(57)【要約】  本発明の課題は、ヒト幹細胞を高い細胞生存率で保存することができる、ヒト幹細胞の保存液、ヒト幹細胞懸濁液およびヒト幹細胞の保存方法を提供することである。本発明によれば、ヒト幹細胞の保存液であって、少なくともヒト血清を含有し、保存液全体に対するヒト血清の体積比が０．７０以上であり、ヒト幹細胞を０℃より高い温度で保存するための保存液が提供される。
2018147457.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト幹細胞の保存液であって、少なくともヒト血清を含有し、保存液全体に対するヒト血清の体積比が０．７０以上であり、ヒト幹細胞を０℃より高い温度で保存するための保存液。
【請求項２】
ヒト血清が、血液凝固促進酵素をコートしたビーズを用いた血液分離操作により得られるヒト血清である、請求項１に記載の保存液。
【請求項３】
さらに、日本薬局方リンゲル液、ダルベッコ改変イーグル培地、アルファ最小必須培地およびアルファ改変イーグル培地から成る群より選ばれる少なくとも一以上を含む、請求項１または２に記載の保存液。
【請求項４】
ヒト幹細胞が、滑膜由来のヒト幹細胞である、請求項１から３のいずれか一項に記載の保存液。
【請求項５】
請求項１から４の何れか一項に記載の保存液と、前記保存液に懸濁されたヒト幹細胞とを含む、ヒト幹細胞懸濁液。
【請求項６】
ヒト幹細胞懸濁液が患者に直接投与される、請求項５に記載のヒト幹細胞懸濁液。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか一項に記載の保存液にヒト幹細胞を懸濁することにより得られるヒト幹細胞懸濁液を保存することを含む、ヒト幹細胞の保存方法。
【請求項８】
ヒト幹細胞懸濁液を４〜２０℃の温度で保存する、請求項７に記載の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血清を含むヒト幹細胞の保存液に関する。本発明はさらに、ヒト血清を含むヒト幹細胞懸濁液、およびヒト血清を用いるヒト幹細胞の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生きた細胞を患者へ移植して治療を行う再生医療が盛んになってきた。移植する細胞が治療効果を発揮するには、移植に用いる直前までその細胞の生存率を高く維持することが必要であり、そのため、細胞の活性を維持したまま保存する技術に関する研究が行われている。【０００３】
再生医療のうち、患者自身の細胞を用いる自家細胞治療においては、患者組織から分離および採取される幹細胞が頻用されている。患者より幹細胞を採取後に直ちに移植する一部の治療を除き、多くの自家細胞治療においては十分な治療効果を得るために必要な細胞数を確保するべく、細胞加工施設等で拡大培養が行われる。その後、必要な細胞数が得られ次第、患者へ移植するために医療機関へ輸送され、医療機関に到着後、直ちに患者へ移植される。そのため、幹細胞の保存は、輸送中および医療機関に到着してから移植が開始されるまでの短い時間となる。【０００４】
細胞を短時間保存する方法としては、凍結を行わずに懸濁状態で保存する方法が知られている。例えば、特許文献１には、少なくとも糖類と、ナトリウムイオンと、カリウムイオンと、炭酸水素イオンおよび／または炭酸イオンと、リン酸イオンを含有し、グリセロールを含有せず、カリウムイオンのモル濃度に対するナトリウムイオンのモル濃度の比、炭酸水素イオンおよび／または炭酸イオンの含有量、糖類の種類、浸透圧およびｐＨを規定した冷蔵保存用細胞保存液が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４９４７９４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記した通り、凍結を行わずに懸濁状態で保存する方法においては、多種の成分から成る細胞保存液が用いられている。保存液にて保存した細胞を患者に移植する際、これらの成分が細胞と共に患者体内へ投与されるため、毒性や抗原性を示さない成分を選択しなければならない。【０００７】
また、医療機関での移植に際しては、手術室等での清潔な環境にて細胞を取り扱うことから、可能な限り、移植前の作業数を少なくすることが清潔度を維持するためにも重要である。そのため、細胞保存液を除去することなく、移植を行うことができれば、高い清潔度を維持することに貢献できる。【０００８】
本発明は、ヒト幹細胞を高い細胞生存率で保存することができる、ヒト幹細胞の保存液、ヒト幹細胞懸濁液およびヒト幹細胞の保存方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、保存液が存在していても安全にヒト幹細胞を移植することを可能とするヒト幹細胞の保存液、ヒト幹細胞懸濁液およびヒト幹細胞の保存方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、少なくともヒト血清を含有し、保存液全体に対するヒト血清の体積比が０．７０以上である保存液をヒト幹細胞の保存液として使用することによって、ヒト幹細胞を、高い細胞生存率で保存できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【００１０】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  ヒト幹細胞の保存液であって、少なくともヒト血清を含有し、保存液全体に対するヒト血清の体積比が０．７０以上であり、ヒト幹細胞を０℃より高い温度で保存するための保存液。
（２）  ヒト血清が、血液凝固促進酵素をコートしたビーズを用いた血液分離操作により得られるヒト血清である、（１）に記載の保存液。
（３）  さらに、日本薬局方リンゲル液、ダルベッコ改変イーグル培地、アルファ最小必須培地およびアルファ改変イーグル培地から成る群より選ばれる少なくとも一以上を含む、（１）または（２）に記載の保存液。
（４）  ヒト幹細胞が、滑膜由来のヒト幹細胞である、（１）から（３）のいずれか一に記載の保存液。
（５）  （１）から（４）の何れか一に記載の保存液と、上記保存液に懸濁されたヒト幹細胞とを含む、ヒト幹細胞懸濁液。
（６）  ヒト幹細胞懸濁液が患者に直接投与される、（５）に記載のヒト幹細胞懸濁液。
（７）  （１）から（４）のいずれか一に記載の保存液にヒト幹細胞を懸濁することにより得られるヒト幹細胞懸濁液を保存することを含む、ヒト幹細胞の保存方法。
（８）  ヒト幹細胞懸濁液を４〜２０℃の温度で保存する、（７）に記載の保存方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の保存液、幹細胞懸濁液および保存方法によれば、ヒト幹細胞を高い細胞生存率で保存することができ、さらに本発明によれば、ヒト幹細胞の保存液を除去する操作なしに患者へ投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、細胞生存率を測定した結果を示す。
【図２】図２は、顕微鏡観察像を示す。
【図３】図３は、細胞生存率を測定した結果を示す。
【図４】図４は、クリスタルバイオレット染色像を示す
【図５】図５は、軟骨ペレットの外観を示す。
【図６】図６は、軟骨ペレットの組織学的評価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明のヒト幹細胞の保存液は、少なくともヒト血清を含有し、保存液全体に対するヒト血清の体積比が０．７０以上であり、ヒト幹細胞を０℃より高い温度で保存するための保存液である。
【００１４】
細胞の凍結保存のための細胞保存液に血清（ウシ胎児血清が頻用）を添加することは知られている。これに対し、本発明においては、ヒト幹細胞を０℃より高い温度で保存するという条件（即ち、細胞を凍結しない条件）においてヒト幹細胞を保存するために用いる保存液として、ウシ胎児血清ではなく、ヒト血清を用いることによって、ヒト幹細胞を高い細胞生存率で保存することができ、ヒト幹細胞の分化能を維持できることが示された。
【００１５】
なお、血清を添加した培地を用いて細胞を培養することも周知である。細胞培養が始まった頃には細胞と同種の血清がよいという理由からヒト細胞の培地にヒト血清を添加することも行われていたが、その後、ウシ胎児血清の方が良好な増殖を示すことなどから、ヒト血清は培地成分としてはあまり使用されていない（細胞培養なるほどＱ＆Ａ、第９２頁、２００４年、羊土社）。また、血清（ヒト血清、ウシ血清など）には、種々の細胞増殖促進物質、細胞障害保護因子および栄養因子などが含まれているが、上記以外にも細胞増殖阻害因子、分化促進因子および補体等が含まれており、これらの因子が細胞に障害を与えることも知られている（細胞培養なるほどＱ＆Ａ、第８８頁及び第９０頁、２００４年、羊土社）。上記のことからも、保存液にヒト血清を含み、さらに、保存液全体に対するヒト血清の体積比が高い（０．７０以上）保存液を用いてヒト幹細胞を保存した場合に、ヒト幹細胞を高い細胞生存率で保存することができ、かつヒト幹細胞の分化能を維持できたことは全く予想外な効果である。
【００１６】
本発明のヒト幹細胞の保存液は、再生医療分野において、細胞加工施設から移植を行う医療機関への輸送、並びに医療機関に到着してから移植が開始されるまでの短時間の幹細胞の保存を行う場合において、幹細胞の生存率を維持するための細胞保存液として利用可能である。また、本発明のヒト幹細胞の保存液によれば、細胞を移植する際に細胞保存液を除く作業を必要とせず、細胞保存液が存在していても移植が可能である。
【００１７】
幹細胞とは、分裂して自分と同じ細胞を作る能力（自己複製能）と、別の種類の細胞に分化する能力とを有し、際限なく増殖できる細胞である。
幹細胞としては、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する幹細胞、および多分化能  （ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する幹細胞を挙げることができる。
【００１８】
多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）とは、個体は形成しないが、三胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の細胞系列の全てに分化し得る能力を指す。多能性を有する幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）、核移植ＥＳ細胞（体細胞由来ＥＳ細胞とも言う。ｎｔＥＳ細胞：ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）などを挙げることができる。
【００１９】
多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）とは、分化可能な細胞系列が限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力を指す。多分化能を有する幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、および皮膚幹細胞などを挙げることができる。間葉系幹細胞は，骨髄、脂肪組織、歯髄、胎盤組織、さい帯組織、滑膜などの種々の組織から取得できることが知られている。
【００２０】
ヒト幹細胞としては、間葉系幹細胞が好ましい。
ヒト幹細胞としては、例えば、骨髄由来ヒト幹細胞、脂肪由来ヒト幹細胞、歯髄由来ヒト幹細胞、胎盤由来ヒト幹細胞、さい帯由来ヒト幹細胞および滑膜由来ヒト幹細胞が挙げられ、滑膜由来ヒト幹細胞が特に好ましい。
【００２１】
血清とは、血液が凝固した際に上澄みにできる淡黄色の液体成分であり、換言すれば血液（全血）を凝固させ凝固因子を除いたものである。血漿が凝固成分を含むのに対して、血清は凝固成分をほとんど含まないか、含んだとしても少量のものを指す。
【００２２】
ヒト血清としては、例えば、血液凝固促進酵素をコートしたビーズを用いた血液分離操作により得られるヒト血清を用いることができるが、ヒト血清の採取方法は特には限定されない。
【００２３】
血液分離操作としては、例えば、ヒトより採取した新鮮な血液を、血液凝固促進酵素がコートされたビーズと接触させながら室温にて３０〜６０分間振とうし、次いで、遠心分離により血餅と血清に分離、その後、血清を回収する一連の操作が挙げられる。ヒト血清の調製手段として、ヒトより採取した血液から血清調製専用血液成分分離バッグ（セルエイド（登録商標）、株式会社ジェイ・エム・エス）を用いて分離および調製した血清を用いることができるが、これに限定されない。
【００２４】
本発明の保存液においては、保存液全体に対するヒト血清の体積比が０．７０以上である。保存液全体に対するヒト血清の体積比を上記の通りにすることにより、良好な細胞生存率を達成することができる。
【００２５】
本発明の保存液は、ヒト幹細胞を０℃より高い温度で保存するための保存液である。即ち、本発明の保存液は、ヒト幹細胞を凍結しない状態で保存するための保存液である。保存する際の温度は、０℃より高ければ特に限定されないが、温度の上限は、一般的には５０℃以下である。温度の下限は、一般的には１℃以上である。保存する際の温度は、上記の中でも好ましくは４〜２０℃であり、より好ましくは４〜１５℃である。本発明においては、ヒト幹細胞を０℃より高い温度で保存することにより、良好な細胞生存率を達成することができる。
【００２６】
本発明の保存液は、ヒト血清のほかに、日本薬局方リンゲル液、ダルベッコ改変イーグル培地、アルファ最小必須培地およびアルファ改変イーグル培地から成る群より選ばれる少なくとも一以上を含んでいてもよい。
【００２７】
本発明の保存液にはさらに、例えば抗生物質、抗菌剤、抗酸化剤、ビタミン、タンパク質、アミノ酸、ｐＨ指示薬、キレート剤等を適宜含有させることもできる。
【００２８】
本発明によれば、上記した本発明の保存液と、上記保存液に懸濁されたヒト幹細胞とを含む、ヒト幹細胞懸濁液が提供される。
ヒト幹細胞を保存液に懸濁する方法は特に限定されず、常法により行うことができる。例えば、ヒト幹細胞と保存液とを混合して撹拌することによりヒト幹細胞懸濁液を得ることができる。
本発明のヒト幹細胞懸濁液は、再生医療などの医療用途に使用する場合、患者に直接投与することができる。本発明のヒト幹細胞懸濁液は保存液を除去することなく、患者に投与することができることは本発明の利点の一つである。
【００２９】
本発明のヒト幹細胞懸濁液における細胞の濃度は、細胞の種類、細胞の用途、細胞の大きさ、および保存期間等の条件に応じて適宜設定することができ、特に限定されないが、例えば、１．０×１０4〜１．０×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度であり、好ましくは１．０×１０5〜１．０×１０9ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度である。また、保存液に懸濁する際のヒト幹細胞は、継代した細胞でも継代していない細胞でもよく、継代した細胞である場合、継代数は特に限定されないが、例えば、１回（ｐａｓｓａｇｅ１）〜９回（ｐａｓｓａｇｅ９）、好ましくは１回（ｐａｓｓａｇｅ１）〜５回（ｐａｓｓａｇｅ５）、より好ましくは１回（ｐａｓｓａｇｅ１）〜３回（ｐａｓｓａｇｅ３）である。
【００３０】
本発明は、本発明の保存液を用いたヒト幹細胞の保存方法にも関する。即ち、本発明によればさらに、本発明の保存液にヒト幹細胞を懸濁することにより得られるヒト幹細胞懸濁液を保存することを含む、ヒト幹細胞の保存方法が提供される。
【００３１】
保存の方法としては、ヒト幹細胞懸濁液を凍結させない条件で保存することができる。保存する際の温度は、本明細書中において上記した通りであるが、０℃より高ければ特に限定されない。温度の上限は、一般的には５０℃以下であり、好ましくは４５℃以下であり、より好ましくは４０℃以下であり、さらに好ましくは３７℃以下であり、さらに好ましくは２０℃以下であり、特に好ましくは１５℃以下である。温度の下限は、一般的には１℃以上であり、好ましくは２℃以上であり、より好ましくは４℃以上である。保存する際の温度は、上記の中でも好ましくは４〜２０℃であり、より好ましくは４〜１５℃である。
【００３２】
本発明においてヒト幹細胞の保存期間は、特に限定されないが、一般的には、例えば５分〜１４日間である。
【００３３】
また保存容器は、細胞の種類、保存温度、保存期間、保存後の細胞の用途等を考慮して、適宜選択して用いることができる。保存容器としては、例えば、チューブ、フラスコ、輸液バッグ、細胞培養用バッグ、シリンジ等を用いることができる。
【００３４】
本発明の保存方法により保存したヒト幹細胞は、保存後において、高い生存率、コロニー形成能および分化能を有していることが好ましい。
細胞の生存率の測定方法は、特に限定されないが、例えば、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ（登録商標）ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｌｏｇｏｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、取扱説明書の記載の手順に従って生細胞数を求めることにより細胞の生存率を評価することができる。
【００３５】
本発明の保存方法により４℃に設定した恒温機内にて４８時間保存した場合において、細胞の生存率は好ましくは６０％以上である。
本発明の保存方法により１３℃に設定した恒温機内にて４８時間保存した場合において、細胞の生存率は好ましくは６０％以上である。
本発明の保存方法により３７℃に設定した恒温機内にて４８時間保存した場合において、細胞の生存率は好ましくは４０％以上である。
【００３６】
ヒト幹細胞がコロニー形成能を有しているかどうかの評価方法は特に限定されず、常法により評価することができる。例えば、培養ディッシュに保存後の細胞を播種し、適当な培地（例えば、抗生物質およびウシ胎児血清を含むα最小必須培地）において５％ＣＯ2雰囲気下で３７℃にて培養を所定の期間（例えば、１４日後）行い、１％クリスタルバイオレット液にて染色を行い、コロニーが形成されるかどうかを観察することにより、コロニー形成能を評価することができる。
【００３７】
ヒト幹細胞が分化能を有しているかどうかの評価方法は特に限定されず、常法により評価することができる。例えば、保存後の細胞をチューブへ移し、ＴＧＦ−β３（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β３）（終濃度：１０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｋ．Ｋ．社）およびＢＭＰ２（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２）（終濃度：１μｇ／ｍｌ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社）を含む軟骨分化培地にて培養する。培地は３〜４日毎に変え、培養開始２１日後に軟骨ペレットのトルイジンブルー染色像の観察によって組織学的評価を行うことにより、軟骨分化能を評価することができる。
【００３８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
＜ヒト血清の採取＞
新鮮な血液を３名の健常人ボランティアより採取し、血液成分分離バック（セルエイド（登録商標）、株式会社ジェイ・エム・エス）を用いて血清を分離および回収した。具体的には、採取した新鮮な血液を、血液凝固促進酵素がコートされたビーズと接触させながら室温にて３０分間振とうし、その後、遠心分離により血餅と血清に分離した。分離した血清は０．４５μｍのナイロン製フィルター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にてフィルターろ過し、その後、別の保存バックへ移した後、使用まで−２０℃にて保管した。【００４０】
セルエイド（登録商標）の使用方法は製造販売元が発行する添付文書（第1版、添付文書管理番号12890Z01）を参照した。【００４１】
＜滑膜由来ヒト幹細胞の調製＞
ヒト滑膜組織を１０名のドナーより採取した。採取した滑膜組織は３ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）に浸し、３７℃で３時間消化させた。その後、消化反応後液をセルストレイナー（孔径７０μｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社）に通し、滑膜細胞を得た。得られた滑膜細胞を、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（終濃度１％、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびウシ胎児血清（終濃度１０％）を含むα最小必須培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にて、５％ＣＯ2雰囲気下で３７℃にて培養を行った。細胞数はＬｕｎａ−ＦＬ（商品名）（Ｌｏｇｏｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にてカウントした。【００４２】
試験例１：細胞生存率に対する保存液の影響の確認
＜滑膜由来ヒト幹細胞の調製＞に記載の方法にて得た滑膜由来ヒト幹細胞（ｐａｓｓａｇｅ２）を、ＴｒｙｐＬＥ（商品名）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて回収した。２×１０6個の滑膜由来ヒト幹細胞を、＜ヒト血清の採取＞に記載の方法にて得たヒト血清１００μｌ（保存液１）、グルコース加酢酸リンゲル液（ＫＹＯＷＡ  ＣｒｉｔｉＣａｒｅ社）１００μｌ（保存液２）にそれぞれ懸濁し、細胞懸濁液を保存チューブ（住友ベークライト社）に入れ保存した。【００４３】
保存液１および保存液２の細胞生存率に対する影響を確認するため、各保存液に保存した細胞懸濁液を、４℃、１３℃、および３７℃にそれぞれ設定した恒温機内にて４８時間保存した。保存後の細胞の細胞生存率は、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ(登録商標)ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｌｏｇｏｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、取扱説明書の記載の手順に従って生細胞数を求め、保存前後の細胞生存率（％）を求めた。また、保存後の細胞形態を顕微鏡にて観察した。【００４４】
結果を図１（グラフ）、図２（写真）に示した。
図１に示す通り、保存液１のヒト血清にて保存した細胞の生存率は、保存液２のヒト血清を含まないリンゲル液に比べ、４℃、１３℃、および３７℃のいずれの温度条件においても生存率が高い結果となった。特に、３７℃では顕著な差が観察された。
図２に示す通り、保存前後の細胞の形態を観察した結果、いずれも形態には変化は見られなかった。また、図１の結果と同様、保存液２を用いて３７℃にて４８時間保存した場合では生細胞は観察されなかった。【００４５】
試験例２：ウシ血清を用いた保存液の影響の確認
＜滑膜由来ヒト幹細胞の調製＞に記載の方法にて得た滑膜由来ヒト幹細胞（ｐａｓｓａｇｅ２）を、ＴｒｙｐＬＥ（商品名）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて回収した。１×１０5個の滑膜由来ヒト幹細胞を、α最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ社）５００μｌ（保存液３）およびウシ胎児血清５００μｌ（保存液４）にそれぞれ懸濁し、細胞懸濁液を保存チューブ（住友ベークライト社）に入れ保存した。【００４６】
保存液３および保存液４の細胞生存率に対する影響を確認するため、各保存液に保存した細胞懸濁液を、１８℃に設定した恒温機内にて３日間保存した。保存後の細胞の細胞生存率は、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ（登録商標）ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｌｏｇｏｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、取扱説明書の記載の手順に従って生細胞数を求め、保存前後の細胞生存率（％）を求めた。【００４７】
結果を図３（グラフ）に示した。
保存液３は、保存液２（図１）の１３℃４８時間保存後の細胞生存率とほぼ同等の結果を示した。一方、保存液４のウシ胎児血清で保存した細胞の生存率は、保存液３に比べ、低値であった。
試験例１および試験例２の結果から、細胞保存液に用いる血清は、ヒト血清であることが重要であることが示された。【００４８】
試験例３：コロニー形成能に対する保存液の影響の確認
＜滑膜由来ヒト幹細胞の調製＞に記載の方法にて得た滑膜由来ヒト幹細胞（ｐａｓｓａｇｅ２）を、ＴｒｙｐＬＥ（商品名）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて回収した。２×１０6個の滑膜由来ヒト幹細胞を、＜ヒト血清の採取＞に記載の方法にて得たヒト血清１００μｌ（保存液１）、グルコース加酢酸リンゲル液（ＫＹＯＷＡ  ＣｒｉｔｉＣａｒｅ社）１００μｌ（保存液２）にそれぞれ懸濁し、細胞懸濁液を保存チューブ（住友ベークライト社）に入れ保存した。【００４９】
保存液１および保存液２のコロニー形成能に対する影響を確認するため、各保存液に保存した細胞懸濁液を、４℃、１３℃および３７℃にそれぞれ設定した恒温機内にて４８時間保存した。６０ｃｍ2の培養ディッシュに４８時間保存後の細胞を１×１０4個播種し、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（終濃度１％、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびウシ胎児血清（終濃度１０％）を含むα最小必須培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にて、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃にて培養を行った。播種１４日後、１％クリスタルバイオレット液にて染色を行い、形成されたコロニーを観察した。【００５０】
クリスタルバイオレット染色像を図４に示した。
保存液１のヒト血清中に保存したグループではいずれもコロニー形成が観察された。保存液２のグループでは３７℃にて４８時間保存したものはコロニーが観察されなかった。【００５１】
試験例４：軟骨分化能に対する保存液の影響の確認
＜滑膜由来ヒト幹細胞の調製＞に記載の方法にて得た滑膜由来ヒト幹細胞（ｐａｓｓａｇｅ２）を、ＴｒｙｐＬＥ（商品名）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて回収した。２×１０6個の滑膜由来ヒト幹細胞を、＜ヒト血清の採取＞に記載の方法にて得たヒト血清１００μｌ（保存液１）、グルコース加酢酸リンゲル液（ＫＹＯＷＡ  ＣｒｉｔｉＣａｒｅ社）１００μｌ（保存液２）にそれぞれ懸濁し、細胞懸濁液を保存チューブ（住友ベークライト社）に入れ保存した。【００５２】
保存液１および保存液２の軟骨分化能に対する影響を確認するため、各保存液に保存した細胞懸濁液を、４℃、１３℃および３７℃にそれぞれ設定した恒温機内にて４８時間保存した。【００５３】
２．５×１０5個の４８時間保存後の細胞を１５ｍｌチューブ（ＢＤ社）へ移し、ＴＧＦ−β３（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β３）（終濃度：１０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｋ．Ｋ．社）およびＢＭＰ２（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２）（終濃度：１μｇ／ｍｌ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社）を含む軟骨分化培地にて培養した。培地は３〜４日毎に変え、培養開始２１日後に軟骨ペレットのトルイジンブルー染色像の観察によって組織学的評価を行った。【００５４】
結果を図５（外観）および図６（組織学的観察像）に示した。
図５に示す通り、保存液１のヒト血清にて保存した細胞より作製した軟骨ペレットは、保存液２のヒト血清を含まないリンゲル液に比べ、その大きさに顕著な差が観察された。また、保存前の細胞から作製した軟骨ペレットと同様の大きさであった。このことから、保存液１を用いた保存では滑膜由来ヒト幹細胞の軟骨分化能が維持されることが示された。一方、３７℃での保存においては保存液の種類に拘わらず、軟骨ペレットの形成は見られなかった。【００５５】
図６に示す通り、保存液１のヒト血清にて保存した細胞より作製した軟骨ペレットは、保存液２のヒト血清を含まないリンゲル液に比べ、その染色像に顕著な差が観察された。トルイジンブルー染色は軟骨ペレットが産生する基質の程度を評価する方法であるが、この結果から、保存液１で保存した細胞は軟骨形成能に加え、基質産生能も維持することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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