(57)【要約】  本発明は、線維芽細胞増殖因子９を有効成分として含む、肝細胞における脂肪蓄積量を低減させるための脂肪低減剤、並びに当該脂肪低減剤を有効成分として含む、脂肪性肝疾患特にＮＡＦＬＤの治療及び／又は予防のための医薬に関する。本発明によれば、脂肪性肝疾患特にＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤにおける脂肪肝の改善及び／又は肝臓への脂肪の蓄積を低減させることが可能となり、運動療法とは別の又は運動療法に加えて、脂肪性肝疾患に対して直接的な治療手段及び／又は予防手段を提供することが可能となる。また本発明は、ＦＧＦ９又はその機能的等価物を有効成分として含む、脂肪性肝疾患特にＮＡＦＬＤに罹患した又は罹患するおそれのある対象の血中コレステロールを低減させる及び／又はその増加を抑制するための医薬に関する。
2018079054.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ９又はその機能的等価物を有効成分として含む、肝細胞における脂肪蓄積量を低減させるための脂肪低減剤。
【請求項２】
ＦＧＦ９の機能的等価物が、ＦＧＦ９のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸が欠失した若しくは置換されたアミノ酸配列、又はＦＧＦ９のアミノ酸配列に１個から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ肝細胞における脂肪蓄積量を低減させる活性を有するタンパク質である、請求項１に記載の脂肪低減剤。
【請求項３】
ＦＧＦ９の機能的等価物が、肝細胞における脂肪蓄積量を低減させる活性を保持したＦＧＦ９のポリペプチド断片である、請求項１に記載の脂肪低減剤。
【請求項４】
ＦＧＦ９の機能的等価物が、ＦＧＦ９、請求項２に記載のタンパク質若しくは請求項３に記載のポリペプチド断片をコードする核酸である、請求項１に記載の脂肪低減剤。
【請求項５】
ＦＧＦ９が配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトのＦＧＦ９である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の脂肪低減剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の脂肪低減剤を有効成分として含む、脂肪性肝疾患の治療及び／又は予防のための医薬。
【請求項７】
脂肪性肝疾患が非アルコール性脂肪性肝疾患又は非アルコール性脂肪肝炎である、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
ＦＧＦ９又はその機能的等価物を有効成分として含む、脂肪性肝疾患に罹患した又は罹患するおそれのある対象の血中コレステロールを低減させる及び／又はその増加を抑制するための医薬。
【請求項９】
脂肪性肝疾患が非アルコール性脂肪性肝疾患又は非アルコール性脂肪肝炎である、請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
ＦＧＦ９の機能的等価物が、ＦＧＦ９のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸が欠失した若しくは置換されたアミノ酸配列、又はＦＧＦ９のアミノ酸配列に１個から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪性肝疾患に罹患した又は罹患するおそれのある対象の血中コレステロールを低減させる及び／又はその増加を抑制する活性を有するタンパク質である、請求項８又は９に記載の医薬。
【請求項１１】
ＦＧＦ９の機能的等価物が、脂肪性肝疾患に罹患した又は罹患するおそれのある対象の血中コレステロールを低減させる及び／又はその増加を抑制する活性を保持したＦＧＦ９のポリペプチド断片である、請求項８又は９に記載の医薬。
【請求項１２】
ＦＧＦ９の機能的等価物が、ＦＧＦ９、請求項１０に記載のタンパク質若しくは請求項１１に記載のポリペプチド断片をコードする核酸である、請求項８又は９に記載の医薬。
【請求項１３】
ＦＧＦ９が配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトのＦＧＦ９である、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の医薬。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、線維芽細胞増殖因子９を有効成分として含む、肝細胞における脂肪蓄積量を低減させるための脂肪低減剤、並びに当該脂肪低減剤を有効成分として含む、脂肪性肝疾患特に非アルコール性脂肪性肝疾患の治療及び／又は予防のための医薬に関する。本発明はさらに、ＦＧＦ９又はその機能的等価物を有効成分として含む、脂肪性肝疾患特に非アルコール性脂肪性肝疾患に罹患した又は罹患するおそれのある対象の血中コレステロールを低減させる及び／又はその増加を抑制するための医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】  脂肪肝、肝炎及び肝硬変は、最終的には肝がんに至る肝障害の代表例である。従来、肝がんの主な原因としては、肝炎ウイルスへの感染の他、アルコールの多飲による肝臓における脂肪蓄積が大半を占めていた。しかし近年、アルコールの多飲以外の、肥満、糖尿病、高血圧といった生活習慣病、運動不足などが原因となって肝障害が生じ、さらに肝がんに至る症例の増加が問題となっている。【０００３】  アルコールの多飲を原因としない脂肪性肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（Ｎｏｎ  ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＮＡＦＬＤ）と呼ばれており、ＮＡＦＬＤはさらに、肝細胞での脂肪沈着のみを特徴とする単純性脂肪肝と、脂肪沈着に加えて炎症や線維化が起こる非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ  ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＮＡＳＨ）に分けられる。以下、これらを纏めてＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤと表す。【０００４】  食生活の欧米化及び慢性的な運動不足によってＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤと診断される患者数、さらには肝がん全体に占めるＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤなどの肝障害が原因となる肝がんの割合も増加してきており、脂肪性肝疾患、特にＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの早期発見及び治療への介入は、重要な課題となってきている。特に、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの病態進行は加齢や運動不足による骨格筋量減少と関連している（非特許文献１）ことから、高齢化が進む我が国においては、国を挙げて是正に取り組むべき問題となってきている。【０００５】  本発明者らは、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの早期発見を可能にする遺伝子多型を特定し、これらを利用したＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの発症リスクの判定方法について特許出願した（特許文献１）。一方、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤにおける肝臓への脂肪の蓄積を食い止めたり、脂肪肝を改善する方法としては、これまでのところ、患者に対する食事や運動の指導が主である。しかし、高齢化が深刻な我が国においては運動の指導は功を奏さない可能性が高く、脂肪性肝疾患に直接的に介入した治療法の確立が望まれている。【０００６】  一方、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）は、血管新生、創傷治癒、胚発生などに関与するヘパリン結合性タンパク質で、ヒト及びマウスでは２０種類以上のメンバーを含むＦＧＦファミリーを構成していることが知られている。ＦＧＦ１〜１０は、膜貫通タンパク質チロシンキナーゼの一種である線維芽細胞増殖因子受容体（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＦＧＦＲ）１〜４と結合し、前述の血管新生その他の生化学的反応に関するシグナリングを細胞に伝達する、シグナリング分子である。【０００７】  ヒトのＦＧＦ９は２０８アミノ酸残基からなり、グリア細胞、ＰＣ−１２細胞及びＢＡＬＢ／Ｃ  ３Ｔ３線維芽細胞の増殖を促進する機能を有している（例えば、非特許文献２）。しかし、ＦＧＦ９と脂肪性肝疾患との関連性は依然として不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１６−１７８８９８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈｏｎｇ  Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２０１４，５９（５），ｐｐ．１７７２−８
【非特許文献２】Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １９９３，１３（７），ｐｐ．４２５１−４２５９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  本発明は、脂肪性肝疾患特にＮＡＦＬＤに対して、より直接的な治療手段及び／又は予防手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  本発明者らは、ＦＧＦ９として知られているタンパク質が肝細胞への脂肪蓄積を低減させることができることを見いだし、下記の各発明を完成させた。【００１２】（１）ＦＧＦ９又はその機能的等価物を有効成分として含む、肝細胞における脂肪蓄積量を低減させるための脂肪低減剤。（２）ＦＧＦ９の機能的等価物が、ＦＧＦ９のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸が欠失した若しくは置換されたアミノ酸配列、又はＦＧＦ９のアミノ酸配列に１個から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ肝細胞における脂肪蓄積量を低減させる活性を有するタンパク質である、（１）に記載の脂肪低減剤。（３）ＦＧＦ９の機能的等価物が、肝細胞における脂肪蓄積量を低減させる活性を保持したＦＧＦ９のポリペプチド断片である、（１）に記載の脂肪低減剤。（４）ＦＧＦ９の機能的等価物が、ＦＧＦ９、（２）に記載のタンパク質若しくは（３）に記載のポリペプチド断片をコードする核酸である、（１）に記載の脂肪低減剤。（５）ＦＧＦ９が配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトのＦＧＦ９である、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の脂肪低減剤。（６）（１）〜（５）のいずれか一項に記載の脂肪低減剤を有効成分として含む、脂肪性肝疾患の治療及び／又は予防のための医薬。（７）脂肪性肝疾患がＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨである、（６）に記載の医薬。（８）ＦＧＦ９又はその機能的等価物を有効成分として含む、脂肪性肝疾患に罹患した又は罹患するおそれのある対象の血中コレステロールを低減させる及び／又はその増加を抑制するための医薬。（９）脂肪性肝疾患が非アルコール性脂肪性肝疾患又は非アルコール性脂肪肝炎である、（８）に記載の医薬。（１０）ＦＧＦ９の機能的等価物が、ＦＧＦ９のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸が欠失した若しくは置換されたアミノ酸配列、又はＦＧＦ９のアミノ酸配列に１個から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪性肝疾患に罹患した又は罹患するおそれのある対象の血中コレステロールを低減させる及び／又はその増加を抑制する活性を有するタンパク質である、（８）又は（９）に記載の医薬。（１１）ＦＧＦ９の機能的等価物が、脂肪性肝疾患に罹患した又は罹患するおそれのある対象の血中コレステロールを低減させる及び／又はその増加を抑制する活性を保持したＦＧＦ９のポリペプチド断片である、（８）又は（９）に記載の医薬。（１２）ＦＧＦ９の機能的等価物が、ＦＧＦ９、（１０）に記載のタンパク質若しくは（１１）に記載のポリペプチド断片をコードする核酸である、（８）又は（９）に記載の医薬。（１３）ＦＧＦ９が配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトのＦＧＦ９である、（８）〜（１２）のいずれか一項に記載の医薬。
【発明の効果】
【００１３】  本発明によれば、脂肪性肝疾患特にＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤにおける脂肪肝の改善及び／又は肝臓への脂肪の蓄積を低減させることが可能となり、運動療法とは別の又は運動療法に加えて、脂肪性肝疾患に対して直接的な治療手段及び／又は予防手段を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】肝細胞における脂肪の蓄積に対するＦＧＦ９の抑制効果（オイルレッドＯ染色法による定量値）を示すグラフである。
【図２】パルミチン酸非存在下（Ｐａｌ（−））、パルミチン酸存在下（Ｐａｌ（＋）：ＦＧＦ９（−））並びにパルミチン酸及びＦＧＦ９存在下（Ｐａｌ（＋）：ＦＧＦ９（＋））で培養した肝細胞における脂肪の蓄積（オイルレッドＯ染色法による褐色の染色））を示す光学顕微鏡観察像である。
【図３】強制水泳させた（ｓｗｉｍ（＋））又はさせない（ｓｗｉｍ（−））若齢マウス及び老齢マウスから調製した血清及びオレイン酸を含有する培地中で肝細胞を培養したときの、肝細胞における脂肪の蓄積量を示すグラフである。
【図４】高脂肪食を与えながら通常飼育した対照マウス（Ｃｏｎｔ．）及び尾懸垂飼育したマウス（ＴＳ）のヒラメ筋組織及び肝組織のＨＥ染色後の光学顕微鏡観察像である。
【図５】対照マウス（Ｃｏｎｔ．）及びＴＳマウスの血中ＡＳＴ、ＡＬＴ及びＬＤＨ（ＩＵ／Ｌ）を示すグラフである。
【図６】対照マウス（Ｃｏｎｔ．）及びＴＳマウスのヒラメ筋組織における、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量したＦＧＦ９及びＢＭＰ４の発現レベルを示すグラフである。
【図７】対照マウス（Ｃｏｎｔ．）及びＴＳマウスのヒラメ筋組織（上段パネル）及び血清（下段パネル）におけるＦＧＦ９をウェスタンブロッティングで検出した結果を示す写真である。
【図８】正常マウス肝組織及び初代培養肝細胞に対して、抗マウスＦＧＦＲ３抗体を用いて免疫組織化学染色又は免疫蛍光細胞染色を行ったときの顕微鏡観察像である。
【図９】対照マウス（Ｃｏｎｔ．）及びＴＳマウスから採取した肝組織におけるＦＧＦＲ３をウェスタンブロッティングで検出した結果を示す写真である。
【図１０】実施例２における通常食マウス（Ｃｏｎｔ．ｓａｌｉｎｅ及びＣｏｎｔ．ＦＧＦ９）の血中ＡＳＴ、ＡＬＴ、総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）及びトリグリセライド（ＴＧ）を示すグラフである。
【図１１】実施例２におけるＮＡＳＨモデルマウス（ＨＦＤ  ｓａｌｉｎｅ及びＨＦＤ  ＦＧＦ９）の血中ＡＳＴ、ＡＬＴ、総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）及びトリグリセライド（ＴＧ）を示すグラフである。
【図１２】実施例２における通常食マウス及びＮＡＳＨモデルマウス由来肝組織の総脂肪含有量を示すグラフである。
【図１３】実施例２におけるＮＡＳＨモデルマウス由来肝組織のＨＥ染色後の光学顕微鏡観察像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】  本発明の第一の態様は、ＦＧＦ９又はその機能的等価物を有効成分として含む、肝細胞における脂肪蓄積量を低減させるための脂肪低減剤に関する。
【００１６】  本発明においては、哺乳動物のＦＧＦ９、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモットを含むげっ歯類、ヒト、チンパンジー、アカゲザルを含む霊長類、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジを含む家畜、イヌ、ネコを含む愛玩動物などのＦＧＦ９の使用が好ましい。特に、げっ歯類又は霊長類のＦＧＦ９、とりわけヒトのＦＧＦ９（ｈＦＧＦ９）の使用が好ましい。
【００１７】  ＦＧＦ９は、生体から単離精製したものであってもよいが、遺伝子組換え的に製造されるＦＧＦ９であってもよい。例えば、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋにおいてｈＦＧＦ９のアミノ酸配列はアクセッション番号ＢＡＡ０３５７２として、塩基配列はアクセッション番号Ｄ１４８３８として登録されている。ｈＦＧＦ９のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００１８】  ＦＧＦ９の機能的等価物には、天然に存在するＦＧＦ９のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸が欠失した又は置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、天然に存在するＦＧＦ９のアミノ酸配列に１個から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、天然に存在するＦＧＦ９のポリペプチド断片などであって、肝細胞における脂肪蓄積量を低減させる活性を有するタンパク質又はポリペプチド断片が包含される。例えば、ｈＦＧＦ９の機能的等価物には、配列番号１に示されるｈＦＧＦ９のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸が欠失した又は置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１に示されるアミノ酸配列に１個から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるｈＦＧＦ９のスプライスバリアントであるタンパク質、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるｈＦＧＦ９のポリペプチド断片などであって、肝細胞における脂肪蓄積量を低減させる活性を有するタンパク質又はポリペプチド断片が包含される。
【００１９】  肝細胞における脂肪蓄積量を低減させる活性とは、肝細胞内に蓄積された脂肪の量を減少させる、又は肝細胞内への脂肪の蓄積を抑制する活性を意味する。かかる活性は、脂質の存在下で肝細胞を培養することで脂肪を蓄積した肝細胞を調製し、これに被験物質を添加してインキュベートを行い、その脂肪蓄積量を被験物質を添加せずにインキュベートした肝細胞と比較することによって、又は脂質と被験物質の共存下で肝細胞を培養し、その脂肪蓄積量を被験物質の非存在下で培養した肝細胞のそれと比較することによって、確認することができる。
【００２０】  ＦＧＦ９の機能的等価物が、天然に存在するＦＧＦ９のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸が欠失した若しくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は天然に存在するＦＧＦ９のアミノ酸配列に１個から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である場合においては、機能的等価物のアミノ酸配列は、天然のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するものであることが好ましい。なお、アミノ酸配列の同一性（％）は、当業者によって通常用いられる適当なソフトプログラム、例えば配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２などを用い、比較されるアミノ酸配列をアラインメントしたときに得られる最大のパーセント配列同一性を意味する。
【００２１】  ＦＧＦ９は、溶液中では単量体又は単量体同士が水素結合を介して会合したホモ二量体として存在するが、本発明では単量体及びホモ二量体のいずれの形態のＦＧＦ９でも利用することができる。
【００２２】  ＦＧＦ９及びその機能的等価物であるタンパク質及びポリペプチド断片は、肝細胞における脂肪蓄積量を低減させる活性を維持するかぎり、タグ付加又は修飾されていてもよい。タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質タグを挙げることができる。修飾としては、例えば、アシル化、プレニル化、アセチル化、リン酸化、グリコシル化、ＰＥＧ化を挙げることができる。
【００２３】  ＦＧＦ９の機能的等価物には、ＦＧＦ９及びその機能的等価物であるタンパク質及びポリペプチド断片をコードする核酸、すなわちＦＧＦ９をコードする核酸、天然に存在するＦＧＦ９のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸が欠失した又は置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、天然に存在するＦＧＦ９のアミノ酸配列に１個から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、天然に存在するＦＧＦ９のポリペプチド断片などであって、肝細胞における脂肪蓄積量を低減させる活性を有するタンパク質又はポリペプチド断片（ＦＧＦ９等と表す）をコードする核酸も包含される。
【００２４】  核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの安定性が高められた核酸修飾体のいずれでもよい。また直鎖状のものでも、環状のものでもよい。ＤＮＡとしては発現ベクターの形状にあるものが好ましく、またＲＮＡとしてはｍＲＮＡが好ましい。発現ベクターの例としては、ｐＢＡｐｏ−ＣＭＶ（Ｔａｋａｒａ）その他の市販の発現ベクターにＦＧＦ９又はＦＧＦ９等をコードするＤＮＡを組み込んだものを挙げることができる。核酸は、これらを生体又は細胞に導入することのできる種々の公知の方法によって、例えばレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルスベクターを用いた核酸導入方法、ｊｅｔＰＥＩ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）やリポフェクトアミン等の非ウイルス性キャリアを用いた核酸導入方法、ハイドロダイナミクス法等によって、生体に導入することができる。生体に導入された核酸は、これらからＦＧＦ９又はＦＧＦ９等が転写翻訳されることで、肝細胞における脂肪蓄積量を低減させるための脂肪低減剤として機能する。
【００２５】  ＦＧＦ９及びその機能的等価物は、当業者に公知の遺伝子組換え手法を用いて製造することも可能である。かかる遺伝子組換え手法は、各種の教科書、ハンドブック、典型的にはＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）などに記載され、当業者に広く利用されている手法を用いて行うことができる。また、市販の実験キット又は試薬を使用するときは、当該キット又は試薬の製造者が定めたプロトコルに従えばよい。
【００２６】  本発明の第二の態様は、第一の態様の脂肪低減剤を有効成分として含む、脂肪性肝疾患の治療及び／又は予防のための医薬に関する。
【００２７】  第二の態様の医薬は、ＦＧＦ９又はその機能的等価物そのままの形態、例えばこれらの乾燥粉末又は水溶液の形態であってもよく、ＦＧＦ９又はその機能的等価物と薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤その他の添加剤及び／又は脂肪性肝疾患の治療に有益な他の有効成分とを含む医薬組成物の形態であってもよい。薬学的に許容される添加剤、特に生理活性タンパク質又は核酸を有効成分とする医薬組成物において好適な添加剤は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十七改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
【００２８】  第二の態様の医薬の剤形は任意であるが、注射剤、点滴剤などの非経口製剤が好ましい。非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトールなどを含む等張液といった水性担体が挙げられる。
【００２９】  第二の態様の医薬は、脂肪性肝疾患に罹患した又は罹患するおそれのある対象、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモットを含むげっ歯類、ヒト、チンパンジー、アカゲザルを含む霊長類、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジを含む家畜、イヌ、ネコを含む愛玩動物といった哺乳動物に投与される。好ましい対象は、ヒトである。
【００３０】  第二の態様の医薬の投与方法は、特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与などを挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、第二の態様の医薬は、静脈内投与又は腹腔内投与により生体に投与される。また、第二の態様の医薬は、脂肪性肝疾患の治療に有益なその他の医薬と併用して使用してもよい。
【００３１】  第二の態様の医薬の投与量は、用法、対象の年齢、疾患の形態、その他の条件などに応じて適宜選択される。例えば、ＦＧＦ９及び／又はその機能的等価物であるタンパク質及びポリペプチド断片の投与量は、タンパク質重量として、通常成人に対して体重１ｋｇあたり１０ｎｇ〜２０００μｇであり、これを１日に１回若しくは複数回に分けて、又は間歇的に投与することができる。
【００３２】  第二の態様の医薬は、脂肪性肝疾患の治療及び／又は予防のために用いられる。脂肪性肝疾患とは、肝臓に中性脂肪が過剰に蓄積した状態、例えば全肝細胞の３０％以上に脂肪滴が蓄積した状態をいう。第二の態様の医薬は、肥満、糖分の過剰摂取、アルコールの過剰摂取、糖尿病、運動不足などが原因とされる脂肪性肝疾患に適用可能であるが、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨへの適用が特に好ましい。
【００３３】  本発明の第三の態様は、ＦＧＦ９又はその機能的等価物を有効成分として含む、脂肪性肝疾患に罹患した又は罹患するおそれのある対象の血中コレステロールを低減させる及び／又はその増加を抑制するための医薬に関する。
【００３４】  第三の態様の医薬は、脂肪性肝疾患、特にＮＡＳＨ又はＮＡＦＬＤに罹患した又は罹患するおそれのある対象において、血中コレステロールを低減させる及び／その増加を抑制するために、好ましくは高コレステロール血症の治療及び／又は予防のために用いられる。第三の態様の医薬の有効成分、剤形、投与対象、投与方法及び投与量等の詳細は、第一及び第二の態様において説明したとおりである。
【００３５】  本明細書において用いられる用語「治療」は、疾患の治癒、一時的寛解などを目的とする医学的に許容される全てのタイプの治療的介入を包含する。また用語「予防」は、疾患への罹患又は発症の防止若しくは抑制などを目的とする医学的に許容される全てのタイプの予防的介入を包含する。すなわち脂肪性肝疾患の治療及び／又は予防とは、脂肪性肝疾患の進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失、発症の予防又は再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００３６】  なお、ＦＧＦ９又はその機能的等価物が脂肪性肝疾患の治療及び／又は予防に有効であるとの知見からは、上述の態様の発明以外にも、有効量のＦＧＦ９又はその機能的等価物を対象に投与することを含む脂肪性肝疾患を治療及び／又は予防する方法、ＦＧＦ９又はその機能的等価物を有効成分として含む脂肪性肝疾患の治療剤又は予防剤、脂肪性肝疾患の治療及び／又は予防に用いるためのＦＧＦ９又はその機能的等価物などの各態様の発明が導かれ、本明細書において開示される。これら各態様にかかる用語の意義は、第一及び第二の態様において説明したとおりである。
【００３７】  同様に、ＦＧＦ９又はその機能的等価物が脂肪性肝疾患に罹患した又は罹患するおそれのある対象の血中コレステロールを低減させる及び／又はその増加を抑制するために有効であるとの知見からは、上述の態様の発明以外にも、有効量のＦＧＦ９又はその機能的等価物を対象に投与することを含む上記対象の血中コレステロールを低減させる及び／又はその増加を抑制する方法、ＦＧＦ９又はその機能的等価物を有効成分として含む血中コレステロール低減剤及び／又は上昇抑制剤、同対象において血中コレステロールを低減させる及び／又はその増加を抑制するためのＦＧＦ９又はその機能的等価物などの各態様の発明が導かれ、本明細書において開示される。これら各態様にかかる用語の意義は、第一から第三の態様において説明したとおりである。
【００３８】  以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００３９】実施例１１）生後６週齢の雄性Ｃ５７Ｂｌ／６ｊマウスからコラゲナーゼ灌流法で分離した肝細胞を、１０％ウシ胎児血清含有Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ  ｍｅｄｉｕｍを分注した９６ウェルコラーゲンコートプレートに播種して、３７℃で一晩培養した。【００４０】２）各ウェルから培地を除去した後、５００μＭのパルミチン酸を含む１％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭ培地、又は５００μＭのパルミチン酸と０、６．２５、１２．５、２５．０、５０．０、１００ｎｇ／ｍＬのマウスリコンビナントＦＧＦ９（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）とを含む１％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭ培地を加えて、さらに２４時間培養した。【００４１】３）培養した肝細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％中性緩衝ホルマリンを加えて室温で１０分間固定した。固定後、肝細胞をＰＢＳで洗浄してから、６０％イソプロパノールを加えてイソプロパノールを細胞内に浸透させた後、オイルレッドＯ染色液（和光純薬工業（株））を加えて、室温で２０分間インキュベートした。【００４２】４）インキュベートした肝細胞を６０％イソプロパノールで、次いでＰＢＳで洗浄し、さらに乾燥させた後、１００％イソプロパノールを加えてオイルレッドＯを細胞から溶出させ、プレートリーダーを用いて５１０ｎｍの吸光度測定を行い、肝細胞内の脂肪含有量を定量した。【００４３】  以上の実験の結果、肝細胞内の脂肪含有量はＦＧＦ９の用量に依存して減少することが確認された（図１）。【００４４】  また、上記１）で分離、培養した肝細胞を、１％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭ培地（Ｐａｌ（−））、５００μＭのパルミチン酸を含む１％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭ培地（Ｐａｌ（＋）：ＦＧＦ９（−））、及び５００μＭのパルミチン酸と５０ｎｇ／ｍＬのマウスリコンビナントＦＧＦ９とを含む１％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭ培地（Ｐａｌ（＋）：ＦＧＦ９（＋））を用いて、２４時間ごとに培地を新たなものに交換しながら３７℃で７２時間培養した。【００４５】  上記３）と同様にしてオイルレッドＯ染色を行った後、肝細胞を６０％イソプロパノールで次いでＰＢＳで洗浄し、さらに乾燥させた後、そのまま光学顕微鏡で肝細胞内に蓄積された脂肪を観察した（図２）。その結果、Ｐａｌ（＋）：ＦＧＦ９（−）では細胞内に多量の脂肪の蓄積が観察される一方、Ｐａｌ（＋）：ＦＧＦ９（＋）では細胞内の脂肪の蓄積が抑制されていることが視認された。【００４６】実験例１）生後５週齢（若齢）及び５０週齢（老齢）の雄性Ｃ５７Ｂｌ／６ｊマウス（各群５匹）について、１５分間強制水泳させた後に３０分間安静にさせた群と強制水泳させなかった群とを用意した。強制水泳の際、老齢マウスは若齢マウスと比べて運動量が少なかった。各群から採血して血清をプールした。【００４７】  マウス初代肝細胞を、２５０μＭのオレイン酸と１０％の上記血清とを含有するＤＭＥＭ培地を用いて３７℃で２４時間培養し、オイルレッドＯ染色を行って細胞内脂肪量を定量した。その結果、強制水泳させた若齢マウスの血清を添加した肝細胞では脂肪蓄積が抑制されるが、強制水泳させた老齢マウスの血清を添加しても脂肪蓄積は抑制されないことが確認され、運動��脂肪蓄積の抑制に関与する可能性が示唆された（図３）。【００４８】２）生後４週齢の雄性Ｃ５７Ｂｌ／６ｊマウスに、高脂肪食を１６週間与えながら飼育して脂肪肝を誘導し、その後に尾懸垂飼育装置を用いて尾を吊り上げて下肢に負荷が加わらない状態にして、7日間飼育した。飼育後、マウスの肝組織及びヒラメ筋組織を摘出してホルマリン固定パラフィン包埋標本を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行って顕微鏡観察した。【００４９】  その結果、尾懸垂飼育装置の代わりに通常のケージで飼育した対照マウス（Ｃｏｎｔ．）と比較して、尾懸垂飼育したマウス（ＴＳ）のヒラメ筋組織において筋線維の萎縮（図４上段、矢印の箇所）が、肝組織において多量の脂肪滴（図４下段、白色空胞）がそれぞれ観察された。さらに、ＴＳマウスにおいて逸脱酵素であるＡＳＴ、ＡＬＴ及びＬＤＨの血中レベルがいずれも増加していることが確認された（図５）。【００５０】３）上記２）のＴＳマウス及び対照マウスの肝組織及びヒラメ筋からＲＮＡを採取し、３０，０００程の遺伝子についてＲＮＡシークエンシングによる網羅的遺伝子発現解析を行った。ＴＳマウスと対照マウスとの間で発現変動が１．５倍より大きく異なる遺伝子（Ｐ値＜０．０５）として、肝組織において４４１個、ヒラメ筋において４１７個の遺伝子を抽出し、パスウェイ解析による関連シグナル経路の推定を行った。その結果、尾懸垂飼育したマウスの肝組織では主なものとして増殖関連転写因子（Ｊｕｎ，Ｎｆｋｂ２）の発現が、並びにヒラメ筋組織では主に筋線維構成蛋白質（Ａｃｔａ１，Ｔｐｍ１）、脂肪酸代謝酵素（Ａｃａｄｍ，Ｌｐｌ）及び組織修復関連増殖因子（Ｆｇｆ９，Ｂｍｐ４）の発現が、それぞれ低下していることが確認された。【００５１】  また、マウスのヒラメ筋組織におけるＦＧＦ９及びＢＭＰ４の発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量したところ、ＴＳマウスではＦＧＦ９の発現が殆ど検出されないことが確認された（図６）。【００５２】  さらに、マウスのヒラメ筋組織及び血清に対して抗マウスＦＧＦ９抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いたウェスタンブロッティングを行ったところ、対照マウスと比較してＴＳマウスにおいてＦＧＦ９のタンパク質レベルが低下していること、特に血清中のＦＧＦ９のタンパク質レベルが大きく低下していることが確認された（図７）。【００５３】  以上から、尾懸垂飼育によって廃用性筋萎縮が誘導され、その影響によりヒラメ筋組織からのＦＧＦ９の分泌が低下したことが推察された。【００５４】４）ＦＧＦ９は、ＦＧＦＲ１ｃ、２ｃ、３ｂ、３ｃ及び４への結合能を有し、特にＦＧＦＲ３ｃとの親和性が高いことが知られている。正常マウス肝組織及び初代培養肝細胞におけるＦＧＦＲ３の発現を図８に示す。上記３）の対照マウス及びＴＳマウスの肝臓におけるＦＧＦＲ３の発現を評価するため、これらのマウスから採取した肝組織に対して抗マウスＦＧＦＲ３抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を用いたウェスタンブロッティングを行った。その結果、いずれのマウスにおいてもＦＧＦＲ３は発現しており、対照マウスと比較してＴＳマウスではその発現が亢進していることが確認された（図９）。【００５５】実施例２１）１０匹の雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに高脂肪食を１６週間与え続けることで、ＮＡＳＨモデルマウス（２０週齢）を作成し、生理食塩水を投与するグループ（ＨＦＤ  ｓａｌｉｎｅ，ｎ＝５）とＦＧＦ９を投与するグループ（ＨＦＤ  ＦＧＦ９、ｎ＝５）とに分けた。また、１０匹の雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに通常食を１６週間与えて飼育した通常食マウス（２０週齢）を用意し、生理食塩水を投与するグループ（Ｃｏｎｔ．ｓａｌｉｎｅ、ｎ＝５）とＦＧＦ９を投与するグループ（Ｃｏｎｔ．ＦＧＦ９、ｎ＝５）とに分けた。【００５６】  生理食塩水を投与するグループには生理食塩水を０．１ｍＬ／日の量で、ＦＧＦ９を投与するグループにはマウスリコンビナントＦＧＦ９（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を２００ｎｇ／０．１ｍＬ／日の量で、それぞれ２１日間連続で腹腔内投与した。その後、マウスを解剖し、血清及び肝組織を回収した。【００５７】２）上記１）で回収した各グループの血清におけるトランスアミナーゼ（ＡＳＴ、ＡＬＴ）、総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）及びトリグリセライド（ＴＧ）の各濃度を測定した。Ｃｏｎｔ．ｓａｌｉｎｅとＣｏｎｔ．ＦＧＦ９との間では、ＡＳＴ、ＡＬＴ、Ｔ−Ｃｈｏ、ＴＧいずれの濃度にも有意な差はなかった（図１０）。また、ＨＦＤ  ｓａｌｉｎｅとＨＦＤ  ＦＧＦ９との間では、ＡＳＴ、ＡＬＴ及びＴＧはいずれも有意な差はなかった。一方、ＨＦＤ  ｓａｌｉｎｅと比較して、ＨＦＤ  ＦＧＦ９においてＴ−Ｃｈｏ濃度は明らかに低下していることが確認された（図１１）。【００５８】３）上記１）で回収した各グループの肝組織からメタノール／クロロホルムにより脂肪を抽出し、Ｌｉｐｉｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ、Ｃｅｌｌ  ＢＩＯＬＡＢＳ社）を使用して組織内の総脂肪含有量を定量評価した。その結果、Ｃｏｎｔ．ｓａｌｉｎｅとＣｏｎｔ．ＦＧＦ９との間では有意な差は観察されなかった一方、ＨＦＤ  ｓａｌｉｎｅと比較して、ＨＦＤ  ＦＧＦ９において肝組織に含まれる脂肪の量が明らかに減少していることが確認された（図１２）。４）上記１）で回収したＨＦＤ  ｓａｌｉｎｅ及びＨＦＤ  ＦＧＦ９の各肝組織をホルマリンで固定してパラフィン包埋試料を作成し、ＨＥ染色を行った。その結果、ＨＦＤ  ｓａｌｉｎｅと比較して、ＨＦＤ  ＦＧＦ９において肝組織における脂肪滴が減少していることが確認された（図１３）【００５９】  以上の結果から、ＦＧＦ９は、通常食を与えたマウスに対して肝障害等を生じさせない一方、ＮＡＳＨモデルマウスに対して血清中の総コレステロールを低下させる効果、及び肝組織内に含まれる総脂肪量を減少させる効果を有することが確認された。【００６０】実施例３  正常マウス肝からコラゲナーゼ灌流法を用いて分離培養することで得られる肝細胞に、マウスＦＧＦ９をコードするＤＮＡを含むプラスミドベクター（タカラ社ｐＢＡＰＯ  ｐｕｒｏ  ＤＮＡにマウスＦＧＦ９を組み込んだもの）又はマウスＦＧＦ９をコードする合成マウスｍＲＮＡ（ｍＲＮＡＥｘｐｒｅｓｓ  ｍＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ��）を用いて導入し、マウス肝細胞内でマウスＦＧＦ９タンパク質を強制発現させることで、肝細胞内での脂肪蓄積を抑制することができる。脂肪蓄積抑制効果の確認は、細胞にパルミチン酸（２５０μＭ）を加えて２４時間培養した後にオイルレッドＯ染色を行って吸光度を測定し、比較対象としてマウスＦＧＦ９をコードするＤＮＡを含まないプラスミドベクターｐＢＡＰＯ  ｐｕｒｏ  ＤＮＡ（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ）を導入した肝細胞について同様の測定を行って吸光度を測定し、それらを比較定量することで行うことができる。【００６１】実施例４  高脂肪食を１６週間与えてＮＡＳＨを誘導したマウスに対して、マウスＦＧＦ９をコードするプラスミドベクター（タカラ社ｐＢＡＰＯ  ｐｕｒｏ  ＤＮＡにマウスＦＧＦ９を組み込んだもの）をハイドロダイナミクス法で肝臓に送達させることで、肝臓への脂肪蓄積を抑制することができる。具体的には、前記ベクター１μｇを１ｍＬの生理食塩水とともに尾静脈から注射して、一週間飼育した後に血液及び肝組織を採取して、血中のＦＧＦ９、トリグリセライド、総コレステロールを測定する。比較対象としてマウスＦＧＦ９をコードするＤＮＡを含まないプラスミドベクターｐＢＡＰＯ  ｐｕｒｏ  ＤＮＡ（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ）を同様にハイドロダイナミクス法で肝臓に送達させ、一週間飼育した後に上記と同様の測定を行うことで、マウスＦＧＦ９をコードする核酸を投与することによる肝臓への脂肪蓄積抑制効果を確認することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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