(57)【要約】［課題］本発明は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。本発明はまた、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と薬物とのコンジュゲートを提供する。本発明はさらに、Ｆａｂ’と薬物とのコンジュゲートを提供する。本発明はさらにまた、筋肉等の組織や細胞に薬物を送達するための上記コンジュゲートのいずれかを含む組成物を提供する。［解決手段］抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と薬物とのコンジュゲート、および抗体のＦａｂ’と薬物とのコンジュゲート。
2017221883.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と薬物とのコンジュゲート。
【請求項２】
抗原結合性断片がＦａｂ’である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片が、抗ＣＤ７１抗体のＦａｂ’である、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
薬物が核酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
薬物がＲＮＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
薬物がｍＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
薬物がｓｉＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
薬物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と薬物とがリンカーによって連結された、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、心筋および骨格筋から選択されるいずれか少なくとも１つに薬物を送達することに用いるための組成物。
【請求項１１】
心筋および骨格筋から選択されるいずれか少なくとも１つに薬物を送達するための、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片の使用。
【請求項１２】
心筋および骨格筋から選択されるいずれか少なくとも１つに薬物を送達することに用いるための、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む医薬。
【請求項１４】
筋肉の疾患の予防および／または治療剤である、請求項１３に記載の医薬。 
【請求項１５】
哺乳動物に対し、請求項１３に記載の医薬の有効量を投与することを含む、筋肉の疾患の予防および／または治療方法。 
【請求項１６】
筋肉の疾患の予防および／または治療剤を製造するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のコンジュゲートの使用。 
【請求項１７】
筋肉の疾患の予防および／または治療に使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
抗ＣＤ７１抗体のＦａｂ’と薬物とのコンジュゲートを製造する方法であって、
前記Ｆａｂ’のチオール基と該チオール基と反応性を有する官能基を有する薬物とを反応させること、または
前記Ｆａｂ’のチオール基と、該チオール基と反応性を有する官能基を有するリンカーに結合した薬物とを反応させること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、特に抗ＣＤ７１抗体の抗原結合性断片（例、Ｆａｂ’）と薬物とのコンジュゲートに関する。本発明により、筋肉に薬物を送達するための上記コンジュゲートを含む組成物が提供される。【０００２】
［発明の背景］
ＣＤ７１は、トランスフェリン受容体であり、鉄を結合したホロトランスフェリンと結合して、これを受容体媒介エンドサイトーシスにより細胞内に移行させ、鉄分を細胞内に取り込む働きをする。ＣＤ７１は、細胞膜上からエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれた後には、また細胞膜上にリサイクルされると考えられている。【０００３】
トランスフェリンは、ＣＤ７１により細胞内に取り込まれるため、トランスフェリンと薬物をコンジュゲートすることにより、薬物をＣＤ７１発現細胞内に取り込ませる研究が行われてきた（非特許文献１〜４）。トランスフェリンとＤＮＡとのコンジュゲートは、それ自体では細胞内に取り込ませることができず、ポリエチレンイミンをコンジュゲートと複合体化させるとＤＮＡが細胞内に取り込まれることが報告されている（非特許文献５）。【０００４】
筋肉は、薬物の送達が難しい組織であるとされる。この理由は、筋肉内の血管の内皮は、血管を敷石上に敷き詰めており、物質が通過するための孔を有しないためと考えられている。この血管内皮の構造などが障壁となるため、筋肉への薬物の効率的な送達は困難である（非特許文献６および７）。【０００５】
非特許文献８には、Ｈｅｒ２、ＴＥＮＢ２などに対する抗体モノマーとｓｉＲＮＡのコンジュゲートが開示されている。非特許文献９には、Ｈｅｒ２、ＩＧＦ１-Ｒ、ＣＤ２２などに対する抗体とｓｉＲＮＡを、ジゴキシゲニンを介して抗体に結合させたＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓが開示されている。【０００６】
非特許文献１０は、抗ＣＤ７１抗体のＦａｂ’断片によりｓｉＲＮＡを筋肉に送達することを開示するが、本願優先日以降に発明者らが基礎出願の内容の一部を発表した文献である。 【０００７】
特許文献１には、抗ＣＤ７１抗体のアミノ酸配列により抗腫瘍効果の有無が決定されること、および抗腫瘍効果を有する抗体のアミノ酸配列が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０００６７１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】E. Wagner et al., PNAS, 87: 3410-3414, 1990
【非特許文献２】E. Chang et al., Hum Gene Ther., 8: 467-475, 1997
【非特許文献３】M. Davis et al., Bioconjug. Chem., 14: 1122-1132, 2003
【非特許文献４】Y. Sato et al., FASEB J., 14: 2018-2118, 2000
【非特許文献５】K.W. Liang et al., Molecular Therapy, 1 (3): 236-243, 2000
【非特許文献６】B. Rippe  et al., Physiol. Rev.  74: 163-219, 1994
【非特許文献７】J.A. Wolff et al., Adv. Genet. 54: 1-20, 2005
【非特許文献８】T.L. Cuellar et al., Nucleic Acid Research, 43 (2): 1189-1203, 2015
【非特許文献９】B. Schneider et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids, 1, e46, 2012
【非特許文献１０】T. Sugo et al., Journal of Controlled Release, 237: 1-13, 2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、核酸等の薬物を筋肉等の組織や細胞へ効果的に送達する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と薬物とのコンジュゲートが、筋肉に良好に送達されることを見出した。また、筋肉に送達された薬物が、当該筋肉において所望の活性を発揮しうる（例えば、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片とミオスタチンに対するｓｉＲＮＡとのコンジュゲートを筋肉に送達させた場合に、筋肉量を増大させる作用を有する）ことを見出した。本発明はこのような知見に基づいてなされたものである。【００１２】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と薬物とのコンジュゲート（本明細書において、本発明のコンジュゲートと称することがある）。
［２］抗原結合性断片がＦａｂ’である、上記［１］に記載のコンジュゲート。
［３］抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片が、抗ＣＤ７１抗体のＦａｂ’である、上記［１］または［２］に記載のコンジュゲート。
［４］薬物が核酸である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載のコンジュゲート。
［５］薬物がＲＮＡである、上記［１］〜［４］のいずれかに記載のコンジュゲート。
［６］薬物がｍＲＮＡである、上記［１］〜［５］のいずれかに記載のコンジュゲート。
［７］薬物がｓｉＲＮＡである、上記［１］〜［５］のいずれかに記載のコンジュゲート。
［８］薬物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、上記［１］〜［４］のいずれかに記載のコンジュゲート。
［９］抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と薬物とがリンカーによって連結された、上記［１］〜［８］のいずれかに記載のコンジュゲート。
［１０］上記［１］〜［９］のいずれかに記載のコンジュゲートを含む、心筋および骨格筋から選択されるいずれか少なくとも１つに薬物を送達することに用いるための組成物。
［１１］心筋および骨格筋から選択されるいずれか少なくとも１つに薬物を送達するための、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片の使用。
［１２］心筋および骨格筋から選択されるいずれか少なくとも１つに薬物を送達することに用いるための、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片。
［１３］上記［１］〜［９］のいずれかに記載のコンジュゲートを含む医薬。
［１４］筋肉の疾患の予防および／または治療剤である、上記［１３］に記載の医薬。
［１５］哺乳動物に対し、上記［１］〜［９］のいずれかに記載のコンジュゲートの有効量を投与することを含む、筋肉の疾患の予防および／または治療方法。
［１６］筋肉の疾患の予防および／または治療剤を製造するための、上記［１］〜［９］のいずれかに記載のコンジュゲートの使用。
［１７］筋肉の疾患の予防および／または治療に治療するための、上記［１］〜［９］のいずれかに記載のコンジュゲート。
［１８］抗ＣＤ７１抗体のＦａｂ’と薬物とのコンジュゲートを製造する方法であって、
前記Ｆａｂ’のチオール基と該チオール基と反応性を有する官能基を有する薬物とを反応させること、または
前記Ｆａｂ’のチオール基と該チオール基と反応性を有する官能基を有するリンカーに結合した薬物とを反応させること
を含む、方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、薬物を効果的に骨格筋及び心筋等の筋肉等の細胞または組織に送達しうる。本発明によれば、また薬物を効果的に骨格筋及び心筋等の筋肉等の細胞または組織に送達することにより、筋肉等の細胞または組織の疾患を予防または治療しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、抗体−薬物コンジュゲートの一例として、抗体がＦａｂ’であり、薬物がｓｉＲＮＡであるコンジュゲートの調製例を示す。図１Ａは、ｓｉＲＮＡに対するチオール反応性基の導入例を示す。図１Ｂは、抗体を消化及び還元してＦａｂ’とし、Ｆａｂ’のチオール基とｓｉＲＮＡのチオール反応性基とを反応させてコンジュゲートを得るスキームを示す。図１Ｃは、サイズ除外クロマトグラフィー−ＨＰＬＣによるクロマトグラムを示す。図１Ｄは、コンジュゲートのピークが認められたクロマトグラムであり、上記コンジュゲートが高精製度で得られることを示す。図１ＥはＦａｂ’の吸光スペクトルを示し、図１Ｆは、ｓｉＲＮＡの吸光スペクトルを示し、図１Ｇは、上記コンジュゲートの吸収スペクトルを示す。
【図２】図２は、抗体−薬物コンジュゲートの一例として、抗体がBioXcell (West Lebanon, NH)から購入した抗ＣＤ７１抗体（ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  ２１７．１．３）（本明細書において、「ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７」と称することがある。）のＦａｂ’であり、薬物がｓｉＲＮＡであるコンジュゲートの結合能の評価結果を示す。図２Ａは、プレート表面に固定化したＣＤ７１に対するｃｌｏｎｅ  ＲＩ７の結合活性を示す。図２Ｂは、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とｓｉＲＮＡ（具体的にはＨＰＲＴに対するｓｉＲＮＡ）とのコンジュゲートのＣＤ７１に対する結合活性を示す。図２Ｃは、ｓｉＲＮＡとアイソタイプコントロールＩｇＧ２ａのＦａｂ’とのコンジュゲートは、ＣＤ７１に対して反応しないことを示す。図２Ｄは、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とｓｉＲＮＡ（具体的にはＨＰＲＴに対するｓｉＲＮＡ）とのコンジュゲートが、ＣＤ７１に対する結合においてｃｌｏｎｅ  ＲＩ７と競合することを示す。図２Ｅは、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とｓｉＲＮＡ（具体的にはＨＰＲＴに対するｓｉＲＮＡ）とのコンジュゲートが、トランスフェリン（Ｔｆ）とは弱くしか競合しないことを示す。図２Ｆは、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とｓｉＲＮＡ（具体的にはＨＰＲＴに対するｓｉＲＮＡ）とのコンジュゲートが、アイソタイプコントロールＩｇＧ２ａとは競合しないことを示す。
【図３】図３は、培養細胞に対するｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とｓｉＲＮＡのコンジュゲートによる遺伝子のサイレンシング（ノックダウン）を示す。図３Ａは、ＣＤ７１を弱発現する初代肝細胞に対して、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とＡｐｏＢに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＡｐｏＢ）とのコンジュゲートを培地に添加した場合の、細胞内におけるＡｐｏＢの遺伝子発現に対するサイレンシングを示す図である。図３Ｂは、マイトージェンの一例としての抗ＩｇＭで刺激したＢ細胞、図３Ｃは、マイトージェンの一例としてのＬ−ＰＨＡで刺激したＴ細胞に対して、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とＨＰＲＴに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＨＰＲＴ）とのコンジュゲートを培地に添加した場合の、細胞内におけるＨＰＲＴの遺伝子発現に対するサイレンシングを示す図である。図３Ａにおいては、黒丸は、ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＡｐｏＢ、白丸は、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とｓｉＡｐｏＢとのコンジュゲートを示す。図３Ｂおよび図３Ｃにおいては、黒丸は、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とｓｉＨＰＲＴとのコンジュゲート、白丸は、アイソタイプコントロールＩｇＧ２ａとｓｉＨＰＲＴとのコンジュゲートを示す。
【図４】図４は、抗体がｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’であり、薬物がｓｉＲＮＡであるコンジュゲートのインビボにおける動態および機能を示す図である。図中の数字（％）は、発現量の低下量を示す。図４Ａは、投与６時間後および２４時間後における血漿中のコンジュゲートの量を示す。図４Ｂは、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とＡｐｏＢに対するｓｉＲＮＡとのコンジュゲート（１０ｍｇ／ｋｇ体重、静脈内）投与２４時間後の肝臓におけるＡｐｏＢの発現量を示す。図４Ｃは、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とＨＰＲＴに対するｓｉＲＮＡとのコンジュゲート（１０ｍｇ／ｋｇ体重、静脈内）投与２４時間後または４８時間後の各組織におけるＨＰＲＴに対するサイレンシングを示す図である（ｎ＝４、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．００５、＊＊＊：ｐ＜０．０００１、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−テストによる）。図４Ｄおよび４Ｅは、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とＨＰＲＴに対するｓｉＲＮＡとのコンジュゲート（１０ｍｇ／ｋｇ体重、静脈内）投与７２時間後の腓腹筋（図４Ｄ）および心筋（図４Ｅ）におけるＨＰＲＴに対するサイレンシングを示す図である。図４Ｆは、陰性対照ｓｉＲＮＡではＨＰＲＴのサイレンシングが生じないことを示す。図中ｓｉＮＣは、陰性対照ｓｉＲＮＡを意味する。図４Ｇは、図４Ｄおよび４Ｅで内部参照をβアクチン（ＡＣＴＢ）としていたのをＧＡＰＤＨに変えても同じ結果が観察されることを示す（ｎ＝４、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、ウェルチテスト）。
【図５】図５は、各組織におけるＣＤ７１の発現量を示す図である（各組織についてｎ＝４）。
【図６】図６は、リンカーの違いによるサイレンシングへの影響を示す図である。図６Ａでは、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とＨＰＲＴに対するｓｉＲＮＡとのコンジュゲート（１０ｍｇ／ｋｇ体重、静脈内）の投与４８時間後のＨＰＲＴのサイレンシングをリンカーの種類別に示す。ここで、リンカーは、図１Ａにおいて同一名称で示される官能基を図１Ｂのスキームに従ってＦａｂ’のチオール基と反応させて得た。図６Ｂは、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とＨＰＲＴに対するｓｉＲＮＡとのコンジュゲート（１０ｍｇ／ｋｇ体重、静脈内）の投与７日後の腓腹筋におけるサイレンシングを、マレイミドリンカー（開裂不可能）とＶａｌ−Ｃｉｔリンカー（開裂可能）とで比較した結果を示す。図６Ｃは、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とＨＰＲＴに対するｓｉＲＮＡとのコンジュゲート（１０ｍｇ／ｋｇ体重、静脈内）の投与４８時間後の心筋における各種リンカーによるサイレンシングの比較を示す。図６Ｄは、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とＨＰＲＴに対するｓｉＲＮＡとのコンジュゲート（１０ｍｇ／ｋｇ体重、静脈内）の投与７日後の心筋におけるサイレンシングを、マレイミドリンカー（開裂不可能）とＶａｌ−Ｃｉｔリンカー（開裂可能）とで比較した結果を示す。ここで、図６ＡおよびＣにおいては、ｎ＝４であり、Ｄｕｎｎｅｔ’ｓテストによる統計解析を行った（＊：ｐ＜０．０５、＊＊＊：ｐ＜０．００１）。図６ＢおよびＤにおいては、ｎ＝４であり、ウィリアムズテストによる統計解析を行った（＊：ｐ＜０．０５）。図６Ｅは、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とＨＰＲＴに対するｓｉＲＮＡとのコンジュゲート（１０ｍｇ／ｋｇ体重、静脈内）の投与２週間後、３週間後または４週間後の腓腹筋におけるＨＰＲＴまたはミオスタチン（陰性対照）に対するサイレンシングを示す。図６Ｆは、図６Ｅの投与後の心筋におけるＨＰＲＴまたはミオスタチン（陰性対照）に対するサイレンシングを示す。図６ＥおよびＦでは、ｎ＝４であり、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−テストによる統計解析を行った（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
【図７】図７は、投与方法の違いがサイレンシングに及ぼす影響を示す図である。図７では、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とＨＰＲＴに対するｓｉＲＮＡとのコンジュゲート（１０ｍｇ／ｋｇ体重）を静脈内投与（ＩＶ）、皮下投与（ＳＣ）または腹腔内投与（ＩＰ）して投与法によりサイレンシングに相違が生じるかを検証した。図７Ａは、投与７日後の腓腹筋におけるＨＰＲＴに対するサイレンシングを示す（ｎ＝４、＊：ウェルチテストにおけるｐ＜０．０５；＊＊：ウェルチテストにおけるｐ＜０．００５；＊＊＊：ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔテストにおけるｐ＜０．０００１）。図７Ｂは、投与７日後の心筋におけるＨＰＲＴに対するサイレンシングを示す。図７Ｃは、筋肉内投与により１μｇの各種コンジュゲートまたは陰性対照により処置された腓腹筋における投与７日後のＨＰＲＴに対するサイレンシングを示す。図７Ｄは、未処置である反対側の腓腹筋におけるサイレンシングを示す。図７ＣおよびＤにおいてｎ＝４であり、Ｄｕｎｎｅｒ’ｓテストにより統計解析した（＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１）。図７ＥおよびＦは、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とＨＰＲＴに対するｓｉＲＮＡとのコンジュゲートの４０μｇを筋肉内投与して、処置した腓腹筋における３日後、７日後または１４日後のＨＰＲＴまたはミオスタチンに対するサイレンシングを示す。ｎ＝４であり、統計解析はウェルチテストによる（＊＊＊：ｐ＜０．００１）。図７Ｆは、未処置の反対側の腓腹筋における３日後、７日後または１４日後のＨＰＲＴまたはミオスタチンに対するサイレンシングを示す。ｎ＝４であり、統計解析はｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓテストによる（＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
【図８】図８は、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）マウスにおけるｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とミオスタチンに対するｓｉＲＮＡとのコンジュゲートの効果を示す。図８Ａは、正常マウスの一方の足の腓腹筋に筋肉内投与したコンジュゲートによるミオスタチンまたはＨＰＲＴに対するサイレンシングを示す。図８Ｂは、未処置である反対側の足の腓腹筋におけるミオスタチンまたはＨＰＲＴに対するサイレンシングを示す。図８ＡおよびＢにおいて、ｎ＝４であり、統計解析はウィリアムズテストにより行った（＊：ｐ＜０．０００１）。図８Ｃは、大腿動脈結紮（ＦＡＬ）によるＰＡＤモデルマウスにおけるｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とミオスタチンに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＭＳＴＮ）とのコンジュゲートのサイレンシングを示す。図８Ｃでは、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とｓｉＭＳＴＮとのコンジュゲート（２０μｇ／ＦＡＬ済みの脚）を週１回の間隔で４週間筋肉内投与した後のミオスタチンに対するサイレンシングを示す。図８Ｃでは、ｎ＝３〜５であり、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔテストにより解析した（＄＄：みせかけ対照（ｓｈａｍ）に対してｐ＜０．０１；＃：ＦＡＬ対照に対してｐ＜０．０５）。図８Ｄは、図８Ｃの通り処置されたマウスにおける腓腹筋の重量を示す。図８Ｄでは、ｎ＝２〜５であり、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔテストによって統計解析した（＃＃＃：ＦＡＬ対照と比較してｐ＜０．００１）。図８Ｅでは、図８Ｃの通り処置されたマウスの腓腹筋の薄層切片のヘマトキシリン・エオシン染色像を示す。矢じりは筋繊維を示し、再生した筋繊維は中心に核が局在することで特徴付けられる。スケールバーは、５０μｍを示す。図８Ｆは、図８Ｅに示された腓腹筋における筋繊維の横断面積の平均値を示す。図８Ｆでは、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔテストにより統計解析した（＄＄：みせかけ対照（ｓｈａｍ）に対してｐ＜０．０１；＃＃＃：ＦＡＬ対照に対してｐ＜０．００１）。図８Ｇでは、図８Ｃの通り処置されたマウスのトレッドミルテストによる走行パフォーマンステストの結果を示す。図８Ｇでは、ｎ＝１２であり、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔテストにより統計解析した（＃：ＦＡＬ対照に対してｐ＜０．０５）。
【図９】図９は、培養ヒト細胞に対するＯＫＴ９抗体のＦａｂ’とｓｉＲＮＡのコンジュゲートによる遺伝子のサイレンシング（ノックダウン）を示す。ＣＤ７１を発現するヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２）に対して、ＯＫＴ９抗体のＦａｂ’とＨＰＲＴに対するｓｉＲＮＡとのコンジュゲート（図中では「ＣＤ７１−ｓｉＲＮＡ（ＨＰＲＴ）で表される）を培地に添加した場合の、細胞内におけるＨＰＲＴの遺伝子発現に対するサイレンシングを示す図である。ＯＫＴ９抗体の代わりにアイソタイプコントロールＩｇＧ２ａのＦａｂ’を用いたコンジュゲート（図中では「ＩｇＧ−ｓｉＲＮＡ（ＨＰＲＴ）で表される）を陰性対照とした。
【図１０】図１０は、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦａｂ’とMALAT1に対するアンチセンスオリゴ核酸（ＡＳＯ）とのコンジュゲート（１０ｍｇ／ｋｇ体重、静脈内）投与４８時間後の各組織におけるMALAT1に対するサイレンシングを示す図である（ｎ＝４）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書では、「対象」とは、動物（例えば、ほ乳動物（例えば、霊長類（例えば、ヒト）））を意味する。
【００１６】
本明細書では、「抗体」とは、免疫グロブリンを意味し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。抗体としては、モノクローナル抗体が好ましい。
抗体の由来は、特に限定されないが例えば、非ヒト動物の抗体（例えば、非ヒト哺乳動物の抗体）、およびヒト抗体が挙げられる。また、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体であってもよい。また、抗体は、二重特異性抗体であってもよい。抗体の由来としては、ヒト化抗体またはヒト抗体が好ましい。
抗体としては、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体が好ましい。なお、キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、非ヒト動物の抗体から自体公知の方法で作成することができる。
抗体は、２本の重鎖と２本の軽鎖とが会合した構造を有する。重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）および、重鎖可変領域と重鎖定常領域との間に位置するヒンジ領域からなる。軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とからなる。重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有し、これにより抗体の抗原特異性が特徴付けられる。ＣＤＲは、重鎖および軽鎖のそれぞれＮ末端側から重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３、並びに、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３と呼ばれる。
【００１７】
本明細書では、「抗原結合性断片」とは、抗原への結合性が維持された抗体の一部を意味する。抗原結合性断片は、本発明の抗体の重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域またはその両方を含みうる。抗原結合性断片は、キメラ化またはヒト化されていてもよい。抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、ダイアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）２（単鎖（Ｆｖ）２）および半分子型Ｉｇが挙げられる。本発明ではこれらの抗体の抗原結合性断片を用いうる。このような抗体の断片は、特に限定されないが例えば、抗体を酵素で処理して得ることができる。例えば、抗体をパパインで消化すると、Ｆａｂを得ることができる。あるいは、抗体をペプシンで消化すると、Ｆ（ａｂ’）２を得ることができ、これをさらに還元するとＦａｂ’を得ることができる。
【００１８】
本明細書では、「処置」（treating）とは、治療（therapy）または予防(prevention)を意味する。
【００１９】
本明細書では、「薬物」とは、例えば、生体において有用な生理活性物質（例えば、タンパク質（例えば、酵素）、核酸（例えば、ＤＮＡや修飾核酸）、脂質、ペプチド、糖、低分子化合物、代謝物および二次代謝物など）、造影剤、蛍光色素など（本明細書において生理活性物質等と称することがある）を意味する。本明細書では、「薬物」は、生理活性物質等に加えて、細胞内で生理活性物質等を放出しうる形態の薬物（例えば、生理活性物質等のプロドラッグおよび生理活性物質等が内包された小胞）を含む意味で用いられる。本明細書では、「生理活性物質」とは、生体の特定の生理的調節機能に作用する物質を意味する。造影剤や蛍光色素を「薬物」として使用することにより、筋肉の画像診断などを実施しうる。
「薬物」としては、生理活性物質が好ましく、生理活性物質としては「核酸」が好ましい。
【００２０】
本明細書では、「核酸」とは、天然のＤＮＡおよび天然のＲＮＡなどの天然の核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、修飾ＤＮＡおよび修飾ＲＮＡなどの修飾核酸、人工核酸およびこれらの組合せが挙げられる。修飾核酸としては、例えば、蛍光色素修飾された核酸、ビオチン化された核酸、コレステリル基を導入した核酸が挙げられる。ＲＮＡは安定性を高めるために、塩基に対して２’−Ｏ−メチル修飾または、２’−フルオロ修飾若しくは２’−メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾をすることがあり、核酸バックボーンのホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合に置き換えることもある。人工核酸としては、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子が架橋された核酸が挙げられる。このような人工核酸としては、例えば、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋された架橋型ＤＮＡであるlocked nucleic acid（ＬＮＡ）、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がエチレンを介して架橋されたＥＮＡ、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子が−ＣＨ２ＯＣＨ２−を介して架橋されたＢＮＡＣＯＣ、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子が−ＮＲ−ＣＨ２−｛ここで、Ｒは、メチルまたは水素原子である｝を介して架橋されたＢＮＡＮＣなどの架橋型核酸（ＢＮＡ）、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子が−ＣＨ２（ＯＣＨ３）−を介して架橋されたｃＭＯＥ、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子が−ＣＨ２（ＣＨ３）−を介して架橋されたｃＥｔ、２’位と４’位の炭素原子がアミドを介して架橋されたＡｍＮＡ、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋され、６’位にシクロプロパンが形成されたｓｃｐＢＮＡ、およびデオキシリボースまたはリボースの代わりにＮ−（２−アミノエチル）グリシンがアミド結合したポリマーが主鎖となったペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。ＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡなどの遺伝子サイレンシングのための人工的なＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アプタマーなどのノンコーディングＲＮＡ、およびｍＲＮＡなどの天然のＲＮＡが挙げられる。これらのＲＮＡは、生体内で安定化するように修飾されうる。
【００２１】
本明細書では、「コンジュゲート」とは、２つの物質が共有結合により連結した結合体を意味する。コンジュゲートにおいて、上記２つの物質は直接連結していてもよいし、リンカーを介して連結していてもよい。本発明では、上記２つの物質のうち１つは、抗体またはその抗原結合性断片であり、もう一つは薬物（例えば、生理活性物質）である。また、本発明では、リンカーは開裂可能なリンカーであってもよいし、開裂不可能なリンカーであってもよい。
【００２２】
本明細書では、「抗体−薬物コンジュゲート」とは、抗体と薬物とのコンジュゲート（ＡＤＣ）を意味する。抗体と連結することにより薬物に抗原に対する親和性が付与され、これにより薬物を標的の生体内の部位に送達する効率が高まりうる。本明細書では、抗体−薬物コンジュゲートは、抗体の抗原結合性断片と薬物とのコンジュゲートも含まれる意味で用いられる。
【００２３】
「ＣＤ７１」は、細胞内に鉄を取り込む働きを有するトランスフェリン受容体として知られる。ＣＤ７１は、肝細胞に発現する。また、ＣＤ７１は通常の休止状態のリンパ球では発現しないが、マイトージェンなどで活性化するとリンパ球に発現する。さらに、ＣＤ７１は、筋肉（例えば、心筋や腓腹筋）に多く発現する。アポトランスフェリン（すなわち、鉄非結合体）は、２つのＦｅ３＋イオンと結合してホロトランスフェリン（すなわち、鉄結合体）を形成するとＣＤ７１と結合する。ＣＤ７１とホロトランスフェリンの複合体は、受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞内移行する。ＣＤ７１とトランスフェリンはエンドソーム内の環境下で解離し、トランスフェリンは細胞内に移行する一方でＣＤ７１は細胞膜にリサイクルされる。従って、トランスフェリンは、ＣＤ７１との適切な結合と適切な解離とによって細胞内に移行すると考えられる。ＣＤ７１としては、ヒトＣＤ７１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＸＭ ０１１５１３１１２に記載の配列を有する）、マウスＣＤ７１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ ０１１６３８に記載の配列を有する）が挙げられる。細胞は、ＣＤ７１を発現した細胞（例えば、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、霊長類細胞、例えば、ヒト細胞）またはそれらを含む組織若しくは臓器であり得る。細胞に発現するＣＤ７１は、内因性のＣＤ７１であっても外因性のＣＤ７１であってもよい。細胞に発現するＣＤ７１は、発現誘導されたものであってもよい。
【００２４】
本明細書では、「抗ＣＤ７１抗体」とは、ＣＤ７１を認識する抗体またはＣＤ７１に結合する抗体を意味する。抗ＣＤ７１抗体は、ヒトＣＤ７１を認識する抗体が好ましい。また、抗ＣＤ７１抗体は、モノクローナル抗体とすることが好ましく、とりわけ抗ＣＤ７１キメラモノクローナル抗体、抗ＣＤ７１ヒト化モノクローナル抗体または抗ＣＤ７１ヒトモノクローナル抗体がより好ましい。
【００２５】
本明細書において、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、可変ドメインおよび定常ドメインの配列がヒト配列である任意の抗体を意味する。その用語は、ヒト遺伝子に由来する配列を有するが、例えば、考えられる免疫原性の低下、親和性の増大、望ましくない折りたたみを引き起こす可能性があるシステインの除去などを行うように変化させている抗体を包含する。その用語はまた、ヒト細胞に特有でないグリコシル化を施すことができる、非ヒト細胞中で組換えにより作製されたそのような抗体をも包含する。これらの抗体は、下記に記載のように、様々な形で調製することができる。
【００２６】
本明細書において「キメラモノクローナル抗体」という用語は、２つ以上の異なる種由来の抗体の領域を連結させた、モノクローナル抗体を意味する。キメラモノクローナル抗体としては、例えば、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に連結させたモノクローナル抗体が挙げられる。
本明細書において、「キメラヒトモノクローナル抗体」という用語は、非ヒト哺乳動物種の抗体のＶＨおよびＶＬ、ならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬドメインを含む。
キメラ抗体の１つまたは複数のＣＤＲは、ヒト抗体に由来し得る。一例では、ヒト抗体由来のＣＤＲを、マウスやラットなどの非ヒト哺乳動物由来の抗体のＣＤＲと組み合わせることができる。他の例では、すべてのＣＤＲがヒト抗体に由来し得る。他の例では、複数のヒト抗体に由来するＣＤＲを、キメラ抗体中で組み合わせることができる。例えば、キメラ抗体は、第１のヒト抗体の軽鎖のＣＤＲ１、第２のヒト抗体の軽鎖のＣＤＲ２および第３のヒト抗体の軽鎖のＣＤＲ３を含んでよく、重鎖のＣＤＲは、１つまたは複数の他の抗体に由来するものでよい。
【００２７】
本明細書において、「ヒト化モノクローナル抗体」という用語は、非ヒト哺乳動物由来のモノクローナル抗体を指し、非ヒト哺乳動物種の抗体配列に特徴的なアミノ酸残基が、ヒト抗体の対応する位置で認められる残基と置換されている。この「ヒト化」の工程が、その結果得られる抗体のヒトでの免疫原性を低下させると考えられる。当技術分野で周知の技術（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１４：４３〜４６（１９９３）に記載された技術）を使用して、非ヒト哺乳動物由来の抗体をヒト化できる。ヒト化モノクローナル抗体は、例えば、非ヒト哺乳動物由来の抗体のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列と置換する組換えＤＮＡ技術（例えば、ＷＯ９２／０２１９０、ならびに米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７９２号、第５，７１４，３５０号、および第５，７７７，０８５号に記載された技術）を用いることによって工学的に作製することができる。本明細書において、「ヒト化モノクローナル抗体」という用語は、その意味の範囲内で、キメラヒトモノクローナル抗体およびＣＤＲ移植抗体を含む。本発明のＣＤＲ移植抗体は、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、ヒト以外の動物の抗体のそれぞれＶＨおよびＶＬのＣＤＲと置換することによって得られる。
【００２８】
本明細書では、「筋肉」とは、横紋筋及び平滑筋を意味する。横紋筋とは、横紋構造のある筋を意味し、その例としては、骨格筋、心筋が挙げられる。平滑筋とは、横紋構造のない筋を意味し、その例としては、内臓筋が挙げられる。
【００２９】
本明細書では、「血管内皮細胞」とは、血管の内側を覆う細胞を意味し、通常は扁平で薄い細胞である。血管内皮細胞は、血管内外の物質の通過および白血球の通過をコントロールしている。そのため、血管内に投与された薬物が組織実質に移動するためには、血管内皮細胞の層を通過することが求められる。
【００３０】
本発明によれば、抗ＣＤ７１抗体と薬物とのコンジュゲートが提供されうる。本発明によればまた、抗ＣＤ７１抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ’）と薬物とのコンジュゲートが提供されうる。本発明によればさらにまた、抗ＣＤ７１抗体のＦａｂ’と核酸とのコンジュゲートが提供されうる。これらのコンジュゲートは、例えば、筋肉（例えば、心筋及び腓腹筋）に効果的に送達されうる。これらのコンジュゲートはまた、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、または腹腔内投与により投与されうる。また、これらのコンジュゲートは、静脈内投与、または筋肉内投与により投与され、これにより筋肉（例えば、心筋及び腓腹筋）に効果的に送達され、さらには細胞内へと送達されうる。このコンジュゲートは、ＣＤ７１を発現する（以下、「ＣＤ７１陽性」と称することがある。）細胞（例えば、筋肉、がん細胞、免疫細胞（たとえばＢ細胞、Ｔ細胞などのリンパ球）及び肝細胞など）に薬物を送達することに好適に用いられ得る。さらに、これらのコンジュゲートは生体の外で、ＣＤ７１陽性の細胞および組織に対して適用することも可能である。細胞がＣＤ７１陽性であることは、当業者であれば、例えば、コンジュゲートの作成に使用する抗ＣＤ７１抗体を用いたフローサイトメトリーで決定することができる。
【００３１】
ＣＤ７１による細胞内へのトランスフェリンの取込みは、エンドサイトーシスによって行われることから、例えば、粒径３００ｎｍ程度または３００ｎｍ以下の粒径の小胞であってもエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれうる。また、巨大分子であっても、ＣＤ７１と共に細胞内に取り込まれうる。従って、本発明のある態様では、粒径３００ｎｍ程度または３００ｎｍ以下の粒径の小胞であって、表面に抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片を有する小胞も提供される。小胞は、内部に薬物を含んでいてもよい。本願明細書では、特段の断りが無い限り、内部に生理活性物質を含む小胞も「薬物」とよばれる。小胞の種類としてはとくに限定されず、例えば、脂質分子を用いたリポソーム、Ｌｉｐｉｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ＬＮＰ）等が挙げられる。小胞の粒径としては特に限定されず、上限としては、通常３００ｎｍ、好ましくは２５０ｎｍ、より好ましくは２００ｎｍとし得る。小胞の粒径の下限としては特に限定されず、３０ｎｍ、４０ｎｍ、６０ｎｍ、または８０ｎｍとし得る。
【００３２】
本発明によれば、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と、薬物とは、リンカーを介して連結させうる。本明細書において、本発明のコンジュゲートが有しうるリンカーとは、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と薬物とを連結させる部分を表す。
本発明のコンジュゲートがリンカーを有する場合、後述する実施例において示されるように、リンカーは開裂可能なリンカーでも開裂不可能なリンカーであってもよい。ここで、「開裂可能」とは、細胞内環境（例えば、エンドソーム内の低ｐＨ環境下および細胞内の還元環境下）において開裂可能であることを意味し、「開裂不可能」とは、細胞内環境において開裂しない、または実質的に開裂しないことを意味する。すなわち、本発明では、薬物が細胞内に到達することができないほど細胞外で活発に分解されるリンカーでなければよく、リンカーは特に限定されず様々なリンカーを用いうる。
【００３３】
本発明では、リンカーとして、開裂可能なリンカーおよび開裂不可能なリンカーを使用しうる。
開裂可能なリンカーとしては、例えば、細胞内の還元環境下で開裂する−Ｓ−Ｓ−結合をその構成中に有するリンカー（例えば、ＳＳリンカー、ＤＭＳＳリンカー）、エンドソーム内の低いｐＨにより開裂するヒドラゾン結合をその構成中に有するリンカー、オルトエステル結合をその構成中に有するリンカー、およびカテプシンＢにより開裂するペプチド結合をその構成中に有するリンカー（たとえば、バリン−シトルリン結合を分子内に有するリンカー（Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー））が挙げられ、本発明で好ましく用いられうる。
【００３４】
開裂可能なリンカーとしては、上記のほかにも、グルクロニダーゼなどの糖鎖分解酵素により開裂する糖鎖をその構成中に有するリンカーなどが挙げられ、本発明で好ましく用いられ得る。
【００３５】
開裂不可能なリンカーとしては、例えば、チオール反応性基がマレイミド基であって、その構成中に細胞内環境（例えば、エンドソーム内の低ｐＨ環境下および細胞内の還元環境下）において開裂可能な結合部位を有しないリンカー（本明細書において、マレイミドリンカーと称することがある）が挙げられ、本発明で好ましく用いられ得る。本明細書において、マレイミドリンカーは、マレイミド基を有するリンカーであって開裂可能なリンカー（例えば、ＤＭＳＳリンカー、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー）及びその他の開裂可能なリンカー（例えば、ＳＳリンカー）と区別される。
【００３６】
本発明のある態様では、リンカーとしては、マレイミドリンカー、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー、ＳＳリンカー、およびＤＭＳＳリンカーが好ましい。本発明のある態様では、例えば後述の式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかで表されるリンカーを用いることが好ましい。
【００３７】
本発明において使用する抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片としては、血中トランスフェリンよりも強くＣＤ７１に対して結合しうるか、ＣＤ７１に対してトランスフェリンとは異なる部位に結合しうるものが好ましい。このような抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片を用いると、血中のトランスフェリンの存在に関わらず、生体内においてＣＤ７１と結合しうる。
【００３８】
抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片は、ＣＤ７１と結合すれば、ＣＤ７１の自発的な細胞内への取込み作用によって、細胞内へ一緒に取り込まれうる。
抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片が血中トランスフェリンよりも強くＣＤ７１に対して結合しうるか否かの評価は、例えば、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と血中トランスフェリンのＣＤ７１に対する結合活性の対比により行うことができる。抗体またはその抗原結合性断片とトランスフェリンのＣＤ７１に対する結合活性の対比は、例えば、競合結合活性評価により行うことができる。より具体的には、ＣＤ７１とインキュベートしたウェルプレートを洗浄し、その後１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＤ−ＰＢＳ（−）等を用いてブロッキングする。さらに洗浄後、ウェル中で抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片とトランスフェリンとをインキュベートする。洗浄後、適当な標識（例えば蛍光標識）を用いて標識化し、その検出強度から競合結合活性を評価することができる。
抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片が、ＣＤ７１に対してトランスフェリンとは異なる部位に結合していることは、上記の競合結合活性の評価において、例えば、競合させる抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片とトランスフェリンとを、識別可能な異なる標識を用いて標識化し、それぞれの検出強度または全体としての検出強度により評価できる。上記評価において、例えば、識別可能な蛍光標識を用いて各々標識化した抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片とトランスフェリンを使用した場合には、これらの混合された蛍光が検出されれば、抗体またはその抗原結合性断片及びトランスフェリンの両方がＣＤ７１に結合しているといえ、これらがＣＤ７１に対して互いに異なる部位に結合していると評価できる。
【００３９】
抗ＣＤ７１抗体としては、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  ２１７．１．３（BioXcell社）、ＯＫＴ９抗体（BioXcell社製：BE0023 (OKT9)）または抗ヒトＣＤ７１抗体（５Ｅ９Ｃ１１）が好ましい。ある態様では、抗ＣＤ７１抗体は、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  ２１７．１．３のキメラモノクローナル抗体、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  ２１７．１．３のヒト化モノクローナル抗体またはｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  ２１７．１．３のヒトモノクローナル抗体、ＯＫＴ９抗体（BioXcell社製：BE0023）のキメラモノクローナル抗体、ＯＫＴ９抗体（BioXcell社製：BE0023）のヒト化モノクローナル抗体またはＯＫＴ９抗体（BioXcell社製：BE0023）のヒトモノクローナル抗体、抗ヒトＣＤ７１抗体（５Ｅ９Ｃ１１）のキメラモノクローナル抗体、抗ヒトＣＤ７１抗体（５Ｅ９Ｃ１１）のヒト化モノクローナル抗体または抗ヒトＣＤ７１抗体（５Ｅ９Ｃ１１）のヒトモノクローナル抗体が好ましく、これらの抗体のいずれかと同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体が好ましく、これらの抗体のいずれかと同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１〜３および軽鎖ＣＤＲ１〜３を含む抗体が好ましい。ＣＤＲのアミノ酸配列はＫａｂａｔの番号付けにしたがって決定することができる。本発明において使用する抗原結合性断片としては、それらのＦａｂ’が好ましい。
本発明において使用する抗ＣＤ７１抗体または抗原結合断片としては、特に限定されず、例えば、ＣＤＲのアミノ酸配列が上記のｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  ２１７．１．３（BioXcell社）、ＯＫＴ９抗体（BioXcell社製：BE0023）または抗ヒトＣＤ７１抗体（５Ｅ９Ｃ１１）のキメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体若しくはヒトモノクローナル抗体の対応するＣＤＲと実質的な同一性（相同性）を有していることが好ましい。また、本発明においては、ＯＫＴ９抗体（BioXcell社製：BE0023）若しくは抗ヒトＣＤ７１抗体（５Ｅ９Ｃ１１）のキメラモノクローナル抗体、または、ヒト化モノクローナル抗体若しくはヒトモノクローナル抗体と、ヒトＣＤ７１との結合に関して競合する抗体、またはその抗原結合性断片であるか、ヒトＣＤ７１との結合に関してエピトープが完全にまたは部分的に同一である抗体（または、エピトープが重複する抗体）、またはその抗原結合性断片であるか、またはこれらの抗体のアミノ酸配列に対して、１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、欠失、又は置換を有するアミノ酸配列を有する抗体、またはその抗原結合性断片であることが好ましい。
【００４０】
ＯＫＴ９抗体（BioXcell社製：BE0023）のＣＤＲと実質的な同一性（相同性）を有する抗体、またはその抗原結合性断片としては、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域と、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域とを含む抗体、またはその抗原結合性断片であるか、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体またはその抗原結合性断片であることが好ましい。なお、本明細書においてこれらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ｅｔ．aｌ，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９０：３８２−９３（１９７１）に記載された方法、または、Ｋａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベース（［Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）にあてはめて、相同性を調べることにより見いだすことが出来る（例えば、OKT9の重鎖可変領域は、GenBank登録番号：AAA51064.1、OKT9の軽鎖可変領域は、GenBank登録番号：AAA51130.1を参照することができる）。
【００４１】
「実質的な同一性」とは、２つのアミノ酸配列が、少なくとも７０％、７５％または８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性を有することを意味する。また、特定の実施形態では、配列が同一でない位置のアミノ酸は、保存的アミノ酸に置換されていてもよい。
【００４２】
「％配列同一性」という用語は、２つのアミノ酸配列を当該アミノ酸（または保存的アミノ酸）の一致が最大となるように整列させたときに、一致している２つの配列中の残基％を意味する。
アミノ酸配列の同一性は、当業者に公知の任意の方法で決定することができる。例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）により決定することが出来、このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）などにより決定することができる。アミノ酸配列の同一性を決定するためのプログラムは、例えば米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
【００４３】
本発明のコンジュゲートとしては、
(i)抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片が、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  ２１７．１．３のキメラモノクローナル抗体、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  ２１７．１．３のヒト化モノクローナル抗体またはｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  ２１７．１．３のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片(好ましくは、Ｆａｂ’)であり;
(ii)薬物が、生理活性物質であり（例えば、核酸（好ましくは、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはＡＳＯ（より好ましくは、ｓｉＲＮＡまたはＡＳＯ））であり；かつ
(iii) 抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と薬物とがリンカー（好ましくは、マレイミドリンカー、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー、ＳＳリンカー、およびＤＭＳＳリンカー）によって連結されたコンジュゲートが好ましい。
【００４４】
本発明のコンジュゲートとしては、
(i)抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片が、
（i-a）配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域と、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域とを含む抗体、またはその抗原結合性断片であるか、
（i-b）配列番号２４で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体（好ましくは、ヒト抗体）またはその抗原結合性断片であるか、
（i-c）上記（i-a）または（i-b）とＣＤ７１との結合に関して競合する抗体（好ましくは、ヒト抗体）、またはその抗原結合性断片であるか、
（i-d）上記（i-a）または（i-b）とＣＤ７１との結合に関してエピトープが完全にまたは部分的に同一である抗体（好ましくは、ヒト抗体）、またはその抗原結合性断片であるか；または
（i-e）上記（i-a）に記載の抗体のアミノ酸配列に対して、１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、欠失、又は置換を有するアミノ酸配列を有する抗体（好ましくは、ヒト抗体）、またはその抗原結合性断片であり；
(ii)薬物が、生理活性物質（例えば、核酸（好ましくは、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはＡＳＯ（より好ましくは、ｓｉＲＮＡまたはＡＳＯ））であり；かつ
(iii) 抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と薬物とがリンカー（好ましくは、マレイミドリンカー、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー、ＳＳリンカー、およびＤＭＳＳリンカー）を介してまたはリンカーによって連結されたコンジュゲートが好ましい。
【００４５】
本発明によれば、筋肉（例えば、骨格筋、心筋であり、これらの神経筋接合部を含む）に薬物を送達することに用いるための組成物であって、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と薬物とのコンジュゲートを含む組成物が提供されうる。この組成物は、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、または筋肉内投与などにより投与されうる。抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片としては、抗ＣＤ７１抗体のＦａｂ’が好ましい。
【００４６】
後述する実施例によれば、抗ＣＤ７１抗体の抗原結合性断片であるＦａｂ’と薬物とのコンジュゲートは、ＣＤ７１を発現する細胞内に取り込まれた。従って、抗ＣＤ７１抗体の抗原結合性断片と薬物とのコンジュゲートは、生体内においてＣＤ７１と結合し、ＣＤ７１発現細胞内に取り込まれうる。
【００４７】
本発明によれば、抗ＣＤ７１抗体のＦａｂ’と薬物とのコンジュゲートが提供されうる。Ｆ（ａｂ’）２を還元して得られるＦａｂ’は、チオール基を有する。従って、Ｆａｂ’と薬物は、Ｆａｂ’の当該チオール基に含まれるＳ原子（硫黄原子）を介して結合させうる。
【００４８】
Ｆａｂ’は、自体公知の方法によって抗体から得ることができる。例えば、抗体をペプシン分解に供してＦ（ａｂ’）２を得て、これをさらにシステアミンなどの還元剤を用いて還元することでＦａｂ’を得ることができる。
【００４９】
本発明のある態様では、Ｆａｂ’と薬物とのコンジュゲートにおいて、薬物は、リンカーを介して、または介さずにＦａｂ’と連結していてもよい。Ｆａｂ’と薬物とのコンジュゲートにおいて、リンカーの導入やコンジュゲートの作製は当業者に周知の方法を用いることができる。
【００５０】
リンカーを介してＦａｂ’と薬物を連結させる場合には、反応の簡便性の観点や得られたコンジュゲートの生体毒性の観点から、例えば、Ｆａｂ’のチオール基に対して薬物に導入されたリンカー中のチオール反応性基とを反応させることにより連結されうる。（例えば、図１Ｂ参照）。
【００５１】
本発明によれば、Ｆａｂ’はリサイクルする膜タンパク質との結合親和性とエンドソームにおける解離性とのバランスに優れる。従って、抗原結合性断片であるＦａｂ’と薬物とのコンジュゲートは、細胞内への薬物の送達に好ましく用いられうる。
【００５２】
本発明によれば、抗ＣＤ７１抗体のＦａｂ’とｓｉＲＮＡとのコンジュゲートが提供される。ｓｉＲＮＡは、１５ｋＤａ程度であり、腎臓によるクリアランスで急速に血中から除去される。しかしながら、Ｆａｂ’とのコンジュゲートの形態では、ｓｉＲＮＡは、血中でより安定に存在できる。
【００５３】
本発明によれば、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ’）とミオスタチンに対するｓｉＲＮＡまたはＡＳＯとのコンジュゲートが提供される。抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ’）とミオスタチンに対するｓｉＲＮＡまたはＡＳＯとのコンジュゲートは、筋肉または心筋においてミオスタチンの発現量を低下させ、これにより、筋肉量を増加させることができる。本発明によれば、その必要のある対象において筋肉量を増加させることに用いるための医薬であって、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ’）とミオスタチンに対するｓｉＲＮＡまたはＡＳＯとのコンジュゲートを含む、医薬が提供される。この態様では、医薬は、例えば、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、または筋肉内投与により投与されうる。ミオスタチンに対するｓｉＲＮＡとしては、配列番号１５（または配列番号５）の塩基配列を有するセンス鎖と配列番号１６（または配列番号６）の塩基配列を有するアンチセンス鎖とを有するｓｉＲＮＡが挙げられる。ミオスタチンに対するｓｉＲＮＡとしては、実施例１における（２）の３）に記載されたＲＮＡを用いることができる。ミオスタチンとしては、ヒトミオスタチン（例えば、GenBankのアクセッション番号NM_005259.2に記載の配列を有する）が挙げられる。
【００５４】
本明細書において、アンチセンスまたはアンチセンス鎖とは、ある配列のＤＮＡやＲＮＡに対して相補的な配列をもつＤＮＡ断片やＲＮＡ断片のことであり、例えば、ｍＲＮＡに相補的に結合することができるものが含まれる。従って、ｓｉＲＮＡにおけるアンチセンス鎖とは、標的となるｍＲＮＡに相補的に結合するＲＮＡ鎖を意味する。
【００５５】
本明細書において、センス鎖とは、二重鎖を構成する核酸における、アンチセンス鎖ではない方の鎖を意味する。
【００５６】
本発明では、ｓｉＲＮＡとしては、安定化のための修飾を有するｓｉＲＮＡを用いることができる。安定化のための修飾としては、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾および２’−フルオロ修飾が挙げられる。ＲＮＡは、連続する塩基に対して２’−Ｏ−メチル修飾および２’−フルオロ修飾により交互に修飾してもよい。
【００５７】
本発明において、薬物は、ｓｉＲＮＡでありうる。本発明において、チオール反応性基は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖に導入されうる。本発明のある態様では、チオール反応性基は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖（例えば、センス鎖の３’末端）に導入されうる。このようにすることで、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が細胞質においてサイレンシングされる遺伝子のｍＲＮＡと結合してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を引き起こすことが容易になると考えられる。
【００５８】
本発明において、薬物は、アンチセンスオリゴ核酸（ＡＳＯ）でありうる。本発明において、チオール反応性基は、アンチセンスオリゴ核酸のアミノ化した５’末端または３’末端に導入されうる。本発明のある態様では、チオール反応性基は、ＡＳＯの５’末端に導入されうる。本発明のある態様では、ＡＳＯとチオール反応性基とは、スペーサー、例えば、１〜数塩基の核酸からなるスペーサーを介して連結させてもよい。
【００５９】
がんの治療のためには、薬物は、抗がん活性を有する物質であり得る。抗がん活性を有する物質としては、腫瘍サイズの低下（遅延又は停止）、腫瘍の転移の阻害、腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、及びがんと関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも１つを生じさせる物質が挙げられる。具体的には、毒素、抗がん剤、ラジオアイソトープを挙げることができるがこれらに限定されない。
毒素としては、例えば、緑膿菌外毒素（PE）又はその細胞障害性フラグメント（例えばPE38）、ジフテリア毒素、リシンA等が挙げられる。
抗がん剤としては、例えば、アドリアマイシン、ダウノマイシン、マイトマイシン、シスプラチン、ビンクリスチン、エピルビシン、メトトレキセート、5-フルオロウラシル、アクラシノマイシン、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミド、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、タモキシフェン、デキサメタゾン等の低分子化合物や、免疫担当細胞を活性化するサイトカイン（例えば、ヒトインターロイキン2、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、ヒトインターロイキン12）等のタンパク質が挙げられる。
ラジオアイソトープとしては、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、９０Ｙ等が挙げられる。
【００６０】
抗がん作用を有する物質としては、上記の他に、免疫細胞及び／または腫瘍細胞における遺伝子発現を変化させる物質も挙げられる。免疫細胞及び／または腫瘍細胞における遺伝子発現を変化させることにより、腫瘍細胞および腫瘍組織等に対する免疫細胞の作用を維持または増強させることが可能である。免疫細胞における遺伝子発現を変化させる物質としては、例えば、ＰＤ１遺伝子、内因性のＴ細胞受容体遺伝子などのサイレンシングが可能なｓｉＲＮＡ、ＡＳＯなどの核酸が挙げられる。腫瘍細胞における遺伝子発現を変化させる物質としては、ＰＤ−Ｌ１遺伝子、ＰＤ−Ｌ２遺伝子などの免疫チェックポイントのサイレンシングが可能なｓｉＲＮＡ、ＡＳＯなどの核酸が挙げられる。
【００６１】
（製造方法）
抗体は、当業者であれば、常法に従って、抗原を動物に免疫することにより得ることができる。モノクローナル抗体は、当業者であれば、常法に従って、抗原を免疫した動物の脾臓細胞とミエローマとを融合させてハイブリドーマを形成させ、抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし、前記ハイブリドーマから産生される抗体として得ることができる。抗ＣＤ７１抗体は、抗原としてＣＤ７１を用いて得ることができる。抗ＣＤ７１抗体は、ＣＤ７１を表出するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を動物に免疫して得てもよい。抗ＣＤ７１抗体は、ＶＬＰに対する抗体を除く目的でＣＤ７１を提示しないＶＬＰに結合しないものをさらに選択して得てもよい。抗ＣＤ７１抗体は、ＣＤ７１を表出する細胞を動物に免疫して得てもよい。抗ＣＤ７１抗体は、細胞に対する抗体を除く目的でＣＤ７１を提示しない細胞に結合しないものをさらに選択して用いてもよい。抗体の抗原結合性断片は、得られた抗体を当業者に周知の方法で処理して得ることができる。
【００６２】
ＣＤ７１との結合に関してある抗体（所望の抗体）と競合する抗体は、競合アッセイにより取得することができる。競合アッセイで、例えば、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０〜５０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％所望の抗体とＣＤ７１との結合をブロックすることができるならば、ＣＤ７１に対する結合に関して所望の抗体と競合する抗体とすることができる。競合する抗体は、交差ブロッキングアッセイ、好ましくは、競合ＥＬＩＳＡアッセイにより確認することができる。交差ブロッキングアッセイでは、ＣＤ７１を、例えばマイクロタイタープレート上にコーティングし、標識した所望の抗体を添加してインキュベートし、抗原と所望の抗体との結合を形成させる。その後、候補となる競合抗体をウェルに添加してインキュベートし、洗浄して、所望の抗体の結合量（標識残存量）を定量することにより、抗体が競合したか否かを判断することができる。
【００６３】
ＣＤ７１に関してある抗体と完全にまたは部分的に同じエピトープに結合する抗体は、上述の通り競合アッセイによって取得することができる。ＣＤ７１に関してある抗体と完全にまたは部分的に同じエピトープに結合する抗体はまた、水素−重水素交換質量分析（ＨＤＸ  ＭＳ）によって取得してもよい。水素−重水素交換質量分析では、溶液中の重水素がタンパク質表面のアミド水素と置換したときの質量変化を検出することにより、タンパク質結合面（結合面では置換が起こりにくい）を特定することができる。
【００６４】
抗体と薬物とのコンジュゲートは、当業者であれば、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の作製方法として周知の方法を用いて作製することができる。抗体の抗原結合性断片と薬物とのコンジュゲートも同様である。
【００６５】
本発明によれば、抗原結合性断片であるＦａｂ’と薬物とのコンジュゲートの製造方法であって、薬物あるいは、薬物に結合した置換基を有する炭素鎖に、チオール反応性基を導入する基を導入することを含む方法が提供される。本発明によれば、抗原結合性断片であるＦａｂ’と薬物とのコンジュゲートの製造方法であって、薬物あるいは、薬物に結合した、置換基を有する炭素鎖にチオール反応性基を導入する基を導入することと、抗原結合性断片であるＦａｂ’のチオール基と薬物あるいは、薬物に導入されたチオール反応性基とを反応させることとを含む方法が提供される。
【００６６】
薬物がＡＳＯである場合、チオール反応性基、チオール反応性基を導入する基、または、置換基を有する炭素鎖は、ＡＳＯに導入されたスペーサー（例えば、１〜数塩基の核酸からなるスペーサー）を介して連結されることにより導入されうる。
【００６７】
本発明のコンジュゲートのうちリンカーを有するものは、自体公知の方法により製造することができ、例えば、薬物に置換基を有する炭素鎖（好ましくは、炭素鎖の末端にアミノ基を有する炭素鎖）を結合させたあと、当該アミノ基とチオール反応性基を導入する基とを結合し、さらに当該チオール反応性基と抗ＣＤ７１抗体またはその結合性断片と反応させることにより製造することができる。
【００６８】
上記置換基を有する炭素鎖における炭素鎖の炭素数は１〜１０、好ましくは２〜８、より好ましくは４〜６、さらに好ましくは６とし得る。
【００６９】
上記置換基を有する炭素鎖における炭素鎖が有する置換基としては、アミノ基、チオール基等が挙げられ、好ましくはアミノ基とし得る。
【００７０】
上記置換基を有する炭素鎖としては、末端にアミノ基を有する炭素数６のアルキル鎖（本明細書中、Ｃ６アミノ鎖と称することがある）が特に好ましく用いられ得る。
【００７１】
薬物と置換基を有する炭素鎖との結合は、薬物として核酸を用いる場合、市販の３’あるいは５’-アミノ修飾用担体あるいはアミダイト試薬（例えば限定されるものではないが、３’−ＰＴ−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ＣＰＧ、あるいは５’−ＤＭＳ(Ｏ)ＭＴ−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社））を用いたホスホロアミダイト法による核酸合成反応により実施することができる。
【００７２】
置換基を有する炭素鎖として末端にアミノ基を有するものを用いた場合、次に当該アミノ基とチオール反応性基を導入する基とを結合させうる。
【００７３】
チオール反応性基とは、抗ＣＤ７１抗体またはその結合性断片の特定の部位（チオール基）との反応性を有する官能基を意味する。チオール反応性基としては、例えば、マレイミド基、ブロモアセトアミド基、ピリジルジチオ基、ビニルスルホン基およびヨードアセトアミド基が挙げられる。
【００７４】
チオール反応性基を導入する基とは、チオール反応性基を有する試薬を意味し、そのような試薬としては、例えば、マレイミドカプロイル（ｍｃ）；マレイミドカプロイル−ｐ−アミノベンジルカルバメート；マレイミドカプロイル−ペプチド−アミノベンジルカルバメート（例えば、マレイミドカプロイル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−リシン−ｐ−アミノベンジルカルバメートおよびマレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメート（ｖｃ））；Ｎ−マレイミドカプロイル−バリル−シトルリル−ｐ−アミノベンジルカルバメート  ｐ−ニトロフェニルエステル（ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ）；Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート；Ｎ−スクシンイミジル  ４−メチル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタネート；４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−２−メチル−２−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）；Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）；２−イミノチオラン；Ｓ−アセチルコハク酸無水物；ジスルフィドベンジルカルバメート；カルボネート；ヒドラゾンリンカー；Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル；Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＭＡＳ）；Ｎ−スクシンイミジル  ３−マレイミドプロピオネート（ＢＭＰＳ）；［Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）；Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）；スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］（ＬＣ−ＳＭＣＣ）；スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）；スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド（ＳＰＤＰ）；［Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＥＭＣＳ）；Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）；４−スルホスクシンイミジル−６−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート）（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；スルホスクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）；スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）；スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）；エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＥＧＳ）；酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）；ジエチレントリアミン−五酢酸（ＤＴＰＡ）；Ｎ−マレイミドカプロイル−バリル−シトルリル−ｐ−アミノベンジルカルバメート  ｐ−ニトロフェニルエステル（ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ）；およびチオ尿素が挙げられる。
チオール反応性基を導入する基としては、ＳＰＤＰ、ＢＭＰＳ、ＧＭＢＳまたはｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰが好ましい。
【００７５】
アミノ基とチオール反応性基を導入する基との結合は、例えば、縮合反応、付加反応等により実施することができる。より具体的には、例えば、アミノ基を有する炭素鎖が結合した薬物に対して過剰量のＢＭＰＳを添加し、室温で２〜４時間程度保温し、アミノ基が完全に反応した後、未反応のＢＭＰＳを限外ろ過等により除去することにより実施することができる。
【００７６】
本発明のある実施形態においては、薬物としての小胞にチオール反応性基を導入する基を導入することができる。例えば、末端にアミノ基を有する脂質を用いた小胞の場合、アミノ基とチオール反応性基を導入する基とを、縮合反応、付加反応等により結合させることができる。より具体的には、例えば、薬物に対して過剰量のＢＭＰＳを添加し、室温で２〜４時間程度保温し、アミノ基が完全に反応した後、未反応のＢＭＰＳを限外ろ過等により除去することにより実施することができる。
【００７７】
抗体またはその抗原結合性断片が−ＳＨ基を有する場合、チオール反応性基と上記−ＳＨ基との結合は、例えば、酸化還元反応、縮合反応、付加反応等により実施することができる。より具体的には、例えば、ほぼ等量の抗体またはその抗原結合性断片とチオール反応性基が導入された薬物とを混合し、室温で４〜１６時間保温することにより実施することができる。余剰の反応物は、クロマトグラフィーにより除去することができる。
【００７８】
本発明によれば、薬物が、チオール反応性基を有する場合には、抗原結合性断片であるＦａｂ’と薬物とのコンジュゲートの製造方法であって、抗原結合性断片であるＦａｂ’と薬物のチオール反応性基とを反応させることを含む方法が提供される。
【００７９】
Ｆａｂ’と薬物とのコンジュゲートは、サイズ除外クロマトグラフィーおよびＨＰＬＣなどの分離技術を用いてＦａｂ’や薬物などの未反応物質と分離することができる。
【００８０】
（疾患の治療用の医薬）
本発明のコンジュゲートは、そのまま、または薬理学的に許容される担体（例えば、賦形剤）等と混合して医薬とすることができる。
【００８１】
本発明のコンジュゲートは、筋肉の疾患の治療剤等の医薬として用いられ得る。
筋肉の疾患としては、特に限定されないが、例えば、筋疾患、筋萎縮性疾患、動脈硬化性疾患、心臓に関連する疾患が挙げられる。
【００８２】
筋疾患としては、例えば、筋ジストロフィー（例えば、Duchenne型筋ジストロフィー、Becker型筋ジストロフィー、Emery-Dreifuss型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、眼咽頭筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー）、周期性四肢麻痺、横隔膜まひ、横隔膜弛緩症、遠位型ミオパチー、ミオトニア症候群、ミトコンドリア病、筋消耗性疾患が挙げられる。
【００８３】
筋萎縮性疾患としては、例えば、サルコペニア（加齢性筋萎縮）、廃用性筋萎縮、悪液質、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症が挙げられる。
【００８４】
動脈硬化性疾患としては、例えば、末梢動脈閉塞症が挙げられる。
【００８５】
心臓に関連する疾患としては、例えば、狭心症（労作性狭心症、異型狭心症を含む)、急性冠症候群（不安定狭心症、急性心筋梗塞、心筋梗塞後の心不全移行を含む）、心不全（ＨＦｒＥＦ、ＨＦｐＥＦ、急性心不全、慢性心不全、非代償性心不全を含む）、心筋症（拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症を含む）、肺性心、無症候性心筋虚血、不整脈（伝導障害、洞結節機能不全、異所性上室性調律、房室ブロック、心房細動、心房粗動、リエントリー性上室性頻拍症(ＳＶＴ，ＰＳＶＴ)、Ｗｏｌｆｆ−Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ−Ｗｈｉｔｅ（ＷＰＷ）症候群、脚および束ブロック、心室性期外収縮、心室頻拍、心室細動、心臓突然死を含む）弁膜異常（大動脈弁閉鎖不全、大動脈弁狭窄、僧帽弁逸脱（ＭＶＰ）、僧帽弁逆流、僧帽弁狭窄、肺動脈弁閉鎖不全、肺動脈狭窄、三尖弁逆流、三尖弁狭窄を含む）、心内膜炎、心臓腫瘍、人工心肺手術後の心機能低下、重症心不全に対する非薬物療法（大動脈内バルーンパンピング、補助人工心臓、バチスタ術、細胞移植、遺伝子治療、心臓移植等）施行時における心機能の維持・心事故の予防が挙げられる。
【００８６】
本発明の抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合断片と抗がん作用を有する物質とのコンジュゲートは、がんの治療剤等の、がんを処置することに用いるための医薬として用いられ得る。
がんとしては、ＣＤ７１陽性のがん、例えば、血液癌（白血病、赤白血病）、リンパ腫、大腸癌、乳がん、中皮腫、肝臓癌、腎臓癌、小細胞肺がん、悪性黒色腫、髄芽腫、神経芽腫、子宮頸がん、卵巣癌、グリオーマ、グリオブラストーマなどが挙げられる。
【００８７】
本発明のコンジュゲートは、肝疾患を処置することに用いるための医薬として用いられ得る。
肝疾患としては、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、糖原病、アミノ酸代謝異常症、尿素サイクル代謝異常症、ポルフィリン症、体質性黄疸、線維性多嚢胞性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、Ｂ型肝炎、肝線維症、肝硬変、遺伝性ＡＴＴＲアミロイドーシス（家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ））、α-1アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）などが挙げられる。
【００８８】
本発明のコンジュゲートの薬物としては、種々の遺伝子、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびタンパクなどを標的とする薬物（例えば、発現量を増加させる、または低減する）を用いることかできる。そのような薬物としては、標的となる遺伝子などに作用して本来発現すべきタンパク質などの産生を抑制することができるものとすることができ、例えば、種々の遺伝子、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびタンパク質などの標的に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＡＳＯ、アプタマー、ｍｉＲＮＡなどの核酸およびこれらの修飾核酸などが挙げられる。また、標的とするタンパク質を細胞内または組織内で産生させることができるものとしてもよく、例えば、標的とするタンパク質をコードするｍＲＮＡなどの核酸およびこれらの修飾核酸などが挙げられる。
【００８９】
本発明におけるコンジュゲートの薬物の標的としては特に限定されず、例えば、以下のような標的が挙げられる。
＜がん、免疫に関する標的＞
Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ（クラスタリン）遺伝子、Ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ（ヌクレオリン）遺伝子、ＡＫＴ１プロテインキナーゼ遺伝子、ＢＩＲＣ５遺伝子、ＭＡＧＥＣ１遺伝子、ＭＡＧＥＣ２遺伝子、ＣＴＡＧ１遺伝子、ＴＰＢＧ遺伝子、Ｈｓｐ２７遺伝子、β−Ｃａｔｅｎｉｎ（カテニン）遺伝子、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）遺伝子、ＳＴＡＴ−３遺伝子、ＰＫＮ３遺伝子、ＰＬＫ１遺伝子、変異ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）遺伝子、Ｇｒｂ−２遺伝子、Ａｎｄｒｏｇｅｎ（アンドロゲン）受容体遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子（ＴＧＦβ−１遺伝子、ＴＧＦβ−２遺伝子、ＴＧＦβ−３遺伝子）ＳＴＡＴ−３遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＫＳＰ（Ｅｇ５）遺伝子、ＣＥＢＰＡ遺伝子、Ｎｅｋ２遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＭＵＣ１遺伝子、ＴＰＢＧ遺伝子、ＨＩＦ−１α遺伝子、ＲＰＮ２遺伝子、ＥｐｈＡ２遺伝子、ＲＲＭ１遺伝子、ＣＤＣ４５遺伝子、ｓｉｘ−１遺伝子、ＩＧＦ−１受容体遺伝子、ＨｏｘＡ１遺伝子、ＩＧＦＢＰ−２遺伝子、ＩＧＦＢＰ−５遺伝子、ＥＧＦ受容体遺伝子、Ｒａｆ−１遺伝子、ｍＴＯＲ遺伝子、Ｂｃｌ−２遺伝子、Ｃａｓｅｉｎ（カゼイン）キナーゼ−２遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＣＯＸ−２遺伝子、β−３ｔｕｂｉｎ遺伝子、ＩＴＣＨ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＶＥＧＦ受容体２遺伝子、ＳＩＰ１遺伝子、ＡＧＴ遺伝子、ＥＲＶ−９  ＬＴＲ遺伝子、ＥＶＩ１遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子、ＰＡＸ−２遺伝子、Ｓｒｐｘ２遺伝子、ＩＲＳ−１遺伝子、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（サバイビン）遺伝子、ＤＵＳＰ６遺伝子、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７遺伝子、ＨＳＰＡ９遺伝子、ミトコンドリアＲＮＡ（ノンコーディングミトコンドリアＲＮＡ）、ＥＷＳ  ＦＬＩ１遺伝子、ＳＲＣ−３遺伝子、ＭＤＲ１遺伝子、ＮＴＲＫ１遺伝子、ＮＴＲＫ２遺伝子、ＭＤＸ３遺伝子、ＮＲ２Ｆ６遺伝子、ＭＹＤ８８遺伝子、ＮＯＴＣＨ１遺伝子、β−３インテグリン遺伝子、ｃ−ＦＬＩＰ遺伝子、ＭＡＤＤ遺伝子、ＨＥＲ２遺伝子、ＣＣＡＴ２遺伝子、ＣＴＣＦＬ遺伝子、ＨＩＦ−２α遺伝子、ＢＭＩ−１遺伝子、ＮＥＴＯ−２遺伝子、ＣＴＦＲ遺伝子、ＰＤ−１遺伝子、ＰＤ−Ｌ１遺伝子、ＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ（ＣＤ２７３））遺伝子、ＣＬＴＡ４遺伝子、ＨＬＡ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ）、ＭＣＨ遺伝子、遺伝子、４−１ＢＢ遺伝子、４−１ ＢＢＬ遺伝子、ＣＤ３遺伝子（ＣＤ３α、ＣＤ３β、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ＣＤ３ζ遺伝子、ＩＬ−６遺伝子、ＩＬ−１７遺伝子、ＩＬ−２３遺伝子、ＩＣＯＳ遺伝子、ＣＤ７０遺伝子、ＣＤ２７遺伝子、ＯＸ４０遺伝子、ＯＸ４０Ｌ遺伝子、ＴＬ１Ａ遺伝子、ＤＲ３遺伝子、ＧＩＴＲＬ遺伝子、ＧＩＴＲ遺伝子、ＣＤ３０Ｌ遺伝子、ＣＤ３０遺伝子、ＴＩＭ１遺伝子、ＴＩＭ１Ｌ遺伝子、ＴＩＭ４遺伝子、ＳＬＡＭ遺伝子、ＣＤ４８遺伝子、ＣＤ５８遺伝子、ＣＤ２遺伝子、ＣＤ１５５遺伝子、ＣＤ１１２遺伝子、ＣＤ２２６遺伝子、ＣＤ８０（Ｂ７−１）遺伝子、ＣＤ８６（Ｂ７−２）遺伝子、Ｂ７−Ｈ２遺伝子、ＬＩＧＨＴ遺伝子、ＨＶＥＭ遺伝子、ＣＤ４０遺伝子、ＣＤ４０Ｌ遺伝子、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９（ガレクチン９）遺伝子、ＣＤ１１３、Ｃｏｌｌａｇｅｎ（コラーゲン）遺伝子、ＣＤ１６０遺伝子、ＬＡＧ３遺伝子、ＰＳＡ遺伝子、ＰＳＭＡ遺伝子、ＰＳＣＡ遺伝子、ＳＴＥＡＰ遺伝子、ＢＩＲＣ５遺伝子、ＭＡＧＥＣ１遺伝子、ＭＡＧＥＣ２遺伝子、ＣＴＡＧ１遺伝子、ＴＰＢＧ遺伝子、またはこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質などの分子あるいはこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ＨＤＧＦファミリーとして知られるタンパク質（原型タンパク質、ＨＤＧＦ；ＨＲＰ−１、ＨＲＰ−２、ＨＲＰ−３、ＨＲＰ−４（ＨＲＰ＝ＨＤＧＦ関連タンパク質（ＨＤＧＦ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ））；及びＬＥＤＧＦ（特に、ＨＲＰ−３））、ＴｒｋＢ受容体、またはこれらの受容体をコードする遺伝子あるいはｍＲＮＡ、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−２１５、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−３１５７、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−３１８９−３ｐ、ｍｉＲ−３１５１、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２などのｍｉＲＮＡ。
＜肝疾患に関する標的＞
ＨＳＰ４７遺伝子、α１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ（アンチトリプシン）遺伝子、ＡＬＡＳ−１遺伝子、ＤＧＡＴ２遺伝子、Ｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ（ヒドロキシ酸オキシダーゼ）遺伝子、ＴＧＦβ−２遺伝子、Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ（トランスチレチン）遺伝子、ＰＣＳＫ９遺伝子、またはこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質などの分子あるいはこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７。
＜骨格筋に関する標的＞
Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ（ミオスタチン）遺伝子、Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ遺伝子、ＳＭＮ２遺伝子、ＤＭＰＫ遺伝子、ＳＯＤ１遺伝子、ＰＡＢＰＮ１遺伝子、ｃＰＬＡ２遺伝子、ＡＭＰＡ型Ｇｌｕ受容体１遺伝子、ＡＭＰＡ型Ｇｌｕ受容体３遺伝子、ＦＯＸＯ−１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子、ＡｃｔＲＩＩＢ遺伝子、ＤＵＸ４遺伝子、ＮＬＲＰ３遺伝子、またはこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質などの分子あるいはこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｍｉＲ−１５５。好ましくはＭｙｏｓｔａｔｉｎ遺伝子、またはこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質などの分子あるいはこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質をコードするｍＲＮＡ。
＜心筋に関する標的＞
Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ（ミオスタチン）遺伝子、ＡｐｏＡ遺伝子、ＳＴＩＭ１遺伝子、ＥＧＦ１遺伝子、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子、Ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ（ホスホランバン）遺伝子、Ｓｅｒｃａ２ａ遺伝子、Ｓａｒｃｏｌｉｐｉｎ（サルコリピン）遺伝子、またはこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質などの分子あるいはこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質をコードするｍＲＮＡ、β１−アドレナリン受容体、ＴＬ受容体４、またはこれらの受容体をコードする遺伝子あるいはｍＲＮＡ、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−４８６。好ましくはＭｙｏｓｔａｔｉｎ遺伝子、またはこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質などの分子あるいはこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質をコードするｍＲＮＡ。
【００９０】
本発明のコンジュゲートを含む医薬は薬理学的に許容される担体（例えば、賦形剤）を含有していてもよい。上記医薬に含有されうる賦形剤としては、例えば、塩、溶媒（例えば、水およびエタノール）、緩衝剤、糖および糖アルコール、界面活性剤、等張剤、保存剤、抗酸化剤、キレート剤、賦形剤が挙げられる。本発明のコンジュゲートを含む医薬は、例えば、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与または筋肉内投与することができる。従って、本発明のコンジュゲートを含む医薬は、静脈内投与、皮下、腹腔内または筋肉内投与用の医薬として常法に従って製剤化されていてもよい。本発明によれば、上記コンジュゲートは、使用前に投与に適した媒体（例えば、滅菌済発熱物質不含水）を用いて医薬として調製されてもよい。本発明では、組成物も医薬と同様に賦形剤を含んでいてもよい。
【００９１】
（方法）
本発明によれば、対象において、薬物を筋肉（例えば、心筋及び腓腹筋）に送達する方法であって、薬物と抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片とのコンジュゲートを対象に投与することを含む方法が提供される。本発明によれば、抗ＣＤ７１抗体または抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ’を用いることができる。
【００９２】
本発明によればまた、対象において、薬物を肝細胞、Ｂ細胞若しくはＴ細胞などの免疫細胞、またはがん細胞に送達する方法であって、薬物と抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片とのコンジュゲートを対象に投与することを含む方法が提供される。本発明によれば、抗ＣＤ７１抗体または抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ’を用いることができる。
【００９３】
本発明のコンジュゲートの１日の投与量は患者の状態や体重、薬物の種類、投与経路等によって異なるが、例えば、筋肉の疾患の治療目的で患者に筋肉内投与する場合には、成人（体重約６０ｋｇ）１日当りの投与量は、本発明のコンジュゲートにおける薬物として約１〜約１０００ｍｇ、好ましくは約３〜約３００ｍｇ、さらに好ましくは約１０〜約２００ｍｇとし得る。上記１日用量は、複数回（例えば、１回、２回または３回）に分けて投与し得る。
【００９４】
本発明によれば、対象において、筋肉（例えば、心筋及び腓腹筋）において筋肉量を増加させる方法であって、前記対象に、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片とミオスタチンに対するｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡとのコンジュゲートを投与することを含む方法が提供される。本発明によればまた、対象において、末梢動脈疾患をその必要のある対象において処置する方法であって、前記対象に、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片とミオスタチンに対するｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡとのコンジュゲートを投与することを含む方法が提供される。本発明によれば、抗ＣＤ７１抗体または抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ’を用いることができる。
【００９５】
本発明によれば、対象において、がんを処置する方法であって、前記対象に、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と抗がん活性を有する物質とのコンジュゲートを投与することを含む方法が提供される。
【００９６】
本発明によれば、対象において、肝疾患を処置する方法であって、前記対象に、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と肝疾患の治療および／または予防効果を有する物質とのコンジュゲートを投与することを含む方法が提供される。
【００９７】
本発明によれば、対象において、免疫疾患を処置する方法であって、前記対象に、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と免疫疾患の治療および／または予防効果を有する物質とのコンジュゲートを投与することを含む方法が提供される。特定の態様においては、免疫疾患の治療および／または予防効果を有する物質とのコンジュゲートを投与する前に、免疫細胞にＣＤ７１を誘導してもよい。
【００９８】
（使用）
本発明によれば、細胞内に薬物を送達するための、細胞表面抗原に結合する抗体またはその抗原結合性断片と薬物とのコンジュゲートの使用が提供される。本発明によれば、細胞内に薬物を送達するための、細胞表面抗原に結合する抗体またはその抗原結合性断片と薬物とのコンジュゲートの使用が提供される。この態様では、細胞は、エンドサイトーシスにより膜タンパク質を細胞内に取り込む細胞であり得る。また、この態様では、細胞表面抗原は、膜タンパク質（例えば受容体）であって、エンドサイトーシスによって該膜タンパク質を細胞内に取り込まれうる。本発明によれば、細胞表面抗原に結合する抗体またはその抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ’を用いることができる。
【００９９】
本発明によれば、薬物を筋肉（例えば、心筋及び腓腹筋）に送達するための、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片の使用が提供される。本発明によればまた、筋肉量を増大させるための、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片の使用が提供される。本発明によれば、薬物を筋肉（例えば、心筋及び腓腹筋）に送達するための組成物の製造における、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片の使用が提供される。本発明によればまた、筋肉量を増大させることに用いるための医薬の製造における、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片の使用が提供される。本発明によればまた、末梢動脈疾患をその必要のある対象において処置するための、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片とミオスタチンに対するｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡの使用が提供される。本発明によればさらに、末梢動脈疾患をその必要のある対象において処置するための医薬を調製における、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片の使用が提供される。本発明によればさらにまた、末梢動脈疾患をその必要のある対象において処置するための医薬の調製における、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片とミオスタチンに対するｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡの使用が提供される。本発明によれば、抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ’を用いることができる。
【０１００】
本発明によれば、薬物を肝細胞、Ｂ細胞若しくはＴ細胞などの免疫細胞、またはがん細胞などの細胞（特に、ＣＤ７１陽性細胞）に送達するための、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片の使用が提供される。本発明によれば、薬物を肝細胞、Ｂ細胞若しくはＴ細胞などの免疫細胞、またはがん細胞などの細胞（特に、ＣＤ７１陽性細胞）に送達するための組成物の製造における、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片の使用が提供される。本発明によればまた、薬物を肝細胞、Ｂ細胞若しくはＴ細胞などの免疫細胞、またはがん細胞などの細胞（特に、ＣＤ７１陽性細胞）に送達するための組成物の製造における、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と薬物の使用、または、抗ＣＤ７１抗体若しくはその抗原結合性断片と薬物とのコンジュゲートの使用が提供される。本発明によればまた、がんをその必要のある対象において処置するための医薬の製造における、抗ＣＤ７１抗体またはその抗原結合性断片と薬物の使用、または、抗ＣＤ７１抗体若しくはその抗原結合性断片と薬物とのコンジュゲートの使用が提供される。がん細胞への送達またはがんの治療用途においては、薬物は抗がん活性を有する物質とすることができる。
【実施例】
【０１０１】
以下、本発明を非限定的な意図で記載された実施例に基づいて説明する。【０１０２】
実施例１：抗ＣＤ７１抗体−薬物コンジュゲートの作製
本実施例では、抗ＣＤ７１抗体−薬物コンジュゲートの一例として、抗ＣＤ７１抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを作製した。【０１０３】
本実施例で非限定的例として作製するコンジュゲートは以下の通りである。以下のコンジュゲートはいずれも、ＲＮＡと抗体断片とのコンジュゲートであり、具体的にはＲＮＡとＦａｂ’とがリンカーを介して連結したものである。以下の式（Ｉ）〜（ＩＶ）により表されたコンジュゲートはそれぞれ、マレイミドリンカー、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー、ＳＳリンカー及びＤＭＳＳリンカーによってＲＮＡとＦａｂ’とが連結したコンジュゲートを表す。
【化１】
2017221883.tif 000003
【化２】
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【化３】
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【化４】
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【０１０４】
（１）抗ＣＤ７１抗体
本実施例における抗ＣＤ７１抗体としては、BioXcell (West Lebanon, NH)から購入した抗ＣＤ７１抗体（ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  ２１７．１．３）を用いた。本実施例における対照ＩｇＧとしては、BioXcellから購入したアイソタイプコントロールＩｇＧ２ａ（BP0089）（本明細書において、「ＩｇＧ２ａ」と称することがある。また、下記表１中では「ＩｇＧ」と記載する。）を用いた。
（２）ｓｉＲＮＡ
ＡｐｏＢ、ヒポキサンチン-ホスフォリボシル-トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、およびミオスタチン（ＭＳＴＮ）に対するｓｉＲＮＡ、並びに本実施例において陰性対照として用いたｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＣ）の配列は、以下の通りであった。
1)  siApoB 
センス鎖: 5′-GgAaUcUuAuAuUuGaUcCaA-(CH2)6NH2-3′（配列番号１）;
アンチセンス鎖: 5′-puUgGaUcAaAuAuAaGaUuCcsCsu-3′（配列番号２）; 
2)  siHPRT 
センス鎖: 5′-UcCuAuGaCuGuAgAuUuUaU-(CH2)6NH2-3′（配列番号３）; 
アンチセンス鎖: 5′-paUaAaAuCuAcAgUcAuAgGasAsu-3′（配列番号４）; 
3)  siMSTN 
センス鎖: 5′-GaGuAuGcUcUaGuAaCgUaU-(CH2)6NH2-3′（配列番号５）; 
アンチセンス鎖: 5′-aUaCgUuAcUaGaGcAuAcUcsAsa-3′（配列番号６）; 
4)  siNC
センス鎖: 5′-UgUaAuAaCcAuAuCuAcCuU-(CH2)6NH2-3′（配列番号７）; 
アンチセンス鎖: 5′-aAgGuAgAuAuGgUuAuUaCasAsa-3′（配列番号８）
上記配列番号１〜８において、２’−Ｏ−メチル修飾を有するヌクレオチドを小文字で示し、２’−フルオロ修飾を有するヌクレオチドを下線で示し、ホスフェートおよびホスホロチオエート連結基をそれぞれｐおよびｓで示した。２’−Ｏ−メチル修飾および２’−フルオロ修飾は、ｓｉＲＮＡの血中安定性を高めるために導入された。なお、添付配列表では、塩基の配列のみを表示した。【０１０５】
（３）抗体コンジュゲート作製のためのｓｉＲＮＡの修飾
各センス鎖の3′側のＣ６アミノ鎖に対して、以下の化合物を反応させてチオール反応性基を有するリンカーが導入されたセンス鎖を得た：Ｎ−スクシンイミジル  ３−マレイミドプロピオネート（ＢＭＰＳ）(Acme Bioscience, Palo Alto, CA)、Ｎ−スクシンイミジル  ３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート（ＳＰＤＰ）(Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA)、Ｎ−マレイミドカプロイル−バリル−シトルリル−ｐ−アミノベンジルカルバメート  ｐ−ニトロフェニルエステル（mc-Val-Cit-PABC-PNP）、またはＮ−スクシンイミジル  ４−メチル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタネート（Synchem, Elk Grove Village, IL）。また、４−メチル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタネート修飾ｓｉＲＮＡは、２−メルカプトエタノールで還元し、ＢＭＰＳと反応させてマレイミド基を形成させ、これをジメチルＳＳ（ＤＭＳＳ）リンカーと表記した。但し、断りが無い限り、ｓｉＲＮＡと抗体とのリンカーを形成させるためにはＢＭＰＳを用いた。全ての反応は、高速液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＨＰＬＣ−ＭＳ）によりモニターされ、残存する試薬は、Amicon Ultra ultrafiltration devices (MWCO 3K, Millipore)を用いて除去された。ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖をアニールした。このようにして、図１Ａに示される、各種リンカーがセンス鎖の３’末端に結合した分子を得た。これらのリンカーはチオール基に対して反応性を有する。【０１０６】
（４）抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの作製
コンジュゲートは、図１Ｂに示されるスキームに従って調製した。具体的には、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７をペプシン分解に供してそのＦ（ａｂ’）２を得て、これをさらにシステアミンを用いて還元してそのＦａｂ’断片を得た。得られるＦａｂ’断片は、コンジュゲートの作製に用いる２つのチオール基を有する。Ｆａｂ’断片は、緩衝液（30mM HEPES(pH 7.0), 150mM NaCl）で平衡化したSephadex G-25 columnを用いて精製し、上記で得られたｓｉＲＮＡのマレイミド基または（２−ピリジルジチオ）ペンタネート基と溶出緩衝液中で反応させてコンジュゲートさせた。これらの反応は、20mM リン酸-300mM NaCl緩衝液(pH7.0)を用いたTSKgel G2000SWxL (7.8mm×300mm, TOSOH)を用いたサイズ除外クロマトグラフィー−ＨＰＬＣを用いてモニタリングした。室温で一晩インキュベーションし、Ｆａｂ’−ｓｉＲＮＡコンジュゲートをＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて未反応のＦａｂ’およびｓｉＲＮＡと分離した（図１Ｃ参照）。Ｆａｂ’−ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、未反応のＦａｂ’およびｓｉＲＮＡと分離できた（図１Ｄ参照）。Amicon Ultra ultrafiltration device (MWCO 10kDa)を用いてＦａｂ’−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを濃縮し、ｓｉＲＮＡについは、Quant-it RiboGreen RNA assay kit (Life technologies, Carlsbad, CA)を用いて定量し、Ｆａｂ’については、ATTO-TAG FQ Derivatization Reagent (FQ; ３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド) (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて定量した。以下、コンジュゲートの濃度および重量は、ｓｉＲＮＡの濃度および重量として表示する。血漿ｓｉＲＮＡは、Trizolを用いて抽出し、その後、TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life technologies, Carlsbad, CA)を用いて逆転写した。これらの試料は、リアルタイムPCRにより定量した。図１Ｅによると、抗ＣＤ７１抗体のＦａｂ’の吸光スペクトルを測定したところ２８０ｎｍにピークを有することが分かり、図１Ｆによると、ｓｉＨＲＰＴの吸光スペクトルが２６０ｎｍにピークを有することが分かるが、図１Ｇによると、単離したｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、双方の吸光スペクトルを足し合わせたスペクトルを示すことが分かった。他の各種リンカーについても同様に調製し、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＲＮＡコンジュゲートが単離できたことが検証できた。【０１０７】
ｓｉＲＮＡとタンパク質との分子数比を検証すると、表１の通りであった。
【表１】
2017221883.tif 000007
※表中、式（Ｉ）のリンカーをマレイミドリンカーと表示し、式（ＩＩ）のリンカーをＶａｌ−Ｃｉｔリンカーと表示し、式（ＩＩＩ）のリンカーをＳＳリンカーと表示し、式（ＩＶ）のリンカーをＤＭＳＳリンカーと表示する。【０１０８】
表１に示されるように、１つのＦａｂ’に存在する２つのチオール基に対して１つ、または２つのｓｉＲＮＡがコンジュゲートしたことが分かった。【０１０９】
実施例２：ＣＤ７１結合アッセイ
本実施例では、上記で作製したｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＲＮＡコンジュゲートのＣＤ７１に対する結合能を検証した。本実施例のコンジュゲートとしては、マレイミドリンカーで連結させたｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴを用いた。【０１１０】
平底９６ウェル黒イミュノプレート（Corning 3925）を組換えマウスＣＤ７１（50μL of 5μg/L; Sino Biological Inc., Beijing, China）と４℃で一晩インキュベートした。プレートを0.05% Tween 20を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Ｄ−ＰＢＳ)（−）で２回洗浄し、その後１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＤ−ＰＢＳ（−）を用いて室温で１時間ブロッキングした。0.05% Tween 20を含むＤ−ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ウェル中で競合試薬の存在下または非存在下でコンジュゲート（ｓｉＲＮＡ換算で１００ｎｇ）の試料を室温で２時間インキュベートした。0.05% Tween 20を含むＤ−ＰＢＳ（−）で４回洗浄し、ｓｉＲＮＡ検出のためにRiboGreen溶液を添加して、蛍光（励起光485nm、蛍光535nm）をEnvision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer)により測定した。抗CD71抗体の結合の検出は、4 μg/mLのAlexa Fluor 488標識ヤギ抗ウサギIgG（Invitrogen, Carlsbad, CA）を添加して１時間インキュベートした。蛍光は４回洗浄した後に観察した。非特異的な結合は、ＣＤ７１非被覆ウェルを用いて評価した。ＥＣ５０は、GraphPad Prism 6を用いて算出した。【０１１１】
図２Ａに示されるように、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７の結合に関するＥＣ５０は、1.5 nMであった。このことは、プレートを被覆するＣＤ７１が天然のコンフォメーションを維持していることを示唆するものである。これに対して、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴコンジュゲートでは、PBSで200倍希釈したRibogreen溶液を各ウェルに加え、CD71蛋白質と結合しているコンジュゲートのRNAと結合して生じるRibogreen由来の蛍光をプレートリーダーで定量すると、ＥＣ５０が、29 nMであった。これに対してＩｇＧ２ａ−ｓｉＨＰＲＴでは、結合はみられなかった。ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７とコンジュゲートとのＥＣ５０値を比較すると２０倍近く異なるが、この程度の親和性の差異は、一価であるＦａｂ’への断片化により通常引き起こされる程度のものである（M. Temponi et al., Cancer Res. 52 (1992) 2497-2503）。【０１１２】
ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴコンジュゲートと、その元となったｃｌｏｎｅ  ＲＩ７（親抗体）とを競合させると、競合させる親抗体の濃度依存的に、親抗体に置き換わり、親抗体の濃度がｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴコンジュゲートの濃度に比して著しく高い場合にはほぼ完全に置き換わることが示された（図２Ｄ）。このことは、親抗体とコンジュゲートとが同一のエピトープに結合することを示唆する。さらに、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴコンジュゲートとトランスフェリン(Ｔｆ)とを競合させた場合では、競合させるＴｆの濃度を上昇させても、弱い競合しか示さなかった（図２Ｅ）。血中には相当量のＴｆが存在すると考えられ、抗体がＴｆよりもＣＤ７１に対して強い結合を示すということは、抗体の生体への応用を考える上で重要な特性であると考えられる。【０１１３】
実施例３：サイレンシングのインビトロでの検証
GalNAc-siApoBをJ.K. Nair et al., J. Am. Chem. Soc. 136 (2014) 16958-16961に記載される通りに合成した。GalNAc-siApoBは、肝細胞表面のアシアログリコプロテイン受容体に結合して細胞内に取り込まれ、細胞内でサイレンシングを引き起こすことが知られている。本実施例では、この分子と対比することにより、肝細胞におけるｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＡｐｏＢのサイレンシング並びに、Ｂ細胞及びＴ細胞におけるｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴのサイレンシングを検証した。なお、いずれのコンジュゲートにおいてもリンカーとしてはマレイミドを用いた。【０１１４】
サイレンシングの測定は以下のように行った。トータルＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ抽出法を用いて調製し、これをテンプレートとしてランダムプライマーとSuperscript II reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて逆転写し、ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡをテンプレートとして定量的ＰＣＲを実施した。ＡｐｏＢおよびＨＰＲＴの定量は、Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて行った。定量的ＰＣＲの際には、プライマーとして、以下のプライマーを用いた。【０１１５】
ＡｐｏＢ増幅用フォワードプライマー（配列番号９）：
5′-AATGTGGAGTATAATGAAGATGGTCTATTT-3′
ＡｐｏＢ増幅用リバースプライマー（配列番号１０）：
5′-AGTGCTGGGCTGGTGATGTC-3′
ＡｐｏＢ検出用プローブ（配列番号１１）：
5′-(FAM)-TTGGGACTGGCAGGGAGAGGCTC-(TAMRA)-3′
なお、本明細書では、「ＦＡＭ」は、６−カルボキシフルオレセインを表し、「ＴＡＭＲＡ」は、カルボキシテトラメチルローダミンを表す。【０１１６】
ＨＰＲＴ増幅用フォワードプライマー（配列番号１２）：
5′-CTCCTCAGACCGCTTTTTGC-3′
ＨＰＲＴ増幅用リバースプライマー（配列番号１３）：
5′-TAACCTGGTTCATCATCGCTAATC-3′
ＨＰＲＴ検出用プローブ（配列番号１４）：
5′-(FAM)-CCGTCATGCCGACCCGCAGT-(TAMRA)-3′【０１１７】
内部参照としての、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨまたはリボソームタンパク質ｌａｒｇｅＰ０（Rplp0）はそれぞれ、ACTB, GAPDH,または Rplp0 control reagent（Applied Biosystems, Forster City, CA）を用いて定量し、ＡｐｏＢおよびＨＰＲＴの定量値は、これらのいずれかのｍＲＮＡ量により標準化した。【０１１８】
本実施例のｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＡｐｏＢのサイレンシングの検証のための細胞としては初代肝細胞を用いた。また、遺伝子の発現量はβアクチンの発現量により標準化した。この細胞は、ＣＤ７１の発現は高くはないが、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＡｐｏＢは、ＡｐｏＢ遺伝子発現の抑制に対するＥＣ５０が１１ｎＭであり、９００ｎＭで４６％のサイレンシングを示した（図３Ａの白丸）。一方で、GalNAc-siApoBは、ＥＣ５０が０．２９ｎＭであり、９００ｎＭで９０％のサイレンシングを示した（図３Ａの黒丸）。【０１１９】
次に、抗ＩｇＭで刺激したＢ細胞、Ｌ−ＰＨＡにより刺激したＴ細胞において、ＣＤ７１が誘導されることが知られていることから、このような刺激によりＣＤ７１を発現したＢ細胞およびＴ細胞を用いて、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴのサイレンシングを検証した。【０１２０】
Ｂ細胞およびＴ細胞は、マウス(BALB/cA Jcl, 8週齢, 雄)の脾臓から単離した。細胞は、AutoMACSを用いて、B cell isolation kit mouse (Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)およびPan T cell isolation kit II mouse (Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)をそれぞれ用いて単離した。細胞を９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルの濃度で播種し、Ｂ細胞を１０μｇ／ｍＬの抗マウスＩｇＭ（SouthernBiotech, Birmingham, AL）存在下で、各種濃度のｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴと反応させた。また、Ｔ細胞を５μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン−Ｌ４（Ｌ−ＰＨＡ）(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan)存在下で、各種濃度のｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴと反応させた。７２時間後、ｍＲＮＡの発現をリアルタイムPCRにより定量した。結果は図３ＢおよびＣに示される通りであった。陰性対照としては、ＩｇＧ２ａのＦａｂ’−ｓｉＨＰＲＴを用いた。【０１２１】
図３Ｂに示されるように、抗ＩｇＭで活性化されたＢ細胞では、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴによりＨＰＲＴがサイレンシングされることが明らかとなった。また、図３Ｃに示されるように、Ｌ−ＰＨＡで活性化されたＴ細胞は、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴによりＨＰＲＴがサイレンシングされることが明らかとなった。図３ＢおよびＣでは、黒丸が抗ＣＤ７１抗体Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴによる結果であり、白丸がＩｇＧ２ａのＦａｂ’−ｓｉＨＰＲＴによる結果である。【０１２２】
実施例４：インビボにおけるサイレンシング
マウスにおいて、インビボでの抗ＣＤ７１抗体Ｆａｂ’−ｓｉＲＮＡによる内在性遺伝子のサイレンシングを検証した。本実施例のコンジュゲートとしては、マレイミドリンカーで連結させたｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＡｐｏＢを用いた。【０１２３】
ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＡｐｏＢを１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量でマウスに静脈内投与した。図４Ａに示されるように、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＡｐｏＢは、投与２４時間後においても血中で検出された。【０１２４】
次に肝臓におけるサイレンシングを確認した。ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＡｐｏＢを投与したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、７週齢、雌）のそれぞれの組織を取り出し、Ｔｒｉｚｏｌ抽出法を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出後は、実施例３に記載されるようにｍＲＮＡを定量的ＰＣＲにより確認した。【０１２５】
その結果、図４Ｂに示されるように、肝臓におけるＡｐｏＢのサイレンシングは、静脈内投与から２４時間後においても４４％の低下を示した。【０１２６】
次に、全身でユビキタスに発現するＨＰＲＴ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いて、各種組織におけるサイレンシングを調べた。１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量でマウス（ｎ＝４）にｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴコンジュゲートを静脈内投与し、２４時間後に、肝臓、心筋および腓腹筋においてＨＰＲＴのサイレンシングが確認されたが、脾臓においては確認されなかった（図４Ｃ参照）。より具体的には、心筋で２２％のサイレンシングが観察され、腓腹筋で３９％のサイレンシングが観察された（図４Ｃ参照）。この結果は、ひらめ筋においても同様であった。また、４８時間後には、心筋および腓腹筋においてＨＰＲＴのサイレンシングが確認されたが、肝臓および脾臓並びにその他の組織では、サイレンシングは確認されなかった（図４Ｃ参照）。静脈内投与４８時間後のサイレンシングは、心筋で３７％、腓腹筋で７２％にまで増加した。このように、肝臓におけるサイレンシングは一過的であり、心筋および腓腹筋において持続的なサイレンシングが確認された。そして、静脈内投与約３日後において、心筋および腓腹筋におけるＨＰＲＴのサイレンシングは最大値に達した（図４ＤおよびＥ参照）。一方で、ＩｇＧ２ａのＦａｂ’−ｓｉＨＰＲＴコンジュゲートでは優位な効果は確認されなかった。また、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＮＣ（陰性対照）では、サイレンシングは確認されなかった（図４Ｆ参照）。ＧＡＰＤＨを内部参照として用いて標準化した場合でも同様の結果であった（図４Ｇ参照）。【０１２７】
全身におけるＣＤ７１の発現を定量的ＰＣＲにより確認した。すると、ＣＤ７１は、心筋および腓腹筋において高発現していることが明らかとなった（図５参照）。【０１２８】
実施例５：抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）におけるリンカーの影響
本実施例では、ＡＤＣにおけるリンカーの影響を調べた。【０１２９】
リンカーとして、非開裂型マレイミドリンカー、カテプシンＢに対して感受性でありエンドソーム内で開裂するＶａｌ−Ｃｉｔリンカー、還元環境において開裂するＳＳリンカー、および還元環境においてより感受性高く開裂するＤＭＳＳリンカーを比較し（図１参照）、ＡＤＣにおけるリンカーの影響を確認した。【０１３０】
Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカーで連結させたｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴでは、１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で静脈内投与した場合には、腓腹筋におけるＨＰＲＴのサイレンシングが６６％であったが、マレイミドリンカーで連結させたｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴでは、ＨＰＲＴのサイレンシングが６５％であった（図６ＡおよびＢ）。このようにリンカーが開裂するか否かそれ自体は、ＡＤＣによる遺伝子サイレンシングに影響しないことが示された（図１Ａ参照）。また、ＳＳリンカーで連結させたｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴでは、サイレンシングは２７％であり、ＤＭＳＳリンカーで連結させたｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴでは、サイレンシングは４８％であった（図６Ａ）。この結果は、１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で静脈内投与した場合における心筋においても同様であった（図６Ｃ）。また、心筋においても、リンカーが開裂するか否かそれ自体は、ＡＤＣによる遺伝子サイレンシングに影響しないことが示された（図６ＣおよびＤ）。【０１３１】
このことから、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカーで連結させた抗ＣＤ７１抗体Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴが細胞内に取り込まれた後Ｆａｂ’が結合しているか否かはｓｉＲＮＡのサイレンシングには影響しないことが明らかとなった。また、開裂可能なリンカーを用いた場合と開裂不可能なリンカーを用いた場合とサイレンシングに大きな違いは無かったことから、エンドソーム中に取り込まれた後のＣＤ７１からのｓｉＲＮＡの離脱を阻害しないことも示唆された。すなわち、Ｆａｂ’は、細胞表面の抗原との結合親和性とエンドソームからの離脱性とのバランスにおいて優れており、細胞内への薬物輸送に適していることが示唆された。さらには、筋肉の血管内皮細胞は、血管壁に敷き詰められており、孔を有しないため、物質透過性が低いことで知られている。Ｆａｂ’−薬物コンジュゲートは、筋肉内に薬物を送達できたことから、血管内皮を通過する効率と、筋肉細胞内に取り込まれる効率の両面において優れていることが示唆された。【０１３２】
さらに、マレイミドリンカーで連結させたｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴについて、１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で静脈内投与で単回投与したマウスにおける腓腹筋におけるＨＰＲＴサイレンシング効果を経時的に確認した。その結果、図６Ｅに示されるように、投与４週間後においても、腓腹筋におけるＨＰＲＴサイレンシングは持続した。当然、他の遺伝子であるミオスタチンに対するサイレンシング効果は観察されず（図６Ｅ右）、４週間まで持続したサイレンシングが、配列特異的なサイレンシングであることが確認できた。【０１３３】
一方で、１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で静脈内投与で単回投与したマウスにおいて、心筋では、投与４週間後においても、腓腹筋におけるＨＰＲＴサイレンシングは持続したが、徐々に弱まった（図６Ｆ）。心筋におけるミオスタチンの発現量の変動は有意ではなかった（図６Ｆ）。【０１３４】
このことから、抗ＣＤ７１抗体Ｆａｂ’−ｓｉＲＮＡは、リンカーによらず効果が奏されることが明らかとなった。また、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴは、標的組織において極めて長時間にわたり遺伝子のサイレンシングを持続させた。【０１３５】
実施例６：抗ＣＤ７１抗体Ｆａｂ’−ｓｉＲＮＡの投与経路とサイレンシングとの関係
本実施例では、静脈内投与、腹腔内投与および皮下投与での抗ＣＤ７１抗体Ｆａｂ’−ｓｉＲＮＡのサイレンシングを比較し、投与経路によるサイレンシングの違いを検証した。本実施例におけるコンジュゲートとしては、マレイミドリンカーで連結させたｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴを用いた。【０１３６】
１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量でｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴを、静脈内投与（i.v.）、腹腔内投与（i.p.）または皮下投与（s.c.）し、その７日後にサイレンシングを検証した。その結果は、図７ＡおよびＢに示される通りであった。【０１３７】
図７Ａに示されるように、i.v.投与、i.p.投与、およびs.c.投与のいずれにおいても、腓腹筋においてＨＰＲＴの高いサイレンシングが観察された。また、図７Ｂに示されるように、i.v.投与、i.p.投与、およびs.c.投与のいずれにおいても、心筋においてＨＰＲＴの高いサイレンシングが観察された。この結果から、いずれの箇所に投与しても、コンジュゲートが血行により標的組織に到達したことが示された。【０１３８】
次に、腓腹筋への筋肉内投与によりｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴの効果を検証した。まず、マウスの右腓腹筋に１μｇのｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴを筋肉内投与し、７日後にサイレンシングを確認したところ、右腓腹筋においてＨＰＲＴのサイレンシングが観察された（図７Ｃ）。ＩｇＧ２ａ Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴや、Ｃ６アミノ鎖に結合したｓｉＨＰＲＴ、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＭＳＴＮでは、ＨＰＲＴのサイレンシングが起こらなかったことから（図７Ｃ）、このサイレンシングは、配列依存的かつＣＤ７１特異的であったことが分かった。そして、このマウスの左腓腹筋においてはＨＰＲＴのサイレンシングが観察されなかった（図７Ｄ）。この用量は、５０μｇ／ｋｇ体重の用量に相当する。従って、筋肉内投与は、静脈内投与の３ｍｇ／ｋｇ体重の用量（図３Ｂ参照）と比較して６０分の１も有効用量を低減した。【０１３９】
Ｃ６アミノ鎖に結合したｓｉＨＰＲＴでは、６３０μｇの投与量のときに１μｇの抗ＣＤ７１抗体Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴを投与したときと同じ効果を示した。この結果から、抗ＣＤ７１抗体とコンジュゲートすることによりサイレンシングの効果が１０３のオーダーで増強したことを意味する。４０μｇの抗ＣＤ７１抗体Ｆａｂ’−ｓｉＨＰＲＴを筋肉内投与したマウスでは、８７％のＨＰＲＴのサイレンシングが投与１４日後にも確認された（図７Ｅ左パネル）。図７Ｅ右パネルによれば、このマウスでは、ミオスタチンの発現量は有意には変化しておらず、配列特異的なサイレンシングが図７Ｅ左パネルで観察されたことが分かる。この用量においても、図７Ｆ左パネルに示されるように、反対側の腓腹筋においては、サイレンシングが２０％程度であった。【０１４０】
実施例７：末梢動脈疾患モデルにおける抗ＣＤ７１抗体Ｆａｂ’−ｓｉＭＳＴＮの効果
本実施例では、末梢動脈疾患モデルにおいて、抗ＣＤ７１抗体Ｆａｂ’−ｓｉＭＳＴＮの効果を調べた。本実施例におけるコンジュゲートとしては、マレイミドリンカーで連結させたｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＭＳＴＮを用いた。【０１４１】
末梢動脈疾患（ＰＡＤ）モデルは、CLEA Japan, Inc.から購入したマウス（C57BL/6J、１０週齢、雄）をイソフルランを用いて麻酔し、大腿部動脈の近位および遠位部と大腿深在動脈の近位を切開し、結紮して、その後、縫合閉鎖した。大腿部動脈結紮（ＦＡＬ）により引き起こされる後脚虚血は筋肉に損傷を与えるものであり、このモデルは、ＰＡＤモデルとして、様々な医薬品の効果検証に用いられている。【０１４２】
これらのマウスは、２０μｇ／足のｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＭＳＴＮ（または対照としてＰＢＳ）を週１回で４週間にわたり筋肉内投与した。【０１４３】
その後、トレッドミル（model LE8706, Panlab, Barcelona, Spain）を用いて走行パフォーマンステストを実施した。マウスは、上記手術前からトレッドミルに慣らしておき、手術後も週１回トレッドミル走行訓練を実施した。各回のトレッドミル走行訓練において、初期の走行速度は、５ｃｍ／秒とし、５ｃｍ／秒ずつ速度を上昇させて４０ｃｍ／秒とした。実験を終了し、総走行距離を決定した。【０１４４】
まず、正常マウスに対してｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＭＳＴＮのサイレンシングを確認すると、腓腹筋へのｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＭＳＴＮの筋肉内投与７日後に、ミオスタチンのｍＲＮＡ発現量が用量依存的に減少した（図８Ａ左パネル参照）。図８Ａ右パネルに示されるように、ＨＰＲＴ遺伝子の発現には影響がなく、この効果は、配列依存的なサイレンシングであることがわかった。【０１４５】
上記と同様にして、マウスの両大腿部動脈を結紮した末梢動脈疾患（ＰＡＤ）モデルを作製し、上記投与計画に従ってｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＭＳＴＮを筋肉内投与した。【０１４６】
末梢動脈疾患（ＰＡＤ）モデルに対して、２０μｇ／足のｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＭＳＴＮを週１回の頻度で４回投与してその治療効果を検証した。大腿部動脈結紮（ＦＡＬ）は、ＰＢＳ処理した腓腹筋においてミオスタチンのｍＲＮＡ発現量を減少させたが（図８Ｃ参照）、筋肉重量を変化させなかった（図８Ｄ参照）。しかしながら、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＭＳＴＮを投与したモデルでは、ＰＢＳを投与した対照群と比較して１７％の筋肉量の増大がみられた（図８Ｄ参照）。【０１４７】
次に、筋肉の組織学的検証を実施した。腓腹筋を取り出し、１０％中性緩衝ホルマリン（Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan）で固定した。４μｍ厚の切片を作製し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色、または、ポリクローナルウサギ抗ラミニン抗体（Abcam）を用いた免疫組織学染色に供した。抗ラミニン抗体を反応させた切片は、Dako Envision Kit（Dako, Denmark）で処理し、DAB substrate kit (Nichirei Bioscience INC. Japan)で発色させた。腓腹筋における筋繊維の平均断面積と中心に核を有する再生筋繊維の数を、HALOTM image analysis system (Indica Labs, Inc. Corrales, NM)を用いて測定した。その結果は、図８ＥおよびＦに示される通りであった。図８ＥおよびＦに示される通り、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ｓｉＭＳＴＮで処理されたＰＡＤモデルは、腓腹筋における筋繊維の平均断面積が増大していた。【０１４８】
走行パフォーマンス試験を実施したところ、未処置ＰＡＤモデル（ＰＢＳ投与群）では、総走行距離が１，９８６ｍであったのに対して、抗ＣＤ７１抗体Ｆａｂ’−ｓｉＭＳＴＮで処理したマウスでは、２，３５９ｍであり、有意な増大が確認された（図８Ｇ）。なお、このときの体重および心臓重量は、未処置ＰＡＤモデル（ＰＢＳ投与群）では、それぞれ２７．０９±０．７３ｇおよび１１９．１±４．３ｍｇ（ｎ＝１２）であり、抗ＣＤ７１抗体Ｆａｂ’−ｓｉＭＳＴＮで処理したマウスでは、それぞれ２７．１６±０．９３ｇおよび１１７．７±５．２ｍｇ（ｎ＝１２）であり、有意な変化は認められなかった。【０１４９】
実施例８：慢性骨髄性白血病細胞株K562における抗ヒトCD71抗体Fab'-siRNAによる遺伝子サイレンシングの評価【０１５０】
ヒトCD71発現細胞であるK562細胞における抗ヒトCD71抗体Fab'-siRNAのサイレンシングを評価した。本実施例における抗ヒトCD71抗体としては、OKT9（BioXcell社製：BE0023）を用い、ｓｉＲＮＡとしてはヒトＨＰＲＴ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いた。本実施例では実施例１に記載した方法と同様の方法でOKT9 Fab’-siRNAコンジュゲートを作製した。リンカーとしては式（Ｉ）のマレイミドリンカーを用いた。ヒトHPRTに対するsiRNAとしては配列番号３および４に表される配列を有するsiRNAを用いた。
96ウェルプレートに各種濃度のOKT9 Fab'-siHPRTおよびＩｇＧ２ａFab'-siHPRTを添加し、これにK562細胞を1000細胞/ウェルの濃度で播種した。72時間後、RNeasy 96 Kit (Qiagen, Hilden, Germany)を用いてtotal RNAを抽出し、SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてcDNAを合成した。得られたcDNAをテンプレートとして定量的PCRを実施し、サイレンシングを評価した。定量的ＰＣＲの際には、プライマーおよびプローブとして、以下を用いた。【０１５１】
ｈＨＰＲＴ増幅用フォワードプライマー（配列番号１７）：
5’-CGTCTTGCTCGAGATGTGATG-3’
ｈＨＰＲＴ増幅用リバースプライマー（配列番号１８）：
5’-CCAGCAGGTCAGCAAAGAATT-3’
ｈＨＰＲＴ検出用プローブ（配列番号１９）：
5’-(FAM)-CCATCACATTGTAGCCCTCTGTGTGCTC-(TAMRA)-3’【０１５２】
定量的PCRはViiA7 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて行い、比較Ct法によってサイレンシング効率を算出した。このとき、内部標準としては３６Ｂ４遺伝子を用いた。定量的ＰＣＲの際には、プライマーおよびプローブとして、以下を用いた。【０１５３】
ｈ３６Ｂ４増幅用フォワードプライマー（配列番号２０）：
5’-CGTCTTGCTCGAGATGTGATG-3’
ｈ３６Ｂ４増幅用リバースプライマー（配列番号２１）：
5’-CCAGCAGGTCAGCAAAGAATT-3’
ｈ３６Ｂ４検出用プローブ（配列番号２２）：
5’-(FAM)-CCATCACATTGTAGCCCTCTGTGTGCTC-(TAMRA)-3’【０１５４】
結果は、図９に示される通りであった。図９に示されるように、OKT9のＦａｂ’断片にコンジュゲートされたhHPRT遺伝子に対するsiRNAは、K562細胞において、HPRTの発現を強く抑制した。
したがって、ＯＫＴ９抗体またはその抗原結合断片と薬物とのコンジュゲートを用いることで、薬物を効果的にがん細胞に送達することができることが明らかである。【０１５５】
実施例９：アンチセンスオリゴ核酸（ＡＳＯ）による遺伝子サイレンシングの評価
マウスにおいて、インビボでの抗ＣＤ７１抗体Ｆａｂ’−ＡＳＯコンジュゲートによる内在性遺伝子のサイレンシングを調べた。
本実施例における抗ＣＤ７１抗体としては、ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７を用いた。ＡＳＯとしては、MALAT1遺伝子に対するアンチセンスオリゴ核酸（本明細書において「ＭＡＬＡＴ１-ＡＳＯ」と称することがある。）を用いた。【０１５６】
MALAT1遺伝子に対するアンチセンスオリゴ核酸
５’−aCTAgttcactgaaTGC−３’（配列番号２３）
｛ここで、大文字は核酸がＢＮＡＮＣであり、小文字はＤＮＡであることを示し、全ての核酸がホスホロチオエート修飾を受けている。下線を付したアデニンは、スペーサーとして用い、ホスホジエステル結合でリンカーおよびCと連結させた。｝【０１５７】
（１）マレイミド基を導入したＡＳＯの調製
スペーサーとしてa（アデニン）を介してＣ６アミノ鎖を結合させることによりアミノ基を導入したＭＡＬＡＴ１-ＡＳＯ（1680 nmol、株式会社ジーンデザインに合成委託）の水溶液に、DMSO、10×PBS水溶液、蒸留水を加えた。ついでDMSOに溶解したＢＭＰＳ（1680 nmol）を加え室温にて30分間反応させた。限外ろ過透析を行い試薬の残渣等を除去し、目的物であるマレイミド基を導入したＭＡＬＡＴ１-ＡＳＯ（1630 nmol）を得た。
（２）抗ＣＤ７１抗体Ｆａｂ’の調製
ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７のＦ（ａｂ）’２（７８．２ｍｇ）を２−アミノエタンチオールで還元し、サイズ排除カラムクロマトグラフィーにより目的のＦａｂ’を分取した。得られたＦａｂ’はそのままＭＡＬＡＴ１-ＡＳＯとの連結反応に用いた。
（３）抗ＣＤ７１抗体Ｆａｂ’−ＡＳＯの調製
調製したｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’に対してマレイミド基を導入したＭＡＬＡＴ１-ＡＳＯ（1470 nmol）を加え、室温で一晩反応させた。反応系を濃縮し、サイズ排除カラムクロマトグラフィーにより目的物を分取した。目的画分を混合濃縮しＰＢＳに溶媒置換することで目的の抗ＣＤ７１抗体Ｆａｂ’−ＡＳＯコンジュゲート（250 nmol）を得た（下記式（I’）参照）。
【化５】
2017221883.tif 000008
｛式中において、“（ＡＳＯ）”は、アンチセンスオリゴ（ＡＳＯ）を表し、ＡＳＯとリンカーとはＡＳＯの５’末端において連結している。｝【０１５８】
ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ＭＡＬＡＴ１-ＡＳＯを１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量でマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、７週齢、雌）（ｎ＝４）に静脈内投与した。次に心臓および腓腹筋におけるサイレンシングを確認した。ｃｌｏｎｅ  ＲＩ７  Ｆａｂ’−ＭＡＬＡＴ１-ＡＳＯを投与したマウスのそれぞれの組織を取り出し、Ｔｒｉｚｏｌ抽出法を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出後は、実施例３に記載されるようにｍＲＮＡを定量的ＰＣＲにより確認した。内部標準としてはβアクチンを用いた。【０１５９】
その結果、図１０に示されるように、心臓および腓腹筋におけるＭａｌａｔ１の発現は、静脈内投与から４８時間後においても、それぞれ８９％、および６５％のサイレンシングを受けた。
【図１】
2017221883.tif 000009
【図２】
2017221883.tif 000010
【図３】
2017221883.tif 000011
【図４】
2017221883.tif 000012
【図５】
2017221883.tif 000013
【図６】
2017221883.tif 000014
【図７】
2017221883.tif 000015
【図８】
2017221883.tif 000016
【図９】
2017221883.tif 000017
【図１０】
2017221883.tif 000018
【配列表】
2017221883000001.app
【国際調査報告】
2017221883.tif 000019
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