(57)【要約】  プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子であるタンパク質分解誘導タグと、特定タンパク質に対して親和性を有する特定タンパク質親和性分子とのコンジュゲートであるタンパク質分解誘導分子をヒト又は非ヒト動物に投与し、前記ヒト又は非ヒト動物の生体内で前記特定タンパク質の分解を誘導する工程と、前記ヒト又は非ヒト動物の少なくとも一部分である検体における前記特定タンパク質の分解を検出することにより、前記特定タンパク質親和性分子又は前記タンパク質分解誘導分子の分子動態を評価する工程と、を含む分子動態評価方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子であるタンパク質分解誘導タグと、特定タンパク質に対して親和性を有する特定タンパク質親和性分子とのコンジュゲートであるタンパク質分解誘導分子をヒト又は非ヒト動物に投与し、前記ヒト又は非ヒト動物の生体内で前記特定タンパク質の分解を誘導する工程と、
前記ヒト又は非ヒト動物の少なくとも一部分である検体における前記特定タンパク質の分解を検出することにより、前記特定タンパク質親和性分子又は前記タンパク質分解誘導分子の分子動態を評価する工程と、
を含む分子動態評価方法。
【請求項２】
前記特定タンパク質の分解を誘導する工程では、ユビキチン非依存的に前記特定タンパク質の分解を誘導する請求項１に記載の分子動態評価方法。
【請求項３】
前記タンパク質分解誘導タグが、プロテアーゼ阻害剤のプロテアーゼ阻害活性を失活させた構造を有する請求項１又は請求項２に記載の分子動態評価方法。
【請求項４】
前記プロテアーゼがプロテアソームである請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の分子動態評価方法。
【請求項５】
前記タンパク質分解誘導タグが、プロテアソーム阻害剤のプロテアソーム阻害活性を失活させた構造を有する請求項４に記載の分子動態評価方法。
【請求項６】
前記プロテアソーム阻害活性が、カスパーゼ様活性、トリプシン様活性、及びキモトリプシン様活性から選ばれる少なくとも１種に対する阻害活性である請求項５に記載の分子動態評価方法。
【請求項７】
前記タンパク質分解誘導分子が医薬候補分子であり、
前記ヒト又は非ヒト動物の生体内で前記特定タンパク質の分解を誘導することによる薬理作用を評価する工程を更に含む請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の分子動態評価方法。
【請求項８】
前記特定タンパク質の分解を誘導する工程では、前記タンパク質分解誘導分子を非ヒト動物に投与し、前記非ヒト動物の生体内で前記特定タンパク質の分解を誘導し、
前記特定タンパク質親和性分子又は前記タンパク質分解誘導分子の分子動態を評価する工程では、前記非ヒト動物の少なくとも一部分である検体における前記特定タンパク質の分解を検出する請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の分子動態評価方法。
【請求項９】
前記分子動態が、組織、器官、細胞、又は分子に対する特異性である請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の分子動態評価方法。
【請求項１０】
プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子であるタンパク質分解誘導タグと、特定タンパク質に対して親和性を有する特定タンパク質親和性分子とのコンジュゲートであるタンパク質分解誘導分子をヒト又は非ヒト動物に投与し、前記ヒト又は非ヒト動物の生体内で前記特定タンパク質の分解を誘導する工程と、
前記ヒト又は非ヒト動物の少なくとも一部分である検体における前記特定タンパク質の分解を検出することにより、特定の分子動態を示す前記特定タンパク質親和性分子又は前記タンパク質分解誘導分子を選抜する工程と、
を含むスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記特定タンパク質の分解を誘導する工程では、ユビキチン非依存的に前記特定タンパク質の分解を誘導する請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記特定タンパク質の分解を誘導する工程では、前記タンパク質分解誘導分子を非ヒト動物に投与し、前記非ヒト動物の生体内で前記特定タンパク質の分解を誘導し、
前記特定タンパク質親和性分子又は前記タンパク質分解誘導分子を選抜する工程では、前記非ヒト動物の少なくとも一部分である検体における前記特定タンパク質の分解を検出する請求項１０又は請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記分子動態が、組織、器官、細胞、又は分子に対する特異性である請求項１０〜請求項１２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、分子動態評価方法及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品の研究開発においては、被験物質（被験分子）の組織、器官、細胞、分子（分子の複合体を含む）等に対する特異性などの、被験物質の体内動態（以下、「分子動態」ともいう。）を評価することが欠かせない要素となっている。被験物質の分子動態を評価することは、例えば、標的となる組織、器官、細胞、分子等への特異性が高い被験物質をスクリーニングする際にも有用である。【０００３】
従来、被験物質の分子動態を評価する方法としては、被験物質をヒト又は非ヒト動物に投与し、各組織、器官、細胞等に移行した被験物質を高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）等により分析する方法；放射性同位元素で標識した被験物質をヒト又は非ヒト動物に投与し、各組織、器官、細胞等に移行した被験物質をオートラジオグラフ等により分析する方法；等が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−２２００２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、ＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等を用いた分析方法は分析条件の設定等が煩雑であり、また、オートラジオグラフ等を用いた分析方法は放射性同位元素を使用する必要があり、いずれも簡便な方法とはいい難いものであった。【０００６】
本開示は、上記のような事情に鑑み、被験物質の分子動態を評価するための新規な分子動態評価方法、及び特定の分子動態を示す被験物質を選抜するための新規なスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞  プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子であるタンパク質分解誘導タグと、特定タンパク質に対して親和性を有する特定タンパク質親和性分子とのコンジュゲートであるタンパク質分解誘導分子をヒト又は非ヒト動物に投与し、前記ヒト又は非ヒト動物の生体内で前記特定タンパク質の分解を誘導する工程と、
前記ヒト又は非ヒト動物の少なくとも一部分である検体における前記特定タンパク質の分解を検出することにより、前記特定タンパク質親和性分子又は前記タンパク質分解誘導分子の分子動態を評価する工程と、
を含む分子動態評価方法。【０００８】
＜２＞  前記特定タンパク質の分解を誘導する工程では、ユビキチン非依存的に前記特定タンパク質の分解を誘導する＜１＞に記載の分子動態評価方法。【０００９】
＜３＞  前記タンパク質分解誘導タグが、プロテアーゼ阻害剤のプロテアーゼ阻害活性を失活させた構造を有する＜１＞又は＜２＞に記載の分子動態評価方法。【００１０】
＜４＞  前記プロテアーゼがプロテアソームである＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の分子動態評価方法。【００１１】
＜５＞  前記タンパク質分解誘導タグが、プロテアソーム阻害剤のプロテアソーム阻害活性を失活させた構造を有する＜４＞に記載の分子動態評価方法。【００１２】
＜６＞  前記プロテアソーム阻害活性が、カスパーゼ様活性、トリプシン様活性、及びキモトリプシン様活性から選ばれる少なくとも１種に対する阻害活性である＜５＞に記載の分子動態評価方法。【００１３】
＜７＞  前記タンパク質分解誘導分子が医薬候補分子であり、
前記ヒト又は非ヒト動物の生体内で前記特定タンパク質の分解を誘導することによる薬理作用を評価する工程を更に含む＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の分子動態評価方法。【００１４】
＜８＞  前記特定タンパク質の分解を誘導する工程では、前記タンパク質分解誘導分子を非ヒト動物に投与し、前記非ヒト動物の生体内で前記特定タンパク質の分解を誘導し、
前記特定タンパク質親和性分子又は前記タンパク質分解誘導分子の分子動態を評価する工程では、前記非ヒト動物の少なくとも一部分である検体における前記特定タンパク質の分解を検出する＜１＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の分子動態評価方法。【００１５】
＜９＞  前記分子動態が、組織、器官、細胞、又は分子に対する特異性である＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載の分子動態評価方法。【００１６】
＜１０＞  プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子であるタンパク質分解誘導タグと、特定タンパク質に対して親和性を有する特定タンパク質親和性分子とのコンジュゲートであるタンパク質分解誘導分子をヒト又は非ヒト動物に投与し、前記ヒト又は非ヒト動物の生体内で前記特定タンパク質の分解を誘導する工程と、
前記ヒト又は非ヒト動物の少なくとも一部分である検体における前記特定タンパク質の分解を検出することにより、特定の分子動態を示す前記特定タンパク質親和性分子又は前記タンパク質分解誘導分子を選抜する工程と、
を含むスクリーニング方法。【００１７】
＜１１＞  前記特定タンパク質の分解を誘導する工程では、ユビキチン非依存的に前記特定タンパク質の分解を誘導する＜１０＞に記載のスクリーニング方法。【００１８】
＜１２＞  前記特定タンパク質の分解を誘導する工程では、前記タンパク質分解誘導分子を非ヒト動物に投与し、前記非ヒト動物の生体内で前記特定タンパク質の分解を誘導し、
前記特定タンパク質親和性分子又は前記タンパク質分解誘導分子を選抜する工程では、前記非ヒト動物の少なくとも一部分である検体における前記特定タンパク質の分解を検出する＜１０＞又は＜１１＞に記載のスクリーニング方法。【００１９】
＜１３＞  前記分子動態が、組織、器官、細胞、又は分子に対する特異性である＜１０＞〜＜１２＞のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００２０】
本開示によれば、被験物質の分子動態を評価するための新規な分子動態評価方法、及び特定の分子動態を示す被験物質を選抜するための新規なスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＨｅＬａ細胞において強制発現させた野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質のＴＵＳ−００７を介した分解（ノックダウン）について、ＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）解析により評価した結果を示す図である。
【図２】ＨｅＬａ細胞において強制発現させた野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質のＴＵＳ−００７を介した分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図３】ＴＵＳ−００７を添加したＨｅＬａ細胞における内在の野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質及び野生型Ｈ−Ｒａｓタンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図４】ＴＵＳ−００７をマウス個体に投与した後、マウスの各組織における野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図５Ａ】プロテアソームの触媒サブユニットβ１に対する、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴ及びＭＧ−１３２の阻害活性を示す図である。
【図５Ｂ】プロテアソームの触媒サブユニットβ２に対する、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴ及びＭＧ−１３２の阻害活性を示す図である。
【図５Ｃ】プロテアソームの触媒サブユニットβ５に対する、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴ及びＭＧ−１３２の阻害活性を示す図である。
【図６】ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを介した分解（ノックダウン）について、ＦＡＣＳ解析により評価した結果を示す図である。
【図７Ａ】ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを介した分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図７Ｂ】ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを介した分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図８Ａ】ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加したＨｅＬａ細胞における内在のＤＨＦＲタンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図８Ｂ】ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加したＨｅＬａ細胞における内在のＤＨＦＲタンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図９】ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮをマウス個体に投与した後、マウスの各組織におけるＤＨＦＲタンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図１０】ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加したＨＣＴ１１６細胞における内在の野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図１１】ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加したＨｅＬａ細胞における内在の野生型ｐ５３タンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図１２】ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮをマウス個体に投与した後、マウスの各組織における野生型ｐ５３タンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図１３】ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮをマウス個体に投与した後、マウスの各組織におけるＭＤＭ２タンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図１４Ａ】プロテアソームの触媒サブユニットβ１に対する、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ及びＡＬＬＮの阻害活性を示す図である。
【図１４Ｂ】プロテアソームの触媒サブユニットβ２に対する、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ及びＡＬＬＮの阻害活性を示す図である。
【図１４Ｃ】プロテアソームの触媒サブユニットβ５に対する、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ及びＡＬＬＮの阻害活性を示す図である。
【図１５】ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを介した分解（ノックダウン）について、ＦＡＣＳ解析により評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本明細書において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
本明細書においてアミノ酸は、本技術分野で周知の一文字表記（例えば、グリシンであれば「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシンであれば「Ｇｌｙ」）で表記する。
【００２３】
＜タンパク質分解誘導分子＞
本開示で用いられるタンパク質分解誘導分子は、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子であるタンパク質分解誘導タグと、特定タンパク質に対して親和性を有する特定タンパク質親和性分子とのコンジュゲートである。このタンパク質分解誘導分子をヒト又は非ヒト動物に投与すると、ヒト又は非ヒト動物の生体内において、特定タンパク質のユビキチン化を介することなく（すなわち、ユビキチン非依存的に）、特定タンパク質をプロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）による分解（ノックダウン）へと導くことが可能となる。
【００２４】
なお、テトラユビキチン鎖（Ｕｂ４）等のポリユビキチン鎖又はユビキチン様ドメイン（ＵｂＬ）は、タンパク質分解誘導タグとして機能する可能性があるが、ポリユビキチン鎖又はユビキチン様ドメインをタンパク質分解誘導タグとした場合、特定タンパク質親和性分子を介して特定タンパク質が間接的にユビキチン化されることになる。本明細書では、このような特定タンパク質の間接的なユビキチン化も、特定タンパク質のユビキチン化に含まれるものとする。
【００２５】
後述する本開示の分子動態評価方法及び本開示のスクリーニング方法では、この特定タンパク質の分解を指標として、被験物質（特定タンパク質親和性分子又はタンパク質分解誘導分子）の分子動態を評価し、また、特定の分子動態を示す被験物質（特定タンパク質親和性分子又はタンパク質分解誘導分子）を選抜することができる。
【００２６】
（タンパク質分解誘導タグ）
タンパク質分解誘導タグは、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子である。以下では、このタンパク質分解誘導タグをＣｉＫＤ（Chemical interactions and KnockDown）タグ又はＣＡＮＤＤＹ（Chemical AffiNities and Degradation DYnamics）タグとも称する。
【００２７】
プロテアーゼとしては特に制限されず、プロテアーゼ活性を有するあらゆる分子が挙げられる。例えば、プロテアソームのような複合体型プロテアーゼであってもよく、プロテアソーム以外のプロテアーゼであってもよい。また、プロテアーゼ活性を有する限り、プロテアソームの一部分であってもよい。
【００２８】
プロテアソームとしては、例えば、２６Ｓプロテアソーム、免疫プロテアソーム、及び胸腺プロテアソームが挙げられる。
２６Ｓプロテアソームは、２０Ｓプロテアソームに１９Ｓプロテアソームが２つ結合したものである。２０Ｓプロテアソームは、α１〜α７の７つのサブユニットから構成されるαリングと、β１〜β７の７つのサブユニットから構成されるβリングとが、αββαの順に積み重なった筒状構造をしており、β１、β２、及びβ５がそれぞれカスパーゼ様活性、トリプシン様活性、及びキモトリプシン様活性という触媒活性を発揮する。
免疫プロテアソームは、触媒サブユニットβ１、β２、及びβ５がそれぞれβ１ｉ、β２ｉ、及びβ５ｉに置き換わったものである（Science, 1994, 265, 1234-1237）。
胸腺プロテアソームは、β１ｉ及びβ２ｉとともに、胸腺皮質上皮細胞（ｃＴＥＣ）特異的に発現するβ５ｔが組み込まれたものである（Science, 2007, 316, 1349-1353）。
【００２９】
また、プロテアソーム以外のプロテアーゼとしては、β−セクレターゼ、γ−セクレターゼ、アミノペプチダーゼ、アンジオテンシン変換酵素、ブロメライン、カルパインＩ、カルパインＩＩ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＹ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１３、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＧ、カテプシンＬ、キモトリプシン、クロストリパイン、コラゲナーゼ、補体Ｃ１ｒ、補体Ｃ１ｓ、補体Ｂ因子、補体Ｄ因子、ジペプチジルペプチダーゼＩ、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、ディスパーゼ、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、フィシン、グランザイムＢ、カリクレイン、ロイシンアミノペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、パパイン、ペプシン、プラスミン、プロカスパーゼ３、プロナーゼＥ、プロテイナーゼＫ、レニン、サーモリシン、トロンビン、トリプシン、細胞質アラニルアミノペプチダーゼ、エンケファリナーゼ、ネプリライシン等が挙げられる。
【００３０】
本明細書において「プロテアーゼに対して親和性を有する」とは、例えば、プロテアーゼに対して共有結合、水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力等により結合可能であることを意味する。ある分子の存在下においてプロテアーゼの熱安定性が変化する場合、その分子は、プロテアーゼに対して親和性を有すると判断することができる。
【００３１】
また、本明細書において「プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない」とは、例えば、プロテアーゼの分解活性サイトに共有結合しないことを意味する。ある分子の存在下においてもプロテアーゼによってタンパク質が分解され、更にプロテアーゼ阻害剤を共存させるとタンパク質の分解が阻害される場合、その分子は、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しないと判断することができる。
【００３２】
タンパク質分解誘導タグとしては、低分子化合物、天然物、ペプチド、抗体等が挙げられる。なお、本開示において、抗体には、２本のＨ鎖と２本のＬ鎖とを含む、いわゆる免疫グロブリン（Ｉｇ）以外に、ＩｇのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント等の抗体における可変部位を含むフラグメントなどが含まれる。タンパク質分解誘導タグの分子量は、例えば、５０〜２０００００の範囲が好ましい。タンパク質分解誘導タグが低分子化合物である場合、タンパク質分解誘導タグの分子量は、例えば、５０〜５０００の範囲が好ましい。
【００３３】
タンパク質分解誘導タグの構造は、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しないものである限り、特に制限されない。タンパク質分解誘導タグは、例えば、候補分子の中からスクリーニングによって得ることができる。また、プロテアーゼ阻害剤（例えば、プロテアソーム阻害剤）のプロテアーゼ阻害活性（例えば、プロテアソーム阻害活性）を失活させることにより製造することもできる。
【００３４】
ある態様では、タンパク質分解誘導タグは、例えば、下記式（Ｉ）で表される構造とすることができる。下記式（Ｉ）で表される化合物は、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しないことが確認されている（例えば、後述する参考例４〜６を参照）。
【００３５】
【化１】
2018092724.tif 000002
【００３６】
式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、炭素数１〜２０の炭化水素基、炭素数１〜２０のアルコキシ基、炭素数６〜２０のアリールオキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、又はハロゲノ基を示す。
【００３７】
炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基、アリール基、これらの組み合わせ等が挙げられる。具体的には、メチル基、エチル基等の炭素数１〜２０のアルキル基；ビニル基、アリル基等の炭素数２〜２０のアルケニル基；フェニル基、ナフチル基等の炭素数６〜２０のアリール基；ベンジル基、フェネチル基等の炭素数７〜２０のアリールアルキル基；トリル基、キシリル基等の炭素数７〜２０のアルキルアリール基；等が挙げられる。
ハロゲノ基としては、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基等が挙げられる。
【００３８】
別の態様では、タンパク質分解誘導タグは、プロテアソーム阻害剤のプロテアソーム阻害活性を失活させた構造とすることができる。プロテアソーム阻害活性としては、より具体的には、カスパーゼ様活性、トリプシン様活性、及びキモトリプシン様活性から選ばれる少なくとも１種に対する阻害活性が挙げられる。
【００３９】
ここで、「プロテアソーム阻害活性を失活させた構造」には、プロテアソーム阻害活性を完全に消失させた構造に加え、プロテアソーム阻害活性を減弱させた構造も含まれる。ある態様では、タンパク質分解誘導タグは、カスパーゼ様活性、トリプシン様活性、及びキモトリプシン様活性から選ばれる少なくとも１種に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が、元のプロテアソーム阻害剤の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の２倍以上である。
【００４０】
プロテアソーム阻害剤としては、プロテアソーム阻害活性を有するあらゆる化合物を使用することができる。プロテアソーム阻害剤は、プロテアソーム（複合体型プロテアーゼ）に対して親和性を有し、且つ、プロテアソームによるタンパク質の分解を阻害する化合物である。したがって、プロテアソーム阻害剤の活性部位を他の構造部分に置き換えてプロテアソーム阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
プロテアソーム阻害剤は、抗癌剤等として研究が進んでおり、医薬品として認可済みの化合物及び臨床試験中の化合物が数多く存在する。また、プロテアソーム阻害剤は、分子量が比較的小さく、疎水性が低いものが多く、細胞膜透過性、細胞毒性等の問題も生じ難い。このため、プロテアソーム阻害剤を基にタンパク質分解誘導タグを合成することは、非常に合理的且つ効率的である。
【００４１】
プロテアソーム阻害剤の一例を以下の表１及び表２に示す。表１及び表２に示すプロテアソーム阻害剤は、いずれも２０Ｓプロテアソームの活性中心部に対して親和性を有する２０Ｓプロテアソーム阻害剤である。また、表１及び表２に示すプロテアソーム阻害剤は、当然に２６Ｓプロテアソームに対しても親和性を有する。ただし、タンパク質分解誘導タグの製造に使用可能なプロテアソーム阻害剤がこれらの例に限定されるものではない。
【００４２】
【表１】
2018092724.tif 000003
【００４３】
【表２】
2018092724.tif 000004
【００４４】
例えば、ボロン酸型プロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブ（Bortezomib）は、下記式に示すように、活性部位であるボロニル基が２０Ｓプロテアソームの分解活性サイトと共有結合することで、プロテアソーム活性を阻害することが知られている（Kisselev, A.F. et al., Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115）。
【００４５】
【化２】
2018092724.tif 000005
【００４６】
また、ボロン酸型プロテアソーム阻害剤であるＭＬＮ９７０８及びＭＬＮ２２３８は、下記式に示すように、活性部位であるボロン酸エステル部位又はボロニル基が２０Ｓプロテアソームの分解活性サイトと共有結合することで、プロテアソーム活性を阻害することが知られている（Kisselev, A.F. et al., Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115）。
【００４７】
【化３】
2018092724.tif 000006
【００４８】
このため、ボルテゾミブ、ＭＬＮ９７０８、及びＭＬＮ２２３８の活性部位であるボロニル基又はボロン酸エステル部位を他の構造部分（カルボキシ基、アルキル基、アリール基、アミノ基、ヒドロキシ基等）に置き換えてプロテアソーム阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
【００４９】
なお、ＣＥＰ−１８７７０等の他のボロン酸型プロテアソーム阻害剤についても、活性部位を他の構造部分（カルボキシ基、アルキル基、アリール基、アミノ基、ヒドロキシ基等）に置き換えることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
【００５０】
また、アルデヒド型プロテアソーム阻害剤であるＡＬＬＮは、下記式に示すように、活性部位であるホルミル基が２０Ｓプロテアソームの分解活性サイトと共有結合することで、プロテアソーム活性を阻害することが知られている（Kisselev, A.F. et al., Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115）。
【００５１】
【化４】
2018092724.tif 000007
【００５２】
このため、ＡＬＬＮの活性部位であるホルミル基を他の構造部分（カルボキシ基、アルキル基、アリール基、アミノ基、ヒドロキシ基等）に置き換えてプロテアソーム阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
【００５３】
なお、ＭＧ−１３２、ＢＳｃ−２１１８、ＰＳＩ等の他のアルデヒド型プロテアソーム阻害剤についても、活性部位であるホルミル基を他の構造部分（カルボキシ基、アルキル基、アリール基、アミノ基、ヒドロキシ基等）に置き換えることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
【００５４】
プロテアソーム阻害剤のプロテアソーム阻害活性を失活させた構造を有するタンパク質分解誘導タグの一例を以下の表３及び表４に示す。表中のＲで表される１価の基としては、カルボキシ基、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基、アミノ基、ヒドロキシ基等が挙げられる。
【００５５】
【表３】
2018092724.tif 000008
【００５６】
【表４】
2018092724.tif 000009
【００５７】
プロテアソーム阻害剤の他の例を以下の表５〜表１０に示す。これらのプロテアソーム阻害剤についても、上記と同様にしてプロテアソーム阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
【００５８】
【表５】
2018092724.tif 000010
【００５９】
【表６】
2018092724.tif 000011
【００６０】
【表７】
2018092724.tif 000012
【００６１】
【表８】
2018092724.tif 000013
【００６２】
【表９】
2018092724.tif 000014
【００６３】
【表１０】
2018092724.tif 000015
【００６４】
別の態様では、タンパク質分解誘導タグは、プロテアーゼ阻害剤（前述したプロテアソーム阻害剤を除く）のプロテアーゼ阻害活性を失活させた構造とすることができる。
【００６５】
ここで、「プロテアーゼ阻害活性を失活させた構造」には、プロテアーゼ阻害活性を完全に消失させた構造に加え、プロテアーゼ阻害活性を減弱させた構造も含まれる。ある態様では、タンパク質分解誘導タグは、プロテアーゼ阻害剤の阻害対象となるプロテアーゼに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が、元のプロテアーゼ阻害剤の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の２倍以上である。
【００６６】
プロテアーゼ阻害剤としては、プロテアーゼ阻害活性を有するあらゆる化合物を使用することができる。プロテアーゼ阻害剤は、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害する化合物である。したがって、プロテアーゼ阻害剤の活性部位を他の構造部分に置き換えてプロテアーゼ阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
【００６７】
プロテアーゼ阻害剤の一例を以下の表１１〜表７８に示す。これらのプロテアーゼ阻害剤の活性部位を他の構造部分に置き換えてプロテアーゼ阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。ただし、タンパク質分解誘導タグの製造に使用可能なプロテアーゼ阻害剤がこれらの例に限定されるものではない。プロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤については、必要に応じて、既存のデータベース（MEROPS-the peptidase database（http://merops.sanger.ac.uk/index.shtml）等）の情報を参照することができる。
【００６８】
【表１１】
2018092724.tif 000016
【００６９】
【表１２】
2018092724.tif 000017
【００７０】
【表１３】
2018092724.tif 000018
【００７１】
【表１４】
2018092724.tif 000019
【００７２】
【表１５】
2018092724.tif 000020
【００７３】
【表１６】
2018092724.tif 000021
【００７４】
【表１７】
2018092724.tif 000022
【００７５】
【表１８】
2018092724.tif 000023
【００７６】
【表１９】
2018092724.tif 000024
【００７７】
【表２０】
2018092724.tif 000025
【００７８】
【表２１】
2018092724.tif 000026
【００７９】
【表２２】
2018092724.tif 000027
【００８０】
【表２３】
2018092724.tif 000028
【００８１】
【表２４】
2018092724.tif 000029
【００８２】
【表２５】
2018092724.tif 000030
【００８３】
【表２６】
2018092724.tif 000031
【００８４】
【表２７】
2018092724.tif 000032
【００８５】
【表２８】
2018092724.tif 000033
【００８６】
【表２９】
2018092724.tif 000034
【００８７】
【表３０】
2018092724.tif 000035
【００８８】
【表３１】
2018092724.tif 000036
【００８９】
【表３２】
2018092724.tif 000037
【００９０】
【表３３】
2018092724.tif 000038
【００９１】
【表３４】
2018092724.tif 000039
【００９２】
【表３５】
2018092724.tif 000040
【００９３】
【表３６】
2018092724.tif 000041
【００９４】
【表３７】
2018092724.tif 000042
【００９５】
【表３８】
2018092724.tif 000043
【００９６】
【表３９】
2018092724.tif 000044
【００９７】
【表４０】
2018092724.tif 000045
【００９８】
【表４１】
2018092724.tif 000046
【００９９】
【表４２】
2018092724.tif 000047
【０１００】
【表４３】
2018092724.tif 000048
【０１０１】
【表４４】
2018092724.tif 000049
【０１０２】
【表４５】
2018092724.tif 000050
【０１０３】
【表４６】
2018092724.tif 000051
【０１０４】
【表４７】
2018092724.tif 000052
【０１０５】
【表４８】
2018092724.tif 000053
【０１０６】
【表４９】
2018092724.tif 000054
【０１０７】
【表５０】
2018092724.tif 000055
【０１０８】
【表５１】
2018092724.tif 000056
【０１０９】
【表５２】
2018092724.tif 000057
【０１１０】
【表５３】
2018092724.tif 000058
【０１１１】
【表５４】
2018092724.tif 000059
【０１１２】
【表５５】
2018092724.tif 000060
【０１１３】
【表５６】
2018092724.tif 000061
【０１１４】
【表５７】
2018092724.tif 000062
【０１１５】
【表５８】
2018092724.tif 000063
【０１１６】
【表５９】
2018092724.tif 000064
【０１１７】
【表６０】
2018092724.tif 000065
【０１１８】
【表６１】
2018092724.tif 000066
【０１１９】
【表６２】
2018092724.tif 000067
【０１２０】
【表６３】
2018092724.tif 000068
【０１２１】
【表６４】
2018092724.tif 000069
【０１２２】
【表６５】
2018092724.tif 000070
【０１２３】
【表６６】
2018092724.tif 000071
【０１２４】
【表６７】
2018092724.tif 000072
【０１２５】
【表６８】
2018092724.tif 000073
【０１２６】
【表６９】
2018092724.tif 000074
【０１２７】
【表７０】
2018092724.tif 000075
【０１２８】
【表７１】
2018092724.tif 000076
【０１２９】
【表７２】
2018092724.tif 000077
【０１３０】
【表７３】
2018092724.tif 000078
【０１３１】
【表７４】
2018092724.tif 000079
【０１３２】
【表７５】
2018092724.tif 000080
【０１３３】
【表７６】
2018092724.tif 000081
【０１３４】
【表７７】
2018092724.tif 000082
【０１３５】
【表７８】
2018092724.tif 000083
【０１３６】
なお、以上の説明では、便宜上、プロテアソーム阻害剤とプロテアソーム阻害剤以外のプロテアーゼ阻害剤とを区別したが、プロテアソームとプロテアソーム以外のプロテアーゼとの両者の活性を阻害可能な化合物も知られている。したがって、このような化合物を用いることで、プロテアソームとプロテアソーム以外のプロテアーゼとの両者に対して親和性を有するタンパク質分解誘導タグを得ることができる。
【０１３７】
プロテアソームとプロテアソーム以外のプロテアーゼとの両者の活性を阻害可能な化合物の一例を以下の表７９に示す。ただし、プロテアソームとプロテアソーム以外のプロテアーゼとの両者の活性を阻害可能な化合物がこれらの例に限定されるものではない。
【０１３８】
【表７９】
2018092724.tif 000084
【０１３９】
別の態様では、タンパク質分解誘導タグとして、プロテアソーム活性化剤を使用することができる。プロテアソーム活性化剤は、プロテアソーム（複合体型プロテアーゼ）に対して親和性を有し、且つ、プロテアソームによるタンパク質の分解を阻害しない化合物であり、タンパク質分解誘導タグとして使用することができる。
【０１４０】
プロテアソーム活性化剤の一例を以下の表８０〜表８２に示す。ただし、タンパク質分解誘導タグの製造に使用可能なプロテアソーム活性化剤がこれらの例に限定されるものではない。
【０１４１】
【表８０】
2018092724.tif 000085
【０１４２】
【表８１】
2018092724.tif 000086
【０１４３】
【表８２】
2018092724.tif 000087
【０１４４】
以上のとおり例示したタンパク質分解誘導タグの中でも、特に、２６Ｓプロテアソームに親和性を有するものが好ましい。細胞内のプロテアソームは、通常、２０Ｓプロテアソームに１９Ｓプロテアソームが２つ結合した２６Ｓプロテアソームの状態で存在する。このため、２６Ｓプロテアソームに親和性を有するタンパク質分解誘導タグを用いることで、細胞内の特定タンパク質をより効率的に分解へと導くことが可能となる。
【０１４５】
（特定タンパク質親和性分子）
特定タンパク質親和性分子は、特定タンパク質に対して親和性を有する分子である。
【０１４６】
特定タンパク質としては、例えば、細胞内又は細胞膜に存在するタンパク質が挙げられる。特定タンパク質は、変異によって生成した変異タンパク質であってもよく、転座等によって生成した融合タンパク質であってもよい。また、特定タンパク質は、内因性のタンパク質であってもよく、ウイルス、細菌等に由来する外来性のタンパク質であってもよい。また、特定タンパク質は、何らかの要因により分解が滞って蓄積したタンパク質であってもよい。ある態様では、特定タンパク質は、細胞周期、シグナル伝達、細胞分化、細胞脱分化、細胞増殖、又はサイトカイン等の生理活性物質の産生に関与するタンパク質である。
【０１４７】
また、特定タンパク質は、複数のタンパク質からなる複合体であってもよい。複数のタンパク質からなる複合体の一例としては、ｐ５３／ＭＤＭ２複合体（ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質との複合体。以下同様）、ｐ５３／Ｅ６複合体、ｐ５３／ＨＤＭ２複合体、ｐ５３／ＡＩＣＤ複合体、ｐ５３／ＲＵＮＸ２複合体、ｐ５３／ＲＵＮＸ３複合体等のｐ５３複合体が挙げられる。ただし、本開示における複合体がこれらの例に限定されるものではない。
【０１４８】
特定タンパク質が複数のタンパク質からなる複合体である場合、特定タンパク質親和性分子は、複合体を構成する一部のタンパク質に対して親和性を有するものであってもよく、複合体自体に対して親和性を有するものであってもよい。
【０１４９】
後述する本開示の分子動態評価方法及び本開示のスクリーニング方法は、このような複合体を標的とし、複合体の分解を指標として、被験物質（特定タンパク質親和性分子又はタンパク質分解誘導分子）の分子動態を評価し、また、特定の分子動態を示す被験物質（特定タンパク質親和性分子又はタンパク質分解誘導分子）を選抜することができる点で非常に有用である。
【０１５０】
本明細書において「特定タンパク質に対して親和性を有する」とは、例えば、特定タンパク質に対して共有結合、水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力等により結合可能であることを意味する。特定タンパク質と相互作用することが知られている他の分子（タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、代謝物、低分子化合物等）と特定タンパク質との相互作用が、ある分子によって濃度依存的に影響を受ける場合、その分子は、特定タンパク質に対して親和性を有すると判断することができる。
【０１５１】
特定タンパク質親和性分子としては、低分子化合物、抗体、ペプチド等の医薬又は医薬候補物質；サイトカイン、成長因子、ホルモン等の内因性の生理活性物質；天然物、代謝物、植物成分、食品成分などが挙げられる。
特定タンパク質の中には、結合する分子（阻害剤等）が知られているものも存在するため（例えば、国際公開第２００８／１２３２６６号参照）、このような既知の分子を特定タンパク質親和性分子として使用することができる。特定タンパク質に結合する分子が未知の場合には、ハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）により、結合する分子をスクリーニングしてもよい。また、特定タンパク質と結合する抗体を作製し、これを特定タンパク質親和性分子として使用してもよい。
【０１５２】
（タンパク質分解誘導タグと特定タンパク質親和性分子とのコンジュゲートの様式）
タンパク質分解誘導タグと特定タンパク質親和性分子とのコンジュゲートの様式は、タンパク質分解誘導タグのプロテアーゼとの結合性、及び特定タンパク質親和性分子の特定タンパク質との親和性が維持される限り、特に制限されない。なお、タンパク質分解誘導タグ及び特定タンパク質親和性分子がいずれもタンパク質である場合、両者を融合した融合タンパク質を合成することが可能であるが、このような融合タンパク質は「コンジュゲート」には含まれない。
【０１５３】
タンパク質分解誘導分子は、例えば、少なくとも１つのタンパク質分解誘導タグと少なくとも１つの特定タンパク質親和性分子とが連結された構造とすることができる。タンパク質分解誘導分子は、１つのタンパク質分解誘導タグと１つの特定タンパク質親和性分子とが連結された構造であってもよく、１つのタンパク質分解誘導タグと複数の特定タンパク質親和性分子とが連結された構造であってもよく、複数のタンパク質分解誘導タグと１つの特定タンパク質親和性分子とが連結された構造であってもよく、複数のタンパク質分解誘導タグと複数の特定タンパク質親和性分子とが連結された構造であってもよい。ある態様では、タンパク質分解誘導分子は、１つのタンパク質分解誘導タグと１つの特定タンパク質親和性分子とが連結された構造である。
【０１５４】
タンパク質分解誘導タグにおける特定タンパク質親和性分子との連結位置は、プロテアーゼとの親和性が維持される限り、特に制限されない。例えば、タンパク質分解誘導タグが、前述のように、プロテアーゼ阻害剤（例えば、プロテアソーム阻害剤）の活性部位を他の構造部分に置き換えた構造である場合、この置き換えた他の構造部分において特定タンパク質親和性分子と連結することができる。具体的に、プロテアーゼ阻害剤の活性部位をカルボキシ基に置き換えた場合、カルボキシ基を介して特定タンパク質親和性分子と連結することができる。
一方、特定タンパク質親和性分子におけるタンパク質分解誘導タグとの連結位置は、特定タンパク質との親和性が維持される限り、特に制限されない。
【０１５５】
なお、タンパク質分解誘導タグ及び特定タンパク質親和性分子は、相互に連結可能な構造であってもよい。タンパク質分解誘導タグと特定タンパク質親和性分子とを直接連結することが困難な場合には、相互に連結可能とする構造を、タンパク質分解誘導タグ及び特定タンパク質親和性分子の少なくとも一方に導入することも考えられる。
例えば、特定タンパク質親和性分子としては、特定タンパク質に親和性を有する既知の分子を使用することができるが、この既知の分子とタンパク質分解誘導タグとを直接連結することが困難な場合も想定される。このような場合には、タンパク質分解誘導タグと連結可能な構造を当該既知の分子に導入し、特定タンパク質親和性分子として使用してもよい。
【０１５６】
＜分子動態評価方法＞
本開示の分子動態評価方法は、前述したタンパク質分解誘導分子をヒト又は非ヒト動物に投与し、ヒト又は非ヒト動物の生体内で特定タンパク質の分解を誘導する工程（以下、「分解誘導工程」ともいう。）と、ヒト又は非ヒト動物の少なくとも一部分である検体における特定タンパク質の分解を検出することにより、特定タンパク質親和性分子又はタンパク質分解誘導分子の分子動態を評価する工程（以下、「分子動態評価工程」ともいう。）と、を含む。
本開示の分子動態評価方法によれば、特定タンパク質親和性分子又はタンパク質分解誘導分子の分子動態を評価することが可能である。
【０１５７】
分解誘導工程では、前述したタンパク質分解誘導分子をヒト又は非ヒト動物に投与する。この投与により、ヒト又は非ヒト動物の生体内において、特定タンパク質のユビキチン化を介することなく（すなわち、ユビキチン非依存的に）、特定タンパク質をプロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）による分解（ノックダウン）へと導くことが可能となる。
【０１５８】
非ヒト動物は特に制限されず、サル等の霊長類、マウス、ラット、豚、犬、猫などが挙げられる。非ヒト動物は、遺伝子を改変した遺伝子改変型の動物（例えば、疾患モデル動物）であってもよく、遺伝子を改変していない野生型の動物であってもよい。また、タンパク質分解誘導分子の投与方法は特に制限されず、経口投与であっても非経口投与（静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、胸腔内投与、髄腔内投与、筋肉内投与等）であってもよい。
【０１５９】
分子動態評価工程では、ヒト又は非ヒト動物の少なくとも一部分である検体における特定タンパク質の分解を検出することにより、特定タンパク質親和性分子又はタンパク質分解誘導分子の分子動態を評価する。タンパク質分解誘導分子が移行した検体においては、特定タンパク質の分解が誘導される。したがって、この特定タンパク質の分解を検出することにより、特定タンパク質親和性分子又はタンパク質分解誘導分子の分子動態を評価することができる。
【０１６０】
ヒト又は非ヒト動物の少なくとも一部分である検体とは、ヒト又は非ヒト動物から採取された組織、器官、細胞、分子等である。検体としては、例えば、臓器の一部又は全部、皮膚、血液、それらに含まれる細胞、それらに含まれる分子等が挙げられる。
検体を採取する方法は特に制限されず、例えば、生検（バイオプシー）において通常用いられる検体採取方法（例えば、内視鏡又は鉗子カテーテルを用いた検体採取方法）、外科的手術による検体採取方法等が挙げられる。非ヒト動物であれば、解剖等により採取してもよい。
【０１６１】
検体における特定タンパク質の分解を検出する方法は特に制限されない。例えば、特定タンパク質の量をウェスタンブロット解析等により測定してもよい。あるいは、特定タンパク質が分解されることにより発現量が変化する他のタンパク質の量をウェスタンブロット解析等により測定することで、特定タンパク質の分解を間接的に検出してもよい。また、特定タンパク質が分解されることにより発現量が変化するｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法等により測定することで、特定タンパク質の分解を間接的に検出してもよい。
なお、特定タンパク質が複合体である場合、複合体を構成する一部のタンパク質の分解を検出することで、特定タンパク質の分解を検出してもよく、複合体を構成する全てのタンパク質の分解を検出することで、特定タンパク質の分解を検出してもよい。
分子動態評価工程では特定タンパク質の分解を検出すればよいため、従来のようにＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、オートラジオグラフ等を使用する必要がなく簡便である。
【０１６２】
分子動態の評価対象となる被験物質は、特定タンパク質親和性分子であってもタンパク質分解誘導分子であってもよい。
【０１６３】
特定タンパク質親和性分子の分子動態を評価する場合、特定タンパク質親和性分子をタンパク質分解誘導タグと組み合わせてタンパク質分解誘導分子を製造し、ヒト又は非ヒト動物に投与すればよい。タンパク質分解誘導分子が移行した検体では特定タンパク質の分解が誘導されるため、この分解を検出することにより、特定タンパク質親和性分子の分子動態を評価することができる。ある態様では、低分子化合物、抗体、ペプチド等の医薬候補分子を特定タンパク質親和性分子として用いることができる。
【０１６４】
また、タンパク質分解誘導分子の分子動態を評価する場合、タンパク質分解誘導分子をヒト又は非ヒト動物に投与すればよい。タンパク質分解誘導分子が移行した検体においては特定タンパク質の分解が誘導されるため、この分解を検出することにより、タンパク質分解誘導分子の分子動態を評価することができる。
【０１６５】
ここで、特定タンパク質が疾患に関連するタンパク質である場合には、タンパク質分解誘導分子は、その疾患に対する医薬候補分子ともなり得る。この場合、タンパク質分解誘導分子のヒト又は非ヒト動物の生体内における分布は、薬理作用が発現する場所の分布を表すことになるため、タンパク質分解誘導分子の分子動態を評価することで、対象となる疾患又は患者を絞り込むことができる。一例として、特定タンパク質が癌に関連するタンパク質である場合、タンパク質分解誘導分子の分子動態を評価することで、どのような癌に対する医薬候補分子となるかを評価することができる。
【０１６６】
なお、特定タンパク質が疾患に関連するタンパク質である場合、本開示の分子動態評価方法は、ヒト又は非ヒト動物の生体内で特定タンパク質の分解を誘導することによる薬理作用を評価する工程（以下、「薬理作用評価工程」ともいう。）を更に含んでいてもよい。これにより、タンパク質分解誘導分子の分子動態と薬理作用とを併せて評価することができる。分子動態評価工程と薬理作用評価工程との順序は特に制限されない。
【０１６７】
＜スクリーニング方法＞
本開示のスクリーニング方法は、前述したタンパク質分解誘導分子をヒト又は非ヒト動物に投与し、ヒト又は非ヒト動物の生体内で特定タンパク質の分解を誘導する工程（以下、「分解誘導工程」ともいう。）と、ヒト又は非ヒト動物の少なくとも一部分である検体における特定タンパク質の分解を検出することにより、特定の分子動態を示す特定タンパク質親和性分子又はタンパク質分解誘導分子を選抜する工程（以下、「選抜工程」ともいう。）と、を含む。
本開示のスクリーニング方法によれば、特定の分子動態を示す特定タンパク質親和性分子又はタンパク質分解誘導分子を選抜することができる。
【０１６８】
分解誘導工程は、前述した本開示の分子動態評価方法と同様であるため、詳細な説明を省略する。
【０１６９】
選抜工程では、ヒト又は非ヒト動物の少なくとも一部分である検体における特定タンパク質の分解を検出することにより、特定の分子動態を示す特定タンパク質親和性分子又はタンパク質分解誘導分子を選抜する。タンパク質分解誘導分子が移行した検体においては、特定タンパク質の分解が誘導される。したがって、この分解を検出することにより、特定の分子動態を示す特定タンパク質親和性分子又はタンパク質分解誘導分子を選抜することができる。
【０１７０】
検体、及び検体における特定タンパク質の分解を検出する方法は、前述した本開示の分子動態評価方法と同様であるため、詳細な説明を省略する。
選抜工程では特定タンパク質の分解を検出すればよいため、従来のようにＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、オートラジオグラフ等を使用する必要がなく簡便である。
【０１７１】
選抜対象となる被験物質は、特定タンパク質親和性分子であってもタンパク質分解誘導分子であってもよい。
【０１７２】
特定の分子動態を示す特定タンパク質親和性分子を選抜する場合、特定タンパク質親和性分子をタンパク質分解誘導タグと組み合わせてタンパク質分解誘導分子を製造し、ヒト又は非ヒト動物に投与すればよい。タンパク質分解誘導分子が移行した検体では特定タンパク質の分解が誘導されるため、この分解を検出することにより、特定の分子動態を示す特定タンパク質親和性分子を選抜することができる。ある態様では、低分子化合物、抗体、ペプチド等の医薬候補分子を特定タンパク質親和性分子として用いることができる。
【０１７３】
また、特定の分子動態を示すタンパク質分解誘導分子を選抜する場合、タンパク質分解誘導分子をヒト又は非ヒト動物に投与すればよい。タンパク質分解誘導分子が移行した検体では特定タンパク質の分解が誘導されるため、この分解を検出することにより、特定の分子動態を示すタンパク質分解誘導分子を選抜することができる。
【実施例】
【０１７４】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以下の実施例、合成例、及び参考例において、室温とは２０℃〜３０℃の範囲を示す。【０１７５】
以下の実施例、合成例、及び参考例で使用される化合物等の略称は以下のとおりである。
H-Gly-OtBu・HCl：L-Glycine t-butyl ester hydrochloride
ＤＭＦ：N,N-Dimethylformamide
ＤＩＰＥＡ：N,N-Diisopropylethylamine
ＰｙＢＯＰ：1H-Benzotriazol-1-yloxy-tri(pyrrolidino)phosphonium hexafluorophosphate
ＴＦＡ：Trifluoroacetic acid
H-Leu-OtBu・HCl：L-Leucine t-butyl ester hydrochloride
ＨＡＴＵ：O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate
ｅｃ：Escherichia coli
ＤＨＦＲ：Dihydrofolate reductase
ＲＦ：Restriction-free
ＨＡ：Hemagglutinin
ＧＦＰ：Green fluorescent protein
ＤｓＲｅｄ：Discosoma sp. red fluorescent protein
Ｄ−ＭＥＭ：Dulbecco's modified eagle's medium
ＤＭＳＯ：Dimethyl sulfoxide
ＰＢＳ：Phosphate buffered saline
ＥＤＴＡ：Ethylenediamine tetraacetic acid
ＦＢＳ：Fetal bovine serum
ＳＤＳ：Sodium dodecyl sulfate
ＰＡＧＥ：Polyacrylamide gel ectrophoresis
ＢＰＢ：Bromophenol blue
ＰＶＤＦ：Polyvinylidene difluoride
ＴＢＳ：Tris buffered saline
ＧＡＰＤＨ：Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
ＰＭＳＦ：Phenylmethylsulfonyl fluoride
ＤＴＴ：Dithiothreitol
ＴＭＰ：Trimethoprim
ＤＭＴ−ＭＭ：4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride n-hydrate
ＡＭＣ：7-Amino-4-methylcoumarin
ＭＴＸ：Methotrexate
ＤＭＡ：N,N-Dimethylacetamide
ＢＯＰ：(Benzotriazol-1-yloxy)-tris(dimetylamino)phosphonium hexafluorophosphate
ＤＥＰＣ：Diethylpyrocarbonate【０１７６】
＜合成例１：ＴＵＳ−００７の合成＞
合成例１では、タンパク質分解誘導タグと、Ｒａｓタンパク質に対して親和性を有する特定タンパク質親和性分子とを連結することにより、タンパク質分解誘導分子であるＴＵＳ−００７を合成した。【０１７７】
タンパク質分解誘導タグとしては、プロテアソーム阻害剤であるＭＬＮ９７０８及びＭＬＮ２２３８の活性部位（ボロン酸エステル部位又はボロニル基）をカルボキシ基に置き換えた化合物（ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ）を用いた。【０１７８】
また、特定タンパク質親和性分子としては、下式で表されるＲａｓ−ＳＯＳ−ＮＨ２を用いた。Ｒａｓ−ＳＯＳ−ＮＨ２は、下式で表されるＲａｓ−ＳＯＳのアミノ基に、Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)６−ＣＯＯＨを反応させて得られた化合物である。【０１７９】
【化５】
2018092724.tif 000088
【０１８０】
Ｒａｓ−ＳＯＳは、Sun, Q.らの文献（Sun, Q. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51, 6140-6143）に記載されたCompound 12である。ＳＯＳタンパク質がＲａｓタンパク質に結合すると、Ｒａｓタンパク質に結合するＧＤＰがＧＴＰに置き換わり、Ｒａｓタンパク質が活性化される。Ｒａｓ−ＳＯＳは、Ｒａｓタンパク質に結合してＲａｓタンパク質とＳＯＳタンパク質との相互作用を阻害することにより、Ｒａｓタンパク質の活性化を阻害することが知られている。【０１８１】
なお、Ｒａｓ−ＳＯＳ及びＲａｓ−ＳＯＳ−ＮＨ２は、Sun, Q.らの文献に記載された方法に従って合成した。【０１８２】
ＴＵＳ−００７の合成方法の詳細は以下のとおりである。【０１８３】
（ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの合成）
下記合成スキームに従ってＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを合成した。【０１８４】
【化６】
2018092724.tif 000089
【０１８５】
まず、枝付きナスフラスコにH-Gly-OtBu・HCl（286.8 mg, 1.69 mmol, 1 eq）を仕込み、窒素置換した。窒素気流下で脱水ＤＭＦ１０ｍＬとＤＩＰＥＡ５ｍＬとを加え、室温にて撹拌した。２，５−ジクロロ安息香酸（309.3 mg, 1.62 mmol, 1 eq）を１ｍＬの脱水ＤＭＦ及び１ｍＬのＤＩＰＥＡに溶解した後、反応溶液に加え、室温にて２０分間撹拌した。ＰｙＢＯＰ（1.02 g, 1.96 mmol, 1.2 eq）を１ｍＬの脱水ＤＭＦに溶解した後、反応溶液に加え、室温にて３時間撹拌した。反応溶液を水及び炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈し、酢酸エチル／ヘキサン（＝４／１）で２回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／クロロホルム＝１／１〜０／１, gradient）を用いた分離精製処理により、化合物Ｓ１（531.0 mg, 1.75 mmol, 103%）を得た。【０１８６】
次いで、ナスフラスコに化合物Ｓ１（212.4 mg, 0.70 mmol）を仕込み、ジクロロメタンを５ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＴＦＡを５ｍＬ加え、室温にて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、真空乾燥し、化合物Ｓ２（190.7 mg, quant.）を得た。【０１８７】
次いで、枝付きナスフラスコに化合物Ｓ２（190.7 mg, 0.77 mmol, 1 eq）及びH-Leu-OtBu・HCl（175.8 mg, 0.79 mmol, 1 eq）を仕込み、窒素置換した。窒素気流下で脱水ＤＭＦ５ｍＬとＤＩＰＥＡ５ｍＬとを加え、室温にて２０分間撹拌した。ＰｙＢＯＰ（886.7 mg, 1.70 mmol, 2.2 eq）を１．５ｍＬの脱水ＤＭＦに溶解した後、反応溶液に加え、室温にて３時間撹拌した。反応溶液を水及び炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈し、酢酸エチル／ヘキサン（＝４／１）で２回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／クロロホルム＝１／１〜０／１, gradient）を用いた分離精製処理により、化合物Ｓ３（244.2 mg, 0.58 mmol, 76%）を得た。【０１８８】
次いで、ナスフラスコに化合物Ｓ３（240.8 mg, 0.58 mmol）を仕込み、ジクロロメタンを５ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＴＦＡを５ｍＬ加え、室温にて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、真空乾燥し、ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ（214.7 mg, 0.59 mmol, 100%）を得た。【０１８９】
（ＴＵＳ−００７の合成）
下記合成スキームに従ってＴＵＳ−００７を合成した。【０１９０】
【化７】
2018092724.tif 000090
【０１９１】
ナスフラスコにＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ（52.4 mg, 0.15 mmol, 1 eq）及び別途合成したＲａｓ−ＳＯＳ−ＮＨ２（62.4 mg, 0.12 mmol, 0.9 eq）を仕込み、脱水ＤＭＦを４ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡを４ｍＬ加え、溶液を中性にした。室温にて５分間撹拌した後、ＨＡＴＵ（114.1 mg, 0.30 mmol, 2 eq）を反応溶液に直接加え、室温にて６時間撹拌した。冷却下で飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機層を分離した後、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を集め、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝２０／１〜４／１, gradient）を用いた分離精製処理により、ＴＵＳ−００７（25.2 mg, 0.03 mmol, 24%, isolated yield）を得た。得られたＴＵＳ−００７は、分取用薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１０／１）を用いて、更に精製処理を行った。
ＴＵＳ−００７の物性データを以下に示す。
HRMS-FAB (m/z): [M+H]+ calcd for C44H55Cl2N8O5, 845.3672; found, 845.3674.【０１９２】
＜参考例１＞
参考例１では、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌細胞）において強制発現させた野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質のＴＵＳ−００７を介した分解（ノックダウン）について、ＦＡＣＳ解析により評価した。【０１９３】
（プラスミドの準備）
野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質（K-Ras-WT）を発現するプラスミドは、ｅｃＤＨＦＲタンパク質を発現するプラスミド（pMIR-DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）を用いて、ＲＦクローニングにより作製した。ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の全長ｃＤＮＡクローン（Accession No. AK292510）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構から購入した。ＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ酵素としてKOD-Plus-Neo（東洋紡(株)）を用いて行った。ＲＦクローニングに用いたフォワードプライマー及びリバースプライマーを以下の表８３に示す。【０１９４】
【表８３】
2018092724.tif 000091
【０１９５】
（ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
ＨｅＬａ細胞にプラスミドを導入することにより、細胞内に野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質（詳細には、ＨＡタグを介した野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質）又は比較用のＤｓＲｅｄタンパク質を一過的に過剰発現させた。【０１９６】
ＨｅＬａ細胞へのプラスミド導入は、トランスフェクション試薬であるScreenFectA（和光純薬工業(株)）を用いて常法により行った。プラスミド導入後のＨｅＬａ細胞を４×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４０時間培養した。【０１９７】
（ＨｅＬａ細胞へのＴＵＳ−００７の添加）
プラスミドを導入してから４０時間培養した後、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にＴＵＳ−００７を添加した。培地としては、Ｄ−ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ−グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ−グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＵＳ−００７を含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、各ウェル当たり５００μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。また、ＴＵＳ−００７を含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群のほかに、ＴＵＳ−００７及びＭＬＮ２２３８の両方、又はＲａｓ−ＳＯＳ−ＮＨ２を含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群も準備した。なお、コントロールとしてはＤＭＳＯを用いた。【０１９８】
（ＴＵＳ−００７を介した野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質の分解（ノックダウン）の評価（ＦＡＣＳ解析））
ＴＵＳ−００７の添加２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、３７℃のトリプシン（0.25 w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red）（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり２００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１分間培養した。培養後、Ｄ−ＭＥＭ（Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red）（和光純薬工業(株)）に１０質量％ ＦＢＳ及び１質量％ PenStrep（100 U/mL Sodium Penicillin G and 100 μg/mL Streptomycin Sulfate）（和光純薬工業(株)）を添加した培地を各ウェル当たり３００μＬ添加して懸濁し、１５ｍＬチューブに細胞溶液を回収した。【０１９９】
回収した細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、２ｍＬのＰＢＳ（３７℃）により懸濁した。懸濁後の細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、４℃のＦＡＣＳバッファー（１質量％ ＦＢＳ／ＰＢＳ）を５００μＬ添加し、氷上に静置した。【０２００】
フローサイトメトリーにはBD FACSCanto II（BD Biosciences）を用い、細胞中におけるＧＦＰ及びＤｓＲｅｄタンパク質の発現を定量した。ＦＡＣＳ解析の直前に、細胞溶液を孔径３２μｍのメッシュに通し、ＦＡＣＳチューブへと移した。解析ソフトFlowJo（トミーデジタルバイオロジー(株)）により細胞１個当たりのＧＦＰ／ＤｓＲｅｄ比を算出し、グラフのシフトから、ＴＵＳ−００７による野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質の分解（ノックダウン）を確認した。【０２０１】
ＦＡＣＳ解析結果を図１に示す。図１に示すとおり、ＴＵＳ−００７を添加した場合には、濃度依存的にグラフが左にシフトしており、ＴＵＳ−００７によって野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質の分解が誘導されていることが確認できた。一方、Ｒａｓ−ＳＯＳ−ＮＨ２を添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）とグラフが重なっており、野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質が分解されていないことが確認できた。この結果から、Ｒａｓ−ＳＯＳ−ＮＨ２に対してタンパク質分解誘導タグであるＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを連結することにより、野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質の分解が誘導されることが分かる。
また、ＴＵＳ−００７及びＭＬＮ２２３８の両方を添加した場合には、ＴＵＳ−００７を添加した場合と比較して野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質の分解が阻害された。この結果は、ＴＵＳ−００７によって、野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質がプロテアソームによる分解へと導かれていることを裏付けるものである。【０２０２】
＜参考例２＞
参考例２では、ＨｅＬａ細胞において強制発現させた野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質のＴＵＳ−００７を介した分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。【０２０３】
（プラスミドの準備）
参考例１と同様にして、野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質（K-Ras-WT）を発現するプラスミドを作製した。【０２０４】
（ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
参考例１と同様にして、ＨｅＬａ細胞にプラスミドを導入することにより、細胞内に野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質（詳細には、ＨＡタグを介した野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質）又は比較用のＤｓＲｅｄタンパク質を一過的に過剰発現させた。プラスミド導入後のＨｅＬａ細胞は、４×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４０時間培養した。【０２０５】
（ＨｅＬａ細胞へのＴＵＳ−００７の添加）
プラスミドを導入してから４０時間培養した後、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にＴＵＳ−００７を添加した。培地としては、Ｄ−ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ−グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ−グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＵＳ−００７を含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、各ウェル当たり５００μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。また、ＴＵＳ−００７を含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群のほかに、ＴＵＳ−００７及びＭＬＮ２２３８の両方、ＭＬＮ２２３８、又はＲａｓ−ＳＯＳ−ＮＨ２を含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群も準備した。なお、コントロールとしてはＤＭＳＯを用いた。【０２０６】
（ＴＵＳ−００７を介した野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質の分解（ノックダウン）の評価（ウェスタンブロット解析））
ＴＵＳ−００７の添加２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、細胞溶解バッファー（CelLytic M, Sigma）とプロテアーゼ阻害剤（cOmplete Mini, EDTA-free, Roche）との混合溶液を各ウェル当たり２７μＬ添加した。４℃にて１５分間静置した後、ピペットチップを用いて氷上で細胞を剥がした。細胞溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、液体窒素で瞬間凍結した後、氷上で融解させた。凍結融解を３回繰り返した後、遠心分離（１３８００ｒｐｍ×２０分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。【０２０７】
回収した細胞抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２−メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で４分間ヒートブロックした。電気泳動は１５０Ｖで５０分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。【０２０８】
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、１２０分間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／High-salt TBS-T（100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.2% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、メンブレンをHigh-salt TBS-Tでリンスし、１％スキムミルク／High-salt TBS-T中で抗体反応を行った。抗体としては、Anti-HA-Peroxidase, High-Affinity（3F10）Rat monoclonal antibody（25 U/mL）（Roche）を１０００倍希釈して用いた。室温にて１時間振盪させた後、メンブレンをHigh-salt TBS-Tで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをHigh-salt TBS（100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。【０２０９】
次に、同一のメンブレンを用いて、コントロールであるＧＡＰＤＨの検出反応を行った。メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）で洗浄し、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ＧＡＰＤＨ抗体（6C5, SantaCruz、２００００倍希釈）を用いた。室温にて６０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、２％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で二次抗体反応を行った。二次抗体としては、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（A90-116P-33, Bethyl）を２００００倍希釈して用いた。室温にて３０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。検出されたバンドの定量には、画像処理ソフトウェアImageJ（NIH）を用いた。【０２１０】
ウェスタンブロット解析結果を図２に示す。図２中のグラフは、ウェスタンブロット解析により検出された野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質の定量結果を、コントロール（ＤＭＳＯ）を１とした相対値で示したものである。
図２に示すとおり、ＴＵＳ−００７を添加した場合には、野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質の量が減少したが、Ｒａｓ−ＳＯＳ−ＮＨ２を添加した場合には、野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質の量が減少しなかった。この結果から、Ｒａｓ−ＳＯＳ−ＮＨ２に対してタンパク質分解誘導タグであるＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを連結することにより、野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質の分解が誘導されることが分かる。
また、ＴＵＳ−００７及びＭＬＮ２２３８の両方を添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）よりも野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質の量が増加した。この結果は、ＴＵＳ−００７によって、野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質がプロテアソームによる分解へと導かれていることを裏付けるものである。【０２１１】
＜参考例３＞
参考例３では、ＴＵＳ−００７を添加したＨｅＬａ細胞における内在の野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質及び野生型Ｈ−Ｒａｓタンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。【０２１２】
（細胞播種）
ＨｅＬａ細胞を８×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１６時間培養した。【０２１３】
（ＨｅＬａ細胞へのＴＵＳ−００７の添加）
細胞播種から１６時間後に、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にＴＵＳ−００７を添加した。培地としては、Ｄ−ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ−グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ−グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＵＳ−００７を含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、各ウェル当たり５００μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。コントロールとしてはＤＭＳＯを用いた。【０２１４】
（ＴＵＳ−００７を介した内在の野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質及び野生型Ｈ−Ｒａｓタンパク質の分解（ノックダウン）の評価（ウェスタンブロット解析））
ＴＵＳ−００７の添加４８時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、細胞溶解バッファー（CelLytic M, Sigma）とプロテアーゼ阻害剤（cOmplete Mini, EDTA-free, Roche）との混合溶液を各ウェル当たり２７μＬ添加した。４℃にて１５分間静置した後、ピペットチップを用いて氷上で細胞を剥がした。細胞溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、液体窒素で瞬間凍結した後、氷上で融解させた。融解後、遠心分離（１３８００ｒｐｍ×２０分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。【０２１５】
回収した細胞抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２−メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で４分間ヒートブロックした。電気泳動は１５０Ｖで５０分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。【０２１６】
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、２時間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗Ｋ−Ｒａｓ抗体（C-17, SantaCruz、５００倍希釈）、抗Ｈ−Ｒａｓ抗体（C-20, SantaCruz、１０００倍希釈）、及び抗ＳＯＳ１抗体（C-23, SantaCruz、１０００倍希釈）を用いた。４℃にて１６時間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。【０２１７】
次に、同一のメンブレンを用いて、コントロールであるＧＡＰＤＨの検出反応を行った。メンブレンをＴＢＳ−Ｔで洗浄し、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ＧＡＰＤＨ抗体（6C5, SantaCruz、２００００倍希釈）を用いた。室温にて６０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、２％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で二次抗体反応を行った。二次抗体としては、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（A90-116P-33, Bethyl）を２００００倍希釈して用いた。室温にて３０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。検出されたバンドの定量には、画像処理ソフトウェアImageJ（NIH）を用いた。【０２１８】
ウェスタンブロット解析結果を図３に示す。図３中の各バンドの下の数値は、ウェスタンブロット解析により検出された各タンパク質の定量結果を、コントロール（ＤＭＳＯ）を１．０とした相対値で示したものである。
図３に示すとおり、ＴＵＳ−００７を添加した場合には、内在の野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質及び野生型Ｈ−Ｒａｓタンパク質の量が減少したが、ＳＯＳ１タンパク質の量は減少しなかった。この結果は、Sun, Q.らの文献（Sun, Q. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51, 6140-6143）にて報告されているＲａｓ−ＳＯＳのタンパク質親和性の結果と整合するものであった。【０２１９】
＜実施例１＞
実施例１では、ＴＵＳ−００７をマウス個体に投与した後、マウスの各組織における野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質の分解（ノックダウン）を検出することにより、ＴＵＳ−００７の分子動態を評価した。【０２２０】
（マウスへのＴＵＳ−００７の投与）
ＴＵＳ−００７をＤＭＳＯに溶解した後、ＤＭＳＯの濃度が１０体積％となるようにトウモロコシ油に溶解し、４０ｍｇ／ｋｇ体重又は８０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス（８週齢〜９週齢、雄）（日本クレア(株)）に腹腔内投与した（ｎ＝３〜４）。また、ＴＵＳ−００７を投与する投与群のほかに、Ｒａｓ−ＳＯＳを８０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与する投与群も準備した。コントロールとしては、注射液の担体（１０体積％ ＤＭＳＯを含有するトウモロコシ油）を用いた。マウスは、餌及び水が自由摂取できる環境下で飼育した。投与４８時間後に、ソムノペンチル（共立製薬(株)）による深麻酔下でマウスを解剖した。開腹してから順次、脾臓、膵臓、肝臓、腎臓、大腸、肺、及び心臓を摘出し、液体窒素で瞬間凍結させた。液体窒素で凍結後の各組織は、−８０℃のディープフリーザーにて保管した。【０２２１】
（マウス組織のウェスタンブロット解析）
凍結した組織（脾臓は０．０２ｇ、その他は０．０４ｇ）をそれぞれ粉砕した後、５００μＬのＴＫＭ組織溶解バッファー（50 mM トリエタノールアミン（pH 7.8）, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.25 M sucrose, 1 mM PMSF, protein inhibitors cocktail-EDTA free（ナカライテスク(株)）, 1 mM DTT，Recombinant RNase inhibitor（0.2 U/μL, Takara Bio））を加え、１５分間回転（１ｒｐｍ、２５℃）して溶解させた。その後、遠心分離（１３８００ｒｐｍ×３０分間、４℃）し、上清（各組織抽出物）を回収した。抽出したタンパク質は、分光光度計で濃度を定量した。【０２２２】
回収した各組織抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２−メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で５分間ヒートブロックした。電気泳動は１６０Ｖで６０分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。【０２２３】
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、１．５時間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。メンブレンは、２５ｋＤａマーカーの位置で２つに分割した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗Ｋ−Ｒａｓ抗体（sc-30, SantaCruz、５００倍希釈）及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（sc-32233, SantaCruz、２００００倍希釈）を用いた。室温にて６０分間（抗Ｋ−Ｒａｓ抗体）又は４℃で一晩（抗ＧＡＰＤＨ抗体）振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は４回行った。一次抗体反応後、１％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で二次抗体反応を行った。室温にて３０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は４回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で１０分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。検出されたバンドの定量には、画像処理ソフトウェアImageJ（NIH）を用いた。【０２２４】
ウェスタンブロット解析結果を図４に示す。図４に示すとおり、ＴＵＳ−００７をマウスに投与した場合、膵臓、大腸、腎臓、及び脾臓では濃度依存的に野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質の量が減少し、特に膵臓内における減少量が大きかった。一方、肺、肝臓、及び心臓では、野生型Ｋ−Ｒａｓタンパク質の量は減少しなかった。この結果から、ＴＵＳ−００７は、肺、肝臓、及び心臓に比べて、膵臓、大腸、腎臓、及び脾臓への移行性が高いことが示唆された。【０２２５】
＜合成例２＞
合成例２では、タンパク質分解誘導タグと、ｅｃＤＨＦＲタンパク質に対して親和性を有する特定タンパク質親和性分子とを連結することにより、タンパク質分解誘導分子であるＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを合成した。【０２２６】
タンパク質分解誘導タグとしては、前述した式（Ｉ）においてＲ１及びＲ２をいずれもメトキシ基とした化合物（ＤＭＴ）を用いた。ＤＭＴは、プロテアソーム阻害剤に由来しないものの、プロテアソームに対して親和性を有する化合物である。
また、特定タンパク質親和性分子としては、ｅｃＤＨＦＲタンパク質と結合するジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤であるＴＭＰにアミノ基を含む官能基を導入したＴＭＰ誘導体（ＴＭＰ−ＮＨ２）を用いた。【０２２７】
ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの合成方法の詳細は下記合成スキームのとおりである。【０２２８】
【化８】
2018092724.tif 000092
【０２２９】
ナスフラスコにＴＭＰ−ＮＨ２（Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637）（31.7 mg, 0.073 mmol）を仕込み、脱水ＤＭＦを０．３ｍＬ加えた。室温で１０分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡを０．１ｍＬ加え、室温で１０分間撹拌した。ＤＭＴ−ＭＭ（33.6 mg, 0.12 mmol, 1.6 eq, 和光純薬工業(株)）を反応溶液に直接加え、室温にて１８時間撹拌した。反応溶液を水及び炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈し、クロロホルムで５回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９２／８）を用いた分離精製処理により、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴ（25.8 mg, 0.045 mmol, 62%, isolated yield）を得た。【０２３０】
＜参考例４＞
参考例４では、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴのプロテアソーム阻害活性及びプロテアソームとの親和性を評価した。ポジティブコントロールとしては、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ−１３２を用いた。【０２３１】
評価には、20S Proteasome StressXpress Assay Kit Gold（Bioscience）を用い、２０Ｓプロテアソームのβ５（キモトリプシン様活性）、β２（トリプシン様活性）、及びβ１（カスパーゼ様活性）の各βサブユニットに特異的なＡＭＣ結合プロテアソーム蛍光基質のＣ末端が切断されることにより生成するＡＭＣをMulti-Detection Microplate Reader（Synergy HT, BIO-TEK）により測定した。測定波長は、励起光（Ex.）を３６０ｎｍ、蛍光（Em.）を４６０ｎｍとした。【０２３２】
β１（カスパーゼ様活性）、β２（トリプシン様活性）、及びβ５（キモトリプシン様活性）の各プロテアソーム活性を図５Ａ〜図５Ｃに示す。
図５Ａ〜図５Ｃに示すとおり、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴは、ＭＧ−１３２と比較して、プロテアソーム阻害活性が著しく低いことが確認できた。また、β１、β２、及びβ５のいずれに対しても、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの濃度依存的に阻害活性が高まることから、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴがプロテアソームと穏やかな親和性を有していることが示唆された。すなわち、ＤＭＴは、プロテアソームと親和性を有するものの、分解を阻害しないと評価された。【０２３３】
＜参考例５＞
参考例５では、ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを介した分解（ノックダウン）について、ＦＡＣＳ解析により評価した。【０２３４】
（プラスミドの準備）
ｅｃＤＨＦＲタンパク質を発現するプラスミド（pMIR-DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）を大腸菌で増幅した後、Miniprep Kit（QIAGEN）で精製した。【０２３５】
（ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
参考例１と同様にして、ＨｅＬａ細胞にプラスミドを導入することにより、細胞内にｅｃＤＨＦＲタンパク質（詳細には、ＨＡタグを介したｅｃＤＨＦＲタンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質）又は比較用のＤｓＲｅｄタンパク質を一過的に過剰発現させた。プラスミド導入後のＨｅＬａ細胞は、６×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４０時間培養した。【０２３６】
（ＨｅＬａ細胞へのＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの添加）
プラスミドを導入してから４０時間培養した後、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを添加した。培地としては、Ｄ−ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ−グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用い、各ウェル当たり２９７μＬ添加した。なお、Ｌ−グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを含有するＤＭＳＯ溶液を各ウェル当たり３μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。コントロールとしては、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。【０２３７】
（ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを介したｅｃＤＨＦＲタンパク質の分解（ノックダウン）の評価（ＦＡＣＳ解析））
ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの添加２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、３７℃のトリプシン（0.25 w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red）（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり３００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１分間培養した。培養後、Ｄ−ＭＥＭ（Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red）（和光純薬工業(株)）に１０質量％ ＦＢＳ及び１質量％ PenStrep（100 U/mL Sodium Penicillin G and 100 μg/mL Streptomycin Sulfate）（和光純薬工業(株)）を添加した培地を各ウェル当たり５００μＬ添加して懸濁し、１５ｍＬチューブに細胞溶液を回収した。【０２３８】
回収した細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、２ｍＬのＰＢＳ（３７℃）により懸濁した。懸濁後の細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、４℃のＦＡＣＳバッファー（１質量％ ＦＢＳ／ＰＢＳ）を５００μＬ添加し、氷上に静置した。【０２３９】
フローサイトメトリーにはBD FACSCanto II（BD Biosciences）を用い、細胞中におけるＧＦＰ及びＤｓＲｅｄタンパク質の発現を定量した。ＦＡＣＳ解析の直前に、細胞溶液を孔径３２μｍのメッシュに通し、ＦＡＣＳチューブへと移した。解析ソフトFlowJo（トミーデジタルバイオロジー(株)）により細胞１個当たりのＧＦＰ／ＤｓＲｅｄ比を算出し、グラフのシフトから、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴによるｅｃＤＨＦＲタンパク質の分解（ノックダウン）を確認した。【０２４０】
ＦＡＣＳ解析結果を図６に示す。図６に示すとおり、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを添加した場合には、濃度依存的にグラフが左にシフトしており、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴによってｅｃＤＨＦＲタンパク質の分解が誘導されていることが確認できた。一方、ＴＭＰを添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）とグラフが重なっており、ｅｃＤＨＦＲタンパク質が分解されていないことが確認できた。【０２４１】
＜参考例６＞
参考例６では、ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを介した分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。【０２４２】
（プラスミドの準備）
参考例５と同様にして、ｅｃＤＨＦＲタンパク質を発現するプラスミドを準備した。【０２４３】
（ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
参考例５と同様にして、ＨｅＬａ細胞にプラスミドを導入することにより、細胞内にｅｃＤＨＦＲタンパク質又は比較用のＤｓＲｅｄタンパク質を一過的に過剰発現させた。プラスミド導入後のＨｅＬａ細胞は、４×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４０時間培養した。【０２４４】
（ＨｅＬａ細胞へのＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの添加）
プラスミドを導入してから４０時間培養した後、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを添加した。培地としては、Ｄ−ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ−グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ−グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、各ウェル当たり３００μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。また、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群のほかに、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴ及びボルテゾミブ（Bortezomib）を含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群も準備した。ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの添加１２時間後に、タンパク質合成阻害剤であるシクロへキシミドを５０μｇ／ｍＬの濃度となるように培地中に添加した。なお、コントロールとしては、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。【０２４５】
（ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを介したｅｃＤＨＦＲタンパク質の分解（ノックダウン）の評価（ウェスタンブロット解析））
ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの添加２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、細胞溶解バッファー（CelLytic M, Sigma）とプロテアーゼ阻害剤（cOmplete Mini, EDTA-free, Roche）との混合溶液を各ウェル当たり５５μＬ添加した。４℃にて１５分間静置した後、ピペットチップを用いて氷上で細胞を剥がした。細胞溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、液体窒素で瞬間凍結した後、氷上で融解させた。凍結融解を３回繰り返した後、遠心分離（１３０００ｒｐｍ×２０分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。【０２４６】
回収した細胞抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２−メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で４分間ヒートブロックした。電気泳動は１５０Ｖで５０分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。【０２４７】
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、４０分間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／High-salt TBS-T（100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.2% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、メンブレンをHigh-salt TBS-Tでリンスし、１％スキムミルク／High-salt TBS-T中で抗体反応を行った。抗体としては、Anti-HA-Peroxidase, High-Affinity（3F10）Rat monoclonal antibody（25 U/mL）（Roche）を１０００倍希釈して用いた。室温にて１時間振盪させた後、メンブレンをHigh-salt TBS-Tで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをHigh-salt TBS（100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。【０２４８】
次に、同一のメンブレンを用いて、コントロールであるＧＡＰＤＨの検出反応を行った。メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）で洗浄し、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ＧＡＰＤＨ抗体（6C5, SantaCruz、２００００倍希釈）を用いた。室温にて６０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、２％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で二次抗体反応を行った。二次抗体としては、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（A90-116P-33, Bethyl）を２００００倍希釈して用いた。室温にて３０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。検出されたバンドの定量には、画像処理ソフトウェアImageJ（NIH）を用いた。【０２４９】
ウェスタンブロット解析結果を図７Ａ及び図７Ｂに示す。図７Ａ及び図７Ｂに示すとおり、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを添加した場合には、ｅｃＤＨＦＲタンパク質の量が減少したが、ＴＭＰを添加した場合には、ｅｃＤＨＦＲタンパク質の量が減少しなかった。また、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴ及びボルテゾミブの両方を添加した場合には、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを添加した場合と比較してｅｃＤＨＦＲタンパク質の分解が阻害された。この結果は、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴによって、ｅｃＤＨＦＲタンパク質がプロテアソームによる分解へと導かれていることを裏付けるものである。【０２５０】
＜合成例３＞
合成例３では、タンパク質分解誘導タグと、ＤＨＦＲタンパク質に対して親和性を有する特定タンパク質親和性分子とを連結することにより、タンパク質分解誘導分子であるＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを合成した。【０２５１】
タンパク質分解誘導タグとしては、前述のＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを用いた。
また、特定タンパク質親和性分子としては、ＤＨＦＲタンパク質と結合するジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤であるＭＴＸにアミノ基を含む官能基を導入したＭＴＸ誘導体（ＭＴＸ−ＮＨ２）を用いた。【０２５２】
ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの合成方法の詳細は下記合成スキームのとおりである。【０２５３】
【化９】
2018092724.tif 000093
【０２５４】
（化合物２１（ＭＴＸ−ＮＨ２）の合成）
化合物１３をＤＭＡ中でトリフェニルホスフィンジブロミドと反応させ、化合物１４を得た。化合物１４を窒素気流下でＤＭＡに溶解した後、化合物１５とＤＩＰＥＡとを加えて反応させ、化合物１６を得た（収率：６９％）。次いで、化合物１６と化合物１７とを窒素気流下でＤＭＳＯに溶解し、ＢＯＰ試薬により縮合反応を行い、化合物１８を得た（収率：４６％）。次いで、化合物１８と化合物１９とを窒素気流下でＤＭＡに溶解し、ＨＡＴＵにより縮合反応を行い、化合物２０を得た（収率：６９％）。次いで、化合物２０をジクロロメタンに溶解し、ＴＦＡにより脱保護を行うことで、化合物２１（ＭＴＸ−ＮＨ２）を得た。【０２５５】
（化合物２２（ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ）の合成）
化合物２１（ＭＴＸ−ＮＨ２）とＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮとを窒素気流下でＤＭＦに溶解し、ＰｙＢＯＰにより縮合反応を行った（室温、３時間）。反応溶液を水及び炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈し、酢酸エチルで３回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝２０／１〜４／１, gradient）により分離精製処理を行った。次いで、分取用薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝８５／１５）を用いた分離精製処理により、化合物２２（ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ）を得た（単離収率：８％）。【０２５６】
＜参考例７＞
参考例７では、ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加したＨｅＬａ細胞における内在のＤＨＦＲタンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。【０２５７】
（培養細胞の準備及び細胞播種）
参考例３と同様にして、ＨｅＬａ細胞を準備し、２４ウェルプレートに播種した。【０２５８】
（ＨｅＬａ細胞へのＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの添加）
参考例５と同様にして、ＨｅＬａ細胞にＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加した。コントロールとしては、ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを含有するＤＭＳＯ溶液の代わりに、ＭＴＸを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。【０２５９】
（ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを介したＤＨＦＲタンパク質の分解（ノックダウン）の評価（ウェスタンブロット解析））
ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ（５０μＭ、１００μＭ、若しくは２００μＭ）又はＭＴＸ（５０μＭ、１００μＭ、若しくは２００μＭ）の添加１６時間後、培地を除去し、４℃のＰＢＳ（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり１ｍＬ添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、細胞溶解バッファー（CelLytic M, Sigma）とプロテアーゼ阻害剤（cOmplete Mini, EDTA-free (REF 11 836 170 001), Roche）との混合溶液を各ウェル当たり２７μＬ添加した。４℃にて１５分間静置した後、ピペットチップ（P1000）を用いて氷上で細胞を剥がした。細胞溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、液体窒素で瞬間凍結した後、氷上で融解させた。融解後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ×１５分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。【０２６０】
回収した細胞抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１４ウェル）は、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２−メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で４分間ヒートブロックした。調製した泳動サンプルは、各ウェル当たり２０μＬずつアプライした。泳動マーカーとしては、Precision Plus Protein Dual Color Standards（Bio-Rad）を用いた。電気泳動は１６０Ｖで６５分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。【０２６１】
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、２時間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。メンブレンは、２５ｋＤａマーカーの位置で２つに分割した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ＤＨＦＲ抗体（sc-14780, SantaCruz、５００倍希釈）及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（sc-32233, SantaCruz、２００００倍希釈）を用いた。室温にて９０分間（抗ＤＨＦＲ抗体）又は４５分間（抗ＧＡＰＤＨ抗体）振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、２％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で二次抗体反応を行った。室温にて３０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。検出されたバンドの定量には、画像処理ソフトウェアImageJ（NIH）を用いた。【０２６２】
ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ又はＭＴＸを添加したＨｅＬａ細胞において、内在のＤＨＦＲタンパク質のウェスタンブロット解析により検出されたバンドの定量結果を図８Ａに示し、検出されたバンドを図８Ｂに示す。
図８Ａ及び図８Ｂに示すとおり、ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加した場合には、濃度依存的にＤＨＦＲタンパク質の量が減少した。一方、ＭＴＸを添加した場合には、濃度が２００μＭの場合であっても、ＤＨＦＲタンパク質の量の減少は観察されなかった。【０２６３】
＜実施例２＞
実施例２では、ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮをマウス個体に投与した後、マウスの各組織におけるＤＨＦＲタンパク質の分解（ノックダウン）を検出することにより、ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの分子動態を評価した。【０２６４】
（マウスへのＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの投与）
投与の直前に、ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮをＤＭＳＯに溶解した後、ＤＭＳＯの濃度が１０体積％となるようにトウモロコシ油（Code No. 25606-55, Nacalai Tesque）に溶解し、５０ｍｇ／ｋｇ体重又は１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス（７週齢、雄）（日本クレア(株)）に腹腔内投与した（ｎ＝３）。また、ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを投与する投与群のほかに、ＭＴＸを１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与する投与群も準備した。コントロールとしては、注射液の担体（１０体積％ ＤＭＳＯを含有するトウモロコシ油）を用いた。マウスは、餌及び水が自由摂取できる環境下で飼育した。投与２４時間後に、ソムノペンチル（共立製薬(株)）による深麻酔下でマウスを解剖した。開腹してから順次、肝臓、腎臓、及び心臓を摘出し、液体窒素で瞬間凍結させた。液体窒素で凍結後の各組織は、−８０℃のディープフリーザーにて保管した。【０２６５】
（マウス組織のウェスタンブロット解析）
凍結した組織（０．０４ｇ）をそれぞれ凍結粉砕した後、９８０μＬの１×ＴＫＭ組織溶解バッファー（50 mM トリエタノールアミン（pH 7.8）, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.25 M sucrose, 1 mM PMSF, protein inhibitors cocktail-EDTA free（Code No.03969-21, Nacalai Tesque), 1 mM DTT，Recombinant RNase inhibitor 5 μL/mL (40 U/μL, Cat No. 2313A, Lot No. K8402DA, TAKARA Bio)）を加え、１５分間回転（１ｒｐｍ、２５℃）して溶解させた。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ×１５分間、４℃）し、上清（各組織抽出物）を回収した。各組織抽出物をＤＥＰＣ処理水により２０倍希釈したものを用いて、分光光度計で各組織抽出物におけるタンパク質濃度を定量した。【０２６６】
回収した各組織抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２−メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で５分間ヒートブロックした。調製した泳動サンプルは、ＧＡＰＤＨの検出用においては５０μｇ／ウェルずつアプライし、それ以外の検出用においては１００μｇ／ウェルずつアプライした。電気泳動は１６０Ｖで６０分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。【０２６７】
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、１．５時間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。メンブレンは、２５ｋＤａマーカーの位置で２つに分割した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ＤＨＦＲ抗体（ｓｃ−１４７８０，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，５００倍希釈）及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（sc-32233, SantaCruz、２００００倍希釈）を用いた。室温にて６０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、１％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で二次抗体反応を行った。室温にて３０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で１０分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。検出されたバンドの定量には、画像処理ソフトウェアImageJ（NIH）を用いた。【０２６８】
ウェスタンブロット解析結果を図９に示す。図９に示すとおり、ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮをマウスに投与した場合、肝臓及び腎臓では濃度依存的にＤＨＦＲタンパク質の量が減少した。一方、心臓では、ＤＨＦＲタンパク質の量の減少は認められなかった。この結果から、ＭＴＸ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮは、心臓に比べて、肝臓及び腎臓への移行性が高いことが示唆された。【０２６９】
＜合成例４：ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの合成＞
合成例４では、タンパク質分解誘導タグと、ｐ５３／ＭＤＭ２複合体に対して親和性を有する特定タンパク質親和性分子とを連結することにより、タンパク質分解誘導分子であるＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを合成した。【０２７０】
タンパク質分解誘導タグとしては、前述のＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを用いた。
また、特定タンパク質親和性分子としては、下式で表されるＴＩＢＣ−ＮＨ２を用いた。ＴＩＢＣ−ＮＨ２は、下式で表されるＴＩＢＣに、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）６−ＣＯＯＨを付加させた化合物である。ＴＩＢＣは、ｐ５３／ＭＤＭ２複合体に対して親和性を有する。【０２７１】
【化１０】
2018092724.tif 000094
【０２７２】
ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの合成方法の詳細は以下のとおりである。【０２７３】
【化１１】
2018092724.tif 000095
【０２７４】
ナスフラスコにＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ（21.7 mg, 0.06 mmol, 1 eq）及び別途合成したＴＩＢＣ−ＮＨ２（29.3 mg, 0.06 mmol, 1 eq）を仕込み、脱水ＤＭＦを５ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡを５ｍＬ加え、溶液を中性にした。室温にて２０分間撹拌した後、ＰｙＢＯＰ（46.8 mg, 0.09 mmol, 1.5 eq）を反応溶液に直接加え、室温にて１６時間撹拌した。冷却下で飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機層を分離した後、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を集め、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝２０／１〜４／１，gradient）を用いた分離精製処理により、ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ（10.8 mg, 0.013 mmol, 22%, isolated yield）を得た。得られたＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮは、分取用薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１０／１）を用いて、更に精製処理を行った。
ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの物性データを以下に示す。
HRMS-FAB (m/z): [M+H]+ calcd for C37H42Cl2N4O5I, 819.1577; found, 819.1577【０２７５】
＜参考例８＞
参考例８では、ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加したＨＣＴ１１６細胞（ヒト大腸がん細胞）における内在の野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。【０２７６】
（細胞播種）
ＨＣＴ１１６細胞を８×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１６時間培養した。【０２７７】
（ＨＣＴ１１６細胞へのＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ又はＴＩＢＣの添加）
細胞播種から１６時間後に、以下のようにして、ＨＣＴ１１６細胞にＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ又はＴＩＢＣを添加した。培地としては、Ｄ−ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ−グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ−グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ又はＴＩＢＣを含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、各ウェル当たり５００μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。コントロールとしてはＤＭＳＯを用いた。【０２７８】
（ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを介した内在の野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質の分解（ノックダウン）の評価（ウェスタンブロット解析））
ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ又はＴＩＢＣの添加４８時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、細胞溶解バッファー（CelLytic M, Sigma）とプロテアーゼ阻害剤（cOmplete Mini, EDTA-free, Roche）との混合溶液を各ウェル当たり２７μＬ添加した。４℃にて１５分間静置した後、ピペットチップを用いて氷上で細胞を剥がした。細胞溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、液体窒素で瞬間凍結した後、氷上で融解させた。融解後、遠心分離（１３８００ｒｐｍ×２０分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。【０２７９】
回収した細胞抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２−メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で４分間ヒートブロックした。電気泳動は１６０Ｖで６５分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。【０２８０】
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、２時間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ｐ５３抗体（DO-1, SantaCruz, １５００倍希釈）、抗ＭＤＭ２抗体（SMP14, SantaCruz, ５００倍希釈）、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（6C5, SantaCruz、２００００倍希釈）を用いた。４℃にて一晩振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、２％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で二次抗体反応を行った。二次抗体としては、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（A90-116P-33, Bethyl, ２００００倍希釈）を用いた。室温にて４５分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。【０２８１】
ウェスタンブロット解析結果を図１０に示す。図１０に示すとおり、ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加した場合には、内在の野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質の量が減少した。一方、ＴＩＢＣを添加した場合には、内在の野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質の量は減少しなかった。【０２８２】
＜参考例９＞
参考例９では、ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加したＨｅＬａ細胞における内在の野生型ｐ５３タンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。同時に、プロテアソーム阻害剤によるｐ５３タンパク質分解のレスキューを評価した。【０２８３】
（細胞播種）
ＨｅＬａ細胞を４×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１６時間培養した。【０２８４】
（Ｈｅｌａ細胞へのＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの添加）
細胞播種から１６時間後に、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加した。培地としては、Ｄ−ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ−グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ−グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、各ウェル当たり５００μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。コントロールとしてはＤＭＳＯを用いた。また、ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群のほかに、ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ及びＭＬＮ２２３８の両方、又はＭＬＮ２２３８を含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群も準備した。【０２８５】
（ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを介した内在の野生型ｐ５３タンパク質の分解（ノックダウン）の評価（ウェスタンブロット解析））
ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ又はＭＬＮ２２３８の添加２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、細胞溶解バッファー（CelLytic M, Sigma）とプロテアーゼ阻害剤（cOmplete Mini, EDTA-free, Roche）との混合溶液を各ウェル当たり２７μＬ添加した。４℃にて１５分間静置した後、ピペットチップを用いて氷上で細胞を剥がした。細胞溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、液体窒素で瞬間凍結した後、氷上で融解させた。融解後、遠心分離（１３８００ｒｐｍ×２０分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。【０２８６】
回収した細胞抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２−メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で４分間ヒートブロックした。電気泳動は１６０Ｖで６５分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。【０２８７】
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、２時間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ｐ５３抗体（DO-1, SantaCruz、１０００倍希釈）、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（6C5, SantaCruz、１００００倍希釈）を用いた。４℃にて一晩振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、２％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で二次抗体反応を行った。二次抗体としては、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（A90-116P-33, Bethyl, １００００倍希釈）を用いた。室温にて３０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。【０２８８】
ウェスタンブロット解析結果を図１１に示す。図１１に示すとおり、ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加した場合には、内在の野生型ｐ５３タンパク質の量が減少した。また、ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ及びＭＬＮ２２３８の両方を添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）よりも野生型ｐ５３タンパク質の量が増加した。この結果は、ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮによって、野生型ｐ５３タンパク質がプロテアソームによる分解へと導かれていることを裏付けるものである。【０２８９】
＜実施例３＞
実施例３では、ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮをマウス個体に投与した後、マウスの各組織における野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質の分解（ノックダウン）を検出することにより、ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの分子動態を評価した。【０２９０】
（マウスへのＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの投与）
投与の直前に、ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮをＤＭＳＯに溶解した後、ＤＭＳＯの濃度が１０体積％となるようにトウモロコシ油（Code No. 25606-55, Nacalai Tesque）に溶解し、５０ｍｇ／ｋｇ体重又は１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス（７〜８週齢、雄）（日本クレア(株)）に腹腔内投与した（ｎ＝３）。コントロールとしては、注射液の担体（１０体積％ ＤＭＳＯを含有するトウモロコシ油）を用いた。マウスは、餌及び水が自由摂取できる環境下で飼育した。投与４８時間後に、ソムノペンチル（共立製薬(株)）による深麻酔下でマウスを解剖した。開腹してから順次、肝臓、腎臓、脾臓、及び心臓を摘出し、液体窒素で瞬間凍結させた。液体窒素で凍結後の各組織は、−８０℃のディープフリーザーにて保管した。【０２９１】
凍結した組織（脾臓は０．０２ｇ、その他は０．０４ｇ）をそれぞれ凍結粉砕した後、脾臓は４９０μＬ、その他は９８０μＬの１×ＴＫＭ組織溶解バッファー（50 mM トリエタノールアミン（pH 7.8）, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.25 M sucrose, 1 mM PMSF, protein inhibitors cocktail-EDTA free（Code No.03969-21, Nacalai Tesque), 1 mM DTT，Recombinant RNase inhibitor 5 μL/mL (40 U/μL, Cat No. 2313A, Lot No. K8402DA, TAKARA Bio)）を加え、１５分間回転（１ｒｐｍ、２５℃）して溶解させた。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ×１５分間、４℃）し、上清（各組織抽出物）を回収した。各組織抽出物をＤＥＰＣ処理水により２０倍希釈したものを用いて、分光光度計で各組織抽出物におけるタンパク質濃度を定量した。【０２９２】
回収した各組織抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２−メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で５分間ヒートブロックした。調製した泳動サンプルは、ＧＡＰＤＨの検出用においては５０μｇ／ウェルずつアプライし、それ以外の検出用においては１００μｇ／ウェルずつアプライした。電気泳動は１６０Ｖで６０分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。【０２９３】
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、１．５時間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。メンブレンは、２５ｋＤａマーカーの位置で２つに分割した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ｐ５３抗体（MAB1355, R&D Systems, Inc., ５００倍希釈）、抗ＭＤＭ２抗体（sc-965, SantaCruz, ５００倍希釈）、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（sc-32233, SantaCruz、２００００倍希釈）を用いた。室温にて６０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、１％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で二次抗体反応を行った。室温にて３０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で１０分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。検出されたバンドの定量には、画像処理ソフトウェアImageJ（NIH）を用いた。【０２９４】
ウェスタンブロット解析結果を図１２及び図１３に示す。図１２及び図１３に示すとおり、ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮをマウスに投与した場合、心臓及び脾臓では濃度依存的に野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク量の減少が認められた。また、肝臓では１００ｍｇ／ｋｇ体重で投与した場合のみ、野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク量の若干の減少が認められた。一方、腎臓では、標的の減少は見られなかった。この結果から、ＴＩＢＣ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮは、腎臓に比べて、心臓、肝臓、及び脾臓への移行性が高いことが示唆された。【０２９５】
＜参考例１０＞
参考例１０では、タンパク質分解誘導タグと、ｅｃＤＨＦＲタンパク質に対して親和性を有する特定タンパク質親和性分子とを連結することにより、タンパク質分解誘導分子であるＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを合成した。【０２９６】
タンパク質分解誘導タグとしては、プロテアソーム阻害剤であるＡＬＬＮの活性部位（ホルミル基）をカルボキシ基に置き換えた化合物（ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ）を用いた。
また、特定タンパク質親和性分子としては、前述したＴＭＰ−ＮＨ２を用いた。【０２９７】
ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮの合成方法の詳細は下記合成スキームのとおりである。【０２９８】
【化１２】
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【０２９９】
（ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮの合成）
ナスフラスコにＡＬＬＮ（87.2 mg, 0.23 mmol, 1 eq, Code No. 07036-24, ナカライテスク(株)）を仕込み、脱水ＤＭＦを２ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、Oxone（212.1 mg, 0.69 mmol, 3 eq, Code No. 228036, Sigma-Aldrich）を反応溶液に直接加え、室温にて５時間撹拌した。反応溶液を水で希釈した後、クロロホルムで３回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィー（Code No. 30511-35, ナカライテスク(株)）（クロロホルム／メタノール＝２０／１〜１０／１, gradient）を用いた分離精製処理により、ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ（27.0 mg, 0.068 mmol, 30%）を得た。【０３００】
（ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮの合成）
ナスフラスコにＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ（26.8 mg, 0.067 mmol, 1 eq）及び別途合成したＴＭＰ−ＮＨ２（Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637）（26.0 mg, 0.060 mmol, 0.9 eq）を仕込み、脱水ＤＭＦを２ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡを０．１ｍＬ加え、溶液を中性にした。室温にて５分間撹拌した後、ＤＭＴ−ＭＭ（30.0 mg, 0.11 mmol, 1.6 eq, Code No. 329-53751, 和光純薬工業(株)）を反応溶液に直接加え、室温にて２時間撹拌した。冷却下で１０ｍＬの１０質量％食塩水／０．１Ｎ 塩酸水溶液を加え、酢酸エチルで３回抽出した。０．５Ｎ 塩酸水溶液、次いで食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（Code No. 30511-35, ナカライテスク(株)）（クロロホルム／メタノール＝１０／１）を用いた分離精製処理により、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ（8.2 mg, 0.010 mmol, 15%, isolated yield）を得た。【０３０１】
＜参考例１１＞
参考例１１では、参考例４と同様にして、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮのプロテアソーム阻害活性及びプロテアソームとの親和性を評価した。【０３０２】
β１（カスパーゼ様活性）、β２（トリプシン様活性）、及びβ５（キモトリプシン様活性）の各プロテアソーム活性を図１４Ａ〜図１４Ｃに示す。
図１４Ａ〜図１４Ｃに示すとおり、β２及びβ５の活性に対して、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮでは、ＡＬＬＮ単独と比較して阻害活性が弱まり、ＡＬＬＮの阻害活性が失活していることが確認できた。β１については、ＡＬＬＮではあまり阻害されないことが報告されており（Kaiser, M. et al., Chem. Bio. Chem., 2004, 5, 1256-1266）、この報告と矛盾しない結果であった。
また、β１、β２、及びβ５のいずれに対しても、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮの濃度依存的に阻害活性が高まることから、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮとプロテアソームとの親和性が確認された。【０３０３】
＜参考例１２＞
参考例１２では、ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを介した分解（ノックダウン）について、ＦＡＣＳ解析により評価した。【０３０４】
（プラスミドの準備）
参考例５と同様にして、ｅｃＤＨＦＲタンパク質を発現するプラスミド（pMIR-DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）を準備した。【０３０５】
（ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
参考例５と同様にして、ＨｅＬａ細胞にプラスミドを導入することにより、細胞内にｅｃＤＨＦＲタンパク質又は比較用のＤｓＲｅｄタンパク質を一過的に過剰発現させた。プラスミド導入後のＨｅＬａ細胞は、４×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４０時間培養した。【０３０６】
（ＨｅＬａ細胞へのＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮの添加）
プラスミドを導入してから４０時間培養した後、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを添加した。培地としては、Ｄ−ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ−グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用い、各ウェル当たり３００μＬ添加した。なお、Ｌ−グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを含有するＤＭＳＯ溶液を各ウェル当たり３μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。コントロールとしては、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。【０３０７】
（ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを介したｅｃＤＨＦＲタンパク質の分解（ノックダウン）の評価（ＦＡＣＳ解析））
参考例１と同様にして、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを介したｅｃＤＨＦＲタンパク質の分解について、ＦＡＣＳ解析により評価した。【０３０８】
ＦＡＣＳ解析結果を図１５に示す。図１５に示すとおり、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）と比較してグラフが大きく左にシフトしており、ＴＭＰ−ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮによってｅｃＤＨＦＲタンパク質の分解が誘導されていることが確認できた。一方、ＴＭＰを添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）とグラフが重なっており、ｅｃＤＨＦＲタンパク質が分解されていないことが確認できた。【０３０９】
２０１６年１１月１５日に出願された日本出願２０１６−２２２６８２の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的且つ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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