(57)【要約】  本発明は、新規組織再生材料およびその製造方法に関する。当該組織再生材料の製造方法は、（１）コラーゲン溶液または分散体と、幹細胞を含む中性の培養培地と混合する；（２）（１）の混合物を遠心分離して、幹細胞とコラーゲンを集積させる；（３）幹細胞とコラーゲンの集積物を培養する；工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織再生材料の製造方法であって、以下の工程：
（１）幹細胞を含む中性の培養培地と、コラーゲン溶液または分散体とを混合する；
（２）（１）の混合物を遠心分離して、幹細胞とコラーゲンを集積させる；
（３）幹細胞とコラーゲンの集積物を培養する；
を含む、前記方法。
【請求項２】
幹細胞が、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（１）の幹細胞が、１．０×１０５細胞／ｃｍ２〜６．０×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度まで培養した幹細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
コラーゲンが、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型コラーゲンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（１）のコラーゲン溶液または分散体が、再線維化コラーゲンの線維分散体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（１）または工程（３）においてアスコルビン酸もしくはアスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を添加することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により製造される、組織再生材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規組織再生材料およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化やスポーツによる軟骨や靱帯の変性、損傷は増加の一途をたどっている。関節に存在する腱、靱帯、軟骨は関節の安定を保つ重要な役割を担う一方で、一度損傷すると自己治癒しにくい特性を有している。これらの組織が損傷した場合、同一個体内の移植により治療が行われることが多いが、修復組織の力学特性が正常組織と比較して劣るという問題がある。国民の３０％以上が罹患している変形性関節症などでは、ＱＯＬ維持・向上のために組織修復の質的レベルを向上させることが急務とされている。【０００３】
そのための修復材料として最も有望視されているのがｉＰＳ細胞や間葉系幹細胞などの幹細胞を基本とする幹細胞由来組織修復材料である。幹細胞は増殖能（自己を増やす能力）と分化能（他の細胞になる能力）をあわせもつ細胞の総称であり、理論的にはすべて生体組織を作り上げることができるため、幹細胞を基本とする組織修復材料に寄せる期待は大きい。幹細胞のなかの間葉系幹細胞は生体内に存在している体性幹細胞の一種であり、個体から容易に収集でき、拒絶反応の心配も少ないため、再生医療の現実的な切り札として注目されている。【０００４】
例えば、腱、靱帯、軟骨の修復に関する問題を解決するためのアプローチとして、膝滑膜より採取した間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）にコラーゲンなどの細胞外基質（extracellular matrix：ＥＣＭ）を自己生成させて作製される幹細胞自己生成組織（stem cell-based self-assembled tissue:ｓｃＳＡＴ）が開発され、基礎的な研究が行われている（非特許文献１）。ｓｃＳＡＴは、当該技術分野においてティッシュ・エンジニアード・コンストラクト（tissue engineered construct：ＴＥＣ）としても知られている。ｓｃＳＡＴは、動物由来のコラーゲンや人工化合物からなるスキャフォールドを必要としないため、生体内に埋入した際に拒絶反応等を起こしにくいといった特徴を有している。これまでにｓｃＳＡＴは軟骨修復に効果があることが報告されている（非特許文献２）。しかし、ｓｃＳＡＴは細胞およびそれが自己生成する細胞外基質で構成される組織であり、薄く破れやすいなど移植手術の現場での取り扱いが難しい点が課題であったことに加え、修復組織の力学特性は正常軟骨と比較して低く、特に表層のコラーゲン密度が正常軟骨ほど高まらないことが課題となっている（非特許文献３）。【０００５】
しかし、上記の技術を含め、間葉系幹細胞由来の組織再生材料には以下の３つの問題がある。
ａ）培養環境の制約から幹細胞の分化能などのポテンシャルが最大限活かされていない。
ｂ）組織再生材料の力学的強度が低く、また周囲組織と癒合能が低い。
ｃ）調製可能な組織再生材料が小体積のため広領域の治療に用いることができない。【０００６】
組織再生材料において力学的強度を高めるためには、細胞と何らかのスキャフォールドの複合体を作成することが考えられるが、一般に、細胞とスキャフォールドの複合体の作成では、細胞をスキャフォールド内に侵入させることは困難とされている。例えば、陰圧の負荷や培養液の環流により、細胞をスキャフォールド内に侵入させる検討が行われているが、これらの方法は効果が少なく、生体組織のように細胞をある程度均一かつ高密度に含むような状態は作り出すことができない。【０００７】
Yokoyamaらは、コラーゲンゲル内で細胞を培養するコラーゲンゲル培養法を用いて、低分子量コラーゲンからなる基質内に多量の幹細胞を含有させることに成功している（非特許文献４）。この培養法は、既存の細胞培養方としてニッタゼラチン（ニッタ）など、市販品も存在する。この方法は細胞をスキャフォールド内に充分に侵入させるという観点で、上記の問題を解決するものであるが、この方法では１０６細胞／ｃｍ２以上の多量の細胞が必要な上、生成された材料内のコラーゲンは量が少なく、再線維化度の低い低分子量の線維がほとんどである。これより少量の細胞を用い、より生体内環境に近い線維化度の高い多量のコラーゲン線維内に高密度に細胞を含有させることは不可能であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ando, W., et al., Biomaterials, Vol.28, No.36, pp.5462-5470, 2007
【非特許文献２】Shimomura, K., et al., Biomaterials, Vol.31, No. 31, pp.8004-8011, 2010
【非特許文献３】Ando, W., et al., European Cells and Materials, Vol.24, pp.292-307, 2012
【非特許文献４】Yokoyama, A., et al., Cell Tissue Res., Vol.32, pp.289-298, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規組織再生材料およびその製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
以上に鑑み、本件の発明者は、コラーゲン溶液中での幹細胞の培養に注目し、研究を開始した。鋭意検討の結果、少量の幹細胞を含む培養液にコラーゲン溶液またはコラーゲン分散体を混入させ、遠心分離による遠心力を与えて幹細胞とコラーゲンを培養平面に高密度に集積させ、その集積物を再び培養環境に戻す培養法の開発に至った（図１）。この手法により、幹細胞と線維化度の高いコラーゲン線維を基本組成とし、両材料の密度および密着度の極めて高い、新規の組織再生材料（本願明細書において、「幹細胞／コラーゲン複合体」とも称する）を開発することに成功した。当該知見に基づいて、本発明は完成された。【００１１】
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。【００１２】
［１］  組織再生材料の製造方法であって、以下の工程：
（１）幹細胞を含む中性の培養培地と、コラーゲン溶液または分散体とを混合する；
（２）（１）の混合物を遠心分離して、幹細胞とコラーゲンを集積させる；
（３）幹細胞とコラーゲンの集積物を培養する；
を含む、前記方法。【００１３】
［２］  幹細胞が、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、上記［１］に記載の方法。【００１４】
［３］  工程（１）の幹細胞が、１．０×１０５細胞／ｃｍ２〜６．０×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度まで培養した幹細胞である、上記［１］または［２］に記載の方法。【００１５】
［４］  コラーゲンが、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型コラーゲンである、上記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。【００１６】
［５］  工程（１）のコラーゲン溶液または分散体が、再線維化コラーゲンの線維分散体である、上記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。【００１７】
［６］  工程（１）または工程（３）においてアスコルビン酸もしくはアスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を添加することを含む、上記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法。【００１８】
［７］  上記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法により製造される、組織再生材料。
【発明の効果】
【００１９】
本願に記載した手法により調製される新規の組織再生材料（幹細胞／コラーゲン複合体）は、従来のＴＥＣと比較して、細胞含有度が高く、大型の組織として得られた。また、幹細胞／コラーゲン複合体における再線維化コラーゲンの構造は、細胞が生体内に置かれた際の周囲環境に酷似しており、メカノバイオロジーの観点から、その環境下で培養される幹細胞の分化能等が最大限発揮される可能性が高い。これらの特徴から、好ましい特性を有する組織再生材料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、幹細胞／コラーゲン複合体の作製方法の概念図である。
【図２】図２は、ＳＥＭ画像解析によるＴＥＣおよび幹細胞／コラーゲン複合体の比較である。（Ａ）および（Ｂ）は５００倍観察の画像であり、異なる視野について解析した画像である。（Ｃ）は１０００倍観察の画像である。
【図３】図３は、培養１４日目における幹細胞／コラーゲン複合体と、コラーゲン線維／ＭＳＣｓ溶液のを遠心分離する工程を欠く実験で作製した組織、およびコラーゲンゲル内培養で生成される組織を比較した写真である。
【図４】図４は、培養７日目におけるコラーゲンゲル内培養により得られた組織、幹細胞／コラーゲン複合体（アスコルビン酸２−リン酸無し）、および幹細胞／コラーゲン複合体（アスコルビン酸２−リン酸有り）、についてのＳＥＭ画像解析結果の比較である。（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）はそれぞれ、２００倍観察の画像、１０００倍観察の画像、および２５００倍観察の画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
【００２３】
組織再生材料の製造方法
一態様において本発明は以下の工程：
（１）幹細胞を含む中性の培養培地と、コラーゲン溶液または分散体とを混合する；
（２）（１）の混合物を遠心分離して、幹細胞とコラーゲンを集積させる；
（３）幹細胞とコラーゲンの集積物を培養する；
を含む、組織再生材料の製造方法に関する。
【００２４】
上記の方法において、幹細胞の種類は特に限定されないが、例えば、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、からなる群より選択してもよい。好ましくは、幹細胞は間葉系幹細胞である。幹細胞は哺乳動物由来の細胞、好ましくはヒト由来の細胞である。
【００２５】
上記工程（１）において、幹細胞の密度は特に限定されないが、例えば、１．０×１０５細胞／ｃｍ２〜１．０×１０６細胞／ｃｍ２の細胞密度まで培養した幹細胞であってもよく、好ましくは１．０×１０５細胞／ｃｍ２〜６．０×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度まで培養した幹細胞である。さらに好ましくは２．０×１０５細胞／ｃｍ２〜４．０×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度まで培養した幹細胞である。
【００２６】
培養培地または培地は、幹細胞の培養に適した培地である限り特に限定はないが、例えば、ＤＭＥＭなどを好適に使用することができる。培養培地または培地は、血清、抗生物質等の追加の成分を含んでいてもよく、これらは培養する幹細胞の種類に応じて当業者が適宜選択することができる。培地のｐＨは中性であり、例えばｐＨ６．０〜８．０、またはｐＨ６．５〜７．５、の範囲で調製される。
【００２７】
コラーゲン溶液または分散体は、コラーゲンを含む溶液または分散体であれば特に制限はない。コラーゲン分散体は、好ましくは再線維化コラーゲンの線維分散体である。コラーゲンの再線維化は、コラーゲン溶液を中性の環境に置くことで進行する。したがって、再線維化コラーゲンの線維分散体は、コラーゲン溶液を中性の条件下に置くことで調製してもよい。
【００２８】
コラーゲン溶液または分散体に含まれるコラーゲンは、コラーゲンであれば特に限定されない。好ましくは、中性、３７℃でインキュベートすることで線維形成することができるコラーゲンであればよい。そのようなコラーゲンとしては、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型コラーゲンが挙げられる。より好ましくは、コラーゲンは、Ｉ型またはＩＩ型コラーゲンであってもよい。
【００２９】
上記工程（１）を実施する温度は、幹細胞の培養に適した温度である限り特に制限はなく、当業者が適宜選択することができる。好ましい温度は、例えば、３５℃〜４０℃、より好ましくは３７℃である。
【００３０】
上記工程（２）において、遠心分離は、細胞を沈降・集積させるのに当業者が通常使用する条件であれば特に限定されない。例えば１０００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ、好ましくは１０００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍ、より好ましくは１０００ｒｐｍ、の回転数で５分間、といった条件を利用してもよい。
【００３１】
上記工程（３）において、幹細胞とコラーゲンの集積物を培養は、上述のとおりの培養培地または培地中で行うことができる。培養温度は、幹細胞の培養に適した温度である限り特に制限はなく、当業者が適宜選択することができる。好ましい温度は、例えば、３５℃〜４０℃、より好ましくは３７℃である。培養時間は、例えば、６日〜２８日の間、より好ましくは６日〜１４日の間、であってよい。
【００３２】
一態様において、上記の方法において、工程（１）または（３）においてアスコルビン酸もしくはアスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を添加してもよい。これらの添加は、細胞によるコラーゲンを含む細胞外基質の生成を向上させる作用が期待される。
【００３３】
アスコルビン酸誘導体は、特に限定されないが、アスコルビン酸の２位、３位、５位、および／または６位の水酸基が、リン酸、硫酸、グルコースなどの糖、脂肪酸（例えば、ステアリン酸、パルミチン酸、ヘキシルデカン酸、など）、でエステル化された誘導体やアルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル）でエーテル化された誘導体、などが挙げられる。アスコルビン酸誘導体には、アスコルビン酸２−リン酸、アスコルビン酸２−硫酸、アスコルビル−２−グルコシド、アスコルビル−６−グルコシド、が含まれてもよい。
【００３４】
アスコルビン酸の塩またはアスコルビン酸誘導体の塩は、特に限定されないが、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（マグネシウム塩、カリウム塩など）を含む。
【００３５】
アスコルビン酸もしくはアスコルビン酸誘導体またはそれらの塩は、水和物の形で存在していてもよい。
【００３６】
上記工程（１）〜（３）を経て、幹細胞がコラーゲン分散体を巻き込む形で三次元化した構造を有する組織構築物を生じてくる。この得られた組織構築物を組織再生材料として利用できる。
【００３７】
組織再生材料
一態様において本発明は、以下の工程：
（１）幹細胞を含む中性の培養培地と、コラーゲン溶液または分散体とを混合する；
（２）（１）の混合物を遠心分離して、幹細胞とコラーゲンを集積させる；
（３）幹細胞とコラーゲンの集積物を培養する；
を含み、ここで上記（１）または（３）の工程においてアスコルビン酸もしくはアスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を添加することを含む方法、により製造される組織再生材料に関する。
【００３８】
上記組織再生材料を製造する方法の各構成に関する説明は、上記「組織再生材料の製造方法」の項目において記載したとおりである。
【００３９】
組織再生材料は、強固なシート状の組織の形態を有する。その厚みは６００μｍ〜１５００μｍ程度、面積は３０ｍｍ２〜３６０ｍｍ２程度のものも作成可能である。これは、非特許文献１に記載されるような従来のＴＥＣと比較して１０倍程度厚く、体積も１００倍程度大きい。
【００４０】
上記の方法により製造された組織再生材料を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察したところ、多孔性の高い表面を有するとともに、直径がサブマイクロメーターレベルのコラーゲン（フィブリル、サブフィブリル）構造に加え、その高次構造であるマイクロメーターレベルのコラーゲン（ファシクル）構造が共存している様子が観察された。このようなコラーゲンの構造は天然の生体線維構造に酷似している。また、細胞に結合するコラーゲンが多量かつ立体的である様子も観察された。したがって、上記の方法により製造された組織再生材料は、当該材料内のコラーゲン原線維が豊富であり、線維形成度も高く、細胞が生体内に置かれた際の周囲環境に近い。
【００４１】
本発明の組織再生材料は、腱、靱帯および軟骨の修復のために用いることができる。腱、靱帯および軟骨の修復のために本発明の組織再生材料を用いる際は、腱、靱帯および軟骨の欠損部位に本発明の組織再生材料を置くことで埋入し、当該欠損部位を覆う皮膚を縫合すればよい。本発明の組織再生材料は、幹細胞が細胞外基質を自己生成することから接着因子等が分泌されるため、腱、靱帯および軟骨の欠損部位と組織修復材を抱合または接着するための特別な手順は不要である。
【００４２】
また、本発明の組織再生材料は、上記のように従来のＴＥＣと比較して厚みがある材料として、または大きなサイズの材料として得ることができる。これらの特性は、従来のＴＥＣと比較して、手術時に材料をハンドリングする際の安定性の向上する、腱修復および軟骨修復が必要な場合に欠損患部への移植が容易になる、より広範な欠損部への移植に利用可能である、等の利点を提供する。
【実施例】
【００４３】
以下に本発明の具体例を示す。これらの具体例は、本発明を理解するための説明を提供することを目的とするものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。【００４４】
実施例１：幹細胞／コラーゲン複合体の作製およびＳＥＭ観察
（１）幹細胞／コラーゲン複合体の作製
ヒト滑膜より採取した間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）を、培養培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレイプトマイシン）中で、４．０×１０５細胞／ｃｍ２または２．０×１０５細胞／ｃｍ２となるまで培養した。培養した細胞をチューブに集め、培養培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、０．２ｍＭアスコルビン酸２−リン酸）中、５．６×１０５細胞／ｍＬまたは２．８×１０５細胞／ｍＬの細胞懸濁液となるよう調製した。【００４５】
別のチューブに、３．０ｍｇ／ｍＬのＩ型コラーゲン溶液２．５ｍＬに対し、培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、０．２ｍＭアスコルビン酸２−リン酸）およびＮａＨＣＯ３を添加して中性にした。３７℃で１日間インキュベートすることにより、再線維化コラーゲン分散液を得た。これを、３７℃で、４０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、上清を除去した。【００４６】
上清を除去した再線維化コラーゲンに上記細胞懸濁液を３ｍＬ加え、駒込ピペットで懸濁させ、コラーゲン線維／ＭＳＣｓ溶液を得た。このコラーゲン線維／ＭＳＣｓ溶液を、細胞培養インサートを設置した６ウェルプレートに移した。このプレートを、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、コラーゲン線維およびＭＳＣｓ線維を圧縮および脱水した。これをインキュベータで３７℃で培養した。培地交換は、上記遠心分離の翌日、およびその後は２日おきに行った。培養は上記遠心分離の日を０日とし、１４日目まで行った。培養６日目頃から自己組織化が観察され、ピンセットでも把持可能な強固なシート状の組織を生じた。この組織を、本願において幹細胞／コラーゲン複合体と称する。【００４７】
（２）幹細胞／コラーゲン複合体のＳＥＭ観察
上記（１）において、２．８×１０５細胞／ｍＬの細胞懸濁液を用いて作製した幹細胞／コラーゲン複合体を用い、特許文献１の方法に従って作製したＴＥＣとの比較を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像解析により行った。結果を図２に示す。【００４８】
ＴＥＣについては、多孔度の低い表面が観察され、コラーゲン構造は確認できなかった。また、ＴＥＣでは、壁状の構造に細胞が埋め込まれているか、球形状の細胞が点在する様子が観察された。【００４９】
一方、幹細胞／コラーゲン複合体については、多孔度の高い表面が観察され、直径がサブマイクロメーターレベルのコラーゲン（フィブリル、サブフィブリル）構造と、その高次構造であるマイクロメーターレベルのコラーゲン（ファシクル）構造が共存していることが観察された。このようなコラーゲンの構造は天然の生体線維構造に酷似している。また、細胞とコラーゲン構造の連結性が高い様子も観察された。【００５０】
実施例２：遠心分離の影響
実施例１（１）では、コラーゲン線維／ＭＳＣｓ溶液を６ウェルプレートにおいて遠心分離を行った。実施例２においては、この遠心分離工程のない実験により得られる組織と、実施例１（１）の方法による幹細胞／コラーゲン複合体を比較した。また、下記実施例４において示すコラーゲンゲル内培養で生成される組織と、実施例１（１）の方法による幹細胞／コラーゲン複合体を比較した。【００５１】
その結果、培養１４日時点において、上記遠心分離工程のない実験およびコラーゲンゲル内培養では、非常に脆く、円盤形状の大きい組織が得られたのに対し、上記遠心分離工程を含む実施例１（１）の方法では、シート状の強固な組織が得られた。（図３）【００５２】
実施例３：アスコルビン酸２−リン酸添加の影響
幹細胞／コラーゲン複合体生成におけるアスコルビン酸２−リン酸添加の影響を検討すべく、以下の方法で幹細胞／コラーゲン複合体を調製した。【００５３】
方法
ヒト滑膜より採取した間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）を、培養培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレイプトマイシン）中で、２．０×１０５細胞／ｃｍ２となるまで培養した。培養した細胞をチューブに集め、培養培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、０．２ｍＭアスコルビン酸２−リン酸）中、２．８×１０５細胞／ｍＬの細胞懸濁液となるよう調製した。【００５４】
別のチューブに、３．０ｍｇ／ｍＬのＩ型コラーゲン溶液２．５ｍＬに対し、培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ）およびＮａＨＣＯ３を添加して中性にした。３７℃で１日間インキュベートすることにより、再線維化コラーゲン分散液を得た。これを、３７℃で、４０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、上清を除去した。【００５５】
上清を除去した再線維化コラーゲンに上記細胞懸濁液を３ｍＬ加え、駒込ピペットで懸濁させ、コラーゲン線維／ＭＳＣｓ溶液を得た。このコラーゲン線維／ＭＳＣｓ溶液を、細胞培養インサートを設置した６ウェルプレートに移した。このプレートを、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、コラーゲン線維およびＭＳＣｓ線維を圧縮および脱水した。これをインキュベータで３７℃で培養した。上記遠心分離の日を０日とし、培養１日目にアスコルビン酸２−リン酸（０．２ｍＭ）を添加した群、培養４日目にアスコルビン酸２−リン酸（０．２ｍＭ）を添加した群、およびアスコルビン酸２−リン酸を添加しない群、を調製した。培地交換は、上記遠心分離の翌日、およびその後は２日おきに行った。培養は上記遠心分離の日を０日とし、１４日目まで行った。【００５６】
結果
上記の培養１日目にアスコルビン酸２−リン酸（０．２ｍＭ）を添加した群、培養４日目にアスコルビン酸２−リン酸（０．２ｍＭ）を添加した群、およびアスコルビン酸２−リン酸を添加しない群はともに、シート状の幹細胞／コラーゲン複合体を形成した。【００５７】
肉眼による形態観察では、アスコルビン酸２−リン酸の添加の有無による影響、およびアスコルビン酸２−リン酸の添加時期による影響は、いずれも確認されなかった。【００５８】
また、実施例１（１）の方法により作製された幹細胞／コラーゲン複合体（アスコルビン酸２−リン酸有り）と、本実施例のアスコルビン酸２−リン酸を添加しない群として調製された幹細胞／コラーゲン複合体（アスコルビン酸２−リン酸無し）についてのＳＥＭ画像を比較した。いずれにおいても、多孔度が高い表面を有する様子、直径がサブマイクロメーターレベルのコラーゲン（フィブリル、サブフィブリル）構造に加え、その高次構造であるマイクロメーターレベルのコラーゲン（ファシクル）構造が共存している様子、および細胞に結合するコラーゲンが多量かつ立体的である様子、が観察された（図４）。そして、高倍率（１５００〜２０００倍）のＳＥＭ観察では、両者において立体的形状の細胞の存在や、細胞に結合するコラーゲンが多量かつ立体的であることが観察されたが、この傾向はアスコルビン酸２−リン酸有りの幹細胞／コラーゲン複合体においてより顕著であった。【００５９】
実施例４：コラーゲンゲル内培養との比較
上記（１）において、２．８×１０５細胞／ｍＬの細胞懸濁液を用いて作製した幹細胞／コラーゲン複合体を用い、以下に示すコラーゲンゲル内培養によって作製した組織との形態学的な比較を、肉眼による形態観察およびＳＥＭ画像解析により行った。【００６０】
コラーゲンゲル内培養（比較例）
コラーゲン線維とともに細胞培養を行う一般的な方法として、コラーゲンゲル内培養が知られている。非特許文献４の記載に基づき、以下の方法により、組織を調製した。【００６１】
氷冷下で、３ｍｇ／ｍＬのコラーゲン溶液  ７ｍＬ、５倍ＤＭＥＭ  ２ｍＬ、３７ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３  １ｍＬを混合し、１０ｍＬのゲル溶液を作製した。１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、０．２ｍＭアスコルビン酸２−リン酸を添加した。【００６２】
細胞数２．０×１０５細胞／ｃｍ２のＭＳＣｓを含む細胞懸濁液を遠心分離し、細胞を遠沈管の底に集積させ、上清を除去した。細胞の集積物に、上記の１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、０．２ｍＭアスコルビン酸２−リン酸を添加したコラーゲンゲル溶液を３．７ｍＬ添加し、３７℃でインキュベート（培養）し、ゲル化した。培養は７日目、ないし１４日目まで行った。【００６３】
結果
結果を図４に示す（「コラーゲンゲル内培養」と「細胞／コラーゲン複合体（アスコルビン酸２リン酸有り」の画像）。実施例２において言及したとおり、コラーゲンゲル内培養では大きいものの、ピンセットで把持すると破壊しそうな、多量の水を含む非常に弱い組織が生じた。一方、実施例１（１）の方法により作製した幹細胞／コラーゲン複合体は、強固なシート状の組織であった。【００６４】
また、低倍率（２００倍）のＳＥＭ観察では、コラーゲンゲル内培養で得られた組織について、実施例１（２）で比較に用いたＴＥＣと同様に、コラーゲン線維構造が確認されず、のっぺりとした多孔度の低い表面が観察された。一方、実施例１（１）の方法により作成した幹細胞／コラーゲン複合体については、低倍率（２００倍観察）で多孔度の高い表面が観察され、直径がマイクロメーターレベルのコラーゲン（ファシクル）構造が存在することが確認された（図４（Ａ））。【００６５】
中倍率（１０００倍）のＳＥＭ観察では、コラーゲンゲル内培養で得られた組織について、直径がサブマイクロメーターレベルのコラーゲン（フィブリル、サブフィブリル）構造が観察された。一方、幹細胞／コラーゲン複合体については、直径がサブマイクロメーターレベルのコラーゲン（フィブリル、サブフィブリル）構造に加え、その高次構造であるマイクロメーターレベルのコラーゲン（ファシクル）構造が共存している様子が観察された。また、細胞に結合するコラーゲンが多量かつ立体的である様子も観察された（図４（Ｂ））。【００６６】
高倍率（１５００倍〜２５００倍）のＳＥＭ観察では、コラーゲンゲル内培養で得られた組織について、平板状の細胞が存在する様子が観察された。一方、幹細胞／コラーゲン複合体については、立体的形状の細胞が存在する様子が観察された。また、中倍率の観察と同様に、細胞に結合するコラーゲンが多量かつ立体的である様子も観察された（図４（Ｃ））。【００６７】
したがって、幹細胞／コラーゲン複合体は、多孔度が高く、フィブリルとファシクルを有するコラーゲン線維の階層構造を有すること確認された。また、幹細胞／コラーゲン複合体では、細胞周囲のコラーゲン線維が密であることから、細胞の基質生成が盛んであると推測される。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本願に記載した手法により調製される新規の組織再生材料（幹細胞／コラーゲン複合体）は、細胞含有度が高く大型の組織として得られる、および幹細胞／コラーゲン複合体における再線維化コラーゲンの構造は、細胞が生体内に置かれた際の周囲環境に酷似している、といった特性から、組織再生材料として利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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