(57)【要約】本発明は、ＣＤ２４陰性の間葉系幹細胞を含む寿命延長剤、及び前記寿命延長剤を用いた認知症、脳梗塞、脊髄損傷等の治療に関する。
2018034023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２４陰性の間葉系幹細胞を含む、寿命延長剤。
【請求項２】
細胞が、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ２００から選ばれる少なくとも１以上が陽性、及び／又はＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９α、及びＨＬＡ−ＤＲから選ばれる少なくとも１以上が陰性である、請求項１に記載の寿命延長剤。
【請求項３】
細胞が骨髄又は血液由来である、請求項１又は２に寿命延長剤。
【請求項４】
骨髄又は血液が、寿命延長剤の投与を受ける対象の骨髄又は血液である、請求項３に記載の寿命延長剤。
【請求項５】
細胞がヒト血清を含む培地中で増殖されたものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の寿命延長剤。
【請求項６】
ヒト血清が、寿命延長剤の投与を受ける対象の自己血清である、請求項５に記載の寿命延長剤。
【請求項７】
静脈内投与製剤、腰椎穿刺投与製剤、脳内投与製剤、脳室内投与製剤、局所投与製剤、又は動脈内投与製剤である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の寿命延長剤。
【請求項８】
静脈内投与製剤である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の寿命延長剤。
【請求項９】
細胞が、抗凝固剤を含まない、あるいは抗凝固剤が０．０２Ｕ／ｍＬ未満である培地中で増殖、富化されたものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の寿命延長剤。
【請求項１０】
骨髄又は血液が、採取時に添加される抗凝固剤の量を該骨髄又は血液の容積に対して０．２Ｕ／ｍＬ未満として調製されたものである、請求項３〜９のいずれか１項に記載の寿命延長剤。
【請求項１１】
抗凝固剤が、ヘパリン、ヘパリン誘導体又はその塩である、請求項９又は１０に記載の寿命延長剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１６−１６０２６９号（２０１６年８月１８日出願）の明細書に記載された内容を包含する。
［技術分野］
本発明は、ＣＤ２４陰性の間葉系幹細胞を含む寿命延長剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）には、脳（実質及び血管）の保護作用があることが知られている。脳梗塞後のＭＳＣ投与は、梗塞体積を減らし、行動機能を改善することが、実験的梗塞モデルを用いて確認されている（非特許文献１〜３、特許文献１）。また、ＭＳＣの静脈投与による脳梗塞患者の治療も多数実施され、運動機能や損傷部位の改善が報告されている（非特許文献４、特許文献２）。【０００３】
一方、脊髄損傷患者についても、ＭＳＣの静脈投与により、機能回復、及び軸索再生の促進、損傷部位の低減が認められている。ＭＳＣの効果は、これまで急性期の脊髄損傷患者においては多数報告されているが、慢性期の患者に対する研究や予後、寿命に対する効果は十分確認されていない。【０００４】
ＭＳＣの治療メカニズムについては、多数の作用機序が推測されており、これらは神経栄養因子による神経栄養・保護作用、血管新生作用（脳血流の回復）、神経再生の３つに分類される。神経栄養・保護作用は、神経栄養因子であるＢＤＮＦ（Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ）やＧＤＮＦ（Ｇｌｉａｌ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ）等の液性因子を介して発揮されることが予測される。血管新生作用には、二つのメカニズムが考えられ、一つは病巣部に集積したＭＳＣが血管新生因子等を分泌し血管新生を誘導することであり、もう一つは投与されたＭＳＣ自身が血管内皮に分化して新たな血管を形成することである。神経再生作用も、二つのメカニズムが考えられ、一つは病巣部に集積したＭＳＣが内因性の神経形成を促進することであり、もう一つは投与されたＭＳＣ自身が神経細胞・グリア細胞へと分化することである。【０００５】
しかしながら、上記の作用機序はいずれも観察された現象からの推測にすぎず、ＭＳＣの静脈投与によって脳梗塞や脊髄損傷が治療されるメカニズムは実証されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００２／０００８４９号
【特許文献２】ＷＯ２００９／０３４７０８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｉｈｏｓｈｉ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２００４；１００７：１−９．
【非特許文献２】Ｎｏｍｕｒａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００５；１３６：１６１−１６９．
【非特許文献３】Ｈｏｎｍａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２００６；１９９：５６−６６．
【非特許文献４】Ｈｏｎｍｏｕ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ．２０１１；１３４：１７９０−１８０７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の新たな効果を見出し、ＭＳＣ移植の治療戦略や新たな臨床応用を確立することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、ＳＨＲＳＰ（Ｓｔｒｏｋｅ−ｐｒｏｎｅ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒａｔｓ）において、ＭＳＣを静脈投与することで寿命が延長されることを確認した。さらに、通常の老齢ラットにおいても、ＭＳＣの静脈投与により運動機能の亢進が認められることが確認された。これらのことから、ＭＳＣの静脈投与には、疾病の有無に拘わらず、一般的に延命効果があると考えられる。【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１５）に関する。
（１）骨髄又は血液に由来するＣＤ２４陰性の間葉系幹細胞を含む、寿命延長剤。
（２）細胞が、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ２００から選ばれる少なくとも１以上が陽性、及び／又はＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９α、及びＨＬＡ−ＤＲから選ばれる少なくとも１以上が陰性である、上記（１）に記載の寿命延長剤。
（３）細胞が骨髄又は血液、好ましくはヒト骨髄又は血液に由来する、上記（１）又は（２）に記載の寿命延長剤。
（４）骨髄又は血液が、寿命延長剤の投与を受ける対象の骨髄又は血液である、上記（３）に記載の寿命延長剤。
（５）細胞がヒト血清を含む培地中で増殖されたものである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の寿命延長剤。
（６）ヒト血清が、寿命延長剤の投与を受ける対象の自己血清である、上記（５）に記載の寿命延長剤。
（７）静脈内投与製剤、腰椎穿刺投与製剤、脳内投与製剤、脳室内投与製剤、局所投与製剤、又は動脈内投与製剤である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の寿命延長剤。
（８）静脈内投与製剤である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の寿命延長剤。
（９）細胞が、抗凝固剤を含まない、あるいは抗凝固剤が０．０２Ｕ／ｍＬ未満である培地中で増殖、富化されたものである、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の寿命延長剤。
（１０）骨髄又は血液が、採取時に添加される抗凝固剤の量を該骨髄又は血液の容積に対して０．２Ｕ／ｍＬ未満として調製されたものである、上記（３）〜（９）のいずれかに記載の寿命延長剤。
（１１）抗凝固剤が、ヘパリン、ヘパリン誘導体又はその塩である、上記（９）又は（１０）に記載の寿命延長剤。
（１２）対象の運動機能及び／又は認知機能を改善させる、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の寿命延長剤。
（１３）対象の脳組織におけるＦｏｘＯ１遺伝子の発現を亢進させる、上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の寿命延長剤。
（１４）さらにＴＧＦ−β１、ＡＬＫ５、及びＳｍａｄ３からなる群から選ばれる１又は２以上の遺伝子の発現を亢進させる、上記（１３）に記載の寿命延長剤。
（１５）投与後に間葉系幹細胞がＴＧＦ−β１を分泌しうる、上記（５）、（６）、（９）〜（１１）のいずれかに記載の寿命延長剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、静脈投与されたＭＳＣが、脳梗塞、脊髄損傷、認知症などの神経疾患を有する患者だけでなく、健常人においても、運動機能を改善させ、寿命を延長しうることが確認された。よって、健常人（とくに中高年者）の若返りや寿命延長、（とくに若年者の）体力増強を目的として、ＭＳＣを投与することができる。また、認知症（血管性認知症、アルツハイマー型認知症）や、脳梗塞及び脊髄損傷などの難治性神経疾患患者においては、神経機能や運動機能の改善と合わせて、その治療後の寿命延長効果を期待してＭＳＣを投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＭＳＣを投与したＳＨＲＳＰにおける投与日からの日数と生存率の関係を示すカプランマイヤー曲線である。検定はＬｏｇ−ｒａｎｋ法で行い、ｐ＜０．０５を有意水準とした。
【図２】図２は、１７週齢の老齢ラットにおけるＭＳＣ投与による運動機能の改善を示す（−●−：ＭＳＣ投与群、−■−：ＤＭＥＭ投与群）。
【図３】図３は、５０週齢の老齢ラットにおけるＭＳＣ投与による生存率の向上を示す（−●−：ＭＳＣ投与群、−■−：ＤＭＥＭ投与群）。
【図４】図４は、５０週齢の老齢ラットにおけるＭＳＣ投与による運動機能の改善を示す（−●−：ＭＳＣ投与群、−■−：ＤＭＥＭ投与群）。
【図５】図５は、５０週齢の老齢ラットにおけるＭＳＣ投与による、投与１０週後における認知機能の改善を示す（−●−：ＭＳＣ投与群、−■−：ＤＭＥＭ投与群）。
【図６】図６は、ＭＳＣ投与後のラット脳組織の免疫染色結果を示す。（Ａ）ＤＡＰＩ／ＧＦＰ、（Ｂ）ＤＡＰＩ／ＴＧＦ−β１、（Ｃ）Ｍｅｒｇｅ（ＧＦＰ／ＴＧＦ−β）、（Ｄ）ＤＡＰＩ／ＧＦＰ（ＭＳＣ）／ＴＧＦ−β１
【図７】図７は、ＭＳＣ投与後のラット脳組織の免疫染色結果を示す。ＧＦＰ（ＭＳＣ）／ＴＧＦ−β１
【図８】図８は、ＳＤラットにおけるＭＳＣ投与による遺伝子発現の変化を示す。（Ａ）ＦｏｘＯ１（長寿遺伝子）、（Ｂ）ＴＧＦ−β１、（Ｃ）ＡＬＫ５、（Ｄ）Ｓｍａｄ５。
【図９】図９は、ＭＳＣの寿命改善するメカニズム（推定）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［間葉系幹細胞］
本発明で使用される「間葉系幹細胞」とは、間葉系組織の間質細胞の中に微量に存在する多分化能及び自己複製能を有する幹細胞であり、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞などの結合組織細胞に分化するだけでなく、神経細胞や心筋細胞への分化能を有することが知られている。
【００１４】
間葉系幹細胞は、骨髄、末梢血、臍帯血、胎児胚、胎盤、脂肪、脳など全身に存在するが、本発明においては骨髄又は血液由来の間葉系幹細胞（骨髄間葉系幹細胞）、とくにヒト骨髄又は血液由来の間葉系幹細胞（ヒト骨髄間葉系幹細胞）が好ましい。骨髄間葉系幹細胞は、１）顕著な効果が期待できる、２）副作用の危険性が低い、３）充分なドナー細胞の供給が期待できる、４）非侵襲的な治療であり自家移植が可能である、５）感染症のリスクが低い、６）免疫拒絶反応の心配がない、７）倫理的問題がない、８）社会的に受け入れられやすい、９）一般的な医療として広く定着しやすいなどの利点がある。さらに、骨髄移植療法は、既に臨床の現場で用いられている治療であり、安全性も確認されている。また、骨髄由来の幹細胞は遊走性が高く、局所への移植ばかりか、静脈内投与によっても目的の損傷組織へ到達し、治療効果が期待できる。
【００１５】
前記細胞は、ＥＳ細胞や誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞等）から分化誘導した細胞であっても、株化された細胞であっても、生体から単離・増殖させた細胞であってもよい。細胞は、生体内のどの組織（例えば、脂肪、臍帯、胎盤、羊膜など）からでも採取でき、特に限定されない。細胞は、他家細胞由来でも自家細胞由来であってもよいが、自家細胞由来（患者自身の細胞に由来する）間葉系幹細胞が好ましい。
【００１６】
本発明で使用される間葉系幹細胞は、分化マーカーであるＣＤ２４陰性であり、未分化状態を維持した細胞である。そのため、増殖率及び生体内導入後の生存率が高いという特徴を有する。発明者らは、こうした未分化な間葉系幹細胞の取得方法も開発しており、その詳細はＷＯ２００９／００２５０３号に記載されている。
【００１７】
ＣＤ２４のほか、本発明で使用される間葉系幹細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ２００から選ばれる少なくとも１以上が陽性、及び／又はＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９α、及びＨＬＡ−ＤＲから選ばれる少なくとも１以上が陰性であることで特徴づけられる。好ましくは、本発明で使用される間葉系幹細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ２００の２以上が陽性であり、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９α、及びＨＬＡ−ＤＲの４以上が陰性であることで特徴づけられる。より好ましくは本発明で使用される間葉系幹細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ２００が陽性であり、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９α、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性であることで特徴づけられる。
【００１８】
発明者らが開発した前記方法では、骨髄液等から抗凝固剤（ヘパリン等）と実質的に接触しない条件で分離した細胞を、ヒト血清（好ましくは、自家血清）を含み、かつ、抗凝固剤（ヘパリン等）を含まないかあるいは極めて低濃度で含む培地を用いて増殖させる。
【００１９】
培地における細胞の密度は、細胞の性質及び分化の方向性に影響を与える。間葉系幹細胞の場合、培地中の細胞密度が８，５００個／ｃｍ２を超えると、細胞の性質が変化してしまうため、最大でも８，５００個／ｃｍ２以下で継代培養させることが好ましく、より好ましくは、５，５００個／ｃｍ２以上になった時点で継代培養させる。
【００２０】
発明者らが、開発した前記方法ではヒト血清含有培地を使用するため、血清ドナーの負担を考慮して、培地交換はなるべく少ない回数であることが望ましく、例えば、少なくとも週１回、より好ましくは週１〜２回の培地交換を行う。
【００２１】
培養は、細胞の総数が１０８個以上になるまで継代培養を繰り返し行う。必要とされる細胞数は、使用目的に応じて変化し得るが、例えば、脳梗塞の治療のための移植に必要とされる間葉系幹細胞の数は、１０７個以上と考えられている。発明者らが開発した方法によれば、１２日間程度で１０７個の間葉系幹細胞を得ることができる。
【００２２】
増殖したＭＳＣは、必要に応じて、使用されるまで凍結保存などの手法で（例えば、−１５２℃のディープフリーザーにて）保存してもよい。凍結保存には、血清（好ましくはヒト血清、より好ましくは自家血清）、デキストラン、ＤＭＳＯを含む培地（ＲＰＭＩ等の哺乳動物細胞用の培地）を凍結保存液として使用する。例えば、通常の濾過滅菌したＲＰＭＩ２０．５ｍＬと、患者から採取した自己血清２０．５ｍＬ、デキストラン５ｍＬ、ＤＭＳＯ  ５ｍＬを含む凍結保存液に細胞を懸濁して−１５０℃で凍結保存することができる。例えば、ＤＭＳＯとしては、ニプロ株式会社製のクライオザーブ、デキストランとしては、大塚製薬製の低分子デキストランＬ注を使用できるが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明のＭＳＣは投与後にＴＧＦ−β１を分泌しうる。ＭＳＣの投与は、対象の組織（例えば脳組織）において、ＴＧＦ−β１／Ｓｍａｄ３経路を活性化し、長寿遺伝子と言われるＦｏｘＯ１遺伝子の発現を亢進させることで、対象の運動機能、認知機能、生存期間を高めることが推定される。
【００２４】
［寿命延長剤］
本発明の「寿命延長剤」は、ＣＤ２４陰性の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞製剤であり、投与された対象の寿命を延長させる効果を有する医薬である。後述するように、本発明の「寿命延長剤」は、健常人においては、運動機能改善等の様々な作用を通じて、寿命延長効果を有し、認知症ならびに脳梗塞及び脊髄損傷などの難治性神経疾患患者においては、神経機能や運動機能の改善と合わせて、治療後の寿命延長効果を有する。
【００２５】
本発明の寿命延長剤に含まれるＭＳＣの細胞数は、多い程好ましいが、対象への投与時期や、培養に要する時間を勘案すると、効果を示す最小量であることが実用的である。したがって、本発明の寿命延長剤の好ましい態様において、間葉系幹細胞の細胞数は、１０７個以上、好ましくは５×１０７個以上、より好ましくは１０８個以上、さらに好ましくは５×１０８個以上である。
【００２６】
本発明の寿命延長剤は、好ましくは非経口投与製剤、より好ましくは非経口全身投与製剤、特に静脈内投与製剤である。非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤等の注射剤や移植片などが挙げられる。非経口投与用製剤は、水性又は非水性の等張性無菌溶液もしくは懸濁液の形態であり、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、培地（とくに、ＲＰＭＩ等の哺乳動物細胞の培養に用いられる培地）、ＰＢＳなどの生理緩衝液、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤等を適宜組み合わせて、適切な単位投与形態に製剤化される。
【００２７】
注射用の水溶液としては、例えば、生理食塩水、培地、ＰＢＳなどの生理緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールや非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等と併用してもよい。
【００２８】
本発明の寿命延長剤は、認知症、脳梗塞、脊髄損傷、神経変性疾患、精神疾患を罹患している患者において、運動機能や単純な認知機能を改善するとともに、注意障害、記憶障害、失語症、失念、失行、遂行機能、情緒障害等の高次機能を改善し、治療後の対象の寿命も延長することができる。さらに、健常人おいても、若返りや体力増強、寿命延長効果を有する。
【００２９】
認知症は、後天的な脳の障害により、正常に発達した知能が不可逆的に低下し、認知障害を呈する疾患で、アルツハイマー型認知症、脳血管型認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症を挙げることができる。本発明の寿命延長剤は、認知症患者において、認知機能を改善することに加えて（特願２０１６−０９１２８６、特願２０１６−０９１３００）、生活全般の質を向上させることができるため、その余命を延ばすことができる。
【００３０】
脳梗塞は、脳動脈の閉塞又は狭窄により脳虚血を来たし、脳組織が壊死又はこれに近い状態になる病態を言う。ＭＳＣには、脳（実質及び血管）の保護作用があり、急性期や亜急性期の脳梗塞においては、ＭＳＣの静脈投与は、梗塞体積を減らし、行動機能を改善する。壊死した細胞や損傷を受けた神経線維は慢性期になると元には戻らないため、慢性期の脳梗塞においては、再発の防止とともに、壊死した細胞の周辺に存在する、死滅していない細胞や、機能停止している細胞を回復させ、病状を軽減することが治療の中心と考えられてきた。しかし、ＭＳＣの静脈投与により、神経回路の再建と正常組織による代償を促進させることで、慢性期の脳梗塞においても、運動機能や脳機能を回復させることに加えて（特願２０１６−０９１２８６、特願２０１６−０９１３００）、その余命を延ばすことができる。これは、寝たきりになると全身衰弱が進み、筋肉のみならず内臓も機能低下するが、ＭＳＣ治療により歩行運動が可能になることより、全身の筋肉や内臓を含めて健康を回復・維持することができるためである。
【００３１】
脊髄を含む中枢神経系は末梢神経と異なり、一度損傷すると修復・再生されることはない。とくに、瘢痕化の進んだ慢性期脊髄損傷に対する治療は難しく、ＥＳ細胞を用いた臨床試験も試みられたが成功に至っていない。しかし、ＭＳＣの静脈投与により、神経回路の再建と正常組織による代償を促進させることで、慢性期の脊椎損傷においても、運動機能や神経機能の回復させることに加えて（特願２０１６−０９１２８６、特願２０１６−０９１３００）、その余命を延ばすことができる。上述のとおり、寝たきりになると全身衰弱が進み、筋肉のみならず内臓も機能低下するが、ＭＳＣ治療により歩行運動が可能になることより、全身の筋肉や内臓を含めて健康を回復・維持することができるためである。
【００３２】
本発明の寿命延長剤は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、ハンチントン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、黒質線状体変性症（ＳＮＤ）、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症（ＯＰＣＡ）、脊髄小脳変性症（ＳＣＤ）等の神経変性疾患にも有用である。
【００３３】
さらに、本発明の寿命延長剤は、統合失調症、躁うつ病、人格障害、気分障害、心理発達障害、ストレス関連障害、自閉症、学習障害、行動・情緒障害、精神遅滞、睡眠障害、摂食障害、同一性障害、解離性障害、適応障害、アルコール性障害、依存症、等の精神疾患にも有用である。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００３５】
実施例１．脳卒中易発症高血圧自然発症ラット（ＳＨＲＳＰ）における延命効果
１．材料・方法
（１）ラット骨髄由来間葉系幹細胞の調製
実験は、札幌医科大学の動物実験管理規定にしたがって実施した。既報に従い、成熟ＳＤラットの大腿骨から得た骨髄をダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で２５ｍｌに希釈し、加熱不活化した１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを添加し、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃で３日間インキュベートした（Ｋｉｍ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２００６；１１２３：２７−３３．Ｕｋａｉ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．２００７；２４：５０８−５２０．）。コンフルエントになるまで培養し、接着細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで剥離し、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で３回継代培養して間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を得た。【００３６】
（２）脳卒中易発症高血圧自然発症ラット（ＳＨＲＳＰ）
ＳＨＲＳＰ（Ｓｔｒｏｋｅ−ｐｒｏｎｅ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒａｔ）は、星野試験動物飼育所より購入した。このラットは、毎世代脳卒中で死亡した親からの仔を選抜・交配して確立された脳卒中易発性高血圧自然発症ラットで、高血圧によって血液脳関門の破綻を生じ、脳梗塞や脳出血、認知症を発症し、短命である。【００３７】
（３）生存率の評価
１６〜２０週の時点で、脳梗塞又は脳出血を起こしていたラットを対象として、ＭＳＣ群とＤＭＥＭ群に分けた。
ＭＳＣ群（培地＋ＭＳＣ；ｎ＝８）：
新鮮な培地（ＤＭＥＭ）で全量１ｍｌとしたＭＳＣｓ（１．０×１０６ｃｅｌｌｓ）を静脈投与した。
ＤＭＥＭ群（培地のみ；ｎ＝８）：
新鮮な培地（ＤＭＥＭ；１ｍｌ）を静脈投与した。【００３８】
すべてのラットに毎日シクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。静脈投与はすべて左大腿静脈から行った。ＭＳＣあるいはＤＭＥＭ投与日から死亡日までの日数をカプランマイヤー法で評価した。検定はＬｏｇ−ｒａｎｋ法で行い、ｐ＜０．０５を有意水準とした。【００３９】
２．結果
図１に示されるとおり、ＭＳＣ群では、ＤＭＥＭ群に比べて顕著な延命が確認された（Ｌｏｇ−ｒａｎｋ法  ｐ＝０．００８２）。このことから、脳梗塞モデルにおいて、ＭＳＣ投与により、神経機能や運動機能の回復だけでなく、寿命も延長できることが確認された。【００４０】
実施例２．老齢ラットにおける運動機能の亢進
ＳＨＲＳＰは、高塩食を与えることで自然に血管が老化し血圧が高くなり、最終的には脳梗塞や脳出血、認知症を呈するようになるが、これは人間の老化現象とも似ている。よって、ＭＳＣの静脈投与がＳＨＲＳＰの寿命を延長させたことは、通常の高齢者においても寿命延長効果を有することを示唆する。そこで、本実施例では、１７週齢の老齢ラットを用いて、ＭＳＣの運動機能に対する効果を評価した。【００４１】
１．材料・方法
ＭＳＣは実施例１にしたがって調製した。９週齢で実施例３に記載した方法で脳梗塞を誘導し、その後８週経過後のＳＤラット（１７週齢）を、以下のとおり、無作為に２群に分けた。
ＭＳＣ群（生理食塩水＋ＭＳＣ；ｎ＝８）：
１７週齢のＳＤラットに、培地（ＤＭＥＭ）で全量１ｍｌとしたＭＳＣｓ（１．０×１０６ｃｅｌｌｓ）を左大腿静脈より投与した。
ＤＭＥＭ群（培地；ｎ＝８）：
１７週齢のＳＤラットに、新鮮な培養液（ＤＭＥＭ；１ｍｌ）を左大腿静脈より投与した。【００４２】
ラットは、リハビリテーションを行わず、シクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を移植後１週間は連日、その後は隔日投与した。毎週トレッドミル（角度２０度）にて運動評価を行った。【００４３】
２．結果
図２に示すとおり、ＭＳＣ群は、もともと運動機能が良いものはその機能が維持され、低いものは運動機能が改善した。一方、ＤＭＥＭ群は、徐々に運動機能の低下を認めた。よって、健常人においても、ＭＳＣ投与は老化による運動機能の低下を抑制し、寿命を延長させることが期待できる。【００４４】
実施例３．脳梗塞モデルラットにおける治療効果
脳梗塞モデルとして、ラット一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）モデルを使用した。既報にしたがい、成熟雌性ＳＤラット（２００−２５０ｇ）をケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、２０．０−２２．０ｍｍの塞栓糸（ＭＯＮＯＳＯＦ）を外頸動脈から挿入して、一過性中大脳動脈閉塞を誘導する（Ｈｏｎｍａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２００６；１９９：５６−６６．Ｓａｓａｋｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００９；５４９：１８７−１９５．）。このラットを脳梗塞モデルとして、ＭＳＣ投与の脳梗塞に対する延命効果を実施例１にしたがって実施することができる。【００４５】
実施例４．慢性期脊髄損傷モデルにおける治療効果
既報にしたがい、成熟雄性ＳＤラットをケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、Ｔ９−Ｔ１０レベルの脊髄を、椎弓切除により露出し、脊髄損傷作製装置（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｉｍｐａｃｔｏｒ、６０−ｋｉｌｏｄｙｎｅ）を用いて圧迫挫滅することで慢性期脊髄損傷モデルラットを作製することができる（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。このラット慢性期脊髄損傷モデルにより、ＭＳＣ投与の認知症に対する延命効果を実施例１にしたがって実施することができる。【００４６】
実施例５．老齢ラットにおける延命効果
５０週齢の正常ラットを用いて、ＭＳＣ投与の生存率、運動機能、認知機能に対する効果を評価した。【００４７】
１．材料・方法
ＭＳＣは実施例１にしたがって調製した。何も処置をしていないＳＤラットを、以下のとおり無作為に２群に分け、ＭＳＣ又は培地（ＤＭＥＭ）を投与した。
ＭＳＣ群（生理食塩水＋ＭＳＣ；ｎ＝１５）：
５０週齢のＳＤラットに培地（ＤＭＥＭ）で全量１ｍｌとしたＭＳＣｓ（１．０×１０６ｃｅｌｌｓ）を左大腿静脈より投与した。
ＤＭＥＭ群（培地；ｎ＝１５）：
５０週齢のＳＤラットに新鮮な培養液（ＤＭＥＭ；１ｍｌ）を左大腿静脈より投与した。
すべてのラットはリハビリテーションを行うことなく、シクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）をＭＳＣ投与から１週間は毎日、それ以後は隔日で腹腔内投与した。【００４８】
（１）生存率の評価
ＭＳＣ（ｎ＝１０）あるいはＤＭＥＭ（ｎ＝９）投与日から死亡日までの日数をカプランマイヤー法で評価した。結果を図３に示す。【００４９】
（２）運動機能の評価
実施例２にしたがい、ＭＳＣ群（ｎ＝１０）及びＤＭＥＭ群（ｎ＝９）について、毎週トレッドミル（角度２０度）にて運動評価を行った。結果を図４に示す。【００５０】
（３）認知機能の評価
ＭＳＣ投与の老齢ラットの認知機能に対する効果を水迷路試験（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｗａｔｅｒ  Ｍａｚｅ  Ｔｅｓｔ（ＭＷＭ）テスト）により検証した。水温２４℃の白濁させた不透明水で、直径１．３ｍの円形のプールを深さ３０ｃｍでみたし、水面直下にゴールとなるプラットフォームを置きプールの端からラットを入れてゴールに到達するまでの時間を測定した。
測定はビデオトラッキングにて実施し（Ａｎｙｍａｚｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．）、移植前５日間と移植後１０週目から連続６日間で行った。１日目は、１分間４サイクルの装置順化を行い、２日目から、連続５日間で到達時間を測定した。１日４サイクルの測定を行い、平均値を測定値とした。結果を図５に示す。【００５１】
２．結果
図３〜５に示されるとおり、ＭＳＣ群では、ＤＭＥＭ群に比べて顕著な生存率、運動機能、認知機能の向上が確認された。このことから、老齢正常ラットにおいても、ＭＳＣ投与は延命効果を有することが確認された。【００５２】
実施例６．ＭＳＣ投与による遺伝子発現の変化
１．材料・方法
実施例１で用いた認知症モデル動物（ＳＨＲＳＰ）で、１６〜２０週の時点で、脳梗塞又は脳出血を起こしていたラットを対象として、発症後２週間後に、ＭＳＣ群とＤＭＥＭ群に分けて、ＧＦＰでラベルしたＭＳＣ（ＭＳＣ−ＧＦＰ）  １．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ・ＤＭＥＭを左大腿静脈より投与した。ＭＳＣ−ＧＦＰ投与の１週間後に、ラットを屠殺し、ＰＢＳ  ２００ｍｌで潅流を行い、脳組織を摘出した。【００５３】
摘出した脳組織はイソペンタンで凍結（ｓｈｏｃｋ  ｆｒｏｚｅｎ）し、使用するまで−８０℃で保存した。脳組織を３０μｍでスライスして冠状断の標本を作製し、免疫染色を行った。免疫染色は、一次抗体として、抗ＧＦＰ抗体（ニワトリポリクローナル抗体（１：１０００；Ａｂｃａｍ，ａｂ１３９７０）、抗ＴＧＦ−β１抗体（ウサギポリクローナル抗体（１：１００；Ａｂｃａｍ，ａｂ９２４８６）を使用し、二次抗体として、ＡＦ４８８コンジュゲートヤギ抗ニワトリイムノグロブリン（１：１０００）、ＡＦ５９４コンジュゲートヤギ抗ウサギイムノグロブリン（１：１０００）を用いた。【００５４】
ＬＳＭ７８０共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｌａｓｅｒ：Ａｒｇｏｎ  ４８８（ＧＦＰ）、５６１（ＴＧＦ−β１）、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  １０ｘ／０．４５  Ｍ２７，Ｚｅｉｓｓ）により免疫染色後の標本を観察した。結果を図６及び７に示す。【００５５】
２．結果
ＭＳＣ投与後の脳組織では、ＧＦＰとＴＧＦ−β１が共発現していた。この結果は、ＭＳＣからＴＧＦ−β１が分泌されていることを示唆する。【００５６】
実施例７．ＭＳＣ投与による遺伝子発現の変化
１．材料・方法
試料は実施例６にしたがって調製した。以下のとおり無作為に２群に分け、ＭＳＣまたは培地（ＤＭＥＭ）を投与した。
ＭＳＣ群（生理食塩水＋ＭＳＣ；ｎ＝４）：
ラットに培地（ＤＭＥＭ）で全量１ｍｌとしたＭＳＣｓ（１．０×１０６ｃｅｌｌｓ）を左大腿静脈より投与した。
ＤＭＥＭ群（培地；ｎ＝４）：
ラットに新鮮な培養液（ＤＭＥＭ；１ｍｌ）を左大腿静脈より投与した。
すべてのラットはリハビリテーションを行うことなく、シクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）をＭＳＣ投与から１週間は毎日腹腔内投与した。【００５７】
投与１週間後にラットを屠殺し、２０〜３０ｍｇの皮質をすみやかに採取し、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡを抽出した。次いで、１μｇのＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを作成した。プライマーは、ＴａｑＭａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を購入し、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ  ｗｉｔｈ  ＵＮＧを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨ（ＴａｑＭａｎ  ｒｏｄｅｎｔ  ＧＡＰＤＨ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）を内因性コントロールとして、Ｆｏｘ０１、ＴＧＦ−β１、ＡＬＫ５、Ｓｍａｄ３の発現を解析した。ＰＣＲはＡＢＩ−ＳｔｅｐＯｎｅ  リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を用いて行い、９５℃３分加温後に、９５℃１５秒、５５℃６０秒のサイクルを４０回繰り返し、比較Ｃｔ法により各遺伝子の発現量を評価した。結果を図８に示す。【００５８】
２．結果
ＭＳＣ群はＤＭＥＭ群と比較して、Ｆｏｘ０１、ＴＧＦ−β１、ＡＬＫ５、Ｓｍａｄ３のいずれも有意に高く発現していた（図８、下表１）。【００５９】
【表１】
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【００６０】
３．考察
ＭＳＣの投与により、ＴＧＦ−β１／Ｓｍａｄ３経路が活性化し、ＦｏｘＯ１の発現が亢進している可能性が示唆された（図９）。この結果は、長寿遺伝子として注目されているＦｏｘＯ１を活性化することで、ＭＳＣが対象の生存期間を延長させる可能性を示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、延命が望まれる対象の治療に有用である。とくに、認知症、脳梗塞、脊髄損傷などの神経変性疾患、精神疾患等については、神経機能や運動機能の改善に加えて、対象の延命を図ることができるため、ＭＳＣを使用した新たな治療戦略を確立できる。さらに健常な対象においても、対象の運動機能の向上や延命を図ることができ、ＭＳＣの投与は疾病の有無に拘わらず対象の寿命延長に有用である。【００６２】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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