(57)【要約】  本発明は、サバ科魚類未分化生殖細胞を特異的に認識する、モノクローナル抗体であって、モノクローナル抗体が、サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞に対する抗体に関する。本発明は、サバ科魚類の未分化生殖細胞を分離できる抗体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サバ科魚類未分化生殖細胞を特異的に認識する、モノクローナル抗体であって、
モノクローナル抗体が、サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞に対する抗体である、モノクローナル抗体。
【請求項２】
サバ科魚類未分化生殖細胞を特異的に認識する、モノクローナル抗体であって、
モノクローナル抗体が、抗体産生ハイブリドーマＴＡ−Ｎｏ．６−２８（ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２２２２）またはＴＡ−Ｎｏ．１５−１（ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２２２３）により産生される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
未分化生殖細胞が、始原生殖細胞、Ａ型精原細胞または卵原細胞である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
サバ科魚類が、マグロ属魚類、スマ属魚類、カツオ属魚類およびサバ属魚類から選択される１種である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
サバ科魚類未分化生殖細胞の表面を特異的に認識する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を分離することを含んでなる、サバ科魚類未分化生殖細胞濃縮方法。
【請求項７】
サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することを含んでなる、未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法において、
移植前に、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、サバ科魚類未分化生殖細胞を分離、濃縮し、
該分離、濃縮した未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植する
ことを含んでなる、未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法。
【請求項８】
移植する未分化生殖細胞を提供するサバ科魚類が、宿主魚類とは異種である、請求項７に記載の未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法。
【請求項９】
移植する未分化生殖細胞を提供するサバ科魚類が、宿主魚類より大型魚類である、請求項７または８に記載の未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法。
【請求項１０】
宿主魚類が、サバ科魚類から選択される１種であり、移植する未分化生殖細胞を提供するサバ科魚類がマグロから選択される１種である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法。
【請求項１１】
サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することを含んでなる、サバ科魚類の精子または卵の生産方法であって、
移植前に、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、サバ科魚類未分化生殖細胞を分離、濃縮し、
該分離、濃縮した未分化生殖細胞を孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植し、
該移植した末分化生殖細胞を配偶子へ分化誘導して、サバ科魚類の精子または卵子を得る
ことを含んでなる、サバ科魚類の精子または卵の生産方法。
【請求項１２】
サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することを含んでなる、サバ科魚類の生産方法であって、
移植前に、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、サバ科魚類未分化生殖細胞を分離、濃縮し、
該分離、濃縮した未分化生殖細胞を孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植し、
移植した未分化生殖細胞を配偶子へ分化誘導し、
得られた精子および卵を交配する
ことを含んでなる、サバ科魚類の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本特許出願は、先に出願された日本国特許出願である特願２０１６−６０９０８（出願日：２０１６年３月２４日）に基づくものであって、その優先権の利益を主張するものであり、その開示内容全体を参照することによりここに組み込まれる。
【発明の背景】
【０００２】
技術分野
本発明はサバ科魚類未分化生殖細胞を特異的に認識する抗体に関し、また、これを用いたサバ科魚類未分化生殖細胞の濃縮方法および分化誘導方法、ならびにこれらの方法を用いたサバ科魚類の精子または卵の生産方法およびサバ科魚類の生産方法に関する。
【０００３】
背景技術
クロマグロをはじめとするサバ科魚類は、経済的価値の高い漁業上重要な魚類である。一方、高級魚として需要の高いクロマグロやミナミマグロなど大型サバ科魚類は、過剰漁獲による天然資源量の著しい減少が問題となっている。そのため、資源量増加を目的とした人工種苗生産および人工種苗（稚魚）放流が検討されている。人工種苗生産では、近親交配や特定疾病の発症による全滅を避けるために、親魚となる個体の遺伝的多様性が必要とされ、従って、多数の親魚を育成する必要がある。しかしながら、例えば、クロマグロでは、体重１００ｋｇ以上、体長１ｍ以上、年齢３〜５歳になって初めて成熟するため親魚となるまでの時間が長いうえ、高速で遊泳するため非常に広大な飼育スペースを必要とする。さらに、ハンドリングに対するストレスに弱いことから人為催熟は技術的に難しく１対１交配の成功率も低い。こうした背景から、多数の親魚を人為的な管理下で育成し、精子や卵を採取することは、飼料や飼育スペースの問題を含め、コスト的および技術的に極めて難しい。
【０００４】
魚類の人工種苗生産技術として、本発明者らは、宿主（レシピエント）魚類とは異なる異種の魚類（ドナー魚類）由来の生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することによって、生殖細胞を生殖細胞系列（配偶子）へ分化誘導することができることを見いだし、異種の宿主魚類を利用し、目的とする魚類の配偶子を分化誘導することに成功している（例えば、特許文献１参照）。この技術は、代理親魚技法または借り腹養殖技法とも呼ばれ、クロマグロなど飼育が難しい魚類の精子や卵を、飼育しやすい異種の宿主魚類によって生産し、交配することにより低コストで簡便な種苗生産を可能にする技術として、期待されている。
【０００５】
この代理親魚技法においては、商業的な量産化に十分な移植効率を確保するために、ドナー魚類の生殖腺、精巣または卵巣から、未分化生殖細胞のみを分離して、それを移植に用いる必要がある。特許文献１では、始原生殖細胞のみを分離するために、始原生殖細胞に対して特異的に発現するｖａｓａ遺伝子の転写調節領域にＧＦＰ（Green Fluorescent Protein：緑色蛍光タンパク質）遺伝子を導入した遺伝子組換えニジマスをドナー魚類として使用し、ＧＦＰ遺伝子が発現している細胞を始原生殖細胞として分離している。しかしながら、このような遺伝子組換え魚類由来の始原生殖細胞を分化誘導して得られる精子や卵はＧＦＰ遺伝子が導入されたものであり、これらの精子や卵を利用して生産される稚魚も同様にＧＦＰ遺伝子が導入された種苗となる。そのため、食用魚や放流種苗として利用することはできず、実用化生産技術としては適さない。
【０００６】
ＧＦＰ遺伝子などのレポーター遺伝子の導入を行わずに、ドナー魚類から始原生殖細胞等の未分化生殖細胞を分離する方法として、生殖細胞に特異的に結合する抗体を用いた生殖細胞の分離方法が検討されている。例えば、特許文献２ではマグロ由来生殖細胞を特異的に検出することができる抗マグロｖａｓａ抗体が開示されている。しかしながら、この抗体はその抗原認識部位が細胞質内に存在するため、固定した細胞や組織中で生殖細胞を検出することは可能であるが、生きた状態の細胞を検出することや分離することは不可能である。
【０００７】
一方、本発明者らは、ニジマスなどサケ科魚類では、ＧＦＰ遺伝子導入ニジマスより単離した生きた精原細胞を抗原としてマウスに免疫することにより得られた抗体が、精原細胞を選択的に標識でき、その抗体を用いることで遺伝子導入魚でなくても生殖細胞を分離できることを確認している（非特許文献１参照）。しかしながら、非特許文献１の方法では、抗原となる精原細胞が遺伝子導入魚由来であり、クロマグロなどサバ科魚類では、遺伝子導入魚の樹立が困難であるため、該方法による抗体の生産は困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４３００２８７号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１０／０３５４６５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】10th International Symposium of Reproductive Physiology of Fish (ISRPF), Abstract book, Olhao, Portugal, 25-30, May 2014
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、非特許文献１のニジマスの抗体を、クロマグロの精原細胞を選択的に分離するために用いた。しかしながら、ニジマスの抗体は、クロマグロの生殖腺細胞に対するシグナルの検出はできるものであったが、クロマグロの生きた精原細胞など未分化生殖細胞を特異的に検出、分離することはできなかった。
【００１１】
このように、クロマグロなどサバ科魚類の代理親魚技法の実用化のために用いられる抗体として、十分満足のいくものは発明者らが知る限りこれまで報告されていない。
【００１２】
本発明者らは、これまでに、遺伝子導入技術を利用することなく、クロマグロにおいて、精原細胞など未分化生殖細胞を多く含むゲート（画分）の樹立に成功した。また、その得られた画分を抗原として、モノクローナル抗体を調製したところ、該モノクローナル抗体が、未分化生殖細胞、特に未分化生殖細胞の表面を特異的に認識することを見いだした。また、該モノクローナル抗体を標識に、サバ科魚類未分化生殖細胞を特異的に、分離、濃縮することに成功した。さらに、該モノクローナル抗体で濃縮したクロマグロ未分化生殖細胞と、濃縮をしていないクロマグロ未分化生殖細胞を含む精巣分散細胞（生殖腺細胞）とをニベの腹腔内に、それぞれ同じ細胞数移植したところ、驚くべきことに、濃縮をしていないクロマグロ精巣分散細胞を移植した場合においては移植細胞のニベ宿主生殖腺への生着が全く観察されなかったのに対し、該モノクローナル抗体で濃縮したクロマグロ未分化生殖細胞を移植した場合においては、移植細胞がニベ宿主生殖腺に生着したことを確認した。上記の結果より該モノクローナル抗体で濃縮したクロマグロ未分化生殖細胞を移植細胞に用いることで、宿主生殖腺への生着効率が著しく上昇することを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【００１３】
すなわち、本発明は、新規なサバ科魚類未分化生殖細胞を特異的に認識する抗体、サバ科魚類未分化生殖細胞の濃縮方法、分化誘導法、これらの方法を用いたサバ科魚類の生産方法を提供することをその目的とする。
【００１４】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）サバ科魚類未分化生殖細胞を特異的に認識する、モノクローナル抗体であって、
モノクローナル抗体が、サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞に対する抗体である、モノクローナル抗体。
（２）サバ科魚類未分化生殖細胞を特異的に認識する、モノクローナル抗体であって、
モノクローナル抗体が、ハイブリドーマＴＡ−Ｎｏ．６−２８（ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２２２２）またはＴＡ−Ｎｏ．１５−１（ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２２２３）により産生される、（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）未分化生殖細胞が、始原生殖細胞、Ａ型精原細胞または卵原細胞である、（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体。
（４）サバ科魚類が、マグロ属魚類、スマ属魚類、カツオ属魚類およびサバ属魚類から選択される１種である、（１）〜（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（５）サバ科魚類未分化生殖細胞の表面を特異的に認識する、（１）〜（４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を分離することを含んでなる、サバ科魚類未分化生殖細胞濃縮方法。
（７）サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することを含んでなる、未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法において、
移植前に、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、サバ科魚類未分化生殖細胞を分離、濃縮し、
該分離、濃縮した未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植する
ことを含んでなる、未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法。
（８）移植する未分化生殖細胞を提供するサバ科魚類が、宿主魚類とは異種である、（７）に記載の未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法。
（９）移植する未分化生殖細胞を提供するサバ科魚類が、宿主個体より大型魚類である、（７）または（８）に記載の未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法。
（１０）宿主魚類が、サバ科魚類から選択される１種であり、移植する未分化生殖細胞を提供するサバ科魚類がマグロから選択される１種である、（７）〜（９）のいずれかに記載の未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法。
（１１）サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することを含んでなる、サバ科魚類の精子または卵の生産方法であって、
移植前に、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、サバ科魚類未分化生殖細胞を分離、濃縮し、
該分離、濃縮した未分化生殖細胞を孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植し、
該移植した末分化生殖細胞を配偶子へ分化誘導して、サバ科魚類の精子または卵子を得る
ことを含んでなる、サバ科魚類の精子または卵の生産方法。
（１２）サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することを含んでなる、サバ科魚類の生産方法であって、
移植前に、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、サバ科魚類未分化生殖細胞を分離、濃縮し、
該分離、濃縮した未分化生殖細胞を孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植し、
移植した未分化生殖細胞を配偶子へ分化誘導し、
得られた精子および卵を交配する
ことを含んでなる、サバ科魚類の生産方法。
【００１５】
本発明の抗体を用いることにより、サバ科魚類未分化生殖細胞を特異的に認識することができる。また、本発明の抗体を用いることで、サバ科魚類未分化生殖細胞を特異的に分離、濃縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１ａは、クロマグロのパラフィン包埋組織切片（精巣組織）でのＨＥ染色およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す。図１ｂは、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析により得られた、クロマグロ細胞懸濁液に含まれる細胞の散布図である。ＦＳは細胞の大きさを表し、ＳＳは細胞の内部構造の複雑さを表す。図１ｃは、それぞれ、散布図のＡ〜Ｇゲート（画分）に含まれる細胞の形態の写真（生物顕微鏡、Olympus）を示す。
【図２】図２ａは、未成熟個体（１齢）での、ＦＣＭ解析により得られたクロマグロ細胞懸濁液に含まれる細胞の散布図と、それぞれ、散布図のＡ〜Ｇゲートに含まれる細胞のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す。図２ｂは、全細胞に対する各ゲートのｖａｓａ陽性細胞割合（ｖａｓａ＋ ｒａｔｉｏ）を示す。
【図３】図３ａは、成熟個体（３齢）での精巣のＨＥ染色およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｖａｓａ）の結果を示す。図３ｂは、ＦＣＭ解析により得られたクロマグロ粗精製細胞懸濁液に含まれる細胞の散布図の結果を示す。図３ｃは、Ａゲートに含まれる分離された細胞の形態およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す。図３ｄは、全細胞に対する各ゲートのｖａｓａ陽性細胞割合（ｖａｓａ＋ ｒａｔｉｏ）を示す。
【図４】図４は、二次スクリーニングでの免疫細胞染色の結果を示す。ａは、緑色蛍光が明瞭に細胞膜で観察された細胞（陽性シグナル）であり、ｂは、血球細胞やデブリなど非特異的なシグナルが観察された細胞であり、ｃは、シグナルが認められなかった細胞の一例を示す。
【図５】図５ａは、三次スクリーニングで用いた全細胞のＦＣＭ解析（ＦＳ−ＳＳ展開）により得られた散布図を示す。図５ｂは、抗体陽性（右側の矢印）と抗体陰性（左側の矢印）のヒストグラムを示す。横軸が抗体のシグナル強度を示し、縦軸が細胞数を示す。図５ｃは、抗体陽性の細胞集団のＦＣＭ解析（ＦＳ−ＳＳ展開）により得られた散布図を示す。
【図６】図６は、ＴＡ−Ｎｏ．６−２８ハイブリドーマ産生抗体を用いた、免疫細胞染色およびｉｎ  ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図７】図７は、ＴＡ−Ｎｏ．６−２８ハイブリドーマ産生抗体（ａ）およびＴＡ−Ｎｏ．１５−１ハイブリドーマ産生抗体（ｂ）を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す。濃縮率は、それぞれ、８５．２％、７８．９％であった。
【図８】図８は、クロマグロの精巣組織切片でのＨＥ染色およびＴＡ−Ｎｏ．６−２８ハイブリドーマ産生抗体を用いた免疫組織染色結果を示す。
【図９】図９は、クロマグロの精巣組織切片でのＨＥ染色（左）ならびにＴＡ−Ｎｏ．６−２８ハイブリドーマ産生抗体（上段）およびＴＡ−Ｎｏ．１５−１ハイブリドーマ産生抗体（下段）を用いた免疫組織染色（右）の結果を示す。
【図１０】図１０は、ＴＡ−Ｎｏ．６−２８ハイブリドーマ産生抗体（左）およびＴＡ−Ｎｏ．１５−１ハイブリドーマ産生抗体（右）を用いた、クロマグロＭＡＣＳ濃縮未分化生殖細胞のフローサイトメトリー解析の（ａ）細胞の形態の写真（生物顕微鏡、Olympus）（フロー画分（Ｆｌｏｗ）と溶出画分（Ｅｌｕｔｅ））ならびに（ｂ）ｖａｓａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションの写真（生物顕微鏡、Olympus）（フロー画分（Ｆｌｏｗ）と溶出画分（Ｅｌｕｔｅ））を示す。
【図１１】図１１は、移植したニベの開腹写真を示す。蛍光視野（蛍光生物顕微鏡、Olympus）および明視野の写真である。
【図１２】図１２は、移植した細胞の、ニベ宿主生殖線への生着率を示すグラフである。縦軸は、観察した全ニベ宿主中で、移植したクロマグロ未分化生殖細胞の生着が観察された個体の割合（％）を示す。
【発明の具体的説明】
【００１７】
本発明の一つの態様によれば、サバ科魚類未分化生殖細胞、好ましくはサバ科魚類未分化生殖細胞の表面を特異的に認識するモノクローナル抗体が提供される。
【００１８】
「サバ科魚類」とは、スズキ目サバ科に含まれる魚類を意味し、例えば、マグロ属魚類、スマ属魚類、カツオ属魚類、サバ属魚類、サワラ属魚類、ソウダガツオ属、ハガツオ属、イソマグロ属が挙げられ、好ましくは、マグロ属魚類、スマ属魚類、カツオ属魚類またはサバ属魚類である。サバ科魚類の代表的な魚種として、マグロ属魚類では、例えば、クロマグロ（例えば、タイヘイヨウクロマグロ、タイセイヨウクロマグロ）、ミナミマグロ、メバチマグロ、キハダマグロ、ビンナガマグロ、タイセイヨウマグロ、コシナガが挙げられる。スマ属魚類では、例えば、スマ、タイセイヨウヤイトが挙げられる。カツオ属魚類では、例えば、カツオが挙げられる。サバ属魚類では、マサバ、ゴマサバが挙げられる。本発明のサバ科魚類の魚種は、好ましくは、クロマグロ、ミナミマグロ、メバチマグロ、キハダマグロ、ビンナガマグロ、タイセイヨウマグロまたはコシナガであり、これらは総称としてマグロと呼ばれることもある。本発明のサバ科魚類の魚種は、より好ましくは、人工種苗生産による資源保護が期待されている点で、クロマグロ、ミナミマグロ、タイセイヨウマグロまたはスマである。
【００１９】
「未分化生殖細胞」とは、生殖細胞に分類される、始原生殖細胞、卵原細胞、精原細胞、卵母細胞、精母細胞、精細胞、卵および精子の内、ほとんど分化していない生殖細胞を意味し、例えば、始原生殖細胞、精原細胞、卵原細胞が挙げられる。生殖細胞が、未分化生殖細胞であるか否かは、その形態的特徴によって判断することができる。例えば、Ａ型精原細胞は、組織学的観察を行った際、精巣細胞中で周囲を体細胞に囲まれた状態かつ単独で存在する生殖細胞であるため、組織学的観察により同定することが可能である。また卵原細胞は、卵黄形成期になる前の小型の生殖細胞のうち、第１減数分裂が開始していない細胞集団であり、よって、Ｓｙｃｐ３等をはじめとする減数分裂マーカー遺伝子を発現していないことも、卵原細胞を同定する一つの指標となりうる。本発明の未分化生殖細胞は、好ましくは、代理親魚技法において、宿主魚類生殖腺に移植した際の生着能をもつ、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞である。宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞としては、始原生殖細胞、Ａ型精原細胞または卵原細胞が挙げられる。Ａ型精原細胞とは、未分化精巣において体細胞と共に存在する未分化生殖細胞であり、該Ａ型精原細胞は、成熟を開始した精巣または成熟精巣において、Ｂ型精原細胞、精母細胞、精細胞、精子へと分化する細胞である。卵原細胞とは、未分化卵巣に体細胞と共に存在する未分化生殖細胞であり、成熟に従って卵母細胞、卵へと分化する細胞である。生殖細胞が、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞であるか否かは、代理親魚技法において、宿主魚類生殖腺に移植した際の生着能の有無により判断することができる。具体的には、ｖａｓａ遺伝子の高い発現が認められ、かつ、代理親魚技法において宿主魚類生殖腺へ移植した際の生着能が認められた細胞を、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞と判断することができ、例えば、非特許文献１を参照することができる。
【００２０】
「サバ科魚類未分化生殖細胞を特異的に認識する」とは、サバ科魚類の未分化生殖細胞に対して特異的に結合し、サバ科魚類の分化生殖細胞、体細胞には、特異的には結合しないことを意味し、好ましくは、サバ科魚類の未分化生殖細胞の細胞表面抗原に対して特異的に結合することである。「サバ科魚類未分化生殖細胞を特異的に認識する」は、好ましくは、サバ科魚類未分化生殖細胞の表面、より好ましくは、生殖細胞膜表面を特異的に認識することをいう。本発明において、「特異的に結合」には、優先的に結合することも含まれる。
【００２１】
「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体（免疫グロブリン分子）を意味し、免疫グロブリンのクラスとしては特に限定されず、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥが挙げられ、好ましくは、ＩｇＧである。
【００２２】
本発明のモノクローナル抗体は、サバ科魚類の未分化生殖細胞を抗原として、抗体産生ハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマが産生する抗体について、未分化生殖細胞を認識する抗体であることを検出することによって取得できる。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体を作製するための抗原は、好ましくは、代理親魚技法の移植に用いる未分化生殖細胞の数の確保が容易な点で、サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞である。本発明の好ましい態様では、精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞として、精巣または卵巣由来の体細胞なども含む細胞懸濁液から、未分化生殖細胞のみが分離、濃縮された細胞集団を用いることができ、具体的には、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析により得られた未分化生殖細胞が多く含まれる細胞集団の画分について、ＦＳ、ＳＳをリニア値で表示した際に、相対的にＦＳの値が大きく、ＳＳの値が小さい画分を用いることができる。より具体的には、後述する実施例の例１で示される様に、４８８ｎｍアルゴンレーザーを備えたＥｐｉｃｓ Ａｌｔｒａ（ベックマンコールター）でＦＣＭ解析した場合、細胞分散により、単一の状態である精巣細胞を全て検出可能な条件でＦＳ−ＳＳのプロット図で展開をした際に、相対的にＦＳが大きく、ＳＳが小さい画分、好ましくは、ＦＳ値が高い方におよそ１／３、ＳＳ値が低い方におよそ１／３の画分、に出現する細胞集団を用いることができる。このような、未分化生殖細胞が多く含まれる細胞集団は、後述する実施例の例１の方法では、Ａゲートとして調製できる。よって、本発明の一つの態様によれば、本発明のサバ科魚類未分化生殖細胞を特異的に認識する抗体を調製するための抗原が提供され、該抗原は、好ましくは、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析により得られた未分化生殖細胞が多く含まれる細胞集団の画分について、ＦＳ、ＳＳをリニア値で表示した際に、相対的にＦＳの値が大きく、ＳＳの値が小さい画分である。
【００２４】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のモノクローナル抗体は、サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞を抗原として、抗体産生ハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマが産生する抗体について、未分化生殖細胞を認識する抗体であることを検出することによって取得できる。抗体産生ハイブリドーマの作製は、常法に従って調製でき、例えば、抗原を、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に投与し、免疫感作させ、該動物から得られたリンパ節由来の細胞とミエローマ細胞とを融合させることにより調製できる。未分化生殖細胞を認識する抗体であることの検出は、例えば後述する実施例の例２に記載のＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ法、免疫細胞染色、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのほか、ｖａｓａ遺伝子に対するＲＴ−ＰＣＲ法などによって行うことができる。宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞を認識する抗体であることの検出は、代理親魚技法において宿主生殖腺に移植した際の宿主生殖腺への生着能を確認する（非特許文献１を参照）ことにより行うことができる。
【００２５】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のサバ科魚類未分化生殖細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている抗体産生ハイブリドーマＴＡ−Ｎｏ．６−２８（受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２２２２）またはＴＡ−Ｎｏ．１５−１（受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２２２３）により産生される。
【００２６】
ＴＡ−Ｎｏ．６−２８は、サバ科魚類精原細胞を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマであり、２０１６年３月２２日（原寄託日）付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号）に、受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２２２２（国内寄託ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２２２より移管）（識別の表示：ＴＡ−Ｎｏ．６−２８）として寄託されている。ＴＡ−Ｎｏ．６−２８は、骨髄腫細胞と抗体産生細胞であるＢリンパ細胞を細胞融合させ作製されたハイブリドーマであり、その形態は円形で弱接着性であり、終濃度１％のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，Ｌｉｑｕｉｄ（Gibco）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＨｙｂｉｒｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Gibco、12300-067）中で３７℃、５％ＣＯ２下のインキュベートにより増殖する。マウス抗体産生能（ＩｇＧ抗体）を有し、その産生量は１〜１０μｇ／ｍｌ程度である。
【００２７】
ＴＡ−Ｎｏ．１５−１は、サバ科魚類精原細胞を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマであり、２０１６年３月２２日（原寄託日）付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号）に、受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２２２３（国内寄託ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２２３より移管）（識別の表示：ＴＡ−Ｎｏ．１５−１）として寄託されている。ＴＡ−Ｎｏ．１５−１は、骨髄腫細胞と抗体産生細胞であるＢリンパ細胞を細胞融合させ作製されたハイブリドーマであり、その形態は円形で弱接着性であり、終濃度１％のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，Ｌｉｑｕｉｄ（Gibco）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＨｙｂｉｒｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Gibco、12300-067）中で３７℃、５％ＣＯ２下のインキュベートにより増殖する。マウス抗体産生能（ＩｇＧ抗体）を有し、その産生量は１〜１０μｇ／ｍｌ程度である。
【００２８】
本発明のモノクローナル抗体は、サバ科魚類の精巣または卵巣からサバ科魚類の未分化生殖細胞を分離することができる。本発明のモノクローナル抗体を用いたサバ科魚類の未分化生殖細胞の分離方法は、生きたまま未分化生殖細胞を分離することができれば特に限定されず、公知の方法を用いることができ、例えば、ＦＩＴＣなどの蛍光標識をした抗体を用いたフローサイトメトリー解析での細胞分離（単離）や、磁気ビーズをつけた抗体を用いた磁気細胞分離を用いることができる。好ましくは、高度な設備や技術を必要としない点で、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）法である。磁気細胞分離法は、フローサイトメトリー解析での細胞分離と比較して、磁気ビーズによって分離するため大量の細胞であっても簡便に処理ができる点で有利である。また、本発明のモノクローナル抗体を用いたＭＡＣＳ法は、パーコールを用いた密度勾配遠心法のように細胞毒性がある溶液を使用する必要がないことから細胞の性状に悪影響を与えにくい点で有利であり、さらに比重が近い細胞集団においても一部の細胞集団を濃縮可能な点で有利である。
【００２９】
本発明のモノクローナル抗体により分離（単離）した未分化生殖細胞を集めることにより、未分化生殖細胞を濃縮することができる。よって、本発明の一つの態様によれば、本発明の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を分離することを含んでなる、サバ科魚類未分化生殖細胞濃縮方法が提供される。本発明の濃縮方法により得られた濃縮された未分化生殖細胞は、生きた細胞であるため代理親魚技法の移植に用いる未分化生殖細胞として用いることにより、移植効率の向上が期待できる。すなわち、本発明の一つの態様によれば、本発明の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を分離することを含んでなる、サバ科魚類未分化生殖細胞生産方法が提供される。
【００３０】
本発明のモノクローナル抗体により分離（単離）した未分化生殖細胞を用いることで、代理親魚技法において、効率良く、移植した未分化生殖細胞を配偶子へ分化誘導することができる。ここで、移植した未分化生殖細胞を配偶子へ分化誘導することは、腹腔内へ移植した未分化生殖細胞が、自ら移植された宿主の生殖腺へ移動して生着し、該宿主の生殖腺において成熟して配偶子に分化誘導されることを意味する。よって、移植した未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導の成否は、宿主の生殖腺において移植した未分化生殖細胞の生着の有無により判断することができる（Okutsu, T., Suzuki, K., Takeuchi, Y.,Takeuchi, T &  Yoshizaki, G. (2006) Testicular germ cells can colonize sexually undifferentiated embryonic gonad and produce functional eggs in fish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103, 2725-2729参照）。宿主の生殖腺において移植した未分化生殖細胞の生着が確認できれば、高い確率で、移植した未分化生殖細胞を配偶子へ分化誘導することができるといえる。よって、本発明の一つの態様によれば、サバ科魚類の代理親魚技法、すなわち、サバ科魚類の未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することを含んでなる、未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法において、移植前に、本発明の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣からサバ科魚類未分化生殖細胞を分離、濃縮し、該分離、濃縮した未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することを含んでなる、未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法が提供される。
【００３１】
本発明の一つの態様によれば、サバ科魚類の代理親魚技法において、すなわち、サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することを含んでなる、未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法において、移植前に、本発明の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、サバ科魚類未分化生殖細胞を分離、濃縮し、該分離、濃縮した未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することを含んでなる、未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法が提供される。
【００３２】
本発明の一つの態様によれば、本発明の分化誘導方法において、移植前に、本発明の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、宿主生殖腺への生着能を有するサバ科魚類未分化生殖細胞を分離、濃縮し、該分離、濃縮した未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することを含んでなる、未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法が提供されうる。
【００３３】
本発明の分化誘導方法において、ドナー魚類として、移植される未分化生殖細胞を提供するサバ科魚類は、宿主魚類とは異種であっても、同種であってもよく、好ましくは異種である。ドナー魚類と宿主魚類とが、同種であるとは、未分化生殖細胞を提供するサバ科魚類の種と、宿主魚類の種が同じことを意味し、この方法を用いることで、例えば、形質の良好な品種をドナー魚類とすることで、選抜育種をすることなく、短時間に大量に良好な品種を生産することができる。ドナー魚類と宿主魚類とが、異種であるとは、未分化生殖細胞を提供するサバ科魚類の種と、宿主魚類の種が異なることを意味し、例えば、未分化生殖細胞を提供するサバ科魚類の種が、宿主魚類の属と異なる魚種である場合や、同じ属に含まれる他の魚種である場合が含まれる。異種である場合、ドナー魚類と宿主魚類の組み合わせは、それぞれの生息環境の類似性、生殖腺の大きさなどを考慮して決定することができる。
【００３４】
ドナー魚類としてのサバ科魚類は、好ましくは、宿主魚類より大型魚類である。サバ科魚類の大型魚類としては、例えば、クロマグロ（例えば、タイヘイヨウクロマグロ、タイセイヨウクロマグロ）およびミナミマグロが挙げられる。また、魚類は年齢と共に大型化するため、大型魚類には巨大に成長した親魚も含まれる。大型魚類の生殖細胞を、分離し、小型の宿主魚類の生殖腺に移植して、配偶子に分化誘導することにより、大型魚類の親魚で問題となっている飼料や飼育スペースを減少することができる。
【００３５】
本発明のより好ましい態様によれば、本発明の分化誘導法において、宿主魚類は、サバ科魚類から選択される１種であり、ドナー魚類として、移植する未分化生殖細胞を提供するサバ科魚類が、マグロ、すなわち、クロマグロ、ミナミマグロ、メバチマグロ、キハダマグロ、ビンナガマグロ、タイセイヨウマグロまたはコシナガから選択される１種である。本発明のさらに好ましい態様によれば、宿主魚類は、サバまたはスマであり、移植する未分化生殖細胞のドナーとして用いるサバ科魚類は、クロマグロ（例えば、タイヘイヨウマグロおよびタイセイヨウマグロ）またはミナミマグロであり、より好ましくは、宿主魚類と移植する未分化生殖細胞を提供するサバ科魚類の組み合わせは、飼育困難な魚種をドナーとし、ドナーの近縁種かつ小型の水槽内で種苗生産が可能な種の組み合わせである点で、サバとタイヘイヨウクロマグロ、サバとミナミマグロ、サバとタイセイヨウクロマグロ、スマとタイヘイヨウクロマグロ、スマとミナミマグロ、スマとタイセイヨウクロマグロである。
【００３６】
本発明の一つの態様によれば、本発明の分化誘導法を含んでなる、サバ科魚類の精子または卵の生産方法が提供される。すなわち、本発明の一つの態様によれば、サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することを含んでなる、サバ科魚類の精子または卵の生産方法であって、移植前に、本発明の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、宿主生殖腺への生着能を有するサバ科魚類未分化生殖細胞を分離、濃縮し、該分離、濃縮した未分化生殖細胞を孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植し、該移植した末分化生殖細胞を配偶子へ分化誘導して、サバ科魚類の精子または卵子を得ることを含んでなる、サバ科魚類の精子または卵の生産方法が提供される。
【００３７】
本発明の別の態様によれば、サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することを含んでなる、サバ科魚類の生産方法であって、移植前に、本発明の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、宿主生殖腺への生着能を有するサバ科魚類未分化生殖細胞を分離、濃縮し、該分離、濃縮した未分化生殖細胞を孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植し、移植した未分化生殖細胞を配偶子へ分化誘導し、得られた精子および卵を交配することを含んでなる、サバ科魚類の生産方法が提供される。
【００３８】
本発明のサバ科魚類の精子または卵の生産方法およびサバ科魚類の生産方法は、本発明の濃縮方法および分化誘導方法について本願明細書に記載された内容に従って実施することができる。
【実施例】
【００３９】
本発明を以下の実施例によって詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。【００４０】
例１：サバ科魚類の未分化生殖細胞画分の取得
（１）精巣の摘出
１個体のクロマグロ（２〜３歳体重３０〜４０ｋｇ、生殖腺重量１００〜２００ｇ程度）から精巣を摘出し、細かく切り刻んだ。細かく刻んだ精巣に、終濃度２mg／ｍｌのコラゲナーゼＨ（Roche）、終濃度１．６５mg／ｍｌのディスパーゼII（合同酒精）／Ｌ−１５培地（インビトロジェン）（５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））１０ｍｌを添加し、２時間、２０℃で、ピペッティングによる物理的な分散を行いながらインキュベートした。Ｌ−１５培地（インビトロジェン）１ｍｌを添加して酵素反応を停止した。得られた細胞懸濁液（約１０００万細胞／ｍｌ）を、パーコール（GE Healthcare）密度勾配遠心法により粗精製し、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析および細胞分離に用いた。【００４１】
使用した精巣の成熟度は、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳ固定液で固定されたクロマグロ精巣組織のパラフィン包埋組織切片（４μｍ）を、ＨＥ染色およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析することにより確認した。【００４２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析は（Nagasawa, K., Takeuchi, Y., Miwa, M., Higuchi, K., Morita, T., Mitsuboshi, T., & Yoshizaki, G. (2009). cDNA cloning and expression analysis of a vasa-like gene in Pacific bluefin tuna Thunnus orientalis. Fisheries Science, 75(1), 71-79.）に従い行った。具体的には組織切片に対してキシレン・エタノールシリーズ及び水和により脱パラフィン処理を行った。得られた切片を、４％パラホルムアルデヒドにより後固定し、１％過酸化水素による内在性アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）の失活、プロテアーゼＫ(Wako)によるタンパク質分解、そしてアセチル化を行った。ハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、５０ｎｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、５０ｎｇ／ｍｌヘパリン、０．０２％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸）中にて６５℃で１時間静置した後、クロマグロｖａｓａプローブ：ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＲＮＡプローブを１ｎｇ／μｌの濃度になるように加えたハイブリダイゼーション緩衝液中で６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。クロマグロｖａｓａプローブは、クロマグロｖａｓａ遺伝子に特異的なプライマー(vasa F 5’-CAACCAGGGAGCTCATCAACCAGA-3’/ vasa R 5’-GCAACTCAGGTCAATGCTGTGTGG-3’)を用いたＰＣＲにより、１０８５ｂｐの断片を増幅し、これをインサートに含むプラスミドＤＮＡを鋳型にＤＩＧ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ(Roche)を用いてＤＩＧ標識プローブの標準方法に従って合成した。【００４３】
十分な洗浄を行った後、ＲＮａｓｅＡ(Invitrogen)により非特異的に結合しているプローブを除去した。ブロッキング溶液（２％ Ｂｌｏｃｋｉｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Roche）／ＴＢＳＴ）によりマスキングを施し、ＡＰ標識抗ＤＩＧ抗体溶液（Roche）（ブロッキング溶液にて１：５００に希釈したもの）を滴下した。室温で１時間静置し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ発色基質を用いて可視化した。エタノールシリーズ・キシレンを通し、エンテランを用いてスライドガラスの封入を行った。顕微観察を行い、画像をデジタル記録した。【００４４】
組織切片の結果を、図１ａ（未成熟個体）および図３ａ（成熟個体）に示す。【００４５】
（２）フローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析
フローサイトメトリー分析は、４８８ｎｍアルゴンレーザーを備えたＥｐｉｃｓ Ａｌｔｒａ（ベックマンコールター）を用いて行った。これまでの研究により魚類の精原細胞は他の生殖細胞よりも大型かつ丸い形態をしていることが明らかとなっており、ｖａｓａ−ＧＦＰ遺伝子導入魚を用いてフローサイトメトリー分析を行うと、精原細胞集団が大型かつ内部構造が単純な集団に分画化されることが明らかとなっている。そのため、クロマグロ精原細胞においても同様に分画化可能であると仮定し、パーコール密度交配法により得られた粗精製細胞懸濁液に対してレーザーを照射し、得られた散乱光を解析し、細胞の大きさ（Forward light scatter：ＦＳ）および内部構造の複雑さ（side light scatter：ＳＳ）のシグナルを測定した。得られた散布図に基づいて、各細胞集団が密集して分布している分画をＡ〜Ｇゲート（画分）に分け、各ゲートに細胞分離を行った。分離した各ゲートの細胞集団を、形態およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより解析した。【００４６】
形態の分析は、細胞の一つ一つにレーザーを照射し、得られた散乱光により得られた各細胞の特徴から、細胞をＡ〜Ｇの７種類のゲートに分類した。一般的に、精原細胞は他の精巣細胞より大型で丸い形態をしている。そこで、大型で内部構造が単純な分画を、精原細胞が多い分画と推定した（図１ｃでのＡゲート）。【００４７】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析は、上記（１）のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析に従い、パラフィン包埋組織切片の代わりに、各ゲートの細胞をそれぞれスライドグラスに塗抹し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳにより固定した細胞塗抹標本を用いた。【００４８】
散布図の結果を、図１ｂ（未成熟個体）および図２ａ（成熟個体）に示し、解析結果を、図１ｃ、図２（未成熟個体）および図３（成熟個体）に示す。【００４９】
図２および図３に示されるように、Ａゲートに、精原細胞など未分化生殖細胞が多く含まれることが確認された。Ａゲートに含まれる精原細胞など未分化生殖細胞の割合は、未成熟個体の場合、全細胞数に対して８０．７±１．５％（標準誤差）であり、成熟個体の場合、約７７．２±４．９％（標準誤差）だった。【００５０】
例２：未分化生殖細胞識別抗体の取得
（１）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
上記例１で得られたＡ−ゲートに含まれる細胞集団を抗原として用いてマウスモノクローナル抗体の作製を行った。具体的には、Ａゲートの細胞集団（５×１０６細胞／ｍｌ）を４尾のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ系統）に対して、５回に分けて免疫を行った。免疫には、Ａゲートの細胞集団をフロイントコンプリートアジュバンド（Sigma）をＰＢＳで２倍希釈したものを用い、マウス足裏に１００μｌずつ免疫した。【００５１】
５回目の免疫から８日目に、上記マウス５尾の足から肥大したリンパ節を無菌的に摘出し、リンパ節細胞を回収した。回収したリンパ節細胞と、ミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１、東京海洋大学）とを、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）存在下にて混合し、細胞融合を行った。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）の混合液を、１５％ＦＢＳを含むＨＡＴ培地で希釈し、９６ｗｅｌｌプレート１２枚に播種した。【００５２】
（２）一次スクリーニング：Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ
１４日間インキュベート（３７℃）したところ、１１５２コロニーの形成が認められた。そこで、これらのハイブリドーマが未分化生殖細胞を認識する抗体を産生しているか否かを明らかにするために、Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡによるスクリーニングを行った。具体的には、パーコール密度勾配遠心法により得られた粗精製精原細胞をプレートに播種（１０５細胞／ｗｅｌｌ）し、このプレートを用いて、ハイブリドーマが産生する抗体の免疫した抗原に対する力価を測定した。力価の測定には、ＨＲＰ発色系を用いた。Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡでのシグナル値が０．１００以上のクローンを、力価の高い（親和性の高い）陽性クローンとして選択した。【００５３】
（３）二次スクリーニング：免疫細胞染色（蛍光顕微鏡観察）
一次スクリーニングで陽性シグナルが得られた３８４クローンから産生された抗体が、未分化生殖細胞の細胞表面抗原を認識することができるか否か明らかにするために、免疫細胞染色によるスクリーニングを行った。クロマグロ（２〜３齢、２尾）から摘出した精巣を、コラゲナーゼＩＶ（Sigma）による酵素消化（２０℃、２時間）し、得られた分散細胞を生きた状態のまま、上記３８４クローン由来の抗体と結合させ、緑色蛍光物質が標識された二次抗体ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ｉｇＧ（life technology）を用いて、クロマグロ精巣細胞を間接標識した。その後、蛍光顕微鏡下で観察し、緑色蛍光が明瞭に細胞膜で観察されたクローンを、細胞表面抗原を認識可能なクローンとして選択した。二次スクリーニングにおける蛍光顕微鏡下で観察した結果を、図４に示す。【００５４】
（４）三次スクリーニング：ＦＣＭ解析
二次スクリーニングで得られた５０ローンにより産生される抗体が、Ａゲートの細胞、すなわち未分化生殖細胞分画を特異的に認識することができるか否かを明らかにするために、全細胞および抗体陽性細胞に対してＦＣＭ解析を行った。具体的には、全細胞のＦＣＭ解析（ＦＳ−ＳＳ展開）により散布図（図５ａ）を得て、Ａゲート率を算出した。その全細胞に対して、蛍光標識された２次抗体を反応させ、ＦＣＭ解析に供し抗体陽性の細胞集団と抗体陰性の細胞集団のヒストグラムを得た（図５ｂ）。得られた抗体陽性の細胞集団のＦＣＭ解析（ＦＳ−ＳＳ展開）により散布図（図５ｃ）を得て、Ａゲート率を算出した。このようにして得られた抗体陽性細胞集団中でのＡゲートの割合（抗体陽性分画中のＡゲート率）と、抗体陽性細胞と抗体陰性細胞とを含めた全細胞中でのＡゲートの割合（全細胞中のＡゲート率）から、抗体による未分化生殖細胞の濃縮率を、下記式を用いて算出した。【００５５】
［式１］
抗体による生殖細胞の濃縮率
＝抗体陽性分画中のＡゲート率／全細胞中のＡゲート率【００５６】
濃縮率が１．０以上の抗体を陽性クローンとして選択した。結果を表１に示す。【００５７】
【表１】
2017164390.tif 000002
【００５８】
（４）四次スクリーニング：ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
三次スクリーニングで得られた２０クローンについて、抗体を用いてクロマグロ精原細胞をＦＣＭ解析により細胞分離することができるか否か明らかにするために、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析によりスクリーニングを行った。例１（１）の方法に従い、クロマグロの精巣から調製した粗精製細胞懸濁液に対して１次抗体として各抗体を結合させたのち、２次抗体として緑色蛍光物質が標識された抗体を結合させ、ＦＣＭ解析を用いて緑色蛍光を指標に抗体陽性分画を単離した。次に単離した細胞をスライドグラスに塗抹し、細胞塗抹標本を作製した。これらの細胞塗抹標本に対して、例２（２）の方法に従って、未分化生殖細胞マーカーとして知られているｖａｓａ遺伝子のＲＮＡプローブを用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析を行い、ｖａｓａ陽性細胞の割合を求めた。【００５９】
結果を図６および７に示す。【００６０】
図７に示されるように、得られた２種類のクローン、ＴＡ−Ｎｏ．６−２８ハイブリドーマおよびＴＡ−Ｎｏ．１５−１ハイブリドーマから産生される抗体により分離された細胞集団は、それぞれ、８５．２％および７８．９％の割合でｖａｓａ陽性細胞を含み、すなわち、これらの抗体を用いることにより、クロマグロ未分化生殖細胞を高濃度に分離（単離）、濃縮することができたことが確認された。【００６１】
これらの２種類のクローン産生抗体を用いた免疫組織染色の結果を図８および図９に示す。免疫組織染色は例１（１）の方法に従って行った。【００６２】
図８および図９に示されるとおり、これらの２種類の抗体は、組織切片において、精原細胞集団、すなわち未分化生殖細胞集団を特異的に認識していることが確認された。またこれらの２種類の抗体は、固定および細胞膜の消化を施していない生きた状態の細胞に抗体溶液を反応させる操作で抗体の結合が確認されたことから、未分化生殖細胞の表面、具体的には、細胞膜表面を特異的に認識していることが確認された。【００６３】
例３：マグロ未分化生殖細胞のＭＡＣＳ（磁気細胞分離、Magnetic activated cell sorting）法による濃縮
上記例２で得られた２種類の抗体を用いて、ＭＡＣＳ法を用いてマグロの精巣細胞から未分化生殖細胞の濃縮を行った。具体的には以下の通りである。まず、マグロ精巣細胞を終濃度２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＨ（Roche）、終濃度１．６５ｍｇ／ｍｌのディスパーゼＩＩ（合同酒精）／Ｌ−１５培地（インビトロジェン）を用いて分散し、細胞数を３×１０６細胞に調整した。そこに、１次抗体として、ｏｎｅ  ｓｔｅｐ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｏｔｉｎｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Miltenyi biotech製）に懸濁し、室温、２４時間反応させることでビオチン化した、ＴＡ−Ｎｏ．６−２８ハイブリドーマおよびＴＡ−Ｎｏ．１５−１ハイブリドーマから産生される抗体を、１００μｌ添加し、４℃下にて、３０分間反応させた。反応終了後、遠心分離（２００×ｇ、５分）を行い、得られた細胞沈殿物に対してＬ−１５培地で洗浄を行った。さらに該細胞沈殿物を２４０μｌのＬ−１５培地に再懸濁し、２次抗体としてａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｎマイクロビーズ（miltenyi biotech製）を６０μｌ加えて、４℃下にて、１５分間反応させた。反応終了後、遠心分離（２００×ｇ、５分)を行い、得られた細胞沈殿物に対してＬ−１５培地で洗浄を行い、さらに該細胞沈殿物を５００μｌのａｕｔｏ−ＭＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒ(Miltenyi biotech製)に懸濁した。懸濁液から、磁気分離装置：Ｍｉｎｉ  ＭＡＣＳ  ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Miltenyi biotech製）およびＭＳカラム(Miltenyi biotech製)を用いて、磁気ビーズの結合した細胞を回収し、ＭＡＣＳ濃縮未分化生殖細胞を得た。【００６４】
得られたＭＡＣＳ濃縮未分化生殖細胞に対して、例１の方法に従って、フローサイトメトリー解析とｖａｓａ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析とを行った。結果を図１０に示す。【００６５】
図１０に示されるようにＭＡＣＳ法により濃縮された精巣細胞は、ｖａｓａ陽性細胞を多く含むものであった。【００６６】
例４：クロマグロ濃縮未分化生殖細胞のニベ（宿主）への移植
例３で得られたクロマグロＭＡＣＳ濃縮未分化生殖細胞を、ニベの腹腔内に移植し、移植細胞のニベ生殖腺への生着能を確認した。具体的には以下の通りである。【００６７】
ニベ宿主として、２週齢のニベ（東京海洋大学、館山ステーション産）、２４６個体を用いた。例３で得られたクロマグロＭＡＣＳ濃縮未分化生殖細胞を、ＰＫＨ２６（SIGMA社製）で染色した。染色したクロマグロＭＡＣＳ濃縮未分化生殖細胞を、約７０００〜１００００細胞／尾となるように、マイクロインジェクション法（Yazawa, R., Takeuchi, Y., Higuchi, K., Yatabe, T., Kabeya, N  &  Yoshizaki, Goro（2010）Chub mackerel gonads support colonization, survival, and proliferation of intraperitoneally transplanted xenogenic germ cells. Biology of reproduction, 82, 896-904参照）に従って、ニベ宿主の腹腔内に移植した。移植後２０日後に開腹して蛍光解析を行った。コントロール（未濃縮）とて、濃縮を行っていないクロマグロ精巣細胞を、終濃度２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＨ（Roche）、終濃度１．６５ｍｇ／ｍｌのディスパーゼＩＩ（合同酒精）／Ｌ−１５培地（インビトロジェン）を用いて分散して得た精巣分散細胞を用いた。結果を図１１に示す。【００６８】
図１１に示されるように、クロマグロＭＡＣＳ濃縮未分化生殖細胞を移植したニベは、蛍光視野において生殖腺での陽性が確認され、すなわち、移植したクロマグロＭＡＣＳ濃縮未分化生殖細胞が、ニベ生殖腺に生着したことが確認された。一方、コントロール（未濃縮）では、陽性反応は一切確認されなかった。それぞれの生着した個体の割合を生着率として、図１２に示す。生着率は下記式に基づいて算出した。【００６９】
［式２］
生着率（％）＝移植細胞が生着した個体数／移植を施し開腹した個体数【００７０】
図１２に示されるように、クロマグロＭＡＣＳ濃縮未分化生殖細胞の生着率が、未濃縮の細胞の生着率に比べ著しく上昇した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月13日(2017.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サバ科魚類未分化生殖細胞の表面を特異的に認識する、モノクローナル抗体であって、
モノクローナル抗体が、サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞に対する抗体であり、かつ、精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞が、未分化生殖細胞、並びに精巣または卵巣由来の体細胞を含む細胞懸濁液を、ＦＳおよびＳＳをリニア値で表示し、かつ、細胞分散により単一の状態である細胞を全て検出可能な条件でＦＳ−ＳＳのプロット図で展開した、４８８ｎｍアルゴンレーザーによるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析において、ＦＳ値が高い方におよそ１／３、およびＳＳ値が低い方におよそ１／３の画分、に出現する細胞集団である、モノクローナル抗体。
【請求項２】
サバ科魚類未分化生殖細胞の表面を特異的に認識する、モノクローナル抗体であって、
モノクローナル抗体が、抗体産生ハイブリドーマＴＡ−Ｎｏ．６−２８（ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２２２２）またはＴＡ−Ｎｏ．１５−１（ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２２２３）により産生される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
未分化生殖細胞が、始原生殖細胞、Ａ型精原細胞または卵原細胞である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
サバ科魚類が、マグロ属魚類、スマ属魚類、カツオ属魚類およびサバ属魚類から選択される１種である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を分離することを含んでなる、サバ科魚類未分化生殖細胞濃縮方法。
【請求項７】
サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することを含んでなる、未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法において、
移植前に、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、サバ科魚類未分化生殖細胞を分離、濃縮し、
該分離、濃縮した未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植する
ことを含んでなる、未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法。
【請求項８】
移植する未分化生殖細胞を提供するサバ科魚類が、宿主魚類とは異種である、請求項７に記載の未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法。
【請求項９】
移植する未分化生殖細胞を提供するサバ科魚類が、宿主魚類より大型魚類である、請求項７または８に記載の未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法。
【請求項１０】
宿主魚類が、サバ科魚類から選択される１種であり、移植する未分化生殖細胞を提供するサバ科魚類がマグロから選択される１種である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の未分化生殖細胞の配偶子への分化誘導方法。
【請求項１１】
サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移稙することを含んでなる、サバ科魚類の精子または卵の生産方法であって、
移植前に、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、サバ科魚類未分化生殖細胞を分離、濃縮し、
該分離、濃縮した未分化生殖細胞を孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植し、
該移植した末分化生殖細胞を配偶子へ分化誘導して、サバ科魚類の精子または卵子を得る
ことを含んでなる、サバ科魚類の精子または卵の生産方法。
【請求項１２】
サバ科魚類の精巣または卵巣から分離された未分化生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植することを含んでなる、サバ科魚類の生産方法であって、
移植前に、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体を用いて、サバ科魚類由来の未分化生殖細胞を含んでなるサバ科魚類の精巣または卵巣から、サバ科魚類未分化生殖細胞を分離、濃縮し、
該分離、濃縮した未分化生殖細胞を孵化前後の宿主魚類個体の腹腔内へ移植し、
移植した未分化生殖細胞を配偶子へ分化誘導し、
得られた精子および卵を交配する
ことを含んでなる、サバ科魚類の生産方法。
【国際調査報告】
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