような有用な類似タンパク質を得るための手法として、当該タンパク質のアミノ酸配列に対し１〜数個のアミノ酸を欠失、置換ないし付加した配列を有する変異タンパク質を種々作成し、これらについて、それらの有用な性質を有するか否かを、生理活性試験等により確かめる手法は、本願優先日当時には当業者に周知の手法であった。そのような技術水準においては、新たな変異タンパク質を取得したからといって直ちに特許性のあるタンパク質を提供したと評価することはできない。そもそも「化学物質特許」は、新規で有用な化学物質を世の中に提供した貢献に対して付与されるべき強大な独占的権利であって、公知のタンパク質に周知の手法を適用し、単に変異タンパク質を製造した程度のことでは、そのような独占的権利に値するほどの「化学物質」を初めて世の中に提供したことにはならないからである。変異により生理活性などが格別に優れるなどの顕著な効果があってこそ、特許に値するのである。
　
　引用例の記載をみると、そこにはｐｒｏ−ＵＫには、非特異的な影響が本来的な活性と関係があることが示され、位置３００のリジンがアラニンにしたｐｒｏ−ＵＫ変異体がzymogen(ｐｒｏ−ＵＫ)の本来的な活性を事実上除去したことが示されているから、当業者であれば、さらに優れた変異体を得ようとし、位置３００のリジンをアラニン以外のアミノ酸、例えば、ヒスチジンに変異してみる程度のことは容易になし得ることである。
　なお、この点について、請求人は「このように、野生型の３００位のＬｙｓは酵素活性にとり非常にクリティカルな位置であることがわかる。例えば、上記のように、野生型の３００位のＬｙｓをＡｌａに変化させるとプラスミノーゲン活性化能がおよそ６分の１に低下してしまうのである。それゆえ、無闇にその位置を修飾・改変すると活性の低下を招くと考えられるので、当業者は、これを除去したり、他のアミノ酸に置換したりしてみようとは決して思わなかったのである。」ことを主張している。しかし、ランダムに変異させただけでは、生理活性に影響がない（中立的な）ものが得られる場合が多く、例え、生理活性に影響があったとしても好ましくない影響であることが多い中で、ｐｒｏ−ＵＫの本来的な活性を事実上除去したにもかかわらず、プラスミノーゲン活性化能がおよそ６分の１のものが得られたということは、３００位のＬｙｓの変異に対し興味を当業者に抱かせることはあっても、これを除去したり、他のアミノ酸に置換したりしてみようとは決して思わなかったとはいえない。
　
　そこで、本願発明において位置３００のリジンをヒスチジンとしたことにより格別の効果を奏するか否かを検討する。
　本願明細書には、「本発明は、天然に存在するネイティブなｐｒｏ−ＵＫの望ましくない本来的かつ非特異的な酵素活性の低下を示すが、フィブリン（フラグメントＹまたはＥ2）により促進される（活性化される）能力においてネイティブなｐｒｏ−ＵＫと少なくとも同程度に有効で、プラスミノーゲンをプラスミンに変換し、２本鎖ＵＫへの変換後も血栓融解活性を保持する変異種形態のｐｒｏ−ＵＫを設計できることを見いだしたことに基づく。結果として、これらのｐｒｏ−ＵＫ変異種は、患者に投与した場合、非特異的プラスミノーゲン活性化および出血性合併症がネイテイブなｐｒｏ−ＵＫよりも抑えられる。」（２頁１３−２０行）、
　「詳細には、変異は、通常には、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫの柔軟性のあるループ（アミノ酸２９７〜３１３）における１個のネイティブなアミノ酸の１個の新しいアミノ酸への置換であってもよい。例えば、新しいアミノ酸は、Ｌｙｓ300、Ｇｌｙ299、および／またはＧｌｕ301の、例えばアラニンまたはヒスチジンへの置換であってもよい。さらに、新しいアミノ酸は、Ｌｙｓ313の、例えばアラニンまたはヒスチジンへの置換、あるいはＴｙｒ306の、例えばグリシンへの置換であってもよい。」（３頁１６−２２行）と記載されており、位置３００のリジンをヒスチジンとしたものについては、
　「 変異種２：Ｌｙｓ300→Ｈｉｓ
  第２の変更として、ｐｒｏ−ＵＫモデルのＬｙｓ300をヒスチジン（Ｈｉｓ）に置換した。ヒスチジンは水素イオンを獲得することができ、６.５より低いｐＨにおいては正に荷電するが、リジンのε−アミノ基の電荷ほど強くない。ｐｒｏ−ＵＫモデルにおいて、Ｈｉｓ300のイミダゾール基は、外部よりも低いエネルギー状態において、分子内部に包み込まれる。なぜなら、イミダゾール基はやや疎水的であるからである。このことにより、イミダゾール基はＡｓｐ355に向いているために正電荷を有することができ、局部的に環境が酸性となる。それゆえ、弱い塩ブリッジがＡｓｐ355とＨｉｓ300との間に存在し、Ｈｉｓ300は弱いＬｙｓ300のように挙動することとなる。Ｈｉｓの静電気的荷電状況は局部的環境に依存し、さらに上記のごとくＨｉｓ300が柔軟性のあるループ領域（２９７〜３１３）中に存在するので、モジュレーター（フラグメントＥ2）はやはりｐｒｏ−ＵＫの本来的活性を調節する。Ｌｙｓ300→ＡｌａのデータおよびＬｙｓと比較した場合のＨｉｓの特性に基づくと、変異種２の本来的活性もまた、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫの本来的活性よりも１０倍低いはずであるが、変異種１の本来的活性よりは高いはずである。しかしながら、２本鎖形態の活性およびフィブリンでの促進能はともに保持されるはずであり、それらは変異種１よりは高いはずであるが、ネイテイブなｐｒｏ−ＵＫよりは低いはずである。」（１１頁２−１９行）と記載されている。
　しかし、本願明細書には、位置３００のリジンをアラニンとしたｐｒｏ−ＵＫ変異種１については、それを製造し、活性などについてアッセイしたことが記載されているものの、位置３００のリジンをヒスチジンとしたｐｒｏ−ＵＫ変異種については、それを製造したことも、活性などについてアッセイしたことも記載されていない。
　これらの記載からすれば、位置３００のリジンをヒスチジンとしたｐｒｏ−ＵＫ変異種は、ヒスチジンの電荷の強さから、引用例に記載されるものと同じものである位置３００のリジンをアラニンとしたｐｒｏ−ＵＫ変異種１とネイティブなｐｒｏ−ＵＫの中間的な性質を示すことが予測されているものといえるが、このことからは、本願発明が、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫと引用例に記載される位置３００のリジンをアラニンとしたｐｒｏ−ＵＫ変異種を超えるような格別な効果を有するということはできない。また、この分野の技術レベルは、変異体の生理活性などがどのように変化するかを確実に予測できるには程遠いものであって、出願時の技術常識を考慮しても、位置３００のリジンをヒスチジンとしたｐｒｏ−ＵＫ変異種の効果を当業者が理解することは困難であるといえる。とすると、本願発明の効果を当業者が理解するためには、本願明細書には、変異体を具体的に製造し、アッセイを行った結果により効果が示されている必要があるというべきであり、そのような開示のない本願明細書の記載からは、本願発明の位置３００のリジンをヒスチジンとしたｐｒｏ−ＵＫ変異種に格別な効果があるものとは全く認められないものである。
　この点について、請求人は、本願発明者らの文献、Liu et al., Circulation Research, 90:757-763 (2002)、及びLiuおよびGurewich（いずれも本願発明者）が行った新たな実験データを示し、本願発明のｐｒｏ−ＵＫ変異種が、野生型ｐｒｏ−ＵＫと比べて高い２本鎖活性を有し、ｐｒｏ−ＵＫよりも創傷における出血がずっと少なく、しかもｔ−ＰＡよりも有意に迅速な血栓溶解を引き起こすという、本願明細書の記載からは全く予測できない効果があることを主張しているが、該文献は本願の国際出願日からも７年以上経過して発表されたものであるし、新たな実験データも審判請求後に初めて提出されたものである。出願時に具体例もなく、効果が全く把握することができなかったものを、特許出願後に提出した文献と実験データのみによって、明細書の記載内容を記載外で補足することは、発明の十分な公開を前提に特許を付与するという特許制度の趣旨に反し許されないというべきものであるから、提出された文献と実験データのみから、本願発明の効果を認めることはできない。
　
５．むすび
　
　以上のとおり、本願発明は、引用例に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明できたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
　したがって、本出願に係る他の請求項について検討するまでもなく、本出願は拒絶すべきものである。
　
　よって、結論のとおり審決する。