(57)【要約】  本発明は、遺伝子変異の導入に依らない、かつ、疾患患者の神経細胞における病態を均一に再現しうる神経変性疾患モデル細胞の作製方法及び該モデル細胞を用いたスクリーニング方法を提供することを目的としている。本発明は、ビタミンＢ１取り込み阻害作用を有する、不溶化ＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積誘導剤を用いた神経変性疾患モデル細胞の作製方法及び該モデル細胞を用いた神経変性疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＢ１取り込み阻害作用を有し、神経細胞内に不溶化したトランス活性応答ＤＮＡ結合蛋白質−４３の蓄積を引き起こす、神経変性疾患モデル細胞の誘導剤。
【請求項２】
アンプロリウム若しくはオキシチアミン又はそれらの薬理学的に許容される塩である、請求項１記載の誘導剤。
【請求項３】
前頭側頭葉変性症又は筋萎縮性側索硬化症のモデル細胞である、請求項１又は２記載の誘導剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載の誘導剤の存在下で、哺乳動物の非癌性の神経細胞を培養する培養工程を備える、神経変性疾患モデル細胞の作製方法。
【請求項５】
前記誘導剤は、２〜１２ｍｍｏｌ／Ｌのアンプロリウム又はその薬理学的に許容される塩である、請求項４記載の作製方法。
【請求項６】
前記培養工程は、哺乳動物の非癌性の神経細胞を６時間〜２１日間培養する工程である、請求項４又は５記載の作製方法。
【請求項７】
前記神経細胞は、ヒト人工多能性幹細胞由来神経細胞である、請求項４〜６のいずれか一項記載の作製方法。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか一項記載の作製方法で作製した神経変性疾患モデル細胞に、被験物質を接触させる接触工程と、
前記神経変性疾患モデル細胞内の不溶化したトランス活性応答ＤＮＡ結合蛋白質−４３の蓄積量、前記神経変性疾患モデル細胞の生存数及び前記神経変性疾患モデル細胞の形態からなる群より選択される１以上の評価項目を測定する実験群測定工程と、
前記実験群測定工程で測定された評価項目を指標として、前記不溶化したトランス活性応答ＤＮＡ結合蛋白質−４３の蓄積量が抑制された場合、前記生存数が減少した場合、及び／又は前記形態の変化が抑制された場合に、前記被験物質は、神経変性疾患の治療薬及び／又は予防薬の候補物質であると判定する判定工程（Ａ）と、
を備える、神経変性疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項４〜７のいずれか一項記載の作製方法で作製した神経変性疾患モデル細胞に、被験物質を接触させる接触工程と、
前記神経変性疾患モデル細胞内の不溶化したトランス活性応答ＤＮＡ結合蛋白質−４３の蓄積量、前記神経変性疾患モデル細胞の生存数及び前記神経変性疾患モデル細胞の形態からなる群より選択される１以上の評価項目を測定する実験群測定工程と、
前記被験物質を接触させていない前記神経変性疾患モデル細胞内の不溶化したトランス活性応答ＤＮＡ結合蛋白質−４３の蓄積量、前記神経変性疾患モデル細胞の生存数及び前記神経変性疾患モデル細胞の形態からなる群より選択される１以上の評価項目を測定する対照群測定工程と、
前記実験群測定工程で測定された評価項目の結果が、前記対照群測定工程で測定された対照となる評価項目の結果と比較して、前記不溶化したトランス活性応答ＤＮＡ結合蛋白質−４３の蓄積量が抑制された場合、前記生存数が減少した場合、及び／又は前記形態の変化が抑制された場合に、前記被験物質は、神経変性疾患の治療薬及び／又は予防薬の候補物質であると判定する判定工程（Ｂ）と、
を備える、神経変性疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記形態は、神経突起の長さ及び／又は密度である、請求項８又は９記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記神経変性疾患は、前頭側頭葉変性症又は筋萎縮性側索硬化症である、請求項８〜１０のいずれか一項記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積誘導剤、神経変性疾患モデル細胞の作製方法及び神経変性疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの神経変性疾患では、神経細胞内における特定の蛋白質の蓄積及び神経突起の異常が病態的特徴として知られており、これらの現象により神経細胞死が引き起こされると考えられている。【０００３】
例えば、前頭側頭葉変性症（以下、ＦＴＬＤ）や筋萎縮性側索硬化症（以下、ＡＬＳ）では、その病態的特徴として、不溶化した、トランス活性応答ＤＮＡ結合蛋白質−４３（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ４３  ｋＤａ；  以下、ＴＤＰ−４３蛋白質）の細胞質への蓄積（非特許文献１）、神経突起の異常及び細胞死が見られることが報告されている（非特許文献２）。また、一部の家族性ＦＴＬＤ及び家族性ＡＬＳの患者では、ＴＤＰ−４３蛋白質をコードする遺伝子（以下、ＴＤＰ−４３遺伝子）に変異が存在することが報告されている（非特許文献３）。【０００４】
神経変性疾患の病態的特徴を再現するモデル細胞を提供することは、該疾患の病態の理解及び治療法の開発に不可欠であるため、これまでに、さまざまなモデル細胞が提供されてきている。【０００５】
例えば、変異を有するＴＤＰ−４３遺伝子を培養細胞に導入することによる家族性ＦＴＬＤ及び家族性ＡＬＳの病態的特徴を再現するモデル及び該モデルを用いた治療薬及び／又は予防薬のスクリーニング方法が報告されている（特許文献１及び２）。【０００６】
また、近年、ヒトの神経変性疾患のモデルとして、ヒト人工多能性幹細胞（以下、ヒトｉＰＳ細胞）を分化させることにより得られる神経細胞が注目されている。神経変性疾患の患者、特に上記疾患の病因遺伝子に変異を有する患者から作製したヒトｉＰＳ細胞を分化させることにより得られる神経細胞は、上記疾患の病態的特徴をよく再現するモデルとして、期待を寄せられている（特許文献３及び４）。【０００７】
さらに、癌細胞由来の細胞株を用いたモデル細胞も報告されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００９／１２５６４６号
【特許文献２】特開２０１４−１７１４２５号公報
【特許文献３】国際公開第２０１４／１４８６４６号
【特許文献４】特表２０１５−５０６９０５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｒａｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００６年、第３５１巻、３号、ｐ．６０２−６１１
【非特許文献２】Ｒｏｓｓｉら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、２０１３年、第１章、ｐ．１−３１
【非特許文献３】Ｙｏｋｏｓｅｋｉら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２００８年、第６３巻、４号、ｐ．５３８−５４２
【非特許文献４】Ｍｕｎｏｚ−Ｓａｅｚら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１３年、第３８巻、３号、ｐ．４２５−４３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、ＦＴＬＤ及びＡＬＳの患者のうち、９０％以上の患者は、ＴＤＰ−４３遺伝子に変異を持たない、又は家族性でない孤発性疾患の患者である。そのため、一部の家族性疾患の患者に見られる、変異を有するＴＤＰ−４３遺伝子の導入により作製したモデル細胞のみでは、必ずしもＦＴＬＤ及びＡＬＳの十分なモデルとはいえない。【００１１】
また、神経変性疾患の病因遺伝子に変異を有する患者から作製したヒトｉＰＳ細胞を分化させることにより得られる神経細胞も、病因遺伝子の変異に依拠して作製されたものであるため、孤発性疾患を含めた神経変性疾患のモデルとはいえない。さらに、ヒトｉＰＳ細胞から分化させ、目的の神経細胞を作製する場合、ヒトｉＰＳ細胞の由来によっては、分化の同調性を制御することが難しい場合もある。そのため、神経変性疾患の治療薬及び予防薬のスクリーニングに用いるために不可欠な、均一な病態的特徴を呈する細胞集団を得ることが困難な場合がある。【００１２】
また、特定の蛋白質の蓄積を病態的特徴とする、ＦＴＬＤ、ＡＬＳ及びアルツハイマー病等の神経変性疾患は、動物において相当する疾患の報告がないため、ヒトに特有の疾患と考えられる。したがって、従来、ヒト以外の哺乳動物由来の細胞を用いたモデル細胞では、ヒト特有の疾患の病態的特徴を十分に再現することが困難であり、ヒトの神経変性疾患の治療薬及び予防薬のスクリーニングには適さないと考えられていた。また、ＴＤＰ−４３蛋白質は、癌の増殖期によって発現が変化することから、癌細胞由来の細胞株を用いたモデル細胞も、神経変性疾患の治療薬及び予防薬のスクリーニングに適さない。【００１３】
したがって、神経変性疾患の治療薬及び予防薬の探索において、遺伝子変異の導入に依らない、かつ、疾患患者の神経細胞における病態を均一に再現しうる神経変性疾患モデル細胞及び該モデル細胞を用いたスクリーニング方法が切望されていた。【００１４】
そこで、本発明は、神経細胞内に不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積を引き起こす、神経変性疾患モデル細胞の誘導剤、神経変性疾患モデル細胞の作製方法及び神経変性疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ビタミンＢ１取り込み阻害作用を有し、神経細胞内に不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積を引き起こす誘導剤を見出し、本発明を完成させた。【００１６】
すなわち、本発明は、ビタミンＢ１取り込み阻害作用を有し、神経細胞内に不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積を引き起こす、神経変性疾患モデル細胞の誘導剤を提供する。【００１７】
上記の誘導剤は、アンプロリウム若しくはその薬理学的に許容される塩又はオキシチアミン若しくはその薬理学的に許容される塩であることが好ましい。【００１８】
上記の神経変性疾患モデル細胞は、前頭側頭葉変性症又は筋萎縮性側索硬化症のモデル細胞であることが好ましい。【００１９】
上記の神経細胞は、哺乳動物の非癌性の神経細胞であることが好ましい。【００２０】
また、本発明は、上記の誘導剤の存在下で、哺乳動物の非癌性の神経細胞を培養する培養工程を備える、神経変性疾患モデル細胞の作製方法を提供する。【００２１】
上記の誘導剤は、２〜１２ｍｍｏｌ／Ｌのアンプロリウム又はその薬理学的に許容される塩であることが好ましい。【００２２】
また、上記の培養工程は、哺乳動物の非癌性の神経細胞を６時間〜２１日間培養する工程であることが好ましい。【００２３】
上記の哺乳動物の非癌性の神経細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞由来神経細胞であることが好ましく、ヒトｉＰＳ細胞由来神経細胞であることがより好ましく、ヒト正常ｉＰＳ細胞由来神経細胞であることがさらに好ましく、ヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞又はヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリンアセチルトランスフェラーゼ陽性神経細胞であることが特に好ましい。【００２４】
また、本発明は、上記作製方法で作製した神経変性疾患モデル細胞に、被験物質を接触させる接触工程と、上記神経変性疾患モデル細胞の細胞内の不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積量、上記神経変性疾患モデル細胞の生存数及び上記神経変性疾患モデル細胞の形態からなる群より選択される１以上の評価項目を測定する実験群測定工程と、上記実験群測定工程で測定された評価項目を指標として、上記不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積量が抑制された場合、上記生存数が減少した場合、及び／又は上記形態の変化が抑制された場合に、上記被験物質は、神経変性疾患の治療薬及び／又は予防薬の候補物質であると判定する判定工程（Ａ）と、を備える、神経変性疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法を提供する。【００２５】
また、本発明は、上記の作製方法で作製した神経変性疾患モデル細胞に、被験物質を接触させる接触工程と、上記神経変性疾患モデル細胞内の不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積量、上記神経変性疾患モデル細胞の生存数及び上記神経変性疾患モデル細胞の形態からなる群より選択される１以上の評価項目を測定する実験群測定工程と、上記被験物質を接触させていない上記神経変性疾患モデル細胞内の不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積量、上記神経変性疾患モデル細胞の生存数及び上記神経変性疾患モデル細胞の形態からなる群より選択される１以上の評価項目を測定する対照群測定工程と、上記実験群測定工程で測定された評価項目の結果が、上記対照群測定工程で測定された対照となる評価項目の結果と比較して、上記不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積量が抑制された場合、上記生存数が減少した場合、及び／又は上記形態の変化が抑制された場合に、上記被験物質は、神経変性疾患の治療薬及び／又は予防薬の候補物質であると判定する判定工程（Ｂ）と、を備える、神経変性疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法を提供する。【００２６】
上記の形態は、神経突起の長さ及び／又は密度であることが好ましい。【００２７】
また、上記のスクリーニング方法において、神経変性疾患は、ＦＴＬＤ又はＡＬＳであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の、神経細胞内に不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積を引き起こす、神経変性疾患モデル細胞の誘導剤によれば、遺伝子変異の導入に依らない、かつ、神経変性疾患患者の神経細胞における病態を均一に再現しうる、不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質が細胞内に蓄積した神経変性疾患モデル細胞を作製できる。また、該神経変性疾患モデル細胞を用いれば、神経変性疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニングを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質が細胞内に蓄積した神経変性疾患モデル細胞を作製する手順及び該神経変性疾患モデル細胞を用いた神経変性疾患の治療薬及び／又は予防薬のスクリーニングの流れの一例を示す図である。
【図２】図２Ａ：アンプロリウム処置による、ヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞の不溶性画分における全長ＴＤＰ−４３及び断片化ＴＤＰ−４３の発現のウエスタンブロット像である。図２Ｂ：アンプロリウム処置による、ヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞の不溶性画分における、全長ＴＤＰ−４３及び断片化ＴＤＰ−４３のウエスタンブロット像から定量化した発現量を示す図である。
【図３】図３Ａ：オキシチアミン処置による、ヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞の不溶性画分における全長ＴＤＰ−４３及び断片化ＴＤＰ−４３の発現のウエスタンブロット像である。図３Ｂ：オキシチアミン処置による、ヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞の不溶性画分における、全長ＴＤＰ−４３及び断片化ＴＤＰ−４３のウエスタンブロット像から定量化した発現量を示す図である。
【図４】図４Ａ：アンプロリウム処置によるヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞の生存数の画像解析結果を示す図である。図４Ｂ：アンプロリウム処置によるヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞の神経突起の長さの画像解析結果を示す図である。図４Ｃ：溶媒処置及びアンプロリウム処置によるヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞の画像解析に用いた画像の一例である。
【図５】図５Ａ：アンプロリウム処置によるヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞の生存数に対する、既存のＡＬＳ治療薬（エダラボンとリルゾール）の作用を示す図である。図５Ｂ：アンプロリウム処置によるヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞の神経突起の長さに対する、既存のＡＬＳ治療薬（エダラボンとリルゾール）の作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００３１】
本発明の、神経細胞内に不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積を引き起こす、神経変性疾患モデル細胞の誘導剤は、ビタミンＢ１取り込み阻害作用を有することを特徴としている。
【００３２】
「ビタミンＢ１取り込み阻害作用」とは、細胞内へのビタミンＢ１取り込みを阻害又は抑制し、細胞内のビタミンＢ１量を低下させる作用を意味する。ビタミンＢ１取り込み阻害作用を有する物質としては、例えば、アンプロリウム若しくはその薬理学的に許容される塩、オキシチアミン若しくはその薬理学的に許容される塩又はピリチアミン等が挙げられるが、アンプロリウム若しくはその薬理学的に許容される塩又はオキシチアミン若しくはその薬理学的に許容される塩が好ましく、アンプロリウム若しくはその薬理学的に許容される塩がより好ましい。アンプロリウム若しくはその薬理学的に許容される塩、オキシチアミン若しくはその薬理学的に許容される塩又はピリチアミン等のビタミンＢ１取り込み阻害物質は市販品として入手可能である。
【００３３】
「哺乳動物」としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ又はサル等が挙げられるが、特にヒトが好ましい。
【００３４】
「非癌性の神経細胞」とは、癌由来ではない神経細胞を意味する。神経細胞は、培養細胞であることが好ましく、正常な生体内の神経細胞の性質に近い性質を保持した状態で培養した神経細胞であることがより好ましい。
【００３５】
「哺乳動物の非癌性の神経細胞」としては、例えば、哺乳動物の初代培養神経細胞、哺乳動物の組織幹細胞由来神経細胞又は哺乳動物の多能性幹細胞由来神経細胞等が挙げられるが、哺乳動物の多能性幹細胞由来神経細胞であることが好ましく、ヒト多能性幹細胞由来神経細胞であることがより好ましい。
【００３６】
「多能性幹細胞」とは、生体内に存在する全ての細胞に分化する能力と、自己増殖する能力とを兼ね備えた細胞を意味する。多能性幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞（以下、ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞、生殖幹細胞及びＭｕｓｅ細胞等が挙げられるが、ｉＰＳ細胞が好ましい。
【００３７】
「多能性幹細胞由来神経細胞」とは、多能性幹細胞から分化誘導して得られた神経細胞を意味する。多能性幹細胞由来神経細胞は、ｉＰＳ細胞由来神経細胞であることが好ましく、ヒトｉＰＳ細胞由来神経細胞であることがより好ましい。
【００３８】
「ｉＰＳ細胞」とは、特定の初期化因子をＤＮＡ、ｍＲＮＡ又は蛋白質の形態で、体細胞に導入することで人工的に作製した幹細胞であり、胚性幹細胞に近い性質、例えば各種生体組織の細胞への分化能と自己増殖能とを有する細胞である。
【００３９】
ヒトｉＰＳ細胞由来神経細胞は、ヒト正常ｉＰＳ細胞由来神経細胞であることが好ましい。ヒト正常ｉＰＳ細胞由来神経細胞は、ヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞又はヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリンアセチルトランスフェラーゼ陽性神経細胞であることが好ましい。
【００４０】
初代培養神経細胞は、例えば、ＡＴＣＣ社又はＬｏｎｚａ社から購入することができる。また、哺乳動物の胎仔の脳を取り出し、文献（Ｋａｅｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００６年、第１巻、５号、ｐ．２４０６−２４１５）に記載の方法で単離・培養することで、作製することもできる。
【００４１】
ヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞又はヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリンアセチルトランスフェラーゼ陽性神経細胞は、例えば、Ｆ１２／ＤＭＥＭ／Ｎ２培地中でヒト正常ｉＰＳ細胞を培養し神経前駆細胞を誘導した後、さらにレチノイン酸及びソニックヘッジホッグ存在下で２０日間培養を継続することで作製する方法（Ｂｒｉｓｃｏｅら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００１年、第１１巻、１号、ｐ．４３−４９）や、Ｆ１２／ＤＭＥＭ／Ｎ２培地中でヒト正常ｉＰＳ細胞を培養し神経前駆細胞を誘導後、Ｎｇｎ２、Ｉｓｌ−１及びＬｈｘ３の３つの転写因子を神経前駆細胞に強制発現させた後、さらにレチノイン酸及びソニックヘッジホッグ存在下で７日間培養を継続することで作製する方法（Ｈｅｓｔｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１１年、第１９巻、１９号、ｐ．１９０５−１９４９）等で作製できる。また、ヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリンアセチルトランスフェラーゼ陽性神経細胞は、細胞キットとして日本では、Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社から購入することもできる。
【００４２】
「ＴＤＰ−４３蛋白質」とは、核に局在する不均一核内リボ蛋白質であり、リボ核酸や他のリボ蛋白質と結合して、リボ核酸の安定化、選択的スプライシング、又は／及び転写調節などのプロセスに関与する蛋白質である。ＴＤＰ−４３蛋白質は、ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ４３  ｋＤａの他に、ｔｒａｎｓａｃｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４３  ｋＤａ、ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｒｅｇｉｏｎ−ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ４３  ｋＤａ、ＴＡＲ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４３ ｋＤａ又は４３  ｋＤａ  ＴＡＲ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎとも表記される。本明細書において、特記しない限り、「ＴＤＰ−４３蛋白質」は、不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質、全長ＴＤＰ−４３蛋白質、断片化したＴＤＰ−４３蛋白質を全て含む。
【００４３】
「不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質」とは、ＴＤＰ−４３蛋白質が可溶化される通常の蛋白質抽出条件（例えば、界面活性剤等を用いた条件）で、可溶化されない性質に変化したものを意味する。不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質としては、例えば、断片化したＴＤＰ−４３蛋白質、異常リン酸化されたＴＤＰ−４３蛋白質又はユビキチン化されたＴＤＰ−４３蛋白質が挙げられる。
【００４４】
「断片化したＴＤＰ−４３蛋白質」とは、蛋白質分解酵素等の働きによって、全長ＴＤＰ−４３蛋白質が、より小さい断片に分解されたものを意味し、分子量が、全長ＴＤＰ−４３蛋白質の４３ｋＤａより小さければ特に限定されないが、例えば、３５ｋＤａ又は２５ｋＤａに切断されたＴＤＰ−４３蛋白質が挙げられる。
【００４５】
「異常リン酸化されたＴＤＰ−４３蛋白質」とは、リン酸化酵素反応によって、ＴＤＰ−４３蛋白質の一部のアミノ酸残基がリン酸化されたものを意味し、例えば、Ｃ末端領域の複数の部位（Ｓｅｒ４０３、Ｓｅｒ４０４、Ｓｅｒ４０９及びＳｅｒ４１０等）がリン酸化されたＴＤＰ−４３蛋白質が挙げられる。
【００４６】
「ユビキチン化されたＴＤＰ−４３蛋白質」とは、ユビキチンリガーゼ等の働きによりユビキチン蛋白質がイソペプチド結合で付加されたＴＤＰ−４３蛋白質のことである。
【００４７】
「神経細胞内の不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積」とは、上記の不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質が神経細胞内で増加することを意味する。神経細胞内とは、特に神経細胞の細胞質内であることが好ましい。
【００４８】
また、本発明は、上記の誘導剤の存在下で、哺乳動物の非癌性の神経細胞を培養する培養工程を備える、神経変性疾患モデル細胞の作製方法を提供することを特徴としている。
【００４９】
「神経変性疾患」とは、中枢神経系において特定の種類の神経細胞群が徐々に変性し、細胞死を起こす進行性疾患の総称である。
【００５０】
上記の神経変性疾患モデル細胞は、不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質が細胞内に蓄積した神経変性疾患モデル細胞であることが好ましい。
【００５１】
「不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質が細胞内に蓄積した神経変性疾患モデル細胞」は、上記の不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質が細胞内（好ましくは、細胞質内）に蓄積した細胞であるため、神経細胞での不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積が病態のいずれかの時期に生じることが知られている神経変性疾患の病態的特徴を模倣した細胞である。したがって、上記の神経変性疾患は、神経細胞での不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積が病態のいずれかの時期に生じることが知られている神経変性疾患であれば特に限定されない。神経細胞での不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積が病態のいずれかの時期に生じることが知られている神経変性疾患としては、例えば、ＦＴＬＤ及びＡＬＳ等が挙げられるが、特にＡＬＳが好ましい。また、上記の病態的特徴とは、神経細胞の細胞内の不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積、神経細胞の生存数の減少（細胞死）及び神経細胞の形態の変化（神経突起の異常）を包含する。上記の神経細胞の形態の変化は、神経突起の長さ及び／又は密度の変化であることが好ましい。
【００５２】
上記の神経変性疾患モデル細胞の作製方法において、上記の誘導剤は、０．０１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。また、上記の誘導剤は、０．０１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌのアンプロリウム又はその薬理学的に許容される塩であることが好ましく、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌのアンプロリウム又はその薬理学的に許容される塩であることがより好ましく、２〜１２ｍｍｏｌ／Ｌのアンプロリウム又はその薬理学的に許容される塩であることがさらに好ましく、６〜１２ｍｍｏｌ／Ｌのアンプロリウム又はその薬理学的に許容される塩であることが特に好ましい。また、上記の誘導剤は、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌのオキシチアミン又はその薬理学的に許容される塩であることが好ましく、０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌのオキシチアミン又はその薬理学的に許容される塩であることがより好ましく、０．６〜３ｍｍｏｌ／Ｌのオキシチアミン又はその薬理学的に許容される塩であることがさらに好ましい。上記の誘導剤は、例えば、細胞培養用培地の中に添加し、溶解させることが好ましく、該細胞培養用培地には各種緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）が含まれていてもよい。
【００５３】
上記の培養工程は、６時間〜２１日間培養する工程であることが好ましく、１〜１４日間培養する工程であることがより好ましく、３〜１４日間培養する工程であることがさらに好ましく、３〜７日間培養する工程であることが特に好ましい。
【００５４】
上記の神経変性疾患モデル細胞の作製方法は、哺乳動物の非癌性の神経細胞を、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌのアンプロリウム若しくはその薬理学的に許容される塩又は０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌのオキシチアミン若しくはその薬理学的に許容される塩の存在下に１〜１４日間培養する工程を備えることが好ましく、哺乳動物の非癌性の神経細胞を、６〜１２ｍｍｏｌ／Ｌのアンプロリウム若しくはその薬理学的に許容される塩又は０．６〜３ｍｍｏｌ／Ｌのオキシチアミン若しくはその薬理学的に許容される塩の存在下に３〜７日間培養する工程を備えることがより好ましい。さらに、上記の神経変性疾患モデル細胞を作製する方法は、ヒト正常ｉＰＳ細胞由来神経細胞を、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌのアンプロリウム若しくはその薬理学的に許容される塩又は０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌのオキシチアミン若しくはその薬理学的に許容される塩の存在下に１〜１４日間培養する工程を備えることがさらに好ましく、ヒト正常ｉＰＳ細胞由来神経細胞を、２〜１２ｍｍｏｌ／Ｌのアンプロリウム若しくはその薬理学的に許容される塩又は０．６〜３ｍｍｏｌ／Ｌのオキシチアミン若しくはその薬理学的に許容される塩の存在下に３〜７日間培養する工程を備えることが特に好ましい。
【００５５】
また、本発明は、上記の方法で作製した神経変性疾患モデル細胞を用いた、神経変性疾患の治療薬及び／又は予防薬のスクリーニング方法を提供することを特徴としている。該スクリーニング方法は、上記の方法で作製した神経変性疾患モデル細胞に、被験物質を接触させる接触工程と、上記神経変性疾患モデル細胞内の不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積量、上記神経変性疾患モデル細胞の生存数及び上記神経変性疾患モデル細胞の形態からなる群より選択される１以上の評価項目を測定する実験群測定工程と、上記実験群測定工程で測定された評価項目を指標として、上記不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積量が抑制された場合、上記生存数が減少した場合、及び／又は上記形態の変化が抑制された場合に、上記被験物質は、神経変性疾患の治療薬及び／又は予防薬の候補物質であると判定する判定工程（Ａ）と、を備える。
【００５６】
より具体的には、上記のスクリーニング方法は、以下の工程（１）〜（５）を備えることが好ましい。
（１）上記の神経変性疾患モデル細胞を作製する方法からなる、神経変性疾患モデル細胞作製工程と、
（２）神経変性疾患モデル細胞に、被験物質を接触させる接触工程と、
（３）上記神経変性疾患モデル細胞内の不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積量、上記神経変性疾患モデル細胞の生存数及び上記神経変性疾患モデル細胞の形態からなる群より選択される１以上の評価項目を測定する実験群測定工程と、
（４）上記被験物質を接触させていない上記神経変性疾患モデル細胞内の不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積量、上記神経変性疾患モデル細胞の生存数及び上記神経変性疾患モデル細胞の形態からなる群より選択される１以上の評価項目を測定する対照群測定工程と、
（５）上記実験群測定工程の測定結果が、上記対照群測定工程で測定された対象となる評価項目の結果と比較して、上記不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質量の蓄積量が抑制された場合、上記生存数が減少した場合、及び／又は上記形態の変化が抑制された場合に、上記被験物質は、神経変性疾患の治療薬及び／又は予防薬の候補物質であると判定する工程（Ｂ）。
【００５７】
上記のスクリーニング方法は、神経変性疾患モデル細胞の細胞内の不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質量、上記細胞の生存数及び上記細胞の形態からなる群より選択される１以上の評価項目を測定する工程を備えるが、上記の評価項目としては、神経変性疾患モデル細胞の生存数及び／又は形態が、簡便に測定できるため好ましく、神経変性疾患モデル細胞の生存数及び形態の両項目を測定することがより好ましい。
【００５８】
「被験物質」は、生体内物質、遺伝子組換え物質、天然物又は化学合成化合物等の別を問わず、また、これらに限定されるものでもない。また、上記の被験物質は、溶媒に溶解又は懸濁して添加することができる。溶媒は、適当な薬学的に許容可能な担体であればいずれでもよい。また、上記の被験物質の添加量、添加回数及び添加期間は、細胞の種類及び被験物質の種類等に応じて適宜設定することができる。また、効力を比較するための既知の神経変性疾患の治療剤又は予防剤であってもよい。
【００５９】
被験物質と上記の神経変性疾患モデル細胞との接触は、例えば、細胞培養用培地や各種緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）の中に被験物質を添加して、細胞を一定時間インキュベートすることにより実施することができる。上記の被験物質の添加期間、タイミング、回数及び濃度は、被験物質の効力により適宜設定すればよい。例えば、上記の被験物質を添加するタイミングは、上記の誘導剤（好ましくは、アンプロリウム、オキシチアミン又はその薬理学的に許容される塩）を添加する前、同時又は後から添加してもよい。好ましくは、上記の誘導剤との同時添加である。
【００６０】
「被験物質を接触させていない神経変性疾患モデル細胞」とは、該被験物質を添加されていない対応する神経変性疾患モデル細胞を意味し、上記神経変性疾患モデル細胞は「被験物質を接触させた神経変性疾患モデル細胞」とは別細胞であっても同一細胞であってもよい。例えば、同一細胞の場合は、被験物質を添加する前の神経変性疾患モデル細胞が「被験物質を接触させていない神経変性疾患モデル細胞」に該当し、被験物質を添加した後の該神経変性疾患モデル細胞が「被験物質を接触させた神経変性疾患モデル細胞」に該当する。本発明の神経変性疾患モデル細胞は、神経変性疾患患者（好ましくは、ＦＴＬＤ及びＡＬＳ）の神経細胞における病態を均一に再現しうる神経変性疾患モデル細胞であるため、被験物質を接触させていない神経変性疾患モデル細胞は、被験物質を接触させた神経変性疾患モデル細胞と別細胞を用い、同条件下で培養した細胞を用いることが好ましい。なお、「被験物質を接触させていない」とは、被験物質の代わりに被験物質と同量の溶媒（ブランク）を添加する場合や、測定項目に影響を与えないネガティブコントロール物質を添加する場合も含まれる。
【００６１】
上記の実験群測定工程と上記の対照群測定工程は、同時期に行っても、異なる時期に行ってもよい。例えば、対照となる、被験物質を接触させていない神経変性疾患モデル細胞の細胞内の不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質量、上記神経変性疾患モデル細胞の生存数及び／又は上記神経変性疾患モデル細胞の形態は、予め測定しておいた値を用いてもよい。上記の実験群測定工程と上記の対照群測定工程は、同時期に行うことが好ましい。
【００６２】
上記の不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質量を測定する方法は、ＴＤＰ−４３蛋白質の量を定量的に検出できる方法であればいずれの方法でもよい。例えば、細胞から不溶性画分の蛋白質溶液を調製し、不溶性画分の蛋白質溶液中のＴＤＰ−４３蛋白質を免疫学的手法により検出する方法が挙げられる。また、細胞を直接免疫染色し、不溶化したＴＤＰ―４３蛋白質が局在する細胞質の封入体量を検出してもよい。不溶性画分の蛋白質溶液中のＴＤＰ−４３蛋白質を免疫学的手法により検出する方法が好ましい。
【００６３】
不溶性画分の蛋白質溶液中のＴＤＰ−４３蛋白質を免疫学的手法により検出する方法において、細胞からの不溶性画分の蛋白質溶液の調製は、細胞の回収直後に行ってもよいし、細胞の蛋白質が分解又は変性等されない条件下で適切に保存後（例えば、凍結保存後）、後日実施することでもかまわない。不溶性画分の蛋白質溶液中のＴＤＰ−４３蛋白質を免疫学的手法により検出するためには、その前処理として、回収した細胞から蛋白質を抽出する処理を行うことが好ましい。蛋白質を抽出する方法は、例えば、組織破砕方法及び蛋白質抽出バッファーを用いた方法で行うことができる。具体的には、細胞に可溶性画分のみを溶解するバッファーを添加後、超音波により細胞を破砕し、遠心後、上清を回収することで可溶性画分の蛋白質を抽出することができる。この遠心後の沈殿物を、さらに不溶性画分も溶解可能なバッファーを用いて懸濁し、再度超音波処理することにより不溶性画分の蛋白質を抽出することができる（実施例１参照）。蛋白質の抽出は、細胞の回収直後に行ってもよいし、蛋白質が分解又は変性等されない条件下で適切に保存後（例えば、凍結保存後）、後日抽出することでもかまわない。蛋白質抽出液は、次の作業まで、蛋白質が分解又は変性等されない条件下で適切に保存（例えば、凍結保存）してもよい。
【００６４】
不溶性画分の蛋白質溶液中のＴＤＰ−４３蛋白質量を測定するための免疫学的手法は、特に限定されないが、抗ＴＤＰ−４３抗体で検出する免疫学的手法が好ましい。例えば、ウエスタンブロット、ドットブロット、免疫沈降法、ＲＩＡ、プロテインアレイ及びＥＬＩＳＡ等を用いて測定することができるが、抗ＴＤＰ―４３抗体を用いて、全長ＴＤＰ―４３蛋白質及び断片化したＴＤＰ―４３蛋白質をバンドとして検出するウエスタンブロットによる測定が好ましい。
【００６５】
ウエスタンブロットにより不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質量の測定を行う方法は、公知の方法であり、特に限定されないが、例えば、上記の蛋白質抽出液を同質量ずつポリアクリルアミドゲルのウェルにアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動を行った後、ＰＶＤＦ膜へと転写し、その膜上に転写されたＴＤＰ−４３蛋白質を抗ＴＤＰ−４３抗体と抗ＴＤＰ−４３抗体を認識する標識２次抗体とを用いて特異的バンドとして検出し、市販の画像解析ソフトにてバンドを定量化する方法がある。
【００６６】
上記の抗ＴＤＰ−４３抗体は、ＴＤＰ−４３蛋白質を検出しうる抗体であればよく、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよいし、場合によっては、抗体のフラグメント、例えば、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２を用いることができる。また、これらの抗体は、公知の方法により作製することが可能である。
【００６７】
神経変性疾患モデル細胞の生存数を測定する方法は、特に限定されないが、公知の方法を用いて測定することができる。例えば、ＭＴＴ法、ＷＳＴ−１法、ＷＳＴ−８法若しくはＡｌａｍｅｒ  Ｂｌｕｅ法を用いて吸光度を測定する方法、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）を用いて染色し、フローサイトメーターを用いて計数する方法、顕微鏡下での目視による計測若しくは取り込んだ画像を解析して細胞核の数を測定する方法又は神経様の細胞形態と核形態共存性から神経細胞のみを同定し、その細胞数を測定する方法等が挙げられるが、神経様の細胞形態と核形態共存性から神経細胞のみを同定し、その細胞数を測定する方法が好ましい。
【００６８】
神経様の細胞形態と核形態共存性から神経細胞のみを同定し、その細胞数を測定する方法は、特に限定されないが、例えば、顕微鏡下で神経様の細胞形態と核形態が共存している細胞を目視で計測する方法又は核特異的マーカーによる核染色及び神経細胞特異的マーカーによる細胞標識を行い、核染色と細胞標識との重なり部分を測定し神経細胞を計測する（その重なり部分を有する細胞を神経細胞の本体とする）方法が挙げられる。核染色と細胞標識は、顕微鏡下に目視で観察してもよいし、細胞画像取得装置により撮影した画像を画像解析ソフトにより解析してもよいが、細胞画像取得装置により撮影した画像を解析ソフトにより解析することが好ましい。
【００６９】
上記の細胞標識の方法は、特に限定されないが、公知の方法を用いることができる。例えば、神経細胞特異的マーカー蛋白質に結合する抗体を用いて免疫染色により標識する方法又は神経細胞特異的に発現する蛋白質のプロモーター領域下流にレポーター遺伝子を連結したベクターを細胞に導入し、発現するレポーター蛋白質を標識として検出する方法が挙げられる。上記の細胞標識の方法は、神経細胞特異的マーカー蛋白質に結合する抗体を用いて免疫染色により標識する方法が好ましい。
【００７０】
上記の免疫染色は公知の方法により実施することができる。例えば、神経細胞特異的マーカーに結合する１次抗体をラベル物質で直接標識したものを、細胞サンプルに添加し免疫染色を行う方法又は未標識の１次抗体と、その１次抗体を特異的に認識する、ラベル物質で標識された２次抗体を用いて免疫染色を行う方法が挙げられるが、未標識の１次抗体と、その１次抗体を特異的に認識する、ラベル物質で標識された２次抗体を用いて免疫染色を行う方法が好ましい（以下の、実施例１及び２参照）。
【００７１】
上記の神経細胞特異的マーカーに結合する１次抗体としては、特に限定されないが、例えば、抗βＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体、抗ＮｅｕＮ抗体，抗ＭＡＰ２抗体又は抗Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ抗体等が挙げられる。神経細胞特異的マーカーに結合する１次抗体としては、抗βＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体が好ましい。これら抗体はモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。
【００７２】
上記の１次抗体を特異的に認識する、ラベル物質で標識された２次抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。
【００７３】
上記のラベル物質は、特に限定されないが、例えば、蛍光ラベル物質として、ＦＩＴＣ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、ＣＹ３又はＣＹ５等が挙げられる。また酵素ラベル物質としてＨｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ及びＡｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｓｅ等を用いることができる。ラベル物質としては、蛍光ラベル物質が好ましい。
【００７４】
上記の核染色の方法は、神経細胞特異的マーカーの免疫染色の色と区別が可能な方法であれば特に限定されないが、例えば、蛍光核染色としてＤＡＰＩ、ＰＩ又はＨｏｅｃｈｓｔ等による染色法が挙げられる。また、明視野観察の核染色として、ヘマトキシリン染色又はメチルグリーン染色等の染色法が挙げられる。上記の核染色の方法としては、蛍光核染色であることが好ましい。
【００７５】
「神経変性疾患モデル細胞の形態」の測定項目としては、例えば、神経突起の長さ、神経突起の断片化の程度、神経突起数、神経突起の密度、神経突起の膨化程度又は神経突起のビーズ状変化度等が挙げられるが、神経突起の長さ及び／又は密度が好ましい。神経突起の密度は、神経突起の画像上における蛍光強度と面積との積として測定してもよい。
【００７６】
上記の神経変性疾患モデル細胞の形態を測定する方法は、特に限定されないが、例えば、顕微鏡下で神経突起の形態を目視で計測する方法又は顕微鏡カメラ若しくは細胞画像取得装置により撮影した画像を解析ソフトにより解析する方法等が挙げられるが、細胞画像取得装置により撮影した画像を画像解析ソフトにより解析する方法が好ましい。
【００７７】
上記の細胞画像取得装置は、特に限定されないが、例えば、ＴｏｘＩｎｓｉｇｈｔ，ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｉｍａｇｅ  Ｘｐｒｅｓｓ、Ｏｐｅｒａ又はＯｐｅｒｅｔｔａ等が挙げられる。
【００７８】
上記の画像解析ソフトは、特に限定されないが、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ｓｃａｎ、Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ、Ｍｅｔａ  Ｘｐｒｅｓｓ、Ｈａｒｍｏｎｙ、Ｉｍａｇｅ  Ｊ又はＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ等が挙げられる。
【００７９】
「神経変性疾患モデル細胞の形態の変化」としては、神経突起の短縮、神経突起の断片化、神経突起数の減少、神経突起の密度低下、神経突起の膨化及び神経突起のビーズ状変化等が挙げられるが、神経突起の短縮及び密度低下が好ましい。「形態の変化が抑制される」とは、例えば、上記の被験物質を接触させていない神経変性疾患モデル細胞と比較して神経突起の短縮度合いが小さい、神経突起の断片化が少ない、神経突起数の減少が抑制されている、神経突起の密度低下が抑制されている、神経突起の膨化が抑制されている又は神経突起のビーズ状変化が抑制されていることを意味する。
【００８０】
上記の神経変性疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法は、神経細胞での不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積が病態のいずれかの時期に生じることが知られている神経変性疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法であることが好ましい。神経細胞での不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積が病態のいずれかの時期に生じることが知られている神経変性疾患としては、例えば、ＦＴＬＤ及びＡＬＳ等が挙げられるが、特にＡＬＳが好ましい。
【実施例】
【００８１】
以下に実施例を示して本発明を更に詳しく説明するが、本発明は、これら実施例に何ら限定されるものではない。【００８２】
（実施例１）ビタミンＢ１取り込み阻害作用を有する誘導剤の処置による神経細胞の変化
１．神経細胞の分化
ヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞として、ＲｅｐｒｏＮｅｕｒｏ  Ａｃｈ（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社，ＲＣＥＳＤＡ００１）を用いた。【００８３】
コーティングプレートの作製は、ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社のプロトコルに従い行った。すなわち、ポリスチレン製９６ウェルプレート又は１２ウェルプレートに０．０２％  ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ液（０．１％液をＰＢＳで５倍希釈）を添加し、３７℃で２時間以上インキュベートした。Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ液をプレートから除去後、プレートをＰＢＳで２回洗浄した後、コーティング液（Ｒｅｐｒｏ  Ｃｏａｔ）をプレートに添加し、３７℃で一晩インキュベートし、１週間以内に使用した。コーティング液は、細胞播種前に除去した。【００８４】
細胞播種は、ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社のプロトコルに従い行った。すなわち、細胞のバイアルをドライアイス又は液体窒素から取り出し、直ちに３７℃のウォーターバスで９０秒間加温した後、Ｔｈａｗｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍに移し、３５０×ｇ、５分間室温で遠心した。遠心後、上清を除去し、細胞を培地（Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ、ＡＣｈ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを添加）に懸濁し、上記のコーティングプレートに播種した。播種日をｄａｙ０とし、以降、ｄａｙ３及びｄａｙ７に半量ずつ培地交換を行い、神経突起の十分な伸展が見られたｄａｙ１４の細胞を以下の実験に使用した。【００８５】
２．ビタミンＢ１取り込み阻害作用を有する誘導剤による細胞処置
細胞の培養上清を除去し、ビタミンＢ１取り込み阻害作用を有する誘導剤として、アンプロリウム（１２ｗｅｌｌプレートでは６．０ｍｍｏｌ／Ｌ若しくは１２ｍｍｏｌ／Ｌ、９６ｗｅｌｌプレートでは２〜１２ｍｍｏｌ／Ｌ）又はオキシチアミン（最終濃度：３ｍｍｏｌ／Ｌ若しくは０．６ｍｍｏｌ／Ｌ）を含有する新たな培地を細胞に添加した（それぞれ「アンプロリウム処置群」、「オキシチアミン処置群」と呼ぶ）。対照として、溶媒（０．１％  ＤＭＳＯ）のみを添加した（ビタミンＢ１取り込み阻害物質を含有しない）。新たな培地を細胞に添加した（これを「溶媒処置群」と呼ぶ）。１２ウェルプレートの場合は、さらに３日間培養した。９６ウェルプレートの場合は、さらに７日間培養した（細胞処置開始の４日後に、古い培地を半量除き、各添加物質を含有する新しい培地を半量分添加した）。【００８６】
３．ＴＤＰ−４３の不溶化及び断片化（細胞の蛋白質分画及びウエスタンブロット）
１２ウェルプレートで３日間培養した細胞から、培養上清を除去し、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄後、ＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒ混合液（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｐｈｏ  Ｓｔｏｐ及びＵＲＥＡ  ｂｕｆｆｅｒを含む）を添加し、氷冷しながら３０分間静置した後、ソニケーションして細胞破砕液を回収した。この時点での細胞破砕液中の蛋白質量をＢＣＡ法により定量した。上記細胞破砕液を４℃、１００，０００×ｇで遠心し、上清を可溶性画分として回収した。さらに、ペレットを同様にＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒ混合液で２回遠心洗浄し（４℃、１００，０００×ｇ）、得られたペレットにＵＲＥＡ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、ソニケーションで溶解したものを不溶性画分として回収した。【００８７】
回収した不溶性画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動を行った後、ゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜をブロッキング液（Ｂｒｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ、ナカライテスク社）に浸して室温で３０分ブロッキングした後、ウサギ抗ＴＤＰ−４３抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈ社、抗体希釈液で１０００倍希釈）と４℃で一晩インキュベーションして反応させた。次に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで３回洗浄後、ＨＲＰ標識ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア、抗体希釈液で１００００倍希釈）と室温で１時間インキュベーションして反応させた。さらに、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで３回洗浄後、ＰＶＤＦ膜にＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア社）を添加して５分間静置した後、発光検出装置（Ｃｈｅｍｉ−Ｄｏｃ  ＸＲＳ  Ｐｌｕｓ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて発光を検出した。得られた画像から、画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｌａｂ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて各バンドのシグナル強度を検出し、相対的なＴＤＰ−４３蛋白質の発現量を測定した。【００８８】
４．神経細胞の生存数及び形態の測定（免疫細胞化学）
９６ウェルプレートで７日間培養した細胞から、培養上清を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄後、４％ＰＦＡを添加して室温で３０分間、固定した。細胞をＰＢＳで２回洗浄後、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳを添加して室温で３０分間、浸透化処理を行った。細胞をＰＢＳで２回洗浄後、ブロッキング液（Ｂｌｏｃｋｎｇ  Ｏｎｅ、ナカライテスク社）を添加して室温で３０分間、ブロッキングした後、マウス抗βＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（ブロッキング液で希釈）と、室温で２時間又は４℃で一晩インキュベートして反応させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体（ブロッキング液で希釈）と、遮光条件下、室温で１時間インキュベートして反応させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄後、細胞にＤＡＰＩ（ＰＢＳで希釈）を添加して室温で１０分間反応させることで核染色した。最後に、１００μＬ／ウェルのＰＢＳを添加してＴｏｘＩｎｓｉｇｈｔを用いて細胞を撮影した。【００８９】
神経細胞の生存数及び神経突起の長さの定量解析は、撮影装置ＴｏｘＩｎｓｉｇｈｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて撮影した画像を、画像解析ソフトウェアＡｒｒａｙＳｃａｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の神経突起解析プロトコルＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｐａｎｅｌ（ＤＮＴＰ）ｖ４．１を用いて解析することにより行った。データ解析はＣｅｌｌｏｍｉｃｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて行った。【００９０】
上記の実施例１の１．〜４．の流れを図１に示す。【００９１】
５．結果
不溶性画分における全長ＴＤＰ−４３蛋白質及び断片化ＴＤＰ−４３蛋白質の発現量の測定結果を図２に示す。【００９２】
図２は、アンプロリウム処置時の結果を示す。図２Ａは、ウエスタンブロット像を示す。図２Ｂのグラフの縦軸は、不溶性画分におけるＴＤＰ−４３蛋白質の発現量を示し、棒グラフは、全長ＴＤＰ−４３蛋白質（４３ｋＤａ、黒色）、断片化ＴＤＰ−４３蛋白質（３５ｋＤａが薄い灰色、２５ｋＤａが濃い灰色）の合計を示す。横軸は、左から溶媒処置群（図中、「溶媒」）、アンプロリウム６．０ｍｍｏｌ／Ｌ処置群、アンプロリウム１２ｍｍｏｌ／Ｌ処置群を示す。【００９３】
図３は、オキシチアミン処置時の結果を示す。図３Ａは、ウエスタンブロット像を示す。図３Ｂのグラフの縦軸は、不溶性画分におけるＴＤＰ−４３蛋白質の発現量を示し、棒グラフは、全長ＴＤＰ−４３蛋白質（４３ｋＤａ、黒色）、断片化ＴＤＰ−４３蛋白質（３５ｋＤａが薄い灰色、２５ｋＤａが濃い灰色）の合計を示す。横軸は、左から溶媒処置群（図中、「溶媒」）、オキシチアミン３．０ｍｍｏｌ／Ｌ処置群、オキシチアミン０．６ｍｍｏｌ／Ｌ処置群を示す。【００９４】
アンプロリウム６．０ｍｍｏｌ／Ｌ又は１２ｍｍｏｌ／Ｌによる細胞処置では、対照の溶媒処置群と比較して、不溶性画分における全長ＴＤＰ−４３蛋白質（４３ｋＤａ）及び断片化ＴＤＰ−４３蛋白質（２５ｋＤａ及び３５ｋＤａ）の発現量が増加した（図２Ｂ）。オキシチアミン３．０ｍｍｏｌ／Ｌ又は０．６ｍｍｏｌ／Ｌを処置した場合でも、溶媒処置群と比較して、不溶性画分における全長ＴＤＰ−４３蛋白質（４３ｋＤａ）及び断片化ＴＤＰ−４３蛋白質（２５ｋＤａ及び３５ｋＤａ）の発現量が増加した（図３Ｂ）。この結果から、ヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞において、アンプロリウム又はオキシチアミン処置によって、不溶性画分における全長ＴＤＰ−４３蛋白質及び断片化ＴＤＰ−４３蛋白質の量が増加することが示された。【００９５】
神経細胞の生存数及び形態の測定結果を図４に示す。【００９６】
図４Ａの縦軸は、神経細胞の生存数（図中、「神経細胞数」）を示し、横軸は、アンプロリウムの濃度を示す。図４Ｂの縦軸は、神経突起長の合計／神経細胞数すなわち神経細胞あたりの神経突起の長さを示し、横軸は、アンプロリウムの濃度を示す。図４Ｃは、神経細胞を、溶媒で処置した場合又は８ｍｍｏｌ／Ｌのアンプロリウムを処置した場合の抗βＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎによる免疫染色像を示す。【００９７】
アンプロリウム６ｍｍｏｌ／Ｌによる細胞処置では、ヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞の生存数が４５％減少し、上記神経細胞あたりの神経突起の長さが２５％減少した。また、アンプロリウム８ｍｍｏｌ／Ｌによる細胞処置では、ヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞の生存数が５９％減少し、上記神経細胞あたりの神経突起の長さが３６％減少した。この結果から、ヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞において、アンプロリウムの濃度が高いほど、上記神経細胞の生存数は減少し、上記神経細胞あたりの神経突起の長さが短縮することが示された。【００９８】
したがって、アンプロリウム又はオキシチアミンは、神経細胞の細胞内に不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積を引き起こし、さらには、神経細胞の生存数の減少及び神経細胞の神経突起の短縮を引き起こすことが示された。【００９９】
この結果から、ビタミンＢ１取り込み阻害作用を有する誘導剤は、哺乳動物の非癌性の神経細胞の細胞内に不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積を引き起こし、さらには、神経変性疾患の病態的特徴である神経細胞の生存数の減少及び神経細胞の神経突起の短縮を引き起こすことが示された。【０１００】
（実施例２）ビタミンＢ１取り込み阻害作用を有する誘導剤で処置した神経細胞に対する既存治療薬の影響
１．神経細胞の分化
ヒト正常ｉＰＳ細胞由来コリン作動性神経細胞として、ＲｅｐｒｏＮｅｕｒｏ  Ａｃｈ（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社，ＲＣＥＳＤＡ００１）を用いた。【０１０１】
コーティングプレートの作製は、ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社のプロトコルに従い行った。すなわち、ポリスチレン製９６ウェルプレートに０．０２％  ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ液（０．１％液をＰＢＳで５倍希釈）を添加し、３７℃で２時間以上インキュベートした。Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ液をプレートから除去後、プレートをＰＢＳで２回洗浄した後、コーティング液（Ｒｅｐｒｏ  Ｃｏａｔ）を添加し、３７℃で一晩インキュベートし、１週間以内に使用した。コーティング液は細胞播種前に除去した。【０１０２】
細胞播種は、ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社のプロトコルに従い行った。すなわち、細胞のバイアルをドライアイス又は液体窒素から取り出し、直ちに３７℃のウォーターバスで９０秒間加温した後、Ｔｈａｗｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍに移し、３５０×ｇ、５分間室温で遠心した。遠心後、上清を除去し、細胞を培地（Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ、ＡＣｈ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを添加）に懸濁し、上記のコーティングプレートに直ちに播種した。播種日をｄａｙ０とし、以降、ｄａｙ３及びｄａｙ７に半量ずつ培地交換を行い、神経突起の十分な伸展が見られたｄａｙ１４の細胞を以下の実験に使用した。【０１０３】
２．ビタミンＢ１取り込み阻害作用を有する誘導剤による細胞処置及び既存治療薬の処置
細胞の培養上清を除去し、ビタミンＢ１取り込み阻害作用を有する誘導剤であるアンプロリウム（最終濃度：７ｍｍｏｌ／Ｌ）及び既存のＡＬＳ治療薬（エダラボン又はリルゾール）を含有する新たな培地を細胞に添加した。それぞれ、エダラボン処置群、リルゾール処置群と呼ぶ。比較として、溶媒（０．１％  ＤＭＳＯ）のみを含有した（アンプロリウム及び既存のＡＬＳ治療薬を含有しない）新たな培地を添加した細胞（これを溶媒処置群と呼ぶ）と、アンプロリウム（最終濃度：７ｍｍｏｌ／Ｌ）のみを含有する（既存のＡＬＳ治療薬を含有しない）新たな培地を添加した細胞（これを対照群と呼ぶ）を設けた。培地を添加後、さらに７日間培養した。【０１０４】
３．神経細胞の生存数及び形態の測定（免疫細胞化学）
７日間培養後、培養上清を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄後、４％ＰＦＡを添加して室温で３０分間、固定した。細胞をＰＢＳで２回洗浄後、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳを添加して室温で２０分間、浸透化処理を行った。細胞をＰＢＳで２回洗浄後、ブロッキング液（５倍希釈Ｂｌｏｃｋｎｇ  Ｏｎｅ、ナカライテスク社）を添加して室温で４０分間ブロッキングした後、マウス抗βＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（ブロッキング液で希釈）と、室温で２時間又は４℃で一晩インキュベートして反応させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５標識抗マウスＩｇＧ抗体（ブロッキング液で希釈）と、遮光条件下、室温で１時間インキュベートして反応させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄後、細胞にＤＡＰＩ（ＰＢＳで希釈）を添加して室温で１０分間反応させることで核染色した。最後に、２００μＬ／ウェルのＰＢＳを添加してＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて細胞を撮影した。【０１０５】
神経細胞の生存数及び神経突起の長さの定量解析は、撮影した画像を、画像解析ソフトウェアＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて解析することにより行った。統計解析は、ｔ検定を用いた。統計解析の結果、Ｐ値が０．０５未満の場合に統計学的に有意であると判断した。【０１０６】
４．結果
結果を図５に示す。【０１０７】
図５Ａの縦軸は、神経細胞の生存数（図中、「神経細胞数」）を示し、横軸は、アンプロリウム及び被験物質（既存のＡＬＳ治療薬）並びにその濃度を示し、具体的には左から順に、０．１％ＤＭＳＯのみを処置した溶媒処置群（図中、「溶媒」）、アンプロリウム（７ｍｍｏｌ／Ｌ）のみを処置した対照群（図中、「被験物質なし」）、アンプロリウム（７ｍｍｏｌ／Ｌ）及び被験物質であるエダラボン（１及び１０μｍｏｌ／Ｌ）を処置した群、アンプロリウム（７ｍｍｏｌ／Ｌ）及び被験物質であるリルゾール（１及び３μｍｏｌ／Ｌ）処置した群を示す。図５Ｂの縦軸は、神経突起長の合計／神経細胞数すなわち神経細胞あたりの神経突起の長さを示し、横軸は、図５Ａと同様に、アンプロリウム及び被験物質（既存ＡＬＳ治療薬）並びにその濃度を示す。また、図中の記号＊（アスタリスク）は、対照群（図中「被験物質なし」）と結果（縦軸の値）を比較したときの差が、統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）であることを示す。【０１０８】
アンプロリウムと同時に、被験物質であるエダラボン（１０μｍｏｌ／Ｌ）又はリルゾール（３μｍｏｌ／Ｌ）を添加して培養した神経細胞では、アンプロリウムのみ処置した対照群と比較して、神経細胞の生存数の減少が、有意に抑制された（図５Ａ）。【０１０９】
一方、アンプロリウムにより引き起こされる神経突起の短縮に対する、エダラボン又はリルゾールの作用はいずれも弱い抑制傾向のみであった（図５Ｂ）。エダラボン及びリルゾールは、ＡＬＳ治療薬として承認され使用されているが、その作用は、いずれも数ヶ月の延命効果又はイベントなしの生存期間延長効果といった限定的ものであることが知られている。アンプロリウムにより引き起こされる神経突起の短縮に対して、十分な抑制効果が見られなかったのは、エダラボン及びリルゾールの臨床における限定的な作用を反映したものと考えられる。したがって、アンプロリウム処置をした神経細胞は、ＡＬＳの病態的特徴をよく反映したモデルであると同時に、薬物に対する作用を確度よく評価できるモデルであることが示された。【０１１０】
以上の結果から、上記の誘導剤を用いて作製した神経変性疾患モデル細胞は、神経変性疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニングに使用できることか明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明の、神経細胞内に不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質の蓄積を引き起こす誘導剤によれば、遺伝子変異の導入に依らない、かつ、神経変性疾患患者の神経細胞における病態を均一に再現しうる、不溶化したＴＤＰ−４３蛋白質が細胞内に蓄積した神経変性疾患モデル細胞を作製できる。また、該神経変性疾患モデル細胞を用いれば、神経変性疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニングを行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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