(57)【要約】  本発明のペプチド断片の調製方法では、多孔質体の細孔内にＦｃドメインが固定された抗体と、微粒子の表面に固定されたプロテアーゼとを接触させる。これにより、抗体のＦａｂドメインをプロテアーゼにより位置選択的に切断し、Ｆａｂドメイン由来のペプチド断片を高濃度で含む試料が得られる。本発明に用いられるプロテアーゼは、キモトリプシンが混入している動物由来のトリプシンであり、キモトリプシンは不活性化されおり、トリプシンはリジン残基のアミノ基が化学修飾されている。
2018025346.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質体の細孔内にＦｃドメインが固定された抗体と、微粒子の表面に固定されたプロテアーゼとを接触させることにより、前記抗体のＦａｂドメインを前記プロテアーゼにより位置選択的に切断する、ペプチド断片の調製方法であって、
前記プロテアーゼは、キモトリプシンが混入している動物由来のトリプシンであり、
前記キモトリプシンは不活性化されており、前記トリプシンはリジン残基のアミノ基が化学修飾されている、ペプチド断片の調製方法。
【請求項２】
前記キモトリプシンは、ヒスチジン残基にＮ‐トシル‐Ｌ‐フェニルアラニンクロロメチルケトンが結合することにより不活性化されている、請求項１に記載のペプチド断片の調製方法。
【請求項３】
前記トリプシンは、リジン残基のアミノ基がジメチル化されている、請求項１に記載のペプチド断片の調製方法。
【請求項４】
前記微粒子の平均粒子径が、前記多孔質体の平均細孔径よりも大きい、請求項１に記載のペプチド断片の調製方法。
【請求項５】
前記多孔質体の平均細孔径が３０〜１５０ｎｍであり、前記微粒子の平均粒子径が１００ｎｍ以上である、請求項１に記載のペプチド断片の調製方法。
【請求項６】
前記多孔質体は、表面がプロテインＡまたはプロテインＧにより被覆されている、請求項１に記載のペプチド断片の調製方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法に用いるためのペプチド断片調製用キットであって、
表面にプロテアーゼが固定された微粒子を含み、
前記プロテアーゼは、キモトリプシンが混入している動物由来のトリプシンであり、
前記キモトリプシンは不活性化されており、前記トリプシンはリジン残基のアミノ基が還元アルキル化されている、ペプチド断片調製用キット。
【請求項８】
さらに、細孔内に抗体のＦｃドメインを選択的に固定可能な多孔質体を含む、請求項７に記載のペプチド断片調製用キット。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法に用いるためのプロテアーゼを調製する方法であって、
動物由来のトリプシンを、セリンプロテアーゼ阻害剤と反応させることにより、トリプシンに混入しているキモトリプシンを不活性化するステップ；および
アルキル化剤および還元剤を用いた還元アルキル化により、トリプシンのリジン残基のアミノ基をアルキル化するステップを有し、
前記還元アルキル化に用いられるアルキル化剤の合計量が、トリプシンの２００モル倍以上である、プロテアーゼの調製方法。
【請求項１０】
前記セリンプロテアーゼ阻害剤が、Ｎ‐トシル‐Ｌ‐フェニルアラニンクロロメチルケトンである、請求項９に記載のプロテアーゼの調製方法。
【請求項１１】
前記アルキル化剤がホルムアルデヒドである、請求項９に記載のプロテアーゼの調製方法。
【請求項１２】
キモトリプシンの不活性化およびトリプシンのリジン残基のアミノ基のアルキル化を実施後に、アフィニティークロマトグラフィーによる精製が行われる、請求項９に記載のプロテアーゼの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼを用いて抗体を位置選択的に切断して、ペプチド断片を調製する方法、およびそれに用いられるプロテアーゼの調整方法、ならびにペプチド断片調製用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬の需要が急速に拡大しており、臨床現場において、血液中の抗体濃度を定量することの重要性が高まっている。従前は、抗体医薬を投与後の血液中濃度を正確に測定することは重要視されていなかったが、トラスツズマブ（商品名：Herceptin）の胃がん適用拡大に伴う臨床試験において、その血液中濃度と生存期間に有意差が見出されて以降、抗体医薬の臨床試験等においても、抗体の血中濃度を測定することが必須となりつつある。例えば、薬物動態確認等の品質管理や、後発医薬品の臨床試験等における先発医薬品との同一性確認等においても、抗体医薬の同定や、その血液中濃度の定量が要求されるようになっている。【０００３】
抗体は、重鎖からなる１つのFc (Fragment, crystallizable)ドメインと、重鎖および軽鎖からなる２つのFab (Fragment, antigen binding)ドメインを有する。Fabドメインのうち、Ｎ末端側の部分は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化がみられる。この領域は、可変領域（Ｖ領域）と称され、抗体の特異性（すなわち抗原への特異的結合性）は、Ｖ領域のアミノ酸配列の組み合わせにより決定される。軽鎖および重鎖のそれぞれは、Ｖ領域内に、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。ＣＤＲは抗体を特徴付ける領域であり、抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を特定することにより、抗体を同定できる。【０００４】
プロテオミクスの発展に伴い、質量分析により、タンパク質を網羅的に検出・定量可能な技術が開発されており、近年では、抗体等の巨大生体分子の解析も可能となっている。質量分析では、測定対象分子をイオン化する必要があり、抗体等の巨大生体分子をそのまま質量分析で分析することは困難な場合が多い。そのため、プロテアーゼ消化によりタンパク質を切断（断片化）し、断片化されたペプチドの中から、分析対象のタンパク質に特異的なアミノ酸配列を有するペプチド断片を選択して、質量分析装置により検出・定量する手法が採用されている。【０００５】
抗体のＣＤＲ由来のペプチド断片は、抗体に特異的なアミノ酸配列を有するため、ＣＤＲ由来のペプチド断片を質量分析により検出・定量することにより、特定の抗体の定量が可能となる。抗体からＣＤＲ由来のペプチド断片を選択的に生成させる方法として、多孔質体の細孔内に固定された抗体と、ナノ粒子表面に固定されたプロテアーゼとの反応により、抗体を位置選択的に切断してペプチド断片を生成させる手法（nano-Surface and Molecular-Orientation Limited proteolysis; nSMOL法）が開発されている（例えば、特許文献１）。【０００６】
nSMOL法では、多孔質体の細孔内に抗体のＦｃドメインを結合させることにより、Ｆｃドメインへのプロテアーゼのアクセスを制限し、ＣＤＲを含むＦａｂドメインを位置選択的にプロテアーゼと反応させる。そのため、プロテアーゼとの反応後の試料中には、抗体のＣＤＲ由来のペプチド断片が、全生成ペプチドに対して高濃度で含まれており、高精度の定量分析が可能となる。【０００７】
種々の抗体医薬について、nSMOL法により高精度の定量分析が可能であることが報告されている。具体的には、トラスツズマブ（非特許文献１および非特許文献２）、ベバシズマブ（非特許文献１および非特許文献３）、およびニボルマブ（非特許文献４）等のヒト化抗体、ならびにセツキシマブ（非特許文献５）、およびリツキシマブ（非特許文献６）等キメラ抗体の血中濃度を、nSMOL法により定量した例が報告されている。【０００８】
上記の特許文献および非特許文献では、いずれも抗体を断片化するためのプロテアーゼとしてトリプシンが用いられている。トリプシンは主に膵臓で産生される分子量約２３ｋＤａのセリンプロテアーゼであり、塩基性アミノ酸（リジンおよびアルギニン）のＣ末端のカルボキシ基を加水分解により切断する。トリプシンは基質特異性が極めて高いため、質量分析用のペプチド断片を産生するためのプロテアーゼとしての有用性が高く、多くのタンパク質の構造解析に用いられている。【０００９】
動物の膵臓から抽出されるトリプシンには、キモトリプシンが混入している。キモトリプシンの基質特異性は、トリプシンのそれとは異なり、主に芳香族アミノ酸のＣ末端のカルボキシ基を加水分解により切断する。また、天然のトリプシンは自己消化により擬似トリプシンを生成し、キモトリプシン様の活性を含む広い特異性を示す場合がある。そのため、プロテアーゼとして動物由来のトリプシンを用いると、混入しているキモトリプシンやトリプシンの自己消化産物の影響により、基質特異性が失われ、目的外のペプチド断片が生成するために、分析精度が低下することが問題となる。【００１０】
精製により動物由来のトリプシンからキモトリプシンを完全に除去することは困難である。そのため、動物由来のトリプシンは主に細胞培養における接着細胞の剥離に用いられている。動物由来のトリプシンを質量分析用のプロテアーゼとして用いるために、キモトリプシンの不活性化や、トリプシンの自己消化抑制により、トリプシンの基質特異性を向上する方法が知られている。例えば、Ｎ‐トシル‐Ｌ‐フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）で処理することにより、トリプシンに混入しているキモトリプシンは不活性化する。【００１１】
これらの化学処理は、動物由来トリプシンの基質特異性の向上に有用であるが、酵素活性の大幅な低下や、ロット間の活性のバラツキが生じやすい。そのため、高精度の定量性が求められる質量分析用試料の調製には、主に、質量分析グレードの遺伝子組換型（リコンビナント）トリプシンが用いられている。リコンビナントトリプシンは、動物由来の夾雑物を含有しないため、高い基質特異性および酵素活性を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO2015/033479号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Iwamoto et. al, Analyst., 2014, 139(3), 576-80.
【非特許文献２】Iwamoto et. al, Anal. Methods, 2015, 21, 9177-9183.
【非特許文献３】Iwamoto et. al, Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 2016, 31, 46-50.
【非特許文献４】Iwamoto et. al, J. Chromatogr. B: Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 2016, 1023-1024, 9-16.
【非特許文献５】Iwamoto et. al, Bioanalysis, 2016, 8(10), 1009-1020.
【非特許文献６】Iwamoto et. al, Biol. Pharm. Bull., 2016, 39(7), 1187-1194.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記の様に、リコンビナントトリプシンは高い基質特異性を示し、抗体を位置選択的に切断するnSMOL法においても、その有用性が確認されている。しかし、リコンビナントトリプシンは酵母で発現させるためその産生量が少ない上に、アフィニティークロマトグラフィーによる精製後にゲル濾過クロマトグラフィーによる精製を必要とするため、精製効率が悪い。そのため、リコンビナントトリプシンは、十分な供給量の確保が困難である上に、非常に高価である。したがって、リコンビナントトリプシンは、タンパク質の構造解析等の研究目的での利用が大半であり、産業的な利用は制限されている。本発明は、十分な供給量を確保可能でありかつ安価な動物由来のトリプシンを用いて、抗体の血中濃度の定量等を行うための質量分析用の試料調製方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、多孔質体の細孔内にＦｃドメインが固定された抗体と、微粒子の表面に固定されたプロテアーゼとを接触させることにより、抗体のＦａｂドメインをプロテアーゼにより位置選択的に切断する、ペプチド断片の調製方法に関する。さらに、本発明は、上記方法に用いられるペプチド断片調製用キットに関する。本発明のキットは、表面にプロテアーゼが固定された微粒子を含む。【００１６】
微粒子の表面に固定されたプロテアーゼは、キモトリプシンが混入している動物由来のトリプシンであり、キモトリプシンは不活性化されている。微粒子の表面に固定されたトリプシンは、リジン残基のアミノ基が化学修飾されている。【００１７】
キモトリプシンは、例えば、活性中心のヒスチジン残基にＮ‐トシル‐Ｌ‐フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）が結合することにより、不可逆的に不活性化される。トリプシンのリジン残基のアミノ基は、例えば還元アルキル化されている。【００１８】
多孔質体は、細孔内に抗体のＦｃドメインを選択的に固定可能であることが好ましく、例えば、プロテインＡやプロテインＧにより被覆された多孔質体が用いられる。【００１９】
上記のプロテアーゼは、動物由来のトリプシンの改変により調製できる。トリプシンの改変は、例えばセリンプロテアーゼ阻害剤による処理および還元アルキル化処理を施すことにより行われる。キモトリプシンの不活性化および還元アルキル化を行った後のトリプシンは、アフィニティークロマトグラフィーにより精製することが好ましい。【００２０】
動物由来トリプシンをセリンプロテアーゼ阻害剤と反応させることにより、キモトリプシンが不活性化される。セリンプロテアーゼ阻害剤としては、トリプシンを失活させることなくキモトリプシンを選択的に失活させるものが好ましく、前述のＴＰＣＫ等が好ましく用いられる。【００２１】
アルキル化剤および還元剤を用いた還元アルキル化により、トリプシンのリジン残基のアミノ基がアルキル化され、トリプシンの自己消化が抑制される。還元アルキル化に用いられるアルキル化剤の合計量は、トリプシンの２００モル倍以上が好ましい。還元アルキル化に用いられる還元剤の合計量も、トリプシンの２００モル倍以上が好ましい。アルキル化剤としてはアルデヒドが好ましい。アルキル化剤としてホルムアルデヒドを用いることにより、トリプシンのリジン残基のアミノ基がメチル化される。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に用いられる改変トリプシンは動物由来であるため、質量分析用として広く用いられているリコンビナントトリプシンに比べて、安価でありかつ供給量の確保が容易である。また、微粒子の表面に改変トリプシンを固定して、抗体の位置選択的断片化を行った場合に、リコンビナントトリプシンと同等または同等以上の基質特異性および酵素活性を示す。そのため、本発明によれば、血液等の生体試料中の抗体濃度の定量を、安価かつ簡便に実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】抗体をプロテアーゼにより位置選択的に切断する原理を説明するための概念図である。
【図２】クロマトグラフィーの各フラクションのタンパク質濃度および酵素活性の測定結果である。
【図３】基質の特異性断片の生成量を表すグラフである。
【図４Ａ】実施例の改変酵素の化学的適合性の評価結果を表すグラフである。
【図４Ｂ】実施例の改変酵素の化学的適合性の評価結果を表すグラフである。
【図４Ｃ】実施例の改変酵素の化学的適合性の評価結果を表すグラフである。
【図４Ｄ】実施例の改変酵素の化学的適合性の評価結果を表すグラフである。
【図４Ｅ】実施例の改変酵素の化学的適合性の評価結果を表すグラフである。
【図５】アルブミン、ヘモグロビンおよびラクトグロブリンのトリプシン消化による基質特異性断片の生成量を表すグラフである。
【図６Ａ】血漿中のベバシズマブ濃度と、位置選択的断片化により生成したペプチド断片の質量分析におけるピーク面積の関係をプロットしたグラフである。
【図６Ｂ】血漿中のベバシズマブ濃度と、位置選択的断片化により生成したペプチド断片の質量分析におけるピーク面積の関係をプロットしたグラフである。
【図７】血漿中のトラスツズマブ濃度と、位置選択的断片化により生成したペプチド断片の質量分析におけるピーク面積の関係をプロットしたグラフである。
【図８】血漿中のニボルマブ濃度と、位置選択的断片化により生成したペプチド断片の質量分析におけるピーク面積の関係をプロットしたグラフである。
【図９】トリプシンの改変時のアルキル化剤の使用量と酵素活性および抗体のＣＤＲ由来断片の生成量との関係を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の方法では、多孔質体の細孔内に固定された基質と微粒子の表面に固定されたプロテアーゼとを接触させることにより、基質がプロテアーゼにより位置選択的に切断され、ペプチド断片が得られる。図１は、基質が位置選択的に切断される原理を説明するための概念図である。微粒子１０（平均粒子径Ｄ１）の表面には、プロテアーゼ１５が固定されている。多孔質体２０は、多数の細孔２９（平均細孔径Ｄ２）を有し、細孔内に基質２５が固定されている。
【００２５】
［基質］
基質２５は抗体であり、抗体のＦｃドメインが多孔質体２０の細孔２９内に固定されていることが好ましい。抗体のＦｃドメインが多孔質体に固定されることにより、細孔内での抗体の配向が制御され、プロテアーゼによるＦａｂドメインの位置選択的な切断が可能となる。抗体の種類は特に制限されないが、モノクローナル抗体が好ましく、中でも生体試料（例えば血液）中での濃度の定量を必要とする抗体（例えば、分子標的治療薬）が好ましい。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体等であってもよい。
【００２６】
［多孔質体］
多孔質体２０は、多数の細孔２９を有するものであれば、その材料は特に限定されず、活性炭、多孔質膜、多孔質樹脂ビーズ、金属粒子等が用いられる。図１では、半球形状の細孔が図示されているが、細孔の形状は特に限定されない。多孔質膜のように、多孔質体を貫通する細孔が形成されたものを用いることもできる。
【００２７】
多孔質体は、抗体と特異的に結合可能であることが好ましく、抗体のＦｃドメインと部位特異的に結合可能であることが特に好ましい。抗体との特異的な結合を実現するために、多孔質体の細孔内の表面には、抗体と特異的に結合可能なリンカー２１が固定されていることが好ましい。抗体のＦｃドメインと部位特異的に結合可能なリンカーとしては、プロテインＡやプロテインＧが挙げられる。すなわち、多孔質体２０は、プロテインＡやプロテインＧ等の、抗体と特異的に結合可能な分子により被覆されていることが好ましい。特に、プロテインＡは、Ｆｃドメインとの結合の部位特異性が高い。そのため、プロテアーゼ消化の位置選択性を高めるためには、プロテインＡで被覆された多孔質体を用いることが好ましい。
【００２８】
多孔質体２０の細孔２９の大きさは特に限定されない。多孔質体２０の平均細孔径Ｄ２が、微粒子１０の平均粒子径Ｄ１よりも小さい場合、微粒子１０は細孔２９の奥深くにはアクセスできない。これに伴って、微粒子１０表面に固定されたプロテアーゼ１５も、細孔２９の奥深くにはアクセスできない。
【００２９】
図１において、細孔２９付近の点線は、プロテアーゼ１５がアクセスできる領域の境界を表している。このように、細孔内の表面に結合している抗体のＦｃドメインへのプロテアーゼのアクセスが制限されることにより、細孔との結合部位から離れて位置するＦａｂドメインへのプロテアーゼのアクセス確率が相対的に高められる。これにより、抗体のＦａｂドメインを位置選択的にプロテアーゼにより切断して、ペプチド断片を得ることができる。
【００３０】
Ｆｃドメインを細孔内に固定し、Ｆａｂドメインを位置選択的にプロテアーゼ消化するためには、多孔質体の平均細孔径は、３０ｎｍ〜１５０ｎｍが好ましく、４０ｎｍ〜１２０ｎｍがより好ましく、５０ｎｍ〜１００ｎｍがさらに好ましい。
【００３１】
［微粒子］
微粒子１０は、その表面にプロテアーゼ１５を固定して、多孔質体２０の細孔２９内に固定された抗体２５へのプロテアーゼのアクセスを制御する。微粒子１０は、多孔質体２０の細孔２９の奥深くまで入り込まないように、その平均粒子径Ｄ１が、多孔質体２０の平均細孔径Ｄ２よりも大きいことが好ましい。微粒子１０の形状は特に限定されないが、多孔質体２０の細孔２９へのプロテアーゼのアクセス可能な領域を均一化する観点から、球状の微粒子が好ましい。また、微粒子１０は、平均粒子径が均一であることが好ましい。
【００３２】
微粒子１０の平均粒子径Ｄ１は、多孔質体２０の平均細孔径Ｄ２の１．２倍以上がより好ましく、１．５倍以上がさらに好ましく、１．８倍以上が特に好ましい。微粒子１０の平均粒子径Ｄ１は１００ｎｍ以上が好ましく、１５０ｎｍ以上がより好ましい。微粒子１０の平均粒子径Ｄ１の上限は特に限定されないが、プロテアーゼによる消化効率を高める観点から、１μｍ以下が好ましく、５００ｎｍ以下がより好ましい。
【００３３】
微粒子１０は、プロテアーゼを表面に固定できるものであれば、その材質は特に限定されず、金属や樹脂等が適宜に用いられる。微粒子１０は、表面への非特異的なタンパク質の吸着が抑制され、プロテアーゼを選択的に固定できるものが好ましく、例えば、プロテアーゼと特異的に結合するスペーサ１１で修飾された微粒子が好適に用いられる。スペーサは、プロテアーゼと結合可能であり、かつプロテアーゼを失活させないものが好ましい。
【００３４】
微粒子１０の表面に固定されたプロテアーゼ１５のアクセス範囲を制御する観点から、スペーサ１１は分子径が小さいものが好ましい。スペーサの分子径は、５ｎｍ以下が好ましく、３ｎｍ以下がより好ましく、２ｎｍ以下がさらに好ましい。プロテアーゼを固定できるスペーサ１１は、非タンパク質が好ましく、アミノ基、アミド基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ビオチン、アビジン、キレート等の官能基を有する分子が好ましい。
【００３５】
［プロテアーゼ］
本発明においては、プロテアーゼとしてトリプシンが用いられる。トリプシンは分子径が小さく、かつ活性部位が分子の内部に存在している。そのため、微粒子表面に固定されたトリプシンは、活性部位が基質としての抗体にアクセスできる領域が制限され、抗体の切断部位の選択性が高められる。
【００３６】
プロテアーゼとして用いられるトリプシンは、動物由来のトリプシンであり、例えば、ブタやウシの膵臓由来である。遺伝子組み換えによるトリプシンは動物由来の夾雑物を含まないのに対して、動物の膵臓由来のトリプシンには、不可避的にキモトリプシンが混入している。本発明において、プロテアーゼとして用いられるトリプシンに混入しているキモトリプシンは、不活性化されている。
【００３７】
キモトリプシンは、各種のセリンプロテアーゼ阻害剤により不活性化できる。キモトリプシンの不活性化に使用可能なセリンプロテアーゼ阻害剤としては、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、フッ化４‐（２‐アミノエチル）ベンゼンスルホニル（ＡＥＢＳＦ）、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、ベンズアミジン、キモスタチン、Ｎ‐トシル‐Ｌ‐リシルクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）およびＮ‐トシル‐Ｌ‐フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）等が挙げられる。これらの中でも、トリプシンの酵素活性を維持してキモトリプシンを選択的かつ不可逆的に不活性化できることから、ＴＰＣＫが好ましい。
【００３８】
ＴＰＣＫは、キモトリプシンの活性中心に含まれるヒスチジン残基に不可逆的に結合するため、ＴＰＣＫ処理により、トリプシンの活性を維持したままキモトリプシンを不活性化できる。キモトリプシンが混入している動物由来のトリプシンを、溶液中でＴＰＣＫと混合することにより、キモトリプシンが不活性化される。ＴＰＣＫ処理は、例えば４℃程度で１時間〜５時間程度行えばよい。
【００３９】
本発明に用いられるプロテアーゼに含まれるトリプシンは、リジン残基のアミノ基が化学修飾されている。トリプシンのリジン残基に含まれるε‐アミノ基が化学修飾されることにより、自己消化が抑制され、トリプシンの酵素活性および基質特異性が高められる。アミノ基の化学修飾としては、アルキル化が好ましい。例えば、還元剤の存在下でのアルデヒドとの反応により、リジン残基のアミノ基が還元アルキル化される。還元アルキル化に用いられる還元剤は、水溶液中で安定であり、還元アルキル化の最初の段階で形成されるシッフ塩基を選択的に還元できるものが好ましい。好ましい還元剤としては、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、およびピリジンボラン等が挙げられる。
【００４０】
リジン残基の量に対して過剰量のアルデヒドおよび還元剤を存在させることにより、リジン残基のアミノ基がジアルキル化される。例えば、ホルムアルデヒドおよび還元剤を過剰に存在させることにより、リジン残基のアミノ基が還元ジメチル化される。トリプシンの自己消化を抑制して基質特異性を高めるために、アルキル化剤（アルデヒド）の使用量（合計量）は、トリプシン量の２００モル倍以上が好ましく、６００モル倍以上がより好ましく、１０００モル倍以上がさらに好ましい。還元剤の使用量は、トリプシン量の２００モル倍以上が好ましく、５００モル倍以上がより好ましく、８００モル倍以上がさらに好ましい。一方、還元剤およびアルキル化剤の使用量が過度に多いと、酵素活性の低下や、精製時の回収率の低下を招く場合がある。そのため、還元剤およびアルキル化剤の使用量は、トリプシン量の２００００モル倍以下が好ましく、１００００モル倍以下がより好ましく、５０００モル倍以下がさらに好ましい。還元剤およびアルキル化剤は、全量を一度に添加してもよく、複数回に分けて添加してもよい。
【００４１】
キモトリプシンの不活性化およびトリプシンのリジン残基のアミノ基の修飾を行った後、精製を行うことが好ましい。精製方法は特に限定されないが、トリプシンを可逆的に吸着可能なアフィニティーカラムを用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより精製を行うことが好ましい。アフィニティーカラムの担体としては、ベンズアミジン等のセリンプロテアーゼ阻害剤をカップリングしたセファロースビーズ等が用いられる。溶出液から、酵素活性の高いフラクションを選択することにより、基質特異性および活性の高いトリプシンが得られる。
【００４２】
動物由来のトリプシンを用い、ＴＰＣＫ処理等によるキモトリプシンの不活性化および還元ジメチル化等の修飾を行い、クロマトグラフィーにより精製を行った改変トリプシンは、後述の実施例に示すように、リコンビナントトリプシンと同等またはそれ以上の基質特異性および酵素活性を示す。また、改変トリプシンは、リコンビナントトリプシンに比べて供給量増加等への対応が容易であり、かつ安価である。
【００４３】
本発明においては、動物由来のトリプシンを改変したものに加えて、他のプロテアーゼを併用してもよい。例えば、リジン残基のＣ末端のカルボキシ基を選択的に加水分解するリジルエンドペプチダーゼを併用してもよい。トリプシン以外のプロテアーゼを用いる場合においても、全プロテアーゼ中のトリプシンの量を９０％以上とすることが好ましい。
【００４４】
［試料調製方法］
本発明のペプチド断片の調製方法では、血液等の試料中に含まれる抗体を多孔質体に固定した後、抗体が固定された多孔質体とプロテアーゼが固定された微粒子とを接触させることにより、抗体が位置選択的にプロテアーゼにより切断され、ペプチド断片が産生される。
【００４５】
多孔質体の細孔内に基質としての抗体を固定する方法は特に限定されない。プロテインＡやプロテインＧ等の抗体と特異的に結合可能な分子により多孔質体が被覆されている場合は、多孔質体の懸濁液と抗体を含む溶液とを混合することにより、多孔質体の細孔内に抗体を容易に固定できる。
【００４６】
抗体を含む溶液としては、血液等の生体由来試料が挙げられる。生体由来試料には、抗体以外に、多種多様な夾雑物が含まれている。多孔質体と検体としての生体由来試料とを混合して、抗体が多孔質体に選択的に固定された状態で洗浄を行うことにより、多孔質体に非選択的に付着した夾雑成分を除去する。夾雑成分が凝集しやすく強固に付着している場合は、界面活性剤等を用いて、夾雑成分を変性させ、液体中に溶解させることが好ましい。界面活性剤による処理後、界面活性剤を含まない液体を用いて洗浄を行い、多孔質体に付着した界面活性剤を除去することが好ましい。
【００４７】
プロテアーゼを微粒子の表面に固定する方法は特に限定されず、プロテアーゼと微粒子（あるいは微粒子表面を修飾するスペーサ分子）の特性等に応じて適宜の方法を採用できる。例えば、スペーサ修飾された微粒子の表面にトリプシンを固定する場合は、微粒子の懸濁液とトリプシンを含む溶液とを混合することにより、微粒子表面にプロテアーゼを固定できる。微粒子の表面にプロテアーゼを固定後に、微粒子表面のプロテアーゼと未結合の活性部分を化学修飾等により不活性化させてもよい。
【００４８】
プロテアーゼは予め微粒子に固定された状態で提供されてもよく、使用直前に微粒子の表面にプロテアーゼを固定して用いてもよい。プロテアーゼが固定された微粒子は、懸濁液として提供されることが好ましい。
【００４９】
上記の改変トリプシンが固定された微粒子は、ペプチド断片調製用キットの一部として提供されてもよい。トリプシンは、微粒子表面に固定された状態でも活性を保持し得るため、プロテアーゼが微粒子表面に固定された状態でキットの構成要素として提供されれば、ペプチド断片調製の操作を簡略化できる。ペプチド断片調製用キットは、改変トリプシンが固定された微粒子に加えて、細孔内に抗体のＦｃドメインを選択的に固定可能な多孔質体を含んでいてもよい。細孔内に抗体のＦｃドメインを選択的に固定可能な多孔質体としては、前述のようにプロテインＡやプロテインＧ等により被覆されたものが好ましい。ペプチド断片調製用キットは、さらに、多孔質体への検体中の抗体の固定や、反応等に用いるための容器や溶液等を含んでいてもよい。
【００５０】
抗体が固定された多孔質体とプロテアーゼが固定された微粒子とを液体中で混合することにより、抗体の位置選択的なプロテアーゼ消化が行われる。反応条件は特に限定されず、一般的なプロテアーゼ消化と同様の条件を適宜に採用できる。例えば、トリプシンの至適ｐＨ近傍（ｐＨ７〜９程度）に調整された緩衝溶液中で、通常３５〜６０℃程度の温度で、３時間〜３０時間程度インキュベートすることが好ましい。
【００５１】
プロテアーゼとの反応により産生したペプチド断片は、溶液中に遊離する。多孔質体との結合部位である抗体のＦｃドメインへのプロテアーゼのアクセスが制限されているため、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＦａｂドメインが、プロテアーゼにより位置選択的に切断される。そのため、液体中に遊離するペプチド断片は、抗体の同定に重要な相補性決定領域のアミノ酸配列を含むペプチド断片を高濃度で含んでいる。
【００５２】
［質量分析による抗体濃度の定量］
上記で得られたペプチド断片を含む試料を、クロマトグラフィーや質量分析により分析することにより、抗体の同定や定量を行い得る。本発明では、抗体のＦａｂドメインが位置選択的にトリプシンにより切断されるため、試料中に含まれるペプチド断片の種類が少なく、相補性決定領域のアミノ酸配列を含むペプチド断片が高濃度で含まれている。そのため、質量分析等による分析条件の設定を容易になし得る。
【００５３】
ペプチド断片の分離をより確実として、分析精度を高める等の目的で、質量分析に供する前の試料を、液体クロマトグラフ（ＬＣ）や、固相抽出（ＳＰＥ）等により、分離・濃縮してもよい。
【００５４】
質量分析結果に基づいて抗体の同定を行う場合は、既存のデータベースを用いてもよい。抗体濃度の定量には、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた多重反応モニタリング（Multiple Reaction Monitoring; MRM）が適している。血液等の検体中の抗体の含有量（濃度）を定量する場合、ペプチド断片由来のイオンのピーク面積やピーク強度基づいて、抗体の量を算出できる。例えば、予め求められた検量線（較正曲線）とピーク面積との関連付けや、試料中に添加された内部標準由来のピーク面積と試料由来のピーク面積との関連付け等によって、試料中のペプチド断片の濃度が算出され、これに基づいて、血液等の検体中の抗体の量や濃度が算出される。
【００５５】
上記の改変トリプシンは、質量分析に広く用いられているリコンビナントトリプシンと同等の優れた基質特異性を有し、かつ抗体の切断部位の位置選択性にも優れている。そのため、定量分析の再現性が高く、血液等の検体中の抗体医薬濃度の定量にも使用できる。
【００５６】
本発明の方法は、操作が簡便で、かつ再現性や定量性を確保できるとともに、自動化もなし得る。さらに、試料調製に用いられるプロテアーゼの供給が安定しており、かつ安価であるため産業的な利用価値も高い。本発明の方法は、薬物動態の解析、抗原抗体反応を用いた相互作用の解析、各種のインタラクトーム解析、免疫沈降タンパク質の同定等の基礎研究にも適用できる。その他、抗体医薬等の生体分子医薬の配列解析、品質保証、後発医薬品の同一性確認等への応用も期待できる。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。以下において、％の記載は、特に断りがない限り重量％を表す。【００５８】
［トリプシンの改変およびクロマトグラフィー精製］
（ＴＰＣＫ処理）
ブタ膵臓トリプシン（SIGMA ALDRICH, T0303）を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．４）に溶解し、１ｍｇ／ｍＬ（約４０μＭ）の溶液を調製した。この溶液に、Ｎ‐トシル‐Ｌ‐フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）のＤＭＳＯ溶液（４０ｍＭ）を、ＴＰＣＫ濃度が１００μＭとなるように添加し、４℃で２時間穏やかに撹拌した。【００５９】
（還元ジメチル化処理）
ＴＰＣＫ処理後のトリプシン溶液に、１Ｍジメチルアミンボランおよび１Ｍホルムアルデヒドを、トリプシン１ｍｇに対して、ジメチルアミンボランが２０μｍｏｌ、ホルムアルデヒドが４０μｍｏｌとなるように添加し、４℃で１．５時間穏やかに撹拌した。その後、さらに、ジメチルアミンボランおよびホルムアルデヒドを上記と同量添加し、４℃で１．５時間穏やかに撹拌した。その後、トリプシン１ｍｇに対して１０μｍｏｌのジメチルアミンボランを添加して、４℃で終夜穏やかに撹拌した。この処理においては、トリプシンに対して約２０００モル倍のホルムアルデヒドおよび約１２５０モル倍のジメチルアミンボラン用いられた。【００６０】
（クロマトグラフィー精製）
容量２ｍＬのベンズアミジンセファロースカラム（ＧＥヘルスケア  HiTrap Benzamidine FFカラム，容量１ｍＬのカラムを２本連結）に、カラム容量の１０倍の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．４）を通して平衡化した後、上記の処理済のトリプシン溶液（トリプシン量：２５ｍｇ）を通してカラムに固定した。１５０ｍＭの塩化ナトリウム濃度を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．４）をカラム容量の１０倍量通してカラムを洗浄した後、カラム容量の４倍の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）をカラムに通して脱塩を行った。その後、１０ｍＭ塩酸１０ｍＬで溶出を行い、最初の０．５ｍＬをフラクションＮｏ．１とし、以降は１ｍＬを１フラクションとして溶出液（フラクションＮｏ．２〜１０）を回収した。【００６１】
（タンパク質濃度の定量）
上記の各フラクションから５０μＬを採取し、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、Micro BCATM Protein Assay Kitによりタンパク質濃度を定量した。【００６２】
（トリプシンの酵素活性）
５０ｍＭトリス塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．０）に、基質としてＮ‐α‐ベンゾイル‐ＤＬ‐アルギニン‐ｐ‐ニトロアニリド塩酸塩（ＢＡＮＡ）を濃度が５０μＬ／ｍＬとなるように添加した。この溶液に、各フラクションの溶出液を、トリプシン濃度が１０μＬ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で穏やかに攪拌しながら、一定時間ごとに４０５ｎｍの吸光度を測定して、その経時変化（基質の分解によるｐ‐ニトロアニリンの生成速度）からトリプシンの活性を算出した。【００６３】
（特異性断片の生成量）
基質としてアルブミン（Ａｌｂ）、ヘモグロビン（Ｈｂ）、およびラクトグロブリン（Ｌａｃ）を用い、上記のフラクションＮｏ．１〜１０を基質に添加して、３７℃で終夜消化反応を行った。消化反応後の溶液のＭＳ／ＭＳ分析を行い、データベース（Mascot server）解析により、それぞれの基質の特異性断片の生成量を求めた。酵素として、ＴＰＣＫ処理のみを行い還元ジメチル化を行っていないトリプシン、およびリコンビナントトリプシンの市販品（プロメガ Trypsin Gold）を用い、上記と同様に、基質の特異性断片の生成量を求めた。【００６４】
（評価結果および回収フラクションの決定）
フラクションＮｏ．１〜１０のタンパク質濃度および酵素活性の測定結果を図２に示す。フラクションＮｏ．１〜１０、ならびにリコンビナントトリプシン（ｒｅｃ）およびＴＰＣＫ処理のみを行ったトリプシン（ＴＰＣＫ）を用いて基質（Ａｌｂ，ＨｂおよびＬａｃ）の消化を行った際の特異性断片の生成量を図３に示す。【００６５】
図２に示すように、フラクションＮｏ．３〜７はタンパク質濃度が高く、略同等の酵素活性を示していた。また、図３に示すように、フラクションＮｏ．３〜８は、基質特異性断片の生成量が、市販のリコンビナントトリプシンを用いた場合と同等であった。これらの結果に基づき、フラクションＮｏ．３〜７を回収フラクションと決定した。以降では、この回収フラクション（以降「改変トリプシン」と記載する場合がある。）を用いて、評価を実施した。【００６６】
［酵素活性の評価］
（リコンビナントトリプシンとの酵素活性の比較）
Ｎ‐α‐ベンゾイル‐ＤＬ‐アルギニン‐ｐ‐ニトロアニリド塩酸塩を基質として、改変トリプシンおよび市販のリコンビナントトリプシンの酵素活性を測定したところ、改変トリプシンはリコンビナントトリプシンの約２倍の酵素活性を示した。【００６７】
（化学的適合性）
トリス塩酸緩衝溶液のｐＨを７．０〜９．０の範囲で変化させ、反応温度３７℃および５０℃で改変トリプシンの酵素活性を測定した。３７℃および５０℃のそれぞれについて、ｐＨ８．０における酵素活性を１として規格化したグラフを図４Ａに示す。【００６８】
アセトニトリル（１０％および２０％）、ＤＭＳＯ（１０％）、ならびにメタノール（１０％）、およびグリセロール（１０％）の各溶液中での酵素活性の測定結果を図４Ｂに示す。尿素（１Ｍおよび２Ｍ）、塩化ナトリウム（５０ｍＭ、１５０ｍＭおよび５００ｍＭ）、硫酸アンモニウム（５０ｍＭ、１５０ｍＭおよび５００ｍＭ）、インドール‐３‐酢酸（５０ｍＭ）、ならびにエチレンジアミン四酢酸（１ｍＭおよび１０ｍＭ）の各溶液中での酵素活性の測定結果を図４Ｃに示す。ジチオスレイトール（１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭおよび２０ｍＭ）、ならびにトリス（２‐カルボキシメチル）フォスフィン（０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭおよび５ｍＭ）の各溶液中での酵素活性の測定結果を図４Ｄに示す。ｎ‐オクチル‐β‐Ｄ‐チオグルコシド（０．１％）、ｎ‐オクチル‐β‐Ｄ‐グルコシド（０．１％）、ドデシル硫酸ナトリウム（０．１％）、ならびにラフィノース（１００ｍＭおよび２００ｍＭ）の各溶液中での酵素活性の測定結果を図４Ｅに示す。図４Ｂ〜Ｅにおける酵素活性は、ｐＨ８．０のトリス塩酸緩衝溶液中での３７℃および５０℃での酵素活性（図４Ａ参照）を１として規格化した値として示されている。【００６９】
［微粒子表面へのトリプシンの固定］
ポリグリシジルメタクリレート被覆フェライトナノ粒子（FG beads；多摩川精機製、粒子径約２００ｎｍ）のイソプロパノール懸濁液５０μＬを、４℃で遠心して微粒子を沈降させ、上清を取り除いた後、メタノールで洗浄した。５０μｇの改変トリプシントリプシンを含む溶液を上記の微粒子に加えて、微粒子を懸濁させた。微粒子の懸濁液を、４℃で３０分撹拌し、４℃で遠心して微粒子を沈降させ、上清を取り除いた。５０ｍＭトリス塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．０）による洗浄と遠心を２回繰り返した後、トリス塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．０）に微粒子を懸濁させ、微粒子の表面に固定されたトリプシンの濃度が１μｇ／μＬの懸濁液を得た。
改変トリプシンに代えて、リコンビナントトリプシンの市販品を用い、表面にリコンビナントトリプシンが固定された微粒子の懸濁液を調製した。【００７０】
（酵素活性の比較）
Ｎ‐α‐ベンゾイル‐ＤＬ‐アルギニン‐ｐ‐ニトロアニリド塩酸塩を基質として、微粒子表面に固定された改変トリプシンおよびリコンビナントトリプシンの酵素活性を測定したところ、微粒子表面に固定された改変トリプシンは、微粒子表面に固定されたリコンビナントトリプシンの約４倍の酵素活性を示した。【００７１】
（特異性断片の生成量）
基質としてアルブミン（Ａｌｂ）、ヘモグロビン（Ｈｂ）、およびラクトグロブリン（Ｌａｃ）を用い、トリプシンが固定された微粒子を添加して、３７℃で終夜消化反応を行い、ＭＳ／ＭＳ分析結果のデータベース解析により、それぞれの基質の特異性断片の生成量を求めた。結果を図５に示す。微粒子に固定された改変トリプシン（ｍｏｄ）は、リコンビナントトリプシン（ｒｅｃ）と同等の特異性断片生成量を示した。【００７２】
［ｎＳＭＯＬ法による抗体の断片化］
ヒト血漿中に、所定濃度（３．７，１１．１，３３．３，１００および３００μｇ／ｍＬ）のモノクローナル抗体を添加した。抗体としては、ベバシズマブ、トラスツズマブおよびニボルマブを用いた。抗体を添加した血漿１０μＬを、０．１％のオクチルチオグリコシドを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により１０倍に希釈した。【００７３】
上記の試料に、プロテインＡで被覆された多孔質体の懸濁液（トヨパール AF-rProtein A HC-650F；東ソー製、粒子径３０〜６０μｍ、空孔率８６％、樹脂濃度５０重量％、IgG静的吸着量８０ｇ／Ｌ）２５μＬを加え、室温で１５分穏やかに撹拌して、血漿中の抗体をプロテインＡ被覆樹脂に固定した。０．１％のオクチルチオグリコシドを含むＰＢＳで洗浄を行った後、ＰＢＳで洗浄を行い、オクチルチオグリコシドを除去した。【００７４】
抗体が固定されたプロテインＡ被覆樹脂に、２５ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ８．０）７５μＬ、およびトリプシンを固定した微粒子の懸濁液１０μＬを添加し、５０℃で５時間穏やかに撹拌しながら反応を行った。終濃度が０．５％となるようにギ酸を加えて反応を停止させ、遠心濾過により樹脂を除去し、回収した濾液をＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ（島津製作所、LCMS-8050）により分析した。分析条件は下記の通りとした。【００７５】
＜ＬＣ条件＞
移動相Ａ： ０．１％ギ酸水溶液
移動相Ｂ： ０．１％ギ酸アセトニトリル溶液
オートサンプラー洗浄：超純水
カラム：Shim-Pack GISS（内径：２．１ｍｍ、カラム長：５０ｍｍ、粒子径：１．９μｍ、孔径：２０ｎｍ）
流速： ０．４ｍＬ／分
カラムオーブン温度：５０℃
サンプルクーラー温度：５℃
＜ＭＳ条件＞
インターフェイス電圧：１．５ｋＶ
ネブライザーガス流量：３Ｌ／分
ヒーティングガス流量：１０Ｌ／分
ドライイングガス流量：１０Ｌ／分
インターフェイス温度：３５０℃
ＤＬ温度：２５０℃
ヒートブロック温度：４００℃【００７６】
血漿中のベバシズマブ濃度とベバシズマブのＣＤＲ由来のトリプシン消化ペプチド断片（FTFSLDTSKおよびVLIYFTSSLHSGVPSR）の検出量（質量分析のピーク面積）との関係をプロットしたものを図６Ａおよび図６Ｂに示す。血漿中のトラスツズマブ濃度とトラスツズマブのＣＤＲ由来のトリプシン消化ペプチド断片（IYPTNGYTR）の検出量との関係をプロットしたものを図７に示す。血漿中のニボルマブ濃度とニボルマブのＣＤＲ由来のトリプシン消化ペプチド断片（ASGITFSNSGMHWVR）との関係をプロットしたものを図８に示す。【００７７】
３種類の抗体医薬（４種類のＣＤＲ由来ペプチド断片）の全てにおいて、改変トリプシンを用いた場合は、リコンビナントトリプシンを用いた場合と同様に、血漿中の抗体医薬濃度とペプチド断片の検出量との間に高い線形性がみられた。これらの結果から、改変トリプシンを用いた場合も、リコンビナントトリプシンを用いた場合と同様に、血漿中の抗体医薬の濃度を定量可能であることが分かる。【００７８】
［酵素活性とｎＳＭＯＬ法によるペプチド断片生成量の関係］
上記の実施例では、トリプシン改変のための還元ジメチル化処理において、トリプシンの約２０００モル倍のアルキル化剤（ホルムアルデヒド）を用いた。これは、ｎＳＭＯＬ法により抗体の断片化を行った際に、ＣＤＲ由来の特異的ペプチド断片の産生量が最大となるように調製を行ったものである。図９は、アルキル化剤の使用量と、微粒子に固定されたプロテアーゼの酵素活性（ＢＡＮＡを基質として求めたもの）および抗体のＣＤＲ由来断片（ベバシズマブのＦＴＦＳＬＤＴＳＫ断片）の産生量（質量分析のピーク面積）との関係を表すグラフである。図９では、市販のリコンビナントトリプシン（ｒｅｃ）の評価結果もあわせて示している。【００７９】
還元アルキル化剤の使用量が、トリプシンの３０倍，４０倍，５０倍および６０倍の場合、微粒子に固定した改変トリプシンは、微粒子に固定したリコンビナントトリプシンの約１０倍の酵素活性を示したが、ｎＳＭＯＬ法によるＣＤＲ由来の特異的ペプチド断片の産生量は、リコンビナントトリプシンの１／２０以下であった。一方、還元アルキル化剤の使用量を、トリプシンの２０００モル倍とした場合、微粒子に固定した改変トリプシンの酵素活性は、微粒子に固定したリコンビナントトリプシンの約４倍であり、ｎＳＭＯＬ法によるＣＤＲ由来の特異的ペプチド断片の産生量は、リコンビナントトリプシンと同等であった。【００８０】
これらの結果から、酵素活性は、抗体の位置選択的な切断によるペプチドフラグメントの産生量とは必ずしも相関していないことが分かる。また、還元アルキル化の際に、トリプシンに対して過剰量の還元アルキル化剤を用いることにより、抗体を位置選択的に切断可能な改変トリプシンが得られることが分かる。
【図１】
2018025346.tif 000003
【図２】
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【図３】
2018025346.tif 000005
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2018025346.tif 000007
【図４Ｃ】
2018025346.tif 000008
【図４Ｄ】
2018025346.tif 000009
【図４Ｅ】
2018025346.tif 000010
【図５】
2018025346.tif 000011
【図６Ａ】
2018025346.tif 000012
【図６Ｂ】
2018025346.tif 000013
【図７】
2018025346.tif 000014
【図８】
2018025346.tif 000015
【図９】
2018025346.tif 000016
【国際調査報告】
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2018025346.tif 000018