(57)【要約】  本発明は、ＨＥＲ２陽性癌等の癌に対する薬物療法の効果を予測可能な指標を提供する。より具体的には、本発明は、以下（１）及び（２）を含む、癌に対する薬物療法の効果の予測方法を提供する：（１）ヒト被験体から採取されたサンプルにおいて、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する１以上のＣｐＧサイト中のシトシン残基のメチル化率を解析すること；並びに（２）解析されたメチル化率に基づいて、癌に対する薬物療法の効果を予測すること。
2017212734.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（１）及び（２）を含む、癌に対する薬物療法の効果の予測方法：
（１）ヒト被験体から採取されたサンプルにおいて、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する１以上のＣｐＧサイト中のシトシン残基のメチル化率を解析すること；並びに
（２）解析されたメチル化率に基づいて、癌に対する薬物療法の効果を予測すること。
【請求項２】
ヒト被験体から採取されたサンプルは、血液、体液、組織、及び細胞からなる群より選択された１又は２以上のサンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣｐＧサイトは、転写開始点を基準にして、５６位から９４位の間に標準的に存在するＣｐＧサイトである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＣｐＧサイトは、転写開始点を基準にして９２位及び９３位に標準的に存在するＣｐＧサイトである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
癌はＨＥＲ２陽性癌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
癌は乳癌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
サンプルにおいて、エストロゲンレセプターの発現を測定することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
薬物療法は、ＨＥＲ２阻害剤による治療である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＨＥＲ２阻害剤は抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗体はトラスツズマブである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
解析が、亜硫酸水素塩、１以上のプライマー、１以上の核酸プローブ、制限酵素、抗メチル化シトシン抗体、及びナノポアからなる群より選ばれる１または２以上の手段を用いて行われる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
解析が、バイサルファイトシーケンシング法、バイサルファイト・パイロシーケンシング法、メチル化特異的ＰＣＲ法、制限酵素ランドマーク・ゲノム・スキャニング（ＲＬＧＳ）法、単一ヌクレオチド・プライマー伸長（ＳＮｕＰＥ）法、ＣｐＧアイランド・マイクロアレイ法、メチライト法、ＣＯＢＲＡ法、質量分析（マスアレイ）法、メチル化特異的制限酵素の使用、高解像度融解解析（ＨＲＭ）法、ナノポア解析法、ＩＣＯＮプローブ法、メチル化特異的ＭＬＰＡ法、又はイムノアッセイにより行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する１以上のＣｐＧサイト中のシトシン残基のメチル化を解析する解析手段を含む、癌に対する薬物療法の効果の診断キット。
【請求項１４】
ＣｐＧサイトは、転写開始点を基準にして、５６位から９４位の間に標準的に存在するＣｐＧサイトである、請求項１３に記載の診断キット。
【請求項１５】
ＣｐＧサイトは、転写開始点を基準にして９２及び９３位に標準的に存在するＣｐＧサイトである、請求項１４に記載の診断キット。
【請求項１６】
解析手段が、亜硫酸水素塩、１以上のプライマー、１以上の核酸プローブ、制限酵素、抗メチル化シトシン抗体、及びナノポアからなる群より選ばれる１または２以上の手段である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項１７】
以下（１）〜（４）を含む、癌に対する薬物療法：
（１）ヒト被験体から採取されたサンプルにおいて、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する１以上のＣｐＧサイト中のシトシン残基のメチル化率を解析すること；並びに
（２）解析されたメチル化率に基づいて、癌に対する薬物療法の効果を予測すること；
（３）癌に対する薬物療法の効果があると予測されたヒトを選択すること；並びに
（４）選択されたヒトに薬物療法を行うこと。
【請求項１８】
以下（１）及び（２）を含む、癌に対する治療の選択方法：
（１）ヒト被験体から採取されたサンプルにおいて、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する１以上のＣｐＧサイト中のシトシン残基のメチル化率を解析すること；並びに
（２）解析されたメチル化率に基づいて、癌に対する治療を選択すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌に対する薬物療法の効果の予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、癌の治療法として、薬物療法や外科的手術などが行われている。例えば、日本乳癌学会のガイドラインでは、遠隔転移のない乳癌患者の治療に際して原則全例外科的手術を行うことが推奨されている。しかし、外科的手術、特に乳房全摘手術は、乳癌治癒の可能性は高いものの、患者にとって乳房喪失の苦しみは大きい。よって、術前薬物療法が奏効した症例にまで全例外科的手術を適用する必要があるか、という点につき議論がある。【０００３】
ところで、癌等の疾患の指標（例、診断マーカー、疾患のリスク評価マーカー）としては、例えば、特定の遺伝子又はタンパク質の発現の有無又はその量の変化、特定の代謝産物の有無又はその量の変化、遺伝的多型（例、ＳＮＰ、ハプロタイプ）、転座、ゲノムＤＮＡのメチル化の有無又はその程度が知られている。このような指標として、例えば、ＨＥＲ２陽性乳癌におけるゲノムＤＮＡメチル化の解析が行われ、ＨＥＲ２陽性乳癌の挙動に関連し得るメチル化サイトが複数見出されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０１５；８８：ｐｐ．３７７−３８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＨＥＲ２陽性癌等の癌症例のうち、術前薬物療法で治癒可能な症例を予測できる指標については、明らかにされていなかった。【０００６】
本発明は、ＨＥＲ２陽性癌等の癌に対する薬物療法の効果を予測可能な指標を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、癌に対する薬物療法の効果を予測可能な指標として、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の非コーディング領域における特定のＣｐＧサイトのメチル化率を利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕以下（１）及び（２）を含む、癌に対する薬物療法の効果の予測方法：
（１）ヒト被験体から採取されたサンプルにおいて、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する１以上のＣｐＧサイト中のシトシン残基のメチル化率を解析すること；並びに
（２）解析されたメチル化率に基づいて、癌に対する薬物療法の効果を予測すること。
〔２〕ヒト被験体から採取されたサンプルは、血液、体液、組織、及び細胞からなる群より選択された１又は２以上のサンプルである、〔１〕に記載の方法。
〔３〕ＣｐＧサイトは、転写開始点を基準にして、５６位から９４位の間に標準的に存在するＣｐＧサイトである、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕ＣｐＧサイトは、転写開始点を基準にして９２位及び９３位に標準的に存在するＣｐＧサイトである、〔３〕に記載の方法。
〔５〕癌はＨＥＲ２陽性癌である、〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６〕癌は乳癌である、〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７〕サンプルにおいて、エストロゲンレセプターの発現を測定することをさらに含む、〔６〕に記載の方法。
〔８〕薬物療法は、ＨＥＲ２阻害剤による治療である、〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９〕ＨＥＲ２阻害剤は抗体である、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕抗体はトラスツズマブである、〔９〕に記載の方法。
〔１１〕解析が、亜硫酸水素塩、１以上のプライマー、１以上の核酸プローブ、制限酵素、抗メチル化シトシン抗体、及びナノポアからなる群より選ばれる１または２以上の手段を用いて行われる、〔１〕〜〔１０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２〕解析が、バイサルファイトシーケンシング法、バイサルファイト・パイロシーケンシング法、メチル化特異的ＰＣＲ法、制限酵素ランドマーク・ゲノム・スキャニング（ＲＬＧＳ）法、単一ヌクレオチド・プライマー伸長（ＳＮｕＰＥ）法、ＣｐＧアイランド・マイクロアレイ法、メチライト法、ＣＯＢＲＡ法、質量分析（マスアレイ）法、メチル化特異的制限酵素の使用、高解像度融解解析（ＨＲＭ）法、ナノポア解析法、ＩＣＯＮプローブ法、メチル化特異的ＭＬＰＡ法、又はイムノアッセイにより行われる、〔１〕〜〔１１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３〕ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する１以上のＣｐＧサイト中のシトシン残基のメチル化を解析する解析手段を含む、癌に対する薬物療法の効果の診断キット。
〔１４〕ＣｐＧサイトは、転写開始点を基準にして、５６位から９４位の間に標準的に存在するＣｐＧサイトである、〔１３〕に記載の診断キット。
〔１５〕ＣｐＧサイトは、転写開始点を基準にして９２及び９３位に標準的に存在するＣｐＧサイトである、〔１４〕に記載の診断キット。
〔１６〕解析手段が、亜硫酸水素塩、１以上のプライマー、１以上の核酸プローブ、制限酵素、抗メチル化シトシン抗体、及びナノポアからなる群より選ばれる１または２以上の手段である、〔１３〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載の診断キット。
〔１７〕以下（１）〜（４）を含む、癌に対する薬物療法：
（１）ヒト被験体から採取されたサンプルにおいて、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する１以上のＣｐＧサイト中のシトシン残基のメチル化率を解析すること；並びに
（２）解析されたメチル化率に基づいて、癌に対する薬物療法の効果を予測すること；
（３）癌に対する薬物療法の効果があると予測されたヒトを選択すること；並びに
（４）選択されたヒトに薬物療法を行うこと。
〔１８〕以下（１）及び（２）を含む、癌に対する治療の選択方法：
（１）ヒト被験体から採取されたサンプルにおいて、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する１以上のＣｐＧサイト中のシトシン残基のメチル化率を解析すること；並びに
（２）解析されたメチル化率に基づいて、癌に対する治療を選択すること。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の予測方法は、例えば、ＨＥＲ２陽性癌等の癌の患者に対する外科的手術の要否及び薬物療法の選択の判断における指標として有用である。
本発明のキットは、例えば、本発明の予測方法の簡便な実施に有用である。
本発明の薬物療法は、抗癌剤による効果的な治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の転写開始点近傍の構造を示す図である。転写開始点のｇを１位として、５つのＣｐＧサイト（＃１〜＃５）を含む５６〜９４位のヌクレオチド残基からなるヌクレオチド配列をパイロシーケンス法で読み込んだ。
【図２】図２は、病理学的完全奏効（ｐＣＲ）２２例及びｐＣＲ以外４５例における、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の＃１のＣｐＧサイトのメチル化率を示す図である。
【図３】図３は、奏効例４９例及び非奏効例１８例における、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の＃１のＣｐＧサイトのメチル化率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、癌に対する薬物療法の効果の予測方法を提供する。
【００１２】
癌は、任意の癌である。癌としては、例えば、乳癌（例、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌）、卵巣癌、子宮癌（例、子宮内膜癌、子宮頚癌）、肺癌（例、扁平上皮がん、腺がんおよび大細胞がん等の非小細胞癌、ならびに小細胞癌）、消化器系癌（例、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌）、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胸腺癌、脾臓癌、甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、骨癌、皮膚癌、脳腫瘍、肉腫、黒色腫、芽細胞腫（例、神経芽細胞腫）、腺癌、扁平細胞癌、固形癌、上皮性癌、中皮腫が挙げられるが、乳癌が好ましい。また、癌としては、例えば、ＨＥＲ２陽性癌、ＥＧＦＲ陽性癌、ｃ−ＭＥＴ陽性癌、ＡＬＫ陽性癌、ＰＤＧＦＲ陽性癌、ｃ−ＫＩＴ陽性癌が挙げられるが、ＨＥＲ２陽性癌が好ましい。特に好ましくは、癌はＨＥＲ２陽性乳癌である。
【００１３】
癌に対する薬物療法としては、例えば、抗癌剤による治療が挙げられる。抗癌剤としては、例えば、微小管阻害剤、抗がん抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、プラチナ製剤、アルキル化剤が挙げられる。抗癌剤はまた、分子標的薬であってもよい。このような分子標的薬としては、例えば、ＨＥＲ２阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤（例、ゲフィチニブ、ラパチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ）、ｃ−ＭＥＴ阻害剤（例、ＰＨＡ−６６５７５２、ＳＵ１１２７４、ＸＬ−８８０）、ＡＬＫ阻害剤（例、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＴＡＥ６８４、ＰＦ−２３４１０６６）、ＰＤＧＦＲ阻害剤（例、イマチニブ、デサチニブ、ヴァラチニブ）、ｃ−ＫＩＴ阻害剤（例、スニチニブ、マシチニブ、モテサニブ）が挙げられる。
【００１４】
好ましくは、癌に対する薬物療法は、ＨＥＲ２阻害剤による治療である。ＨＥＲ２は、上皮成長因子（ＥＧＦＲ）と同じファミリーに属する受容体型チロシンキナーゼである。ＨＥＲ２は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及びチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインが一本鎖で連結した構造を有する（例、Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，Ｖｏｌ．２３０，Ｎｏ．４７３０，ｐｐ．１１３２−１１３９、及びＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１００５８６２．１を参照）。ＨＥＲ２阻害剤としては、例えば、抗体（例、トラスツズマブ、ペルツヅマブ）、低分子有機化合物（例、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ等のＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤）、薬物結合抗体（例、Ｔ−ＤＭ１）が挙げられる。
【００１５】
癌に対する薬物療法においては、複数の抗癌剤を併用することができる。併用される複数の抗癌剤としては、例えば、上述した２以上の抗癌剤の組み合わせ、及び上述した１以上の抗癌剤と他の抗癌剤との組み合わせが挙げられる。他の抗癌剤としては、例えば、タキサン系抗癌剤（例、パクリタキセル）等の微小管阻害剤、アントラサイクリン系（例、アドリアシン）、アロマターゼ阻害剤（例、レトロゾール）が挙げられる。
【００１６】
癌に対する薬物療法としては、上記の既知の抗癌剤に加えて、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の発現を抑制または促進し得る医薬、特に発現を抑制し得る医薬、並びにＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の特に非コーディング領域をメチル化し得る医薬の使用等が挙げられる。
【００１７】
本発明の方法は、以下（１）及び（２）を含む：
（１）ヒト被験体から採取されたサンプルにおいて、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する１以上のＣｐＧサイト中のシトシン残基のメチル化率を解析すること；並びに
（２）解析されたメチル化率に基づいて、癌に対する薬物療法の効果を予測すること。
【００１８】
工程（１）において、サンプルとしては、血液、体液、組織、及び細胞からなる群より選択された１又は２以上のサンプルを使用することができるが、上述した癌に対応する組織サンプルを好適に使用できる。本発明では、このような癌組織サンプルに含まれるゲノムＤＮＡにおいて、特定のＣｐＧサイトが解析される。ゲノムＤＮＡは、癌組織サンプルから、任意の方法により適宜抽出することができる。癌組織サンプルとしては、例えば、針生検等の生検により採取されたものを用いることができる。癌組織サンプルは、予備処理に付されてもよい。このような予備処理としては、例えば、抽出、細胞固定、組織固定、組織薄片化、細胞解離処理、加熱、凍結、冷蔵、液状化が挙げられる。
【００１９】
癌組織サンプルは、通常、癌細胞と正常細胞（非癌細胞）を含む細胞集団のサンプルである。したがって、純粋な癌細胞集団のゲノムＤＮＡのメチル化率を実測するため、癌組織サンプルから癌細胞集団を選別して回収してもよい。このような回収を可能にする好ましい方法の例は、レーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ）法である。ＬＭＤ法によれば、組織切片に含まれる癌細胞集団をレーザー（例、赤外線レーザー、紫外線レーザー）で切り出すことにより、回収することができる。ＬＭＤ法は、例えば、ＬＭＤ６５００／７０００（Ｌｅｉｃａ）、ＰＡＬＭ  ＭｉｃｒｏＢｅａｍ（ＺＥＩＳＳ）等の装置を用いて行うことができる。また、このような回収を可能にする他の方法としては、例えば、癌細胞マーカー（例、タンパク質マーカー）及び必要に応じて標識（例、蛍光標識）を利用して癌細胞を選別できる任意の方法（例、ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【００２０】
本発明において解析されるＣｐＧサイトは、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する１以上のＣｐＧサイトである。特に、転写開始点を基準にして５６位から９４位の間に標準的に存在するＣｐＧサイトが好ましく、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の転写開始点を基準にして９２及び９３位に標準的に存在するＣｐＧサイトがより好ましい（図１のｃｇ１５８９６３０１を参照）。なお、本明細書において「転写開始点」は、ＧＲＣｈ３７（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｕｉｌｄ  ３７）およびＨｇ１９（ＵＣＳＣ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  １９）に基づいて決定するものとする。このようなＣｐＧサイトは、図１に示される配列番号１のヌクレオチド配列（転写開始点から−１０位のヌクレオチド残基から開始されるヌクレオチド配列）では１０２及び１０３番目のヌクレオチド残基の位置に存在し、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子における転写開始点の周辺ヌクレオチド配列を記載した配列番号２のヌクレオチド配列では１０９２及び１０９３番目のヌクレオチド残基の位置に存在する。勿論、ヒト被験体間でゲノムＤＮＡの変異（例、ＤＮＡの欠失、挿入、置換）が存在することがあるので、上記位置、及び上記配列番号のヌクレオチド配列は、異なることがある。例えば、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の転写開始点と上記ＣｐＧサイトとの間に１個のヌクレオチド残基の挿入又は欠失であるＳＮＰ（一塩基多型）が存在する場合、上記位置は１つ異なる。また、ゲノムＤＮＡに変異が存在する場合、上記配列番号のヌクレオチド配列は異なる。したがって、上記位置、及び上記配列番号のヌクレオチド配列は、参照上の便宜のための「標準的」なものである。あるいは、本発明において解析されるＣｐＧサイトは、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の転写開始点下流の非コーディング領域中に存在するｃａｇｃｇｇｃｔ（例、配列番号１のヌクレオチド配列における９９〜１０６番目のヌクレオチド残基、又は配列番号２のヌクレオチド配列における１０８９〜１０９６番目のヌクレオチド残基）中のＣＧ部分と定義することもできる（５’側のｃａｇ部分及び３’側のｇｃｔ部分が変異していない場合）。当業者であれば、ゲノムＤＮＡの変異が認められるヒト被験体について、ゲノムＤＮＡの変異を考慮して、上記位置に存在するＣｐＧサイトに相当するＣｐＧサイトを適宜決定することができる。
【００２１】
本発明において解析されるメチル化は、シトシン残基の５位のメチル化である。
【００２２】
メチル化率の解析は、当該分野において公知である任意の方法により行うことができる。例えば、解析は、亜硫酸水素塩、１以上のプライマー、１以上の核酸プローブ、制限酵素、抗メチル化シトシン抗体、及びナノポアからなる群より選ばれる１または２以上の解析手段を用いて行うことができる。
【００２３】
亜硫酸水素塩〔バイサルファイト（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）〕は、非メチル化シトシンをウラシルに変換する一方で、メチル化シトシンをウラシルに変換しない。よって、重亜硫酸水素塩は、このような性質のため、メチル化シトシンの解析では他の解析手段と組み合わせて汎用されている。
【００２４】
１以上のプライマー（例、１〜３個のプライマー）は、シークエンシング用プライマー、若しくは遺伝子増幅用プライマー（例、ＰＣＲプライマー）、又はその組み合わせである。プライマーは、目的のＣｐＧサイトを解析できるように適宜設計することができる。例えば、プライマーは、目的のＣｐＧサイトの下流領域（例、配列番号２のヌクレオチド配列における１０９４〜２００１番目のヌクレオチド残基からなる部分中の任意の領域）にアニールするように、又は目的のＣｐＧサイトを含む遺伝子領域を増幅するため、目的のＣｐＧサイトの上流領域（例、配列番号２のヌクレオチド配列における１〜１０９１番目のヌクレオチド残基からなる部分中の任意の領域）及び下流領域（例、配列番号２のヌクレオチド配列における１０９４〜２００１番目のヌクレオチド残基からなる部分中の任意の領域）においてセンス鎖及びアンチセンス鎖がアニールするように設計することができる。
【００２５】
１以上の核酸プローブ（例、１〜３個の核酸プローブ）は、目的のＣｐＧサイトを含む領域（例、配列番号１のヌクレオチド配列における１〜１２０番目のヌクレオチド残基からなる部分中の目的のＣｐＧサイトを含む部分）又はその上流領域（例、配列番号２のヌクレオチド配列における１〜１０９１番目のヌクレオチド残基からなる部分中の任意の領域）若しくは下流領域（例、配列番号２のヌクレオチド配列における１０９４〜２００１番目のヌクレオチド残基からなる部分中の任意の領域）にハイブリダイズするように設計することができる。核酸プローブは、遊離の形態、又は固相に固定された形態において用いることができる。固相としては、例えば、粒子（例、磁性粒子）；アレイ、メンブレン（例、ニトロセルロース膜、ろ紙）、カラム等の支持体；及びプレート（例、マルチウェルプレート）、チューブ等の容器が挙げられる。固相の材料としては、例えば、ガラス、プラスチック、及び金属が挙げられる。核酸プローブはまた、抗メチル化シトシン抗体を用いるメチル化シトシンの解析において詳述したような核酸プローブであってもよい。
【００２６】
制限酵素は、メチル化特異的又は非特異的制限酵素であり、上述したような亜硫酸水素塩、１以上のプライマー、１以上の核酸プローブと適宜組み合わせて用いることができる。
【００２７】
具体的には、上述したような解析手段を用いる解析方法としては、例えば、バイサルファイトシーケンシング法、バイサルファイト・パイロシーケンシング法、メチル化特異的ＰＣＲ法、制限酵素ランドマーク・ゲノム・スキャニング（ＲＬＧＳ）法、単一ヌクレオチド・プライマー伸長（ＳＮｕＰＥ）法、ＣｐＧアイランド・マイクロアレイ法、メチライト法、ＣＯＢＲＡ法、質量分析（マスアレイ）法、メチル化特異的制限酵素の使用、高解像度融解解析（ＨＲＭ）法、ナノポア解析法、ＩＣＯＮプローブ法、メチル化特異的ＭＬＰＡ法が挙げられる。これらの方法は、当該分野において周知である（例、特開２０１２−０９０５５５号公報、特開２０１４−０３６６７２号公報、特表２０１０−５３８６３８号公報、再表２００９／１３６５０１号公報）。
【００２８】
解析はまた、抗メチル化シトシン抗体を用いて行うことができる。抗メチル化シトシン抗体を用いるメチル化シトシンの解析は、当該分野において周知である（例、ＷＯ２０１５／０２５８６２；ＷＯ２０１５／０２５８６３；ＷＯ２０１５／０２５８６４；ＷＯ２０１６／０５２３６８；特開２０１２−２３００１９号公報；ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３，３７−４２（２００６）；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．  ２０１２，８４，７５３３−７５３８）。抗メチル化シトシン抗体は、上述したような１または２以上の解析手段と組み合わされて用いられてもよい。具体的には、このような解析手段を用いる方法としては、例えば、抗メチル化シトシン抗体、及び異種核酸プローブ（例、ノーマルＲＮＡプローブ、修飾ＲＮＡプローブ）を組み合わせて用いる方法（例、ＷＯ２０１５／０２５８６２）；抗メチル化シトシン抗体、並びに固相プローブ及び捕捉プローブを組み合わせて用いる方法（例、ＷＯ２０１５／０２５８６３）；抗メチル化シトシン抗体、並びに吸収剤ポリヌクレオチド及び捕捉プローブを組み合わせて用いる方法（例、ＷＯ２０１５／０２５８６４）；抗メチル化シトシン抗体、及び修飾核酸塩基対合性異種核酸プローブを組み合わせて用いる方法（例、ＷＯ２０１６／０５２３６８）が挙げられる。抗メチル化シトシン抗体と組み合わせて用いられる核酸プローブは、本発明において解析される上記ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ鎖ハイブリダイズして、当該ＤＮＡ鎖と核酸プローブからなる二本鎖構造部分が形成されたときに、ＣｐＧサイト中のメチルシトシン残基が核酸プローブと不対部分を形成するように（換言すれば、相補的に結合しないように）、設計されてもよい（例、ＷＯ２０１５／０２５８６２）。したがって、核酸プローブは、不対部分に対応するヌクレオチド残基として、メチルシトシン残基と相補的に結合し得るグアニン残基以外のヌクレオチド残基（例、シトシン残基、チミン残基、アデニン残基、ウラシル残基）を有していてもよい。あるいは、核酸プローブは、このような不対部分が形成されないように設計されてもよい（例、ＷＯ２０１６／０５２３６８）。
【００２９】
抗メチル化シトシン抗体を用いる方法は、当該分野において公知である任意の免疫学的方法により行うことができる。具体的には、このような方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、ＣＬＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、凝集法、免疫染色、フローサイトメトリー法、バイオレイヤー干渉法、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  ＰＬＡ法、化学増幅型ルミネッセンス・プロキシミティ・ホモジニアス・アッセイ、ラインブロット法、ウエスタンブロット法が挙げられる。
【００３０】
本発明において解析されるメチル化率は、癌細胞における上記ＣｐＧ中のシトシン残基のメチル化の割合である。メチル化率の測定は、当該分野において周知である（例、特開２０１２−０９０５５５号公報、特開２０１４−０３６６７２号公報、特表２０１０−５３８６３８号公報、再表２００９／１３６５０１号公報）。
【００３１】
一実施形態では、メチル化率は、癌組織サンプルから癌細胞を選別せずに解析される。癌組織サンプルは、通常、癌細胞と正常細胞を含む。このような癌組織サンプルにおいてメチル化率を解析した場合、癌細胞のメチル化率は、癌組織サンプルにおける癌細胞率〔癌細胞／（癌細胞＋正常細胞）〕で実測メチル化率を補正することにより算出することができる。癌組織サンプルにおける癌細胞率は、当該分野における任意の方法により得ることができる。例えば、癌細胞率は、検鏡試験、又は癌細胞及び／若しくは正常細胞マーカー（例、タンパク質マーカー）並びに標識（例、蛍光標識）を用いる方法により得ることができる。あるいは、このような癌組織サンプルにおいてメチル化率を解析した場合、メチル化率は、癌組織サンプルにおける正常細胞存在率〔正常細胞／（癌細胞＋正常細胞）〕及び正常細胞のメチル化率を考慮してさらに補正されてもよい。
【００３２】
別の実施形態では、メチル化率は、癌組織サンプルから癌細胞を選別した後に解析される。この場合、メチル化率として、実測メチル化率をそのまま利用してもよい。癌組織サンプルからの癌細胞の選別は、上述したような方法により行うことができる。
【００３３】
工程（２）において、解析されたメチル化率に基づいて、癌に対する薬物療法の効果が予測される。解析されたメチル化率は、基準値と比較するための指標として利用される。癌に対する薬物療法が有効である被験体群（有効群）は、癌に対する薬物療法が有効でない被験体群（非有効群）に比し、上記ＣｐＧサイトのメチル化率が有意に高い。したがって、本発明の方法によれば、上記ＣｐＧサイトのメチル化率が基準値以上のとき、被験体は、癌に対する薬物療法が有効である可能性が高い、及び／又は癌に対する薬物療法が有効でない可能性が低いと予測することができる。また、上記ＣｐＧサイトのメチル化率が基準値未満のとき、被験体は、癌に対する薬物療法が有効である可能性が低い、及び／又は癌に対する薬物療法が有効でない可能性が高いと予測することができる。
【００３４】
有効群及び非有効群の設定は、有効性の基準を適切に定義することにより行うことができる。例えば、有効性は、病理学的完全奏効（Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ｐＣＲ）、又は奏効（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を基準に設定されてもよい。病理学的完全奏効及び奏効の詳細については、実施例を参照のこと。
【００３５】
上記基準値としては、例えば、有効群及び非有効群を鑑別し得るように適切に設定されたカットオフ値を利用することができる。カットオフ値は、その値を基準として疾患の判定をした場合に、高い診断感度（有病正診率）及び高い診断特異度（無病正診率）の両方を満たす値である。
【００３６】
診断感度（又は単に感度）は、特定状態を有する被験体のうち、正しく診断される被験体の割合である。特定状態を有する全ての被験体について「陽性」の結果が得られる場合、感度は１００％である。
【００３７】
診断特異度（又は単に特異度）は、特定状態を有しない被験体のうち、正しく診断される被験体の割合である。特定状態を有しない全ての被験体について「陰性」の結果が得られる場合、特異度は１００％である。
【００３８】
カットオフ値の算出方法は、本分野において周知である。例えば、有効群及び非有効群において上記ＣｐＧサイトのメチル化率を解析し、任意のメチル化率における有効群と非有効群との診断感度及び診断特異度を求め、これらの値に基づいて、ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線を作成する。そして、診断感度及び診断特異度が最大となるようなメチル化率を求め、その値をカットオフ値とすることができる。また、任意のメチル化率における診断効率（全症例数に対する、有病正診症例と無病正診症例の合計数の割合）を求め、最も高い診断効率が算出されるメチル化率をカットオフ値とすることもできる。あるいは、癌に対する薬物療法が本来有効でない被験体が、癌に対する薬物療法が有効である（偽陽性）と誤って予測されること（ひいては、外科的治療の実施時期が遅延して病状が悪化すること）を極力排除する観点から、診断特異度をより重視してカットオフ値を決定してもよい。
【００３９】
本発明の方法は、癌組織サンプルにおいて、癌の性質に関連する他のマーカーを測定することをさらに含んでいてもよい。他のマーカーとしては、例えば、特定の遺伝子、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ又はタンパク質の発現の有無又はその量の変化、特定の代謝産物（例、リン酸化タンパク質等の修飾タンパク質）の有無又はその量の変化、遺伝的多型（例、ＳＮＰ、ハプロタイプ）、転座、ゲノムＤＮＡのメチル化又はその程度、が挙げられる。本発明の方法は、他の癌マーカーをさらに測定することにより、診断の特異度を向上させることができる。例えば、乳癌では、病理診断においてエストロゲンレセプターが陰性である場合に、さらに診断の特異度を上げられることが確認されている（実施例）。なお、本明細書において、エストロゲンレセプターとは、特に記載のない限りＥＲαを指すものとする。エストロゲンレセプターの発現の有無を検査する方法については、特に制限はないが、通常用いられる酵素抗体法（ＬＳＡＢ）を好適に使用できる。
【００４０】
本発明はまた、癌に対する薬物療法の効果の診断キットを提供する。
【００４１】
本発明の診断キットは、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する１以上のＣｐＧサイト、より好ましくは転写開始点を基準にして５６位から９４位の間に標準的に存在するＣｐＧサイト、さらに好ましくはＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の転写開始点を基準にして９２及び９３位に存在するＣｐＧサイト中のシトシン残基のメチル化の解析手段を含む。このような解析手段としては、例えば、上述したような、亜硫酸水素塩、１以上のプライマー、１以上の核酸プローブ、制限酵素、抗メチル化シトシン抗体、及びナノポアからなる群より選ばれる１または２以上の手段が挙げられる。本発明の診断キットは、上述したような解析方法の実施のために用いることができる。
【００４２】
好ましくは、本発明の診断キットは、上記ＣｐＧサイトの特異的な解析を可能にする手段と、メチル化シトシンの解析を可能にする手段（例、亜硫酸水素塩、抗メチル化シトシン抗体、又はメチル化特異的制限酵素）との組み合わせを含む。上記ＣｐＧサイトの特異的な解析を可能にする手段としては、例えば、１以上のプライマー、１以上の核酸プローブ、制限酵素、ナノポアが挙げられるが、１以上のプライマー、又は１以上の核酸プローブが好ましい。核酸プローブは、固相に固定されていてもよい。メチル化シトシンの解析を可能にする手段としては、例えば、亜硫酸水素塩、シーケンシング用プライマー、抗メチル化シトシン抗体、メチル化特異的制限酵素、ＩＣＯＮプローブ法が挙げられるが、亜硫酸水素塩又は抗メチル化シトシン抗体が好ましい。
【００４３】
本発明の診断キットは、上記解析手段に加え、補助的な手段を含んでいてもよい。このような補助的な手段としては、例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、緩衝液、安定化剤、酵素（例、ＤＮＡポリメラーゼ、スルフリラーゼ、アピラーゼ）、標識物質、及び酵素の基質が挙げられる。
【００４４】
本発明の診断キットはまた、抗メチル化シトシン抗体を含む場合、例えば、２次抗体（例、抗ＩｇＧ抗体）、２次抗体の検出試薬をさらに含んでいてもよい。
【００４５】
本発明の診断キットはさらに、生体サンプルを採取し得る器具をさらに含んでいてもよい。生体サンプルを採取し得る器具は、被験体から生体サンプルを入手可能である限り特に限定されないが、例えば、生検針等の生検器具が挙げられる。
【００４６】
実施例で使用したバイサルファイト・パイロシーケンシングでは、上記ＣｐＧサイトの特異的な解析を可能にする手段として、（ａ）一対のＰＣＲプライマー及び（ｂ）シーケンシングプライマーが用いられ、メチル化シトシンの解析を可能にする手段として、（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｄ）スルフリラーゼ、（ｅ）ルシフェラーゼ及びルシフェリン、（ｆ）アピラーゼ、（ｇ）ｄＮＴＰ、（ｈ）亜硫酸水素塩が用いられている。したがって、本発明の診断キットは、上記ＣｐＧサイトに対するバイサルファイト・パイロシーケンシング用キットである場合、例えば上記（ａ）〜（ｈ）の構成要素を含んでいてもよい。
【００４７】
本発明はまた、癌に対する薬物療法を提供する。
【００４８】
本発明の薬物療法は、以下を含む：
（１）ヒト被験体から採取された癌組織サンプルにおいて、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する１以上のＣｐＧサイト中のシトシン残基のメチル化率を解析すること；
（２）解析されたメチル化率に基づいて、癌に対する薬物療法の効果を予測すること；
（３）癌に対する薬物療法の効果があると予測されたヒトを選択すること；並びに
（４）選択されたヒトに薬物療法を行うこと。
【００４９】
本発明の薬物療法における（１）及び（２）は、本発明の予測方法における（１）及び（２）と同様にして行うことができる。
【００５０】
本発明の薬物療法における（３）は、（２）の予測に基づき、癌に対する薬物療法の効果があると予測されたヒトを選択することにより行うことができる。
【００５１】
本発明の薬物療法における（４）では、選択されたヒトに薬物療法が行われる。薬物療法は、上述したような抗癌剤による治療である。例えば、癌がＨＥＲ２陽性癌である場合、ＨＥＲ２阻害剤による薬物療法が行われる。抗癌剤による治療は、その抗癌剤について採用されている通常の様式で行うことができる。
【００５２】
本発明はまた、以下（１）及び（２）を含む、癌に対する治療を選択する方法を提供する：
（１）ヒト被験体から採取されたサンプルにおいて、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する１以上のＣｐＧサイト中のシトシン残基のメチル化率を解析すること；並びに
（２）解析されたメチル化率に基づいて、癌に対する治療を選択すること。
【００５３】
本発明の選択方法における（１）は、本発明の予測方法における（１）と同様にして行うことができる。
【００５４】
本発明の選択方法における（２）のメチル化率の解析は、本発明の予測方法における（２）の解析と同様にして行うことができる。（２）で解析されたメチル化率では、既存の抗癌剤（例えば、トラスツズマブ）による薬物療法の効果が見込まれない場合、例えば、他の抗癌剤に変更する、または他の抗癌剤を併用するという選択を行うことができる。また、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の発現を抑制または促進し得る医薬や、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の特に非コーディング領域をメチル化し得る医薬の使用を組み合せるという選択も行うことができる。さらには、放射線療法等の他の非外科的療法を組み合せるという選択も行うことができる。このように、本発明の方法では、（２）で解析されたメチル化率に基づいて、治療対象のヒトに対して、より有効な治療方法を選択することを可能とする。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。【００５６】
１．組織サンプル
術前療法の臨床試験に登録された６７人の患者から、組織サンプルを採取した。この試験におけるすべてのサンプルは、パクリタキセル（８０ｍｇ／ｍ２・週）とトラスツズマブ（初回投与量４ｍｇ／ｋｇ、次いで２ｍｇ／ｋｇ・週）の投与を毎週、計１２回受けた患者より採取した。患者には乳腺切除術を施し、治療効果を病理学的に判定する。この試験のプロトコールは、国立がん研究センター倫理委員会で承認され、ＵＭＩＮ臨床試験登録システムに登録された。すべての患者に対し、書面によるインフォームドコンセントが実施された。【００５７】
術前療法開始前の原発腫瘍の針生検検体を採取した。１人の患者につき、２つのサンプルを取得し、２種類の方法で固定した。１つのサンプルは、中性緩衝ホルマリンで固定した後、薄層をＨ＆Ｅ染色し、検鏡試験に供した。もう１つのサンプルは、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  （キアゲン社、ドイツ）を用いて固定した後、低融点パラフィンで包埋し、１０μｍ厚の薄片１０枚からＤＮＡ／ＲＮＡ抽出を実施した。病理学者により、生検試料の検鏡試験における全細胞に対する癌細胞分画の割り出し、分子解析に十分な数の腫瘍細胞が含まれる生検試料の選別が行われた。また、病理学者により、手術時の試料の解析による治療効果判定が行われた。【００５８】
本発明において、病理学的完全奏効（Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ｐＣＲ）とは、表１の治療効果判定基準（日本乳癌学会編「臨床・病理乳癌取扱規約」第１７版８４ページ（２０１２）金原出版より引用）のＧｒａｄｅ３に該当し、かつ、乳管内の癌細胞の遺残も見られない場合を指すものとする。一方、ｐＣＲには分類できない場合であっても、表１のＧｒａｄｅ２以上の患者については、術前治療の効果が高いと予測することができるため、本明細書においては、これらの患者をｐＣＲとは別に「奏効例」として取り扱うものとする。【００５９】
【表１】
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【００６０】
６７例のＨＥＲ２陽性乳癌は、浸潤性乳管癌６４例、浸潤性小葉癌２例、他の組織型１例に分類された。ホルモンについて、３４例（５０．７％）はエストロゲンレセプター陽性であり、２６例（３８．８％）はプロゲステロンレセプター陽性であった。腫瘍分画（組織サンプル中の癌細胞率）が４０％以上のサンプルのみを使用した。６７例のＨＥＲ２陽性乳癌患者の詳細な臨床病理学的特性を表２に示す。【００６１】
【表２】
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【００６２】
２．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子領域のバイサルファイト・パイロシーケンシング
図１にＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の部分的なヌクレオチド配列を示す。ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の転写開始点のｇを１位として、５つのＣｐＧサイト（＃１〜＃５）を含む５６〜９４位のヌクレオチド残基からなるヌクレオチド配列をパイロシーケンスで読み込んだ。５つのＣｐＧサイトのメチル化率を、以下の手順により測定し、算出した。【００６３】
既報（Ｔ．  Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  １２８（２０１１）ｐｐ．３３−３９）の方法にて、ゲノムＤＮＡ  １μｇを用いた亜硫酸水素ナトリウム修飾を実施した。修飾ＤＮＡは、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー  ４０μＬに懸濁し、そのうち２μＬを分取してバイサルファイト・パイロシーケンシングに供した。パイロシーケンシングに用いたプライマーは、キアゲン社（ＰｙｒｏＭａｒｋ  ＣｐＧ  Ａｓｓａｙ）より入手した。ビオチン標識したＰＣＲ産物を０．２μＭパイロシーケンシングプライマーにアニーリングし、ＰＳＱ９６  パイロシーケンシングシステム（キアゲン社、米国カリフォルニア州）を用いてパイロシーケンシングを実施した。メチル化率は、ＰＳＱ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ソフトウェア（キアゲン社）を用いて算出した。【００６４】
メチル化率は、０（完全にメチル化なし）から１（完全にメチル化された）の範囲のβ値として算出し、これを百分率で表示した。また、メチル化率の測定値は、試料中の癌細胞率を用いて補正した。具体的な補正式は、下記の通りである。補正メチル化率の上限値は１００とし、下記式により計算値が１００を超えた場合は「補正メチル化率１００％」として解析した。
補正メチル化率（％）＝１００×実測メチル化率（％）／試料中の癌細胞率（％）
ここでいう癌細胞率は、検鏡試験により求めた。【００６５】
３．統計解析
２群間の相対頻度の有意差は、フィッシャーの直接確率検定を用いて算出した。治療応答症例群と治療不応答症例群との間の補正メチル化率の有意差は、マン−ホイットニーＵ検定により評価した。単変量解析において、オッズ比（ＯＲｓ）及び９５％信頼区間（９５％  ＣＩ）を算出した。トラスツズマブと化学療法の併用に対する応答性について、明確な傾向に独立的に関連し得る指標を見出すため、交絡要因を除去した後に多変量ロジスティック回帰分析を行った。統計解析は、すべてＰＡＳＷ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｖｅｒ．１８．０．０（ＳＰＳＳ株式会社）を用いて実施した。【００６６】
４．結果
表３に、ｐＣＲ群、その他の症例群における、図１中の＃１のＣｐＧサイトの補正メチル化率、＃１〜＃５のＣｐＧサイトの補正メチル化率の平均値について、各群の平均値及び２群間の有意差（Ｐ値）を示す。＃１のＣｐＧサイトの補正メチル化率も、＃１〜＃５の補正メチル化率の平均値も、ｐＣＲ群で有意に高くなることが判明した。特に、図２に示す通り、＃１のＣｐＧサイトで、ｐＣＲ群において、その他の症例群と比して補正メチル化率が顕著に高いことが判明した（Ｐ＝０．００１）。一方で、＃１のＣｐＧサイトにおいても、奏効例群（Ｇ２ａ以上）の補正メチル化率は、非奏効例と比して有意に高いとはいえなかった（Ｐ＝０．１７６、図３）。【００６７】
【表３】
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【００６８】
以下、「ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のメチル化」とは、特に記載のない限り、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の＃１のＣｐＧサイトのメチル化を示すものとする。ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のメチル化率のカットオフを５０％に設定し、５０％以上を「陽性」と判定し、５０％未満を「陰性」と判定し、ｐＣＲを陽性、その他の症例を陰性とした場合の臨床診断成績を表４に示す。同様に、奏効例を陽性、非奏効例を陰性とした場合の臨床診断成績を表５に示す。ｐＣＲを陽性とした場合のメチル化率の臨床診断成績は、感度が７７．２％、特異度が８４．４％であった。一方、奏効例を陽性とした場合のメチル化率の臨床診断成績は、感度が４０．８％、特異度が７７．８％であった。【００６９】
【表４】
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【００７０】
【表５】
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【００７１】
６７症例の臨床病理学的特性を、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のメチル化率の陽性群、陰性群に分けて集計した結果を表５に示す。表６に示す複数の臨床的指標のうち、ホルモンレセプター、特にエストロゲンレセプターの陽性／陰性判定結果が、メチル化率陽性群と陰性群との間の有意差が高く、メチル化率と高い関連性を有していることが示唆された。臨床的腫瘍ステージ（ｃＴ）、リンパ節転移ステージ（ｃＮ）、臨床病期（ｃＳｔａｇｅ）、エストロゲンレセプター（ＥＲ）、プロゲステロンレセプター（ＰｇＲ）、及びＫｉ−６７ラべリングインデックスの多変量解析より、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のメチル化は、ＨＥＲ２標的療法への応答性の独立の予測因子であることが示された（表７）。【００７２】
【表６】
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【００７３】
【表７】
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【００７４】
ＨＥＲ２標的療法への応答性予測の精度（特異度）を高めることを目的として、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のメチル化率にエストロゲンレセプターの結果を組み合わせて臨床評価を行った。なお、エストロゲンレセプターの検査は、乳癌患者のほぼ全例で公知の方法で実施されるものであり、本実施例の６７例についても同様に検査が行われた。ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子のメチル化率が陽性で、かつ、エストロゲンレセプターが陰性である症例を「陽性」、その他の症例を「陰性」と判定し、ｐＣＲを陽性、その他を陰性とした場合の臨床診断成績を表８に示す。同様に、奏効例を陽性、非奏効例を陰性とした場合の臨床診断成績を表９に示す。ｐＣＲを陽性とした場合のメチル化率及びエストロゲンレセプターの組み合わせの臨床診断成績は、感度が５９．１％、特異度が９１．１％であった。一方、奏効例を陽性とした場合のメチル化率及びエストロゲンレセプターの組み合わせの臨床診断成績は、感度が３２．７％、特異度が９４．４％であった。なお、表９で「陽性」判定された非奏効例１例は、腫瘍サイズが非常に大きく、術前療法の効果の有無にかかわらず、外科的手術が強く推奨される症例であった。【００７５】
【表８】
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【００７６】
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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