(57)【要約】【課題】ペリオスチンの容器への吸着を防止する方法を提供する。【解決手段】界面活性作用を有する物質よりなるペリオスチンの吸着防止剤、前記ペリオスチンの吸着防止剤を含有する、試料中のペリオスチン測定試薬、及び界面活性作用を有する物質の存在下で、ペリオスチンを含有する試料を容器と接触させることによる、ペリオスチンの吸着防止方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面活性作用を有する物質よりなるペリオスチンの吸着防止剤。
【請求項２】
界面活性作用を有する物質が、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤から選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、請求項１記載のペリオスチンの吸着防止剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のペリオスチンの吸着防止剤を含有する、試料中のペリオスチン測定試薬。
【請求項４】
界面活性作用を有する物質の存在下で、ペリオスチンを含有する試料を容器と接触させることによる、ペリオスチンの吸着防止方法。
【請求項５】
界面活性作用を有する物質が、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤から選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、請求項４記載のペリオスチンの吸着防止方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペリオスチンの吸着防止剤及び吸着防止方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ペリオスチンは、Ｆａｓｃｉｃｌｉｎファミリーに属する分子量約９万のマトリセルラータンパク質と呼ばれる細胞外マトリックスタンパク質の一種であり、そのＮ末端側からＣ末端側にかけて順に、システイン残基に富むＥＭＩ領域、４つのｆａｓｃｉｃｌｉｎ  Ｉ（ＦＡＳ１）領域よりなるものである。【０００３】
ペリオスチンは、当初、骨芽細胞で発現しているタンパク質として同定され、Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆａｃｔｏｒ ２（ＯＳＦ２）と呼ばれたが（特許文献１、非特許文献１）、その後、骨膜や歯根膜靭帯に高頻度で発現していることから、ペリオスチンと呼ばれるようになった。【０００４】
また、ペリオスチンは、Ｔｈ２型サイトカインであるＩＬ−４／ＩＬ−１３によってその発現が誘導されることから、Ｔｈ２型アレルギー状態の指標となることや、種々の線維化を伴う疾患でも発現が上昇していることが明らかにされている。  
このペリオスチンは、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、全身性強皮症、胆管細胞癌、糖尿病性網膜症などで血中濃度が上昇することが報告されており、さらに近年では、喘息患者に対する分子標的薬の治療効果予測因子として注目されている。【０００５】
また、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定がアレルギー性疾患の検査方法として有用であるとして、アレルギー疾患の検査方法の発明が報告されている（特許文献２及び非特許文献２参照。）。
さらに、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定が特発性間質性肺炎の検査方法としても有用であることが報告されている（特許文献１参照。）。【０００６】
なお、他に、ＯＳＦ２（ペリオスチン）に対するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びこれらの抗体を用いる診断方法等が開示され（特許文献３参照。）、Ｏｓｆ２／Ｃｂｆａ１と命名される新規造骨細胞特異的転写因子を測定するのに抗ＯＳＦ２（ペリオスチン）抗体を用いた免疫測定法が開示され（特許文献４参照。）、ヒトペリオスチンに対して特異的に結合する精製抗体及びこの抗体を用いる乳癌の骨への転移等を調べる診断アッセイ法等が開示され（特許文献５参照。）、そして、抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体及びこの抗体を用いるペリオスチンの定量方法等が開示されている（特許文献６参照。）。【０００７】
このように、ペリオスチンは種々の疾患の検査に有用とされている。しかしながら、このペリオスチンはプラスチック等の容器に吸着しやすいという性質を有しており、ペリオスチンがプラスチック等を使用した容器に吸着してしまうことによって、正確な測定値が得られないという問題点が本発明者により確認された。
例えば、試料中のペリオスチンを抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用して測定する場合、試料中のペリオスチンが測定容器や測定器具等に吸着してしまうことにより、正確な測定値を得られないという問題があった。
また、ペリオスチンの正確な測定値を得るためには、標準液を使用することが必要であり、ペリオスチンの測定に際しては既知濃度のペリオスチン含有溶液をペリオスチン標準液として用いる場合が多い。また、この場合、ペリオスチン標準液は水溶液という形態で供される。
しかしながら、前述したようにペリオスチンはプラスチック等の容器に吸着しやすいという性質を有するため、保存中にペリオスチンが容器に吸着してしまうことが確認された。このため、このようなペリオスチン含有溶液を標準液として使用した場合、ペリオスチンの正確な測定値を得られないという問題があった。【０００８】
さらに、ペリオスチンを血清や培養液等から精製する場合、精製に用いる容器にペリオスチンが吸着してしまい、ペリオスチンの収率が低下してしまうという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平５−２６８９８２号公報
【特許文献２】国際公開第０２／０５２００６号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０９／１４８１８４号パンフレット
【特許文献４】特表２００２−５０２２５０号公報
【特許文献５】特表２００５−５０００５９号公報
【特許文献６】国際公開第０７／０７７９３４号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓ．Ｔａｋｅｓｈｉｔａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ ．Ｊ．，２９４巻，２７１〜２７８頁，１９９３年発行
【非特許文献２】Ｇ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１８巻，９８〜１０４頁，２００６年発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明の課題は、ペリオスチンの容器への吸着を防止する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、界面活性作用を有する物質を用いることにより、ペリオスチンの容器への吸着を防止できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
（１）  界面活性作用を有する物質よりなるペリオスチンの吸着防止剤。
（２）  界面活性作用を有する物質が、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤から選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、前記（１）記載のペリオスチンの吸着防止剤。
（３）  前記（１）又は（２）記載のペリオスチンの吸着防止剤を含有する、試料中のペリオスチン測定試薬。
（４）  界面活性作用を有する物質の存在下で、ペリオスチンを含有する試料を容器と接触させることによる、ペリオスチンの吸着防止方法。
（５）  界面活性作用を有する物質が、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤から選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、前記（４）記載のペリオスチンの吸着防止方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、界面活性作用を有する物質をペリオスチンと接触させることにより、ペリオスチンの容器への吸着を防止することができ、誤差のない正確な測定結果が得られるものであり、その結果として、健常者や他の疾患の罹患者との鑑別を向上させ、診断を誤らせることを防ぐことができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の吸着防止剤を用いて、試料中のペリオスチンの測定を行った結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明はこの実施の形態に限定されるものではない。また、本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施することができる。
【００１７】
〔１〕ペリオスチンの吸着防止剤
本発明のペリオスチンの吸着防止剤は、界面活性作用を有する物質からなるものである。
【００１８】
〔２〕界面活性作用を有する物質
本発明において、界面活性作用を有する物質における界面活性作用とは、二つの相が接するとき、その界面に一つ又は二つの相に溶けている物質が強く吸着し界面張力を低下させる作用のことである。
本発明における界面活性作用を有する物質は、界面活性作用を有する物質であれば、特に制限なく用いることができる。この界面活性作用を有する物質は、その分子内に親水性原子団と疎水性原子団を持つ両親媒性物質が代表的なものである。
【００１９】
この界面活性作用を有する物質としては、例えば、界面活性剤等の界面活性作用を有することが知られている物質を挙げることができる。ここで、界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤等を挙げることができる。
【００２０】
（１） 非イオン性界面活性剤
本発明において非イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−アルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン−脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルアミド、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油又はポリオキシエチレンラノリンなど。
【００２１】
なお、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレンの直鎖アルキルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンオクチルエーテル、ポリオキシエチレンノニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、若しくはポリオキシエチレンベヘニルエーテル）、又はポリオキシエチレンの分岐鎖アルキルエーテル等を挙げることができる。
【００２２】
また、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレンの直鎖アルキルフェニルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル〔４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール［商品名：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００］、ポリオキシエチレン（４０）イソオクチルフェニルエーテル［商品名：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５］等〕、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルフェニルエーテル、若しくはポリオキシエチレンステアリルフェニルエーテル）、又はポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキルフェニルエーテル等を挙げることができる。
【００２３】
また、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン−脂肪酸エステルとしては、例えば、ポリオキシエチレンの直鎖脂肪酸エステル（例えば、ラウリン酸ポリオキシエチレン、ステアリン酸ポリオキシエチレン、オレイン酸ポリオキシエチレン、若しくはヤシ油脂肪酸ポリオキシエチレン）、ポリオキシエチレンの分岐鎖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンの直鎖アルキル置換安息香酸エステル（例えば、オクチル安息香酸ポリオキシエチレン、ノニル安息香酸ポリオキシエチレン、ラウリル安息香酸ポリオキシエチレン、若しくはステアリル安息香酸ポリオキシエチレン）、又はポリオキシエチレンの分岐鎖アルキル置換安息香酸エステル等を挙げることができる。
【００２４】
（２）陰イオン性界面活性剤
本発明において陰イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
硫酸エステル塩、スルホン酸塩、脂肪酸塩、リン酸エステル塩又はアミノ酸型界面活性剤など。
【００２５】
なお、陰イオン性界面活性剤である硫酸エステル塩としては、例えば、アルキル硫酸エステル塩又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩等を挙げることができる。
そして、このアルキル硫酸エステル塩としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ドデシル硫酸ナトリウム）、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキル硫酸エステル−トリエタノールアミン塩又は２−エチルヘキシル−硫酸エステルナトリウム塩等を挙げることができる。
また、このポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩としては、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸トリエタノールアミン等を挙げることができる。
【００２６】
なお、陰イオン性界面活性剤であるスルホン酸塩としては、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル塩、α−オレフィンスルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩又はその他のスルホン酸塩等を挙げることができる。
そして、このアルキルベンゼンスルホン酸塩としては、例えば、直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸、直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸又はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等を挙げることができる。
また、ジアルキルスルホコハク酸塩としては、例えば、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム又はジ２−エチルヘキシル−スルホコハク酸ナトリウム等を挙げることができる。
また、その他のスルホン酸塩としては、例えば、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム又はアルカンスルホン酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００２７】
なお、陰イオン性界面活性剤である脂肪酸塩としては、例えば、アルキルエーテルカルボン酸塩等を挙げることができる。
【００２８】
なお、陰イオン性界面活性剤であるアミノ酸型界面活性剤としては、例えば、アシル−Ｎ−メチルタウリン、脂肪酸メチルタウリン酸ナトリウム、Ｎ−ココイルメチルタウリン酸−ナトリウム塩、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルタウリン酸−ナトリウム塩、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチル−β−アラニンナトリウム塩、 Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチル−β−アラニントリエタノールアミン塩、α−スルホ脂肪酸メチル−エステルナトリウム塩、脂肪酸アミドエーテル硫酸−エステルナトリウム塩、Ｎ−オレイル−Ｎ−メチルグリシン又はＮ−ラウロイル−Ｎ−メチルグリシン−ナトリウム塩等を挙げることができる。
【００２９】
（３）陽イオン性界面活性剤
本発明において陽イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
モノアルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、又はトリアルキルアミン塩などの脂肪族化合物アミン塩；テトラアルキルアンモニウム塩、又は塩化ステアリルトリメチルアンモニウムなどの脂肪族化合物第四級アンモニウム塩；又はトリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、若しくはＮ，Ｎ−ジアルキルモルホリニウム塩などの環状化合物第四級アンモニウム塩；ポリエチレンポリアミン脂肪族アミド塩、ポリエチレンポリアミン脂肪族アミドの尿素縮合物の塩、又はポリエチレンポリアミン脂肪族アミド尿素縮合物の第四級アンモニウム塩などのポリエチレンポリアミン誘導体。
【００３０】
（４）両性界面活性剤
本発明において両性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
カルボキシベタイン型両性界面活性剤、グリシン型両性界面活性剤、アミンオキシド型両性界面活性剤若しくは２−アルキルイミダゾリンの誘導型両性界面活性剤など。
【００３１】
なお、両性界面活性剤であるカルボキシベタイン型両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン又は脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酸ベタイン等を挙げることができる。
そして、このアルキルジメチルアミノ酢酸ベタインとしては、例えば、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン等を挙げることができる。
【００３２】
また、グリシン型両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジアミノエチルグリシン又はジアルキルジアミノエチルグリシン等を挙げることができる。
【００３３】
また、アミンオキシド型両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジメチルアミンオキシド等を挙げることができる。
【００３４】
また、２−アルキルイミダゾリンの誘導型両性界面活性剤としては、例えば、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等を挙げることができる。
【００３５】
本発明のペリオスチンの吸着防止剤においては、１種類の界面活性作用を有する物質だけを用いてもよく、又は２種類以上の界面活性作用を有する物質を組み合わせて用いてもよい。
【００３６】
なお、前記の各界面活性剤は、日油株式会社（日本国）、花王株式会社（日本国）、日光ケミカルズ株式会社（日本国）又は和光純薬工業株式会社（日本国）等より市販されている。
【００３７】
〔３〕界面活性作用を有する物質の濃度
本発明におけるペリオスチンの測定容器への吸着防止は、界面活性作用を有する物質をペリオスチンと接触させることにより達成することができる。
【００３８】
これは、例えば、界面活性作用を有する物質を含有する溶液を、ペリオスチンに接触させることにより、界面活性作用を有する物質とペリオスチンとの接触を行うことができる。
【００３９】
すなわち、本発明のペリオスチンの吸着防止剤は、界面活性作用を有する物質を含有する水溶液等の溶液であってもよく、好適である。
【００４０】
この際の、溶液中の界面活性作用を有する物質の濃度は、特に限定されないが、通常、０．０００１％（ｗ／ｖ）以上の濃度とすることが好ましく、０．００１％（ｗ／ｖ）以上の濃度とすることがより好ましく、そして、０．００４％（ｗ／ｖ）以上の濃度とすることが特に好ましい。
【００４１】
なお、この濃度の上限は特にはないが、コスト等のことを考えると、５％（ｗ／ｖ）以下の濃度とすることが好ましく、０．５％（ｗ／ｖ）以下の濃度とすることがより好ましく、０．１％（ｗ／ｖ）以下の濃度とすることが更に好ましく、０．０１％（ｗ／ｖ）以下の濃度とすることが特に好ましい。
【００４２】
〔４〕その他の構成成分
本発明のペリオスチンの吸着防止剤には、界面活性作用を有する物質とともに他の物質を必要に応じて適宜含有させてもよい。この他の物質としては、例えば、塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清、正常マウス血清、正常ウシ血清、若しくは正常ウマ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウム又は抗生物質などの各種防腐剤等を挙げることができるが、これらに限定されない。
これらをペリオスチンの吸着防止剤に存在させる際の濃度は、特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【００４３】
また、本発明のペリオスチンの吸着防止剤には、界面活性作用を有する物質とともに緩衝剤を共存させてもよい。
この緩衝剤としては、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、リン酸、リン酸塩、リン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）、ホウ酸、ホウ酸塩、グリシン、グリシルグリシン、イミダゾール、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕等を挙げることができる。
この緩衝剤をペリオスチンの吸着防止剤に存在させる際の濃度は、特に限定されるものではないが、１〜２０００ｍＭが好ましく、特に５〜１０００ｍＭが好ましい。  
【００４４】
〔５〕ペリオスチンの吸着防止剤の使用
本発明のペリオスチンの吸着防止剤は、ペリオスチンを含有する溶液に添加して使用することができる。ここで、ペリオスチンを含有する溶液としては、例えば、生体試料や、試料中のペリオスチンの測定に使用するためのペリオスチン標準液等を挙げることができる。
なお、生体試料としては、血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、涙液、鼻汁、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、糞便、腹水若しくは羊水などの体液；あるいは血管若しくは肝臓などの臓器、組織又は細胞などの抽出液等、ペリオスチンが含まれる可能性のある試料を挙げることができる。
【００４５】
また、本発明のペリオスチンの吸着防止剤は、公知のペリオスチン測定方法のいずれにも好適に使用することができる。すなわち、本発明のペリオスチンの吸着防止剤を前記したペリオスチンを含有する溶液に添加して使用すると、ペリオスチンの測定容器への吸着を防止することができ、誤差のない正確な測定結果を得ることができる。  
なお、前記のペリオスチン標準液に本発明のペリオスチン吸着防止剤を含有させると、標準液中のペリオスチンを正確に測定できるため、ペリオスチンの測定に必要な検量線を正確に作成することができる。
また、ペリオスチンを血清や培養液等から精製する場合には、精製操作時に本発明のペリオスチンの吸着防止剤を共存させることで、精製に用いる容器にペリオスチンが吸着するのを防止することができる。さらに、精製後のペリオスチン容器にも、本発明のペリオスチンの吸着防止剤を共存させておくことで、保存中の容器にペリオスチンが吸着するのを防止することができる。
【００４６】
なお、本発明のペリオスチンの吸着防止剤は、そのもの単独にて、販売することができる。
また、本発明のペリオスチンの吸着防止剤は、他の試薬と組み合わせて、販売し、  又は試料に含まれるペリオスチンの測定に使用することもできる。
【００４７】
〔６〕ペリオスチンの測定方法
ここで、試料中のペリオスチンの測定方法としては、抗ペリオスチン抗体と試料に含まれるペリオスチンとの抗原抗体反応を利用した測定方法であれば、特にその測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
【００４８】
この試料に含まれるペリオスチンを抗ペリオスチン抗体との抗原抗体反応を利用して測定する測定方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；国際公開第９８／２３９６３号パンフレット）等を挙げることができる。
【００４９】
そして、ペリオスチンの測定には、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法をも、適用することができる。
また、ペリオスチンの測定は、用手法により行ってもよく、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【００５０】
また、測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。
なお、いずれのペリオスチン測定方法の測定原理（測定法）に基づいて実施するにしても、その測定原理（測定法）の公知の手法に従って、測定を行えばよい。
【００５１】
（１）抗ペリオスチン抗体
前記した抗ペリオスチン抗体は、ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体であれば特に限定はない。
この抗ペリオスチン抗体としては、例えば、ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清、抗体の断片〔Ｆａｂ及びＦ(ａｂ’)２など〕、又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等を挙げることができる。
なお、この抗ペリオスチン抗体は、遺伝子組み換え技術等により免疫原を免疫する動物とは異なる動物種のアミノ酸配列に変化させた抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体等）であってもよい。
そして、抗ペリオスチン抗体としては、モノクローナル抗体であることが好ましい。
また、本発明においては、２種以上の、抗ペリオスチン抗体を用いてもよい。
【００５２】
（２）免疫原
抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原としては、ペリオスチンの全部又は一部を用いることができる。
すなわち、ヒト又はウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス若しくはラットなどの哺乳動物又はニワトリなどの鳥類等由来のペリオスチン、又は遺伝子組み換え操作により得たペリオスチン等のペリオスチンの全部又は一部を用いることができる。
【００５３】
前記のペリオスチンの全部又は一部を免疫原とすることにより、抗ペリオスチン抗体を取得することができる。
なお、この抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原は、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等であってもよい。
【００５４】
また、抗体は、３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を認識できるとの報告（Ｆ．Ｈｕｄｅｃｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４７巻，２０１〜２１０頁，１９９２年発行）がある。
よって、抗ペリオスチン抗体の免疫原のアミノ酸配列の最小単位としては、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列の内、連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を考えることができるので、これらの連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列からなるトリペプチド、又はこれに他のアミノ酸若しくはペプチドが付加したもの等を、抗ペリオスチン抗体の免疫原の最小単位として考えることができる。
【００５５】
前記の免疫原としての、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等、又はペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等は、ヒト等の体液、細胞、組織もしくは臓器等より、公知の方法等により抽出、精製等して、取得することができる。
【００５６】
なお、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を取得する方法としては特に限定はなく、如何なる方法によるものでもよく、例えば、公知の方法により取得することができる。
【００５７】
例えば、ヒトのペリオスチンを取得する方法として、次の方法（“Ｇ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１８巻，１号，７１３〜７２３頁，２００６年発行”）等を挙げることができる。
（ａ）まず、ペリオスチン（ポリヌクレオチドの塩基配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒＤ１３６６６（配列番号１）；アミノ酸配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒＢＡＡ０２８３７（配列番号２））にＶ５／Ｈｉｓタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるＳ２細胞において発現させた上で精製する。
【００５８】
（ｂ）すなわち、具体的には、Ｓ２細胞の形質転換体は次のように調製する。
ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）にペリオスチンの上記部分をコードするｃＤＮＡを挿入して、これをｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｖ５−ＨｉｓＡとする。
Ｓ２細胞にｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｖ５−ＨｉｓＡ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるｐＡｃＨｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を公知の方法で共導入し、形質転換させる。
ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得る。
そして、Ｓ２細胞の形質転換体では、カルボキシ末端にＶ５エピトープ／Ｈｉｓタグの結合したペリオスチンを発現させる。
【００５９】
（ｃ）Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行う。
ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導する。
これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌される。
この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国Ｈｉｌｄｅｎ）と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させる。
レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出させる。
溶出されたＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をＰＢＳ等に透析し、精製されたヒトのペリオスチンタンパク質を取得する。
【００６０】
また、ヒトのペリオスチンは、次の方法によっても取得することができる。
すなわち、ペリオスチンのｃＤＮＡを、ＧＥＸ−ＫＧベクター（“ＫＬ．Ｇｕａｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９２巻，２６２〜２６７頁，１９９１年発行”）に組み込んで、大腸菌ＢＬ２１にトランスフェクションする。
これをアンピシリン入りＬＢ培地にて培養し、菌体よりグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）により、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を付加したペリオスチンを精製する。
これにトロンビンにてＧＳＴを切断し、ＧＳＴを付加しないペリオスチンを取得する。
これをブラッドフォード法にて定量して、その量（濃度）が明確となったヒトのペリオスチンを取得することができる。
【００６１】
更に、ヒトのペリオスチンは、例えば、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４６巻，５号，７１３〜７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等によっても取得することができる。ヒトのペリオスチンのアミノ酸配列は、前記の通り配列番号２で表し、当該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は配列番号１で表す。
【００６２】
なお、ヒトのペリオスチンのＥＭＩ領域は、例えば、“Ｉ．Ｋｉｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５巻，３号，２０２８〜２０３９頁，２０１０年発行”、又は“Ｔ．Ｍａｒｕｈａｓｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５巻，１７号，１３２９４〜１３３０３頁，２０１０年発行”などに記載された方法等により取得することができる。ヒトのペリオスチンのＥＭＩ領域のアミノ酸配列は配列番号４で表し、当該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は配列番号３で表す。
【００６３】
また、ヒトのペリオスチンのＲ１領域、Ｒ２領域又はＲ３領域はそれぞれ、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１４６巻，５号，７１３〜７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等により取得することができる。ヒトのペリオスチンのＲ１領域、Ｒ２領域及びＲ３領域のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号６、８及び１０で表し、当該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ、配列番号５、７及び９で表す。
【００６４】
また、ヒトのペリオスチンのＲ４領域及びＣ末端領域のアミノ酸配列はそれぞれ、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１４６巻，５号，７１３〜７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等により取得することができる。ヒトのペリオスチンのＲ４領域及びＣ末端領域のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１２及び１４で表し、当該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ、配列番号１１及び１３で表す。
【００６５】
なお、前記の免疫原は、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、更にペプチド自動合成装置を用いてもよく、日本生化学会編「生化学実験講座１  タンパク質の化学ＩＶ」，東京化学同人，１９７５年、泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，１９８５年、日本生化学会編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学  下」，東京化学同人，１９８７年等に記載された方法に従い合成することができ、前記のアミノ酸配列に、欠失、置換、挿入又は付加を施した変異体を作製することも容易である。
また、非天然型アミノ酸の導入、各アミノ酸残基の化学修飾やシステイン残基を導入することにより分子内を環化させて構造を安定化させる等の修飾を施してもよい。
【００６６】
更に、前記の免疫原は、対応する核酸塩基配列を持つＤＮＡ又はＲＮＡより遺伝子工学技術を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法Ｉ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩＩ」，東京化学同人，１９８７年等を参照して調製すればよい。
【００６７】
ところで、免疫原が低分子物質の場合には、免疫原に担体（キャリア）を結合させたものを動物等に免疫するのが一般的ではあるが、アミノ酸数５のペプチドを免疫原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報告（木山ら，「日本薬学会第１１２回年会講演要旨集３」，１２２頁，１９９２年発行）もあるので、担体を使用することは必須ではない。
【００６８】
なお、抗体を産生させる際に担体（キャリア）を使用する場合の担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。
【００６９】
免疫原と担体の結合法は、グルタルアルデヒド法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ベンジジン法又はＮ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法等の公知の結合法を用いることができる。
また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に免疫原を吸着させたものを免疫原とすることもできる。
【００７０】
（３）ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の調製方法
ペリオスチンに特異的に結合することができるポリクローナル抗体、すなわち、ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、以下の操作により調製することができる。
【００７１】
このポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の産生用の免疫原としては、前記の免疫原を用いることができる。
【００７２】
前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体（キャリア）の結合物を、哺乳動物（マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ロバ、若しくはラクダなど）又は鳥類（ニワトリ、アヒル、若しくはダチョウなど）等に免疫する。
【００７３】
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫する免疫動物としては、その体内でのペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた、すなわちペリオスチンの生産に関わる遺伝子をノックアウトした動物がより好ましい。
【００７４】
その理由は、その動物の体内で生産されたペリオスチンが、ペリオスチンなどの免疫原等の免疫により体内に産生した抗ペリオスチン抗体と結合してしまうことにより、抗ペリオスチン抗体の抗体活性が低下してしまう可能性が、前記のノックアウト動物においては低いからである。
また、前記のノックアウト動物においては、その動物の体内でペリオスチンが生産されないため、免疫されたペリオスチンを異物と認識し易く、よって抗体の産生が高くなるためである。
【００７５】
このペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた動物としては、例えば、ペリオスチンについてのノックアウトマウス（“Ｈ．Ｒｉｏｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５巻，２４号，１１１３１〜１１１４４頁，２００５年発行”）等を挙げることができる。
【００７６】
ところで、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫原、担体、免疫動物の種類、免疫注射部位等により決められるものであるが、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記免疫原、又は前記免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。
【００７７】
なお、この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントと添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、化学合成アジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知のものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
【００７８】
初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては、２〜６回が一般的である。
この場合も、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して抗体を含む抗血清を得る。
【００７９】
この抗血清を、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。
【００８０】
以上の操作により、ペリオスチンに結合することができるポリクローナル抗体（ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体）を得ることができる。
【００８１】
ところで、免疫原と担体の結合物を用いて動物等に免疫した場合には、得られたポリクローナル抗体中に、この担体に対する抗体が存在するので、このような担体に対する抗体の除去処理を行うことが好ましい。
【００８２】
この除去処理方法としては、担体を、得られたポリクローナル抗体の溶液中に添加して生成した凝集物を取り除くか、担体を不溶化固相に固定化してアフィニティークロマトグラフィーにより除去する方法等を用いることができる。
【００８３】
（４）モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の調製方法
ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体、すなわち、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、以下の操作により調製することができる。
【００８４】
このモノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年発行）によるハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。
【００８５】
更に、抗体遺伝子のｃＤＮＡライブラリーから、マカフェティーらのファージディスプレイ法（Ｍ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８巻，５５２〜５５４頁，１９９０年発行）を用いてモノクローナル抗体を作製することも可能である。
【００８６】
なお、例えば、細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、下記の操作により行うことができる。
【００８７】
（ａ）まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を、哺乳動物（マウス、ハムスター、ラット、又はラビットなど、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリなど）等に免疫する。
【００８８】
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫する免疫動物としては、その体内でのペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた、すなわちペリオスチンの生産に関わる遺伝子をノックアウトした動物がより好ましい。
【００８９】
その理由は、その動物の体内で生産されたペリオスチンが、ペリオスチンなどの免疫原等の免疫により体内に産生した抗ペリオスチン抗体と結合してしまうことにより、抗ペリオスチン抗体の抗体活性が低下してしまう可能性が、前記のノックアウト動物においては低いからである。
また、前記のノックアウト動物においては、その動物の体内でペリオスチンが生産されないため、免疫されたペリオスチンを異物と認識し易く、よって抗体の産生が高くなるためである。
【００９０】
このペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた動物としては、例えば、ペリオスチンについてのノックアウトマウス（“Ｈ．Ｒｉｏｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２５巻，２４号，１１１３１〜１１１４４頁，２００５年発行”）等を挙げることができる。
【００９１】
ところで、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。
【００９２】
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、化学合成アジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内、足蹠又は背部等の部位に行えばよい。
【００９３】
（ｂ）初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内、足蹠又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては２〜６回が一般的である。
この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
【００９４】
（ｃ）初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。
【００９５】
（ｄ）この最終免疫の３〜５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
【００９６】
（ｅ）この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物等（マウス、ヌードマウス、ラットなど）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク〔ＪＣＲＢ〕９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ  ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ  ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ  ００２９）等を用いることができる。
【００９７】
細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソームもしくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。
ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞との融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
【００９８】
（ｆ）このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、ヒト又はウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ラット若しくはニワトリなどの動物等（例えば、ヒトのペリオスチンの測定に用いる場合にはヒト由来のものが好ましく、ウシのペリオスチンの測定に用いる場合にはウシ由来のものが好ましく、イヌのペリオスチンの測定に用いる場合にはイヌ由来のものが好ましい）のペリオスチンの全部又は一部よりなるタンパク質又はペプチド等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などの免疫学的測定法等により測定することにより、「ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体（モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体）」を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【００９９】
（ｇ）このハイブリドーマ選択方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の産生細胞株を単離して得ることができる。
【０１００】
（ｈ）このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。
また、このモノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることもできる。
【０１０１】
（ｉ）このようにして得られた、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製された、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることができる。
【０１０２】
（ｊ）なお、前記（６）の通り、得られたハイブリドーマの培養上清を、ヒト又はイヌ等の動物のペリオスチンの全部又は一部よりなるタンパク質又はペプチド等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などの免疫学的測定法等により測定することにより、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【０１０３】
（ｋ）この「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」を産生するハイブリドーマより、前記（７）〜（９）のようにして、「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」を得ることができる。
【０１０４】
なお、得られた「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」は、ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体である。
【０１０５】
なお、ペリオスチンの測定方法において、例えば、ペリオスチン一分子に二分子の抗体を抗原抗体反応させる場合、これらの抗体のいずれもが抗ペリオスチン抗体である必要がある。
例えば、酵素標識抗体と固相化抗体を用いるＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法においては、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる酵素標識抗体及び固相化抗体のいずれもが、この抗ペリオスチン抗体である必要がある。
また、前記の抗ペリオスチン抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを同時に使用してもよい。
【０１０６】
（５）標識抗体を用いた免疫学的測定
本発明において、ペリオスチンの測定を、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる固相化抗体及び標識抗体のいずれの抗体もが抗ペリオスチン抗体である必要がある。
【０１０７】
測定の操作法は公知の方法等（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１  酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）等により行うことができる。
【０１０８】
例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体＝固相化抗体＝ペリオスチン＝標識抗体」の複合体を抗原抗体反応により形成させる。
【０１０９】
そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相化抗体＝ペリオスチン」を介して固相担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料に含まれていたペリオスチンの量（濃度）のみを測定することができる。
【０１１０】
具体的には、酵素免疫測定法の場合は、例えば抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度等を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量等を測定する。
そして、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量等を測定する。
【０１１１】
（６）凝集反応法による免疫学的測定
本発明において、ペリオスチンの測定を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定方法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法（凝集反応法）により実施する場合には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる抗体が抗ペリオスチン抗体である必要がある。
【０１１２】
測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と抗ペリオスチン抗体、又は試料と「固相担体に固定化させた抗ペリオスチン抗体」を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と「固相担体に固定化させた抗ペリオスチン抗体」を反応させ、凝集の状態を目視的に測定する。
なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
【０１１３】
測定の操作法の例を以下挙げる。
例えば、まず、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する測定試薬を調製し、準備する。
【０１１４】
次に、例えば、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」を含有する測定試薬と、試料とを混合し、これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」と試料とを接触させる。
【０１１５】
これにより、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」の「抗ペリオスチン抗体」と、試料に含まれていた「ペリオスチン」との、抗原抗体反応を行わせる。
【０１１６】
そして、これより生成した、「抗ペリオスチン抗体を固定化した固相担体」（抗ペリオスチン抗体＝固相担体＝抗ペリオスチン抗体）と「ペリオスチン」との複合体凝集物（…〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体＝固相担体＝抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体＝固相担体＝抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕…）を測定する。
【０１１７】
この生成した複合体凝集物の測定は、この複合体凝集物が存在する測定反応時の反応混合液の透過光又は散乱光などの吸光度等の測定を、エンドポイント法又はレート法等により行うことにより、実施する。
【０１１８】
そして、試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質（ペリオスチンの濃度が既知の試料）を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていたペリオスチンの濃度（定量値）を算出する。
【０１１９】
なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、透過光を測定しても、又は散乱光を測定してもよく、そして、１波長測定であっても、又は２波長測定（２つの波長による差又は比）であってもよい。
なお、測定波長は、３４０ｎｍから１，０００ｎｍの中から選ばれるのが一般的である。
【０１２０】
〔７〕ペリオスチンの吸着防止方法
本発明のペリオスチンの吸着防止方法は、界面活性作用を有する物質の存在下で、ペリオスチンを含有する試料を測定容器と接触させることにより、ペリオスチンの測定容器への吸着を防止することができるものである。
【０１２１】
なお、本発明のペリオスチンの吸着防止方法における界面活性作用を有する物質は、前記〔２〕に記載した通りである。
【０１２２】
また、本発明のペリオスチンの吸着防止方法における試料としては、血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、涙液、鼻汁、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、糞便、腹水若しくは羊水などの体液；あるいは血管若しくは肝臓などの臓器、組織又は細胞などの抽出液等、ペリオスチンが含まれる可能性のある生体試料等の試料であれば対象となる。
【０１２３】
さらに、本発明のペリオスチンの吸着防止方法において、容器としては、ペリオスチン測定のために使用される容器のことをいい、例えば、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、トレイ、セル等を挙げることができるが、これに限定されない。
また、本発明においては、容器がポリプロピレンやポリスチレン等のプラスチック、ガラス、又はステンレスからなるものであることが好ましい。
【実施例】
【０１２４】
以下、本発明を実施例等により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等により限定されるものではない。【０１２５】
〔実施例１〕（本発明の効果の確認）
ヒト血清中のペリオスチンの測定を行い、本発明のペリオスチン吸着抑制剤の効果を確かめた。【０１２６】
１．ペリオスチンの調製
ペリオスチン（ヌクレオチド配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒＤ１３６６６のヌクレオチド配列、アミノ酸配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒＢＡＡ０２８３７のアミノ酸配列）にＶ５／Ｈｉｓタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるＳ２細胞において発現させた上で精製した。【０１２７】
具体的には、Ｓ２細胞の形質転換体は次のように調製した。
ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にペリオスチンの上記部分をコードするｃＤＮＡを挿入して、これをｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｖ５−ＨｉｓＡとした。【０１２８】
次に、Ｓ２細胞にこのｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｖ５−ＨｉｓＡ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるｐＡｃＨｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を公知の方法で共導入し、形質転換した。【０１２９】
次に、ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得た。
そして、Ｓ２細胞の形質転換体では、カルボキシ末端にＶ５／Ｈｉｓタグの結合したペリオスチンを発現させた。【０１３０】
そして、このＣ末端に６個のヒスチジンが結合したＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行った。
まず、ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導した。
これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌された。【０１３１】
次に、この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕に透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ社）と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させた。
次に、レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出することにより、ペリオスチンを取得した。
なお、作成したプラスミドのＤＮＡの配列を確認し、組み込まれた配列が目的通りのものであることを確認した。【０１３２】
２．抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製
以下の手順により、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。【０１３３】
（１）前記１で調製したペリオスチン溶液１容量に対して、化学合成アジュバントとしてのＴｉｔｅｒ  Ｍａｘ  Ｇｏｌｄ（フナコシ社）を１容量の割合で混合した。【０１３４】
（２）次に、雌ラットの足蹠に免疫原として、１０〜５０μｇの前記のペリオスチン溶液とＴｉｔｅｒ  Ｍａｘ  Ｇｏｌｄとの混合物を皮下注射し、１０日〜２週間後、再度ラットの足蹠に免疫原として、１０〜５０μｇの前記のペリオスチン溶液とＴｉｔｅｒ  Ｍａｘ  Ｇｏｌｄとの混合物を皮下注射した。
なお、ここで、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット〔雌、６〜８週齢〕（日本チャールズリバー社）を用いた。【０１３５】
（３）最終免疫より３〜４日後に、免疫したラットの膝窩、鼠径、腸骨リンパ節内の細胞と、ミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ細胞）を１対１から１０対１の割合で混合し、一般的な方法でポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｒｏｃｈｅ社）を加えて細胞融合させ、生育したハイブリドーマコロニーを選別した。【０１３６】
具体的には、細胞融合は次のように行った。
混合した前記リンパ節細胞とミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ細胞）を遠心して上清を除き、室温でポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｒｏｃｈｅ社）１ｍＬに１分間かけて懸濁した後、３７℃で１分間撹拌した。
血清不含培地１ｍＬを１分間かけて加え、その後、血清不含培地１０ｍＬを１分間かけて加えた。
細胞を数回洗浄した後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン含有培地に懸濁して９６穴マイクロタイタープレートに分注して、３７℃において５％ＣＯ２存在下で培養した。【０１３７】
生育したモノクローナル抗体産生細胞株（融合細胞株）の選別の方法としては、細胞融合から７〜１４日後、免疫原に使用した前記のペリオスチンを固相化し、融合細胞培養上清を一次抗体としたＥＬＩＳＡ法の系にて行った。【０１３８】
このＥＬＩＳＡ法は具体的には、次のように行った。
１μｇ／ｍＬの前記のペリオスチンを９６穴マイクロタイタープレートに分注し、数時間固相化させた。
この固相化溶液を洗浄した後、融合細胞培養上清を各ウェルに加え、１時間室温にて静置した。【０１３９】
融合細胞培養上清を洗浄して、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を加え１時間室温に静置した。【０１４０】
この二次抗体を洗浄後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社）を加えて発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。【０１４１】
（４）この選別したモノクローナル抗体産生細胞株からＩｇＧを次のように精製した。
このモノクローナル抗体産生細胞株を、ＧＩＴ培地（日本製薬社）を用いてＣＯ２インキュベータ内３７℃で培養した。【０１４２】
培養後、上清中のＩｇＧをプロテインＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に結合させた。
結合させたＩｇＧを、５０ｍＭクエン酸水溶液（ｐＨ２．６）で溶出した。【０１４３】
溶出液４容量に対して、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕１容量を添加し、精製ＩｇＧとして、ラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体を前記のモノクローナル抗体産生細胞株より取得した。【０１４４】
４．ペリオスチン吸着抑制剤の調製
表１に記載した各界面活性剤０．１ｇをそれぞれ１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔ｐＨ７．５〕で溶解し、１７種類のペリオスチン吸着抑制剤の調製を行った。【０１４５】
５．試料の調製
１．５ｍＬ容のマイクロチューブ(Ｗａｔｓｏｎ社)に、上記のペリオスチン吸着抑制剤１ｍＬにペリオスチンが２０〜３０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、混和後ただちに混和液の５μＬを検体希釈液（カゼイン溶液）１ｍＬに添加したものを「分注回数０回試料」とした。【０１４６】
前記混和液の残り全量を別のマイクロチューブに移し、軽く混和後５μＬを検体希釈液（カゼイン溶液）１ｍＬに添加したものを「分注回数１回試料」とした。同様の操作をもう一度行ったものを「分注回数２回試料」とし、さらにもう一度行ったものを「分注回数３回試料」とした。【０１４７】
６．抗ペリオスチンモノクローナル抗体固相化プレートの調製
前記２で調製した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ社）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。【０１４８】
７．試料中のペリオスチンの測定
（１）前記５で調製した４種類の試料（分注回数０〜３回試料）を、前記６で調製した抗ペリオスチンモノクローナル抗体固相化プレートの各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを遮光・室温（約２５℃）で１８〜２４時間インキュベートした。【０１４９】
（２）次に、前記のウェルより、前記の試料を吸引して除去した。そして、このウェルを、４００μＬの洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水〔ｐＨ７．５〕）で５回洗浄した後、ペーパータオルなどを敷いた上に叩いて水分をできる限り除去した。【０１５０】
（３）次に、前記２で調製した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体」にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を結合させ標識したＰＯＤ標識抗ペリオスチンモノクローナル抗体を、０．５％のカゼイン及び１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）で５０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、その１００μＬを前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、遮光・室温（約２５℃）にて９０分間インキュベートし、反応を行わせた。【０１５１】
（４）その後、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルを前記の洗浄液で５回洗浄した後、ペーパータオルなどを敷いた上に叩いて水分をできる限り除去した。た。【０１５２】
（５）その後、なるべく早く、ＰＯＤの基質液〔０．８ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、２．５ｍＭの過酸化水素、及び３０ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．９）〕の１００μＬを前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて正確に１０分間静置し、反応を行わせ、発色させた。【０１５３】
（６）その後、前記（５）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．７Ｎ硫酸の１００μＬを注入し、前記の反応を停止させた。【０１５４】
（７）反応停止後、1時間以内にマイクロプレートリーダー〔６８０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定し測定し、キャリブレーターを用いた検量線からペリオスチン濃度を演算した。【０１５５】
８．測定結果
これらの測定結果を表１及び図１に示した。なお、表１において、各欄に示した値は、試料中のペリオスチン濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。また、（かっこ）内の数値は、分注回数０回試料のペリオスチン濃度を１００％とした時の分注回数１〜３回試料のペリオスチン濃度を相対比率（％）で表したものである。【０１５６】
【表１】
2018070397.tif 000002
【０１５７】
〔比較例〕
実施例１における、ペリオスチン吸着抑制剤を用いずに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のみを使用した以外は、実施例１と同様にしてペリオスチン吸着抑制の効果を確かめた。測定結果を表１及び図１に示した。【０１５８】
９．考察
表１から明らかなように、比較例のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のみを使用した場合は、分注回数の増加に従って、ペリオスチン濃度が徐々に低下していることが分かる。【０１５９】
これに対して、本発明のペリオスチン吸着抑制剤を使用した場合は、分注回数が増加しても、ペリオスチン濃度の低下が抑制されていることが分かる。【０１６０】
よって、本実施例における測定結果より、界面活性作用を有する物質をペリオスチンと接触させることにより、ペリオスチンの容器への吸着を防止することができることが確かめられた。すなわち、本発明のペリオスチンの吸着防止剤及び吸着防止方法によれば、誤差のない正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
【図１】
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【国際調査報告】
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