(57)【要約】  本発明の目的は、ポリエステルを微生物の細胞外に分泌することのできるポリエステルの製造方法を提供することである。  前記課題は、本発明の末端に分子量３００以下のアルコール残基を有するアルコール終止ポリエステルによって解決することができる。また、本発明のポリエステル生産能を有する微生物を、分子量３００以下のアルコールを含む培地で培養することを特徴とする、ポリエステルの製造方法によって解決することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端に分子量３００以下のアルコール残基を有するアルコール終止ポリエステル。
【請求項２】
前記ポリエステルが、α−ヒドロキシ酸及び／又はβ−ヒドロキシ酸からなるポリエステルである、請求項１に記載のアルコール終止ポリエステル。
【請求項３】
前記α−ヒドロキシ酸及び／又はβ−ヒドロキシ酸が、乳酸及び／又は３−ヒドロキシブタン酸である、請求項２に記載のアルコール終止ポリエステル。
【請求項４】
ポリエステルの平均繰り返し単位数が２〜１２である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアルコール終止ポリエステル。
【請求項５】
平均乳酸含有率が７０モル％〜１００モル％である、請求項３又は４に記載のアルコール終止ポリエステル。
【請求項６】
ポリエステル生産能を有する微生物を、分子量３００以下のアルコールを含む培地で培養することを特徴とする、ポリエステルの製造方法。
【請求項７】
前記ポリエステルが、α−ヒドロキシ酸及び／又はβ−ヒドロキシ酸からなるポリエステルである、請求項６に記載のポリエステルの製造方法。
【請求項８】
前記α−ヒドロキシ酸及び／又はβ−ヒドロキシ酸が、乳酸及び／又は３−ヒドロキシブタン酸である、請求項７に記載のポリエステルの製造方法。
【請求項９】
前記ポリエステルの一部又は全部が微生物から分泌される、請求項６〜８のいずれか一項に記載のポリエステルの製造方法。
【請求項１０】
ポリエステルの平均繰り返し単位数が２〜１２である、請求項６〜９のいずれか一項に記載のポリエステルの製造方法。
【請求項１１】
前記ポリエステルが、ポリエステルの末端に分子量３００以下のアルコール残基を有するアルコール終止ポリエステルを含む、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のポリエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール終止ポリエステル及びポリエステルの製造方法に関する。本発明によれば、微生物によって産生されたポリエステルを培地中に効率的に分泌することができる。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石燃料の大量消費による温暖化や将来的な化石燃料の枯渇問題が活発に議論されるようになり、これらに換わる再生可能なバイオマスを利用した素材の開発が行われてきた。中でも、微生物を利用したポリエステル類の開発は、素材としての有用性のほか、環境中の微生物によって容易に分解資化される生分解性を有するため、注目されている。
ある種の微生物がポリエステル類を合成することは以前から知られており、最初の報告例は、１９２６年にパスツール研究所で発見されたpolyhydroxybutyrate(PHB)である。その後、微生物ポリエステルの構成ユニットは現在に至るまで3-hydroxybutyrate(3HB)をはじめとする１５０種類以上が報告されており、ＰＨＡ(polyhydroxyalkanoate)と総称されている。【０００３】
しかし、ポリエステル類を生産することのできる微生物の多くは菌体内に生産物を蓄積するものであり、ポリエステル類を回収する際には菌体を破砕する必要があるほか、菌体内での蓄積に伴い生育が阻害されたり、ポリエステル類の生産量に上限があるといった問題が生じる場合があり、大量生産を行ううえで障害となっていた。
菌体内で生産された有用物質を菌体外へ移行させる検討はこれまでにも各種行われている。目的物質がタンパク質等の場合、例えば特許文献１には、大腸菌のＯｍｐＦタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された微生物を用いることで、目的タンパク質を菌体外へ生産する方法が開示され、特許文献２には、尿路病原性大腸菌が産生する溶血毒素α−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）の分泌に使われるグラム陰性菌ＴｙｐｅＩ分泌システムを改変することにより、低温培養において目的タンパク質の分泌を高効率に実現するシステムが開示されている。しかし、特許文献１及び２のようなシグナル配列を付加する方法は、タンパク質以外には適用が難しい。【０００４】
一方、タンパク質以外の生成物を菌体外へ移行させる方法としては、特定のシトロバクター属に属する微生物を用いてシキミ酸を製造する方法（特許文献３）、人為的処理を施した微生物又は自然界から採取した微生物を固体培地で生育させ、コロニーの周りに油滴小胞を形成する菌株および／または透明な液体培地を用いた培養で培養液に濁りが生じる菌株を選抜する、微生物のスクリーニング方法と当該微生物を用いて不飽和脂肪酸を含有する脂質を効率よく製造する方法（特許文献４）等が開示されている。さらにポリエステル類については、宿主微生物に対して、乳酸を乳酸ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、ヒドロキシアシルＣｏＡを基質としてポリヒドロキシアルカン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とを導入してなる組み換え微生物を培養し、培地から脂肪族ポリエステルを回収する脂肪族ポリエステルの製造方法が開示されている（特許文献５）。【０００５】
しかし、特許文献３及び４の方法は、菌体外へ分泌する特定の菌株を利用するものであり、生産物が大きく制限されるものであった。また、特許文献５の方法は、得られる乳酸重合体の量が１Ｌあたり２００ｍｇ程度であり、生産量が十分とはいえなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００３／０１６５３８号パンフレット
【特許文献２】ＷＯ２００５／０４９８２３号パンフレット
【特許文献３】特開２００２−２８１９９３号公報
【特許文献４】ＷＯ０１／０１２７８０号パンフレット
【特許文献５】特開２０１１−２００１５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、ポリエステルを微生物の細胞外に分泌することのできるポリエステルの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ポリエステルを微生物の細胞外に分泌することのできるポリエステルの製造方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、微生物を培養する培地に分子量３００以下のアルコールを添加することにより、微生物の細胞内で生成されたポリエステルが培地中に効率的に分泌されることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］末端に分子量３００以下のアルコール残基を有するアルコール終止ポリエステル、
［２］前記ポリエステルが、α−ヒドロキシ酸及び／又はβ−ヒドロキシ酸からなるポリエステルである、［１］に記載のアルコール終止ポリエステル、
［３］前記α−ヒドロキシ酸及び／又はβ−ヒドロキシ酸が、乳酸及び／又は３−ヒドロキシブタン酸である、［２］に記載のアルコール終止ポリエステル、
［４］ポリエステルの平均繰り返し単位数が２〜１２である、［１］〜［３］のいずれかに記載のアルコール終止ポリエステル、
［５］平均乳酸含有率が７０モル％〜１００モル％である、［３］又は［４］に記載のアルコール終止ポリエステル、
［６］ポリエステル生産能を有する微生物を、分子量３００以下のアルコールを含む培地で培養することを特徴とする、ポリエステルの製造方法、
［７］前記ポリエステルが、α−ヒドロキシ酸及び／又はβ−ヒドロキシ酸からなるポリエステルである、［６］に記載のポリエステルの製造方法、
［８］前記α−ヒドロキシ酸及び／又はβ−ヒドロキシ酸が、乳酸及び／又は３−ヒドロキシブタン酸である、［７］に記載のポリエステルの製造方法、
［９］前記ポリエステルの一部又は全部が微生物から分泌される、［６］〜［８］のいずれかに記載のポリエステルの製造方法、
［１０］ポリエステルの平均繰り返し単位数が２〜１２である、［６］〜［９］のいずれかに記載のポリエステルの製造方法、及び
［１１］前記ポリエステルが、ポリエステルの末端に分子量３００以下のアルコール残基を有するアルコール終止ポリエステルを含む、［６］〜［１０］のいずれかに記載のポリエステルの製造方法、
に関する。
また、本明細書は、
［１２］乳酸からなるポリエステル、又は乳酸及び３−ヒドロキシブタン酸からなるポリエステルの末端に分子量３００以下のアルコール残基を有するアルコール終止ポリエステル、
［１３］乳酸及び／又は３−ヒドロキシブタン酸の平均繰り返し単位数が２〜１２である、［１２］に記載のアルコール終止ポリエステル、
［１４］平均乳酸含有率が７０モル％〜１００モル％である、［１２］又は［１３］に記載のアルコール終止ポリエステル、
［１５］乳酸からなるポリエステル、又は乳酸及び３−ヒドロキシブタン酸からなるポリエステル生産能を有する微生物を、分子量３００以下のアルコールを含む培地で培養することを特徴とする、ポリエステルの製造方法、
［１６］前記ポリエステルの一部又は全部が微生物から分泌される、［１５］に記載のポリエステルの製造方法、
［１７］ポリエステルの乳酸及び／又は３−ヒドロキシブタン酸の平均繰り返し単位数が２〜１２である、［１５］又は［１６］に記載のポリエステルの製造方法、及び
［１８］前記ポリエステルが、ポリエステルの末端に分子量３００以下のアルコール残基を有するアルコール終止ポリエステルを含む、［１５］〜［１７］のいずれかに記載のポリエステルの製造方法、
を開示する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のポリエステルによれば、微生物の菌体外に効率的に分泌されることができる。
また、本発明のポリエステルの製造方法によれば、微生物によって乳酸を含むポリエステルを効率的に生産することができる。また、天然にはＬ体の乳酸が多いが、本発明において特定のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素を用いた場合は、Ｄ体の乳酸を含むポリエステルを菌体外に分泌することが可能であり、得られたポリエステルは生分解性材料の原料として有用である。
本発明により得られたアルコール終止ポリエステルは、アルコール終止ポリエステルそのものをポリマー原料として利用できるほか、食品や化粧品原料としての利用も期待できる。
また、本発明により得られるアルコール終止ポリエステルの乳酸含有率が高い場合には、ポリ乳酸を生産する際のラクチド原料として好適に利用可能である。高分子量のポリ乳酸を工業的に生産する場合、一般に乳酸の環状二量体（ラクチド）による開環重合反応で行われる。一般にＤ乳酸、あるいはＬ乳酸を原料としてポリ乳酸を生産するには一度ラクチドを合成する必要があるため、工程が煩雑になるほか、コストがかかるという問題があった。
乳酸含有率の高いアルコール終止ポリエステルからラクチドを合成することで、従来よりも簡便に効率よくポリ乳酸を製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の製造方法によって得られるアルコール終止ポリエステルの微生物による産生を模式的に示した図である。
【図２】異なる変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素を有する２種の大腸菌（ＳＴ／ＱＫ（Ａ）及びＳＴ／ＦＳ／ＱＫ（Ｂ））を、ポリエチレングリコールを添加した培地で培養することによって、培地中に乳酸を含むポリエステルのオリゴマーが分泌されたことを示すグラフである。黒色のバーが培養上清中のＦｒｅｅ  ＬＡ（単量体の乳酸）を示し、白抜きのバーがＴｏｔａｌ  ＬＡ（単量体及びオリゴマーの乳酸）を示す。
【図３】異なる変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素を有する２種の大腸菌（ＳＴ／ＱＫ（Ａ）及びＳＴ／ＦＳ／ＱＫ（Ｂ））を、ジエチレングリコールを添加した培地で培養することによって、培地中に乳酸を含むポリエステルのオリゴマーが分泌されたことを示すグラフである。黒色のバーが培養上清中のＦｒｅｅ  ＬＡ（単量体の乳酸）を示し、白抜きのバーがＴｏｔａｌ  ＬＡ（単量体及びオリゴマーの乳酸）を示す。
【図４】本発明の製造方法により細胞外に分泌されたポリエステルのオリゴマーの乳酸含有率を示したグラフである。
【図５】本発明の製造方法により得られた細胞外オリゴマー（Ａ）、細胞内オリゴマー（Ｂ）、及び細胞内ポリマー（Ｃ）に、ジエチレングリコールが結合していることを示したＮＭＲのチャートである。
【図６】大腸菌の遺伝子破壊変異体を用いて本発明の製造方法を実施し、細胞内及び細胞外のポリエステルの量を測定したグラフである。
【図７】ポリエチレングリコール（Ａ）又はジエチレングリコール（Ｂ）を添加した培地で大腸菌を培養することによって、細胞外に分泌されたオリゴマーに含まれる乳酸の量（合計の乳酸量から単量体の乳酸量を減算した量）を示したグラフである。
【図８】本発明の製造方法により得られた培地の上清中の分子の分子量をＥＳＩ−ＭＳで分析した結果を示すグラフである。
【図９】本発明で得られた細胞外オリゴマーの１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ  ＮＭＲ（ａ）及び１Ｈ−１Ｈ  ＤＯＳＹ  ＮＭＲ（ｂ）を示した図である。
【図１０】本発明で得られた細胞外オリゴマーの１Ｈ  ＮＭＲ（ａ）、１３Ｃ  ＮＭＲ（ｂ）、及び１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣ（ｃ）を示した図である。
【図１１】本発明で得られた細胞外オリゴマーから合成されたラクチドの１Ｈ  ＮＭＲを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
〔１〕アルコール終止ポリエステル
本発明のアルコール終止ポリエステルは、末端に分子量３００以下のアルコール残基を有する。すなわち、本発明のアルコール終止ポリエステルは、アルコールが多価アルコールの場合、下記一般式（１）のＡの繰り返し単位及び水素原子からなるポリエステル部分、及びＢ及びヒドロキシ基からなるアルコール残基からなる。
【化１】
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前記一般式（１）において、ｌは特に限定されるものではないが、ある態様では２〜１０００であり、ある態様では２〜１００であり、ある態様では２〜５０であり、ある態様では２〜２０である。例えば、前記ポリエステル部分が乳酸又は３−ヒドロキシブタン酸からなるポリエステル、或いは乳酸及び３−ヒドロキシブタン酸からなるポリエステルであり、そのポリエステル部分の末端に、例えばアルコールとしてジエチレングリコールが結合している場合、本発明のアルコール終止ポリエステルは、一般式（２）
【化２】
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で表すことができる。
なお、本明細書において、「ポリエステル」はオリゴマーを含むものである。
【００１２】
《ポリエステル部分》
本発明のポリエステル部分の繰り返し単位は、ポリエステルを構成できる限りにおいて特に限定されるものではないが、好ましくはヒドロキシ酸であり、より好ましくはα−ヒドロキシ酸及び／又はβ−ヒドロキシ酸である。ヒドロキシ酸としては、例えば２−ヒドロキシプロピオン酸（乳酸）、２−ヒドロキシブタン酸、２−ヒドロキシペンタン酸、２−ヒドロキシヘキサン酸、２−ヒドロキシヘプタン酸、２−ヒドロキシオクタン酸、２−ヒドロキシノナン酸、２−ヒドロキシデカン酸等のα−ヒドロキシ酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシブタン酸、３−ヒドロキシペンタン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸等のβ−ヒドロキシ酸、４−ヒドロキシブタン酸、４−ヒドロキシペンタン酸、４−ヒドロキシヘキサン酸、４−ヒドロキシヘプタン酸、４−ヒドロキシオクタン酸、４−ヒドロキシノナン酸、４−ヒドロキシデカン酸等を挙げることができる。ポリエステル部分の繰り返し単位は、１種の繰り返し単位でもよく、２種以上の繰り返し単位の組み合わせでもよい。本明細書において、繰り返し単位を、例えばヒドロキシ酸残基と称するが、便宜的に前記ヒドロキシ酸残基を「ヒドロキシ酸」と称することがある。
本発明のアルコール終止ポリエステルのポリエステル部分は、繰り返し単位及びアルコールの結合していない末端のヒドロキシ基からなる。ポリエステル部分においては、例えばヒドロキシ酸が縮合反応により重合している。
本発明のアルコール終止ポリエステルのポリエステル部分の１つの態様としては、乳酸残基及びアルコールの結合していない末端のヒドロキシ基を挙げることができる。また、ポリエステル部分の別の態様としては、乳酸残基、３−ヒドロキシブタン酸残基及びアルコールの結合していない末端のヒドロキシ基を挙げることができる。更に、ポリエステル部分の別の態様としては、３−ヒドロキシブタン酸残基及びアルコールの結合していない末端のヒドロキシ基を挙げることができる。このような態様のポリエステル部分においては、乳酸及び乳酸、乳酸及び３−ヒドロキシブタン酸、又は３−ヒドロキシブタン酸及び３−ヒドロキシブタン酸が、縮合反応により重合している。
【００１３】
本発明のアルコール終止ポリエステルは、下記式（３）
【化３】
2017170423.tif 000005
で表される乳酸を含むことができる。より具体的には、本発明のアルコール終止ポリエステルは、乳酸の繰り返し単位（４）
【化４】
2017170423.tif 000006
を含むことができ、前記繰り返し単位を乳酸残基と称する。しかしながら、本明細書において、前記乳酸残基を便宜的に「乳酸」と称することがある。
【００１４】
本発明のアルコール終止ポリエステルは、下記式（５）
【化５】
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で表される３−ヒドロキシブタン酸を含むことができる。より具体的には、本発明のアルコール終止ポリエステルは、３−ヒドロキシブタン酸の繰り返し単位（６）
【化６】
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を含むことができ、前記繰り返し単位を３−ヒドロキシブタン酸残基と称する。しかしながら、本明細書において、前記３−ヒドロキシブタン酸残基を、便宜的に「３−ヒドロキシブタン酸」と称することがある。
【００１５】
本発明のアルコール終止ポリエステルにおける乳酸及び／又は３−ヒドロキシブタン酸の繰り返し単位数は、特に限定されるものではないが、ある態様では２〜１０００であり、ある態様では２〜１００であり、ある態様では２〜５０であり、ある態様では２〜２０であり、ある態様では２〜１０である。すなわち、一般式（２）における「ｎ＋ｍ」は、限定されるものではないが、ある態様では２〜１０００であり、ある態様では２〜１００であり、ある態様では２〜５０であり、ある態様では２〜２０であり、ある態様では２〜１０である。また、３−ヒドロキシブタン酸の繰り返し単位数であるｍは限定されるものではないが、ある態様では０〜１０００であり、ある態様では０〜１００であり、ある態様では０〜５０であり、ある態様では０〜２０であり、ある態様では０〜１０であるが、アルコール終止ポリエステルが３−ヒドロキシブタン酸のみからなる場合は、ｍの下限は２である。また、乳酸の繰り返し単位数であるｎは、ある態様では０〜１０００であり、ある態様では０〜１００であり、ある態様では０〜５０であり、ある態様では０〜２０であり、ある態様では０〜１０であるが、アルコール終止ポリエステルが乳酸のみからなる場合は、ｎの下限は２である。
従って、本発明のアルコール終止ポリエステルの分子量も特に限定されるものではないが、好ましくは分子量の下限は２００程度であり、分子量の上限は１０万である。また、より好ましい分子量の上限は１万、さらに好ましくは５０００、最も好ましくは１０００である。
【００１６】
また、本発明のアルコール終止ポリエステルにおける乳酸と３−ヒドロキシブタン酸との比率は、特に限定されるものではない。
例えば、本発明のアルコール終止ポリエステルが乳酸からなるポリエステルの場合、乳酸の比率は１００モル％である。また、アルコール終止ポリエステルが３−ヒドロキシブタン酸からなるポリエステルの場合、３−ヒドロキシブタン酸の比率は１００モル％である。
一方、本発明のアルコール終止ポリエステルが乳酸及び３−ヒドロキシブタン酸からなるポリエステルの場合、乳酸の含有率は特に限定されるものではないが、好ましくは７０モル％以上であり、より好ましくは８０モル％以上であり、更に好ましくは９０モル％以上である。乳酸の含有率が高いことによって、本発明のアルコール終止ポリエステルは、生分解性材料の原料として、好適に使用することができる。
なお、上記一般式（２）では、上記乳酸残基及び上記３−ヒドロキシブタン酸残基がブロック状に配列されているように表されているが、これらの残基の配列はブロック状、ランダム状の何れでよく、ブロック状の部分とランダム状の部分との組合せでもよい。すなわち、ポリエステル部分の末端に３−ヒドロキシブタン酸残基が存在してもよい。
【００１７】
アルコール終止ポリエステルに含まれる乳酸は、Ｄ体でもよく、Ｌ体でもよいが、Ｄ体が好ましい。自然界に存在する天然の乳酸はＬ体が多い。生分解性材料を製造する場合、ラセミ体のポリ乳酸を用いると、生分解材料がもろくなることがある。従って、Ｌ体のポリ乳酸と、Ｄ体のポリ乳酸とを混合し共結晶化させ、ステレオコンプレックス型のポリマーを使用するのが好ましいとされる。前記の通り、天然のＤ体のポリ乳酸は入手が困難であるため、Ｄ体のポリ乳酸は、生分解材料の原料として、有用である。
【００１８】
《アルコール部分》
本発明のアルコール終止ポリエステルのアルコール部分においては、乳酸にアルコールが縮合反応によりエステル結合を形成しているか、又は３−ヒドロキシブタン酸にアルコールが縮合反応によりエステル結合を形成している。
本明細書において、乳酸又は３−ヒドロキシブタン酸に結合したアルコール由来の基をアルコール残基と称する。具体的には、アルコール残基は前記アルコールからヒドロキシ基を除いた残基を意味する。しかしながら、本明細書において、前記アルコール残基を、便宜的に「アルコール」と称することがある。
【００１９】
《分子量３００以下のアルコール》
本発明のアルコール終止ポリエステルに含まれるアルコール残基を生成できるアルコールは、分子量３００以下のアルコールである。また、分子量の下限としては、好ましくは５０以上、より好ましくは６５以上である。前記分子量３００以下のアルコールは、ヒドロキシ基を有し、且つ分子量が３００以下である限りにおいて、特に限定されるものではないが、好ましくは、多価アルコール又はエーテル結合を有するアルコールであり、より好ましくはエーテル結合を有する多価アルコールであり、更に好ましくはエーテル結合を有するジオールである。また別の好ましい態様としては、１〜３価のヒドロキシ基を有する脂肪族アルコールである。具体的な脂肪族アルコールとしては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、１−ブタノール、１−ペンタノール、１−ヘキサノール、シクロヘキサノール、１−ヘプタノール、１−オクタノール、１−ノナノール、１−デカノール、グリシドール、メチルシクロヘキサノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、４−メチル−２−ペンタノール、イソプロピルアルコール、２−エチルブタノール、２−エチルヘキサノール、２−オクタノール、テルピネオール、ジヒドロテルピネオール、２−メトキシエタノール、２−エトキシエタノール、２−ｎ−ブトキシエタノール、カルビトール、エチルカルビトール、ｎ−ブチルカルビトール、ジアセトンアルコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、１，２−ブチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，４−ブチレングリコール、ペンタメチレングリコール、へキシレングリコール、又はグリセリンを挙げることができるが、好ましくは、ジエチレングリコール、プロパンジオール又はブタンジオールである。更に、アルコールとして、アルコールが縮合したポリエーテルを挙げることができ、具体的にはポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールなどを挙げることができる。
【００２０】
本発明のアルコール終止ポリエステルに、前記メタノール又はエタノールなどの一価アルコールが含まれる場合、本発明のアルコール終止ポリエステルは、下記一般式（７）のＡの繰り返し単位及び水素原子からなるポリエステル部分、及びＢのアルコール残基からなる。
【化７】
2017170423.tif 000009
【００２１】
本発明のアルコール終止ポリエステルは、アルコール終止ポリエステルそのものをポリマー原料や食品、化粧品原料等として利用することもできるが、末端の水酸基とさらに反応させることにより誘導体化することもできる。ポリエステルの水酸基と反応する基としては、イソシアネート基、カルボキシル基、又はカルボン酸ハロゲン化物基、エポキシ基等を挙げることができる。従って、ポリエステルの水酸基と反応する基を有する低分子化合物としては、イソシアネート化合物、カルボン酸、及びカルボン酸ハロゲン化物、エポキシ化合物等を挙げることができる。
【００２２】
単官能のイソシアネート化合物としては、２，６−ジイソプロピルフェニルイソシアネートが挙げられる。また、多官能のイソシアネート化合物としては、トリレンジイソシアネート（ＴＤＩ）、ジフェニルメタンジイソシアネート（ＭＤＩ）、キシリレンジイソシアネート（ＸＤＩ）、イソホロンジイソシアネート（ＩＰＤＩ）、キシリレンジイソシアネート（ＸＤＩ）、イソホロンジイソシアネート（ＩＰＤＩ）、メチルシクロヘキシルジイソシアネート（Ｈ６ＴＤＩ）、４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート（Ｈ１２ＭＤＩ）、１，３−ビス（イソシアナトメチル）シクロヘキサン（Ｈ６ＸＤＩ）、テトラメチルキシリレンジイソシアネート（ＴＭＸＤＩ）、２，２，４−トリメチルヘキサメチレンジイソシアネート（ＴＭＨＤＩ）、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＤＩ）、ノルボルネンジイソシアネート（ＮＢＤＩ）、２，４，６−トリイソプロピルフェニルジイソシアネート（ＴＩＤＩ）、１，１２−ジイソシアネートドデカン（ＤＤＩ）、２，４，−ビス−（８−イソシアネートオクチル）−１，３−ジオクチルシクロブタン（ＯＣＤＩ）、又はｎ−ペンタン−１，４−ジイソシアネートが挙げられる。
【００２３】
単官能のカルボン酸としては、酢酸、プロピオン酸、酪酸、ラウリル酸などの直鎖状または分岐状の飽和脂肪族単官能カルボン酸、アクリル酸、メタクリル酸などの直鎖状または分岐状の不飽和脂肪族単官能カルボン酸、及び安息香酸、２−フェノキシ安息香酸などの芳香族単官能カルボン酸を挙げることができる。
二官能カルボン酸（ジカルボン酸）としては、コハク酸、アジピン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ドデカンジカルボン酸、及びエイコサン二酸等の脂肪族ジカルボン酸、１，２−シクロヘキサンジカルボン酸、１，３−シクロヘキサンジカルボン酸、１，４−シクロヘキサンジカルボン酸、パーヒドロナフタレンジカルボン酸、及びダイマー酸等の脂環族ジカルボン酸、フマール酸、マレイン酸、及びイタコン酸等の不飽和ジカルボン酸、テトラヒドロフタル酸、及びシクロブテンジカルボン酸等の不飽和脂環族ジカルボン酸、ｐ−ヒドロキシエチルオキシ安息香酸、及びε−カプロラクトン等のオキシ酸を挙げることができる。更に、トリメリット酸、及びピロメリット酸などの３官能以上のカルボン酸を挙げることができる。
【００２４】
単官能のカルボン酸ハロゲン化物としては、塩化アセチル、臭化アセチル、塩化プロパノイル、臭化プロパノイル、塩化ブタノイル、臭化ブタノイル、塩化ペンタノイル、臭化ペンタノイル、塩化ヘキサノイル、臭化ヘキサノイル、塩化ベンゾイル、及び臭化ベンゾイルを挙げることができる。
多官能のカルボン酸ハロゲン化物としては、ジカルボン酸塩化物、ジカルボン酸臭化物、ジカルボン酸ヨウ化物を挙げることができるが、より具体的には、２個以上のカルボン酸ハライド基を有する多官能カルボン酸ハロゲン化物であれば、特に制限はなく、例えば、ビフェニルジカルボン酸ジクロライド、ビフェニレンジカルボン酸ジクロライド、アゾベンゼンジカルボン酸ジクロライド、テレフタル酸ジクロライド、イソフタル酸ジクロライド、ナフタレンジカルボン酸ジクロライド等の芳香族２官能カルボン酸ハロゲン化物、アジポイルジクロライド、セバコイルジクロライド等の脂肪族２官能カルボン酸ハロゲン化物、シクロペンタンジカルボン酸ジクロライド、シクロヘキサンジカルボン酸ジクロライド、テトラヒドロフランジカルボン酸ジクロライド等の脂環式２官能カルボン酸ハロゲン化物等を挙げることができる。更に、３官能カルボン酸ハロゲン化物としては、トリメシン酸トリクロライド、１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸トリクロライド、及び１，２，４−シクロブタントリカルボン酸トリクロライドを挙げることができる。
【００２５】
前記イソシアネート化合物、カルボン酸、又はカルボン酸ハロゲン化物を用いることにより、アルコール終止ポリエステルの誘導体を得ることができる。なお、イソシアネート化合物、カルボン酸、又はカルボン酸ハロゲン化物終止ポリエステルは、本明細書において、アルコールをイソシアネート化合物、カルボン酸、又はカルボン酸ハロゲン化物に置き換えたものであり、それらの製造方法は、アルコールをイソシアネート化合物、カルボン酸、又はカルボン酸ハロゲン化物に置き換えることによって実施することができる。
エポキシ化合物としては、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド、フェニレンオキサイドなどを挙げることができる。
【００２６】
本発明のアルコール終止ポリエステルは、限定されるものではないが、後述の製造方法に記載のように、例えば微生物によって産生することができる。微生物によって製造されるアルコール終止ポリエステルは、図１に示すように、微生物の細胞外に分泌される細胞外アルコール終止ポリエステル及び微生物の細胞内に存在する細胞内アルコール終止ポリエステルを含む。
【００２７】
細胞外アルコール終止ポリエステルは、微生物を培養した培地から回収することができる。従って、細胞内に蓄積されたポリエステルと比較して、回収及び精製が容易である。細胞外アルコール終止ポリエステルの繰り返し単位数は、特に限定されるものではないが、ある態様では２〜１２であり、ある態様では２〜１０であり、ある態様では２〜８である。従って、細胞外アルコール終止ポリエステルが３−ヒドロキシブタン酸及び乳酸からなる場合、一般式（２）における「ｎ＋ｍ」は、限定されるものではないが、ある態様では２〜１２であり、ある態様では２〜１０であり、ある態様では２〜８である。すなわち、細胞外アルコール終止ポリエステルは、一般的にオリゴマーと称されるポリエステルを多く含む。また、細胞外アルコール終止ポリエステルが３−ヒドロキシブタン酸からなる場合、一般式（２）におけるｍは限定されるものではないが、ある態様では２〜１２であり、ある態様では２〜１０であり、ある態様では２〜８である。また、細胞外アルコール終止ポリエステルが乳酸からなる場合、一般式（２）におけるｎは限定されるものではないが、ある態様では２〜１２であり、ある態様では２〜１０であり、ある態様では２〜８である。
【００２８】
細胞内アルコール終止ポリエステルは、細胞外アルコール終止ポリエステルと比較して繰り返し単位数が多い。従って、高分子量の生分解材料の原料として有用である。細胞内アルコール終止ポリエステルの繰り返し単位数は、特に限定されるものではないが、ある態様では２〜１０００であり、ある態様では２〜１００であり、ある態様では２〜５０である。すなわち、細胞内アルコール終止ポリエステルが３−ヒドロキシブタン酸及び乳酸からなる場合、一般式（２）における「ｎ＋ｍ」は、限定されるものではないが、ある態様では２〜１０００であり、ある態様では２〜１００であり、ある態様では２〜５０である。すなわち、細胞内アルコール終止ポリエステルは、高分子量のポリマー、及び中低の分子量のオリゴマーを含む。また、細胞内アルコール終止ポリエステルが３−ヒドロキシブタン酸からなる場合、一般式（２）におけるｍは限定されるものではないが、ある態様では２〜１２であり、ある態様では２〜１０であり、ある態様では２〜８である。また、細胞内アルコール終止ポリエステルが乳酸からなる場合、一般式（２）におけるｎは限定されるものではないが、ある態様では２〜１２であり、ある態様では２〜１０であり、ある態様では２〜８である。
【００２９】
微生物として大腸菌を用いて製造されたアルコール終止ポリエステルは、下記式（８）
【化８】
2017170423.tif 000010
で表されるＤ体の乳酸残基を含むことができる。前記の通り、天然のＤ体のポリ乳酸は入手が困難であるため、大腸菌を宿主として製造されたＤ体のポリ乳酸は、生分解材料の原料として有用である。
【００３０】
〔２〕ポリエステルの製造方法
本発明のポリエステルの製造方法は、ポリエステル生産能を有する微生物を、分子量３００以下のアルコールを含む培地で培養することを特徴とする。例えば、乳酸からなるポリエステル生産能を有する微生物、３−ヒドロキシブタン酸からなるポリエステル生産能を有する微生物、又は乳酸及び３−ヒドロキシブタン酸からなるポリエステル生産能を有する微生物を、分子量３００以下のアルコールを含む培地で培養することによってポリエステルを得ることができる。
【００３１】
《微生物》
本発明の製造方法に用いる微生物は、ポリエステル生産能を有する限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば、乳酸からなるポリエステル生産能を有する微生物、３−ヒドロキシブタン酸からなるポリエステル生産能を有する微生物又は乳酸及び３−ヒドロキシブタン酸からなるポリエステル生産能を有する微生物を挙げることができる。具体的には、例えば、ラルストニア・ユートロファ等の細菌を挙げることができる。
また、本発明の製造方法に用いる微生物として、組み換え微生物を用いることもできる。例えば、元来ポリエステル生産能を有さない微生物を形質転換によりポリエステル生産能を有するようにした微生物、ポリエステル生産能を有する微生物を形質転換することによりさらにポリエステル類生産能が増強された組み換え微生物を用いることができる。これらの形質転換された組み換え微生物を用いることにより、操作の簡便性を向上させたり、そして生産性を向上させることができる。
組み換え微生物に使用できる微生物は特に制限されるものではないが、大腸菌が特に好ましく、大腸菌の中でもtatB、tatE、araf（欠損変異株）を用いると単位培地量あたりのポリエステル生産量を向上させることができる点でさらに好ましい。また、pfla及びdld欠損変異株（ＪＷＭＢ１株）は、ポリエステル生産量を向上させ、オリゴマー中の乳酸の含有量を増加させる場合には、好ましい。
組み換え微生物としては、例えば、微生物にポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、β−ケトチオラーゼ遺伝子、及びアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子からなる群から選択させる少なくとも１つの遺伝子を導入し、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ、β−ケトチオラーゼ、及びアセトアセチルＣｏＡレダクターゼの少なくとも１つを発現させることによって、ポリエステルの産生能を向上させることが可能であり、ポリエステルを細胞外に効率的に分泌することができる。特に、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素を発現させることによって、ポリエステルの産生能を付与、あるいは効率よく向上させることができる。また、前記遺伝子のコドンは、形質転換に用いる宿主生物のコドン使用頻度に合わせて変換されたものであってもよい。
【００３２】
前記のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ、β−ケトチオラーゼ、及びアセトアセチルＣｏＡレダクターゼについて、説明する。
（１）ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素は、ヒドロキシアシルＣｏＡをモノマーとしてポリヒドロキシアルカン酸を合成する反応の触媒活性を有するタンパク質である。また、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素は、ラクチルＣｏＡをモノマーとしてポリ乳酸を合成する反応を触媒する。さらに、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素は、ヒドロキシアシルＣｏＡおよびラクチルＣｏＡをモノマーとして、ヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体を合成する反応を触媒する。
本発明に用いる組み換え微生物に導入する好ましいポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子は、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、およびメガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）のいずれかに由来するものであり、特に好ましくはシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６１−３に由来するものであり、その塩基配列を配列番号１に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
更に、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子として、変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子も利用することができる。このような変異型としては、配列番号１に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２）の１３０番目、３２５番目、３９２番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸が、それぞれ単独で置換された単独変異、任意の２つのアミノ酸が置換された二重変異、任意の３つのアミノ酸が置換された三重変異、４つのアミノ酸が置換された四重変異を挙げることができる。好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列において３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、及び４８１番目のＧｌｎがＬｙｓに置換された二重変異を有する変異型をコードする遺伝子、または配列番号２のアミノ酸配列において３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、３９２番目のＰｈｅがＳｅｒに、及び４８１番目のＧｌｎがＬｙｓに置換された三重変異を有する変異型をコードする遺伝子である。
【００３３】
（２）プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子
プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼは、適当なＣｏＡ基質からプロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒する活性を有するタンパク質である。以下、本明細書において、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼを「ＰＣＴ」と記載する。
本発明における好ましいＰＣＴ遺伝子は、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、およびメガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）のいずれかに由来するものである。特に好ましくはメガスファエラ・エルスデニ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ）に由来するものであり、その塩基配列を配列番号３に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００３４】
（３）β−ケトチオラーゼ遺伝子
β−ケトチオラーゼは、２分子のアセチルＣｏＡが縮合してアセトアセチルＣｏＡが形成される反応を触媒するタンパク質である。以下、本明細書において、β−ケトチオラーゼを、「βＫＴ」と記載する。
本発明における好ましいβＫＴ遺伝子は、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、およびメガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）のいずれかに由来するものである。特に好ましくはラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）に由来するものであり、その塩基配列を配列番号５に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００３５】
（４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子
アセトアセチルＣｏＡレダクターゼは、アセトアセチルＣｏＡのＮＡＤＰ等の補酵素の存在下で生じる還元反応によって、Ｄ（−）−β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡが形成される反応を触媒するタンパク質である。以下、本明細書において、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼを、「ＡＡＣｏＡ−Ｒ」と記載する。
本発明における好ましいＡＡＣｏＡ−Ｒ遺伝子は、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、およびメガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）のいずれかに由来するものである。特に好ましくはラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）に由来するものであり、その塩基配列を配列番号７に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００３６】
前記の本発明に用いるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ、β−ケトチオラーゼ、及びアセトアセチルＣｏＡレダクターゼは、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有するものでもよい。ここで用語「数個」とは、１〜４０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１０個以下をいう。また、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ、β−ケトチオラーゼ、及びアセトアセチルＣｏＡレダクターゼは、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡの塩基配列であってもよい。但し、前記ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子は、ヒドロキシアシルＣｏＡをモノマーとしてポリヒドロキシアルカン酸を合成する反応の触媒活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子は、プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応の触媒活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、β−ケトチオラーゼ遺伝子は、２分子のアセチルＣｏＡが縮合してアセトアセチルＣｏＡが形成される反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子は、アセトアセチルＣｏＡの還元反応の触媒活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。前記プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応の触媒活性は、例えばＡ．Ｅ．Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２０６巻、第５４７−５５２頁）に記載された方法に従って測定することができる。前記２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡが形成される反応の触媒活性は、例えばＳｌａｔｅｒら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９９８年、第１８０巻、第１９７９−１９８７頁）に記載された方法によって測定することができる。前記アセトアセチルＣｏＡの還元反応の触媒活性は、例えばＧ．Ｗ．Ｈａｙｗｏｏｄら（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８８年、第５２巻、第２５９−２６４頁）に記載された方法によって測定することができる。
【００３７】
前記のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、β−ケトチオラーゼ遺伝子、及びアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子が導入された微生物を用いた場合、特に乳酸分率（乳酸含有量）の高いポリエステルを得ることができる。
【００３８】
《培地》
本発明の製造方法に用いる培地は、用いる微生物によって、適宜選択することができるが、通常炭素源を含む培地を用いる。大腸菌を用いる場合、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地、ＮＺＹＭ培地、ＳＯＢ培地、２ｘＹＴ培地、又はＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈを用いることができる。
培地に含まれる炭素源は、本発明のポリエステルを産生できる限りにおいて特に限定されるものではないが、例えばグルコース、キシロース、フラクトース、セルビオース、ラフィノース、マルトース、ガラクトース、デンプン、デンプン加水分解物、糖蜜、廃糖蜜等の糖類、麦、米等の天然物等を挙げることができる。特に乳酸分率（乳酸含有量）の高いポリエステルを得る場合には、キシロースが好ましい。
【００３９】
《分子量３００以下のアルコール》
本発明の製造方法においては、分子量３００以下のアルコールを培地に添加する。すなわち、前記微生物に分子量３００以下のアルコールを接触させる。
分子量３００以下のアルコールとしては、前記「〔１〕アルコール終止ポリエステル」の項に記載の「分子量３００以下のアルコール」を限定することなく用いることができるが、好ましくは、多価アルコール又はエーテル結合を有するアルコールであり、より好ましくはエーテル結合を有する多価アルコールであり、更に好ましくはエーテル結合を有するジオールである。また、別の好ましい態様としては、１〜３価のヒドロキシ基を有する脂肪族アルコールである。
特にはジエチレングリコール、ブタンジオール、又はポリエチレングリコールが好ましい。ポリエチレングルコールを用いる場合、分子量３００以下のポリエチレングリコールを用いるが、ポリエチレングルコールの分子量は、好ましくは２８０以下であり、より好ましくは２６０以下である。
分子量の下限は好ましくは５０以上、より好ましくは６５以上である。
前記アルコールは、ポリエステル部分の末端と、縮合反応によって結合し、ポリエステルの重合を停止させていると推測される。
培地に添加されるアルコール濃度は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば微生物の生育を阻害しない濃度を、アルコールの種類、及び微生物の種類に応じて、適宜決定することができる。例えば、大腸菌及びジエチレングリコールを用いる場合は、ジエチレングリコールの濃度は、好ましくは０．０１〜２０容量％であり、より好ましくは０．１〜１０容量％である。また、大腸菌及びポリエチレングリコールを用いる場合、ポリエチレングリコールの濃度は、好ましくは０．０１〜１５容量％であり、より好ましくは０．１〜１０容量％である。
【００４０】
本発明のポリエステルの製造方法においては、ポリエステルの一部又は全部が微生物から分泌される。すなわち、得られるポリエステルは、微生物の細胞内に蓄積されるだけでなく、細胞外へも分泌されているという特徴を有する。すなわち、培地中に分子量３００以下のアルコール類を含有させない場合の細胞外のポリエステルの生産量に比べ、培地中に分子量３００以下のアルコール類を含有させる場合の細胞外のポリエステルの生産量は顕著に向上している。
本発明のポリエステルの製造方法で得られるポリエステルは、ポリエステルの末端に分子量３００以下のアルコール残基が結合しているアルコール終止ポリエステルを含む。すなわち、限定されるものではないが、前記「〔１〕アルコール終止ポリエステル」の項に記載のアルコール終止ポリエステルを製造することができる。ポリエステルの末端にアルコールが結合していることにより、効率的に微生物の細胞外に、ポリエステルを分泌することができる。
【００４１】
本発明のポリエステルの製造方法によって、低分子量から高分子量のポリエステルを製造することができる。得られるポリエステルは、分子量が数千〜数万の高分子化合物のほか、２量体〜１０量体程度のオリゴマーや２種以上のモノマー単位からなるコポリマーを含む。すなわち、本発明においては、通常、低分子量から高分子量のポリエステル産生することができる。
細胞外に分泌されるポリエステルは、比較的分子量の小さいものが多く、例えばポリエステルの乳酸及び３−ヒドロキシブタン酸の平均繰り返し単位数は、ある態様では２〜１２であり、ある態様では２〜１０であり、ある態様では２〜８である。
細胞内のポリエステルの分子量も、特に限定されるものではないが、比較的分子量の大きいものが多く、例えばポリエステルの乳酸及び３−ヒドロキシブタン酸の平均繰り返し単位数はある態様では２〜１０００であり、ある態様では２〜１００であり、ある態様では２〜５０である。
【００４２】
前記生産されたポリエステルの回収は、微生物から共重合ポリエステルを回収するための、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、培養液から遠心分離によって集菌、洗浄した後、乾燥させ、クロロホルムに乾燥菌体を懸濁し、加熱することによって、目的とする共重合ポリエステルをクロロホルム画分に抽出し、さらにこのクロロホルム溶液にメタノールを加えてポリエステルを沈殿させ、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去した後、乾燥することで、精製された共重合ポリエステルを得ることができる。
回収されたポリエステルの組成の確認は、通常の方法、例えばガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行えばよい。
【００４３】
《作用》
前記の通り、本発明の製造方法によって得られるポリエステルの少なくとも一部は、ポリエステルの末端に分子量３００以下のアルコール残基が結合している。特に、細胞外へ分泌されるポリエステルは、分子量３００以下のアルコール残基が結合している割合が高い。本願発明において、得られるポリエステルにアルコールが結合している理由は、詳細には明らかではないが以下のように推定することができる。添加された分子量３００以下のアルコールは、菌体内に取り込まれた後、ポリエステル類生合成のターミネーションに作用していると思われる。その結果、末端に上記アルコール類が結合したポリエステルが得られることになる。具体的には、分子量３００以下のアルコールが連鎖移動剤として作用していると考えられる。連鎖移動剤はポリマー鎖からラジカルを受け取り、ポリマーの伸長を止めるものであるが、連鎖移動剤はモノマーを攻撃して重合を開始させることもできる。また、ポリエステルの末端に結合したアルコールがシグナル配列のような役割を果たすことで菌体外へ移行している可能性も考えられる。しかしながら、本発明は、前記の説明によって限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００４５】
《実施例１》
ポリエステルの製造
ＷＯ２００９／１３１１８６の実施例１に記載された方法で、Ｍ．エルスデニ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ）由来のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、Ｒ．ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のβ−ケトチオラーゼをコードするＤＮＡ、Ｒ．ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードするＤＮＡ、及びシュードモナスｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６１−３株由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに置換され、そして４８１番目のＧｌｎがＬｙｓに置換された二重変異を有する変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素（以下、ＳＴ／ＱＫ変異酵素と称することがある）をコードするＤＮＡを含む、組み換えプラスミドｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１ＰＳ（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢを調製した。
また、上記ＳＴ／ＱＫ変異酵素の代わりに、シュードモナスｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６１−３株由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに置換され、３９２番目のＰｈｅがＳｅｒに置換され、そして４８１番目のＧｌｎがＬｙｓに置換された三重変異を有する変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素（以下、ＳＴ／ＦＳ／ＱＫ変異酵素と称することがある）をコードするＤＮＡを含むことを除いて上記ｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１ＰＳ（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢと同様にして、組み換えプラスミドｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１ＰＳ（ＳＴ／ＦＳ／ＱＫ）ＡＢを調製した。
続いて、大腸菌ＢＷ２５１１３をリン酸カルシウム法により形質転換し、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、ＳＴ／ＱＫ変異酵素が発現した形質転換体（以下、ＳＴ／ＱＫ大腸菌と称することがある）、及びプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、ＳＴ／ＦＳ／ＱＫ変異酵素が発現した形質転換体（以下、ＳＴ／ＦＳ／ＱＫ大腸菌と称することがある）の合計２種類の形質転換体を得た。【００４６】
得られた形質転換体を、２重量％グルコース及びアンピシリン含有ＬＢ培地を用いて、１８０ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃で４８時間培養した。あらかじめＬＢ培地に最終濃度として１〜５容量％となる量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００、以下実施例において単に「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」ということもある）又はジエチレングリコールを添加した（以下、アルコールを培地に添加する場合について同じ）。
培養上清を回収し、培養上清に含まれる乳酸を、定量キット（International Ireland 社、Megazyme）によって測定した。乳酸量は、培養上清をそのまま（塩酸で処理しない）サンプルとして乳酸（Free LA）を測定するか、又は１００μＬの培養上清に８０μＬの５規定の塩酸と水２０μＬを添加し、そして１００℃で一晩加水分解を行った。その後、２規定のＮａＯＨを２００μＬ加え中和し、サンプル中の乳酸（Total LA）を測定した。Free LAは、塩酸で処理しないため培養上清中の単量体の乳酸が測定される。Total LAは培養上清中のオリゴマーの乳酸が塩酸によって分解され、単量体となるために、単量体及びオリゴマーの乳酸の合計量が測定される。従って、Total LAの乳酸量からFree LAの乳酸量を減算したものが、培養上清中の乳酸のオリゴマーの量であると考えられる。結果を、図２及び図３に示す。黒色のバーがFree LAを示し、白抜きのバーがTotal LAを示す。【００４７】
ＳＴ／ＱＫ変異酵素を発現する大腸菌、又はＳＴ／ＦＳ／ＱＫ変異酵素を発現する大腸菌のいずれにおいても、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はジエチレングリコール（ＤＥＧ）を添加することによって、培養上清中にポリ乳酸のオリゴマーが分泌されていた。特に、ＳＴ／ＦＳ／ＱＫ変異酵素を発現する大腸菌にジエチレングリコールを添加することにより、菌体外へのポリ乳酸のオリゴマーが顕著に分泌された（図２及び図３）。【００４８】
《実施例２》
本実施例では、培養上清に分泌されたポリ乳酸のオリゴマーに含まれる乳酸と３−ヒドロキシブタン酸の比率を測定した。実施例１で得られたＳＴ／ＦＳ／ＱＫ大腸菌を、ジエチレングリコールを添加した培地で、実施例１と同じように培養し、培養上清を得た。実施例１と同様に、得られた培養上清から、塩酸で処理しないサンプルと、塩酸で処理したサンプルを調製した。それぞれのサンプルについて、乳酸量を定量キット（International Ireland 社、Megazyme）で測定し、３−ヒドロキシブタン酸の量を定量キット（和光純薬社、AUTOKIT 3-HB）で測定した。結果を図４に示す。各バーの下部が３−ヒドロキシブタン酸の量を示し、上部が乳酸の量を示す。
１容量％となるようジエチレングリコールを添加した場合、上清中の乳酸の含有量は９１モル％であった。３容量％となるようジエチレングリコールを添加した場合、上清中の乳酸の含有量は９６モル％であった。５容量％となるようジエチレングリコールを添加した場合、上清中の乳酸の含有量は８７モル％であった。細胞外に分泌されたオリゴマーには多くの乳酸が含まれていることが分かった。【００４９】
《実施例３》
本実施例では、ＮＭＲを用いて、細胞外のポリ乳酸のオリゴマー（図５Ａ）、細胞内のポリ乳酸のオリゴマー（図５Ｂ）、及び細胞内のポリ乳酸のポリマー（図５Ｃ）に、アルコールが結合していることを確認した。
（菌体外オリゴマー、菌体内オリゴマー、及びポリマーの分離と試料調製）
ｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１ｐｓ（ＳＴ／ＦＳ／ＱＫ）ＡＢを有する大腸菌ＢＷ２５１１３株を、２重量％グルコース及びアンピシリン含有ＬＢ培地を用いて、１８０ｒｐｍで撹拌しながら、３容量％ＤＥＧ添加条件下で３０℃４８時間培養し、上清と菌体を遠心によって分離した。上清１質量部に対し、クロロホルムを１質量部加え、混合することにより菌体外オリゴマーを抽出した。過剰なＤＥＧを除去するため、クロロホルム画分１質量部に対して水１質量部を加え、混合し水洗を行った。この操作を２回繰り返した。抽出されたオリゴマーを定量するため、クロロホルム画分のＬＡと３ＨＢをＧＣ／ＭＳで分析した。
菌体内の高分子量体は、凍結乾燥された細胞からクロロホルムで室温２日間抽出することにより得られた。細胞破砕物はＰＴＦＥフィルターを通すことにより取り除かれ、続いてポリマーを沈殿させるため、１０倍量のメタノールを加えた。混合物はさらに４℃で１日インキュベートした。ポリマーはメタノール中で沈殿し、細胞内のオリゴマーはメタノール中に可溶であった。沈殿したポリマーと細胞内オリゴマーは遠心により分離された。ポリマーと菌体内オリゴマーに占めるＬＡと３ＨＢの量はＧＣ／ＭＳにより分析された。【００５０】
（ＮＭＲ分析）
菌体外オリゴマー、菌体内オリゴマー及びポリマーにＤＥＧが結合していることの確認は１Ｈ  −ＮＭＲと二次元ＮＭＲ（１Ｈ−１Ｈ  ＤＯＳＹ  ＮＭＲ  と  １Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣ）により確認した。サンプルは乾固したあと重クロロホルムに再度懸濁させＢｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ５００  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒにより測定した。
１Ｈ−１Ｈ  ＤＯＳＹ  ＮＭＲ分析により、オリゴマー／ポリマーに結合したＤＥＧは高分子化合物としてふるまうことを確認でき、ポリマー／オリゴマー鎖と同様の拡散を示した（図５Ａ、Ｂ、及びＣ）。
さらに、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣ分析から、遊離しているＤＥＧと結合しているＤＥＧを異なるケミカルシフトとして確認した（図５Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ）。遊離しているＤＥＧは２つのメチレン基を有する対象分子であり、そのため２つのシグナルのみを確認できる。一方、オリゴマー／ポリマーに結合しているＤＥＧは対象分子ではなく、このため４つのメチレン基が異なるケミカルシフトを有すると考えられる。
図９（ａ）に１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ  ＮＭＲを示す。３．７ｐｐｍ／４．３ｐｐｍの交差シグナルは、４．３ｐｐｍの共鳴がＤＥＧの（Ｂ）のプロトン由来であることを示しており、従ってＤＥＧはカルボキシ末端でポリエステルに結合していると考えられた。更に、１．５ｐｐｍ／４．３ｐｐｍ及び１．３ｐｐｍ／４．２ｐｐｍの弱い交差シグナルは、ポリエステルの乳酸及び３ＨＢのヒドロキシ末端のメチンプロトンの共鳴を示していると考えられた。更に、図９（ｂ）は、１Ｈ−１Ｈ  ＤＯＳＹ  ＮＭＲを示しており、ＤＥＧの拡散係数が、Ｄ−乳酸オリゴマーと似ており、非結合ＤＥＧよりも低いことを示していた。従って、観察されたＤＥＧは、完全にＤ−乳酸オリゴマーと結合していた。
図１０（ａ，ｂ，ｃ）に、１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲ、及び１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣを示すが、これらのデータも、ＤＥＧを添加して得られた分泌オリゴマーは、Ｄ−乳酸オリゴマーのＤＥＧ結合体であることを支持していた。【００５１】
《実施例４》
本実施例では、大腸菌の遺伝子破壊変異体を用いて、細胞内及び細胞外のポリエステルの量を測定した。大腸菌ＢＷ２５１１３に代えて、図６の遺伝子破壊変異体大腸菌を用いたことを除いては、実施例２の操作を繰り返して、培養上清及び大腸菌の菌体を得た。培養上清及び菌体について、乳酸量を測定した。
図６に示すように、tatB、tatE、arafをはじめとする欠損変異株を用いた場合に単位培地量あたりのポリエステル生産量の増加が見られた。一方で、欠損変異株によっては菌体の生育阻害も顕著に見られた。
なお、図６の上図は培養液１リットルあたりの乳酸オリゴマー生産量を示し、下図は培養液１リットルあたりの菌体重量（Dry Cell Weight）を示す。【００５２】
《実施例５》
実施例１の操作を繰り返して、培養上清中のＴｏｔａｌ  ＬＡ及びＦｒｅｅ  ＬＡを測定した。Ｔｏｔａｌ  ＬＡからＦｒｅｅ  ＬＡを減算したオリゴマーの産生量を図７に示す。
ＳＴ／ＱＫ大腸菌では、アルコールとして５容量％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた場合、オリゴマーの分泌が増加した。また、アルコールとしてジエチレングリコール（ＤＥＧ）を用いた場合、ＤＥＧの容量依存的にオリゴマーの分泌が増加した。
ＳＴ／ＦＳ／ＱＫ大腸菌では、アルコールとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた場合、１〜５容量％のいずれでもほぼ同程度のオリゴマーが分泌された。一方、アルコールとしてジエチレングリコール（ＤＥＧ）を用いた場合、５容量％までＤＥＧの容量依存的にオリゴマーの分泌が増加した。【００５３】
《実施例６》
本実施例では、ＳＴ／ＦＳ／ＱＫ大腸菌及び３容量％のＤＥＧを用いて、培養上清に分泌される分子をＥＳＩ−ＭＳで測定した。
実施例２の操作を繰り返して、培養上清を得た。
得られた培養上清をＥＳＩ−ＭＳ（Bruker社製）を用いて分析した。結果を図８に示す。【００５４】
《実施例７》
本実施例では、ＳＴ／ＦＳ／ＱＫ大腸菌及び１〜５容量％のＤＥＧを用いて、本発明の製造方法によって産生される細胞外のポリ乳酸のオリゴマー、細胞内のポリ乳酸のオリゴマー、及び細胞内のポリ乳酸のポリマーの量を測定した。
実施例３の操作を繰り返して、細胞外のポリ乳酸のオリゴマー、細胞内のポリ乳酸のオリゴマー、及び細胞内のポリ乳酸のポリマーを取得した。表１に示すように、ＤＥＧを用いて、ＳＴ／ＦＳ／ＱＫ大腸菌を培養することにより、細胞外に分泌されるオリゴマーが顕著に増加した。【００５５】
【表１】
2017170423.tif 000011
【００５６】
《実施例８》
本実施例では、実施例１の５容量％ＤＥＧを含む培地で培養することによって得られたＤＥＧ結合ポリエステル、及びＤＥＧを含まない培地で培養することによって得られたＤＥＧ非結合ポリエステルを用いて、ラクチドを合成した。
１０ｍｇの乾燥したＤＥＧ結合ポリエステル又はＤＥＧ非結合ポリエステルを１０ｍｇの酸化亜鉛（触媒）と混合した。混合物を、オーブン（ＧＴＯ−３５０ＲＤグラスオーブン：シバタ社製）を用いて、１８０℃、１時間、真空中で加熱した。蒸発したラクチドを、氷上の丸底フラスコで液化し、クロロホルムで粗精製ラクチドを回収した。粗生成ラクチドは、１Ｈ  −ＮＭＲで解析した。ＤＥＧ結合ポリエステルから得られたラクチドは、標準品のＤ−ラクチドと一致するδ１．６８（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ）のシグナル、及びδ５．０３（ｑ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ）のシグナルを示した（図１１）。ＤＥＧ結合ポリエステルからＤ−ラクチドが生成されたことが分かった。また、ＤＥＧ非結合ポリエステルから得られたラクチドも、同様のシグナルを示した。
ラクチドの収率（％［μｍｏｌ  ラクチドに含まれるＬＡユニット］／［μｍｏｌ  転換ＤＥＧ結合ポリエステルに含まれるＬＡユニット］）は、産生されたラクチドの量、及び安息香酸を１Ｈ  −ＮＭＲの内部標準として用いて定量した転換オリゴマーの量を基にして計算した。市販の合成オリゴマー（Ｌ−乳酸）をコントロールとして用いた。ＤＥＧ結合ポリエステル又はＤＥＧ非結合ポリエステルの収率は、それぞれ１８％及び１２％であった（表２）。【００５７】
【表２】
2017170423.tif 000012
【００５８】
《実施例９》
実施例１と同様の手法で、Ｒ．ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のβ−ケトチオラーゼをコードするＤＮＡ、Ｒ．ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードするＤＮＡ、及びＲ．ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードするＤＮＡを含む、組み換えプラスミドｐＴＶ１１８ＮｐｈａＣＡＢを調製した。
続いて、大腸菌ＢＷ２５１１３をリン酸カルシウム法により形質転換し、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素が発現した形質転換体を得た。
得られた形質転換体を、２重量％グルコース及びアンピシリン含有ＬＢ培地を用いて、１８０ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃で４８時間培養した。あらかじめＬＢ培地に最終濃度として３容量％となる量の化合物Ａ〜Ｃのいずれかを添加した。
培養上清を回収し、塩酸で処理したサンプルを調製した。サンプルについて３−ヒドロキシブタン酸の量を定量キット（和光純薬社、AUTOKIT 3-HB）で測定した。結果を表３に示す。【００５９】
【表３】
2017170423.tif 000013
【００６０】
《実施例１０》
本実施例では、ＬＢ培地への炭素源の添加についての効果を検討した。
実施例１と同様にして、大腸菌ＢＷ２５１１３をリン酸カルシウム法により形質転換し、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、ＳＴ／ＦＳ／ＱＫ変異酵素が発現した形質転換体（ＳＴ／ＦＳ／ＱＫ大腸菌）を得た。培地は、最終濃度として５容量％となるようジエチレングリコールが添加され、また２０ｇ／Ｌとなるようグルコース又はキシロースが添加された１００ｍｇ／Ｌアンピシリン含有ＬＢ培地を準備した。
続いて、上記得られたＳＴ／ＦＳ／ＱＫ大腸菌を、グルコース又はキシロースが添加された上記２種類の培地で１８０ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃で４８時間培養した。
培養終了後、培養上清を回収し、実施例１、２と同様に分析した。結果を表４に示す。【００６１】
【表４】
2017170423.tif 000014
【００６２】
キシロースを炭素源として用いた場合、オリゴマーに含まれる乳酸が９７ｍｏｌ％に増加した。【００６３】
《実施例１１》
本実施例では、大腸菌として、２つの遺伝子欠損（Δpfla及びΔdld）変異株ＪＷＭＢ１を用いて、培養を行った。
大腸菌としてＪＷＭＢ１株を用いたことを除いては、実施例１０の操作を繰り返した。結果を表５に示す。【００６４】
【表５】
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【００６５】
大腸菌としてＪＷＭＢ１株を、そして炭素源としてキシロースを用いた場合、培地中に分泌されるオリゴマー量が８．１±２．９ｇ／Ｌに増加し、オリゴマー中の乳酸の比率も９７±１ｍｏｌ％と高くなった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明のアルコール終止ポリエステル、及び本発明のポリエステルの製造方法により得られたポリエステルは、生分解性材料の原料として用いることができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変法や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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