(57)【要約】  本発明は、蛍光タンパク質によって形成された会合体からなるエンドサイトーシス増強剤を提供することを目的とする。前記蛍光タンパク質は、白色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることが好ましい。  本発明のエンドサイトーシス増強剤は、蛍光タンパク質を担持させたカルボシランデンドリマーで形成されたミセルに内包された薬物の細胞内へエンドサイトーシスによる取込みを増強することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光タンパク質によって形成された会合体からなるエンドサイトーシス増強剤。
【請求項２】
前記蛍光タンパク質は、白色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載のエンドサイトーシス増強剤。
【請求項３】
前記会合体は、前記蛍光タンパク質が２〜１０分子凝集したものであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のエンドサイトーシス増強剤。
【請求項４】
前記会合体は、細胞内への前記会合体自体の取込みをも増強するものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のエンドサイトーシス増強剤。
【請求項５】
標的認識配列は、前記蛍光タンパク質の会合体形成を調節できる配列をさらに備えるものであることを特徴とする、請求項４に記載のエンドサイトーシス増強剤。
【請求項６】
前記蛍光タンパク質の会合体形成を調節できる配列は標的認識配列である、ことを特徴とする請求項５に記載のエンドサイトーシス増強剤。
【請求項７】
前記標的認識配列は、機能性ペプチドで構成されているものであることを特徴とする、請求項６に記載のエンドサイトーシス増強剤。
【請求項８】
前記機能性ペプチドは、各種の組織に発現されている、表面抗原、受容体、ゲート、トランスポーター及びチャンネルからなる群から選ばれるいずれかの標的タンパク質と特異的に結合するものであることを特徴とする、請求項７に記載のエンドサイトーシス増強剤。
【請求項９】
前記機能性ペプチドは、配列表の配列番号１〜３からなる群から選ばれるいずれかの配列を有するペプチドであることを特徴とする、請求項７に記載のエンドサイトーシス増強剤。
【請求項１０】
下記式（Ｉ）で表される骨格構造を有する凝集性分子で構成されたミセルのエンドサイトーシスによる取込みを増強させる、請求項１〜９のいずれかに記載のエンドサイトーシス増強剤。式中、ｎは１〜６の整数を表す。
【化１】
2018101477.tif 000022
【請求項１１】
前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、下記式（II）で表される化合物である、ことを特徴とする請求項１０に記載のエンドサイトーシス増強剤。
【化２】
2018101477.tif 000023
【請求項１２】
前記凝集性分子は、下記式（III）〜（VI）からなる群から選ばれるいずれかの式で表されるものであることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載のエンドサイトーシス増強剤。下記式中、GFPは蛍光タンパク質を表す。
【化３】
2018101477.tif 000024
【化４】
2018101477.tif 000025
【化５】
2018101477.tif 000026
【化６】
2018101477.tif 000027
【請求項１３】
水性溶媒中でタンパク質を外側にして形成され、FRETによる蛍光を発する、直径５０〜５００ｎｍのミセルのエンドサイトーシスを増強する、請求項１０〜１２のいずれかに記載のエンドサイトーシス増強剤。
【請求項１４】
前記ミセルは、分子量２０万以下のタンパク質、核酸、及び疎水性分子からなる群から選ばれるいずれかの分子を内包し得るものである、ことを特徴とする請求項１３に記載のエンドサイトーシス増強剤。
【請求項１５】
前記分子量２０万以下のタンパク質は、免疫グロブリンG、レクチン、及びペプチドホルモンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１４に記載のエンドサイトーシス増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達系において使用できるエンドサイトーシス増強剤に関する。より詳細には、カルボシランデンドリマー及び蛍光タンパク質を含む薬物送達系用のエンドサイトーシス増強剤に関する。【０００２】
シロール基を含有するデンドリマー（以下、本明細書においては、「カルボシランデンドリマー」という。）は、通常、ミセルを形成すると蛍光発光することが知られている。糖等の親水性化合物を担持させたカルボシランデンドリマーは、有機溶媒中でAIE（aggregation-induced emission）により発光するが、親水基を担持させたカルボシランデンドリマーで形成されたミセルの発光は環境依存であり、強度も弱い。ここで、AIEとは、発光性化合物が互いに凝集し合い、特定の波長の光を照射することによって、高効率発光を惹起する現象をいう。（非特許文献１参照、以下、「従来技術１」という。）。【０００３】
また、糖を担持させたカルボシランデンドリマー（以下、「SCD」ということがある。）は、有機溶媒中で溶媒駆動型ミセルを形成するが水溶性溶媒中ではミセルを形成しないことが知られている（図１参照及び図２参照）。これに対し、タンパク質を担持させたカルボシランデンドリマー（以下、「PCD」又は「凝集性分子」ということがある。）は、タンパク質を外側に向けた状態で、リポソーム(以下、「ベジクル」ということがある。)又はミセルを形成することが知られている（図３参照）。このようにして形成されたベジクル又はミセルを、以下、「PCDミセル」ということがある。【０００４】
そして、カルボシランデンドリマーにタンパクを提示させると、AIEによって強い蛍光発光が生じることが知られている（特許文献１参照、以下、「従来技術２」という。図３参照）。そして、提示されるタンパク質を蛍光タンパク質に代えると、さらに強い蛍光発光が観察される。【０００５】
現在では、種々の蛍光を発する蛍光タンパク質が生体内での標識のために汎用されるようになっている。蛍光標識としての使用が始まった当初は、蛍光タンパク質によって望まない会合が起こり、所望の観察に支障を来すことがしばしば起こっていた。例えば、4量体でなければ蛍光を発しないdsREDのような蛍光タンパク質をアクチンに付加すると、dsREDの作用によって4つのアクチンサブユニットが会合してしまい、細胞内で所望の観察ができなくなったりしていた。【０００６】
このため、天然には4量体で存在する蛍光タンパクに修飾を加える等して、単量体としても蛍光を発するようにする、又は2量体であっても会合を起こさないように変異させる等の操作を行なって、蛍光タンパクを凝集させない工夫が行われてきた。その結果、現在市販されているのは、２量体又は単量体である（非特許文献２参照）。【０００７】
ところで、医薬製剤を投与する場合には、治療を要する疾病と薬剤の性質にもよるが、標的部位にどれだけの有効成分を送達できるかが、副作用の発生の有無及び奏効率に影響する。このため、医薬製剤を標的部位に適切に送達するための手段として、様々の薬剤送達システム（ＤＤＳ：ドラッグデリバリーシステム）の開発が、盛んに行われている。【０００８】
そして、ＤＤＳに使用する担体として、例えば、リポソーム、合成樹脂粒子、デンドリマー等が知られており、ウイルスや細菌への感染によって生じる疾患を予防及び／又は治療するために、例えば、デンドリマーを利用した担体の開発が行われてきている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第５６２９８８８号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１６／０８４９７９
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Chem Commun (Camb). 2009 Aug 7;(29):4332-53. doi: 10.1039/b904665h. Epub 2009 May 13
【非特許文献２】https://pdbj.org/mom/174
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
投与された薬剤のうち、90％以上は未変化体として生体による代謝を受けることなく排出されるため、一定量以上の投薬量が必要である。また、抗体、ペプチドその他の次世代医薬といわれるような生体高分子を有効成分とする医薬の場合には、そのままでは標的部位に送達される前に失活してしまうため、上記のCDミセルその他のミセルに内包する必要がある（図４参照）。
一方で、こうしたミセルに内包された薬物が薬理効果を発揮するためには、細胞内への取り込みが必要である。そして、こうしたミセルに内包された薬剤の取り込みは、エンドサイトーシスによって行われることが殆どであるため、エンドサイトーシスを高める必要がある。【００１２】
また、エンドサイトーシスを増強するためには何らかの増強剤が必要とされるが、こうした増強剤は、それ自身に生体適合性があり、上記CDミセルの安定性を損なうことのないものでなければならない。しかし、これまで、こうした特性・性質を有するエンドサイトーシス増強剤は従来知られておらず、こうした特性・性質を有するエンドサイトーシス増強剤に対する強い社会的要請があった。【００１３】
また、エンドサイトーシスが増強されると、投薬量の減少につながる。そして、このことは、未変化体の排出量を減少させることができるため、環境に対して化学物質を放出することによる環境負荷が軽減される。さらに、薬剤によっては、副作用の軽減も図れる可能性がある。
このため、投薬量を減少させ、標的組織への送達や薬剤の放出を確認しつつ、薬剤の有効投与量を見積もるツールとして使用できる、ミセルのエンドサイトーシスを増強させることが可能な増強剤に対する強い社会的要請があった。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、チオールとハロゲン化アルキルの反応性を利用して、シロール含有カルボシランデンドリマーと、標識タンパク質とを（例えば、緑色蛍光タンパク質、以下、（後述する緑色以外の蛍光を発する蛍光タンパク質を含めて、集合的に「GFP」ということがある。）を水性溶媒中、又は前記水性溶媒と有機溶媒との混合溶媒中で混合したところ、前記デンドリマーとタンパク質との複合体である凝集性分子（GFPを提示したカルボシランデンドリマー）が形成されること、GFP自身の会合体が生じること、及びこの会合特性がCDミセルを生成させる動力となっていることを見出した。【００１５】
その後、さらに研究を重ねた結果、本発明の発明者等は、上記凝集性分子の作成の過程で生じるGFP自身の会合体が、上記CDミセルの細胞内へのエンドサイトーシスを著しく増強することを見出した。また、GFPに標的結合性のペプチドを結合させると、GFPの会合し易さが変動することをも見出し、本発明を完成したものである。【００１６】
本発明は、以上のような状況の下で完成されたものであり、カルボシランデンドリマー及び蛍光タンパク質を含む薬物送達系用のエンドサイトーシス増強剤を提供することを目的とする。【００１７】
本発明は、以下の態様を含むものである。
本発明の一の実施態様においては、蛍光タンパク質によって形成された会合体からなるエンドサイトーシス増強剤である。ここで、前記蛍光タンパク質は、白色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることが好ましい。【００１８】
また、前記会合体は、前記蛍光タンパク質が２〜１０分子凝集したものであることが好ましい。前記蛍光タンパク質は標的認識配列をさらに備えるものであることが好ましく、細胞内への前記会合体自体の取り込みをも増強するものであることが好ましい。標的認識配列は、前記蛍光タンパク質の会合体形成を調節できる配列であることが好ましい。【００１９】
前記標的認識配列は機能性ペプチドで構成されているものであることが好ましく、前記機能性ペプチドは、標的組織に発現されている、表面抗原、受容体、ゲート、トランスポーター及びチャンネルからなる群から選ばれるいずれかの標的タンパク質と特異的に結合するものであることが好ましい。前記標的認識配列は、前記蛍光タンパク質の会合体の形成を調節するように作用することが好ましく、前記標的認識配列は、配列表の配列番号１〜３からなる群から選ばれるいずれかの配列を有するペプチドであることが好ましい。【００２０】
DMPGTVLPGG（配列表の配列番号１）
VPTDTDYSGG（配列表の配列番号２）
DMPGTVLPGG GGGSEGEWQ QQQHQWAKQE（配列表の配列番号３）【００２１】
また、前記エンドサイトーシス増強剤は、下記式（Ｉ）で表される骨格構造を有する凝集性分子で構成されたミセルのエンドサイトーシスによる取込みを増強させるものであることが好ましい。式中、ｎは１〜６の整数を表す。【００２２】
【化１】
2018101477.tif 000002
【００２３】
前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、下記式（II）で表される骨格を有する化合物であることが好ましい。【００２４】
【化２】
2018101477.tif 000003
【００２５】
前記凝集性分子は、下記式（III）〜（VI）からなる群から選ばれるいずれかの式で表されるものであることが好ましい。下記式中、GFPは蛍光タンパク質を表す。【００２６】
【化３】
2018101477.tif 000004
【００２７】
【化４】
2018101477.tif 000005
【００２８】
【化５】
2018101477.tif 000006
【００２９】
【化６】
2018101477.tif 000007
【００３０】
本発明のエンドサイトーシス増強剤は、上述した凝集性分子で形成されたミセルのエンドサイトーシスを増強するものであることが好ましい。ここで、上記ミセルは、水性溶媒中でタンパク質を外側にして形成され、FRETによる蛍光を発する、直径50〜500 nmのものである。【００３１】
また、上記ミセルは、分子量20万以下のタンパク質、核酸、及び疎水性分子からなる群から選ばれるいずれかの分子を内包し得るものであることが好ましく、前記分子量20万以下のタンパク質は、免疫グロブリンG、レクチン、及びペプチドホルモンからなる群から選ばれるものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、本発明のエンドサイトーシスは、上述した凝集性分子で構成されたミセルの細胞へのエンドサイトーシスを増強することができる、エンドサイトーシス増強剤を提供することができる。ここで、本発明のエンドサイトーシス増強剤は、生体内においても検出・観察が可能な、強い蛍光強度を有している。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、シロールダンベル(1)6-Lacの基本的な形態(A)及びミセル形成を示す模式図(B)である。
【図２】図２は、アセトン/水の混合溶媒中におけるシロールダンベル(1)6-Lacが形成するミセルの粒径と蛍光強度との関係(A)及び蛍光波長の変化を示す図(B)である。
【図３】図３は、GFPと結合したカルボシランデンドリマーを示す模式図(A)である。図中、蛍光タンパク質は黒い長方形で示し、詳細な構造を吹き出しの中に模式的に示している。GFPを提示したカルボシランデンドリマー（凝集分子）が凝集する前の状態を示す図(B)である。上記凝集性分子が凝集した状態を示す図(C)である。
【００３４】
【図４】図４は、上記凝集性分子に内包させることができる生体高分子の模式図(A)及びタンパク質駆動型の凝集を示す模式図(B)である。図４(B)では、図３と同様にGFPを吹き出し内に模式的に示し、また、同様に免疫グロブリンGを模式的に示した。
【図５】図５は、本発明の凝集性分子及び本発明のエンドサイトーシス増強剤の製造及び、それに伴う蛍光波長の変化を示す模式図である。
【図６】図６は、カルボシランデンドリマーに上記蛍光タンパク質を提示させた後のミセルの形成と、蛍光タンパク質の会合体（GFP残量）との量が異なる画分を示す蛍光検出の結果である。(A)は蛍光タンパク質の会合体の含有量の少ないもの、(B)は中程度のもの、(C)は多いものをそれぞれ示す。
【００３５】
【図７】図７は、本発明の凝集性分子によって形成されたミセル粒子の形状を示す走査型電子顕微鏡写真(A)、粒径分布及び発光特性の変化を示すグラフ（(B)及び(C)）である。図７(B)中、TPSは内包分子なしの粒子を、また、GDSミセルは内包分子ありのミセルを示す。
【図８】図８は、低温低真空走査型電子顕微鏡を用いて、形成された粒子がミセルなのか、ベジクルなのかを判定するために観察したときの電子顕微鏡像である。図中、白い円及び白い矢印で示した構造物は、塩の結晶であると考えられる。また、黒の円及び黒の矢印で示した構造物は、ベジクル様物質と思われる。
【００３６】
【図９】図９は、使用した標的ペプチド中に含まれる会合体を調べたゲル電気泳動結果を示す図である。(A)は蛍光検出結果を、また、(B)はCBB（クマジーブリリアントブルー）染色結果を示す図である。
【図１０】図１０は、形成された会合体を検討したゲル電気泳動像を示す図である。(A)及び(B)はFITC染色結果（レーザー475及びPMT500）である。また、(C)及び(D)はCBB染色後に脱色した結果である（その１）。
【００３７】
【図１１】図１１は、形成された会合体を検討したゲル電気泳動像を示す図である。(A)及び(B)はFITC染色結果（レーザー475及びPMT500）である。また、(C)及び(D)はCBB染色後に脱色した結果である（その２）。
【図１２】図１２は、使用した会合体中に含まれる標的ペプチドによって細胞中へミセルの取込みがどのように変化するかについての結果を示すグラフである（その１）。
【図１３】図１３は、使用した会合体中に含まれる標的ペプチドによって細胞中へミセルの取込みがどのように変化するかについての結果を示すグラフである（その２）。
【００３８】
【図１４】図１４は、使用した会合体中に含まれる標的ペプチドによって細胞中へミセルの取込みがどのように変化するかについての結果を示すグラフである（その３）。
【図１５】図１５は、使用した会合体中に含まれる標的ペプチドによって細胞中へミセルの取込みがどのように変化するかについての結果を示すグラフである（その４）。
【図１６】図１６は、50 mMのTris-HClバッファー（pH 8.0）を用いたときに形成されたミセルの粒度分布を示す図である。(A)はミセル画分液、(B)は未反応ミセル画分液である。
【００３９】
【図１７】図１７は、50 mMのHEPESバッファー（pH 7.6）を用いたときに形成されたミセルの粒度分布を示す図である。(A)はミセル画分液、(B)は未反応ミセル画分液である。
【図１８】図１８は、50 mMのクエン酸ナトリウムバッファー（pH 7.6）を用いたときに形成されたミセルの粒度分布を示す図である。(A)はミセル画分液、(B)は未反応ミセル画分液である。
【図１９】図１９は、50 mMの炭酸−重炭酸ナトリウムバッファー（pH 8.36）を用いたときに形成されたミセルの粒度分布を示す図である。(A)はミセル画分液、(B)は未反応ミセル画分液である。
【００４０】
【図２０】図２０は、50 mMのTris-HClバッファー（pH 8.0）を用いたときに形成されたミセルの蛍光特性を示す図（調製直後）である。
【図２１】図２１は、50 mMのHEPESバッファー（pH 7.6）を用いたときに形成されたミセルの蛍光特性を示す図である。(A)は調製直後の蛍光特性、(B)は1日後の蛍光特性をそれぞれ表す。
【図２２】図２２は、50 mMのクエン酸バッファー（pH 7.6）を用いたときに形成されたミセルの蛍光特性を示す図である。(A)は調製直後の蛍光特性、(B)は1日後の蛍光特性をそれぞれ表す。
【図２３】図２３は、50 mMの炭酸ナトリウムバッファー（pH 8.36）を用いたときに形成されたミセルの蛍光特性を示す図である。(A)は調製直後の蛍光特性、(B)は1日後の蛍光特性をそれぞれ表す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。本発明は、上述した通りの蛍光タンパク質によって形成された会合体からなるエンドサイトーシス増強剤である。本発明のエンドサイトーシス増強剤を構成する蛍光タンパク質は特に限定されないが、緑色蛍光タンパク質及びその変異体を含む蛍光タンパク質であることが好ましい。上記GFPが会合して会合体となったときに強い蛍光を発すること、及び形成された会合体が細胞表面近くに存在する物質を細胞内に取り込む、エンドサイトーシスを増強する効果を発揮する。また、これとともに、この会合体自身も大量に細胞内に取り込まれるようになるからである。
【００４２】
本発明において使用することができるGFPとしては、前記タンパク質は、白色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質等を挙げることができ、会合体を形成するものであれは、特に限定されない。例えば、配列表の配列番号７に示すGFP、配列番号８に示すGFP、配列表の配列番号９に示すBFP（青色蛍光タンパク質)、配列表の配列番号１０に示すTFP等のほか、クロンテック社等から市販されているCFPやRFPその他のGFP誘導体を挙げることができる。
【００４３】
また、これら以外にも、配列表の配列番号５に示すイソギンチャクモドキ由来の蛍光タンパク質なども使用することができる。さらには、MBL社から市販されているアザミグリーンやその他の色変異体も好適に使用可能であることは、構造上の特性から想定できる。こうした蛍光タンパク質は検出できる波長の範囲が広く、蛍光強度が高いことから好適に使用することができる。ここで、前記青色蛍光タンパク質は、ブルー又はシアンの蛍光を呈するものがいずれも含まれる。
【００４４】
本発明で使用するGFPは、上述したように、２量体以上の会合体を容易に形成する性質を有するものであることが好ましく、蛍光の強さ及び会合体を形成しやすいことから、配列表の配列番号７に示すGFPを使用することが好ましい。
【００４５】
こうしたGFPは、公知の方法（例えば、Biochim. Biophys. Acta 1679 (2004) 222-229; Biochem. Biophys. Res. Commun. 330 (2005) 454-460等を参照されたい。）を用いて産生してもよく、こうしたGFPの製造受託を行なっている企業に依頼して作製したものを使用してもよい。
【００４６】
また、具体的な会合度としては、上記蛍光タンパク質が2〜10分子が凝集したものであることが、エンドサイトーシス増強効果が高いことから好ましく、4量体以上であることがさらに好ましい。本発明のエンドサイトーシス増強剤は、上述した蛍光タンパク質の会合度が高いほど、エンドサイトーシス増強効果が高く、また、上記会合体は、細胞内への前記会合体自体の取込みをも増強するものであることによる。
【００４７】
上記蛍光タンパク質は、標的認識配列をさらに備えるものであることが、上記蛍光タンパク質の会合体が形成しやすくなるために好ましい。こうした標的認識配列としては、各種の組織に発現されている、表面抗原、受容体、ゲート、トランスポーター及びチャンネルからなる群から選ばれるいずれかの標的タンパク質と特異的に結合するもの等を挙げることができる。こうした標的認識配列を有しない蛍光タンパク質と比較したときに、上記蛍光タンパク質が会合しやすくなるからである。
【００４８】
より具体的には、前記機能性ペプチドは、配列表の配列番号１〜３からなる群から選ばれるいずれかの配列を有するペプチドを挙げることができる。これらのペプチドをGFPに付加することによって、上述したGFPの会合体の形成を調節できるからである。
【００４９】
DMPGTVLPGG（配列表の配列番号１）
VPTDTDYSGG（配列表の配列番号２）
DMPGTVLPGG GGGSEGEWQ QQQHQWAKQE（配列表の配列番号３）
【００５０】
前記ペプチドを有するGFPは、具体的には、配列表の配列番号４〜６からなる群から選ばれるいずれかに記載の配列を有するもの等を挙げることができる。
【００５１】
MASMTGGQQMGR DMPGTVLPGG MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGT ELYK GG HHHHHH（配列表の配列番号４）
【００５２】
MASMTGGQQMGR VPTDTDYSGG MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF NDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNDKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGT ELYK GG HHHHHH（配列表の配列番号５）
【００５３】
MASMTGGQQMGR DMPGTVLPGG GGGSEGEWQQQQHQWAKQE MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGTC ELYK GG HHHHHH（配列表の配列番号６）
【００５４】
本発明のエンドサイトーシス増強剤は、生理食塩水等のタンパク質が変性しない水性溶媒中にて所望のGFPを溶解させ、会合させることによって得ることができる。また、図５で表される反応によって、下記式（II）で表される骨格を有する化合物とＧＦＰとを結合させるときに、同時に製造することができる。
【００５５】
【化７】
2018101477.tif 000008
【００５６】
例えば、上記の反応は、適当な溶媒（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、生理食塩水、Tris-HClバッファー、HEPESバッファー、クエン酸ナトリウムバッファー、炭酸−炭酸水素ナトリウムバッファー等の水溶性溶媒）中で行うことができる。この場合の反応条件は、使用するタンパク質によって異なるが、反応温度は、使用するタンパク質の変性温度を下回ってさえいればよく、例えば、0〜50℃、好ましくは30℃〜45℃、より好ましくは37℃程度とすることができる。GFPを用いると、42℃までは、温度依存的に反応性を向上させることができる。
【００５７】
また、ミセルを形成させるときに上記のようなバッファーを使用し、形成されたミセルを分離するときに、例えば、1×PBSを使用すると、ミセルに内包されたバッファーと、ミセルが浮遊しているバッファーとが異なるミセル画分液を得ることができる。このようにすることによって、ミセルに内包させる薬剤の溶解等により適したミセルを作製することができる。
【００５８】
GFPは、DTTなどの還元剤で予め処理をして、-SH基が酸化されていない状態にしておくことが望ましい。蛍光タンパク質とデンドリマーとの混合比（モル比）は、タンパク質を１として、デンドリマーが例えば、１〜２０とすることができ、好ましくは、１：５〜１：15、より好ましくは、１：10程度である。ただし、この比率は濃度に依存して最適な値が変動する。
【００５９】
また、反応時間は、反応温度によっても異なるが、例えば、1時間〜24時間、好ましくは、10時間〜19時間、より好ましくは、15時間〜18時間程度とすることが好ましい。この程度の反応時間とすることにより、使用したチオール基を有するGFPが上記シロールデンドリマーに結合する（以下、「GFP-TPS」ということがある）とともに、本発明のエンドサイトーシス増強剤であるGFPの会合体が形成されるからである。この反応で、1分子以上のGFPが上記シロールデンドリマーに組み込まれ得る。
【００６０】
その後、常法にしたがって生成することにより、上記GFP-TPSを含む画分を得ることができる。ここで、上記GFP-TPSを含む画分には、一定の範囲の濃度のGFPの会合体が含まれる。GFPの会合体の濃度は、上述した標的ペプチドの有無及び種類によって相違し、GFPの会合体の含有量の少ないもの（ミセルA）、中程度のもの（ミセルB）、及び多いもの（ミセルC）の３種類に大別される（図６(A)〜(C)を参照されたい）。
上記のミセルを含む画分中のGFPの含有量については、励起波長488nm、検出波長510nmとすることによって測定することができ、GFP-TPSについては、励起波長370nm、検出波長510nmで測定することができる。
【００６１】
ミセルが崩壊するとミセルのFRETは消失するため、上記担体（ミセル）の生体内における状態を、FRETの変化を指標としてモニターすることができる。さらに、このようなモニターが可能となることによって、こうしたミセルが、水性溶媒中に存在するのか、細胞内に取り込まれているのか、また、ミセルが壊れているのかいないのかといった状態を追跡することができる。一方、会合体のFRETは残存するため、ミセルが消光しても、会合体が水性溶媒中に存在しているのか、例えば、細胞膜上に存在しているのかなどを追跡することができる。
【００６２】
本願発明によれば、上記のような薬物送達用エンドサイトーシス増強剤を提供することができる。
【実施例】
【００６３】
以下の実施例は、あくまでも例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）本発明のエンドサイトーシス増強剤の作製
本実施例においては、エンドサイトーシス増強剤作製用のタンパク質、及びGFP-TPS作製用のタンパク質として配列表の配列番号７に示すGFPを、また、デンドリマーとしてシロールデンドリマーを用いた。ここで、使用したGFP（配列表の配列番号７）は、既に発明者らが報告した方法に従って（Biochim.Biophys.Acta 1679 (2004) 222-229; Biochem. Biophys. Res. Commun. 330 (2005) 454-460を参照されたい）、配列番号７に示すGFPのアミノ酸配列のＣ末端領域の251番目のアミノ酸をシステインに置換するとともに、元々存在していたシステイン（48番目及び70番目）をセリン及びバリンにそれぞれ置換したものである。【００６４】
（１）DDS用凝集性分子の作製
本実施例において、ハロゲン基を有するデンドリマーとして、下記の化学式（I）に示す化合物を使用し、チオール基を有するタンパク質として、GFP（緑色蛍光タンパク質）（配列番号７）を用いた。【００６５】
【化８】
2018101477.tif 000009
【００６６】
まず、20μＭ濃度のGFP溶液（PBS中）に、最終濃度１mMとなるようにDTTを加え、10分間室温で処理し、GFP表面に存在するシステインの還元を行った。システインを還元した、400〜450μLの20μMのGFP溶液（PBS中）に、最終濃度10倍モル等量になるように、200μMの上記式(VI)に示すシロールデンドリマー溶液（DMSO溶媒）を10μL加えてボルテックスで混合した。【００６７】
混合後、37℃で静置した状態で、終夜インキュベートし、GFPと上記シロールデンドリマーとを結合させ、引き続き、ミセルを形成させた。このときのインキュベート時間は、約16〜18時間であった。得られたミセルを含む溶液中のミセルの粒子の特性を、動的光散乱法（DLS; Dynamic light scattering）により測定した。結果を表１に示す。【００６８】
【表１】
2018101477.tif 000010
【００６９】
また、上記反応液を、25℃にてZETASIZER NANO-S（マルバーン社製）を用いて、レーザー光の波長を532 nmとして、粒径を測定した。結果を図７に示す。図７(A)はGDSミセルの電気顕微鏡像である。図７(B)に、GFPのみでインキュベートして得られた産物の粒径分布、シロールデンドリマーのみでインキュベートして得られた産物の粒径分布を調べた結果、及びGFPと式（VI）のシロールデンドリマーとを混合してインキュベートして得られた産物（GFP-TPS）の粒径分布を調べた結果を示す。横軸は得られた産物の粒径（nm）を、縦軸は各産物の全体に占める％（出願頻度）を表す。
また、図７(C)は、上記3つの産物の蛍光検出結果を示すグラフである。横軸は波長（nm）を、縦軸は各産物の全体に占める％（出願頻度）を表す。【００７０】
GFPと上記シロールデンドリマーとをインキュベートした場合（上記表１中、「GFP-Silole only」と表示。）には、得られたミセルの粒径はおよそ150nmであった。これに対し、GFPのみをインキュベートした場合に観察された粒径はおよそ４nm、上記シロールデンドリマーのみでインキュベートした場合に観察された粒径はおよそ650nmであった。【００７１】
次に、得られたミセルの粒子を走査型電子顕微鏡（SEM; Scanning Electron Microscope）で観察したところ、粒子径がおよそ100〜500nmの多数の粒子と、粒子径が500nm程度の少数の粒子とが確認された（図８(A)〜(C)参照）。【００７２】
以上の結果から、本発明のDDS用凝集性担体を用いて形成されたミセルの粒子径は、およそ100〜500nmであり、およそ100〜200nm程度の粒子径のものが多いことが明らかになった。また、SEMを用いた電顕微鏡写真の像から、球状のミセル構造を形成していることも確認された（図７(A)参照）。【００７３】
（２）蛍光共鳴エネルギー移動の確認
本実施例において使用したシロールデンドリマーは、疎水性のシロールのコア部分が凝集すると発光する（ＡＩＥ効果を発揮する）性質を有しているため、ミセル構造をとった場合にも発光することが確認されていた。そこで、シロールデンドリマーにＧＦＰを結合させたGFP-シロールデンドリマーからなるミセルを作製した場合に、シロールとＧＦＰとの間において蛍光共鳴エネルギー移動（FRET：Fluorescence resonance energy transfer）が生じるがどうかを検討した。【００７４】
シロールデンドリマーのみでインキュベートした産物は370nmの波長で励起し（一点鎖線）、GFPのみでインキュベートした産物は488nmの波長で励起し（破線）、GFPおよびシロールデンドリマーを用いてインキュベートした産物は370nmの波長で励起し（実線）、各々の発光波長の特性を調べた（図７(C)参照）。GFP-シロールデンドリマー複合体からなるミセル（ＧＦＰおよび式（X）のシロールデンドリマーでインキュベートして得られた産物）は、シロールからGFPへのFRETによる発光が、510nm付近に観察された。【００７５】
図７(C)に示すように、GFPの発光は、510nm付近にシャープなピークとして観察され、これは上記シロールデンドリマーからGFPへのFRETによるものと考えられた。シロールデンドリマーの発光のピークは480nm付近で観察された。また、GFPとシロールデンドリマーとの結合体の発光では、シャープなピークは認められず、510nm付近でもっとも高い値を示した。これに対し、また、ミセルが崩壊したときに、FRETに起因すると考えられる発光も消失した。【００７６】
すなわち、AIE効果を有するデンドリマーと、蛍光タンパク質等の会合性のタンパク質とを結合させた分子（GFP-TPS）を作製すると、こうした分子を用いてミセルを形成させると、ミセルの状態でもデンドリマーと蛍光タンパク質との間でFRETが生じること、ミセルの崩壊によってFRETが消失することが確認された。また、本発明のエンドサイトーシス増強剤であるGFPの会合体も発光することが確認された。【００７７】
以上から、本発明のエンドサイトーシス増強剤を使用すると、細胞内に送達されたGFP-TPS及びGFPの会合体を確認できることが示された。また、標的組織・器官に送達されたミセルが崩壊した後であっても、蛍光タンパク質の蛍光を追跡することはでき、これによって、蛍光タンパク質が送達された細胞内の環境等を感知することもできることが示された。【００７８】
（実施例２）標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質の調製
本願発明のミセルとＣ末端で結合し、かつ、癌細胞の表面に発現する受容体と結合する標的ペプチドとＮ末端で結合する、標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質を以下のように調製した。【００７９】
（１）インバースＰＣＲ
（１−１）ペプチド配列の選定
選定した標的結合部位に組み込んだペプチドのアミノ酸配列を下記表２に記載した。MCF7-1は、下記表２に示す配列を含む、ヒト乳腺癌由来細胞であるMCF7であり（以下、「標的タイプ1型」ということがある。）、MCF-2は、下記表２に示す配列を含むMCF-1の変異体（以下、「標的タイプ2型」ということがある。）である。また、MCF7-1+αスタンドは、下記表２に示すように、上記のMCF7-1にαへリックス構造の短いペプチド（以下、「αスタンド」という。）をつないだ構造を有するMCF7-1の別の変異体である（以下、「タイプ1強化型」ということがある。）。【００８０】
【表２】
2018101477.tif 000011
【００８１】
（１−２）プライマーの作成
表２に示された上記ペプチド配列についてインバースＰＣＲを行なうためのプライマーを下記表３に記載した。これらプライマーは、配列表の配列番号１及び３については上記ペプチド配列のDMとPGTVLPの間から、配列番号２については上記ペプチド配列のVPとTDTDYSGGの間から伸長反応が開始するように設計した。これはインバースPCRが最適に行われることを鑑みている。【００８２】
【表３】
2018101477.tif 000012
【００８３】
（１−３）インバースＰＣＲ用テンプレートプラスミドの調製
インバースPCR用テンプレートプラスミドは、以下の論文に記載の方法で調製した。
「Protease-sensitive signalling by chemically engineered intramolecular fluorescent resonance energy transfer mutants of green fluorescent protein.   - Miho Suzuki, et al. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression
Volume 1679, Issue 3, 17 September 2004, Pages 222-229」【００８４】
（１−３−１）GFPuv5変異体のプラスミド構築
GFPuv5は、pGFPgcn4から以下のようにして得た。まず、I167T突然変異＋フォワードプライマー 5’CATTGAAGATGGCTCCGTTCAA（配列番号18）及びリバースプライマー5’TTGTGGCGAGTTTTGAAGTTAG（配列番号19）を用いたインバースＰＣＲを用いて遺伝子マニピュレーション用の同義の突然変異を生じさせたPCR産物を得て、引き続きこのPCR産物を環化処理して作製された。以上のようにして得られたコンストラクトを、pGFPgcn5と命名した。【００８５】
その後、GFPuv5のcDNAをpET21a（Novagen社製）にクローニングしてタンパクを発現させた。ここで発現したタンパク質を精製し、GFPuv5tagと命名した。そのコード領域を、プライマー5’CTCGACCAT[ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGT]CGCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA（配列番号20）（GFPuv5シリーズのＮ末端向きのT7遺伝子の10タンパク質用の最初の11アミノ酸のエピトープタグに接着する、接着するタグは［  ］で示した）、及びGFPuv5シリーズのＣ末端にHisタグを提供する、5’TGACGTGAATTCATTA[GTGATGGTGATGGTGATG]TTTGTAGAGCTCATCCATGC（配列番号21）（Hisタグを[  ]で示す）を用いて増幅させた。【００８６】
配列番号1〜３に示した塩基配列をpET21aに挿入し、NdeI及びEcoRIで消化した。このpGFPgcnプラスミドを遺伝子マニュピレーションに使用し、pET21aプラスミドをT7プロモーターの制御下でのタンパク質発現に使用した。GFPuv5の遺伝子及びその突然変異体の遺伝子の塩基配列を、ＤＮＡシーケンシングにより確認した(ABI PRISM 3100 Genetic Analyser社製)。実験中に、さらに３つの同義の突然変異が発見された(Ser-30 agtがagcへ、His-78 catがcacへ、Gln-183 caaがcagへ)。【００８７】
それらの突然変異は蛍光タンパク質にとっては有害ではないため、これらの突然変異を含んだまま実験を継続した。精製されたGFPuv5tagの蛍光強度は、GFPuv4tagの約1.9倍であった。その後、48位又は70位のいずれかのシステイン残基（以下、「システイン48」又は「システイン70」という。）を、pGFPgcn5を用いたインバースＰＣＲによってランダム化されたアミノ酸で置換した。【００８８】
オリゴヌクレオチドである、5’CTTAAATTTATTNNKACTGGAAAAC（配列番号22）及び5’GGTAAGTTTTCCGTATGTTG（配列番号23）をシステイン48の突然変異に使用し、5’GTGTTCAANNKTTTTCCCGTTATCCG（配列番号24）及び5’CATACGTCAGAGTAGTGACAAG（配列番号25）をシステイン70の突然変異に使用した。大腸菌BL21(DE3)の培養物を、得られたプラスミドで形質転換し、昼光励起の下で、強い蛍光についてスクリーニングを行ない、寒天培地上で選択した。48では、幾つかの強い蛍光を発する変異体が得られた(Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, 及びTyr置換)。しかし、70位のアミノ酸を置換した突然変異体では、C70Vシステイン変異体のみが適切な蛍光を与えた。【００８９】
強い蛍光強度を有する二重システイン突然変異GFPuv5を作製するために、一重突然変異を有するプラスミドをNcoI及びEcoRIで消化し、それぞれの領域に再度ライゲーションした。選択は一重突然変異体で行った。UV5C0 tag (C48S/C70V) が全ての組換体の中で最も高い蛍光強度を示した。
次に、システインを6位及び229位にそれぞれインバースPCRによって導入した。この導入には、C48S突然変異を有するプラスミドと、以下のプライマーのセットをそれぞれの突然変異に使用した。【００９０】
Glu置換用：5’TGTCTTTTCACTGGAGTTGTCCC（配列番号26）及び5’TTCTCCTTTACTCATTTTTTC（配列番号27）
Ile置換用：5’TGCACACATGGCATGGATGAGCTC（配列番号28）及び5’CCCAGCAGCAGTTACAAACTC（配列番号29）
トリプシン標的配列(Gln-Gly-Arg)からなる３つのプロテアーゼタグは、種々のスペーサー配列を有し（スペーサーなし、Thrスペーサー又はGly-Thrスペーサー）、必要なシステインがHis-231とAsp-234との間で置換されている。このコンストラクトを、puvC48Stagと得られたプラスミド（テンプレート）と、下記表４に示すプライマーとを用いて得た。【００９１】
【表４】
2018101477.tif 000013
【００９２】
（１−３−２）GFPuv5tag突然変異体の精製
全てのプラスミドで大腸菌BL 21(DE3)を形質転換した。アンピシリン(50Ag/ml)及びIPTG (0.5mM)を添加したＬＢ培地(38mL)に、定常期の終夜培養した大腸菌(12ml)を播種し、37℃で８時間インキュベートした。2,500xgで20分間遠心して細胞を集め、10mLのＰＢＳに再懸濁した。細胞のペレットを、50mMトリス及び8M尿素を含む10mLの溶解バッファー（pH8.0）中で、15分間、室温にて溶解させ、ボルテックスした。1,200xgで15分間遠心し、上清をＰＢＳ中に懸濁したNi2+-NTA 樹脂(Qiagen Co. Ltd.製)と混合した。この樹脂を、ＰＢＳ及び20mMのイミダゾールで順番に洗浄した後に、結合したGFPuv5tag突然変異体を250mMのイミダゾール溶液で溶出させた。【００９３】
バッファー交換のために、溶出物を10倍希釈したＰＢＳで平衡化したPD-10ゲル電気泳動濾過カラム(Amersham Bioscience Co. Ltd.製)にアプライした。溶出されたGFPuv5tag突然変異体タンパク質を集め、それらの濃度をクマジータンパクアッセイ試薬(Pierce社製)で定量した。精製されたGFPuv5tag突然変異体を、15％ SDS-PAGEによって分析した。
インバースＰＣＲ用テンプレートプラスミドの塩基配列を配列番号２６に示した。【００９４】
（１−４）ＰＣＲの条件
下記表５に示す反応液を調製し、下記表６の条件でインバースＰＣＲを行った。【００９５】
【表５】
2018101477.tif 000014
【００９６】
【表６】
2018101477.tif 000015
【００９７】
（１−５）電気泳動による確認
上記ＰＣＲ反応液の一部をとって、0.8％PAGE、電圧100V、印圧時間30分間のゲル電気泳動を行い、各サンプル中で増幅されたペプチドを確認した。泳動結果を図９に示す。【００９８】
（２）非依存的Ａ配列の除去及びPCR産物の精製
下記表７の反応液を調製し、120℃で30分間反応させ、上記PCRによって生じた非依存的Ａ配列を除去した。その後、QIAquick（登録商標） PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を使用して、キットに添付の説明書に従って上記PCR産物を精製した。【００９９】
【表７】
2018101477.tif 000016
【０１００】
（３）ライゲーション反応
引き続き、下記表８に示す反応液を調製し、16℃で３時間以上反応させて、後述する大腸菌ＤＨ５αの形質転換用環状プラスミドを作製した。変異体に応じて、25℃、37℃等を使い分けた。【０１０１】
【表８】
2018101477.tif 000017
【０１０２】
（４）大腸菌ＤＨ５αの形質転換
大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（BioDynamics Laboratory社製）10μlを使用直前に氷上で融解させ、コンピテントセル溶液を調製した。このコンピテントセル溶液にライゲーション反応液を1μL加え、氷上で30分間放置した。その後、42℃で30秒間インキュベートした後に、氷上で2分間冷却した。ここに、SOC（東洋紡（株）製）培地を90μL加え、37℃で1時間シェーカー上において反応させた。その後、アンピシリン含有LB選択培地（東洋紡（株）製）に播種し、37℃で一晩静置した。【０１０３】
（５）コロニーＰＣＲ
上記形質転換で得られたコロニーからコロニーＰＣＲを行い、想定されるインサートを確認した。
（５−１）ＰＣＲ用反応液溶液の調製
下記表９のコロニーＰＣＲ用反応液を調製した。【０１０４】
【表９】
2018101477.tif 000018
【０１０５】
上記コロニーＰＣＲ用反応液をＰＣＲ用チューブに入れ、上記アンピシリン含有ＬＢ培地で増殖した大腸菌を採取し、これを加えた。ＰＣＲは下記の表１０に示すプログラムで行った。【０１０６】
【表１０】
2018101477.tif 000019
【０１０７】
（５−２）電気泳動
上記ＰＣＲ反応液の1.2％アガロースゲルで印加電圧100V、時間30分間の電気泳動を行い、増幅が確認できたコロニーを、ＬＢ液体培地（東洋紡（株）製）が入った培養ボトルに移植し、37℃でインキュベートした。【０１０８】
（６）プラスミドの精製
上記ＬＢ液体培地で培養した大腸菌中の上記プラスミドを、Wizard Plus SV Minipreps. DNA Purification System（プロメガ（株）製）を用い、製品に添付された説明書に従って精製した。その後、精製したプラスミドの配列をユーロフィンジェノミクス株式会社に依頼して解析した。【０１０９】
（７）大腸菌BL21(DE3）の形質転換
大腸菌BL21(DE3）コンピテントセル（BioDynamics Laboratory社製）10μLを使用直前に氷上で融解させ、コンピテントセル溶液を調製した。このコンピテントセル溶液に、上記シーケンスにより目的とする配列が入っていることが確認できたプラスミド液1μlを加え、氷上で30分間放置した。【０１１０】
その後、42℃で30秒間インキュベート後、氷上で２分間冷却した。ここに、ＳＯＣ（東洋紡（株）製）培地を90μL加え、37℃で１時間シェーカー上において反応させた。その後、アンピシリン含有LB選択培地に播種し、37℃で一晩静置した。翌日、形質転換されて緑色の蛍光を発しているコロニーを取り、アンピシリン含有ＬＢ液体培地１mlが入った培養ボトルに入れ、37℃で一晩静置して前培養を行った。【０１１１】
（８）標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質の精製
（８−１）コロニーの培養
50mLチューブにアンピシリン含有ＬＢ液体培地４mLを入れ、ここに上記前培養液290μLを加えたものを試料として４本用意し、28℃で４時間シェーカー上で培養した。その後、100mMのIPTG（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を43μL加え、28℃で一晩シェーカー上で培養した。【０１１２】
（８−２）タンパク質の回収
翌日、上記の４本のチューブの培養液を１本のチューブに集約した。内容物を移した３本のチューブを、それぞれ１ｍlのＰＢＳ（-）バッファー（和光純薬工業（株）製）で洗浄し、この洗浄液もまとめたチューブに加えた。以上のように培養物を集約したチューブを、室温にて、5,000rpm（遠心機名：KUBOTA3740、ローター番号KUBOTA AF2018、久保田商事（株）製）で５分間遠心した。【０１１３】
その後、(i)上清を捨て、沈殿したペレットに、ＰＢＳ（-）バッファーを３ml加えて、(ii)よく攪拌した後、5,000rpmで５分間遠心した。上記の(i)と(ii)とを２回繰り返した。沈殿したペレットに、B-PER Lysis Buffer（Reagent社製）を４mL加え、蓋を締めて室温にて一晩シェーカーで攪拌した。【０１１４】
（８−３）His-tagによる精製
Ni-NTA Agarose（QlAGEN社製）を15mLチューブに２mLとり、(i)1,000rpmで１分間遠心し、(ii)上清を捨てて、１×ＰＢＳバッファーを1mL加えてよく攪拌した。上記(i)と(ii)とを３回繰り返し、Ni-NTA樹脂を調製した。【０１１５】
上記B-PER Lysis Buffer溶液が入ったチューブを、12,000rpmで10分間、室温にて遠心した後、上清を15mLのファルコンチューブに移した。ここに、よく撹拌した上記Ni-NTA樹脂400μLを加え、回転シェーカーで10分間、室温にて攪拌した。その後、1,000rpmで１分間、室温にて遠心し、上清を捨てた。ここに、(iii)１×ＰＢＳバッファーを４mL加えてよく攪拌し、(iv)1,000rpmで１分間、室温にて遠心し、上清を捨てた。(iii)と(iv)とを２回繰り返した。【０１１６】
その後、(v)20ｍMのイミダゾール（和光純薬工業（株）製）を４mL加えてよく攪拌し、(vi)1,000rpmで１分間、室温にて遠心し、上清を捨てた。(v)と(vi)とを２回繰り返した。ここに、250ｍMのイミダゾールを500μL加え、回転シェーカーで10分間、室温にて攪拌した。その後、1,000rpmで１分間遠心し、緑色蛍光を発している上清を、新しい15mLのファルコンチューブに入れ、次のゲルろ過用タンパク質精製溶液とした。【０１１７】
（８−４）ゲルろ過による精製
上記タンパク質精製溶液中のイミダゾールとPBSバッファーとを置換し、精製して目的の標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質を得た。以上の操作では、GEヘルスケア・ジャパン株式会社のNAP5カラムを使用し、製品に添付の説明書に従って精製を行った。【０１１８】
（９）標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質の選択
上記精製作業で得られた標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質濃度の吸光度（280nm）、及び発色団濃度（形成能）の吸光度（488nm）を常法に従って計測し、A488/A280の値が1.5を超えたものを、目的の標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質として選択した。結果を表１１に示した。【０１１９】
【表１１】
2018101477.tif 000020
【０１２０】
（実施例３）標的ペプチド配列結合ミセル（蛍光タンパク質会合駆動型ミセル）の作製
未修飾GFPに代えて、実施例２で調製した標的ペプチド配列結合GFPを用いて、実施例１と同様の方法により、標的ペプチド配列が結合した凝集性分子を調製した。引き続き、実施例１と同様の方法でミセル（蛍光タンパク質会合駆動型ミセル）を作成し、ミセル画分溶液中に存在する会合体の量を調べた。【０１２１】
（１）発光特性
上記のようにして反応させたミセル画分中の凝集体の量が、標的ペプチドによってどのように相違するかを実施例１と同様にして測定した（図６(A)〜(C)参照）。図６(A)〜(C)中、会合体を破線で、また、GFP-TPSを実線で示した。縦軸は、蛍光が観察された粒子数/50,000個、横軸は検出波長（nm）を示す。標的ペプチド配列結合ミセルでも、実施例１と同様に、510nm付近に発光のピークが観察された。【０１２２】
（２）会合体の存在の確認
ついで、ミセル画分中に存在する本発明のエンドサイトーシス増強剤（会合体）の量を、標的ペプチド配列なし（MCF7-0：未標的型）、標的ペプチドあり（MCF７-1(標的タイプ1型)及びMCF7-2(標的タイプ2型)）及び標的ペプチド+αスタンド（MCF７-1＋α(標的タイプ1強化型)）の4種類を用いた場合について確認した。【０１２３】
（３）標的ペプチドと結合したGFPの挙動の確認
（３−１）上記4つのタイプの凝集性分子を用いた場合の画分の分類
上記のようにして製造したGFPのそれぞれを、TPSとモル比10:1で混合し、37℃にて終夜静置し、標的ペプチド付きのGFP（標的ペプチドは、MCF7-0、MCF7-1、MCF7-2,MCF7-1＋αの4種類）の会合体及びGFP-TPSを得た。【０１２４】
この後、励起波長370nm−測定波長510nmの蛍光強度と、及び励起波長488nm−測定波長510nmの蛍光強度との比（I0）から、会合体の含有量（以下、「残留GFP量」ということがある。）を、Ａ（I0≦1.0(GFP残量が少ない）），Ｂ（1＜I0≦2.0(GFP残量が中程度），及び（ＣI0≦2.0(GFP残量が多い）という3つのクラスに分類した（図６(A)〜(C)参照）。【０１２５】
このような分類は、以下の理由に基づいて行った。まず、上記のようについてカルボシランデンドリマーとGFPとを図６に示すように終夜反応させると、タンパク質が提示された凝集性分子が得られるが、前記凝集性分子中にパーツとして取り込まれたタンパク質（GFP）の量には差があることがわかった。これは、上記式(II)から明らかなように、シロールとGFPとの結合可能部位は6か所あるためである。【０１２６】
ここで、励起波長370nmで励起した蛍光波形はミセルのFRET効率であるため、この波形内の480nm（シロール骨格凝集誘起発光体の蛍光）と510nm（GFPの蛍光）との強度比が高くなるということは、GFP側の蛍光強度が上昇し、FRET効率が良くなっていくことを示す。
また、励起波長488nmの蛍光はミセル内のGFPとは無関係に存在しているGFPの総量を計測していることになる。なぜなら、この蛍光量が上記のようなFRET効率とは独立した挙動をしていること、残留しているGFPであると想定されたこと、及び、実際にミセルの成分を電気泳動すると会合したGFPの存在が確認できたからである。その結果、使用した標的ペプチドによって、上記３つのクラスに属する会合体の量に相違があることが示された。【０１２７】
【表１２】
2018101477.tif 000021
*1：488nmで励起した場合の発光強度と370nmで励起した場合の発光強度との比
*2：A≦1.0, 1.0<B<3, 3.0≦C【０１２８】
上記表１２に示されるように、MCF7-2及びMCF7-1+αの2種類の標的配列を付けたものの方が会合体の生成率が他の配列をつけたものよりも有意に高くなっていた。【０１２９】
（３−２）GFP会合体形成の標的ペプチドによる相違−１
以上のようにして得られた凝集性分子を含む各溶液について何等の処理をすることなく、タンパク質濃度5μMの溶液10μLを、ゲル電気泳動に供して、含有される会合体を確認した。結果を図９(A)〜(B)に示す。(A)は蛍光検出結果、(B)はCBB染色結果である。
以上より、会合体としてはダイマー、テトラマー及びオクタマーが存在していることが確認された。【０１３０】
（実施例４）DDSリポソーム又はミセルの細胞取込み実験-2（会合体共存時）
（１）凝集性分子を含むミセル溶液の標的ペプチドによる相違−１
上記実施例3で得られた標的配列なしのGFPの会合体を、会合体の含量の多いもの（ミセルC）、中程度（ミセルB）、少ないもの（ミセルA）に分けてサンプル溶液とし、ゲル電気泳動を行なって、形成された会合体が何量体であるのかを検討した。12％ランイングゲル−4％スタッキングゲルにSDSを添加し（終濃度0.1％）、各サンプルの蛍光測定の条件を、分光光度計の感度を3ｘ3とし、蛍光強度のMaxを500に合わせて、ミセルCを1としたときに、ミセルAはその2倍量、GFPは各々5倍量を、それぞれアプライして20mAで2時間の条件でゲル電気泳動を行なった。この実験では、ミセル及びGFPはすべて原液をアプライした。【０１３１】
結果を図10(A)〜(D)に示す。ここで、(A)及び(B)はFITC染色結果（レーザー475及びPMT500）である。また、(C)及び(D)はCBB染色後に脱色した結果である（レーザー635(cy5)及びPMT500）。【０１３２】
図10(A)及び(B)に示すように、凝集性分子の会合体の含量が高い試料を使用した場合には、モノマー及びダイマー以外に、テトラマー、オクタマーの含有量が多いことが確認された。このとき、MCF7-0では上記会合体の濃度が低いものしか得られなかったため、ミセルCはゲル電気泳動に供することができなかった。また、MCF7-0のミセルAでは、GFPのみを泳動した場合と同程度のテトラマー及びオクタマーが観察された。図10(C)及び(D)では、モノマー及びダイマーの存在は確認されたが、テトラマー及びオクタマーについては確認できなかった。【０１３３】
（２）凝集性分子を含むミセル溶液の標的ペプチドによる相違−２
次いで、上記実施例２と同じゲル電気泳動条件の下、Amikon 100Kで濃縮し会合させたGFPを、MCF7-1及びMCF7-と比較した。各サンプルの蛍光測定の条件を、分光光度計の感度を3ｘ3とした。MCF7-1のミセルC・タンパク質（300μM）は5μL又は20μLアプライした。MCF7-2のミセルC・タンパク質（300μM）についても同量でアプライした。蛍光検出及び染色も上記（１）に準じて行った。【０１３４】
結果を図11(A)〜(D)に示す。図11の(A)及び(B)は蛍光検出の結果（FITC (Laser 635)及びPMT 400）である。また、(C)及び(D)はCBB染色結果（FITC (Laser 635 (cy5))及びPMT 600）である。結果は、上記（１）と同様であった。【０１３５】
（３）タンパク質の混合物の取り込み量と会合タンパク質の量との相関関係
上述した標的ペプチドなし及び標的ペプチドありのミセルをそれぞれ、MCF-7細胞の培養ウェルに50μLの量で添加して、細胞内への各ミセルの取り込み量と、同じ画分中に存在する会合体の量との関係を検討した。【０１３６】
1x109個／ウェルの細胞に対して、上記のミセルと凝集性分子の会合体とを含む試料を50μLの量で添加し、37℃にて9時間インキュベートした後に、FACSで蛍光を検出した。
FACSデータを、横軸を残留タンパク質のクラス分けを示す蛍光タンパク質の発光強度比(ミセルと総合）とし、縦軸をFACSデータの50,000個の細胞のうち、明らかな蛍光強度を持つ細胞数の割合（％）としてまとめた。結果を図12〜15に示す。【０１３７】
図12及び13中、黒い丸はミセルA（会合体の量が少ないもの）、黒い四角はミセルB（会合体の含有量が中程度のもの）、黒い三角はミセルC（会合体の含有量が多いもの）、白抜きの四角はミセルにGFPを加えた場合の取り込み量を示す。凝集性分子の会合体の含有量が多いほどミセルの細胞内への取込み量が増加すること、すなわち、これらの間には相関があることが確認された。【０１３８】
図14及び15に、GFPに結合させた標的ペプチドの有無及び標的ペプチドによる相違を示す。この結果から、標的ペプチドが結合している方が取り込み量が多いことが確認された。蛍光寿命に基づいて当業者蛍光タンパク質処理を行なった結果も、この傾向を支持した。【０１３９】
以上より、本発明のエンドサイトーシス増強剤は、GFPを提示するカルボシランデンドリマーによって形成されたミセル（又はベジクル）の細胞内への取込みを大きく増強することが示された。【０１４０】
（実施例５）ミセル作製用バッファーの検討
これまでMCF-7ミセルの調製は、1×PBSという１種類のバッファー中のみで行ってきた。薬物の内包実験を実施するにあたり、内包するさまざまな薬剤の溶解性や安定性を考慮する必要があったため、1×PBS以外のバッファーを使用したMCF-7ミセルの調製の可否を検討した。【０１４１】
（１）使用するバッファーの検討
分子生物学の分野で、PBSに近いpH 7付近で最もよく利用されているTris-HClバッファー、グッドバッファー（1966年に Norman Goodらによって示された12種類の緩衝剤をいう）の１つであるHEPESバッファー、有機酸バッファーとしてクエン酸バッファー、及び無機酸バッファーとして炭酸バッファーの４種類を調製し、それぞれのバッファー中でミセルを形成させ、分離してミセルの内側が上記４種類のうちのいずれかのバッファー、ミセルの外側がPBSというミセル画分を得て、蛍光及び粒度を測定し、短期安定性（ミセル作製後１〜２日間の安定性）を確認した。【０１４２】
（２）50ｍM Tris-HClバッファー(pH 8.0)中でのミセル形成
（２−１）従来のミセル作製法
これまで、生体内と同じイオン種で構成され、等張であるためより生体条件に近いと思われる1xPBS中でミセルを作製していた。【０１４３】
しかし、ミセル内部は、当該ミセルを形成させたバッファーで満たされることになるため、薬剤との親和性のよいバッファー中でのミセル作製を検討することとした。一般的に使用されるバッファーとしては、Tris-HClバッファー、Hepesバッファー、MOPSバッファー、CHAPSバッファー等を上げることができるが、まず、50 mM Tris-HCl (pH 8.0)（以下、単に「トリスバッファー」ということがある。）中でのミセル形成を検討した。【０１４４】
（２−２）ミセル作製法の変更
使用するバッファーをすべて50 mMのTris-HCl (pH 8.0)とし、このバッファーでNICKカラムを予め5回洗浄し、NICKカラムを上記トリスバッファーで平衡化した。【０１４５】
（２−３）ミセルの作製
Amicon 10k Filterを用いて、14,000×gで15分間遠心し、219.2μLのMCF-7ミセル用蛍光タンパク質を濃縮した。トリスバッファーで99μLにメスアップし、100 mMのDTTを1μL加えて10分間静置して試料混合液とした。【０１４６】
上記のようにトリスバッファーで平衡化したNICKカラムに上記試料混合液をかけ、365 μLのトリスバッファーを添加し、その後、380 μLのトリスバッファーで溶出した。この後、10.28 μLのTPSを溶出した溶液に加え、10分間ボルテックスして37℃にて終夜静置し、ミセル反応液を得た。この反応液中には、形成されたミセル（以下、「MCF-7ミセル」という。）及びMCF-7ミセル用蛍光タンパク質の会合体が含まれていた。
使用するトリスバッファーは、1MのTris-HCl (pH 8.0)をストック溶液として調整し、これをmilliQ（Merk Millipore）で20倍希釈して使用した。【０１４７】
（２−４）ミセルの分離
以上のようにして得たミセル反応液をAmicon 100k Filterにかけ、14,000×gで10 分間遠心し、フィルター上液とフィルター下液に分離した。【０１４８】
上液の入ったフィルターに100 μLの1×PBSを加えて14,000×gで10分間遠心する洗浄操作を3回繰り返し、トリスバッファーを1×PBSに交換した。バッファー交換した上液（ミセル画分液）を卓上遠心機で遠心して回収した。次いで、空のフィルターに適量の1xPBSを加えて10分間置き、フィルターの天地を返してさらに回収した。回収した液を1×PBSで160 μLにメスアップした。この液5μLを取り、1×PBS 95μLを加えて20倍希釈（2.5μM）として粒度を測定、8 μLを取り、1×PBS 392μLを加えて50倍希釈（1μM）として蛍光を測定した。
下液（ミセル未反応画分）5 μLを取り、20倍希釈して100 μLとし、粒度を測定した（図16(A)参照）。また、下液16 μLを取って400 μLに希釈し、蛍光を測定した（図20参照）。【０１４９】
粒度測定には、Zetasizer（Malvern製、セル：ZEN0040）を使用した。また、蛍光測定には蛍光光度計RF-5300PC（（株）島津製作所製）を使用し、励起波長を370 nmとし、488 nmで測定した。【０１５０】
（３）50 mM HEPESバッファー(pH 7.6)中でのミセル形成
ミセル画分液は50μM×160μLを作製した。経過濃度は20μM、終濃度50μMであった。ミセル作製用として50ｍMのHEPES バッファー(pH 7.6)とした点を除いて、トリスバッファーを用いた場合と同様にしてミセルを作製した。ミセル分離時は、Amicon 100k Filterを用いて、トリスバッファーの場合と同様に、1×PBSにバッファー交換を行ってミセル画分液を得た。【０１５１】
ミセル画分液及びミセル未反応画分液の各5μLを取り、1×PBS 95μLを加えて20倍希釈（2.5μM）として粒度を測定した（図17参照）。
8μLのミセル画分液に392 μLの1×PBS を添加して50倍希釈（1μM）とし、蛍光を測定した。16 μLの未反応画分液に384 μLの1×PBS を添加して25倍希釈し、蛍光を測定した（図21(A)参照）。【０１５２】
（４）50 mMクエン酸バッファー（pH 7.6）中でのミセル形成
クエン酸ナトリウムリムを使用して50 mMのクエン酸バッファー（pH 7.6）を調製した。ミセル画分液は50 μM×160 μLを作成した。経過濃度は20 μM、終濃度は50 μMとした。ミセル作製用バッファーを50 mMクエン酸バッファーに代えた点を除いて、トリスバッファーを使用した場合と同様にしてミセルを形成し、分離した。5 μLのミセル画分液に95 μLの1×PBSを加えて試料（2.5μM）とし、また、5 μLのミセル未反応画分に95μLの1×PBSを加えて20倍希釈し、それぞれ粒度を測定した（図18参照）。【０１５３】
ミセル画分液及びミセル未反応画分液の各5 μLを取り、1×PBS 95μLを加えて20倍希釈（2.5 μM）として粒度を測定した（図18参照）。
8 μLのミセル画分液に392 μLの1×PBS を添加して50倍希釈（1μM）とし、蛍光を測定した。16 μLの未反応画分液に384 μLの1×PBS を添加して25倍希釈し、蛍光を測定した（図22(A)参照）。【０１５４】
（５）50 mM 炭酸−重炭酸バッファー(pH 8.36)中でのミセル形成
炭酸水素ナトリウムを用いて、50 ｍMの炭酸−重炭酸バッファー (pH 8.36)を調整した。ミセル画分液は50 μM×160 μLを作成した。経過濃度は20μM、終濃度50μMであった。ミセル作製用としてバッファーを50 mM 炭酸−重炭酸バッファー(pH 8.36)に代えた点を除いて、トリスバッファーを用いた場合と同様にしてミセルを作製した。ミセル分離時は、Amicon 100k Filterを用いてトリスバッファーを用いた場合と同様にして、バッファー交換を行ってミセル画分液を得た。【０１５５】
ミセル画分液及びミセル未反応画分液の各5μLを取り、1×PBS 95μLを加えて20倍希釈（2.5μM）として粒度を測定した（図19参照）。
8μLのミセル画分液に392 μLの1×PBS を添加して50倍希釈（1 μM）とし、蛍光を測定した。16 μLの未反応画分液に384μLの1×PBS を添加して25倍希釈し、蛍光を測定した（図23(A)参照）。【０１５６】
（６）結果
上記の通り、４種類のバッファー用いて、終濃度50μMのMCF-7ミセルを調製した。それぞれのMCF-7ミセルの粒度測定において、いずれの場合も1×PBSと同じ100〜200nm付近に粒度分布が認められた（図16〜図19）。また、励起波長を370 nm、蛍光波長488 nmの蛍光光度計を用いた測定においても、すべてのバッファーで1×PBSと同様の蛍光スペクトルが観測された（図20〜23）。Tris-HClバッファー、HEPESバッファー、炭酸バッファー、及びクエン酸バッファーのいずれを使用した場合でも、1×PBSと同様に、MCF-7ミセルの調製が可能であることが示された。【０１５７】
また、各バッファーを使用して作製したMCF-7ミセル溶液を４℃にて保存し、ミセル作製から１〜４日後に、上記と同様の条件で蛍光分析を行なった。いずれのバッファーを使用した場合でも、蛍光強度はほぼ横ばいで推移し、短期の安定性が確認された（図20(B)〜図23(B)）。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
本願発明は、医薬製剤分野、特に薬剤送達の分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１５９】
配列番号１：ＧＦＰに組み込む標的認識配列ペプチド（MCF7-1）
配列番号２：ＧＦＰに組み込む標的認識配列ペプチド（MCF7-2）
配列番号３：ＧＦＰに組み込む標的認識配列ペプチド（MCF7-1＋αスタンド）
配列番号４：MCF7-1を組み込んだＧＦＰ
配列番号５：MCF7-2を組み込んだＧＦＰ
配列番号６：MCF7-1＋αスタンドを組み込んだＧＦＰ
配列番号７：ＧＦＰのアミノ酸配列
配列番号８：ＧＦＰのアミノ酸配列
配列番号９：ＢＦＰのアミノ酸配列
配列番号１０：ＹＦＰのアミノ酸配列
配列番号１１：イソギンチャクモドキ由来の蛍光タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２：ＭＣＦ７−１の増幅用フォワードプライマー
配列番号１３：ＭＣＦ７−１の増幅用リバースプライマー
配列番号１４：ＭＣＦ７−２増幅用フォワードプライマー
配列番号１５：ＭＣＦ７−２増幅用リバースプライマー
配列番号１６：MCF7-1＋αスタンド増幅用フォワードプライマー
配列番号１７：MCF7-1＋αスタンド増幅用リバースプライマー
配列番号１８：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号１９：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号２０：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号２１：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号２２：オリゴヌクレオチド
配列番号２３：オリゴヌクレオチド
配列番号２４：オリゴヌクレオチド
配列番号２５：オリゴヌクレオチド
配列番号２６：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号２７：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号２８：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号２９：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号３０：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号３１：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号３２：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号３３：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号３４：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
【図１】
2018101477.tif 000028
【図２】
2018101477.tif 000029
【図３】
2018101477.tif 000030
【図４】
2018101477.tif 000031
【図５】
2018101477.tif 000032
【図６】
2018101477.tif 000033
【図７】
2018101477.tif 000034
【図８】
2018101477.tif 000035
【図９】
2018101477.tif 000036
【図１０】
2018101477.tif 000037
【図１１】
2018101477.tif 000038
【図１２】
2018101477.tif 000039
【図１３】
2018101477.tif 000040
【図１４】
2018101477.tif 000041
【図１５】
2018101477.tif 000042
【図１６】
2018101477.tif 000043
【図１７】
2018101477.tif 000044
【図１８】
2018101477.tif 000045
【図１９】
2018101477.tif 000046
【図２０】
2018101477.tif 000047
【図２１】
2018101477.tif 000048
【図２２】
2018101477.tif 000049
【図２３】
2018101477.tif 000050
【配列表】
2018101477000001.app
【国際調査報告】
2018101477.tif 000051
2018101477.tif 000052
2018101477.tif 000053
2018101477.tif 000054