(57)【要約】  酵素法による全血試料のＨｂＡ１ｃ測定における共存物質の影響を回避する方法の提供。酵素法による試料中のヘモグロビン濃度に対するヘモグロビンＡ１ｃ濃度の比率の測定方法であって、ヘモグロビン濃度を光学的に測定する第一工程と、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度を光学的に測定する第二工程を有し、該第二工程で測定したヘモグロビンＡ１ｃ濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してＨｂＡ１ｃ％を算出する際に、第１の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、第２の波長で測定した結果を用いて補正する、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素法による試料中のヘモグロビン濃度に対するヘモグロビンＡ１ｃ濃度の比率の測定方法であって、
ヘモグロビン濃度を光学的に測定する第一工程と、
ヘモグロビンＡ１ｃ濃度を光学的に測定する第二工程を有し、
該第二工程で測定したヘモグロビンＡ１ｃ濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してＨｂＡ１ｃ％を算出する際に、第１の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、以下を満たす第２の波長で測定した結果を用いて補正する、
４８０ｎｍより長波長であり、
１００μｍｏｌ／Ｌヘモグロビン生理食塩水液の４８０ｎｍにおける吸光度に対して１／１０以下の吸光度を与える波長であり、
脂肪粒子濃度と吸光度の間に相関関係がある波長である、
方法。
【請求項２】
酵素法による試料中のヘモグロビン濃度に対するヘモグロビンＡ１ｃ濃度の比率の測定方法であって、
前記ヘモグロビン濃度を光学的に測定する第一工程と、
前記ヘモグロビンＡ１ｃ濃度を光学的に測定する第二工程を有し、
該第二工程で測定したヘモグロビンＡ１ｃ濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してＨｂＡ１ｃ％を算出する際に、４５０ｎｍ〜６１０ｎｍから選択された第１の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、６９０ｎｍ〜９００ｎｍから選択された第２の波長で測定した結果を用いて補正する、
方法。
【請求項３】
酵素法による試料中のヘモグロビン濃度に対するヘモグロビンＡ１ｃ濃度の比率を測定する方法であって、
前記ヘモグロビン濃度は第一工程で光学的に測定され、
前記ヘモグロビンＡ１ｃ濃度は第二工程で光学的に測定され、
該第二工程で測定したヘモグロビンＡ１ｃ濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してＨｂＡ１ｃ％を算出する際に、４５０ｎｍ〜６１０ｎｍから選択された第１の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、６９０ｎｍ〜９００ｎｍから選択された第２の波長で測定した脂質粒子の濃度情報及びヘモグロビンの濃度情報を用いて補正する、
方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨｂＡ１ｃの測定法に関する。詳細には、自動分析装置を用いたＨｂＡ１ｃ測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）は、ＨｂＡ１ｃのβ鎖Ｎ末端が糖化されたものであって、ヘモグロビンの大部分を占めるＨｂＡ０の糖化産物である。ＨｂＡ１ｃのヘモグロビン全体量に対する存在比率は、被験個体における採血時点から過去１〜２ケ月の平均的な血糖値を反映するため、糖尿病の血糖コントロール状態の指標として、臨床における診断、治療法選択に広く利用されている。【０００３】
ＨｂＡ１ｃの存在比率は、ＮＧＳＰ％では、ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）に対するヘモグロビンＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）の比率（％）として、ＩＦＣＣ値では、ヘモグロビン１ｍｏｌに対するヘモグロビンＡ１ｃ（ｍｍｏｌ）の比率（ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）として、算出される。以下、本明細書において、算出されたＨｂＡ１ｃ存在比率を、総称してＨｂＡ１ｃ％ということがある。ＨｂＡ１ｃ％を算出するためのＨｂＡ１ｃの測定方法として、ＨＰＬＣ法、免疫凝集法、電気泳動法、酵素法が報告されている。これらのうち酵素法は、近年実用化された方法で、臨床検査の分野において繁用される自動分析装置に適用可能であり、かつ同じく自動分析装置への適用が可能な免疫凝集法と比較して、試薬による自動分析装置（特に反応セル）の汚染が少ないという利点を有している。【０００４】
ＨｂＡ１ｃ％を測定するための試料として、全血より分離した血球を使用する場合と全血を使用する場合があるが、酵素法については、全血を試料とした場合の報告はあるものの、未だ技術蓄積が十分ではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，５０（１）、１６６−１７４（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、酵素法において全血を試料とした場合について検討を行っていたところ、試料中の共存物質の影響を強く受け、誤差を生じる場合があることを経験した。本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、全血を試料とする酵素法によるＨｂＡ１ｃ％の測定における共存物質の影響を回避する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態において、本発明は、酵素法による試料中のヘモグロビン濃度に対するヘモグロビンＡ１ｃ濃度の比率（ＨｂＡ１ｃ％）の測定方法であって、
ヘモグロビン濃度を光学的に測定する第一工程と、
ヘモグロビンＡ１ｃ濃度を光学的に測定する第二工程を有し、
該第二工程で測定したヘモグロビンＡ１ｃ濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してＨｂＡ１ｃ％を算出する際に、第１の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、以下を満たす第２の波長で測定した結果を用いて補正する、
４８０ｎｍより長波長であり、
１００μｍｏｌ／Ｌヘモグロビン生理食塩水液の４８０ｎｍにおける吸光度に対して１／１０以下の吸光度を与える波長であり、
脂肪粒子濃度と吸光度の間に相関関係がある波長である、
方法を提供する。【０００８】
一実施形態において、本発明は、酵素法による試料中のヘモグロビン濃度に対するヘモグロビンＡ１ｃ濃度の比率（ＨｂＡ１ｃ％）の測定方法であって、
ヘモグロビン濃度を光学的に測定する第一工程と、
ヘモグロビンＡ１ｃ濃度を光学的に測定する第二工程を有し、
該第二工程で測定したヘモグロビンＡ１ｃ濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してＨｂＡ１ｃ％を算出する際に、４５０ｎｍ〜６１０ｎｍから選択された第１の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、６９０ｎｍ〜９００ｎｍから選択された第２の波長で測定した結果を用いて補正する、
方法を提供する。【０００９】
一実施形態において、本発明は、酵素法による試料中のヘモグロビン濃度に対するヘモグロビンＡ１ｃ濃度の比率（ＨｂＡ１ｃ％）を測定する方法であって、
ヘモグロビン濃度は第一工程で光学的に測定され、
ヘモグロビンＡ１ｃ濃度は第二工程で光学的に測定され、
該第二工程で測定したヘモグロビンＡ１ｃ濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してＨｂＡ１ｃ％を算出する際に、４５０ｎｍ〜６１０ｎｍから選択された第１の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、６９０ｎｍ〜９００ｎｍから選択された第２の波長で測定した脂質粒子の濃度情報及びヘモグロビンの濃度情報を用いて補正する、
方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、自動分析装置を用いた全血試料のＨｂＡ１ｃ測定法における、試料由来色素（例えば、乳びによる濁り）に起因する誤差の補正が可能になる。また本発明によれば、全血を試料として酵素法によりＨｂＡ１ｃ％を測定する際、試薬の組成を変更することなく、自動分析装置側で試料中の共存物質の影響を回避することができる。本発明によれば、全血を試料として酵素法によりＨｂＡ１ｃ％を測定する際、特殊検体（例えば乳び検体）であっても正確なＨｂＡ１ｃ％の測定を容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】イントラリピッドを含む試料を酵素法により測定した場合のヘモグロビン濃度測定における反応タイムコース（左図）とヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定における反応タイムコース（右図）を示す図である。
【図２】イントラリピッドを含む試料の４００ｎｍ〜９００ｎｍにおける吸収スペクトルを示す図である。左図は４００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の測定結果であり、右図は６５０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲について、拡大した図である。
【図３】第２の波長（８８４ｎｍ）におけるイントラリピッドの吸光度と偽高値化分ヘモグロビン濃度との関係を示す図である。
【図４】試料のヘモグロビン濃度と実施例２で測定されたＨｂＡ１ｃ％との関係を示す図である。左図のＸ軸はヘモグロビン濃度、Ｙ軸はＨｂＡ１ｃ％（Ｙ軸）であり、右図のＸ軸はヘモグロビン濃度、Ｙ軸は、補正前のＨｂＡ１ｃに対する補正後のＨｂＡ１ｃ％のバイアス（補正後−補正前）である。
【図５】第２の波長（８８４ｎｍ）におけるヘモグロビン濃度と吸光度変化との関係を示す図である。
【図６】実検体を用いた本発明の方法によるＨｂＡ１ｃ％測定値について、ヘモグロビン濃度補正なしの場合と補正ありの場合との関係を示す図である。左図のＸ軸は補正前のＨｂＡ１ｃ％、Ｙ軸は補正後のＨｂＡ１ｃ％であり、右図のＸ軸は、補正後のＨｂＡ１ｃ％、Ｙ軸は、補正なしのＨｂＡ１ｃ％に対する補正ありのＨｂＡ１ｃ％のバイアス（補正有り−補正なし）である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
自動分析装置を用いた酵素法によるＨｂＡ１ｃ％の測定方法は、大きく、ヘモグロビンを光学的に測定する第一工程、ＨｂＡ１ｃを光学的に測定する第二工程、第二工程の測定値を第一工程の測定値で除する演算工程よりなる。この測定方法を全血試料で実施した場合、血液中の乳び等の共存物質の影響による測定誤差を生じ得る。本発明者は、当該測定誤差を補正することができるＨｂＡ１ｃ％の測定方法を提供する。
【００１３】
以下、本発明の好ましい実施形態を例示して、本発明を説明する。
【００１４】
［実施形態１］
酵素法による試料中のヘモグロビン濃度に対するヘモグロビンＡ１ｃ濃度の比率（ＨｂＡ１ｃ％）の測定方法であって、
ヘモグロビン濃度を光学的に測定する第一工程と、
ヘモグロビンＡ１ｃ濃度を光学的に測定する第二工程を有し、
該第二工程で測定したヘモグロビンＡ１ｃ濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してＨｂＡ１ｃ％を算出する際に、第１の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、以下を満たす第２の波長で測定した結果を用いて補正する、
４８０ｎｍより長波長であり、
１００μｍｏｌ／Ｌヘモグロビン生理食塩水液の４８０ｎｍにおける吸光度に対して１／１０以下の吸光度を与える波長であり、
脂肪粒子濃度と吸光度の間に相関関係がある波長である、
方法。
【００１５】
［実施形態２］
酵素法による試料中のヘモグロビン濃度に対するヘモグロビンＡ１ｃ濃度の比率（ＨｂＡ１ｃ％）の測定方法であって、
ヘモグロビン濃度を光学的に測定する第一工程と、
ヘモグロビンＡ１ｃ濃度を光学的に測定する第二工程を有し、
該第二工程で測定したヘモグロビンＡ１ｃ濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してＨｂＡ１ｃ％を算出する際に、４５０ｎｍ〜６１０ｎｍから選択された第１の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、６９０ｎｍ〜９００ｎｍから選択された第２の波長で測定した結果を用いて補正する、
方法。
【００１６】
［実施形態３］
酵素法による試料中のヘモグロビン濃度に対するヘモグロビンＡ１ｃ濃度の比率（ＨｂＡ１ｃ％）を測定する方法であって、
ヘモグロビン濃度は第一工程で光学的に測定され、
ヘモグロビンＡ１ｃ濃度は第二工程で光学的に測定され、
該第二工程で測定したヘモグロビンＡ１ｃ濃度を該第一工程で測定したヘモグロビン濃度で除してＨｂＡ１ｃ％を算出する際に、４５０ｎｍ〜６１０ｎｍから選択された第１の波長により測定した分母となるヘモグロビン濃度を、６９０ｎｍ〜９００ｎｍから選択された第２の波長で測定した脂質粒子の濃度情報及びヘモグロビンの濃度情報を用いて補正する、
方法。
【００１７】
本発明によるＨｂＡ１ｃ％の測定方法は、基本的には、試料中のヘモグロビン濃度を光学的に測定する第一工程と、該試料中のＨｂＡ１ｃ濃度を光学的に測定する第二工程と、該試料中のヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ濃度の比率（ＨｂＡ１ｃ％）を算出する工程を含む。該第一工程において、該試料の光学的測定は、第１の波長の光と第２の波長の光をそれぞれ用いて、吸光度を測定することにより行われる。該第１の波長で測定されたヘモグロビン濃度は、該第２の波長での測定値を用いて補正される。該補正されたヘモグロビン濃度が、該ＨｂＡ１ｃ％算出工程で用いられる。すなわち、該ＨｂＡ１ｃ％算出工程では、該第二工程で測定されたＨｂＡ１ｃ濃度を、該補正されたヘモグロビン濃度で除することにより、ＨｂＡ１ｃ％を算出する。本発明のＨｂＡ１ｃ％測定方法では、分母となるヘモグロビン濃度に該補正されたヘモグロビン濃度を用いることにより、試料中の乳び等の共存物質に起因する測定誤差を補正して、高精度にＨｂＡ１ｃ％が測定される。
【００１８】
自動分析装置の多くは、第一工程のヘモグロビン濃度の測定の際、試料中の共存物質（乳び等）の影響を回避するための機構を有していない。一方、本発明の方法を各種の自動分析装置に適用した場合、共存物質の影響を排除したＨｂＡ１ｃ％の測定方法を提供することができる。
【００１９】
本発明の方法で使用する「試料」又は「検体」としては、全血、全血より分離された赤血球、全血より分離され、さらに洗浄された赤血球等が挙げられる。本発明の方法は、血液中の共存物質（乳び等）の影響を回避できるので、試料として全血を問題なく使用することができる。
【００２０】
本明細書において「乳び検体」とは、含まれる脂肪粒子により乳白色を呈している検体（血清など）をいう。食事として摂取される脂肪の大部分は中性脂肪で、血中に吸収された後リポ蛋白リパーゼなどの酵素により分解され、脂肪酸などに代謝される。食後に時間をおかないで採血した場合は、脂肪があまり分解されず血液中に残っており、その脂肪分が白くみえるため、検体が白濁して見える。この白濁は、脂質代謝の異常を伴う個体から採取された検体では、食事の時期によらず顕著である。血液中の中性脂肪には、食事から吸収されて血液中に入ったもの（主にカイロミクロン）と肝臓で合成されたもの（主にＶＬＤＬ）がある。乳び検体の白濁の原因のほとんどは、食後一過性に増加するカイロミクロンである。
【００２１】
本明細書において「脂肪粒子」とは、臨床検査等の分野における通常の意味であればよいが、好ましくは上記の乳び検体に含まれる脂肪分により構成された粒子（例えばカイロミクロン又はＶＬＤＬ）をいう。あるいは、臨床で患者のエネルギー補給のために輸液に添加される脂肪乳剤（例えば、イントラリピッド、イントラリポス等）に含まれる大豆由来の脂質（レシチン等）も、本明細書における脂肪粒子に含まれ得る。
【００２２】
本発明の方法の第二工程におけるＨｂＡ１ｃ濃度の光学的測定は、基本的にはこれまで自動分析装置で行われてきた通常の方法に従って実施することができる。第二工程は、いわゆる発色剤を使用して行われるので、使用する発色剤により光学的測定における波長が定まる。第二工程は、ヘモグロビンの共存下で実施されるので、ヘモグロビンの吸収波長との重複が少ない４８０ｎｍより長波長側で行うことが好ましい。好適な波長を例示すると５５０ｎｍ〜７５０ｎｍの波長を挙げることができる。
【００２３】
本明細書において「ＨｂＡ１ｃ％」とは、臨床において通常使用される、試料中のヘモグロビンＡ１ｃ濃度とヘモグロビン濃度の比（％）を意味する。ＨｂＡ１ｃ％としては、ＮＧＳＰ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ）値として定められる値、ＩＦＣＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）値として定められる値、ＪＤＳ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｐｃｉｅｔｙ）値として定められる値等があり、特に断らない場合には、本明細書における「ＨｂＡ１ｃ％」とは、これらの値の総称を意味する（個々の値の相互関係については、非特許文献１を参照されたい）。本発明の方法におけるＨｂＡ１ｃ％の算出は、ＮＧＳＰ、ＩＦＣＣ、ＪＤＳ等の基準に従って行えばよい。
【００２４】
本発明が適用可能な酵素法は、特に限定されず、公知の方法を使用することができる。特異性の高い測定方法として好ましい酵素法の例としては、第一反応でＨｂＡ１ｃβ鎖Ｎ末端の糖化ジペプチドをプロテアーゼにより消化、切断すると同時に所定の波長によりヘモグロビン濃度を求め、第二反応で前記糖化ジペプチドに特異的な酸化酵素を作用させ、生成した過酸化水素をパーオキシダーゼの存在下に発色剤を発色させ、比色定量する方法が挙げられる。酵素法に基づくＨｂＡ１ｃ％の測定用試薬は、体外診断用医薬品として販売されており、これらを使用することができる。また本発明で用いられる酵素法には、既に報告されている酵素法における各種の修飾、改変も適宜に採用することができる。
【００２５】
ヘモグロビン濃度の測定にあたり、メト化など公知の方法によりヘモグロビンを一定の構造として吸光度を安定化させる処置を行ってもよい。また、ＨｂＡ１ｃ濃度の測定にあたり、プロテアーゼによる消化、切断の際に、界面活性剤等を共存させることにより、ＨｂＡ１ｃβ鎖より糖化ジペプチドが消化、切断されやすくする処置を行ってもよい。
【００２６】
本明細書において「第１の波長」とは、ヘモグロビンを測定するための波長を意味し、好ましくは、本発明の方法の第一工程におけるヘモグロビン濃度の光学的測定に使用する第１の光の波長である。当該第１の波長は、４５０ｎｍ〜６１０ｎｍの範囲より適宜に選択することができる。
【００２７】
本明細書において「第２の波長」とは、第１の波長で測定したみかけのヘモグロビン濃度を真のヘモグロビン濃度に補正するための波長を意味し、好ましくは、本発明の方法の第一工程での光学的測定に使用する第２の光の波長である。第２の波長は、６９０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲より適宜に選択することができる。別の観点から、第２の波長は、４８０ｎｍより長波長であり、１００μｍｏｌ／Ｌヘモグロビン生理食塩水液の４８０ｎｍにおける吸光度に対して１／１０以下の吸光度を与える波長であり、脂肪粒子濃度と吸光度の間に相関関係がある波長から選択することができる。本発明の方法において、第一工程での該第２の波長による測定は、該第１の波長による測定の後、先、又は並行して行うことができる。
【００２８】
本明細書において「第１の波長」、「第２の波長」の語における「波長」とは、ともに主波長のことをいい、バックグランド補正の目的等で測定する、いわゆる「副波長」を意味しない。
【００２９】
本明細書において「項目間演算」とは、それぞれ独立して測定されたヘモグロビンＡ１ｃの測定値とヘモグロビンの測定値を関連付けることをいい、自動分析装置の演算機能によって演算させることができる。
【００３０】
本発明の方法において、上記補正されたヘモグロビン濃度の算出は、該第一工程での第１及び第２の波長により測定値の取得からＨｂＡ１ｃ％算出までの間に行えばよい。例えば、該第一工程で第１及び第２の波長による測定値の取得後直ちに行ってもよく、第二工程と並行して行ってもよく、又はＨｂＡ１ｃ％算出の直前に行ってもよい。
【００３１】
本発明による、上記補正されたヘモグロビン濃度の算出の手順を説明する。該補正の手順は、基本的には乳び検体（脂肪粒子を含む検体）と同様の性状を与える脂肪乳剤又は測定系の性能評価用の妨害物質試薬を含む試料を用いた試験により説明あるいは構築することができる。脂肪乳剤としては、イントラリピッド、イントラリポスが挙げられ、測定系の性能評価用の試薬としては干渉チェックＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
ヘモグロビンを測定するための第１の波長による該試料の測定において、脂質粒子による吸収がヘモグロビンによる吸収に上乗せされ、試料全体の吸光度が上昇する。これにより、第１の波長で測定したヘモグロビン濃度は、真のヘモグロビン濃度に対して高値化（偽高値化）する。
【００３３】
第１の波長における吸光度より算出された、脂質粒子を含む試料のヘモグロビン濃度（みかけのヘモグロビン濃度）と脂質粒子を含まない試料のヘモグロビン濃度（真のヘモグロビン濃度）の差より、脂質粒子がヘモグロビンとして測りこまれた偽高値化分ヘモグロビン濃度（偽高値化分ヘモグロビン濃度：Ｘlipid）が求められる。Ｘlipidは、脂質粒子に起因する第１の波長によるヘモグロビン濃度測定値の上昇分である。
【００３４】
一方、異なる濃度の脂質粒子を含む複数の試料を第２の波長で測定して脂質粒子の濃度に依存した吸光度の変動を調べ、偽高値化分ヘモグロビン濃度（Ｘlipid）と第２の波長における脂質粒子の吸光度（Ｙlipid）との関係式（回帰式）［式Ａ］を求める。
［式Ａ］：Ｘlipid＝ａ1Ｙlipid−ｂ1（ａ1は傾き、ｂ1は切片である）
【００３５】
前記［式Ａ］を利用し、以下の［式Ｂ］により、みかけのヘモグロビン濃度が真のヘモグロビン濃度に補正される。
［式Ｂ］：補正されたヘモグロビン濃度＝みかけのヘモグロビン濃度−偽高値化分ヘモグロビン濃度＝みかけのヘモグロビン濃度−（ａ1Ｙlipid−ｂ1）
【００３６】
上記補正されたヘモグロビン濃度を使用し、ＮＧＳＰ％であれば、以下によりＨｂＡ１ｃ％を算出できる。
ＨｂＡ１ｃ％（ＮＧＳＰ％）＝ＨｂＡ１ｃ濃度／補正されたヘモグロビン濃度＊９１．５＋２．１５
【００３７】
本発明のＨｂＡ１ｃ％算出方法の別の態様を説明する。
【００３８】
第２の波長は、ヘモグロビンによる吸収がゼロである波長が最適であるが、感度の問題からヘモグロビンの濃度により吸収を実質的にゼロとできない場合がある。そのような場合には、以下により、第２の波長での測定値に与えるヘモグロビン濃度の影響を補正することができる。
【００３９】
試料のヘモグロビン濃度（ＸHb）と第２の波長による該試料の吸光度の変化分（ＹHb）との関係式（回帰式）［式Ｃ］を求める。
［式Ｃ］：ＹHb＝ａ2ＸHb−ｂ2（ａ2は傾き、ｂ2は切片である）
この関係式により、試料のヘモグロビン濃度に依存した第２の波長による吸光度の変化分が求められる。
【００４０】
前記［式Ｃ］を利用し、以下により第２の波長におけるヘモグロビン濃度の影響を排除した脂肪粒子濃度に由来する吸光度（補正された脂肪粒子の吸光度：Ｙlipid offset）が求められる。
［式Ｄ］：補正された脂肪粒子の吸光度Ｙlipid offset＝第２の波長による試料の吸光度−第２の波長におけるヘモグロビン濃度に依存した吸光度の変化分＝第２の波長における試料の吸光度−ＹHb
【００４１】
前記補正された脂肪粒子の吸光度Ｙlipid offsetを用いて、偽高値化分ヘモグロビン濃度Ｘlipidをさらに補正し、偽高値化分ヘモグロビン濃度２：Ｘlipid-2を算出する。
［式Ｅ］：偽高値化分ヘモグロビン濃度２：Ｘlipid-2＝補正された脂肪粒子の吸光度Ｙlipid offset ＊ａ1＝（第２の波長における試料の吸光度−ＸHb＊ａ2）＊ａ1
ここで［式Ａ］における切片ｂ1は、［式Ｅ］中の「−ＸHb＊ａ2＊ａ1」で表されるヘモグロビン濃度によって変動する数値であることが理解される。
【００４２】
上記偽高値化ヘモグロビン濃度２：Ｘlipid-2を用いて、補正されたヘモグロビン濃度をさらに補正し、補正されたヘモグロビン濃度２を算出する。
［式Ｆ］補正されたヘモグロビン濃度２＝みかけのヘモグロビン濃度−偽高値化分ヘモグロビン濃度２：Ｘlipid-2＝みかけのヘモグロビン濃度−（第２の波長における試料の吸光度−ＸHb＊ａ2）＊ａ1
【００４３】
上記補正されたヘモグロビン濃度２を使用し、ＮＧＳＰ％であれば、以下によりＨｂＡ１ｃ％を算出できる。
ＨｂＡ１ｃ％（ＮＧＳＰ％）＝ＨｂＡ１ｃ濃度／補正されたヘモグロビン濃度２＊９１．５＋２．１５
【００４４】
本発明は同一反応槽内でヘモグロビンとＨｂＡ１ｃを連続して測定する方法に好適に使用することができるが、第一工程と第二工程を別々の反応槽内で行ってもよい。例えば、１つの槽では第一工程だけを行ってヘモグロビンを測定し、これとは別の槽では第一工程の試薬を添加するがヘモグロビンは測定をせず、引き続いて第二工程を行ってＨｂＡ１ｃを測定する場合にも利用できることは、当業者であれば当然に理解する。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は、実施例により限定されるものではない。【００４６】
［参考例１］
脂肪乳剤のＨｂＡ１ｃ％に与える影響を確認した。【００４７】
１．材料
（１）試料：ＥＤＴＡ採血した全血をプールして使用した。以下、プール全血ということがある。
（２）測定試薬とキャリブレータ：
＜前処理液＞
１０ｍＭ  亜硝酸ナトリウム
＜プロテアーゼ含有基質試薬（Ｒ１）＞
以下の成分を含む５０ｍＭ  
リン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ７．０
１．５％  アンヒトール２０ＢＳ（花王社）
２．０  ｍｇ／ｍＬ  プロチンＰＣ１０Ｆ（大和化成工業社）
０．０１％  アジ化ナトリウム（キシダ化学社製）
５０μＭ  ＤＡ−６７（１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム、和光純薬工業社）
＜発色試薬（Ｒ２）＞
以下の成分を含む５０ｍＭ  
リン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ７．０
１０Ｕ／ｍＬ  フルクトシルペプチドオキシダーゼ（キッコーマン社）
１Ｕ／ｍＬ  パーオキシダーゼ（東洋紡社）
＜キャリブレータ＞
ノルディアＮＨｂＡ１ｃキャリブレータ（積水メディカル社）を使用した。
（３）脂肪乳剤：イントラリピッド（フレゼニウス カービ社）を使用した。【００４８】
２．操作
（１）試験試料の調製：プール全血に対して表１の終濃度になるようイントラリピッドを添加し、試験試料を調製した。
（２）試験試料の測定：自動分析装置ＪＣＡ−ＢＭ９１３０（日本電子社）を用い、以下の測定パラメータにより試験試料を測定し、ＨｂＡ１ｃ％を測定した。
また、各試験試料毎に、ヘモグロビン濃度測定、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定における反応タイムコースを確認した。【００４９】
パラメータ：
［ＨｂＡ１ｃ，Ｈｂ］
分析方法：ＥＰＡ
計算方法：ＭＳＴＤ
測定波長（副／主）：ＨｂＡ１ｃ  ８０５／６５８、Ｈｂ  ８０５／４７８
主ＤＥＴ．Ｐｌ−Ｐ．ｍ−Ｐ．ｎ：ＨｂＡ１ｃ  ０−９５−９８、Ｈｂ  ０−４４−４７
副ＤＥＴ．Ｐ．ｐ−Ｐ．ｒ：ＨｂＡ１ｃ  ４４−４７、Ｈｂ  ０−０
反応時間：１０分
血球測定時：
希釈検体量（全血量）：４．０μＬ
希釈液量（希釈液）：１１０μＬ
キャリブレータ測定時：
希釈検体量（キャリブレータ）：２５μＬ
希釈液量（希釈液）：１５μＬ
反応検体量（Ｓａｍｐｌｅ量）：６．４μＬ
第１試薬量（Ｒ１）：６０μＬ、第２試薬量：０μＬ、
第３試薬量（Ｒ２）：２０μＬ、第４試薬量：０μＬ【００５０】
３．結果
（１）各測定値の変動
試験試料中のイントラリピッドの濃度に依存したヘモグロビン濃度測定値の増加とＨｂＡ１ｃ％の低下が確認された。その一方、ＨｂＡ１ｃ濃度測定値は、ほぼ一定であった（以上、表１）。以上より、ＨｂＡ１ｃ％の低下は、ＨｂＡ１ｃ％算出の際の分母となるヘモグロビン濃度測定値の増加に起因すると考えられた。【００５１】
【表１】
2018030531.tif 000002
【００５２】
（２）反応タイムコースの確認
各試験試料毎のヘモグロビン濃度測定、ＨｂＡ１ｃ濃度測定における反応タイムコースを図１に示した。全ての試験試料について、ヘモグロビン濃度測定（図１左）及びＨｂＡ１ｃ濃度測定（図１右）における、イントラリピッドの濃度に依存した吸光度の増加が確認された。本参考例で使用した自動分析装置ＪＣＡ−ＢＭ９１３０のような一般的な自動分析装置によるヘモグロビン濃度測定では、検出された吸光度それ自体がヘモグロビン濃度の算出に用いられる。そのため、本試験では、イントラリピッドに由来する吸光度の増加がそのままヘモグロビンの吸光度に上乗せされた結果、表１のようにヘモグロビン濃度測定値が偽高値化したものと推定された。一方、本参考例で使用した自動分析装置によるＨｂＡ１ｃ濃度測定では、ＨｂＡ１ｃ濃度の算出に用いる吸光度として発色試薬添加直前の主波長や副波長での測定値による補正が行われた吸光度を用いるため、発色試薬の発色による吸光度の増加分のみがＨｂＡ１ｃ濃度の算出に用いられる。そのため本試験でのＨｂＡ１ｃ濃度測定では、ヘモグロビン濃度測定のような偽高値化が観察されなかったものと推定された。【００５３】
［参考例２］
試験試料の吸収スペクトル解析（図２）の結果、ヘモグロビン及び発色試薬の発色時における吸収が少なく、かつイントラリピッドの濃度と相関する吸収波長として約６９０ｎｍ〜約９００ｎｍの範囲の波長が見出された。この中から８８４ｎｍを選択し、表１で観察されたようなイントラリピッドに由来するヘモグロビン濃度の偽高値化との相関関係を確認した。【００５４】
１．操作
８８４ｎｍにおけるイントラリピッドの吸光度を（Ｘ）とし、表１のイントラリピッド各濃度の４７８ｎｍにおけるヘモグロビン濃度測定値と８８４ｎｍにおけるイントラリピッド無添加試験試料のヘモグロビン濃度測定値の差を偽高値化によるヘモグロビン濃度上昇分（偽高値化分ヘモグロビン濃度：Ｙ）とし、両者の相関係数（Ｒ２）及び回帰式（Ｙ＝ａＸ−ｂ）を求めた。【００５５】
２．結果
相関係数：Ｒ２＝０．９８３６で、回帰式：Ｙ＝１４２７．６Ｘ−４．７５１２［式Ａ１］が得られ、偽高値化分ヘモグロビン濃度がイントラリピッドに起因することが確認された（図３）。【００５６】
［実施例１］
８８４ｎｍでの測定により得られた偽高値化分ヘモグロビン濃度の回帰式を利用して、ヘモグロビン濃度の補正を検討した。【００５７】
１．操作
参考例２で得られた回帰式［式Ａ１］より［式Ｂ１］を導き、［式Ｂ１］により４７８ｎｍでのヘモグロビン濃度測定値（みかけのヘモグロビン濃度）の補正を行い、補正後のヘモグロビン濃度を用いてＨｂＡ１ｃ％を算出した。
［式Ｂ１］
補正後のヘモグロビン濃度
＝みかけのヘモグロビン濃度−偽高値化分ヘモグロビン濃度
＝みかけのヘモグロビン濃度−（８８４ｎｍでの吸光度＊１４００−５）
なお、１４００は回帰式の傾きを簡略化した数値であり、−５は切片を簡略化した数値である。
２．結果
［式Ｂ１］により求めた補正後のヘモグロビン濃度で算出したＨｂＡ１ｃ％はイントラリピッド無添加の値と近似し、イントラリピッドの濃度に依存した値の低下も観察されなかった（表２）。【００５８】
【表２】
2018030531.tif 000003
【００５９】
以上より、８８４ｎｍの吸光度より導かれる［式Ｂ１］を用いてヘモグロビン濃度を補正することにより、イントラリピッドによるヘモグロビン濃度の偽高値化を補正できることが確認された。【００６０】
［実施例２］
実施例１により、イントラリピッド添加によるヘモグロビン濃度の偽高値化を補正できることが確認されたが、イントラリピッド添加試料におけるＨｂＡ１ｃ％の若干の低値化が認められた。これは、８８４ｎｍにおけるヘモグロビンの吸収がゼロではないことが影響していると考えられたため、この影響を確認した。【００６１】
１．材料
（１）試料：パネル検体（洗浄血球）（積水メディカル社）３種類（レベル１、３、５）〔ＨｂＡ１ｃ値：５．０％（レベル１）；８．０％（レベル３）；１１．８％（レベル５）〕
（２）前処理液：参考例１に記載の前処理液を使用した。【００６２】
２．操作
各パネル検体を前処理液で７倍及び８０倍に希釈したヘモグロビン濃度調整液を調製し、両液を適宜に混合して、ＨｂＡ１ｃ％は一定でヘモグロビン濃度の異なる測定試料を各レベルについてそれぞれ１１種類調製した。希釈検体量（血球量）を２．０μＬとした以外は、参考例１と同様の手順を使用して測定試料のＨｂＡ１ｃ％を測定した。ヘモグロビン濃度の補正は、実施例１と同様に［式Ｂ１］により行った。【００６３】
３．結果
［式Ｂ１］による補正前と補正後でＨｂＡ１ｃ％が一致せず、ヘモグロビン濃度に依存して両者の差が拡大した（図４）。【００６４】
以上より、ヘモグロビン濃度に依存した８８４ｎｍでの吸光度の変動が存在することが確認された。【００６５】
［実施例３］
ヘモグロビン濃度に依存した８８４ｎｍでの吸光度の変動の補正を検討した。【００６６】
１．操作
実施例２で使用した８８４ｎｍで測定した各パネル検体のヘモグロビン濃度を（ｘ）、８８４ｎｍにおける該各パネル検体の吸光度の変化分を（ｙ）とし、両者の相関係数（Ｒ２）及び回帰式（ｙ＝ａｘ−ｂ）を求めた。
２．結果
相関係数：Ｒ２＝０．９８４４で、回帰式：ｙ＝３．８２＊１０−５ｘ−０［式Ｃ１］が得られた。８８４ｎｍにおいてヘモグロビン濃度に依存した吸光度変化が存在することが再度確認された（図５）。【００６７】
［実施例４］
ヘモグロビン濃度に依存した８８４ｎｍでの吸光度変化分を利用した、４７８ｎｍにおけるヘモグロビン濃度測定値の補正を検討した。【００６８】
１．操作
実施例３で得られた回帰式［式Ｃ１］により、ヘモグロビン濃度に依存した８８４ｎｍでの吸光度の変化分を求め、これを利用して８８４ｎｍにおけるイントラリポス（大塚製薬工場社）による正味のヘモグロビン濃度上昇分を求める［式Ｄ１］を導き、次いで、［式Ｄ１］を利用した計算式（［式Ｅ１］）により、偽高値化分ヘモグロビン濃度の補正値を算出した。これらを踏まえ、最終的に、補正ヘモグロビン濃度を求める［式Ｆ１］を導いた。【００６９】
２．結果
［式Ｃ１］
ヘモグロビン濃度に依存した８８４ｎｍでの吸光度の変化分＝ヘモグロビン濃度ｘ３．８２＊１０−５
［式Ｄ１］
８８４ｎｍにおけるイントラリポスによる正味の吸光度上昇分＝８８４ｎｍの吸光度−（［式Ｃ１］で得られる値）
［式Ｅ１］
偽高値化分ヘモグロビン濃度の補正値＝（［式Ｄ１］で得られる値）＊１４００
［式Ｆ１］
補正ヘモグロビン濃度
＝４７８ｎｍより算出されるヘモグロビン濃度−（［式Ｅ１］で得られる値）
＝１．０５５＊ヘモグロビン濃度−８８４ｎｍ吸光度＊１４００【００７０】
［実施例５］
［式Ｆ１］の妥当性を確認した。【００７１】
１．材料
（１）試料：プール全血を使用した。
（２）測定試薬とキャリブレータ：参考例１と同様の測定試薬、キャリブレータを使用した。
（３）脂肪乳剤類：イントラリピッド、イントラリポス（大塚製薬工場社）、干渉チェックＡプラス乳び（シスメックス）を使用した。【００７２】
２．操作
（１）試験試料の調製：プール全血に対して表３ａ〜３ｃの終濃度になるよう各脂肪乳剤類を添加し、試験試料を調製した。
（２）試験試料の測定：自動分析装置ＪＣＡ−ＢＭ９１３０（日本電子社）を用い、以下の測定パラメータにより試験試料を測定し、ＨｂＡ１ｃ％を測定した。【００７３】
パラメータ：
［ＨｂＡ１ｃ，Ｈｂ］
分析方法：ＥＰＡ
計算方法：ＭＳＴＤ
測定波長（副／主）：ＨｂＡ１ｃ  ８０５／６５８、Ｈｂ  ８０５／４７８
主ＤＥＴ．Ｐｌ−Ｐ．ｍ−Ｐ．ｎ：ＨｂＡ１ｃ  ０−９５−９８、Ｈｂ  ０−４４−４７
副ＤＥＴ．Ｐ．ｐ−Ｐ．ｒ：ＨｂＡ１ｃ  ４４−４７、Ｈｂ  ０−０
反応時間：１０分
血球測定時：
希釈検体量（血球量）：４．０μＬ
希釈液量（希釈液）：１１０μＬ
キャリブレータ測定時
希釈検体量（キャリブレータ）：２５μＬ
希釈液量（希釈液）：１５μＬ
反応検体量（Ｓａｍｐｌｅ量）：６．４μＬ
第１試薬量（Ｒ１）：６０μＬ、第２試薬量：０μＬ、
第３試薬量（Ｒ２）：２０μＬ、第４試薬量：０μＬ【００７４】
［８８４ｎｍ］
分析方法：ＥＰＡ
計算方法：ＡＢＳ
測定波長（副／主）：Ｈｂ  なし／８８４ｎｍ
ＦＶ＝１
主ＤＥＴ．Ｐｌ−Ｐ．ｍ−Ｐ．ｎ：Ｈｂ  ０−４４−４７
副ＤＥＴ．Ｐ．ｐ−Ｐ．ｒ：Ｈｂ  ０−０
反応時間：１０分
血球測定時：
希釈検体量（血球量）：４．０μＬ
希釈液量（希釈液）：１１０μＬ
キャリブレータ測定時
希釈検体量（キャリブレータ）：２５μＬ
希釈液量（希釈液）：１５μＬ
反応検体量（Ｓａｍｐｌｅ量）：６．４μＬ
第１試薬量（Ｒ１）：６０μＬ、第２試薬量：０μＬ、
第３試薬量（Ｒ２）：２０μＬ、第４試薬量：０μＬ
＊８８４ｎｍのキャリブレーションには生理食塩水を使用する。【００７５】
項目間演算
［補正Ｈｂ］
桁数：１  定性判定：しない
Ｘ：８８４ｎｍ  Ｙ：Ｈｂ
項目間演算式：１．０５５＊Ｙ−１４００＊Ｘ⇒［式Ｆ１］
［ＮＧＳＰ％］
桁数：２  定性判定：しない
Ｘ：ＨｂＡ１ｃ  Ｙ＝補正Ｈｂ
項目間演算式：Ｘ／Ｙ＊９１．５＋２．１５【００７６】
３．結果
各脂肪乳剤類添加の成績を表３ａ〜３ｃに示した。［式Ｆ１］を用いて補正を行った場合、脂肪乳剤類の種類によらず、ＨｂＡ１ｃ％の偽高値化を補正できることが確認された。【００７７】
【表３】
2018030531.tif 000004
【００７８】
［実施例６］
［式Ｆ１］が８８４ｎｍ波長の代わりに７５１ｎｍ波長を用いた場合、及びＮＧＳＰ％の代わりにＩＦＣＣに基づくＨｂＡ１ｃ％測定においても有効であることを確認した。【００７９】
１．材料
（１）試料：プール全血を使用した。
（２）測定試薬とキャリブレータ：参考例１と同様の測定試薬、キャリブレータを使用した。
（３）脂肪乳剤類：イントラリピッドを使用した。【００８０】
２．操作
（１）試験試料の調製：プール全血に対して表４ａ〜４ｂの終濃度になるよう各脂肪乳剤類を添加し、試験試料を調製した。
（２）試験試料の測定：自動分析装置ＪＣＡ−ＢＭ９１３０（日本電子社）を用い、実施例５の測定パラメータを一部変更して試験試料を測定し、ＨｂＡ１ｃ％を測定した。
なお、実施例５から変更したパラメータのみを以下に記載した。【００８１】
実施例５のパラメータ→変更後のパラメータ
［８８４ｎｍ］→［７５１ｎｍ］
測定波長（副／主）：Ｈｂ  なし／８８４ｎｍ→測定波長（副／主）：Ｈｂ  なし／７５１ｎｍ【００８２】
項目間演算１
［補正Ｈｂ］
桁数：１  定性判定：しない
Ｘ：７５１ｎｍ  Ｙ：Ｈｂ
項目間演算式：１．０５３＊Ｙ−８９６＊Ｘ⇒７５１ｎｍ用［式Ｆ１］
［ＮＧＳＰ％］
桁数：２  定性判定：しない
Ｘ：ＨｂＡ１ｃ  Ｙ＝補正Ｈｂ
項目間演算式：Ｘ／Ｙ＊９１．５＋２．１５【００８３】
項目間演算２
［補正Ｈｂ］
桁数：１  定性判定：しない
Ｘ：７５１ｎｍ  Ｙ：Ｈｂ
項目間演算式：１．０５３＊Ｙ−８９６＊Ｘ⇒７５１ｎｍ用［式Ｆ１］
［ＩＦＣＣ値］
桁数：２  定性判定：しない
Ｘ：ＨｂＡ１ｃ  Ｙ＝補正Ｈｂ
項目間演算式：Ｘ／Ｙ＊１０００＋０【００８４】
３．結果
７５１ｎｍ用［式Ｆ１］を用いて補正を行ったところ、ＮＧＳＰ％の場合もＩＦＣＣ値の場合も、イントラリピッドの影響を受けずにＨｂＡ１ｃ％を算出することができた（表４ａ〜４ｂ）。【００８５】
【表４】
2018030531.tif 000005
【００８６】
［実施例７］
実検体を用い［式Ｆ１］の有効性を確認した。【００８７】
１．材料
（１）試料：ＥＤＴＡ採血した全血３５０例（ＴＧ値が基準範囲内であり、かつ目視で濁りを認めない）を使用した。
（２）測定試薬とキャリブレータ：参考例１と同様の測定試薬、キャリブレータを使用した。【００８８】
２．操作
（１）試料の測定：自動分析装置ＪＣＡ−ＢＭ９１３０（日本電子社）を用い、実施例５に記載の測定パラメータにより試験試料を測定し、［式Ｆ１］を用いて４７８ｎｍヘモグロビン濃度の補正を行い、ＨｂＡ１ｃ％を測定した。【００８９】
３．結果
［式Ｆ１］による補正前のＨｂＡ１ｃ％を（ｘ）、補正後のＨｂＡ１ｃ％を（ｙ）として相関性を確認した。結果、相関係数：Ｒ２＝０．９９９９で、回帰式：ｙ＝０．９９３ｘ＋０．０１９９が得られ、実検体を測定した場合においても、本発明の方法が使用できることが確認された（図６）。 
【図１】
2018030531.tif 000006
【図２】
2018030531.tif 000007
【図３】
2018030531.tif 000008
【図４】
2018030531.tif 000009
【図５】
2018030531.tif 000010
【図６】
2018030531.tif 000011
【国際調査報告】
2018030531.tif 000012
2018030531.tif 000013
2018030531.tif 000014
2018030531.tif 000015