(57)【要約】  本発明は、キメラ動物は、胎児期には免疫反応または炎症が報告されてにもかかわらず、出生後には、顕著な炎症を生じることを見出した。これまで、キメラ動物は胎児期の分析しかなされておらず、理論上は免疫寛容が成立していると考えられることからこの発見は意外であった。本発明は、出生したキメラ動物が胎児期において免疫反応または炎症を鎮静化するための組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
出生した異種間または同種異系間のキメラ動物において生じる免疫反応または炎症を抑制することに用いるための組成物であって、抗炎症剤または免疫抑制剤を含む、組成物。
【請求項２】
免疫反応または炎症が、皮膚において生じる免疫反応または炎症または補完された臓器若しくは組織において生じる免疫反応または炎症である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抑制が、予防的に行われる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
抗炎症剤または免疫抑制剤が、ステロイドを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
出生した異種間または同種異系間のキメラ動物から成体を得る方法であって、出生したキメラ動物に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含む、方法。
【請求項６】
抗炎症剤または免疫抑制剤が、キメラ動物に免疫反応または炎症が生じる前に投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
出生したキメラ動物の表皮に免疫反応または炎症が生じたことを確認することと、
免疫反応または炎症が確認されたらキメラ動物に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
出生した異種間または同種異系間のキメラ動物を飼育するまたは成長させる方法であって、当該キメラ動物に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含み、これにより、当該キメラ動物の免疫反応または炎症が予防される、または治療される、方法。
【請求項９】
出生した異種間または同種異系間のキメラ動物から成体を得る方法であって、当該キメラ動物に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含み、これにより、当該キメラ動物の免疫反応または炎症が予防される、または治療される、方法。
【請求項１０】
免疫不全である、異種間または同種異系間のキメラ動物。
【請求項１１】
免疫不全である、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する動物、またはその着床前胚。
【請求項１２】
臓器が、膵臓および腎臓からなる群から選択される臓器である、請求項１１に記載の動物、またはその着床前胚。
【請求項１３】
特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する動物が、Ｐｄｘ１遺伝子のノックアウト動物、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１遺伝子のトランスジェニック動物、およびＳａｌｌ１遺伝子のノックアウト動物、Flk1遺伝子のノックアウト動物、Hex遺伝子のノックアウト動物、Foxa1/Foza2遺伝子のダブルノックアウト動物、Otx2遺伝子のノックアウト動物、およびFoxn1遺伝子のノックアウト動物；これらの遺伝子のプロモーターに駆動される細胞死誘導因子をコードする遺伝子を有する動物；並びに、臓器または細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターに駆動される細胞死誘導因子をコードする遺伝子を有する動物から選択される遺伝子改変を有する動物である、請求項１１または１２に記載の動物。
【請求項１４】
免疫不全が、IL2Rg、RAG1、RAG2、Foxn1、PRKDC、MHCおよびSIRPaから選択されるいずれか１以上の遺伝子改変または異常を伴う、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の動物。
【請求項１５】
特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物の体内で当該臓器または細胞を作製する方法であって、
哺乳動物の多能性細胞を当該非ヒト哺乳動物の着床前胚に移植して、キメラ胚を得ることを含み、
前記多能性細胞および前記着床前胚のいずれかまたは両方は、免疫不全となる遺伝子改変または異常を有し、
前記多能性細胞と前記着床前胚とが、同種異系または異種の関係である、
方法。
【請求項１６】
免疫不全となる遺伝子改変または異常を有する多能性細胞を含む組成物であって、キメラ動物を作製することに用いるための組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物であって、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物の体内で当該臓器または細胞を作製することに用いるための組成物。
【請求項１８】
免疫不全の原因となる遺伝子改変または遺伝子異常を有する、臓器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、出生したキメラ動物が胎児期（胎児は体細胞キメラ状態である）には免疫反応および炎症を示すことがないにもかかわらず、出生後、発症する免疫反応と炎症を治療および／または予防することに用いるための組成物、方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
着床前の胚に同種異系の多能性幹細胞を移植して作製した同種異系キメラ動物においては、免疫成立前から同種異系の多能性幹細胞由来の細胞が胸腺やリンパ球に共に共存する。よって、同種異系の多能性幹細胞由来の細胞は自己として認識され、免疫系による攻撃を受けることはない。
異種間キメラ動物の作製においても、免疫成立前から異種細胞を胚盤胞に導入するため、原則として異種細胞は自己として認識され、免疫系による攻撃を加えられることがない。そして、これまでのところ、上記理論通りに、異種間キメラ動物においては、免疫拒絶や炎症反応は一切報告されていなかった。
【発明の概要】
【０００３】
これに対して、本発明者らは、意外にも、出生したキメラ動物が、胎児期（胎児はキメラ状態である）には炎症が報告されたことがなかったにもかかわらず、出生後には顕著な炎症が体内で生じることを明らかにした。本発明によれば、異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）において、出生後に誘発される免疫反応を抑制することに用いるための組成物、出生後に発症する炎症を治療および／または予防することに用いるための組成物、並びに、出生後に誘発される免疫反応を抑制する方法、および、出生後に発症する炎症を治療および／または予防する方法が提供される。
【０００４】
本発明者らは、出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）において、表皮及びドナー組織部分（すなわち、例えば、胚盤胞補完キメラ動物においては補完された臓器または組織部分）に免疫反応および炎症が認められることを発見した。この症状は、出生前（胎児期）にはほとんど認められなかった。表皮における免疫反応および炎症反応は数多くのキメラ動物個体において観察され、ドナー組織部分における免疫反応および炎症は一部の個体において顕著に観察された。また、観察されたドナー組織部分における炎症は、白血球の浸潤とマクロファージの浸潤を伴っていた。上記免疫反応および炎症は、ステロイド剤によって鎮めることができた。また、上記免疫反応および炎症は、胚および／または多能性細胞を免疫不全とすることで抑制することができた。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００５】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）において生じる免疫反応または炎症を抑制することに用いるための組成物であって、抗炎症剤または免疫抑制剤を含む、組成物。
（２）免疫反応または炎症が、皮膚において生じる免疫反応または炎症または補完された臓器若しくは組織において生じる免疫反応または炎症である、上記（１）に記載の組成物。
（３）抑制が、予防的に行われる、上記（１）に記載の組成物。
（４）抗炎症剤または免疫抑制剤が、ステロイドを含む、上記（１）または（２）に記載の組成物。
（５）出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）から成体を得る方法であって、出生した胚盤胞補完キメラ動物に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含む、方法。
（６）抗炎症剤または免疫抑制剤が、キメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）に免疫反応または炎症が生じる前に投与される、上記（５）に記載の方法。
（７）出生したキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）の表皮に免疫反応または炎症が生じたことを確認することと、
免疫反応または炎症が確認されたらキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含む、上記（６）に記載の方法。
（８）出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）を飼育するまたは成長させる方法であって、当該キメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含み、これにより、当該キメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）の免疫反応または炎症が予防される、または治療される、方法。
（９）出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）から成体を得る方法であって、当該キメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含み、これにより、当該キメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）の免疫反応または炎症が予防される、または治療される、方法。
（１０）免疫不全である、異種間または同種異系間のキメラ動物。
（１１）免疫不全である、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する動物、またはその着床前胚。
（１２）臓器が、膵臓および腎臓からなる群から選択される臓器である、上記（１１）に記載の動物、またはその着床前胚。
（１３）特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する動物が、Ｐｄｘ１遺伝子のノックアウト動物、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１遺伝子のトランスジェニック動物、およびＳａｌｌ１遺伝子のノックアウト動物、Flk1遺伝子のノックアウト動物、Hex遺伝子のノックアウト動物、Foxa1/Foza2遺伝子のダブルノックアウト動物、Otx2遺伝子のノックアウト動物、およびFoxn1遺伝子のノックアウト動物；これらの遺伝子のプロモーターに駆動される細胞死誘導因子をコードする遺伝子を有する動物；並びに、臓器または細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターに駆動される細胞死誘導因子をコードする遺伝子を有する動物から選択される遺伝子改変を有する動物である、上記（１１）または（１２）に記載の動物。
（１４）免疫不全が、IL2Rg、RAG1、RAG2、Foxn1、PRKDC、MHCおよびSIRPaから選択されるいずれか１以上の遺伝子改変または異常を伴う、上記（１１）〜（１３）のいずれかに記載の動物。
（１５）特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物の体内で当該臓器または細胞を作製する方法であって、
哺乳動物の多能性細胞を当該非ヒト哺乳動物の着床前胚に移植して、キメラ胚を得ることを含み、
前記多能性細胞および前記着床前胚のいずれかまたは両方は、免疫不全となる遺伝子改変または異常を有し、
前記多能性細胞と前記着床前胚とが、同種異系または異種の関係である、
方法。
（１６）免疫不全となる遺伝子改変または異常を有する多能性細胞を含む組成物であって、キメラ動物を作製することに用いるための組成物。
（１７）上記（１６）に記載の組成物であって、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物の体内で当該臓器または細胞を作製することに用いるための組成物。
（１８）免疫不全の原因となる遺伝子改変または遺伝子異常を有する、臓器。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、Ｐｄｘ１遺伝子領域のＴＡＬＥＮによる破壊スキーム（パネルＡ）と、破壊された変異体Ａ〜Ｄの当該箇所の遺伝子配列（パネルＢ）を示す。図１Ｃは、Ｐｄｘ１ｍｕ／ｍｕでは、膵臓が欠損することを示す。
【図２】図２は、ラット−マウス間の胚盤胞補完キメラ動物の生後６週目での血糖負荷テストの結果と、生後１０週間目での血糖負荷テストの結果を示す（図２上）。図２はまた、ラット−マウス間の胚盤胞補完キメラ動物の膵島領域において異常な細胞の浸潤が認められた。
【図３】図３は、組織の炎症箇所について免疫組織学検討を行った結果を示す。
【図４】図４は、ラット−マウス間のキメラ動物において生じる角質肥厚・皮膚の脱落といった皮膚炎症状を示す部位に、Ｔ細胞を含む血球細胞が集積していることを示す図である。
【図５】図５は、ラット−マウス間のキメラ動物において生じる免疫反応および炎症を伴う皮膚炎が抗炎症剤によりほぼ完全に予防できていることを示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＩＬ２Ｒｇ遺伝子破壊動物を作製するためのターゲッティングベクターおよび破壊された遺伝子の構造を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラットの末梢血のフローサイトメトリーによる血球分析の結果を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラットの末梢血中の免疫グロブリンの量を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラにおける末梢血の血球分析の結果を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラの表皮の炎症の状態を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラの表皮の組織学的分析結果を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ＩＬ２Ｒｇ−／−マウスＥＳ細胞と野生型ラット胚から作製したラット−マウスキメラ動物における表皮の角化異常および肥厚を示す（パネルａ〜ｄ）。図８Ａはまた、ＩＬ２Ｒｇ−／−マウスＥＳ細胞とＩＬ２Ｒｇ−／−ラット胚から作製したラット−マウスキメラ動物における表皮の状態を示す（パネルｅおよびｆ）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＮＳＧマウスＥＳ細胞とＩＬ２Ｒｇ−／−Ｒａｇ２−／−ラット胚から作製したラット−マウスキメラ動物における表皮の状態を示す（パネルｇ〜ｊ）。
【発明の具体的な説明】
【０００７】
本明細書では、「キメラ動物」とは、免疫系が構築される前に同種異系若しくは異種の細胞を混合して（例えば、着床前胚などの胚に同種異系若しくは異種の多能性細胞を導入して）得られた胚を成長させて得られる胎児および生後の個体を意味する。本明細書では、「キメラ動物」は、胚に対して同種異系または異種の細胞を導入して得られる体細胞キメラである胎児、および当該胎児から得られる出生後の個体を含む意味で用いられる。このようなキメラ動物は、導入された細胞に対して免疫寛容状態にあると考えられる。本明細書では、「胚盤胞補完キメラ動物」とは、胚盤胞に同種異系または異種の細胞を導入し、得られた胚盤胞を成長させて得られる胎児および生後の個体を意味する。キメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）は、哺乳動物の胚盤胞と哺乳動物の細胞との間で成立させ得る。胚盤胞補完キメラ動物は、哺乳動物の胚盤胞と哺乳動物の多能性細胞（pluripotent cell）との間で成立させ得る。胚盤胞補完キメラ動物では、胚盤胞が有する欠陥（例えば、臓器や組織の欠失、特に細胞自律的な欠陥、細胞自律的な臓器や組織の欠失）を外部から導入した同種異系または異種の細胞が補い、これにより本来の欠陥が緩和され、低減され、または完全に消失する。胚盤胞補完キメラ動物としては、レシピエント動物において、特定の臓器または細胞が形成できず、代わりにドナー細胞がこれを肩代わりして欠失する臓器や組織を補完する場合が有用な一例としてあげられる。特定の臓器または細胞が形成できない異常としては、例えば、臓器または細胞が細胞自律的に形成されない異常が挙げられる。本明細書では、「細胞自律的」とは、細胞が有する異常が当該細胞に対する影響しか質的にまたは量的に実質的に有しないことを意味する。
【０００８】
本明細書では、「免疫寛容」とは、特定抗原に対して特異的な免疫反応が欠如した状態または免疫反応が抑制された状態を意味する。免疫系は、自己のＭＨＣに提示された自己の抗原に対しては応答しないようになっており、このような現象は「自己寛容」と呼ばれる。体内では、自己の抗原に反応してこれを攻撃する免疫細胞が生まれないよう、胸腺においてＴ細胞の成熟過程において自己抗原に強く反応する細胞は死滅する。このことから、免疫系の発生前（例えば、胚盤胞期）に導入された外来の細胞は、個体内では自己と認識され、免疫系が反応しない（自己寛容が成立している）と考えられている。
【０００９】
本明細書では、「哺乳動物」には、ヒトおよびサルなどの霊長類；ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物；並びに、イヌおよびネコなどの愛玩動物が含まれる。但し、本明細書では、他に断りの無い限り、レシピエント動物は、非ヒトである。
【００１０】
本明細書では、「多能性細胞」（pluripotent cell）とは、多能性を有する細胞を意味する。多能性細胞には、内部細胞塊、胚性幹細胞（ES細胞）および人工多能性幹細胞（iPS細胞）などの多能性幹細胞が挙げられる。
【００１１】
本明細書では、「異種」とは、レシピエントとドナーとが異なる種であることを意味する。異種は、同族間、同科間、同目間、または同綱間であり得る。本明細書では、「同種異系」とは、レシピエントとドナーとが同種の異なる個体であることを意味する。
【００１２】
本明細書では、「ドナー」とは、胚盤胞などの着床前胚に導入される細胞または該細胞が由来する動物を意味する。本明細書では、「レシピエント」とは、胚盤胞などの着床前胚または該胚盤胞などの着床前胚が由来する動物を意味する。
【００１３】
本明細書では、「炎症」とは、免疫系細胞の反応の結果引き起こされる病理学上の変化を示す。本明細書では、炎症は、特に、異種間または同種異系間のキメラ動物において出生後に、ドナー細胞周辺において顕著に観察される炎症を言う。ドナーおよびレシピエント間の免疫反応により誘発される炎症は、出生前には有意なものは認められず、出生後に認められる。
【００１４】
本明細書では、「免疫反応」とは、非自己を識別し、非自己に対して生じる反応を言う。本明細書では、免疫反応は、特に、異種間または同種異系間のキメラ動物において出生後に、ドナー細胞周辺において顕著に観察される免疫反応を言う。ドナーおよびレシピエント間の免疫反応は、出生前には有意なものは認められず、出生後に認められる。
【００１５】
本明細書では、「抗炎症剤」とは、炎症を鎮めることに用いられる薬剤を意味する。本明細書では、「免疫抑制剤」とは、免疫機能を抑制することに用いられる薬剤を意味する。本明細書では、「抗炎症剤または免疫抑制剤」という用語は、「抗炎症剤および免疫抑制剤」、「抗炎症剤」または「免疫抑制剤」を意味する。なお、免疫抑制剤としては、自然免疫を抑制することに用いられる薬剤および獲得免疫を抑制することに用いられる薬剤が挙げられる。また、薬剤の中には、ステロイド剤など、抗炎症作用と抗免疫作用の両方を備えた薬剤も存在する。
【００１６】
本発明者らは、出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）において、表皮及びドナー組織部分（すなわち、胚盤胞補完キメラ動物においては補完された臓器または組織部分）に免疫反応または炎症が認められることを発見した。この免疫反応または炎症は、異種間または同種異系間のキメラ動物の出生前（胎児期）にはほとんど認められなかった。免疫反応または炎症は、表皮においては数多くのキメラ動物個体において観察されたが、ドナー組織部分における免疫反応または炎症は、一部の個体においてのみ観察された。また、観察されたドナー組織部分における免疫反応または炎症は、白血球の浸潤とマクロファージの浸潤を伴っていた。免疫反応および炎症は、ステロイド剤によって鎮めることができた。
【００１７】
従って、本発明では、出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）において生じる免疫反応または炎症を抑制することに用いるための組成物であって、抗炎症剤または免疫抑制剤を含む、組成物が提供される。本発明の組成物は、例えば、出生前に、出生時に、出生後に、および／または炎症発症後に投与することができる。
【００１８】
本発明では、免疫反応または炎症は出生後に生じるので、例えば、抗炎症剤または免疫抑制剤を出生直後（例えば、数日以内）に、異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）に投与することで免疫反応または炎症を予防することができる。本発明では、抗炎症剤または免疫抑制剤を出生前から異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）に投与することで免疫反応または炎症を予防してもよいであろう。このようにして、本発明では、出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）において生じる免疫反応または炎症を予防することができる。本発明のある態様では、出生前には、抗炎症剤も免疫抑制剤も投与しないことができる。ここで、本明細書では、「予防」とは、その処置を行わない場合と比較してその処置を免疫反応または炎症が生じる前に行うことにより、免疫反応または炎症の程度を軽減し、または、免疫反応または炎症の発生を消失（発生率を低減）させることを意味する。
【００１９】
また、本発明では、免疫反応または炎症は全ての個体において明確に観察されたわけではない。従って、本発明は、免疫反応または炎症を抑制するとは、免疫反応または炎症の発生率を低下させることを含む意味で用いられる。すなわち、本発明によれば、出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）において生じる免疫反応または炎症の発症率を低下させることに用いるための組成物であって、抗炎症剤または免疫抑制剤を含む、組成物が提供される。
【００２０】
また、本発明では、抗炎症剤または免疫抑制剤を出生後に免疫反応または炎症が観察された後で異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）に投与することで免疫反応または炎症を治療してもよいであろう。この態様では、例えば、免疫反応が観察されなかった場合には免疫抑制剤を投与しなくてもよく、炎症が観察されなかった場合には抗炎症剤を投与しなくてもよい。ここで、本明細書では、「治療」とは、その処置を行わない場合と比較してその処置を免疫反応または炎症が生じた後に行うことにより、免疫反応または炎症の程度を軽減し、または、免疫反応または炎症の発生を消失させることを意味する。
【００２１】
本発明のある側面では、出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）において、出生後に生じる免疫反応または炎症を予防および／または治療することに用いるための組成物であって、抗炎症剤または免疫抑制剤を含む、組成物が提供される。
本発明のある側面では、出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）において、出生後に生じる免疫反応または炎症を予防および／または治療する方法であって、抗炎症剤または免疫抑制剤を該動物に投与することを含む、方法が提供される。
【００２２】
本発明のある側面では、出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）を飼育する方法であって、抗炎症剤または免疫抑制剤を該動物に投与することを含む、方法が提供される。飼育中に、抗炎症剤または免疫抑制剤を出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）に投与することにより、該動物の表皮または臓器若しくは組織において生じる免疫反応または炎症を予防および／または治療することができる。
本発明のある側面では、出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）のための飼料であって、抗炎症剤または免疫抑制剤を含む、飼料が提供される。
【００２３】
本発明のある側面では、出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）を飼育するまたは成長させる方法であって、当該キメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含み、これにより、当該キメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）の免疫反応または炎症が予防および／または治療される、あるいは、免疫反応または炎症の発生率を低下させる、方法が提供される。
【００２４】
本発明のある側面では、出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）から成体を得る方法であって、当該キメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含み、これにより、当該キメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）の免疫反応または炎症が予防および／または治療される、あるいは、免疫反応または炎症の発生率を低下させる、方法が提供される。
【００２５】
抗炎症剤または免疫抑制剤は、有効成分の他に賦形剤を含んでいてもよい。抗炎症剤または免疫抑制剤は、表皮の免疫反応または炎症に対しては例えば表皮の当該免疫反応または炎症箇所に塗布することにより投与することができる。抗炎症剤または免疫抑制剤は、適宜、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、炎症組織内、または腹腔内）により投与することができる。抗炎症剤または免疫抑制剤は、全身投与してもよいし、患部に局所投与してもよい。抗炎症剤または免疫抑制剤の投与量は、当業者であれば免疫反応または炎症の鎮静化に必要な量を容易に決定することができる。
【００２６】
免疫抑制剤としては、特に限定されないが例えば、カルシニューリン阻害剤としてシクロスポリン、タクロリムス、mTOR阻害剤としてラパマイシン、エベロリムス、代謝拮抗剤であるアザチオプリン、ミゾリビン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、アルキル化剤としてシクロフォスファミドが挙げられ、本発明に用いることができる。
抗炎症剤としては、特に限定されないが例えば、ステロイド系抗炎症薬（ＳＡＩＤｓ）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）等が挙げられ、本発明で用いることができる。ステロイドとしては、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾンが挙げられ、本発明で用いることができる。その他、抗炎症剤としては、抗炎症性サイトカイン抗体、例えば抗ＴＮＦ−α抗体や、可溶化型サイトカイン抗体、例えば可溶化型ＴＮＦ受容体などの炎症性サイトカイン阻害薬が挙げられ、本発明で用いることができる。
本発明のある態様では、免疫抑制剤としての機能と抗炎症剤としての機能を有するステロイド系抗炎症剤が好ましく用いられ得る。また、本発明のある態様では、異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）に対して出生後に生じる免疫反応および炎症反応を抑制するために免疫抑制剤と抗炎症剤との組合せを投与してもよいであろう。但し、本発明では、免疫反応または炎症のどちらかを抑制するだけでも、十分な効果が得られると期待できる。
【００２７】
本発明のある側面では、出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）において、機能的な臓器または組織を製造する確率を向上させることに用いるための組成物であって、抗炎症剤または免疫抑制剤を含む、組成物が提供される。本発明のある側面では、本発明の異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）において、機能的な臓器または組織を製造する確率を向上させる方法であって、出生した異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含む、方法が提供される。抗炎症剤若しくは免疫抑制剤または抗炎症剤若しくは免疫抑制剤を含む組成物は、出生後に異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）に投与することができ、これにより体内または表皮において生じた免疫反応または炎症を抑えることができる。
【００２８】
本発明のある側面では、出生した異種間または同種異系間の胚盤胞補完キメラ動物において、機能的な臓器または組織を製造する方法であって、出生した異種間または同種異系間の胚盤胞補完キメラ動物に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含む、方法が提供される。出生した異種間または同種異系間の胚盤胞補完キメラ動物においては、多くの個体で多少なりとも免疫反応または炎症が生じる（顕著な免疫反応または炎症は一部の個体でのみ生じる）。従って、出生した異種間または同種異系間の胚盤胞補完キメラ動物に抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することにより、免疫反応または炎症の発生が抑制され、抗炎症剤または免疫抑制剤を投与しない場合と比較して得られる臓器または組織の機能が高まることとなる。本発明のある態様では、出生した複数の異種間または同種異系間の胚盤胞補完キメラ動物において、複数の機能的な臓器または組織を製造する方法であって、出生した複数の異種間または同種異系間の胚盤胞補完キメラ動物それぞれに抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含む、方法が提供される。また、これにより、複数、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、または５０以上の出生した異種間または同種異系間の胚盤胞補完キメラ動物において、機能的な臓器または組織を製造する場合に、抗炎症剤または免疫抑制剤を投与しない場合と比較して、より多くの機能的な臓器または組織を得ることができる。
【００２９】
本発明の異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ動物）においては、獲得免疫における寛容は成立していると思われるから、本発明の組成物は、獲得免疫の免疫抑制剤を含まないものであってよい。従って、本発明のある態様では、本発明の組成物または抗炎症剤若しくは免疫抑制剤は、獲得免疫の免疫抑制剤を含まない。しかし、本発明の別のある態様では、本発明の組成物は、獲得免疫の免疫抑制剤を含んでいてもよい。
【００３０】
本発明では、レシピエントの臓器の機能および形状を有する、ドナー細胞から実質的になる臓器が提供される。
本発明では、異種間の胚盤胞補完キメラ動物の体内にドナー細胞から実質的になる臓器を製造する方法であって、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有するレシピエント動物の胚盤胞にドナー多能性細胞を導入することと、胚盤胞を偽妊娠仮親雌の子宮に移植することと、胚盤胞補完キメラ動物を出産させることと、出産した動物を抗炎症剤または免疫抑制剤で処理することとを含む、方法が提供される。
【００３１】
本発明では、レシピエントの臓器の機能および形状を有する、ドナー細胞から実質的になる臓器であって、レシピエントの臓器形状が、ドナーの臓器形状とは異なる、臓器が提供される。
本発明では、異種間の胚盤胞補完キメラ動物の体内にドナー細胞から実質的になる臓器を製造する方法であって、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有するレシピエント動物の胚盤胞にドナー多能性細胞を導入することと、胚盤胞を偽妊娠仮親雌の子宮に移植することと、胚盤胞補完キメラ動物を出産させることと、出産した動物を抗炎症剤または免疫抑制剤で処理することとを含む、方法｛ここで、レシピエントの臓器形状が、ドナーの臓器形状とは異なる｝が提供される。
本明細書では、「レシピエントの臓器形状が、ドナーの臓器形状とは異なる」とは、形態分類学的に臓器形状（大きさおよび／または形）が異なることを意味する。
【００３２】
異種間または同種異系間のキメラ動物（例えば、胚盤胞補完キメラ）は、例えば以下のようにして得ることができる。まず、非ヒト哺乳動物の着床前胚（例えば、胚盤胞）を得る。次に、着床前胚（例えば、胚盤胞）とは異種であるか、または同種異系の多能性細胞を得る。多能性細胞は、内部細胞塊、ES細胞またはiPS細胞などを用いることができ、これらは当業者であれば適宜作成することができる。得られた着床前胚（例えば、胚盤胞）に上記異種または同種異系の多能性細胞を導入する。例えば、着床前胚（例えば、胚盤胞）の内腔に導入することができる。これを偽妊娠仮親雌の子宮に移植し、成長させると胎児が得られる。これをさらに出生させると、出生した異種間または同種異系間のキメラ（例えば、胚盤胞補完キメラ）が得られる。体のサイズが１０倍以上異なる種間であっても問題無くキメラ（例えば、胚盤胞補完）が成立する。従って、例えば、異種間のキメラ（例えば、胚盤胞補完キメラ）は、体の平均サイズの相違が１０倍以下である、哺乳動物間において実施することができる。また、遺伝子のコード配列に関しては、８０％以上（例えば、９０％以上、または９５％以上）の同一性があれば異なる種間であっても問題無くキメラ（例えば、胚盤胞補完キメラ）が成立する。従って、遺伝子のコード配列について８０％以上の同一性を有する哺乳動物間においてキメラ形成を成立または胚盤胞補完を実施することができる。本発明のある態様では、体の平均サイズの相違が１０倍以下であり、かつ、遺伝子のコード配列について８０％以上（例えば、９０％以上、または９５％以上）の同一性を有する哺乳動物間においてキメラ形成または胚盤胞補完を実施する。ヒトとブタやヒトとヒツジは、体の平均サイズの相違が１０倍以下であり、遺伝子のコード配列について８０％以上（例えば、９０％以上、または９５％以上）の同一性を有し、かつ、皮膚移植などの組織移植で過去実績を有する組合せであり、本発明において好ましい。
【００３３】
本発明によれば、免疫不全である、異種間または同種間のキメラ動物が提供される。本発明のある態様では、キメラ動物は、遺伝子改変を有していてもよい。本発明のある態様では、キメラ動物は、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有していてもよい。本発明のある態様では、キメラ動物は、免疫不全となる遺伝子改変または異常を含む多能性細胞と免疫不全ではない着床前胚とから作製されうる。本発明のある態様では、キメラ動物は、免疫不全となる遺伝子改変または異常を含む着床前胚と、免疫不全ではない多能性細胞とから作製されうる。ある態様では、キメラ動物は、それぞれ独立して免疫不全となる遺伝子改変または異常を含む多能性細胞と着床前胚とから作製されうる。
【００３４】
本明細書では、「免疫不全」とは、免疫反応の全部または一部が抑制されている状態を含む意味で用いられる。また、自然免疫系の機能低下、例えば補体経路活性化の一部または全ての抑制、マクロファージ、モノサイトの貪食作用の回避、NK細胞による細胞傷害の阻害、も含まれる。本発明のある態様では、免疫不全では、IL2Rg、RAG1、RAG2、Foxn1、PRKDC、MHCおよびSIRPaからなる群から選択される１以上が欠損され、または改変若しくは破壊されている。本発明のある態様では、免疫不全では、IL2Rg、RAG1、RAG2、Foxn1、およびPRKDCからなる群から選択される1以上の遺伝子が欠損され、または改変若しくは破壊されている。本発明のある態様では、免疫不全では、IL2RgおよびRAG2からなる群から選択される1以上の遺伝子が欠損され、または改変若しくは破壊されている。本発明のある態様では、免疫不全は、免疫系の発生および維持に不可欠な遺伝子の改変、免疫反応を弱める遺伝子の改変に起因する。例えば、免疫不全は、IL2Rg遺伝子、RAG1遺伝子、RAG2遺伝子、Foxn1遺伝子、PRKDC遺伝子、Hc(C5) 遺伝子、MHC遺伝子（クラスIをコードする遺伝子および／またはクラスIIをコードする遺伝子）およびSIRPa遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子の機能が不十分であることによる免疫不全であり得る。
【００３５】
本発明によれば、免疫不全である、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する動物、またはその着床前胚が提供される。このような動物の着床前胚は、当該臓器を形成する能力のある多能性細胞（例えば、野生型多能性細胞）を移植されることにより、移植した多能性細胞由来の臓器を備えたキメラ動物（例えば、同種異系キメラ動物および異種間キメラ動物）に成長させ得る。また、この際に、移植される多能性細胞を免疫不全となる多能性細胞とすることで、得られるキメラ動物における炎症がより改善され得る。ある態様では、動物は、非ヒト哺乳動物である。ある態様では、非ヒト哺乳動物は、ヒト細胞を体内に含んでいてもよい。
【００３６】
本発明によれば、
特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物の体内で当該臓器または細胞を作製する方法であって、
哺乳動物の多能性細胞を当該非ヒト哺乳動物の着床前胚に移植して、キメラ胚を得ることを含み、
前記多能性細胞および前記着床前胚のいずれかまたは両方は、免疫不全となる遺伝子改変または異常を有し、
前記多能性細胞と前記着床前胚とが、同種異系または異種の関係である、
方法
が提供される。多能性細胞が免疫不全となる遺伝子改変または異常を有する場合は、得られる臓器は、免疫不全の原因となる遺伝子改変または異常を有する。
【００３７】
本発明のある態様では、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物の体内で当該臓器を作製する方法は、キメラ胚を仮親雌（例えば、偽妊娠仮親雌）の子宮に移植することをさらに含んでいてもよい。本発明のある態様では、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物の体内で当該臓器または細胞を作製する方法は、キメラ胚から産仔を得ることをさらに含んでいてもよい。本発明のある態様では、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物の体内で当該臓器または細胞を作製する方法は、キメラ胚から得られた産仔を成長させることをさらに含んでいてもよい。本発明のある態様では、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物の体内で当該臓器または細胞を作製する方法は、産仔を成体にまで成長させることをさらに含んでいてもよい。本発明のある態様では、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物の体内で当該臓器または細胞を作製する方法は、得られた当該非ヒト哺乳動物に対して免疫抑制剤および抗炎症剤からなる群から選択される１以上を投与することをさらに含んでいてもよい。
【００３８】
本発明のある態様では、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物としては、特に限定されないが例えば、臓器または細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターに駆動される細胞死誘導因子をコードする遺伝子を有する非ヒト哺乳動物が挙げられる。上記のように、臓器または細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターにより細胞死誘導因子をコードする遺伝子を駆動させることによって、特定の臓器または特定の細胞に細胞死を誘導し、当該臓器または細胞を非ヒト哺乳動物に作らせないことができる。一方で、このような非ヒト哺乳動物に対して、当該臓器または細胞に寄与することができる細胞（例えば、多能性細胞等）を導入することにより、当該非ヒト哺乳動物において失われるはずであった当該臓器または細胞が、導入細胞により補完され、当該非ヒト哺乳動物の体内で導入細胞からなる当該臓器または細胞を作製することができる。細胞死誘導因子としては、Ｃａｓｐａｓｅ−８、Ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｂａｒｎａｓｅ、およびジフテリアトキシンなどの細胞障害性遺伝子が挙げられ、本発明で用いることができる。臓器または細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターとしては、AlbプロモーターやCD45プロモーターが挙げられ、本発明で用いることができる。
【００３９】
本発明のある態様ではまた、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物としては、特に限定されないが例えば、当該特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する遺伝子ノックアウト非ヒト哺乳動物またはトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることができる。そのようなトランスジェニック動物やノックアウト動物の例としては、Ｐｄｘ１遺伝子のノックアウト、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１遺伝子のトランスジェニック、およびＳａｌｌ１遺伝子のノックアウト、Flk1遺伝子のノックアウト、Hex遺伝子のノックアウト、Foxa1/Foza2遺伝子のダブルノックアウト、Otx2遺伝子のノックアウト、およびFoxn1遺伝子のノックアウトが挙げられ、本発明で用いることができる。例えば、Ｐｄｘ１遺伝子のノックアウトやＰｄｘ１−Ｈｅｓ１遺伝子のトランスジェニックでは、膵臓が欠損することが知られ、Ｓａｌｌ１遺伝子のノックアウトでは、腎臓が欠損することが知られており、これらは、上記遺伝子改変を有する胚に多能性細胞を導入することで多能性細胞に由来する細胞からなる臓器で補完されることが知られている。本発明のある態様ではまた、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物としては、特に限定されないが例えば、細胞自律的に当該特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物を用いることができる。本発明では、「細胞が形成されない異常」は、造血細胞、血球細胞または造血系が形成されない異常を含む意味で用いられる。
【００４０】
本発明によれば、免疫不全となる遺伝子改変または異常を有する多能性細胞を含む組成物であって、キメラ動物を作製することに用いるための組成物が提供される。本発明によれば、免疫不全となる遺伝子改変または異常を有する多能性細胞を含む組成物であって、特定の臓器または細胞が形成されない異常を有する非ヒト哺乳動物の体内で当該臓器または細胞を作製することに用いるための組成物が提供される。
これらの態様において、多能性細胞は、キメラ形成能を有する多能性細胞である。ある態様では、多能性細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト）のＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性細胞であり得る。ある態様では、キメラ動物の作製法は上述の通りである。ある態様では、多能性細胞は、免疫不全となる遺伝子改変または異常に加えて更なる遺伝子改変または異常を有しうる。ある態様では、多能性細胞は、当該免疫不全となる遺伝子改変または異常の他に更なる遺伝子改変および異常を有しない。ある態様では、多能性細胞は、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞であり得る。ある態様では、多能性細胞は、ヒト内部細胞塊（ヒトＩＣＭ）であり得る。ある態様では、多能性細胞は、アポトーシス抑制処理がなされた細胞であり得る。ある態様では、多能性細胞は、アポトーシス抑制遺伝子を過剰発現した細胞であり得る。ある態様では、多能性細胞は、単一細胞に分散した状態でコロニー形成する能力を有し得る。
【実施例】
【００４１】
実施例１：異種間キメラ動物の作製
本実施例では、膵臓欠損ラットの胚盤胞にマウス多能性幹細胞を導入することにより、胚盤胞を成長させて得られるラットの体内にマウスの細胞からなる膵臓を作製した。【００４２】
（１）膵臓欠損ラットの作製
膵臓欠損ラットは、マウスで行われたのと同様にPdx1コード領域内における変異導入により作製した（Takahashi, R., et al., Transgenic Res. 8, 397-400 (1999)）。ラットとしてはWisterラット（SLC Japanから購入）を用いた。具体的には、図１Ａに示されるように、雄のラット接合体の核に対して、Pdx1開始コドンの３ｂｐから下流および３５ｂｐから下流をそれぞれ標的としたPdx1 TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）とラットExo1のインビトロで転写したｍRNA（各ｍRNAを3 ng/μlまたは10 ng/μl）をインジェクションすることにより、Pdx1遺伝子を破壊して、Pdx1＋／ｍｕ膵臓欠損ラットを得た（3 ng/μlインジェクション群から４匹と10 ng/μlインジェクション群から３匹）。
得られたPdx1変異体には、図１Ｂに示されるように４種類のPdx1遺伝子の変異体Ａ〜Ｄが見られた。変異体ＡおよびＢ（以下、それぞれ「Pdx1+/muA」および「Pdx1+/muB」と呼ぶ）は、フレームシフト変異体であり、それぞれ３０番目および２８番目のアミノ酸において終止コドンを生じていた。変異体Ａを有するラットと変異体Ｂを有するラットとを交配させて、変異体AとBとをそれぞれのアリルに有するラット（Pdx1muA/muB）を得た。得られたラットはすべて、膵臓欠損の表現型を示し（図１Ｃ参照）、生後３日以内に死亡した。【００４３】
（２）胚盤胞補完による膵臓の再生
EGFP標識野生型マウスiPS細胞（GT3.2）またはESC（ｍRHT, SGE2）をPdx1+/muAの雄ラットとPdx1+/muBの雌ラット、またはPdx1+/muBの雄ラットとPdx1+/muAの雌ラットを交配させて得た複数の胚盤胞にインジェクションした。得られた１０週齢ラットの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からＥＧＦＰ陰性のＰＢＭＣの有無を検出した。Pdx1muA/muBの遺伝子型を有するラットは、iPS細胞注入群では１０％の頻度で、ES細胞注入群では２０％の頻度で確認された。膵臓が欠損するとラットは生後３日で死滅することから、Pdx1muA/muBの遺伝子型を有するラットは、iPS細胞またはES細胞で膵臓が補完されたラットであると理解された。【００４４】
Pdx1muA/muBの遺伝子型を有するラットにおいて形成された膵臓を観察すると全体がＥＧＦＰを発現していた。すなわち、Pdx1muA/muBの遺伝子型を有するラットにおいて形成された膵臓は、実質的にマウスのiPS細胞またはES細胞で形成されていた。以下、Pdx1muA/muBの遺伝子型を有するラットにおいて形成された膵臓を「マウスR膵臓」という。形成されたマウスR膵臓は、同一週齢の野生型ラットの膵臓と同じ大きさを有していた。すなわち、体の小さいマウスの細胞から、ラットサイズの大きな膵臓が得られた。糖負荷テスト（50％Ｄ−グルコース溶液を2.5g/kg体重で投与）では、Pdx1+/muキメララットや野生型ラットと比較して、胚盤胞補完したPdx1muA/muBのラットではグルコースに対する応答は遅かったが（グルコース投与６０分後にWTに対してp=0.035；120分後にWTに対してp=0.025）、グルコース投与から１２０分で＜200mg/dLにまで低下した。このことからマウスR膵臓は、ラット体内で機能することが分かった。【００４５】
実施例２：免疫拒絶と炎症の検出
同種異系での膵臓移植においては、移植直後から免疫拒絶により５０〜７０％の膵島が破壊される。そこで、実施例１で作製したマウスR膵臓を有するPdx1muA/muBのラットにおいて免疫拒絶の有無を観察した。【００４６】
マウスR膵臓を有するPdx1muA/muBのラットでは、著しい膵島の破壊は観察されなかった。しかし、成長と共に異常が生じ、一部のラットでは顕著な異常が認められ、多尿症およびケトン尿症（これらは糖尿病の兆候として知られる）を発症した。【００４７】
そこで、異常を示したマウスR膵臓を有するPdx1muA/muBラットについて６週齢と１０週齢にて糖負荷テストを行った。結果は、図２で示される通りであった。図２に示されるように、胚盤胞補完により得たマウスR膵臓を有するPdx1muA/muBのラットA（Pdx1muA/muBのラット−マウスキメラ個体A）は、6週齢では空腹時血糖が正常（95 mg/dL）であり、糖負荷テストでも糖尿病の兆候を示さないラットと同程度の応答を示した。しかし、このラットAは、１０週齢では糖尿病の兆候を示し、空腹時血糖が252 mg/dLになり、グルコース応答が見られなくなった。【００４８】
糖尿病を発症した上記ラットの膵臓を組織学的に解析した。膵臓切片にヘマトキシリン-エオシン染色を行ったところ、マウスR膵臓においてリンパ球の浸潤が認められ（図２右下図の矢印）、集積部を中心に膵島を含む周囲の組織にも存在が認められた。マウスR膵臓の膵島（図２右下図のIL）はリンパ球の攻撃により構造が崩壊していた。また、免疫組織学染色によりマウスR膵臓へのT細胞の浸潤とマクロファージの浸潤を確認した。T細胞は、１次抗体として抗CD3抗体を用い、さらにホースラディッシュペルオキシダーゼで標識された二次抗体を反応させ、染色したのちに観察した。マクロファージは、１次抗体として抗CD11ｂ抗体を用いて同様に染色し、観察した。その他、免疫組織学染色は常法の通りに行った。結果は、図３に示される通りであった。図３に示されるように、膵臓（特に腺房細胞および膵島）にリンパ球およびマクロファージが浸潤している様子が観察された（それぞれ矢印で示される）。このことは、膵臓が宿主から免疫による攻撃を受け、炎症を生じていることを示す。
胚盤胞補完により作製した異種間キメラ動物個体は、母体内ではこのような炎症反応を引き起こすことがなかった。また、上記の炎症反応は、異種間キメラ動物個体すべてで認められる現象ではなく、一部の異種間キメラ動物個体で生じた。
このことから、少なくとも抗炎症剤によって炎症を抑制することで、このような一部の個体においても、正常な異種膵臓を得ることが可能になると考えられた。【００４９】
ところで、胚盤胞補完により作製した異種間キメラ動物個体では、生後、表皮でも炎症が生じた。ヘマトキシリン-エオシン染色を行ったところ、ラット胚にマウスＥＳ細胞を移植して作製したマウス−ラットキメラでは表皮の肥厚（図４ｄ，ｈのＥｐ）、角質肥厚と脱落（図４ｄ，ｈの＊）といった異常な所見が認められた。さらに免疫染色により詳細な解析を進めた。ＧＦＰを元に移植細胞由来細胞の分布を確認したところ、皮膚の異常な所見が認められた領域にはマウスＥＳ細胞由来細胞が存在することがわかった（図４ｅ，ｉ）。移植されたマウスＥＳ細胞はＧＦＰで標識されていたことから、１次抗体として抗ＧＦＰ抗体を反応させ、ＨＲＰで標識された二次抗体を反応させ、常法のように染色した。同様に、抗ＣＤ４５抗体を１次抗体として血球細胞を染色したところ、異常な所見が認められた領域において血球細胞の集積が観察された（図４ｆ，ｊ）。さらに抗ＣＤ３抗体を１次抗体としてＴ細胞を染色したところ、集積した血球細胞の中にＴ細胞が含まれることが確認された（図４ｇ，ｋ）。以上から、皮膚においても図２、３のマウスR膵臓と同様、免疫反応・炎症反応が引き起こされていることがわかった。そこで、生後１日目からステロイド剤（デルモベート軟膏0.05%、グラクソ・スミスクライン社）を皮膚に塗布した。すると、無処理群に矢印で示したような皮膚異常は全く観察されなくなった（図５参照）。従って、膵臓の炎症も同様に抗炎症剤の投与により治療または予防できることが示された。【００５０】
実施例３：免疫不全動物を用いた異種間キメラの作製
本実施例では、まず、免疫不全動物の胚盤胞を得るため、ＩＬ２Ｒｇの破壊による免疫不全動物を作製した。ＩＬ２Ｒｇ−／−動物の表現型を確認し、その後、ＩＬ２Ｒｇ−／−動物の胚盤胞を用いて異種間キメラを作製した。【００５１】
（１）ＩＬ２Ｒｇ−／−ラットの作製
ＩＬ２Ｒｇは、インターロイキン２受容体γサブユニットをコードする遺伝子である。本実施例では、図６Ａに示されるようにターゲッティングベクターを用いてＩＬ２Ｒｇ遺伝子のエキソンの一部を薬剤耐性遺伝子であるネオマイシンに置き換えることによりＩＬ２Ｒｇを破壊したラットを作製した。ターゲッティングベクターにより相同組換えを受けたラットＥＳ細胞を着床前のラット胚に移植し、得られたキメララットを野生型ラットと交配させてＩＬ２Ｒｇ＋／−ラットを作製した。その後、ＩＬ２Ｒｇ＋／−ラット同士を交配させ、ＩＬ２Ｒｇ遺伝子が破壊されたＩＬ２Ｒｇ−／−ラットを得た。【００５２】
（２）ＩＬ２Ｒｇ−／−ラットの表現型
得られたＩＬ２Ｒｇ−／−ラットから末梢血を採取し、フローサイトメトリーにより血球分画を観察した。結果は、図６Ｂに示される通りであった。図６Ｂに示されるように、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラットでは、ＣＤ４５Ｒ陽性かつＣＤ３陰性であるＢ細胞が、野生型ラットと比較して顕著に減少していた。また、図６Ｂに示されるように、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラットでは、ＣＤ４５Ｒ陰性かつＣＤ３陽性であるＴ細胞が３３．５％（野生型）から３．４％へと顕著に減少していた上に、減少したＴ細胞をさらにソーティングすると、残存していたＴ細胞のほとんどがＣＤ４シングルポジティブ細胞であり、ＣＤ８シングルポジティブ細胞はほとんど消失していた。さらに、図６Ｂに示されるように、末梢血のＣＤ３陰性の分画に対して、ＣＤ４５ＲおよびＣＤ１６１でソーティングしたところ、ＣＤ４５Ｒ陰性かつＣＤ１６１陽性であるＮＫ細胞が野生型ラットと比較して顕著に減少していた。このように、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラットでは、Ｂ細胞、ＣＤ８シングルポジティブ細胞およびＮＫ細胞などの免疫細胞が野生型と比較して顕著に減少していた。【００５３】
ＩＬ２Ｒｇ−／−ラットの血液中の免疫グロブリンの量を常法に従って分析した。結果は、図６Ｃに示される通りであった。血中ＩｇＧ量は、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラットと野生型ラットとで同等であったのに対して、血中ＩｇＡ量は、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラットにおいて顕著に減少していた。このことから、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラットは、細胞性免疫が強く抑制されていると考えられた。【００５４】
（３）ＩＬ２Ｒｇ−／−ラット胚を用いたラット−マウスキメラ動物の作製と解析
上記実施例と同様にして、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラットの着床前胚に野生型マウスＥＳ細胞を移植して異種間キメラ動物（ＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラという）を作製した。対照として、野生型ラットの着床前胚に野生型マウスＥＳ細胞を移植して得た異種間キメラ動物（野生型ラット−マウスキメラという）を用いた。次に、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラの末梢血を回収し、フローサイトメトリーにより血球分画を得た。結果は図７Ａに示される通りであった。図７Ａに示されるように、野生型ラット−マウスキメラでは、ラット由来とマウス由来の両方のＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞が観察されたのに対して、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラでは、マウス由来のＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞が観察された一方でラット由来のＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞は顕著に減少していた。このように、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラでは、ＩＬ２Ｒｇ遺伝子を破壊した胚盤胞由来の免疫細胞が顕著に減少していた。【００５５】
次に、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラの表皮を観察した。結果は、図７Ｂに示される通りであった。図７Ｂのパネルｂは野生型ラット−マウスキメラ（６週齢）に多く見られる表皮の炎症像を示し、図７Ｂのパネルｇは、野生型ラット−マウスキメラ（１２週齢）に多く見られる表皮の炎症像を示す。図７Ｂのパネルｃおよびｄは、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラ（７週齢）のそれぞれ背側および腹側を示し、図７Ｂのパネルｈおよびｉは、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラ（１２週齢）のそれぞれ背側および腹側を示す。ＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラでは、野生型で認められた表皮の炎症や脱毛は、観察されなかった。ＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラの表皮の炎症を異なる別の個体でも確認したが、同様に表皮の炎症は特に確認されなかった。なお、図７Ｂのパネルｅおよびｆは、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラの別の個体（７週齢）のそれぞれ背側および腹側を示し、図７Ｂのパネルｊおよびｋは、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラ（１２週齢）のそれぞれ背側および腹側を示す。【００５６】
さらにＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラの皮膚から常法により組織切片を作製し、組織学的に分析した。結果は図７Ｃに示される通りであった。図７Ｃのパネルｌおよびその高倍率画像であるパネルｏに示される野生型ラットの皮膚と比較して、図７Ｃのパネルｍおよびその高倍率画像であるパネルｐに示される野生型ラット−マウスキメラの皮膚では、上皮層および真皮層の肥厚が確認された。上皮層および真皮層のこの肥厚は、炎症によるものであると考えられた。これに対して、図７Ｃのパネルｎおよびその高倍率画像であるｑに示されるＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラでは、皮膚組織の肥厚は観察されなかった。なお、野生型ラット−マウスキメラでは、皮膚の角化異常（角化の亢進）が認められたが、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラット−マウスキメラではこの角化異常は抑制されなかった。【００５７】
（４）ＩＬ２Ｒｇ−／−マウスＥＳ細胞を用いたラット−マウスキメラ動物の作製と解析
マウスＥＳ細胞のＩＬ２Ｒｇ遺伝子をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法によって破壊して、ＩＬ２Ｒｇ−／−マウスＥＳ細胞を得た。得られたＩＬ２Ｒｇ−／−マウスＥＳ細胞を野生型ラットの着床前胚に移植し、異種間キメラを作製した。得られた異種間キメラの表皮を生後１日目および７日目において観察した。結果は図８Ａのパネルａ〜ｄに示される通りであった。図８Ａのパネルｂ〜ｄに示されるように、この異種間キメラでは、表皮に角化異常（角化の亢進）や皮膚の肥厚が認められた。【００５８】
（５）ＥＳ細胞および胚の両方における免疫系破壊の影響
そこで、ＩＬ２Ｒｇ−／−ラットの着床前胚にＩＬ２Ｒｇ−／−マウスＥＳ細胞を導入して、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞が顕著に減少または消失した異種間キメラを作製した。得られた異種間キメラの表皮を生後１日目および７日目において観察した。結果は図８Ａのパネルｅおよびｆに示される通りであった。図８Ａのパネルｅおよびｆに示される通り、ＥＳ細胞および胚の両方においてＩＬ２Ｒｇ遺伝子を破壊した異種間キメラ動物では、皮膚の上記角化異常や肥厚は観察されなかった。また、生後６週前後において、ＥＳ細胞および胚の両方においてＩＬ２Ｒｇ遺伝子を破壊した異種間キメラ動物では、表皮の炎症反応も観察されなかった。【００５９】
次に、ＮＳＧマウス（NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ）のＥＳ細胞を、ＩＬ２Ｒｇ−／−ＲＡＧ２−／−ラットの着床前胚に導入して免疫系が重度に破壊された異種間キメラを作製した。ＮＳＧマウスは、重度免疫不全マウスとして知られ、ＩＬ２Ｒｇ−／−ＲＡＧ２−／−ラットも重篤な免疫不全を呈する。キメラ個体の判定は、ＮＳＧマウスＥＳ細胞に強制発現させたＧＦＰに基づいて行った。免疫系が重度に破壊されたこの異種間キメラ動物を蛍光顕微鏡下で観察すると、図８Ｂのパネルｊに示されるように、ＧＦＰを発現するマウス細胞とＧＦＰを発現しないラット細胞とを有する異種間キメラ個体が得られた。このような異種間キメラ動物において生後７日目において表皮を観察したところ、皮膚の異常角化や肥厚は全く観察されなかった。また、この異種間キメラ動物では、生後６週前後においても、表皮の炎症反応も観察されなかった。なお、図８Ｂ中、頭部に記号「＊」が付された動物が異種間キメラ個体であり、記号「＊」を有しない動物は非キメラ同腹仔であった。ＮＳＧマウスでは、獲得免疫系と自然免疫系の機能低下がより強く生じており、ＮＳＧマウス由来ES細胞を移植した際により強く異常が抑制された上記結果は、上記炎症や免疫反応に獲得免疫系および自然免疫系が関与していることを示唆する。また、ＩＬ２Ｒｇ−／−動物と比較してＮＳＧ動物やＩＬ２Ｒｇ−／−ＲＡＧ２−／−動物では獲得免疫系の抑制を強く受けているが、ＮＳＧとＩＬ２Ｒｇ−／−ＲＡＧ２−／−とを組み合わせた実験においてＩＬ２Ｒｇ−／−動物におけるよりも強く上記炎症や免疫反応が抑制されたことから、上記炎症や免疫反応には獲得免疫系の関与も示唆された。
このように、免疫や炎症を抑制することにより、異種間キメラ個体における炎症や免疫異常が低減されることが確認された。【００６０】
配列表
配列番号１：ラットＰｄｘ１遺伝子のエキソン１中のＴＡＬＥＮの標的配列（左側）
配列番号２：ラットＰｄｘ１遺伝子のエキソン１中のＴＡＬＥＮの標的配列（右側）
配列番号３：ラットＰｄｘ１遺伝子の標的部分の野生型の配列
配列番号４：ラットＰｄｘ１遺伝子の標的部分の改変された配列（変異体Ａ）
配列番号５：ラットＰｄｘ１遺伝子の標的部分の改変された配列（変異体Ｂ）
配列番号６：ラットＰｄｘ１遺伝子の標的部分の改変された配列（変異体Ｃ）
配列番号７：ラットＰｄｘ１遺伝子の標的部分の改変された配列（変異体Ｄ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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