(57)【要約】  本発明は、安全性の高い天然の食品添加物を用いて、呼吸器感染症の原因となる感染菌に対して新規な抗菌性組成物を提供するものであり、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有し、呼吸器感染症を引き起こす感染菌に対して抗菌性を有する抗菌性組成物。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有し、呼吸器感染症を引き起こす感染菌に対して抗菌性を有する抗菌性組成物。
【請求項２】
前記抗菌性が、ＭＲＳＡの増殖抑制作用、緑膿菌の増殖抑制作用、又は、非結核性抗酸菌の増殖抑制作用を含む請求項１記載の抗菌性組成物。
【請求項３】
前記抗菌性がＭＲＳＡの増殖抑制作用の場合、前記複合体の濃度が０．００１質量％以上である請求項２記載の抗菌性組成物。
【請求項４】
前記抗菌性が緑膿菌の増殖抑制作用の場合、前記複合体の濃度が０．０１質量％以上である請求項２記載の抗菌性組成物。
【請求項５】
耐熱性を有する、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項６】
耐性菌の発生抑制作用を有する、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の抗菌性組成物を含有する洗浄水。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、呼吸器感染症の原因となる感染菌に対して抗菌性を有する抗菌性組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＭＲＳＡ、緑膿菌又は肺ＭＡＣ（Mycobacterium avium complex）等の非結核性抗酸菌は、呼吸器感染症を引き起こす感染菌である。この感染症は、難治性化することから問題視されている。【０００３】
ここで、呼吸器感染症の予防・治療剤として、特許文献１に示すように、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）に属する乳酸菌を抗呼吸器感染症作用の有効成分として含有するものが考えられている。【０００４】
しかしながら、特許文献１は、インフルエンザウイルス（具体的には、マウス・インフルエンザウイルスＰＲ８［Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）］）に対する増殖抑制作用を示しているに過ぎず、ＭＲＳＡ、緑膿菌又は非結核性抗酸菌に対する増殖抑制作用については一切示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−２４１００９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一方で、本願発明者は、安全性の高い天然の食品添加物であるリゾチーム及びキトサンの複合体を用いて、各種菌に対する抗菌性の検討を行っている。その中で、本願発明者は、リゾチームとキトサンとが結合した複合体が、呼吸器感染症の原因となる感染菌に対して抗菌性を示すことを見い出した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち本発明に係る抗菌性組成物は、リゾチームとキトサンとを結合させた複合体を含有し、呼吸器感染症を引き起こす感染菌に対して抗菌性を有することを特徴とする。【０００８】
前記抗菌性には、ＭＲＳＡの増殖抑制作用、緑膿菌の増殖抑制作用、又は、非結核性抗酸菌の増殖抑制作用が含まれる。つまり、前記抗菌性組成物は、ＭＲＳＡ増殖抑制組成物、緑膿菌増殖抑制組成物又は非結核性抗酸菌増殖抑制組成物を含む。この抗菌性組成物の効果については、後述する。【０００９】
前記抗菌性がＭＲＳＡの増殖抑制作用の場合、前記複合体の濃度が０．００１質量％以上であることが望ましい。また、前記抗菌性が緑膿菌の増殖抑制作用の場合、前記複合体の濃度が０．０１質量％以上であることが望ましい。【００１０】
前記抗菌性組成物は、注射用水、生理食塩液、リンゲル液、精製水又は蒸留水等の液体と混ぜて洗浄水とすることが好ましい。このように洗浄水とすることで、ネブライザーに用いることができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、呼吸器感染症を引き起こす感染菌の増殖を抑える効果を奏する。したがって、本発明に依れば、呼吸器感染症の症状の改善、呼吸器感染症の治癒、感染の予防をすることができる。また、リゾチームは、安全性の高い天然の食品添加物として広く利用されており、このリゾチームとキトサンとの複合体を用いた抗菌性組成物は、利用する患者を安心させるとともに、その負担を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による希釈した培地におけるＭＲＳＡの増殖抑制効果を示す図である。
【図２】リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による希釈した培地における緑膿菌の増殖抑制効果を示す図である。
【図３】リゾチーム−キトサン複合体による濃度別の肺ＭＡＣの増殖抑制効果を示す図である。
【図４】リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による希釈した培地における肺ＭＡＣの増殖抑制効果を示す図である。
【図５】１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）をさらに添加した試験培地サンプルにおける、リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による肺ＭＡＣの増殖抑制効果を示す図である。
【図６】リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物の耐熱性評価試験の結果を示す図である。
【図７】リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による標準培地におけるＭＲＳＡの増殖抑制効果を示す図である。
【図８】リゾチーム−キトサン複合体による濃度別の標準培地におけるＭＲＳＡの発生コロニー数の対コントロール比率を示す図である。
【図９】リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による標準培地における緑膿菌（ＮＢＲＣ１３２７５）の増殖抑制効果を示す図である。
【図１０】リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による標準培地における緑膿菌（ＰＡＯ１）の増殖抑制効果を示す図である。
【図１１】リゾチーム−キトサン複合体による濃度別の標準培地における緑膿菌（ＮＢＲＣ１３２７５）の発生コロニー数の対コントロール比率を示す図である。
【図１２】リゾチーム−キトサン複合体に対するＭＲＳＡの耐性菌獲得プロトコールの結果を示す図である。
【図１３】走査電子顕微鏡により得られたＭＲＳＡの形態変化を示す画像である。
【図１４】透過電子顕微鏡により得られたＭＲＳＡの形態変化を示す画像である。
【図１５】透過電子顕微鏡により得られた緑膿菌の形態変化を示す画像である。
【図１６】リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物をそれぞれ添加した場合の走査電子顕微鏡により得られたＭＲＳＡの形態変化を示す画像である。
【図１７】リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物をそれぞれ添加した場合の走査電子顕微鏡により得られた緑膿菌の形態変化を示す画像である。
【図１８】リゾチーム−キトサン複合体を添加したＭＲＳＡに対してＤＮａｓｅ  Ｉ処理を行った場合の走査電子顕微鏡により得られたＭＲＳＡの形態変化を示す画像である。
【図１９】リゾチーム−キトサン複合体を添加したＭＲＳＡに対してＤＮａｓｅ  Ｉ処理を行った場合の走査電子顕微鏡により得られた緑膿菌の形態変化を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に本発明の一実施形態を詳述する。
【００１４】
本実施形態に係る抗菌性組成物は、リゾチームとキトサン（水溶性のものであり、分子量は２５０００Ｄａ以下である。）と結合させた複合体を含有するものである。なお、本実施形態では、分子量１４０００Ｄａのキトサンを用いている。
【００１５】
本実施形態のリゾチーム−キトサン複合体は、リゾチームとキトサンをメイラード反応により結合させることにより製造することができる。リゾチームとキトサンとをメイラード反応により結合させることで、リゾチーム中の抗原構造のほとんど又はすべてがマスクされるため、リゾチーム−キトサン複合体を摂取してもアレルギーを起こしにくい。
【００１６】
具体的な製造方法は次のとおりである。
リゾチーム／キトサンの質量比が、より好ましくは６０／４０〜４０／６０となる量のリゾチーム及びキトサンを、水に混合溶解し、水溶液中のリゾチーム及びキトサンの合計含量が５〜３０質量％となるように調製する。得られた水溶液を凍結乾燥することにより粉末化する。得られた粉末を温度５０〜８０℃、より好ましくは５５〜６５℃、相対湿度５０〜８０％、より好ましくは６０〜７０％の条件下で、２〜２０日、より好ましくは７〜１４日、メイラード反応させることにより本発明のリゾチーム−キトサン複合体を製造することができる。
【００１７】
本実施形態のリゾチーム−キトサン複合体の生成は、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）電気泳動により得られるプレートを、染色処理したものにより、蛋白質−キトサン複合体である高分子物質の生成を確認することができる。
【００１８】
次に、本実施形態の抗菌性組成物について説明する。
本実施形態の抗菌性組成物は、リゾチーム−キトサン複合体を、注射用水、生理食塩液、リンゲル液、精製水又は蒸留水等の液体と混ぜて構成されるものであり、その抗菌力をより保持させるために、リゾチーム−キトサン複合体を、好ましくは０．００１質量％以上含有するものである。なお、呼吸器感染症の治療にあたって、リゾチーム−キトサン複合体の濃度が濃すぎるとアレルギーの原因となる可能性がある。ここで、リゾチーム−キトサン複合体の濃度の上限値は、１．０質量％である。
【００１９】
例えば、抗菌性組成物をＭＲＳＡ増殖抑制組成物として用いる場合には、リゾチーム−キトサン複合体の濃度は０．００１質量％以上とすることが好ましい。また、抗菌性組成物を緑膿菌増殖抑制組成物として用いる場合には、リゾチーム−キトサン複合体の濃度は０．０１質量％以上とすることが好ましい。さらに、抗菌性組成物を非結核性抗酸菌増殖抑制組成物（肺ＭＡＣ増殖抑制組成物）として用いる場合には、リゾチーム−キトサン複合体の濃度は０．１質量％以上とすることが好ましい。
【００２０】
この抗菌性組成物は、ネブライザーに用いられる洗浄水とすることができる。これにより抗菌性組成物を感染部位に直接噴霧することで、感染菌の増殖を抑制することができる。
【００２１】
また、本実施形態の抗菌性組成物は、例えば、ＭＲＳＡ、緑膿菌又は肺ＭＡＣ（Mycobacterium avium complex）等の非結核性抗酸菌等の呼吸器感染症を引き起こす各種感染菌に対して増殖抑制作用を有する。
【実施例】
【００２２】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下の実施例において、リゾチーム−キトサン複合体をＬＹＺＯＸ（和興フィルタテクノロジー株式会社の登録商標）ともいう。【００２３】
［実施例１］
リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による希釈した培地におけるＭＲＳＡの増殖抑制効果【００２４】
本試験には、ＭＲＳＡ  ＩＩＤ１６７７を用い、この菌株を普通ブイヨン培地で３７℃、２０時間培養した。培養した菌液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）により回収し、滅菌水により懸濁した。そして、吸光度ＯＤ６００＝１．０となるように滅菌水で希釈した。これを２０００倍に希釈（１０６ＣＦＵ／ｍｌ相当）し、反応菌液とした。【００２５】
それぞれのＬＢ試験培地サンプルへ、１００μｌの反応菌液を添加し、３７℃の条件下で４８時間振とう培養した。ここで、それぞれのＬＢ試験培地サンプルは、１０ｍｌの１／２．５ＬＢ培地に、
（１）１０ｍｌの滅菌水、
（２）１０ｍｌの濃度０．００２％のリゾチーム−キトサン複合体（添加後の濃度０．００１％）、
（３）１０ｍｌの濃度０．００１％のリゾチーム単体（添加後の濃度０．０００５％）、
（４）１０ｍｌの濃度０．００１％のキトサン単体（添加後の濃度０．０００５％）、又は、
（５）１０ｍｌの濃度０．００１％のリゾチーム及びキトサンの混合物（添加後のそれぞれの濃度０．０００５％）、
を添加して作製したものである。【００２６】
そして、経時的（０、１、２ｄａｙｓ）に３ｍｌずつ抜き取り、吸収波長６００ｎｍにて吸光度を測定した。また必要に応じて、１００μｌ抜き取り、ＬＢ寒天培地へ播種し、発生コロニー数を観察した。【００２７】
実験の結果、図１に示すように、リゾチーム単体、リゾチーム及びキトサンの混合物では、４８時間のＭＲＳＡの増殖抑制効果が若干見られた。
一方で、リゾチーム−キトサン複合体の４８時間のＭＲＳＡの増殖抑制効果は、リゾチーム単体、リゾチーム及びキトサンの混合物に比べて、著しい改善効果が認められた。【００２８】
［実施例２］
リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による希釈した培地における緑膿菌の増殖抑制効果【００２９】
本試験には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＮＢＲＣ１３２７５を用い、この菌株を普通ブイヨン培地で３７℃、２０時間培養した。培養した菌液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）により回収し、滅菌水により懸濁した。そして、吸光度ＯＤ６００＝１．０となるように滅菌水で希釈した。これを２０００倍に希釈（１０６ＣＦＵ／ｍｌ相当）し、反応菌液とした。【００３０】
それぞれのＴＳＢ試験培地サンプルへ、１００μｌの反応菌液を添加し、３７℃の条件下で４８時間振とう培養した。ここで、それぞれのＴＳＢ試験培地サンプルは、１０ｍｌの１／２．５ＴＳＢ培地に、２００μｌの１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を添加し、さらに、
（１）１０ｍｌの滅菌水、
（２）１０ｍｌの濃度０．０２％（添加後の濃度０．０１％）のリゾチーム−キトサン複合体、
（３）１０ｍｌの濃度０．０１％（添加後の濃度０．００５％）のリゾチーム単体、
（４）１０ｍｌの濃度０．０１％（添加後の濃度０．００５％）のキトサン単体、又は、
（５）１０ｍｌの濃度０．０１％（添加後のそれぞれの濃度０．００５％）のリゾチーム及びキトサンの混合物、
を添加して作製したものである。【００３１】
そして、経時的（０、１、２ｄａｙｓ）に３ｍｌずつ抜き取り、吸収波長６００ｎｍにて吸光度を測定した。また必要に応じて、１００μｌ抜き取り、ＭＨ寒天培地へ播種し、発生コロニー数を観察した。【００３２】
実験の結果、図２に示すように、２４時間までは、リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム及びキトサンの混合物に緑膿菌の増殖抑制効果が見られた。
一方、２４時間を過ぎてから、リゾチーム−キトサン複合体による強い増殖抑制効果が見られた。【００３３】
［実施例３］
リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による希釈した培地における肺ＭＡＣの増殖抑制効果【００３４】
本試験には、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  Ｃｈｅｓｔｅｒ  ＪＣＭ１５４２９を用い、この菌株をＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９培地で３７℃、２週間培養した。培養した菌液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）により回収し、滅菌水により懸濁した。そして、吸光度ＯＤ６００＝１．０となるように滅菌水で希釈した。これを２０００倍に希釈（１０６ＣＦＵ／ｍｌ相当）し、反応菌液とした。【００３５】
それぞれのＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９試験培地サンプルへ、１００μｌの反応菌液を添加し、３７℃の条件下で静置培養した。ここで、それぞれのＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９試験培地サンプルは、１０ｍｌの１／２．５Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９培地に、
（１）１０ｍｌの滅菌水、
（２）１０ｍｌの濃度０．００２％のリゾチーム−キトサン複合体（添加後の濃度０．００１％）、
（３）１０ｍｌの濃度０．０２％のリゾチーム−キトサン複合体（添加後の濃度０．０１％）、
（４）１０ｍｌの濃度０．２％のリゾチーム−キトサン複合体（添加後の濃度０．１％）、
（５）１０ｍｌの濃度０．１％のリゾチーム単体（添加後の濃度０．０５％）、
（６）１０ｍｌの濃度０．１％のキトサン単体（添加後の濃度０．０５％）、又は、
（７）１０ｍｌの濃度０．１％のリゾチーム及びキトサンの混合物（添加後のそれぞれの濃度０．０５％）、
を添加して作製したものである。【００３６】
そして、経時的（０、５、７，１２ｄａｙｓ）に３ｍｌずつ抜き取り、吸収波長６００ｎｍにて吸光度を測定した。また必要に応じて、１００μｌ抜き取り、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０寒天培地へ播種し、発生コロニー数を観察した。【００３７】
実験の結果、図３に示すように、リゾチーム−キトサン複合体の濃度が大きくなるに連れて肺ＭＡＣの増殖抑制効果が増大することが認められた。
また、図４に示すように、リゾチーム−キトサン複合体は、キトサン単体、リゾチーム単体、リゾチーム及びキトサンの混合物に比べて、７日間に亘って、肺ＭＡＣの増殖抑制効果が著しいことが認められた。【００３８】
なお、図５は、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）をさらに添加したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９試験培地サンプルを用いた結果を示している。
この図５においても、リゾチーム−キトサン複合体は、キトサン単体、リゾチーム単体、リゾチーム及びキトサンの混合物に比べて、７日間に亘って、肺ＭＡＣの増殖抑制効果が著しいことが認められた。【００３９】
［実施例４］
リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による耐熱性評価【００４０】
本試験は、リゾチーム感受性の細菌であるミクロコッカスルテウス菌を用いた溶菌試験である。なお、溶菌活性はリゾチーム特有の活性である。リゾチームは熱に対して比較的安定なタンパク質であるが、一般的には８０℃で３０分加熱したリゾチームはこの活性がかなり低下することが知られている。本試験は、リゾチーム−キトサン複合体（リゾチームにキトサンオリゴ糖を結合させたもの）が、原料のリゾチームに耐熱性を付加するということを示すべく行った。【００４１】
本試験には、濃度５％のリゾチーム−キトサン複合体水溶液、濃度２．５％のリゾチーム水溶液、及び、濃度２．５％のリゾチーム及びキトサンの混合物水溶液を用いた。また、使用菌には、和光純薬製のミクロコッカスルテウス菌を用いた。【００４２】
まず試験前日にミクロコッカスルテウス菌を１ｇ秤とり、１００ｍｌの生理食塩水に加えて、４℃で一晩攪拌した。そして、試験当日に、ミクロコッカスルテウス菌について、波長６４０ｎｍで、ＯＤ＝１．００±０．０５となるように調整し、これを試験菌液とした。なお希釈には同じ生理食塩水を用いた。【００４３】
各溶液を調整し、２ｍｌずつ５ｍｌのチューブに入れて、乾燥炉にて８０℃、２時間の熱処理を実施した。なお、加熱処理しないものも同量作製した。この熱処理後、室温に戻した後に、３７℃の恒温槽にて３０分インキュベートした。【００４４】
前記試験菌液２８００μｌを吸光度計にセットし、検体添加直前のＯＤ（０−１）を記録した。その後、検体２００μｌを添加し、攪拌した。このときＯＤが上昇するため、一番高くなった値ＯＤ（０−２）を記録した。【００４５】
検体添加後からタイマーにて計測し、２、４、６、８、１０分経過時点のＯＤを記録した。試験はそれぞれ２回実施し、平均を算出した。【００４６】
（０−２）のＯＤを開始時のＯＤとして、それぞれの点におけるΔ吸光度（ΔＯＤ）を算出した。【００４７】
図６の（Ａ）〜（Ｃ）は、各溶液において、縦軸にΔ吸光度、横軸に時間をプロットしたものである。また、図６の（Ｄ）は、加熱の有無でのΔ吸光度を比較し、加熱処理後の溶液が、加熱処理無しの溶液に対してどの程度活性が残っているかを活性残存率（下記の式）として算出したものである。
活性残存率（％）＝「加熱処理有りのΔＯＤ（１０分）」／「加熱処理無しのΔＯＤ（１０分）」×１００【００４８】
図６の（Ｄ）から分かるように、リゾチーム溶液における加熱処理後の活性残存率が７３．３％であるのに対して、ＬＹＺＯＸ溶液における加熱処理後の活性残存率が９１．９％と加熱処理を施しても高い溶菌活性を有していることが分かる。したがって、リゾチームをキトサンと結合させることによって、リゾチーム単体に比べて、耐熱性を向上させることができる。【００４９】
［実施例５］
リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による標準培地におけるＭＲＳＡの増殖抑制効果【００５０】
本試験には、ＭＲＳＡ  ＩＩＤ１６７７を用い、この菌株を普通ブイヨン培地（栄研化学株式会社製、‘栄研’）２０ｍｌに植菌して３７℃で一夜振とう培養した。培養した菌液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）により回収し、滅菌水により懸濁した。そして、吸光度ＯＤ６００＝１．０となるように滅菌水で希釈した。これを２０００倍に希釈（１０６ＣＦＵ／ｍｌ相当）し、反応菌液とした。【００５１】
それぞれのＴＳＢ試験培地サンプルへ、１００μｌの反応菌液を添加し、３７℃の条件下で４８時間振とう培養した。ここで、それぞれのＴＳＢ試験培地サンプルは、１０ｍｌのＴＳＢ培地（ＢＤ  ＢＢＬＴＭ）に、２００μｌの１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を添加し、さらに、
（１）１０ｍｌの滅菌水、
（２）１０ｍｌの濃度０．４％のリゾチーム−キトサン複合体（添加後の濃度０．２％）、
（３）１０ｍｌの濃度０．２％のリゾチーム単体（添加後の濃度０．１％）、
（４）１０ｍｌの濃度０．２％のキトサン単体（添加後の濃度０．１％）、又は、
（５）１０ｍｌの濃度０．２％のリゾチーム及びキトサンの混合物（添加後のそれぞれの濃度０．１％）、
を添加して作製したものである。【００５２】
そして、１００μｌ抜き取り、ＭＨ寒天培地へ播種し、発生コロニー数を観察した（コロニーカウント法）。その結果を図７に示す。図７は、１０ｍｌの滅菌水を添加して作成したＴＳＢ試験培地サンプル（コントロール）の６時間後の発生コロニー数に対する各サンプルの６時間後の発生コロニー数の比率を示している。なお、図７の結果は、コロニーカウント法を３回行って得られた値の平均値である。【００５３】
実験の結果、図７から分かるように、リゾチーム単体ではＭＲＳＡの増殖抑制効果はほとんど見られないが、リゾチーム−キトサン複合体、キトサン単体、リゾチーム及びキトサンの混合物にＭＲＳＡの増殖抑制効果が見られた。特に、リゾチーム−キトサン複合体のＭＲＳＡの増殖抑制効果は、キトサン単体、リゾチーム及びキトサンの混合物に比べて、著しい改善効果が認められた。【００５４】
次に、ＴＳＢ試験培地サンプルにおけるリゾチーム−キトサン複合体の添加後の濃度を、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％とした場合それぞれの発生コロニー数を観察した。その結果を図８に示す。図８は、前記コントロールの発生コロニー数に対する各濃度の発生コロニー数の比率の変化を示している。なお、図８の結果は、複製した２つのサンプルによって得られた平均値である。【００５５】
実験の結果、図８から分かるように、何れの濃度であっても、９時間後には、十分な増殖抑制効果が見られる。また、濃度０．２％のリゾチーム−キトサン複合体では、６時間経過後にほぼ０％となっており、増殖抑制効果の即効性が示された。【００５６】
［実施例６］
リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物による標準培地における緑膿菌の増殖抑制効果【００５７】
本試験には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＮＢＲＣ１３２７５又はＰＡＯ１を用い、その他の処理は、前記［実施例５］と同様とした。【００５８】
ＮＢＲＣ１３２７５における結果を図９に示し、ＰＡＯ１における結果を図１０に示す。なお、図９の結果は、コロニーカウント法を３回行って得られた値の平均値であり、図１０の結果は、コロニーカウント法を５回行って得られた値の平均値である。【００５９】
図９から分かるように、リゾチーム−キトサン複合体のＮＢＲＣ１３２７５の増殖抑制効果は、リゾチーム単体、キトサン単体、リゾチーム及びキトサンの混合物に比べて、著しい改善効果が認められた。【００６０】
図１０から分かるように、リゾチーム−キトサン複合体のＰＡＯ１の増殖抑制効果は、リゾチーム単体、キトサン単体、リゾチーム及びキトサンの混合物に比べて、著しい改善効果が認められた。【００６１】
次に、ＴＳＢ試験培地サンプルにおけるリゾチーム−キトサン複合体の添加後の濃度を、０．０５％、０．１％、０．２％、０．５％とした場合それぞれの発生コロニー数を観察した。その結果を図１１に示す。図１は、前記コントロールの発生コロニー数に対する各濃度の発生コロニー数の比率の変化を示している。なお、図１１の結果は、複製した３つのサンプルによって得られた平均値である。【００６２】
実験の結果、図１１から分かるように、濃度０．２％、０．５％のリゾチーム−キトサン複合体は、６時間後にほぼ０％となっており、十分な増殖抑制効果が見られる。【００６３】
［実施例７］
リゾチーム−キトサン複合体に対するＭＲＳＡの耐性菌の不発生効果【００６４】
本試験には、ＭＲＳＡ  ＩＩＤ１６７７を用い、日本化学療法学会の提唱する微量液体希釈法を用いた耐性菌獲得プロトコールを実施した。その結果を図１２に示す。【００６５】
図１２から分かるように、リゾチーム−キトサン複合体により継代培養（２５代）しても、ＭＩＣ（最小発育阻止濃度）には、ほとんど変化が無かった。【００６６】
一方、「青木、柏木“メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）院内感染における医療従事者鼻腔保有株の意義に関する検討”感染症学雑誌  第６４巻」のＦｉｇ．３に記載されている通り、ＭＲＳＡの抗菌薬として知られているゲンタマイシンでは、３代目で耐性菌の発生が確認され、ミノマイシンでは、６代目で耐性菌の発生が確認されていることが報告されている。【００６７】
［実施例８］
リゾチーム−キトサン複合体によるＭＲＳＡの形態変化の観察【００６８】
まず、ＭＲＳＡの形態変化を走査電子顕微鏡を用いて観察した。この走査電子顕微鏡による観察は、導電処理としてオスミウムコーティング（４ｎｍ）を行い、低加速超高分解能走査電子顕微鏡（株式会社日立ハイテクノロジーズ製ＳＵ９０００（加速電圧１ｋＶ））を用いて行った。また、試料は、ＭＲＳＡに生理食塩水を添加したもの、ＭＲＳＡに濃度０．２質量％のリゾチーム−キトサン複合体を添加したものである。【００６９】
走査電子顕微鏡により得られた画像を図１３に示す。図１３に示される通り、生理食塩水を添加したものではＭＲＳＡに形態変化が生じていないが、リゾチーム−キトサン複合体を添加したものでは、ＭＲＳＡの外表面に繊維状の付着物が出現していることがわかる。【００７０】
次に、ＭＲＳＡの形態変化を透過電子顕微鏡を用いて観察した。この透過電子顕微鏡による観察は、前処理としてダイヤモンドナイフにて５０ｎｍに薄切りし、酢酸ウラン、クエン酸鉛により染色し、透過電子顕微鏡（日本電子株式会社製ＪＥＭ−１４００）を用いて行った。また、試料は、ＭＲＳＡに生理食塩水を添加したもの、ＭＲＳＡに濃度０．２質量％のリゾチーム−キトサン複合体を添加したものである。【００７１】
透過電子顕微鏡により得られた画像を図１４に示す。図１４に示される通り、生理食塩水を添加したものではＭＲＳＡに形態変化が生じていないが、リゾチーム−キトサン複合体を添加したものでは、ＭＲＳＡの内部の繊維状構造（ＤＮＡ）が消失していることがわかる。【００７２】
これらの画像から、リゾチーム−キトサン複合体は、ＭＲＳＡの細胞壁に複合的に作用してＭＲＳＡを破壊すると考えられる。１つは、リゾチーム活性によるペプチドグリカン層の加水分解やキトサンの細胞壁への沈着による抗菌作用であり、もう１つは、リゾチームーキトサンのハイブリッドによる界面活性作用である。リゾチーム−キトサン複合体により穴をあけられた細菌体内より染色体ＤＮＡが引き出されて、細菌体外で沈着を引き起こすと考えられる。これによって、ＭＲＳＡは増殖ができなくなると同時に、遺伝子損失による耐性菌獲得の機会も奪われると考えられる。【００７３】
なお、緑膿菌にリゾチーム−キトサン複合体を添加した場合の形態変化についても、上記と同様に、透過電子顕微鏡を用いた観察した。その結果を図１５に示す。図１５から分かるように、緑膿菌にリゾチーム−キトサン複合体を添加することで、緑膿菌の細胞壁が破壊されていることが分かる。つまり、リゾチーム−キトサン複合体は、緑膿菌に対しても耐性菌の不活性効果を有することが分かる。【００７４】
［実施例９］
リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物によるＭＲＳＡ及び緑膿菌の形態変化の観察【００７５】
リゾチーム−キトサン複合体、リゾチーム単体、キトサン単体、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物それぞれで処理（処理時間：２時間）したＭＲＳＡ及び緑膿菌の形態変化を、走査電子顕微鏡を用いて観察した。この走査電子顕微鏡による観察は、上記の実施例８と同様に、導電処理としてオスミウムコーティング（４ｎｍ）を行い、低加速超高分解能走査電子顕微鏡（株式会社日立ハイテクノロジーズ製ＳＵ９０００（加速電圧１ｋＶ））を用いて行った。また、各試料は、ＭＲＳＡ又は緑膿菌に、生理食塩水、濃度０．１質量％のリゾチーム−キトサン複合体、０．０５質量％のリゾチーム、０．０５質量％のキトサン、それぞれ０．０５質量％のリゾチーム及びキトサンの混合物を添加したものである。【００７６】
走査電子顕微鏡により得られたＭＲＳＡの画像を図１６に、緑膿菌の画像を図１７に示す。図１６に示す通り、生理食塩水を添加したものだけでなく、リゾチーム単体を添加したもの、キトサン単体を添加したもの、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物を添加したものでは、ＭＲＳＡがその形態を維持しており、目立った形態変化は見られなかった。一方で、リゾチーム−キトサン複合体を添加したものでは、ＭＲＳＡの形態が変化して、それらの外部に繊維状の付着物が塊となって出現していることがわかる。【００７７】
同様に、図１７に示す通り、生理食塩水を添加したものだけでなく、リゾチーム単体を添加したものでは、緑膿菌がその形態を維持しており、目立った形態変化は見られなかった。また、キトサン単体を添加したもの、及び、リゾチーム及びキトサンの混合物を添加したものでは、緑膿菌に若干の形態変化が見られたものの、大部分の緑膿菌がその形態を維持している。一方、リゾチーム−キトサン複合体を添加したものでは、緑膿菌の形態が大きく変化して、それらの外部に繊維状の付着物が塊となって出現していることがわかる。【００７８】
また、ＭＲＳＡにリゾチーム−キトサン複合体を添加したもの、及び、緑膿菌にリゾチーム−キトサン複合体を添加したものに対して、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理を行った。【００７９】
図１８は、ＭＲＳＡにリゾチーム−キトサン複合体を添加したものに対して、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理を行った場合と、行わなかった場合とにおいて、走査電子顕微鏡により得られたＭＲＳＡの画像である。また、図１９は、緑膿菌にリゾチーム−キトサン複合体を添加したものに対して、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理を行った場合と、行わなかった場合とにおいて、走査電子顕微鏡により得られた緑膿菌の画像である。【００８０】
図１８及び図１９の何れにおいても、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理を行った場合には、ＭＲＳＡ及び緑膿菌の外部に出現していた繊維状の付着物が消失している。つまり、ＭＲＳＡ及び緑膿菌の外部に出現した繊維状の付着物は、遺伝子（ＤＮＡ）であることが分かった。このように、ＭＲＳＡ及び緑膿菌にリゾチーム−キトサン複合体を添加することによって、それらの遺伝子が外部に放出されることによって、ＭＲＳＡ及び緑膿菌は増殖ができなくなると同時に、遺伝子損失による耐性菌獲得の機会も奪われると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明によれば、安全性の高い天然の食品添加物を用いて、呼吸器感染症の原因となる感染菌に対して新規な抗菌性組成物を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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