(57)【要約】  嫌気性アーキアである組換え細胞であって、第１外来遺伝子として、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子、モノテルペン合成酵素をコードする遺伝子、セスキテルペン合成酵素をコードする遺伝子、ジテルペン合成酵素をコードする遺伝子、スクアレン合成酵素をコードする遺伝子、又はフィトエン合成酵素をコードする遺伝子を有し、当該第１外来遺伝子が発現し、イソプレン又は炭素数１０、１５、２０、３０若しくは４０のテルペンを生産可能である組換え細胞が提供される。
2018079619.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気性アーキアである組換え細胞であって、
第１外来遺伝子として、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子、モノテルペン合成酵素をコードする遺伝子、セスキテルペン合成酵素をコードする遺伝子、ジテルペン合成酵素をコードする遺伝子、スクアレン合成酵素をコードする遺伝子、又はフィトエン合成酵素をコードする遺伝子を有し、
当該第１外来遺伝子が発現し、イソプレン又は炭素数１０、１５、２０、３０若しくは４０のテルペンを生産可能である組換え細胞。
【請求項２】
一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、メタノール、及び酢酸からなる群より選ばれた少なくとも１つを唯一の炭素源として増殖可能である、請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項３】
一酸化炭素脱水素酵素を有する、請求項１又は２に記載の組換え細胞。
【請求項４】
メチルテトラヒドロプテリン、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項５】
メタン生成能を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項６】
二酸化炭素を唯一の炭素源とし、水素をエネルギー源として生育可能である、請求項１〜５のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項７】
メタノールを唯一の炭素源として生育可能である、請求項１〜６のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項８】
メタンを唯一の炭素源として生育可能である、請求項１〜７のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項９】
Methanosarcina属、Methanococcus属、Methanothermococcus属、Methanothermobacter属、Methanothrix属、Thermococcus属、Thermofilum属、又はArchaeoglobus属に属するものである、請求項１〜８のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１０】
Methanosarcina属、Methanococcus属、又はMethanothermococcus属に属するものである、請求項１〜８のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１１】
Methanosarcina barkeri、Methanosarcina mazei、Methanosarcina acetivorans、Methanococcus voltae、Methanococcus vannielii、Methanococcus maripaludis、又はMethanothermococcus (Methanococcus) thermolithotrophicusである、請求項１０に記載の組換え細胞。
【請求項１２】
さらに、第２外来遺伝子として一酸化炭素脱水素酵素をコードする遺伝子を有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１３】
前記第１外来遺伝子がイソプレン合成酵素をコードする遺伝子であり、
イソプレンを生産可能であり、
前記イソプレン合成酵素が植物由来のものである、請求項１〜１２のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１４】
前記イソプレン合成酵素が、下記（ａ−１）、（ａ−２）、又は（ａ−３）のタンパク質である、請求項１３に記載の組換え細胞。
（ａ−１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ａ−２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ａ−３）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１５】
さらに、第３外来遺伝子としてイソペンテニル二リン酸異性化酵素をコードする遺伝子を有する、請求項１３又は１４に記載の組換え細胞。
【請求項１６】
前記第１外来遺伝子がセスキテルペン合成酵素をコードする遺伝子であり、
炭素数１５のテルペンを生産可能であり、
前記セスキテルペン合成酵素がファルネセン合成酵素である、請求項１〜１２のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１７】
前記第１外来遺伝子がセスキテルペン合成酵素をコードする遺伝子であり、
炭素数１５のテルペンを生産可能であり、
前記セスキテルペン合成酵素が環式セスキテルペン合成酵素である、請求項１〜１２のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１８】
前記ファルネセン合成酵素が、下記（ｄ−１）、（ｄ−２）、又は（ｄ−３）のタンパク質である、請求項１６に記載の組換え細胞。
（ｄ−１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ−２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつファルネセン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ｄ−３）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつファルネセン合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１９】
さらに、第４外来遺伝子としてイソペンテニル二リン酸異性化酵素をコードする遺伝子を有する、請求項１６〜１８のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項２０】
さらに、第５外来遺伝子として、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子及びファルネシル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子からなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子を有する、請求項１６〜１９のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項２１】
前記第１外来遺伝子がモノテルペン合成酵素をコードする遺伝子であり、
炭素数１０のテルペンを生産可能であり、
前記モノテルペン合成酵素が環式モノテルペン合成酵素である、請求項１〜１２のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項２２】
さらに、第６外来遺伝子としてイソペンテニル二リン酸異性化酵素をコードする遺伝子を有する、請求項２１に記載の組換え細胞。
【請求項２３】
さらに、第７外来遺伝子としてゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子を有する、請求項２１又は２２に記載の組換え細胞。
【請求項２４】
さらに、第８外来遺伝子としてネリル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子を有する、請求項２１又は２２に記載の組換え細胞。
【請求項２５】
前記環式モノテルペン合成酵素がフェランドレン合成酵素である、請求項２１〜２４のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項２６】
前記フェランドレン合成酵素が、下記（ｂ−１）、（ｂ−２）、又は（ｂ−３）のタンパク質である、請求項２５に記載の組換え細胞。
（ｂ−１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ−２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−フェランドレン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ｂ−３）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつα−フェランドレン合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２７】
前記フェランドレン合成酵素が、下記（ｃ−１）、（ｃ−２）、又は（ｃ−３）のタンパク質である、請求項２５に記載の組換え細胞。
（ｃ−１）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ−２）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−フェランドレン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ−３）配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつβ−フェランドレン合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２８】
前記第１外来遺伝子がジテルペン合成酵素をコードする遺伝子であり、
炭素数２０のテルペンを生産可能であり、
前記ジテルペン合成酵素が環式ジテルペン合成酵素である、請求項１〜１２のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項２９】
さらに、第９外来遺伝子としてコパリル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子を有する、請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３０】
さらに、第１０外来遺伝子としてイソペンテニル二リン酸異性化酵素をコードする遺伝子を有する、請求項２８又は２９に記載の組換え細胞。
【請求項３１】
さらに、第１１外来遺伝子として、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子、ファルネシル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子、及びゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子からなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子を有する、請求項２８〜３０のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項３２】
前記第１外来遺伝子がスクアレン合成酵素をコードする遺伝子であり、
炭素数３０のテルペンを生産可能であり、
さらに、第１２外来遺伝子としてイソペンテニル二リン酸異性化酵素をコードする遺伝子を有する、請求項１〜１２のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項３３】
さらに、第１３外来遺伝子として、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子及びファルネシル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子からなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子を有する、請求項３２に記載の組換え細胞。
【請求項３４】
前記第１外来遺伝子がフィトエン合成酵素をコードする遺伝子であり、
炭素数４０のテルペンを生産可能であり、
さらに、第１４外来遺伝子としてイソペンテニル二リン酸異性化酵素をコードする遺伝子を有する、請求項１〜１２のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項３５】
さらに、第１５外来遺伝子として、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子、ファルネシル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子、及びゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素からなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子を有する、請求項３４に記載の組換え細胞。
【請求項３６】
さらに、第１６外来遺伝子として、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸−５−キナーゼ、５−ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニルリン酸キナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子を有する、請求項１〜３５のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項３７】
前記第１外来遺伝子が、構成発現プロモーターの下で発現している、請求項１〜３６のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれかに記載の組換え細胞に、一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、メタノール、及び酢酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの炭素源を接触させ、当該組換え細胞に前記炭素源からイソプレン又は炭素数１０、１５、２０、３０若しくは４０のテルペンを生産させる、イソプレン又はテルペンの生産方法。
【請求項３９】
前記組換え細胞を、一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、メタノール、及び酢酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの炭素源として用いて培養し、その培養物からイソプレン又は炭素数１０、１５、２０、３０若しくは４０のテルペンを取得する、請求項３８に記載のイソプレン又はテルペンの生産方法。
【請求項４０】
増殖定常期の培養液の細胞濃度が１ｇ乾燥細胞／リットル以上であり、
培地の供給と培養液の排出を連続的に行う、請求項３８又は３９に記載のイソプレン又はテルペンの生産方法。
【請求項４１】
前記組換え細胞を培養槽内で培養するものであり、
一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素からなる混合ガスを前記培養槽に供給する、請求項３８〜４０のいずれかに記載のイソプレン又はテルペンの生産方法。
【請求項４２】
前記混合ガスの一酸化炭素濃度が２０％以上である、請求項４１に記載のイソプレン又はテルペンの生産方法。
【請求項４３】
前記混合ガスの二酸化炭素濃度が５％以上である、請求項４１又は４２に記載のイソプレン又はテルペンの生産方法。
【請求項４４】
前記混合ガスの硫化水素濃度が１０ｐｐｍ以下である、請求項４１〜４３のいずれかに記載のイソプレン又はテルペンの生産方法。
【請求項４５】
さらに培養液中にメタノール及び／又は酢酸を添加する、請求項４１〜４４のいずれかに記載のイソプレン又はテルペンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え細胞、並びに、イソプレン又はテルペンの生産方法に関し、さらに詳細には、アーキアである組換え細胞であってイソプレン又はテルペンを生産可能な組換え細胞、並びに、当該組換え細胞を用いたイソプレン又はテルペンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、廃棄物等の燃焼ガスである合成ガス（ＣＯ、ＣＯ2、Ｈ2の混合ガス）より微生物を用いて石化代替化学品を製造する技術開発が進められている。中でもタイヤ原料であるイソプレンの石化代替プロセスの構築は重要であり、Clostridium属に属する組換え合成ガス資化性細菌を用いたイソプレン、テルペンの生産技術が検討されている（例えば、特許文献１〜３）。しかしながら従来技術においては、外来の目的物合成遺伝子を強力な構成発現プロモーター下で発現させているにもかかわらず、宿主細胞による負の制御を受けるため、低い生産性しか得られていない。【０００３】
一方、野生型の枯草菌や、組換え大腸菌、組換え酵母等によるイソプレン若しくはテルペンの生産も従来より試みられているが、依然としてコスト高であり、実用化が困難なのが現状である。また、イソプレン、テルペンの合成代謝は、殆どの生物において厳密に制御されており、組換え微生物によるイソプレン及びテルペン生産において、事業化に見合うレベルの生産が実証された例は見当たらない。特許文献１、特許文献３では構成発現系を用いるイソプレン生産が検証されているが、その生産性は極めて少なく、野生型のそれに比べて数倍程度である。【０００４】
異種メバロン酸経路遺伝子、及びイソプレン合成酵素遺伝子が導入された組換え大腸菌によるグルコースからのイソプレンの大量生産（収率:６０ｇ／Ｌ）も実証されている（非特許文献１）。この技術では、ＩＰＴＧによる誘導によってグルコースからのイソプレン生産を促進している。しかしながら、グルコースを原料とするプロセスは、原料供給が制限的であるという欠点がある。さらに誘導発現系を使用する物質生産は、炭素転化率が低い（１５％以下）上に、連続式プロセスではなくバッチ式プロセスであるため、イソプレンを生産するには事業的に不向きである。【０００５】
また、メチロトローフ（Methylotroph）であるMethanobacterium extroquenceによって異種メバロン酸経路遺伝子、及びα−フムレン（Ｃ１５環式テルペン）合成酵素遺伝子を含むオペロン遺伝子を構成的に発現させた場合には、本経路遺伝子発現に起因する毒性によって形質転換体は得られず、厳密な制御活性を有する誘導発現法によってのみ効率的にα−フムレンが生産されることが報告されている（非特許文献２）。
以上のように、微生物によるイソプレン、テルペン生産は、数多く検討されてきているにも関わらず、未だ実用化レベルの生産性に至った例は極めて少なく、より効率的な微生物プロセスの確立が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１８０５８４号
【特許文献２】国際公開第２０１３／１８１６４７号
【特許文献３】国際公開第２０１４／０６５２７１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Whited GM et al., Industrial biotechnology 2010, 6 (3), 152-163
【非特許文献２】Sonntag F. et al., Metabolic Engineering 2015, 32, 82-94
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一方、天然のアーキア、アーキア変異体、アーキア組換え体、等のアーキアを用いてイソプレン又はテルペンを生産する技術については、具体的な報告は見当たらない。そこで本発明は、合成ガス、メタノール、メタン等の豊富かつ安価な原料からイソプレン又はテルペンを効率的に生産可能な組換えアーキア細胞、並びに、それを用いたイソプレン又はテルペンの生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の１つの様相は、嫌気性アーキアである組換え細胞であって、第１外来遺伝子として、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子、モノテルペン合成酵素をコードする遺伝子、セスキテルペン合成酵素をコードする遺伝子、ジテルペン合成酵素をコードする遺伝子、スクアレン合成酵素をコードする遺伝子、又はフィトエン合成酵素をコードする遺伝子を有し、当該第１外来遺伝子が発現し、イソプレン又は炭素数１０、１５、２０、３０若しくは４０のテルペンを生産可能である組換え細胞である。【００１０】
組換え細胞は、好ましくは、一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、メタノール、及び酢酸からなる群より選ばれた少なくとも１つを唯一の炭素源として増殖可能である。【００１１】
組換え細胞は、好ましくは、一酸化炭素脱水素酵素を有するものである。【００１２】
組換え細胞は、好ましくは、メチルテトラヒドロプテリン、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する。【００１３】
組換え細胞は、好ましくは、メタン生成能を有する。【００１４】
組換え細胞は、好ましくは、二酸化炭素を唯一の炭素源とし、水素をエネルギー源として生育可能である。【００１５】
組換え細胞は、好ましくは、メタノールを唯一の炭素源として生育可能である。【００１６】
組換え細胞は、好ましくは、メタンを唯一の炭素源として生育可能である。【００１７】
組換え細胞は、好ましくは、Methanosarcina属、Methanococcus属、Methanothermococcus属、Methanothermobacter属、Methanothrix属、Thermococcus属、Thermofilum属、又はArchaeoglobus属に属するものである。【００１８】
組換え細胞は、好ましくは、Methanosarcina属、Methanococcus属、又はMethanothermococcus属に属するものである。【００１９】
組換え細胞は、好ましくは、Methanosarcina barkeri、Methanosarcina mazei、Methanosarcina acetivorans、Methanococcus voltae、Methanococcus vannielii、Methanococcus maripaludis、又はMethanothermococcus (Methanococcus) thermolithotrophicusである。【００２０】
組換え細胞は、好ましくは、さらに、第２外来遺伝子として一酸化炭素脱水素酵素をコードする遺伝子を有する。【００２１】
組換え細胞は、好ましくは、前記第１外来遺伝子がイソプレン合成酵素をコードする遺伝子であり、イソプレンを生産可能であり、前記イソプレン合成酵素が植物由来のものである。【００２２】
組換え細胞は、好ましくは、前記イソプレン合成酵素が、下記（ａ−１）、（ａ−２）、又は（ａ−３）のタンパク質である。
（ａ−１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ａ−２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ａ−３）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素活性を有するタンパク質。【００２３】
組換え細胞は、好ましくは、さらに、第３外来遺伝子としてイソペンテニル二リン酸異性化酵素をコードする遺伝子を有する。【００２４】
組換え細胞は、好ましくは、前記第１外来遺伝子がセスキテルペン合成酵素をコードする遺伝子であり、炭素数１５のテルペンを生産可能であり、前記セスキテルペン合成酵素がファルネセン合成酵素である。【００２５】
組換え細胞は、好ましくは、前記第１外来遺伝子がセスキテルペン合成酵素をコードする遺伝子であり、炭素数１５のテルペンを生産可能であり、前記セスキテルペン合成酵素が環式セスキテルペン合成酵素である。【００２６】
組換え細胞は、好ましくは、前記ファルネセン合成酵素が、下記（ｄ−１）、（ｄ−２）、又は（ｄ−３）のタンパク質である。
（ｄ−１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ−２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつファルネセン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ｄ−３）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつファルネセン合成酵素活性を有するタンパク質。【００２７】
組換え細胞は、好ましくは、さらに、第４外来遺伝子としてイソペンテニル二リン酸異性化酵素をコードする遺伝子を有する。【００２８】
組換え細胞は、好ましくは、さらに、第５外来遺伝子として、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子及びファルネシル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子からなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子を有する。【００２９】
組換え細胞は、好ましくは、前記第１外来遺伝子がモノテルペン合成酵素をコードする遺伝子であり、炭素数１０のテルペンを生産可能であり、前記モノテルペン合成酵素が環式モノテルペン合成酵素である。【００３０】
組換え細胞は、好ましくは、さらに、第６外来遺伝子としてイソペンテニル二リン酸異性化酵素をコードする遺伝子を有する。【００３１】
組換え細胞は、好ましくは、さらに、第７外来遺伝子としてゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子を有する。【００３２】
組換え細胞は、好ましくは、さらに、第８外来遺伝子としてネリル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子を有する。【００３３】
組換え細胞は、好ましくは、前記環式モノテルペン合成酵素がフェランドレン合成酵素である。【００３４】
組換え細胞は、好ましくは、前記フェランドレン合成酵素が、下記（ｂ−１）、（ｂ−２）、又は（ｂ−３）のタンパク質である。
（ｂ−１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ−２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−フェランドレン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ｂ−３）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつα−フェランドレン合成酵素活性を有するタンパク質。【００３５】
組換え細胞は、好ましくは、前記フェランドレン合成酵素が、下記（ｃ−１）、（ｃ−２）、又は（ｃ−３）のタンパク質である。
（ｃ−１）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ−２）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−フェランドレン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ−３）配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつβ−フェランドレン合成酵素活性を有するタンパク質。【００３６】
組換え細胞は、好ましくは、前記第１外来遺伝子がジテルペン合成酵素をコードする遺伝子であり、炭素数２０のテルペンを生産可能であり、前記ジテルペン合成酵素が環式ジテルペン合成酵素である。【００３７】
組換え細胞は、好ましくは、さらに、第９外来遺伝子としてコパリル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子を有する。【００３８】
組換え細胞は、好ましくは、さらに、第１０外来遺伝子としてイソペンテニル二リン酸異性化酵素をコードする遺伝子を有する。【００３９】
組換え細胞は、好ましくは、さらに、第１１外来遺伝子として、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子、ファルネシル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子、及びゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子からなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子を有する。【００４０】
組換え細胞は、好ましくは、前記第１外来遺伝子がスクアレン合成酵素をコードする遺伝子であり、炭素数３０のテルペンを生産可能であり、さらに、第１２外来遺伝子としてイソペンテニル二リン酸異性化酵素をコードする遺伝子を有する。【００４１】
組換え細胞は、好ましくは、さらに、第１３外来遺伝子として、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子及びファルネシル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子からなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子を有する。【００４２】
組換え細胞は、好ましくは、前記第１外来遺伝子がフィトエン合成酵素をコードする遺伝子であり、炭素数４０のテルペンを生産可能であり、さらに、第１４外来遺伝子としてイソペンテニル二リン酸異性化酵素をコードする遺伝子を有する。【００４３】
組換え細胞は、好ましくは、さらに、第１５外来遺伝子として、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子、ファルネシル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子、及びゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素からなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子を有する。【００４４】
組換え細胞は、好ましくは、さらに、第１６外来遺伝子として、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸−５−キナーゼ、５−ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルリン酸キナーゼ、及びイソペンテニル二リン酸異性化酵素からなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子を有する。【００４５】
組換え細胞は、好ましくは、前記第１外来遺伝子が、構成発現プロモーターの下で発現している。【００４６】
本発明の他の様相は、上記の組換え細胞に、一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、メタノール、及び酢酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの炭素源を接触させ、当該組換え細胞に前記炭素源からイソプレン又は炭素数１０、１５、２０、３０若しくは４０のテルペンを生産させる、イソプレン又はテルペンの生産方法である。【００４７】
前記方法は、好ましくは、前記組換え細胞を、一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、メタノール、及び酢酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの炭素源として用いて培養し、その培養物からイソプレン又は炭素数１０、１５、２０、３０若しくは４０のテルペンを取得することを含む。【００４８】
前記方法は、好ましくは、増殖定常期の培養液の細胞濃度が１ｇ乾燥細胞／リットル以上であり、培地の供給と培養液の排出を連続的に行うことを含む。【００４９】
前記方法は、好ましくは、前記組換え細胞を培養槽内で培養するものであり、一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素からなる混合ガスを前記培養槽に供給することを含む。【００５０】
前記方法は、好ましくは、前記混合ガスの一酸化炭素濃度が２０％以上である。【００５１】
前記方法は、好ましくは、前記混合ガスの二酸化炭素濃度が５％以上である。【００５２】
前記方法は、好ましくは、前記混合ガスの硫化水素濃度が１０ｐｐｍ以下である。【００５３】
前記方法は、好ましくは、さらに培養液中にメタノール及び／又は酢酸を添加することを含む。
【発明の効果】
【００５４】
本発明によれば、組換え細胞を用いたイソプレン又はテルペンの生産を高効率で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】アーキアにおけるメバロン酸経路と膜脂質合成経路を表す説明図である。
【図２】メバロン酸からイソペンテニル二リン酸が合成される経路の多様性を表す説明図である。
【図３】メタン生成アーキアMethanosarcina acetivoransの一酸化炭素及び酢酸資化代謝の経路を表す説明図である。
【図４】アーキアにおけるメタノール及びメタン資化経路を表す説明図である。
【図５】イソプレン生産用シャトルベクターpAC:Pmcr-IDI-IspSの構成を表す説明図である。
【図６】ファルネセン生産用シャトルベクターpAC:Pmcr-IDI-FnSの構成を表す説明図である。
【図７】ファルネセン生産用シャトルベクターpAC:Pmcr-IDI-FnS-FPSの構成を表す説明図である。
【図８】イソプレン生産用シャトルベクターpAC:Pmcr-MVA1-IDI-IspSの構成を表す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明において「遺伝子」という用語は、全て「核酸」あるいは「ＤＮＡ」という用語に置き換えることができる。
【００５７】
本発明の組換え細胞は、嫌気性アーキアに属するものである。一般に、アーキアの膜脂質は、グリセロール骨格に、イソプレン骨格から成る炭化水素（炭素数２０〜４０）がエーテル結合したエーテル型極性脂質である。このアーキア特有の膜脂質は、図１に示されるように、Ｃ２０であるゲラニルゲラニル二リン酸（geranylgeranyl diphosphate（ＧＧＰＰ））及びグリセロール−１−リン酸（sn-glycerol 1-phosphate）からゲラニルゲラニルグリセロールリン酸（3-O-geranylgeranyl sn-glycerol-1-phosphate（ＧＧＧＰ））が生成し、その後２段階の反応を経て合成される。ゲラニルゲラニル二リン酸（炭素数２０）は、図１に示されるように、アーキアが有する内在性のメバロン酸経路によって供給されるイソペンテニル二リン酸（isopentenyl diphosphate（ＩＰＰ）、炭素数５）、ゲラニル二リン酸（geranyl diphosphate（ＧＰＰ）、炭素数１０）、及びファルネシル二リン酸（farnesyl diphosphate（ＦＰＰ）、炭素数１５）を経て合成される。このようにアーキアでは、他の生物と異なり、増殖に伴う膜脂質合成のために、常に多量のゲラニルゲラニル二リン酸がメバロン酸経路を経て供給されている。本発明は、上記のようなアーキア特有の主要代謝を利用して、組換え細胞によるイソプレン又は炭素数１０〜４０のテルペンの生産を効率よく行うものである。
【００５８】
嫌気性アーキアとは、分子状酸素がほとんど存在しない条件下（１００ｐｐｍ以下）で増殖できるアーキアをいう。本発明における嫌気性アーキアには、絶対嫌気性と通性嫌気性の両方のアーキアが含まれる。
【００５９】
本発明において、第１外来遺伝子としてイソプレン合成酵素遺伝子を有する組換え細胞は、イソプレンを生産可能である。また、第１外来遺伝子としてモノテルペン合成酵素遺伝子を有する組換え細胞は、モノテルペン（炭素数１０のテルペン）を生産可能である。また、第１外来遺伝子としてセスキテルペン合成酵素遺伝子を有する組換え細胞は、セスキテルペン（炭素数１５のテルペン）を生産可能である。また、第１外来遺伝子としてジテルペン合成酵素遺伝子を有する組換え細胞は、ジテルペン（炭素数２０のテルペン）を生産可能である。また、第１外来遺伝子としてスクアレン合成酵素遺伝子を有する組換え細胞は、トリテルペン（炭素数３０のテルペン）を生産可能である。また、第１外来遺伝子としてフィトエン合成酵素遺伝子を有する組換え細胞は、テトラテルペン（炭素数４０のテルペン）を生産可能である。以下、各酵素及び遺伝子について順次説明する。
【００６０】
＜イソプレン合成酵素＞
イソプレン合成酵素（イソプレンシンターゼ、isoprene synthase、ＩｓｐＳ）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の異性体であるジメチルアリル二リン酸（dimethylallyl diphosphate（ＤＭＡＰＰ））をイソプレンに変換する作用を有する。なお、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸間の構造変換は、イソペンテニル二リン酸異性化酵素（isopentenyl diphosphate isomerase（ＩＤＩ））が触媒する。イソペンテニル二リン酸異性化酵素は全ての生物に存在する。
【００６１】
本発明で用いるイソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）としては特に限定はなく、例えば、植物等の真核生物由来のものを用いることができる。植物由来のイソプレン合成酵素としては、ポプラ（Populus nigra）、ムクナ、クズ由来のものが一般的であるが、これらに限定されない。イソプレン合成酵素の具体例としては、Q50L36、Q6EJ97、Q9AR86、Q7XAS7、A0PFK2、A0A0M4UQH9、A0A0M5MSL0（以上UniProtKB entry）等が挙げられる。
【００６２】
配列番号１にポプラ由来イソプレン合成酵素（GenBank Accession No.: AM410988.1）をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号２にアミノ酸配列のみを示す。
【００６３】
本発明で用いるイソプレン合成酵素については、天然で見いだされ且つ単離されたイソプレン合成酵素の他、これらの改変体であってもよい。例えば、既存のイソプレン合成酵素の部分断片やアミノ酸置換変異体であって且つイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質であってもよい。
【００６４】
例えば、本発明で用いるイソプレン合成酵素には、少なくとも、下記（ａ−１）〜（ａ−３）のタンパク質が含まれる。
（ａ−１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ａ−２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ａ−３）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素活性を有するタンパク質。
なお（ａ−３）におけるアミノ酸配列の同一性については、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上である。
【００６５】
好ましい実施形態では、イソプレン合成酵素遺伝子に加えて、外来遺伝子としてイソペンテニル二リン酸異性化酵素（ＩＤＩ）をコードする遺伝子をさらに有する。ＩＤＩ遺伝子を導入することで、ＩＰＰからＤＭＡＰＰへの変換が増強され、イソプレン合成能を増強することが可能となる。本発明で使用されるＩＤＩは特に限定されないが、P61615、Q13907、Q46822、P50740、Q8TT35、P15496、Q10132、Q9KWG2（以上UniProtKB entry）、等が例として挙げられる。また、本発明ではアーキア由来のＩＤＩを使用してもよく、例えばMethanosarcina属菌由来のQ8TT35、Q8PW37、Q46CL4、A0A0E3LM81、A0A0E3QQI3 (UniProtKB entry)、等を用いることが好ましい。
【００６６】
＜モノテルペン合成酵素＞
モノテルペンは２つのイソプレン単位から成る炭素数１０のテルペンである。モノテルペンには非環式と環式のものがある。非環式モノテルペンには、ゲラニオール、ミルセン、シトラール、リナロール、ネロール等がある。環式モノテルペンには、リモネン、α−フェランドレン、β−フェランドレン、メントール、チモール、α−ピネン、β−ピネン、カレン、カルボン、シネオール、カンファー等がある。
【００６７】
モノテルペン合成酵素は、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）又はネリル二リン酸（neryl diphosphate（ＮＰＰ））をモノテルペンに変換する酵素の総称である。モノテルペンの合成経路としては、ＧＰＰ合成酵素（GPP synthase（ＧＰＰＳ））又はＮＰＰ合成酵素（NPP synthase（ＮＰＰＳ））の作用によって、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からＧＰＰ又はＮＰＰが合成される。続いて、モノテルペン合成酵素の作用により、ＧＰＰ又はＮＰＰからモノテルペンが合成される。
【００６８】
好ましい実施形態では、モノテルペン合成酵素が環式モノテルペン合成酵素である。さらに好ましくは、環式モノテルペン合成酵素がフェランドレン合成酵素であり、具体的には、α−フェランドレン合成酵素又はβ−フェランドレン合成酵素である。
【００６９】
α−フェランドレン合成酵素としては、基質であるＧＰＰ又はＮＰＰからα−フェランドレンを生成させる活性のある酵素であればいずれのものも使用可能である。α−フェランドレン合成酵素の例としては、G5CV35、E5GAG2 (以上UniProtKB entry)、GN65-37361 (SolCyc GeneID)、等があるがこれらに限定されない。
【００７０】
β−フェランドレン合成酵素としては、基質であるＧＰＰ又はＮＰＰからβ−フェランドレンを生成させる活性のある酵素であればいずれのものも使用可能である。β−フェランドレン合成酵素の例としては、Q9M7D1、C1K5M3、Q1XBU4、R9QMW3、R9QMR4、R9QMW7、E9N3U9、C0PTH8、F2XFA5、F2XFA1、F2XFA4、A0A0B0P314 (以上UniProtKB entry)、等があるがこれらに限定されない。
【００７１】
本発明で用いるモノテルペン合成酵素については、天然で見いだされ且つ単離されたモノテルペン合成酵素の他、これらの改変体であってもよい。例えば、既存のモノテルペン合成酵素の部分断片やアミノ酸置換変異体であって且つモノテルペン合成酵素の活性を有するタンパク質であってもよい。
【００７２】
例えば、本発明で用いるフェランドレン合成酵素（モノテルペン合成酵素の一例）には、少なくとも、下記（ｂ−１）〜（ｂ−３）のタンパク質が含まれる。
（ｂ−１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ−２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−フェランドレン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ｂ−３）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつα−フェランドレン合成酵素活性を有するタンパク質。
なお（ｂ−３）におけるアミノ酸配列の同一性については、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上である。
【００７３】
その他、本発明で用いるフェランドレン合成酵素（モノテルペン合成酵素の一例）には、少なくとも、下記（ｃ−１）〜（ｃ−３）のタンパク質が含まれる。
（ｃ−１）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ−２）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−フェランドレン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ−３）配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつβ−フェランドレン合成酵素活性を有するタンパク質。
なお（ｃ−３）におけるアミノ酸配列の同一性については、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上である。
【００７４】
好ましい実施形態では、モノテルペン合成酵素遺伝子に加えて、外来遺伝子としてイソペンテニル二リン酸異性化酵素（ＩＤＩ）をコードする遺伝子をさらに有する。ＩＤＩ遺伝子を導入することで、ＩＰＰからＤＭＡＰＰへの変換が増強され、ＧＰＰ合成能又はＮＰＰ合成能を増強することが可能となる。その結果、モノテルペン合成能を増強することが可能となる。
【００７５】
好ましい実施形態では、モノテルペン合成酵素遺伝子等に加えて、外来遺伝子としてＧＰＰ合成酵素（ＧＰＰＳ）をコードする遺伝子又はＮＰＰ合成酵素（ＮＰＰＳ）遺伝子をさらに有する。これらの遺伝子を導入することにより、ＧＰＰ又はＮＰＰからのモノテルペン合成能を増強することが可能となる。ＧＰＰＳの例としては、S4S927、S4S8D9、D8LHY4、H6VLF6、H6VLF3、D8RV97、Q6V4K1、Q8LKJ3、Q8LKJ2、Q8LKJ1、Q9FSW8、H6VLF7、V5REB1、Q58GE8 (以上UniProtKB entry)、等が挙げられる。ＮＰＰＳの例としては、トマト由来のNDPS1 (Schilmiller AL et al., PNAS 2009, 106 (26), 10865-10870)、等が挙げられる。なおＧＰＰＳの場合、アーキアに由来するＧＰＰＳを使用してもよく、例えばMethanosarcina属菌由来のMSBRM_0487、MA_0606、MM_1767、MSBRW_3310、Mbar_A1417 (KEGG entry)、等を使用することが特に好ましい。
【００７６】
＜セスキテルペン合成酵素＞
セスキテルペンは３つのイソプレン単位から成る炭素数１５のテルペンである。セスキテルペンには非環式、単環式、二環式、及び三環式のものがある。非環式セスキテルペンにはファルネセン、ファルネソール等がある。単環式セスキテルペンにはzingiberene、Humulene、アブシジン酸等がある。二環式セスキテルペンにはCaryophyllene、Eudesman、Eremophilan、Valeran、Cadinan、Cadinene、Guajan、Driman、Cedrol、Nootkatone等がある。三環式セスキテルペンにはIlludan、Prezizaan、Marasman、Cedran、Thujopsan、Hirsutan等がある。
【００７７】
セスキテルペン合成酵素は、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）をセスキテルペンに変換する酵素の総称である。セスキテルペンの合成経路としては、ＧＰＰ合成酵素の作用によって、ＩＰＰからＧＰＰが合成される。続いて、ＦＰＰ合成酵素の作用によって、ＧＰＰからＦＰＰが合成される。続いて、セスキテルペン合成酵素の作用によって、ＦＰＰからセスキテルペンが合成される。
【００７８】
好ましい実施形態では、セスキテルペン合成酵素が環式セスキテルペン合成酵素である。別の好ましい実施形態では、セスキテルペン合成酵素がファルネセン合成酵素である。
【００７９】
ファルネセン合成酵素としては、基質であるファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）からファルネセンを生成させる活性のある酵素であればいずれのものも使用可能である。ファルネセン合成酵素の例としては、ファルネセンのα体（(3E, 6E)-alpha-farnesene）を合成するには、Q84LB2, B9RXW0、B2KSJ6、Q84KL5 (以上、UniProtKB entry)等があり、ファルネセンのβ体（(E)-beta-farnesene）を合成するには、Q9FXY7、O48935、Q2NM15、C7E5V9、C7E5V7、Q94JS8、C7E5W0、C7E5V8 (以上、UniProtKB entry)等があるが、これらに限定されない。
【００８０】
本発明で用いるセスキテルペン合成酵素については、天然で見いだされ且つ単離されたセスキテルペン合成酵素の他、これらの改変体であってもよい。例えば、既存のセスキテルペン合成酵素の部分断片やアミノ酸置換変異体であって且つセスキテルペン合成酵素の活性を有するタンパク質であってもよい。
【００８１】
例えば、本発明で用いるファルネセン合成酵素（セスキテルペン合成酵素の一例）には、少なくとも、下記（ｄ−１）〜（ｄ−３）のタンパク質が含まれる。
（ｄ−１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ−２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつファルネセン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ｄ−３）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつファルネセン合成酵素活性を有するタンパク質。
なお（ｄ−３）におけるアミノ酸配列の同一性については、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上である。
【００８２】
好ましい実施形態では、セスキテルペン合成酵素遺伝子に加えて、外来遺伝子としてＩＤＩをコードする遺伝子をさらに有する。ＩＤＩ遺伝子を導入することで、ＧＰＰ合成能を増強することが可能となる。その結果、ＦＰＰ合成能が強化され、セスキテルペン合成能を増強することが可能となる。
【００８３】
好ましい実施形態では、セスキテルペン合成酵素遺伝子等に加えて、外来遺伝子としてＧＰＰ合成酵素（ＧＰＰＳ）をコードする遺伝子及び／又はＦＰＰ合成酵素（ＦＰＰＳ）遺伝子をさらに有する。これらの遺伝子を導入することにより、ＧＰＰ及び／又はＦＰＰの合成能が増強され、結果としてセスキテルペン合成能を増強することが可能となる。ＧＰＰＳの例としては、上記で例示したものが挙げられる。ＦＰＰＳの例としては、P08524、P09152、P49349、P14324、P05369、O014230 (以上UniProtKB entry)、等が挙げられる。なお、アーキアに由来するＦＰＰＳを使用してもよく、例えばMethanosarcina属菌由来のMSBRM_0487、MA_0606、MM_1767、MSBRW_3310、Mbar_A1417 (KEGG entry)等を使用することが特に好ましい。ＧＰＰＳ遺伝子とＦＰＰＳ遺伝子については、いずれか一方が導入されていてもよいし、両方が導入されていてもよい。
【００８４】
＜ジテルペン合成酵素＞
ジテルペンは４つのイソプレン単位から成る炭素数２０のテルペンである。ジテルペンには非環式、単環式、二環式、及び三環式のものがある。非環式ジテルペンにはα−トコフェノール、レチノール、及びフィトール等がある。環式ジテルペンにはAbietane、Abietic acid、Neoabietic acid、Levomaric acid、Sapietic acid、Atisane、Beyerane、Gibbane、Gibberellic acid、Kaurane、Steviol、Labdane、Picrasane、Pimarane、Podocarpane、Rosane、Taxane、レチナール、レチノイン酸、レチノール、等がある。
【００８５】
ジテルペン合成酵素は、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）をジテルペンに変換する酵素の総称である。ジテルペンの合成経路としては、ＧＰＰ合成酵素の作用によって、ＩＰＰからＧＰＰが合成される。続いて、ＦＰＰ合成酵素の作用によって、ＧＰＰからＦＰＰが合成される。続いて、ＧＧＰＰ合成酵素（GGPP synthase（ＧＧＰＰＳ））の作用によって、ＦＰＰからＧＧＰＰが合成される。続いて、ジテルペン合成酵素の作用によって、ＧＧＰＰからジテルペンが合成される。
【００８６】
ジテルペン合成酵素としては、ＧＧＰＰからジテルペンを生成させる活性のある酵素であればいずれのものも使用可能である。ジテルペン合成酵素の例としては、Q38710、P9WJ61、G9MAN7、M4HY05、H8ZM70、M1VDX3、A2PZA5、Q675L5、Q0E088、P9WJ60、Q6Z5J6、M4HYP3 (UniProtKB entry)、等があるが、これらに限定されない。
【００８７】
本発明で用いるジテルペン合成酵素については、天然で見いだされ且つ単離されたジテルペン合成酵素の他、これらの改変体であってもよい。例えば、既存のジテルペン合成酵素の部分断片やアミノ酸置換変異体であって且つジテルペン合成酵素の活性を有するタンパク質であってもよい。
【００８８】
好ましい実施形態では、ジテルペン合成酵素遺伝子に加えて、外来遺伝子としてＩＤＩをコードする遺伝子をさらに有する。ＩＤＩ遺伝子を導入することで、ＧＰＰ合成能を増強することが可能となる。その結果、ＦＰＰ合成能とＧＰＰ合成能が強化され、ジテルペン合成能を増強することが可能となる。
【００８９】
好ましい実施形態では、ジテルペン合成酵素遺伝子等に加えて、外来遺伝子としてＧＰＰ合成酵素（ＧＰＰＳ）をコードする遺伝子、ＦＰＰ合成酵素（ＦＰＰＳ）をコードする遺伝子、及びＧＧＰＰ合成酵素（ＧＧＰＰＳ）をコードする遺伝子からなる群から選ばれた少なくとも１つの遺伝子をさらに有する。これらの遺伝子を導入することにより、ＧＰＰ、ＦＰＰ、又はＧＧＰＰの合成能が増強され、結果としてジテルペン合成能を増強することが可能となる。ＧＰＰＳ、ＦＰＰＳの例としては、上記で例示したものが挙げられる。ＧＧＰＰＳの例としては、Q12051、Q84J75、P34802、P80042、Q94ID7、Q9SLG2、Q9C446、Q54BK1、Q9LUE1、Q92236、Q39108、O95749、Q12051、Q9P885、P24322 (UniProtKB entry)、等が挙げられる。なお、アーキアに由来するＧＧＰＰＳを使用してもよく、例えばMethanosarcina属菌由来のMSBRM_0487、MA_0606、MM_1767、MSBRW_3310、Mbar_A1417 (KEGG entry)等を使用することが特に好ましい。
ＧＰＰＳ遺伝子、ＦＰＰＳ遺伝子、ＧＧＰＰＳ遺伝子については、いずれか１つが導入されていてもよいし、２つ以上が導入されていてもよい。
【００９０】
好ましい実施形態では、ジテルペン合成酵素遺伝子等に加えて、外来遺伝子としてコパリル二リン酸合成酵素（ＣＰＰＳ）をコードする遺伝子をさらに有する。コパリル二リン酸（Copalyl diphosphate、ＣＰＰ）は炭素数２０のＧＧＰＰ誘導体である。ＣＰＰ合成酵素遺伝子を導入することにより、ジテルペン合成酵素の基質がＣＰＰである場合にも対応できる。ＣＰＰＳの例としては、G8HZG6、O22667、A0A0N7I618、Q0Q2G7 (UniProtKB entry)、等が挙げられる。
【００９１】
＜スクアレン合成酵素＞
トリテルペンは６つのイソプレン単位から成る炭素数３０のテルペンである。一般的には、ＦＰＰ（Ｃ１５）の二量体化で非環式トリテルペンであるスクアレン（Squalene）（Ｃ３０）が生成し(スクアレン合成酵素が触媒する)、スクアレンから2,3-Oxidosqualene（2,3-epoxy-2,3-dihydroaqualene）が生成し、2,3-Oxidosqualeneの環化を経て２００種以上のトリテルペン骨格が生合成され得る。ただし、スクアレンから2,3-Oxidosqualeneの生成が酸素要求性であるので、嫌気性アーキアである本発明の組換え細胞が生産可能なトリテルペンは、スクアレンの環化によって生じるホペン（Hopene）、ホパノール（Hopanol）、及びその誘導体であるホパノイド（Hopanoid）化合物が主となる。
【００９２】
上述のように、スクアレン合成酵素（squalene synthase（ＳＳ））（EC 2.5.1.21）はＦＰＰを二量体化する作用を有する。ホパノイド化合物を合成する場合には、スクアレン合成酵素遺伝子に加えて、少なくともスクアレン／ホペン環化酵素（Squalene/Hopene cyclase）(EC 5.4.99.17)遺伝子、もしくはスクアレン／ホパノール環化酵素（Squalene/Hopanol cyclase）(EC 4.2.1.129)遺伝子を導入すればよい。一般的は、スクアレン／ホペン環化酵素は、スクアレン／ホパノール環化酵素活性も持ち合わせている。スクアレン合成酵素（ＳＳ）の例としては、P53799、P36596、P29704、P37268、P52020、Q9HGZ6、Q9Y753、Q9SDW9、P78589 (UniProtKB entry)、等が挙げられる。スクアレン／ホペン環化酵素（スクアレン／ホパノール環化酵素）の例としては、P33247、P33990、P54924、P55348 (UniProtKB entry)、等が挙げられる。
【００９３】
ＳＳ遺伝子に加え、さらにＩＤＩ遺伝子を導入することで、スクアレン合成能を増強することが可能である。またさらに、ゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＰＰＳ）遺伝子及び／又はファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）遺伝子を導入することで、スクアレンの合成能を増強することが可能である。ＧＰＰＳ、ＦＰＰＳの例としては、上記で例示したものが挙げられる。
【００９４】
本発明で用いるスクアレン合成酵素については、天然で見いだされ且つ単離されたスクアレン合成酵素の他、これらの改変体であってもよい。例えば、既存のスクアレン合成酵素の部分断片やアミノ酸置換変異体であって且つスクアレン合成酵素の活性を有するタンパク質であってもよい。
【００９５】
＜フィトエン合成酵素＞
テトラテルペンは８つのイソプレン単位から成る炭素数４０のテルペンであり、主にカロテノイドとばれる化合物群が含まれる。テトラテルペンには非環式又は環式のものが多数存在する。非環式のテトラテルペンには、フィトエン、リコペン、ネウロスポレン等がある。一環式のテトラテルペンには、γ−カロテン等がある。二環式テトラテルペンには、α−カロテン、β−カロテン、アスタキサンチン、アンテラキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、β−クリプトキサンチン、ルテイン、ミキソキサントフィル、ゼアキサンチン、フコキサンチン、ロドキサンチン、ネオキサンチン、フラボキサンチン等がある。
【００９６】
フィトエン合成酵素（phytoene synthase（ＰＹＳ））（EC 2.5.1.32)は、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を二量体化する作用を有する。ＰＹＳの例としては、Q7Z859、Q9P854、P37272、Q67GH9、D5KXJ0、P21683、Q9UUQ6、P08196、B2ATB0、Q2U4X9、A2QM49、P37271、P37273、P49085、P54975、P9WHP3、P54977、P22872、P17056 (UniProtKB entry)、等が挙げられる。
【００９７】
ＰＳＹ遺伝子に加え、さらにＩＤＩ遺伝子を導入することで、フィトエン合成能を増強することが可能である。またさらに、ＧＰＰ合成酵素遺伝子、ＦＰＰ合成酵素遺伝子、及びＧＧＰＰ合成酵素遺伝子からなる群より選ばれた少なくとも１つの遺伝子を導入することで、フィトエン合成能を増強することが可能である。ＧＰＰＳ、ＦＰＰＳ、ＧＧＰＰＳの例としては、上記で例示したものが挙げられる。
【００９８】
本発明で用いるフィトエン合成酵素については、天然で見いだされ且つ単離されたフィトエン合成酵素の他、これらの改変体であってもよい。例えば、既存のフィトエン合成酵素の部分断片やアミノ酸置換変異体であって且つフィトエン合成酵素の活性を有するタンパク質であってもよい。
【００９９】
以上のように、本発明の組換え細胞は、外来遺伝子としてイソプレン合成酵素遺伝子、モノテルペン合成酵素遺伝子、セスキテルペン合成酵素遺伝子、ジテルペン合成酵素遺伝子、スクアレン合成酵素遺伝子、又はフィトエン合成酵素遺伝子を有し、任意的に、ＩＤＩ遺伝子、ＧＰＰＳ遺伝子、ＮＰＰＳ遺伝子、ＧＧＰＰＳ遺伝子、ＣＰＰＳ遺伝子、ＳＳ遺伝子、等をさらに有する。
【０１００】
本発明で採用される上記外来遺伝子は、宿主であるアーキアからみて異種の遺伝子と同種の遺伝子のいずれであってもよい。
【０１０１】
既に述べたとおり、アーキアの膜脂質成分はイソプレン骨格を有する。そのため、アーキアは、図１に示すアーキア型メバロン酸経路（ＭＶＡ経路）によって、イソプレンやイソプレノイド化合物の単位構造であるＩＰＰを、他の生物に比べて大量に合成している。さらに大量のイソプレンやテルペンを生産させることを目的として、ＩＰＰ合成能をさらに高める方策を適用してもよい。例えば、組換え細胞の増殖に影響を与えることなく、さらに大量のイソプレンやテルペンを生産させることを目的として、外来遺伝子としてＭＶＡ経路遺伝子をさらに導入してもよい。導入するＭＶＡ経路遺伝子としては、組換え細胞内で正常に機能するものであれば特に限定はない。例えば、宿主と同じ由来（内在性）、他のアーキア由来、アーキア以外の生物由来、等のＭＶＡ経路遺伝子を用いることができる。
【０１０２】
また、外部からＭＶＡ経路遺伝子を導入するのではなく、内在性のＭＶＡ経路の機能を向上させてもよい。例えば、プロモーター改変により内在性のＭＶＡ経路遺伝子の発現レベルを増大させることができる。
【０１０３】
図１には、代表的なアーキア由来MVA経路を構成する酵素が示されているが、図２に示されるように、真核生物及び原核生物において、メバロン酸からＩＰＰまでの生合成経路は多様性を有する。導入される前記ＭＶＡ経路遺伝子は、図１又は図２に示される酵素の一部又は全部をコードする遺伝子である。同様に、機能が向上される前記内在性ＭＶＡ経路の酵素は、これらの酵素の一部又は全部である。
【０１０４】
図１又は図２に示される前記酵素は、具体的には、
アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（acetoacetyl-CoA thiolase）(EC:2.3.1.9)、
ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（HMG-CoA synthase）(EC: 2.3.3.10)、
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（HMG-CoA reductase）(EC: 1.1.1.34; 1.1.1.88)、
メバロン酸−５−キナーゼ（mevalonate-5-kinase）(EC: 2.7.1.36)、
５−ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（mevalonate-5-phosphate decarboxylase）(EC: 4.1.1.99)、
イソペンテニルリン酸キナーゼ（isopentenyl phosphate kinase）(EC: 2.7.4.26)、
イソペンテニル二リン酸異性化酵素（isopentenyl diphosphate isomerase）（EC: 5.3.3.2）、
ホスホメバロン酸キナーゼ（phosphomevalonate kinase）(EC: 2.7.4.2)、
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（mevalonate diphosphate decarboxylase）(EC: 4.1.1.33)、
メバロン酸−３−キナーゼ（mevalonate-3-kinase）(EC: 2.7.1.185)、
３−ホスホメバロン酸−５−キナーゼ（mevalonate-3-phosphate-5-kinase）(EC: 2.7.1.186)、
３，５−ビスホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（mevalonate-3,5-bisphosphate decarboxylase）、
である。
このうち、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸−５−キナーゼ、５−ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニルリン酸キナーゼからなる群より選ばれる１又は２以上の酵素であることが特に好ましい。
【０１０５】
また、導入される前記ＭＶＡ経路遺伝子の由来は特に限定されない。好ましくはアーキア由来であり、さらに好ましくは、Methanosarcina属、Methanococcus属、Methanothermococcus属、Methanothermobacter属、Methanothrix属、Thermococcus属、Thermofilum属、Thermoplasma、又はArchaeoglobus属由来である。
【０１０６】
本発明の組換え細胞は嫌気性アーキアに属するものであり、具体的には、宿主である嫌気性アーキアに外来遺伝子が導入されたものである。
【０１０７】
一般に、アーキアは、一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、メタノール、及び酢酸から選ばれる少なくとも１つを唯一の炭素源として増殖可能である。それらは、図３に示されるような還元型アセチルＣｏＡ経路を有し、メチルテトラヒドロプテリン、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成するとともに、酢酸生成、メタン生成を行うことを基本代謝とする。還元型アセチルＣｏＡ経路における一酸化炭素及び二酸化炭素の同化及び異化においては、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ (carbon monoxide dehydrogenase / acetyl-CoA synthase)複合体が重要な役割を果たしている。
【０１０８】
本発明で使用可能なアーキアとしては、Methanobacterium属、Methanobrevibacter属、Methanocalculus属、Methanococcus属、Methanosarcina属、Methanosphaera属、Methanothermobacter属、Methanothrix属,、Methanoculleus属、Methanofollis属、Methanogenium属、Methanospirillium属、Methanosaeta属、Thermococcus属、Thermofilum属、Archaeoglobus属、等に属するものが挙げられる。このうち、Methanosarcina属、Methanococcus属、Methanothermococcus属、Methanothermobacter属、Methanothrix属、Thermococcus属、Thermofilum属、又はArchaeoglobus属が好ましく、さらに、一酸化炭素及び二酸化炭素資化性の観点から、Methanosarcina属、Methanococcus属、又はMethanothermococcus属が特に好ましい。具体例として、Methanosarcina barkeri、Methanosarcina mazei、Methanosarcina acetivorans、Methanococcus voltae、Methanococcus vannielii、Methanococcus maripaludis、又はMethanothermococcus (Methanococcus) thermolithotrophicus、等が挙げられる
【０１０９】
一方、一酸化炭素脱水素酵素（一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、CO dehydrogenase、ＣＯＤＨ）は、一酸化炭素代謝に重要な酵素の１つであり、一酸化炭素から二酸化炭素とプロトンを生成させる活性を有する。本活性はEC 1.2 (Oxidoreductase)に属し、具体的には、EC1.2.7.4 (旧 EC1.2.99.2)等に属する。一酸化炭素と水から、二酸化炭素とプロトンを生成させる（water-gas shift）反応は本酵素反応の代表例である。
【０１１０】
好ましい実施形態では、組換え細胞が一酸化炭素脱水素酵素を有する。すなわち本発明の組換え細胞は、合成ガス発酵に応用する観点から、上記酵素活性を有することが好ましい。一酸化炭素脱水素酵素は、宿主が本来的に有するものでもよいし、外来遺伝子が発現したものでもよい。宿主がＣＯＤＨ活性を有しないか、当該活性が低いものである場合には、外来遺伝子としてＣＯＤＨ遺伝子を導入することが有用である。この際のＣＯＤＨの由来としては、例えば細菌では、一酸化炭素資化性であるRhodopseudomonas属、Rhodospirillum属、Rubrivivax属、Rhodocyclus属、Clostridium属、Peptostreptococcus属、Acetobacterium属、Moorella属、Carboxydothermus属、等がある。一方、アーキアでは、Thermococcus属、Thermofilum属、Archeoglobus属、Methsanosarcina属、Methanococcus属、Methanothermococcus属、Methanothermobacter属、等に由来するＣＯＤＨがある。
【０１１１】
本発明の組換え細胞は、通常、図３に示される還元型アセチルＣｏＡ経路を有するため、二酸化炭素を唯一の炭素源とし、水素をエネルギー源として生育可能である。二酸化炭素、及び水素を資化して増殖する能力は、廃棄物燃焼ガスや鉄鋼排ガス等の産業排気ガスの有価物への変換へ応用可能である。
【０１１２】
好ましい実施形態では、組換え細胞がメタノールを唯一の炭素源として生育可能である。すなわち本発明の組換え細胞には、メタノール：コエンザイムＭメチルトランスフェラーゼ(EC:2.1.1.246；methanol:coenzyme M methyltransferase)を有するものも含まれる。これらは、メタノール及びＣｏＭからメチルＣｏＭを生成させるため、メタノールを唯一の炭素源とする培地で生育可能である（図４）。メタノールは、天然ガス、石炭、及び廃棄物燃焼ガス等から安価に豊富に生産されるため、メタノール資化能を有する本発明の組換え細胞はメタノールの有価物への変換へ応用可能である。
【０１１３】
好ましい実施形態では、組換え細胞がメタンを唯一の炭素源として生育可能である。すなわち本発明の組換え細胞には、メチルコエンザイムＭレダクターゼ(EC2.8.4.1; Methyl-CoM reductase)を有するものも含まれる。これらは、メタンからメチルＣｏＭを生成させるため、メタンを唯一の炭素源とする培地で生育可能である（図４）。メタン資化能を有する本発明の組換え細胞は、天然ガス及びバイオマス処理生成メタン等の有価物への変換へ応用可能である。
【０１１４】
アーキアに遺伝子（核酸）を導入する方法としては特に限定はなく、宿主細胞であるアーキアの種類等によって適宜選択すればよい。例えば、宿主細胞に導入可能でかつ組み込まれた遺伝子を発現可能なベクターを用いることができる。当該ベクターとして、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記外来遺伝子、および転写終結配列からなる一連の構成を宿主細胞内で構築することが好ましい。
宿主細胞がMethanosarcina属の場合について説明すると、例えば、Methanosarcina acetivorans (DSM2834)に内在するプラスミドpC2Aをベースとした大腸菌とのシャトルベクターが使用可能である（Sowers K.R. et al., J. Bacteriol. 1988, 170, 4979-4982; Metcalf W.W. et al., PNAS 1997, 94, 2626-2631）。相同組換えによる遺伝子の導入、欠損の例もあり（Rother M., et al., J. Bacteriol 2005, 187, 5552-5559; Conway D.M., J. Mol. Biol. 1996, 262, 12-20）、本発明でもこれらの手法が利用可能である。
宿主細胞がMethanococcus属又はMethanothermococcus属の場合には、Methanococcus maripaludis、Methanococcus st. AG83等に内在するプラスミドpURB500、pURB900等からシャトルベクターを構築することが可能である(Lange M. et al., FEMS Microbiol. 2001, 25, 553-571)。
【０１１５】
外来遺伝子を発現させるプロモーターとして、構成発現プロモーターを用いることができる。構成発現プロモーターとしては特に限定はないが、アーキアの多くはメタン生成能を有することから、例えば、Methyl Co-Enzyme M reductase promoter (Pmcr)が使用可能である(Buan N. et al., Methods in Enzymology 2011, 494, 23-42)。一方、誘導発現系としては、Tn10トランスポゾン由来テトラサイクリン耐性遺伝子発現の制御系を利用した手法（Guess A.M. et al., Archaea 2008, 2, 193-203）等が利用可能である。
【０１１６】
また、ベクターを用いて複数種の外来遺伝子を宿主に導入する場合、各遺伝子を１つのベクターに組み込んでもよいし、別々のベクターに組み込んでもよい。さらに１つのベクターに複数の遺伝子を組み込む場合には、各遺伝子を共通のプロモーターの下で発現させてもよいし、別々のプロモーターの下で発現させてもよい。複数種の酵素を融合タンパク質の形で発現させるべく、複数種の遺伝子を連結させた融合遺伝子を導入してもよい。
【０１１７】
形質転換法としては特に限定はないが、Methanosarcina属にはリポソーム法(Metcalf WW. et al., PNAS 1997, 94, 2626-2631)が有用である。また、Methanococcus属やMethanothermococcus属の場合には、ＰＥＧ法(Gernhardt P. et al., Mol. Gen. Genet. 1990, 221, 273-279)が有効である。
【０１１８】
上記のような外来遺伝子導入に加え、突然変異や細胞融合をさらに施すことで、イソプレン、及びテルペンの生産性が格段向上した菌株を育種することも可能である。
【０１１９】
本発明のイソプレン又はテルペンの生産方法は、上記の組換え細胞に一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、メタノール、及び酢酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの炭素源を接触させ、当該組換え細胞に前記炭素源からイソプレン又は炭素数１０、１５、２０、３０若しくは４０のテルペンを生産させるものである。典型的には、前記組換え細胞を一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、メタノール、及び酢酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの炭素源として用いて培養し、その培養物からイソプレン又は炭素数１０、１５、２０、３０若しくは４０のテルペンを取得する。
【０１２０】
本発明の組換え細胞は、通常、還元型アセチルＣｏＡ経路、さらにはメタノール資化経路、可逆的な酢酸合成経路、及び可逆的なメタン生成経路を有しているため、一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、メタノール、及び酢酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの炭素源を使用してイソプレン又はテルペンを生産することができる。これらのＣ１化合物又は酢酸については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。
主要炭素源、エネルギー源がガス成分の場合は、好ましくは０．２〜０．３ＭＰａ（絶対圧）程度の加圧状態で培養することによりガス成分の資化性は高まる。さらには、初期増殖及び到達細胞密度を良好にするためには、ビタミン、酵母エキス、コーンスティープリカー、バクトトリプトン等の有機物を少量加えてよい。
【０１２１】
培養を行わずにイソプレン又はテルペンの生産を行うこともできる。すなわち、細胞分裂（細胞増殖）を伴うか否かにかかわらず、組換え細胞に前記したＣ１化合物又は酢酸を接触させて、イソプレン又はテルペンを生産させることができる。例えば、固定化した組換え細胞に前記したＣ１化合物又は酢酸を連続的に供給し、イソプレン又はテルペンを連続的に生産させることができる。本態様においても、これら炭素源であるＣ１化合物又は酢酸については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。また、エネルギー源として水素（Ｈ2）を同時に接触させることが好ましい。
【０１２２】
好ましい実施形態では、前記組換え細胞を培養槽内で培養し、一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素からなる混合ガスを前記培養槽に供給する。好ましくは、混合ガスの一酸化炭素濃度が２０％以上である。好ましくは、前記混合ガスの二酸化炭素濃度が５％以上である。好ましくは、前記混合ガスの硫化水素濃度が１０ｐｐｍ以下である。
【０１２３】
なお、前記混合ガスを用いて本発明の組換え細胞を培養する場合に、培地中にメタノール及び／又は酢酸を添加しておくと、培養を安定化することができる場合がある。例えば、本発明の組換え細胞には、化学独立栄養増殖（ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2資化）と従属栄養増殖（メタノール資化）の双方が可能なものが含まれる。この場合には、以下のような炭素源とエネルギー源の組み合わせを用いた効率的かつ安定的な培養が可能となる。
【０１２４】
ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2／メタノール
ＣＯ／Ｈ2／メタノール
ＣＯ／メタノール
ＣＯ2／Ｈ2／メタノール
ＣＯ2／メタノール
ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2／酢酸
ＣＯ／Ｈ2／酢酸
ＣＯ／酢酸
ＣＯ2／Ｈ2／酢酸
ＣＯ2／酢酸
【０１２５】
上記のガス成分（ＣＯ、ＣＯ2、Ｈ2）と液性成分（メタノール、酢酸）は、常に共存させてもよく、培養の段階で使い分けても良い。例えば、メタノールのみで細胞を定常状態まで増殖させ、その後ガス成分のみ、もしくはガス成分とメタノールの組み合わせに切りかえてもよい。合成ガス（ＣＯ、ＣＯ2、Ｈ2の混合ガス）発酵においてメタノールを共存させておくことで、長期連続培養における合成ガス資化性の安定化を図ることができる。メタノールによる雑菌汚染の低減も期待できる。
【０１２６】
本発明は、廃棄物燃焼排ガス及び製鋼業排ガス等のリサイクルへの応用が可能である。すなわち、上記排ガス中の主要炭素およびエネルギー成分である、一酸化炭素（ＣＯ）、二酸化炭素（ＣＯ2）、及び水素（Ｈ2）を主成分とする混合ガスを、前記組換え細胞に提供する。すなわち、混合ガスを炭素源として用いて組換え細胞を培養したり、あるいは、混合ガスを組換え細胞に接触させて、混合ガス中の一酸化炭素又は二酸化炭素からイソプレン又はテルペンを生産させる。この場合も、水素はエネルギー源として使用される。上記産業排気ガスの主要成分組成は、廃棄物燃焼廃ガスの場合、例えばＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2＝３０−５０／１０−４０／２５−４５％であり、製鋼業廃ガスの場合は、例えばＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2＝５０−７０／１０−４０／２−１０％である。
使用するアーキアのガス資化性に応じて上記のガス組成を変えることも可能である。例えば、水性ガスシフト反応等によって容易に上記混合ガス中の一酸化炭素を水蒸気の存在下、二酸化炭素と水素に変換し、二酸化炭素、及び水素の濃度を上げることも可能である。
また、上記産業廃ガス中には硫化水素が存在するが、一般的に１０００ｐｐｍ以上の暴露では、アーキアの増殖は劇的に悪化する場合がある。そのため、上記廃ガスを培養槽へ供給する前に、湿式石灰石膏法、水素化脱硫法等によって、硫化水素濃度を好ましくは１００ｐｐｍ以下に、さらに好ましくは１０ｐｐｍ以下までに減少させる。
【０１２７】
好ましい実施形態では、増殖定常期の培養液の細胞濃度が１ｇ乾燥細胞／リットル以上であり、培地の供給と培養液の排出を連続的に行う。すなわち、培養法が連続式であり、かつ細胞密度が高く維持されている。
【０１２８】
連続式培養とは、細胞密度があるレベルに達した後、新鮮培地、及びガスの供給と培養液（菌体入り）の排出を連続的に行うことによって、細胞密度、及び目的物の生産速度を一定に保ち、かつ長期間（例えば１か月以上）にわたる培養を行うことを意味する。これによってバッチ方式の生産に比べて、イソプレン又はテルペンの生産性を格段に上げることが可能となり、さらに、より安価に生産可能となる。上記連続式培養における細胞密度は通常、１ｇ乾燥細胞／リットル以上であり、好ましくは５ｇ乾燥細胞／リットル、さらに好ましくは１０ｇ乾燥細胞／リットルである。
【０１２９】
生産されたイソプレン又はテルペンは、細胞外、すなわち、培養液もしくは気相画分から回収することができる
【０１３０】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１３１】
〔実施例１〕
アーキア細胞でのイソプレン生産のためのイソプレン合成遺伝子導入ベクターの作製【０１３２】
本実施例では、図５に示されるアーキア細胞におけるイソプレン合成用ベクターpAC:Pmcr-IDI-IspSを作製した。本ベクターは、Methanosarcina acetivoransの内在性プラスミドが有する複製領域、及び大腸菌での複製領域p15Aを有するシャトルベクターであり、Methanococcus voltae由来のプロモーターPmcrB (methyl coenzyme M reductase)によってSaccharomyces cerevisiae由来IDI (isopentenyl diphosphate isomerase)遺伝子、及びPoplus canescens由来IspS (isoprene synthase)遺伝子を構成的に発現させることができる。【０１３３】
プラスミドpACYC184（ニッポンジーン社）をHindIIIとBclIで切断し、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Cat）、及び複製領域p15Aを含む断片を得、配列番号５と配列番号６からなるリンカー配列を導入し、プラスミドpAMCSを得た。pAMCSのSphI-AscI切断部位に配列番号７のpuromycin耐性遺伝子(PuR、Genewiz社)を導入し、pAY:PuRを構築した。本プラスミドベクターのPacI-NotI切断部位へ配列番号８のIDI-IspS遺伝子を含む遺伝子断片（Genewiz社）を導入し、プラスミドpAY:Pmcr-IDI-IspSを構築した。【０１３４】
一方、Sowers KRらの方法(Sowers KR et al., 1988 J. Bacterial., 170 (10), 4979-4982) に従って、M. acetivorans (DSM2834)の培養菌体より、内在性プラスミドpC2A (GenBank No. U78295）を調製した。SpeIによる切断によって直鎖化されたpC2Aと、SpeIによる切断で直鎖化された上記pAY:Pmcr-IDI-IspSとを融合し、アーキア細胞にてイソプレン合成遺伝子を構成的に発現させるシャトルベクターpAC:Pmcr-IDI-IspSを構築した（配列番号９、図５）。
同様の手順でpAY:PuRとpC2Aとを融合し、コントロール用のシャトルベクターpAC:PuRを作製した（配列番号１０）。【０１３５】
〔実施例２〕
Methanosarcina barkeriの形質転換、及び各種炭素源からのイソプレン生成【０１３６】
Methanosarcina barkeri (DSM800)の単細胞化培養とコンピテントセルの調製は、Metcalf WWらの方法（Metcalf WW et al., PNAS 1997, 94, 1997）に従った。すなわち、ＡＴＣＣ２８２５改変培地（ただし、１Ｌあたり塩化マグネシウム６水和物１０ｇ、塩化カリウム０．７６ｇ、塩化ナトリウム２４ｇとした）(ｐＨ６．８)にて厳密な嫌気条件下で対数増殖期（ＯＤ６００＝０．３−０．６）まで培養した。菌体を嫌気チャンバー（Ｃｏｙ社）内で遠心分離にて回収した。回収した菌体を０．８５Ｍサッカロース水溶液に懸濁し、コンピテントセル懸濁液を得た(約１０9cells/mL)。【０１３７】
１５μＬのＤＯＴＡＰリポソーム（Boehringer Mannheim社)、１００μＬの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ (ｐＨ７．４)、及び２μgのpAC:Pmcr-IDI-IspS(５０μＬのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）中）を混合し、１５分間インキュベートした。上記コンピテントセル懸濁液１ｍＬを添加し、さらに４時間インキュベートした。本混合溶液(１．１６５ｍＬ)を１０ｍＬの上記ＡＴＣＣ２８２５改変培地にて３５℃で１２−１６時間回復培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体を、０．５％アガロースを含むＡＴＣＣ２８２５改変培地(４５℃)２ｍＬに懸濁した後、１．４％アガロース及びpuromycin (２μg／ｍＬ)を含むＡＴＣＣ２８２５改変寒天培地に播いた。寒天培地での培養は、気相がＮ2／ＣＯ2／Ｈ2Ｓ＝８０／２０／０．１％の混合ガスで置換された嫌気ジャー内にて３５℃で１０−１４日間行った。【０１３８】
生育したコロニーを、２００μＬのＡＴＣＣ２８２５改変培地（ただし、１Ｌあたり酵母エキス５００ｍｇ、Casitone ５００ｍｇ、塩化ナトリウム５ｇとし、かつメタノールを含まない。）と所定の炭素源を用いて、３５℃で３日間培養した。培養液全量の菌体を、表１に示す５種の条件下で３５℃で７〜１０日間振とう培養した。実験１〜４では各種ガスを絶対圧で２．５気圧に充填した。実験５と実験６では気相にＮ2を用い、絶対圧で１．５気圧に充填した。培養は、ブチルゴム栓で密閉されたHS-20用20mLバイアル中（気相１５ｍＬ、培養液５ｍＬ）で行った。各実験とも、培養を３クローンずつ行った（Ｎ＝３）。培養終了後、気相をヘッドスペースＧＣＭＳ分析（GCMS-QP2010 Ultra / HS-20, 島津製作所社）に供し、イソプレン濃度を測定した。【０１３９】
コントロールとして、pAC:Pmcr-IDI-IspSに代えてpAC:PuRを用いて同様の操作を行った。【０１４０】
結果を表１に示す。すなわち、pAC:Pmcr-IDI-IspS（図５）を導入した場合には、ＣＯ2／Ｈ2（実験１）、ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2（実験２）、ＣＯ／Ｈ2／Ｎ2（実験３）のいずれの炭素源を使用した場合においても、有意なイソプレン産生が確認できた。また、メタノール（実験４）、酢酸（実験５）を炭素源として使用した場合においても、有意なイソプレン産生が確認できた。これらのイソプレン生産量は、いずれも１ｍｇ／ｇ乾燥菌体を超えていた。一方、主要炭素源が存在しない場合（実験６）は、イソプレン生成はわずかであった。なお、pAC:PuRを導入した場合は、いずれもイソプレンは殆ど検出されなかった。
以上のことから、組換えアーキア細胞によるＣＯ、ＣＯ2、メタノール、及び酢酸全ての炭素に由来するイソプレンの生成が確認できた。【０１４１】
このイソプレン生産量（１ｇ乾燥菌体あたり１ｍｇ超）は、従来報告されている合成ガス資化性のClostridium属細菌によるイソプレン生産（特許文献１、３等）のそれより明らかに高く、アーキア細胞でのイソプレン生産が効率的であることが示された。またＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2、ＣＯ2／Ｈ2を炭素源としてイソプレンを産生することから、廃棄物燃焼ガス等である合成ガスを炭素源として産業利用できることが示された。【０１４２】
また、上記のClostridium属での検討例を含めた細菌等を宿主として使用する従来技術においては、６種以上の外来酵素遺伝子で構成されるＭＶＡ経路遺伝子を導入することが必要であった。すなわち遺伝子操作の簡便性からも、アーキア内在性のＭＶＡ経路遺伝子を利用できる、換言すれば、外来のＭＶＡ経路遺伝子を要しない本発明が有効であることが示された。
以上のように、安価かつ豊富に製造されている廃棄物燃焼ガス、メタノール、酢酸等からのイソプレン生産に本発明が応用可能であることも示された。【０１４３】
【表１】
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【０１４４】
〔実施例３〕
アーキア細胞でのファルネセン生産のためのベクターの作製【０１４５】
本実施例では、アーキア細胞におけるファルネセン合成用ベクターpAC:Pmcr-IDI-FnS（図６）、及びpAC:Pmcr-IDI-FnS-FPS（図７）を作製した。pAC:Pmcr-IDI-FnSは、Saccharomyces cerevisiae由来IDI、及びArtemisia annua由来ファルネセン合成酵素（Farnesene synthase）(FnS)遺伝子を含有する。pAC:Pmcr-IDI-FnS-FPSは、上記IDI、Saccharomycess cerevisiae由来farnesyl diphosphate synthase (FPS)、及び上記FnS遺伝子を含有する。【０１４６】
実施例１で作製したpAC:Pmcr-IDI-IspS（図５）をMluI-NotIで切断してIDI-IspS領域を除去し、直鎖断片を得た。この直鎖断片と、IDI-FnS（配列番号１１）を含む遺伝子断片とを融合し、pAC:Pmcr-IDI-FnS（配列番号１３、図６）を構築した。また、この直鎖断片と、IDI-FnS-FPS遺伝子（配列番号１２）（Genewiz社）を含有する遺伝子断片とを融合し、pAC:Pmcr-IDI-FnS-FPS（配列番号１４、図７）を構築した。図６、図７中、scIDIはSaccharomyces cerevisiae由来IDI、aaFnSはArtemisia annua由来FnS、scFPSはSaccharomycess cerevisiae由来farnesyl diphosphate synthaseを表す。【０１４７】
〔実施例４〕
組換えMethanosarcina barkeriによる各種炭素源からのファルネセン生成【０１４８】
実施例２と同様のリポソーム法による形質転換法によって、pAC:Pmcr-IDI-FnS又はpAC:Pmcr-IDI-FnS-FPSをMethanosarcina barkeri (DSM800)へ導入し、それぞれ形質転換体を得た。次いで、これらの形質転換体を実施例２と同様の条件下で培養した。但し、生成するファルネセンを抽出・吸収する目的で、１０％(v/v)のドデカンを培養液に重層した。培養終了後、各培養液から遠心分離によってドデカン層を回収した。回収したドデカン層をｎ−ヘキサンによって１０倍に希釈し、ＧＣＭＳ（GCMS-QP2010 Ultra、島津製作所社）分析によってファルネセン濃度を測定した。【０１４９】
コントロールとして、pAC:Pmcr-IDI-FnS又はpAC:Pmcr-IDI-FnS-FPSに代えてpAC:PuR（実施例１）を用いて同様の操作を行った。【０１５０】
結果を表２に示す。すなわち、pAC:Pmcr-IDI-FnS（図６）又はpAC:Pmcr-IDI-FnS-FPS（図７）を導入した場合には、ＣＯ2／Ｈ2（実験７）、ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2（実験８）、ＣＯ／Ｈ2／Ｎ2（実験９）のいずれの炭素源・エネルギー源を使用した場合においても有意なファルネセン産生が確認できた。また、メタノール（実験１０）、酢酸(実験１１）を炭素源として使用した場合においても、有意なファルネセン産生が確認できた。これらのファルネセン生産量は、いずれも１ｍｇ／ｇ乾燥菌体を超えていた。
一方、pAC:Pmcr-IDI-FnS（図６）又はpAC:Pmcr-IDI-FnS-FPS（図７）を導入しても、主要炭素源が存在しない場合（実験１２）は、生成したファルネセンはわずかであった。ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2、ＣＯ2／Ｈ2、ＣＯ／Ｈ2を炭素源としてファルネセンを産生できることから、本発明は廃棄物燃焼ガス等である合成ガスからのファルネセン生産に応用できることが示された。
なお、pAC:PuRを導入した場合は、いずれもファルネセンは殆ど検出されなかった。
以上より、安価かつ豊富に製造されている廃棄物燃焼ガス、メタノール、酢酸等からのファルネセンの生産に、本発明が応用できることが示された。【０１５１】
【表２】
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【０１５２】
〔実施例５〕
組換えMethanosarcina barkeriによるイソプレン生産における、外来イソペンニル二リン酸異性化酵素（ＩＤＩ）遺伝子の影響【０１５３】
ベクターpAC:Pmcr-IspS（配列番号１５）を作製した。本ベクターは、pAC:Pmcr-IDI-IspS（図５）からＩＤＩ遺伝子を削除したものに相当する。
pAC:Pmcr-IspS又はpAC:Pmcr-IDI-IspSを、Methanosarcina barkeri(DSM800)に実施例２と同様の方法で導入し、それぞれの形質転換体を得た。それぞれの形質転換体を実施例２と同様の条件で培養し、気相のイソプレン濃度を測定した。培養の炭素源としてＣＯ2／Ｈ2（実験１３）又はメタノール（実験１４）を使用した。【０１５４】
結果を表３に示す。すなわち、いずれの炭素源を使用した場合にも、ＩＤＩ遺伝子を導入した方がイソプレンの生産量が高かった。これにより、ＩＤＩを同時に作用させることでイソプレン生産量が増大することがわかった。【０１５５】
【表３】
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【０１５６】
〔実施例６〕
ＭＶＡ経路酵素遺伝子導入によるイソプレン産生の増強【０１５７】
ベクターpAC:Pmcr-MVA1-IDI-IspS（配列番号１６、図８）を作製した。本ベクターは、Saccharomyces cerevisiae由来IDI遺伝子（実施例１）、Poplus canescens由来IspS遺伝子（実施例１）に加え、Methanosarcina acetivotans由来ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素（KEGG entry: MA_4041）遺伝子及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ(MA_3073)遺伝子をさらに有する。【０１５８】
pAC:Pmcr-MVA1-IDI-IspS又はpAC:Pmcr-IDI-IspS（実施例１）を、Methanosarcina barkeri(DSM800)に実施例２と同様の方法で導入し、それぞれの形質転換体を得た。それぞれの形質転換体を実施例２と同様の条件で培養し、気相のイソプレン濃度を測定した。培養の炭素源としてＣＯ2／Ｈ2（実験１６）又はメタノール（実験１７）を使用した。【０１５９】
結果を表４に示す。すなわち、いずれの炭素源を使用した場合にも、pAC:Pmcr-MVA1-IDI-IspSを導入した形質転換体の方が、イソプレン生産量が大きかった。これにより、ＭＶＡ経路を構成する酵素の一部を補強することのみで、イソプレン生産量が増大することがわかった。【０１６０】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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