(57)【要約】  本発明は、腫瘍組織や炎症患部組織といった疾病標的組織に対する移行性、浸透性、滞留性を向上させて薬理活性物質の作用を向上させることにより薬理活性効果を効率的に発揮させることができる高分子ミセル型ＤＤＳ製剤を提供することを課題とし、ポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメントと、疎水性置換基を側鎖に有するポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック共重合体であって、該親水性ポリマーセグメントに標的結合部位が結合しており、該ポリエチレングリコール鎖と該ポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であるブロック共重合体（Ａ）である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメントと、疎水性置換基を側鎖に有するポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック共重合体であって、該親水性ポリマーセグメントに標的結合部位が結合しており、該ポリエチレングリコール鎖と該ポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であるブロック共重合体（Ａ）。
【請求項２】
ポリアミノ酸鎖が、ポリアスパラギン酸鎖、ポリグルタミン酸鎖又はポリ（アスパラギン酸−グルタミン酸）鎖であり、側鎖カルボキシ基に疎水性置換基をエステル結合及び／又はアミド結合にて有している請求項１に記載のブロック共重合体（Ａ）。
【請求項３】
ポリエチレングリコール鎖の分子量が１キロダルトン以上で６キロダルトン以下である請求項１又は請求項２に記載のブロック共重合体（Ａ）。
【請求項４】
標的結合部位を除いたブロック共重合体における疎水性置換基の質量含有率が５質量％以上で６０質量％以下である請求項１乃至請求項３の何れか一項に記載のブロック共重合体（Ａ）。
【請求項５】
ブロック共重合体（Ａ）が、一般式（１）
【化１】
2018025699.tif 000008
［式中、Ｒ１は標的結合部位の結合残基を示し、ｔａは２０〜１４０の整数を示し、Ａａは置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｒ２ａは水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基を示し、Ｒ３ａは、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のジアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基、水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質の結合残基、水酸基及び／又はアミノ基を有する蛍光物質の結合残基からなる群から選択される１種以上の疎水性置換基の結合残基を１以上含み、残部は水酸基であり、Ｂａは単結合又は二価の結合基を示し、ｎａは１又は２を示し、ｘ１ａ、ｘ２ａ及びｚａは、それぞれ独立して０〜２０の整数を示し、ｘ１ａ＋ｘ２ａは１〜２０の整数を示し、（ｘ１ａ＋ｘ２ａ＋ｚａ）は３〜２０の整数を示し、前記Ｒ３ａが結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基が分子内環化した構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。］で示される請求項１乃至請求項４の何れか一項に記載のブロック共重合体（Ａ）。
【請求項６】
水溶液中で自己会合性のナノ粒子を形成し、該ナノ粒子の平均粒径が３０ナノメートル以下である、請求項１乃至請求項５の何れか一項に記載のブロック共重合体（Ａ）。
【請求項７】
請求項１乃至請求項６の何れか一項に記載のブロック共重合体（Ａ）、並びにポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメントと、疎水性置換基を側鎖に有するポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物であって、前記ブロック共重合体（Ｂ）のポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であり、ブロック共重合体（Ｂ）の疎水性置換基の質量含有率が５質量％以上で６０質量％以下であるブロック共重合体（Ｂ）である、ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物。
【請求項８】
ブロック共重合体（Ｂ）のポリアミノ酸鎖が、ポリアスパラギン酸鎖、ポリグルタミン酸鎖又はポリ（アスパラギン酸−グルタミン酸）鎖であり、側鎖カルボキシ基に疎水性置換基をエステル結合及び／又はアミド結合にて有している請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ブロック共重合体（Ｂ）のポリエチレングリコール鎖の分子量が１キロダルトン以上で６キロダルトン以下である請求項７又は請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ブロック共重合体（Ｂ）が、一般式（２）
【化２】
2018025699.tif 000009
［式中、Ｒ５は水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｔｂは２０〜１４０の整数を示し、Ａｂは置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｒ２ｂは水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基を示し、Ｒ３ｂは、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のジアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基、水酸基及び／又はアミノ基を有する蛍光物質の結合残基からなる群から選択される１種以上の疎水性置換基の結合残基を１以上含み、残部は水酸基であり、Ｂｂは単結合又は二価の結合基を示し、ｎｂは１又は２を示し、ｘ１ｂ、ｘ２ｂ及びｚｂは、それぞれ独立して０〜２０の整数を示し、ｘ１ｂ＋ｘ２ｂは１〜２０の整数を示し、（ｘ１ｂ＋ｘ２ｂ＋ｚｂ）は３〜２０の整数を示し、前記Ｒ３ｂが結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基が分子内環化した構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。］で示される請求項７乃至請求項９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ブロック共重合体（Ａ）及びブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物が水溶液中でナノ粒子を形成し、該ナノ粒子の平均粒径が３０ナノメートル以下である、請求項７乃至請求項１０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１乃至請求項６の何れか一項に記載のブロック共重合体（Ａ）、並びにポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメントと、側鎖カルボキシ基に水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質が結合したポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物であって、前記ブロック共重合体（Ｃ）のポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であり、ブロック共重合体（Ｃ）の水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質の質量含有率が５質量％以上で６０質量％以下であるブロック共重合体（Ｃ）である、ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物。
【請求項１３】
ブロック共重合体（Ｃ）のポリアミノ酸鎖が、ポリアスパラギン酸鎖、ポリグルタミン酸鎖又はポリ（アスパラギン酸−グルタミン酸）鎖であり、側鎖カルボキシ基に水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質をエステル結合及び／又はアミド結合にて有している請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ブロック共重合体（Ｃ）のポリエチレングリコール鎖の分子量が１キロダルトン以上で６キロダルトン以下である請求項１２又は請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ブロック共重合体（Ｃ）が、一般式（３）
【化３】
2018025699.tif 000010
［式中、Ｒ５ｃは水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｔｃは２０〜１４０の整数を示し、Ａｃは置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｒ２ｃは水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基を示し、Ｒ３ｃは水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質の結合残基を示し、Ｒ４ｃは疎水性置換基の結合残基であって、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のジアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基、水酸基及び／又はアミノ基を有する蛍光物質の結合残基、並びに水酸基からなる群から選択される１種以上の置換基を示し、Ｂｃは単結合又は二価の結合基を示し、ｎｃは１又は２を示し、ｘ１ｃ、ｘ２ｃ、ｙ１ｃ、ｙ２ｃ及びｚｃは、それぞれ独立して０〜２０の整数を示し、（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ）は必須の構成であって１〜２０の整数を示し、（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ＋ｙ１ｃ＋ｙ２ｃ＋ｚｃ）は３〜２０の整数を示し、前記Ｒ３ｃ及びＲ４ｃが結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基が分子内環化した構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。］で示される請求項１２乃至請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ブロック共重合体（Ａ）及びブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物が水溶液中でナノ粒子を形成し、該ナノ粒子の平均粒径が３０ナノメートル以下である、請求項１２乃至請求項１５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１乃至請求項１６の何れか一項に記載のブロック共重合体を含有する医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的結合部位を有する高分子誘導体、及び該高分子誘導体を含む組成物であって、疾病標的組織に対する移行性、浸透性、滞留性を有し、並びに／若しくは、腎臓等における排泄性を有するアクティブターゲティング型高分子誘導体、及び該高分子誘導体を含む組成物、それらを用いた医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品において、有効成分である生理活性物質の薬物動態を制御して、生体内の特異的な作用部位に望ましい薬物濃度−作用時間で送達させるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）が開発されている。非特許文献１は、ポリエチレングリコールセグメントとポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック共重合体を薬剤運搬担体とするＤＤＳ化製剤を開示している。このブロック共重合体は、ポリエチレングリコールの外殻と疎水性内核を有する粒径が２０〜１００ｎｍの高分子ミセルを形成し、様々な種類の薬剤を化学結合又は物理的取込みにより安定に内核に包含する。
この高分子ミセル型ＤＤＳ製剤は、ＥＰＲ（正常の血管に比べて透過性が高い腫瘍部位や炎症部位近傍の血管において、１００ｎｍ以下の粒子が特異的に集まるという現象）効果を持つこと、生体内に投与すると排泄が抑制されて体内滞留性が向上すること、受動的に腫瘍等の組織へ移行して集積して行くことが特徴である。これらの性質に基づき、高分子ミセル型ＤＤＳ製剤は生理活性物質を生体内に長時間留め、有効成分の利用率を高めることができる。すなわち、高分子ミセル型ＤＤＳ製剤は搭載薬と比較して、より強力な生理活性効果をもたらす。
特許文献１及び特許文献２はパクリタキセルを物理的に取り込んだ高分子ミセル型ＤＤＳ製剤を開示している。特許文献３にはカンプトテシン誘導体が化学結合した高分子ミセル型ＤＤＳ製剤、特許文献４にはレゾルシノール誘導体が化学結合した高分子ミセル型ＤＤＳ製剤、特許文献５にはタキサン誘導体が化学結合した高分子ミセル型ＤＤＳ製剤、特許文献６にはステロイド誘導体が化学結合した高分子ミセル型ＤＤＳ製剤が記載されている。様々な薬剤が高分子ミセル型ＤＤＳ製剤に適用可能であり、様々なブロック共重合体及び高分子ミセル型ＤＤＳ製剤が知られている。【０００３】
従来の高分子ミセル型ＤＤＳ製剤では、内包薬剤の血中滞留性が向上するため、疾病組織のみならず、正常組織にも長時間、薬剤が作用する。例えば特許文献３で開示の抗腫瘍剤であるカンプトテシン誘導体が化学結合したブロック共重合体は、生体内においてカンプトテシン誘導体が徐放的に放出する。その結果、腫瘍組織だけでなく骨髄等の正常組織に対しても遊離したカンプトテシン誘導体が長期間に亘り作用してしまう懸念がある。従来のカンプトテシン誘導体結合ブロック共重合体は、強力な抗腫瘍効果を発揮すると共に不可避的に好中球減少等の骨髄抑制を発現し、これが用量制限毒性（ＤＬＴ；ｄｏｓｅ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｔｏｘｉｔｙ）となってしまっている（非特許文献２）。そのため、抗腫瘍効果を維持しつつ、より骨髄抑制を軽減したカンプトテシン誘導体の開発が求められている。このように、従来の高分子ミセル型ＤＤＳ製剤は、強力な薬理活性効果を発揮させることができるものの、正常組織においては副作用を発現させてしまうことがあった。【０００４】
一方、非特許文献３は、癌種及び動物種によりＥＰＲ効果が異なることを指摘している。また、この違いが、高分子ミセル型ＤＤＳ製剤が含む成分の効果に影響しているのではないかと考察している。非特許文献４は、３０ｎｍと７０ｎｍの高分子ミセル型ＤＤＳ製剤を用い、ＥＰＲ効果を示しやすい動物モデルと示しにくい動物モデルがあること、３０ｎｍの高分子ミセル型ＤＤＳ製剤の方がＥＰＲ効果が低い動物モデルでその効果を示すことを報告している。
特許文献７には、標的結合部位を有するポリマー成分α、及び薬剤を有するポリマー成分βを含有する組成物、具体的には、標的結合部位としてトランスフェリン、薬剤としてドセタキセルが使用された高分子ミセル型ＤＤＳ製剤が開示されている。腫瘍組織へのターゲティング効果による強力な抗腫瘍活性とともに、ミセルが崩壊して、代謝によりポリマーユニットβが体外に排泄されることによる副作用の低下が記載されている。しかし、詳細な副作用軽減効果が記載されていないこと、組成物の体内挙動を追跡していないことに加え、多くの実施例で粒子径が約１００ｎｍと大きいことから、癌種及び動物種によっては十分な抗腫瘍効果と副作用低減を実現できないと考えられる。
以上のことから、高分子ミセル型ＤＤＳ製剤において、ＥＰＲ効果を示しにくい疾病組織に対する浸透性と滞留性を有することで効果を増強し、且つ正常組織への分布を抑制して副作用を軽減したブロック共重合体、及び該ブロック共重合体を含む組成物の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００４／０８２７１８号
【特許文献２】国際公開第２００６／０３３２９６号
【特許文献３】国際公開第２００４／０３９８６９号
【特許文献４】国際公開第２００８／０４１６１０号
【特許文献５】国際公開第２００７／１１１２１１号
【特許文献６】国際公開第２００９／０４１５７０号
【特許文献７】特許第４５３８６６６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００８年，６０巻，８９９〜９１４頁
【非特許文献２】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０年，１６巻，５０５８〜５０６６頁
【非特許文献３】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３年，７３巻，２４１２〜２４１７頁
【非特許文献４】ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，２０１５年，９（５），４９５７〜４９６７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来の生理活性物質を化学結合又は物理的取込みにより内核に包含した高分子ミセル型ＤＤＳ製剤よりも、有効性及び／又は安全性が向上したブロック共重合体及び該ブロック共重合体からなる医薬組成物を提供することを課題とする。特に腫瘍組織や炎症患部組織といった疾病標的組織に対する移行性、浸透性、滞留性を向上させて薬理活性物質の作用を向上させることにより薬理活性効果を効率的に発揮させることができる高分子ミセル型ＤＤＳ製剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ポリマー主鎖が２キロダルトン以上１０キロダルトン以下の分子量の担体ポリマーを用いて調製される高分子ミセル型ＤＤＳ製剤が、従来の高分子ミセル型ＤＤＳ製剤と全く異なる薬物動態特性を示すことを見出した。
更に、高分子ミセル型ＤＤＳ製剤を調製するための担体ポリマーであるポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメントと、疎水性置換基を側鎖に有するポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック共重合体において、ポリエチレングリコール鎖に抗体分子や受容体結合性ペプチド等の標的結合部位を結合させたブロック共重合体とすることで、当該ブロック共重合体が高分子ミセル様会合体を形成すると共に、標的部位認識性を有して、標的部位特異的に滞留することを見出し、有効性及び／又は安全性を向上させることができる動態を持つことを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は次の［１］〜［１７］に関する。【０００９】
［１］  ポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメントと、疎水性置換基を側鎖に有するポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック共重合体であって、該親水性ポリマーセグメントに標的結合部位が結合しており、該ポリエチレングリコール鎖と該ポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であるブロック共重合体（Ａ）。
本発明は、高分子ミセル型ＤＤＳ製剤を調製するための親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック共重合体において、当該ブロック共重合体のポリマー主鎖が２キロダルトン以上１０キロダルトン以下の分子量の担体ポリマーであることを第１の特徴とする。併せて、親水性ポリマーセグメントに抗体分子や受容体結合性ペプチド等の標的結合部位を結合させたブロック共重合体であることを第２の特徴とする。
本発明は、前記第１の特徴により、従来の高分子ミセル型ＤＤＳ製剤より標的疾患組織に対する移行性・浸透性を有すると共に、腎臓からの排泄性を具備する従来の高分子ミセル型ＤＤＳ製剤とは異なる薬物動態特性を有している。また、第２の特徴により、標的組織に対するターゲティング機能を有しており、標的疾患組織で長期間滞留することができる。【００１０】
［２］  ポリアミノ酸鎖が、ポリアスパラギン酸鎖、ポリグルタミン酸鎖又はポリ（アスパラギン酸−グルタミン酸）鎖であり、側鎖カルボキシ基に疎水性置換基をエステル結合及び／又はアミド結合にて有している前記［１］に記載のブロック共重合体（Ａ）。
疎水性ポリマーセグメントには、カルボン酸側鎖を有するポリアミノ酸を用いると、種々の疎水性置換基を容易に、結合量を制御して付与することができることから有利である。
［３］  ポリエチレングリコール鎖の分子量が１キロダルトン以上で６キロダルトン以下である前記［１］又は［２］に記載のブロック共重合体（Ａ）。
［４］  標的結合部位を除いたブロック共重合体における疎水性置換基の質量含有率が５質量％以上で６０質量％以下である前記［１］乃至［３］の何れか一項に記載のブロック共重合体（Ａ）。
［５］  ブロック共重合体（Ａ）が、一般式（１）
【化１】
2018025699.tif 000002
［式中、Ｒ１は標的結合部位の結合残基を示し、ｔａは２０〜１４０の整数を示し、Ａａは置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｒ２ａは水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基を示し、Ｒ３ａは、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のジアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基、水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質の結合残基、水酸基及び／又はアミノ基を有する蛍光物質の結合残基からなる群から選択される１種以上の疎水性置換基の結合残基を１以上含み、残部は水酸基であり、Ｂａは単結合又は二価の結合基を示し、ｎａは１又は２を示し、ｘ１ａ、ｘ２ａ及びｚａは、それぞれ独立して０〜２０の整数を示し、ｘ１ａ＋ｘ２ａは１〜２０の整数を示し、（ｘ１ａ＋ｘ２ａ＋ｚａ）は３〜２０の整数を示し、前記Ｒ３ａが結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基が分子内環化した構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。］で示される前記［１］乃至［４］の何れか一項に記載のブロック共重合体（Ａ）。
［６］  水溶液中で自己会合性のナノ粒子を形成し、該ナノ粒子の平均粒径が３０ナノメートル以下である、前記［１］乃至［５］の何れか一項に記載のブロック共重合体（Ａ）。
本発明は、当該ブロック共重合体（Ａ）が両親媒性であることに基づき自己会合性を有して、３０ナノメートル以下のナノ粒子を形成し、疾病組織における浸透性に優れると共に、腎臓等からの排泄性も併せ持ち、従来既知の高分子ミセル型ＤＤＳ製剤とは明らかに異なる薬物動態特性を示すことが大きな特徴である。【００１１】
本願は、前記の標的結合部位を有する主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であるブロック共重合体（Ａ）と、標的結合部位を具備しない主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であるブロック共重合体（Ｂ）を組み合わせて調製される組成物も、発明の態様の１つとして挙げる。
［７］  前記［１］乃至［６］の何れか一項に記載のブロック共重合体（Ａ）、並びにポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメントと、疎水性置換基を側鎖に有するポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物であって、前記ブロック共重合体（Ｂ）のポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であり、ブロック共重合体（Ｂ）の疎水性置換基の質量含有率が５質量％以上で６０質量％以下であるブロック共重合体（Ｂ）である、ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物。
標的結合部位を有してアクティブターゲティング能を有するブロック共重合体（Ａ）と、標的結合部位を具備しないブロック共重合体（Ｂ）を組み合わせると、これらの２種類の共重合体は相互作用に基づく一体の会合性凝集体を形成する。したがって、アクティブターゲティング作用を有するブロック共重合体（Ａ）の含有量を調整することで、標的疾患に対する親和能を調整することができる。また、ブロック共重合体（Ｂ）に様々な疎水性置換基を付与することで、高分子ミセル様会合体の会合性を調整することができる。【００１２】
［８］  ブロック共重合体（Ｂ）のポリアミノ酸鎖が、ポリアスパラギン酸鎖、ポリグルタミン酸鎖又はポリ（アスパラギン酸−グルタミン酸）鎖であり、側鎖カルボキシ基に疎水性置換基をエステル結合及び／又はアミド結合にて有している前記［７］に記載の組成物。
［９］  ブロック共重合体（Ｂ）のポリエチレングリコール鎖の分子量が１キロダルトン以上で６キロダルトン以下である［７］又は［８］に記載の組成物。
［１０］  ブロック共重合体（Ｂ）が、一般式（２）
【化２】
2018025699.tif 000003
［式中、Ｒ５は水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｔｂは２０〜１４０の整数を示し、Ａｂは置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｒ２ｂは水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基を示し、Ｒ３ｂは、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のジアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基、水酸基及び／又はアミノ基を有する蛍光物質の結合残基からなる群から選択される１種以上の疎水性置換基の結合残基を１以上含み、残部は水酸基であり、Ｂｂは単結合又は二価の結合基を示し、ｎｂは１又は２を示し、ｘ１ｂ、ｘ２ｂ及びｚｂは、それぞれ独立して０〜２０の整数を示し、ｘ１ｂ＋ｘ２ｂは１〜２０の整数を示し、（ｘ１ｂ＋ｘ２ｂ＋ｚｂ）は３〜２０の整数を示し、前記Ｒ３ｂが結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基が分子内環化した構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。］で示される前記［７］乃至［９］の何れか一項に記載の組成物。
［１１］  ブロック共重合体（Ａ）及びブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物が水溶液中でナノ粒子を形成し、該ナノ粒子の平均粒径が３０ナノメートル以下である、前記［７］乃至［１０］の何れか一項に記載の組成物。
本発明は、アクティブターゲティング機能を具備するブロック共重合体（Ａ）、アクティブターゲティング機能を有さないブロック共重合体（Ｂ）が、共に両親媒性であることに基づく相互作用により会合して一体の３０ナノメートル以下のナノ粒子を形成する。そして、そのナノ粒子は、標的組織における移行性・浸透性に優れると共に、腎臓等からの排泄性も併せ持ち、従来既知の高分子ミセル型ＤＤＳ製剤とは明らかに異なる薬物動態特性を示すことが大きな特徴である。また、ブロック共重合体（Ａ）により標的組織に対するターゲティング機能を有しており、標的疾患組織で長期間滞留することができる。【００１３】
本願は、前記の標的結合部位を有する主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であるブロック共重合体（Ａ）と、標的結合部位を具備しない主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であって、生理活性物質を徐放的に開裂する態様の化学結合により具備した高分子プロドラッグ要素を有するブロック共重合体（Ｃ）を組み合わせて調製される組成物も、発明の態様の１つとして挙げる。
［１２］  前記［１］乃至［６］の何れか一項に記載のブロック共重合体（Ａ）、並びにポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメントと、側鎖カルボキシ基に水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質が結合したポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物であって、前記ブロック共重合体（Ｃ）のポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であり、ブロック共重合体（Ｃ）の水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質の質量含有率が５質量％以上で６０質量％以下であるブロック共重合体（Ｃ）である、ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物。
標的結合部位を有してアクティブターゲティング能を有するブロック共重合体（Ａ）と、標的結合部位を具備しない高分子プロドラッグであるブロック共重合体（Ｃ）を組み合わせると、これらの２種類の共重合体は相互作用に基づく一体の会合性凝集体を形成する。したがって、アクティブターゲティング作用を有するブロック共重合体（Ａ）の含有量を調整することで、標的疾患に対する親和能を調整することができる。また、ブロック共重合体（Ｃ）に様々な生理活性物質を付与することで、多様な疾患に対するアクティブターゲティング機能を有する高分子ミセル型ＤＤＳ製剤を提供することができる。【００１４】
［１３］  ブロック共重合体（Ｃ）のポリアミノ酸鎖が、ポリアスパラギン酸鎖、ポリグルタミン酸鎖又はポリ（アスパラギン酸−グルタミン酸）鎖であり、側鎖カルボキシ基に水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質をエステル結合及び／又はアミド結合にて有している前記［１２］に記載の組成物。
［１４］  ブロック共重合体（Ｃ）のポリエチレングリコール鎖の分子量が１キロダルトン以上で６キロダルトン以下である前記［１２］又は［１３］に記載の組成物。
［１５］  ブロック共重合体（Ｃ）が、一般式（３）
【化３】
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［式中、Ｒ５ｃは水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｔｃは２０〜１４０の整数を示し、Ａｃは置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｒ２ｃは水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基を示し、Ｒ３ｃは水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質の結合残基を示し、Ｒ４ｃは疎水性置換基の結合残基であって、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のジアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基、水酸基及び／又はアミノ基を有する蛍光物質の結合残基、並びに水酸基からなる群から選択される１種以上の置換基を示し、Ｂｃは単結合又は二価の結合基を示し、ｎｃは１又は２を示し、ｘ１ｃ、ｘ２ｃ、ｙ１ｃ、ｙ２ｃ及びｚｃは、それぞれ独立して０〜２０の整数を示し、（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ）は必須の構成であって１〜２０の整数を示し、（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ＋ｙ１ｃ＋ｙ２ｃ＋ｚｃ）は３〜２０の整数を示し、前記Ｒ３ｃ及びＲ４ｃが結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基が分子内環化した構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。］で示される前記［１２］乃至［１４］に記載の組成物。
［１６］  ブロック共重合体（Ａ）及びブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物が水溶液中でナノ粒子を形成し、該ナノ粒子の平均粒径が３０ナノメートル以下である、前記［１２］乃至［１５］の何れか一項に記載の組成物。
標的結合部位を有してアクティブターゲティング能を有するブロック共重合体（Ａ）と、標的結合部位を具備しない高分子プロドラッグであるブロック共重合体（Ｃ）を組み合わせると、これらの２種類の共重合体は相互作用に基づく一体の会合性凝集体を形成する。したがって、アクティブターゲティング作用を有するブロック共重合体（Ａ）の含有量を調整することで、標的疾患に対する親和能を調整することができる。また、ブロック共重合体（Ｃ）に様々な生理活性物質を付与することで、多様な疾患の治療に供することができる高分子ミセル型ＤＤＳ製剤を提供することができる。【００１５】
本願のブロック共重合体は医薬品に用いることができることから、当該ブロック共重合体の医薬用途も本願の発明に含まれる。
［１７］  前記［１］乃至［１６］の何れか一項に記載のブロック共重合体を含有する医薬。
すなわち、前記ブロック共重合体（Ａ）を用いる医薬が挙げられる。当該ブロック共重合体（Ａ）に生理活性物質を物理的に包含せしめて高分子ミセル型ＤＤＳ製剤を調製することができる。また、疎水性置換基として生理活性物質を結合させたプロドラッグ型共重合体とすることで、化学結合型の高分子ミセル型ＤＤＳ製剤を調製することができる。
また、前記［７］乃至［１１］の何れか一項に記載の態様であって、ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物、を用いる医薬を挙げることができる。当該ブロック共重合体（Ａ）及び（Ｂ）に生理活性物質を物理的に包含せしめて高分子ミセル型ＤＤＳ製剤を調製することができる。また、ブロック共重合体（Ａ）に疎水性置換基として生理活性物質を結合させたプロドラッグ型共重合体とすることで、化学結合型の高分子ミセル型ＤＤＳ製剤を調製することができる。
若しくは前記［１２］乃至［１６］の何れか一項に記載の態様であって、ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物、を用いる医薬を挙げることができる。当該ブロック共重合体（Ａ）及び（Ｃ）に生理活性物質を物理的に包含せしめて高分子ミセル型ＤＤＳ製剤を調製することができる。また、当該ブロック共重合体（Ａ）の疎水性置換基として生理活性物質を結合させたプロドラッグ型共重合体とすることで、化学結合型の高分子ミセル型ＤＤＳ製剤を調製することができる。若しくは、当該ブロック共重合体（Ａ）の疎水性置換基として生理活性物質ではない疎水性置換基であって、当該ブロック共重合体（Ｃ）をプロドラッグ型共重合体を担い、化学結合型の高分子ミセル型ＤＤＳ製剤を調製することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本願発明の標的結合部位が結合しているブロック共重合体（Ａ）を含有する組成物から形成されるナノ粒子は、生体内に投与された後、標的組織に移行・浸透・滞留し、及び／又は腎臓等における排泄性が向上している。このため本発明に係るブロック共重合体（Ａ）を含有する組成物は、従来の高分子ミセル型ＤＤＳ製剤と比較して、標的組織に対する高い移行性、浸透性、滞留性を有することから、生理活性物質を標的組織の広範囲に亘り感作させ、効率的に薬理活性効果を発揮させることができる。並びに／若しくは、該ブロック共重合体、及びその組成物は、腎臓等における排泄性が向上しているため、血中滞留性が抑えられて標的組織以外の正常組織への生理活性物質の感作を抑制することにより、正常組織の障害発現を回避させることができる
特に生理活性物質として抗腫瘍剤を用いた場合、ブロック共重合体（Ａ）を含有する組成物の腫瘍組織に対する移行性、浸透性、滞留性の向上、及び／又は腎排泄性の向上により、抗腫瘍効果の増強及び／又は骨髄抑制等の正常組織障害の乖離を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例７及び８、並びに比較例３のリン酸緩衝液中における薬剤放出性を示す。
【図２】比較例１及び６のインテグリンαＶβ３に対する結合性試験の結果を示す。
【図３】実施例３及び４のインテグリンαＶβ３に対する結合性試験の結果を示す。
【図４】実施例３、並びに比較例４及び５の腫瘍組織内分布を示す画像である。
【図５】図４の腫瘍組織内分布を示す画像の輝度を算出したグラフである。
【図６】実施例３、並びに比較例４及び５の腎臓組織内分布を示す画像である。
【図７】図６の腎臓組織内分布を示す画像の輝度を算出したグラフである。
【図８】実施例７、並びに比較例２及び３の腫瘍組織内分布を示す画像である。
【図９】図８の腫瘍組織内分布を示す画像の輝度を算出したグラフである。
【図１０】実施例７、並びに比較例２及び３の腎臓組織内分布を示す画像である。
【図１１】図１０の腎臓組織内分布を示す画像の輝度を算出したグラフである。
【図１２】実施例７、並びに比較例２及び３の腫瘍内ＡＵＣ／血漿中ＡＵＣを示す。
【図１３】実施例１１、並びに比較例７の標的結合能試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
［ブロック共重合体（Ａ）］
本発明は、高分子ミセル型ＤＤＳ製剤の構成ポリマーである、ポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメントと、疎水性置換基を側鎖に有するポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック共重合体であって、該親水性ポリマーセグメントに標的結合部位が結合しており、該ポリエチレングリコール鎖と該ポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下である。好ましくは、標的結合部位を除いた疎水性置換基の質量含有率が５質量％以上で５０質量％以下であるブロック共重合体（Ａ）に関する。該ブロック共重合体（Ａ）は、腫瘍組織や炎症性疾患部位といった標的疾患組織や標的細胞に対して親和性を示す標的結合部位を有し、いわゆるアクティブターゲット機能を有する両親媒性のブロック共重合体である。以下に、その詳細について説明する。
【００１９】
ブロック共重合体（Ａ）は、ポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメント部分と、疎水性置換基を側鎖に有するポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントが、適当な結合基を介して連結してなるＡＢブロック共重合体を、担体ポリマーの主鎖構造とする。
【００２０】
ブロック共重合体（Ａ）におけるポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメントは、エチレンオキシ基：（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位の繰り返し構造を有するセグメントである。好ましくはエチレンオキシ基単位重合度が１０〜１８０ユニット、より好ましくは重合度が２０〜１４０ユニットのポリエチレングリコール鎖を含むセグメント構造である。
すなわち該ポリエチレングリコールセグメントとは、ポリエチレングリコール相当の分子量として０．４キロダルトン〜８キロダルトンのセグメント部であることが好ましく、より好ましくは分子量として０．８キロダルトン〜６キロダルトンの構造部分であり、特に好ましくは分子量として１キロダルトン〜６キロダルトンである。分子量が、１キロダルトン〜５キロダルトンのポリエチレングリコールセグメントであることが、殊更好ましい。
標的結合部位を除いたブロック共重合体（Ａ）における前記ポリエチレングリコールセグメントの質量含有率は、２０質量％以上７０質量％以下であることがより好ましい。３０質量％以上６５質量％以下であることが殊更好ましい。
なお、本発明で用いるポリエチレングリコールセグメントの分子量とは本発明のブロック共重合体を調製する際において、用いるポリエチレングリコールセグメント構造化合物の、ポリエチレングリコール標準品を基準としたＧＰＣ法により測定されるピークトップ分子量より求められる分子量を採用し、計算値としては１００の位を四捨五入した値を使用する。
【００２１】
ポリエチレングリコールセグメントの一方の末端基は、後述するポリアミノ酸鎖と結合するための連結基である。ポリエチレングリコール鎖と後述するポリアミノ酸鎖の連結様式としては、２つのポリマー鎖を化学結合により連結する基であれば、特に限定されるものではなく、ポリエチレングリコール末端基及びポリアミノ酸誘導体の末端基と、それぞれ結合できる官能基を具備した連結基であれば良い。好ましくは、末端基に結合官能基を有する（Ｃ１〜６）アルキレン基である。ポリエチレングリコールセグメントとの結合様式は、ポリオキシエチレン基；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）の末端酸素原子によるエーテル結合が好ましく、ポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントとの結合様式はアミド結合又はエステル結合であることが好ましい。すなわち、連結基としては−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−基（ｓは１〜６の整数である）又は−（ＣＨ２）ｓ−ＣＯ−基（ｓは１〜６の整数である）である。−（ＣＨ２）ｓ−ＣＯ−基（ｓは１〜６の整数である）としては、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、ブチレン基、ヘキサメチレン基等が挙げられ、特にトリメチレン基が好ましい。
【００２２】
ブロック共重合体（Ａ）における疎水性ポリマーセグメントのポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントは、アルキル基やアラルキル基等の疎水性置換基を側鎖に有するアミノ酸を含み、前記ポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメントと比して疎水性を示すポリマーセグメントであれば、特に限定されずに適用することができる。
該ポリアミノ酸セグメントを構成するアミノ酸は特に限定されるものではなく、天然型アミノ酸、合成アミノ酸及びその側鎖修飾体の何れを用いても良い。また、Ｌ体、Ｄ体及びラセミ体の何れを用いても良い。例えばグリシン、アラニン、β−アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン、システイン等を挙げることができる。また、側鎖が修飾されたアミノ酸を用いても良く、アスパラギン酸又はグルタミン酸のアルキルエステル、アスパラギン酸又はグルタミン酸のアラルキルエステル、アスパラギン酸又はグルタミン酸のアルキルアミド、アスパラギン酸又はグルタミン酸のアラルキルアミド、Ｂｏｃリシン等のアルキルオキシカルボニルリシン等が挙げられる。該ポリアミノ酸セグメントは、これらのアミノ酸の何れか１種であっても良く、複数種類が混在してセグメントを構築していても良い。
該ポリアミノ酸鎖は、アミノ酸が２〜３０ユニットで重合したセグメント構造であることが好ましい。３〜２０ユニットの重合体であることがより好ましく、５〜２０ユニットの重合体であることが殊更好ましい。
【００２３】
疎水性ポリマーセグメントにおけるポリアミノ酸鎖は、様々な疎水性置換基を制御して導入できることから、カルボン酸側鎖を有するアミノ酸であるアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を含有するポリアミノ酸鎖とすることが好ましい。より好ましくは、アスパラギン酸のみで構築されたポリアスパラギン酸鎖、グルタミン酸のみで構築されたポリグルタミン酸鎖、若しくは、アスパラギン酸とグルタミン酸がランダムに混在して構成されたポリ（アスパラギン酸‐グルタミン酸）鎖であることが好ましい。そして、疎水性置換基が所望の疎水性を示す程度に任意の割合で、側鎖カルボキシ基にエステル結合及び／又はアミド結合により導入されている態様が好ましい。これらの側鎖カルボキシ基を有するポリアミノ酸鎖は、α‐アミド結合型重合体であっても、側鎖カルボキシ基とのアミド結合型重合体であっても、β（又はγ）‐アミド結合型重合体であっても、その混合物であってもよい。また、ポリアミノ酸鎖は、直鎖状ポリアミノ酸であっても良く、側鎖を介した分岐型構造であっても良い。
【００２４】
疎水性ポリマーセグメントにおける疎水性置換基としては、例えば置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、置換基を有していてもよいジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基からなる群から選択される１種以上の置換基であることが好ましい。これらの疎水性置換基は、標的結合部位を除いたブロック共重合体（Ａ）における含有率として５質量％以上で６０質量％以下であることが好ましい。疎水性置換基の含有率が５質量％より低い場合、当該ブロック共重合体（Ａ）の疎水性ポリマーセグメントの疎水性が弱く、疎水性相互作用に基づく十分な会合性が得られない懸念がある。一方、疎水性置換基の含有率が６０質量％を超える場合、会合性は十分に具備するものの、疾患組織への浸透性・分布特性や、体外への排泄性において、満足できる薬物動態特性を奏しない懸念がある。当該疎水性置換基のブロック共重合体（Ａ）における含有率として５質量％以上で５０質量％以下であることが好ましい。
【００２５】
疎水性ポリマーセグメントにおける疎水性置換基として、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基としては、置換基を有していてもよい直鎖状、分岐状又は環状の炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基が挙げられる。すなわち、側鎖カルボキシ基がエステル型誘導体となったものである。置換基としては、水酸基、ハロゲノ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アリール基等を具備していても良い。該炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、シクロヘキシルオキシ基、ベンジルオキシ基、４−フェニルブトキシ基、オクチルオキシ基、デシルオキシ基、ドデシルオキシ基、テトラデシルオキシ基、ヘキサデシルオキシ基、オクタデシルオキシ基、イコシルオキシ基、ドコシルオキシ基、テトラコシルオキシ基、ヘキサコシルオキシ基、オクタコシルオキシ基、トリアコンチルオキシ基等が挙げられる。
【００２６】
置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基としては、置換基を有していてもよい直鎖状、分岐状又は環状の炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基が挙げられる。すなわち、側鎖カルボキシ基が、アルキルアミド型誘導体となったものである。置換基としては、水酸基、ハロゲノ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アリール基等を具備していても良い。該炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、ベンジルアミノ基、４−フェニルブチルアミノ基、オクチルアミノ基、デシルアミノ基、ドデシルアミノ基、テトラデシルアミノ基、ヘキサデシルアミノ基、オクタデシルアミノ基、イコシルアミノ基、ドコシルアミノ基、テトラコシルアミノ基、ヘキサコシルアミノ基、オクタコシルアミノ基、トリアコンチルアミノ基等が挙げられる。
該アルキルアミノ基には、カルボキシ基を保護したアミノ酸又はアミノ基を有する蛍光物質の結合残基も包含される。該カルボキシ基を保護したアミノ酸としては、例えば、グリシンメチルエステル、グリシンベンジルエステル、β−アラニンメチルエステル、β−アラニンベンジルエステル、アラニンメチルエステル、ロイシンメチルエステル、フェニルアラニンメチルエステル等を用いても良い。
【００２７】
該アミノ基を有する蛍光物質としては、例えば、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ＴＲ  Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ＦＬ  Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｎｅ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４  Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）  Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ、ＡＴＴＯ  ５９４  ａｍｉｎｅ等も含まれ、これらのアミド結合残基が含まれる。蛍光物質を導入することで、当該ブロック共重合体（Ａ）の組織内分布や排泄性を確認するための指標とすることができる。
【００２８】
置換基を有していてもよいジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基としては、置換基を有していてもよい直鎖状、分岐状又は環状のジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基が挙げられる。すなわち、側鎖カルボキシ基が、ジアルキルアミド型誘導体となったものである。置換基としては、水酸基、ハロゲノ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アリール基等を具備していても良い。該ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基としては、例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジブチルアミノ基、ピロリジノ基、ピペリジノ基、ジベンジルアミノ基、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノ基、ジオクチルアミノ基、ジノニルアミノ基、ジデシルアミノ基、ジドデシルアミノ基、ジテトラデシルアミノ基、ジヘキサデシルアミノ基、ジオクタデシルアミノ基、ジイコシルアミノ基等が挙げられる。
【００２９】
置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基としては、置換基を有していてもよい直鎖状、分岐状又は環状の（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル基が置換したウレア型誘導体である。該アルキル基は同一種類であっても異なる種類であっても良い。置換基としては、水酸基、ハロゲノ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アリール基等を具備していても良い。置換基を有する場合ジアルキルアミノ基が好ましい。置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノカルボニルメチルアミノ基、エチルアミノカルボニルエチルアミノ基、イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、シクロヘキシルアミノカルボニルシクロヘキシルアミノ基、エチルアミノカルボニル（３−ジメチルアミノプロピル）アミノ基、（３−ジメチルアミノプロピル）アミノカルボニルエチルアミノ基等である。
【００３０】
また、当該疎水性置換基として、水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質を用いることもできる。該生理活性物質が遊離する場合、ブロック共重合体（Ａ）は、アクティブターゲティング機能を有する高分子プロドラッグと成り得る。
疎水性置換基として用いることができる生理活性物質としては、特に限定されるものではないが、高分子ミセル型ＤＤＳ製剤の適応疾病を考慮すると、悪性腫瘍疾患、炎症性疾患、感染症疾患等が挙げられ、これらの疾患の治療に用いられる医薬品の有効成分又は医薬有効成分候補化合物を適用すること、若しくはそれらを誘導体化又はプロドラッグ化した有効成分を適用することが好ましい。以下に、本発明に適用可能な生理活性物質の例を挙げるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
悪性腫瘍疾患に供せられる生理活性物質としては、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、イリノテカン、ノギテカン、９−アミノカンプトテシン等のカンプトテシン誘導体、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル等のタキサン誘導体、ガネテスピブ、ルミネスピブ等のＨＳＰ９０阻害活性を有するレゾルシノール誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、アムルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ピラルビシン等のアントラサイクリン誘導体、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス等のラマパイシン誘導体、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド、エノシタビン、シタラビンオクホスファート、エチニルシチジン、アザシチジン、デシタビン等のシチジン系代謝拮抗剤、メソトレキサート、ペメトレキセド、レボホリナート、ホリナート等の葉酸代謝拮抗剤、フルダラビン、ネララビン、ペントスタチン、クラドリビン等のプリン系代謝拮抗剤、ドキシフルリジン、カペシタビン、テフガール、フルオロウラシル、カルモフール等のフッ化ピリミジン系代謝拮抗剤、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン等の白金含有化合物、マイトマイシンＣ等のマイトマイシン誘導体、ブレオマイシン、リブロマイシン等のブレオマイシン誘導体、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン等のビンカアルカロイド誘導体、エトポシド、テニポシド等のポドフィロトキシン誘導体、エリブリン等のハリコンドリン誘導体、レベカマイシン、ＵＣＮ−０１等のスタウロスポリン誘導体、レナリドミド、ポマリドミド等のサリドマイド誘導体、トレチノイン、タミバロテン等のビタミンＡ誘導体、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、コンブレタスタチンＡ４等のコンブレタスタチン誘導体、ビニメチニブ、コビメチニブ、トラメチニブ等のＭＥＫ阻害剤、ディナシクリブ、フラボピリドール、パルボシクリブ等のＣＤＫ阻害剤、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、ベムラフェニブ等のＲａｆキナーゼ阻害剤、ボリノスタット、ベリノスタット、パナビノスタット、ロミデプシン等のＨＤＡＣ阻害剤、サイトカラシン、ラトランクリン、ファロイジン等のアクチン重合阻害剤、ベリパリブ、ラキャパリブ、オラパリブ等のＰＡＲＰ阻害剤、クリゾチニブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、バンデタニブ、スニチニブ、アキシチニブ、パゾパニブ、レンバチニブ、ラパチニブ、ニンテダニブ、ニロチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ルキソリチニブ、クリゾチニブ、イブルチニブ等のチロシンキナーゼ阻害剤、ベンダムスチン、シクロホスファミド、イホスファミド、ブルスファン、メルファラン等のナイトロジェンマスタード系アルキル化剤、ニムスチン、ラニムスチン、ロムスチン等のニトロソウレア系アルキル化剤、ダカルバジン、テモゾロミド、プロカルバジン、チオテパ等のアルキル化剤、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ファドロゾール等のアロマターゼ阻害剤、ヒドロキシフルタミド、フルタミド、ビカルタミド、エンザルタミド等の抗アンドロゲン剤、アビラテロン等のＣＹＰ１７（リアーゼ）阻害剤、タモキシフェン、トレミフェン等の抗エストロゲン剤、エストラムスチン、プロゲステロン、ミトタン、メドロキシプロゲステロン等のホルモン剤が挙げられる。
【００３２】
炎症性疾患に供せされる生理活性物質としては、タクロリムス等のタクロリムス誘導体、デキサメタゾン、プレドニゾロン等のステロイド誘導体、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス等のラマパイシン誘導体、シクロスポリン、フィンゴリモド、アザチオプリン、ミゾリビン、ミルコフェノール酸モフェチル、グスペリムス等の免疫抑制剤、ジフルニサル、チアラミド等のＮＳＡＩＤｓ等が挙げられる。
【００３３】
感染症疾患に供せられる生理活性物質としては、アムホテリシンＢ、ナイスタチン等のポリエン系抗生物質、フルコナゾール、ボリコナゾール等のアゾール系誘導体、ミカファンギン等のキャンディン系誘導体、フルシトシン等のピリミジン誘導体等の抗真菌剤、アシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル等の抗ウイルス剤、ザナミビル、オセルタミビル、ラニナミビル等の抗ウイルス剤等が挙げられる。
【００３４】
該アスパラギン酸及び／又はポリグルタミン酸のエステル誘導体及び／又はアミド誘導体は、同一種類でも、異なる種類が混在した態様であっても良い。また、側鎖カルボキシ基が遊離酸又はその塩の態様が混在していても良い。
【００３５】
該ポリアミノ酸鎖の一方の末端基は、前述のポリエチレングリコールセグメントと結合するための連結基である。そして、もう一方の末端基は当該ポリアミノ酸鎖のＮ末端基及びＣ末端基であって、無保護の遊離アミノ基及び遊離カルボン酸、並びにそれらの塩であっても良く、Ｎ末端基及びＣ末端基の適当な修飾体であっても良い。
Ｎ末端基の修飾体としては、アシルアミド型修飾体、アルコキシカルボニルアミド型修飾体（ウレタン型修飾体）、アルキルアミノカルボニルアミド型修飾体（ウレア型修飾体）等を挙げることができる。一方、該Ｃ末端基の修飾体としては、エステル型修飾体、アミド型修飾体、チオエステル型修飾体が挙げられる。
【００３６】
該Ｎ末端基及び該Ｃ末端基の修飾基は、任意の修飾基であって良く、好ましくは、Ｎ末端基及びＣ末端基に結合する適当な結合基を介して、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ６〜Ｃ１８）の芳香族基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基等である末端修飾基を挙げることができる。
すなわち、Ｎ末端基は、適当なアシルアミド型修飾体又はアルコキシカルボニルアミド型修飾体（ウレタン型修飾体）であることが好ましく、カルボニル基又はカルボニルオキシ基を介した前記置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ６〜Ｃ１８）の芳香族基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基であることが好ましい。
一方、Ｃ末端基としては、適当なアミド型置換基又はエステル型置換基であることが好ましく、アミド基又はエステル基を介した前記置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ６〜Ｃ１８）の芳香族基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基であることが好ましい。
該末端基における置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
該末端基における置換基を有していても良い炭素数（Ｃ６〜Ｃ１８）の芳香族基としては、フェニル基、ピリジル基、ナフチル基等が挙げられる。
該末端基における置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基としては、いずれか１カ所の水素原子がアリール基で置換されている直鎖又は分岐鎖アルキル基である。例えば、ベンジル基、２−フェニルエチル基、４−フェニルブチル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。
該ポリアミノ酸鎖の該末端基は、Ｎ末端基及びＣ末端基による修飾体であることが好ましい。
【００３７】
ブロック共重合体（Ａ）における、ポリエチレングリコール鎖に結合している標的結合部位とは、生物学的な認識機能を有する部位、すなわち生体及びウイルスなどに由来する特異的な物質に対し選択的に結合して当該物質と生物学的な結合対を形成し得る標的結合性分子種を意味する。生体及びウイルスに由来する物質としては、生体細胞、細菌、真菌、及びウイルスに存在する分子がそれに相当する。具体的には、腫瘍細胞、新生血管細胞、各種臓器を構成する細胞、血管内皮細胞、免疫担当細胞（例えばＴ細胞）、炎症細胞（例えば白血球）等が例示でき、当該標的結合部位は、このような細胞における特異的な物質と結合対を形成するタンパク質、ペプチド及び糖鎖といった化合物、若しくは結合対を形成する特異性を維持したままその構造の少なくとも一部が含有した状態で構成された化合物のことである。
【００３８】
標的結合部位に該当する分子種としては、生体及びウイルスに由来する物質と結合対を形成するタンパク質、ペプチド又は糖鎖を例示できる。こうしたタンパク質としては、生体及びウイルスに由来する物質と結合する抗体及びその断片、トランスフェリンならびに上皮成長因子（ＥＧＦ）を例示できる。抗体としては、がん細胞に代表される投薬対象物の表面に高発現する受容体や細胞表面の抗原である、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＣＤ２０、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０及びＣＤ３３といった抗原を認識する抗体を例示できる。抗体はモノナール抗体であってもよいしポリクロナール抗体であってもよい。抗体の断片としては、抗原を特異的に認識できる長さを有しているものであればよく、（Ｆａｂ’）２及びＦａｂを例示できる。ペプチドとしては、インスリン、ＬＨＲＨ、ＩＧＦ、ＧＥ１１、ＲＧＤペプチド及びそれらの誘導体を例示できる。糖類としては、グルコース、マンノース、ガラクトース及びフコース残基を有する糖類を例示できる。標的結合部位を有する化合物は、それ自身が薬理活性を発揮し得る化合物、例えば、抗体医薬及びワクチンであってもよい。
【００３９】
該ポリエチレングリコールセグメントと標的結合部位の結合様式としては、両者を化学結合により連結する基であれば、特に限定されるものではなく、ポリエチレングリコール末端基及び標的結合部位としての化学種の結合部位と、それぞれ結合できる官能基を具備した連結基であれば良い。好ましくは、末端基に結合官能基を有する（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基である。ポリエチレングリコールセグメントとの結合様式は、ポリオキシエチレン基；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）の末端酸素原子によるエーテル結合が好ましく、ポリエチレングリコール鎖セグメントのα末端は水酸基、アミノ基、ホルミル基、カルボキシ基、アルデヒド基、メルカプト基、マレイミド基であることが好ましい。
【００４０】
ブロック共重合体（Ａ）のポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であることを特徴とする。分子量が２キロダルトン以上で８キロダルトン以下であることが好ましい。
【００４１】
この分子量は、その構成部分の各構成分子量を合算した計算値を分子量として採用する。すなわち、（１）ポリエチレングリコール鎖の分子量、（２）ポリアミノ酸鎖の主鎖部分の分子量を合算した計算値を当該分子量とする。なお、ブロック共重合体（Ａ）における標的結合部位は主鎖ポリマーに含まないため、分子量に考慮しない。
なお、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、キロダルトン単位での精度でよい。以下に、各構成部分における好ましい分析方法を挙げるが、当該ポリアミノ酸誘導体のｋＤａ単位での分子量測定において十分な精度の分析方法であれば特に限定されるものではない。
【００４２】
前記（１）ポリエチレングリコール鎖の分子量は、ポリエチレングリコールセグメントを構築するポリエチレングリコール化合物の分子量測定値であり、ポリエチレングリコール標準品を基準としたＧＰＣ法により測定されるピークトップ分子量により求められる分子量を採用し、計算値としては１００の位を四捨五入した値を使用する。
【００４３】
前記（２）ポリアミノ酸の主鎖部分の分子量は、疎水性ポリマーセグメントの中に含まれるポリアミノ酸鎖の重合モノマー単位の分子量にその平均重合数を乗じた計算値である。該重合数はポリアミノ酸の側鎖カルボキシ基を中和滴定により定量する方法や、１Ｈ−ＮＭＲの積分値から算出された重合数を用いることができる。中和滴定法を用いることが好ましい。
【００４４】
本発明のブロック共重合体（Ａ）は、水溶液中において自己会合性を示し、粒径（平均粒径）は３０ｎｍ以下であることが好ましい。より好ましくは３ｎｍ以上３０ｎｍ以下である。
本発明のブロック共重合体（Ａ）の粒径（体積基準粒径）測定は、本発明のブロック共重合体（Ａ）の１ｍｇ／ｍＬ水溶液をレーザー光を用いた動的光散乱法により測定される。例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ社製粒子径・ゼータ電位測定装置Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳで測定することができ、この時の体積基準粒径とは、ＮＮＬＳ法で解析された体積分布の内、存在する割合が一番多いピークの粒径である。
【００４５】
本発明のブロック共重合体（Ａ）は、親水性のポリエチレングリコールセグメントと、生理活性物質や他の疎水性側鎖により疎水性を示すポリアミノ酸誘導体セグメントが連結したブロック共重合体であるため、水溶液中では複数のブロック共重合体同士のポリアミノ酸誘導体セグメントが疎水性相互作用に基づき会合すると考えられる。結果として、ポリアミノ酸誘導体セグメントを内核（コア部）とし、その周りを親水性のポリエチレングリコールセグメントが覆い外殻層（シェル部）を形成したコア−シェル構造のミセル様会合体を形成し、これが前記のナノ粒子として観測されるものと推測される。
【００４６】
本発明のブロック共重合体（Ａ）は、一般式（１）
【化４】
2018025699.tif 000005
［式中、Ｒ１は標的結合部位の結合残基を示し、ｔａは２０〜１４０の整数を示し、Ａａは置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｒ２ａは水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基を示し、Ｒ３ａは、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のジアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基、水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質の結合残基、水酸基及び／又はアミノ基を有する蛍光物質の結合残基からなる群から選択される１種以上の疎水性置換基の結合残基を１以上含み、残部は水酸基であり、Ｂａは単結合又は二価の結合基を示し、ｎａは１又は２を示し、ｘ１ａ、ｘ２ａ及びｚａは、それぞれ独立して０〜２０の整数を示し、ｘ１ａ＋ｘ２ａは１〜２０の整数を示し、（ｘ１ａ＋ｘ２ａ＋ｚａ）は３〜２０の整数を示し、前記Ｒ３ａが結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基が分子内環化した構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。］で示されるブロック共重合体であることが好ましい。
【００４７】
前記Ｒ１における標的結合部位は、親水性のポリエチレングリコールセグメント側の末端に任意の連結基を介して結合させることにより形成される。該標的結合部位を有する化合物としては、上記に示したものと同義であり、生体及びウイルスに由来する物質と結合対を形成するタンパク質、ペプチド又は糖鎖等を挙げることができる。こうしたタンパク質としては、生体及びウイルスに由来する物質と結合する抗体及びその断片、トランスフェリンならびに上皮成長因子（ＥＧＦ）を例示できる。抗体としては、がん細胞に代表される投薬対象物の表面に高発現する受容体や細胞表面の抗原である、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＣＤ２０、ＶＥＧＦＲ及びＣＤ３３といった抗原を認識する抗体を例示できる。抗体はモノナール抗体であってもよいしポリクロナール抗体であってもよい。抗体の断片としては、抗原を特異的に認識できる長さを有しているものであればよく、（Ｆａｂ’）２及びＦａｂを例示できる。ペプチドとしては、インスリン、ＬＨＲＨ、ＩＧＦ、ＧＥ１１、ＲＧＤペプチド及びそれらの誘導体を例示できる。糖類としては、グルコース、マンノース、ガラクトース及びフコース残基を有する糖類を例示できる。標的結合部位を有する化合物は、それ自身が薬理活性を発揮し得る化合物例えば、抗体医薬及びワクチンであってもよい。
Ｒ１は、治療目的の疾患における標的組織や目的に応じて、任意の化合物を適宜選択することができる。
一般式（１）で示されるブロック共重合体（Ａ）は、ポリエチレングリコール鎖セグメントのα末端に水酸基、アミノ基、ホルミル基、カルボキシ基、アルデヒド基、メルカプト基、マレイミド基を有する連結基を有するブロック共重合体を調製して、標的結合部位を有する化合物と縮合又は付加反応させることによってＲ１を結合させることができる。
【００４８】
一般式（１）のｔａは、ポリエチレングリコールセグメントにおけるエチレンオキシ基の重合数を示す。該ｔａは２０〜１４０の整数である。すなわち、該ポリエチレングリコールセグメントの分子量としては０．８キロダルトン〜６キロダルトンである。
該ｔａが２０より小さいと、ブロック共重合体（Ａ）が十分な水溶性を具備せず、所望の体内動態を発揮しないおそれがある。一方、該ｔａが１４０より大きい場合、相対的に疎水性を担うポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントの含有量が低くなるため所望の自己会合性が得られず、これに伴う体内動態を発揮できない懸念がある。該ｔａは２２〜１３０の整数であることが好ましく、３０〜１２０の整数であることがより好ましい。すなわち、該ポリエチレングリコールセグメントの分子量としては１キロダルトン〜５．７キロダルトンであることが好ましく、１．３キロダルトン〜５．３キロダルトンであることより好ましい。
【００４９】
前記Ａａにおける置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、ｎ−ブチレン基等が挙げられる。有していてもよい置換基とは、水酸基、ハロゲノ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アリール基等を具備していても良い。
該Ａａとしては、特にエチレン基、ｎ−プロピレン基がより好ましい。
【００５０】
前記Ｒ２ａにおける置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基としては、置換基を有していてもよい直鎖状、分岐状又は環状の炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基が挙げられる。置換基としては、水酸基、ハロゲノ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アリール基等を具備していても良い。
前記Ｒ２ａの該炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基としては、例えば、ホルミル基、アセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基、プロピオニル基、ピバロイル基、ベンジルカルボニル基、フェネチルカルボニル基等が挙げられる。置換基を有していてもよい直鎖状、分岐状又は環状の炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）アシル基がより好ましく、アセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基がより好ましい。
前記Ｒ２ａにおける置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル基としては、置換基を有していてもよい直鎖状、分岐状又は環状の炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル基が挙げられる。置換基としては、水酸基、ハロゲノ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アリール基等を具備していても良い。前記Ｒ２の該炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル基としては、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
【００５１】
一般式（１）において、ｎａは１又は２を示す。ｎａが１のときポリアミノ酸鎖を構成するアミノ酸がアスパラギン酸である。一方、ｎａが２のときポリアミノ酸鎖を構成するアミノ酸がグルタミン酸である。したがって、一般式（１）におけるポリアミノ酸鎖は、ポリアスパラギン酸鎖、ポリグルタミン酸鎖又はポリ（アスパラギン酸−グルタミン酸）の混在鎖である。
【００５２】
一般式（１）におけるＢａは、前記Ｒ３ａに係る疎水性置換基の結合残基であって、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のジアルキルアミノ基、水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質の結合残基、蛍光物質の結合残基及び水酸基からなる群から選択される１種以上の置換基と、アスパラギン酸ユニット及び／又はグルタミン酸ユニットの側鎖カルボキシ基との結合基である。
該Ｂａに係る結合基としては単結合又は二価の結合基である。前記二価の結合基としては、前記疎水性置換基の水酸基及び／又はアミノ基とエステル結合及び／又はアミド結合し、前記アスパラギン酸鎖及び／又はグルタミン酸鎖の側鎖カルボキシ基とエステル結合、アミド結合又はチオエステル結合する結合基である。例えば、［Ｒ３ａ］−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−Ｏ−［ＣＯ−ｐｏｌｙｍｅｒ］（ｘは１〜８の整数を示す）、［Ｒ３ａ］−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−［ＣＯ−ｐｏｌｙｍｅｒ］（ｘは１〜８の整数を示す）、［Ｒ３ａ］−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−Ｓ−［ＣＯ−ｐｏｌｙｍｅｒ］（ｘは１〜８の整数を示す）である。Ｂａ中のｘとして好ましくは１乃至６であり、さらに好ましくは１、２、３、又は５である。最も好ましいＢａとしては［Ｒ３ａ］−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−［ＣＯ−ｐｏｌｙｍｅｒ］（ｘ＝１、２、３、又は５）である。
【００５３】
また、該Ｂａに係る二価の結合基としてアミノ酸誘導体を用いても良い。アミノ酸誘導体を結合基とする場合の結合基の使用態様としては、アミノ酸誘導体のＮ末アミノ基が前記側鎖カルボキシ基とアミド結合し、Ｃ末カルボキシ基が疎水性置換基の水酸基及び／又はアミノ基とエステル結合又はアミド結合する態様である。
該Ｂａに係る二価の結合基としてアミノ酸誘導体を用いる場合、天然型アミノ酸又は合成アミノ酸及びその側鎖修飾体の何れを用いても良い。またＬ体、Ｄ体及びラセミ体の何れを用いても良い。例えばグリシン、アラニン、β−アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン、システイン等を挙げることができる。また、側鎖が修飾されたアミノ酸としては、アスパラギン酸又はグルタミン酸のアルキルエステル、アスパラギン酸又はグルタミン酸のアラルキルエステル、アスパラギン酸又はグルタミン酸のアルキルアミド、アスパラギン酸又はグルタミン酸のアラルキルアミド、Ｂｏｃリシン等のアルキルオキシカルボニルリシン等が挙げられる。
また、該二価の結合基としてメチレン基を介して水酸基とカルボキシ基を配するグリコール酸誘導体を用いても良い。グリコール酸誘導体を二価の結合基とする場合の使用態様としては、グリコール酸誘導体の水酸基が、前記側鎖カルボキシ基とエステル結合し、カルボキシ基が疎水性置換基の水酸基及び／又はアミノ基とエステル結合又はアミド結合する態様である。
グリコール酸誘導体としては、例えば、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸等が挙げられる。多価カルボン酸を用いる場合、一方のカルボキシ基に前記疎水性置換基が結合し、もう一方のカルボキシ基はエステル誘導体又はアミド誘導体であることが好ましい。
前記二価の結合基は、単一種類の結合基であっても良く、複数種類の結合基が混在していても良い。
【００５４】
また、該Ｂａは単結合であってよい。単結合とは特に結合基を介せず、前記アスパラギン酸鎖及び／又はグルタミン酸鎖の側鎖カルボキシ基と、前記疎水性置換基の水酸基及び／又はアミノ基が直接エステル結合又はアミド結合している態様を指す。
【００５５】
Ｒ３ａにおける疎水性置換基の結合残基は、前記ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖の側鎖カルボキシ基にエステル型修飾基及び／又はアミド型修飾基が結合したものである。すなわち、該水酸基及び／又はアミノ基は結合性官能基であり、ここから水素原子が除かれた残基を示す。当該疎水性置換基は、特に限定することなく用いることができる。
一般式（１）におけるＲ３ａは、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のジアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基、水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質の結合残基、水酸基及び／又はアミノ基を有する蛍光物質の結合残基からなる群から選択される１種以上の疎水性置換基の結合残基を１以上含み、残部は水酸基である置換基を示す。
該Ｒ３ａは、ブロック共重合体（Ａ）の疎水性を制御する目的で導入する疎水性置換基である。すなわち、該Ｒ３ａに疎水性基を導入することで、該ブロック共重合体（Ａ）のポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖の疎水性を高めることができる。疎水性の程度は、導入する疎水性置換基の疎水性度及び／又は導入率により制御することができる。したがって、該Ｒ３ａは、全てが疎水性置換基であることは必須ではなく、残部が水酸基であって良い。また、該Ｒ３ａは単一の種類であっても複数の種類の置換基であっても良い。
【００５６】
Ｒ３ａにおける置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルコキシ基は、前記ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖の側鎖カルボキシ基にエステル型修飾基が結合したものである。置換基としては、水酸基、ハロゲノ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アリール基等を具備していても良い。
前記Ｒ３ａにおける該炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、１−プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、シクロヘキシルオキシ基、ベンジルオキシ基、４−フェニルブチルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、デシルオキシ基、ドデシルオキシ基、テトラデシルオキシ基、ヘキサデシルオキシ基、オクタデシルオキシ基、イコシルオキシ基、ドコシルオキシ基、テトラコシルオキシ基、ヘキサコシルオキシ基、オクタコシルオキシ基、トリアコンチルオキシ基等が挙げられる。
【００５７】
Ｒ３ａにおける置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基は、前記ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖の側鎖カルボキシ基に、アルキルアミド型修飾基が結合したものである。置換基としては、水酸基、ハロゲノ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アリール基等を具備していても良い。
前記Ｒ３ａにおける該炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、ベンジルアミノ基、４−フェニルブチルアミノ基、オクチルアミノ基、デシルアミノ基、ドデシルアミノ基、テトラデシルアミノ基、ヘキサデシルアミノ基、オクタデシルアミノ基、イコシルアミノ基、ドコシルアミノ基、テトラコシルアミノ基、ヘキサコシルアミノ基、オクタコシルアミノ基、トリアコンチルアミノ基等が挙げられる。
また、カルボキシ基を保護したアミノ酸も、該置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基に包含される。該カルボキシ基を保護したアミノ酸としては、例えば、グリシンメチルエステル、グリシンベンジルエステル、β−アラニンメチルエステル、β−アラニンベンジルエステル、アラニンメチルエステル、ロイシンメチルエステル、フェニルアラニンメチルエステル等を用いても良い。
【００５８】
Ｒ３ａにおける置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のジアルキルアミノ基は、前記ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖の側鎖カルボキシ基に、ジアルキルアミド型修飾基が結合したものである。置換基としては、水酸基、ハロゲノ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アリール基等を具備していても良い。
前記Ｒ３ａにおける該ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基としては、例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジブチルアミノ基、ピロリジノ基、ピペリジノ基、ジベンジルアミノ基、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノ基、ジオクチルアミノ基、ジノニルアミノ基、ジデシルアミノ基、ジドデシルアミノ基、ジテトラデシルアミノ基、ジヘキサデシルアミノ基、ジオクタデシルアミノ基、ジイコシルアミノ基等が挙げられる。
【００５９】
Ｒ３ａにおける置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基は、前記ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖の側鎖カルボキシ基に、ウレア型修飾基が結合したものである。該アルキル基は同一種類であっても異なる種類であっても良い。置換基としては、水酸基、ハロゲノ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アリール基等を具備していても良い。置換基を有する場合ジアルキルアミノ基が好ましい。
置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノカルボニルメチルアミノ基、エチルアミノカルボニルエチルアミノ基、イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、シクロヘキシルアミノカルボニルシクロヘキシルアミノ基、エチルアミノカルボニル（３−ジメチルアミノプロピル）アミノ基、（３−ジメチルアミノプロピル）アミノカルボニルエチルアミノ基等である。
【００６０】
Ｒ３ａにおける水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質の結合残基は、特に限定されるものではなく、医薬品の有効成分又は医薬有効成分候補化合物を適用すること、若しくはそれらを誘導体化又はプロドラッグ化した有効成分を適用することが好ましい。高分子ミセル型ＤＤＳ製剤の適応疾病を考慮すると、悪性腫瘍疾患、炎症性疾患、感染症疾患等が挙げられ、これらの疾患の治療に用いられる医薬品の有効成分又は医薬有効成分候補化合物を適用すること、若しくはそれらを誘導体化又はプロドラッグ化した有効成分を適用することが好ましい。以下に、本発明に適用可能な生理活性物質の例を挙げるが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
悪性腫瘍疾患に供せられる生理活性物質としては、、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、イリノテカン、ノギテカン、９−アミノカンプトテシン等のカンプトテシン誘導体、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル等のタキサン誘導体、ガネテスピブ、ルミネスピブ等のＨＳＰ９０阻害活性を有するレゾルシノール誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、アムルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ピラルビシン等のアントラサイクリン誘導体、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス等のラマパイシン誘導体、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド、エノシタビン、シタラビンオクホスファート、エチニルシチジン、アザシチジン、デシタビン等のシチジン系代謝拮抗剤、メソトレキサート、ペメトレキセド、レボホリナート、ホリナート等の葉酸代謝拮抗剤、フルダラビン、ネララビン、ペントスタチン、クラドリビン等のプリン系代謝拮抗剤、ドキシフルリジン、カペシタビン、テフガール、フルオロウラシル、カルモフール等のフッ化ピリミジン系代謝拮抗剤、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン等の白金含有化合物、マイトマイシンＣ等のマイトマイシン誘導体、ブレオマイシン、リブロマイシン等のブレオマイシン誘導体、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン等のビンカアルカロイド誘導体、エトポシド、テニポシド等のポドフィロトキシン誘導体、エリブリン等のハリコンドリン誘導体、レベカマイシン、ＵＣＮ−０１等のスタウロスポリン誘導体、レナリドミド、ポマリドミド等のサリドマイド誘導体、トレチノイン、タミバロテン等のビタミンＡ誘導体、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、コンブレタスタチンＡ４等のコンブレタスタチン誘導体、ビニメチニブ、コビメチニブ、トラメチニブ等のＭＥＫ阻害剤、ディナシクリブ、フラボピリドール、パルボシクリブ等のＣＤＫ阻害剤、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、ベムラフェニブ等のＲａｆキナーゼ阻害剤、ボリノスタット、ベリノスタット、パナビノスタット、ロミデプシン等のＨＤＡＣ阻害剤、サイトカラシン、ラトランクリン、ファロイジン等のアクチン重合阻害剤、ベリパリブ、ラキャパリブ、オラパリブ等のＰＡＲＰ阻害剤、クリゾチニブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、バンデタニブ、スニチニブ、アキシチニブ、パゾパニブ、レンバチニブ、ラパチニブ、ニンテダニブ、ニロチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ルキソリチニブ、クリゾチニブ、イブルチニブ等のチロシンキナーゼ阻害剤、ベンダムスチン、シクロホスファミド、イホスファミド、ブルスファン、メルファラン等のナイトロジェンマスタード系アルキル化剤、ニムスチン、ラニムスチン、ロムスチン等のニトロソウレア系アルキル化剤、ダカルバジン、テモゾロミド、プロカルバジン、チオテパ等のアルキル化剤、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ファドロゾール等のアロマターゼ阻害剤、ヒドロキシフルタミド、フルタミド、ビカルタミド、エンザルタミド等の抗アンドロゲン剤、アビラテロン等のＣＹＰ１７（リアーゼ）阻害剤、タモキシフェン、トレミフェン等の抗エストロゲン剤、エストラムスチン、プロゲステロン、ミトタン、メドロキシプロゲステロン等のホルモン剤が挙げられる。
【００６２】
炎症性疾患に供せされる生理活性物質としては、タクロリムス等のタクロリムス誘導体、デキサメタゾン、プレドニゾロン等のステロイド誘導体、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス等のラマパイシン誘導体、シクロスポリン、フィンゴリモド、アザチオプリン、ミゾリビン、ミルコフェノール酸モフェチル、グスペリムス等の免疫抑制剤、ジフルニサル、チアラミド等のＮＳＡＩＤｓ等が挙げられる。
【００６３】
感染症疾患に供せられる生理活性物質としては、アムホテリシンＢ、ナイスタチン等のポリエン系抗生物質、フルコナゾール、ボリコナゾール等のアゾール系誘導体、ミカファンギン等のキャンディン系誘導体、フルシトシン等のピリミジン誘導体等の抗真菌剤、アシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル等の抗ウイルス剤、ザナミビル、オセルタミビル、ラニナミビル等の抗ウイルス剤等が挙げられる。
【００６４】
Ｒ３ａは水酸基及び／又はアミノ基を有する蛍光物質の結合残基であっても良い。したがって、該Ｒ３ａが蛍光物質の結合残基である場合、前記水酸基及び又はアミノ基から水素原子が除去された蛍光物質の結合残基を指す。なお、Ｒ３ａとして蛍光物質を適用する目的は、特に本発明の効果に影響するものではなく、組織移行性や排泄性の確認の指標に用いるためである。
該蛍光物質としては、アミノ基を有する蛍光物質が好ましく、例えば、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ＴＲ  Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ＦＬ  Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｎｅ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４  Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）  Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ、ＡＴＴＯ  ５９４  ａｍｉｎｅ等が挙げられる。したがって、該Ｒ３ａの蛍光物質の結合残基とは、これらのアミド結合残基が含まれる。
【００６５】
一般式（１）におけるＲ３ａは水酸基であっても良い。すなわちポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖の側鎖カルボン酸が遊離カルボン酸である。この場合、側鎖カルボン酸は遊離酸の態様であってよく、また、医薬品として許容される任意のカルボン酸塩の形態であっても良い。前記カルボン酸塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩等を挙げることができ、本発明に含まれる。
【００６６】
一般式（１）において、ｘ１ａ、ｘ２ａ及びｚａは、それぞれブロック共重合体（Ａ）のポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖におけるアスパラギン酸誘導体ユニット及び／又はグルタミン酸誘導体ユニットの構成単位の含有量を示し、それぞれ０〜２０の整数である。また、（ｘ１ａ＋ｘ２ａ＋ｚａ）は該ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖の重合数を示し、３〜２０の整数である。すなわち、ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖は平均重合数として、３〜２０の重合体であることを示す。該（ｘ１ａ＋ｘ２ａ＋ｚａ）が３より小さいと、得られるブロック共重合体（Ａ）は自己会合性を具備しない恐れがある。一方、重合数が２０より大きい場合、得られるブロック共重合体（Ａ）の主鎖の分子量が１０キロダルトンを超える可能性があり、所望の薬物動態を奏しない懸念がある。すなわち、ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖の重合数である（ｘ１ａ＋ｘ２ａ＋ｚａ）が３〜２０の範囲を外れると、所望の薬物動態特性が奏功せずに、薬理作用効果の増強作用及び副作用の低減効果が得られない懸念がある。ポリアミノ酸誘導体の重合数は、ブロック共重合体の分子量を勘案して適宜設定することが好ましい。該（ｘ１ａ＋ｘ２ａ＋ｚａ）は好ましくは５〜２０の整数である。
該ポリアミノ酸誘導体の重合数である（ｘ１ａ＋ｘ２ａ＋ｚａ）は、１Ｈ−ＮＭＲによる測定や、Ｒ３ａを結合する前の、ポリエチレングリコール−ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）ブロック共重合体を中和滴定することにより求めることができる。
【００６７】
一般式（１）において、（ｘ１ａ＋ｘ２ａ）はＲ３ａに係る疎水性置換基が結合したアスパラギン酸ユニット及び／又はグルタミン酸ユニットの総数を示す。該疎水性置換基が結合したユニットは必須の構成であり、該（ｘ１ａ＋ｘ２ａ）は１〜２０の整数である。好ましくは、該（ｘ１ａ＋ｘ２ａ）は２〜２０の整数であり、より好ましくは３〜１５の整数である。ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖の重合数である前記（ｘ１ａ＋ｘ２ａ＋ｚａ）に対する（ｘ１ａ＋ｘ２ａ）の割合は４〜１００％である。好ましくは１０〜９０％であり、２０〜８０％がより好ましい。
該（ｘ１ａ＋ｘ２ａ）に係る疎水性置換基が結合したアスパラギン酸単位及び／又はグルタミン酸単位の含有数は、疎水性置換基の結合量とポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖の重合数から算出される。該疎水性置換基の結合量は、当該疎水性置換基が結合したブロック共重合体から該疎水性置換基を開裂させて、遊離する疎水性置換基を定量分析する方法により求めることができる。また、当該疎水性置換基が結合したブロック共重合体を製造する際の疎水性置換基の反応率から算出する方法を用いても良い。
【００６８】
本発明に係る一般式（１）で示される疎水性置換基が結合したブロック共重合体において、前記ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖は、側鎖カルボキシ基にＲ３ａを具備するアスパラギン酸ユニット及び／又はグルタミン酸ユニット、並びに側鎖カルボキシ基が分子内環化した構造のアスパラギン酸ユニット及び／又はグルタミン酸ユニットが混在した重合体セグメントである。それぞれの構成ユニットは１ユニット以上で存在し、その配列は特に制御されておらず不規則に配列したランダムに配列したセグメント構造である。
【００６９】
標的結合部位を除いた一般式（１）で示される疎水性置換基が結合したブロック共重合体は、前記Ｒ３ａで示される疎水性置換基の質量含有率が５質量％以上で６０質量％以下であることが好ましい。該疎水性置換基含量が５質量％より低い場合、疎水性置換基の含量が６０質量％より多い場合のいずれも、該疎水性置換基が結合したブロック共重合体の親水性−疎水性のバランスが大きく変化して適当な自己会合性を具備せず、所望の薬物動態を発揮しない懸念がある。該疎水性置換基の質量含有率は、好ましくは５質量％以上で５０質量％以下であり、さらに好ましくは８質量％以上で４０質量％以下である。
【００７０】
一般式（１）で示される標的結合部位Ｒ１及び疎水性置換基Ｒ３ａ、並びに結合基Ｂａを除いたブロック共重合体におけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であることを特徴とする。この分子量は、その構成部分の各構成分子量を合算した計算値を分子量として採用する。すなわち、（１）ポリエチレングリコール鎖の分子量、（２）ポリアミノ酸鎖の主鎖部分の分子量を合算した計算値を当該分子量とする。
なお、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、キロダルトン単位での精度でよい。以下に、各構成部分における好ましい分析方法を挙げるが、当該ポリアミノ酸誘導体のｋＤａ単位での分子量測定において十分な精度の分析方法であれば特に限定されるものではない。
【００７１】
前記（１）ポリエチレングリコール鎖の分子量は、ポリエチレングリコールセグメントを構築するポリエチレングリコール化合物の分子量測定値であり、ポリエチレングリコール標準品を基準としたＧＰＣ法により測定されるピークトップ分子量により求められる分子量を採用し、計算値としては１００の位を四捨五入した値を使用する。
【００７２】
前記（２）ポリアミノ酸の主鎖部分の分子量は、疎水性ポリマーセグメントの中に含まれるポリアミノ酸鎖の重合モノマー単位の分子量にその平均重合数を乗じた計算値である。該重合数はポリアミノ酸の側鎖カルボキシ基を中和滴定により定量する方法や、１Ｈ−ＮＭＲの積分値から算出された重合数を用いることができる。中和滴定法を用いることが好ましい。
【００７３】
本発明の一般式（１）で示されるブロック共重合体（Ａ）において、標的結合部位Ｒ１及び疎水性置換基Ｒ３ａ、並びに結合基Ｂａを除いたブロック共重合体におけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下である。前記分子量が２キロダルトンより小さい場合、一般式（１）で示されるブロック共重合体は十分なナノ粒子形成能を有さず、標的組織への十分な移行性、浸透性、滞留性が得られない。したがって、生理活性物質を内包させた場合、薬理作用効果を効率的に発揮させることができないことになる。一方、前記分子量が１０キロダルトンより大きい場合、当該ブロック共重合体は腎排泄性が抑制されることに伴い、体内滞留性が高くなる。このため、疾病標的組織以外の正常組織への生理活性物質の感作が起こり得るため正常組織の障害発現が懸念される。例えば、細胞障害性の生理活性物質を用いた場合、骨髄障害に伴う血液毒性の遷延化が考えられる。このため、前記分子量が１０キロダルトン以下に制御する必要がある。当該ブロック共重合体の分子量は、２キロダルトン以上で８キロダルトン以下であることが好ましく、更に好ましくは２キロダルトン以上で７キロダルトン以下である。
【００７４】
本発明の一般式（１）で示されるブロック共重合体（Ａ）は、水溶液中において自己会合性を示し、粒径（平均粒径）は３０ｎｍ以下であることが好ましい。より好ましくは３ｎｍ以上３０ｎｍ以下である。
本発明の一般式（１）で示されるブロック共重合体（Ａ）の粒径（体積基準粒径）測定は、本発明の一般式（１）で示されるブロック共重合体（Ａ）の１ｍｇ／ｍＬ水溶液をレーザー光を用いた動的光散乱法により測定される。例えば，Ｍａｌｖｅｒｎ社製粒子径・ゼータ電位測定装置Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳで測定することができ，この時の体積基準粒径とは、ＮＮＬＳ法で解析された体積分布の内、存在する割合が一番多いピークの粒径である。
【００７５】
［ブロック共重合体（Ｂ）］
次に、ポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメントと、疎水性置換基を側鎖に有するポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントが連結し、該ポリエチレングリコール鎖と該ポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であり、疎水性置換基の質量含有率が５質量％以上で５０質量％以下であるブロック共重合体（Ｂ）について説明する。
なお、ブロック共重合体（Ｂ）は、ポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメント部分と、疎水性置換基を側鎖に有するポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントが、適当な結合基を介して連結してなるＡＢブロック共重合体を、担体ポリマーの主鎖構造とする点において、前記ブロック共重合体（Ａ）と同一である。一方、親水性ポリマーセグメントであるポリエチレングリコール鎖の一方の末端部位に標的結合部位を有さない点、並びに疎水性ポリマーセグメントにおける疎水性置換基として、水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質を含まない点で、前記ブロック共重合体（Ａ）と相違する。そこで、相違点を中心に以下に説明する。
【００７６】
ブロック共重合体（Ｂ）におけるポリエチレングリコール鎖のポリアミノ酸鎖結合側ではない末端基は、特に限定されるものではなく、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）のアルキニル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）アラルキル基等を挙げることができる。該アルキル基、アルキニル基、アラルキル基における置換基としては、水酸基、アミノ基、ホルミル基、カルボキシル基等が挙げられる。
【００７７】
ブロック共重合体（Ｂ）におけるポリエチレングリコール鎖のポリアミノ酸鎖結合側ではない末端基において、置換基を有してもよい直鎖状アルキル基とは、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−へキシル基等を挙げることができる。置換基を有してもよい分岐鎖状アルキル基としては、例えばイソプロピル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、イソペンチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、１−エチルプロピル基、４−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、１−メチルペンチル基、３，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基等が挙げられる。置換基を有してもよい環状アルキル基としては、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
【００７８】
ブロック共重合体（Ｂ）におけるポリエチレングリコール鎖のポリアミノ酸鎖結合側ではない末端基において、直鎖状アルキル基が有しても良い置換基とは、チオール基、水酸基、ハロゲノ基、ニトロ基、シアノ基、アルキルチオ基、炭素環若しくは複素環アリール基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、置換又は無置換アミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、ホルミル基、アシル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基又はシリル基等を挙げることができる。
【００７９】
ブロック共重合体（Ｂ）におけるポリエチレングリコール鎖のポリアミノ酸鎖結合側ではない末端基において、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基とは、例えば、２−プロピニル、３−ブチニル基、４−ヘプチニル基、５−ヘキシニル基等が挙げられる。
【００８０】
ブロック共重合体（Ｂ）におけるポリエチレングリコール鎖のポリアミノ酸鎖結合側ではない末端基において、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）アラルキル基とは、いずれか１カ所の水素原子がアリール基で置換されている直鎖又は分岐鎖アルキル基である。例えば、ベンジル基、２−フェニルエチル基、４−フェニルブチル基、３−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルへキシル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。好ましくはベンジル基、４−フェニルブチル基、８−フェニルオクチル基である。
【００８１】
ブロック共重合体（Ｂ）の疎水性ポリマーセグメントにおける疎水性置換基としては、例えば置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、置換基を有していてもよいジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基からなる群から選択される１種以上の置換基であることが好ましい。これらの疎水性置換基は、ブロック共重合体（Ｂ）における含有率として５質量％以上で６０質量％以下であることが好ましい。疎水性置換基の含有率が５質量％より低い場合、当該ブロック共重合体（Ｂ）の疎水性ポリマーセグメントの疎水性が弱く、疎水性相互作用に基づく十分な会合性が得られない懸念がある。一方、疎水性置換基の含有率が６０質量％を超える場合、会合性は十分に具備するものの、疾患組織への浸透性・分布特性や、体外への排泄性において、満足できる薬物動態特性を奏しない懸念がある。当該疎水性置換基のブロック共重合体（Ｂ）における含有率として５質量％以上で５０質量％以下であることがより好ましい。
なお、疎水性置換基として挙げられる、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、置換基を有していてもよいジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、又は置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基は、前記ブロック共重合体（Ａ）と同義である。なお、ブロック共重合体（Ｂ）は、疎水性置換基として生理活性物質を含まない態様である。
【００８２】
ブロック共重合体（Ｂ）は、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であることを特徴とする。分子量が２キロダルトン以上で８キロダルトン以下であることが好ましい。
【００８３】
この分子量は、その構成部分の各構成分子量を合算した計算値を分子量として採用する。すなわち、（１）ポリエチレングリコール鎖の分子量、（２）ポリアミノ酸鎖の主鎖部分の分子量を合算した計算値を当該分子量とする。なお、ブロック共重合体（Ｂ）における疎水性置換基は主鎖ポリマーに含まないため、分子量に考慮しない。
なお、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、キロダルトン単位での精度でよい。以下に、各構成部分における好ましい分析方法を挙げるが、当該ポリアミノ酸誘導体のｋＤａ単位での分子量測定において十分な精度の分析方法であれば特に限定されるものではない。
【００８４】
前記（１）ポリエチレングリコール鎖の分子量は、ポリエチレングリコールセグメントを構築するポリエチレングリコール化合物の分子量測定値であり、ポリエチレングリコール標準品を基準としたＧＰＣ法により測定されるピークトップ分子量により求められる分子量を採用し、計算値としては１００の位を四捨五入した値を使用する。
【００８５】
前記（２）ポリアミノ酸の主鎖部分の分子量は、疎水性ポリマーセグメントの中に含まれるポリアミノ酸鎖の重合モノマー単位の分子量にその平均重合数を乗じた計算値である。該重合数はポリアミノ酸の側鎖カルボキシ基を中和滴定により定量する方法や、１Ｈ−ＮＭＲの積分値から算出された重合数を用いることができる。中和滴定法を用いることが好ましい。
【００８６】
本発明のブロック共重合体（Ｂ）は水溶液中において自己会合性を示す。
本発明のナノ粒子の粒径（平均粒径）は３０ｎｍ以下であることが好ましい。より好ましくは３ｎｍ以上で３０ｎｍ以下であって、３ｎｍ以上２０ｎｍ未満であることが特に好ましい。
【００８７】
本発明においてナノ粒子の粒径（平均粒径）の測定は、例えば、誘導回折格子法により測定される。誘導回折格子法は（１）本発明のブロック共重合体（Ｂ）の２〜５ｍｇ／ｍＬ水溶液にレーザー光を照射し、誘電泳動により回折格子を形成させる、（２）誘電泳動させていた外力を停止し、拡散による回折格子の消滅速度を計測する、（３）消滅速度をストークス−アインシュタインの関係式に当てはめ、粒子径を求める、という方法である。例えば株式会社島津製作所製シングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００で測定することができる。
【００８８】
本発明のブロック共重合体（Ｂ）は、親水性のポリエチレングリコールセグメントと、疎水性側鎖により疎水性を示すポリアミノ酸誘導体セグメントが連結したブロック共重合体であるため、水溶液中では複数のブロック共重合体同士のポリアミノ酸誘導体セグメントが疎水性相互作用に基づき会合すると考えられる。結果として、ポリアミノ酸誘導体セグメントを内核（コア部）とし、その周りを親水性のポリエチレングリコールセグメントが覆い外殻層（シェル部）を形成したコア−シェル構造のミセル様会合体を形成し、これが前記のナノ粒子として観測されるものと推測される。
【００８９】
ポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメントと、疎水性置換基を側鎖に有するポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントが連結し、該ポリエチレングリコール鎖と該ポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であり、疎水性置換基の質量含有率が５質量％以上で５０質量％以下であるブロック共重合体（Ｂ）は、一般式（２）
【化５】
2018025699.tif 000006
［式中、Ｒ５は水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｔｂは２０〜１４０の整数を示し、Ａｂは置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｒ２ｂは水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基を示し、Ｒ３ｂは、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のジアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基、水酸基及び／又はアミノ基を有する蛍光物質の結合残基からなる群から選択される１種以上の疎水性置換基の結合残基を１以上含み、残部は水酸基であり、Ｂｂは単結合又は二価の結合基を示し、ｎｂは１又は２を示し、ｘ１ｂ、ｘ２ｂ及びｚｂは、それぞれ独立して０〜２０の整数を示し、ｘ１ｂ＋ｘ２ｂは１〜２０の整数を示し、（ｘ１ｂ＋ｘ２ｂ＋ｚｂ）は３〜２０整数を示し、前記Ｒ３ｂが結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基が分子内環化した構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。］で示されるブロック共重合体であることが好ましい。
【００９０】
前記Ｒ５における置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基とは、置換基を有していてもよい直鎖状、分岐状又は環状の炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基等が挙げられる。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、シクロペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
前記有していてもよい置換基とは、ハロゲノ基、ニトロ基、シアノ基、水酸基、メルカプト基、炭素環若しくは複素環アリール基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、置換又は無置換アミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、ホルミル基、アシル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基又はシリル基等を挙げることができる。芳香環上の置換位置は、オルト位でも、メタ位でも、パラ位でも良い。
該Ｒ１として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基、２，２−ジメトキシエチル基、２，２−ジエトキシエチル基、２−ホルミルエチル基が挙げられる。特にメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基等がより好ましい。
【００９１】
一般式（２）のｔｂ、Ａｂ、Ｒ２ｂ、ｎｂ、Ｂｂ、ｘ１ｂ、ｘ２ｂ、ｚｂについては、上記一般式（１）のｔａ、Ａａ、Ｒ２ａ、ｎａ、Ｂａ、ｘ１ａ、ｘ２ａ、ｚａと同じである。一般式（２）のＲ３ｂについては、一般式（１）におけるＲ３ａから、水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質の結合残基を除いたものと同じである。
【００９２】
本発明に係る一般式（２）で示される疎水性置換基が結合したブロック共重合体（Ｂ）において、前記ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖は、側鎖カルボキシ基にＲ３ｂを具備するアスパラギン酸ユニット及び／又はグルタミン酸ユニット、並びに側鎖カルボキシ基が分子内環化した構造のアスパラギン酸ユニット及び／又はグルタミン酸ユニットが混在した重合体セグメントである。それぞれの構成ユニットは１ユニット以上で存在し、その配列は特に制御されておらず不規則に配列したランダムに配列したセグメント構造である。
【００９３】
一般式（２）で示される疎水性置換基が結合したブロック共重合体は、前記Ｒ３ｂで示される疎水性置換基の質量含有率が５質量％以上で６０質量％以下であることが好ましい。該疎水性置換基含量が５質量％より低い場合、疎水性置換基の含量が６０質量％より多い場合のいずれも、該疎水性置換基が結合したブロック共重合体の親水性−疎水性のバランスが大きく変化して適当な自己会合性を具備せず、所望の薬物動態を発揮しない懸念がある。該疎水性置換基の質量含有率は、好ましくは５質量％以上で５０質量％以下であり。さらに好ましくは８質量％以上で４０質量％以下である。
【００９４】
一般式（２）で示されるブロック共重合体（Ｂ）におけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であることを特徴とする。この分子量は、疎水性置換基であるＲ３ｂ及び結合基であるＢｂを含まず、その構成部分の各構成分子量を合算した計算値を分子量として採用する。すなわち、（１）ポリエチレングリコール鎖の分子量、（２）ポリアミノ酸鎖の主鎖部分の分子量を合算した計算値を当該分子量とする。
なお、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、キロダルトン単位での精度でよい。以下に、各構成部分における好ましい分析方法を挙げるが、当該ポリアミノ酸誘導体のｋＤａ単位での分子量測定において十分な精度の分析方法であれば特に限定されるものではない。
【００９５】
前記（１）ポリエチレングリコール鎖の分子量は、ポリエチレングリコールセグメントを構築するポリエチレングリコール化合物の分子量測定値であり、ポリエチレングリコール標準品を基準としたＧＰＣ法により測定されるピークトップ分子量により求められる分子量を採用し、計算値としては１００の位を四捨五入した値を使用する。
【００９６】
前記（２）ポリアミノ酸の主鎖部分の分子量は、疎水性ポリマーセグメントの中に含まれるポリアミノ酸鎖の重合モノマー単位の分子量にその平均重合数を乗じた計算値である。該重合数はポリアミノ酸の側鎖カルボキシ基を中和滴定により定量する方法や、１Ｈ−ＮＭＲの積分値から算出された重合数を用いることができる。中和滴定法を用いることが好ましい。
【００９７】
本発明の一般式（２）で示されるブロック共重合体におけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下である。前記分子量が２キロダルトンより小さい場合、一般式（２）で示されるブロック共重合体（Ｂ）を含有する高分子ミセル型ＤＤＳ製剤は、十分なナノ粒子形成能を有さず、標的組織への十分な移行性、浸透性、滞留性が得られない。したがって、生理活性物質を内包させた場合、薬理作用効果を効率的に発揮させることができないことになる。一方、前記分子量が１０キロダルトンより大きい場合、腎排泄性が抑制されることに伴い、体内滞留性が高くなる。このため、疾病標的組織以外の正常組織への生理活性物質の感作が起こり得るため正常組織の障害発現が懸念される。例えば、細胞障害性の生理活性物質を用いた場合、骨髄障害に伴う血液毒性の遷延化が考えられる。このため、前記分子量が１０キロダルトン以下に制御する必要がある。当該ブロック共重合体の分子量は、２キロダルトン以上で８キロダルトン以下であることが好ましく、更に好ましくは２キロダルトン以上で７キロダルトン以下である。
【００９８】
本発明の一般式（２）で示されるブロック共重合体（Ｂ）は水溶液中において自己会合性を示す。
本発明のナノ粒子の粒径（平均粒径）は３０ｎｍ以下であることが好ましい。より好ましくは３ｎｍ以上で３０ｎｍ以下であって、３ｎｍ以上２０ｎｍ未満であることが特に好ましい。
【００９９】
本発明においてナノ粒子の粒径（平均粒径）の測定は、例えば、誘導回折格子法により測定される。誘導回折格子法は（１）本発明の一般式（２）で示されるブロック共重合体（Ｂ）の２〜５ｍｇ／ｍＬ水溶液にレーザー光を照射し、誘電泳動により回折格子を形成させる、（２）誘電泳動させていた外力を停止し、拡散による回折格子の消滅速度を計測する、（３）消滅速度をストークス−アインシュタインの関係式に当てはめ、粒子径を求める、という方法である。例えば株式会社島津製作所製シングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００で測定することができる。
【０１００】
［ブロック共重合体（Ｃ）］
次に、ポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメントと、側鎖カルボキシ基に水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質が結合したポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントが連結した、該ポリエチレングリコール鎖と該ポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であり、水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質の質量含有率が５質量％以上で５０質量％以下であるブロック共重合体（Ｃ）について説明する。
【０１０１】
なお、ブロック共重合体（Ｃ）は、ポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメント部分と、疎水性置換基を側鎖に有するポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントが、適当な結合基を介して連結してなるＡＢブロック共重合体を、担体ポリマーの主鎖構造とする点において、前記ブロック共重合体（Ｂ）と同一である。一方、疎水性ポリマーセグメントが、側鎖カルボキシ基を有するポリアミノ酸鎖であって、該側鎖カルボキシ基に水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質がエステル結合及び／又はアミド結合した態様であることを必須構成として含む点で、前記ブロック共重合体（Ｂ）と相違する。すなわち、ブロック共重合体（Ｃ）は、生体に投与した後、結合させた生理活性物質を解離して放出する高分子プロドラッグとして機能する。相違点を中心に以下に説明する。
【０１０２】
ブロック共重合体（Ｃ）の疎水性ポリマーセグメントは、側鎖カルボキシ基を有するポリアミノ酸鎖であって、該側鎖カルボキシ基に水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質がエステル結合及び／又はアミド結合した態様である。
疎水性ポリマーセグメントにおけるポリアミノ酸鎖は、生理活性物質を制御して導入できるカルボン酸側鎖を有するアミノ酸であるアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を含有するポリアミノ酸鎖とすることが好ましい。より好ましくは、アスパラギン酸のみで構築されたポリアスパラギン酸鎖、グルタミン酸のみで構築されたポリグルタミン酸鎖、若しくは、アスパラギン酸とグルタミン酸がランダムに混在して構成されたポリ（アスパラギン酸‐グルタミン酸）鎖、であることが好ましい。これらの側鎖カルボキシ基を有するポリアミノ酸鎖は、α‐アミド結合型重合体であっても、側鎖カルボキシ基とのアミド結合型重合体であっても、β（又はγ）‐アミド結合型重合体であっても、その混合物であってもよい。また、ポリアミノ酸鎖は、直鎖状ポリアミノ酸であっても良く、側鎖を介した分岐型構造であっても良い。
【０１０３】
ブロック共重合体（Ｃ）が具備する、水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質は、特に限定されるものではなく、医薬品の有効成分又は医薬有効成分候補化合物を適用すること、若しくはそれらを誘導体化又はプロドラッグ化した有効成分を適用することが好ましい。高分子ミセル型ＤＤＳ製剤の適応疾病を考慮すると、悪性腫瘍疾患、炎症性疾患、感染症疾患等が挙げられ、これらの疾患の治療に用いられる医薬品の有効成分又は医薬有効成分候補化合物を適用すること、若しくはそれらを誘導体化又はプロドラッグ化した有効成分を適用することが好ましい。以下に、本発明に適用可能な生理活性物質の例を挙げるが、これらに限定されるものではない。
【０１０４】
悪性腫瘍疾患に供せられる生理活性物質としては、、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、イリノテカン、ノギテカン、９−アミノカンプトテシン等のカンプトテシン誘導体、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル等のタキサン誘導体、ガネテスピブ、ルミネスピブ等のＨＳＰ９０阻害活性を有するレゾルシノール誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、アムルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ピラルビシン等のアントラサイクリン誘導体、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス等のラマパイシン誘導体、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド、エノシタビン、シタラビンオクホスファート、エチニルシチジン、アザシチジン、デシタビン等のシチジン系代謝拮抗剤、メソトレキサート、ペメトレキセド、レボホリナート、ホリナート等の葉酸代謝拮抗剤、フルダラビン、ネララビン、ペントスタチン、クラドリビン等のプリン系代謝拮抗剤、ドキシフルリジン、カペシタビン、テフガール、フルオロウラシル、カルモフール等のフッ化ピリミジン系代謝拮抗剤、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン等の白金含有化合物、マイトマイシンＣ等のマイトマイシン誘導体、ブレオマイシン、リブロマイシン等のブレオマイシン誘導体、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン等のビンカアルカロイド誘導体、エトポシド、テニポシド等のポドフィロトキシン誘導体、エリブリン等のハリコンドリン誘導体、レベカマイシン、ＵＣＮ−０１等のスタウロスポリン誘導体、レナリドミド、ポマリドミド等のサリドマイド誘導体、トレチノイン、タミバロテン等のビタミンＡ誘導体、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、コンブレタスタチンＡ４等のコンブレタスタチン誘導体、ビニメチニブ、コビメチニブ、トラメチニブ等のＭＥＫ阻害剤、ディナシクリブ、フラボピリドール、パルボシクリブ等のＣＤＫ阻害剤、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、ベムラフェニブ等のＲａｆキナーゼ阻害剤、ボリノスタット、ベリノスタット、パナビノスタット、ロミデプシン等のＨＤＡＣ阻害剤、サイトカラシン、ラトランクリン、ファロイジン等のアクチン重合阻害剤、ベリパリブ、ラキャパリブ、オラパリブ等のＰＡＲＰ阻害剤、クリゾチニブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、バンデタニブ、スニチニブ、アキシチニブ、パゾパニブ、レンバチニブ、ラパチニブ、ニンテダニブ、ニロチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ルキソリチニブ、クリゾチニブ、イブルチニブ等のチロシンキナーゼ阻害剤、ベンダムスチン、シクロホスファミド、イホスファミド、ブルスファン、メルファラン等のナイトロジェンマスタード系アルキル化剤、ニムスチン、ラニムスチン、ロムスチン等のニトロソウレア系アルキル化剤、ダカルバジン、テモゾロミド、プロカルバジン、チオテパ等のアルキル化剤、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ファドロゾール等のアロマターゼ阻害剤、ヒドロキシフルタミド、フルタミド、ビカルタミド、エンザルタミド等の抗アンドロゲン剤、アビラテロン等のＣＹＰ１７（リアーゼ）阻害剤、タモキシフェン、トレミフェン等の抗エストロゲン剤、エストラムスチン、プロゲステロン、ミトタン、メドロキシプロゲステロン等のホルモン剤が挙げられる。
【０１０５】
炎症性疾患に供せされる生理活性物質としては、タクロリムス等のタクロリムス誘導体、デキサメタゾン、プレドニゾロン等のステロイド誘導体、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス等のラマパイシン誘導体、シクロスポリン、フィンゴリモド、アザチオプリン、ミゾリビン、ミルコフェノール酸モフェチル、グスペリムス等の免疫抑制剤、ジフルニサル、チアラミド等のＮＳＡＩＤｓ等が挙げられる。
【０１０６】
感染症疾患に供せられる生理活性物質としては、アムホテリシンＢ、ナイスタチン等のポリエン系抗生物質、フルコナゾール、ボリコナゾール等のアゾール系誘導体、ミカファンギン等のキャンディン系誘導体、フルシトシン等のピリミジン誘導体等の抗真菌剤、アシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル等の抗ウイルス剤、ザナミビル、オセルタミビル、ラニナミビル等の抗ウイルス剤等が挙げられる。
【０１０７】
前記水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質は、ブロック共重合体（Ｃ）における含有率として５質量％以上で６０質量％以下であることが好ましい。当該生理活性物質の含有率が５質量％より低い場合、当該ブロック共重合体（Ｃ）の疎水性ポリマーセグメントの疎水性が弱く、疎水性相互作用に基づく十分な会合性が得られない懸念がある。また、生理活性物質の所望の投与量を得るためにＤＤＳ担体であるブロック共重合体を多く投与することになり、好ましくない。一方、疎水性置換基の含有率が６０質量％を超える場合、会合性は十分に具備するものの、疾患組織への浸透性・分布特性や、体外への排泄性において、満足できる薬物動態特性を奏しない懸念がある。当該疎水性置換基のブロック共重合体（Ｃ）における含有率として５質量％以上で５０質量％以下であることが好ましい。
【０１０８】
ブロック共重合体（Ｃ）は、会合体形成性を調整する目的で、側鎖カルボキシ基に任意の疎水性置換基を導入していても良い。当該疎水性置換基としては、例えば置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、置換基を有していてもよいジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基からなる群から選択される１種以上の置換基であることが好ましい。
なお、疎水性置換基として挙げられる、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、置換基を有していてもよいジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基、又は置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基は、前記ブロック共重合体（Ａ）及び（Ｂ）と同義である。なお、ブロック共重合体（Ｂ）は、疎水性置換基として生理活性物質を含まない態様である。
【０１０９】
ブロック共重合体（Ｃ）は、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であることを特徴とする。分子量が２キロダルトン以上で８キロダルトン以下であることが好ましい。
【０１１０】
この分子量は、その構成部分の各構成分子量を合算した計算値を分子量として採用する。すなわち、（１）ポリエチレングリコール鎖の分子量、（２）ポリアミノ酸鎖の主鎖部分の分子量を合算した計算値を当該分子量とする。なお、ブロック共重合体（Ｃ）における生理活性物質は主鎖ポリマーに含まないため、分子量に考慮しない。
なお、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、キロダルトン単位での精度でよい。以下に、各構成部分における好ましい分析方法を挙げるが、当該ポリアミノ酸誘導体のｋＤａ単位での分子量測定において十分な精度の分析方法であれば特に限定されるものではない。
【０１１１】
前記（１）ポリエチレングリコール鎖の分子量は、ポリエチレングリコールセグメントを構築するポリエチレングリコール化合物の分子量測定値であり、ポリエチレングリコール標準品を基準としたＧＰＣ法により測定されるピークトップ分子量により求められる分子量を採用し、計算値としては１００の位を四捨五入した値を使用する。
【０１１２】
前記（２）ポリアミノ酸の主鎖部分の分子量は、疎水性ポリマーセグメントの中に含まれるポリアミノ酸鎖の重合モノマー単位の分子量にその平均重合数を乗じた計算値である。該重合数はポリアミノ酸の側鎖カルボキシ基を中和滴定により定量する方法や、１Ｈ−ＮＭＲの積分値から算出された重合数を用いることができる。中和滴定法を用いることが好ましい。
【０１１３】
本発明のブロック共重合体（Ｃ）は水溶液中において自己会合性を示す。
本発明のナノ粒子の粒径（平均粒径）は３０ｎｍ以下であることが好ましい。より好ましくは３ｎｍ以上で３０ｎｍ以下であって、３ｎｍ以上２０ｎｍ未満であることが特に好ましい。
【０１１４】
本発明においてナノ粒子の粒径（平均粒径）の測定は、例えば、誘導回折格子法により測定される。誘導回折格子法は（１）本発明のブロック共重合体（Ｃ）の２〜５ｍｇ／ｍＬ水溶液にレーザー光を照射し、誘電泳動により回折格子を形成させる、（２）誘電泳動させていた外力を停止し、拡散による回折格子の消滅速度を計測する、（３）消滅速度をストークス−アインシュタインの関係式に当てはめ、粒子径を求める、という方法である。例えば株式会社島津製作所製シングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００で測定することができる。
【０１１５】
本発明のブロック共重合体（Ｃ）は、親水性のポリエチレングリコールセグメントと、生理活性物質や他の疎水性側鎖により疎水性を示すポリアミノ酸誘導体セグメントが連結したブロック共重合体であるため、水溶液中では複数のブロック共重合体同士のポリアミノ酸誘導体セグメントが疎水性相互作用に基づき会合すると考えられる。結果として、ポリアミノ酸誘導体セグメントを内核（コア部）とし、その周りを親水性のポリエチレングリコールセグメントが覆い外殻層（シェル部）を形成したコア−シェル構造のミセル様会合体を形成し、これが前記のナノ粒子として観測されるものと推測される。
【０１１６】
ブロック共重合体（Ｃ）は、一般式（３）
【化６】
2018025699.tif 000007
［式中、Ｒ５ｃは水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｔｃは２０〜１４０の整数を示し、Ａｃは置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｒ２ｃは水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基を示し、Ｒ３ｃは水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質の結合残基を示し、Ｒ４ｃは疎水性置換基の結合残基であって、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のジアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基、水酸基及び／又はアミノ基を有する蛍光物質の結合残基、並びに水酸基からなる群から選択される１種以上の置換基を示し、Ｂｃは単結合又は二価の結合基を示し、ｎｃは１又は２を示し、ｘ１ｃ、ｘ２ｃ、ｙ１ｃ、ｙ２ｃ及びｚｃは、それぞれ独立して０〜２０の整数を示し、（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ）は必須の構成であって１〜２０の整数を示し、（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ＋ｙ１ｃ＋ｙ２ｃ＋ｚｃ）は３〜２０整数を示し、前記Ｒ３ｃ及びＲ４ｃが結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基が分子内環化した構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。］で示されるブロック共重合体であることが好ましい。
【０１１７】
一般式（３）のＲ５ｃ、ｔｃ、Ａｃ、Ｒ２ｃ、ｎｃ、Ｂｃについては、上記一般式（２）のＲ５、ｔｂ、Ａｂ、Ｒ２ｂ、ｎｂ、Ｂｂと同じである。一般式（３）のＲ３ｃについては、上記一般式（１）のＲ３ａで挙げた水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質の結合残基と同じである。一般式（３）のＲ４ｃについては、上記一般式（２）のＲ３ｂで挙げた疎水性置換基の結合残基と同義である。
【０１１８】
一般式（３）において、ｘ１ｃ、ｘ２ｃ、ｙ１ｃ、ｙ２ｃ及びｚｃは、それぞれ当該ブロック共重合体のポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖におけるアスパラギン酸誘導体ユニット及び／又はグルタミン酸誘導体ユニットの構成単位の含有量を示し、それぞれ０〜２０の整数である。また、（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ＋ｙ１ｃ＋ｙ２ｃ＋ｚｃ）は該ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸））鎖の重合数を示し、３〜２０の整数である。すなわち、ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸））鎖は平均重合数として、３〜２０の重合体であることを示す。該（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ＋ｙ１ｃ＋ｙ２ｃ＋ｚｃ）が３より小さいと、得られるブロック共重合体（Ｃ）は自己会合性を具備しない恐れがある。一方、重合数が２０より大きい場合、得られるブロック共重合体の主鎖ポリマーの分子量が１０キロダルトンを超える可能性があり、所望の薬物動態を奏しない懸念がある。すなわち、ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸））鎖の重合数である（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ＋ｙ１ｃ＋ｙ２ｃ＋ｚｃ）が３〜２０の範囲を外れると、生理活性物質の薬理作用効果の増強作用及び副作用の低減効果が得られない懸念がある。ポリアミノ酸誘導体の重合数は、当該生理活性物質が結合したブロック共重合体の分子量を勘案して適宜設定することが好ましい。該（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ＋ｙ１ｃ＋ｙ２ｃ＋ｚｃ）は好ましくは５〜２０の整数である。
該ポリアミノ酸誘導体の重合数である（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ＋ｙ１ｃ＋ｙ２ｃ＋ｚｃ）は、１Ｈ−ＮＭＲによる測定や、Ｒ３ｃ及びＲ４ｃを結合する前の、ポリエチレングリコール−ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）ブロック共重合体を中和滴定することにより求めることができる。
【０１１９】
一般式（３）において、（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ）はＲ３ｃに係る生理活性物質が結合したアスパラギン酸ユニット及び／又はグルタミン酸ユニットの総数を示す。該生理活性物質が結合したユニットは必須の構成であり、該（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ）は１〜２０の整数である。好ましくは、該（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ）は２〜２０の整数であり、より好ましくは３〜１５の整数である。ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）誘導体）鎖の重合数である前記（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ＋ｙ１ｃ＋ｙ２ｃ＋ｚｃ）に対する（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ）の割合は４〜１００％である。好ましくは１０〜９０％であり、２０〜８０％がより好ましい。
該（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ）に係る生理活性物質が結合したアスパラギン酸単位及び／又はグルタミン酸単位の含有数は、生理活性物質の結合量とポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸））鎖の重合数から算出される。該生理活性物質の結合量は、当該生理活性物質が結合したブロック共重合体から該生理活性物質を開裂させて、遊離する生理活性物質を定量分析する方法により求めることができる。また、当該生理活性物質が結合したブロック共重合体を製造する際の生理活性物質の反応率から算出する方法を用いても良い。
【０１２０】
一般式（３）において、（ｙ１ｃ＋ｙ２ｃ）は、Ｒ４ｃが結合したアスパラギン酸ユニット及び／又はグルタミン酸ユニットの総数を示す。また、ｚｃは側鎖カルボキシ基が分子内環化した構造のアスパラギン酸ユニット及び／又はグルタミン酸ユニットの総数を示す。これらは任意の構成であり、（ｙ１ｃ＋ｙ２ｃ）及びｚｃはそれぞれ０〜１８の整数である。好ましくは、該（ｙ１ｃ＋ｙ２ｃ）及びｚｃはそれぞれ１〜１５の整数である。ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）誘導体セグメントの重合数である前記（ｘ１ｃ＋ｘ２ｃ＋ｙ１ｃ＋ｙ２ｃ＋ｚｃ）に対する（ｙ１ｃ＋ｙ２ｃ＋ｚｃ）の割合は０〜９６％であり、好ましくは４〜９０％である。
該（ｙ１ｃ＋ｙ２ｃ）に係るＲ４ｃが結合したアスパラギン酸単位及び／又はグルタミン酸単位の含有数は、該Ｒ４ｃに係る置換基の結合量とポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）セグメントの重合数から算出される。該Ｒ４ｃに係る置換基の結合量は、当該ブロック共重合体から該Ｒ４ｃに係る置換基を開裂させて、遊離する生理活性物質を定量分析する方法により求めることができる。また、当該ブロック共重合体を製造する際のＲ４ｃに係る置換基の反応率から算出する方法を用いても良い。また、１Ｈ−ＮＭＲの積分値から算出することもできる。
【０１２１】
本発明に係る一般式（３）で示される生理活性物質が結合したブロック共重合体（Ｃ）において、前記ポリ（アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸）鎖は、側鎖カルボキシ基にＲ３ｃを具備するアスパラギン酸ユニット及び／又はグルタミン酸ユニット、Ｒ４ｃを具備するアスパラギン酸ユニット及び／又はグルタミン酸ユニット、並びに側鎖カルボキシ基が分子内環化した構造のアスパラギン酸ユニット及び／又はグルタミン酸ユニットが混在した重合体セグメントである。それぞれの構成ユニットは１ユニット以上で存在し、その配列は特に制御されておらず不規則に配列したランダムに配列したセグメント構造である。
【０１２２】
一般式（３）で示される生理活性物質が結合したブロック共重合体（Ｃ）は、前記Ｒ３ｃで示される生理活性物質の質量含有率が５質量％以上で６０質量％以下であることが好ましい。該生理活性物質含量が５質量％より低い場合、生理活性物質の含量が６０質量％より多い場合のいずれも、該生理活性物質が結合したブロック共重合体の親水性−疎水性のバランスが大きく変化して適当な自己会合性を具備せず、所望の薬物動態を発揮しない懸念がある。該生理活性物質の質量含有率は、好ましくは５質量％以上で５０質量％以下であり。さらに好ましくは８質量％以上で４０質量％以下である。
【０１２３】
一般式（３）で示される生理活性物質が結合したブロック共重合体におけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下であることを特徴とする。この分子量は、生理活性物質の結合残基であるＲ３ｃ及び任意の疎水性置換基の結合残基であるＲ４ｃを除いた構成部分の、各構成分子量を合算した計算値を分子量として採用する。すなわち、（１）ポリエチレングリコール鎖の分子量、（２）ポリアミノ酸鎖の主鎖部分の分子量を合算した計算値を当該分子量とする。
なお、該ブロック共重合体の分子量は、キロダルトン単位での精度でよい。以下に、各構成部分における好ましい分析方法を挙げるが、特に限定されるものではなく、当該ポリアミノ酸誘導体のｋＤａ単位での分子量測定において十分な精度の分析方法であれば特に限定されるものではない。
【０１２４】
前記（１）ポリエチレングリコール鎖の分子量は、ポリエチレングリコールセグメントを構築するポリエチレングリコール化合物の分子量測定値であり、ポリエチレングリコール標準品を基準としたＧＰＣ法により測定されるピークトップ分子量により求められる分子量を採用し、計算値としては１００の位を四捨五入した値を使用する。
【０１２５】
前記（２）ポリアミノ酸の主鎖部分の分子量は、疎水性ポリマーセグメントの中に含まれるポリアミノ酸鎖の重合モノマー単位の分子量にその平均重合数を乗じた計算値である。該重合数はポリアミノ酸の側鎖カルボキシ基を中和滴定により定量する方法や、１Ｈ−ＮＭＲの積分値から算出された重合数を用いることができる。中和滴定法を用いることが好ましい。
【０１２６】
一般式（３）で示される生理活性物質が結合したブロック共重合体におけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量が２キロダルトン以上で１０キロダルトン以下である。前記分子量が２キロダルトンより小さい場合、一般式（３）で示されるブロック共重合体（Ｃ）を含有する高分子ミセル型ＤＤＳ製剤は、十分なナノ粒子形成能を有さず、標的組織への十分な移行性、浸透性、滞留性が得られない。したがって、薬理作用効果を効率的に発揮させることができないことになる。一方、前記分子量が１０キロダルトンより大きい場合、腎排泄性が抑制されることに伴い、体内滞留性が高くなる。このため、疾病標的組織以外の正常組織への生理活性物質の感作が起こり得るため正常組織の障害発現が懸念される。例えば、細胞障害性の生理活性物質を用いた場合、骨髄障害に伴う血液毒性の遷延化が考えられる。このため、前記分子量が１０キロダルトン以下に制御する必要がある。当該ブロック共重合体の分子量は、２キロダルトン以上で８キロダルトン以下であることが好ましく、更に好ましくは２キロダルトン以上で７キロダルトン以下である。
【０１２７】
本発明の一般式（３）で示されるブロック共重合体（Ｃ）は水溶液中において自己会合性を示す。
本発明のナノ粒子の粒径（平均粒径）は３０ｎｍ以下であることが好ましい。より好ましくは３ｎｍ以上で３０ｎｍ以下であって、３ｎｍ以上２０ｎｍ未満であることが特に好ましい。
【０１２８】
本発明においてナノ粒子の粒径（平均粒径）の測定は、例えば、誘導回折格子法により測定される。誘導回折格子法は（１）本発明の一般式（３）で示されるブロック共重合体（Ｃ）の２〜５ｍｇ／ｍＬ水溶液にレーザー光を照射し、誘電泳動により回折格子を形成させる、（２）誘電泳動させていた外力を停止し、拡散による回折格子の消滅速度を計測する、（３）消滅速度をストークス−アインシュタインの関係式に当てはめ、粒子径を求める、という方法である。例えば株式会社島津製作所製シングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００で測定することができる。
【０１２９】
［ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を含む組成物、並びにブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含む組成物］
本発明は、高分子ミセル型ＤＤＳ製剤に用いる理活性物質のキャリアーとして用いる技術であり、特に生体認識機能を有するアクティブターゲティング機能を具備した高分子ミセル型ＤＤＳ製剤に関する。したって、標的結合部位を付与したブロック共重合体（Ａ）を含むＤＤＳ製剤を第１の発明の態様とする。また標的結合部位を具備する該ブロック共重合体（Ａ）と標的結合部位を有さない前記ブロック共重合体（Ｂ）を含む組成物を第２の発明の態様とする。また、別に、標的結合部位を具備する該ブロック共重合体（Ａ）と標的結合部位を有さない高分子プロドラッグである前記ブロック共重合体（Ｃ）を含む組成物を第３の発明の態様とする。これらは、両親媒性のブロック共重合体であって、水溶液中で疎水性ポリマーセグメント同士の疎水性相互作用により会合性性を有しナノ粒子を形成する。すなわち、ブロック共重合体（Ａ）と、ブロック共重合体（Ｂ）及び／又は（Ｃ）を混合した異なる化学構造のブロック共重合体同士であっても、疎水性ポリマーセグメント同士の相互作用が生じて、これらが混在したナノ粒子様会合体を形成することを特徴とする。したがって、ナノ粒子様会合体の内核（コア）部に生理活性物質を化学結合若しくは物理的吸着作用により内包させ、外殻（シェル）部に標的結合部位を具備してアクティブターゲティング機能を有した高分子ミセル型ＤＤＳ製剤として利用することができる。
なお、第２の発明の態様である共重合体（Ａ）と（Ｂ）を含む組成物において、当該ブロック共重合体に生理活性物質を結合して具備していなくとも、疎水性の生理活性物質を物理的吸着作用により保持した物理吸着型ミセルＤＤＳ製剤として用いることができる。
第３の発明の態様である共重合体（Ａ）と（Ｃ）を含む組成物の場合、ブロック共重合体（Ｃ）が高分子プロドラッグであることから、化学結合型ミセルＤＤＳ製剤として用いることができる。
【０１３０】
本発明の組成物は、ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）、ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）、並びにブロック共重合体（Ａ）と（ブロック共重合体（Ｂ）及びブロック共重合体（Ｃ）の混合処方）とは任意の適切な比率で存在し得る。アクティブターゲティング機能を担うブロック共重合体（Ａ）が、本発明に係るブロック共重合体により形成されるナノ粒子会合体に１分子以上含まれていることが好ましい。本発明に係るブロック共重合体は、ポリマー分子としてモル含量を算出することができ、本発明の組成物は、ブロック共重合体（Ａ）と、ブロック共重合体（Ｂ）及び／又はブロック共重合体（Ｃ）のモル比で表すことができる。
ブロック共重合体（Ａ）と、ブロック共重合体（Ｂ）及び／又はブロック共重合体（Ｃ）を混合する好適なモル比（（Ａ）：（Ｂ）及び／又は（Ｃ））は、１：０．１〜３０である。より好ましくは、１：０．５〜２０であり、１：１〜１０で調製することが特に好ましい。本発明の組成物内に、ブロック共重合体（Ａ）、ブロック共重合体（Ｂ）及びブロック共重合体（Ｃ）のいずれでもないブロック共重合体は任意の適切な比率で存在し得る。例えば、ブロック共重合体（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の製造において、不可避的に存在する未反応又は副生成・分解生成のブロック共重合体である。これらは、本発明の組成物の物性に影響を与えない範囲において存在していて良い。その存在比率は、モル比（ブロック共重合体（Ａ）＋ブロック共重合体（Ｂ）＋ブロック共重合体（Ｃ）の合計モル量：その他のブロック共重合体の合計モル量）で、１：０〜２であり、好ましくは１：０〜０．５であり、より好ましくは１：０〜０．２５の範囲で存在し得る。
【０１３１】
本発明の組成物は、例えば、以下の４つの組み合せの態様を挙げることができる。
（組成物１）ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）
（組成物２）ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）
（組成物３）ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）と生理活性物質
（組成物４）ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）とブロック共重合体（Ｃ）
これらの組成物は、ブロック共重合体間の相互作用により会合性の組成物となる。例えば、以下の３種類の調製方法を挙げることができる。
（１）水性溶液中で混合しミセル状に自己組織化させる方法。
（２）有機溶媒に溶解後、透析する方法。
（３）有機溶媒に溶解し、混合して均一化された溶液を減圧留去して得られるポリマーのフィルムに水を加えて混合し、ミセル状に自己組織化させる方法。
【０１３２】
また本発明の組成物は、以下の３通りの組成物調製後に標的結合部位を有する化合物と反応させて調製させても良い。すなわち、
（前駆体組成物１）ブロック共重合体（Ａ）前駆体とブロック共重合体（Ｂ）又はブロック共重合体（Ｃ）
（前駆体組成物２）ブロック共重合体（Ａ）前駆体とブロック共重合体（Ｂ）と生理活性物質
（前駆体組成物３）ブロック共重合体（Ａ）前駆体とブロック共重合体（Ｂ）とブロック共重合体（Ｃ）
上記の前駆体組成物（１）乃至（３）の溶液調製を行い、例えば、以下の２通りの調製方法を挙げることができる。
（１）前駆体組成物（１）乃至（３）を有機溶媒に溶解し、混合して均一化された溶液を減圧留去してポリマーのフィルムを得る。これに水を加えて混合し、ミセル状に自己組織化させる。その後、標的結合部位を有する化合物を、ブロック共重合体（Ａ）前駆体（標的結合部位を有する化合物と反応する前のブロック共重合体（Ａ））に結合させて本発明に係る組成物を調製する方法。
（２）前駆体組成物（１）乃至（３）を水性溶液中で混合させ、ミセル状に自己組織化させる。その後、標的結合部位を有する化合物をブロック共重合体（Ａ）前駆体（標的結合部位を有する化合物と反応する前のブロック共重合体（Ａ））に結合させて本発明に係る組成物を調製する方法。
【０１３３】
上記の組成物を調製するための有機溶媒としては、例えば、メタノール、アセトン、アセトニトリル、及びジメチルホルムアミドなどが挙げられる。
上記の組成物を調製するための水性溶液は、例えば、エタノール及びジメチルスルホキシドといった水混和性有機溶媒と、公知の緩衝剤とを精製水に添加することによって形成できる。
【０１３４】
本発明のブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物、及びブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物は、水溶液中において自己会合性を示す。
本発明に係る組成物のナノ粒子の粒径（平均粒径）は３０ｎｍ以下であることが好ましい。より好ましくは３ｎｍ以上で３０ｎｍ以下であって、３ｎｍ以上２０ｎｍ未満であることが特に好ましい。
【０１３５】
本発明においてナノ粒子の粒径（平均粒径）の測定は、例えば、誘導回折格子法により測定される。誘導回折格子法は（１）本発明のブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物、及びブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物の２〜５ｍｇ／ｍＬ水溶液にレーザー光を照射し、誘電泳動により回折格子を形成させる、（２）誘電泳動させていた外力を停止し、拡散による回折格子の消滅速度を計測する、（３）消滅速度をストークス−アインシュタインの関係式に当てはめ、粒子径を求める、という方法である。例えば株式会社島津製作所製シングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００で測定することができる。
【０１３６】
本発明のブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物、及びブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物は、親水性のポリエチレングリコールセグメントと、生理活性物質や他の疎水性側鎖により疎水性を示すポリアミノ酸誘導体セグメントが連結したブロック共重合体を含有する組成物であるため、水溶液中では複数のブロック共重合体同士のポリアミノ酸誘導体セグメントが疎水性相互作用に基づき会合すると考えられる。結果として、ポリアミノ酸誘導体セグメントを内核（コア部）とし、その周りを親水性のポリエチレングリコールセグメントが覆い外殻層（シェル部）を形成したコア−シェル構造のミセル様会合体を形成し、これが前記のナノ粒子として観測されるものと推測される。
【０１３７】
次に、本発明に係るブロック共重合体（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の製造方法について説明する。
まず、ブロック共重合体（Ｂ）、ブロック共重合体（Ｃ）の製造方法を説明する。これには、親水性ポリマーセグメントであるポリエチレングリコール鎖と、疎水性ポリマーセグメントの主鎖構成であるアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を含むポリアミノ酸鎖が連結したブロック共重合体を合成し、これに生理活性物質及び／又は疎水性置換基を含む化合物を縮合反応により製造する方法が挙げられる。また、ポリエチレングリコール鎖を含む親水性ポリマーセグメントと、生理活性物質及び／又は疎水性置換基が結合したポリアミノ酸鎖を結合させてブロック共重合体を構築する方法、等を挙げることができる。前者のポリエチレングリコールセグメントとポリアミノ酸セグメントが連結したブロック共重合体を予め合成し、これに生理活性物質や疎水性置換基を縮合反応することにより製造する方法が好ましい。
該ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖が連結したブロック共重合体の製造方法としては、ポリエチレングリコールセグメントを含む化合物に対して、用いるアミノ酸−Ｎ−カルボキシ無水物を用いて逐次重合させることによりポリアミノ酸鎖を構築する方法や、ポリエチレングリコールセグメントとポリアミノ酸誘導体を結合させる方法、等が挙げられる。アミノ酸−Ｎ−カルボキシ無水物の反応性が高いこと、ポリアミノ酸重合数が制御しやすいことから、前者の方法を用いることが好ましい。
【０１３８】
ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸誘導体鎖が連結したブロック共重合体を予め合成し、これに、水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質や疎水性置換基を結合させて本発明に係るブロック共重合体を得る製造方法の一態様を説明する。
始めに、一方の末端がアミノ基であるポリエチレングリコール誘導体（例えば、メトキシポリエチレングリコール−１−プロピルアミン）に、アミノ酸の側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸−Ｎ−カルボキシ無水物を順次反応させて、逐次重合によりポリエチレングリコールセグメントとポリアミノ酸セグメントが連結したブロック共重合体の骨格を構築する。この場合、該アミノ酸−Ｎ−カルボキシ無水物として、適当な側鎖カルボキシ基保護したアスパラギン酸−Ｎ−カルボキシ無水物及び／又はグルタミン酸−Ｎ−カルボキシ無水物を含むことにより、ポリアミノ酸セグメントにアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を含めることができる。その後、適当な脱保護反応を施し、側鎖カルボキシ基が脱保護されたアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を含む当該ブロック共重合体を合成することができる。脱保護反応としては、側鎖カルボキシ基がベンジルエステルである場合、アルカリ条件下での加水分解や、加水素分解反応により脱保護基反応をすることができる。
【０１３９】
このポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体に対し、アミノ基及び／又は水酸基を有する生理活性物質質や疎水性置換基を、適当な反応溶媒中で縮合反応条件にて反応させればよい。
該ポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体と生理活性物質質や疎水性置換基の縮合反応において、用いることができる溶媒は両化合物が溶解する溶媒であれば特に限定されることなく用いることができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）等の水溶性有機溶媒を挙げることができる。これらの溶媒は、単独で用いても、これらの混合溶媒として用いても良い。また、前記溶媒と他の有機溶媒による混合溶媒であっても良い。
また、用いる縮合剤は、カルボン酸と水酸基を脱水縮合反応によりエステル反応及び／又はカルボン酸とアミノ基を脱水縮合反応によりアミド反応させる通常の脱水縮合剤であれば、特に問題なく用いることができる。該縮合剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）、等のカルボジイミド系の縮合剤、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルフォリウム  クロライド  ｎ−ハイドレート（ＤＭＴ−ＭＭ）等のトリアジン系縮合剤、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（Ｂｏｃ２Ｏ）等を用いることができる。該縮合反応の際に、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）や、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）等の反応補助剤を用いてもよい。カルボジイミド系縮合剤を用いると、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミノ基を生理活性物質や疎水性置換基と同時に導入することができる。
反応温度は、通常０〜１８０℃、好ましくは５〜１００℃の温度で行えばよい。
【０１４０】
ポリアミノ酸鎖に、前記炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルコキシ基、前記炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基又は前記ジ（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキルアミノ基のような疎水性置換基は、本発明のブロック共重合体の自己会合性を調整する目的で導入する。その方法としては、ポリエチレングリコール−ポリアミノ酸共重合体のカルボキシ基を縮合剤の添加により活性化してから、導入したい疎水性置換基に相当する化合物を所望の当量で反応させる方法、若しく疎水性置換基に相当する化合物を活性化させてから該共重合体のポリアミノ酸セグメントに反応させる方法等が挙げられる。
この場合、疎水性置換基を導入してから、生理活性物質を導入しても良く、その逆であっても良く、該生理活性物質と該疎水性置換基を同時に導入しても良い。該疎水性置換基は、単一種類の置換基であっても、複数種類の置換基であっても良い。
【０１４１】
ポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体に、生理活性物質及び任意の疎水性置換基を導入した後、任意に通常の分離操作や精製操作を行うことにより、本発明のブロック共重合体を製造することができる。
【０１４２】
次に、ブロック共重合体（Ａ）の製造方法を以下に説明する。
ブロック共重合体（Ａ）は、ポリエチレングリコールセグメントとアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を含むポリアミノ酸セグメントを有するブロック共重合体から製造される。その構築方法は、ポリエチレングリコールセグメントとアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を含むポリアミノ酸セグメントを結合させる方法、ポリエチレングリコールセグメントにアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を順次に遂次重合させる方法のいずれの方法でも可能である。
【０１４３】
後者の方法としては、特開平５−９５５号公報等に記載の方法を応用して、例えば、市販の片末端Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノエチル基、他方片末端アミノエチル基で修飾されたポリエチレングリコールにアミノ酸の側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸−Ｎ−カルボキシ無水物を順次反応させて、逐次重合によりポリエチレングリコールセグメントとポリアミノ酸セグメントが連結したブロック共重合体の骨格を構築する方法が挙げられる。この場合、該アミノ酸−Ｎ−カルボキシ無水物として、適当な側鎖カルボキシ基保護したアスパラギン酸−Ｎ−カルボキシ無水物及び／又はグルタミン酸−Ｎ−カルボキシ無水物を含むことにより、ポリアミノ酸セグメントにアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を含めることができる。その後、適当な脱保護反応を施し、側鎖カルボキシ基が脱保護されたアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を含む当該ブロック共重合体を合成することができる。脱保護反応としては、側鎖カルボキシ基がβ−ベンジルエステルである場合、アルカリ条件下での加水分解や、加水素分解反応により脱保護基反応をすることができる。そして、このポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体に対し、一般式（２）、一般式（３）で示されるブロック共重合体（Ｂ）、（Ｃ）と同様にアミノ基及び／又は水酸基を有する生理活性物質や疎水性置換基を、適当な反応溶媒中で縮合反応条件にて反応させることもできる。
【０１４４】
次いで、標的結合部位を導入するためにブロック共重合体のポリエチレングリコール構造部分の末端アミノ基の保護基、例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を脱保護し、該アミノ基とＧＭＢＳ（Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシイミド）とアミド結合させる。こうして得られたマレイミド基に、必要であればタンパク質、ペプチド及び糖鎖といった化合物に存在するジスルフィド結合を還元させ、スルフヒドリル基を介して結合させることで、一般式（１）で示されるブロック共重合体（Ａ）を製造できる。
【０１４５】
この一般式（１）で示されるブロック共重合体（Ａ）を製造する方法は上記方法に限らず、ブロック共重合体のポリエチレングリコール構造部分の末端アミノ基の保護基（例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基）を脱保護後、末端チオール基を保護した（チオ）カルボン酸誘導体とをアミド結合させ、続けて末端チオール基の保護基を脱保護する。一方で、タンパク質、ペプチド及び糖鎖といった化合物に存在するリジンなどのアミノ基と、末端マレイミド基を有するカルボン酸誘導体とをアミド結合させ、得られた化合物のマレイミド基に前記の（末端チオール基の保護基を脱保護して得られた）チオール化合物を付加反応させる方法でも製造することができる。
その他にも、タンパク質、ペプチド及び糖鎖といった化合物に存在するリジンのアミノ基に対し、α-ハロアミド基をもつポリエチレングリコール構造部分の末端と反応させる方法、タンパク質、ペプチド及び糖鎖といった化合物とポリエチレングリコール構造部分の末端にアジド基やアセチレン基を導入し、クリック反応を使用する方法等を用いて製造できる。標的結合部位とポリエチレングリコールを結合させた後は、必要であれば、未反応の活性反応基を消失（例えば活性反応基であるマレイミド基をシステインと反応）させたり、標的化合物が脱離するレトロ-マイケル反応を避けるために、積極的に環状イミド基を開環させることにより標的化合物との結合安定性を図ったり、精製工程を経由して製造してもよい。
【０１４６】
本発明の生理活性物質を内包したブロック共重合体（Ａ）、ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物、並びにブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物は、生体内に投与された後、徐々に内包した生理活性物質を遊離する。遊離した生理活性物質は薬理効果を発揮させることができる。このため、生理活性物質を内包したブロック共重合体（Ａ）、ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物、並びにブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物は、該生理活性物質を有効成分とする医薬品として使用することができる。
本発明の生理活性物質を内包したブロック共重合体（Ａ）、ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物、並びにブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物を医薬品として用いる場合、経口的、非経口的の何れの投与経路で用いても良い。非経口的な注射による投与経路により処方されることが好ましい。注射による投与は静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腫瘍部内投与、等によって行われる。
【０１４７】
本発明の生理活性物質を内包したブロック共重合体（Ａ）、ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物、並びにブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物の製剤化に当たっては、通常使用されている薬学的に許容される担体、例えば賦形剤、増量剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化、溶剤、可溶化剤、懸濁化剤、色素、香料剤及び等張化剤等が使用できる。
注射液剤の場合は、通常溶剤を使用する。溶剤としては、例えば水、生理食塩水、５％ブドウ糖又はマンニトール液、水溶性有機溶剤、例えばグリセロール、エタノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ポリエチレングリコール、クレモホール等、及びそれらの混合液、並びに水と該水溶性有機溶媒の混合液等が挙げられる。これらの製剤用添加剤を用いて、投与可能な医薬製剤に調製して用いることが好ましい。
【０１４８】
本発明の生理活性物質を内包したブロック共重合体（Ａ）、ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物、並びにブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物の投与量は、結合させる生理活性物質の種類、患者の性別、年齢、生理的状態、病態等により当然変更されうるが、非経口的に、通常、成人１日当たり、活性成分として０．０１〜５００ｍｇ／ｍ２、好ましくは０．１〜２５０ｍｇ／ｍ２を投与することが好ましい。
【実施例】
【０１４９】
以下、本発明を実施例により更に説明する。ただし、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１−１、１−２及び２に係るブロック共重合体（Ａ）の体積基準粒径の測定は、Ｍａｌｖｅｒｎ社製粒子径・ゼータ電位測定装置Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（測定温度：２５℃、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ：Ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｕｒｐｏｓｅ（ｎｏｒｍａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｍａｔｅｒｉａｌ  ＲＩ：１．５９）にて行った。
体積基準粒径測定サンプルは、生理活性物質結合ブロック共重合体濃度として１ｍｇ／ｍＬになるように超純水を加え、氷冷下にて超音波にて溶解後、０．４５μｍメンブレンフィルターで濾過した溶液を用いた。
また、実施例３〜１０及び比較例１〜６のブロック共重合体を含む組成物の平均粒径の測定は、株式会社島津製作所製シングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００（測定温度：２５℃、ｔ＝０における光強度：１００〜２００）にて行った。
平均粒径測定サンプルは、組成物重量換算２ｍｇ／ｍＬ若しくは５ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、０．４５μｍメンブレンフィルターで濾過した溶液を用いた。【０１５０】
［合成例１］
ポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体（ポリエチレングリコール分子量１０キロダルトン、ポリグルタミン酸重合数２１．０）の合成
片末端メトキシ基、片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  Ｍ１４１５７３、日油社製社、平均分子量１０キロダルトン、９．０ｇ）をＤＭＳＯ（１８０ｍＬ）に溶解後、γ−ベンジル  Ｌ−グルタミン酸−Ｎ−カルボキシ無水物（５．７ｇ）を加えて３０℃で２１．０時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（２８８０ｍＬ）及びエタノール（７２０ｍＬ）混合液中に０．５時間かけて滴下し、室温にて１時間撹拌した。その後、上澄み除去し、ジイソプロピルエーテル（１４４０ｍＬ）及びエタノール（３６０ｍＬ）混合溶液を加え、１時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥し、重合物（１２．４ｇ）を得た。
得られた重合物（１２．０ｇ）をＤＭＦ（１９８ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（２．４ｍＬ）を加えて２０℃にて２３．５時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（１６００ｍＬ）及び酢酸エチル（４００ｍＬ）混合液中に０．５時間かけて滴下し、室温にて１時間撹拌した。その後、上澄み除去し、ジイソプロピルエーテル（８００ｍＬ）及びエタノール（２００ｍＬ）混合溶液を加え、１時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥することによりアセチル化ポリマー（１０．７ｇ）を得た。
得られたアセチル化ポリマー（１０．７ｇ）をＤＭＦ（２３０ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム−炭素（２．２ｇ）を加えた。その後、反応雰囲気を水素置換し、３０℃、１気圧下にて４３．５時間加水素分解を行った。１０％パラジウム−炭素触媒を濾別後（洗い込みに酢酸エチル２４０ｍＬ使用）、濾液をヘプタン（１９６５ｍＬ）及び酢酸エチル（７１５ｍＬ）混合液中に１．５時間かけて滴下し、室温にて２．５晩撹拌した。その後、上澄み除去し、ヘプタン（８３３ｍＬ）及び酢酸エチル（４１７ｍＬ）混合液を加え、０．５時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥した。この析出物（９．０ｇ）を５％食塩水（９００ｍＬ）に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にて溶解液のｐＨを約１１に調整後、分配吸着樹脂カラムクロマトグラフィー（ＨＰ２０）、続いてイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー（Ｄｏｗｅｘ  ５０）を用いて精製した。溶出した溶液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することでポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体（合成例１  ７．４ｇ）を得た。
０．１Ｎ水酸化カリウムを用いた滴定法により、合成例１のグルタミン酸の重合数は２１．０と算出された。【０１５１】
［合成例２］
ポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体（ポリエチレングリコール分子量２キロダルトン、ポリグルタミン酸重合数７．９）の合成
片末端メトキシ基、片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  Ｍ８９５０６、日油社製、平均分子量２キロダルトン、１４ｇ）をＤＭＳＯ（２８０ｍＬ）に溶解後、γ−ベンジル  Ｌ−グルタミン酸−Ｎ−カルボキシ無水物（１６．８ｇ）を加え、３０℃で２２．５時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（５０４０ｍＬ）及びエタノール（５６０ｍＬ）混合液中に２．０時間かけて滴下し、室温にて４．０時間撹拌した。その後、上澄み除去し、ジイソプロピルエーテル（１８００ｍＬ）及びエタノール（２００ｍＬ）混合溶液を加え、撹拌した後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥し、重合物（３１．９ｇ）を得た。
得られた重合物（３０．０ｇ）をＤＭＦ（３３６ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（６．０ｍＬ）を加えて２０℃にて１８時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（３０２４ｍＬ）及び酢酸エチル（３３６ｍＬ）混合液中に２．５時間かけて滴下し、室温にて６．０時間撹拌した。その後、上澄み除去し、ジイソプロピルエーテル（１８００ｍＬ）及びエタノール（２００ｍＬ）混合溶液を加え、１．５時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥することによりアセチル化ポリマー（２３．７ｇ）を得た。
得られたアセチル化ポリマー（２２．０ｇ）をＤＭＦ（５１５ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム−炭素（４．４ｇ）を加えた。その後、反応雰囲気を水素置換し、３０℃、１気圧下にて６５時間加水素分解を行った。１０％パラジウム−炭素触媒を濾別後（洗い込みに酢酸エチル２００ｍＬ使用）、濾液をヘプタン（３０００ｍＬ）及び酢酸エチル（１２００ｍＬ）混合液中に１．５時間かけて滴下し、室温にて５．０晩撹拌した。その後、上澄み除去し、ヘプタン（１３３３ｍＬ）及び酢酸エチル（６６７ｍＬ）混合液を加え、０．５時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥した。この析出物（１５．０ｇ）を５％食塩水（１５００ｍＬ）に溶解し、２．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にて溶解液のｐＨを約１１に調整後、分配吸着樹脂カラムクロマトグラフィー（ＨＰ−２０）、続いてイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー（Ｄｏｗｅｘ  ５０）を用いて精製した。溶出した溶液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することでポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体（合成例２  １２．３ｇ）を得た。
０．１Ｎ水酸化カリウムを用いた滴定法により、合成例２のグルタミン酸の重合数は７．９と算出された。【０１５２】
［合成例３］（ブロック共重合体（Ｂ）の比較例）
ポリエチレングリコール（１０キロダルトン）−ポリグルタミン酸（２１．０重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体の合成
合成例１（５００ｍｇ）、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（東京化成工業社製、１４．９ｍｇ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ  １０１ｍｇ）をＤＭＦ（６．６ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  １２μＬ）を加え、２５℃にて５時間撹拌した。その後、４−フェニル−１−ブタノール（８５．０μＬ）及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  ２５３μＬ）を加え１６時間撹拌後、さらにジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  １２７μＬ）を加え、１時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（９６ｍＬ）、エタノール（１２ｍＬ）及び酢酸エチル（１２ｍＬ）混合液中に２０分かけて滴下し、室温にて１時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧化で乾燥することで粗生成物を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ）、２０ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ  ５０）を加えて室温にて２．５時間撹拌した。イオン交換樹脂を濾別後にアセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥することにより標記の４−フェニル−１−ブタノール結合ブロック共重合体（合成例３  ５１４ｍｇ）を得た。【０１５３】
合成例３を１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を用いて加水分解処理を行い、遊離した４−フェニル−１−ブタノールを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量して４−フェニル−１−ブタノール含有量を求めた。その結果、合成例３における４−フェニル−１−ブタノール含有量は１０．２質量％であった。
合成例３の２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した反応溶液中の２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの消費率から１．０分子であった。したがって、合成例３の総２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン分子量は３７７≒０．４ｋＤａと算出された。
これらの値より、合成例３の総分子量は１５７００≒１６ｋＤａと算出された。
合成例３におけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、ポリエチレングリコール鎖の分子量（１０，０００）、グルタミン酸２１．０重合体の分子量（１２９．１１×２１．０＝２７１１）、ポリアミノ酸末端のアセチル基の分子量（４２）の合計より１２，７５３≒１２ｋＤａである。
また、合成例３における２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの含有量は２．４質量％、４−フェニル−１−ブタノール含有量は１０．２質量％、ポリエチレングリコールセグメントの含有量は６４質量％である。【０１５４】
［合成例４］（ブロック共重合体（Ｂ））
ポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．９重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体の合成
合成例２（１０００ｍｇ）、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（東京化成工業社製、４６．９ｍｇ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ  ３１５ｍｇ）をＤＭＦ（２１ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  ３８μＬ）を加え、２５℃にて５時間撹拌した。その後、４−フェニル−１−ブタノール（２６６μＬ）及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  ７９４μＬ）を加え１５時間撹拌後、さらにジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  ３９７μＬ）を加え、５．５時間撹拌した。反応液をＭＷＣＯ１．０ｋＤａの透析膜に移液し、外液を水として透析を行った。内液を凍結乾燥することで、生成物を得た。得られた生成物をアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ）、５０ｍＬ）に溶解後、溶液をＭＷＣＯ１．０ｋＤａ透析膜に移液し、外液をアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ）として透析を行った。その後、外液をアセトニトリルとして透析を行った。透析終了後、内液がアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ）、）になるように水を加え、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ  ５０）を加えて室温にて０．５時間撹拌した。イオン交換樹脂を濾別後にアセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥することにより標記の４−フェニル−１−ブタノール結合ブロック共重合体（合成例４  １０１２ｍｇ）を得た。【０１５５】
合成例４を１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を用いて加水分解処理を行い、遊離した４−フェニル−１−ブタノールを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量して４−フェニル−１−ブタノール含有量を求めた。その結果、合成例４における４−フェニル−１−ブタノール含有量は１５．９質量％であった。
合成例４の２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した反応溶液中の２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの消費率から０．３７分子であった。したがって、合成例４の総２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン分子量は１３８≒０．１ｋＤａと算出された。
これらの値より、合成例４の総分子量は４１６９≒４ｋＤａと算出された。
合成例４におけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、ポリエチレングリコール鎖の分子量（２，０００）、グルタミン酸７．９重合体の分子量（１２９．１１×７．９＝１０２０）、ポリアミノ酸末端のアセチル基の分子量（４２）の合計より３０６２≒３ｋＤａである。
また、合成例４における２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの含有量は３．３質量％、４−フェニル−１−ブタノール含有量は１５．９質量％、ポリエチレングリコールセグメントの含有量は４８質量％である。【０１５６】
［合成例５］（ブロック共重合体（Ｃ）の比較例）
ポリエチレングリコール（１２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（２２．０重合体）ブロック共重合体の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体の合成
合成例１及び合成例２と同様な方法で合成したポリエチレングリコール（１２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（２２．０重合体）ブロック共重合体（４１００ｍｇ）をＤＭＦ（６５ｍＬ）に溶解した後、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（藤本分子化学社製、１２０ｍｇ）を加え、最後に４‐（４，６‐ジメトキシ‐１，３，５‐トリアジン‐２‐イル）‐４‐メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ  １１４ｍｇ）を加え、２５℃にて２１時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（７２０ｍＬ）及びエタノール（１８０ｍＬ）混合液中に１．５時間かけて滴下し、室温にて撹拌した。その後、上澄み除去し、ジイソプロピルエーテル（４００ｍＬ）及びエタノール（１００ｍＬ）混合溶液を加え、撹拌し析出物を濾取することで、生成物を得た。得られた生成物をアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ）、１６０ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ  ５０）を加えて０℃にて１．０時間撹拌した。イオン交換樹脂を濾別後にアセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥することにより生成物を得た（４１００ｍｇ）。
得られた生成物及び７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）（１２７２ｍｇ）をＤＭＦ（１８ｍＬ）に溶解した後、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  １８２６μＬ）を加え、２５℃にて２１時間撹拌した。さらにジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  ９１３μＬ）を加え、６．５時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（１６００ｍＬ）及び酢酸エチル（４００ｍＬ）混合液中に１．０時間かけて滴下し、室温にて終夜撹拌した。その後、上澄み除去し、ジイソプロピルエーテル（８００ｍＬ）及び酢酸エチル（２００ｍＬ）混合溶液を加え、撹拌し析出物を濾取することで、生成物を得た。得られた生成物をアセトニトリル／水（７５／２５（ｖ／ｖ）、１２０ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ  ５０）を加えて０℃にて２．０時間撹拌した。イオン交換樹脂を濾別後にアセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥することにより標記の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）結合ブロック共重合体（合成例５  ５１５０ｍｇ）を得た。【０１５７】
合成例５を１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を用いて加水分解処理を行い、遊離した７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量して７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）含有量を求めた。その結果、合成例５における７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）含有量は２３．５質量％であった。
合成例５の２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した反応溶液中の２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの消費率から１分子であった。したがって、合成例５の総２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン分子量は３７１≒０．４ｋＤａと算出された。
これらの値より、合成例５の総分子量は２０８２６≒２１ｋＤａと算出された。
合成例５におけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、ポリエチレングリコール鎖の分子量（１２，０００）、グルタミン酸２２．０重合体の分子量（１２９．１１×２２．０＝２８４０）、ポリアミノ酸末端のアセチル基の分子量（４２）の合計より１４８８２≒１５ｋＤａである。
また、合成例５における２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの含有量は１．８質量％、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）含有量は２３．５質量％、ポリエチレングリコールセグメントの含有量は５８質量％である。【０１５８】
［合成例６］（ブロック共重合体（Ｃ））
ポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．６重合体）ブロック共重合体の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体の合成
合成例１及び合成例２と同様な方法で合成したポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．６重合体）ブロック共重合体（９８１ｍｇ）、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（東京化成工業社製、４２．２ｍｇ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ  ４５ｍｇ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  ３５μＬ）を加え、２５℃にて４時間撹拌した。その後、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）（５３２ｍｇ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  ７７１μＬ）及びＤＭＦ（２６ｍＬ）を加え、さらに２０時間撹拌後、さらにジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  ７７１μＬ）を加え、さらに４時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（６７５ｍＬ）及び酢酸エチル（７５ｍＬ）混合液中に１時間かけて滴下し、得られた析出物を濾取し、減圧化で乾燥することで生成物を得た。得られた生成物をアセトニトリル／水（９８／２（ｖ／ｖ）、３０ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ  ５０）を加えて５℃にて７時間撹拌した。イオン交換樹脂を濾別後にアセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥することにより標記の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）結合ブロック共重合体（合成例６  １４４０ｍｇ）を得た。【０１５９】
合成例６を１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を用いて加水分解処理を行い、遊離した７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量して７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）含有量を求めた。その結果、合成例６における７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）含有量は２４．２質量％であった。
合成例６の２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した反応溶液中の２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの消費率から０．３２分子であった。したがって、合成例６の総２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン分子量は１２３≒０．１ｋＤａと算出された。
これらの値より、合成例６の総分子量は４７７９≒５ｋＤａと算出された。
合成例６におけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、ポリエチレングリコール鎖の分子量（２，０００）、グルタミン酸７．６重合体の分子量（１２９．１１×７．６＝９８１）、ポリアミノ酸末端のアセチル基の分子量（４２）の合計より３０２３≒３ｋＤａである。
また、合成例６における２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの含有量は２．６質量％、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）含有量は２４．２質量％、ポリエチレングリコールセグメントの含有量は４２質量％である。【０１６０】
［合成例７］
片末端がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基であるポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体（ポリエチレングリコール分子量２キロダルトン、ポリグルタミン酸重合数７．８）の合成
片末端ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＢＯ−０２０ＥＡ、日油社製、平均分子量２キロダルトン、７．００ｇ）をＤＭＳＯ（１４０ｍＬ）に溶解後、γ−ベンジル  Ｌ−グルタミン酸−Ｎ−カルボキシ無水物（８．４ｇ）を加えて３０℃で２０．５時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（２，５２０ｍＬ）、エタノール（２８０ｍＬ）及び酢酸エチル（３０ｍＬ）混合液中に０．５時間かけて滴下し、室温にて７時間撹拌した。その後、上澄み除去し、ジイソプロピルエーテル（９００ｍＬ）及びエタノール（１００ｍＬ）混合溶液を加え、０．５時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥し、重合物（１２．３ｇ）を得た。
得られた重合物（１２．０ｇ）をＤＭＦ（１４５ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（２．６ｍＬ）を加えて２０℃にて２時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（１，３０５ｍＬ）及び酢酸エチル（１４５ｍＬ）混合液中に０．５時間かけて滴下し、室温にて１．５時間撹拌した。その後、上澄み除去し、ジイソプロピルエーテル（９００ｍＬ）及びエタノール（１００ｍＬ）混合溶液を加え、撹拌する作業を２回行った後（それぞれの撹拌時間は０．５時間と１時間）、析出物を濾取し、減圧下で乾燥することによりアセチル化ポリマー（１２．１ｇ）を得た。
得られたアセチル化ポリマー（１２．０）をＤＭＦ（２６０ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム−炭素（１．２０ｇ）を加えた。その後、反応雰囲気を水素置換し、３０℃、１気圧下にて２２時間加水素分解を行った。１０％パラジウム−炭素触媒を濾別後（洗い込みに酢酸エチル９０ｍＬ使用）、濾液をヘプタン（１，７５０ｍＬ）及び酢酸エチル（３，５００ｍＬ）混合液中に１時間かけて滴下し、室温にて１．５晩撹拌した。その後、上澄み除去し、ヘプタン（８００ｍＬ）及び酢酸エチル（１，６００ｍＬ）混合液を加え、０．５時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥した（７．８５ｇ）。この析出物（７．６ｇ）を５％食塩水（７６０ｍＬ）に溶解し、２．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にて溶解液のｐＨを約１１に調整後、分配吸着樹脂カラムクロマトグラフィー（ＨＰ−２０）、続いてイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー（Ｄｏｗｅｘ  ５０）を用いて精製した。溶出した溶液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することで片末端がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基であるポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体（合成例７  ５．５ｇ）を得た。
０．１Ｎ水酸化カリウムを用いた滴定法により、合成例７のグルタミン酸の重合数は７．８と算出された。【０１６１】
［合成例８］
片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体の合成
合成例７（５００ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ  １５６ｍｇ）及び４−フェニル−１−ブタノール（１３２μＬ）をＤＭＦ（６．９ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  ３９３μＬ）を加え２５℃にて２２．５時間撹拌した。さらにジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  １９７ｍＬ）を加え、１．５時間撹拌した。反応液をＭＷＣＯ１．０ｋＤａの透析膜に移液し、外液をアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ）として透析を行った。外液を水として透析後、内液がアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ））になるようにアセトニトリルを加え、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ  ５０）を加えて室温にて１時間撹拌した。イオン交換樹脂を濾別後にアセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥することで４−フェニル−１−ブタノール結合体を得た（５５０ｍｇ）。
４−フェニル−１−ブタノール結合体（５３０ｍｇ）にＴＦＡ（１０ｍＬ）を加えて０℃にて１時間撹拌した。続いてＴＦＡを留去した後、ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解させ、溶液をＭＷＣＯ１．０ｋＤａの透析膜に移液した。外液を水として透析を行い、内液を凍結乾燥することにより脱保護体を得た（４３０ｍｇ）。
脱保護体（４１０ｍｇ）及び４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＧＭＢＳ  ８８．７ｍｇ）をＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（１４４μＬ）を加え、２５℃にて１時間撹拌した。その後、ＤＩＰＥＡ（１４４μＬ）を追加し、さらに４時間撹拌した後、反応液をＭＷＣＯ１．０ｋＤａの透析膜に移液し、外液をアセトニトリルとして透析を行った。外液を水として透析後、内液を凍結乾燥することで、標記の片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体（合成例８  ３４０ｍｇ）を得た。【０１６２】
合成例８を１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を用いて加水分解処理を行い、遊離した４−フェニル−１−ブタノールを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量して４−フェニル−１−ブタノール含有量を求めた。その結果、合成例８における４−フェニル−１−ブタノール含有量は１６．０質量％であった。
これらの値から合成例８の総分子量は４１９４≒４ｋＤａと算出された。これにより、合成例８におけるポリエチレングリコールセグメントの含有量は４８質量％である。【０１６３】
[合成例９］（ブロック共重合体（Ｂ）の比較例）
ポリエチレングリコール（１２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（２２．０重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体の合成
合成例１及び合成例２と同様な方法で合成したポリエチレングリコール（１２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（２２．０重合体）ブロック共重合体（６７６ｍｇ）、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（東京化成工業社製、１７．０ｍｇ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ  １２２ｍｇ）をＤＭＦ（８．０ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  １４μＬ）を加え、２５℃にて１．５時間撹拌した。その後、４−フェニル−１−ブタノール（１０２ｍｇ）及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  ３０８μＬ）を加え２５時間撹拌後、反応液をジイソプロピルエーテル（１２０ｍＬ）、エタノール（１５ｍＬ）及び酢酸エチル（１５ｍＬ）混合液中に滴下し、室温にて撹拌した後、析出物を濾取し、減圧化で乾燥することで生成物を得た（７７０ｍｇ）。得られた生成物をアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ）、２０ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ  ５０）を加えて０℃にて２．０時間撹拌した。イオン交換樹脂を濾別後にアセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥することにより標記のポリエチレングリコール（１２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（２２．０重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体（合成例９  ７２０ｍｇ）を得た。【０１６４】
合成例９の４−フェニル−１−ブタノール結合量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した反応溶液中の４−フェニル−１−ブタノールの消費率から１５分子であった。したがって、合成例９の総４−フェニル−１−ブタノール分子量は２２２４≒２ｋＤａと算出された。
また、合成例９の２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した反応溶液中の２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの消費率から１分子であった。したがって、合成例９の総２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン分子量は３７６≒０．４ｋＤａと算出された。
これらの値より、合成例９の総分子量は１８０９１≒１８ｋＤａと算出された。
合成例９におけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、ポリエチレングリコール鎖の分子量（１２，０００）、グルタミン酸７．６重合体の分子量（１２９．１１×２２．０＝２８４０）、ポリアミノ酸末端のアセチル基の分子量（４２）の合計より１４８８２≒１５ｋＤａである。
また、合成例９における２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの含有量は２．１質量％、４−フェニル−１−ブタノールの含有量は１２質量％、ポリエチレングリコールセグメントの含有量は６６質量％である。【０１６５】
[合成例１０］
片末端がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基であるポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体（ポリエチレングリコール分子量１０キロダルトン、ポリグルタミン酸重合数２２．３）の合成
片末端ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（Ｌｏｔ．１２１４，５８７、ＲＡＰＰ  ＰＯＬＹＭＥＲＥ社、平均分子量１０キロダルトン、９．８０ｇ）をＤＭＳＯ（１９６ｍＬ）に溶解後、γ−ベンジル  Ｌ−グルタミン酸−Ｎ−カルボキシ無水物（６．２ｇ）を加えて３０℃で２４時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（３，６００ｍＬ）及びエタノール（４００ｍＬ）混合液中に１時間かけて滴下し、室温にて２時間撹拌した。その後、上澄み除去し、ジイソプロピルエーテル（１，８００ｍＬ）及びエタノール（２００ｍＬ）混合溶液を加え、一時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥し、重合物（１５．３３ｇ）を得た。
得られた重合物（１５．０ｇ）をＤＭＦ（２４８ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（３．０ｍＬ）を加えて２０℃にて１８時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（２，０００ｍＬ）及び酢酸エチル（５２５ｍＬ）混合液中に１．５時間かけて滴下し、室温にて２時間撹拌した。その後、上澄み除去し、ジイソプロピルエーテル（８００ｍＬ）及びエタノール（２００ｍＬ）混合溶液を加え、５時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥することによりアセチル化ポリマー（１３．３４ｇ）を得た。
得られたアセチル化ポリマー（１３．０ｇ）をＤＭＦ（２８０ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム−炭素（１．３２ｇ）を加えた。その後、反応雰囲気を水素置換し、３０℃、１気圧下にて７０時間加水素分解を行った。１０％パラジウム−炭素触媒を濾別後、濾液をヘプタン（３，７００ｍＬ）及び酢酸エチル（１，８５０ｍＬ）混合液中に１時間かけて滴下し、室温にて２晩撹拌した。その後、上澄み除去し、ヘプタン（１，２００ｍＬ）及び酢酸エチル（６００ｍＬ）混合液を加え、０．５時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥した。この析出物（８．７ｇ）を５％食塩水（８７０ｍＬ）に溶解し、２．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にて溶解液のｐＨを約１１に調整後、分配吸着樹脂カラムクロマトグラフィー、続いてイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。溶出した溶液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することで片末端がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基であるポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体（合成例１０  ７．２６ｇ）を得た。
０．１Ｎ水酸化カリウムを用いた滴定法により、合成例１０のグルタミン酸の重合数は２２．３と算出された。【０１６６】
[合成例１１］
片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（１０キロダルトン）−ポリグルタミン酸（２２．３重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体の合成
合成例１０（５００ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ  １０５ｍｇ）及び４−フェニル−１−ブタノール（８８．３μＬ）をＤＭＦ（６．９ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  ２６４μＬ）を加え２５℃にて２２時間撹拌した。その後、さらにジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  １３２μＬ）を加え、１．５時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（１００ｍＬ）、エタノール（１２．５ｍＬ）及び酢酸エチル（１２．５ｍＬ）混合液中に１５分かけて滴下し、室温にて０．５時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧化で乾燥することで生成物を得た。得られた生成物をアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ）、２０ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂を加えて室温にて１．０時間撹拌した。イオン交換樹脂を濾別後にアセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥することにより生成物を得た（５５０ｍｇ）。
続いて、得られた生成物（５３０ｍｇ）にＴＦＡ（６ｍＬ）を加えて０℃にて２時間撹拌した。続いてＴＦＡを留去した後、ＤＭＦ（８ｍＬ）に溶解させ、その溶液をジイソプロピルエーテル（１０４ｍＬ）及び酢酸エチル（５２ｍＬ）混合液中に１５分かけて滴下し、室温にて０．５時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧化で乾燥することで生成物を得た（５９７ｍｇ）。
さらに、得られた生成物（５１６ｍｇ）及び４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＧＭＢＳ  ２８．４ｍｇ）をＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（９２．２μＬ）を加え、２５℃にて２時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（２１６ｍＬ）及び酢酸エチル（５４ｍＬ）混合液中に０．５時間かけて滴下し、室温にて０．５時間撹拌した。その後、上澄み除去し、ジイソプロピルエーテル（２００ｍＬ）及び酢酸エチル（５０ｍＬ）混合溶液を加え、０．５時間撹拌した後、析出物を濾取することで、標記の片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（１０キロダルトン）−ポリグルタミン酸（２２．３重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体（合成例１１  ４７５ｍｇ）を得た。【０１６７】
合成例１１を１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を用いて加水分解処理を行い、遊離した４−フェニル−１−ブタノールを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量して４−フェニル−１−ブタノール含有量を求めた。その結果、合成例１１における４−フェニル−１−ブタノール含有量は１０．３質量％であった。
これらの値から合成例１１の総分子量は１５９３３≒１６ｋＤａと算出された。これにより、合成例８におけるポリエチレングリコールセグメントの含有量は６２．８質量％である。【０１６８】
[合成例１２］（ブロック共重合体（Ａ）の比較例）
ｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ]（ｃＲＧＤｆＣ）が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと結合したポリエチレングリコール（１０キロダルトン）−ポリグルタミン酸（２２．３重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体の合成
合成例１１（４２６ｍｇ）にアセトニトリル／リン酸ｂｕｆｆｅｒ（２５／７５（ｖ／ｖ）、７２ｍＬ）を加えた後、予めアセトニトリル／リン酸ｂｕｆｆｅｒ（２５／７５（ｖ／ｖ）、９ｍＬ）に溶解しておいたｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ]（株式会社ペプチド研究所製，ｃＲＧＤｆＣ：２５．０ｍｇ）を加え、室温にて１時間撹拌後した（リン酸バッファー：塩化カリウム２００ｍｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２００ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム８０００ｍｇ／Ｌ、リン酸水素ナトリウム１１５０ｍｇ／Ｌ及びエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム・二水和物７４２０ｍｇ／Ｌ）。その後、システイン塩酸塩（４９ｍｇ）を加え、さらに１時間撹拌後、反応溶液を、ビバスピン（ＭＷＣＯ：３ｋＤａ）（ザウトリウス社）を用いて精製を行った。続いて、溶液をＭＷＣＯ６〜８ｋＤａの透析膜に移液し、外液を水として透析を行った。透析終了後、内液を凍結乾燥することで、標記の標的結合部位としてｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ]（ｃＲＧＤｆＣ）が片末端４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと結合したポリエチレングリコール（１０キロダルトン）−ポリグルタミン酸（２２．３重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体を得た。【０１６９】
ｃＲＧＤｆＣに対する合成例１１の反応率は７５．６％であった。この値から分子量１６５４４≒１７ｋＤａであるｃＲＧＤｆＣ結合ポリマー、分子量１６０８７≒１６ｋＤａであるｃＲＧＤｆＣ非結合ポリマーがモル比７５．６：２４．４、重量比７６．１：２３．９であることが算出された。
合成例１２を１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を用いて加水分解処理を行い、遊離した４−フェニル−１−ブタノールを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量して４−フェニル−１−ブタノール含有量を求めた。その結果、合成例１２における４−フェニル−１−ブタノール含有量は１０．２質量％であった。
合成例１２におけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、ポリエチレングリコール鎖の分子量（１０，０００）、グルタミン酸２２．３重合体の分子量（１２９．１１×２２．３＝２８７９）、ポリアミノ酸末端のアセチル基の分子量（４２）の合計より１４９２１≒１５ｋＤａである。【０１７０】
［合成例１３］
片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体のＬ−バリンベンジルエステル結合体の合成
合成例７（３９２ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ  １２３ｍｇ）及びＬ−バリンベンジルエステル塩酸塩（１７１ｍｇ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  ３０８μＬ）を加え２５℃にて２２．５時間撹拌した。さらにジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  １５０μＬ）を加え、５時間撹拌した。反応液をＭＷＣＯ１．０ｋＤａの透析膜に移液し、外液をアセトニトリルとして透析を行った。外液を水として透析後、内液がアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ））になるようにアセトニトリルを加え、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ  ５０）を加えて室温にて３０分撹拌した。イオン交換樹脂を濾別後にアセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥することでＬ−バリンベンジルエステル結合体を得た（４４４ｍｇ）。
Ｌ−バリンベンジルエステル結合体（４２８ｍｇ）にＴＦＡ（２ｍＬ）を加えて０℃にて５分撹拌した後、室温で７．５時間撹拌した。続いてＴＦＡを留去した後、Ｈ２Ｏ（７ｍＬ）に溶解させ、溶液をＭＷＣＯ１．０ｋＤａの透析膜に移液した。外液を水として透析を行い、内液を凍結乾燥することにより脱保護体を得た（３８７ｍｇ）。
脱保護体（１９０ｍｇ）及び４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＧＭＢＳ  ４４．８ｍｇ）をＤＭＦ（７．５ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（６８μＬ）を加え、２５℃にて１時間撹拌した。その後、ＤＩＰＥＡ（２２μＬ）を追加し、さらに２０分撹拌した後、反応液をＭＷＣＯ１．０ｋＤａの透析膜に移液し、外液をアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ））として透析を行った。外液を水として透析後、内液を凍結乾燥することで、標記の片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体のＬ−バリンベンジルエステル結合体（合成例１３  １５３ｍｇ）を得た。【０１７１】
合成例１３のＬ−バリンベンジルエステル導入反応を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量したところ１００％反応した。このことから、合成例１３におけるＬ−バリンベンジルエステル含有量は２８．３質量％と算出された。
これらの値から合成例１３の総分子量は４５６９≒４．５ｋＤａと算出された。これにより、合成例１３におけるポリエチレングリコールセグメントの含有量は４４質量％である。【０１７２】
［合成例１４］（ブロック共重合体（Ｃ））
ポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（９．１重合体）ブロック共重合体の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ）結合体の合成
合成例１及び２と同様の方法で合成したポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（９．１重合体）ブロック共重合体（１０００ｍｇ）、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（東京化成工業社製、５０．０ｍｇ）、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）（５００ｍｇ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ  ５１．３ｍｇ）をＤＭＦ（８０ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ  ５０μＬ）を加え、２５℃にて２１時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（１０８０ｍＬ）及び酢酸エチル（１２０ｍＬ）混合液中に滴下し、上澄みを除去した後、ジイソプロピルエーテル（５４０ｍＬ）及び酢酸エチル（６０ｍＬ）混合液を加えた。得られた析出物を濾取し、減圧化で乾燥することで生成物を得た。
得られた生成物をアセトニトリル／水（９９／１（ｖ／ｖ）、４３ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ  ５０）を加えて０℃にて２時間撹拌した。イオン交換樹脂を濾別後にアセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥することにより標記の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ）結合ブロック共重合体（合成例１４  １３６７ｍｇ）を得た。【０１７３】
合成例１４を１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を用いて加水分解処理を行い、遊離した７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量して７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）含有量を求めた。その結果、合成例１４における７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）含有量は２８．９質量％であった。
合成例１４の２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した反応溶液中の２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの消費率から０．４０分子であった。したがって、合成例１４の総２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン分子量は１５１≒０．１５ｋＤａと算出された。【０１７４】
これらの値より、合成例１４の総分子量は４６２５≒４．６ｋＤａと算出された。
合成例１４におけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、ポリエチレングリコール鎖の分子量（２，０００）、グルタミン酸９．１重合体の分子量（１２９．１１×９．１＝１１７５）、ポリアミノ酸末端のアセチル基の分子量（４２）の合計より３２１７≒３．２ｋＤａである。
また、合成例１４における２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの含有量は３．３質量％、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）含有量は２８．９質量％、ポリエチレングリコールセグメントの含有量は４３質量％である。【０１７５】
［合成例１５］
スルフヒドリル基を有するＣｅｔｕｘｉｍａｂの合成
Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（ブリストルマイヤーズスクイブ社、４ｍｇ）をＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に外液交換した（６．３７ｍｇ／ｍＬ）。ＳＡＴ（ＰＥＧ）（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセチレングリコール）／ＤＭＳＯ溶液（１２ｍＭ、１７．５μＬ）を添加して室温で３０分間撹拌した。脱塩カラム（ＰＤ−１０）により未反応の低分子成分を除去した後、ヒドロキシルアミン／５ｍＭ−ＥＤＴＡ含有ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４、０．５Ｍ、４２μＬ）を添加し、室温で５０分撹拌した。再度、ＰＤ−１０により低分子成分を除去することで、スルフヒドリル基を有するＣｅｔｕｘｉｍａｂ（合成例１５、２．２ｍＬ）を得た。
合成例１５は、ＳＥＣ分析によりＣｅｔｕｘｉｍａｂ基準で１．００ｍｇ／ｍＬであった。【０１７６】
［実施例１−１］（ブロック共重合体（Ａ））
ｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ]（ｃＲＧＤｆＣ）が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと結合したポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体の合成
合成例８（１２１ｍｇ）にリン酸バッファー／アセトニトリル（７５／２５（ｖ／ｖ）、８７ｍＬ）を加えた後、予めリン酸バッファー／アセトニトリル（７５／２５（ｖ／ｖ）、１２ｍＬ）に溶解しておいたｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ]（株式会社ペプチド研究所製、ｃＲＧＤｆＣ：２２．０ｍｇ）を加え、室温にて１時間撹拌した（リン酸バッファー：塩化カリウム２００ｍｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２００ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム８０００ｍｇ／Ｌ、リン酸水素ナトリウム１１５０ｍｇ／Ｌ及びエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム・二水和物７４２０ｍｇ／Ｌ）。その後、システイン塩酸塩（５６ｍｇ）を加え、１時間撹拌後、反応溶液をＭＷＣＯ３．５ｋＤａの透析膜に移液し、外液を水として透析を行った。透析終了後、内液を凍結乾燥することで、標記のｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ]（ｃＲＧＤｆＣ）が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと結合したポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体を得た。【０１７７】
ｃＲＧＤｆＣに対する合成例８の反応率は７７．２％であった。この値から分子量４７９０≒５ｋＤａであるｃＲＧＤｆＣ結合ポリマー、分子量４３３３≒４ｋＤａであるｃＲＧＤｆＣ非結合ポリマーがモル比７７．２：２２．８、重量比７８．９：２１．１であることが算出された。なお、本回収物には、反応溶媒由来のＥＤＴＡが５１．５質量％含まれている。
標的結合部位を除いた実施例１−１の４−フェニル−１−ブタノール含有量は合成例８より１６．０質量％である。
実施例１−１におけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、ポリエチレングリコール鎖の分子量（２，０００）、グルタミン酸７．８重合体の分子量（１２９．１１×７．８＝１００７）、ポリアミノ酸末端のアセチル基の分子量（４２）の合計より３０４９≒３ｋＤａである。
実施例１−１を粒子径・ゼータ電位測定装置Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）により粒径測定したところ、平均粒径は２５ｎｍ（１ｍｇ／ｍＬ）であった。【０１７８】
［実施例１−２Ａ］（ブロック共重合体（Ａ））
ｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｃｙｓ）]（ｃＲＧＤｆＫ（Ｃ））が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドであるエステルポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体の合成
合成例８（１４０ｍｇ）にリン酸バッファー／アセトニトリル（７５／２５（ｖ／ｖ）、８７ｍＬ）を加えた後、予めリン酸バッファー／アセトニトリル（７５／２５（ｖ／ｖ）、１１ｍＬ）に溶解しておいたｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｃｙｓ）]（株式会社ペプチド研究所製，ｃＲＧＤｆＫ（Ｃ）：３３．１ｍｇ）を加え、室温にて１．５時間撹拌した（リン酸バッファー：塩化カリウム２００ｍｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２００ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム８０００ｍｇ／Ｌ、リン酸水素ナトリウム１１５０ｍｇ／Ｌ及びエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム・二水和物７４２０ｍｇ／Ｌ）。その後、システイン塩酸塩（５９．７ｍｇ）を加え、さらに２時間撹拌後、反応溶液をＭＷＣＯ１．０ｋＤａの透析膜に移液した。外液を水として透析後、内液を凍結乾燥することで、標記のｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｃｙｓ）]（ｃＲＧＤｆＫ（Ｃ））が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体（実施例１−２Ａ）を得た。【０１７９】
ｃＲＧＤｆＫ（Ｃ）に対する合成例８の反応率は９４．４％であった。この値から分子量４９１８≒５ｋＤａであるｃＲＧＤｆＫ（Ｃ）結合ポリマー、分子量４３３３≒４ｋＤａであるｃＲＧＤｆＫ（Ｃ）非結合ポリマーがモル比９４．４：５．６、重量比９５．０：５．０であることが算出された。なお、本回収物には、反応溶媒由来のＥＤＴＡが４８．２質量％含まれている。
標的結合部位を除いた実施例１−２Ａの４−フェニル−１−ブタノール含有量は合成例８より１６．０質量％である。
実施例１−２Ａにおけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、ポリエチレングリコール鎖の分子量（２，０００）、グルタミン酸７．８重合体の分子量（１２９．１１×７．８＝１００７）、ポリアミノ酸末端のアセチル基の分子量（４２）の合計より３０４９≒３ｋＤａである。【０１８０】
［実施例１−２Ｂ］（ブロック共重合体（Ａ））
ｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｃｙｓ）]（ｃＲＧＤｆＫ（Ｃ））が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドであるエステルポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体の合成（脱塩）
実施例１−２Ａ（１１５ｍｇ）をＤＭＦ／水（５０／５０（ｖ／ｖ）、２０ｍＬ）に溶解させ、溶液をＭＷＣＯ１．０ｋＤａの透析膜に移液した。外液を水として透析後、内液を凍結乾燥することで、標記のｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｃｙｓ）]（ｃＲＧＤｆＫ（Ｃ））が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体（実施例１−２Ｂ）を得た。反応溶媒由来のＥＤＴＡは５．０質量％であった。
実施例１−２Ｂを、粒子径・ゼータ電位測定装置Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）により粒径測定したところ、平均粒径は２２ｎｍ（１ｍｇ／ｍＬ）であった。【０１８１】
［実施例１−３］（ブロック共重合体（Ａ））
ｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｃｙｓ）]（ｃＲＧＤｆＫ（Ｃ））が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドであるエステルポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体の合成
合成例８（６４ｍｇ）をリン酸バッファー／アセトニトリル（５０／５０（ｖ／ｖ）、１２ｍＬ）で溶解後、予めリン酸バッファー／アセトニトリル（５０／５０（ｖ／ｖ）、４．３ｍＬ）に溶解しておいたｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｃｙｓ）]（株式会社ペプチド研究所製、ｃＲＧＤｆＫ（Ｃ）：１６．３ｍｇ）を加え、２５℃室温にて３時間撹拌後した（リン酸バッファー：塩化カリウム２００ｍｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２００ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム８０００ｍｇ／ｍＬ、リン酸水素ナトリウム１１５０ｍｇ／Ｌ及びエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム・二水和物３７２０ｍｇ／Ｌ）。その後、システイン塩酸塩（２８ｍｇ）を加え、さらに１時間撹拌後、反応溶液をＭＷＣＯ３．５ｋＤａの透析膜に移液した。外液をＤＭＦ／水（５０／５０（ｖ／ｖ））、続いて、水として透析後、内液を凍結乾燥することで、標記のｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｃｙｓ）]（ｃＲＧＤｆＫ（Ｃ））が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体（実施例１−３）を得た。【０１８２】
ｃＲＧＤｆＫ（Ｃ）に対する合成例８の反応率は８９．４％であった。この値から分子量４９１７≒５ｋＤａであるｃＲＧＤｆＫ（Ｃ）結合ポリマー、分子量４３３２≒４ｋＤａであるｃＲＧＤｆＫ（Ｃ）非結合ポリマーがモル比８９．４：１０．６、重量比９０．５：９．５であることが算出された。なお、本回収物には、反応溶媒由来のＥＤＴＡが４．５質量％含まれている。
標的結合部位を除いた実施例１−３の４−フェニル−１−ブタノール含有量は合成例８より１６．０質量％である。
実施例１−３におけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、ポリエチレングリコール鎖の分子量（２，０００）、グルタミン酸７．８重合体の分子量（１２９．１１×７．８＝１００７）、ポリアミノ酸末端のアセチル基の分子量（４２）の合計より３０４９≒３ｋＤａである。【０１８３】
［実施例２］（ブロック共重合体（Ａ））
Ｈ[Ｃｙｓ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ]ＯＨ（Ｘ：６−アミノヘキサン酸）（ＣＸ−ＧＥ１１）が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体の合成
合成例８（６４ｍｇ）をリン酸バッファー／アセトニトリル（５０／５０（ｖ／ｖ）、６．１ｍＬ）で溶解後、予めリン酸バッファー／アセトニトリル（５０／５０（ｖ／ｖ）、２．４ｍＬ）に溶解しておいたｃｙｃｌｏＨ[Ｃｙｓ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ]ＯＨ（Ｘ：６−アミノヘキサン酸）（シグマアルドリッチジャパン株式会社製、ＣＸ−ＧＥ１１：１３．６ｍｇ）を加え、２５℃室温にて２．５時間撹拌後した（リン酸バッファー：塩化カリウム２００ｍｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２００ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム８０００ｍｇ／Ｌ、リン酸水素ナトリウム１１５０ｍｇ／Ｌ及びエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム・二水和物３７２０ｍｇ／Ｌ）。その後、システイン塩酸塩（１５ｍｇ）を加え、さらに２時間撹拌後、反応溶液をＭＷＣＯ３．５ｋＤａの透析膜に移液した。外液をＤＭＦ／水（５０／５０（ｖ／ｖ））、続いて、水として透析後、内液を凍結乾燥することで、標記のＨ[Ｃｙｓ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ]ＯＨ（Ｘ：６−アミノヘキサン酸）（ＣＸ−ＧＥ１１）が結合した片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体（実施例２）を得た。【０１８４】
ＣＸ−ＧＥ１１に対する合成例８の反応率は７２．２％であった。この値から分子量５，９６７≒６ｋＤａであるＣＸ−ＧＥ１１結合ポリマー、及び分子量４，３３３≒４ｋＤａであるＣＸ−ＧＲ１１非結合ポリマーがモル比７２．２：２７．８、重量比７８．２：２１．８であることが算出された。なお、本回収物には、反応溶媒由来のＥＤＴＡが８．４質量％含まれている。
標的結合部位を除いた実施例２の４−フェニル−１−ブタノール含有量は合成例８より１６．０質量％である。
実施例２におけるポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖を合せた主鎖ポリマーの分子量は、ポリエチレングリコール鎖の分子量（２，０００）、グルタミン酸７．８重合体の分子量（１２９．１１×７．８＝１００７）、ポリアミノ酸末端のアセチル基の分子量（４２）の合計より３０４９≒３ｋＤａである。【０１８５】
［実施例３］（ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物）
ｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｃｙｓ）]（ｃＲＧＤｆＫ（Ｃ））が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、システインが結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、及びポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．９重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体からなる組成物（重量比３４：２：８０）（モル比２９：２：８０）
実施例１−２Ａ（３４．８ｍｇ、ＥＤＴＡ：４８．２質量％含有）及び合成例４（４０．１ｍｇ）を、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン濃度が０．３３ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＦ／水（５０／１４（ｖ／ｖ））に溶解させた。続いて、ＭＷＣＯ１０００の透析膜に移液し、外液を水にして透析を行った。最終的に２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン濃度が０．１１ｍｇ／ｍＬになるように水を加え、０．４５μｍフィルター濾過することで表記実施例３を調製した。
実施例３をシングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００（株式会社島津製作所製）により粒径測定したところ、平均粒径は３０ｎｍ（２ｍｇ／ｍＬ）であった。【０１８６】
［実施例４］（ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物）
ｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｃｙｓ）]（ｃＲＧＤｆＫ（Ｃ））が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、システインが結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、及びポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．９重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体からなる組成物（重量比３４：２：８０）（モル比２９：２：８０）
実施例１−２Ｂ（３．９ｍｇ、ＥＤＴＡ：４．５質量％含有）及び合成例４（８．２ｍｇ）を、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン濃度が０．０６８ｍｇ／ｍＬになるように水を加え、氷冷下ソニケーションで溶解し、０．４５μｍフィルター濾過することで表記実施例４を調製した。
実施例４をシングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００（株式会社島津製作所製）により粒径測定したところ、平均粒径は１５ｎｍ（２ｍｇ／ｍＬ）であった。【０１８７】
［実施例５］（ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｂ）を含有する組成物）
Ｈ[Ｃｙｓ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ]ＯＨ（Ｘ：６−アミノヘキサン酸）（ＣＸ−ＧＥ１１）が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、システインが結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、及びポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．９重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体からなる組成物（重量比１７：５：８０）（モル比１２：５：８０）
実施例２（３．６ｍｇ、ＥＤＴＡ：８．４質量％含有）及び合成例４（１２．２ｍｇ）を、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン濃度が０．１５ｍｇ／ｍＬになるように水を加え、氷冷下ソニケーションで溶解し、０．４５μｍフィルター濾過することで表記実施例５を調製した。
実施例５をシングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００（株式会社島津製作所製）により粒径測定したところ、平均粒径は１１ｎｍ（２ｍｇ／ｍＬ）であった。【０１８８】
［実施例６］（ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物）
Ｈ[Ｃｙｓ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ]ＯＨ（Ｘ：６−アミノヘキサン酸）（ＣＸ−ＧＥ１１）が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、システインが結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、及びポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．５９重合体）ブロック共重合体の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体からなる組成物（重量比１７：５：８０）（モル比１４：５：８０）
実施例２（３．７ｍｇ、ＥＤＴＡ：８．４質量％含有）及び合成例６（１２．３ｍｇ）を、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン濃度が０．１５ｍｇ／ｍＬになるように水を加え、氷冷下ソニケーションで溶解し、０．４５μｍフィルター濾過することで表記実施例６を調製した。
実施例６をシングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００（株式会社島津製作所製）により粒径測定したところ、平均粒径は１７ｎｍ（２ｍｇ／ｍＬ）であった。【０１８９】
［実施例７］（ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物）
ｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｃｙｓ）]（ｃＲＧＤｆＫ（Ｃ））が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、システインが結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、及びポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．５９重合体）ブロック共重合体の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体からなる組成物（重量比３６：４：６０）（モル比３５：４：６０）
実施例１−３（３７．６ｍｇ、ＥＤＴＡ：４．５質量％含有）及び合成例６（５４．２ｍｇ）を、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン濃度が０．２５ｍｇ／ｍＬになるように水を加え、氷冷下ソニケーションで溶解し、０．４５μｍフィルター濾過することで表記実施例７を調製した。
実施例７をシングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００（株式会社島津製作所製）により粒径測定したところ、平均粒径は２６ｎｍ（２ｍｇ／ｍＬ）であった。【０１９０】
［実施例８］（ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物）
ｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｃｙｓ）]（ｃＲＧＤｆＫ（Ｃ））が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと結合したポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、システインが結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、及びポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．５９重合体）ブロック共重合体の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体からなる組成物（重量比１７：２：８０）（モル比１７：２：８０）
実施例１−３（３７．６ｍｇ、ＥＤＴＡ：４．５質量％含有）及び合成例６（３１．１ｍｇ）を、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン濃度が０．２５ｍｇ／ｍＬになるように水を加え、氷冷下ソニケーションで溶解し、０．４５μｍフィルター濾過することで表記実施例８を調製した。
実施例８をシングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００（株式会社島津製作所製）により粒径測定したところ、平均粒径は８ｎｍ（２ｍｇ／ｍＬ）であった。【０１９１】
［実施例９］（ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物）
Ｈ[Ｃｙｓ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ]ＯＨ（Ｘ：６−アミノヘキサン酸）（ＣＸ−ＧＥ１１）が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、システインが結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、及びポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．５９重合体）ブロック共重合体の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体からなる組成物（重量比３０：８：６０）（モル比２４：９：６０）
実施例２（１７．１ｍｇ、ＥＤＴＡ：８．４質量％含有））及び合成例６（２５．１ｍｇ）を、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン濃度が０．２８ｍｇ／ｍＬになるように水を加え、氷冷下ソニケーションで溶解し、０．４５μｍフィルター濾過することで表記実施例９を調製した。
実施例９をシングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００（株式会社島津製作所製）により粒径測定したところ、平均粒径は１６ｎｍ（２ｍｇ／ｍＬ）であった。【０１９２】
［実施例１０］（ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物）
Ｈ[Ｃｙｓ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ]ＯＨ（Ｘ：６−アミノヘキサン酸）（ＣＸ−ＧＥ１１）が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、システインが結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、及びポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．５９重合体）ブロック共重合体の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体からなる組成物（重量比１５：４：８０）（モル比１２：５：８０）
実施例２（６．７ｍｇ、ＥＤＴＡ：８．４質量％含有）及び合成例６（２５．５ｍｇ）を、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン濃度が０．２８ｍｇ／ｍＬになるように水を加え、氷冷下ソニケーションで溶解し、０．４５μｍフィルター濾過することで表記実施例１０を調製した。
実施例１０をシングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００（株式会社島津製作所製）により粒径測定したところ、平均粒径は１５ｎｍ（２ｍｇ／ｍＬ）であった。【０１９３】
［実施例１１］（ブロック共重合体（Ａ）とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物）
片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体のＬ−バリンベンジルエステル結合体とスルフヒドリル基を有するＣｅｔｕｘｉｍａｂの結合体、及びポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（９．１重合体）ブロック共重合体の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ）からなる組成物（モル比１：１．８１、重量比１：６０．８）。
合成例１３（１．５０ｍｇ）及び合成例１４（８．６４ｍｇ）を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０、５０ｍＬ）に溶解した。８分間超音波照射したのち、ゲル濾過カラム（ＨｉｐｒｅｐＴＭ  １６／６０ ＳｅｐｈａｃｒｙｌＴＭ  Ｓ−３００  ＨＲ）精製することで表記実施例１１の前駆体ナノ粒子を調製した（３．１９ｍｇ／ｍＬ）。
続いて前記の前駆体ナノ粒子（０．５ｍＬ、１．６０ｍｇ）に対して、合成例１５（０．８０ｍＬ、０．８０ｍｇ）を添加し、３０℃で６時間振とう撹拌した。Ｎ−エチルマレイミド／ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０、０．５ｍＭ、０．０５ｍＬ）を添加し３０分振とう撹拌した後、Ｌ−システイン／５ｍＭ−ＥＤＴＡ含有ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５、５ｍＭ、０．１ｍＬ）を添加することで、未反応のスルフヒドリル基及びマレイミド基を不活化処理した。限外濾過フィルター（Ｖｉｖａｓｐｉｎ、ＭＷＣＯ３，０００）を使用して未反応の低分子成分を除去した後、１．５ｍＬとなるようにＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、０．４５μｍフィルター濾過することで表記実施例１１の組成物を調製した（１．６０ｍｇ／ｍＬ）。【０１９４】
実施例１１の組成物におけるＣｅｔｕｘｉｍａｂを標的結合部位として有するブロック共重合体（Ａ）は、合成例１３と合成例１５の混合比が（合成例１３の分子量４，５６９≒４．５ｋＤａと合成例１５の分子量１５１，０００≒１５１ｋＤａより、モル比１：０．２３）であることから、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂを標的結合部位として有するブロック共重合体（Ａ）は、合成例１３の２３％に相当することになる。すなわち、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂを標的結合部位として有するブロック共重合体（Ａ）、及び薬剤ＳＮ−３８を有するブロックコポリマー（Ｃ）の重量比は、Ａ：Ｃ＝１：１．８１（モル比は、Ａ：Ｃ＝１／１５５５６９（Ａの分子量）：１．８１／４６２６（Ｃの分子量）＝１：６０．８）となった。
実施例１１の組成物を、限外濾過により超純水へ置換し、ＩＧ−１０００により粒径測定したところ、平均粒径は１８ｎｍであった。【０１９５】
［比較例１］（ブロック共重合体（Ｂ）の比較例）
ポリエチレングリコール（１０キロダルトン）−ポリグルタミン酸（２１．０重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体（合成例３）のみからなる調製物
合成例３を、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（ＮｉｌｅＲｅｄ）濃度が０．６０ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＦ／水（５０／１０（ｖ／ｖ）に溶解させた。続いて、ＭＷＣＯ１．０ｋＤａの透析膜に移液し、外液水にして透析を行った。最終的に２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン濃度が０．１５ｍｇ／ｍＬになるように水を加え、０．４５μｍフィルター濾過することで表記比較例１を調製した。
比較例１をシングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００（株式会社島津製作所製）により粒径測定したところ、平均粒径は１８ｎｍ（２ｍｇ／ｍＬ）であった。【０１９６】
［比較例２］（ブロック共重合体（Ｃ）の比較例）
ポリエチレングリコール（１２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（２２．０重合体）ブロック共重合体の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体（合成例５）のみからなる調製物
比較例２をシングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００（株式会社島津製作所製）により粒径測定したところ、平均粒径は２３ｎｍ（５ｍｇ／ｍＬ）であった。【０１９７】
［比較例３］（ブロック共重合体（Ｃ））
ポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．５９重合体）ブロック共重合体の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体（合成例６）のみからなる調製物
比較例３をシングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００（株式会社島津製作所製）により粒径測定したところ、平均粒径は１３ｎｍ（２ｍｇ／ｍＬ）であった。【０１９８】
［比較例４］（ブロック共重合体（Ｂ））
ポリエチレングリコール（１２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（２２．０重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体（合成例１１）のみからなる調製物
比較例４をシングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００（株式会社島津製作所製）により粒径測定したところ、平均粒径は３６ｎｍ（２ｍｇ／ｍＬ）であった。【０１９９】
［比較例５］（ブロック共重合体（Ｂ））
ポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．９重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体（合成例４）のみからなる調製物
比較例５をシングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００（株式会社島津製作所製）により粒径測定したところ、平均粒径は１３ｎｍ（２ｍｇ／ｍＬ）であった。【０２００】
［比較例６］（ブロック共重合体（Ａ）の比較例とブロック共重合体（Ｂ）の比較例を含有する組成物）
ｃｙｃｌｏ [Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ]（ｃＲＧＤｆＣ）が結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（１０キロダルトン）−ポリグルタミン酸（２２．３重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、システインが結合した、片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（１０キロダルトン）−ポリグルタミン酸（２２．３重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール結合体、及びポリエチレングリコール（１０キロダルトン）−ポリグルタミン酸（２１．０重合体）ブロック共重合体の４−フェニル−１−ブタノール及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン結合体からなる組成物（重量比１５：５：８０）（モル比１４：５：８０）
合成例３（８３．１ｍｇ）及び合成例１２（２０．８ｍｇ）を、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン濃度が０．５５ｍｇ／ｍＬになるようＤＭＦ／水（５０／１０（ｖ／ｖ）に溶解させた。続いて、ＭＷＣＯ１．０ｋＤａの透析膜に移液し、外液水にして透析を行った。最終的に２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン濃度が０．１８ｍｇ／ｍＬになるように水を加え、最後に０．４５μｍフィルターを通し、調製を行った。
比較例６をシングルナノ粒子径測定装置ＩＧ−１０００（株式会社島津製作所製）により粒径測定したところ、平均粒径は２８ｎｍ（２ｍｇ／ｍＬ）であった。【０２０１】
［比較例７］（ブロック共重合体（Ａ）の比較例とブロック共重合体（Ｃ）を含有する組成物）
片末端が４−マレイミド酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（７．８重合体）ブロック共重合体のＬ−バリンベンジルエステル結合体とＬ−システインの結合体、及びポリエチレングリコール（２キロダルトン）−ポリグルタミン酸（９．１重合体）ブロック共重合体の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）及び２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ）からなる組成物（モル比１：５．６９、重量比１．５４：８．６４）。
合成例１３（１．５０ｍｇ）、及び合成例１４（８．６４ｍｇ）を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０、５０ｍＬ）に溶解した。８分間超音波照射したのち、ゲル濾過カラム（ＨｉｐｒｅｐＴＭ  １６／６０ ＳｅｐｈａｃｒｙｌＴＭ  Ｓ−３００  ＨＲ）精製することで表記実施例１１の前駆体ナノ粒子を調製した（３．１９ｍｇ／ｍＬ）。
続いて前記の前駆体ナノ粒子（０．５ｍＬ、１．６０ｍｇ）に対して、Ｌ−システイン／５ｍＭ−ＥＤＴＡ含有ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５、５ｍＭ、０．０５ｍＬ）（Ｌ−システイン３０．３ｍｇ）を添加することで、マレイミド基を不活化処理した。限外濾過フィルター（Ｖｉｖａｓｐｉｎ、ＭＷＣＯ３，０００）を使用して未反応の低分子成分を除去した後、１．５ｍＬとなるようにＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、０．４５μｍフィルター濾過することで表記比較例７の組成物を調製した（１．０７ｍｇ／ｍＬ）。【０２０２】
比較例７の組成物における、標的結合能を示さないＬ−システインを有するブロック共重合体（ブロック共重合体（Ａ）の比較例）は、合成例１３（分子量４５６９）にＬ−システイン（分子量１２１）が１００％反応したと仮定して、分子量は４，６９０となる。すなわち、Ｌ−システインを有するブロック共重合体（比較Ａ）、及び薬剤ＳＮ−３８を有するブロックコポリマー（Ｃ）の重量比は、比較Ａ：Ｃ＝１．５×４６９０／４５６９：８．６４＝１．５４：８．６４（モル比は、比較Ａ：Ｃ＝１．５４／４６９０（比較Ａの分子量）：８．６４／４６２６（Ｃの分子量）＝１：５．６９）となった。
比較例７の組成物を、限外濾過により超純水へ置換し、ＩＧ−１０００により粒径測定したところ、平均粒径は１９ｎｍであった。【０２０３】
［試験例１］リン酸緩衝溶液中の薬剤放出性試験
実施例７、実施例８並びに比較例３をそれぞれリン酸緩衝溶液中（ｐＨ７．４）に組成物重量換算１．０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、３７℃にて定温放置した。放出された７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）量をＨＰＬＣにて経時的に測定し、使用した化合物中の全ＥＨＣ量に対する放出されたＥＨＣ量の割合を求めた。
結果を図１に示した。
この結果、比較例３、実施例７及び実施例８は酵素非存在下のリン酸緩衝液中において、６時間にてそれぞれ６１％、４２％及び４６％のＥＨＣ放出が確認された。【０２０４】
［試験例２］インテグリン結合アッセイによる標的結合部位（ｃＲＧＤ）含有組成物の結合力測定試験
標的結合部位としてｃＲＧＤを有する実施例３、実施例４、及び比較例６、並びに標的結合部位（ｃＲＧＤ）を有さない比較例１の、インテグリンαＶβ３に対する結合力を測定する試験を以下の手順で行った。
ＰＢＳ（−）で作成した１μｇ／ｍＬのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ
ａｌｐｈａ Ｖ ｂｅｔａ ３ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社)を１００μＬずつ、９６ウェルのＣｏｓｔａｒ
ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｌａｔｅに加え、４℃で一晩おくことでインテグリンαＶβ３を底面に結合させた。その後、ウェルのインテグリンαＶβ３を吸引除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ／Ｂｉｎｄｉｎｇ
ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ
ＭｎＣｌ２、１％ ＢＳＡ）を各ウェルに２００μＬ加えて、室温で１時間おきブロッキングを行った。更にＢｌｏｃｋｉｎｇ／Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを吸引除去し、作成した実施例３及び実施例４、並びに比較例１及び比較例６の希釈系列の被験液を各ウェルに１００μＬ加えて室温で２時間おいた。
予め、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ
Ｋｉｔ ― ＮＨ２（同仁化学研究所）を用いて、ヒト組み換えビトロネクチン（和光純薬）ビオチン化させたビオチン化ビトロネクチン（１μｇ／ｍＬ）を、１００μＬ更に各ウェルに加えて３時間室温においた。その後、ウェルをＢｌｏｃｋｉｎｇ／Ｂｉｎｄｉｎｇ
ｂｕｆｆｅｒ  ２００μＬ用いて３回洗浄し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ／Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１万倍に希釈したｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ―ＨＲＰ（ＧＥヘルスケア社）を各ウェルに１００μＬ加えて室温で一時間おいた。そして、ウェルをＢｌｏｃｋｉｎｇ／Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ  ２００μＬ用いて２回洗浄し、ＴＭＢ
Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｅｔｈｙｌ社）を１００μＬ加えて室温で３０分おいて発色させた後に、１規定のＨＣｌを加えて反応を止めた。
添加後３０分以内に４５０ｎｍの吸光度を測定して、ビオチン化ビトロネクチンのインテグリンαＶβ３の結合率を算出して、結果を図２及び図３に示した。【０２０５】
標的結合部位として、ｃＲＧＤリガンドを結合したブロック共重合体（Ａ）と、蛍光物質の付加したブロック共重合体（Ｂ）の混合物から成るミセル形成性の組成物について、ビトロネクチンとインテグリンαＶβ３への結合阻害を測定した。比較例１及び比較例６の結果を図２に、また実施例３及び実施例４の結果を図３に示した。標的結合部位としてｃＲＧＤリガンドを付加したミセル形成性組成物である実施例３及び実施例４、並びに比較例６において結合阻害が認められた。これに対し標的結合部位（ｃＲＧＤ）を有さない比較例１のミセル形成性組成物は結合阻害は認められなかった。以上のことから、標的結合部位としてｃＲＧＤリガンドを有する組成物は、ｃＲＧＤリガンドが外殻部分に露出してインテグリンαＶβ３へ結合性を有するミセル様会合体を形成していることが示され、ブロック共重合体（Ａ）に付与した標的結合部位（ｃＲＧＤ）が標的部位に対する認識機能を有するとともに、当該組成物の結合機能を有することが明らかとなった。【０２０６】
［試験例３］腫瘍及び腎臓内組織分布評価試験
培養癌細胞ヒトグリオーマＵ８７ＭＧ懸濁液を、注射針付シリンジを用いてヌードマウスの背側部皮下に移植した。実施例３、並びに比較例４、比較例５を５％ブドウ糖注射液で溶解し、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン換算量５ｍｇ／ｋｇで、それぞれ静脈内に単回投与した。
投与１時間後及び２４時間後にマウスをイソフルラン麻酔下で脱血し、取り出した腫瘍及び腎臓の凍結包埋切片を作製し、投与組成物の２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンに由来する蛍光を観察した。
それぞれの組成物の腫瘍内組織分布の結果を図４に、腎臓内組織分布の結果を図６に示す。
また、それらの画像を元にＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いて輝度を算出し、腫瘍組織切片の輝度の値を図５に、腎臓組織切片の輝度の値を図７に示した。【０２０７】
試験例３の結果、実施例３及び比較例５は、投与１時間後において腫瘍全体に浸透してより広域で蛍光のシグナルが観察された。これらと比較すると、比較例４は腫瘍内への浸透が乏しいことが認められた。更に、投与２４時間後の蛍光分布を観察すると、実施例３は腫瘍の内部の広域に亘って蛍光シグナルが認められ、比較例４及び５と比較して、腫瘍組織内部への浸透性が優れていることが示された。
また腎臓において、実施例３及び比較例５は血管内及び尿細管に蛍光が観察された。一方で、比較例４は腎臓内では血管内以外では蛍光が認められなかった。
以上のことから、実施例３は、比較例４と比較して速やかに腫瘍のより深部に浸透し、比較例４及び比較例５と比較して長時間腫瘍中に滞留することが示された。この腫瘍内分布特性から、実施例３は腫瘍組織内部の広範囲に亘り薬剤を送達できるＤＤＳキャリアとして有用であることが示された。また、腎臓において実施例３は、比較例４と比較して速やかに腎排泄を受けることが示された。このことは、高分子型ＤＤＳキャリアでありながら体外排泄性という特徴を有しており、薬剤の過剰な体内滞留を回避することにより血液毒性といった正常組織への障害を低減しうる性能を有するキャリアであると考えられた。【０２０８】
［試験例４］腫瘍及び腎臓内組織分布評価試験
培養癌細胞ヒトグリオーマＵ８７ＭＧ懸濁液を、注射針付シリンジを用いてヌードマウスの背側部皮下に移植した。実施例７、並びに比較例２、比較例３を５％ブドウ糖注射液で溶解し、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン換算量５ｍｇ／ｋｇで、それぞれ静脈内に単回投与した。
投与１時間後及び２４時間後にマウスをイソフルラン麻酔下で脱血し、取り出した腫瘍及び腎臓の凍結包埋切片を作製し、投与組成物の２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンに由来する蛍光を観察した。
それぞれの組成物の腫瘍内組織分布の結果を図８に、腎臓内組織分布の結果を図１０に示す。
また、それらの画像を元にＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いて輝度を算出し、腫瘍組織切片の輝度の値を図９に、腎臓組織切片の輝度の値を図１１に示した。【０２０９】
試験例４の結果、実施例７及び比較例３は投与１時間後において、比較例２と比較して腫瘍全体に浸透してより広域で蛍光のシグナルが観察された。また投与２４時間後において、実施例７は比較例２及び比較例３と比較して、腫瘍内のより広域で蛍光のシグナルが観察された。
また腎臓において、実施例７及び比較例３は血管内及び尿細管に蛍光が観察された。一方で、比較例２は血管内以外では蛍光が認められなかった。
以上のことから、実施例７は比較例２と比較して速やかに腫瘍のより深部に浸透し、比較例２及び比較例３と比較して長時間腫瘍中に滞留することで抗腫瘍効果を増強し得ることが示唆された。また、腎臓において実施例７は、比較例２と比較して速やかに腎排泄を受けることが示され体外排泄性を有することから、薬剤の過剰な体内滞留を回避することにより血液毒性といった正常組織への障害を低減しうる性能を有するキャリアであると考えられた。【０２１０】
［試験例５］血漿及び腫瘍ＡＵＣ比による組織内滞留性評価試験
培養癌細胞ヒトグリオーマＵ８７ＭＧ懸濁液を、注射針付シリンジを用いてヌードマウスの背側部皮下に移植した。実施例７、並びに比較例２、比較例３を５％ブドウ糖注射液で溶解し、比較例２を７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン換算量５２ｍｇ／ｋｇで、比較例３及び実施例７を７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン換算量４６．８ｍｇ／ｋｇでそれぞれ静脈内に単回投与した。
投与１、６及び２４時間後にマウスをイソフルラン麻酔下で採血し、血液を遠心後、血漿を回収した。採血後に安楽死させ、腫瘍を取り出し破砕した。ＨＰＬＣにより血漿及び腫瘍中のポリマー非結合７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンを測定し、１−２４時間のＡＵＣを台形近似法により算出した。この値を用い、腫瘍中ＡＵＣ１−２４（μｇ・ｈｒ/ｇ）と血漿中ＡＵＣ１−２４（μｇ・ｈｒ/ｍＬ）の比を算出した。結果を図１２に示す。【０２１１】
試験例５の結果、実施例７は比較例２及び比較例３と比較して約２倍の腫瘍中ＡＵＣ／血漿中ＡＵＣ値を示した。このことから、実施例７は比較例２及び比較例３と比較して、より選択的に内包化合物である７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンを腫瘍に送達でき、薬効増強及び毒性低減を期待できると考えられた。【０２１２】
［試験例６］フローサイトメトリーによる標的結合部位（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）含有組成物の標的結合能測定試験
標的結合部位としてＣｅｔｕｘｉｍａｂを有するブロック共重合体（Ａ）を含有する実施例１１と、標的結合部位を有さないブロック共重合体を含有する比較例７について、標的結合能を測定する試験を以下の手順で行った。
Ｃｏｓｔｅｒ  ２４  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１  ｗｅｌｌあたり１×１０５のＢｘＰＣ−３細胞を播種し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）培地を用いて一晩培養した。翌日、ＦＩＴＣ標識Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ１分子あたりＦＩＴＣ４．４分子結合）、並びに実施例１１及び比較例７を、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂとしてそれぞれ終濃度１０  μｇ／ｍＬとなるよう培地に添加し、１時間培養した。なお、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂを有さない比較例７は、ブロック共重合体Ｃとして実施例１１と等モルとなるよう添加した。
培養した後にｐｌａｔｅから細胞を回収し、４℃の１％ＦＢＳ含有ＰＢＳにより１回洗浄した。その後、４℃の１％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーター  ＳＨ８００（ＳＯＮＹ）でＦＩＴＣの輝度を測定した。結果を図１３に示した。【０２１３】
試験例６の結果、比較例７はＣｅｔｕｘｉｍａｂを添加していない細胞と同程度の輝度であり、ＦＩＴＣ標識Ｃｅｔｕｘｉｍａｂの標的結合阻害は認められなかった。一方で実施例１１はＣｅｔｕｘｉｍａｂを添加した細胞と同程度の輝度であり、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂと同程度のＦＩＴＣ標識Ｃｅｔｕｘｉｍａｂの標的結合阻害が認められた。以上のことから、標的結合部位としてＣｅｔｕｘｉｍａｂを有する組成物は、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂを外殻部分に露出して標的に対する結合能を有するミセル様会合体を形成していることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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