【手続補正書】
【提出日】平成31年3月13日(2019.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】間葉系幹細胞を含む組成物およびその使用
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ医薬品および軟組織傷害を治療するためのその使用に関する。特に本発明は、間葉系幹細胞集団および生体適合性マトリックスを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎年、何百万人もの人々が軟組織の急性傷害または使いすぎ障害、例えば皮膚への傷害（非治癒性皮膚創傷など）または筋肉への傷害（外傷性創傷または手術創傷など）のための医学的治療を求めている。創傷治癒のプロセスは３つの段階、すなわち炎症反応改善のためのサイトカインの放出からなる炎症段階、増殖因子およびサイトカインの影響を受けた前駆細胞の活性化および増殖と血管新生とを特徴とする修復または増殖段階、ならびに瘢痕組織とコラーゲンの他のコラーゲンおよびタンパク質分子への架橋とを特徴とし、それにより瘢痕の引張り強さを増加させるリモデリングまたは成熟段階を含む正確なパターンを辿る。
【０００３】
いくつかの再生医療手法が提案されたが、それらの臨床応用で制限されたままである。すなわち、増殖因子の局所注射は急速に枯渇する局所濃度、不適当な勾配および生理活性の喪失を依然として伴い(Borselliら, Proc Natl Acad Sci U S A. 2010, 107:3287-3292)、脱細胞化細胞外マトリックス（天然のＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを含有）の直接移植は、増殖因子の制御されない放出および主に外来起源であることに起因する生体適合性の欠如を伴い(Keaneら, Biomaterials. 2012, 33:1771-1781)、分化した筋肉細胞の移植は、例えば低酸素ストレスによる移植後の初期段階での低い細胞の生着によって制限されている(TurnerおよびBadylak, Cell Tissue Res. 2012, 347:759-774)。
【０００４】
次に、高い増殖および自己複製率、酸化ストレスまたは低酸素ストレスに対する抵抗性(Camassolaら, Methods Mol Biol Clifton NJ. 2012, 879:491-504)、筋形成、血管新生および局所的な細胞の免疫調節(Hongら, Curr Opin Organ Transplant. 2010, 15:86-91)により虚血性筋組織のリモデリングを改善するために幹細胞が提案された。
【０００５】
さらに、コラーゲンマトリックス含有組織製品上に播種した幹細胞が同じコラーゲンマトリックス含有組織製品上に播種した非幹細胞と比較して創傷修復を高めることが以前に実証されている(Lafosseら, Plastic and Reconstructive Surgery 2015, 136(2):279-95)。
【０００６】
欧州特許出願公開第２３７４４８５号および米国特許出願公開第２０１３／０１２１９７３号に開示されているように、最近の研究では間葉系幹細胞が播種された３次元足場について記載された。但し、これらの特許出願は、特に線維芽細胞に分化した間葉系幹細胞に関するものである。同様に、国際公開第２０１４／１５０７８４号ではコラーゲンマトリックスと間葉系幹細胞および非間葉系幹細胞を含有する細胞懸濁液とを含む軟組織傷害を治療するための組成物について記載された。
【０００７】
しかし、これらの代替物または組成物は生体内、特にヒトでは試験されなかった。
【０００８】
従って、軟組織傷害のための現在の治療の有効性を高めることがなお求められている。本出願人らは驚くべきことに実質的に純粋な間葉系幹細胞集団が実質的に純粋でない間葉系幹細胞集団と比較して傷害部位での修復および再生を高めることができることを実証した。
【０００９】
従って、本発明は、実質的に純粋な間葉系幹細胞集団および生体適合性マトリックスを含む組成物ならびに軟組織傷害を治療するためのその使用に関する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、生体適合性マトリックスおよび実質的に純粋な間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団を含む組成物に関する。
【００１１】
一実施形態によれば、本発明の間葉系幹細胞集団は２５％未満の線維芽細胞を含む。
【００１２】
一実施形態によれば、本発明の間葉系幹細胞は未分化である。
【００１３】
一実施形態では、本発明の間葉系幹細胞は脂肪組織、骨髄、臍帯組織、ホウォートンゼリー、羊水、胎盤、末梢血、卵管、角膜実質、肺、筋肉、皮膚、骨、歯の組織または胎児肝臓に由来している。好ましくは、本組成物の間葉系幹細胞は脂肪組織、より好ましくは皮下脂肪組織に由来している。
【００１４】
一実施形態によれば、本発明の生体適合性マトリックスは無細胞である。
【００１５】
一実施形態では、本発明の生体適合性マトリックスはコラーゲンを含む。
【００１６】
一実施形態では、本発明の生体適合性マトリックスはヒト、ブタ、ウシまたはウマのものである。
【００１７】
一実施形態によれば、本発明の間葉系幹細胞は治療される対象に由来する。
【００１８】
本発明は、それを必要とする対象における軟組織傷害を治療するために使用される、上記生体適合性マトリックスおよび間葉系幹細胞集団を含む組成物にも関する。
【００１９】
一実施形態によれば、本発明で治療される軟組織は、皮膚組織、筋肉組織、真皮組織、腱組織、靱帯組織、半月板組織および膀胱組織を含む群から選択される。
【００２０】
一実施形態では、軟組織傷害は急性もしくは慢性創傷である。
【００２１】
一実施形態によれば、治療される軟組織傷害は、軟組織の裂傷または断裂、皮膚創傷、皮膚火傷、皮膚潰瘍、手術創傷、血管疾患、筋肉疾患、ヘルニアおよび放射線創傷を含む群から選択される。特定の実施形態では、皮膚創傷は糖尿病性創傷である。
【００２２】
一実施形態によれば、本発明の使用のための組成物は局所投与されるか外科的移植によって投与される。
【００２３】
本発明は、実質的に純粋な間葉系幹細胞集団を生体適合性マトリックスと共にインキュベートする工程を含む、生体適合性マトリックスおよび間葉系幹細胞集団を含む組成物の調製方法にも関する。
【００２４】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
【００２５】
「間葉系幹細胞」またはＭＳＣは、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨髄支持間質細胞(myelosupportive stroma)、筋細胞または神経細胞系などの２種以上の特定の種類の間葉組織または結合組織に分化することができる多分化能幹細胞である。間葉系幹細胞は、限定されるものではないが、脂肪組織、骨髄、臍帯組織、ホウォートンゼリー、羊水、胎盤、末梢血、卵管、角膜実質、肺、筋肉、皮膚、骨、歯の組織、月経前流体、包皮および胎児肝臓などの組織から単離することができる。
【００２６】
「後期継代間葉系幹細胞」とは、初期継代細胞と比較した場合に低い免疫原性特性を示す細胞を指す。間葉系幹細胞の免疫原性は継代数に対応している。好ましくは、当該細胞は少なくとも第４継代まで継代されており、より好ましくは、当該細胞は少なくとも第６継代まで継代されており、最も好ましくは、当該細胞は少なくとも第８継代まで継代されている。
【００２７】
「酸素正常状態」とは、組織酸素レベルまたは生理的酸素レベルを指す。本発明の一実施形態では、酸素正常状態すなわち生理的酸素レベルでの細胞培養は、約３％〜約６％の酸素レベル、好ましくは約５％の酸素レベルでの培養を意味する。
【００２８】
「低酸素」とは低い酸素レベルを指す。本発明の一実施形態では、低酸素での細胞培養は、約０％〜約１％の酸素レベル、好ましくは約０．１％の酸素レベルでの培養を意味する。
【００２９】
「正常血糖」とは正常なレベルのグルコースを指す。本発明の一実施形態では、正常血糖での細胞培養は、約０．５ｇ／ｌ〜約１．５ｇ／ｌのグルコース濃度、好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース濃度での培養を意味する。
【００３０】
「高血糖」とは、高レベルのグルコースを指す。本発明の一実施形態では、高血糖での細胞培養は、約２ｇ／ｌ〜約１０ｇ／ｌのグルコース濃度、好ましくは約３ｇ／ｌ〜約６ｇ／ｌ、より好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース濃度での培養を意味する。
【００３１】
「生体適合性」とは、体、特に軟組織に対して毒性もしくは有害作用を有しないという品質を指す。一実施形態では、材料の生体適合性とは、対象においてどんな望ましくない局所もしくは全身作用も引き起こすことなく最も適当かつ有益な細胞もしくは組織応答を生じる前記材料のその所望の機能を行う能力を指す。
【００３２】
マトリックスまたは足場とも呼ぶ「生体適合性マトリックス」とは、生体適合性材料によって形成された３次元足場を指す。
【００３３】
生体適合性マトリックスについて言及する際の「無細胞」または「脱細胞化」とは、例えば少なくとも約６０％の内因性細胞（その割合は内因性細胞の数に関する）、好ましくは約６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の内因性細胞などの実質的に全ての内因性細胞がそこから除去されているマトリックスを指す。当該マトリックスの脱細胞は、例えばＤＡＰＩ染色で生存細胞を計数することによって評価してもよい。
【００３４】
「軟組織」とは、体の他の構造および臓器を結合、支持または包囲する骨ではない組織を指す。一実施形態では、軟組織としては、限定されるものではないが、腱、靱帯、筋膜、皮膚、線維組織、脂肪および滑膜（これは結合組織である）、筋肉、神経および血管（これは結合組織ではない）が挙げられる。別の実施形態では、軟組織は骨、歯、爪、毛髪および軟骨以外の体組織である。
【００３５】
「対象」とは、哺乳類、好ましくはヒトを指す。一実施形態では、対象は、医療の受診を待っているか医療を受けている、過去に医療処置の対象であったか現在対象であるか将来対象になる、あるいは軟組織傷害の発生または治癒について監視されている「患者」、すなわち温血動物、より好ましくはヒトであってもよい。一実施形態では、対象は成人（例えば１８歳以上の対象）である。別の実施形態では、対象は小児（例えば１８歳未満の対象）である。一実施形態では、対象は男性である。別の実施形態では、対象は女性である。
【００３６】
「治療する」または「治療」あるいは「軽減」とは、患者の状態を改善するために行われる治療行為および控えられている行為を指し、その目的はその進行を遅らせる（抑える）こと、または例えば開いたままの創傷、線維化の発生、血管新生の欠如および炎症などの軟組織傷害の１つ以上の症状を軽減することである。対象または哺乳類は、本発明に係る組成物を摂取した後に患者が軟組織傷害に関連する１つ以上の症状のある程度の緩和、罹患率の低下、死亡率の低下または生活の質の改善のうちの１つ以上の観察可能かつ／または測定可能な減少または不存在を示した場合に、軟組織傷害が良好に「治療されている」と言える。治療の成功および傷害の改善を評価するための上記パラメータは医師によく知られている日常的な手順によって容易に測定可能である。
【００３７】
継代培養または細胞分裂としても知られている「継代する」とは、細胞が集密状態またはほぼ集密状態である場合に少量の細胞を新しい容器に移動させてその寿命を引き延ばし、かつ／または培養液中の細胞の数を拡大することを指す。一実施形態では、０継代（Ｐ０）は細胞を最初に培養液に入れた時点である。
【００３８】
化合物の量、用量、時間、温度などの測定可能な値について言及する場合に本明細書で使用される「約」および「およそ」は、指定されている量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％またはさらには０．１％の変動を包含することを意味する。
【００３９】
「および／または」とは、関連する列挙されている項目の１つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせならびに二者択一（「または」）として解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、かつそれらを包含する。
【００４０】
本明細書で使用される「誘導体」とは、単独であるか他の誘導体または他の成分と組み合わせた物質、誘導体、サブファミリーなどのあらゆる画分またはそれらの混合物を指す。
【００４１】
本明細書で使用される「単離された」は、細胞がその自然環境以外の条件下に置かれていることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
先に記載した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団は、間葉系幹細胞以外の他の種類の細胞を含み、特に線維芽細胞を含んでいてもよく、あるいは一部が線維芽細胞に分化されている。本出願人は本明細書において、間葉系幹細胞が線維芽細胞よりも良好に低酸素および／または高血糖で生存および増殖する能力を有することを実証する。さらに、間葉系幹細胞は線維芽細胞よりも多くのＶＥＧＦを分泌する能力を有し、特に間葉系幹細胞は、酸素正常状態および正常血糖よりも低酸素および高血糖状態（すなわち糖尿病性創傷状態）でより多くのＶＥＧＦを分泌する（実施例２を参照）。
【００４３】
本出願人らは、生体適合性マトリックスの上に播種された間葉系幹細胞が真皮組織を修復することができ（実施例３を参照）、かつ負傷した筋肉の治療のために使用することができることも実証する（実施例４を参照）。
【００４４】
さらに、生体適合性マトリックスの上に播種されたＭＳＣ集団は、低酸素および／または高血糖下で生存して酸素感受性機序による血管新生促進因子の放出を改善し、かつ線維性瘢痕を減少させる能力を示した。これらの特性により、例えば糖尿病状態などでの軟組織再建を促進することができる。
【００４５】
従って、本発明は生体適合性マトリックスおよび間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団を含む組成物に関する。
【００４６】
本発明の組成物は動物における組織工学および再生で使用される。本発明の正確な組成は所望の使用によって異なってもよい。本発明の修正および他の実施形態は、上記説明および関連する図面に示されている教示の利点を有する本発明が属する技術分野の当業者には明らかになるであろう。当然のことながら、本発明は開示されている具体的な実施形態に限定されず、修正および他の実施形態は添付の特許請求の範囲に含められることが意図されている。
【００４７】
一実施形態では、本発明の組成物はバイオ医薬品である。
【００４８】
一実施形態によれば、ＭＳＣ集団は、例えば線維芽細胞、マクロファージ、内皮細胞、樹状細胞、骨芽細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、リンパ球またはナチュラルキラー細胞などのＭＳＣ以外の他の種類の細胞を含んでいてもよい。
【００４９】
細胞はドナー（生体ドナーまたは死体ドナーのいずれか）から得てもよく、あるいは樹立細胞株に由来していてもよい。例えば、当該技術分野で知られている標準的な生検法を用いてドナーから細胞を採取してもよい。
【００５０】
一実施形態では、ＭＳＣをヒトのドナーから得る。
【００５１】
一実施形態では、胚性幹細胞でないという条件で、ＭＳＣをヒトのドナーから得る。
【００５２】
本発明の一実施形態では、ＭＳＣ集団は単離されたＭＳＣ集団である。
【００５３】
本発明の一実施形態では、ＭＳＣ集団は実質的に純粋である。本明細書で使用される「実質的に純粋なＭＳＣ集団」という用語は、ＭＳＣ集団が２５％未満の他の種類の生細胞、特に線維芽細胞を含むことを意味する。一実施形態では、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、少なくとも約７５％、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％のＭＳＣ（この割合は生細胞の総数に対する）を含む。
【００５４】
別の実施形態では、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、約２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％未満の線維芽細胞（この割合は生細胞の総数に対する）を含む。
【００５５】
一実施形態によれば、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、最大で１００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌのＳＤＦ−１αを分泌する。
【００５６】
一実施形態によれば、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を約２１％Ｏ２で少なくとも２４時間培養した場合、最大で５０ｐｇ／ｍＬ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌのＳＤＦ−１αを分泌する。
【００５７】
別の実施形態によれば、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を生理的酸素レベル、好ましくは約５％Ｏ２で少なくとも２４時間培養した場合、最大で５０ｐｇ／ｍＬ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌのＳＤＦ−１αを分泌する。
【００５８】
別の実施形態によれば、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を低酸素、好ましくは約０．１％Ｏ２で少なくとも２４時間培養した場合、最大で５０ｐｇ／ｍＬ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌのＳＤＦ−１αを分泌する。
【００５９】
別の実施形態によれば、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を正常血糖、好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース濃度で少なくとも２４時間培養した場合、最大で１００ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１α、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αを分泌する。
【００６０】
別の実施形態によれば、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を高血糖、好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース濃度で少なくとも２４時間培養した場合、最大で５０ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１α、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αを分泌する。
【００６１】
一実施形態では、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を約２１％Ｏ２および低濃度のグルコース、好ましくは約１ｇ／ｌのグルコースで少なくとも２４時間培養した場合、最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αを分泌する。
【００６２】
別の実施形態では、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を約２１％Ｏ２および高濃度のグルコース、好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコースで少なくとも２４時間培養した場合、最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αを分泌する。
【００６３】
別の実施形態では、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を生理的酸素レベル、好ましくは約５％Ｏ２および低濃度のグルコース、好ましくは約１ｇ／ｌのグルコースで少なくとも２４時間培養した場合、最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αを分泌する。
【００６４】
別の実施形態では、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を生理的酸素レベル、好ましくは約５％Ｏ２および高濃度のグルコース、好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコースで少なくとも２４時間培養した場合、最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αを分泌する。
【００６５】
別の実施形態では、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を低酸素、好ましくは約０．１％Ｏ２および低濃度のグルコース、好ましくは約１ｇ／ｌのグルコースで少なくとも２４時間培養した場合、最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αを分泌する。
【００６６】
別の実施形態では、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を低酸素、好ましくは約０．１％Ｏ２および高濃度のグルコース、好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコースで少なくとも２４時間培養した場合、最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αを分泌する。
【００６７】
一実施形態では、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を低酸素、好ましくは約０．１％Ｏ２および高血糖、好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース濃度で少なくとも２４時間培養した場合、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは少なくとも約２５０、２６０、２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦを分泌する。
【００６８】
別の実施形態では、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を生理的酸素レベル、好ましくは約５％Ｏ２および高血糖、好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース濃度で少なくとも２４時間培養した場合、少なくとも約９０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは少なくとも約９５、１００、１０５、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１８８、１１９または１２０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦを分泌する。
【００６９】
別の実施形態では、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を生理的酸素レベル、好ましくは約５％Ｏ２および正常血糖、好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース濃度で少なくとも２４時間培養した場合、少なくとも約１６０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは少なくとも約１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９または１７０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦを分泌する。
【００７０】
一実施形態では、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を低酸素、好ましくは約０．１％Ｏ２および高血糖、好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース濃度で少なくとも２４時間培養した場合、最大で５０ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１α、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αおよび少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは少なくとも約２５０、２６０、２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦを分泌する。
【００７１】
別の実施形態では、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を生理的酸素レベル、好ましくは約５％Ｏ２および高血糖、好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース濃度で少なくとも２４時間培養した場合、最大で５０ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１α、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αおよび少なくとも約９０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは少なくとも約９５、１００、１０５、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１８８、１１９または１２０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦを分泌する。
【００７２】
別の実施形態では、本発明の実質的に純粋なＭＳＣ集団は、ＭＳＣ集団を生理的酸素レベル、好ましくは約５％Ｏ２および正常血糖、好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース濃度で少なくとも２４時間培養した場合、最大で１００ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１α、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αおよび少なくとも約１６０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは少なくとも約１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９または１７０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦを分泌する。
【００７３】
一実施形態によれば、ＭＳＣ集団を酸素正常状態、好ましくは約２１％Ｏ２および正常血糖、好ましくは約１ｇ／ｌのグルコースで少なくとも１、２、３または４継代まで培養した後、ＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ発現レベルを測定する。一実施形態によれば、ＭＳＣ集団をＭＳＣの集密状態まで培養した後、ＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ発現レベルを測定する。別の実施形態では、ＭＳＣ集団をＭＳＣの少なくとも約８０、８５、９０、９５、９９または１００％の集密状態まで培養した後、ＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ発現レベルを測定する。
【００７４】
一実施形態では、間葉系幹細胞は未分化であり、すなわちＭＳＣは細胞種、特に線維芽細胞に分化されていない。
【００７５】
一実施形態によれば、ＭＳＣを脂肪組織、骨髄、臍帯血、ホウォートンゼリー（例えば臍帯内に存在するホウォートンゼリーなど）、羊水、胎盤、末梢血、卵管、角膜実質、肺、筋肉、皮膚、骨、歯の組織および胎児肝臓などを含む群から選択される組織から単離する。特定の実施形態では、ＭＳＣを脂肪組織から単離する。好ましい実施形態では、ＭＳＣは脂肪幹細胞（ＡＳＣまたはＡＭＳＣと呼ぶ）である。
【００７６】
一実施形態では、ＭＳＣを任意の温血動物の組織、好ましくはヒト、ブタ、ウシまたはウマの組織、より好ましくはヒト組織から単離する。特定の実施形態では、ＭＳＣはヒトのＡＳＣである。
【００７７】
一実施形態では、細胞は培養細胞、好ましくは細胞株であり、かつ／または一次細胞に由来しており、すなわち組織から単離された直後の細胞である。一実施形態では、細胞を例えば生検によって得られた個体の試料から回収する。好ましくは、個体から試料を回収する工程は本発明の方法の一部ではない。
【００７８】
間葉系幹細胞の単離は、当業者に知られている任意の許容可能な方法によって達成してもよい。ＭＳＣを単離する方法の例としては、限定されるものではないが、コラゲナーゼによる消化、トリプシン処理または外植片培養が挙げられる。
【００７９】
特定の実施形態では、間葉系幹細胞を組織の消化、例えばコラゲナーゼによって脂肪組織から単離する。
【００８０】
一実施形態では、本発明のＭＳＣは、好適なプラスミド、ウイルスまたは他のベクター戦略を用いて目的の核酸で安定的または一時的に形質移入または形質導入されていてもよい。目的の核酸としては、限定されるものではないが、修復される組織型に存在する細胞外マトリックス成分の産生を高める遺伝子産物をコードする核酸が挙げられる。
【００８１】
本発明の一実施形態によれば、ＭＳＣ集団を単離後に当業者に知られている細胞の増殖を支持するように設計された任意の培地で培養する。本明細書で使用されるそのような培地を「増殖培地」と呼ぶ。増殖培地の例としては、限定されるものではないが、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＣＭＲＬ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＦＧＭまたはＦＧＭ−２、１９９／１０９培地、ＨａｍＦ１０／ＨａｍＦ１２またはMcCoy’s 5A、好ましくはＤＭＥＭまたはＲＰＭＩが挙げられる。
【００８２】
一実施形態では、培地は任意の添加因子をさらに含んでいてもよい。添加因子の例としては、限定されるものではないが、ＦＢＳ、血小板溶解物、グリシン、アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、プロリンまたはアラニンなど）、好ましくはＬ体のアミノ酸、およびストレプトマイシンまたはペニシリンなどの抗生物質が挙げられる。
【００８３】
一実施形態によれば、ＭＳＣ集団を標準的な培養条件で培養する。本明細書で使用される「標準的な培養条件」は３７℃の温度および５％ＣＯ２を意味する。
【００８４】
一実施形態では、本発明のＭＳＣ集団は特定の組織に分化されていない。従って、一実施形態では、本発明のＭＳＣ集団を例えば分化培地などの分化を誘導するような条件下では培養しない。特定の実施形態では、本発明のＭＳＣ集団を骨分化培地、筋肉分化培地または皮膚分化培地では培養しない。
【００８５】
一実施形態では、ＭＳＣ集団を好ましくは酸素正常状態および正常血糖で少なくとも３継代まで培養することにより、実質的に純粋なＭＳＣ集団を得る。
【００８６】
一実施形態では、好ましくは少なくとも第３継代後にＭＳＣ集団を凍結してもよい。一例として、細胞がそこからの解凍後に幹細胞として使用することができる限り、細胞集団を液体窒素中または任意の温度、好ましくは約−０℃〜−１９６℃で凍結および貯蔵してもよい。一実施形態では、ＭＳＣ集団を解凍および拡大させて新しい細胞をさらに得てもよい。
【００８７】
一実施形態では、生体適合性マトリックスは生体吸収性生物材料によって形成されている。本明細書で使用される「生体吸収性」という用語は、生物材料を体内に同化、溶解または吸収させることができ、機械または手作業による除去を必要としないことを意味する。
【００８８】
一実施形態では、本発明の生体適合性マトリックスは、細胞の増殖のための構造的支持を与える材料によって形成されている。一実施形態では、生体適合性マトリックスは、寒天／アガロース、アルギン酸塩、キトサン、コンドロイチン硫酸、コラーゲン、エラスチンもしくはエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）、フィブリノーゲン、フィブリン、フィブロネクチン、ゼラチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、ポリ無水物、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸とグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリエチレンオキシド／ポリエチレングリコール（ＰＥＯ／ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、フマル酸系ポリマー、例えばポリ（フマル酸プロピレン）（ＰＰＦ）またはフマル酸プロピレンとエチレングリコールの共重合体（Ｐ（ＰＦ−ｃｏ−ＥＧ））、オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）（ＯＰＦ）、ポリ（ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＰＡＡｍ）、ポリ（アルデヒドグルロネート）（ＰＡＧ）、ポリ無水物、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＮＶＰ）、自己集合性オリゴペプチドゲル、および／または組織増殖を補完するための細胞担体としての任意の他の好適なヒドロゲル材料を含む群から選択される天然もしくは合成の材料またはその化学的誘導体を含む。特定の実施形態では、本発明の生体適合性マトリックスは、例えば１型コラーゲンなどのコラーゲンを含む。
【００８９】
一実施形態によれば、本発明の生体適合性マトリックスは任意のコラーゲン組織に由来している。コラーゲン組織の例としては、限定されるものではないが、皮膚、真皮、腱、靱帯、筋肉、羊膜、半月板、小腸粘膜下組織、心臓弁、血管および膀胱が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の生体適合性マトリックスは腱、好ましくは大腿筋膜に由来している。
【００９０】
一実施形態では、生体適合性マトリックスを個体から回収する。一実施形態では、生体適合性マトリックスをヒトから回収する。別の実施形態では、生体適合性マトリックスを非ヒト動物から回収する。そのような生体適合性マトリックスは市販されている。市販されている生体適合性マトリックスの例としては、限定されるものではないが、Ｉｎｔｅｇｒａ（登録商標）(Integra LifeSciences社)、Ｍａｔｒｉｄｅｒｍ（登録商標）(Skin & Health Care社)、Ａｌｌｏｄｅｒｍ（登録商標）(Life Cell社)およびＰｕｒａｍａｔｒｉｘ（登録商標）(3-D Matrix Medical Technology社)が挙げられる。好ましくは、生体適合性マトリックスを個体から回収する工程は本発明の方法の一部ではない。
【００９１】
本発明の特定の実施形態では、生体適合性マトリックスはヒト大腿筋膜張筋に由来している。
【００９２】
一実施形態では、本発明の生体適合性マトリックスは低い免疫原性を有するか免疫原性を有しない。一実施形態では、生体適合性マトリックスをその免疫原性を低下させるための任意の生物学的、化学的および／または物理的手段によって処理する。免疫原性を低下させるためのプロセス後に、本発明の生体適合性マトリックスは、同じ種類の未処理の生体適合性マトリックスと比較して免疫原性が低い。
【００９３】
一実施形態では、免疫原性を低下させるために生体適合性マトリックスを処理して細胞膜、核酸、脂質および細胞質成分を除去する。免疫原性を低下させるためのプロセス後に、生体適合性マトリックスは典型的に、例えばコラーゲン、エラスチン、グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンなどのマトリックスに関連する成分をそのまま含む。
【００９４】
一実施形態では、生体適合性マトリックスを処理して免疫原性を低下させる。一実施形態では、本発明の生体適合性マトリックスは、同じ種類の未処理の生体適合性マトリックスよりも少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％免疫原性が低い。マトリックスの免疫原性を評価するためのパラメータは医師によく知られている日常的な手順によって容易に測定可能である。
【００９５】
免疫原性を低下させるプロセスの例としては、限定されるものではないが、生体適合性マトリックスの脱細胞および生体適合性マトリックスの細胞破壊が挙げられる。
【００９６】
一実施形態では、本発明の生体適合性マトリックスは細胞破壊方法で処理されている。細胞破壊方法の例としては、限定されるものではないが、凍結保存、凍結／解凍サイクリングおよび放射線への曝露が挙げられる。
【００９７】
別の実施形態では、本発明の生体適合性マトリックスは脱細胞方法で処理されている。本明細書で使用される「脱細胞方法」は、物理的、化学的もしくは生化学的手段を用いて生体適合性マトリックスから内因性細胞を除去する方法を意味する。手段の例としては、限定されるものではないが、プロテアーゼおよび／またはヌクレアーゼなどの酵素、酸、塩基、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、界面活性剤および／または双性イオン性界面活性剤などの化学物質、アセトンなどの脱脂剤および／または凍結乾燥が挙げられる。
【００９８】
一実施形態では、本発明の生体適合性マトリックスは無細胞である。一実施形態では、生体適合性マトリックスは、内因性細胞の除去が行われていない同じ種類の生体適合性マトリックスと比較して、最大で約４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％またはそれよりも少ない内因性細胞を含む。
【００９９】
脱細胞は当業者に知られている任意の方法に従って定量化してもよい。脱細胞を定量化する方法の例としては、限定されるものではないが、４０，６−ジアミジノ−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）での染色、あるいは処理前の生体適合性マトリックスまたは処理されていない同じ種類の生体適合性マトリックスと比較した処理済生体適合性マトリックス中のＤＮＡ濃度を測定することが挙げられる。
【０１００】
好ましい実施形態では、生体適合性マトリックスは無細胞コラーゲンマトリックス、好ましくはヒトの無細胞コラーゲンマトリックス（ＨＡＣＭ）である。
【０１０１】
一実施形態では、例えばアセトンまたはＨ２Ｏ２などの検出可能な化学残留物を含まず、かつ約１０％未満、好ましくは８％未満の残留水分を含むマトリックスを得るように、生体適合性マトリックスを調製する。生体適合性マトリックスのそのような調製は当業者に知られている任意の許容可能な方法によって達成してもよい。従って、本発明の一実施形態では、生体適合性マトリックスは、例えばアセトンまたはＨ２Ｏ２などの化学残留物を含まず、かつ約１０％未満、好ましくは８％未満の残留水分を含む。
【０１０２】
別の実施形態では、生体適合性マトリックスを滅菌して、例えばＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ、ＨＢＶ）および細菌感染症などの感染性疾患の伝播を回避する。滅菌方法の例としては、限定されるものではないが、化学物質、熱、ＵＶおよび、γ照射などの電離放射線が挙げられる。
【０１０３】
一実施形態では、生体適合性マトリックスおよび本発明のＭＳＣ集団は同じ生物種からのものである。別の実施形態では、生体適合性マトリックスおよび本発明のＭＳＣ集団は異なる生物種からのものである。別の実施形態では、生体適合性マトリックスおよび本発明のＭＳＣ集団はレシピエント対象であってもレシピエント対象でなくてもよい同じドナー対象からのものである。別の実施形態では、生体適合性マトリックスおよび本発明のＭＳＣ集団は、いずれか一方がレシピエント対象であってもどちらもレシピエント対象でなくてもよい異なる対象からのものである。
【０１０４】
一実施形態では、間葉系幹細胞集団を生体適合性マトリックスと共にインキュベートする。本明細書で使用される「インキュベートする」という用語は、間葉系幹細胞集団が生体適合性マトリックスに接触することを意味する。
【０１０５】
一実施形態では、間葉系幹細胞集団を生体適合性マトリックスの上に播種する。別の実施形態では、間葉系幹細胞集団を生体適合性マトリックスの中に播種する。別の実施形態では、間葉系幹細胞集団を生体適合性マトリックスの上および中に播種する。
【０１０６】
一実施形態では、本組成物中の細胞を任意の配置で播種する。例えば、細胞を生体適合性マトリックス全体に均一に分布させてもよく、あるいは生体適合性マトリックス内の規定のゾーン、領域または層に分布させてもよい。
【０１０７】
細胞の播種は、好ましくは細胞の生存を維持するのに適した温度、ｐＨ、イオン強度およびせん断条件下で行う。
【０１０８】
一実施形態では、ＭＳＣ集団を少なくとも２、３、４または５継代まで培養した後に生体適合性マトリックスと共にインキュベートする。本明細書で使用される「少なくとも４継代まで培養する」という用語は、細胞集団を剥離して少なくとも４回まで新しい容器に移すことを意味する。特定の実施形態では、ＭＳＣ集団を４継代まで培養した後に生体適合性マトリックスと共にインキュベートする。
【０１０９】
一実施形態では、生体適合性マトリックスと共にインキュベートした間葉系幹細胞は後期継代間葉系幹細胞である。
【０１１０】
一実施形態では、ＭＳＣ集団が約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９または１００％の集密状態に達した場合にＭＳＣ集団を継代する。
【０１１１】
別の実施形態では、ＭＳＣ集団を少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも３６、４８、６０または７２時間培養した後に生体適合性マトリックスと共にインキュベートする。別の実施形態では、ＭＳＣ集団を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０日間培養した後に生体適合性マトリックスと共にインキュベートする。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスを１２ウェルまたは２４ウェルプレートの中あるいは２５ｃｍ２、７５ｃｍ２または１５０ｃｍ２の細胞培養フラスコの中でＭＳＣ集団と共にインキュベートする。
【０１１３】
一実施形態では、ＭＳＣ集団を計数し、かつ最初に１ウェル当たり少なくとも０．５×１０５、１×１０５、２×１０５または３×１０５細胞の密度で生体適合性マトリックスと共にインキュベートする。別の実施形態では、ＭＳＣ集団を最初に約０．５×１０５〜約５×１０５細胞／ウェル（１ウェル当たり）、好ましくは約１×１０５〜約４×１０５細胞／ウェル、より好ましくは約２×１０５〜約３×１０５細胞／ウェルの密度で生体適合性マトリックスと共にインキュベートする。好ましい実施形態では、ＭＳＣ集団を最初に１ウェル当たり約２×１０５細胞の密度で生体適合性マトリックスと共にインキュベートする。
【０１１４】
一実施形態では、ＭＳＣ集団を計数し、かつ最初に１ｃｍ２の培養皿またはプレート当たり少なくとも１×１０４、２．５×１０４、５×１０４または８×１０４細胞の密度で生体適合性マトリックスと共にインキュベートする。別の実施形態では、ＭＳＣ集団を最初に１ｃｍ２の培養皿またはプレート当たり約１×１０４〜約１５×１０４細胞、好ましくは約２．５×１０４〜約１２．５×１０４細胞／ｃｍ２、より好ましくは約５×１０４〜約８×１０４細胞／ｃｍ２の密度で生体適合性マトリックスと共にインキュベートする。好ましい実施形態では、ＭＳＣ集団を最初に１ｃｍ２の培養皿またはプレート当たり約５×１０４細胞の密度で生体適合性マトリックスと共にインキュベートする。
【０１１５】
一実施形態では、ＭＳＣ集団を計数し、かつ最初に１ｃｍ２の培養皿またはプレート当たり少なくとも０．２５×１０５、０．５×１０５、１×１０５または１．５×１０５細胞の密度で生体適合性マトリックスと共にインキュベートする。別の実施形態では、ＭＳＣ集団を最初に１ｃｍ２の培養皿またはプレート当たり約０．２５×１０５〜約２．５×１０５細胞、好ましくは約０．５×１０５〜約２×１０５細胞／ｃｍ２、より好ましくは約１×１０５〜約１．５×１０５細胞／ｃｍ２の密度で生体適合性マトリックスと共にインキュベートする。好ましい実施形態では、ＭＳＣ集団を最初に１ｃｍ２の培養皿またはプレート当たり約１×１０５細胞の密度で生体適合性マトリックスと共にインキュベートする。
【０１１６】
一実施形態では、生体適合性マトリックスの本発明の間葉系幹細胞集団とのインキュベーションを上記培地で行う。いくつかの実施形態では、このインキュベーションを５％ＣＯ２および３７℃で行う。
【０１１７】
一実施形態では、ＭＳＣ集団が生物学的マトリックスに接触したら本組成物を培養する。一実施形態では、本発明の組成物をＭＳＣの集密状態まで培養する。別の実施形態では、本発明の組成物をＭＳＣの少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９または１００％の集密状態まで培養する。
【０１１８】
別の実施形態では、本発明の組成物をＭＳＣ集団と生物学的マトリックスとの接触後少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日間培養する。別の実施形態では、本発明の組成物を３０日を超えて培養する。別の実施形態では、本発明の組成物を３〜３０日間、５〜２５日間、５〜２０日間、５〜１５日間または５〜１０日間培養する。
【０１１９】
一実施形態では、培養後に本発明の組成物を洗浄して培地を除去する。特定の実施形態では、本組成物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。
【０１２０】
一実施形態によれば、本発明の組成物は、本組成物を低酸素、好ましくは約０．１％Ｏ２で少なくとも２４時間培養した場合、最大で１００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌのＳＤＦ−１αを分泌する。
【０１２１】
別の実施形態によれば、本発明の組成物は、本組成物を正常血糖、好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース濃度で少なくとも２４時間培養した場合、最大で１００ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１α、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αを分泌する。
【０１２２】
別の実施形態によれば、本発明の組成物は、本組成物を高血糖、好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース濃度で少なくとも２４時間培養した場合、最大で５０ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１α、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αを分泌する。
【０１２３】
一実施形態では、本発明の組成物は、本組成物を低酸素、好ましくは約０．１％Ｏ２および高血糖、好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース濃度で少なくとも２４時間培養した場合、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは少なくとも約２５０、２６０、２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２９９または２９０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦを分泌する。
【０１２４】
別の実施形態では、本発明の組成物は、本組成物を生理的酸素レベル、好ましくは約５％Ｏ２および高血糖、好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース濃度で少なくとも２４時間培養した場合、少なくとも約９０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは少なくとも約９５、１００、１０５、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦを分泌する。
【０１２５】
別の実施形態では、本発明の組成物は、本組成物を生理的酸素レベル、好ましくは約５％Ｏ２および正常血糖、好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース濃度で少なくとも２４時間培養した場合、少なくとも約１６０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは少なくとも約１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９または１７０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦを分泌する。
【０１２６】
一実施形態では、本発明の組成物は、本組成物を低酸素、好ましくは約０．１％Ｏ２および高血糖、好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース濃度で少なくとも６時間培養した場合、最大で５０ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１α、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αおよび少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは少なくとも約２５０、２６０、２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２９９または２９０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦを分泌する。
【０１２７】
別の実施形態では、本発明の組成物は、本組成物を生理的酸素レベル、好ましくは約５％Ｏ２および高血糖、好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース濃度で少なくとも６時間培養した場合、最大で５０ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１α、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αおよび少なくとも約９０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは少なくとも約９５、１００、１０５、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦを分泌する。
【０１２８】
別の実施形態では、本発明の組成物は、本組成物を生理的酸素レベル、好ましくは約５％Ｏ２および正常血糖、好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース濃度で少なくとも２４時間培養した場合、最大で１００ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１α、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αおよび少なくとも約１６０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは少なくとも約１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９または１７０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦを分泌する。
【０１２９】
一実施形態によれば、本発明の組成物をＭＳＣ集団の集密状態まで培養した後、ＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ発現レベルを測定する。別の実施形態では、本組成物をＭＳＣ集団の少なくとも約８０、８５、９０、９５、９９または１００％の集密状態まで培養した後、ＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ発現レベルを測定する。
【０１３０】
一実施形態では、本発明の組成物は、装置（例えば医療装置など）、フィルム、３次元構造体、包帯、複合移植片、軟組織代用物、医薬組成物などである。
【０１３１】
一実施形態では、特性上ホルモン、タンパク質、核酸、脂質および／または炭水化物のいずれかであるさらなる成分をその添加成分が本発明の組成物中のＭＳＣ集団の接着、成長、分化、増殖、血管新生、生着および３次元モデリングの正もしくは負のエフェクターになることができる任意の量で本発明の組成物に添加してもよい。本組成物で使用するのに適したそのような成分の例としては、限定されるものではないが、サイトカイン、リンフォカイン、モノカイン、幹細胞増殖因子、リンフォトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝細胞増殖因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ミュラー管抑制物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、インターロイキン（ＩＬ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ＳＩ因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＬＩＦ、ｋｉｔ−リガンド、ＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＬＴ、コルチコステロイド、シクロスポリン、メトトレキサートなどの免疫促進物質、免疫抑制物質および／または免疫アジュバントの天然に生じる変異体または断片が挙げられ、前記成分はいずれも特異的であるか非特異的であるかは問わない。変異体の産生方法は当該技術分野でよく知られており、例えば保存的アミノ酸変化を行うこと、または突然変異誘発、および得られた変異体を必要な機能性についてアッセイすることが挙げられる。
【０１３２】
一実施形態では、さらなる成分は、添加された成分が本発明の組成物の安定性または形態を著しく変化させずに有用性または取り扱い特性を改善することができる任意の量で本発明の組成物中に存在してもよい。本組成物での使用に適したそのような成分の例としては、限定されるものではないが、消毒薬、抗生物質、抗ウイルス剤、抗酸化剤、麻酔薬、可塑剤、防腐剤、細胞増殖培地および／または凍結保護剤が挙げられる。
【０１３３】
本発明は、
ａ．間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、好ましくは脂肪幹細胞を単離する工程と、
ｂ．実質的に純粋なＭＳＣ集団を得る工程と、
ｃ．ＭＳＣ集団を生体適合性マトリックスと共にインキュベートする工程
とを含む、生体適合性マトリックスおよび間葉系幹細胞集団を含む組成物の調製方法にも関する。
【０１３４】
一実施形態では、生体適合性マトリックスおよび間葉系幹細胞集団を含む組成物の調製方法は、実質的に純粋なＭＳＣ集団を生体適合性マトリックスと共にインキュベートする工程を含む。
【０１３５】
一実施形態では、生体適合性マトリックスおよび間葉系幹細胞集団を含む組成物の調製方法は、
ａ．間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離する工程と、
ｂ．２５％未満の線維芽細胞を含むＭＳＣ集団を得る工程と、
ｃ．ＭＳＣ集団を生体適合性マトリックスと共にインキュベートする工程と
を含む。
【０１３６】
別の実施形態では、生体適合性マトリックスおよび間葉系幹細胞集団を含む組成物の調製方法は、２５％未満の線維芽細胞を含むＭＳＣ集団を生体適合性マトリックスと共にインキュベートする工程を含む。
【０１３７】
一実施形態では、生体適合性マトリックスおよび脂肪幹細胞集団を含む組成物の調製方法は、
ａ．脂肪幹細胞（ＡＳＣ）を単離する工程と、
ｂ．実質的に純粋なＡＳＣ集団を得る工程と、
ｃ．ＡＳＣ集団をコラーゲン含有生体適合性マトリックスと共にインキュベートする工程と
を含む。
【０１３８】
別の実施形態では、生体適合性マトリックスおよび脂肪幹細胞集団を含む組成物の調製方法は、実質的に純粋なＡＳＣ集団をコラーゲン含有生体適合性マトリックスと共にインキュベートする工程を含む。
【０１３９】
一実施形態では、生体適合性マトリックスおよび脂肪幹細胞集団を含む組成物の調製方法は、
ａ．脂肪幹細胞（ＡＳＣ）を単離する工程と、
ｂ．２５％未満の線維芽細胞を含むＡＳＣ集団を得る工程と、
ｃ．ＡＳＣ集団をコラーゲン含有生体適合性マトリックスと共にインキュベートする工程と
を含む。
【０１４０】
別の実施形態では、生体適合性マトリックスおよび脂肪幹細胞集団を含む組成物の調製方法は、２５％未満の線維芽細胞を含むＡＳＣ集団をコラーゲン含有生体適合性マトリックスと共にインキュベートする工程を含む。
【０１４１】
本発明の別の態様は、それを必要とする対象における軟組織傷害を治療するためのものであるか治療するために使用される上記本発明の組成物である。
【０１４２】
一実施形態では、軟組織傷害は、例えば疾患、外傷または組織が正常に発達することができないことに起因していてもよい。
【０１４３】
一実施形態では、本発明の組成物で治療することができる軟組織は、皮膚組織、筋肉組織、真皮組織、腱組織、靱帯組織、半月板組織、心臓弁組織、血管組織、胃粘膜、鼓膜組織、羊膜および膀胱組織を含む群から選択される。
【０１４４】
一実施形態では、本発明の組成物は、皮膚傷害を治療するための組成物または治療するために使用される組成物である。別の実施形態では、本発明の組成物は筋肉傷害を治療するための組成物または治療するために使用される組成物である。
【０１４５】
一実施形態では、本組成物で治療することができる軟組織傷害は、皮膚創傷、皮膚火傷、皮膚潰瘍、筋肉疾患（例えば、炎症性筋肉疾患、神経原性筋疾患、筋原性筋疾患、筋ジストロフィー、先天性ミオパシーまたは重症筋無力症など）、ヘルニア、手術創傷（例えば、術後創傷など）または血管疾患（例えば、末梢動脈疾患、腹部大動脈瘤、頸動脈疾患、静脈疾患または血管損傷など）を含む群から選択される。
【０１４６】
一実施形態では、本発明の組成物は、皮膚創傷、皮膚火傷または皮膚潰瘍を治療するための組成物または治療するために使用される組成物である。特定の実施形態では、本組成物は鎌状赤血球症に起因する皮膚潰瘍を治療するための組成物または治療するために使用される組成物である。別の実施形態では、本組成物は脈管炎に起因する皮膚潰瘍を治療するための組成物または治療するために使用される組成物である。別の実施形態では、本組成物は例えば糖尿病性潰瘍などの糖尿病性創傷を治療するための組成物または治療するために使用される組成物である。別の実施形態では、本組成物は放射線壊死を治療するための組成物または治療するために使用される組成物である。別の実施形態では、本発明の組成物は筋肉疾患を治療するための組成物または治療するために使用される組成物である。
【０１４７】
一実施形態では、軟組織傷害は急性創傷（すなわち傷害後約２〜４日以内）である。別の実施形態では、軟組織傷害は亜急性創傷（すなわち傷害後約２〜４日から６週目までの間）である。別の実施形態では、軟組織傷害は後期の創傷（すなわち傷害後約６週目以降）である。別の実施形態では、軟組織傷害は慢性創傷である。一実施形態では、慢性創傷は３ヶ月後に完全な治癒を達成することができないものと定義されている。別の実施形態では、軟組織傷害は非治癒性創傷である。
【０１４８】
別の実施形態では、本発明の組成物は上記態様に係る軟組織傷害を研究するための生体外モデルを提供する。
【０１４９】
一実施形態では、対象は少なくとも１種の上記軟組織傷害に冒されている。一実施形態では、対象は糖尿病である。一実施形態では、対象は、例えば、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、１．５型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、若年発症成人型糖尿病、新生児糖尿病（例えば、永続型新生児糖尿病または一過性新生児糖尿病）、糖尿病前症、ステロイド誘発性糖尿病などの糖尿病と診断されている。一実施形態によれば、本組成物が投与される対象は１型糖尿病または２型糖尿病に罹患している。
【０１５０】
一実施形態では、対象は軟組織傷害の別の治療で過去に治療されなかった。別の実施形態では、対象は軟組織傷害の少なくとも１種の治療を過去に受けた。軟組織傷害を治療するための他の治療の例としては、限定されるものではないが、縫合糸、ステープル、絆創膏または接着剤での創縫合、抗炎症薬、感染部位のドレナージ、外科手術、皮膚自家移植、超音波治療、高気圧酸素治療、看護、局所的な増殖因子の施用およびケラチノサイト細胞スプレーが挙げられる。
【０１５１】
一実施形態では、本発明の生体適合性マトリックスは本組成物が投与される対象に対して異種である。非限定的な例はブタの生体適合性マトリックスおよびヒト対象である。
【０１５２】
別の実施形態では、本発明の生体適合性マトリックスは本組成物が投与される対象に対して同種異系である。非限定的な例はヒトの生体適合性マトリックスおよびヒト対象である。
【０１５３】
一実施形態では、本発明のＭＳＣ集団は本組成物が投与される対象に対して異種、すなわち異なる生物種のメンバーからのものである。別の実施形態では、本発明のＭＳＣ集団は本組成物が投与される対象に対して同種異系、すなわち同じ生物種の遺伝的に同一でないメンバーからのものである。別の実施形態では、組織移植拒絶反応を最小限に抑えるために、本発明のＭＳＣ集団は本組成物が投与される対象に対して同系、すなわち遺伝的に同一または近縁種である。同系ＭＳＣ集団としては、自家（すなわち治療される対象から）のもの、および同質遺伝子型（すなわち、遺伝的に同一であるが異なる対象、例えば一卵性双生児から）のものが挙げられる。
【０１５４】
一実施形態では、生体適合性マトリックスおよび本発明のＭＳＣ集団はどちらも本組成物が投与される対象に対して異種である。別の実施形態では、生体適合性マトリックスおよび本発明のＭＳＣ集団の少なくとも１つは本組成物が投与される対象に対して同種異系である。別の実施形態では、生体適合性マトリックスおよび本発明のＭＳＣ集団はどちらも本組成物が投与される対象に対して同種異系である。
【０１５５】
一実施形態では、本発明の組成物を当該技術分野で知られている任意の方法に従って対象に投与してもよい。投与方法の例としては、限定されるものではないが、移植（例えば外科的移植など）、局所塗布、注射および別の組織の移植が挙げられる。
【０１５６】
一実施形態では、本発明の組成物を対象に局所投与してもよい。別の実施形態では、本発明の組成物を対象への外科的移植によって投与する。別の実施形態では、本発明の組成物を対象に注射する。
【０１５７】
一実施形態では、本発明の組成物を軟組織の傷害部位において対象に投与する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は治療される組織の形状および／またはサイズに合わせて構成されている。いくつかの実施形態では、本発明の組成物を対象に投与する前に治療される組織の形状および／またはサイズに合わせてサイズを変更する。
【０１５８】
本発明は、上記組成物を投与する工程を含む軟組織傷害の治療方法にも関する。一実施形態では、本組成物を局所投与するか外科的移植によって投与する。一実施形態では、本組成物を軟組織の傷害部位に投与する。
【０１５９】
一実施形態では、軟組織傷害の治療方法は、それを必要とする対象に本発明の組成物を投与する工程を含む。特定の実施形態では、軟組織傷害の治療方法は、糖尿病の対象に本発明の組成物を投与する工程を含む。
【０１６０】
本発明の別の目的は、例えば非治癒性皮膚創傷などの創傷の閉鎖を向上させるか改善する方法である。本発明は、例えば、皮膚の再生または筋肉の再生などの軟組織の再生を促進する方法にも関する。
【０１６１】
本発明の別の態様は、好ましくは軟組織の傷害部位における血管新生を促進または向上させる方法である。本発明の別の態様は、好ましくは軟組織の傷害部位における肉芽組織の合成を促進または向上させる方法である。本発明のさらなる別の態様は、好ましくは軟組織の傷害部位における線維性瘢痕を減少させる方法である。
【０１６２】
本発明は、例えば骨格筋壊死などの軟組織壊死を減少させる方法にも関する。
【０１６３】
本発明の別の目的は、自家移植を行う前に本発明の組成物を投与する工程を含む、例えば皮膚自家移植などの自家移植の有効性を改善する方法である。一実施形態では、自家移植の有効性の改善は潰瘍形成の減少（頻度およびサイズ）と関連している。
【０１６４】
本発明の別の目的は、本発明の組成物に対する化合物の効果をスクリーニングする方法であり、前記方法は、当該化合物を本発明の組成物と接触させる工程および組成物中に存在する細胞に対する当該化合物の効果を決定する工程を含む。
【０１６５】
本組成物中に存在する細胞に対する当該化合物の効果の決定の例としては、限定されるものではないが、どちらも皮膚再生のためのものである表皮リモデリングのためのＫＧＦおよび皮膚の血管新生のためのＶＥＧＦの分泌、骨格筋再生のための前駆細胞の活性化、増殖および分化において示されるＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ、ＦＧＦおよびＴＧＦ−βの分泌、ならびに組織酸素化の機能におけるＶＥＧＦの分泌が挙げられる。
【０１６６】
本発明の別の目的は、本発明のフィルム、３次元構造体、包帯、複合移植片または軟組織代用物の形成に対する化合物の効果をスクリーニングする方法であり、前記方法は、当該化合物を本発明の組成物と接触させる工程と、本発明のフィルム、３次元構造体、包帯、複合移植片または軟組織代用物の形成に対する当該化合物の効果を決定する工程とを含む。
【０１６７】
本発明のフィルム、３次元構造体、包帯、複合移植片または軟組織代用物の形成に対する当該化合物の効果の決定の例としては、限定されるものではないが、純粋な幹細胞による生体外での３Ｄ足場の再コロニー形成および足場表面の修復のための生体外での幹細胞拡散が挙げられる。
【０１６８】
本発明の別の目的は、上記軟組織傷害に対する化合物の治療的効果をスクリーニングする方法であり、前記方法は、
当該化合物を治療される対象または治療される病状または病気を有する対象のＭＳＣにより得られた本発明の組成物と接触させる工程と、
当該化合物をそれを必要とする患者における軟組織傷害を治療するために使用することができるか否かを決定するために、本発明の組成物に対する当該化合物の治療的効果を決定する工程と
を含む。
【０１６９】
本発明の組成物に対する当該化合物の治療的効果の決定の例としては、限定されるものではないが、皮膚表皮再生のためのＫＧＦなどの創傷組織の機能における選択的増殖因子分泌プロファイル、および純粋な幹細胞（糖尿病もしくは非糖尿病対象から得られた幹細胞）の糖尿病性皮膚創傷を治癒させる能力が挙げられる。
【０１７０】
本発明の別の目的は、本発明の組成物が軟組織傷害の治療で使用するのに適しているか否かを決定するための試験または効力試験であり、ここでは
本発明の組成物を上記のように調製し、
本発明の組成物またはフィルム、３次元構造体、包帯、複合移植片または軟組織代用物を分析して、治療される軟組織の少なくとも１つの特性を提供するか否かについて決定する。
【０１７１】
治療される軟組織の少なくとも１つ特性の決定の例としては、限定されるものではないが、低酸素での３Ｄ組成物中の純粋な幹細胞からのＶＥＧＦの分泌が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】脱細胞方法の異なる段階における大腿筋膜から抽出された総タンパク質の定量化を示すグラフである。
【図２】脱細胞方法の異なる段階における大腿筋膜から抽出された増殖因子ＳＤＦ−１α（Ａ）、ＶＥＧＦ（Ｂ）、ｂＦＧＦ（Ｃ）およびＩＧＦ（Ｄ）の定量化を示す１組のグラフである。
【図３】脱細胞方法の前および後に大腿筋膜から抽出された総ＤＮＡの定量化を示すグラフである。
【図４】脱細胞方法の異なる段階における真皮組織から抽出された総タンパク質の定量化を示すグラフである。
【図５】脱細胞方法の異なる段階における真皮組織から抽出された増殖因子ＳＤＦ−１α（Ａ）、ＶＥＧＦ（Ｂ）およびｂＦＧＦ（Ｃ）の定量化を示す１組のグラフである。
【図６】脱細胞方法の前および後に真皮組織から抽出された総ＤＮＡの定量化を示すグラフである。
【図７】脱細胞方法の異なる段階における海綿骨から抽出された総タンパク質の定量化を示すグラフである。
【図８】脱細胞方法の異なる段階における海綿骨から抽出された増殖因子ＳＤＦ−１α（Ａ）、ＶＥＧＦ（Ｂ）、ｂＦＧＦ（Ｃ）およびＩＧＦ（Ｄ）の定量化を示す１組のグラフである。
【図９】脱細胞方法の前および後に海綿骨から抽出された総ＤＮＡの定量化を示すグラフである。
【図１０】脱細胞方法の異なる段階における皮質骨から抽出された総タンパク質の定量化を示すグラフである。
【図１１】脱細胞方法の異なる段階における皮質骨から抽出された増殖因子ＳＤＦ−１α（Ａ）、ＶＥＧＦ（Ｂ）およびｂＦＧＦ（Ｃ）の定量化を示す１組のグラフである。
【図１２】脱細胞方法の前および後に皮質骨から抽出された総ＤＮＡの定量化を示すグラフである。
【図１３】増殖培地（Ａ）ならびに骨分化培地（Ｂ）におけるＡＳＣおよびＤＦを示す写真である。
【図１４】継代数によるＡＳＣおよびＤＦの細胞増殖を示すグラフである。
【図１５】０．１または５％Ｏ２でのＦＢＳを含まない増殖培地におけるＡＳＣおよびＤＦの細胞生存を示すヒストグラムである。
【図１６】０．１または５％Ｏ２での４．５ｇ／ｌのグルコースを含む増殖培地における５種類の異なるＡＳＣ／ＤＦ希釈物のＫＧＦ分泌（Ａ）、ｂ−ＦＧＦ分泌（Ｂ）、ＩＧＦ−１分泌（Ｃ）およびＨＧＦ分泌（Ｄ）を示す１組のヒストグラムである。
【図１７】０．１％Ｏ２での４．５ｇ／ｌのグルコースを含む増殖培地における５種類の異なるＡＳＣ／ＤＦ希釈物のＶＥＧＦ分泌（Ａ）およびＳＤＦ−１α分泌（Ｂ）を示す１組のヒストグラムである。
【図１８】５％Ｏ２での４．５ｇ／ｌのグルコースを含む増殖培地における５種類の異なるＡＳＣ／ＤＦ希釈物のＶＥＧＦ分泌（Ａ）およびＳＤＦ−１α分泌（Ｂ）を示す１組のヒストグラムである。
【図１９】２１％Ｏ２での４．５ｇ／ｌのグルコースを含む増殖培地における５種類の異なるＡＳＣ／ＤＦ希釈物のＳＤＦ−１α分泌を示すヒストグラムである。
【図２０】０．１％Ｏ２での１ｇ／ｌグルコースを含む増殖培地における５種類の異なるＡＳＣ／ＤＦ希釈物のＶＥＧＦ分泌（Ａ）およびＳＤＦ−１α分泌（Ｂ）を示す１組のヒストグラムである。
【図２１】５％Ｏ２での１ｇ／ｌグルコースを含む増殖培地における５種類の異なるＡＳＣ／ＤＦ希釈物のＶＥＧＦ分泌（Ａ）およびＳＤＦ−１α分泌（Ｂ）を示す１組のヒストグラムである。
【図２２】２１％Ｏ２での１ｇ／ｌグルコースを含む増殖培地における５種類の異なるＡＳＣ／ＤＦ希釈物のＳＤＦ−１α分泌を示すヒストグラムである。
【図２３】１ｇ／ｌのグルコースおよび５％Ｏ２（淡灰色）または０．１％Ｏ２（濃灰色）でのＡＭＳＣ、皮膚線維芽細胞（ＦＤ）およびケラチノサイト（Ｋｃ）からのＶＥＧＦ（Ａ）、ＳＤＦ−１α（Ｂ）およびＫＧＦ（Ｃ）分泌を示す１組のグラフである。
【図２４】５％Ｏ２および１ｇ／ｌ（淡灰色）または４．５ｇ／ｌ（濃灰色）のグルコース濃度でのＡＭＳＣ、皮膚線維芽細胞（ＦＤ）およびケラチノサイト（Ｋｃ）からのＶＥＧＦ（Ａ）、ＳＤＦ−１α（Ｂ）およびＫＧＦ（Ｃ）分泌を示す１組のグラフである。
【図２５】生理的状態（５％Ｏ２および１ｇ／ｌグルコース、淡灰色）ならびに糖尿病性創傷状態（０．１％Ｏ２および４．５ｇ／ｌグルコース、濃灰色）でのＡＭＳＣ、皮膚線維芽細胞（ＦＤ）およびケラチノサイト（Ｋｃ）からのＶＥＧＦ（Ａ）、ＳＤＦ−１α（Ｂ）およびＫＧＦ（Ｃ）分泌を示す１組のグラフである。
【図２６】０．１％Ｏ２および１ｇ／ｌのグルコース（０．１％ｎｍｇｌｃ）、０．１％Ｏ２および４．５ｇ／ｌのグルコース（０．１％Ｈｇｌｃ）、５％Ｏ２および１ｇ／ｌのグルコース（５％ｎｍｇｌｃ）ならびに５％Ｏ２および４．５ｇ／ｌのグルコース（５％Ｈｇｌｃ）での糖尿病もしくは非糖尿病のヒトのドナーから得られたＡＭＳＣ（Ａ）および皮膚線維芽細胞（Ｂ）からのＶＥＧＦ分泌を示す１組のグラフである。
【図２７】０．１％Ｏ２および１ｇ／ｌのグルコース（０．１％ｎｍｇｌｃ）、０．１％Ｏ２および４．５ｇ／ｌのグルコース（０．１％Ｈｇｌｃ）、５％Ｏ２および１ｇ／ｌのグルコース（５％ｎｍｇｌｃ）ならびに５％Ｏ２および４．５ｇ／ｌのグルコース（５％Ｈｇｌｃ）での糖尿病もしくは非糖尿病のヒトのドナーから得られたＡＭＳＣ（Ａ）および皮膚線維芽細胞（Ｂ）からのＫＧＦ分泌を示す１組のグラフである。
【図２８】ＡＳＣの間葉系分化、軟骨分化および脂肪分化能力がそれぞれアリザリンレッド染色（カルシウム沈着）（Ａ）、アルシアンブルー染色（グリコサミノグリカン沈着）（Ｂ）およびオイルレッド（細胞内脂質小滴）（Ｃ）によって実証されたことを示す写真である（倍率×２０）。
【図２９】プラスチックウェルプレート上でのＡＳＣと比較したＨＡＣＭ上でのＡＳＣの拡散（Ａ）および接着（Ｂ）を示すグラフである。
【図３０】ヌードラットに複合移植片（ＨＡＣＭ＋ＡＳＣ）および足場のみ（ＨＡＣＭ、対照）を移植してから１ヶ月および３ヶ月後の組織学的分析および肉眼的分析を示す写真である。
【図３１】酸素正常状態（２１％Ｏ２）または低酸素（０．１％Ｏ２）中のＡＳＣによるＶＥＧＦ分泌を示すグラフである。
【図３２】ＨＡＣＭのみ（ｐ＝０．００２、１枚のスライド当たり５つの関心領域を分析した）と比較した、ＨＡＣＭ＋ＡＳＣの皮下移植から１ヶ月後のヌードラットの真皮の血管密度（血管数／２．５６ｃｍ２）を示すグラフである。
【図３３】放射線壊死に罹患している患者１の臨床的進展を示す写真である。
【図３４】移植前（１）、移植中（２）ならびに２２ヶ月、４ヶ月および２ヶ月後（それぞれ患者１、２および３）（３）の患者１（Ａ）、２（Ｂ）および３（Ｃ）の臨床的進展を示す写真である。
【図３５】移植中ならびに３日、１３日よびお２８日後のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）およびフィブリノーゲン濃度を示すグラフである。
【図３６】患者１における移植後０日目（Ａ）および５６日目（Ｂ）の創傷床組織のマッソントリクローム染色によるマクロ組織構造を示す写真である。
【図３７】患者１における移植前（淡灰色）および移植後（濃灰色）のＶＥＧＦおよび因子ＶＩＩＩ（Ａ）ならびにＣＤ３およびＣＤ６８（Ｂ）の組織形態計測学的な半定量的分析を示すグラフである。
【図３８】０日目の肉眼（１）、真皮組織レベル（２）および創縫合の最大持続期間（それぞれ２８日間、６５日間および１６日間）（３）における、患者２における皮膚自家移植片のみ（Ａ）、複合移植片ＨＡＣＭ＋ＡＳＣ移植後の皮膚自家移植片（Ｂ）およびＨＡＣＭのみの移植後の皮膚自家移植片（Ｃ）の創縫合の進展を示す１組の写真である。
【図３９】酸素正常状態（２１％Ｏ２）に対して低酸素（０．１％Ｏ２）でのＢＭ−ＭＳＣおよびＡＳＣ生存を示すグラフである。
【図４０】酸素正常状態（２１％Ｏ２）および低酸素（０．１％Ｏ２）でのＢＭ−ＭＳＣおよびＡＳＣのＶＥＧＦ（Ａ）、ＦＧＦ−β（Ｂ）、ＩＧＦ−１（Ｃ）、ＴＧＦ−β（Ｄ）およびＨＧＦ（Ｅ）分泌を示す１組のグラフである。結果は平均±ＳＥＭとして表されている。
【図４１】プラスチックウェル上での細胞拡散（直線）と比較したＨＡＣＭ上でのＢＭ−ＭＳＣおよびＡＳＣの細胞拡散（それぞれ三角形および四角形）を示すグラフである（＊ｐ＜０．０５）。
【図４２】プラスチックウェル上での細胞拡散（直線）と比較したＨＡＣＭ上でのＢＭ−ＭＳＣおよびＡＳＣの細胞増殖（それぞれ三角形および四角形）を示すグラフである（＊§ｐ＜０．０５）。
【図４３】ＡＳＣまたはＢＭ−ＭＳＣで再細胞化されたＨＡＣＭあるいはＨＡＣＭのみで治療された筋壊死の血管新生（Ａ）および線維化の厚さ（Ｂ）を示す１組のグラフである。結果は未治療の筋壊死（対照）と比較した比として表されている。
【図４４】移植から３０日後のＡＳＣまたはＢＭ−ＭＳＣで再細胞化された外植片ＨＡＣＭあるいはＨＡＣＭのみの血管新生を示すグラフである（ｐ＜０．０５）。
【実施例】
【０１７３】
以下の実施例により、本発明をさらに例示する。
【０１７４】
実施例１：脱細胞化マトリックスの生理活性
材料および方法
ヒト組織の脱細胞
欧州筋骨格移植協会(European Association of Musculoskeletal Transplantation)の共通基準（ＥＡＭＳＴ、ウィーン、１９９７年）に従って、ヒト大腿筋膜および真皮組織を得た。
【０１７５】
ヒト大腿筋膜を無水アセトン中で最長２４時間、エーテル中で１５時間、次いでエタノール７０°中で最長８時間処理した。各工程の間に、当該組織を脱塩水の連続流で激しく洗浄した。次いでヒト大腿筋膜をＮａＯＨ（１Ｎ）およびＮａＣｌの組み合わせで１時間、Ｈ２Ｏ２（１５％）で最長８時間処理した。当該組織を脱塩水でさらに激しく最長６８時間洗浄した。
【０１７６】
ヒト真皮組織をエーテル中で８時間、次いでエタノール７０°中で最長１６時間処理し、脱塩水で７時間洗浄した。次いで、ヒト真皮組織をＮａＯＨ（１Ｎ）およびＮａＣｌの組み合わせで１時間処理した後、脱塩水で１６時間洗浄し、次いでＨ２Ｏ２（１５％）で最長１５時間処理した。当該組織を脱塩水でさらに激しく最長１６時間洗浄した。
【０１７７】
ヒトの海綿骨を脛骨から得、皮質骨を踵骨から得た。
【０１７８】
骨組織（海綿骨および皮質骨）の処理を遠心分離で開始して骨髄および血液を除去した。遠心分離後に、移植組織を切断して脱塩水で洗浄した。次いで、骨組織をアセトン中で最長６８時間処理した後、５時間洗浄した。その後、骨組織をＮａＯＨ（１Ｎ）およびＮａＣｌの組み合わせで１時間処理した後、脱塩水で３時間洗浄し、次いでＨ２Ｏ２（１５％）で最長１５時間処理した。当該組織を脱塩水でさらに激しく最長７２時間洗浄した。
【０１７９】
脱細胞方法の各段階で、タンパク質抽出のために試料を採取した。さらに、天然組織（すなわち脱細胞前）および脱細胞化組織（すなわち脱細胞方法の終了時）の総ＤＮＡを定量化した。
【０１８０】
タンパク質の抽出および精製
Ｗｏｌｆらのプロトコルに従って(Biomaterials.2012,33(10):2916-2925)、ヒト大腿筋膜および真皮組織からタンパク質を抽出した。簡単に言うと、３００ｍｇの組織を５ｍＬの尿素−ヘパリン緩衝液（ｐＨ７．４）（２Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス、５ｍｇ／ｍｌのヘパリン、１０ｍＭのＮ−エチルマレイミド、５ｍＭのベンズアミジンおよび１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル）と共に撹拌しながら４℃の温度で最長２４時間インキュベートした。３０００ｇの速度で３０分間遠心分離した後、上澄みを除去し、同じ抽出プロトコルに従って処理した。次いで、第２の上澄みを排除クロマトグラフィーで精製し、ＥＬＩＳＡで定量化した。
【０１８１】
Ｐｉｅｔｒｚａｌらのプロトコル(Radiat Oncol. 2007, 2(1):5)に従って、ヒトの骨組織からタンパク質を抽出した。簡単に言うと、海綿骨および皮質骨を機械的に粉砕して骨粉末を得た。３００ｍｇの湿重量の骨粉末を４Ｍのグアニジンおよび５ｍＭのベンズアミジンを含む５ｍＬの溶液と共に４℃の温度で最長２４時間インキュベートした。次いで、５ｍＬのトリス−ＨＣｌ緩衝液を添加し、４℃で最長５時間インキュベートした。１０分間の遠心分離後、上澄みを除去し、排除クロマトグラフィーで精製し、ＥＬＩＳＡで定量化した。
【０１８２】
ＢＣＡアッセイキットを用い、供給元の説明書に従って総タンパク質の測定を行った。
【０１８３】
各試料について増殖因子レベルをＥＬＩＳＡキットで定量化した。
【０１８４】
結果
ヒト大腿筋膜および真皮組織では、総タンパク質の定量化は脱細胞方法によるタンパク質レベルの減少を示している（図１および図４）。骨組織（海綿骨および皮質骨の両方）では、総タンパク質は処理の各段階で減少した後、最終段階で増加している（図７および図１０）。これは、分解されたタンパク質の断片間での水素相互作用および／またはジスルフィド結合形成を促進するγ照射に起因していると思われる。
【０１８５】
サイトカインの定量化の結果は、処理による増殖因子レベルの大きな減少も示している（図２、図５、図８および図１１）。特に、ＶＥＧＦおよびＩＧＦレベルは脱細胞方法の各段階で大きく減少した（図２Ｂ、図２Ｄ、図５Ｂ、図８Ｂ、図８Ｄおよび図１１Ｂ）。ＰＤＧＦＢＢおよびＢＭＰ２は当該組織において認められなかった。
【０１８６】
全ての試験した組織では、ＤＮＡ定量化は天然組織中のＤＮＡと比較して脱細胞化マトリックス中に存在するＤＮＡの著しい減少も示している（図３、図６、図９および図１２）。その結果は、大腿筋膜では８２％、真皮組織では３５％、海綿骨では６９％および皮質骨では６５％のＤＮＡ量の除去を示している。
【０１８７】
まとめると、これらの結果は、強力なタンパク質分解、特にサイトカイン分解およびＤＮＡ除去を示している。従って、本発明の方法によって得られる脱細胞化マトリックスは不活性な材料であり、拒絶の恐れまたは新しい病状の出現なしに患者に投与することができる。
【０１８８】
実施例２：ＡＳＣの増殖因子分泌
材料および方法
この研究をベルギーの保健省(Belgian Ministry of Health)のガイドラインに従って行った。全ての手順は、組織入手および臨床研究のために医学部（ルーヴァン・カトリック大学）の倫理委員会によって認可されていた（Ｂ４０３２０１０８２８０）。特に断りのない限り、全ての材料をＬｏｎｚａ社（スイスのヴェルビエ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州セントルイス）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国カリフォルニア州カールズバッド）から得た。
【０１８９】
ＡＳＣおよびＤＦの単離および培養
インフォームドコンセントおよび血清学的スクリーニング後に、それぞれコールマン法を用いる脂肪吸引および皮膚生検により、選択的美容整形手術を受ける８人の患者（表１）においてヒトの脂肪組織（平均：７．４ｇ）および皮膚組織（平均：１．５ｃｍ２）の組み合わせ採取を行った。脂肪組織および皮膚試料を４℃で最長６０分間無菌状態に維持した後、脂肪由来の幹細胞（ＡＳＣ）および皮膚線維芽細胞（ＤＦ）を単離した。
【表１】
2018515211.tif 000001
【０１９０】
脂肪組織を３７℃の水浴中で６０分間コラゲナーゼ（１／２ｗ／ｖ）で消化させた。１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）においてコラゲナーゼを不活性化させた。回収した組織を室温および１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。そのペレットを１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）および抗生物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１μｌ／ｍｌのアムホテリシンＢ）を添加したＤＭＥＭからなる増殖培地に懸濁し、５００μｍの網目スクリーンに通して濾過した。次いで、回収した懸濁液を増殖培地を含む２５ｃｍ２培養フラスコに播種した。
【０１９１】
脱表皮した皮膚生検からＤＦを抽出して単離し、２ｍｍ×２ｍｍ断片に刻み、かつプラスチックウェルに入れた。少量の増殖培地を添加してプラスチック表面からの剥離を回避した。
【０１９２】
３７℃および５％ＣＯ２での２４時間のインキュベーション後に、増殖培地を交換した。一次細胞のこの最初の継代を０継代と呼ぶ。接着細胞が組織断片を取り囲むプラスチック表面において目に見える状態になったときに皮膚片を培養皿から除去した。連続したトリプシン処理後に細胞を４継代まで増殖培地（１週間に２回交換）中に維持した。３人のドナーから得られた細胞を１５継代まで培養して標準的な培養条件（３７℃、２１％Ｏ２、５％ＣＯ２、４．５ｇ／ｌのグルコース）下で増殖プロファイルを調べた。
【０１９３】
膜マーカープロファイルの特性評価
４継代において、ＡＳＣおよびＤＦを蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳｃａｎ、BD Biosciences社、カリフォルニア州サンノゼ）によって標準的な細胞表面マーカー（ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ｓｔｒｏ−１、ＣＤ１０６、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、ＣＤ１９、ＣＤ３１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９α、ＣＤ１３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４、ＣＤ３４）[Dominiciら, Cytotherapy. 2006; 8(4):315-317; Bourinら, Cytotherapy. 2013; 15:641-648]について特性評価した。
【０１９４】
簡単に言うと、ＡＳＣを飽和量のモノクローナルの抗体である抗Ｓｔｒｏ−１、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ１０６、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１４６、抗ＣＤ１６６、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４５（ヒトの間葉系幹細胞マーカー抗体パネル、R&D System社、米国ミネソタ州ミネアポリス）、抗ＣＤ４４（ＰＥ、マウス抗ヒトＣＤ４４、BD Bioscience社、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）、抗ＣＤ７３（ＦＩＴＣ、マウス抗ヒトＣＤ７３、BD Bioscience社）、抗ＣＤ３１（ＦＩＴＣ、マウス抗ヒト、Ａｂｃａｍ社、英国ケンブリッジ）、抗ＣＤ１１ｂ（ＦＩＴＣ、マウス抗ヒト、Ａｂｃａｍ社、英国ケンブリッジ）、抗ＣＤ７９α（ＰＥ、マウス抗ヒト、Ａｂｃａｍ社、英国ケンブリッジ）、抗ＣＤ１３（ＦＩＴＣ、マウス抗ヒト、Ａｂｃａｍ社、英国ケンブリッジ）、抗ＨＬＡ−ＤＲ（ＦＩＴＣ、マウス抗ヒト、Ａｂｃａｍ社、英国ケンブリッジ）、抗ＣＤ１４（ＦＩＴＣ、マウス抗ヒト、Ａｂｃａｍ社、英国ケンブリッジ）、抗ＣＤ３４（ＰＥ、マウス抗ヒト、Ａｂｃａｍ社、英国ケンブリッジ）で染色した。少なくとも１０，０００件のゲート設定した事象をＣｅｌｌｑｕｅｓｔＰｒｏソフトウェアを用いるフローサイトメトリーで解析した。結果を平均蛍光強度（ＭＦＩ）で表し、かつ陽性細胞の割合として表す（閾値：９５％のアイソタイプ）。
【０１９５】
分化能
ＡＳＣおよびＤＦを骨細胞系への分化能力を評価するために特異的培地で４継代において試験した。細胞を特異的分化培地（デキサメタゾン（１μＭ）、アスコルビン酸ナトリウム（５０μｇ／ｍｌ）およびジヒドロリン酸ナトリウム（３６ｍｇ／ｍｌ）を添加した増殖培地）で３週間培養した後、その分化をアリザリンレッド染色によって評価した[Quら, In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2007; 43:95-100]。ホルマリン固定後にリン酸カルシウムをアリザリンレッドで染色して骨分化を確認した。また、オステオカルシンの免疫組織化学的検査を行って骨表現型を確認した。
【０１９６】
細胞増殖に対する酸素圧およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）の影響：ＥｄＵアッセイ
Click-iT（登録商標）EdU Alexa Fluor（登録商標）488フローサイトメトリーアッセイキット（Life Technology社、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用い、５−エチニル−２’−デオキシウリジンの取り込みによる直接的なＤＮＡ合成測定によって細胞増殖能を試験した。ＡＳＣ（ｎ＝３）およびＤＦ（ｎ＝３）を５０００細胞／ｃｍ２の密度で２１．５ｃｍ２の培養皿に播種し、１０％ＦＢＳおよび２１％Ｏ２で２４時間培養した。次いで、増殖培地をＦＢＳを含まない同じもので交換して、細胞増殖を２４時間止めた。こられの細胞を最後に１％ＦＢＳまたは５％ＦＢＳを添加した増殖培地において特定の条件下、すなわち０．１％Ｏ２、５％Ｏ２および２１％Ｏ２に４８時間置き、ＥｄＵ（チミジンのヌクレオシド類似体である５−エチニル−２’−デオキシウリジン、活性ＤＮＡ合成中にＤＮＡに取り込まれる）を添加した。Alexa Fluor（登録商標）４８８での顕色後に、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、BD Biosciences社、カリフォルニア州サンノゼ）で陽性細胞を計数した。
【０１９７】
増殖因子分泌プロファイル
トリプシン処理後に細胞（３継代後）を計数し、５種類の漸増的希釈物、すなわち１００％ＡＳＣ＋０％ＤＦ、７５％ＡＳＣ＋２５％ＤＦ、５０％ＡＳＣ＋５０％ＤＦ、２５％ＡＳＣ＋７５％ＤＦおよび０％ＡＳＣ＋１００％ＤＦを得、それぞれ高度な低酸素環境および組織酸素圧に対応する０．１％Ｏ２および５％Ｏ２の低酸素チャンバー（Modular Incubator Chamber MIC-101、Billups-Rothenberg社、米国カリフォルニア州デル・マー)内でのインキュベーションのために、約８０％〜９５％の集密状態が得られる密度で細胞を含む１２ウェル培養プレートに３連で播種した。これらの細胞を（各希釈および酸素圧で）正常血糖（１ｇ／Ｌ）または高血糖（４．５ｇ／Ｌ）増殖培地に曝露した。これらの制御された条件下での２４時間のインキュベーション後に、細胞培養上澄みを個々に採取し、酵素結合免疫吸着法によるさらなる増殖因子定量化（Quantikine ELISAキット（R&D system社、米国ミネソタ州ミネアポリス）によるＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＳＤＦ−１αおよび塩基性ＦＧＦ）のために−２０℃で貯蔵した。３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム溶液（ＭＴＳ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、オランダのライデン）アッセイにより、低酸素ストレスの直後に細胞生存率を評価した。低酸素／血糖ストレス試験および増殖因子定量化をそれぞれ３連および２連で行った。結果をピコグラム／ミリメートルで表す。
【０１９８】
統計分析
１標本コルモゴロフ検定およびＱ−Ｑプロットを使用して値の正規分布を評価した。対応のあるｔ検定および一元配置分散分析をボンフェローニ事後検定と共に用いて群間の統計的有意差（正規分布に従う）を試験した。ＰＡＳＷ１８（ＳＰＳＳ、ＩＢＭ社、米国ニューヨーク州ニューヨーク）を用いて統計的検定を行った。ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０１９９】
結果
表面マーカープロファイルでは２つの細胞集団を区別することができない（表２）。
【表２】
2018515211.tif 000002
【０２００】
ＡＳＣおよびＤＦは、間葉細胞マーカー（ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６）では陽性（＞９０％の陽性細胞）であり、内皮細胞マーカー（ＣＤ３１）、骨髄由来の間質細胞マーカー（ＣＤ１０６、Ｓｔｒｏ−１、ＣＤ１４６）および造血系マーカー（ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３４）ならびにＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７９αおよびＣＤ１９では陰性であった。特異的分化培地での培養後（図１３）、アリザリンレッド染色およびオステオカルシン免疫組織化学的検査によってＡＳＣおよびＤＦの両方で骨分化能力が実証された。
【０２０１】
ＡＳＣおよびＤＦは１５継代まで同様の増殖プロファイルを有していた（図１４、ＮＳ）。
【０２０２】
ＦＢＳを含まない０．１％Ｏ２および５％Ｏ２での２４時間の培養後に、ＡＳＣおよびＤＦの生存率は有意に影響を受けなかった（図１５）。５％Ｏ２では、ＡＳＣと比較した場合（８７．０４％のＡＳＣ生存、ｐ＜０．０５）、ＤＦの生存率は減少した。
【０２０３】
ＡＳＣおよびＤＦの連続希釈物からのＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦおよびＫＧＦの分泌（０．１％および５％Ｏ２、４．５ｇ／ｌのグルコース）の研究はどんな有意な曲線も示さなかった（図１６）。
【０２０４】
しかし、ＶＥＧＦおよびＳＤＦ−１αでは、ＤＦによるＡＳＣ「汚染」に従う線形回帰が観察された。実際には、ＳＤＦ−１α分泌レベルはＡＳＣの割合の増加と共に減少する。この結果は異なる条件の酸素圧（２１％、５％または０．１％）またはグルコース濃度（１ｇ／ｌまたは４．５ｇ／ｌ）においても認められる（図１７〜図２２）。さらに、高グルコース培養条件および０．１％Ｏ２および５％Ｏ２では、ＶＥＧＦ分泌レベルはＡＳＣの割合の増加と共に増加する（図１７Ａおよび図１８Ａ）。低グルコース条件下での同じ測定は５％Ｏ２でのＶＥＧＦ分泌において有意な線形回帰を示した（図２０Ａ）。
【０２０５】
ＤＦがより高いレベルのＳＤＦ−１αを放出し、かつＶＥＧＦがＡＳＣによってより高い率で産生されたため、この関係は反対であり、これにより細胞の割合（ＡＳＣ純度）の測定が可能になった。
【０２０６】
実施例３：低酸素および高血糖におけるＡＳＣの挙動
材料および方法
ベルギーの保健省のガイドラインに従ってこの研究を行った。全ての手順は医学部（ルーヴァン・カトリック大学）の倫理委員会によって認可されていた。
【０２０７】
ＡＳＣ、ＤＦおよびケラチノサイトの単離および培養
インフォームドコンセントおよび血清学的スクリーニング後に、それぞれコールマン法を用いる脂肪吸引および皮膚生検により、選択的美容整形手術を受ける８人の患者（表１）においてヒトの脂肪組織（平均：７．４ｇ）および皮膚組織（平均：１．５ｃｍ２）の組み合わせ採取を行った。脂肪組織および皮膚試料を４℃で最長６０分間無菌状態に維持した後、脂肪由来の幹細胞（ＡＳＣ）および皮膚線維芽細胞（ＤＦ）を単離した。
【０２０８】
脂肪組織を３７℃の水浴中で６０分間コラゲナーゼ（１／２ｗ／ｖ）で消化させた。コラゲナーゼを１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において不活性化させた。回収した組織を１５００ｒｐｍおよび室温で１０分間遠心分離した。そのペレットを１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）および抗生物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１μｌ／ｍｌのアムホテリシンＢ）を添加したＤＭＥＭからなる増殖培地に懸濁し、５００μｍの網目スクリーンに通して濾過した。次いで、回収した懸濁液を増殖培地を含む２５ｃｍ２培養フラスコに播種した。
【０２０９】
ＤＦを脱表皮した皮膚生検から抽出して単離し、２ｍｍ×２ｍｍ断片に刻み、かつプラスチックウェルに入れた。少量の増殖培地を添加してプラスチック表面からの剥離を回避した。
【０２１０】
ケラチノサイトをＡＴＣＣ（ＰＣＳ−２００−０１１）から購入し、ケラチノサイト増殖キット（ＡＴＣＣ、ＰＣＳ−２００−０４０（商標））を用い、供給元の説明書に従って培養した。
【０２１１】
３７℃および５％ＣＯ２での２４時間のインキュベーション後に、増殖培地を交換した。一次細胞のこの最初の継代を０継代と呼ぶ。接着細胞が組織断片を取り囲むプラスチック表面において目に見える状態になったときに皮膚片を培養皿から除去した。連続したトリプシン処理後に細胞を４継代まで増殖培地（１週間に２回交換）中に維持した。
【０２１２】
増殖因子分泌プロファイル
トリプシン処理後に、細胞（４継代後）をそれぞれ高度な低酸素環境および組織酸素圧に対応する０．１％Ｏ２および５％Ｏ２の低酸素チャンバー（Modular Incubator Chamber MIC-101、Billups-Rothenberg社、米国カリフォルニア州デル・マー)内でのインキュベーションのために、約８０％〜９５％の集密状態が得られる密度で細胞を含む１２ウェル培養プレートに３連で播種した。これらの細胞を（各希釈および酸素圧で）正常血糖（１ｇ／Ｌ）または高血糖（４．５ｇ／Ｌ）増殖培地に曝露した。これらの制御された条件下での２４時間のインキュベーション後に、細胞培養上澄みを個々に採取し、酵素結合免疫吸着法（Quantikine ELISAキットによるさらなる増殖因子定量化（R&D system社、米国ミネソタ州ミネアポリス）によるＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１αおよびＫＧＦ）のために−２０℃で貯蔵した。低酸素／血糖ストレス試験および増殖因子定量化をそれぞれ３連および２連で行った。結果をピコグラム／ミリメートルで表す。
【０２１３】
統計分析
１標本コルモゴロフ検定およびＱ−Ｑプロットを使用して値の正規分布を評価した。対応のあるｔ検定および一元配置分散分析をボンフェローニ事後検定と共に用いて群間の統計的有意差（正規分布に従う）を試験した。ＰＡＳＷ１８（ＳＰＳＳ、ＩＢＭ社、米国ニューヨーク州ニューヨーク）を用いて統計的検定を行った。ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０２１４】
結果
細胞を低酸素条件、すなわち０．１％Ｏ２に曝露した場合、細胞は生理的Ｏ２分圧、すなわち５％Ｏ２の場合よりも高いレベルのＶＥＧＦを分泌する（図２３Ａ）。ケラチノサイトのみが酸素正常状態と比較して低酸素でのＳＤＦ−１αおよびＫＧＦの発現の有意な増加を示すが、レベルは非常に低いままである（図２３Ｂおよび図２３Ｃ）。
【０２１５】
高血糖すなわち４．５ｇ／ｌのグルコースで培養されたＡＳＣは、正常血糖（１ｇ／ｌ）と比較してＶＥＧＦ分泌の僅かな減少を示すが、線維芽細胞のＶＥＧＦ分泌は７０％超も低下する（図２４Ａ）。ＳＤＦ−１α発現レベルはＡＳＣおよび線維芽細胞の両方において減少し、ＫＧＦ分泌は全ての細胞種で実質的に同様である（図２４Ｂおよび図２４Ｃ）。
【０２１６】
糖尿病性創傷状態に対応する低酸素および高血糖では、ＡＳＣは酸素正常状態および正常血糖の場合よりも有意により多くのＶＥＧＦを分泌する（５％Ｏ２および１ｇ／ｌのグルコースでの１７１．１３ｐｇ／ｍｌと比較して、０．１％Ｏ２および４．５ｇ／ｌのグルコースでは２８３．９４ｐｇ／ｍｌ、図２５Ａ）。それに対して、線維芽細胞は、酸素正常状態および正常血糖の場合よりも低酸素および高血糖の場合により低いレベルのＶＥＧＦを分泌する。
【０２１７】
これらの結果は、ＡＳＣが低酸素、高血糖および低酸素かつ高血糖において線維芽細胞よりも多くの増殖因子ＶＥＧＦを分泌することを示している。さらに、糖尿病性創傷状態は生理的状態と比較してＡＳＣからのＶＥＧＦの分泌の増加を引き起こす。従って、ＡＳＣはＶＥＧＦを放出して糖尿病環境において血管新生を促進することができ、かつ従って糖尿病性創傷の修復を促進することができる。
【０２１８】
また、非糖尿病のヒトのドナーから得られたＡＳＣによるＶＥＧＦの分泌プロファイルまたは糖尿病のヒトのドナーから得られたＡＳＣによるＶＥＧＦの分泌プロファイルは類似している（図２６Ａ）。特に、糖尿病のヒトのドナーから得られたＡＳＣのＶＥＧＦ分泌は、非糖尿病のヒトのドナーから得られたＡＳＣのＶＥＧＦ分泌と同じ位高いか、それよりも高い。それに対して、糖尿病のヒトのドナーから得られた線維芽細胞は非糖尿病のヒトのドナーから得られた線維芽細胞よりも少ないＶＥＧＦを分泌する（図２６Ｂ）。
【０２１９】
ＶＥＧＦ分泌と比較して、非糖尿病のヒトのドナーから得られたＡＳＣのＫＧＦ分泌は糖尿病のヒトのドナーから得られたＡＳＣの分泌とは異なる（図２７Ａ）。さらに、非糖尿病のヒトのドナーからのものであるか糖尿病のヒトのドナーからのものであるかに関わらず、ＡＳＣおよび線維芽細胞では同様のＫＧＦ分泌プロファイルが認められる（図２７）。
【０２２０】
つまり、これらの結果は、糖尿病の対象からのＭＳＣもＶＥＧＦを放出して血管新生を促進することができ、従って糖尿病性創傷などの創傷の修復を促進することができることを示している。
【０２２１】
従って、本発明のＭＳＣ集団は治療される対象の組織に由来していてもよい。
【０２２２】
実施例４：皮膚の再生
材料および方法
全ての手順は、組織入手および臨床研究のために医学部（ルーヴァン・カトリック大学）の倫理委員会ならびにヒトおよび前臨床試験のための地方動物実験倫理委員会によって認可されていた（Ｂ４０３２０１０８２８０）。
【０２２３】
ヒトのＡＳＣ
単離および特性評価
選択的美容整形手術（腹部脂肪除去術（ｎ＝３）または乳房形成術（ｎ＝５）、平均して６．２ｇの脂肪組織（１．４〜１４．６ｇ））の間ならびにインフォームドコンセントおよび血清学的スクリーニング後に、８人の患者においてコールマン法(Coleman, Clin Plast Surg. 2001; 28:111-119)を用いた脂肪吸引によってヒトのＡＳＣを採取した。
【０２２４】
脂肪組織を３７℃の水浴中で６０分間ＧＭＰコラゲナーゼ（０．０７５ｇ、Serva Electrophoresis社、ドイツのハイデルベルク）で消化させた。組織の消化後、遠心分離後に細胞を回収し、連続したトリプシン処理後に４継代まで（または遺伝子研究のためにそれ以上の継代まで）増殖培地中に維持して純粋なＡＳＣ集団を得た（４継代後に＞９０％のＡＳＣ）。これらの細胞を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳｃａｎ、BD Biosciences社、カリフォルニア州サンノゼ）によって膜マーカープロファイル（ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９α、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲ）(Dominiciら, Cytotherapy 2006;8(4):315-317)について特性評価し、間葉分化能（脂肪生成、軟骨形成、骨形成）を評価するために特異的培地で試験した(Schubertら, Biomaterials. 2011; 32:8880-8891 ; Cuiら, Biomaterials. 2009; 30:2683-2693)。
【０２２５】
また、それぞれ０．１％（壊死組織で見られるような高度な低酸素環境）または２１％Ｏ２レベル（大気の酸素正常状態、正常な培養条件）の低酸素チャンバー(Modular Incubator Chamber MIC-101; Billups-Rothenberg社、米国カリフォルニア州デル・マー）内での７２時間のインキュベーションのために、ＡＳＣを１２ウェル培養プレートに播種した。インキュベーション後に、細胞培養上澄みを個々に採取し、ＶＥＧＦ定量化（ＶＥＧＦのためのQuantikine ELISAキット、R&D system社、米国ミネソタ州ミネアポリス）のために−２０℃で貯蔵した。
【０２２６】
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム溶液（ＭＴＳ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、オランダのライデン）(Veriterら, Biomaterials 2011;32:5945-5956)で細胞生存率を評価した。
【０２２７】
ＡＳＣの生体外における遺伝的安定性
異なる継代後の核型および蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析により細胞遺伝的安定性を調べて生体包帯の細胞成分の腫瘍学的安全性を評価した。標準的なプロトコルに従って５人のドナーのＡＳＣから中期染色体を得た。簡単に言うと、１、４、１０、１２および１６継代後の指数増殖段階における培養された細胞を０．０２μｇ／ｍＬのコルセミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）で４時間処理した。トリプシン処理後にフラスコから採取した細胞を低張性の０．０５５ＭのＫＣｌ中、３７℃で３０分間インキュベートし、３：１のメタノール：氷酢酸で固定した。標準的な手順(Duhouxら, PLoS ONE. 2011;6:e26311)に従って染色体の採取および中期スライド調製を行い、１１〜２０のリバース−トリプシン−ライトＧバンド染色（ＧＴＷ）した中期を分析し、かつヒト細胞遺伝学的命名法に関する２０１３国際システム(2013 International System for Human Cytogenetics Nomenclature)（ＩＳＣＮ２０１３）に従って核型を報告した。標準的なプロトコル(Veriterら, Biomaterials. 2011; 32:5945-5956)に従ってＦＩＳＨ解析を行い、TelVysion 5q（ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ）、ＣＥＰ７／Ｄ７Ｚ１（ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎまたはＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ）、ＣＥＰ８／Ｄ８Ｚ２（ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅまたはＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ）およびＣＥＰ１８／Ｄ１８Ｚ１（ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ）プローブ（Abbot Molecular社、ベルギーのオティニー＝ルヴァン＝ラ＝ヌーヴ）を用いて染色体５、７、８および１８の異数性を検出した。１継代、４継代および１６継代では２００の核が計数され、１０継代では１２０の核が計数され、１２継代では７３の核が計数された（閾値は９９．９％の信頼区間によりβ法に従って計算した）。
【０２２８】
生体包帯の開発
４継代において、ヒトの無細胞コラーゲンマトリックス(Dufraneら, Biomaterials 2008;29:2237-2248)（ＨＡＣＭ：サンリュック大学病院（ベルギーのブリュッセル）の組織銀行から入手した凍結乾燥した脱細胞化同種異系ヒト大腿筋膜）および対照としてのプラスチックウェルにおいてＡＳＣの接着および拡散能力を比較した。既に記載されているように(BacallaoおよびStelzer, Methods Cell Biol. 1989; 31:437-452)、共焦点レーザー走査型顕微鏡法（ＣＬＳＭ）で細胞接着を評価した。
【０２２９】
簡単に言うと、ヒトのＡＳＣを２×１０５細胞／ウェルの密度で２４ウェル内の処理済大腿筋膜上に播種した。播種後１５日目まで２日ごと、３０日目まで３日ごとに、ＨＡＣＭをリン酸緩衝食塩水で洗浄して培地を除去し、次いで、ＣＬＳＭで調べるために２μＭのカルサインアセトキシメチルエステル（ＡＭ、Molecular Probes社のヨーロッパ法人、オランダのライデン）におよそ３時間浸漬した。Scion Image Beta 4.02n収集および分析ソフトウェア（Ｓｃｉｏｎ社、カリフォルニア州トランス）を用いて、細胞で覆われた総面積、細胞周囲長および形状係数［（面積／周囲長２）×４π］を決定した。
【０２３０】
生体内での生体包帯の腫瘍学的安全性および有効性を評価するために、生体包帯および足場のみの小片（１０ｍｍ×１０ｍｍ）をヌードラット（ｎ＝１０、Charles River Laboratories International社、米国マサチューセッツ州ウィルミントン）の皮下に移植した。
【０２３１】
全身麻酔（イソフルラン３％）下で、各脊椎傍領域に三角形の皮弁を持ち上げて２つの皮下ポケットを作り出し、移植片（右側にはＨＡＣＭ＋ＡＳＣ、左側にはＨＡＣＭのみ）の配置を可能にした。熱による病変（皮膚の壊死）を各皮弁の内側に生じさせて低酸素の創傷環境を再現した。細胞が右側の熱傷した真皮に接触した状態で生体包帯（ＨＡＣＭ＋ＡＳＣ）を移植し、ＨＡＣＭのみを左の脊椎傍領域に移植した。リチウムフタロシアニンの５〜８つの結晶（ＬｉＰＣ結晶）の配置後にこれらの皮弁を非吸収性縫合糸で閉じて、移植後の組織内酸素化過程のさらなる測定を可能にした。
【０２３２】
電子常磁性共鳴による酸素測定法（ＥＰＲ分光計、Ｍａｇｎｅｔｔｅｃｈ社、ドイツのベルリン）を使用して組織内ＰＯ２過程を追跡して、ヌードラットにおける組織酸素化を改善する複合移植片の能力を評価した。移植後に最長４週間にわたって毎週、ガス麻酔（イソフルラン）下で負傷した真皮におけるＰＯ２を調べた。結果を移植後６日目における組織酸素化の割合として表した。
【０２３３】
移植後１ヶ月目（ｎ＝５）または３ヶ月目（ｎ＝５）に、肉眼的および組織学的解析（局所的な腫瘍成長および血管新生を調べるためのヘマトキシリン・エオジンおよびマッソントリクローム染色）のために、移植片＋周囲組織の完全な切除を行った。
【０２３４】
皮膚の再建の臨床応用
非治癒性創傷を有する３人の患者に生体包帯が提案された（表３）。優良医薬品製造基準の推奨に沿って、ＡＳＣの単離および培養のために臍周囲の脂肪組織（それぞれ２２ｇ、８ｇおよび２１ｇ）を採取した（局所麻酔下でコールマン法を用いた）。
【表３】
2018515211.tif 000003
【０２３５】
３継代において、ＡＳＣをトリプシン処理し、ＤＭＥＭに再懸濁し、かつ凍結乾燥したＨＡＣＭ（４継代に対応する）上に載せた。ＡＳＣが９０％超のＨＡＣＭを覆ったときに生体包帯が得られた。最後に、複合移植片をＣＭＲＬ（Ｍｅｄｉａｔｅｃ社、米国ヴァージニア州マナッサス）で洗い流し、移植のために手術室に移した（ＨＡＣＭの上側に載せられられたＡＳＣ）。
【０２３６】
これらの３人の患者において、創傷床における汚染を最小限に抑えるために移植前にハイドロサージャリー（ｈｙｄｒｏｓｕｒｇｅｒｙ）で創傷壊死組織切除を行った。複合移植片を理想サイズに切断し、細胞層を創傷表面と直接接触させた状態に向けて、非吸収性縫合糸で固定した。臨床的および組織学的過程と同様に、炎症パラメータ（Ｃ反応性タンパク質、フィブリノーゲン）を追跡した。ワセリンを塗った（Ｖａｓｅｌｉｎａｔｅｄ）包帯を巻いて毎日交換した。免疫組織化学的検査および組織形態計測のために移植前および後に生検を行って炎症反応、血管新生および組織リモデリング（それぞれＣＤ３／ＣＤ６８、ＶＥＧＦ／因子ＶＩＩＩおよびマッソントリクローム）を調べた。
【０２３７】
統計分析
１標本コルモゴロフ・スミルノフ検定およびＱ−Ｑプロットを使用して値の正規分布を評価した。対応のあるｔ検定および一元配置分散分析をボンフェローニ事後検定と共に用いて群間の統計的有意差（正規分布に従う）を試験した。Ｓｙｓｔａｔバージョン８．０（Cranes Software International社、インドのバンガロール）またはＰＡＳＷ１８（ＳＰＳＳ、ＩＢＭ社、米国ニューヨーク州ニューヨーク）を用いて統計的検定を行った。ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０２３８】
結果
生体外および生体内におけるＡＳＣ＋ＨＡＣＭの安全性
間葉間質細胞表面マーカープロファイルであるＣＤ４４＋（＞９５％の細胞）、ＣＤ７３＋（＞９０％）、ＣＤ９０＋（＞９５％）、ＣＤ１０５＋（＞９５％）、ＣＤ４５−（＜５％）、ＣＤ３４−（＜７％）、ＣＤ１４−（＜７％）、ＣＤ１１ｂ−（＜７％）、ＣＤ７９α−（＜７％）、ＣＤ１９−（＜５％）およびＨＬＡ−ＤＲ−（＜７％）（表４）ならびに石灰化、ヒアリン沈着および脂質胞の陽性標識により、第４継代におけるＡＳＣを特性評価した。
【表４】
2018515211.tif 000004
【０２３９】
間葉分化能（脂肪生成、軟骨形成、骨形成）を評価するために特異的培地でもＡＳＣを特性評価した（図２８）。
【０２４０】
播種後１日目に、大部分のＡＳＣが平均して４．８％の表面被覆（有意でない）で両方の細胞支持体上の周りに現われた（平均形状係数：０．９３±０．１３）。
【０２４１】
播種後３日目と１８日目との間に、ＨＡＣＭと比較して細胞拡大の有意により大きな面積がプラスチックウェルで認められた（ｐ＜０．００５）。プラスチックウェルの場合よりも１週間遅くＨＡＣＭで完全な表面被覆が認められた。プラスチックウェルと比較してＨＡＣＭでのＡＳＣ拡散（形状係数）でも同様の遅れが認められた（ｐ＜０．００５）（図２９）。ＨＡＣＭではプラスチックウェルよりも被覆は遅れたが同じ細胞増殖に達した。
【０２４２】
生体外での安全性研究により、１継代、４継代およびそれ以上の継代（１０、１２または１６継代）においてＡＳＣの核型におけるクローン構造の染色体異常が存在しないことが判明した。全ての継代において、間期細胞に対するＦＩＳＨ解析（カットオフ：４．５％）により、少なくとも２つの試験した染色体で境界域のテトラソミー（１．５〜５．５％）が検出された。この技術により、１６継代における間期細胞の１５％において疑わしいモノソミー７を有するクローンも判明した。これらの異数性細胞は中期細胞で検出されないため、増殖的利点を有していないように思われる。
【０２４３】
肉眼および顕微鏡分析では、免疫不全のラット（移植後１ヶ月および３ヶ月）から外植された組織においてどんな局所的腫瘍成長も認められなかった（図３０）。
【０２４４】
ＡＳＣ＋ＨＡＣＭ（生体包帯）の生体外および生体内での有効性
０．１％Ｏ２分圧での７２時間のインキュベーション後の細胞生存率を２１％Ｏ２分圧と比較した（ｐ＝０．０３４）。低酸素はＡＳＣ生存率に対して有害な影響を有しておらず、２１％Ｏ２分圧と比較して低酸素条件（０．１％Ｏ２分圧）においてＶＥＧＦの有意により高い分泌が認められた（ｐ＜０．００１、ｎ＝８）（図３１）。
【０２４５】
６日目における皮膚の酸素化（各個々のレシピエントについて）を皮膚傷害後のベースラインと見なした。深い真皮における酸素圧の比（熱による病変後）は、ＨＡＣＭのみの場合よりもＨＡＣＭ＋ＡＳＣの場合に有意により高かった（ｐ＜０．０５、移植後１３、２１および２７日目）。ＨＡＣＭのみと接触させた真皮と比較した場合、ＨＡＣＭ＋ＡＳＣで再構成された真皮において首尾一貫して有意により高い血管密度が認められた（ｐ＝０．００２）（図３２）。
【０２４６】
臨床応用
第３継代の終了時のＡＳＣをトリプシン処理し、次いでＨＡＣＭ上に播種してコラーゲン足場において第４継代を得た。ＨＡＣＭ表面の９０％がＡＳＣで被覆されたとき（５．８×１０５細胞／ｃｍ２）に移植組織が得られた。細胞単離から送達までの包帯の完全な製造は平均して１３３日で達成された（表５）。
【表５】
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【０２４７】
移植後３日目に移植片の最初の取り込みが生じ、その後にコラーゲンマトリックスが漸増的に再吸収され、これが移植後およそ２８日目に完了し、創傷床表面に良好に血管新生された肉芽組織が得られた（図３３）。
【０２４８】
患者１では、移植後６０日目に完全な創縫合が達成され、維持された（２２ヶ月超）。患者２および３では、ＡＳＣ移植後６週目に血管新生された肉芽組織に皮膚自家移植を行った。３日後に皮膚自家移植片は完全に取り込まれ（第１の包帯開始）、疼痛緩和を伴い、患者２および３ではそれぞれ移植から６ヶ月および３ヶ月後に毎日の看護を中断した（図３４）。これらの２人の患者では潰瘍形成の再発が生じ、これは恐らく創傷の全身的病因（鎌状赤血球症および脈管炎）が原因であったと思われる。
【０２４９】
移植から１週間後にＣ反応性タンパク質およびフィブリノーゲンにおける有意な増加が生じたが、慢性炎症は観察されず、外科手術後１週間で基底値への減少が生じた（図３５）。
【０２５０】
移植後の生検結果から、包帯移植前の強力な線維化と比較して良好に組織化された血管化組織が判明した（図３６）。移植後の組織においてＶＥＧＦ（ｐ＜０．００１）および因子ＶＩＩＩ（ｐ＜０．０５）における有意な増加が認められた（図３７Ａ）。移植後にリンパ球浸潤の変化を伴わない有意なマクロファージ動員が認められた（ｐ＜０．０５）（図３７Ｂ）。ＨＡＣＭのみ（細胞を含まない）では患者２において有益な効果は得られなかった（図３８）。
【０２５１】
つまり、これらの結果は、ＨＡＣＭ上のＡＳＣは皮膚の治癒のための生理機能の回復を支持することができ、ＡＳＣは高度な低酸素環境において生存し、かつＶＥＧＦを放出して血管新生、肉芽組織の合成および従って治癒の進展を促進することができることを実証している。
【０２５２】
実施例５：骨格筋再生
材料および方法
特に定めがない限り、全ての材料をＬｏｎｚａ社（スイスのバーゼル）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州セントルイス）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国カリフォルニア州カールズバッド）から得た。全ての手順はルーヴァン・カトリック大学の地方動物実験倫理委員会によって認可されていた（２０１３／ＵＣＬ／ＭＤ／０２２）。
【０２５３】
ＢＭ−ＭＳＣおよびＡＳＣの単離および特性評価
ベルギー在来種のブタ（雌、体重：＜１００ｋｇ、年齢：６ヶ月齢未満、Rattlerow Seghers社、ベルギーのローケレン）をＢＭ−ＭＳＣおよびＡＳＣのドナーとして使用した。
【０２５４】
ヘパリン添加ＢＭを採取し、２倍量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と混合した。４５０ｇで１０分間の遠心分離後、細胞を１０７細胞／ｍｌで再懸濁し、細胞懸濁液をフィコール・ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）カラム（密度：１．０７７、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ｎｙｃｏｍｅｄ社、ノルウェーのオスロ）の上に重層し、１２５０ｇで３０分間遠心分離した。単核細胞を界面から回収し、４５０ｇで１０分間ＰＢＳで洗浄した。これらの細胞を、１０％熱不活性化されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質が添加されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む培養フラスコの中に入れた(Veriterら, Biomaterials. 2011; 32:5945-5956)。
【０２５５】
脂肪組織（平均１５ｇ）を９％ＮａＣｌで３回洗浄し、ペトリ皿の中で切断して血管および線維性結合組織を除去し、６０分間連続的に撹拌しながら３７℃の振盪水浴中でハンクス平衡塩類溶液（カルシウムおよびマグネシウムイオンを含む）で再構成されたコラゲナーゼ（０．０７５ｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）の中に入れた。消化後、コラゲナーゼを１０％熱不活性化されたＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）および抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ）が添加されたＤＭＥＭにおいて不活性化させた。回収した組織を４５０ｇおよび室温で１０分間遠心分離した。次いで、このペレットを１０％ＦＢＳおよび抗生物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン）が添加されたＤＭＥＭからなる増殖培地（ＭＰ）に再懸濁した。５００ｍｍの網目スクリーンに通して濾過した後、当該組織を４５０ｇおよび室温で１０分間遠心分離し、次いでＭＰ培地に再懸濁した。一次細胞のこの最初継代を０継代（Ｐ０）と呼んだ。３７℃および５％ＣＯ２での２４〜４８時間のインキュベーション後に、培養物をＰＢＳで洗浄し、ＭＰ培地中に４継代（Ｐ４）まで維持し、次いで特異的培地で分化させた(Schubertら, Biomaterials. 2011; 32:8880-8891)。
【０２５６】
蛍光活性化細胞分類（少なくとも１０，０００件の事象をＣｅｌｌｑｕｅｓｔＰｒｏソフトウェア（ＦＡＣＳｃａｎ、BD Biosciences社、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）を用いるフローサイトメトリーで解析した）により、フィコエリトリン（ＰＥ）に結合させたＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５抗体（BD Pharmigen、BD Biosciences社）の平均蛍光強度のプラスへの変化を明らかにして間葉系幹細胞株を確認したが、ＣＤ４５抗原の発現はマイナスであった。対照的に、末梢血単核細胞（陰性対照）はＣＤ４５では陽性の染色、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５では陰性の染色を示した。Ｐ４において、脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞表現型への細胞分化をそれぞれレッドオイル、アリザリンレッドおよびアルシアンブルー染色で確認した。
【０２５７】
生体外でのＢＭ−ＭＳＣおよびＡＳＣに対する低酸素の影響
以前に記載されたプロトコル(Schubertら, Biomaterials. 2011; 32:8880-8891)に従って、ＡＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣを１２ウェル培養プレートに播種し、低酸素チャンバー（Modular Incubator Chamber MIC-101、Ｂｉｌｌｕｐｓ−Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ社、米国カリフォルニア州デル・マー）内でインキュベートした。細胞を高度な低酸素環境および大気の酸素正常状態にそれぞれ関連する０．１％および２１％Ｏ２レベルで７２時間インキュベートした。各状態で７２時間後に、細胞培養上澄みを個々に採取し、遠心分離し、かつその後の増殖因子定量化のために−２０℃で貯蔵した。
【０２５８】
ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ、ＨＧＦおよびＴＧＦ−β１の定量化は、酵素結合免疫吸着法（ELISA Quantikineキット、R&D system社、米国ミネソタ州ミネアポリス）によって達成した。試料は希釈せず、供給元の説明書に従った。補正波長を６９０ｎｍに設定した状態で４５０ｎｍに設定したMultiskan EX Labsystems分光光度計（Thermo Scientific社、オランダのブレダ）で各ウェルの光学濃度を測定した。増殖因子放出は低酸素と酸素正常状態との比により表した。
【０２５９】
以前に記載されているように(Schubertら, Biomaterials. 2011; 32:8880-8891)、正常酸素圧および低酸素条件下でのＭＴＳ細胞増殖アッセイ（ＭＴＳ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、オランダのライデン）により細胞生存率も評価した。インキュベーション後に、補正波長を６９０ｎｍに設定した状態で４５０ｎｍに設定したMultiskan EX Labsystems分光光度計（Thermo Scientific社）で各ウェルの光学濃度を測定した。
【０２６０】
ヒトの無細胞コラーゲンマトリックス（ＨＡＣＭ）
人体材料に関する欧州およびベルギーの法律に従い、病歴、血清学的検査および微生物学的試験に基づくヒト組織ドナーのスクリーニング後に、選択されたドナーから大腿筋膜を得た。サンリュック大学病院（ベルギーのブリュッセル）の組織銀行によって開発されたプロセスを用い、記載されているようにヒト大腿筋膜張筋を調製して、化学残留物（アセトン／Ｈ２Ｏ２）を含まず、かつ５％未満の残留水分を含むＨＡＣＭを得た。これを２５，０００Ｇｙのγ照射（Ｓｔｅｒｉｇｅｎｉｃｓ社、ベルギーのフルリュース）で滅菌した。次いで、同種移植片を室温で貯蔵した(Dufraneら, Biomaterials. 2008, 29: 2237-2248)。
【０２６１】
別個のドナーから得られた天然ＨＡＣＭ（ｎ＝４）および処理済ＨＡＣＭ（ｎ＝４）のパラホルムアルデヒド固定（４％）した切片に対する４０，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、１μｇ／ｍｌ）染色（Abbot Molecular社、米国）により、（ＨＡＣＭの）脱細胞プロセスを最初に評価した。無限遠カメラおよびDelta Pixビューアープログラムを備えた蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社、ベルギーのザベンテム）を用いて組織切片を観察した。次に、ＱＩＡａｍｐキット（登録商標）ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツのヒルデン）を用いて凍結させた天然マトリックス（ｎ＝４）および処理済マトリックス（ｎ＝４）からの等体積のパラフィン試料上でＤＮＡの単離を行った。波長を２６０ｎｍに設定したＱｕｂｉｔ（商標）蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）による蛍光測定によってＤＮＡ濃度を測定した。結果をμｇ／１ｍＬのＤＮＡ単離溶液で表した。
【０２６２】
生体外におけるＨＡＣＭ上でのＭＳＣの接着および拡散
３継代（Ｐ３）の終了時に、ＨＡＣＭ上に拡散するＭＳＣの細胞能力をプラスチックウェル（対照として）上で培養された細胞の能力と比較した。既に記載されているように(Dufraneら, Biomaterials. 2002, 23: 2979−2988)、足場への細胞接着を共焦点レーザー走査型顕微鏡法（ＣＬＳＭ）で評価した。
【０２６３】
播種後１日目と３０日目との間で、細胞接着および拡散（プラスチックウェルおよびＨＡＣＭ上）をＣＬＳＭで調べた。両方のＭＳＣを２×１０５細胞／ウェルの密度でＨＡＣＭおよび２４ウェルクラスター上に播種した。播種後１日目〜３０日目に、複合移植片を培地から除去し、ＰＢＳで洗浄して培地を除去し、かつカルサインアセトキシメチルエステル（ＡＭ）２ｍｍ（Molecular Probes社のヨーロッパ法人、オランダのライデン）中におよそ３時間浸漬した。次いで、移植片（細胞＋ＨＡＣＭ）をシアノアクリレート接着剤を用いてスライドに付着させ、×１０空気レンズおよびアルゴンイオンレーザーからの４８８ｎｍの励起波長線を用いてＣＬＳＭ（Bio-Rad MRC1024）で調べた。実質的に非蛍光の細胞透過性カルセインＡＭの強烈な蛍光性のカルセインへの酵素的変換によって決定される遍在する細胞内エステラーゼ活性の存在によって生細胞を識別した。プラスチックウェルでの細胞増殖を同場所で観察した。
【０２６４】
３０日目よりも前の日に培地を抽出した。ウェルをＰＢＳで洗い流し、カルセインＡＭに浸漬した。Scion Image Beta 4.02収集および分析ソフトウェアを用いて、総細胞面積および細胞周囲長を決定した。拡散が細胞形状の変化を引き起こしたため、基質および時間の関数として形状係数［（面積／周囲長２）×４π］も計算した。
【０２６５】
複合移植片（ＨＡＣＭ＋ＭＳＣ）の機械的特性
生体外でのＭＳＣによるＨＡＣＭの再細胞化の影響を機械的に評価した。天然のヒト大腿筋膜（ｎ＝５）、再水和させた凍結乾燥ＨＡＣＭ（ｎ＝４）、培地で４週間インキュベートしたＨＡＣＭのみ（ＭＳＣを含まない）（ｎ＝４）、およびＭＳＣで再細胞化されたＨＡＣＭ（インキュベーションの４週間後、ｎ＝４）の３連の試料に対して一軸機械抵抗試験を行った。Instron bluehillソフトウェアを備えたＩｎｓｔｒｏｎ牽引システム（モデル５６００、Ｉｎｓｔｒｏｎ社、米国マサチューセッツ州カントン）を用いて、４ｍｍ×ｍｉｎ−１の伸長速度での破壊荷重試験により機械的試験を行った。２つのグリップ間の距離は各試験で２６．５ｍｍであった。試料を４５ｍｍの一定の長さおよび１５ｍｍの幅に切断した。各試料の厚さを記録した。マトリックスの荷重伸長挙動および破壊モードを記録した。マトリックスの構造特性は剛性（Ｎｍ×ｍ−１）および最大負荷（Ｎ）によって表した。剛性（ｋ）はｋ＝ΔＦ／ΔＬとして計算した（式中、Ｆは本体にかけられる力であり、Ｌは同じ自由度に沿ってその力によって生じる変位（例えば、引き伸ばされたバネの長さの変化）である）。これらのパラメータを各実験群の間で比較した。
【０２６６】
生体内における複合移植片ＨＡＣＭ＋ＭＳＣの有効性
２００〜３００ｇの体重（５〜８週齢）のヌードラット（ｎ＝２０、Charles River Laboratories International社、米国マサチューセッツ州ウィルミントン）の骨格筋欠損の２種類の実験モデルを開発した。麻酔を導入し、イソフルラン（Ａｂｂｖｉｅ社、ベルギーのワーヴル）吸入で維持して長手方向の腹部の切開を行い、腹壁の骨格筋系を露出させた。
【０２６７】
１．電気凝固による筋肉欠損
各動物（ｎ＝６）において、腹部の体壁筋に対する電気凝固により４箇所の１６ｍｍ２の壊死面積を作り出した。電気凝固させた欠損部をＭＳＣ＋ＨＡＣＭ（２つのゾーン、細胞が壊死面積と直接接触）、ＨＡＣＭのみ（１つのゾーン）および対照（移植片なし、１つのゾーン）で覆った。これらの移植組織を４本の５．０プロリーン（登録商標）縫合糸により欠損部に密接に接触させて直接置いた。動物にＨＡＣＭ＋ＡＳＣ（ｎ＝３）またはＢＭ−ＭＳＣ（ｎ＝３）からなる複合移植片のいずれかを移植した。ＨＡＣＭ上での２１〜２８日間のＭＳＣのインキュベーション後に複合移植片を移植した。
【０２６８】
２．腹壁の全層筋肉欠損
腹部の筋肉壁（ｎ＝１４のヌードラット）において全層欠損（１．５×２．５ｃｍ２）を行い、内臓を露出させた。欠損部を複合移植片（ＨＡＣＭ＋ＡＳＣ、ｎ＝４；ＨＡＣＭ＋ＢＭ−ＭＳＣ、ｎ＝４）またはＨＡＣＭのみ（ｎ＝６）で処理した。
【０２６９】
両方のモデルにおいて、非再吸収性縫合を用いて皮膚を閉じて移植部位を覆った。術後３０日目に全身麻酔下でＴ６１（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ社、オランダのボクスメール）の心臓内注射によってヌードラットを屠殺した。次いで移植片の外植を行い、組織形態計測のために移植組織を処理した。
【０２７０】
全層欠損モデルにおける炎症反応、移植片の生着、組織リモデリング、内臓への接着およびヘルニアの発生について移植片の生着を肉眼的に評価した。
【０２７１】
移植後４週目に組織形態計測分析を行って血管新生および組織リモデリングを評価した。移植組織を４％ホルムアルデヒドで一晩直接固定し、パラフィン包埋した。連続切片（５μｍの厚さ）をガラスの上に載せ、３７℃で１２時間乾燥させた。ヘマトキシリン・エオシン染色およびマッソントリクローム染色を行って血管増殖およびリモデリングプロセスを評価した。さらに、ジストロフィンの免疫染色（１：４５０で希釈してＥｎＶｉｓｉｏｎ抗ウサギモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社、英国ケンブリッジ）で顕色させた）により筋肉の再コロニー形成を調べた。
【０２７２】
標準的なマイクロメートル尺度内の×１２．５の倍率で、マッソンで染色した後の天然の無傷の筋肉と移植組織（それぞれ、ＭＳＣを含むか含まないＨＡＣＭまたはＨＡＣＭのための皮膚および対照）との距離を測定して、組織リモデリングを組織形態学的に定量化した（電気凝固モデルにおいて）。各スライドで最小の５つの関心領域（ＲＯＩ）を分析した。ＨＡＣＭ（ＨＡＣＭのみまたはＭＳＣを含むＨＡＣＭ）と対照との間に認められる厚さの比によって組織リモデリングを計算した。腹壁欠損モデルでは、ジストロフィン染色を行って移植組織の筋肉の再コロニー形成を調べた。
【０２７３】
×２５倍率で、マッソントリクロームスライド上の０．１６ｍｍ２の表面を表す標準的な格子内の血管の数を数えて血管密度を調べた。各スライドで最小の５つのＲＯＩを分析した。
【０２７４】
統計分析
１標本コルモゴロフ・スミルノフ検定およびＱ−Ｑプロットを使用して値の正規分布を評価した。特に言及しない限り、結果を平均±ＳＤとして表した。スチューデントのｔ検定または一元配置分散分析をボンフェローニ事後検定と共に用いて実験群間の統計的有意差を試験した。ＰＡＳＷ１８（ＳＰＳＳ、Westlands Centre、Quarry Bay、香港）を用いて統計的検定を行った。差はｐ＜０．０５において有意であると見なした。
【０２７５】
結果
筋肉の再生のためのＭＳＣ増殖因子放出に対する低酸素の影響
低酸素では（酸素正常状態と比較）、ＡＳＣではＢＭ−ＭＳＣと比較して有意により良好な生存率が認められ、それぞれ１１９．５±６．１％および８６．８±１．５％の細胞生存率であった（ｐ＜０．０５、図３９）。０．１％および２１％Ｏ２でのＢＭ−ＭＳＣと比較してＡＭＳＣによりＦＧＦおよびＶＥＧＦの有意により高い放出が得られた（ｐ＜０．０５）（図４０Ａおよび図４０Ｂ）。また、低酸素はＢＭ−ＭＳＣに全く影響を与えず、ＡＳＣではＶＥＧＦ放出を改善した（＋３７％、ｐ＜０．０５）。
【０２７６】
低酸素および酸素正常状態では、ＢＭ−ＭＳＣと比較してＡＳＣにより有意により少ない量のＩＧＦが分泌された（ｐ＜０．００５）。どちらのＭＳＣでも、ＴＧＦおよびＨＧＦ放出に対する酸素圧の有意な影響は認められなかった（図４０Ｄおよび図４０Ｅ）。
【０２７７】
ＨＡＣＭ上でのＭＳＣの接着および拡散
天然のマトリックスと比較して処理済マトリックス上ではＤＡＰＩ染色後の蛍光性の核の検出が稀であること（データは示さず）により、ＨＡＣＭの脱細胞を最初に確認した。Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計によりＤＮＡは検出されなかった（４種類の独立した天然の大腿筋膜に認められた平均して１．４５μｇ／ｍｌと比較して＜０．０１μｇ／ｍｌ）。
【０２７８】
１３日目にＡＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣの両方でプラスチックウェル上での最適な拡散（０に近い形状係数による細胞の伸長を有する）が観察された（０．２２±０．００１）。ＡＳＣ（０．３１±０．０３）およびＢＭ−ＭＳＣ（０．４８±０．０２）でそれぞれ２７日および３０日後に、ＨＡＣＭ上で最大の細胞拡散を得るのに有意な遅れが観察された。５日目と１８日目との間に有意により少ないＭＳＣ拡散が認められた（プラスチックウェルと比較、ｐ＜０．０５、図４１）。また、ＨＡＣＭ上では播種後１１日目と３０日目との間にＭＳＣ拡散における有意差（ＡＳＣ対ＢＭ−ＭＳＣ）が認められた（ｐ＜０．０５、図４１）。
【０２７９】
ＭＳＣ由来の両方とのインキュベーション後２週間以内にプラスチックウェルの総回収が得られ、これはＡＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣではそれぞれ２１日目および３０日目にＨＡＣＭ上で遅れた（ｐ＜０．０５）。ＨＡＣＭ回収面積の割合は、ＡＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣの両方でそれぞれ３日目と１８日目との間および３日目と２７日目との間でプラスチックウェルの回収の割合と比較して有意により低かった（ｐ＜０．０５）。インキュベーション後１３日目と２８日目との間にＡＳＣと比較してＢＭ−ＭＳＣではＨＡＣＭ回収の有意な遅れが得られた（ｐ＜０．０５）（図４２）。
【０２８０】
生体内における複合移植片ＨＡＣＭ＋ＭＳＣの有効性
１．電気凝固による筋肉欠損
移植後４週目では、ＡＳＣおよびＨＡＣＭで処理した領域における血管新生は、ＢＭ−ＭＳＣ＋ＨＡＣＭおよびＨＡＣＭのみと比較して有意により高かった（対照に対して４３４±１０８％対２１５±１３％対１４４±５７％の比、ｐ＜０．００１）（図４３Ａ）。
【０２８１】
４週間後、ヘマトキシリン・エオシンおよびマッソントリクロームで確認すると、複合移植片（ＨＡＣＭ＋ＭＳＣ）を用いた場合にＨＡＣＭのみと比較して骨格筋のより良好な生着が肉眼的に認められ、ＡＳＣまたはＢＭ−ＭＳＣ＋ＨＡＣＭではＨＡＣＭのみと比較して有意により低い残存線維化（対照と比較した比）が生じた（それぞれ２３±９％および２４±１０％対４９±１７％、ｐ＜０．０５）。ＡＳＣとＢＭ−ＭＳＣとの間で差は認められなかった（図４３Ｂ）。
【０２８２】
２．腹壁の全層筋肉欠損
ＨＡＣＭのみまたはＭＳＣが添加されたＨＡＣＭによる腹部の臓器との腹腔内癒着がなく、腹部ヘルニアの発生は観察されなかった。ＨＡＣＭおよびＭＳＣを有する各レシピエントにおいて縫合縁近くにいくつかの陽性ジストロフィン細胞が検出されたが、腹部移植組織の芯部では陽性細胞は認められなかった。移植後４週目に、ＡＳＣおよびＨＡＣＭからなる移植組織において、ＢＭ−ＭＳＣ＋ＨＡＣＭおよびＨＡＣＭのみと比較して血管新生は有意に向上した（２１．４±１．０対１１．２±２．３対１１．８±３．１の血管／格子、ｐ＜０．０５）（図４４）。
【０２８３】
ＡＳＣからなる複合移植片は、無細胞足場と比較して、脂肪幹細胞の生体外における低酸素下で生存する能力、脱細胞化コラーゲンマトリックス足場により最適な細胞送達を得る能力、酸素感受性機序により血管新生促進因子の放出を改善する能力、移植後の初期のストレス段階中の生体内での血管補充能力、および最後に線維性瘢痕を減少させる能力を実証した。全てのこれらの特性は骨格筋再生を促進することもできた。
【０２８４】
さらに、これらの結果は、ＢＭ−ＭＳＣが特異的な抗線維化作用を与えた場合に、ＡＳＣが低酸素下での正確な制御により、より良好な生体外および生体内での血管新生促進作用を与えることを実証した。ＨＡＣＭはＭＳＣ接着、拡散および細胞送達のための理想的な足場であり、これは骨格筋壊死および臨界サイズ欠損のための機械的要件を残したままである。