(57)【要約】【課題】従来の蛍光顕微鏡に利用されているミラーユニットを応用して、目的波長の表面増強ラマン散乱光を簡易なシステムにて検出できる方法を提供する。【解決手段】金属ナノ粒子とラマン活性分子を複合化させた表面増強ラマン散乱プローブを用いて、表面増強ラマン散乱光を検出するシステムであって、励起光を放射する光源と、該光源から特定角度で入射した励起光のうち、特定の波長域の光を反射する第一の光分割素子と、表面増強ラマン散乱プローブを含有する試料であって、該第一の光分割素子からの反射光の照射により散乱光を放射する試料と、前記第一の光分割素子と同一または異なる光分割素子であって、該散乱光の入射により、前記特定の波長域とは異なる波長域の光を透過させる第二の光分割素子と、透過した散乱光が当たり、そのうち特定の波長域のラマン散乱光を通過させる光吸収フィルタと、該光吸収フィルタを通過したラマン散乱光の入射により、増強ラマン散乱を検出する受光部品とを備えてなる、検出システム。【選択図】図６
2017221981.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属ナノ粒子とラマン活性分子を複合化させた表面増強ラマン散乱プローブを用いて、表面増強ラマン散乱光を検出するシステムであって、
励起光を放射する光源と、
該光源から特定角度で入射した励起光のうち、特定の波長域の光を反射する第一の光分割素子と、
表面増強ラマン散乱プローブを含有する試料であって、該第一の光分割素子からの反射光の照射により散乱光を放射する試料と、
前記第一の光分割素子と同一または異なる光分割素子であって、該散乱光の入射により、前記特定の波長域とは異なる波長域の光を透過させる第二の光分割素子と、
透過した散乱光が当たり、そのうち特定の波長域のラマン散乱光を通過させる光吸収フィルタと、
該光吸収フィルタを通過したラマン散乱光の入射により、表面増強ラマン散乱を検出する受光部品とを備えてなる、検出システム。
【請求項２】
前記第一の光分割素子及び第二の光分割素子が、同一のダイクロイックミラーであり、
前記特定角度が４５°±１０°である、
請求項１に記載の検出システム。
【請求項３】
前記ダイクロイックミラーが、前記入射された励起光の光軸に対して４５°±１０°で配置され、
前記光吸収フィルタが、前記透過した散乱光の光軸に対して９０°±２０°に配置されるように適合された、落射蛍光顕微鏡用フィルタキューブをさらに備えてなる、
請求項２に記載の検出システム。
【請求項４】
前記光源がレーザーである、請求項１乃至請求項３のうち何れか一項に記載の検出システム。
【請求項５】
前記光源がキセノンアーク灯、水銀灯又はＬＥＤ光源である、請求項１乃至請求項３のうち何れか一項に記載の検出システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は表面増強ラマン散乱光を用いた分子センシング方法に関する。詳細には、効率的に測定対象表面の表面増強ラマン散乱プローブからの表面増強ラマン散乱を分光器を用いることなく検出する技術を提供するものであって、特に生体組織等の微量検体の検出に対して有用な技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
金属表面に吸着した有機分子に対して特異的に見出される特性として表面増強ラマン散乱（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＥＲＳ）がある。
この表面増強ラマン散乱が注目される１つの理由には単一分子や単一粒子からでも振動スペクトルを得ることができることにある。これにより生体分子認識など微量化学物質の検出が可能となるため、種々の研究が現在盛んに検討されている（非特許文献１、２、３）。【０００３】
そもそもラマン散乱は、その特性上、このような微量検出には全く不向きな物理現象である。その理由は次のように考えられる。
ラマン散乱は測定分子とレーザー光から放出される光子（フォトン）の衝突に起因している。たとえば１秒間に波長４８８ｎｍアルゴンレーザーから放出されるフォトン数は１Ｗ出力でおよそ２．５×１０１８個と見積もることができる。このうち測定分子と衝突できるフォトンは１０１３〜１０１５個程度であり、大多数のフォトンは該分子と衝突することなく素通りする。このわずかに測定分子と衝突するフォトンの衝突モードには、弾性衝突と非弾性衝突の２種類がある。前者は衝突の間に分子とフォトン間でのエネルギーの授受がないもので、この衝突モードで起こる散乱を「レイリー散乱」と呼んでいる。レイリー散乱ではフォトンと分子間のエネルギー授受が無いため散乱光の振動数はあくまでも入射光の波長に等しいことになる。上記のわずかに起こる分子とフォトンの衝突の大部分は、この弾性散乱であり、すなわち、散乱光の大部分がレイリー散乱である。
一方、非弾性散乱は、弾性散乱とは異なり、フォトンが分子と衝突した際にそのエネルギーを分子へと移動する。このため散乱光の振動数は、レイリー散乱とは対照的に、入射光の振動数とは異なるものとなる。このような散乱をラマン散乱と呼ぶ。特に、ラマン散乱光の振動数が入射光の振動数よりも大きい場合（フォトンが分子からエネルギーを得る場合）をアンチストークスラマン散乱（レイリー散乱より短波長側に検出される散乱）、逆にラマン散乱光の振動数が入射光の振動数よりも小さい場合（フォトンが分子にエネルギーを与える場合）ストークスラマン散乱（レイリー散乱より長波長側に検出される散乱）と呼ぶ。このような非弾性衝突を起こすフォトンは衝突フォトン全体のおよそ１／１０７程度である。すなわち、測定分子と衝突し、しかも非弾性衝突を起こし、ラマン散乱を引き起こすフォトン数は、入射フォトン数に対して非常に少ない。このためラマン散乱光の検出感度は低く、今まで微量分析手段として用いられることは少なかった。
しかし、１９７０年代に入るとＷ．Ｈｏｌｚｅｒら（非特許文献４）による気体ハロゲン分子の共鳴ラマン散乱スペクトルの測定など、多数の共鳴ラマンに関する研究が報告され始めた。この共鳴ラマン散乱による散乱強度の増大（通常、共鳴ラマン効果による強度増強は１０３〜１０５倍程度）に伴い、ラマン散乱は脚光を浴びるようになった。共鳴ラマンとは、ある分子の吸収帯に重なる波長の励起光を用いてラマン散乱を測定したときに、吸収帯の原因となる発色団部分の振動に由来するラマンバンドの強度が著しく増大する効果で、数μＭ程度の濃度の色素のラマンスペクトル測定を可能とした。
その後１９７７年に更にＰ．Ｐ．Ｖａｎ  Ｄｕｙｎｅら（非特許文献５）とＪ．Ａ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら（非特許文献６）のグループが独立に表面増強ラマン散乱を見出した。実際は、それより３年前にＦｌｅｉｓｃｈｍａｎｎらのグループがこの現象を観測していたが、彼らは散乱断面積が共鳴ラマン効果同様に増大していることに気がつかなかったようである。【０００４】
表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）は、一般には金属電極、ゾル、結晶、蒸着膜、半導体の表面上に吸着したある種の分子のラマン散乱強度が、その分子が溶液中にあるときよりも著しく増強される現象をいうが、現在でもその現象のメカニズムに関しては不明な点が多い。金、銀、銅、白金、ニッケルなどで表面増強ラマン散乱は確認されているものの、現在分かっている表面増強ラマンの特徴は、特に、銀や金において増強効果が大きいということである。その代表的物性は次のような依存性を示す。
１）金属表面の粗さが表面増強ラマン散乱特性発現に何らかの関与をしている。
２）表面増強ラマン散乱スペクトルは一般に明確な波長依存性を示す。
３）表面増強ラマン散乱強度は金属表面に吸着した分子の配向に依存する。また、金属表面からの距離に依存する。
表面増強ラマン散乱特性発現のメカニズムは現在２つの考え方が提案されている。１つは表面プラズモンモデルである。このモデルは反射スペクトルを励起光が金属表面に当たることによって生じる表面プラズモンの吸収であるとみなし、吸着分子の分子振動とこの表面プラズモン励起とのカップリングによって発現するものと考えるものである。もう１つのモデルは、電荷移動モデルと呼ばれるもので、反射スペクトルを金属表面と分子が形成する錯体の吸収と考え、この吸収に起因する共鳴ラマン効果により表面増強ラマン散乱が発現するという考え方である。
現在そのメカニズムは未だに解明されていないにせよ、先に説明した共鳴ラマン条件とは表面増強ラマン散乱の条件が重なった表面増強ラマン散乱では、散乱強度が１０１１〜１０１４倍程度にも増大することが明らかとなり、単一分子分光の可能性が大きく広がることとなった。この感度の高さゆえ、微量定性分析において表面増強ラマン散乱は既に応用され始めている。【０００５】
表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）による分子認識では、表面構築が非常に重要な役割を果たす。
表面増強ラマン散乱を応用した微量検出や分子認識に関する技術として、非常に強い局在電場を発現する金属ナノ粒子と光機能性分子を複合化させたナノラマンプローブが挙げられる。これに関し、例えば低分子芳香環化合物を直接静電相互作用によりナノ粒子表面に吸着させる方法や、チオール末端を有するローダミン、ナフタレン、キノリンなどレポーター分子をナノ粒子表面に吸着させたもの（非特許文献７）などが報告され、こうしたナノ粒子の分子認識センサーやｐＨセンサーへの表面増強ラマン散乱プローブとしての応用がなされている（非特許文献８）。
表面増強ラマン散乱粒子の合成法としては、ナノフレーク状金属複合体材料合成法（特許文献１）や、ナノ多孔質体表面にローダミン６Ｇなど色素（ラマン活性分子）を吸着させる方法（特許文献２）などが知られており、また金ナノ粒子を応用した例では基板上に金ナノロッドを固定し、その表面分子の増強ラマン散乱を分析に用いるもの（特許文献３）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−０６１５８０号公報
【特許文献２】特開２００８−１８４６７１号公報
【特許文献３】特開２００５−２３３６３７号公報
【特許文献４】特許第５８３５５８４号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ACS Nano 2（4）612-616,（2008）
【非特許文献２】Anal Chem, 79,6927-6932,（2007）
【非特許文献３】Anal Chem, 77, 6134-6139, （2005）
【非特許文献４】J.Chem.Phys. 52,399 （1970）
【非特許文献５】J.Electroanal Chem.,84,1 （1977）
【非特許文献６】J.Am.Chem.Soc.,99,5215,（1977）
【非特許文献７】Langmuir 23,10539-10545（2007）
【非特許文献８】Nano Lett. vol7, No9 2819-2823（2007）
【非特許文献９】J.Am.Chem.Soc. Vol131, 7518-7519 （2009）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一般的に用いられる分子認識法としてイムノブロット法がある。これは特定たんぱく質を検出する方法で、標識分子で修飾した特異抗体たんぱく質で、膜に転写（ブロット）した特定たんぱく質を検出するものである。具体的には、電気泳動法によりたんぱく質を分離しておき、それをメンブレン（膜）へブロティング（転写）し、このブロティングされたメンブレンをさらにブロッキング剤で表面をコートし、該メンブレンに対して目的たんぱく質（抗原）を認識する一次抗体を作用させた後に、該一次抗体に対して分子認識能を示す標識（分子認識プローブ、例えば蛍光分子など）を導入した二次抗体を作用させ、最終的に標識を検出（例えば蛍光検出）することにより、目的たんぱく質を検出するものである。この方法は一般にウェスタンブロティング法と呼ばれる。【０００９】
しかしながら、上記のウェスタンブロッティング法による分子認識は、先ず電気泳動法によるたんぱく質の分離において、目的たんぱく質と他のたんぱく質が近接または重なってしまった場合、誤認識を起こすなど問題があった。
また、分子認識プローブとして蛍光分子を用いた場合、分子認識時に蛍光分子同士が非常に閉所に集まった状態を形成するため、蛍光分子の蛍光発光時にエネルギー移動がおこり、蛍光強度の減少などの問題を起こすことが指摘されている。特に生体分子認識ではレーザー光による検体ダメージを避けるため、赤色蛍光発光剤が用いられることが多く、こうした問題が起こりやすい。
さらに、蛍光検出法において最も問題になるのがバックグラウンド蛍光（ノイズ）である。この原因の一つとして検体その物が持つ蛍光（自家蛍光）が挙げられ、特に生体材料の場合、非常に大きなバックグラウンドノイズにつながることが少なくない。そのため蛍光プローブが非常に微量である場合（すなわち目的物が非常に微量である場合）、このバックグラウンド蛍光（ノイズ）と蛍光プローブからの蛍光との区別がつかない場合が生じ得る。【００１０】
一方、ラマン散乱を用いた検出において、一般にはラマン分光装置が用いられる。本装置（分光器）において、サンプル表面から得られるラマン散乱光は装置内の回折格子（グレーティング）により分光され、分光されたそれぞれの信号をＣＣＤセンサーで検出するため、蛍光検出に比べ得られる情報量が格段に多くなる。
例えば蛍光検出の場合には、得られる情報は蛍光強度に限られるため、検出においてその検出物質の濃度がわかる程度である。また特に生体物質の蛍光検出では、生体物質自身の蛍光発光（自家蛍光）がバックグラウンドノイズとなり得るため、常に信号／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が大きくなるように制御することが非常に重要である。
これに対して、ラマン散乱光による検出では、得られる情報はラマン散乱強度による検出物質の濃度のみならず、その分光スペクトルから物質を構成する結合情報まで得ることができるなどのメリットがある。また、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）によるラマン散乱シグナルは、通常のラマン散乱シグナルに比べ遥かに大きいため、Ｓ／Ｎ比が非常に大きいことがメリットと言える。
しかしながら、従来のラマン散乱分光装置は非常に高価であり、簡易測定には不向きであった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を踏まえ、表面増強ラマン散乱のもつ非常に大きなＳ／Ｎ比を利用し、且つ、より簡易な方法による物質検出システムの提供を考えた。そして、従来の蛍光顕微鏡に利用されているミラーユニットを応用すること、具体的には特定の波長域の光を反射し且つそれとは異なる波長域の光を透過する光分割素子と、特定の波長域の光のみを通過させる光吸収フィルタとを組み合わせることにより、目的波長の表面増強ラマン散乱光を簡易なシステムにて検出できる方法を見出し、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち本発明は、第１観点として、金属ナノ粒子とラマン活性分子を複合化させた表面増強ラマン散乱プローブを用いて、表面増強ラマン散乱光を検出するシステムであって、
励起光を放射する光源と、
該光源から特定角度で入射した励起光のうち、特定の波長域の光を反射する第一の光分割素子と、
表面増強ラマン散乱プローブを含有する試料であって、該第一の光分割素子からの反射光の照射により散乱光を放射する試料と、
前記第一の光分割素子と同一または異なる光分割素子であって、該散乱光の入射により、前記特定の波長域とは異なる波長域の光を透過させる第二の光分割素子と、
透過した散乱光が当たり、そのうち特定の波長域のラマン散乱光を通過させる光吸収フィルタと、
該光吸収フィルタを通過したラマン散乱光の入射により、増強ラマン散乱を検出する受光部品とを備えてなる、検出システムに関する。
第２観点として、前記第一の光分割素子及び第二の光分割素子が、同一のダイクロイックミラーであり、前記特定角度が４５°±１０°である、第１観点に記載の検出システムに関する。
第３観点として、前記ダイクロイックミラーが、前記入射された励起光の光軸に対して４５°±１０°で配置され、前記光吸収フィルタが、前記透過した散乱光の光軸に対して９０°±２０°に配置されるように適合された、落射蛍光顕微鏡用フィルタキューブをさらに備えてなる、第２観点に記載の検出システムに関する。
第４観点として、前記光源がレーザーである、第１観点乃至第３観点のうち何れか一項に記載の検出システムに関する。
第５観点として、前記光源がキセノンアーク灯、水銀灯又はＬＥＤ光源である、第１観点乃至第３観点のうち何れか一項に記載の検出システムに関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ラマン分光装置（分光器）を使用せずとも簡易なシステムにて、例えば従来蛍光検出に用いられてきた蛍光顕微鏡のミラーユニットを利用して、金属ナノ粒子の近接界面に固定された有機分子（表面増強ラマン散乱プローブ）からの目的波長の表面増強ラマン散乱光を検出することにより、物質検出を行うことができる。
特に、従来の蛍光検出では、検体から発せられる検体固有の蛍光（自家蛍光）が常にバックグラウンドノイズとして存在する為、微量検出にあっては、目的の分子認識プローブ（蛍光分子）由来の蛍光とこのノイズとの切り分けが困難となるのに対し、ラマン散乱光はラマンプローブ特有のスペクトルであることから、検体自身の散乱光とは明確に区別することができる。
また、もともと検体自身のラマン散乱スペクトルの強度は非常に小さく、一方、表面増強ラマン散乱プローブ由来の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）の強度は非常に大きいことから、表面増強ラマン散乱を用いた検出では蛍光検出と比べて大きなＳ／Ｎ比を確保することができ、上述の簡易なシステムにて高感度の検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施例１で調製した表面増強ラマン散乱粒子（マラカイトグリーンを金ナノ粒子表面に担持させた粒子）を表面増強ラマン散乱プローブとして用いた時に得られる、金表面からの表面増強ラマンシフト（ｃｍ−１）を示す図である。
【図２】図２は、実施例１で調製した表面増強ラマン散乱粒子（マラカイトグリーンを金ナノ粒子表面に担持させた粒子）を表面増強ラマン散乱プローブとして用いた時に得られる、金表面からの表面増強ラマン波長（ｎｍ）を示す図である。
【図３】図３は、実施例１で調製した表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）粒子の表面増強ラマン散乱波長と、種々の光吸収フィルタの光透過波長との関係を示す図である（各フィルタの透過中心波長  Ａ：６８５ｎｍ、Ｂ：６９０ｎｍ、Ｃ：７００ｎｍ）。
【図４】図４は、実施例で用いたミラーユニットに使用した光吸収フィルタの光透過特性を示す図である（透過中心波長：６８５ｎｍ）。
【図５】図５は、実施例で用いたダイクロイックミラーの光透過特性を示す図である。
【図６】図６は、本発明の表面増強ラマン散乱光を検出するシステムの一例を示す図である。
【図７】図７は、実施例４で検出したＫ５６２細胞表面からのラマン散乱光の観察写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
前述したように、分子認識プローブとして蛍光分子を用いた前述の生体物質の検出法（イムノブロット法）は広く重宝されているものの、生体物質の自家発光がバックグラウンド蛍光（ノイズ）となることから、目的とする検出物が微量発現である場合、Ｓ／Ｎ比を上げることが困難となる事態が生じ得る。
ここで本発明者らは、通常のラマン散乱の強度に対して、表面増強ラマン散乱の強度は飛躍的に高まることに着目した。これまでラマン散乱の研究分野においては分光器を用いたスペクトル分析が研究の主軸であり、単一波長検出への適用については報告がない。本発明者らは、上述した微量の生体物質の検出するにあたり、蛍光検出に代えて、ラマン散乱を用いた特定波長の検出に初めて取り組み、表面増強ラマン散乱プローブを用いることで大きなＳ／Ｎ比を実現し、従来の分光器を用いることなく、簡易なシステムにて、例えば従来の蛍光顕微鏡のミラーユニットを応用することで、微量発現の目的物を簡易に且つ高感度に検出できるシステムを完成させた。
具体的には、表面増強ラマン散乱プローブより得られるラマン散乱スペクトルの特定波長（ｎｍ）の散乱光に着目し、励起波長をサンプルに入射し、着目した特定波長（ｎｍ）のラマン散乱光のみを透過するフィルタとダイクロイックミラー等の光分割素子を組み合わせることにより、ラマン散乱光を検出することが可能となることを見出した。
以下、本発明を詳述する。
【００１６】
＜表面増強ラマン散乱光を検出するシステム＞
本発明の表面増強ラマン散乱光を検出するシステム（以下、“ラマン散乱光検出システム”と称する）は、
励起光を放射する光源、特定の波長域の光を反射する第一の光分割素子、表面増強ラマン散乱プローブを含有する試料、前記特定の波長域とは異なる波長域の光を透過させる第二の光分割素子、特定の波長域の光を通過させる光吸収フィルタ、及び、増強ラマン散乱光を検出する受光部品、から構成される。
以下、本発明に係る各構成について詳述する。
【００１７】
１）励起光を放射する光源
励起光源としては特に限定されるものではないが、測定対象（試料）からのラマン散乱光を効率よく検出するべく、レーザーを使用することが好適であり、使用目的（測定対象）に応じて種々のレーザーが使用され得る。また、光源として、キセノンアーク灯、水銀灯、ＬＥＤ光源等を使用することもできる。
なお測定対象からのラマン散乱光と蛍光が重なると良好なラマンスペクトルが得られないが、ラマン散乱光は励起光の励起波長に依存して波長が変化することから、測定対象のラマン散乱特性及び蛍光特性を考慮して選択することが望ましい。
【００１８】
２）光分割素子
本発明で使用する光分割素子は、特定角度で入射した光のうち、特定の波長域の光を反射する素子、そして前記特定の波長域とは異なる波長域の光を透過する素子である。
本発明のラマン散乱光検出システムにおいて、第一の光分割素子は、前記光源から特定角度で入射した励起光のうち、特定の波長域（例えば、着目したラマン散乱を試料から生じさせる波長域）の光を後述する試料に向けて反射する素子であって、謂わば該試料に反射光を照射する働きを担う素子である。特定の波長域は、試料、例えば表面増強ラマン散乱プローブに用いるラマン活性分子により定められる。また第二の光分割素子は、後述する試料からの散乱光を入射し、前記特定の波長域とは異なる波長域の光を透過する素子であって、謂わば後述する光吸収フィルタに向けて試料からの散乱光を通過させる働きを担う素子である。例えば、第二の光分割素子は試料からの散乱光のうち、レイリー散乱光を実質的に透過しないで、その他のラマン散乱光等の散乱光を透過する素子である。
【００１９】
本発明のラマン散乱光検出システムは、特定の波長域の光を反射する第一の光分割素子と、前記特定の波長域とは異なる波長の光を透過する第二の光分割素子の２つの異なる光分割素子を含み得る。また、後述する試料に照射する反射光（励起光）や、後述する光吸収フィルタに向けて通過させる試料からの散乱光の波長や光の強度などに応じて、第一の光分割素子、並びに、第二の光分割素子のいずれも、２つ以上の複数の光分割素子にて構成することもできる。
あるいはまた、本発明のラマン散乱検出システムにおいて、第一の光分割素子と第二の光分割素子を同一の素子とすることができる。すなわち光分割素子が、励起光を反射させて試料に反射光を照射させる働きを担うと共に、試料からの散乱光を光吸収フィルタに向けて透過させる働きを担ってもよい。
【００２０】
好ましい態様において、前記第一の光分割素子と第二の光分割素子が同一の素子で構成され、こうした光分割素子としてダイクロイックミラーを用いることが好適であり、また波長選択性のないハーフミラーを用いることもできる。
なかでも光分割素子として、特に４５°±１０°で入射した光のうち、特定波長域の光を反射し、またそれとは異なる波長域の光を透過させる、ダイクロイックミラーを用いることが好ましい。
【００２１】
３）表面増強ラマン散乱プローブを含有する試料
測定対象である試料には、第一の光分割素子からの反射光の照射により散乱光を放射する表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）プローブを含有させてなる。
表面増強ラマン散乱シグナルを発現させる表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）プローブは特に限定されるものではない。例えば、後述する数ナノメートル乃至数百ナノメートル、例えば４０ｎｍ程度の粒子径で構成される金属ナノ粒子の表面に、特に限定するものではないがラマン活性分子として色素分子を吸着させ、得られたナノ粒子を沈降しない程度にさらに凝集させることによって作製することができる（特許文献４参照）。さらにこの表面増強ラマン散乱粒子に、特に限定するものではないが、たとえば細胞を認識する核酸アプタマーなどの、目的検体を認識できる分子認識プローブ分子を吸着させることにより、表面増強ラマン散乱による細胞認識粒子とすることができる（ＳＥＲＳ認識粒子）。試料に対して表面増強ラマン散乱認識粒子を作用させ、検体を認識させた後にラマン散乱測定をすることにより、目的検体の検出が可能となる。
【００２２】
上記金属ナノ粒子としては特に限定されないが、表面プラズモン共鳴を生ずる共鳴波長を紫外線領域から赤外線領域に有する金属元素よりなり、例えば、金、銀、銅、白金、ニッケル、アルミニウム等から選択される金属元素よりなる粒子が挙げられ、特に金ナノ粒子又は銀ナノ粒子を用いることが好適であり、中でも金ナノ粒子を用いることが好ましい。
上記金属ナノ粒子は、１ｎｍ乃至５００ｎｍの、好ましくは１ｎｍ乃至１００ｎｍの、より好ましくは５ｎｍ乃至１００ｎｍの、特に好ましくは５ｎｍ乃至５０ｎｍの、例えば２０ｎｍ程度、或いは４０ｎｍ程度の平均粒子径を有することが望ましい
また上記ラマン活性分子としては、例えばローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、クリスタルバイオレット（ＣＲＶ）、クマリン、マラカイトグリーン、各種食品着色料から選択される色素分子が挙げられ、芳香環が幾つか連結した縮合環化合物などもラマン活性分子として使用可能である。
【００２３】
先に述べたように、ラマン分光装置により、上記表面増強ラマン散乱認識粒子のラマン散乱光を観察すると、ラマンプローブに依存するスペクトルが得られる。通常ラマン散乱光のスペクトルは波数（ｃｍ−１）で示される。ここで得られたスペクトル（波数）は、入射レーザー光及び散乱光の波長をそれぞれλｉ、λｓ（ｃｍ）とすると、［波数（ｃｍ−１）＝１／λｉ−１／λｓ］で表されることから、該関係式を用いて波数／波長を互いに変換できる。そして、表面増強ラマン散乱認識粒子に基づき得られるラマン散乱スペクトルの特定波長に着目して、特定の波長域の光を試料に入射させる、そして、着目したラマン散乱光のみを透過させる、前述の光分割素子及び後述の光透過フィルタが選定される。
【００２４】
４）光吸収フィルタ
本発明では、光吸収フィルタとして、前記第二の光分割素子を透過した散乱光のうち、特定の波長域のラマン散乱光を通過させるフィルタを選択すればよい。前述したように、ラマン散乱光は励起光の励起波長に依存して波長が変化することから、測定対象のラマン散乱特性を考慮して、光吸収フィルタを選択すればよい。例えば、着目したラマン散乱光を、後述する受光部品に向けて透過することができる光吸収フィルタを選択する。
【００２５】
５）受光部品
増強ラマン散乱を検出する受光部品としては、特に限定されないが、ＣＣＤセンサなど使用できる。
【００２６】
６）フィルタキューブ
本発明の好ましい態様では、落射蛍光顕微鏡用フィルタキューブを利用し得る。該フィルタキューブは、前記光分割素子（ダイクロイックミラー）を、入射光（励起光）の光軸に対して４５°±１０°に設置でき、また前記光吸収フィルタを、前記透過した散乱光の光軸に対して９０°±２０°に設置できる。なお、通常、蛍光検出を行う場合、フィルタキューブには光吸収フィルタ、光分割素子に加え励起フィルタが設置され、これらを含みてミラーユニットが構成されるが、ラマン検出の場合、多くの場合励起光源としてレーザーが用いられるため、励起光を選択させるための励起フィルタは必ずしも必要とされない。なお、光源として前述のキセノンアーク灯、水銀灯又はＬＥＤ光源を用いる場合には、励起フィルタを用いて励起光を選択することが好適である。
このように、本発明では、既存の蛍光顕微鏡に用いられている器具・装置を用いて、目的波長の表面増強ラマン散乱光を検出するためのシステムを容易に構築できる。
【００２７】
図６に本発明の表面増強ラマン散乱光を検出するシステムの一例を示す。本例では、前記第一の光分割素子（反射）と前記第二の光分割素子（透過）を同一の光分割素子７が担い、該光分割素子７と光吸収フィルタ８がフィルタキューブ６に配置され、ミラーユニットを構成している。
図６に示すように、光源１から照射された励起光（入射光）２−１は光分割素子７にて反射され、反射された励起光（反射光）２−２が試料５（図示されない表面増強ラマン散乱プローブを含む）を照射する。そして励起光２−２の照射により、試料５から励起された散乱光３は、光分割素子７及び光吸収フィルタ８を透過し、目的とする波長のラマン散乱光４が受光部品９、例えばＣＣＤカメラ等にて受光される。
【００２８】
光分割素子７の選択は、例えばストークスラマン散乱を発現する検出プローブを用いる場合、励起波長の光を反射し、励起波長よりも長波長の光を透過するダイクロイックミラーを選択すればよい。具体的には、後述する実施例において用いた金ナノ粒子にラマン活性分子としてマラカイトグリーンを吸着させたプローブを用いる場合、５３０ｎｍレーザーを励起光に用い、５３０ｎｍレーザー光を反射し、５４０ｎｍより長波長の光を透過するミラーを用いれば目的とする６８３ｎｍラマン光を受光部品（検出器）に導入することが可能となる。
また光分割素子としてハーフミラーを用いる場合には、ハーフミラーで８０％の光を反射し、２０％の光を透過するミラーを用いると、上記と同じ理屈でラマン散乱光を検出器に導入することができる。ただ、この場合非常に強いラマン散乱強度が要求される。
【００２９】
光分割素子７を透過したラマン散乱光は、例えば図２に示すように様々な波長を有しているため、この中から特に着目している波長の光を取り出すために、特定の波長のみ透過する光吸収フィルタ８が適用される。後述する実施例において、例えば６８５ｎｍ付近の波長の光のみを透過する光吸収フィルタを用いることにより、この発光波長のラマン散乱光のみを受光部品９（検出器）へ導入することができる。
【００３０】
なお、金属ナノ粒子に対して光などの外部電場を照射するとその電場振動に伴い金属表面の電子が振動し、この振動に付随した振動電場が粒子界面に形成される。例えばこの振動電場は粒子が接近すると足し合わされ増強電場を形成する。この増強電場の強度は近接する粒子の距離に依存し、粒子間隔が狭くなるほど強くなるがある距離で最大値を取り、近接粒子が接合すると粒子形態が変化するため電場強度に偏りが生じる。そこで、先ず金属粒子同士が接合しない状態で近接できる場を形成することが肝要である。
例えば本発明では、後述する実施例において、特許文献４に従い合成した表面増強ラマン散乱粒子を用いる。表面増強ラマン散乱粒子の合成に関し、特に限定するものではないが、ラマン活性分子としてマラカイトグリーンを用いた場合、マラカイトグリーンを用いた表面増強ラマン散乱プローブから得られるラマン散乱光は、図１に示す通りとなる。
この得られたラマン散乱スペクトルの横軸の波数（ｃｍ−１）を、上記関係式を用いて波長（ｎｍ）に変換したものが図２である。たとえば、図２の６８３ｎｍスペクトルを検出する場合、蛍光顕微鏡の蛍光ミラーユニットにおいて特に限定するものではないが、光吸収フィルタに６８５ｎｍ付近の波長を透過するフィルタを用いれば、従来の蛍光顕微鏡を用いてマラカイトグリーンから発せられるラマン散乱光をとらえることができる。
【００３１】
以上述べた通り、本発明は、従来のようなラマン散乱の検出に大掛かりなラマン分光器を用いる事なく簡便にラマン散乱光を検出する非常に有用な技術である。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明について、さらに具体的かつ詳細に実施例を用いて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３３】
［実施例１  表面増強ラマン散乱粒子分散液の合成］
金ナノ粒子分散液（シグマアルドリッチ社製、粒子径４０ｎｍ）１９０マイクロリットルに対して、予め１００マイクロモル／リットルに調整したＤＮＡアプタマー１０マイクロリットルを混合し、１７時間室温で撹拌し、その後５０℃で３時間放置して、アプタマー吸着金粒子分散液を得た。濃度１ミリモル／リットルに調整したマラカイトグリーン溶液  １マイクロリットルを、上記アプタマー吸着金粒子分散液に添加し、１時間撹拌した。撹拌終了後、当該分散液を１０，０００回転／秒で１０分間遠心し、粒子を沈降させ、表面増強ラマン散乱粒子を回収した。必要に応じ、水で数回粒子を洗浄した。その後、所定量の水若しくはリン酸バッファー若しくはその他塩を含む水に分散させ、表面増強ラマン散乱粒子分散液とした。【００３４】
［実施例２  表面増強ラマン散乱光の測定］
実施例１で作製した表面増強ラマン散乱粒子分散液を内径５００ミクロンの石英キャピラリー管に入れ、これを（株）堀場製作所製ラマン分光器（５３０ｎｍレーザー、２０倍対物レンズ）により、表面増強ラマン散乱スペクトル測定を行った。得られた結果を図１（横軸：ラマンシフト）及び図２（横軸：ラマン波長）にそれぞれ示す。【００３５】
［実施例３  蛍光フィルタユニットへ導入するミラー及び光学フィルタの選定］
図３に、実施例１で調製した表面増強ラマン散乱粒子の表面増強ラマン散乱波長と、種々の光吸収フィルタの光透過波長との関係を示す。図３において、Ａ、Ｂ及びＣで表される波長範囲は、それぞれ透過中心波長６８５ｎｍ、６９０ｎｍ、７００ｎｍを有する光吸収フィルタの各光透過波長範囲を示す。
また図４には、透過中心波長：６８５ｎｍの光吸収フィルタの光透過特性を、図５にはダイクロイックミラーの光透過特性（５３０ｎｍレーザーを反射、５４０ｎｍより長波長の光を透過）を、それぞれ示す。
これら光吸収フィルタ及びダイクロイックミラーを図６に示すようにフィルタキューブに配置することで容易に吸収フィルタからラマン散乱光のみを取り出すことができる。【００３６】
［実施例４  細胞表面のラマン散乱光のＣＣＤカメラによる検出］
たとえば、実施例１のＤＮＡアプタマーがＫ５６２白血病細胞に対して親和性のあるＤＮＡアプタマーである場合、先ずＫ５６２細胞を培養する。生細胞と死細胞を分離し生細胞のみを取り出す。取り出したＫ５６２細胞１×１０６細胞に対して実施例１で作成した表面増強ラマン散乱粒子分散液５マイクロリットルを添加し、３７℃で１時間静置する。その後、リン酸バッファー液で細胞を洗浄した後実施例３記載のミラーユニットを設置した蛍光顕微鏡で細胞表面を観察した。その結果図７に示すような細胞表面からのラマン散乱光がＣＣＤカメラによって観察された。
【符号の説明】
【００３７】
１  光源
２  励起光
２−１  励起光（入射光）
２−２  励起光（反射光）
３  散乱光
４  ラマン散乱光
５  試料
６  フィルタキューブ
７  光分割素子（ダイクロイックミラー）
８  光吸収フィルタ
９  受光部品（ＣＣＤカメラ）
１０  Ｋ５６２細胞表面からのラマン散乱光
【図１】
2017221981.tif 000003
【図２】
2017221981.tif 000004
【図３】
2017221981.tif 000005
【図４】
2017221981.tif 000006
【図５】
2017221981.tif 000007
【図６】
2017221981.tif 000008
【図７】
2017221981.tif 000009
【国際調査報告】
2017221981.tif 000010
2017221981.tif 000011
2017221981.tif 000012
2017221981.tif 000013