(57)【要約】  本発明は、アルツハイマー病などに代表されるタンパク質凝集性疾患に対する有効な治療を確立するためのモデル動物を提供する。  より具体的には、本発明は、以下を提供する。（Ａ）タンパク質凝集に起因する変性症状がタンパク質のミスフォールディングにより誘導され、かつ前記変性症状が促進された、タンパク質凝集に起因する変性症状を呈する非ヒト動物；並びに（Ｂ）以下（１）及び（２）を含む、タンパク質凝集に起因する変性症状を呈する非ヒト動物の作製方法：（１）タンパク質のミスフォールディングを非ヒト動物において誘導して、タンパク質凝集に起因する変性症状を非ヒト動物において引き起こすこと；及び（２）タンパク質凝集に起因する変性症状の促進処置を非ヒト動物において行うこと。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質凝集に起因する変性症状がタンパク質のミスフォールディングにより誘導され、かつ前記変性症状が促進された、タンパク質凝集に起因する変性症状を呈する非ヒト動物。
【請求項２】
細胞毒性を有する化学物質により、タンパク質凝集に起因する変性症状が誘導される、請求項１記載の非ヒト動物。
【請求項３】
細胞毒性を有する化学物質が、（１）ジエチルニトロソアミン及び四塩化炭素の組み合わせ、（２）２−アミノ−１−メチル−６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン、（３）ストレプトゾトシン、（４）アドリアマイシン、又は（５）ドキソルビシンである、請求項２記載の非ヒト動物。
【請求項４】
前記変性症状の促進が過酸化脂質の発生の誘導により行われる、請求項１〜３のいずれか一項記載の非ヒト動物。
【請求項５】
前記過酸化脂質の発生の誘導が高脂肪食の給餌により行われる、請求項４記載の非ヒト動物。
【請求項６】
前記非ヒト動物が、（１）肝癌、（２）パーキンソン病、（３）アルツハイマー病、（４）慢性腎臓病、及び（５）心線維化からなる群より選ばれるタンパク質凝集に起因する変性疾患のモデル動物である、請求項１〜５のいずれか一項記載の非ヒト動物。
【請求項７】
前記非ヒト動物が、下記からなる群より選ばれる、タンパク質凝集に起因する変性疾患のモデル動物である、請求項１〜６のいずれか一項記載の非ヒト動物：
（１）ジエチルニトロソアミン及び四塩化炭素の組み合わせ、並びに高脂肪食の給餌による肝癌のモデル動物；
（２）２−アミノ−１−メチル−６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン、及び高脂肪食の給餌によるパーキンソン病のモデル動物；
（３）ストレプトゾトシン、及び高脂肪食の給餌によるアルツハイマー病のモデル動物；
（４）アドリアマイシン、及び高脂肪食の給餌による慢性腎臓病のモデル動物；並びに
（５）ドキソルビシン、及び高脂肪食の給餌による心線維化のモデル動物。
【請求項８】
前記非ヒト動物が齧歯類である、請求項１〜７のいずれか一項記載の非ヒト動物。
【請求項９】
齧歯類がマウスである、請求項８記載の非ヒト動物。
【請求項１０】
以下（１）及び（２）を含む、タンパク質凝集に起因する変性症状を呈する非ヒト動物の作製方法：
（１）タンパク質のミスフォールディングを非ヒト動物において誘導して、タンパク質凝集に起因する変性症状を非ヒト動物において引き起こすこと；及び
（２）タンパク質凝集に起因する変性症状の促進処置を非ヒト動物において行うこと。
【請求項１１】
２−アミノ−１−メチル−６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンが投与された、タンパク質凝集に起因する変性症状を呈する非ヒト動物。
【請求項１２】
２−アミノ−１−メチル−６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンを投与することを含む、タンパク質凝集に起因する変性症状を呈する非ヒト動物の作製方法。
【請求項１３】
以下（ａ）〜（ｃ）を含む、タンパク質凝集性疾患の予防又は治療薬のスクリーニング方法：
（ａ）請求項１〜９及び１１のいずれか一項記載の非ヒト動物へ被験物質を投与すること；
（ｂ）被験物質がタンパク質凝集に起因する変性症状の改善作用を有するか否かを評価すること；及び
（ｃ）タンパク質凝集に起因する変性症状の改善作用を有する被験物質を、タンパク質凝集性疾患の予防又は治療薬として選択すること。
【請求項１４】
以下（ａ）及び（ｂ）を含む、被験薬物の副作用の評価方法：
（ａ）請求項１〜９及び１１のいずれか一項記載の非ヒト動物へ被験薬物を投与すること；及び
（ｂ）被験薬物がタンパク質凝集に起因する変性症状に対する作用を有するか否かを評価すること。
【請求項１５】
請求項１〜９及び１１のいずれか一項記載の非ヒト動物から調製された、タンパク質凝集に起因する変性部位を含む生体試料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質凝集に起因する変性症状を呈する非ヒト動物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質凝集性疾患（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＰＡＤ）は、突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）に基づくタンパク質のミスフォールディングスを発端とするアミロイド等病的タンパク質の異常蓄積による変性疾患を主に示す疾患概念として知られている。しかし、近年は突然変異のみならず、細胞へのトキシックな刺激や老化によるミスフォールディングに基づくタンパク質の異常凝集を含む幅広い疾患概念と認識されてきており、高齢化社会においては極めて重要となる症候群とさえ言える広がりを見せてきている。【０００３】
ＰＡＤに関連し得る知見を開示する先行技術としては、以下が挙げられる。
非特許文献１は、ラット初代培養細胞において、２−アミノ−１−メチル−６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ＰｈＩＰ）がドーパミン神経選択的に毒性を示すことを開示している。
非特許文献２は、糖尿病様背景型のアルツハイマー型認知症のモデル動物として、脳室内（ｉｃｖ）−ストレプトゾシン（ＳＴＺ）モデルを開示している。
非特許文献３は、慢性腎臓病のモデルとしてアドリアマイシンネフロパシーモデル（ＡＮ）を開示している。
非特許文献４は、心線維化モデルとしてドキソルビシン誘導性モデルを開示している。
非特許文献５は、肝癌モデルとしてジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）−四塩化炭素（ＣＣＬ４）誘導モデルを開示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｒｉｇｇｓ  Ａ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４，１４０（１）：１７９−１８９．
【非特許文献２】Ｓｉｎｇｈ，Ｂｉｒｄａｖｉｎｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｎｉｎ−Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  １４．２（２０１３）：１２４−１３６．
【非特許文献３】Ｒｅｓｏｌｖｉｎ  Ｄ１  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ｐｏｄｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  １４−３−３β  Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ，Ｘｕｅｍｉｎｇ  Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｌｏｓ  ｏｎｅ＿２０１３，８＿１−１７
【非特許文献４】Ｈａｇｉｒ  Ｂ．  Ｓｕｌｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．，２００７，１１７，１２，３７３０−３７４１
【非特許文献５】Ｔａｋｅｋｉ  Ｕｅｈａｒａ，  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  ＿２０１５，３０＿１−１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、アルツハイマー病などに代表されるＰＡＤに対する有効な治療は現時点では確立されておらず、その疾患モデルの研究は重要である。従来の疾患モデルは細胞内の突然変異の原因となる遺伝子操作を加えるモデルが主流であり、それだけでは十分な治療が確立されてこなかった。さらに、細胞外の凝集に関しても十分に解析できるモデルもなかったため、高齢化社会に対応する新しいＰＡＤに対する新薬の開発が困難であった。【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、タンパク質のミスフォールディングを非ヒト動物において誘導してタンパク質凝集に起因する変性症状を非ヒト動物において引き起こした上で、この変性症状を促進するように非ヒト動物を処置することで、ＰＡＤの良好なモデル動物を作製できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕タンパク質凝集に起因する変性症状がタンパク質のミスフォールディングにより誘導され、かつ前記変性症状が促進された、タンパク質凝集に起因する変性症状を呈する非ヒト動物。
〔２〕細胞毒性を有する化学物質により、タンパク質凝集に起因する変性症状が誘導される、〔１〕の非ヒト動物。
〔３〕細胞毒性を有する化学物質が、（１）ジエチルニトロソアミン及び四塩化炭素の組み合わせ、（２）２−アミノ−１−メチル−６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン、（３）ストレプトゾトシン、（４）アドリアマイシン、又は（５）ドキソルビシンである、〔２〕の非ヒト動物。
〔４〕前記変性症状の促進が過酸化脂質の発生の誘導により行われる、〔１〕〜〔３〕のいずれかの非ヒト動物。
〔５〕前記過酸化脂質の発生の誘導が高脂肪食の給餌により行われる、〔４〕の非ヒト動物。
〔６〕前記非ヒト動物が、（１）肝癌、（２）パーキンソン病、（３）アルツハイマー病、（４）慢性腎臓病、及び（５）心線維化からなる群より選ばれるタンパク質凝集に起因する変性疾患のモデル動物である、〔１〕〜〔５〕のいずれかの非ヒト動物。
〔７〕前記非ヒト動物が、下記からなる群より選ばれる、タンパク質凝集に起因する変性疾患のモデル動物である、〔１〕〜〔６〕のいずれかの非ヒト動物：
（１）ジエチルニトロソアミン及び四塩化炭素の組み合わせ、並びに高脂肪食の給餌による肝癌のモデル動物；
（２）２−アミノ−１−メチル−６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン、及び高脂肪食の給餌によるパーキンソン病のモデル動物；
（３）ストレプトゾトシン、及び高脂肪食の給餌によるアルツハイマー病のモデル動物；
（４）アドリアマイシン、及び高脂肪食の給餌による慢性腎臓病のモデル動物；並びに
（５）ドキソルビシン、及び高脂肪食の給餌による心線維化のモデル動物。
〔８〕前記非ヒト動物が齧歯類である、〔１〕〜〔７〕のいずれかの非ヒト動物。
〔９〕齧歯類がマウスである、〔８〕の非ヒト動物。
〔１０〕以下（１）及び（２）を含む、タンパク質凝集に起因する変性症状を呈する非ヒト動物の作製方法：
（１）タンパク質のミスフォールディングを非ヒト動物において誘導して、タンパク質凝集に起因する変性症状を非ヒト動物において引き起こすこと；及び
（２）タンパク質凝集に起因する変性症状の促進処置を非ヒト動物において行うこと。
〔１１〕２−アミノ−１−メチル−６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンが投与された、タンパク質凝集に起因する変性症状を呈する非ヒト動物。
〔１２〕２−アミノ−１−メチル−６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンを投与することを含む、タンパク質凝集に起因する変性症状を呈する非ヒト動物の作製方法。
〔１３〕以下（ａ）〜（ｃ）を含む、タンパク質凝集性疾患の予防又は治療薬のスクリーニング方法：
（ａ）〔１〕〜〔９〕及び〔１１〕のいずれかの非ヒト動物へ被験物質を投与すること；
（ｂ）被験物質がタンパク質凝集に起因する変性症状の改善作用を有するか否かを評価すること；及び
（ｃ）タンパク質凝集に起因する変性症状の改善作用を有する被験物質を、タンパク質凝集性疾患の予防又は治療薬として選択すること。
〔１４〕以下（ａ）及び（ｂ）を含む、被験薬物の副作用の評価方法：
（ａ）〔１〕〜〔９〕及び〔１１〕のいずれかの非ヒト動物へ被験薬物を投与すること；及び
（ｂ）被験薬物がタンパク質凝集に起因する変性症状に対する作用を有するか否かを評価すること。
〔１５〕〔１〕〜〔９〕及び〔１１〕のいずれかの非ヒト動物から調製された、タンパク質凝集に起因する変性部位を含む生体試料。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の非ヒト動物は、タンパク質凝集性疾患のモデル動物として、種々の治療薬の前臨床的な試験に用いることが可能である。また、本発明は、薬剤開発や治療標的となるターゲットの探索においても有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】図１−１は、（１）ビヒクル群、（２）ＰｈＩＰ群、及び（３）ＰｈＩＰ＋ＨＦＤ（高脂肪食）群における脳のＴＨ陽性細胞数を示す図である。
【図１−２】図１−２は、（１）ビヒクル群、（２）ＰｈＩＰ群、及び（３）ＰｈＩＰ＋ＨＦＤ群における脳のＴＨ免疫染色を示す写真である。
【図２】図２は、（１）ビヒクル群、（２）ＰｈＩＰ群、及び（３）ＰｈＩＰ＋ＨＦＤ群における脳のレビー小体を示す写真である。
【図３】図３は、（１）Ｓｈａｍコントロール群、（２）ＳＴＺ群、及び（３）ＳＴＺ＋ＨＦＤ群におけるＹ迷路の結果（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ（％））を示す図である。
【図４】図４は、（１）Ｓｈａｍコントロール群、（２）脳室内（ｉｃｖ）ＳＴＺ群、及び（３）脳室内ＳＴＺ＋ＨＦＤ群における脳のコラーゲンタイプＩＶ免疫染色の結果を示す写真である。
【図５−１】図５−１は、（１）正常群、（２）Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ群、及び（３）Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ＋ＨＦＤ群における腎臓切片のシリウスレッド染色陽性面積率（％）を示す図である。
【図５−２】図５−２は、（１）正常群、（２）Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ群、及び（３）Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ＋ＨＦＤ群における腎臓切片のシリウスレッド染色を示す写真である。
【図６−１】図６−１は、（１）正常群、（２）Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ群、及び（３）Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ＋ＨＦＤ群における腎臓切片の免疫染色陽性面積率（％）を示す図である。
【図６−２】図６−２は、（１）正常群、（２）Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ群、及び（３）Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ＋ＨＦＤ群における腎臓切片のＦ４／８０免疫染色を示す写真である。
【図７−１】図７−１は、（１）ビヒクル群、（２）ビヒクル＋ＨＦＤ群、（３）ドキソルビシン群、及び（４）ドキソルビシン＋ＨＦＤ群における心臓のシリウスレッド染色陽性面積率（％）を示す図である。
【図７−２】図７−２は、（１）ビヒクル群、（２）ビヒクル＋ＨＦＤ群、（３）ドキソルビシン群、及び（４）ドキソルビシン＋ＨＦＤ群における心臓のシリウスレッド染色を示す写真である。
【図８−１】図８−１は、（１）正常群、（２）ＤＥＮ−ＣＣｌ４群、及び（３）ＤＥＮ−ＣＣｌ４＋ＨＦＤ群における肝臓の腫瘍数を示す図である。
【図８−２】図８−２は、（１）正常群、（２）ＤＥＮ−ＣＣｌ４群、及び（３）ＤＥＮ−ＣＣｌ４＋ＨＦＤ群における肝臓の腫瘍サイズを示す図である。
【図９−１】図９−１は、（１）正常群、（２）ＤＥＮ−ＣＣｌ４群、及び（３）ＤＥＮ−ＣＣｌ４＋ＨＦＤ群における肝臓切片のシリウスレッド染色陽性面積率（％）を示す図である。
【図９−２】図９−２は、（１）正常群、（２）ＤＥＮ−ＣＣｌ４群、及び（３）ＤＥＮ−ＣＣｌ４＋ＨＦＤ群における肝臓切片のシリウスレッド染色を示す写真である。
【図１０−１】図１０−１は、（１）正常群、（２）ＤＥＮ−ＣＣｌ４群、及び（３）ＤＥＮ−ＣＣｌ４＋ＨＦＤ群における肝臓切片の免疫染色陽性面積率（％）を示す図である。
【図１０−２】図１０−２は、（１）正常群、（２）ＤＥＮ−ＣＣｌ４群、及び（３）ＤＥＮ−ＣＣｌ４＋ＨＦＤ群における肝臓切片のｐ５３免疫染色を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、タンパク質凝集に起因する変性症状を呈する非ヒト動物を提供する。本発明の非ヒト動物は、タンパク質凝集に起因する変性症状がタンパク質のミスフォールディングの誘導により引き起こされ、かつ前記変性症状が促進されている。
【００１１】
本発明において使用する非ヒト動物は、通常、実験動物として一般的に使用される動物であれば特に制限されず、好ましくは、脊椎動物である。脊椎動物としては、例えば、鳥類（例、ニワトリ）および哺乳動物が挙げられるが、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、齧歯類（例、マウス、ラット、モルモット、ウサギ）、霊長類（例、サル、チンパンジー）、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジが挙げられる。本発明の非ヒト動物の作製に使用する動物の遺伝的背景は特に制限されず、任意の遺伝的背景を有する動物を利用することができる。通常は、野生型の動物を好適に使用することができる。
【００１２】
本発明の非ヒト動物は、タンパク質凝集性疾患（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＰＡＤ）のモデル動物として有用である。ＰＡＤとしては、例えば、神経変性疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン病）、腎臓疾患（例、慢性腎臓病）、心臓疾患（例、心線維化）、肝臓疾患（例、肝臓癌）、肺疾患（例、ＣＯＰＤ）、眼疾患（例、網膜色素変性症、白内障、角膜アミロイドーシス、角膜ジストロフィー、緑内障、眼咽頭筋ジストロフィー）、筋肉疾患（例、封入体筋炎）、毛髪疾患（例、頭皮減毛症）、血管疾患（例、動脈硬化症）、消化管疾患（例、ヒルシュスプリング病）、皮膚疾患（例、皮膚アミロードシス）、末梢神経障害（例、シャルコマリ病）、下垂体疾患（例、下垂体老化によるホルモン異常）、更年期障害、癌、線維化、膵臓疾患（例、ＩＩ型糖尿病）が挙げられる。
【００１３】
上記ＰＡＤにおける凝集タンパク質としては、例えば、α-シヌクレイン、β-アミロイド、タウ、コラーゲン、ｐ５３、ＳＰ−Ｃ、ロドプシン、クリスタリン、ラクトフェリン、ケラトエピセリン、ＰＡＰＢ２、ＡＰＰ、Ａβ、コルネオデスモシン、ＡｐｏＢ１００／ＬＤＬ、ＲＥＴ、ミエリン蛋白２２／０、プロラクチン、Ｐ５３が挙げられる。
【００１４】
凝集タンパク質の沈着部位としては、例えば、脳（例、黒質緻密部、腹側被蓋野、海馬、大脳皮質）、腎臓（例、間質）、心臓（例、心室筋内膜）、肝臓、肺、眼（例、網膜、水晶体、角膜、房水体、眼咽頭筋）、筋肉、毛包、血管、消化管（例、胃、小腸、大腸）、皮膚、末梢神経、下垂体、膵臓が挙げられる。凝集タンパク質の沈着部位としてはまた、例えば、細胞内部位（例、核内、細胞質内）、及び細胞外部位が挙げられる。
【００１５】
本発明の非ヒト動物における凝集タンパク質の検出方法としては、例えば、抗体染色、シリウスレッド染色等の任意の染色法が挙げられる。
【００１６】
本発明の非ヒト動物は、以下（１）及び（２）により作製することができる：
（１）タンパク質のミスフォールディングを非ヒト動物において誘導して、タンパク質凝集に起因する変性症状を非ヒト動物において引き起こすこと；及び
（２）タンパク質凝集に起因する変性症状の促進処置を非ヒト動物において行うこと。
【００１７】
本発明の非ヒト動物において、タンパク質凝集に起因する変性症状は、タンパク質のミスフォールディングを誘導する能力を有する物質の投与により引き起こすことができる。タンパク質のミスフォールディングを誘導する能力を有する物質としては、例えば、タンパク質のミスフォールディングを惹起する物質、及びミスフォールディングしたタンパク質凝集を除去又は低減する因子の作用を阻害する物質が挙げられる。具体的には、このような物質の例としては、細胞毒性を有する化学物質、シャペロン阻害物質、オートファジー阻害物質、及び小胞体関連分解阻害物質が挙げられる。
細胞毒性を有する化学物質としては、例えば、２−アミノ−１−メチル−６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン、ストレプトゾトシン、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ジエチルニトロソアミン、四塩化炭素が挙げられる。
シャペロン阻害物質としては、例えば、ツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）、ＥＴＢ、ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、β−メルカプトエタノール（β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、タプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）が挙げられる。
オートファジー阻害物質としては、例えば、バフィロマイシンＡ１（Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ  Ａ１）、クロロキノン（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）、Ｅ−６４ｄ、ＬＹ−２９４００２、ＬＹ  ３０３５１１、ペプスタチンＡ（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ）、（＋）−ウォートマンニン（Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）が挙げられる。
小胞体関連分解阻害物質としては、例えば、ボルテゾニブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｎｉｂ）、ＭＧ−１３２、カルフィルゾミブ（Ｃａｒｆｉｌｚｏｍｉｂ）、ＭＬＮ９７０８、イクサゾミブ（Ｉｘａｚｏｍｉｂ）、ＰＩ−１８４０、ＯＮＸ−０９１４、オプロゾミブ（Ｏｐｒｏｚｏｍｉｂ）、ＣＥＰ−１８７７０、ナファモスタット（Ｎａｆａｍｏｓｔａｔ）、アスピリン（Ａｓｐｉｒｉｎ）、ガベキサート（Ｇａｂｅｘａｔｅ）、ＰＲ−６１９、Ｐ５０９１、ＩＵ１、ＴＣＩＤ、ＬＤＮ−５７４４４、デグラシン（Ｄｅｇｒａｓｙｎ）、ＭＬ３２３、Ｐ２２０７７、ｐ９７インヒビター（ｐ９７  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、ＮＭＳ−８７３、ＤＢｅＱ、ＭＮＳ、ＮＳＣ６９７９２３、ＢＡＹ  １１−７０８２、ＰＹＲ−４１、タリドミド（Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、ＴＡＭＥ、ＲＩＴＡ、テノヴィン−１（Ｔｅｎｏｖｉｎ−１）、Ｅ３リガーゼアクチベーター（Ｅ３  Ｌｉｇａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ）、（−）−パルテノリド（Ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｅ）、ＮＳＣ  ２０７８９５、ヌトリン−３（Ｎｕｔｌｉｎ−３）、ＪＮＪ−２６８５４１６５が挙げられる。
【００１８】
タンパク質のミスフォールディングを誘導する能力を有する物質の投与形態は、特に制限されず、例えば、皮下投与（例、皮下注射）、静脈投与、脳室内投与、経口投与、腹腔内投与等が挙げられる。
【００１９】
タンパク質のミスフォールディングを誘導する能力を有する物質は、物質の種類に応じて、目的タンパク質のミスフォールディングを誘導できる任意の量で投与することができる。
【００２０】
タンパク質のミスフォールディングを誘導する能力を有する物質は、物質及び動物の種類に応じて、任意の齢（例、１日齢から２０週齢、１５週齢又は１０週齢までの間）の動物に適宜投与することができる。
【００２１】
タンパク質凝集に起因する変性症状の促進処置は、タンパク質のミスフォールディングの誘導とは別の処置により行うことができる。例えば、促進処置は、過酸化脂質の発生の誘導により行うことができる。過酸化脂質の発生の誘導は、例えば、過酸化脂質の発生を誘導する食餌又は物質を与えることにより行うことができる。過酸化脂質の発生を誘導する食餌又は物質としては、例えば、高脂肪食、動脈硬化食、鉄含有食、ストレプトゾトシン、四塩化炭素、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２２】
本発明で用いられる場合、高脂肪食とは、油脂添加量２０％以上（好ましくは３０％以上）の脂肪試料をいう。高脂肪食は、総カロリーに占める油脂由来カロリーの比率が約４０％以上（好ましくは約５０％以上）であり得る。油脂としては、例えば、コレステロール、不飽和脂肪酸（例、リノール酸）、飽和脂肪酸が挙げられる。高脂肪食に配合される成分としては、例えば、粉末牛脂、ミルクカゼイン、卵白粉末、Ｌ−シスチン、紅花油、結晶セルロース、マルトデキストリン、乳糖、ショ糖などが挙げられる。高脂肪食は、一般的に動物用餌として市販される種々のものを利用することができる。高脂肪食としては、例えば、研究用動物飼料として市販されているＨｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ３２（日本クレア株式会社製）、Ｄ１２４９２（リサーチダイエット社製）等が挙げられる。
【００２３】
促進処置は、タンパク質のミスフォールディングの誘導と同時に行われてもよく、又はタンパク質のミスフォールディングの誘導前又は後に行われてもよい。あるいは、促進処置は、タンパク質のミスフォールディングの誘導前又は誘導と同時から誘導後にかけて行われてもよい。
【００２４】
好ましい実施形態では、本発明の非ヒト動物は、α−シヌクレイン凝集に起因する中枢神経系（黒質緻密部、腹側被蓋野）の変性症状が２−アミノ−１−メチル−６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ＰｈＩＰ）により誘導され、かつ過酸化脂質の発生の誘導により変性症状が促進された、α−シヌクレイン凝集に起因する中枢神経系の変性症状を呈する。このような非ヒト動物は、パーキンソン病モデルとして有用である。このような非ヒト動物は、例えば、α−シヌクレイン凝集を引き起こすことができる量（例、０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ）のＰｈＩＰを４〜１５週齢（好ましくは５〜９週齢）の時期に投与し、過酸化脂質の発生の誘導（例、高脂肪食の給餌）を同時期またはその後に行うことにより作製することができる。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、本発明の非ヒト動物は、β−アミロイド凝集及び／又はタウ凝集に起因する中枢神経系（海馬、大脳皮質）の変性症状が初回投与のストレプトゾシンにより誘導され、かつその後のストレプトゾシンの投与により変性症状が促進された、β−アミロイド凝集及び／又はタウ凝集に起因する中枢神経系の変性症状を呈する。このような非ヒト動物は、アルツハイマー病モデルとして有用である。このような非ヒト動物は、例えば、β−アミロイド凝集及び／又はタウ凝集を引き起こすことができる量（例、０．３〜３０ｍｇ／ｋｇ）のストレプトゾシンを１日〜１３週齢（好ましくは１日〜１０週齢）の時期に投与し、その後に過酸化脂質の発生を誘導できる量（例、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ）のストレプトゾシンを投与することにより作製することができる。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、本発明の非ヒト動物は、コラーゲン凝集に起因する腎臓（間質）の変性症状がアドリアマイシンにより誘導され、かつ過酸化脂質の発生の誘導により変性症状が促進された、コラーゲン凝集に起因する腎臓（間質）の変性症状を呈する。このような非ヒト動物は、慢性腎疾患モデルとして有用である。このような非ヒト動物は、例えば、腎臓におけるコラーゲン凝集を引き起こすことができる量（例、１〜５０ｍｇ／ｋｇ）のアドリアマイシンを４〜１５週齢（好ましくは６〜１０週齢）の時期に投与し、過酸化脂質の発生の誘導（例、高脂肪食の給餌）を同時期またはその後に行うことにより作製することができる。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、本発明の非ヒト動物は、コラーゲン凝集に起因する心臓（心室筋内膜、間質）の変性症状がドキソルビシンにより誘導され、かつ過酸化脂質の発生の誘導により変性症状が促進された、コラーゲン凝集に起因する心臓（心室筋内膜、間質）の変性症状を呈する。このような非ヒト動物は、心線維化モデルとして有用である。このような非ヒト動物は、例えば、心臓におけるコラーゲン凝集を引き起こすことができる量（例、１〜７５ｍｇ／ｋｇ）のドキソルビシンを４〜１５週齢（好ましくは６〜１０週齢）の時期に投与し、過酸化脂質の発生の誘導（例、高脂肪食の給餌）を同時期またはその後に行うことにより作製することができる。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、本発明の非ヒト動物は、肝臓障害および／または肝線維化に起因する肝癌がＤＥＮ−ＣＣＬ４により誘導され、かつ過酸化脂質の発生の誘導により発癌が促進された、コラーゲン凝集に起因する肝癌を呈する。このような非ヒト動物は、肝癌モデルとして有用である。このような非ヒト動物は、例えば、肝癌を引き起こすことができる量（例、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ）のＤＥＮおよび（例、０．０２〜１ｍＬ／ｋｇ）ＣＣｌ４を１〜５０週齢の時期に投与し、過酸化脂質の発生の誘導（例、高脂肪食の給餌）を同時期またはその後に行うことにより作製することができる。
【００２９】
本発明の非ヒト動物の作製においては、タンパク質のミスフォールディングを誘導する能力を有する物質として、２−アミノ−１−メチル−６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンを用いる場合、促進処置を省略してもよい。本発明はまた、このような方法により作製された非ヒト動物を提供する。
【００３０】
本発明はまた、タンパク質凝集性疾患の予防又は治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【００３１】
本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）本発明の非ヒト動物へ被験物質を投与すること；
（ｂ）被験物質がタンパク質凝集に起因する変性症状の改善作用を有するか否かを評価すること；及び
（ｃ）タンパク質凝集に起因する変性症状の改善作用を有する被験物質を、タンパク質凝集性疾患の予防又は治療薬として選択すること。
【００３２】
工程（ａ）において、被験物質として、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物等が挙げられる。被験物質としてはまた、さらに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。
【００３３】
被験物質の投与方法は、特に制限されず、例えば、経口的に、又は注射等により投与することができる。被験物質がタンパク質である場合、該タンパク質をコードする遺伝子を有するウイルスベクターを構築し、その感染力を利用して、本発明の非ヒト動物へ該遺伝子を導入することも可能である。
【００３４】
工程（ｂ）において、被験物質がタンパク質凝集に起因する変性症状の改善作用を有するか否かの評価は、例えば、非ヒト動物において、タンパク質凝集が抑制されているか否か、又はタンパク質凝集に起因する変性症状が緩和されているか否かを評価することにより行うことができる。タンパク質凝集の抑制の評価は、例えば、抗体染色、シリウスレッド染色等の任意の染色法により行うことができる。タンパク質凝集に起因する変性症状の緩和の評価は、例えば、変性症状に応じた所見（例、病理的所見、行動学的所見）に応じて適宜行うことができる。
【００３５】
工程（ｃ）において、タンパク質凝集に起因する変性症状の改善作用を有する被験物質が、タンパク質凝集性疾患の予防又は治療薬として選択される。
【００３６】
本発明はまた、被験薬物の副作用の評価方法を提供する。本発明の評価方法は、例えば、タンパク質凝集に起因する変性症状に対する作用（例、副作用）が所望されない、所定の薬効を示す医薬（例、副作用が低減した医薬）の開発に有用である。
【００３７】
本発明の評価方法は、以下（ａ）及び（ｂ）を含む：
（ａ）本発明の非ヒト動物へ被験薬物を投与すること；及び
（ｂ）被験薬物がタンパク質凝集に起因する変性症状に対する作用を有するか否かを評価すること。
【００３８】
工程（ａ）において、被験物質は、所定の薬効を示す物質（例、薬物、生理活性物質）である限り特に限定されるものではなく、例えば、上述した被験物質を用いることができる。
【００３９】
工程（ｂ）において、被験薬物がタンパク質凝集に起因する変性症状に対する作用を有するか否かの評価は、本発明のスクリーニング方法における（ｂ）と同様にして行うことができる。
【００４０】
本発明はまた、本発明の非ヒト動物から調製された、タンパク質凝集に起因する変性部位を含む生体試料を提供する。
【００４１】
本発明の生体試料は、タンパク質凝集に起因する変性部位を含む。タンパク質凝集に起因する変性部位は、上述したような凝集タンパク質の沈着部位である。タンパク質凝集に起因する変性部位は、凝集タンパク質に加えて、そのタンパク質の凝集を引き起こしたタンパク質のミスフォールディングを誘導する能力を有する物質を含んでいてもよい。このようなタンパク質と物質の組み合わせは、上述したとおりである。試料としては、例えば、臓器全体、臓器切片、及び初代培養細胞が挙げられる。本発明の生体試料は、例えば、タンパク質凝集性疾患の予防又は治療薬のスクリーニングに有用である。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。【００４３】
実施例１：２−アミノ−１−メチル−６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ＰｈＩＰ）のドーパミン神経毒性を利用した新規パーキンソン病モデルマウスの開発【００４４】
［試験目的］
パーキンソン病は中枢神経におけるドーパミン作動性神経の変性によって生じ、運動緩慢や無動症などとともに、しばしば認知症を併発する神経疾患である。患者数は世界的に約１０００万人とも言われており、既存薬は多いが、長期使用につれ薬が作用する時間が短くなってしまうｗｅａｒｉｎｇ  ｏｆｆと呼ばれる現象が問題となっている（参考文献１参照）。【００４５】
一方で、非臨床においては、６−ＯＨＤＡやＭＰＴＰなど、ドーパミン類縁体による細胞毒性を利用した化学誘導型パーキンソンモデルや、リスク遺伝子として知られるＰａｒｋｉｎやＰｉｎｋ１における遺伝子改変モデルが利用されているが、病理と症状の両方の特徴を十分に反映するモデルは現在まで開発されていない（参考文献２参照）。特にドーパミン作動性神経が進行的に死滅する病理的な特徴をもったモデルが望まれている。【００４６】
近年ラット初代培養細胞において、２−アミノ−１−メチル−６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ＰｈＩＰ）（２−Ａｍｉｎｏ−１−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｐｈｅｎｙｌ−１−Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ）がドーパミン神経選択的に毒性を示すことが報告された。ＰｈＩＰは発がん性物質として知られるサイクリックアミンの一種である。サイクリックアミンは、調理された肉類に含まれ、疫学調査により肉類の摂取とパーキンソン病との関連が指摘されてきた（参考文献３参照）。【００４７】
そこで本実施例は、ＰｈＩＰを利用し、新規パーキンソン病マウスモデルの作製として、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるマウスへのＰｈＩＰ投与による影響の検討を行うことを目的とする。ＰｈＩＰの投与濃度を０．４ｍｇ／ｍＬに設定し（参考文献４参照）、尾静脈投与を行い、投与２８日後に屠殺した。また、高脂肪食（ＨＦＤ：Ｈｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ）負荷との組み合わせによる相乗効果を検討するため、０．２ｍｇ／ｍＬ濃度のＰｈＩＰ投与及びＨＦＤ負荷を行う群を設定し、投与２８日後に屠殺した。ＴＨ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）免疫染色及びレビー小体の観測による評価を行うことで、ＳＮｃ及びＶＴＡのドーパミン作動性細胞数及びレビー小体数を計測し、本モデルのドーパミン作動性神経の傷害性とα-シヌクレイン凝集性を確認した。【００４８】
［遵守する基準及び準拠するガイドラインなど］
動物の福祉
「動物の愛護及び管理に関する法律」
（昭和４８年１０月１日法律第１０５号、最終改正平成２３年８月３０日法律第１０５号）
「実験動物の飼養及び保管並びに苦痛の軽減に関する基準」
（平成１８年４月２８日環境省告示第８８号）
「研究機関等における動物実験等の実施に関する基本指針」
（平成１８年６月１日、文部科学省告示第７１号）【００４９】
なお、本試験は株式会社ステリック・エムシー動物実験委員会の承認を得て、試験施設で定めている実験動物の管理及び福祉に関する指針（株式会社ステリック・エムシー動物実験規則）に従って実施した。【００５０】
［実験材料及び方法］
被験物質及び溶媒
被験物質
名称：ＰｈＩＰ（２−Ａｍｉｎｏ−１−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｐｈｅｎｙｌ−１−Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ）
被験物質用媒体
名称：ＤＭＳＯ＋０．９％ｓａｌｉｎｅ（２０：８０ｖ／ｖ）【００５１】
使用動物
雄性７週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス１２匹を日本エスエルシー株式会社より購入し、検疫・馴化飼育を行った。馴化飼育後、一般状態に問題がないことを確認して試験に供試した。【００５２】
飼料
ＨＦＤ負荷群については、動物入荷日から屠殺日までは、高脂肪食（油脂含量約３２％、総カロリーに占める油脂由来カロリーの比率が約５７％の固形飼料）を自由に摂取させた。【００５３】
群分け
試験開始日（ＰｈＩＰ投与開始日）前日に、雄性マウス１２匹から平均体重が均等になるように体重層別化無作為抽出法によって、３群に群分けを行った。【００５４】
投与経路、投与期間及び投与回数
ＤＭＳＯ及び各濃度のＰｈＩＰの投与経路は尾静脈投与を選択し、投与回数はＤａｙ０の計１回とした。【００５５】
群構成
群構成を表１に示す。【００５６】
【表１】
2017150566.tif 000002
【００５７】
一般状態の観察、体重測定及び摂餌量測定【００５８】
試験期間中は一般状態の観察、体重測定及び摂餌量測定を実施した。試験日の起算に関しては下記の通りとする。
ＰｈＩＰ投与開始日：Ｄａｙ０【００５９】
一般状態の観察
体重測定前に実施した。全個体について、体外表、栄養状態、姿勢、行動及び排泄物の異常などの一般状態を観察した。【００６０】
剖検
Ｄａｙ２８に全ての計画剖検動物について、イソフルランにて麻酔後、断頭により屠殺し、脳を摘出した。摘出した脳は、前方より１／３程度を冠状断にて切り捨てた。後方２／３を４％ＰＦＡで固定し、３０％スクロース溶液にて置換しＯＣＴ包埋凍結ブロックとして−８０℃にて保存した。【００６１】
免疫組織化学染色
凍結切片作製
凍結ブロックは、クリオスタットを用いて厚さ１０μｍに薄切し、スライドガラスに貼り付ける。切片はＳＮｃ及びＶＴＡが同時に観察される断面とした。断面はＡＬＬＥＮ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓを参考に判断した。凍結切片はＴＨ免疫染色に供した。【００６２】
ＴＨ免疫染色及び陽性細胞の計測
凍結切片は、０．０３％過酸化水素水にて常温で１０分間処置し、内因性ペルオキシダーゼの阻害を行った。ＰＢＳで洗浄後、抗ＴＨ抗体（Ａｂｃａｍ）を４℃、一晩反応させた。ＰＢＳにて洗浄し、２５倍希釈ペルオキシダーゼ標識抗ｒａｂｂｉｔ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩＲ）を常温、３０分間反応させた。ＰＢＳにて洗浄、１％グルタールアルデヒド溶液にて常温、１分間固定した。発色基質（シンプルステインＤＡＢ、ニチレイバイオサイエンス株式会社）にて発色させた。発色後、ＲＯ水にて洗浄し、１％グルタールアルデヒド溶液にて固定した。８倍希釈ヘマトキシリンに１分間通し、直ちにＲＯ水で洗浄し、アクアテックス（メルク株式会社）にて封入した。標本は明視野顕微鏡を用いて観察した。ＳＮｃ及びＶＴＡ領域の写真を、ＣＣＤカメラを用いて撮影した。各視野におけるＴＨ陽性細胞数を計測し、面積あたりのＴＨ陽性細胞数の平均値を算出した。その結果、ＰｈＩＰ＋ＨＦＤ群は、ＰｈＩＰ群に比べて、ＴＨ陽性細胞数の減少が認められ、ＨＦＤ負荷によるドーパミン神経の減少が観察された（図１−１、１−２）。【００６３】
ＨＥ染色及びレビー小体の計測
凍結切片を、リリー・マイヤーヘマトキシリン液（武藤化学株式会社）にて１０分間浸透する。ＲＯ水にて余分な染色液を洗い流し、流水にて１０分間色出しした後、１％エオシンＹエタノール水溶液（和光純薬株式会社）に５分間浸透し、ＲＯ水に浸透する。染色した切片は、７０％〜１００％のアルコール系列およびキシレンにて脱水・透徹後，エンテランニュー（メルク株式会社）にて封入し観察に供する。標本は明視野顕微鏡（ライカマイクロシステムズ）を用いて観察する。その結果、ＰｈＩＰ＋ＨＦＤ群は、ＰｈＩＰ群に比べて、レビー小体の増加が認められ、ＨＦＤ負荷によるα―シヌクレイン凝集の増加が示唆された（図２）。【００６４】
統計解析の流れ
各群の平均値の差の検定をＰｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．）を用い、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔにより、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と各濃度のＰｈＩＰ投与群とを比較した。
各群の代表値はｍｅａｎ±ＳＤで表し、検定はそれぞれ有意水準５％で行った。【００６５】
［参考文献］
１．Ｐａｈｗａ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｏｐｉｎｉｏｎ，２００９，２５（４）：８４１−８４９．
２．Ｂｌｅｓａ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，ＮｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｎａｌ，２０１２，２０１２．
３．Ｇｒｉｇｇｓ  Ａ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４，１４０（１）：１７９−１８９．
４．Ｔｅｕｎｉｓｓｅｎ  Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，２０１０，８７８（２５）：２３５３−２３６２．【００６６】
実施例２：ｉｃｖＳＴＺを用いたアルツハイマー病の非臨床評価試験
［試験目的］
アルツハイマー病は、遺伝的な要因により発症する家族性アルツハイマーと、環境要因により発症する孤発性アルツハイマーとに分けられる。アルツハイマー病患者の９９％は孤発性であると言われているが、遺伝子改変型モデルマウスの多くは、家族性アルツハイマー様の病態発症を模倣している（参考文献５参照）。したがって、遺伝子改変によらない孤発性アルツハイマー病のモデル動物の開発が求められている。さらに、糖尿病患者の約６割において認知症を併発することが疫学調査により明らかとなり、アルツハイマー病は第三の糖尿病とも呼ばれている（参考文献６参照）。【００６７】
ｉｃｖＳＴＺは、糖尿病の背景を持つマウスに対し、脳内のインスリンシグナルを障害することで生じる、糖尿病様背景型のアルツハイマー型認知症のモデル動物である。遺伝子改変モデルと比較して、ｉｃｖ−ＳＴＺ単独モデル（参考文献７参照）は強い炎症や神経機能障害を示すため、遺伝子改変型モデルと異なるメカニズムによる病態発症、及び病態進行が起こっていると考えられる。しかしながら、アミロイドベータやタウといった神経細胞死に関わる病的タンパク質の凝集が認められず、臨床に近いモデルとは言い難かった。今回、ＨＦＤにより糖尿病を誘発したマウスを用いることでより病的タンパク質の脳組織内沈着を有するマウスを再現する。本モデルを用いることで、遺伝子改変モデルでは十分に評価できない治療薬候補について、新しい知見を得られる可能性がある。【００６８】
［遵守する基準及び準拠するガイドラインなど］
動物の福祉
「動物の愛護及び管理に関する法律」
（昭和４８年１０月１日法律第１０５号、最終改正平成２３年８月３０日法律第１０５号）
「実験動物の飼養及び保管並びに苦痛の軽減に関する基準」
（平成１８年４月２８日環境省告示第８８号）
「研究機関等における動物実験等の実施に関する基本指針」
（平成１８年６月１日、文部科学省告示第７１号）【００６９】
なお、本試験は株式会社ステリック・エムシー動物実験委員会の承認を得て、試験施設で定めている実験動物の管理及び福祉に関する指針（株式会社ステリック・エムシー動物実験規則）に従って実施した。【００７０】
［実験材料及び方法］
使用動物
試験動物
ＳＰＦマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）、日本エスエルシー株式会社）の雄3０匹を６週齢で購入し、検疫・順化飼育を行った。【００７１】
群分け
投与開始日前日の体重を指標とし、平均体重が均一になるように３群（１０匹／群）に分ける。群構成を表２に示す。【００７２】
【表２】
2017150566.tif 000003
【００７３】
モデルマウスの作製
7週齢の試験開始日（Ｄａｙ０）及びＤａｙ２にて、ストレプトゾトシン（３μＬずつ）を脳室内へ投与することでモデルを誘導した。投与は左右両方の位置に一回ずつ（左から）行った。【００７４】
一般状態の観察、体重測定及び摂餌量測定
試験期間中は一般状態の観察、体重測定及び摂餌量測定を実施した。試験日の起算に関しては下記の通りとした。
ｉｃｖ−ＳＴＺ  7週齢投与開始日：０日（Ｄａｙ０）【００７５】
一般状態の観察
体重測定前に実施した。全個体について、体外表、栄養状態、姿勢、行動及び排泄物の異常などの一般状態を観察した。【００７６】
行動実験
Ｙ迷路によるｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ（ＳＡＢ）の解析（参考文献８）【００７７】
行動試験実施２４時間前（Ｄａｙ２６の投与完了後）において、Ｙ迷路でのｈａｂｉｔｕａｔｉｏｎを行った。すなわち、マウスを迷路の中心へ置き、５分間自由に探索させた。【００７８】
Ｄａｙ２７の最終投与完了後、試験は１回のｔｒｉａｌを行った。マウスを迷路の中心へ置き、８分間自由に探索させた。この間、マウスがアームへ侵入した全ての回数及び、アームへ進入した順番を全て記録した。８分経過した後、マウスをホームケージに戻し、５０％エタノールでＹ迷路を消毒し、次のマウスの試験を行った。【００７９】
ＳＡＢの指標はＡｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ（％）を用いた。Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｒａｔｅは、下記の式１によって計算した。【００８０】
１００×（３回続けて異なるアームへ進入した回数）／（アームへ進入した全回数−２）・・・（式１）【００８１】
その結果、ｉｃｖ−ＳＴＺ＋ＨＦＤ群は、ｉｃｖ−ＳＴＺ群に比べて、Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｒａｔｅの減少が認められた（図３）。【００８２】
剖検
Ｄａｙ２８に、全ての計画剖検動物について、ライフチェッカーにて血糖値を測定後、ジエチルエーテルにて麻酔、断頭により屠殺し、脳を摘出した。摘出した脳は、重量測定し、矢状面で半分に切り分けた。右脳を４％ＰＦＡで固定し（４℃，２ｈ）、３０％スクロース溶液にて置換した（４℃，Ｏ／Ｎ）。翌日ＯＣＴ包埋し、凍結保存した（−８０℃）。左脳は重量を測定した後、急速凍結し凍結保存した（−８０℃）。【００８３】
免疫組織化学染色
凍結切片において、コラーゲンタイプＩＶの免疫染色を行った。その結果、ｉｃｖ−ＳＴＺ＋ＨＦＤ群は、ｉｃｖ−ＳＴＺ群に比べて、脳血管周囲において強い染色が認められ、コラーゲンタイプＩＶの蓄積の亢進が確認された（図４）。【００８４】
切片作製
クライオスタットを用い、−２０℃中で１０μｍ厚の切片を作製した。【００８５】
［参考文献］
５．Ｋａｍｂｏｈ，  Ｍ．  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．’’  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２．５（２０１２）：ｅ１１７．
６．Ａｒｖａｎｉｔａｋｉｓ，  Ｚｏｅ，  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｄｅｃｌｉｎｅ  ｉｎ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．’’  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６１．５（２００４）：６６１−６６６．
７．Ｍｅｈａｎ，  Ｓｉｄｈａｒｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｍｅｎｔｉａ−Ａ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｉｎ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎ  Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ．，ＩＮＴＥＣＨ  Ｏｐｅｎ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，２０１２．
８．Ｇｏｒｒｉｅ，  Ｇｅｏｒｇｅ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｓｐｉｎｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ
ＡＬＳ／ｄｅｍｅｎｔｉａ−ｌｉｎｋｅｄ  ｍｕｔａｎｔ  ＵＢＱＬＮ２．’’  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １１１．４０（２０１４）：１４５２４−１４５２９．【００８６】
実施例３：慢性腎臓病に対するモデル動物の開発
［試験目的］
慢性腎臓病（ＣＫＤ）は糖尿病や高血圧などの原疾患により慢性的に腎臓の機能が低下する病態の総称であり、末期腎不全や心血管疾患のリスクとなる（参考文献９参照）。ＣＫＤの患者数は年々増加しており、人工透析の必要な末期腎不全患者も増加している（参考文献９参照）。ＣＫＤに対する根本的な治療薬は現在なく、各原疾患が進行すると共通して表れるタンパク尿や糸球体高血圧、糸球体障害、尿細間質障害といった進行性腎障害を抑えることがＣＫＤの治療において重要であると考えられている（参考文献１０参照）。【００８７】
慢性腎臓病のモデルとしては尿管結紮モデル（ＵＵＯ）、５／６腎摘出モデル（５／６Ｎｘ）、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｍｏｄｅｌ（ＡＮ）がある。各モデルの特徴、評価可能項目を表３に示すが、いずれも臨床を反映したモデルとは言い難い。今回新たにＣＫＤに対する治療薬の開発を行うためのモデル動物として、ＡＮ投与マウスモデルの検討を行った。また、高脂肪食（実施例１と同じ）負荷との組み合わせによる相乗効果を検討するため、ＡＮ投与及びＨＦＤ負荷を行う群を設定し、同様に飼育し屠殺した。【００８８】
【表３】
2017150566.tif 000004
【００８９】
［遵守する基準及び準拠するガイドラインなど］
動物の福祉
「動物の愛護及び管理に関する法律」
（昭和４８年１０月１日法律第１０５号、最終改正平成２３年８月３０日法律第１０５号）
「実験動物の飼養及び保管並びに苦痛の軽減に関する基準」
（平成１８年４月２８日環境省告示第８８号）
「研究機関等における動物実験等の実施に関する基本指針」
（平成１８年６月１日、文部科学省告示第７１号）【００９０】
なお、本試験は株式会社ステリック・エムシー動物実験委員会の承認を得て、試験施設で定めている実験動物の管理及び福祉に関する指針（株式会社ステリック・エムシー動物実験規則）に従って実施した。【００９１】
［実験材料及び方法］
試薬
Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
名称：Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ
メーカー：和光純薬工業【００９２】
使用動物
種（系統）：Ｃ５７ＢＬ／６
性別：雄
入荷時週齢：８週齢
週齢設定根拠：ＡＮモデルが作製されている参考文献１３に基づき設定する。
規格：ＳＰＦ
供給元：日本エスエルシー株式会社【００９３】
群構成
群構成を表４に示す。【００９４】
【表４】
2017150566.tif 000005
【００９５】
モデルマウスの作製
試験動物を保定器にて保定し、生理食塩水（０．９％  Ｓａｌｉｎｅ）に表４の濃度となるようにＡｄｒｉａｍｙｃｉｎを溶解し、１０ｍＬ／ｋｇで尾静脈投与した。Ｎｏｒｍａｌ群には生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇで尾静脈投与した。作製方法は、ＡＮモデルが作製されている参考文献１３を参照した。【００９６】
一般状態の観察、体重測定
試験期間中は一般状態の観察、体重測定を実施した。死亡動物を発見した場合は速やかに剖検する。試験日の起算に関しては下記の通りとした。
Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ投与日：０日（ｄａｙ０）【００９７】
一般状態の観察
体重測定前に実施した。全個体について、体外表、栄養状態、姿勢、行動及び排泄物の異常などの一般状態を観察した。【００９８】
剖検
各剖検動物について、心採血により屠殺し、腎臓を採材した。採取した腎臓は、ブアン固定液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｊａｐａｎ）に浸漬させ、２４時間室温にて固定後、パラフィン包埋を行った。中心片を液体窒素にて凍結し遺伝子解析に用い、下片を４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ−ＰＢＳで５時間固定後２０％ｓｕｃｒｏｓｅ−ＰＢＳに浸漬させ、ＯＣＴ−ｃｏｍｐｏｕｎｄに包埋し液体窒素にて凍結後−８０℃で保存した。【００９９】
腎臓の組織解析
シリウスレッド染色
パラフィン切片を脱パラフィン・親水化した後、０．０３％ピクロ・シリウスレッド液（シリウスレッド：ワルデック社）に６０分間浸漬させた。０．５％酢酸溶液及びＲＯ水に通した後、エンテランニュー（メルク株式会社）にて封入した。標本は明視野顕微鏡（ライカマイクロシステムズ）を用いて観察した。ＣＣＤカメラ（ライカマイクロシステムズ）を用いて撮影した画像をもとに、ＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を用いて、各視野における撮影面積、シリウスレッド陽性面積を計測した。その結果、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ＋ＨＦＤ群は、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ群に比べて、シリウスレッド染色陽性面積率の有意な増加を示し、ＨＦＤ負荷によるコラーゲン蓄積の増加が観察された（図５−１、５−２）。【０１００】
Ｆ４／８０免疫染色
凍結ブロックより作製された凍結切片をアセトンにて固定後、０．０３％過酸化水素水にて内因性ベルオキシダーゼの阻害を行った。ブロッキング液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ、ＤＳｐｈａｒｍａｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を常温、１０分間反応させた後、２００倍希釈の抗Ｆ４／８０抗体（ＢＭＡｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を４℃、一晩反応させた。ＰＢＳにて洗浄後、２５倍希釈ベルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を常温、３０分間反応させた。発色基質（シンプルステインＤＡＢ、Ｎｉｃｈｉｒｅｉ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にて発色させ、アクアテックス（メルク株式会社）にて封入した。標本は明視野顕微鏡（ライカマイクロシステムズ）を用いて観察した。ＣＣＤカメラ（ライカマイクロシステムズ）を用いて糸球体を撮影し、取得した画像をもとに、ＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を用いて、撮影面積、Ｆ４／８０陽性面積を計測した。その結果、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ＋ＨＦＤ群は、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ群に比べて、Ｆ４／８０免疫染色陽性面積率の有意な増加を示し、ＨＦＤ負荷による糸球体内への炎症細胞浸潤の亢進が観察された（図６−１、６−２）。【０１０１】
標本は明視野顕微鏡を用いて撮影した画像をもとに、ＩｍａｇｅＪを用いてＦ４／８０陽性面積率（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｒｅａ）（％）を算出した。【０１０２】
統計解析の流れ
各群の平均値の差の検定をＰｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用い、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔにより、ｎｏｍａｌ群とＡｄｒｉａｍａｙｃｉｎ投与群およびＡｄｒｉａｍａｙｃｉｎ  投与群とＡｄｒｉａｍａｙｃｉｎ＋ＨＦＤ群と比較する。
各群の平均はｍｅａｎ±ＳＤで表し、検定はそれぞれ有意水準５％で行う。【０１０３】
［参考文献］
９．ＣＫＤ診断ガイド２００９  日本腎臓学会編  東京医学社
１０．ラット及びマウスにおける腎機能低下モデルの簡便な作製方法、高山淳二、日本薬理誌＿２００８，１３１＿３７−４２
１１．Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｈａｉ−ｃｈｕｎ  ｙａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ，Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  Ｄｉｓ  ｍｏｄｅｌｓ＿２０１０，７＿１３−１９
１２．Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒｏｂｕｓｔ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ：Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ，Ｌｉ−ｊｕｎ  Ｍａ，ｅｔ  ａｌ，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ＿２００３，６４＿３５０−３５５
１３．Ｒｅｓｏｌｖｉｎ  Ｄ１  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ｐｏｄｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  １４−４−４β  Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ，Ｘｕｅｍｉｎｇ  Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｌｏｓ  ｏｎｅ＿２０１３，８＿１−１７【０１０４】
実施例４：高脂肪食負荷心線維化モデルを用いた線維化評価試験
［試験背景及び目的］
心不全や心筋梗塞には心臓の炎症、線維化が深く関与している（参考文献１４参照）。心疾患は有効な治療法の確立に至っておらず、心臓の炎症、線維化のメカニズムの解明、治療薬の開発が望まれている。【０１０５】
心線維化モデルとしてドキソルビシン誘導性モデルが報告されている（参考文献１５参照）。今回ドキソルビシン誘導性モデルに高脂肪食を負荷し、心線維化の進行への影響の検討を行った。【０１０６】
［遵守する基準及び準拠するガイドラインなど］
動物の福祉
「動物の愛護及び管理に関する法律」
（昭和４８年１０月１日法律第１０５号、最終改正平成２３年８月３０日法律第１０５号）
「実験動物の飼養及び保管並びに苦痛の軽減に関する基準」
（平成１８年４月２８日環境省告示第８８号）
「研究機関等における動物実験等の実施に関する基本指針」
（平成１８年６月１日、文部科学省告示第７１号）【０１０７】
なお、本試験は株式会社ステリック・エムシー動物実験規則動物実験委員会の承認を得て、試験施設で定めている実験動物の管理及び福祉に関する指針（株式会社ステリック・エムシー動物実験規則）に従って実施した。【０１０８】
［実験材料及び方法］
被験物質
名称：Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
保管方法：冷蔵（２−８℃）【０１０９】
投与液の調製
Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ投与液の調製
調製方法：Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎを３ｍｇ／ｍＬになるよう生理食塩水で溶解させた。
調製頻度：投与前に用時調製
保存方法：室温【０１１０】
使用動物
試験動物
種（系統）：Ｃ５７ＢＬ／６
性別：雄
入荷時週齢：９週齢
週齢設定根拠：心線維化モデルが作製されている参考文献１５に基づき設定した。
規格：ＳＰＦ
供給元：日本エスエルシー株式会社【０１１１】
群分け
投与開始日前日の体重を指標とし、平均体重が均一になるように４群（６匹／群）に分ける。群構成を表５に示す。【０１１２】
【表５】
2017150566.tif 000006
【０１１３】
心線維化モデルマウスの作製
Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎを生理食塩水にて３ｍｇ／ｍＬ濃度とし、１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスにマイショットを用いて５ｍＬ／ｋｇで腹腔内投与した。Ｖｅｈｉｃｌｅ群には生理食塩水を５ｍＬ／ｋｇで腹腔内投与した。作製方法は、心線維化モデルマウスが作製されている参考文献１６を参考に基づき設定した。
試験期間中においてＶｅｈｉｃｌｅ＋ＨＦＤ群とＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ＋ＨＦＤ群は高脂肪食（実施例１と同じ）を自由に摂取させた。【０１１４】
一般状態の観察及び体重測定
試験期間中は一般状態の観察、体重測定を実施した。死亡動物を発見した場合は速やかに剖検した。試験日の起算に関しては下記の通りとした。
心線維化モデルマウス作製開始日：０日（ｄａｙ０）【０１１５】
一般状態の観察
体重測定前に実施した。全個体について、体外表、栄養状態、姿勢、行動及び排泄物の異常などの一般状態を観察した。【０１１６】
剖検
Ｄａｙ２８日目に、全ての計画剖検動物について、腹部大動脈放血により屠殺し心臓を摘出した。採取した心臓は横断面で２分割し、両片を１０％ホルマリン固定液（和光純薬株式会社）に浸漬させ、２４時間室温にて固定後、７０％エタノールで平衡化した。その後エタノールによる脱水、キシレンによる透徹を行い、パラフィン包埋を行った。【０１１７】
病理組織学的検査
シリウスレッド染色
パラフィン切片を脱パラフィン・親水化した後、０．０３％ピクロ・シリウスレッド液（シリウスレッド：ワルデック社）に６０分間浸漬させる。脱水・透徹後、エンテランニュー（メルク株式会社）にて封入した。その結果、Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ＋ＨＦＤ群は、Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ群に比べて、シリウスレッド染色陽性面積率の有意な増加を示し、ＨＦＤ負荷によるコラーゲン蓄積の増加が観察された（図７−１、７−２）。【０１１８】
標本は明視野顕微鏡（ライカマイクロシステムズ）を用いて撮影した画像をもとに、ＩｍａｇｅＪを用いてコラーゲン陽性面積率（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｒｅａ）（％）を算出した。【０１１９】
統計解析の流れ
各群の平均値の差の検定をＰｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用い、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔにより、下記１）〜３）の組み合わせに対して解析を行った。
１）Ｖｅｈｉｃｌｅ群  ｖｓ．  Ｖｅｈｉｃｌｅ＋ＨＦＤ群
２）Ｖｅｈｉｃｌｅ群  ｖｓ．  Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ群
３）Ｖｅｈｉｃｌｅ群  ｖｓ．  Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ＋ＨＦＤ群。
各群の平均はｍｅａｎ±ＳＤで表し、検定はそれぞれ有意水準５％で行った。【０１２０】
［参考資料］
１４．Ｅｄｇｌｅｙ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｔｈｅｒ．，２０１２，３０，１，ｅ３０−４０
１５．Ｈａｇｉｒ  Ｂ．  Ｓｕｌｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．，２００７，１１７，１２，３７３０−３７４１【０１２１】
実施例５：肝癌に対するモデル動物の開発
［試験目的］
抗腫瘍薬の評価において、これまでに多くの実験モデルが開発され、薬効評価試験に用いられている。多くの癌モデルマウスの中でも、ヒトのがん細胞を使用した異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデルが使用されてきたが、癌の発生過程および微小環境を含めた癌組織構造に対する再現性が低いという問題点がある。一方、化学発癌モデルは、より臨床病態に近いモデルと考えているが、簡便性や評価期間がないといった課題がある。【０１２２】
今回新たに肝癌に対する治療薬の開発を行うためのモデル動物として、糖尿病を背景に持たないＤＥＮ−ＣＣｌ４投与マウスモデルの検討を行う（参考文献１６参照）。また、高脂肪食（実施例１と同じ）負荷との組み合わせによる相乗効果を検討するため、ＤＥＮ−ＣＣｌ４投与及びＨＦＤ負荷を行う群を設定し、同様に１４７日間飼育し屠殺した。【０１２３】
［遵守する基準及び準拠するガイドラインなど］
動物の福祉
「動物の愛護及び管理に関する法律」
（昭和４８年１０月１日法律第１０５号、最終改正平成２３年８月３０日法律第１０５号）
「実験動物の飼養及び保管並びに苦痛の軽減に関する基準」
（平成１８年４月２８日環境省告示第８８号）
「研究機関等における動物実験等の実施に関する基本指針」
（平成１８年６月１日、文部科学省告示第７１号）【０１２４】
なお、本試験は株式会社ステリック・エムシー動物実験委員会の承認を得て、試験施設で定めている実験動物の管理及び福祉に関する指針（株式会社ステリック・エムシー動物実験規則）に従って実施した。【０１２５】
［実験材料及び方法］
使用動物
試験動物
ＳＰＦマウス（Ｂ６Ｃ３Ｆ１／Ｓ１、日本エスエルシー株式会社）の雌２０匹を妊娠１４日で購入し、検疫・順化飼育を行った。全動物を自然分娩させ、出生した雄をモデル動物作製に使用した。なお、離乳は生後４週齢とした。【０１２６】
群構成
群構成を表６に示す。【０１２７】
【表６】
2017150566.tif 000007
【０１２８】
モデルマウスの作製
２週齢時の雄にＤＥＮ（Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、シグマアルドリッチジャパン株式会社）をＰＢＳにて０．２ｍｇ／ｍＬ濃度とし、５０μＬ／ｈｅａｄ（０．０１ｍｇ／ｈｅａｄ）で腹腔内に１回投与した。その後は離乳まで母動物に哺育させ、生後２８±２日齢時に離乳した。【０１２９】
８週齢よりＣＣｌ４（Ｃａｒｂｏｎ  ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ、シグマアルドリッチジャパン株式会社）をＯｌｉｖｅ  ｏｉｌ（シグマアルドリッチジャパン株式会社）にて５％ｖ／ｖ濃度とし、１００μＬ／ｈｅａｄで腹腔内に週２回投与した。ＰＢＳ群及びＤＥＮ群については、同様にしてＯｌｉｖｅ  ｏｉｌを投与した。【０１３０】
一般状態の観察、体重測定及び摂餌量測定
試験期間中は一般状態の観察、体重測定及び摂餌量測定を実施した。死亡動物を発見した場合は速やかに剖検した。試験日の起算に関しては下記の通りとする。
８週齢ＣＣｌ４投与開始日：０日（Ｄａｙ０）【０１３１】
一般状態の観察
体重測定前に実施した。全個体について、体外表、栄養状態、姿勢、行動及び排泄物の異常などの一般状態を観察した。【０１３２】
剖検
Ｄａｙ１４７に、全ての剖検動物について、イソフルラン麻酔下で、抗凝固剤としてヘパリンを用い心臓から血液を採取した。採血後、肝臓を摘出した。肝臓については、肝表面の最大径2  mm以上の腫瘍または結節の数および径について肉眼的に計測し、記録した。その結果、ＤＥＮ−ＣＣｌ４＋ＨＦＤ群は、ＤＥＮ−ＣＣｌ４群に比べて、腫瘍のサイズおよび腫瘍数が有意な増加を示し、ＨＦＤ負荷による発癌の促進が観察された（図８−１、８−２）。
採取した肝臓は、外側左葉を６等分し、２片をブアン固定液（シグマアルドリッチジャパン株式会社）に浸漬し、２４時間室温にて固定後、パラフィン包埋を行い、パラフィンブロックを作製した。別の２片をＯ．Ｃ．Ｔ．ｃｏｍｐｏｕｎｄ（サクラファインテックジャパン株式会社）を満たしたクリオディッシュ（株式会社硝英製作所）に包埋後、速やかに液体窒素にて凍結し、−８０°Ｃにて保存した。その他の肝臓片については凍結保存した。【０１３３】
シリウスレッド染色
パラフィン切片を脱パラフィン・親水化した後、０．０３％ピクロ・シリウスレッド液（シリウスレッド：ワルデック社）に６０分間浸漬させた。０．５％酢酸溶液及びＲＯ水に通した後、エンテランニュー（メルク株式会社）にて封入した。標本は明視野顕微鏡（ライカマイクロシステムズ）を用いて観察した。１００倍の視野にて、１切片あたり５視野の写真をＣＣＤカメラ（ライカマイクロシステムズ）を用いて撮影した。撮影した画像をもとに、ＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を用いて、各視野における撮影面積、シリウスレッド染色陽性面積を計測した。その結果、ＤＥＮ−ＣＣｌ４＋ＨＦＤ群は、ＤＥＮ−ＣＣｌ４群に比べて、シリウスレッド染色陽性面積率の有意な増加を示し、ＨＦＤ負荷によるコラーゲン蓄積の増加が観察された（図９−１、９−２）。【０１３４】
ｐ５３免疫染色
凍結ブロックより作製された凍結切片をアセトンにて固定後、０．０３％過酸化水素水にて内因性ベルオキシダーゼの阻害を行った。ブロッキング液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ、ＤＳｐｈａｒｍａｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を常温、１０分間反応させた後、１００倍希釈の抗ｐ５３抗体（ａｂｃａｍ）を４℃、一晩反応させた。ＰＢＳにて洗浄後、２５倍希釈ぺルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）を常温、３０分間反応させた。発色基質（シンプルステインＤＡＢ、Ｎｉｃｈｉｒｅｉ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にて発色させ、アクアテックス（メルク株式会社）にて封入した。標本は明視野顕微鏡（ライカマイクロシステムズ）を用いて観察した。中心静脈を中心とした２００倍の視野にて、１切片あたり５視野の写真をＣＣＤカメラ（ライカマイクロシステムズ）を用いて撮影した。撮影した画像をもとに、ＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を用いて、各視野における撮影面積、ｐ５３陽性面積を計測した。その結果、ＤＥＮ−ＣＣｌ４＋ＨＦＤ群は、ＤＥＮ−ＣＣｌ４群に比べて、ｐ５３免疫染色陽性面積率の有意な増加を示し、ＨＦＤ負荷によるｐ５３タンパク質蓄積の増加が観察された（図１０−１、１０−２）。正常マウスの肝臓切片において、ｐ５３陽性領域は検出されなかった（図１０−１、１０−２）。【０１３５】
統計解析の流れ
各群の平均値の差の検定をＰｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用い、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔにより、Ｎｏｒｍａｌ群とＤＥＮ−ＣＣｌ４群およびＤＥＮ−ＣＣｌ４群とＤＥＮ−ＣＣｌ４＋ＨＦＤ群と比較した。
各群の代表値はｍｅａｎ±ＳＤで表し、検定はそれぞれ有意水準５％で行った。【０１３６】
［参考文献］
１６．Ｔｈｅ  ＤＥＮ  ａｎｄ  ＣＣｌ４−ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｔａｋｅｋｉ  Ｕｅｈａｒａ，  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，＿２０１５，３０＿１−１０
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明のタンパク質凝集性病変を呈する非ヒト動物は、疾患の予防又は治療薬のスクリーニング、及び、薬物の副作用の評価などに有用である。
【図１−１】
2017150566.tif 000008
【図１−２】
2017150566.tif 000009
【図２】
2017150566.tif 000010
【図３】
2017150566.tif 000011
【図４】
2017150566.tif 000012
【図５−１】
2017150566.tif 000013
【図５−２】
2017150566.tif 000014
【図６−１】
2017150566.tif 000015
【図６−２】
2017150566.tif 000016
【図７−１】
2017150566.tif 000017
【図７−２】
2017150566.tif 000018
【図８−１】
2017150566.tif 000019
【図８−２】
2017150566.tif 000020
【図９−１】
2017150566.tif 000021
【図９−２】
2017150566.tif 000022
【図１０−１】
2017150566.tif 000023
【図１０−２】
2017150566.tif 000024
【国際調査報告】
2017150566.tif 000025
2017150566.tif 000026
2017150566.tif 000027
2017150566.tif 000028