(57)【要約】  本発明は、レクチンを用いたレクチン標的分子（例、ＡＦＰ−Ｌ３、ＰＳＡ、ヘモペキシン、およびトランスフェリン）の測定を改善することを提供する。具体的には、本発明は、レクチン反応性糖鎖含有実体の存在下において、レクチンをレクチン標的分子に結合させることを含む、レクチン標的分子の捕捉方法；レクチン標的分子、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を含む複合体；レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を混合形態で含む、レクチン標的分子の捕捉用試薬；ならびに、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を含む、レクチン標的分子の捕捉用キットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レクチン反応性糖鎖含有実体の存在下において、レクチンをレクチン標的分子に結合させることを含む、レクチン標的分子の捕捉方法。
【請求項２】
レクチンがマメ科レクチンまたはキノコレクチンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
レクチンがフコース特異的レクチンである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
レクチンが、レンズマメアグルチニン（ＬＣＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）またはヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
レクチン標的分子が糖タンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
糖タンパク質がＡＦＰ−Ｌ３またはＰＳＡである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
糖タンパク質がヘモペキシン（ＨＰＸ）またはトランスフェリン（ＴＦ）である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記実体がＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を有する糖タンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有する糖タンパク質がＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を可変領域に有する免疫グロブリンである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記実体が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ抗原）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンα鎖（ｈＣＧα）または黄体形成ホルモン（ＬＨ）である、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
レクチンのレクチン標的分子への結合後にレクチン標的分子を測定することを含むレクチン標的分子の測定方法である、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
レクチン標的分子に特異的な親和性物質をさらに用いる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
以下を含む方法である、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法：
（１）レクチン標的分子を、レクチン標的分子に特異的な親和性物質に結合させて、レクチン標的分子およびレクチン標的分子に特異的な親和性物質を含む第１複合体を得ること；
（２）レクチン反応性糖鎖含有実体の存在下においてレクチンを第１複合体と結合させて、レクチン標的分子、レクチン標的分子に特異的な親和性物質、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を含む第２複合体を得ること；ならびに
（３）第２複合体に含まれるレクチン標的分子の量を測定すること。
【請求項１４】
レクチン標的分子、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を含む複合体。
【請求項１５】
レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を混合形態で含む、レクチン標的分子の捕捉用試薬。
【請求項１６】
レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を含む、レクチン標的分子の捕捉用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レクチン標的分子の捕捉方法、レクチン標的分子を含む複合体、レクチン標的分子の捕捉用試薬およびキットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）は、レンズマメアグルチニン（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＬＣＡ）との結合性によって非結合画分（Ｌ１）、弱結合性画分（Ｌ２）、結合性画分（Ｌ３）の３画分に分類される。このうちＡＦＰ−Ｌ３は、肝癌マーカーとして利用されている。肝癌の診断のためＡＦＰ−Ｌ３の優れた測定法の開発が求められている。【０００３】
また、前立腺特異抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＳＡ）は、前立腺癌マーカーとして利用されている。しかし、前立腺肥大や前立腺炎においてもＰＳＡ測定値が上昇するため、特異性が低いことが課題となっている。近年、前立腺癌においてＰＳＡの糖鎖修飾変化が報告されており、この糖鎖修飾の変化を捉えることで癌診断の精度を向上させることが期待されている。【０００４】
特許文献１は、レクチンを用いたフコシル化ＡＦＰの測定法を開示している。
特許文献２は、レクチンを用いたβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を含有する糖鎖をもつＰＳＡの測定方法を開示している。
非特許文献１は、レクチンを用いたＡＦＰ−Ｌ３の測定法を開示している。
非特許文献２は、フコシル化ＰＳＡ量を測定することで前立腺癌の悪性度を判定できることを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９９／３９２０９号
【特許文献２】国際公開第２０１０／９０２６４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００５  Ａｕｇ；６９（８）：１６１６−９
【非特許文献２】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．  ２０１５  Ｊａｎ；５（３）：２６７−７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、レクチンを用いたレクチン標的分子（例、ＡＦＰ−Ｌ３およびＰＳＡ）の測定を改善することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討した結果、レクチン反応性糖鎖含有実体の存在下においてレクチンを用いると、レクチンのレクチン標的分子への結合が増強することなどを見出した。本知見は、レクチンによるレクチン標的分子の測定をはじめとする、レクチン標的分子の捕捉方法全般に応用することができる。本発明者らは、かかる知見に基づき、本発明を完成するに至った。上記特許文献および非特許文献は、レクチンとレクチン標的分子（ＡＦＰ−Ｌ３およびＰＳＡ）との結合を増強する方法を記載も示唆もしていない。【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕レクチン反応性糖鎖含有実体の存在下において、レクチンをレクチン標的分子に結合させることを含む、レクチン標的分子の捕捉方法。
〔２〕レクチンがマメ科レクチンまたはキノコレクチンである、〔１〕の方法。
〔３〕レクチンがフコース特異的レクチンである、〔１〕又は〔２〕の方法。
〔４〕レクチンが、レンズマメアグルチニン（ＬＣＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）またはヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）である、〔１〕〜〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕レクチン標的分子が糖タンパク質である、〔１〕〜〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕糖タンパク質がＡＦＰ−Ｌ３またはＰＳＡである、〔５〕の方法。
〔７〕糖タンパク質がヘモペキシン（ＨＰＸ）またはトランスフェリン（ＴＦ）である、〔５〕の方法。
〔８〕前記実体がＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を有する糖タンパク質である、〔１〕〜〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有する糖タンパク質がＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を可変領域に有する免疫グロブリンである、〔８〕の方法。
〔１０〕前記実体が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ抗原）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンα鎖（ｈＣＧα）または黄体形成ホルモン（ＬＨ）である、〔１〕〜〔８〕のいずれかの方法。
〔１１〕レクチンのレクチン標的分子への結合後にレクチン標的分子を測定することを含むレクチン標的分子の測定方法である、〔１〕〜〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕レクチン標的分子に特異的な親和性物質をさらに用いる、〔１１〕の方法。
〔１３〕以下を含む方法である、〔１〕〜〔１２〕のいずれかの方法：
（１）レクチン標的分子を、レクチン標的分子に特異的な親和性物質に結合させて、レクチン標的分子およびレクチン標的分子に特異的な親和性物質を含む第１複合体を得ること；
（２）レクチン反応性糖鎖含有実体の存在下においてレクチンを第１複合体と結合させて、レクチン標的分子、レクチン標的分子に特異的な親和性物質、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を含む第２複合体を得ること；ならびに
（３）第２複合体に含まれるレクチン標的分子の量を測定すること。
〔１４〕レクチン標的分子、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を含む複合体。
〔１５〕レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を混合形態で含む、レクチン標的分子の捕捉用試薬。
〔１６〕レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を含む、レクチン標的分子の捕捉用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法は、レクチン反応性糖鎖含有実体の存在下においてレクチンを使用することにより、レクチンのレクチン標的分子への結合を増強できる。したがって、本発明の方法は、例えば、レクチン標的分子の測定、抽出、濃縮、精製、検出、定量に有用である。より具体的には、レクチン反応性糖鎖含有実体の存在下でレクチンを使用する本発明の方法をレクチン標的分子の測定に利用した場合、レクチン単独の使用に比し、高感度かつ安定的にレクチン標的分子を測定することができる。
本発明の複合体は、例えば、本発明の捕捉方法の実施に有用である。
本発明の試薬およびキットは、例えば、本発明の捕捉方法の簡便な実施に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、精製マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量、およびレクチンブロットによるＬＣＡ反応性の確認を示す図である。
【図２】図２は、精製マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤについて、ＥＬＩＳＡによるＬＣＡ反応性の確認を示す図である。
【図３】図３は、ＬＣＡ反応性Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体Ａの存在下におけるＬＣＡによるＡＦＰ−Ｌ３の特異的な検出を示す図である。
【図４】図４は、ＬＣＡ反応性Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体Ｂの存在下におけるＬＣＡによるＡＦＰ−Ｌ３の特異的な検出を示す図である。
【図５】図５は、ＬＣＡ非反応性Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体Ｃの存在下におけるＬＣＡによるＡＦＰ−Ｌ３およびＡＦＰ−Ｌ１の検出の結果を示す図である。
【図６】図６は、ＬＣＡ非反応性Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体Ｄの存在下におけるＬＣＡによるＡＦＰ−Ｌ３およびＡＦＰ−Ｌ１の検出の結果を示す図である。
【図７】図７は、糖鎖除去マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量、およびレクチンブロットによるＬＣＡ反応性の確認を示す図である。
【図８】図８は、糖鎖含有マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよび糖鎖除去マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントについて、ＥＬＩＳＡによるＬＣＡ反応性の確認を示す図である。
【図９】図９は、ＬＣＡ反応性を示す糖鎖含有マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ、またはＬＣＡ反応性を示さない糖鎖除去マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰの存在下におけるＬＣＡによるＡＦＰ−Ｌ３およびＡＦＰ−Ｌ１の検出結果を示す図である。
【図１０】図１０は、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有する抗体の存在下におけるＬＣＡによるＡＦＰ−Ｌ３およびＡＦＰ−Ｌ１の検出結果を示す図である。抗ＴＮＦα抗体（Ｐ）：Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を可変領域に有する抗ＴＮＦα抗体；抗ＴＮＦα抗体（Ｎ）：Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を可変領域に有しない抗ＴＮＦα抗体；抗ＩＬ−１０抗体（Ｐ’）：Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を可変領域に有する抗ＩＬ−１０抗体；抗ＩＬ−１０抗体（Ｎ’）：Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を可変領域に有しない抗ＩＬ−１０抗体。
【図１１】図１１は、レクチン反応性抗原（ＨＢｓ抗原）の存在下におけるＬＣＡによるＡＦＰ−Ｌ３の特異的な検出を示す図である。
【図１２】図１２は、糖鎖除去ＨＢｓ抗原について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量、およびレクチンブロットによるＬＣＡ反応性の確認を示す図である。
【図１３】図１３は、糖鎖含有ＨＢｓ抗原および糖鎖除去ＨＢｓ抗原について、ＥＬＩＳＡによるＬＣＡ反応性の確認を示す図である。
【図１４】図１４は、ＬＣＡ反応性を示す糖鎖含有ＨＢｓ抗原−ＨＲＰ、またはＬＣＡ反応性を示さない糖鎖除去ＨＢｓ抗原−ＨＲＰの存在下におけるＬＣＡによるＡＦＰ−Ｌ３およびＡＦＰ−Ｌ１の検出結果を示す図である。
【図１５】図１５は、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰまたはＨＢｓ抗原−ＨＲＰの存在下におけるヒイロチャワンタケレクチン（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ：ＡＡＬ）によるＡＦＰ結合糖鎖の検出を示す図である。
【図１６】図１６は、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰまたはＨＢｓ抗原−ＨＲＰの存在下におけるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）によるＡＦＰ結合糖鎖の検出を示す図である。
【図１７】図１７は、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰまたはＨＢｓ抗原−ＨＲＰの存在下におけるＡＡＬによるＰＳＡ結合糖鎖の検出を示す図である。
【図１８】図１８は、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰの存在下におけるＬＣＡによるＡＦＰ−Ｌ３の特異的な検出を示す図である。同時添加条件：ＡＦＰ捕捉ウェルにおいてＬＣＡおよびマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２抗体Ａ−ＨＲＰを含む溶液をインキュベートした；洗浄条件：ＡＦＰ捕捉ウェルにおいてＬＣＡを含む溶液をインキュベートした後に洗浄して未反応ＬＣＡを除去した。次いで、未反応ＬＣＡが除去されたＡＦＰ捕捉ウェルに、マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２抗体Ａ−ＨＲＰを添加した後にインキュベートした。
【図１９】図１９は、ＨＢｓ抗原−ＨＲＰの存在下におけるＬＣＡによるＡＦＰ−Ｌ３の特異的な検出を示す図である。同時添加条件：ＡＦＰ捕捉ウェルにおいてＬＣＡおよびＨＢｓ抗原−ＨＲＰを含む溶液をインキュベートした；洗浄条件：ＡＦＰ捕捉ウェルにおいてＬＣＡを含む溶液をインキュベートした後に洗浄して、ＡＦＰ捕捉ウェルから未反応ＬＣＡを除去した。次いで、未反応ＬＣＡが除去されたＡＦＰ捕捉ウェルにおいて、ＨＢｓ抗原−ＨＲＰを含む溶液を添加した後にインキュベートした。
【図２０】図２０は、ＨＢｓ抗原−ＨＲＰの存在下におけるＡＡＬによるＡＦＰ−Ｌ３の特異的な検出を示す図である。同時添加条件：ＡＦＰ捕捉ウェルにおいてＡＡＬおよびＨＢｓ抗原−ＨＲＰを含む溶液をインキュベートした；洗浄条件：ＡＦＰ捕捉ウェルにおいてＡＡＬを含む溶液をインキュベートした後に洗浄して、ＡＦＰ捕捉ウェルから未反応ＡＡＬを除去した。次いで、未反応ＡＡＬが除去されたＡＦＰ捕捉ウェルに、ＨＢｓ抗原−ＨＲＰを添加した後にインキュベートした。
【図２１】図２１は、ＬＣＡ反応性抗体フラグメントＡまたはＢを固相とした条件下におけるＬＣＡによるＡＦＰ−Ｌ３の特異的な検出を示す図である。（＋）：ＬＣＡ反応性；（−）：ＬＣＡ非反応性
【図２２】図２２は、ＡＡＬの存在下におけるＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰによる肝臓癌患者血清中のヘモペキシン（ＨＰＸ）結合ＡＡＬ反応性フコシル化糖鎖の検出を示す図である。１％ＢＳＡ−ＰＢＳ：対照；ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２：肝臓癌患者血清２例；ＮＨＳ−１、ＮＨＳ−２：健常人血清２例。
【図２３】図２３は、ＡＡＬの存在下におけるＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰによる肝臓癌患者血清中のトランスフェリン（ＴＦ）結合ＡＡＬ反応性フコシル化糖鎖の検出を示す図である。１％ＢＳＡ−ＰＢＳ：対照；ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２：肝臓癌患者血清２例；ＮＨＳ−１、ＮＨＳ−２：健常人血清２例。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、レクチン反応性糖鎖含有実体の存在下において、レクチンをレクチン標的分子に結合させることを含む、レクチン標的分子の捕捉方法を提供する。
【００１３】
レクチンは、特定の糖鎖構造を認識して結合活性を示すタンパク質である。レクチンとしては、例えば、動物（例、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（例、マメ科、イネ科）、菌類（例、キノコ、麹）由来のものが知られている。マメ科レクチンとしては、例えば、ナタマメレクチン（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ：ＣｏｎＡ）、レンズマメアグルチニン（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＬＣＡ）、エンドウマメレクチン（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）などが挙げられる。キノコレクチンとしては、例えば、ヒイロチャワンタケレクチン（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ：ＡＡＬ）などが挙げられる。
【００１４】
本発明で用いられるレクチンはまた、レクチン標的分子の糖鎖構造に応じて適宜選択することができる。本発明で用いられるレクチンとしては、例えば、フコースに対する親和性を有するフコース特異的レクチン、ガラクトースに対する親和性を有するガレクチン、シアル酸反応性レクチンなどが挙げられるが、フコース特異的レクチンが好ましい。フコース特異的レクチンとしては、例えば、Ｎ型糖鎖の根本のＧｌｃＮＡｃにフコースがα１，６付加した糖鎖構造（コアフコース構造）を認識するレクチン〔例、ＬＣＡ、エンドウマメレクチン（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ：ＰＳＡ）〕、並びにＮ型糖鎖、Ｏ型糖鎖及び糖脂質糖鎖のＧｌｃＮＡｃにフコースをα１，２、α１，３、α１，４、α１，６のいずれかで付加した糖鎖構造を認識するレクチン〔例、ＡＡＬ、麹菌レクチン（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  Ｌｅｃｔｉｎ：ＡＯＬ）〕が挙げられる。
【００１５】
レクチン標的分子とは、レクチンと結合する能力を有する、本発明において捕捉されるべき標的分子をいう。標的分子は、レクチンが結合する特定の糖鎖からなる、又は当該特定の糖鎖を含有する分子である。
【００１６】
好ましくは、レクチン標的分子は、糖タンパク質である。レクチン標的分子としての糖タンパク質としては、例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、植物、昆虫、微生物、またはウイルス由来の糖タンパク質が挙げられる。レクチン標的分子としての糖タンパク質は、測定、抽出、濃縮または精製が所望される糖タンパク質であってもよい。具体的には、糖タンパク質は、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するタンパク質である。Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列は、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのアミノ酸残基（Ｘはプロリン以外のアミノ酸残基）から構成されるアミノ酸配列である。Ｎ型糖鎖は、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列中のアスパラギン（Ａｓｎ）残基に結合することが知られている。より具体的には、レクチン標的分子としては、例えば、ＡＦＰ−Ｌ３、ＰＳＡ、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、およびトランスフェリン（ＴＦ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＰＳＡは、Ｎ型糖鎖等の糖鎖の修飾タンパク質として知られている。
【００１７】
レクチン反応性糖鎖含有実体とは、レクチン反応性糖鎖を含有する分子、またはレクチン反応性糖鎖が付加されている固相をいう。レクチン反応性糖鎖含有実体は、本発明の方法で捕捉されるべきレクチン標的分子とは異なる。レクチン反応性糖鎖含有実体は、その糖鎖がレクチンと反応するのであって、レクチンまたはレクチン標的分子を抗原とする抗体ではない。レクチン反応性糖鎖を含有する分子としては、例えば、生体分子、および人工合成物（例、人工合成高分子等の人工合成分子）が挙げられる。固相としては、例えば、粒子（例、磁性粒子）；メンブレン（例、ニトロセルロース膜、ろ紙）、カラム等の支持体；並びにプレート（例、マルチウェルプレート）、チューブ等の容器が挙げられる。固相の材料としては、例えば、ガラス、プラスチック、多糖体のマトリックス、および金属が挙げられる。レクチン反応性糖鎖含有実体は、用いられるレクチンの種類に応じて適宜選択することができる。例えば、このような選択は、レクチンとの糖鎖または糖鎖含有実体の結合能力を評価することにより行うことができる（例、実施例２を参照）。
【００１８】
好ましくは、レクチン反応性糖鎖含有実体は、レクチン反応性糖鎖を含有する生体分子である。生体分子としては、例えば、ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。より好ましくは、レクチン反応性糖鎖含有実体は、糖タンパク質である。レクチン反応性糖鎖含有実体としての糖タンパク質としては、例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、植物、昆虫、微生物、またはウイルス由来の糖タンパク質が挙げられる。レクチン反応性糖鎖含有実体としての糖タンパク質としてはまた、例えば、免疫グロブリン（例、抗体）、分泌型タンパク質、膜結合型タンパク質、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、ウイルス由来抗原、酵素、細胞外マトリックス、細胞外小胞膜タンパク質、腫瘍特異抗原、及びそれらの部分ペプチドが挙げられる。
【００１９】
好ましくは、レクチン反応性糖鎖含有実体としての糖タンパク質は、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するタンパク質である。Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列は、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのアミノ酸残基（Ｘはプロリン以外のアミノ酸残基）から構成されるアミノ酸配列である。Ｎ型糖鎖は、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列中のアスパラギン（Ａｓｎ）残基に結合することが知られている。より具体的には、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するタンパク質としては、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピンα鎖、黄体形成ホルモン、ＰＳＡ抗原、ＨＥ４抗原、ＭＵＣ１抗原、サイログロブリン、ならびにＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を可変領域に有する抗体が挙げられる。
【００２０】
より好ましくは、レクチン反応性糖鎖含有実体としての糖タンパク質は、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を可変領域に有する抗体である。Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を可変領域に有する抗体としては、例えば、天然の全長抗体および改変抗体が挙げられる。改変抗体としては、例えば、可変領域を有する抗体フラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、および単鎖抗体が挙げられる。また、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を可変領域に有する抗体としては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＹが挙げられる。Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を可変領域に有する抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００２１】
本発明の方法は、レクチン反応性糖鎖含有実体の存在下において、レクチンがレクチン標的分子に結合される。換言すれば、本発明の方法は、レクチン標的分子、ならびにレクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体という少なくとも三成分を含む系において行われ、レクチン標的分子の捕捉手段としてレクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体が併用される。レクチン反応性糖鎖含有実体の存在下においてレクチンを使用することにより、レクチンのレクチン標的分子への結合を増強できる。したがって、本発明の方法は、例えば、レクチン標的分子の測定、抽出、濃縮、精製、定量、検出に有用である。
【００２２】
レクチン標的分子は、液体サンプルに含まれるものが使用される。換言すれば、本発明の方法は、レクチン標的分子を含む液体サンプルに、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を加えた系において行われる。液体サンプルの由来は特に限定されず、生物由来の生物学的サンプルであってもよく、または環境サンプルなどであってもよい。生物学的サンプルが由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物、植物、菌類、魚類が挙げられるが、好ましくは哺乳動物、菌類、魚類であり、より好ましくは哺乳動物であり、さらにより好ましくはヒトである。生物学的サンプルはまた、血液自体または血液に由来するサンプルである血液関連サンプル（例、全血、血清、血漿）、唾液、尿、乳汁、組織または細胞抽出液、あるいはこれらの混合物であってもよい。環境サンプルとしては、土壌、海水、淡水由来のサンプルが挙げられる。液体サンプルは、予備処理に付されたものを用いてもよい。このような予備処理としては、例えば、遠心分離、分画、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、及び攪拌が挙げられる。
【００２３】
本発明の方法において用いられるレクチンの量は、レクチン反応性糖鎖含有実体の存在下で標的レクチンを捕捉できる量である限り特に限定されないが、例えば、０．１μｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである。レクチンの量は、好ましくは１μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５μｇ／ｍＬ以上、さらにより好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上である。レクチンの量はまた、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以下、さらにより好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以下である。このような量のレクチンが、液体サンプルに添加されてもよい。
【００２４】
本発明の方法において用いられるレクチン反応性糖鎖含有実体の量は、レクチンによるレクチン標的分子の捕捉を支援できる量である限り特に限定されないが、例えば、０．００１μｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである。レクチン反応性糖鎖含有実体の量は、好ましくは０．００５μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．０２μｇ／ｍＬ以上、さらにより好ましくは０．１μｇ／ｍＬ以上である。レクチン反応性糖鎖含有実体の量はまた、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以下、さらにより好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以下である。このような量のレクチン反応性糖鎖含有実体が、液体サンプルに添加されてもよい。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、レクチン標的分子の測定方法である。本発明の測定方法では、レクチンのレクチン標的分子への結合後にレクチン標的分子を測定することができる。本発明の測定方法は、免疫学的手法に準じて行うことができ、抗体の代わりにレクチン反応性糖鎖含有実体およびレクチンを併用することにより、免疫学的手法と同様の手法により行うことができる。本発明の測定方法が準じる免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、化学発光ＥＩＡ（ＣＬＥＩＡ）、酵素吸着ＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ））、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、凝集法、免疫染色、フローメトリー法、バイオレイヤー干渉法、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  ＰＬＡ法、化学増幅型ルミネッセンス・プロキシミティ・ホモジニアス・アッセイ、ラインブロット法、ウエスタンブロット法が挙げられる。本発明の測定方法は、定性的または定量的に行われ、レクチン標的分子の有無または量を評価することができる。
【００２６】
本発明の方法では、レクチン標的分子に特異的な親和性物質がさらに用いられてもよい。本発明の方法で用いられるレクチン標的分子に特異的な親和性物質は、レクチン標的分子中のレクチン結合部位（糖鎖）とは異なる部位（例、ペプチド領域）でレクチン標的分子に結合する。レクチン標的分子に特異的な親和性物質としては、例えば、抗体およびアプタマーが挙げられるが、抗体が好ましい。
【００２７】
本発明の方法において用いられるレクチン標的分子に特異的な親和性物質の量は、レクチン標的分子を十分に結合できる量である限り特に限定されないが、例えば、０．０００１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである。親和性物質の量は、好ましくは０．００１μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．００５μｇ／ｍＬ以上、さらにより好ましくは０．０１μｇ／ｍＬ以上である。親和性物質の量はまた、好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ以下、さらにより好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ以下である。このような量の親和性物質が、液体サンプルに添加されてもよい。
【００２８】
レクチン標的分子に特異的な親和性物質がさらに用いられる場合、本発明の測定方法は、サンドイッチ様式で行われてもよい。例えば、固相化手段として、レクチン標的分子に特異的な親和性物質が用いられ、検出手段として、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体が併用されてもよい。あるいは、固相化手段として、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体が併用され、検出手段として、レクチン標的分子に特異的な親和性物質が用いられてもよい。
【００２９】
本発明の測定方法では、レクチン反応性糖鎖含有実体もしくはレクチン、またはレクチン標的分子に特異的な親和性物質が標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジンおよびビオチンのうちの一方、互いに相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖の核酸のうちの一方）、蛍光物質またはタンパク質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウムエステル、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム、ルミノール）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）が挙げられる。好ましくは、レクチン反応性糖鎖含有実体、またはレクチン反応性糖鎖含有実体に特異的な親和性物質が標識される。
【００３０】
より具体的には、本発明の測定方法は、サンドイッチ様式で行われる場合、以下の工程により行うことができる：
（１）レクチン標的分子を、レクチン標的分子に特異的な親和性物質に結合させて、レクチン標的分子およびレクチン標的分子に特異的な親和性物質を含む第１複合体を得ること；
（２）レクチン反応性糖鎖含有実体の存在下においてレクチンを第１複合体と結合させて、レクチン標的分子、レクチン標的分子に特異的な親和性物質、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を含む第２複合体を得ること；ならびに
（３）第２複合体に含まれるレクチン標的分子の量を測定すること。
【００３１】
工程（１）では、レクチン標的分子は、上述したような液体サンプルに含まれるものを使用することができる。したがって、工程（１）の具体的な実施形態として、レクチン標的分子を含む液体サンプルに、レクチン標的分子に特異的な親和性物質を添加することにより、工程（１）が行われてもよい。工程（１）では、上述したような量のレクチン標的分子に特異的な親和性物質を用いることができるが、好ましくは、予想されるレクチン標的分子に対して、過剰当量のレクチン標的分子に特異的な親和性物質を用いてもよい。レクチン標的分子に特異的な親和性物質としては、上述したような固相に固定されたものを用いるのが好ましい。レクチン標的分子とレクチン標的分子に特異的な親和性物質との結合は、両者を溶液（例、緩衝液）中でインキュベートすることにより達成することができ、これによりレクチン標的分子およびレクチン標的分子に特異的な親和性物質を含む第１複合体が得られる。
【００３２】
工程（２）では、第２複合体が得られる。工程（１）の具体的な実施形態として、工程（１）で得られた上記第１複合体を含む溶液に、レクチン、およびレクチン反応性糖鎖含有実体を添加することにより、工程（２）が行われてもよい。工程（２）では、上述したような量のレクチン、および上述したような量のレクチン反応性糖鎖含有実体を用いることができるが、好ましくは、予想されるレクチン標的分子に対して、過剰当量のレクチンおよび過剰当量のレクチン反応性糖鎖含有実体を用いてもよい。レクチンまたはレクチン反応性糖鎖含有実体のいずれかが標識物質で標識されていてもよいが、好ましくはレクチン反応性糖鎖含有実体が標識物質で標識されていてもよい。レクチン反応性糖鎖含有実体の存在下におけるレクチンの第１複合体への結合は、三者を溶液（例、緩衝液）中でインキュベートすることにより達成することができ、これによりレクチン標的分子、レクチン標的分子に特異的な親和性物質、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を含む第２複合体が得られる。レクチン標的分子に特異的な親和性物質として固相に固定されたものを用いた場合、第２複合体は固相に固定されている。この場合、工程（２）の後に、液相の除去および添加から構成される洗浄工程が設けられてもよい。
【００３３】
工程（３）では、第２複合体における標識物質からのシグナルを指標に、レクチン標的分子の量を測定することができる。
【００３４】
本発明はまた、レクチン標的分子、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を含む複合体を提供する。本発明の複合体は、レクチン標的分子に特異的な親和性物質をさらに含んでいてもよい。本発明の複合体は、これらの構成因子を溶液中でインキュベートして結合させることにより、作製することができる。
【００３５】
本発明の複合体において、レクチン標的分子、レクチン、レクチン反応性糖鎖含有実体、およびレクチン標的分子に特異的な親和性物質の定義、例および好ましい例は、上述したとおりである。
【００３６】
本発明の複合体は、例えば、本発明の捕捉方法の実施に有用である。
【００３７】
本発明はさらに、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を混合形態で含む、レクチン標的分子の捕捉用試薬を提供する。換言すれば、本発明の捕捉用試薬は、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体の組成物を含む。本発明の試薬に含まれるレクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体は混合形態にあることから、本発明の捕捉用試薬ではレクチンとレクチン反応性糖鎖含有実体との間で複合体が形成されていてもよい。
【００３８】
本発明の試薬がレクチン標的分子の測定に用いられる場合、レクチンまたはレクチン反応性糖鎖含有実体のいずれかが標識物質で標識されていてもよいが、好ましくはレクチン反応性糖鎖含有実体が標識物質で標識されていてもよい。あるいは、レクチンまたはレクチン反応性糖鎖含有実体のいずれも標識物質で標識されていない場合、本発明の試薬は、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体と非混合形態で標識物質を含んでいてもよい。
【００３９】
本発明の試薬は、レクチン標的分子に特異的な親和性物質をさらに含んでいてもよい。レクチン標的分子に特異的な親和性物質は、標識物質で標識されていてもよい。また、レクチン標的分子に特異的な親和性物質は、上述したような固相に固定されていてもよい。この場合、本発明の試薬は、サンドイッチ様式においてレクチン標的分子を測定するために好適に用いることができる。本発明の試薬は、レクチン標的分子に特異的な親和性物質を、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体と混合形態または非混合形態のいずれかで含むが、非混合形態で含むことが好ましい。
【００４０】
本発明の試薬において、レクチン標的分子、レクチン、レクチン反応性糖鎖含有実体、およびレクチン標的分子に特異的な親和性物質の定義、例および好ましい例は、上述したとおりである。
【００４１】
本発明の試薬は、例えば、本発明の捕捉方法の簡便な実施に有用であり、例えば、本発明の測定方法に好適に用いることができる。
【００４２】
本発明はまた、レクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体を含む、レクチン標的分子の捕捉用キットを提供する。本発明のキットに含まれるレクチンおよびレクチン反応性糖鎖含有実体は、混合形態（すなわち、組成物の形態）にあるか、または非混合形態（すなわち、互いに隔離された形態）にある。よって、本発明のキットに含まれる構成成分は、それぞれ異なる容器（例、チューブ、プレート）に収容された形態、または同一容器の異なる区画に収容された形態で提供される。
【００４３】
本発明のキットがレクチン標的分子の測定に用いられる場合、レクチンまたはレクチン反応性糖鎖含有実体のいずれかが標識物質で標識されていてもよいが、好ましくはレクチン反応性糖鎖含有実体が標識物質で標識されていてもよい。あるいは、レクチンまたはレクチン反応性糖鎖含有実体のいずれも標識物質で標識されていない場合、本発明のキットは、標識物質および／またはレクチン標的分子に特異的な親和性物質（標識物質で標識されていてもよい）を含んでいてもよい。
【００４４】
本発明のキットは、レクチン標的分子に特異的な親和性物質をさらに含んでいてもよい。この場合、本発明のキットは、サンドイッチ様式においてレクチン標的分子を測定するために好適に用いることができる。レクチン標的分子に特異的な親和性物質は、上述したような固相に固定されていてもよい。
【００４５】
本発明のキットにおいて、レクチン標的分子、レクチン、レクチン反応性糖鎖含有実体、およびレクチン標的分子に特異的な親和性物質の定義、例および好ましい例は、上述したとおりである。
【００４６】
本発明のキットは、例えば、本発明の捕捉方法の簡便な実施に有用であり、例えば、本発明の測定方法に好適に用いることができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。【００４８】
実施例１：抗体フラグメントの調製、及び抗体フラグメント−ＨＲＰの調製
抗ＬＣＡ抗体ではないマウスＩｇＧ１をペプシンで消化し、ＬＣＡ反応性マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントとＬＣＡ非反応性マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを調製した。【００４９】
具体的には、調製は、以下のとおり行った。
（１）抗ＬＣＡ抗体ではないマウスＩｇＧ１抗体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤをペプシンで消化した。消化は、クエン酸緩衝液にバッファー交換したマウスＩｇＧ１抗体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤにペプシン（ＳＩＧＭＡ）を添加し、３７℃１時間反応させ、トリス緩衝液の添加により反応停止させることにより行った。
（２）ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００ＧＬでゲルろ過を行い、４種の精製マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを得た。
（３）精製マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した。ＨＲＰの標識は、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学研究所）を用いて、添付のプロトコールに従って行い、４種の精製抗体フラグメント−ＨＲＰ（マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ）を得た。【００５０】
実施例２：抗体フラグメントの精製度、分子量およびレクチン反応性の確認
実施例１で調製した４種の抗体フラグメントについて、精製度、分子量およびレクチン反応性を確認した。【００５１】
具体的には、確認は、以下のとおり行った。
（１）精製マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した（図１左）。
（２）精製マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのＬＣＡ反応性をレクチンブロットにて確認した（図１右）。
（３）精製マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのＬＣＡ反応性をＥＬＩＳＡにて確認した。精製マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを各５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。Ｕ９６  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）において、希釈された溶液５０μＬを４℃２４時間インキュベートして、上記抗体を固相化した。抗体固相化ウェルを、ＰＢＳＴ  ２５０μＬで３回洗浄した後、１０％ブロッキング試薬（Ｃａｒｂｏｆｒｅｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｖｅｃｔｏｒ）１５０μＬで３７℃１時間ブロッキングした。抗体固相化ウェルをＰＢＳＴ  ２５０μＬで３回洗浄した。次いで、１０％ブロッキング試薬でＬＣＡ−ＨＲＰ（Ｊ−オイルミルズ）を５μｇ／ｍＬとなるように希釈した溶液  ５０μＬを加え、抗体固相化ウェルにおいて溶液を３７℃１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ  ２５０μＬでウェルを３回洗浄した。洗浄後のウェルに５０μＬのＴＭＢ基質溶液（Ｄａｋｏ）を加え室温で５分反応を行った。１Ｎ硫酸で反応停止後、４５０ｎｍで吸光度を測定した（図２）。【００５２】
その結果、抗体フラグメントＡおよびＢはＬＣＡ反応性であるが、抗体フラグメントＣおよびＤはＬＣＡ非反応性であることが確認された（表１、図１、２）。【００５３】
【表１】
2017183711.tif 000002
【００５４】
用いた抗体を解析した。
抗体Ａは、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を抗体可変領域の重鎖に有していた。このことは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントがＮ型糖鎖で修飾されていることを示す。よって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体Ａは、Ｎ型糖鎖を介してレクチン反応性を示すと考えられる。
抗体Ｂは、抗体Ａと同様である。
抗体Ｃは、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を抗体可変領域の重鎖にも軽鎖にも有していなかった。このことは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントはＮ型糖鎖で修飾されていないことを示す。よって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体Ｃは、レクチン反応性を示さないと考えられる。
抗体Ｄは、抗体Ｃと同様である。【００５５】
実施例３：レクチン反応性抗体フラグメントの存在下におけるレクチンによるＡＦＰ−Ｌ３測定系の構築
実施例１で調製したマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰを用いて、ＡＦＰ−Ｌ３の免疫学的測定系を構築した。【００５６】
具体的には、構築は、以下のとおり行った。
（１）ａｎｔｉ−ＡＦＰ  Ｆ（ａｂ’）２を１０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。Ｕ９６  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅにおいて、希釈された溶液  ５０μＬを４℃２４時間インキュベートして、上記抗体を固相化した。
（２）抗体固相化ウェルを、ＰＢＳＴ  ２５０μＬで３回洗浄した後、１０％ブロッキング試薬  １５０μＬで３７℃１時間ブロッキングした。
（３）抗体固相化ウェルを、ＰＢＳＴ  ２５０μＬで３回洗浄した。次いで、ミュータスワコーＡＦＰ−Ｌ３（和光純薬工業）の測定値から濃度を換算したＡＦＰ−Ｌ３溶液とＡＦＰ−Ｌ１溶液を、それぞれ１０％ブロッキング試薬で、１０００ｎｇ／ｍＬから２ｎ希釈した溶液  ５０μＬを抗体固相化ウェルに加え３７℃１時間インキュベートした。
（４）抗体固相化ウェルを、ＰＢＳＴ  ２５０μＬで３回洗浄した。次いで、実施例１で調製したマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰをそれぞれ１０％ブロッキング試薬で５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、さらにＬＣＡ（Ｖｅｃｔｏｒ）を１００μｇ／ｍＬとなるように加えた混合液を調製し、その混合液を抗体固相化ウェルに加え３７℃１時間インキュベートした。
（５）抗体固相化ウェルを、ＰＢＳＴ  ２５０μＬで３回洗浄した。次いで、５０μＬのＴＭＢ基質溶液（Ｄａｋｏ）を加え室温で５分反応させた。１Ｎ硫酸で反応停止後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。【００５７】
その結果、ＬＣＡは、ＬＣＡ反応性抗体フラグメントＡまたはＢの存在下でＡＦＰ−Ｌ３を特異的に検出することができた（表２、図３〜６）。【００５８】
【表２】
2017183711.tif 000003
【００５９】
以上より、レクチンは、標識されたレクチン反応性抗体フラグメントの存在下でＡＦＰ−Ｌ３を特異的に検出できることが示された。【００６０】
実施例４：ＡＦＰ−Ｌ３検出における、レクチン反応性抗体フラグメント中のレクチン反応性糖鎖の関与の確認
実施例１で調製したマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２抗体Ｂの糖鎖をＮ−グリコシダーゼＦで除去することにより、糖鎖除去マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２抗体ＢがＬＣＡ共存下でのＡＦＰ−Ｌ３反応性を維持しているか否かを確認した。【００６１】
具体的には、確認は、以下のとおり行った。
（１）実施例１で調製したマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２抗体ＢのＮ−グリコシダーゼＦ処理を実施した。Ｎ−グリコシダーゼＦ処理は、トリス塩酸緩衝液にバッファー交換したマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２抗体ＢにＮ−グリコシダーゼＦ（ＲＯＣＨＥ）を添加し、３７℃２４時間反応させた。Ｎ−グリコシダーゼＦは、Ｎ結合型糖鎖とタンパク質とのＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ結合を特異的に切断する酵素である。
（２）ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００ＧＬでゲルろ過を行い、糖鎖除去マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを得た。
（３）糖鎖除去マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰを、実施例１と同様に調製した。
（４）実施例２と同様に、精製度、分子量およびＬＣＡ反応性を確認した（図７、８）。
（５）実施例３と同様に、標識抗体の存在下におけるＬＣＡのＡＦＰ−Ｌ３反応性を確認した（図９、表３）。ＡＦＰ濃度は１μｇ／ｍＬで検討した。【００６２】
その結果、ＬＣＡ反応性を消失した糖鎖除去標識抗体フラグメント（図７、８）の存在下では、ＬＣＡはＡＦＰ−Ｌ３を検出できなかった（表３、図９）。【００６３】
【表３】
2017183711.tif 000004
【００６４】
以上より、抗体の可変領域中の糖鎖が、レクチンによるＡＦＰ−Ｌ３の検出に重要であることが示された。【００６５】
実施例５：可変領域中にＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧの存在下におけるレクチンによるＡＦＰ−Ｌ３検出
抗体の可変領域中のＮ型糖鎖結合コンセンサス配列の有無がＡＦＰ−Ｌ３検出に影響するか否かを検討した。【００６６】
具体的には、検討は、以下のとおり行った。
（１）可変領域にＮ型糖鎖結合コンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）を有する抗ＴＮＦα抗体（Ｐ）と有さない抗ＴＮＦα抗体（Ｎ）、可変領域にＮ型糖鎖結合コンセンサス配列（Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ）を有する抗ＩＬ−１０抗体（Ｐ’）と有さない抗ＩＬ−１０抗体（Ｎ’）を、それぞれ実施例１と同様にＨＲＰ標識を行った。
（２）実施例３と同様に、ＬＣＡ共存下でのＡＦＰ−Ｌ３反応性を確認した。ＡＦＰ濃度は５μｇ／ｍＬで検討した。【００６７】
その結果、ＬＣＡは、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有する抗体の存在下で、ＡＦＰ−Ｌ３を特異的に検出することができた（表４、図１０）。【００６８】
【表４】
2017183711.tif 000005
【００６９】
以上より、レクチンは、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を可変領域に有する抗体（本抗体が結合する抗原の種類を問わない）の存在下でＡＦＰ−Ｌ３を特異的に検出できることが示された。【００７０】
実施例６：レクチン反応性抗原の存在下におけるレクチンによるＡＦＰ−Ｌ３測定系の構築
マウスＩｇＧ以外のＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を有する糖タンパク質であるＨＢｓ抗原（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）を用いて、ＡＦＰ−Ｌ３の免疫学的測定系を構築した。【００７１】
具体的には、構築は、以下のとおり行った。
（１）Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するＨＢｓ抗原を、それぞれ実施例１と同様にＨＲＰ標識を行った。
（２）実施例３と同様に、ＬＣＡ共存下でのＡＦＰ−Ｌ３反応性を確認した。ＡＦＰ濃度は１０００ｎｇ／ｍＬから２ｎ希釈して検討した。ＨＢｓ抗原−ＨＲＰは２μｇ／ｍＬで反応させた。【００７２】
その結果、ＬＣＡは、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するＨＢｓ抗原の共存下で、ＡＦＰ−Ｌ３を特異的に検出することができた（表５、図１１）。【００７３】
【表５】
2017183711.tif 000006
【００７４】
以上より、レクチンは、抗体のみならず、レクチン反応性抗原の存在下でも、ＡＦＰ−Ｌ３を特異的に検出できることが示された。【００７５】
実施例７：ＡＦＰ−Ｌ３検出における、抗原中のレクチン反応性糖鎖の関与の確認
ＨＢｓ抗原の糖鎖をＮ−グリコシダーゼＦで除去することにより、糖鎖除去ＨＢｓ抗原がＬＣＡ共存下でのＡＦＰ−Ｌ３反応性を維持するか確認した。【００７６】
具体的には、確認は、以下のとおり行った。
（１）ＨＢｓ抗原のＮ−グリコシダーゼＦ処理を実施した。Ｎ−グリコシダーゼＦ処理は、Ｎ−グリコシダーゼＦとＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）付属の反応溶液を用いて、ＰＮＧａｓｅＦ添付のプロトコールに従って行い、糖鎖除去を行った。
（２）糖鎖除去ＨＢｓ抗原を、実施例１と同様にＨＲＰで標識した。
（３）実施例２と同様に、精製度、分子量およびＬＣＡ反応性を確認した。
（４）実施例６と同様に、ＬＣＡ共存下でのＡＦＰ−Ｌ３反応性を確認した。ＡＦＰ濃度は１μｇ／ｍＬで検討した。ＨＢｓ抗原−ＨＲＰは、１μｇ／ｍＬで添加した。【００７７】
その結果、ＬＣＡは、ＬＣＡ反応性を消失した糖鎖除去標識抗原（図１２、１３）の存在下では、ＡＦＰ−Ｌ３を検出できなかった（表６、図１４）。【００７８】
【表６】
2017183711.tif 000007
【００７９】
以上より、糖タンパク質抗原中の糖鎖が、レクチンによるＡＦＰ−Ｌ３の検出に重要であることが示された。【００８０】
実施例８：レクチン反応性糖タンパク質の存在下におけるレクチンによるＡＦＰ−Ｌ３検出
抗体のみならず抗原の存在下においても、ＬＣＡはＡＦＰ−Ｌ３を検出することが可能であった（実施例７）。そこで、アミノ酸配列にＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を有する他の糖タンパク質をＨＲＰ標識し、他の糖タンパク質の存在下においてＬＣＡがＡＦＰ−Ｌ３を検出できるか確認した。【００８１】
具体的には、確認は、以下のとおり行った。
（１）アミノ酸配列中にＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するｈＣＧα（ヒト絨毛性ゴナドトロピンα鎖）とＬＨ（黄体形成ホルモン）を、それぞれ実施例１と同様にＨＲＰ標識を行った。
（２）実施例３と同様に、ＬＣＡのＡＦＰ−Ｌ３反応性を確認した。ＡＦＰ濃度は１μｇ／ｍＬで検討した。【００８２】
その結果、ＬＣＡは、ｈＣＧαまたはＬＨの存在下で、ＡＦＰ−Ｌ３を特異的に検出することができた（表７、８）。【００８３】
【表７】
2017183711.tif 000008
数値は、ＯＤ４５０の測定値を示す。【００８４】
【表８】
2017183711.tif 000009
【００８５】
以上より、レクチンは、レクチン反応性糖タンパク質の存在下で、ＡＦＰ−Ｌ３を特異的に検出できることが示された。【００８６】
実施例９：レクチン反応性標識抗体またはレクチン反応性標識抗原の存在下における各種レクチンによるＡＦＰ結合糖鎖の検出系の構築
Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰまたはＨＢｓ抗原−ＨＲＰの存在下で、ヒイロチャワンタケレクチン（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ：ＡＡＬ）とコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）をレクチンとして用いることにより、下記構造式を有するＡＦＰ結合糖鎖の検出系を構築した。【００８７】
【化１】
2017183711.tif 000010
【００８８】
上記構造式については、既報（Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２００８  Ｊｕｎ；７（６）：２２２２−３３）により、培養細胞（Ｈｕｈ７）と肝細胞癌検体中に６０％以上含まれると報告されている構造式を代表例として示した。【００８９】
具体的には、構築は、以下のとおり行った。
（１）実施例３と同様に、ＡＦＰ−Ｌ３とＡＦＰ−Ｌ１を１０％ブロッキング試薬でそれぞれ１μｇ／ｍＬとなるように希釈し、その希釈溶液を用いて反応を行った。
（２）抗体固相化ウェルを、ＰＢＳＴ  ２５０μＬで３回洗浄した。次いで、実施例１で調製したＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰと実施例６で調製したＨＢｓ抗原−ＨＲＰを１０％ブロッキング試薬でそれぞれ１μｇ／ｍＬとなるようにブロッキング試薬希釈し、さらにＡＡＬ（Ｊ−オイルミルズ）を１０μｇ／ｍＬ、またはＣｏｎＡ（Ｖｅｃｔｏｒ）を１０μｇ／ｍＬとなるようにいずれかを加えた混合液を調製し、その混合液を抗体固相化ウェルに加え３７℃１時間インキュベートした。
（３）抗体固相化ウェルを、ＰＢＳＴ  ２５０μＬで３回洗浄した。洗浄後のウェルに５０μＬのＴＭＢ基質溶液を加え室温で５分反応を行った。１Ｎ硫酸で反応停止後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。【００９０】
その結果、ＡＡＬおよびＣｏｎＡは、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰまたはＨＢｓ抗原−ＨＲＰの存在下で、ＬＣＡと同様にＡＦＰ結合糖鎖を検出することができた（表９、図１５、１６）。【００９１】
【表９】
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【００９２】
以上より、ＬＣＡに限らず他のレクチンについても、糖タンパク質の存在下で、ＡＦＰ結合糖鎖を検出できることが示された。【００９３】
実施例１０：レクチン反応性標識抗体またはレクチン反応性標識抗原の存在下におけるレクチンによるＰＳＡ結合糖鎖の検出系の構築
ＡＡＬ反応性糖鎖がＰＳＡ（前立腺特異的抗原）に結合していることが報告されている。Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰとＨＢｓ抗原−ＨＲＰの存在下で、ＡＡＬをレクチンとして用いた、下記構造式を有するＰＳＡ結合ＡＡＬ反応性フコシル化糖鎖の検出系を構築した。【００９４】
【化２】
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【００９５】
上記構造式については、既報（Ｔａｊｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ２００８  Ｊａｎ；１８（１）：２−８）により、前立腺癌検３例を解析し、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｂｕｎｄａｎｃｅが共通して最も高いと報告されている構造式を代表例として示した。【００９６】
具体的には、構築は、以下のとおり行った。
（１）ａｎｔｉ−ＰＳＡ  Ｆ（ａｂ’）２を１０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。Ｕ９６  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅにおいて、希釈された溶液  ５０μＬを４℃２４時間インキュベートして、上記抗体を固相化した。
（２）抗体固相化ウェルを、ＰＢＳＴ  ２５０μＬで３回洗浄した後、１０％ブロッキング試薬  １５０μＬで３７℃１時間ブロッキングした。
（３）抗体固相化ウェルを、ＰＢＳＴ  ２５０μＬのＰＢＳＴで３回洗浄し、ルミパルスＰＳＡ−Ｎ標準ＰＳＡ溶液（富士レビオ）１００ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０ｎｇ／ｍＬを抗体固相化ウェルに５０μＬ加え、３７℃１時間インキュベートした。
（４）抗体固相化ウェルを、ＰＢＳＴ  ２５０μＬで３回洗浄した。実施例１で調製したＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰと実施例６で調製したＨＢｓ抗原−ＨＲＰを、１０％ブロッキング試薬でそれぞれ１μｇ／ｍＬとなるように希釈し、さらにＡＡＬを１０μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ加えた。その溶液を抗体固相化ウェルに加え３７℃１時間インキュベートした。
（５）抗体固相化ウェルを、ＰＢＳＴ  ２５０μＬで３回洗浄した。洗浄後のウェルに５０μＬのＴＭＢ基質溶液を加え室温で５分反応を行った。１Ｎ硫酸で反応停止後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。【００９７】
その結果、ＡＡＬは、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰまたはＨＢｓ抗原−ＨＲＰの存在下で、ＰＳＡ結合ＡＡＬ反応性糖鎖を濃度依存的に検出することができた（表１０、図１７）。【００９８】
【表１０】
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【００９９】
以上より、レクチンは、レクチン反応性標識抗体またはレクチン反応性標識抗原の存在下で、ＡＦＰ−Ｌ３のみならず、ＰＳＡ等の他のレクチン反応性糖タンパク質を検出できることが示された。【０１００】
実施例１１：糖タンパク質によるレクチンと標的分子との結合力の増強（１）
本実施例は、糖タンパク質によるレクチンと標的分子との結合力の増強について証明するため行った。標的分子（ＡＦＰ−Ｌ３）とレクチン（ＬＣＡ）の反応後に洗浄し、糖タンパク質（Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰまたはＨＢｓ抗原−ＨＲＰ）で検出した条件（洗浄条件）と、標的分子（ＡＦＰ−Ｌ３）を糖タンパク質（Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰまたはＨＢｓ抗原−ＨＲＰ）の存在下でレクチン（ＬＣＡ）と反応させた条件（同時添加条件）で、標的分子の検出能に差があるか検討した。洗浄回数は、条件間でそろえた。【０１０１】
具体的には、検討は、以下のとおり行った。
（１）ａｎｔｉ−ＡＦＰ  Ｆ（ａｂ’）２を１０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。Ｆ１６  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）において、希釈された溶液  １００μＬを４℃２４時間インキュベートして、上記抗体を固相化した。
（２）抗体固相化ウェルを、ＰＢＳＴ  ３００μＬで３回洗浄した後、１０％ブロッキング試薬  ２００μＬで３７℃１時間ブロッキングした。
（３）抗体固相化ウェルを、ＰＢＳＴ  ３００μＬで３回洗浄した。その後、ミュータスワコーＡＦＰ−Ｌ３の測定値から濃度を換算したＡＦＰ−Ｌ３溶液とＡＦＰ−Ｌ１溶液をそれぞれ１０％ブロッキング試薬で５００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈した。その希釈された溶液  １００μＬを加え３７℃１時間インキュベートした。
（４）抗体固相化ウェルを、ＰＢＳＴ  ３００μＬで３回洗浄した。洗浄条件では、ＬＣＡを１００μｇ／ｍＬとなるように１０％ブロッキング試薬で希釈し、その希釈溶液  １００μＬを抗体固相化ウェルに加え３７℃１時間インキュベートした。同時添加条件では、１０％ブロッキング試薬のみを抗体固相化ウェルに１００μＬ加え、３７℃１時間インキュベートした。
（５）抗体固相化ウェルを、ＰＢＳＴ  ３００μＬで３回洗浄した。洗浄条件では、実施例１で調製したマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２抗体Ａ−ＨＲＰ  ５μｇ／ｍＬまたは実施例６で調製したＨＢｓ抗原−ＨＲＰを２μｇ／ｍＬとなるように１０％ブロッキング試薬で希釈し、その希釈溶液  １００μＬを抗体固相化ウェルに加え３７℃１時間インキュベートした。同時添加条件では、実施例１で調製したマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２抗体Ａ−ＨＲＰ  ５μｇ／ｍＬまたはＨＢｓ抗原−ＨＲＰを２μｇ／ｍＬとなるように１０％ブロッキング試薬で希釈し、さらにＬＣＡを１００μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ添加した。その希釈された溶液  １００μＬを抗体固相化ウェルに加え、３７℃１時間インキュベートした。
（６）抗体固相化ウェルを、ＰＢＳＴ  ３００μＬで３回洗浄した。洗浄後のウェルにＴＭＢ基質溶液  １００μＬを加え室温で５分反応を行った。１Ｎ硫酸で反応停止後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。【０１０２】
その結果、ＡＦＰ−Ｌ３とレクチン（ＬＣＡ）との反応後に洗浄ステップを入れることで、ＡＦＰ−Ｌ３に対する反応性は著しく減弱した（図１８、１９）。ＡＦＰ−Ｌ３を、標識糖タンパク質（Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰまたはＨＢｓ抗原−ＨＲＰ）の存在下でレクチン（ＬＣＡ）と反応させた同時添加条件でのみ、ＡＦＰ−Ｌ３を特異的に検出することができた（図１８、１９）。【０１０３】
以上より、レクチン（ＬＣＡ）を糖タンパク質の存在下で標的分子（ＡＦＰ−Ｌ３）と反応させることにより、レクチンと標的分子との結合力が増強することが示された。【０１０４】
実施例１２：糖タンパク質によるレクチンと標的分子との結合力の増強（２）
本実施例は、糖タンパク質によるレクチンと標的分子との結合力の増強について証明するため行った。標的分子（ＡＦＰ結合フコシル化糖鎖）とレクチン（ＡＡＬ）の反応後に洗浄し、糖タンパク質（ＨＢｓ抗原−ＨＲＰ）で検出した条件（洗浄条件）と、標的分子（ＡＦＰ結合フコシル化糖鎖）を糖タンパク質（ＨＢｓ抗原−ＨＲＰ）の存在下でレクチン（ＡＡＬ）と反応させた条件（同時添加条件）で、標的分子の検出能に差があるか検討した。洗浄回数は、条件間でそろえた。【０１０５】
具体的には、検討は、以下のとおり行った。
（１）実施例１１と同様に、ａｎｔｉ−ＡＦＰ  Ｆ（ａｂ’）２を固相化したウェルにそれぞれ５００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈したＡＦＰ−Ｌ３とＡＦＰ−Ｌ１を１００μＬ加え、３７℃１時間インキュベートした。
（２）抗体固相化ウェルを３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄条件では、ＡＡＬを１０μｇ／ｍＬとなるように１０％ブロッキング試薬で希釈し、希釈されたＡＡＬ溶液  １００μＬを抗体固相化ウェルに加え、得られた溶液を３７℃１時間インキュベートした。同時添加条件では、抗体固相化ウェルに１０％ブロッキング試薬のみを１００μＬ加え、得られた溶液を３７℃１時間インキュベートした。
（３）抗体固相化ウェルをＰＢＳＴ  ３００μＬで３回洗浄した。洗浄条件では、実施例６で調製したＨＢｓ抗原−ＨＲＰを２μｇ／ｍＬとなるように１０％ブロッキング試薬で希釈し、希釈された溶液  １００μＬを３７℃１時間インキュベートした。同時添加条件では、実施例６で調製したＨＢｓ抗原−ＨＲＰを２μｇ／ｍＬとなるように１０％ブロッキング試薬で希釈し、希釈されたＨＢｓ抗原−ＨＲＰ溶液に、さらにＡＡＬを１０μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ添加し、抗体固相化ウェルに希釈された溶液  １００μＬを加え３７℃１時間インキュベートした。
（４）（３）で得られた溶液を３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後のウェルに１００μＬのＴＭＢ基質溶液を加え室温で５分反応させた。１Ｎ硫酸で反応停止後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。【０１０６】
その結果、ＡＦＰ結合フコシル化糖鎖とレクチン（ＡＡＬ）との反応後に洗浄ステップを入れることで、ＡＦＰ結合フコシル化糖鎖に対する反応性は著しく減弱した（図２０）。ＡＦＰ結合フコシル化糖鎖を、標識糖タンパク質（ＨＢｓ抗原−ＨＲＰ）の存在下でレクチン（ＡＡＬ）と反応させた同時添加条件でのみ、ＡＦＰ結合フコシル化糖鎖を検出することができた（図２０）。【０１０７】
以上より、レクチン（ＡＡＬ）を糖タンパク質の存在下で標的分子（ＡＦＰ結合フコシル化糖鎖）と反応させることにより、レクチンとその標的分子との結合力が増強することが示された。【０１０８】
実施例１３：Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２を固相に用いた、ＡＦＰ−Ｌ３の検出系の構築
本実験は、実施例１で調製したマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２が固相上でＡＦＰ−Ｌ３を捕捉できるかどうかを証明するため行った。Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体ＡおよびＢ、ならびにＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を有しないマウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体ＣおよびＤを固相化し、次いでＡＦＰ−Ｌ３およびＡＦＰ−Ｌ１をＬＣＡ共存下でこれらの固相化抗体と反応させることにより、マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２がＡＦＰ−Ｌ３を特異的に捕捉できるかどうか検討した。【０１０９】
具体的には、検討は以下のとおり行った。
（１）実施例１で調製した精製マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを１０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。Ｕ９６  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅにおいて、希釈された溶液  ５０μＬを３７℃１時間インキュベートして固相化した。
（２）抗体固相化ウェルをＰＢＳＴ  ２５０μＬで３回洗浄し、１０％ブロッキング試薬  １５０μＬで３７℃２４時間ブロッキングした。
（３）抗体固相化ウェルをＰＢＳＴ  ２５０μＬで３回洗浄し、ミュータスワコーＡＦＰ−Ｌ３の測定値から濃度を換算したＡＦＰ−Ｌ３溶液とＡＦＰ−Ｌ１溶液をそれぞれ１０％ブロッキング試薬で５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、さらにＬＣＡを１００μｇ／ｍＬとａｎｔｉ−ＡＦＰ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰを１μｇ／ｍＬとなるように添加して溶液を調製した。調製された溶液  ５０μＬを抗体固相化ウェルに加え３７℃１時間インキュベートした。
（４）抗体固相化ウェルをＰＢＳＴ  ２５０μＬで３回洗浄した。次いで、ＴＭＢ基質溶液  ５０μＬを加え室温で５分反応させた。１Ｎ硫酸で反応停止後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。【０１１０】
その結果、ＬＣＡは、ＬＣＡ反応性抗体フラグメントＡまたはＢを固相とした条件下でＡＦＰ−Ｌ３を特異的に検出することができた（図２１）。【０１１１】
以上より、固相化されたレクチン反応性糖鎖含有実体をレクチンと併用することによりレクチン標的分子を捕捉できることが示された。【０１１２】
実施例１４：可変領域にＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ−ＨＲＰを用いた、ヘモペキシン（ＨＰＸ）結合糖鎖とトランスフェリン（ＴＦ）結合糖鎖の検出系の構築
可変領域にＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧを用いて、ＡＡＬと共存下で反応させ、肝臓癌患者血清中のＨＰＸ結合ＡＡＬ反応性フコシル化糖鎖とＴＦ結合ＡＡＬ反応性フコシル化糖鎖を検出できるかどうか検討した。【０１１３】
具体的には、検討は以下のとおり行った。
（１）可変領域のアミノ酸配列中にＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧを、実施例１と同様にＨＲＰ標識を行った。
（２）抗ＨＰＸ抗体（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ  Ｃｌｏｎｅ＃６９８８１３）と抗ＴＦ抗体（ａｂｃａｍ  Ｃｌｏｎｅ＃２Ａ２）のＮグリコシダーゼ処理を実施した。Ｎグリコシダーゼ処理は、トリス酸緩衝液にバッファー交換した抗ＨＰＸ抗体に、ＮグリコシダーゼＦ（ＲＯＣＨＥ社）を添加し、３７℃２４時間反応させた。その後、１００ＫＤａの限界ろ過を実施し、Ｎグリコシダーゼを除去した。
（３）Ｎグリコシダーゼ処理を実施した抗ＨＰＸ抗体と抗ＴＦ抗体を２μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈し、Ｃ９６  ＭａｘｉＳｏｕｐ  Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ社）に５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃２４時間固相化した。
（４）２５０μＬの１％ＢＳＡ−ＰＢＳを２００μＬ添加し、４℃２４時間ブロッキングした。
（５）３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５００倍希釈した肝臓癌患者血清２例（ＨＣＣ−１，ＨＣＣ−２）と健常人血清２例（ＮＨＳ−１，ＮＨＳ−２）を、５０μＬ加え３７℃１時間インキュベートした。
（６）３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄し、可変領域にＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧ−ＨＲＰを２μｇ／ｍＬとなるように、希釈液（自社製）で希釈し、さらにＡＡＬ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を２０μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ加え、３７℃１時間インキュベートした。
（７）３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄し、５０μＬのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社）を加え室温で２分反応させ、１Ｎ硫酸で反応停止後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。【０１１４】
その結果、可変領域にＮ型糖鎖結合コンセンサス配列を有するマウスＩｇＧを用いて、ＡＡＬと共存下、肝臓癌患者血清中のＨＰＸ結合ＡＡＬ反応性フコシル化糖鎖（図２２）とＴＦ結合ＡＡＬ反応性フコシル化糖鎖（図２３）を検出できた。【０１１５】
以上より、固相化されたレクチン反応性糖鎖含有実体をレクチンと併用することによりレクチン標的分子を捕捉できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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