(57)【要約】高い毛髪再生活性を有する毛髪再生用細胞包埋ビーズ及びその製造方法を提供する。毛髪再生用細胞包埋ビーズは、間葉系細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する。毛髪再生用細胞包埋ビーズの製造方法は、間葉系細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する液滴を作製し、前記生体適合性ハイドロゲルを硬化させ、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製する細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程と、前記細胞包埋硬化ゲル形成体を浮遊培養し、細胞の牽引力により凝集させる凝集工程と、を備える方法である。
2017217393.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有することを特徴とする毛髪再生用細胞包埋ビーズ。
【請求項２】
前記生体適合性ハイドロゲルがゲル化する細胞外マトリックス成分である請求項１に記載の毛髪再生用細胞包埋ビーズ。
【請求項３】
前記細胞外マトリックス成分がＩ型コラーゲンである請求項２に記載の毛髪再生用細胞包埋ビーズ。
【請求項４】
前記間葉系細胞の細胞密度が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以下である請求項１〜３のいずれか一項に記載の毛髪再生用細胞包埋ビーズ。
【請求項５】
間葉系細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する液滴を作製し、前記生体適合性ハイドロゲルを硬化させ、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製する細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程と、
前記細胞包埋硬化ゲル形成体を浮遊培養し、細胞の牽引力により凝集させる凝集工程と、
を備えることを特徴とする毛髪再生用細胞包埋ビーズの製造方法。
【請求項６】
前記細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程において、撥水性表面を有する支持体に滴下し、前記液滴を作製する請求項５に記載の毛髪再生用細胞包埋ビーズの製造方法。
【請求項７】
前記細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程において、前記液滴に含まれる前記間葉系細胞の濃度が、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬである請求項５又は６に記載の毛髪再生用細胞包埋ビーズの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の毛髪再生用細胞包埋ビーズと、
上皮系細胞と、
を備えることを特徴とする毛髪再生用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛髪再生用細胞包埋ビーズ及びその製造方法、並びに毛髪再生用キットに関する。
本願は、２０１６年６月１７日に、日本に出願された特願２０１６−１２０８０８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
臨床応用に足る毛包再生医療の確立には、再生毛包が正常な組織構造を有し、移植部位に適した毛幹を有する毛が、形成、伸長することが必要である。毛等の皮膚付属器を含む外胚葉性付属器官は、通常、胎児期において、上皮系細胞及び間葉系細胞の相互作用により発生する。外胚葉性付属器官の一つである毛包は、個体の生涯にわたって成長と退行（毛周期）とを繰り返し、成長期における毛球部の再生は、毛包器官発生期と同様な分子機構により誘導されることが知られている。また、このような毛周期における毛球部の再生は、間葉系細胞である毛乳頭細胞により誘導されると考えられている。すなわち、成長期において、毛包上皮幹細胞が間葉系細胞である毛乳頭細胞により分化誘導され毛球部が再生される。【０００３】
これまでに毛包再生に向けて間葉系細胞（毛乳頭細胞及び真皮毛根鞘細胞）を置換することによる毛包可変領域の再生や毛包誘導能を有する間葉系細胞による毛包新生、上皮系細胞及び間葉系細胞による毛包の再構築等が試みられてきた。具体的には、体性に由来する複数種の細胞にＷｎｔシグナル活性剤を添加した培養液を用いて混合培養することで、原始的な毛包器官を形成する方法（例えば、特許文献１参照。）、毛包間葉系細胞の細胞集塊（スフェロイド）の外側に上皮細胞が接着している人工毛球体を作製する方法（例えば、特許文献２参照。）、及び毛乳頭細胞のスフェロイドを上皮系細胞とともに移植し、毛髪を再生する方法（例えば、非特許文献１参照。）等が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−７８３４４号公報
【特許文献２】特開２００３−７０４６６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Huang, Y-C., et al., “Scalable production of controllable dermal papilla spheroids on PVA surfaces and the effects of spheroid size on hair follicle regeneration”, Biomaterials, vol.34, p442-451, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の毛包再生方法では、インビトロで再生した毛包器官を皮膚に移植することで、移植部から正常な毛髪を再生させる方法が一般的であったが、毛髪再生効率に課題があった。【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、高い毛髪再生活性を有する毛髪再生用細胞包埋ビーズ及びその製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、間葉系細胞を用いて作製された毛髪再生用細胞包埋ビーズが高い毛髪再生活性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００９】
本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る毛髪再生用細胞包埋ビーズは、間葉系細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する。
前記生体適合性ハイドロゲルがゲル化する細胞外マトリックス成分であってもよい。
前記細胞外マトリックス成分がＩ型コラーゲンであってもよい。
前記間葉系細胞の細胞密度が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以下であってもよい。【００１０】
本発明の第２態様に係る毛髪再生用細胞包埋ビーズの製造方法は、間葉系細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する液滴を作製し、前記生体適合性ハイドロゲルを硬化させ、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製する細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程と、前記細胞包埋硬化ゲル形成体を浮遊培養し、細胞の牽引力により凝集させる凝集工程と、を備える方法である。
前記細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程において、撥水性表面を有する支持体に滴下し、前記液滴を作製してもよい。
前記細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程において、前記液滴に含まれる前記間葉系細胞の濃度が、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってもよい。【００１１】
本発明の第３態様に係る毛髪再生用キットは、上記第１態様に係る毛髪再生用細胞包埋ビーズと、上皮系細胞とを備える。
【発明の効果】
【００１２】
上記態様によれば、高い毛髪再生活性を有する毛髪再生用細胞包埋ビーズ及びその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態に係る毛髪再生用細胞包埋ビーズの製造方法を模式的に示す工程図である。
【図２】（Ａ）は、実施例１における位相差顕微鏡（ＩＸ−７１  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いて培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ及びスフェロイドを観察した結果を示す画像である。（Ｂ）は、実施例１における培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ及びスフェロイドのＨＥ染色の結果を示す画像である。
【図３】試験例１における培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、スフェロイド、及び単層培養のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色を行った結果を示す画像である。
【図４Ａ】試験例１における培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、スフェロイド、及び単層培養のベッシー・ローリー法によるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を定量化した結果を示すグラフである。
【図４Ｂ】試験例１における培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、スフェロイド、及び単層培養の細胞数を示すグラフである。
【図５】試験例２における培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、及びスフェロイドでのＧＡＰＤＨの発現量に対するＶｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量を示すグラフである。
【図６Ａ】試験例３における培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、及びスフェロイドでのＧＡＰＤＨの発現量に対するＩｇｆｂｐ５の相対的な発現量を示すグラフである。
【図６Ｂ】試験例３における培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、及びスフェロイドでのＧＡＰＤＨの発現量に対するＴｇｆｂ２の相対的な発現量を示すグラフである。
【図７】試験例４におけるヌードマウスへの培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、又はスフェロイドと、上皮系細胞との混合物のパッチ法による皮下移植方法を模式的に示す図である。
【図８】（Ａ）及び（Ｂ）は、試験例４における実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物の移植から１ヶ月後のヌードマウスの移植部での再生毛髪を、デジタルマイクロスコープ（ＶＨＸ−１０００  ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて撮影した画像である。（Ｃ）は、試験例４における（Ａ）の内部の毛髪を取り出した様子を、デジタルマイクロスコープ（ＶＨＸ−１０００  ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて撮影した画像である。（Ｄ）〜（Ｆ）は、試験例４における走実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物の移植から１ヶ月後のヌードマウスの移植部での再生毛髪を、査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＥＭ）を用いて撮影した画像である。
【図９】（Ａ）及び（Ｂ）は、試験例４における比較例２の間葉系細胞のスフェロイドと上皮系細胞との混合物の移植から１ヶ月後のヌードマウスの移植部での再生毛髪を、デジタルマイクロスコープ（ＶＨＸ−１０００  ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて撮影した画像である。（Ｃ）は、試験例４における（Ａ）の内部の毛髪を取り出した様子を、デジタルマイクロスコープ（ＶＨＸ−１０００  ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて撮影した画像である。（Ｄ）〜（Ｆ）は、試験例４における比較例２の間葉系細胞のスフェロイドと上皮系細胞との混合物の移植から１ヶ月後のヌードマウスの移植部での再生毛髪を、走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＥＭ）を用いて撮影した画像である。
【図１０Ａ】試験例４における実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、又は比較例２の間葉系細胞のスフェロイドと、上皮系細胞との混合物の移植から１ヶ月後のヌードマウスの移植部での再生毛髪数を示すグラフである。
【図１０Ｂ】試験例４における実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、又は比較例２の間葉系細胞のスフェロイドと、上皮系細胞との混合物の移植から１ヶ月後のヌードマウスの移植部での再生毛髪の太さを示すグラフである。
【図１１Ａ】実施例２における位相差顕微鏡（ＩＸ−７１  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いて培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ（間葉系細胞の細胞数：５、１０、２０、又は４０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｂｅａｄｓ）を観察した結果を示す画像である。
【図１１Ｂ】実施例２における毛髪再生用細胞包埋ビーズ（間葉系細胞の細胞数：５、１０、２０、又は４０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｂｅａｄｓ）の直径の経時変化を示すグラフである。
【図１２】（ｉ）は、試験例５における実施例２の培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ（間葉系細胞の細胞数：５、１０、２０、又は４０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｂｅａｄｓ）でのＧＡＰＤＨの発現量に対するＶｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量を示すグラフである。（ｉｉ）は、試験例５における実施例２の培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ（間葉系細胞の細胞数：５、１０、２０、又は４０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｂｅａｄｓ）でのＧＡＰＤＨの発現量に対するＨＩＦ１αの相対的な発現量を示すグラフである。
【図１３Ａ】実施例３における位相差顕微鏡（ＩＸ−７１  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いて培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ（コラーゲンの濃度：０．７５、１．５、２．２５、３．０ｍｇ／ｍＬ）を観察した結果を示す画像である。
【図１３Ｂ】実施例３における毛髪再生用細胞包埋ビーズ（コラーゲンの濃度：０．７５、１．５、２．２５、３．０ｍｇ／ｍＬ）の直径の経時変化を示すグラフである。
【図１４】試験例６における実施例３の培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ（コラーゲンの濃度：０．７５、１．５、２．２５、３．０ｍｇ／ｍＬ）でのＧＡＰＤＨの発現量に対するＶｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量を示すグラフである。
【図１５Ａ】（上）実施例４のブレビスタチン無添加（−）での培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、及び、比較例３のブレビスタチン添加（＋）での培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズを、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ７００  Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて観察した結果を示す画像である。（下）実施例４のブレビスタチン無添加（−）での培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、及び、比較例３のブレビスタチン添加（＋）での培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズを、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ７００  Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて観察した結果を示す画像である。
【図１５Ｂ】実施例４のブレビスタチン無添加（−）での培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、及び、比較例３のブレビスタチン添加（＋）での培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズの直径の経時変化を示すグラフである。
【図１６】試験例７における実施例４のブレビスタチン無添加（−）での培養開始から１日目及び３日目の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、及び、比較例３のブレビスタチン添加（＋）での培養開始から１日目及び３日目の毛髪再生用細胞包埋ビーズでのＧＡＰＤＨの発現量に対するＶｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量を示すグラフである。
【図１７Ａ】試験例８における実施例５の毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物（Ｈａｉｒ  ｂｅａｄｓ；ＨＢ）、又は、参考例１の再生毛包原基（Ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｇｅｒｍｓ；ＨＦＧ）のヌードマウスへのパッチ法による皮下移植方法を模式的に示す図である。
【図１７Ｂ】（ｉ）は、試験例８における実施例５のＨＢの移植から３週間後のヌードマウスの移植部での再生毛髪を、デジタルマイクロスコープ（ＶＨＸ−１０００  ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて撮影した画像である。（ｉｉ）は、（ｉ）の拡大画像である。（ｉｉｉ）は、参考例１のＨＦＧの移植から３週間後のヌードマウスの移植部での再生毛髪を、デジタルマイクロスコープ（ＶＨＸ−１０００  ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて撮影した画像である。（ｉｖ）は、（ｉｉｉ）の拡大画像である。
【図１７Ｃ】試験例８における実施例５のＨＢ及び参考例１のＨＦＧの移植から３週間後のヌードマウスの移植部での再生毛髪数を示すグラフである。
【図１８Ａ】ａ）は、試験例９における実施例６のヒト毛乳頭細胞を用いて作製した毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物（ＨＢ２）の移植から３週間後のヌードマウスの移植部での再生毛髪を、デジタルマイクロスコープ（ＶＨＸ−１０００  ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて撮影した画像である。ｂ）は、試験例９における参考例２の再生毛包原基（ＨＦＧ２）の移植から３週間後のヌードマウスの移植部での再生毛髪を、デジタルマイクロスコープ（ＶＨＸ−１０００  ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて撮影した画像である。
【図１８Ｂ】試験例９における実施例６のＨＢ２又は参考例２のＨＦＧ２の移植から３週間後のヌードマウスの移植部での再生毛髪数を示すグラフである。
【図１８Ｃ】試験例９における実施例６のＨＢ２の移植から３週間後のヌードマウスの移植部の皮膚切片のＨＥ染色の結果を示す画像である。
【図１８Ｄ】試験例９における実施例６のＨＢ２の移植から３週間後のヌードマウスの移植部での再生毛髪を、ＳＥＭを用いて撮影した画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００１５】
≪毛髪再生用細胞包埋ビーズ≫
本発明の一実施形態に係る毛髪再生用細胞包埋ビーズは、間葉系細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する。
【００１６】
本実施形態の毛髪再生用細胞包埋ビーズは、高い毛髪再生活性を有する。そのため、本実施形態の毛髪再生用細胞包埋ビーズを用いることで、高い毛髪再生効率を実現することが可能となる。
【００１７】
本明細書において、「間葉系細胞」とは、間葉組織由来の細胞又はその細胞を培養して得られる細胞を意味する。間葉系細胞として具体的には、例えば、毛乳頭細胞、真皮毛根鞘細胞、発生期の皮膚間葉系細胞、万能細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞等）から誘導された毛包間葉系細胞等が挙げられる。
本明細書において、「上皮系細胞」とは、上皮組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味する。上皮系細胞として具体的には、例えば、バルジ領域の外毛根鞘最外層細胞、毛母基部の上皮系細胞、万能細胞万能細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞等）から誘導された毛包上皮系細胞等が挙げられる。
細胞の由来として、好ましくは、動物由来細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞であり、特に好ましくはヒト由来細胞である。
【００１８】
本明細書において、「毛髪再生用細胞包埋ビーズ」とは、上述の通り、間葉系細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含み、後述の製造方法において、細胞の牽引力により凝集させ、生体移植にそのまま利用可能なビーズを意味する。
【００１９】
本明細書において、「毛包原基」とは、毛包のもととなる組織を意味し、上述の間葉系細胞及び上述の上皮系細胞から構成されている。毛包原基が形成される流れとしては、まず、上皮系細胞が肥厚し、間葉系細胞側に陥入することで、間葉性細胞の細胞集塊（スフェロイド）を包み込む。次いで、間葉性細胞のスフェロイドを包み込んだ上皮性細胞は毛母原基を形成し、間葉性細胞のスフェロイドは毛誘導能を持つ毛乳頭を形成することで、毛母原基と毛乳頭等からなる毛包原基を形成する。この毛包原基では、毛乳頭細胞が毛母細胞に増殖因子を提供しており、毛母細胞の分化を誘導し、分化した細胞が毛を形成することができる。
本明細書において、「毛包」とは、表皮が内側に筒状に入り込んだ部分であって、毛を産生する皮膚の付属器官を意味する。
本明細書において、「再生毛包原基」とは、例えば、本実施形態の毛髪再生用細胞包埋ビーズと、上皮系細胞とを用いて再生された毛包原基を意味する。
【００２０】
また、本明細書において、「毛髪再生活性」とは、間葉系細胞において毛髪の再生に係る遺伝子の発現が増加していることを意味する。前記遺伝子としては、例えば、Ｖｅｒｓｉｃａｎ（ヴァーシカン）、Ｗｎｔ、トランスフォーミング増殖因子β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ；ＦＧＦ）等が挙げられる。
【００２１】
本実施形態において、上述の間葉系細胞の細胞密度が密であることが必要であり、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以下であり、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以上２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以下であることが好ましく、７．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以上１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３であることがより好ましく、９×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以上１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３であることがさらに好ましく、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３であることが特に好ましい。細胞密度が上記範囲内にあることにより、毛乳頭に近しい細胞密度となり、高い毛髪再生効率を実現できる。
【００２２】
本明細書において、「生体適合性ハイドロゲル」とは、生体への適合性を有するゲルであって、高分子が化学結合によって網目構造をとり、その網目に多量の水を保有した物質を意味する。より具体的には、天然物由来の高分子や合成高分子の人工素材に架橋を導入してゲル化させたものをいう。
【００２３】
天然物由来の高分子としては、ゲル化する細胞外マトリックス成分等が挙げられる。ゲル化する細胞外マトリックス成分としては、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型等）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等を含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン等を例示することができる。その他天然物由来の高分子として、ゼラチン、寒天、アガロース等を使用することもできる。それぞれのゲル化に至適な塩等の成分、その濃度、ｐＨ等を選択しハイドロゲルを作製することが可能である。また、これらの原料を組み合わせてもよい。
【００２４】
また、合成高分子としては、例えば、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（ＩＩ−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ等が挙げられる。また、これらの高分子を２種以上用いてハイドロゲルを作製することも可能である。
【００２５】
中でも、生体適合性ハイドロゲルは、天然物由来の高分子であることが好ましく、ゲル化する細胞外マトリックス成分であることがより好ましく、Ｉ型コラーゲンであることがさらに好ましい。Ｉ型コラーゲンを含有することにより、毛乳頭に近しい組成となり、高い毛髪再生効率を実現できる。
【００２６】
≪毛髪再生用細胞包埋ビーズの製造方法≫
本発明の一実施形態に係る毛髪再生用細胞包埋ビーズの製造方法は、間葉系細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する液滴を作製し、前記生体適合性ハイドロゲルを硬化させ、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製する細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程と、前記細胞包埋硬化ゲル形成体を浮遊培養し、細胞の牽引力により凝集させる凝集工程と、を備える方法である。
【００２７】
本実施形態の製造方法によれば、高い毛髪再生活性を有する毛髪再生用細胞包埋ビーズを容易に得ることができる。
【００２８】
図１は、本発明の一実施形態に係る毛髪再生用細胞包埋ビーズの製造方法を模式的に示す工程図である。図１を参照しながら、本実施形態の毛髪再生用細胞包埋ビーズの製造方法について、以下に詳細を説明する。
【００２９】
［細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程］
まず、間葉系細胞１を、生体適合性ハイドロゲル２を含む溶液に懸濁し、目的に合わせた大きさの液滴を作製する。
【００３０】
本実施形態の製造方法において、間葉系細胞は上述のとおりである。
細胞の由来として、好ましくは、動物由来細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞であり、特に好ましくはヒト由来細胞である。
【００３１】
本実施形態の製造方法において、生体適合性ハイドロゲルとは、上述したものと同様のものが挙げられる。中でも、生体適合性ハイドロゲルは、天然物由来の高分子であることが好ましく、ゲル化する細胞外マトリックス成分であることがより好ましく、Ｉ型コラーゲンであることがさらに好ましい。Ｉ型コラーゲンを使用することにより、毛乳頭に近しい組成となり、高い毛髪再生効率を実現できる。
【００３２】
生体適合性ハイドロゲルを含む溶液は、Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ  Ｆ−１０又はＨａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ  Ｆ−１２等の無血清培地や、生体適合性ハイドロゲル再構成用の緩衝液（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸水水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ−Ｂｕｆｆｅｒからなる緩衝液等）等を含んでいてもよい。
生体適合性ハイドロゲルがコラーゲンである場合、溶液中のコラーゲン濃度は、例えば１．０ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下、例えば２．０ｍｇ以上５．０ｍｇ以下であればよい。溶液中のコラーゲン濃度が上記範囲であることにより、後述の実施例に示すように、発毛（毛包誘導）マーカーであるＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子の発現が増加し、より高い効率で毛髪を再生することができる。
【００３３】
上述の間葉系細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する懸濁液に含まれる前記間葉系細胞の濃度としては、５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることが好ましく、２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上５．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることがより好ましく、２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。前記間葉系細胞の濃度が上記範囲であることにより、後述の凝集工程後の細胞密度が毛乳頭に近しい細胞密度となり、高い毛髪再生効率を実現できる。
【００３４】
液滴の作製方法は、特別な限定はなく、公知の方法に従って当業者が決定できる。例えば、油性成分からなる溶液中に、上述の間葉系細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する懸濁液を滴下し、液滴を作製する方法や、図１及び後述の実施例のように、撥水性表面を有する支持体３に上記の懸濁液を滴下し、液滴を作製する方法等が挙げられる。
【００３５】
本明細書において、「撥水性」とは、水をはじく性質を意味する。撥水性として具体的には、水接触角が典型的には９０°以上、好ましくは１００°以上、より好ましくは１０５°以上である。また、水接触角が１５０°を超える超撥水状態も含む。
支持体の表面に、撥水処理又は撥水性を有する材質を重ね合せることにより、撥水性表面を有する支持体を得ることができる。
撥水処理としては、特別な限定はなく、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルコキシ基又はアルケニルオキシ基等の低極性の官能基や、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されたアルキル基又はアルコキシ基等の疎水性の官能基を基板表面に導入する方法が挙げられる。また、撥水性を有する材質としては、特別な限定はなく、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスルフォン等の疎水性高分子；ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、フッ素化カーボン、ポリテトラフルオロエチレン等の塩素又はフッ素含有高分子等が挙げられる。
【００３６】
支持体の材質としては、特別な限定はなく、例えば、樹脂（例えばポリエステル樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂（Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ Ｓｔｙｒｅｎｅ樹脂）、ナイロン樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリオレフィン樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリ塩化ビニリデン、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、ピーク樹脂、エポキシ樹脂及び塩化ビニル樹脂等）、金属（例えば金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等）、合金（例えばステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等）、ガラス（例えばガラス、石英ガラス、溶融石英、合成石英、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト及び感光性ガラス等）、半導体材料、シリコン、ゴム（例えば天然及び合成ゴム）等が挙げられ、これらに限定されない。また、これらの材質のうち、複数の材質を組み合わせてもよい。
【００３７】
次いで、作製した液滴を２０分以上６０分未満（好ましくは、３０分）、２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）で静置し、生体適合性ゲルを硬化させる。続いで、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）等の基本培地により、表面を洗浄し、細胞包埋硬化ゲル形成体を回収する。
【００３８】
［凝集工程］
次いで、回収した前記細胞包埋硬化ゲル形成体を１日以上１０日以下、好ましくは２日以上４日以下、２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）で浮遊培養する。
【００３９】
使用する培地は、特別な限定はなく、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地であればよい。例えば、ＤＭＥＭ、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）等が挙げられ。これらに限定されない。
【００４０】
細胞包埋硬化ゲル形成体４を上記条件において浮遊培養することにより、細胞の牽引力により凝集させ、上述の毛髪再生用細胞包埋ビーズにおいて例示されたものと同様の細胞密度の毛髪再生用細胞包埋ビーズ６を得ることができる。
また、本実施形態における凝集工程では、実際に生体の皮膚組織で行われる、間葉系細胞が凝集し、毛乳頭を形成するという一連の発生過程を再現することができる。そのため、高い毛髪活性を有す毛髪再生用細胞包埋ビーズ６を得ることができる。
【００４１】
≪毛髪再生用キット≫
本発明の一実施形態に係る毛髪再生用キットは、上述の毛髪再生用細胞包埋ビーズと、上皮系細胞とを備える。
【００４２】
本実施形態の毛髪再生用キットによれば、高効率で毛髪を再生することができる。
【００４３】
毛髪再生用細胞包埋ビーズ及び上皮系細胞としては、上述の毛髪再生用細胞包埋ビーズにおいて例示されたものと同様のものが挙げられる。
毛髪再生用細胞包埋ビーズに含まれる間葉系細胞及び上皮系細胞の由来として、好ましくは、動物由来細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞であり、特に好ましくはヒト由来細胞である。
【００４４】
本実施形態の毛髪再生用キットは、さらに、後述に示す、移植時に毛髪再生用細胞包埋ビーズを固定するために使用可能な支持体を備えていてもよい。
また、本実施形態の毛髪再生用キットは、さらに、毛髪再生用細胞包埋ビーズ及び上皮系細胞を移植するために使用する器具（例えば、ピンセット）等を備えていてもよい。
【００４５】
≪毛髪再生用細胞包埋ビーズの使用方法≫
＜毛髪再生用細胞包埋ビーズの移植方法＞
移植する際に、本実施形態の毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞とを同時に移植部に移植することが好ましい。
移植に使用する上皮系細胞としては、上述の毛髪再生用細胞包埋ビーズで例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、上皮系細胞に対する本実施形態の毛髪再生用細胞包埋ビーズに含まれる間葉系細胞の割合は、０．１倍以上１００倍以下であることが好ましく、１倍以上１０倍以下であることがより好ましい。
【００４６】
また、後述の実施例に示すように、上述の毛髪再生用細胞包埋ビーズの製造方法において、細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程の後に、上皮系細胞と細胞包埋硬化ゲル形成体とを混合し、凝集工程を経て、毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物を作製してもよい。得られた毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物を移植部に移植することで、毛包原基が再生され、毛髪を再生することができる。
【００４７】
本実施形態の毛髪再生用細胞包埋ビーズは、当業者に公知の方法で対象となる部位に移植することができる。例えば、シャピロ式植毛術やチョイ式植毛器を用いた植毛、空気圧を利用したインプランター等を使用し、移植することができる。シャピロ式植毛術とは、移植部位をマイクロメス等で移植創を作った後に、ピンセットを用いて移植する方法である。
本実施形態の毛髪再生用細胞包埋ビーズの移植量は、被検動物（ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物、好ましくはヒト）の年齢、性別、症状、治療部位、治療時間等を勘案して適宜調節される。
【００４８】
また、移植深度としては、再生対象となる部位により適宜変更することができる。例えば０．０５ｍｍ以上５ｍｍ以下であってよく、例えば０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下であってよく、例えば０．３ｍｍ以上０．５ｍｍ以下であってよい。また、移植する部位としては、被験動物の真皮層内に移植することが好ましく、さらに好ましくは、毛包形成及びその後の発毛効率の優れた、真皮及び皮下組織の境界面より上方とすることが好ましい。また、移植創上端部に毛包原基の上皮系細胞成分の上端部が露出するよう移植深度を調節すると、さらに被験動物の上皮系細胞との連続性を高めることができるため、好ましい。
本実施形態の毛髪再生用細胞包埋ビーズにおいて、皮膚接合用のテープやバンド、縫合等により、毛髪再生用細胞包埋ビーズと移植対象部位とを固定してもよい。
【００４９】
また、本実施形態の毛髪再生用細胞包埋ビーズは、支持体を用いて固定してもよい。支持体の材質としては、移植後に、移植し、形成された再生毛包原基に含まれる上皮系細胞側の部分と被験動物側の上皮系細胞との連結を促進させることができるものであれば、特別な限定はない。支持体の材質として具体的には、例えば、ナイロン等のポリマーや合成又は天然の生体吸収可能なポリマーより作られた繊維、ステンレス等の金属繊維、炭素繊維、ガラス繊維等の化学繊維、天然の動物繊維（生体由来の毛髪等）や植物繊維等が挙げられ、より具体的には、ナイロン糸やステンレス線等が挙げられる。支持体の直径及び長さは、再生対象となる部分により適宜設計することができる。直径は、例えば５μｍ以上１００μｍ以下であってよく、例えば２０μｍ以上５０μｍ以下であってよい。また、長さは、例えば１ｍｍ以上１０ｍｍ以下であってよく、例えば４ｍｍ以上６ｍｍ以下であってよい。
【００５０】
また、本実施形態の毛髪再生用細胞包埋ビーズにおいて、支持体を用いた場合、本実施形態の毛髪再生用細胞包埋ビーズ及び上皮系細胞を移植後しばらくして、被験動物の上皮系細胞と、再生毛包原基の上皮系細胞由来の側との連続性が確保された後、支持体を移植部位より抜くことができる。移植後の状態により適宜設定することができるが、例えば、移植後３日以上７日以下で移植部位から抜くことが好ましい。又は、支持体が、自然と移植部位より抜けるまで放置することもできる。生体吸収性の材料の支持体は、自然と移植部位より抜けるか、分解又は吸収されるまで放置することができる。
【００５１】
また、本実施形態の毛髪再生用細胞包埋ビーズにおいて、支持体を用いた場合、毛包原基の上皮系細胞由来の細胞が、支持体に沿って伸長する。これにより、移植後の被験動物側の上皮系細胞と毛包原基の上皮系細胞側との連続性を向上させることができる。特に、支持体が移植部位の表皮より外に維持される場合には、被験動物側の上皮系細胞が、異物を排除するように、支持体に沿って移植部位の内側へ伸長するため、連続性をさらに向上させることができる。さらに、意図した方向へ毛包形成を促すことができる。その結果、毛包原基からの発毛率を向上させることができるとともに、発毛方向の制御も可能となる。
【００５２】
＜毛髪再生方法＞
また、本発明の一側面は、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療のための毛髪再生用細胞包埋ビーズを提供する。
また、本発明の一側面は、治療的に有効量の毛髪再生用細胞包埋ビーズを含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、毛包再生治療剤を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、毛包再生治療剤を製造するための上記毛髪再生用細胞包埋ビーズの使用を提供する。
また、本発明の一側面は、上記毛髪再生用細胞包埋ビーズの有効量を、治療を必要とする患者に移植することを含む、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療方法を提供する。
【００５３】
本明細書において、再生可能な毛包組織を含む組織としては、毛包を再生し、さらに毛髪を再生したい体表皮であれば、特別な限定はなく、例えば、頭皮等が挙げられる。
また、適用可能な疾患としては、脱毛を伴う任意の疾患であって、例えば男性型脱毛症（Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＡＧＡ）、女子男性型脱毛症（Ｆｅｍａｌｅ  Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＦＡＧＡ）分娩後脱毛症、びまん性脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、牽引性脱毛症、代謝異常性脱毛症、圧迫性脱毛症、円形脱毛症、神経性脱毛症、抜毛症、全身性脱毛症、症候性脱毛症等が挙げられ、これらに限定されない。
【００５４】
治療対象としては、特別な限定はなく、ヒト又は非ヒト動物を含む哺乳動物が挙げられ、ヒトが好ましい。
【実施例】
【００５５】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００５６】
［実施例１］マウス毛髪再生用細胞包埋ビーズの作製１
（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
参考資料「Toyoshima, K., et al., “Fully functional hair follicle regeneration through the rearrangement of stem cells and their niches”, Nat. Commun., vol.3, no.784, 2012.」に記載の方法を一部改変した方法を用いて、間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。より具体的には、妊娠マウスＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌの子宮内の胎齢１８日齢のマウス胎児の背部皮膚を採取し、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）ＩＩ（Ｗａｋｏ社製）による処理を４℃で３０ｒｐｍの振盪条件で１時間行い、上皮層と間葉層とを分離した。次いで、上皮層は１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ（Ｗａｋｏ社製）による処理を２時間、さらにトリプシンによる処理を１０分行い、上皮系細胞を単離した。一方、間葉層は１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ（Ｗａｋｏ社製）による処理を２時間行い、間葉系細胞を単離した。得られた間葉系細胞は１．０×１０７ｃｅｌｌｓ、上皮系細胞は１．０×１０６ｃｅｌｌｓであった。【００５７】
（２）細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程
次いで、採取した間葉系細胞のうち２．５×１０６ｃｅｌｌｓにダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）（１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）含有）を添加し、１，０００ｒｐｍ、１８０秒間遠心した後、上清を除去した。次いで、間葉系細胞をコラーゲン  Ｔｙｐｅ１（コラーゲン３ｍｇ／ｍＬ含有、新田ゼラチン社製）１ｍＬに懸濁した。【００５８】
培養ディッシュの蓋の裏面（撥水性表面）に、懸濁液を２μＬ（５．０×１０３ｃｅｌｌｓ／２μＬ）ずつ滴下した。３７℃で３０分間インキュベートし、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製した。【００５９】
（３）凝集工程
次いで、ピペットマンを用いて、細胞包埋硬化ゲル形成体を培養ディッシュの蓋の裏面から剥がした。次いで、細胞包埋硬化ゲル形成体を培養ディッシュに入れ、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ含有）を添加し、３日間浮遊培養し、毛髪再生用細胞包埋ビーズを作製した。【００６０】
（４）観察結果
位相差顕微鏡（ＩＸ−７１  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いて、培養開始から３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズを観察した結果を図２の（Ａ）に示す。
図２の（Ａ）から、毛髪再生用細胞包埋ビーズでは、細胞の牽引力により、平均直径２ｍｍから０．５ｍｍまで凝集することが確かめられた。【００６１】
（５）毛髪再生用細胞包埋ビーズのヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ：ＨＥ）染色
（５−１）毛髪再生用細胞包埋ビーズの切片の作製
毛髪再生用細胞包埋ビーズをリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。次いで、固定液を回収し、７０％エタノール、９０％エタノール、１００％エタノール、２−ブタノールに各１時間ずつ浸漬した。次いで、ミクロトームを用いて、毛髪再生用細胞包埋ビーズを微小の厚さにカットした。カットされた切片をスライドガラスに垂直に押し当て、転写した。【００６２】
（５−２）ヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ：ＨＥ）染色
得られたスライドガラスにキシレンを１ｍＬ滴下し１時間静置した後、溶液を除去した。次いで、１００％エタノールを１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。次いで、１００％エタノールを１ｍＬ滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。次いで、９０％エタノール溶液を１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。次いで、７０％エタノール溶液を１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。次いで、蒸留水を１ｍＬ滴下し３分間静置した後、水を除去した。次いで、マイヤー・ヘマトキシリン染色液（Ｗａｋｏ社製）を１ｍＬ滴下し４分間静置した後、溶液を除去した。次いで、流水に１３分間浸し、洗い流した。次いで、エマジン溶液（武藤化学社製）を１ｍＬ滴下し４分間静置した後、溶液を除去した。次いで、蒸留水を１ｍＬ滴下し１分間静置した後、水を除去した。次いで、７０％エタノール溶液を１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。次いで、９０％エタノール溶液を１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。次いで、１００％エタノールを１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。次いで、１００％エタノールを１ｍＬ滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。次いで、キシレンを１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。最後に、キシレンを１ｍＬ滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。スライドガラスが乾いたら、マウントクイック（封入剤）を少量垂らし、気泡が入らないようにマイクロカバーガラスをゆっくりかぶせ、封入した。位相差顕微鏡（ＩＸ−７１  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）で観察した結果を図２の（Ｂ）に示す。【００６３】
（５−３）結果と考察
図２の（Ｂ）から、毛髪再生用細胞包埋ビーズにおけるＨＥ染色では、細胞質がピンク色に染色するが、ピンク色に染色していない部分が数か所存在した。染色されていない部分には、コラーゲンが多く存在する部分であると推察された。【００６４】
［比較例１］
比較例として、９６ウェルプレートに５．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように間葉系細胞を播種し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ含有）を添加し、３日間単層培養した。【００６５】
［比較例２］
（１）スフェロイドの作製
比較例として、５．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｓｐｈｅｒｏｉｄとなるように間葉系細胞のスフェロイドを作製し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ含有）を添加し、３日間培養した。【００６６】
（２）観察結果
位相差顕微鏡（ＩＸ−７１  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いて、培養開始から３日後のスフェロイドを観察した結果を図２の（Ａ）に示す。
図２の（Ａ）から、培養開始から３日後のフェロイドは、直径が約２００μｍであることが確かめられた。【００６７】
（３）スフェロイドのＨＥ染色
（３−１）スフェロイドの切片の作製
スフェロイドについても、実施例１の（５−１）と同様の方法を用いて、切片を作製した。【００６８】
（３−２）ＨＥ染色
スフェロイドについても、実施例１の（５−２）と同様の方法を用いて、ＨＥ染色を行った。染色後のスフェロイドを位相差顕微鏡（ＩＸ−７１  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）で観察した結果を図２の（Ｂ）に示す。
図２の（Ｂ）から、スフェロイドでは、細胞が密に凝集していることが確認された。【００６９】
［試験例１］アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＡＬＰ）活性評価試験
（１）アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＡＬＰ）染色
実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、比較例１の間葉系細胞の単層培養、及び比較例２の間葉系細胞のスフェロイドについて、クエン酸−アセトン固定液に３０秒間浸漬し、脱イオン水で４５秒間リンスした。次いで、染色液（Ｆａｓｔ  ｂｌｕｅ  ＲＲ  ｓａｌｔカプセルを１カプセル（Ｓｉｇｍａ社製）＋脱イオン水４８ｍＬ＋Ｎａｐｈｔｈｏｌ  ＡＳ−ＭＸ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社製）２ｍＬ）を用いて、遮光、常温条件で３０分間染色した。次いで、脱イオン水で１２０秒間リンスした。次いで、ＡＬＰ染色した実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、比較例１の間葉系細胞の単層培養、及び比較例２の間葉系細胞のスフェロイドそれぞれを、位相差顕微鏡（ＩＸ−７１  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いて、観察した。結果を図３に示す。【００７０】
図３から、毛乳頭細胞のマーカータンパクとして知られるＡＬＰが活性化された細胞は、単層培養ではほとんど観察されなかった。一方、スフェロイド及び毛包再生用細胞包埋ビーズではＡＬＰの活性が観察された。特に、毛包再生用細胞包埋ビーズではＡＬＰの活性が強く観察された。【００７１】
（２）ベッシー・ローリー法によるＡＬＰ活性の定量
（２−１）細胞の破砕及び細胞抽出液の調製
実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、比較例１の間葉系細胞の単層培養、及び比較例２の間葉系細胞のスフェロイドについて、それぞれＰＢＳ（−）で２回洗浄し、１ｍＬバッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ７．６、０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加え、−８０℃で凍結保存した。次いで、この凍結と融解を３回繰り返し、ディスポーザブルホモジナイザー（ＡＳＯＮＥ社製）を用いて、ホモジナイズした。次いで、超音波処理を３０秒間、ボルテックス１０秒間を２回繰り返すことにより、細胞膜を破壊した。次いで、１３００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を回収し、細胞抽出液を得た。【００７２】
（２−２）希釈標準液の調製
標準液（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐ−ニトロフェノール溶液）を順次倍々希釈し、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０ｍｍｏｌ／Ｌの２倍希釈系列を調製した。【００７３】
（２−３）ＡＬＰ反応
（２−１）で得られた細胞抽出液を２０μＬずつ取って、９６ウェルプレートに添加した。スタンダード列として、列の一番端のウェルに（２−２）で調製した希釈標準液を２０μＬずつ加えた。次いで、全てのウェルに基質緩衝液（ｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム６．７ｍｍｏｌ／Ｌ＋２．０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム）を１００μＬずつ加えた。次いで、ウェルプレートを遮光し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）で１分間攪拌させた後、１５分間３７℃でインキュベートした。その後、各ウェルに反応停止液（０．２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム）を８０μＬずつ加えることで反応を停止させた。【００７４】
（２−４）解析
次いで、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）で１分間攪拌した後、マイクロプレートリーダーを用いて、各細胞抽出液の吸光度４０５ｎｍを測定し、各細胞抽出液中のＡＬＰ活性を算出した。結果を図４Ａ示す。図４において、「Ｇｅｌ  ｂｅａｄｓ」は実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズを示し、「Ｓｐｈｅｒｏｉｄ」は比較例２の間葉系細胞のスフェロイドを示し、「Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ」は比較例１の間葉系細胞の単層培養を示す。
また、図４Ｂは、細胞抽出液調製前の浮遊培養３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、スフェロイド、及び単層培養の細胞数を計測した結果を示すグラフである。【００７５】
（２−５）結果と考察
図４Ａから、ＡＬＰ活性の高さは、「Ｇｅｌ  ｂｅａｄｓ」（実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズ）＞「Ｓｐｈｅｒｏｉｄ」（比較例２の間葉系細胞のスフェロイド）＞「Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ」（比較例１の間葉系細胞の単層培養）であった。
また、図４Ｂから、播種細胞数を揃えた３日間の培養後の細胞数は、「Ｇｅｌ  ｂｅａｄｓ」（実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズ）＜「Ｓｐｈｅｒｏｉｄ」（比較例２の間葉系細胞のスフェロイド）＜「Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ」（比較例１の間葉系細胞の単層培養）であった。
間葉系細胞の細胞倍化時間（細胞数が倍になるのに要する時間）は、２４時間であると報告されている。比較例１の間葉系細胞の単層培養では、報告通り、約２４時間の細胞倍化時間で増殖した（培養開始時５．０×１０３ｃｅｌｌｓ→培養３日後４．５×１０４ｃｅｌｌｓ）。
一方、実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズ及び比較例２の間葉系細胞のスフェロイドでは、ほとんど細胞数の増加が見られなかった。
一般に、間葉系細胞は増殖を重ねるたびに（継代数を増やすたびに）、毛乳頭細胞マーカーであるＡＬＰ活性を失うことが知られている。
今回の結果から、細胞増殖が少ない実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、比較例２の間葉系細胞のスフェロイド、比較例１の間葉系細胞の単層培養の順でＡＬＰ活性が高くなったことから、実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズは細胞増殖が抑制されたために、ＡＬＰ活性を維持されたと推察された。【００７６】
［試験例２］Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子のＰＣＲ解析
実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、及び比較例２の間葉系細胞のスフェロイドを用いて、発毛マーカータンパク質であるＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。【００７７】
（１）ＲＮＡ抽出
まず、実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、及び比較例２の間葉系細胞のスフェロイドをそれぞれ１５ｍＬチューブに回収し、毛髪再生用細胞包埋ビーズ又はスフェロイドが沈殿したら、１ｍＬの溶液となるように上澄みの培地を除去した。次いで、１ｍＬとなった毛髪再生用細胞包埋ビーズ又はスフェロイドを含む溶液を１．５ｍＬマイクロチューブに移しかえた。
次いで、４℃、５０００ｒｐｍで、３分間遠心した。この操作は、残存する培地を捨てるため、毛髪再生用細胞包埋ビーズ又はスフェロイドを沈殿させると同時に、遠心分離機内の予冷のために行った。次いで、上清（培地）を捨てた後、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴを３５０μＬ加え、よくピペッティングした。次いで、ピペッティング後の溶液をＱＩＡ  Ｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムに回収し、４℃、１００００ｒｐｍで、２分間遠心した。次いで、ＱＩＡ  Ｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムの上部を捨て、コレクションチューブ内の溶液に７０％エタノールを３５０μＬ加え、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに移した。次いで、４℃、１００００ｒｐｍで、１５秒間遠心した。次いで、コレクションチューブ内の濾液を捨て、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＷ１を７００μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、１５秒間遠心した。次いで、コレクションチューブ内の濾液を捨て、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥを５００μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、１５秒間遠心した。次いで、コレクションチューブ内の濾液を捨て、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥを５００μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、２分間遠心した。次いで、新しい２ｍＬコレクションチューブに遠心後のカラムを移し、４℃、１００００ｒｐｍで、１分間遠心した。これは、残存するＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥを除去するために行った。次いで、１ｍＬマイクロチューブに遠心後のカラムを移し、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを３０μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、１分間遠心した。次いで、遠心後のカラムが設置された１ｍＬマイクロチューブに、再度ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを３０μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、１分間遠心し、ＲＮＡ溶解液を得た。【００７８】
（２）分光光度計によるＲＮＡ濃度測定
次いで、Ｎａｎｏ  Ｖｕｅの電源を付け、希釈率を６０．０に設定した。ここで、希釈率とは、ＲＮＡ抽出における最終容量である。次いで、測定板を７０％エタノールで拭いた後、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ２μＬを測定板の中心にアプライし、［ＯＡ／１００％Ｔ］のボタンを押した。この操作でベースラインを得た。次いで、（１）で得られたＲＮＡ溶解液２μＬを測定板の中心にアプライし、測定ボタンを押した。Ａ２６０／Ａ２８０はサンプルの純度を表し、２．０に近い方が好ましい。次いで、次のサンプル（ＲＮＡ溶解液）を測定する際は、キムワイプで拭きとって７０％エタノールで拭いてから使用した。
毛髪再生用細胞包埋ビーズ由来のＲＮＡ溶解液の濃度は、３１１μｇ／ｍＬであり、スフェロイド由来のＲＮＡ溶解液の濃度は、３４４μｇ／ｍＬであった。【００７９】
（３）ＲＴ−ＰＣＲ
次いで、（２）で濃度を測定したＲＮＡ溶解液を１５０μｇ／ｍＬとなるように希釈し、６５℃で、５分間インキュベートし、その後氷上で冷却した。次いで、マイクロチューブに下記表１に示す組成の溶液を加え、透明フィルムで覆った。表１において、ＲＮＡとは、毛髪再生用細胞包埋ビーズ由来のＲＮＡ溶解液、又はスフェロイド由来のＲＮＡ溶解液を示す。【００８０】
【表１】
2017217393.tif 000003
【００８１】
次いで、サーマルサイクラーにセットし、しっかり閉まっていることを確認した。次いで、３７℃で１５分間、９８℃で５分間の逆転写反応を行い、毛髪再生用細胞包埋ビーズ由来のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡ、及びスフェロイド由来のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡをそれぞれ得た。【００８２】
次いで、マイクロチューブに下記表２に示す組成の溶液を加え、透明フィルムで覆った。表２において、ＤＮＡとは、毛髪再生用細胞包埋ビーズ由来のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡ、又はスフェロイド由来のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡを示す。さらに、ＰＣＲで用いたプライマーの塩基配列について、表３に示す。【００８３】
【表２】
2017217393.tif 000004
【００８４】
【表３】
2017217393.tif 000005
【００８５】
次いで、サーマルサイクラーにセットし、しっかり閉まっていることを確認した。次いで、９５℃で４分間、（９５℃で５秒間、６０℃で６０秒間）×４５サイクル、７２℃で１０分間のプロトコールにてＰＣＲを行った。コントロールとして、ＧＡＰＤＨの発現量を測定し、ＧＡＰＤＨの発現量に対するＶｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量を算出した。結果を図５に示す。図５において、「Ｇｅｌ  ｂｅａｄｓ」は実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズを示し、「Ｓｐｈｅｒｏｉｄ」は比較例２の間葉系細胞のスフェロイドを示す。【００８６】
図５から、Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子の発現について、実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズが、比較例２の間葉系細胞のスフェロイドと比較して約３倍向上することが明らかとなった。
一般に、間葉系細胞は増殖を重ねるたびに（継代数を増やすたびに）、Ｖｅｒｓｉｃａｎの発現が低下することが知られている。また、スフェロイド培養は、培養ディッシュ上での単層培養と比較して、Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子の発現を維持できることが報告されている。
今回の結果により、実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズが、比較例２の間葉系細胞のスフェロイドよりも高いＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子の発現を示しており、実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズによる間葉系細胞の培養法が、既存のスフェロイドによる間葉系細胞の培養法よりも適した間葉系細胞の培養法になりうる可能性が示唆された。【００８７】
［試験例３］Ｉｇｆｂｐ５遺伝子及びＴｇｆｂ２遺伝子のＰＣＲ解析
実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、及び比較例２の間葉系細胞のスフェロイドを用いて、発毛に関連するマーカー遺伝子の発現を評価した。【００８８】
（１）ＲＮＡ抽出
試験例２の（１）と同様の方法を用いて、実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、及び比較例２の間葉系細胞のスフェロイドからＲＮＡ溶解液を得た。【００８９】
（２）分光光度計によるＲＮＡ濃度測定
次いで、  試験例２の（１）と同様の方法を用いて、実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、及び比較例２の間葉系細胞のスフェロイドのＲＮＡ溶解液の濃度を測定した。
毛髪再生用細胞包埋ビーズ由来のＲＮＡ溶解液の濃度は、３９８μｇ／ｍＬであり、スフェロイド由来のＲＮＡ溶解液の濃度は、２７９μｇ／ｍＬであった。【００９０】
（３）ＲＴ−ＰＣＲ
次いで、試験例２の（３）と同様の方法を用いて、逆転写反応を行い、毛髪再生用細胞包埋ビーズ由来のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡ、又はスフェロイド由来のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡを得た。次いで、Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子の増幅用のフォワードプライマー及びリバースプライマーの代わりに、下記表４に示すＩｇｆｂｐ５遺伝子及びＴｇｆｂ２遺伝子の増幅用のフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いた以外は、試験例２の（３）と同様の方法を用いて、ＰＣＲ反応を行い、ＧＡＰＤＨの発現量に対するＩｇｆｂｐ５又はＴｇｆｂ２の相対的な発現量を算出した。結果を図６Ａ及び図６Ｂに示す。【００９１】
【表４】
2017217393.tif 000006
【００９２】
図６Ａ及び図６Ｂから、Ｉｇｆｂｐ５遺伝子及びＴｇｆｂ２遺伝子の発現について、実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズが、比較例２の間葉系細胞のスフェロイドと比較して約１．６〜３倍向上することが明らかとなった。
先行技術において、マウス間葉系細胞をスフェロイド培養することで、これらの遺伝子発現が単層培養と比較して、優位に増加することが報告されている。
今回の結果により、実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズによる間葉系細胞の培養法が、既存のスフェロイドによる間葉系細胞の培養法よりも、高いＩｇｆｂｐ５遺伝子及びＴｇｆｂ２遺伝子の発現を示した。
また、試験例２から、実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズが、比較例２の間葉系細胞のスフェロイドよりも高いＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子の発現を示すことも明らかとなっている。
これらの結果を踏まえると、実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズによる間葉系細胞の培養法は、既存のスフェロイドによる間葉系細胞の培養法と比較して、高い毛髪再生活性を発現させる培養法であることが示唆された。
考えられる要因としては、コラーゲンリッチな環境であること、スフェロイドと比較して酸素供給が改善されていること、及びビーズの製造における凝集工程での細胞への力学刺激が寄与していること等が挙げられる。【００９３】
［試験例４］ヌードマウスを用いた皮下移植試験
（１）ヌードマウスへの皮下移植
実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズ、及び比較例２の間葉系細胞のスフェロイドをヌードマウス皮内にパッチ法を用いて移植した。動物の飼育及び動物実験は、横浜国立大学動物実験委員会の指針に遵守して行った。
具体的には、まず、ヌードマウスにイソフルラン吸引麻酔を行い、背部をイソジンで消毒した。次いで、Ｖランスマイクロメス（日本アルコン社製）を用いて、皮膚表皮層から真皮層下部に至る移植創を形成した（図７左参照。）。次いで、実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズ各３０個／１箇所、又は比較例２の間葉系細胞のスフェロイド各３０個／１箇所と、妊娠マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌ）子宮内のマウス胎児から採取した上皮系細胞１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／１箇所とを混合し、合計３箇所の移植創に挿入した（図７右参照。）。
なお、一匹のヌードマウスの左側面の３箇所に実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物を移植し、右側面の３箇所に比較例２の間葉系細胞のスフェロイドと上皮系細胞との混合物を移植した。実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物の移植から１ヶ月後のヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図８に示す。また、比較例２の間葉系細胞のスフェロイドと上皮系細胞との混合物の移植から１ヶ月後のヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図９に示す。なお、図８及び図９において、（Ａ）、（Ｂ）はデジタルマイクロスコープ（ＶＨＸ−１０００  ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて、移植部における再生毛髪を撮影した画像である。（Ｃ）はデジタルマイクロスコープ（ＶＨＸ−１０００  ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて、（Ａ）の内部の毛髪を取り出した様子を撮影した画像である。（Ｄ）〜（Ｆ）は、走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＥＭ）を用いて、再生毛髪を撮影した画像である。
また、図１０は、毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物、又は比較例２の間葉系細胞のスフェロイドと上皮系細胞との混合物の移植から１ヶ月後のヌードマウスの移植部での再生毛髪数（図１０Ａ参照。）と再生毛髪の太さ（図１０Ｂ参照。）とを示す図である。【００９４】
図８及び９から、実施例１の毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物の移植部では黒い塊となって毛が形成しており、黒塊内からは大量の毛が観察された。
一方、比較例２の間葉系細胞のスフェロイドと上皮系細胞との混合物の移植部では、毛の再生数が少なく、黒塊の大きさも小さい様子が観察された。
また、いずれの毛もキューティクル構造を有する形態的に正常な毛が形成されていた。
図１０に示したように、それぞれの再生毛数を解析したところ、再生毛数は毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物の移植部は、比較例２の間葉系細胞のスフェロイドと上皮系細胞との混合物の移植部と比較して、２倍近く多いことが示された。
また、再生毛の太さはいずれも２０μｍとマウスの体毛とほぼ同様の太さであった。【００９５】
以上の結果から、本発明の毛髪再生用細胞包埋ビーズは、スフェロイドよりも高い毛髪再生効率を実現できることが示された。【００９６】
［実施例２］マウス毛髪再生用細胞包埋ビーズの作製２
（１）間葉系細胞の採取
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、妊娠マウスＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌの子宮内の胎齢１８日齢のマウス胎児から間葉系細胞を採取した。【００９７】
（２）細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程
次いで、採取した間葉系細胞のうち１．０×１０６、２．０×１０６、４．０×１０６、又は８．０×１０６ｃｅｌｌｓにＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ含有）を添加し、１，０００ｒｐｍ、１８０秒間遠心した後、上清を除去した。次いで、間葉系細胞をコラーゲン  Ｔｙｐｅ１（コラーゲン３ｍｇ／ｍＬ含有、新田ゼラチン社製）０．２ｍＬに懸濁した。【００９８】
培養ディッシュの蓋の裏面（撥水性表面）に、懸濁液を２μＬ（０．５×１０４、１．０×１０４、２．０×１０４、４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／２μＬ）ずつ滴下した。３７℃で３０分間インキュベートし、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製した。【００９９】
（３）凝集工程
次いで、ピペットマンを用いて、細胞包埋硬化ゲル形成体を培養ディッシュの蓋の裏面から剥がした。次いで、細胞包埋硬化ゲル形成体を培養ディッシュに入れ、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ含有）を添加し、３日間浮遊培養し、毛髪再生用細胞包埋ビーズを作製した。【０１００】
（４）観察結果
位相差顕微鏡（ＩＸ−７１  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いて、培養開始から３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズを観察した結果を図１１Ａに示す。
図１１Ａから、包埋細胞数の増加に伴い、ビーズの直径が小さくなる傾向が観察された。【０１０１】
（５）毛髪再生用細胞包埋ビーズの直径測定
位相差顕微鏡を用いて、培養開始から０日目、１日目及び３日目の毛髪再生用細胞包埋ビーズの画像を取得した。次いで、Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて画像を解析し、毛髪再生用細胞包埋ビーズの直径を測定した。結果を図１１Ｂに示す。
図１１Ｂから、３日間の培養により、毛髪再生用細胞包埋ビーズの直径はダイナミックに変化し、その直径は５００〜８００μｍであった。
また、包埋細胞数の増加に伴い、ビーズの直径が小さくなる傾向が観察された。これは、細胞の牽引力によって、ビーズ内のコラーゲン線維が凝集されることに起因しており、細胞数が増加することにより、コラーゲン線維を凝集する力が増したためと考えられる。【０１０２】
［試験例５］Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＨＩＦ１α遺伝子のＰＣＲ解析
実施例２の間葉系細胞の細胞数が異なる毛髪再生用細胞包埋ビーズを用いて、発毛マーカータンパク質であるＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及び低酵素マーカーであるＨＩＦ１α遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。【０１０３】
（１）ＲＮＡ抽出
まず、実施例２の間葉系細胞の細胞数が異なる毛髪再生用細胞包埋ビーズについて試験例２の（１）と同様の方法を用いて、ＲＮＡ溶解液を得た。【０１０４】
（２）分光光度計によるＲＮＡ濃度測定
次いで、試験例２の（２）と同様の方法を用いて、各毛髪再生用細胞包埋ビーズのＲＮＡ溶解液の濃度を測定した。【０１０５】
（３）ＲＴ−ＰＣＲ
次いで、試験例２の（３）と同様の方法を用いて、各毛髪再生用細胞包埋ビーズ由来のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡを得た。【０１０６】
次いで、マイクロチューブに上記表２に示す組成の溶液を加え、透明フィルムで覆った。表２において、ＤＮＡとは、各毛髪再生用細胞包埋ビーズ由来のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡを示す。さらに、ＰＣＲで用いたプライマーの塩基配列について、表５に示す。【０１０７】
【表５】
2017217393.tif 000007
【０１０８】
次いで、サーマルサイクラーにセットし、しっかり閉まっていることを確認した。次いで、９５℃で４分間、（９５℃で５秒間、６０℃で６０秒間）×４５サイクル、７２℃で１０分間のプロトコールにてＰＣＲを行った。コントロールとして、ＧＡＰＤＨの発現量を測定し、ＧＡＰＤＨの発現量に対するＶｅｒｓｉｃａｎ又はＨＩＦ１αの相対的な発現量を算出した。結果を図１２（（ｉ）Ｖｅｒｓｉｃａｎ、（ｉｉ）ＨＩＦ１α）に示す。【０１０９】
図１２の（ｉ）から、Ｖｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量について、間葉系細胞の細胞数が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｂｅａｄｓである毛髪再生用細胞包埋ビーズが最も高い遺伝子発現を示した。また、ビーズ内の間葉系細胞の細胞数が増加するに伴い、低酸素マーカーであるＨＩＦ１α遺伝子の発現量は低下し、一方、Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子の発現量は減少した。
以上のことから、毛髪再生用細胞包埋ビーズ内の間葉系細胞の細胞数を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｂｅａｄｓ（細胞密度：約１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３）よりも多くすることで、一部の細胞で低酸素による発毛活性の低下が生じることが示唆された。そこで、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｂｅａｄｓを毛髪再生用細胞包埋ビーズ内の間葉系細胞が低酸素に陥らず、最も高い毛包誘導能を示す包埋細胞数と判断し、以降の実験を進めることとした。【０１１０】
［実施例３］マウス毛髪再生用細胞包埋ビーズの作製３
（１）間葉系細胞の採取
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、妊娠マウスＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌの子宮内の胎齢１８日齢のマウス胎児から間葉系細胞を採取した。【０１１１】
（２）コラーゲン溶液の調製
次いで、３ｍｇ／ｍＬのコラーゲン  Ｔｙｐｅ１（新田ゼラチン社製）を、必要に応じてｐＨ３の塩酸で希釈し、０．７５、１．５０、２．２５、又は３．００ｍｇ／ｍＬのコラーゲン溶液を調製した。【０１１２】
（３）細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程
次いで、採取した間葉系細胞のうち１．０×１０６ｃｅｌｌｓにＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ含有）を添加し、１，０００ｒｐｍ、１８０秒間遠心した後、上清を除去した。次いで、間葉系細胞を（２）で調製した０．７５、１．５０、２．２５、又は３．００ｍｇ／ｍＬのコラーゲン溶液０．２ｍＬに懸濁した。【０１１３】
培養ディッシュの蓋の裏面（撥水性表面）に、懸濁液を２μＬ（１．０×１０４／２μＬ）ずつ、１００個滴下した。３７℃で３０分間インキュベートし、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製した。【０１１４】
（４）凝集工程
次いで、ピペットマンを用いて、細胞包埋硬化ゲル形成体を培養ディッシュの蓋の裏面から剥がした。次いで、細胞包埋硬化ゲル形成体を培養ディッシュに入れ、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ含有）を添加し、３日間浮遊培養し、毛髪再生用細胞包埋ビーズを作製した。【０１１５】
（５）観察結果
位相差顕微鏡（ＩＸ−７１  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いて、培養開始から３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズを観察した結果を図１３Ａに示す。
図１３Ａから、コラーゲン濃度の上昇に伴い、ビーズの直径が大きくなる傾向が観察された。【０１１６】
（６）毛髪再生用細胞包埋ビーズの直径測定
位相差顕微鏡を用いて、培養開始から０日目、１日目及び３日目の毛髪再生用細胞包埋ビーズの画像を取得した。次いで、Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて画像を解析し、毛髪再生用細胞包埋ビーズの直径を測定した。結果を図１３Ｂに示す。
図１３Ｂから、３日間の培養により、毛髪再生用細胞包埋ビーズの直径はダイナミックに変化し、その直径は３００〜９００μｍであった。
また、コラーゲン濃度の上昇に伴い、ビーズの直径が大きくなる傾向が観察された。これは、コラーゲン濃度、つまりコラーゲン線維の密度が低いほど、ゲルの架橋が脆くなり、細胞のけん引力によりゲルを容易に収縮することができたと考えられる。【０１１７】
［試験例６］Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子のＰＣＲ解析
実施例３のコラーゲン濃度が異なる毛髪再生用細胞包埋ビーズを用いて、発毛マーカータンパク質であるＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。【０１１８】
（１）ＲＮＡ抽出
まず、実施例２の間葉系細胞の細胞数が異なる毛髪再生用細胞包埋ビーズについて試験例２の（１）と同様の方法を用いて、ＲＮＡ溶解液を得た。【０１１９】
（２）分光光度計によるＲＮＡ濃度測定
次いで、試験例２の（２）と同様の方法を用いて、各毛髪再生用細胞包埋ビーズのＲＮＡ溶解液の濃度を測定した。【０１２０】
（３）ＲＴ−ＰＣＲ
次いで、試験例２の（３）と同様の方法を用いて、各毛髪再生用細胞包埋ビーズ由来のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡを得た。
次いで、マイクロチューブに上記表２に示す組成の溶液を加え、透明フィルムで覆った。表２において、ＤＮＡとは、各毛髪再生用細胞包埋ビーズ由来のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡを示す。さらに、ＰＣＲで用いたプライマーの塩基配列について、上記表３に示す。【０１２１】
次いで、サーマルサイクラーにセットし、しっかり閉まっていることを確認した。次いで、９５℃で４分間、（９５℃で５秒間、６０℃で６０秒間）×４５サイクル、７２℃で１０分間のプロトコールにてＰＣＲを行った。コントロールとして、ＧＡＰＤＨの発現量を測定し、ＧＡＰＤＨの発現量に対するＶｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量を算出した。結果を図１４に示す。【０１２２】
図１４から、コラーゲン濃度が減少するのに従い、発毛（毛包誘導）マーカーであるＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子の発現は減少する傾向がみられた。
以上のことから、毛髪再生用細胞包埋ビーズを構成するコラーゲン濃度は３．０ｍｇ／ｍＬが最も高い発毛活性を示し、一方、コラーゲン濃度を減少させることで、発毛活性の低下が生じることが示された。そこで、３．０ｍｇ／ｍＬが毛髪再生用細胞包埋ビーズを構成するコラーゲン濃度として適している判断し、この濃度で以降の実験を進めることとした。【０１２３】
［実施例４］マウス毛髪再生用細胞包埋ビーズの作製４
（１）間葉系細胞の採取
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、妊娠マウスＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌの子宮内の胎齢１８日齢のマウス胎児から間葉系細胞を採取した。【０１２４】
（２）細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程
次いで、採取した間葉系細胞のうち１．０×１０６ｃｅｌｌｓにＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ含有）を添加し、１，０００ｒｐｍ、１８０秒間遠心した後、上清を除去した。次いで、間葉系細胞をコラーゲン  Ｔｙｐｅ１（コラーゲン３ｍｇ／ｍＬ含有、新田ゼラチン社製）０．２ｍＬに懸濁した。【０１２５】
培養ディッシュの蓋の裏面（撥水性表面）に、懸濁液を２μＬ（１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／２μＬ）ずつ、１００個滴下した。３７℃で３０分間インキュベートし、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製した。【０１２６】
（３）凝集工程
次いで、ピペットマンを用いて、細胞包埋硬化ゲル形成体を培養ディッシュの蓋の裏面から剥がした。次いで、細胞包埋硬化ゲル形成体を培養ディッシュに入れ、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ含有）を添加し、３日間浮遊培養し、毛髪再生用細胞包埋ビーズを作製した。【０１２７】
（４）アクチン及び核の染色
培養開始から３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズをパラホルムアルデヒドで固定し、以下の手順でアクチン及び核を染色した。
まず、毛髪再生用細胞包埋ビーズにＰＢＳを添加し１分間静置して、ＰＢＳを除去した。次いで、同じ操作を２回繰り返し、毛髪再生用細胞包埋ビーズを洗浄した。次いで、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を添加し１０分間静置した（透徹）。次いで、ＰＢＳを添加し１分間静置して、ＰＢＳを除去した。次いで、同じ操作を２回繰り返し、毛髪再生用細胞包埋ビーズを洗浄した。次いで、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を添加し、３０分間静置してアクチンを染色した。次いで、ＰＢＳを添加し１分間静置して、ＰＢＳを除去した。次いで、同じ操作を２回繰り返し、毛髪再生用細胞包埋ビーズを洗浄した。次いで、４’、６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）（和光純薬工業社製）を添加し、５分間静置して核を染色した。次いで、ＰＢＳを添加し５分間静置して、ＰＢＳを除去した。次いで、同じ操作を２回繰り返し、毛髪再生用細胞包埋ビーズを洗浄した。【０１２８】
（５）観察結果
蛍光顕微鏡（ＤＰ−７１  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）及び共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ７００  Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて、培養開始から３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズを観察した結果を図１５Ａ（上右：蛍光顕微鏡像、下右：共焦点レーザー顕微鏡像）に示す。
図１５Ａ（上右：蛍光顕微鏡像、下右：共焦点レーザー顕微鏡像）から、毛髪再生用細胞包埋ビーズ内の間葉系細胞は発達したアクチン骨格を形成していた。【０１２９】
（６）毛髪再生用細胞包埋ビーズの直径測定
位相差顕微鏡（ＩＸ−７１  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いて、培養開始から０日目、１日目及び３日目の毛髪再生用細胞包埋ビーズの画像を取得した。次いで、Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて画像を解析し、毛髪再生用細胞包埋ビーズの直径を測定した。結果を図１５Ｂの（−）に示す。
図１５Ｂの（−）から、３日間の培養により、毛髪再生用細胞包埋ビーズの直径はダイナミックに変化し、その直径は８００μｍ程度であった。【０１３０】
［比較例３］
（１）間葉系細胞の採取
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、妊娠マウスＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌの子宮内の胎齢１８日齢のマウス胎児から間葉系細胞を採取した。【０１３１】
（２）細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程
実施例４の（２）と同様の方法を用いて、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製した。【０１３２】
（３）凝集工程
次いで、３０μＭのブレビスタチンを添加したＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ含有）を用いた以外は、実施例４の（３）と同様の方法を用いて、毛髪再生用細胞包埋ビーズを作製した。
なお、ブレビスタチンとは、細胞の牽引力に関わるミオシンを阻害する阻害剤であり、発達したアクチン骨格の形成を阻害することが知られている。【０１３３】
（４）アクチン及び核の染色
培養開始から３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズについて、実施例４の（４）と同様の方法を用いて、アクチン及び核を染色した。【０１３４】
（５）観察結果
蛍光顕微鏡（ＤＰ−７１  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）及び共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ７００  Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて、培養開始から３日後の毛髪再生用細胞包埋ビーズを観察した結果を図１５Ａ（上左：蛍光顕微鏡像、下左：共焦点レーザー顕微鏡像）に示す。
図１５Ａ（上左：蛍光顕微鏡像、下左：共焦点レーザー顕微鏡像）から、毛髪再生用細胞包埋ビーズ内の間葉系細胞について、アクチン骨格の形成が観察されなかった。【０１３５】
（６）毛髪再生用細胞包埋ビーズの直径測定
位相差顕微鏡（ＩＸ−７１  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いて、培養開始から０日目、１日目及び３日目の毛髪再生用細胞包埋ビーズの画像を取得した。次いで、Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて画像を解析し、毛髪再生用細胞包埋ビーズの直径を測定した。結果を図１５Ｂの（＋）に示す。
図１５Ｂの（＋）から、３日間の培養により、毛髪再生用細胞包埋ビーズの直径はほとんど変化せず、約２．０ｍｍ程度のままであった。
これは、ブレビスタチンの添加により、間葉系細胞の細胞牽引力が阻害されたためであると推察された。【０１３６】
［試験例７］Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子のＰＣＲ解析
実施例４及び比較例３の毛髪再生用細胞包埋ビーズを用いて、発毛マーカータンパク質であるＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。【０１３７】
（１）ＲＮＡ抽出
まず、実施例４及び比較例３の毛髪再生用細胞包埋ビーズについて試験例２の（１）と同様の方法を用いて、ＲＮＡ溶解液を得た。【０１３８】
（２）分光光度計によるＲＮＡ濃度測定
次いで、試験例２の（２）と同様の方法を用いて、各毛髪再生用細胞包埋ビーズのＲＮＡ溶解液の濃度を測定した。【０１３９】
（３）ＲＴ−ＰＣＲ
次いで、試験例２の（３）と同様の方法を用いて、各毛髪再生用細胞包埋ビーズ由来のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡを得た。
次いで、マイクロチューブに上記表２に示す組成の溶液を加え、透明フィルムで覆った。表２において、ＤＮＡとは、各毛髪再生用細胞包埋ビーズ由来のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡを示す。さらに、ＰＣＲで用いたプライマーの塩基配列について、上記表３に示す。【０１４０】
次いで、サーマルサイクラーにセットし、しっかり閉まっていることを確認した。次いで、９５℃で４分間、（９５℃で５秒間、６０℃で６０秒間）×４５サイクル、７２℃で１０分間のプロトコールにてＰＣＲを行った。コントロールとして、ＧＡＰＤＨの発現量を測定し、ＧＡＰＤＨの発現量に対するＶｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量を算出した。結果を図１６に示す。なお、図１６において、（＋）とは、比較例３のブレビスタチンを添加して培養した毛髪再生用細胞包埋ビーズを示し、（−）とは、実施例４のブレビスタチン無添加で培養した毛髪再生用細胞包埋ビーズを示す。【０１４１】
図１６から、培養開始から１日目及び３日目ともに、ブレビスタチン（＋）（比較例３）の方がブレビスタチン（−）（実施例４）よりもＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子の発現が有意に低い傾向が見られた。これは、ブレビスタチン添加による毛髪再生用細胞包埋ビーズの収縮阻害が、毛包誘導遺伝子（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）の発現を抑制したためと考えられる。
以上のことから、毛髪再生用細胞包埋ビーズの収縮は、間葉系細胞の毛包誘導遺伝子の発現を増加させる効果があることが示唆された。【０１４２】
［実施例５］マウス毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物の作製
（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、妊娠マウスＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌの子宮内の胎齢１８日齢のマウス胎児から間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。【０１４３】
（２）細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程
次いで、採取した間葉系細胞のうち１．０×１０６ｃｅｌｌｓにＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ含有）を添加し、１，０００ｒｐｍ、１８０秒間遠心した後、上清を除去した。次いで、間葉系細胞をコラーゲン  Ｔｙｐｅ１（コラーゲン３ｍｇ／ｍＬ含有、新田ゼラチン社製）０．２ｍＬに懸濁した。【０１４４】
Ｐｒｉｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ９６  ｕ  ｐｌａｔｅ（住友ベークライト社製）のウェルに、懸濁液を２μＬ（１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／２μＬ）ずつ、滴下した。３７℃で３０分間インキュベートし、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製した。【０１４５】
（３）上皮系細胞の細胞懸濁液の調製
次いで、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ含有）とＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（ＫＵＲＡＢＯ社製）との１：１混合培地に、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、（１）で採取した上皮系細胞を懸濁させた。【０１４６】
（４）毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物作製工程
次いで、上皮系細胞を含む懸濁液を１００μＬずつ、（２）で作製した細胞包埋硬化ゲル形成体を含むウェルに添加し、３日間浮遊培養し、毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物を作製した。【０１４７】
［参考例１］マウス再生毛包原基の作製
（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、妊娠マウスＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌの子宮内の胎齢１８日齢のマウス胎児から間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。【０１４８】
（２）毛包原基の形成
次いで、Ｐｒｉｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ９６  ｕ  ｐｌａｔｅ（住友ベークライト社製）のウェルに、上皮系細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）及び間葉系細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）の細胞混合懸濁液を０．１ｍＬ（上皮系細胞及び間葉系細胞、各１×１０４ｃｅｌｌｓずつ含有）加え、３日間培養し、再生毛包原基を作製した。培地は、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ含有）とＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（ＫＵＲＡＢＯ社製）との１：１混合培地を用いた。【０１４９】
［試験例８］ヌードマウスを用いた皮下移植試験
（１）ヌードマウスへの皮下移植
実施例５の毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物、及び、参考例１の再生毛包原基をヌードマウス皮内にパッチ法を用いて移植した。動物の飼育及び動物実験は、横浜国立大学動物実験委員会の指針に遵守して行った。
具体的には、まず、ヌードマウスにイソフルラン吸引麻酔を行い、背部をイソジンで消毒した。次いで、２０Ｇ  Ｖランスマイクロメス（日本アルコン社製）を用いて、皮膚表皮層から真皮層下部に至る移植穴を形成した。次いで、この移植穴に、実施例５の毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物各１個／１箇所（合計５０箇所）、又は、参考例１の再生毛包原基各１個／１箇所（合計５０箇所）を、マイクロピペットを用いて挿入した（図１７Ａ参照。）。
図１７Ａは実施例５のマウス毛髪再生用細胞包埋ビーズの製造方法、及び、参考例１の再生毛包原基の製造方法、並びに、ヌードマウスへのパッチ法による皮下移植方法を模式的に示す図である。図１７Ａにおいて、「ＨＢ」とは“Ｈａｉｒ  ｂｅａｄｓ”の略称であり、実施例５で作製された毛髪再生用細胞包埋ビーズ及び上皮系細胞の混合物を示す。また、「ＨＦＧ」は“Ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｇｅｒｍｓ”の略称であり、参考例１の再生毛包原基を示す。
実施例５の毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物（ＨＢ）及び参考例１の再生毛包原基（ＨＦＧ）の移植から３週間後に、デジタルマイクロスコープ（ＶＨＸ−１０００  ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて、移植部を観察した結果を図１７Ｂに示す。
また、図１７Ｃは、実施例５のＨＢ及び参考例１のＨＦＧの移植から３週間後のヌードマウスの移植部での再生毛髪数を示すグラフである。【０１５０】
（２）結果
図１７Ｂから、移植から３週間後には、実施例５の毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物（ＨＢ）、及び、参考例１の再生毛包原基（ＨＦＧ）はそれぞれホストであるヌードマウスの皮膚内に生着して、毛成長する様子が観察された。
また、図１７Ｃから、再生毛髪数について、ＨＢはＨＦＧよりも有意に高い値を示した。
以上のことから、高密度のコラーゲンを含むＨＢはＨＦＧよりも高い毛髪再生能を有することが示された。【０１５１】
［実施例６］ヒト毛乳頭細胞を用いた毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物の作製
（１）上皮系細胞の採取
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、妊娠マウスＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌの子宮内の胎齢１８日齢のマウス胎児から上皮系細胞を採取した。【０１５２】
（２）細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程
次いで、ヒト毛乳頭細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）１．０×１０６ｃｅｌｌｓにヒト毛乳頭細胞増殖培地（ＤＰＣＧＭ）（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を添加し、１，０００ｒｐｍ、１８０秒間遠心した後、上清を除去した。次いで、間葉系細胞をコラーゲン  Ｔｙｐｅ１（コラーゲン３ｍｇ／ｍＬ含有、新田ゼラチン社製）０．２ｍＬに懸濁した。【０１５３】
Ｐｒｉｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ９６  ｕ  ｐｌａｔｅ（住友ベークライト社製）のウェルに、懸濁液を２μＬ（１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／２μＬ）ずつ、滴下した。３７℃で３０分間インキュベートし、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製した。【０１５４】
（３）上皮系細胞の細胞懸濁液の調製
次いで、ヒト毛乳頭細胞増殖培地（ＤＰＣＧＭ）（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）とＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（ＫＵＲＡＢＯ社製）との１：１混合培地に、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、（１）で採取した上皮系細胞を懸濁させた。【０１５５】
（４）毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物作製工程
次いで、上皮系細胞を含む懸濁液を１００μＬずつ、（２）で作製した細胞包埋硬化ゲル形成体を含むウェルに添加し、３日間浮遊培養し、毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物を作製した。【０１５６】
［参考例２］ヒト間葉系細胞とマウス上皮系細胞とを用いた再生毛包原基の作製
（１）上皮系細胞の採取
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、妊娠マウスＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌの子宮内の胎齢１８日齢のマウス胎児から上皮系細胞を採取した。【０１５７】
（２）毛包原基の形成
次いで、Ｐｒｉｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ９６  ｕ  ｐｌａｔｅ（住友ベークライト社製）のウェルに、上皮系細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）及びヒト毛乳頭細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）の細胞混合懸濁液を０．１ｍＬ（上皮系細胞及びヒト毛乳頭細胞、各１×１０４ｃｅｌｌｓずつ含有）加え、３日間培養し、再生毛包原基を作製した。培地は、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ含有）とＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（ＫＵＲＡＢＯ社製）との１：１混合培地を用いた。【０１５８】
［試験例９］ヌードマウスを用いた皮下移植試験
（１）ヌードマウスへの皮下移植
実施例６の毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物（以下、「ＨＢ２」と称する場合がある。）、及び、参考例２の再生毛包原基（以下、「ＨＦＧ２」と称する場合がある。）をヌードマウス皮内にパッチ法を用いて移植した。動物の飼育及び動物実験は、横浜国立大学動物実験委員会の指針に遵守して行った。
具体的には、まず、ヌードマウスにイソフルラン吸引麻酔を行い、背部をイソジンで消毒した。次いで、２０Ｇ  Ｖランスマイクロメス（日本アルコン社製）を用いて、皮膚表皮層から真皮層下部に至る移植穴を形成した。次いで、この移植穴に、実施例６の毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物各１個／１箇所（合計２５箇所）、又は、参考例２の再生毛包原基各１個／１箇所（合計２５箇所）を、マイクロピペットを用いて挿入した。【０１５９】
（２）観察結果
実施例６の毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物（ＨＢ２）及び参考例２の再生毛包原基（ＨＦＧ２）の移植から３週間後に、デジタルマイクロスコープ（ＶＨＸ−１０００  ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて、移植部を観察した。その結果を図１８Ａに示す。
また、図１８Ｂは、実施例６のＨＢ２及び参考例２のＨＦＧ２の移植から３週間後のヌードマウスの移植部での再生毛髪数を示すグラフである。【０１６０】
（３）切片の作製
次いで、実施例６のＨＢ２の移植から３週間後のヌードマウスの移植部の皮膚を切り出した。続いて、１０％中性緩衝ホルマリン液（Ｗａｋｏ社製）に１日浸漬することで、組織の固定を行った。続いて、１０％、２０％、３０％スクロース溶液（Ｗａｋｏ社製のスクロースを希釈して調製した溶液）にそれぞれ１時間ずつ浸した。スクロース置換した切片を凍結組織切片作製用包埋剤（Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ：Ｏ．Ｃ．Ｔ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（サクラファインテック社製）を静かに流し込み、混合スフェロイドを封入した。続いて、クライオミクロトームを用いて微小の厚さにカットした。カットされた切片をスライドガラスに垂直に押し当て、転写した。【０１６１】
（４）ＨＥ染色
次いで、（３）で作製した切片について、実施例１の（５−２）と同様の方法を用いて、ＨＥ染色を行った。染色後の切片を位相差顕微鏡（ＩＸ−７１  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）で観察した結果を図１８Ｃに示す。【０１６２】
（５）毛のキューティクル構造の観察
毛のキューティグル構造を確認するために、実施例６のＨＢ２の移植から３週間後のヌードマウスの移植部を、ＳＥＭを用いて観察した。その結果を図１８Ｄに示す。【０１６３】
（６）結果と考察
図１８Ａから、移植から３週間後には、実施例６の毛髪再生用細胞包埋ビーズと上皮系細胞との混合物（ＨＢ２）、及び、参考例２の再生毛包原基（ＨＦＧ２）はそれぞれホストであるヌードマウスの皮膚内に生着して、毛成長する様子が観察された。
また、図１８Ｂから、再生毛髪数について、ＨＢ２はＨＦＧ２よりも有意に高い値を示した。
また、図１８Ｃから、ＨＢ２の移植部において毛包が形成されたことが確認できた。
また、図１８Ｄから、ＨＢ２の移植部において、キューティクル構造を有する毛の再生が確認できた。【０１６４】
以上のことから、高密度のコラーゲンを含むＨＢ２はＨＦＧ２よりも高い毛髪再生能を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１６５】
本発明によれば、高い毛髪再生活性を有する毛髪再生用細胞包埋ビーズを提供することができる。さらに、本発明の毛髪再生用細胞包埋ビーズを利用することにより、高い毛髪再生効率を実現できる。
【符号の説明】
【０１６６】
１…間葉系細胞、２…生体適合性ハイドロゲル、３…撥水性表面を有する支持体、４…細胞包埋硬化ゲル形成体、５…培地、６…毛髪再生用細胞包埋ビーズ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月14日(2018.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系細胞と、１．０ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下の生体適合性ハイドロゲルとを含有することを特徴とする毛髪再生用細胞包埋ビーズ。
【請求項２】
間葉系細胞と、１．０ｍｇ／ｍＬ以上３．０ｍｇ／ｍＬ以下の生体適合性ハイドロゲルとを含有する、請求項１に記載の毛髪再生用細胞包埋ビーズ。
【請求項３】
前記生体適合性ハイドロゲルがゲル化する細胞外マトリックス成分である請求項１又は２に記載の毛髪再生用細胞包埋ビーズ。
【請求項４】
前記細胞外マトリックス成分がＩ型コラーゲンである請求項３に記載の毛髪再生用細胞包埋ビーズ。
【請求項５】
前記間葉系細胞の細胞密度が５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以上２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以下である請求項１〜４のいずれか一項に記載の毛髪再生用細胞包埋ビーズ。
【請求項６】
間葉系細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する液滴を作製し、前記生体適合性ハイドロゲルを硬化させ、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製する細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程と、
前記細胞包埋硬化ゲル形成体を浮遊培養し、細胞の牽引力により凝集させる凝集工程と、
を備えることを特徴とする毛髪再生用細胞包埋ビーズの製造方法。
【請求項７】
前記細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程において、撥水性表面を有する支持体に滴下し、前記液滴を作製する請求項６に記載の毛髪再生用細胞包埋ビーズの製造方法。
【請求項８】
前記細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程において、前記液滴に含まれる前記間葉系細胞の濃度が、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である請求項６又は７に記載の毛髪再生用細胞包埋ビーズの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の毛髪再生用細胞包埋ビーズと、
上皮系細胞と、
を備えることを特徴とする毛髪再生用キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る毛髪再生用細胞包埋ビーズは、間葉系細胞と、１．０ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下の生体適合性ハイドロゲルとを含有する。
上記第１態様に係る毛髪再生用細胞包埋ビーズは、間葉系細胞と、１．０ｍｇ／ｍＬ以上３．０ｍｇ／ｍＬ以下の生体適合性ハイドロゲルとを含有してもよい。
前記生体適合性ハイドロゲルがゲル化する細胞外マトリックス成分であってもよい。
前記細胞外マトリックス成分がＩ型コラーゲンであってもよい。
前記間葉系細胞の細胞密度（凝集後）が５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以上２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以下であってもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明の第２態様に係る毛髪再生用細胞包埋ビーズの製造方法は、間葉系細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する液滴を作製し、前記生体適合性ハイドロゲルを硬化させ、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製する細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程と、前記細胞包埋硬化ゲル形成体を浮遊培養し、細胞の牽引力により凝集させる凝集工程と、を備える方法である。
前記細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程において、撥水性表面を有する支持体に滴下し、前記液滴を作製してもよい。
前記細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程において、前記液滴に含まれる前記間葉系細胞の濃度が、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であってもよい。
【国際調査報告】
2017217393.tif 000037
2017217393.tif 000038
2017217393.tif 000039
2017217393.tif 000040