(57)【要約】  外来性のイソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子を発現することができる形質転換体、および、当該形質転換体を用いたイソプレノイド前駆体またはイソプレノイドの製造方法を提供する。油性酵母から取得したプロモーター配列により、イソプレノイド生合成酵素遺伝子を発現させることができる形質転換体を利用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核宿主に、イソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子と、当該遺伝子の上流に以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチド構築物が、導入されていることを特徴とする、形質転換体：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
上記ポリヌクレオチド構築物は、更に、上記イソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子の下流に以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする、請求項１に記載の形質転換体：
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｇ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
真核宿主に、イソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子と、当該遺伝子の上流に以下の（ａ´）〜（ｄ´）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチド構築物が、導入されていることを特徴とする、形質転換体：
（ａ´）配列番号５に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｂ´）配列番号５に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ´）配列番号５に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ´）配列番号５に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項４】
上記ポリヌクレオチド構築物は、更に、上記イソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子の下流に以下の（ｅ´）〜（ｈ´）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする、請求項３に記載の形質転換体：
（ｅ´）配列番号６に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのターミネーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｆ´）配列番号６に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのターミネーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｇ´）配列番号６に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのターミネーター配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ´）配列番号６に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのターミネーター配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項５】
上記真核宿主が、油性酵母であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項６】
上記油性酵母が、リポマイセス・スターキー（Lipomyces starkeyi）であることを特徴とする、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
上記イソプレノイド生合成酵素は、メバロン酸経路酵素、カロテノイド生合成酵素、モノテルペン生合成酵素、セスキテルペン合成酵素、トリテルペン合成酵素、またはジテルペン合成酵素であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項８】
上記メバロン酸経路酵素は、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＨＭＧＲ）であることを特徴とする、請求項７に記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の形質転換体を培養する培養工程と、
培養後の培地および／又は当該形質転換体内より目的物質を回収する回収工程と、を含むことを特徴とする、イソプレノイド前駆体またはイソプレノイドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換体、および当該形質転換体を用いたイソプレノイド前駆体またはイソプレノイドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプレノイド（テルペノイドとも呼ばれる）は、これまでに植物を含め、動物、微生物などの種々の生物から約４０，０００種が単離されており、自然界で最も多様な化合物群を形成している。イソプレノイドの中には、医薬品、農薬、機能性食品又は香料として用いられている化合物など産業上有用な化合物が多く含まれている。これらの化合物は、自然界に微量にしか蓄積しない化合物が多いことから、遺伝子組換えテクノロジーを利用した生産技術の開発が進められている。【０００３】
こうした中、組換えＤＮＡ技術の進歩により、従来、真核宿主として利用できなかった微生物を用いて、目的の代謝物をより効率良く生産することが可能となりつつある。油性酵母もその一つであり、油性酵母は、バイオマスの２０％以上もの量の脂質を、生産および蓄積する能力を持つ、一連の酵母の総称である。これらの酵母は、その脂質生産能の高さからイソプレノイド生合成経路の潜在活性が高いことが期待される。この油性酵母のイソプレノイド生合成経路をさらに強化することによってイソプレノイド化合物を高生産することが期待できる。【０００４】
イソプレノイド化合物の生産においては、特にメバロン酸経路が重要な役割を担っている。メバロン酸経路を構成するヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子は、メバロン酸経路の律速酵素の一つであることが、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）において報告されている。【０００５】
ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子を利用したメバロン酸経路の改良は、従来型酵母である出芽酵母および分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）で研究が進められ、ＧＡＰＤＨ、ＧＡＬ１、ＰＧＫ１、ＴＤＨ３、ＴＥＦ２、及びＮＭＴ１遺伝子のプロモーターの制御下で、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子を発現させることによって、メバロン酸経路の下流のイソプレノイド等の生合成を促進することが報告されている（非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３）。一方、非従来型酵母では、油性酵母の１種であるヤロビア・リポリティカ（Yarrowia lipolitica）およびトルラ酵母（Candida utilis）において、ＴＥＦ遺伝子プロモーター、またはＧＡＰ遺伝子プロモーター制御下でヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子を発現させることにより、イソプレノイド類の生産性を上げることに成功しており、リコペンの生産量が、ＴＥＦ遺伝子プロモーター制御下では４．２倍、ＧＡＰ遺伝子プロモーター制御下では３．９倍増加することが報告されている（非特許文献４および非特許文献５）。以上説明してきたように、油性酵母で利用可能なプロモーターに関する情報は極めて少ないのが現状であった。【０００６】
現在では、出芽酵母や分裂酵母など種々の酵母においてゲノム塩基配列が公開されており、油性酵母の１種であるリポマイセス・スターキー（Lipomyces starkeyi）のゲノム塩基配列についても、Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（http://jgi.doe.gov/）によって公開されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】K. Allen G. Donald et. al., Appl Environment Microbiol, 1997, Vol. 63(9) P.3341-3344
【非特許文献２】Chikara Ohto et. al., Appl Microbiol Biotechnol, 2009, Vol. 82, P.837-845
【非特許文献３】Bing Cheng et. al., Appl Biochem Biotechnol, 2010, Vol. 160, P. 523-531
【非特許文献４】Falk Matthaus et. al., Appl Enviroment Microbiol, 2014, Vol. P.1660-1669
【非特許文献５】Hiroshi shimada et. al., Appl Enviroment Microbiol, 1998, Vol. 64, P.2676-2680
【非特許文献６】Nikolai A. Shevchuk et. al., Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32(2) e19
【非特許文献７】Christopher H. Calvey et. al., Current Genetics, 2014, 60(3) P.223-230
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
真核宿主（例えば、油性酵母）によっては遺伝子発現を制御するプロモーターおよびターミネーターに関する情報が極めて不足しており、イソプレノイド生合成酵素をコードしている遺伝子を発現させるのに適した発現制御配列を準備する必要があった。【０００９】
本発明の一態様は、外来性のイソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な形質転換体、および、当該形質転換体を用いたイソプレノイド前駆体またはイソプレノイドの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討したところ、脂質生産培地で発現する、油性酵母の遺伝子を調べ、脂質生産培地で比較的高い発現を示した遺伝子群の発現制御配列を取得し、これら発現制御配列を用いてイソプレノイドの生産量を指標にイソプレノイド生合成酵素遺伝子の発現に適した発現制御配列を探索し、本発明を完成するに至った。【００１１】
本発明は、以下の（１）〜（９）に記載の発明を含む。
（１）真核宿主に、イソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子と、当該遺伝子の上流に以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチド構築物が、導入されていることを特徴とする、形質転換体：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。【００１２】
（２）上記ポリヌクレオチド構築物は、更に、上記イソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子の下流に以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする、（１）に記載の形質転換体：
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｇ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチド。【００１３】
（３）真核宿主に、イソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子と、当該遺伝子の上流に以下の（ａ´）〜（ｄ´）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチド構築物が、導入されていることを特徴とする、形質転換体：
（ａ´）配列番号５に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｂ´）配列番号５に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ´）配列番号５に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ´）配列番号５に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。【００１４】
（４）上記ポリヌクレオチド構築物は、更に、上記イソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子の下流に以下の（ｅ´）〜（ｈ´）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする、（３）に記載の形質転換体：
（ｅ´）配列番号６に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのターミネーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｆ´）配列番号６に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのターミネーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｇ´）配列番号６に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのターミネーター配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ´）配列番号６に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのターミネーター配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチド。【００１５】
（５）上記真核宿主が、油性酵母であることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれか１つに記載の形質転換体。【００１６】
（６）上記油性酵母が、リポマイセス・スターキー（Lipomyces starkeyi）であることを特徴とする、（５）に記載の形質転換体。【００１７】
（７）上記イソプレノイド生合成酵素は、メバロン酸経路酵素、カロテノイド生合成酵素、モノテルペン生合成酵素、セスキテルペン合成酵素、トリテルペン合成酵素、またはジテルペン合成酵素であることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれか１つに記載の形質転換体。【００１８】
（８）上記メバロン酸経路酵素は、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＨＭＧＲ）であることを特徴とする、（７）に記載の形質転換体。【００１９】
（９）（１）〜（８）のいずれか１つに記載の形質転換体を培養する培養工程と、
培養後の培地および／又は当該形質転換体内より目的物質を回収する回収工程と、を含むことを特徴とする、イソプレノイド前駆体またはイソプレノイドの製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の一態様によれば、油性酵母等の真核宿主を用いて効率的にイソプレノイド前駆体およびイソプレノイドを生産することができる、という効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本願の実施例における、リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現量解析の結果を示す図である。
【図２】本願の実施例における、短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素（ｔＨＭＧＲ）遺伝子発現ベクターの構築方法を示す図である。
【図３】本願の実施例における、リコペン生合成ベクター（ｐＵＣ−ｌｙｃ）の構築方法を示す図である。
【図４】本願の実施例における、短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子の発現調節株におけるリコペン生産量の比較結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」および「遺伝子」は、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、遺伝子は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、又は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。ＤＮＡおよびＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。また、遺伝子は、化学的に合成された遺伝子であってもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Codon usage）が変更された遺伝子であってもよい。同じアミノ酸をコードするコドン同士であれば置換することも可能である。
【００２４】
また、用語「タンパク質」は、「ペプチド」又は「ポリペプチド」と交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、塩基およびアミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記又は３文字表記を使用する。
【００２５】
本明細書中において「イソプレノイド」とは、イソプレノイド生合成酵素の触媒活性により、基質としてゲラニル二リン酸（ＧＤＰおよびＧＰＰとも称する）（ＧＰＰの各種異性体を含む）、ファルネシル二リン酸（ＦＤＰおよびＦＰＰとも称する）（ＦＰＰの各種異性体を含む）、および／または、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＤＰおよびＧＧＰＰとも称する）（ＧＧＰＰの各種異性体を含む）から生成されるＣｘＨｙＯｚ（ｘは１０、１５、２０、３０、または、４０であり、ｙは１４〜５４であり、ｙは０〜４である）の化学式を有する化合物を意図する。また、「イソプレノイド」とは、当該化合物に対して、炭素原子数の増加、炭素原子数の減少、または、酸化等の修飾を施した化合物、をも意図する。触媒活性によるイソプレノイドの環化、酸化および水酸化等の生体内の酵素反応、並びに付随する非酵素反応により、イソプレノイドにおいて脱水反応等が行われることがあるが、これらに限定されない。イソプレノイドは、非環、単環または多環の任意の形態をとり得るが、共通して、イソプレノイド基本骨格を有する。したがって、イソプレノイド基本骨格を有する任意の化合物は、本明細書におけるイソプレノイドの概念に包含される。
【００２６】
本明細書において「相同性（homology）」とは、類縁の塩基配列と同一の塩基配列を有する割合を意味している。また、「同一性（identity）」とは、比較塩基配列と同一の塩基配列を有する割合を意図している。
【００２７】
〔１．形質転換体〕
本発明の一実施形態に係る形質転換体は、真核宿主に、イソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子と、当該遺伝子の上流に、（動作可能、又は、機能可能に連結された）以下の（ａ）〜（ｄ）または（ａ´）〜（ｄ´）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチド構築物が、導入されていることを特徴とする。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（a´）配列番号５に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｂ´）配列番号５に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ´）配列番号５に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ´）配列番号５に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
【００２８】
本発明の一実施形態に係る形質転換体は、真核宿主に、特定の遺伝子と、ポリヌクレオチド構築物とが導入されている。
【００２９】
本明細書において「真核宿主」とは、真核生物に由来する宿主（例えば、真核細胞、または、真核生物）を意図する。なお、上記真核生物は、例えば、非ヒトである真核生物であってもよい。真核宿主としては、例えば、酵母などのアルコール発酵を行う微生物および耐酸性微生物等が挙げられる。真核宿主の中でも、油性酵母が好ましい。油性酵母とは、一般の酵母と比較し、脂質の生産能力および蓄積能力が高い酵母を意味する。真核宿主が油性酵母であれば、イソプレノイド生合成経路の潜在活性が高いため、好ましい。
【００３０】
「油性酵母」という用語は、油を産生し得る、すなわちそれらの乾燥細胞重量（「ＤＣＷ」）の約２０％を超えて脂質を蓄積し得る、酵母に分類される油性微生物を指す。油性酵母の例としては、ヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、これらに限定されるものではない。酵母がＤＣＷの約２０％を超えて脂質を蓄積する能力は、組換え遺伝子操作の試みを通じて得られた能力、または生物の天然能力を通じた能力であってもよい。
【００３１】
例えば、上記油性酵母としては、リポマイセス・スターキー（Lipomyces starkeyi）、リポマイセス・メセブリウス（Lipomyces mesembrius）、リポマイセス・ドーレンジョンギ（Lipomyces doorenjongii）およびリポマイセス・コッキー（Lipomyces kockii）等のリポマイセス属酵母；ロドトルラ・グラミニス（Rhodotorula graminis）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・ムシラギノーサ（Rhodotorula mucilaginosa）、ロドトルラ・オウランティアカ（Rhodotorula aurantiaca）、ロドトルラ・バカラム（Rhodotorula bacarum）、ロドトルラ・アルメニアカ（Rhodotorula armeniaca）およびロドトルラ・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）等のロドトルラ属酵母；クリプトコッカス・カーバタス（Cryptococcus curvatus）およびクリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）等のクリプトコッカス属酵母；カンジダ・カーバタ（Candida curvata）といった一部のカンジダ属酵母；ヤロビア・リポリティカ（Yarrowia lipolitica）；キサントフィロマイセス・デンドロハス（Xanthophyllomyces dendrorhous）；アピオトリカム・カーバタム（Apiotrichum curvatum）等が挙げられる。中でも、油性酵母としては、リポマイセス・スターキー（Lipomyces starkeyi）が好ましい。
【００３２】
本発明の一実施形態に係る形質転換体は、イソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子が導入されている。
【００３３】
イソプレノイド生合成酵素としては、イソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体を生合成する酵素、つまりイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体を基質として触媒作用を有する酵素である限り、特に限定されないが、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、もしくは、カロテノイドを生合成する酵素、または、これらを基質とする酵素を挙げることができる。具体的には、上記酵素は、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、または、カロテノイドに、様々な官能基（例えば、−ＣＯ−、−ＯＨ、−Ｏ−、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｃ＝Ｃ＝Ｃ−、−Ｏ−Ｏ−、−ＮＨ２、または、−Ｃ≡Ｃ−）を導入する酵素であってもよい。更に具体的には、上記酵素は、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＨＭＧＲ）、ＧＧＰＰ合成酵素、フィトエン合成酵素、フィトエンデサチュラーゼ、リコペンシクラーゼ、β−カロテンケト化酵素およびβ−カロテン水酸化酵素等のカロテノイド生合成酵素；メントール、リモネン、ゲラニオール、シトロネロール、β−ミルセンおよびリナロール等のモノテルペン合成酵素；ベツリン酸合成酵素、ルペオール合成酵素、グリチルリチン合成酵素、スクアレン合成酵素、ウルソール酸合成酵素およびオレアノール酸合成酵素等のトリテルペン生合成酵素；ステビオサイド合成酵素およびタキサジエン合成酵素等のジテルペン生合成酵素；ファルネソール合成酵素、エレモール合成酵素、ゲルマクレンＤ合成酵素、β−エレメン合成酵素、β−カリオフィレン合成酵素、β−ユーデスモル合成酵素、α−ネオクロベン合成酵素、β−キュベベン合成酵素、セドレン合成酵素、アルテミシニン合成酵素、サントニン合成酵素およびファルネセン合成酵素等のセスキテルペン生合成酵素等が挙げられる。好ましくは、上記酵素は、メバロン酸経路酵素、カロテノイド生合成酵素、モノテルペン生合成酵素、セスキテルペン合成酵素、トリテルペン合成酵素、またはジテルペン合成酵素であり、さらに好ましくは、上記酵素は、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）である。イソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子が、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素をコードする遺伝子であることにより、メバロン酸経路を活性化でき、イソプレノイド前駆体またはイソプレノイドの生産量を増大させることができるため、好ましい。
【００３４】
本発明の一実施形態に係る形質転換体に導入されているポリヌクレオチドは、以下の（ａ）〜（ｄ）または（ａ´）〜（ｄ´）からなる群より選択される。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（ａ´）配列番号５に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｂ´）配列番号５に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ´）配列番号５に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ´）配列番号５に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
【００３５】
なお、本明細書中「ポリヌクレオチドまたは（あるいは）その一部」との記載は、プロモーター配列またはターミネーター配列（これらは遺伝子発現調節配列である）は、一部のコアとなる配列のみがあれば、プロモーター活性またはターミネーター活性を有する場合があるという知見を反映した記載である。すなわち、プロモーター配列またはターミネーター配列は、典型的な遺伝子配列である、タンパク質をコードする遺伝子配列（すなわち、構造遺伝子配列）が少なくともその大部分の配列を持たないと、機能するタンパク質を作れないという科学的常識とは、違った遺伝子配列として捉える必要がある。
【００３６】
上記（ａ）および（ａ´）のポリヌクレオチドについて具体的に説明する。
【００３７】
配列番号１は、ピルビン酸キナーゼ（Pyruvate kinase）(ＰＹＫ)遺伝子のプロモーター配列であり、配列番号５は、ホスホケトラーゼ（Phosphoketolase）（ＰＫ）遺伝子のプロモーター配列である。
【００３８】
配列番号１および５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、プロモーター活性を有する。そのため、配列番号１または５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを真核宿主に導入することで、短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素等のイソプレノイド生合成酵素をコードしている遺伝子の発現を活性化することができるため、好ましい。
【００３９】
上記「ピルビン酸キナーゼのプロモーター配列」の具体的な塩基配列は、配列番号１に限定されないし、上記「ホスホケトラーゼのプロモーター配列」の具体的な塩基配列は、配列番号５に限定されない。この場合、「ピルビン酸キナーゼのプロモーター配列」は、周知のあらゆるピルビン酸キナーゼのプロモーター配列（例えば、様々な生物における周知のピルビン酸キナーゼのプロモーター配列）であってもよい。また、「ホスホケトラーゼのプロモーター配列」は、周知のあらゆるホスホケトラーゼのプロモーター配列（例えば、様々な生物における周知のホスホケトラーゼのプロモーター配列）であってもよい。
【００４０】
本明細書中、「プロモーター活性を有するポリヌクレオチド」とは、任意の真核宿主において機能し、当該ポリヌクレオチドの下流に、任意のタンパク質をコードする塩基配列を導入した場合、当該塩基配列の転写が活性化されて、任意のｍＲＮＡ、または、タンパク質の合成（すなわち、発現）が確認できることを意味する。タンパク質の発現を確認する手段としては、ＲＴ−ＰＣＲ、または、ウエスタンブロット等の公知のｍＲＮＡ、または、タンパク質検出方法が挙げられる。なお、下流とは、転写方向、すなわちセンス鎖における５’側から３’側に向かう方向において、より３’側の位置を意味する。
【００４１】
上記（ｂ）および（ｂ´）のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１および５に記載の塩基配列、またはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列およびホスホケトラーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有する。
【００４２】
このようなポリヌクレオチドは、配列番号１もしくは５に記載の塩基配列、またはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドあるいはその一部をプローブとして、一般的なハイブリダイゼーション技術により得ることができる。
【００４３】
上記（ｂ）および（ｂ´）のポリヌクレオチドが、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドであれば、短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素等のイソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子の発現を活性化することができるため、好ましい。
【００４４】
上記（ｂ）および（ｂ´）のポリヌクレオチドは、配列番号１もしくは５に記載の塩基配列、またはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列からなる遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ技術により合成することができる。かかるハイブリダイゼーションあるいはＰＣＲによって、配列番号１もしくは５に記載の塩基配列、またはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列からなるポリヌクレオチドと相同性の高いポリヌクレオチドを単離することができる。
【００４５】
上記ポリヌクレオチドの単離は、特に限定されないが、好ましくは、ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションによって行う。本明細書中、用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件をいう。上記ストリンジェントな条件としては、５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃であるハイブリダイゼーション条件、あるいはこれと同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が好ましい。よりストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション条件によれば、より相同性の高いポリヌクレオチドを単離できるため好ましい。かかるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が４２℃のハイブリダイゼーション条件を挙げることができ、さらにストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション条件としては、５０％ホルムアミド存在下で６５℃のハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。
【００４６】
上記単離されたポリヌクレオチドの、配列番号１もしくは５に記載の塩基配列、またはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列もしくはホスホケトラーゼのプロモーター配列との相同性は、７０％以上であることが好ましく、より好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。なお、遺伝子の塩基配列の相同性は、遺伝子解析プログラム、ＢＬＡＳＴ（http://blast.genome.ad.jp）又はＦＡＳＴＡ（http://fasta.genome.ad.jp/SIT/FASTA.html）などによって決定することができる。
【００４７】
上記（ｃ）および（ｃ´）のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１および５に記載の塩基配列、またはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列およびホスホケトラーゼのプロモーター配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有する。
【００４８】
上記（ｃ）および（ｃ´）のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１および５のいずれかに示す塩基配列、またはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列およびホスホケトラーゼのプロモーター配列を有する遺伝子と、機能的に同等である、つまりプロモーター活性を有する限り、その具体的な配列については限定されない。ここで置換、欠失、挿入および／または付加されてもよい塩基の数は、前記機能を失わせない限り、限定されてないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の導入法によって置換、欠失、挿入および／または付加できる程度の数をいい、５０塩基以内であり、好ましくは４０塩基以内であり、さらに好ましくは３０塩基以内であり、さらに好ましくは２０塩基以内であり、さらに好ましくは１０塩基以内であり、さらに好ましくは５塩基以内であり、さらに好ましくは３塩基以内である。また、明細書中において「変異」とは、部位特異的突然変異誘発法等によって人為的に導入された変異を主に意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。
【００４９】
上記（ｄ）および（ｄ´）のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１および５に記載の塩基配列、またはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列およびホスホケトラーゼのプロモーター配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、プロモーター活性を有する。
【００５０】
上記（ｄ）および（ｄ´）のポリヌクレオチドと、配列番号１および５に記載の塩基配列、またはピルビン酸キナーゼのプロモーター配列およびホスホケトラーゼのプロモーター配列との同一性は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることがさらに好ましい。なお、遺伝子の塩基配列の同一性は、遺伝子解析プログラム、ＢＬＡＳＴ（http://blast.genome.ad.jp）又はＦＡＳＴＡ（http://fasta.genome.ad.jp/SIT/FASTA.html）などによって決定することができる。
【００５１】
上記ポリヌクレオチド構築物は、更に、上記イソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子の下流に、（動作可能、又は、機能可能に連結された）以下の（ｅ）〜（ｈ）または（ｅ´）〜（ｈ´）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｇ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチド。
（ｅ´）配列番号６に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのターミネーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部；
（ｆ´）配列番号６に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのターミネーター配列からなるポリヌクレオチドまたはその一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｇ´）配列番号６に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのターミネーター配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ´）配列番号６に記載の塩基配列もしくはホスホケトラーゼのターミネーター配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドまたはその一部からなり、かつ、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチド。
【００５２】
上記（ｅ）および（ｅ´）の遺伝子について具体的に説明する。
【００５３】
配列番号２は、ピルビン酸キナーゼ（Pyruvate kinase）(ＰＹＫ)遺伝子のターミネーター配列であり、配列番号６は、ホスホケトラーゼ（Phosphoketolase）（ＰＫ）遺伝子のターミネーター配列である。
【００５４】
配列番号２または６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ターミネーター活性を有する。そのため、配列番号２または６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを真核宿主に導入することで、短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素等のイソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子の発現を最適化することができるため、好ましい。
【００５５】
上記「ピルビン酸キナーゼのターミネーター配列」の具体的な塩基配列は、配列番号２に限定されないし、上記「ホスホケトラーゼのターミネーター配列」の具体的な塩基配列は、配列番号６に限定されない。この場合、「ピルビン酸キナーゼのターミネーター配列」は、周知のあらゆるピルビン酸キナーゼのターミネーター配列（例えば、様々な生物における周知のピルビン酸キナーゼのターミネーター配列）であってもよい。また、「ホスホケトラーゼのターミネーター配列」は、周知のあらゆるホスホケトラーゼのターミネーター配列（例えば、様々な生物における周知のホスホケトラーゼのターミネーター配列）であってもよい。
【００５６】
本明細書中「ターミネーター活性を有するポリヌクレオチド」とは、任意の真核宿主において機能し、任意のタンパク質をコードする塩基配列の下流に当該ポリヌクレオチドを導入した場合、当該塩基配列の転写を終了させることを意味する。転写が終了していることを確認する手段としては、当該ポリヌクレオチドの下流にレポーター遺伝子を導入し、当該レポーター遺伝子が発現していないことが確認できればよい。
【００５７】
上記（ｆ）および（ｆ´）のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２および６に記載の塩基配列、またはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列およびホスホケトラーゼのターミネーター配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ターミネーター活性を有する。
【００５８】
このようなポリヌクレオチドは、配列番号２または６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドあるいはその一部をプローブとして、一般的なハイブリダイゼーション技術により得ることができる。
【００５９】
上記（ｆ）および（ｆ´）の遺伝子が、ターミネーター活性を有する遺伝子であれば、短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素等のイソプレノイド生合成酵素をコードしている遺伝子の発現を最適化することができるため、好ましい。
【００６０】
上記ポリヌクレオチドの単離は、特に限定されないが、好ましくは、ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションによって行う。上記ストリンジェントな条件としては、５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃であるハイブリダイゼーション条件、あるいはこれと同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が好ましい。よりストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション条件によれば、より相同性の高いポリヌクレオチドを単離できるため好ましい。かかるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が４２℃のハイブリダイゼーション条件を挙げることができ、さらにストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション条件としては、５０％ホルムアミド存在下で６５℃のハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。
【００６１】
上記単離されたポリヌクレオチドの、配列番号２もしくは６に記載の塩基配列、またはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列もしくはホスホケトラーゼのターミネーター配列との相同性は、７０％以上であることが好ましく、より好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。
【００６２】
上記（ｇ）および（ｇ´）のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２および６に記載の塩基配列、またはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列およびホスホケトラーゼのターミネーター配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたポリヌクレオチドからなり、かつ、ターミネーター活性を有する。
【００６３】
上記（ｇ）および（ｇ´）のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２および６のいずれかに示す塩基配列、またはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列およびホスホケトラーゼのターミネーター配列を有する遺伝子と機能的に同等である、つまりターミネーター活性を有する限り、その具体的な配列については限定されない。ここで置換、欠失、挿入および／または付加されてもよい塩基の数は、前記機能を失わせない限り、限定されないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の導入法によって置換、欠失、挿入および／または付加できる程度の数をいい、５０塩基以内であり、好ましくは４０塩基以内であり、さらに好ましくは３０塩基以内であり、さらに好ましくは２０塩基以内であり、さらに好ましくは１０塩基以内であり、さらに好ましくは５塩基以内であり、さらに好ましくは３塩基以内である。また、明細書中において「変異」とは、部位特異的突然変異誘発法等によって人為的に導入された変異を主に意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。
【００６４】
上記（ｈ）および（ｈ´）のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２および６に記載の塩基配列、またはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列およびホスホケトラーゼのターミネーター配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドからなり、かつ、ターミネーター活性を有する。
【００６５】
上記（ｈ）および（ｈ´）のポリヌクレオチドと、配列番号２もしくは６に記載の塩基配列、またはピルビン酸キナーゼのターミネーター配列もしくはホスホケトラーゼのターミネーター配列との同一性は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることがさらに好ましい。なお、遺伝子の塩基配列の同一性は、遺伝子解析プログラム、ＢＬＡＳＴ（http://blast.genome.ad.jp）又はＦＡＳＴＡ（http://fasta.genome.ad.jp/SIT/FASTA.html）などによって決定することができる。
【００６６】
プロモーター活性を有するポリヌクレオチドと、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチドとの好ましい組み合わせは、それぞれ上記（ａ）〜（ｄ）と（ｅ）〜（ｈ）との組み合わせ、または、（ａ´）〜（ｄ´）と（ｅ´）〜（ｈ´）との組み合わせから選択される限り、特に限定されない。プロモーター活性を有するポリヌクレオチドが配列番号１に記載の塩基配列からなる場合は、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチドは配列番号２に記載の塩基配列からなることが好ましい。また、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドが配列番号５に記載の塩基配列からなる場合は、ターミネーター活性を有するポリヌクレオチドは配列番号６に記載の塩基配列からなることが好ましい。
【００６７】
配列番号１、２、５および６に記載の塩基配列からなる各ポリヌクレオチドは、それぞれ、油性酵母の遺伝子の、プロモーター活性又は、ターミネーター活性を有するＤＮＡ断片として取得された。したがって、本発明の一実施形態に係る発現制御配列は、油性酵母、あるいはリポマイセス属酵母のこれらの遺伝子のプロモーター活性、又はターミネーター活性を有するＤＮＡ、あるいはかかるプロモーター配列、又はターミネーター配列に相同性を有し、本プロモーター活性、又は本ターミネーター活性を有するポリヌクレオチドであってもよい。このようなポリヌクレオチドは、配列番号１、２、５および６のいずれかに記載の塩基配列の少なくとも一部からなるプローブを用いたハイブリダイゼーション技術や、該塩基配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いたＰＣＲ技術を利用して、酵母から取得することができる。さらに、上述したストリンジェントな条件で配列番号１、２、５および６のいずれかに記載の塩基配列からなる各ポリヌクレオチドにハイブリダイズするＤＮＡを選択することができる。なお、本発明の一実施形態に係るプロモーター配列又はターミネーター配列は、本プロモーター活性又は本ターミネーター活性を有する限りこのような各種形態のポリヌクレオチドの一部分であってもよい。本発明の一実施形態に係るプロモーター配列およびターミネーター配列は、ゲノムＤＮＡであってもよく、また、化学的に合成されたＤＮＡであってもよい。
【００６８】
本発明の一実施形態に係る形質転換体が導入されているポリヌクレオチド構築物は、イソプレノイド生合成酵素をコードする遺伝子と、遺伝子発現制御配列をコードしている特定のポリヌクレオチドとが、機能的に連結されていることが好ましい。
【００６９】
本明細書において「遺伝子発現制御配列（単に、発現制御配列とも言う）」とは、プロモーター活性又はターミネーター活性を有する配列を示す。また、本明細書において「機能的な連結」とは、連結したタンパク質をコードするＤＮＡの発現を本発現制御配列の影響下あるいは支配下におくような結合をいう。
【００７０】
ポリヌクレオチド構築物の形態は、特に限定されず、プラスミド（ＤＮＡ）、ウイルス（ＤＮＡ）、ウイルス（ＲＮＡ）、バクテリオファージ（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）および人工染色体（ＹＡＣ、ＰＡＣ、ＢＡＣおよびＭＡＣ等）から、外来遺伝子の導入形態（染色体外あるいは染色体内）又は真核宿主の種類に応じて選択されるベクターである。つまり、本ポリヌクレオチド構築物は、遺伝子発現制御配列からなるＤＮＡの他、これらのいずれかの形態のベクターとしてのＤＮＡ等を含んでいてもよい。本ポリヌクレオチド構築物は、好ましくは、プラスミドベクター又ウイルスベクターの形態を採る。プラスミドベクターとしては、例えば、原核細胞性ベクター、真核細胞性ベクター、動物細胞性ベクターおよび植物細胞性ベクター等の当該分野において周知であるベクターを使用することができる。本ポリヌクレオチド構築物は、真核宿主において、細胞質あるいは宿主染色体外において保持されていてもよいし、また、宿主染色体に組み込まれて保持されていてもよい。
【００７１】
上記ポリヌクレオチド構築物は、本プロモーター配列および本ターミネーター配列に対して機能的に結合された、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、コードＤＮＡともいう。）を含んでいてもよい。また、本プロモーター配列が機能的であれば、ターミネーター配列については、必ずしも必要ではない。コードＤＮＡは、ｃＤＮＡのみならず、転写されても翻訳されないＤＮＡ配列を含むものであってもよい。
【００７２】
上記ポリヌクレオチド構築物においては、相同組換えにより本プロモーター配列およびコードＤＮＡを宿主染色体に組み込むための相同組換え用ＤＮＡ配列を含んでいることが好ましい。このようなＤＮＡ配列を含んでいることにより、宿主染色体の所望の部位にこれらのＤＮＡ配列の組み込みを達成する他、所望の遺伝子の破壊を同時に達成することができる。相同組換え用ＤＮＡ配列は、例えば、宿主染色体における、本ＤＮＡ配列を導入しようとするターゲット部位あるいはその近傍のＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ配列である。相同組換え用ＤＮＡ配列は、ターゲット遺伝子あるいはその近傍のＤＮＡ配列の、少なくとも１箇所に相同である配列を有しており、好ましくは、ターゲット遺伝子あるいはその近傍の少なくとも２箇所にそれぞれ相同な配列を備えている。例えば、２個の相同組換え用ＤＮＡ配列を、染色体上のターゲット部位の上流側のＤＮＡと下流側のＤＮＡとのそれぞれに相同なＤＮＡ配列とし、これらの相同組換え用ＤＮＡ配列の間に本プロモーター配列とコードＤＮＡとを連結することが好ましい。
【００７３】
上記ポリヌクレオチド構築物は、前記遺伝子が真核宿主に導入されたか否か、さらには真核宿主中で確実に発現しているか否かを確認するために、選択マーカーを含んでいることが好ましい。選択マーカーとしては、特に限定しないが、薬剤抵抗性遺伝子および栄養要求性遺伝子などを始めとする公知の各種選択マーカー遺伝子を用いることができる。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ナーセオスリシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性Ｇ４１８遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子等を使用することができる。
【００７４】
本ポリヌクレオチド構築物を適当な真核宿主に導入する方法は、特に限定されない。例えば、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法又は直接マイクロインジェクション法等の各種の適切な手段のいずれかにより、上記ポリヌクレオチド構築物を適当な真核宿主に導入することができる。本ポリヌクレオチド構築物の導入後、そのポリヌクレオチド構築物を導入された形質転換体は、選択培地で培養されることが好ましい。
【００７５】
上記ポリヌクレオチド構築物を導入された形質転換体においては、ポリヌクレオチド構築物の構成成分である、プロモーターＤＮＡ、ターミネーターＤＮＡおよびコードＤＮＡ等が染色体上あるいは染色体外因子（人工染色体を含む）上に存在することになる。上述のポリヌクレオチド構築物に、相同組換えを達成できる相同組換え用ＤＮＡ構築物が導入されると、宿主染色体上の所望の位置に本プロモーターＤＮＡおよび本ターミネーターＤＮＡと該ＤＮＡに対して機能的に結合されたコードＤＮＡを保持する形質転換体が得られる。また、相同組換え用ＤＮＡを保持しない構築物を導入した際には、宿主染色体上のランダムな位置に本プロモーターＤＮＡおよび本ターミネーターＤＮＡが該ＤＮＡに対して機能的に結合されたコードＤＮＡを保持する形質転換体が得られる。
【００７６】
〔２．イソプレノイド前駆体またはイソプレノイドの製造方法〕
本発明の一実施形態に係るイソプレノイド前駆体またはイソプレノイド（本明細書中、イソプレノイド化合物ともいう）の製造方法は、上記形質転換体を培養する培養工程と、培養後の培地および／又は当該形質転換体内より目的物質を回収する回収工程と、を含むことが好ましい。
【００７７】
イソプレノイド前駆体としては例えば、メバロン酸（ＭＶＡ）、ホスホメバロン酸（ＰＭＶＡ）、ジホスホメバロン酸（ＤＰＭＶＡ）、イソペンテル二リン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）およびゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）が挙げられる。
【００７８】
イソプレノイドとしては例えば、モノテルペン、ポリテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペンおよびカロテノイド等の各種イソプレノイドが挙げられる。
【００７９】
モノテルペンは特に限定されず、その一例としてメントール、リモネン、ゲラニオール、シトロネロール、β-ミルセン、およびリナロールを挙げることができる。
【００８０】
ポリテルペンは特に限定されず、その一例として、イソプレンゴムを挙げることができる。
【００８１】
セキステルペンは特に限定されず、その一例として、ファルネソール、エレモール、ゲルマクレンD、β-エレメン、β-カリオフィレン、β-ユーデスモル、α-ネオクロベン、β-キュベベン、セドレン、アルテミシニン、サントニン、およびファルネセンを挙げることができる。
【００８２】
ジテルペンは特に限定されず、その一例として、タキサン類（例えば、バッカチンＩＩＩ、１０デアセチルバッカチンＩＩＩ、およびパクリタキセル）およびステビオシド類（例えば、ステビオサイド、レバウディオサイドＡ、およびレバウディオサイドＣ）を挙げることができる。
【００８３】
トリテルペンは特に限定されず、その一例として、スクアレン、ウルソール酸、グリチルリチン、β-アミリン、ルペオール、オレアノール酸およびジンセノシド類（例えば、２０（Ｒ）−ジンセノシド  Ｒｂ３、ジンセノシド  Ｒｂ２、およびジンセノシド  Ｒｃ）を挙げることができる。
【００８４】
カロテノイドは、特に限定されず、その一例として、カロテン類（例えば、αカロテン、βカロテン、γカロテン、δカロテン、リコペン、およびトルレン）並びにキサントフィル類（例えば、ルテイン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、フコキサンチン、アスタキサンチン、アンテラキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、レチノール、レチナール、レチノイン酸およびビオラキサンチン）を挙げることができる。
【００８５】
イソプレノイドは、好ましくは、カロテノイドを示す。さらに好ましくは、カルテノイドは、リコペンである。
【００８６】
上記培養工程では、形質転換体を、固体培地を用いて培養（すなわち、固体培養）してもよいし、液体培地を用いて培養（すなわち、液体培養）してもよい。形質転換体の培養スケール（換言すれば、イソプレノイド化合物の生産スケール）の調節の容易性、および、イソプレノイド化合物生産の低コスト化の観点からは、液体培地を用いて培養することが好ましい。また、液体培地を用いた培養であれば、形質転換体を連続培養することによって、イソプレノイド化合物の生産量を飛躍的に上げることができる。
【００８７】
本発明の一実施形態に係る形質転換体の培養にあたっては、形質転換体の種類に応じて培養条件を選択することができる。このような培養条件は、当業者においては周知である。真核宿主が資化可能な炭素源、窒素源および無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地および合成培地のいずれも使用することができる。炭素源としては、グルコース、キシロース、グリセロール、フルクトース、スクロースおよびデンプン等の炭水化物；酢酸およびプロピオン酸等の有機酸；エタノール等のアルコールを用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物の他、ペプトン、イースト抽出物等を用いることができる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅および炭酸カルシウムなどを用いることができる。
【００８８】
上記培養工程は、通常、振とう培養又は通気攪拌培養等の好気条件下、３０℃で７２〜１９２時間行う。培養時間は、好ましくは９６〜１９０時間、さらに好ましくは１００〜１８０時間、より好ましくは１２０〜１６８時間であるが、本発明の一実施形態は、これらの培養時間に限定されない。培養期間中、ｐＨは２．０〜７．０に保持することが好ましい。培養期間中のｐＨは、ｐＨ３．０〜７．０が好ましく、ｐＨ４．０〜７．０がさらに好ましく、ｐＨ５．０〜７．０がより好ましい。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、およびアルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてＧ４１８、ハイグロマイシンおよびノーセオスリシン（ｃｌｏｎＮＡＴ）などの抗生物質を培地に添加することができる。
【００８９】
本発明の一実施形態に係るイソプレノイド化合物の製造方法は、上述した培養工程の後に、培養後の培地および／又は当該形質転換体内より目的物質を回収する回収工程を有していてもよい。回収工程の具体的な構成は特に限定されないが、回収工程は、以下に説明する抽出工程、および／又は、精製工程を包含する工程であってもよい。
【００９０】
本発明の一実施形態に係るイソプレノイド化合物の製造方法は、上述した培養工程の後に、形質転換体からイソプレノイド化合物を抽出するための抽出工程を有していてもよい。当該構成であれば、純度の高いイソプレノイド化合物を取得することができる。
【００９１】
抽出工程では、形質転換体と有機溶媒とを接触させ、形質転換体によって生産されたイソプレノイド化合物を有機溶媒中に移行させる。そして、当該有機溶媒を回収することによって、イソプレノイド化合物を回収することができる。また、抽出工程では、炭酸ガス、メタノール、および水等を用いて、イソプレノイド化合物を超臨界抽出することもできる。
【００９２】
形質転換体と有機溶媒とを接触させる場合には、形質転換体を含む培地と有機溶媒とを混合してもよいし、形質転換体を含む培地を遠心分離して形質転換体を回収し、当該形質転換体を水に懸濁した後、当該水と有機溶媒とを混合してもよい。より純度の高いイソプレノイド化合物を取得するという観点からは、形質転換体を含む培地を遠心分離して形質転換体を回収し、当該形質転換体を水に懸濁した後、当該水と有機溶媒とを混合する方が好ましい。
【００９３】
上述した有機溶媒の種類は、イソプレノイド化合物の種類に応じて、適宜選択すればよい。有機溶媒として、例えば、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチルメチルケトン、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ジメチルスルフォキシド、クロロフォルム、ジクロロメタン、四塩化炭素、アセトニトリル、又は、ピリジンを単独で使用してもよい。また、これらの有機溶媒の少なくとも２つを混合して使用してもよい。
【００９４】
本発明の一実施形態に係るイソプレノイド化合物の製造方法は、上述した抽出工程の後に、抽出物に含まれるイソプレノイド化合物をクロマトグラフィーで精製する精製工程を有していてもよい。当該構成であれば、更に純度の高いイソプレノイド化合物を取得することができる。
【００９５】
この際使用される分離用の担体としては、例えば、シリカゲル、硝酸銀添加シリカゲル、オクタデシルジメチルシリル修飾シリカゲル、ジメチルシリル修飾シリカゲル、オクチルジメチルシリル修飾シリカゲル、プロピルアミノ修飾シリカゲル、シアノプロピル修飾シリカゲルおよびフェニル修飾シリカゲル等の各種化学修飾シリカゲル；アルミナ並びに活性炭等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
本発明の一実施形態に係る製造方法を用いることで、イソプレノイド化合物が、遺伝的修飾を含まない対照細胞におけるイソプレノイド化合物のレベルより少なくとも５０％高いレベルで生産することができる。
【００９７】
以下、本発明の具体例を記載するが、本発明を以下の具体例に限定する趣旨ではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の態様で実施できる。
【実施例】
【００９８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、具体的には以下のように鋭意研究を行った。【００９９】
具体的には、本発明者らは、油性酵母の１種であるリポマイセス・スターキー（Lipomyces starkeyi）においてヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子の発現に最適なプロモーター種の探索を試みた。脂質生産培地で培養している油性酵母リポマイセス・スターキー（Lipomyces starkeyi）より、トータルＲＮＡを取得した。その後、ＲＮＡシークエンスによる網羅的な油性酵母の遺伝子発現解析を行い、脂質生産培地で発現している遺伝子の発現量の情報を取得した。さらに、リアルタイムＰＣＲ法によって各遺伝子の発現量の解析を行った。その結果に基づき、脂質生産培地において大小、様々な発現量を示す複数の遺伝子を選定し、その遺伝子のプロモーター配列、およびターミネーター配列を単離した。単離した発現制御配列（プロモーター配列、および／又はターミネーター配列）を用いてメバロン酸経路の改良を行い、リコペン生合成遺伝子を導入した油性酵母株でのリコペン生産量の改善を試みた。【０１００】
メバロン酸経路の中でもヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素は、メバロン酸経路の律速ステップの１つに関わることが、出芽酵母において報告されている。今回新たに油性酵母から探索したプロモーター配列およびターミネーター配列を用いて、リコペン生産を指標に、メバロン酸経路に対するヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子の発現の影響を評価した。【０１０１】
油性酵母に導入したヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子としてはアミノ末端を削った短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素（ｔＨＭＧＲ）遺伝子を利用した。この目的は、短縮型酵素遺伝子を利用することによって酵素活性のフィードバック阻害による減少を抑えることであった（非特許文献６）。【０１０２】
以下に、その詳細を説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されない。【０１０３】
＜実施例１．ＲＮＡシークエンス解析による発現遺伝子の検出＞
油性酵母リポマイセス・スターキー株を脂質生産培地にて３０℃、１８０ｒｐｍの回転振とうにより５日間培養後、菌体を採取し、トータルＲＮＡを調製した。脂質生産培地は４０ｇ／ｌのグルコース、０．５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ｌのＮａＣｌおよび１．５ｇ／ｌの酵母の抽出物（Yeast extract）から構成される。ＲＮＡの調製にはアイソジェンＩＩ（ISOGEN II）（ニッポンジーン社製）を用いた。得られたトータルＲＮＡについて、ＲＮＡシークエンス解析を外注し、各遺伝子の発現量を示すＦＰＫＭ値データを取得した。取得したＦＰＫＭ値および既に解読していた、リポマイセス・スターキー株のゲノム塩基配列情報から、脂質生産培地で発現している遺伝子とその発現量とをリスト化した。【０１０４】
（定量的ＰＣＲ法による遺伝子の発現解析）
ＲＮＡシークエンス解析によって、脂質生産培地で発現している遺伝子を選抜した。選抜した遺伝子の中から発現強度が高い遺伝子５種について、リアルタイムＰＣＲ法により各遺伝子の発現量を確認した。次に、プライムスクリプト（登録商標）逆転写酵素（PrimeScriptTM Reverse Transcriptase）（タカラバイオ株式会社製）用いて、トータルＲＮＡ  ０．５μｇを逆転写反応させ、１本鎖ｃＤＮＡを調製した。調製したｃＤＮＡ溶液１μｌとＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）とを混合し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３００５Ｐ（アジレントテクノロジー(Agilent technologies)株式会社製）による定量的ＰＣＲ解析を行った。これらの結果を図１に示す。図１に示すように、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素遺伝子の発現強度に対して、ホスホケトラーゼ遺伝子の発現強度は８００倍に相当し、翻訳伸長因子遺伝子の発現強度は６００倍に相当し、ヒスチジンキナーゼ遺伝子の発現強度は３００倍に相当し、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ遺伝子の発現強度は１２０倍に相当し、ピルビン酸キナーゼ遺伝子の発現強度は、１２０倍に相当した。【０１０５】
さまざまな発現活性を示す遺伝子発現制御配列を得るため、上述の定量的ＰＣＲ解析の結果を元にして、上記５種の遺伝子についてプロモーター配列、およびターミネーター配列を取得した。遺伝子のプロモーター配列の情報と、予想される開始コドン上流１．０ｋｂおよび、ストップコドン下流０．５ｋｂのターミネーター配列の情報とをそれぞれ取得した。なお、逆転写反応およびリアルタイムＰＣＲについては、キットおよび測定装置のプロトコールに従って行った。【０１０６】
＜実施例２．ベースベクターの構築＞
以下に、本実施例におけるベクター構築の詳細を図２および図３に基づいて説明するが、ベクター構築の手順はこれに限定されるものではない。図２は、本願の実施例における、短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素（ｔＨＭＧＲ）遺伝子発現ベクターの構築方法を示す図である。それぞれ、ＰＹＫ：ピルビン酸キナーゼ（Pyruvate kinase）、ＴＥＦ：翻訳伸長因子（Translation elongation factor 1）、ＰＫ：ホスホケトラーゼ（Phosphoketolase）、ＨＫ：ヒスチジンキナーゼ（Histidine kinase）、ＡＣＣ：アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（Acetyl Co-A carboxylase）の各遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列をベクターに導入した。図３は、本願の実施例における、リコペン生合成ベクター（ｐＵＣ−ｌｙｃ）の構築方法を示す図である。ＰＧＫ：ホスホグリセリン酸キナーゼ（Phosphoglycerate kinase）、ＴＰＩ：Triosephosphate isomerase、ＴＥＦ：翻訳伸長因子（Translation elongation factor 1）の各遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列を、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢおよびｃｒｔＩの各遺伝子の発現に用いた。なお、ベクター構築における一連の反応操作は、当業者に標準的な方法である、制限酵素処理とライゲーションとによるクローニング、オーバーラップエクステンションＰＣＲクローニング（非特許文献６参照）、およびＨｉｆｉ  ＤＮＡクローニングキット（ＮＥＢ社製）の各方法に準じて行った。その他、一般的なクローニング法において、一連の酵素類はＮＥＢ社製の製品を使用した。なお、本キットを用いたＤＮＡ構築物についてはＮＥＢ社の利用許諾権利が及ばないことが、使用説明書に明記されている。【０１０７】
（ｐＵＣ１９−Ｎｏｔベクターの構築）
ｐＵＣ１９ベクター内のＢｓｐＱＩサイトの削除および、ＮｏｔＩサイトの新たな導入を行うため、プライマーとして、ｐＵＣ−Ｎｏｔ−Ｆ（配列番号７）およびｐＵＣ−Ｎｏｔ−Ｒ（配列番号８）を用いてインバースＰＣＲを行った。使用した各プライマー配列の詳細を、表１に記載する。ＰＣＲ反応には増幅酵素として、増幅断片の正確性が高いとされる、プライムスター  ＨＳ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（PrimStar HS DNA polymerase）（タカラバイオ社製）を使用した。プライマーＤＮＡ５０ｐｍｏｌ×２、５倍濃縮酵素反応用バッファー１０μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰｍｉｘ４μｌおよびプライムスター  ＨＳ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ１．２５ユニットを加えた溶液を作製した。サーマルサイクラーＰＣＲ（製品名：Thermal Cycler DiceＲ Gradient、タカラバイオ社製）にｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ１０ｎｇと、上記溶液５０μｌとをセットし、ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡを鋳型に用いてＤＮＡ断片を増幅した。サーマルサイクラーの反応条件は、９４℃１分の熱処理を行った後、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒および７２℃で２分４０秒（伸長時間１分／１ｋｂ）の３つの温度変化を１サイクルとし、これを３５サイクル繰り返し、最後に４℃で反応試料を保存した。この反応試料５μｌを０．８％ＴＡＥアガロースゲル（含有）にて電気泳動し、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド溶液に浸漬した。その後、このゲルを２５４ｎｍの紫外線照射（紫外線照射機はニッポンジーン社製）によってＤＮＡのバンドを検出し、遺伝子増幅の確認を行った。増幅したＤＮＡ断片をセルフライゲーションしてベクター上にＮｏｔＩサイトを導入した。ライゲーション反応液を大腸菌コンピテント細胞に導入し、大腸菌を形質転換した。大腸菌コンピテント細胞は、ＤＨ５α株（東洋紡社製）を使用し、詳細な取り扱いは付属のプロトコールに従った。抗生物質であるアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有したＬＢプレートを用いてコロニー選抜を行い、各選抜コロニーから、エタノール沈殿処理によってプラスミドＤＮＡを調製した。なお、エタノール沈殿処理および制限酵素処理等の一連操作の詳細なマニュアルは、Molecular Cloning : A Laboratory Manual second edition（Maniatisetal., Cold Spring Harbor Laboratory press. 1989）に従った。【０１０８】
（ｐＵＣ−Ｇ４１８ベクターおよびｐＵＣ−ｃｌｏｎＮＡＴベクターの構築）
ＴＥＦ遺伝子のプロモーター配列（配列番号３）およびＴＤＨ遺伝子のターミネーター配列を、リポマイセス・スターキー株から精製したゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲにより増幅した。プライマーは、ＴＥＦ遺伝子のプロモーター配列に対して、ｐＴＥＦ−Ｆ１（配列番号９）とｐＴＥＦ−Ｒ１（配列番号１０）とを用い、ＴＤＨ遺伝子のターミネーター配列に対して、ｔＴＤＨ３−Ｆ１（配列番号１１）とｔＴＤＨ３−Ｒ１（配列番号１２）とを用いた。ｐｒｉｍｅｓｔａｒ  ＨＳによるＰＣＲ反応で、プロモーター配列およびターミネーター配列のＤＮＡ断片を調製した。以降、全ての発現制御配列はリポマイセス・スターキー株のゲノムＤＮＡを鋳型に用いて調製した。Ｇ４１８遺伝子についても、ｐＵＣ１９ベクターを鋳型に用いてＧ４１８遺伝子をＰＣＲにより増幅した。プライマーはＧ４１８−Ｆ（配列番号１３）およびＧ４１８−Ｒ（配列番号１４）を用いた。増幅した３断片を利用してオーバーラップＰＣＲを行い、プロモーター配列およびターミネーター配列をＧ４１８遺伝子に機能的に連結した。オーバーラップＰＣＲは、非特許文献６に記載の方法に従い行った。作製したＧ４１８カセットの両端に、ベースベクターへの連結のためにＮｏｔＩサイトが付加されるようにプライマーを設計した。次に、連結したＤＮＡ断片をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific社製）へサブクローニングした。サブクローニングの一連の反応操作は、一般的なＤＮＡサブクローニング法に準じて行った。ＤＮＡサブクローニング法の詳細は付属のプロトコールに従った。次に、ＮｏｔＩ処理したｐＵＣ１９−ＮｏｔＩおよびＧ４１８カセットをライゲーションすることにより、Ｇ４１８選抜マーカーを持つベースベクターｐＵＣ−Ｇ４１８を構築した。【０１０９】
同様にｃｌｏｎＮＡＴ耐性遺伝子についても、プライマーとして、ｃｌｏｎＮＡＴ−Ｆ（配列番号１５）およびｃｌｏｎＮＡＴ−Ｒ（配列番号１６）を用いてＰＣＲによりｃｌｏｎＮＡＴ耐性遺伝子を増幅させた後、オーバーラップＰＣＲにより、ＴＥＦ遺伝子のプロモーター配列およびＴＤＨ遺伝子のターミネーター配列をｃｌｏｎＮＡＴ耐性遺伝子に機能的に連結した発現カセットを構築した。Ｇ４１８遺伝子と同様に連結した耐性遺伝子発現カセットは、ｐＣＲ  ｂｌｕｎｔ  ｔｏｐｏベクターにサブクローニングした後、ＮｏｔＩ処理して、ｐＵＣ−ＮｏｔＩのＮｏｔＩサイトに常法によりクローニングし、ｐＵＣ−ｃｌｏｎＮＡＴを構築した（コンストラクトの詳細は、図２の上段参照）。【０１１０】
【表１】
2018138966.tif 000002
【０１１１】
＜実施例３．発現カセットベクターの構築＞
（発現制御配列（プロモーターＤＮＡおよびターミネーターＤＮＡ）のクローニング）
実施例１および２において脂質生産培地で発現を示した遺伝子について、高い発現活性を示す遺伝子を５種類選定し、選定した遺伝子の発現制御配列（プロモーターＤＮＡ（１．５ｋｂ）およびターミネーターＤＮＡ（０．５ｋｂ））をクローニングした。当該発現制御配列の取得における遺伝子資源は、油性酵母リポマイセス・スターキー株のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅法によって単離した。本株をＹＰＤ培養液５ｍｌで２晩培養した後、ゲノムＤＮＡ調製キット（製品名：Ｇｅｎとるくん（商標）−酵母用−、タカラバイオ社製）を用いて、ゲノムＤＮＡを調製した。また、調製したゲノムＤＮＡは、分光光度計（製品名：ＵＶｍｉｎｉ−１２４０、株式会社島津製作所製）によりＤＮＡ濃度を測定した。各遺伝子の発現制御配列は、リポマイセス・スターキー株のゲノムＤＮＡ配列を鋳型に用いて、プライムスター  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅により取得した。各遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列の増幅に用いたプライマーは以下である：ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）遺伝子発現制御配列のプロモーター配列に対しては、ｐＰＹＫ−Ｆ（配列番号１７）とｐＰＹＫ−Ｒ（配列番号１８）；ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）遺伝子発現制御配列のターミネーター配列に対しては、ｔＰＹＫ−Ｆ（配列番号１９）とｔＰＹＫ−Ｒ（配列番号２０）；ヒスチジンキナーゼ（Histidine kinase）（ＨＫ）遺伝子発現制御配列のプロモーター配列に対しては、ｐＨＫ−Ｆ（配列番号２１）とｐＨＫ−Ｒ（配列番号２２）；ヒスチジンキナーゼ（Histidine kinase）（ＨＫ）遺伝子発現制御配列のターミネーター配列に対しては、ｔＨＫ−Ｆ（配列番号２３）とｔＨＫ−Ｒ（配列番号２４）；ホスホケトラーゼ（Phosphoketolase）（ＰＫ）遺伝子発現制御配列のプロモーター配列に対しては、ｐＰＫ−Ｆ（配列番号２５）とｐＰＫ−Ｒ（配列番号２６）；ホスホケトラーゼ（Phosphoketolase）（ＰＫ）遺伝子発現制御配列のターミネーター配列に対しては、ｔＰＫ−Ｆ（配列番号２７）とｔＰＫ−Ｒ（配列番号２８）；アセトアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（Acetoacetyl Co-A carboxylase）（ＡＣＣ）遺伝子発現制御配列のプロモーター配列に対しては、ｐＡＣＣ−Ｆ（配列番号２９）とｐＡＣＣ−Ｒ（配列番号３０）；アセトアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（Acetoacetyl Co-A carboxylase）（ＡＣＣ）遺伝子発現制御配列のターミネーター配列に対しては、ｔＡＣＣ−Ｆ（配列番号３１）とｔＡＣＣ−Ｒ（配列番号３２）；翻訳伸長因子（Translation elongation factor 1）（ＴＥＦ）遺伝子発現制御配列のプロモーター配列に対しては、ｐＴＥＦ−Ｆ（配列番号３３）とｐＴＥＦ−Ｒ（配列番号３４）；翻訳伸長因子（Translation elongation factor 1）（ＴＥＦ）遺伝子発現制御配列のターミネーター配列に対しては、ｔＴＥＦ−Ｆ（配列番号３５）とｔＴＥＦ−Ｒ（配列番号３６）であった。各プライマー配列の詳細を表２に記載する。油性酵母リポマイセス・スターキー株のゲノムＤＮＡ１００ｎｇを鋳型に用いて、プライマーＤＮＡ５０ｐｍｏｌ×２、５倍濃縮酵素反応用バッファー×１０μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰｍｉｘ４μｌおよびプライムスター  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ１．２５ユニットを加えた５０μｌの反応液を、サーマルサイクラーＰＣＲ（製品名：Thermal Cycler DiceＲ Gradient、タカラバイオ社製）にセットしてＤＮＡ断片を得た。サーマルサイクラーの反応条件は、９４℃２分間の熱処理を行った後、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、７２℃で１分３０秒の３つの温度変化を１サイクルとし、これを３５サイクル繰り返し、最後に４℃で反応試料を保存した。当該反応試料５μｌを０．８％ＴＡＥアガロースゲル（含有）にて電気泳動し、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド溶液に浸漬した。その後、本ゲルを２５４ｎｍの紫外線照射（紫外線照射機はニッポンジーン社製）によってＤＮＡのバンドを検出し、遺伝子増幅の確認を行った。【０１１２】
ｐＵＣ１９−ＮｏｔＩをＳｍａＩ制限酵素で処理し、ベクターを調製した。【０１１３】
プライマーとしてそれぞれ、ＰＹＫ遺伝子のプロモーター配列（配列番号１）に対して、ｐＰＹＫ−Ｆ（配列番号１７）およびｐＰＹＫ−Ｒ（配列番号１８）、ＰＹＫ遺伝子のターミネーター配列（配列番号２）に対して、ｔＰＹＫ−Ｆ（配列番号１９）およびｔＰＹＫ−Ｒ（配列番号２０）を用いて、各配列を前述した方法でＰＣＲにより増幅した。Ｈｉｆｉ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ社製）を用いて、ｐＵＣ−Ｇ４１８のＳｍａＩサイト中、プロモーター配列とターミネーター配列との間に２つのＢｓｐＱＩサイトが含まれるように、増幅したプロモーター配列およびターミネーター配列をクローニングし、ＤＨ５α株に形質転換してｐＵＣ−ｐｔＰＹＫを構築した。ＰＹＫ遺伝子と同様に、プライマーとして、それぞれ、ＴＥＦ遺伝子のプロモーター配列（配列番号３）に対して、ｐＴＦＥ−Ｆ（配列番号３３）およびｐＴＥＦ−Ｒ（配列番号３４）、ＴＥＦ遺伝子のターミネーター配列（配列番号４）に対して、ｔＴＦＥ−Ｆ（配列番号３５）およびｔＴＥＦ−Ｒ（配列番号３６）を用いてｐＵＣ−ｐｔＴＥＦを構築した。ＰＹＫ遺伝子と同様に、プライマーとして、それぞれ、ＰＫ遺伝子のプロモーター配列（配列番号５）に対して、ｐＰＫ−Ｆ（配列番号２５）およびｐＰＫ−Ｒ（配列番号２６）、ＰＫ遺伝子のターミネーター配列（配列番号６）に対して、ｔＰＫ−Ｆ（配列番号２７）およびｔＰＫ−Ｒ（配列番号２８）を用いてｐＵＣ−ｐｔＰＫを構築した。ＰＹＫ遺伝子と同様に、プライマーとして、それぞれ、ヒスチジンキナーゼ（ＨＫ）遺伝子のプロモーター配列に対して、ｐＨＫ−Ｆ（配列番号２１）およびｐＨＫ−Ｒ（配列番号２２）、ヒスチジンキナーゼ（ＨＫ）遺伝子のターミネーター配列に対して、ｔＨＫ−Ｆ（配列番号２３）およびｔＨＫ−Ｒ（配列番号２４）を用いてｐＵＣ−ｐｔＨＫを構築した。ＰＹＫ遺伝子と同様に、プライマーとして、それぞれ、アセトアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（Acetoacetyl Co-A carboxylase）（ＡＣＣ）遺伝子のプロモーター配列に対して、ｐＡＣＣ−Ｆ（配列番号２９）およびｐＡＣＣ−Ｒ（配列番号３０）、アセトアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（Acetoacetyl Co-A carboxylase）（ＡＣＣ）遺伝子のターミネーター配列に対して、ｔＡＣＣ−Ｆ（配列番号３１）およびｔＡＣＣ−Ｒ（配列番号３２）を用いてｐＵＣ−ｐｔＡＣＣを構築した（ｐＵＣ−ｐｔＰＹＫ、ｐＵＣ−ｐｔＴＥＦ、ｐＵＣ−ｐｔＰＫ、ｐＵＣ−ｐｔＨＫおよびｐＵＣ−ｐｔＡＣＣの各コンストラクトの詳細は、図２の中段参照）。【０１１４】
構築した各ベクターを、アルカリ抽出法によって調製し、これをＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉＰｒｅｐＫｉｔ（キアゲン社製）にてカラム精製した。次に、分光光度計ＵｌｔｒｏＪＰ２００５−１３７３０６Ａ２００５．６．２ｓｐｅｃ３０００（株式会社島津製作所製）にてＤＮＡ濃度を測定し、ＤＮＡ塩基配列キットＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  アプライド  バイオシステムズ（PE Applied Biosystems）社製）に従ってシークエンシング反応を行った。反応試料を塩基配列解析装置ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  アプライド  バイオシステムズ（PE Applied Biosystems）社製）にセットし、構築した遺伝子カセットの塩基配列を決定した。なお、機器の使用方法の詳細は本装置付属のマニュアルに従った。【０１１５】
【表２】
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【０１１６】
（短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素（ｔＨＭＧＲ）遺伝子発現制御用ベクターの構築）
実施例１において脂質生産培地での培養で比較的高い発現を示した５種の遺伝子から発現制御配列を取得し、リポマイセス・スターキー用コドンに最適化した、出芽酵母由来の短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素（ｔＨＭＧＲ）遺伝子のＤＮＡ断片を遺伝子合成により準備した。合成した遺伝子断片を、プライマーとして、ｔＨＭＧＲ−ＰＹＫ−Ｆ（配列番号３７）およびｔＨＭＧＲ−ＰＹＫ−Ｒ（配列番号３８）を用いてプライムスターＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲにより増幅した。これをＢｓｐＱＩ処理したｐＵＣ−ｐｔＰＹＫおよびＨｉｆｉ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ社）を用いてライゲーションした（図３参照）。そして、ＤＨ５α株へ形質転換し、５０ｍｇ／Ｌのアンピシリン含有ＬＢ寒天培地で選抜することによってｐＵＣ−ｐｔＰＹＫ−ｔＨＭＧＲを持つクローンを得た（コンストラクトの詳細は、図２の下段参照）。【０１１７】
ｐＵＣ−ｐｔＰＹＫ−ｔＨＭＧＲと同様の方法で、ｐＵＣ−ｐｔＴＥＦ−ｔＨＭＧＲ、ｐＵＣ−ｐｔＰＫ−ｔＨＭＧＲ、ｐＵＣ−ｐｔＨＫ−ｔＨＭＧＲおよびｐＵＣ−ｐｔＡＣＣ−ｔＨＭＧＲを構築した。すなわち、短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子のＤＮＡ断片を鋳型に用いて、プライマーとしてそれぞれ、以下を用いてＤＮＡ断片を増幅した：ｐＵＣ−ｐｔＴＥＦ−ｔＨＭＧＲに対して、ｔＨＭＧＲ−ＴＥＦ−Ｆ（配列番号４５）とｔＨＭＧＲ−ＴＥＦ−Ｒ（配列番号４６）；ｐＵＣ−ｐｔＰＫ−ｔＨＭＧＲに対して、ｔＨＭＧＲ−ＰＫ−Ｆ（配列番号４１）とｔＨＭＧＲ−ＰＫ−Ｒ（配列番号４２）；ｐＵＣ−ｐｔＨＫ−ｔＨＭＧＲに対して、ｔＨＭＧＲ−ＨＫ−Ｆ（配列番号３９）とｔＨＭＧＲ−ＨＫ−Ｒ（配列番号４０）、；ｐＵＣ−ｐｔＡＣＣ−ｔＨＭＧＲに対して、ｔＨＭＧＲ−ＡＣＣ−Ｆ（配列番号４３）とｔＨＭＧＲ−ＡＣＣ−Ｒ（配列番号４４）。増幅した各ＤＮＡ断片を、それぞれ、ＢｓｐＱＩ処理したｐＵＣ−ｐｔＴＥＦ、ｐＵＣ−ｐｔＰＫ、ｐＵＣ−ｐｔＨＫおよびｐＵＣ−ｐｔＡＣＣの各ベクターにライゲーションすることで、それぞれ、ｐＵＣ−ｐｔＴＥＦ−ｔＨＭＧＲ、ｐＵＣ−ｐｔＰＫ−ｔＨＭＧＲ、ｐＵＣ−ｐｔＨＫ−ｔＨＭＧＲおよびｐＵＣ−ｐｔＡＣＣ−ｔＨＭＧＲの各ベクターを構築した。各プライマーの塩基配列を表３に、各ベクターのコンストラクトの詳細を、図２の下段に示す。【０１１８】
【表３】
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【０１１９】
＜実施例４．リコペン生合成ベクターの構築＞
パントエア・アナティス（Patoea ananatis）由来のリコペン生合成経路遺伝子（ｃｒｔＥ，ｃｒｔＢおよびｃｒｔＩ）発現カセットを下記のように構築した。【０１２０】
ｃｒｔＥ発現カセットの構築のため、ＰＧＫ遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列を、リポマイセス・スターキー株から精製したゲノムＤＮＡを鋳型に用いてプライムスターＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼにより増幅した。プライマーは、ＰＧＫ遺伝子のプロモーター配列に対して、ｐＰＧＫ−ｓａｃＩ−Ｆ（配列番号４７）とｐＰＧＫ−ｓａｃＩ−Ｒ（配列番号４８）とを用い、ＰＧＫ遺伝子のターミネーター配列に対して、ｔＰＧＫ−ｓａｃＩ−Ｆ（配列番号４９）とｔＰＧＫ−ｓａｃＩ−Ｒ（配列番号５０）とを用いた（各プライマーの塩基配列は、表４参照）。ｃｒｔＥ遺伝子について遺伝子合成によりコドンを最適化した配列を準備し、プライマーとして、ｃｒｔＥ−Ｆ（配列番号５９）およびｃｒｔＥ−Ｒ（配列番号６０）を用いて上記配列をＰＣＲにより増幅した。増幅した３断片を利用してオーバーラップＰＣＲを行い、ｃｒｔＥ遺伝子に機能的にプロモーター配列およびターミネーター配列を連結させた（非特許文献６参照）。以後のベクター構築のため、作製したｃｒｔＥ発現カセットの両端にはＳａｃＩサイトが付加されるようにプライマーを設計した（配列番号４７〜５０）。連結したＤＮＡ断片をｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（ライフテクノロジー社製）にサブクローニングした後、ＤＮＡ配列を解読し、設計どおりに連結されていることを確認した。【０１２１】
同様にｃｒｔＢについては、ＴＰＩ遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列の制御下になるように、プライマーとして、ｐＴＰＩ−Ｆ（配列番号５１）、ｐＴＰＩ−Ｒ（配列番号５２）、ｔＴＰＩ−Ｆ（配列番号５３）、ｔＴＰＩ−Ｒ（配列番号５４）、ｃｒｔＢ−Ｆ（配列番号６１）およびｃｒｔＢ−Ｒ（配列番号６２）を用いて、発現制御配列と遺伝子合成したｃｒｔＢとが機能的に連結したｃｒｔＢ発現カセットを構築した。以後のベクター構築のため、作製したｃｒｔＢ発現カセットの両端にはＳｍａＩサイトが付加されるようにプライマーを設計した（配列番号５１〜５４）。同様にｃｒｔＩについては、ＴＥＦ遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列の制御下になるように、プライマーとして、ｐＴＥＦ−ｐｓｔＩ−Ｆ（配列番号５５）、ｐＴＥＦ−ｐｓｔＩ−Ｒ（配列番号５６）、ｔＴＥＦ−ｐｓｔＩ−Ｆ（配列番号５７）、ｔＴＥＦ−ｐｓｔＩ−Ｒ（配列番号５８）、ｃｒｔＩ−Ｆ（配列番号６３）およびｃｒｔＩ−Ｒ（配列番号６４）を用いて、発現制御配列と遺伝子合成したｃｒｔＩが機能的に連結したｃｒｔＩ発現カセットを構築した。以後のベクター構築のため、作製したｃｒｔＩ発現カセットの両端にはＰｓｔＩサイトが付加されるようにプライマーを設計した（配列番号５５〜５８）。ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢおよびｃｒｔＩの各発現カセットをそれぞれ、ｐＵＣ−Ｇ４１８のＳａｃＩサイト、ＳｍａＩサイトおよびＰｓｔＩサイトへと、常法に従いクローニングし、リコペン生合成用ベクターｐＵＣ−ｌｙｃを構築した（図３参照）。【０１２２】
油性酵母リポマイセス・スターキー株へのリコペン生合成遺伝子の導入は、非特許文献７に記載されている方法に従い、酢酸リチウム法による核ゲノムへの遺伝子導入により行った。ｐＵＣ−ｌｙｃを鋳型に用いて、プライマーとして、ｐＵＣ−Ｆ（配列番号６５）およびｐＵＣ−Ｒ（配列番号６６）を用いて、リコペン生合成遺伝子と選抜マーカーとを含む領域１１ｋｂｐをＰＣＲにより増幅し、形質転換に用いるＤＮＡ断片を調製した。ＰＣＲにはＴｋｓ  Ｇｆｌｅｘ（タカラバイオ社）を用いた。２５μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ寒天培地でＧ４１８耐性を示すコロニーを３０℃、７日間培養して取得し、コロニーＰＣＲによりｃｒｔＥ発現カセット、ｃｒｔＢ発現カセットおよびｃｒｔＩ発現カセットを保持していることを確認した。コロニーＰＣＲにはＫＯＤＦｘ酵素（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用し、リコペン生合成に必要な３遺伝子を検出するためのプライマーとして、ｃｒｔＥ発現カセットに対して、ｃｒｔＥ−Ｆ（配列番号５９）とｃｒｔＥ−Ｒ（配列番号６０）とを使用し、ｃｒｔＢ発現カセットに対して、ｃｒｔＢ−Ｆ（配列番号６１）とｃｒｔＢ−Ｒ（配列番号６２）とを使用し、ｃｒｔＩ発現カセットに対して、ｃｒｔＩ−Ｆ（配列番号６３）とｃｒｔＩ−Ｒ（配列番号６４）とを使用した。リコペン生合成遺伝子導入株は野生株と比べて、薄い赤色を呈色していることから、呈色を指標にスクリーニングすることも可能である。【０１２３】
【表４】
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【０１２４】
＜実施例５．形質転換酵母の作製＞
油性酵母リポマイセス・スターキー株へのリコペン生合成遺伝子の導入は、非特許文献７に記載されている方法に従い、酢酸リチウム法による核ゲノムへの遺伝子導入によって行った。ｐＵＣ−ｌｙｃを鋳型に用いて、プライマーとして、ｐＵＣ−Ｆ（配列番号６５）およびｐＵＣ−Ｒ（配列番号６６）を用いて、リコペン生合成遺伝子と選抜マーカーとを含む領域１１ｋｂｐをＰＣＲにより増幅し、形質転換に用いるＤＮＡ断片を調製した（各プライマーの塩基配列は、表５参照）。ＰＣＲにはＴｋｓ  Ｇｆｌｅｘ（タカラバイオ社製）を用いた。プライマーＤＮＡ５０ｐｍｏｌ×２、２倍濃縮酵素反応用バッファー２５μｌおよびＴｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡポリメラーゼ１．２５ユニットを加えた５０μｌの反応液をサーマルサイクラーにセットして、ｐＵＣ−ｌｙｃプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを鋳型に用いて、ＤＮＡ断片を調製した。サーマルサイクラーの反応条件は、９４℃１分の熱処理を行った後、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、６８℃で５分３０秒（伸長時間３０秒／１ｋｂ）の３つの温度変化を１サイクルとし、これを３５サイクル繰り返し、最後に４℃で反応試料を保存した。２５ｍｇ／ｌのＧ４１８を含むＹＰＤ寒天培地でＧ４１８耐性を示すコロニーを３０℃、７日間培養して取得し、コロニーＰＣＲによりｃｒｔＥ遺伝子（０．９１ｋｂ）、ｃｒｔＢ遺伝子（０．９３ｋｂ）およびｃｒｔＩ遺伝子（１．４８ｋｂ）を保持していることを確認した。コロニーＰＣＲにはＫＯＤＦｘ酵素（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用し、リコペン生合成に必要な３遺伝子を検出するためのプライマーとして、それぞれ以下を使用した；ｃｒｔＥ遺伝子に対して、ｃｒｔＥ−Ｆ（配列番号５９）とｃｒｔＥ−Ｒ（配列番号６０）、ｃｒｔＢ遺伝子に対して、ｃｒｔＢ−Ｆ（配列番号６１）とｃｒｔＢ−Ｒ（配列番号６２）、およびｃｒｔＩ遺伝子に対して、ｃｒｔＩ−Ｆ（配列番号６３）とｃｒｔＩ−Ｒ（配列番号６４）。プライマーＤＮＡ５０ｐｍｏｌ×２、２倍濃縮酵素反応用バッファー５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｍｉｘ０．４μｌおよびＫＯＤ  Ｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ０．１ユニットを加えた１０μｌの反応液をサーマルサイクラーにセットし、菌体懸濁液１μｌを鋳型に用いて、ＤＮＡ断片を調製した。サーマルサイクラーの反応条件は、９５℃５分の熱処理を行った後、９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分３０秒（伸長時間１分／１ｋｂ）の３つの温度変化を１サイクルとし、これを３５サイクル繰り返し、最後に４℃で反応試料を保存した。リコペン生合成遺伝子導入株は野生株と比べて、薄い赤色を呈色していることから、呈色を指標にスクリーニングすることも可能である。【０１２５】
次に、リコペン生合成遺伝子を保持している株に対して、短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子の導入を行った。遺伝子導入用ベクターｐＵＣ−ｐｔＰＹＫ−ｔＨＭＧＲ、ｐＵＣ−ｐｔＴＥＦ−ｔＨＭＧＲ、ｐＵＣ−ｐｔＰＫ−ｔＨＭＧＲ、ｐＵＣ−ｐｔＨＫ−ｔＨＭＧＲ又はｐＵＣ−ｐｔＡＣＣ−ｔＨＭＧＲを鋳型に用いて、プライマーｐＵＣ−Ｆ（配列番号６５）およびｐＵＣ−Ｒ（配列番号６６）を用いてリコペン生合成遺伝子と選抜マーカーとを含む領域６．５ｋｂｐをＰＣＲにより増幅して形質転換に用いるＤＮＡ断片を調製した。ＰＣＲにはＴｋｓ  Ｇｆｌｅｘ（タカラバイオ社）を用いた。前述と同様に、酢酸リチウム法による核ゲノムＤＮＡへの遺伝子導入を行った。形質転換体の選抜は２５μｇ／ｍｌのｃｌｏｎＮＡＴを含有するＹＰＤ寒天培地上で行い、取得したコロニーについて、コロニーＰＣＲにより短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子を保持していることを確認した。コロニーＰＣＲにはプライマーとして、ｔＨＭＧＲ−ＰＹＫ−Ｆ（配列番号３７）およびｔＨＭＧＲ−ＰＹＫ−Ｒ（配列番号３８）を用い、１．５ｋｂの増幅として電気泳動により検出した。【０１２６】
【表５】
2018138966.tif 000006
【０１２７】
＜実施例６．発酵試験による各プロモーターの検証＞
リコペン生合成遺伝子と、各遺伝子の発現制御配列とを連結させた短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子発現カセットを導入した遺伝子組換え体において、リコペン生産量を定量した。これにより、短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子の発現に適した発現制御配列を選抜した。それぞれの菌株を２ｍｌのＹＰＤ培地に植菌後、３０℃、１８０ｒｐｍの振とう培養により２日間、前培養した。その後、５０ｍｌの脂質生産培地を入れた三角フラスコに前培養液を５００μｌ植菌した。３０℃、１８０ｒｐｍの回転振とう培養を５日間行い、培養液５ｍｌから菌体ペレットを回収した。上記菌体ペレットに０．５ｍｌのＤＭＳＯと２ｍｌの酢酸エチルとを添加して１分間ボルテックスした後、２時間静置した。次に、塩化ナトリウム飽和水溶液２ｍｌを添加して１分間ボルテックスした後、２０００×Ｇ  ５分の遠心分離により、有機層と水層とに分離した。リコペンは有機層（酢酸エチル）に分配されることから、上層の有機層１ｍｌを回収し、回収した有機層をＨＰＬＣ（株式会社島津製作所製）に供した。逆相カラム（ＣＯＳＭＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ  ４．６ＩＤ×１５０ｍｍ）、移動相（アセトニトリル：エタノール＝７：３）および流速１ｍｌ／ｍｉｎというＨＰＬＣでの検出条件下、吸収波長  ４５２ｎｍでリコペンの検出を行った。濃度既知のリコペン標品を用いた検量線からサンプル濃度を定量した（図４参照）。図４に、短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子の発現調節株におけるリコペン生産量の比較の結果を示す。図４中、ｐＵＣ−ｐｔＰＹＫ−ｔＨＭＧＲは、ピルビン酸キナーゼ（Pyruvate kinase）遺伝子の発現制御配列を用いてｔＨＭＧＲ遺伝子を発現させた結果を示し、ｐＵＣ−ｐｔＴＥＦ−ｔＨＭＧＲは、翻訳伸長因子（Translation elongation factor 1）遺伝子の発現制御配列を用いてｔＨＭＧＲ遺伝子を発現させた結果を示し、ｐＵＣ−ｐｔＰＫ−ｔＨＭＧＲは、ホスホケトラーゼ（Phosphoketolase）遺伝子の発現制御配列を用いてｔＨＭＧＲ遺伝子を発現させた結果を示し、ｐＵＣ−ｐｔＡＣＣ−ｔＨＭＧＲは、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（Acetyl Co-A carboxylase）遺伝子の発現制御配列を用いてｔＨＭＧＲ遺伝子を発現させた結果を示し、ｐＵＣ−ｐｔＨＫ−ｔＨＭＧＲは、ヒスチジンキナーゼ（Histidine kinase）遺伝子の発現制御配列を用いてｔＨＭＧＲ遺伝子を発現させた結果を示す。図４に示すように、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）遺伝子の発現制御配列を用いた場合のリコペン生産量が最も高く、次に翻訳伸長因子（ＴＥＦ）遺伝子の発現制御配列を用いた場合のリコペン生産量が高く、３番目に、ホスホケトラーゼ（ＰＫ）遺伝子の発現制御配列を用いた場合のリコペン生産量が高いことが分かった。【０１２８】
発明者らが、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列の制御下で、短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子をリポマイセス・スターキー内で発現させたところ、イソプレノイド化合物の生産量が最も増加することがわかった。これは、各プロモーターの発現強度と、イソプレノイド化合物の生産量との関連性からでは当業者が思いつかない結果であった。また、ホスホケトラーゼ（ＰＫ）遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列の制御下で、短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子を発現させることによって、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列の制御下で発現させる場合に比べてイソプレノイド化合物の生産量が減少することが分かった。これはイソプレノイド生合成経路の活性を任意に調節できることを示しており、ホスホケトラーゼ（ＰＫ）遺伝子の発現解析で示された本遺伝子が最も高い発現量であったというデータからは予想困難な結果であった。【０１２９】
なお、油性酵母においてはもちろんのこと、真核宿主においても、ＰＹＫ遺伝子のプロモーター配列、およびＰＫ遺伝子のプロモーター配列を利用すると、イソプレノイド生合成酵素遺伝子についてそれぞれ相当高い発現レベルで、およびかなり高い発現レベルで制御できるという知見はこれまで存在しなかった。【０１３０】
実施例の形質転換体は、メバロン酸経路の律速ステップであるヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素活性を最適化するために発現に適した発現制御配列が、機能的に短縮型ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素遺伝子に連結されているポリヌクレオチド構築物を導入されている。従って、実施例の形質転換体を培養することで、メバロン酸経路の活性を増大し、イソプレノイド生合成酵素の働きを促進し、イソプレノイドの生産量を増大させることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明は、医薬品、飼料、食品添加物、機能性食品、香料およびバイオ燃料などの種々の産業において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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