(57)【要約】本発明は、Rhizomucor属の真菌から単離された高温条件下で活性を保持する新規なエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、その多様な変異酵素、当該酵素をコードする遺伝子、組み換えプラスミド、当該プラスミドにより形質転換された形質転換体等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特性を有するポリペプチド；
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性及び９５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号７のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列である；
（Ｂ）複合糖鎖に対する加水分解活性及び／又は糖転移活性が、４５〜６０℃のいずれかの温度で最大活性値の４０％以上を示す。
【請求項２】
以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特性を有する請求項１のポリペプチド；
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性及び９５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１のアミノ酸番号１９１〜１９５のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列が、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（ＬＡＫＬＬ）である；
（Ｂ）複合糖鎖に対する加水分解活性が、４５〜６０℃のいずれかの温度で最大活性値の４０％以上を示す。
【請求項３】
５０℃における複合糖鎖に対する加水分解活性が、最大活性値の６０％以上を示すことを特徴とする、請求項１のポリペプチド。
【請求項４】
（Ａ）及び（Ｂ）の特性に加えて、更に（Ｃ）大腸菌を用いた遺伝子組み換え発現において、１０  ｍｇ／Ｌ培養以上を示すことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかのポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列において、アミノ酸番号５４〜３４１の領域における配列同一性が、８５％以上であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかのポリペプチド。
【請求項６】
Ｄ２７６、Ｖ２２３、Ｗ２２５、Ｙ２４７及びＷ２４８のアミノ酸のうち少なくとも一つが維持されていること（好ましくは、少なくともＤ２７６が維持されていること）を特徴とする請求項１〜５のいずれかのポリペプチド。
【請求項７】
配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号1のアミノ酸配列において、Ａ１２８Ｔ、Ｄ３３３Ｇ、Ｉ４３４Ｌ、Ｖ４６０Ａ、Ｉ５２７Ｖ、Ｋ５６９Ｔ、Ｆ６１０Ｓ及びＨ６２６Ｒからなる群から選択される少なくとも一つの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかのポリペプチド。
【請求項８】
配列番号1〜６のいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１のポリペプチド。
【請求項９】
特性（Ａ）を充足するアミノ酸配列を有し、配列番号２３に示される変異の少なくともひとつを有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかのポリペプチド。
【請求項１０】
Ｎ１７２、Ｄ１７６，Ｙ２１４、Ｓ２１６，Ｌ２４５、Ｎ２４６、Ｔ２７５、Ｌ３０６、Ｆ３０７及びＡ３１０から選択される少なくともひとつのアミノ酸に変異を有し、増強された糖鎖転移活性を有することを特徴とする、請求項９のポリペプチド。
【請求項１１】
以下の群から選択される少なくともひとつの変異を有することを特徴とする請求項７のポリペプチド；
Ｎ１７２がＧｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ又はＭｅｔに置換された変異、Ｄ１７６がＡｒｇに置換された変異、Ｙ２１４がＰｈｅに置換された変異、Ｓ２１６がＶａｌに置換された変異、、Ｌ２４５がＳｅｒに置換された変異、Ｎ２４６がＡｓｐに置換された変異、Ｔ２７５がＩｌｅに置換された変異、Ｆ２８３がＳｅｒに置換された変異、Ｌ３０６がＩｌｅに置換された変異、Ｆ３０７がＴｙｒに置換された変異、Ａ３１０がＡｓｐに置換された変異、及び、Ｅ３１４がＧｌｎに置換された変異。
【請求項１２】
Ｗ２７８がＰｈｅ又はＴｙｒに置換された変異を有することを特徴とする請求項９〜１１のいずれかのポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号８〜１７のヌクレオチド番号１〜２０８８のヌクレオチド配列、及び配列番号１８〜１９のヌクレオチド番号１〜２０９１のヌクレオチド配列のいずれかのヌクレオチド配列を有する、請求項１３のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１３又は１４のポリヌクレオチドを含む発現用プラスミド。
【請求項１６】
請求項１５のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項１７】
配列番号９、１１、１３、１５若しくは１７のヌクレオチド番号１〜２０８８のヌクレオチド配列、又は、配列番号１９のヌクレオチド番号１〜２０９１のヌクレオチド配列、を含むポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された大腸菌である、請求項１６の宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１６又は１７の宿主細胞を培養し、得られた培養物から請求項１〜１２のいずれかのポリペプチドを回収する工程を含む、請求項１〜１２のいずれかのポリペプチドの製造方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれかのポリペプチドを含有する試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高温条件下で活性を保持するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、当該酵素をコードする遺伝子、組み換えプラスミド、当該プラスミドにより形質転換された形質転換体等に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質は動植物の組織、真核微生物の細胞膜、壁などに広く存在している。近年、糖タンパク質の糖鎖が、細胞の分化、癌化、細胞間の認識などの機構に重要な役割を果たしていることが明らかになりつつあり、その機構解明のため糖鎖の構造と機能との相関について研究が進められている。創薬研究においては、抗体など糖タンパク質に含まれる糖鎖を均一な構造の糖鎖に置き換える糖鎖リモデリングや、ペプチドや低分子化合物を糖鎖修飾するなどの試みが進められている。このような創薬研究においては、天然に存在する均一な糖鎖を有する糖タンパク質／糖ペプチドからエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼなどの酵素を用いて切り出された糖鎖が用いられる場合が多い。【０００３】
動物の糖タンパク質に含まれる糖鎖の代表的なものとして、アスパラギン側鎖に結合するＮ結合型糖鎖が挙げられる。Ｎ結合型糖鎖は、その構造によって、高マンノース型、混成型及び複合型に分類されるが、共通の構造として還元末端にＧｌｃＮＡｃが２つ連結したキトビオース構造を有する。エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、このキトビオース構造の間のグリコシド結合を加水分解する活性と切り出した糖鎖を特定の構造を有するアクセプターに結合させる糖転移活性を併せ持つ酵素である。エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、様々な生物種から分離され、それぞれ異なる基質特異性を有しており、目的に応じて使い分けられている。その中で複合型糖鎖を基質とするエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとしては以下のものが報告されている。【０００４】
Ｅｎｄｏ−Ｍは、Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ由来の酵素であり、その基質特異性は高マンノース型のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に対する活性を１００％とした際に、複合型２分岐糖鎖（ａｇａｌａｃｔｏ  ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ  ＰＡｓｕｇａｒ）に対して４．４％である（非特許文献１：Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙ．４３２：ｐ４１−４９）。同文献において、Ｅｎｄｏ−Ｍの大腸菌を用いた発現については、３７℃での発現誘導では全て不溶性凝集体となり、誘導温度を２０℃に変更すると、可溶性画分の酵素活性が弱いものであったため、酵母による発現を検討したことが報告されており、大腸菌での適切な発現は難しいと考えられていた。また、４０℃以上で失活することが知られている。【０００５】
Ｅｎｄｏ−Ｏｍは、酵母であるＯｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ由来の酵素（特許文献１：ＷＯ２０１３／０５１６０８号公報又はＵＳ２０１４−０３１３２４６号公報）であり、複合型糖鎖を基質とすること、加水分解反応における至適温度は、５０℃と報告されている。酵母以外での発現については知られていない。【０００６】
Ｅｎｄｏ−Ｆ２及びＥｎｄｏ−Ｆ３は、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｉｒｉｃｏｌａ由来の酵素であり（非特許文献２：Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８：ｐ９７０２−９７０８）、Ｅｎｄｏ−Ｆ２は高マンノース型および２分岐複合型糖鎖を加水分解するが、混成型糖鎖の加水分解活性はない。一方、Ｅｎｄｏ−Ｆ３は、２分岐または３分岐複合型糖鎖を加水分解するが、高マンノース型、混成型糖鎖の加水分解活性はない。【０００７】
Ｅｎｄｏ−Ｓは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の酵素であり、２分岐複合型糖鎖のみを加水分解するが、高マンノース型、混成型糖鎖の加水分解活性はない（非特許文献３：Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．１３４：ｐ８０３０−８０３３）。【０００８】
Ｅｎｄｏ−ＣＥ  は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ由来の酵素であり、高マンノース型および２分岐の複合型糖鎖を加水分解するが、混成型糖鎖を切断できるかどうかは不明である（非特許文献４：Ｋａｔｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：ｐ５８１−５８７）。加水分解反応における至適温度は、２０℃と報告されている。【０００９】
Ｅｎｄｏ−ＣＣは、従来知られていたＥｎｄｏ−ＭやＥｎｄｏ−Ｏｍと比較して、大腸菌における発現が可能であるとして報告された酵素であるが、非特許文献５（Ｙ．  Ｅｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２１；１０（７）：ｅ０１３２８５９）においては、大腸菌での発現量が０．１  ｍｇ／２５０  ｍＬ  培養（＝  ０．４  ｍｇ／Ｌ  培養）として報告されている。加水分解反応における至適温度は、３５℃と報告されている。【００１０】
切り出した糖鎖を医薬品原料として用いる場合、反応効率の向上や雑菌混入防止の観点から５０℃程度の高温で活性を保持する酵素が望まれている。また、医薬品の原材料として、複数種の遺伝子組み換え材料が用いられる場合に、宿主生物種を揃えることで、医薬品の安全性の問題が低減されるとされている。このような原材料の宿主として大腸菌が選択される場合が多く、大腸菌で一定量以上の生産能を有することが望ましい。しかしながら、公知の複合型糖鎖を基質とするエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼについて高温条件で活性を維持し、且つ、大腸菌で良好な生産能を示すものは知られていなかった。【００１１】
好熱性真菌の一種であるＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ（Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓ）は、至適生育温度が３５〜４５℃であり、チーズ製造用レンネットの生産菌として知られている。Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓのゲノム配列については、Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＣＢＳ  １８３．６７株由来の配列情報がＧｅｎｏｚｙｍｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（Ｃｏｎｃｏｒｄｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のデータベース上に公開されている。同データベースには、Ｅｎｄｏ−Ｍと４１．５６％の相同性を持つ遺伝子及びそれにコードされるアミノ酸配列（配列番号７）が登録されていたが、活性に関するアノテーションは記載されておらず、これまでにＲ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを実際に取得した報告はない。また、データベース上でエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼと推定された配列番号７のアミノ酸配列（以下、「公知推定配列」という）は、１９１位〜１９８位のアミノ酸配列が、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ（ＬＡＮＴＹＹＩＲ）であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／０５１６０８号公報又はＵＳ２０１４−０３１３２４６号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙ．４３２：ｐ４１−４９
【非特許文献２】Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８：ｐ９７０２−９７０８
【非特許文献３】Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．１３４：ｐ８０３０−８０３３
【非特許文献４】Ｋａｔｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：ｐ５８１−５８７
【非特許文献５】Ｙ．  Ｅｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２１；１０（７）：ｅ０１３２８５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、大腸菌によって生産が可能な、高温条件下で複合型糖鎖に対する加水分解活性を保持する新規なエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓに属する複数の菌株の培養上清が高温条件下で複合糖鎖に対して良好な加水分解活性を有すること、当該菌株からクローニングされたエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが、大腸菌を用いた産生系で良好な発現効率を示し、産生された酵素が当該加水分解活性を保持することを見出し、さらに研究を進めることにより、本発明を完成するに至った。【００１６】
本発明は、以下の発明を提供する。【００１７】
（１）  以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特性を有するポリペプチド；
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性及び９５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号７のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列である；
（Ｂ）複合糖鎖に対する加水分解活性及び／又は糖転移活性が、４５〜６０℃のいずれかの温度で最大活性値の４０％以上を示す。【００１８】
（２）    以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特性を有する（１）のポリペプチド；
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性及び９５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１のアミノ酸番号１９１〜１９５のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列が、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（ＬＡＫＬＬ）である；
（Ｂ）複合糖鎖に対する加水分解活性が、４５〜６０℃のいずれかの温度で最大活性値の４０％以上を示す。【００１９】
（３）  ５０℃における複合糖鎖に対する加水分解活性が、最大活性値の６０％以上を示すことを特徴とする、（１）のポリペプチド。【００２０】
（４）  （Ａ）及び（Ｂ）の特性に加えて、更に（Ｃ）大腸菌を用いた遺伝子組み換え発現において、１０  ｍｇ／Ｌ培養以上を示すことを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかのポリペプチド。【００２１】
（５）  配列番号１のアミノ酸配列において、アミノ酸番号５４〜３４１の領域における配列同一性が、８５％以上であることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれかのポリペプチド。【００２２】
（６）  Ｄ２７６、Ｖ２２３、Ｗ２２５、Ｙ２４７及びＷ２４８のアミノ酸のうち少なくとも一つが維持されていること（好ましくは、少なくともＤ２７６が維持されていること）を特徴とする（１）〜（５）のいずれかのポリペプチド。【００２３】
（７）  配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号1のアミノ酸配列において、Ａ１２８Ｔ、Ｄ３３３Ｇ、Ｉ４３４Ｌ、Ｖ４６０Ａ、Ｉ５２７Ｖ、Ｋ５６９Ｔ、Ｆ６１０Ｓ及びＨ６２６Ｒからなる群から選択される少なくとも一つの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかのポリペプチド。【００２４】
（８）  配列番号1〜６のいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とする、（１）のポリペプチド。【００２５】
（９）  特性（Ａ）を充足するアミノ酸配列を有し、配列番号２３に示される変異の少なくともひとつを有することを特徴とする、（１）〜（６）のいずれかのポリペプチド。【００２６】
（１０）  Ｎ１７２、Ｄ１７６，Ｙ２１４、Ｓ２１６，Ｌ２４５、Ｎ２４６、Ｔ２７５、Ｌ３０６、Ｆ３０７及びＡ３１０から選択される少なくともひとつのアミノ酸に変異を有し、増強された糖鎖転移活性を有することを特徴とする、（９）のポリペプチド。【００２７】
（１１）  以下の群から選択される少なくともひとつの変異を有することを特徴とする（７）のポリペプチド；
Ｎ１７２がＧｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ又はＭｅｔに置換された変異、Ｄ１７６がＡｒｇに置換された変異、Ｙ２１４がＰｈｅに置換された変異、Ｓ２１６がＶａｌに置換された変異、、Ｌ２４５がＳｅｒに置換された変異、Ｎ２４６がＡｓｐに置換された変異、Ｔ２７５がＩｌｅに置換された変異、Ｆ２８３がＳｅｒに置換された変異、Ｌ３０６がＩｌｅに置換された変異、Ｆ３０７がＴｙｒに置換された変異、Ａ３１０がＡｓｐに置換された変異、及び、Ｅ３１４がＧｌｎに置換された変異。【００２８】
（１２）  Ｗ２７８がＰｈｅ又はＴｙｒに置換された変異を有することを特徴とする（９）〜（１１）のいずれかのポリペプチド。さらに具体的な変異体としては、配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列において、Ｎ１７２Ｑ、Ｎ１７２Ｄ、Ｗ２７８Ｆ、Ｎ１７２Ｑ／Ｗ２７８Ｆ、Ｎ１７２Ｄ／Ｗ２７８Ｆ、又は、Ｙ２１４／Ｌ３０６Ｉ／Ｌ３０７Ｙの変異を有することを特徴とする。（１１）のポリペプチド。【００２９】
（１３）  （１）〜（１２）のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【００３０】
（１４）  配列番号８〜１７のヌクレオチド番号１〜２０８８のヌクレオチド配列、及び配列番号１８〜１９のヌクレオチド番号１〜２０９１のヌクレオチド配列のいずれかのヌクレオチド配列を有する、（１３）のポリヌクレオチド。【００３１】
（１５）  （１３）又は（１４）のポリヌクレオチドを含む発現用プラスミド。【００３２】
（１６）  （１５）のプラスミドで形質転換された宿主細胞。【００３３】
（１７）  配列番号９、１１、１３、１５若しくは１７のヌクレオチド番号１〜２０８８のヌクレオチド配列、又は、配列番号１９のヌクレオチド番号１〜２０９１のヌクレオチド配列、を含むポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された大腸菌である、（１６）の宿主細胞。【００３４】
（１８）  （１６）又は（１７）の宿主細胞を培養し、得られた培養物から（１）〜（１２）のいずれかのポリペプチドを回収する工程を含む、（１）〜（１２）のいずれかのポリペプチドの製造方法。【００３５】
（１９）  （１）〜（１２）のいずれかのポリペプチドを含有する試薬。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の新規なエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、５０℃以上の高温反応条件において複合型糖鎖に対する良好な加水分解活性を保持するため、当該酵素を利用した医薬品製造においてバクテリアの増殖を防ぎ、高い反応効率が期待できる高温条件下で、糖鎖を安全且つ効率的に取得することが可能である。また、本発明の酵素は、大腸菌を用いた異種発現系により、良好な酵素量での生産が可能である。医薬品の製造に用いる場合に、当該酵素以外の原材料（生理活性ペプチド／タンパク質、別の酵素など）が大腸菌により産生されている場合に、生物材料の宿主生物種を揃えることで、最終製品の安全性に対する原料の宿主生物種による影響の評価が容易になる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、Ｅｎｄｏ−ＲｐによるＳＧＰを基質とした加水分解反応の模式図を示す。
【図２】図２は、ＳＧＰの酵素処理前溶液（上）及び粗酵素処理液（下）の、分析条件ＡによるＬＣ−ＭＳ分析結果のチャートである。３〜４分に検出される大きいピークはＳＧＰを示し、４．５〜５分付近に検出されるピークはＳＧ（１０）を示す。
【図３】図３は、各種Ｒ．ｐｕｓｉｌｌｕｓ株由来の粗酵素（ＮＢＲＣ  ９７４０（△）、ＮＢＲＣ  ９７４１（▲）、ＮＢＲＣ  ９７４２（□）及びＮＢＲＣ  ９７４３（■））及びＥｎｄｏ−Ｍ（●）の、ＳＧＰに対する加水分解活性の温度依存性を示すグラフである。Ｘ軸は反応温度（℃）、Ｙ軸は加水分解率、をそれぞれ表す。
【図４】図４は、Ｅｎｄｏ−Ｒｐとその各種ホモログ、Ｅｎｄｏ−Ｒｍ、及び、公知の推定配列のアミノ酸配列のアラインメントを表す。
【図５】図５は、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ（〇）、Ｅｎｄｏ−Ｍ（●）、Ｅｎｄｏ−Ｓ（■）及びＥｎｄｏ−Ｏｍ（▲）の、ＳＧＰに対する加水分解活性の経時変化を示すグラフである。Ｘ軸は反応開始後の経過時間、Ｙ軸は加水分解率を表す。
【図６】図６は、Ｅｎｄｏ−ＲｐのＳＧＰに対する加水分解活性の温度依存性を示すグラフである。Ｘ軸は反応温度（℃）、Ｙ軸は加水分解率、をそれぞれ表す。
【図７】図７は、Ｅｎｄｏ−ＲｐのＳＧＰに対する加水分解活性のｐＨ依存性を示すグラフである。Ｘ軸は反応液のｐＨ値、Ｙ軸は加水分解率、をそれぞれ表す。
【図８】図８は、ＳＧＰ単独（上）及びＳＧＰ＋アクセプター（（ＧｌｃＮＡｃ―）Ａｓｎ）（下）、のＥｎｄｏ−Ｒｐ反応液のＬＣ−ＭＳ分析結果のチャートである。１分付近に検出される大きいピークはＳＧＰを示し、４〜５分付近に検出されるピークはＳＧ（１０）を示し、３分付近に検出されるピークは（ＳＧ−）Ａｓｎを示す。
【図９】図９は、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ（○）及びＥｎｄｏ−Ｒｐ  Ｎ１７２Ｑ（■）の糖転移活性の経時変化を示すグラフである。Ｘ軸は、酵素反応開始後の経過時間（時間）、Ｙ軸は糖転移率（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００３９】
本発明は、以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特性；
（Ａ）配列番号１《Ｅｎｄｏ−Ｒｐアミノ酸配列》に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性及び９５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号７のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列である；
（Ｂ）複合型糖鎖に対する加水分解活性及び／又は糖転移活性が、４５〜６０℃の範囲で最大活性値の４０％以上を示す；
を有するポリペプチドであるエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを提供する。
【００４０】
本発明において、「複合型糖鎖」とは、ヒト型Ｎ結合糖鎖のうち下記式（Ｉ）及び（ＩＩ）からなる基本構造を有する糖鎖を意味する。当該糖鎖において、還元末端に近い位置にあるマンノース（βマンノース）から枝分かれした２つの分岐鎖（１−３鎖、１−６鎖）にＧｌｃＮＡｃを有する構造となっており、その非還元末端側におけるガラクトースの有無、シアル酸の有無、さらにこれらの結合異性や位置異性を含む多彩な構造を有するものである。また、この基本構造を有する限り、別の枝分かれ構造を有していても良いし、非還元末端側の糖の水酸基の一部あるいはシアル酸のカルボニル基に対して化学的に修飾を加えた構造を有していてもよい。このような化学修飾された複合型糖鎖の例として、ＳＧＰのシアル酸のジオールを酸化開裂後、オキシム化により修飾したＳＧＰが、Ｅｎｄｏ−Ｍの基質となることが報告されている（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ，２０１６，１４，９５０１−９５１８）。
【００４１】
【化１】
2018101454.tif 000002
（Ｉ）
【００４２】
【化２】
2018101454.tif 000003
（ＩＩ）
【００４３】
代表的な複合型糖鎖としては、鶏卵の卵黄から抽出されるシアリルグリコペプチド（ＳＧＰ：下記式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ））に含まれる糖鎖部分（ＳＧ）を挙げることができる。ＳＧＰは、鳥類の卵黄から精製することができるが、精製されたＳＧＰが市販されており、例えば東京化成工業（株）などから購入することもできる。
【００４４】
【化３】
2018101454.tif 000004
（ＩＩＩ）
【００４５】
【化４】
2018101454.tif 000005
（ＩＶ）
【００４６】
本発明において、「エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ」とは、基質となる糖鎖を認識し、加水分解活性と糖転移活性を併せ持つ酵素である。天然型のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、両方の活性を併せ持つが、アミノ酸配列を改変することにより、それらの活性を調整し、いずれか一方の活性を増強又は減弱させた変異体やいずれかの活性を消失させることで、加水分解活性又は糖転移活性のみを保持する酵素を作製することもできる。本発明は、天然型のみならず、これらの変異酵素も包含する。
【００４７】
本発明の酵素の有する加水分解活性は、上記の複合型糖鎖の還元末端側の２つの連続したＧｌｃＮＡｃからなるコアキトビオースに含まれるβ１，４グリコシド結合を特異的に加水分解する活性（本明細書において、特に言及が無い限り、「加水分解活性」とは、この活性を意味する。）である。例えば、ＳＧＰを基質としたエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼによる加水分解反応においては、図１に示されるように、ＳＧの還元末端のＧｌｃＮＡｃを除く構造からなるＳＧ（１０）（下記式（Ｖ）及び（ＶＩ）の構造）が生成される。
【００４８】
【化５】
2018101454.tif 000006
（Ｖ）
【００４９】
【化６】
2018101454.tif 000007
（ＶＩ）
【００５０】
当該酵素の糖転移活性は、糖としてＧｌｃＮＡｃのみを有する分子又は非還元末端にＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖を含む分子（以下、「アクセプター分子」という）に、還元末端にＧｌｃＮＡｃを有し糖鎖ドナーに由来する糖鎖の還元末端をβ１，４グリコシド結合させる活性（以下、「糖転移活性」という。）である。例えば、下記式（ＶＩＩ）の構造を有する（ＧｌｃＮＡｃ−）Ａｓｎをアクセプター分子、ＳＧＰをドナー分子とした糖転移反応においては、アクセプター分子のＧｌｃＮＡｃにＳＧＰに由来するＳＧ（１０）が転移することによって、下記式（ＶＩＩＩ）に示される（ＳＧ−）Ａｓｎが生成される。同様に、下記式（ＩＸ）の構造を有するＧｌｃＮＡｃ−ＡｃＡをアクセプター分子、ＳＧＰをドナー分子とした糖転移反応によって、下記式（Ｘ）に示されるＳＧ−Ａが生成される。
【００５１】
【化７】
2018101454.tif 000008
（ＶＩＩ）
【００５２】
【化８】
2018101454.tif 000009
（ＶＩＩＩ）
【００５３】
【化９】
2018101454.tif 000010
（ＩＸ）
【００５４】
【化１０】
2018101454.tif 000011
（Ｘ）
【００５５】
＜酵素・アミノ酸配列＞
本発明の酵素は、上記の特性を有するものであれば、実施例で取得された具体的な配列の酵素に限定されるものではなく、天然から分離された酵素であっても、本発明の酵素の配列情報に基づき人為的に作製又は改変された酵素であっても良い。天然から分離する場合、その分離源とする生物種は特に限定されないが、好ましくは真菌であり、より好ましくは好熱性真菌であり、更に好ましくはＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属の真菌であり、さらにより好ましくはＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ又はＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉに属する真菌である。
【００５６】
本発明において、好熱性真菌であるＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ（Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓ）に属する複数の菌株から、本特性を有するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼがクローニングされ、それぞれ、Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＮＢＲＣ  ９７４２株に由来する酵素をＥｎｄｏ−Ｒｐ（アミノ酸配列；配列番号１、菌株由来核酸配列：配列番号８）、ＮＢＲＣ  ９７４０株に由来する酵素をＥｎｄｏ−Ｒｐ２（アミノ酸配列：配列番号２、菌株由来核酸配列：配列番号１０）、ＮＢＲＣ  ９７４１株に由来する酵素をＥｎｄｏ−Ｒｐ３（アミノ酸配列：配列番号３、菌株由来核酸配列：配列番号１２）、ＮＢＲＣ  ９７４３株に由来する酵素をＥｎｄｏ−Ｒｐ４（アミノ酸配列：配列番号４、菌株由来核酸配列：配列番号１４）、と命名した。上述した、Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓの菌株は、全てＮＢＲＣから入手することができ、その原産地はいずれも日本である。
【００５７】
一方で、Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓのゲノム公開株の配列情報に基づき、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの推定アミノ酸配列として公開されていた配列番号７のアミノ酸配列（推定核酸配列：配列番号２０）について、その核酸配列を大腸菌発現系に最適化して大腸菌で発現させたところ、酵素の発現がほとんど確認できず、酵素活性も非常に低いものであった（実施例３）。この配列番号７のアミノ酸配列では、配列番号１の１９３番目のＬｙｓに相当するアミノ酸がＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇのアミノ酸に置換された配列（図４参照）である。この配列番号７の１９３〜１９８のＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇを配列番号１と同じようにＬｙｓに置換したアミノ酸配列（配列番号５）からなるＥｎｄｏ−Ｒｐ５は大腸菌における適切な発現と加水分解活性が確認され、このアミノ酸配列を有する酵素をＥｎｄｏ−Ｒｐ５と命名した。このことから、配列番号１の１９１〜１９５番目に相当する配列は、本発明の酵素の特性にとって非常に重要な領域であると同定される。
【００５８】
また、Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓの類縁種であるＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ（Ｒ．  ｍｉｅｈｅｉ）の公開されているゲノム情報（Ｒ．  ｍｉｅｈｅｉ  ＣＡＵ４３２株）に対して、本発明で特定されたＥｎｄｏ−Ｒｐの配列情報に基づき関連配列を特定し、該当するタンパク質を、大腸菌発現用に核酸配列を最適化して大腸菌で発現させたところ、本発明の酵素活性を有する酵素が一定量産生されることが確認され、この酵素をＥｎｄｏ−Ｒｍ（アミノ酸配列：配列番号６、真菌由来核酸配列：配列番号１８）と命名した。
【００５９】
Ｅｎｄｏ−ＲｐとそのホモログであるＥｎｄｏ−Ｒｐ２、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ３、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ４及びＥｎｄｏ−Ｒｐ５のアミノ酸配列の同一性は９９％以上であり、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ２は配列番号１にＡ１２８Ｔ及びＫ５６９Ｔの変異を有するホモログであり、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ３は配列番号１にＤ３３３Ｇ、Ｉ４３４Ｌ、Ｉ５２７Ｖ、Ｋ５６９Ｔ、Ｆ６１０Ｓ及びＨ６２６Ｒの変異を有するホモログであり、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ４は配列番号１に、Ｖ４６０Ａ及びＫ５６９Ｔの変異を有するホモログであり、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ５は配列番号１にＫ５６９Ｔの変異を有するホモログである。Ｅｎｄｏ−Ｒｍのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と９６％の類似性、７７％の同一を示すものである。この配列において５４〜３４０番目の領域における同一性は高く（同一性：８９％、類似性：９７％））、１９０番目から１９５番目のＨｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（ＨＬＡＫＬＬ）は完全同一であり、本発明の酵素の特性（Ａ）を充足するものである。
【００６０】
本発明の酵素が真菌に由来する酵素である場合、そのタンパク質は、真菌の培養上清あるいは菌体破砕液から単離したものであってもよく、大腸菌、酵母等の異種発現系を用いて発現させた酵素であっても良い。公知のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの多くは大腸菌を用いた異種発現系での生産量が少ないことが知られているのに対して、本発明の酵素のアミノ酸配列は、大腸菌を用いた発現系において良好な生産効率を示すという特性を有する。真菌由来のタンパク質を大腸菌で発現させる場合、その核酸配列を大腸菌発現に適した配列に最適化することが一般的に行われる。このような最適化をした場合であっても、例えばＥｎｄｏ−Ｍ  Ｎ１７５Ｑ（１アミノ酸変異体）の大腸菌での生産量は、３．７ｍｇ／Ｌ培養であった。また、Ｅｎｄｏ−ＣＣでは０．４ｍｇ／Ｌ培養であることが報告されている。これに対して、本発明の酵素の大腸菌における発現量は、１０  ｍｇ／Ｌ培養以上（好ましくは、１２  ｍｇ／Ｌ培養以上、より好ましくは１５  ｍｇ／Ｌ培養以上であり、従来の酵素よりも優れた大腸菌での生産効率を示す。実施例４の公知推定配列（配列番号７）とＥｎｄｏ−Ｒｐ５（配列番号５）の大腸菌での生産効率の結果が示すとおり、この特性はアミノ酸配列（特に、配列番号１のアミノ酸番号１９１〜１９５を含む領域であり、中でも１９２〜１９４の配列、特に１９３番目のＬｙｓ）により付与される特性であると考えられる。
【００６１】
本発明の酵素のアミノ酸配列は、配列番号１の全長アミノ酸配列と７５％以上の同一性及び９５％以上の類似性を示すアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号７と異なるアミノ酸配列（好ましくは、配列番号１のアミノ酸番号１９３に相当するアミノ酸がＬｙｓ（好ましくはアミノ酸番号１９２〜１９４のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列が、Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（ＡＫＬ）、より好ましくはアミノ酸番号１９１〜１９５のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列が、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（ＬＡＫＬＬ）））である。
【００６２】
アミノ酸配列の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）とは、対応するアミノ酸が完全に一致するアミノ酸を同じアミノ酸として、全長配列に対するアミノ酸の一致割合を数値化したものである。一方で、アミノ酸配列の類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）とは、対応するアミノ酸が類似した性質を有するアミノ酸であれば、その類似性を考慮して、２つのアミノ酸配列の関係性を数値化するものである。本発明における配列の同一性及び類似性は配列解析ソフトウェアであるＧＥＮＥＴＹＸ−ＳＶ／ＲＣ（株式会社ゼネティックス製）を用いて算出されるものであり、このアルゴリズムは、当該技術分野で通常使用されるものである。
【００６３】
Ｅｎｄｏ−Ｒｐの活性ドメインは、結晶構造解析が行われているＥｎｄｏ−Ａ（Ｚｈｅｎｌｉａｎ  Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００９），Ｖｏｌ．３８９，Ｎｏ．１，Ｐａｇｅｓ１−９）との配列比較から、配列番号１のアミノ酸番号１〜３７４の領域であると推察された。実際、本発明の酵素（Ｅｎｄｏ−Ｒｐ１〜５、Ｅｎｄｏ−Ｒｍ）のアミノ酸配列と配列番号１との配列同一性として、全長配列の比較では７５％以上であるが、活性ドメインと推測される領域中の配列番号１のアミノ酸番号５４〜３４１番目の領域における同一性は８９％であり非常に高い同一性を示した。また、全長のアミノ酸配列の同一性として、好ましくは、８０％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらにより好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９９％以上である。また、配列番号１のアミノ酸番号５４から３４１の領域の同一性として、好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、さらよりより好ましくは９８％以上であり、最も好ましくはこの領域のアミノ酸配列が完全同一である。
【００６４】
本明細書において、分子中に含まれるアミノ酸の表記法は、本分野の慣例に従い、変異箇所を示す場合は野生型のアミノ酸（又は核酸）の一文字表記とその番号（例えば、１７２番目のＡｓｎであれば「Ｎ１７２」）により表す。また、変異については、野生型のアミノ酸（又は核酸）の一文字表記、その番号及び変異後のアミノ酸（又は核酸）の一文字表記（例えば、１７２番目のＡｓｎがＧｌｎに置換された変異は「Ｎ１７２Ｑ」）により表す。また、変異を有する特定の変異体は、分子名と変異（例えば、Ｅｎｄｏ―Ｒｐの１７２番目ＡｓｎがＧｌｎに置換された変異体は、「Ｅｎｄｏ―Ｒｐ  Ｎ１７２Ｑ」）により表し、複数の変異を有する場合は、変異の間を「／」で区切る形（例えば、Ｅｎｄｏ―Ｒｐ  Ｎ１７２Ｑにおいて、２７８番目のＴｒｐがＰｈｅに置換された追加変異を有する変異体は、「Ｅｎｄｏ―Ｒｐ  Ｎ１７２Ｑ／Ｗ２７８Ｆ」）と表す。
【００６５】
本発明の酵素は、配列番号１と一定以上の同一性・類似性を保持する限り、アミノ酸の変異（置換）、欠失、挿入及び／又は付加が起こっていても良いが、少なくとも配列番号１において配列番号７の１９３〜１９８に相当する配列がＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇとは異なる配列であり、好ましくは配列番号１の１９３番目（好ましくは１９２〜１９４番目、より好ましくは１９１〜１９５番目）のアミノ酸に相当する部位が配列番号１と完全同一のアミノ酸配列を有するものである。また、実施例８の結果から、配列番号１のＤ２７６のアミノ酸を変異させた場合、加水分解活性及び糖転移活性の両方がほぼ消失し、また、Ｅ１２６Ａ、Ｖ２２３Ｒ、Ｗ２２５Ｈ、Ｙ２４７Ｆ、Ｗ２４８Ｎの各変異体については両方の活性が大幅に減弱した。このことから、これらのアミノ酸についても配列番号１と類似又は同一のアミノ酸であることが好ましい。この様に配列番号１と完全同一のアミノ酸配列を示す領域は、好ましくはアミノ酸番号１１８〜３３２番目の領域、より好ましくは５４〜３４１番目の領域であり、さらに好ましくは１〜３７４番目の領域である。
【００６６】
本発明の酵素において、上述の配列同一性／類似性を保持し、上述の完全同一領域を除いて、配列番号１〜６のアミノ酸配列のいかなる領域においても、数箇所（好ましくは５箇所以下、より好ましくは３、２又は１箇所）において、１箇所当たり数個（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、更に好ましくは５、４、３、２又は１個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加していても良い。このようなアミノ酸の欠失は、例えば、配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端から数個のアミノ酸を欠失させた場合にも、本発明の酵素としての特性を保持するポリペプチドが得られることが考えられる。特に、配列番号１の３７５よりもＣ末端側の領域は、活性ドメインではないため、多くのアミノ酸の変更（置換、欠失、挿入及び／又は付加）が許容される。また、アミノ酸の付加については、配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に活性に影響しないことが知られているアミノ酸又はペプチドを付加したポリペプチドを挙げることができ、このような付加ペプチドとしてはタンパク精製の目的で付加されるタグペプチド（Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグなど）を挙げることができる。
【００６７】
本発明の酵素におけるアミノ酸変異の位置としては、少なくとも配列番号２３においてＸａａと表示される位置の少なくともひとつに変異を有する酵素が、加水分解活性及び糖転移活性の少なくともひとつを保持することが確認されている。本酵素は、配列番号１のアミノ酸番号１〜３７４が活性ドメインと推測されるが、公知のＥｎｄｏ酵素の構造活性相関の知見、及び本発明の開示内容に基づき、活性ドメインに変異を有しながら、活性を保持又は所望の活性にチューニングされた変異体を設計することができる。
【００６８】
本発明の酵素については、各種ホモログの結果から、配列番号１のＡ１２８、Ｄ３３３、Ｉ４３４、Ｖ４６０、Ｉ５２７、Ｋ５６９、Ｆ６１０及びＨ６２６において、アミノ酸の置換が許容される。また、実施例８に示されるように、活性ドメインのアミノ酸を置換した多くの変異体が作製され、その多くが野生型Ｅｎｄｏ−Ｒｐと比較して見た目の活性が低下したものの、糖鎖修飾に利用可能な程度の一定の加水分解活性及び／又は糖転移活性を保持（少なくとも、いずれか一方の活性の比活性値が野生型Ｅｎｄｏ−Ｒｐの０．５％以上）することが確認され、この領域においても一定のアミノ酸置換が許容されることが確認された。具体的には、以下のアミノ酸変異が許容される。
【００６９】
Ｎ１７２は、基質と接触する活性残基と考えられるが、Ｔｒｐ、Ａｒｇ及びＴｙｒ以外のアミノ酸への置換であれば、活性が保持されたため、嵩高い構造の側鎖を有するアミノ酸以外のアミノ酸への置換が広く許容される。また、Ｇｌｎ、Ａｓｐのような極性の高い側鎖を有するアミノ酸やＧｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｍｅｔなどへの置換により、転移活性比率（転移活性／加水分解活性）が増強されることが確認された。
【００７０】
Ｄ１７６は、Ａｒｇへ置換しても活性が維持されたため、多くのアミノ酸への置換を許容すると考えられる。また、Ａｒｇへの置換は転移活性比率を増強させた変異体の作製に有用である。
【００７１】
Ｙ２１４は、Ａｌａのような小さな側鎖のアミノ酸では両方の活性が大きく低下するため、比較的大きな構造の側鎖を有するアミノ酸を許容する。Ｐｈｅへの置換は転移活性比率を増強させた変異体の作製に有用である。
【００７２】
Ｓ２１６は、小さな側鎖を有するアミノ酸（好ましくは、Ａla又はＶal）に置換することで、糖転移活性を維持し、加水分解活性を低下させるため、これらの変異は転移活性比率を増強させた変異体の作製に有用である。
【００７３】
Ｌ２４５は、Ｓｅｒへ置換しても活性が維持されたため、多くのアミノ酸への置換を許容すると考えられる。また、Ｓｅｒへの置換は転移活性比率を増強させた変異体の作製に有用である。
【００７４】
Ｎ２４６は、大きな変化を許容しにくいと考えられるがＡｓｐへの置換により転移活性を維持したまま加水分解活性を大きく低下させたため、このような変異は転移活性比率を増強させた変異体変異体の作製に有用である。
【００７５】
Ｔ２７５は、Ｉｌｅへ置換しても活性が維持されたため、多くのアミノ酸への置換を許容すると考えられる。また、Ｉｌｅへの置換は転移活性比率を増強させた変異体の作製に有用である。
【００７６】
Ｗ２７８は、基質糖鎖との疎水的相互作用が活性に寄与すると考えられており、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅなどの疎水性の高い側鎖を有するアミノ酸を許容すると考えられる。
【００７７】
Ｆ２８３は、Ｓｅｒへ置換しても活性が維持されたため、多くのアミノ酸への置換を許容すると考えられる。また、Ｓｅｒへの置換は転移活性比率を増強させた変異体の作製に有用である。
【００７８】
Ｌ３０６は、Ｉｌｅへの置換により大きく活性の変動は見られないが、糖転移活性を維持し、加水分解活性を低下させる傾向が見られたため、転移活性比率を増強させた変異体の作製に有用と考えられる。また、推測される立体構造から、嵩高い側鎖を有するアミノ酸や荷電した側鎖のアミノ酸は好ましくない可能性がある。
【００７９】
Ｆ３０７は、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ等さまざまなアミノ酸を許容すると考えられる。このＨｉｓ、Ｔｙｒへの置換により糖転移活性よりも加水分解活性を大きく低下させるため、転移活性比率を増強した変異体の作製に有用である。
【００８０】
Ａ３１０は、極性残基又は荷電残基を側鎖に有するアミノ酸（好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ，Ｌｙｓ、Ｓｅｒなど）に置換することで、糖転移活性よりも、加水分解活性をより大きく低下させるため、これらの変異は、転移活性比率を増強した変異体の作製に有用である。
【００８１】
Ｅ３１４は、Ｇｌｎに置換しても大きな活性の変動はなく、置換を許容すると考えられる。
【００８２】
アミノ酸の置換／変異について、好ましくは、本発明の特性（Ａ）を充足し,且つ、配列番号２３に示される変異（配列番号１のＡ１２８、Ｎ１７２、Ｄ１７６、Ｙ２１４、Ｓ２１６，Ｌ２４５、Ｎ２４６，Ｔ２７５、Ｗ２７８、Ｆ２８３、Ｌ３０６、F３０７，Ａ３１０、Ｅ３１４、Ｄ３３３、Ｉ４３４、Ｖ４６０、Ｉ５２７、Ｋ５６９、Ｆ６１０及びＨ６２６）から選択される少なくとも一つ又は複数のアミノ酸において置換を有するアミノ酸配列であり、より好ましくは配列番号1においてＡ１２８Ｔ（Ｒｐ２）、Ｄ３３３Ｇ（Ｒｐ３）、Ｉ４３４Ｌ（Ｒｐ３）、Ｖ４６０Ａ（Ｒｐ４）、Ｉ５２７Ｖ（Ｒｐ３）、Ｋ５６９Ｔ（Ｒｐ２−４）、Ｆ６１０Ｓ（Ｒｐ３）及びＨ６２６Ｒ（Ｒｐ３）から選択される少なくとも一つの変異を有するアミノ酸配列、或いは、それらのアミノ酸配列においてさらにＮ１７２、Ｄ１７６、Ｙ２１４、Ｓ２１６、Ｌ２４５、Ｎ２４６，Ｔ２７５、Ｗ２７８、Ｆ２８３、Ｌ３０６、F３０７、Ａ３１０及びＥ３１４、の少なくともひとつのアミノ酸に変異を有するアミノ酸配列であり、複数の変異が同時に起こっていてもよく、全ての変異を含むものも本発明の酵素に含まれる。
【００８３】
エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、加水分解活性と糖転移活性を併せ持つため、強い加水分解活性を保持する酵素は、転移活性によりアクセプター分子に転移させた糖鎖をも基質として加水分解してしまうため、所望の糖転移体を適切に取得できない場合がある。そのため、糖鎖修飾化合物の合成においては、このような転移型変異酵素も重要である。
【００８４】
上述のとおり配列番号１の、Ｎ１７２、Ｄ１７６，Ｙ２１４、Ｓ２１６、Ｌ２４５、Ｎ２４６，Ｔ２７５、Ｆ２８３、Ｌ３０６、Ｆ３０７，Ａ３１０及びＥ３１４における変異のいくつかは、本発明の酵素の糖転移活性を向上させる、又は、糖転移活性と比較して加水分解活性をより大きく低下させることが確認されている。そのため、これらの変異は転移活性比率（転移活性／加水分解活性）を向上させた転移型変異酵素を設計するために有用であり、本発明はこのような転移型変異酵素をも提供する。具体的な転移型変異酵素における変異としては、配列番号1において、Ｎ１７２がＧｌｎ又はＡｓｐに置換された変異、Ｄ１７６がＡｒｇに置換された変異、Ｙ２１４がＰｈｅに置換された変異、Ｓ２１６がＶａｌに置換された変異、、Ｌ２４５がＳｅｒに置換された変異、Ｔ２７５がＩｌｅに置換された変異、Ｗ２７８がＰｈｅ又はＴｙｒに置換された変異、Ｆ２８３がＳｅｒに置換された変異、Ｌ３０６がＩｌｅに置換された変異、Ｆ３０７がＴｙｒに置換された変異、Ａ３１０がＡｓｐに置換された変異。Ｅ３１４がＧｌｎに置換された変異、が挙げられる。本発明の糖転移型変異酵素に採用される変異としては、これらのうち少なくとも一つが採用されていれば良く、単独の変異であっても、これらの変異を複数含む多重変異体であっても良い。好ましい変異体は、Ｎ１７２Ｑ、Ｎ１７２Ｄ、Ｗ２７８Ｆ、Ｎ１７２Ｑ／Ｗ２７８Ｆ、Ｎ１７２Ｄ／Ｗ２７８Ｆ、又は、Ｙ２１４／Ｌ３０６Ｉ／Ｆ３０７Ｙである。
【００８５】
＜加水分解活性・糖転移活性＞
本発明の酵素は、複合型糖鎖を加水分解及び／又は糖転移する活性を有し、その活性は、４５〜６０℃のいずれかの温度において最大活性値の４０％以上を示すとの特性を有する。
【００８６】
本発明の酵素は、様々な複合型糖鎖を基質として加水分解する活性を有するが、酵素を特定するための指標としては、以下の方法によって、ＳＧＰを基質として加水分解し、ＳＧ（１０）を産生する活性により評価される。
【００８７】
加水分解反応は、終濃度２００  ｍＭのカリウムリン酸バッファー（ｐＨ  ６．２５）、６９  ｍＭ  ＳＧＰ、および０．０２  μＭの酵素（ｂｌａｎｋには同量のバッファーを添加）を含む反応液（総容量  １００  μＬ）を調製し、所定の温度で１８時間インキュベートする。得られた反応液及びｂｌａｎｋ液をＬＣ−ＭＳで分析してＳＧＰおよびＳＧ（１０）を定量し、以下の式により加水分解率および比活性を算出する。
【００８８】
［ＬＣ−ＭＳ分析条件Ａ］
ＭＳ装置：６１３０  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＬＣ−ＭＳ  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＨＰＬＣ：１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  ３  μｍ  φ３．０×５０  ｍｍ（ＧＬサイエンス社）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％  ＨＣＯＯＨ
移動相Ｂ：アセトニトリル＋０．１％  ＨＣＯＯＨ
グラジエント（移動相Ｂ％）：０％（０分）、１０％（５分）、３０％（７分）
流速：０．６  ｍＬ／ｍｉｎ
【００８９】
［加水分解率］
加水分解率は、以下の式で算出される。
加水分解率（％）＝反応後のＳＧ（１０）濃度（Ｍ）／ｂｌａｎｋのＳＧＰ濃度（Ｍ）ｘ１００
【００９０】
［比活性］
比活性は、以下の式で算出される。
比活性（μｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ）＝  生成したＳＧ（１０）量（μｍｏｌ）／反応時間（ｍｉｎ）／酵素量（μｇ）
【００９１】
本発明の酵素は、様々な糖鎖ドナーやアクセプター分子を認識し糖鎖を転移させる活性を有するが、酵素を特定するための指標としては、以下の方法によって、ＳＧＰを基質として糖鎖を転移させＳＧ−Ａを産生する活性により評価される。
【００９２】
転移反応は、終濃度１．６  Ｍのカリウムリン酸バッファー（ｐＨ  ６．２５）、６９  ｍＭ  ＳＧＰ、６９０  ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ−ＡｃＡおよび１．０  μＭの酵素（ｂｌａｎｋには同量のバッファーを添加）を含む反応液（総容量  ３０  μＬ）を調製し、所定の温度でインキュベートする。反応１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、および９６時間の反応液およびｂｌａｎｋ液をＬＣ−ＭＳで分析してＳＧＰ、ＳＧ（１０）およびＳＧ−Ａを定量し、以下の式により加水分解率および比活性を算出する。
【００９３】
［ＬＣ−ＭＳ分析条件Ｂ］
ＭＳ装置：６１３０  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＬＣ−ＭＳ  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＨＰＬＣ：１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  ２  μｍ  φ２．１×５０  ｍｍ（ＧＬサイエンス社）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％  ＨＣＯＯＨ
移動相Ｂ：アセトニトリル＋０．１％  ＨＣＯＯＨ
グラジエント（移動相Ｂ％）：０．８％（０分）、８％（０．１分）、８％（５分）
流速：０．７  ｍＬ／ｍｉｎ
【００９４】
［転移率］
転移率は、以下の式で算出される。
転移率（％）＝反応後のＳＧ−Ａ濃度（Ｍ）／ｂｌａｎｋのＳＧＰ濃度（Ｍ）ｘ１００
【００９５】
［比活性］
比活性は、以下の式で算出される。
比活性（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）＝  生成したＳＧ−Ａ量（μｍｏｌ）／反応時間（ｍｉｎ）／酵素量（ｍｇ）
【００９６】
本発明の酵素は、上記の方法による加水分解活性及び／又は糖転移活性測定を、例えば１０℃〜７０℃の間で適宜温度を変化（例えば、２、３、５又は１０℃間隔）させて実施した場合において、全ての温度条件で算出された活性値の最大値を１００％とした場合の、４５℃〜６０℃でのいずれかの温度（好ましくは５０℃）における相対活性値が、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上であり、最も好ましくは当該温度範囲において最大活性値を示すことである。
【００９７】
比活性は、通常は酵素の至適温度条件において測定される。本発明の酵素は、高い比活性を示す。例えば、Ｅｎｄｏ−Ｒｐは、５０℃で６９  ｍＭ  ＳＧＰを基質とした際、０．２１  μｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇの比活性を示し、これはＥｎｄｏ−Ｍの３７℃での比活性（０．００７１  μｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ）の３０倍という優れた活性である。
【００９８】
本発明の酵素は、本明細書の実施例に具体的に記載された酵素及び変異体に限定されず、特性（Ａ）及び（Ｂ）を充足する限り、さまざまなポリペプチドが本発明の酵素に含まれる。その加水分解活性及び糖転移活性のうち少なくともいずれか一方が、配列番号１のアミノ酸配列からなる酵素と上記の温度条件で比較して一定レベル以上の活性を示すものであれば良く、好ましくは０．５％以上であり、より好ましくは１％以上であり、さらに好ましくは５％以上であり、さらにより好ましくは１０％以上であり、最も好ましくは３０％以上である。
【００９９】
＜遺伝子＞
本発明は、さらに上記の本発明の酵素をコードする核酸配列を有する遺伝子を提供する。
【０１００】
これらの遺伝子は、本酵素の遺伝子としてＲ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓ又はＲ．  ｍｉｅｈｅｉの遺伝子情報に基づき、自然界（例えば、好熱性真菌、好ましくはＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属の真菌、より好ましくはＲ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓ又はＲ．  ｍｉｅｈｅｉ）からクローニングすることもできる。また、酵素のアミノ酸配列に基づき、公知の遺伝子工学的手法に従って、組み換え遺伝子として作成することができる。
【０１０１】
本発明の酵素をコードする核酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性及び９５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号７のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列であるポリペプチドをコードする配列である。このような核酸配列の例としては、例えば、配列番号８、１０、１２、１４、１６又は１８（終止コドン含む）に記載された、真菌自体が保持する核酸配列であっても良い。また、酵素のアミノ酸配列を元に、例えばＧｅｎｅＡｒｔ  Ｓｔｒｉｎｇｓ  ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を利用して、大腸菌での発現に最適化された核酸配列を有する核酸を作製することができる。配列番号９、１１、１３、１５，１７及び１９の核酸配列は、それぞれ配列番号１（Ｅｎｄｏ−Ｒｐ）、２（Ｅｎｄｏ−Ｒｐ２）、３（Ｅｎｄｏ−Ｒｐ３）、４（Ｅｎｄｏ−Ｒｐ４）、５（Ｅｎｄｏ−Ｒｐ５）及び６（Ｅｎｄｏ−Ｒｍ）のアミノ酸配列を元に設計された、Ｃ末端にＨｉｓタグ（Ｈｉｓｘ６）を付加した酵素の大腸菌での発現用に最適化された核酸配列である。このような核酸配列を参考にすることで、例えば配列番号２３のアミノ酸配列のような、様々なアミノ酸の改変を施したポリペプチドを大腸菌で効率的に発現させる核酸配列を設計することができる。
【０１０２】
本発明の酵素をコードする核酸配列の具体例としては、配列番号８〜１７のヌクレオチド番号１〜２０８８及び配列番号１８〜１９のヌクレオチド番号１〜２０９１（好ましくは、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ又はそのホモログをコードする配列番号８〜１７のヌクレオチド番号１〜２０８８）のいずれかに記載された核酸配列と８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％以上の同一性を示す核酸配列であり、各核酸配列における５７０〜５８５の領域においては、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕをコードする核酸、を挙げることができる。
【０１０３】
＜酵素の製造・精製＞
本発明は、さらに上記の本発明の酵素をコードする組み換え遺伝子を含むプラスミドや発現ベクター等の遺伝子構築物、当該遺伝子構築物により形質転換された宿主細胞、当該宿主細胞の培養物から本発明の酵素を回収する工程を含む、本発明の酵素の製造方法などを提供する。本発明の酵素をコードする遺伝子の導入により形質転換された宿主細胞（動物細胞、植物細胞、大腸菌、酵母など、タンパク質産生に通常用いられる細胞等を適宜選択できる）は、細胞の種類に応じて適切なプラスミド／発現ベクターに導入され、当該プラスミド／発現ベクターにより対象細胞を形質転換し、当該形質転換細胞を適切な条件下で培養し、その培養物から本発明の酵素を回収することができる。
【０１０４】
形質転換のための遺伝子構築物の作成には、通常遺伝子工学の分野で知られているベクター、プラスミドを発現させる細胞種に応じて選択し、公知の手法に従って構築することができる。例えば、大腸菌へ発現させる際には、ｐＥＴベクター、ｐＣｏｌｄベクター、ｐＦＬＡＧベクター等を採用することができるが、これに限定されない。
【０１０５】
大腸菌としては、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）等が挙げられる。
【０１０６】
本発明の酵素を産生させるための大腸菌の培養条件としては、例えば、形質転換した菌液を１００  ｍＬフラスコ中の２５  ｍＬ  ＴＢ培地（５０  ｕｇ／ｍＬ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）に接種し、３７℃で一晩振とう培養する（１６０  ｒｐｍ，  Ｏ／Ｎ）。この前培養液２０  ｍＬを２．５  Ｌバッフル付きフラスコ中の１  Ｌ  ＴＢ培地（５０  ｕｇ／ｍＬ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ、０．０１％  ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４、２  ｍＭ  ＭｇＳＯ４）に植菌し、３７℃で振とう培養（２００  ｒｐｍ、２時間）し、インキュベーターの温度を１６℃に下げて３時間培養した後、終濃度０．２  ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、２４時間培養する等の方法を用いることができるが、これに限定されない。培地としては、ＴＢ培地のほか、ＬＢ培地、Ｍ９培地等一般的な培地を使用することができる。
【０１０７】
本発明の酵素の回収は、当該酵素の物性を利用して、通常の精製手法を適宜組み合わせて行うが、簡便に回収するために、予めＨｉｓタグやＧＳＴ等のタグペプチドを酵素に連結させた形で発現させるように、遺伝子構築物を設計しておくことにより、当該タグペプチドの親和性を利用した回収を行うことができる。タグペプチドは、精製後に除去してもよいが、酵素活性に影響がない場合は、タグペプヂドを連結させたままの酵素を、加水分解等の反応に使用してもよい。本発明の酵素には、このようなタグペプチドが連結したアミノ酸配列を有する酵素を含み、その具体例としては、配列番号１〜６のアミノ酸配列のＣ末端に、Ｈｉｓタグ（Ｈｉｓ  ｘ  ６）が結合したアミノ酸配列である。
【０１０８】
本発明の酵素は、そのアミノ酸配列の特性上、大腸菌における産生効率が良好である。本発明の酵素は、上記培養条件を用いた大腸菌での産生において、１Ｌ培養当たり２ｍｇ以上の発現効率を示すが、好ましくは１Ｌ培養当たり４ｍｇ以上であり、より好ましくは８ｍｇ以上であり、更に好ましくは１２ｍｇ以上であり、さらにより好ましくは１５ｍｇ以上である。
【実施例】
【０１０９】
以下、実施例を用いて、本発明を具体的に説明する。実施例に示されたものは、本発明の実施形態の一例であり、本発明はこれに限定されるものではない。【０１１０】
本明細書に記載されているタンパク濃度は、超微量分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）あるいはＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて定量した。【０１１１】
本実施例において、酵素のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとしての加水分解活性の測定において、反応液中のＳＧＰ及びＳＧ（１０）の検出は上述のＬＣ−ＭＳ分析条件Ａを採用し、上述の算出式により加水分解率、比活性を算出した。【０１１２】
＜実施例１＞  Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓ由来エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの発見
Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＮＢＲＣ  ９７４０、ＮＢＲＣ  ９７４１、ＮＢＲＣ  ９７４２、およびＮＢＲＣ  ９７４３株をＧＳＹＦｅスラント（５％  Ｇｌｕｃｏｓｅ，  ２％  Ｓｏｙｔｏｎｅ，  １％  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，  ０．０５％  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  １．５％  ａｇａｒ）に植菌し、４０℃で５日間培養した。菌体を採取し、ガラス製ホモジナイザーを用いて２  ｍＬの１００  ｍＭ  カリウムリン酸バッファー（ｐＨ  ６．２５）中で破砕後、フィルター滅菌したものを粗酵素液とした。【０１１３】
粗酵素液５０  μＬにＳＧＰ  ３  ｍｇを添加（終濃度２１  ｍＭ）し、５０℃でインキュベートした。反応液をＬＣ−ＭＳで解析したところ、ＳＧＰの消失とＳＧ（１０）の生成が確認された（図２）ため、Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＮＢＲＣ  ９７４２はエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを有すると考えられた。【０１１４】
また、反応温度を変化させて加水分解反応を行い、各サンプルについて、最も反応が進行した温度における活性を１００％として相対活性を算出した。結果を図３に示す。比較対象に用いたＥｎｄｏ−Ｍ（東京化成工業（株）製）は４５℃で失活しているのに対し、Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓ由来の粗酵素は至適温度が５５℃以上であることが確認できた。【０１１５】
＜実施例２＞  Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓ由来エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子のクローニング
以下の方法により、Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＮＢＲＣ  ９７４２株からエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子のクローニング及びゲノム公開配列からの関連配列の抽出を行った。【０１１６】
（１）微生物からの遺伝子クローニング
まず、Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＮＢＲＣ  ９７４２株をＧＳＹＦｅスラントに植菌し、４０℃で５日間培養した。菌体を採取し、メタルコーンと一緒にスクリューキャップ付き２  ｍＬマイクロチューブに入れ、−８０℃で凍結した。凍結したサンプルをマルチビーズショッカー（安井器機械社）で４℃に冷却しながら、２，０００ｒｐｍ、オンタイム３０秒、オフタイム３０秒で５サイクル繰り返し菌体を破砕した。このサンプルから、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  Ｐｌａｎｔ（マッハライ・ナーゲル社）およびＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｍＲＮＡ溶液を得た。【０１１７】
得られたｍＲＮＡを鋳型に、プライマー１（配列番号２２）と３’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ（タカラバイオ社）を用いてエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードする遺伝子を増幅し、ｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。この遺伝子は終止コドンを含めて２０９１塩基（配列番号８）からなり、６９６アミノ酸残基（配列番号１）からなる分子量７８，８７４のタンパク質をコードしており、このタンパク質をＥｎｄｏ−Ｒｐと命名した。【０１１８】
同様にして、Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＮＢＲＣ  ９７４０、９７４１、および９７４３株からもＥｎｄｏ−ＲｐのホモログであるＥｎｄｏ−Ｒｐ２（配列番号2のアミノ酸配列）、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ３（配列番号３のアミノ酸配列）及びＥｎｄｏ−Ｒｐ４（配列番号４のアミノ酸配列）がクローニングされた。ＮＢＲＣ  ９７４０からはＥｎｄｏ−Ｒｐ２のみが検出されたが、ＮＢＲＣ  ９７４１からは、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ２およびＥｎｄｏ−Ｒｐ３の2種類、ＮＢＲＣ  ９７４３からはＥｎｄｏ−Ｒｐ３およびＥｎｄｏ−Ｒｐ４の2種類の配列が、それぞれ検出された。いずれも、Ｅｎｄｏ−Ｒｐとのアミノ酸配列の同一性は９９％であった。【０１１９】
（２）ゲノム公開配列との比較
Ｅｎｄｏ−Ｒｐ、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ２、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ３、およびＥｎｄｏ−Ｒｐ４の配列とＧｅｎｏｚｙｍｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔのデータベースで公開されている推定配列を比較したところ、配列番号１の１９３番目のＬｙｓに相当するアミノ酸が、配列番号７ではＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇに置換され、タンパクの長さが異なっていた（図４）。Ｒ．  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＮＢＲＣ  ９７４２株からゲノムＤＮＡを抽出し、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ遺伝子のＯＲＦ全長配列をＰＣＲ増幅して解析したところ、ゲノム公開株の推定配列ではイントロンの予測位置が異なっていることが示唆され、このために上記のアミノ酸配列の相違が発生していると考えられた。【０１２０】
また、Ｅｎｄｏ−Ｒｐのアミノ酸配列を用いて、ＮＣＢＩのデータベースに対してＢＬＡＳＴ検索を行った結果、近縁種のＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ  ＣＡＵ４３２株のゲノム配列中に対応する配列がヒットしたため、この配列情報からエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードすると思われる核酸配列（配列番号１８）、及びアミノ酸配列（配列番号６）を特定し、このアミノ酸配列からなるタンパク質をＥｎｄｏ−Ｒｍと命名した。Ｅｎｄｏ−Ｒｐとの相同性は６７％であった。【０１２１】
＜実施例３＞  大腸菌を用いたＥｎｄｏ−Ｒｐの発現
実施例２で得た真菌由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子に対してＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＧｅｎｅＡｒｔ  Ｓｔｒｉｎｇｓ  ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓを利用し、大腸菌での異種発現用に最適化した核酸配列（配列番号１５）を設計し、当該配列を用いてＥｎｄｏ−ＲｐのＣ末端に６×Ｈｉｓタグを付加したポリペプチドをコードする遺伝子を作製した。これをｐＥＴ２４ｂ（＋）ベクターにクローニングし、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。形質転換後の菌液を１００  ｍＬフラスコ中の２５  ｍＬ  ＴＢ培地（５０  μｇ／ｍＬ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）に接種し、３７℃で一晩振とう培養を行った（１６０  ｒｐｍ，  Ｏ／Ｎ）。この前培養液２０  ｍＬを２．５  Ｌバッフル付きフラスコ中の１  Ｌ  ＴＢ培地（５０  μｇ／ｍＬ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ、０．０１％  ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４、２  ｍＭ  ＭｇＳＯ４）に植菌し、３７℃で振とう培養した（２００  ｒｐｍ、２時間）。インキュベーターの温度を１６℃に下げて３時間培養した後、終濃度０．２  ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、引き続き２４時間培養した。【０１２２】
集菌した菌体を１００  ｍＬのｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ８．０）、０．５  Ｍ  ＮａＣｌ、２０  ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、５％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁し、超音波破砕と遠心分離を行った上清を、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗおよびＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇカラム（ＧＥヘルスケア社）で精製した。収量（Ａ２８０、吸光係数換算）は１６．９  ｍｇ／Ｌ  ｂｒｏｔｈであった。【０１２３】
また、Ｅｎｄｏ−Ｒｐホモログ及びＥｎｄｏ−Ｒｍについても同様に異種発現を実施した。Ｅｎｄｏ−Ｒｐのホモログとしては実施例２で同定された酵素に加え、配列番号７の１９３番目から１９８番目のＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇを他のホモログ同様のＬｙｓ残基に置換した配列（Ｅｎｄｏ−Ｒｐ５、配列番号５）の発現についても検討した。大腸菌用に最適化したＥｎｄｏ−Ｒｍ遺伝子の配列は、配列番号６のアミノ酸配列に基づきＧｅｎｅＡｒｔ  Ｓｔｒｉｎｇｓ  ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で入手した（配列番号２０）。その他の遺伝子は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）の標準プロトコルに従い配列番号１５の塩基配列を含むＥｎｄｏ−Ｒｐの大腸菌発現用ベクターに変異を導入することで入手した（Ｅｎｄｏ―Ｒｐ２：配列番号１６、Ｅｎｄｏ―Ｒｐ３：配列番号１７、Ｅｎｄｏ―Ｒｐ４：配列番号１８、Ｅｎｄｏ―Ｒｐ５：配列番号１９）。【０１２４】
発現誘導は上述の条件で行い、本培養のみ５００  ｍＬバッフル付きフラスコ中の１００  ｍＬ  ＴＢ培地で実施した。集菌した菌体を６  ｍＬのｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、超音波破砕と遠心分離を行った上清をＨｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＧＥヘルスケア社）で精製した。【０１２５】
精製の結果、配列番号７を除き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで発現タンパクのバンドを確認した。各タンパクの収量は、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ：２．０６７  ｍｇ（２０．６７  ｍｇ／Ｌ  培養）、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ２：２．１３９  ｍｇ（２１．３９  ｍｇ／Ｌ  培養）、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ３：２．７６５  ｍｇ（２７．６５  ｍｇ／Ｌ  培養）、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ４：２．３０１  ｍｇ（２３．０１  ｍｇ／Ｌ  培養）、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ５：２．１８７  ｍｇ（２１．８７  ｍｇ／Ｌ  培養）、Ｅｎｄｏ−Ｒｍ：１．６５０  ｍｇ（１６．５０  ｍｇ／Ｌ  培養）であった。【０１２６】
＜実施例４＞  Ｅｎｄｏ−Ｒｐの複合型糖鎖に対する加水分解活性
実施例３で取得した酵素について、上述の方法により加水分解活性を測定した。この際、Ｅｎｄｏ−Ｍ（東京化成工業（株）製）、ＥｎｄｏＳおよびＥｎｄｏ−Ｏｍを比較対象に用いた。【０１２７】
終濃度２００  ｍＭ  カリウムリン酸バッファー（ｐＨ  ６．２５）、６９  ｍＭ  ＳＧＰ、および０．０２  μＭの酵素を含む反応液（総容量  １００  μＬ）を調製し、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ及びＥｎｄｏ−Ｏｍを含む反応液は５０℃、Ｅｎｄｏ−Ｍ及びＥｎｄｏ−Ｓを含む反応液は３７℃でインキュベートした。反応１時間、２時間、６時間、１２時間、１８時間、および２４時間の反応液をサンプリングし、上述の分析条件ＡでＬＣ−ＭＳ分析した。反応収率の経時変化を図５に示す。比活性はＥｎｄｏ−Ｒｐ：０．２１  μｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ、Ｅｎｄｏ−Ｍ：０．００７１  μｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ、Ｅｎｄｏ―Ｓ：０．００２２  μｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ、Ｅｎｄｏ−Ｏｍ：０．０６０  μｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇであった。Ｅｎｄｏ−Ｒｐの比活性はＥｎｄｏ−Ｍの３０倍、Ｅｎｄｏ−Ｓの１００倍、Ｅｎｄｏ−Ｏｍの４倍であり、公知の酵素と比較してＳＧＰに対して非常に強い加水分解活性を有することが確認された。【０１２８】
また、実施例３で発現・精製したＥｎｄｏ−Ｒｐホモログについても活性を測定した。終濃度２００  ｍＭのカリウムリン酸バッファー（ｐＨ  ６．２５）、６９  ｍＭ  ＳＧＰ、および０．２  μＭの酵素を含む反応液（総容量  ３０  μＬ）を調製し、５０℃で１時間インキュベートした。１時間後の加水分解率は、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ：８７％、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ２：９１％、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ３：８４％、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ４：７９％、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ５：９４％、Ｅｎｄｏ−Ｒｍ：２３％であり、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ２、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ３、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ４、Ｅｎｄｏ−Ｒｐ５は、ＳＧＰに対して、Ｅｎｄｏ−Ｒｐとほぼ同等の加水分解活性を有することが確認された。【０１２９】
＜実施例５＞  Ｅｎｄｏ−Ｒｐの至適反応条件の検討
Ｅｎｄｏ−Ｒｐの至適反応温度およびｐＨを検討した。【０１３０】
反応温度の検討は、終濃度２００  ｍＭのカリウムリン酸バッファー（ｐＨ  ６．２５）、６９  ｍＭ  ＳＧＰ、および０．０２  μＭの酵素を含む反応液（総容量：１００  μＬ）を調製し、４５、５０、５２、５５、５７、６０及び６３℃の各温度で１８時間インキュベートし、加水分解率を算出した。結果を図６に示す。
反応ｐＨの検討は、終濃度２００  ｍＭの酢酸ナトリウムバッファーもしくはカリウムリン酸バッファー、６９  ｍＭ  ＳＧＰ、および０．０２  μＭの酵素を含む、ｐＨ４．５、５．０、５．５、５．８，６．０、６．２、６．５、７．０、及び、７．５の反応液（容量  １００  μＬ）を調製し、５０℃で２３時間インキュベートし、加水分解率を算出した。結果を図７に示す。【０１３１】
この検討の結果、Ｅｎｄｏ−Ｒｐの至適反応温度は５５℃付近、至適反応ｐＨは５．８付近であった。【０１３２】
＜実施例６＞Ｅｎｄｏ−Ｒｐの糖転移活性
Ｅｎｄｏ−Ｒｐが糖転移活性を有するか、以下のように検討した。【０１３３】
終濃度１．６  Ｍのカリウムリン酸バッファー（ｐＨ  ６．２５）、６９  ｍＭ  ＳＧＰ、６９０  ｍＭ  （ＧｌｃＮＡｃ−）Ａｓｎ（渡辺化学工業（株）製）および０．１  μＭの酵素を含む反応液（総容量：３０  μＬ）を調製し、５０℃で４時間インキュベートした。【０１３４】
反応液を下記の条件でＬＣ−ＭＳ分析した。
ＭＳ装置：６１３０  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＬＣ−ＭＳ  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＨＰＬＣ：１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  ２  μｍ  φ２．１×５０  ｍｍ（ＧＬサイエンス社）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％  ＨＣＯＯＨ
移動相Ｂ：アセトニトリル＋０．１％  ＨＣＯＯＨ
グラジエント（移動相Ｂ％）：０．８％（０分）、２％（５分）、２％（６分）
流速：０．７  ｍＬ／ｍｉｎ【０１３５】
結果を図８に示す。アクセプターを加えていない条件では、ドナーであるＳＧＰと加水分解物であるＳＧ（１０）のピークのみが検出された。アクセプターとして（ＧｌｃＮＡｃ−）Ａｓｎを加えた条件では、ＳＧ（１０）の他に糖転移反応生成物である（ＳＧ−）Ａｓｎのピークが観測された。この結果から、Ｅｎｄｏ−Ｒｐは糖転移活性を有することが確認された。【０１３６】
＜実施例７＞Ｅｎｄｏ−Ｒｐ  Ｎ１７２Ｑの作製
Ｅｎｄｏ−Ｒｐの糖鎖転移活性を維持したまま糖鎖加水分解活性を抑制した酵素を取得すべく、活性中心である１７２番目のアスパラギン（Ｎ)をグルタミン（Ｑ)に置換したＮ１７２Ｑ改変体を作製した。Ｎ１７２Ｑ改変体は、配列番号９に示すＥｎｄｏ−Ｒｐをコードする塩基配列において、５１４番目から５１６番目のＡＡＣをＣＡＡに置換し、実施例３に記載した方法で調製した。【０１３７】
糖転移活性の評価は次のように行った。終濃度１．６  Ｍのカリウムリン酸バッファー（ｐＨ  ６．２５）、６９  ｍＭ  ＳＧＰ、６９０  ｍＭ  （ＧｌｃＮＡｃ−）Ａｓｎおよび１．０  μＭの酵素を含む反応液（総容量：３０  μＬ）を調製し、５０℃でインキュベートした。反応２０分、４０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２０時間、２４時間、および４８時間の反応液をサンプリングし、実施例６に記載した条件でＬＣ−ＭＳ分析した。【０１３８】
反応収率の経時変化を図９に示す。Ｅｎｄｏ−Ｒｐ  ＷＴでは糖転移反応生成物である（ＳＧ−）Ａｓｎは速やかに加水分解されるのに対し、Ｎ１７２Ｑ改変体では加水分解が抑制され、収率よく（ＳＧ−）Ａｓｎが生成することを確認できた。【０１３９】
＜実施例８＞Ｅｎｄｏ−Ｒｐの改変
Ｅｎｄｏ−Ｒｐ  Ｎ１７２Ｑ改変体よりも糖鎖転移活性の高い酵素を取得すべく、改変検討を実施した。Ｅｎｄｏ−Ａ（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＦＨＱ）およびＥｎｄｏ−Ｄ（ＰＢＤ  ＩＤ：２Ｗ９２）の構造に基づいて、表１に示す各種変異体をデザインし、そのＳＧＰに対する加水分解活性及び糖転移活性を測定した。【０１４０】
糖転移活性の評価は次のように行った。終濃度１．６  Ｍのカリウムリン酸バッファー（ｐＨ  ６．２５）、６９  ｍＭ  ＳＧＰ、６９０  ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ−ＡｃＡおよび１．０  μＭの酵素を含む反応液（総容量：３０  μＬ）を調製し、５０℃でインキュベートした。反応１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、および９６時間の反応液をサンプリングし、上述のＬＣ−ＭＳ分析条件Ｂで分析した。【０１４１】
加水分解活性の評価は次のように実施した。終濃度１．６  Ｍ  カリウムリン酸バッファー（ｐＨ  ６．２５）、６９  ｍＭ  ＳＧ−Ａ、および０．２  μＭの酵素を含む反応液（総容量  ２０  μＬ）を調製し、５０℃でインキュベートした。反応１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、および７２時間の反応液をサンプリングし、上述のＬＣ−ＭＳ分析条件Ｂで分析した。【０１４２】
表１に、Ｅｎｄｏ−Ｒｐの転移および加水分解の比活性を１００とした時の、各改変体の比活性（加水分解及び糖転移）の相対値を示した。Ｎ１７２Ａ、Ｎ１７２Ｃ、Ｎ１７２Ｄ、Ｎ１７２Ｅ、Ｎ１７２Ｇ、Ｎ１７２Ｈ、Ｎ１７２Ｉ、Ｎ１７２Ｍ、Ｎ１７２Ｓ、Ｎ１７２Ｔ、Ｎ１７２Ｖ、Ｄ１７６Ｒ、Ｙ２１４Ｆ、Ｓ２１６Ｖ、Ｌ２４５Ｓ、Ｎ２４６Ｄ、Ｔ２７５Ｉ、Ｆ２８３Ｓ、Ｌ３０６Ｉ、Ｆ３０７Ｙ、Ｆ３０７Ｈ、Ａ３１０Ｄ、Ｅ３１４Ｑの変異を導入した改変体では、転移活性は維持したまま加水分解活性が抑制され、転移活性比率（転移活性/加水分解活性；表中では、転移／加水分解比）が向上していることが確認された。また、Ｗ２７８Ｆ、Ｗ２７８Ｙの変異を導入した改変体では、転移活性と加水分解活性がともに向上した一方、転移活性比率は低下した。【０１４３】
【表１−１】
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【０１４４】
【表１−２】
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【０１４５】
【表１−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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