(57)【要約】ＰＨＡの生産性が向上した、微生物によるＰＨＡの製造方法、及び、当該製造方法に利用されるＰＨＡ産生微生物を提供する。ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、鞭毛タンパク質をコードする遺伝子が不活性化された微生物を培養して、当該微生物にポリヒドロキシアルカン酸を生産させる工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。前記微生物は、さらに、リパーゼ、脱リン酸化酵素、配列番号６又は７に記載のアミノ酸配列で示されるタンパク質が不活性化されたものであってもよい。前記微生物はＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒであってもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、鞭毛タンパク質をコードする遺伝子が不活性化された微生物を培養して、当該微生物にポリヒドロキシアルカン酸を生産させる工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項２】
前記微生物は、さらに、配列番号２又は３に記載のアミノ酸配列で示されるリパーゼ、配列番号４又は５に記載のアミノ酸配列で示される脱リン酸化酵素、配列番号６又は７に記載のアミノ酸配列で示されるタンパク質、及び、配列番号２〜７のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示されるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子が不活性化されたものである、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項３】
前記ポリヒドロキシアルカン酸は、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合体である、請求項１又は２に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項４】
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、鞭毛タンパク質をコードする遺伝子が不活性化された微生物。
【請求項５】
前記微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒである、請求項４に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の製造方法、及び当該微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境問題、食糧問題、健康及び安全に対する意識の高まり、天然又は自然志向の高まりなどを背景に、微生物を利用した物質製造（発酵生産、バイオ変換など）の意義及び重要性が益々高まっており、タンパク質医薬品や遺伝子治療用の核酸などの製造にも、微生物による物質生産が応用されている。例えば、酵母やバクテリアなどの微生物を利用したエタノール、酢酸、医療用タンパク質の生産などが活発に産業応用されている。【０００３】
その一例として、生分解性プラスチックとしての産業利用が期待されているポリヒドロキアルカン酸（以下、ＰＨＡともいう）の微生物による生産が挙げられる（非特許文献１を参照）。ＰＨＡは、多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として産生、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在、環境への意識の高まりから非石油由来のプラスチックが注目されるなか、特に、微生物が菌体内に産生、蓄積するＰＨＡは、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響が小さいと予想されており、その実用化が切望されている。微生物を利用したＰＨＡ生産では、例えば、バクテリアであるＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒに炭素源として糖、植物油脂や脂肪酸を与え、細胞内にＰＨＡを蓄積させることでＰＨＡを生産することが知られている（非特許文献２及び３を参照）。【０００４】
しかしながら、微生物を利用した物質生産は、煩雑な操作や培地コスト、低生産性（低生産物濃度、及び／または、低生産速度）などの問題によって生産コストが高くなることが問題となるケースがある。従って、微生物培養での生産性を向上し、微生物による物質生産の効率を上げることは生産コストの低減のための大きな課題であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＡＪ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１２，２０１−１０５（１９９０）
【非特許文献２】Ｓａｔｏ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１２０（３），２４６−２５１（２０１５）
【非特許文献３】Ｉｎｓｏｍｐｈｕｎ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，２７，３８−４５（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記現状に鑑み、ＰＨＡの生産性が向上した、微生物によるＰＨＡの製造方法、及び、当該製造方法に利用されるＰＨＡ産生微生物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一般に、微生物は環境（温度、ｐＨ、栄養状態、溶存酸素濃度、炭素源など）に適応する目的で多種多様な遺伝子を発現させている。遺伝子が転写、翻訳されて生産されたタンパク質は環境適応に重要な役割を果たしている。微生物におけるタンパク質の生産は、微生物の生存、生育、及び外部環境への適応のために必要な生命現象であることから、タンパク質の生産能力を低下させると、それに伴い微生物の生育や微生物による有用物質の生産能力の低下は当然予想される現象であった。【０００８】
Ｒａｂｅｒｇら（Ｒａｂｅｒｇ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７４（１４），４４７７−４４９０（２００８））によれば、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒの転写因子をコードする遺伝子ｒｐｏＮを破壊した株（ＨＦ０９）では、鞭毛形成量が野生型と比較して低下しており、ＰＨＡ含量も培養終点で３４％と低くなることが報告されている。さらに、ΔＰＨＡＰ１株をＴＳＢ培地で培養した際には、鞭毛の形成は確認されず、ＰＨＡ含量は著しく低下する結果が示されている。このように、転写因子をコードする遺伝子ｒｐｏＮを破壊して鞭毛形成能を低下させた株では、ＰＨＡ産生能も低下する結果が示されていた。【０００９】
しかしながら本願発明者らは、驚くべきことに、本来的に鞭毛タンパク質の生産能を有するＰＨＡ産生微生物において、鞭毛タンパク質をコードする遺伝子を不活性化したＰＨＡ産生微生物では、ＰＨＡ産生能が顕著に向上することを見出し、本発明に至った。【００１０】
すなわち本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、鞭毛タンパク質をコードする遺伝子が不活性化された微生物を培養して、当該微生物にポリヒドロキシアルカン酸を生産させる工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法である。【００１１】
好ましくは、前記微生物は、さらに、配列番号２又は３に記載のアミノ酸配列で示されるリパーゼ、配列番号４又は５に記載のアミノ酸配列で示される脱リン酸化酵素、配列番号６又は７に記載のアミノ酸配列で示されるタンパク質、及び、配列番号２〜７のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示されるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子が不活性化されたものである。【００１２】
好ましくは、前記ポリヒドロキシアルカン酸は、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合体である。【００１３】
また本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、鞭毛タンパク質をコードする遺伝子が不活性化された微生物でもある。【００１４】
好ましくは、前記微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、微生物によりＰＨＡを生産するにあたって、ＰＨＡの生産性を向上させることができる。さらには、微生物培養中に細胞外に排出されるタンパク質を低減することもできる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明に係る微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有するＰＨＡ産生微生物であって、鞭毛タンパク質をコードする遺伝子が不活性化された微生物（以下、本発明の鞭毛破壊株とういう）である。
【００１８】
（微生物）
本発明により鞭毛タンパク質をコードする遺伝子を不活性化する微生物は特に限定されず、細菌、酵母、糸状菌などが例示され、好ましくは、細菌である。当該細菌としては、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する細菌類が好ましい例として挙げられる。安全性及び生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、アエロモナス属、ワウテルシア属に属する細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス属又はアエロモナス属に属する細菌であり、さらにより好ましくはカプリアビダス属に属する微生物であり、特に好ましくはカプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）である。
【００１９】
本発明の鞭毛破壊株は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有するＰＨＡ産生微生物であるが、鞭毛タンパク質をコードする遺伝子を不活性化する微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を本来的に有する野生株であってもよいし、そのような野生株を人工的に突然変異処理して得られる変異株や、あるいは、遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された菌株であってもよい。
【００２０】
（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）
形質転換により導入されるＰＨＡ合成酵素遺伝子としては特に限定されず、例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅやＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、ＰｓｅｕｒｏｍｏｎａｓＳＰ  ６１−３、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子や、それらの改変体などが挙げられる。前記改変体としては、１以上のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、又は置換されたＰＨＡ合成酵素をコードする塩基配列などを用いることができる。具体的には、配列番号８に記載のアミノ酸配列で示されるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子、及び、配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、かつポリヒドロキシアルカン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。上記配列相同性としては好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【００２１】
（ＰＨＡ）
本発明の鞭毛破壊株が生産するＰＨＡの種類としては、微生物が生産し得るＰＨＡである限り特に限定されないが、炭素数４〜１６の３−ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーの単独重合体、炭素数４〜１６の３−ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーとその他のヒドロキシアルカン酸（例えば、炭素数４〜１６の４−ヒドロキシアルカン酸）の共重合体、及び、炭素数４〜１６の３−ヒドロキシアルカン酸から選択される２種以上のモノマーの共重合体が好ましい。例えば、３−ヒドロキシ酪酸（略称：３ＨＢ）のホモポリマーであるＰ（３ＨＢ）、３ＨＢと３−ヒドロキシ吉草酸（略称：３ＨＶ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（略称：３ＨＨ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）（略称：ＰＨＢＨ）、３ＨＢと４−ヒドロキシ酪酸（略称：４ＨＢ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）、並びに、乳酸（略称：ＬＡ）を構成成分として含むＰＨＡ、例えば３ＨＢとＬＡの共重合体Ｐ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）などが挙げられるが、これらに限定されない。この中でも、ポリマーとしての応用範囲が広いという観点から、ＰＨＢＨが好ましい。なお、生産されるＰＨＡの種類は、目的に応じて、使用する微生物の保有するあるいは別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。
【００２２】
（鞭毛タンパク質）
本発明の鞭毛破壊株は、微生物が本来有する鞭毛タンパク質をコードする遺伝子を不活性化したものである。鞭毛タンパク質とは、鞭毛繊維（フラジェリン）を構成するタンパク質を指す。鞭毛とは細胞の運動に関与する細胞器官であり、細胞外に伸びた鞭毛タンパク質、フックタンパク質、及び、細胞表層膜中のリポ多糖体膜、ペプチドグリカン層、ペリプラズム層、脂肪質膜に存在するリング、ロッドを構成する各タンパク質から構成される。バクテリアにおいては、大腸菌、サルモネラ菌、枯草菌、及び、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌のように数本の鞭毛を有する属、及び、ビブリオ属細菌のように、単鞭毛のものが存在することが知られている。不活性化する鞭毛タンパク質遺伝子は、微生物が本来的に有する鞭毛タンパク質遺伝子であればよく、特に限定されない。微生物がカプリアビダス・ネカトールである場合、鞭毛タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。本発明においては、配列番号１に記載のアミノ酸配列で示される鞭毛タンパク質をコードする遺伝子、または、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示される鞭毛タンパク質をコードする遺伝子が不活性化されることが好ましい。上記配列相同性としては好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【００２３】
（不活性化）
本発明において、鞭毛タンパク質遺伝子を不活性化する方法としては、鞭毛タンパク質の合成を妨げる方法、又は、細胞内で合成された鞭毛タンパク質の細胞外への輸送を妨げる方法が挙げられる。より具体的には、例えば、鞭毛タンパク質をコードする遺伝子、又はそのプロモーター配列の塩基配列の全体または一部を欠失させる方法、前記塩基配列の途中に終始コドンを導入する方法、前記遺伝子の転写を阻害する方法や、鞭毛タンパク質を細胞外に輸送するシステム（シャペロンタンパク質、シグナル配列、トランスポータータンパク質など）の機能を停止または抑制する方法などが挙げられる。また、遺伝子工学的手法を用いて不活性化してもよいし、突然変異を誘導する手法を用いて不活性化してもよい。
【００２４】
（不活性化する他の遺伝子）
本発明の鞭毛破壊株では、ＰＨＡ産生能の顕著な向上が確認されたが、それと共に、微生物の培養中に細胞外に蓄積するタンパク質の濃度が低下することが確認された。これらの効果は、鞭毛タンパク質遺伝子の不活性化により達成されるが、鞭毛タンパク質遺伝子に加えて他のタンパク質遺伝子を不活性化することで前記効果をより高めることができる。
【００２５】
本発明において、鞭毛タンパク質遺伝子以外で、不活性化するタンパク質遺伝子としては特に限定されないが、ＰＨＡ産生能の向上及び細胞外タンパク質濃度の低減という観点から、フォスフォリパーゼ等のリパーゼ、アルカリフォスファターゼ等のフォスファターゼ、配列番号６又は７に記載のアミノ酸配列で示されるタンパク質などの酵素タンパク質；ＡＢＣトランスポーターの基質結合ドメイン（Ｌｏｃｈｅｒ  ＫＰ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂ，３４６，２３９−２４５（２００９））などの細胞のペリプラズム領域に存在するタンパク質等が好ましい。より好ましくは、フォスフォリパーゼ、アルカリフォスファターゼ、配列番号６又は７に記載のアミノ酸配列で示されるタンパク質又はその相同タンパク質、及びこれらの組合せであり、特に好ましくは、配列番号２又は３に記載のアミノ酸配列で示されるフォスフォリパーゼ又はその相同タンパク質、配列番号４又は５に記載のアミノ酸配列で示されるフォスファターゼ又はその相同タンパク質、配列番号６又は７に記載のアミノ酸配列で示されるタンパク質又はその相同タンパク質、及びこれらの組合せである。ここで、相同タンパク質とは、前記で特定したアミノ酸配列に対して９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、かつ前記で特定した酵素活性を示すタンパク質のことをいう。上記配列相同性としては好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上である。なお、これら他のタンパク質遺伝子を不活性化する方法としては、上述した鞭毛タンパク質を不活性化する方法と同じ方法が挙げられる。
【００２６】
（ＰＨＡ製造方法）
本発明の鞭毛破壊株を培養することで、菌体内にＰＨＡを蓄積させることができる。本発明の鞭毛破壊株を培養する方法としては、常法の微生物培養法に従うことができ、培地に適切な炭素源を添加して培養を行なえばよい。培地組成、炭素源の添加方法、培養スケール、通気攪拌条件や、培養温度、培養時間などは特に限定されない。炭素源は、連続的に、または間欠的に培地に添加することが好ましい。
【００２７】
培養を適切な時間行なって菌体内にＰＨＡを蓄積させた後、周知の方法を用いて菌体からＰＨＡを回収する。具体的には、次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収することができる。
【００２８】
本発明の鞭毛破壊株を用いたＰＨＡの製造方法によると、微生物を用いた工業規模でのＰＨＡ生産という観点から、好ましくは、ＰＨＡ生産量が１５０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１６０ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１７０ｇ／Ｌ以上を達成することができる。しかも、培養液の上清中のタンパク質濃度が好ましくは８００ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは７００ｍｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは５００ｍｇ／Ｌ以下、最も好ましくは３００ｍｇ／Ｌ以下を達成することができる。上清中のタンパク質濃度の低減により原料収率の向上や、排水処理における負荷低減などの利点を得ることができる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。【００３０】
（ＰＨＡ生産量の測定方法）
培養終了後、培養液１０ｍｌを量り取り、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定することにより、乾燥菌体重量（Ｘ  ｇ／Ｌ）を取得した。【００３１】
得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、菌体内のポリマー含量（Ｙ  ｗｔ％）を算出した。ＰＨＡの生産量（Ｚ  ｇ／Ｌ）をＸ×Ｙ／１００＝Ｚの式により算出した。【００３２】
（タンパク質濃度の測定方法）
各実施例及び比較例では、培養液の上清中のタンパク質濃度を以下の方法で測定した。
（１）培養液１ｍｌを１．５ｍｌ容のマイクロチューブに入れ、１５０００ｇにて５分間遠心分離を行なった。
（２）遠心後の上清を分離した。
（３）分離した培養上清中のタンパク質濃度をタンパク質測定キット（Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔプロテインアッセイ：ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて定量した。なお、検量線作成用タンパク質としてはＢＳＡを使用した。【００３３】
（製造例１）ＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ株の作製
まず、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号９及び配列番号１０で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、（３）６０℃で３０秒、（４）６８℃で２分を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用いた。また同様に、配列番号１１及び配列番号１２で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号９及び配列番号１２で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉＩで消化した。【００３４】
消化して得られたＤＮＡ断片を、ＳｍｉＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｆｌｉＣ構造遺伝子より上流及び下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｆｌｉＣＵＤを作製した。【００３５】
次に、遺伝子破壊株の作製を行った。作製は以下のように行った。遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｆｌｉＣＵＤで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、ＫＮＫ−００５  ＲＥＰ−ＰＨＡＪ４ｂ  ΔＰＨＡＺ１：：Ｐｌａｃ−ＰＨＡＣＲｅΔＰＨＡＺ２，６株（国際公開第２０１５／１４６１９５号を参照。以後、同菌株をＫＮＫ−２５２株とする）とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。【００３６】
なお、ＫＮＫ−２５２株はＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のＰＨＡＺ１遺伝子およびＰＨＡＺ６遺伝子を全長欠失し、ＰＨＡＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、ＰＨＡＪ４ｂ遺伝子の直上流にＲＥＰプロモーターおよびＰＨＡＣ１ＳＤ（ＲＥＰ−ＳＤ）配列からなる発現調節配列が挿入され、ＰＨＡＺ１遺伝子を欠失した領域にｌａｃプロモーター、ＰＨＡＣ１ＳＤ（ＲＥＰ−ＳＤ）配列、およびＰＨＡＣＲｅ構造遺伝子配列が挿入され、染色体上に配列番号８に記載のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有する菌株である。【００３７】
さらに、混合培養後の菌体を２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ−２５２株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。【００３８】
さらに、ＰＣＲによる解析により、染色体上の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするｆｌｉＣ遺伝子（鞭毛タンパク質遺伝子）の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株をＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ株と命名した。【００３９】
（製造例２）ＫＮＫ−２５２／ｄｐｌｃＮ４株の作製
まず、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号１３及び配列番号１４で示されるプライマーを用いて、製造例１に記載の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号１５及び配列番号１６で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、列番号１３及び配列番号１６で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉＩで消化した。【００４０】
消化して得られたＤＮＡ断片を、ＳｍｉＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｌｃＮ４構造遺伝子より上流及び下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｌｃＮ４ＵＤを作製した。【００４１】
次に、製造例１の遺伝子破壊株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ−２５２株を親株として遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｌｃＮ４ＵＤを用いて、染色体上のｐｌｃＮ４遺伝子（フォスフォリパーゼ遺伝子）の開始コドンから終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株ＫＮＫ−２５２／ｄｐｌｃＮ４株を作製した。【００４２】
（製造例３）ＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ／ｄｐｌｃＮ４株の作製
製造例１の遺伝子破壊株の作製方法と同様にして、製造例１で作製したＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ株を親株として、製造例２で作製した遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｌｃＮ４ＵＤを用いて、染色体上のｐｌｃＮ４遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株ＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ／ｄｐｌｃＮ４株を作製した。ＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ／ｄｐｌｃＮ４株はＫＮＫ−２５２株の染色体上のｆｌｉＣ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｌｃＮ４遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。【００４３】
（製造例４）ＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ／ｄｐｌｃＮ４／ｄｐｈｏＡ１，２株の作製
まず、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。ｐｈｏＡ１構造遺伝子とｐｈｏＡ２構造遺伝子はＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株のゲノム上でオペロンを形成しており、このｐｈｏＡオペロンを破壊するようにプラスミドを設計した。作製は以下のように行った。Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号１７及び配列番号１８で示されるプライマーを用いて、製造例１に記載の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号１９及び配列番号２０で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号１７及び配列番号２０で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉＩで消化した。【００４４】
消化して得られたＤＮＡ断片を、ＳｍｉＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈｏＡオペロンより上流及び下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈｏＡ１，２ＵＤを作製した。【００４５】
次に、製造例１の遺伝子破壊株の作製方法と同様にして、製造例３で作製したＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ／ｄｐｌｃＮ４株を親株として、遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈｏＡ１，２ＵＤを用いて、染色体上のｐｈｏＡ１遺伝子の開始コドンからｐｈｏＡ２遺伝子（配列番号４及び５に記載のアミノ酸配列で示される脱リン酸化酵素をコードする遺伝子）の終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株ＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ／ｄｐｌｃＮ４／ｄｐｈｏＡ１，２株を作製した。【００４６】
（製造例５）ＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ／ｄｐｌｃＮ１，４／ｄｐｈｏＡ１，２株の作製
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号２１及び配列番号２２で示されるプライマーを用いて、製造例１に記載の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号２３及び配列番号２４で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号２１及び配列番号２４で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉＩで消化した。【００４７】
消化して得られたＤＮＡ断片を、ＳｍｉＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｌｃＮ１より上流及び下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｌｃＮ１ＵＤを作製した。【００４８】
次に、製造例１の遺伝子破壊株の作製方法と同様にして、製造例４で作製したＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ／ｄｐｌｃＮ４／ｄｐｈｏＡ１，２株を親株として、遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｌｃＮ１ＵＤを用いて、染色体上のｐｌｃＮ１遺伝子（フォスフォリパーゼ遺伝子）の開始コドンから終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株ＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ／ｄｐｌｃＮ１，４／ｄｐｈｏＡ１，２株を作製した。【００４９】
（製造例６）ＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ／ｄｐｌｃＮ１，４／ｄｐｈｏＡ１，２／Ｂ１１６８株の作製
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号２５及び配列番号２６で示されるプライマーを用いて、製造例１に記載の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号２７及び配列番号２８で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号２５及び配列番号２８で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉＩで消化した。【００５０】
消化して得られたＤＮＡ断片を、ＳｍｉＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、配列番号２９で示される遺伝子より上流及び下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｂ１１６８ＵＤを作製した。【００５１】
次に、製造例１の遺伝子破壊株の作製方法と同様にして、製造例５で作製したＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ／ｄｐｌｃＮ１，４／ｄｐｈｏＡ１，２株を親株として、遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｂ１１６８ＵＤを用いて、染色体上の配列番号２９で示される遺伝子（配列番号７に記載のアミノ酸配列で示されるタンパク質をコードする遺伝子）の開始コドンから終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株ＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ／ｄｐｌｃＮ１，４／ｄｐｈｏＡ１，２／Ｂ１１６８株を作製した。【００５２】
（製造例７）ＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ／ｄｐｌｃＮ１，４／ｄｐｈｏＡ１，２／Ｂ１１６８／Ａ３７３３株の作製
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号３０及び配列番号３１で示されるプライマーを用いて、製造例１に記載の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号３２及び配列番号３３で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号３０及び配列番号３３で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉＩで消化した。【００５３】
消化して得られたＤＮＡ断片を、ＳｍｉＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、配列番号３４で示される遺伝子より上流及び下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ａ３７３３ＵＤを作製した。【００５４】
次に、製造例１の遺伝子破壊株の作製方法と同様にして、製造例６で作製したＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ／ｄｐｌｃＮ１，４／ｄｐｈｏＡ１，２／Ｂ１１６８株を親株として、遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ａ３７３３ＵＤを用いて、染色体上の配列番号３４で示される遺伝子（配列番号６に記載のアミノ酸配列で示されるタンパク質をコードする遺伝子）の開始コドンから終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株ＫＮＫ−２５２／ｄｆｌｉＣ／ｄｐｌｃＮ１，４／ｄｐｈｏＡ１，２／Ｂ１１６８／Ａ３７３３株を作製した。【００５５】
（実施例１〜６及び比較例１〜３）ＰＨＡの製造
製造例１〜７で作製した微生物、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株（ＡＴＣＣ１７６９９株）、及びＫＮＫ−２５２株を用いた培養検討を行なった。【００５６】
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％  Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％  Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％  Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  、０．１５ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。【００５７】
前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％  パームオレインオイル、０．５ｖ／ｖ％  微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）とした。炭素源としてパームオレインオイルを１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。【００５８】
ＰＨＡ生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、０・２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４  、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％  微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）とした。【００５９】
まず、各株のグリセロールストック（５０μｌ）をそれぞれ種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。【００６０】
次に、前培養液を、２．５ＬのＰＨＡ生産培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ−Ｕ５０型）に５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度４２０ｒｐｍ、通気量２．１Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには２５％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源は断続的に添加した。炭素源としてはパームオレインオイルを使用した。培養は４８時間行い、培養終了時点に培養液サンプルを取得し、上述の方法にてＰＨＡ生産量及びタンパク質濃度を測定した。結果を表１に示す。【００６１】
培養の結果、鞭毛タンパク質を不活性化した製造例１、３〜８の株において、鞭毛タンパク質を不活性化していない比較例の株と比較して、ＰＨＡ産生能の向上が認められた。また、製造例１、３〜８の株では、比較例の株と比較して培養液の上清中のタンパク質濃度の低下が確認された。【００６２】
なお、各製造例の株によって生産されたポリヒドロキシアルカン酸はＰＨＢＨであることをＨＰＬＣ分析にて確認した。【００６３】
【表１】
2018117168.tif 000002
【配列表】
2018117168000001.app
【国際調査報告】
2018117168.tif 000003
2018117168.tif 000004
2018117168.tif 000005
2018117168.tif 000006