(57)【要約】下記式（Ｉａ）等で表されるプリンヌクレオシド誘導体が開示される。    【化１】2018047909.tif 000023Ｘ１及びＸ２はぞれぞれ独立に窒素原子、−ＣＨ＝又は−ＣＲ２＝（Ｒ２はアルキル基を示す。）を示し、Ａｒは置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示し、Ｒ１は水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示し、Ｚは糖残基を示す。
2018047909.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）：
【化１】
2018047909.tif 000017
で表され、これら式中、Ｘ１及びＸ２はぞれぞれ独立に窒素原子、−ＣＨ＝又は−ＣＲ２＝（Ｒ２はアルキル基を示す。）を示し、Ａｒは置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示し、Ｒ１は水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示し、Ｚは下記式（ＩＩＩ）：
【化２】
2018047909.tif 000018
で表される糖残基を示し、式中、＊は窒素原子との結合部位を示し、Ｙ２は水素原子又は水酸基を示し、Ｙ５は水酸基又はリン酸基を示し、式中の水酸基及びリン酸基はそれぞれ独立にアニオン化していても、化学修飾されていてもよい、
プリンヌクレオシド誘導体。
【請求項２】
下記式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）：
【化３】
2018047909.tif 000019
で表され、これら式中、Ｘ１及びＸ２はぞれぞれ独立に窒素原子、−ＣＨ＝又は−ＣＲ２＝（Ｒ２はアルキル基を示す。）を示し、Ａｒは置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示し、Ｒ１は水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示し、Ｚは下記式（ＩＶ）：
【化４】
2018047909.tif 000020
で表される基を示し、式中、＊は窒素原子との結合部位を示し、Ｂａｓｅは核酸塩基を示し、式中の水酸基及びリン酸基はそれぞれ独立にアニオン化していても、化学修飾されていてもよい、
プリンヌクレオシド誘導体。
【請求項３】
下記式（Ｉａ’）、（Ｉｂ’）、（ＩＩａ’）又は（ＩＩｂ’）：
【化５】
2018047909.tif 000021
で表される塩基部分及びこれが結合した糖部分を有する修飾ヌクレオチド単位を含み、これら式中、Ｘ１及びＸ２はぞれぞれ独立に窒素原子、−ＣＨ＝又は−ＣＲ２＝（Ｒ２はアルキル基を示す。）を示し、Ａｒは置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示し、Ｒ１は水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示し、Ｚ’は前記糖部分との結合部位を示す、
ポリヌクレオチド。
【請求項４】
下記式（Ｖ）：
【化６】
2018047909.tif 000022
で表される５’キャップ構造を有するＲＮＡであって、式中、＊はポリヌクレオチドの５’末端との結合部位を示し、Ｘ１及びＸ２はぞれぞれ独立に窒素原子、−ＣＨ＝又は−ＣＲ２＝（Ｒ２はアルキル基を示す。）を示し、Ａｒは置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示し、式中の水酸基及びリン酸基はアニオン化していても、化学修飾されていてもよい、
ＲＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＲＮＡが導入された真核細胞に光を照射することを含む、タンパク質の産生量を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プリンヌクレオシド誘導体、ポリヌクレオチド及びＲＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、特定の波長を有する光の照射によってタンパク質の産生量を制御し得るＲＮＡを開示している。非特許文献１は、各種の核酸機能の光制御について記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−２０７８６３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Chem.  Rev.  2013,  113,  6114-6178
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生体細胞中の各種核酸の作用を光の照射によって制御する場合、生体細胞の損傷又は死滅を防ぐために、短い照射時間で活性を制御できることが望ましい。例えば特許文献１に開示されるＲＮＡは、光照射によって作用を発現する構造に異性化しても、光の供給が途絶えると熱反応によって数１０ミリ秒以内の極めて短時間で元の構造に戻るため、所望の機能を維持するためには長時間の継続的な光照射が必要となることがある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一側面は、下記式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）：
【化１】
2018047909.tif 000003
で表されるプリンヌクレオシド誘導体を提供する。これら式中、Ｘ１及びＸ２はぞれぞれ独立に窒素原子、−ＣＨ＝又は−ＣＲ２＝（Ｒ２はアルキル基を示す。）を示し、Ａｒは置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示し、Ｒ１は水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示す。Ｚは下記式（ＩＩＩ）：
【化２】
2018047909.tif 000004
で表される糖残基を示す。式（ＩＩＩ）中、＊は式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）中の窒素原子との結合部位を示し、Ｙ２は水素原子又は水酸基を示し、Ｙ５は水酸基又はリン酸基を示す。式（ＩＩＩ）中の水酸基及びリン酸基はそれぞれ独立に水素原子が脱離してアニオン化していてもよいし、化学修飾されていてもよい。【０００７】
式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）中のＺは、下記式（ＩＶ）：
【化３】
2018047909.tif 000005
で表される基であってもよい。式（ＩＶ）中、＊は式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）中の窒素原子との結合部位を示し、Ｂａｓｅは核酸塩基を示す。式（ＩＶ）中の水酸基及びリン酸基は水素原子が脱離してアニオン化していてもよいし、化学修飾されていてもよい。【０００８】
本発明の別の側面は、上記プリンヌクレオシド誘導体から誘導される構成単位を任意の位置に含む、ポリヌクレオチドを提供する。上記プリンヌクレオシド誘導体から誘導される構成単位は、下記式（Ｉａ’）、（Ｉｂ’）、（ＩＩａ’）、又は（ＩＩｂ’）で表される塩基部分及びこれが結合した糖部分を有する修飾ヌクレオチド単位であることができる。これら式中、Ｘ１、Ｘ２、Ａｒ及びＲ１は式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）中のＸ１、Ｘ２、Ａｒ及びＲ１と同義である。Ｚ’は前記糖部分との結合部位を示す、【０００９】
【化４】
2018047909.tif 000006
【００１０】
上記修飾ヌクレオチド単位が導入されたポリヌクレオチドは、下記式（Ｖ）：
【化５】
2018047909.tif 000007
で表される５’キャップ構造を有するＲＮＡであってもよい。式（Ｖ）中、＊は５’末端との結合部位を示し、Ｘ１、Ｘ２、及びＡｒは式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）中のＸ１、Ｘ２、及びＡｒと同義である。式（Ｖ）中の水酸基及びリン酸基はそれぞれ独立にアニオン化していても、化学修飾されていてもよい。【００１１】
本発明の更に別の側面は、上記ＲＮＡが導入された真核細胞に光を照射することを含む、タンパク質の産生量を制御する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の一側面に係るプリンヌクレオシド誘導体から誘導される構成単位を導入したポリヌクレオチド又はＲＮＡは、短時間の光照射によりその活性を制御できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】タンパク質の産生量を制御するメカニズムを示す模式図である。
【図２】プリンヌクレオシド誘導体（２ＰＡ−ｃａｐ）の吸収スペクトルである。
【図３】プリンヌクレオシド誘導体（ｐＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）の吸収スペクトルである。
【図４】プリンヌクレオシド誘導体（ｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）の吸収スペクトルである。
【図５】プリンヌクレオシド誘導体（ｏＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）の吸収スペクトルである。
【図６】プリンヌクレオシド誘導体（ｐＥｔ−２ＰＡ−ｃａｐ）の吸収スペクトルである。
【図７】プリンヌクレオキシド誘導体（２ＰＡ−ｃａｐ）の３７０ｎｍ又は４３０ｎｍの光照射下でのトランス体の比率の時間変化を示すグラフである。
【図８】プリンヌクレオキシド誘導体（ｐＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）の３７０ｎｍ又は４３０ｎｍの光照射下でのトランス体の比率の時間変化を示すグラフである。
【図９】プリンヌクレオキシド誘導体（ｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）の３７０ｎｍ又は４３０ｎｍの光照射下でのトランス体の比率の時間変化を示すグラフである。
【図１０】プリンヌクレオキシド誘導体（ｐＥｔ−２ＰＡ−ｃａｐ）の３７０ｎｍ又は４３０ｎｍの光照射下でのトランス体の比率の時間変化を示すグラフである。
【図１１】プリンヌクレオキシド誘導体（２ＰＡ−ｃａｐ）の光平衡状態におけるトランス体の比率と照射光波長との関係を示すグラフである。
【図１２】プリンヌクレオキシド誘導体（ｐＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）の光平衡状態におけるトランス体の比率と照射光波長との関係を示すグラフである。
【図１３】プリンヌクレオキシド誘導体（ｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）の光平衡状態におけるトランス体の比率と照射光波長との関係を示すグラフである。
【図１４】プリンヌクレオキシド誘導体（ｏＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）の光平衡状態におけるトランス体の比率と照射光波長との関係を示すグラフである。
【図１５】プリンヌクレオキシド誘導体（ｐＥｔ−２ＰＡ−ｃａｐ）の光平衡状態におけるトランス体の比率と照射光波長との関係を示すグラフである。
【図１６】３７０ｎｍ及び４３０ｎｍの光を交互に照射したときのプリンヌクレオキシド誘導体（２ＰＡ−ｃａｐ）の可逆的なシス体−トランス体のスイッチングを示すグラフである。
【図１７】３７０ｎｍ及び４３０ｎｍの光を交互に照射したときのプリンヌクレオキシド誘導体（ｐＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）の可逆的なシス体−トランス体のスイッチングを示すグラフである。
【図１８】３７０ｎｍ及び４３０ｎｍの光を交互に照射したときのプリンヌクレオキシド誘導体（ｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）の可逆的なシス体−トランス体のスイッチングを示すグラフである。
【図１９】３７０ｎｍで２分間の光照射後の、２８．５℃におけるトランス体の比率の時間変化を示すグラフである。
【図２０】３７０ｎｍで２分間の光照射後の、２８．５℃におけるトランス体の比率の時間変化を示すグラフである。
【図２１】３７０ｎｍで２分間の光照射後の、２８．５℃におけるトランス体の比率の時間変化を示すグラフである。
【図２２】３７０ｎｍで２分間の光照射後の、２８．５℃におけるトランス体の比率の時間変化を示すグラフである。
【図２３】３７０ｎｍで２分間の光照射後の、２８．５℃におけるトランス体の比率の時間変化を示すグラフである。
【図２４】シス体又はトランス体が優勢なゼブラフィッシュ胚からの蛍光強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明のいくつかの実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１５】
一実施形態に係るプリンヌクレオシド誘導体は、下記式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）で表される化合物である。
【００１６】
【化６】
2018047909.tif 000008
【００１７】
式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）中のＸ１及びＸ２は、ぞれぞれ独立に窒素原子、−ＣＨ＝又は−ＣＲ２＝（Ｒ２はアルキル基を示す。）を示す。−Ｘ１＝Ｘ２−の基は、シス体又はトランス体のいずれであってもよく、所定の光の照射によりシス体からトランス体、又はトランス体からシス体に容易に異性化する。したがって、通常、シス体及びトランス体が混在しながら、一方の比率が他方の比率よりも大きい状態にあることが多い。
【００１８】
生体細胞内に存在する翻訳開始因子等の各種のタンパク質との相互作用の強さがシス体とトランス体とで異なることに基づいて、生体細胞内での各種ＲＮＡによる翻訳等の作用の発現を制御することができる。式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）のプリンヌクレオシド誘導体は、光照射後、周囲温度によるシス体−トランス体の異性化を生じ難い。そのため、例えば数秒〜数分程度の短時間の光照射の後、数分から数時間にわたって異性化による活性状態が維持され得る。Ｘ１及びＸ２が窒素原子であってもよい。言い換えると、−Ｘ１＝Ｘ２−がアゾ基（−Ｎ＝Ｎ−）であってもよい。これにより、より長波長の光によってシス体−トランス体の異性化を進行させることができる。
【００１９】
式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）中のＡｒは、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示し、これらは、単環又は複数の環から構成される縮合環であってもよい。
【００２０】
Ａｒとしてのアリール基の炭素数は５〜３０、又は６〜１３であってもよい。炭素数５〜３０のアリール基の例としては、フェニル基、ナフチル基、ａｓ−インダセニル基、ｓ−インダセニル基、アセナフチレニル基、９Ｈ−フルオレニル基、フェナントリル基、アントリル基、フルオランテニル基、アセフェナントリレニル基、アセアントリレニル基、トリフェニレニル基、ピレニル基、クリセニル基、テトラフェニル基、ナフタセニル基、ペリレニル基、ピセニル基、ペンタフェニル基、及びペンタセニル基が挙げられる。
【００２１】
Ａｒとしてのヘテロアリール基は、例えば、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる１又は２以上のヘテロ原子を環構成原子として含む、５〜１０員環の基であってもよい。ヘテロアリール基は、窒素原子を１個又は２個含む５員環又は６員環の基であってもよい。ヘテロアリール基の例として、ピロリル基、及びイミダゾリル基のような窒素原子を含む単環式ヘテロアリール基、インドリル基のような窒素原子を含む縮合環式ヘテロアリール基、キノリニル基、２，７−ナフチリジニル基、２，６−ナフチリジニル基、１，６−ナフチリジニル基、１，５−ナフチリジニル基、キノキサリニル基、キナゾリニル基、シンノリニル基、９Ｈ−カルバゾリル基、９Ｈ−β−カルボリニル基、フェナントリジニル基、１Ｈ−ペリミジニル基、フェナントロリニル基（４，７−フェナントロリニル基、３，８−フェナントロリニル基及び２，９−フェナントロリニル基など）、フェナジニル基、テベニジニル基、並びに１０Ｈ−キンドリニル基が挙げられる。
【００２２】
Ａｒは特に、下記（１０）で表される置換又は無置換のフェニル基であってもよい。
【００２３】
【化７】
2018047909.tif 000009
【００２４】
式（１０）中、＊はＸ２との結合部位を示し、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよいテロアリール基を示す。
【００２５】
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４又はＲ１５としてのアルキル基は、例えば炭素数１〜２０のアルキル基であってもよく、その例としてはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、ベンジル基、フェネチル基、ジフェニルメチル基、及びトリチル基が挙げられる。
【００２６】
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４又はＲ１５としてのアリール基は、炭素数５〜３０のアリール基であってもよく、その例としてはフェニル基、トリル基、キシリル基、メシチル基、ビフェニリル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、フルオレニル基、及びピレニル基が挙げられる。
【００２７】
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４又はＲ１５としてのヘテロアリール基は、５〜１０員環であってもよく、その例としては、ピロリル基、イミダゾリル基、インドリル基、フェナントロリニル基、フェナジニル基、テベニジニル基、及び１０Ｈ−キンドリニル基が挙げられる。
【００２８】
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立に水素原子、又は炭素数１〜１０若しくは１〜３のアルキル基であってもよい。
【００２９】
式（Ｉａ）及び（ＩＩａ）中のＲ１は水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示す。Ｒ１は炭素数１〜３のアルキル基、特にメチル基であってもよい。
【００３０】
以上説明した各置換基の種類及び組み合わせは、シス体とトランス体とでターゲットとするタンパク質との相互作用の差異が大きくなるなど、各種の核酸機能を光制御できるように、適宜選択することができる。
【００３１】
式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）中のＺは、下記式（ＩＩＩ）：
【化８】
2018047909.tif 000010
で表される糖残基であってもよい。式（ＩＩＩ）中、＊は窒素原子との結合部位を示し、Ｙ２は水素原子又は水酸基を示し、Ｙ５は水酸基又はリン酸基を示す。式（ＩＩＩ）中の水酸基及びリン酸基はそれぞれ独立に水素原子が脱離してアニオン化していてもよく、化学修飾されていてもよい。
【００３２】
本明細書において、水酸基及びリン酸基の化学修飾は、保護基による保護、及び反応性を付与するための活性化基との結合を含む。水酸基を保護する保護基の例としては、アセチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、及びジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）が挙げられる。
【００３３】
本明細書において、リン酸基は、下記各式で表される一リン酸基、二リン酸基、三リン酸基、四リン酸基、五リン酸基、及び六リン酸基を含む。式中の−ＯＨは、水素原子が脱離してアニオン化していてもよい。
【００３４】
【化９】
2018047909.tif 000011
【００３５】
式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）中のＺは、下記式（ＩＶ）：
【００３６】
【化１０】
2018047909.tif 000012
で表される基であってもよい。式（ＩＶ）中、＊は式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）中の窒素原子との結合部位を示し、Ｂａｓｅは核酸塩基を示す。式（ＩＶ）中の水酸基及びリン酸基は水素原子が脱離してアニオン化していてもよい。式（ＩＶ）中の核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン又はウラシルの残基であることができ、これら核酸塩基は必要により置換基の導入等によって化学的に修飾されていてもよい。式（ＩＶ）で表される基を有するプリンヌクレオシド誘導体は、例えば、ＲＮＡ（特に、ｍＲＮＡ）に光応答性の５’キャップ構造を導入するために用いることができる。
【００３７】
これらプリンヌクレオシド誘導体は、当業者に理解されるように、通常の各種素反応を組み合わせながら、商業的に利用可能な原料から合成することができる。
【００３８】
以上説明した実施形態に係るプリンヌクレオシド誘導体は、ポリヌクレオチドの構成単位（ヌクレオチド単位）として各種のポリヌクレオチド中に導入することができる。例えば、一実施形態に係るポリヌクレオチドは、下記式（Ｉａ’）、（Ｉｂ’）、（ＩＩａ’）、又は（ＩＩｂ’）で表される塩基部分及びこれが結合した糖部分を有する修飾ヌクレオチド単位を任意の位置に含む。これら式中、Ｘ１、Ｘ２、Ａｒ及びＲ１は式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）中のＸ１、Ｘ２、Ａｒ及びＲ１と同義である。Ｚ’は糖部分との結合部位を示す、
【００３９】
【化１１】
2018047909.tif 000013
【００４０】
修飾ヌクレオチド単位は、ＲＮＡ又はＤＮＡの任意の位置のヌクレオチド単位を置換していてもよいし、ポリヌクレオチドの５’末端又は３’末端に結合していてもよい。例えば、５’キャップ構造を有するＲＮＡの場合、５’キャップ構造、又はポリヌクレオチドの５’末端から１０塩基までの範囲の位置に修飾ヌクレオチド単位が導入されていてもよい。
【００４１】
上記修飾ヌクレオチド単位がＲＮＡの中間部分の位置に導入される場合、式（Ｉａ’）、（Ｉｂ’）、（ＩＩａ’）、及び（ＩＩｂ’）中のＺ’は例えば下記式（ＩＩＩ’）で表される糖部分であることができる。式（ＩＩＩ’）中、＊は塩基部分との結合部位であり、＊＊は隣接するヌクレオチド単位との結合部位である。
【００４２】
【化１２】
2018047909.tif 000014
【００４３】
上記修飾ヌクレオチド単位が導入されたｍＲＮＡの５’キャップ構造は、例えば、下記式（Ｖ）：
【化１３】
2018047909.tif 000015
で表される。式（Ｖ）中、＊はポリヌクレオチドの５’末端との結合部位を示す。式（Ｖ）中の水酸基及びリン酸基はそれぞれ独立にアニオン化していても、化学修飾されていてもよい。
【００４４】
上記修飾ヌクレオチド単位を含む５’キャップ構造を有するｍＲＮＡを真核細胞の細胞質に導入し、真核細胞に光を照射することにより、当該ｍＲＮＡがコードするタンパク質の産生量を制御することができる。
【００４５】
照射される光は、シス体又はトランス体の比率が大きくなる所定の波長を有することができる。タンパク質の産生量を制御する方法は、例えば、シス体の比率が大きくなる第一の波長の光を照射することと、トランス体の比率が大きくなる第二の波長の光を照射することとを含んでいてもよい。これにより、タンパク質産生のオン／オフのスイッチングを任意のタイミングで行うことができる。図１は、式（Ｖ）の５’キャップ構造を有するｍＲＮＡを例とした、タンパク質の産生量を制御するメカニズムを示す模式図である。図中の（ａ）に示されるように、４３０ｎｍ（第二の波長）の光照射により生じるトランス体は翻訳開始因子ｅｌＦ４Ｅと結合しないことから、ｍＲＮＡからの翻訳によるタンパク質の合成が抑制される。３７０ｎｍ（第一の波長）の光照射によって生成するシス体はｅｌＦ４Ｅと結合し、タンパク質の合成が促進される。なお、塩基部分の構造等によっては、シス体よりもトランス体のときにタンパク質産生が促進され得る。
【００４６】
本実施形態に係るヌクレオチド単位中の塩基部分は、熱による異性化に対して安定であるため、光を長時間連続的に照射する必要がない。例えば、１回あたりの照射時間を１秒〜２分とすることができる。このような短時間であれば、細胞の損傷又は死滅を抑制しながら光を照射することができる。シス体又はトランス体の比率が大きい状態を長時間維持する必要がある場合、例えば、３０分〜１０時間毎に１秒〜２分、光を照射してもよい。照射される光は、例えば紫外線であることができる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を挙げて本発明についてさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００４８】
１．光応答性ｃａｐアナローグ（プリンヌクレオシド誘導体）の合成
真核生物翻訳開始因子ｅｌＦ４Ｅとの相互作用を制御可能な光応答性ｃａｐアナローグとして、下記合成反応式に従って、反応式中に示す２ＰＡ−ｃａｐ（６ａ）、ｐＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ（６ｂ）、ｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ（６ｃ）、ｏＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ（６ｄ）及びｐＥｔ−２ＰＡ−ｃａｐ（６ｅ）の５種を合成した。【００４９】
【化１４】
2018047909.tif 000016
【００５０】
１−１．反応ａ
２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｐ−メチル−フェニルアゾアデノシン（２ｂ）
２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−２−ニトロアデノシン（１）（５００ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）及び無水アセトニトリル（１０ｍＬ）を含む懸濁液に、酢酸（０．７９ｍＬ）及びｐ−トルイジン（０．１５ｍＬ、１．４２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で３時間攪拌した後、真空下で濃縮した。残渣をトルエンに溶解し、３回同時蒸着し、シリカゲルカラムにより精製した。３〜１０％のグラジエントをかけたメタノール／クロロホルムで生成物を溶出させて、５７８ｍｇ（収率９６％）の２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｐ−メチル−フェニルアゾアデノシン（２ｂ）（橙色固体）を得た。
1H  NMR  (chloroform-d,400  MHz)  δ:  8.08  (s,  1H),  7.96  (d,  J  =  8.0,  2H),  7.30  (d,  J  =  8.0,  2H),  6.44  (s,  2H),  6.43  (d,  J  =  6.0,  1H),5.80  (t,  J  =  6.0,  1H),  5.61  (dd,  J  =  6.0,  3.6,  1H),  4.45-4.41  (m,  3H),  2.42  (s,  3H),  2.13  (s,  3H),  2.12  (s,  3H),2.04  (s,  3H)
13C  NMR  (chloroform-d,  400MHz)  δ:  170.4,  169.7,  169.6,  162.7,  156.4,  151.0,  150.7,  139.7,129.9,  124.0,  119.8,  85.3,  80.6,  77.3,  73.5,  70.8,  63.4,  21.8,  20.9,  20.7,  20.5
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C23H25N7O7,  Calculated:  510.17;  Found:  510.22【００５１】
２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｍ−ジメチル−フェニルアゾアデノシン（２ｃ）
２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−２−ニトロアデノシン（１）（１．０ｇ、２．３７ｍｍｏｌ）及び無水アセトニトリル（１６ｍＬ）を含む懸濁液に、酢酸（１．５８ｍＬ）及び３，５−キシリジン（０．３６ｍＬ、２．８４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で３時間攪拌した後、真空下で濃縮した。残渣をトルエンに溶解し、３回同時蒸着し、シリカゲルカラムにより精製した。３〜１０％のメタノール／クロロホルムのグラジエントで生成物を溶出させて、８８１ｍｇ（収率７１％）の２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｍ−ジメチル−フェニルアゾアデノシン（２ｃ）（赤色固体）を得た。
1H  NMR  (chloroform-d,  400  MHz)  δ:  8.10  (s,  1H),  7.70  (s,  2H),  7.17  (s,  1H),  6.46  (d,  J  =  6.0,  1H),  6.26  (s,  2H),  5.79  (t,  J  =  6.0,  1H),  5.61  (dd,  J  =  6.0,  3.6,  1H),  4.46-4.41  (m,  3H),  2.40  (s,  6H),  2.14  (s,  3H),  2.13  (s,  3H),  2.04  (s,  3H)
13C  NMR  (chloroform-d,  400MHz)  δ:170.4,  169.7,  169.6,  162.7,  156.3,  152.8,  151.1,  139.7,  138.9,  134.5,  121.8,  119.8,  85.2,  80.6,  77.3,  73.5,  70.9,  63.4,  21.3,  20.9,  20.7,  20.5
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C24H27N7O7,  Calculated:  524.19;  Found:  524.23【００５２】
２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｏ−ジメチル−フェニルアゾアデノシン（２ｄ）
２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−２−ニトロアデノシン（１）（１．０ｇ、２．３７ｍｍｏｌ）及び無水アセトニトリル（１６ｍＬ）を含む懸濁液に、酢酸（１．５８ｍＬ）及び２，６−キシリジン（０．３６ｍＬ、２．８４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で３時間攪拌した後、真空下で濃縮した。残渣をトルエンに溶解し、３回同時蒸着し、シリカゲルカラムにより精製した。３〜１０％のメタノール／クロロホルムのグラジエントで生成物を溶出させて、３１２ｍｇ（収率２５％）の２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｏ−ジメチル−フェニルアゾアデノシン（２ｄ）（茶色固体）を得た。
1H  NMR  (chloroform-d,  400  MHz)  δ:  8.08  (s,  1H),  7.16  (d,  J  =  7.2,  1H),7.12  (d,  J  =  7.2,  2H),  6.36  (d,  J  =  5.6,  1H),  6.11  (s,  2H),  5.84  (t,  J  =  5.6,  1H),  5.63  (dd,  J  =  5.6,  4.0,  1H),  4.47-4.41  (m,  3H),  2.36  (s,  6H),  2.12  (s,  3H),  2.11  (s,  3H),  2.06  (s,  3H)
13C  NMR  (chloroform-d,  400MHz)  δ:  170.4,  169.7,  169.6,  162.5,  156.2,  152.0,  150.9,  140.0,  131.0,  129.1,  120.0,  86.0,  80.5,  77.3,  73.6,  70.9  63.3,  20.9,  20.6,  20.5,  18.9
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C24H27N7O7,  Calculated:  524.19;  Found:  524.17【００５３】
２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｐ−エチル−フェニルアゾアデノシン（２ｅ）
２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−２−ニトロアデノシン（１）（１．０ｇ、２．３７ｍｍｏｌ）及び無水アセトニトリル（２０ｍＬ）を含む懸濁液に、酢酸（１．５８ｍＬ）及び４−エチルアニリン（０．３６ｍＬ、２．８４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で３時間攪拌した後、真空下で濃縮した。残渣をトルエンに溶解し、３回同時蒸着し、シリカゲルカラムにより精製した。３〜１０％のメタノール／クロロホルムのグラジエントで生成物を溶出させて、１．０８ｇ（収率８７％）の２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｐ−エチル−フェニルアゾアデノシン（２ｅ）（橙色固体）を得た。
1H  NMR  (chloroform-d,  400  MHz)  δ:  8.07  (s,  1H),  7.95  (d,  J  =  8.4,  2H),  7.29  (d,  J  =  8.4  2H),  6.41  (d,  J  =  5.6,  1H),  5.79  (t,  J  =  5.6,  1H),  5.60  (dd,  J  =  5.6,  3.6,  1H),  4.43-4.39  (m,  3H),  2.67  (q,  J  =  7.6,  2H),  2.10  (s,  3H),  2.09  (s,  3H),  2.01  (s,  3H),  2.04  (s,  3H),  1.23  (t,  J  =  7.6,  3H)
13C  NMR  (chloroform-d,  400MHz)  δ:170.4,  169.7,  169.6,  162.8,  156.6,  150.9,  150.7,  149.8,  139.6,  128.7,  124.0,  119.7,  85.3,  80.5,  77.4,  73.5,  70.9,  63.4,  29.0,  20.9,  20.7,  20.5,  15.2
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C24H27N7O7,  Calculated:  524.19;  Found:  524.28【００５４】
１−２．反応ｂ，ｃ
２−フェニルアゾアデノシン一リン酸（３ａ）
常法に従って、２−フェノルアゾアデノシン（２ａ）を合成した。得られた２−フェニルアゾアデノシン（１９０ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を、リン酸トリメチル（２．０ｍＬ）中で塩化ホスホリル（０．１４ｍＬ、１．５４ｍｍｏｌ）と混合した。得られた反応混合物を０℃で１６時間攪拌した後、１Ｍ  臭化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）で中和した。粗生成物をＤＥＡＥ−Ｓｈｅｐｈａｄｅｘカラムで精製した。０〜１Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、１４４ｍｇ（収率４３％）の２−フェニルアゾアデノシン一リン酸（３ａ）（橙色泡状物）を得た。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  8.15  (s,  1H),  7.18  (d,  J  =  7.6,  2H),  7.0  (t,  J  =  7.6,  1H),  6.93  (t,  J  =  7.6,  2H),  5.77  (d,  J  =  4.4,  1H),  4.34  (t,  J  =  4.4,  1H),  4.26  (t,  J  =  4.4,  1H),  4.18  (m,  1H),  4.04-4.00  (m,  1H),  3.98-3.93  (m,  1H),  2.99  (q,  J  =  7.6,  12H),  1.07  (t,  J  =  7.6,  18H)
13C  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  159.8,  155.2,  150.2,  149.1,  140.6,  132.9,  128.7,  122.8,  118.4,  83.5,  83.4,  74.8,  69.9,  64.0,  46.6,  8.2
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  0.57  (s,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C16H18N7O7P,  Calculated:  451.08;  Found:  451.05【００５５】
２−ｐ−メチル−フェニルアゾアデノシン一リン酸（３ｂ）
２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｐ−メチル−フェニルアゾアデノシン（２ｂ）（５７０ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）及び無水メタノール（２０ｍＬ）を含む溶液に、ナトリウムメトキシドの２８％メタノール溶液（０．８２ｍＬ、ナトリウムメトキシド３．３５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で３時間攪拌した。その後混合物を酢酸で中和し、真空下で濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムにより精製した。生成物を５−１２％のグラジエントをかけたメタノール／クロロホルムで溶出し、３８７ｍｇ（収率９０％）の２−ｐ−メチル−フェニルアゾアデノシン（橙色固体）を得た。得られた生成物を更に精製することなく次のステップに用いた。２−ｐ−メチル−フェニルアゾアデノシン（３８０ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）を、リン酸トリメチル（５．０ｍＬ）中でプロトンスポンジ（３１７ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）及び塩化ホスホリル（０．２３ｍＬ、２．４７ｍｍｏｌ）と混合した。反応混合物を０℃で１６時間攪拌し、１Ｍ  ＴＥＡＢで中和した。粗生成物をＤＥＡＥ−Ｓｈｅｐｈａｄｅｘカラムで精製した。０〜１Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、３３６ｍｇ（収率４９％）の２−ｐ−メチル−フェニルアゾアデノシン一リン酸（３ｂ）（橙色泡状物）を得た。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  8.03  (s,  1H),  6.68  (d,  J  =  7.6,  2H),  6.31  (d,  J  =  7.6,  2H),  5.54  (d,  J  =  3.6,  1H),  4.19-4.13  (m,  3H),  4.03-3.99  (m,  1H),  3.94-3.91  (m,  1H),  2.97  (q,  J  =  7.2,  12H),  1.69  (s,  3H),  1.06  (t,  J  =  7.2,  18H)
13C  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:159.3,  154.7,  148.5,  147.8,  144.1,  139.9,  128.6,  122.4,  118.1,  74.8,  69.6,  63.9,  46.6,  20.7,  8.2
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  0.42  (s,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C17H20N7O7P,  Calculated:  464.11;  Found:  464.11【００５６】
２−ｍ−ジメチル−フェニルアゾアデノシン一リン酸（３ｃ）
２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｍ−ジメチル−フェニルアゾアデノシン（２ｃ）（６９０ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）及び無水メタノール（２０ｍＬ）を含む溶液に、ナトリウムメトキシドの２８％メタノール溶液（０．９６ｍＬ、ナトリウムメトキシド３．９４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で３時間攪拌した。その後混合物を酢酸で中和し、真空下で濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムにより精製した。生成物を５−１２％のグラジエントをかけたメタノール／クロロホルムで溶出し、４４０ｍｇ（収率８４％）の２−ｍ−ジメチル−フェニルアゾアデノシン（橙色固体）を得た。得られた生成物を更に精製することなく次のステップに用いた。２−ｍ−ジメチル−フェニルアゾアデノシン（１１２ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を、リン酸トリメチル（１．４ｍＬ）中でプロトンスポンジ（９０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）及び塩化ホスホリル（６２μＬ、０．６７ｍｍｏｌ）と混合した。反応混合物を０℃で１６時間攪拌し、１Ｍ  ＴＥＡＢで中和した。粗生成物をＤＥＡＥ−Ｓｈｅｐｈａｄｅｘカラムで精製した。０〜１Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、１３０ｍｇ（収率６８％）の２−ｍ−ジメチル−フェニルアゾアデノシン一リン酸（３ｃ）（橙色泡状物）を得た。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  8.32  (s,  1H),  6.97  (s,  2H),  6.81  (s,  1H),  5.90  (d,  J  =  4.8,  1H),  4.41  (t,  J  =  4.8,  1H),  4.31  (t,  J  =  4.8,  1H),  4.23  (m,  1H),  4.06-4.01  (m,  1H),  3.99-3.94  (m,  1H),  3.03  (q,  J  =  7.2,  12H),  2.01  (s,  6H),  1.11  (t,  J  =  7.2,  18H)
13C  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  160.2,  155.4,  150.8,  149.3,  140.8,  139.1,  120.7,  118.4,  117.7,  87.5,  75.0,  69.9,  63.9,  58.9,  46.6,  20.3,  8.2
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  0.83  (s,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C18H22N7O7P,  Calculated:  478.12;  Found:  478.17【００５７】
２−ｏ−ジメチル−フェニルアゾアデノシン一リン酸（３ｄ）
２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｏ−ジメチル−フェニルアゾアデノシン（２ｄ）（１１９ｍｇ、０．２２７ｍｍｏｌ）及び無水メタノール（５ｍＬ）を含む溶液に、ナトリウムメトキシドの２８％メタノール溶液（０．１７ｍＬ、ナトリウムメトキシド０．６８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で３時間攪拌した。その後混合物を酢酸で中和し、真空下で濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムにより精製した。生成物を５−１２％のグラジエントをかけたメタノール／クロロホルムで溶出し、５３ｍｇ（収率５８％）の２−ｏ−ジメチル−フェニルアゾアデノシン（赤色固体）を得た。得られた生成物を更に精製することなく次のステップに用いた。２−ｏ−ジメチル−フェニルアゾアデノシン（５３ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を、リン酸トリメチル（０．７ｍＬ）中でプロトンスポンジ（４３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）及び塩化ホスホリル（０．０３ｍＬ、０．３２ｍｍｏｌ）と混合した。反応混合物を０℃で１６時間攪拌し、１Ｍ  ＴＥＡＢで中和した。粗生成物をＤＥＡＥ−Ｓｈｅｐｈａｄｅｘカラムで精製した。０〜１Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、６１ｍｇ（収率６７％）の２−ｏ−ジメチル−フェニルアゾアデノシン一リン酸（３ｄ）（橙色泡状物）を得た。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  8.29  (s,  1H),  6.75-6.67  (m,  3H),  5.90  (d,  J  =  4.8,  1H),  4.44  (t,  J  =  4.8,  1H),  4.32  (t,  J  =  4.8,  1H),  4.20  (m,  1H),  4.02-3.97  (m,  1H),  3.00  (q,  J  =  7.2,  12H),  2.02  (s,  6H),  1.08  (t,  J  =  7.2,  18H)
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  0.39  (s,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C17H20N7O7P,  Calculated:  478.12;  Found:  478.25【００５８】
２−ｐ−エチル−フェニルアゾアデノシン一リン酸（３ｅ）
２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−２−ｐ−エチル−フェニルアゾアデノシン（２ｅ）（１．０８ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ）及び無水メタノール（７ｍＬ）を含む溶液に、アンモニアの２Ｍメタノール溶液（７ｍＬ）を加えた。得られた反応混合物を５０℃で５時間攪拌した。その後混合物を酢酸で中和し、真空下で濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムにより精製した。生成物を５−１２％のグラジエントをかけたメタノール／クロロホルムで溶出し、５９５ｍｇ（収率７２％）の２−ｐ−エチル−フェニルアゾアデノシン（橙色固体）を得た。得られた生成物を更に精製することなく次のステップに用いた。２−ｐ−エチル−フェニルアゾアデノシン（５８０ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を、リン酸トリメチル（６．０ｍＬ）中で塩化ホスホリル（１．３３ｍＬ、１４．５ｍｍｏｌ）と混合した。反応混合物を０℃で１時間攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムで中和した。粗生成物をＤＥＡＥ−Ｓｈｅｐｈａｄｅｘカラムで精製した。０〜１Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、５３０ｍｇ（収率５４％）の２−ｐ−エチル−フェニルアゾアデノシン一リン酸（３ｅ）（橙色泡状物）を得た。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  8.05  (s,  1H),  6.84  (d,  J  =  8.4,  2H),  6.44  (d,  J  =  8.4,  2H),  5.63  (d,  J  =  4.0,  1H),  4.18  (m,  2H),  4.12  (m,  1H),  3.98-3.89  (m,  2H),  2.92  (q,  J  =  7.2,  12H),  2.02  (q,  J  =  7.2,  2H),  1.05  (t,  J  =  7.2,  18H),  0.74  (t,  J  =  7.2,  3H)
13C  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:180.9,  159.7,  154.9,  150.0,  148.8,  148.2,  140.1,  127.4,  122.7,  118.1,  87.3,  83.3,  83.2,  74.8,  69.7,  64.0,  58.7,  48.4,  46.5,  42.2,  27.7,  13.3,  8.2,  7.3
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  0.48  (s,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C17H20N7O7P,  Calculated:  478.12;  Found:  478.21【００５９】
１−３．反応ｄ
２−フェノルアゾグアノシン一リン酸（４ａ）
亜硝酸ナトリウム（２．０ｇ、２９．０ｍｍｏｌ）を、２−フェニルアゾアデノシン一リン酸（３ａ）（１１２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）が水（５０ｍＬ）及び酢酸（１０ｍＬ）に溶解した溶液に加えた。反応混合物を室温で２０時間攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。粗生成物をＤＥＡＥ−Ｓｈｅｐｈａｄｅｘカラムで精製した。０〜１Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、１０２ｍｇ（収率９０％）の２−フェニルアゾグアノシン一リン酸（４ａ）（橙色泡状物）を得た。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  8.35  (s,  1H),  7.46  (d,  J  =  6.8,  2H),  7.21  (t,  J  =  6.8,  1H),  7.13  (t,  J  =  6.8,  2H),  5.93  (d,  J  =  4.4,  1H),  4.61  (t,  J  =  4.4,  1H),  4.47  (t,  J  =  4.4,  1H),  4.38  (m,  1H),  4.21-4.12  (m,  2H),  3.18  (q,  J  =  7.2,  12H),  1.27  (t,  J  =  7.2,  18H)
13C  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:157.0,  153.1,  149.8,  147.7,  140.8,  135.2,  129.5,  124.2,  123.8,  87.7,  84.3,  75.2,  70.5,  64.6,  46.9,  8.4
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  0.21  (s,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C16H17N6O8P,  Calculated:  451.08;  Found:  451.05【００６０】
２−ｐ−メチル−フェノルアゾグアノシン一リン酸（４ｂ）
亜硝酸ナトリウム（２．８２ｇ、４０．９ｍｍｏｌ）を、２−ｐ−メチル−フェニルアゾアデノシン一リン酸（３ｂ）（１４１ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）が水（５５ｍＬ）及び酢酸（１２ｍＬ）に溶解した溶液に加えた。反応混合物を室温で２０時間攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。粗生成物をＤＥＡＥ−Ｓｈｅｐｈａｄｅｘカラムで精製した。０〜１Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、１２０ｍｇ（収率８５％）の２−ｐ−メチル−フェニルアゾグアノシン一リン酸（４ｂ）（橙色泡状物）を得た。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  8.14  (s,  1H),  6.83  (d,  J  =  7.6,  2H),  6.39  (d,  J  =  7.6,  2H),  5.59  (d,  J  =  4.8,  1H),  4.38  (t,  J  =  4.8,  1H),  4.47  (t,  J  =  4.8,  1H),  4.20  (m,  1H),  3.97  (m,  1H),  3.04  (q,  J  =  7.2,  12H),  1.77  (s,  3H),  1.12  (t,  J  =  7.2,  18H)
13C  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  181.1,  156.4,  152.7,  147.6,  147.2,  147.1,  140.2,  129.5,  123.6,  87.0,  84.2,  75.1,  70.5,  64.3,  46.7,  23.1,  8.3
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  0.44  (s,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C17H19N6O8P,  Calculated:  465.09;  Found:  465.15【００６１】
２−ｍ−ジメチル−フェノルアゾグアノシン一リン酸（４ｃ）
亜硝酸ナトリウム（５．０ｇ、７２．５ｍｍｏｌ）を、２−ｍ−ジメチル−フェニルアゾアデノシン一リン酸（３ｃ）（２２４ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）が水（８０ｍＬ）及び酢酸（２０ｍＬ）に溶解した溶液に加えた。反応混合物を室温で２０時間攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。粗生成物をＤＥＡＥ−Ｓｈｅｐｈａｄｅｘカラムで精製した。０〜１Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、２０８ｍｇ（収率９３％）の２−ｍ−ジメチル−フェニルアゾグアノシン一リン酸（４ｃ）（橙色泡状物）を得た。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  8.34  (s,  1H),  6.86  (s,  2H),  6.6  (s,  1H),  5.77  (d,  J  =  5.2,  1H),  4.43  (t,  J  =  5.2,  1H),  4.33  (t,  J  =  5.2,  1H),  4.24  (m,  1H),  4.02-3.97  (m,  2H),  3.04  (q,  J  =  7.6,  12H),  1.84  (s,  6H),  1.12  (t,  J  =  7.6,  18H)
13C  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  156.4,  152.5,  149.5,  147.1,  140.5,  139.5,  136.4,  123.5,  121.2,  87.2,  84.1,  75.3,  70.2,  63.9,  46.6,  19.9,  8.2
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  0.82  (s,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C18H21N6O8P,  Calculated:  479.11;  Found:  479.23【００６２】
２−ｏ−ジメチル−フェノルアゾグアノシン一リン酸（４ｄ）
亜硝酸ナトリウム（１．２ｇ、１７．４ｍｍｏｌ）を、２−ｏ−ジメチル−フェニルアゾアデノシン一リン酸（３ｄ）（６０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）が水（２０ｍＬ）及び酢酸（５ｍＬ）に溶解した溶液に加えた。反応混合物を室温で２０時間攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。粗生成物をＤＥＡＥ−Ｓｈｅｐｈａｄｅｘカラムで精製した。０〜１Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、４３ｍｇ（収率７２％）の２−ｏ−ジメチル−フェニルアゾグアノシン一リン酸（４ｄ）（橙色泡状物）を得た。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  8.18  (s,  1H),  6.45-6.38  (m,  3H),  5.67  (d,  J  =  4.8,  1H),  4.43  (t,  J  =  4.8,  1H),  4.32  (t,  J  =  4.8,  1H),  4.20  (m,  1H),  3.87-3.75  (m,  1H),  3.01  (q,  J  =  7.2,  12H),  2.01  (s,  6H),  1.09  (t,  J  =  7.2,  18H)
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  0.63  (s,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C17H19N6O8P,  Calculated:  479.11;  Found:  479.11【００６３】
２−ｐ−エチル−フェノルアゾグアノシン一リン酸（４ｅ）
亜硝酸ナトリウム（５．０ｇ、７２．５ｍｍｏｌ）を、２−ｐ−エチル−フェニルアゾアデノシン一リン酸（３ｅ）（５３０ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）が水（１００ｍＬ）及び酢酸（２０ｍＬ）に溶解した溶液に加えた。反応混合物を室温で２０時間攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。粗生成物をＤＥＡＥ−Ｓｈｅｐｈａｄｅｘカラムで精製した。０〜１Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、２７７ｍｇ（収率５２％）の２−ｐ−エチル−フェニルアゾグアノシン一リン酸（４ｅ）（橙色泡状物）を得た。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  8.14  (s,  1H),  6.93  (d,  J  =  8.4,  2H),  6.50  (d,  J  =  8.4,  2H),  5.64  (d,  J  =  5.6,  1H),  4.39  (t,  J  =  5.6,  1H),  4.25  (t,  J  =  8.0,  1H),  3.94  (m,  2H),  3.01  (q,  J  =  7.2,  12H),  2.01  (q,  J  =  7.2,  2H),  1.09  (t,  J  =  7.2,  18H),  0.74  (t,  J  =  7.2,  3H)
13C  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  181.2,  156.5,  153.0,  152.9,  147.5,  147.3,  140.2,  128.1,  123.5,  87.0,  84.3,  84.2,  75.1,  70.5,  64.3,  46.6,  27.7,  23.2,  12.5,  8.2
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  0.49  (s,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C17H19N6O8P,  Calculated:  479.11;  Found:  479.16【００６４】
１−４．反応ｅ
２−フェニルアゾ−７−メチル−グアノシン一リン酸（５ａ）
２−フェニルアゾグアノシン一リン酸（４ａ）（１２２ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を水（１０ｍＬ）に溶解し、得られた溶液のｐＨを酢酸で４．０に調節した。そこに、硫酸ジメチル（０．１８ｍＬ、１．８９ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下し、室温で４時間攪拌した。０．２Ｍ  ＮａＯＨで中和した後、粗生成物をクロロホルムで３回洗浄し、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで精製した。０〜１Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、４３ｍｇ（収率３４％）の２−フェニルアゾグ−７−メチル−グアノシン一リン酸（５ａ）（橙色泡状物）を得た。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  9.02  (s,  1H),  7.33  (d,  J  =  7.6,  2H),  7.25  (t,  J  =  7.6,  1H),  7.14  (t,  J  =  7.6,  2H),  5.88  (d,  J  =  2.8,  1H),  4.31  (m,  1H),  4.26  (m,  2H),  4.17-4.13  (m,  1H),  4.01-3.97  (m,  1H),  3.82  (s,  3H),  3.02  (q,  J  =  7.2,  12H),  1.10  (t,  J  =  7.2,  18H)
13C  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  150.3,  147.1,  133.6,  129.0,  123.2,  120.2,  114.4,  89.9,  83.9,  75.1,  68.6,  63.0,  46.6,  35.8,  8.2
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  0.50  (s,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C17H19N6O8P,  Calculated:  465.09;  Found:  465.05【００６５】
２−ｐ−メチル−フェニルアゾ−７−メチル−グアノシン一リン酸（５ｂ）
２−ｐ−メチル−フェニルアゾグアノシン一リン酸（４ｂ）（１１０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を水（１０ｍＬ）に溶解し、得られた溶液のｐＨを酢酸で４．０に調節した。そこに、硫酸ジメチル（０．１５ｍＬ、１．５８ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下し、室温で４時間攪拌した。０．２Ｍ  ＮａＯＨで中和した後、粗生成物をクロロホルムで３回洗浄し、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで精製した。０〜１Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、５６ｍｇ（収率５０％）の２−ｐ−メチル−フェニルアゾ−７−メチル−グアノシン一リン酸（５ｂ）（橙色泡状物）を得た。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  9.41  (s,  1H),  7,52  (s,  2H),  6.07  (d,  J  =  2.4,  1H),  4.50  (m,  1H),  4.34  (m,  2H),  4.18  (dd,  J  =  10.8,  4.4,  1H),  4.05  (s,  3H),  4.03  (dd,  J  =  10.8,  4.4,  1H),  3.05  (q,  J  =  7.2,  12H),  2.21  (s,  3H),  3.05  (q,  J  =  7.2,  12H),  1.13  (t,  J  =  7.2,  18H)
13C  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  153.2,  146.1,  136.6,  130.4,  124.8,  115.8,  110.8,  109.0,  90.7,  84.6,  75.6,  69.2,  63.4,  46.7,  42.3,  21.2,  8.3
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  0.19  (s,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C18H21N6O8P,  Calculated:  479.11;  Found:  479.12【００６６】
２−ｍ−ジメチル−フェニルアゾ−７−メチル−グアノシン一リン酸（５ｃ）
２−ｍ−ジメチル−フェニルアゾグアノシン一リン酸（４ｃ）（１３９ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を水（１２ｍＬ）に溶解し、得られた溶液のｐＨを酢酸で４．０に調節した。そこに、硫酸ジメチル（０．４０ｍＬ、４．２２ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下し、室温で４時間攪拌した。０．２Ｍ  ＮａＯＨで中和した後、粗生成物をクロロホルムで３回洗浄し、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで精製した。０〜１Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、３８ｍｇ（収率２７％）の２−ｍ−ジメチル−フェニルアゾ−７−メチル−グアノシン一リン酸（５ｃ）（橙色泡状物）を得た。
1H  NMR  (methanol-d4,  400  MHz)  δ:  7.58  (s,  2H),  7.25  (s,  1H),  6.19  (d,  J  =  2.4,  1H),  4.55  (dd,  J  =  4.8,  2.4,  1H),  4.42  (dd,  J  =  6.4,  4.8,  1H),  4.32-4.27  (m,  1H),  4.26  (s,  3H),  4.12-4.09  (m,  1H),  3.18  (q,  J  =  7.2,  12H),  2.39  (s,  6H),  1.28  (t,  J  =  7.6,  18H)
13C  NMR  (methanol-d4,  400  MHz)  δ:  165.8,  163.6,  152.5,  148.3,  139.2,  134.3,  121.0,  114.5,  90.9,  84.4,  75.5,  68.7,  62.8,  46.2,  35.4,  19.9,  7.8
31P  NMR  (methanol-d4,  162  MHz)  δ:  -0.35  (s,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C19H23N6O8P,  Calculated:  493.12;  Found:  493.23【００６７】
２−ｏ−ジメチル−フェニルアゾ−７−メチル−グアノシン一リン酸（５ｄ）
２−ｏ−ジメチル−フェニルアゾグアノシン一リン酸（４ｄ）（４０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を水（５ｍＬ）に溶解し、得られた溶液のｐＨを酢酸で４．０に調節した。そこに、硫酸ジメチル（０．１１ｍＬ、１．１７ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下し、室温で４時間攪拌した。０．２Ｍ  ＮａＯＨで中和した後、粗生成物をクロロホルムで３回洗浄し、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで精製した。０〜１Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、２１ｍｇ（収率５２％）の２−ｏ−ジメチル−フェニルアゾ−７−メチル−グアノシン一リン酸（５ｄ）（橙色泡状物）を得た。
1H  NMR  (Methanol-d4,  400  MHz)  δ:  9.66  (s,  1H),  7.28  (d,  J  =  7.2,  1H),  7.21  (d,  J  =  7.2,  2H),  6.24  (d,  J  =  2.4,  1H),  4.61  (dd,  J  =  4.8,  2.4,  1H),  4.43  (dd,  J  =  4.8,  2.4,  1H),  4.28  (s,  3H),  3.17  (q,  J  =  7.2,  6H),  2.45  (s,  6H),  1.29  (t,  J  =  7.2,  12H)
13C  NMR  (DMSO-d6,  400  MHz)  δ:  167.2,  163.1,  151.1,  148.8,  137.1,  130.5,  129.6,  129.4,  113.8,  89.5,  84.6,  75.2,  70.3,  63.7,  45.8,  35.9,  18.8,  9.0
31P  NMR  (Methanol-d4,  162  MHz)  δ:  0.04  (s,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C18H21N6O8P,  Calculated:  493.12;  Found:  493.11【００６８】
２−ｐ−エチル−フェニルアゾ−７−メチル−グアノシン一リン酸（５ｅ）
２−ｐ−エチル−フェニルアゾグアノシン一リン酸（４ｄ）（１５０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を水（１０ｍＬ）に溶解し、得られた溶液のｐＨを酢酸で４．０に調節した。そこに、硫酸ジメチル（０．２１ｍＬ、２．２０ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下し、室温で４時間攪拌した。０．２Ｍ  ＮａＯＨで中和した後、粗生成物をクロロホルムで３回洗浄し、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで精製した。０〜１Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、７６ｍｇ（収率５０％）の２−ｐ−エチル−フェニルアゾ−７−メチル−グアノシン一リン酸（５ｅ）（橙色泡状物）を得た。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  9.02  (s,  1H),  7.23  (d,  J  =  8.4,  2H),  6.95  (d,  J  =  8.4,  2H),  5.81  (d,  J  =  2.4,  1H),  4.28  (t,  J  =  3.2,  1H),  4.22-4.18  (m,  2H),  4.10-4.05  (m,  1H),  3.96-3.92  (m,  1H),  3.83  (s,  3H),  2.98  (q,  J  =  7.2,  12H),  2.36  (q,  J  =  7.2,  2H),  1.07  (t,  J  =  7.2,  18H),  0.95  (t,  J  =  7.2,  3H)
13C  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  162.4,  162.1,  151.5,  148.7,  147.3,  128.4,  123.5,  114.3,  89.9,  83.8,  83.7,  75.1,  68.5,  62.8,  46.6,  35.9,  28.2,  14.1,  8.2
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  0.70  (s,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C18H21N6O8P,  Calculated:  493.12;  Found:  493.15【００６９】
１−５．反応ｆ
２−フェニルアゾ  ｃａｐ（２ＰＡ−ｃａｐ）（６ａ）
２−フェニルアゾ−７−メチル−グアノシン一リン酸（５ａ）（４３ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）、及びグアノシン二リン酸イミダゾリド（６６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）が３ｍＬの無水ＤＭＦに溶解している溶液に、塩化亜鉛（５３ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応溶液を室温で７２時間攪拌し、２５１ｍｇのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が２５ｍＬの水に溶解している０℃の溶液に注ぎ入れた。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した後、溶液をＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムに装填した。０〜１．２Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、２ＰＡ−ｃａｐのテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）塩（橙色泡状物）を得た。２ＰＡ−ｃａｐのＴＥＡ塩を１０ｍＬの水に溶解し、得られた溶液をＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに載せ、１０ｍＬの水、及び１０ｍＬのメタノールの順で洗浄した。次いで、１５ｍＬのＮＨ４ＯＨ／メタノール／水（２／２５／７３）で２ＰＡ−ｃａｐを溶出させ、回収した溶液を凍結乾燥機で乾燥して、２６ｍｇの２ＰＡ−ｃａｐ（６ａ）を得た（収率４５％）。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  9.09  (s,  1H),  7.74  (s,  1H),  7.61  (d,  J  =  7.6,  2H),  7.39  (t,  J  =  7.6,  1H),  7.30  (t,  J  =  7.6,  2H),  5.91  (d,  J  =  2.8,  1H),  5.51  (d,  J  =  5.6,  1H),  4.40-4.35  (m,  2H),  4.31-4.24  (m,  4H),  4.19-4.14  (m,  2H),  4.09-4.06  (m,  2H),  3.98  (s,  3H),  3.03  (q,  J  =  7.2,  18H),  1.11  (t,  J  =  7.2,  27H)
13C  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  161.9,  161.2,  158.1,  153.5,  151.1,  150.7,  147.2,  136.9,  134.1,  129.4,  123.6,  115.7,  114.7,  89.9,  86.7,  83.6,  75.2,  74.0,  70.3,  68.6,  65.4,  64.1,  46.6,  36.2,  8.2
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  -11.70  (d,  J  =  19.3,  2P),  -23.19  (t,  J  =  19.3,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C27H31N11O18P3,  Calculated:  890.11;  Found:  890.11【００７０】
２−ｐ−メチル−フェニルアゾ  ｃａｐ（ｐＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）（６ｂ）
２−ｐ−メチル−フェニルアゾ−７−メチル−グアノシン一リン酸（５ｂ）（４０ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）、及びグアノシン二リン酸イミダゾリド（５８ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）が２ｍＬの無水ＤＭＦに溶解している溶液に、塩化亜鉛（４６ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応溶液を室温で７２時間攪拌し、２２０ｍｇのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が１５ｍＬの水に溶解している０℃の溶液に注ぎ入れた。飽和炭酸水素ナトリウムで中和した後、溶液をＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムに装填した。０〜１．２Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、ｐＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐのテトラエチルアンモニウム塩（橙色泡状物）を得た。ｐＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐのテトラエチルアンモニウム塩を１０ｍＬの水に溶解し、得られた溶液をＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに載せ、１０ｍＬの水、及び１０ｍＬのメタノールの順で洗浄した。次いで、１５ｍＬのＮＨ４ＯＨ／メタノール／水（２／２５／７３）で２−ｐ−メチル−フェニルアゾ  ｃａｐを溶出させ、回収した溶液を凍結乾燥機で乾燥して、２３ｍｇのｐＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ（６ｂ）を得た（収率４４％）。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  7,75  (s,  1H),  7.44  (d,  J  =  8.4,  2H),  7.05  (d,  J  =  8.4,  2H),  5.86  (d,  J  =  2.8,  1H),  5.53  (d,  J  =  6.0,  1H),  4.43-4.38  (m,  2H),  4.31-4.26  (m,  4H),  4.21-4.16  (m,  2H),  4.10-4.07  (m,  2H),  3.98  (s,  3H),  3.05  (q,  J  =  7.2,  18H),  2.18  (s,  3H),  1.13  (t,  J  =  7.2,  27H)
13C  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  158.0,  153.4,  151.0,  148.8,  147.0,  136.8,  129.9,  123.8,  115.6,  114.7,  90.0,  86.7,  83.7,  75.2,  74.0,  70.3,  68.6,  65.5,  64.1,  46.7,  36.2,  21.0,  8.2
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  -11.71  (d,  J  =  19.3,  2P),  -23.18  (t,  J  =  19.3,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C28H33N11O18P3,  Calculated:  904.12;  Found:  904.16【００７１】
２−ｍ−ジメチル−フェニルアゾ  ｃａｐ（ｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）（６ｃ）
２−ｍ−ジメチル−フェニルアゾ−７−メチル−グアノシン一リン酸（５ｃ）（３８ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）、及びグアノシン二リン酸イミダゾリド（５６ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）が２ｍＬの無水ＤＭＦに溶解している溶液に、塩化亜鉛（４４ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応溶液を室温で７２時間攪拌し、２１４ｍｇのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が１５ｍＬの水に溶解している０℃の溶液に注ぎ入れた。飽和炭酸水素ナトリウムで中和した後、溶液をＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムに装填した。０〜１．２Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、ｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐのテトラエチルアンモニウム塩（橙色泡状物）を得た。ｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐのテトラエチルアンモニウム塩を１０ｍＬの水に溶解し、得られた溶液をＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに載せ、１０ｍＬの水、及び１０ｍＬのメタノールの順で洗浄した。次いで、１５ｍＬのＮＨ４ＯＨ／メタノール／水（２／２５／７３）でｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐを溶出させ、回収した溶液を凍結乾燥機で乾燥して、２６ｍｇのｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ（６ｃ）を得た（収率４４％）。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  9.05,  (s,  1H),  7,72  (s,  1H),  7.10  (s,  2H),  6.91  (s,  1H),  5.82  (d,  J  =  2.8,  1H),  5.47  (d,  J  =  5.6,  1H),  4.33-4.22  (m,  6H),  4.18-4.13  (m,  2H),  4.09-4.04  (m,  2H),  3.94  (s,  3H),  3.02  (q,  J  =  7.2,  18H),  2.05  (s,  6H),  1.10  (t,  J  =  7.2,  27H);
13C  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  157.9,  153.3,  150.9,  146.8,  139.7,  136.7,  136.0,  121.3,  115.4,  114.6,  90.2,  86.7,  83.5,  75.1,  74.1,  70.3,  68.4,  65.4,  63.9,  46.6,  36.3,  20.2,  8.2;
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  -11.72  (d,  J  =  18.8,  2P),  -23.15  (t,  J  =  18.8,  1P);  
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C29H35N11O18P3,  Calculated:  918.34;  Found:  918.32【００７２】
２−ｏ−ジメチル−フェニルアゾ  ｃａｐ（ｏＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）（６ｄ）
２−ｏ−ジメチル−フェニルアゾ−７−メチル−グアノシン一リン酸（５ｄ）（２１ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、及びグアノシン二リン酸イミダゾリド（３１ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）が２ｍＬの無水ＤＭＦに溶解している溶液に、塩化亜鉛（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応溶液を室温で７２時間攪拌し、１１８ｍｇのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が８ｍＬの水に溶解している０℃の溶液に注ぎ入れた。飽和炭酸水素ナトリウムで中和した後、溶液をＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムに装填した。０〜１．２Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、ｏＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐのテトラエチルアンモニウム塩（橙色泡状物）を得た。ｏＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐのテトラエチルアンモニウム塩を１０ｍＬの水に溶解し、得られた溶液をＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに載せ、１０ｍＬの水、及び１０ｍＬのメタノールの順で洗浄した。次いで、１５ｍＬのＮＨ４ＯＨ／メタノール／水（２／２５／７３）でｏＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐを溶出させ、回収した溶液を凍結乾燥機で乾燥して、１６ｍｇのｏＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ（６ｄ）を得た（収率５６％）。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  7.87  (s,  1H),  7.86  (s,  1H),  7.06-7.03  (m,  1H),  6.95  (d,  J  =  7.2,  2H),  6.00  (d,  J  =  3.2,  1H),  5.64  (d,  J  =  5.6,  1H),  4.51-4.44  (m,  2H),  4.38-4.29  (m,  4H),  4.21-4.16  (m,  2H),  4.12-4.07  (m,  2H),  3.93  (s,  3H),  3.60  (q,  J  =  7.2,  18H),  2.20  (s,  6H),  1.14  (t,  J  =  7.2,  27H)
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  -11.73  (d,  J  =  19.3,  2P),  -23.22  (t,  J  =  19.3,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C28H33N11O18P3,  Calculated:  918.14;  Found:  918.17【００７３】
２−ｐ−エチル−フェニルアゾ  ｃａｐ（ｐＥｔ−２ＰＡ−ｃａｐ）（６ｅ）
２−ｐ−エチル−フェニルアゾ−７−メチル−グアノシン一リン酸（５ｅ）（７６ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、及びグアノシン二リン酸イミダゾリド（１１２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）が２ｍＬの無水ＤＭＦに溶解している溶液に、塩化亜鉛（８９ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応溶液を室温で７２時間攪拌し、４２５ｍｇのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が３０ｍＬの水に溶解している０℃の溶液に注ぎ入れた。飽和炭酸水素ナトリウムで中和した後、溶液をＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムに装填した。０〜１．２Ｍの直線的なグラジエントをかけたＴＥＡＢで生成物を溶出させた。生成物を含む画分から溶媒を留去し、真空乾燥して、ｐＥｔ−２ＰＡ−ｃａｐのテトラエチルアンモニウム塩（橙色泡状物）を得た。ｐＥｔ−２ＰＡ−ｃａｐのテトラエチルアンモニウム塩を１０ｍＬの水に溶解し、得られた溶液をＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに載せ、１０ｍＬの水、及び１０ｍＬのメタノールの順で洗浄した。次いで、１５ｍＬのＮＨ４ＯＨ／メタノール／水（２／２５／７３）でｐＥｔ−２ＰＡ−ｃａｐを溶出させ、回収した溶液を凍結乾燥機で乾燥して、１６ｍｇのｐＥｔ−２ＰＡ−ｃａｐ（６ｅ）を得た（収率７３％）。
1H  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  9.00  (s,  1H),  7.73  (s,  1H),  7.42  (d,  J  =  8.4,  2H),  7.05  (d,  J  =  8.4,  2H),  5.83  (d,  J  =  2.8,  1H),  5.51  (d,  J  =  6.0,  1H),  4.37  (t,  J  =  5.6,  1H),  4.33  (dd,  J  =  4.0,  2.8,  1H),  4.26-4.23  (m,  3H),  4.18-4.11  (m,  2H),  4.07-4.04  (m,  2H),  3.93  (s,  3H),  3.00  (q,  J  =  7.2,  18H),  2.43  (q,  J  =  7.6,  2H),  1.08  (t,  J  =  7.2,  27H),  1.01  (t,  J  =  7.6,  3H)
13C  NMR  (D2O,  400  MHz)  δ:  162.5,  161.9,  157.9,  153.4,  151.9,  151.0,  149.0,  147.4,  136.8,  128.6,  123.7,  115.6,  114.4,  89.9,  86.6,  75.1,  74.0,  70.4,  68.4,  65.4,  64.0,  46.6,  36.1,  28.3,  14.2,  8.2
31P  NMR  (D2O,  162  MHz)  δ:  -11.91  (d,  J  =  20.1,  2P),  -23.33  (t,  J  =  20.1,  1P)
ESI-TOF  MS  [M-H]-  for  C28H33N11O18P3,  Calculated:  918.14;  Found:  918.14【００７４】
２．光応答性ｃａｐアナローグの評価
合成した光応答性ｃａｐアナローグについて、水溶液中での光異性化特性を、３００Ｗのキセノンランプを光源として用いて評価した。【００７５】
図２、図３、図４、図５及び図６は、それぞれ、２ＰＡ−ｃａｐ、ｐＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ、ｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ、ｏＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ及びｐＥｔ−２ＰＡ−ｃａｐのシス体及びトランス体の吸収スペクトルである。２ＰＡ−ｃａｐ、ｐＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ及びｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐのトランス体、ｏＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ及びｐＥｔ−２ＰＡ−ｃａｐはそれぞれ、３１０ｎｍ、３３１ｎｍ、３２３ｎｍ、３３９ｎｍ及び３３７ｎｍにππ＊遷移に対応するピークを示し、シス体は４１６ｎｍ、４１８ｎｍ及び４１７ｎｍ、４１２ｎｍ及び４１７ｎｍにｎπ＊遷移に対応するピークを示した。【００７６】
図７、図８、図９及び図１０は、３７０ｎｍ又は４３０ｎｍの光照射下でのトランス体の比率の時間変化を示すグラフである。いずれのｃａｐアナローグも、およそ２分以内に光平衡状態に到達した。【００７７】
図１１、図１２、図１３、図１４及び図１５は、光平衡状態におけるトランス体の比率と照射光波長との関係を示すグラフである。トランス体の比率は、３７０ｎｍにおいて２３％（２ＰＡ−ｃａｐ）、６％（ｐＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）、２１％（ｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）、２８％（ｏＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）、１３％（ｐＥｔ−２ＰＡ−ｃａｐ）と最も小さくなり、４３０ｎｍにおいて８２％（２ＰＡ−ｃａｐ）、７４％（ｐＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）、８２％（ｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）、８９％（ｏＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）、７７％（ｐＥｔ−２ＰＡ−ｃａｐ）と最も大きくなった。ただし、ｐＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐに関しては５５０ｎｍの光照射においてもトランス体の比率が２７％であった。トランス体の比率は、３１０ｎｍ（２ＰＡ−ｃａｐ）、３３１ｎｍ（ｐＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）、又は３２３ｎｍ（ｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）、３３９ｎｍ（ｏＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）、又は３３７ｎｍ（ｐＥｔ−２ＰＡ−ｃａｐ）での吸光度をモニターすることにより求めた（以下でも同様）。【００７８】
図１６、図１７及び図１８は、３７０ｎｍ及び４３０ｎｍの光を交互に照射したときの可逆的なシス体−トランス体のスイッチングを示すグラフである。２分毎の交互な光照射を４０回繰り返したところ、良好な可逆性のシス体−トランス体の光異性化が確認された。【００７９】
図１９、図２０、図２１、図２２及び図２３は、３７０ｎｍで２分間の光照射後の、２８．５℃におけるトランス体の比率の時間変化を示すグラフである。いずれの光応答性ｃａｐについても、熱異性化の場合、シス体からトランス体への変換が数時間かけて緩慢に進行した。異性化の時定数τは２．４２時間（２ＰＡ−ｃａｐ）、０．７３時間（ｐＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）、１．３０時間（ｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）、９．３０時間（ｏＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐ）、又は１．８９時間（ｐＥｔ−２ＰＡ−ｃａｐ）であった。この結果から、光照射を継続することなく、シス体又はトランス体の比率が高い状態を長時間維持できることが確認された。【００８０】
３．ｍＲＮＡの翻訳制御
３−１．テンプレートＤＮＡの合成
Ｔ７プロモータを５’に含む黄色蛍光タンパク質でるｖｅｎｕｓ、及びｎｏｒｄａｌ関連タンパク質であるｓｑｕｉｎｔのテンプレートＤＮＡと、グロビンの３’−ＵＴＲ配列を、ｐＣＳ２  ｖｅｎｕｓ又はｐＣＳ２  ｓｑｕｉｎｔから、２段階のＰＣＲで調製した。第１段階ではｖｅｎｕｓ順方向プライマー（配列番号１）、ｖｅｎｕｓ逆方向プライマー（配列番号２）、ｓｑｕｉｎｔ順方向プライマー（配列番号３）、及びｓｑｕｉｎｔ逆方向プライマー（配列番号４）を用いた。第２段階では順方向プライマー（配列番号５）及び逆方向プライマー（配列番号６）をｖｅｎｕｓ及びｓｑｕｉｎｔの両方に用いた。１ｘ反応バッファー、３００ｎｇのプラスミド、２００ｍＭのｄＮＴＰｓ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、６μＬのＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）、及び３ｍＭのプライマーを含む、全体積３００ｍＬの反応溶液を、３５サイクルの増幅に供した。ＰＣＲの条件を以下のように設定した。
変性：９８℃で２分間
アニーリング：５８℃で３秒冷却
伸長反応：６８℃で６０秒間の加熱
反応後、生成物をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ及びＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐシステム（プロメガ製）を用いて精製した。【００８１】
３−２．光応答性ｃａｐを導入したｍＲＮＡの調製
ｉｎ  ｖｉｔｏでのＲＮＡ転写を、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて行った。１ｘ反応バッファーと、０．５ｍｇのテンプレートＤＮＡと、それぞれ６ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰと、１．２ｍＭのＧＴＰと、４．８ｍＭｃａｐアナローグと、５０Ｕ／ｍＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼとを含む反応液（全体積２０ｍＬ）を、３７℃で４時間インキュベートした。残存したＤＮＡの加水分解のため、１ｍＬのｔｕｒｂｏ  ＤＮＡａｓｅを反応液に加え、更に反応液を３７℃で１５分インキュベートした。合成したｍＲＮＡを、ポリ（Ａ）テーリングキット（Ａｍｂｉｏｎ製）を用いてポリアデニル化した。ｍＲＮＡ、１ｘ反応バッファー、１ｍＭのＡＴＰ、２．５ｍＭのＭｎＣｌ２、及び４ｍＬ（２Ｕ／ｍＬ）のＥ−ＰＡＰを含む反応液（全体積１００ｍＬ）を３７℃で１時間インキュベートした。ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（登録商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて、５’キャップ構造として光応答性ｃａｐが導入されたｍＲＮＡを反応液から精製した。【００８２】
３−３．ゼブラフィッシュ胚中でのｍＲＮＡ翻訳
（１）光応答性の検討
ｓｑｕｉｎｔタンパク質に対応する配列を含み光応答性ｃａｐが導入されたｍＲＮＡ（５ｐｇ）、及びｖｅｎｕｓタンパク質に対応する配列を含み光応答性ｃａｐが導入されたｍＲＮＡ（２５ｐｇ）の混合物を、ＦｅｍｔｏＪｅｔ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用いて１細胞期のゼブラフィッシュ胚の細胞質に導入した。ｍＲＮＡを導入した胚を０．０１％のカナマイシン及びペニシリン／ステレオマイシンを含むリンゲル液中、２８．５℃で培養した。胚への導入の前に、光応答性ｃａｐを導入したｍＲＮＡに対して４３０ｎｍの光を照射し、トランス体が優勢な状態とした。また、ｃａｐを導入していないｍＲＮＡ、又は正常ｃａｐを導入したｍＲＮＡも同様にゼブラフィッシュ胚に導入した。【００８３】
培養中、メタルハライドランプを光源とする３７０ｎｍの光を、１時間毎に２分間、共焦点顕微鏡の視野内で胚に照射した。発現したｖｅｎｕｓタンパク質による蛍光が観察されたことから、３７０ｎｍで優勢となるシス体のｃａｐを有するｍＲＮＡによる翻訳が進行したことが確認された。一方、培養中に３７０ｎｍの光照射を行わなかった場合、トランス体が優勢な状態が維持され、ｖｅｎｕｓタンパク質による蛍光がほとんど観察されなかった。図２４は、培養中２４ｈｐｆの時点でのシス体又はトランス体が優勢なゼブラフィッシュ胚からの蛍光強度を示すグラフである。シス体はトランス体と比較して明らかに多くのタンパク質を発現させており、光応答性ｃａｐのシス体／トランス体の変換により、ｍＲＮＡ翻訳によるタンパク質発現が制御できることが確認された。ただし、ｏＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐだけ、トランス体のときにタンパク質発現をより促進した。特に、２ＰＡ−ｃａｐ又はｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐを導入したｍＲＮＡの場合、正常ｃａｐの場合に近いレベルでタンパク質が発現した。【００８４】
（２）光照射に基づく体軸形成制御
ｍＭｅ−２ＰＡ−ｃａｐを導入したｍＲＮＡを上記と同様にゼブラフィッシュ胚に導入し、培養を行った。培養中、８細胞期から５０％エピボリー期（５．５ｐｈｆ）までの間、３７０ｎｍの光を１時間毎に２分間照射した。６ｈｐｆにおいて４３０ｎｍの光を胚全体に照射した。その結果、２４ｈｐｆの時点で、発現したｓｑｕｉｎｔタンパク質の作用によって形成された完全な頭部を伴う２個目の体軸が観察された。完全な２個目の頭部を有する胚の割合は、全培養胚のうち１２％（８／８８）、２個目の体軸を発現した胚のうち７３％（８／１１）であった。また、（６ｈｐｆ）においてトランス体を優勢にする４３０ｎｍの光を照射しなかった場合、完全な２個目の頭部を有する胚の割合は、全培養胚のうち１６％（１１／７０）、２個目の体軸を発現した胚のうち９２％（１１／１２）であった。この結果から、ｓｑｕｉｎｔタンパク質は、発生初期段階では体軸の形成を誘起するが、より後期の段階では頭部の発達を阻害することが示唆される。このように、所定の期間のみ短時間の光照射を行うことで、細胞の損傷を抑制しながらタンパク質の産生を制御することができた。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明に係るプリンヌクレオシド誘導体を利用して、タンパク質の生産、又は核酸機能などの各種の生体内で発現される機能を光制御することができる。例えば非特許文献１に記載されるような、核酸の二本鎖形成、リボザイムの触媒機能発現などの各種の核酸機能の光制御への応用が期待できる。また、本発明に係るプリンヌクレオシド誘導体は、ゲノム編集の光制御にも利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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