(57)【要約】  新規なスギ花粉タンパク質、及びそれを用いたスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬、予防薬、及び治療薬等の提供。  以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるスギ花粉タンパク質。  （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質  （ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質  （ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるスギ花粉タンパク質。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるスギ花粉タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
【請求項３】
以下の（ｄ）〜（ｆ）から選択されるポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、スギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項４】
請求項１記載のスギ花粉タンパク質を有効成分とするスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤。
【請求項５】
請求項１記載のスギ花粉タンパク質を有効成分とするスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬。
【請求項６】
請求項１記載のスギ花粉タンパク質に対する抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体である請求項６記載のスギ花粉タンパク質に対する抗体。
【請求項８】
スギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤を製造するための、請求項１記載のスギ花粉タンパク質の使用。
【請求項９】
スギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬を製造するための、請求項１記載のスギ花粉タンパク質の使用。
【請求項１０】
スギ花粉を原因とするアレルギー疾患を予防又は治療するための、請求項１記載のスギ花粉タンパク質。
【請求項１１】
スギ花粉を原因とするアレルギー疾患を診断するための、請求項１記載のスギ花粉タンパク質。
【請求項１２】
請求項１記載のスギ花粉タンパク質を患者に投与することを特徴とするスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療方法。
【請求項１３】
請求項１記載のスギ花粉タンパク質を患者に投与することを特徴とするスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スギ花粉に由来する新規なタンパク質、及び該タンパク質の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
花粉症は、空中に飛散している花粉を吸入することにより発症し、眼のかゆみや痛み等のアレルギー性結膜炎、鼻炎、皮膚の炎症あるいは喘息等の症状を呈するアレルギー疾患である。花粉症の原因となる植物は数多く知られているが、日本でもっとも多い花粉症はスギ花粉症（スギ花粉を原因とするアレルギー疾患）である。２００３年の報告では、スギ花粉症の有病率は２００１年時点で１９．４％と推定されており（非特許文献１）、少なくとも２０００万人以上がスギ花粉症に苦しんでいることが推定され、国民病と言っても過言ではない。【０００３】
スギ花粉症のさらに深刻な問題のうちの一つに、スギ花粉飛散量の経年増加が挙げられる。スギ花粉の飛散量は花粉飛散期前年の夏季の平均気温に正の相関することが知られており、日本の平均気温の上昇に伴い、スギ花粉飛散量が年々増加していることが報告されている（非特許文献２）。それに伴い、今後もスギ花粉症患者の増加が容易に予想され、日本国民の健康を損なう恐れがある。実際、３８報を用いたメタアナリシスの結果によると１９８０年から２０００年にかけてスギ花粉症有病率は２．６倍に上昇したことが報告されている（非特許文献３）。【０００４】
これらスギ花粉症治療には抗ヒスタミン薬等の使用をはじめとした一連の対症療法が用いられているが、スギ花粉症の根治が期待できる唯一の治療法として、アレルゲン免疫療法（減感作療法）が期待されている。これは、アレルギー疾患の原因となるアレルゲンを皮下や舌下等に投与することにより、アレルギー症状の緩和を期待する治療法である。これらアレルゲン免疫療法の開発や、その治療効果の向上には原因アレルゲンの特定とその理解が欠かせない。【０００５】
スギ花粉症の発症に関連する主なスギ花粉アレルゲンとして、これまでにCry j 1、Cry j 2、Cry j 3が報告されており（非特許文献４、５、および６）、特にCry j 1、およびCry j 2はそれらを主成分とした標準化スギ花粉エキス（非特許文献７）が開発され、日本におけるスギ花粉症に対するアレルゲン免疫療法が実施されてきた。しかしながら、アレルゲン免疫療法が奏功しない患者群も存在する。スギ花粉中にはいまだ同定されていない新規アレルゲンが存在することが示唆されており（非特許文献８）、より有用性の高いスギ花粉症の免疫療法を目的とした、特徴的な新規アレルゲンタンパク質が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Okuda M，Ann Allergy Asthma Immunol. ，91:288-296，2003
【非特許文献２】Yamada T, et al., J Allergy Clin Immunol., 133:632-639, 2014
【非特許文献３】Kaneko Y, et al., Int Arch Allergy Immunol., 136:365-371, 2005
【非特許文献４】Yasueda H, et al., J. Allergy Clin. Immunol., 71:77-86, 1983
【非特許文献５】Sakaguchi M, et al., Allergy, 45:309-312, 1990
【非特許文献６】Fujimura T, et al., Allergy, 62:547-553, 2007
【非特許文献７】Yasueda H, et al., Allergol. Int., 46:135-140, 1997
【非特許文献８】Fujimura T, et al., Int Arch Allergy Immunol., 133:125-135, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規なスギ花粉タンパク質、及びそれを用いたスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬、予防薬、及び治療薬等を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく検討したところ、スギ花粉粗抗原から、スギ花粉症患者由来のリンパ球ならびに血清中ＩｇＥと高い反応性を示す新たなタンパク質を発見し、これがスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬、予防薬、又は治療薬として有用であることを見出した。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の１）〜１３）に係るものである。
１）以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるスギ花粉タンパク質。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
２）以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるスギ花粉タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
３）以下の（ｄ）〜（ｆ）から選択されるポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、スギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
４）上記１）のスギ花粉タンパク質を有効成分とするスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤。
５）上記１）のスギ花粉タンパク質を有効成分とするスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬。
６）上記１）のスギ花粉タンパク質に対する抗体。
７）モノクローナル抗体である上記６）のスギ花粉タンパク質に対する抗体。
８）スギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤を製造するための、上記１）のスギ花粉タンパク質の使用。
９）スギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬を製造するための、上記１）のスギ花粉タンパク質の使用。
１０）スギ花粉を原因とするアレルギー疾患を予防又は治療するための、上記１）のスギ花粉タンパク質。
１１）スギ花粉を原因とするアレルギー疾患を診断するための、上記１）のスギ花粉タンパク質。
１２）上記１）のスギ花粉タンパク質を患者に投与することを特徴とするスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療方法。
１３）上記１）のスギ花粉タンパク質を患者に投与することを特徴とするスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のスギ花粉タンパク質は、スギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬、予防薬、及び治療薬等に利用することができる。当該スギ花粉タンパク質は、Cry j 1、Cry j 2、その他既知スギ花粉タンパク質とは相同性を持たないアミノ酸一次配列を有することから、これらと組み合わせることによって、より有用な減感作治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】精製したリコンビナントスギ花粉タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で解析した図である。
【図２】スギ花粉症患者(ImmunoCAP Score≧2)４名の末梢血単核細胞を用いて、精製リコンビナントタンパク質添加による増殖反応を測定した結果を示す図である。
【図３】スギ花粉症患者(ImmunoCAP Score≧2)１３名の末梢血中の好塩基球が、精製リコンビナントタンパク質により活性化されCD203cの発現が増強した一方、健常者(ImmunoCAP Score＜2)２名の末梢血中の好塩基球ではCD203cの発現が変化しないことを示したフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
スギ花粉タンパク質
本発明のスギ花粉タンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるタンパク質である。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
【００１３】
本発明のスギ花粉タンパク質には、スギ花粉アレルゲン活性を有する限り、当該配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（上記（ｂ））が包含される。このようなアミノ酸配列からなるスギ花粉タンパク質としては、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するスギ花粉タンパク質のアイソフォーム等が挙げられる。
ここで、欠失、置換又は付加される数個のアミノ酸とは、例えば１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸を意味する。また、上記の付加又は欠失には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加や欠失が含まれる。
アイソフォームの具体例としては、例えば、Ｃ末端の４残基の欠失が挙げられる。
【００１４】
ここで、「スギ花粉アレルゲン活性」とは、肥満細胞上のＩｇＥと結合し、アトピー性のヒトに即時型アレルギー反応を引き起こす活性（De Weck, AL. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 146:177-189, 2008）のみならず、単に血清中のＩｇＥと結合する活性が包含される。ＩｇＥと結合する活性は、国際公開第２０１２／１０５５４１パンフレット等に記載の手法で測定できる。
【００１５】
また、本発明のスギ花粉タンパク質には、スギ花粉アレルゲン活性を有する限り、配列番号２で示されるアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するタンパク質からなるタンパク質（（上記（ｃ））が包含される。
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上である。当該アミノ酸配列の同一性は、例えばBLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information）を使用し、オプションパラメータを初期設定値で計算する方法が適用できる。
【００１６】
また、本発明のスギ花粉タンパク質は、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保するためのタンパク質等との融合体を形成してもよい。
【００１７】
スギ花粉タンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、上記スギ花粉タンパク質をコードするものであり、好適には、（ｄ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｅ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｆ）配列番号１に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
（ｅ）及び（ｆ）のポリヌクレオチドには、（ｄ）のポリヌクレオチドの変異体が含まれる。当該変異体には、天然の対立遺伝子変異体や、当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る天然に存在しない変異体が包含される。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各種１本鎖ＤＮＡやＲＮＡをも包含する。アンチセンス鎖は、プローブ等として利用可能である。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明にかかるポリヌクレオチドに対し、本発明にかかるポリペプチドをコードする塩基配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの塩基配列が付加していてもよい。
【００１９】
ここで、ストリンジエントな条件とは、例えばMolecular Cloning:A Laboratory Manual (Second Edition, J.Sambrook et.al, 1989)に記載の条件等が挙げられる。すなわち、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
また、配列番号１で示される塩基配列との同一性は、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上である。当該塩基配列の同一性は、例えばBLASTを使用し、オプションパラメータを初期設定値で計算する方法が適用できる。
【００２０】
上記ポリヌクレオチドの変異体としては、例えば、配列番号１で示される塩基配列の４番目のaがgに、８９８番目のtがcに、１０２９番目のｇがａに、１６４３番目のｔがaに、それぞれ変異したものが挙げられる。
【００２１】
スギ花粉タンパク質をコードするポリヌクレオチドの取得
本発明のスギ花粉タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、スギ花粉からクローン化することができ、クローニング方法としては、既知の手段、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いて行う方法が挙げられる。
例えば、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、当該プローブを用いてゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーに対してスクリーニングを行えばよい。このようなプローブとしては、本発明にかかるポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いかなる配列および長さのものを用いてもよい。また人工的にポリヌクレオチドを合成する方法が挙げられる。(Kosuri S et. al., Nature Methods 11, 499-507, 2014)
【００２２】
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの一部又は全部を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列を適当な原理を用いて取得することにより得ることもできる。例えば、上記の本発明のポリヌクレオチドの一部を含むポリヌクレオチドをプライマーとして用いて行うＰＣＲ法、上記の本発明のポリヌクレオチドの一部を含むポリヌクレオチドをプローブとして用いる方法が挙げられる。
例えば、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法は、本発明のポリヌクレオチドの５'側および３'側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等の増幅反応を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、当該ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
【００２３】
また、本発明で提供するポリヌクレオチドは、例えば、計画的な若しくはランダムな変異導入法等の方法により、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを改変することにより作製することもできる。
ここで、計画的に変異を導入する際の変異の計画は、例えば、ポリヌクレオチド配列上の特徴的な配列を参酌することにより行うことができる。また、ランダムに変異を導入する方法としては、例えば、ＰＣＲ法、変異原処理による方法が挙げられる。計画的に変異を導入する方法としては、部位特異的突然変異誘発法が挙げられ、より具体的には、例えばSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット（タカラバイオ）等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ法(PCR protocols,Academic Press,New York,1990)を用いることもできる。
【００２４】
スギ花粉タンパク質の製造
本発明のスギ花粉タンパク質は、スギ花粉から分離精製することにより得ることができる。分離精製方法は特に限定されるものではないが、例えば、スギ花粉抽出液をゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、等の従来公知の手法を用いて分離・精製すればよい。
また、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチドを組み込むことにより作製された組換えベクターを宿主細胞に導入して、スギ花粉タンパク質を細胞内或いは細胞外に発現させて、採取することが可能である。
【００２５】
宿主としては、形質転換が可能な生細胞であれば特に限定されず、例えば大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母や糸状菌等の真菌類、Ｓｆ９細胞等の昆虫培養細胞、カイコ等の昆虫、動物細胞、植物又は植物由来細胞等が挙げられる。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、上記の宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、導入する宿主の種類、導入方法等に応じて適宜決定できる。
例えば、プラスミド DNA、ファージDNA、ウイルスベクター等が挙げられる。発現ベクターの構築に用いられるベクターDNAは、広く普及した入手の容易なものが用いられる。例えば、pUC19（タカラバイオ）、pTV118N （タカラバイオ）、pMAMneo（クロンテック）、pGEX（GEヘルスケア）、pET160（Invitrogen）、pDEST（Invitrogen）、pIEx（メルクミリポア）、pBacPAK（クロンテック）等が挙げられる。また、ウイルスベクターとしては、例えば、バキュロウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）等のＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等が挙げられる。
【００２７】
当該組換えベクターを用いて宿主を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。斯くして得られた培養液から、一般的な方法によってタンパク質の採取、精製を行い、本発明のスギ花粉タンパク質を得ることができる。例えば、宿主として大腸菌を用いた場合は、pET System Manual, 10th edition (Novagen) に記載の方法等が挙げられる。
【００２８】
スギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤
本発明のスギ花粉タンパク質は、スギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤となり、それを必要とするヒト（患者）に投与してスギ花粉を原因とするアレルギー疾患を予防又は治療するために使用できる。
ここで、スギ花粉を原因とするアレルギー疾患としては、スギ花粉の特異抗原が原因となるあらゆるアレルギー疾患が挙げられ、具体的には、例えばアトピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎等が挙げられる。
斯かるスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤は、例えば、スギ花粉を原因とするアレルギー疾患に対する減感作療法剤として用いることができる。
【００２９】
本発明のスギ花粉タンパク質は、GENETYX Ver.12を用いたアミノ酸相同性解析の結果、スギ花粉症の発症に関連する主なスギ花粉アレルゲンとして報告されているCry j 1、Cry j 2、Cry j 3との相同性は見られず、従来公知のCry j 1、Cry j 2、Cry j 3とは異なるタンパク質であると考えられ、これらと組み合わせることによって、より有用な減感作治療が可能となる。
【００３０】
本発明のスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤を減感作治療剤として用いる場合、本発明のスギ花粉タンパク質をそのまま、或いは乾燥して粉末状とし、又は必要に応じて一般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加した配合剤として調製されるのが好ましい。
例えば、粉末状の精製されたスギ花粉タンパク質を、フェノールを添加した生理食塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液として用いることができる。
【００３１】
本発明のスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤は、通常の投与経路例えば経皮、経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与方法により行うことができる。更に、例えば、トローチ、舌下錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬としても使用することができる。
【００３２】
本発明のスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状などに応じて異なるが、例えば、成人１回あたり約0.1〜1000μgの範囲となるように適宜選択し、毎週１から数回程度投与される。
【００３３】
スギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断
本発明のスギ花粉タンパク質は、スギ花粉を原因とするアレルギー疾患診断薬となり、スギ花粉を原因とするアレルギー疾患を診断するために使用できる。
斯かるスギ花粉を原因とするアレルギー疾患診断薬は、例えばスギ花粉を原因とするアレルギー疾患に対する皮膚反応診断、すなわち皮内テスト又はプリックテスト試薬等として用いられる。加えて、特異的ＩｇＥ抗体検査用試薬を調製することで患者血清または血漿を用いた診断が可能である。（鼻アレルギー診療ガイドライン−通年性鼻炎と花粉症−2013年版、株式会社ライフ・サイエンス）
【００３４】
皮膚反応診断試薬として用いる場合、前記の方法により取得された本発明のスギ花粉タンパク質を、例えば乾燥して粉末状とし、これをフェノールまたはグリセリンを含む生理食塩水に溶解し、希釈して用いられる。特異的ＩｇＥ抗体検査用試薬としては、水相中または固相上で本発明のスギ花粉タンパク質に患者検体中のＩｇＥ抗体を結合させ、Fluoro enzyme immunoassay、Chemiluminescence enzyme immunoassay、enzyme immunoassay等の原理に基づき検出する方法が挙げられるが、検出方法はこれらに限定されない。
【００３５】
スギ花粉タンパク質に対する抗体
本発明のスギ花粉タンパク質に対する抗体は、本発明のスギ花粉タンパク質と特異的に結合することができる抗体である。上記抗体とは免疫グロブリン(IgA、IgD、IgE、IgG、IgMおよびこれらのFabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fcフラグメント）を意味し、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
上記抗体は、種々の公知の方法を用いて作製することができ、作製方法は特に限定されるものではない。
【００３６】
上記抗体は、本発明のスギ花粉タンパク質を発現する生物体またはその組織もしくは細胞の同定などに利用することができる。例えば、大気中や屋内の空間またはヒトの粘膜におけるスギ花粉タンパク質の有無等を測定するために利用することができる。該測定は公知の免疫学的方法により行うことができ、例えばELISA法により行うことができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１  新規スギ花粉タンパク質の粗精製
＜スギ花粉タンパク質の粗精製＞
2gのスギ花粉に抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0)50mLを加え、10分間超音波破砕を行った。続いて室温にて10分間混和した後、遠心(10,000g、10分)して上清を得た。この上清をさらに超遠心分離(50,000g、60分)し、上清を回収した。この上清17mLに対し、抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0)で平衡化させたQ sepharose high performance樹脂 (GEヘルスケア)懸濁液を等量加え、30分間室温で振盪させた。遠心分離により(1,000g、10分)上清を除去後、抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0)にて50mLまでメスアップし、転倒混和後、再度遠心分離することで樹脂を洗浄した。続いて、洗浄した樹脂に0.0125M NaCl含有抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0)を10mL加え、5分間室温で振盪させた。遠心分離(1,000g、10分)により上清を除去し樹脂に吸着したタンパク質を溶出させた。同じ操作を、0.025M NaCl含有抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0) 、 0.05M NaCl含有抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0)、0.1M NaCl含有抽緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0) 、0.2M NaCl含有抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0) 、0.4M NaCl含有抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0) 、0.6M NaCl含有抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0)で繰り返した。最後に、0.6M NaCl含有抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0)を用いて溶出させたタンパク質溶液を粗精製液として回収した。【００３８】
＜部分内部アミノ酸配列の同定＞
回収した粗精製液を、100,000MWCOスピンカラムにて濃縮操作を行った。濃縮したサンプルに対し、Novex（登録商標） NuPAGE（登録商標） SDS-PAGE system（invitrogen）の一般的なプロトコルを用いて還元及びSDS-PAGEを行った。電気泳動後のSDS-PAGEゲルは、SilverQuest（登録商標） Silver Staining Kit（ThermoFisher）の標準プロトコルを用いて銀染色した。続いて本発明タンパク質内部の部分アミノ酸配列を明らかにするために、プロテアーゼにより限定分解して得られる断片の解析を行った。即ち、分子量70 kDaバンド付近のゲルを細断後、細片をまとめて水及びアセトニトリルで洗浄し、DTT及びヨードアセトアミドによるアルキル化処理に供した。続いてサンプルにトリプシンを加え、37℃で16時間保温して加水分解反応を行った。反応後、25 mM 重炭酸アンモニウム、5%ギ酸、及びアセトニトリルを用いてゲル片からペプチドを抽出した。最後に抽出溶液を減圧下で乾燥した。乾燥済みのサンプルを、水、アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸からなる溶媒（体積比 98:2:0.1）に溶解させ、LC-MS/MSシステム（Paradigm MS4（Michrom Bioresources社）、MS/MS： LTQ OrbiTrap XL質量分析計（ThermoFisher））にて分析した．カラムは分析用 C18 カラム L-Column Micro(化学物質評価研究機構）を、移動相A（[水]：[アセトニトリル]：[ギ酸]  =  98:2:0.1（体積比））及び移動相B（ [水]：[アセトニトリル]：[ギ酸]  =  5:95:0.1（体積比））を選択した．サンプルを添加後、アセトニトリル送液勾配（分, %B）： (0, 5) → (20, 35) → (25, 90) → (30, 90) → (30.01, 5) → (40, 5)条件で溶出、分画し、MS/MSにてペプチド分子量を測定した。得られた分子量はMascot（Matrix Science）ソフトウェアを用いてペプチド配列を決定した。その結果、部分配列WIVDEATGLRが得られた。【００３９】
実施例２  精製リコンビナントタンパク質の調製
＜スギtotal RNAの抽出＞
液体窒素中で凍結粉砕したスギ雄花（葯）2gを、Plant RNA Isolation Reagent (Invitrogen)25mLが入っている50mLチューブに添加して混和した後、室温にて５分間静置した。
4℃にて遠心(2600 x g、5分)の後、上層をデカントにより網目サイズ100μmのメッシュで濾過した。続いて回収した濾液に１／５倍量の5M NaClと３／５倍量のクロロホルムを加えた。4℃にて遠心(2600 x g、30分)の後、上層20mLを回収し、９／１０倍量のイソプロピルアルコールを加え、撹拌した。室温にて10分間静置した後、4℃にて遠心(2600 x g、30分)し、RNAを沈殿させた。上清を除去後、RNAペレットに75%エタノール10mLを加えて洗浄した。さらに4℃にて遠心(2600 x g、5分)の後、上清除去後Total RNAを室温で乾燥してから、200μLのRNase free waterに溶解させた。室温にて遠心(12000 x g、3分)後、RNase-Free DNase Set（キアゲン）を用いてDNase処理を行った。すなわちTotal RNA溶液上清180μLに15μL Buffer RDD、5μL DNase I stock solutionを加え室温にて10分間静置させて実施した。続いてRNeasy mini kit（キアゲン）を用いてtotal RNAのクリーンアップを実施した。すなわち、DNase処理後サンプル200μLに700μLのBuffer RLT、500μLのエタノールを添加後，RNeasy mini kit添付のカラムに添加し遠心(8000x g、15秒)した。
続いて、カラムに500μLのBuffer RPEを加え室温にて遠心(8000x g、15秒)し，本操作を2回繰り返した。次に、30μLのRNase free waterをカラムに加え室温にて遠心(8000x g、1分)し、得られた溶液をクリーンアップ済みtotal RNAとして回収した。【００４０】
＜スギcDNAの作製＞
得られたクリーンアップ済みtotal RNAから、Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)を用いてcDNAを合成した。Total RNA 2μgを8μLの精製水に溶解し、50μM oligo(dT)20を1μL、10mM dNTPを1μL加えてから、65℃で5分間インキュベートした。サンプルを氷上で冷却した後、10X RT bufferを2μL、25mM MgCl2を4μL、0.1M DTTを2μL、RNaseOUT(40U/μL)を1μL、SuperScript III Reverse Transcriptaseを1μL加えて混和した。50℃で50分間インキュベートした後、85℃で5分間処理して反応を停止した。続いてサンプルにRNase Hを1μL加え37℃で20分間インキュベートすることで、スギcDNAとした。【００４１】
＜クローニング＞
得られた部分配列WIVDEATGLRについて、GENETYX Ver.12.0.4ソフトウェアを用いてcDNA配列の推定を行い、ForestGEN (http://forestgen.ffpri.affrc.go.jp/ja/index.html)データベースにてホモロジー検索を行った。その結果、cluster ID: Cj5792がヒットした。さらにヒットしたCj5796の相同遺伝子であるVitis vinifera由来未同定タンパク遺伝子配列gi|157358255|emb|CAO65892.1| は、ForestGEN cluster ID: Cj822が含まれていることを見出した。加えて、Cj5792及びCj822はスギcDNAライブラリーBY882225.1、 BY900252.1とそれぞれ高い相同性を有していた。これら情報に基づき、クローニングに用いるプライマーセットをデザインし下記検討に供した。即ち、配列番号１で示すポリヌクレオチドを得るため、スギのcDNAを鋳型として、センスプライマーとしてPrimer 1(GATTTCATGRCAGCGACAG：配列番号３)及びその下流のPrimer 2(CATGRCAGCGACAGSGAT：配列番号４)、アンチセンスプライマーとしてPrimer 3(TCAAAGTTGATGCAACAATTG：配列番号５)を用いて、KOD Fx Neo(TOYOBO)によりnested PCRを行った。PCR産物をWizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)にて精製した。精製したPCR産物をTOPO TA Cloning Kit for Sequencing（Thermo Fischer）キットを用いてpCR 2.1-TOPO TA Vectorに組み込み、配列番号1で示すポリヌクレオチドを含むベクターを作製した。【００４２】
＜リコンビナントタンパク質の精製＞
配列番号２に示すアミノ酸一次配列（シグナル配列部分と推測される１−２６番目までのアミノ酸は除く）のＣ末端にFlagタグを付加したリコンビナントタンパク質を、シスメックス株式会社のProCube（登録商標）サービスにて、特開2014-195411公報の方法に従って実施した。すなわち、前述で作製したベクターから配列番号1で示すポリヌクレオチド（シグナル配列部分と推測される１−２６のアミノ酸をコードする１−７８番目までのポリヌクレオチドは除く）を、カイコ発現用シグナル配列を有し、FlagタグをC末端に融合発現するトランスファープラスミドに組換え、バキュロウイルスを作成後、カイコ蛹に接種後、7日目に得られた蛹を磨砕バッファー（20mM Trs-HCl, 100mM NaCl, Complete EDTA free 1錠/50mL, フェニルチオウレア）で磨砕した。磨砕物を超遠心後、上清を回収し、DDDDK-tagged Protein PURIFICATION GEL(MBL)を用いて添付文書に準じてアフィニティ精製することで、精製リコンビナントタンパク質を調製した。精製したリコンビナントタンパク質をSDS-PAGEにより解析した結果を図1に示す。【００４３】
実施例３  精製リコンビナントタンパク質のアレルゲン活性確認
(i) スギ花粉症患者リンパ球増殖応答
スギ花粉症患者(ImmunoCAP score≧2)より得た末梢血30mLより末梢血単核細胞を単離し、10%非働化自己血漿入りRPMI-1640培地に1.11×106cells/mLとなるよう懸濁した。調製した細胞懸濁液180μLと、20μLの本発明のリコンビナントタンパク質溶液(濃度100μg/mL)を96 穴プレートに播種した(2×105cells/well)。37℃、5% CO2条件で3日間培養した後、3H-チミジンを添加し、16時間後までの取込量を放射活性として測定することにより細胞増殖を評価した。精製リコンビナントタンパク質添加時の3H-チミジン取込量を非添加時の取込量で除した値をStimulation indexとして算出した結果を、図2に示す。一般に、臨床検査におけるリンパ球刺激試験では、Stimulation index 1.8以上が陽性基準とされている（内田重行ら、肝臓  30巻4号439-443, 1989）。この基準に則ることにより、4例中3例（75%）が陽性と判定された。以上の結果より、スギ花粉症患者において高頻度に本発明のリコンビナントタンパク質にT細胞レベルで感作されていることが示された。【００４４】
(ii) スギ花粉症患者好塩基球の活性化
アレルゲンで刺激され活性化された好塩基球では、CD203cの発現が増強することが知られている（De Weck, AL. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 146:177-189, 2008）。この原理に基づくAllergenicityキット(ベックマン・コールター)を用いて、スギ花粉症患者(ImmunoCAP score≧2)又は健常者 (ImmunoCAP score<2)血液中の好塩基球活性化を解析した。すなわち、ヘパリン採血した全血100μLに本発明のリコンビナントタンパク質溶液20μLを最終濃度 3 μg/mLとなるように加え、陰性対照サンプルにはPBS(-)20μLを加えた。続いて全てのサンプルにCD3-PC7，CRTH2-FITC及びCD203c-PEを含む抗体カクテル20μLを加え、37℃で15分間インキュベートした。反応停止液100μLと溶血固定液2mLを加え、室温で10分間反応させた。遠心(200 x g、5分)後、上清を除去し、リン酸緩衝液(PBS) 3mLを加えて再び遠心した。上清を除去後、細胞を0.1%ホルムアルデヒド加PBSに懸濁し、フローサイトメーター(FACScanto、BD Biosciences)により測定した。得られたデータについて、CD3-PC7陰性かつCRTH2-FITC陽性であることを指標として血球の中の好塩基球を選別し、CD203cの発現強度を解析した。データは、本発明タンパク質溶液刺激サンプルにおけるCD203c陽性好塩基球割合（％）から各陰性対照サンプルにおけるCD203c陽性好塩基球割合（％）を示し、健常者における最高値0.8%の2倍にあたる1.6以上の値を陽性と判定した。その結果、図3で示した通り健常者2例中2例にて、リコンビナントタンパク質添加時におけるCD203cの発現増強が認められなかった一方、スギ花粉症患者において13例中7例（54％）でCD203cの発現増強が認められ、その差は有意であった（p<0.05, Welch's t test）。従って、スギ花粉症患者は頻度よく本発明のリコンビナントタンパク質に結合するIgEを有しており、さらに本発明のリコンビナントタンパク質にアレルゲン活性があることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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