(57)【要約】  美白化粧料は、アルブミン系化合物を含む。アルブミン系化合物は、アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫黄原子が付加したものである。アルブミン系化合物は、１部位につき複数個の硫黄原子を有する。アルブミン系化合物の製造方法は、アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫化物を付加反応させる工程を含む。アルブミン系化合物は、美白化粧料に含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミン系化合物を含み、
前記アルブミン系化合物は、アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫黄原子が付加したものであり、
前記アルブミン系化合物は、１部位につき複数個の硫黄原子を有する、美白化粧料。
【請求項２】
前記アルブミン系化合物は、１部位につき２個以上６個以下の硫黄原子を有する、請求項１に記載の美白化粧料。
【請求項３】
前記アルブミンは、血清アルブミンである、請求項１又は２に記載の美白化粧料。
【請求項４】
アルブミン系化合物の製造方法であって、
前記アルブミン系化合物は、請求項１に記載の美白化粧料に含まれるものであり、
アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫化物を付加反応させる工程を含む、アルブミン系化合物の製造方法。
【請求項５】
前記アルブミンは、血清アルブミンである、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記硫化物は、多硫化ナトリウムである、請求項４又は５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記多硫化ナトリウムは、Ｎａ2Ｓ2、Ｎａ2Ｓ3、又はＮａ2Ｓ4である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
加温して、前記アルブミンまたは前記アルブミン誘導体に前記硫化物を付加反応させる、請求項４〜７の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
金属イオンの存在下において、前記アルブミンまたは前記アルブミン誘導体に前記硫化物を付加反応させる、請求項４〜８の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記金属イオンは、二価の金属イオンである、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記金属イオンは、温泉成分由来である、請求項９または１０に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美白化粧料、及びそれに含まれるアルブミン系化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
美白化粧品として、例えば、美白用皮膚外用剤が知られている（特許文献１）。この美白用皮膚外用剤は、必要に応じて酵素架橋処理を施したタンパク質ナノ粒子に、グルタチオン等のメラニン生成抑制剤を内包させたものを、有効成分として含む。【０００３】
また、硫化ナトリウムは、メラニンの産生を抑制して美白効果を奏することが知られており、硫化ナトリウムの化粧品への応用が検討されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２４７８１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載の美白用皮膚外用剤に含まれる有効成分の調製には、上述のとおり、タンパク質ナノ粒子が用いられる。このタンパク質ナノ粒子は、複数の工程にて調製される。有効成分を得るには、さらに、タンパク質ナノ粒子にメラニン生成抑制剤を内包させる必要がある。よって、美白用皮膚外用剤に含まれる有効成分の調製は煩雑である。【０００６】
一方、硫化ナトリウム（Ｎａ2Ｓ）は、溶剤に溶解させて溶液の状態にすると、硫化水素（Ｈ2Ｓ）となり、生理的ｐＨでは、その約半数が速やかに気体となって消失してしまう。したがって、硫黄原子の担体として有用な物質を見出し、安定した状態でメラニン産生抑制成分（有効成分）が含まれた化粧品を開発することが待ち望まれている。【０００７】
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、有効成分の安定性に優れた美白化粧料を提供することである。また、その目的は、美白化粧料に含まれる有効成分を簡易な工程で製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の美白化粧料は、アルブミン系化合物を含む。前記アルブミン系化合物は、アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫黄原子が付加したものである。前記アルブミン系化合物は、１部位につき複数個の硫黄原子を有する。【０００９】
本発明の製造方法は、アルブミン系化合物の製造方法である。前記アルブミン系化合物は、前記美白化粧料に含まれる。本発明の製造方法は、アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫化物を付加反応させる工程を含む。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の美白化粧料は、美白効果に優れるのは勿論のこと、有効成分の安定性及び安全性に優れ、化粧料として適した匂いを有する。また、本発明の製造方法により、美白化粧料に含まれる有効成分を簡易な工程で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】試験例２において、細胞溶解液の波長４０５ｎｍにおける吸光度を示す棒グラフである。
【図２】（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、それぞれ、試験例２において、培養後のＢ１６マウスメラノーマ細胞の光学顕微鏡写真である。
【図３】試験例２において、細胞溶解液における培養後のＢ１６マウスメラノーマ細胞内のメラニン産生量を示す棒グラフである。
【図４】試験例４において、測定試料の蛍光強度を示す棒グラフである。
【図５】試験例４において、細胞溶解液における培養後のＢ１６マウスメラノーマ細胞内のメラニン産生量を示す棒グラフである。
【図６】試験例５において、クリームにおける細胞生存率を示す棒グラフである。
【図７】（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ、試験例６における平均蛍光強度を示す棒グラフである。
【図８】アルブミン系化合物によるメラミン抑制を説明するための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。本発明は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内で、適宜変更を加えて実施できる。なお、説明が重複する箇所については、適宜説明を省略する場合があるが、発明の要旨を限定するものではない。なお、有機化合物名の後に「系」を付けて、有機化合物及びその誘導体を包括的に総称する場合がある。
【００１３】
＜第一実施形態：アルブミン系化合物及びその製造方法＞
第一実施形態は、アルブミン系化合物及びその製造方法に関する。アルブミン系化合物は、メラニン産生抑制効果を付与する有効成分として、美白化粧料に含まれる。
【００１４】
上述のとおり、硫化ナトリウム等の硫化物は、メラニンの産生を抑制して美白効果を奏することが知られており、美白化粧料の有効成分として注目されている。化粧料の調製には、通常、溶剤が使用されるが、硫化物を溶剤に溶解させた溶液中で、硫化物は硫化水素となる。溶液中の硫化水素は、メラニンの産生を抑制する能力を維持しているものの、それ自身が消失し易い。硫化水素は、生理的ｐＨ（化粧料の好適なｐＨ）の溶液中では、その約半数が速やかに気体となって消失してしまう。
【００１５】
そこで、このように消失し易い硫化水素ではなく、安定した状態のアルブミン系化合物を調製し、有効成分として美白化粧料に配合することを検討した。
【００１６】
アルブミン系化合物は、アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫黄原子が付加したものであり、１部位につき複数個の硫黄原子を有する。アルブミン系化合物の製造方法は、アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫化物を付加反応させる工程を含む。
【００１７】
１．アルブミンまたはアルブミン誘導体
アルブミンまたはアルブミン誘導体は、いわゆる、硫黄原子の担体として作用する成分である。
【００１８】
アルブミンまたはアルブミン誘導体の種類は、特に制限されない。アルブミンは、血清アルブミン及び遺伝子組換えアルブミンの何れであってもよい。入手が容易である点から、アルブミンとして、血清アルブミンが好適に用いられる。血清アルブミンとしては、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、又はニワトリ血清アルブミンが挙げられる。特にヒト血清アルブミンは、より高い安全性を有する点から好適である。また、遺伝子組換えの場合、二量体や多量体化したアルブミンも含まれる。また、アルブミンそのものだけでなく、アルブミンを化学的に修飾したアルブミン誘導体を用いてもよい。アルブミンまたはアルブミン誘導体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００１９】
アルブミンまたはアルブミン誘導体の分子量は、特に制限されない。例えば血清アルブミンの場合、６６０００以上６６５００以下のものを用いることが好ましい。多量体化の場合は、１００ｎｍ程度の粒子サイズであることが好ましい。
【００２０】
２．硫化物
硫化物の種類は、特に制限されない。硫化物としては、例えば、一般式：Ｎａ2Ｓn（一般式中、ｎは１以上６以下の整数を表す）で表される硫化ナトリウム、硫化アリル（具体的には、ジアリルスルフィド又はジアリルジスルフィド）、若しくは硫黄（例えば、Ｓ8で表される硫黄）が挙げられる。入手が容易である点から、硫化物の中でも硫化ナトリウムが好適に用いられる。硫化ナトリウムの中でも、多硫化ナトリウム（上述の一般式中、ｎが２以上６以下の整数を表す化合物）は、アルブミンまたはアルブミン誘導体への付加反応が良好で、アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫黄原子が安定して付加し易い点で好適である。より高い安定性及びより優れたメラニン産生抑制能力を示すアルブミン系化合物が得られる点から、多硫化ナトリウムの中でも、特にＮａ2Ｓ2、Ｎａ2Ｓ3、又はＮａ2Ｓ4が好適である。硫化物は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００２１】
３．付加反応工程
アルブミンまたはアルブミン誘導体と硫化物との反応は、付加反応である。アルブミンまたはアルブミン誘導体と硫化物との反応比（アルブミンまたはアルブミン誘導体：硫化物）は、特に制限されないが、モル濃度比で、０．１：１〜０．６：１であることが好ましく、０．２：１〜０．５：１であることがさらに好ましい。硫化物１モル濃度に対して、アルブミンまたはアルブミン誘導体の物質量が０．１モル濃度以上であると、未反応の硫化物の除去を容易に行うことができる。硫化物１モル濃度に対して、アルブミンまたはアルブミン誘導体の物質量が０．６モル濃度以下であると、より高い安定性及びより優れたメラニン産生抑制能力を示すアルブミン系化合物が得られる。
【００２２】
アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫化物を付加反応させるには、例えば、アルブミンもしくはアルブミン誘導体及び硫化物を加温する方法、または、アルブミンもしくはアルブミン誘導体及び硫化物を振盪する方法を採用することができる。特にアルブミンまたはアルブミン誘導体及び硫化物を加温する方法は、特別な装置を必要とせず、より簡易に反応を進行させることができる点で好適である。
【００２３】
アルブミンまたはアルブミン誘導体及び硫化物を加温する方法では、アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫化物を加え、ｐＨを調整した緩衝液中で、反応温度及び反応時間を調整して、アルブミンまたはアルブミン誘導体と硫化物とを反応させる。
【００２４】
加温する方法で、緩衝液の種類には特に制限がなく、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、フタル酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、又は酢酸緩衝液が挙げられる。アルブミンまたはアルブミン誘導体と硫化物との反応が促進され易い点から、緩衝液のｐＨは、７．０以上７．８以下であることが好ましく、７．２以上７．６以下であることがさらに好ましい。
【００２５】
加温する方法で、アルブミンまたはアルブミン誘導体と硫化物との反応温度は、３０℃以上５０℃以下であることが好ましく、３２℃以上４５℃以下であることがさらに好ましい。反応温度が３０℃以上であると、アルブミンまたはアルブミン誘導体と硫化物との反応が促進され易い。反応温度が５０℃以下であると、アルブミンまたはアルブミン誘導体が、劣化や凝集等の変性を起こす恐れがない。
【００２６】
加温する方法で、アルブミンまたはアルブミン誘導体と硫化物との反応時間は、アルブミンまたはアルブミン誘導体と硫化物との反応が促進され易い点から、４時間以上１０時間以下であることが好ましく、５時間以上８時間以下であることがさらに好ましい。
【００２７】
アルブミンまたはアルブミン誘導体及び硫化物を振盪する方法では、アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫化物を加え、ｐＨを調整した緩衝液中で、振盪速度及び反応時間を調整して、アルブミンまたはアルブミン誘導体と硫化物とを反応させる。
【００２８】
振盪する方法で、緩衝液の種類には特に制限がなく、上述の加温する方法で例示された緩衝液を用いることができる。緩衝液のｐＨも、上述の加温する方法と同様に、７．０以上７．８以下であることが好ましく、７．２以上７．６以下であることがさらに好ましい。
【００２９】
振盪する方法で、アルブミンまたはアルブミン誘導体及び硫化物の振盪速度は、アルブミンまたはアルブミン誘導体と硫化物との反応が促進される限り特に制限はなく、３０回／分程度以上１８０回／分程度以下に調整することが好ましい。
【００３０】
振盪する方法で、アルブミンまたはアルブミン誘導体と硫化物との反応時間は、アルブミンまたはアルブミン誘導体と硫化物との反応が促進され易い点から、４時間以上１０時間以下であることが好ましく、５時間以上８時間以下であることがさらに好ましい。
【００３１】
なお、アルブミンまたはアルブミン誘導体及び硫化物の振盪には、例えば、一般的な振盪機を用いることができ、これにより、例えば上述の振盪速度となるように、適宜調整すればよい。
【００３２】
例えば上述の加温する方法又は振盪する方法により、アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫化物を付加反応させることができるが、例えば、酸化物質（具体的には、一酸化窒素又は過酸化水素）、若しくは金属イオンの存在下において、アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫化物を付加反応させると、付加反応が促進され、反応効率が向上する。
【００３３】
特に金属イオンの存在下において付加反応を行うことが、付加反応がより促進され、反応効率がさらに向上し、充分に硫黄原子が付加したアルブミン系化合物が得られ易い点から好適である。金属イオンの存在による反応効率の向上について、詳細は明らかではないが、おそらく、金属イオンが硫化物中の硫黄原子を引き付けることにより、アルブミンまたはアルブミン誘導体への硫黄原子の付加が促進されると考えられる。金属イオンは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組合せて用いてもよい。金属イオンの中でも、効果の発現がさらによく、取扱い易い点から、二価の金属イオンが好ましい。二価の金属イオンとしては、例えば、Ｆｅ2+、Ｍｇ2+、Ｃａ2+、又はＣｕ2+が挙げられる。
【００３４】
金属イオンの存在下において付加反応を行う場合、金属イオンと硫化物との割合（金属イオン：硫化物）が、モル濃度比で、０．２：１〜２：１であることが好ましく、０．５：１〜１．５：１であることがさらに好ましい。硫化物１モル濃度に対して、金属イオンの物質量が０．２モル濃度以上であると、反応効率の向上効果が充分に発現される。硫化物１モル濃度に対して、金属イオンの物質量が２モル濃度以下であると、過剰の金属イオンによる代表的なフェントン反応などによる酸化反応による付加反応阻害の恐れがない。
【００３５】
なお、金属イオンの存在下において付加反応を行う際には、例えば、温泉水を使用することができる。温泉水は、一般に、上述のごとき二価の金属イオンを複数種含むものである。よって、含まれる金属イオン種に応じて温泉水を適宜選択し、例えば金属イオンと硫化物との割合が上述のモル濃度比範囲となるように、硫化物に対する温泉水の使用割合を調整することが好ましい。すなわち、含まれる金属イオン種に応じて温泉水を適宜選択し、硫化物と金属イオンとの割合を考慮して硫化物に対する温泉水の使用割合を決定した後、ｐＨを調整した緩衝液と温泉水とを混合する。この混合液中で、アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫化物を加えることにより、金属イオンの存在下において、アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫化物を付加反応させることができる。
【００３６】
４．その他の工程
アルブミンまたはアルブミン誘導体と硫化物との反応の終了を確認した後に、ゲルを濾過することにより（例えばゲル濾過カラムクロマトグラフィーを用いることにより）、未反応の硫化物を除去して、目的とするアルブミン系化合物を精製して得ることができる。
【００３７】
５．アルブミン系化合物
アルブミン系化合物は、アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫黄原子が付加したものであり、１部位につき複数個の硫黄原子を有する。
【００３８】
元来アルブミンまたはアルブミン誘導体は、それ自身がシステイン由来のＳＨ基を有し、システインのＳＨ基が酸化された場合は、Ｓ−Ｓ結合で共有結合されたシステイン付加体となっている。しかし、ＳＨ基を有するだけのアルブミンやシステイン付加アルブミンおよびその誘導体のみでは、メラニン産生抑制作用を呈さない。よって、このようなアルブミンまたはアルブミン誘導体を配合しても、優れた美白効果を奏する美白化粧料を得ることはできない。
【００３９】
アルブミン系化合物は、アルブミンまたはアルブミン誘導体中のＳＨ基及びＳ−Ｓ結合において、硫黄原子にさらに硫黄原子が付加して、例えば、ＳＳＨ基、ＳＳＳＨ基、Ｓ−Ｓ−Ｓ結合等が形成されたものである。詳細は明らかではないが、アルブミンまたはアルブミン誘導体において、このように硫黄原子にさらに硫黄原子が付加されると、複数の硫黄原子が担体により担持され、アルブミンまたはアルブミン誘導体では認められなかったメラニン産生抑制作用が認められる。そして、硫黄原子にさらに硫黄原子が付加している（以下、多硫黄付加ともいう）アルブミン系化合物は、硫化物とは異なり、生理的ｐＨでも安定した状態が維持される。
【００４０】
アルブミン系化合物は、１部位につき２個以上６個以下の硫黄原子を有することが好ましく、１部位につき２個以上４個以下の硫黄原子を有することがさらに好ましい。アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫黄原子が付加せず、アルブミン系化合物において、１部位につき１個の硫黄原子しか存在しないと、上述のとおり、メラニン産生抑制作用が認められない。アルブミン系化合物が、１部位につき６個以下の硫黄原子を有する場合には、硫黄原子の転移反応が起こることがほとんどなく、充分なメラニン産生抑制作用が付与され、アルブミン系化合物の美白化粧料への適用が容易である。なお、アルブミン系化合物における硫黄原子の転移反応の有無は、詳細は明らかでないが、アルブミン系化合物が存在する環境（温度、湿度等）に起因する場合もあると考えられる。よって、アルブミン系化合物の１部位における硫黄原子の数は、上述のごとく６個以下が好ましいが、これに限定されるものではない。
【００４１】
アルブミンまたはアルブミン誘導体において、ＳＨ基やＳ−Ｓ結合の存在位置及び存在数は、特定されている。しかしながら、アルブミン系化合物において、多硫黄付加部位の存在位置及び存在数は、特定されるものではない。詳細は明らかでないが、多硫黄付加部位の存在位置及び存在数は、付加反応の反応条件に応じて適宜変化すると考えられる。また、アルブミン系化合物における多硫黄付加部位の存在位置が、アルブミンまたはアルブミン誘導体におけるＳＨ基やＳ−Ｓ結合の存在位置に対して変化を起こしている場合も考えられる。
【００４２】
アルブミン系化合物において、各多硫黄付加部位に存在する硫黄原子の数は、各部位で同じであってもよく、異なっていてもよい。すなわち、例えばアルブミンまたはアルブミン誘導体中のＳＨ基各々に、同じ数の硫黄原子が付加していてもよく、ＳＨ基各々に応じて、異なる数の硫黄原子が付加していてもよい。
【００４３】
アルブミン系化合物中の硫黄原子（サルフェン硫黄）の検出は、例えば、蛍光プローブ法にて行うことができる。
【００４４】
サルフェン硫黄（Ｓｕｌｆａｎｅ  ｓｕｌｆｕｒ）化合物とは、一般に、Ｓ−Ｓ*−Ｓ、Ｓ−Ｓ*−Ｓ*−Ｓ等の硫黄原子に挟まれた硫黄を含む分子の総称であり、サルフェン硫黄の検出には、サルフェン硫黄検出用蛍光プローブが用いられる。サルフェン硫黄検出用蛍光プローブとしては、細胞や組織を破壊せずにサルフェン硫黄を検出することが可能な、非破壊的な蛍光プローブが好ましい。このような非破壊的なサルフェン硫黄検出用蛍光プローブとしては、例えば、ＳＳＰ２又はＳＳＰ４が挙げられる。ＳＳＰ２及びＳＳＰ４は、求核性官能基を有するチオサリチル酸を１分子（ＳＳＰ２）または２分子（ＳＳＰ４）有し、蛍光色素であるフルオレセインから構成されている。蛍光色素のフェノール性水酸基がチオサリチル酸で保護された状態では、ＳＳＰ２及びＳＳＰ４は、ほとんど蛍光を発しないが、チオサリチル酸がサルフェン硫黄と反応すると、反応物は、速やかな分子内環化反応によって、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オンを脱離し、蛍光体を生成する。よって、この蛍光体に基づく蛍光強度を測定し、ＳＳＰ２又はＳＳＰ４の蛍光強度と比較することにより、サルフェン硫黄を検出することができる。
【００４５】
以上、第一実施形態に係るアルブミン系化合物及びその製造方法を説明した。第一実施形態に係る製造方法によって得られるアルブミン系化合物は、メラニン産生抑制効果、安定性及び安全性に優れ、化粧料の成分として適した匂いを有する。第一実施形態に係る製造方法は、このようなアルブミン系化合物を、簡易な工程で製造することができる。
【００４６】
＜第二実施形態：美白化粧料＞
第二実施形態は、美白化粧料に関する。美白化粧料は、アルブミン系化合物を含む。アルブミン系化合物は、第一実施形態に係るアルブミン系化合物であり、メラニン産生抑制効果、安定性及び安全性に優れ、化粧料の成分として適した匂いを有する。
【００４７】
美白化粧料に含まれるアルブミン系化合物は、１種であってもよく、異なる２種以上が適宜併用されていてもよい。
【００４８】
美白化粧料におけるアルブミン系化合物の配合量は、目的とする美白化粧料の種類（形態）等に応じて適宜調整することができ、特に制限はない。アルブミン系化合物の配合量は、例えば、美白化粧料１００質量部に対して、固形分換算で、０．１質量部以上２０質量部以下であることが好ましく、０．１２質量部以上０．３質量部以下であることがさらに好ましい。アルブミン系化合物の配合量が０．１３３質量部以上の場合は、アルブミン系化合物による美白効果がより充分に発現される。
【００４９】
美白化粧料には、アルブミン系化合物の他に、例えば一般に化粧料に用いられる添加剤を適宜配合することができる。添加剤としては、例えば、油脂、界面活性剤、保湿剤、美白剤、ｐＨ調整剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、顔料、洗浄剤、乳化剤、賦形剤、又は香料が挙げられる。
【００５０】
油脂としては、例えば、植物性油脂（具体的には、流動パラフィン、パラフィン、セタノール、アボカド油、オリーブ油、ホホバ油、又はヤシ油）、動物性油脂（具体的には、牛脂、豚脂、馬脂、タートル油、ミンク油、パーセリン油、又はスクワラン）、若しくは合成油脂（具体的には、メチルポリシロキサン、ベヘニルアルコール、トリカプリルカプリン酸グリセリル、トリオクタン酸グリセリル、トリイソパルミチン酸グリセリン、又はシリコーンオイル）が挙げられる。
【００５１】
界面活性剤としては、例えば、陰イオン性界面活性剤（具体的には、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、又はラウリン酸ジエタノールアミド）、陽イオン性界面活性剤（具体的には、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、又は塩化ベンザルコニウム）、若しくは非イオン性界面活性剤（具体的には、グリセリルモノステアレート、ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖エステル、又は脂肪酸アミド）が挙げられる。
【００５２】
保湿剤としては、例えば、合成保湿剤（具体的には、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ピロリドンカルボン酸ソーダ、又はパントテテイン−Ｓ−スルホン酸塩）、若しくは天然保湿剤（具体的には、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、胎盤抽出液、ローヤルゼリー、微生物発酵液、キチン、キトサン、又はペクチン）が挙げられる。
【００５３】
美白剤としては、アルブミン系化合物以外の化合物が例示され、例えば、コウジ酸、アスコルビン酸、又は胎盤抽出液が挙げられる。
【００５４】
ｐＨ調整剤としては、例えば、クエン酸、又はクエン酸ナトリウムが挙げられる。
【００５５】
増粘剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、トラガントガム、アルギン酸ナトリウム、又はカラギーナンが挙げられる。
【００５６】
防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル（具体的には、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、又はブチルパラベン）、フェノキシエタノール、エタノール、若しくはデヒドロ酢酸が挙げられる。
【００５７】
酸化防止剤としては、例えば、ビタミンＥ、ブチルオキシトルエン（ＢＨＴ）、又はブチルオキシアニゾール（ＢＨＡ）が挙げられる。
【００５８】
紫外線吸収剤としては、例えば、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、オキシベンゾン、サリチル酸オクチル、ジヒドロキシベンゾフェノン、パラアミノ安息香酸、パラジメチルアミノ安息香酸オクチル、又はメトキシケイ皮酸オクチルが挙げられる。
【００５９】
顔料としては、例えば、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化チタン、ナイロンパウダー、セリサイト、マイカ、又はタルクが挙げられる。
【００６０】
洗浄剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００６１】
乳化剤としては、例えば、大豆レシチン油が挙げられる。
【００６２】
賦形剤としては、例えば、硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００６３】
添加剤の配合量は、目的とする美白化粧料の種類（形態）等に応じて適宜調整することができ、アルブミン系化合物による効果を阻害しない限り、特に制限されるものではない。
【００６４】
美白化粧料の調製方法には特に制限がなく、一般的な化粧料の調製方法を採用することができ、例えば、後述する形態に応じて適宜決定すればよい。
【００６５】
美白化粧料の形態には特に制限がない。美白化粧料の優れた美白効果を考慮すると、美白化粧料の形態としては、例えば、基礎化粧品（具体的には、クリーム、乳液、ローション、洗顔料、又はパック）、若しくはメイクアップ化粧品（具体的には、口紅、パウダーファンデーション、又はリキッドファンデーション）が挙げられる。
【００６６】
以上、第二実施形態に係る美白化粧料を説明した。第二実施形態に係る美白化粧料は、メラニン産生抑制効果、安定性及び安全性に優れ、化粧料に適した匂いを有するアルブミン系化合物を有効成分として含んでいる。第二実施形態に係る美白化粧料により、メラニンの蓄積によるシミ、ソバカス等の発現が抑制され、くすみが改善されて白く美しい肌が維持される。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は実施例の範囲に何ら限定されるものではない。【００６８】
製造例１（アルブミン系化合物の製造）
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、脱脂ヒト血清アルブミン（分子量：６６，５００、２０ｍｇ、３００μＭ）にＮａ2Ｓ（７８μｇ、１ｍＭ）を加え、３７℃に加温して７時間反応させて、ヒト血清アルブミンに硫黄原子を付加させた。付加反応後の生成物について、以下の条件にてゲルを濾過して未反応の硫化物を除去し、目的とするアルブミン系化合物−１（９．５ｍｇ）を得た。
［ゲル濾過の条件］
移動相：  リン酸緩衝液
流速  ：  １０ｍＬ／分
温度  ：  ２５℃【００６９】
製造例２〜４（アルブミン系化合物の製造）
Ｎａ2Ｓ（７８μｇ、１ｍＭ）に代えて、Ｎａ2Ｓ2（１１０μｇ、１ｍＭ、製造例２）、Ｎａ2Ｓ3（１４２μｇ、１ｍＭ、製造例３）、又はＮａ2Ｓ4（１７４μｇ、１ｍＭ、製造例４）を用いた以外は、アルブミン系化合物−１の製造と同様にして、アルブミン系化合物−２（９．４ｍｇ、製造例２）、アルブミン系化合物−３（９．５ｍｇ、製造例３）、又はアルブミン系化合物−４（１０．５ｍｇ、製造例４）を得た。【００７０】
試験例１（サルフェン硫黄の検出）
蛍光プローブ法によりサルフェン硫黄（Ｓｕｌｆａｎｅ  ｓｕｌｆｕｒ）の検出を行った。サルフェン硫黄検出用蛍光プローブとしてＳＳＰ２（蛍光色素：フルオレセイン）を用いた。【００７１】
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（１ｍＭ）を溶解させた溶液に、モル濃度が２０μＭとなるように、アルブミン系化合物−１〜４の何れかを加えて、試料を調製した。この試料と、ジメチルスルホキシドにＳＳＰ２（５μＭ）を溶解させた蛍光指示薬とを、室温（２５℃）で１０分間反応させた後、分光蛍光光度計（日本分光株式会社製、ＦＰ−８２００）を用いて反応物の蛍光強度（励起波長：４５７ｎｍ、蛍光波長：４９０〜５８０ｎｍ）を測定した。ＳＳＰ２の蛍光強度と併せて、各反応物の蛍光強度を以下に示す。【００７２】
蛍光強度（単位なし）
ＳＳＰ２                              ５１２
反応物１（アルブミン系化合物−１）    １１３５
反応物２（アルブミン系化合物−２）    １２１９
反応物３（アルブミン系化合物−３）    １５３４
反応物４（アルブミン系化合物−４）    ３３８０【００７３】
上述のとおり、アルブミン系化合物−１〜４の試料は何れも、ＳＳＰ２との反応により、ＳＳＰ２の蛍光強度の約２〜７倍の蛍光強度を示している。このように、アルブミン系化合物−１〜４は何れも、分子内にサルフェン硫黄を有していることが確認された。よって、アルブミン系化合物−１〜４は何れも、ヒト血清アルブミンに硫黄原子が付加したものであり、１部位につき複数個の硫黄原子を有するものであることが分かる。また、アルブミン系化合物−１〜４は何れも、生理的ｐＨで安定した状態であることが分かる。【００７４】
試験例２（メラニン産生抑制効果の確認）
２−１．吸光度の測定及び光学顕微鏡写真の撮影
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を、２．５×１０4セル／ウェルとなるように、２４ウェルプレートに播種し、ダルベッコ改変イーグル培地（以下、ＤＭＥＭ（＋）という）で３７℃、５％ＣＯ2の条件下において２４時間プレ培養した。次いで、プレ培養した培地を、アルブミン系化合物−２を添加したＤＭＥＭ（＋）（アルブミン系化合物：２０μＭ、チロシン：０．４ｍＭ、ＮＨ4Ｃｌ：１０ｍＭ）と交換し、さらに３７℃、５％ＣＯ2の条件下において７２時間培養した。【００７５】
なお、アルブミン系化合物−２を添加したＤＭＥＭ（＋）に代えて、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を添加したＤＭＥＭ（＋）にて培養したもの、及び市販の美白化粧水（アルブチン：終濃度１．１０ｍＭ、アスコルビン酸：５９１μＭ）を添加したＤＭＥＭ（＋）にて培養したものを、コントロールとして用意した。【００７６】
次いで、ウェルに接着している培養後のＢ１６マウスメラノーマ細胞を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ）を２００μＬずつ加えた。これを６０℃で１時間インキュベートして、培養後のＢ１６マウスメラノーマ細胞を溶解させ、細胞溶解液を回収した。分光光度計（バイオラッド株式会社製、モデル６８０μプレートリーダー）を用いて、細胞溶解液の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図１に示す。なお、４０５ｎｍはメラニンの吸収波長である。また、オールインワン蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＢＺ−Ｘ７００、以下、蛍光顕微鏡という）を用いて培養後のＢ１６マウスメラノーマ細胞（４００倍）を撮影した。その結果を図２に示す。【００７７】
図１は、リン酸緩衝液を添加したＤＭＥＭ（＋）にて培養した細胞溶解液及びアルブミン系化合物−２を添加したＤＭＥＭ（＋）にて培養した細胞溶解液の波長４０５ｎｍにおける吸光度を示す棒グラフである。図１において、縦軸は吸光度（単位なし）を表し、吸光度が小さいほど、メラニンの産生が少ない。【００７８】
図１のとおり、アルブミン系化合物−２の波長４０５ｎｍにおける吸光度は、コントロールであるリン酸緩衝液の波長４０５ｎｍにおける吸光度の約１／２である。【００７９】
図２（ａ）は、リン酸緩衝液を添加したＤＭＥＭ（＋）にて培養したＢ１６マウスメラノーマ細胞のＳＥＭ写真、図２（ｂ）は、市販の美白化粧水を添加したＤＭＥＭ（＋）にて培養したＢ１６マウスメラノーマ細胞のＳＥＭ写真、及び図２（ｃ）は、アルブミン系化合物−２を添加したＤＭＥＭ（＋）にて培養したＢ１６マウスメラノーマ細胞のＳＥＭ写真である。図２のＳＥＭ写真において、黒色の斑点様の箇所が、メラニンの産生部位である。【００８０】
図２のとおり、市販の美白化粧水を用いた場合、リン酸緩衝液を用いた場合よりは、メラニンの産生が少ない。しかし、アルブミン系化合物−２を用いると、メラニンの産生は殆ど認められず、リン酸緩衝液と比較してメラニンの産生が著しく抑制されているのは勿論のこと、市販の美白化粧水と比較しても、メラニンの産生が著しく抑制されている。【００８１】
よって、図１及び図２より、アルブミンに硫黄原子が付加したものであり、１部位につき複数個の硫黄原子を有するアルブミン系化合物は、メラニン産生抑制効果に極めて優れることが分かる。【００８２】
２−２．メラニン産生量の測定
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を、２．５×１０4セル／ウェルとなるように、２４ウェルプレートに播種し、ＤＭＥＭ（＋）で３７℃、５％ＣＯ2の条件下において２４時間プレ培養した。次いで、プレ培養した培地を、アルブミン系化合物−１〜４の何れかを添加したＤＭＥＭ（＋）（アルブミン系化合物：２０μＭ、チロシン：０．４ｍＭ、ＮＨ4Ｃｌ：１０ｍＭ）と交換し、さらに３７℃、５％ＣＯ2の条件下において７２時間培養した。【００８３】
なお、アルブミン系化合物を添加したＤＭＥＭ（＋）に代えて、製造例１〜４で用いた脱脂ヒト血清アルブミンを添加したＤＭＥＭ（＋）にて培養したものを、コントロールとして用意した。【００８４】
次いで、ウェルに接着している培養後のＢ１６マウスメラノーマ細胞を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ）を２００μＬずつ加えた。これを６０℃で１時間インキュベートして、培養後のＢ１６マウスメラノーマ細胞を溶解させ、細胞溶解液を回収した。上述の「２−１．吸光度の測定及び光学顕微鏡写真の撮影」で用いたものと同じ分光光度計を用いて、細胞溶解液の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定して、培養後のＢ１６マウスメラノーマ細胞内のメラニン産生量を算出した。その結果を図３に示す。【００８５】
図３は、各細胞溶解液における培養後のＢ１６マウスメラノーマ細胞内のメラニン産生量を示す棒グラフである。図３において、縦軸は、細胞溶解液（１ｍＬ）中のメラニン産生量（ｍｇ）を表す。【００８６】
図３のとおり、アルブミン系化合物−１〜４は何れも、コントロールの脱脂ヒト血清アルブミンと比較して、メラニン産生量が少ない。これにより、アルブミンに硫黄原子が付加したものであり、１部位につき複数個の硫黄原子を有するアルブミン系化合物は、アルブミンと比較して、メラニン産生抑制効果に優れることが分かる。【００８７】
特に、脱脂ヒト血清アルブミンにＮａ2Ｓ2、Ｎａ2Ｓ3、及びＮａ2Ｓ4をそれぞれ付加反応させたアルブミン系化合物−２、アルブミン系化合物−３、及びアルブミン系化合物−４は、メラニン産生量が非常に少ない。これにより、硫化物の中でも、特にＮａ2Ｓ2、Ｎａ2Ｓ3、又はＮａ2Ｓ4といった多硫化ナトリウムを、アルブミンに付加反応させて得られるアルブミン系化合物は、メラニン産生抑制効果にさらに優れることが分かる。【００８８】
試験例３（タンパク質濃度の測定）
上述の試験例２の「２−２．メラニン産生量の測定」と同様の方法にて培養したＢ１６マウスメラノーマ細胞を、生理食塩水で２回以上洗浄し、ウェルからできる限り水分を吸い取った。これに水酸化ナトリウム２００μＬを加えた後、細胞抽出液をマイクロチューブに移して、６０℃で２時間インキュベートした。インキュベート後の上清のタンパク質溶液を新しいマイクロチューブに回収し、これを試料とした。【００８９】
また、スタンダードとしてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）標準タンパク質溶液（タンパク質濃度：１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、又は０．１２５ｍｇ／ｍＬ）を準備した。【００９０】
試験管に、各試料１０μＬ、各スタンダード１０μＬ、又はバックグラウンド１０μＬを取り、各々タンパク質定量試薬（ビシンコニン酸試薬）１００μＬを加えてよく撹拌し、３７℃で３０分間加温した。試験管内の溶液の温度が室温（２５℃）まで下がったことを確認した後、上述の試験例２の「２−１．吸光度の測定及び光学顕微鏡写真の撮影」で用いたものと同じ分光光度計を用いて吸光度を測定した。【００９１】
波長５４０ｎｍにおけるバックグラウンドの吸光度を０．００に設定した。次いで、波長５４０ｎｍにおける各スタンダードの吸光度を測定して、標準直線を作成した。波長５４０ｎｍにおける各試料の吸光度を測定した後、スタンダードの標準直線を用いて、各試料のタンパク質濃度を求めた。各試料のタンパク質濃度を以下に示す。【００９２】
タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）
コントロール（ヒト血清アルブミン）  ０．８１
試料１（アルブミン系化合物−１）    ０．８４
試料２（アルブミン系化合物−２）    ０．８８
試料３（アルブミン系化合物−３）    ０．９７
試料４（アルブミン系化合物−４）    ０．９５【００９３】
試験例４（金属イオンによる効果の確認）
４−１．サルフェン硫黄の検出
まず、測定試料１ａ及び２ａを調製した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）と塩化第二鉄（Ｆｅ3+濃度：１ｍＭ）との混合液に、脱脂ヒト血清アルブミン（２０ｍｇ、３００μＭ）を溶解させて測定試料１ａを調製した。リン酸緩衝液と塩化銅（Ｃｕ2+濃度：１ｍＭ）との混合液に、脱脂ヒト血清アルブミン（２０ｍｇ、３００μＭ）を溶解させて測定試料２ａを調製した。【００９４】
次いで、測定試料１ｂ及び２ｂを調製した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）と塩化第二鉄（Ｆｅ3+濃度：１ｍＭ）との混合液中、脱脂ヒト血清アルブミン（２０ｍｇ、３００μＭ）にＮａ2Ｓ（７８μｇ、１ｍＭ）を加え、３７℃に加温して７時間反応させて、ヒト血清アルブミンに硫黄原子を付加させた。付加反応後の生成物について、製造例１と同じ条件にてゲルを濾過して未反応の硫化物を除去し、測定試料１ｂを調製した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）と塩化第二鉄（Ｆｅ3+濃度：１ｍＭ）との混合液に代えて、リン酸緩衝液と塩化銅（Ｃｕ2+濃度：１ｍＭ）との混合液を用いたほかは、測定試料１ｂと同様にして、測定試料２ｂを調製した。【００９５】
測定試料１ａ及び２ａ、並びに測定試料１ｂ及び２ｂについて、上述の試験例１と同様の蛍光プローブ法によりサルフェン硫黄の検出を行った。【００９６】
すなわち、測定試料と、ジメチルスルホキシドにＳＳＰ２（５μＭ）を溶解させた蛍光指示薬とを、室温（２５℃）で１０分間反応させた後、分光蛍光光度計を用いて反応物の蛍光強度を測定した。その結果を図４に示す。【００９７】
図４は、測定試料１ａ及び２ａ、並びに測定試料１ｂ及び２ｂの蛍光強度を示す棒グラフである。図４において、縦軸は蛍光強度（単位なし）を表す。【００９８】
図４のとおり、測定試料１ａの蛍光強度よりも測定試料１ｂの蛍光強度の方が高く、測定試料２ａの蛍光強度よりも測定試料２ｂの蛍光強度の方が高い。これにより、金属イオンの存在下においてヒト血清アルブミンに硫化ナトリウムを反応させると、ヒト血清アルブミンへの硫黄原子の付加反応が促進されることが分かる。【００９９】
また、測定試料１ｂの蛍光強度と測定試料１ａの蛍光強度との差よりも、測定試料２ｂの蛍光強度と測定試料２ａの蛍光強度との差の方がはるかに大きい。これにより、特に、三価のＦｅ3+を存在させるよりも、二価のＣｕ2+を存在させた方が、ヒト血清アルブミンへの硫黄原子の付加反応が促進され易いことが分かる。【０１００】
４−２．メラニン産生量の測定
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に、後述の表１及び表２に示すｐＨ及び成分の温泉水−１〜１０を６６．７質量％の割合で混合させた混合溶液中、脱脂ヒト血清アルブミン（２０ｍｇ、３００μＭ）にＮａ2Ｓ2（１１０μｇ、１ｍＭ）を加え、３７℃に加温して７時間反応させて、ヒト血清アルブミンに硫黄原子を付加させた。付加反応後の生成物について、製造例１と同じ条件にてゲルを濾過して未反応の硫化物を除去し、アルブミン系化合物−２Ａ〜２Ｊ（１０〜１８ｍｇ）を得た。なお、表１及び表２中、ラドン以外の各成分の量は、温泉水１ｋｇあたりの含有量（ｍｇ）であり、ラドンの量は、温泉水１ｋｇあたりの含有量（×１０-10Ｃｉ）である。【０１０１】
【表１】
2017209028.tif 000002
【０１０２】
【表２】
2017209028.tif 000003
【０１０３】
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を、２．５×１０4セル／ウェルとなるように、２４ウェルプレートに播種し、ＤＭＥＭ（＋）で３７℃、５％ＣＯ2の条件下において２４時間プレ培養した。次いで、プレ培養した培地を、アルブミン系化合物−２Ａ〜２Ｊの何れかを添加したＤＭＥＭ（＋）（アルブミン系化合物：２０μＭ、チロシン：０．４ｍＭ、ＮＨ4Ｃｌ：１０ｍＭ）と交換し、さらに３７℃、５％ＣＯ2の条件下において７２時間培養した。【０１０４】
なお、アルブミン系化合物−２Ａ〜２Ｊの何れかを添加したＤＭＥＭ（＋）に代えて、製造例１で用いた脱脂ヒト血清アルブミンを添加したＤＭＥＭ（＋）にて培養したものを、コントロールとして用意した。また、アルブミン系化合物−２Ａ〜２Ｊの何れかを添加したＤＭＥＭ（＋）に代えて、アルブミン系化合物−２（温泉水なしで製造）を添加したＤＭＥＭ（＋）にて培養したものも併せて用意した。【０１０５】
次いで、上述の試験例２の「２−２．メラニン産生量の測定」と同様にして細胞溶解液を回収し、上述の試験例２の「２−１．吸光度の測定及び光学顕微鏡写真の撮影」で用いたものと同じ分光光度計を用いて、細胞溶解液の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定して、培養後のＢ１６マウスメラノーマ細胞内のメラニン産生量を算出した。その結果を図５に示す。【０１０６】
図５は、各細胞溶解液における培養後のＢ１６マウスメラノーマ細胞内のメラニン産生量を示す棒グラフである。図５において、縦軸は、細胞溶解液（１ｍｇ／ｍＬ）中の吸光度（４５０ｎｍ）を表す。【０１０７】
図５のとおり、アルブミン系化合物−２Ａ〜２Ｊの中でも、アルブミン系化合物−２Ｃ〜２Ｅ及び２Ｆ〜２Ｊは、コントロールの脱脂ヒト血清アルブミンと比較して、メラニン産生量が非常に少ないのは勿論のこと、温泉水なしで製造したアルブミン系化合物−２と比較しても、メラニン産生量が非常に少ない。これにより、各種金属イオンを含む温泉水の存在下においてヒト血清アルブミンに硫化ナトリウムを反応させると、より充分に硫黄原子が付加しており、メラニン産生抑制効果にさらに優れたアルブミン系化合物が得られることが分かる。【０１０８】
試験例５（安全性の確認）
まず、アルブミン系化合物を配合した美白化粧料を処方した。以下のアルブミン系化合物以外の各成分を以下の配合量（固形分換算）となるように調製した後、５０℃に加温し、均一な状態となるまで撹拌混合した。混合物を室温（２５℃）まで冷却し更にアルブミン系化合物を混合したのち、クリームＡを得た。【０１０９】
成分                            配合量（質量部）
アルブミン系化合物−２                  ０．１３３
乳化ワックス                            ５
オホバ油                              １５
精製水                                残量
（合計）                              １００【０１１０】
また、上述のアルブミン系化合物−２に代えて、アルブミン系化合物−２Ｄを配合したほかは、クリームＡと同様にして、クリームＢを得た。さらに、上述のアルブミン系化合物−２を配合しなかったほかは、クリームＡと同様にして、コントロールクリームを得た。【０１１１】
経済協力開発機構が示すガイドライン（化学物質の試験に関するＯＥＣＤガイドライン）ＴＧ４３９「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ皮膚刺激性：再構築ヒト表皮試験法」に記載の方法に準拠して、クリームＡ、クリームＢ及びコントロールクリームの安全性を、３次元培養皮膚細胞の生存率にて評価した。その結果を図６に示す。【０１１２】
図６は、各クリームにおける細胞生存率を示す棒グラフである。図６において、縦軸は細胞生存率（％）を表す。なお、細胞生存率が５０％を超える場合、皮膚刺激性がないと判断される。【０１１３】
図６のとおり、クリームＡ及びクリームＢは何れも、コントロールクリームと同様に、細胞生存率が５０％を超えている。これにより、温泉水なしで製造したアルブミン系化合物−２及び温泉水の存在下において製造したアルブミン系化合物−２Ｄは何れも、皮膚刺激性がなく、安全性に優れたものであることが分かる。【０１１４】
なお、アルブミン系化合物−２及びアルブミン系化合物−２Ｄは何れも、硫化水素臭を有さず不適切な匂いを持たない。よって、アルブミン系化合物−２を配合したクリームＡ及びアルブミン系化合物−２Ｄを配合したクリームＢは何れも、不適切な匂いを持たない。【０１１５】
試験例６（細胞内ＲＯＳ及びＮＯの測定）
蛍光試薬ＣＭ−Ｈ2ＤＣＦ−ＤＡ、ＣＭ−Ｈ2ＤＣＦ−ＤＡを用いて細胞内活性酸素（ＲＯＳ）及び一酸化窒素（ＮＯ）に基づく蛍光強度を測定した。【０１１６】
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を、１×１０4セル／ウェルとなるように、９６ウェルプレートに播種し、ＤＭＥＭ（＋）で３７℃、５％ＣＯ2の条件下において２４時間プレ培養した。【０１１７】
培地に蛍光試薬ＣＭ−Ｈ2ＤＣＦ−ＤＡを濃度５μＭまで添加し、３７℃で３０分反応させて細胞内に取り込ませた。反応後、上清を除去したのち、アルブミン系化合物−４を添加した。同様の作業を行った培地をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）及び脱脂ヒト血清アルブミンを添加したサンプルとして用意し、コントロールとした。それぞれのサンプルに波長２５４ｎｍの紫外線を１０分間照射した。その後、波長４８５ｎｍの励起光を照射し、波長５３５ｎｍの蛍光強度を測定した。【０１１８】
また、培地に蛍光試薬ＤＡＦ−ＦＭ−ＤＡを濃度１０μＭまで添加し、３７℃で３０分反応させて細胞内に取り込ませ、一酸化窒素（ＮＯ）測定用の懸濁液サンプルとした。反応後、培地をアルブミン系化合物−４溶液に置換した。同様の培地においてリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）及び脱脂ヒト血清アルブミン溶液で置換したサンプルを用意し、コントロールとした。これらのサンプルに波長２５４ｎｍの紫外線を１０分照射した。得られたサンプルについて、波長４８５ｎｍの励起光を照射し、波長５３５ｎｍの蛍光強度を測定した。【０１１９】
図７（ａ）および図７（ｂ）は、それぞれ、細胞内活性酸素および一酸化窒素に起因する平均蛍光強度を示す棒グラフである。蛍光強度が少ないほど、細胞内に含まれる活性酸素（ＲＯＳ）及び一酸化窒素（ＮＯ）が少ないことを示す。【０１２０】
図７（ａ）に示すように、脱脂ヒト血清アルブミンを用いた場合でもリン酸緩衝液を用いた場合よりは、活性酸素に基づく蛍光強度が減少した。しかし、アルブミン系化合物−４を用いると活性酸素に基づく蛍光強度が大きく減少しており、リン酸緩衝液を添加した場合と比較して活性酸素が著しく減少されているのは勿論のこと、脱脂ヒト血清アルブミンを添加した場合と比較しても、活性酸素が減少していることが分かる。【０１２１】
また、図７（ｂ）に示すように、脱脂ヒト血清アルブミンを用いた場合は、リン酸緩衝液を用いた場合よりも、一酸化窒素に基づく蛍光強度は増大した。しかし、アルブミン系化合物−４を用いると、一酸化窒素に基づく蛍光強度は大きく減少しており、リン酸緩衝液及び脱脂ヒト血清アルブミンを添加した場合と比較して一酸化窒素が大きく減少していることが分かる。【０１２２】
図８は、メラニン発生の発生メカニズムを説明するためのメカニズムを示す模式図である。皮膚のメラニンは以下のように発生すると考えられている。【０１２３】
まず、皮膚内のチロシンは、酸化酵素チロシナーゼを介して、ドーパに変換される。ドーパはさらにチロシナーゼの働きにより、ドーパキノンに変化する。ドーパキノンは反応性が高く、体内の諸反応を経て、最終的には安定構造メラニンを生成し、メラニンが皮膚の褐色化の原因となる。【０１２４】
チロシナーゼは細胞内の活性酸素（ＲＯＳ）及び一酸化窒素（ＮＯ）により活性化されることが知られている。活性酸素及び一酸化窒素は紫外線によって増大するが、活性酸素及び一酸化窒素を低減できれば、チロシナーゼの活性化を抑制でき、メラニンの発生を抑制できると考えられる。【０１２５】
図７（ａ）及び図７（ｂ）に示したように、硫黄原子の付加されたアルブミン系化合物は活性酸素及び一酸化窒素の発生を抑制し、その結果、メラニンの発生を低減させて美白効果を奏するものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明に係る美白化粧料は、基礎化粧品又はメイクアップ化粧品として好適に使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年10月18日(2017.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミン系化合物を含み、
前記アルブミン系化合物は、アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫黄原子が付加したものであり、
前記アルブミン系化合物は、１部位につき複数個の硫黄原子を有する、美白化粧料。
【請求項２】
前記アルブミン系化合物は、１部位につき２個以上６個以下の硫黄原子を有する、請求項１に記載の美白化粧料。
【請求項３】
前記アルブミンは、血清アルブミンである、請求項１又は２に記載の美白化粧料。
【請求項４】
美白化粧料の製造方法であって、
アルブミンまたはアルブミン誘導体に硫化物を付加反応させる工程を含む、美白化粧料の製造方法。
【請求項５】
前記アルブミンは、血清アルブミンである、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記硫化物は、多硫化ナトリウムである、請求項４又は５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記多硫化ナトリウムは、Ｎａ２Ｓ２、Ｎａ２Ｓ３、又はＮａ２Ｓ４である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
加温して、前記アルブミンまたは前記アルブミン誘導体に前記硫化物を付加反応させる、請求項４〜７の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
金属イオンの存在下において、前記アルブミンまたは前記アルブミン誘導体に前記硫化物を付加反応させる、請求項４〜８の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記金属イオンは、二価の金属イオンである、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記金属イオンは、温泉成分由来である、請求項９または１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
二価の金属イオンを複数種含む温泉水を用いる、請求項４〜１１の何れか一項に記載の製造方法。
【国際調査報告】
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