(57)【要約】  多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体の凍結方法であって、（ｉ）多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体を凍結保護液に浸漬すること、および、（ｉｉ）凍結保護液に浸漬した前記凝集体を凍結すること、  を含む方法が提供される。また、前記方法により凍結された凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体の凍結方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体を凍結保護液に浸漬すること、および、
（ｉｉ）凍結保護液に浸漬した前記凝集体を凍結すること、
を含む、方法。
【請求項２】
凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体の製造方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体を凍結保護液に浸漬すること、および、
（ｉｉ）凍結保護液に浸漬した前記凝集体を凍結すること、
を含む、方法。
【請求項３】
凝集体を５〜６０分間凍結保護液に浸漬する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
凝集体を２〜２４℃で凍結保護液に浸漬する、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
凝集体を−６０〜−１５０℃で凍結する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
凝集体の直径が５０〜５０００μｍである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
多能性幹細胞由来心筋細胞がＧＦＰ−カルモジュリン−ミオシン軽鎖フラグメント結合蛋白質を発現する細胞である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
多能性幹細胞由来心筋細胞が、
（１）多能性幹細胞をＷＮＴシグナル活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を含む培地中で培養すること、および
（２）工程（１）で得られた細胞をＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養すること、
を含む方法により得られたものである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
凍結保護液がＤＭＳＯまたはグリセロールを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法により凍結または製造された、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
【請求項１１】
薬剤応答評価または移植に用いるための、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
【請求項１２】
解凍後に７０％以上の生存率を有する、請求項１０または１１に記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
【請求項１３】
直径が５０〜５０００μｍである、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれかに記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を含むキット。
【請求項１５】
薬剤応答評価または移植に用いるための、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
直径５０〜５０００μｍの凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を含む、組成物。
【請求項１７】
薬剤応答評価または移植に用いるための、請求項１６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、日本国特許出願第２０１６−０５５９１３号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本発明は、多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体の凍結方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞由来の心筋細胞は、細胞移植、ドラッグスクリーニング、心毒性評価などの用途での実用化が期待されている。その実現には、同一の機能的性質を持った同一ロットの心筋細胞の大量生産および供給と、効率的な心筋細胞の凍結保存法が必要とされる。【０００３】
現在の多能性幹細胞由来心筋細胞の凍結法は、まず多能性幹細胞から誘導したシート状やコロニー状の心筋細胞凝集体をタンパク分解酵素で分散させ、単一細胞の状態で凍結する手法である。この方法では、細胞生存率が不安定かつ低く、タンパク分解酵素や凍結のダメージにより、均一な凝集体を再形成することが困難である。また単一心筋細胞の凍結では、凍結前の電気生理学的機能パターン（細胞内カルシウム変化の波形や心拍数など）を解凍後に再現することができない。これは、単一細胞に分散して凍結することにより、元の心筋細胞凝集体の形状や細胞間結合等の３次元構造の情報が失われることによる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０２６４９１号
【特許文献２】国際公開第２０１３／１１１８７５号
【特許文献３】国際公開第２０１４／１３６５１９号
【特許文献４】国際公開第２０１５／０３７７０６号
【特許文献５】国際公開第２０１５／１８２７６５号
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１３／０１８３７５３号
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１４／０１２７８０７号
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１５／００１７７１８号
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１６／０００２６００号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kim YY, et al., Cryopreservation  of human embryonic stem cells derived-cardiomyocytes induced by BMP2 in serum-free condition., Reprod Sci. 2011 Mar;18(3):252-60. doi: 10.1177/1933719110385130. Epub 2011 Jan 25.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体の凍結方法および凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ある態様において、多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体の凍結方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体を凍結保護液に浸漬すること、および、
（ｉｉ）凍結保護液に浸漬した前記凝集体を凍結すること、
を含む、方法を提供する。
本発明は、さらなる態様において、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体の製造方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体を凍結保護液に浸漬すること、および、
（ｉｉ）凍結保護液に浸漬した前記凝集体を凍結すること、
を含む、方法を提供する。
本発明は、さらなる態様において、前記方法により凍結または製造された凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を提供する。
本発明は、さらなる態様において、薬剤応答評価または移植に用いるための、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を提供する。
本発明は、さらなる態様において、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を含む組成物またはキットを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
多能性幹細胞由来心筋細胞の実用化に資する心筋細胞凝集体凍結方法および凍結心筋細胞凝集体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ヒトｉＰＳ由来心筋細胞の単一細胞凍結法と凝集体凍結法の形状比較を示す。Ａは、単一細胞凍結による凍結解凍後３日目の心筋細胞凝集体の形態（１凝集体／ウェル）、Ｂは、凝集体凍結による凍結解凍後２日目の心筋細胞凝集体の形態（１凝集体／ウェル）を示す。
【図２】図２は、単一細胞凍結法と凝集体凍結法の形状解析と、細胞生存率の定量比較を示す。
【図３】図３は、凝集体凍結法による凍結解凍前後のＧＣａＭＰ−心筋細胞の蛍光パターン変化を示す。
【図４】図４は、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞およびサルｉＰＳ細胞由来心筋細胞の凝集体凍結法による凍結解凍前後の各パラメータ変化率と凍結保護液の比較を示す。
【図５】図５は、凍結解凍後の心筋細胞凝集体におけるＧＣａＭＰ蛍光を指標としたＥ４０３１薬剤効果を示す。
【図６】図６は、凍結解凍後の心筋細胞凝集体におけるＥ４０３１薬剤効果の濃度依存性を示す。
【図７】図７は、凍結解凍後の心筋細胞凝集体におけるＧＣａＭＰ蛍光を指標としたいくつかの薬剤（Ｅ４０３１、アステミゾール（Astemizole）、ニフェカラント（Nifekalant）、クロマノール２９３ｂ（Chromanole293b）、メキシレチン（Mexiletine）、ニフェジピン（Nifedipine）、イソプロテレノール（Isoproterenol）、プロプラノロール（Propranol）、リアノジン（Ryanodine））の薬剤効果を示す。
【図８】図８は、凍結解凍後の心筋細胞凝集体におけるアンスラサイクリン心毒性を示す。
【図９】図９は、凍結解凍後の心筋細胞凝集体におけるアンスラサイクリン心毒性の解析結果を示す。
【図１０】図１０は、サイズの異なる凝集体の凍結解凍前後の各パラメータ変化率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意味する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。よって、例えば、「約２０〜３０」は、「２０±１０％〜３０±１０％」を含むものとする。
【００１１】
「多能性幹細胞」とは、成体を構成する全ての細胞に分化することができる多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）と、細胞分裂を経てもその多分化能を維持することができる自己複製能を有する細胞を意味する。「多能性幹細胞」には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が含まれる。「多能性幹細胞」の生物種は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは齧歯類または霊長類、さらにより好ましくは霊長類である。本発明は、サルまたはヒト多能性幹細胞に、特にサルまたはヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞に、好適である。
【００１２】
ＥＳ細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞であり、胚盤胞の内部細胞塊または着床後の初期胚のエピブラストから樹立することができる。ＥＳ細胞としては、ヒト（Thomson J. A. et al., Science 282: 1145-1147 (1998)；Biochem Biophys Res Commun. 345(3),  926-32 (2006)）；アカゲザルおよびマーモセット等の霊長類（Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848 (1995）；Thomson J. A. et al., Biol. Reprod. 55: 254-259 (1996)）；ウサギ（特表２０００−５０８９１９号）；ハムスター（Doetshman T. et al., Dev. Biol. 127: 224-227 (1988)）、ブタ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125128 (1990); Piedrahita J.A. et al., Theriogenology 34: 879-891 (1990); Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. 40: 51-56 (1990); Talbot N. C. et al., Cell. Dev. Biol. 29A: 546-554 (1993)）、ヒツジ（Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. Suppl. 43: 255-260 (1991)）、ウシ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125-128 (1990); Saito S. et al., Roux. Arch. Dev. Biol. 201: 134-141 (1992)）、ミンク（Sukoyan M. A. et al., Mol. Reorod. Dev. 33: 418-431 (1993)）などのＥＳ細胞が挙げられる。例えば、ＥＳ細胞としては、ＣＭＫ６．４、ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−３、ＫｈＥＳ−４、ＫｈＥＳ−５、Ｈ１、Ｈ９などを使用できる。
【００１３】
ＥＧ細胞は、始原生殖細胞に由来する多能性幹細胞であり、例えば、ヒトＥＧ細胞（Shamblott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 13726-13731 (1998))が挙げられる。
【００１４】
「ｉＰＳ細胞」とは、体細胞や組織幹細胞などの多能性幹細胞以外の細胞から誘導された多能性幹細胞を意味する。ｉＰＳ細胞の作製方法は、例えば、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００８／１１８８２０、Cell Stem Cell 3(5): 568-574 (2008) 、Cell Stem Cell 4(5): 381-384 (2009)、Nature 454: 646-650 (2008) 、Cell 136(3) :411-419 (2009) 、Nature Biotechnology 26: 1269-1275 (2008) 、Cell Stem Cell 3: 475-479 (2008) 、Nature Cell Biology 11: 197-203 (2009) 、Cell 133(2): 250-264 (2008)、Cell 131(5): 861-72 (2007)、Science 318 (5858): 1917-20 (2007)に記載される。しかしながら、人工的に誘導された多能性幹細胞であれば、いかなる方法で作製された細胞も本明細書における「ｉＰＳ細胞」に含まれる。ｉＰＳ細胞としては、ＩＭＲ９０−１、ＩＭＲ９０−４、２０１Ｂ７、２５３Ｇ１などを使用できる。
【００１５】
多能性幹細胞由来心筋細胞は、多能性幹細胞から誘導された心筋細胞を意味し、その誘導方法は特に限定されない。誘導方法としては、ＢＭＰ４およびアクチビンＡを用いる方法（Nat Biotechnol. 2007 Sep;25(9):1015-24. Epub 2007 Aug 26.）、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦＡおよびＤｋｋ１等を用いる方法（Cell Stem Cell. 2012 Jan 6;10(1):16-28. doi: 10.1016/j.stem.2011.12.013.）、遺伝子組み換えアルブミンとＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ阻害剤を用いる方法（Nat Methods. 2014 Aug;11(8):855-60. doi: 10.1038/nmeth.2999. Epub 2014 Jun 15.）などが例示される。iCell（登録商標） Cardiomyocytes（Cellular Dynamics International, Inc.）、Cellartis（登録商標） Cardiomyocytes (from P11012)/(from ChiPSA22) （タカラバイオ株式会社）などの心筋細胞、およびこれらと同様の方法で誘導された心筋細胞も用いることができる。
【００１６】
好ましい態様において、多能性幹細胞由来心筋細胞は、国際公開第２０１５／１８２７６５号に記載の方法により誘導された細胞である。
すなわち、多能性幹細胞由来心筋細胞は、
（１）多能性幹細胞をＷＮＴシグナル活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を含む培地中で培養すること、および
（２）工程（１）で得られた細胞をＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養すること、
を含む方法により得られたものでありうる。
【００１７】
また、本発明の凍結方法は、工程（ｉ）に先立ち、
（１）多能性幹細胞をＷＮＴシグナル活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を含む培地中で培養すること、および
（２）工程（１）で得られた細胞をＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養すること、
を含む方法により多能性幹細胞由来心筋細胞を得ることを、さらに含んでもよい。
【００１８】
例えば、多能性幹細胞由来心筋細胞は、以下のいずれかの方法により誘導された細胞でありうる。また、本発明の凍結方法は、以下のいずれかの方法により多能性幹細胞由来心筋細胞を得ることをさらに含みうる。
１．多能性幹細胞の心筋分化誘導法であって、以下の工程を含む方法：
（１）多能性幹細胞をＷＮＴシグナル活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を含む培地中で培養する工程、および；
（２）工程（１）で得られた細胞をＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養する工程。
２．Ｗｎｔシグナル阻害剤が、以下の式（Ｉ）の化合物またはその塩である、前記１に記載の方法：
式（Ｉ）：
【化１】
2017159862.tif 000002
［式中、
Ｒ１−Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１−Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい、
Ｒ１０−Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である、
Ｘは、−ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
ｎは、０から６の整数である］。
３．Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素原子であり、
Ｒ２及びＲ３が、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、
Ｒ７が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）であり、
Ｒ８が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基であり、又は、
Ｒ７及びＲ８が、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成しており、
Ｘが、硫黄原子であり、および
ｎが、０から４の整数である、前記２に記載の方法。
４．Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素原子であり、
Ｒ２及びＲ３が、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、
Ｒ７が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基である）であり、
Ｘが、硫黄原子であり、および
ｎが、０から４の整数である、前記２に記載の方法。
５．Ｒ７が、ハロゲン原子である、前記４に記載の方法。
６．ｎが、１から４の整数である、前記３〜５のいずれかに記載の方法。
７．Ｗｎｔシグナル阻害剤が、以下から選択される化合物またはその塩である、前記１に記載の方法：
ＫＹ０２１１１
【化２】
2017159862.tif 000003
ＫＹ０１０４１
【化３】
2017159862.tif 000004
Ｔ６１１６４
【化４】
2017159862.tif 000005
ＫＹ０２１１４
【化５】
2017159862.tif 000006
ＫＹ０１０４５
【化６】
2017159862.tif 000007
ＫＹ０１０４０
【化７】
2017159862.tif 000008
ＫＹ０２１０９
【化８】
2017159862.tif 000009
ＫＹ０１０４２
【化９】
2017159862.tif 000010
ＫＹ０１０４３
【化１０】
2017159862.tif 000011
ＫＹ０１０４６
【化１１】
2017159862.tif 000012
ＰＢ２８５２
【化１２】
2017159862.tif 000013
Ｎ１１４７４
【化１３】
2017159862.tif 000014
ＰＢ２５７２
【化１４】
2017159862.tif 000015
ＰＢ２５７０
【化１５】
2017159862.tif 000016
ＫＹ０２１０４
【化１６】
2017159862.tif 000017
ＳＯ０８７
【化１７】
2017159862.tif 000018
ＳＯ１０２
【化１８】
2017159862.tif 000019
ＳＯ０９６
【化１９】
2017159862.tif 000020
ＳＯ０９４
【化２０】
2017159862.tif 000021
ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）
【化２１】
2017159862.tif 000022
ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）
【化２２】
2017159862.tif 000023
ＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）
【化２３】
2017159862.tif 000024
および、
ＳＯ２０７７
【化２４】
2017159862.tif 000025
。
８．Ｗｎｔシグナル阻害剤が、ＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）、またはＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）である、前記７に記載の方法。
９．Ｗｎｔシグナル阻害剤が、ＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）である、前記８に記載の方法。
１０．工程（２）の培地が２種以上のＷＮＴシグナル阻害剤を含み、前記２種以上のＷＮＴシグナル阻害剤の１つが前記２〜９のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩であり、他のＷＮＴシグナル阻害剤がＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１から選択される１種以上の化合物である、前記１〜９のいずれかに記載の方法。
１１．２種以上のＷＮＴシグナル阻害剤が、前記２〜９のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩およびＸＡＶ９３９である、前記１０に記載の方法。
１２．ＷＮＴシグナル活性化剤が、ＢＩＯまたはＣＨＩＲ９９０２１である、前記１〜１１のいずれかに記載の方法。
１３．ＷＮＴシグナル活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、前記１〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．ＰＫＣ活性化剤が、ＰＭＡまたはプロストラチンである、前記１〜１３のいずれかに記載の方法。
１５．ＰＫＣ活性化剤が、ＰＭＡである、前記１〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．Ｓｒｃ阻害剤が、Ａ４１９２５９またはＳＵ６６５６である、前記１〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．Ｓｒｃ阻害剤が、Ａ４１９２５９である、前記１〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．ＥＧＦ受容体阻害剤が、ＡＧ１４７８またはゲフィチニブである、前記１〜１７のいずれかに記載の方法。
１９．ＥＧＦ受容体阻害剤が、ＡＧ１４７８である、前記１〜１８のいずれかに記載の方法。
２０．ＷＮＴシグナル活性化剤がＣＨＩＲ９９０２１であり、
ＰＫＣ活性化剤がＰＭＡであり、
ＷＮＴシグナル阻害剤が、ＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）、およびＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）から選択される化合物並びにＸＡＶ９３９であり、
Ｓｒｃ阻害剤がＡ４１９２５９であり、および
ＥＧＦ受容体阻害剤がＡＧ１４７８である、前記１〜１９のいずれかに記載の方法。
２１．ＷＮＴシグナル阻害剤が、ＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）およびＸＡＶ９３９である、前記２０に記載の方法。
２２．工程（１）および（２）における培地が蛋白質成分およびペプチド成分を含まない、前記１〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．工程（１）および（２）において細胞を浮遊培養により培養する、前記１〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．工程（１）が１〜３日間であり、工程（２）が２〜１３日間である、前記１〜２３のいずれかに記載の方法。
【００１９】
「Ｗｎｔシグナル活性化剤」とは、Ｗｎｔシグナル経路を活性化する物質を意味する。Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、ＢＩＯおよびＣＨＩＲ９９０２１、ＴＷＳ１１９などのＧＳＫ３β阻害剤が例示される。ある態様において、Ｗｎｔシグナル活性化剤はＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯであり、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１である。国際公開第２０１５／１８２７６５号に記載の方法において、２種以上のＷｎｔシグナル活性化剤を併用してもよく、例えばＣＨＩＲ９９０２１とＢＩＯの両方を使用してもよい。
【００２０】
「Ｗｎｔシグナル阻害剤」とは、Ｗｎｔシグナル経路を阻害する物質を意味する。Ｗｎｔシグナル阻害剤には、例えば、前記式（Ｉ）の化合物またはその塩、ＩＷＰ２、ＩＷＰ４、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１などの化合物が含まれる。本発明においては、２種以上のＷｎｔシグナル阻害剤を併用してもよい。ある態様において、２種以上のＷｎｔシグナル阻害剤の１つが式（Ｉ）の化合物またはその塩であり、他のＷｎｔシグナル阻害剤がＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１から選択される１種以上の化合物、好ましくはＸＡＶ９３９、である。２種以上のＷｎｔシグナル阻害剤がいずれも式（Ｉ）の化合物またはその塩であってもよい。
【００２１】
炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基が挙げられる。
【００２２】
炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基が挙げられる。
【００２３】
炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基としては、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基が挙げられる。
【００２４】
ハロゲン原子としては、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＦが挙げられる。
【００２５】
好ましい態様において、Ｒ１−Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基であり、ここでＲ１−Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい。
【００２６】
Ｒ２及びＲ３は、好ましくは、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基であるか、又は、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している。さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３は、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、さらにより好ましくはメトキシ基である。
【００２７】
Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、好ましくは、水素原子である。
【００２８】
ある態様において、Ｒ６−Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖または分岐のアルキル基である）であり、ここでＲ６−Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成していてもよい。
【００２９】
Ｒ６及びＲ９は、好ましくは、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基であり、より好ましくは、水素原子である。
【００３０】
好ましい態様において、Ｒ７は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基−ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基である）であって、Ｒ８は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基であるか、又は、Ｒ７及びＲ８は、一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成している。
【００３１】
ある態様において、Ｒ７は、基−Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１〜５の直鎖アルコキシ基であり、基−Ｃ（Ｏ）Ａは前記アルコキシ基の末端の炭素原子に結合している。
【００３２】
好ましい態様において、Ａは窒素原子を少なくとも１つ含み、そのようなＡとしては、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、及びピリダジニル基が例示される。より好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジニル基、ピペラジニル基、又はモルホリニル基である。さらに好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１〜５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジン−１−イル基、ピペラジン−１−イル基、又はモルホリン−４−イル基である。
【００３３】
Ｒ１０及びＲ１１は、好ましくは、水素原子である。
【００３４】
ある態様において、ｎは、０から４、１から４、もしくは１から３の整数、または２もしくは３である。
【００３５】
ある態様において、Ｘは、酸素原子；硫黄原子；基−ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アルキル基、炭素数１〜５の直鎖又は分岐アシル基である）である。Ｘは、好ましくは、硫黄原子である。
【００３６】
ある態様において、式（I）の化合物は、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素原子であり、
Ｒ７が、ハロゲン原子であり、
Ｒ２及びＲ３が、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、
Ｘが、硫黄原子であり、および
ｎが、０から４、好ましくは１から４の整数である。
【００３７】
ある態様において、式（I）の化合物は、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素原子であり、
Ｒ７が、ハロゲン原子であり、
Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基であり、
Ｘが、硫黄原子であり、および
ｎが、０から４、好ましくは１から４の整数である。
【００３８】
式（Ｉ）の化合物は、好ましくはＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）、またはＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）であり、より好ましくはＫＹ０２１１１またはＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）であり、さらにより好ましくはＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）である。
【００３９】
式（Ｉ）の化合物は、公知の方法（J. Med. Chem., 1965, 8 (5), pp 734-735）により、あるいは国際公開第２０１２／０２６４９１号パンフレットに記載の方法に準じて、合成することができる。あるいは、UkrOrgSynthesis社（ＰＢ２８５２、ＰＢ２５７２、ＰＢ２５７０）やENAMINE社（Ｔ６１１６４）などから入手可能である。
【００４０】
「ＰＫＣ活性化剤」は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）またはその下流のシグナル伝達経路を活性化する物質を意味する。ＰＫＣ活性化剤としては、ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（Phorbol 12-myristate 13-acetate）（ＰＭＡ）、プロストラチン、ブリオスタチン１（Bryostatin 1）、ブリオスタチン２（Bryostatin 2）、ＦＲ２３６９２４、（−）−インドラクタムＶ（(-)-Indolactam V）、ＰＥＰ００５、ホルボール１２，１３−ジブチラート（Phorbol 12,13-dibutyrate）、ＳＣ−９、ＳＣ−１０、１−オレオイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロール（1-Oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol）、１−Ｏ−ヘキサデシル−２−Ｏ−アラキドニル−ｓｎ−グリセロール（1-O-Hexadecyl-2-O-arachidonyl-sn-glycerol）、１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール（1,2-Dioctanoyl-sn-glycerol）、ＰＩＰ２、レシニフェラトキシン（Resiniferatoxin）、ホルボール１２，１３−ジヘキサノアート（Phorbol 12,13-Dihexanoate）、メゼレイン（Mezerein）、インゲノール３−アンゲラート（Ingenol 3-Angelate）、ＲＨＣ−８０２６７、ＤＣＰ−ＬＡ、リポキシンＡ４（Lipoxin A4）などが例示される。ある態様において、ＰＫＣ活性化剤は、ホルボルエステル系ＰＫＣ活性化剤である、ＰＭＡ、プロストラチン、ＰＥＰ００５、ホルボール１２，１３−ジブチラート、レシニフェラトキシン、ホルボール１２，１３−ジヘキサノアート、メゼレイン、またはインゲノール３−アンゲラートである。国際公開第２０１５／１８２７６５号に記載の方法において、２種以上のＰＫＣ活性化剤を併用してもよい。好ましい態様において、ＰＫＣ活性化剤は、ＰＭＡまたはプロストラチンであり、より好ましくはＰＭＡである。
【００４１】
「Ｓｒｃ阻害剤」は、チロシンキナーゼであるＳｒｃまたはその下流のシグナル伝達経路を阻害する物質を意味する。Ｓｒｃ阻害剤としては、Ａ４１９２５９、ＳＵ６６５６、ＰＰ１、１−ナフチルＰＰ１（1-Naphthyl PP1）、ＰＰ２、インジルビン−３’−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−オキシムエーテル（Indirubin-3'-(2,3-dihydroxypropyl)-oximether）、ＴＸ−１１２３、Src Kinase Inhibitor I（CAS 179248-59-0）、ＡＺＭ４７５２７１、ボスチニブ（Bosutinib）、ハービマイシンＡ（Herbimycin A）、ＫＢ  ＳＲＣ  ４、ＭＮＳ、ＰＤ１６６２８５、ＴＣ−Ｓ７００３などが例示される。ある態様において、Ｓｒｃ阻害剤は、Ａ４１９２５９、ＫＢ  ＳＲＣ  ４、ＳＵ６６５６、またはインジルビン−３’−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−オキシムエーテルである。国際公開第２０１５／１８２７６５号に記載の方法において、２種以上のＳｒｃ阻害剤を併用してもよい。好ましい態様において、Ｓｒｃ阻害剤は、Ａ４１９２５９またはＳＵ６６５６であり、より好ましくはＡ４１９２５９である。
【００４２】
「ＥＧＦ受容体阻害剤」（ＥＧＦＲ阻害剤とも記載する）は、ＥＧＦ受容体からのシグナル伝達を阻害する物質を意味する。ＥＧＦ受容体阻害剤としては、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ（Gefitinib）、アファチニブ（Afatinib）、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＳＴ１３０６、ＡＺＤ８９３１、ＢＩＢＵ１３６１、ＢＩＢＸ１３８２、ＢＰＤＱ、ＢＰＩＱ−Ｉ、ＢＰＩＱ−ＩＩ、カネルチニブ（Canertinib）、ＣＬ−３８７，７８５、ＣＵＤＣ１０１、ダコミチニブ（Dacomitinib）、バンデタニブ（Vandetanib）、EGFR Inhibitor III（Ｎ−（４−（（３，４−ジクロロ−６−フルオロフェニル）アミノ）−キナゾリン−６−イル）−２−クロロアセトアミド、CAS 733009-42-2）、EGFR/ErbB-2 Inhibitor（４−（４−ベンジルオキシアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン、CAS 179248-61-4）、エルロチニブ（Erlotinib）、ＧＷ５８３３４０、ＧＷ２９７４、ＨＤＳ０２９、ラパチニブ（Lapatinib）、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＯＳＩ−４２０、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ１６８３９３、ＰＤ１７４２６５、ペリチニブ（Pelitinib）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ５６、ＸＬ６５７、ＰＰ３、ＡＧ−４９０、ＡＧ５５５、チロホスチン（Tyrphostin）Ｂ４２、チロホスチンＢ４４、ＡＧ５５６、ＡＧ４９４、ＡＧ８２５、ＲＧ−１３０２２、ＤＡＰＨ、EGFR Inhibitor（シクロプロパンカルボン酸−（３−（６−（３−トリフルオロメチル−フェニルアミノ）−ピリミジン−４−イルアミノ）−フェニル）−アミド、CAS 879127-07-8）、エルブスタチンアナログ（Erbstatin Analog）（メチル  ２，５−ジヒドロキシシナマート、CAS 63177-57-1）、ＪＮＪ２８８７１０６３、チロホスチン４７、ラベンダスチン（Lavendustin）Ａ、ラベンダスチンＣ、ラベンダスチンＣメチルエステル、ＬＦＭ−Ａ１２、ＴＡＫ１６５、ＴＡＫ２８５、チロホスチン５１、チロホスチンＡＧ１８３、チロホスチンＡＧ５２８、チロホスチンＡＧ９９、チロホスチンＲＧ１４６２０、ＷＺ３１４６、ＷＺ４００２、ＷＺ８０４０、ブテイン、チロホスチンＡＧ１１２などが例示される。ある態様において、ＥＧＦ受容体阻害剤は、キナゾリン系骨格を有するＥＧＦ受容体阻害剤、例えばＡＧ１４７８、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＳＴ１３０６、ＡＺＤ８９３１、ＢＩＢＵ１３６１、ＢＩＢＸ１３８２、ＢＰＤＱ、ＢＰＩＱ−Ｉ、ＢＰＩＱ−ＩＩ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７，７８５、ＣＵＤＣ１０１、ダコミチニブ、バンデタニブ、EGFR Inhibitor III（CAS 733009-42-2）、EGFR/ErbB-2 Inhibitor（CAS 179248-61-4）、エルロチニブ、ＧＷ５８３３４０、ＧＷ２９７４、ＨＤＳ０２９、ラパチニブ、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＯＳＩ−４２０、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ１６８３９３、ＰＤ１７４２６５、ペリチニブ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ５６、もしくはＸＬ６５７である。好ましい態様において、ＥＧＦ受容体阻害剤は、ＡＧ１４７８またはゲフィチニブ、より好ましくはＡＧ１４７８である。ＥＧＦ受容体阻害剤は、Santa Cruz Biotechなどから入手可能である。
【００４３】
国際公開第２０１５／１８２７６５号に記載の方法は、インビトロで実施される。前記方法に用いる培地は、一般的な多能性幹細胞用の心筋分化培地であればよく、その組成は特に限定はされない。心筋分化培地は、タンパク質成分やペプチド成分を含んでいてもよいが、含まないことが好ましい。国際公開第２０１５／１８２７６５号に記載の方法に用いる心筋分化培地は、例えば、ＩＭＤＭ培地および／またはＤＭＥＭ培地、MEM non-essential amino acid solution、並びにＬ−グルタミンを含む。ある態様において、培地は、ＩＭＤＭ培地およびＤＭＥＭ培地（好ましくはＩＭＤＭ：ＤＭＥＭ=１：１）、MEM non-essential amino acid solution、並びにＬ−グルタミンを含む。培地は、ＩＭＤＭ培地および／またはＤＭＥＭ培地、MEM non-essential amino acid solution、並びにＬ−グルタミンに加えて、Ｌ−カルニチン、アスコルビン酸、および／またはクレアチンを含んでもよい。好ましい態様において、培地は、ＩＭＤＭ培地およびＤＭＥＭ培地（好ましくはＩＭＤＭ：ＤＭＥＭ=１：１）、MEM non-essential amino acid solution、Ｌ−グルタミン、Ｌ−カルニチン、アスコルビン酸、およびクレアチンを含む。培地は、必要に応じてペニシリン-ストレプトマイシン等の抗生物質を含んでもよい。具体的な培地としては、実施例で使用しているＩＭＤＭおよびＤＭＥＭを基礎培地とする培地（ＩＭＤＭ  ２４２ｍｌ、ＤＭＤＭ  ２４２ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution（×１００）  ５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン（×１００）  ５ｍｌ、０．２Ｍ  Ｌ−グルタミン  ５ｍｌ、１Ｍ  Ｌ−カルニチン  １００μｌ、アスコルビン酸  ５０ｍｇ、０．５Ｍクレアチン  １ｍｌ含有）が例示される。
【００４４】
また、心筋分化培地としては、公知のＩＭＤＭ培地を基礎培地とする心筋分化培地（例えば、ＩＭＤＭ培地  ２００ｍｌ、ウシ胎児血清  ５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution（×１００）  ２．５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン（×１００）  ２．５ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン  ２．５ｍｌ、２−メルカプトエタノール  ２μ１、５Ｎ  ＮａＯＨ  ２５５μｌ含有）、公知のＤＭＥＭ培地を基礎培地とする心筋分化培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地  ２００ｍｌ、ウシ胎児血清  ５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution（×１００）  ２．５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン（×１００）  ２．５ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン  ２．５ｍｌ、２−メルカプトエタノール含有）、またはStemPro（登録商標）-34SFM（GIBCO）＋ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）などを使用可能である。
【００４５】
多能性幹細胞由来心筋細胞の誘導には、一般的に多能性幹細胞の心筋分化に適した培養方法を用いることができる。培養方法としては、例えば、接着培養法、浮遊培養法等が挙げられる。好ましい態様において、多能性幹細胞由来心筋細胞の誘導は、浮遊培養法で実施される。培養開始時の多能性幹細胞の細胞数は、培養方法、培養容器、細胞の種類等によって適宜決定されるが、１×１０５細胞／ｍｌ〜１０×１０５細胞／ｍｌ程度で播種すればよい。培地の交換は、１〜３日に１回、例えば２日に一回、行えばよい。
【００４６】
工程（１）および工程（２）の期間、および工程（１）の終了から工程（２）の開始までの期間は、細胞の種類等に応じて適宜変更されうる。工程（２）は、工程（１）の終了直後から開始してもよいし、工程（１）の終了から一定期間後に開始してもよい。例えば、工程（１）の終了後、ＷＮＴシグナル活性化剤、ＰＫＣ活性化剤、ＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤のいずれも含まない培地中で細胞を１〜２日間、好ましくは１日間培養した後、培地をＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地に交換し、工程（２）を開始してもよい。
【００４７】
例えば、工程（１）を１〜３日間実施し、次いで、工程（２）を、工程（１）の終了直後または工程（１）の終了の１〜２日後から、２〜１３日間、好ましくは３〜１０日間、より好ましくは４〜１０日間、さらに好ましくは４〜８日間、実施する。例えば、工程（１）の開始日を０日目として、０〜１日目、０〜２日目または０〜３日目に工程（１）を実施し、工程（１）の終了直後または工程（１）の終了の１〜２日後から、２〜１０日目（８日間）、２〜９日目（７日間）、２〜８日目（６日間）、２〜７日目（５日間）、２〜６日目（４日間）、３〜１０日目（７日間）、３〜９日目（６日間）、３〜８日目（５日間）、３〜７日目（４日間）、４〜１０日目（６日間）、４〜９日目（５日間）、または４〜８日目（４日間）に、工程（２）を実施することができる。
【００４８】
工程（１）は、多能性幹細胞から中胚葉への分化誘導期である心筋分化誘導の前期段階にあたることから、工程（１）の期間は、中胚葉関連遺伝子の発現に基づき決定することもできる。中胚葉関連遺伝子としては、Ｔ、ＭＩＸＬ１、ＮＯＤＡＬ等が挙げられる。工程（２）は中胚葉から心筋細胞へ分化する心筋分化誘導の後期段階にあたり、その期間は、心筋細胞への分化を確認することによって決定することができる。心筋細胞への分化は、拍動心筋細胞の数、心筋マーカーの発現、イオンチャネルの発現、電気生理学的刺激に対する反応等により確認することができる。心筋マーカーとしては、αＭＨＣ、βＭＨＣ、ｃＴｎＴ、αアクチニン、およびＮＫＸ２．５が挙げられる。また、イオンチャネルとしては、ＨＣＮ４、Ｎａｖ１．５、Ｃａｖ１．２、Ｃａｖ３．２、ＨＥＲＧ１ｂ、およびＫＣＮＱ１が挙げられる。
【００４９】
Ｗｎｔシグナル活性化剤およびＷｎｔシグナル阻害剤の濃度は、使用する細胞および薬剤等に応じて適宜変更されうる。Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＢＩＯまたはＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合、例えば最終濃度１００ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは１μＭ〜１０μＭで使用すればよい。Ｗｎｔシグナル阻害剤としてＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、またはＩＷＲ１を用いる場合、例えば最終濃度０.５〜２０μＭ、好ましくは０.５〜１０μＭ、より好ましくは１〜１０μＭで使用すればよい。Ｗｎｔシグナル阻害剤として式（Ｉ）の化合物またはその塩を用いる場合、使用する化合物またはその塩に応じて、例えば最終濃度０.１〜２０μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭ、より好ましくは１〜１０μＭで使用すればよい。
【００５０】
ＰＫＣ活性化剤の濃度は、使用する細胞および薬剤等に応じて適宜変更されうる。ＰＭＡの場合、例えば最終濃度０．０１μＭ〜１０μＭ、好ましくは０．０３〜１μＭ、より好ましくは０．1〜１μＭで、プロストラチンの場合、例えば最終濃度０．１μＭ〜１００μＭ、好ましくは１〜１０μＭで、使用すればよい。
【００５１】
Ｓｒｃ阻害剤の濃度は、使用する細胞および薬剤等に応じて適宜変更されうる。Ａ４１９２５９およびＳＵ６６５６の場合、例えば最終濃度０．１μＭ〜１０μＭ、好ましくは０．１μＭ〜３μＭ、より好ましくは０．３〜３μＭで使用すればよい。
【００５２】
ＥＧＦ受容体阻害剤の濃度は、使用する細胞および薬剤等に応じて適宜変更されうる。ゲフィチニブまたはＡＧ１４７８の場合、例えば最終濃度１００ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは１μＭ〜２０μＭで、ＰＰ３の場合、例えば最終濃度１μＭ〜１ｍＭ、好ましくは１０μＭ〜１００μＭで使用すればよい。
【００５３】
前記工程（２）の後、培地をＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含まない心筋分化培地に交換し、数日間、数週間、または数ヶ月間、好ましくは約１週間〜３ヶ月間、より好ましくは約３週間〜３ヶ月間培養した心筋細胞を、凍結に用いることが好ましい。
【００５４】
多能性幹細胞由来心筋細胞は、細胞内Ｃａ２＋濃度変化の検出が可能となるよう、ＧＦＰ−カルモジュリン−ミオシン軽鎖フラグメント結合蛋白質（本明細書中、ＧＣａＭＰシリーズ蛋白質とも称する）などのカルシウムセンサー蛋白質や、ＶＳＦＰなどの膜電位センサー蛋白質を発現する多能性幹細胞から誘導された細胞であってもよい。すわなち、ある態様において、多能性幹細胞または多能性幹細胞由来心筋細胞は、カルシウムセンサー蛋白質、好ましくはＧＣａＭＰシリーズ蛋白質、を発現する細胞である。ＧＣａＭＰシリーズ蛋白質としては、ＧＣａＭＰ、ＧＣａＭＰ２、ＧＣａＭＰ３、ＧＣａＭＰ７などが例示される。Ｃａ２＋と結合して蛍光を発するカルシウムセンサー蛋白質を発現する心筋細胞では、細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を蛍光強度の変化として検出することができ、また、心筋拍動を蛍光により可視化することができる。Ｃａ２＋は筋収縮の直接的トリガーであり、心毒性評価などの実用化に適している。また、細胞外電極を必要としないので、浮遊状態のまま評価が可能であり、細胞−電極間の接着状態による影響を受けず、薬剤をウォッシュすれば同じ心筋凝集体から長期にわたって繰り返し測定が可能である。
【００５５】
本発明の凍結方法で凍結する多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体は、直径５０〜５０００μｍのサイズであればよい。好ましくは、凝集体の直径は、５０〜３０００μｍ、５０〜２０００μｍ、１００〜３０００μｍ、または１００〜２０００μｍである。ある実施形態において、凝集体の直径は、２００〜２０００μｍ、好ましくは５００〜１０００μｍである。凝集体の直径は、図２に示すような凝集体の外径の値とする。
【００５６】
多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体は、多能性幹細胞からの分化誘導で得られた心筋細胞の凝集体を単一細胞に分散後、再形成したものであってよい。あるいは、多能性幹細胞からの分化誘導で得られた心筋細胞の凝集体を直接（すなわち、単一細胞への分散および凝集体の再形成の経ることなしに）、凍結してもよい。
【００５７】
すなわち、本発明の方法は、工程（ｉ）に先立ち、
（ａ）多能性幹細胞からの分化誘導で得られた心筋細胞の凝集体を、タンパク分解酵素を用いて単一細胞に分散すること、および
（ｂ）上記（ａ）の細胞を容器に播種して培養し、心筋細胞の凝集体を作製すること、
を含んでもよい。
【００５８】
単一細胞への分散には、トリプシン／コラゲナーゼ液、TryPLE selectなどのタンパク分解酵素溶液を用いることができる。単一細胞に分散後の細胞を、０．３〜３０×１０５細胞／ｃｍ２で容器に播種して培養し、上記のサイズの心筋細胞凝集体を作製する。培養容器としては、後述する凝集体の凍結保護液への浸漬に用いる容器を用いることができ、この場合、凝集体を作製後、凝集体の凍結保護液への浸漬を同じ容器中で行うことができる。例えば、９６ウェルプレートの場合、０．１〜１０×１０５細胞／ウェル、好ましくは０．５〜２×１０５細胞／ウェルで播種すればよい。培養期間は、限定はされないが、通常３〜１８０日間の間で適宜決定することができる。ある態様において、培養期間は、１４〜３０日間である。
【００５９】
多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体の凍結保護液への浸漬は、マルチウェルプレート、ディッシュ、またはチューブなどの容器中で行う。容器としては、細胞の凍結に使用可能な市販の容器を使用することができ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、およびガラス製の容器が例示される。マルチウェルプレートとしては、６、１２、２４、４８、９６または３８４ウェルの、平底、Ｕ底、またはＶ底のプレートが例示される。例えば、スミロンPrimeSurface（登録商標）９６ウェルＶ底プレートを使用することができる。
【００６０】
凍結保護液は、特に限定されず、セルバンカー１（日本全薬工業）、ステムセルバンカー（日本全薬工業）、バンバンカー（日本ジェネティクス）などの市販の凍結保護液を用いることができる。また、当業者は適切な凍結保護液を調製することができる。凍結保護液は、一般的な細胞の凍結保護剤を含むものであってよいが、ＤＭＳＯまたはグリセロールを含む凍結保護液が好適に用いられる。例えば、ＤＭＳＯ含有血清またはグリセロール含有血清を凍結保護液として用いることができる。凍結保護液は、例えば、約５−２０％のＤＭＳＯまたは約５−２０％のグリセロールを含む。
【００６１】
凍結保護液への浸漬は、好ましくは２〜２４℃、より好ましくは２〜１０℃、さらにより好ましくは約４℃にて行う。浸漬時間は、例えば５〜６０分間、より好ましくは１０〜４０分間、さらにより好ましくは１０〜３０分間、さらにより好ましくは２０〜３０分間である。凍結保護液の量は、細胞凝集体が十分に覆われる量であればよい。例えば、９６ウェルプレートの場合、５〜３０μｌ／ウェルでありうる。
【００６２】
凍結保護液への浸漬の後、凝集体を凍結する。凍結は、好ましくは−６０〜−１５０℃、より好ましくは−６０〜−１００℃、さらにより好ましくは−７０〜−９０℃、さらに好ましくは約−８０℃で行う。凝集体を含む容器を、バイセル凍結処理容器などの一般的な凍結処理容器に入れ、フリーザーで凍結すればよい。例えばプログラムフリーザーなどを用いて、時間をかけて（例えば、０．１〜１℃／分で）温度を低下させる場合、前記の凍結保護液への浸漬時間を５分未満とすることもできる。凍結時の凍結保護液の量は少ないことが好ましく、そのため細胞凝集体が露出しない程度に余分な凍結保護液を取り除くことが好ましい。例えば、９６ウェルプレートの場合、凍結保護液が５〜２０μｌ／ウェル程度となるよう、余分な凍結保護液を取り除けばよい。前記温度での凍結後、凍結された凝集体は、−１４０〜−１５０℃で保存することができる。
【００６３】
凍結された凝集体は、使用前に解凍される。例えば、凍結された凝集体を含む容器に心筋細胞培養用の培地を加えて解凍することができる。培地としては、ＩＭＤＭおよび／またはＤＭＥＭを基礎培地とする心筋細胞培養用の培地を用いることができるが、これらに限定されない。前述の国際公開第２０１５／１８２７６５号に記載の方法に用いる心筋分化培地を解凍に用いてもよい。例えば、培地は、ＩＭＤＭ培地および／またはＤＭＥＭ培地、MEM non-essential amino acid solution、並びにＬ−グルタミンを含む。ある態様において、培地は、ＩＭＤＭ培地およびＤＭＥＭ培地（好ましくはＩＭＤＭ：ＤＭＥＭ=１：１）、MEM non-essential amino acid solution、並びにＬ−グルタミンを含む。培地は、ＩＭＤＭ培地および／またはＤＭＥＭ培地、MEM non-essential amino acid solution、並びにＬ−グルタミンに加えて、Ｌ−カルニチン、アスコルビン酸、および／またはクレアチンを含んでもよい。好ましい態様において、培地は、ＩＭＤＭ培地およびＤＭＥＭ培地（好ましくはＩＭＤＭ：ＤＭＥＭ=１：１）、MEM non-essential amino acid solution、Ｌ−グルタミン、Ｌ−カルニチン、アスコルビン酸、およびクレアチンを含む。培地は、必要に応じてペニシリン-ストレプトマイシン等の抗生物質を含んでもよい。具体的な培地としては、実施例で使用しているＩＭＤＭおよびＤＭＥＭを基礎培地とする培地（ＩＭＤＭ  ２４２ｍｌ、ＤＭＤＭ  ２４２ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution（×１００）  ５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン（×１００）  ５ｍｌ、０．２Ｍ  Ｌ−グルタミン  ５ｍｌ、１Ｍ  Ｌ−カルニチン  １００μｌ、アスコルビン酸  ５０ｍｇ、０．５Ｍクレアチン  １ｍｌ含有）が例示される。
【００６４】
解凍用培地は、血清（例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはヒト血清）を含むことが好ましく、血清とＲｏｃｋ阻害剤とを含むことがさらに好ましい。好ましくは、解凍用培地は、５〜３０％、好ましくは約２０％の血清を含む。さらに好ましくは、解凍用培地は、血清に加えて、１〜１０μＭ、好ましくは約３μＭのＲｏｃｋ阻害剤を含む。Ｒｏｃｋ阻害剤としては、Ｙ２７６３２、ファスジル（Fasudil）、リパスジル（Ripasudil）が例示される。
【００６５】
解凍は、できるだけ速やかに行うことが望ましい。例えば、凍結された凝集体を含む容器に、約３７℃に温めた解凍用培地を、容器中の凍結保護液の５倍量以上、好ましくは１０倍量以上の量で加えた後、速やかに上清を捨て、再度解凍用培地を加え、培養する。解凍用培地がＲｏｃｋ阻害剤を含む場合、解凍の翌日に、Ｒｏｃｋ阻害剤を含まない培地に培地の全量を交換する。解凍の翌日以降、例えば１〜７日後から、細胞の機能解析を行うことができる。
【００６６】
多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体の凍結解凍方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体を凍結保護液に浸漬すること、
（ｉｉ）凍結保護液に浸漬した前記凝集体を凍結すること、および
（ｉｉｉ）凍結された凝集体を血清およびＲｏｃｋ阻害剤を含む培地で解凍すること
を含む方法もまた提供される。
【００６７】
工程（ｉ）および（ｉｉ）は、本発明の凍結方法と同様に実施すればよい。ある態様において、工程（ｉｉｉ）は、
約３７℃に温めた血清およびＲｏｃｋ阻害剤を含む培地を、前記凝集体を含む容器に、好ましくは容器中の凍結保護液の５倍量以上、より好ましくは１０倍量以上の量で、加えること、
速やかに上清を捨て、再度、前記容器に前記培地を加えること、および
１日後に、培地を、血清を含みＲｏｃｋ阻害剤を含まない培地に交換すること、
を含む。
【００６８】
本発明の凍結方法により、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体が製造される。すなわち、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体の製造方法もまた提供される。さらに、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を含む組成物もまた提供される。ある実施形態において、本発明の組成物は、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体および凍結保護液を含む。
【００６９】
心毒性評価やドラッグスクリーニングなどの薬剤応答評価や移植に用いる場合、凍結心筋細胞は、解凍後に凍結前の電気生理学的性質（例えば、細胞内カルシウム変化の波形や心拍数）や薬剤応答を維持している必要がある。また、解凍が容易であり、かつ解凍後の生存率が高いことが望ましい。本発明の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体は、解凍後にこれら用途に十分な電気生理学的性質や薬剤応答を維持しており、薬剤応答評価または移植に用いることができる。また、簡便な操作で解凍可能であり、解凍後の生存率も高い。ある態様において、本発明の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体は、解凍後に７０％以上、好ましくは８０％以上の細胞生存率を有するものである。細胞生存率は、トリパンブルー染色などにより生存細胞と死細胞とを区別して細胞数を計測することにより得られる、生存細胞数と全細胞数とから算出することができる。
【００７０】
ＧＣａＭＰなどのカルシウムセンサー蛋白質やＶＳＦＰなどの膜電位センサー蛋白質を発現する心筋細胞の場合、細胞内カルシウム濃度や膜電位の変化を蛍光強度の変化として検出することができ、また、心筋拍動を蛍光により可視化することができる。カルシウムセンサー蛋白質を発現しない心筋細胞の場合、Ｆｌｕｏ−４、Ｆｌｕｏ−８、Ｆｕｒａ−２などのカルシウムインジケーターや、ＤｉＯＣなどの膜電位感受性色素、細胞外電極などを用いて、薬剤応答評価を行うことができる。
【００７１】
本発明の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体は、薬剤応答評価や移植などに用いるためのキットとして提供されうる。キットは、用途に応じた容器（例えば、マイクロプレート、ディッシュ、またはチューブ）を含み、その容器中に凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体が含まれていてもよい。キットはさらに、解凍用および／または培養用の培地や、その他必要な試薬を含んでいてもよい。
【００７２】
特に、国際公開第２０１５／１８２７６５号に記載の方法で誘導された多能性幹細胞由来心筋細胞を本発明の凍結方法で凍結することで、心毒性評価やドラッグスクリーニングなどの薬剤応答評価により適する凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体およびこれを含むキットを提供することができる。
【００７３】
ある実施形態において、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を含む組成物またはキット中の１０％以上の多能性幹細胞由来心筋細胞が、直径５０〜５０００μｍの凝集体を形成している。好ましくは、組成物またはキット中の１０％以上の多能性幹細胞由来心筋細胞が、直径５０〜３０００μｍ、５０〜２０００μｍ、１００〜３０００μｍ、または１００〜２０００μｍの凝集体を形成している。ある実施形態において、組成物またはキット中の１０％以上の多能性幹細胞由来心筋細胞が、直径２００〜２０００μｍまたは５００〜１０００μｍの凝集体を形成している。組成物またはキット中の２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０％、９０％、または９５%以上の多能性幹細胞由来心筋細胞が、所定の直径の凝集体を形成していてもよい。好ましい実施形態において、組成物またはキット中の７０、８０％、９０％、または９５%以上の多能性幹細胞由来心筋細胞が、所定の直径の凝集体を形成している。
【００７４】
国際公開第２０１５／１８２７６５号に記載の方法によれば、低コストかつ高効率に多能性幹細胞から心筋細胞を誘導することができ、心筋細胞の大量生産が可能である。また、前記方法により誘導した心筋細胞は、チャネル遺伝子（ＨＥＲＧ、ＫＣＮＱ１等）の発現量が比較的高く、パッチクランプ法でも比較的成熟した心筋細胞と同様の電気生理学的性質を示し、それぞれのチャネル阻害剤であるＥ４０３１やクロマノール２９３ｂによる活動電位の延長（ＱＴ延長）が見られる。そして、本発明の凍結方法によれば、生存率と機能性を維持したまま誘導された心筋細胞の凍結保存が可能である。よって、同一ロットの心筋細胞を大量に生産・保存して、電気生理学的性質が担保された細胞をいつでも供給可能となる。これにより、動物試験やＨＥＲＧチャネル試験に代わる新たな薬剤評価系が提供されうる。
【００７５】
本発明の例示的実施形態を以下に示す。
１．多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体の凍結方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体を凍結保護液に浸漬すること、および、
（ｉｉ）凍結保護液に浸漬した前記凝集体を凍結すること、
を含む、方法。
２．凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体の製造方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体を凍結保護液に浸漬すること、および、
（ｉｉ）凍結保護液に浸漬した前記凝集体を凍結すること、
を含む、方法。
３．凝集体を５〜６０分間凍結保護液に浸漬する、前記１または２に記載の方法。
４．凝集体を１０〜３０分間凍結保護液に浸漬する、前記１〜３のいずれかに記載の方法。
５．凝集体を２〜２４℃で凍結保護液に浸漬する、前記１〜４のいずれか記載の方法。
６．凝集体を２〜１０℃で凍結保護液に浸漬する、前記１〜５のいずれかに記載の方法。
７．凝集体を−６０〜−１５０℃で凍結する、前記１〜６のいずれかに記載の方法。
８．凝集体を−７０〜−９０℃で凍結する、前記１〜７のいずれかに記載の方法。
９．凝集体の直径が５０〜５０００μｍである、前記１〜８のいずれかに記載の方法。
１０．凝集体の直径が５０〜２０００μｍである、前記１〜９のいずれかに記載の方法。
１１．凝集体の直径が１００〜２０００μｍである、前記１〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．多能性幹細胞由来心筋細胞がＧＦＰ−カルモジュリン−ミオシン軽鎖フラグメント結合蛋白質を発現する細胞である、前記１〜１１のいずれかに記載の方法。
１３．多能性幹細胞由来心筋細胞が、
（１）多能性幹細胞をＷＮＴシグナル活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を含む培地中で培養すること、および
（２）工程（１）で得られた細胞をＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養すること、
を含む方法により得られたものである、前記１〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．工程（ｉ）に先立ち、
（１）多能性幹細胞をＷＮＴシグナル活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を含む培地中で培養すること、および
（２）工程（１）で得られた細胞をＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養すること、
を含む方法により多能性幹細胞由来心筋細胞を得ることをさらに含む、前記１〜１３のいずれかに記載の方法。
１５．多能性幹細胞がヒトまたはサル多能性幹細胞である、前記１〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、前記１〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．多能性幹細胞がＧＦＰ−カルモジュリン−ミオシン軽鎖フラグメント結合蛋白質を発現する細胞である、前記１〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．凍結保護液がＤＭＳＯまたはグリセロールを含む、前記１〜１７のいずれかに記載の方法。
１９．前記１〜１８のいずれかに記載の方法により凍結または製造された、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
２０．薬剤応答評価または移植に用いるための、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
２１．解凍後に７０％以上の生存率を有する、前記１９または２０に記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
２２．凝集体の直径が５０〜５０００μｍである、前記１９〜２１のいずれかに記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
２３．凝集体の直径が５０〜２０００μｍである、前記１９〜２２のいずれかに記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
２４．凝集体の直径が１００〜２０００μｍである、前記１９〜２３のいずれかに記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
２５．直径が５０〜５０００μｍである、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
２６．凝集体の直径が５０〜２０００μｍである、前記２５に記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
２７．凝集体の直径が１００〜２０００μｍである、前記２５または２６に記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
２８．前記１９〜２７のいずれかに記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を含むキット。
２９．マルチウェルプレート、ディッシュまたはチューブをさらに含む、前記２８に記載のキット。
３０．解凍用培地および／または培養用培地をさらに含む、前記２８または２９に記載のキット。
３１．薬剤応答評価または移植に用いるための、前記２８〜３０のいずれかに記載のキット。
３２．直径５０〜５０００μｍの凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を含む、組成物。
３３．凝集体の直径が５０〜２０００μｍである、前記３２に記載の組成物。
３４．凝集体の直径が１００〜２０００μｍである、前記３２または３３に記載の組成物。
３５．薬剤応答評価または移植に用いるための、前記３２〜３４のいずれかに記載の組成物。
３６．前記１９〜２７のいずれかに記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体、前記２８〜３１のいずれかに記載のキット、または前記３２〜３４のいずれかに記載の組成物の、薬剤応答評価または移植のための使用。
【００７６】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これら実施例は如何なる意味においても本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７７】
１．ヒトｉＰＳ由来心筋細胞の単一細胞凍結法と凝集体凍結法の形状比較
国際公開第２０１５／１８２７６５号に記載の方法により、ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）から心筋細凝集体を作製した。具体的には、心筋分化前期（ｄａｙ０−２）において、ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）の浮遊コロニー（Minami, I. et al., Cell reports 2, 1448-1460 (2012)および国際公開第２０１３／１１１８７５号パンフレットに記載のとおり調製）をＧＳＫ３β阻害剤（２μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１）とＰＫＣ活性剤（０．３μＭ  ＰＭＡ）を添加した表１の培地（以下、プロテインフリー心筋分化（ＰＦＣＤ）培地とも称する）により、浮遊培養条件下で培養した。次に、１日間（ｄａｙ２−３）、ＧＳＫ３β阻害剤およびＰＫＣ活性剤化合物を含まないＰＦＣＤ培地で培養した後、分化後期（ｄａｙ３−７）にＷｎｔシグナル阻害剤（３μＭ  ＫＹ０３−Ｉおよび１μＭ  ＸＡＶ９３９）とＥＧＦＲ阻害剤（１０μＭ  ＡＧ１４７８）、Ｓｒｃ阻害剤（０．３  μＭＡ４１９２５９）を添加したＰＦＣＤ培地中で、浮遊培養条件下（低接着ディッシュ（和光６４１−０７３９１またはコーニングＹＯ−０１８３５−２４）上で）で４日間培養した。その後、Ｗｎｔシグナル阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、およびＳｒｃ阻害剤を含まないＰＦＣＤ培地で２１〜３０日間培養したものを以下の実験に使用した。
【表１】
2017159862.tif 000026
【００７８】
単一細胞凍結については、得られた心筋細胞コロニーをトリプシン／コラゲナーゼ溶液で単一細胞に分散した後、直ちに培養液を凍結保護液（セルバンカー１（日本全薬工業株式会社））で置換し、ＣｒｙｏＴｕｂｅ（Ｎｕｎｃ）で−８０℃で凍結した。凝集体凍結については、得られた心筋細胞凝集体をトリプシン／コラゲナーゼ溶液で単一細胞に分散し、スミロンPrimeSurface ９６ウェルＶ底プレートに１×１０５細胞／ウェルで細胞を播種して７日間培養し、凝集体（直径７００〜１０００μｍ）を形成した。次いで、培養液を凍結保護液（セルバンカー１）に置換し、４℃で２０分間静置後、凍結保護液が５〜２０μｌ／ウェルになるように余分な凍結保護液を捨て、−８０℃で凍結した。【００７９】
解凍用培地として、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および３μＭのＲｏｃｋ阻害剤（Ｙ−２７６３２）を含むＰＦＣＤ培地を３７℃に温めた。単一細胞凍結サンプルは、前記解凍用培地（１０ｍｌ）を速やかに加えて解凍した後、上清を捨てて、同じ解凍用培地に懸濁し、スミロンPrimeSurface ９６ウェルＶ底プレートに１×１０５／ウェルで播種した。翌日に１０％ＦＢＳ含有ＰＦＣＤ培地（Ｒｏｃｋ阻害剤不含）で全量培地交換し、３日間培養して凝集体を形成後、解析した（図１−Ａ）。凝集体凍結サンプルは、前記解凍用培地を速やかに２００μｌ／ウェルで各ウェルに加えて解凍した後、上清を捨て、同じ解凍用培地を添加して培養し、翌日に１０％ＦＢＳ含有ＰＦＣＤ培地（Ｒｏｃｋ阻害剤不含）で全量培地交換した。２日間培養後、解析に用いた（図１−Ｂ）。【００８０】
凍結した単一細胞から形成した凝集体は、大きさと形がウェル間で非常に不均一であった（図１−Ａ）。これは、細胞生存率のバラつきや細胞間接着の不安定さによると考えられる。一方、凝集体を形成してから凍結解凍すると、大きさと形を維持したまま、高い生存率で均一な凝集体として解凍できた（図１−Ｂ）。【００８１】
２．単一細胞凍結法と凝集体凍結法の形状解析と細胞生存率の定量比較
図１−Ａと図１−Ｂの凝集体の形態について、外径と内径を計測し（図２−Ａ）、その比率を計算し解析した（図２−Ｂ）。凝集体のまま凍結解凍したほうが、外径と内径の差が小さく、球形に近い形状であった。また、単一細胞凍結の凍結解凍の前後と凝集体凍結の凍結解凍の前後で、細胞数をセルカウンターで計測し細胞生存率の比較を行った（図２−Ｃ）。単一細胞凍結の細胞生存率が５０％前後であったのに対して、凝集体凍結では８５％前後と安定して高かった。【００８２】
３．ＧＣａＭＰ陽性ｉＰＳ細胞由来心筋細胞の作製
細胞内カルシウムと結合してＧＦＰ蛍光を発するカルシウム感受性ＧＦＰであるＧＣａＭＰ３の遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲを用いたＡＡＶＳ１領域特異的遺伝子導入により、ヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１）またはとサルｉＰＳ細胞株（ＨＴ４Ｍ２）に導入した。このＧＣａＭＰ３−ヒトｉＰＳ細胞から、上記１と同様の方法で心筋細胞を誘導し、拍動時の細胞内カルシウム濃度変化に対応してＧＦＰ蛍光を発する心筋細胞凝集体を作製した。また、ＧＣａＭＰ−サルｉＰＳ細胞からサイトカインを用いる方法（Nat Biotechnol. 2007 Sep;25(9):1015-24. Epub 2007 Aug 26.に記載）で心筋細胞を誘導し、細胞内カルシウム濃度変化に対応してＧＦＰ蛍光を発する心筋細胞凝集体を作製した。具体的には、ＧＣａＭＰ−サルｉＰＳ細胞を、ヒト組換えアクチビンＡ（R&D Systems）（１００ｎｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ−Ｂ２７培地（Invitrogen）で２４時間培養した後、ヒト組換えＢＭＰ４（R&D Systems）（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ−Ｂ２７培地で４日間培養し、その後、培地をこれらサイトカインを含まないＲＰＭＩ−Ｂ２７培地に交換して、２１日間培養した。これらのＧＣａＭＰ−心筋細胞をトリプシン／コラゲナーゼ溶液で単一細胞に分散した後、スミロンPrimeSurface ９６ウェルＶ底プレートに１×１０５／ウェルで播種して均一な凝集体（直径７００〜１０００μｍ）を形成し、心筋細胞の拍動と同期する細胞内カルシウムイオン濃度変化の波形解析に用いた。【００８３】
４．凝集体凍結法による凍結解凍前後のＧＣａＭＰ−心筋細胞の蛍光パターン変化
ヒトｉＰＳ細胞由来のＧＣａＭＰ−心筋細胞の凝集体の、凝集体凍結前の細胞内カルシウム応答の波形パターンと解凍後１日における波形パターンを測定した（図３−Ａ）。その結果、波形パラメータ（Time to peak（ＴｔＰ）、ＣＡＤ５０、７０、９０、下記６参照）や拍動間隔（Peak to peak（ＰｔＰ））について、凍結解凍前後で大きな変化がなかった（図３−Ｂ）。また、凝集体の外径は、凍結解凍後に５〜１０％程度しか減少せず、また基本的な形状も保たれていた（図３−Ｃ）。これらの結果は、心筋細胞凝集体のサイズおよび形態、並びに電気生理学的応答のパターンが、凍結解凍前後で非常に良く保存されていることを示している。【００８４】
５．凝集体凍結解凍前後の各パラメータ変化率と凍結保護液の比較
凍結保護液として、セルバンカー１（日本全薬工業）にかえて、５％ＤＭＳＯ含有ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（５％ＤＭＳＯ／ＦＢＳ溶液）（ＤＭＳＯ（Sigma）、ＦＢＳ（Gibco））、１０％グリセロール含有ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（１０％グリセロール／ＦＢＳ溶液）（グリセロール（Sigma）、ＦＢＳ（Gibco））、ステムセルバンカー（日本全薬工業）、またはバンバンカー（日本ジェネティクス）を用いて、上記１と同様にヒトｉＰＳ由来心筋細胞の凝集体を凍結解凍し、凍結前と解凍後１日で凝集体の各パラメータを測定し、凍結前後の変化を解析した。また、上記３のサルｉＰＳ由来心筋細胞について、上記１と同様にセルバンカー１を凍結保護液として用いて凝集体凍結を行い、凍結前後の変化を解析した。ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞の凝集体の外径の直径（図４中「直径」と示す）は、どの凍結保護液においても１０％程度しか減少しなかった。また、ＧＣａＭＰ蛍光波形の各パラメータ（ＴｔＰ、ＣａＤ５０、７０、９０、ＰｔＰ）の凍結前後の変化率は±２５％以内であり、大きな変化は見られなかった。サルｉＰＳ細胞由来心筋細胞凝集体では、直径は２０％程度減少し、ＧＣａＭＰ蛍光波形の各パラメータは２０〜４０％程度上昇していた。サイトカインを用いる方法で誘導されたサルｉＰＳ由来心筋細胞についても、ヒトｉＰＳ由来心筋細胞に比べ変化率は大きいものの、機能性を維持しつつ凍結解凍が可能であった。【００８５】
６．凍結解凍後の心筋細胞凝集体におけるＧＣａＭＰ蛍光を指標としたＥ４０３１薬剤効果
凍結解凍後７日目のヒトｉＰＳ細胞由来のＧＣａＭＰ−心筋細胞凝集体に、ＨＥＲＧチャネル阻害剤であるＥ４０３１（３００ｎＭ）を添加し、Ｅ４０３１添加前と添加後１０分におけるＧＣａＭＰ蛍光波形（細胞内カルシウムイオン濃度変化）の各パラメータを比較した。蛍光波形の立ち上がりからピークまでの時間（ＴｔＰ）、波形の立ち上がりからピークに達した後さらにピーク値の５０％減衰するまでの時間（ＣａＤ５０）、７０％減衰するまでの時間（ＣａＤ７０）、９０％減衰するまでの時間（ＣａＤ９０）を解析した（図５−Ａ）。その結果、Ｅ４０３１の添加によりすべてのパラメータが４０％前後延長しており、ウェル間のばらつきも非常に少なかった（図５−Ｂ）。ＨＥＲＧチャネルを阻害すると心筋活動電位と細胞内カルシウムイオン上昇の持続時間が延長し、心電図において薬剤誘導性ＱＴ延長が起こることが知られている。この結果は、凍結解凍後もＨＥＲＧチャネル阻害剤の薬剤応答（ＱＴ延長）が安定して検出できることを示している。【００８６】
７．凍結解凍後の心筋細胞凝集体におけるＥ４０３１薬剤効果の濃度依存性
凍結解凍後７日目のヒトｉＰＳ細胞由来のＧＣａＭＰ−心筋細胞凝集体に、Ｅ４０３１を０、０．３、３、３０、３００ｎＭの各濃度で添加し、Ｅ４０３１による変化率を解析した。Ｅ４０３１を３００ｎＭで添加した前後のＧＣａＭＰ蛍光波形（図６−Ａ）とその各波形パラメータ変化率（図６−Ｂ）を示す。ＴｔＰ、ＣＡＤ５０、ＣＡＤ７０、およびＣＡＤ９０の値が、３ｎＭ以上のＥ４０３１添加において濃度依存的に延長した（図６−Ｃ）。この結果は、凝集体の凍結解凍後において、ＨＥＲＧチャネル阻害剤の薬剤応答（ＱＴ延長）が安定して高感度に検出できることを示している。このように濃度依存的なＥ４０３１薬剤応答（ＱＴ延長）を示すことは、薬剤の心毒性評価において重要である。これらの結果により、凝集体の凍結解凍後に心毒性評価が可能であることが示された。【００８７】
８.  凍結解凍後の心筋細胞凝集体におけるいくつかの薬剤（Ｅ４０３１、アステミゾール、ニフェカラント、クロマノール２９３ｂ、メキシレチン、ニフェジピン、イソプロテレノール、プロプラノロール、リアノジン）の薬剤効果
凍結解凍後７日目のヒトｉＰＳ細胞由来のＧＣａＭＰ−心筋細胞凝集体に、３００ｎＭ  Ｅ４０３１、１μＭ  アステミゾール、１μＭ  ニフェカラント、１０μＭ  クロマノール２９３ｂ、３０μＭ  メキシレチン、５０ｎＭ  ニフェジピン、３００ｎＭ  イソプロテレノール、１μＭ  プロプラノロール、または５０μＭ  リアノジンを添加し、各パラメータの変化率を解析した（図７−Ａ）。またＴｔＰ、ＣａＤ５０、ＣＡＤ７０、およびＣＡＤ９０の値をＰｔＰの立方根で割って補正した値の変化率（ＴｔＰｃＦ、ＣａＤ５０ｃＦ、ＣＡＤ７０ｃＦ、およびＣＡＤ９０ｃＦ）も示した（図７−Ｂ）。この補正は薬剤誘導性ＱＴ延長を解析する際に用いられる補正法である（修正ＱＴ間隔Fridericia法、QT corrected Fridericia）。Ｅ４０３１、アステミゾール、ニフェカラントはＨＥＲＧチャネル阻害剤であり、クロマノール２９３ｂはＫＣＮＱ１チャネル阻害剤、メキシレチンは電位依存性ナトリウムチャネル阻害剤、ニフェジピンはＬ型カルシウムチャネル阻害剤、イソプロテレノールはβ刺激剤、プロプラノロールはβ阻害剤、リアノジンは小胞体リアノジン受容体の阻害剤である。ＨＥＲＧ阻害剤、ＫＣＮＱ１阻害剤または電位依存性ナトリウムチャネル阻害剤の添加によりＴｔＰ、ＣＡＤ５０、ＣＡＤ７０およびＣＡＤ９０の値が延長し、Ｌ型カルシウムチャネル阻害剤でこれらのパラメータが短縮した。また、β刺激剤でＰｔＰが減少（心拍数が増加）し、β阻害剤でＰｔＰが増加（心拍数が減少）し、リアノジン受容体阻害剤でＰｔＰが増加してＧＣａＭＰ蛍光のピーク値（PeakValue、細胞内カルシウム増加量）が減少していた。これらの結果は、凍結解凍後の心筋細胞凝集体のカルシウム応答が実際の心臓における各種薬剤の効果を反映していることを示す。【００８８】
９．凍結解凍後の心筋細胞凝集体におけるアンスラサイクリン心毒性
凍結解凍後７日目のヒトｉＰＳ細胞由来のＧＣａＭＰ−心筋細胞凝集体を用いて、アンスラサイクリン系抗がん剤の心毒性を検出するために、ドキソルビシン（Doxorubicin）（１０μＭ）とダウノルビシン（Daunorubicin）（２０μＭ）を２４時間添加した。薬剤添加なしのコントロール心筋細胞凝集体（図８−Ａ、８−Ｂ）とドキソルビシン添加後３日（図８−Ｃ）あるいはダウノルビシン添加後３日（図８−Ｄ）の凝集体の細胞内カルシウム波形をＧＣａＭＰ蛍光でプロットした。その結果、アンスラサイクリン添加した凝集体ではＰｔＰが短く、頻脈が見られ、また心拍間隔が一定ではなく、不整脈の発生が見られた（図８−Ｃ、８−Ｄ）。ＱＴ延長等の数分〜数十分の短期間で見られる心毒性だけでなく、抗がん剤による心毒性のような、数日以上の長期にわたる心毒性も検出可能であることが示された。【００８９】
１０．凍結解凍後の心筋細胞凝集体におけるアンスラサイクリン心毒性の解析
ドキソルビシン（１０μＭ）とダウノルビシン（２０μＭ）添加による、ＧＣａＭＰ蛍光波形のパラメータ変化を解析した（図９−Ａ、９−Ｂ）。ＴｔＰやＣａＤに有意な変化はなかったが、ＰｔＰが有意に減少しており、頻脈が起こっていることが定量的に示されている。また、ＧＣａＭＰ蛍光波形の振幅（立ち上がりからピーク値までの蛍光量の絶対値）が有意に減少する傾向が見られた（図９−Ｃ）。この結果は、アンスラサイクリンの心毒性により心筋細胞死や細胞内カルシウムイオン増加量の低下が起こり、頻脈や不整脈が起きていることを示唆している。【００９０】
１１．サイズの異なる凝集体の凍結解凍前後の各パラメータ変化率
上記１のヒトｉＰＳ由来心筋細胞を用いて、比較的少量の細胞数（０．１×１０５細胞／ウェル）で作製した直径１００〜２００μｍの小さいサイズの凝集体（ＣＢ１＿Ｓｍａｌｌ  ｓｉｚｅ）と、比較的大量の細胞数（２×１０５細胞／ウェル）で作製した直径１２００〜１６００μｍの大きいサイズの凝集体（ＣＢ１＿Ｌａｒｇｅ  ｓｉｚｅ）について、上記１と同様にセルバンカー１を凍結保護液として用いて凝集体凍結を行い、凍結前後の変化を解析した（図１０）。上記５と同様に、凝集体の外径の直径（図１０中「直径」と示す）は、どちらのサイズの凝集体においても、１０％程度しか減少しなかった。また、ＧＣａＭＰ蛍光波形の各パラメータ（ＴｔＰ、ＣａＤ５０、７０、９０、ＰｔＰ）の凍結前後の変化率は±２５％以内であり、大きな変化は見られなかった。凝集体の細胞数とサイズを変えても、同様に凍結解凍が可能であった。
【図１】
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【図２】
2017159862.tif 000028
【図３】
2017159862.tif 000029
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月6日(2017.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体の凍結方法であって、
（ｉ）直径２００〜５０００μｍの多能性幹細胞由来心筋細胞の疑集体を凍結保護液に２〜２４℃で５〜６０分間浸漬すること、および、
（ｉｉ）凍結保護液に浸漬した前記凝集体を−６０〜−１５０℃で凍結すること、
を含む、方法。
【請求項２】
凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体の製造方法であって、
（ｉ）直径２００〜５０００μｍの多能性幹細胞由来心筋細胞の凝集体を凍結保護液に２〜２４℃で５〜６０分間浸漬すること、および、
（ｉｉ）凍結保護液に浸漬した前記凝集体を−６０〜−１５０℃で凍結すること、
を含む、方法。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
凝集体の直径が２００〜２０００μｍである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
多能性幹細胞由来心筋細胞がＧＦＰ−カルモジュリン−ミオシン軽鎖フラグメント結合蛋白質を発現する細胞である、請求項１、２および６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
多能性幹細胞由来心筋細胞が、
（１）多能性幹細胞をＷＮＴシグナル活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を含む培地中で培養すること、および
（２）工程（１）で得られた細胞をＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養すること、
を含む方法により得られたものである、請求項１、２、６および７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
凍結保護液がＤＭＳＯまたはグリセロールを含む、請求項１、２および６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１、２および６〜９のいずれかに記載の方法により凍結または製造された、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
解凍後に７０％以上の生存率を有する、請求項１０に記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
【請求項１３】
直径が２００〜５０００μｍである、凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体。
【請求項１４】
請求項１０、１２および１３のいずれかに記載の凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を含むキット。
【請求項１５】
薬剤応答評価または移植に用いるための、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
直径２００〜５０００μｍの凍結多能性幹細胞由来心筋細胞凝集体を含む、組成物。
【請求項１７】
薬剤応答評価または移植に用いるための、請求項１６に記載の組成物。
【国際調査報告】
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2017159862.tif 000038
2017159862.tif 000039
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