(57)【要約】Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸及び／又はヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸の新たな製造方法を提供すること。Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸にＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを作用させる工程（Ａ）を含む、Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸を製造する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸にＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを作用させる工程（Ａ）を含む、Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸を製造する方法。
【請求項２】
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸がＮ−サクシニル−３−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸及び／又はＮ−サクシニル−４−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸にＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを作用させる工程（Ａ）、及び
工程（Ａ）で得られたＮ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸にＤ−サクシニラーゼを作用させる工程（Ｂ）
を含む、ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸を製造する方法。
【請求項４】
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸がＮ−サクシニル−３−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸及び／又はＮ−サクシニル−４−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼがゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、又はクロロフレクサス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ）属に属する微生物由来である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
Ｄ−サクシニラーゼがクプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、又はラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属に属する微生物由来である、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸及び／又はヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸の製造に関連する技術が開示される。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシアミノ酸は、機能性食品、化粧品、農薬、医薬品の原料及びその中間体等において、有用な化合物であり、例えば、４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン、３−ヒドロキシ−Ｌ−リジン、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、及びシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンなどが知られる（非特許文献１、２、特許文献１）。これらの化合物は、いずれも微生物及び酵素反応による効率的な製造方法が報告されているおり、いずれもＬ体のヒドロキシアミノ酸である（非特許文献３及び４、並びに特許文献２）。Ｄ体のヒドロキシアミノ酸の製造方法は、特許文献３などに報告されているが、製造効率等に改善の余地があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−１９９７１４
【特許文献２】ＷＯ２０１４／１２９４５９
【特許文献３】特開２０１０−０９８９７５
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｒｏｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９９，２７７，Ｅ６１７
【非特許文献２】Ｃｏｕｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９８、３９、６４６７
【非特許文献３】Ｓｈｉｂａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，１９９９，６５，４０２８
【非特許文献４】Ｈｉｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，２０１１，７７，６９２６
【非特許文献５】Ｏｄｏｋｏｎｙｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．，２０１４，１１１，８５３５
【非特許文献６】Ｓａｋａｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，４５，４４５５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のような現状の下、Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸及び／又はヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸の新たな製造方法を提供することが１つの課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題等を達成すべく鋭意研究を重ねたところ、次のような知見を得るに至った。即ち、従前、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、Ｎ−サクシニルアミノ酸の異性化反応に加え、脱水反応を触媒する活性を有することが知られていた（非特許文献５、６）。具体的に、非特許文献５には、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ属、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属由来のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ活性（以下、ＮＳＡＲ活性とも称する）を有する全ての酵素がＮＳＡＲ活性よりも高い脱水活性（以下、ＯＳＢＳ活性とも称する）を有することが報告されている。また、非特許文献６には、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼがＮＳＡＲ活性と同等のＯＳＢＳ活性を有することが報告されている。よって、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、ヒドロキシル化された化合物の異性化反応には適さないと考えられていた。しかし、実際には当該酵素が、Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸をヒドロキシル化された状態で効率的にＤ体に変換できることを見出した。斯かる知見に基づき、更なる研究と改良を重ねた結果、下記に代表される発明が提供される。【０００７】
項１．
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸にＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを作用させる工程（Ａ）を含む、Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸を製造する方法。項２．
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸がＮ−サクシニル−３−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸及び／又はＮ−サクシニル−４−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸である、項１に記載の方法。
項３．
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸にＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを作用させる工程（Ａ）、及び
工程（Ａ）で得られたＮ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸にＤ−サクシニラーゼを作用させる工程（Ｂ）
を含む、ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸を製造する方法。
項４．
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸がＮ−サクシニル−３−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸及び／又はＮ−サクシニル−４−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸である、項３に記載の方法。
項５．
Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼがゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、又はクロロフレクサス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ）属に属する微生物由来である、項１〜４のいずれかに記載の方法。
項６．Ｄ−サクシニラーゼがクプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、又はラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属に属する微生物由来である、項３〜５のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸及び／又はヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸を効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例２において３−ヒドロキシ−Ｄ−イソロイシンが生成されたことを示す。
【図２】実施例３において３−ヒドロキシ−Ｄ−ロイシンが生成されたことを示す。
【図３】実施例４において３−ヒドロキシ−Ｄ−バリンが生成されたことを示す。
【図４】実施例５において３−ヒドロキシ−Ｄ−ノルロイシンが生成されたことを示す。
【図５】実施例６において３−ヒドロキシ−Ｄ−ノルバリンが生成されたことを示す。
【図６】実施例７において４−ヒドロキシ−Ｄ−イソロイシンが生成されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸にＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを作用させる工程（Ａ）を含む、Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸を製造する方法が提供される。
【００１１】
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸におけるＬ−アミノ酸の種類は任意であり、目的に応じて適宜選択することができる。本発明に従えば、原則として、Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸に採用するＬ−アミノ酸と同じ側鎖を有するＤ−アミノ酸を含むヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸が得られる。
【００１２】
アミノ酸とは、アミノ基とカルボキシル基の両方の官能基を持つ化合物である。具体的なアミノ酸の種類としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン等の遺伝情報から直接的に合成されるアミノ酸；シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、サイロキシン、Ｏ−ホスホセリン、及びデスモシン等のタンパク質合成後修飾によって得られるアミノ酸；並びに、β−アラニン、サルコシン、オルニチン、シトルリン、クレアチン、γ−アミノ酪酸、オパイン、トリメチルグリシン、テアニン、トリコロミン酸、カイニン酸、ドウモイ酸、イボテン酸、アクロメリン酸、ノルバリン、及びノルロイシン等のタンパク質を構成しないアミノ酸を挙げることができる。一実施形態において、好ましいアミノ酸は、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、及びフェニルアラニンである。
【００１３】
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸において、ヒドロキシ基は、Ｌ−アミノ酸の任意の炭素原子に結合していても良い。一実施形態において、ヒドロキシ基は、アミノ酸のアミノ基を持つ炭素原子の隣りのカルボキシル炭素を１位、アミノ基及びカルボキシル基が結合している炭素を２位として、３位、４位、及び／又は５位の炭素に結合していることが好ましく、３位及び／又は４位に結合していることが好ましい。
【００１４】
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸は公知であり、任意の手法で得ることができる。例えば、Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸は、ヒドロキシラーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を水酸化して得ることができる。Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸は、例えば、後述する実施例に示すように、無水コハク酸を用いてｐＨ８〜９の条件下でＬ−アミノ酸のアミノ基を構成する窒素原子にサクシニル基を結合させて得ることができる。また、Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸をヒドロキシラーゼで先に水酸化してヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸を取得し、それをＮ−サクシニル化することによって得ることもできる。
【００１５】
ヒドロキシラーゼとは、基質分子のいずれかの原子を水酸化する酵素活性（以下、「ヒドロキシラーゼ活性」という。）を有するタンパク質である。ヒドロキシラーゼには、酸素分子を基質として酸素１原子を化合物に導入する反応を触媒するモノオキシゲナーゼ及び酸素分子中の酸素２原子いずれもを化合物に導入する反応を触媒するジオキシゲナーゼが含まれる。
【００１６】
ヒドロキシラーゼは、Ｌ−アミノ酸又はＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を位置選択的に水酸化する反応を触媒する酵素であることが好ましい。このような酵素としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、及びＮｏｓｔｏｃ属由来のヒドロキシラーゼ並びにその変異体等が挙げられる。一実施形態においてヒドロキシラーゼは、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、又はＮｏｓｔｏｃ属に由来することが好ましく、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ属に由来することがより好ましい。
【００１７】
本書において「変異体」とは、基準となる酵素のアミノ酸配列に対して一定以上の同一性を有するアミノ酸配列を有しかつ当該基準となる酵素と同種の酵素活性を有する酵素を意味する。ここで、一定の以上の同一性とは、例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上を意味する。基準となる酵素は任意であり、例えば、本書に例示される野生型の酵素、又は配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列を有する酵素を挙げることができる。
【００１８】
アミノ酸の同一性は、市販の又はインターネットを通じて利用可能な解析ツールを用いて計算することができる。例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴにおいてデフォルトのパラメーターを用いて算出することができる。
【００１９】
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸の製造においては、（１）Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を出発原料とし、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を位置選択的に水酸化する反応を触媒するヒドロキシラーゼを用いても良いし、（２）Ｌ−アミノ酸を出発原料とし、Ｌ−アミノ酸を位置選択的に水酸化する反応を触媒するヒドロキシラーゼを用いて、ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸を合成し、化学合成でＮ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸を製造しても良い。（１）の例としては、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸の３位を特異的に水酸化するＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ属のヒドロキシラーゼ（以上、特許文献４に記載）が挙げられる。（２）の例としては、４位を水酸化する酵素として、例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｏｃｕｓ）由来のヒドロキシラーゼ（以上、特許文献４に記載）が挙げられる。また、５位を水酸化する酵素として、例えば、ノストック ・パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）由来のヒドロキシラーゼ（ＷＯ２０１１／０２１７１７に記載）が挙げられる。
【００２０】
Ｌ−アミノ酸又はＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を構成するＬ−アミノ酸をヒドロキシラーゼで水酸化する条件は特に限定されず任意に設計できる。例えば、下記の条件でＬ−アミノ酸又はＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸とヒドロキシラーゼとを任意の添加剤および緩衝剤を含む反応溶液中で混合することにより上記アミノ酸をヒドロキシル化することができる。
【００２１】
反応温度は、使用するヒドロキシラーゼが機能する温度であれば特に限定されず、酵素の種類に応じて適宜設定することができる。一般的な温度は２０〜５０℃であり、２５〜３５℃が好ましい。反応時のｐＨは、使用するヒドロキシラーゼが機能するｐＨであれば特に限定されず、酵素の種類に応じて適宜設定することができる。一般的なｐＨは、ｐＨ５〜９であり、ｐＨ６〜７が好ましい。
【００２２】
反応溶液は、添加剤として二価の鉄イオン、アスコルビン酸、及び／又は２−オキソグルタル酸を含むことが好ましい。２価の鉄イオンは、例えば、０．１ｍＭ〜１Ｍの終濃度で含まれることが好ましい。アスコルビン酸は、例えば、０．１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭの終濃度で含まれることが好ましい。また、アスコルビン酸はトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP-HCl）でも代替できる。２−オキソグルタル酸は、反応基質であるＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸（又はＬ−アミノ酸）と同モルまたは同モルから２倍モルの範囲で配合されることが好ましい。これにより、ヒドロキシラーゼの活性を顕著に高めることができる。
【００２３】
ヒドロキシラーゼの反応に用いる緩衝剤は、ヒドロキシラーゼが機能するものであれば特に制限されず、任意に選択することができる。一実施形態において、作業効率の観点から、緩衝材は、後述するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ及びＤ−サクシニラーゼの反応に用いる緩衝剤と同種のものが好ましい。
【００２４】
ヒドロキシル化の反応時間は、所望のヒドロキシルＬ−アミノ酸又はＮ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸が得られる限り特に制限されず、任意に設定することができる。例えば、反応時間は、３〜７２時間、好ましくは６〜２４時間とすることができる。
【００２５】
反応溶液中のＬ−アミノ酸又はＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸の量は特に制限されず、目的及び使用する酵素の種類等に応じて適宜設定することができる。例えば、Ｌ−アミノ酸又はＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸は、０．０１％〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％〜２０％（ｗ／ｖ）とすることができる。    
【００２６】
反応溶液中のヒドロキシラーゼの量は特に制限されず、目的及び使用する酵素の種類等に応じて適宜設定することができる。例えば、ヒドロキシラーゼの濃度は、湿菌体重量として、０．１％〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１％〜１０％（ｗ／ｖ）である。
【００２７】
ヒドロキシラーゼは、精製されたものを使用することができるが、ヒドロキシラーゼを微生物に発現させて製造する場合は、それを発現する微生物の状態で使用することができる。一実施形態において、ヒドロキシラーゼは、安定性の観点で微生物が発現している状態のものであることが好ましい。従って、ヒドロキシラーゼを発現させるために微生物を培養した培養液をそのまま酵素溶液として使用することができる。
【００２８】
微生物を用いたヒドロキシラーゼの生産は周知の方法を用いて行うことができる。例えば、ヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターで適当な宿主細胞（例えば、大腸菌）を形質転換し、それを宿主に適当な条件で培養することで行うことができる。
【００２９】
Ｌ−アミノ酸のサクシニル化は任意の手法で行うことができる。例えば、アミノ酸及びアミノ酸と当量以上の無水コハク酸を酢酸中で反応させた後、溶媒を留去し、酢酸エチル及び／又はメタノール中で再結晶させることによってＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を得ることができる。また、アミノ酸及びアミノ酸と当量以上の無水コハク酸を水中でｐＨをアルカリ側に保ちながら反応させた後、ｐＨを酸性にして結晶として析出させる方法によってＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を得ることもできる。
【００３０】
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸を製造する際に使用するＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、このような反応を触媒できる活性を有する限り特に制限されない。使用可能なＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼとしては、アミコラトプシス・エスピー（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）・ＴＳ−１−６０由来（特開平４−３６５４８２）、セベキア・ベニハナ（Ｓｅｂｅｋｉａ  Ｂｂｅｎｉｈａｎａ）（以下、単にベニハナという場合がある）由来（特開２００１−３１４１９１）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）由来（特開２００２−２３８５８１）、クロロフレクサス・オーランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）由来（特開２００７−０８２５３４）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＡ１５０３株由来（特開２００８−０６１６４２）、ゲオバチルス・カウストフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＢＲＣ１０２４４５株由来（特開２０１５−９１２６５）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来（特開２０１５−９１２６５）のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ並びにそれらの変異体等を挙げることができる。一実施形態において、クロロフレクサス・オーランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）由来、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＡ１５０３株由来、ゲオバチルス・カウストフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＢＲＣ１０２４４５株由来、又はサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＨＢ８株由来のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼが好ましく、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、又はクロロフレクサス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ）属由来のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼがより好ましい。
【００３１】
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸にＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを作用させてＮ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸を製造する際の反応条件は特に限定されず任意に設計できる。例えば、下記の条件でＮ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸とＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼとを任意の添加剤および緩衝剤を含む反応溶液中で混合することによりラセミ化することができる。
【００３２】
反応温度は、使用するＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼが機能する温度であれば特に限定されず、酵素の種類に応じて適宜設定することができる。一般的な温度は２０〜５０℃であり、２５〜３５℃が好ましい。反応時のｐＨは、使用するＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼが機能するｐＨであれば特に限定されず、酵素の種類に応じて適宜設定することができる。一般的なｐＨは、ｐＨ５〜９であり、ｐＨ６〜７が好ましい。
【００３３】
反応溶液は、添加剤として二価のコバルトイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、１価のカリウムイオン、ナトリウムイオン、リチウムイオン等を含むことが好ましく、コバルトイオンがより好ましい。金属イオンは、例えば、０．０１ｍＭ〜１Ｍの終濃度で含まれることが好ましく、０．１ｍＭ〜１ｍＭの終濃度がより好ましい。
【００３４】
Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼの反応に用いる緩衝剤は、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼが機能するものであれば特に制限されず、任意に選択することができる。例えば、リン酸緩衝溶液、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＥＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及びＴｒｉｃｉｎｅ等を挙げることができる。
【００３５】
反応時間は、所望のＮ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸が得られる限り特に制限されず、任意に設定することができる。例えば、反応時間は、３〜７２時間、好ましくは６〜２４時間とすることができる。
【００３６】
反応溶液中のＮ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸の量は特に制限されず、目的及び使用する酵素の種類等に応じて適宜設定することができる。例えば、Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸は、０．０１％〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％〜２０％（ｗ／ｖ）とすることができる。      
【００３７】
反応溶液中のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼの量は特に制限されず、目的及び使用する酵素の種類等に応じて適宜設定することができる。例えば、ヒドロキシラーゼの濃度は、酵素濃度として０．００１（ｇ／Ｌ）〜１０（ｇ／Ｌ）、好ましくは０．０１（ｇ／Ｌ）〜１（ｇ／Ｌ）である。
【００３８】
Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、精製されたものを使用することができるが、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを微生物に発現させて製造する場合は、当該酵素を発現する微生物の状態で使用することができる。一実施形態において、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、安定性の観点で微生物が発現している状態のものであることが好ましい。従って、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを発現させるために微生物を培養した培養液をそのまま酵素溶液として使用することができる。
【００３９】
微生物を用いたＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼの生産は周知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターで適当な宿主細胞（例えば、大腸菌）を形質転換し、それを宿主に適当な条件で培養することで行うことができる。
【００４０】
上記のようにして得られるＮ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸にＤ−サクシニラーゼを作用させること(工程Ｂ)により、ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸を得ることができる。Ｄ−サクシニラーゼは、Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸を脱サクシニル化してヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸を生成する活性を有する限り特に制限されず、その種類は任意である。Ｄ−サクシニラーゼの具体例としては、クプリアビダス・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ株、クプリアビダス・メタリデュランス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）、クプリアビダス・ネケター（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）、及びラルストニア・ピケッティ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ）由来のＤ−サクシニラーゼ（以上ＷＯ２０１２／００２４５０）、並びにそれらの改変体（特開２０１２−２０５５８７）等を挙げることができる。一実施形態において好ましいＤ−サクシニラーゼは、クプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属又はラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属由来のＤ−サクシニラーゼである。
【００４１】
Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸にＤ−サクシニラーゼを作用させてヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸を製造する際の反応条件は特に限定されず任意に設計できる。例えば、下記の条件でＮ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸とＤ−サクシニラーゼとを任意の添加剤および緩衝剤を含む反応溶液中で混合することにより脱サクシニル化することができる。
【００４２】
反応温度は、使用するＤ−サクシニラーゼが機能する温度であれば特に限定されず、酵素の種類に応じて適宜設定することができる。一般的な温度は２０〜５０℃であり、２５〜３５℃が好ましい。反応時のｐＨは、使用するＤ−サクシニラーゼが機能するｐＨであれば特に限定されず、酵素の種類に応じて適宜設定することができる。一般的なｐＨは、ｐＨ５〜９であり、ｐＨ６〜７が好ましい。
【００４３】
Ｄ−サクシニラーゼの反応に用いる緩衝剤は、Ｄ−サクシニラーゼが機能するものであれば特に制限されず、任意に選択することができる。例えば、リン酸緩衝溶液、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＥＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及びＴｒｉｃｉｎｅ等を挙げることができる。
【００４４】
反応時間は、所望のヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸が得られる限り特に制限されず、任意に設定することができる。例えば、反応時間は、３〜７２時間、好ましくは６〜２４時間とすることができる。
【００４５】
反応溶液中のＮ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸の量は特に制限されず、目的及び使用する酵素の種類等に応じて適宜設定することができる。例えば、Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸は、０．０１％〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％〜２０％（ｗ／ｖ）とすることができる。      
【００４６】
反応溶液中のＤ−サクシニラーゼの量は特に制限されず、目的及び使用する酵素の種類等に応じて適宜設定することができる。例えば、Ｄ−サクシニラーゼの濃度は、酵素濃度として０．０００１（ｇ／Ｌ）〜１（ｇ／Ｌ）  、好ましくは０．００１（ｇ／Ｌ）〜０．１（ｇ／Ｌ）である。
【００４７】
Ｄ−サクシニラーゼは、精製されたものを使用することができるが、Ｄ−サクシニラーゼを微生物に発現させて製造する場合は、当該酵素を発現する微生物の状態で使用することができる。一実施形態において、Ｄ−サクシニラーゼは、安定性の観点で微生物が発現している状態のものであることが好ましい。従って、Ｄ−サクシニラーゼを発現させるために微生物を培養した培養液をそのまま酵素溶液として使用することができる。
【００４８】
微生物を用いたＤ−サクシニラーゼの生産は周知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｄ−サクシニラーゼをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターで適当な宿主細胞（例えば、大腸菌）を形質転換し、それを宿主に適当な条件で培養することで行うことができる。
【００４９】
このようにして得られるヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸において、ヒドロキシ基は、Ｄ−アミノ酸の任意の炭素原子に結合していても良い。一実施形態において、ヒドロキシ基は、Ｄ−アミノ酸のカルボキシル基を構成している炭素を１位、アミノ基及びカルボキシル基が結合している炭素を２位として、３位、４位、及び／又は５位の炭素に結合していることが好ましく、３位及び／又は４位に結合していることが好ましい。
【００５０】
一実施形態において、１つの反応系（反応溶液）でＮ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸からＮ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸への変換、及び、Ｎ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸からヒドロキシル−Ｄ−アミノ酸への変換を同時及び／又は連続的に行うことが効率性の観点で好ましい。他の実施形態において、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸をヒドロキシラーゼの存在下でＮ−サクシニル−ヒドロキシ−Ｌ−アミノ酸に変換し、その反応溶液にＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ及びＤ−サクシニラーゼ並びに他の添加剤を添加して連続的にヒドロキシ−Ｄ−アミノ酸を製造することが効率性の観点で好ましい。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。【００５２】
［参考例１］Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ  ＡＭＭＤ（ＤＳＭ１６０７８）株由来ヒドロキシラーゼ（ＳａｄＡ）の調製
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ  ＡＭＭＤ（ＤＳＭ１６０７８）株由来のヒドロキシラーゼ（ＳａｄＡ）遺伝子（配列番号１）の全長を増幅させるために配列番号４及び５に示す塩基配列を有するプライマーを合成した。次に、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ  ＡＭＭＤ（ＤＳＭ１６０７８）株を液体培養で培養し、得られた菌体からゲノム抽出キットにより、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）及び上記プライマーを用いてＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片をプラスミドｐＱＥ８０ＬのＢａｍＨＩ認識部位とＨｉｎｄＩＩＩ認識部位の間に挿入し、発現ベクターｐＢａＳａｄＡを構築した。この発現ベクターｐＢａＳａｄＡで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９を形質転換した。得られた組換え大腸菌をアンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含む液体ＬＢ培地で２８℃で振盪培養し、ＯＤ（６６０ｎｍ）の値が、０．８に達した際、最終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを培地に添加した。その後も、２８℃にて振盪培養し、培養開始から２０時間後に集菌した。【００５３】
［参考例２］Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ  ＡＭＭＤ（ＤＳＭ１６０７８）株由来ヒドロキシラーゼ（ＳａｄＡ）の活性測定
５０μｌ（終濃度５０ｍＭ）のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、１５μｌ（終濃度１５ｍＭ）の２−オキソグルタル酸、１０μｌ（終濃度１０ｍＭ）のアスコルビン酸、５０μｌ（終濃度５ｍＭ）のＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ、１００μｌ（終濃度１０ｍＭ）のＮ−サクシニル−Ｌ−ロイシン、及び７６５μｌの滅菌蒸留水を混和し、この溶液に参考例１に記載の方法で調製した集菌液を生理食塩水で洗浄した菌体懸濁液１０μｌを加え、３０℃で反応を開始させ、適当な時間で反応を停止させた。この反応で生成したコハク酸をコハク酸定量キット（Ｒｏｃｈｅ／Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ社製）により、定量し、酵素活性を算出した。酵素活性は、２−オキソグルタル酸からコハク酸が１分間に１μｍｏｌ生成された場合を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義した。【００５４】
［参考例３］Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ２−ｅ−２株由来ヒドロキシラーゼ（ＩＤＯ）の調製
特許５２４６６３９に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ２−ｅ−２株由来のヒドロキシラーゼ（ＩＤＯ）（配列番号２）の全長を増幅させるために配列番号６及び７の塩基配列を有するプライマーを合成した。次にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ２−ｅ−２株を液体培養で培養し、得られた菌体からゲノム抽出キットにより、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）及び上記プライマーを用いたＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片をプラスミドｐＱＥ８０ＬのＢａｍＨＩ認識部位とＨｉｎｄＩＩＩ認識部位の間に挿入し、発現ベクターｐＢｔＩＤＯを構築した。この発現ベクターｐＢｔＩＤＯで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９を形質転換した。得られた組換え大腸菌をアンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含む液体ＬＢ培地で２８℃で振盪培養し、ＯＤ（６６０ｎｍ）の値が、０．８に達した際、最終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加した。その後も、２８℃にて振盪培養し、培養開始から２０時間後に集菌した。【００５５】
［参考例４］Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ２−ｅ−２株由来ヒドロキシラーゼ（ＩＤＯ）の活性測定
１００μｌ（終濃度１００ｍＭ）のＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）、５μｌ（終濃度５ｍＭ）の２−オキソグルタル酸、５μｌ（終濃度５ｍＭ）のアスコルビン酸、５０μｌ（終濃度５ｍＭ）のＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ、５０μｌ（終濃度５ｍＭ）のＬ−イソロイシン、及び７８０μｌの滅菌蒸留水を混和し、この溶液に参考例３に記載の方法で調製した集菌液を生理食塩水で洗浄した菌体懸濁液１０μｌを加え、３０℃で反応を開始させ、適当な時間で反応を停止させた。この反応で生成した４−ヒドロキシイソロイシンをＨＰＬＣにより、定量し、酵素活性を算出した。酵素活性は、２−オキソグルタル酸からコハク酸が１分間に１μｍｏｌ生成された場合を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義した。【００５６】
［参考例５］Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ（ＮＳＡＲ）の調製
特開２００７−８２５３４に記載の方法で、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のＮＳＡＲの発現ベクターｐＣａＮＳＡＲを構築した。ｐＣａＮＳＡＲを用い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９を形質転換した。得られた組換え大腸菌をアンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含む液体ＬＢ培地を用いて、２８℃で振盪培養し、ＯＤ（６６０ｎｍ）の値が、０．８に達した際、最終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加した。その後も、２８℃にて振盪培養し、培養開始から２０時間後に集菌した。【００５７】
［参考例６］Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ（ＮＳＡＲ）の調製
特開２００８−０６１６４２に記載の方法で、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＮＳＡＲの発現ベクターｐＧｓＮＳＡＲを構築した。ｐＣａＮＳＡＲを用い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９を形質転換した。得られた組換え大腸菌をアンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含む液体ＬＢ培地を用いて、２８℃で振盪培養し、ＯＤ（６６０ｎｍ）の値が、０．８に達した際、最終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加した。その後も、２８℃にて振盪培養し、培養開始から２０時間後に集菌した。【００５８】
［参考例７］Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼの活性測定
１００μｌ（終濃度１０ｍＭ）の基質となるＮ−サクシニル−Ｌ−フェニルアラニン溶液(基質)を１００μｌ（終濃度１０ｍＭ）、１０μｌ（終濃度１ｍＭ）の塩化コバルト水溶液を１０μｌ（終濃度１ｍＭ）、１００μｌ（終濃度２５ｍＭ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（０．２５Ｍ／ｐＨ７．５）を１００μｌ（終濃度２５ｍＭ）、及び７４０μｌの滅菌蒸留水を７４０μｌを混和し、この反応液に適当な濃度のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ溶液５０μｌを加えて３０℃で反応を行い、煮沸処理により、反応を停止させた。生成したＮ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニンを高速液体クロマトグラフィーにより定量し、酵素活性を算出した。酵素活性はＮ−サクシニル−Ｌ−フェニルアラニンからＮ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニンが１分間に１μｍｏｌｅ生成された場合を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義した。【００５９】
［参考例８］Ｄ−サクシニラーゼ（ＤＳＡ）の調製
特許５８０６６６４に記載のＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株由来のＤ−サクシニラーゼ遺伝子（配列番号３）の全長を増幅させるために配列番号８及び９の塩基配列を有するプライマーを合成した。次にＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株を液体培地で培養し、特許５８０６６６４に記載の方法で、抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）及び上記プライマーを用いてＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＮｄｅＩ認識部位とＢａｍＨＩ認識部位の間に挿入し、発現ベクターｐＣｓＤＳＡを構築した。さらに常法に従い、部位特異的変異を導入し、１８２位のロイシン残基がグルタミン酸残基に置換されたｐＣｓＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ）を取得した。ｐＣｓＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ）を用い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９を形質転換した。得られた組換え大腸菌をアンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含む液体ＬＢ培地で培養し、ＯＤ（６６０ｎｍ）の値が、０．８に達した際、最終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加した。その後も、２８℃にて振盪培養し、培養開始から２０時間後に集菌した。菌体を遠心分離により、回収した。【００６０】
［参考例９］Ｄ−サクシニラーゼの活性測定
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ法を利用した酵素法により測定した。
＜試薬＞
１４ｍＭ  Ｎ−サクシニル−Ｄ−バリン
２．５（Ｕ／ｍＬ）  ペルオキシダーゼ（東洋紡製ＰＥＯ−３０２）
１．５ｍＭ  ４−アミノアンチピリン（第一化学薬品製）
２．４ｍＭ  ＴＯＯＳ（同人化学研究所製）
６．０（Ｕ／ｍＬ）  Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（バイオザイム製ＤＯＸ２）
を含む２５ｍＭリン酸緩衝溶液を反応試薬とする。
＜測定条件＞
反応試薬３．０ｍＬを３７℃で５分間予備加温する。酵素溶液０．１ｍＬを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、５５５ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検は、酵素溶液の代わりに酵素を溶解する溶液を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＤ−サクシニラーゼ活性を求める。ここでＤ−サクシニラーゼ活性における１単位（Ｕ）とは、上記条件下で１分間に１マイクロモルのＤ−アミノ酸を生成する酵素量として定義する。
活性（Ｕ／ｍＬ）＝
｛（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．１×希釈倍率｝／｛３１．０×１／２×０．１×１．０｝
なお、式中の３．１は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、３１．０は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、１／２は酵素反応で生成したＨ２Ｏ２の１分子から形成するＱｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素が１／２分子であることによる係数、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。【００６１】
［実施例１］（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンの製造
参考例８と同様にして得られたＤＳＡを発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）及び参考例５と同様にして得られたＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のＮＳＡＲを発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）を反応液１０ｍｌ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＣｏＣｌ２、１５ｍＭ  Ｎ−サクシニル−（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン）に懸濁し、２８℃又は３７℃、２０時間、反応させた。また、ＮＳＡＲに関しては、参考例５に記載のＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のＮＳＡＲの代わりに、参考例６と同様にして得られたＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＮＳＡＲを発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）を使った評価も実施した。【００６２】
得られた反応液１０μｌに対して、６％  トリエチルアミンを２０μｌ、及び１％  ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルイソチオシアナート（ＧＩＴＣ）を２０μｌ加えて室温で１０分間静置した後、５％  酢酸を２０μｌ加えることでアミノ酸のキラル誘導化を行った。このサンプルを下記条件の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）にて分離分析することにより、アミノ酸の反応生成物（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン（４−ヒドロキシ−Ｄ−イソロイシン））及び副生成物（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン（４−ヒドロキシ−Ｌ−イソロイシン））を測定した。
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ５μｍ（２．１×１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）溶離液Ａ：酢酸アンモニウム（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５）
溶離液Ｂ：メタノール（０〜１５ｍｉｎ（２０→６０％）、１５〜１５．１ｍｉｎ（２０％→８０％）、１５．１〜２０ｍｉｎ（２０％）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
温度：３０℃
検出：紫外吸収（２５４ｎｍ）【００６３】
その結果、いずれのＮＳＡＲを用いた場合においても、反応の生成物（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン（４−ヒドロキシ−Ｄ−イソロイシン））を確認することが出来た（表１）。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＮＳＡＲ（ＧｓＮＳＡ）を使用した場合に対して、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のＮＳＡＲ（ＣａＮＳＡＲ）を使用した場合の方が、反応効率が高かったため、以後の実施例では、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のＮＳＡＲを使用した。いずれのＮＳＡＲを用いた場合も反応温度が３７℃の場合の方が２８℃の場合よりも反応効率が高かった。【００６４】
【表１】
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【００６５】
［実施例２］（２Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシイソロイシンの製造
Ｌ−イソロイシン（６．５ｇ）を１００ｍｌの水に溶解し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８〜９に調整した。５ｇの無水コハク酸を添加し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８〜９に保ちながら完全に溶解させた。さらに少量の無水コハク酸を同様に添加し、ＴＬＣプレート上でのニンヒドリン発色がなくなるまでこの操作を繰り返した。塩酸溶液で中和後、凍結乾燥することでＮ−サクシニル−Ｌ−イソロイシンの２ナトリウム塩を１３ｇ得た。次いで、参考例１と同様にして得られたＳａｄＡを発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）を反応液１０ｍｌ（５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、４５ｍＭ  ２−オキソグルタル酸、１０ｍＭ  アスコルビン酸、０．５ｍＭ  ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ、３０ｍＭ  Ｎ−サクシニル−Ｌ−イソロイシン）に懸濁し、３０℃、２０時間、反応させた。続いて、反応液に最終濃度１ｍＭとなるようにＣｏＣｌ２を添加し、参考例５と同様にして得られたＮＳＡＲを発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）及び参考例８と同様にして得られたＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ）を発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）を懸濁し、３０℃、２０時間、反応させた。【００６６】
得られた反応液１０μｌをウォーターズ社ＡｃｃＱ・Ｔａｇメソッドを用いて誘導体化した。このサンプルを下記条件の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）にて分離分析することにより、アミノ酸の反応生成物（（２Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシイソロイシン（３−ヒドロキシ−Ｄ−イソロイシン））を測定した。
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ５μｍ（２．１×１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）溶離液Ａ：酢酸アンモニウム（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５）
溶離液Ｂ：メタノール（０〜１５ｍｉｎ（２０→６０％）、１５〜１５．１ｍｉｎ（２０％→８０％）、１５．１〜２０ｍｉｎ（２０％）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
温度：３０℃
検出：質量分析計（ポジティブイオンモード）【００６７】
図１に示すとおり、ＨＰＬＣ上で分子量３１８を示す新規ピークを検出したことから、（２Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシイソロイシンの生成が確認できた。脱水物と考えられる分子量３００のピークはＳａｄＡによる水酸化反応の際に生じる副産物であり、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ及びＤ−サクシニラーゼ反応においては脱水物の増加は観察されなかった。【００６８】
［実施例３］（２Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシロイシンの製造
Ｌ−ロイシン（６．５ｇ）を１００ｍｌの水に溶解し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８〜９に調整した。５ｇの無水コハク酸を添加し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８〜９に保ちながら完全に溶解させた。さらに少量の無水コハク酸を同様に添加し、ＴＬＣプレート上でのニンヒドリン発色がなくなるまでこの操作を繰り返した。塩酸溶液で中和後、凍結乾燥することでＮ−サクシニル−Ｌ−ロイシン１３ｇを得た。次いで、
参考例１と同様にして得られたＳａｄＡを発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）を反応液１０ｍｌ（５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、４５ｍＭ  ２−オキソグルタル酸、１０ｍＭ  アスコルビン酸、０．５ｍＭ  ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ、３０ｍＭ  Ｎ−サクシニル−Ｌ−ロイシン）に懸濁し、３０℃、２０時間、反応させた。続いて、反応液に最終濃度１ｍＭとなるようにＣｏＣｌ２を添加し、参考例５と同様にして得られたＮＳＡＲを発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）及び参考例８と同様にして得られたＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ）を発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）を懸濁し、３０℃、２０時間、反応させた。【００６９】
得られた反応液１０μｌをウォーターズ社ＡｃｃＱ・Ｔａｇメソッドを用いて誘導体化した。このサンプルを下記条件の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）にて分離分析することにより、アミノ酸の反応生成物（（２Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシロイシン（３−ヒドロキシ−Ｄ−ロイシン））を測定した。
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ５μｍ（２．１×１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）溶離液A：酢酸アンモニウム（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５）
溶離液B：メタノール（０〜１５ｍｉｎ（２０→６０％）、１５〜１５．１ｍｉｎ（２０％→８０％）、１５．１〜２０ｍｉｎ（２０％）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
温度：３０℃
検出：質量分析計（ポジティブイオンモード）【００７０】
図２に示すとおり、ＨＰＬＣ上で分子量３１８を示す新規ピークを検出したことから、（２Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシロイシンの生成が確認できた。一方で脱水物と考えられる分子量３００のピーク生成は観察されなかった。【００７１】
［実施例４］（２Ｒ）−３−ヒドロキシバリンの製造
Ｌ−バリン（５．８ｇ）を１００ｍｌの水に溶解し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８〜９に調整した。５ｇの無水コハク酸を添加し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８〜９に保ちながら完全に溶解させた。さらに少量の無水コハク酸を同様に添加し、ＴＬＣプレート上でのニンヒドリン発色がなくなるまでこの操作を繰り返した。塩酸溶液で中和後、凍結乾燥する事でＮ−サクシニル−Ｌ−バリン１２ｇを得た。次いで、参考例１と同様にして得られたＳａｄＡを発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）を反応液１０ｍｌ（５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、４５ｍＭ  ２−オキソグルタル酸、１０ｍＭ  アスコルビン酸、０．５ｍＭ  ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ、３０ｍＭ  Ｎ−サクシニル−Ｌ−バリン）に懸濁し、３０℃、２０時間、反応させた。続いて、反応液に最終濃度１ｍＭとなるようにＣｏＣｌ２を添加し、参考例５と同様にして得られたＮＳＡＲを発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）及び参考例８と同様にして得られたＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ）を発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）を懸濁し、３０℃、２０時間、反応させた。【００７２】
得られた反応液１０μｌをウォーターズ社ＡｃｃＱ・Ｔａｇメソッドを用いて誘導体化した。このサンプルを下記条件の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）にて分離分析することにより、アミノ酸の反応生成物（（２Ｒ）−３−ヒドロキシバリン（３−ヒドロキシ−Ｄ−バリン））を測定した。
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ５μｍ（２．１×１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）溶離液Ａ：酢酸アンモニウム（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５）
溶離液Ｂ：メタノール（０〜１５ｍｉｎ（２０→６０％）、１５〜１５．１ｍｉｎ（２０％→８０％）、１５．１〜２０ｍｉｎ（２０％）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
温度：３０℃
検出：質量分析計（ポジティブイオンモード）【００７３】
図３に示すとおり、ＨＰＬＣ上で分子量３０４を示す新規ピークを検出したことから、（２Ｒ）−３−ヒドロキシバリンの生成が確認できた。脱水物と考えられる分子量２８６のピークはＳａｄＡによる水酸化反応の際に生じる副産物であり、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ及びＤ−サクシニラーゼ反応においては脱水物の増加は観察されなかった。【００７４】
［実施例５］（２Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシノルロイシンの製造
Ｌ−ノルロイシン（６．５ｇ）を１００ｍｌの水に溶解し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８〜９に調整した。５ｇの無水コハク酸を添加し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８〜９に保ちながら完全に溶解させた。さらに少量の無水コハク酸を同様に添加し、ＴＬＣプレート上でのニンヒドリン発色がなくなるまでこの操作を繰り返した。塩酸溶液で中和後、凍結乾燥する事でＮ−サクシニル−Ｌ−ノルロイシン１３ｇを得た。次いで、参考例１と同様にして得られたＳａｄＡを発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）を反応液１０ｍｌ（５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、４５ｍＭ  ２−オキソグルタル酸、１０ｍＭ  アスコルビン酸、０．５ｍＭ  ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ、３０ｍＭ  Ｎ−サクシニル−Ｌ−ノルロイシン）に懸濁し、３０℃、２０時間、反応させた。続いて、反応液に最終濃度１ｍＭとなるようにＣｏＣｌ２を添加し、参考例５と同様にして得られたＮＳＡＲを発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）及び参考例８と同様にして得られたＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ）を発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）を懸濁し、３０℃、２０時間、反応させた。【００７５】
得られた反応液１０μｌをウォーターズ社ＡｃｃＱ・Ｔａｇメソッドを用いて誘導体化した。このサンプルを下記条件の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）にて分離分析することにより、アミノ酸の反応生成物（（２Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシノルロイシン（３−ヒドロキシ−Ｄ−ノルロイシン））を測定した。
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ５μｍ（２．１×１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）溶離液Ａ：酢酸アンモニウム（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５）
溶離液Ｂ：メタノール（０〜１５ｍｉｎ（２０→６０％）、１５〜１５．１ｍｉｎ（２０％→８０％）、１５．１〜２０ｍｉｎ（２０％）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
温度：３０℃
検出：質量分析計（ポジティブイオンモード）【００７６】
図４に示すとおり、ＨＰＬＣ上で分子量３１８を示す新規ピークを検出したことから、（２Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシノルロイシンの生成が確認できた。一方で脱水物と考えられる分子量３００のピーク生成は観察されなかった。【００７７】
［実施例６］（２Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシノルバリンの製造
Ｌ−ノルバリン（５．８ｇ）を１００ｍｌの水に溶解し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８〜９に調整した。５ｇの無水コハク酸を添加し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８〜９に保ちながら完全に溶解させた。さらに少量の無水コハク酸を同様に添加し、ＴＬＣプレート上でのニンヒドリン発色がなくなるまでこの操作を繰り返した。塩酸溶液で中和後、凍結乾燥する事でＮ−サクシニル−Ｌ−ノルバリン１２ｇを得た。次いで、参考例１と同様にして得られたＳａｄＡを発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）を反応液１０ｍｌ（５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、４５ｍＭ  ２−オキソグルタル酸、１０ｍＭ  アスコルビン酸、０．５ｍＭ  ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ、３０ｍＭ  Ｎ−サクシニル−Ｌ−ノルバリン）に懸濁し、３０℃、２０時間、反応させた。続いて、反応液に最終濃度１ｍＭとなるようにＣｏＣｌ２を添加し、参考例５と同様にして得られたＮＳＡＲを発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）及び参考例８と同様にして得られたＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ）を発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）を懸濁し、３０℃、２０時間、反応させた。【００７８】
得られた反応液１０μｌをウォーターズ社ＡｃｃＱ・Ｔａｇメソッドを用いて誘導体化した。このサンプルを下記条件の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）にて分離分析することにより、アミノ酸の反応生成物（（２Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシノルバリン（３−ヒドロキシ−Ｄ−ノルバリン））を測定した。
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ５μｍ（２．１×１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）溶離液Ａ：酢酸アンモニウム（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５）
溶離液Ｂ：メタノール（０〜１５ｍｉｎ（２０→６０％）、１５〜１５．１ｍｉｎ（２０％→８０％）、１５．１〜２０ｍｉｎ（２０％）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
温度：３０℃
検出：質量分析計（ポジティブイオンモード）【００７９】
図５に示すとおり、ＨＰＬＣ上で分子量３０４を示す新規ピークを検出したことから、（２Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシノルバリンの生成が確認できた。一方で脱水物と考えられる分子量２８６のピーク生成は観察されなかった。【００８０】
［実施例７］（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンの製造 
参考例３と同様にして得られたＩＤＯを発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）を反応液１０ｍｌ（５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）、４５ｍＭ  ２−オキソグルタル酸、１０ｍＭ  アスコルビン酸、０．５ｍＭ  ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ、３０ｍＭ  Ｌ−イソロイシン）に懸濁し、２５℃、２０時間、反応させた。反応液のｐＨを２に調整した後、遠心分離により上清を回収した。上清を強酸性陽イオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸ  ５０Ｗ×８）に加えた後、蒸留水で３回洗浄し、１Ｍ  ＮＨ４ＯＨで溶出した。さらに溶出液を強塩基性陰イオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸ  １×８）に加えた後、蒸留水で３回洗浄し、１Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＨで溶出した。溶出液をＮＨ４ＯＨで中和後、凍結乾燥し、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンを得た。
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン（７．３ｇ）を１００ｍｌの水に溶解し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８〜９に調整した。５．６ｇの無水コハク酸を添加し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８〜９に保ちながら完全に溶解させた。さらに少量の無水コハク酸を同様に添加し、ＴＬＣプレート上でのニンヒドリン発色がなくなるまでこの操作を繰り返した。塩酸溶液で中和後、凍結乾燥する事でＮ−サクシニル−（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン１４．６ｇを得た。続いて参考例５と同様にして得られたＮＳＡＲを発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）及び参考例８と同様にして得られたＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ）を発現した菌体（培養液１００ｍｌ分）を反応液１０ｍｌ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＣｏＣｌ２、３０ｍＭ  Ｎ−サクシニル−（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン）となるよう懸濁し、３０℃、２０時間、反応させた。【００８１】
得られた反応液１０μｌをウォーターズ社ＡｃｃＱ・Ｔａｇメソッドを用いて誘導体化した。このサンプルを下記条件の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）にて分離分析することにより、アミノ酸の反応生成物（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン（４−ヒドロキシ−Ｄ−イソロイシン））を測定した。
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ５μｍ（２．１×１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）溶離液Ａ：酢酸アンモニウム（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５）
溶離液Ｂ：メタノール（０〜１５ｍｉｎ（２０→６０％）、１５〜１５．１ｍｉｎ（２０％→８０％）、１５．１〜２０ｍｉｎ（２０％）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
温度：３０℃
検出：質量分析計（ポジティブイオンモード）、蛍光検出器（励起波長２５０ｎｍ、検出波長３９５ｎｍ）【００８２】
図６に示すとおり、ＨＰＬＣ上で蛍光検出器により測定された反応液中に生成したアミノ酸の主要なピークは、分子量３１８を示す（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンであった。その他、分子量３１８の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンのピーク、および分子量３００の脱水物と考えられるピークも測定されたがその生成量はわずかであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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