【手続補正書】
【提出日】令和1年10月2日(2019.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３からなる認識配列を認識及び切断する組換えメガヌクレアーゼであって、
第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、
前記第１のサブユニットが前記認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、
前記第２のサブユニットが前記認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含み、並びに
前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項２】
前記第１のサブユニットが、配列番号８の残基１９８〜３４４と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記第２のサブユニットが、配列番号８の残基７〜１５３と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項３】
前記第１のサブユニットが、配列番号８の残基１９８〜３４４を含む、請求項１又は２に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項４】
前記第２のサブユニットが、配列番号８の残基７〜１５３を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項５】
配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の前記組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項８】
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターをコードする、請求項７に記載の組換えＤＮＡ構築物。
【請求項９】
請求項６に記載の前記単離ポリヌクレオチドを含む、組換えＡＡＶベクター。
【請求項１０】
真核細胞（但し、ヒト配偶子及びヒト接合子を除く。）の染色体に挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子改変真核細胞をインビトロで作製するための方法であって、真核細胞に、
（ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列、及び
（ｂ）前記目的の配列を含む第２の核酸配列、
を含む１又は複数の核酸をトランスフェクトする工程を含み、
前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号３からなる認識配列において前記染色体に切断部位を生成し、前記目的の配列が前記切断部位において前記染色体に挿入される、方法。
【請求項１１】
前記第２の核酸が、前記切断部位に隣接する配列に相同な配列を更に含み、前記目的の配列が、相同組換えによって前記切断部位に挿入される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記真核細胞が、ヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記目的の配列がキメラ抗原受容体をコードする、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも前記第２の核酸配列が、組換えＡＡＶベクターによって前記真核細胞に導入される、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
真核細胞（但し、ヒト配偶子及びヒト接合子を除く。）の染色体に挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子改変真核細胞をインビトロで作製するための方法であって、
（ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の前記組換えメガヌクレアーゼを真核細胞に導入する工程；及び
（ｂ）前記真核細胞に、前記目的の配列を含む核酸をトランスフェクトする工程；
を含み、
前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号３からなる認識配列において前記染色体に切断部位を生成し、前記目的の配列が前記切断部位において前記染色体に挿入される方法。
【請求項１６】
前記核酸が、前記切断部位に隣接する配列に相同な配列を更に含み、前記目的の配列が相同組換えによって前記切断部位に挿入される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記真核細胞が、ヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記目的の配列がキメラ抗原受容体をコードする、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸配列が、組換えＡＡＶベクターによって前記真核細胞に導入される、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
真核細胞（但し、ヒト配偶子及びヒト接合子を除く。）の染色体中の標的配列を破壊することによって遺伝子改変真核細胞をインビトロで作製する方法であって、真核細胞に、請求項１〜５のいずれか１項に記載の前記組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸をトランスフェクトする工程を含み、
前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号３からなる認識配列において前記染色体に切断部位を生成し、前記標的配列が前記切断部位において非相同末端結合により破壊される方法。
【請求項２１】
前記真核細胞が、ヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記真核細胞に、目的の外因性配列を含む第２の核酸をトランスフェクトする工程をさらに含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記目的の配列がキメラ抗原受容体をコードする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
真核細胞（但し、ヒト配偶子及びヒト接合子を除く。）の染色体中の標的配列を破壊することにより遺伝子改変真核細胞をインビトロで作製する方法であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の前記組換えメガヌクレアーゼを真核細胞に導入する工程を含み、
前記メガヌクレアーゼが配列番号３からなる認識配列において前記染色体に切断部位を生成し、前記標的配列が前記切断部位において非相同末端結合により破壊される方法。
【請求項２５】
前記真核細胞が、ヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記真核細胞に、目的の外因性配列を含む核酸をトランスフェクトする工程を更に含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記目的の配列がキメラ抗原受容体をコードする、請求項２６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
【図１】ヒトＴＲＣアルファ定常領域遺伝子中のＴＲＣ認識配列を示す。図１Ａは本発明の組換えメガヌクレアーゼによって標的とされる各認識配列は、２つの認識半部位を含む。各認識半部位は、４塩基対の中央配列によって分離された９塩基対を含む。ＴＲＣ１−２認識配列（配列番号３）は、ヒトＴ細胞アルファ定常領域（配列番号１）のヌクレオチド１８７〜２０８に及んでおり、ＴＲＣ１及びＴＲＣ２と呼ばれる２つの認識半部位を含む。ＴＲＣ３−４認識配列（配列番号４）は、ヒトＴ細胞アルファ定常領域（配列番号１）のヌクレオチド９３〜１１４に及んでおり、ＴＲＣ３及びＴＲＣ４と呼ばれる２つの認識半部位を含む。ＴＲＣ７−８認識配列（配列番号５）は、ヒトＴ細胞アルファ定常領域（配列番号１）のヌクレオチド１１８〜１３９に及んでおり、ＴＲＣ７及びＴＲＣ８と呼ばれる２つの認識半部位を含む。Ｂ）本発明の組換えメガヌクレアーゼは、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットが第１の認識半部位（例えばＴＲＣ１、ＴＲＣ３、又はＴＲＣ７）に結合し、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットが第２の認識半部位（例えば、ＴＲＣ２、ＴＲＣ４、又はＴＲＣ８）に結合する、２つのサブユニットを含む。組換えメガヌクレアーゼが単鎖メガヌクレアーゼである実施形態において、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして配置することができる。同様に、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして配置することができる。
【図２Ａ−２Ｂ】ＴＲＣ１結合サブユニットのアミノ酸アライメントを示す。図２Ａ〜図２Ｂは本発明に包含されるいくつかの組換えメガヌクレアーゼは、配列番号３の９塩基対のＴＲＣ１認識半部位に結合する１つのブユニットを含む。アミノ酸配列アライメントは、配列番号８〜２７に示される組換えメガヌクレアーゼのＴＲＣ１結合サブユニット（配列番号３３〜５２）について提供される。示されるように、配列番号８〜１８のＴＲＣ１結合サブユニットは残基１９８〜３４４を含み、配列番号１９〜２７のＴＲＣ１結合サブユニットは残基７〜１５３を含む。各ＴＲＣ１結合サブユニットは、示されるように５６アミノ酸の超可変領域を含む。超可変領域内の可変残基は網掛けされており、各位置で最も頻度の高いアミノ酸は、最も一般的な残基は太字で、２番目に多いものは太字かつイタリック体でさらに強調されている。超可変領域外の残基は、８０位又は２７１位のＱ又はＥ残基を除いて、各サブユニットにおいて同一である（米国特許第８，０２１，８６７号を参照されたい）。図２に提供される全てのＴＲＣ１結合サブユニットは、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ（配列番号３３）のＴＲＣ１結合サブユニット（残基１９８〜３４４）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。示した残基番号は、配列番号８〜２７の残基番号である。
【図３Ａ−３Ｂ】ＴＲＣ２結合サブユニットのアミノ酸アライメントを示す。図３Ａ〜図３Ｂは本発明に包含されるいくつかの組換えメガヌクレアーゼは、配列番号３の９塩基対のＴＲＣ２認識半部位に結合する１つのサブユニットを含む。配列番号８〜２７に示される組換えメガヌクレアーゼのＴＲＣ２結合サブユニット（配列番号５８〜７７）についてのアミノ酸配列アライメントが提供される。示されるように、配列番号８〜１８のＴＲＣ２結合サブユニットは残基７〜１５３を含み、配列番号１９〜２７のＴＲＣ２結合サブユニットは残基１９８〜３４４を含む。各ＴＲＣ２結合サブユニットは、示されるように５６アミノ酸の超可変領域を含む。超可変領域内の可変残基は網掛けされており、各位置で最も頻度の高いアミノ酸は更に強調され、最も一般的な残基は太字であり、２番目に多いものは太字でイタリック体である。超可変領域外の残基は、８０位又は２７１位のＱ又はＥ残基（米国特許第８，０２１，８６７号を参照されたい）、並びにメガヌクレアーゼＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＱＥ、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＱ、ＴＲＣ１−２ｘ．８７、及びＴＲＣ１−２ｘ．１６３の１３９位のＲ残基（灰色の網掛け及び下線）を除いて、各サブユニットにおいて同一である。図３に提供される全てのＴＲＣ２結合サブユニットは、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ（配列番号５８）のＴＲＣ２結合サブユニット（残基７〜１５３）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。示した残基番号は、配列番号８〜２７の残基番号である。
【図４】ＴＲＣ３結合サブユニットのアミノ酸アライメントを示す。本発明に包含されるいくつかの組換えメガヌクレアーゼは、配列番号４の９塩基対のＴＲＣ３認識半部位に結合する１つのサブユニットを含む。配列番号２８及び２９に示される組換えメガヌクレアーゼのＴＲＣ３結合サブユニット（配列番号５３及び５４）についてのアミノ酸配列アラインメントが提供される。示されるように、配列番号２８及び２９のＴＲＣ３結合サブユニットは、残基７〜１５３を含む。各ＴＲＣ３結合サブユニットは、示されるように５６アミノ酸の超可変領域を含む。超可変領域内の可変残基は網掛けされている。超可変領域外の残基は、８０位のＱ又はＥ残基を除いて、各サブユニットにおいて同一である（米国特許第８，０２１，８６７号を参照されたい）。ＴＲＣ３−４ｘ．３及びＴＲＣ３−４ｘ．１９メガヌクレアーゼのＴＲＣ３結合サブユニットは、９７％の配列同一性を共有する。示した残基番号は、配列番号２８及び２９の残基番号である。
【図５】ＴＲＣ４結合サブユニットのアミノ酸アライメントを示す。本発明に包含されるいくつかの組換えメガヌクレアーゼは、配列番号４の９塩基対のＴＲＣ４認識半部位に結合する１つのサブユニットを含む。配列番号２８及び２９に示される組換えメガヌクレアーゼのＴＲＣ４結合サブユニット（配列番号７８及び７９）についてのアミノ酸配列アラインメントが提供される。示されるように、配列番号２８及び２９のＴＲＣ４結合サブユニットは残基１９８〜３４４を含む。各ＴＲＣ４結合サブユニットは、示されるように５６アミノ酸の超可変領域を含む。超可変領域内の可変残基は網掛けされている。超可変領域外の残基は、８０位のＱ又はＥ残基を除いて、各サブユニットにおいて同一である（米国特許第８，０２１，８６７号を参照されたい）。ＴＲＣ３−４ｘ．３及びＴＲＣ３−４ｘ．１９メガヌクレアーゼのＴＲＣ４結合サブユニットは、９７％の配列同一性を共有する。示した残基番号は、配列番号２８及び２９の残基番号である。
【図６Ａ−６Ｂ】ＴＲＣ７結合サブユニットのアミノ酸アライメントを示す。図６Ａ〜図６Ｂは本発明に包含されるいくつかの組換えメガヌクレアーゼは、配列番号５の９塩基対のＴＲＣ７認識半部位に結合する１つのサブユニットを含む。配列番号３０〜３２に示される組換えメガヌクレアーゼのＴＲＣ７結合サブユニット（配列番号５５〜５７）についてのアミノ酸配列アライメントが提供される。示されるように、配列番号３０のＴＲＣ７結合サブユニットは残基７〜１５３を含み、配列番号３１及び３２のＴＲＣ７結合サブユニットは残基１９８〜３４４を含む。各ＴＲＣ７結合サブユニットは、示されるように５６アミノ酸の超可変領域を含む。超可変領域内の可変残基は網掛けされており、各位置で最も頻度の高いアミノ酸は更に強調され、最も一般的な残基は太字であり、２番目に多いものは太字でイタリック体である。超可変領域外の残基は、８０位又は２７１位のＱ又はＥ残基を除いて、各サブユニットにおいて同一である（米国特許第８，０２１，８６７号を参照されたい）。図６で提供される全てのＴＲＣ７結合サブユニットは、ＴＲＣ７−８ｘ．７メガヌクレアーゼ（配列番号５５）のＴＲＣ７結合サブユニット（残基７−１５３）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。示される残基番号は、配列番号３０〜３２の残基番号である。
【図７Ａ−７Ｂ】ＴＲＣ８結合サブユニットのアミノ酸アライメントを示す。図７Ａ〜図７Ｂは本発明に包含されるいくつかの組換えメガヌクレアーゼは、配列番号５の９塩基対のＴＲＣ８認識半部位に結合する１つのサブユニットを含む。配列番号３０〜３２に示される組換えメガヌクレアーゼのＴＲＣ８結合サブユニット（配列番号８０〜８２）についてのアミノ酸配列アライメントが提供される。示されるように、配列番号３０のＴＲＣ８結合サブユニットは残基１９８〜３４４を含み、配列番号３１及び３２のＴＲＣ８結合サブユニットは残基７〜１５３を含む。各ＴＲＣ８結合サブユニットは、示されるように５６アミノ酸の超可変領域を含む。超可変領域内の可変残基は網掛けされており、各位置で最も頻度の高いアミノ酸は、最も一般的な残基は太字で、２番目に多いものは太字且つイタリック体で更に強調されている。超可変領域外の残基は、８０位又は２７１位のＱ又はＥ残基を除いて、各サブユニットにおいて同一である（米国特許第８，０２１，８６７号を参照されたい）。図７で提供される全てのＴＲＣ８結合サブユニットは、ＴＲＣ７−８ｘ．７メガヌクレアーゼ（配列番号８０）のＴＲＣ８結合サブユニット（残基１９８〜３４４）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。示される残基番号は、配列番号３０〜３２の残基番号である。
【図８】Ｔ細胞受容体アルファ定常領域（配列番号１）に見出される認識配列を標的とする組換えメガヌクレアーゼを評価するためのＣＨＯ細胞におけるレポーターアッセイの模式図である。本明細書中に記載の組換えメガヌクレアーゼのために、レポーターカセットが細胞のゲノムに安定に組み込まれたＣＨＯ細胞株が作製された。レポーターカセットは、５’から３’の順序で、：ＳＶ４０初期プロモータ；ＧＦＰ遺伝子の５’の２／３；本発明の操作されたメガヌクレアーゼの認識配列（例えば、ＴＲＣ１−２認識配列、ＴＲＣ３−４認識配列、又はＴＲＣ７−８認識配列）；ＣＨＯ−２３／２４メガヌクレアーゼの認識配列（ＷＯ／２０１２／１６７１９２）；及びＧＦＰ遺伝子の３’の２／３、で構成されていた。このカセットを安定にトランスフェクトされた細胞は、ＤＮＡ破壊誘発剤の不在下ではＧＦＰを発現しなかった。メガヌクレアーゼは、それぞれのメガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡの形質導入によって導入された。メガヌクレアーゼ認識配列のいずれかでＤＮＡ破壊が誘導された場合、ＧＦＰ遺伝子の重複領域は互いに組換えられて機能的ＧＦＰ遺伝子を生成する。次いで、ＧＦＰ発現細胞のパーセンテージは、メガヌクレアーゼによるゲノム切断の頻度の間接的測定として、フローサイトメトリによって決定することができる。
【図９】ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおいて、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域（配列番号１）中の認識配列を認識し、切断する組換えメガヌクレアーゼの効率を示す。配列番号８〜３２に示される組換えメガヌクレアーゼのそれぞれを、ＴＲＣ１−２認識配列（配列番号３）、ＴＲＣ３−４認識配列（配列番号４）、又はＴＲＣ７−８認識配列（配列番号５）を標的とするように操作し、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける有効性についてスクリーニングした。示した結果は、ＴＲＣ標的認識配列又はＣＨＯ−２３／２４認識配列を切断するための各メガヌクレアーゼの有効性を示す、各アッセイで観察されたＧＦＰ発現細胞のパーセンテージを提供する。陰性対照（ＲＨＯ１−２ｂｓ）を各アッセイに更に含めた。図９Ａ〜図９ＣはＴＲＣ１−２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼ。Ｄ）ＴＲＣ３−４認識配列を標的とするメガヌクレアーゼ。図９Ｅ〜図９ＦはＴＲＣ７−８認識配列を標的とするメガヌクレアーゼ。図９Ｇは２７１位のＱがＥで置換された（ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＱＥ）、８０位のＱがＥで（ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＱ）、又は８０位のＱ及び２７１位のＱの両方がＥで置換された（ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ）ＴＲＣ１−２ｘ．８７メガヌクレアーゼの変異体。
【図１０】ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける組換えメガヌクレアーゼ有効性の時間経過を示す。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＱＥ、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＱ、及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼを、メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡをＣＨＯレポーター細胞に導入した１、４、６、８、及び１２日後に決定されたＧＦＰ発現細胞のパーセンテージを用いてＣＨＯレポーターアッセイで評価した。
【図１１】ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼのトランスフェクション後でのＪｕｒｋａｔ細胞ゲノムＤＮＡの分析を示す。ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡのトランスフェクションの７２時間後に、ゲノムＤＮＡを回収し、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイを実施して、内因性ＴＲＣ１−２認識配列における遺伝子改変を推定した。
【図１２】内因性ＴＲＣ１−２認識配列における遺伝子改変についての、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼ発現の用量応答を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞に、３μｇ又は１μｇいずれかの所与のＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼｍＲＮＡをトランスフェクトした。９６時間で、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイを用いてゲノムＤＮＡを分析した。
【図１３】ヒトＴ細胞におけるＴＲＣ１−２認識配列の切断を示す。図１３ＡはＣＤ３＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いでＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを電気穿孔した。トランスフェクション後３日目及び７日目にゲノムＤＮＡを回収し、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイを使用して分析した。図１３Ｂは内因性ＴＲＣ１−２認識配列の突然変異がＴ細胞受容体の表面発現を排除するのに十分であるかどうかを決定するために、抗ＣＤ３抗体を使用したフローサイトメトリによって細胞を分析した。トランスフェクション後３日目及び７日目に対照細胞（水をトランスフェクトした）及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥトランスフェクト細胞を分析し、ＣＤ３陽性Ｔ細胞及びおＣＤ３陰性Ｔ細胞のパーセンテージを決定した。
【図１４】ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼの発現後でのヒトＴ細胞中のＴＲＣ１−２認識配列で観察された代表的な核酸配列の欠失を示す。
【図１５】組換えＡＡＶベクターの配列要素及び外因性核酸配列を内因性ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子に挿入するための操作されたヌクレアーゼと組み合わせたその使用を示す図である。
【図１６】ＡＡＶ４０５ベクターを作製するために使用されるプラスミドのマップを示す。
【図１７】ＡＡＶ４０６ベクターを作製するために使用されるプラスミドのマップを示す。
【図１８】ＡＡＶ形質導入効率を向上させるための、メガヌクレアーゼｍＲＮＡトランスフェクション及び組換えＡＡＶ形質導入のタイミングの決定を示す。ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを電気穿孔し、トランスフェクション後２、４、又は８時間に、細胞にＧＦＰをコードする組換えＡＡＶベクター（ＧＦＰ−ＡＡＶ）を形質導入した。Ｔ細胞を、形質導入の７２時間後に、ＧＦＰ発現についてフローサイトメトリによって分析し、形質導入効率を決定した。
【図１９】組換えＡＡＶベクターを使用した外因性核酸配列の挿入についてのヒトＴ細胞の分析を示す。ＣＤ３＋Ｔ細胞にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡをトランスフェクトし、続いて（トランスフェクション２時間後）ＡＡＶ４０５又はＡＡＶ４０６を形質導入した。形質導入のみの対照には（水を）擬似トランスフェクトし、ＡＡＶ４０５又はＡＡＶ４０６のいずれかを形質導入した。メガヌクレアーゼのみの対照にはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをトランスフェクトし、次いでトランスフェクションの２時間後に（水を）擬似形質導入した。ゲノムＤＮＡをＴ細胞から回収し、ＡＡＶベクター中の相同領域を超える配列を認識するプライマーを使用して、ＰＣＲによりＴＲＣ１−２遺伝子座を増幅させた。相同性領域の外側のＰＣＲプライマーは、ＡＡＶベクターからではなく、Ｔ細胞ゲノムの増幅のみを可能にした。ＰＣＲ産物を精製し、ＥａｇＩで消化した。次いで、ＰＣＲ産物を切断について分析した。
【図２０】ＡＡＶ４０５を使用したヒトＴ細胞のＴＲＣ１−２認識配列へのＥａｇＩ挿入の特徴付けを示す。図２０Ａでは先の実験で生成した未消化ＰＣＲ産物をｐＣＲ−平滑ベクター（ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ  ｖｅｃｔｏｒ）にクローニングした。コロニーＰＣＲを、Ｍ１３フォワード及びリバースプライマーを使用して行い、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ及びＡＡＶ４０５をトランスフェクトした細胞由来のＰＣＲ産物の一部をゲル電気泳動によって分析した。分析により、完全長ＰＣＲ産物（約１６００ｂｐ）、より小さいインサート、及び空のプラスミド（約３００ｂｐ）の混合物が示されている。図２０Ｂでは並行して、ＰＣＲ産物の別の部分をＥａｇＩで消化して、ＴＲＣ１−２認識配列に挿入されたＥａｇＩ認識部位を含むクローンのパーセントを決定した。ＥａｇＩで切断されたＰＣＲ産物は、約７００及び８００ｂｐの予想された断片を生成した。
【図２１】ＡＡＶ４０６を使用したヒトＴ細胞のＴＲＣ１−２認識配列へのＥａｇＩ挿入の特徴付けを示す。図２１Ａでは先の実験で生成した未消化ＰＣＲ産物をｐＣＲ−平滑ベクター（ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ  ｖｅｃｔｏｒ）にクローニングした。コロニーＰＣＲを、Ｍ１３フォワード及びリバースプライマーを使用して行い、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ及びＡＡＶ４０６をトランスフェクトした細胞由来のＰＣＲ産物の一部をゲル電気泳動によって分析した。分析により、完全長ＰＣＲ産物（約１６００ｂｐ）、より小さいインサート、及び空のプラスミド（約３００ｂｐ）の混合物が示されている。図２１Ｂでは並行して、ＰＣＲ産物の別の部分をＥａｇＩで消化して、ＴＲＣ１−２認識配列に挿入されたＥａｇＩ認識部位を含むクローンのパーセントを決定した。ＥａｇＩで切断されたＰＣＲ産物は、約７００及び８００ｂｐの予想された断片を生成した。
【図２２】図２２Ａは、ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼの発現後のヒトＴ細胞におけるＴＲＣ１−２認識配列で観察された代表的な核酸配列の欠失及び挿入（即ち、インデル（ｉｎｄｅｌ））である。図２２Ｂは、ＥａｇＩ制限部位を含む外因性核酸配列の挿入を確認するＴＲＣ１−２認識配列の核酸配列である。
【図２３】組換えＡＡＶ形質導入効率の向上を示す図を示す。形質導入効率を、メガヌクレアーゼｍＲＮＡトランスフェクションのタイミング及びその後のＡＡＶ形質導入のタイミングを最適化することによってさらに分析した。トランスフェクション直後又はトランスフェクションの２時間後に、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを電気穿孔し、続いてＧＦＰ−ＡＡＶを形質導入した。更に、刺激されていない休止Ｔ細胞にＧＦＰ−ＡＡＶを形質導入した。擬似形質導入細胞も分析した。形質導入の７２時間後、細胞をＧＦＰ発現についてフローサイトメトリによって分析し、ＡＡＶ形質導入効率を決定した。
【図２４】ＡＡＶ−ＣＡＲ１００（ＡＡＶ４０８）ベクターを作製するために使用されるプラスミドのマップを示す。
【図２５】ＡＡＶ−ＣＡＲ７６３（ＡＡＶ４１２）ベクターを作製するために使用されるプラスミドのマップである。
【図２６】ヒトＴ細胞におけるＴＲＣ１−２認識部位でのキメラ抗原受容体コード配列の挿入を示す図を示す。ＡＡＶ４１２ＨＤＲ鋳型がＴＲＣ１−２認識配列における二本鎖切断の修復に利用されたかどうかを決定するための、ＰＣＲに基づくアッセイを開発した。
【図２７】ヒトＴ細胞におけるＴＲＣ１−２認識部位でのキメラ抗原受容体コード配列の挿入を示す図を示す。ＡＡＶ４０８  ＨＤＲ鋳型がＴＲＣ１−２認識配列における二本鎖切断の修復に利用されたかどうかを決定するための、ＰＣＲに基づくアッセイを開発した。図２７ＡはＣＡＲ遺伝子がその遺伝子座に挿入されている場合、ＴＲＣ１−２認識配列座の５’末端にのみ産物を増幅するプライマー対を使用して生成されたＰＣＲ産物を示す。図２７ＢはＣＡＲ遺伝子がその遺伝子座に挿入されている場合、ＴＲＣ１−２認識配列座の３’末端にのみ産物を増幅するプライマー対を用いて生成されたＰＣＲ産物を示す。
【図２８】デジタルＰＣＲの図を示す。図２８ＡはヒトＴ細胞におけるＴＲＣ１−２認識部位へのキメラ抗原受容体コード配列の挿入効率を定量的に決定するために開発されたデジタルＰＣＲアッセイの略図を示す。図２８ＢはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼｍＲＮＡ及び／又は漸増量のＡＡＶ４０８を電気穿孔したヒトＴ細胞由来のゲノムＤＮＡについてのデジタルＰＣＲの結果を示す。
【図２９】ヒトＴ細胞上のＣＤ１９キメラ抗原受容体の細胞表面発現の図を示す。抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体の発現レベルを、ＡＡＶ４０８をＨＤＲ鋳型として使用して、ＴＲＣ１−２認識配列にＣＡＲ遺伝子を挿入した細胞において決定した。細胞表面発現をフローサイトメトリによって分析した。図２９Ａは擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）、及び擬似電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４０８を形質導入した細胞を示す。図２９ＢはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）、及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４０８を形質導入した細胞を示す。
【図３０】ＡＡＶ４２１ベクターを作製するために使用されるプラスミドのマップを示す。
【図３１】ＡＡＶ４２２ベクターを作製するために使用されるプラスミドのマップを示す。
【図３２】キメラ抗原受容体コード配列の挿入を示す図を示す。ＰＣＲ法を使用して、ＡＡＶ４２１又はＡＡＶ４２２によって導入されたキメラ抗原受容体コード配列が、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼによって切断されたＴＲＣ１−２認識部位に挿入されたかどうかを決定した。図３２ＡはＡＡＶ４２１による形質導入後の挿入の分析を示す。図３２ＢはＡＡＶ４２２による形質導入後の挿入の分析を示す。
【図３３】ヒトＴ細胞上のＣＤ１９キメラ抗原受容体の細胞表面発現を示す。抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体の発現レベルを、ＡＡＶ４２１をＨＤＲ鋳型として使用して、ＴＲＣ１−２認識配列にＣＡＲ遺伝子を挿入した細胞において決定した。細胞表面発現をフローサイトメトリによって分析した。図３３Ａは擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）、及び擬似電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４２１を形質導入した細胞を示す。図３３ＢはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）、及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４２１を形質導入した細胞を示す。
【図３４】細胞表面キメラ抗原受容体を発現するヒトＴ細胞の増殖を示す。いくつかの方法により、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼのためのｍＲＮＡの電気穿孔及びＡＡＶ４２１の形質導入後に、ＣＤ３−／ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の優先的な拡大及び濃縮を決定した。図３４ＡはＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の補添。Ｂ）ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の補添、並びにマイトマイシンＣにより不活性化されたＩＭ−９細胞とのインキュベーションを示す。図３４ＣはＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の補添、並びにマイトマイシンＣにより不活性化されたＩＭ−９細胞との２回のインキュベーションを示す。
【図３５】ヒトＴ細胞上のＣＤ１９キメラ抗原受容体の細胞表面発現を示す。抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体の発現レベルを、ＡＡＶ４２２をＨＤＲ鋳型として使用して、ＴＲＣ１−２認識配列にＣＡＲ遺伝子を挿入した細胞において決定した。細胞表面発現をフローサイトメトリによって分析した。図３５Ａは擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）、及び擬似電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４２２を形質導入した細胞を示す。図３５ＢはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）、及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４２２を形質導入した細胞を示す。
【図３６】細胞表面キメラ抗原受容体を発現するヒトＴ細胞の増殖を示す。いくつかの方法により、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼのためのｍＲＮＡの電気穿孔及びＡＡＶ４２２の形質導入後に、ＣＤ３−／ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の優先的な拡大及び濃縮を決定した。図３６ＡはＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の補添を示す。図３６ＢはＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の補添、並びにマイトマイシンＣにより不活性化されたＩＭ−９細胞とのインキュベーションを示す。図３６ＣはＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の補添、並びにマイトマイシンＣにより不活性化されたＩＭ−９細胞との２回のインキュベーションを示す。
【図３７】一本鎖ＡＡＶを使用したメガヌクレアーゼノックアウト効率を示す。実験は、一本鎖ＡＡＶベクターを同時に形質導入した場合のヒトＴ細胞における２つのメガヌクレアーゼのノックアウト効率を調べるために行った。図３７ＡはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥのためのｍＲＮＡを電気穿孔し、漸増量の一本鎖ＡＡＶ４１２を形質導入した細胞を示す。図３７Ｂはベータ−２ミクログロブリン遺伝子を標的とするメガヌクレアーゼのためのｍＲＮＡを電気穿孔し、漸増量の一本鎖ＡＡＶ４１２を形質導入した細胞を示す。図３７ＣはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥのためのｍＲＮＡを電気穿孔し、漸増量の一本鎖ＡＡＶ４２２を形質導入した細胞を示す。
【図３８】抗ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能活性を示す。図３８ＡはＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞又はＣＤ１９−Ｕ９３７細胞のいずれかを標的集団とするＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを示す。図３８Ｂはルシフェラーゼ標識ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞を標的とする細胞死滅アッセイを示す。
【図３９】線形化ＤＮＡドナー鋳型の形質導入後の、キメラ抗原受容体の発現を示す。これらの実験は、ＴＲＣ１−２認識配列座に相同な相同アーム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｒｍ）に隣接する抗ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子を含むプラスミドを生成した。いくつかのプラスミドにおいて異なるプロモータが使用され、相同アームは「短い」（５’相同アームで２００ｂｐ及び３’相同アームで１８０ｂｐ）か、又は「長い」（５’相同アームで９８５ｂｐ及び３’相同アーム上で７６３ｂｐ）化のいずれかであった。ＣＡＲドナープラスミドをベクター骨格中の制限部位で線形化し、ゲル精製した。図３９ＡはバックグラウンドＣＤ３−／ＣＡＲ＋染色。Ｂ）ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡ単独を電気穿孔した細胞を示す。図３９ＣはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡと、ＥＦ１αコアプロモータ及びＨＴＬＶエンハンサーを有する長い相同アームベクターとを共電気穿孔した細胞を示す。図３９ＤはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡと、ＥＦ１αコアプロモータ（エンハンサーなし）とを有する短い相同アームベクターを共電気穿孔した細胞を示す。図３９ＥはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡの不在下でＥＦ１αコアプロモータ及びＨＴＬＶエンハンサーを有する長い相同アームベクターを電気穿孔した細胞を示す。図３９ＦはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡの不在下でＥＦ１αコアプロモータを有する（エンハンサーなし）短い相同アームベクターを電気穿孔した細胞を示す。図３９ＧはＣＡＲ遺伝子の５’末端にＣＡＲの発現を駆動するＭＮＤプロモータ及びイントロンを含む長い相同アーム構築物と、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡとを電気穿孔した細胞を示す。図３９ＨはＣＡＲの発現を駆動するＭＮＤプロモータ含み、イントロンを含まない長い相同アーム構築物と、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡとを電気穿孔した細胞を示す。図３９ＩはＭＮＤプロモータを含み、イントロンを含まない短い相同アームプラスミドと、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡとを電気穿孔した細胞を示す。図３９ＪはＣＡＲ遺伝子の５’末端にＣＡＲの発現を駆動するＭＮＤプロモータ及びイントロンを含む長い相同アーム構築物を電気穿孔したが、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡは電子穿孔されなかった細胞を示す。図３９ＫはＣＡＲの発現を駆動するＭＮＤプロモータ含み、イントロンを含まない長い相同アーム構築物を電気穿孔したが、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡは電気穿孔しなかった細胞を示す。図３９ＬはＭＮＤプロモータを含み、イントロンを含まない短い相同アームプラスミドを電気穿孔したが、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡは電気穿孔しなかった細胞を示す。図３９ＭはＪｅＴプロモータを含んだ短い相同アーム構築物と、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡとを電気穿孔した細胞を示す。図３９ＮはＣＭＶプロモータを含んだ長い相同アーム構築物と、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡとを電気穿孔した細胞を示す。図３９ＯはＪｅＴプロモータを含んだ短い相同アーム構築物を電気穿孔したが、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡは電気穿孔しなかった細胞を示す。図３９ＰはＣＭＶプロモータを含んだ長い相同アーム構築物を電気穿孔したが、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲ��Ａは電気穿孔しなかった細胞を示す。
【図４０】線形化されたＤＮＡ構築物によって送達されたキメラ抗原受容体コード領域が、ヒトＴ細胞においてＴＲＣ１−２認識配列に挿入されたかどうかを決定するためのＰＣＲ分析を示す。
【図４１】ＡＡＶ４２３ベクターを作製するために使用されるプラスミドのマップを示す。
【図４２】ヒトＴ細胞上のＣＤ１９キメラ抗原受容体の細胞表面発現を示す。抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体の発現レベルを、ＡＡＶ４２３をＨＤＲ鋳型として使用して、ＴＲＣ１−２認識配列にＣＡＲ遺伝子を挿入した細胞において決定した。細胞表面発現をフローサイトメトリによって分析した。Ａ）擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）及び擬似電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４２３を形質導入した細胞。Ｂ）ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、擬似形質導入した細胞（ＭＯＩ−０）及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを電気穿孔し、漸増量のＡＡＶ４２３を形質導入した細胞。
【図４３】キメラ抗原受容体コード配列の挿入を示す。ＰＣＲ法を使用して、ＡＡＶ４２３によって導入されたキメラ抗原受容体コード配列が、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼによって切断されたＴＲＣ１−２認識部位に挿入されたかどうかを決定した。
【図４４】抗ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型分析を示す。図４４Ａでは活性化Ｔ細胞にＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥｍＲＮＡで電気穿孔し、次にＪｅＴプロモータにより駆動され、相同アームに隣接する抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現カセットを含むＡＡＶ６ベクターを形質導入した。ＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）と共に５日間培養した後、フローサイトメトリによって細胞表面ＣＤ３及び抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現について細胞を分析した。図４４Ｂでは抗ＣＤ３磁気ビーズを用いてＣＤ３＋細胞を枯渇させることによりＣＤ３−細胞を濃縮した。次いで、枯渇させた細胞をＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍＬ）中で３日間培養し、ＣＤ３及び抗ＣＤ１９ＣＡＲの細胞表面発現について再分析した。図４４ＣではＣＤ３−ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の精製された集団をフローサイトメトリによって分析し、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋である細胞のパーセンテージを決定した。図４４ＤではＣＤ３−ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の精製された集団を、フローサイトメトリによって更に分析し、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯを染色することによってそれらがセントラルメモリーＴ細胞、移行性メモリーＴ細胞、又はエフェクターメモリーＴ細胞であるかどうかを決定した。
【図４５】Ｒａｊｉ播種性リンパ腫モデルを示す。ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）４４を安定に発現するＲａｊｉ細胞を、２．０×１０５細胞／マウスの用量で、１日目に５〜６週齢の雌ＮＳＧマウスに静脈注射した。４日目に、ＰＢＳ、又は同じ健康なドナーＰＢＭＣから調製された遺伝子編集された対照ＴＣＲ  ＫＯ  Ｔ細胞を含有するＰＢＳ、又は同じドナーから調製されたＣＡＲ  Ｔ細胞の表示の用量を含有するＰＢＳを、マウスに静脈注射した。表示の日に、生存マウスにルシフェリン基質（１５０ｍｇ／ｋｇ生理食塩水）を腹腔内注射し、麻酔し、７分後に「ＩＶＩＳ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＣＴ」（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア４．５．１（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してデータを分析し、エクスポートした。発光信号強度は、ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒの輝度で表される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０３】
図２及び図３に示すように、ＴＲＣ１結合サブユニット及びＴＲＣ２結合サブユニットは各々、それぞれＨＶＲ１及びＨＶＲ２と呼ばれる５６塩基対の超可変領域を含む。ＴＲＣ１結合サブユニットは、８０位又は２７１位（Ｑ又はＥ残基を含む）を除いてＨＶＲ１領域の外側で同一であり、ＨＶＲ１領域内では高度に保存されている。同様に、ＴＲＣ２結合サブユニットもまた、８０位又は２７１位（Ｑ又はＥ残基を含む）並びにメガヌクレアーゼＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＱＥ、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＱ、ＴＲＣ１−２ｘ．８７、及びＴＲＣ１−２ｘ．１６３の１３９位（Ｒ残基を含む）（網掛けの灰色及び下線）を除いて、ＨＶＲ２領域の外側で同一である。ＨＶＲ１領域と同様に、ＨＶＲ２領域も高度に保存されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ａ】
2018536390.tif 000001
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ｂ】
2018536390.tif 000002