(57)【要約】  本発明は、ステビオール配糖体ヘキソース転移酵素及び同酵素を用いたグルコース及び／又はラムノースを含有するステビオール配糖体の製造方法を提供することを目的とする。  本発明は、ステビオール配糖体ヘキソース転移酵素及び同酵素を用いたグルコース及び／又はラムノースを含有するステビオール配糖体の製造方法を提供する。本発明は、ステビオール配糖体ヘキソース転移酵素遺伝子を導入した形質転換体及び当該形質転換体の作製方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）〜（c）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質。
（a）配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X7以外の1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質；
（c）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、かつアミノ酸残基X7に対応するアミノ酸は同一であるアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
【化１】
2018124141.tif 000008
（式中、R1はH、C1〜C20アルキル基、C2〜C20アルケニル基、C2〜C20アルキニル基、C4〜C20アルキルジエニル基、C6〜C18アリール基、C6〜C20アルキルアリール基、C6〜C20アリールアルキル基、C4〜C20シクロアルキル基、C4〜C20シクロアルケニル基、（C3〜C10シクロアルキル）C1〜C10アルキル基又は糖残基を表す。）
【請求項２】
（b’）配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X1〜X7以外の1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質；または
（c’）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、かつアミノ酸残基X1〜X7に対応するアミノ酸は同一であるアミノ酸配列を有し、かつ前記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質である、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項３】
以下の（b’’）、（c’’）、（d）〜（i）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質。
（b’’）配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X2及び／又はX3以外の1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質； 
（c’’）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、かつアミノ酸残基X2及び／又はX3に対応するアミノ酸は同一であるアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質；
（d）配列番号4のアミノ酸配列において第156番目のアミノ酸残基がValであり、及び／又は、第233番目のアミノ酸残基がPheであるアミノ酸配列からなるタンパク質； 
（e）上記（d）のタンパク質において、1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加され、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValであり、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheであるアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質； 
（f）上記（d）のタンパク質のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValであり、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheであるアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質；
（g）配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X2がThrであり、及び／又は、アミノ酸残基X3がSerであるタンパク質；
（h）上記（g）のタンパク質において、1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加され、アミノ酸残基X2に対応するアミノ酸残基がThrであり、及び／又は、アミノ酸残基X3に対応するアミノ酸残基がSerであるアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質； 
（i）上記（g）のタンパク質のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、アミノ酸残基X2に対応するアミノ酸残基がThrであり、及び／又は、アミノ酸残基X3に対応するアミノ酸残基がSerであるアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
【化２】
2018124141.tif 000009
（式中、R1はH、C1〜C20アルキル基、C2〜C20アルケニル基、C2〜C20アルキニル基、C4〜C20アルキルジエニル基、C6〜C18アリール基、C6〜C20アルキルアリール基、C6〜C20アリールアルキル基、C4〜C20シクロアルキル基、C4〜C20シクロアルケニル基、（C3〜C10シクロアルキル）C1〜C10アルキル基又は糖残基を表す。）
【請求項４】
前記ヘキソースが、グルコース又はラムノースからなる群より選択されるものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記R1が、H又はグルコース単量体若しくはグルコース2量体の糖残基である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記化合物が、ステビオールモノシド、又はルブソシドである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
以下の（a）〜（d）よりなる群より選ばれるポリヌクレオチド。
（a）配列番号1の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X7以外の1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、かつアミノ酸残基X7に対応するアミノ酸は同一であるアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【化３】
2018124141.tif 000010
（式中、R1はH、C1〜C20アルキル基、C2〜C20アルケニル基、C2〜C20アルキニル基、C4〜C20アルキルジエニル基、C6〜C18アリール基、C6〜C20アルキルアリール基、C6〜C20アリールアルキル基、C4〜C20シクロアルキル基、C4〜C20シクロアルケニル基、（C3〜C10シクロアルキル）C1〜C10アルキル基又は糖残基を表す。）
【請求項８】
（c’）配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X1〜X7以外の1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
（d’）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、かつアミノ酸残基X1〜X7に対応するアミノ酸は同一であるアミノ酸配列を有し、かつ前記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項7に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
以下の（c’’）、（d’’）、（e）〜（j）よりなる群より選ばれるポリヌクレオチド。
（c’’）配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X2及び／又はX3以外の1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d’’）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、かつアミノ酸残基X2及び／又はX3に対応するアミノ酸は同一であるアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（e）配列番号4のアミノ酸配列において第156番目のアミノ酸残基がValであり、及び／又は、第233番目のアミノ酸残基がPheであるタンパク質をコードするポリヌクレオチド； 
（f）上記（e）に記載のタンパク質において、1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加され、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValであり、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheであるアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（g）上記（e）に記載のタンパク質のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValであり、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheであるアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（h）配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X2がThrであり、及び／又は、アミノ酸残基X3がSerであるタンパク質をコードするポリヌクレオチド； 
（i）上記（h）に記載のタンパク質において、1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加され、アミノ酸残基X2に対応するアミノ酸残基がThrであり、及び／又は、アミノ酸残基X3に対応するアミノ酸残基がSerであるアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（j）上記（h）に記載のタンパク質のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、アミノ酸残基X2に対応するアミノ酸残基がThrであり、及び／又は、アミノ酸残基X3に対応するアミノ酸残基がSerであるアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【化４】
2018124141.tif 000011
（式中、R1はH、C1〜C20アルキル基、C2〜C20アルケニル基、C2〜C20アルキニル基、C4〜C20アルキルジエニル基、C6〜C18アリール基、C6〜C20アルキルアリール基、C6〜C20アリールアルキル基、C4〜C20シクロアルキル基、C4〜C20シクロアルケニル基、（C3〜C10シクロアルキル）C1〜C10アルキル基又は糖残基を表す。）
【請求項１０】
前記ヘキソースが、グルコース又はラムノースからなる群より選択されるものである、請求項7〜9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記R1が、H又はグルコース単量体若しくはグルコース2量体の糖残基である、請求項7〜10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記化合物が、ステビオールモノシド、又はルブソシドである、請求項7〜11のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項7〜12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項13に記載の形質転換体。
【請求項１５】
植物体である、請求項13又は14に記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求項13〜15のいずれか一項に記載の形質転換体の抽出物。
【請求項１７】
請求項16に記載の抽出物を含む飲食品、医薬品又は工業原料。
【請求項１８】
請求項13〜15のいずれか一項に記載の非ヒト形質転換体を培養することを特徴とするタンパク質の製造方法であって、前記タンパク質が下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有する、方法。
【化５】
2018124141.tif 000012
（式中、R1はH、C1〜C20アルキル基、C2〜C20アルケニル基、C2〜C20アルキニル基、C4〜C20アルキルジエニル基、C6〜C18アリール基、C6〜C20アルキルアリール基、C6〜C20アリールアルキル基、C4〜C20シクロアルキル基、C4〜C20シクロアルケニル基、（C3〜C10シクロアルキル）C1〜C10アルキル基又は糖残基を表す。）
【請求項１９】
請求項13〜15のいずれか一項に記載の非ヒト形質転換体を用いることを特徴とするステビオール配糖体の製造方法。
【請求項２０】
前記ステビオール配糖体が、ステビオールビオシド、ステビオシド、ズルコシドA、Reb.E若しくはReb.C又はこれらの組み合わせである、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
請求項1〜6のいずれか一項に記載のタンパク質と、UDP-糖と、下記一般式（I）で示される化合物とを反応させる工程を含む、ステビオール配糖体の製造方法。
【化４】
2018124141.tif 000013
（式中、R1はH、C1〜C20アルキル基、C2〜C20アルケニル基、C2〜C20アルキニル基、C4〜C20アルキルジエニル基、C6〜C18アリール基、C6〜C20アルキルアリール基、C6〜C20アリールアルキル基、C4〜C20シクロアルキル基、C4〜C20シクロアルケニル基、（C3〜C10シクロアルキル）C1〜C10アルキル基又は糖残基を表す。）
【請求項２２】
前記UDP-糖における糖が、グルコース又はラムノースである、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステビオール配糖体が、ステビオールビオシド、ステビオシド、ズルコシドA、Reb.E若しくはReb.C又はこれらの組み合わせである、請求項21又は22に記載の方法。
【請求項２４】
植物体に蓄積されたステビオール配糖体の13位グルコースの2位に結合した糖の種類を推定する方法であって、
(1)植物体が発現するUDP糖依存的糖転移酵素（UGT）のアミノ酸配列を特定する工程、
(2)前記(1)で同定したUGTのアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸残基X2、配列番号2のアミノ酸残基X3、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を同定する工程、及び
(3)配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がThrもしくはSerであった場合、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がSerもしくはThrであった場合は、植物体に蓄積されたステビオール配糖体の13位グルコースの2位に結合した糖に占めるグルコースの割合が高いと推定し、配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がVal、Leu、Ile、AlaもしくはMetであった場合、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheもしくはTyrであった場合は、植物体に蓄積されたステビオール配糖体の13位グルコースの2位に結合した糖に占めるラムノースの割合が高いと推定する工程
を含む方法。
【請求項２５】
ステビオール配糖体として13位グルコースの2位にグルコースまたはラムノースを含む配糖体を蓄積する植物体をスクリーニングする方法であって、
(1)植物体が発現するUGTのアミノ酸配列を特定する工程、
(2)前記(1)で同定したUGTのアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸残基X2、配列番号2のアミノ酸残基X3、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を同定する工程、及び
(3)配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がThrもしくはSerであった場合、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がSerもしくはThrであった場合は、植物体がステビオール配糖体として13位グルコースの2位にグルコースを含む配糖体を蓄積している可能性があると判定し、配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がVal、Leu、Ile、AlaもしくはMetであった場合、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheもしくはTyrであった場合は、植物体がステビオール配糖体として13位グルコースの2位にラムノースを含む配糖体を蓄積している可能性があると判定する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステビオール配糖体にヘキソースを転移する活性を有するタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチド、同タンパク質を利用したステビオール配糖体の製造方法、ステビオール配糖体化酵素を高発現する形質転換体並びに前記方法により作製されたステビオール配糖体及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
キク科ステビア(Stevia rebaudiana)の葉にはジテルペノイドの一種であるステビオール(Steviol)とよばれる二次代謝産物が含まれており、ステビオール配糖体は砂糖の約300倍もの甘味を呈することからカロリーレスの甘味料として食品産業に利用されている。肥満が深刻な社会問題として国際的に発展しており、健康増進および医療費削減の観点からもカロリーレスの甘味料の要望は日々大きくなっている。現在では人工的に合成されたアミノ酸誘導体のアスパルテーム(Aspartame)やアセスルファムカリウム(Acesulfame Potassium)が人工甘味料として利用されているが、ステビオール配糖体のように天然に存在するカロリーレス甘味料はより安全で消費者理解（Public Acceptance）が得られやすいと期待される。【０００３】
ステビアの主要なステビオール配糖体は最終的には4つの糖が付いたレバウディオシドA  (Rebaudioside A; Reb.A)と呼ばれる配糖体にまで糖で修飾される（図1）。その前駆体であるステビオール3糖配糖体のステビオシド(Stevioside)が量的に最も多く、これら2つがステビアの甘味の中心的な物質である。ステビオシドは、ステビア葉で最も含有量が多く、砂糖の250〜300倍程の甘味を呈することが知られている。Reb.Aは、甘味が高く（砂糖の350〜450倍）、且つ味質が良いとされるステビオール4糖配糖体であり、これらはカロリーレス甘味料として注目されている。これら以外に反応中間体と思われる配糖体や糖の種類が異なる類縁体の存在が知られている。例えば、Reb.Aの4つの配糖体糖はすべてグルコースであるが、このうち13位のグルコースの2位にグルコースではなくラムノースが付加されたレバウディオシドC(Reb.C)や、同位置にキシロースが付加されたレバウディオシドF(Reb.F)が知られている。【０００４】
Reb.Aの生合成に至る酵素遺伝子はステビアのExpressed Sequence Tag（EST）解析を通じて単離されている（非特許文献1及び2、特許文献1）。植物ホルモンであるジテルペノイドのジベレリン(Gibberellin)の前駆体であるエントカウレン酸(ent-kaurenoic acid)の13位がエントカウレン酸13位水酸化酵素(EK13H)によって水酸化されることでステビオールが生成する（図2）（特許文献１）。ステビオールはまず13位の水酸基がステビアのUDP糖依存的糖転移酵素(UDP-sugar dependent glycosyltransferase: UGT)であるUGT85C2によって配糖体化（グルコシル化）されることでステビオールモノシド(Steviolmonoside)が生成する（非特許文献１、２）。ステビオールモノシドの13位のグルコースの2位が更にグルコシル化されることでステビオールビオシド(Steviolbioside)、あるいはステビオールモノシドの19位のカルボキシル基がグルコシル化されてルブソシド（Rubusoside）と呼ばれるステビオールの二糖配糖体が生じる。ステビオールモノシド、あるいはルブソシドの13位グルコースの2位をグルコシル化する酵素としてはUGT91D2が報告されている（特許文献2：なお、UGT91D2は同文献においてはUGT91D-like3と称されている）。一方、13位グルコースの3位はUGT76G1によってグルコシル化され、19位のカルボン酸についてはUGT74G1によってそれぞれグルコシル化されることが報告されている（非特許文献2）。このようにReb.Aまで配糖化を担う酵素遺伝子は同定されており、ステビオール配糖体の生合成酵素群を酵母で異所的に発現させ、培養によりステビオール配糖体を生産させることが報告されているとおり（特許文献3）、ステビア酵素の産業利用が進められている。その一方で、グルコース以外の配糖体糖を含むReb.CやReb.Fの生合成を担うUGT酵素は未解明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】EP 1 897 951 B1
【特許文献２】WO2013/137487
【特許文献３】WO2014 122328
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Brandle and Telmer (2007) Phytochemistry 68, 1855-1863
【非特許文献２】Richman et al (2005) Plant J. 41, 56-67
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ステビオール配糖体ヘキソース転移酵素及び同酵素を用いたグルコース及び／又はラムノースを含有するステビオール配糖体の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を遂行した結果、ステビアにおいてステビオール配糖体であるルブソシドの13位グルコースの2位にラムノース付加反応を触媒するUGT91D2L＃16酵素、並びにそれらのタンパク質をコードする遺伝子配列を同定することに成功した。また、UGT91D2L＃16酵素はグルコースの転移も触媒することが分かった。
また、本発明者らは、ステビアのステビオール配糖体に対するグルコース転移酵素（UGT91D2）とラムノース転移酵素（UGT91D2L#16）の間に介在する7つのアミノ酸変異のうち、ホモロジーモデル解析および変異体タンパク質の評価を通じて、実際に糖供与体の選択に関与するアミノ酸残基を同定した。
本発明は、上記知見に基づくものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の酵素を用いることで、ステビオール配糖体ヘキソース転移酵素及び同酵素を用いたグルコース及び／又はラムノースを含有するステビオール配糖体の製造方法を提供することができる。また本発明の酵素の働きを促進または阻害することで、ステビア植物体の中で発現するステビオール配糖体の種類を制御することができる。さらに本酵素遺伝子の配列および発現量に基づいて特定のステビオール配糖体を含有する個体を選抜することや、代謝工学的にグルコース及び／又はラムノースを含有するステビオール配糖体の生産が可能となる。【００１０】
また、本発明のタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチドを、他のステビオール配糖体ヘキソース転移酵素又は同酵素をコードするポリヌクレオチドと同一の宿主細胞内で共発現させることにより、より高度に配糖化されたステビオール配糖体（例えば、レバウディオシドC、N及びO等）を作製することができる。【００１１】
さらに、本発明を利用することで効率的にＵＧＴの糖供与体選択性をデザインしたり、天然のＵＧＴの活性ならびに、蓄積している代謝物の配糖体糖を推定したりすることができる。また、本発明で同定した糖供与体の選択に係るアミノ酸残基をゲノム編集技術等で特異的にアミノ酸置換することで、Reb.Cなどラムノース含有ステビオール配糖体のみならず植物二次代謝物の配糖体糖を制御することに応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ステビオール配糖体群の名称と構造を示す。図1において「Glc-Glc（β2→1）」は「Glc-Glc」がβ2,1グリコシド結合により結合していることを示し、「Glc-Glc（β3→1）」は「Glc-Glc」がβ3,1グリコシド結合により結合していることを示す。
【図２】ステビオール配糖体の生合成経路を示す。
【図３】PCR産物を0.8％アガロースゲルにより電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した結果を示す。
【図４】大腸菌で発現させたステビアUGTタンパク質のWestern BlottingとSDS-PAGE結果を示す。
【図５−１】ネガティブコントロール区における、ルブソシドをグルコシル化してステビオシドを生成する活性を示す。
【図５−２】SrUGT91D2における、ルブソシドをグルコシル化してステビオシドを生成する活性を示す。
【図５−３】SrUGT91D2L＃16における、ルブソシドをグルコシル化してステビオシドを生成する活性を示す。
【図６−１】ネガティブコントロール区における、ルブソシドをラムノシル化してズルコシドAを生成する活性を示す。
【図６−２】SrUGT91D2における、ルブソシドをラムノシル化してズルコシドAを生成する活性を示す。
【図６−３】SrUGT91D2L＃16における、ルブソシドをラムノシル化してズルコシドAを生成する活性を示す。
【図７】ルブソシドのグルコシル化及びラムノシル化に関して、UGT91D2及びUGT91D2L＃16の比活性を示す。
【図８】UGT91D2とUGT91D2L＃16を用いたステビオール配糖体の配糖体化経路を示す。
【図９】酵母でのステビオール配糖体の生産（ステビオール添加量0.5μｇ/ｍｌ）によって得られた、ステビオール配糖体のHPLC分析結果を示す図である。
【図１０】酵母でのステビオール配糖体の生産（ステビオール添加量2μｇ/ｍｌ）によって得られた、ステビオール配糖体のHPLC分析結果を示す図である。図１０中、RebCはレバウディオシドCを示し、SteEはステビオールモノグルコシルエステルを示し、SteMはステビオールモノグルコシドを示す。
【図１１】ステビオール添加量2μｇ/ｍｌにおいて、A-5678株およびA-56R78株で生成したReb.Cの量を示すLC-MSの結果である。
【図１２】UDP-グルコースとドッキングさせたUGT91D2のホモロジーモデルを示した図である。
【図１３】図１２の枠内の拡大図である。UDP-グルコース（UDP-Glc）と、これに近接する第156番目のアミノ酸（Thr156）および第233番目のアミノ酸（Ser233）との位置関係を示す。
【図１４】大腸菌で発現させた野生型UGT91D2と変異体１とのin vitroでのグリコシル化活性（A）及びラムノシル化活性（B）の比較、野生型UGT91D2L#16と変異体２とのin vitroでのグルコシル化活性（C）及びラムノシル化活性（D）の比較を示したグラフである。数値は、野生型UGT91D2または野生型UGT91D2L#16を100％とした場合の、変異体１または２の相対活性を示す。
【図１５】各種UGTを導入した酵母における、野生型UGT91D2、野生型UGT91D2L#16及び変異体１〜６によるグルコシル化活性（A）及びラムノシル化活性（B〜D）の比較を示したグラフである。数値は、LC-MSで測定した各生成物のシグナル強度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【００１４】
本発明者らは、ステビオール配糖体の13位グルコースの2位へのグルコース及び／又はラムノース付加反応を担う酵素タンパク質が、UGT91D2およびUGT91D2L＃16であることを初めて解明した。UGT91D2およびUGT91D2L＃16のCDS配列及び推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号1〜4である。前記ポリヌクレオチド及び酵素は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。
【００１５】
1.  ステビオール配糖体ヘキソース転移酵素
本発明は、以下の（a）〜（c）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」という）を提供する。
（a）配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（b）配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X7以外の1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質；
（c）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、かつアミノ酸残基X7に対応するアミノ酸は同一であるアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
【化１】
2018124141.tif 000002
（式中、R1はH、C1〜C20アルキル基、C2〜C20アルケニル基、C2〜C20アルキニル基、C4〜C20アルキルジエニル基、C6〜C18アリール基、C6〜C20アルキルアリール基、C6〜C20アリールアルキル基、C4〜C20シクロアルキル基、C4〜C20シクロアルケニル基、（C3〜C10シクロアルキル）C1〜C10アルキル基又は糖残基を表す。）
【００１６】
本発明のタンパク質は、他の実施態様によれば、
（b’）配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X1〜X7以外の1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質；または
（c’）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、かつアミノ酸残基X1〜X7に対応するアミノ酸は同一であるアミノ酸配列を有し、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質である。
【００１７】
本発明のタンパク質は、他の実施態様によれば、
（b’’）配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X2及び／又はX3以外の1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質；又は
（c’’）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、かつアミノ酸残基X2及び／又はX3に対応するアミノ酸は同一であるアミノ酸配列を有し、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質である。
【００１８】
本発明のタンパク質は、他の実施態様によれば、
（d）配列番号4のアミノ酸配列において第156番目のアミノ酸残基がValであり、及び／又は、第233番目のアミノ酸残基がPheであるアミノ酸配列からなるタンパク質；又は
（e）上記（d）のタンパク質において、1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加され、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValであり、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheであるアミノ酸配列からなり、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質；又は
（f）上記（d）のタンパク質のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValであり、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheであるアミノ酸配列を有し、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質である。
【００１９】
本発明のタンパク質は、他の実施態様によれば、
（g）配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X2がThrであり、及び／又は、アミノ酸残基X3がSerであるタンパク質；又は
（h）上記（g）のタンパク質において、1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加され、アミノ酸残基X2に対応するアミノ酸残基がThrであり、及び／又は、アミノ酸残基X3に対応するアミノ酸残基がSerであるアミノ酸配列からなり、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質；又は
（i）上記（g）のタンパク質のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、アミノ酸残基X2に対応するアミノ酸残基がThrであり、及び／又は、アミノ酸残基X3に対応するアミノ酸残基がSerであるアミノ酸配列を有し、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質である。
【００２０】
上記（b）、（b’）、（b’’）、（c）、（c’）、（c’’）、（d）〜（i）に記載のタンパク質は、代表的には、天然に存在する配列番号2又は4のポリペプチドの変異体であるが、例えば、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆Sons 1987-1997"、"Nuc. Acids. Res., 10, 6487（1982）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409（1982）"、"Gene, 34, 315 （1985）"、"Nuc.  Acids.  Res., 13, 4431（1985）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488（1985）"等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
【００２１】
本明細書中、「配列番号2のアミノ酸配列において、アミノ酸残基X7以外の1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質」としては、配列番号2のアミノ酸配列において、アミノ酸残基X7以外に、例えば、1〜48個、1〜47個、1〜46個、1〜45個、1〜44個、1〜43個、1〜42個、1〜41個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個（1〜数個）、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
【００２２】
また、このようなタンパク質としては、配列番号2のアミノ酸配列と90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸残基X7に対応するアミノ酸は同一であるアミノ酸配列を有し、かつ一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００２３】
同様に、本明細書中、「配列番号2のアミノ酸配列において、アミノ酸残基X1〜X7以外の1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質」としては、配列番号2のアミノ酸配列において、アミノ酸残基X1〜X7以外に、例えば、1〜48個、1〜47個、1〜46個、1〜45個、1〜44個、1〜43個、1〜42個、1〜41個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個（1〜数個）、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
【００２４】
また、このようなタンパク質としては、配列番号2のアミノ酸配列と90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸残基X1〜X7に対応するアミノ酸は同一であるアミノ酸配列を有し、かつ一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００２５】
本明細書中、「配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X2及び／又はX3以外の1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質」としては、配列番号2のアミノ酸配列において、アミノ酸残基X2及び／又はX3以外の、例えば、1〜48個、1〜47個、1〜46個、1〜45個、1〜44個、1〜43個、1〜42個、1〜41個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個（1〜数個）、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
【００２６】
また、このようなタンパク質としては、配列番号2のアミノ酸配列と90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の配列同一性を有し、かつアミノ酸残基X2及び／又はX3に対応するアミノ酸は配列番号2のアミノ酸配列のものと同一であるアミノ酸配列を有し、かつ一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００２７】
本明細書中、「（d）のタンパク質において、1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加され、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValであり、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheであるアミノ酸配列からなり、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質」としては、（d）のタンパク質のアミノ酸配列において、例えば、1〜48個、1〜47個、1〜46個、1〜45個、1〜44個、1〜43個、1〜42個、1〜41個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個（1〜数個）、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加され、かつ配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValであり、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheであるアミノ酸配列からなり、かつ一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
【００２８】
また、このようなタンパク質としては、（d）のタンパク質のアミノ酸配列と90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の配列同一性を有し、かつ配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValであり、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheであるアミノ酸配列を有し、かつ一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００２９】
本明細書中、「（g）のタンパク質において、1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加され、アミノ酸残基X2に対応するアミノ酸残基がThrであり、及び／又は、アミノ酸残基X3に対応するアミノ酸残基がSerであるアミノ酸配列からなり、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質」としては、（g）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸残基X1〜X7以外の、例えば、1〜48個、1〜47個、1〜46個、1〜45個、1〜44個、1〜43個、1〜42個、1〜41個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個（1〜数個）、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加され、かつアミノ酸残基X2に対応するアミノ酸残基がThrであり、及び／又は、アミノ酸残基X3に対応するアミノ酸残基がSerであるアミノ酸配列からなり、かつ一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
【００３０】
また、このようなタンパク質としては、（g）のタンパク質のアミノ酸配列と90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の配列同一性を有し、かつアミノ酸残基X2に対応するアミノ酸残基がThrであり、及び／又は、アミノ酸残基X3に対応するアミノ酸残基がSerであるアミノ酸配列を有し、かつ一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００３１】
ここで、「一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性」とは、下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコース基の2位に、ヘキソースを付加する活性を意味する。
【化２】
2018124141.tif 000003
【００３２】
一般式（I）において、Glcは、グルコース残基を表す。また、一般式（I）においてR1はH、C1〜C20アルキル基、C2〜C20アルケニル基、C2〜C20アルキニル基、C4〜C20アルキルジエニル基、C6〜C18アリール基、C6〜C20アルキルアリール基、C6〜C20アリールアルキル基、C4〜C20シクロアルキル基、C4〜C20シクロアルケニル基、（C3〜C10シクロアルキル）C1〜C10アルキル基又は糖残基を表す。
【００３３】
本明細書において、「C1〜C20アルキル基」は、C1〜C10アルキル基であることが好ましく、C1〜C6アルキル基であることが更に好ましい。アルキル基の例としては、制限するわけではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ドデカニル等を挙げることができる。
【００３４】
本明細書において、「C2〜C20アルケニル基」は、C2〜C10アルケニル基であることが好ましく、C2〜C6アルケニル基であることが更に好ましい。アルケニル基の例としては、制限するわけではないが、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、2-メチル-1-プロペニル、2-メチルアリル、2-ブテニル等を挙げることができる。
【００３５】
本明細書において、「C2〜C20アルキニル基」は、C2〜C10アルキニル基であることが好ましく、C2〜C6アルキニル基であることが更に好ましい。アルキニル基の例としては、制限するわけではないが、エチニル、2-プロピニル、2-ブチニル等を挙げることができる。
【００３６】
本明細書において、「C4〜C20アルキルジエニル基」は、C4〜C10アルキルジエニル基であることが好ましく、C4〜C6アルキルジエニル基であることが更に好ましい。アルキルジエニル基の例としては、制限するわけではないが、1,3-ブタジエニル等を挙げることができる。
【００３７】
本明細書において、「C6〜C18アリール基」は、C6〜C10アリール基であることが好ましい。アリール基の例としては、制限するわけではないが、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、インデニル、ビフェニリル、アントリル、フェナントリル等を挙げることができる。
【００３８】
本明細書において、「C6〜C20アルキルアリール基」は、C6〜C12アルキルアリール基であることが好ましい。アルキルアリール基の例としては、制限するわけではないが、o-トリル、m-トリル、p-トリル、2,3-キシリル、2,4-キシリル、2,5-キシリル、o-クメニル、m-クメニル、p-クメニル、メシチル等を挙げることができる。
【００３９】
本明細書において、「C6〜C20アリールアルキル基」は、C6〜C12アリールアルキル基であることが好ましい。アリールアルキル基の例としては、制限するわけではないが、ベンジル、フェネチル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、1-ナフチルメチル、2-ナフチルメチル、2,2-ジフェニルエチル、3-フェニルプロピル、4-フェニルブチル、5-フェニルペンチル等を挙げることができる。
【００４０】
本明細書において、「C4〜C20シクロアルキル基」は、C4〜C10シクロアルキル基であることが好ましい。シクロアルキル基の例としては、制限するわけではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等を挙げることができる。
【００４１】
本明細書において、「C4〜C20シクロアルケニル基」は、C4〜C10シクロアルケニル基であることが好ましい。シクロアルケニル基の例としては、制限するわけではないが、シクロプロペニル、シクロブテニル、2-シクロペンテン-1-イル、2-シクロヘキセン-1-イル、3-シクロヘキセン-1-イル等を挙げることができる。
【００４２】
本明細書において、「（C3〜C10シクロアルキル）C1〜C10アルキル基」の例としては、メチルシクロプロピル、エチルシクロプロピル、メチルシクロブチル、エチルシクロペンチル、メチルシクロヘキシル等を挙げることができる。
【００４３】
本明細書において、「糖残基」は、特に限定されないが、1以上のペントース、ヘキソース（デオキシヘキソースを含む）又はその組み合わせからなる糖の残基であってもよい。
【００４４】
ペントースの例としてはリボース、アラビノース及びリキソースが挙げられ、ヘキソースの例としては、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、ラムノースが挙げられる。
【００４５】
好ましくは「糖残基」は、1以上のヘキソース単位からなる糖の残基であり、さらに好ましくはグルコース単量体（-Glc）又はグルコース2量体(-Glc-Glc)の糖残基である。グルコース2量体の糖残基において、好ましくは、グルコース同士はβ2,1グリコシド結合により結合している。
【００４６】
好ましくは、一般式（I）の化合物は、ステビオールモノシド、又はルブソシドである。
【００４７】
本発明のタンパク質により、一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位に付加されるヘキソースは、特に限定されないが、好ましくは、グルコース、ラムノース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるヘキソースであり、さらに好ましくはグルコース又はラムノースである。最も好ましくは、前記ヘキソースは、ラムノースである。上記（a）、（b'）、（b''）、（c'）、（c''）、（d）〜（f）に記載のタンパク質においては、前記ヘキソースとして、ラムノースを特に有利に用いることができる。また、上記（g）〜（i）に記載のタンパク質においては、前記ヘキソースとして、グルコースを特に有利に用いることができる。
【００４８】
一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性は、被検タンパク質、UDP糖（例えば、UDP-グルコース）1〜1000 μM（好ましくは、100〜700 μM、最も好ましくは500 μM）、及び基質化合物（一般式（I）の化合物）1〜500 μM（好ましくは、100〜500 μM、最も好ましくは250 μM）を含むpH6.0〜8.0の中性領域の緩衝液（例えば、リン酸ナトリウムバッファー又はリン酸カリウムバッファー）中において、20〜40℃の温度で10分間〜2時間インキュベートした後に、前記基質化合物を精製し、精製したモノテルペンをLC-MS分析（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry）等の公知の手法により分析することで検証することができる。
【００４９】
LC-MS分析の結果、一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの２位にヘキソースが付加した化合物が検出された場合、前記被検タンパク質は一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するものと言える。
前記ヘキソース付加反応は、一般に、1分〜12時間程度で終了する。
【００５０】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ1若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1若しくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
【００５１】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、o−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸；C群：アスパラギン、グルタミン；D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2，4−ジアミノブタン酸、2，3−ジアミノプロピオン酸；E群：プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン；F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００５２】
本発明のタンパク質は、これをコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を適切な宿主細胞内で発現させることにより得ることができるが、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Advanced Automation Peptide Protein Technologies社製、Perkin Elmer社製、Protein Technologies社製、PerSeptive社製、Applied Biosystems社製、SHIMADZU社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００５３】
2．ステビオール配糖体の製造方法
本発明のタンパク質が有する、一般式（I）で示される化合物の13位のグルコースの２位にヘキソースを付加する活性を利用することにより、ステビオール配糖体を容易かつ多量に製造することが可能である。
【００５４】
そこで、別の実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質と、UDP-糖と、下記一般式（I）及び／又は下記一般式（II)で示される化合物とを反応させて、一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの２位にヘキソースを付加する工程を含む、ステビオール配糖体の第1の製造方法を提供する。
【化３】
2018124141.tif 000004
一般式（I）のGlc及びR1の定義は前述の通りである。好ましくは、一般式（I）の化合物は、ステビオールモノシド、又はルブソシドである。
【００５５】
本明細書において、「UDP-糖」とは、ウリジン二リン酸（Uridine DiPhosphate：UDP）結合型の糖である。UDP-糖における糖部分の好ましい例としては1以上のヘキソースからなる糖が挙げられる。ヘキソースの例は上述の通りである。好ましくはUDP-糖は、UDP-ヘキソースであり、更に好ましくは、グルコース、ラムノース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるヘキソースである。最も好ましくは、前記UDP-糖は、UDP-ラムノースである。本発明のタンパク質として上記（a）、（b'）、（b''）、（c'）、（c''）、（d）〜（f）に記載のタンパク質を用いる場合は、UDP-糖として、UDP-ラムノースを特に有利に用いることができる。また、本発明のタンパク質として上記（g）〜（i）に記載のタンパク質を用いる場合は、UDP-糖として、UDP-グルコースを特に有利に用いることができる。
【００５６】
本発明に係るステビオール配糖体の第1の製造方法は、本発明のタンパク質と、UDP糖と、一般式（I）で示される化合物とを反応させて、一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する工程を含む。本発明の第1の製造方法は、さらに、前記工程で生成したステビオール配糖体を精製する工程を含んでいてもよい。また、本発明の第1の製造方法は、前記工程で生成したステビオール配糖体に、さらに糖を付加する工程を含んでいてもよい。
【００５７】
第1の製造方法により生成されるステビオール配糖体の例としては、ステビオールビオシド、ステビオシド、ズルコシドA、Reb.E、若しくはReb.C又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
生成したステビオール配糖体は、適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry：TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー (Ultra （High）Performance Liquid chromatography：UPLC) 等の公知の方法によって精製することができる。
【００５９】
3．ステビオール配糖体高含有非ヒト形質転換体
ステビオール配糖体は、本発明のタンパク質を用いて細菌（大腸菌又は酵母など）、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などの細胞内で生成することもできる。本発明のタンパク質は、ステビアに由来する酵素又はその変異体であるため、細胞内環境においても高い活性を有することが期待されるからである。この場合、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を、細菌、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して本発明のタンパク質を発現させ、本発明のタンパク質と、前記細胞内に存在するUDP-糖及び一般式（I）で示される化合物とを反応させることによりステビオール配糖体を生成することができる。
【化４】
2018124141.tif 000005
【００６０】
そこで、本発明は、以下の（a）〜（e）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」という）が導入された非ヒト形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」という）を提供する。
（a）配列番号1の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X7以外の1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、かつアミノ酸残基X7に対応するアミノ酸は同一であるアミノ酸配列を有し、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００６１】
また、本発明の一態様によれば、
（c’）配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X1〜X7以外の1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
（d’）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、かつアミノ酸残基X1〜X7に対応するアミノ酸は同一であるアミノ酸配列を有し、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００６２】
本発明の他の態様によれば、
（c’’）配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X2及び／又はX3以外の1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（d’’）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、かつアミノ酸残基X2及び／又はX3に対応するアミノ酸は同一であるアミノ酸配列を有し、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００６３】
本発明の他の態様によれば、
（e）配列番号4のアミノ酸配列において第156番目のアミノ酸残基がValであり、及び／又は、第233番目のアミノ酸残基がPheであるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（f）上記（e）に記載のタンパク質において、1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加され、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValであり、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheであるアミノ酸配列からなり、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（g）上記（e）に記載のタンパク質のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValであり、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheであるアミノ酸配列を有し、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００６４】
本発明の他の態様によれば、
（h）配列番号2のアミノ酸配列においてアミノ酸残基X2がThrであり、及び／又は、アミノ酸残基X3がSerであるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（i）上記（h）に記載のタンパク質において、1〜48個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加され、アミノ酸残基X2に対応するアミノ酸残基がThrであり、及び／又は、アミノ酸残基X3に対応するアミノ酸残基がSerであるアミノ酸配列からなり、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（j）上記（h）に記載のタンパク質のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有し、アミノ酸残基X2に対応するアミノ酸残基がThrであり、及び／又は、アミノ酸残基X3に対応するアミノ酸残基がSerであるアミノ酸配列を有し、かつ上記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００６５】
一般式（I）の定義及び具体例は既に述べた通りであり、また、一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位に付加されるヘキソースの定義及び具体例も前述の通りである。
【００６６】
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、DNA又はRNAを意味する。
本明細書中、「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号2のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook ＆ Russell， Molecular Cloning： A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"及び"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書中、「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、（1）5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃、（2）0.2 x SSC、0.1％SDS、60℃、（3）0.2 x SSC、0.1％ SDS、62℃、（4）0.2 x SSC、0.1％ SDS、65℃、又は（5）0.1ｘSSC、0.1％ SDS、65℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling and Detection System（GE Healthcare）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55〜60℃の条件下で0.1％（w/v）SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。あるいは、配列番号1の塩基配列と相補的な塩基配列、又は配列番号2のアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部と相補的な配列に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、PCRラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（DIG）ラベルした場合には、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００６７】
上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLAST等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号1のDNA、又は配列番号2のアミノ酸配列をコードするDNAと80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の配列同一性を有するDNAをあげることができる。
【００６８】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、FASTA(Science 227 (4693): 1435-1441, (1985))や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたblastn、blastx、blastp、tblastnやtblastxと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。blastnを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore = 100、wordlength = 12とする。また、blastpを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００６９】
上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。
【００７０】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。
適切な発現ベクターは、通常、
（i）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ii）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；及び
（iii）RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ又はコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００７１】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００７２】
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター及び／又は複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、trcプロモーター、tacプロモーター、lacプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、GAL1プロモーター、GAL10プロモーター、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、trpC等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの35S RNAプロモーター、rd29A遺伝子プロモーター、rbcSプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの35S RNAプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の5’側に付加したmac-1プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター等）が挙げられる。
【００７３】
発現ベクターは、少なくとも1つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ura5、niaD、TRP1、URA3、HIS3、 LEU2）、薬剤耐性マーカー（hygromycin、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 337, 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ、猪腰淳嗣ら, 生化学, vol. 64, p. 660, 1992；Hussain et al., Gene, vol. 101, p. 149, 1991）などが利用可能である。
【００７４】
本発明の形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。
【００７５】
本発明の形質転換体は、ステビオール配糖体を高効率で生産することが期待される。形質転換に用いられる宿主細胞は、特に限定されるものではなく、公知の各種細胞を好適に用いることができる。例えば、宿主細胞の例としては、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、植物細胞、ヒトを除く動物細胞等が挙げられる。宿主細胞は、異種細胞（ステビア以外に由来する細胞）であっても、同種細胞（ステビアに由来する細胞）であってもよい。形質転換体として同種細胞を用いる場合、本発明の形質転換体は、内因性に発現しているタンパク質に加え、外因性に導入された本発明のタンパク質も発現するため、野生型ステビア細胞に比べ酵素反応が促進される。
【００７６】
好ましくは、宿主細胞は、一般式（I）に示される化合物を生成することのできる宿主細胞である。ここで、宿主細胞は、天然状態で一般式（I）に示される化合物を生成することのできるものに限定されず、例えば、一般式（I）に示される化合物を生成することができるように公知の遺伝子で組換操作されたものであってもよい。
【００７７】
一般式（I）に示される化合物の合成に寄与する酵素をコードする遺伝子としては、EK13H、UGT74G1及びUGT76G1（非特許文献2）等が公知のものとして挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００７８】
宿主細胞が一般式（I）に示される化合物を生成することができないものである場合、同宿主細胞に本発明の遺伝子を導入して得られた形質転換体の培養系に基質として一般式（I）の化合物又は同化合物を含む植物抽出物を添加することにより、一般式（I）に示される化合物の合成に寄与する酵素をコードする遺伝子を導入せずともステビオール配糖体を製造することが可能である。
【００７９】
さらに、ステビオールからレバウディオシドAまでの一連の配糖体合成に関与する配糖体化酵素をコードする遺伝子を導入した宿主細胞を用い、同宿主細胞で本発明のポリヌクレオチドを発現させることにより、より高度に配糖化されたステビオール配糖体（例えば、ステビオールビオシド、レバウディオシドA、ステビオシド及びレバウディオシドB等）を作製することができる。ステビオールからレバウディオシドAまでの一連の配糖体合成に関与する配糖体化酵素及びその遺伝子の例としては、UGT85C2（CDS配列：配列番号７、アミノ酸配列：配列番号８）、UGT74G1（CDS配列：配列番号９、アミノ酸配列：配列番号１０）、UGT76G1（CDS配列：配列番号１１、アミノ酸配列：配列番号１２）等が挙げられる。
【００８０】
上記の宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物又は植物又はヒトを除く動物が挙げられる。
【００８１】
その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual （Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY）"等を参照することができる。
【００８２】
このようにして得られた形質転換体を培養することにより、形質転換体にステビオール配糖体を生産させることが可能である。前述の通り、形質転換体の培養系に基質として一般式（I）の化合物又は同化合物を含む植物抽出物を添加することにより、ステビオール配糖体の製造を促進することもできる。蓄積されたステビオール配糖体を抽出・精製することにより、目的のステビオール配糖体を得ることができる。
【００８３】
従って、本発明は、本発明の形質転換体を用いることを特徴とするステビオール配糖体の第2の製造方法を提供する。適切な培養培地及び条件は当分野で周知である。また、ステビオール配糖体の抽出・精製方法については既に述べた通りである。
【００８４】
ステビオール配糖体は、特に限定されないが、好ましくはステビオールビオシド、ステビオシド、ズルコシドA、Reb.E若しくはReb.C又はこれらの組み合わせからなる群より選択されるものであってもよい。
【００８５】
本発明の1つの態様において、形質転換の宿主細胞としては任意の酵母を用いることができる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、これに限定されない。
【００８６】
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194,p182(1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)、 Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなど に記載の方法で実施可能であるが、これらに限定されない。形質転換株は、使用した選択マーカーに合わせた選択圧のある培地（たとえば、抗生物質を含む培地あるいは栄養素を欠失させた培地）で生育する株として選抜して取得する。
【００８７】
本発明の1つの態様において、形質転換体は、植物形質転換体であり得る。本実施形態に係る植物形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように植物中に導入することによって取得される。あるいは、本発明の遺伝子は子孫に遺伝することから、本発明の形質転換体を交配親として用いることで、当該遺伝子を有する新たな植物体を得ることができる。
【００８８】
組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明に係るポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターを有するベクター又は外的な刺激によって誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
【００８９】
植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの35S RNAプロモーター、rd29A遺伝子プロモーター、rbcSプロモーター、mac-1プロモーター等が挙げられる。
【００９０】
外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターの例としては、mouse mammary tumor virus（MMTV）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネインプロモーター及びヒートショックプロテインプロモーター等が挙げられる。
【００９１】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱又は双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
【００９２】
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃法、PEG法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法など）が用いられる。
【００９３】
遺伝子が導入された細胞又は植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
【００９４】
本発明のポリヌクレオチドが植物に導入されたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖又は無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体又はその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。従って、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、若しくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、又はこれら由来の組織も含まれる。
【００９６】
また、種々の植物に対する形質転換方法が既に報告されている。本発明に係る形質転換体植物としては制限はないが、特に好ましい例としては、ステビオールをアグリコンとして種々の配糖体を生合成することが知られている植物を使用することが望ましく、このような植物としては、ステビアやテンチャ（Rubus suavissimus）等を挙げることができる。
【００９７】
本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物体（以下、「本発明の植物」又は「本発明の植物体」）は、適切な基質を有する場合、もしくは、適切な基質を外部から添加した場合、その野生型と比べてステビオール配糖体を多く生産することができる。
【００９８】
本発明の植物は、本発明の植物の種子、挿し木、球根等を育成することにより、容易に完全な植物体を得ることができる。
【００９９】
よって、本発明の植物には、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子、球根等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が含まれる。
【０１００】
4.  形質転換体の抽出物及びその利用
本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換体の抽出物を提供する。本発明の形質転換体は、適切な基質を有する場合、もしくは、適切な基質を外部から添加した場合、その野生型と比べてステビオール配糖体の含有量が高いので、その抽出物には、ステビオール配糖体が高濃度で含まれると考えられる。
【０１０１】
本発明の形質転換体の抽出物は、形質転換体がステビアに由来する細胞であったとしても、野生型ステビアの抽出物に比べ、ステビオール配糖体全体におけるアグリコンに対するヘキソースの割合、特にラムノース及び／又はグルコースの割合が高い。本発明の形質転換体においては、導入された本発明のタンパク質が発現し、ステビオール配糖体にヘキソースを付加するため、ステビオール配糖体全体を集合的に捉えた場合、当然のことながら、かかるタンパク質が発現していない細胞（例えば、野生型ステビア細胞）に比べ、単位数量（例えば、単位分子数）のステビオールアグリコンに付加されているヘキソースの残基数は多くなる。ステビオール配糖体全体におけるアグリコンに対するヘキソースの割合の変化は、抽出物の特性、例えば、甘味などの官能的特性に影響を与える。
【０１０２】
本発明の形質転換体の抽出物は、形質転換体をガラスビーズ、ホモジェナイザー又はソニケーター等を用いて破砕し、当該破砕物を遠心処理し、その上清を回収することにより、得ることができる。さらに、上記で述べたステビオール配糖体の抽出方法により、さらなる抽出工程を施してもよい。
【０１０３】
本発明の形質転換体の抽出物は、常法に従って、例えば、食品、医薬品、工業原料の製造等の用途に使用することができる。
【０１０４】
本発明はまた、別の実施形態において、本発明の形質転換体の抽出物を含む食品、医薬、工業原料（食品等の原料）を提供する。本発明の形質転換体の抽出物を含む食品、医薬、工業原料の調製は、常法による。このように、本発明の形質転換体の抽出物を含む食品、医薬、工業原料等は、本発明の形質転換体を用いて生成されたステビオール配糖体を含有する。前記食品、医薬、工業原料は非天然成分を含んでいてもよい。非天然成分としては、天然に存在しない化合物、例えば、合成風味料、合成保存料などの合成添加物、発酵産物などが挙げられる。
【０１０５】
本発明の食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、老人用食品等が挙げられる。本明細書中、食品は、固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称である。
【０１０６】
栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等を含む。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用途食品と同義である。幼児用食品とは、約6歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。
【０１０７】
本発明の食品は、甘味料としてカロリーレスのステビオール配糖体を使用している。このため、本発明の食品は低カロリーであり、健康増進又は健康維持に寄与するというメリットを有する。
【０１０８】
これらの食品の形態の例としては、パン、麺類、パスタ、ごはん、菓子類（ケーキ、アイスクリーム、アイスキャンデー、ドーナツ、焼き菓子、キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、並びに団子及びまんじゅう等の和菓子）、豆腐及びその加工品等の農産食品、清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発酵食品、ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品、かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品、果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等又は調味料であってもよい。さらなる食品の形態の例としては、低カロリー飲料、ノンシュガー飲料、フルーツ缶詰、乳飲料、粉末飲料、ヨーグルト、ゼリー、ドレッシング、麺つゆ、漬物、佃煮、醤油、味噌、塩辛、バーモント酢、甘酢らっきょ漬け、甘酢生姜、酢レンコン、また、漬物、天ぷら及びカバ焼きのタレ、焼肉のタレ、ソース等、ガム、キャンディー・飴、歯磨きペースト、さつま揚げ、だし巻き、焼きそばソース、冷やし中華のタレ、しめ鯖、氷菓、シャーベット、ソフトクリーム、練り製品、スナック、米菓、コーンカップ、味付け海苔、天カス、ふりかけなどが挙げられる。
【０１０９】
本発明の食品は、任意の加工食品を包含する。一態様において、加工食品は天然物を原料とするが、天然物とはその特性（例えば、弾力性、粘性、硬度などの物理的特性、味、匂い、食感などの官能的特性）が異なる。既存の多くの加工食品がこの部類に属する。別の態様において、加工食品は非天然成分を含む。
また、本発明の食品は任意の飲料を包含する。一態様において、飲料は天然物を原料とするが、天然物とはその特性（例えば、粘性、凝集力などの物理的特性、味、匂い、食感などの官能的特性）が異なる。かかる飲料の例としては、発酵飲料（例えば、乳酸飲料、清酒、ワイン、ビール、薬用酒などのアルコール飲料、ウーロン茶などの半発酵茶、紅茶などの全発酵茶、プーアール茶などの後発酵茶）、スムージー、ミルクセーキなどが挙げられる。別の態様において、飲料は非天然成分を含む。
【０１１０】
本発明の医薬品（組成物）の剤型は、特に限定されず、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をとることができる。また、本発明の医薬品（医薬組成物）は、オイル、ローション、クリーム、乳液、ゲル、シャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、エナメル、ファンデーション、リップスティック、おしろい、パック、軟膏、パウダー、歯磨、エアロゾル、クレンジングフォーム等の皮膚外用薬の他、浴用剤、養毛剤、皮膚美容液、日焼け防止剤等に用いることができる。
【０１１１】
本発明の医薬組成物は、必要に応じてさらに、その他の医薬活性成分（例えば、消炎成分）又は補助成分（例えば、潤滑成分、担体成分）を含んでいてもよい。医薬活性成分又は補助成分は、天然成分であっても非天然成分であってもよい。
【０１１２】
5．ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量の高い植物をスクリーニングする方法
本発明は、ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量の高い植物をスクリーニングする方法を提供する。具体的には、前記方法は、以下の(1)〜(3)の工程を含む。
（1）被検植物からmRNAを抽出する工程
（2）前記mRNA又は前記mRNAから調製したcDNAと、本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程
（3）前記ハイブリダイゼーションを検出する工程
【０１１３】
上記工程（1）は、被検植物から、mRNAを抽出することにより行うことができる。mRNAを抽出する被検植物の部位は、特に限定されないが、好ましくは、花弁である。mRNAを抽出した場合には、逆転写することにより、mRNA からcDNAを調製してもよい。
【０１１４】
工程（2）は、上記で抽出したmRNAに対し、本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせることにより行うことができる。高ストリンジェントな条件は、既に述べたとおりである。ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドは、好ましくは、5〜500 bp、より好ましくは、10〜200 bp、さらに好ましくは、10〜100 bpの長さである。ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドは、各種自動合成装置（例えば、AKTA oligopilot plus 10/100（GE Healthcare））を用いて容易に合成することが可能であり、あるいは、第三者機関（例えば、Promega社又はTakara社）等に委託することもできる。
【０１１５】
工程（2）において本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして用いた場合には、工程（3）は、通常のサザンブロッティング、ノーザンブロッティング（Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）、マイクロアレイ（Affymetrix社；米国特許第6,045,996号、同第5,925,525号、及び同第5,858,659号参照）、TaqMan PCR（Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）、又はFluorescent In Situ Hybridization（FISH）（Sieben V.J. et al., (2007-06). IET Nanobiotechnology 1 (3): 27-35）等のハイブリダイゼーション検出方法により行うことができる。一方、工程（2）において本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドをプライマーとして用いた場合には、工程（3）は、PCR増幅反応を行い、得られた増幅産物を電気泳動又はシークエンシング（Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）等によって解析することにより、ハイブリダイゼーションを検出することができる。
【０１１６】
ハイブリダイゼーションがより多く検出された植物体は、他の植物体と比べて下記一般式（I）で示される化合物の13位グルコースの2位にヘキソース、特にラムノース、を付加する活性を有するタンパク質をより多く発現しているといえるので、ラムノース基を有するステビオール配糖体含有量が高いことが予測される。
【化５】
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【０１１７】
6．糖供与体選択性を変化させたUGTを製造する方法
別の側面において、本発明は糖供与体選択性を変化させたUGTを製造する方法を提供する。一態様において、前記方法は、以下の(1)〜(2)の工程を含む。
(1)UGTのアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸残基X2、配列番号2のアミノ酸残基X3、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を同定する工程、及び
(2)配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がThrもしくはSer、好ましくはThrであった場合は、これをVal、Leu、Ile、AlaもしくはMet、好ましくはValに、Val、Leu、Ile、AlaもしくはMet、好ましくはValであった場合は、これをThrもしくはSer、好ましくはThrに置換し、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がSerもしくはThr、好ましくはSerであった場合は、これをPheもしくはTyr、好ましくはPheに、PheもしくはTyr、好ましくはPheであった場合は、これをSerもしくはThr、好ましくはSerに置換する工程。
【０１１８】
特定の態様において、本発明は、糖供与体選択性がUDP-グルコースからUDP-ラムノースにシフトしたUGTを製造する方法を提供する。一態様において、前記方法は、以下の(1)〜(2)の工程を含む。
(1)配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がThrもしくはSer、好ましくはThrであり、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がSerもしくはThr、好ましくはSerであるアミノ酸配列を有するUGTを同定する工程、
(2)(1)で同定したUGTのアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がThrもしくはSer、好ましくはThrであった場合は、これをVal、Leu、Ile、AlaもしくはMet、好ましくはValに置換し、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がSerもしくはThr、好ましくはSerであった場合は、これをPheもしくはTyr、好ましくはPheに置換する工程。
【０１１９】
別の態様において、前記方法は以下の(1)〜(3)の工程を含む。
(1)UDP-グルコースに対して糖供与体選択性を有するUGTを同定する工程、
(2)(1)で同定したUGTのアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸残基X2、配列番号2のアミノ酸残基X3、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を同定する工程、及び
(3)配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がThrもしくはSer、好ましくはThrであった場合は、これをVal、Leu、Ile、AlaもしくはMet、好ましくはValに置換し、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がSerもしくはThr、好ましくはSerであった場合は、これをPheもしくはTyr、好ましくはPheに置換する工程。
【０１２０】
別の特定の態様において、本発明は、糖供与体選択性がUDP-ラムノースからUDP-グルコースにシフトしたUGTを製造する方法を提供する。一態様において、前記方法は、以下の(1)〜(2)の工程を含む。
(1)配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がVal、Leu、Ile、AlaもしくはMet、好ましくはValであり、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheもしくはTyr、好ましくはPheであるアミノ酸配列を有するUGTを同定する工程、
(2)(1)で同定したUGTのアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がVal、Leu、Ile、AlaもしくはMet、好ましくはValであった場合は、これをThrもしくはSer、好ましくはThrに置換し、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheもしくはTyr、好ましくはPheであった場合は、これをSerもしくはThr、好ましくはSerに置換する工程。
【０１２１】
別の態様において、前記方法は以下の(1)〜(3)の工程を含む。
(1)UDP-ラムノースに対して糖供与体選択性を有するUGTを同定する工程、
(2)(1)で同定したUGTのアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸残基X2、配列番号2のアミノ酸残基X3、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を同定する工程、及び
(3)配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がVal、Leu、Ile、AlaもしくはMet、好ましくはValであった場合は、これをThrもしくはSer、好ましくはThrに置換し、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheもしくはTyr、好ましくはPheであった場合は、これをSerもしくはThr、好ましくはSerに置換する工程。
【０１２２】
上記の糖供与体選択性を変化させたUGTを製造する各方法において、対象となるUGTのアミノ酸配列における、所定のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の同定は、既知の任意の方法、例えば、対象となるUGTのアミノ酸配列と、基準となるアミノ酸配列（配列番号2又は4）とのアラインメントや、配列番号2又は4のアミノ酸配列からなるタンパク質を鋳型としたホモロジーモデリングなどにより行うことができる。
対象となるUGTにおけるアミノ酸の置換は、例えば、上述の部位特異的変異導入法などにより行うことができる。また、対象となるUGTを有する植物のゲノムにおいて、糖供与体選択性に係る前記アミノ酸をコードするポリヌクレオチドをゲノム編集等により、所望のアミノ酸を発現するように改変することもできる。
【０１２３】
UDP-グルコース又はUDP-ラムノースに対して糖供与体選択性を有するUGTの同定は、文献的又は実験的に行うことができる。前記UGTを実験的に同定するには、例えば、対象となるUGTと、UDP-グルコース又はUDP-ラムノースと、糖受容体基質（例えば、一般式（I）で示される化合物）とを、配糖体化反応に適した条件で反応させた結果と、糖供与体として前記反応で用いたものとは異なる化合物を用いる以外は同じ条件で反応を行った結果を比較することができる。UDP-グルコース又はUDP-ラムノースを用いた反応が、これ以外の糖供与体を用いた反応より効率が良い場合、そのUGTは、UDP-グルコース又はUDP-ラムノースに対して糖供与体選択性を有すると決定することができる。
上記各方法により、UDP-グルコース又はUDP-ラムノースに対して糖供与体選択性を有するUGTを簡便に設計又は製造することができる。また、UGTのアミノ酸残基をゲノムレベルで置換することにより、植物体内で発現するUGTの糖供与体選択性を変更し、植物体に蓄積される配糖体糖の種類を制御することが可能となる。
【０１２４】
7．UGTの糖供与体選択性を推定する方法
別の側面において、本発明はUGTの糖供与体選択性を推定する方法を提供する。一態様において、前記方法は、以下の(1)〜(2)の工程を含む。
(1)UGTのアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸残基X2、配列番号2のアミノ酸残基X3、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を同定する工程、及び
(2)配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がThrもしくはSer、好ましくはThrであった場合、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がSerもしくはThr、好ましくはSerであった場合は、前記UGTがUDP-グルコースに対する糖供与体選択性を有すると推定し、配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がVal、Leu、Ile、AlaもしくはMet、好ましくはValであった場合、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheもしくはTyr、好ましくはPheであった場合は、前記UGTがUDP-ラムノースに対する糖供与体選択性を有すると推定する工程。
【０１２５】
上記方法の工程(1)において、対象となるUGTのアミノ酸配列における、所定のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の同定は、糖供与体選択性を変化させたUGTを製造する方法と同様に行うことができる。
本方法によりUGTの糖供与体選択性を推定することで、UGTの特徴付けに関する実験設計を合理的に行い、不要な実験を削減することができる。
【０１２６】
8．植物体に蓄積されたステビオール配糖体の13位グルコースの2位に結合した糖の種類を推定する方法
別の側面において、本発明は植物体に蓄積されたステビオール配糖体の13位グルコースの2位に結合した糖の種類を推定する方法を提供する。一態様において、前記方法は、以下の(1)〜(3)の工程を含む。
(1)植物体が発現するUGTのアミノ酸配列を特定する工程、
(2)(1)で同定したUGTのアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸残基X2、配列番号2のアミノ酸残基X3、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を同定する工程、及び
(3)配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がThrもしくはSer、好ましくはThrであった場合、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がSerもしくはThr、好ましくはSerであった場合は、植物体に蓄積されたステビオール配糖体の13位グルコースの2位に結合した糖に占めるグルコースの割合が高いと推定し、配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がVal、Leu、Ile、AlaもしくはMet、好ましくはValであった場合、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheもしくはTyr、好ましくはPheであった場合は、植物体に蓄積されたステビオール配糖体の13位グルコースの2位に結合した糖に占めるラムノースの割合が高いと推定する工程。
【０１２７】
上記方法の工程(1)における、植物体が発現するUGTのアミノ酸配列の特定は、文献学的に、又は、既知の任意の実験手法により行うことができる。UGTのアミノ酸配列の実験的な特定手法としては、例えば、対象となる植物体からmRNAを抽出し、既知のUGTの塩基配列に基づいて作製したプローブやプライマーなどを用いて類似の塩基配列を有する遺伝子を取得し、これをもとにアミノ酸配列を特定する手法などが挙げられる。
上記方法の工程(2)において、対象となるUGTのアミノ酸配列における、所定のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の同定は、糖供与体選択性を変化させたUGTを製造する方法と同様に行うことができる。
【０１２８】
上記方法の工程(3)において、植物体に蓄積されたステビオール配糖体の13位グルコースの2位に結合した糖に占めるグルコースの割合が高いとは、前記植物体が発現するUGTのアミノ酸配列において配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がThrもしくはSer、好ましくはThrであった場合、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がSerもしくはThr、好ましくはSerであった場合に、そうでない植物体、例えば、配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValであり、かつ配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheであるアミノ酸配列を有するUGTを発現する植物体に比べ、植物体に蓄積されたステビオール配糖体の13位グルコースの2位に結合した糖に占めるグルコースの割合が高いことを意味する。前記グルコースの割合は、例えば、配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValであり、かつ配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheであるアミノ酸配列を有するUGTを発現する植物体に比べ、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上高くてもよい。
【０１２９】
上記方法の工程(3)において、植物体に蓄積されたステビオール配糖体の13位グルコースの2位に結合した糖に占めるラムノースの割合が高いとは、前記植物体が発現するUGTのアミノ酸配列において配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がVal、Leu、Ile、AlaもしくはMet、好ましくはValであった場合、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheもしくはTyr、好ましくはPheであった場合に、そうでない植物体、例えば、配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がThrであり、かつ配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がSerであるアミノ酸配列を有するUGTを発現する植物体に比べ、植物体に蓄積されたステビオール配糖体の13位グルコースの2位に結合した糖に占めるラムノースの割合が高いことを意味する。前記ラムノースの割合は、例えば、配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がThrであり、かつ配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がSerであるアミノ酸配列を有するUGTを発現する植物体に比べ、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上高くてもよい。
【０１３０】
本方法により植物体に蓄積される配糖体糖を推定することで、配糖体糖の特徴付けに関する実験設計を合理的に行い、不要な実験を削減したり、所望の配糖体糖プロファイルを有する植物体のスクリーニングを効率的に行うことができる。
【０１３１】
9．ステビオール配糖体としてグルコースまたはラムノースを含む配糖体を蓄積する植物体をスクリーニングする方法
別の側面において、本発明はステビオール配糖体として13位グルコースの2位にグルコースまたはラムノースを含む配糖体を蓄積する植物体をスクリーニングする方法を提供する。一態様において、前記方法は、以下の(1)〜(3)の工程を含む。
(1)植物体が発現するUGTのアミノ酸配列を特定する工程、
(2)(1)で同定したUGTのアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸残基X2、配列番号2のアミノ酸残基X3、配列番号4の第156番目のアミノ酸残基、及び／又は、配列番号4の第233番目のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を同定する工程、及び
(3)配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がThrもしくはSer、好ましくはThrであった場合、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がSerもしくはThr、好ましくはSerであった場合は、植物体がステビオール配糖体として13位グルコースの2位にグルコースを含む配糖体を蓄積している可能性があると判定し、配列番号2のアミノ酸残基X2又は配列番号4の第156番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がVal、Leu、Ile、AlaもしくはMet、好ましくはValであった場合、及び／又は、配列番号2のアミノ酸残基X3又は配列番号4の第233番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がPheもしくはTyr、好ましくはPheであった場合は、植物体がステビオール配糖体として13位グルコースの2位にラムノースを含む配糖体を蓄積している可能性があると判定する工程。
【０１３２】
上記方法の工程(1)および(2)は、上記の「植物体に蓄積されたステビオール配糖体の13位グルコースの2位に結合した糖の種類を推定する方法」と同様に行うことができる。同一植物体において調査するUGTは１つであっても複数であってもよい。調査するUGTが複数存在する場合、あるUGTについては植物体がステビオール配糖体として13位グルコースの2位にグルコースを含むものを蓄積している可能性があると判定され、別のUGTについては植物体がステビオール配糖体として13位グルコースの2位にラムノースを含むものを蓄積している可能性があると判定されることもあるが、このような場合は、植物体がステビオール配糖体として13位グルコースの2位にグルコースを含むものおよびラムノースを含むものの両方を蓄積していると判定することができる。
本方法により、植物体に含まれる配糖体を直接検出することなく、所望の配糖体を蓄積している植物体をスクリーニングすることが可能となり、食品原料の選択などを効率化することができる。
【実施例】
【０１３３】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されるものではない。【０１３４】
［実施例1］ステビオール配糖体ヘキソース転移酵素の候補遺伝子の単離
本実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Molecular Cloning（Sambrookら, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001）に記載の方法に従った。【０１３５】
ステビア葉cDNAについてはステビア葉からRNeasy Plant Miniキット（QIAGEN）を用いて総RNAを抽出し、そのうち0.5μgをRandom Oligo-dTプライマーで逆転写（RT）反応することによって得た。【０１３６】
PCR反応液（50μl）は、ステビア葉由来cDNA 1μl、1×ExTaq buffer（TaKaRaBio）、0.2mM dNTPs、プライマー各0.4pmol/μl、ExTaq polymerase 2.5Uからなる組成とした。プライマーとしては下記のものを用いた。
UGT91D2及びUGT91D2#16遺伝子増幅用プライマーセット
SrUGT91D2-pET15b-FW
5’-TGCCGCGCGGCAGCCATATGTACAACGTTACTTATCATC-3’（配列番号３７）
SrUGT91D2-pET15b-RV
5’-GTTAGCAGCCGGATCCTTAACTCTCATGATCGATGGCAA-3’（配列番号３８）
PCR反応は、94℃で3分間反応させた後、94℃で1分間、50℃で1分間、72℃で2分間の反応を計30サイクルの増幅を行った。PCR産物を0.8％アガロースゲルによる電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した結果、それぞれの鋳型DNAから推定された約1.4kbのサイズに増幅バンドが得られた（図３）。【０１３７】
このPCR産物はpENTR-TOPO Directionalベクター（Invitrogen）に製造業者が推奨する方法でサブクローニングした。DNA Sequencer model 3100（Applied Biosystems）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって配列を決定した。その結果、２種類の遺伝子が存在することが明らかとなった。【０１３８】
そのうちの一つは既知のUGT91D2（CDS配列：配列番号３、アミノ酸配列：配列番号４）であり、もう一つはUGT91D2と相同性が高い新規なステビアUGT遺伝子（CDS配列：配列番号１、アミノ酸配列:配列番号２）であった。この相同遺伝子（UGT91D2L＃16）は、UGT91D2とDNAレベルで99％（9塩基異なる）、アミノ酸レベルで98％（7残基異なる）の配列同一性を示した。【０１３９】
［実施例2］発現ベクターの構築
プライマーに付加したNdeIおよびBamHIの制限酵素部位（配列番号５および６の下線部）を利用して約1.4kbのUGT91D2およびUGT91D2L＃16のORF断片を切り出し、大腸菌発現ベクターであるpET15b（Novagen社）のNdeIおよびBamHIサイトへ連結し、本酵素遺伝子の大腸菌発現ベクターを得た。本ベクターNdeIサイト上流にあるHisタグと挿入した遺伝子のオープンリーディングフレームが合っており、UGTとHisタグの融合したキメラタンパク質が発現するよう設計した。【０１４０】
［実施例3］組み換えタンパク質の発現および精製
本酵素の生化学的な機能を明らかにするために、本酵素を大腸菌において発現させた。上記で得られた2種のUGT91D2遺伝子の大腸菌発現用プラスミドを用い定法に従って大腸菌BL21（DE3）株を形質転換した。得られた形質転換体を、50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地（10 g/l typtone pepton，5 g/l yeast extract，1 g/l NaCl）4 mlにて、37℃で一晩振盪培養した。静止期に達した培養液4 mlを同組成の培地80 mlに接種し、37℃で振盪培養した。菌体濁度（OD600）がおよそ0.5に達した時点で終濃度0.5 mMのIPTGを添加し、18℃で20 hr振盪培養した。【０１４１】
以下のすべての操作は4℃で行った。培養した形質転換体を遠心分離（5,000×g，10 min）にて集菌し、Buffer S［20 mM HEPESバッファー（pH 7.5）、20 mM imidazol, 14 mM β-メルカプトエタノール］1 ml/g cellを添加して、懸濁した。続いて、超音波破砕（15 sec×8回）を行い、遠心分離（15,000×g、15 min）を行った。得られた上清を粗酵素液として回収した。粗酵素液をBuffer Sにて平衡化したHis SpinTrap（GE Healthcare）に負荷し、遠心（70×g、30 sec）した。Bufferで洗浄後、100mMおよび 500 mMのimidazoleを含むBuffer S 各5mlにて、カラムに結合したタンパク質を段階的に溶出した。各溶出画分をMicrocon YM-30（Amicon）を用いて20 mM HEPESバッファー（pH 7.5）、14 mM β-メルカプトエタノールにバッファー置換した（透析倍率約500倍）。【０１４２】
調製した酵素のSDS-PAGE分離後のCBB染色および抗HisTag抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果、200 mM imidazole溶出画分においてHisTag融合UGT91D2およびUGT91D2L＃16のキメラタンパク質の推定分子量の約50kDa付近にタンパク質を確認したので、この画分を酵素解析に用いた（図4）。【０１４３】
［実施例4］UGT91D2およびUGT91D2L＃16の酵素活性測定
標準的な酵素反応条件は以下の通りである。反応液（2mM UDP-グルコース、0.1ｍM 糖受容体基質、100 mM リン酸カリウムバッファー（pH 7.5）、精製酵素溶液25μl）を蒸留水で50μlに調製し、30℃、1時間反応させた。酵素反応液5μlを下記の条件でLC-MS分析を行った。【０１４４】
LC condition
カラム : Imtakt SM-C18 3.0 um  4.6 mm I.D.×250 mm
移動相：A: MilliQ Water (+0.2% acetic acid),  B: Methanol
グラジエント：0 - 5 min (B conc 10% 一定)、5 - 20 min (B conc 10% → 70%)、20 - 25 min (B conc 70% → 100%)、25 - 35 min (B conc 100% 一定)、35 - 36 min (B conc 100% → 10%)、45 min分析終了
流速：0.4 mL/min
カラムオーブン：４０℃
MS condition
ESI (negative mode) 
Selected ion monitoring: m/z 641.3、787.3、803.3、935.4、949.4、965.4、1111.4、1127.4、1259.5、1273.5、1289.5、1435.5【０１４５】
先行文献（特許文献２）に記載のように  組換えSrUGT91D2タンパク質をUDP-グルコースと共にルブソシドと反応させたところ、13位のグルコースの2位がグルコシル化されたステビオシドが生成された(図５−２)。同様の条件でSrUGT91D2L＃16もルブソシドをグルコシル化してステビオシドを生成する活性を有していたが、SrUGT91D2に比べ活性は弱かった（図５−３）。一方、ネガティブコントロール区では、ルブソシドにはヘキソース転移反応は認められなかった（図５−１）。【０１４６】
次に、組換えSrUGT91D2タンパク質をUDP-ラムノースと共にルブソシドと反応させたところ、13位のグルコースの2位がラムノシル化されたズルコシドAが生成された(図６−２)。同様の条件でSrUGT91D2L＃16は、ルブソシドをラムノシル化してズルコシドAを生成する活性を有しており、しかもSrUGT91D2に比べて活性が著しく高かった（図６−３）。一方、ネガティブコントロール区では、ルブソシドにはヘキソース転移反応は認められなかった（図６−１）。上記の結果に基づくUGT91D2およびUGT91D2L＃16の比活性を、図７にまとめた。また、UGT91D2とUGT91D2L＃16を用いたステビオール配糖体の配糖体化経路を図８にまとめた。【０１４７】
以上の結果より、SrUGT91D2およびSrUGT91D2L＃16はルブソシドの13位のグルコースの2位をラムノシル化し、ズルコシドAを生成する活性を有していることが明らかとなった。特にSrUGT91D2と比べて7残基のアミノ酸の違いを持つSrUGT91D2L＃16は、著しいラムノース転移活性を有しており、ステビアにおいてズルコシドA、およびその派生体であるReb.Cの合成に寄与しているものと考えられる。【０１４８】
［実施例5］酵母を用いた発酵生産によるRebC合成
酵母において、ステビオールから各種ステビオール配糖体を生成させた。まず、ステビア由来の配糖化酵素遺伝子UGT85C2（配列番号７）、UGT91D2（配列番号３）、UGT74G1（配列番号９）、UGT76G1（配列番号１１）の4種、またはUGT85C2、UGT91D2L＃16、UGT74G1、UGT76G1の4種と、シロイヌナズナ由来UDP-ラムノース合成酵素遺伝子AtRHM2（配列番号１３）を同時に発現させる酵母を育種した。【０１４９】
配糖化酵素遺伝子およびラムノース合成酵素遺伝子ｃDNAのクローニング
ステビア由来のUGT91D２およびUGT91D2L＃16のｃDNAのクローニングは上述のとおり行った。そのほかのステビア由来の各UGT遺伝子をクローン化するために、以下のプライマーセットを作成した。
UGT85C2遺伝子増幅用プライマーセット
CACC-NdeI-SrUGT85C2-Fw（下線部NdeI認識部位）：
5’-CACCCATATGGATGCAATGGCTACAACTGAGAA-3’（配列番号１４）
BglII-SrUGT85C2-Rv（下線部BglII認識部位）：
5’-AGATCTCTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTT-3’（配列番号１５）
UGT74G1遺伝子増幅用プライマーセット
CACC-NdeI-SrUGT74G1-Fw（下線部NdeI認識部位）： 
5’-CACCCATATGGCGGAACAACAAAAGATCAAGAAAT-3’ （配列番号１６）
BamHI-SrUGT74G1-Rv（下線部BamHI認識部位）：
5’-GGATCCTTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATT-3’ （配列番号１７）
UGT76G1遺伝子増幅用プライマーセット
CACC-NdeI-SrUGT76G1-Fw（下線部NdeI認識部位）： 
5’-CACCCATATGGAAAATAAAACGGAGACCA-3’ （配列番号１８）
BamHI-SrUGT76G1-Rv（下線部BamHI認識部位）：
5’-GGATCCTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTA-3’ （配列番号１９）
【０１５０】
PCR反応液（50μl）は、ステビア葉由来cDNA 1μl、1×KOD plus buffer（TOYOBO）、0.2mM dNTPs、プライマー各0.4pmol/μl、1mM MgSO4, 1U 耐熱性KOD plus polymeraseからなる組成とした。PCR反応は、95℃で5分間反応させた後、94℃で0.5分間、50℃で0.5分間、68℃で2分間の反応を計30サイクルの増幅を行った。各PCR産物を0.8％アガロースゲルによる電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した結果、それぞれの鋳型DNAから推定された約1.4kbのサイズに増幅バンドが得られた。【０１５１】
このPCR産物はpENTR-TOPO Directionalベクター（Invitrogen）に製造業者が推奨する方法でサブクローニングした。DNA Sequencer model 3100（Applied Biosystems）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって配列を決定し、目的のUGT遺伝子、すなわちUGT85C2、UGT74G1、UGT76G1の全てのUGT遺伝子がクローニングできたことを確認した。【０１５２】
酵母用発現ベクターの構築
これらのUGT遺伝子およびUDP-ラムノース合成酵素遺伝子、およびシロイヌナズナ由来のUDP-ラムノース合成酵素遺伝子AtRHM2（J Biol Chem 2007 Oka et. al）を酵母発現ベクターに組み込むために下記のプライマーセットを設計した。
SrUGT85C2セット
Bgl2-UGT85C2-F（下線部BglII認識部位）：
5’-ACAGATCTATGGATGCAATGGCTACAACTGAGA-3’ （配列番号２０）
Sal-UGT85C2-R（下線部SalI認識部位）：
5’-TAGTCGACTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTTC-3’ （配列番号２１）
SrUGT91D2セット
NotI-UGT91DIL3-F（下線部NotI認識部位）：
5’-AAGCGGCCGCATGTACAACGTTACTTATCATCAAAATTCAAA-3’ （配列番号２２）
Pac-UGT91D1L3-R（下線部PacI認識部位）：
5’-CGTTAATTAACTCTCATGATCGATGGCAACC-3’ （配列番号２３）
SrUGT74G1セット
Not-UGT74G1-F（下線部NotI認識部位）：
5’-AAGCGGCCGCATGGCGGAACAACAAAAGATCAAG-3’ （配列番号２４）
Pac-UGT74G1-R（下線部PacI認識部位）：
5’-CGTTAATTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATTCG-3’ （配列番号２５）
SrUGT76G1セット
Bam-UGT76G1-F(下線部BamHI認識部位）：
5’-AAGGATCCATGGAAAATAAAACGGAGACCACCG-3’ （配列番号２６）
Sal-UGT76G1-R(下線部SalI認識部位）：
5’-GCGTCGACTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTAGAGACTCTAA-3’ （配列番号２７）
AtRHM2セット
Bam-AtRHM2-F（下線部BamHI認識部位）：
5’-GGATCCATGGATGATACTACGTATAAGCCAAAG-3’  （配列番号２８）
Xho-AtRHM2-R（下線部XhoI認識部位）：
5’-CTCGAGTTAGGTTCTCTTGTTTGGTTCAAAGA-3’  （配列番号２９）
【０１５３】
UGT85C2を鋳型としてSrUGT85C2セット、UGT91D2またはUGT91D2L＃16を鋳型としてSrUGT91D2セット、UGT74G1を鋳型としてSrUGT74G1セット、UGT76G1を鋳型としてSrUGT76G1セット、AtAHM2を鋳型としてAtAHM2セットの鋳型とプライマーの組み合わせで、耐熱性KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡）を用いて、PCRにより増幅し、それぞれのORFの両端に制限酵素サイトを付加した。得られたDNA断片を、ゼロBlunt-TOPO  PCRクローニングキット（インビトロジェン）を用いてサブクローニングし、DNA Sequencer model 3100（Applied Biosystems）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって配列を決定し、目的のUGT遺伝子がそれぞれクローン化されていることを確認した。【０１５４】
pESC酵母発現システム（ストラタジーン）を用いて、上記遺伝子を酵母で発現させるために、次の発現ベクターを構築した。
（1）プラスミドpESC-URA-UGT56またはpESC-URA-UGT56Rの構築
UGT85C2を制限酵素BglIIと制限酵素SalIで切り出し、ベクターpESC-URA（ストラタジーン）を制限酵素BamHIと制限酵素SalIで切断したものと連結して、プラスミドpESC-URA-UGT-1を得た。このプラスミドpESC-URA-UGT-1を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切断したものと、UGT91D2またはUGT91D2L＃16を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切り出したものを連結し、pESC-URA-UGT56またはpESC-URA-UGT56Rを得た。
（2）プラスミドpESC-HIS-UGT78の構築
UGT76G1を制限酵素BamHIと制限酵素SalIで切り出し、ベクターpESC-HIS（ストラタジーン）を同じ制限酵素で切断したものを連結し、プラスミドpESC-HIS-UGT-8を得た。このプラスミドpESC-HIS-UGT-8を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切断したものと、UGT74G1をNotIとPacIで切り出したものを連結し、pESC-HIS-UGT78を得た。
（3）プラスミドpESC-TRP-AtRHM2の構築
AtAHM2を制限酵素BamHIと制限酵素XhoIで切り出し、ベクターpESC-TRP（ストラタジーン）を同じ制限酵素で切断したものを連結し、プラスミドpESC-TRP-AtAHM2を得た。【０１５５】
酵母の形質転換
Saccharomyces cerevisiae YPH499株（ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1-Δ63  his3-Δ200 leu2-Δ1  a）を宿主として、酢酸リチウム法で、表１のプラスミドを導入した。形質転換株として、SC-Trp&Ura＆His寒天培地（1Lあたり、Yeast nitrogen baase without amino acids 6.7g、グルコース  20g、アミノ酸ミックスパウダー-Trp&Ura&His  1.3g、Bacto agar  20g）で生育するものを選抜した。
【表１】
2018124141.tif 000007
【０１５６】
なお、アミノ酸ミックスパウダー-Trp&Ura&Hisは、アデニン硫酸塩  2.5g、L-アルギニン塩酸塩  1.2g、L-アスパラギン酸  6.0g、L-グルタミン酸  6.0g、L-ロイシン3.6g、L-リジン  1.8g、L-メチオニン  1.2g、L-フェニルアラニン  3.0g、L-セリン  22.5g、L-スレオニン12g、L-チロシン  1.8g、L-バリン  9.0gを混ぜて調製した。【０１５７】
導入遺伝子の発現誘導と発現解析
得られた形質転換株を以下の通り培養した。
まず、前培養としてSC-Trp&Ura&His液体培地（SC- Trp&Ura&His寒天培地のBacto agarを除く）10 mlに、それぞれの形質転換株を植菌し、30℃で1日間振とう培養した。次に、本培養として前培養液のうち、1 mlを10 mlのSG-Trp&Ura&His液体培地（1Lあたり、Yeast nitrogen baase without amino acids 6.7g、ガラクトース  20g、アミノ酸ミックスパウダー-Trp&Ura&His  1.3g）に植菌し、30℃で2日間振とう培養した。【０１５８】
形質転換株で導入した遺伝子が発現したかどうかを確認するため、培養液から菌体を集め、RNeasy Mini Kitを用いて、トータルRNAを精製した。【０１５９】
トータルRNA  1μgをとり、スーパースクリプトII逆転写酵素（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ランダムヘキサマーをプライマーとして、cDNAを合成した。【０１６０】
導入遺伝子の発現を確認するために、以下のプライマーを作製した。
UGT85C2発現確認用
UGT85C2-r1：
5’-CAAGTCCCCAACCAAATTCCGT-3’ （配列番号３０）
UGT91D2およびUGT91D2L3#16発現確認用
UGT91D1L3-r1：
5’-CACGAACCCGTCTGGCAACTC-3’ （配列番号３１）
UGT74G1発現確認用
UGT74G1-r1：
5’-CCCGTGTGATTTCTTCCACTTGTTC-3’ （配列番号３２）
UGT76G1発現確認用
UGT76G1-r1：
5’-CAAGAACCCATCTGGCAACGG-3’ （配列番号３３）
AtAHM2 発現確認用
AtAHM2-r1
5’-GCTTTGTCACCAGAATCACCATT-3’ （配列番号３４）
GAL10p領域 （プロモーター領域）
PGAL10-f3：
5’-GATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCA-3’ （配列番号３５）
GAL1p領域（プロモーター領域）
PGAL1-f3：
5’-CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACC-3’ （配列番号３６）【０１６１】
各導入遺伝子が発現していることは、以下のプライマーの組み合わせで、先に合成したcDNAを鋳型として、ExTaq（タカラバイオ）を用いてPCRを行い、その産物をアガロースゲル電気泳動により確認した。
UGT85C2：UGT85C2-r1（配列番号３０）とPGAL1-f3（配列番号３６）
UGT91D2またはUGT91D2L3：UGT91D1L3-r1（配列番号３１）とPGAL10-f3（配列番号３５）
UGT74G1：UGT74G1-r1（配列番号３２）とPGAL1-f3（配列番号３６）
UGT76G1：UGT76G1-r1（配列番号３３）とPGAL10-f3（配列番号３５）
AtAHM2：AtAHM2-r1（配列番号３４）とPGAL10-f3（配列番号３５）
これにより、形質転換株で、導入した遺伝子が発現していることが確認できた。【０１６２】
Reb.Cの生産
培養は、本培養用の液体培地に培地1 mlあたり0.5μgまたは2μｇのステビオール（ChromaDex Inc.）を添加した以外は、上記実施例３と同様の条件で行った。培養終了後、培養液を遠心分離により、上清と菌体に分離した。培養上清を、アセトニトリルで洗浄後、水で平衡化したSep-Pak C18カラムに供し、20％ アセトニトリルで洗浄後、80％アセトニトリルで溶出し、乾固後、少量の80％ アセトニトリルに溶解して配糖体サンプルを調製した。この配糖体サンプルを以下の分析に供した。【０１６３】
HPLCによる分析
高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：HPLC）を用いて、得られた配糖体サンプルを分析した。HPLC条件は以下のとおりである。
カラム：コスモシール５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ  ４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５０ｍｍ（ナカライテスク）
移動相：Ａ；アセトニトリル、Ｂ；10mM リン酸ナトリウムバッファー（pH2.6）グラジエント：40min B conc70%→30％  linear gradient 
流速：１ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：ＵＶ  ２１０ｎｍ【０１６４】
LC-MSによる分析
LC-MSによる分析は、下記の条件で行った。
LC condition
カラム : Imtakt SM-C18 3.0 um  4.6 mm I.D.×250 mm
移動相：A: MilliQ Water (+0.2% acetic acid),  B: Methanol
グラジエント：0 - 5 min (B conc 10% 一定)、5 - 20 min (B conc 10% → 70%)、20 - 25 min (B conc 70% → 100%)、25 - 35 min (B conc 100% 一定)、35 - 36 min (B conc 100% → 10%)、45 min分析終了
流速：0.4 mL/min
カラムオーブン：４０℃
MS condition
ESI (negative mode) 
Selected ion monitoring: m/z 641.3、787.3、803.3、935.4、949.4、965.4、1111.4、1127.4、1259.5、1273.5、1289.5、1435.5
【０１６５】
結果を図9〜11に示した。UDP-ラムノース合成酵素遺伝子とステビオール配糖化酵素遺伝子を共発現させたA-5678株およびA-56R78株でReb.Cが生成した。UGT91D2L#16を発現させたA-56R78株のほうがUGT91D2を発現させたA-5678株よりReb.Cの生成量は多かった。【０１６６】
［実施例6］SrUGT91D2L#16の解析
ホモロジー構造解析
UGT91D2L＃16について、著しいラムノース転移活性に寄与するアミノ酸残基の推定を行った。UGT91D2L＃16とUGT91D2との間で異なる7残基のうち、どの残基が活性に関連しているかを推定するためにホモロジー構造解析を行った。既に結晶構造が解かれているマメ科メディカゴのUGT85H2の構造情報（RCSB Protein Data Bank(PDB)、PDB ID:2PQ6）をタンパク質構造の鋳型とし、糖供与体のUDP-グルコース（PDB ID:2C1Z）を基質としてドッキングさせ、既存の方法（Noguchi et al (2009) Plant Cell. 21(5):1556-152）でUGT91D2のホモロジーモデルを作製した。
構築されたUGT91D2ホモロジーモデルの中で、UGT91D2L＃16と異なる7残基の位置を確認したところ、156番目のThr残基がUDP-グルコースと近接しており、UDP-糖の選択性への寄与が示唆された。また233番目のSer残基についてもThr残基と近接しており、UDP-糖選択性への寄与が示唆された（図１２〜１３）。【０１６７】
変異体の作製
ホモロジーモデルから推定されたアミノ酸をUGT91D2およびUGT91DL#16において置換した変異体を作製した。変異体１および２は大腸菌発現タンパク質によるin vitroアッセイに用い、変異体１〜６は酵母によるin vivoアッセイに供した。
変異体１：UGT91D2-T156V（UGT91D2の156番目のThr残基をVal残基に置換）
変異体２：UGT91D2L#16-V156T（UGT91D2L#16の156番目のVal残基をThr残基に置換）
変異体３：UGT91D2-S233F（UGT91D2の233番目のSer残基をPhe残基に置換）
変異体４：UGT91D2L#16-F233S（UGT91D2L#16の233番目のPhe残基をSer残基に置換）
変異体５：UGT91D2-T156V/S233F（UGT91D2の156番目のThr残基をVal残基に、233番目のSer残基をPhe残基にそれぞれ置換）
変異体６：UGT91D2L#16-V156T/F233 （UGT91D2L#16の156番目のVal残基をThr残基に、233番目のPhe残基をSer残基にそれぞれ置換）【０１６８】
変異体をコードするＤＮＡを含むプラスミドは、以下のように調製した。変異体１を例にとると、下記のSrUGT91D2-T156V-FWとSrUGT91D2-pET15b-RVのプライマーセット（配列番号３９及び配列番号３８）でUT91D2のｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片と、SrUGT91D2-T156V-RVとSrUGT91D2-pET15b-FWのプライマーセット（配列番号４０及び配列番号３７）でUT91D2のｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片とを混合し、SrUGT91D2-pET15b-FWとSrUGT91D2-pET15b-RVのプライマーセット（配列番号３７及び配列番号３８）で再度PCRを行い、2断片を連結した増幅断片を得た。この連結断片を、NdeIとBamHIで消化した大腸菌発現ベクターpET15b（Novagen）にGeneArt Seamless Cloning and Assembly（Thermo Fisher Scientific社）を用いて挿入することで、UGT91D2-T156V変異体をコードするＤＮＡを含む大腸菌発現用プラスミドを得た。UGT91D2-T156V変異体をコードするＤＮＡについてはDNA Sequencer model 3100（Applied Biosystems）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって配列を決定し、目的変異以外に変異がないことを確認した。その他の変異体をコードするＤＮＡを含むプラスミドも同様にして調製した。【０１６９】
SrUGT91D2-pET15b-FW：
5’-TGCCGCGCGGCAGCCATATGTACAACGTTACTTATCATC-3’（配列番号３７）
SrUGT91D2-pET15b-RV：
5’-GTTAGCAGCCGGATCCTTAACTCTCATGATCGATGGCAA-3’（配列番号３８）
SrUGT91D2-T156V-FW：
5’-CACTTCTCCGTCGTCACTCCATG-3’ （配列番号３９）
SrUGT91D2-T156V-RV：
5’-CATGGAGTGACGACGGAGAAGTG-3’ （配列番号４０）
SrUGT91D2-Like-V156T-FW
5’-CACTTCTCCGTCACCACTCCATG-3’ （配列番号４１）
SrUGT91D2-Like-V156T-RV
5’-CATGGAGTGGTGACGGAGAAGTG-3’ （配列番号４２）
SrUGT91D2-S233F-FW
5’-CTGATTGTTTGCTTTTCAAATGTTACCATGAG-3’ （配列番号４３）
SrUGT91D2-S233F-RV
5’-CTCATGGTAACATTTGAAAAGCAAACAATCAG-3’ （配列番号４４）
SrUGT91D2L-F233S-FW
5’-CTGATTGTTTGCTTTCCAAATGTTACCATGAG-3’ （配列番号４５）
SrUGT91D2L-F233S-RV
5’-CTCATGGTAACATTTGGAAAGCAAACAATCAG-3’ （配列番号４６）
【０１７０】
大腸菌での評価
実施例３および４と同様の方法を用いて大腸菌で発現させた6種の変異型タンパク質はいずれも、CBB染色ならびにウェスタンブロット解析により、推定された５５ｋDa付近にバンドが確認された。
次に、変異体１および２について実施例４と同様に大腸菌で発現させたタンパク質を用いて評価を行った。糖受容体である基質としてルブソシドを用い、糖供与体についてはＵＤＰ−グルコースを用いてグルコシル化活性（ＧｌｃＴ）、ＵＤＰ−ラムノースを用いてラムノシル活性（ＲｈａＴ）をそれぞれ評価した。前者では反応生成物としてステビオシドが、後者では反応生成物としてズルコシドＡがそれぞれ生成する。【０１７１】
変異体１では、野生型UGT91D2のＧｌｃＴ活性を100％とした相対的なＧｌｃＴ活性は5.5％まで低下したが（図１４Ａ）、野生型UGT91D2のＲｈａＴ活性を100％とした相対的なＲｈａＴ活性は約4.4倍の高い活性を示した（図１４Ｂ）。一方、変異体２では、野生型のUGT91D2L#16のＧｌｃＴ活性を100％とした相対的なＧｌｃＴ活性は3.7倍の高い活性を示したが（図１４Ｃ）、野生型のUGT91D2L#16のＲｈａＴ活性を100％とした相対的なＲｈａＴ活性は35％と低い活性を示した（図１４Ｄ）。以上の結果から、UGT91D2の156番目の位置のアミノ酸がＴｈｒ残基の場合、主にＵＤＰ−グルコースへの糖供与体選択性にシフトし、同位置がＶａｌ残基の場合は主にＵＤＰ−ラムノースへ糖供与体選択性がシフトすることが分かった。【０１７２】
酵母での評価
次に酵母において変異体の特異性を確認するために、変異体１〜６の酵素活性をUGT91D2およびUGT91D2L＃16と比較、評価した。なお、各形質転換酵母に導入し発現させる遺伝子は、各種UGT91のいずれか１つ、UGT85C2、UGT74G1及びAtAHM2の4つとした。
（1）プラスミドpESC-URA-UGT56Mの構築
変異体の酵母発現用ベクターは、以下の通り構築した。上記で作製した各種変異体をコードするＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として、SrUGT91D2セットのプライマー（配列番号２２、２３）を用いてＰＣＲにてＤＮＡを増幅した。実施例５と同様に、制限酵素で切断したＤＮＡ断片を、プラスミドpESC-URA-UGT-1に組み込み、UGT85C2とそれぞれのUGT91D2変異体を共発現できるプラスミドpESC-URA-UGT56M1〜pESC-URA-UGT56M6を構築した。
（2）プラスミドpESC-HIS-UGT7の構築
UGT74G1を制限酵素NotIとPacIで切り出し、ベクターpESC-HISを同じ制限酵素で切断したものと連結し、プラスミドpESC-HIS-UGT7を得た。
なお、UGT91D2、UGT91D2L＃16またはAtAHM2のベクターとしては、実施例５で用いたpESC-URA-UGT56、pESC-URA-UGT56RまたはpESC-TRP-AtAHM2をそれぞれ用いた。【０１７３】
酵母の形質転換
Saccharomyces cerevisiae YPH499株を宿主として、酢酸リチウム法で、プラスミドpESC-TRP-AtAHM2と、pESC-HIS-UGT7と、ESC-URA-UGT56M1〜pESC-URA-UGT56M6、pESC-URA-UGT56およびpESC-URA-UGT56Rのいずれか１つとを組み合わせて導入し、実施例５と同様に形質転換株を選抜した。こうしてUGT91D2の違いより、8種類の形質転換株を得た。得られた形質転換株で導入遺伝子が発現していることは、実施例５と同様に確認した。各形質転換株の培養と培養上清のステビオール配糖体の分析は、培地1mlあたり2μgのステビオールを添加して行ったこと以外は、実施例５と同様に行った。【０１７４】
酵母の培養上清中のステビオール配糖体の分析の結果、UGT91D2ベースの変異体（変異体１、３、５）を発現させた酵母において、ＧｌｃＴ活性生成物であるステビオシドの生成量が低下する傾向が見られた。例えば、変異体５を発現させた酵母では、野生型のUGT91D2を発現させた酵母のステビオシド生成量を100％とした場合に、37.5％まで低下が見られ、その活性はUGT91D2L#16の野生型と同等であった（図１５Ａ）。一方、UGT91D2L#16ベースの変異体（変異体２、４、６）のＧｌｃＴ活性は、いずれも野生型UGT91D2L#16より高く、変異体６の活性は野生型UGT91D2L#16の約2.7倍まで上昇し、野生型UGT91D2と同等であった（図１５Ａ）。【０１７５】
ＲｈａＴ活性生成物であるズルコシドAの生成量については、野生型のUGT91D2を発現させた酵母のズルコシド生成量に比べ、変異体１、３および５を発現させた酵母において約1.5倍以上の増加が確認できた（図１５Ｂ）。一方、UGT91D2L#16ベースの変異体のＲｈａＴ活性については、いずれの変異体においても野生型UGT91D2L#16に比べ30％以上の低下が認められた。
さらにズルコシドA以外のステビオールラムノシド2種（ステビオール13位-Glc-Rha(α1,2）、19位-Glc-Rha(α1,2）、およびステビオール13位-Glc-Rha(α1,2）、19位-H）についてもズルコシドAと同様の生成物挙動を示した（図１５Ｃ〜Ｄ）。
以上の結果から、大腸菌組換えタンパク質の結果と同様に、酵母によるデノボ発現によってもUGT91D2の156番目の残基がValの場合はステビオール配糖体の糖がラムノースへシフトし、Thrの場合はグルコースにシフトすることが確認できた。さらに233番目の残基についてもPheの場合はラムノース、Serの場合はグルコースへぞれぞれシフトすることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１７６】
本発明によれば、SrUGT91D2L＃16遺伝子を利用してステビオールの13位グルコースの2位をラムノシル化することができ、ステビオール配糖体の甘味度および味質を制御させることができる。これらの遺伝子をマーカーとしてReb.Cの含有率の異なる植物体を選抜することができる。また本発明は、植物のみならず微生物においてReb.Cに代表されるラムノースを含有するステビオール配糖体を生産させるための分子ツールを与える。
【配列表フリーテキスト】
【０１７７】
配列番号２について、アミノ酸残基X1とは第42番目のアミノ酸残基Pheを示し、アミノ酸残基X2とは第156番目のアミノ酸残基Valを示し、アミノ酸残基X3とは第233番目のアミノ酸残基Pheを示し、アミノ酸残基X4とは第298目のアミノ酸残基Alaを示し、アミノ酸残基X5とは第394番目のアミノ酸残基Leuを示し、アミノ酸残基X6とは第439番目のアミノ酸残基Asnを示し、アミノ酸残基X7とは第471番目のアミノ酸残基Pheを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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