(57)【要約】  キラルアミノ酸の分析において消光を生じない光学分割試薬の開発を目的とする。消光を生じさせない光学分割用の新規化合物を提供することにより、課題が解決される。本発明は、新規化合物、当該新規化合物を含む光学分割用試薬、当該新規化合物を反応させる工程を含む光学分割する方法、及び当該新規化合物をアミノ酸と反応させて得た光学異性体に関する。
2018159841.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化１】
2018159841.tif 000019
で表される化合物、又はその塩。
【請求項２】
以下の式：
【化２】
2018159841.tif 000020
で表される化合物、又はその塩を含む、蛍光誘導体化用試薬。
【請求項３】
試料中のアミノ基含有化合物を分析する方法であって、
アミノ基含有化合物を含む試料と、以下の式：
【化３】
2018159841.tif 000021
で表される化合物とを反応させる工程；
反応物をクロマトグラフィーに導入する工程
を含む、前記方法。
【請求項４】
前記分析方法が、光学異性体の光学分割方法であって、クロマトグラフィーがキラルクロマトグラフィーである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アミノ基含有化合物が、アミノ酸である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
アミノ酸誘導体の製造方法であって、
アミノ酸を、以下の式：
【化４】
2018159841.tif 000022
で表される化合物と反応させることを含む、前記方法。
【請求項７】
以下の式：
【化５】
2018159841.tif 000023
[式中、Ｒは、アミノ酸の側鎖である]
で表される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規化合物、当該新規化合物を含む蛍光誘導体化用試薬、及び当該新規化合物をアミノ酸と反応させて得た蛍光誘導体化アミノ酸を光学分割する方法、及び当該新規化合物をアミノ酸と反応させて得たアミノ酸の蛍光誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、高等動物の生体中に存在するアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸のみであると考えられてきた。しかしながら、近年、分析技術の発展により、高等動物、特にヒトを含む哺乳類の生体内にもＤ−アミノ酸が存在し、記憶・学習やホルモン産生・分泌などの生理機能を有することが明らかになっている。また、様々な組織や生体試料において存在するＤ−アミノ酸のうちの幾つかが、体の状態、例えば腎不全などの疾患により変動することが示されており、健康・疾患マーカーとしての利用が期待されている（特許文献１）。【０００３】
生体内のアミノ酸の生理的役割を解明する観点から、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法を利用して、アミノ酸（例えば、非特許文献１−３参照）やＤ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸を精密に分離して定量する分析手法（例えば、非特許文献４参照）の開発研究が進められている。また、従来のＨＰＬＣラベル化用の試薬である４−フルオロ-７-ニトロ-２，１，３-ベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）により蛍光誘導体化を図り、２次元キラルＨＰＬＣを組み合わせることで、タンパク質を構成するアミノ酸の全てを選択的に分析する方法が開発されている（非特許文献５）。さらに、より高感度で簡便にアミノ酸の光学異性体混合物を光学分割できる光学分割用の試薬も開発されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１４０７８５号公報
【特許文献２】特開２０１５−４８３３２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】K．Shimbo et al., Anal．Chem．，2009，81，5172−5179
【非特許文献２】K．Shimbo et al., Rapid  Commun．Mass  Spectrom．，2009，23，1483−1492
【非特許文献３】S．A．Cohen et al.,  Anal．Biochem．，1993，211，279−287
【非特許文献４】R．J．Reischl et al., J．Chromatogra．A．，2012，1269，262−269
【非特許文献５】T. Kimura, et al., Scientific Reports, (2016), 6, 26137
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来のＨＰＬＣラベル化用の試薬である４−フルオロ-７-ニトロ-２，１，３-ベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）を用いたＤ−アミノ酸の分析技術では、トリプトファンとＮＢＤ−Ｆ試薬が反応して生じるＮＢＤ−トリプトファンにおいて、消光が生じてしまい、検出感度が低くなるという課題を見出した。一般的なアミノ酸分析システムの測定レンジは３〜４桁オーダーであるが、ＮＢＤ−トリプトファンは消光により測定値がこのレンジに収まらず、４０以上ある他のキラルアミノ酸との同時分析が困難となるため、代謝物を網羅的に分析するメタボロミクスの手法に適用できないことがあった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題に対して、アミノ酸を誘導体化した際に、消光が生じない化合物について探索したところ、以下の式：
【化１】
2018159841.tif 000003
で表される化合物でトリプトファンを誘導体化した場合に、得られたトリプトファン誘導体について消光が生じず、またトリプトファン誘導体のＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸をキラルカラムクロマトグラフィーによって分離可能であることを見いだし、本発明に至った。【０００８】
そこで本発明は以下に関する：
[１]  以下の式：
【化２】
2018159841.tif 000004
で表される化合物、又はその塩。
[２]  以下の式：
【化３】
2018159841.tif 000005
で表される化合物、又はその塩を含む、蛍光誘導体化用試薬。
[３]  試料中のアミノ基含有化合物を分析する方法であって、
当該アミノ基含有化合物を含む試料と、以下の式：
【化４】
2018159841.tif 000006
で表される化合物とを反応させる工程；
反応物をクロマトグラフィーに導入する工程
を含む、前記方法。
[４]  前記分析方法が、光学異性体を光学分割する方法であり、クロマトグラフィーがキラルクロマトグラフィーである、項目３に記載の方法。
[５]  前記アミノ基含有化合物が、アミノ酸である、項目３又は４に記載の方法。
[６]  アミノ酸の蛍光誘導体の製造方法であって、
アミノ酸と、以下の式：
【化５】
2018159841.tif 000007
で表される化合物とを反応させることを含む、前記方法。
[７]  以下の式：
【化６】
2018159841.tif 000008
[式中、Ｒは、アミノ酸の側鎖である]
で表される化合物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、消光による検出感度の低下を抑えることができ、光学分割に用いられる蛍光誘導体化用の化合物を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、タンパク質構成アミノ酸を含有する試料を、ＮＢＤ−Ｆで蛍光誘導体化して、ＨＰＬＣ分析に供して得たクロマトグラムに関する。
【図２】図２は、Ｄ−アラニン及びＬ−アラニン、及びＤ−トリプトファン及びＬ−トリプトファンを含有する試料を、ＮＢＤ−Ｆ（Ａ）又はＮＢＤ−ＣＯＯＳｕ（Ｂ）及び（Ｃ）で誘導体化して、キラルＨＰＬＣ分析に供して得たクロマトグラムを表す。（Ａ）及び（Ｂ）では、キラルＨＰＬＣの分離物を蛍光分析により測定している一方で、（Ｃ）ではキラルＨＰＬＣの分離物を質量分析により測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（新規化合物）
本発明者らは、下記式で表される化合物(２，５−ジオキソピロリジン−１−イル２−[Ｎ‐（４−ニトロベンゾ[ｃ][１，２，５]オキサジアゾール−７−イル）‐Ｎ‐メチルアミノ］アセテート（ＮＢＤ−ＣＯＯＳｕ）)を新規に製造した。したがって、本発明の一の態様は、以下の式：
【化７】
2018159841.tif 000009
で表される化合物又はその塩に関する。塩としては、任意の酸と形成された塩を挙げることができる。例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩及び過塩素酸塩などの無機酸塩、又は酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩又はマロン酸塩などの有機酸塩が挙げられる。
【００１２】
（新規化合物の合成）
この化合物は、任意の方法により製造されてもよいが、例えば下記のスキーム１及びスキーム２に基づいて製造することができる。
【化８】
2018159841.tif 000010
【００１３】
（蛍光誘導体化用試薬及びその反応）
本発明の化合物は、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）に基づいて蛍光を発すると共に、スクシンイミジル基の反応性に基づいて、アミノ基を有する化合物と反応して蛍光誘導体を生成する。アミノ基を有する化合物であれば、任意の化合物と反応することができ、例えばアミノ酸が挙げられる。具体的に、例えば下記のスキームに基づき、アミノ酸の蛍光誘導体を生成する。したがって、本発明の別の態様では、２，５−ジオキソピロリジン―１−イル２−[Ｎ‐（４−ニトロベンゾ[ｃ][１，２，５]オキサジアゾール−７−イル）‐Ｎ‐メチルアミノ]アセテート（ＮＢＤ−ＣＯＯＳｕ）を含む蛍光誘導体化用試薬に関する。後述のとおり、蛍光誘導体化試薬により蛍光誘導体化されたアミノ酸をキラルカラムクロマトグラフィーに導入することで、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸を分離することができることから、本発明の蛍光誘導体化試薬は、光学分割用試薬ということもできる。
【化９】
2018159841.tif 000011
（式中、Ｒは、アミノ酸の任意の側鎖を表す）
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の化合物を、アミノ酸と反応させることを含む、アミノ酸の蛍光誘導体を製造する方法にも関する。また当該製造方法により製造されたアミノ酸の蛍光誘導体、すなわち以下の式：
【化１０】
2018159841.tif 000012
（式中、Ｒは、任意のアミノ酸の側鎖を表す）
を有する、アミノ酸蛍光誘導体にも関する。本発明において、Ｒは、任意のアミノ酸の側鎖を表すが、タンパク質構成アミノ酸の側鎖であってもよい。さらに光学分割する観点では、タンパク質構成アミノ酸のうち、グリシン側鎖（-Ｈ）を除く任意の側鎖であることが好ましい。代表的には、アラニン側鎖（−ＣＨ3）又はトリプトファン側鎖（
【化１１】
2018159841.tif 000013
）がある。これらのアミノ酸蛍光誘導体は、ＮＢＤ部分に起因した蛍光を発することができ、また一部のアミノ酸側鎖の構造に起因して生じうる蛍光消光が生じない点に特徴がある。また、これらのアミノ酸蛍光誘導体は、元のアミノ酸の有するキラリティを保持している。したがって、アミノ酸蛍光誘導体をキラルカラムクロマトグラフィーに導入することで、元のアミノ酸のキラリティに基づき、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の分離が可能である点も特徴となる。
【００１５】
従来技術であるＮＢＤ−Ｆを用いて誘導体化された場合に、トリプトファン誘導体は、消光が生じていた（図１及び図２Ａ）。したがって、消光を生じないトリプトファン誘導体は、Ｄ−アミノ酸の網羅的解析の上で特に有用である。本発明の実施例において、上述のアミノ酸誘導体のうち、トリプトファン誘導体において、消光が生じないことが明らかにされた（図２Ｂ）。ここで、消光は、理論に限定されることを意図するものではないが、化合物中の蛍光性を有する構造に隣接する構造に起因して蛍光が失われることをいう。
【００１６】
本発明の化合物を、光学異性体を有する化合物、例えばアミノ酸（Ｄ−アミノ酸＋Ｌ−アミノ酸）と反応させて得たアミノ酸の蛍光誘導体に対して、光学分割クロマトグラフィーを行うことにより、元の光学異性に基づいて、分離及び分析が可能になる。したがって、本発明のさらに別の態様では、本発明の化合物を含む、光学分割用試薬に関する。光学分割及び／又は蛍光誘導体化用試薬と、光学分割用カラムとを含む光学分割及び／又は蛍光誘導体化用のキット又はシステムに関していてもよい。
【００１７】
本発明の別の態様では、本発明は、試料中のアミノ基含有化合物を分析する方法に関する。具体的に、アミノ基含有化合物を含む試料と、以下の式：
【化１２】
2018159841.tif 000014
で表される化合物とを反応させる工程；
反応物をクロマトグラフィーに導入する工程
を含む。本発明の分析方法は、特に光学異性体を分離する光学分割方法であることが好ましく、その場合クロマトグラフィーとしては、キラルクロマトグラフィーが行われる。アミノ基を有する化合物であれば、任意の化合物を用いることができる。例えばアミノ酸が挙げられ、アミノ酸、特にタンパク構成アミノ酸の光学異性体、すなわちＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸を分離して分析することができる。
【００１８】
アミノ基含有化合物を含む試料と本発明の化合物とを反応させる工程は、アミノ基含有化合物を含む試料と、本発明の化合物を含む溶液とを混合し、場合により加熱することで反応を行うことができる。この反応は、蛍光退色を避ける目的から暗所で行われることが好ましい。適切な溶媒を任意に使用することができ、例えば水、メタノール、エタノール、アセトニトリルなどを用いることができる。
【００１９】
アミノ基含有化合物を含む試料は、生体試料、環境試料、実験試料、工業試料（食品試料、医薬品試料、化粧品試料）などの任意の試料であってよい。生体試料としては、血液、唾液、涙液、リンパ液などの体液、細胞や臓器などの組織試料、及び尿や糞便などの排泄物試料が挙げられる。これらの試料を直接、本発明の化合物と反応させてもよいが、反応工程の前に、試料に応じて適宜精製することが好ましい。また、反応工程後に精製を行うこともできる。試料の精製は、濾過、徐タンパク、溶媒抽出、イオン交換、固相抽出などが、試料の種類に応じて適宜選択して、または組み合わせて行うことができる。
【００２０】
上述の反応工程において、本発明の化合物と反応し、誘導体化されたアミノ基含有化合物は、光学分割カラムを備えたクロマトグラフィーに供される。クロマトグラフィーとしては、ＨＰＬＣが好ましい。光学分割カラムを備えたクロマトグラフィーに供する前に、別のカラム系を用いて予めクロマトグラフィーを行っていてもよい。光学分割カラムは、本発明の化合物により誘導体化されたＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸を分離できるカラムを任意に選択することができる。光学分割カラムは、一方の光学異性体のみを含む化合物を固定相として用いたものであり、例えば一例として、グリシン誘導体、ロイシン誘導体、キニーネ誘導体等を使用することができる。クロマトグラフィーによりＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸とに分離されたアミノ酸誘導体について、その蛍光を検出することにより分析することができる。蛍光の検出は、クロマトグラフィーシステムに含まれる検出器において行われうる。検出器は、ＮＢＤを励起する励起光（４７０ｎｍ）を照射し、励起したＮＢＤに由来する蛍光（蛍光波長：５３０ｎｍ）を検出することで、誘導体化されたアミノ酸を分析することができる。
【００２１】
タンパク質構成アミノ酸とは、タンパク質を構成する２０種類のアミノ酸を指す。タンパク質構成アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ／Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ／Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ／Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ／Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ／Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ／Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ／Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ／Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ／Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ／Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ／Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ／Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ／Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ／Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ／Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ／Ｖ）が挙げられる。これらのアミノ酸のうち、グリシンを除くアミノ酸について、Ｄ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の光学異性体が存在する。また、スレオニンとイソロイシンにはアロ体が存在する。本発明の試料中のアミノ酸を光学分割して分析する方法において、分析されるアミノ酸は、好ましくはグリシンを除くタンパク質構成アミノ酸であるが、その他のアミノ酸、例えばオルニチン、シトルリン等についても分析することができる。
【実施例】
【００２２】
実施例１：２，５−ジオキソピロリジン―１−イル２−[Ｎ‐（４−ニトロベンゾ[ｃ][１，２，５]オキサジアゾール―７−イル）‐Ｎ‐メチルアミノ]アセテート（ＮＢＤ−ＣＯＯＳｕ）の合成
（１）ＮＢＤ−ＣＯＯＨの合成
【化１３】
2018159841.tif 000015
暗所にて、Ｎ−メチルグリシン（１．８５ｇ、２０．８ｍｍｏｌ）を０．５２Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）に溶解し、これにＮＢＤ−Ｃｌ（１．０４ｇ、５．２３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５０ｍＬ）を滴下して加えた。溶液を室温で２時間撹拌した後、減圧下でアセトニトリルを留去した。溶液に６Ｍ塩酸水溶液（１４ｍＬ）を加えて酸性とした後、室温で３０分間撹拌した。析出した固体を吸引濾過し、減圧下で乾燥して、橙色固体を得た（1.35 g, quant.）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.54 (d, J= 9.0Hz, 1H), 6.47 (d, J=9.2 Hz, 1H), 4.91 (s, 2H), 3.47 (s, 3H)。【００２３】
（２）  ２，５−ジオキソピロリジン―１−イル２−[Ｎ‐（４−ニトロベンゾ[ｃ][１，２，５]オキサジアゾール―７−イル）‐Ｎ‐メチルアミノ]アセテート（ＮＢＤ−ＣＯＯＳｕ）の合成
【化１４】
2018159841.tif 000016
暗所にて、実施例１で調製したＮＢＤ−ＣＯＯＨ（２３６ｍｇ、０．９３５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２ｍＬ）に溶解し、塩化オキサリル（１．１ｍＬ）を滴下して溶液に加えた。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５μＬ）を溶液に加え、室温で１時間撹拌した。その後、減圧下で溶媒を留去し、真空乾燥した。得られた残渣を塩化メチレン（１ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（１１５．２ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（０．１ｍＬ）を塩化メチレン（１ｍＬ）に溶解した溶液に滴下した。１日の撹拌後、塩化メチレン（５０ｍＬ）を加え、水（２０ｍＬ）で２回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）で２回、水（２０ｍＬ）で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過した後、減圧下で溶媒を留去し、橙色の粉末を得た（２０６ｍｇ、収率６３．２％）
1H NMR (500 MHz, CD2Cl2) δ 8.50 (d, J= 8.7Hz, 1H), 6.32 (d, J=8.8 Hz, 1H), 5.26 (s, 2H), 3.52 (s, 3H), 2.84 (s, 4H)。【００２４】
実施例２：ＮＢＤ−ＣＯＯＳｕによるアミノ酸の蛍光誘導体化
【化１５】
2018159841.tif 000017
【化１６】
2018159841.tif 000018
２０ｐＭのＤ−トリプトファン及び８０ｐＭのＬ−トリプトファンをそれぞれ含むトリプトファン水溶液（１０μＬ）、及び０．５ｐＭのＤ−アラニン及び２ｐＭのＬ−アラニンをそれぞれ含むアラニン水溶液（１０μＬ）に４００ｍＭホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）２０μＬを加え、さらに４０ｍＭのＮＢＤ−ＣＯＯＳｕのアセトニトリル溶液（５μＬ）加えて６０°Ｃで２分間反応させた。次に０．２％トリフルオロ酢酸水溶液（７５μＬ）を加えて反応を停止させて、アミノ酸誘導体（ＮＢＤ−ＣＯ−Ｔｒｐ、及びＮＢＤ−ＣＯ−Ａｌａ）を取得した。【００２５】
実施例３：ＨＰＬＣによる分離
実施例２において得られたアミノ酸誘導体を、ＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ分析に使用したカラムは、ＫＳＡＡＣＳＰ−００１Ｒ（１．５ｍｍ i.d.×２５０ｍｍ）をキラル固定相としたオリジナルＰｒｉｋｌｅ型カラム（特許５９７７７６５号）であり、移動相としては、アセトニトリル：メタノール（３０：７０）を用いた。検出は、蛍光（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍ）及びＵＶ／ＶＩＳ（測定波長４７０ｎｍ）検出器を用いて行った。アラニン誘導体水溶液を、ＨＰＬＣ分析に供した。分析後、カラムを洗い（メタノール１０分、ギ酸アンモウムで１０分、さらにメタノールで２０分）、溶出液で４０分間の安定化を行い、次いでトリプトファン誘導体水溶液をＨＰＬＣ分析に供した。蛍光検出により得られたクロマトグラムを図２Ｂに示す。また、蛍光検出に代えて、検出を質量分析により行った。質量分析により検出したクロマトグラムを図２Ｃに示す。【００２６】
比較例１：ＮＢＤ−Ｆを用いた場合のＨＰＬＣ分析
タンパク質構成アミノ酸及びアロ体を含むアミノ酸の標準試料に４００ｍＭホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）１０μＬを加え、さらに４０ｍＭのＮＢＤ−Ｆ溶液（５μＬ）加えて６０°Ｃで２分間反応させた。次に０．２％トリフルオロ酢酸水溶液（７５μＬ）を加えて反応を停止させて、アミノ酸誘導体を取得した。取得したアミノ酸誘導体を、４５℃に設定した逆相カラム（モノリシックＯＤＳカラム、０．５３ｍｍ  ｉ．ｄ．×１０００ｍｍ;資生堂）を備えたＨＰＬＣに供した。５〜３５％ＭｅＣＮ、０〜２０％ＴＨＦ、及び０．０５％ＴＦＡを含む水性移動相を用いて、移動相の流速を２５μＬ／分として勾配溶出を行った。蛍光検出により得られたクロマトグラムを図１に示す。トリプトファンの蛍光強度が際立って低く、定量が困難であることが示された。【００２７】
比較例２：ＮＢＤ−Ｆを用いた場合のキラルＨＰＬＣ分析
２０ｐＭのＤ−トリプトファン及び８０ｐＭのＬ−トリプトファンをそれぞれ含むトリプトファン水溶液（１０μＬ）、及び０．５ｐＭのＤ−アラニン及び２ｐＭのＬ−アラニンをそれぞれ含むアラニン水溶液（１０μＬ）に４００ｍＭホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）１０μＬを加え、さらに４０ｍＭのＮＢＤ−Ｆ溶液（５μＬ）加えて６０°Ｃで２分間反応させた。次に０．２％トリフルオロ酢酸水溶液（７５μＬ）を加えて反応を停止させて、アミノ酸誘導体（ＮＢＤ−Ｔｒｐ、及びＮＢＤ−Ａｌａ）を取得した。
取得したアミノ酸誘導体を、実施例３と同様にＨＰＬＣ分析に供した。蛍光検出により得られたクロマトグラムを図２Ａに示す。【００２８】
比較例２において、従来技術であるＮＢＤ−Ｆを用いて、アラニン及びトリプトファンを誘導体化し、誘導体をそれぞれキラルＨＰＬＣに供した結果が示された。アラニンでは、Ｄ−アラニン及びＬ−アラニンのピークが分離して観察されたものの、トリプトファンではＤ−トリプトファン及びＬ−トリプトファンの両方のピークが極めて低く定量ができなかった（図２Ａ）。理論に限定されることを意図するものではないが、ＮＢＤ環と、トリプトファンのインドール環との間で、光誘起電子移動が生じた結果消光が生じたものと考えられる。一方で、実施例３において、ＮＢＤ−ＣＯＯＳｕを用いてアラニン及びトリプトファンを誘導体化し、誘導体をそれぞれキラルＨＰＬＣに供した結果が示された。アラニン及びトリプトファンの両方について、それぞれＤ体及びＬ体のピークが分離して観察された（図２Ｂ）。そしてこのピークは、質量分析で検出した結果と一致した。これらの結果から、ＮＢＤ−ＣＯＯＳｕを用いたアミノ酸の誘導体化は、Ｄ体及びＬ体を含むアミノ酸を分離して、検出するために有効であることが示された。
【図１】
2018159841.tif 000024
【図２】
2018159841.tif 000025
【国際調査報告】
2018159841.tif 000026
2018159841.tif 000027
2018159841.tif 000028
2018159841.tif 000029