(57)【要約】  被験試料中のヒトゲノムＤＮＡを高感度に検出及び／又は定量する方法を提供すること。  ４６のヒトＡｌｕサブファミリーのコンセンサス配列を代表する一つの「ヒトＡｌｕモデル配列」を同定し、このヒトＡｌｕモデル配列を用いてＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー・プローブ候補を選択する。次に、ヒトＡｌｕ配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列であって、且つ、ダイマーの形成を最小限に抑え得るオリゴヌクレオチド配列からなるプライマー・プローブセットを、独自のクライテリアを用いて選択する。このようにして得られたＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー・プローブを用いて定量リアルタイムＰＣＲを行うことにより、被験試料中のヒトゲノムＤＮＡを高感度に検出及び／又は定量することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなるヒトＡｌｕモデル配列の一部又は全部の領域を増幅することができるフォワードプライマー群及びリバースプライマー群から、以下のクライテリア１’〜７’を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーを選択する工程Ａ’を含む、ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対の設計方法；
［クライテリア１’］フォワードプライマー及びリバースプライマー中の連続した１７以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；
［クライテリア２’］フォワードプライマー及びリバースプライマーのヌクレオチド長がそれぞれ１８以上である；
［クライテリア３’］少なくともプライマーの５’末端又は３’末端のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの５’末端がＧ又はＣでない場合は、５’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの３’末端がＧ又はＣでない場合は、３’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣである；
［クライテリア４’］プライマーの３’末端から３番目までのヌクレオチド（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド）のうちの、少なくとも１つがＡ又はＴである；
［クライテリア５’］フォワードプライマー同士、及びリバースプライマー同士の二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア６’］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア７’］フォワードプライマー同士、及びリバースプライマー同士の二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
【請求項２】
以下のクライテリア１〜７を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーを選択する工程Ａを含む、請求項１記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対の設計方法；
［クライテリア１］フォワードプライマー及びリバースプライマー中の連続した１９ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；
［クライテリア２］フォワードプライマー及びリバースプライマーのヌクレオチド長がそれぞれ２０以上である；
［クライテリア３］少なくともプライマーの５’末端又は３’末端のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの５’末端がＧ又はＣでない場合は、５’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの３’末端がＧ又はＣでない場合は、３’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣである；
［クライテリア４］プライマーの３’末端から３番目までのヌクレオチド（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド）のうちの、少なくとも１つがＡ又はＴである；
［クライテリア５］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア６］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア７］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
【請求項３】
ヒトＡｌｕモデル配列が配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなる、請求項１又は２記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対の設計方法。
【請求項４】
非ヒト生物がげっ歯類である請求項１〜３のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対の設計方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対の設計方法により設計されたヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ａ’）のフォワードプライマー及び（ｂ）又は（ｂ’）のリバースプライマーにより構成される、ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対。
（ａ）配列番号１８に示されるヌクレオチド配列；又は配列番号１８に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列；からなるフォワードプライマー；
（ａ’）配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列；又は配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列；からなるフォワードプライマー；
（ｂ）配列番号１９に示されるヌクレオチド配列；又は配列番号１９に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号１９に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列；からなるリバースプライマー；
（ｂ’）配列番号１４８に示されるヌクレオチド配列；又は配列番号１４８に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号１４８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列；からなるリバースプライマー；
【請求項７】
配列番号１８に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー、及び配列番号１９に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマーにより構成される、請求項６記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対。
【請求項８】
配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー、及び配列番号１４８に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマーにより構成される、請求項６記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対。
【請求項９】
被験試料より抽出されたＤＮＡを鋳型として、請求項５〜８のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲを行う工程を含む、前記被験試料中のヒトゲノムＤＮＡを検出及び／又は定量する方法。
【請求項１０】
被験試料が、非ヒト動物にヒト細胞を移植して作製された異種移植モデル動物由来の生体試料、又は古人骨由来の陳旧試料である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなるヒトＡｌｕモデル配列のうち、請求項５〜８のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対により増幅される領域にハイブリダイズすることができるプローブの群から、以下のクライテリア８’〜１１’を満たすプローブを選択する工程Ｂ’を含む、ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブの設計方法；
［クライテリア８’］プローブ中の連続した１７以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；
［クライテリア９’］プローブのヌクレオチド長が１８以上である；
［クライテリア１０’］フォワードプライマーとプローブ及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア１１’］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
【請求項１２】
以下のクライテリア８〜１１を満たすプローブを選択する工程Ｂを含む、請求項１１記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブの設計方法；
［クライテリア８］プローブ中の連続した１９ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；
［クライテリア９］プローブのヌクレオチド長が２０以上である；
［クライテリア１０］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア１１］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
【請求項１３】
工程Ｂ’又はＢにより複数のプローブが選択されたとき、以下のクライテリア１２〜１５の少なくとも１つ又は２つ以上を満たすプローブを選択する工程Ｃをさらに含む、請求項１１又は１２記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブの設計方法。
［クライテリア１２］フォワードプライマーとプローブ、又はリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア１３］プローブの５’末端のヌクレオチドがＧでない；
［クライテリア１４］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間で、最も安定なダイマーを形成させた場合の自由エネルギーの変化が−７ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である；
［クライテリア１５］ヌクレオチド長が最も短い；
【請求項１４】
ヒトＡｌｕモデル配列が配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなる、請求項１１〜１３のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブの設計方法。
【請求項１５】
非ヒト生物がげっ歯類である、請求項１１〜１４のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブの設計方法。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブの設計方法により設計された、ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブ。
【請求項１７】
配列番号３７、３９、４２、４７若しくは１４９に示されるヌクレオチド配列；又は配列番号３７、３９、４２、４７若しくは１４９に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号３７、３９、４２、４７若しくは１４９に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列；からなるヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブ。
【請求項１８】
配列番号４２又は１４９に示されるヌクレオチド配列からなる、請求項１７記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブ。
【請求項１９】
プローブの５’末端が蛍光物質により、３’末端がクエンチャー物質によりそれぞれ標識されている、請求項１６〜１８のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブ。
【請求項２０】
請求項５〜８のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対と、請求項１６〜１９のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブとを備えた、ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー・プローブセット。
【請求項２１】
請求項２０記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー・プローブセットを用いて被験試料中のヒトゲノムＤＮＡを検出及び／又は定量する方法であって、以下の（Ｉ）〜（III）の工程を含む、方法。
（Ｉ）前記被験試料より抽出されたＤＮＡを鋳型として、前記プライマー・プローブセットを用いたリアルタイムＰＣＲを行う工程；
（II）既知量のヒトゲノムＤＮＡを段階希釈して調製された標準試料を鋳型として、上記工程（Ｉ）と同様の条件においてリアルタイムＰＣＲを行い、検量線を作成する工程；
（III）前記検量線から、前記被験試料中のヒトゲノムＤＮＡ量を算出する工程；
【請求項２２】
被験試料が、非ヒト動物にヒト細胞を移植して作製された異種移植モデル動物由来の生体試料、又は古人骨由来の陳旧試料である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項５〜８のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対及び／又は請求項１６〜１８のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブを備えた、ヒトゲノムＤＮＡ検出及び／又は定量用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対の設計方法や、それを用いて設計されたヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対や、該ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対を用いて被験試料中のヒトゲノムＤＮＡを検出及び／又は定量する方法等に関する。また、本発明は、ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブの設計方法や、それを用いて設計されたヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブや、該ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブ及び上記ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマーを用いて、被験試料中のヒトゲノムＤＮＡを検出及び／又は定量する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ａｌｕ配列は、レトロトランスポゾンであるＳＩＮＥ（short interspersed element）の一種であり、ヒトを含む霊長類のゲノムに特異的に存在する反復配列である。Ａｌｕ配列は、レフトモノマー及びライトモノマーと呼ばれる２つの７ＳＬ ＲＮＡ由来配列と、それらに挟まれたＡ−ｒｉｃｈ配列から構成されている。Ａｌｕ配列は霊長類のゲノムに特異的な配列であるが、その一部を構成する７ＳＬ ＲＮＡ由来配列はげっ歯類のゲノム中にも存在することが分かっている。また、最近の研究により、ヒトゲノム中のＡｌｕ配列は全てが同一の配列からなるものではなく、４６のサブファミリーからなることが明らかにされている（非特許文献１）。【０００３】
Ａｌｕ配列は、ヒトゲノム中に１００万コピー以上存在し、ヒトゲノムの１０％以上を占めることが知られている。ヒトゲノムの全長は約３０億ヌクレオチド対であることから、単純に計算すると、ヒトゲノムＤＮＡ３０００ヌクレオチド対につき平均１コピーのＡｌｕ配列が存在していることになる。重量に換算すると、一倍体のヒトゲノム全体の重さは３ｐｇであることから、０．００３ｆｇのヒトゲノムＤＮＡに平均１コピーのＡｌｕ配列が含まれると考えられる。このように、Ａｌｕ配列はごく微量のヒトゲノムＤＮＡにも必ず存在し、また、霊長類に特異的なヌクレオチド配列であることから、ヒト細胞の検出・定量のための理想的な標的であると考えられている。【０００４】
Ａｌｕ配列を標的とした定量リアルタイムＰＣＲ法（以下、「Ａｌｕ−ｑＰＣＲ」と称する場合がある）を用いてヒトゲノムを検出・定量する方法は、これまでに複数報告されている（例えば、特許文献１、非特許文献２等）。また、Ａｌｕ−ｑＰＣＲのためのキットとして、Innoquant（登録商標）（InnoGenomics Technologies 社製）や、Femto（登録商標）Human DNA Quantification Kit（ZYMO RESEARCH社製）が既に市販されている。さらに、Ａｌｕ−ｑＰＣＲを利用して、マウス等に異種移植したヒト幹細胞の生着・増殖の程度を確認できること（非特許文献３）、血中ＤＮＡ濃度を測定して癌の診断ができること（非特許文献４）、法医学分野で使用される陳旧試料中のヒトゲノムＤＮＡを検出できることが報告されている（非特許文献５）。【０００５】
しかし、これまでに報告されているＡｌｕ−ｑＰＣＲはいずれも十分な感度を持つものではない。すなわち、理論的には、リアルタイムＰＣＲにより０．１ｆｇ程度のヒトゲノムＤＮＡからＡｌｕを検出できるはずであるが、既知のＡｌｕ−ｑＰＣＲでは数ｐｇ以上のヒトゲノムＤＮＡが必要であるとされており（非特許文献５）、理論的な検出限界と比較して極めて低い感度しか得られていない。また、既知のＡｌｕ−ｑＰＣＲ用プライマーには、ヒト以外の生物種ゲノムの一部と同一のヌクレオチド配列が含まれており、他の生物種由来のゲノムＤＮＡとヒトゲノムＤＮＡとが混在したサンプルを用いた場合に、微量のＡｌｕを特異的に検出することは不可能であった。以上のことから、より高い感度と特異性を有するＡｌｕ−ｑＰＣＲの開発が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平８−１０５８８７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Wheeler et al., Nucleic Acids Res, 41, D70-82. 2013
【非特許文献２】McBride, C., Gaupp, D. and Phinney, D.G. (2003) Quantifying levels of transplanted murine and human mesenchymal stem cells in vivo by real-time PCR. Cytotherapy, 5, 7-18.
【非特許文献３】Terrovitis JV, Smith RR, Marban E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. (2010) Circ. Res. 106, 479-494.
【非特許文献４】Heitzer E, Ulz P., Geigl JB. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. (2015) Clin. Chem. 61, 112-123.
【非特許文献５】Lee SB, McCord B, Buel E. Advances in forensic DNA quantification: a review. (2014) Electrophoresis. 35, 3044-3052.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ヒトＡｌｕ配列を特異的に増幅することができ、さらに、プライマーダイマー（ホモダイマー及びヘテロダイマー）形成を最小限に抑え得るヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対、及び該ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対による増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブであって、さらに、上記プライマー対とプローブ間でのヘテロダイマー形成及びホモダイマー形成を最小限に抑え得るヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブを提供することにある。さらに、本発明の課題は、かかるヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対及びプローブを用いて、被験試料中のヒトゲノムＤＮＡを高感度に検出及び／又は定量する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行い、４６のヒトＡｌｕサブファミリーのコンセンサス配列を代表する一つの「ヒトＡｌｕモデル配列」を同定し、このＡｌｕモデル配列を用いてヒトゲノム中のＡｌｕ配列を最も多くカバーするプライマー・プローブセットの設計を試みた。まず、本発明者らは一般的なプライマー・プローブ設計プログラム（Ｐｒｉｍｅｒ３）を用いて、上記ヒトＡｌｕモデル配列からプライマー対及びプローブを設計したが、かかるプライマー対及びプローブを用いてＡｌｕ−ｑＰＣＲを行っても、従来技術と同程度の低い感度（検出限界値がヒトゲノムＤＮＡ数ｐｇ以上）しか得られなかった。
以上の結果から、本発明者らは、Ａｌｕを高感度に検出するためのプライマー・プローブを設計するためには、通常の設計プログラムでは不十分であると考え、独自のクライテリアを設定する必要があると考えた。当該技術分野においては、ＰＣＲプライマー及びプローブを設計するためのクライテリアは無数に報告されているが、本発明者らは自身のそれまでの経験に基づいて、以下のクライテリア１〜７をヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対の設計のために、以下のクライテリア８〜１５をヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブの設計のためにそれぞれ設けた。
［クライテリア１］フォワードプライマー及びリバースプライマー中の連続した１９ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；
［クライテリア２］フォワードプライマー及びリバースプライマーのヌクレオチド長がそれぞれ２０以上である；
［クライテリア３］少なくともプライマーの５’末端又は３’末端のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの５’末端がＧ又はＣでない場合は、５’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの３’末端がＧ又はＣでない場合は、３’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣである；
［クライテリア４］プライマーの３’末端から３番目までのヌクレオチド（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド）のうちの、少なくとも１つがＡ又はＴである；
［クライテリア５］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア６］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア７］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア８］プローブ中の連続した１９ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；
［クライテリア９］プローブのヌクレオチド長が２０以上である；
［クライテリア１０］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア１１］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア１２］フォワードプライマーとプローブ、又はリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア１３］プローブの５’末端のヌクレオチドがＧでない；
［クライテリア１４］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間で、最も安定なダイマーを形成させた場合の自由エネルギーの変化が−７ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である；
［クライテリア１５］ヌクレオチド長が最も短い；【００１０】
上記クライテリアを設定するにあたって、発明者らは、一般的なプライマー・プローブ設計において強く推奨されている２つの条件、すなわち、（１）プローブのＴｍ値はプライマーのＴｍ値より１０℃程度高く設計すること；（２）プライマーの３’末端はＴとしないこと；という条件（例えば、Apte, A. and Daniel, S. (2009) PCR primer design. Cold Spring Harb Protoc, 2009）を無視した。また、従来技術においては、Ａｌｕが霊長類特異的な配列であることから、プライマー及びプローブがヒト以外の生物のゲノムＤＮＡにハイブリダイズする可能性について全く考慮されていなかった。これに対して、本発明者らは、ヒト以外の生物のゲノムＤＮＡが混在する試料からもヒトＡｌｕを特異的に検出し得るプライマー対及びプローブを得るために、上記クライテリア１及び８を設けた。さらに、上記クライテリア３、７、及び１２はこれまでに報告のない、全く新しいクライテリアである。【００１１】
本発明者らは、上記クライテリア１〜７を用いて、一組のプライマー対（フォワードプライマー：ＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＴ（配列番号１８）、リバースプライマー：ＧＧＴＴＣＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣ（配列番号１９））、及び４つのプローブ（ＡＴＡＣＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣＣＧＧＧＣＧ（配列番号３７）、ＴＡＣＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣＣＧＧＧＣＧＴ（配列番号３９）、ＣＧＣＣＣＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＡＴ（配列番号４２）、ＡＣＧＣＣＣＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＡ（配列番号４７））を選択した。上述の通り、上記クライテリアは、一般的なプライマー・プローブ設計において強く推奨されている２つの条件を無視しており、その結果、実際に選択されたプローブのＴｍ値はフォワードプライマー及びリバースプライマーのＴｍ値と比較して１〜２℃低く、また、フォワードプライマーの３’末端はＴであった。【００１２】
さらに、本発明者らは、これらのプライマー対及びプローブを組み合わせてＡｌｕ−ｑＰＣＲを行い、その結果、（１）被験試料がヒトゲノムＤＮＡのみを含む場合には、０．１ｆｇ〜１０ｎｇの範囲のヒトゲノムＤＮＡを定量的に測定することが可能であること（２）被験試料がヒトゲノムＤＮＡとげっ歯類ゲノムＤＮＡとを含む場合には、１ｆｇ〜１０ｎｇの範囲のヒトゲノムＤＮＡを定量的に測定することが可能であること、（３）被験試料が断片化ヒトゲノムＤＮＡ（２０ｋｂｐ〜２５０ｂｐ）であっても、１０ｆｇ〜１０ｎｇの範囲で定量的な測定が可能であること、（４）被験試料が家畜・ペット動物由来ゲノムＤＮＡを含む場合でも、１０ｆｇ〜１０ｎｇの範囲のヒトゲノムＤＮＡを定量的に測定することが可能であること、（５）被験試料が陳旧試料（数百年前の古人骨由来の試料）であっても、１０ｆｇ〜１０ｎｇの範囲のヒトゲノムＤＮＡを定量的に測定することが可能であることを明らかにした。【００１３】
また、発明者らは、より高度に断片化されたヒトゲノムＤＮＡ（１００ｂｐ）の定量が可能なプライマー・プローブセットを設計するために上記クライテリア１〜１１を改良し、以下のプライマー用クライテリア１’〜７’及びプローブ用必須クライテリア８’〜１１’を設けた。
［クライテリア１’］フォワードプライマー及びリバースプライマー中の連続した１７以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；
［クライテリア２’］フォワードプライマー及びリバースプライマーのヌクレオチド長がそれぞれ１８以上である；
［クライテリア３’］少なくともプライマーの５’末端又は３’末端のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの５’末端がＧ又はＣでない場合は、５’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの３’末端がＧ又はＣでない場合は、３’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣである；
［クライテリア４’］プライマーの３’末端から３番目までのヌクレオチド（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド）のうちの、少なくとも１つがＡ又はＴである；
［クライテリア５’］フォワードプライマー同士、及びリバースプライマー同士の二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア６’］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア７’］フォワードプライマー同士、及びリバースプライマー同士の二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア８’］プローブ中の連続した１７以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；
［クライテリア９’］プローブのヌクレオチド長が１８以上である；
［クライテリア１０’］フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア１１’］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；【００１４】
本発明者らは、上記クライテリア１’〜７’を用いて、一組のプライマー対（フォワードプライマー：ＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧ（配列番号１２３）、リバースプライマー：ＧＴＣＴＣＧＣＴＣＴＧＴＣＧＣＣＣＡ（配列番号１４８））を選択し、さらに、上記クライテリア８’〜１１’と上記クライテリア１３、１５とを用いて、１つのプローブ（ＴＧＣＡＧＴＧＧＣＧＣＧＡＴＣＴＣＧ（配列番号１４９））を選択した。そして、本発明者らは、これらのプライマー対及びプローブを組み合わせてＡｌｕ−ｑＰＣＲを行い、その結果、１００ｂｐに断片化されたヒトゲノムＤＮＡにおいても、１０ｆｇ〜１０ｎｇの範囲での定量的な測定が可能であることを明らかにした。以上のように、発明者らは、独自のクライテリアにより設計されたヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー・プローブを用いて、理論的検出限界に近い感度（すなわち、従来技術と比較して数百倍以上の感度）を有するＡｌｕ−ｑＰＣＲが可能となることを見い出し、本発明を完成するに至った。【００１５】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなるヒトＡｌｕモデル配列の一部又は全部の領域を増幅することができるフォワードプライマー群及びリバースプライマー群から、［クライテリア１’］フォワードプライマー及びリバースプライマー中の連続した１７以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；［クライテリア２’］フォワードプライマー及びリバースプライマーのヌクレオチド長がそれぞれ１８以上である；［クライテリア３’］少なくともプライマーの５’末端又は３’末端のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの５’末端がＧ又はＣでない場合は、５’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの３’末端がＧ又はＣでない場合は、３’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣである；［クライテリア４’］プライマーの３’末端から３番目までのヌクレオチド（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド）のうちの、少なくとも１つがＡ又はＴである；［クライテリア５’］フォワードプライマー同士、及びリバースプライマー同士の二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；［クライテリア６’］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；［クライテリア７’］フォワードプライマー同士、及びリバースプライマー同士の二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；のクライテリア１’〜７’を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーを選択する工程Ａ’を含む、ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対の設計方法や、
（２）［クライテリア１］フォワードプライマー及びリバースプライマー中の連続した１９ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；［クライテリア２］フォワードプライマー及びリバースプライマーのヌクレオチド長がそれぞれ２０以上である；［クライテリア３］少なくともプライマーの５’末端又は３’末端のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの５’末端がＧ又はＣでない場合は、５’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの３’末端がＧ又はＣでない場合は、３’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣである；［クライテリア４］プライマーの３’末端から３番目までのヌクレオチド（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド）のうちの、少なくとも１つがＡ又はＴである；［クライテリア５］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；［クライテリア６］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；［クライテリア７］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；のクライテリア１〜７を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーを選択する工程Ａを含む、ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対の設計方法や、
（３）ヒトＡｌｕモデル配列が配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなる、上記（１）又は（２）記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対の設計方法や、
（４）非ヒト生物がげっ歯類である上記（１）〜（３）のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対の設計方法や、
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対の設計方法により設計されたヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対に関する。【００１６】
また、本発明は、
（６）以下の（ａ）又は（ａ’）のフォワードプライマー及び（ｂ）又は（ｂ’）のリバースプライマーにより構成される、ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対
（ａ）配列番号１８に示されるヌクレオチド配列；又は配列番号１８に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列；からなるフォワードプライマー；
（ａ’）配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列；又は配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列；からなるフォワードプライマー；
（ｂ）配列番号１９に示されるヌクレオチド配列；又は配列番号１９に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号１９に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列；からなるリバースプライマー；
（ｂ’）配列番号１４８に示されるヌクレオチド配列；又は配列番号１４８に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号１４８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列；からなるリバースプライマー；や、
（７）配列番号１８に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー、及び配列番号１９に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマーにより構成される、上記（６）記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対や、
（８）配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー、及び配列番号１４８に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマーにより構成される、上記（６）記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対や、
（９）被験試料より抽出されたＤＮＡを鋳型として、上記（５）〜（８）のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲを行う工程を含む、前記被験試料中のヒトゲノムＤＮＡを検出及び／又は定量する方法や、
（１０）被験試料が、非ヒト動物にヒト細胞を移植して作製された異種移植モデル動物由来の生体試料、又は古人骨由来の陳旧試料である、上記（９）記載の方法に関する。【００１７】
さらに、本発明は、
（１１）配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなるヒトＡｌｕモデル配列のうち、上記（５）〜（８）のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対により増幅される領域にハイブリダイズすることができるプローブの群から、［クライテリア８’］プローブ中の連続した１７以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；［クライテリア９’］プローブのヌクレオチド長が１８以上である；［クライテリア１０’］フォワードプライマーとプローブ及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；［クライテリア１１’］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；のクライテリア８’〜１１’を満たすプローブを選択する工程Ｂ’を含む、ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブの設計方法や、
（１２）［クライテリア８］プローブ中の連続した１９ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；［クライテリア９］プローブのヌクレオチド長が２０以上である；［クライテリア１０］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；［クライテリア１１］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；のクライテリア８〜１１を満たすプローブを選択する工程Ｂを含む、上記（１１）記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブの設計方法や、
（１３）工程Ｂにより複数のプローブが選択されたとき、［クライテリア１２］フォワードプライマーとプローブ、又はリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；［クライテリア１３］プローブの５’末端のヌクレオチドがＧでない；［クライテリア１４］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間で、最も安定なダイマーを形成させた場合の自由エネルギーの変化が−７ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である；［クライテリア１５］ヌクレオチド長が最も短い；のクライテリア１２〜１５の少なくとも１つ又は２つ以上を満たすプローブを選択する工程Ｃをさらに含む、上記（１１）又は（１２）記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブの設計方法や、
（１４）ヒトＡｌｕモデル配列が配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなる、上記（１１）〜（１３）のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブの設計方法や、
（１５）非ヒト生物がげっ歯類である、上記（１１）〜（１４）のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブの設計方法や、
（１６）上記（１１）〜（１５）のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブの設計方法により設計された、ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブに関する。【００１８】
また、本発明は、
（１７）配列番号３７、３９、４２、４７若しくは１４９に示されるヌクレオチド配列；又は配列番号３７、３９、４２、４７若しくは１４９に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号３７、３９、４２、４７若しくは１４９に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列；からなるヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブや、
（１８）配列番号４２又は１４９に示されるヌクレオチド配列からなる、請求項１７記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブや、
（１９）プローブの５’末端が蛍光物質により、３’末端がクエンチャー物質によりそれぞれ標識されている、上記（１６）〜（１８）のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブや、
（２０）上記（５）〜（８）のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対と、上記（１６）〜（１９）のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブとを備えた、ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー・プローブセットや、
（２１）上記（２０）記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー・プローブセットを用いて被験試料中のヒトゲノムＤＮＡを検出及び／又は定量する方法であって、（Ｉ）前記被験試料より抽出されたＤＮＡを鋳型として、前記プライマー・プローブセットを用いたリアルタイムＰＣＲを行う工程；（II）既知量のヒトゲノムＤＮＡを段階希釈して調製された標準試料を鋳型として、上記工程（Ｉ）と同様の条件においてリアルタイムＰＣＲを行い、検量線を作成する工程；（III）前記検量線から、前記被験試料中のヒトゲノムＤＮ
Ａ量を算出する工程；の（Ｉ）〜（III）の工程を含む方法や、
（２２）被験試料が、非ヒト動物にヒト細胞を移植して作製された異種移植モデル動物由来の生体試料、又は古人骨由来の陳旧試料である、上記（２１）記載の方法や、
（２３）上記（５）〜（８）のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対及び／又は上記（１６）〜（１８）のいずれかに記載のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブを備えた、ヒトゲノムＤＮＡ検出及び／又は定量用キットに関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、ヒトＡｌｕ配列を特異的且つ高感度に検出できるヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対及びプローブを提供することができる。また、かかるヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対及びプローブ用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲにより、条件の悪い試料（他生物ゲノムＤＮＡが多量に混在した試料や、ＤＮＡが高度の断片化された試料など）からでも、０．１〜１０ｆｇ程度のヒトゲノムＤＮＡを特異的に検出及び／又は測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＲＮａｓｅ Ａ及び／又はＲＮａｓｅ Ｔ１を用いて細胞から抽出された核酸に、ＤＮＡ及びＲＮＡがどのような割合で含まれるかを示す図である。図中、白カラムは、抽出されたサンプル中の核酸濃度（ＤＮＡ及びＲＮＡ濃度）を紫外線吸光度法により調べた結果を、黒カラムは、抽出されたサンプル中のＤＮＡ濃度をＰｉｃｏＧｒｅｅｎＤＮＡ定量法により調べた結果を、それぞれ示す。
【図２】McBrideのプライマー・プローブセットを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「Ｂｕｆ．」は、バッファーのみ（テンプレート１）を、「Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」はスタンダードサンプル（テンプレート３）に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量をそれぞれ示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が１ｆｇ〜１ｎｇの間で直線性が認められた。
【図３】McBrideのプライマー・プローブセットを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「Ｂｕｆ．」は、バッファーのみ（テンプレート１）を、「ｍｏｕｓｅ」はマウスゲノムＤＮＡ（テンプレート２）をそれぞれ示す。また、「Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」は、マウスゲノムＤＮＡを混合させたスタンダードサンプル（テンプレート４）に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が１ｐｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた。
【図４−１】Ａｌｕのマルチプルアライメントに基づいて作成された位置特異的スコアマトリックスを示す図である。
【図４−２】Ａｌｕのマルチプルアライメントに基づいて作成された位置特異的スコアマトリックスを示す図である。
【図４−３】Ａｌｕのマルチプルアライメントに基づいて作成された位置特異的スコアマトリックスを示す図である。
【図５】Ａｌｕモデル配列（配列番号５）を示す図である。
【図６】Ａｌｕモデル配列における、Ｐｒｉｍｅｒ３のフォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブのそれぞれの位置を示す図である。
【図７】Ｐｒｉｍｅｒ３のプライマー・プローブセットを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「Ｂｕｆ．」は、バッファーのみ（テンプレート１）を、「Ｍｏｕｓｅ」はマウスゲノムＤＮＡ（テンプレート２）をそれぞれ示す。また、「Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」は、マウスゲノムＤＮＡを混合させたスタンダードサンプル（テンプレート４）に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が１００ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた。
【図８】Ａｌｕモデル配列のポジション＃１〜＃２６４について、それぞれのポジションを開始点とする１９ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列がマウス、ラット、及びギニアピッグゲノム中にいくつ存在するか示す図である。図中、「Position#」はＡｌｕモデル配列中のポジション＃を、「Nucleotide」はＡｌｕモデル配列中の各ポジション＃におけるヌクレオチドの種類をそれぞれ示す。また、「Mouse Blast」、「Rat Blast」、及び「Guinea pig Blast」はそのポジション＃から連続する１９ヌクレオチドのヌクレオチド配列が、マウス、ラット、及びギニアピッグのゲノム中に何か所存在するかを示す。
【図９】Ｐｒｉｍｅｒ３のフォワードプライマー（配列番号６）及びリバースプライマー（配列番号７）において形成される二次構造を示す図である。
【図１０】McBrideのプライマー・プローブセット（フォワードプライマー；配列番号１、リバースプライマー；配列番号２、及びプローブ；配列番号３）の２分子間において形成される二次構造を示す図である。
【図１１】Ａｌｕモデル配列における、本発明のフォワードプライマーＦ１０、リバースプライマーＲ１、及びプローブＰ１６のそれぞれの位置を示す図である。
【図１２】本発明のプライマー・プローブセットＡ（フォワードプライマーＦ１０；配列番号１８、リバースプライマーＲ１；配列番号１９、及びプローブＰ１６；配列番号４２）の２分子間において形成される二次構造を示す図である。
【図１３】本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「Ｂｕｆ．」は、バッファーのみ（テンプレート１）を、「Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」はスタンダードサンプル（テンプレート３）に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量をそれぞれ示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が０．１ｆｇ〜１ｎｇの間で直線性が認められた。
【図１４】本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「Ｂｕｆ．」は、バッファーのみ（テンプレート１）を、「Ｍｏｕｓｅ」はマウスゲノムＤＮＡ（テンプレート２）をそれぞれ示す。また、「Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」は、マウスゲノムＤＮＡを混合させたスタンダードサンプル（テンプレート４）に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が１ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた。
【図１５】本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「Ｂｕｆ．」は、バッファーのみ（テンプレート１）を、「Ｒａｔ」はラットゲノムＤＮＡ（テンプレート５）をそれぞれ示す。また、「Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」は、ラットゲノムＤＮＡを混合させたスタンダードサンプル（テンプレート６）に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が１ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた。
【図１６】本発明のプライマー・プローブセットＣを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「Ｂｕｆ．」は、バッファーのみ（テンプレート１）を、「Ｒａｔ」はラットゲノムＤＮＡ（テンプレート５）をそれぞれ示す。また、「Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」は、ラットゲノムＤＮＡを混合させたスタンダードサンプル（テンプレート６）に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が１ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた。
【図１７】本発明のプライマー・プローブセットＤを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「Ｂｕｆ．」は、バッファーのみ（テンプレート１）を、「Ｒａｔ」はラットゲノムＤＮＡ（テンプレート５）をそれぞれ示す。また、「Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」は、ラットゲノムＤＮＡを混合させたスタンダードサンプル（テンプレート６）に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が１ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた。
【図１８】異種移植モデルマウスの肺に含まれるヒトゲノムＤＮＡを、本発明のプライマー・プローブセットＡを用いて定量した結果を示す図である。（ａ）は、０．５ｆｇ／μＬから５ｎｇ／μＬのヒトゲノムＤＮＡと、コントロールマウスの肺由来のゲノムＤＮＡと混合スタンダードサンプル（テンプレート８）を用いて作成した検量線を示す。また、（ｂ）は、上記検量線に基づいて、異種移植モデルマウスの肺全体に含まれるヒトＭＳＣの数を算出した結果を示す。
【図１９】異種移植モデルマウスの腎臓に含まれるヒトゲノムＤＮＡを、本発明のプライマー・プローブセットＡを用いて定量した結果を示す図である。（ａ）は、０．５ｆｇ／μＬから５ｎｇ／μＬのヒトゲノムＤＮＡと、コントロールマウスの腎臓由来のゲノムＤＮＡと混合スタンダードサンプル（テンプレート１１）を用いて作成した検量線を示す。また、（ｂ）は、上記検量線に基づいて、異種移植モデルマウスの腎臓全体に含まれるヒトＭＳＣの数を算出した結果を示す。
【図２０】異種移植モデルマウスの肝臓に含まれるヒトゲノムＤＮＡを、本発明のプライマー・プローブセットＡを用いて定量した結果を示す図である。（ａ）は、０．５ｆｇ／μＬから５ｎｇ／μＬのヒトゲノムＤＮＡと、コントロールマウスの肝臓由来のゲノムＤＮＡと混合スタンダードサンプル（テンプレート１１）を用いて作成した検量線を示す。また、（ｂ）は、上記検量線に基づいて、異種移植モデルマウスの肝臓全体に含まれるヒトＭＳＣの数を算出した結果を示す。
【図２１】腎皮膜下移植モデルマウスの腎臓に含まれるヒトゲノムＤＮＡを、本発明のプライマー・プローブセットを用いて定量し、かかる定量値に基づいて算出した、各マウス腎臓におけるヒト細胞の数を示す図である。横軸のcell数は、そのモデルマウスの腎臓に始めに移植したヒト細胞の数を表す。
【図２２】本発明のプライマー・プローブセットＡに含まれる連続する１６〜２０ヌクレオチドからなる配列が、様々な生物種（マウス、ラット、ギニアピッグ、クマ、ウシ、ウサギ、ニワトリ、ブタ、微生物）のゲノム中にいくつ存在するかを示す図である。図中、「１０１Ｆ」はフォワードプライマーＦ１０を、「２０６Ｒ」はリバースプライマーＲ１を、「１４４ＲＨ」はプローブＰ１６をそれぞれ示す。また、図中、「20」は上記プライマー及びプローブ中の連続する２０ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列（全長）が各生物種のゲノム中にいくつ存在するかを、「19」は上記プライマー及びプローブ中の連続する１９ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が各生物種のゲノム中にいくつ存在するかを、「18」は上記プライマー及びプローブ中の連続する１８ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が各生物種のゲノム中にいくつ存在するかを、「17」は上記プライマー及びプローブ中の連続する１７ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が各生物種のゲノム中にいくつ存在するかを、「16」は上記プライマー及びプローブ中の連続する１６ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列（全長）が各生物種のゲノム中にいくつ存在するかを、それぞれ示す。
【図２３】実施例１７において作製された断片化ヒトゲノムＤＮＡ（２０ｋｂｐ）の長さの分布を示す図である。
【図２４】実施例１７において作製された断片化ヒトゲノムＤＮＡ（１０００ｂｐ）の長さの分布を示す図である。
【図２５】実施例１７において作製された断片化ヒトゲノムＤＮＡ（２５０ｂｐ）の長さの分布を示す図である。
【図２６】本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「ネガティブコントロール」はバッファーのみ（テンプレート１）を、「ヒトゲノムＤＮＡ量（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」は２０ｋｂｐに断片化されたヒトゲノムＤＮＡを含むスタンダードサンプル（テンプレート１８）をそれぞれ示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が１０ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた。
【図２７】本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「ネガティブコントロール」はバッファーのみ（テンプレート１）を、「ヒトゲノムＤＮＡ量（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」は１０００ｂｐに断片化されたヒトゲノムＤＮＡを含むスタンダードサンプル（テンプレート１９）をそれぞれ示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が１０ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた。
【図２８】本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「ネガティブコントロール」はバッファーのみ（テンプレート１）を、「ヒトゲノムＤＮＡ量（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」は２５０ｂｐに断片化されたヒトゲノムＤＮＡを含むスタンダードサンプル（テンプレート２０）をそれぞれ示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が１０ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた。
【図２９】本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「ネガティブコントロール」はニワトリゲノムＤＮＡのみ（テンプレート２１）を、「ヒトゲノムＤＮＡ量（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」はニワトリゲノムＤＮＡとヒトゲノムＤＮＡとを混合させたスタンダードサンプル（テンプレート２２）に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が１ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた。
【図３０】本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「ネガティブコントロール」はブタゲノムＤＮＡのみ（テンプレート２３）を、「ヒトゲノムＤＮＡ量（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」はブタゲノムＤＮＡとヒトゲノムＤＮＡとを混合させたスタンダードサンプル（テンプレート２４）に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が１０ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた。
【図３１】本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「ネガティブコントロール」はウシゲノムＤＮＡのみ（テンプレート２５）を、「ヒトゲノムＤＮＡ量（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」はウシゲノムＤＮＡとヒトゲノムＤＮＡとを混合させたスタンダードサンプル（テンプレート２６）に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が１ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた。
【図３２】本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「ネガティブコントロール」はイヌゲノムＤＮＡのみ（テンプレート２７）を、「ヒトゲノムＤＮＡ量（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」はイヌゲノムＤＮＡとヒトゲノムＤＮＡとを混合させたスタンダードサンプル（テンプレート２８）に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が１０ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた。
【図３３】本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲにより得られた増幅曲線を示す図である。図中、「畑内−１７」は畑内１７号由来のサンプル（テンプレート３０）を、「畑内−２６」は畑内１７号由来のサンプル（テンプレート３１）を、「畑内−４５」は畑内４５号由来のサンプル（テンプレート３２）ををそれぞれ示す。
【図３４】本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「ネガティブコントロール」はバッファーのみ（テンプレート１）を、「ヒトゲノムＤＮＡ量（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」はヒトゲノムＤＮＡのみを含むスタンダードサンプル（テンプレート２９）それぞれを示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が１０ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた。
【図３５】本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲによって、古人骨中のヒトゲノムＤＮＡ量を定量した結果を示す図である。古人骨由来サンプル（テンプレート３０〜３２）の定量はduplicateで行い、Ｃｔ値の平均値からサンプル中のヒトゲノムＤＮＡ濃度を算出した。
【図３６】既知のプローブ法によるＡｌｕ−ｑＰＣＲ用ＰＣＲプライマー・プローブセットと、本発明との違いを示す図である。図中の「Type」欄における、「Ｆ」はフォワードプライマーを「Ｒ」はリバースプライマーを、「Ｈ」は加水分解プローブをそれぞれ示す。また、「クライテリア＃」欄は、既知の各プライマー・プローブ配列が本発明のクライテリア１〜７（プライマーに対して）及びクライテリア８〜１３（プローブに対して）を満たすか否かを示す（満たす場合は「Ｘ」、満たさない場合は空欄）。
【図３７】既知のプローブ法によるＡｌｕ−ｑＰＣＲ用ＰＣＲプライマー・プローブセットと、本発明との違いを示す図である。図中の「Type」欄における、「Ｆ」はフォワードプライマーを「Ｒ」はリバースプライマーを、「Ｈ」は加水分解プローブをそれぞれ示す。また、「Mouse」、「Rat」、及び「Guinea pig」欄の「０」は、既知の各プライマーに含まれる連続する２０ヌクレオチドからなる配列、又は全長配列（１９ヌクレオチド長以下）がマウス、ラット、及びギニアピッグのゲノム中にいくつ存在するかを示し、「−１」は、既知の各プライマーに含まれる連続する１９ヌクレオチドからなる配列、又は全長配列（１９ヌクレオチド長以下）がマウス、ラット、及びギニアピッグのゲノム中にいくつ存在するかを示し、「−２」は、既知の各プライマーに含まれる連続する１８ヌクレオチドからなる配列、又は全長配列（１８ヌクレオチド長以下）がマウス、ラット、及びギニアピッグのゲノム中にいくつ存在するかをそれぞれ示す。さらに、「Human」欄の「０」は、既知の各プライマーに含まれる連続する２０ヌクレオチドからなる配列、又は全長配列（１９ヌクレオチド長以下）がヒトのゲノム中にいくつ存在するかを示す。また、図中の「＊」はＴａｑＭａｎ−ＭＧＢ効果を考慮せずに算出したＴｍ値であることを示し、「＊＊」はラットゲノムデータベースＮＷ＿００７９０６６３７におけるポジション＃８０７〜１５６６の配列を含むヒット数を示す。
【図３８】既知のインターカレーター法によるＡｌｕ−ｑＰＣＲ用ＰＣＲプライマー・プローブセットと、本発明との違いを示す図である。図中の「Type」欄における、「Ｆ」はフォワードプライマーを「Ｒ」はリバースプライマーをそれぞれ示す。「クライテリア」欄は、既知の各プライマー配列が本発明のクライテリア１〜７を満たすか否かを示す（満たす場合は「Ｘ」、満たなない場合は空欄）。また、「Mouse」、「Rat」、及び「Guinea pig」欄の「０」は、既知の各プライマーに含まれる連続する２０ヌクレオチドからなる配列、又は全長配列（１９ヌクレオチド長以下）がマウス、ラット、及びギニアピッグのゲノム中にいくつ存在するかを示し、「−１」は、既知の各プライマーに含まれる連続する１９ヌクレオチドからなる配列、又は全長配列（１９ヌクレオチド長以下）がマウス、ラット、及びギニアピッグのゲノム中にいくつ存在するかを示し、「−２」は、既知の各プライマーに含まれる連続する１８ヌクレオチドからなる配列、又は全長配列（１８ヌクレオチド長以下）がマウス、ラット、及びギニアピッグのゲノム中にいくつ存在するかをそれぞれ示す。さらに、「Human」欄の「０」は、既知の各プライマーに含まれる連続する２０ヌクレオチドからなる配列、又は全長配列（１９ヌクレオチド長以下）がヒトのゲノム中にいくつ存在するかを示す。
【図３９】Ａｌｕモデル配列のポジション＃１〜＃２６６について、それぞれのポジションを開始点とする１８ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列がマウス、ラット、及びギニアピッグゲノム中にいくつ存在するか示す図である。図中、「Position」はＡｌｕモデル配列中のポジション＃を示す。また、「Mouse Blast」、「Rat Blast」、及び「Guinea pig Blast」はそのポジション＃から連続する１８ヌクレオチドのヌクレオチド配列が、マウス、ラット、及びギニアピッグのゲノム中に何か所存在するかを示す。
【図４０】Ａｌｕモデル配列のポジション＃１〜＃２６６について、それぞれのポジションを開始点とする１７ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列がマウス、ラット、及びギニアピッグゲノム中にいくつ存在するか示す図である。図中、「Position」はＡｌｕモデル配列中のポジション＃を示す。また、「Mouse Blast」、「Rat Blast」、及び「Guinea pig Blast」はそのポジション＃から連続する１７ヌクレオチドのヌクレオチド配列が、マウス、ラット、及びギニアピッグのゲノム中に何か所存在するかを示す。
【図４１】本発明のフォワードプライマーＦ３４’（配列番号１２３）及びリバースプライマーＲ２０’（配列番号１４８）において形成されるプライマーダイマーの二次構造を示す図である。
【図４２】実施例２２において作製された断片化ヒトゲノムＤＮＡ（１００ｂｐ）の長さの分布を示す図である。
【図４３】本発明のプライマー・プローブセットＥを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの結果を示す図である。図中の「ネガティブコントロール」はバッファーのみ（テンプレート１）を、「ヒトゲノムＤＮＡ量（Ｌｏｇ１０ｐｇ）」は１００ｂｐに断片化されたヒトゲノムＤＮＡを含むスタンダードサンプル（テンプレート３３）をそれぞれ示す。各ヒトゲノムＤＮＡ量におけるＣｔ値に基づいて検量線を作成した結果、ヒトゲノムＤＮＡの量が１０ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（本発明のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対の設計方法）
本発明の「ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対の設計方法」（以下、単に「本発明のプライマー対設計方法」とも称する）としては、配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなるヒトＡｌｕモデル配列の一部又は全部の領域を増幅することができるフォワードプライマー群及びリバースプライマー群から、以下のクライテリア１’〜７’を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーを選択する工程Ａ’を含むものであれば特に制限されない。
［クライテリア１’］フォワードプライマー及びリバースプライマー中の連続した１７以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；
［クライテリア２’］フォワードプライマー及びリバースプライマーのヌクレオチド長がそれぞれ１８以上である；
［クライテリア３’］少なくともプライマーの５’末端又は３’末端のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの５’末端がＧ又はＣでない場合は、５’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの３’末端がＧ又はＣでない場合は、３’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣである；
［クライテリア４’］プライマーの３’末端から３番目までのヌクレオチド（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド）のうちの、少なくとも１つがＡ又はＴである；
［クライテリア５’］フォワードプライマー同士、及びリバースプライマー同士の二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア６’］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア７’］フォワードプライマー同士、及びリバースプライマー同士の二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
【００２２】
上記本発明のプライマー対設計方法の特に好適な例としては、以下のクライテリア１〜７を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーを選択する工程Ａを含むものを挙げることができる。
［クライテリア１］フォワードプライマー及びリバースプライマー中の連続した１９ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；
［クライテリア２］フォワードプライマー及びリバースプライマーのヌクレオチド長がそれぞれ２０以上である；
［クライテリア３］少なくともプライマーの５’末端又は３’末端のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの５’末端がＧ又はＣでない場合は、５’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの３’末端がＧ又はＣでない場合は、３’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣである；
［クライテリア４］プライマーの３’末端から３番目までのヌクレオチド（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド）のうちの、少なくとも１つがＡ又はＴである；
［クライテリア５］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア６］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア７］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
【００２３】
上記「ヒトＡｌｕモデル配列」としては、配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなるものであれば特に制限されないが、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるものが特に好ましい。また、上記本発明のプライマー対設計方法においては、常法にしたがって「ヒトＡｌｕモデル配列の一部又は全部の領域を増幅することができるフォワードプライマー群」（以下、単に「フォワードプライマー群」とも称する）、及び「ヒトＡｌｕモデル配列の一部又は全部の領域を増幅することができるリバースプライマー群」（以下、単に「リバースプライマー群」とも称する）を選定することができる。具体的には、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３、ProbeFinder Software、ＣＯＤＥＨＯＰ、Gene Finder等の公知のプライマー設計プログラムに、配列番号５に示されるヌクレオチド配列の一部又は全部を入力することにより、上記「フォワードプライマー群」及び上記「リバースプライマー群」を選定することができる。
【００２４】
上記「工程Ａ’」としては、上記「フォワードプライマー群」及び「リバースプライマー群」の中からクライテリア１’〜７’の全てを満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーを選定する工程であれば特に制限されず、上記「フォワードプライマー群」及び上記「リバースプライマー群」にクライテリア１’〜７’をどのような順序で適用させてもよいが、クライテリア１’〜７’を順次適用させて選定する工程であることが好ましい。具体的には、上記「工程Ａ’」の例としては、上記「フォワードプライマー群」及び上記「リバースプライマー群」を構成するそれぞれのプライマーがクライテリア１’〜４’を満たすか否かを判定し、クライテリア１’〜４’を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーがそれぞれ一つずつであった場合には、その１対の組合せについてクライテリア５’〜７’を満たすか否かを判定し、また、クライテリア１’〜４’を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーが複数であった場合には、全てのフォワードプライマー及びリバースプライマーの組合せについてクライテリア５’〜７’を満たすか否かを判定する工程を挙げることができる。
また、上記「工程Ａ」としては、上記「フォワードプライマー群」及び「リバースプライマー群」の中からクライテリア１〜７の全てを満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーを選定する工程であれば特に制限されず、上記「フォワードプライマー群」及び上記「リバースプライマー群」にクライテリア１〜７をどのような順序で適用させてもよいが、クライテリア１〜７を順次適用させて選定する工程であることが好ましい。具体的には、上記「工程Ａ」の例としては、上記「フォワードプライマー群」及び上記「リバースプライマー群」を構成するそれぞれのプライマーがクライテリア１〜４を満たすか否かを判定し、クライテリア１〜４を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーがそれぞれ一つずつであった場合には、その１対の組合せについてクライテリア５〜７を満たすか否かを判定し、また、クライテリア１〜４を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーが複数であった場合には、全てのフォワードプライマー及びリバースプライマーの組合せについてクライテリア５〜７を満たすか否かを判定する工程を挙げることができる。
【００２５】
上記クライテリア１’を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、それぞれのプライマーに含まれる連続した１７以上ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しないものであれば特に制限されず、また、上記クライテリア１を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、それぞれのプライマーに含まれる連続した１９ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しないものであれば特に制限されない。ここで、上記「非ヒト生物」としては、ヒトＡｌｕ検出の対象となる被験試料中にその一部が混入し得るヒト以外の生物であれば特に制限されず、ヒト以外の動物、植物、細菌、原生生物、ウイルス等のどのような生物であってもよいが、ヒト以外の哺乳動物であることが好ましく、げっ歯類動物であることがさらに好ましい。具体的には、上記「非ヒト生物」の例としては、マウス、ラット、ギニアピッグ、イヌ、ウサギ、ニワトリ、ウマ、ウシ、ネコ、クマ、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、メダカ、トラフグ、ホヤ、ヤツメウナギ、線虫、ウニ、プラナリア、シロイヌナズナ、イネ、コムギ、タバコ、ショウジョウバエ、カイコ、ミツバチ、大腸菌、枯草菌、藍藻などを挙げることができるが、なかでも、マウス、ラット、及びギニアピッグ等のげっ歯類動物を好ましく挙げることができる。
【００２６】
また、上記クライテリア１’を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーを選定する方法としては、具体的には、配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ等）及びホモロジーサーチ用ソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ（登録商標）等）などを利用する方法を例示することができる。このようなホモロジーサーチによって、上記「非ヒト生物」のゲノム中に、上記「ヒトＡｌｕモデル配列」に含まれる連続する１７ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列がいくつ存在するかを知ることができる。また、かかるホモロジーサーチの結果を上記「ヒトＡｌｕモデル配列」にマッピングすることにより、クライテリア１’を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計可能なヒトＡｌｕモデル配列中の領域を特定し、この情報に基づいて、クライテリア１’を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーを選定することができる。同様に、上記クライテリア１を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーを選定する方法としては、具体的には、配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ等）及びホモロジーサーチ用ソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ（登録商標）等）などを利用する方法を例示することができる。このようなホモロジーサーチによって、上記「非ヒト生物」のゲノム中に、上記「ヒトＡｌｕモデル配列」に含まれる連続する１９ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列がいくつ存在するかを知ることができる。また、かかるホモロジーサーチの結果を上記「ヒトＡｌｕモデル配列」にマッピングすることにより、クライテリア１を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計可能なヒトＡｌｕモデル配列中の領域を特定し、この情報に基づいて、クライテリア１を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーを選定することができる。
【００２７】
上記クライテリア２’を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、それぞれのヌクレオチド長が１８以上のものであれば特に制限されないが、例えば、フォワードプライマー及びリバースプライマーのそれぞれが、２０〜６０ヌクレオチド長、より好ましくは２０〜４０ヌクレオチド長、さらに好ましくは２０〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは２０〜２５ヌクレオチド長、さらに好ましくは２０〜２３ヌクレオチド長、より好ましくは２０ヌクレオチド長、さらに好ましくは１９ヌクレオチド長、より好ましくは１８ヌクレオチド長のプライマー対を挙げることができる。プライマーは同じヌクレオチド長であってもよいし、異なるヌクレオチド長であってもよい。また、上記クライテリア２を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、それぞれのヌクレオチド長が２０以上のものであれば特に制限されないが、例えば、フォワードプライマー及びリバースプライマーのそれぞれが、２０〜６０ヌクレオチド長、より好ましくは２０〜４０ヌクレオチド長、さらに好ましくは２０〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは２０〜２５ヌクレオチド長、さらに好ましくは２０〜２３ヌクレオチド長、より好ましくは２０ヌクレオチド長のプライマー対を挙げることができる。プライマー対において、フォワードプライマーとリバースプライマーは同じヌクレオチド長であってもよいし、異なるヌクレオチド長であってもよい。
【００２８】
上記クライテリア３’及び３を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、それぞれのプライマーの少なくとも５’末端又は３’末端のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの５’末端がＧ又はＣでない場合は、５’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの３’末端がＧ又はＣでない場合は、３’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣであれば特に制限されないが、プライマーの５’末端及び３’末端のヌクレオチドがＧ又はＣであることがさらに好ましい。
【００２９】
上記クライテリア４’及び４を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、それぞれプライマーの３’末端から３番目までのヌクレオチド（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド）のうちの、少なくとも１つがＡ又はＴであれば特に制限されないが、プライマーの３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列のうちの、２つがＡ又はＴであることがさらに好ましい。
【００３０】
上記クライテリア５’を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、フォワードプライマー同士、及びリバースプライマー同士の二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まないものであれば特に制限されず、また、上記クライテリア５を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まないものであれば特に制限されない。さらに、上記クライテリア６’及び６を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まないものであれば特に制限されずない。また、上記クライテリア７’を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、フォワードプライマー同士、及びリバースプライマー同士の二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まないものであれば特に制限されず、上記クライテリア７を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まないものであれば特に制限されない。上記クライテリア５’〜７’又は５〜７を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーの選定方法としては、特に制限されないが、例えば、「http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html」からダウンロードできるRNAstructure、「http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/dna/form1.cgi」からダウンロードできるmfold等の公知のプログラムにより、フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において形成される二次構造を予測し、その結果に基づいてフォワードプライマー及びリバースプライマーが上記クライテリア５’〜７’又は５〜７を満たすか否かを判定する方法を好ましく挙げることができる。
【００３１】
（本発明のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対）
本発明の「ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー対」（以下、単に「本発明のプライマー対」とも称する）としては、上記本発明のプライマー対設計方法により設計されたものであれば特に制限されないが、具体的には、以下の（ａ）又は（ａ’）のフォワードプライマー及び（ｂ）又は（ｂ’）のリバースプライマーにより構成されるプライマー対を好適に例示することができる。
（ａ）配列番号１８に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー、又は配列番号１８に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチド、好ましくは１７ヌクレオチド、より好ましくは１８ヌクレオチド、さらに好ましくは１９ヌクレオチド、より好ましくは２０ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー；
（ａ’）配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列；又は配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチド、好ましくは１７ヌクレオチド、より好ましくは１８ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列；からなるフォワードプライマー；
（ｂ）配列番号１９に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマー、又は配列番号１９に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチド、好ましくは１７ヌクレオチド、より好ましくは１８ヌクレオチド、さらに好ましくは１９ヌクレオチド、より好ましくは２０ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号１９に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチド（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）が欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列からなるリバースプライマー；
（ｂ’）配列番号１４８に示されるヌクレオチド配列；又は配列番号１４８に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチド、好ましくは１７ヌクレオチド、より好ましくは１８ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号１４８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列；からなるリバースプライマー；
【００３２】
上記本発明のプライマー対としては、上記フォワードプライマーと、上記リバースプライマーとをどのように組み合わせてもよく、上記（ａ）のフォワードプライマーと上記（ｂ）のリバースプライマーの組合せ、上記（ａ’）のフォワードプライマーと上記（ｂ’）のリバースプライマーの組合せ、上記（ａ）のフォワードプライマーと上記（ｂ’）のリバースプライマーの組合せ、上記（ａ’）のフォワードプライマーと上記（ｂ）のリバースプライマーの組合せのいずれのプライマー対であってもよいが、なかでも、上記（ａ’）のフォワードプライマーと上記（ｂ’）のリバースプライマーの組合せ、又は上記（ａ）のフォワードプライマーと上記（ｂ’）のリバースプライマーの組合せを特に好適に例示することができる。なかでも、上記本発明のプライマー対としては、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー、及び配列番号１９に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマーにより構成されるプライマー対、又は配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー、及び配列番号１４８に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマーにより構成されるプライマー対を特に好適に例示することができる。以下の実施例１６に示すように、配列番号１８及び１９に示されるヌクレオチド配列中に含まれる１６ヌクレオチド以上の連続するヌクレオチド配列は、マウス、ラット、ギニアピッグ、クマ、ウシ、ウサギ、ニワトリ、ブタ、及び微生物のいずれのゲノム中にも殆ど存在しないことが確認されている。したがって、上記（ａ）に記載の「配列番号１８に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー」、及び（ｂ）に記載の「配列番号１９に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号１９に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列からなるリバースプライマー」からなるプライマー対は、ヒトＡｌｕ配列を特異的に増幅することができる。
【００３３】
（本発明のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブの設計方法）
本発明の「ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブの設計方法」（以下、単に「本発明のプローブ設計方法」とも称する）としては、配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなるヒトＡｌｕモデル配列のうち、上記本発明のプライマー対により増幅される領域にハイブリダイズすることができるプローブの群から、以下のクライテリア８’〜１１’を満たすプローブを選択する工程Ｂ’を含むものであれば特に制限されない。
［クライテリア８’］プローブ中の連続した１７以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；
［クライテリア９’］プローブのヌクレオチド長が１８以上である；
［クライテリア１０’］フォワードプライマーとプローブ及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア１１’］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
【００３４】
上記本発明のプローブ設計方法の特に好適な例としては、以下のクライテリア８〜１１を満たすプローブを選択する工程Ａを含むものを挙げることができる。
［クライテリア８］プローブ中の連続した１９ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；
［クライテリア９］プローブのヌクレオチド長が２０以上である；
［クライテリア１０］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア１１］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
【００３５】
また、本発明のプローブ設計方法は、上記工程Ｂ’又はＢにより複数のプローブが選択されたとき、さらに以下のクライテリア１２〜１５の少なくとも１つ又は２つ以上を満たすプローブ選択する工程Ｃをさらに含むものであってもよい。
［クライテリア１２］フォワードプライマーとプローブ、又はリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア１３］プローブの５’末端のヌクレオチドがＧでない；
［クライテリア１４］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間で、最も安定なダイマーを形成させた場合の自由エネルギーの変化が−７ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である；
［クライテリア１５］ヌクレオチド長が最も短い；
【００３６】
上記「本発明のプローブ設計方法」における「フォワードプライマー」及び「リバースプライマー」とは、上記本発明のプライマー対を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーをそれぞれ意味する。また、上記「ヒトＡｌｕモデル配列」としては、配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなるものであれば特に制限されないが、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるものが特に好ましい。さらに、上記本発明のプローブ設計方法においては、常法にしたがって「上記本発明のプライマー対により増幅される領域にハイブリダイズすることができるプローブの群」（以下、単に「プローブの群」とも称する）を選定することができる。具体的には、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３、ProbeFinder Software、ＣＯＤＥＨＯＰ、Gene Finder等の公知のプライマー設計プログラムに、上記本発明のプライマー対により増幅される領域のヌクレオチド配列の一部又は全部を入力することにより得られるプローブ、及び該プローブに相補的なヌクレオチド配列からなるプローブを、上記「プローブの群」として選定することができる。
【００３７】
上記「工程Ｂ’」としては、上記「プローブの群」からクライテリア８’〜１１’を満たすプローブを選択する工程であれば特に制限されないが、上記「プローブの群」にクライテリア８’〜１１’を順次適用させて選択する工程であることが好ましい。また、上記「工程Ｂ」としては、上記「プローブの群」からクライテリア８〜１１を満たすプローブを選択する工程であれば特に制限されないが、上記「プローブの群」にクライテリア８〜１１を順次適用させて選択する工程であることが好ましい。
【００３８】
上記「工程Ｃ」としては、クライテリア８’〜１１’を満たす複数のプローブから、上記クライテリア１２〜１５の少なくとも１つ又は２つ以上を満たすプローブを選択する工程であれば特に制限されず、プローブの使用目的や標識方法、選択されたプローブの数等に応じて、上記クライテリア１２〜１５から選択される１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ、さらに好ましくは４つのクライテリアを使用することができるが、クライテリア８’〜１１’を満たす複数のプローブから、上記クライテリア１３、１５を満たすプローブを選択する工程を特に好ましく例示することができる。また、上記「工程Ｃ」としては、クライテリア８〜１１を満たす複数のプローブから、上記クライテリア１２〜１５の少なくとも１つ又は２つ以上を満たすプローブを選択する工程であってもよく、上記クライテリア１２〜１５から選択される１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ、さらに好ましくは４つのクライテリアを使用することができるが、クライテリア８〜１１を満たす複数のプローブから、上記クライテリア１２〜１５の全てを満たすプローブを選択する工程を特に好ましく例示することができる。上記「工程Ｃ」において上記クライテリア１２〜１５から選択される２つ以上を用いる場合には、どのような順序でクライテリアを用いてもよい。
【００３９】
上記クライテリア８’を満たすプローブとしては、プローブ中の連続した１７ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しないものであれば特に制限されず、ここで、上記「非ヒト生物」とは、上記クライテリア１’における「非ヒト生物」と同様のものを指す。また、上記クライテリア８’を満たすプローブを選定する方法としては、具体的には、配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ等）及びホモロジーサーチ用ソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ（登録商標）等）などを利用する方法を例示することができる、このようなホモロジーサーチによって、上記「非ヒト生物」のゲノム中に、上記「ヒトＡｌｕモデル配列」に含まれる連続する１７ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列がいくつ存在するかを知ることができる。また、かかるホモロジーサーチの結果を上記「ヒトＡｌｕモデル配列」にマッピングすることにより、クライテリア８’を満たすプローブを設計可能なヒトＡｌｕモデル配列中の領域を特定し、この情報に基づいて、クライテリア８’を満たすプローブを選定することができる。同様に、上記クライテリア８を満たすプローブとしては、プローブ中の連続した１９ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しないものであれば特に制限されず、上記クライテリア８を満たすプローブを選定する方法としては、具体的には、配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ等）及びホモロジーサーチ用ソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ（登録商標）等）などを利用する方法を例示することができる、このようなホモロジーサーチによって、上記「非ヒト生物」のゲノム中に、上記「ヒトＡｌｕモデル配列」に含まれる連続する１９ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列がいくつ存在するかを知ることができる。また、かかるホモロジーサーチの結果を上記「ヒトＡｌｕモデル配列」にマッピングすることにより、クライテリア８を満たすプローブを設計可能なヒトＡｌｕモデル配列中の領域を特定し、この情報に基づいて、クライテリア８を満たすプローブを選定することができる。
【００４０】
上記クライテリア９’を満たすプローブとしては、ヌクレオチド長が１８以上のものであれば特に制限されないが、例えば、２０〜６０ヌクレオチド長、より好ましくは２０〜４０ヌクレオチド長、さらに好ましくは２０〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは２０〜２５ヌクレオチド長、さらに好ましくは２０〜２３ヌクレオチド長、より好ましくは２０ヌクレオチド長、さらに好ましくは１９ヌクレオチド長、より好ましくは１８ヌクレオチド長のプローブを挙げることができる。また、上記クライテリア９を満たすプローブとしては、ヌクレオチド長が２０以上のものであれば特に制限されないが、例えば、２０〜６０ヌクレオチド長、より好ましくは２０〜４０ヌクレオチド長、さらに好ましくは２０〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは２０〜２５ヌクレオチド長、さらに好ましくは２０〜２３ヌクレオチド長、より好ましくは２０ヌクレオチド長のプローブを挙げることができる。
【００４１】
上記クライテリア１０’を満たすプローブとしては、フォワードプライマーとプローブの組合せ、及びリバースプライマーとプローブの組合せのそれぞれの組合せの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まないものであれば特に制限されず、上記クライテリア１０を満たすプローブとしては、プローブ同士の組合せ、フォワードプライマーとプローブの組合せ、及びリバースプライマーとプローブの組合せのそれぞれの組合せの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まないものであれば特に制限されない。また、上記クライテリア１１’又は１１を満たすプローブとしては、プローブ同士の組合せ、フォワードプライマーとプローブの組合せ、及びリバースプライマーとプローブの組合せのそれぞれの組合せの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まないものであれば特に制限されない。上記クライテリア１０’、１０、１１’、又は１１を満たすプローブの選定方法としては、特に制限されないが、例えば、RNAstructure、Mfold等の公知のプログラムにより、プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、又はリバースプライマーとプローブの二分子間において形成される二次構造を予測し、その結果に基づいてプローブが、上記クライテリア１０’、１０、１１’、又は１１を満たすか否かを判定する方法を好ましく挙げることができる。
【００４２】
さらに、上記クライテリア１２を満たすプローブとしては、フォワードプライマーとプローブの組合せ、又はリバースプライマーとプローブの組合せのそれぞれの組合せの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まないものであれば特に制限されず、上記クライテリア１２を満たすプローブの選定方法としては、特に制限されないが、例えば、RNAstructure、Mfold等の公知のプログラムにより、フォワードプライマーとプローブ、又はリバースプライマーとプローブの二分子間において形成される二次構造を予測し、その結果に基づいてプローブが上記クライテリア１２を満たすか否かを判定する方法を好ましく挙げることができる。
【００４３】
上記クライテリア１３を満たすプローブとしては、プローブの５’末端のヌクレオチドがＧでないものであれば特に制限されず、具体的には、プローブの５’末端のヌクレオチドがＡ、Ｔ、又はＣであるプローブを挙げることができる。このクライテリアを満たすプローブは、その５’末端を蛍光物質により標識したときに、Ｇによるクエンチングを回避することができる。したがって、加水分解プローブや分子ビーコンプローブとしての使用が想定されるプローブを選択する場合には、上記クライテリア１３を満たすプローブを選択することが好ましい。
【００４４】
上記クライテリア１４を満たすプローブとしては、プローブ同士の組合せ、フォワードプライマーとプローブの組合せ、及びリバースプライマーとプローブの組合せのそれぞれの組合せの二分子間のそれぞれで、最も安定なダイマーを形成させた場合の自由エネルギーの変化が−７ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、好ましくは−６．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、より好ましくは−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、さらに好ましくは−６．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、より好ましくは−６．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、さらに好ましくは−５．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、より好ましくは−５．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、さらに好ましくは−５．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、より好ましくは−５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、さらに好ましくは−４．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、より好ましくは−４．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、さらに好ましくは−４．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、より好ましくは−４．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上のものであれば特に制限されない。ここで、上記「自由エネルギーの変化」は、プローブ同士の組合せ、フォワードプライマーとプローブの組合せ、及びリバースプライマーとプローブの組合せのそれぞれの組合せにおける二分子間でそれぞれ異なるものであってもよい。上記クライテリア１４を満たすプローブの選択方法としては、特に制限されないが、例えば、RNAstructure、Mfold等の公知のプログラムにより、プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、又はリバースプライマーとプローブの二分子間において形成される二次構造を予測し、最も安定なダイマーを形成させた場合の自由エネルギーの変化（ΔＧ°）を算出して、プローブが上記クライテリア１４を満たすか否かを判定する方法を好ましく挙げることができる。
【００４５】
上記クライテリア１５を満たすプローブとしては、選択対象となる複数のプローブのヌクレオチド長を比較したときに、ヌクレオチド長が最も短いものであれば特に制限されない。
【００４６】
（本発明のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブ）
本発明の「ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプローブ」（以下、単に「本発明のプローブ」とも称する）としては、上記本発明のプローブ設計方法により設計されたものであれば特に制限されないが、具体的には、配列番号３７、３９、４２、４７若しくは１４９に示されるヌクレオチド配列からなるプローブ、又は配列番号３７、３９、４２、４７若しくは１４９に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する１６ヌクレオチド好ましくは１７ヌクレオチド、より好ましくは１８ヌクレオチド、さらに好ましくは１９ヌクレオチド、より好ましくは２０ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号３７、３９、４２、４７若しくは１４９に示されるヌクレオチド配列において１若しくは数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列からなるプローブを好適に例示することができるが、なかでも、配列番号３７、３９、４２、４７若しくは１４９に示されるヌクレオチド配列からなるプローブであることが好ましく、配列番号４２又は１４９に示されるヌクレオチド配列からなるプローブであることがさらに好ましい。
【００４７】
上記本発明のプローブは、上記本発明のプライマー対による増幅産物を検出及び／又は定量するために標識物質で標識されていることが好ましく、より迅速又はより高感度で検出又は定量する観点から、蛍光物質で標識されていることが好ましい。蛍光物質以外の上記標識物質としては、ビオチン、ビオチンとアビジンの複合体、あるいはペルオキシダーゼ等の酵素が挙げられ、上記蛍光物質としては、ルシフェラーゼ等の蛍光タンパク質のほか、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＨＥＸ（４，７，２’，４’，５，’，７’−ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）等の蛍光色素が好ましく挙げられる。また、上記本発明のプローブは、蛍光物質（レポーター蛍光色素）とクエンチャー物質（クエンチャー蛍光色素）で二重標識されていることがより好ましく、蛍光物質（レポーター蛍光色素）により５’末端が、クエンチャー物質（クエンチャー蛍光色素）により３’末端がそれぞれ標識されていることが特に好ましい。蛍光物質（レポーター蛍光色素）の例としては前述の蛍光色素が挙げられ、クエンチャー物質（クエンチャー蛍光色素）の例としては、６‐カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）等のローダミン系蛍光色素や、ＢＨＱ−１（［（４−（２−ニトロ−４−メチル−フェニル）−アゾ）−イル−（（２−メトキシ−５−メチル−フェニル）−アゾ）］−アニリン）、ＢＨＱ−２（［（４−（１−ニトロ−フェニル）−アゾ）−イル−（（２，５−ジメトキシ−フェニル）−アゾ）］−アニリン）等のブラックホールクエンチャーが挙げられるが、なかでも、蛍光物質（レポーター蛍光色素）として６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）を、クエンチャー物質（クエンチャー蛍光色素）としてＢＨＱ−１（［（４−（２−ニトロ−４−メチル−フェニル）−アゾ）−イル−（（２−メトキシ−５−メチル−フェニル）−アゾ）］−アニリン）を特に好適に例示することができる。
【００４８】
（本発明のヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー・プローブセット）
本発明の「ヒトＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー・プローブセット」（以下、単に「本発明のプライマー・プローブセット」とも称する）としては、上記本発明のプライマー対及び上記本発明のプローブを備えたものであれば特に制限されないが、（１）配列番号１８に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマーと配列番号１９に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマーにより構成される本発明のプライマー対、及び配列番号３７、３９、４２、又は４７に示されるヌクレオチド配列からなる本発明のプローブを備えたもの；（２）配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４８に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマーにより構成される本発明のプライマー対、及び配列番号１４９に示されるヌクレオチド配列からなる本発明のプローブを備えたもの；（３）配列番号１８に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４８に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマーにより構成される本発明のプライマー対、及び配列番号３７、３９、４２、４７、又は１４９に示されるヌクレオチド配列からなる本発明のプローブを備えたもの；
（１）〜（３）のいずれかであることが好ましく、なかでも、（４）配列番号１８に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー、及び配列番号１９に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマーにより構成される本発明のプライマー対、及び配列番号４２に示されるヌクレオチド配列からなる本発明のプローブを備えたもの；又は、上記（２）であることがさらに好ましい。また、本発明のプライマー・プローブセットは、本発明のプライマー対と、２つ以上の本発明のプローブとを備えたものであってもよく、例としては、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマーと配列番号１９に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマーにより構成される本発明のプライマー対、及び配列番号３７、３９、４２、及び４７に示されるヌクレオチド配列からなる本発明のプローブ群のうちの２つ以上を備えたプライマー・プローブセットを挙げることができる。
【００４９】
（本発明のヒトゲノムＤＮＡを検出及び／又は定量する方法）
本発明の「本発明のヒトゲノムＤＮＡを検出及び／又は定量する方法」（以下、単に「本発明の検出・定量方法」とも称する）としては、被験試料より抽出されたＤＮＡを鋳型として、上記本発明のプライマー対を用いたＰＣＲを行う工程を含む、前記被験試料中のヒトゲノムＤＮＡを検出及び／又は定量する方法であれば特に制限されないが、特に、上記本発明のプライマー・プローブセットを用いて被験試料中のヒトゲノムＤＮＡを検出及び／又は定量する方法であって、以下の（Ｉ）〜（III）の工程を含む方法であることが好ましい。
（Ｉ）前記被験試料より抽出されたＤＮＡを鋳型として、前記プライマー・プローブセットを用いたリアルタイムＰＣＲを行う工程；
（II）既知量のヒトゲノムＤＮＡを段階希釈して調製された標準試料を鋳型として、上記工程（Ｉ）と同様の条件においてリアルタイムＰＣＲを行い、検量線を作成する工程；
（III）前記検量線から、前記被験試料中のヒトゲノムＤＮＡ量を算出する工程；
【００５０】
上記「被験試料」としては、ヒトゲノムＤＮＡを含み得る試料であれば特に制限されず、ヒトゲノムＤＮＡ以外に、非ヒト生物由来のＤＮＡをさらに含み得るものであってもよい。上記「被験試料」の例としては、非ヒト生物由来の生体試料、陳旧試料、法医学試料、古生物試料等を挙げることができ、なかでも、非ヒト動物にヒト細胞を移植して作製された異種移植モデル動物由来の生体試料や古人骨由来の陳旧試料を好ましく挙げることができる。また、上記「非ヒト動物」の例としては、マウス、ラット、ギニアピッグ、イヌ、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウシ等の非ヒト哺乳動物を挙げることができ、マウス、ラット、ギニアピッグ等のげっ歯類動物をより好ましく挙げることができる。さらに、上記「ヒト細胞」としては、ヒト幹細胞、ヒトがん細胞、ヒト体細胞、ヒト生殖細胞等のヒト由来の細胞であればどのような種類の細胞であってもよいが、ヒト間葉系幹細胞、ヒト造血幹細胞、ヒト神経幹細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト体細胞由来胚性幹細胞等のヒト幹細胞を特に好適に例示することができる。なお、本明細書において「陳旧試料」とは、様々な環境下で数日〜数百万年以上経過した「新鮮でない試料」を指し、経過時間の下限としては例えば２日、１週間、２週間、１ヶ月、３か月、１年、３年などが挙げられ、経過時間の上限としては、５年、１０年、２０年、４０年、１００年、２００年、４００年、６００年、５０００年、１万年などが挙げられる。なかでも、「古人骨由来の陳旧試料」とは、ヒトＤＮＡを検出及び／又は定量する時点から数年以上前の人骨由来の試料を意味し、かかる陳旧試料には、ヒトＤＮＡを検出及び／又は定量する時点から数年〜２００万年前、５０〜１万年前、１００〜１万年前、２００〜１万年前、３００〜１万年前、４００〜１万年前、５０〜５０００年前、１００〜５０００年前、２００〜５０００年前、３００〜５０００年前、４００〜５０００年前、５０〜６００年前、１００〜６００年前、２００〜６００年前、３００〜６００年前、４００〜６００年前の人骨由来の試料が挙げられる。
【００５１】
また、上記被験試料よりＤＮＡを抽出する方法としては、「プロテイナーゼＫ／フェノール抽出法」、「プロテイナーゼＫ／フェノール／クロロホルム抽出法」、「アルカリ溶解法」、「ボイリング法」、市販のＤＮＡ抽出カラムを用いた方法等の公知の方法であれば特に制限されないが、ＲＮａｓｅによるＲＮＡ分解工程を含む方法であることが好ましく、ＲＮａｓｅ Ａ及びＲＮａｓｅ ＴによるＲＮＡ分解工程を含む方法であることがさらに好ましい。具体的には、上記被験試料よりＤＮＡを抽出する方法としては、「プロテイナーゼＫ／フェノール抽出法」においてプロテイナーゼＫ処理工程の前に、ＲＮａｓｅ Ａ及びＲＮａｓｅ Ｔ１を用いてＲＮＡ分解処理を行う方法を好適に例示することができる。
【００５２】
上記「本発明のプライマー対を用いたＰＣＲ」としては、上記本発明のプライマー対を用いたＰＣＲであれば特に制限されず、ＰＣＲ増幅産物をサイクルの終わりに検出するエンドポイントＰＣＲ法であっても、ＰＣＲ増幅産物の増加をリアルタイムでモニタリングするリアルタイムＰＣＲ法であってもよい。エンドポイントＰＣＲ法において増幅産物を検出する方法としては、ＰＣＲを終えた反応液をそのままアガロースなどを使用した慣用のゲル電気泳動に付し、泳動後のＤＮＡ断片をエチジウムブロマイド染色、蛍光試薬などで検出する方法を例示することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法において増幅産物を検出する方法としては、非特異的ＤＮＡインターカレート色素を、あらかじめＰＣＲ反応液中に添加し、増幅産物の二重鎖ＤＮＡを経時的に検出するインターカレーション法を例示することができる。上記インターカレーション法においては、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩＩ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、ＢＥＢＯ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯ−９、ＳＹＴＯ−１３、ＳＹＴＯ−１６、ＳＹＴＯ−６０、ＳＹＴＯ−６２、ＳＹＴＯ−６４、ＳＹＴＯ−８２、ＰＯＰＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＢＯＢＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅ、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）等の非特異的ＤＮＡインターカレート色素を用いることができるが、なかでも、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩを用いることが好ましい。
【００５３】
また、上記「本発明のプライマー・プローブセットを用いたリアルタイムＰＣＲ」としては、蛍光標識した本発明のプローブを用いるプローブ法であることが好ましい。ここで使用される本発明のプローブのタイプは特に制限されず、例として加水分解プローブ、分子ビーコンプローブ、サイクリングプローブ、Eprobe（登録商標）、Qprobe（登録商標）、スコーピオンプローブ、hybridization-probe等を挙げることができるが、なかでも、加水分解プローブを好ましく挙げることができる。加水分解プローブは、通常、核酸プローブの５’末端が蛍光物質（レポーター蛍光色素）で修飾され、３’末端が消光物質（クエンチャー）で修飾されたリニアオリゴヌクレオチドである。分子ビーコンプローブは、通常、核酸プローブの５’末端が蛍光物質（レポーター蛍光色素）で修飾され、３’末端が消光物質（クエンチャー）で修飾された、ステムループ構造を取り得るオリゴヌクレオチドである。サイクリングプローブは、通常、ＲＮＡとＤＮＡからなるキメラオリゴヌクレオチドであり、一方の末端が蛍光物質（レポーター蛍光色素）で修飾され、他方の末端が消光物質（クエンチャー）で修飾されたオリゴヌクレオチドである。Eprobeは、通常、チミンヌクレオチドに蛍光色素を２つ有する人工核酸であり、ターゲットと結合していない１本鎖の状態では蛍光発光が抑制され、ターゲットと結合すると蛍光を発する。Qprobeは、通常、シトシンを末端とするオリゴヌクレオチドであり、その末端のシトシンが蛍光物質で標識されており、グアニン消光プローブとも呼ばれる。スコーピオンプローブは、通常、核酸プローブの一方の末端が蛍光物質（レポーター蛍光色素）で修飾され、３’末端が消光物質（クエンチャー）で修飾された、ヘアピンループ構造を取り得るオリゴヌクレオチドである。hybridization-probeは、３’末端が蛍光色素で修飾されたオリゴヌクレオチドからなるドナープローブと、５’末端が蛍光色素で修飾されたオリゴヌクレオチドからなるアクセプタープローブから構成されており、これらプローブがターゲットに結合すると両方の蛍光色素が近接して、ドナープローブの蛍光色素の蛍光によってアクセプタープローブの蛍光色素が励起して発光するものである。
【００５４】
上記ＰＣＲは、モレキュラー・クローニング（Molecular cloning）、ア・ラボラトリーマニュアル（A laboratory manual）等の文献に記載の方法に従って行うこともできるし、KOD-Plus-Neo（東洋紡績社製）、TaKaRa PCR Amplification Kit（TaKaRa社製）、TaqMan（登録商標）Real-Time PCR Master Mixes（Thermo Fisher Scientific社製）等の市販のＰＣＲ用キットを用いて、製品添付の説明書に従って行うこともできる。また、上記ＰＣＲには、被検試料から得られた核酸と、本発明のプライマー対又は本発明のプローブ・プライマーセットの他、ＰＣＲ反応に必要な各試薬を用いることができる。かかる試薬としては、核酸を重合させる酵素（例えばポリメラーゼ）、核酸の材料となる物質（例えばｄＮＴＰ）、核酸増幅反応用のバッファー（例えば、Tris-Cl等の緩衝作用を有する成分や、Tween20等の界面活性剤など）、及び、Ｍｇ２＋からなる群から選択される１種又は２種以上が挙げられる他、ＰＣＲの種類に応じて、必要な試薬を追加的に用いることもができる。
【００５５】
上記ＰＣＲを行う際には、用いる核酸増幅反応の種類などに応じて、市販の核酸増幅装置を用いることができ、なかでも、プローブのシグナル（好ましくは蛍光シグナル）を測定し得る装置も備えた核酸増幅装置を好ましく挙げることができる。核酸の増幅と、蛍光シグナルの測定の両方が可能なリアルタイムＰＣＲ装置として、Applied Biosystems社製の７５００ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Bio-RAD社製のＣＦＸ９６、Roche社製のＬｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅｒ ４８０等を挙げることができる。
【００５６】
工程（Ｉ）及び（II）は、工程（Ｉ）に次いで工程（II）の順序であっても、工程（II）に次いで工程（Ｉ）の順序であってもよく、あるいは、工程（Ｉ）及び工程（II）は同時に実施されてもよいが、工程（Ｉ）及び工程（II）が同時に実施されることが好ましい。上記工程（III）は、工程（Ｉ）及び（II）を実施した後に実施される。
【００５７】
上記工程（II）において用いる「標準試料」としては、既知量のヒトゲノムＤＮＡを段階希釈して調製された標準試料であれば特に制限されないが、ＰＣＲ反応用のチューブごとに添加されるヒトゲノムＤＮＡの量が、例えば、１ｆｇ〜１０ｎｇ、好ましくは０．１ｆｇ〜１０ｎｇ、より好ましくは０．０１ｆｇ〜１０ｎｇ、さらに好ましくは０．００１ｆｇ〜１０ｎｇ、より好ましくは０．０００１ｆｇ〜１００ｎｇの範囲となるように調製された標準試料を挙げることができる。また、上記「標準試料」は、ヒトゲノムＤＮＡに加えて、被験試料に含まれ得る非ヒト生物由来のゲノムＤＮＡをさらに含んでいてもよい。さらに、上記「標準試料」に含まれるヒトゲノムＤＮＡは、上記「被験試料」の種類に応じて断片化されたものであってもよく、例えば、２０ｋｂｐ〜１００ｂｐの範囲の適切なサイズに断片化されたヒトゲノムＤＮＡを用いることができる。
【００５８】
上記工程（II）において「検量線を作成する」方法としては、例えば、上記標準試料を鋳型としたリアルタイムＰＣＲによって得られる蛍光シグナルの強度レベルを、ヒトゲノムＤＮＡの量に対してプロットすることより作成する方法や、上記標準試料を鋳型としたリアルタイムＰＣＲによって得られる蛍光シグナルのＣｔ値を、ヒトゲノムＤＮＡの量に対してプロットすることより作成する方法を挙げることができる。ここで、「Ｃｔ値」とは、リアルタイムＰＣＲにおいて、増幅曲線と閾値（Threshold）が交差するサイクル数を意味し、ＰＣＲ増幅産物の生成に由来する蛍光量がある所定量（閾値）に達するときのサイクル数を表す。Ｃｔ値は試料中に最初に含まれる標的ＤＮＡ量が多い程小さく、逆に試料中に含まれる標的ＤＮＡ量が少ない程大きくなる。上記工程（III）においては、被験試料のリアルタイムＰＣＲによって得られた蛍光シグナルの強度レベル又はＣｔ値を、上記検量線と比較することにより被験試料に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を算出することができる。
【００５９】
（本発明のヒトゲノムＤＮＡ検出及び／又は定量用キット）
本発明の「ヒトゲノムＤＮＡ検出及び／又は定量用キット」（以下、単に「本発明のキット」とも称する）としては、上記本発明のプライマー対及び／又は上記本発明のプローブを備えた、ヒトゲノムＤＮＡ検出及び／又は定量用キットであれば特に制限されない。本発明のキットには、一般にこの種の検出キットに用いられる成分（例えば、担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤など）の他、取扱説明書等の添付文書を含んでいてもよい。また、本発明のキットには、標準試料として用いるためのヒトゲノムＤＮＡ、ネガティブコントロールとして用いるための非ヒト生物由来ＤＮＡ（例えば、マウスゲノムＤＮＡ、ラットゲノムＤＮＡ、ギニアピッグゲノムＤＮＡ等）がさらに含まれていてもよい。
【００６０】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６１】
［Ａｌｕ−ｑＰＣＲの理論的検出限界値］
本発明者らは、以下の（１）〜（４）の計算に基づいて、Ａｌｕ−ｑＰＣＲにより理論的には０．０６〜０．１５ｆｇ程度のヒトゲノムＤＮＡからＡｌｕ配列を検出することが可能であると算出した。
（１）ヒトゲノムＤＮＡにおけるＡｌｕ配列の出現頻度
Ａｌｕ配列はヒトゲノム全体に１００万コピー以上存在している。ここで、ヒトゲノムＤＮＡの全長は３０億ヌクレオチド対であることから、以下の式１のように単純に出現頻度を計算すると、３０００ヌクレオチド対の長さのヒトゲノムＤＮＡに少なくとも１コピー以上のＡｌｕ配列が存在することになる。
［式１］  ３０億ヌクレオチド対／１００万コピー＝３０００ヌクレオチド対
また、ヒト体細胞は２倍体であることを踏まえて、ヒトゲノムＤＮＡにおけるＡｌｕ配列の出現頻度を重量に換算すると、１つのヒト体細胞に含まれるヒトゲノムＤＮＡ（３０億ヌクレオチド対×２＝６０億ヌクレオチド対）の重量は６ｐｇであり、１つのヒト体細胞に含まれるＡｌｕ配列は２００万コピーであるから、Ａｌｕ配列は０．００３ｆｇのヒトゲノムＤＮＡに少なくとも１コピー以上存在することになる（式２）。
［式２］  ６ｐｇ／２００万コピー＝０．００３ｆｇ【００６２】
（２）抽出工程後のヒトゲノムＤＮＡ断片のサイズ、数、及び重量
上述の通り、１つのヒト体細胞に含まれるヒトゲノムＤＮＡの全長は６０億ヌクレオチド対であるが、通常の方法によってヒト細胞からゲノムＤＮＡを抽出すると、物理的な力が加わることによりゲノムＤＮＡはランダムに切断され、２〜５万ヌクレオチド対のＤＮＡ断片になることが知られている。すなわち、抽出工程後のヒトゲノムＤＮＡ断片は、それぞれが２〜５万ヌクレオチド対の長さの、１２〜３０万個のＤＮＡ断片に断片化される（式３）。
［式３］  ６０億ヌクレオチド対／２〜５万ヌクレオチド対＝１２〜３０万断片
また、これを重量に換算すると、総重量６ｐｇのヒトゲノムＤＮＡが、１２〜３０万個に断片化される計算になるので、それぞれの断片の重量は０．０２〜０．０５ｆｇとなる（式４）。
［式４］  ６ｐｇ／１２〜３０万断片＝０．０２〜０．０５ｆｇ【００６３】
（３）抽出ＤＮＡ断片含まれるＡｌｕ配列
上記（１）で述べたように、Ａｌｕ配列は３０００ヌクレオチド対のヒトゲノムＤＮＡに１コピー以上含まれると考えられる。一方、上記（２）で述べたように、抽出されたヒトゲノムＤＮＡ断片は２〜５万ヌクレオチド対の長さであるから、１つの断片には数個〜十数個のＡｌｕ配列が含まれると想定できる。このような計算に基づき、本発明者らは、Ａｌｕ配列の分布に偏りがある可能性を考慮しても、１つの断片に少なくとも１コピーのＡｌｕ配列が含まれると仮定できると判断した。【００６４】
（４）Ａｌｕ−ｑＰＣＲに必要なヒトゲノムＤＮＡの量
通常のリアルタイムＰＣＲ法においては、テンプレート中に標的配列が３コピー以上存在していれば、該標的配列を増幅して検出することが可能であるとされている。一方、上記（３）で述べたように、抽出後のヒトゲノムＤＮＡにおいては、１つのＤＮＡ断片に１コピー以上のＡｌｕ配列が含まれると考えられることから、理論的には３つ以上のＤＮＡ断片が試料中に含まれていれば、リアルタイムＰＣＲ法によりＡｌｕ配列を検出することが可能である。すなわち、重量に換算すると、０．０６〜０．１５ｆｇのヒトゲノムＤＮＡがテンプレート中に含まれていれば（式５）、リアルタイムＰＣＲ法によりＡｌｕ配列を検出することが可能である。以上のことから、理論的にはＡｌｕ−ｑＰＣＲにより０．１ｆｇ程度のヒトゲノムＤＮＡからＡｌｕ配列の検出が可能であると考えられる。
［式５］  ０．０２〜０．０５ｆｇ×３＝０．０６〜０．１５ｆｇ
【実施例２】
【００６５】
［ゲノムＤＮＡの精製方法の検討］
次に、本発明者らは、Ａｌｕ−ｑＰＣＲのテンプレートとして用いるゲノムＤＮＡの精製方法について検討した。細胞や組織から抽出したゲノムＤＮＡには、ＲＮＡが混入することが知られている（Sambrook, J. and Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, NY.）。一般的には、ＲＮＡの混入はＰＣＲ反応を阻害しないと考えられており、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ等に記載のプロトコールにおいても、ＰＣＲ用のサンプル（テンプレート）に含まれるにどの程度ＲＮＡが混入しているかはあまり注意を払われていない。
しかし、微量のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う場合には、大量のＲＮＡの混入が増幅効率に影響を及ぼす可能性が考えられる。なぜなら、ＤＮＡ−ＲＮＡの結合のほうがＤＮＡ−ＤＮＡの結合よりも安定であることから、プライマー・プローブがＲＮＡにトラップされてしまい、本来の標的であるＤＮＡにハイブリダイズできない可能性があるからである。したがって、本発明のＡｌｕ−ｑＰＣＲのように、微量のヒトゲノムＤＮＡの定量を行う場合には、テンプレートへのＲＮＡの混入を最小限に抑える必要がある。
そこで、本発明者らは、ＲＮＡの混入を最小限に抑えるためのゲノムＤＮＡ抽出条件を検討した。具体的には、培養したヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ細胞）をトリプシンで剥離させて回収し、遠心分離した（４００ｘｇ、室温、５分間）。得られた細胞ペレットをＴＢＳで懸濁し、細胞数をカウントした。ＬｏＢｉｎｄチューブ（エッペンドルフ社製）に１００万細胞ずつ分注した後に遠心分離した（１０００ｘｇ、４℃、１０分間）。上清を除去した後に、ＴＥ（５０μＬ）を加えて細胞をよく懸濁し、さらに、ＲＮａｓｅ Ａ（Nippon Gene社製）及び／又はＲＮａｓｅ Ｔ１（Invitrogen社製）を含むＬｙｓｉｓバッファー（４５０μＬ）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。次に、プロテイナーゼＫ溶液（和光純薬工業社製）を最終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるよう加え、５０℃で一晩インキュベートした後に、同量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１（ナカライテスク社製；以下「ＰＣＩ」と称する場合がある）を加えてボルテックスで混和した。遠心分離（最大速度、４℃、１５分間）して、水層（上層）を回収し、再度ＰＣＩを加えてボルテックスで混和して遠心分離（最大速度、４℃、１５分間）した。水層を回収して、０．２倍量の１０Ｍ酢酸アンモニウム（Nippon Gene社製）及び２．５倍量の１００％ＥｔＯＨ（和光純薬社製）を加えて転倒混和した後に、遠心分離した（最大速度、４℃、１５分間）。上清を完全に除去して７０％ＥｔＯＨで洗浄し、ペレットを１０分乾燥させた後に、ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）を適量加えてペレットを溶解させた。得られたサンプル中に含まれる核酸濃度を、紫外線吸光度法及びＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ＤＮＡ定量法により測定した。紫外線吸光度法では、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いてＡ２６０の吸光度を測定した。また、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ＤＮＡ定量法では、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（登録商標） ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ Ｋｉｔｓ(Invitrogen社製）を用いて、該キットに添付の説明書に従ってＤＮＡの定量を行った。
紫外線吸光度法により得られた核酸濃度を全核酸量（ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡ）とし、また、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎＤＮＡ定量法で得られた核酸濃度をゲノムＤＮＡ量として、各抽出サンプルにおいてどの程度の割合でＲＮＡが混入しているかを調べた。結果を図１に示す。ＲＮａｓｅ Ａ及びＲＮａｓｅ Ｔ１のいずれも使用しない場合には、サンプル中の全核酸のうちＲＮＡが占める割合は７６．１％であった。また、ＲＮａｓｅ Ａ（２０又は２００μｇ／ｍＬ）のみを使用した場合には、サンプル中の全核酸のうちゲノムＤＮＡが占める割合は６０．５〜４３．３％であり、ＲＮａｓｅ Ｔ１（１００Ｕ又は１０００Ｕ）のみを使用した場合には、サンプル中の全核酸のうちＲＮＡが占める割合は６５．２〜４３．３％であった。これに対して、ＲＮａｓｅ Ａ（２０μｇ／ｍＬ）及びＲＮａｓｅ Ｔ１（１００Ｕ）を組み合わせて使用した場合には、サンプル中の全核酸のうちＲＮＡが占める割合は５８．６％であり、さらに、ＲＮａｓｅ Ａ（２００μｇ／ｍＬ）及びＲＮａｓｅ Ｔ１（１０００Ｕ）を組み合わせて使用した場合には、ＲＮＡが占める割合は３２．０％であった。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇには、細胞・組織からのゲノムＤＮＡ抽出プロトコールが複数記載されているが、それらのプロトコールではＲＮａｓｅは全く使用されないか、又は、ＲＮａｓｅ Ａのみが使用されている。図１の結果から、このようなＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載の一般的なプロトコールに従って抽出されたゲノムＤＮＡには、多量のＲＮＡが混入することが明らかとなった。また、ゲノムＤＮＡ抽出の際に２００μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａと１０００ＵのＲＮａｓｅ Ｔ１とを組み合わせて使用することにより、ＲＮＡの混入を大幅に抑えることが可能であることが明らかとなった。これらの結果に基づいて、以下の実験では、細胞又は組織からのゲノムＤＮＡの抽出の際に２００μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａ及び１０００Ｕ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ｔ１によるＲＮＡ分解処理を行い、また、サンプル中のＤＮＡ濃度の測定は全てＰｉｃｏＧｒｅｅｎＤＮＡ定量法により行った。
【実施例３】
【００６６】
［既知のプライマー・プローブセットの感度及び特異性の確認］
（１）既知のプライマー・プローブセット
本発明者らは、まず既に当該技術分野において使用されているプライマー・プローブセットの感度及び特異性を確認した。実験には、２００３年にMcBrideらにより報告されたフォワードプライマー（ＣＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡ；配列番号１）、リバースプライマー（ＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＧＡＧＴＡＧ；配列番号２）、及びプローブ（ＡＴＴＡＧＣＣＧＧＧＣＧＴＧＧＴＧＧＣＧ；配列番号３）を用いた（McBride et al., (2003) Quantifying levels of transplanted murine and human mesenchymal stem cells in vivo by real-time PCR. Cytotherapy, 5, 7-18.、Lee et al., (2009) Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell, 5, 54-63.）。また、上記プローブの５’末端はＦＡＭで、３’末端はＴＡＭＲＡでそれぞれ標識した（以下、かかるプライマー・プローブセットを「McBrideのプライマー・プローブセット」と称する場合がある）。【００６７】
（２）テンプレートの調製
ＰＣＲには、以下のテンプレート１〜４を用いた。（なお、テンプレート３の調製にはEASY Dilutionバッファーを、テンプレート２及び４の調製にはＴＥバッファーをそれぞれ用いた。）
テンプレート１：バッファーのみ（ＴＥバッファー、又はEASY Dilutionバッファー）
テンプレート２：５０ｎｇ／μＬのマウスゲノムＤＮＡ
テンプレート３：０．０００５ｆｇ／μＬから５ｎｇ／μＬまでの１１段階の濃度のヒトゲノムＤＮＡのみを含むスタンダードサンプル
テンプレート４：０．５ｆｇ／μＬから５ｎｇ／μＬまでの８段階の濃度のヒトゲノムＤＮＡと、マウスゲノムＤＮＡとをトータルで５０ｎｇ／μＬの濃度となるように調製した混合スタンダードサンプル
上記テンプレート３及び４を用いたＰＣＲでは、得られた増幅曲線の適切な位置に閾値（Threshold）を設定してＣｔ値（Threshold Cycle）を算出し、ヒトゲノムＤＮＡの各量におけるＣｔ値をプロットすることにより検量線を作成する。この検量線の直線性が認められる範囲が、ＰＣＲによる検出が可能なヒトゲノムＤＮＡの量である。すなわち、テンプレート３及び４を用いることにより、ヒトゲノムＤＮＡのみを含むサンプル、又はヒト及びマウスゲノムＤＮＡを含む混合物サンプルに対する検出限界値を決定することができる。一方、上記テンプレート１及び２はネガティブコントロールサンプルであり、テンプレート１及び２を用いたＰＣＲにより検出されるシグナルは非特異的なものである。すなわち、テンプレート１及び２におけるＣｔ値が低いほどＰＣＲの特異性が低いことを意味する。【００６８】
（３）リアルタイムＰＣＲ
McBrideのプライマー・プローブセットと上記テンプレート１〜４とを用いて、論文（McBride et al., (2003) Quantifying levels of transplanted murine and human mesenchymal stem cells in vivo by real-time PCR. Cytotherapy, 5, 7-18.、Lee et al., (2009) Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell, 5, 54-63.）に記載された条件と同様の条件でＰＣＲを行った。【００６９】
（４）McBrideのプライマー・プローブセットによるリアルタイムＰＣＲの結果
図２及び３に示すように、テンプレート１のＣｔ値は３０程度であり（図２及び３の「ＢＵＦ．」）、テンプレート２のＣｔ値も３０程度であった（図３の「Ｍｏｕｓｅ」）。また、図２に示すように、テンプレート３のＰＣＲにより作成された検量線では、ヒトゲノムＤＮＡの量が１ｆｇ〜１ｎｇの間で直線性が認められた（図２）。これに対し、テンプレート４のＰＣＲにより作成された検量線では、ヒトゲノムＤＮＡの量が１ｐｇ〜１０ｎｇの間では直線性が認められたが、ヒトゲノムＤＮＡの量が１００ｆｇ以下では直線性は認められなかった（図３）。これらの結果から、McBrideのプライマー・プローブセットの検出限界値は、テンプレートがヒトゲノムＤＮＡのみを含む場合には１ｆｇであるが、テンプレートがヒトゲノムＤＮＡとマウスゲノムＤＮＡとを含む場合には１ｐｇまで低下してしまうことが明らかとなった。これらの結果から、McBrideのプライマー・プローブセットは特異性が低く、微量のヒトゲノムＤＮＡを検出・定量することはできないことが示された。
【実施例４】
【００７０】
［ヒトＡｌｕモデル配列の同定］
以上のように、実施例３の結果はMcBrideのプライマー・プローブセットの感度及び特異性が低いことを示している。この原因として、本発明者らは、ａ）McBrideのプライマー・プローブセットがヒトゲノム中のＡｌｕ配列を十分にカバーするように設計されていない可能性があること、また、ｂ）プライマー及び／又はプローブ同士での非特異的結合と、マウスゲノムＤＮＡに対する非特異的結合とによりバックグラウンドが上昇することの２点にあると考えた。
そこで本発明者らは、上記ａ）の問題を解決するために、Ａｌｕ配列に関する最新のデータ（Wheeler et al., Nucleic Acids Res, 41, D70-82. 2013）に基づいて、４６のＡｌｕサブファミリーのコンセンサス配列を代表する一つの「ヒトＡｌｕモデル配列」を同定し、このヒトＡｌｕモデル配列を用いてヒトゲノム中のＡｌｕ配列の最も多くカバーするプライマー・プローブセットの設計を試みた。
具体的には、Ｄｆａｍ１．３データベースに登録されている４６のＡｌｕサブファミリーの全てのコンセンサス配列を基に、ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いてマルチプルアライメントを作成した。さらに、作成したマルチプルアライメント全体を確認して一部を手動で再アライメントした後に、かかるマルチプルアライメントの各ポジションにおけるＡ、Ｔ、Ｇ、及びＣの出現頻度を、４６のサブファミリーごとの構成因子数（ヒトゲノム中のコピー数）を重率として算出して位置特異的スコアマトリックスを作成した（図４−１〜図４−３）。本発明者らは、この位置特異的スコアマトリックスを使用して、ヒトゲノム中のＡｌｕ配列を最大数カバーする「ヒトＡｌｕモデル配列」の同定を試みた。【００７１】
上記位置特異的スコアマトリックスに基づいて、ヒトＡｌｕモデル配列の原型を以下のように決定した。このヒトＡｌｕモデル配列の原型において、ＹはＣ又はＴを、ＳはＣ又はＧを、ＲはＡ又はＧをそれぞれ示す。
ヒトＡｌｕモデル配列の原型（配列番号４）：
ＧＧＣＣＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＡＣＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＧＹＧＧＡＴＣＡＣＹＴＧＡＧＧＹＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣＣＧＧＧＣＧＴＧＧＴＧＧＣＧＳＧＹＧＣＣＴＧＴＡＲＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＹＧＡＣＡＧＡＧＹＧＡＧＡＣＴＣＹＧＴＣＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ【００７２】
次に、上記ヒトＡｌｕモデル配列の原型において、「Ｙ」、「Ｓ」、又は「Ｒ」で示した各ポジションを詳細に検討し、最終的に以下のヒトＡｌｕモデル配列を同定した（図５）。
ヒトＡｌｕモデル配列（配列番号５）：
ＧＧＣＣＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＡＣＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＴＣＡＣＴＴＧＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣＣＧＧＧＣＧＴＧＧＴＧＧＣＧＣＧＴＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＣＧＡＧＡＣＴＣＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
【実施例５】
【００７３】
［Ｐｒｉｍｅｒ３（初期設定）を用いたプライマー・プローブセットの設計］
次に、本発明者らは、プライマー設計プログラムＰｒｉｍｅｒ３（Ｐｒｉｍｅｒ３ｗｅｂ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０．０）の初期設定を用いて、上記ヒトＡｌｕモデル配列の部分配列又はその相補配列からなる、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブの組合せを選定した。具体的には、Ｐｒｉｍｅｒ３において、以下のｉ）及びii）のパラメータのみ設定を変更し、それ以外は全てデフォルトの設定を用いて、ヒトＡｌｕモデル配列（ポジション＃１〜＃３００）を入力した。
ｉ）Mispriming Library (repeat library)：RODENT_AND_SIMPLE
ii）Pick hybridization probe (internal oligo), or use oligo below：チェックする
そして、出力された中から「quality」が最も高い（すなわち、「objective functionの値」が最も低い）プライマー及びプローブの組合せを選定した。選出された組合せは、フォワードプライマー：ＣＧＧＡＴＣＡＣＴＴＧＡＧＧＴＣＡＧＧＡ（配列番号６；ヒトＡｌｕモデル配列のポジション＃５７〜＃７６）、リバースプライマー：ＧＧＴＴＣＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣ（配列番号７；ヒトＡｌｕモデル配列のポジション＃２０６〜＃１８７の相補配列）、プローブ：ＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣ（配列番号８；ヒトＡｌｕモデル配列のポジション＃１００〜＃１１９）である（図６）。これらのプライマー及びプローブを合成し、さらに、プローブの５’末端をＦＡＭで、３’末端をＢＨＱ１でそれぞれ標識した（以下、かかるプライマー及びプローブの組合せを「Ｐｒｉｍｅｒ３のプライマー・プローブセット」と称する場合がある）。
【実施例６】
【００７４】
［Ｐｒｉｍｅｒ３のプライマー・プローブセット感度及び特異性］
（１）リアルタイムＰＣＲの条件
実施例３に記載のテンプレート１、２、及び４と，実施例５に記載のＰｒｉｍｅｒ３のプライマー・プローブセットとを用いて以下のようにＰＣＲサンプルを調製した。
ＰＣＲサンプル調製：
テンプレート                            ２μＬ
TaqMan Universal Master MixII, no UNG
（Applied Biosystems社製）              １０μＬ
フォワードプライマー（１０μＭ）        ０．４μＬ
リバースプライマー（１０μＭ）          ０．４μＬ
プローブ（１２．５μＭ）                ０．５μＬ
水                                      ６．７μＬ
トータル  ２０μＬ【００７５】
７５００ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Applied Biosystems社
製）を用いて、以上のように調製したＰＣＲサンプルのリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間の熱変性の後、９５℃で１５秒、６０℃で１分のサイクルを５０回繰り返した。なお、テンプレート及びサンプルの調製は、微量のＤＮＡが失われないように低吸着チューブ及びチップを用いて行った。【００７６】
（２）Ｐｒｉｍｅｒ３のプライマー・プローブセットによるリアルタイムＰＣＲの結果
図７に示すように、テンプレート１及び２のＣｔ値は３０〜３５程度であった（図７の「Ｂｕｆ．」及び「ｍｏｕｓｅ」）。これらの結果は、McBrideのプライマー・プローブセットと同様に、プライマー・プローブセットでもプライマー・プローブ同士、及びプライマー・プローブとマウスゲノムＤＮＡとの非特異的結合が起こっていることを示唆するものである。
また、図７に示すように、テンプレート４のＰＣＲにより作成された検量線では、ヒトゲノムＤＮＡの量が１００ｆｇ〜１０ｎｇの間では直線性が認められたが、それ以下では直線性は認められなかった。これらの結果から、Ｐｒｉｍｅｒ３のプライマー・プローブセットを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの検出限界値は１００ｆｇであることが明らかとなった。以上のことから、ヒトＡｌｕモデル配列に基づいてＰｒｉｍｅｒ３（初期設定）でプライマー・プローブセットを選定しても、McBrideのプライマー・プローブセットと同様の、低感度のプライマー・プローブセットしか得られないことが明らかとなった。
【実施例７】
【００７７】
［プライマー対及びプローブ選定クライテリアの設定］
（１）クライテリアの設定
上記実施例３及び６の結果から、McBrideのプライマー・プローブセット及びＰｒｉｍｅｒ３のプライマー・プローブセットを用いたリアルタイムＰＣＲでは、ヒトゲノムＤＮＡを含まないネガティブコントロールサンプル（テンプレート１及びテンプレート２）においても非特異的なシグナルが検出されること、また、ヒトゲノムＤＮＡとマウスゲノムＤＮＡとを含むサンプル（テンプレート４）を用いた場合には、検出限界値が１００ｆｇ〜１ｐｇ程度まで大幅に低下することが明らかとなった。
以上のことから、本発明者らは、ネガティブコントロールサンプルで見られたような非特異的なシグナルによるバックグラウンドの増大が、リアルタイムＰＣＲの検出感度を低下させる最も大きな要因となっていると考えた。そして、本発明者らは、Ａｌｕ−ｑＰＣＲの感度を上げるためには、プライマー及びプローブ配列の選定過程において、プライマー・プローブ間での非特異的結合、及び、プライマー・プローブとマウスゲノムＤＮＡとの非特異的結合が起こるような配列を避ける必要があると考え、そのために独自のプライマー及びプローブ選定クライテリアを設定した。具体的には、プライマー対の選定のために以下のクライテリア１〜７を設定し、さらに、プローブの選定のために以下のクライテリア８〜１５を設定した。なお、以下、クライテリア１〜７を「プライマー用クライテリア」、クライテリア８〜１１を「プローブ用必須クライテリア」、クライテリア１２〜１５を「プローブ用補足クライテリア」と称する場合がある。【００７８】
（２）プライマー用クライテリア
［クライテリア１］フォワードプライマー及びリバースプライマー中の連続した１９ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；
［クライテリア２］フォワードプライマー及びリバースプライマーのヌクレオチド長がそれぞれ２０以上である；
［クライテリア３］少なくともプライマーの５’末端又は３’末端のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの５’末端がＧ又はＣでない場合は、５’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣであり、プライマーの３’末端がＧ又はＣでない場合は、３’末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣである；
［クライテリア４］プライマーの３’末端から３番目までのヌクレオチド（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド）のうちの、少なくとも１つがＡ又はＴである；
［クライテリア５］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア６］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア７］フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；【００７９】
（３）プローブ用必須クライテリア
［クライテリア８］プローブ中の連続した１９ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；
［クライテリア９］プローブのヌクレオチド長が２０以上である；
［クライテリア１０］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア１１］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；【００８０】
（４）プローブ用補足クライテリア
［クライテリア１２］フォワードプライマーとプローブ、又はリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［クライテリア１３］プローブの５’末端のヌクレオチドがＧでない；
［クライテリア１４］プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間で、最も安定なダイマーを形成させた場合の自由エネルギーの変化が−７ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である；
［クライテリア１５］ヌクレオチド長が最も短い；【００８１】
（５）プライマー用クライテリアの説明
クライテリア１について：
本発明者らは、ヒトゲノムＤＮＡと他生物のゲノムＤＮＡとが混在したサンプルをテンプレートとして使用する場合に、プライマーによる他生物ゲノムＤＮＡの非特異的な増幅を防ぐために、クライテリア１を設けた。本発明者らは、異種移植モデル動物の臓器におけるヒト細胞の検出を想定して、本実施例においては、クライテリア１における「非ヒト生物」として、マウス、ラット、及びギニアビッグを設定して以下の実験をおこなった。
クライテリア１を満たすヌクレオチド配列を選定するために、ヒトＡｌｕモデル配列のポジション＃１〜＃２８２のヌクレオチド配列（ポジション＃２８３〜＃３００のポリＡを除いたヌクレオチド配列）を入力配列として、マウス、ラット、及びギニアピッグのゲノム全体のＢＬＡＳＴ検索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を行った。使用した検索データベースは、以下の通りである。
マウスゲノム：all assemblies top-level, Annotation Release 105
ラットゲノム：all assemblies, Annotation Release 105
ギニアピッグゲノム：Cavpor3.0 reference Annotation Release 102
探索パラメータは、以下を除いて初期パラメータで行った。
Program selection：Megablast
Short queries： off
Word size： 16;
Match/Mismatch Scores：1, -4
Gap Costs：5, 2
Filters and Masking：off
上記パラメータは、マウス、ラット、及びギニアピッグのゲノムにおける、ヒトＡｌｕモデル配列のポジション＃１〜＃２８２に含まれる１９ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と１００％マッチする領域を最大限抽出できるように設定したものである。ＢＬＡＳＴ検索の結果、ヒトＡｌｕモデル配列中の連続する１９ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と１００％マッチするヌクレオチド配列が、マウスでは６０５５か所、ラットでは２９５１か所、ギニアピッグでは１３２９８か所存在することが分かった。続いて、これらのげっ歯類ゲノム中の相補配列の全てを抽出し、ヒトＡｌｕモデル配列上にマッピングした。さらに、各相補配列について、１９ヌクレオチドの連続する部分配列が開始するヒトＡｌｕモデル配列中のポジションを特定した。
以上の結果を図８にまとめた。図８では、ヒトＡｌｕモデル配列のポジション＃１〜＃２６４について、それぞれのポジションを開始点とする１９ヌクレオチドの連続配列がマウス、ラット、及びギニアピッグゲノム中にいくつ存在するか示されている。例えば、図８のポジション＃１においては、マウス、ラット、及びギニアピッグの欄はいずれも「０」と記載されている。これはポジション＃１から開始する１９ヌクレオチドの連続配列（ポジション＃１〜＃１９の配列）と同一のヌクレオチド配列が、マウス、ラット、及びギニアピッグのいずれのゲノムにも存在しないことを示している。また、図８のポジション＃１１においては、マウスの欄に「３０」、ラットの欄に「２４」、ギニアピッグの欄に「１１６２」とそれぞれ記載されている。これはポジション＃１１から開始する１９ヌクレオチドの連続配列（ポジション＃１１〜＃２０の配列）と同一のヌクレオチド配列が、マウスゲノム中には３０箇所、ラットゲノム中には２４箇所、ギニアピッグゲノム中には１１６２箇所存在することを示している。
図８において、本発明者らは、クライテリア２の「フォワードプライマー及びリバースプライマーの長さがそれぞれ２０ヌクレオチド以上である」という条件も考慮して、ヒトＡｌｕモデル配列のポジション＃１〜＃２８２のうち、クライテリア１を満たすことができるポジションは白で、クライテリア１を満たすことができないポジションはグレーでそれぞれ示した。
さらに、参考として、McBrideのプライマー・プローブセット及びＰｒｉｍｅｒ３のプライマー・プローブセットのヌクレオチド配列中に、げっ歯類ゲノムとの１９ヌクレオチドの完全相補配列が存在するかを検証した結果、Ｐｒｉｍｅｒ３のフォワードプライマーは３個、McBrideのフォワードプライマーは７個、McBrideのリバースプライマーは７９個、McBrideのプローブは１８６個の完全相補配列が存在することが分かった。特に、McBrideのリバースプライマーは全長が１９ヌクレオチドであるため、プライマー全体がげっ歯類ゲノム配列と完全にマッチする。上述の通り、McBrideのプライマー・プローブセットは、テンプレート４（ヒト及びマウスゲノムの混合サンプル）を用いた場合に感度が著しく低下するが、これはMcBrideのプライマーがげっ歯類ゲノム配列を認識することが原因であると考えられる。【００８２】
クライテリア２について：
本発明者らのこれまでの経験から、プライマーに十分な特異性を持たせるためには、その長さが２０ヌクレオチド以上であることが好ましいことが分かっている。このため、プライマー長を２０ヌクレオチド以上とするクライテリア２を設定した。【００８３】
クライテリア３について：
クライテリア１及び２により、げっ歯類ゲノムと１９ヌクレオチド以上の相補性を有するプライマーはほとんど除去されるが、げっ歯類ゲノムと１８ヌクレオチド以下の相補性を有するプライマーが依然として残っている。このため、本発明者らは、プライマー全長（２０ヌクレオチド以上）が鋳型となるヌクレオチド配列とマッチする場合（すなわち、Ａｌｕ配列に対して特異的に結合する場合）と、プライマーの内の１８ヌクレオチドしか鋳型となるヌクレオチド配列にマッチしない場合（すなわち、Ａｌｕ配列以外の配列に非特異的に結合した場合）との間でＴｍ値の違いが最大となるようにプライマーを設計することで、ＰＣＲによる非特異的な増幅を防ごうと考えた。
全長が２０ヌクレオチドであって、そのうちの連続する１８ヌクレオチドがげっ歯類ゲノムに交叉するプライマーを想定すると、該プライマーの両末端の２ヌクレオチドはげっ歯類ゲノムと相補的結合を形成しない可能性がある。最近接塩基対法によるＴｍ値の予測によれば、プライマー末端のヌクレオチドがテンプレートと相補的結合を形成しない場合、その末端のヌクレオチドがＧ又はＣであるときは、Ａ又はＴのときと比較して、Ｔｍ値が低下することが知られている。このため、プライマーが特異的に結合した場合と、非特異的に結合した場合のＴｍ値の差が最も大きくするために、プライマーの５’又は３’両末端のうち、少なくとも一方の末端をＧ又はＣとすること、また、末端のヌクレオチドがＧ又はＣでない場合には、末端から２番目のヌクレオチドをＧ又はＣとするという、クライテリア３を設けた。【００８４】
クライテリア４について：
プライマーと標的配列とが相補的に結合したときに、プライマーの３’末端側の結合の安定性が低くなるように（ギブスの自由エネルギーが高くなるように）設計した方が、プライマーの特異性が高いという報告がある（Rychlik, W. (1995) Selection of primers for polymerase chain reaction. Mol Biotechnol, 3, 129-134）。一方、クライテリア３は、プライマーの３’末端又は末端から２番目のヌクレオチドがＧ又はＣとするように設定している。Ｇ又はＣの自由エネルギーは、Ａ又はＴと比較して低いことから、クライテリア３によりプライマーの３’末端近傍の安定性が極端に高くなる可能性が考えられる。このような可能性を防ぐために、３’末端から１〜３番目のヌクレオチドのうちの少なくとも一つをＡ又はＴとするクライテリア４を設定した。【００８５】
クライテリア５〜７について：
プライマー同士での相補鎖の形成は、非特異的シグナル上昇や、増幅効率低下の原因となることが知られている。実際に、二次構造予測プログラムRNAstructure（RNAstructure version 5.6）を用いて確認したところ、Ｐｒｉｍｅｒ３のプライマー・プローブセットにおいては、フォワードプライマーの３’末端と、リバースプライマーとの間で連続５ヌクレオチドの相補鎖が形成されることが明らかとなった（図９）。本発明者らは、このようなプライマー間での相補鎖形成（ホモダイマー及び／又はヘテロダイマー形成）が、Ｐｒｉｍｅｒ３のプライマー・プローブセットによるＡｌｕ−ｑＰＣＲのバックグラウンドの上昇と、それに伴う感度の低下の要因となっていると考えた。そこで、プライマー間での相補鎖形成が起きやすいヌクレオチド配列を排除するために、クライテリア５〜７を設定した。【００８６】
（６）プローブ用必須クライテリアの説明
クライテリア８について：
クライテリア１〜７を満たすプライマー対はヒトＡｌｕ配列に特異的なものであるが、非特異的なヌクレオチド配列の増幅が起こる可能性は０ではない。このため、非特異的な増幅産物にハイブリダイズしないプローブを用いることは、Ａｌｕ−ｑＰＣＲの特異性を高めるために重要である。したがって、非ヒト生物のゲノム配列を増幅しないようなヌクレオチド配列からなるプローブを選択するために、クライテリア８を設定した。【００８７】
クライテリア９について：
本発明者らのこれまでの経験から、プローブに十分な特異性を持たせるためには、その長さが２０ヌクレオチド以上であることが好ましいことが分かっている。このため、２０ヌクレオチド以上のプローブを選択するために、クライテリア９を設定した。【００８８】
クライテリア１０及び１１について：
プライマーとプローブ、又はプローブ同士での相補鎖形成は、非特異的なヌクレオチド配列の増幅や、標的とするヌクレオチド配列の増幅効率低下の原因となることが知られている。実際に、RNAstructure（RNAstructure version 5.6）を用いて確認したところ、McBrideのプライマー・プローブセットにおいては、フォワードプライマーとプローブ、リバースプライマーとプローブ、及びプローブ同士の間で、Ｇ及びＣのみからなる連続４ヌクレオチドの相補鎖が形成されることが明らかとなった（図１０）。本発明者らは、このようなプライマー・プローブ間での相補鎖形成が、McBrideのプライマー・プローブセットによるＡｌｕ−ｑＰＣＲのバックグラウンドの上昇と、それに伴う感度の低下の要因となっていると考えた。そこで、プライマーとプローブ、又はプローブ同士での相補鎖形成が起きやすいヌクレオチド配列を排除するために、クライテリア１０及び１１を設定した。【００８９】
（７）プローブ用補足クライテリアの説明
上記クライテリア８〜１１により、Ａｌｕ−ｑＰＣＲ用プライマーとして使用可能なプローブを選定することができる。しかし、上記クライテリア８〜１１を満たすプローブが複数選定された場合には、クライテリア１２〜１５のうち１以上のクライテリアを用いて、より望ましい性質を持つプローブを選定することができる。【００９０】
クライテリア１２について：
上述の通り、本発明者らは、McBrideのプライマー・プローブセットの感度が低下する原因の一つが、フォワードプライマーとプローブ、リバースプライマーとプローブ、及びプローブ同士の間で、Ｇ及びＣのみからなる連続４ヌクレオチドの相補鎖が形成されることにあると考えた（図１０）。そこで、このようなプライマー・プローブ間における相補鎖形成（ホモダイマー及び／又はヘテロダイマー形成）が起きやすいヌクレオチド配列を排除するために、クライテリア１２を設定した。【００９１】
クライテリア１３について：
種々の蛍光分子はグアニン塩基に近接することでクエンチングされることが知られている。このため、プローブの５’末端を蛍光物質により標識する場合には、該５’末端のヌクレオチドがＧでないことが望ましい。このため、クライテリア１３を設定した。【００９２】
クライテリア１４について：
上記「クライテリア１０及び１１について」で述べたように、プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、又はリバースプライマーとプローブの二分子間における結合安定化エネルギーが高いと、非特異的なヌクレオチド配列の増幅や、標的とするヌクレオチド配列の増幅効率低下が起こる可能性がある。このことから、プライマー・プローブ間で最も安定なダイマーを形成させた場合の自由エネルギーの変化が−７ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上となるプローブを選定するために、クライテリア１４を設定した。【００９３】
クライテリア１５について：
加水分解プローブ法では、５’末端を蛍光物質で、３’末端をクエンチャー物質でそれぞれ標識したプローブを用いる。このプローブは鋳型にハイブリダイズしてもクエンチャーによって蛍光を発することはない。しかし、伸長反応の際に、プライマーを起点としたＤＮＡの伸張が起こり、それが鋳型にハイブリダイズしたプローブの５’末端まで達すると、ポリメラーゼによってプローブが加水分解され、プローブから蛍光色素が遊離して蛍光を発する。従って、加水分解プローブ法においては、ポリメラーゼによるプライマーの伸張反応がプローブのハイブリダイズする位置に達する前に、プローブが鋳型とハイブリダイズしている必要がある。プローブの鋳型へのハイブリダイズは、プローブの長さが短いほど速やかに起こることが知られている。そこで、ヌクレオチド長が最も短いプローブを選択するために、クライテリア１５を設定した。
【実施例８】
【００９４】
［本発明のプライマー対の選定］
（１）プライマー候補の選定
プライマー設計プログラムＰｒｉｍｅｒ３を用いてヒトＡｌｕモデル配列から、複数のプライマー候補配列を選定した。具体的には、Ｐｒｉｍｅｒ３において、以下のｉ）〜iii）のパラメータのみ設定を変更し、それ以外は全てデフォルトの設定を用いて、ヒトＡｌｕモデル配列（ポジション＃１〜＃３００）を入力した。
ｉ）Task値：pick_primer_list
ii）Numbers To Return値：150
iii）Mispriming Library (repeat library)値：RODENT_AND_SIMPLE
上記ｉ）及びii）の設定は、設計できる全てのプライマー配列を得るためのものであり、上記iii）の設定はげっ歯類配列との交叉を避けるためのものである。この選定の結果、１０６個のフォワードプライマー候補、及び１０２個のリバースプライマー候補が得られた。【００９５】
（２）クライテリア１〜４を用いた選定
クライテリア１によるフォワードプライマーの選定は図８を用いて行った。具体的には、選定の対象となるプライマー候補の５’末端が図８の白で示されたポジション（ポジション＃３６、４２〜５６、６３〜６７、８５、８８〜９５、９９〜１１１、１２１〜１２７、１３７〜１３９、１８７〜２３８、２４４〜２４９、及び２５２〜２６０）である場合には該フォワードプライマーはクライテリア１を満たすと判断し、選定の対象となるフォワードプライマー候補の５’末端が図８のグレーで示されたポジション（ポジション＃１〜３５、３７〜４１、５７〜６２、６８〜８４、８６、８７、９６〜９８、１１２〜１２０、１２８〜１３６、１４０〜１８６、２３９〜２４３、２５０、２５１、及び２６１〜２６４）である場合には該フォワードプライマーはクライテリア１を満たさないと判断した。また、クライテリア１によるリバースプライマーの選定においては、選定の対象となるプライマー候補の３’末端が図８の白で示されたポジション（ポジション＃３６、４２〜５６、６３〜６７、８５、８８〜９５、９９〜１１１、１２１〜１２７、１３７〜１３９、１８７〜２３８、２４４〜２４９、及び２５２〜２６０）である場合には該フォワードプライマー候補はクライテリア１を満たすと判断し、選定の対象となるフォワードプライマー候補の３’末端が図８のグレーで示されたポジション（ポジション＃１〜３５、３７〜４１、５７〜６２、６８〜８４、８６、８７、９６〜９８、１１２〜１２０、１２８〜１３６、１４０〜１８６、２３９〜２４３、２５０、２５１、及び２６１〜２６４）である場合には該フォワードプライマー候補はクライテリア１を満たさないと判断した。この結果、上記１０６個のフォワードプライマー候補から、クライテリア１を満たすものとして４９個の候補を選定し、また、上記１０２個のリバースプライマー候補から、クライテリア１を満たすものとして４８個の候補を選定した。【００９６】
続いて、クライテリア２〜４による選定を目視にて行った結果、上記１０６個のフォワードプライマー候補のうち、クライテリア２を満たすものは６４個、クライテリア３を満たすものは６８個、クライテリア４を満たすものは９３個であり、クライテリア１〜４を全て満たすものは１２個であった。さらに、上記１０２個のリバースプライマー候補のうち、クライテリア２を満たすものは５９個、クライテリア３を満たすものは６８個、クライテリア４を満たすものは７９個であり、クライテリア１〜４を全て満たすものは１４個であった。
さらに、以上のようにして選定されたプライマー候補のうち、ヒトＡｌｕモデル配列のポジション＃１８７又は＃１９３を開始点とする２つのフォワードプライマー候補は、対になるリバースプライマーが存在しないために除外し、また、ヒトＡｌｕモデル配列のポジション＃８３、８４、又は８５を開始点とする６つのリバースプライマーは、対となるフォワードプライマーが存在しないために除外した。以上の結果、クライテリア１〜４を満たすフォワードプライマー候補として表１に示す１０個のヌクレオチド配列を、クライテリア１〜４を満たすリバースプライマー候補として表２に示す８個のヌクレオチド配列を選定した。【００９７】
【表１】
2018101375.tif 000002
【００９８】
【表２】
2018101375.tif 000003
【００９９】
（３）クライテリア５〜７を用いた選定
Rochester大学のMathews Lab（http://rna.urmc.rochester.edu/index.html）から提供される二次構造予測プログラムRNAstructure（RNAstructure version 5.6）を用いて、表１及び表２に示されるプライマー候補の中からクライテリア５〜７を満たす組合せを選定した。
具体的には、まず、表１及び表２に示されるプライマー候補のそれぞれについて、同一のヌクレオチド配列からなる２つの分子間で形成される二次構造をRNAstructureにより予測し、ｉ）いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；ii）いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；iii）いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；というｉ）〜iii）の条件を満たすプライマー候補を選定した。その結果、表１に記載の１０個のフォワードプライマー候補のうち、上記ｉ）を満たすものは７個、上記ii）を満たすものは１０個、上記iii）を満たすものは１０個であり、上記ｉ）〜iii）を全て満たすものは７個であった。また、表２に記載の８個のリバースプライマー候補のうち、上記ｉ）を満たすものは８個、上記ii）を満たすものは６個、上記iii）を満たすものは５個であり、上記ｉ）〜iii）を全て満たすものは５個であった。
以上の解析により、上記ｉ）〜iii）を全て満たすと判断された７個のフォワードプライマー候補と、５個のリバースプライマー候補とを選定し、続いて、フォワード及びリバースプライマーの組合せの二次構造予測を行った。これらのフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せとして考えられる３５パターンについて、それぞれの二次構造をRNAstructureにより予測し、上記ｉ）〜iii）の条件を全て満たす組合せを探した。その結果、フォワードプライマー候補Ｆ１０とリバースプライマー候補Ｒ１との組合せのみが上記ｉ）〜iii）を全て満たすことが分かった。以上の結果から、クライテリア１〜７を満たすプライマーとして、フォワードプライマーＦ１０（ＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＴ；配列番号１８）及びリバースプライマーＲ１（ＧＧＴＴＣＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣ；配列番号１９）が選定された。
【実施例９】
【０１００】
［本発明のプローブの選定］
（１）プローブの必要性について
リアルタイムＰＣＲにおいて蛍光を検出する方法としては、増幅産物に非特異的に結合する試薬を用いるインターカレーター法と、増幅産物に特異的なヌクレオチド配列に結合する試薬を用いるプローブ法の２種類がある。インターカレーター法では非特異的なヌクレオチド配列も検出されてしまうため、特異性の観点からプローブ法の方が優れていると一般的に考えられている。また、本発明では、リアルタイムＰＣＲによりサンプルに含まれるＡｌｕのコピー数を測定することを目指しているが、ゲノム中ではＡｌｕ同士の距離が２０ヌクレオチド以下となるような非常に近い位置に存在する場合も多いため（Stenger, J.E., Lobachev, K.S., Gordenin, D., Darden, T.A., Jurka, J. and Resnick, M.A. (2001) Biased distribution of inverted and direct Alus in the human genome: implications for insertion, exclusion, and genome stability. Genome Res, 11, 12-27.）、ＰＣＲ酵素の伸張時間などによって単一のＡｌｕのみを増幅する条件を設定することはほとんど不可能である。このため、本発明者らは、リアルタイムＰＣＲによるＡｌｕ定量のためにはプローブ法が適していると考え、実施例８で選定したフォワード及びリバースプライマー（Ｆ１０及びＲ１）と組み合わせて使用するプローブの選定を行った。【０１０１】
（２）プローブ候補の選定
プライマー設計プログラムＰｒｉｍｅｒ３を用いて、フォワードプライマーＦ１０及びリバースプライマーＲ１により増幅される領域におけるプローブ候補を選定した。具体的には、Ｐｒｉｍｅｒ３において、以下のｉ）〜vii）のパラメータのみ設定を変更し、それ以外は全てデフォルトの設定を用いて、ヒトＡｌｕモデル配列のポジション＃１２０〜＃１８６のヌクレオチド配列を入力した。
ｉ）Pick left primer, or use left primer below値：チェックを外す
ii）Pick right primer, or use right primer below (5' to 3' on opposite strand)値：チェックを外す
iii）Pick hybridization probe (internal oligo), or use oligo below値：チェックする
iv）Task値：pick_primer_list
ｖ）Numbers To Return値：100
vi）Internal Oligo Mishyb Library値：RODENT_AND_SIMPLE
vii）Internal Oligo TmのMax値：68℃
上記ｉ）〜vii）の設定はプローブを設計するためのものであり、上記iv）及びｖ）の設定は設計できる全てのプライマー配列を得るためのものであり、上記vi）の設定はげっ歯類配列との交叉を避けるためのものである。また、上記vii）の設定は、プローブのＴｍ値はプライマーのＴｍより１０℃程度高いことが望ましいという報告に基づいたものである(Holland, P.M., Abramson, R.D., Watson, R. and Gelfand, D.H. (1991) Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A, 88, 7276-7280.、Bustin, S.A. (2000) Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of molecular endocrinology, 25, 169-193.)。この選定の結果、７６個のプローブ候補が得られた。【０１０２】
（３）クライテリア８及び９を用いた選定
クライテリア８によるプローブの選定は、クライテリア１と同様に、図８を用いて行った。具体的には、選定の対象となるプローブ候補の５’末端が図８の白で示されたポジション（ポジション＃３６、４２〜５６、６３〜６７、８５、８８〜９５、９９〜１１１、１２１〜１２７、１３７〜１３９、１８７〜２３８、２４４〜２４９、及び２５２〜２６０）である場合には該プローブ候補はクライテリア８を満たすと判断し、選定の対象となるプローブ候補の５’末端が図８のグレーで示されたポジション（ポジション＃１〜３５、３７〜４１、５７〜６２、６８〜８４、８６、８７、９６〜９８、１１２〜１２０、１２８〜１３６、１４０〜１８６、２３９〜２４３、２５０、２５１、及び２６１〜２６４）である場合には該プローブ候補はクライテリア８を満たさないと判断した。その結果、上記７６個のプローブ候補のうち、２５個がクライテリア８を満たすことが分かった。さらに、この２５個のプローブ候補から、クライテリア９による選定を目視にて行い、２０個のプローブ候補を選定した。
選定された２０個のプローブ候補はいずれもヒトＡｌｕモデル配列のポジション＃１２１〜＃１４６の領域内のヌクレオチド配列であった。ここで、本発明者らは、ヒトＡｌｕモデル配列のポジション＃１２１〜＃１４６の領域中に、マウス、ラット、及びギニアピッグのゲノム中の１９ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列が含まれていないかを再度確認した。具体的には、ヒトＡｌｕモデル配列のポジション＃１２１〜＃１４６のヌクレオチド配列を入力配列として、マウス、ラット、及びギニアピッグのゲノム全体のＢＬＡＳＴ検索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を行った。使用した検索データベースは、以下の通りである。
マウスゲノム：all assemblies top-level, Annotation Release 105
ラットゲノム：all assemblies, Annotation Release 105
ギニアピッグゲノム：Cavpor3.0 reference Annotation Release 102
探索パラメータは、以下を除いて初期パラメータで行った。
Program selection：Megablast
Short queries： off
Word size： 16;
Match/Mismatch Scores：1, -4
Gap Costs：5, 2
Filters and Masking：off
このＢＬＡＳＴ検索の結果、ヒトＡｌｕモデル配列のポジション＃１２８を開始点とする１９ヌクレオチドのヌクレオチド配列（ポジション＃１２８〜＃１４６）と１００％マッチするヌクレオチド配列が、げっ歯類ゲノム中に存在することが新たに分かった。この結果を考慮すると、クライテリア８及び９の両方を満たすプローブ候補は以下の表３に示す１３個に絞られた。また、プローブはセンス鎖・アンチセンス鎖のどちらであってもよいので、表３に示す１３個のプローブ配列に加えて、表４に示すそれらの相補配列もプローブ候補として選定した。【０１０３】
【表３】
2018101375.tif 000004
【０１０４】
【表４】
2018101375.tif 000005
【０１０５】
（４）クライテリア１０及び１１を用いた選定
Rochester大学のMathews Lab（http://rna.urmc.rochester.edu/index.html）から提供される二次構造予測プログラムRNAstructure（RNAstructure version 5.6）を用いて、表３及び４に示されるプローブ候補の中からクライテリア１０及び１１を満たすものを選定した。具体的には、まず、表３及び表４に示される２６個のプローブ候補のそれぞれについて、同一のヌクレオチド配列からなる２つの分子間で形成される二次構造をRNAstructureにより予測し、ｉ）いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；ii）いずれか一方の分子に含まれる連続する５ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；というｉ）及びii）の条件を満たすか否かを確認した。その結果、表３及び４に記載の２６個のプローブ候補全てが、上記ｉ）及びii）を満たすことが分かった。
次に、表３及び表４に示される２６個のプローブ候補のそれぞれと、フォワードプライマーＦ１０及びリバースプライマーＲ１との間で形成される二次構造をRNAstructureにより予測し、上記ｉ）及びii）の条件を満たすか否かを確認した。その結果、表３及び４に記載の２６個のプローブ候補全てが、上記ｉ）及びii）を満たすことが分かった。以上のことから、表３及び４に記載の２６個のプローブ候補はいずれも、クライテリア１０及び１１を満たすことが分かった。【０１０６】
本発明者らは、上記２６個のプローブは同程度のプローブとしての機能を有するであろうと予測したが、より好ましい性質を有するプローブを得るために、プローブ用補足クライテリア（クライテリア１２〜１５）を用いてさらなる選定を行った。具体的には、まず、上記２６個の候補から、クライテリア１２を満たす１３個の候補（プローブＰ１４〜Ｐ２６）を選定した。次に、これらの１３個の候補から、クライテリア１３を満たす１１個（Ｐ１６〜Ｐ２６）の候補を選定した。さらに、これらの１１個の候補から、クライテリア１４を満たす７個の候補（Ｐ１４〜Ｐ２０）を選定した。最後に、これらの７個の候補から、クライテリア１５を満たすＰ１６を選定した。図１１に、選定されたフォワードプライマーＦ１０、リバースプライマーＲ１、及びプローブＰ１６のヒトＡｌｕモデル配列における位置を示した。また、図１２に、RNAstructureを用いて予測されたフォワードプライマーＦ１０、リバースプライマーＲ１、及びプローブＰ１６の間の二次構造を示す。
また、本発明者らは、クライテリア８〜１５を満たすＰ１６は最もプローブに適していると考えられるが、クライテリア８〜１１、１３、及び１５を満たすＰ１１とＰ１３、クライテリア８〜１３、及び１５を満たすＰ２１も、Ｐ１６と同程度のプローブとしての機能を果たすであろうと予測した。したがって、本発明者らは、Ｐ１１、Ｐ１３、Ｐ１６、及びＰ２１を本発明のプローブとして選択した。
【実施例１０】
【０１０７】
［本発明のプライマー・プローブセットＡ〜Ｄ］
以上のようにして、本発明のＡｌｕ−ｑＰＣＲに用いるフォワードプライマーとしてＦ１０（ＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＴ；配列番号１８）が、リバースプライマーとしてＲ１（ＧＧＴＴＣＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣ；配列番号１９）が、プローブとしてＰ１１（ＡＴＡＣＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣＣＧＧＧＣＧ；配列番号３７）、Ｐ１３（ＴＡＣＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣＣＧＧＧＣＧＴ；配列番号３９）、Ｐ１６（ＣＧＣＣＣＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＡＴ；配列番号４２）、及びＰ２１（ＡＣＧＣＣＣＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＡ；配列番号４７）が選定された。
以下、プローブＰ１６、フォワードプライマーＦ１０、及びリバースプライマーＲ１の組合せを「本発明のプライマー・プローブセットＡ」と、プローブＰ１１、フォワードプライマーＦ１０、及びリバースプライマーＲ１の組合せを「本発明のプライマー・プローブセットＢ」、プローブＰ１３、フォワードプライマーＦ１０、及びリバースプライマーＲ１の組合せを「本発明のプライマー・プローブセットＣ」と、プローブＰ２１、フォワードプライマーＦ１０、及びリバースプライマーＲ１の組合せを「本発明のプライマー・プローブセットＤ」と、それぞれ称する場合がある。さらに、上記本発明のプライマー・プローブセットＡ〜Ｄを総称して「本発明の２０ｎｔのプライマー・プローブセット」と称する場合がある。
【実施例１１】
【０１０８】
［本発明のプライマー・プローブセットＡの感度及び特異性の確認］
（１）リアルタイムＰＣＲの条件
フォワードプライマーＦ１０、リバースプライマーＲ１、及びプローブＰ１６を合成し、さらに、プローブは５’末端をＦＡＭで、３’末端をＢＨＱ１でそれぞれ標識した。また、実施例３に記載のテンプレート１〜４に加えて、以下のテンプレート５及び６を用いた（なお、テンプレート５及び６の調製にはＴＥバッファーを用いた）。
テンプレート５：５０ｎｇ／μＬのラットゲノムＤＮＡ
テンプレート６：０．５ｆｇ／μＬから５ｎｇ／μＬまでの８段階の濃度のヒトゲノムＤＮＡと、ラットゲノムＤＮＡとをトータルで５０ｎｇ／μＬの濃度となるように調製した混合スタンダードサンプル
本発明のプライマー・プローブセットＡと上記テンプレート１〜６とを用いて以下のようにＰＣＲサンプルを調製した。
テンプレート                            ２μＬ
TaqMan Universal Master MixII, no UNG
（Applied Biosystems社製）              １０μＬ
フォワードプライマー（１０μＭ）        ０．４μＬ
リバースプライマー（１０μＭ）          ０．４μＬ
プローブ（１２．５μＭ）                ０．５μＬ
水                                      ６．７μＬ
トータル  ２０μＬ
７５００  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Applied Biosystems社製）を用いて、以上のように調製したＰＣＲサンプルのリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間の熱変性の後、９５℃で１５秒、５６℃で３０秒、及び７２℃で３０秒のサイクルを５０回繰り返した。なお、テンプレート及びサンプルの調製は、微量のＤＮＡが失われないように低吸着チューブ及びチップを用いて行った。【０１０９】
（２）本発明のプライマー・プローブセットＡによるリアルタイムＰＣＲの結果
図１３〜１５に結果を示す。テンプレート１を用いたリアルタイムＰＣＲの結果、Ｃｔ値は４０程度か、又は、シグナルが全く検出されない場合もあった（図１３及び１４の「Ｂｕｆ．」）。これらの結果は、本発明のプライマー・プローブセットＡにおいてはプライマー／プローブ間の非特異的な結合が殆ど形成されないことを示唆する。また、テンプレート２及び５を用いたリアルタイムＰＣＲにおいても、Ｃｔ値は４０以上であった（図１４の「Ｍｏｕｓｅ」、図１５の「Ｒａｔ」）。これらの結果は、本発明のプライマー・プローブセットＡはマウス及びラットゲノムＤＮＡのいずれにも非特異的に結合することがほとんどないことを示している。
さらに、テンプレート３のリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づいて検量線を作成すると、ヒトゲノムＤＮＡの量が０．１ｆｇ〜１ｎｇの間で直線性が認められた（図１３）。すなわち、テンプレートがヒトゲノムＤＮＡのみを含む場合には、本発明のプライマー・プローブセットＡにより０．１ｆｇまでの検出が可能であることが明らかとなった。また、テンプレート４のリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づいて検量線を作成すると、ヒトゲノムＤＮＡの量が１ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた（図１４）。さらに、テンプレート６のリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づいて検量線を作成すると、ヒトゲノムＤＮＡの量が１ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた（図１５）。すなわち、ヒトゲノムＤＮＡとマウス又はラットゲノムＤＮＡとを含むサンプルをテンプレートとして用いた場合であっても、本発明のプライマー・プローブセットＡにより１ｆｇのヒトゲノムＤＮＡを検出することが可能であることが明らかとなった。これらの結果から、本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲにより、ほぼ理論的検出限界に近い感度でＡｌｕを検出・定量することが可能であることが示された。
【実施例１２】
【０１１０】
［本発明のプライマー・プローブセットＣの感度及び特異性の確認］
フォワードプライマーＦ１０、リバースプライマーＲ１、及びプローブＰ１３を合成し、さらに、プローブは５’末端をＦＡＭで、３’末端をＢＨＱ１でそれぞれ標識した。また、本発明のプライマー・プローブセットＣと、上記テンプレート１、３、５、及び６とを用いて実施例１１と同様にＰＣＲサンプルを調製し、７５００ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Applied Biosystems社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間の熱変性の後、９５℃で１５秒、５６℃で３０秒、及び７２℃で３０秒のサイクルを５０回繰り返した。なお、テンプレート及びサンプルの調製は、微量のＤＮＡが失われないように低吸着チューブ及びチップを用いて行った。【０１１１】
（１）本発明のプライマー・プローブセットＣによるリアルタイムＰＣＲの結果
図１６に結果を示す。テンプレート１を用いたリアルタイムＰＣＲの結果、Ｃｔ値は５０程度であった（図１６の「Ｂｕｆ．」）。これの結果は、本発明のプライマー・プローブセットＣにおいてはプライマー／プローブ間の非特異的な結合が殆ど形成されないことを示唆する。また、テンプレート５を用いたリアルタイムＰＣＲにおいても、Ｃｔ値は４０以上であった（図１６の「Ｒａｔ」）。これらの結果は、本発明のプライマー・プローブセットＣはラットゲノムＤＮＡに非特異的に結合することがほとんどないことを示している。
さらに、テンプレート６のリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づいて検量線を作成すると、ヒトゲノムＤＮＡの量が１ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた（図１６）。すなわち、テンプレートがヒトゲノムＤＮＡとラットゲノムＤＮＡとを含む場合であっても、本発明のプライマー・プローブセットＣにより１ｆｇのヒトゲノムＤＮＡを検出することが可能であることが明らかとなった。これらの結果から、本発明のプライマー・プローブセットＣを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲにより、ほぼ理論的検出限界に近い感度でＡｌｕを検出・定量することが可能であることが示された。
【実施例１３】
【０１１２】
［本発明のプライマー・プローブセットＤの感度及び特異性の確認］
フォワードプライマーＦ１０、リバースプライマーＲ１、及びプローブＰ２１を合成し、さらに、プローブは５’末端をＦＡＭで、３’末端をＢＨＱ１でそれぞれ標識した。また、本発明のプライマー・プローブセットＤと、上記テンプレート１、３、５、及び６とを用いて実施例１１と同様にＰＣＲサンプルを調製し、７５００ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Applied Biosystems社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間の熱変性の後、９５℃で１５秒、５６℃で３０秒、及び７２℃で３０秒のサイクルを５０回繰り返した。なお、テンプレート及びサンプルの調製は、微量のＤＮＡが失われないように低吸着チューブ及びチップを用いて行った。【０１１３】
（１）本発明のプライマー・プローブセットＤによるリアルタイムＰＣＲの結果
図１７に結果を示す。テンプレート１を用いたリアルタイムＰＣＲの結果、Ｃｔ値は検出できなかった（図１７の「Ｂｕｆ．」）。これの結果は、本発明のプライマー・プローブセットＤにおいてはプライマー／プローブ間の非特異的な結合が殆ど形成されないことを示唆する。また、テンプレート５を用いたリアルタイムＰＣＲにおいても、Ｃｔ値は４０以上であった（図１７の「Ｒａｔ」）。これらの結果は、本発明のプライマー・プローブセットＤはラットゲノムＤＮＡに非特異的に結合することがほとんどないことを示している。
さらに、テンプレート６のリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づいて検量線を作成すると、ヒトゲノムＤＮＡの量が１ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた（図１７）。すなわち、テンプレートがヒトゲノムＤＮＡとラットゲノムＤＮＡとを含む場合であっても、本発明のプライマー・プローブセットＤにより１ｆｇのヒトゲノムＤＮＡを検出することが可能であることが明らかとなった。これらの結果から、本発明のプライマー・プローブセットＤを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲにより、ほぼ理論的検出限界に近い感度でＡｌｕを検出・定量することが可能であることが示された。
【実施例１４】
【０１１４】
［マウスに異種移植したヒト細胞の検出］
（１）異種移植モデルマウスの作製とＤＮＡの抽出
ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウス（７週齢、雄）の尾静脈に、５０万細胞のヒト間葉系幹細胞（ヒトＭＳＣ）を注射投与して異種移植モデルマウスを作製した（計１８例）。投与から１日、３日、及び１週間後にマウスを安楽死させて肺、腎臓、肝臓を摘出し（各６例ずつ）、すぐに液体窒素で凍結させて−８０℃で保存した。各臓器を凍結粉砕して、２００μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａ及び１０００Ｕ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ｔ１を含むＬｙｓｉｓバッファーを加え、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、プロテイナーゼＫ溶液（和光純薬工業社製）を最終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるよう加え、５０℃で２晩インキュベートした後に、同量のＰＣＩ（ナカライテスク社製）を加えてボルテックスで混和した。遠心分離（最大速度、４℃、１５分間）して、水層（上層）を回収し、再度ＰＣＩを加えてボルテックスで混和して遠心分離（最大速度、４℃、１５分間）した。水層を回収して、０．２倍量の１０Ｍ酢酸アンモニウム（Nippon Gene社製）及び２．５倍量の１００％ＥｔＯＨ（和光純薬社製）を加えて転倒混和した後に、遠心分離した（最大速度、４℃、１５分間）。上清を完全に除去して７０％ＥｔＯＨで洗浄し、ペレットを１０分間風乾させた後に、ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）を適量加えてペレットを溶解させた。得られたサンプル中に含まれるＤＮＡ濃度をＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ＤＮＡ定量法により測定した。また、ヒトＭＳＣを投与していないコントロールマウス（計３例）からも肺、腎臓、及び肝臓を採取し、上記と同様の方法でゲノムＤＮＡを抽出して定量した。【０１１５】
（２）テンプレートの調製
上記（１）により抽出したゲノムＤＮＡを用いて、以下のようにテンプレート７〜１５を調製した。なお、テンプレート９、１２、及び１５は定量対象サンプルであり、異種移植モデルマウスの各臓器から抽出したゲノムＤＮＡを５０ｎｇ／μＬとなるように希釈して作製した。テンプレート７、１０、及び１３はそれぞれ、テンプレート９、１２、及び１５に対応するネガティブコントロールサンプルである。また、テンプレート８、１１、及び１４はそれぞれ、テンプレート９、１２、及び１５の定量のための検量線を作成するためのスタンダードサンプルサンプルである。なお、テンプレート７〜１５の調製にはＴＥバッファーを用いた。
テンプレート７：
５０ｎｇ／μＬのコントロールマウスの肺由来のゲノムＤＮＡ
テンプレート８：
０．５ｆｇ／μＬから５ｎｇ／μＬまでの８段階の濃度のヒトゲノムＤＮＡと、コントロールマウスの肺由来のゲノムＤＮＡとをトータルで５０ｎｇ／μＬの濃度となるように調製した混合スタンダードサンプル
テンプレート９：
ヒトＭＳＣ移植後１日、３日、又は１週間後の異種移植モデルマウスの肺由来のゲノムＤＮＡを５０ｎｇ／μＬの濃度で含むサンプル
テンプレート１０：
５０ｎｇ／μＬのコントロールマウスの腎臓由来のゲノムＤＮＡ
テンプレート１１：
０．５ｆｇ／μＬから５ｎｇ／μＬまでの８段階の濃度のヒトゲノムＤＮＡと、コントロールマウスの腎臓由来のゲノムＤＮＡとをトータルで５０ｎｇ／μＬの濃度となるように調製した混合スタンダードサンプル
テンプレート１２：
ヒトＭＳＣ移植後１日、３日、又は１週間後の異種移植モデルマウスの腎臓由来のゲノムＤＮＡを５０ｎｇ／μＬの濃度で含むサンプル
テンプレート１３：
５０ｎｇ／μＬのコントロールマウスの肝臓由来のゲノムＤＮＡ
テンプレート１４：
０．５ｆｇ／μＬから５ｎｇ／μＬまでの８段階の濃度のヒトゲノムＤＮＡと、コントロールマウスの肝臓由来のゲノムＤＮＡとをトータルで５０ｎｇ／μＬの濃度となるように調製した混合スタンダードサンプル
テンプレート１５：
ヒトＭＳＣ移植後１日、３日、又は１週間後の異種移植モデルマウスの肝臓由来のゲノムＤＮＡを５０ｎｇ／μＬの濃度で含むサンプル【０１１６】
（３）リアルタイムＰＣＲ
本発明のプライマー・プローブセットＡと、上記テンプレート７〜１５とを用いて実施例１１と同様にＰＣＲサンプルを調製し、７５００ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Applied Biosystems社製）を用いて、調製したサンプルのリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間の熱変性の後、９５℃で１５秒、５６℃で３０秒、及び７２℃で３０秒のサイクルを５０回繰り返した。なお、テンプレート及びサンプルの調製は、微量のＤＮＡが失われないように低吸着チューブ及びチップを用いて行った。【０１１７】
（４）異種移植モデルマウスの肺に含まれるヒト細胞の算出
テンプレート８により得られたＣｔ値に基づいて検量線を作成したところ、ヒトゲノムＤＮＡの量が１０ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた（図１８（ａ））。この検量線に基づいて、テンプレート９に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を算出した。その結果、ＭＳＣ移植１日、３日、１週間後のサンプルには、それぞれ、平均２４．７７５ｐｇ／μＬ、３．１８６ｐｇ／μＬ、及び０．２３２ｐｇ／μＬのヒトゲノムＤＮＡが含まれていることが明らかとなった。また、この数値に、テンプレート９を調製の際の希釈倍率と、肺から抽出したゲノムＤＮＡの全容量（μＬ）とを乗じて、異種移植モデルマウスの肺全体に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を算出した。その結果、ＭＳＣ移植１日、３日、１週間後の肺全体には、それぞれ、７９３４５．５２７ｐｇ、８８５１．０７１ｐｇ、及び６７４．７６５ｐｇのヒトゲノムＤＮＡが含まれることが明らかとなった。さらに、１個のヒト細胞に含まれるゲノムＤＮＡの重量を６ｐｇとして、異種移植モデルマウスの肺全体に含まれるヒトＭＳＣの数を算出した。その結果、ボックスプロットにおける中央値で、ＭＳＣ移植１日後の肺には１万個以上のＭＳＣが存在するが、３日後には１３１６個、１週間後には７４個に減少することが分かった（図１８（ｂ））。【０１１８】
（５）異種移植モデルマウスの腎臓に含まれるヒト細胞の算出
テンプレート１１により得られたＣｔ値に基づいて検量線を作成したところ、ヒトゲノムＤＮＡの量が１ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた（図１９（ａ））。この検量線に基づいて、テンプレート１２に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を算出した。その結果、ＭＳＣ移植１日、３日、１週間後のサンプルには、それぞれ、平均０．０７８２ｐｇ／μＬ、０．００９５ｐｇ／μＬ、及び０．００１４ｐｇ／μＬのヒトゲノムＤＮＡが含まれていることが明らかとなった（図１９（ａ））。また、この数値に、テンプレート１２を調製の際の希釈倍率と、腎臓から抽出したゲノムＤＮＡの全容量（μＬ）とを乗じて、異種移植モデルマウスの腎臓全体に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を算出した。その結果、ＭＳＣ移植１日、３日、１週間後の腎臓全体には、それぞれ、１２６０．５９８９ｐｇ、１６５．４５６７ｐｇ、及び２５．８３３３ｐｇのヒトゲノムＤＮＡが含まれることが明らかとなった。さらに、１個のヒト細胞に含まれるゲノムＤＮＡの重量を６ｐｇとして、異種移植モデルマウスの腎臓全体に含まれるヒトＭＳＣの数を算出した。その結果、ボックスプロットにおける中央値で、ＭＳＣ移植１日後の腎臓には１９１個のＭＳＣが存在しており、３日後には２２個、１週間後には４個に減少することが分かった（図１９（ｂ））。以上のことから、異種移植モデルマウスにおいて、移植から１週間後でもＭＳＣが腎臓に存在していることが明らかとなった。従来の報告では、尾静注によってヒト細胞を移植された異種移植モデルマウスにおいては、肺以外にはヒト細胞の生着は認められないとされていた。図１９に示す結果は、移植されたヒトＭＳＣが、マウス腎臓に生着することを示すはじめての結果である。【０１１９】
（６）異種移植モデルマウスの肝臓に含まれるヒト細胞の算出
テンプレート１４により得られたＣｔ値に基づいて検量線を作成したところ、ヒトゲノムＤＮＡの量が１０ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた（図２０（ａ））。この検量線に基づいて、テンプレート１５に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を算出した。その結果、ＭＳＣ移植１日後のサンプルには、平均０．０２３ｐｇ／μＬのヒトゲノムＤＮＡが含まれていることが明らかとなった（図２０（ａ））。３日後、１週間後のサンプルは検出限界以下であった。また、この数値に、テンプレート１５を調製の際の希釈倍率と、肝臓から抽出したゲノムＤＮＡの全容量（μＬ）とを乗じて、異種移植モデルマウスの肝臓全体に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を算出した。その結果、ＭＳＣ移植１日後の肝臓全体には、７１５．９４０ｐｇのヒトゲノムＤＮＡが含まれることが明らかとなった。さらに、１個のヒト細胞に含まれるゲノムＤＮＡの重量を６ｐｇとして、異種移植モデルマウスの肝臓全体に含まれるヒトＭＳＣの数を算出した。その結果、ボックスプロットにおける中央値で、ＭＳＣ移植１日後の肝臓には１０７個のＭＳＣが存在していたが、３日後及び１週間後では検出限界以下となることが分かった（図２０（ｂ））。
【実施例１５】
【０１２０】
［マウス腎皮膜下に移植したヒト細胞の検出］
（１）腎皮膜下移植モデルマウスの作製とＤＮＡの抽出
培養したヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ細胞）をＰＢＳ中に懸濁して段階希釈することにより、１０００細胞／５０μＬ、１００細胞／５０μＬ、及び１０細胞／５０μＬの細胞懸濁液を調製した。イソフルランを用いてマウスに麻酔をかけ、背部を切って腎臓を露出させた後、腎皮膜を破らないように注射針（３０Ｇ）を刺し、上記細胞懸濁液（それぞれ５０μＬ）を注射投与した。手術部位を縫合して１２時間後にマウスを安楽死させ、腎臓を摘出し、すぐに液体窒素で凍結させて−８０℃で保存した。実施例１４と同様の方法により、腎臓からゲノムＤＮＡを抽出して濃度を測定した。【０１２１】
（２）テンプレートの調製とリアルタイムＰＣＲ
上記（１）により抽出したゲノムＤＮＡを用いて、以下のようにテンプレート１６及び１７を調製した。テンプレート１７は定量対象サンプルであり、テンプレート１６は検量線を作成するためのスタンダードサンプルサンプルである。これらのテンプレートと本発明のプライマー・プローブセットＡとを用いて、実施例１４と同様の条件でＰＣＲを行った。なお、テンプレート１６及び１７の調製にはＴＥバッファーを用いた。
テンプレート１６：
腎皮膜下移植モデルマウスの腎臓由来のゲノムＤＮＡを５０ｎｇ／μＬの濃度で含むサンプル
テンプレート１７：
０．５ｆｇ／μＬから５ｎｇ／μＬまでの８段階の濃度のヒトゲノムＤＮＡと、コントロールマウスの腎臓由来のゲノムＤＮＡとをトータルで５０ｎｇ／μＬの濃度となるように調製した混合スタンダードサンプル【０１２２】
（３）腎皮膜下移植モデルマウスに含まれるヒト細胞の算出
上記ＰＣＲによって、１０、１００、及び１０００細胞のＮＨＤＦ細胞が移植されたマウス腎臓におけるヒトゲノムＤＮＡ量を定量した。ＰＣＲの結果に基づいて、各マウス腎臓におけるヒト細胞の数を算出したところ、１０細胞を移植した腎臓では３個程度の、１００細胞を移植した腎臓では５０個程度の、１０００細胞を移植した腎臓では３００個程度のヒト細胞が存在することが明らかとなった（図２１）。
【実施例１６】
【０１２３】
［様々な動物種ゲノムに対する本発明のプライマー・プローブセットＡの交叉性］
本発明のプライマー・プローブセットＡが、様々な動物種ゲノムに対して交叉する可能性を調べた。具体的には、フォワードプライマーＦ１０（ＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＴ；配列番号１８）、リバースプライマーＲ１（ＧＧＴＴＣＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣ；配列番号１９）、及びプローブＰ１６（ＣＧＣＣＣＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＡＴ；配列番号４２）のそれぞれに含まれる１６〜２０ヌクレオチドの配列について、様々な生物種（マウス、ラット、ギニアピッグ、クマ、ウシ、ウサギ、ニワトリ、ブタ、及び微生物）のゲノム全体に対するＢＡＬＳＴ検索を行った。使用した検索データベースは、以下の通りである。
マウスゲノム：GPIPE/10090/105/all_top_level
ラットゲノム：GPIPE/10116/105/all_top_level
ギニアピッグゲノム：GPIPE/10141/102/ref_top_level
クマゲノム：GPIPE/29073/100/ref_top_level
ウシゲノム：GPIPE/9913/105/ref_top_level
ウサギ：GPIPE/9986/102/ref_top_level
ニワトリ：GPIPE/9031/103/ref_top_level
ブタ：GPIPE/9823/105/ref_top_level
微生物：prok_complete_genomes及びref_prok_rep_genomes
探索パラメータは、以下を除いて初期パラメータで行った。
Program selection：Megablast
Short queries： off
Word size： 16;
Match/Mismatch Scores：1, -4
Gap Costs：5, 2
Filters and Masking：off【０１２４】
ＢＬＡＳＴ検索の結果、フォワードプライマーＦ１０、リバースプライマーＲ１、及びプローブＰ１６に含まれる１６以上の連続する配列は、マウス、ラット、ギニアピッグ、クマ、ウシ、ウサギ、ニワトリ、ブタ、及び微生物のいずれにも殆ど存在しないことが明らかとなった（図２２）。なお、図２２に示すように、ウシ及び微生物のゲノム中には、上記本発明のプライマーと２０塩基連続して同一の配列が見いだされた。しかし、これらの結果は、ウシ及び微生物ゲノムのデータベースにヒトゲノム配列の一部が誤って登録されていることに起因するものである可能性が高いと考えられる。なぜなら、微生物ゲノムにおける当該配列の周辺を詳細に調べると、かかる配列は、１）Ａｌｕモデル配列全体と相同性を示し、また、２）微生物ゲノム中の位置が不明で孤立しており、さらに、３）ヒトゲノム配列との相同性が極めて高いものであるからである。これらの結果から、本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲにより、様々な動物種のゲノムＤＮＡが混在するサンプルにおいてもＡｌｕを特異的に検出・定量できることが示された。
【実施例１７】
【０１２５】
［断片化されたヒトゲノムＤＮＡ（２０ｋｂｐ〜２５０ｂｐ）の定量］
（１）ヒトゲノムＤＮＡの断片化
本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲにより、断片化されたヒトゲノムＤＮＡをどの程度の感度で定量することが可能かを調べた。具体的には、DNA Shearing システム M220（コバリス社製）を用いて、ヒトゲノムＤＮＡを３つのサイズ（２０ｋｂｐ、１０００ｂｐ、及び２５０ｂｐ）に断片化した。そして、LabChip GX Touchシステム(パーキンエルマー社製)を用いて、ＤＮＡが所望の長さに断片化されていることを確認した（図２３〜２５）。
（２）テンプレートの調製
次に、上記（１）により作製した断片化ヒトゲノムＤＮＡ（２０ｋｂｐ、１０００ｂｐ、及び２５０ｂｐ）を、EASY Dilutionバッファーを用いて段階希釈し、以下のようにテンプレート１８〜２０を調製した。
テンプレート１８：
０．０５ｆｇ／μＬから５０ｎｇまでの１０段階の濃度の、２０ｋｂｐに断片化されたヒトゲノムＤＮＡを含むサンプル
テンプレート１９：
０．０５ｆｇ／μＬから５０ｎｇまでの１０段階の濃度の、１０００ｂｐに断片化されたヒトゲノムＤＮＡを含むサンプル
テンプレート２０：
０．０５ｆｇ／μＬから５０ｎｇまでの１０段階の濃度の、２５０ｂｐに断片化されたヒトゲノムＤＮＡを含むサンプル
（３）リアルタイムＰＣＲ
本発明のプライマー・プローブセットＡと、上記テンプレート１８〜２０とを用いて実施例１１と同様にＰＣＲサンプルを調製し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（ロシュ・ライフサイエンス社製）用いてリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間の熱変性の後、９５℃で３０秒、５６℃で４分３０秒、及び７２℃で３０秒のサイクルを５回繰り返し、さらにその後、９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、及び７２℃で３０秒のサイクルを４５回繰り返した。なお、テンプレート及びサンプルの調製は、微量のＤＮＡが失われないように低吸着チューブ及びチップを用いて行った。
（４）断片化ＤＮＡに対する感度
上記（３）のリアルタイムＰＣＲの結果を図２６〜２８に示す。テンプレート１８〜２０（２０ｋｂｐ、１０００ｂｐ、及び２５０ｂｐの長さの断片化ＤＮＡを用いたスタンダードサンプル）のリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づいて検量線を作成したところ、いずれの場合でも１０ｆｇ〜１０ｎｇの間で検量線の直線性が認められた（図２６〜２８）。これらの結果から、本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲは、定量対象サンプルに含まれるＤＮＡが高度に断片化されている場合であっても、その感度を維持できることが示された。
【実施例１８】
【０１２６】
［家畜・ペット動物由来ゲノムＤＮＡが混在したサンプルにおける定量］
（１）ニワトリ、ブタ、ウシ、及びイヌゲノムＤＮＡの抽出
家畜・ペット動物由来ゲノムＤＮＡが混在したサンプルにおける、本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲの定量限界を調べた。具体的には、市販の食用ニワトリ肉、ブタ肉、及びウシ肉を液体窒素で凍結し、実施例１４と同様の方法によりそれぞれのゲノムＤＮＡを抽出して濃度を測定した。また、イヌ（ビーグル）から採取した血液（１ｍＬ）から、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（QIAGEN社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、実施例１４と同様の方法で濃度を測定した。
（２）テンプレートの調製
上記（１）により抽出したニワトリ、ブタ、ウシ、及びイヌゲノムＤＮＡを用いて、以下のようにテンプレート２１〜２８を調製した。テンプレート２１、２３、２５、及び２７はそれぞれ、テンプレート２２、２４、２６、及び２８に対応するネガティブコントロールサンプルである。
テンプレート２１：
５０ｎｇ／μＬのニワトリゲノムＤＮＡ
テンプレート２２：
０．０５ｆｇ／μＬから５０ｎｇまでの１０段階の濃度のヒトゲノムＤＮＡと、ニワトリゲノムＤＮＡとをトータルで５０ｎｇ／μＬの濃度となるように調製したニワトリゲノム混合スタンダードサンプル
テンプレート２３：
５０ｎｇ／μＬのブタゲノムＤＮＡ
テンプレート２４：
０．０５ｆｇ／μＬから５０ｎｇまでの１０段階の濃度のヒトゲノムＤＮＡと、ブタゲノムＤＮＡとをトータルで５０ｎｇ／μＬの濃度となるように調製したブタゲノム混合スタンダードサンプル
テンプレート２５：
５０ｎｇ／μＬのウシゲノムＤＮＡ
テンプレート２６：
０．０５ｆｇ／μＬから５０ｎｇまでの１０段階の濃度のヒトゲノムＤＮＡと、ウシゲノムＤＮＡとをトータルで５０ｎｇ／μＬの濃度となるように調製したウシゲノム混合スタンダードサンプル
テンプレート２７：
５０ｎｇ／μＬのイヌゲノムＤＮＡ
テンプレート２８：
０．０５ｆｇ／μＬから５０ｎｇまでの１０段階の濃度のヒトゲノムＤＮＡと、イヌゲノムＤＮＡとをトータルで５０ｎｇ／μＬの濃度となるように調製したイヌゲノム混合スタンダードサンプル【０１２７】
（３）リアルタイムＰＣＲ
本発明のプライマー・プローブセットＡと、上記テンプレート２１〜２８とを用いて実施例１１と同様にＰＣＲサンプルを調製し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（ロシュ・ライフサイエンス社製）用いてリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間の熱変性の後、９５℃で３０秒、５６℃で４分３０秒、及び７２℃で３０秒のサイクルを５回繰り返し、さらにその後、９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、及び７２℃で３０秒のサイクルを４５回繰り返した。なお、テンプレート及びサンプルの調製は、微量のＤＮＡが失われないように低吸着チューブ及びチップを用いて行った。
（４）家畜・ペット動物由来ゲノムＤＮＡ混合サンプルにおける感度
上記（３）のリアルタイムＰＣＲの結果を図２９〜３２に示す。テンプレート２２（ニワトリゲノム混合スタンダードサンプル）及び２６（ウシゲノム混合スタンダードサンプル）のリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づいて検量線を作成したところ、ヒトゲノムＤＮＡの量が１ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた（図２９及び３１）。また、テンプレート２４（ブタゲノム混合スタンダードサンプル）及び２８（イヌゲノム混合スタンダードサンプル）のリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づいて検量線を作成したところ、ヒトゲノムＤＮＡの量が１０ｆｇ〜１０ｎｇの間で直線性が認められた（図３０及び３２）。これらの結果から、本発明のプライマー・プローブセットＡを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲによれば、ニワトリ、ブタ、ウシ、及びイヌゲノムＤＮＡが多量に混在したサンプルからでも、微量のヒトゲノム（検出限界：１〜１０ｆｇ）を特異的に検出・定量することが可能であることが示された。
【実施例１９】
【０１２８】
［陳旧試料の定量］
（１）古人骨からのＤＮＡの抽出
古人骨等の陳旧試料に含まれるヒトゲノムＤＮＡは、微量かつ断片化が進んでいること、また、土壌中に存在する様々な他生物ゲノムＤＮＡによって汚染されていることから、その定量は困難であることが知られている。本実験では、本発明のＡｌｕ−ｑＰＣＲによって江戸時代（１６００〜１８００年ごろ）の古人骨由来のサンプル中に含まれるヒトゲノムＤＮＡの定量を行った。具体的には、江戸時代古人骨（畑内遺跡から出土した３個体；以下それぞれ「畑内１７号」、「畑内２６号」、「畑内４５号」と称する）からAdachi et al.（Phylogenetic analysis of the human ancient mitochondrial DNA. J. Archaeol. Sci., 31, 1339-1348. 2004）に記載の方法によって採取された試料を以下の実験に用いた。
（２）テンプレートの調製
上記（１）により抽出したゲノムＤＮＡを用いて、以下のようにテンプレート２９〜３２を調製した。なお、テンプレート３０〜３２は定量対象サンプルであり、古人骨から抽出した１μＬのゲノムＤＮＡサンプルを用いた。また、テンプレート２９は、テンプレート３０〜３２の定量のための検量線を作成するためのスタンダードサンプルサンプルである。
テンプレート２９：
０．０５ｆｇ／μＬから５０ｎｇまでの１０段階の濃度の、１ｋｂｐに断片化されたヒトゲノムＤＮＡを含むスタンダードサンプル
テンプレート３０：
畑内１７号由来のサンプル
テンプレート３１：
畑内２６号由来のサンプル
テンプレート３２：
畑内４５号由来のサンプル【０１２９】
（３）リアルタイムＰＣＲ
本発明のプライマー・プローブセットＡと、上記テンプレート２９〜３２とを用いて実施例１１と同様にＰＣＲサンプルを調製し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（ロシュ・ライフサイエンス社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間の熱変性の後、９５℃で３０秒、５６℃で４分３０秒、及び７２℃で３０秒のサイクルを５回繰り返し、さらにその後、９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、及び７２℃で３０秒のサイクルを４５回繰り返した。なお、テンプレート及びサンプルの調製は、微量のＤＮＡが失われないように低吸着チューブ及びチップを用いて行った。
（４）古人骨由来サンプルの定量
テンプレート２９〜３２のリアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を図３３に、テンプレート２９のリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づいて作成した検量線を図３４にそれぞれ示す。図３３に示すように、古人骨由来サンプル（テンプレート３０〜３２）の増幅曲線はいずれも検量線が直線の範囲（１０ｆｇ〜１０ｎｇ）に入っており、本発明のＡｌｕ−ｑＰＣＲによって正確に定量できることが明らかとなった。また、図３４に示す検量線に基づいて、テンプレート３０〜３２に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を算出した結果、畑内１７号、畑内２６号、及び畑内４５号由来のサンプルには、それぞれ２．１９ｐｇ／μＬ、０．１１ｐｇ／μＬ、及び０．６１ｐｇ／μＬのヒトゲノムＤＮＡが含まれていることが明らかとなった（図３５）。
【実施例２０】
【０１３０】
［本発明と従来技術との比較］
（１）プローブ法による従来技術と本発明との比較
既知のプローブ法によるＡｌｕ−ｑＰＣＲ用ＰＣＲプライマー・プローブセット（以下の文献１〜５に記載されたプライマー・プローブセット）が、上記クライテリア１〜１１を満たすか否かを確認した。その結果、図３６に示すように、既知のプローブ法によるＡｌｕ−ｑＰＣＲ用ＰＣＲプライマー・プローブセットはいずれも、「本発明のプライマー対設計方法」及び「本発明のプローブ設計方法」を満たすものではないことが明らかとなった。
文献１：McBride, C., Gaupp, D. & Phinney, D. G. Quantifying levels of transplanted murine and human mesenchymal stem cells in vivo by real-time PCR. Cytotherapy 5, 7-18 (2003).
文献２：Nicklas, J. A. & Buel, E. Simultaneous determination of total human and male DNA using a duplex real-time PCR assay. J. Forensic Sci. 51, 1005-1015 (2006).
文献３：Preston Campbell, J. et al. TRIzol and Alu qPCR-based quantification of metastatic seeding within the skeleton. Sci. Rep. 5, 12635; 10.1038/srep12635 (2015).
文献４：Walker, J. A. et al. Multiplex polymerase chain reaction for simultaneous quantitation of human nuclear, mitochondrial, and male Y-chromosome DNA: application in human identification. Anal. Biochem. 337, 89-97 (2005).
文献５：Zhang, W. et al. Development and qualification of a high sensitivity, high throughput Q-PCR assay for quantitation of residual host cell DNA in purification process intermediate and drug substance samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 100, 145-149 (2014).【０１３１】
さらに、上記の既知プライマー・プローブセットのＴｍ値を算出するとともに、各配列についてヒト及びげっ歯類ゲノムに対するＢＬＡＳＴ検索した。その結果、図３７に示すように、上記文献１、３〜５のプライマー・プローブセットでは、プローブのＴｍ値がプライマーのそれよりも５〜１０度程度高く設計されていた。また、上記文献１〜５のプライマー・プローブセットはいずれも、その中に含まれる連続する１８塩基からなる配列と同一の配列が、マウス、ラット及び／又はギニアピッグのゲノム中に２ヶ所以上存在することが明らかとなった（図３７）。【０１３２】
（２）インターカレーター法（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）による従来技術と本発明との比較
既知のインターカレーター法によるＡｌｕ−ｑＰＣＲ用ＰＣＲプライマーセット（以下の文献６〜１３に記載されたプライマーセット）が、上記クライテリア１〜７を満たすか否かを確認した。さらに、上記の既知プライマー・プローブセットのＴｍ値を算出するとともに、各配列についてヒト及びげっ歯類ゲノムに対するＢＬＡＳＴ検索した。
その結果、図３８に示すように、既知のインターカレーター法によるＡｌｕ−ｑＰＣＲ用ＰＣＲプライマーセットはいずれも、「本発明のプライマー対設計方法」を満たすものではないことが明らかとなった。また、以下の文献６〜１３のプライマーセットはいずれも、その中に含まれる連続する１８塩基からなる配列と同一の配列が、マウス、ラット及び／又はギニアピッグのゲノム中に２ヶ所以上存在することが明らかとなった。
文献６：Mira, E., Lacalle, R. A., Gomez-Mouton, C., Leonardo, E. & Manes, S. Quantitative determination of tumor cell intravasation in a real-time polymerase chain reaction-based assay. Clin. Exp. Metastasis 19, 313-318 (2002).
文献７：Nehmann, N., Wicklein, D., Schumacher, U. & Muller, R. Comparison of two techniques for the screening of human tumor cells in mouse blood: quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) versus laser scanning cytometry (LSC). Acta Histochem. 112, 489-496 (2010).
文献８：Nicklas, J. A. & Buel, E. Development of an Alu-based, real-time PCR method for quantitation of human DNA in forensic samples. J. Forensic Sci. 48, 936-944 (2003).
文献９：Opel, K. L., Fleishaker, E. L., Nicklas, J. A., Buel, E. & McCord, B. R. Evaluation and quantification of nuclear DNA from human telogen hairs. J. Forensic Sci. 53, 853-857 (2008).
文献１０：Schneider, T., Osl, F., Friess, T., Stockinger, H. & Scheuer, W. V. Quantification of human Alu sequences by real-time PCR--an improved method to measure therapeutic efficacy of anti-metastatic drugs in human xenotransplants. Clin. Exp. Metastasis 19, 571-582 (2002).
文献１１：Umetani, N. et al. Increased integrity of free circulating DNA in sera of patients with colorectal or periampullary cancer: direct quantitative PCR for ALU repeats. Clin. Chem. 52, 1062-1069 (2006).
文献１２：Walker, J. A. et al. Human DNA quantitation using Alu element-based polymerase chain reaction. Anal. Biochem. 315, 122-128 (2003).
文献１３：Witt, N. et al. An assessment of air as a source of DNA contamination encountered when performing PCR. J. Biomol. Tech. 20, 236-240 (2009).
【実施例２１】
【０１３３】
［本発明のプライマー・プローブセットＥの設計］
（１）クライテリアの改良
実施例１７に記載のとおり、本発明の２０ｎｔのプライマー・プローブセットを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲは、被験試料中のＤＮＡが２５０ｂｐの長さに断片化された場合であっても、高感度にヒトゲノムＤＮＡを検出・定量できることが確認された。そこで本発明者らは、さらに小さなサイズ（１００ｂｐ）に断片化されたヒトゲノムＤＮＡを定量できるプライマー・プローブセットの設計を試みた。具体的には、本発明者らは、１８ヌクレオチド長以上のプライマー及び／又はプローブを設計するために、上記クライテリア１、２、５、及び７〜１０を改良して、以下の修正クライテリア１、２、５、及び７〜１０を設定した（下線は変更箇所を示す）。【０１３４】
［修正クライテリア１］フォワードプライマー及びリバースプライマー中の連続した１７以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；
［修正クライテリア２］フォワードプライマー及びリバースプライマーのヌクレオチド長がそれぞれ１８以上である；
［修正クライテリア５］フォワードプライマー同士、及びリバースプライマー同士の二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［修正クライテリア７］フォワードプライマー同士、及びリバースプライマー同士の二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるＧ又はＣからなる連続する４ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；
［修正クライテリア８］プローブ中の連続した１７以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない；
［修正クライテリア９］プローブのヌクレオチド長が１８以上である；
［修正クライテリア１０］フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子の３’末端から３番目までのヌクレオチド配列（３’末端から１〜３番目のヌクレオチド配列）と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない；【０１３５】
１８ヌクレオチド長以上のプライマー及び／又はプローブを設計する際には、上記修正クライテリア１、２、５、及び７〜１０と、上記クライテリア３、４、６、及び１１（必要に応じてさらに上記クライテリア１２〜１５）とを組み合わせて用いる（なお、本願明細書においては、上記修正クライテリア１、２、５、及び７と、上記クライテリア３、４、及び６とを組み合わせたプライマー用クライテリアを「クライテリア１’〜７’」と称する場合があり、また、上記修正クライテリア８〜１０と、上記クライテリア１１とを組み合わせたプローブ用クライテリアを「クライテリア８’〜１１’」と称する場合がある）。また、１９ヌクレオチド長のプライマー及び／又はプローブを設計する場合には、上記修正クライテリア１において「フォワードプライマー及びリバースプライマー中の連続した１８ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない」配列であって、かつ、上記修正クライテリア８において「プローブ中の連続した１８ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない」配列を選定し、１８ヌクレオチド長のプライマー及び／又はプローブを設計する場合には、上記修正クライテリア１において「フォワードプライマー及びリバースプライマー中の連続した１７ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない」配列であって、かつ、上記修正クライテリア８において「プローブ中の連続した１７ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない」配列を選定する。【０１３６】
なお発明者らは、上記修正クライテリア１において「フォワードプライマー及びリバースプライマー中の連続した１８ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない」配列を選択するために図３９を、上記修正クライテリア１において「フォワードプライマー及びリバースプライマー中の連続した１７ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される１種又は２種以上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列中に２ヶ所以上存在しない」配列を選択するために図４０をそれぞれ作成した。【０１３７】
（２）改良されたクライテリアを用いたプライマー対及びプローブの選定
プライマー設計プログラムＰｒｉｍｅｒ３ｗｅｂ４．１．０を用いてヒトＡｌｕモデル配列から複数のプライマー候補を選定した。具体的には、Ｐｒｉｍｅｒ３の「Old Secondary Structure Alignments」を使用し、パラメータを以下のように設定した上で、ヒトＡｌｕモデル配列（ポジション＃１〜＃３００）を入力した。
ｉ）Max Self Complementarity：5.0
ii）Max 3’ Self Complementarity：4.0
iii）Max Pair Complementarity：5.0
iv）Max 3' Pair Complementarity：5.0
次に、Ｐｒｉｍｅｒによって選定された候補の中から、図４０を用いてクライテリア１’を満たす候補を選定した後に、さらに、クライテリア２’、５’、及び７’を満たすプライマー対を選定した。このようにして選定された３９個のフォワードプライマー候補（Ｆ１’〜Ｆ３９’）及び２０個のリバースプライマー候補（Ｒ１’〜Ｒ２０’）を、表５及び６にそれぞれ示す。表５及び６における「位置＃」は、各プライマーの開始点となるヒトＡｌｕモデル配列のポジション＃を示す。【０１３８】
【表５】
2018101375.tif 000006
【０１３９】
【表６】
2018101375.tif 000007
【０１４０】
最終的に、上記候補から、ヒトＡｌｕモデル配列中の１００塩基以下の配列を増幅可能なプライマー対として、フォワードプライマーＦ３４’（ＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧ；配列番号１２３）及びリバースプライマーＲ２０’（ＧＴＣＴＣＧＣＴＣＴＧＴＣＧＣＣＣＡ；配列番号１４８）を選定した。図４１に、RNAstructureを用いて予測されたプライマーダイマーの（フォワードプライマーＦ３４’同士、及びリバースプライマーＲ２０’同士）の二次構造を示す。【０１４１】
また、フォワードプライマーＦ３４’及びリバースプライマーＲ２０’によって増幅されるヒトＡｌｕモデル配列の中から、クライテリア８’、９’、１０、１１、及び１３、１５を満たすプローブとして、ポジション＃２４８から開始するアンチセンス方向の配列（ＴＧＣＡＧＴＧＧＣＧＣＧＡＴＣＴＣＧ；配列番号１４９）を選定した。なお、以下、かかるプローブを「プローブＰ１’」と称する。また、以下、フォワードプライマーＦ３４’、リバースプライマーＲ２０’、及びプローブＰ１’の組合せを「本発明のプライマー・プローブセットＥ」と称する場合がある。
【実施例２２】
【０１４２】
［断片化されたヒトゲノムＤＮＡ（１００ｂｐ）の定量］
（１）ヒトゲノムＤＮＡの断片化
本発明のプライマー・プローブセットＥを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲにより、１００ｂｐに断片化されたヒトゲノムＤＮＡをどの程度の感度で定量することが可能かを調べた。具体的には、DNA Shearing システム M220（コバリス社製）を用いて、ヒトゲノムＤＮＡを１００ｂｐに断片化した。そして、LabChip GX Touchシステム(パーキンエルマー社製)を用いて、ＤＮＡが所望の長さに断片化されていることを確認した（図４２）。
（２）テンプレートの調製
次に、上記（１）により作製した断片化ヒトゲノムＤＮＡを、EASY Dilutionバッファーを用いて段階希釈し、以下のようにテンプレート３３を調製した。
テンプレート３３：
０．０５ｆｇ／μＬから５０ｎｇまでの１０段階の濃度の、１００ｂｐに断片化されたヒトゲノムＤＮＡを含むサンプル
（３）リアルタイムＰＣＲ
本発明のプライマー・プローブセットＥと、上記テンプレート３３とを用いて実施例１１と同様にＰＣＲサンプルを調製し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（ロシュ・ライフサイエンス社製）用いてリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間の熱変性の後、９５℃で３０秒、５６℃で４分３０秒、及び７２℃で３０秒のサイクルを５回繰り返し、さらにその後、９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、及び７２℃で３０秒のサイクルを４５回繰り返した。なお、テンプレート及びサンプルの調製は、微量のＤＮＡが失われないように低吸着チューブ及びチップを用いて行った。
（４）断片化ＤＮＡに対する感度
上記（３）のリアルタイムＰＣＲの結果を図４３に示す。テンプレート３３（１００ｂｐ、の長さの断片化ＤＮＡを用いたスタンダードサンプル）のリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づいて検量線を作成したところ、１０ｆｇ〜１０ｎｇの間で検量線の直線性が認められた（図４３）。この結果から、本発明のプライマー・プローブセットＥを用いたＡｌｕ−ｑＰＣＲは、１００ｂｐ程度に高度に断片化されたヒトゲノムＤＮＡも、高感度で検出・定量できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明によれば、被験試料中のヒトゲノムＤＮＡを高感度に検出し得る方法を提供することができる。特に、本発明によれば、従来技術では定量できなかった条件の悪い試料（例えば、他生物ゲノムが多量に混在する試料やＤＮＡが高度に断片化された陳旧試料など）からでも、ヒトゲノムＤＮＡを高感度に検出・定量することが可能となる。したがって、かかる方法により、異種移植モデル動物におけるヒト細胞の生着・増殖を正確に確認することができる。また、かかる方法は、法医学試料や古生物試料等に含まれる微量のヒトゲノムＤＮＡの検出にも利用できる。
【図１】
2018101375.tif 000008
【図２】
2018101375.tif 000009
【図３】
2018101375.tif 000010
【図４−１】
2018101375.tif 000011
【図４−２】
2018101375.tif 000012
【図４−３】
2018101375.tif 000013
【図５】
2018101375.tif 000014
【図６】
2018101375.tif 000015
【図７】
2018101375.tif 000016
【図８】
2018101375.tif 000017
【図９】
2018101375.tif 000018
【図１０】
2018101375.tif 000019
【図１１】
2018101375.tif 000020
【図１２】
2018101375.tif 000021
【図１３】
2018101375.tif 000022
【図１４】
2018101375.tif 000023
【図１５】
2018101375.tif 000024
【図１６】
2018101375.tif 000025
【図１７】
2018101375.tif 000026
【図１８】
2018101375.tif 000027
【図１９】
2018101375.tif 000028
【図２０】
2018101375.tif 000029
【図２１】
2018101375.tif 000030
【図２２】
2018101375.tif 000031
【図２３】
2018101375.tif 000032
【図２４】
2018101375.tif 000033
【図２５】
2018101375.tif 000034
【図２６】
2018101375.tif 000035
【図２７】
2018101375.tif 000036
【図２８】
2018101375.tif 000037
【図２９】
2018101375.tif 000038
【図３０】
2018101375.tif 000039
【図３１】
2018101375.tif 000040
【図３２】
2018101375.tif 000041
【図３３】
2018101375.tif 000042
【図３４】
2018101375.tif 000043
【図３５】
2018101375.tif 000044
【図３６】
2018101375.tif 000045
【図３７】
2018101375.tif 000046
【図３８】
2018101375.tif 000047
【図３９】
2018101375.tif 000048
【図４０】
2018101375.tif 000049
【図４１】
2018101375.tif 000050
【図４２】
2018101375.tif 000051
【図４３】
2018101375.tif 000052
【配列表】
2018101375000001.app
【国際調査報告】
2018101375.tif 000053
2018101375.tif 000054
2018101375.tif 000055
2018101375.tif 000056