(57)【要約】  本発明は、ポリマー多孔質膜と、前記ポリマー多孔質膜を有する細胞培養部と、前記細胞培養部を貫通した軸と、前記細胞培養部の少なくとも一部を浸漬する培地槽と、を備え、ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、前記軸を中心として前記細胞培養部が回転し、細胞が気相及び液相において交互に培養されることを特徴とする、細胞培養装置を提供する。
2018021363.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー多孔質膜と、
前記ポリマー多孔質膜を有する細胞培養部と、
前記細胞培養部を貫通した軸と、
前記細胞培養部の少なくとも一部を浸漬する培地槽と、
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、
前記軸を中心として前記細胞培養部が回転し、前記ポリマー多孔質膜に担持された細胞が気相及び液相において交互に培養されることを特徴とする、細胞培養装置。
【請求項２】
さらに、前記軸を回転するための回転モータを備えた、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記細胞培養部が、ポリマー多孔質膜支持体と、ポリマー多孔質膜留めと、
を備えるものであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜は、前記ポリマー多孔質膜支持体及び前記ポリマー多孔質膜留めによって挟持されている、請求項１又は２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記ポリマー多孔質膜が、２枚以上積層されて挟持されている、請求項３に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
前記細胞培養部が、円筒形容器であって、
ここで、前記円筒形容器の端面は、１以上の培地流出入口を備え、
ここで、前記円筒形容器の側面は、１以上の培地流出入口を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜は、前記円筒形容器内に収容されている、請求項１又は２に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記円筒形容器が、前記円筒形容器の一方の端面の一部と、他方の端面の一部とを連通する１以上の螺旋状流路を備えた、請求項５に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記ポリマー多孔質膜が、
ｉ）折り畳まれて、
ｉｉ）ロール状に巻き込まれて、
ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結されて、
ｉｖ）縄状に結まれて、及び／又は
ｖ）２以上が積層されて、
前記円筒形容器に収容されている、請求項５又は６に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に収容されたものであって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、前記円筒形容器に収容されている、請求項５又は６に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記細胞培養部が、２以上連結された、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
前記培地槽と一端部で連通した培地排出ラインと、
前記培地排出ラインの他端部と連通した培地排出槽と、
前記培地排出槽と一端部で連通した培地供給ラインと、
前記培地供給ラインの途中に設けられた培地供給ポンプと、
をさらに備えた、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
さらに、液滴化培地供給手段を備え、前記ポリマー多孔質膜に液滴化培地を供給することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の細孔を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
前記ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５〜５００μｍである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１６】
前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１７】
前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項１６に記載の細胞培養装置。
【請求項１８】
前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項１６又は１７に記載の細胞培養装置。
【請求項１９】
前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の細胞培養装置を用いた培養方法であって、
前記軸を中心として前記細胞培養部を回転し、前記ポリマー多孔質膜に担持された細胞を気相及び液相において交互に培養することを特徴とする、培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置に関する。また、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置を使用した細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、治療やワクチンに用いられる酵素、ホルモン、抗体、サイトカイン、ウイルス（ウイルスタンパク質）等のタンパク質が培養細胞を用いて工業的に産生されている。しかし、こうしたタンパク質の生産技術はコストが高く、それが医療費を引き上げていた。そのため、大幅なコスト削減を目指して、高密度に細胞を培養する技術や、タンパク質の産生量を増大させるような革新的な技術が求められていた。【０００３】
タンパク質を産生させる細胞として、培養基材に接着する足場依存性の接着細胞が用いられることがある。こうした細胞は、足場依存的に増殖するため、シャーレ、プレート又はチャンバーの表面に接着させて培養する必要がある。従来、こうした接着細胞を大量に培養するためには、接着するための表面積を大きくする必要があった。ところが、培養面積を大きくするには、空間を必然的に増大させる必要があり、それがコストを増大させる要因となっていた。【０００４】
培養空間を小さくしつつ、接着細胞を大量に培養する方法として、微小多孔を有する担体、特に、マイクロキャリアを用いた培養法が開発されている（例えば、特許文献１）。マイクロキャリアを用いた細胞培養系は、マイクロキャリアが互いに凝集しないようにするために十分に攪拌・拡散される必要がある。そのため、マイクロキャリアを分散させた培地を十分に攪拌・拡散することができるだけの容積が必要となるため、培養できる細胞の密度には上限がある。また、マイクロキャリアと培地とを分離するためには、細かな粒子を分別できるフィルターで分離させる必要があり、それがコストを増大させる原因ともなっていた。こうした状況から、高密度の細胞を培養する革新的な細胞培養の方法論が希求されていた。【０００５】
＜ポリイミド多孔質膜＞
ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献２〜４は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。【０００６】
細胞をポリイミド多孔質膜に適用して培養することを含む、細胞の培養方法が報告されている（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００３／０５４１７４号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０３８８７３号
【特許文献３】特開２０１１−２１９５８５号公報
【特許文献４】特開２０１１−２１９５８６号公報
【特許文献５】国際公開第２０１５／０１２４１５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置を提供することを目的とする。また、本発明は、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置を使用した細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、所定の構造を有するポリマー多孔質膜が、細胞を大量に培養可能な最適な空間を提供するのみならず、乾燥に強い湿潤環境を提供することを見出し、ポリマー多孔質膜に細胞を担持させ、気相暴露しながら培養する装置及びそれを使用する培養方法を完成させた。すなわち、限定されるわけではないが、本発明は好ましくは以下の態様を含む。【００１０】
［１］  ポリマー多孔質膜と、前記ポリマー多孔質膜を有する細胞培養部と、前記細胞培養部を貫通した軸と、前記細胞培養部の少なくとも一部を浸漬する培地槽と、を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、
前記軸を中心として前記細胞培養部が回転し、前記ポリマー多孔質膜に担持された細胞が気相及び液相において交互に培養されることを特徴とする、細胞培養装置。
［２］  さらに、前記軸を回転するための回転モータを備えた、［１］に記載の細胞培養装置。
［３］  前記細胞培養部が、ポリマー多孔質膜支持体と、ポリマー多孔質膜留めと、
を備えるものであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜は、前記ポリマー多孔質膜支持体及び前記ポリマー多孔質膜留めによって挟持されている、［１］又は［２］に記載の細胞培養装置。
［４］  前記ポリマー多孔質膜が、２枚以上積層されて挟持されている、［３］に記載の細胞培養装置。
［５］  前記細胞培養部が、円筒形容器であって、
ここで、前記円筒形容器の端面は、１以上の培地流出入口を備え、
ここで、前記円筒形容器の側面は、１以上の培地流出入口を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜は、前記円筒形容器内に収容されている、［１］又は［２］に記載の細胞培養装置。
［６］  前記円筒形容器が、前記円筒形容器の一方の端面の一部と、他方の端面の一部とを連通する１以上の螺旋状流路を備えた、［５］に記載の細胞培養装置。
［７］  前記ポリマー多孔質膜が、
ｉ）折り畳まれて、
ｉｉ）ロール状に巻き込まれて、
ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結されて、
ｉｖ）縄状に結まれて、及び／又は
ｖ）２以上が積層されて、
前記円筒形容器に収容されている、［５］又は［６］に記載の細胞培養装置。
［８］  前記ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に収容されたものであって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、前記円筒形容器に収容されている、［５］又は［６］に記載の細胞培養装置。
［９］  前記細胞培養部が、２以上連結された、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１０］  前記培地槽と一端部で連通した培地排出ラインと、前記培地排出ラインの他端部と連通した培地排出槽と、前記培地排出槽と一端部で連通した培地供給ラインと、前記培地供給ラインの途中に設けられた培地供給ポンプと、をさらに備えた、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１１］  さらに、液滴化培地供給手段を備え、前記ポリマー多孔質膜に液滴化培地を供給することを特徴とする、［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１２］  前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の細孔を有する、［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１３］  前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１４］  前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１５］  前記ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５〜５００μｍである、［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１６］  前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、［１］〜［１５］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１７］  前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、［１６］に記載の細胞培養装置。
［１８］  前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、［１６］又は［１７］に記載の細胞培養装置。
［１９］  前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である、［１］〜［１５］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。【００１１】
［２０］  ［１］〜［１９］のいずれか１項に記載の細胞培養装置を用いた培養方法であって、前記軸を中心として前記細胞培養部を回転し、前記ポリマー多孔質膜に担持された細胞を気相及び液相において交互に培養することを特徴とする、培養方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、細胞培養担体としてポリマー多孔質膜を用いることにより、培養スペースや培地の量が少ない条件下でも、簡便かつ効率的な連続型細胞培養を可能とする。また、本発明のポリマー多孔質膜は、微親水性の多孔質特性を有するため、ポリマー多孔質膜内に安定した液保持がなされ、乾燥にも強い湿潤環境が保たれる。そのため、従来の細胞培養装置と比較しても極めて少量の培地でも、細胞の生存及び増殖を達成することができる。また、ポリマー多孔質膜の一部又はすべてが空気に露出した状態であっても培養が可能であるため、細胞に対して効率的な酸素供給を行うことができ、大量の細胞を培養することができる。【００１３】
本発明によれば、用いる培地の量が極めて少なく、また、培養担体であるポリマー多孔質膜を気相に露出することができるため、細胞への酸素供給は繰り返される気相への露出によって十分に行われる。したがって、本発明では特に酸素供給装置を必要としない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、一実施形態における細胞培養装置の構成例を示す斜視図である。
【図２】図２は、一実施形態における細胞培養装置の構成例を示す斜視図である。
【図３】図３は、一実施形態における培養槽を示す図である。（Ａ）平面図、（Ｂ）左側面図、（Ｃ）（Ａ）におけるＺ−Ｚ’軸の断面図、（Ｄ）右側面図。
【図４】図４は、一実施形態における細胞培養部を示す図である。（Ａ）ポリマー多孔質膜支持体（左：平面図、右：断面図）、（Ｂ）ポリマー多孔質膜留め（左：平面図、右：断面図）。
【図５】図５は、一実施形態における細胞培養部（円筒形容器）を示す斜視図である。上下の図は、同一の円筒形容器を違う角度から示した図である。
【図６】図６は、ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を示す。
【図７】図７は、本発明の一実施形態における細胞培養装置を示す図である。
【図８】図８は、本発明の一実施形態における細胞培養装置を示す図である。
【図９】図９は、本発明の一実施形態における細胞培養装置を示す図である。（Ａ）モジュール、（Ｂ）細胞培養部、（Ｃ）一実施形態における細胞培養装置、を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態について、必要に応じて図面を参照しながら説明する。実施形態の構成は例示であり、本発明の構成は、実施形態の具体的構成に限定されない。
【００１６】
１．ポリマー多孔質膜
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ａ（以下で、「Ａ面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、０．０１μｍ以上２００μｍ未満、０．０１〜１５０μｍ、０．０１〜１００μｍ、０．０１〜５０μｍ、０．０１μｍ〜４０μｍ、０．０１μｍ〜３０μｍ、０．０１μｍ〜２０μｍ、又は０．０１μｍ〜１５μｍであり、好ましくは、０．０１μｍ〜１５μｍである。
【００１７】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ｂ（以下で、「Ｂ面」又は「大穴面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、表面層Ａに存在する孔の平均孔径よりも大きい限り特に限定されないが、例えば、５μｍ超２００μｍ以下、２０μｍ〜１００μｍ、３０μｍ〜１００μｍ、４０μｍ〜１００μｍ、５０μｍ〜１００μｍ、又は６０μｍ〜１００μｍであり、好ましくは、２０μｍ〜１００μｍである。
【００１８】
ポリマー多孔質膜表面の平均孔径は、多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真より、２００点以上の開孔部について孔面積を測定し、該孔面積の平均値から下式（１）に従って孔の形状が真円であるとした際の平均直径を計算より求めることができる。
【数１】
2018021363.tif 000003
（式中、Ｓａは孔面積の平均値を意味する。）
【００１９】
表面層Ａ及びＢの厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは０．０１〜２０μｍである。
【００２０】
ポリマー多孔質膜におけるマクロボイド層中のマクロボイドの膜平面方向の平均孔径は、特に限定されないが、例えば１０〜５００μｍであり、好ましくは１０〜１００μｍであり、より好ましくは１０〜８０μｍである。また、当該マクロボイド層中の隔壁の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは、０．０１〜２０μｍである。一の実施形態において、当該マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、当該マクロボイド層中の隔壁は孔を有さない。
【００２１】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜表面の総膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５〜５００μｍであり、より好ましくは２５〜７５μｍである。
【００２２】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。
【００２３】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜の空孔率は特に限定されないが、例えば、４０％以上９５％未満である。
【００２４】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式（２）に従って求めることができる。
【数２】
2018021363.tif 000004
（式中、Ｓは多孔質フィルムの面積、ｄは総膜厚、ｗは測定した質量、Ｄはポリマーの密度をそれぞれ意味する。ポリマーがポリイミドである場合は、密度は１．３４ｇ／ｃｍ3とする。）
【００２５】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリマー多孔質膜である。一の実施形態において、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、隔壁は、そのような孔を有さない。
【００２６】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。
【００２７】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜は、上記した構造的特徴を備える限り、特に限定されないが、好ましくはポリイミド多孔質膜、又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である。
【００２８】
１−１．ポリイミド多孔質膜
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
【００２９】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。
【００３０】
一実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。
【００３１】
ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。
【００３２】
ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。
【００３３】
ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。
【００３４】
本明細書において、「着色前駆体」とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。
【００３５】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得る着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解または分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。
【００３６】
着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。
【００３７】
炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリルニトリルが好ましい。
【００３８】
また、別の実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、上記の着色前駆体を使用せずに、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液を成形した後、熱処理することにより得られる、ポリイミド多孔質膜も含まれる。
【００３９】
着色前駆体を使用せずに製造されるポリイミド多孔質膜は、例えば、極限粘度数が１．０〜３．０であるポリアミック酸３〜６０質量％と有機極性溶媒４０〜９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製し、その後当該ポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化することにより製造されてもよい。この方法において、水を必須成分とする凝固溶媒が、水であるか、又は５質量％以上１００質量％未満の水と０質量％を超え９５質量％以下の有機極性溶媒との混合液であってもよい。また、上記イミド化の後、得られた多孔質ポリイミド膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施してもよい。
【００４０】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るテトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ−ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ−フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ−ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ｐ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、１，３−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２−ビス〔（３，４−ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’−（２，２−ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００４１】
これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。
【００４２】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
１）１，４−ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６−ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン；
２）４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ビス（トリフルオロメチル）−４，４’−ジアミノビフェニル、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジカルボキシ−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’−テトラメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、ビス（４−アミノフェニル）スルフィド、４，４’−ジアミノベンズアニリド、３，３’−ジクロロベンジジン、３，３’−ジメチルベンジジン、２，２’−ジメチルベンジジン、３，３’−ジメトキシベンジジン、２，２’−ジメトキシベンジジン、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，３’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’−ジアミノジフェニルスルホン、３，４’−ジアミノジフェニルスルホン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、３，３’−ジアミノベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジクロロベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノジフェニルメタン、３，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、３，３’−ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’−ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；
３）１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェノキシ）−４−トリフルオロメチルベンゼン、３，３’−ジアミノ−４−（４−フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジ（４−フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（３−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；
４）３，３’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。
【００４３】
これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。
【００４４】
これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。
【００４５】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。
【００４６】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
【００４７】
本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。ここで、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。
【００４８】
例えば、国際公開第２０１０／０３８８７３号、特開２０１１−２１９５８５号公報、又は特開２０１１−２１９５８６号公報に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明に使用可能である。
【００４９】
１−２．ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、ポリエーテルスルホンを含み、典型的には実質的にポリエーテルスルホンからなる。ポリエーテルスルホンは当業者に公知の方法で合成されたものであってよく、例えば、二価フェノール、アルカリ金属化合物及びジハロゲノジフェニル化合物を有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法、二価フェノールのアルカリ金属二塩を予め合成しジハロゲノジフェニル化合物と有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法等によって製造できる。
【００５０】
アルカリ金属化合物としては、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属アルコキシド等が挙げられる。特に、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムが好ましい。
【００５１】
二価フェノール化合物としては、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシン、４，４’−ビフェノール、ビス（ヒドロキシフェニル）アルカン類（例えば２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）プロパン、及び２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）メタン）、ジヒドロキシジフェニルスルホン類、ジヒドロキシジフェニルエーテル類、又はそれらのベンゼン環の水素の少なくとも１つが、メチル基、エチル基、プロピル基等の低級アルキル基、又はメトキシ基、エトキシ基等の低級アルコキシ基で置換されたものが挙げられる。二価フェノール化合物としては、上記の化合物を二種類以上混合して用いることができる。
【００５２】
ポリエーテルスルホンは市販品であってもよい。市販品の例としては、スミカエクセル７６００Ｐ、スミカエクセル５９００Ｐ（以上、住友化学(株)製）等が挙げられる。
【００５３】
ポリエーテルスルホンの対数粘度は、多孔質ポリエーテルスルホン膜のマクロボイドを良好に形成する観点で、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．５５以上であり、多孔質ポリエーテルスルホン膜の製造容易性の観点から、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、更に好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．７５以下である。
【００５４】
また、ＰＥＳ多孔質膜、又はその原料としてのポリエーテルスルホンは、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が、２００℃以上であるか、又は明確なガラス転移温度が観察されないことが好ましい。
【００５５】
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜の製造方法は特に限定されないが、例えば、
対数粘度０．５〜１．０のポリエーテルスルホンの０．３質量％〜６０質量％と有機極性溶媒４０質量％〜９９．７質量％とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、ＰＥＳ多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、若しくは２４０℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。
【００５６】
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、好ましくは、表面層Ａ、表面層Ｂ、及び前記表面層Ａと前記表面層Ｂとの間に挟まれたマクロボイド層、を有するＰＥＳ多孔質膜であって、
前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が１０μｍ〜５００μｍである複数のマクロボイドとを有し、
前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢはそれぞれ、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢのうち、一方が平均孔径５μｍ超２００μｍ以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径０．０１μｍ以上２００μｍ未満の複数の細孔を有し、
表面層Ａ及び表面層Ｂの、一方の表面開口率が１５％以上であり、他方の表面層の表面開口率が１０％以上であり、
前記表面層Ａ及び前記表面層Ｂの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記ＰＥＳ多孔質膜は、総膜厚が５μｍ〜５００μｍであり、かつ空孔率が５０％〜９５％である、
ＰＥＳ多孔質膜である。
【００５７】
本発明の細胞培養装置に用いられる、細胞培養担体としての上述のポリマー多孔質膜は、微親水性の多孔質特性を有するため、ポリマー多孔質膜内に安定した液保持がなされ、乾燥にも強い湿潤環境が保たれる。そのため、従来の細胞培養担体を用いる細胞培養装置と比較して、極めて少量の培地でも細胞の生存及び増殖を達成することができる。また、ポリマー多孔質膜の一部又はすべてが空気に露出した状態であっても培養が可能であるため、細胞に対して効率的な酸素供給を行うことができ、大量の細胞を培養することができる。
【００５８】
本発明によれば、用いる培地の量が極めて少なく、また、培養担体であるポリマー多孔質膜を気相に露出することができるため、細胞への酸素供給は拡散によって十分に行われる。したがって、本発明では特に酸素供給手段を必要としない。
【００５９】
２．細胞培養装置
【００６０】
本発明の一態様は、
ポリマー多孔質膜と、
前記ポリマー多孔質膜を有する細胞培養部と、
前記細胞培養部を貫通した軸と、
前記細胞培養部の少なくとも一部を浸漬する培地槽と、
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
前記軸を中心として前記細胞培養部が回転し、前記ポリマー多孔質膜に担持された細胞が気相及び液相において交互に培養されることを特徴とする、細胞培養装置に関する。該細胞培養装置を、以下で、「本発明の細胞培養装置」とも呼ぶ。以下に本発明の細胞培養装置の実施態様について、図を示しながら説明する。
【００６１】
図１は、本発明の細胞培養装置１の構成例を示す図である。細胞培養装置１は、上述のポリマー多孔質膜を有する細胞培養部２と、細胞培養部２の中心を貫通した軸２３と、細胞培養部２の少なくとも一部を浸漬する培地槽３とを備えている。培地槽３には、所定量の培地が充填されている。軸２３を中心として細胞培養部２が回転することにより、細胞培養部２の一部分が定期的に培地に浸漬される。これにより、ポリマー多孔質膜に担持された細胞が気相及び液相において交互に培養される。本実施形態のように、気相においても細胞培養が可能であるのは、本発明において使用されるポリマー多孔質膜に安定した液保持がなされ、乾燥にも強い湿潤環境が提供可能であるからである。本発明のポリマー多孔質を使用することで、本発明の構成を実現することが可能となった。
【００６２】
本実施形態では、さらに、軸２３と軸接合部６２で固定された回転モータ６を備えている。本実施形態において、軸２３は細胞培養部２と任意の手段によって固定されている。これにより、回転モータ６が動作することで回転モータ軸６１が回転し、軸２３へ回転運動が伝わって、軸２３に固定された細胞培養部２が回転する。回転モータ６は、コンピュータ等によって制御されていてもよく、例えば、回転スピード、始動、停止等を組み合わせることにより、細胞培養に最適な条件で回転制御することが可能である。
【００６３】
本実施形態においては、培地排出ライン４２をさらに備えており、培地排出ライン４２の一端部は、培地槽３の培地排出管３３と接続されており、培地排出ライン４２の他端部は培地排出槽４に接続されている。これにより、培地槽３から排出される培地が培地排出槽４に貯留される。本実施形態においては、さらに培地供給ライン４１を備え、培地供給ライン４１の一端部は培地排出槽４に接続されており、培地供給ライン４１の他端部は培地槽３の培地供給管３４へ接続されている。また、培地供給ライン４１の途中には培地供給ポンプ５が備えられており、該培地供給ポンプ５が動作することによって、培地排出槽４の培地が再び培地槽３へと送り出される。培地供給ポンプ５の種類は、特に限定されないが、例えば、チューブポンプ、ペリスタポンプ等が使用可能である。本実施態様においては、細胞培養装置１の構成の一部が、設置台７の上に設置されているが、本発明の効果を発揮される形態であれば、設置台７は使用されなくてもよい。
【００６４】
図２は、本発明の細胞培養装置１の構成例を示す斜視図であり、図１の構成例に含まれる一部の部材をそれぞれ独立させた状態で示している。本実施態様において、図１で示された細胞培養部２は、ポリマー多孔質膜２０と、それを挟持するためのポリマー多孔質支持体２１及びポリマー多孔質膜留め２２から形成され、それぞれが軸２３に貫通されている。軸２３には、ポリマー多孔質膜支持体２１が、回転モータ６方向へ外れることを防止するフランジ２６が設けられている。ポリマー多孔質支持体２１は軸２３に直接形成されたものであってもよい。ポリマー多孔質膜留め２２止めの外側に止めリング２４を設け、該止めリング２４によってポリマー多孔質膜支持体２１方向へ圧力をかけることで、ポリマー多孔質膜を固定することができる。他の実施形態では、螺着によって圧力がかけられるように、止めリング２４は雌ねじを有し、軸２３の少なくとも一部に雄ねじを有する構造であってもよい。他の実施形態では、例えば、止めリング２４の一部にねじ穴を有し、該ねじ穴へ雄ねじを挿入し、軸２３に垂直に螺着してもよい。
【００６５】
ポリマー多孔質膜は、１枚使用されてもよく、２以上積層されて使用されてもよい。２枚以上使用することにより、細胞培養可能な空間が増大し、より多くの細胞を生育可能となる。
【００６６】
本発明の実施形態において、細胞培養部２の両側の軸２３には、軸受ブッシュ（２５ａ、２５ｂ）が設けられている。軸受ブッシュ（２５ａ、２５ｂ）はそれぞれ、培地槽３に設けられた軸受（３１ａ、３１ｂ）に嵌め込まれる。軸受（３１ａ、３１ｂ）によって、軸２３がずれることなく安定して回転可能となる。
【００６７】
図３は、本発明の細胞培養装置１を構成する培養槽３を示す図である。図３（Ａ）のＺＺ’軸で切断した断面図が図３（Ｃ）であり、図３（Ｂ）及び（Ｄ）は、それぞれ図３（Ａ）の左側面及び右側面図である。上述の軸受（３１ａ、３１ｂ）には、軸受ブッシュ（２５ａ、２５ｂ）が嵌まり、軸受ブッシュ（２５ａ、２５ｂ）の回転を妨害しない程度の深さの軸受凹部３１０を備えている。これにより、軸２３が培養槽３から外れることが防止される。培地貯留部３２の一部には、培地貯留内壁３５が設けられており、培地貯留内壁３５の複数箇所に培地貯留内壁凹部３５１を備えている。培地貯留内壁３５及び培地貯留内壁凹部３５１の大きさ、形状等によって、培地貯留部に収容される培地量が決定される。細胞培養部２を設置した際、細胞培養部２の体積分の培地が、培地オーバーフロー部へあふれ出す。あふれた培地は、培地オーバーフロー部３６に設けられた培地排出孔３７を通って培地排出管３３から培地槽３の外へ排出される。培地排出孔３７の周囲は、テーパ３８を形成し、培地が排出されやすいように加工されている。培地貯留部３２の底面の形状は、細胞培養部２を適用して回転させた場合、培地の流れを邪魔しない形状であればよい。本実施態様においては、細胞培養部２が円盤形状であるため、細胞培養部２の半径よりも大きい半円柱の側面形状を有している。
【００６８】
図４は、本発明の細胞培養装置１に使用される細胞培養部２の一実施形態を示す図である。（Ａ）はポリマー多孔質支持体２１の平面及び断面図、（Ｂ）はポリマー多孔質膜留め２２の平面及び断面図である。ポリマー多孔質支持体２１は、中心に、軸２３を貫通するための軸貫通口２７が設けられている。軸貫通口２７の径は、軸２３の径によって決定されるため、特に限定されない。ポリマー多孔質膜支持体２１は、固定するポリマー多孔質膜に培地及び空気（酸素）を供給するための培地通過口２８が設けられている。培地通過口２８の形状及び径は図の形状に限定されず、ポリマー多孔質膜に培地及び空気（酸素）を供給するために十分であれば、任意の形状、面積を採用することが可能である。
【００６９】
本実施態様において、ポリマー多孔質膜留め２２は、軸貫通口２７を有するポリマー多孔質膜留めリング２９から放射状に伸びた複数のスポーク２２aを備える。スポーク２２aの長さは、ポリマー多孔質膜支持体２１の半径と同等又はそれよりも短い。ポリマー多孔質膜留め２２は、ポリマー多孔質膜支持体２１と組み合わせることによって、ポリマー多孔質膜２０を固定することが可能である。ポリマー多孔質膜留め２２は、ポリマー多硬質膜支持体２１と組み合わせることでポリマー多孔質膜を固定できればよく、図示した形状に限定されない。例えば、ポリマー多孔質膜２０が、２枚以上積層されてポリマー多硬質膜支持体２１及びポリマー多孔質膜留め２２に挟持されていてもよい。ポリマー多孔質膜２０とポリマー多孔質膜支持体２１とポリマー多孔質膜留め２２とを一組とした細胞培養部２を、２以上連結して培養することも可能である。図１には、細胞培養部２を５組連結させて構成した細胞培養装置１を示す。
【００７０】
図５は、本発明の細胞培養装置１に使用される細胞培養部２の他の実施形態を示す図である。図５の上段及び下段ともに、同一の細胞培養部２を異なる角度から描いた図である。本実施態様の細胞培養部２は、円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）である。円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）の端面２０１には、１以上の培地流出入口２０４を備えており、かつ、円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）の側面２０２には、１以上の培地流出入口２０５を備えている。ここでは図示されないが、ポリマー多孔質膜が、円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）内に収容されている。細胞培養部２が、円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）の形状であるため、任意の量のポリマー多孔質膜を収容可能となる。培地流出入口２０４及び培地流出入口２０５の形状及び面積は図の形状に限定されないが、ポリマー多孔質膜に培地及び空気（酸素）を供給するために十分であり、内部に収容したポリマー多孔質膜が脱落しない程度の形状、面積であれば採用することが可能である。
【００７１】
円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）の端面２０１は、円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）の蓋の機能を有し、端面２０１に備えられた爪２０３によって開けることが可能である。これにより、円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）内部へポリマー多孔質膜を収容することができる。側面２０２の高さは、所望の量のポリマー多孔質膜を収容可能な程度の高さであってよく、特に限定されない。図５では、円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）を３つ連結したものであり、所望の個数の円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）を連結可能である。これによって、所望の細胞数を培養可能となる。
【００７２】
本実施形態の円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）は、その中心に軸２３が貫通する軸貫通口２０６を有する。軸貫通口２０６の径は、軸２３の径によって決定されるため、特に限定されない。
【００７３】
本実施形態の円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）は、円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）の一方の端面の一部と、他方の端面の一部とを連通する１以上の螺旋状流路２０７を備えている。本実施形態において、連結した円筒形容器２００には、軸貫通口２０６方向に連続した螺旋状流路２０７が形成されている。螺旋状流路２０７は、それぞれの円筒形容器（２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）単位においても形成されている。螺旋状流路２０７が２以上設けられた場合、全ての螺旋状流路２０７は、平行となるように形成される。螺旋状流路２０７は、円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）を形成しない空間であるため、当該空間にはポリマー多孔質膜を収容できない。螺旋状流路２０７を備えた円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）を培養槽３の培地中で回転させた場合、螺旋状流路２０７によって、一方向から他方向へ培地が送られ、培養槽３内部の培地が攪拌される。これによって、培養槽３の培地の各種成分の濃度が一定となる。
【００７４】
円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）に螺旋状流路２０７が設けられている場合、円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）と軸２３とは、固定されていなくてもよい。この場合、軸２３を中心として、円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）のみが回転することとなる。培養槽３内の一方向から他方向へ発生させた培地の流れによって、螺旋状流路２０７に培地が流入し、円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）に回転運動を生じさせることが可能となる。螺旋状流路２０７の数、角度、形状等を適宜調整することによって、任意の速度で回転させることが可能となる。
【００７５】
本発明の実施態様で使用される細胞培養部２及び円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）は、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ステンレス鋼（「ステンレス」ともいう）などの金属などが挙げられるが、細胞の培養に影響を与えない素材であれば特に限定されない。
【００７６】
本発明の別の実施態様において、螺旋状流路２０７は、円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）に設けられていない。この場合、円筒形容器（２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ）は、軸貫通口２０６を貫通する軸２３と固定されている。
【００７７】
本発明の別の実施態様において使用される細胞培養部２は、図９（Ｂ）で示されるように、例えばステンレス鋼のメッシュによって作製されたステンレス鋼メッシュ円筒形容器２０００であってもよい。ステンレス鋼のメッシュ形状を有しているため、培地を自由にステンレス鋼メッシュ円筒形容器２０００の内部に流出入させることができる。また、ステンレス鋼メッシュであるために、内部にポリマー多孔質膜を有したままで、乾熱滅菌等の滅菌手段によって滅菌することが可能である。
【００７８】
図示されないが、本発明の別の実施形態において、細胞培養部２の気相領域に、培地を微小液滴の状態で供給する液滴化培地供給手段を備えても良い。液滴化培地供給手段から培地が微小液滴として供給され、細胞培養部２内のポリマー多孔質に供給される。これにより、細胞が生育するポリマー多孔質膜は、気相に暴露されつつ培地も供給されることとなる。本発明において、液滴化培地供給手段は、培地が液滴の状態で供給される手段であればよく、供給される液滴のサイズは限定されない。本明細書において、液滴化培地供給手段とは、供給される液滴のサイズを限定しないため、ミスト状の培地からシャワー状の培地を供給するデバイスもその意味に含む。好ましくは、液滴化培地供給手段は、細胞培養部２の気相暴露領域に噴霧可能なように配置される。
【００７９】
本明細書において、「液滴化培地」とは、ミスト状化又は水滴化された培地をいい、本発明に用いられるポリマー多孔質膜に噴射又は噴霧可能な状態の培地をいう。液滴化培地の径は限定されないが、例えば、重力によって自由落下せず、空気中に浮遊可能な程度に小さいミスト状の液滴化培地であってもよい。ミスト状の液滴化培地の径は、例えば、１μｍ〜１００μｍ程度であってもよく、さらに小さい径であってもよい。また、液滴化培地は、例えば、重力によって自由落下する水滴状の培地であってもよく、例えば、１００μｍ以上であってもよい。培地を液滴化する方法については、公知の手段により液滴化する方法を用いればよく、例えば、ミスト状ノズルやシャワーノズル等を用いて液滴化させればよい。ただし、液滴化方法は、培地の成分を変化させない方法によって液滴化されなければならず、例えば、液滴化させる方法からは、蒸発させる方法は除かれる。
【００８０】
本発明の実施態様において、液滴化培地は、細胞を担持したポリマー多孔質膜へ適用される。液滴化した培地は、ポリマー多孔質膜へ到達するまでの間に気相を通過し、培地中に酸素が溶け込むことになる。これにより、十分な量の酸素を有する培地が、継続的に供給されることとなり、細胞が虚血に陥ることなく、培養することが可能となる。また、ポリマー多孔質膜が常に気相に暴露されているため、ポリマー多孔質膜に付着している培地も常に酸素を取り込むことが可能となり、酸素を効率的に供給できる培養が可能となる。
【００８１】
本発明の実施形態で使用されるポリマー多孔質膜は、例えば、ｉ）折り畳んで、ｉｉ）ロール状に巻き込んで、ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、及び／又は、ｉｖ）縄状に結んで、細胞培養部２に適用されてもよい。また、本発明の実施形態で使用されるポリマー多孔質膜は、ｖ）２以上が積層されて、細胞培養部２に適用されてもよい。ｉ）〜ｖ）のように形状を加工することにより、一定容量の細胞培養培地中に多くのポリマー多孔質膜を入れることができる。
【００８２】
本発明の実施態様で使用されるポリマー多孔質膜は、モジュール化されたポリマー多孔質膜（以下、「モジュール化ポリマー多孔質膜」という。）が使用されてもよい。本明細書において「モジュール化ポリマー多孔質膜」とは、ケーシングに収容されたポリマー多孔質膜をいう。本明細書において、「モジュール化ポリマー多孔質膜」との記載は、単に「モジュール」と記載することができ、相互に変更しても同一のことを意味する。
【００８３】
本発明の実施態様で使用されるモジュール化ポリマー多孔質膜が備えるケーシングは、２以上の細胞培地流出入口を有し、該細胞培地流出入口によって培地がケーシングの内外へ流出入する。該ケーシングの細胞培地流出入口の径は、ケーシングの内部へ細胞が流入可能であるように、前記細胞の径よりも大きいことが好ましい。また、細胞培地流出入口の径が、該細胞培地流出入口よりポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さいことが好ましい。ポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さい径は、ケーシングに収容されたポリマー多孔質膜の形状、大きさによって適宜選択可能である。例えば、ポリマー多孔質膜がひも状である場合、該ポリマー多孔質膜の短辺の幅より小さく、該ポリマー多孔質膜が流出しない適度の径であれば特に限定されない。該細胞培地流出入口の数は、細胞培地がケーシング内外へ供給及び／又は排出されやすいように、出来るだけ多く設けられていることが好ましい。好ましくは、５以上、好ましくは１０以上、好ましくは２０以上、好ましくは５０以上、好ましくは１００以上である。細胞培地流出入口は、ケーシングの一部又は全部が、メッシュ状の構造を有していてもよい。また、該ケーシング自体がメッシュ状であってもよい。本発明において、メッシュ形状の構造とは、例えば、縦、横、及び／又は斜めの格子状の構造を有するものであって、各目開きが、流体が通過出来る程度に細胞培地流出入口を形成するものであるが、これに限定されない。
【００８４】
本発明の実施態様で使用されるモジュール化ポリマー多孔質膜のケーシングは、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ステンレス鋼などの金属などが挙げられるが、細胞の培養に影響を与えない素材であれば特に限定されない。
【００８５】
本発明の実施態様で使用されるモジュール化ポリマー多孔質膜は、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
該ケーシング内に収容されたものであって、該モジュール化ポリマー多孔質膜を細胞培養部２へ適用することが可能である。
【００８６】
本明細書において、「ケーシング内に２以上の独立した該ポリマー多孔質膜が集約されて収容されている」とは、互いに独立した２以上のポリマー多孔性膜が、ケーシングで囲まれた一定空間内に集約されて収容されている状態を指す。本発明において、２以上の独立した該ポリマー多孔質膜は、該ポリマー多孔質膜の少なくとも１カ所と該ケーシング内の少なくとも１カ所とを任意の方法によって固定され、該ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態に固定されたものであってもよい。また、２以上の独立したポリマー多孔質膜は、小片であってもよい。小片の形状は、例えば、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など、任意の形をとりうるが、略正方形が好ましい。本発明において、小片の大きさは、任意の大きさをとりうるが、略正方形である場合、長さは任意の長さでよいが、例えば、幅は、８０ｍｍ以下がよく、好ましくは５０ｍｍ以下がよく、より好ましくは３０ｍｍ以下がよく、さらにより好ましくは２０ｍｍ以下がよよく、１０ｍｍ以下であってもよい。また、ポリマー多孔性膜の小片が略正方形である場合、その一辺の長さは、ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態となるように、ケーシングの内壁に沿って、又は内壁の一辺の長さより短く（例えば、０．１ｍｍ〜１ｍｍ程度短い）形成されたものであってもよい。これによって、ポリマー多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止される。
【００８７】
本明細書において、「折り畳まれたポリマー多孔質膜」とは、該ケーシング内にて折り畳まれていることで、ポリマー多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリマー多孔質膜である。本明細書において、「折り畳まれた」とは、ポリマー多孔膜に折り目がついた状態であってもよく、折り目がついていない状態であってもよい。
【００８８】
本明細書において、「ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜」とは、ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、ポリマー多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリマー多孔性膜をいう。また、本発明おいて、縄状に編み込まれたポリマー多孔質膜とは、例えば短冊状の複数のポリマー多孔質膜を、任意の方法によって縄状に編み込み、ポリマー多孔質膜同士の摩擦力によって互いに動かない状態のポリマー多孔質膜をいう。（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が集約されたポリマー多孔質膜、（ｉｉ）折り畳まれたポリマー多孔質膜、（ｉｉｉ）ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜、及び（ｉｖ）縄状に結ばれたポリマー多孔質膜、が、組み合わせられてケーシング内に収容されていてもよい。
【００８９】
本明細書において、「該ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態」とは、該モジュール化ポリマー多孔質膜を細胞培養培地中で培養する場合に、該ポリマー多孔質膜が継続的に形態変化しない状態になるようにケーシング内に収容されている状態をいう。換言すれば、該ポリマー多孔質膜自体が、流体によって、継続的に波打つ動きを行わないように抑制された状態である。ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態を保つため、ポリマー多孔質膜内で生育されている細胞にストレスが加えられることが防止され、細胞が死滅されることなく安定的に細胞が培養可能となる。
【００９０】
３．細胞培養装置を使用した細胞培養方法
【００９１】
＜細胞をポリマー多孔質膜へ適用する工程＞
本発明で使用される細胞のポリマー多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、細胞のポリマー多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
【００９２】
（Ａ）細胞を前記ポリマー多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様；
（Ｂ）前記ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せ、
放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様；並びに、
（Ｃ）前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面を、細胞培地又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリマー多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
【００９３】
（Ａ）の態様は、ポリマー多孔質膜の表面に細胞、細胞塊を直接播種することを含む。あるいは、ポリマー多孔質膜を細胞縣濁液中に入れて、膜の表面から細胞培地を浸潤させる態様も含む。
【００９４】
ポリマー多孔質膜の表面に播種された細胞は、ポリマー多孔質膜に接着し、多孔の内部に入り込んでいく。好ましくは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞はポリマー多孔質膜に接着する。ポリマー多孔質膜の表面に播種された細胞は、膜の表面及び／又は内部において安定して生育・増殖することが可能である。細胞は生育・増殖する膜の位置に応じて、種々の異なる形態をとりうる。
【００９５】
（Ｂ）の態様において、ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せる。ポリマー多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませることにより、細胞縣濁液が膜中に浸透する。理論に縛られるわけではないが、これはポリマー多孔質膜の各表面形状等に由来する性質によるものであると考えられる。本態様により、膜の細胞縣濁液が装填された箇所に細胞が吸い込まれて播種される。
【００９６】
あるいは、（Ｃ）の態様のように、前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面の部分又は全体を、細胞培地又は滅菌された液体で湿潤してから、湿潤したポリマー多孔質膜に細胞縣濁液を装填してもよい。この場合、細胞懸濁液の通過速度は大きく向上する。
【００９７】
例えば、膜の飛散防止を主目的として膜極一部を湿潤させる方法（以後、これを「一点ウェット法」と記載する）を用いることができる。一点ウェット法は、実質上は膜を湿潤させないドライ法（（Ｂ）の態様）にほぼ近いものである。ただし、湿潤させた小部分については、細胞液の膜透過が迅速になると考えられる。また、ポリマー多孔質膜の片面又は両面の全体を十分に湿潤させたもの（以後、これを「ウェット膜」と記載する）に細胞懸濁液を装填する方法も用いることができる（以後、これを「ウェット膜法」と記載する）。この場合、ポリマー多孔質膜の全体において、細胞懸濁液の通過速度が大きく向上する。
【００９８】
（Ｂ）及び（Ｃ）の態様において、細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる。これにより細胞縣濁液中の細胞の濃度を濃縮する、細胞以外の不要な成分を水分とともに流出させる、などの処理も可能になる。
【００９９】
（Ａ）の態様を「自然播種」（Ｂ）及び（Ｃ）の態様を「吸込み播種」と呼称する場合がある。
【０１００】
限定されるわけではないが、好ましくは、ポリマー多孔質膜には生細胞が選択的に留まる。よって、本発明の方法の好ましい実施形態において、生細胞が前記ポリマー多孔質膜内に留まり、死細胞は優先的に水分とともに流出する。
【０１０１】
態様（Ｃ）において用いる滅菌された液体は特に限定されないが、滅菌された緩衝液若しくは滅菌水である。緩衝液は、例えば、(+)及び(-)Dulbecco’s PBS 、(+)及び(-)Hank's Balanced Salt Solution等である。緩衝液の例を以下の表１に示す。
【０１０２】
【表１】
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【０１０３】
さらに、本発明の方法において、細胞のポリマー多孔質膜への適用は、浮遊状態にある接着性細胞をポリマー多孔質膜と縣濁的に共存させることにより細胞を膜に付着させる態様（絡め取り）も含む。例えば、本発明の方法において、細胞をポリマー多孔質膜に適用するために、細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び１又はそれ以上の前記ポリマー多孔質膜を入れてもよい。細胞培養培地が液体の場合、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である。ポリマー多孔質膜の性質から、細胞はポリマー多孔質膜に接着しうる。よって、生来浮遊培養に適さない細胞であっても、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態で培養することが可能である。好ましくは、細胞は、ポリマー多孔質膜に接着する。「自発的に接着する」とは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞がポリマー多孔質膜の表面又は内部に留まることを意味する。
【０１０４】
上述した細胞のポリマー多孔質膜への適用は、２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いてもよい。例えば、態様（Ａ）〜（Ｃ）のうち、２つ以上の方法を組み合わせてポリマー多孔質膜に細胞を適用してもよい。細胞を担持させたポリマー多孔質膜を、上述の細胞培養装置１における、細胞培養部２へ適用して、培養することが可能である。
【０１０５】
その他、予め、ポリマー多孔質膜が収容された細胞培養部２に、懸濁された細胞が含まれる培地を、細胞供給手段３より滴下して播種してもよい。
【０１０６】
本明細書において、「懸濁された細胞」とは、例えば、トリプシン等のタンパク質分解酵素によって、接着細胞を強制的に浮遊させて培地中に懸濁して得られた細胞や、公知の馴化工程によって、培地中に浮遊培養可能となった接着細胞などを含んでいる。
【０１０７】
本発明に利用し得る細胞の種類は、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される。動物細胞は、脊椎動物門に属する動物由来の細胞と無脊椎動物（脊椎動物門に属する動物以外の動物）由来の細胞とに大別される。本明細書における、動物細胞の由来は特に限定されない。好ましくは、脊椎動物門に属する動物由来の細胞を意味する。脊椎動物門は、無顎上綱と顎口上綱を含み、顎口上綱は、哺乳綱、鳥綱、両生綱、爬虫綱などを含む。好ましくは、一般に、哺乳動物と言われる哺乳綱に属する動物由来の細胞である。哺乳動物は、特に限定されないが、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどを含む。
【０１０８】
本発明に利用しうる動物細胞の種類は、限定されるわけではないが、好ましくは、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、及び生殖細胞からなる群から選択される。
【０１０９】
本明細書において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。限定されるわけではないが、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等を含む。好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開第２００９／１２３３４９号（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５７０４１）に記載の多能性幹細胞を使用可能である。
【０１１０】
「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味する。例えば骨髄中の造血幹細胞は血球のもととなり、神経幹細胞は神経細胞へと分化する。このほかにも肝臓をつくる肝幹細胞、皮膚組織になる皮膚幹細胞などさまざまな種類がある。好ましくは、組織幹細胞は、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択される。
【０１１１】
「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞のことを言う。有性生殖においては次世代へは受け継がれない。好ましくは、体細胞は、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される。
【０１１２】
「生殖細胞」は、生殖において遺伝情報を次世代へ伝える役割を持つ細胞を意味する。例えば、有性生殖のための配偶子、即ち卵子、卵細胞、精子、精細胞、無性生殖のための胞子などを含む。
【０１１３】
細胞は、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択してもよい。「肉腫」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血液等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する癌で、軟部肉腫、悪性骨腫瘍などを含む。肉腫細胞は、肉腫に由来する細胞である。「株化細胞」とは、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもつに至り、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞を意味する。ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ−６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株）、ＢＨＫ細胞（新生児ハムスター腎臓細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス胎児線維芽細胞由来）などヒトを含む様々な生物種の様々な組織に由来する細胞株が存在する。「形質転換細胞」は、細胞外部から核酸（ＤＮＡ等）を導入し、遺伝的性質を変化させた細胞を意味する。
【０１１４】
本明細書において、「接着細胞」とは、一般に、増殖のために適切な表面に自身を接着させる必要がある細胞であって、付着細胞又は足場依存性細胞ともいわれる。本発明のいくつかの実施形態では、使用する細胞は接着細胞である。本発明に用いられる細胞は、接着細胞であって、より好ましくは、培地中に懸濁した状態でも培養可能な細胞である。懸濁培養可能な接着細胞とは、公知の方法によって、接着細胞を懸濁培養に適した状態へ馴化させることによって得ることが可能であり、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などや、これらの細胞から派生して得られた細胞株が挙げられる。
【０１１５】
ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を図１に示す。図１は理解を助けるための図であり、各要素は実寸ではない。本発明の細胞の培養方法では、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、培養することにより、ポリマー多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の細胞が生育するため、大量の細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明の細胞の培養方法では、細胞培養に用いる培地の量を従来の方法よりも大幅に減らしつつ、大量の細胞を培養することが可能となる。例えば、ポリマー多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない状態であっても、大量の細胞を長期にわたって培養することができる。また、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和に対して、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積を著しく減らすことも可能となる。
【０１１６】
本明細書において、細胞を含まないポリマー多孔質膜がその内部間隙の体積も含めて空間中に占める体積を「見かけ上ポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図６参照）。そして、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、ポリマー多孔質膜の表面及び内部に細胞が担持された状態において、ポリマー多孔質膜、細胞、及びポリマー多孔質膜内部に浸潤した培地が全体として空間中に占める体積を「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図６参照）。膜厚２５μｍのポリマー多孔質膜の場合、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積は、見かけ上ポリマー多孔質膜体積より、最大で５０％程度大きな値となる。本発明の方法では、１つの細胞培養容器中に複数のポリマー多孔質膜を収容して培養することができるが、その場合、細胞を担持した複数のポリマー多孔質膜のそれぞれについての細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和を、単に「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和」と記載することがある。
【０１１７】
本発明の方法を用いることにより、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することが可能となる。また、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。さらに、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。そして、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。
【０１１８】
つまり、本発明によれば、細胞培養する空間（容器）を従来の二次元培養を行う細胞培養装置に比べて極限まで小型化可能となる。また、培養する細胞の数を増やしたい場合は、積層するポリマー多孔質膜の枚数を増やす等の簡便な操作により、柔軟に細胞培養する体積を増やすことが可能となる。本発明に用いられるポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置であれば、細胞を培養する空間（容器）と細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）とを分離することが可能となり、培養する細胞数に応じて、必要となる量の細胞培養培地を準備することが可能となる。細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）は、目的に応じて大型化又は小型化してもよく、あるいは取り替え可能な容器であってもよく、特に限定されない。
【０１１９】
本発明の細胞の培養方法において、例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数が、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして、培地１ミリリットルあたり１．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、５．０×１０8個以上、１．０×１０9個以上、２．０×１０9個以上、または５．０×１０9個以上となるまで培養することをいう。
【０１２０】
なお、培養中または培養後の細胞数を計測する方法としては、種々の公知の方法を用いることができる。例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数を、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして計測する方法としては、公知の方法を適宜用いることができる。例えば、ＣＣＫ８を用いた細胞数計測法を好適に用いることができる。具体的には、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ  Ｋｉｔ８；同仁化学研究所製溶液試薬（以下、「ＣＣＫ８」と記載する。）を用いて、ポリマー多孔質膜を用いない通常の培養における細胞数を計測し、吸光度と実際の細胞数との相関係数を求める。その後、細胞を適用し、培養したポリマー多孔質膜を、ＣＣＫ８を含む培地に移し、１〜３時間インキュベータ内で保存し、上清を抜き出して４８０ｎｍの波長にて吸光度を測定して、先に求めた相関係数から細胞数を計算する。
【０１２１】
また、別の観点からは、細胞の大量培養とは、例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後にポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数が１．０×１０5個以上、２．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、または５．０×１０8個以上となるまで培養することをいう。ポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数は、セルカウンター等の公知の方法を用いて適宜計測することが可能である。
【実施例】
【０１２２】
以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。【０１２３】
以下の実施例で使用されたポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分である３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）とジアミン成分である４，４’−ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）とから得られるポリアミック酸溶液と、着色前駆体であるポリアクリルアミドとを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより、調製された。得られたポリイミド多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、表面層Ａに存在する孔の平均孔径は６μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は４６μｍであり、膜厚が２５μｍであり、空孔率が７３％であった。【０１２４】
（実施例１）
気相露出型回転培養装置【０１２５】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、１．３×１０６になるまで培養を継続した。図７に示す気相露出型回転培養装置（竪ドラム式、螺旋状流路無し）内部にナイロンメッシュ（３０＃、目開き５４７μｍ）にて外套（ケーシング）を形成し滅菌的にポリイミド多孔質膜を一定量（１モジュールあたり２０ｃｍ２）加えて封じたモジュール１８個を据え付け、回転可能な状態に準備した。上記浮遊培養液を上部液溜め（図１の培養槽３に相当）に４０ｍｌ注加した後、毎分６回転のゆっくりした速度で浮遊培養液に湿潤させた。この回転部を含む機器全体を、ＣＯ２インキュベータ内で５時間放置した後、上部液溜めの浮遊培養液を排除し、モジュールの回転は継続させたまま、５００ｍｌの培地を（ＦＢＳ２％を含むＩＭＤＭ）貯留した下部液溜め（図１の培地排出槽４に相当）より、同培地をチューブポンプ経由で毎分１０ｍｌの速度で循環させた。７日間培養した時点で、細胞密度３．２×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数１．０×１０８個の細胞が観察された。【０１２６】
（実施例２）
気相露出型回転培養装置【０１２７】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、１．３×１０６になるまで培養を継続した。図５及び図８に示す気相回転培養装置（切れ込みドラム式、螺旋状流路有り）内部にナイロンメッシュ（３０＃、目開き５４７μｍ）にて外套（ケーシング）を形成し滅菌的にポリイミド多孔質膜を一定量（１モジュールあたり２０ｃｍ２）加えて封じたモジュール１８個を据え付け、回転可能な状態に準備する。上記浮遊培養液を上部液溜めに４０ｍｌ注加した後、毎分６回転のゆっくりした速度で浮遊培養液に湿潤させた。この回転部を含む機器全体を、ＣＯ２インキュベータ内で終夜放置した後、上部液溜め（図１の培養槽３に相当）の浮遊培養液を排除し、モジュールの回転は継続させたまま、５００ｍｌの培地を（ＦＢＳ２％を含むＩＭＤＭ）貯留した下部液溜め（図１の培地排出槽４に相当）より、同培地をチューブポンプ経由で毎分１０ｍｌの速度で循環させた。７日間培養した時点で、細胞密度２．４×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数８．５×１０７個の細胞が観察された。【０１２８】
（実施例３）
＜ステンレス綱製ケーシングを有するモジュール化ポリマー多孔質膜（以下、「メタルモジュール」という）及びステンレス綱製細胞培養部（以下、「メタルドラム」という）の作製＞
ポリイミド多孔質膜の有する耐熱性を最大限に活用し、簡単な全体乾熱滅菌で滅菌作業を完了すべく、ステンレス鋼メッシュ製のケーシング、中敷、及びポリイミド多孔質膜で構成されるメタルモジュールを作製した（図９（Ａ）を参照）。具体的には、１ｃｍ×１ｃｍのポリイミド多孔質膜及びポリイミド多孔質膜と同面積のステンレス鋼メッシュ（「中敷」という。図示しない）を積層したもの（ポリイミド多孔質３枚、中敷１枚、ポリイミド多孔質４枚、中敷１枚、ポリイミド多孔質３枚、の順番で積層）を、ステンレスメッシュ製のケーシングで封止して、メタルモジュールを作製した（図９（Ａ））。作業は、開放空間下で非滅菌的に実施した。このメタルモジュールを運用するためのメタルドラムも、同様にステンレス綱メッシュにて作製し（図９（Ｂ））、内部にメタルモジュール２０個を入れた状態で、非滅菌的に組み立てた。その後、メタルモジュールを含むメタルドラムをアルミホイルで包み、摂氏１９０度にて８０分間乾熱滅菌し、放冷した。【０１２９】
＜気相露出型回転培養装置＞
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、１．１×１０６になるまで培養を継続した。図９（Ｃ）に示す様にメタルモジュールを含むメタルドラムを滅菌的に据え付け、クリーン環境下で回転可能な状態に準備した（図９（Ｃ））。上記のように細胞を浮遊培養して得た培地３４ｍｌと、新鮮な培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）６ｍｌを上部液溜め（図１の培養槽３に相当）に注加した後、メタルドラムを毎分１回転の速度で回転させ、ポリイミド多孔質膜に培地を湿潤させた。この装置全体を、ＣＯ２インキュベータ内で２１時間放置した後、上部液溜めの培地を排除し、メタルドラムの回転は継続させたまま、２００ｍｌの培地（ＫＢＭ−２７０）を貯留した下部液溜め（図１の培地排出槽４に相当）より、同培地をチューブポンプ経由で毎分１０ｍｌの速度で循環させた。４日間培養した時点で、細胞密度３．９×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数７．８×１０７個の細胞が観察された。その後、上部液溜め及び下部液溜め全量の培地を新鮮な培地（ＫＢＭ−２７０）に交換し、更に２日間同条件で培養を継続した。その時点で細胞密度１．３×１０６Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、総細胞数２．６×１０８個の細胞が観察された。
【符号の説明】
【０１３０】
１    細胞培養装置
２    細胞培養部
２０    ポリマー多孔質膜
２１    ポリマー多孔質膜支持体
２２    ポリマー多孔質膜留め
２２ａ    スポーク
２３    軸
２４    止めリング
２５ａ、２５ｂ    軸受ブッシュ
２６    フランジ
２７    軸貫通口
２８    培地通過口
２９    ポリマー多孔質膜留めリング
２００、２００ａ、２００ｂ、２００ｃ    円筒形容器
２０１    端面
２０２    側面
２０３    爪
２０４、２０５    培地流出入口
２０６    軸貫通口
２０７    螺旋状流路
２０００    ステンレス鋼メッシュ円筒形容器
２０２３    軸
３    培地槽
３１ａ、３１ｂ    軸受
３１０    軸受凹部
３２    培地貯留部
３３    培地排出管
３４    培地供給管
３５    培地貯留内壁
３５１    培地貯留内壁凹部
３６    培地オーバーフロー部
３７    培地排出孔
３８    テーパ部
４    培地排出槽
４１    培地供給ライン
４２    培地排出ライン
５    ポンプ
６    回転モータ
６１    回転モータ軸
６２    軸接合部
７    設置台
８    モジュール化ポリマー多孔質膜
８１    ステンレス鋼メッシュ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2018021363.tif 000012
【図８】
2018021363.tif 000013
【図９】
2018021363.tif 000014
【国際調査報告】
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2018021363.tif 000016
2018021363.tif 000017
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