(57)【要約】  ヒドロキシアルキルキトサンを含む細胞培養担体において、温度応答性を維持しつつ力学的特性を向上させることを目的とし、温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンと、ポリエチレングリコール、その誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸およびそれらの塩から選択される水溶性高分子とを含む、温度応答性を有することを特徴とする細胞培養担体を提供するものである。
2018043153.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンと、ポリエチレングリコール、その誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸およびそれらの塩から選択される水溶性高分子とを含む、温度応答性を有することを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
前記水溶性高分子の数平均分子量が２０，０００以上である、請求項１に記載の細胞培養担体。
【請求項３】
前記水溶性高分子の含有量が０．０１重量％以上１０重量％以下である、請求項１または２に記載の細胞培養担体。
【請求項４】
４℃〜３７℃に下限臨界溶液温度を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項５】
４℃における貯蔵弾性率Ｇ’が５０（Ｐａ）未満であり、２５〜４０℃における最大貯蔵弾性率が１００Ｐａ以上である、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項６】
前記ヒドロキシアルキルキトサンと前記水溶性高分子が非架橋状態にある、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコールが、２種類のマルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体を含む、請求項１〜６の何れかに記載の細胞培養担体。
【請求項８】
下記溶液Ａおよび水溶液Ｂ、 
水溶液Ａ：第１のマルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体を含む水溶液；
水溶液Ｂ：前記第１のマルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体と反応し得る第２のポリエチレングリコール活性誘導体を含む水溶液
を含み、水溶液Ａまたは水溶液Ｂの少なくとも一方はヒドロキシアルキルキトサンを含む、細胞培養担体作製キット。
【請求項９】
下限臨界溶液温度未満の温度でゾル状態または液体状態にある請求項１〜７のいずれかに記載の細胞培養担体に細胞を分散させる工程、および得られた細胞分散体を、下限臨界溶液温度以上の温度に加温してゲル化させる工程を含む、ゲル／細胞ハイブリッド組織の製造方法。
【請求項１０】
下限臨界溶液温度未満の温度でゾル状態または液体状態にある請求項１〜７のいずれかに記載の細胞培養担体に細胞を分散させて得られた細胞分散体を、３Ｄプリンタを使用して、所定の立体構造を有する細胞培養担体に造形する工程を含む、ゲル／細胞ハイブリッド組織の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養担体に関するものであり、より詳細には所定の温度応答性高分子と水溶性高分子とを含む温度応答性細胞培養担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養担体は、所定の構造を有する細胞組織を培養するために用いられる。例えば、ポリ乳酸からなる多孔性の足場材料内で細胞を培養することにより、細胞が足場材料に接着し、足場材料と細胞からなる立体構造を有する細胞組織が得られる（例えば、非特許文献１）。【０００３】
しかし、こうした足場材料は、組織形成後に取り除くことが難しく、細胞の含有率が高い、あるいは細胞のみからなる細胞組織を得ることが困難であった。【０００４】
また、再生医療において、足場材料と細胞から成る組織を体内に移植する場合は、人工物である足場材料が残留すること、あるいは足場材料が消失するのに非常に長い期間を要することが課題となっていた。【０００５】
そこで、刺激応答性材料を足場材料として用い、組織形成後に何らかの刺激を加えることにより足場材料を除去することが試みられている。このような目的のための刺激応答性材料としては、温度に応答して状態が変化する温度応答性高分子が注目されている。例えば、ある温度以上でゲル（固体状）、以下でゾル（液体状）になる温度応答性高分子を足場材料として使用すると、細胞組織形成後に温度を低下させてゾル化させることで足場材料を除去することができる。【０００６】
このように注目される温度応答性高分子は、一般に水和状態にある高分子が、ある一定温度以上で脱水和して体積や形態、性質等が変化する下限臨界溶液温度(Lower Critical Solution Temperature; 以下、「ＬＣＳＴ」と略す。）を示すものと、ある一定温度以上で水和して体積や形態、性質等が変化する上限臨界溶液温度（Upper Critical Solution Temperature; 以下「ＵＣＳＴ」と略す。）を示すものが知られている。ＬＣＳＴを示すものとして、例えば、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）のホモポリマーまたはコポリマーやポロキサマーが知られている。特に、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）系ゲルは、体温に近い３２℃付近で膨潤、収縮の体積転移が起こることから、医療材料等として広く研究が行われている（例えば、特許文献１）。【０００７】
しかし、ＰＮＩＰＡＭは、ゲル形成に非可逆的な化学架橋を必要とするため、組織形成後に除去することが困難である。また、ポロキサマーは毒性を示すのに加えて、ゲル化に高濃度を必要とすることや培地の添加で溶解する問題があり使用されていない。【０００８】
それに対して、ヒドロキシアルキルキトサンは２５℃付近にＬＣＳＴを有し、ゾル−ゲル転移することから、組織形成後に除去が可能であり、更に低毒性でもあることから、細胞培養担体としての利用が期待されている（例えば、非特許文献２および特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−２２３１０６号公報
【特許文献２】国際公開第２０１５／１２９８８１号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Nature Biotechnology, vol.12, 1994, p689
【非特許文献２】Biomaterials, vol.27, 2006, p406
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、細胞の増殖には、細胞培養担体が一定以上の強度であることが必要である。従来のヒドロキシアルキルキトサンのゲルは力学的強度が弱いため、細胞培養担体として用いても細胞の増殖が起こらず、ゲル内での細胞組織形成が難しいのに加えて、形成した細胞組織の移植等の際のハンドリングも困難であった。例えば、再生医療用途で立体構造を有する細胞組織を製造する場合に、ヒドロキシブチルキトサンゲル中で細胞を培養すると、ゲルの立体構造を維持できないのに加えて、製造中の取り扱いが困難であった。また、三次元造形装置（３Ｄプリンタ）によりヒドロキシアルキルキトサンゲルを三次元に造形することも行われているが、極めて細い紐状の細胞含有ゲルを積層することで立体構造を構築するため、自重に耐えきれず、構造を維持することができなかった。【００１２】
本発明は、ヒドロキシアルキルキトサンを含む細胞培養担体において、温度応答性を維持しつつ力学的特性を向上させることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
すなわち、本発明は、温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンと、ポリエチレングリコール、その誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸およびそれらの塩から選択される水溶性高分子とを含む、温度応答性を有することを特徴とする細胞培養担体を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ヒドロキシアルキルキトサン単体で構成したゲルの力学的強度を向上、改良させることができ、温度応答性と優れた力学的特性とを両立させた細胞培養担体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒドロキシブチルキトサンとヒアルロン酸、ヒト繊維芽細胞からなるゲル／細胞ハイブリッド組織の上方からの写真。
【図２】ヒドロキシブチルキトサンを除去して得られた細胞組織切片の顕微鏡写真。
【図３】３Ｄプリンタに格子状にバイオプリンティングしたヒドロキシブチルキトサンとヒアルロン酸、ヒト繊維芽細胞からなるゲル／細胞ハイブリッド組織の顕微鏡写真。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜細胞培養担体＞
本発明は、温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンと、ポリエチレングリコール、その誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸およびそれらの塩から選択される水溶性高分子とを含む、温度応答性を有することを特徴とする細胞培養担体に関する。
【００１７】
また、本発明は、温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンに、ポリエチレングリコール、その誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸およびそれらの塩から選択される水溶性高分子を含ましめることを特徴とする、ヒドロキシアルキルキトサン単体で構成した細胞培養担体（ゲル）の力学的強度を改良する方法を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、ヒドロキシアルキルキトサン単体で構成した細胞培養担体（ゲル）の力学的強度に比べその強度が改良された温度応答性細胞培養担体を製造する方法であって、温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンとともに、ポリエチレングリコール、その誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸およびそれらの塩から選択される水溶性高分子を含ましめることを特徴とする、上記製造方法を提供する。
【００１９】
〔温度応答性ヒドロキシアルキルキトサン〕
本発明の細胞培養担体は、ヒドロキシアルキルキトサン（ヒドロキシアルキル基導入キトサン）を含む。ヒドロキシアルキルキトサンとしては、ヒドロキシエチルキトサン、ヒドロキシプロピルキトサン、ヒドロキシイソプロピルキトサン、ヒドロキシブチルキトサン、ヒドロキシペンチルキトサン、好ましくはヒドロキシブチルキトサンが挙げられる。
【００２０】
ヒドロキシアルキルキトサンは、例えば、キトサンのアミノ基および／または水酸基を、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ブチレンオキシド、プロピレンオキシドなどでヒドロキシアルキル化する方法などで製造することができる。また、キチンを出発物質とし、これをヒドロキシアルキル化した後、脱アセチル化してもよい。
【００２１】
ヒドロキシアルキルキトサンは、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）以下では流動性のある状態（液体またはゾル）、ＬＣＳＴ以上では固体（ゲル）状態となる温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンを用いる。温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンのLCSTは、用途に応じて調整することができる。例えば、単糖あたりのヒドロキシアルキル基の導入数を下げるとLCSTを上昇させることができ、導入数を上げると低下させることができる。キトサン分子の単糖単位あたりのヒドロキシアルキル基の導入数は、１．０〜３．０個が好ましく、１．５〜２．５個がより好ましい。ヒドロキシアルキル基の導入部位は、キトサンのアミノ基でもヒドロキシル基でも良いが、単糖単位あたりに少なくとも１個はアミノ基に導入されていることが望ましい。
【００２２】
また、ヒドロキシアルキルキトサンの脱アセチル化度は、特に制限されないが、LCST以下の温度で水溶性を維持するために、ピラノース環１モル当り好ましくは５０〜１００モル％の範囲が好ましい。
【００２３】
ヒドロキシアルキルキトサンの分子量は特に限定されないが、水溶性高分子との絡み合いによる相互貫入ネットワークを形成させる点では、数平均分子量が３，０００以上であることが好ましく、１０,０００以上であることがより好ましく、１００,０００以上であることが更に好ましく、１５０,０００以上であることがより更に好ましい。ヒドロキシアルキルキトサンの分子量の上限は、温度応答性が発現する限り特に限定されず、〜１,０００,０００程度まで、好ましくは〜９００,０００程度まで、より好ましくは〜８００,００００程度までのものを使用できる。
【００２４】
なお、本明細書において、ヒドロキシアルキルキトサンの分子量は、還元末端をＳｈａｌｅｓ変法で定量し求めたものである。
【００２５】
細胞培養担体中におけるヒドロキシアルキルキトサンの重量濃度は、温度応答前後の形状および／または性質等の変化がより顕著に発揮できる点で、５０重量％以下であることが好ましく、３０重量％以下であることがより好ましく、２０重量％以下であることがさらに好ましく、１０重量％以下であることがよりさらに好ましい。また、細胞培養担体が必要十分な力学的特性を保つ点で、０．１０重量％以上が好ましく、０．５０重量％以上がより好ましく、１．０重量％以上が更に好ましく、１．５重量％以上がより更に好ましい。
【００２６】
〔水溶性高分子〕
本発明の実施態様に係る細胞培養担体に用いる水溶性高分子としては、ポリエチレングリコール、その誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸およびこれらの塩から選択されるものが用いられる。
【００２７】
ポリエチレングリコールおよびその誘導体としては、ポリエチレングリコール活性誘導体、好ましくはマルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体、より好ましくは、２から８、さらにより好ましくは４から８分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体が挙げられる。このようなマルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体は、末端に相互に反応し得る官能基を有する２種類の活性誘導体を混合（反応）して得られるものが好ましい。相互に反応し得る２種類の官能基としては、アミノ基と活性エステルの組み合わせ、チオール基とマレイミド基の組み合わせが好ましい。活性エステルとしては、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミドとカルボン酸が縮合したものが好ましい。
【００２８】
ヒアルロン酸の由来は特に限定されず、鶏冠、靱帯由来のもの、乳酸菌や連鎖球菌により生産されたものを使用することができる。
【００２９】
アルギン酸の由来は特に限定されず、褐藻、紅藻由来のもの、細菌により生産されたものを使用することができる。
【００３０】
本発明で用いる水溶性高分子の分子量は、水に溶解する限り特に限定されないが、ヒドロキシアルキルキトサンとの絡み合いによる相互貫入ネットワークを形成させる点では、数平均分子量が１０,０００〜１,５００,０００、好ましくは１５,０００〜１２００,０００程度のものを使用できる。具体的には、ポリエチレングリコールおよびその誘導体は、数平均分子量が１０，０００以上、好ましくは１５，０００以上程度のものを使用でき、アルギン酸、ヒアルロン酸については、数平均分子量が１０，０００以上、好ましくは１００,０００以上、より好ましく２００,０００以上、さらに好ましくは３００,０００以上、さらにより好ましくは４００,０００以上、１,５００,０００以下、好ましくは１,３００,０００以下程度のものを使用できる。なお、本明細書における水溶性高分子の分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて求めた値である。
【００３１】
細胞培養担体中における水溶性高分子の重量濃度は、温度応答の前後での形状および／または性質等の変化がより顕著に発揮できる点で、１０重量％以下であることが好ましく、５．０重量％以下であることがより好ましく、３．０重量％以下であることが更に好ましい。また、細胞培養担体の力学的特性の向上効果を十分に得るためには、０．０１重量％以上が好ましく、０．０５重量％以上が好ましく、０．１重量％以上がより好ましい。
【００３２】
細胞培養担体中におけるヒドロキシアルキルキトサンと水溶性高分子は、ＬＣＳＴ以下での流動性を保つために、非架橋状態にあることが望ましい。LCST以下で流動性が保たれることによって、３Ｄプリンタによる組織製造時に分注チップからの吐出が容易になる。
【００３３】
〔温度応答性〕
本明細書において「温度応答性」とは、外部温度変化に応答し、その温度変化が起こる前とその温度変化が起こる後で液体状と固体状間の変化、すなわちゾル−ゲル転移を起こす性質を言う。
【００３４】
細胞培養担体が温度応答性を有することにより、ＬＣＳＴ未満として流動性を保ったゾル状態で細胞を分散させることができる。また、三次元細胞組織を形成させる培養中にはＬＣＳＴ以上として立体構造を保つことができる。さらに、三次元細胞組織形成後には再びＬＣＳＴ未満としてゾル状態にすることで、ヒドロキシアルキルキトサンを取り除くことができる。本発明における細胞培養担体は、取り扱いや細胞培養の点から、室温以下でゾル状態、細胞培養温度および体温でゲル状態であることが望ましく、好ましくは４℃〜３７℃にＬＣＳＴを有し、より好ましくは２５℃〜３７℃にＬＣＳＴを有する。
【００３５】
ここで、本明細書において、細胞培養担体が「温度応答性を有する」とは、４℃における貯蔵弾性率（Ｇ’（４℃））と３７℃における貯蔵弾性率（Ｇ’（３７℃））の比（Ｇ’（３７℃）／Ｇ’（４℃））が、１．０を上回ることを意味するものとする。Ｇ’（３７℃）／Ｇ’（４℃）は、１．５以上であることが好ましく、２．０以上であることがより好ましく、１０以上であることがさらに好ましく、１００以上であることが一層好ましい。
【００３６】
４℃における貯蔵弾性率は、５０Ｐａ未満であることが好ましく、１０Ｐａ未満であることがより好ましい。５０Ｐａ未満、より好ましくは１０Ｐａ未満であることによって、細胞の懸濁や３Ｄプリンタによる吐出、細胞組織形成後の除去が容易になる。
【００３７】
また、取り扱いのし易さや立体構造の維持等の効果を発揮する観点から、２５〜４０℃における最大貯蔵弾性率が１００Ｐａ以上であることが好ましく、３００Ｐａ以上であることがより好ましく、１０００Ｐａ以上であることが更に好ましい。２５〜４０℃における最大貯蔵弾性率の上限は特に限定されないが、一般に５００００Ｐａ以下となる。本発明でいう最大貯蔵弾性率とは、所定の温度範囲での貯蔵弾性率のうち、最大のものをいう。本発明における貯蔵弾性率（G’）は、パラレルプレートをプレート間隔０．５ｍｍで取り付けた動的粘弾性測定装置に、測定するサンプル液を入れてから５分間静置後、ひずみ１％、周波数１Ｈｚ、昇温速度１．８℃/分で測定した値を用いる。なお、より具体的には、３７℃における貯蔵弾性率が１００Ｐａ以上であることが好ましく、３００Ｐａ以上であることがより好ましく、１０００Ｐａ以上であることが更に好ましい。３７℃における貯蔵弾性率の上限は特に限定されないが、一般に５００００Ｐａ以下となる。
【００３８】
細胞培養担体中におけるヒドロキシアルキルキトサンと水溶性高分子の重量濃度比（ヒドロキシアルキルキトサン／水溶性高分子）は、１．０〜１００であることが好ましく、１．０〜３０がより好ましく、１．０〜２５が更に好ましい。当該重量比を１００以下、より好ましくは３０以下、更に好ましくは２５以下とすることにより、ヒドロキシアルキルキトサンに対して水溶性高分子が適度に分散して、力学的特性を向上させることができる。重量比が０．５以下である場合、水溶性高分子の絡まりやヒドロキシアルキルキトサンの寄与の減少等によってヒドロキシアルキルキトサンと水溶性高分子と水からなる材料が温度応答性を示さない場合がある。
【００３９】
特に、水溶性高分子がポリエチレングリコールである場合には、ヒドロキシアルキルキトサン／水溶性高分子が１．０以上３．５以下の場合、力学的特性の向上効果が特に顕著に発揮される。また、特に、水溶性高分子がヒアルロン酸である場合には、ヒドロキシアルキルキトサン／水溶性高分子が１０以上２０以下の場合、力学的特性の向上効果が特に顕著に発揮される。アルギン酸の場合、ヒドロキシアルキルキトサン／水溶性高分子が、５以上２０以下の場合、力学的特性の向上効果が特に顕著に発揮される。
【００４０】
ヒドロキシアルキルキトサンおよび水溶性高分子は、水性液剤に分散および／または溶解、好ましくは溶解していることが好ましい。水性液剤としては、例えば、水、水性緩衝液（リン酸緩衝液、トリス一塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液など）、生理食塩水、糖水溶液（５重量％グルコース水溶液、ブドウ糖水溶液など）、細胞培養液（例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地）が挙げられる。水溶液中の緩衝剤、塩、糖、その他培養液に添加されている溶質の濃度は、ヒドロキシアルキルキトサンのヒドロゲルが形成される濃度であれば良い。
【００４１】
＜細胞培養担体作製キット＞
本発明によれば、次のような細胞培養担体作製キットが提供される。すわなち、第１のポリエチレングリコール活性誘導体を含む水溶液Ａと前記第１のポリエチレングリコール活性誘導体と反応し得る第２のポリエチレングリコール活性誘導体を含む水溶液Ｂとからなり、水溶液Ａまたは水溶液Ｂの少なくとも一方はヒドロキシアルキルキトサンを含む。ポリエチレングリコール活性誘導体としては、上記したマルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体が好ましく使用される。
【００４２】
水溶液Ａまたは水溶液Ｂの少なくとも一方に、細胞を分散させた後、両者を混合することで、第１および第２のポリエチレングリコール活性誘導体間に架橋結合が形成される。例えば、水溶液Ａがアミノ基を有する活性誘導体を含む場合、活性エステルを有する活性誘導体を含む水溶液Ｂを用いることができる。また、例えば、水溶液Ａがチオール基を有する活性誘導体を含む場合、マレイミド基を有する活性誘導体を含む水溶液Ｂを用いることができる。これらの例の場合、水溶液Ａ中のポリエチレングリコール活性誘導体のモル濃度と水溶液Ｂ中のポリエチレングリコール活性誘導体のモル濃度との比率（水溶液Ａ／水溶液Ｂ）は、より効率的に反応が進み、細胞培養担体の力学的特性向上効果を十分に得させるために、０．５〜２．０が好ましく、０．９〜１．１がより好ましい。水溶液ＡおよびＢには、温度応答性を損なわない限り、細胞培養に適した緩衝剤、塩、糖などの添加剤を加えることができる。
【００４３】
＜細胞組織の製造方法＞
ＬＣＳＴ未満の温度でゾル状態または液体状態にある本発明の細胞培養担体に細胞を分散し、その細胞分散体を、その後ＬＣＳＴ以上の温度に加温してゲル化させることで、ゲル／細胞ハイブリッド組織（以下、単に「ハイブリッド組織」ということがある）を製造することができる。
【００４４】
ハイブリッド組織を作製する際には、まず、ＬＣＳＴ未満の温度でゾル状態または液体状態にある本発明の細胞培養担体中に細胞を分散させる。以下、細胞を分散させたゾル状態または液体状態の細胞培養担体を、「液状細胞組成物」と呼ぶ。このときの細胞濃度は、１．０×１０６〜 １．０×１０８個/mlとすることが好ましく、３．０×１０７〜 １．０×１０８個/mlとすることがより好ましい。
【００４５】
液状細胞組成物は、任意の形状をした細胞培養用基材を用い、任意の形状に加工することができる。例えば、平板上の細胞培養用基材上に液状細胞組成物を流延した後、ＬＣＳＴ以上の温度に加温することで、液状細胞組成物をシート状にゲル化させることができる。また、立体的な鋳型となる細胞培養用基材に液状細胞組成物を流し込んだ後、ＬＣＳＴ以上の温度に加温することで、液状細胞組成物を立体的にゲル化させることができる。
【００４６】
細胞培養用の基材は、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ乳酸、ポリエステル、ポリビニルアルコール、セルロース、ポリアクリレート、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリウレタンおよびポリイミドなどの成形性に優れたプラスチック、あるいはガラス、金、白金、銅、チタン、タンタル、ジルコニア、シリカ、アルミナ、ハイドロキシアパタイト、リン酸カルシウムおよびリン酸マグネシウム等の無機物により形成されたものを用いることができる。
【００４７】
液状細胞組成物を細胞培養用の基材の上に、ピペット、スポッターおよびアレイヤー等を使用してスポットすれば、ドット状のパターンを形成することができる。スタンプ法、ステンシル法およびスプレー法などを使用すると、さらに精密なパターンを形成することもできる。このようなパターンは、規則的なものであっても不規則なものであってもよい。
【００４８】
形状を固定する際の温度は、細胞培養担体のＬＣＳＴ以上であれば特に限定されないが、細胞へ障害を与えないためには４０℃以下が好ましく、更に好ましくは３７℃以下である。ゲル化する、すなわち形状を固定するための加温時間は特に限定されないが、例えば、１０秒から３０分であることが好ましく、更に好ましくは３０秒から５分である。
【００４９】
ゲル化により形状を固定化した後、ＬＣＳＴ以上の温度に保たれた培養液を添加し、ＬＣＳＴ以上の細胞培養に適した温度で培養を行うことで、本発明の細胞培養担体と該細胞培養担体に保持された細胞組織とからなるハイブリッド組織が得られる。
【００５０】
＜バイオインク＞
三次元造形装置（例えば、３Ｄプリンタやバイオプリンタ）を用いて、細胞培養担体を立体的に造形することも可能である。すなわち、下限臨界溶液温度未満の温度でゾル状態または液体状態にある本発明の細胞培養担体に細胞を分散させて得られた細胞分散体を、３Ｄプリンタを使用して、所定の立体構造を有する細胞培養担体に造形する工程を経て、ゲル／細胞ハイブリッド組織を製造できる。このような手法は、一般にバイオプリンティングと呼ばれている。バイオプリンティングにおいては、コンピュータープログラムに従い、任意の位置に正確に液状細胞組成物を配置できる。例えば、ディスペンサー型三次元造形装置を用いたバイオプリンティングでは、ゾル状態または液体状態にある本発明の細胞培養担体と細胞とを混合して液状細胞組成物（バイオインク）を調製し、貯蔵器に接続された分注チップ（例えば、注射器、キャピラリーチューブなど）を介して吐出する。そして、吐出されたバイオインクを瞬時にＬＣＳＴ以上の温度に加温することにより、細胞培養担体をゲル化さる。この操作をコンピュータープログラムに従って繰り返すことで、ハイブリッド組織を立体的に造形することができる。
【００５１】
バイオプリンティングにおいては、繰り返しパターンでバイオインクを吐出することができる。繰り返しパターンは、例えば、円、正方形、長方形、三角形、多角形、および不規則な幾何学的形状を含む、任意の適切な幾何学的構造をとることができる。更に、繰り返しパターンは層状に積み重ねることができ、複数の層は隣接してプリントされ、ハイブリッド組織が形成される。
【００５２】
＜細胞培養担体を実質的に含まない細胞組織＞
ハイブリッド組織が得られた後、さらにＬＣＳＴ未満に温度を下げ、細胞培養担体を再びゾル化させて除去することで、細胞培養担体を実質的に含まない細胞組織を得ることができる。ここで、細胞培養担体を実質的に含まない、とは、細胞培養担体が全く残存していないか、残存していたとしても細胞組織全体中の１重量％以下となっている状態を意味するものとする。細胞培養担体のゾル化のための温度は、ＬＣＳＴ以下であれば特に限定されず、下限の温度は例えば４℃である。除去のための時間は特に限定されないが、３０秒から１０分とすることが好ましい。
【００５３】
本発明の細胞培養担体は、神経、心臓、血管、軟骨、皮膚、角膜、腎臓、肝臓、毛髪、心筋、筋肉および腱などの組織再生または移植用組織形成に使用する足場成型体の一部または全部に使用することができる。また、本発明の細胞培養担体を用いて、培養し得る細胞の具体例としては、繊維芽細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、肝細胞、小腸上皮細胞、表皮角化細胞、骨芽細胞、骨髄間葉細胞等を例示でき、好ましいものとしては繊維芽細胞を例示できる。更に、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、中胚葉系幹細胞、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、多能性幹細胞、ＣＤ３４陽性細胞、免疫系細胞、血球系細胞、神経細胞、膵β細胞、心筋細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、羊膜細胞および臍帯血細胞などの生体由来の細胞、ＮＩＨ３Ｔ３（エヌアイエイチスリーティースリー）細胞、３Ｔ３−Ｌ１（スリーティースリーエルワン）細胞、３Ｔ３−Ｅ１（スリーティースリーイーワン）細胞、Ｈｅｌａ（ヒーラ）細胞、ＰＣ１２（ピーシーツェルブ）細胞、Ｐ１９（ピーナインティーン）細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵母）細胞、ＣＯＳ（シーオーエス）細胞、ＨＥＫ（エッチイーケー）細胞、Ｈｅｐ−Ｇ２（ヘップジーツー）細胞、ＣａＣｏ２（カコツー）細胞、Ｌ９２９（エルナインツーナイン）細胞、Ｃ２Ｃ１２（シーツーシーツェルブ）細胞、Ｄａｕｄｉ（ダウディ）細胞、Ｊｕｒｋａｔ（ジャーカット）細胞、ＫＧ−１ａ（ケージーワンエー）細胞、ＣＴＬＬ−２（シーティーエルエルツー）細胞、ＮＳ−１（エヌエスワン）細胞、ＭＯＬＴ−４（エムオーエルティーフォー）細胞、ＨＵＴ７８（エッチユーティーセブンティエイト）細胞およびＭＴ−４（エムティーフォー）細胞などの株化細胞、あるいは抗体産生細胞である各種ハイブリドーマ細胞株、およびこれら細胞を遺伝子工学的に改変した細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本発明の細胞培養担体は、再生医療用途の細胞組織を再生するために使用することができる。再生される対象としては、血管、心臓弁、心膜、骨、軟骨、神経、皮膚、粘膜、靭帯、腱、筋肉、気管、食道、腸、硬膜などの全ての臓器、組織が含まれる。医療成型体や医療材料として目的を達した後、温度変化によりヒドロキシアルキルキトサンを除去することも可能である。本発明の細胞培養担体と該細胞培養担体に保持された細胞組織とを含むゲル／細胞ハイブリッド組織は、例えば、再生医療用途で生体内にそのまま移植してもよい。このような技術を応用すれば、再生医療、組織工学、細胞培養、バイオセンサー、バイオチップおよびドラッグスクリーニングを用途とした医療、研究および分析分野のデバイス開発が可能となる。
【００５５】
また、細胞として組織由来の細胞を使用することにより、例えば、筋芽細胞を使用すれば筋組織が、心筋細胞を使用すれば心筋が、また血管内皮細胞を使用すれば血管が細胞培養担体の形状に組織形成することができる。
【００５６】
以下、具体的に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はそれらの実施例に限定的に解釈されるべきでなく、本発明の概念に接した当業者が想到し、実施可能であると観念するであろうあらゆる技術的思想、その具体的態様が本発明に含まれるものとして理解されるべきものである。
【実施例】
【００５７】
実施例中の貯蔵弾性率は以下の方法で測定した。
粘弾性測定はＡｎｔｏｎ  Ｐａａｒ製レオメーター“Ｐｈｙｓｉｃａ  ＭＣＲ３０２”(登録商標)を用いて行った。測定条件を以下に示す。
・プレート：パラレルプレート（φ２５ｍｍ）
・プレート間隔：０．５ｍｍ
・ひずみ：１％
・周波数：１Ｈｚ
・温度変化範囲：４℃〜４０℃
・温度変化速度：１．８℃／分【００５８】
＜試験例１：細胞を含まない細胞培養用担体＞
［水溶性高分子としてPEGを用いたサンプルの調製］
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が２．１のヒドロキシブチルキトサン（分子量２０万）および末端にアミノ基が導入された４分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体（日油製、分子量２万）を４℃で水に溶解させて溶液Ａを調製した。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は２．５重量％、４分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体の重量濃度は、０、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、５．０もしくは１０重量％である。【００５９】
別途、単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が２．１のヒドロキシブチルキトサン（分子量２０万）および末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルが導入された４分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体（日油製、分子量２万）を４℃で水に溶解させて溶液Ｂを調製した。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は２．５重量％、４分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体の重量濃度は、０、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、５．０もしくは１０重量％である。【００６０】
２００μＬの溶液Ａと２００μＬの溶液Ｂを４℃で混合し、ヒドロキシブチルキトサン２．５重量％、４分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、５．０もしくは１０重量％の溶液を得た。一晩、３７℃で静置することで、アミノ基と活性化エステルの反応を完了した。【００６１】
［水溶性高分子としてヒアルロン酸またはアルギン酸を用いた場合のサンプル調製］
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が１．９のヒドロキシブチルキトサン（分子量２０万）と、ヒアルロン酸（分子量１００万）またはアルギン酸（分子量５０万）を４℃で水に溶解させて溶液を得た。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は２．５または５．０重量％、ヒアルロン酸の重量濃度は、０．２５または０．５重量％、アルギン酸の重量濃度は、０．２５、０．５、０．７５、１または２重量％である。【００６２】
試験例１で調製した各細胞培養用担体サンプルの３７℃および４℃における弾性率およびその比を表１に示す。
【表１】
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【００６３】
＜試験例２：細胞を含む細胞培養用担体＞
［水溶性高分子としてPEGを用いたサンプルの調製］
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が１．８のヒドロキシブチルキトサン（分子量２０万）および末端にチオール基が導入された４分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体（日油製、分子量２万）を４℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液Ａを調製した。更に、溶液Ａには、ヒト繊維芽細胞を分散させた。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は２．５重量％、４分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体の重量濃度は、０．７５重量％である。【００６４】
別途、単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が１．８のヒドロキシブチルキトサン（分子量２０万）および末端にマレイミド基が導入された４分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体（日油製、分子量２万）を４℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液Ｂを調製した。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は２．５重量％、４分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体の重量濃度は、０．７５重量％である。【００６５】
２００μＬの溶液Ａと２００μＬの溶液Ｂを４℃で混合し、ヒドロキシブチルキトサン２.５重量％、４分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体（ＰＥＧ）０、０．７５重量％、細胞濃度５．０×１０７個／ｍＬの細胞分散液を得た。一晩、３７℃で培養液中で培養することで、チオール基とマレイミド基の反応を完了した。得られた組成物の弾性率を、４℃から４０℃まで１．８℃／分で昇温しつつ測定した。表２に、４℃、３７℃での貯蔵弾性率（Ｇ’）と、それらの比を示す。【００６６】
［水溶性高分子としてヒアルロン酸またはアルギン酸を用いた場合のサンプル調製］
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が１．８のヒドロキシブチルキトサン（分子量２０万）およびヒアルロン酸（分子量１００万）、アルギン酸（分子量５０万）を４℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液を得た。この溶液にヒト繊維芽細胞を分散させ細胞分散液を得た。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は２．５重量％、ヒアルロン酸の重量濃度は、０、０．１２５または０．２５重量％、アルギン酸の濃度は０．２５または０．５重量％、細胞濃度は５．０×１０７個／ｍＬである。【００６７】
試験例２で調製した各細胞培養用担体サンプルの３７℃および４℃における弾性率およびその比を表２に示す。
【表２】
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【００６８】
＜製造例１：ゲル／細胞ハイブリッド組織の作製＞
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が１．８のヒドロキシブチルキトサン（分子量８０万）およびヒアルロン酸（分子量１００万）を４℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液を得た。この溶液にヒト繊維芽細胞を分散させ細胞分散液を得た。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は２．５重量％、ヒアルロン酸の重量濃度は、０．1２５重量％、細胞濃度１．０×１０８個／ｍＬである。分散液を直径３５ｍｍの細胞培養用ポリスチレンディッシュ上に円形に成形し、３７℃で５分間静置することで分散液をゲル化させた。３７℃の細胞培養用の培地（１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM培地））を添加した後、３７℃で一晩培養することで、ゲル／細胞ハイブリッド組織を得た（図１）。【００６９】
＜製造例２：細胞培養担体を実質的に含まない細胞組織の作製＞
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が１．８のヒドロキシブチルキトサン（分子量８０万）およびヒアルロン酸（分子量１００万）を４℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液を得た。この溶液にヒト繊維芽細胞を分散させ細胞分散液を得た。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は２．５重量％、ヒアルロン酸の重量濃度は、０．1２５重量％、細胞濃度１．０×１０８個／ｍＬである。分散液を直径３５ｍｍの細胞培養用ポリスチレンディッシュ上に円形に成形し、３７℃で５分間静置することで分散液をゲル化させた。３７℃の細胞培養用の培地（１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地、２ｍL）を添加した後、３７℃で一晩培養した。培養後、４℃で１０分間冷却し、細胞培養担体をゾル化させ、担体を含んだ培地を吸引除去した。新鮮な培地を添加した後に更に一晩培養することで、細胞培養担体を実質的に含まない細胞組織を得た（図２）。【００７０】
＜製造例３：３Dプリンタを用いたゲル／細胞ハイブリッド組織の作製＞
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が１．８のヒドロキシブチルキトサン（分子量８０万）およびヒアルロン酸（分子量１００万）を４℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液を得た。この溶液にヒト繊維芽細胞を分散させ細胞分散液を得た。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は２．５重量％、ヒアルロン酸の重量濃度は０．１２５重量％、細胞濃度は５．０×１０７個／ｍＬである。１０℃に冷却した分散液を３Ｄプリンタ（武蔵エンジニアリング社製；SHOTMASTER200DS）で、３７℃に保った直径３５ｍｍの細胞培養用ガラスボトムディッシュ上に格子状にプリントした。細胞培養用の培地（１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地）を添加した後、３７℃で一晩培養することで、ゲル／細胞ハイブリッド組織を得た（図３）。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、温度応答性と力学的特性を両立することができる細胞培養担体およびそれを用いた医療材料として利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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