(57)【要約】  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析において、試料を、液体クロマトグラフに設けられた、互いに直列に接続され且つそれぞれ異なる種類の充填剤が充填された複数のカラムから成るカラム群に至る流路に注入する試料注入ステップと、前記カラム群のうち、最も下流側のカラムを含む一つ又は複数のカラムに対して、溶離液を送給することにより、該一つ又は複数のカラム中で前記試料中の分析対象成分の一部を分離し、最も下流側のカラムから順次溶出させて質量分析する第１の分析ステップと、前記カラム群のうち、最も下流側のカラムを含む一つ又は複数のカラムに対して、前記溶離液とは組成の異なる溶離液を送給することにより、該一つ又は複数のカラム中で、前記分析対象成分のうち前記第１の分析ステップで溶出しなかった成分の少なくとも一部を分離し、前記最も下流側のカラムから順次溶出させて質量分析する第２の分析ステップと、を実行する。これにより幅広い特性を有する多数の分析対象成分を１回の分析で定量することが可能となる。
2018189871.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)液体クロマトグラフに設けられた、互いに直列に接続可能に構成され且つそれぞれ異なる種類の充填剤が充填された複数のカラムから成るカラム群のうち、最も上流側のカラムに試料を注入する試料注入ステップと、
b)前記カラム群のうち、最も下流側のカラムを含む一つ又は直列に接続された複数のカラムに対して、第１の溶離液を送液することにより、該一つ又は直列に接続された複数のカラム中で、前記試料中の分析対象成分の一部を分離し、前記最も下流側のカラムから順次溶出させて質量分析装置で分析する第１の分析ステップと、
c)前記カラム群のうち、最も下流側のカラムを含む一つ又は直列に接続された複数のカラムに対して、前記第１の溶離液とは組成の異なる第２の溶離液を送液することにより、該一つ又は直列に接続された複数のカラム中で、前記分析対象成分のうち前記第１の分析ステップで溶出しなかった成分の少なくとも一部を分離し、前記最も下流側のカラムから順次溶出させて前記質量分析装置で分析する第２の分析ステップと、
を有することを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
【請求項２】
前記異なる種類の充填剤が、少なくとも、イオン交換モードに対応した充填剤と、逆相モードに対応した充填剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
【請求項３】
前記複数のカラムのうち、前記最も下流側のカラムを除くカラムの少なくとも１つのカラムがトラップカラムであって、その他のカラムが分離カラムであることを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
【請求項４】
前記液体クロマトグラフが複数のトラップカラムを備え、流路の切替によって前記複数のトラップカラムの中から前記カラム群に含めるトラップカラムを選択可能なものであって、前記複数のトラップカラムのいずれか一つが前記カラム群に含まれている間に、残りのトラップカラムのうちの少なくとも１つの洗浄を行うことを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
【請求項５】
前記第１の分析ステップにおける第１の溶離液の送液又は前記第２の分析ステップにおける前記第２の溶離液の送液の少なくとも一方がグラジエント送液であることを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
【請求項６】
a)液体クロマトグラフに設けられた、複数種類の充填剤の混合物が充填されたカラムへと至る流路中に試料を注入する試料注入ステップと、
b)前記カラムに対して第１の溶離液を送液することにより、該カラム中で前記試料中の分析対象成分の一部を分離し、該カラムから溶出させて質量分析装置で分析する第１の分析ステップと、
c)前記カラムに対して、前記第１の溶離液とは組成の異なる第２の溶離液を送液することにより、該カラム中で、前記分析対象成分のうち前記第１の分析ステップでは溶出しなかった成分の少なくとも一部を分離し、該カラムから溶出させて前記質量分析装置で分析する第２の分析ステップと、
を有することを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフ質量分析法（ＬＣ／ＭＳ分析又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析）による試料の分析方法に関し、特に、幅広い化学的又は物理的性質の分析対象成分を含んだ試料の分析に好適な分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析では、試料中の夾雑成分が、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）において分析対象成分と同じ保持時間で溶出することにより、質量分析（ＭＳ）における分析対象成分のイオン化抑制（イオンサプレッション）又はイオン化促進（イオンエンハンスメント）が生じる場合がある（例えば、特許文献１を参照）。イオンサプレッションやイオンエンハンスメントは、定量の再現性低下の要因となるため、ＬＣにおいて試料に含まれる各種分析対象成分と夾雑成分とを適切に分離する必要がある。【０００３】
ところで、近年、環境汚染物質の人体への影響を調査するため、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析による生体試料（例えば血漿）中の環境汚染物質の定量分析が広く行われている。環境汚染物質のうち、残留性有機汚染化学物質である有機フッ素化合物 (perfluoroalkyl acids：PFAAs)やそれらの類縁物質（PFCAs、PFASs、FOSA、FTS、PAPなど）は、炭素鎖の長短で化合物の特性（水溶性、脂溶性など）に大きな差異が生じる。そのため、単一条件によるＬＣでは、これらの成分をＭＳ／ＭＳに適した状態、すなわち、各分析対象成分が他の分析対象成分及び夾雑成分と十分に分離された状態にするのは困難であり、PFAAｓやそれらの類縁物質のうちの低分子化合物（PFBA、PFPeA、PFHxA、4:2FTS）のイオン化抑制や、N-MeFOSA-M、N-EtFOSA-Mのイオン化抑制、6:2FTS、8:2FTSのイオン化促進などの問題が避けられない。【０００４】
そのため、従来、血漿中のPFAAs及びそれらの類縁物質をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析する場合には、一つの血漿試料について、ＬＣ条件を変えた複数回（例えば３回）の分析を行っていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開WO2009/123297公報（[0002]）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、このような方法では、当然ながら、一つの試料について複数回の分析を行うために分析のスループットが低下する。更に、複数回の分析のために試料を分割する必要があるという問題や、複数回のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析で得られたデータが同一試料のものであることを担保する必要がある、という問題もある。【０００７】
なお、こうした問題は、上記のようなPFAAsやそれらの類縁物質の分析に限らず、化学的性質又は物理的性質の異なる多数の分析対象成分を含む試料を、ＬＣ／ＭＳ分析又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析しようとする場合に共通する問題である。【０００８】
本発明は、上記の点に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、化学的又は物理的性質の異なる多数の分析対象成分を含む試料を１回のＬＣ／ＭＳ分析又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって一斉分析可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために成された本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法は、
a)液体クロマトグラフに設けられた、互いに直列に接続可能に構成され且つそれぞれ異なる種類の充填剤が充填された複数のカラムから成るカラム群のうち、最も上流側のカラムに試料を注入する試料注入ステップと、
b)前記カラム群のうち、最も下流側のカラムを含む一つ又は直列に接続された複数のカラムに対して、第１の溶離液を送液することにより、該一つ又は直列に接続された複数のカラム中で、前記試料中の分析対象成分の一部を分離し、前記最も下流側のカラムから順次溶出させて質量分析装置で分析する第１の分析ステップと、
c)前記カラム群のうち、最も下流側のカラムを含む一つ又は直列に接続された複数のカラムに対して、前記第１の溶離液とは組成の異なる第２の溶離液を送液することにより、該一つ又は直列に接続された複数のカラム中で、前記分析対象成分のうち前記第１の分析ステップで溶出しなかった成分の少なくとも一部を分離し、前記最も下流側のカラムから順次溶出させて前記質量分析装置で分析する第２の分析ステップと、
を有することを特徴としている。【００１０】
ここで、第１の分析ステップ及び第２の分析ステップにおける「最も下流側のカラムを含む一つ又は直列に接続された複数のカラム」は、前記カラム群を構成する複数のカラムの一部であっても全てであってもよい。また、第２の分析ステップにおける「一つ又は直列に接続された複数のカラム」は、第１の分析ステップにおける「一つ又直列に接続されたは複数のカラム」と一致していても一致していなくてもよい。【００１１】
上記本発明によれば、１回の試料注入に伴う液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ分析又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析）において、分離特性の異なる複数回のＬＣ分離を行うことができる。そのため、幅広い特性の分析対象成分を含む試料の分析において、各分析対象成分を他の分析対象成分及び夾雑成分と適切に分離することが可能となり、その結果、イオンエンハンスメントやイオンサプレッションの影響を抑えた再現性の高い質量分析が可能となる。【００１２】
また、本発明に係る試料分析方法は、前記異なる種類の充填剤が、少なくとも、イオン交換モードに対応した充填剤と、逆相モードに対応した充填剤を含むものとすることが望ましい。【００１３】
また、本発明に係る試料分析方法は、前記カラム群を構成する複数のカラムのうち、最も下流側のカラムを除くカラムの少なくとも１つのカラムが試料を捕集するトラップカラムであって、その他のカラムが試料を分離する分離カラムであるものとすることができる。【００１４】
この場合、前記試料注入ステップと第１の分析ステップの間、若しくは第１の分析ステップと第２の分析ステップの間、又はその両方において、前記トラップカラムに捕集されている分析対象成分の少なくとも一部を該トラップカラムから溶出させる溶出ステップを設けることが望ましい。【００１５】
また、本発明に係る試料分析方法は、
前記液体クロマトグラフが複数のトラップカラムを備え、流路の切替によって前記複数のトラップカラムの中から前記カラム群に含めるトラップカラムを選択可能なものであって、前記複数のトラップカラムのいずれか一つが前記カラム群に含まれている間に、残りのトラップカラムのうちの少なくとも１つの洗浄を行うものとすることが望ましい。【００１６】
また、本発明に係る試料分析方法は、前記第１の分析ステップにおける第１の溶離液の送液又は前記第２の分析ステップにおける前記第２の溶離液の送液の少なくとも一方をグラジエント送液とすることが望ましい。【００１７】
また、上記課題を解決するために成された本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法は、
a)液体クロマトグラフに設けられた、複数種類の充填剤の混合物が充填されたカラムへと至る流路中に試料を注入する試料注入ステップと、
b)前記カラムに対して第１の溶離液を送液することにより、該カラム中で前記試料中の分析対象成分の一部を分離し、該カラムから溶出させて質量分析装置で分析する第１の分析ステップと、
c)前記カラムに対して、前記第１の溶離液とは組成の異なる第２の溶離液を送液することにより、該カラム中で、前記分析対象成分のうち前記第１の分析ステップでは溶出しなかった成分の少なくとも一部を分離し、該カラムから溶出させて前記質量分析装置で分析する第２の分析ステップと、
を有することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１８】
以上の通り、本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法によれば、試料中に含まれる幅広い特性を有する多数の分析対象成分を１回のＬＣ／ＭＳ分析又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって分析することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の試料分析方法において複数のカラムを使用する場合におけるＬＣ−ＭＳの概略構成を示す図。
【図２】本発明の試料分析方法において単一のカラムを使用する場合におけるＬＣ−ＭＳの概略構成を示す図。
【図３】本発明の試料分析方法において複数のカラムを使用する場合におけるＬＣ−ＭＳの構成の別の例を示す図。
【図４】本発明の試料分析方法において複数のカラムを使用する場合におけるＬＣ−ＭＳの構成の更に別の例を示す図。
【図５】本発明の一実施例におけるＬＣ−ＭＳの第１状態を示す流路構成図。
【図６】同実施例におけるＬＣ−ＭＳの第２状態を示す流路構成図。
【図７】同実施例における送液プロファイルを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明に係る試料分析方法は、複数種類の充填剤と、組成の異なる複数種類の溶離液とを使用して、分離特性の異なる複数回のＬＣ分離を行うことにより、試料に含まれる各分析対象成分を他の分析対象成分及び夾雑成分と適切に分離した上で質量分析するものである。これにより、１回の試料導入に伴うＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析又はＬＣ／ＭＳ分析（以下これを「１回の分析」とよぶ）において、化学的性質又は物理的性質の大きく異なる多数の分析対象成分を再現性よく定量することが可能となる。
【００２１】
なお、本発明において使用する質量分析装置は、液体クロマトグラフから溶出した試料成分の分析が可能なものであればいかなるものであってもよく、例えば、トリプル四重極型質量分析計、シングル四重極型質量分析計、ＭＡＬＤＩイオン源を搭載した質量分析計などを用いることができる。
【００２２】
また、本発明における試料分析方法は、イオンサプレッションやイオンエンハンスメントの原因となる夾雑成分を多数含む試料、例えば、生体試料（血液、尿等）、環境試料、食品試料等の分析に好適に用いることができるが、これらの試料の分析に限定されるものではない。
【００２３】
前記複数種類の充填剤としては、それぞれ異なる分離モードに対応した充填剤を用いることが望ましい。液体クロマトグラフィにおける分離モードには、例えば、逆相モード、順相モード、HILICモード、イオン交換モード、配位子交換モード、イオン排除モード、サイズ排除モード（GPCモード又はGFCモード）、及びアフィニティモードなどがあり、本発明における試料分析方法では、前記複数種類の充填剤として、例えばイオン交換モードに対応した充填剤と、逆相モードに対応した充填剤を使用することができる。なお、前記複数種類の充填剤として、同一の分離モードに対応したものであるが、充填剤を構成する基材の材質（シリカゲル、ポリマーゲルなど）、形状、粒度、細孔径、又は基剤に結合された官能基が異なるものを用いるようにしてもよい。
【００２４】
本発明の試料分析方法は、例えば、図１に示すように、複数のカラム１３、１４（図中では２つであるが３つ以上でもよい）を直列に接続して成るカラム群を備えた液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）によって実現できるのほか、図２に示すような、単一のカラム１６を備えたＬＣ−ＭＳによっても実現可能である。前者の場合は、各カラム１３、１４にそれぞれ異なる種類の充填剤を充填し、後者の場合は、単一のカラム１６に、複数種類の充填剤を混合したものを充填する。また、複数のカラムを用いる場合において、少なくとも一つのカラムを複数種類の充填剤の混合物を充填したものとしてもよい。なお、複数のカラムを用いる場合は、全てのカラムを分離カラムとしてもよく、少なくとも１つのカラムをトラップカラムとしてもよい。
【００２５】
本発明に係る試料分析方法では、図１又は図２のような構成のＬＣ−ＭＳにおいて、送液部１０からカラム１３又はカラム１６に至る溶離液の流路中に、試料注入部１２から試料を導入し、その後、組成の異なる溶離液を用いてカラム１３、カラム１４、又はカラム１６による分析対象成分の分離（成分分離）を複数回行い、これに伴ってカラム１４又はカラム１６から順次溶出する分析対象成分をＭＳ部１５で分析する。ここで、分析対象成分の分離のための送液は、一定組成の溶離液を送液するアイソクラティック送液であってもよく、複数種類の溶媒を混合して成る溶離液を、その混合比を連続的又は段階的に変化させつつ送液するグラジエント送液（段階的に変化させる場合はステップワイズ送液ともよばれる）であってもよい。なお、本発明では、複数回のアイソクラティック送液を行うようにしてもよく、複数回のグラジエント送液を行うようにしてもよい。複数回のアイソクラティック送液を行う場合は、溶離液の組成が各送液時で異なるようにする。また、複数回のグラジエント送液を行う場合は、使用する溶媒の組み合わせ、グラジエント開始時における各溶媒の混合比、グラジエント終了時における各溶媒の混合比の少なくともいずれかが、各送液時で異なるようにする。
【００２６】
なお、複数のカラムを使用する場合には、例えば、図３又は図４に示すような構成のＬＣ−ＭＳを用いることもできる。図３の構成では、流路切替部１８〜２３により、カラム１３とカラム１４を互いに接続しない状態（第１状態）と、これらのカラム１３、１４を直列に接続した状態（第２状態）とを切り替え可能となっている。なお、第１状態は、図３において、流路切替部１８〜２３内部の流路を実線で示すように接続した状態であり、第２状態は、図３において、流路切替部１８〜２３内部の流路を破線で示すように接続した状態である。第１状態では、第１送液部１１から送給される溶離液は、直接カラム１４に送られ、第２送液部１７から送給される溶離液はカラム１３を経てドレインに送られる。一方、第２状態では、第１送液部１１から送給される溶離液はカラム１３を経てカラム１４に送られ、第２送液部１７から供給される溶離液は、直接ドレインに送られる。
【００２７】
図３のような構成のＬＣ−ＭＳでは、例えば、カラム１３にトラップカラムを使用し、カラム１４に分離カラムを使用することにより、以下のような手順で本発明の試料分析方法を実施することができる。
(1) 第１状態において、第２送液部１７より供給される溶離液の流路中に、試料注入部１２から試料を注入し、該試料に含まれる分析対象成分をカラム１３に捕集させる。
(2) 第２状態に切り替え、第１送液部１１から所定の溶媒を送給することによりカラム１３に捕集されている分析対象成分の一部を溶出させてカラム１４に導入する。
(3) 第１状態に切り替え、第１送液部１１から所定の溶離液を送給することにより、カラム１４で分析対象成分を分離させ、カラム１４から順次溶出する分析対象成分をＭＳ部１５で分析する（本発明における「第１の分析ステップ」に相当）。
(4) 第２状態に切り替え、第１送液部１１から前記所定の溶離液とは異なる溶離液を送給することにより、カラム１３から残りの分析対象成分を溶出させると共に、該成分をカラム１４で分離してＭＳ部１５で分析する（本発明における「第２の分析ステップ」に相当）。
【００２８】
図４のような構成のＬＣ−ＭＳでは、流路切替部１８、１９により、上流側のカラム（図中の１３ａ又は１３ｂ）と下流側のカラム１４を互いに接続しない状態（第１状態）と、これらを直列に接続した状態（第２状態）とを切り替え可能であると共に、流路切替部２４、２５内部の流路を図中の実線で示す接続状態と点線で示す接続状態の間で切り替えることにより、互いに並列に接続されたカラム１３ａとカラム１３ｂのいずれを分析に使用するかを選択することができる。このような構成により、図３と同様のＬＣ−ＭＳと同様の分析を行うことができると共に、カラム１３ａ又はカラム１３ｂのうち、一方を分析に使用している間に、他方を洗浄することができるため、より効率的な試料分析が可能となる。なお、カラム１３ａ及びカラム１３ｂとしては、同一種類の充填剤が充填されたものを使用する。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明に係る試料分析方法により実施した、血漿中のＰＦＡＡｓ及びそれらの類縁物質のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析について説明する。【００３０】
本実施例における試料分析に使用したＬＣ−ＭＳの構成を図５及び図６に示す。このＬＣ−ＭＳは、上述した図３の構成を具現化したものであり、二つのカラム１３０、１４０を互いに接続しない状態（第１状態）と、該二つのカラム１３０、１４０を直列に接続した状態（第２状態）とを切り替え可能な構成を有している。【００３１】
このＬＣ−ＭＳは、分析用溶媒を送給する第１送液部１１０と、試料導入用溶媒を送給する第２送液部１７０、オートサンプラ１２０、第１カラム１３０、第２カラム１４０、第１流路切替バルブ３００、第２流路切替バルブ４００、及びＭＳ部１５０を備えている。第１送液部１１０には、それぞれ異なる溶媒が収容された溶媒容器１１１、１１２、１１３、これらの溶媒容器１１１、１１２、１１３から溶媒を吸引するためのポンプＡ、Ｂ、Ｃ、溶媒容器１１１、１１２、１１３とポンプＡ、Ｂ、Ｃの間の流路に設けられたデガッサ１１４、ポンプＢにより吸引された溶媒とポンプＣにより吸引された溶媒を混合するための溶媒混合部１１５、及び溶媒混合部１１５で混合された溶媒とポンプＡにより吸引された溶媒を混合するための溶媒混合部１１６が設けられている。また、第２送液部１７０には、溶媒容器１７１、溶媒容器１７１から溶媒を吸引するためのポンプＤ、及び溶媒容器１７１とポンプＤの間の流路に設けられたデガッサ１７２が設けられている。ポンプＡの下流側の流路は、溶媒混合部１１６及び第２カラム１４０を介してＭＳ部１５０に接続されており、ポンプＢ及びポンプＣの下流側の流路は溶媒混合部１１５で合流した上で、第２流路切替バルブ４００に接続されている。ポンプＤの下流側の流路は、流路中に試料を自動的に導入するためのオートサンプラ１２０を介して第１流路切替バルブ３００に接続されている。【００３２】
第１流路切替バルブ３００及び第２流路切替バルブ４００は、いずれも六方バルブであり、第１流路切替バルブ３００は、ポートａ〜ｆを有し、第２流路切替バルブ４００はポートｇ〜ｌを備えている。これらの流路切替バルブ３００、４００は、バルブの内部で各ポートが、図５中の実線で示すように接続された状態（第１状態）と、図６中の実線で示すように接続された状態（第２状態）とを切り替え可能となっている。第１流路切替バルブ３００のポートａはドレインに接続され、ポートｂはオートサンプラ１２０を介してポンプＤに接続されている。第１流路切替バルブ３００のポートｃは第２流路切替バルブ４００のポートｈに接続されており、第１流路切替バルブ３００のポートｄ、ｅ、ｆは閉鎖されている。第２流路切替バルブ４００のポートｇは第１カラム１３０を介して第２流路切替バルブ４００のポートｊに接続されており、ポートｉはドレインに接続されている。第２流路切替バルブ４００のポートｋはポンプＡから第２カラム１４０に至る流路の途中に設けられた溶媒混合部１１６に接続されている。また、第２流路切替バルブ４００のポートｌは、ポンプＢ及びポンプＣの下流に設けられた溶媒混合部１１５に接続されている。【００３３】
本実施例では、液体クロマトグラフとしてNexcera（株式会社島津製作所製）を使用し、質量分析装置（ＭＳ部１５０）としてLCMS-8060（株式会社島津製作所製）を使用した。また、第１カラム１３０としてトラップカラムであるOasis WAX（Waters社製）を使用し、第２カラム１４０として分離カラムであるTriart C18（株式会社ワイエムシィ製）を使用した。更に、本実施例では、ポンプＡにより送給される溶媒（すなわち溶媒容器１１１に収容される溶媒）を2.5 mM 酢酸アンモニウム水溶液（2.5 mM NH4Ac_H2O）とし、ポンプＢにより送給される溶媒（溶媒容器１１２に収容される溶媒）を2.5 mM 酢酸アンモニウム含有95%メタノール溶液（2.5 mM NH4Ac_95%MeOH）とし、ポンプＣにより送給される溶媒（溶媒容器１１３に収容される溶媒）を0.1%アンモニア含有メタノール溶液（0.1%NH3_MeOH）とし、ポンプＤにより送給される溶媒（溶媒容器１７１に収容される溶媒）を超純水とした。試料としては、血漿に有機フッ素化合物を添加したものを使用し、インジェクションボリュームは500 μL（水250 μL＋試料250 μL）とした。【００３４】
本実施例における分析動作を図７の送液プロファイルを参照しつつ説明する。なお、同図において、太い実線はポンプＡ、Ｂ、Ｃの流量（mL/min）の合計（以下「合計流量Ｔ」とよぶ）を示し、細い実線は合計流量Ｔに占めるポンプＢの流量の比率（％）を、破線は合計流量Ｔに占めるポンプＣの流量の比率（％）を示している。なお、図７ではポンプＡの流量の比率（％）を示していないが、該流量比率の値は、当然ながら、１００％からポンプＢの流量比率（％）とポンプＣの流量比率（％）を減じた値となる。また、図中の一点鎖線はポンプＤの流量（mL/min）を示している。【００３５】
（１）試料ロード工程
まず、ＬＣ−ＭＳが第１状態（図５）であり、且つポンプＢの流量比率：65%、ポンプＣの流量比率：0%、合計流量：0.3 mL/min、及びポンプＤの流量：1.0 mL/minの状態で、オートサンプラ１２０から試料の注入（インジェクション）を行い（この時点が送液プロファイルの0.00分となる）、該試料を第１カラム１３０に捕集させる。【００３６】
（２）第１溶出工程
試料の注入後、2.00分の時点でポンプＢ及びポンプＣの流量比率並びに合計流量Ｔを維持したままポンプＤの流量を０とし、ＬＣ−ＭＳを第２状態（図６）とする。これにより、ポンプＡからの溶媒（2.5 mM 酢酸アンモニウム水溶液）が35%と、ポンプＢからの溶媒（2.5 mM 酢酸アンモニウム_95%メタノール）が65%の割合で混合された混合液が第１カラム１３０及び第２カラム１４０に流入する。その結果、第１カラム１３０に捕集されている分析対象成分のうち、第１カラム１３０中の充填剤との結合が弱い成分（具体的には、N-MeFOSA-MとN-EtFOSA-M）のみが第１カラム１３０から溶出して第２カラム１４０に流入する。【００３７】
（３）第１分析工程
その後、試料注入後3.50分の時点で、ＬＣ−ＭＳを第１状態（図５）とし、ポンプＢの流量比率：87.5%、ポンプＣの流量比率：0%、合計流量Ｔ：0.5 mL/minに変更する。これにより、ポンプＡからの溶媒（2.5 mM 酢酸アンモニウム水溶液）が12.5%、ポンプＢからの溶媒（2.5 mM 酢酸アンモニウム_95%メタノール）が87.5%の割合で混合された混合液が第２カラム１４０に流入し、上記（２）で第１カラム１３０から溶出した成分（N-MeFOSA-MとN-EtFOSA-M）が第２カラム１４０によって時間的に分離され、該カラム１４０から順次溶出してＭＳ部１５０で分析される。なお、このとき、第１カラム１３０は、前記混合液の流路から切り離された状態にあるため、第１カラム１３０中に捕集されている残りの分析対象成分が第１カラム１３０から溶出されることはない。【００３８】
（４）第２溶出工程
続いて、試料注入後7.50分の時点で、ＬＣ−ＭＳを第２状態（図６）とし、ポンプＢの流量比率：0%、ポンプＣの流量比率：7.5%、合計流量Ｔ：0.25 mL/minに変更する。これにより、ポンプＡからの溶媒（2.5 mM 酢酸アンモニウム水溶液）が92.5%、ポンプＣからの溶媒（NH3_MeOH）が7.5%の割合で混合された混合液が第１カラム１３０及び第２カラム１４０に流入する。このとき、前記混合液に含まれるNH3の作用により、第１カラム１３０に捕集されていた残りの分析対象成分が溶出され、第２カラム１４０に流入する。但し、前記混合液は、第２カラム１４０においては溶出力の弱い溶離液として働くため、前記残りの分析対象成分は、第２カラム１４０の入口付近に留まって、一旦濃縮される。また、このとき第２カラム１４０内の液体が前記混合液により満たされた状態となる（すなわちカラムが平衡化される）。【００３９】
（５）第２分析工程
その後、試料注入後11.50分から23.00分に掛けてポンプＢの流量比率を0%から80%まで徐々に上げていく（グラジエント送液）。これにより、第２カラム１４０に流入する溶離液の溶出力が徐々に高くなり、第２カラム１４０の入口付近に吸着していた各成分がその極性に応じて分離され、第２カラム１４０から順次溶出してＭＳ部１５０で分析される。続いて、試料注入後23.00分の時点でポンプＢの流量比率が90%に変更され、これにより、第２カラム１４０が洗浄される。【００４０】
（６）平衡化工程
その後、試料注入後26.50分の時点で、ＬＣ−ＭＳを第１状態（図５）とし、ポンプＡ〜Ｃの流量比率を維持したまま、合計流量Ｔを0.3 mL/min、ポンプＤの流量を1.0 mL/minとすることで、第１カラム１３０及び第２カラム１４０を平衡化する。【００４１】
以上の分析により求められた内部標準の回収率を表１に示す。【００４２】
【表１】
2018189871.tif 000003
【００４３】
表１に示すように、本実施例による測定によれば、PFtriDA、PFteDA、PFHxDA、PFODA、及び4:2FTSを除く全ての対象化合物について５０％以上の回収率が得られた。これはイオンサプレッションが改善された結果と考えられる。また、PFtriDA、PFteDA、PFHxDA、PFODA、及び4:2FTSについても４０％以上の比較的高い回収率が得られた。なお、6:2FTS及び8:2FTSについてはイオンエンハンスメントが改善されず１００％を超える回収率を示したが、これはカラムの洗浄不足によるものと考えられる。
【符号の説明】
【００４４】
１０…送液部
１１、１１０…第１送液部
１７、１７０…第２送液部
１２…試料注入部
１２０…オートサンプラ
１３、１３ａ、１３ｂ、１４、１６…カラム
１３０…第１カラム
１４０…第２カラム
１５、１５０…ＭＳ部
１８、２４…流路切替部
３００…第１流路切替バルブ
４００…第２流路切替バルブ
【図１】
2018189871.tif 000004
【図２】
2018189871.tif 000005
【図３】
2018189871.tif 000006
【図４】
2018189871.tif 000007
【図５】
2018189871.tif 000008
【図６】
2018189871.tif 000009
【図７】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月23日(2019.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)液体クロマトグラフに設けられた、互いに直列に接続可能に構成され且つ互いに異なる種類の充填剤が充填された複数のカラムから成るカラム群のうち、最も上流側のカラムに試料を注入する試料注入ステップと、
b)前記カラム群のうち、最も下流側のカラムを含む一つ又は直列に接続された複数のカラムに対して、アイソクラティック送液又はグラジエント送液のいずれかである第１の送液を行うことにより、該一つ又は直列に接続された複数のカラム中で、前記試料中の分析対象成分の一部を分離し、前記最も下流側のカラムから順次溶出させて質量分析装置で分析する第１の分析ステップと、
c)前記カラム群のうち、最も下流側のカラムを含む一つ又は直列に接続された複数のカラムに対して、アイソクラティック送液又はグラジエント送液のいずれかであって前記第１の送液とは分離特性の異なる第２の送液を行うことにより、該一つ又は直列に接続された複数のカラム中で、前記分析対象成分のうち前記第１の分析ステップで溶出しなかった成分の少なくとも一部を分離し、前記最も下流側のカラムから順次溶出させて前記質量分析装置で分析する第２の分析ステップと、
を有することを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
【請求項２】
前記異なる種類の充填剤が、少なくとも、イオン交換モードに対応した充填剤と、逆相モードに対応した充填剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
【請求項３】
前記複数のカラムのうち、前記最も下流側のカラムを除くカラムの少なくとも１つのカラムがトラップカラムであって、その他のカラムが分離カラムであることを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
【請求項４】
前記液体クロマトグラフが複数のトラップカラムを備え、流路の切替によって前記複数のトラップカラムの中から前記カラム群に含めるトラップカラムを選択可能なものであって、前記複数のトラップカラムのいずれか一つが前記カラム群に含まれている間に、残りのトラップカラムのうちの少なくとも１つの洗浄を行うことを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
【請求項５】
前記第１の分析ステップにおける第１の送液又は前記第２の分析ステップにおける前記第２の送液の少なくとも一方がグラジエント送液であることを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
【請求項６】
a)液体クロマトグラフに設けられた、複数種類の充填剤の混合物が充填されたカラムへと至る流路中に試料を注入する試料注入ステップと、
b)前記カラムに対してアイソクラティック送液又はグラジエント送液のいずれかである第１の送液を行うことにより、該カラム中で前記試料中の分析対象成分の一部を分離し、該カラムから溶出させて質量分析装置で分析する第１の分析ステップと、
c)前記カラムに対して、アイソクラティック送液又はグラジエント送液のいずれかであって前記第１の送液とは分離特性の異なる第２の送液を行うことにより、該カラム中で、前記分析対象成分のうち前記第１の分析ステップでは溶出しなかった成分の少なくとも一部を分離し、該カラムから溶出させて前記質量分析装置で分析する第２の分析ステップと、
を有することを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
【国際調査報告】
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