(57)【要約】  本発明は、血管新生の促進または軸索伸展の促進、特に脳血管障害、虚血性心疾患または外傷性脳脊髄神経障害の治療のための細胞培養物の製造方法であって、ミクログリアおよび／または単球を含む細胞群を、低酸素濃度および／または低糖濃度の条件下で培養することにより前記培養物を生成することを含む、方法、該方法により得られ得る細胞製剤、並びに該細胞製剤を用いる、脳血管障害、虚血性心疾患または外傷性脳脊髄神経障害の治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生の促進または軸索伸展の促進のための細胞培養物の製造方法であって、ミクログリアおよび／または単球を含む細胞群を、低酸素濃度および／または低糖濃度の条件下で培養することにより前記培養物を生成することを含む、方法。
【請求項２】
前記培養物が脳血管障害、虚血性心疾患または外傷性脳脊髄神経障害の治療用である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単球を含む細胞群は、末梢血細胞又はその細胞分画である、請求項１または２に記載の細胞製剤の製造方法。
【請求項４】
前記単球を含む細胞群は、末梢血から採取した単核球を含む画分である、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
低酸素濃度は、１％未満の酸素濃度である、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
低糖濃度は、１．０ｇ／Ｌ以下の糖濃度である、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞群を低酸素濃度かつ低糖濃度の条件下で２４時間未満培養する、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記培養物を洗浄した後、容器に封入することをさらに含む、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
脳血管障害、虚血性心疾患または外傷性脳脊髄神経障害の治療に十分な血管新生の促進および／または軸索伸展の促進能力を有するミクログリアおよび／または単球を含む、脳血管障害、虚血性心疾患または外傷性脳脊髄神経障害の治療のための細胞製剤。
【請求項１０】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法により生成された培養物を含む、請求項９に記載の細胞製剤。
【請求項１１】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法により生成された培養物を含む、血管新生の促進または軸索伸展の促進のための細胞製剤。
【請求項１２】
ミクログリアおよび／または単球を含む細胞群を、低酸素濃度および／または低糖濃度の条件下で培養することにより生成された、治療上有効量のミクログリアおよび／または単球を含む培養物を、対象に投与することを含む、脳血管障害、虚血性心疾患または外傷性脳脊髄神経障害の治療方法。
【請求項１３】
脳血管障害、虚血性心疾患または外傷性脳脊髄神経障害の治療における使用のための、低酸素濃度および／または低糖濃度の条件下で培養されたミクログリアおよび／または単球。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば脳梗塞などにより損傷を受けた組織の修復及び再生に有効な細胞製剤およびその製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
脳梗塞は、脳局所の虚血性壊死によって生じる脳機能障害を指し、救急治療の必要な疾患であり、癌及び心臓病と並んで３大死因の一つである。脳梗塞は、作用機序の面から、血栓性、塞栓性、血行力学性に分類され、また臨床所見の側面からはアテローム血栓性脳梗塞、心原性脳塞栓症、ラクナ梗塞などに分類される。【０００３】
虚血は、動脈硬化など脳血管病変、又は心原性血栓により局所脳血流が遮断されることにより起こり、虚血中心部位ではエネルギー枯渇による神経細胞死が引き起こされる。虚血後、神経再生に乏しく、慢性期には症状の回復は現状では難しく、半数が何らかの後遺症をきたす。虚血中心の辺縁部位の神経再生の過程として、血管再生がその引き金となると想定されている。そこを標的として治療法の開発が望まれている。【０００４】
脳梗塞の治療に関して様々な試みがされているが、十分なものではなく、近年は生体細胞を用いた治療方法が試みられている（特許文献１および２、ならびに非特許文献１参照）。【０００５】
特許文献１には、骨髄または血液から採取された間葉系幹細胞を含む細胞を、ヘパリン等の抗凝固剤を用いずに採取し、これを用いて脳梗塞等の疾患を治療する方法が記載されている。特許文献２には、ＭＵＳＥ細胞を用いた脳梗塞の治療方法が記載されている。【０００６】
また、マウスの脳梗塞モデルで骨髄由来単球（ＣＤ１１５陽性細胞）を静脈投与することで、本細胞が梗塞巣に移行することと、その効果が確認されているが、その効果は十分なものではなかった（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００９／０３４７０８号
【特許文献２】特開２０１５−１５９８９５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Somsak Wattananit "Monocyte-Derived Macrophages Contribute to Spontaneous Long-Term Functional Recovery after Stroke in Mice" The Journal of Neuroscience， 13 April 2016，36(15): 4182-4195; doi: 10．1523/JNEUROSCI．4317-15．2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、上記特許文献１および特許文献２に記載の細胞製剤では、骨髄液を採取する必要があるため、患者の負担が大きく、また、間葉系幹細胞を取得するためには長期間の培養を必要とするという問題がある。また、上記非特許文献１の骨髄由来の単球の投与では、梗塞領域への移行は確認できたが、脳梗塞などの治療の効果が不十分であるという問題がある。【００１０】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、患者の負担が少なく安全性が高く、脳梗塞の治療効果が高い細胞製剤とその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、低酸素低糖（ＯＧＤ）処理したミクログリアまたは単球を含む単核球細胞を投与することにより、脳梗塞発症後の悪化を防ぎ、血管新生および軸索伸展を促進することで脳梗塞を治療できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。【００１２】
＜１＞本発明は、虚血性脳疾患、心筋梗塞、脳出血及び脳脊髄外傷性神経障害から選ばれる疾患の治療のための細胞培養物の製造方法であって、ミクログリアおよび／または単球を含む細胞群を、低酸素濃度および／または低糖濃度の条件下で培養することにより前記培養物を生成することを含む、方法である。【００１３】
＜１ａ＞本発明は、血管新生の促進または軸索伸展の促進のための細胞培養物の製造方法であって、ミクログリアおよび／または単球を含む細胞群を、低酸素濃度および／または低糖濃度の条件下で培養することにより前記培養物を生成することを含む、方法である。
＜２＞前記いずれかの方法において、少なくとも低糖濃度条件下で該細胞群を培養することが好ましい。
＜３＞前記いずれかの方法において、好ましくは、該細胞群は基本培地中で培養される。
＜４＞例えば、前記単球を含む細胞群は、末梢血細胞またはその分画である。
＜４ａ＞または、前記単球を含む細胞群は、末梢血から採取した単核球を含む画分である。
＜５＞また、低酸素濃度は、１％未満の酸素濃度であってもよい。
＜６＞また、低糖濃度は、１．０ｇ／Ｌ以下の糖濃度であってもよい。
＜７＞また、前記培養物の生成では、前記細胞群を低酸素濃度かつ低糖濃度の条件下で２４時間未満培養してもよい。
＜８＞また、前記細胞製剤の製造では、さらに、生成された前記培養物を洗浄し、洗浄された前記培養物を容器に封入してもよい。【００１４】
＜９＞本発明は、虚血性脳疾患、心筋梗塞、脳出血及び脳脊髄外傷性神経障害から選ばれる疾患の治療に十分な血管新生の促進および／または軸索伸展の促進能力を有するミクログリアおよび／または単球を含む、虚血性脳疾患、心筋梗塞、脳出血及び脳脊髄外傷性神経障害から選ばれる疾患の治療のための細胞製剤である。
＜９ａ＞本発明は、ミクログリアおよび／または単球を含む細胞群を、低酸素濃度および／または低糖濃度の条件下で培養することにより生成された培養物を含む、虚血性脳疾患、心筋梗塞、脳出血及び脳脊髄外傷性神経障害から選ばれる疾患の治療のための細胞製剤である。【００１５】
＜１０＞本発明は、ミクログリアおよび／または単球を含む細胞群を、低酸素濃度および／または低糖濃度の条件下で培養することにより生成された培養物を含む、血管新生の促進または軸索伸展の促進のための細胞製剤である。【００１６】
＜１１＞本発明は、ミクログリアおよび／または単球を含む細胞群を、低酸素濃度および／または低糖濃度の条件下で培養することにより生成された、治療上有効量のミクログリアおよび／または単球を含む培養物を、対象に投与することを含む、虚血性脳疾患、心筋梗塞、脳出血及び脳脊髄外傷性神経障害から選ばれる疾患の治療方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ミクログリアまたは単球を低酸素濃度および／または低糖濃度の条件下できわめて短期間培養するのみで、血管新生や軸索伸展の促進能を該細胞に付与し得るので、虚血脳疾患や心筋梗塞の発症早期から治療が可能である。しかも、間葉系幹細胞や骨髄幹細胞を用いる場合のように、細胞調整施設（ＣＰＣ）内での実施という制限がないので、広く一般の医療機関で利用可能である。また、培養に血清や増殖因子などを必要としないので、安価にかつ安全に細胞製剤を提供することができる。
さらに、末梢血由来の単球を含む細胞群を用いる場合には、骨髄液を採取する必要がないため、脳梗塞の治療において患者の負担を軽減し安全性を高めることができる。
一方、脳出血又は脳脊髄外傷患者の場合、血腫除去手術後、血腫周辺の破壊された白質から容易にミクログリアを採取することができるので、患者の脳や脊髄から直接採取したミクログリアに本発明を適用することにより、前記疾患の治療が可能となる。
また、低酸素濃度および／または低糖濃度の条件下での培養を行うため、血管新生および軸索伸展をより促進することができ、治療効果を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植後の一過性局所脳虚血ラットモデルにおける神経学的転帰の改善結果の一例を示す図である。
【図２】図２は、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植後の一過性局所脳虚血ラットモデルにおける神経学的転帰の改善結果の他の例を示す図である。
【図３】図３は、ＯＧＤによって前処理されたマウス初代培養ミクログリアの特性を示す図である。
【図４】図４は、ＯＧＤによって前処理されたマウス初代培養ミクログリアの他の特性を示す図である。
【図５】ＯＧＤ前処理済みミクログリアの移植によって促進される、脳虚血後２８日目のＶＥＧＦの強度を示す図である。
【図６】ＯＧＤ前処理済みミクログリアの移植によって促進される、脳虚血後２８日目のＭＭＰ−９の強度を示す図である。
【図７】ＯＧＤ前処理済みミクログリアの移植によって促進される、脳虚血後２８日目のＴＧＦ−βの強度を示す図である。
【図８】図８は、単位体積あたりのＣＤ３１ボリュームの免疫反応性を表す図である。
【図９】図９は、単位体積あたりのＳＭＩ３１のボリュームの免疫反応性を表す図である。
【図１０】図１０は、大脳皮質からのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン／ニューロングリア抗原２（ＣＳＰＧ／ＮＧ２）の、虚血後２８日目および虚血前のラットにおける相対強度を表す図である。
【図１１】図１１は、脳虚血後のＯＧＤ前処理済みミクログリア移植のメカニズムを示す図である。
【図１２】図１２は、細胞製剤の製造方法を示すフローチャートである。
【図１３】図１３は、ＯＧＤ前処理済み末梢血単核球（ＰＭＮＣ）移植後の一過性局所脳虚血ラットモデルにおける神経学的転帰の改善結果の一例を示す図である。図中、「＃」はコントロールに対してｐ＜０．０５であることを示す。
【図１４】図１４は、一過性局所脳虚血ラットモデルにおける神経学的転帰の改善における、ＯＧＤ前処理済みＰＭＮＣの移植細胞数依存性を示す図である。図中、「＃」はコントロールに対してｐ＜０．０５であることを示す。
【図１５】図１５は、ＯＧＤ前処理済みＰＭＮＣを移植した一過性局所脳虚血ラットモデルの脳虚血病変部における血管新生の促進を示す図である。上パネルは血管新生マーカーであるＣＤ３１の免疫染色とＤＡＰＩによる核染色との二重染色像であり、下パネルは、該染色結果から血管体積を算出しグラフ化したものである。
【図１６】図１６は、ＯＧＤ前処理済みＰＭＮＣを移植した一過性局所脳虚血ラットモデルの脳虚血病変部における神経軸索伸展の促進を示す図である。上パネルは神経軸索マーカーであるＳＭＩ３１の免疫染色とＤＡＰＩによる核染色との二重染色像であり、下パネルは、該染色結果から神経軸索体積を算出しグラフ化したものである。
【図１７】図１７は、ヒトＰＭＮＣにおけるＶＥＧＦの産生（Ａ）及び分泌（Ｂ）に及ぼす低酸素刺激（ＯＤ）、低糖刺激（ＧＤ）又は低酸素低糖刺激（ＯＧＤ）の効果を示す図である。（Ａ）各刺激後の細胞抽出液（上パネル）及び培養上清（下パネル）のウェスタンブロット像（左）とＶＥＧＦの相対的バンド強度（右）をグラフ化したものを示す。（Ｂ）各刺激後の培養上清に対するＥＬＩＳＡの結果をグラフ化したものを示す。図中、「＊＊」はｐ＜０．０１、「＊」はｐ＜０．０５であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（本発明の基礎となった知見）
【００２０】
虚血性脳卒中患者の生存者の半分以上は、運動機能障害に苦しむため、亜急性と慢性期での脳卒中患者の機能回復を促進するための方法を確立することが必要である。しかしながら、治療薬を開発するための様々なアプローチはされているが、現在のところ十分な治療薬はなく、物理的なリハビリが、虚血性脳卒中患者の機能回復を促すための唯一の治療選択肢のままである。
【００２１】
骨髄単核細胞または骨髄由来間葉系幹細胞／間質細胞を用いた細胞治療は、亜急性期及び慢性期の脳卒中患者の機能回復を促すための別の治療方法であるかもしれない。神経前駆細胞、骨髄間質細胞、間葉系幹細胞を用いた細胞ベースの治療のメカニズムの一つは、ＶＥＧＦまたは脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の分泌を介して血管新生を誘導する。細胞治療後の軸索伸展も報告されている。しかし、最近の多無作為化比較試験では、虚血性脳卒中に対する骨髄単核幹細胞の静脈内投与の有益な効果がなかったことが実証されている。また、虚血性脳卒中患者は、再発予防のため抗凝固剤または抗血小板療法を行うため、骨髄から幹細胞を採取することは、技術的に困難である。また、骨髄由来細胞は、血液脳関門（ＢＢＢ）を透過せず、脳内に移行しない場合がある。
【００２２】
そこで、本発明者らは、ミクログリア細胞が、中枢神経系（ＣＮＳ）における上記増殖因子の主要な供給源であるので、ミクログリアを用いた細胞療法が別の有望な治療方法であるかもしれない、と考えた。これまでのいくつかの研究では、ミクログリアが急性期における脳梗塞体積を拡張していることを実証しているが、亜急性期及び慢性期における脳虚血後のミクログリアは、組織および血管のリモデリングを介して保護の役割を果たしていることが知られている。
【００２３】
この保護的なミクログリアは、Ｍ２ミクログリアと呼ばれ、その保護効果は、脳虚血後の血管形成及び軸索伸展を促進することができるＶＥＧＦとＢＤＮＦ、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）、およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）などのリモデリング因子を分泌することによって引き起こされると考えられる。また、移植されたミクログリアは、特に脳虚血状態で、ＢＢＢを通過して脳内に移行することができる。
また、血液中の単球が脳内に移行しミクログリアに分化することも知られている。
【００２４】
本発明者らは、上記の知見に基づいて、ＯＧＤで予め調整されて末梢投与されたミクログリアまたは単球は、ＢＢＢを通過して脳実質内に移行し、リモデリング因子を分泌し、亜急性期における局所脳虚血に対する血管新生及び軸索伸展の促進を介して、多面的な治療効果を発揮することができると、仮定した。
【００２５】
本発明者らは、その仮説を検証するために、ＯＧＤ処理されたミクログリアまたは末梢血単核球（ＰＭＮＣ）を、一過性局所脳虚血のラットモデルに投与したところ、ミクログリアまたは単球がＢＢＢを通過して脳内に移行し、血管新生および軸索伸展の促進を介して脳の機能回復を促すことができることを見出した。
【００２６】
本発明者らはまた、ヒトＰＭＮＣをＯＧＤ処理した場合と、低酸素（ＯＤ）または低糖（ＧＤ）のいずれか一方の刺激を行った場合とで、該細胞集団における該血管新生のための液性因子であるＶＥＧＦの産生量・分泌量を比較したところ、ＯＧＤ処理、ＧＤ処理、ＯＤ処理の順で、いずれも無刺激の場合よりもＶＥＧＦ産生量が高く、ＯＧＤ処理、ＧＤ処理では、ＯＤ処理に比べてＶＥＧＦの分泌量が顕著に高いことが明らかとなった。
【００２７】
本発明は、血管新生の促進または軸索伸展の促進のための細胞培養物、特に脳血栓や脳梗塞等の虚血性脳疾患（脳梗塞）または脳内出血やクモ膜下出血等の出血性脳障害（脳出血）、心筋梗塞等の虚血性心疾患、あるいは、脳脊髄外傷性神経障害の治療のための前記培養物の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう。）を提供する。当該方法は、ミクログリアおよび／または単球を含む細胞群を、低酸素濃度および／または低糖濃度の条件下で培養することにより前記培養物を生成することを含む。
本発明の製造方法において使用される細胞群は、ミクログリア又は単球を含んでいる細胞群であれば、その由来に特に制限はなく、ヒト又は他の哺乳動物（例、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ブタ等）から適宜採取することができる。ミクログリアを含む細胞は、例えば、大脳などの神経組織を分散し、血清添加培養液を用いて接着性の細胞培養容器で培養する。これにより、まず培養容器表面にアストロサイトを主とするグリア細胞が増殖し単層状になる。この後にミクログリアの増殖が容易に認められる状態になるが、これを採取し、培養することによりミクログリアの培養試験系を作ることが出来る。この細胞採取時には培養容器を振とうする方法が、よく用いられる。これは単層アストロサイト培養細胞上に接着しているミクログリアを遊離させるため物理的刺激を加えるもので、より多くの細胞を採取することが出来る。また大脳などの神経組織の分散液から直接、又は上記方法で得られたミクログリア細胞画分を、ＣＤ１１５を指標に、抗ＣＤ１１５抗体を用いたＭＡＣＳやＦＡＣＳによりミクログリアを精製することもできる。また、単球や造血幹細胞等の前駆細胞や幹細胞から分化させることにより得ることができる。
ヒトへの適用においては、例えば、脳出血や脳外傷により外科的手術を必要とする患者において、血腫除去後に、神経内視鏡を用いて、血腫周辺の破壊された白質を切除し、該白質内に遊走したミクログリアを単離して使用することができる。ヒトからのミクログリアの採取は高侵襲性で本来難しいが、上記の場合、手術により必然的に採取される破壊された白質をソースとするので、十分に許容され得る。
【００２８】
単球を含んでいる細胞群としては、公知の方法で得られた骨髄由来の単核球画分又は末梢血由来の単核球画分を用いることができる。低侵襲性であること、虚血性疾患の場合、通常再発防止のために抗凝固・抗血栓療法を実施するため、骨髄液採取が困難であることを考慮すると、末梢血由来の単核球画分がより好ましい。単核球画分は、骨髄液や末梢血から、例えば、フィコール密度勾配遠心を用いて自体公知の方法により分離精製することができる。更に、例えば抗ＣＤ１４抗体を用いてＭＡＣＳやＦＡＣＳにより単球を生成し用いることもできる。また、造血幹細胞や多能性幹細胞から分化させて用いることもできる。
【００２９】
本願における低酸素低糖処理（ＯＧＤ処理）とは、上記細胞群を通常の培養条件に比べて、低酸素、低糖の培地で培養する処理をいう。ＯＧＤ処理の条件は、本願で使用するミクログリア又は単球を含む細胞群の種類により適宜選択されるが、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＭＭＰ−９の生産量を指標に、その発現量が極大化している条件の前後で選択できる。例えば、ＣＤ１１５陽性のラットマイクログリア画分においては、本実施例の条件の培養チャンバーを密閉し、無酸素雰囲気下、１．０ｇ／Ｌ グルコースを含むＤＭＥＭ培地で培養した場合、低酸素チャンバー内の酸素濃度は、１時間で１％未満に減少し、４時間で０．１〜０．４％に減少し、実験を通して維持された。ＯＧＤの下での２４時間の培養は、細胞死を引き起し、ＯＧＤの下での１８時間の培養は、ヨウ化プロピジウムアッセイおよび乳酸脱水素酵素アッセイによって評価すると、細胞死を引き起こさなかった。また、Ｍ２ミクログリアは、ＯＧＤの培養開始後１２時間から検出され始め、２４時間で最大に増加し、その後、著しく低下した。したがって、上記の条件では１８時間前後（例、１８±６時間）のＯＧＤ処理が望ましい。
【００３０】
本発明において、「低酸素濃度」とは、好ましくは、脳梗塞局所における酸素濃度を模倣する濃度を意味し、例えば、１％未満であり、より好ましくは０．１〜０．４％である。１％を超える低酸素濃度（例、２〜１０％）での培養は、ＥＳ細胞の未分化維持やｉＰＳ細胞の樹立効率改善に有効であるとの報告があるが、本発明における好ましい低酸素（ＯＤ）処理は、２４時間を超えるとミクログリアや単球の細胞死を引き起こすような苛酷な低酸素条件である。当該低酸素条件は、例えば、培養チャンバー内の大気を、例えば５％ ＣＯ２含有窒素ガスなどの無酸素不活性ガスにて置換することにより作出できる。
【００３１】
本発明において、「低糖濃度」とは、好ましくは、脳梗塞局所における糖濃度を模倣する濃度を意味し、例えば、１．０ｇ／Ｌ以下である。本発明の効果を奏するためには、糖濃度を１．０ｇ／Ｌ以下とすれば十分であり、必要以上に糖濃度を下げても細胞の生存にとってむしろ望ましくない場合がある。当該低糖条件は、ミクログリアまたは単球を含む細胞群を、当該低糖濃度の培地中で培養することにより作出できる。培地としては、例えば、イーグル培地、最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ培地（例、ＲＰＭＩ１６３０、ＲＰＭＩ１６４０）、フィッシャー培地、ハム培地（例、Ｆ１０、Ｆ１２）、ＭＣＤＢ培地（例、ＭＣＤＢ１０４、ＭＣＤＢ１０７）等の周知慣用の基本培地及びそれらの混合培地を用いることができ、各基本培地の糖濃度に応じて、本発明における低糖濃度となるように適宜糖の添加量を低減させて使用することができる。例えば、ＤＭＥＭの場合、低グルコース培地（１．０ｇ／Ｌ）と高グルコース培地（４．５ｇ／Ｌ）とが市販されているので、低グルコース培地を選択して使用することができる。あるいは、グルコース不含培地も市販されており、これに所望の低糖濃度となるように糖を添加することもできる。糖としては、ミクログリアや単球が資化できるものであれば特に制限はなく、グルコース、ガラクトース、フルクトース等が使用できるが、通常グルコースである。
【００３２】
培地には、上記のような基本培地に加えて、５〜２０％の血清（例、ウシ胎児血清）もしくは血清代替物（例、Knockout Serum Replacement）、増殖因子（例、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インスリン、ＩＬ−１、ＩＬ−６）、アルブミン、トランスフェリン、プロテアーゼインヒビター（例、α１−アンチトリプシン）、細胞接着因子（例、フィブロネクチン、ラミニン）、脂質（例、コレステロール、リノール酸、ステロイド）、微量元素（鉄、亜鉛、亜セレン酸、マンガン、銅）等の周知慣用の培地添加物を含有してもよいが、本発明は、血清や増殖因子等の動物由来成分を添加せずとも、ミクログリアや単球に十分な血管新生及び／又は軸索伸展促進能を付与し得るので、好ましい実施態様においては、培地として、血清や増殖因子を含まない、実質的に基本培地のみからなる培地を用いることができる。高価でウイルス等の夾雑のリスクのある動物由来成分を含まないことで、安価にかつ安全な細胞製剤を提供することができる。
【００３３】
これらのＯＧＤの条件を総括すると、低酸素濃度は１％未満の酸素濃度であり、低糖濃度は１．０ｇ／Ｌ以下の糖濃度であり、培養時間は２４時間未満であると言える。また、単球または末梢血単核球画分を用いた場合には、培養時間を１８時間以下にすることが好ましい。
【００３４】
上記のようにして得られる細胞培養物は、そのままで、あるいは医薬上許容される担体とともに製剤化することができる。医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることができる。本発明の細胞培養物を含む細胞製剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などを配合してもよい。
【００３５】
後述の実施例に示されるように、ミクログリア又は単球を含む細胞群をＯＧＤ処理した培養物は、通常の酸素濃度・糖濃度条件下で処理した培養物（あるいは、ＯＧＤ処理前の該細胞群）と比較して、
（ａ）ＶＥＧＦの分泌量が有意に高い、
（ｂ）ＭＭＰ−９の分泌量が有意に高い、及び
（ｃ）ＴＧＦ−βの分泌量が有意に高い
という物性を有することを特徴とする。ＶＥＧＦ、ＭＭＰ−９及びＴＧＦ−βは血管新生及び軸索伸展促進作用を有するので、ＯＧＤ処理した培養物を投与することにより、虚血や出血により損傷・破壊された神経組織の再生を誘導することができる。
また、ミクログリア又は単球を含む細胞群をＯＧＤ処理した培養物は、通常の酸素濃度・糖濃度条件下で処理した培養物（あるいは、ＯＧＤ処理前の該細胞群）と比較して、
（ｄ）ＴＮＦ−α分泌量に対するＴＧＦ−βの分泌量の比が有意に高い、及び／又は
（ｅ）ＩＬ−６の分泌量が有意に低い
という物性をさらに有する。即ち、炎症性サイトカインに比べて抗炎症性のサイトカインを優位に分泌することで、虚血／出血部位における炎症抑制効果を奏し得る。
従って、ミクログリア又は単球を含む細胞群をＯＧＤ処理した培養物を含む細胞製剤は、虚血性脳疾患または虚血性心疾患の治療のために使用でき、血管新生の促進や抗炎症の作用が期待できる。本願における虚血性脳疾患とは、いわゆる脳血管障害を指し、脳梗塞（脳血栓、脳塞栓）の他、出血性脳障害（脳内出血、クモ膜下出血）も含まれる。好ましい適応としては、脳梗塞があげられる。また、単球を含む細胞群をＯＧＤ処理した培養物を含む細胞製剤は、虚血性心疾患（例、心筋梗塞）等の虚血性疾患にも使用することができる。あるいは、外傷性の脳脊髄神経障害にも使用することができる。
【００３６】
本発明の方法によって製造された細胞製剤を患部に送達する方法として、例えば、外科的手段による局所移植、静脈内投与、局所注入投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、脳内投与、脳室内投与、または動脈内投与などが考えられる。
【００３７】
患者への細胞の注射による移植は、例えば、神経系の修復のために用いられる場合、移植する細胞を、人工脳脊髄液や生理食塩水などを用いて浮遊させた状態で注射器に溜め、手術により損傷した神経組織を露出し、この損傷部位に注射針で直接注入することにより行うことができる。また、損傷部位の近傍へ移植してもよく、また、脳脊髄液中への注入によっても効果が期待できる。さらに、静脈内への注入でも効果が期待できる。したがって、通常の輸血の要領での移植が可能となり、病棟での移植操作が可能である点で好適である。
【００３８】
本発明の細胞製剤の投与量は、例えば、脳梗塞患者にＰＭＮＣを静脈内投与する場合、単核球数として１０５〜１０８個、好ましくは５×１０５〜１０７個を投与することができる。単核球に占める単球の割合は１／３〜１／１５程度と見積もられるので、単球数としては、上記単核級数に当該割合を乗じた数を投与すればよいと考えられる。ミクログリアの投与量も、単球の投与量に相当する細胞数が挙げられる。
【実施例】
【００３９】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例は、米国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の勧告に厳密に従って行われ、新潟大学動物実験倫理委員会によって承認された後に実施された。【００４０】
（局所脳虚血）
一過性局所脳虚血は、体重２９０〜３２０グラムの雄性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを用いて、シリコーンコートナイロンモノフィラメントにて誘導した。【００４１】
具体的には、７０％亜酸化窒素と３０％酸素の混合物中の１．５％ハロタンの吸入により、ラットに麻酔を誘導した。直径０．１４８ｍｍのナイロンモノフィラメントを、血管閉塞のために使用した。ナイロンモノフィラメントの先端を熱で丸めた。縫合糸の末端１１ｍｍを直径０．３５０ｍｍのシリコーンでコーティングした。外頸動脈を介して内頚動脈に塞栓糸を挿入することによって中大脳動脈（ＭＣＡ）を閉塞した。虚血の９０分後に、血流を回復するために、塞栓糸を引き抜いた。【００４２】
これにより、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）の存在によって決定される虚血中心とペナンブラの領域が形成された。また、再灌流によってペナンブラの組織を救うための治療時間域は９０分であった。【００４３】
（免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡）
脳虚血後１日目、３日目、７日目、１４日目、および２８日目に生存したラットを、生理食塩水での心臓内灌流の後、冷０．１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）の冷４％パラホルムアルデヒドで灌流し、ハロタンの過剰投与で安楽死させた。【００４４】
脳を取り出し、パラフィンワックス中に包埋した。パラフィンブロックから連続切片（厚さ４μｍ）を切り出し、抗体を用いて染色した。また、フリーフトート切片を作成し（５０μｍ厚）、染色した。ベクタシールド４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）にて核染色した。共焦点レーザー走査顕微鏡下で切片を検鏡した。虚血中心またはペナンブラに対応する大脳皮質組織をＭＡＰ２染色によって決定した。
（免疫染色による脳組織構造の定量分析）【００４５】
脳組織構造の定量分析を行うために、組織切片を、分化（ＣＤ）３１（内皮細胞及び血管新生のマーカー）、ＭＡＰ２（ニューロンの樹状突起のマーカー）、ＳＭＩ３１および成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ４３）（ニューロンの軸索のマーカー）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β、およびＭＭＰ−９に対する抗体で免疫染色し、カウントした。【００４６】
（ミクログリアの初代培養細胞）
初代マウスミクログリアを採取した。具体的には、パパインで大脳皮質を消化した後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で細胞懸濁液を１０日間培養させることによって、混合グリア細胞を出生後のＣ５７ＢＬ／６マウスの大脳皮質から分離した。１０日後、ミクログリアを単離するために培養フラスコを１５分間振とうした。フローサイトメトリーにおけるＭａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）免疫反応性による評価では、これらのミクログリアの培養物の純度は９９％であった。【００４７】
（末梢血単核球）
ラットまたはヒト末梢血をＰＢＳと混和して全量３５ｍＬとし、５０ｍＬコニカルチューブ中のフィコール（ＧＥヘルスケアジャパン  Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｒｅｍｉｕｍ  １．０８４）１５ｍＬ上に重層し、４００×ｇで３０分間遠心し、フィコール層上に出現するＰＭＮＣ層を分離した。【００４８】
（ＯＧＤ：低酸素低糖刺激、ＯＤ：低酸素刺激、ＧＤ：低糖刺激）
ＯＧＤの誘導のために、まず、血清含有培地を、二回ＰＢＳで十分に洗浄することにより、血清成分を除去した。次に、低糖培地に置換し、９５％Ｎ２及び５％ＣＯ２の混合ガスにて、低酸素チャンバー中を１時間で置換し、その後１８時間閉鎖した。低糖培地には、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  ｍｅｄｉｕｍ）を用い、その糖濃度を１．０ｇ／Ｌとした。
低酸素チャンバー内の酸素濃度は、１時間で１％未満に減少し、４時間で０．１〜０．４％に減少し、実験を通して維持された。
ＯＤは低糖培地の代わりに血清不含高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）ＤＭＥＭを用いる以外はＯＧＤと同様に行った。ＧＤは、チャンバー内雰囲気を５％ＣＯ２、９５％大気とする以外は、ＯＧＤと同様に行った。【００４９】
ＯＧＤの下での２４時間の培養は、細胞死を引き起し、ＯＧＤの下での１８時間の培養は、ヨウ化プロピジウムアッセイおよび乳酸脱水素酵素アッセイによって評価すると、細胞死を引き起こさなかった。また、Ｍ２ミクログリアは、ＯＧＤの培養開始後１２時間から検出され始め、２４時間で最大に増加し、その後、著しく低下した。したがって、本実施例では１８時間のＯＧＤを選択した。【００５０】
なお、ＯＧＤの下で培養されたミクログリアを、以下、ＯＧＤ前処理済みミクログリアという。また、ＯＧＤ前処理済みミクログリアと比較するために、正常な酸素濃度（例えば約２０％）の下で培養されたミクログリアを、正常酸素ミクログリアという。【００５１】
（細胞移植）
本実施例では、同じ生理学的状態にするため、脳虚血後７日目に平均−２ＳＤ以下の体重のラットを除外した。１×１０６個のミクログリア又は１×１０５個もしくは１×１０６個のラットＰＭＮＣをＰＢＳ３００μＬで希釈した。脳虚血後７日目に、一過性のＭＣＡＯ（中大脳動脈閉塞術）に供したラットを無作為に以下の群に割り当てた。これらの群は、ゆっくりと３分間にわたって外頚動脈（ＥＣＡ）の断端を介してミクログリア又はＰＭＮＣが移植されたラットからなる細胞処理群と、同じ体積のＰＢＳが注入されたラットからなる無細胞対照群とである。なお、細胞処理群には、ＯＧＤ前処理済みミクログリア又はＰＭＮＣが移植されたラットからなるＯＧＤ前処理済みミクログリア又はＰＭＮＣ移植群と、正常酸素ミクログリア又はＰＭＮＣが移植されたラットからなる正常酸素ミクログリア又はＰＭＮＣ移植群とがある。さらに、ＯＧＤ前処理済みＰＭＮＣ移植群には、移植細胞数により、１×１０５個ＰＭＮＣ移植群と、１×１０６個ＰＭＮＣ移植群とがある。【００５２】
（感覚運動評価）
感覚運動評価は、脳虚血前と後、１日目、４日目、７日目、１０日目（移植後３日目）、１４日目（移植後７日目）、２１日目（移植後１４日目）、および２８日目（移植後２１日目）に、コーナーテストによって行われた。コーナーテストでは、ラットがコーナーから左右いずれかに回って脱出するテスト２０回実施し、右から脱出する回数をカウントした。【００５３】
（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マウス）
移植されたミクログリアが、動脈内投与された後に、それらの有益な効果を発揮するために血液から脳実質への移行できるかどうかを判断するために、本実施例では、ＧＦＰマウスからの初代ミクログリアを用いた。ＧＦＰマウスからの初代ミクログリアをＯＧＤによって前処理した後、動脈内にこの細胞を投与した。その後、脳虚血７日後に行った移植から、３日目および２１日目に、共焦点顕微鏡検査を行った。【００５４】
（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）
ヒトＰＭＮＣを１８時間ＯＧＤ、ＧＤ又はＯＤ刺激した後、細胞と培養上清とを分離した。細胞抽出液と培養上清のそれぞれについてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、マウス抗ヒトＶＥＧＦ抗体及び標識化抗マウスＩｇＧ抗体を用いたウェスタブロットによりＶＥＧＦを定量した。内部標準としてβ−アクチン（細胞抽出液）又はトランスフェリン（培養上清）をそれぞれ用いた。また、培養上清については、ＥＬＩＳＡによるＶＥＧＦの定量も実施した。【００５５】
（結果）
まず、局所脳虚血に対するＯＧＤ前処理済みミクログリア移植の治療効果について説明する。
局所脳虚血に対するＯＧＤ前処理済みミクログリア移植の治療効果を比較するために、局所脳虚血後の感覚運動評価によって、無細胞対照群と、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植群の間で神経学的転帰を分析した。
図１は、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植後の神経学的転帰の改善結果の一例を示す図である。【００５６】
ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植群のラットは、２０回実施されたコーナーテストにより、無細胞対照群のラットと比較して、機能回復が大幅に改善された。つまり、脳虚血後２８日目に行われた２０回実施されたコーナーテストにおいて、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植群では、約５０％の割合でラットが右に回り、無細胞対照群では、約１０％の割合でラットが右に回った。これは、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植群では、無細胞対照群よりも、神経障害の改善が有意に良好であったことを示している。なお、これらの群において、脳虚血前と後７日目、１４日目、２１日目、および２８日目における体重に有意な差はなかった。【００５７】
次に、局所脳虚血後の感覚運動評価によって、ミクログリアに対するＯＧＤ前処理の有無による治療効果を比較した。
図２は、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植後の神経学的転帰の改善結果の他の例を示す図である。
ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植後のラットは、２０回実施したコーナーテストにより、正常酸素ミクログリア移植後のラット（ｎｏｒｍ）と比較して、機能回復が大幅に改善された。つまり、脳虚血後２８日目に行われた２０回実施されたコーナーテストにおいて、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植群では、約４０％の割合でラットが右に回り、正常酸素ミクログリア移植群では、約１０％の割合でラットが右に回った。これは、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植群では、正常酸素ミクログリア移植群よりも、神経障害の改善が有意に良好であったことを示している。なお、これらの群において、脳虚血前と後７日目、１４日目、２１日目、および２８日目における体重に有意な差はなかった。【００５８】
ここで、共焦点顕微鏡検査によって、ＧＦＰマウスからのミクログリアが動脈内に投与された後、つまり移植後の２１日目には、そのミクログリアは観察されなかったが、移植後の３日目に、そのミクログリアが虚血中心とペナンブラの間の境界領域で観察された。つまり、ミクログリアが血液から脳実質への移行していることを共焦点顕微鏡検査によって確認した。【００５９】
図３は、ＯＧＤによって前処理されたマウス初代培養ミクログリアの特性を示す図である。具体的には、図３は、正常酸素状態（ｎｏｒｍ）およびＯＧＤのそれぞれのマウス初代培養ミクログリアの培地への分泌レベルを示す。図３の（ａ）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の分泌レベルを示し、（ｂ）は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の分泌レベルを示し、（ｃ）は、ＭＭＰ−９の分泌レベルを示す。【００６０】
図３の（ａ）に示すように、ＯＧＤ前処理済みミクログリアの培地からのＶＥＧＦの分泌レベルは、正常酸素ミクログリアでの分泌レベルよりも著しく高いことがわかった。【００６１】
一方、図３の（ｂ）に示すように、ＯＧＤと正常酸素状態とで、ミクログリアの培地からのＢＤＮＦの分泌レベルの差はなかった。しかし、図３の（ｃ）に示すように、ＯＧＤ前処理済みミクログリアの培地からのＭＭＰ−９の分泌レベルは、正常酸素ミクログリアでの分泌レベルより高かったことを発見した。【００６２】
図４は、ＯＧＤによって前処理されたマウス初代培養ミクログリアの他の特性を示す図である。具体的には、図４は、図３と同様、正常酸素状態（ｎｏｒｍ）およびＯＧＤのそれぞれのマウス初代培養ミクログリアの培地からの分泌レベルを示す。図４の（ａ）および（ｂ）は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）およびインターロイキン１０（ＩＬ−１０）といった抗炎症性サイトカインの分泌レベルを示す。図４の（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）は、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびＩＬ−１βといった炎症性サイトカインの分泌レベルを示す。図４の（ｆ）は、ＴＮＦ−αに対するＴＧＦ−βの比率を示す。【００６３】
ＯＧＤ前処理済みミクログリアのサイトカインプロファイルの変化を決定するために、図４に示すように、正常酸素状態とＯＧＤとで、ミクログリアからのいくつかのサイトカインのレベルを比較した。なお、一般的には、Ｍ１ミクログリアは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−６を分泌するが、脳保護的なＭ２ミクログリアは、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを分泌する。【００６４】
図４の（ａ）に示すように、ＯＧＤ前処理済みミクログリアによる抗炎症性サイトカインＴＧＦ−βの分泌レベルは、正常酸素ミクログリアによる分泌レベルと比べて２５倍高い。また、図４の（ｃ）に示すように、ＯＧＤ前処理済みミクログリアによる炎症性サイトカインＩＬ−６の分泌レベルは、正常酸素ミクログリアによる分泌レベルと比べて、半分だったことが分かった。【００６５】
それとは反対に、図４の（ｂ）に示すように、ＯＧＤ前処理済みミクログリアと正常酸素ミクログリアによる抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の分泌レベルには差はなかった。その一方、図４の（ｄ）および（ｅ）に示すように、ＯＧＤ前処理済みミクログリアによる炎症性サイトカイン、すなわちＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの分泌レベルは、正常酸素ミクログリアによる分泌レベルと比べて３倍または４倍高かった。【００６６】
図４の（ｆ）に示すように、ＯＧＤ前処理済みミクログリアからの、Ｍ１ミクログリアとＭ２ミクログリアとの偏りを示している、ＴＮＦ−αに対するＴＧＦ−βの比率は、正常酸素ミクログリアからの比率よりも６倍高かった。このＴＮＦ−αに対するＴＧＦ−βの比率の増加は、ＯＧＤ前処理後のＭ２ミクログリアへの偏りを示している。つまり、これらの結果は、最適なＯＧＤの前処理が、ミクログリアを抗炎症Ｍ２サブタイプ優勢にしていくことを実証した。【００６７】
次に、ＯＧＤ前処理されたミクログリアの移植によるＶＥＧＦ、ＭＭＰ−９、およびＴＧＦ−βの発現について説明する。
ＯＧＤ前処理済みミクログリアの移植後の改善された結果が、脳実質におけるリモデリング因子（ＶＥＧＦ、ＭＭＰ−９、およびＴＧＦ−β）の上昇によって引き起こされたかどうかを確認するために、分析を行った。すなわち、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ−９およびＴＧＦ−βに対する抗体を用いて、脳虚血後２８日目の移植したラットの脳の免疫組織化学的分析を行った。ＶＥＧＦ、ＭＭＰ−９、およびＴＧＦ−βの発現が虚血前のラットの脳では検出できなかったが、それらの発現は、脳虚血後の２８日目（移植後２１日目）の虚血中心とペナンブラ内の境界領域で観察された。【００６８】
図５〜図７は、ＯＧＤ前処理済みのミクログリアの移植によって促進される、脳虚血後２８日目の種々のリモデリングを促進する因子の発現を示す図である。図５は、ＶＥＧＦの強度を示し、図６は、ＭＭＰ−９の強度を示し、図７は、ＴＧＦ−βの強度を示す。【００６９】
図５〜図７に示す免疫反応性の強度の分析は、これらのリモデリング因子の発現が、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植群では、無細胞対照群と比べて一層顕著であったことを実証した。【００７０】
なお、ＶＥＧＦ及びＭＭＰ−９の発現は、ミクログリアだけでなく、虚血性ラット内の周皮細胞、内皮細胞、および神経細胞にも観察された。また、ＴＧＦ−βの発現はミクログリアだけでなく、虚血ラット内の周皮細胞および神経細胞にも観測された。【００７１】
次に、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植は、脳虚血後２８日目の、虚血中心内の境界領域における血管新生と、虚血性ペナンブラにおける軸索伸展とを促進することを確認した。
まず、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植による血管新生の促進について説明する。【００７２】
本発明者らは、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植によるＶＥＧＦ、ＭＭＰ−９、およびＴＧＦ−βの発現は、血管新生を促進するものと推測した。そこで、本発明者らは、脳虚血後の２８日目に、血管新生マーカー抗ＣＤ３１抗体を用いた大脳皮質の免疫蛍光染色によって、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植の血管新生に対する効果を調べた。【００７３】
図８は、単位体積あたりのＣＤ３１免疫反応性を表す図である。具体的には、そのＣＤ３１免疫反応性は、虚血後２８日目における無細胞対照群とＯＧＤ前処理済みミクログリア移植群とのそれぞれの虚血中心の１μｍ３あたりの体積（μｍ３）として、つまり体積比率として表現される。【００７４】
共焦点顕微鏡による評価においては、図８に示すように、脳虚血後２８日目（移植後２１日目）において、ＯＧＤミクログリア移植群でのＣＤ３１の免疫反応性が、無細胞対照群でのＣＤ３１の免疫反応性よりも遥かに顕著であったことを明らかにした。このＣＤ３１の免疫反応性は、虚血中心を含む境界領域における単位体積当たりのＣＤ３１の免疫反応性である。なお、これらの群において、虚血性ペナンブラにおける単位体積当たりのＣＤ３１の免疫反応性に有意差はなかった。【００７５】
次に、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植による軸索伸展の促進について説明する。
本発明者らは、ニューロフィラメントのタンパク質マーカー抗ＳＭＩ３１抗体を用いた脳虚血後２８日目の虚血性皮質の免疫蛍光染色によって、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植の軸索伸展に対する効果を調べた。【００７６】
図９は、単位体積あたりのＳＭＩ３１の免疫反応性を表す図である。具体的には、そのＳＭＩ３１免疫反応性は、虚血後２８日目における無細胞対照群とＯＧＤ−ミクログリア移植群とのそれぞれの虚血ペナンブラの１μｍ３あたりの体積（μｍ３）として、つまり比率として表現される。
ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植群における虚血性ペナンブラでのＳＭＩ３１の発現は、無細胞対照群における発現よりも顕著であった。【００７７】
なお、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植群では、虚血性ペナンブラの他の軸索伸展マーカーＧＡＰ４３の発現が、無細胞対照群における発現よりも顕著であった。対照的に、これらの群において、虚血性ペナンブラにおけるＭＡＰ２の発現に有意差はなかった。【００７８】
ここで、本発明者らは、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植が軸索伸展を促進するメカニズムを決定するために、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）の発現を評価した。それが軸索伸展を阻害し、ＭＭＰ−９によって切断され、分解されるからである。【００７９】
つまり、本発明者らは、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植によって発現するＭＭＰ−９の増加がＣＳＰＧの発現の低下を引き起こして軸索伸展に至るという仮説を確認するために、抗ＣＳＰＧ／ＮＧ２抗体を用いた免疫蛍光染色を行った（ＮＧ２はＣＳＰＧの主成分である）。【００８０】
図１０は、大脳皮質からのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン／ニューロングリア抗原２（ＣＳＰＧ／ＮＧ２）の、偽手術群ラットにおける虚血後２８日目の相対強度を表す図である。その大脳皮質には、無細胞対照群の皮質と、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植群の皮質とがある。【００８１】
図１０に示すように、脳虚血後２８日目の移植したラットと偽手術群のラットにおけるＣＳＰＧ／ＮＧ２のレベルを比較した。共焦点顕微鏡による評価では、移植後２１日目（脳虚血後２８日目）において、ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植群の虚血性ペナンブラにおけるＣＳＰＧ／ＮＧ２の発現は、偽手術群および無細胞対照群における発現よりもはるかに低いことが明らかになった。
図１１は、脳虚血後のＯＧＤ前処理済みミクログリア移植のメカニズムを示す図である。【００８２】
ＯＧＤ前処理済みミクログリア移植は、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β、およびＭＭＰ−９を直接分泌する。これらの因子は、ＯＧＤ前処理済みミクログリアが分泌するリモデリング因子を介して、常在する細胞が分泌したパラクラインによる可能性がある。これらの因子は、虚血中心で血管新生を直接促す。なお、虚血中心は、ＭＡＰ２−免疫陰性部位として定義されるが、その中には不可逆的な血管新生陰性虚血中心と血管新生を認める血管新生陽性虚血中心とで構成される。【００８３】
ミクログリアからのＭＭＰ−９は、軸索伸展阻害因子であるＣＳＰＧ発現を低下させる。このため軸索伸展を誘導することが容易となる。また、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β、およびＭＭＰ−９は、軸索伸展を直接誘導する可能性がある。【００８４】
単球は脳血管からＢＢＢを通過して脳実質に移行し、ミクログリアに分化する。単球は末梢血から容易に採取することができるので、ミクログリアよりも低侵襲性に入手することができる。そこで、単球を含む末梢血単核球（ＰＭＮＣ）画分をＯＧＤ処理することにより、ミクログリアと同様の効果が得られるかを、ラットＰＭＮＣ（１×１０６個）を移植した局所脳虚血ラットモデルにおける感覚運動評価により検証した。
結果を図１３に示す。ＯＧＤ刺激のないＰＭＮＣ投与群（ｎｏｒｍｏｘｉａ）では、細胞非投与群（ＰＢＳ  ｃｏｎｔｒｏｌ）と有意な差はなかったが、ＯＧＤ刺激ＰＭＮＣ投与群（ＯＧＤ）では、虚血処理後２８日目で有意に症状の改善を認めた。【００８５】
次に、移植するＰＭＮＣ数を変動させて、ＯＧＤ刺激の効果の細胞数依存性を調べた。
結果を図１４に示す。ＯＧＤ刺激ＰＭＮＣ投与群では、虚血処理後２８日目で、細胞数依存的に有意に症状の改善を認めた。【００８６】
次に、ＯＧＤ刺激ＰＭＮＣ移植による脳虚血病変部における血管新生及び神経軸索伸展を評価するために、該病変部及びその近傍の組織切片の免疫染色を行った。血管新生の評価には抗ＣＤ３１抗体を、また、軸索伸展の評価には抗ＳＭＩ３１抗体を、それぞれ一次抗体として使用した。
結果を図１５及び１６に示す。ＯＧＤ刺激１×１０６個ＰＭＮＣ投与群（ＯＧＤ−ＰＭＮＣ  １０＾６）では、ＯＧＤ刺激のないＰＭＮＣ投与群（ｎｏｒｍ）に比べて、有意に血管新生及び軸索伸展が促進されていた。【００８７】
次に、低酸素刺激のみ（ＯＤ）、低糖刺激のみ（ＧＤ）に対するＯＧＤ刺激の優位性について、ヒトＰＭＮＣを用いて、ＶＥＧＦの産生量・分泌量を指標として評価を行った。ヒトＰＭＮＣを１８時間ＯＤ、ＧＤ又はＯＧＤ刺激し、細胞中のＶＥＧＦ量及び培養上清中のＶＥＧＦ量（分泌量）をウェスタンブロットにより定量した。また、培養上清については、ＥＬＩＳＡによる定量も実施した。
結果を図１７に示す。ＯＤ刺激のみでも、細胞のＶＥＧＦ産生量は、ＯＧＤ刺激のないＰＭＮＣ投与群（ｎｏｒｍ）に比べて増加傾向にあったが、ＧＤ刺激のみの方がより高値であり、ＯＧＤ刺激によりさらに高値を示し、ＯＧＤ刺激のないＰＭＮＣ投与群（ｎｏｒｍ）に対して有意にＶＥＧＦ産生量が増大していた。一方、培地への分泌量は、ＯＤ刺激のみではコントロールに対して顕著な差は認められなかったのに対し、ＧＤ刺激のみでもコントロールに対して増加傾向が認められた。ＯＧＤ刺激によりさらにＶＥＧＦ分泌量は増大し、コントロールのみならず、ＯＤ刺激のみに対しても有意差を示した。【００８８】
次に、脳出血患者における血腫除去手術の際に摘出した血腫周辺の破壊された白質からミクログリアを単離し、該ミクログリアをＯＧＤ刺激した後、該患者に再移植することによる脳出血の治療プロトコルの一例を示す。
まず、神経内視鏡観察下で血腫を吸引除去した後、出血血管を同定し止血を行う。血腫腔を洗浄した後、破壊された白質を鉗子を用いて採取する。該白質の細胞を解離させた後、抗ＣＤ１１５抗体を用いたＭＡＣＳもしくはＦＡＣＳによりミクログリアを単離する。得られたミクログリアを１８時間ＯＧＤ刺激した後、１×１０６個のミクログリアをＰＢＳ中に懸濁し、患者に静脈内投与する。【００８９】
（まとめ）
以上のように、上記実施例では、ミクログリア又は単球を含む細胞群をＯＧＤ条件下で培養することによって、脳梗塞の治療、血管新生の促進、および軸索伸展の促進のための培養物を含む細胞製剤を製造することができた。また、ＯＧＤによって治療効果を高めることができた。【００９０】
ヒトＰＭＮＣを用いた実施例から明らかなように、ミクログリアや単球に血管新生及び／又は軸索伸展の促進能力を付与するためには、細胞群を虚血の状態に近づけるための刺激をその細胞群に与えればよく、そのためには、低酸素濃度および低糖濃度の何れか一方だけの条件下で細胞群を培養してもよいが、少なくとも低糖濃度の条件下で該細胞群を培養することが好ましく、ＯＧＤの条件下、つまり低酸素濃度および低糖濃度の条件下で細胞群を培養することがより好ましい。【００９１】
また、ラット及びヒトＰＭＮＣを用いた実施例から明らかなように、血管から脳実質に移行した単球がミクログリアになるため、ミクログリアの代わりに、または、ミクログリアと共に単球を含む細胞群をＯＧＤの条件下で培養してもよい。細胞群が単球を含む場合、その細胞群は、末梢血細胞又はその細胞分画、例えば、末梢血から採取した単核球を含む画分であってもよい。したがって、細胞製剤の製造のために、骨髄液を採取する必要がないため、脳梗塞の治療において患者の負担を軽減し安全性を高めることができる。また、上記特許文献１の場合には、間葉系幹細胞を採取するため、十分な数の細胞を得ることができず、その細胞を増殖する必要があり、培養時間が長くなってしまうだけでなく、細胞調整施設（ＣＰＣ）などの特殊な施設が必要となる。しかし、本発明では、末梢血から単球を容易に採取することができるため、増殖する必要がなく、培養時間を短くするとともに、ＣＰＣを持たない移植を実施する医療機関内で、移植細胞を調製することができる。【００９２】
また、上記実施例では、ＯＧＤにおいて、低酸素チャンバー内の酸素濃度を、１時間で１％未満に減少させ、４時間で０．１〜０．４％に減少させてそのまま維持することによって、ミクログリア及びＰＭＮＣに、脳虚血ラットモデルにおける脳機能回復に十分な血管新生及び軸索伸展促進活性を付与することができた。これは、培養雰囲気中の平均酸素濃度が１％乃至０．４％未満であれば、本発明の効果を奏するのに十分であることを意味する。同様に、上記実施例では、ＯＧＤにおいて、糖濃度を１．０ｇ／Ｌとすることによって、ミクログリア及びＰＭＮＣに上記活性を付与することができた。これは、本発明の効果を奏するためには、培地中の糖濃度が１．０ｇ／Ｌ以下であれば十分であることを意味する。【００９３】
また、上記実施例では、細胞群をＯＧＤの条件下で１８時間培養したが、その培養時間は一例であって、２４時間未満であればよい。これは、上述のとおり、Ｍ２ミクログリアが２４時間で最大に増加してその後、著しく低下し、さらに、２４時間で細胞死を引き起こしたからである。【００９４】
また、上記実施例によって製造された細胞製剤は、典型的には脳梗塞を治療するための細胞製剤であるが、この細胞製剤は、ミクログリア又は単球が虚血部位に到達し得る限り、脳梗塞だけでなく、いかなる虚血性疾患に対しても治療効果がある。例えば、心筋梗塞、肺梗塞または腎梗塞などに対しても治療効果がある。
また、本発明の一態様に係る細胞製剤の製造方法は、培養物の洗浄などを行ってもよい。
図１２は、細胞製剤の製造方法を示すフローチャートである。【００９５】
まず、ミクログリアおよび／または単球を含む細胞群を、低酸素濃度および／または低糖濃度の条件下で培養することにより培養物を生成する（ステップＳ１）。次に、その培養物を洗浄する（ステップＳ２）。具体的には、ＯＧＤによって死滅した顆粒球またはデブリを遠心力によって培養物から分離したうえでその培養物を洗浄する。次に、その培養物をバックに封入することにより細胞製剤を製造する（ステップＳ３）。【００９６】
また、本発明は、図１２のフローチャートによって製造された細胞製剤を患者に投与することにより、虚血性の疾患（例えば脳梗塞）を治療する治療方法であってもよい。この場合、図１２のステップＳ３では、例えば、４０ｍＬのバックに約１×１０８個の細胞をに封入する。そして、その細胞製剤を例えば３０分から１時間かけて静脈内に投与することによって移植を行う。なお、静脈内に限らず、動脈内または脳脊髄腔内などに細胞製剤を投与してもよい。また、腰椎穿刺投与、脳内投与、脳室内投与あるいは局所投与であってもよい。【００９７】
また、人の治療方法では、図１２に示すステップＳ１の前に、患者から末梢血を採取し、その末梢血から、単球を含む細胞群を分離する。つまり、その細胞群は、末梢血から採取した単球を含む画分である。あるいは、その細胞群は、末梢血から採取した単核球を含む画分である。そして、その細胞群をＯＧＤの条件下で培養することによって細胞製剤を製造し、その患者に投与する。この場合、患者である人の負担が極めて少なく、安全性が高いという効果がある。また、単球を増殖する必要が無く、薬剤の添加も必要ない。さらに、培養時間が短いため、発症早期からの治療が可能である。一方、発症から時間が経過していても治療効果が見込める。さらに、この治療は、低コストであり、静脈内投与でも効果がある。【００９８】
また、人以外の動物の治療方法では、図１２に示すステップＳ１の前に、例えば上記実施例の（初代細胞培養）に示すように、人以外の動物の脳からミクログリアを採取し、そのミクログリアを含む細胞群をＯＧＤの条件下で培養する。その培養によって細胞製剤を製造し、患者である人以外の動物に投与する。なお、本明細書において、単に患者と記載されている場合、その患者は人と、人以外の動物とを意味する。【００９９】
また、上記実施例によって製造される細胞製剤に含まれる培養物は、ＯＧＤの条件下で培養されたミクログリア及び／又は単球である。このように培養されたミクログリア又は単球は、出願時の技術常識を斟酌しても構造として特定できないか、少なくとも構造として特定することがおよそ現実的ではないため、添付の請求の範囲では、製造方法によりそのミクログリア又は単球を特定する場合がある。【０１００】
以上、本発明の一態様に係る細胞製剤、その細胞製剤の製造方法、および治療方法について、実施例に基づいて説明したが、本発明は、この実施例に限定されるものではない。本発明の趣旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を本実施例に施したものも、本発明に含まれてもよい。また、本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明の細胞製剤は、虚血性疾患の機能回復に顕著な効果があり、その疾患の薬剤として利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年8月24日(2018.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生の促進または軸索伸展の促進のための細胞製剤の製造方法であって、ミクログリアおよび／または単球を含む細胞群を、酸素濃度１％未満の低酸素濃度および糖濃度１．０ｇ／Ｌ以下の低糖濃度の条件下で、１２時間以上２４時間未満培養することにより、血管新生の促進および軸索伸展の促進能力を有するミクログリアおよび／または単球を生成することを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞製剤が脳血管障害、虚血性心疾患または外傷性脳脊髄神経障害の治療用である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単球を含む細胞群は、末梢血細胞又はその細胞分画である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記単球を含む細胞群は、末梢血から採取した単核球を含む画分である、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
低酸素濃度は、０．１〜０．４％の酸素濃度である、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
前記培養時間が約１８時間である、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記培養物を洗浄した後、容器に封入することをさらに含む、請求項１〜５及び７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
脳血管障害、虚血性心疾患または外傷性脳脊髄神経障害の治療に十分な血管新生の促進および軸索伸展の促進能力を有するミクログリアおよび／または単球を含む、脳血管障害、虚血性心疾患または外傷性脳脊髄神経障害の治療のための細胞製剤。
【請求項１０】
請求項１〜５、７及び８の何れか１項に記載の方法により生成された培養物を含む、請求項９に記載の細胞製剤。
【請求項１１】
請求項１〜５、７及び８の何れか１項に記載の方法により生成された培養物を含む、血管新生の促進および軸索伸展の促進のための細胞製剤。
【請求項１２】
ミクログリアおよび／または単球を含む細胞群を、酸素濃度１％未満の低酸素濃度および糖濃度１．０ｇ／Ｌ以下の低糖濃度の条件下で、１２時間以上２４時間未満培養することにより生成された、治療上有効量のミクログリアおよび／または単球を含む培養物を、対象に投与することを含む、脳血管障害、虚血性心疾患または外傷性脳脊髄神経障害の治療方法。
【請求項１３】
脳血管障害、虚血性心疾患または外傷性脳脊髄神経障害の治療における使用のための、酸素濃度１％未満の低酸素濃度および糖濃度１．０ｇ／Ｌ以下の低糖濃度の条件下で、１２時間以上２４時間未満培養されたミクログリアおよび／または単球。
【請求項１４】
脳血管障害、虚血性心疾患または外傷性脳脊髄神経障害の治療のため細胞製剤の製造方法であって、単球を含む細胞群を、酸素濃度１％未満の低酸素濃度および糖濃度１．０ｇ／Ｌ以下の低糖濃度の条件下で、１２時間以上２４時間未満培養することにより、血管新生の促進および軸索伸展の促進能力を有する単球を生成することを含む、方法。
【請求項１５】
前記単球を含む細胞群は、末梢血細胞又はその細胞分画である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記単球を含む細胞群は、末梢血から採取した単核球を含む画分である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
低酸素濃度は、０．１〜０．４％の酸素濃度である、請求項１４〜１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記培養時間が約１８時間である、請求項１４〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養物を洗浄した後、容器に封入することをさらに含む、請求項１４〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
脳血管障害、虚血性心疾患または外傷性脳脊髄神経障害の治療に十分な血管新生の促進および軸索伸展の促進能力を有するは単球を含む、脳血管障害、虚血性心疾患または外傷性脳脊髄神経障害の治療のための細胞製剤。
【請求項２１】
請求項１４〜１８の何れか１項に記載の方法により生成された培養物を含む、請求項２０に記載の細胞製剤。
【請求項２２】
単球を含む細胞群を、酸素濃度１％未満の低酸素濃度および糖濃度１．０ｇ／Ｌ以下の低糖濃度の条件下で、１２時間以上２４時間未満培養することにより生成された、治療上有効量の単球を含む培養物を、対象に投与することを含む、脳血管障害、虚血性心疾患または外傷性脳脊髄神経障害の治療方法。
【国際調査報告】
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