(57)【要約】  2-[4-[2-(ベンズイミダゾール-2-イルチオ)エチル]ピペラジン-1-イル]-N-[2,4-ビス(メチルチオ)-6-メチル-3-ピリジル]アセトアミドの一塩酸塩、及び有機酸を含有する、経鼻投与用医薬組成物により、ACAT阻害剤をより効率的に脳内に送達させることができる。
2018092765.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2-[4-[2-(ベンズイミダゾール-2-イルチオ)エチル]ピペラジン-1-イル]-N-[2,4-ビス(メチルチオ)-6-メチル-3-ピリジル]アセトアミドの塩酸塩、及び有機酸を含有する、経鼻投与用医薬組成物。
【請求項２】
前記有機酸がカルボン酸である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記カルボン酸の分子構造内にヒドロキシ基を有する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記カルボン酸がヒドロキシ基を2つ以上有する、請求項２又は３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記カルボン酸が、アルドン酸、カルボキシ基を2つ以上有する脂肪族ヒドロキシ酸、及びウロン酸を構成糖として有する多糖類からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項２〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
液体製剤である、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記2-[4-[2-(ベンズイミダゾール-2-イルチオ)エチル]ピペラジン-1-イル]-N-[2,4-ビス(メチルチオ)-6-メチル-3-ピリジル]アセトアミドの塩酸塩の脳内への送達用である、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
脳内のコレステロールエステル又はヒドロキシコレステロールエステルの産生抑制用である、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
脳神経変性死抑制用である、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
脳内アミロイドβ産生抑制又は除去用である、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
脳神経変性疾患の予防又は治療用である、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経鼻投与用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、先進国では食生活及び医療福祉の改善により、長寿社会が実現すると共に高齢化が進み、これに伴い高齢者の認知症の増加が社会問題となりつつある。認知症の発症機構について、完全には明らかとはなっていないが、現時点では、酸化ストレス等の環境因子や代謝物、或いは遺伝子変異が、神経細胞の機能を乱すことによって細胞死を引き起こし、最終的に運動障害や認知障害を齎すと考えられている。現在、世界の認知症患者数は4680万人いるとされ、2050年にはその3倍の1億3200万人に達すると予測されている。認知症の中ではアルツハイマー病（AD）が最も多い疾患であり、その治療薬の開発は国際的要請である。【０００３】
現在、ADの治療法として確立されているのは、アセチルコリンエステラーゼ（AChE）を阻害することでアセチルコリン濃度の減少を抑制し、これにより神経伝達を維持する方法である。米国食品医薬品局（FDA）はADの治療のために４種のコリンエステラーゼ阻害剤：タクリン、ドネペジル、リバスチグミン及びガランタミンを認可しているが、長期的効果、非常に軽度なADに対する効果、及び重篤なADに対する効果は未だ実証されていない。【０００４】
近年、コレステロールの脂肪酸エステルと神経変性疾患との関連を示唆する報告がなされている。非特許文献１では、細胞をヒドロキシコレステロール（24S-OHC：24(S)-hydroxycholesterol）で処理すると、細胞内においてその脂肪酸エステルが増加し、脂肪滴と呼ばれる構造体が形成され、そして神経細胞死が引き起こされることが報告されている。非特許文献２及び特許文献１では、ヒドロキシコレステロールに脂肪酸をエステル縮合させる酵素（ACAT：acyl-CoA:cholesterol acyltransferase）の阻害剤により、上記脂肪滴が消失し、神経細胞死が抑制されることが報告されている。非特許文献３では、ACAT阻害剤が遊離コレステロールとコレステロールの脂肪酸エステルとの平衡を緊密に制御することによって、神経細胞死の原因であるアミロイドβ産生を抑制することを報告している。非特許文献４では、ACAT-1選択的阻害剤である2-[4-[2-(ベンズイミダゾール-2-イルチオ)エチル]ピペラジン-1-イル]-N-[2,4-ビス(メチルチオ)-6-メチル-3-ピリジル]アセトアミドの一塩酸塩：非特許文献５（本明細書では、「化合物Aの一塩酸塩」と示すこともある）が、オートファジー（自食）を促進し、アミロイドβを除去することが報告されている。このため、ACAT阻害剤は、AD等の認知症の治療に有用であると考えられている。なお、非特許文献６では、24S-OHCはCYP46A１によりコレステロールの24位が水酸化されたヒドロキシコレステロールである。ACAT-1ノックアウトマウスを用いた研究では、コレステロールエステル化の抑制による遊離コレステロールの増加に伴い、24S-OHCへの変換が増加することが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2014-091703号公報
【特許文献２】国際公開第98/54153号
【特許文献３】国際公開第2004/076441号
【特許文献４】特表2007-534686号公報
【特許文献５】国際公開第2011/081118号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Bio. Chem., 2011, 286, 24666-24673
【非特許文献２】Cell Death & Disease 2014, 990e
【非特許文献３】Nat. Cell. Biol. 2001, 3, 905
【非特許文献４】J. Neurosci., 2014, 34, 14484- 14501
【非特許文献５】Atherosclerosis 2007, 191, 290-297
【非特許文献６】Proc. Nat. Acad. Sci. 2010, 107, 3081-3086.
【非特許文献７】薬学雑誌、2012, 132, 1247-1253
【非特許文献８】Expert Opin. Drug. Deliv. 2013, 10, 957-972
【非特許文献９】Am. J. Rhinol. Allergy, 2015, 29, 124-127
【非特許文献１０】J. Pharm. Sci., 2005, 94, 1736-1746
【非特許文献１１】Eur. J. Pharm. Biopharm., 2008, 70, 735-740
【非特許文献１２】Int. J. Pharm., 2008, 358, 285-291
【非特許文献１３】J. Drug Target., 2008, 16, 806-814
【非特許文献１４】J. Drug Target., 2010, 18, 223-234
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ACAT阻害剤を効率的に脳内に送達することができれば、神経細胞内のヒドロキシコレステロールの脂肪酸エステル体の量を減少させることができ、これにより神経細胞死を抑制することができ、ひいてはAD等の認知症を、より効果的に予防及び治療することができると考えられる。【０００８】
薬物を脳内に効率的に送達する方法の1つとして、経鼻投与が報告されている。薬物を経鼻投与すると、嗅上皮から嗅球を介して脳内に薬物が送達される、或いは薬物が嗅上皮の間隙を通過して、嗅神経軸索の間隙又は神経索とグリア細胞の間隙を満たしている脳脊髄液に到達すると考えられている（非特許文献７）。【０００９】
血液脳関門を迂回する薬物の脳内送達法として経鼻投与法の総説が多く報告されているが、その主目的は即効性であり、薬剤の全身暴露を低減することにより全身性の副作用の軽減と生体利用率（Bioavailability:BA）の改善を志向している。特にナノ粒子のポリマー担体やマイクロエマルジョン、ナノエマルジョンとすることにより鼻腔上皮細胞の経粘膜を通過し易くし、その吸収改善を目指している（非特許文献８）。【００１０】
一方で、経鼻投与による脳内到達法は未だ議論の余地があり、同一物質（ドーパミン）でも矛盾する結果を生じ確実な方法ではないと疑問視する報告もある（非特許文献９）。【００１１】
AChE阻害剤であるガランタミン臭酸塩は溶解性が低く、経口投与した際に吐き気や嘔吐などの重篤な胃腸への副作用が知られている。そこで臭酸塩から乳酸等にイオン交換することにより溶解度が顕著に改善され、それをラットに経鼻投与することで薬物の送達経路が消化管、肝臓及び肺を迂回する。その結果、中枢神経に対するBAは改善し且つTmax（最高血中濃度の到達時間）も経口投与よりも短縮することで即効性を示した。しかしながら、本投与法ではAUC（血中濃度−時間曲線下面積、area under the blood concentration-time curve）には、経口投与における血漿AUC 13288 min・ng/mL に対して 経鼻投与における血漿AUC 11031 min・ng/mL であり、大差は見られていない（非特許文献１０、特許文献４）。【００１２】
女性ホルモンであるエストラジオールがAD女性患者では低く、リスク要因であるとの報告もある。そこでエストラジオールをキトサンに担体支持したナノ粒子製剤をラットに経鼻投与したところ、静脈内投与と比較し、脳脊髄液(CSF)における薬物濃度はそれぞれAUC（12788 ng・min/mL vs 6121 ng・min/mL）となり、2.5倍の効率性を示した（非特許文献１１）。【００１３】
抗精神病治療薬のリスペリドン(Risperidone)は経口投与では肝臓の初回通過効果によりBAが低い。そこで、放射標識されたリスペリドンのナノエマルジョン製剤をラットに経鼻投与すると即効性が期待できたが、静脈内投与と比較し、脳内のAUC（0.45 % h/g vs 0.48 % h/g）となり、脳内暴露では何ら効果はない (非特許文献１２) 。【００１４】
統合失調症治療薬のオランザピン(olanzapine)を放射標識したナノエマルジョン製剤をラットに経鼻投与すると、静脈内投与と比較し、脳内のAUC（5.4 % h/g vs 2.5 % h/g）となり、2倍の効率性を示した（非特許文献１３）。【００１５】
パーキンソン病治療薬のドーパミンD2アゴニストである放射標識されたロピニロール(Ropinirole) をキトサンとのヒドロキシプロピルメチルセルロースから成るゲル製剤をラットに経鼻投与すると、静脈内投与と比較し、脳内における薬物放射能濃度はそれぞれAUC（869 % min/g vs 102 % min/g）となり、 8.5倍の効率性を示した（非特許文献１４）。【００１６】
本発明は、ACAT阻害剤をより効率的に脳内に送達させる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、ACAT阻害剤として2-[4-[2-(ベンズイミダゾール-2-イルチオ)エチル]ピペラジン-1-イル]-N-[2,4-ビス(メチルチオ)-6-メチル-3-ピリジル]アセトアミド（本明細書において、「化合物A」と示すこともある。）の一塩酸塩を選択し、これと有機酸を組み合わせたものを経鼻投与することにより、単回投与であっても非常に多量のACAT阻害剤を脳内に送達できることを見出した。本発明者はこのような知見に基づき、さらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。【００１８】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
項１．  2-[4-[2-(ベンズイミダゾール-2-イルチオ)エチル]ピペラジン-1-イル]-N-[2,4-ビス(メチルチオ)-6-メチル-3-ピリジル]アセトアミドの一塩酸塩、及び有機酸を含有する、経鼻投与用医薬組成物。【００１９】
項２．  前記有機酸がカルボン酸である、項１に記載の医薬組成物。【００２０】
項３．  前記カルボン酸の分子構造内にヒドロキシ基を有する、項２に記載の医薬組成物。【００２１】
項４．  前記カルボン酸がヒドロキシ基を2つ以上有する、項２又は３に記載の医薬組成物。【００２２】
項５．  前記カルボン酸が、アルドン酸、カルボキシ基を2つ以上有する脂肪族ヒドロキシ酸、及びウロン酸を構成糖として有する多糖類からなる群より選択される少なくとも1種である、項２〜４のいずれかに記載の医薬組成物。【００２３】
項６．  液体製剤である、項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。【００２４】
項７．  前記2-[4-[2-(ベンズイミダゾール-2-イルチオ)エチル]ピペラジン-1-イル]-N-[2,4-ビス(メチルチオ)-6-メチル-3-ピリジル]アセトアミドの一塩酸塩の脳内への送達用である、項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。【００２５】
項８．  脳内のコレステロールエステル又はヒドロキシコレステロールエステルの産生抑制用である、項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。【００２６】
項９．  脳神経変性死抑制用である、項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。【００２７】
項１０．  脳内アミロイドβ産生抑制又は除去用である、項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。【００２８】
項１１．  脳神経変性疾患の予防又は治療用である、項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。【００２９】
項１２．  2-[4-[2-(ベンズイミダゾール-2-イルチオ)エチル]ピペラジン-1-イル]-N-[2,4-ビス(メチルチオ)-6-メチル-3-ピリジル]アセトアミドの塩酸塩、及び有機酸を含有する組成物を、経鼻投与することを含む、疾患治療方法。【００３０】
項１３．  経鼻投与剤としての使用のための、
2-[4-[2-(ベンズイミダゾール-2-イルチオ)エチル]ピペラジン-1-イル]-N-[2,4-ビス(メチルチオ)-6-メチル-3-ピリジル]アセトアミドの塩酸塩、及び有機酸を含有する組成物。【００３１】
項１４．  経鼻投与剤の製造のための、
2-[4-[2-(ベンズイミダゾール-2-イルチオ)エチル]ピペラジン-1-イル]-N-[2,4-ビス(メチルチオ)-6-メチル-3-ピリジル]アセトアミドの塩酸塩、及び有機酸を含有する組成物の使用。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、ACAT阻害剤をより効率的に脳内に送達させることができる。よって、ACAT阻害剤の作用により、神経細胞死の原因であるヒドロキシコレステロールエステルの量をより効果的に抑制することができる。このため、本発明によれば、脳神経変性疾患を、より効果的に予防及び治療することが可能となる。さらに、本発明によれば、脆弱且つ繊細な嗅上皮組織をより傷つけることなく、ACAT阻害剤をより効率的に脳内に送達させることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】マウス（各群n=5）に化合物Aの一塩酸塩を単回経口投与（6mg/kg）した際の、血漿、大脳、小脳、嗅球における化合物Aの薬物動態を示す（参考例1）。縦軸は、各組織中における化合物Aの薬物濃度（ng/mL、又は、ng/g）を示し、横軸は化合物Aの一塩酸塩の投与後の経過時間（0, 30, 60, 120 min）を示し、各プロットは平均値を示し、プロット上のバーは標準偏差を示す。
【図２】マウス（各群n=5）に化合物Aの一塩酸塩の0.01N塩酸水溶液10μL又は50μLを、それぞれ7日間に渡り、1日1回経鼻投与した際の、嗅球、脳、血漿中における化合物Aの濃度を示す（参考例２）。縦軸は、各組織中における化合物Aの薬物濃度（ng/mL、又は、ng/g）を示し、横軸は化合物Aの一塩酸塩の投与後の経過時間（0, 15, 30, 45, 60, 120 min, 血漿は更に240, 360 min）を示し、各プロットは平均値を示し、プロット上のバーは標準偏差を示す。
【図３】マウス（各群n=5）に化合物Aの一塩酸塩の0.01N塩酸水溶液10μLを、単回経鼻投与した際の、或いは7日間に渡り、1日1回経鼻投与した際の、血漿、大脳、嗅球における化合物Aの薬物動態を示す（参考例3）。縦軸は、各組織中における化合物Aの薬物濃度（ng/mL、又は、ng/g）を示し、横軸は化合物Aの一塩酸塩を投与後の経過時間（0, 15, 30, 45, 60, 120 min）を示し、各プロットは平均値を示し、プロット上のバーは標準偏差を示す。
【図４】マウス（各群n=5）に化合物Aの一塩酸塩のヒアルロン酸、グルコン酸、又はクエン酸水溶液10μLを単回経鼻投与した際の、大脳における化合物Aの濃度を示す（実施例1）。縦軸は、大脳における化合物Aの薬物濃度（ng/g）示し、横軸は化合物Aの一塩酸塩の投与後の経過時間（0, 15, 30, 120 min）を示し、各プロットは平均値を示し、プロット上のバーは標準偏差を示す。
【図５】化合物Aの一塩酸塩のクエン酸水溶液を反復投与（各群n=4）した際の、大脳における総コレステロールの濃度 (μmol/g)（左側の図）及びコレステロールエステル体の濃度(μmol/g)（右側の図）を示す（実施例2）。縦軸は、脳における総コレステロールの濃度（左側の図）又はコレステロールエステル体の濃度（右側の図）を示し、横軸中対照群は化合物Aの一塩酸塩非投与群を示し、横軸中化合物Aの一塩酸塩は化合物Aの一塩酸塩投与群を示す。白カラムは非けん化処理サンプルの測定値を示し、黒カラムはけん化処理サンプルの測定値を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。
【図６】化合物Aの一塩酸塩のクエン酸水溶液を反復投与（各群n=5）した際の、大脳における24(S)−ヒドロキシコレステロー濃度 (nmol/g)を示す（実施例3）。縦軸は、24(S)−ヒドロキシコレステロール濃度を示し、横軸中対照群は化合物Aの一塩酸塩非投与群を示し、横軸中化合物Aの一塩酸塩は化合物Aの一塩酸塩のクエン酸水溶液投与群を示す。各群のカラムはけん化処理サンプルの測定値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００３５】
本発明は、その一態様において、2-[4-[2-(ベンズイミダゾール-2-イルチオ)エチル]ピペラジン-1-イル]-N-[2,4-ビス(メチルチオ)-6-メチル-3-ピリジル]アセトアミドの一塩酸塩、及び有機酸を含有する、経鼻投与用医薬組成物（本明細書において、「本発明の医薬組成物」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００３６】
2-[4-[2-(ベンズイミダゾール-2-イルチオ)エチル]ピペラジン-1-イル]-N-[2,4-ビス(メチルチオ)-6-メチル-3-ピリジル]アセトアミド（化合物A）は、以下の式：
【００３７】
【化１】
2018092765.tif 000003
【００３８】
で表される化合物である。化合物Aは、2種類のACAT（ACAT-1とACAT-2）の内、ACAT-1を選択的に阻害することができる。
【００３９】
化合物Aは、公知の方法に従って又は準じて、製造することができる。例えば、特許文献２に記載の方法に従って又は準じて、製造することが可能である。
【００４０】
化合物Aの塩酸塩は、化合物Aと塩酸とから形成される塩である限りにおいて特に制限されない。該塩酸塩における塩酸付加数は、例えば1〜4つ、好ましくは1〜2つ、より好ましくは1つである。
【００４１】
化合物Aの塩酸塩は、公知の方法に従って又は準じて、製造することができる。例えば、特許文献３に記載の方法に従って又は準じて、製造することが可能である。
【００４２】
化合物Aの塩酸塩は、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒和物を形成する溶媒としては、例えば、水や、薬学的に許容される有機溶媒（例えばエタノール、グリセロール、酢酸等）等が挙げられ、好ましくは水が挙げられる。
【００４３】
化合物Aの塩酸塩は1種単独でもよく、2種以上の組合せであってもよい。
【００４４】
本発明の医薬組成物における「化合物Aの塩酸塩」の含有量は特に制限されないが、本発明の医薬組成物の乾燥質量を100質量％とした場合に、例えば5〜95質量％、好ましくは10〜90質量％、さらに好ましくは40〜80質量％である。
【００４５】
有機酸は、薬学的に許容される有機酸である限り特に制限されない。有機酸としては、より効率的に化合物Aを脳内に送達できるという観点から、例えばカルボキシ基を有する有機酸が挙げられ、この中でも好ましくはその分子構造内にヒドロキシ基を（例えば1つ以上、2つ以上、3つ以上）有する有機酸が挙げられ、より好ましくはアルドン酸、カルボキシ基を2つ以上有する脂肪族ヒドロキシ酸、ウロン酸を構成糖として有する多糖類等が挙げられる。また、有機酸は、より効率的に化合物Aを脳内に送達できるという観点から、水に溶け易いことが好ましく、より具体的には有機酸1 gを溶かすのに要する水の量が例えば30 mL未満、好ましくは10 mL未満、より好ましくは5 mL未満、さらに好ましくは3 mL未満である。
【００４６】
アルドン酸は、アルドースの1位のホルミル基がカルボキシ基に置き換えられてなるカルボン酸であれば特に制限されず、例えばグルコン酸、ガラクトン酸、マンノン酸等が挙げられ、これらの中でも、より効率的に化合物Aを脳内に送達できるという観点から、好ましくはグルコン酸が挙げられる。
【００４７】
カルボキシ基を2つ以上有する脂肪族ヒドロキシ酸としては、特に制限されない。該ヒドロキシ酸が有するカルボキシ基の数としては、より効率的に化合物Aを脳内に送達できるという観点から、好ましくは2〜5つ、より好ましくは3〜4つ、さらに好ましくは3つである。該ヒドロキシ酸の炭素原子数としては、より効率的に化合物Aを脳内に送達できるという観点から、好ましくは3〜10個、より好ましくは4〜8個、さらに好ましくは5〜7個である。該ヒドロキシ酸の具体例としては、クエン酸、リンゴ酸、タルトロン酸、酒石酸、イソクエン酸等が挙げられ、これらの中でも、より効率的に化合物Aを脳内に送達できるという観点から、好ましくはクエン酸が挙げられる。
【００４８】
ウロン酸を構成糖として有する多糖類としては、特に制限されない。ウロン酸は、単糖の主鎖の末端のヒドロキシメチル基がカルボキシ基に置き換えられてなるカルボン酸であれば特に制限されず、例えばグルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、イズロン酸等が挙げられ、これらの中でも、より効率的に化合物Aを脳内に送達できるという観点から、好ましくはグルクロン酸が挙げられる。ウロン酸を構成糖として有する多糖類は、構成糖としてウロン酸のみを有していてもよく、構成糖としてウロン酸以外の糖を有していてもよい。ウロン酸を構成糖として有する多糖類の具体例としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン4−硫酸、コンドロイチン6−硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン等が挙げられ、これらの中でも、より効率的に化合物Aを脳内に送達できるという観点から、好ましくはヒアルロン酸が挙げられる。
【００４９】
有機酸の具体例としては、上記以外にも、ギ酸、酢酸、プロピオン酸等の脂肪族カルボン酸；  安息香酸等の芳香族カルボン酸；  乳酸、メバロン酸、パントイン酸、キナ酸、シキミ酸等の脂肪族ヒドロキシ酸；  サリチル酸、没食子酸等の芳香族ヒドロキシ酸；  コハク酸、マレイン酸、フマル酸等の脂肪族ジカルボン酸等、更にメタンスルホン酸などのアルキルスルホン酸が挙げられる。
【００５０】
有機酸は1種単独でもよく、2種以上の組合せであってもよい。
【００５１】
本発明の医薬組成物における有機酸の含有量は特に制限されないが、本発明の医薬組成物の乾燥質量を100質量％とした場合に、例えば5〜95質量％、好ましくは10〜90質量％、より好ましくは20〜60質量％である。
【００５２】
本発明の医薬組成物における、化合物Aの一塩酸塩と有機酸との含有比は特に制限されないが、化合物Aの一塩酸塩100質量部に対して、例えば5〜400質量部、好ましくは10〜200質量部、より好ましくは20〜150質量部、さらに好ましくは30〜100質量部である。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、化合物Aの一塩酸塩と有機酸を含有する限りにおいて特に制限されず、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではないが、例えば溶媒、基剤、担体、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤、溶解補助剤、刺激低減剤等が挙げられる。
【００５４】
本発明の医薬組成物の剤形は、そのまま経鼻投与に用いることができる剤形、或いは使用時に溶媒を添加して経鼻投与に用いることができる剤形である限り特に制限されず、その使用態様に応じて適切な剤形を採ることができる。剤形としては、例えば液体製剤；  軟膏剤、ゼリー剤、クリーム剤、ムース剤等の半固形製剤；  顆粒剤、散剤、丸剤、錠剤等の固形製剤等が挙げられる。経鼻投与により適している（すなわち、より簡便に（例えば溶媒添加等することなく）経鼻投与に用いることができる）という観点から、剤形は、液体製剤、半固形製剤等が好ましく、液体製剤がより好ましい。液体製剤の中でも、より効率的に化合物Aを脳内に送達できるという観点から、溶媒として水を含む（好ましくは溶媒全量に対して50質量％以上、80質量％以上、90質量％以上、99質量％以上含む）水性液体製剤が好ましい。
【００５５】
なお、化合物Aの一塩酸塩は水に難溶（水100質量％に対して0.02〜0.05質量％）であるが、本発明の医薬組成物は、有機酸を含有していることにより、水性液体製剤であっても（好ましくは水をより多く含む水性液体製剤であっても）化合物Aの一塩酸塩をより多く溶解することが可能である。この観点から、本発明の医薬組成物が水性液体製剤である場合、本発明の医薬組成物100質量％に対する「化合物Aの一塩酸塩」の割合は、例えば0.1〜10質量％、好ましくは0.3〜5質量％、より好ましくは0.8〜2質量％である。
【００５６】
また、本発明の医薬組成物が水性液体製剤である場合、化合物Aの一塩酸塩をより多く溶解した状態で含有しつつも、pHをより高く保つことができる。この観点から、本発明の医薬組成物が水性液体製剤である場合のpHは、例えばpH 2.3〜5、好ましくはpH 2.9〜4である。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、例えば特許文献５の記載に準じて、製造することができる。一例として、本発明の医薬組成物が水性液体製剤の場合であれば、化合物Aの一塩酸塩、有機酸、水を含む溶媒、及び必要に応じて他の成分を混合し、必要に応じて超音波照射を加えて化合物Aの一塩酸塩を溶解させることによって、製造することができる。
【００５８】
本発明の医薬組成物によれば、化合物Aの一塩酸塩をより効率的に脳内へ送達することができる。これにより、化合物AのACAT-1選択的阻害作用を脳の神経細胞内で発揮することができ、脳内のコレステロールエステルやヒドロキシコレステロールエステルの産生を抑制することができ、さらには脳内アミロイドβの産生の抑制又は除去が可能である。したがって、本発明の医薬組成物によれば、脳神経変性死を抑制し、さらには脳神経変性疾患の予防又は治療も可能である。また、本発明の医薬組成物によれば、上記のみならず、化合物Aの作用に基づく各種疾患の予防又は治療が可能である。
【００５９】
抑制対象であるヒドロキシコレステロールエステルは、ヒドロキシコレステロールのヒドロキシ基（好ましくは3位のヒドロキシ基、或いは24−ヒドロキシコレステロールの場合は3位又は24位のヒドロキシ基）と、脂肪酸のカルボキシ基とがエステル結合してなるエステル体である限り特に限定されない。抑制対象であるコレステロールエステルは、コレステロールのヒドロキシ基と、脂肪酸のカルボキシ基とがエステル結合してなるエステル体である限り特に限定されない。
【００６０】
ヒドロキシコレステロールは、特に限定されることはない。ヒドロキシコレステロールとしては、例えば生体内、好ましくはヒト生体内、より好ましくはヒト脳又は血液内に存在するヒドロキシコレステロールが挙げられる。具体的には、例えば24（好ましくは24（S））−ヒドロキシコレステロール、7−ケトコレステロール、7α−ヒドロキシコレステロール、7β−ヒドロキシコレステロール、22（好ましくは22（R））−ヒドロキシコレステロール、25−ヒドロキシコレステロール、27−ヒドロキシコレステロール、24S，25−エポキシコレステロール等が挙げられ、これらの中でも好ましくは24−ヒドロキシコレステロール、7−ケトコレステロール、7α−ヒドロキシコレステロール、7β−ヒドロキシコレステロール、22−ヒドロキシコレステロール等が挙げられ、より好ましくは24−ヒドロキシコレステロールが挙げられる。
【００６１】
脂肪酸は、特に限定されることはない。脂肪酸としては、例えば生体内、好ましくはヒト生体内、より好ましくはヒト脳又は血液内に存在する脂肪酸が挙げられる。具体的には、例えば炭素原子数10〜30の脂肪酸（好ましくは直鎖状）が挙げられ、好ましくは炭素原子数10〜30の脂肪酸が挙げられ、より好ましくは炭素原子数13〜27の脂肪酸が挙げられ、さらに好ましくは炭素原子数15〜25の脂肪酸が挙げられ、よりさらに好ましくは炭素原子数18〜22の脂肪酸が挙げられる。より具体的には、例えばドコサヘキサエン酸、アラキドン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、γ−リノレン酸、α−リノレン酸、ミリスチン酸、パルミトレイン酸、ドコサペンタエン酸等が挙げられ、これらの中でも好ましくはドコサヘキサエン酸、アラキドン酸、リノール酸、オレイン酸等が挙げられる。
【００６２】
脳神経変性疾患としては、特に制限されないが、例えばアルツハイマー型痴呆、パーキンソン症候群、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはアルツハイマー型痴呆が挙げられる。また、化合物Aの作用に基づく各種疾患としては、膠芽腫が挙げられる。
【００６３】
本発明の医薬組成物の投与量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分である本発明の化合物の重量として、一日あたり0.01〜10 mg/kg体重である。上記投与量は1日1回又は2〜3回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
【実施例】
【００６４】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００６５】
参考例1
ICR雌マウス1群5匹に、2-[4-[2-(ベンズイミダゾール-2-イルチオ)エチル]ピペラジン-1-イル]-N-[2,4-ビス(メチルチオ)-6-メチル-3-ピリジル]アセトアミドの一塩酸塩（化合物Aの一塩酸塩）の0.05N塩酸水で調製した水溶液を、マウスの体重換算で化合物Aの一塩酸塩の投与量が6 mg/kgとなるように、イソフルラン麻酔下で単回経口投与した。【００６６】
投与から5、15、30、45、60、120分後に、イソフルラン麻酔下で、ヘパリン添加シリンジを用いて腹部大静脈より約0.5 mLの血液を採取し、得られた血液を遠心分離（4℃、1,500×g、10分間）して血漿を得た。投与後の各時間における採血後、各群のマウスを麻酔下で放血死させ、採血開始から15分以内に大脳、小脳及び嗅球を摘出、分離し生理食塩水で洗浄した。それぞれの重量を測定した後、摘出した大脳は9倍量の生理食塩水を添加し、ホモジナイザーを用いてホモジナイズした(ホモジネート液 500 μL が脳50 mgに相当)。小脳は9倍量の生理食塩水を添加し、ビーズ式ホモジナイザーを用いてホモジナイズ（5000 rpm、10秒、2 回）した(ホモジネート液 500 μL が小脳50 mgに相当)。嗅球は19倍量の生理食塩水を添加し、ビーズ式ホモジナイザーを用いてホモジナイズ（5000 rpm、10秒、2 回）した(ホモジネート液 500 μL が嗅球25 mgに相当)。それぞれチューブに入れ、液体窒素で急速冷凍した。それぞれのサンプル中の化合物A濃度を、LC-MSにより測定した。【００６７】
測定結果を図１に示す。化合物Aの濃度は投与から5分後に血漿、大脳はそれぞれ5.01 ng/mL、1.14 ng/gのCmaxに達し、小脳は30分後に0.62 ng/ gのCmaxに達し、その後、速やかに減衰した。嗅球中の化合物Aの濃度は、投与後のいずれの時間においても定量下限（LLOQ）（1 ng/g）未満であった。大脳中の化合物Aの濃度及び小脳中の化合物Aの濃度の、血漿中の化合物Aの濃度に対する割合は、それぞれ0.114〜0.245及び0.127〜0.136であり、差はほとんどなかった。以上より、化合物Aの一塩酸塩は経口投与でも血液脳関門を通過し、脳内移行することが判明した。【００６８】
参考例2
化合物Aの一塩酸塩を効率的に脳内移行させるための経鼻投与法を開発すべく、化合物Aの一塩酸塩の各媒体に対する溶解度を測定した。その結果、化合物Aの一塩酸塩の溶解度は、Milli-Q水（超純水）では0.4 mg/mL、0.01N塩酸水では3.2 mg/mL、0.05N 塩酸水では 9.6 mg/mLであった。一方で、各媒体の刺激性及び忍容性を確認する目的で、各媒体をマウスにイソフルラン麻酔下で経鼻投与した結果、0.05N 塩酸水を経鼻投与したマウスは、麻酔から覚醒した。このことから、0.05N 塩酸水は酸性刺激が強いので媒体として不適切であると判断した。そこで、より酸性度の低い0.01N 塩酸水を、化合物Aの一塩酸塩の経鼻投与の媒体として選択した。【００６９】
参考例3
ICR雌マウス1群5匹に、化合物Aの一塩酸塩の0.01N塩酸水で調製した水溶液10μL（化合物Aの一塩酸塩を0.0324 mg含有）又は50μL（化合物Aの一塩酸塩を0.162 mg含有）を、7日間に渡り、1日1回、イソフルラン麻酔下で経鼻投与した。一方で、該マウスに該水溶液50μLをイソフルラン麻酔下で単回経鼻投与した。各投与において、マウスは、投与から数分後には覚醒した。なお、化合物Aの一塩酸塩の0.01N塩酸水溶液の水素イオン濃度を測定した結果、pH 2.3であった。【００７０】
7日目の最後の投与或いは単回投与から5、15、30、45、60、120、240、360、1440分後に、イソフルラン麻酔下で、ヘパリン添加シリンジを用いて腹部大静脈より約0.5 mLの血液を採取し、得られた血液を遠心分離（4℃、1,500×g、10分間）して血漿を得た。最後の投与後の各時間における採血後、各群のマウスを麻酔下で放血死させ、採血開始から15分以内に脳（大脳及び小脳を含む）及び嗅球を摘出した。それぞれの重量を測定した後、それぞれチューブに入れ、液体窒素で急速冷凍した。【００７１】
得られた血漿、脳及び嗅球からサンプル調製し、それぞれのサンプル中の化合物Aの濃度を、LC-MSにより測定した。【００７２】
測定結果を図２及び３に示す。大脳（含小脳）中の化合物Aの濃度は、投与から120分後でも2.3 ng/mL (4.6 nM)であった（図２の「大脳」の「50μL」、及び図３の「脳（大脳及び小脳を含む）」の「反復」）。10μL経鼻投与した場合の、投与から5分後の血漿、大脳及び嗅球中の化合物Aの濃度は、それぞれ142 ng/mL、20.9 ng/g及び156 ng/gのCmaxに達し、その後、速やかに減衰した（図２の「10μL」）。50μL経鼻投与の５分後の血漿、大脳及び嗅球中の化合物Aの濃度は、それぞれ870 ng/mL、82.8 ng/g及び285 ng/gのCmaxに達し、その後、速やかに減衰した（図２の「大脳」の「50μL」、及び図３の「脳」の「反復」）。【００７３】
さらに、0.01N 塩酸水溶液を7日間投与した後、鼻腔組織を観察した結果、50μL投与群では、鼻腔から肺組織にも流出し細気管支上皮に変化が大きく、呼吸上皮においては投与容積に関わらず変性、壊死、剥離が観察された。一方、嗅上皮では50μL投与群では変性、壊死、萎縮が観察されたが、10μL投与群では変化はなかった。以上より、投与容積は10μLが適当であると判断した。【００７４】
実施例1
10.8 mg (20 μmol)の化合物Aの一塩酸塩に対し、それぞれヒアルロン酸5 mg、グルコン酸 (50% w/w) 8 mg、又はクエン酸7.7 mg と水1 mLを加え、外温80℃にて超音波照射しながら均一に溶解し透明水溶液とした。得られた水溶液の水素イオン濃度は、ヒアルロン酸を用いた場合はpH 3.53であり、グルコン酸を用いた場合はpH 3.56であり、クエン酸を用いた場合はpH 2.96であった。【００７５】
得られた水溶液10μLを投与液として、参考例1と同様にして単回経鼻投与し、脳中の化合物Aの濃度の測定を行った。【００７６】
測定結果を図４に示す。単回投与から15分経過後の脳における化合物Aの濃度は、ヒアルロン酸を用いた場合は37.8 ng/g、グルコン酸を用いた場合は20.9 ng/g、クエン酸を用いた場合は26.7 ng/gであった。AUC (0〜120 min) は、ヒアルロン酸を用いた場合は1380 ng・min/g、グルコン酸を用いた場合は1025 ng・min/g、クエン酸を用いた場合は1474 ng・min/gであった。【００７７】
以上の参考例の結果及び本実施例の結果より、有機酸を添加することにより、化合物Aの一塩酸塩の超純水の溶解度と比較し、30倍程向上できた。また、0.01N 塩酸水溶液と比較して、水素イオン濃度 pH を低くすることなく約3.3倍の溶解度を示し、用量依存的に3倍の薬物脳内暴露を達成した。これは、投与量換算で経口投与による脳内暴露（AUC）の65倍から94倍の暴露量に至り、その効率性を実現した。これは、所謂、ACAT阻害剤による全身暴露から来る副作用や毒性発現の懸念を払拭、軽減できる薬剤送達法である。【００７８】
実施例2
ICR雌マウス1群5匹に、実施例1で得た化合物Aの一塩酸塩のクエン酸水溶液10μLを、7日間に渡り、1日1回、イソフルラン麻酔下で経鼻投与した。最終投与後、参考例3と同様にして脳を摘出し、サンプルを調製した。ガスクロマトグラフ装置（島津製作所製QP2010Plus）及び質量分析装置（島津製作所製QP2010Ultra）を用いたガスクロマトグラフィー質量分析法（GC/MS）により、コレステロール及びコレステロールエステル体の濃度を測定した。ステロールエステル等のエステル体はそのままの状態では検出が困難であるため、下記の手順に示すように、サンプルに対してエステル結合を切断するけん化処理を行い、けん化処理サンプルの測定値と非けん化処理サンプルの測定値の差に基づいて、エステル体の量を算出した。具体的には、以下の手順1〜9に従って本試験を行った。【００７９】
1．大脳に9倍量の生理食塩水を添加し、ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。遠心後、上清を大脳サンプルとした。【００８０】
2．大脳サンプルに内部標準としてコレステロール-d7 (CAS 83199-47-7) を加えて混合し、3倍量のクロロホルム:メタノール (2:1)と1 mLのMilli-Q水（超純水）を添加して混合した後、3,500 rpmで10分間遠心した。【００８１】
3．遠心したサンプルについてシリンジでクロロホルム層を新しいガラスチューブに移し、二等分後、窒素下で乾燥させた。【００８２】
4．エタノール1 mLで再溶解した後、けん化処理用サンプルは、10 M 水酸化カリウム/70%エタノールを300μL、非けん化処理用サンプルには70% エタノール300μL加え混合した。【００８３】
5．けん化処理用サンプルは80℃で1時間反応させ。非けん化処理用サンプルは氷中に1時間静置した。【００８４】
6．クロロホルム2 mLとMilli-Q水（超純水）2.5mLを添加、混合した後、3,500 rpmで10分間遠心した。【００８５】
7．遠心したサンプルのクロロホルム層をシリンジで新しいガラスチューブに移し、窒素下で乾燥させた。【００８６】
8．50μLのイソプロパノール:アセトニトリル(55:45)で脂質を溶解させた後、10μLを分取し、窒素下で乾燥させた。【００８７】
9．100μLのN,O-ビス（ トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（BSTFA）を加えて混合し、60℃で1時間静置後、さらに25℃で48時間静置した。【００８８】
10．得られた試料を、下記条件のGC/MSにより解析した。【００８９】
条件
(1) キャピラリーカラム: DB-5ms (アジレントテクノロジーズ社製) (5%-フェニル)-メチルポリシクロヘキサン相当のフェニルアリレンポリマー、30m (length) x 0.25mm (ID) x 0.25μm (film) 
(2) 流速 (Heガス) 1.41mL/min
(3) 温度【００９０】
【表１】
2018092765.tif 000004
【００９１】
(4) 気化室温度: 280℃
(5) イオン源温度: 200℃
(6) 表面温度: 280℃
(7) 注入容量: 1μL。【００９２】
結果を図５に示す。なお、コレステロールエステル量は、ケン化処理したコレステロール量から非ケン化したコレステロール量を差し引き、算出した。【００９３】
対照群では総コレステロール量（37.6μmol/g）の内コレステロールエステル体が0.70μmol/gであったのに対し、化合物Aの一塩酸塩投与群では総コレステロール量（36.9μmol/g）の内コレステロールエステル体が0.04μmol/gであった。このように、化合物Aの一塩酸塩投与により、脳内でのコレステロールエステル体が減少することが示された。【００９４】
実施例3
ICR雌マウス1群5匹に、実施例1で得た化合物Aの一塩酸塩のクエン酸水溶液10μLを、7日間に渡り、1日1回、イソフルラン麻酔下で経鼻投与した。最終投与後、参考例3と同様にして脳を摘出し、サンプルを調製した。質量分析装置（ウオーターズ社製TQ-S）を用いた液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS-MS）により、24(S)−ヒドロキシコレステロールの濃度測定を試みた。具体的には、以下の手順1)〜10) に従って測定、定量を行った。【００９５】
1) 大脳に9倍量の生理食塩水を添加し、ホモジナイザーを用いてホモジナイズして大脳サンプルとした。【００９６】
2) 大脳サンプル(50 μL) をエッペンチューブに分注し、メタノール 50 μLを添加し、ボルテックス・ミキサーを用いて混合した。【００９７】
3) 次に、けん化処理サンプルは2 mol/L水酸化ナトリウム溶液 200 μLを添加、非けん化処理サンプルは生理食塩水 200 μLを添加してボルテックス・ミキサーを用いて混合し10分間超音波処理を行った。【００９８】
4) けん化処理サンプルを恒温槽上で70℃、30分間加熱しエステル結合の加水分解を行った。また、非けん化処理サンプルも同様に70℃、30分間加熱した。【００９９】
5) 加熱処理後、両サンプルを氷上で5分間冷却し、けん化処理サンプルは2 mol/L塩酸水 210 μLを添加、非けん化処理サンプルは生理食塩水 210 μLを添加してボルテックス・ミキサーを用いて混合した。【０１００】
6) 上記サンプルに内部標準として重水素標識体の標品d5(100 ng/mL 10μL) とクロロホルム (700 μL)を加え、ボルテックス・ミキサーを用いて混合し、更に10分間超音波処理した後に、3,500 rpmで5分間遠心分離した。【０１０１】
7) 遠心サンプルより下層のクロロホルム層を採取してエッペンチューブに移し、窒素を通風し乾燥させた。【０１０２】
8) 上記残留物をメタノール (200 μL) に再溶解し10分間超音波処理した後、ボルテックス・ミキサーを用いて混合し、3,500 rpmで5分間遠心分離した。【０１０３】
9) 上記溶液より上清50 μLをLC/MS-MS用サンプルバイアルに採取し、LC/MS-MSにて測定した。【０１０４】
10) また、検量線用の作成のための24(S)−ヒドロキシコレステロール標準品のサンプルは大脳サンプルの代わりに生理食塩水 50 μLを分注し、メタノールで調製した24(S)−ヒドロキシコレステロール標準溶液 (0、0.6、1.2、3、6、12 μg/mL)を50 μLを分注した。その後、2)〜9)の処理を同様に行った。【０１０５】
下記条件のLC/MS-MSにより測定サンプルを解析した。
MS-MS条件
イオン源：Zspray、プローブ：APCI。
液体クロマトグラフィー条件
カラム: ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm (粒径) 2.1 x 50 mm (内径x長さ) (ウオーターズ社製)
移動相Ａ：10 mM ギ酸アンモニウム。
移動相Ｂ：アセトニトリル。
流速：0.5 mL/min。【０１０６】
結果を図６に示す。対照群では総24(S)−ヒドロキシコレステロール量（5.16 nmol/g ）であり、化合物Aの一塩酸塩の投与群では総24(S)−ヒドロキシコレステロール量（5.36 nmol/g）と絶対量の増加を示した。即ち、化合物Aの一塩酸塩投与によりコレステロールからコレステロール・エステル体へのACAT酵素による生成反応が抑制され、その減少と共に遊離コレステロールが増加した結果、CYP46A1により脳内での24(S)−ヒドロキシコレステロール量は0.2 nmol/g 増加した。
【図１】
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【図２】
2018092765.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月6日(2018.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミド（化合物Ａ）の塩酸塩、及び有機酸を含有し、
化合物Ａの塩酸塩と有機酸との含有比が、化合物Ａの塩酸塩１００質量部に対して３０〜４００質量部であり、
水性液体製剤であり、且つ
ｐＨ２．３〜５である、
経鼻投与用医薬組成物。
【請求項２】
前記有機酸がカルボン酸である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記カルボン酸の分子構造内にヒドロキシ基を有する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記カルボン酸がヒドロキシ基を２つ以上有する、請求項２又は３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記カルボン酸が、アルドン酸、カルボキシ基を２つ以上有する脂肪族ヒドロキシ酸、及びウロン酸を構成糖として有する多糖類からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
前記２−［４−［２−（ベンズイミダゾール−２−イルチオ）エチル］ピペラジン−１−イル］−Ｎ−［２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチル−３−ピリジル］アセトアミドの塩酸塩の脳内への送達用である、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
脳内のコレステロールエステル又はヒドロキシコレステロールエステルの産生抑制用である、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
脳神経変性死抑制用である、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
脳内アミロイドβ産生抑制又は除去用である、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
脳神経変性疾患の予防又は治療用である、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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