(57)【要約】  目的タンパク質を活性な可溶性組換タンパク質として形質転換体中で発現させるための効率的な方法として、以下の工程を含む、基準体に比して、組換体あたりの活性が向上した酵素を製造する方法を提供する。（１）基準体のアミノ酸配列において１以上のシステインが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異体を発現する組換体を作成する工程、（２）基準体の活性１００％に比して５０％以上の組換体あたりの活性を示す複数の変異体を選択する工程、（３）工程（２）において選択されたそれぞれの変異体が有するアミノ酸残基が置換された部位のうち、２以上の部位において、それぞれ対応するアミノ酸残基が置換された変異体を発現させる工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基準体のアミノ酸配列において２以上のシステインが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異体を発現させる工程、
を含む、基準体に比して、組換体あたりの活性が向上した酵素の製造方法。
【請求項２】
以下の工程を含む、請求項１に記載の酵素の製造方法；
（１）基準体のアミノ酸配列において１以上のシステインが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異体を発現する組換体を作成する工程、
（２）基準体の活性１００％に比して５０％以上の組換体あたりの活性を示す複数の変異体を選択する工程、
（３）工程（２）において選択されたそれぞれの変異体が有するアミノ酸残基が置換された部位のうち、２以上の部位において、それぞれ対応するアミノ酸残基が置換された変異体を発現させる工程。
【請求項３】
前記酵素がアルコールアシルトランスフェラーゼである請求項１又は２に記載の酵素の製造方法。
【請求項４】
前記基準体のアミノ酸配列が、配列番号１、２、３、６４、６５及び６６のいずれかに示されるアミノ酸配列である、請求項３記載の酵素の製造方法。
【請求項５】
前記他のアミノ酸残基が、アラニン又はアルギニンである請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素の製造方法。
【請求項６】
基準体に比して活性が向上した、変異型アルコールアシルトランスフェラーゼであって、
基準体のアミノ酸配列において１以上のシステインが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する、変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
【請求項７】
配列番号１又は２に示すアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる請求項６に記載の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼであって、
以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて４８番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（２）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１５０番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（３）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１６７番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（４）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２７０番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（５）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２７４番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（６）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて４４７番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
【請求項８】
配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる請求項６に記載の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼであって、
以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２０６番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（２）配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２０９番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（３）配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２５６番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（４）配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２６９番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（５）配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて３２２番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
【請求項９】
配列番号６５に示すアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる請求項６に記載の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼであって、
以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）配列番号６５に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１１５番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（２）配列番号６５に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１６７番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（３）配列番号６５に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１７９番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（４）配列番号６５に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて３２５番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（５）配列番号６５に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて３５６番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
【請求項１０】
前記他のアミノ酸残基が、アラニン又はアルギニンである請求項６〜９のいずれか一項に記載の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
【請求項１１】
配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する請求項６に記載の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）４８番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（２）１５０番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（３）１６７番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（４）２７０番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（５）２７４番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（６）４４７番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
【請求項１２】
配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列において以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する請求項６に記載の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）２０６番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（２）２０９番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（３）２５６番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（４）２６９番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（５）３２２番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
【請求項１３】
配列番号６５に示すアミノ酸配列において以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する請求項６に記載の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）１１５番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（２）１６７番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（３）１７９番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（４）３２５番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（５）３５６番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
【請求項１４】
前記他のアミノ酸残基が、アラニン又はアルギニンである請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
【請求項１５】
配列番号４又は７に記載のアミノ酸配列からなる請求項１１記載の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
【請求項１６】
さらに以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する請求項７又は１１記載の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）６４番目のアラニンのバリン、イソロイシン又はスレオニンへの置換、
（２）１１７番目のリジンのグルタミンへの置換、
（３）２４８番目のバリンのアラニンへの置換、
（４）３６３番目のグルタミンのリジン、プロリン、アデニン、アルギニン、グリシン又はトリプトファンへの置換。
【請求項１７】
配列番号５，６，８〜１１，１３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる請求項１６記載の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
【請求項１８】
配列番号１又は２に示すアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる変異型アルコールアシルトランスフェラーゼであって、
以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて６４番目のアラニンに相当するアミノ酸残基のバリン、イソロイシン又はスレオニンへの置換、
（２）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１１７番目のリジンに相当するアミノ酸のグルタミンへの置換、
（３）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２４８番目のバリンに相当するアミノ酸のアラニンへの置換、
（４）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて３６３番目のグルタミンに相当するアミノ酸のリジン、プロリン、アデニン、アルギニン、グリシン又はトリプトファンへの置換。
【請求項１９】
配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）６４番目のアラニンのバリン、イソロイシン又はスレオニンへの置換、
（２）１１７番目のリジンのグルタミンへの置換、
（３）２４８番目のバリンのアラニンへの置換、
（４）３６３番目のグルタミンのリジン、プロリン、アデニン、アルギニン、グリシン又はトリプトファンへの置換。
【請求項２０】
配列番号３，５，６，８〜１１，１３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる請求項１９記載の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
【請求項２１】
請求項６〜２０のいずれか一項に記載のアルコールアシルトランスフェラーゼを発現するベクター。
【請求項２２】
請求項２１記載のベクターが導入された形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型酵素の製造方法及び変異型アルコールアシルトランスフェラーゼに関する。より詳しくは、アルコールアシルトランスフェラーゼなどの酵素を、高活性な可溶性組換タンパク質として得るための方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、細胞内で翻訳された後、固有の立体構造に折りたたまれて、機能を有するようになる。形質転換体（組換体）を用いて異種タンパク質を発現させる場合には、タンパク質の正常なフォールディングが宿主細胞内で行われず、封入体が形成されてしまうことがある。封入体中のタンパク質は、本来の活性が失われた不活性型タンパク質となり、場合によって不溶化することが知られている。タンパク質の由来種の細胞内環境（温度、転写速度、翻訳速度等）とは異なる宿主の細胞内環境下では当該タンパク質の正常なフォールディングがなされないことが、封入体の形成の要因と考えられている。【０００３】
この問題を解決するため、タンパク質に変異を導入することによって、組換体中で野生型タンパク質と同様の正常なフォールディングを実現し、活性型として発現する変異タンパク質を取得する試みがなされている。例えば、植物由来のヒドロキシニトリルリアーゼについて、変異の導入によって可溶性が大きく向上した酵素を取得できたことが報告されている（非特許文献１）。【０００４】
本発明に関連して、アルコールアシルトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）について説明する。特許文献１〜３には、バイオマスから生成されるイソブチリル−ＣｏＡやメタクリリル−ＣｏＡからアルコールアシルトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）を用いてイソ酪酸エステルやメタクリル酸エステルを製造する方法が提案されている。【０００５】
カルボン酸エステル類は、各種の工業用化学品、香料、医薬品などの原料として用いられている。例えばイソ酪酸エステルは、主に香料用エステル類、医薬品、過酸化物などの原料として重要なエステル化合物である。メタクリル酸エステルは、主にアクリル樹脂の原料として使われており、塗料、接着剤、樹脂改質剤などの分野のコモノマーとしても多くの需要がある。【０００６】
近年、地球温暖化防止及び環境保護の観点から、炭素源として従来の化石原料に替えてバイオマスを用い、種々の化学製品を製造する技術が注目されている。イソ酪酸エステルやメタクリル酸エステルについても、バイオマスからの製造が期待されている。【０００７】
ＡＡＴを用いてバイオマスからイソ酪酸エステルやメタクリル酸エステルなどのエステルを合成するための方法として、バイオマスからイソブチリル−ＣｏＡやメタクリリル−ＣｏＡなどのＣｏＡ化合物を合成する遺伝子群と、ＣｏＡ化合物からエステルへの反応を触媒するＡＡＴ遺伝子とを導入した微生物組換体を用いた発酵生産が考えられる。【０００８】
しかしながら、組換体中でＡＡＴを発現させる場合にも、上述の封入体形成が問題となっている。特に植物由来ＡＡＴは、大腸菌を宿主として発現させた場合、大部分が不活性な不溶性タンパク質として発現することが知られている（非特許文献２）。【０００９】
非特許文献３，４では、リンゴ由来のＡＡＴを大腸菌組換体で発現させた場合、特定の系統（Ｃ４３（ＤＥ３））を用いた場合においてのみ可溶性タンパク質として得られ、一般的な系統（ＢＬ２１（ＤＥ３）誘導株）では可溶性タンパク質としては得られなかったことが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１５−１１６１４１号公報
【特許文献２】国際公開２０１４／０３８２１４号
【特許文献３】国際公開２０１４／０３８２１６号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Protein Eng. Des. Sel. (2011) 24:607-616.
【非特許文献２】Metabolic Engineering (2015) 27:20-28.
【非特許文献３】FEBS J. (2005) 272: 3132-3144.
【非特許文献４】Phytochemistry (2006) 67:658-667.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述の通り、封入体形成を抑制するため、タンパク質に変異を導入することによって、形質転換体（組換体）中で野生型タンパク質と同様の正常なフォールディングを実現する方法が提案されている。しかし、この方法においては、正常なフォールディングの実現を可能とする変異をどのようにして効率的に探索するかが課題となる。【００１３】
そこで、本発明は、目的タンパク質を活性な可溶性組換タンパク質として組換体中で発現させるための効率的な方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題解決のため、本発明は、以下の〔１〕〜〔２５〕を提供する。
〔１〕  基準体のアミノ酸配列において２以上のシステインが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異体を発現させる工程、
を含む、基準体に比して、組換体あたりの活性が向上した酵素の製造方法。
〔２〕  以下の工程を含む、〔１〕の酵素の製造方法；
（１）基準体のアミノ酸配列において１以上のシステインが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異体を発現する組換体を作成する工程、
（２）基準体の活性１００％に比して５０％以上の組換体あたりの活性を示す複数の変異体を選択する工程、
（３）工程（２）において選択されたそれぞれの変異体が有するアミノ酸残基が置換された部位のうち、２以上の部位において、それぞれ対応するアミノ酸残基が置換された変異体を発現させる工程。
〔３〕  前記酵素がアルコールアシルトランスフェラーゼである〔１〕又は〔２〕の酵素の製造方法。
〔４〕  前記基準体のアミノ酸配列が、配列番号１、２、３、６４、６５及び６６のいずれかに示されるアミノ酸配列である、〔３〕の酵素の製造方法。
〔５〕  前記他のアミノ酸残基が、アラニン又はアルギニンである〔１〕〜〔４〕のいずれかの酵素の製造方法。【００１５】
〔６〕  基準体に比して活性が向上した、変異型アルコールアシルトランスフェラーゼであって、
基準体のアミノ酸配列において１以上のシステインが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する、変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
〔７〕  配列番号１又は２に示すアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる〔６〕の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼであって、
以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて４８番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（２）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１５０番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（３）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１６７番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（４）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２７０番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（５）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２７４番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（６）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて４４７番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
〔８〕  配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる〔６〕の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼであって、
以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２０６番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（２）配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２０９番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（３）配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２５６番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（４）配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２６９番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（５）配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて３２２番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
〔９〕  配列番号６５に示すアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる〔６〕の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼであって、
以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）配列番号６５に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１１５番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（２）配列番号６５に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１６７番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（３）配列番号６５に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１７９番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（４）配列番号６５に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて３２５番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（５）配列番号６５に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて３５６番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
〔１０〕  前記他のアミノ酸残基が、アラニン又はアルギニンである〔６〕〜〔９〕のいずれかの変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
〔１１〕  植物由来である〔７〕〜〔１０〕のいずれかの変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
〔１２〕  配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する〔６〕の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）４８番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（２）１５０番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（３）１６７番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（４）２７０番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（５）２７４番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（６）４４７番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
〔１３〕  配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列において以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する〔６〕の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）２０６番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（２）２０９番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（３）２５６番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（４）２６９番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（５）３２２番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
〔１４〕  配列番号６５に示すアミノ酸配列において以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する〔６〕の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）１１５番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（２）１６７番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（３）１７９番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（４）３２５番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（５）３５６番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
〔１５〕  前記他のアミノ酸残基が、アラニン又はアルギニンである〔１２〕〜〔１４〕のいずれか一項に記載の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
〔１６〕  配列番号４又は７に記載のアミノ酸配列からなる〔１２〕の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
〔１７〕  さらに以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する〔７〕又は〔１２〕記載の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）６４番目のアラニンのバリン、イソロイシン又はスレオニンへの置換、
（２）１１７番目のリジンのグルタミンへの置換、
（３）２４８番目のバリンのアラニンへの置換、
（４）３６３番目のグルタミンのリジン、プロリン、アデニン、アルギニン、グリシン又はトリプトファンへの置換。
〔１８〕  配列番号５，６，８〜１１，１３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる〔１７〕の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。【００１６】
〔１９〕  配列番号１又は２に示すアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる変異型アルコールアシルトランスフェラーゼであって、
以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて６４番目のアラニンに相当するアミノ酸残基のバリン、イソロイシン又はスレオニンへの置換、
（２）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１１７番目のリジンに相当するアミノ酸のグルタミンへの置換、
（３）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２４８番目のバリンに相当するアミノ酸のアラニンへの置換、
（４）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて３６３番目のグルタミンに相当するアミノ酸のリジン、プロリン、アデニン、アルギニン、グリシン又はトリプトファンへの置換。
〔２０〕  植物由来である〔１９〕のいずれかの変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
〔２１〕  配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ；
（１）６４番目のアラニンのバリン、イソロイシン又はスレオニンへの置換、
（２）１１７番目のリジンのグルタミンへの置換、
（３）２４８番目のバリンのアラニンへの置換、
（４）３６３番目のグルタミンのリジン、プロリン、アデニン、アルギニン、グリシン又はトリプトファンへの置換。
〔２２〕  配列番号３，５，６，８〜１１，１３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる〔２１〕の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
〔２３〕  〔６〕〜〔２０〕のいずれかのアルコールアシルトランスフェラーゼを発現するベクター。
〔２４〕  〔２３〕のベクターが導入された形質転換体。【００１７】
また、本発明は、他の一側面において、以下の［１］〜［２４］をも提供する。
［１］  以下の工程を含む、基準体に比して、組換体あたりの活性が向上した酵素を製造する方法。
（１）基準体のアミノ酸配列において１以上のシステインが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異体を発現する組換体を作成する工程。
（２）基準体に比して５０％以上の組換体あたりの活性を示す変異体を選択する工程。
（３）工程（２）において選択されたそれぞれの変異体が有するアミノ酸置換が導入された部位のうち２以上の部位においてそれぞれ対応するアミノ酸置換が導入された変異体を発現させる工程。
［２］  前記酵素がアルコールアシルトランスフェラーゼである［１］の製造方法。
［３］  前記基準体のアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示されるアミノ酸配列である、［２］の製造方法。
［４］  前記他のアミノ酸残基が、アラニン又はアルギニンである［１］〜［３］のいずれかの製造方法。【００１８】
［５］  基準体のアミノ酸配列において１以上のシステインが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異体を発現させる工程、
を含む、基準体に比して組換体あたりの活性が向上した酵素の製造方法。
［６］  前記酵素がアルコールアシルトランスフェラーゼである［５］の製造方法。
［７］  前記基準体のアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示されるアミノ酸配列である、［６］の製造方法。
［８］  前記他のアミノ酸残基が、アラニン又はアルギニンである［５］〜［７］のいずれかの製造方法。【００１９】
［９］  配列番号１記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる変異型アルコールアシルトランスフェラーゼであって、
以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて４８番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１５０番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１６７番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（４）配列番号１に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２７０番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（５）配列番号１に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２７４番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（６）配列番号１に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて４４７番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
［１０］  前記他のアミノ酸残基が、アラニン又はアルギニンである［９］の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
［１１］  配列番号１に示すアミノ酸配列において以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
（１）４８番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（２）１５０番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（３）１６７番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（４）２７０番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（５）２７４番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（６）４４７番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
［１２］  前記他のアミノ酸残基が、アラニン又はアルギニンである［１１］の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
［１３］  配列番号４又は７に記載のアミノ酸配列からなる［１１］の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
［１４］  さらに以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する［１１］の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
（１）６４番目のアラニンのバリン、イソロイシン又はスレオニンへの置換。
（２）１１７番目のリジンのグルタミンへの置換。
（３）２４８番目のバリンのアラニンへの置換。
（４）３６３番目のグルタミンのリジン、プロリン、アデニン、アルギニン、グリシン又はトリプトファンへの置換。
［１５］  配列番号５，６，８〜１１，１３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる［１４］の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。【００２０】
［１６］  配列番号１記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる変異型アルコールアシルトランスフェラーゼであって、
以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて６４番目のアラニンに相当するアミノ酸残基のバリン、イソロイシン又はスレオニンへの置換。
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２４８番目のバリンに相当するアミノ酸のアラニンへの置換。
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて３６３番目のグルタミンに相当するアミノ酸のリジン、プロリン、アデニン、アルギニン、グリシン又はトリプトファンへの置換。
（４）配列番号１に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１１７番目のリジンに相当するアミノ酸のグルタミンへの置換。
［１７］  配列番号１に示すアミノ酸配列において以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。
（１）６４番目のアラニンのバリン、イソロイシン又はスレオニンへの置換。
（２）１１７番目のリジンのグルタミンへの置換。
（３）２４８番目のバリンのアラニンへの置換。
（４）３６３番目のグルタミンのリジン、プロリン、アデニン、アルギニン、グリシン又はトリプトファンへの置換。
［１８］  配列番号３，５，６，８〜１１，１３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる［１７］の変異型アルコールアシルトランスフェラーゼ。【００２１】
［１９］  ［９］〜［１８］のアルコールアシルトランスフェラーゼを発現するベクター。
［２０］  ［１９］のベクターが導入された形質転換体。【００２２】
［２１］  基準体に比して、組換体あたりの活性が向上した植物由来酵素を製造する方法であって、
（１）基準体のアミノ酸配列において１又は２以上のシステインが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異体を発現する非植物細胞組換体を作成する工程と、
（２）前記変異体の組換体あたりの酵素活性を測定する工程と、
（３）基準体に比して５０％以上の組換体あたりの活性を示す変異体を選択する工程と、
（４）工程（３）において選択されたそれぞれの変異体が有するアミノ酸置換が導入された部位のうち２以上の部位においてそれぞれ対応するアミノ酸置換が導入された変異体を前記非植物細胞中で発現させる工程と、を含む製造方法。
［２２］  前記酵素がリンゴ由来のアルコールアシルトランスフェラーゼである［２１］の製造方法。
［２３］  前記非植物細胞が大腸菌細胞である［２１］又は［２２］の製造方法。
［２４］  前記他のアミノ酸残基が、アラニン又はアルギニンである［２１］〜［２３］のいずれかの製造方法。【００２３】
本発明に係る変異型酵素の製造方法において、「基準体」とは、１以上のシステインの他のアミノ酸残基への置換を導入する対象となる酵素を意味する。本発明に係る製造方法により得られる変異型酵素のアミノ酸配列は、１以上のシステインが他のアミノ酸残基に置換されている点でのみ、基準体のアミノ酸配列と相違する。基準体は、天然型（野生型）の酵素に限られず、野生型の酵素のアミノ酸配列にアミノ酸置換が一以上導入された変異型の酵素であってもよい。また、基準体は、野生型の酵素のアミノ酸配列に一以上のアミノ酸を挿入又は付加したアミノ酸配列、あるいは野生型の酵素のアミノ酸配列から一以上のアミノ酸を欠失させたアミノ酸配列を有する変異型の酵素であってもよい。これらの変異型の酵素を基準体として、さらに１又は２以上のシステインの他のアミノ酸残基への置換を導入することによって、活性の向上した変異型酵素を得ることができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、目的タンパク質を活性な可溶性組換タンパク質として組換体中で発現させるための効率的な方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】配列番号１（リンゴ）、配列番号１２（リンゴ）、配列番号６１（ナシ）、配列番号６２（ビワ）及び配列番号６３（カキ）由来のＡＡＴのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図２】配列番号６６（トマト（野生種））、配列番号６７（トマト（栽培種））、配列番号６８（バレイショ）、配列番号６９（トウガラシ）及び配列番号７０（タバコ）由来のＡＡＴのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図３】配列番号６５（イチゴ）、配列番号７１（チリイチゴ）、配列番号７２（エゾヘビイチゴ）及び配列番号７３（ハマナス）由来のＡＡＴのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図４】リンゴＡＡＴの１５個のシステインを１つずつアラニンに置換して作成した１５種類の変異体を発現する組換体について、ＡＡＴ活性を測定した結果を示すグラフである。縦軸は、菌体重量あたりのＡＡＴ活性を、システイン置換を有さない基準体（ｐＡＡＴ１１６）を発現する組換体の活性を１とした相対値で示す。
【図５】図上段は、リンゴ野生型ＡＡＴに４重変異を導入した変異体（ｐＡＡＴ０２１）、システイン６置換を導入した変異体（ｐＡＡＴ０２４）、４重変異とシステイン６置換を導入した変異体（ｐＡＡＴ０２５）、４重変異とＣｙｓ１５０Ａｒｇを導入した変異体（ｐＡＡＴ１５５）、４重変異とシステイン６置換（うち１５０位はＣｙｓ１５０Ａｒｇ）を導入した変異体（ｐＡＡＴ１５４）を発現する組換体について、菌体重量あたりのＡＡＴ活性を測定した結果を示すグラフである。縦軸は、ＡＡＴ活性を、４重変異及びシステイン置換を有さない基準体（ｐＡＡＴ１１６）を発現する組換体の活性を１とした相対値で示す。図下段は、変異体を含む細胞抽出液の可溶性画分と不溶性画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動像である。
【図６】図上段は、リンゴ野生型ＡＡＴに４重変異を導入した変異体（ｐＡＡＴ０２１）、４重変異とシステイン６置換を導入した変異体（ｐＡＡＴ０２５）、４重変異とシステイン５置換を導入した変異体（ｐＡＡＴ１５１）、４重変異とシステイン４置換を導入した変異体（ｐＡＴＭ０１７、ｐＡＴＭ０１８、ｐＡＴＭ０１９、ｐＡＴＭ０２１）を発現する組換体について、菌体重量あたりのＡＡＴ活性を測定した結果を示すグラフである。縦軸は、ＡＡＴ活性を、４重変異及びシステイン置換を有さない基準体（ｐＡＡＴ１１６）を発現する組換体の活性を１とした相対値で示す。図下段は、変異体を含む細胞抽出液の可溶性画分と不溶性画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動像である。
【図７】図上段は、トマトＡＡＴの８個のシステインを１つずつアラニンに置換して作成した８種類の変異体を発現する組換体と、トマト野生型ＡＡＴにシステイン５置換を導入した変異体（ｐＡＡＴ１６４）を発現する組換体について、菌体重量あたりのＡＡＴ活性を測定した結果を示すグラフである。縦軸は、ＡＡＴ活性を、基準体（ｐＡＡＴ０３２）を発現する組換体の活性を１とした相対値で示す。図下段は、変異体を含む細胞抽出液の可溶性画分と不溶性画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動像である。
【図８】図上段は、イチゴＡＡＴの９個のシステインを１つずつアラニンに置換して作成した９種類の変異体を発現する組換体と、イチゴ野生型ＡＡＴにシステイン５置換を導入した変異体（ｐＡＡＴ０３７）を発現する組換体について、菌体重量あたりのＡＡＴ活性を測定した結果を示すグラフである。縦軸は、ＡＡＴ活性を、基準体（ｐＡＡＴ０３３）を発現する組換体の活性を１とした相対値で示す。図下段は、変異体を含む細胞抽出液の可溶性画分と不溶性画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動像である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２７】
１．変異型酵素の製造方法
本発明は、基準体のアミノ酸配列において２以上のシステインが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異体を発現させる工程、を含む、基準体に比して組換体あたりの活性が向上した酵素の製造方法に関する。
具体的には、本発明に係る変異型酵素の製造方法は、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする。
（１）基準体のアミノ酸配列において１以上のシステインが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異体を発現する組換体を作成する工程。
（２）基準体の活性１００％に比して５０％以上の組換体あたりの活性を示す複数の変異体を選択する工程。
（３）工程（２）において選択されたそれぞれの変異体が有するアミノ酸残基が置換された部位のうち２以上の部位においてそれぞれ対応するアミノ酸残基が置換された変異体を発現させる工程。
【００２８】
［酵素］
本発明に係る変異型酵素の製造方法が対象とする酵素は、当該酵素の由来種とは異なる宿主で基準体を発現させた場合に、形質転換体（組換体）中で封入体を形成する酵素であることが好ましい。本発明に係る変異型酵素の製造方法が対象とする酵素は、例えば、植物由来の酵素であって、大腸菌等の非植物細胞で基準体を発現させた場合に、組換体細胞中で封入体を形成する酵素であってよい。
【００２９】
酵素の例としては、特に限定されないが、アルコールアシルトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）などのトランスフェラーゼ類；デヒドロゲナーゼやオキシダーゼ、オキシゲナーゼなどのオキシドレダクターゼ類；エステラーゼやニトリラーゼ、アミダーゼなどのヒドロラーゼ類；ラセマーゼやエピメラーゼ、ムターゼなどのイソメラーゼ類；アシルＣｏＡシンテターゼやＤＮＡリガーゼなどのリガーゼ類；ニトリルヒドラターゼやヒドロキシニトリルリアーゼ、アンモニアリアーゼなどのリアーゼ類などが挙げられる。
【００３０】
酵素の由来としては、動物、植物、糸状菌、酵母、古細菌や真正細菌が挙げられ、上記の特徴を有するものであれば特に限定されない。
【００３１】
本発明のＡＡＴの由来としては、例えば、ショウガ目（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）、バラ目（Ｒｏｓａｌｅｓ）、ツツジ目（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）、ウリ目（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｌｅｓ）、アブラナ目（Ｂｒａｓｓｉｃａｌｅｓ）、クスノキ目（Ｌａｕｒａｌｅｓ）、イネ目（Ｐｏａｌｅｓ）、ヤシ目（Ａｒｅｃａｌｅｓ）、クサスギカズラ目（Ａｓｐａｒａｇａｌｅｓ）、ユキノシタ目（Ｓａｘｉｆｒａｇａｌｅｓ）、ナデシコ目（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ）、ブドウ目（Ｖｉｔａｌｅｓ）、キントラノオ目（Ｍａｌｐｉｇｈｉａｌｅｓ）、カタバミ目（Ｏｘａｌｉｄａｌｅｓ）、マメ目（Ｆａｂａｌｅｓ）、ムクロジ目（Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ）、アオイ目（Ｍａｌｖａｌｅｓ）、フトモモ目（Ｍｙｒｔａｌｅｓ）、キンポウゲ目（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ）、ナス目（Ｓｏｌａｎａｌｅｓ）、シソ目（Ｌａｍｉａｌｅｓ）、リンドウ目（Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ）およびキク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）からなる群から選択されるいずれかの目に属するものである。これらの中で、好ましくは、ショウガ目（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）、バラ目（Ｒｏｓａｌｅｓ）、ツツジ目（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）、ウリ目（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｌｅｓ）、アブラナ目（Ｂｒａｓｓｉｃａｌｅｓ）およびクスノキ目（Ｌａｕｒａｌｅｓ）からなる群から選択されるいずれかの目に属するものが挙げられる。
【００３２】
ショウガ目に属するものとしてはバショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）およびショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ）、バラ目に属するものとしてはバラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）およびクワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）、ツツジ目に属するものとしてはツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）、カキノキ科（Ｅｂｅｎａｃｅａｅ）およびツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）、ウリ目に属するものとしてはウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、アブラナ目に属するものとしてはパパイア科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）およびアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、クスノキ目に属するものとしてはクスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）、イネ目に属するものとしてはパイナップル科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）およびイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、ヤシ目に属するものとしてはヤシ科（Ａｒｅｃａｃｅａｅ）、クサスギカズラ目に属するものとしてはラン科（Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ）およびアヤメ科（Ｉｒｉｄａｃｅａｅ）、ユキノシタ目に属するものとしてはスグリ科（Ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、ナデシコ目に属するものとしてはナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、ブドウ目に属するものとしてはブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）、キントラノオ目に属するものとしてはキントラノオ科（Ｍａｌｐｉｇｈｉａｃｅａｅ）、トケイソウ科（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）およびヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ）、カタバミ目に属するものとしてはカタバミ科（Ｏｘａｌｉｄａｃｅａｅ）、マメ目に属するものとしてはマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、ムクロジ目に属するものとしてはミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）、ムクロジ科（Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）およびウルシ科（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、アオイ目に属するものとしてはアオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、フトモモ目に属するものとしてはミソハギ科（Ｌｙｔｈｒａｃｅａｅ）、アカバナ科（Ｏｎａｇｒａｃｅａｅ）およびフトモモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）、キンポウゲ目に属するものとしてはキンポウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）およびケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、ナス目に属するものとしてはナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、シソ目に属するものとしてはモクセイ科（Ｏｌｅａｃｅａｅ）、クマツヅラ科（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）およびシソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）、リンドウ目に属するものとしてはキョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）、キク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）に属するものとしてはキク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）の植物が好ましい。上記植物の近縁種も利用することができる。これらの中でさらに好ましくは、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、ツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、パパイア科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）およびクスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）に属する植物である。
【００３３】
具体的にはバショウ科に属するものとしてはバショウ（Ｍｕｓａ）属、ショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ）に属するものとしてはショウガ属（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ）、バラ科に属するものとしてはオランダイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ）属、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属、サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ）属、ナシ（Ｐｙｒｕｓ）属、ビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ）属、ボケ（Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓ）属、キイチゴ（Ｒｕｂｕｓ）属およびバラ（Ｒｏｓａ）属、クワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）に属するものとしてはイチジク（Ｆｉｃｕｓ）属、ツツジ科に属するものとしてはスノキ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）属、マタタビ科に属するものとしてはマタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）属、カキノキ科に属するものとしてはカキノキ（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ）属、ツバキ科に属するものとしてはツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属、ウリ科に属するものとしてはキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ）属およびスイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）属、パパイア科に属するものとしてはパパイア（Ｃａｒｉｃａ）属およびヴァスコンセレア（Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｌｅａ）属、アブラナ科に属するものとしてはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属、クスノキ科に属するものとしてはワニナシ（Ｐｅｒｓｅａ）属、パイナップル科に属するものとしてはアナナス属（Ａｎａｎａｓ）、イネ科に属するものとしてはイネ（Ｏｒｙｚａ）属、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）属、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ）属、トウモロコシ（Ｚｅａ）属、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）属およびヤマカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）属、ヤシ科に属するものとしてはココヤシ（Ｃｏｃｏｓ）属、ラン科に属するものとしてはバンダ（Ｖａｎｄａ）属、アヤメ科に属するものとしてはアヤメ（Ｉｒｉｓ）属、スグリ科に属するものとしてはスグリ（Ｒｉｂｅｓ）属、ナデシコ科に属するものとしてはカスミソウ属（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）、ブドウ科に属するものとしてはブドウ（Ｖｉｔｉｓ）属、キントラノオ科に属するものとしてはヒイラギトラノオ（Ｍａｌｐｉｇｈｉａ）属、トケイソウ科に属するものとしてはトケイソウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ）属、トウダイグサ科に属するものとしてはトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ）属、ヤナギ科に属するものとしてはヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）属、カタバミ科に属するものとしてはゴレンシ（Ａｖｅｒｒｈｏａ）属、マメ科に属するものとしてはウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）属、ハウチワマメ（Ｌｕｐｉｎｕｓ）属、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ）属およびチョウマメ（Ｃｌｉｔｏｒｉａ）属、ミカン科に属するものとしてはミカン（Ｃｉｔｒｕｓ）属およびアエグレ（Ａｅｇｌｅ）属、ムクロジ科に属するものとしてはレイシ（Ｌｉｔｃｈｉ）属、ウルシ科に属するものとしてはマンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ）属、アオイ科に属するものとしてはドリアン（Ｄｕｒｉｏ）属およびカカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属、ミソハギ科に属するものとしてはザクロ（Ｐｕｎｉｃａ）属、アカバナ科に属するものとしてはサンジソウ（Ｃｌａｒｋｉａ）属、フトモモ科に属するものとしてはバンジロウ（Ｐｓｉｄｉｕｍ）属、キンポウゲ科に属するものとしてはルイヨウショウマ（Ａｃｔａｅａ）属、ケシ科に属するものとしてはケシ（Ｐａｐａｖｅｒ）属、ナス科に属するものとしてはナス（Ｓｏｌａｎｕｍ）属、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）属、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属およびツクバネアサガオ（Ｐｅｔｕｎｉａ）属、モクセイ科に属するものとしてはオリーブ（Ｏｌｅａ）属、クマツヅラ科に属するものとしてはグランデュラリア（Ｇｌａｎｄｕｌａｒｉａ）属、シソ科に属するものとしてはアキギリ（Ｓａｌｖｉａ）属、キョウチクトウ科に属するものとしてはラウオルフィア（Ｒａｕｖｏｌｆｉａ）属およびニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）属、キク科に属するものとしてはカミツレ（Ｃｈａｍａｅｍｅｌｕｍ）属の植物が好ましい。その中でも、バショウ属、オランダイチゴ属、リンゴ属、サクラ属、ナシ属、スノキ属、マタタビ属、キュウリ属、パパイア属又はワニナシ属に属する植物がより好ましい。
さらにその中でも、バショウ属、リンゴ属、ナシ属、ビワ属、カキノキ属、マタタビ属、キュウリ属、パパイア属又はワニナシ属に属する植物が特に好ましい。
【００３４】
さらに、具体的にはバショウ属に属するものとしてはバナナ（Ｍｕｓａ ｘ ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ）、バショウ（Ｍｕｓａ ｂａｓｊｏｏ）、ヒメバショウ（Ｍｕｓａ ｃｏｃｃｉｎｅａ）およびマレーヤマバショウ（Ｍｕｓａ ａｃｕｍｉｎａｔａ）、ショウガ属に属するものとしてはショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、オランダイチゴ属に属するものとしてはオランダイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ ｘ ａｎａｎａｓｓａ）（以下、単に「イチゴ」と記載することもある。）、バージニアイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、チリイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ ｃｈｉｌｏｅｎｓｉｓ）およびエゾノヘビイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ ｖｅｓｃａ）、リンゴ属に属するものとしてはリンゴ（Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ、Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、Ｍａｌｕｓ ｂａｃｃａｔａ）、ハナカイドウ（Ｍａｌｕｓ ｈａｌｌｉａｎａ）、カイドウズミ（Ｍａｌｕｓ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）およびイヌリンゴ（Ｍａｌｕｓ ｐｒｕｎｉｆｏｌｉａ）、サクラ属に属するものとしてはウメ（Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ）、セイヨウミザクラ（Ｐｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、アンズ（Ｐｒｕｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ｄｕｌｃｉｓ）、スモモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｓａｌｉｃｉｎａ）およびセイヨウスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ナシ属に属するものとしてはセイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ナシ（Ｐｙｒｕｓ ｐｙｒｉｆｏｌｉａ）、マメナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃａｌｌｅｒｙａｎａ）、ヤセイセイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ ｐｙｒａｓｔｅｒ）およびチュウゴクナシ（Ｐｙｒｕｓ  ｘ  ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ）、ビワ属に属するものとしてはビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、ボケ属に属するものとしてはカリン（Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、キイチゴ属に属するものとしてはラズベリー（Ｒｕｂｕｓ ｉｄａｅｕｓ）およびブラックラズベリー（Ｒｕｂｕｓ ｆｒｕｔｉｃｏｓｕｓ）、バラ属に属するものとしてはハマナス（Ｒｏｓａ ｒｕｇｏｓａ）、イチジク属に属するものとしてはイチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）、スノキ属に属するものとしてはブリーベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍ、Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ）、ビルベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ）、コケモモ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｖｉｔｉｓ-ｉｄａｅａ）およびツルコケモモ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｏｘｙｃｏｃｃｏｓ）、マタタビ属に属するものとしてはキウイ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｄｅｌｉｃｉｏｓａ）、サルナシ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ａｒｇｕｔａ）、シマサルナシ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｒｕｆａ）およびマタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｐｏｌｙｇａｍａ）、カキノキ属に属するものとしてはカキ（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ ｋａｋｉ）、ツバキ属に属するものとしてはチャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、キュウリ属に属するものとしてはキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）、ニシインドコキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ａｎｇｕｒｉａ）およびツノニガウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｔｕｌｉｆｅｒ）、スイカ属に属するものとしてはスイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）、パパイア属に属するものとしてはパパイア（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、ヴァスコンセレア属に属するものとしてはマウンテンパパイア（Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｌｅａ ｃｕｎｄｉｎａｍａｒｃｅｎｓｉｓ）、シロイヌナズナ属に属するものとしてはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）およびミヤマハタザオ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ）、ワニナシ属に属するものとしてはアボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、アナナス属に属するものとしてはパイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、イネ属に属するものとしてはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、コムギ属に属するものとしてはコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、オオムギ属に属するものとしてはオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、トウモロコシ属に属するものとしてはトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、モロコシ属に属するものとしてはモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ヤマカモジグサ属に属するものとしてはセイヨウヤマカモジ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、ココヤシ属に属するものとしてはココナッツ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、バンダ属に属するものとしてはバンダ（Ｖａｎｄａ ｈｙｂｒｉｄ ｃｕｌｔｉｖａｒ）、アヤメ属に属するものとしてはオランダアヤメ（Ｉｒｉｓ ｘ ｈｏｌｌａｎｄｉｃａ）、スグリ属に属するものとしてはクロスグリ（カシス）（Ｒｉｂｅｓｎｉｇｒｕｍ）、カスミソウ属に属するものとしてはカスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ）、ブドウ属に属するものとしてはブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ、Ｖｉｔｉｓ ｌａｂｒｕｓｃａ）、ヒイラギトラノオ属に属するものとしてはアセロラ（Ｍａｌｐｉｇｈｉａ ｇｌａｂｒａ）、トケイソウ属に属するものとしてはパッションフルーツ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｅｄｕｌｉｓ）、トウゴマ属に属するものとしてはトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ヤマナラシ属に属するものとしてはコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、ゴレンシ属に属するものとしてはスターフルーツ（Ａｖｅｒｒｈｏａ ｃａｒａｍｂｏｌａ）、ウマゴヤシ属に属するものとしてはタルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、ハウチワマメ属に属するものとしてはルピナス（シロバナハウチワマメ）（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ）、ダイズ属に属するものとしてはダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、チョウマメ属に属するものとしてはチョウマメ（Ｃｌｉｔｏｒｉａ ｔｅｒｎａｔｅａ）、ミカン属に属するものとしてはレモン（Ｃｉｔｒｕｓ ｌｉｍｏｎ）、スダチ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｕｄａｃｈｉ）、カボス（Ｃｉｔｒｕｓｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐａ）、グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ ｘ ｐａｒａｄｉｓｉ）、ユズ（Ｃｉｔｒｕｓ ｊｕｎｏｓ）ライム（Ｃｉｔｒｕｓ ａｕｒａｎｔｉｆｏｌｉａ）、ウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ ｕｎｓｈｉｕ）およびオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、アエグレ属に属するも��としてはアエグレ・マルメロス（Ａｅｇｌｅｍａｒｍｅｌｏｓ）、レイシ属に属するものとしてはライチ（Ｌｉｔｃｈｉ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、マンゴー属に属するものとしてはマンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）、ドリアン属に属するものとしてはドリアン（Ｄｕｒｉｏ ｚｉｂｅｔｈｉｎｕｓ）、カカオ属に属するものとしてはカカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、ザクロ属に属するものとしてはザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、サンジソウ属に属するものとしてはフェアリーファンズ（ｆａｉｒｙ ｆａｎｓ）（Ｃｌａｒｋｉａ ｂｒｅｗｅｒｉ）およびレッドリボンズ（Ｒｅｄ ｒｉｂｂｏｎｓ）（Ｃｌａｒｋｉａ ｃｏｎｃｉｎｎａ）、バンジロウ属に属するものとしてはグァバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、ルイヨウショウマ属に属するものとしてはアメリカショウマ（Ａｃｔａｅａ ｒａｃｅｍｏｓａ）、ケシ属に属するものとしてはケシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、オニゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）およびハカマオニゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）、ナス属に属するものとしてはトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  Ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ，Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）およびバレイショ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、トウガラシ属に属するものとしてはトウラガシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）およびハバネロ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ）、タバコ属に属するものとしてはタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）、ツクバネアサガオ属に属するものとしてはペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｘ ｈｙｂｒｉｄａ）、オリーブ属に属するものとしてはオリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、グランデュラリア属に属するものとしてはビジョザクラ（Ｇｌａｎｄｕｌａｒｉａ ｘ ｈｙｂｒｉｄａ）、アキギリ属に属するものとしてはサルビア（Ｓａｌｖｉａ ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ）、ラウオルフィア属に属するものとしてはインドジャボク（Ｒａｕｖｏｌｆｉａ ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）、ニチニチソウ属に属するものとしてはニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、カミツレ属に属するものとしてはローマカミツレ（Ｃｈａｍａｅｍｅｌｕｍ ｎｏｂｉｌｅ）が特に好ましい。
【００３５】
本発明に係る変異型酵素の製造方法が対象とする酵素としては、特に、リンゴ、トマト、イチゴ、ナシ、ビワ、カキ、メロン、バナナ、パパイア、サンジソウ、ブドウ、キウイ及びローマンカモミール等の植物由来のＡＡＴが挙げられ、このうちリンゴ、トマト、イチゴ、ナシ、ビワ及びカキ由来のＡＡＴが好ましい。
【００３６】
リンゴＡＡＴに関し、本発明に係る変異型酵素の製造方法において「基準体」となり得る酵素のアミノ酸配列の例を、配列番号１〜３に示す。配列番号１は、野生型ＡＡＴのアミノ酸配列を示す。野生型リンゴＡＡＴは、アミノ酸配列中に１５個のシステインを有する。配列番号２は、野生型ＡＡＴのアミノ酸配列において２番目のメチオニンがリジンに置換された変異型ＡＡＴ（Ｍ２Ｋ型ＡＡＴ）のアミノ酸配列である。配列番号３は、野生型ＡＡＴのアミノ酸配列において、６４番目のアラニンがバリンに、２４８番目のバリンがアラニンに、３６３番目のグルタミンがリジンに、１１７番目のリジンがグルタミンに置換された変異型ＡＡＴのアミノ酸配列である（この変異型ＡＡＴは、野生型ＡＡＴに比して高活性である）。
トマトＡＡＴに関し、本発明に係る変異型酵素の製造方法において「基準体」となり得る酵素のアミノ酸配列の例を、配列番号６４，６６に示す。配列番号６６は、トマト（野生種）野生型ＡＡＴのアミノ酸配列を示す。配列番号６４は、野生型ＡＡＴのアミノ酸配列において２番目のアラニンがリジンに置換された変異型ＡＡＴ（Ａ２Ｋ型ＡＡＴ）のアミノ酸配列である。
イチゴＡＡＴに関し、本発明に係る変異型酵素の製造方法において「基準体」となり得る酵素のアミノ酸配列の例を、配列番号６５に示す。配列番号６５は、野生型ＡＡＴのアミノ酸配列である。
【００３７】
［工程（１）］
本工程は、基準体のアミノ酸配列において１以上のシステインが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異体を発現する組換体を作成する工程である。
【００３８】
本工程では、基準体のアミノ酸配列において１又は２以上のシステインが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異体を発現する組換体を複数作成する。例えば、基準体のアミノ酸配列中にシステインがＮ個存在する場合、各システインをシステイン以外のアミノ酸に置換した変異体はＮ種類作成できる。また、例えば、基準体のアミノ酸配列中にシステインがＮ個存在する場合、いずれか２つのシステインをシステイン以外のアミノ酸に置換した変異体はＮ（Ｎ−１）／２種類作成できる。
【００３９】
１つの変異体において置換されるシステインの個数は、１又は２以上であってよく、最大で、基準体のアミノ酸配列中に存在するシステインの全数未満とされる。１つの変異体において置換されるシステインの個数は、好ましくは１である。作成される複数の変異体間において、置換されるシステインの個数は、異なっていてもよく同じであってもよい。システインから置換されるアミノ酸は、システイン以外のアミノ酸であればよく、特に限定されないが、例えばアラニン又はアルギニンとすることができる。
【００４０】
変異体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、従来公知の遺伝子工学的手法により、基準体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに変異を導入することにより作成できる。作成された変異体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、従来汎用の発現ベクターに組み込まれる。
【００４１】
変異体の発現は、発現ベクターを従来公知の手法により宿主細胞に導入することにより行えばよい。
【００４２】
宿主細胞は、特に限定されないが、細菌として、大腸菌、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属などが挙げられ、酵母ではＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、糸状菌ではＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属などが挙げられる。これらの中で、特に大腸菌を用いることが簡便であり、効率もよく好ましい。
【００４３】
必要に応じて、工程（１）で作成された変異体のそれぞれの組換体あたりの酵素活性を測定すればよい。
【００４４】
変異体の組換体あたりの酵素活性の測定は、変異体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む発現ベクターが導入された一定量の組換体から、変異体を含む細胞抽出液あるいは細胞破砕液を調製し、細胞抽出液等中の酵素活性を測定することにより行えばよい。酵素反応の基質と細胞抽出液等とを混合し、反応生成物の生成量をクロマトグラフィー等の公知の手段を用いて検出することにより酵素活性を測定できる。
【００４５】
［工程（２）］
本工程は、基準体の活性１００％に比して５０％以上の組換体あたりの活性を示す複数の変異体を選択する工程である。ここで、「変異体の組換体あたりの活性が基準体の活性１００％に比して５０％以上である」とは、一定量の組換体から発現した変異体によって触媒される反応生成物の量が、当該変異体の高い活性と可溶性に起因して、同一条件下において同一量の組換体から発現させた基準体の触媒による反応生成物の量の５０％以上となることを意味する。
【００４６】
例えば、工程（１）において、基準体のアミノ酸配列中にシステインが１０個存在し、各システインをシステイン以外のアミノ酸に置換して変異体を１０種類作成した場合に、基準体の活性１００％に比して５０％以上の組換体あたりの活性を示す変異体が５種類存在した場合、それら５種の変異体を選択する。
【００４７】
基準体のアミノ酸配列中に存在するシステインのうち、これを変異体において他のアミノ酸に置換した場合にも一定の酵素活性が維持されるシステインは、基準体の正常なタンパク質フォールディングへの寄与が小さく、むしろ基準体を由来種とは異なる宿主細胞中で発現させた場合に過剰なジスルフィド結合を形成することで正常なタンパク質フォールディングを妨げる可能性があると考えられる。
【００４８】
変異体の選択基準は、基準体の活性１００％に比して５０％以上の組換体あたりの活性を示すことを一応の指標とするが、基準体の活性１００％に比してより高い活性、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％以上の組換体あたりの活性を示す基準体を選択することも可能である。
【００４９】
［工程（３）］
本工程は、工程（２）で選択したそれぞれの変異体が有するアミノ酸残基が置換された部位のうち２以上の部位においてそれぞれ対応するアミノ酸残基が置換された変異体を発現させる工程である。
【００５０】
例えば、上述の基準体のアミノ酸配列中にシステインが１０個存在する例では、基準体の活性１００％に比して５０％以上の組換体あたりの活性を示した５種類の変異体が存在するので、その５種類の変異体がそれぞれ有する変異部位（合計５ヶ所）のうち２ヶ所以上の変異部位（２ヶ所以上のシステインの他のアミノ酸への置換）を有する変異体を発現させる。３ヶ所以上の変異部位を有する変異体を発現させることが好ましく、４ヶ所以上の変異部位を有する変異体を発現させることがより好ましく、全ての変異部位を有する変異体を発現させることがさらに好ましい。
【００５１】
上述の通り、基準体のアミノ酸配列中に存在するシステインのうち、これを変異体において他のアミノ酸に置換した場合にも一定の酵素活性が維持されるシステインは、基準体を由来種とは異なる宿主細胞中で発現させた場合に正常なタンパク質フォールディングを妨げる可能性がある。これらのシステインを全て他のアミノ酸に置換した変異体は、由来種とは異なる宿主細胞中で発現させた場合にも正常かあるいは正常に近いフォールディンが行われ、これによって当該宿主細胞中で発現させた基準体に比して高活性、高可溶性となるものと考えられる。
【００５２】
本工程の変異体においてシステインから置換されるアミノ酸は、工程（２）で選択された変異体においてシステインから置換されているアミノ酸と同じであることが好ましいが、異なっていてもよい。システインから置換されるアミノ酸の種類を種々変更することで、組換体の活性をさらに向上させることができる場合がある。
【００５３】
本工程の変異体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡも、従来公知の遺伝子工学的手法により、基準体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに変異を導入することにより作成できる。作成された変異体をコードするＤＮＡは、工程（１）と同様に、従来汎用の発現ベクターに組み込まれ、宿主細胞にトランスフェクトされて発現させられる。
【００５４】
２．変異型アルコールアシルトランスフェラーゼＩ
本発明は、上述の変異型酵素の製造方法により得られる変異型ＡＡＴをも提供する。
【００５５】
本発明に係る変異型ＡＡＴは、基準体に比して活性が向上した、変異型アルコールアシルトランスフェラーゼであって、基準体のアミノ酸配列において１以上のシステインが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する、変異型アルコールアシルトランスフェラーゼである。
本発明に係る変異型ＡＡＴは、基準体のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする。基準体は、野生型リンゴＡＡＴ（配列番号１）、野生型リンゴＡＡＴのアミノ酸配列において２番目のメチオニンがリジンに置換された変異型ＡＡＴ（配列番号２、リンゴＭ２Ｋ型）、又は野生型リンゴＡＡＴのアミノ酸配列において６４番目のアラニンがバリンに、２４８番目のバリンがアラニンに、３６３番目のグルタミンがリジンに、１１７番目のリジンがグルタミンに置換された変異型ＡＡＴ（配列番号３）であってよい。
【００５６】
（１）４８番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（２）１５０番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（３）１６７番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（４）２７０番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（５）２７４番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（６）４４７番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
【００５７】
本発明に係る変異型ＡＡＴにおいて、４８番目、１５０番目、１６７番目、２７０番目、２７４番目及び４４７番目の各システインは、２以上組み合わされて置換されることが好ましく、３以上組み合わされて置換されることがより好ましく、４以上組み合わされて置換されることがさらに好ましく、５以上組み合わされて置換されることが特に好ましく、全て組み合わされて置換されることが最も好ましい。システインから置換されるアミノ酸は、システイン以外のアミノ酸であればよく、特に限定されないが、例えばアラニン又はアルギニンとできる。特に１５０番目のシステインをアルギニンに置換することで、変異型ＡＡＴの活性をさらに向上させることができる。
【００５８】
本発明に係る変異型ＡＡＴとして、具体的には、リンゴＭ２Ｋ型ＡＡＴ（配列番号２）を基準体として作成された、配列番号４又は７に記載のアミノ酸配列からなる変異型ＡＡＴが挙げられる。配列番号４のアミノ酸配列を有する変異型ＡＡＴは、リンゴＭ２Ｋ型ＡＡＴ（配列番号２）の４８番目、１５０番目、１６７番目、２７０番目、２７４番目及び４４７番目のシステインを全てアラニンに置換したものである。また、配列番号７のアミノ酸配列を有する変異型ＡＡＴは、４８番目、１６７番目、２７０番目、２７４番目及び４４７番目のシステインをアラニンに、１５０番目のシステインをアルギニンに置換したものである。
【００５９】
本発明に係る変異型ＡＡＴの他の具体例として、変異型ＡＡＴ（配列番号３）を基準体として作成された、配列番号５，６，８〜１１，１３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる変異型ＡＡＴも挙げられる。配列番号５，６，８〜１１，１３のアミノ酸配列における変異及びシステイン置換の導入箇所を「表１」に示す。
【００６０】
【表１】
2018043546.tif 000002
【００６１】
上記表において６４番目のアラニンはイソロイシン又はスレオニンとされてもよい。また、３６３番目のグルタミンは、プロリン、アデニン、アルギニン、グリシン又はトリプトファンとされてもよい。これらの場合にも、高活性の変異型ＡＡＴを得ることが可能である。
【００６２】
また、本発明に係る変異型ＡＡＴは、基準体のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする。基準体は、トマト（野生種）野生型ＡＡＴ（配列番号６６）、トマト（野生種）野生型ＡＡＴのアミノ酸配列において２番目のアラニンがリジンに置換された変異型ＡＡＴ（配列番号６４、トマト（野生種）Ａ２Ｋ型）であってよい。
【００６３】
（１）２０６番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（２）２０９番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（３）２５６番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（４）２６９番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（５）３２２番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
【００６４】
本発明に係る変異型ＡＡＴにおいて、２０６番目、２０９番目、２５６番目、２６９番目及び３２２番目の各システインは、２以上組み合わされて置換されることが好ましく、３以上組み合わされて置換されることがより好ましく、４以上組み合わされて置換されることがさらに好ましく、全て組み合わされて置換されることが最も好ましい。システインから置換されるアミノ酸は、システイン以外のアミノ酸であればよく、特に限定されないが、例えばアラニン又はアルギニンとすることができる。
【００６５】
さらに、本発明に係る変異型ＡＡＴは、基準体のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする。基準体は、配列番号６５に示すアミノ酸配列からなる野生型イチゴＡＡＴであってよい。
【００６６】
（１）１１５番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（２）１６７番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（３）１７９番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（４）３２５番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（５）３５６番目のシステインの他のアミノ酸残基への置換。
【００６７】
本発明に係る変異型ＡＡＴにおいて、１１５番目、１６７番目、１７９番目、３２５番目及び３５６番目の各システインは、２以上組み合わされて置換されることが好ましく、３以上組み合わされて置換されることがより好ましく、４以上組み合わされて置換されることがさらに好ましく、全て組み合わされて置換されることが最も好ましい。システインから置換されるアミノ酸は、システイン以外のアミノ酸であればよく、特に限定されないが、例えばアラニン又はアルギニンとすることができる。
【００６８】
本発明によれば、配列番号１のリンゴ野生型ＡＡＴ又は配列番号２のリンゴＭ２Ｋ型ＡＡＴのアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる変異型ＡＡＴであって、以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型ＡＡＴも提供される。
（１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて４８番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（２）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１５０番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（３）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１６７番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（４）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２７０番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（５）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２７４番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
（６）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて４４７番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
本発明に係る変異型ＡＡＴにおいて、４８番目、１５０番目、１６７番目、２７０番目、２７４番目及び４４７番目の各システインは、２以上組み合わされて置換されることが好ましく、３以上組み合わされて置換されることがより好ましく、４以上組み合わされて置換されることがさらに好ましく、５以上組み合わされて置換されることが特に好ましく、全て組み合わされて置換されることが最も好ましい。システインから置換されるアミノ酸は、システイン以外のアミノ酸であればよく、特に限定されないが、例えばアラニン又はアルギニンとすることができる。特に１５０番目のシステインをアルギニンに置換することで、変異型ＡＡＴの活性をさらに向上させることができる。
【００６９】
また、本発明によれば、配列番号６６のトマト（野生種）ＡＡＴ又は配列番号６４のトマト（野生種）Ａ２Ｋ型ＡＡＴのアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる変異型ＡＡＴであって、以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型ＡＡＴも提供される。
（１）配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２０６番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（２）配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２０９番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（３）配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２５６番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（４）配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２６９番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（５）配列番号６４又は６６に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて３２２番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
本発明に係る変異型ＡＡＴにおいて、２０６番目、２０９番目、２５６番目、２６９番目及び３２２番目の各システインは、２以上組み合わされて置換されることが好ましく、３以上組み合わされて置換されることがより好ましく、４以上組み合わされて置換されることがさらに好ましく、全て組み合わされて置換されることが最も好ましいていてよい。システインから置換されるアミノ酸は、システイン以外のアミノ酸であればよく、特に限定されないが、例えばアラニン又はアルギニンとすることができる。
【００７０】
さらに、本発明によれば、配列番号６５のイチゴ野生型ＡＡＴのアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる変異型ＡＡＴであって、以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型ＡＡＴも提供される。
（１）配列番号６５に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１１５番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（２）配列番号６５に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１６７番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（３）配列番号６５に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１７９番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（４）配列番号６５に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて３２５番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換、
（５）配列番号６５に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて３５６番目のシステインに相当するシステインの他のアミノ酸残基への置換。
本発明に係る変異型ＡＡＴにおいて、１１５番目、１６７番目、１７９番目、３２５番目及び３５６番目の各システインは、２以上組み合わされて置換されることが好ましく、３以上組み合わされて置換されることがより好ましく、４以上組み合わされて置換されることがさらに好ましく、全て組み合わされて置換されることが最も好ましいていてよい。システインから置換されるアミノ酸は、システイン以外のアミノ酸であればよく、特に限定されないが、例えばアラニン又はアルギニンとすることができる。
【００７１】
システインの置換を導入する対象となるＡＡＴのアミノ酸配列は、配列番号１のリンゴ野生型ＡＡＴ又は配列番号２のリンゴＭ２Ｋ型ＡＡＴのアミノ酸配列、配列番号６６のトマト（野生種）野生型ＡＡＴ又は配列番号６４のトマト（野生種）Ａ２Ｋ型ＡＡＴのアミノ酸配列、あるいは配列番号６５のイチゴ野生型ＡＡＴのアミノ酸配列とのアラインメントを可能とするため、配列番号１、２、６４、６５あるいは６６のアミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、好ましくは８０以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。アラインメントは、比較すべき２つの配列のアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように両配列を整列させることにより行われる。整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。
【００７２】
また、システインの置換を導入する対象となるＡＡＴのアミノ酸配列と、配列番号１、２、６４、６５、６６のアミノ酸配列との配列同一性は、アラインメントを行って、一致したアミノ酸数を全アミノ酸数で除すことにより得られる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸数で、一致したアミノ酸数を除して算出される。
【００７３】
配列番号１のリンゴ野生型ＡＡＴ又は配列番号２のリンゴＭ２Ｋ型ＡＡＴのアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＡＴでは、配列番号１のリンゴ野生型ＡＡＴ又は配列番号２のリンゴＭ２Ｋ型ＡＡＴのアミノ酸配列にみられる４８番目、１５０番目、１６７番目、２７０番目、２７４番目及び４４７番目のシステインが保存されている可能性が高く、これらのシステインを他のアミノ酸に置換することで、各種ＡＡＴ（好ましくは植物由来の各種ＡＡＴ）においても、高活性の変異体を得ることが可能と考えられる。
例えば、配列番号１のリンゴ野生型ＡＡＴと８８％の配列同一性を示すＡＡＴとして、リンゴ属の異なる亜種に由来する配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるリンゴＡＡＴがある。配列番号１のリンゴ野生型ＡＡＴのアミノ酸配列にみられるシステインのうち、４８番目、１５０番目、１６７番目、２７０番目、２７４番目及び４４７番目のシステインは、配列番号１２に示すアミノ酸配列においていずれも保存されている。
また、配列番号１のリンゴ野生型ＡＡＴと９１％の配列同一性を示すＡＡＴとして、配列番号６１に示すアミノ酸配列からなるナシＡＡＴがある。配列番号１のリンゴ野生型ＡＡＴのアミノ酸配列にみられるシステインのうち、４８番目、１５０番目、１６７番目、２７０番目及び２７４番目のシステインは、配列番号６１に示すアミノ酸配列においていずれも保存されている。
さらに、配列番号１のリンゴ野生型ＡＡＴと９１％の配列同一性を示すＡＡＴとして、配列番号６２に示すアミノ酸配列からなるビワＡＡＴがある。配列番号１のリンゴ野生型ＡＡＴのアミノ酸配列にみられるシステインのうち、４８番目、１５０番目、１６７番目、２７０番目、２７４番目及び４４７番目のシステインのシステインは、配列番号６２に示すアミノ酸配列においていずれも保存されている。
加えて、配列番号１のリンゴ野生型ＡＡＴと９０％の配列同一性を示すＡＡＴとして、配列番号６３に示すアミノ酸配列からなるカキＡＡＴがある。配列番号１のリンゴ野生型ＡＡＴのアミノ酸配列にみられるシステインのうち、１５０番目、１６７番目、２７０番目、２７４番目及び４４７番目のシステインのシステインは、配列番号６３に示すアミノ酸配列においていずれも保存されている。
配列番号１，１２，６１〜６３のアミノ酸配列のアラインメントを図１に示す。
【００７４】
また、配列番号６６のトマト（野生種）野生型ＡＡＴ又は配列番号６４のトマト（野生種）Ａ２Ｋ型ＡＡＴのアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＡＴでは、トマト（野生種）野生型ＡＡＴ又はトマト（野生種）Ａ２Ｋ型ＡＡＴのアミノ酸配列にみられる２０６番目、２０９番目、２５６番目、２６９番目及び３２２番目のシステインが保存されている可能性が高く、これらのシステインを他のアミノ酸に置換することで、各種ＡＡＴ（好ましくは植物由来の各種ＡＡＴ）においても、高活性の変異体を得ることが可能と考えられる。
例えば、配列番号６６のトマト（野生種）野生型ＡＡＴと９３％の配列同一性を示すＡＡＴとして、トマト（栽培種）に由来する配列番号６７に示すアミノ酸配列からなるトマトＡＡＴがある。トマト（野生種）野生型ＡＡＴのアミノ酸配列にみられるシステインのうち、２０９番目、２５６番目、２６９番目及び３２２番目のシステインは、配列番号６７に示すアミノ酸配列においていずれも保存されている。
また、配列番号６６のトマト（野生種）野生型ＡＡＴと８４％の配列同一性を示すＡＡＴとして、配列番号６８示すアミノ酸配列からなるバレイショＡＡＴがある。トマト（野生種）野生型ＡＡＴのアミノ酸配列にみられるシステインのうち、２０６番目、２０９番目、２５６番目、２６９番目及び３２２番目のシステインは、配列番号６８に示すアミノ酸配列においていずれも保存されている。
さらに、配列番号６６のトマト（野生種）野生型ＡＡＴと７８％の配列同一性を示すＡＡＴとして、配列番号６９示すアミノ酸配列からなるトウガラシＡＡＴがある。トマト（野生種）野生型ＡＡＴのアミノ酸配列にみられるシステインのうち、２０６番目、２０９番目、２６９番目及び３２２番目のシステインは、配列番号６９に示すアミノ酸配列においていずれも保存されている。
加えて、配列番号６６のトマト（野生種）野生型ＡＡＴと７４％の配列同一性を示すＡＡＴとして、配列番号７０に示すアミノ酸配列からなるタバコＡＡＴがある。トマト（野生種）野生型ＡＡＴのアミノ酸配列にみられるシステインのうち、２０６番目、２０９番目及び３２２番目のシステインは、配列番号７０に示すアミノ酸配列においていずれも保存されている。
配列番号６６〜７０のアミノ酸配列のアラインメントを図２に示す。
【００７５】
さらに、配列番号６５のイチゴ野生型ＡＡＴのアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＡＴでは、イチゴ野生型ＡＡＴのアミノ酸配列にみられる１１５番目、１６７番目、１７９番目、３２５番目及び３５６番目のシステインが保存されている可能性が高く、これらのシステインを他のアミノ酸に置換することで、各種ＡＡＴ（好ましくは植物由来の各種ＡＡＴ）においても、高活性の変異体を得ることが可能と考えられる。
例えば、配列番号６５のイチゴ野生型ＡＡＴと９４％の配列同一性を示すＡＡＴとして、配列番号７１に示すアミノ酸配列からなるチリイチゴＡＡＴがある。イチゴ野生型ＡＡＴのアミノ酸配列にみられるシステインのうち、１１５番目、１６７番目、１７９番目、３２５番目及び３５６番目のシステインは、配列番号７１に示すアミノ酸配列においていずれも保存されている。
例えば、配列番号６５のイチゴ野生型ＡＡＴと９１％の配列同一性を示すＡＡＴとして、配列番号７２示すアミノ酸配列からなるエゾヘビイチゴＡＡＴがある。イチゴ野生型ＡＡＴのアミノ酸配列にみられるシステインのうち、１１５番目、１６７番目、１７９番目、３２５番目及び３５６番目のシステインは、配列番号７１に示すアミノ酸配列においていずれも保存されている。
例えば、配列番号６５のイチゴ野生型ＡＡＴと６７％の配列同一性を示すＡＡＴとして、配列番号７３に示すアミノ酸配列からなるハマナスＡＡＴがある。イチゴ野生型ＡＡＴのアミノ酸配列にみられるシステインのうち、１６７番目、３２５番目及び３５６番目のシステインは、配列番号７３に示すアミノ酸配列においていずれも保存されている。
配列番号６５，７１〜７３のアミノ酸配列のアラインメントを図３に示す。  
【００７６】
３．変異型アルコールアシルトランスフェラーゼＩＩ
また、本発明は、リンゴ野生型ＡＡＴ又はリンゴＭ２Ｋ型ＡＡＴのアミノ酸配列において６４番目のアラニン、２４８番目のバリン、３６３番目のグルタミン、１１７番目のリジンが置換された変異型ＡＡＴをも提供する。この変異型ＡＡＴは、野生型ＡＡＴに比して高い活性と可溶性を示す。
【００７７】
すなわち、本発明に係る変異型ＡＡＴは、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする。
（１）６４番目のアラニンのバリン、イソロイシン又はスレオニンへの置換。
（２）１１７番目のリジンのグルタミンへの置換。
（３）２４８番目のバリンのアラニンへの置換。
（４）３６３番目のグルタミンのリジン、プロリン、アデニン、アルギニン、グリシン又はトリプトファンへの置換。
本発明に係る変異型ＡＡＴにおいて、６４番目のアラニン、１１７番目のリジン、２４８番目のバリン、３６３番目のグルタミンは、２以上組み合わされて置換されることが好ましく、３以上組み合わされて置換されることがより好ましく、全て組み合わされて置換されることが最も好ましい。
【００７８】
本発明に係る変異型ＡＡＴとして、具体的には、配列番号３，５，６，８〜１３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる変異型アルコールアシルトランスフェラーゼが挙げられる（表１参照）。
【００７９】
上述のリンゴ変異型ＡＡＴにおける変異導入による高活性化は、配列番号１のリンゴ野生型ＡＡＴ又は配列番号２のリンゴＭ２Ｋ型ＡＡＴのアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列からなる各種ＡＡＴ（好ましくは各種植物由来ＡＡＴ）にも適用が可能と考えられる。
【００８０】
従って、本発明によれば、配列番号１のリンゴ野生型ＡＡＴ又は配列番号２のリンゴＭ２Ｋ型ＡＡＴのアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＡＴであって、以下のアミノ酸置換から選択される一以上のアミノ酸置換を有する変異型ＡＡＴが提供される。
（１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて６４番目のアラニンに相当するアミノ酸残基のバリン、イソロイシン又はスレオニンへの置換。
（２）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて１１７番目のリジンに相当するアミノ酸のグルタミンへの置換。
（３）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて２４８番目のバリンに相当するアミノ酸のアラニンへの置換。
（４）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列とのアラインメントにおいて３６３番目のグルタミンに相当するアミノ酸のリジン、プロリン、アデニン、アルギニン、グリシン又はトリプトファンへの置換。
本発明に係る変異型ＡＡＴにおいて、６４番目のアラニンに相当するアミノ酸残基、１１７番目のリジンに相当するアミノ酸残基、２４８番目のバリンに相当するアミノ酸残基、３６３番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基は、２以上組み合わされて置換されることが好ましく、３以上組み合わされて置換されることがより好ましく、全て組み合わされて置換されることが最も好ましい。
【００８１】
配列番号１のリンゴ野生型ＡＡＴ又は配列番号２のリンゴＭ２Ｋ型ＡＡＴのアミノ酸配列にみられる１１７番目のリジン、２４８番目のバリン及び３６３番目のグルタミンは、配列番号１２，６１，６２，６３に示すアミノ酸配列においていずれも保存されている。従って、これらのアミノ酸をそれぞれイソロイシン又はスレオニン；グルタミン；アラニン；リジン、プロリン、アデニン、アルギニン、グリシン又はトリプトファンに置換することで、各種ＡＡＴ（好ましくは植物由来ＡＡＴ，特に好ましくはリンゴ属の各種植物由来ＡＡＴ）においても、高活性の変異体を得ることが可能と考えられる。アミノ酸の置換を導入する対象となるＡＡＴのアミノ酸配列は、配列番号１のリンゴ野生型ＡＡＴ又は配列番号２のリンゴＭ２Ｋ型ＡＡＴのアミノ酸配列とのアラインメントを可能とするため、配列番号１又は２のアミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、好ましくは８０以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００８２】
４．ベクター・形質転換体
本発明に係る変異型ＡＡＴ及び変異型ＡＡＴをコードするＤＮＡを挿入した発現ベクターは、従来公知の遺伝子工学的手法を用いて作成できる。
【００８３】
ベクターは宿主細胞中で自立複製可能なものであればく、宿主細胞に適したベクターを用いることができる。ベクターへの変異型ＡＡＴ遺伝子の挿入は、当業者に知られた遺伝子組換え技術を用いて行うことができる。例えば、制限酵素切断とライゲーションキットを用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法、Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎキット（タカラバイオ）等を利用することができる。ベクターに挿入される遺伝子は、宿主細胞中で各遺伝子にコードされるタンパク質の転写翻訳を調節することが可能なプロモーターの下流に連結して挿入される。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、必要に応じて、遺伝子を導入しようとする宿主生物において利用可能なターミネーター配列、エンハンサー配列、スプライシングシグナル配列、ポリＡ付加シグナル配列、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列などのリボソーム結合配列、選択マーカー遺伝子などを連結することができる。選択マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子の他、アミノ酸や核酸等の栄養素の細胞内生合成に関与する遺伝子、あるいはルシフェラーゼ等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子などを挙げることができる。挿入にともない、ＤＮＡがコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。
【００８４】
ベクターは、当業者に知られた方法によって、宿主細胞に導入され、形質転換体の作成に用いられる。宿主細胞へのベクターの導入方法としては、宿主細胞に適した方法であれば特に限定されるものではなく、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、接合伝達法等が挙げられる。
【００８５】
宿主細胞は、特に限定されないが、細菌として、大腸菌、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属などが挙げられ、酵母ではＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、糸状菌ではＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属などが挙げられる。これらの中で、特に大腸菌を用いることが簡便であり、効率もよく好ましい。
【実施例】
【００８６】
［参考例１：リンゴＡＡＴ（ＭｐＡＡＴ１）遺伝子発現プラスミドｐＡＡＴ０１２・ｐＡＡＴ１１５・ｐＡＡＴ１１６の作製］
リンゴＡＡＴ（ＭｐＡＡＴ１）遺伝子を発現するプラスミドを３種類作成した。
プラスミドｐＡＡＴ０１２は、野生型リンゴＡＡＴ（配列番号１）を含む。
プラスミドｐＡＡＴ１１５は、野生型リンゴＡＡＴの２番目のアミノ酸がメチオニンからバリンに置換された改変リンゴＡＡＴを含む。
プラスミドｐＡＡＴ１１６は、野生型リンゴＡＡＴの２番目のアミノ酸がメチオニンからリジンに置換された改変リンゴＡＡＴ（配列番号２）を含む。【００８７】
はじめに、大腸菌コドンに最適化した野生型リンゴＡＡＴ遺伝子（配列番号１４）を合成した（ＤＮＡ２．０社に委託）。ＡＡＴ遺伝子を発現ベクター（ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４）に挿入し、ｐＡＡＴ０１２と命名した。【００８８】
以下の方法によって、ＡＡＴ遺伝子を、Ｔ７プロモーターを有する発現ベクター（ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４）から、ｔｒｃプロモーターを有する発現ベクター（ｐＴｒｃ９９Ａ）に移し替えた。【００８９】
プライマーＭＭＡ−１５６、ＭＭＡ−１６３を用いてｐＡＡＴ０１２を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、ＡＡＴ遺伝子を含む断片を増幅した。この際、ＮｃｏＩ制限酵素部位を導入するために、ＡＡＴ遺伝子の２番目のコドンATG（Met）をGTG（Val）に変換した。【００９０】
プライマーＭＭＡ−１５６（配列番号１５）：
CACAGGAAACAGACCATGGTGAGCTTTTCTGTACTCCAAGTCAAACG
プライマーＭＭＡ−１６３（配列番号１６）：
GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTTACTGGCTGGTGCTACGCAG【００９１】
増幅産物をＧｅｌ／ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＦＡＶＯＲＧＥＮ社製）を用いて精製し、これを挿入断片とした。制限酵素ＮｃｏＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉにより予め切断しておいたベクターｐＴｒｃ９９Ａと挿入断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結を行った。【００９２】
反応液を５０℃で１５分間インキュベートした後、氷上で冷却し、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換に用いた。大腸菌形質転換体をアンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地（ＬＢＡｍｐ培地）で液体培養し、Ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて目的のプラスミドｐＡＡＴ１１５を調製した。【００９３】
ｐＡＡＴ１１５に挿入したリンゴＡＡＴ遺伝子の遺伝子産物の２番目のアミノ酸残基はバリンであるが、２番目のアミノ酸残基をリジンやアルギニン等に置換することによりタンパク質の発現量が向上するという例が知られている（特開２００８−６１５４７号公報）。そこで、以下のようにして、ＡＡＴ遺伝子の２番目のコドンの変換を行った。【００９４】
まず、ｐＡＡＴ１１５をＮｃｏＩとＳｍａＩで切断し、約５．１ｋｂのベクター領域を含む断片を調製した。【００９５】
プライマーＭＭＡ−１６６、ＭＭＡ−１６９を用いてｐＡＡＴ１１５を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、ＡＡＴ遺伝子を含む断片（約４００ｂｐ）を増幅し、上述の方法で精製して挿入断片を得た。【００９６】
プライマーＭＭＡ−１６６（配列番号１７）：
CACAGGAAACAGACCATGAAAAGCTTTTCTGTACTCCAAGTC
プライマーＭＭＡ−１６９（配列番号１８）：
CGATGATACCATCGCTGCCCGGGAAGTTGTACAG【００９７】
ベクター領域を含む断片と挿入断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結させた後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換に供した。大腸菌形質転換体（組換体）を液体培養し、目的のプラスミドｐＡＡＴ１１６を調製した。ｐＡＡＴ１１６では、ＡＡＴ遺伝子の２番目のコドンGTG（Val）がAAA（Lys）に置換されていた。【００９８】
［実施例１：高活性リンゴＡＡＴの製造］
（１）システイン残基がアラニン残基に置換された変異体を発現する組換体の作成
参考例１で作製したプラスミドｐＡＡＴ１１６中のリンゴＡＡＴ遺伝子がコードするタンパク質には、１５個のシステインが存在する。それぞれのシステインがアラニンに置換された１５種のプラスミドを委託合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）した（表２）。【００９９】
【表２】
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【０１００】
「表２」に示した１６種のプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。アンピシリンを含むＬＢ（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１％ＮａＣｌ）培地に大腸菌形質転換体を植菌し、３７℃にて７時間前培養を行った。培養液を０．１ｍｌ取り、１００ｍｌの同培地（１ｍＭＩＰＴＧ含有）に加え、３７℃にて１５時間振盪培養した。培養液から菌体を回収し、５０ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。【０１０１】
（２）変異体を含む細胞抽出液の調製
得られた菌体懸濁液をＯＤ６３０が１０となるように調整した。超音波処理により細胞を破砕し、遠心分離により菌体及び膜画分を除き、細胞抽出液を調製した。【０１０２】
（３）変異体を含む細胞抽出液のＡＡＴ活性測定
メタクリリル−ＣｏＡ  １ｍＭとｎ−ブタノール  ４０ｍＭを含む反応液０．８ｍｌに０．２ｍｌの細胞抽出液を添加し、ブチリル酸エステルの生成反応を開始した。反応は、１０ｍｌ容量のセプタム付サンプル瓶（ＧＣ用）中で行った。サンプル瓶を３０℃で１〜２時間インキュベートして反応を進行させた。反応終了後、サンプル瓶中の反応液に１ｍｌのアセトニトリルを添加し混和した。その後、シリンジフィルターＤＩＳＭＩＣ（穴径０．４５μｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過後、ＨＰＬＣ分析に供した。【０１０３】
ＨＰＬＣ分析条件：
装置：Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５
カラム：Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ１２０  ５μｍ
移動相：６５％ＭｅＯＨ、０．２％リン酸
流量：０．２５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３５℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
注入量：１０μＬ【０１０４】
結果を図４に示す。ｐＡＡＴ１１６から発現する基準体の活性１００％に比して５０％以上の組換体あたりのＡＡＴ活性を示した変異体は８つ得られ、その中でも、ｐＡＡＴ１１６Ｃ４８Ａ、ｐＡＡＴ１１６Ｃ１５０Ａ、ｐＡＡＴ１１６Ｃ１６７Ａ、ｐＡＡＴ１１６Ｃ２７０Ａ、ｐＡＡＴ１１６Ｃ２７４Ａ及びｐＡＡＴ１１６Ｃ４４７Ａから発現する変異体は、ｐＡＡＴ１１６から発現する基準体の活性１００％に比して７０％以上の組換体あたりのＡＡＴ活性を示した。そこでこれら６つの変異体が有する全てのアミノ酸置換Ｃ４８Ａ、Ｃ１５０Ａ、Ｃ１６７Ａ、Ｃ２７０Ａ、Ｃ２７４Ａ及びＣ４４７Ａが全て導入された変異体を作成した。なお、ここで、「ＡＡＴ活性」とは、ＣｏＡ化合物からのエステルの生成を触媒する活性を意味する。また、「変異体の組換体あたりのＡＡＴ活性が基準体の活性１００％に比して５０％以上である」とは、一定量の大腸菌組換体から発現した変異体によって触媒されるエステルの生成量が、当該変異体の高い活性と可溶性に起因して、同一条件下において大腸菌組換体から発現させた基準体の触媒により生成するエステル量の５０％以上となることを意味する。【０１０５】
（４）システイン残基がアラニン残基に６置換された変異体を発現する組換体の作成
４８位、１５０位、１６７位、２７０位、２７４位及び４４７位のシステインが全てアラニンに置換されたＡＡＴ遺伝子を委託合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）し、ベクターｐＴｒｃ９９Ａへ挿入してプラスミドｐＡＡＴ０２４を取得した。【０１０６】
上述の方法により、変異体を含む細胞抽出液を調製し、細胞抽出液のＡＡＴ活性を測定した。さらに、細胞抽出液（可溶性画分）と、遠心分離によって細胞抽出液から分離された不溶性画分（菌体及び膜画分）とを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、組換体ＡＡＴタンパク質のバンドを検出した。【０１０７】
結果を図５に示す。グラフ縦軸は、菌体重量あたりのＡＡＴ活性を、ｐＡＡＴ１１６から発現する基準体のＡＡＴ活性を１として示す。ｐＡＡＴ０２４から発現する変異体の組換体あたりのＡＡＴ活性は、基準体の活性に比して約５倍を示した。また、ｐＡＡＴ０２４から発現する変異体は、基準体に比べて、可溶性画分により多く存在していた。この結果により、４８位、１５０位、１６７位、２７０位、２７４位及び４４７位のシステインのアラニンへの置換によってＡＡＴの可溶性を高め、組換体あたりの活性を向上させられることが明らかとなった。【０１０８】
［参考例２：ＡＡＴ−クロラムフェニコール（ＣＡＴ）融合タンパク質を利用した高可溶性変異体のスクリーニング］
リンゴＡＡＴの高可溶性変異体の取得のために、まず、ＡＡＴ遺伝子のランダム変異ライブラリーを作製した。次に、変異型ＡＡＴ遺伝子にクロラムフェニコール（ＣＡＴ）耐性遺伝子を連結させた変異ＡＡＴ−ＣＡＴ融合遺伝子を含む発現プラスミドライブラリーを作製し、これらにより形質転換された大腸菌形質転換体から、クロラムフェニコール耐性を指標にして高可溶性ＡＡＴのスクリーニングを行った。ＡＡＴタンパク質の可溶性が向上すれば、ＡＡＴ−クロラムフェニコール融合タンパク質の可溶性も向上し、結果として大腸菌形質転換体のクロラムフェニコール耐性が向上する。具体的には、以下の手順で行った。【０１０９】
（１）ランダム変異遺伝子ライブラリーの作製
ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）とプライマーＭＭＡ−１８５、ＭＭＡ−１５７を用いて、ｐＡＡＴ１１６を鋳型としたＰＣＲを行い、増幅断片（１．４Ｋｂ）を得た。
プライマーＭＭＡ−１８５（配列番号１９）：
GGATCATGAAAAGCTTTTCTGTACTCCAAGTC
プライマーＭＭＡ−１５７（配列番号２０）：
GTGATTTTTTTCTCCGCACTAGTCTACTGGCTGGTGCTACGCAG【０１１０】
増幅断片を制限酵素ＢｓｐＨＩ及びＳｐｅＩで処理し、アガロースゲル電気泳動により断片を分離後、Ｇｅｌ／ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＦＡＶＯＲＧＥＮ社）を用いてゲルより抽出し、これをランダム変異遺伝子ライブラリー（変異ＡＡＴ（Ｍ２Ｋ）遺伝子ライブラリー）とした。【０１１１】
（２）ＡＡＴ−ＣＡＴ融合遺伝子を含む発現プラスミドｐＡＡＴ１１３の作製
プラスミドベクターｐＳＴＶ２８Ｎの作製
ＣＡＴ遺伝子には、プラスミドベクターｐＳＴＶ２８（タカラバイオ）由来のものを用いた。本ＣＡＴ遺伝子内にはＮｃｏＩ制限酵素部位が存在するが、後のライブラリーの作製において不都合が生じるため、ＮｃｏＩ部位である配列をＮｃｏＩにより切断されない配列に変換した。変換は、プラスミドｐＳＴＶ２８を鋳型としたＰＣＲ反応により以下のようにして行った。【０１１２】
フォワードプライマーＭＭＡ−１５２（配列番号２１）：
GCCCCCGTTTTCACGATGGGCAAATAT
リバースプライマーＭＭＡ−１５３（配列番号２２）：
ATATTTGCCCATCGTGAAAACGGGGGC【０１１３】
ＰＣＲ反応液１２．５μｌにＤｐｎＩを０．５μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートし、処理後の反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。大腸菌形質転換体からプラスミドを調製し、ｐＳＴＶ２８Ｎと命名した。【０１１４】
ＡＡＴ−ＣＡＴ融合遺伝子を発現するプラスミドｐＡＡＴ１１３の作製
参考例１に記載のプラスミドｐＡＡＴ０１２を鋳型として、プライマーＭＭＡ−１５６、１５７を用いて、ＰＣＲによりＡＡＴ遺伝子断片を増幅した後、精製を行った。【０１１５】
プライマーＭＭＡ−１５６（配列番号２３）：
CACAGGAAACAGACCATGGTGAGCTTTTCTGTACTCCAAGTCAAACG
プライマーＭＭＡ−１５７（配列番号２４）：
GTGATTTTTTTCTCCGCACTAGTCTACTGGCTGGTGCTACGCAG【０１１６】
ｐＳＴＶ２８Ｎを鋳型として、プライマーＭＭＡ−１５９、１６０を用いて、ＰＣＲによりＣＡＴ遺伝子断片を増幅した後、精製を行った。【０１１７】
プライマーＭＭＡ−１５９（配列番号２５）：
CTGCGTAGCACCAGCCAGTAGACTAGTGCGGAGAAAAAAATCAC
プライマーＭＭＡ−１６０（配列番号２６）：
GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCG【０１１８】
ＡＡＴ遺伝子断片及びＣＡＴ遺伝子断片と、ＮｃｏＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉにより予め切断しておいたベクターｐＴｒｃ９９Ａとを混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて３断片を連結した。反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。大腸菌形質転換体からプラスミドを調製し、ｐＡＡＴ１１３と命名した。ｐＡＡＴ１１３中のＡＡＴ遺伝子の２番目のアミノ酸はバリンである。【０１１９】
ＡＡＴ（Ｖ２Ｋ）−ＣＡＴ融合遺伝子を発現するプラスミドｐＡＡＴ１１７の作製
ｐＡＡＴ１１３中のＡＡＴ遺伝子の２番目のアミノ酸をバリンからリジンに変換し、プラスミドｐＡＡＴ１１７を作製した。アミノ酸の置換は、参考例１におけるｐＡＡＴ１１５からのｐＡＡＴ１１６の作製にならって行った。【０１２０】
（３）変異ＡＡＴ−ＣＡＴ融合遺伝子プラスミドライブラリーの作製
ｐＡＡＴ１１３をＮｃｏＩとＳｐｅＩにより切断後、ＳＡＰ（Shrimp Alkaline Phosphatase）処理を行った。アガロースゲル電気泳動とＧｅｌ／ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＦＡＶＯＲＧＥＮ社）によりＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ断片と上記（１）で得られたランダム変異遺伝子ライブラリーをＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ.２（タカラバイオ）を用いて連結した。反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。【０１２１】
大腸菌形質転換体をＬＢＡｍｐ寒天培地上で培養し、約１２，０００個のコロニーを回収し、菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液の一部を取り、Ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドを調製し、変異ＡＡＴ（Ｍ２Ｋ）−ＣＡＴ融合遺伝子プラスミドライブラリーとした。【０１２２】
（４）クロラムフェニコール耐性を指標とした高可溶性ＡＡＴのスクリーニングと変異箇所の同定
上記（３）で得られた変異ＡＡＴ（Ｍ２Ｋ）−ＣＡＴ融合遺伝子プラスミドライブラリーを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。大腸菌形質転換体の培養液を、３０ｍｇ／ｌ  クロラムフェニコールと０．４ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。得られたコロニーを液体培養し、プラスミドを調製した。プラスミド中のＡＡＴ遺伝子配列を解析し、変異箇所を同定した（表３）。【０１２３】
【表３】
2018043546.tif 000004
【０１２４】
（５）同定された変異を導入した変異体のＡＡＴ活性評価
「表３」に示す変異を導入した変異体を発現するプラスミドを作製した（表４）。【０１２５】
まず、ｐＡＡＴ１１６を鋳型として下記の「表４」に示すプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。反応液にＤｐｎＩを１μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＤｐｎＩ処理液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。大腸菌形質転換体より変異型ＡＡＴ遺伝子を含むプラスミドを調製した。【０１２６】
【表４】
2018043546.tif 000005
【０１２７】
「表４」に示すプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、大腸菌形質転換体の細胞破砕液のＡＡＴ活性を、実施例１に記載の方法により測定した。「表５」に結果を示す。表中、活性値は、ｐＡＡＴ１１６から発現する基準体の活性を１とした相対値により示す。【０１２８】
【表５】
2018043546.tif 000006
【０１２９】
Ａ６４Ｖ、Ｖ２４８Ａ及びＱ３６３Ｋの変異の導入によりＡＡＴ活性の向上が認められた。Ｋ１１７Ｑの変異も若干の活性向上を示した。表には示していないが、６４位のアラニンをイソロイシン又はスレオニンに置換した場合、及び３６３位のグルタミンをプロリン、アデニン、アルギニン、グリシン又はトリプトファンに置換した場合にも、ｐＡＡＴ１１６から発現する基準体の活性に比して１２０％以上の活性が確認された。【０１３０】
次に、Ａ６４Ｖ、Ｋ１１７Ｑ、Ｖ２４８Ａ及びＱ３６３Ｋの４重変異体を作成した。【０１３１】
（６）４重変異体の作成及び活性評価
Ａ６４Ｖ、Ｋ１１７Ｑ、Ｖ２４８Ａ及びＱ３６３Ｋの４箇所の変異を有するＡＡＴ遺伝子を委託合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）し、ベクターｐＴｒｃ９９Ａへ挿入してプラスミドｐＡＡＴ０２１を取得した。プラスミドｐＡＡＴ０２１により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、大腸菌形質転換体の細胞破砕液のＡＡＴ活性を、実施例１に記載の方法により測定した。【０１３２】
結果を図５に示す。ｐＡＡＴ１１６から発現する基準体に対して、４重変異体は約６倍の活性を示した。【０１３３】
［実施例２：システイン６置換４重変異体の作成及び活性評価］
ＡＡＴの４８位、１５０位、１６７位、２７０位、２７４位及び４４７位のシステインが全てアラニンに置換され、かつ、Ａ６４Ｖ、Ｋ１１７Ｑ、Ｖ２４８Ａ及びＱ３６３Ｋの４箇所の変異を有するＡＡＴ遺伝子を委託合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）し、ベクターｐＴｒｃ９９Ａへ挿入してプラスミドｐＡＡＴ０２５を取得した。ラスミドｐＡＡＴ０２５により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、大腸菌形質転換体の細胞破砕液のＡＡＴ活性を、実施例１に記載の方法により測定した。【０１３４】
結果を図５に示す。ｐＡＡＴ０２１から発現する基準体（４重変異体）に対して、システイン６置換４重変異体は約２．８倍の組換体あたりの活性を示した。【０１３５】
［実施例３：システイン６置換４重変異組換体の作成及び活性評価２］
プラスミドｐＡＡＴ０２１（４重変異体）において、ＡＡＴの１５０位のシステインがアルギニンに置換されたプラスミドｐＡＡＴ１５５、ｐＡＡＴ０２５（システイン６置換４重変異体）において、ＡＡＴの１５０位のシステインがアルギニンに置換されたプラスミドｐＡＡＴ１５４を作成した。【０１３６】
プラスミドｐＡＡＴ１５５は、ＡＡＴの１５０位のシステインがアルギニンに置換され、かつ、Ａ６４Ｖ、Ｋ１１７Ｑ、Ｖ２４８Ａ及びＱ３６３Ｋの４重変異を有する変異型ＡＡＴ遺伝子を含む。
プラスミドｐＡＡＴ１５４は、ＡＡＴの４８位、１６７位、２７０位、２７４位及び４４７位のシステインが全てアラニンに置換され、１５０位のシステインがアルギニンに置換され、かつＡ６４Ｖ、Ｋ１１７Ｑ、Ｖ２４８Ａ及びＱ３６３Ｋの４重変異を有する変異型ＡＡＴ遺伝子を含む。【０１３７】
アミノ酸の置換は、参考例１におけるｐＡＡＴ１１５からのｐＡＡＴ１１６の作成にならって行った。ＰＣＲ反応は、プライマーＭＭＡ−３８０、ＭＭＡ−３８１を用い、鋳型をｐＡＡＴ０２１又はｐＡＡＴ０２５として行った。【０１３８】
プライマーＭＭＡ−３８０（配列番号５９）：
CTGATTCAAGTCACTCGTCTGACGTGTGGTGG
プライマーＭＭＡ−３８１（配列番号６０）：
CCACCACACGTCAGACGAGTGACTTGAATCAG【０１３９】
プラスミドｐＡＡＴ１５５、ｐＡＡＴ１５４により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、大腸菌形質転換体の細胞破砕液のＡＡＴ活性を、実施例１に記載の方法により測定した。また、細胞抽出液（可溶性画分）と、遠心分離によって細胞抽出液から分離された不溶性画分（菌体及び膜画分）とを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、組換体ＡＡＴタンパク質のバンドを検出した。【０１４０】
結果を図５に示す。ｐＡＡＴ１５５、ｐＡＡＴ１５４から発現する組換体は、ｐＡＡＴ０２１から発現する基準体（４重変異体）に比してそれぞれ約３．７倍、約５倍の組換体あたりのＡＡＴ活性を示した。また、ｐＡＡＴ１５５、ｐＡＡＴ１５４を発現する組換体では、基準体を発現する組換体に比べて、可溶性画分により多くのタンパク質が存在していた。この結果により、１５０位のシステインを特にアルギニンに置換することによって基準体の可溶性をより高め、活性をさらに向上させられることが明らかとなった。【０１４１】
［実施例４：システイン４〜５置換４重変異体の作成及び活性評価］
ＡＡＴの４８位、１５０位、１６７位、２７０位、２７４位及び４４７位の６つのシステインのうち５つ又は４つがアラニンに置換され、かつ、Ａ６４Ｖ、Ｋ１１７Ｑ、Ｖ２４８Ａ及びＱ３６３Ｋの４箇所の変異を有するＡＡＴ遺伝子を委託合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）し、ベクターｐＴｒｃ９９Ａへ挿入して「表６」に示すプラスミドを取得した。各プラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、大腸菌形質転換体の細胞破砕液のＡＡＴ活性を、実施例１に記載の方法により測定した。【０１４２】
【表６】
2018043546.tif 000007
【０１４３】
結果を図６に示す。グラフ縦軸は、菌体重量あたりのＡＡＴ活性を、ｐＡＡＴ１１６から発現する基準体の活性を１として示す。システイン５置換４重変異体、及びシステイン４置換４重変異体はいずれも、ｐＡＡＴ０２１から発現する基準体（４重変異体）に比して高い可溶性及び組換体あたりの活性を示した。【０１４４】
［実施例５：高活性トマトＡＡＴの製造］
（１）システイン残基がアラニン残基に置換された変異体を発現する組換体の作成
トマトＡＡＴ（ＳｐＡＡＴ）遺伝子を発現するプラスミドｐＡＡＴ０３２を委託合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社、以下同じ）。ｐＡＡＴ０３２は、トマト（野生種）野生型ＡＡＴ（配列番号６６）の２番目のアミノ酸がアラニンからリジンに置換されたトマト（野生種）Ａ２Ｋ型ＡＡＴ（配列番号６４）を含む。本遺伝子がコードするタンパク質には、８個のシステインが存在する。それぞれのシステインがアラニンに置換された８種のプラスミドを委託合成した（表７）。【０１４５】
【表７】
2018043546.tif 000008
【０１４６】
「表７」に示した９種のプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。【０１４７】
（２）変異体を含む細胞抽出液のＡＡＴ活性測定
実施例１と同様にして大腸菌形質転回体を培養し、菌体を回収して、細胞抽出液を調製し、ＡＡＴ活性を測定した。結果を図７に示す。
ｐＡＡＴ０３２から発現する基準体の活性１００％に比して５０％以上の組換体あたりのＡＡＴ活性を示した変異体は５つ得られた（ｐＡＴＭ１０４、ｐＡＴＭ１０５、ｐＡＴＭ１０６、ｐＡＴＭ１０７、ｐＡＴＭ１０８から発現する変異体）。【０１４８】
（３）システイン残基がアラニン残基に５置換された変異体を発現する組換体の作成
そこでこれら５つの変異体が有する全てのアミノ酸置換Ｃ２０６Ａ、Ｃ２０９Ａ、Ｃ２５６Ａ、Ｃ２６９Ａ及びＣ３２２Ａが導入された変異体を含むプラスミドｐＡＡＴ１６４を委託合成した。ＡＡＴ活性を測定した結果を図７に示す。
ｐＡＡＴ１６４から発現する変異体の組換体あたりのＡＡＴ活性は、基準体の活性に比して約３倍を示した。また、ｐＡＡＴ１６４から発現する変異体は、基準体に比べて、可能性画分により多く存在していた。この結果により、２０６位、２０９位、２５６位、２６９位及び３２２位のシステインのアラニンへの置換によってＡＡＴの可溶性を高め、組換体あたりの活性を向上させられることが明らかとなった。【０１４９】
［実施例６：高活性イチゴＡＡＴの製造］
（１）システイン残基がアラニン残基に置換された変異体を発現する組換体の作成
イチゴＡＡＴ（ＳＡＡＴ）遺伝子（配列番号６５）を発現するプラスミドｐＡＡＴ０３３を委託合成した。本遺伝子がコードされたタンパク質には、９個のシステインが存在する。それぞれのシステインがアラニンに置換された９種のプラスミドを委託合成した（表８）。【０１５０】
【表８】
2018043546.tif 000009
【０１５１】
「表８」に示した１０種のプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。【０１５２】
（２）変異体を含む細胞抽出液のＡＡＴ活性測定
実施例１と同様にして大腸菌形質転回体を培養し、菌体を回収して、細胞抽出液を調製し、ＡＡＴ活性を測定した。結果を図８に示す。
ｐＡＡＴ０３３から発現する基準体の活性１００％に比して５０％以上の組換体あたりのＡＡＴ活性を示した変異体は７つ得られた（ｐＡＴＭ２０２、ｐＡＴＭ２０３、ｐＡＴＭ２０４、ｐＡＴＭ２０５、ｐＡＴＭ２０６、ｐＡＴＭ２０７、ｐＡＴＭ２０８から発現する変異体）。【０１５３】
（３）システイン残基がアラニン残基に５置換された変異体を発現する組換体の作成
上記７つの変異体が有するアミノ酸置換のうち、Ｃ１１５Ａ、Ｃ１６７Ａ、Ｃ１７９Ａ、Ｃ３２５Ａ及びＣ３５６Ａが導入された変異体を含むプラスミドｐＡＡＴ０３７を委託合成した。ＡＡＴ活性を測定した結果を図８に示す。
ｐＡＡＴ０３７から発現する変異体の組換体あたりのＡＡＴ活性は、基準体の活性に比して約１．７倍を示した。この結果により、１１５位、１６７位、１７９位、３２５位及び３５６位のシステインのアラニンへの置換によって組換体あたりの活性を向上させられることが明らかとなった。
【配列表フリーテキスト】
【０１５４】
配列番号１：リンゴ野生型ＡＡＴ（Mp-AAT1_apple）
配列番号２：リンゴＭ２Ｋ型ＡＡＴ
配列番号３：リンゴＭ２Ｋ型に４重変異を導入したＡＡＴ
配列番号４：リンゴＭ２Ｋ型にシステイン６置換を導入したＡＡＴ
配列番号５：リンゴＭ２Ｋ型に４重変異とシステイン６置換を導入したＡＡＴ
配列番号６：リンゴＭ２Ｋ型に４重変異とＣｙｓ１５０Ａｒｇを導入したＡＡＴ
配列番号７：リンゴＭ２Ｋ型に４重変異とシステイン６置換（うち１５０位はＣｙｓ１５０Ａｒｇ）を導入したＡＡＴ
配列番号８：リンゴＭ２Ｋ型に４重変異とシステイン５置換を導入したＡＡＴ
配列番号９：リンゴＭ２Ｋ型に４重変異とシステイン４置換を導入したＡＡＴ
配列番号１０：リンゴＭ２Ｋ型に４重変異とシステイン４置換を導入したＡＡＴ
配列番号１１：リンゴＭ２Ｋ型に４重変異とシステイン４置換を導入したＡＡＴ
配列番号１２：リンゴ由来ＡＡＴのアミノ酸配列（Md-AAT2_apple）
配列番号１３：リンゴＭ２Ｋ型に４重変異とシステイン４置換を導入したＡＡＴ
配列番号１４：大腸菌コドンに最適化した野生型リンゴＡＡＴ遺伝子
配列番号１５：プライマーＭＭＡ−１５６
配列番号１６：プライマーＭＭＡ−１６３
配列番号１７：プライマーＭＭＡ−１６６
配列番号１８：プライマーＭＭＡ−１６９
配列番号１９：プライマーＭＭＡ−１８５
配列番号２０：プライマーＭＭＡ−１５７
配列番号２１：プライマーＭＭＡ−１５２
配列番号２２：プライマーＭＭＡ−１５３
配列番号２３：プライマーＭＭＡ−１５６
配列番号２４：プライマーＭＭＡ−１５７
配列番号２５：プライマーＭＭＡ−１５９
配列番号２６：プライマーＭＭＡ−１６０
配列番号２７：プライマーＭＭＡ−２０７
配列番号２８：プライマーＭＭＡ−２０８
配列番号２９：プライマーＭＭＡ−２１５
配列番号３０：プライマーＭＭＡ−２１６
配列番号３１：プライマーＭＭＡ−２１７
配列番号３２：プライマーＭＭＡ−２１８
配列番号３３：プライマーＭＭＡ−２１９
配列番号３４：プライマーＭＭＡ−２２０
配列番号３５：プライマーＭＭＡ−２２１
配列番号３６：プライマーＭＭＡ−２２２
配列番号３７：プライマーＭＭＡ−２２３
配列番号３８：プライマーＭＭＡ−２２４
配列番号３９：プライマーＭＭＡ−２２５
配列番号４０：プライマーＭＭＡ−２２６
配列番号４１：プライマーＭＭＡ−２４１
配列番号４２：プライマーＭＭＡ−２４２
配列番号４３：プライマーＭＭＡ−２４３
配列番号４４：プライマーＭＭＡ−２４４
配列番号４５：プライマーＭＭＡ−２２９
配列番号４６：プライマーＭＭＡ−２３０
配列番号４７：プライマーＭＭＡ−２３１
配列番号４８：プライマーＭＭＡ−２３２
配列番号４９：プライマーＭＭＡ−２４５
配列番号５０：プライマーＭＭＡ−２４６
配列番号５１：プライマーＭＭＡ−２３３
配列番号５２：プライマーＭＭＡ−２３４
配列番号５３：プライマーＭＭＡ−２３９
配列番号５４：プライマーＭＭＡ−２４０
配列番号５５：プライマーＭＭＡ−２３７
配列番号５６：プライマーＭＭＡ−２３８
配列番号５７：プライマーＭＭＡ−２３５
配列番号５８：プライマーＭＭＡ−２３６
配列番号５９：プライマーＭＭＡ−３８０
配列番号６０：プライマーＭＭＡ−３８１
配列番号６１：ナシ由来ＡＡＴのアミノ酸配列
配列番号６２：ビワ由来ＡＡＴのアミノ酸配列
配列番号６３：カキ由来ＡＡＴのアミノ酸配列
配列番号６４：トマト（野生種）Ａ２Ｋ型ＡＡＴ
配列番号６５：イチゴ野生型ＡＡＴのアミノ酸配列
配列番号６６：トマト（野生種）野生型ＡＡＴのアミノ酸配列
配列番号６７：トマト（栽培種）由来ＡＡＴのアミノ酸配列
配列番号６８：バレイショ由来ＡＡＴのアミノ酸配列
配列番号６９：トウガラシ由来ＡＡＴのアミノ酸配列
配列番号７０：タバコ由来ＡＡＴのアミノ酸配列
配列番号７１：チリイチゴ由来ＡＡＴのアミノ酸配列
配列番号７２：エゾヘビイチゴ由来ＡＡＴのアミノ酸配列
配列番号７３：ハマナス由来ＡＡＴのアミノ酸配列
【図１】
2018043546.tif 000010
【図２】
2018043546.tif 000011
【図３】
2018043546.tif 000012
【図４】
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【図５】
2018043546.tif 000014
【図６】
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【図７】
2018043546.tif 000016
【図８】
2018043546.tif 000017
【配列表】
2018043546000001.app
【国際調査報告】
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