(57)【要約】  本発明の課題は、簡便な工程による細胞増殖能に優れた細胞培養方法、及び上記した細胞培養方法において使用される培地及び培地キットを提供することである。本発明によれば、ヒト型リコンビナント蛋白質が溶解している培地において細胞を培養することを含む、細胞培養方法であって、ヒト型リコンビナント蛋白質が、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体であり、培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、細胞培養方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト型リコンビナント蛋白質が溶解している培地において細胞を培養することを含む、細胞培養方法であって、ヒト型リコンビナント蛋白質が、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体であり、培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、細胞培養方法。
【請求項２】
培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬである、請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
ヒト型リコンビナント蛋白質が、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを含む、請求項１又は２に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
ヒト型リコンビナント蛋白質が、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有し、Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、ヒト型リコンビナント蛋白質の分子量が２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下である、請求項１から３の何れか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項５】
ヒト型リコンビナント蛋白質が、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有し、Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、ヒト型リコンビナント蛋白質の分子量が１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下である、請求項１から４の何れか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項６】
ヒト型リコンビナント蛋白質が、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有し、Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、ヒト型リコンビナント蛋白質が細胞接着シグナルを一分子中に２配列以上含む、請求項１から５の何れか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項７】
細胞接着シグナルがＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐで示されるアミノ酸配列である、請求項６に記載の細胞培養方法。
【請求項８】
ヒト型リコンビナント蛋白質のアミノ酸配列が、下記式で示される、請求項１から７の何れか一項に記載の細胞培養方法。
Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【請求項９】
ヒト型リコンビナント蛋白質のアミノ酸配列が、下記式で示される、請求項１から８の何れか一項に記載の細胞培養方法。
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙ
式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【請求項１０】
ヒト型リコンビナント蛋白質が、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、細胞接着性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１から９の何れか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項１１】
細胞が、接着細胞である、請求項１から１０の何れか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項１２】
基礎培地成分と、溶解したヒト型リコンビナント蛋白質とを含む培地であって、ヒト型リコンビナント蛋白質が、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体であり、培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、培地。
【請求項１３】
５容量％以下の血清をさらに含む、請求項１２に記載の培地。
【請求項１４】
基礎培地成分とヒト型リコンビナント蛋白質とを別々に含む培地キットであって、ヒト型リコンビナント蛋白質が、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体であり、基礎培地成分とヒト型リコンビナント蛋白質とを混合して製造される培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、培地キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト型リコンビナント蛋白質が溶解している培地を用いた細胞培養方法に関する。本発明はさらに、ヒト型リコンビナント蛋白質を含む培地及び培地キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
接着して増殖する細胞を培養する際には、フィブロネクチン又はコラーゲン等の細胞外マトリックスをコートした培養基材上において細胞を培養することが一般的である。例えば、特許文献１には、歯肉上皮細胞の培養において、細胞外マトリックスがコートされた培養器を用いる歯肉上皮細胞の培養方法が記載されており、細胞外マトリックスとしては、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンなどが記載されている。【０００３】
また、リコンビナント蛋白質を含む培地を用いて細胞を培養することが知られている。特許文献２には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の高分子ブロックが配置されている細胞構造体を製造することが記載されている。特許文献３には、リコンビナントヒトアルブミンが０．１〜２質量％の量で添加されているヒト胚の体外受精及び培養用培養液が記載されている。特許文献４には、以下の（ａ）〜（ｃ）ステップを、（ａ）ステップの後、（ｂ）及び（ｃ）ステップを順次繰り返すことを特徴とする未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養する方法が記載されている。（ａ）アクチビンを含む多能性幹細胞用培地である第一の培地でヒト多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）第一の培地を、アクチビンを含まない多能性幹細胞用培地である第二の培地に交換してヒト多能性幹細胞を培養するステップ；（ｃ）第一の培地でヒト多能性幹細胞を継代培養するステップ。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−７８３２６号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１１／１０８５１７号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００９／１２２５４１号公報
【特許文献４】特開２０１２−１７５９６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞外マトリックスをコートした培養基材を使用して細胞を培養する場合、実験者自身が細胞外マトリックスを培養基材にコートするか、又は細胞外マトリックスがコートされた培養基材を市販品として購入して使用する必要があった。しかし、実験者自身が細胞外マトリックスを培養基材にコートする場合は、作業工程が増えるという問題があり、市販品を購入する場合には入手できる基材の種類が限定されるという問題があり、細胞の大量培養においては工程面及びコスト面からの制約があった。【０００６】
本発明は、簡便な工程による細胞増殖能に優れた細胞培養方法を提供することを解決すべき課題とする。さらに本発明は、上記した本発明の細胞培養方法において使用される培地及び培地キットを提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ヒト型リコンビナント蛋白質が溶解している培地を用いた細胞培養方法において、ヒト型リコンビナント蛋白質としてラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体を使用し、培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量を０．０１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬとすることによって、簡便な工程による細胞増殖能に優れた細胞培養方法を提供できることを見出した。本発明は上記知見に基づいて完成したものである。本発明によれば以下の発明が提供される。【０００８】
［１］  ヒト型リコンビナント蛋白質が溶解している培地において細胞を培養することを含む、細胞培養方法であって、ヒト型リコンビナント蛋白質が、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体であり、培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、細胞培養方法。
［２］  培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬである、［１］に記載の細胞培養方法。
［３］  ヒト型リコンビナント蛋白質が、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを含む、［１］又は［２］に記載の細胞培養方法。
［４］  ヒト型リコンビナント蛋白質が、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有し、Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、ヒト型リコンビナント蛋白質の分子量が２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下である、［１］から［３］の何れか一に記載の細胞培養方法。【０００９】
［５］  ヒト型リコンビナント蛋白質が、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有し、Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、ヒト型リコンビナント蛋白質の分子量が１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下である、［１］から［４］の何れか一に記載の細胞培養方法。
［６］  ヒト型リコンビナント蛋白質が、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有し、Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、ヒト型リコンビナント蛋白質が細胞接着シグナルを一分子中に２配列以上含む、［１］から［５］の何れか一に記載の細胞培養方法。
［７］  細胞接着シグナルがＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐで示されるアミノ酸配列である、［６］に記載の細胞培養方法。【００１０】
［８］  ヒト型リコンビナント蛋白質のアミノ酸配列が、下記式で示される、［１］から［７］の何れか一に記載の細胞培養方法。
Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
［９］  ヒト型リコンビナント蛋白質のアミノ酸配列が、下記式で示される、［１］から［８］の何れか一に記載の細胞培養方法。
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙ
式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
［１０］  ヒト型リコンビナント蛋白質が、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、細胞接着性を有するアミノ酸配列を有する、［１］から［９］の何れか一に記載の細胞培養方法。
［１１］  細胞が、接着細胞である、［１］から［１０］の何れか一に記載の細胞培養方法。【００１１】
［１２］  基礎培地成分と、溶解したヒト型リコンビナント蛋白質とを含む培地であって、ヒト型リコンビナント蛋白質が、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体であり、培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、培地。
［１３］  ５容量％以下の血清をさらに含む、［１２］に記載の培地。
［１４］  基礎培地成分とヒト型リコンビナント蛋白質とを別々に含む培地キットであって、ヒト型リコンビナント蛋白質が、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体であり、基礎培地成分とヒト型リコンビナント蛋白質とを混合して製造される培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、培地キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の細胞培養方法は、簡便な工程であり、細胞増殖能に優れている。本発明の培地及び培地キットによれば、簡便な工程により細胞増殖能に優れた細胞培養を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、軟骨由来細胞Yub2478を用いた５継代での細胞増殖曲線を示す。
【図２】図２は、軟骨由来細胞Yub2478を用いた短期培養時の細胞増殖率を示す。
【図３】図３は、培養容器を示す。
【図４】図４は、骨髄由来細胞BMSCを用いた培養バッグ表面への細胞接着能を調べる試験における細胞の画像を示す。
【図５】図５は、骨髄由来細胞BMSCを用いた培養バッグ表面への細胞接着率を示す。
【図６】図６は、CBE3添加時の細胞数の濃度依存性を示す。
【図７】図７は、骨髄由来細胞UDE BMを用いた５継代での細胞増殖曲線を示す。
【図８】図８は、軟骨由来細胞Yub2478を用いた短期培養時の細胞増殖を示す。
【図９】図９は、細胞外マトリクス及び細胞接着関連遺伝子群の遺伝子発現プロファイルを示す。
【図１０】図１０は、細胞外マトリクス及び細胞接着関連遺伝子群の遺伝子発現プロファイルを示す。
【図１１】図１１は、細胞周期関連遺伝子群の遺伝子発現プロファイルを示す。
【図１２】図１２は、細胞周期関連遺伝子群の遺伝子発現プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の細胞培養方法は、ヒト型リコンビナント蛋白質が溶解している培地において細胞を培養することを含む細胞培養方法であって、ヒト型リコンビナント蛋白質が、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体であり、培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである方法である。
【００１５】
リコンビナント蛋白質を含む培地を用いて細胞を培養することは、特許文献２〜４に記載されている。しかし、特許文献２に記載の方法は、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって高分子ブロックと細胞との細胞構造体を製造する方法であり、リコンビナント蛋白質を培地に溶解させる本発明の方法とは全く異なる。特許文献３には、リコンビナントヒトアルブミンを含むヒト胚の体外受精及び培養用培養液が記載されているが、本発明で使用するヒト型リコンビナント蛋白質についての記載はなく、またリコンビナントヒトアルブミンの添加量も、本発明におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量とは異なる。特許文献４には、アクチビンを含む多能性幹細胞用培地が記載されているが、本発明で使用するヒト型リコンビナント蛋白質についての記載はない。
【００１６】
後記の実施例に示す通り、間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cell：MSC)及びそれに類する接着増殖系の細胞に対して、培地中へヒト型リコンビナント蛋白質を添加するだけで（培養基材にヒト型リコンビナント蛋白質をコートすることなしに）、培養器材(６ウエル細胞培養プレート、培養バッグ)への細胞の接着能が改善され、さらに細胞の増殖能が改善された。さらに、培養器材にヒト型リコンビナント蛋白質をコートする場合と比べて、少量のヒト型リコンビナント蛋白質によって細胞の接着及び増殖能を改善することができる。上記の通り、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体から選ばれるヒト型リコンビナント蛋白質を０．０１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬという含有量で溶解させた培地を使用することによって優れた細胞増殖能を達成できることは、予想外なことであった。
【００１７】
本発明によりヒト型リコンビナント蛋白質がコートされた培養器材を使用することなく、培地中にヒト型リコンビナント蛋白質を直接添加するだけで、細胞の接着及び増殖能を改善できることが示された。本発明によれば、細胞の大量培養が可能になり、治療用細胞の供給という観点からの利点は大きく、再生医療の実用化への貢献が期待される。
【００１８】
また再生医療の実用化のもう１つの課題として、血清不使用(Serum free)及び動物由来成分不使用(Xeno free)があるが、本発明においてはヒト型リコンビナント蛋白質を使用することから、この点においても有利である。
本発明の細胞培養方法、培地及び培地キットは、例えば、再生医療における治療用細胞の製造に利用することができる。
【００１９】
［１］細胞培養方法
本発明の細胞培養方法は、添加したヒト型リコンビナント蛋白質が溶解している培地において細胞を培養することを含む。
ヒト型リコンビナント蛋白質が溶解しているとは、培地が液体であり、この液体培地にヒト型リコンビナント蛋白質の６０質量％以上、好ましくは７０質量％以上、より好ましくは９０質量％以上、特に好ましくはヒト型リコンビナント蛋白質の１００質量％が溶解していることを意味する。
【００２０】
本発明で使用するヒト型リコンビナント蛋白質は、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体である。
ヒト型とは、ヒトにおける蛋白質のアミノ酸配列に由来することを意味する。
リコンビナント蛋白質とは、遺伝子組み換え技術により製造される蛋白質であり、具体的には、目的蛋白質をコードする遺伝子を有する宿主細胞において発現された蛋白質を意味する。
改変体とは、ラミニン、コラーゲン又はゼラチンのアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を有する蛋白質であって、改変を有さない元のラミニン、コラーゲン又はゼラチンと同等の生理活性を有する蛋白質と意味する。改変とは、１〜数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個）のアミノ酸残基の欠失、置換、付加、及び／又は挿入を意味する。
【００２１】
培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量は０．０１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬであり、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬである。培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量は、０．０２ｎｇ／ｍＬ以上、０．０３ｎｇ／ｍＬ以上、０．０４ｎｇ／ｍＬ以上、０．０５ｎｇ／ｍＬ以上、０．０６ｎｇ／ｍＬ以上、０．０７ｎｇ／ｍＬ以上、０．０８ｎｇ／ｍＬ以上、または０．０９ｎｇ／ｍＬ以上でもよい。培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量は、１μｇ／ｍＬ以下、０．５μｇ／ｍＬ以下、０．４μｇ／ｍＬ以下、０．３ｇ／ｍＬ以下、０．２μｇ／ｍＬ以下、０．１μｇ／ｍＬ以下、０．０５μｇ／ｍＬ以下、０．０４μｇ／ｍＬ以下、または０．０３μｇ／ｍＬ以下でもよい。
【００２２】
ヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が０．０１ｎｇ／ｍＬより小さいと細胞増殖能が低下し、また５００μｇ／ｍＬより大きくすることは細胞増殖能の観点から不要であり、またコスト的にも不利である。
本発明においては、培地にヒト型リコンビナント蛋白質を添加すればよく、培養器材にヒト型リコンビナント蛋白質をコートすることは不要である。間葉系幹細胞のような接着増殖系の細胞を培養する場合、培地にヒト型リコンビナント蛋白質を添加することによって、培養器材への接着能が改善され、結果として細胞増殖能が改善する。
【００２３】
培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量は、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフ質量分析）等の質量分析により測定することができる。
【００２４】
＜ヒト型リコンビナント蛋白質＞
本発明においては、ヒト型リコンビナント蛋白質として、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体を使用するが、好ましくはゼラチンである。
ゼラチンとしては、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を使用することができ、好ましくはコラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを使用することができる。
【００２５】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
リコンビナントゼラチンとしては、例えばＥＰ１０１４１７６、米国特許６９９２１７２号、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
【００２６】
リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然ゼラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度及び分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００２７】
リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ（キロダルトン）以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
【００２８】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成及び配列における、他の蛋白質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ及びＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。より好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。
【００２９】
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン及びアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が好ましくは５％以上２０％未満であり、より好ましくは５％以上１０％未満である。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインのうち好ましくはいずれか１アミノ酸、より好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、好ましくは、セリン及びスレオニンを含まない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、より好ましくは、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインを含まない。
【００３０】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２配列以上有するものでもよい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。
【００３１】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間、好ましくは２５〜６０の間で均一でないことが好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、蛋白質１分子中３〜５０個が好ましく、さらに好ましくは４〜３０個、特に好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。
【００３２】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）モチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、より好ましくは少なくとも０．６％であり、さらに好ましくは少なくとも０．８％であり、さらに一層好ましくは少なくとも１．０％であり、特に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、より好ましくは６、さらに好ましくは８、特に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００３３】
リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００３４】
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、下記式で示される。
Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｎは好ましくは３〜１００の整数を示し、１５〜７０の整数がより好ましく、５０〜６５の整数がさらに好ましい。ｍは好ましくは２〜１０の整数を示し、より好ましくは３〜５の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００３５】
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、下記式で示される。
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙ
式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００３６】
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、又はV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、又はIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス又はラットであり、より好ましくはヒトである。
【００３７】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に記載されたように、１質量％ゼラチン溶液をカチオン及びアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。
【００３８】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
【００３９】
リコンビナントゼラチンであるヒト型リコンビナント蛋白質は、特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上）の配列同一性を有し、細胞接着性を有するアミノ酸配列：
を有する。
リコンビナントゼラチンであるヒト型リコンビナント蛋白質は、最も好ましくは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
【００４０】
本発明における配列同一性は、以下の式で計算される値を指す。
％配列同一性＝［（同一残基数）／（アラインメント長）］×１００
２つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、ＢＬＡＳＴ（(Basic Local Alignment Search Tool)）プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）等を使用して決定することができる。
【００４１】
リコンビナントゼラチンは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞接着性を有するアミノ酸配列を有するものでもよい。
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００４２】
リコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、リコンビナントゼラチンを調製することができる。
【００４３】
本発明で用いるヒト型リコンビナント蛋白質の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、好ましくは０から１．０であり、より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ4）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００４４】
本発明で用いるヒト型リコンビナント蛋白質のGrand average of hydropathicity（ＧＲＡＶＹ）値で表される親疎水性指標は、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
【００４５】
＜細胞及び細胞培養方法＞
本発明の方法で培養する細胞は、培地で培養できる細胞であればその種類は特に限定されない。細胞としては、接着細胞でも浮遊細胞の何れでもよいが、好ましくは接着細胞である。接着細胞とは、培養器や基材に接着する性質を有する細胞をいう。
【００４６】
細胞は、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、又は成熟細胞の何れでもよい。
【００４７】
万能細胞としては、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、生殖幹（ＧＳ）細胞、又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を使用することができる。
体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、又は神経幹細胞を使用することができる。
【００４８】
前駆細胞及び成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、又は毛に由来する細胞を使用することができる。
【００４９】
ヒト由来細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、神経細胞、肝細胞、ベータ細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、又は造血幹細胞を使用することができる。
培養した細胞を移植に用いる場合、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。
【００５０】
細胞の培養は、所望によりＣＯ2インキュベータ（５％ＣＯ2インキュベータ）内で行うことができ、一般的には３０〜４５℃、好ましくは３５℃〜４０℃（例えば、３７℃）で、１時間〜７２時間、好ましくは１時間〜２４時間、より好ましくは１時間〜１２時間、さらに好ましくは２時間〜８時間行うことができる。細胞増殖の状況によっては、７２時間を超えて培養することもできる。培養は静置培養でもよいし、振盪培養でもよい。
【００５１】
［２］培地及び培地キット
本発明はさらに、基礎培地成分と、溶解したヒト型リコンビナント蛋白質とを含む培地であって、ヒト型リコンビナント蛋白質が、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体であり、培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、培地を提供する。
【００５２】
本発明はさらに、基礎培地成分とヒト型リコンビナント蛋白質とを別々に含む培地キットであって、ヒト型リコンビナント蛋白質が、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン又はこれらの改変体であり、基礎培地成分とヒト型リコンビナント蛋白質とを混合して製造される培地におけるヒト型リコンビナント蛋白質の含有量が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、培地キットを提供する。
【００５３】
ヒト型リコンビナント蛋白質とその好ましい態様は、本明細書中上記した通りである。
基礎培地としては、特に限定されないが、例えば、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＭＥＭ（イーグル最小必須培地）、Ｆ１２、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ(登録商標)、ＲＩＴＣ８０−７、ＭｅｓｅｎＰｒｏ（ライフテクノロジーズ）などを挙げることができる。これらの基礎培地の多くは市販されている。
【００５４】
基礎培地成分としては、上記の基礎培地を、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。従って、基礎培地成分は、公知の組成のものに限定されず、１又は２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものでもよい。
【００５５】
基礎培地成分に含まれるアミノ酸としては、特に限定されず、例えば、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンなどが挙げられる。
【００５６】
基礎培地成分に含まれるビタミン類としては、特に限定されず、例えば、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ビオチン、リポ酸、ビタミンＢ12、アデニン、チミジンなどが挙げられる。
【００５７】
基礎培地成分に含まれる電解質としては、特に限定されず、例えば、ＣａＣｌ2、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ4、ＮａＣｌ、ＮａＨ2ＰＯ4、ＮａＨＣＯ3、Ｆｅ（ＮＯ3）3、ＦｅＳＯ4、ＣｕＳＯ4、ＭｎＳＯ4、Ｎａ2ＳｉＯ3、（ＮＨ4）６Ｍｏ7Ｏ24、ＮａＶＯ3、ＮｉＣｌ2、ＺｎＳＯ4などが挙げられる。
基礎培地成分には、これらの成分のほか、Ｄ−グルコースなどの糖類、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬、プトレシン、抗生物質などを含んでもよい。
【００５８】
本発明の培地は、血清を含む培地でもよいし、血清を含まない培地でもよい。本発明の培地における血清の含有量は、０容量％以上２０容量％以下であることが好ましく、０容量％以上１０容量％以下であることがより好ましく、０容量％以上５容量％以下であることがさらに好ましく、０容量％以上２容量％以下であることが特に好ましい。
【００５９】
なお、細胞のヒトへの適用を想定した場合においては、培地は、異種血清成分を実質的に含まないことが好ましい。ここで「異種血清成分」は、レシピエントとは異なる種の生物に由来する血清成分を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ウシやウマに由来する血清、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＦＣＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ）などが異種血清成分に該当する。
【００６０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
（１）リコンビナントゼラチン
リコンビナントゼラチンとして以下のＣＢＥ３を使用した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造：  ＧＡＰ［（ＧＸＹ）63］3Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G【００６２】
（２）ＣＢＥ３のコート量の測定
以下の実験において、ＣＢＥ３のコート量はＥＰ０１３８０９２Ａ２に記載の方法に準じて測定した。なお、試料は、ＣＢＥ３をコートしたプレートにＮａＯＨを添加し、５０℃で６時間以上処理して得られたアミノ酸を用いた。【００６３】
［実施例１］軟骨由来細胞Yub2478を用いた５継代での細胞増殖（５週間）
・水準
水準１：ＣＢＥ３コート（コート量：５．７μｇ／ｗｅｌｌ）
水準２：ＣＢＥ３添加  （添加量：５．７μｇ／ｗｅｌｌ、コート時と同一量の添加）
水準３：ＣＢＥ３添加  （添加量：５７ｎｇ／ｗｅｌｌ、コート時の１／１００量の添加）
水準４：ＣＢＥ３無添加（対照）【００６４】
・材料
使用細胞：Ｙｕｂ２４７８（国立成育医療研究センター（以降、成育研）で樹立された軟骨由来細胞）Ｙｕｂ２４７８は参考文献（Nasu, Takayama S, Umezawa A. Endochondral ossification model system: designed cell fate of human epiphyseal chondrocytes during long-term implantation.J. Cell Physiol. 2015 ; 230 : 1376-1388. ）に記載の方法に準じて樹立した。
使用培地：ＭｅｓｅｎＰｒｏ ＲＳ（２容量％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)含有、ライフテクノロジーズ）
培養容器：６ｗｅｌｌ組織培養用（ＴＣ）プレート（Ｆａｌｃｏｎ）【００６５】
・方法
ＣＢＥ３コート法：
ｃｅｌｌｎｅｓｔ（登録商標）（０．１質量％ＣＢＥ３水溶液、富士フイルム）をプレートの各ｗｅｌｌに２ｍＬ滴下し、プレートを３７℃のインキュベータ内で２時間放置した。ｃｅｌｌｎｅｓｔ（登録商標）を各ｗｅｌｌから吸引除去し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を各ｗｅｌｌに６ｍＬ滴下し、プレートを３０分間放置した。ＰＢＳを各ｗｅｌｌから吸引除去し、プレートを使用するまで冷蔵保管した。プレートの各ｗｅｌｌに培地２ｍＬを滴下し、細胞を播種して培養を開始した。細胞播種量は、０．２×１０6ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌである。【００６６】
ＣＢＥ３添加法：
培地を各ｗｅｌｌに２ｍＬ滴下し、次いで、ｃｅｌｌｎｅｓｔ（登録商標）（０．１質量％ＣＢＥ３水溶液、富士フイルム）を所定の濃度になるよう各ｗｅｌｌに滴下した。対照（ＣＢＥ３無添加）のｗｅｌｌには、ｃｅｌｌｎｅｓｔ（登録商標）と同量のＰＢＳを滴下した。ピペッティングしてｗｅｌｌ内の液を均一化した後、細胞を播種して培養を開始した。細胞播種量は、０．２×１０6ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌである。【００６７】
細胞培養法：
上記プロトコルにて培養開始後、３７℃／５％ＣＯ2濃度のインキュベータ内でプレートを保存した。１週間経過後、トリプシン溶液（和光純薬工業）を用いて細胞を剥離し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、以下「ＢＤ」とも表記する）を用いて細胞数を計測した。新たにプレートを準備して、細胞を再び播種（０．２×１０6ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）して継代し、３７℃／５％ＣＯ2濃度のインキュベータ内でプレートを保存した。１週間後に上記のトリプシン溶液による細胞の剥離、細胞数の計測、細胞の継代、及び３７℃／５％ＣＯ2濃度のインキュベータ内でのプレートの保存という操作を繰り返し、５継代まで実施した。【００６８】
・計算方法
ＰＤ（細胞の分裂回数）を以下の式により計算することにより得た細胞増殖曲線を図１に示す。
ＰＤ（細胞の分裂回数）＝前回継代時のＰＤ値＋ｌｏｇ2（計測細胞数／播種細胞数）【００６９】
・結果
水準４に比べ、水準１〜３では全て増殖が改善される。また水準１〜３では増殖にほとんど差がなく、ＣＢＥ３コートに比べＣＢＥ３添加は１／１００まで減量しても効果が変わらない。【００７０】
［実施例２］軟骨由来細胞Yub2478を用いた短期培養時（培養１日後〜培養３日後）の細胞増殖率
・水準
水準１：ＣＢＥ３コート（コート：５．７μｇ／ｗｅｌｌ）
水準２：ＣＢＥ３添加  （添加量：５７ｎｇ／ｗｅｌｌ、コート時の１／１００量の添加）
水準３：ＣＢＥ３無添加（Ｃｏｎｔｒｏｌ）【００７１】
・材料
使用細胞：Yub2478（成育研で樹立された軟骨由来細胞）
使用培地：ＭｅｓｅｎＰｒｏ ＲＳ（２容量％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)含有、ライフテクノロジーズ）
培養容器：６ｗｅｌｌ組織培養用（ＴＣ）プレート（Ｆａｌｃｏｎ）【００７２】
・方法
ＣＢＥ３コート法は、実施例１と同様に行った。
ＣＢＥ３添加法は、実施例１と同様に行った。
細胞播種量は、０．２×１０6ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌである。【００７３】
細胞培養法：
上記プロトコルにて培養開始後、３７℃／５％ＣＯ2濃度のインキュベータ内でプレートを保存した。プレートは各水準２枚ずつ準備した。所定の期間経過後、トリプシン溶液（和光純薬工業）を用いて細胞を剥離し、１日後に１枚のプレート、３日後に残りの１枚のプレートについて、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（ＢＤ）を用いて細胞数を計測した。【００７４】
・計算方法
以下の式により計算することにより得た細胞増殖率を図２に示す。
細胞増殖率  ＝  培養３日後の細胞数／培養１日後の細胞数【００７５】
・結果
水準３に比べ、水準１及び水準２はともに増殖率が改善される。また水準１と水準２では細胞増殖率にほとんど差がなく、ＣＢＥ３コートとＣＢＥ３添加（１／１００量）では効果が変わらない。【００７６】
［実施例３］骨髄由来細胞を用いた培養バッグ表面への細胞接着能
・水準
水準１：ＣＢＥ３添加（添加量１：５７ｎｇ／ｗｅｌｌ）
水準２：ＣＢＥ３無添加（Ｃｏｎｔｒｏｌ）【００７７】
・材料
使用細胞：骨髄由来幹細胞（Bone marrow derived stem cell: BMSC）（骨髄由来細胞、Ｌｏｎｚａ）（商品名HMSC、カタログ番号PT-2501）
使用培地：ＭｅｓｅｎＰｒｏ ＲＳ（２容量％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)含有、ライフテクノロジーズ）
培養容器：６φ（直径６ｃｍ）のディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）上に、培養バッグ（ニプロ）を切り取ったシートをバッグ内部が上になるように置き、その上に穴の空いた（底がない）シリコン製ｗｅｌｌ（ＳＡＲＳＴＥＤＴ社）を密着させ、培養容器とした（図３）。
観察装置：蛍光顕微鏡ＢＺ−Ｘ７１０（キーエンス）【００７８】
・方法
ＣＢＥ３添加法：
培地を各ｗｅｌｌに０．５ｍＬ滴下した。ｃｅｌｌｎｅｓｔ（登録商標）（０．１質量％ＣＢＥ３水溶液、富士フイルム）を所定の濃度になるよう各ｗｅｌｌに滴下した。Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＢＥ３無添加）のｗｅｌｌには、ｃｅｌｌｎｅｓｔ（登録商標）と同量のＰＢＳバッファーを滴下した。ペッティングしてｗｅｌｌ内の液を均一化した後、細胞を播種して培養を開始した。細胞播種量は、０．０５×１０6ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌである。【００７９】
細胞培養法：
上記プロトコルにて培養開始後、３７℃／５％ＣＯ2濃度の環境にした蛍光顕微鏡チャンバー内に上記培養容器を置いて、チャンバー蓋を閉じた。視野内の細胞数がほぼ同数になるよう、観察する視野の位置決めをした。５分に１枚、ｗｅｌｌの画像を撮影し、１８０分まで継続した。各時間における画像から、接着していない細胞数をカウントした（接着した細胞は黒く映り、カウントされない）。０分、１２０分及び１８０分後における細胞の画像を図４に示す。白い点が接着していない細胞を示し、全体的に黒く、周囲が若干白く残っているものが接着した細胞を示す。【００８０】
・計算方法
以下の式により計算することにより得た接着率を図５に示す。
接着率［％］＝（１−その時間における細胞数の計測値／細胞数の最大計測値）×１００【００８１】
・結果
水準２に比べ水準１の接着が良好で、ＣＢＥ３を添加することにより細胞が早く培養バッグ表面に接着する。【００８２】
［実施例４］ＣＢＥ３添加時の濃度依存性
軟骨由来細胞Ｙｕｂ２５０５を用いた短期培養時（培養７日後）の細胞増殖
・水準
水準１：ＣＢＥ３添加なし
水準２：ＣＢＥ３添加量（０．００２８μｇ／ｍＬ）
水準３：ＣＢＥ３添加量（０．０２８μｇ／ｍＬ）
水準４：ＣＢＥ３添加量（０．２８μｇ／ｍＬ）
水準５：ＣＢＥ３添加量（２．８μｇ／ｍＬ）
水準６：ＣＢＥ３添加量（２８０μｇ／ｍＬ）【００８３】
・材料
使用細胞：Ｙｕｂ２５０５（成育研で樹立された軟骨由来細胞）Ｙｕｂ２５０５は参考文献（Nasu, Takayama S, Umezawa A. Endochondral ossification model system: designed cell fate of human epiphyseal chondrocytes during long-term implantation. J. Cell Physiol. 2015 ; 230 : 1376-1388. ）に記載の方法に準じて樹立した。
使用培地：ＭｅｓｅｎＰｒｏ ＲＳ（２容量％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)含有、ライフテクノロジーズ）
培養容器：６ｗｅｌｌ組織培養用（ＴＣ）プレート（Ｆａｌｃｏｎ）【００８４】
・方法
ＣＢＥ３添加法は、実施例１と同様に行った。細胞播種量は、０．１×１０6ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌである。【００８５】
細胞培養法：
上記プロトコルにて培養開始後、３７℃／５％ＣＯ2濃度のインキュベータ内でプレートを保存した。７日後、トリプシン溶液（和光純薬工業）を用いて細胞を剥離し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（ＢＤ）を用いて細胞数を計測した。【００８６】
・結果
細胞数の計測結果を図６に示す。
水準１に比べ、水準２〜水準６で増殖が良好であった。ＣＢＥ３添加量０．０２８μｇ／ｍＬである水準３以降は増殖能改善効果にあまり差がなく、ＣＢＥ３添加量２８０μｇ／ｍＬである水準６では、水準３から５と比較して、増殖能改善効果が逆に低下した。但し、無添加である水準１と比べると、水準６は良好な増殖を維持していた。【００８７】
［実施例５］ＣＢＥ３添加時の濃度依存性
骨髄由来細胞ＢＭＳＣを用いた短期培養時（培養７日後）の細胞増殖
・水準
水準１：ＣＢＥ３添加なし
水準２：ＣＢＥ３添加量（０．００００９μｇ／ｍＬ＝０．０９ｎｇ／ｍＬ）
水準３：ＣＢＥ３添加量（０．０２８μｇ／ｍＬ）
水準４：ＣＢＥ３添加量（５１３μｇ／ｍＬ）
水準５：ＣＢＥ３添加量（６２７μｇ／ｍＬ）【００８８】
・材料
使用細胞：骨髄由来幹細胞（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＢＭＳＣ）  （骨髄由来細胞、Ｌｏｎｚａ）  （商品名ＨＭＳＣ、カタログ番号ＰＴ−２５０１）
使用培地：ＭｅｓｅｎＰｒｏ  ＲＳ（２容量％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有、ライフテクノロジーズ）
培養容器：６φ（直径６ｃｍ）のディッシュ（住友ベークライト）【００８９】
・方法
ＣＢＥ３添加法は、実施例１と同様に行った。細胞播種量は、０．１５×１０6ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌである。【００９０】
・細胞培養法：
上記プロトコルにて培養開始後、３７℃／５％ＣＯ2濃度のインキュベータ内でディッシュを保存した。７日後、トリプシン溶液（和光純薬工業）を用いて細胞を剥離し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（ＢＤ）を用いて細胞数を計測した。【００９１】
・結果
細胞数の計測結果を表１に示す。
判定は、Ａ：細胞数０．３３×１０6ｃｅｌｌｓ以上、Ｂ：細胞数０．３０×１０6ｃｅｌｌｓ以上０．３３×１０6ｃｅｌｌｓ未満、Ｃ：０．２７×１０6ｃｅｌｌｓ以上０．３０×１０6ｃｅｌｌｓ未満、Ｄ：０．２７×１０6ｃｅｌｌｓ未満とした。
水準１に比べ、水準２および水準３で増殖が良好であった。水準４および水準５では増殖能改善効果が低下した。【００９２】
【表１】
2017200039.tif 000002
【００９３】
［参考例１］：ＣＢＥ３コートとフィブロネクチンコートの細胞増殖比較
骨髄由来細胞ＵＤＥ  ＢＭを用いて５継代での細胞増殖（５週間）を比較した。
・水準
水準１：ＣＢＥ３コート（コート量：５．７μｇ／ｗｅｌｌ）
水準２：フィブロネクチン・コート（市販品：バイオコート、Ｆａｌｃｏｎ）【００９４】
・材料
使用細胞：ＵＤＥ  ＢＭ（成育研で樹立された骨髄由来細胞）ＵＤＥ  ＢＭは以下の方法で樹立した。
骨から骨髄液を取り出し、密度勾配遠心分離によって細胞を集めた。回収した細胞をPBSで洗浄し、DMEM(10％FBS含有)培地中に播種して培養した。培養容器に接着した細胞を回収した。
使用培地：ＭｅｓｅｎＰｒｏ ＲＳ（２容量％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)含有、ライフテクノロジーズ）
培養容器：
水準１：６ｗｅｌｌ組織培養用（ＴＣ）プレート（Ｆａｌｃｏｎ）
水準２：市販品：バイオコート（既にフィブロネクチンがコートされたものをそのまま使用、Ｆａｌｃｏｎ）【００９５】
・方法
ＣＢＥ３コート法：
ｃｅｌｌｎｅｓｔ（登録商標）（０．１質量％ＣＢＥ３水溶液、富士フイルム）をプレートの各ｗｅｌｌに２ｍＬ滴下し、プレートを３７℃インキュベータ内で２時間放置した。ｃｅｌｌｎｅｓｔ（登録商標）を各ｗｅｌｌから吸引除去し、ＰＢＳを各ｗｅｌｌに６ｍＬ滴下し、プレートを３０分間放置した。ＰＢＳを各ｗｅｌｌから吸引除去し、プレートを使用するまで冷蔵保管した。プレートの各ｗｅｌｌに培地２ｍＬを滴下し、細胞を播種して培養を開始した。細胞播種量は、０．２×１０6ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌである。【００９６】
細胞培養法：
上記プロトコルにて培養開始後、３７℃／５％ＣＯ2濃度のインキュベータ内でプレートを保存した。１週間経過後、トリプシン溶液（和光純薬工業）を用いて細胞を剥離し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（ＢＤ）を用いて細胞数を計測した。新たにプレートを準備して、細胞を再び播種（０．２×１０6ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）して継代し、３７℃／５％ＣＯ2濃度のインキュベータ内でプレートを保存した。１週間後に上記のトリプシン溶液による細胞の剥離、細胞数の計測、細胞の継代、及び３７℃／５％ＣＯ2濃度のインキュベータ内でのプレートの保存という操作を繰り返し、５継代まで実施した。【００９７】
・計算方法
ＰＤ（細胞の分裂回数）を以下の式により計算することにより得た細胞増殖曲線を図７に示す。
ＰＤ（細胞の分裂回数）＝前回継代時のＰＤ値＋ｌｏｇ2（計測細胞数／播種細胞数）【００９８】
・結果
水準２に比べ水準１の増殖が良好で、コート材として一般的に使用されているフィブロネクチンよりもＣＢＥ３のほうが良好な増殖を示す。【００９９】
［参考例２］ＣＢＥ３コートとフィブロネクチンコートの細胞増殖比較
軟骨由来細胞Ｙｕｂ２４７８を用いて短期培養時（培養１日後）の細胞増殖を比較した。
・水準
水準１：ＣＢＥ３コート（コート量：５．７μｇ／ｗｅｌｌ）
水準２：フィブロネクチン・コート（市販品：バイオコート、Ｆａｌｃｏｎ）【０１００】
・材料
使用細胞：Yub2478（成育研で樹立された軟骨由来細胞）、
使用培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（１０容量％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)添加）
培養容器：
水準１：６ｗｅｌｌ組織培養用（ＴＣ）プレート（Ｆａｌｃｏｎ）
水準２：市販品：バイオコート（既にフィブロネクチンがコートされたものをそのまま使用、Ｆａｌｃｏｎ）【０１０１】
・方法
ＣＢＥ３コート法：
ｃｅｌｌｎｅｓｔ（登録商標）（０．１質量％ＣＢＥ３水溶液、富士フイルム）をプレートの各ｗｅｌｌに２ｍＬ滴下し、プレートを３７℃のインキュベータ内で２時間放置した。ｃｅｌｌｎｅｓｔ（登録商標）を各ｗｅｌｌから吸引除去し、ＰＢＳを各ｗｅｌｌに６ｍＬ滴下し、プレートを３０分間放置した。ＰＢＳを各ｗｅｌｌから吸引除去し、プレートを使用するまで冷蔵保管した。プレートの各ｗｅｌｌに培地２ｍＬを滴下し、細胞を播種して培養を開始した。細胞播種量は、０．２×１０6ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌである。【０１０２】
細胞培養法：
上記プロトコルにて培養開始後、３７℃／５％ＣＯ2濃度のインキュベータ内でプレートを保存した。１日後、トリプシン溶液（和光純薬工業）を用いて細胞を剥離し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（ＢＤ）を用いて細胞数を計測した。【０１０３】
・結果
細胞数の計測結果を図８に示す。
水準２に比べ、水準１は増殖が改善される。【０１０４】
［参考例３］ＣＢＥ３添加有無における遺伝子発現の差
骨髄由来細胞ＢＭＳＣを用いた短期培養時（培養８日後）の細胞増殖と遺伝子発現
・水準
水準１：ＣＢＥ３添加なし
水準２：ＣＢＥ３添加量（０．０２８μｇ／ｍＬ）【０１０５】
・材料
使用細胞：骨髄由来幹細胞（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＢＭＳＣ）  （骨髄由来細胞、Ｌｏｎｚａ）  （商品名ＨＭＳＣ、カタログ番号ＰＴ−２５０１）
使用培地：ＭｅｓｅｎＰｒｏ  ＲＳ（２容量％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有、ライフテクノロジーズ）
培養容器：１０φ（直径１０ｃｍ）のディッシュ（住友ベークライト）【０１０６】
・方法
ＣＢＥ３添加法は、実施例１と同様に行った。細胞播種量は、０．４×１０6ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌである。【０１０７】
・細胞培養法：
上記プロトコルにて培養開始後、３７℃／５％ＣＯ2濃度のインキュベータ内でディッシュを保存した。８日後、トリプシン溶液（和光純薬工業）を用いて細胞を剥離し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（ＢＤ）を用いて細胞数を計測した。【０１０８】
・ｍＲＮＡ抽出法
上記プロトコルにて細胞数計測後、その計測に使用した残りの細胞を用いて遠心（１０００ｒｐｍ、５分）して上清を除去した。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を加えて懸濁し、エッペンチューブ（エッペンドルフ）に移して再び遠心（２０００ｒｐｍ、５分）して上清を除去、細胞ペレットとして−８０℃にて保存した。細胞ペレットからのｍＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  ＭｉｎｉＫｉｔ（キアゲン、７４１３４）及びＱＩＡ  Ｓｈｒｅｄｄｅｒ（キアゲン、７９６５６）を用いて行った。抽出したｍＲＮＡの検定は、Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用して２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定することによって実施した。【０１０９】
・ｃＤＮＡ調製法
抽出したｍＲＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、１８４２７−０１３）を混合してＰｒｏＦｌｅｘTMＰＣＲシステム（ライフテクノロジーズ）を用いてアニーリングを行い、５×ＦＳバッファー、０．１Ｍ  ＤＴＴ、ＲＮａｓｅ  ＯＵＴ、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  IV  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（何れもインビトロジェン）を用いてＰＣＲ反応を行い、ｃＤＮＡを得た。上記プロトコルと同様にして調製したｃＤＮＡの検定を実施した。【０１１０】
・遺伝子発現プロファイル
上記水準１、２で培養した細胞から調製したｃＤＮＡを用いて遺伝子発現プロファイルの差を確認した。ＲＴ2  ＰｒｏｆｉｌｅｒTM  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙｓ（キアゲン）のＨｕｍａｎ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ＆Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（ＰＡＨＳ−０１３Ｚ）及びＨｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ（ＰＡＨＳ−０２０Ｚ）を使用してＲＴＰＣＲによる遺伝子発現の確認を行った。【０１１１】
・結果
細胞外マトリクス及び細胞接着関連遺伝子群の遺伝子発現プロファイルを図９および図１０に示し、細胞周期関連遺伝子群の遺伝子発現プロファイルを図１１および図１２に示す。図９〜図１２において、各遺伝子の欄の左側の棒グラフは、水準１（ＣＢＥ３添加なし）を示し、各遺伝子の欄の右側の棒グラフは、水準２（ＣＢＥ３添加）を示す。細胞外マトリクス及び細胞接着関連遺伝子群にはＣＢＥ３添加によって発現上昇する遺伝子が認められる一方で、細胞周期関連遺伝子群には発現変化がほとんど認められなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2017200039.tif 000013
【図１２】
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【配列表】
2017200039000001.app
【国際調査報告】
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2017200039.tif 000016
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