【手続補正書】
【提出日】令和1年9月4日(2019.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を特徴付ける方法であって、複数のベッセルのうちの少なくとも１つの単一ベッセル中で反応を実行することを含み、前記反応が、第１のベッセルバーコード配列を含む第１のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分に付着させることを含み、前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、前記複数のベッセルのうちの前記少なくとも１つの単一ベッセル中で単離された単一の細胞によって発現される標的抗原に結合し、前記オリゴヌクレオチド部分は、抗原識別（ＡＩＤ）配列を含み、必要に応じて、前記標的抗原は細胞外抗原である、方法。
【請求項２】
前記単一の細胞が、単一の試料に由来する複数の細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＩＤ配列が、前記標的抗原、または前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記親和性部分にバーコード化される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの単一ベッセル中で前記単一の細胞が単離される前に、前記単一の細胞を含む複数の細胞を前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと接触させることをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のベッセルの任意の１つの単一ベッセルにおいて、前記第１のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの前記第１のベッセルバーコード配列またはそのアンプリコンが、前記１つの単一ベッセルに固有である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの単一ベッセル中の前記単一の細胞を溶解させることと、第２のベッセルバーコード配列を含む第２のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、前記単一の細胞由来の細胞ポリヌクレオチドに付着させることと、必要に応じて、前記第１のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドおよび前記第２のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを同時に付着させることとをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１または前記第２の親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分が、親和性分子バーコード（ＡＭＢ）配列、プライマー結合配列、融合配列、または定常配列の少なくとも１つをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分を、前記付着したベッセルベーコード化ポリヌクレオチド、その相補体、その増幅された産物、またはそれらの組合せと配列決定し、それによって、オリゴヌクレオチド配列読み取りを生成すること；および／または前記細胞ポリヌクレオチドを、前記付着したベッセルベーコード化ポリヌクレオチド、その相補体、その増幅された産物、またはそれらの組合せと配列決定し、それによって、細胞ポリヌクレオチド配列読み取りを生成することをさらに含む、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、オリゴヌクレオチド配列読み取りを細胞ポリヌクレオチド配列読み取りと、前記オリゴヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を前記細胞ポリヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列と、前記オリゴヌクレオチド配列読み取りの抗原識別（ＡＩＤ）配列を前記オリゴヌクレオチド配列読み取りの親和性分子バーコード（ＡＭＢ）配列または細胞ポリヌクレオチド配列読み取りと比較すること；および／または、前記細胞ポリヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列または前記細胞ポリヌクレオチド配列読み取りの分子バーコード配列を分析することをさらに含み、
前記方法は、必要に応じて、前記比較および／または分析に基づいて細胞の特徴を決定することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記オリゴヌクレオチド部分に付着した前記第１のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの前記第１のベッセルバーコード配列と、前記細胞ポリヌクレオチドに付着した前記第２のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの前記第２のベッセルバーコード配列とが同じである、および／または前記少なくとも１つの単一ベッセル中の同じ鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチド由来である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの単一ベッセルが、ウェル、エマルジョンまたは液滴である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
分子バーコード配列を含む分子バーコード化ポリヌクレオチドを前記細胞ポリヌクレオチドに付着させることをさらに含み、前記分子バーコード配列が、前記細胞ポリヌクレオチドおよび／またはそのアンプリコンにバーコード化される、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを前記オリゴヌクレオチド部分に付着させること、または前記第２のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを前記細胞ポリヌクレオチドに付着させることが、ライゲーション反応、酵素反応、ハイブリダイゼーション反応、伸長反応、または増幅反応を含む、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記単一の細胞の前記細胞外抗原が、免疫細胞、必要に応じてＴ細胞またはＢ細胞に特異的な抗原またはそれによって発現される抗原である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞外抗原が、ＣＤ１５４、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１３７、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ１２５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１４およびＣＤ１９からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記親和性部分が、抗体もしくはその断片、ペプチド、タンパク質、アプタマー、小分子、薬物または細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記親和性部分が、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）またはその機能的部分もしくは結合性部分、あるいは抗体もしくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に結合するペプチドのうちの１つを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
複数のベッセルを含む、細胞を特徴付けるための組成物であって、前記複数のベッセルのうちの少なくとも１つの単一ベッセルが、
（ａ）複数の細胞を含む試料由来の単一の細胞；
（ｂ）ベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体；および
（ｃ）親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、前記単一の細胞の標的抗原に結合する、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート
を含み、
前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体が、前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分に付着し、そして、必要に応じて、前記単一の細胞が溶解されることを特徴とする、組成物。
【請求項１９】
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを作製するためのキットであって、
（ａ）第１の抗原識別（ＡＩＤ）配列および第１の親和性分子バーコード（ＡＭＢ）配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを含む第１の容器であって、前記第１のＡＩＤ配列および前記第１のＡＭＢ配列が既知の配列である、第１の容器；
（ｂ）第２の抗原識別（ＡＩＤ）配列および第２の親和性分子バーコード（ＡＭＢ）配列を含む第２のオリゴヌクレオチドを含む第２の容器であって、前記第２のＡＩＤ配列が既知の配列であり、前記第１のＡＩＤ配列とは異なり、前記第２のＡＭＢ配列が既知の配列であり、前記第１のＡＭＢ配列とは異なる、第２の容器；
（ｃ）前記第１のオリゴヌクレオチドを第１の親和性分子にコンジュゲートすることが可能な試薬、および／または、前記第２のオリゴヌクレオチドを第２の親和性分子にコンジュゲートすることが可能な試薬を含む、１つまたは複数のさらなる容器であって、
前記第１の親和性分子は、細胞の第１の細胞外タンパク質に結合するように構成されており、前記第２の親和性分子は、細胞の第２の細胞外タンパク質に結合するように構成されており、前記第１の細胞外タンパク質は、前記第２の細胞外タンパク質とは異なる、さらなる容器；ならびに
（ｄ）前記第１のオリゴヌクレオチドを前記第１の親和性分子にどのようにコンジュゲートするか、および前記第２のオリゴヌクレオチドを前記第２の親和性分子にどのようにコンジュゲートするかを記載する、指示書のセット
を含む、キット。
【請求項２０】
（ｅ）複数のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを含むさらなる容器であって、前記複数のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドのそれぞれのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドは、固有のベッセルバーコード化配列を含む、容器；および
（ｆ）前記第１または第２の親和性分子にコンジュゲートされるときに、前記複数のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、前記第１または第２のオリゴヌクレオチドに結合させる試薬および指示書のセット
をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
本明細書に記載されている新規特徴は、特に添付の特許請求の範囲に示されている。本明細書に記載されている特徴および特徴の利点に関するより良好な理解は、本明細書に記載されている特徴の原理が利用されている説明例が示されている以下の詳細な記載および添付の図面を参照することにより得られ得る。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
複数のベッセルのうちの１つのベッセル中で反応を実行することを含む方法であって、前記反応が、ベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分に付着させることを含み、前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、前記複数のベッセルのうちの１つのベッセル中で細胞によって発現される標的抗原に結合する、方法。
（項目２）
前記細胞が、前記ベッセル内に含まれる単一の細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３）
反応が、前記複数のベッセルのうちの２またはそれよりも多くのベッセル中で起こる、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記ベッセルが、前記複数のベッセルの各ベッセルを構成する、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記複数のベッセルが、２またはそれよりも多くの複数のベッセルを含む、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
各ベッセル中の前記細胞が、同じ試料由来である、項目４または５に記載の方法。
（項目７）
前記２またはそれよりも多くの複数のベッセルのうちの第１の複数のベッセルのうちの１つのベッセル中の前記細胞が、前記２またはそれよりも多くの複数のベッセルのうちの第２の複数のベッセルのうちの１つのベッセル中の前記細胞と同じ試料由来である、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記オリゴヌクレオチド部分が、抗原識別配列（ＡＩＤ）を含む、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記ＡＩＤが、前記標的抗原、または前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にバーコード化される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記抗原識別配列（ＡＩＤ）が既知の配列である、項目８または９に記載の方法。
（項目１１）
前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、前記ベッセル中の鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチド由来である、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
配列情報を取得するために、前記オリゴヌクレオチドまたはそのアンプリコンを配列決定することをさらに含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記配列情報に基づいて、前記ベッセル中の前記細胞の特徴を決定することをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記配列情報が、前記抗原識別（ＡＩＤ）配列もしくはその相補体を含み、および／または前記ＡＩＤ配列を有する分子のコピー数を含む、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１５）
前記配列情報に基づいて、前記単一の細胞の特徴を決定することをさらに含む、項目１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記特徴が表現型である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記表現型が免疫表現型である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、単一の細胞を含む複数の細胞に接触させることをさらに含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記接触させることが、前記ベッセル中で前記単一の細胞が単離される前である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記接触させることの後に、前記複数の細胞を洗浄することをさらに含む、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ベッセルが、標的抗原に結合していない親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含まない、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記ベッセル中の前記単一の細胞を単離することをさらに含む、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記単一の細胞が、前記単離することの前に前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに結合される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記単一の細胞を溶解させることをさらに含む、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記溶解させることが、前記ベッセル中で前記単一の細胞が単離された後である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記複数の細胞が、複数のソーティングされていない細胞である、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記複数のベッセルのうちの第１のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの前記ベッセルバーコード配列が、前記複数のベッセルのうちの第２のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの前記ベッセルバーコード配列とは異なる、項目１から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記複数のベッセルのうちの単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの前記ベッセルバーコード配列が、同じベッセルバーコード配列を含む、項目１から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記複数のベッセルのうちの任意の単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドおよびそのアンプリコンの前記ベッセルバーコード配列が、前記複数のベッセルのうちの任意の他の単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドおよびそのアンプリコンの前記ベッセルバーコード配列に対して固有である、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記ベッセルバーコードを含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、前記細胞由来の細胞ポリヌクレオチドに付着させることをさらに含む、項目１から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドに付着させることと、前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、前記単一の細胞由来の細胞ポリヌクレオチドに付着させることとが、同時に実行される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記オリゴヌクレオチドまたはその相補体を増幅することをさらに含む、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞ポリヌクレオチドまたはその相補体を増幅することをさらに含む、項目３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記オリゴヌクレオチドまたはその相補体を増幅することと、前記細胞ポリヌクレオチドまたはその相補体を増幅することとが、同時に実行される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記細胞ポリヌクレオチドの前記ベッセルバーコード配列と前記オリゴヌクレオチドの前記ベッセルバーコード配列とが同じである、項目３０から３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記複数のベッセルのうちの２またはそれよりも多くのベッセルから、オリゴヌクレオチドまたはそのアンプリコンをプールすることをさらに含む、項目１から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記複数のベッセルのうちの２またはそれよりも多くのベッセルから、オリゴヌクレオチドまたはそのアンプリコンおよび細胞ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンをプールすることをさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記プールすることが、配列決定することの前である、項目３６または３７に記載の方法。
（項目３９）
前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、複数の異なる親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む、項目１から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの各親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、固有の抗原識別（ＡＩＤ）配列を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記オリゴヌクレオチドが、複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のうちの単一の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子にバーコード化される親和性分子バーコード（ＡＭＢ）配列を含む、項目１から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の各親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子が、固有の親和性分子バーコード（ＡＭＢ）配列を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記オリゴヌクレオチドが、融合配列を含み、前記付着させることが、前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを前記融合配列に付着させることを含む、項目１から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記オリゴヌクレオチドが、プライマー結合配列を含む、項目１から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記オリゴヌクレオチドが、定常配列を含む、項目１から４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記オリゴヌクレオチド、その相補体、その増幅された産物、またはそれらの組合せを配列決定することであって、それによって、オリゴヌクレオチド配列読み取りを生成することをさらに含む、項目１から４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
１つまたは複数の第１のオリゴヌクレオチド配列読み取りを、１つまたは複数の第２のオリゴヌクレオチド配列読み取りと比較することをさらに含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記オリゴヌクレオチド配列読み取りを分析することをさらに含む、項目４６または４７に記載の方法。
（項目４９）
前記オリゴヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を分析することをさらに含む、項目４６から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記オリゴヌクレオチド配列読み取りの抗原識別（ＡＩＤ）配列を分析することをさらに含む、項目４６から４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記オリゴヌクレオチド配列読み取りの親和性分子バーコード（ＡＭＢ）配列を分析することをさらに含む、項目４６から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記分析することが、１もしくは複数のベッセルバーコード配列、１もしくは複数のＡＩＤ配列、１もしくは複数の親和性分子バーコード（ＡＭＢ）配列、またはそれらの組合せの頻度を決定することを含む、項目４８から５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記分析することが、比較することを含む、項目４８から５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
オリゴヌクレオチド配列読み取りの抗原識別（ＡＩＤ）配列を、オリゴヌクレオチド配列読み取りの親和性分子バーコード（ＡＭＢ）配列と比較することをさらに含む、項目４６から５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記細胞ポリヌクレオチド、その相補体、その増幅された産物、またはそれらの組合せを配列決定することであって、それによって、細胞ポリヌクレオチド配列読み取りを生成することをさらに含む、項目３０から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
オリゴヌクレオチド配列読み取りを、前記細胞ポリヌクレオチド配列読み取りと比較することをさらに含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
オリゴヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を、前記細胞ポリヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列と比較することをさらに含む、項目５５または５６に記載の方法。
（項目５８）
前記細胞ポリヌクレオチド配列読み取りを比較することをさらに含む、項目５５から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記細胞ポリヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を分析することをさらに含む、項目５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記細胞ポリヌクレオチド配列読み取りの分子バーコード配列を分析することをさらに含む、項目５５から５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記分析することまたは前記比較することに基づいて、細胞の特徴を決定することをさらに含む、項目４６から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記オリゴヌクレオチド配列読み取りに基づいて、抗体またはＴＣＲを選択することをさらに含む、項目４６から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記細胞ポリヌクレオチド配列読み取りに基づいて、抗体またはＴＣＲを選択することを含む、項目５５から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記オリゴヌクレオチドに付着させた前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドと、前記細胞ポリヌクレオチドに付着させた前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドとが、前記ベッセル中の同じ鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチド由来である、項目１から６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記オリゴヌクレオチドに付着させた前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの増幅産物である、項目１から６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記細胞ポリヌクレオチドに付着させた前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、前記鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの増幅産物である、項目６４または６５に記載の方法。
（項目６７）
前記ベッセルが、固体支持体を含む、項目１から６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記ベッセルが、固体支持体を含まない、項目１から６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記複数のベッセルの各ベッセルが、単一の細胞を含む、項目１から６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記ベッセルが、ウェル、エマルジョンまたは液滴である、項目１から６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、固体支持体に結合していない、項目１から７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、固体支持体に結合している、項目１から７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドのうちの１つの分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコード配列を、前記細胞ポリヌクレオチドに付着させることをさらに含み、前記分子バーコード配列が、単一の細胞ポリヌクレオチド分子およびそのアンプリコンにバーコード化される、項目１から７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記付着させることが、前記ベッセルポリヌクレオチドを前記オリゴヌクレオチドにライゲーションすることを含む、項目１から７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記付着させることが、酵素を用いて前記ベッセルポリヌクレオチドを前記オリゴヌクレオチドに付着させることを含む、項目１から７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
前記付着させることが、前記ベッセルポリヌクレオチドを前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることを含む、項目１から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記付着させることが、前記オリゴヌクレオチドを伸長させることをさらに含む、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記付着させることが、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを増幅することを含む、項目１から７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、前記単一の細胞の細胞外抗原に結合する、項目１から７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記単一の細胞の前記細胞外抗原が、免疫細胞に特異的な抗原である、項目１から７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記単一の細胞の前記細胞外抗原が、Ｔ細胞に特異的な抗原またはＴ細胞によって発現される抗原である、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記細胞外抗原がＣＤ４である、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記細胞外抗原がＣＤ８である、項目８１に記載の方法。
（項目８４）
前記細胞外抗原が、ＣＤ１５４、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１３７、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ１２５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１４およびＣＤ１９からなる群から選択される、項目８１に記載の方法。
（項目８５）
前記単一の細胞の前記細胞外抗原が、Ｂ細胞に特異的な抗原またはＢ細胞によって発現される抗原である、項目８０に記載の方法。
（項目８６）
前記細胞外抗原が免疫グロブリンである、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記オリゴヌクレオチドが二本鎖である、項目１から８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖である、項目１から８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８９）
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡである、項目１から８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡである、項目１から８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記細胞ポリヌクレオチドが、可変領域配列を含む、項目１から９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
可変領域配列を含むネイティブ鎖配列を対合させることをさらに含む、項目１から９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記単一の細胞がＴ細胞である、項目１から８４および８７から９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９４）
前記単一の細胞がＢ細胞である、１から８０および８５から９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
前記細胞ポリヌクレオチドがＤＮＡである、項目３０から９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
前記細胞ポリヌクレオチドがＲＮＡである、項目３０から９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、抗体またはその断片である、項目１から９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、ペプチドである、項目１から９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、タンパク質である、項目１から９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、アプタマーである、項目１から９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、小分子である、項目１から９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、薬物である、項目１から９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、細胞である、項目１から９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０５）
前記細胞が抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）またはその機能的部分もしくは結合性部分を含む、項目１から９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０７）
前記親和性部分が、前記ＭＨＣの多量体、任意選択で、前記ＭＨＣの四量体を含む、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
前記ＭＨＣが可溶性形態である、項目１０６または１０７に記載の方法。
（項目１０９）
前記ＭＨＣが、前記ＭＨＣの溝内で、ペプチドに結合しているか、そして／またはペプチドを含む、項目１０６から１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
前記ペプチドが合成ペプチドである、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記ＭＨＣが、前記単一の細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合する、項目１０６から１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記親和性部分が、抗体もしくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に結合するペプチドを含み、および／または前記標的が、抗体もしくはＣＡＲである、項目１から９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記親和性部分が、前記抗体もしくは前記キメラ抗原受容体によって特異的に認識される抗原もしくはエピトープであるかまたはそれを含み、そして／またはそれに特異的に結合する抗体、任意選択で、その抗原結合性部分に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を含む、項目１１２に記載の方法。
（項目１１４）
複数のベッセルを含む組成物であって、前記複数のベッセルのうちの１つのベッセルが、
（ａ）複数の細胞を含む試料由来の単一の細胞、および
（ｂ）ベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチド
を含み、
前記ベッセルが、前記単一の細胞の標的抗原に結合する親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはそれ由来のオリゴヌクレオチド部分をさらに含む、組成物。
（項目１１５）
反応が、前記複数のベッセルのうちの２またはそれよりも多くのベッセル中で起こる、項目１１４に記載の組成物。
（項目１１６）
前記ベッセルが、前記複数のベッセルの各ベッセルを構成する、項目１１４または１１５に記載の組成物。
（項目１１７）
前記複数のベッセルが、２またはそれよりも多くの複数のベッセルを含む、項目１１４から１１６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１８）
各ベッセル中の前記細胞が、同じ試料由来である、項目１１６または１１７に記載の組成物。
（項目１１９）
前記２またはそれよりも多くの複数のベッセルのうちの第１の複数のベッセルのうちの１つのベッセル中の前記細胞が、前記２またはそれよりも多くの複数のベッセルのうちの第２の複数のベッセルのうちの１つのベッセル中の前記細胞と同じ試料由来である、項目１１７に記載の組成物。
（項目１２０）
前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体が、前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記オリゴヌクレオチドに付着される、項目１１４から１１９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２１）
前記単一の細胞が溶解される、項目１１４から１２０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２２）
複数のベッセルを含む組成物であって、前記複数のベッセルのうちの１つのベッセルが、
（ａ）複数の細胞を含む試料由来の単一の溶解細胞、および
（ｂ）前記単一の溶解細胞の標的抗原に結合する親和性部分を含む親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分
を含み、
前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分が、ベッセルバーコード配列を含み、前記単一の溶解細胞由来の細胞ポリヌクレオチドが、同じベッセルバーコード配列を含む、組成物。
（項目１２３）
（ａ）第１の抗原識別（ＡＩＤ）配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを含む第１の容器であって、前記第１のＡＩＤ配列が既知の配列である、第１の容器；
（ｂ）第２の抗原識別（ＡＩＤ）配列を含む第２のオリゴヌクレオチドを含む第２の容器であって、前記第２のＡＩＤ配列が既知の配列であり、前記第１のＡＩＤ配列とは異なる、第２の容器；
（ｃ）前記第１のオリゴヌクレオチドを第１の親和性分子にコンジュゲートすることが可能な試薬と、前記第２のオリゴヌクレオチドを第２の親和性分子にコンジュゲートすることが可能な試薬とを含む、１つまたは複数の第３の容器；
（ｄ）前記第１のオリゴヌクレオチドを前記第１の親和性分子にどのようにコンジュゲートするか、および前記第２のオリゴヌクレオチドを前記第２の親和性分子にどのようにコンジュゲートするかを記載する、指示書のセット
を含む、キット。
（項目１２４）
（ａ）抗原識別（ＡＩＤ）配列を含むオリゴヌクレオチドを含む第１の容器であって、前記ＡＩＤ配列が既知の配列である、第１の容器；
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドを親和性分子にコンジュゲートすることが可能な試薬を含む第２の容器；
（ｃ）複数のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを含む第３の容器；および
（ｄ）前記親和性分子にコンジュゲートされたときに、前記複数のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドのうちの１つのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを前記オリゴヌクレオチドにどのように付着させるかを記載する、指示書のセット
を含む、キット。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１９】
（実施例１）
Ｔ細胞集団中の単一Ｔリンパ球のイムノタイピング
本明細書に記載されているイムノフェノタイピング法を、ヒトＴリンパ球におけるＣＤ４およびＣＤ８のｍＲＮＡならびに表面タンパク質発現の両方を分析することにより検証した。通常、成熟Ｔ細胞は、ＣＤ４サブタイプまたはＣＤ８サブタイプのいずれかであると予想される。ＣＤ４サブタイプは、ＣＤ４  ｍＲＮＡおよびＣＤ４タンパク質を共に発現するはずであるが、ＣＤ８  ｍＲＮＡまたはＣＤ８タンパク質のいずれかを発現するはずである。ＣＤ８サブタイプは、ＣＤ８  ｍＲＮＡおよびＣＤ８タンパク質を共に発現するはずであるが、ＣＤ４  ｍＲＮＡまたはＣＤ４タンパク質のいずれかを発現するはずである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２４】
（実施例３）
健常血液試料からのＢ細胞ＶＨＶＬペア対の大規模回収
最初に、本技術を開発し、対合能力およびスループットを、陰性ビーズ濃縮により健常ボランティアの末梢血から単離された３００万個のＢ細胞でアセスメントした。エマルジョンを６つの別々の画分に分割し、それらを並列で処理し、配列決定前に再混合しなかった。エマルジョンを、１液滴当たり０．２細胞になるように装填した。これは、占有液滴の約９０％が単一細胞を含有するというポアソン期待値をもたらし、エマルジョン液滴観察と一致していた（図６Ａ）。エマルジョン破壊および追加のライブラリー処理ステップを行った後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑを用いて、ペアエンド３２５＋３００ｂｐ配列決定を実施した。配列決定データを処理するため、液滴および分子バーコードを共に使用して、元々の各ｍＲＮＡ分子からＰＣＲ複製読み取りを収集し、各ｍＲＮＡについてコンセンサスを決定して、少なくとも２つの読み取りから組み立てられたｍＲＮＡ配列のみを維持した。フォワードおよびリバース読み取りを繋ぎ合わせて、５’ＵＴＲ、完全Ｖ（Ｄ）Ｊ配列、およびアイソタイプ決定に十分な定常領域を含む全長産物を生成した。ＩＭＧＴ  Ｈｉｇｈ−ＶＱｕｅｓｔおよび／またはＩｇＢＬＡＳＴを用いて、再配置された免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列に注釈を付けた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２５】
得られたデータセットは、少なくとも１つの重鎖（ＶＨ）および１つの軽鎖（ＶＬ）ｍＲＮＡと関連していた３２４，９８８個の液滴バーコードを含有し、重鎖クラスター分析で評価して２２９，８６９個の異なるＶＨクローン系列が存在していた。この生セットは、複数細胞ならびに単一細胞液滴に由来するデータを含むため、非一致の重鎖または軽鎖Ｖ（Ｄ）Ｊ配列に関連した液滴バーコードをフィルタリングして取り除くことにより、単一細胞液滴に由来するデータを濃縮した（図６Ｂ）。このことを実施することが可能であるのは、典型的な免疫レパートリーの多様性が高いためであり、２つのランダム細胞に由来するＶＨまたはＶＬ  ｍＲＮＡがマッチングすることは、ほとんど全くないだろう。得られた濃縮データセットは、２５９，３６８個のＶＨＶＬ液滴バーコードを含み、１８２，７４５個のＶＨのクローン系列を含有していた。これは、現在までで最も高深度の対合した免疫レパートリーのサンプリングであることをほぼ間違いなく示す。クローン的に関連する細胞は、それらのＶＨＶＬ対合が一貫しているはずであるため、クローン拡大の発生を識別することにより、ＶＨＶＬ対合の精度を直接的に評価した。１つよりも多くのエマルジョン画分で、クローン的に拡大した細胞であることが高い信頼性で観察された２，６０４個のＶＨクローンが識別された。これらＶＨクローンと対合したＶＬ配列は、画分間の一貫性が非常に高く、９６．１％の対合精度を示した。これにより、２５９，３６８個のＶＨＶＬペアのフィルタリングされたデータセット全体に高い信頼性が与えられた。交差画分ＶＨおよびＶＬ配列は、各画分にて異なる液滴および分子バーコードと関連することが常であり、したがってライブラリー交差汚染を示さなかった。一部のＢ細胞は複数の軽鎖を発現することが公知であるため、分析は、対合精度を過小評価する場合がある。２５９，３６８個のフィルタリングされたＶＨＶＬ液滴バーコードまたは「ＶＨＶＬペア」の７５．０％は、ＩｇＭおよび／またはＩｇＤを含有していた（図６Ｃ）。これは、未感作ナイーブＢ細胞は典型的にはＩｇＭ＋ＩｇＤ＋表現型であることを考慮すると、予想通り一緒に観察されることが多かった。より少ないがかなりの割合のＩｇＡ（１８．３％）およびＩｇＧ（６．６％）ＶＨＶＬペアも見出された。ＶＨアイソタイプは全て、約３：２の比率でＩｇκまたはＩｇλのいずれかと対合した。１８２，７４５個のＶＨクローン系列中のクローン拡大を２つの方法でアセスメントした：クローンに関連する液滴バーコードの数；およびエマルジョン画分にわたるそのクローンの観察。複数の液滴バーコードでクローンが見られることは、クローン拡大を反映する場合もあり、または複数バーコード液滴を反映する場合もある。初期λ＝１であったこと、つまり液滴内へのバーコードの分散がポアソン分散であったことを考慮すると、液滴の約３７％で複数バーコード液滴が予想された。しかしながら、＞８つの液滴バーコードにより表わされるクローンは全て、間違いなく拡大性である可能性が高い（単一液滴中のポアソン確率は、＜１０−６）。全体でクローンの６．０％が１つよりも多くの画分で見られたが、８つよりも多くの液滴バーコードで見���れたクローン（全体で０．７％）の場合、それらの９９％は、１つよりも多くの画分で見られた。１００個の最も高頻度のクローン（各々３０〜１３７個の液滴バーコード、図６Ｄ）は全て、６つの画分の少なくとも５つで見られた。したがって、バーコード計数および独立した画分分析を組み合わせると、非増殖クローンの厖大なバックグラウンドの中から、希少な拡大系列を検出することが可能になる。しかしながら、最も多量の拡大したクローンでさえ、１０００個に１個未満の細胞にしか存在していなかったことは注目すべきことであり、ヒト末梢免疫レパートリーの多様性が非常に高いことを例示している。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２６】
発現レベルの推定としての、ペア内の各ＶＨおよびＶＬ鎖の捕捉ｍＲＮＡの数（図６Ｅ）。概して、１液滴バーコード当たり１０個未満の重鎖（平均２．０）および軽鎖（平均４．０）ｍＲＮＡが捕捉され、１細胞当たり、数ダース〜数百個の捕捉重鎖および軽鎖ｍＲＮＡを有する液滴バーコードの小集団が、ほとんど排他的にＩｇＧおよびＩｇＡ発現細胞から観察された。興味深いことには、ペア内のＶＨおよびＶＬ突然変異の程度は、各アイソタイプ（例えば、ＩｇＧの場合は、ＶＨ対ＶＬ）内、およびアイソタイプ間（例えば、ＩｇＧ対ＩｇＭ）の両方で、強い相関性を示した（図６Ｆ）。さらに、ＩｇＧおよびＩｇＡ対はほとんど全てが、ＶＨおよびＶＬ鎖の両方にかなりの突然変異を示したが、ＩｇＭおよびＩｇＤペアはほとんどが、ＶＨまたはＶＬ突然変異をほとんど示さなかった。こうした結果は、Ｂ細胞活性化の機序と一致し、ＩｇＭおよびＩｇＤからＩｇＧまたはＩｇＡへのクラススイッチ、免疫グロブリン発現の増加、ならびに細胞の重鎖および軽鎖遺伝子座の両方に影響を及ぼす体細胞超変異に至る。高度に突然変異を起こしたＶＨ鎖は、高度に突然変異を起こしたＶＬ鎖と対合する傾向があるというこの観察に加えて、本方法は、休止ヒトＢ細胞レパートリーに由来する多数の全長のネイティブに対合したＢＣＲを生成することが可能である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２７】
（実施例４）
ＨＩＶ長期非進行者からの公既知の低頻度ＶＨＶＬ対ペアの回収。
アッセイの対合感度および正確性のさらなる検証として、いくつかの希少な（１０，０００個の細胞中、＜１個の細胞）ネイティブＶＨＶＬ対合が既に既知である試料を処理した。ＨＩＶ長期非進行患者から末梢Ｂ細胞を得た。この患者のメモリＢ細胞は、ＨＩＶ中和活性を示す抗体が近年詳細に探索されている。３５０，０００個のＢ細胞を処理して、合計３８，６２０個のフィルタリングされたＶＨＶＬペアを生成した。興味深いことには、この個体は、以前の健常試料（図７Ａ）または典型的な健常末梢Ｂ細胞レパートリーよりも高い割合のＩｇＧを示した。このデータセットに由来するＶＨ配列を、ＰＧＴ１２１を含む、この個体に由来する全ての報告されている広域中和抗体（ｂＮＡｂ）と比較し、８つの類似または同一のＶＨ配列を見出した。これは、ｂＮＡｂのこのファミリーが循環Ｂ細胞の０．０３％未満であることを示す。重要なことには、これら重鎖と対合した全ての軽鎖は、予想される同様に希少のｂＮＡｂ系列のものであり、以前に報告されているように、同じＩｇλ−Ｖ３−２１／Ｊ３再配置および特徴的な３コドン挿入を示し、本発明者らの方法の正確性および感度が高いことが支持された。さらに、この個体に由来する、全ての既知の新らたに生成されたＰＧＴ１２１様ＶＨＶＬペアの系統樹（図７Ｂ）では、ＶＨおよびＶＬツリーは、鏡像様位置を占める対合したＶＨおよびＶＬ配列と非常に類似したトポロジーを示しており、これは、系統発生史が共通していることを反映している可能性が高い。ここで発見されたバリアントペアは、このルールに良好に当てはまる。興味深いことには、２つの発表されている抗体ＰＧＴ１２２およびＰＧＴ１２３は、例外であると考えられ、これら２つの対合を支持するものは見出されなかったが、その代わりに、ＰＧＴ１２２ＶＨ：ＰＧＴ１２３ＶＬ様のおよびＰＧＴ１２３ＶＨ：ＰＧＴ１２２ＶＬ様のペアが見出された。これは、元々の報告書では確認されていない対合を示している。８つの新規なＰＧＴ様ＶＨＶＬペアの完全なＶ（Ｄ）Ｊ領域をコードするＤＮＡを合成し、抗体を完全ＩｇＧとして発現させ、複数のＨＩＶ擬似系統を中和する能力を試験した（図７Ｃ）。抗体は良好に発現され、全てがウイルスに対する強力な中和活性を示し、関連する生物学的試料からネイティブに対合した機能性抗体バリアントを迅速に生成する本発明者らの手法の有用性が実証された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２８】
（実施例５）
腫瘍浸潤リンパ球に由来するＢ細胞およびＴ細胞受容体対ペア
対合した受容体をハイスループットで回収するためにエマルジョンバーコード付与が検証されたことを受けて、免疫受容体を、腫瘍から直接回収した。プロテアーゼで分離された切除卵巣腺癌試料を得、４００，０００個のソーティングされていない細胞をエマルジョンに入れた。別々の等量の試料をＣＤ３／ＣＤ１９染色することにより、かなりの数の浸潤性Ｂ（約５％）およびＴ細胞（約２０％）が物質中に存在することが示唆された。エマルジョン中の単一細胞分散系は、いくつかの限定的な塊が視認されたとはいえ、精製細胞と類似しており、試料の細胞タイプが不均質であったことを考慮すると予想通りに液滴内の細胞サイズおよび形状に広範なばらつきがあった（図８Ａ）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２９】
Ｔ細胞受容体アルファおよびベータ鎖の定常領域を共に標的とするプライマーを、以前に使用されたＢＣＲプライマーと共に使用し、配列決定およびストリンジェントなフィルタリング後に、ＢＣＲまたはＴＣＲ産物にリンクする数千個の液滴バーコードを回収した。単一細胞精度をアセスメントするため、液滴バーコード内の４つの標的遺伝子座（ＶＨ、ＶＬ、Ｖα、Ｖβ）のあらゆる考え得る組合せを計数した（図８Ｂ）。１つよりも多くの標的鎖を有する液滴バーコードの大部分（９７．９％）は、生物学的に予想されるＢＣＲ  ＶＨ＋ＶＬまたはＴＣＲ  Ｖα＋Ｖβの対合を含有し、混合ＢＣＲ−ＴＣＲ組合せは２．１％しか含有されていなかった。産物のバーコード付与は、標的鎖に関して偏りがないため、この結果は、得られた６，０５６個のＢＣＲ  ＶＨＶＬおよび５，２１７個のＴＣＲ  ＶαＶβペアの信頼性を高度化することが可能である。ＢＣＲでは、他のアイソタイプと比較して、ＩｇＧ（＞８０％）が著しく優勢であったが（図８Ｃ）、全てが存在した（ＩｇＥ＜０．０５％のみ）ことが示された。カッパおよびラムダ軽鎖は、末梢血データセットと同様の比率で存在した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３０】
末梢血と同様に、ＢＣＲアイソタイプとＶＨおよびＶＬ鎖の両方の突然変異レベルとの間に相関性が観察され、ＩｇＧおよびＩｇＡペアは、ＩｇＤおよびＩｇＭよりも大きなＶＨおよびＶＬ突然変異、ならびに各アイソタイプ内でのＶＨおよびＶＬ間の突然変異の一般的相関性を示した（図８Ｄ）。興味深いことには、ＩｇＤ、ＩｇＭ、およびＩｇＡペアは、腫瘍と末梢血データセットとの間で非常に類似した突然変異分布を示した。また、腫瘍ＩｇＧ画分は、末梢血では観察されなかった、ほとんど突然変異していないかまたは全く突然変異してない配列をかなりの割合で含有していた。ＴＣＲの場合、およびＩｇＤを含有するＢＣＲの場合、１液滴バーコード当たり、末梢血のＢＣＲ結果と同様の数の捕捉ｍＲＮＡが観察された（図８Ｅ、ほとんどが１液滴バーコード当たり＜１０）。極めて対照的だが、腫瘍由来のＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＧペアは、１０〜１００倍の平均発現レベル増加を示し、液滴バーコードの多くには数百または数千個の標的ｍＲＮＡが捕捉された。その後、捕捉ＴＩＬ−ＴＣＲおよびＢＣＲレパートリーの多様性をアセスメントした（図８Ｆ）。５，２１７個の合計ＴＣＲペアの中で、２，４２３個の異なるＴＣＲベータクローンが観察された。７つのクローンが、＞１％の頻度で存在し、上位クローンは、全ての液滴バーコードの１６．９％に相当した。６，０５６個の合計ＢＣＲペア中で、１，５１８個の異なる重鎖クローンが観察され、１５個のクローンが＞１％の頻度であったが、＞５％の頻度のものはなかった。これは、多様性が、健常末梢ＢＣＲレパートリーよりも実質的により制限されていることを表わしているが（０．０６％を超える頻度で存在するクローンはなかった）、クラス転換し、突然変異を起こし、高度に発現されたクローンが、腫瘍試料中に非常に多く存在することは、ＴＩＬを特徴付けるためには、高深度で高感度のサンプリング手法が必要であることを示す。本方法は、規定されたＴＩＬ集団を事前にソーティングまたは外因的活性化する必要なく、ＢおよびＴ細胞の両方から同時に、多数のＴＩＬ免疫受容体ペアを迅速に回収することを可能にする。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３１】
（実施例６）
追加の目的の表現型マーカーの捕捉
液滴バーコード付与による受容体鎖の対合は、潜在的に、免疫受容体の他に追加の標的の捕捉を可能にする。この可能性を調査するため、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団に入る健常Ｔ細胞を、磁気ビーズ濃縮により分離し、各タイプの２０，０００個の細胞を別々のエマルジョンに入れ、ＴＣＲアルファおよびベータ鎖を標的とするプライマーならびにＣＤ４およびＣＤ８のｍＲＮＡを用いて実験を行った。配列決定後、ＣＤ４＋単離細胞に由来するＴＣＲ  ＶαおよびＶβ（「ＴＣＲペア」）を含有する３，８６１個の液滴バーコードの４７．０％は、ＣＤ４  ｍＲＮＡに関連していたが、ＣＤ８  ｍＲＮＡに関連したものは０．３％に過ぎなかった。反対に、ＣＤ８＋単離細胞に由来する２，２３５個のＴＣＲペアの５０．６％が、ＣＤ８  ｍＲＮＡにリンクしていたが、ＣＤ４  ｍＲＮＡにリンクしていたものは０．６％に過ぎなかった。これは、以前の報告と同様に、細胞表現型を決定するためのｍＲＮＡに基づく手法は、高特異性だが、感度に制限があることを示す。対照的に、細胞表面受容体等のタンパク質は、通常、それらのコードｍＲＮＡよりも非常に大きな数（１細胞当たり１，０００〜１００，０００個）で存在し、検出がより容易である可能性が高いだけでなく、より直接的に細胞表現型と関連する可能性が高い。各細胞での標的タンパク質レベルを測定するため、特注オリゴヌクレオチドＤＮＡ標識を、抗ヒトＣＤ４およびＣＤ８抗体にコンジュゲートし、標識抗体を、３０，０００個の細胞をエマルジョンに入力する前に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の未分離混合物と共にインキュベートした（図３Ａ）。ＤＮＡ標識は、抗体特異的配列タグだけでなく、分子バーコード、および増幅された液滴バーコードに相補的な配列を担持し、ｍＲＮＡでの実施と同様に、エマルジョン液滴バーコード付与、および分子計数を可能にする。ＤＮＡ標識、ならびにＴＣＲ、ＣＤ４、およびＣＤ８  ｍＲＮＡを、同時に標的とした。配列決定およびフィルタリング後、３，６８２個の液滴バーコードを、高い信頼性でＴＣＲ  ＶαＶβペアであると識別した。以前の実験と一致して、ＴＣＲペアのおよそ半分（５２％）を、ｍＲＮＡに基づいてＣＤ４またはＣＤ８ステータスに帰属させることができた（図３Ｂ〜３Ｃ）。しかしながら、液滴バーコードの９５％超は、タンパク質ステータスに基づいてＣＤ４またはＣＤ８に帰属させることができ、１液滴当たりの平均分子計数は、ＣＤ４／８タンパク質（平均２０．５）が、ＣＤ４／８  ｍＲＮＡ（平均１．０）よりもかなり高かった。ｍＲＮＡおよびタンパク質決定が両方とも合致していたことを考慮すると、ｍＲＮＡとタンパク質シグナルとの間の合致率は高く（図３Ｄ）、液滴の９６．０％だった。一部の希少な例では、ＣＤ４およびＣＤ８タンパク質の両方が検出された。これは、液滴が、２つまたはそれよりも多くの細胞を含有していた結果であると考えられた。エマルジョンバーコード付与により、単一細胞免疫受容体を、目的のｍＲＮＡおよびタンパク質マーカーと、全てハイスループットで直接的に関連付けることが初めて可能になった。抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４等の拡大された免疫腫瘍学的関連マーカーセットを用いて、この手法をＴＩＬに応用���ることは、保証されている。