(57)【要約】  腎臓組織モデルとして利用可能な新たな組織を提供すること。  間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び純系胎児性腎臓細胞を含む細胞群を共培養することを含む、腎臓様組織の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び純系胎児性腎臓細胞を含む細胞群を共培養することを含む、腎臓様組織の製造方法。
【請求項２】
間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び純系胎児性腎臓細胞がヒト又はマウス由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
純系胎児性腎臓細胞がHEK細胞又はM15細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
細胞群が、iPS細胞、ES細胞、或いはこれらの細胞から分化誘導された細胞を含まない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
共培養を１２時間以上３６時間以下の時間行う、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
間葉系幹細胞と純系胎児性腎臓細胞の細胞数の比率（間葉系幹細胞：純系胎児性腎臓細胞）が１：１０〜１０：１である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
細胞群が、更に尿細管細胞及び／又はメサンギウム細胞を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
腎臓細胞に外来遺伝子が導入されている、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法によって得られた腎臓様組織。
【請求項１０】
請求項９に記載の腎臓様組織の腎臓モデルとしての使用。
【請求項１１】
請求項９に記載の腎臓様組織に候補物質を添加し、添加前と添加後の腎臓様組織の遺伝子発現プロファイルを比較することを含む、腎疾患に影響を与える物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
腎臓組織モデルに関する技術が開示される。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の腎臓は、生涯にわたる水塩基平衡の制御及び老廃物の排出による身体の恒常性の維持にとって不可欠である。腎疾患は先進国全体で増え続ける深刻な問題である。糸球体疾患は、主に世界的な末期腎不全（ＥＳＲＤ）と関連するコストの増加の原因となっている。【０００３】
実物大の成人の腎臓は、６０を超える細胞種を含有し、解剖学的に複雑な構造を有する。その複雑さ及びその分裂終了性（postmitotic nature）のために、ポドサイトは糸球体濾過障壁の最も脆弱な構成要素である。残念なことに、ポドサイトを様々な種類の環境ストレスから防御する修復機構の分子的性状については非常に僅かしか知られていない。ポドサイトは毛細血管内皮細胞及び糸球体基底膜（ＧＢＭ）とともに濾過障壁を形成し、糸球体毛細血管壁の選択的な透過性を可能にする。よって、ポドサイト損傷は、糸球体疾患の進行及び糸球体硬化の発症において重要な役割を果たす。【０００４】
ポドサイトは高度に特殊化した細胞であり、その機能には糸球体毛細血管の支持、糸球体基底膜の合成及び糸球体透過選択性の調節が含まれる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで三次元（３Ｄ）ネフロン構造を再構成するネフロン前駆体を構築し、維持することが、発生生物学及び再生医療において課題となっている。それぞれの器官についてモデル系として使用されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ３Ｄ組織様構造を構築する概念は、魅力的な実験アプローチである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表2015-510500号公報
【特許文献２】ＷＯ2009/099152号公報
【特許文献３】ＷＯ2010/047132号公報
【特許文献４】ＷＯ2014/200115号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Takasato et al., Nature, VOL.526, 564-568, 2015
【非特許文献２】Morizane et al., Nature Biotechnology, Vol. 33, 1193-1200
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のような現状の下、腎臓組織モデルとして利用可能な新たな組織を提供することは一つの課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、胎児由来腎臓細胞、間葉幹細胞、及び血管内皮細胞を共培養することにより、自己組織化される三次元腎臓様組織が形成され、当該組織がポドサイトと同様の遺伝子発現プロファイルを示すことを見出した。また、当該組織の遺伝子発現プロファイルは、胎児由来腎臓細胞の遺伝子発現プロファイルよりも成人の腎臓における遺伝子発現プロファイルに近いことが確認された。斯かる知見に基づいて更なる研究を重ねた結果、上記の三種類の細胞に尿細管細胞及び／又はメサンギウム細胞を組み合わせて共培養することにより尿細管の特徴をも備えた三次元腎臓様組織が得られることを見出した。これらの知見に基づいて更なる研究を重ねた結果、下記に代表される発明が提供される。【０００９】
項１．
間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び純系胎児性腎臓細胞を含む細胞群を共培養することを含む、腎臓様組織の製造方法。
項２．
間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び純系胎児性腎臓細胞がヒト又はマウス由来である、項１に記載の方法。
項３．
純系胎児性腎臓細胞がHEK細胞又はM15細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
項４．
細胞群が、iPS細胞、ES細胞、或いはこれらの細胞から分化誘導された細胞を含まない、項１又は２に記載の方法。
項５．
共培養を１２時間以上３６時間以下の時間行う、項１〜４のいずれかに記載の方法。
項６．
間葉系幹細胞と純系胎児性腎臓細胞の細胞数の比率（間葉系幹細胞：純系胎児性腎臓細胞）が１：１０〜１０：１である、項１〜５のいずれかに記載の方法。
項７．
細胞群が、更に尿細管細胞及び／又はメサンギウム細胞を含む、項１〜６のいずれかに記載の方法。
項８．
腎臓細胞に外来遺伝子が導入されている、項１〜７のいずれかに記載の方法。
項９．
項１〜８のいずれかに記載の方法によって得られた腎臓様組織。
項１０．
項９に記載の腎臓様組織の腎臓モデルとしての使用。
項１１．
項９に記載の腎臓様組織に候補物質を添加し、添加前と添加後の腎臓様組織の遺伝子発現プロファイルを比較することを含む、腎疾患に影響を与える物質をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００１０】
ｉＰＳ細胞を用いた場合と比較すると、誘導する手間が省け及び癌化の懸念もない。誘導するための特殊な培地の使用は不要であり、細胞を培養する一般的な培地が使用できる。短時間（例えば、２４時間）の培養で自己組織化した腎臓様組織を得ることができる。より成人の腎臓に近いプロファイルを有するモデル組織を提供することができる。腎疾患患者等の個人の腎細胞を用いることにより、当該個人に特徴的なモデル腎組織を得ることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒト胎児由来腎臓細胞単独の培養、又は、内皮細胞、間葉系幹細胞、及びヒト胎児由来腎臓細胞の共培養によって得られた細胞の凝集体の経時的な形態変化を示す。
【図２】ヒト胎児由来腎臓細胞単独の培養によって得られた凝集体組織、並びに、内皮細胞、間葉系幹細胞、及びヒト胎児由来腎臓細胞の共培養によって得られた腎臓様組織の遺伝子発現プロファイルを示す。
【図３】内皮細胞、間葉系幹細胞、及びヒト胎児由来腎臓細胞の共培養によって得られた腎臓様組織（腎臓様ミクロスフィア）を共焦点レーザー走査型顕微鏡で撮像した画像を示す。
【図４】腎臓様ミクロスフィア内での血管構築を確認した結果を示す。
【図５】腎臓様ミクロフフィア当たりのウロモジュリン（THP）分泌量を測定した結果を示す。
【図６】内皮細胞、間葉系幹細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞、ヒトメサンギウム細胞、及びヒト尿細管細胞を共培養することによって腎臓様ミクロスフィアが形成されたことを示す。
【図７】内皮細胞、間葉系幹細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞、ヒトメサンギウム細胞、及びヒト尿細管細胞を共培養して得た腎臓様ミクロスフィア（KLS）の遺伝子発現プロファイル、並びにそれに対するシスプラチン（cis）、メトフォルミン、又はTGF1βの中和抗体の影響を示す。
【図８】マウス胎児由来腎臓細胞単独の培養、又は、マウス由来の内皮細胞、間葉系幹細胞、及び胎児由来腎臓細胞の共培養によって得られた凝集体組織における遺伝子発現プロファイルを示す。
【図９】胎児由来腎臓細胞、間葉幹細胞、近位尿細管細胞及び血管内皮細胞を共培養して形成された三次元腎臓様組織（Ａ）、これを５μMの濃度のcisplatinに暴露させた後にβ２ミクログロブリンを測定した結果（Ｂ）、及びスフィアの形状の変化を撮影した画像（Ｃ）を示す。
【図１０】三次元腎臓様組織にpuromycinを暴露させることによるnephrin遺伝子発現の変化を示す。
【図１１】三次元腎臓様組織（Ａ）に、巣状糸球体硬化症患者の血清を添加した後の形状の変化を示す（Ｂ）。
【図１２】三次元腎臓様組織を免疫不全マウスに腎被膜下移植した後の形状・構造の変化を示す。Ａ及びＢは、管腔内部の赤血球の存在、Ｃ及びＤは管腔の存在、Ｅ及びＦは基底膜の存在を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び純系胎児性腎臓細胞を含む細胞群を共培養することを含む、腎臓様組織を製造する方法が提供される。
【００１３】
間葉系幹細胞の種類は任意であり、血管内皮細胞及び純系胎児由来腎臓細胞と共培養されることによって腎臓様ミクロスフィアを形成し得るものであれば、特に制限されない。間葉系幹細胞は、例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、及び臍帯血から成る群より選択される組織に由来するものを挙げることができる。間葉系幹細胞は、ヒト由来でもヒト以外の動物由来であっても良い。ヒト以外の動物としては、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、チンパンジー、ヤギ、及びウシ等を挙げることができる。一実施形態において好ましい動物はマウスである。一実施形態において好ましい間葉系幹細胞はヒト由来である。間葉系幹細胞は、生体から単離して用いることも可能であるが、市販されているため、それらを適宜選択して使用することができる。
【００１４】
血管内皮細胞の種類は任意であり、間葉系幹細胞及び純系胎児由来腎臓細胞と共培養されることによって腎臓様ミクロスフィアを形成し得るものであれば特に制限されない。血管内皮細胞は、例えば、糸球体内皮細胞、臍帯静脈内皮細胞、臍帯動脈内皮細胞、冠状動脈内皮細胞、伏在静脈内皮細胞、肺動脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、皮膚血管内皮細胞、皮膚微小血管内皮細胞、膀胱微小血管内皮細胞、子宮微小血管内皮細胞、肺微小血管内皮細胞、心臓微小血管内皮細胞、皮膚微小リンパ管内皮細胞、頸動脈内皮細胞、及び肝類洞内皮細胞などが挙げることができる。血管内皮細胞は、ヒト由来でもヒト以外の動物由来であっても良い。ヒト以外の動物としては、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、チンパンジー、ヤギ、及びウシ等を挙げることができる。一実施形態において好ましい動物はマウスである。一実施形態において好ましい血管内皮細胞はヒト由来である。血管内皮細胞は、生体から単離して用いることも可能であるが、市販されているため、それらを適宜選択して使用することができる。
【００１５】
純系胎児由来腎臓細胞は、間葉系幹細胞及び血管内皮細胞と共培養されることによって腎臓様ミクロスフィアを形成することが可能である限り特に制限されない。純系胎児由来腎臓細胞としては、例えば、ヒト胚性腎細胞（HEK293）、及びマウス胎児由来腎細胞（M15）を挙げることができる。
【００１６】
間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び純系胎児性腎臓細胞が由来する動物種は統一されていることが好ましい。例えば、純系胎児性腎臓細胞がヒト由来である場合は、間葉系幹細胞及び血管内皮細胞もヒト由来であることが好ましい。同様に、純系胎児性腎臓細胞がマウス由来である場合は、間葉系幹細胞及び血管内皮細胞もマウス由来であることが好ましい。
【００１７】
一実施形態において、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び純系胎児性腎臓細胞は、in vitroでiPS細胞又はES細胞を分化誘導させて得ることも可能である。好適な一実施形態において、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び純系胎児性腎臓細胞は、作業効率及びガン化の危険性という観点からiPS細胞又はES細胞をin vitroで分化誘導させて得たものではないことが好ましい。同様の理由で共培養に供される細胞群には、iPS細胞、ES細胞、又はこれらの細胞をin vitroで分化誘導させた細胞を含まないことが好ましい。
【００１８】
共培養に供される細胞群は、腎臓様組織が形成される限り、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び純系胎児性腎臓細胞以外の任意の細胞を含み得るが、一実施形態において、細胞群は、当該３種類の細胞以外の細胞を実質的に含まないことが好ましい。ここで、実質的に含まないとは、人為的に添加しなくても不可避的に混入する量の存在を許容することを意味する。例えば、実質的に含まないとは、そのような他の細胞の存在が培養液２ｍｌ当たり１０００個以下、１００個以下、５０個以下、２５個以下、１０個以下、又は５個以下であることを意味する。
【００１９】
間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び純系胎児性腎臓細胞を含む細胞群の共培養は、腎臓様組織（ミクロスフィア）を得ることができる限り任意の条件で行うことができる。培地は、例えば、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び／又は、純系胎児性腎臓細胞の培養に適した培地を用いることができる。これらの細胞の培養に適した培地は市販されているため、それらを適宜選択して使用することができる。一実施形態において培地として、例えば、１０％ＦＣＳ含有培地、又は、間葉系幹細胞培養用培地（HSCGM）に抗生物質及びグルタミン酸を添加したものを用いることができる。
【００２０】
共培養に使用する培地には、腎臓様組織が得られる限り、任意の成分を配合することができる。そのような成分としては、例えば、BMP4、BMP7、FGF2、FGF9、RA(retinotic acid)、activin、及びNoggin等のサイトカイン、並びに、Wnt阻害剤（例えば、CHIR)、BMP阻害剤（例えば、Dorsomorphin）、cAMP活性化剤（例えば、Forskolin）、及びROCK阻害剤(例えば、Y27632)等の分化誘導剤を挙げることができる。一実施形態において培地は、これらの成分の少なくとも一種又は全てを含まないことが好ましい。
【００２１】
培養温度は腎臓様組織を得ることができる限り特に制限されない場合、例えば、３７℃付近で行うことが好ましい。培養は５％ＣＯ２の条件下で行うことが好ましい。
【００２２】
共培養に供する各細胞の量は腎臓様組織を得ることができる限り特に制限されない。例えば、間葉系幹細胞は、液体培地２ｍｌあたり、１．０×１０２〜１．０×１０６個、好ましくは１．０×１０３〜１．０×１０５個用いることができる。血管内皮細胞は、例えば、液体培地２ｍｌあたり、１．０×１０３〜１．０×１０７個、好ましくは１．０×１０４〜１．０×１０６個用いることができる。純系胎児性腎臓細胞は、液体培地２ｍｌあたり、１．０×１０２〜１．０×１０６個、好ましくは１．０×１０３〜１．０×１０５個用いることができる。一実施形態において、間葉系幹細胞と純系胎児性腎臓細胞の細胞数の比率（間葉系幹細胞：純系胎児性腎臓細胞）は１：１０〜１０：１であることが好ましく、より好ましくは１：５〜５：１であり、更に好ましくは１：３〜３：１である。
【００２３】
培養時間は、腎臓様組織を得ることができる限り特に制限されないが、例えば、製造効率の観点から、４８時間以下、４２時間以下、３６時間以下、３０時間以下、２４時間以下、２２時間以下、２０時間以下、又は１８時間以下であることが好ましい。
【００２４】
上記のような条件によって得られる腎臓様組織は、in vivoの腎臓と同等の特性を有することが好ましい。例えば、腎臓様組織は、次の遺伝子の発現が陽性であることが好ましい：ＷＴ１、nephrin、podxl(podocalyxin)、podocin、Actn4、CD2AP、Synaptopodin、PTPRO、CDH1、CDH2、及びNgal。腎臓様組織が間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び純系胎児性腎臓細胞から形成されたポドサイトのモデルとして適したものである場合、腎臓様組織は、ＷＴ１、nephrin、podxl(podocalyxin)、podocin、Actn4、CD2AP、Synaptopodin、及びPTPROの発現が陽性であることが好ましい。腎臓様組織が間葉系幹細胞、血管内皮細胞、純系胎児性腎臓細胞、尿細管細胞、及びメサンギウム細胞から形成された尿細管の特性を備えたものである場合、腎臓様組織は、上記１１種類の遺伝子全ての発現が陽性であることが好ましい。また、腎臓様組織は、ミクロスフィアの形態を形成後は細胞増殖が進行せず、一組織として恒常性を有するという特徴を有することが好ましい。
【００２５】
一実施形態において、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び純系胎児性腎臓細胞を含む細胞群は、更に尿細管細胞及び／又はメサンギウム細胞を含むことが好ましい。尿細管細胞の種類は、腎臓様組織内に尿細管様形態を形成することができる限り特に制限されない。例えば、尿細管細胞として、腎近位尿細管細胞を用いることができる。尿細管細胞は、ヒト由来でもヒト以外の動物由来であっても良い。ヒト以外の動物としては、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、チンパンジー、ヤギ、及びウシ等を挙げることができる。一実施形態において好ましい動物はマウスである。一実施形態において好ましい尿細管細胞はヒト由来である。尿細管細胞は、生体から単離して用いることも可能であるが、市販されているものがあるため、それらを適宜選択して使用することができる。
【００２６】
メサンギウム細胞の種類は任意であり、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び純系胎児性腎臓細胞との共培養によって腎臓様組織を形成できるものであれば特に制限されない。メサンギウム細胞は、ヒト由来でもヒト以外の動物由来であっても良い。ヒト以外の動物としては、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、チンパンジー、ヤギ、及びウシ等を挙げることができる。一実施形態において好ましい動物はマウスである。一実施形態において好ましいメサンギウム細胞はヒト由来である。メサンギウム細胞は、生体から単離して用いることも可能であるが、市販されているものがあるため、それらを適宜選択して使用することができる。
【００２７】
共培養に供する尿細管細胞及びメサンギウム細胞の量は特に制限されず、所望の尿細管特性を備えた腎臓様組織が得られる限り特に制限されない。例えば、尿細管細胞は、液体培地２ｍｌあたり、１．０×１０２〜１．０×１０６個、好ましくは１．０×１０３〜１．０×１０５個用いることができる。メサンギウム細胞は、液体培地２ｍｌあたり、１．０×１０２〜１．０×１０６個、好ましくは１．０×１０３〜１．０×１０５個用いることができる。
【００２８】
腎臓様組織の形成に用いられる、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、純系胎児性腎臓細胞、尿細管細胞及びメサンギウム細胞は任意の外来遺伝子が導入されていてもよい。一実施形態において、腎臓様組織は外来遺伝子が導入された純系胎児性腎臓細胞を用いて形成されていることが好ましい。このような腎臓様組織は、例えば、ポドサイトの機能に影響を及ぼす物質のスクリーニングに利用することができる。他の実施形態において、腎臓様組織は、外来遺伝子が導入された尿細管細胞を用いて形成されていることが好ましい。このような腎臓様組織は、例えば、尿細管障害を引き起こす物質及び／又は尿細管障害の治療に有用な物質のスクリーニングに利用することができる。
【００２９】
外来遺伝子の種類は目的に応じて適宜選択でき特に制限されない。一実施形態において、外来遺伝子は、マーカー遺伝子であることが好ましい。ここでマーカー遺伝子とは、特定の遺伝子の発現を検出するための目印として利用することができる遺伝子である。そのようなマーカー遺伝子としては、例えば、蛍光タンパク質遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子、薬剤体制遺伝子等を挙げることができる。
【００３０】
例えば、腎臓組織の機能に重要な遺伝子（例えば、ＷＴ１）の下流に蛍光タンパク質等のマーカー遺伝子を導入した胎児性腎臓細胞を形成した腎臓様組織を用いることにより、マーカー遺伝子を指標にして、ＷＴ１遺伝子の発現に影響を及ぼす物質のスクリーニングを効率的に行うことができる。具体的に、スクリーニングは、腎臓様組織に候補物質を添加し、添加前と添加後の腎臓様組織の遺伝子発現プロファイルを比較することよって実施することができる。同様のマーカー遺伝子導入は、ゲノム編集技術により、遺伝子座およびそのプロモーター・エンハンサー等、目的とする遺伝子の発現調節部位に挿入し、物質のスクリーニングを実施することができる。このように腎臓様組織は腎臓モデルとして利用することができる。
【００３１】
腎臓様組織（ミクロスフィア）は、腎機能障害の治療薬のスクリーニングに利用できる。例えば、腎臓様組織を候補物質の存在下に置き、腎機能に関連する遺伝子発現レベルを測定し、当該候補物質の非存在下での遺伝子発現レベル（プロフィール）と比較することにより、治療薬（又は有望な物質）をスクリーニングすることができる。スクリーニングに利用可能な腎機能に関連する遺伝子の種類は制限されない。一実施形態において、前記腎機能に関連する遺伝子は、nephrin(NPHS1)、podocin(NPHS2)、PLCE1、Arhgap24、Myo1E、MYH9、INF2、ARHGDIA、ANLN、wt1(wilms tumor-1)、LMX1B、SMARCAL1、synaptopodin、CD2AP、GLEPP-1NEPH1、NEPH2、podocalyxin、α-Actinin-4、α-dystroglycan、Nestin、Vimentin、MAGI2、IQGAP2、TRPC6、CASK、CD31、podoplanin、Ezrin、ZO-1、FAT、及びP-cadherinから成る群より選択される１種以上であることが好ましい。また、腎臓様組織は、健康な腎臓のモデルであっても、腎機能障害を有する腎臓のモデルであってもよい。一実施形態において、腎臓様組織は、腎機能障害を有する腎臓のモデルであることが好ましい。腎機能障害を有する腎臓のモデルは、任意の手法で作成することができる。例えば、糖尿病モデルは、腎臓様組織を高血糖条件に曝すことにより調製することができる。腎炎モデルは、腎臓様組織を炎症性サイトカイン類に曝すことにより調製することができる。薬剤性急性腎障害モデルは、腎臓様組織をシスプラチン等の薬剤に曝すことにより調製することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。【００３３】
１．３種類の細胞を用いた腎臓用オルガノイド（ミクロスフィア）の作製
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腎臓様オルガノイドを作製するために、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及びヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）をヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ）とともに共培養した。５×１０４個のｈＭＳＣ、２×１０５個のＨＵＶＥＣ、及び５×１０４個のＨＥＫを２ｍｌの１０％ＦＣＳ又はＭＳＣＧＭに懸濁し、マイクロウェル培養プレートに播種した。加湿５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間のインキュベーションの後、細胞の凝集体（腎臓様ミクロスフィア）の形成が観察された（図１）。対照的に、ＨＥＫを単独培養した場合は、僅かに捻れた形状の凝集体が得られた。生成した腎臓様ミクロスフィアは、それらの球状形態を２０日間以上維持した。【００３４】
２．遺伝子発現の解析
腎臓様ミクロスフィア及びＨＥＫの単独培養で得られた凝集体のｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。スフィアからＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔファーストストランド合成キット（Invitrogen）を用いてオリゴ（ｄＴ）プライマーにより逆転写して、ファーストストランドｃＤＮＡを生成した。続いてポドサイト特異的遺伝子及びＧＡＰＤＨの発現を検出するためにＰＣＲを行った。比較対象として、ヒト胎児腎（Agilent社）およびヒト成人腎（Agilent社）についても同様に遺伝子発現を調べた。その結果、腎臓様ミクロスフィアでは、ポドサイトに典型的な転写マーカー（例えばＷＴ１）、及びポドシン、ネフリン等のような重要な構造マーカーが構成的に発現していることが確認された（図２）。また、腎臓様ミクロスフィアの遺伝子発現プロファイルは、ヒト胎児腎における遺伝子発現プロファイルとヒト成人腎における遺伝子発現プロファイルの中間であると考えられた。ＲＴ−ＰＣＲ分析で使用したプライマーの配列は下記の表１とおりである。【００３５】
【表１】
2018070346.tif 000002
【００３６】
３．細胞染色による解析
腎臓様ミクロスフィアの形成初期及び後期での３つの異なる細胞型の個々の局在を決定するために、細胞種特異的なマーカータンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学的染色を行った。腎臓様ミクロスフィアを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。腎臓様ミクロスフィアを、ｉＰＧｅｌｌ（ジェノスタッフ株式会社）を用いて収集し、１時間４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、製造業者の使用説明書に従って１０％スクロース中に４時間、２０％スクロース中に４時間、及び続いて３０％スクロース中に一晩浸漬した。次いで、スフィアをＯｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ化合物（サクラファインテックジャパン株式会社）に包埋し、それらをクライオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０  Ｓ、Leica Microsystems，IL，USA）上で１０μｍに切片化した。これらの切片をＨＥ染色により行い、画像を共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＬＳＭ７８０；Carl Zeiss，Jena，Germany）によって得た。また、スフィア自体は位相差顕微鏡にて撮像した（図３）。結果から、異なる細胞種がオルガノイドにおいて単に無作為に分布するのではなく、それらがポドサイト及び内皮細胞の再現可能な空間分布を有する構造を急速に形成し始めることが示された。対照的に、ＭＳＣ（ビメンチンに対して染色される）はポドサイトと内皮細胞との間で無作為に分布した。総合すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導されたこのポドサイトは正常成体内における非増殖細胞としての形質を有しているだけでなく、転写プロファイルにおいてもｉｎ  ｖｉｖｏのポドサイトの典型的な特徴を有していた。【００３７】
４．血管構築の確認
腎臓様ミクロスフィアから生成された糸球体が血管内皮細胞と一体化するか否かを試験した。腎臓様ミクロスフィア内の内皮出芽の形成を可視化するために、ＤＡＰＩ標識（和光純薬工業株式会社）をＨＵＶＥＣに導入したところ、生成された三次元組織におけるＨＵＶＥＣによる血管構築が確認された（図４）。【００３８】
５．腎機能評価
ヒト腎機能の維持を評価するために、ウエスタンブロット法を用いてヒトウロモジュリン産生を評定した。腎臓様ミクロフフィアよりタンパク質を抽出し、その培養液を回収し、各ミクロスフィア当たりのウロモジュリン（THP）分泌量を比較した。コントロールとしてβ−アクチンを用いた。共培養の培地中のウロモジュリンの量は７日目にＨＥＫの単独培養よりも高く、腎機能の維持における間質細胞依存性の補助が支持された（図５）。【００３９】
６．５種類の細胞を用いた腎臓用ミクロスフィアの作製
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腎臓様オルガノイドの作製を、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）及びヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ）に加えて、ヒトメサンギウム細胞（ｈＭＣ）及びヒト尿細管細胞（ＨＫ２）を共培養して行った。５×１０４のｈＭＳＣ、２×１０５のＨＵＶＥＣ、５×１０４のＨＥＫ、５×１０４のｈＭＣ、５×１０４のＨＫ２を２ｍｌの１０％ＦＣＳ又はＭＳＣＧＭに懸濁し、マイクロウェル培養プレートに播種した。加湿５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間のインキュベーションの後、細胞の凝集体及びミクロスフィアの形成が観察された（図６）。生成した腎臓様ミクロスフィアは、それらの球状形態を２０日間以上維持した。【００４０】
７．遺伝子発現の解析
５種の細胞を用いた腎臓様ミクロスフィアのｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。スフィアからＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔファーストストランド合成キット（Invitrogen）を用いてオリゴ（ｄＴ）プライマーにより逆転写して、ファーストストランドｃＤＮＡを生成した。続いて尿細管細胞特異的遺伝子、尿細管障害マーカー（epithelial-mesenchymal transition;ＥＭＴ）遺伝子及びＧＡＰＤＨの発現を検出するためにＰＣＲを行った。その結果、尿細管細胞特異的遺伝子（CDH1、CDH2、Ngal、及びCLU）が構成的に発現していること、それらは、代表的な尿細管障害薬剤であるシスプラチンによって発現が低下すること、及び、ＥＭＴの変化がスフイア内において再現されていることが確認された（図７左）。シスプラチンによる影響は、最終濃度が５μＭとなるようにシスプラチンを培養液に添加し、３時間後及び２４時間後にＲＮＡを抽出し、解析した。ＲＴ−ＰＣＲ分析で使用したプライマーの配列は上記表１及び下記表２のとおりである。【００４１】
【表２】
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【００４２】
また、シスプラチンによる尿細管障害は急性腎障害を呈し、慢性化すると、尿細管細胞のみならず、ポドサイト障害に至り、この場合、不可逆的な腎機能低下の主要因となる。シスプラチンの長期投与による解析では、ポドサイトに恒常的に発現している遺伝子の発現低下が確認され（図７）、このスフィアを用いることで、現在、解決方法の存在しない、急性腎障害から腎不全に至る障害モデルが構築できることが示された。【００４３】
８．ミクロスフィアの腎臓モデルとしての利用（急性腎障害）
シスプラチンによる急性腎障害（投与３時間後）としての急性尿細管障害に対して、尿細管細胞のシスプラチンの輸送トランスポーターOCT2における競合薬となるメトフォルミンを前投与することによって、急性腎障害における遺伝子発現の異常な変化は抑制された（図７左）。また、急性腎障害から不可逆的な腎機能低下へ進行する過程でポドサイト障害が生じることが知られているが、このスフィアにおいても同様に、ポドサイトの恒常性に必須の遺伝子の発現低下が確認された。このような、シスプラチンによる慢性腎障害（投与２４時間後）としてのポドサイト障害は、その一因とされるTGFβ1の中和抗体を前投与することによって抑制することが確認された（図７右）。【００４４】
９．マウス細胞を用いた腎臓用オルガノイド（ミクロスフィア）の作製
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腎臓様オルガノイドの作製を、マウスの細胞を用いて行った。その結果、ヒトにおける細胞の凝集体及びミクロスフィアと同様の形成が観察された（図８）。生成した腎臓様ミクロスフィアは、それらの球状形態を１０日間以上維持した。腎臓様オルガノイドの作製は、内皮細胞（MSS31）、間葉系幹細胞（C3H10T1/2）及びマウス胎児由来腎臓細胞（M15）を共培養して行った。５×１０４個のC3H10T1/2、２×１０５個のMSS31、５×１０４個のM15を２ｍｌの１０％ＦＣＳ又はＭＳＣＧＭに懸濁し、マイクロウェル培養プレートに播種した。加湿５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間のインキュベーションの後、腎臓様オルガノイドの形成が観察された。腎臓様ミクロスフィア及びM15の単独培養で得られた凝集体のｍＲＮＡおよび５週齢のマウスの腎より抽出したmRNAに対してＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。腎臓様ミクロスフィアからＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔファーストストランド合成キット（Invitrogen）を用いてオリゴ（ｄＴ）プライマーにより逆転写して、ファーストストランドｃＤＮＡを生成した。続いてポドサイト特異的遺伝子及びＧＡＰＤＨの発現を検出するためにＰＣＲを行った。その結果、ポドサイトに典型的な転写マーカー（例えばＷＴ１）、及びポドシン、ネフリン等のような重要な構造マーカーが構成的に発現していることが確認された（図8）。ＲＴ−ＰＣＲ分析で使用したプライマーの配列は下記の表３とおりである。【００４５】
【表３】
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【００４６】
１０．ミクロスフィアの腎臓モデルとしての利用（尿細管障害）
胎児由来腎臓細胞、間葉幹細胞、近位尿細管細胞及び血管内皮細胞を２４時間共培養し、自己組織化により形成された三次元腎臓様組織を得た（図９（Ａ））。これを５μMの濃度のcisplatinに暴露させ、その３時間後および２４時間後にスフィアを回収し、RNAを抽出後、RT-PCR法により遺伝子発現の変化を解析した。また、スフィアの培養液を回収し、遠心にて細胞成分を分離した後、「ルミパルスプレストβ２−M」キット（富士レビオ社製）にて、β２ミクログロブリンを測定した（図９（Ｂ））。更に、光学顕微鏡を用いて、スフィアの形状の変化を撮影した（図９（Ｃ））。【００４７】
従来のヒト近位尿細管細胞の培養に対する薬物投与による解析では、明らかにできなかった、慢性期の薬物による広範囲の腎障害をこの手法で再現できた。急性期は尿細管障害を反映し、慢性期にはポドサイト障害を反映し、ヒトにおける進行性の薬物障害を同一のモデルで同時解析可能であることが確認された。【００４８】
１１．ミクロスフィアの腎臓モデルとしての利用（ポドサイト障害）
胎児由来腎臓細胞、間葉幹細胞、及び血管内皮細胞を２４時間共培養し、自己組織化により形成された三次元腎臓様組織を得た。これに、puromycinを５0μg/mlの濃度に暴露させ、その２４時間後に、sphereを回収し、RNAを抽出後、qRT-PCR法によりnephrin遺伝子発現の変化を解析した（図１０）。これにより、従来マウスを用いていたポドサイト障害モデルを、三次元腎臓様組織を用いて再現可能であることが確認された。このモデルを用いることで、ポドサイト障害時に有効な薬剤のscreeningが可能となる。【００４９】
１２．ヒト難治性腎疾患の病態解析システムとしての利用
胎児由来腎臓細胞、間葉幹細胞、及び血管内皮細胞を２４時間共培養し、自己組織化により形成された三次元腎臓様組織を得た（図１１（Ａ））。これを、５％FCSにより施行し、ここに、巣状糸球体硬化症患者の血清を最終濃度５％（計１０％）となるように添加し、１０〜２４時間経過後に、光学顕微鏡を用いて、sphereの形状の変化を撮影した（図１１（Ｂ））。患者血清に含まれる成分の影響によりミクロスフィアの形態が大きく変化することが確認された。よって、スフィアを回収し、RNAを抽出し、コントロールと網羅的に遺伝子発現を比較することで、難治性腎疾患の標的遺伝子を同定することができる。また、正常ポドサイトの遺伝子プロファイルを有する、三次元腎臓様組織を用いることによって、難治性腎疾患の原因に関与するポドサイト関連遺伝子を明らかにできるだけでなく、治療前後や治療の経過中においても、モニターすることが可能となる。このように本発明のミクロスフィアを治療の有効性の判定にも用いることができる。【００５０】
１３．腎被膜下移植法
胎児由来腎臓細胞、間葉幹細胞、及び血管内皮細胞を共培養し、自己組織化により形成された三次元腎臓様組織の潜在的な糸球体の構造形成能を、免疫不全マウスを用いた腎被膜下移植法により検証した。免疫不全マウス（NOD/SCIDマウス）をレシピエントとし、毛刈りをすませた後、移植24時間前に共培養を開始し、新鮮な三次元腎臓様組織を用意した。この際、共培養に用いる細胞のうち、血管内皮細胞をBFP（青色蛍光タンパク質）が発現し、同細胞が青の蛍光色を呈するようにした。【００５１】
レシピエントに吸入麻酔をかけ、消毒して術野を決めた。まず、移植片が球形を崩さないように、アガロースロッドを２本挿入し、移植片の入る空間を腎被膜下につくった。移植する三次元腎臓様組織を、そのすべて被膜に覆われるまで挿入し、腎臓を腹腔に戻し、切開部位を閉じ、通常に飼育した。移植後、１０日で移植片を含む腎を摘出した。パラフィン包埋の後、各種染色を行った。HE染色により、移植片内に糸球体様構造を認め、その内部に管腔構造を確認でき、管腔内部に赤血球が確認された（図１２（Ａ、Ｂ））。さらに、蛍光を観察すると、管腔に一致して青色の蛍光が認められた（図１２（Ｃ、Ｄ））。また、PAM染色によって、基底膜が観察された（図１２（Ｅ、Ｆ））。【００５２】
胎児由来腎臓細胞、間葉幹細胞、及び血管内皮細胞を用いて形成された、三次元腎臓様組織は腎の被膜下において、さらに分化が促進され、明らかな脈管構造が誘導され、これは、レシピエント由来の細胞ではなく、導入した血管内皮細胞によって形成されたことが明らかとなった。また、血管基底膜も形成され、赤血球の流入も確認されたことから、さらに時間をかければ、レシピエントの血液を濾過する糸球体構造が形成されることが示唆された。これは、臓器移植のような侵襲性はなく、繰り返し実施が可能であり、一方で、多能性幹細胞を用いた移植のような癌化の可能性も相当に低い、治療手段になり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月4日(2018.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び純系胎児性腎臓細胞を含む細胞群を共培養することを含む、腎臓様組織の製造方法であって、前記純系胎児性腎臓細胞がＨＥＫ細胞又はＭ１５細胞である、腎臓様組織の製造方法。
【請求項２】
間葉系幹細胞、血管内皮細胞、及び純系胎児性腎臓細胞がヒト又はマウス由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
細胞群が、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、或いはこれらの細胞から分化誘導された細胞を含まない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
共培養を１２時間以上３６時間以下の時間行う、請求項１、２、及び４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
間葉系幹細胞と純系胎児性腎臓細胞の細胞数の比率（間葉系幹細胞：純系胎児性腎臓細胞）が１：１０〜１０：１である、請求項１、２、４、及び５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
細胞群が、更に尿細管細胞及び／又はメサンギウム細胞を含む、請求項１、２、４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
腎臓細胞に外来遺伝子が導入されている、請求項１、２、４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１、２、４〜８のいずれかに記載の方法によって得られた腎臓様組織。
【請求項１０】
請求項９に記載の腎臓様組織の腎臓モデルとしての使用。
【請求項１１】
請求項９に記載の腎臓様組織に候補物質を添加し、添加前と添加後の腎臓様組織の遺伝子発現プロファイルを比較することを含む、腎疾患に影響を与える物質をスクリーニングする方法。
【国際調査報告】
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