(57)【要約】  一実施形態によれば、抗体およびＨＣＰを含む溶液を、クロマトグラフィー担体に接触させて、前記抗体と前記ＨＣＰとを分離することを含む、抗体の精製方法であって、前記クロマトグラフィー担体は、多孔性粒子を含むベース担体と、前記ベース担体に結合した第一級アミノ基を複数有する化合物とを含み、前記第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基の２０〜５５％が、疎水基で修飾されており、前記抗体の回収率が８５％以上であり、精製後の抗体溶液中の前記ＨＣＰ量が４５ｐｐｍ未満である、方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体および宿主由来タンパク質（ＨＣＰ）を含む溶液を、クロマトグラフィー担体に接触させて、前記抗体と前記ＨＣＰとを分離することを含む、抗体の精製方法であって、
前記クロマトグラフィー担体は、多孔性粒子を含むベース担体と、前記ベース担体に結合した第一級アミノ基を複数有する化合物とを含み、前記第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基の２０〜５５％が、疎水基で修飾されており、
前記抗体の回収率が８５％以上であり、精製後の抗体溶液中の前記ＨＣＰ量が４５ｐｐｍ未満である、方法。
【請求項２】
前記方法がフロースルーモードで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基の４０％超が、前記疎水基で修飾されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一級アミノ基を複数有する化合物が、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、キトサン、ポリリジン、ポリグアニジン、およびポリオルニチンからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第一級アミノ基を複数有する化合物が、ポリアリルアミンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリアリルアミンの重量平均分子量が、５，０００〜１５，０００である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記疎水基が、以下の一般式（１）〜（３）のいずれかの構造を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法：
【化１】
2018092691.tif 000009
［式中、
ｎは、０〜８の整数であり、
Ｒ１は、ｎが０〜３の整数である場合はフェニル基であり、ｎが４〜８の整数である場合はＨまたはフェニル基であり、
＊は、前記第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基との結合部位である］。
【請求項８】
前記疎水基が、前記一般式（１）の構造を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記一般式（１）において、ｎが４〜８の整数であり、Ｒ１がＨである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記一般式（１）において、ｎが０〜８の整数であり、Ｒ１がフェニル基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記疎水基が、無水吉草酸、無水カプロン酸、無水エナント酸、無水カプリル酸、無水ペラルゴン酸、無水安息香酸、ブチルグリシジルエーテル、およびフェニルグリシジルエーテルからなる群より選ばれる化合物に由来する基である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記疎水基が、無水吉草酸または無水安息香酸に由来する基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体およびＨＣＰを含む溶液の電気伝導度が、２２ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体およびＨＣＰを含む溶液に多価陰イオンがさらに含まれる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記多価陰イオンが、クエン酸イオン、リン酸イオン、および硫酸イオンからなる群より選択される１種以上である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の精製方法に関する。より詳しくは、本発明は、抗体および宿主由来タンパク質（ＨＣＰ）などの不純物を含む溶液から抗体と不純物とを分離する抗体の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーを用いてバイオ医薬品等の精製を行うことは広く知られており、種々の分子間相互作用を利用して目的物と不純物の分離が行われる。例として、静電的相互作用を利用したイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用を利用した疎水性クロマトグラフィーおよび抗体に対するアフィニティー相互作用を利用したプロテインＡクロマトグラフィーなどがある。【０００３】
バイオ医薬品の精製において最も多く用いられているのは、イオン交換クロマトグラフィーである。イオン交換クロマトグラフィーは、処理液の電気伝導度が増加することで吸着能が減少することが知られている。従って、電気伝導度の高い試料においては、吸着処理を行う前に、希釈や脱塩により、電気伝導度を例えば５ｍＳ／ｃｍまで下げる必要がある。【０００４】
このようなイオン交換クロマトグラフィーの欠点を補うため、近年は静電的相互作用に加え、疎水性相互作用、親水性相互作用、キレート相互作用などを併せ持つクロマトグラフィー担体の開発が盛んに行われている。【０００５】
このように複数の作用を併せ持つクロマトグラフィー担体としては、Ｃａｐｔｏ（登録商標）ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ（登録商標）ＭＭＣ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）  ＡＸ  ＳＴＡＲ（以上、Ｐａｌｌ社製）、Ｅｓｈｕｍｕｎｏ（登録商標）ＨＣＸ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、ＣＨＴ（登録商標）Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（バイオ・ラッド社製）、およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＭＸ  Ｔｒｐ−６５０（東ソー社製）などが市販されている。【０００６】
これらの複数の作用を併せ持つクロマトグラフィー担体は、静電的相互作用を有するリガンドに加え、異なる原理の相互作用を有するリガンドを同一のベース担体に導入するか、あるいは、ベース担体に結合させたリガンドの一部をさらに修飾することにより得られる。このようにして得られた担体は、静電的相互作用を有するリガンドのみを担持したイオン交換クロマトグラフィー担体とは異なる選択性を有する。ベース担体に結合させるリガンドとしては、例えばポリアミンが検討されている。【０００７】
例えば、特許文献１には、ポリアミンをリガンドとして有するクロマトグラフィー担体およびその血液凝固因子の精製への使用が開示されている。
特許文献２には、ポリアリルアミンの架橋重合体で被覆された表面を有する多孔質吸着媒体が開示されている。【０００８】
特許文献３には、ベース担体にポリアリルアミンを結合させ、該ポリアリルアミンをさらなる官能基で修飾したクロマトグラフ媒体が開示されており、さらなる官能基として陽イオン交換基が使用されている。
特許文献５には、異なる相互作用を有する複数種の官能基を含むリガンドを付加した担体が、免疫グロブリンの精製に好適に使用され得ることが記載されている。特にアミノ基とフェニル基を有するリガンド構造体を使用した場合、免疫グロブリンをｐＨ７でフロースルー画分にて回収できることが示唆されている。【０００９】
特許文献６には、疎水的陰イオン交換担体として知られているＳｐｅｒｏｓｉｌ  ＱＭＡを用いて、初乳またはその血清中に存在する免疫グロブリンをフロースルーにて分離する方法が記載されている。また、特許文献７には、色素結合型クロマト担体が、コーンフラクションＩＩ由来の免疫グロブリンをフロースルーにて他の不純物と分離する事例を示している。
特許文献８には、陰イオン交換基と芳香族基とを有する担体をフロースルーモードで使用して、抗体を精製する方法が開示されている。【００１０】
非特許文献１には、ベース担体であるセファロースＦＦ樹脂にポリエチレンイミンを結合させ、該ポリエチレンイミンをさらにベンゾイル基で修飾したクロマトグラフィー担体が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の精製において優れた性能を発揮することが記載されている。【００１１】
このように、種々のクロマトグラフィー担体が提案されているが、精製対象物質に応じて、その物質に適した吸着力、細孔径、比表面積等の吸着および／または分離特性を有するクロマトグラフィー担体を開発することは、尽きることのない課題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表平４−５０６０３０号公報
【特許文献２】特開２００９−５３１９１号公報
【特許文献３】特表２００４−５２２４７９号公報
【特許文献４】特開２０１６−６４１０号公報
【特許文献５】特表２００１−５０１５９５号公報
【特許文献６】米国特許第４５８２５８０号明細書
【特許文献７】豪国特許出願公告第５９４０５４号明細書
【特許文献８】特許第５０６４２２５号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，１３７２（２０１４），１５７−１６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記のような背景のもと、精製対象物質に適した吸着および／または分離特性を有するクロマトグラフィー担体が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは上記の課題を解決するため鋭意検討した結果、多孔性粒子を含むベース担体にポリアミンを付加し、その後、ポリアミンにおけるアミノ基を疎水基で修飾して得られたクロマトグラフィー担体が、タンパク質の吸着能に優れており、タンパク質の分離精製に使用できることを見出した（特許文献４）。今般さらに検討を進めることにより、多孔性粒子を含むベース担体に、第一級アミノ基を複数有する化合物を付加し、その後、前記第一級アミノ基の一部を疎水基で修飾して得られたクロマトグラフィー担体が、特に抗体の分離精製に適した特性を有することを見出し、本発明に至った。すなわち本発明は、例えば以下のとおりである。
［１］抗体および宿主由来タンパク質（ＨＣＰ）を含む溶液を、クロマトグラフィー担体に接触させて、前記抗体と前記ＨＣＰとを分離することを含む、抗体の精製方法であって、
前記クロマトグラフィー担体は、多孔性粒子を含むベース担体と、前記ベース担体に結合した第一級アミノ基を複数有する化合物とを含み、前記第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基の２０〜５５％が、疎水基で修飾されており、
前記抗体の回収率が８５％以上であり、精製後の抗体溶液中の前記ＨＣＰ量が４５ｐｐｍ未満である、方法。
［２］前記方法がフロースルーモードで行われる、［１］に記載の方法。
［３］前記第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基の４０％超が、前記疎水基で修飾されている、［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記第一級アミノ基を複数有する化合物が、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、キトサン、ポリリジン、ポリグアニジン、およびポリオルニチンからなる群より選択される、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］前記第一級アミノ基を複数有する化合物が、ポリアリルアミンである、［４］に記載の方法。
［６］前記ポリアリルアミンの重量平均分子量が、５，０００〜１５，０００である、［５］に記載の方法。
［７］前記疎水基が、以下の一般式（１）〜（３）のいずれかの構造を有する、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法：
【化１】
2018092691.tif 000002
［式中、
ｎは、０〜８の整数であり、
Ｒ１は、ｎが０〜３の整数である場合はフェニル基であり、ｎが４〜８の整数である場合はＨまたはフェニル基であり、
＊は、前記第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基との結合部位である］。
［８］前記疎水基が、前記一般式（１）の構造を有する、［７］に記載の方法。
［９］前記一般式（１）において、ｎが４〜８の整数であり、Ｒ１がＨである、［８］に記載の方法。
［１０］前記一般式（１）において、ｎが０〜８の整数であり、Ｒ１がフェニル基である、［８］に記載の方法。
［１０−１］  ｎが４〜８の整数であり、Ｒ１がＨであり、前記第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基の４０％超〜５５％が前記疎水基で修飾されている、［７］に記載の方法。
［１１］前記疎水基が、無水吉草酸、無水カプロン酸、無水エナント酸、無水カプリル酸、無水ペラルゴン酸、無水安息香酸、ブチルグリシジルエーテル、およびフェニルグリシジルエーテルからなる群より選ばれる化合物に由来する基である、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］前記疎水基が、無水吉草酸または無水安息香酸に由来する基である、［１１］に記載の方法。
［１２−１］  前記疎水基で修飾された前記第一級アミノ基を複数有する化合物が、以下の一般式（ａ）で表される繰返し単位と一般式（ｂ）で表される繰返し単位を含む、［８］に記載の方法：
【化２】
2018092691.tif 000003
（式（ｂ）中、ｎおよびＲ１は、前記一般式（１）において定義したとおりである）。
［１２−２］前記疎水基で修飾された前記第一級アミノ基を複数有する化合物が、親水性基であり静電的相互作用を有するアミノ基（一般式（ａ）における−ＮＨ２基）、静電的相互作用を有するアミド基（一般式（ｂ）における−ＮＨ−ＣＯ−基）、疎水的相互作用を有する疎水性基（一般式（ｂ）におけるＲ基）を有する、［１２−１］に記載の方法。
［１３］前記抗体およびＨＣＰを含む溶液の電気伝導度が、２２ｍＳ／ｃｍ以下である、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］前記抗体およびＨＣＰを含む溶液に多価陰イオンがさらに含まれる、［１］〜［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］前記多価陰イオンが、クエン酸イオン、リン酸イオン、および硫酸イオンからなる群より選択される１種以上である、［１４］に記載の方法。
［１６］前記抗体がモノクローナル抗体である、［１］〜［１５］のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の実施形態によると、抗体およびＨＣＰなどの不純物を含む溶液から、抗体と不純物とを分離することにより高い精製度で抗体を精製する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】参考例１においてサイズ排除クロマトグラフィー分析を実施して得られたクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施形態について、詳細に説明する。
本発明の一実施形態によると、抗体およびＨＣＰなどの不純物を含む溶液をクロマトグラフィー担体に接触させて、前記抗体と前記不純物とを分離することを含む抗体の精製方法であって、前記クロマトグラフィー担体は、多孔性粒子を含むベース担体と、前記ベース担体に結合した第一級アミノ基を複数有する化合物とを含み、前記第一級アミノ基を複数有する化合物における前記第一級アミノ基の２０〜５５％が、疎水基で修飾されている、方法が提供される。
【００１９】
実施形態に係る方法において使用されるクロマトグラフィー担体は、リガンドとして第一級アミノ基を複数有する化合物を含み、さらに第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基の２０〜５５％が、疎水基で修飾されている。このような構成のクロマトグラフィー担体を抗体の精製において使用した場合、抗体およびＨＣＰなどの不純物を含む溶液から抗体と不純物とを分離する能力（特にＨＣＰ除去能）が高く、高い精製度および回収率で精製抗体を得ることができる。従来、イオン交換クロマトグラフィーでは、精製対象である抗体および不純物を含む溶液（以下、「抗体溶液」とも称する）の電気伝導度が高くなると、吸着能および分離能が低下することが課題となっていた。また、特に抗体医薬精製でフロースルーモードにて利用される陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて、培地や緩衝液に含まれることにより抗体溶液中にクエン酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン等の多価陰イオンが存在する場合にも、同様の課題があった。しかしながら、実施形態に係る方法によると、抗体溶液の電気伝導度が比較的高い場合および／または抗体溶液中に多価陰イオンが存在する場合においても、高い吸着能および分離能を維持することができ、高い精製度および回収率で精製抗体を得ることができる。
【００２０】
このように、実施形態に係る方法は、抗体溶液の電気伝導度にかかわらず優れた吸着能および分離能を発揮するため、広範囲の抗体溶液の精製に使用可能であると言える。また、抗体培養液と同等の電気伝導度（約１４ｍＳ／ｃｍ）を有する抗体溶液をそのままカラムに供することができ、従来行っていた精製前に抗体溶液を脱塩、希釈等して電気伝導度を調整する工程を行う必要がないため、より簡便に抗体の精製を行うことができる。さらに、精製前に抗体溶液から多価陰イオンを除去する必要もないため、この点でもより簡便に抗体の精製を行うことができると言える。
【００２１】
１．クロマトグラフィー担体
以下、実施形態で使用するクロマトグラフィー担体の各構成要素について、順に説明する。
（１）ベース担体
クロマトグラフィー担体は、一般的に、ベース担体にリガンドが結合した構成を有する。ベース担体は多孔性粒子を含み、多孔性粒子は、リガンドとしての第一級アミノ基を複数有する化合物を導入するための官能基（例えば、水酸基、カルバモイル基など）で修飾されている。そのような官能基で修飾され得る限り、使用される多孔性粒子は限定されないが、例えば、アガロース、デキストラン、でんぷん、セルロース、プルラン、キチン、キトサン、三酢酸セルロース、二酢酸セルロースなどの多糖類およびその誘導体；ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアルキルビニルエーテル、ポリビニルアルコールなどの有機重合体などが好ましく挙げられる。多孔性粒子は、架橋構造を形成していることが、機械的強度を確保できる点から好ましい。これらの中でも、架橋反応によってセルロース粒子の骨格が補強された架橋セルロース粒子を用いることがより好ましい。
【００２２】
架橋セルロース粒子としては、クロマトグラフィー担体のベース担体として使用され得るものであれば特に制限されない。原料となるセルロースは、結晶セルロースであっても非結晶セルロースであってもよいが、強度が高いことから結晶セルロースが好ましい。
【００２３】
好適に使用できる架橋セルロース粒子としては、例えば、特開２００９−２４２７７０号公報に開示されている多孔性セルロースゲルが挙げられる。同公報に開示されている多孔性セルロースゲルは、未架橋セルロース粒子の懸濁液に、セルロースモノマーのモル数の６〜２０倍量の塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩およびホウ酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種の無機塩の存在下、セルロースモノマーのモル数の４〜１２倍量の架橋剤と、架橋剤のモル数の０．１〜１．５倍量のアルカリとを３時間以上かけて連続滴下または分割添加する工程を含む方法で得られる。このようにして得られた架橋セルロース粒子は、機械的強度が高く、流速の速いクロマトグラフィー条件下での使用が可能であり、生産性の高い陽イオン交換クロマトグラフィー担体を与えることができる。ここで、「セルロースモノマー」とは、セルロースの構成単位であるグルコースユニットを意味する。また、セルロースモノマーのモル数（すなわち、重合度）は、グルコース１ユニットから水分を引いた量（すなわちセルロースの乾燥重量）に基づいて計算する（分子量１６２を１モルとする）。
【００２４】
多孔性粒子の形状は特に制限されないが、機械的強度が高く、ゲル沈降性に優れ、均一な充填床を作製できることから、球状のものが好ましい。この場合、多孔性粒子の真球度は０．８〜１．０であることが好ましい。ここで「真球度」とは、多孔性粒子の短径／長径を意味する。
【００２５】
球状セルロース粒子は、例えば、結晶セルロースまたは結晶領域と非結晶領域とからなるセルロースを溶解し再生することで容易に得ることができる。球状セルロース粒子の製造方法としては、例えば、特公昭５５−３９５６５号公報、特公昭５５−４０６１８号公報などに記載される酢酸エステルを経由する方法；特公昭６３−６２２５２号公報などに記載されるチオシアン酸カルシウム塩を含む溶液から製造する方法；特開昭５９−３８２０３号公報などに記載されるパラホルムアルデヒドおよびジメチルスルホキシドを含む溶液から製造する方法；特許第３６６３６６６号公報に記載される、セルロースを塩化リチウム含有アミドに溶解させたセルロース溶液から製造する方法などが挙げられる。また、球状の架橋セルロース粒子は、球状セルロース粒子を架橋することで得ることができる。
【００２６】
多孔性粒子の粒子径は、１０〜５００μｍが好ましく、３０〜２００μｍがより好ましく、５０〜１５０μｍが特に好ましい。また、平均粒子径は、３０〜１０００μｍが好ましく、４０〜２００μｍがより好ましく、５０〜１００μｍが特に好ましい。ここで、「粒子径」とは、各多孔性粒子の粒子径の実測値を意味し、「平均粒子径」とは、上記粒子径に基づいて算出される平均値を意味する。
【００２７】
本明細書において、多孔性粒子の粒子径および平均粒子径は、例えば、レーザー回折／散乱式の粒子径分布測定装置を用いて測定することができる。この装置では、粒子群にレーザー光を照射し、そこから発せられる回折／散乱光の強度分布パターンから粒度分布を求め、それに基づいて粒子径および平均粒子径を算出する。具体的な測定装置としては、レーザー回折／散乱式の粒子径分布測定装置ＬＡ−９５０（株式会社堀場製作所製）などを用いることができる。
【００２８】
あるいは、光学顕微鏡で撮影した画像を使用して粒子径を測定することもできる。具体的には、ノギスなどを用いて画像上の粒子径を計測し、撮影倍率から元の粒子径を求める。そして、光学顕微鏡画像から求めたそれぞれの粒子径の値から、下記の式によって平均粒子径を算出する。
体積平均粒子径（ＭＶ）＝Σ（ｎｄ４）／Σ（ｎｄ３）
［式中、ｄは光学顕微鏡画像から求めた各粒子の粒子径の値を表し、ｎは測定した粒子の個数を表す。］
【００２９】
多孔性粒子の多孔性は、細孔サイズ特性をもって特徴づけることができる。細孔サイズ特性を示す指標の一つとして、ゲル分配係数Ｋａｖがある。細孔サイズは、粒子の物理的強度や精製対象となる目的物質の多孔性粒子内での拡散性に影響を及ぼす。従って、細孔サイズによって、多孔性粒子中を通過する液体の流速や多孔性粒子の動的吸着容量に違いが生じる。そのため、目的に応じた細孔サイズとなるような多孔性粒子の設計が必要となる。特に動的吸着容量の観点から、多孔性粒子のゲル分配係数Ｋａｖは、重量平均分子量１．５×１０５Ｄａの標準ポリエチレンオキシドをサンプルとして使用し、純水を移動相として使用した場合に、０．１５〜０．６の範囲であるものが好ましく、より好ましくは０．２〜０．５５であり、特に好ましくは０．３〜０．５である。
【００３０】
実施形態に係る発明においては、上記範囲のゲル分配係数を得られるような細孔サイズを有する多孔性粒子を使用することが、吸着特性の観点から好ましい。多孔性粒子として架橋セルロース粒子を使用する場合、そのゲル分配係数Ｋａｖは、例えば、粒子形成時のセルロースの溶解濃度を制御することにより調整することができる。
【００３１】
ゲル分配係数Ｋａｖは、特定の分子量を有する標準物質（例えば、ポリエチレンオキシド）をサンプルとして使用した場合の保持容量とカラム体積との関係から、次式により求めることができる。
Ｋａｖ＝（Ｖｅ−Ｖ０）／（Ｖｔ−Ｖ０）
［式中、Ｖｅはサンプルの保持容量（ｍＬ）、Ｖｔは空カラム体積（ｍＬ）、Ｖ０はブルーデキストランの保持容量（ｍＬ）を表す。］
ゲル分配係数Ｋａｖの具体的な測定方法は、例えば、Ｌ．Ｆｉｓｃｈｅｒ著生物化学実験法２「ゲルクロマトグラフィー」第１版（東京化学同人）などに記載されている。
【００３２】
（２）リガンド
実施形態に係る方法で使用するクロマトグラフィー担体は、リガンドとして第一級アミノ基を複数有する化合物を含み、さらに第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基の２０〜５５％が、疎水基で修飾されている。ここで、「第一級アミノ基を複数有する化合物」は上述したベース担体に結合した状態で存在し、したがって本明細書において、用語「第一級アミノ基を複数有する化合物」とは「第一級アミノ基を複数有するリガンド」と表すこともできる。
【００３３】
（第一級アミノ基を複数有する化合物）
まず、第一級アミノ基を複数有する化合物について説明する。
リガンドとして使用される第一級アミノ基を複数有する化合物は、ベース担体上の官能基と結合し得るものであれば、特に限定されない。具体的には、ポリアリルアミン、ポリビニルアミンなどのポリアミン；キトサンなどの多糖類；ポリリジン、ポリグアニジン、ポリオルニチンなどのポリアミノ酸等が挙げられる。中でも、ポリアリルアミンおよびポリリジンが好ましく、ポリアリルアミンがより好ましい。
【００３４】
第一級アミノ基を複数有する化合物の重量平均分子量は、３００，０００以下であってよく、１，０００〜１００，０００であることが好ましく、３，０００〜５０，０００であることがより好ましく、５，０００〜１５，０００であることが特に好ましい。ポリアリルアミンを使用する場合、重量平均分子量は１５０，０００以下であってよく、１，０００〜１００，０００であることが好ましく、３，０００〜５０，０００であることがより好ましく、５，０００〜１５，０００であることが特に好ましく、１０，０００〜１５，０００であることが最も好ましい。
【００３５】
ベース担体への第一級アミノ基を複数有する化合物の付加方法は、特に限定されず、公知の方法で行うことができる。例えば、第一級アミノ基を複数有する化合物が結合し得る官能基（例えば、水酸基、カルバモイル基など）で修飾された多孔性粒子と第一級アミノ基を複数有する化合物とを含む溶液を、所定の条件下で撹拌することにより行うことができる。
あるいは、ベース担体上でモノマーをグラフト重合させて、第一級アミノ基を複数有する化合物を付加してもよい。この場合、モノマーとして第一級アミノ基を含む化合物を使用してもよいし、グリシジルメタクリレートのようにアミンに対して反応性の基を有するモノマーをベース担体上でグラフト重合し、その後アンモニアと反応させて第一級アミノ基を複数有する化合物を付加してもよい。
【００３６】
（疎水基）
疎水基としては、第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基に結合し、疎水性を有する限り特に限定されることはないが、疎水性クロマトグラフィー担体において通常用いられる疎水基が好ましい。そのような疎水基としては、飽和アルキル基および／またはフェニル基を含む基が挙げられる。飽和アルキル基は、直鎖状の飽和アルキル基であることが好ましく、炭素数４〜８の直鎖状飽和アルキル基であることがより好ましく、ｎ−ブチル基であることが特に好ましい。
【００３７】
好ましい疎水基の構造として、以下の一般式（１）〜（３）のいずれかの構造が挙げられる。
【化３】
2018092691.tif 000004
［式（１）〜（３）中、
ｎは、０〜８の整数であり、
Ｒ１は、ｎが０〜３の整数である場合はフェニル基であり、ｎが４〜８の整数である場合はＨまたはフェニル基であり、
＊は、第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基との結合部位である］。
【００３８】
言い換えると、ｎは、Ｒ１がフェニル基の場合に０〜８の整数であり、Ｒ１がＨである場合に４〜８の整数である。
上記式（１）〜（３）で表される構造における炭素原子は、炭素数１〜２のアルキル基やアルコキシ基等の置換基、例えばメチル基、エチル基、メトキシ基およびエトキシ基等を有していてもよい。
上記一般式（１）〜（３）の構造のうち、一般式（１）の構造がより好ましい。さらに好適なものとして、一般式（１）の構造のうち、ｎが４であることが好ましい。
【００３９】
疎水基の第一級アミノ基への結合方式は、共有結合であれば特に制限されない。具体的には、例えば、酸無水物、酸塩化物、または活性エステルとアミノ基との反応によって形成されるアミド結合、あるいはエポキシ化合物またはハロゲン化物とアミノ基との反応によって形成される炭素−窒素結合であってよい。
【００４０】
上記のような疎水基を導入するための化合物としては、無水吉草酸、無水カプロン酸、無水エナント酸、無水カプリル酸、無水ペラルゴン酸、無水安息香酸、ブチルグリシジルエーテル、フェニルグリシジルエーテルなどが挙げられる。すなわち、疎水基としてはこれらの化合物由来の基が好都合である。これらの化合物と第一級アミノ基を複数有する化合物とを反応させることにより、疎水基を、第一級アミノ基を複数有する化合物の第一級アミノ基に結合させることができる。上記化合物の中で、無水吉草酸および無水安息香酸がより好ましい。酸無水物は、第一級アミノ基を複数有する化合物との反応が温和な条件で収率よく進行する点から好ましい。
【００４１】
第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基を、疎水基で修飾する際の方法は、特に限定されず、公知の方法で行うことができる。例えば、第一級アミノ基を複数有する化合物と疎水基を導入するための化合物とを含む溶液を、所定の条件下で撹拌することにより行うことができる。
【００４２】
疎水基の構造は、以下の一般式（４）または（５）の構造であってもよい。
【化４】
2018092691.tif 000005
［式（４）および（５）中、
Ｒ１は、複素環基であり、
＊は、第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基との結合部位である］。
【００４３】
Ｒ１の複素環基としては、特に限定されないが、窒素原子を含む複素環基が好ましく、窒素原子を有する芳香族複素環基がより好ましい。複素環基における複素環として、具体的には、ピリジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、ピラゾール、イミダゾリン、ピラジン、インドール、イソインドール、キノリン、イソキノリン、キノキサリン等が挙げられ、ピリジン、イミダゾール、およびベンズイミダゾールが好ましい。
複素環基における炭素原子は、置換基を有していてもよい。置換基としては、炭素数１〜４のアルキル基やアルコキシ基が挙げられ、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、およびブトキシ基であることが好ましい。
【００４４】
上記式（４）で表される疎水基を、第一級アミノ基を複数有する化合物に導入するには、例えば、第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基に、メタクリル基を結合させ、さらにメタクリル基に複素環含有基を結合させる。メタクリル基は、第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基と、無水メタクリル酸、メタクリル酸の酸塩化物、またはメタクリル酸から誘導される活性エステル化合物などとを反応させることにより導入することができる。また、複素環含有基は、複素環基含有化合物を、第一級アミノ基に結合したメタクリル基と反応させることにより導入することができる。複素環基含有化合物は、例えば複素環基およびチオール基を含んでおり、この場合、チオール基がメタクリル基と反応する。
【００４５】
上記式（５）で表される疎水基を第一級アミノ基を複数有する化合物に付加するには、例えば、第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基に、アリル基を結合させ、さらにアリル基に複素環含有基を結合させる。アリル基は、第一級アミノ基を複数有する化合物における第一級アミノ基と、第一級アミノ基と結合する官能基およびアリル基を併せ持つ化合物（例えば、アリルグリシジルエーテル）とを反応させることにより導入することができる。また、複素環含有基は、複素環基含有化合物を第一級アミノ基に結合したアリル基と反応させることにより導入することができる。複素環基含有化合物は、例えば複素環基およびチオール基を含んでおり、この場合、チオール基がアリル基またはアリル基から誘導される官能基と反応する。
【００４６】
上記式（４）および（５）で表される疎水基の導入において使用される複素環基含有化合物は、複素環基を導入できる限り特に限定されないが、複素環基およびチオール基を含む化合物が好ましい。そのような化合物として、例えば、２−メルカプトエチルピリジン、２−メルカプトベンズイミダゾール、２−メルカプト−４−メチルイミダゾール、２−メルカプト−４，５−メチルイミダゾール等が挙げられる。
【００４７】
第一級アミノ基を複数有する化合物は、該化合物における第一級アミノ基の２０〜５５％が、疎水基で修飾されている。このアミノ基の修飾率は、第一級アミノ基を複数有する化合物中に存在する第一級アミノ基の全数に基づく値であり、例えば第一級アミノ基を複数有する化合物に１００個の第一級アミノ基が存在する場合、そのうちの２０〜５５個が疎水基で修飾されていることを意味する。アミノ基の修飾率は２５〜５５％がより好ましい。あるいは、本発明の一実施形態においては、アミノ基の修飾率は、１０〜７５％であってもよい。なお、疎水基がブチル基などの飽和アルキル基を含み、フェニル基を含まない場合、アミノ基の修飾率が４０％超〜５５％、より好ましくは４５％〜５５％、あるいは５０％〜５５％であると、回収フラクション中のＨＣＰ量が少なく、高純度の精製抗体を得ることができる。また、疎水基がフェニル基を含む場合はアミノ基の修飾率が高くなるほど抗体回収率の低下が認められることから、抗体回収率と純度のバランスを最適化していくことが好ましい。
【００４８】
第一級アミノ基を複数有する化合物と疎水基を導入するための化合物とを反応させる際に、疎水基を導入するための化合物の量を調節することにより、アミノ基の修飾率が上記範囲になるように調節することができる。アミノ基の修飾率は、疎水基を導入する前後でクロマトグラフィー担体のイオン交換容量をそれぞれ測定し、その値を比較することにより算出することができる。
【００４９】
上述したリガンドは、例えば、以下の一般式（ａ）で表される繰返し単位と一般式（ｂ）で表される繰返し単位を含む。
【化５】
2018092691.tif 000006
【００５０】
式（ｂ）中、ｎおよびＲ１は上記一般式（１）において定義したとおりである。本実施形態で使用するリガンドは、親水性基であり静電的相互作用を有するアミノ基（一般式（ａ）における−ＮＨ２基）、静電的相互作用を有するアミド基（一般式（ｂ）における−ＮＨ−ＣＯ−基）、疎水的相互作用を有する疎水性基（一般式（ｂ）における−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１基）を有することが好ましく、これら３種の基が相互に作用することによって特に好ましい特性が得られる。
【００５１】
上述したように、実施形態に係る方法は、抗体溶液の電気伝導度にかかわらず使用することができ、例えば、２２ｍＳ／ｃｍ程度（例えば、１４〜２２ｍＳ／ｃｍ）の比較的高い電気伝導度を有する抗体溶液についても高効率で精製することができる。したがって、実施形態に係る方法によると、２２ｍＳ／ｃｍ以下、好ましくは２〜２２ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは６〜２２ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有する抗体溶液から抗体を精製することができる。
【００５２】
また、上述したように、実施形態に係る方法は、抗体溶液中に多価陰イオンが存在する場合においても使用することができる。抗体溶液中に存在し得る多価陰イオンとしては、クエン酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン等が挙げられ、クエン酸イオン、リン酸イオンおよび硫酸イオンからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
【００５３】
２．抗体
精製対象の抗体としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が挙げられるが、モノクローナル抗体であることが好ましい。抗体の種類としては、例えば、マウス抗体、ラマ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはそれらのＦｃ領域などを改変した抗体などが挙げられ、分子型としては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆｃ−融合蛋白、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、Ｆａｂ’２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｓｃＤｂ、ｓｃＤｂＦｃなどが挙げられる。
【００５４】
また、抗体としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の一部を積極的に変性させた、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体も含まれる。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の変性方法としては、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、２０１１、１００、２１０４−２１１９に記載の方法が挙げられる。
【００５５】
抗体は、単量体であっても重合体であってもよいが、単量体であることが好ましい。抗体単量体とは、１分子の抗体からなる分子である。抗体重合体とは、２分子以上の抗体の単量体が共有結合または非共有結合により重合した分子であり、例えば、二量体、三量体、多量体、凝集体、凝集塊などが挙げられる。
【００５６】
抗体溶液に含まれる不純物としては、宿主由来タンパク質（ＨＣＰ）の他、例えば、核酸、ウイルス、プロテインＡリーク、抗体の分解物、および変性、糖鎖成分の除去、酸化、脱アミド等を受けた修飾抗体など、培養過程または他のクロマトグラフィー処理工程などで生じ得るものが挙げられる。
【００５７】
抗体溶液としては、例えば、血漿、血清、乳もしくは尿などの生体から得られる組成物、遺伝子組換え技術もしくは細胞融合技術を用いて得られる抗体産生細胞、大腸菌などの菌類の培養液、またはトランスジェニック非ヒト動物、植物もしくは昆虫などから得られる組成物などが挙げられる。
【００５８】
抗体産生細胞としては、例えば、宿主細胞に所望の抗体をコードする遺伝子が組み込まれた形質転換細胞などが挙げられる。宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、酵母細胞などの細胞株が挙げられる。具体的には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ラットミエローマ細胞であるＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞などが挙げられる。
【００５９】
抗体産生細胞を培養する培地としては、各々の細胞の培養に適した培地であればいずれも使用することができる。例えば、血清含有培地、血清アルブミンもしくは血清分画物などの動物由来成分を含まない培地、無血清培地、無蛋白培地などが挙げられるが、好ましくは無血清培地または無蛋白培地である。また、必要に応じて、抗体産生細胞の生育に必要な生理活性物質、栄養因子などを添加することができる。これらの添加剤は、培養前に予め培地に含有させるか、培養中に添加培地または添加溶液として培地へ適宜追加供給する。添加剤は１種類でも２種以上でもよく、また、連続的に添加しても、断続的に添加してもよい。
【００６０】
抗体を産生するトランスジェニック非ヒト動物、植物または昆虫としては、タンパク質をコードする遺伝子が細胞内に組み込まれた非ヒト動物、植物または昆虫が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、サルなどが挙げられる。植物としては、例えば、タバコ、ポテト、トマト、ニンジン、ソイビーン、アブラナ、アルファルファ、コメ、小麦、大麦、コーンなどが挙げられる。
【００６１】
また、クロマトグラフィー担体に負荷される抗体溶液としては、上述したような抗体を含有する血漿、尿などの生体から得られるものの他、精製する過程で得られる抗体溶液も含まれる。具体的には、例えば、細胞除去液、沈殿物除去液、アルコール分画液、塩析分画液、クロマトグラフィー溶出液などが挙げられる。さらに、抗体溶液中に粒子などの不溶物が存在する場合には予めそれらを除去し、その後に実施形態に係る精製方法に供してもよい。粒子などの不溶物の除去方法としては、例えば、遠心分離法、クロスフローろ過法（タンジェンシャルフローろ過法）、デプスフィルターによるろ過法、メンブレンフィルターによるろ過法、透析法、これらの方法を組み合わせた方法などが挙げられる。
【００６２】
また、必要に応じて、抗体溶液のｐＨ、導電率、緩衝液、塩濃度、添加物、抗体濃度、クロマトグラフィー担体の単位体積あたりの抗体負荷量などを予め好適な条件に調整してから、実施形態に係る精製方法に供してもよい。これらの調整方法としては、例えば、限外ろ過膜を用いた限外ろ過法が挙げられる。
【００６３】
３．精製方法
実施形態に係る抗体の精製方法は、抗体およびＨＣＰなどの不純物を含む溶液を上述したクロマトグラフィー担体に接触させて、抗体と不純物とを分離することを含む。具体的には、カラムに上述したクロマトグラフィー担体を充填し、そこへ抗体溶液を流して、抗体または不純物のいずれか一方を選択的に担体に吸着させることにより抗体を精製することができる。あるいは、抗体と不純物を共に担体に吸着させ、溶出時の塩濃度を段階的あるいは連続的に増加させることで、クロマトグラフィー担体への親和性の違いを利用して抗体を精製することもできる。
【００６４】
実施形態に係る方法で使用するクロマトグラフィー担体は抗体溶液中に含まれるＨＣＰなどの不純物を吸着および分離する能力が高いため、実施形態に係る方法ではフロースルーモードを採用することが好ましい。ここで、フロースルーモードとは、不純物をクロマトグラフィー担体に結合させ、目的物質はクロマトグラフィー担体に結合せずに流れて回収される精製方法を言う。例えば、目的物質が抗体であり、不純物が宿主由来タンパク質（ＨＣＰ）である場合、ＨＣＰがクロマトグラフィー担体に結合し、抗体はクロマトグラフィー担体に結合することなくカラム中を流れる。この時、多少であれば抗体も結合してよいが、ＨＣＰがより選択的にクロマトグラフィー担体に結合することにより、抗体が精製される。
【００６５】
それに対してバインド・アンド・エリュートモードは、目的物質をクロマトグラフィー担体にいったん結合させ、その後、目的物質を溶出（エリュート）させて回収する精製方法を言う。例えば、抗体を精製する場合、まず、抗体をクロマトグラフィー担体に結合させ、不純物はクロマトグラフィー担体に結合することなくカラム中を通過させる。次いで、適切な塩濃度またはｐＨを有する移動相を使用して抗体のみを移動相に溶出させ、回収する。溶出方法としては、抗体とクロマトグラフィー担体との親和性が低下するような特定の塩濃度またはｐＨを有する緩衝液を通液して溶出させる一段階溶出法、段階的に塩濃度またはｐＨを変化させて抗体を溶出させるステップワイズ法、または連続的に塩濃度またはｐＨを変化させて抗体を溶出させるグラジエント法が挙げられる。
【００６６】
クロマトグラフィー条件の設定においては、クロマトグラフィー担体に対する、抗体と不純物の親和性の違いを利用する。例えば、担体構造（リガンド種、リガンド密度、リガンド配向性、粒子径、細孔径、ベースマトリクス組成など）や、抗体および不純物の物理化学的性質（等電点、電荷、疎水性度、分子サイズ、立体構造など）の違いを考慮して条件設定する。
【００６７】
抗体溶液およびカラムの洗浄または溶出に使用する緩衝液に含まれる成分としては、緩衝能を有するものであれば特に限定はされないが、例えば、１〜３００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅなどが挙げられる。また上記の塩は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの他の塩と組み合わせて用いることもできる。さらに、緩衝液には、例えば、グリシン、アラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジンなどのアミノ酸、グルコース、スクロース、ラクトース、シアル酸などの糖、またはこれらの誘導体などが含まれていてもよい。
【００６８】
抗体溶液およびカラムの洗浄または溶出に使用する緩衝液のｐＨとしては、好ましくは２〜９の範囲であり、より好ましくは３〜８の範囲である。
抗体溶液およびカラムの洗浄または溶出に使用する緩衝液の線速度としては、好ましくは５０〜１０００ｃｍ／ｈの範囲である。
【００６９】
クロマトグラフィー担体の単位体積あたりの抗体負荷量としては、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌであり、より好ましくは６０〜２００ｇ／Ｌである。
【００７０】
実施形態に係る精製方法は、他の精製方法と組み合わせて実施してもよい。他の精製方法としては、抗体の精製に適した方法であればいずれも用いられるが、例えば、クロマトグラフィー、活性炭処理、アルコール分画、沈殿物除去、塩析、緩衝液交換、濃縮、希釈、ろ過、ウイルス不活性化、ウイルス除去などが挙げられる。他の精製方法としては、一つまたは複数の方法を選択してもよく、実施形態に係る精製方法の前に行っても後に行ってもよい。
また、モノクローナル抗体の製造分野では、一般的に陽イオン交換体をバインド・アンド・エリュートモードで、陰イオン交換体をフロースルーモードで用いているが、本発明のクロマトグラフィー担体を用いれば、陽イオン交換体をフロースルーモードにて使用する方法にも適応できる。
【００７１】
他の精製方法がクロマトグラフィーである場合、使用される担体または膜としては、ヘパリン担体およびプロテインＡ担体などのアフィニティー担体、陽イオン交換担体、陽イオン交換膜、陰イオン交換担体、陰イオン交換膜、ゲルろ過担体、疎水性相互作用担体、逆相担体、ヒドロキシアパタイト担体、フルオロアパタイト担体、硫酸化セルロース担体、硫酸化アガロース担体、混合モード（マルチモーダル）担体などが挙げられる。
【００７２】
実施形態に係る方法によると、８５％以上、好ましくは９０％以上の回収率で抗体を精製することができる。ここで、回収率とは、クロマトグラフィー担体に負荷した抗体量（すなわち、精製前の抗体溶液中の抗体量）に対する抗体回収量の割合を意味する。また、上述したとおり、実施形態に係る方法において使用するクロマトグラフィー担体は、抗体溶液中のＨＣＰなどの不純物を吸着する能力に優れるため、高い精製度で抗体を得ることができる。具体的には、精製後の抗体溶液（回収フラクション）中に含まれるＨＣＰ量は、好ましくは５０ｐｐｍ未満（０〜５０ｐｐｍ未満）であり、より好ましくは３５ｐｐｍ以下（０〜３５ｐｐｍ）であり、さらに好ましくは２５ｐｐｍ以下（０〜２５ｐｐｍ）であり、特に好ましくは１０ｐｐｍ以下（０〜１０ｐｐｍ）である。なお、上記ＨＣＰ量は、式｛精製後の抗体溶液におけるＨＣＰ量（ｎｇ）／精製後の抗体溶液における抗体量（ｍｇ）｝から算出した値である。
【００７３】
上記の好ましいＨＣＰ量は、抗体溶液の電気伝導度の高低にかかわらず達成することができ、例えば、精製前の抗体溶液の電気伝導度が６ｍＳ／ｃｍおよび１４ｍＳ／ｃｍのいずれの場合においても、精製後の抗体溶液（回収フラクション）中に含まれるＨＣＰ量は、好ましくは４５ｐｐｍ未満（０〜４５ｐｐｍ未満）であり、より好ましくは３５ｐｐｍ以下（０〜３５ｐｐｍ）であり、さらに好ましくは２５ｐｐｍ以下（０〜２５ｐｐｍ）であり、特に好ましくは１０ｐｐｍ以下（０〜１０ｐｐｍ）である。特に、陽イオンクロマトグラフィーに供した後に実施形態に係る精製方法を実施することにより、比較的高い電気伝導度を有する抗体溶液であっても高い精製度で（すなわち、低いＨＣＰ量）精製することができる。また、本発明の好ましい態様によれば、抗体溶液中に多価陰イオンが存在する場合であっても、上記のような回収率およびＨＣＰ量で抗体を精製することができる。
【実施例】
【００７４】
１．クロマトグラフィー担体の製造
（１）担体Ａ（疎水基なし）
〔６％球状セルロース粒子（含水）の製造〕
６％球状セルロース粒子を、以下の手順に従って製造した。ここで、以下の（ｉ）の工程で結晶性セルロースの濃度が６重量％である場合に、製造されるセルロース粒子を「６％球状セルロース粒子」と呼ぶ。
（ｉ）１００ｇのチオシアン酸カルシウム６０重量％水溶液に、６．４ｇの結晶性セルロース（旭化成ケミカルズ株式会社製、商品名：セオラスＰＨ１０１）を加え、１１０〜１２０℃に加熱して溶解した。
（ｉｉ）この溶液に、界面活性剤としてソルビタンモノオレエート６ｇを添加した。それを、１３０〜１４０℃に予め加熱したｏ−ジクロロベンゼン４８０ｍＬ中に滴下し、２００〜３００ｒｐｍにて撹拌して分散液を得た。
（ｉｉｉ）次いで、上記分散液を４０℃以下まで冷却した。それをメタノール１９０ｍＬ中に注ぎ、粒子の懸濁液を得た。
（ｉｖ）得られた懸濁液を濾過分別して粒子を回収し、その粒子をメタノール１９０ｍＬで洗浄した。この洗浄操作を数回行った。
（ｖ）さらに大量の水で粒子を洗浄し、球状セルロース粒子を得た。
（ｖｉ）次いで、この球状セルロース粒子をＪＩＳ標準ふるい規格５３μｍ〜１２５μｍのふるいにかけて、所望の粒子径（粒子径：５０〜１５０μｍ、平均粒子径：約１００μｍ）を有する６％球状セルロース粒子（含水、セルロース溶解濃度：６重量％）を得た。【００７５】
なお、ここでの平均粒子径は、光学顕微鏡で撮影した画像を使用して測定した。具体的には、ノギスを用いて画像上の粒子径を計測し、撮影倍率から元の粒子径を求めた。そして、光学顕微鏡画像から求めたそれぞれの粒子径の値から、下記の式によって平均粒子径を算出した。
体積平均粒子径（ＭＶ）＝Σ（ｎｄ４）／Σ（ｎｄ３）
［式中、ｄは光学顕微鏡画像から求めた各粒子の粒子径の値を表し、ｎは測定した粒子の個数を表す。］【００７６】
〔架橋６％セルロース粒子の製造〕
上記で製造した６％球状セルロース粒子を架橋反応させ、架橋６％セルロース粒子を製造した。その手順は以下の通りである。
（ｉ）上記で得られた６％球状セルロース粒子（含水）１００ｇに１２１ｇの純水を加え、撹拌しながら加温した。３０℃に到達したところで、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．３ｇおよびＮａＢＨ４０．５ｇを加え、さらに加温および撹拌した。ここでの初期アルカリ濃度は、０．６９％（ｗ／ｗ）であった。
（ｉｉ）３０分後、６０ｇのＮａ２ＳＯ４を反応液に加え、溶解させた。混合物の温度が５０℃に到達した時点から、温度を５０℃に維持しながらさらに２時間撹拌を継続した。
（ｉｉｉ）５０℃で混合物の撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４８ｇと、エピクロロヒドリン５０ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分おきにおよそ６時間かけて添加した。
（ｉｖ）添加終了後、この混合物を温度５０℃で１６時間反応させた。
（ｖ）反応混合物を４０℃以下の温度に冷却した後、酢酸２．６ｇを加えて中和した。
（ｖｉ）反応混合物を濾過してセルロース粒子を回収し、セルロース粒子を純水で濾過洗浄して架橋６％セルロース粒子を得た。【００７７】
得られた架橋６％セルロース粒子の平均粒子径およびＫａｖ値を、以下の通り測定した。
（平均粒子径の測定）
レーザー回折／散乱式の粒子径分布測定装置ＬＡ−９５０（株式会社堀場製作所製）を用いて平均粒子径を測定したところ、８５μｍであった。【００７８】
（Ｋａｖ値の測定）
ゲル分配係数Ｋａｖは、重量平均分子量１．５×１０５Ｄａの標準ポリエチレンオキシドをサンプルとして用い、その保持容量とカラム体積との関係から、次式により算出した。なお、移動相としては純水を使用した。
Ｋａｖ＝（Ｖｅ−Ｖ０）／（Ｖｔ−Ｖ０）
［式中、Ｖｅはサンプルの保持容量（ｍＬ）、Ｖｔは空カラム体積（ｍＬ）、Ｖ０はブルーデキストランの保持容量（ｍＬ）を表す。］
上記で得られた架橋６％セルロース粒子のゲル分配係数Ｋａｖは、０．３８であった。【００７９】
〔架橋６％セルロース粒子のエポキシ化〕
上記で得られた湿潤セルロース粒子３０００ｇと純水１９５２ｇを１０ＬのＳＵＳ容器に加え、スラリーとした。次に、エピクロロヒドリンを１７６４ｇ加えた。２８度まで昇温後、４８．７％水酸化ナトリウム水溶液１６５５ｇを液温が３０度を超えないように２時間かけて滴下した。滴下終了後さらに３時間、３０度で撹拌した。次に１４５ｇの酢酸を加え、１０分間撹拌した。反応終了後に、湿潤粒子を濾過して回収し、回収した湿潤粒子を６Ｌの純水で１６回洗浄して、目的のエポキシ化セルロース粒子を得た。【００８０】
〔ポリアリルアミン付加〕
１０ＬのＳＵＳ容器に、上記で得られたエポキシ化セルロース粒子３０００ｇと重量平均分子量１５０００のポリアリルアミン１５．３％水溶液ＰＡ−１５Ｃ（ニットーボーメディカル株式会社）４９９５ｇを入れて、４５℃で１８時間撹拌した。反応終了後、湿潤粒子を濾過し、回収した湿潤粒子を６Ｌの純水で１０回洗浄して、目的のポリアリルアミン付加セルロース粒子（担体Ａ）を得た。このポリアリルアミン付加セルロース粒子のイオン交換容量は、０．２３ｍｍｏｌ／ｍＬであった。イオン交換容量の測定方法は、後述するとおりである。【００８１】
（２）担体Ｂ（疎水基付加；無水吉草酸；アミノ基修飾率２６％）
上記で得られた担体Ａ  ３０ｇを９０ｍＬのメタノールで５回洗浄した。メタノール洗浄した粒子とメタノール５０ｍＬを１５０ｍＬ容器に加え、スラリーとした。その後、無水吉草酸０．５７ｇとトリエチルアミン０．３１ｇを加え、２５℃で２４時間撹拌した。反応終了後、湿潤粒子を濾過し、回収した湿潤粒子を４５ｍＬのメタノールで１回、４５ｍＬの０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で１回、４５ｍＬの純水で１０回洗浄して目的物を得た。得られた粒子のイオン交換容量は、０．１７ｍｍｏｌ／ｍＬであった。【００８２】
（３）担体Ｃ（疎水基付加；無水吉草酸；アミノ基修飾率５２％）
無水吉草酸の量を１．１２ｇに、トリエチルアミンの量を０．６１ｇに変更したことを除き、担体Ｂと同様の方法で担体Ｃを製造した。得られた粒子のイオン交換容量は、０．１１ｍｍｏｌ／ｍＬであった。【００８３】
（４）担体Ｄ（疎水基付加；無水安息香酸；アミノ基修飾率２６％）
無水吉草酸の代わりに無水安息香酸０．５７ｇを使用したことを除き、担体Ｂと同様の方法で担体Ｄを製造した。得られた粒子のイオン交換容量は、０．１７ｍｍｏｌ／ｍＬであった。【００８４】
（５）担体Ｅ（疎水基付加；無水安息香酸；アミノ基修飾率５２％）
無水吉草酸の代わりに無水安息香酸１．３６ｇを使用し、トリエチルアミンの量を０．６０ｇに変更したことを除き、担体Ｂと同様の方法で担体Ｅを製造した。得られた粒子のイオン交換容量は、０．１１ｍｍｏｌ／ｍＬであった。【００８５】
２．抗体溶液の調製
（１）抗体溶液ａ
〔プロテインＡカラムによる精製〕
（ｉ）使用樹脂、機器
プロテインＡ樹脂：ＫＡＮＥＫＡ  ＫａｎＣａｐ  Ａ（株式会社カネカ）
カラム：内径２．６ｃｍ、高さ４０ｃｍ
システム：Ａｋｔａ  ａｖａｎｔ２５
（ｉｉ）精製に使用した培養液および溶液
培養液：モノクローナル抗体（ＩｇＧ１）を産生したＣＨＯ細胞培養液（除細胞済）
Ａ１バッファー：２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ
Ａ２バッファー：２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）
Ｂ１バッファー：６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）
０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液
（ｉｉｉ）手順
プロテインＡ樹脂をカラムに１０ｃｍの高さまで充填した。カラムをシステムに接続し、２カラム体積分のＡ１バッファーを１３．２５ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液し、平衡化した。以後の工程も、流速はすべて１３．２５ｍＬ／ｍｉｎで実施した。次に、培養液１４００ｍＬをカラムに通液した。３カラム体積分のＡ１バッファーで未吸着の培養液を洗浄後、２カラム体積分のＡ２バッファーを更に通液した。次に、４．８カラム体積分のＢ１バッファーを通液して、プロテインＡ樹脂に吸着したモノクローナル抗体を溶出させた。測定波長２８０ｎｍで吸光度を測定することにより抗体の回収を確認し、４．８カラム体積分のうち、約２カラム体積分を回収フラクションとして回収した。溶出後のカラムに、２カラム体積分のＡ１バッファーと３カラム体積分の０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を通液して洗浄した。最後に、５カラム体積分のＡ１バッファーを通液して再平衡化した。【００８６】
〔回収フラクションのウイルス不活化処理〕
上記で得られた回収フラクションに、０．１Ｍのクエン酸をｐＨが３．４になるまで加えた。２５℃で１時間静置後、１Ｍトリスヒドロキシアミノメタン水溶液をｐＨが７．０になるまで加えた。にごりが確認されたため１．２μｍおよび０．４５μｍの孔径のフィルターを用いてろ過した。ろ液中のモノクローナル抗体の濃度は１６．３７ｍｇ／ｍＬであり、ＨＣＰ量は１８４ｐｐｍであった。【００８７】
〔溶液調製〕
上記で得られたろ液の一部を超純水で希釈した。その後、１Ｍトリスヒドロキシアミノメタン水溶液および５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を使用して、ｐＨ７．０、電気伝導度６ｍＳ／ｃｍに調整し、抗体溶液ａを得た。抗体溶液ａにおけるモノクローナル抗体の濃度は、１０．４２ｍｇ／ｍＬであった。【００８８】
（２）抗体溶液ｂ
溶液調製の工程において、電気伝導度を１４ｍＳ／ｃｍに調整したことを除き、抗体溶液ａと同様の方法で抗体溶液ｂを調製した。抗体溶液ｂにおけるモノクローナル抗体の濃度は、１０．６３ｍｇ／ｍＬであった。【００８９】
（３）抗体溶液ｃ
〔プロテインＡカラムによる精製〕
（ｉ）使用樹脂、機器
抗体溶液ａと同じ
（ｉｉ）精製に使用した培養液および溶液
培養液：モノクローナル抗体（ＩｇＧ１）を産生したＣＨＯ細胞培養液（除細胞済）
Ａ１バッファー：２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ
Ａ２バッファー：２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）
Ｂ２バッファー：６０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）
０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液
（ｉｉｉ）手順
Ｂ１バッファーの代わりにＢ２バッファーを使用したことを除き、抗体溶液ａと同様の処理を行った。【００９０】
〔回収フラクションのウイルス不活化処理〕
上記で得られた回収フラクションに、１Ｍの塩酸をｐＨが３．４になるまで加えた。２５℃で１時間静置後、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液をｐＨが５．０になるまで加えた。にごりが確認されたため、１．２μｍおよび０．４５μｍ、０．２μｍの孔径のフィルターを用いてろ過した。ろ液中のモノクローナル抗体の濃度は１８．１７ｍｇ／ｍｌであり、ＨＣＰ量は７２ｐｐｍであった。【００９１】
〔溶液調整〕
上記で得られたろ液の一部を超純水で希釈した。その後、１Ｍトリスヒドロキシアミノメタン水溶液および５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を使用して、ｐＨ７．０、電気伝導度６ｍＳ／ｃｍに調整し、抗体溶液ｃを得た。抗体溶液ｃにおけるモノクローナル抗体の濃度は、１０．７９ｍｇ／ｍＬであった。【００９２】
（４）抗体溶液ｄ
溶液調製の工程において、電気伝導度を１４ｍＳ／ｃｍに調整したことを除き、抗体溶液ｃと同様の方法で抗体溶液ｄを調製した。抗体溶液ｄにおけるモノクローナル抗体の濃度は、１０．４８ｍｇ／ｍＬであった。【００９３】
（５）抗体溶液ｅ
〔プロテインＡカラムによる精製〕
（ｉ）使用樹脂、機器
抗体溶液ａと同じ
（ｉｉ）精製に使用した培養液および溶液
培養液：モノクローナル抗体（ＩｇＧ１）を産生したＣＨＯ細胞培養液（除細胞済）
Ａ３バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ
Ａ４バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）
Ｂ２バッファー：６０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）
０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液
（ｉｉｉ）手順
プロテインＡ樹脂をカラムに１０ｃｍの高さまで充填した。カラムをシステムに接続し、２カラム体積分のＡ３バッファーを１３．２５ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液し、平衡化した。以後の工程も、流速はすべて１３．２５ｍＬ／ｍｉｎで実施した。次に、培養液１５００ｍＬをカラムに通液した。３カラム体積分のＡ３バッファーで未吸着の培養液を洗浄後、２カラム体積分のＡ４バッファーを更に通液した。次に、４．８カラム体積分のＢ２バッファーを通液して、プロテインＡ樹脂に吸着したモノクローナル抗体を溶出させた。測定波長２８０ｎｍで吸光度を測定することにより抗体の回収を確認し、４．８カラム体積分のうち、約２カラム体積分を回収フラクションとして回収した。溶出後のカラムに、２カラム体積分のＡ３バッファーと３カラム体積分の０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を通液して洗浄した。最後に、５カラム体積分のＡ３バッファーを通液して再平衡化した。【００９４】
〔回収フラクションのウイルス不活化処理〕
上記で得られた回収フラクションに、１Ｍの塩酸をｐＨが３．４になるまで加えた。２５℃で１時間静置後、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液をｐＨが５．０になるまで加えた。にごりが確認されたため、１．２μｍ、０．４５μｍおよび０．２μｍの孔径のフィルターを用いてろ過した。ろ液中のモノクローナル抗体の濃度は１６．５ ｍｇ／ｍｌであり、ＨＣＰ量は９５５ｐｐｍであった。【００９５】
〔溶液調整〕
上記で得られたろ液の一部を１Ｍトリスヒドロキシアミノメタン水溶液および５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を使用して、ｐＨ７．０、電気伝導度２２ｍＳ／ｃｍに調整し、抗体溶液ｅを得た。抗体溶液eにおけるモノクローナル抗体の濃度は、１４．００ｍｇ／ｍＬであった。【００９６】
（６）抗体溶液ｆ
試薬のγグロブリン人血清由来（和光純薬）を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し抗体溶液ｆを得た。抗体溶液ｆの濃度は９．４３ｍｇ／ｍｌであった。サイズ排除クロマトグラフィーで測定した単量体の純度は８４．５％であった。【００９７】
（７）抗体溶液ｇ
〔プロテインＡカラムによる精製〕
（ｉ）使用樹脂、機器
抗体溶液aと同じ
（ｉｉ）精製に使用した培養液および溶液
培養液：モノクローナル抗体（ＩｇＧ１）を産生したＣＨＯ細胞培養液（除細胞済）
Ａ３バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ
Ａ４バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）
Ｂ２バッファー：６０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）
０．１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液
（ｉｉｉ）手順
プロテインＡ樹脂をカラムに１０ｃｍの高さまで充填した。カラムをシステムに接続し、２カラム体積分のＡ３バッファーを１３．２５ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液し、平衡化した。以後の工程も、流速はすべて１３．２５ｍＬ／ｍｉｎで実施した。次に、培養液８００ｍＬをカラムに通液した。３カラム体積分のＡ３バッファーで未吸着の培養液を洗浄後、２カラム体積分のＡ４バッファーを更に通液した。次に、４．８カラム体積分のＢ２バッファーを通液して、プロテインＡ樹脂に吸着したモノクローナル抗体を溶出させた。測定波長２８０ｎｍで吸光度を測定することにより抗体の回収を確認し、４．８カラム体積分のうち、約２カラム体積分を回収フラクションとして回収した。溶出後のカラムに、２カラム体積分のＡ３バッファーと３カラム体積分の０．１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を通液して洗浄した。最後に、５カラム体積分のＡ３バッファーを通液して再平衡化した。【００９８】
〔回収フラクションのウイルス不活化処理〕
上記で得られた回収フラクションに、１Ｍの塩酸をｐＨが３．４になるまで加えた。２５℃で１時間静置後、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液をｐＨが５．０になるまで加えた。にごりが確認されたため、フィルターを用いてろ過した。ろ液中のモノクローナル抗体の濃度は１３．１０ｍｇ／ｍｌであり、ＨＣＰ量は４８０ｐｐｍであった。【００９９】
〔溶液調整〕
上記で得られたろ液の一部を５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を使用して、電気伝導度２２ｍＳ／ｃｍに調整し、抗体溶液ｇを得た。抗体溶液ｇにおけるモノクローナル抗体の濃度は、１２．９ｍｇ／ｍＬであった。【０１００】
（８）抗体溶液ｈ
〔陽イオン交換クロマトグラフィー工程〕
（ｉ）クロマトグラフィー担体、機器
担体：Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＭＡＸ  ＧＳ
カラム：内径０．５ｃｍ、高さ２．５ｃｍ
システム：Ａｋｔａ  ａｖａｎｔ２５
（ｉｉ）精製に使用した抗体溶液および溶液
抗体溶液：抗体溶液ｇ
Ａ６バッファー：２０ｍＭ  Ａｃｅｔａｔｅ−Ｎａ緩衝液  ＋ＮａＣｌ  （ｐＨ５．０、２２ｍＳ／ｃｍ）
１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液
１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液
（ｉｉｉ）手順
担体をカラムに２．５ｃｍの高さまで充填した。カラムをシステムに接続し、５カラム体積分のＡ６バッファーを０．２４５ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液し、平衡化した。次に、抗体溶液１６ｍＬを０．２４５ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液した。次いで、１０カラム体積分のＡ６バッファーを０．２４５ｍＬ／ｍｉｎで通液して洗浄した。その後、１０カラム体積分の１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を０．２４５ｍＬ／ｍｉｎで通液した。次に、５カラム体積分の１．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を０．２４５ｍＬ／ｍｉｎで通液して洗浄した。最後に、１０カラム体積分のＡ６バッファーを１．０ｍＬ／ｍｉｎで通液して再平衡化した。
抗体溶液通液時のカラム通過液１６ｍＬ全量と未吸着物洗浄時のカラム洗浄液２．５ｍＬ分を合わせて、回収フラクションとした。モノクローナル抗体の回収率（クロマトグラフィー担体に負荷した抗体量に対する抗体回収量の割合）は９６％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は２５３ｐｐｍであった。【０１０１】
〔溶液調整〕
上記で得られた回収フラクションの一部を１Ｍトリスヒドロキシアミノメタン水溶液および５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を使用して、ｐＨ７．０、電気伝導度２２ｍＳ／ｃｍに調整し、抗体溶液ｈを得た。抗体溶液ｈにおけるモノクローナル抗体の濃度は、９．４１ｍｇ／ｍＬであった。【０１０２】
３．抗体の精製
＜実施例１＞
（ｉ）クロマトグラフィー担体、機器
担体：担体Ｂ
カラム：内径０．５ｃｍ、高さ３ｃｍ
システム：Ａｋｔａ  ａｖａｎｔ２５
（ｉｉ）精製に使用した抗体溶液および溶液
抗体溶液：抗体溶液ａ
Ａ３バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）＋ＮａＣｌ（６ｍＳ／ｃｍ）
Ｂ２バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）＋１Ｍ  ＮａＣｌ
０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液
（ｉｉｉ）手順
担体をカラムに１．５ｃｍの高さまで充填した。カラムをシステムに接続し、１０カラム体積分のＡ３バッファーを０．３ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液し、平衡化した。次に、抗体溶液５．４ｍＬを０．０７５ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液した。次いで、１０カラム体積分のＡ３バッファーを０．０７５ｍＬ／ｍｉｎで通液して洗浄した。その後、１０カラム体積分のＢ２バッファーを０．３ｍＬ／ｍｉｎで通液した。次に、５カラム体積分の０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を０．０７５ｍＬ／ｍｉｎで通液して洗浄した。最後に、２０カラム体積分のＡ３バッファーを０．３ｍＬ／ｍｉｎで通液して再平衡化した。
抗体溶液通液時のカラム通過液５．４ｍＬ全量と未吸着物洗浄時のカラム洗浄液１．８ｍＬを合わせて、回収フラクションとした。モノクローナル抗体の回収率（クロマトグラフィー担体に負荷した抗体量に対する抗体回収量の割合）は９６％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は２２ｐｐｍであった。【０１０３】
＜実施例２＞
クロマトグラフィー担体として担体Ｃを使用したことを除き、実施例１と同じ方法で抗体の精製を実施した。モノクローナル抗体の回収率は９５％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は２３ｐｐｍであった。【０１０４】
＜実施例３＞
クロマトグラフィー担体として担体Ｄを使用したことを除き、実施例１と同じ方法で抗体の精製を実施した。モノクローナル抗体の回収率は９５％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は２２ｐｐｍであった。【０１０５】
＜実施例４＞
クロマトグラフィー担体として担体Ｅを使用したことを除き、実施例１と同じ方法で抗体の精製を実施した。モノクローナル抗体の回収率は９０％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は２１ｐｐｍであった。【０１０６】
＜比較例１＞
クロマトグラフィー担体としてＣｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＭＡＸ  Ｑ−ｈ（ＪＮＣ株式会社製）を使用したことを除き、実施例１と同じ方法で抗体の精製を実施した。モノクローナル抗体の回収率は９８％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は１１４ｐｐｍであった。【０１０７】
＜比較例２＞
クロマトグラフィー担体としてＣａｐｔｏ  Ｑ（ＧＥヘルスケア製）を使用したことを除き、実施例１と同じ方法で抗体の精製を実施した。モノクローナル抗体の回収率は９７％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は１３３ｐｐｍであった。【０１０８】
＜比較例３＞
クロマトグラフィー担体として担体Ａを使用したことを除き、実施例１と同じ方法で抗体の精製を実施した。モノクローナル抗体の回収率は９７％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は１４５ｐｐｍであった。【０１０９】
＜実施例５＞
（ｉ）クロマトグラフィー担体、機器
担体：担体Ｂ
カラム：内径０．５ｃｍ、高さ３ｃｍ
システム：Ａｋｔａ  ａｖａｎｔ２５
（ｉｉ）精製に使用した抗体溶液および溶液
抗体溶液：抗体溶液ｂ
Ａ４バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）＋ＮａＣｌ（１４ｍＳ／ｃｍ）
Ｂ２バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）＋１Ｍ  ＮａＣｌ
０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液
（ｉｉｉ）手順
担体をカラムに１．５ｃｍの高さまで充填した。カラムをシステムに接続し、１０カラム体積分のＡ４バッファーを０．３ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液し、平衡化した。次に、抗体溶液５．４ｍＬを０．０７５ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液した。次いで、１０カラム体積分のＡ４バッファーを０．０７５ｍＬ／ｍｉｎで通液して洗浄した。その後、１０カラム体積分のＢ２バッファーを０．３ｍＬ／ｍｉｎで通液した。次に、５カラム体積分の０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を０．０７５ｍＬ／ｍｉｎで通液して洗浄した。最後に、２０カラム体積分のＡ４バッファーを０．３ｍｌ／ｍｉｎで通液して再平衡化した。
抗体溶液通液時のカラム通過液５．４ｍＬ全量と未吸着物洗浄時のカラム洗浄液１．８ｍＬを合わせて、回収フラクションとした。モノクローナル抗体の回収率は９７％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は３５ｐｐｍであった。【０１１０】
＜実施例６＞
クロマトグラフィー担体として担体Ｃを使用したことを除き、実施例５と同じ方法で抗体の精製を実施した。モノクローナル抗体の回収率は９６％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は２２ｐｐｍであった。【０１１１】
＜実施例７＞
クロマトグラフィー担体として担体Ｄを使用したことを除き、実施例５と同じ方法で抗体の精製を実施した。モノクローナル抗体の回収率は９５％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は４２ｐｐｍであった。【０１１２】
＜実施例８＞
クロマトグラフィー担体として担体Ｅを使用したことを除き、実施例５と同じ方法で抗体の精製を実施した。モノクローナル抗体の回収率は９１％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は１９ｐｐｍであった。【０１１３】
＜比較例４＞
クロマトグラフィー担体としてＣｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＭＡＸ  Ｑ−ｈ（ＪＮＣ株式会社製）を使用したことを除き、実施例５と同じ方法で抗体の精製を実施した。モノクローナル抗体の回収率は９７％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は１４７ｐｐｍであった。【０１１４】
＜比較例５＞
クロマトグラフィー担体として担体Ａを使用したことを除き、実施例５と同じ方法で抗体の精製を実施した。モノクローナル抗体の回収率は９９％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は１４５ｐｐｍであった。【０１１５】
＜実施例９＞
（ｉ）クロマトグラフィー担体、機器
担体：担体Ｃ
カラム：内径０．５ｃｍ、高さ３ｃｍ
システム：Ａｋｔａ  ａｖａｎｔ２５
（ｉｉ）精製に使用した抗体溶液および溶液
抗体溶液：抗体溶液ｃ
Ａ３バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）＋ＮａＣｌ（６ｍＳ／ｃｍ）
Ｂ２バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）＋１Ｍ  ＮａＣｌ
０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液
（ｉｉｉ）手順
担体をカラムに１．５ｃｍの高さまで充填した。カラムをシステムに接続し、１０カラム体積分のＡ３バッファーを０．３ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液し、平衡化した。次に、抗体溶液５．４ｍＬを０．０７５ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液した。次いで、１０カラム体積分のＡ３バッファーを０．０７５ｍＬ／ｍｉｎで通液して洗浄した。その後、１０カラム体積分のＢ２バッファーを０．３ｍＬ／ｍｉｎで通液した。次に、５カラム体積分の０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を０．０７５ｍＬ／ｍｉｎで通液して洗浄した。最後に、２０カラム体積分のＡ３バッファーを０．３ｍＬ／ｍｉｎで通液して再平衡化した。
抗体溶液通液時のカラム通過液５．４ｍＬ全量と未吸着物洗浄時のカラム洗浄液１．８ｍＬを合わせて、回収フラクションとした。モノクローナル抗体の回収率は９５％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は３ｐｐｍであった。【０１１６】
＜比較例６＞
クロマトグラフィー担体としてＣｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＭＡＸ  Ｑ−ｈ（ＪＮＣ株式会社製）を使用したことを除き、実施例９と同じ方法で抗体の精製を実施した。モノクローナル抗体の回収率は９７％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は２２ｐｐｍであった。【０１１７】
＜比較例７＞
クロマトグラフィー担体としてＣａｐｔｏ  Ｑ（ＧＥヘルスケア製）を使用したことを除き、実施例９と同じ方法で抗体の精製を実施した。モノクローナル抗体の回収率は９６％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は２７ｐｐｍであった。【０１１８】
＜実施例１０＞
（ｉ）クロマトグラフィー担体、機器
担体：担体Ｂ
カラム：内径０．５ｃｍ、高さ３ｃｍ
システム：Ａｋｔａ  ａｖａｎｔ２５
（ｉｉ）精製に使用した抗体溶液および溶液
抗体溶液：抗体溶液ｄ
Ａ４バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）＋ＮａＣｌ（１４ｍＳ／ｃｍ）
Ｂ２バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）＋１Ｍ  ＮａＣｌ
０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液
（ｉｉｉ）手順
担体をカラムに１．５ｃｍの高さまで充填した。カラムをシステムに接続し、１０カラム体積分のＡ４バッファーを０．３ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液し、平衡化した。次に、抗体溶液５．４ｍＬを０．０７５ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液した。次いで、１０カラム体積分のＡ４バッファーを０．０７５ｍＬ／ｍｉｎで通液して洗浄した。その後、１０カラム体積分のＢ２バッファーを０．３ｍＬ／ｍｉｎで通液した。次に、５カラム体積分の０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を０．０７５ｍＬ／ｍｉｎで通液して洗浄した。最後に、２０カラム体積分のＡ４バッファーを０．３ｍＬ／ｍｉｎで通液して再平衡化した。
抗体溶液通液時のカラム通過液５．４ｍＬ全量と未吸着液洗浄時のカラム洗浄液１．８ｍＬを合わせて、回収フラクションとした。モノクローナル抗体の回収率は９６％、ＨＣＰ量は８ｐｐｍであった。【０１１９】
＜実施例１１＞
クロマトグラフィー担体として担体Ｃを使用したことを除き、実施例１０と同じ方法で抗体の精製を実施した。モノクローナル抗体の回収率は９４％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は５ｐｐｍであった。【０１２０】
＜比較例８＞
クロマトグラフィー担体としてＣｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＭＡＸ  Ｑ−ｈ（ＪＮＣ株式会社製）を使用したことを除き、実施例１０と同じ方法で抗体の精製を実施した。モノクローナル抗体の回収率は１０１％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は５０ｐｐｍであった。【０１２１】
＜比較例９＞
クロマトグラフィー担体としてＣａｐｔｏ  Ｑ（ＧＥヘルスケア製）を使用したことを除き、実施例１０と同じ方法で抗体の精製を実施した。モノクローナル抗体の回収率は１００％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は５２ｐｐｍであった。【０１２２】
＜実施例１２＞
（ｉ）クロマトグラフィー担体、機器
担体：担体Ｃ
カラム：内径０．５ｃｍ、高さ２．５ｃｍ
システム：Ａｋｔａ  ａｖａｎｔ２５
（ｉｉ）精製に使用した抗体溶液および溶液
抗体溶液：抗体溶液ｅ
Ａ５バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液
０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液
（ｉｉｉ）手順
担体をカラムに５．０ｃｍの高さまで充填した。カラムをシステムに接続し、１０カラム体積分のＡ５バッファーを０．４９ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液し、平衡化した。次に、抗体溶液５．５ｍＬを０．２５ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液した。次いで、１０カラム体積分のＡ５バッファーを０．４９ｍＬ／ｍｉｎで通液して洗浄した。その後、１０カラム体積分の１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を１．０ｍＬ／ｍｉｎで通液した。次に、５カラム体積分の０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を０．０７５ｍＬ／ｍｉｎで通液して洗浄した。最後に、１５カラム体積分のＡ５バッファーを１．０ｍＬ／ｍｉｎで通液して再平衡化した。
抗体溶液通液時のカラム通過液５．５ｍＬ全量と未吸着物洗浄時のカラム洗浄液２．５ｍＬ分を合わせて、回収フラクションとした。モノクローナル抗体の回収率（クロマトグラフィー担体に負荷した抗体量に対する抗体回収量の割合）は９６％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は１６ｐｐｍであった。【０１２３】
＜実施例１３＞
（ｉ）クロマトグラフィー担体、機器
担体：担体Ｃ
カラム：内径０．５ｃｍ、高さ２．５ｃｍ
システム：Ａｋｔａ  ａｖａｎｔ２５
（ｉｉ）精製に使用した抗体溶液および溶液
抗体溶液：抗体溶液ｈ
Ａ７バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液＋ＮａＣｌ（ｐＨ７．０，２２ｍＳ／ｃｍ）
１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液
１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液
（ｉｉｉ）手順
担体をカラムに５．０ｃｍの高さまで充填した。カラムをシステムに接続し、１０カラム体積分のＡ７バッファーを０．２４５ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液し、平衡化した。次に、抗体溶液１７ｍＬを０．２４５ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液した。次いで、１０カラム体積分のＡ７バッファーを０．２４５ｍＬ／ｍｉｎで通液して洗浄した。その後、５カラム体積分の１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を０．２４５ｍＬ／ｍｉｎで通液した。次に、５カラム体積分の１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を０．２４５ｍＬ／ｍｉｎで通液して洗浄した。最後に、１０カラム体積分のＡ７バッファーを０．２４５ｍＬ／ｍｉｎで通液して再平衡化した。
抗体溶液通液時のカラム通過液１７ｍＬ全量と未吸着物洗浄時のカラム洗浄液４．９ｍＬ分を合わせて、回収フラクションとした。モノクローナル抗体の回収率（クロマトグラフィー担体に負荷した抗体量に対する抗体回収量の割合）は９３％であり、回収フラクション中のＨＣＰ量は２ｐｐｍであった。【０１２４】
＜参考例１＞
（ｉ）クロマトグラフィー担体、機器
担体：担体Ｃ
カラム：内径０．５ｃｍ、高さ５．０ｃｍ
システム：Ａｋｔａ  ａｖａｎｔ２５
（ｉｉ）精製に使用した抗体溶液および溶液
抗体溶液：抗体溶液ｆ
Ａ６バッファー：２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）
１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液
０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液
（ｉｉｉ）手順
担体をカラムに５．０ｃｍの高さまで充填した。カラムをシステムに接続し、１０カラム体積分のＡ６バッファーを１．０ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液し、平衡化した。次に、抗体溶液２０ｍＬを０．２５ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液した。次いで、５カラム体積分のＡ６バッファーを０．２５ｍＬ／ｍｉｎで通液して洗浄した。その後、５カラム体積分の１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を１．０ｍＬ／ｍｉｎで通液した。次に、５カラム体積分の０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を０．２５ｍＬ／ｍｉｎで通液して洗浄した。最後に、２０カラム体積分のＡ６バッファーを１．０ｍＬ／ｍｉｎで通液して再平衡化した。
抗体溶液通液時のカラム通過液２０ｍＬ全量と未吸着物洗浄時のカラム洗浄液４．９ｍＬを合わせて、回収フラクションとした。抗体の回収率（クロマトグラフィー担体に負荷した抗体量に対する抗体回収量の割合）は８７％であり、回収フラクション中の単量体の純度は８９．８％であった。【０１２５】
４．分析方法
（１）イオン交換容量
１ｍＬのクロマトグラフィー担体（湿潤ゲルの状態でカラムに詰めた際に容積１ｍＬを構成する量のクロマトグラフィー担体）を、５０ｍＬ三角フラスコに加えた。そこに０．０１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液５０ｍＬを加えて軽く振とうした。１時間室温で静置後、上澄み１０ｍＬをホールピペットで５０ｍＬビーカーに量りとった。そこにフェノールフタレイン溶液を加え、０．０１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液で滴定した。滴定量から塩酸の吸着量を計算し、クロマトグラフィー担体１ｍＬ当たりのイオン交換容量を求めた。【０１２６】
（２）アミノ基修飾率
ベース担体に結合した第一級アミノ基を複数有する化合物のアミノ基を疎水基で修飾する前および後（以下、「疎水基での修飾前」および「疎水基での修飾後」とも称する）のクロマトグラフィー担体について、それぞれイオン交換容量を上記の方法で測定した。測定したイオン交換容量の値を用い、下式より第一級アミノ基を複数有する化合物におけるアミノ基の修飾率を計算した。
【数１】
2018092691.tif 000007
【０１２７】
（３）モノクローナル抗体の回収率（％）
実施例１〜１２および比較例１〜９で使用した精製前の抗体溶液および得られた回収フラクション（精製後の抗体溶液）のそれぞれについて、測定波長２８０ｎｍでの吸光度を分光光度計にて測定した。吸光係数Ｅ１％１．４０を用いて測定値を抗体量に換算し、式（回収フラクション中の抗体量／精製前の抗体溶液中の抗体量）×１００から回収率（％）を計算した。【０１２８】
（４）ＨＣＰ量
抗体溶液調製工程における回収フラクション中のＨＣＰ量、ならびに実施例および比較例で得られた回収フラクション中のＨＣＰ量を、Ｅｌｉｓａ  ｋｉｔ（Ｃｙｇｎｕｓ，Ｆ５５０）を使用して測定した。得られたＨＣＰ量および測定波長２８０ｎｍでの吸光度から算出したモノクローナル抗体量を用いて、式｛回収フラクション中のＨＣＰ量（ｎｇ）／回収フラクション中のモノクローナル抗体量（ｍｇ）｝から、ＨＣＰ量を濃度（ｐｐｍ）で表した。【０１２９】
（５）ポリクローナル抗体の回収率（％）
参考例１で使用した精製前の抗体溶液（抗体溶液ｆ）および得られた回収フラクション（精製後の抗体溶液）のそれぞれについて、測定波長２８０ｎｍでの吸光度を分光光度計にて測定した。吸光係数Ｅ１％  １．３５を用いて測定値を抗体量に換算し、式（回収フラクション中の抗体量／精製前の抗体溶液中の抗体量）×１００から回収率（％）を計算した。【０１３０】
（６）サイズ排除クロマトグラフィー分析法
カラム：ＴＳＫ  ｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ  ｍＡｂ  ＨＲ  （東ソー）
システム：Ｉｎｆｉｎｉｔｙ１２００（Ａｇｉｌｅｎｔ）
移動相：０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液＋０．１Ｍ硫酸ナトリウム（ｐＨ６．７）
流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ
インジェクション量：５０μＬ
参考例１で使用した抗体溶液（抗体溶液ｆ）および回収フラクションを移動相で１０倍希釈しサイズ排除クロマトグラフィー分析を実施した。得られたクロマトグラムを図１に示す。得られたクロマトグラムから単量体と凝集体のピーク面積をそれぞれ求め、以下の計算式を用いて単量体純度を計算した。
単量体純度（％）＝（（単量体のピーク面積／（単量体のピーク面積＋凝集体のピーク面積））×１００【０１３１】
上記実施例および比較例で得られた結果を、表１にまとめる。
【表１】
2018092691.tif 000008
【０１３２】
表１より、実施形態に係る精製方法を使用した実施例１〜１３では、高い抗体回収率が得られ、回収フラクション中の不純物（ＨＣＰ）の量が少ないことが分かる。また、実施例１〜１３は、抗体溶液の電気伝導度の高低にかかわらず、高い抗体回収率および低いＨＣＰ量を達成できた。さらに、多価陰イオンであるクエン酸イオンが存在する抗体溶液ａおよびｂを使用した場合にも（実施例１〜８）、高い抗体回収率および低い不純物量を達成できた。【０１３３】
一方、他の担体を使用した比較例によると、回収フラクション中にＨＣＰが多く含まれてしまう傾向にあり、また、ＨＣＰ量は抗体溶液の電気伝導度および抗体溶液中の多価陰イオンの存在によって左右された。比較例においては、抗体溶液の電気伝導度が高い場合（比較例４、５、８および９）ならびに抗体溶液中に多価陰イオンが存在する場合（比較例１〜５）に特にＨＣＰ量が多くなった。【０１３４】
抗体溶液ｃはＨＣＰが除去されやすい溶液組成であるが、その溶液を用いた際も、比較例６、７に比べ、実施例７は１桁低いＨＣＰ含有量となった。
抗体溶液ｈは、担体Ｃを用いた精製の前に、抗体溶液ｇを陽イオン交換担体を使用してフロースルーモードで精製して得られた抗体溶液である。そのような抗体溶液ｈを用いた実施例１３では、陽イオン交換クロマトグラフィーなしの抗体溶液ｇを用いた実施例１２に比べて低いＨＣＰ含有量となった。
また、参考例１の結果から、担体Ｃをフロースルーモードで用いることでポリクローナル抗体中に含まれる不純物としての凝集体を低減させることができ、抗体純度として８４．５％から８９．８％に向上させることができた。【０１３５】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【図１】
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【国際調査報告】
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