(57)【要約】  細胞の培養方法は、腎臓細胞２４を培養容器２６に非接着の状態で５日以上の期間培養し、培養期間中に腎臓細胞２４の凝集体３０を形成して、一部の期間は凝集体３０の状態で腎臓細胞２４を培養する工程を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で５日以上の期間培養し、培養期間中に前記腎臓細胞の凝集体を形成して、一部の期間は凝集体の状態で前記腎臓細胞を培養する工程を含むことを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項２】
前記凝集体は、培養１日目に形成され、
前記腎臓細胞の培養期間は、１０日以下である請求項１に記載の細胞の培養方法。
【請求項３】
前記凝集体を構成する前記腎臓細胞の数は、５００個以上５０００個以下である請求項１又は２に記載の細胞の培養方法。
【請求項４】
前記凝集体の大きさは、１００μｍ以上３５０μｍ以下である請求項１乃至３のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
【請求項５】
前記培養容器は、細胞非接着処理が施されているか、細胞非接着材料で構成されている請求項１乃至４のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
【請求項６】
コラーゲンＩを含む培地で前記腎臓細胞を培養することを含む請求項１乃至５のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
【請求項７】
前記培地中の前記コラーゲンＩの濃度は、０．０００５ｍｇ／ｍｌ超０．１５ｍｇ／ｍｌ未満である請求項６に記載の細胞の培養方法。
【請求項８】
ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上を含むコーティング剤を、基材の少なくとも一部に塗布する工程と、
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の細胞の培養方法で形成された凝集体を、個々の培養細胞に分離する工程と、
前記コーティング剤を塗布した前記基材に前記培養細胞を播種し、前記基材上で前記培養細胞を培養して、前記培養細胞の単層構造を形成する工程と、
を含むことを特徴とする細胞支持複合体の製造方法。
【請求項９】
腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で５日以上の期間培養し、培養期間中に前記腎臓細胞の凝集体を形成して、一部の期間は凝集体の状態で前記腎臓細胞を培養することで作製されることを特徴とする培養細胞。
【請求項１０】
基材と、
前記基材の少なくとも一部を被覆する、ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上を含むコーティング剤層と、
前記コーティング剤層を介して前記基材に付着する請求項９に記載の培養細胞と、
を備えることを特徴とする細胞支持複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養方法、細胞支持複合体の製造方法、培養細胞及び細胞支持複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、腎不全患者の腎機能を代替するバイオ人工腎臓として、中空糸膜等のポリマー膜と近位尿細管上皮細胞等の腎臓細胞（腎機能を有する細胞）をハイブリッド化したモジュールの開発が進められている。特に、バイオ人工腎臓の製造や供給、使用を考慮すると、数週間以上にわたって腎機能を維持できるバイオ人工腎臓が必要になる。【０００３】
また、生体に投与された薬剤は、生体内で作用した後、近位尿細管で血液から尿中に排出される。このため、近位尿細管細胞は、薬剤の影響を受けやすく、薬剤の毒性によって損傷する可能性がある。このため、新薬開発において、近位尿細管細胞に対する候補物質の毒性や、薬物の代謝を予測するモジュールの開発は非常に有用である。上述したポリマー膜と尿細管上皮細胞のハイブリッドモジュールは、この薬物評価モジュールとしても好適に採用し得る。【０００４】
バイオ人工腎臓や薬物評価モジュールに用いられる近位尿細管上皮細胞に関して、特許文献１には、細胞周期制御因子の遺伝子発現を抑制することで、十分な数の近位尿細管上皮細胞が得られるように当該細胞の分裂寿命を延長する培養技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−５０３５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、近位尿細管上皮細胞等の腎臓細胞の培養技術について鋭意研究を重ねた結果、従来の培養技術では、培養により腎臓細胞の生理機能が低下してしまい、このためバイオ人工腎臓や薬物評価モジュールへ利用可能な培養細胞の作製が困難であることを見出した。【０００７】
本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的の１つは、生理機能がより良好な状態にある細胞を培養により獲得するための技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明のある態様は細胞の培養方法である。当該培養方法は、腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で５日以上の期間培養し、培養期間中に腎臓細胞の凝集体を形成して、一部の期間は凝集体の状態で腎臓細胞を培養する工程を含む。この態様によれば、生理機能がより良好な状態にある細胞を獲得することができる。【０００９】
上記態様において、凝集体は、培養１日目に形成され、腎臓細胞の培養期間は、１０日以下であってもよい。また、凝集体を構成する腎臓細胞の数は、５００個以上５０００個以下であってもよい。また、凝集体の大きさは、１００μｍ以上３５０μｍ以下であってもよい。また、培養容器は、細胞非接着処理が施されているか、細胞非接着材料で構成されていてもよい。また、コラーゲンＩを含む培地で腎臓細胞を培養することを含んでもよい。培地中のコラーゲンＩの濃度は、０．０００５ｍｇ／ｍｌ超０．１５ｍｇ／ｍｌ未満であってもよい。【００１０】
本発明の別の態様は、細胞支持複合体の製造方法である。当該製造方法は、ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上を含むコーティング剤を、基材の少なくとも一部に塗布する工程と、上記いずれかの態様の細胞の培養方法で形成された凝集体を、個々の培養細胞に分離する工程と、コーティング剤を塗布した基材に培養細胞を播種し、基材上で培養細胞を培養して、培養細胞の単層構造を形成する工程と、を含む。【００１１】
本発明のさらに別の態様は、培養細胞である。当該培養細胞は、腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で５日以上の期間培養し、培養期間中に腎臓細胞の凝集体を形成して、一部の期間は凝集体の状態で腎臓細胞を培養することで作製される。【００１２】
本発明のさらに別の態様は、細胞支持複合体である。当該細胞支持複合体は、基材と、基材の少なくとも一部を被覆する、ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上を含むコーティング剤層と、コーティング剤層を介して基材に付着する上記態様の培養細胞とを備える。【００１３】
なお、以上の構成要素の任意の組み合わせや、本発明の構成要素や表現を方法、装置、システムなどの間で相互に置換したものもまた、本発明の態様として有効である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、生理機能がより良好な状態にある細胞を培養により獲得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１（Ａ）及び図１（Ｂ）は、参考例に係る細胞支持複合体の構造を模式的に示す図である。
【図２】図２（Ａ）〜図２（Ｃ）は、実施の形態に係る培養細胞と、この培養細胞を含む細胞支持複合体の構成を模式的に示す図である。
【図３】図３（Ａ）〜図３（Ｅ）は、実施の形態に係る細胞の培養方法及び細胞支持複合体の製造方法の工程図である。
【図４】図４（Ａ）〜図４（Ｆ）は、実施の形態に係る細胞支持複合体の採用例を模式的に示す図である。
【図５】細胞を接着培養した場合における遺伝子発現量の経時変化を示す図である。
【図６】図６（Ａ）は、非接着培養３，７日の細胞の光学顕微鏡画像である。図６（Ｂ）は、凝集体の直径の最大値と最小値とを示す図である。図６（Ｃ）は、凝集体の構成細胞数の経時変化を示す図である。
【図７】凝集体を構成する細胞における遺伝子発現量の経時変化を示す図である。
【図８】凝集体を構成する細胞における遺伝子発現量の経時変化を示す図である。
【図９】凝集体から分離した細胞の再播種０，３，７日の光学顕微鏡画像である。
【図１０】ロット及び継代培養数が異なる細胞の播種から２４時間後の光学顕微鏡画像である。
【図１１】凝集状態が異なる細胞におけるＯＡＴ１遺伝子の発現量を示す図である。
【図１２】異なる細胞接着因子を添加した細胞懸濁液の播種から２４時間後の光学顕微鏡画像である。
【図１３】図１３（Ａ）は、様々な濃度のコラーゲンＩを添加した細胞懸濁液の播種２４時間後の光学顕微鏡画像である。図１３（Ｂ）は、コラーゲンＩの濃度と凝集体形成の有無との関係を示す図である。
【図１４】コラーゲンＩを添加した細胞懸濁液及びコラーゲンＩを非添加の細胞懸濁液の、播種から２４時間後の光学顕微鏡画像である。
【図１５】図１５（Ａ）は、コラーゲンＩを添加して培養した細胞におけるＯＡＴ１遺伝子の発現量を示す図である。図１５（Ｂ）は、コラーゲンＩを添加せずに培養した細胞におけるＯＡＴ１遺伝子の発現量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者は、腎臓細胞の培養技術について考察し、以下のような認識を得た。すなわち、腎臓から酵素処理により単離された近位尿細管上皮細胞等の腎臓細胞（初代培養細胞）は、生体内環境の消失や、シャーレ上での二次元培養といった培養環境により、脱分化して機能が徐々に消失する。このため、腎臓細胞を単に培養するだけでは、生理機能が不十分な細胞が増えるだけである。脱分化した細胞を用いてバイオ人工腎臓を製造した場合、血漿中の有用成分の再吸収機能が十分に高くないものとなる可能性がある。また、脱分化した細胞を用いて薬物評価モジュールを製造した場合、高い精度で薬物動態や毒性反応を示さない可能性がある。これに対し本発明者は、特定の培養を行うことで、脱分化した腎臓細胞の生理機能を回復させられることを見出した。
【００１７】
また、腎臓から単離された近位尿細管上皮細胞は、本来の円柱状の細胞構造を維持できず、扁平形状に変化する。さらに、近位尿細管上皮細胞をシャーレや人工膜上に播種すると、単層上皮構造を消失して細胞間に隙間が生じたり、細胞が重層化したりする。このような現象が生じることで、バイオ人工腎臓において有用成分の再吸収機能が劣化し得る。また、薬物評価モジュールの精度が低下し得る。これに対し本発明者は、生理機能が回復した近位尿細管上皮細胞を用いて、基材上に安定した単層上皮構造を形成する技術を見出した。実施の形態は、このような思索に基づいて案出されたものである。
【００１８】
以下、本発明を好適な実施の形態をもとに図面を参照しながら説明する。実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。各図面に示される同一又は同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、各図に示す各部の縮尺や形状は、説明を容易にするために便宜的に設定されており、特に言及がない限り限定的に解釈されるものではない。また、本明細書または請求項中に「第１」、「第２」等の用語が用いられる場合には、この用語はいかなる順序や重要度を表すものでもなく、ある構成と他の構成とを区別するためのものである。
【００１９】
図１（Ａ）及び図１（Ｂ）は、参考例に係る細胞支持複合体の構造を模式的に示す図である。図１（Ａ）には、一般的なコーティング剤を用いた場合の細胞支持複合体が図示されている。図１（Ｂ）には、コーティング剤を用いない場合の細胞支持複合体が図示されている。図１（Ａ）に示すように、従来公知の一般的なコーティング剤１０２をコーティングした人工膜等の基材１０４に、近位尿細管上皮細胞１０６を播種して得られる細胞支持複合体１００ａでは、近位尿細管上皮細胞１０６が重層化したり、細胞間に隙間が空いてしまうことがあった。図１（Ｂ）に示すように、コーティング剤１０２を塗布していない基材１０４に近位尿細管上皮細胞１０６を播種して得られる細胞支持複合体１００ｂにおいても同様に、近位尿細管上皮細胞１０６の重層化や隙間の発生があった。
【００２０】
近位尿細管上皮細胞１０６が重層化した領域では、細胞頂端膜側から細胞基底膜側への、トランスポーターを介した有用物質の移動が妨げられ得る（矢印Ｐ）。また、隣り合う近位尿細管上皮細胞１０６の隙間において、基材１０４を介した濃度依存性の物質移動が生じ得る（矢印Ｑ）。
【００２１】
図２（Ａ）〜図２（Ｃ）は、実施の形態に係る培養細胞と、この培養細胞を含む細胞支持複合体の構成を模式的に示す図である。図２（Ａ）には、水透過性を有する基材、言い換えれば水透過性が相対的に高い基材を用いた場合の細胞支持複合体が図示されている。図２（Ｂ）には、水透過性を有しない基材、言い換えれば水透過性が相対的に低い基材を用いた場合の細胞支持複合体であって、短時間経過した状態が図示されている。図２（Ｃ）には、水透過性を有しない基材を用いた場合の細胞支持複合体であって、長時間経過した状態が図示されている。
【００２２】
細胞支持複合体１０は、基材１２と、コーティング剤層１４と、培養細胞１６とを備える。
【００２３】
［基材］
基材１２は、例えば人工材料で構成される。図２（Ａ）に示すように、基材１２は、水や各種イオンに対する透過性を有する。また、基材１２は、糖や低分子タンパク質に対する透過性も有することが好ましい。このような基材１２を備える細胞支持複合体１０は、例えばバイオ人工腎臓として利用することができる。細胞頂端膜側に存在する有用物質５０は、培養細胞１６が備える細胞頂端膜側のトランスポーター１８及び細胞基底膜側のトランスポーター２０と、基材１２とを介して細胞支持複合体１０を通過し、細胞基底膜側に移動する。
【００２４】
各種の物質に対する透過性を持たせるために、基材１２には、例えば孔が設けられる。基材１２に設けられる孔の平均孔径は、好ましくは５μｍ以下である。平均孔径を５μｍ以下とすることで、培養細胞１６が基材１２を通過するおそれを低減することができる。このような基材１２として、例えばＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社：平均孔径０．４μｍ又は３．０μｍ）を用いることができる。
【００２５】
また、図２（Ｂ）及び図２（Ｃ）に示すように、基材１２は、水や各種イオンに対する透過性を有しなくてもよい。このような基材１２を備える細胞支持複合体１０は、例えば、薬物の代謝（培養細胞１６による薬物の取込量等）や毒性を評価する薬物評価モジュールとして利用することができる。基材１２には、水透過性を有しないシャーレやウェルプレート等を用いることができる。細胞頂端膜側に存在する有用物質５０は、培養細胞１６のトランスポーター１８を介して培養細胞１６の内部に取り込まれる。使用開始から短時間のうちは、培養細胞１６のトランスポーター２０を介した有用物質５０の細胞基底膜側への移動が少ないため、図２（Ｂ）に示すように培養細胞１６の層に変形は生じない。一方、長時間経過すると、トランスポーター２０を介した有用物質５０の移動量が増えるが、有用物質５０は基材１２を通過できないため、図２（Ｃ）に示すように培養細胞１６の層が浮き上がってドーム２２が形成される。
【００２６】
基材１２を構成する素材としては、特に限定されないが、例えばポリスチレン、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエステル（ＰＥＴ）、ポリエステル系ポリマーアロイ（ＰＥＰＡ）、エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）、ポリエチレン、ポリスルホン（ＰＳｆ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）等が例示される。また、基材１２の形態としては、特に限定されないが、例えば培養ウェルプレート、培養シャーレ、中空糸膜、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、平膜等の人工膜や、微細流路チップ、中実粒子、中空粒子等が例示される。
【００２７】
［コーティング剤層］
コーティング剤層１４は、コーティング剤で構成される層である。コーティング剤層１４は、基材１２の少なくとも一部を被覆する。コーティング剤層１４は、基材１２の表面に接着して基材１２に固定される。前記「基材１２の少なくとも一部」とは、例えば、平面又は曲面を有する基材１２の少なくとも１つの面を意味する。基材１２が平板状である場合には、「基材１２の少なくとも一部」は、例えば平板の少なくとも一方の主表面を意味する。基材１２が円筒状である場合には、「基材１２の少なくとも一部」は、例えば円筒の内側面又は外側面の少なくとも一方を意味する。
【００２８】
コーディング剤は、ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上の接着分子を含む。コーティング剤層１４がこれらの接着分子を含有することで、培養細胞１６の単層構造をより確実に形成することができる。
【００２９】
（ラミニン分子）
ラミニン分子は、α鎖、β鎖、γ鎖をそれぞれ１本ずつ持つヘテロ三量体構造をとる。現時点では５種類のα鎖、３種類のβ鎖、３種類のγ鎖が同定されている。ラミニン分子は、これらの組合せによって少なくとも１２種類のアイソフォームを形成することが知られている。本実施の形態では、ラミニン１１１、ラミニン２１１、ラミニン２２１、ラミニン３１１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、ラミニン５２１及びこれらの断片のうち１つ以上から選択される。
【００３０】
なお、ラミニン分子には、上述したアイソフォームの１か所以上に所定の修飾基が付加された、ラミニンの改変体（改変ラミニン）も含まれる。改変体には、遺伝子組み換え体、すなわち組み換え遺伝子から得られたタンパク質に変異を導入したタンパク質や、遺伝子組み換え体の部分タンパク質、遺伝子組み換え体由来のペプチドを有するタンパク質も含まれる。
【００３１】
ラミニン分子のアイソフォームのうち、ラミニン３１１、ラミニン５１１及びラミニン５２１は、細胞間のバリア機能の指標である電気抵抗値がラミニン１１１よりも高いため、より好ましい。また、ラミニン５１１及びラミニン５２１は、例えばラミニン１１１と比較してコストが安いため、より好ましい。
【００３２】
コーティング剤におけるラミニン分子の濃度と、基材１２に対するラミニン分子の接着量とは、細胞支持複合体１０が実用期間の間その性能を維持できるように、適宜調整される。ラミニン分子の接着量は、コーティング剤におけるラミニン分子の濃度を調整することで、制御することができる。細胞支持複合体１０の実用期間は、好ましくは基材１２上での培養細胞１６の培養開始から２週間以上であり、より好ましくは３週間以上でり、さらに好ましくは４週間以上である。
【００３３】
基材１２に対するラミニン分子の接着量は、当業者に公知の方法を用いて測定することができる。例えば、ラミニン分子を含むコーティング剤が基材１２に塗布された後、４℃にて一晩静置することでコーティング剤層１４が形成される。そして、基材１２に接着したラミニン分子の量が、例えば２−Ｄ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて定量される。
【００３４】
ラミニン１１１の場合、濃度を３．０μｇ／ｍｌ以上として、約０．１５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることが好ましい。これにより、接着分子としての機能をより確実に発揮させることができる。また、培養細胞１６の単層構造を約１５日以上維持することができる。また、濃度を４．０μｇ／ｍｌ以上として、約０．１９μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることがより好ましい。これにより、培養細胞１６の単層構造を２８日以上維持することができる。
【００３５】
ラミニン２１１の場合、濃度を８．０μｇ／ｍｌ超として、約０．４５μｇ／ｃｍ２超の接着量とすることが好ましい。これにより、接着分子としての機能をより確実に発揮させることができる。また、培養細胞１６の単層構造を約１５日以上維持することができる。また、濃度を１０μｇ／ｍｌ以上として、約０．５２μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることがより好ましい。これにより、培養細胞１６の単層構造を２８日以上維持することができる。
【００３６】
ラミニン２２１の場合、濃度を８．０μｇ／ｍｌ超として、約０．３０μｇ／ｃｍ２超の接着量とすることが好ましい。これにより、接着分子としての機能をより確実に発揮させることができる。また、培養細胞１６の単層構造を約１５日以上維持することができる。また、濃度を１０μｇ／ｍｌ以上として、約０．３４μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることがより好ましい。これにより、培養細胞１６の単層構造を１８日以上維持することができる。
【００３７】
ラミニン３１１の場合、濃度を約２．５μｇ／ｍｌ以上として、約０．１０μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることが好ましい。これにより、接着分子としての機能をより確実に発揮させることができる。また、培養細胞１６の単層構造を約１５日以上維持することができる。また、濃度を４．０μｇ／ｍｌ以上として、約０．１５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることがより好ましい。これにより、培養細胞１６の単層構造を２８日以上維持することができる。
【００３８】
ラミニン３３２の場合、濃度を８．０μｇ／ｍｌ以上とすることが好ましい。これにより、接着分子としての機能をより確実に発揮させることができる。また、培養細胞１６の単層構造を１５日以上維持することができる。また、濃度を１０μｇ／ｍｌ以上とすることがより好ましい。これにより、培養細胞１６の単層構造を１８日以上維持することができる。
【００３９】
ラミニン４２１の場合、濃度を５．０μｇ／ｍｌ以上として、約０．５０μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることが好ましい。これにより、接着分子としての機能をより確実に発揮させることができる。また、培養細胞１６の単層構造を１５日以上維持することができる。また、濃度を６．０μｇ／ｍｌ以上として、約０．５４μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることがより好ましい。これにより、培養細胞１６の単層構造を１８日以上維持することができる。また、濃度を１０μｇ／ｍｌ以上として、約０．６９μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることがさらに好ましい。これにより、培養細胞１６の単層構造を２８日以上維持することができる。
【００４０】
ラミニン５１１の場合、濃度を約８．０μｇ／ｍｌ超として、約０．３０μｇ／ｃｍ２超の接着量とすることが好ましい。これにより、接着分子としての機能をより確実に発揮させることができる。また、培養細胞１６の単層構造を約１５日以上維持することができる。また、濃度を１０μｇ／ｍｌ以上として、約０．３２μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることがより好ましい。これにより、培養細胞１６の単層構造を１８日以上維持することができる。
【００４１】
ラミニン５２１の場合、濃度を約４．５μｇ／ｍｌ以上として、約０．４０μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることが好ましい。これにより、接着分子としての機能をより確実に発揮させることができる。また、培養細胞１６の単層構造を約１５日以上維持することができる。また、濃度を５．０μｇ／ｍｌ以上として０．４４μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることがより好ましい。これにより、培養細胞１６の単層構造を２８日以上維持することができる。
【００４２】
なお、各ラミニン分子の市販品の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度では処理が煩雑となり、またコストがかかる。このため各ラミニン分子の濃度は、１００μｇ／ｍｌ以下であることが好ましい。
【００４３】
ラミニン分子として改変ラミニンが使用される場合、修飾基は、例えば増殖因子結合分子又は細胞接着分子である。このような改変ラミニンを用いた場合にも、改変されていないラミニン分子と同様の作用効果を奏することができる。
【００４４】
コーティング剤に含有させる接着因子として、ラミニン分子の断片が用いられてもよい。ラミニン分子の断片としては、例えば完全長ラミニンのうちドメインＩの細胞接着部位（インテグリン結合部位）を含むＥ８領域の改変体（ラミニン＊＊＊−Ｅ８と表記する）が例示される。このような改変体として、例えばラミニン１１１−Ｅ８、ラミニン２１１−Ｅ８、ラミニン４２１−Ｅ８及びラミニン５２１−Ｅ８が挙げられる。これらの分子量は、いずれも完全長ラミニンの１／５程度である。
【００４５】
ラミニン分子の断片としてラミニン５１１のＥ８領域の改変体（ラミニン５１１−Ｅ８）が使用される場合、市販のラミニン５１１−Ｅ８（ｉＭａｔｒｉｘ−５１１：株式会社ニッピ）の濃度を考慮すると、濃度を約１．４μｇ／ｍｌ以上約５００μｇ／ｍｌ以下として、０．１５μｇ／ｃｍ２以上３１．１８μｇ／ｃｍ２以下の接着量とするが好ましい。ラミニン５１１−Ｅ８の濃度を約１．４μｇ／ｍｌ以上とすることで、接着分子としての機能をより確実に発揮させることができる。また、ラミニン５１１−Ｅ８の濃度を約５００μｇ／ｍｌ以下とすることで、コーティング剤の調製が難しくなることを回避することができる。また、これにより、培養細胞１６の単層構造を２８日以上維持することができる。また、濃度を約２．５μｇ／ｍｌ以上約５０μｇ／ｍｌ以下として、０．２１μｇ／ｃｍ２以上６．２１μｇ／ｃｍ２以下の接着量とすることがより好ましい。
【００４６】
ラミニン分子の断片としては、Ｅ８領域の改変体だけでなく、細胞接着活性を有するラミニンペプチド、あるいは細胞活性部位のみをペプチド合成したものを用いることもできる。このようなラミニンペプチドとしては、例えばβ鎖のドメインＩＩＩに由来するＹＩＧＳＲ含有ペプチド、β鎖のドメインＩＩＩに由来するＰＤＳＧＲ含有ペプチド、β鎖のドメインＩＩＩに由来するＲＹＶＶＬＰＲ含有ペプチド、α鎖のドメインＩＩＩに由来するＲＧＤ含有ペプチド、γ鎖のドメインＩに由来するＫＡＦＤＩＴＹＶＲＬＫＦ含有ペプチド、α鎖のドメインＩに由来するＩＫＶＡＶ含有ペプチド及びβ鎖のドメインＩに由来するＬＲＥ含有ペプチド等が例示される。ラミニンペプチドの濃度は、例えば約０．５〜約５００μｇ／ｍｌである。なお、ラミニン分子の断片の大きさは、特に制限されない。
【００４７】
ラミニン分子の断片を用いる場合、完全長のラミニン分子に比べて分子量が小さいため、より安定したコーティングが可能となる。また、微細領域に対してコーティングしやすくなる。また、接着分子の凝集が生じにくくなるため、コーティング斑の形成を抑制することができる。これらにより、培養細胞１６の単層構造が不均一になることを抑制することができる。また、ラミニン分子の断片を用いることで、高濃度且つ高密度にて接着分子をコーティングすることができる。さらに、リコンビナントタンパク質は、分子量が小さいほど生産効率及び精製効率が上昇する。このため、ラミニン分子の断片を用いることで、細胞支持複合体１０の製造コストをより低下させることができる。
【００４８】
完全長ラミニン分子とラミニン分子の断片とはそれぞれ、複数のアイソフォームが混合されて用いられてもよい。また、完全長ラミニン分子とラミニン分子の断片とが混合されて用いられてもよい。また、異なる種類の完全長ラミニン及び／又はラミニン分子の断片を含む複数のコーティング剤を基材１２に塗布して、含有するラミニン種の異なる複数のコーティング剤層１４が積層されてもよい。
【００４９】
（基底膜マトリックス混合物）
基底膜マトリックス混合物は、マウス肉腫から抽出された細胞外マトリックスタンパク質の混合物である。基底膜マトリックス混合物は、ラミニンと、コラーゲンＩＶと、エンタクチンとを主な構成成分として含む。基底膜マトリックス混合物としては、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標：Ｃｏｒｎｉｎｇ社）が例示される。
【００５０】
Ｍａｔｒｉｇｅｌとは、細胞外マトリックスタンパク質を豊富に含むＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された、可溶性の基底膜マトリックスをいう。本実施の形態において、Ｍａｔｒｉｇｅｌには、成長因子を含む通常のＭａｔｒｉｇｅｌに加えて、このＭａｔｒｉｇｅｌと比べて成長因子が低減されたＭａｔｒｉｇｅｌ（Growth Factor Reduced Matrigel Matrix）も含まれる。以下では適宜、通常のＭａｔｒｉｇｅｌを第１Ｍａｔｒｉｇｅｌと称し、成長因子が低減されたＭａｔｒｉｇｅｌを第２Ｍａｔｒｉｇｅｌと称する。第１Ｍａｔｒｉｇｅｌ及び第２Ｍａｔｒｉｇｅｌは、例えばＣｏｒｎｉｎｇ社から入手することができる。第１Ｍａｔｒｉｇｅｌは、ラミニンを約５６％、コラーゲンＩＶを約３１％、エンタクチンを約８％含む。一方、第２Ｍａｔｒｉｇｅｌは、ラミニンを約６１％、コラーゲンＩＶを約３０％、エンタクチンを約７％含む。
【００５１】
また、基底膜マトリックス混合物としては、ラミニンと、コラーゲンＩＶと、エンタクチンとが約５６〜約６１：約３０〜約３１：約７〜約８の質量比にて混合された混合物を用いることもできる。
【００５２】
コーティング剤における基底膜マトリックス混合物の濃度と、基材１２に対する基底膜マトリックス混合物の接着量とは、細胞支持複合体１０が実用期間の間その性能を維持できるように、適宜調整される。基底膜マトリックス混合物の接着量は、コーティング剤における基底膜マトリックス混合物の濃度を調整することで、制御することができる。
【００５３】
第１Ｍａｔｒｉｇｅｌの場合、濃度を０μｇ／ｍｌ超３０００μｇ／ｍｌ以下として、０μｇ／ｃｍ２超約３４．８５μｇ／ｃｍ２以下の接着量とすることが好ましい。第１Ｍａｔｒｉｇｅｌの濃度を３０００μｇ／ｍｌ以下とすることで、第１Ｍａｔｒｉｇｅｌがゲル化して培養細胞１６が凝集化するおそれを低減することができる。また、濃度を５．０μｇ／ｍｌ以上２０００μｇ／ｍｌ以下として、約０．５μｇ／ｃｍ２以上約２５μｇ／ｃｍ２以下の接着量とすることがより好ましい。また、濃度を５．０μｇ／ｍｌ以上１０００μｇ／ｍｌ以下として、約０．５μｇ／ｃｍ２以上約１６．０４μｇ／ｃｍ２以下の接着量とすることがさらに好ましい。これにより、培養細胞１６の単層構造を２８日以上維持することができる。
【００５４】
第２Ｍａｔｒｉｇｅｌの場合、濃度を２０μｇ／ｍｌ超１０００μｇ／ｍｌ以下として、１．３６μｇ／ｃｍ２超３０．６μｇ／ｃｍ２以下の接着量とすることが好ましい。第２Ｍａｔｒｉｇｅｌの濃度を２０μｇ／ｍｌ超とすることで、接着分子としての機能をより確実に発揮させることができる。また、第２Ｍａｔｒｉｇｅｌの濃度を１０００μｇ／ｍｌ以下とすることで、第２Ｍａｔｒｉｇｅｌがゲル化して培養細胞１６が凝集化するおそれを低減することができる。また、濃度を４０μｇ／ｍｌ以上１０００μｇ／ｍｌ以下として、３．１５μｇ／ｃｍ２以上３０．６μｇ／ｃｍ２以下の接着量とすることがより好ましい。これにより、培養細胞１６の単層構造を２８日以上維持することができる。
【００５５】
コーティング剤に含有させる接着因子として、基底膜マトリックス混合物の断片が用いられてもよい。基底膜マトリックス混合物の断片とは、ラミニンの断片、コラーゲンＩＶの断片及びエンタクチンの断片の少なくとも１つが混合されたものを意味する。また、基底膜マトリックス混合物の完全体と断片とはそれぞれ、複数種が混合されて用いられてもよい。また、完全体と断片とが混合されて用いられてもよい。また、異なる種類の完全体及び／又は断片を含む複数のコーティング剤を基材１２に塗布して、含有する混合物種の異なる複数のコーティング剤層１４が積層されてもよい。
【００５６】
（コラーゲン分子）
コラーゲン分子としては、コラーゲンＩ及びコラーゲンＩＶ等が例示される。これらは、例えば新田ゼラチン株式会社から入手することができる。コーティング剤におけるコラーゲン分子の濃度と、基材１２に対するコラーゲン分子の接着量とは、細胞支持複合体１０が実用期間の間その性能を維持できるように、適宜調整される。コラーゲン分子の接着量は、コーティング剤におけるコラーゲン分子の濃度を調整することで、制御することができる。
【００５７】
コラーゲンＩの場合、濃度を７５０μｇ／ｍｌ超３０００μｇ／ｍｌ以下として、約５０μｇ／ｃｍ２超１３８μｇ／ｃｍ２以下の接着量とすることが好ましい。コラーゲンＩの濃度を７５０μｇ／ｍｌ超とすることで、接着分子としての機能をより確実に発揮させることができる。また、コラーゲンＩの濃度を３０００μｇ／ｍｌ以下とすることで、コラーゲンＩの高い粘性に起因してコーティング剤の均一な塗布が困難になることを、より確実に回避することができる。また、これにより、培養細胞１６の単層構造を１５日以上維持することができる。また、濃度を１０００μｇ／ｍｌ以上３０００μｇ／ｍｌ以下として、６５．４μｇ／ｃｍ２以上１３８μｇ／ｃｍ２以下の接着量とすることがより好ましい。これにより、培養細胞１６の単層構造を２８日以上維持することができる。
【００５８】
コラーゲンＩＶの場合、濃度を５００μｇ／ｍｌ超３０００μｇ／ｍｌ以下として、１９．２μｇ／ｃｍ２超１２１μｇ／ｃｍ２以下の接着量とすることが好ましい。コラーゲンＩＶの濃度を５００μｇ／ｍｌ超とすることで、接着分子としての機能をより確実に発揮させることができる。また、コラーゲンＩＶの濃度を３０００μｇ／ｍｌ以下とすることで、コラーゲンＩＶの高い粘性に起因してコーティング剤の均一な塗布が困難になることを、より確実に回避することができる。また、これにより、培養細胞１６の単層構造を１５日以上維持することができる。また、濃度を７５０μｇ／ｍｌ以上３０００μｇ／ｍｌ以下として、約２５μｇ／ｃｍ２以上１２１μｇ／ｃｍ２以下の接着量とすることがより好ましい。これにより、培養細胞１６の単層構造を２８日以上維持することができる。
【００５９】
コーティング剤に含有させる接着因子として、コラーゲン分子の断片が用いられてもよい。また、コラーゲン分子の完全体と断片とはそれぞれ、複数種が混合されて用いられてもよい。また、完全体と断片とが混合されて用いられてもよい。また、異なる種類の完全体及び／又は断片を含む複数のコーティング剤を基材１２に塗布して、含有するコラーゲン種の異なる複数のコーティング剤層１４が積層されてもよい。
【００６０】
上述したラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらの断片は、それぞれ単独で、又は２種以上を混合して用いられてもよい。また、コーティング剤には、ゼラチン等の他の接着タンパク質がさらに混合されてもよい。
【００６１】
［培養細胞］
培養細胞１６は、コーティング剤層１４を介して基材１２に付着する。すなわち、培養細胞１６は、コーティング剤層１４によって基材１２に固定される。培養細胞１６は、細胞頂端膜側に位置するトランスポーター１８と、細胞基底膜側に位置するトランスポーター２０とを有する。
【００６２】
培養細胞１６は、腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で５日以上（すなわち１２０時間以上）の期間培養することで作製される。培養細胞１６は、細胞支持複合体１０に使用される上で、生理機能を保持している必要がある。一方で、腎臓細胞を生体内環境とは異なる環境で培養すると、脱分化して生理機能が低下していく。これに対し、腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で５日以上培養することで、腎臓細胞の低下した生理機能を回復させることができる。なお、培養により低下した生理機能が少しでも改善されていれば、本実施の形態における「回復」に含まれる。
【００６３】
より具体的には、腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で培養すると、培養期間中に腎臓細胞が凝集体を形成する。例えば、腎臓細胞の凝集体は培養１日目（すなわち２４時間以内）に形成される。そして、一部の期間は凝集体の状態で腎臓細胞を培養することで、腎臓細胞の生理機能を回復させることができる。したがって、培養細胞１６は、腎臓細胞の生理機能を有する細胞である。細胞の培養方法については後に詳細に説明する。
【００６４】
培養細胞１６の基になる腎臓細胞には、組織由来の腎臓細胞や、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞由来の腎臓細胞が含まれる。また、腎臓細胞には、例えば近位尿細管系、遠位尿細管系及び集合管系の上皮細胞の少なくとも１つが含まれる。より具体的には、腎臓細胞としては、例えば腎臓から採取、単離したヒト近位尿細管上皮細胞、ヒト遠位尿細管上皮細胞及びヒト集合管上皮細胞や、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞から分化誘導した近位尿細管上皮細胞、遠位尿細管上皮細胞及び集合管上皮細胞が例示される。より好ましくは、腎臓細胞は、近位尿細管上皮細胞である。また、腎臓細胞には、上述した腎臓細胞の不死化細胞、株化細胞（ＨＫ−２細胞等）、特定のトランスポーター等のタンパク質を発現させるために腎臓細胞に遺伝子導入した形質転換細胞が含まれる。さらに、腎臓細胞としては、ヒト由来の腎臓細胞に代えて、他動物種由来の細胞（ＭＤＣＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、ＪＴＣ−１２細胞等）を用いることもできる。
【００６５】
培養細胞１６は、基材１２上で、実質的に重層化することなくコンフルエントな単層を形成する。前記「実質的に」とは、重層化による物質の移動効率の低下が問題とならない程度に単層構造が維持されていることを意味し、必ずしも重層化が全く生じていないことを意味するものではない。また、前記「コンフルエント」とは、培養細胞１６の培養面全体に対して細胞の占める面積の割合が１００％であること、すなわち培養面いっぱいに隙間なく細胞が増殖した状態を意味する。細胞がコンフルエントの状態にあるか否かは、当業者であれば容易に判断することができる。
【００６６】
（細胞の培養方法及び細胞支持複合体の製造方法）
図３（Ａ）〜図３（Ｅ）は、実施の形態に係る細胞の培養方法及び細胞支持複合体の製造方法の工程図である。本実施の形態に係る細胞の培養方法は、上述した腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で５日以上の期間培養し、培養期間中に凝集体を形成して、一部の期間は凝集体の状態で腎臓細胞を培養する工程を含む。当該培養方法により、生理機能を有する状態にある培養細胞１６を作製することができる。
【００６７】
また、本実施の形態に係る細胞支持複合体の製造方法は、コーティング剤を基材１２の少なくとも一部に塗布する工程と、本実施の形態に係る細胞の培養方法で形成された培養細胞１６の凝集体３０を個々の培養細胞１６に分離する工程と、コーティング剤を塗布した基材１２に培養細胞１６を播種し、基材１２上で培養細胞１６を培養して、培養細胞１６の単層構造を形成する工程とを含む。
【００６８】
具体的には、図３（Ａ）に示すように、腎臓細胞２４を培養容器２６に播種する。培養容器２６としては、例えばＵ底の９６ウェルプレート、Ｖ底の９６ウェルプレート、Ｕ底の３８４ウェルプレート、ウェル数のさらに多いマイクロウェルプレート、スピナーフラスコ、シャーレ、中空糸、ボトル、微細流路等が例示される。培養容器２６の１ウェルあたりの腎臓細胞２４の播種数は、好ましくは５００個以上５０００個以下である。
【００６９】
培養容器２６には、培地２８が添加される。培地２８としては従来公知の培地、例えばＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）、ＥｐｉＣＭ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）、ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等を用いることができる。また、細胞培養に必要な従来公知の材料を適宜使用することができる。
【００７０】
そして、５日以上の期間、腎臓細胞２４を培養する。腎臓細胞２４は、培養容器２６の表面に接着していない状態で培養される。このため、図３（Ｂ）に示すように、培養期間中に腎臓細胞２４の凝集体３０が形成される。凝集体３０の状態で腎臓細胞２４を培養することで、生理機能がより良好な状態にある培養細胞１６を得ることができる。凝集体３０の大きさは、例えば約１００μｍ以上約３５０μｍ以下である。凝集体３０の大きさは、培養容器２６に播種する細胞数を調整することで、制御することができる。凝集体３０の大きさは、凝集体３０の最大幅と定義される。すなわち、凝集体３０の大きさは、凝集体３０の外縁上の２点をつなぐ直線のうち最大のものの長さである。なお、凝集体３０は略球形であるため、以下では適宜、凝集体３０の大きさを便宜的に凝集体３０の直径という。
【００７１】
例えば、マルチウェルプレートで培養する場合、１つのウェルに１つの凝集体３０が形成される。このため、１ウェルあたりの腎臓細胞２４の播種数が５００個以上５０００個以下のとき、凝集体３０を構成する腎臓細胞の数は、５００個以上５０００個以下となる。凝集体３０の大きさは、構成細胞数が５００個以上５０００個以下のとき、１００μｍ以上３５０μｍ以下となる。凝集体３０の構成細胞数を５００個以上、あるいは大きさを１００μｍ以上とすることで、培地交換の際などに細胞凝集体が古い培地とともに吸引されてしまうことをより確実に回避することができる。また、構成細胞数を５０００個以下、あるいは大きさを３５０μｍ以下とすることで、より良好な生理機能を有する培養細胞１６を得ることができる。
【００７２】
より多くの凝集体３０を形成したい場合は、シャーレやスピナーフラスコ等の容器を用いて培養することが好ましい。この場合、凝集体３０の直径、言い換えれば１つの凝集体３０を構成する腎臓細胞２４の数は、容器中の細胞密度を調整することで、制御することができる。例えば、６０ｍｍシャーレ（住友ベークライト社）上で、直径が約１００μｍ以上約３５０μｍ以下、あるいは構成細胞数が５００個以上５０００個以下の凝集体３０を形成する場合、シャーレ中の細胞密度は１５００個／ｃｍ２以上１５０００個／ｃｍ２以下に調整される。そして、腎臓細胞２４を静置培養、振盪培養又は撹拌培養することで、所望の直径や構成細胞数を有する複数の凝集体３０を一度に形成することができる。なお、シャーレやフラスコを用いて腎臓細胞２４を培養する場合は、凝集体３０を含む培地を全量回収した後、遠心分離によって凝集体３０を沈降させることで培地交換が行われる。
【００７３】
培地２８には、コラーゲンＩ（Ｉ型コラーゲン）を添加することが好ましい。コラーゲンＩは、腎臓細胞２４同士を接着させる機能を有する。このため、コラーゲンＩを含む培地２８で腎臓細胞２４を培養することで、凝集体３０をより確実に形成させることができる。コラーゲンＩは、完全長のコラーゲンＩであることが好ましいが、コラーゲンＩを構成するα１鎖やα２鎖、さらには各鎖を断片化したコラーゲンペプチド等であってもよい。また、コラーゲンＩの動物種は特に限定されず、ヒト由来だけでなく、他の動物由来のものも用いることができる。
【００７４】
培地２８中のコラーゲンＩの濃度は、好ましくは０．０００５ｍｇ／ｍｌ超０．１５ｍｇ／ｍｌ未満である。つまり、培地（言い換えれば細胞懸濁液）１ｍｌあたり０．０００５ｍｇ超０．１５ｍｇ未満のコラーゲンＩを、培地に添加することが好ましい。コラーゲンＩの濃度を０．０００５ｍｇ／ｍｌ超とすることで、コラーゲンＩによる凝集体３０の形成促進効果を、より確実に発揮させることができる。また、コラーゲンＩの濃度を０．１５ｍｇ／ｍｌ未満とすることで、コラーゲンＩが培地２８中でゲル化してしまうおそれを、より確実に回避することができる。この結果、コラーゲンＩによる凝集体３０の形成促進効果を、より確実に発揮させることができる。また、細胞懸濁液に添加するコラーゲンＩの量を上記範囲に設定することで、より確実に、細胞播種後２４時間以内に凝集体３０を形成させることができる。
【００７５】
培地２８中のコラーゲンＩの濃度は、より好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｌ以上であり、さらに好ましくは０．００６ｍｇ／ｍｌ以上であり、またさらに好ましくは０．０１ｍｇ／ｍｌ以上である。これにより、より多くの腎臓細胞２４で凝集体３０を形成させることができる。また、コラーゲンＩの濃度は、より好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ以下である。これにより、コラーゲンＩのゲル化をより確実に回避することができる。なお、培地に添加するコラーゲンＩは、極力低濃度であることが好ましい。コラーゲンＩの濃度は、ｐＨ３．０に調整した滅菌水や培地で調整することが好ましい。また、低温（例えば室温以下）の培地にコラーゲンＩを添加し、その後に培地を３７℃まで暖めて、細胞を懸濁することが好ましい。これらにより、コラーゲンＩのゲル化をより確実に防ぐことができる。
【００７６】
培養容器２６は、細胞非接着処理が施されているか、細胞非接着材料で構成されていることが好ましい。これにより、凝集体３０をより確実に形成させることができる。細胞非接着処理としては、容器表面への細胞非接着ハイドロゲルコーティング処理、ＭＰＣ（2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine)コーティング処理、プロテオセーブ（登録商標）ＳＳコーティング処理、鏡面研磨処理等が例示される。細胞非接着材料としては、ガラス等が例示される。また、細胞非接着材料としては、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン−ビニルアセテートコポリマー、ポリ（エチレン−エチルアクリレート）コポリマー、ポリ（エチレン−メタアクリレート）コポリマー、ポリ（エチレン酢酸ビニル）コポリマー、及びこれらのポリマーの２種以上の混合物といった高分子材料が例示される。例えば、当該高分子材料からなる培養バッグを培養容器２６として用いることができる。腎臓細胞２４の培養期間は、好ましくは１０日以下（すなわち２４０時間以下）である。これにより、生理機能のより高い発現状態にある培養細胞１６を得ることができる。培養条件は、例えば３７℃、５％ＣＯ２である。培養期間中、培地２８は定期的に交換することが好ましい。例えば、培地２８は２日毎に交換される。
【００７７】
続いて、図３（Ｃ）に示すように、上述した細胞の培養方法で形成された凝集体３０を、個々の培養細胞１６に分離する。凝集体３０からの培養細胞１６の分離は、トリプシン／ＥＤＴＡ、Ａｃｃｕｔａｓｅ、ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ等を用いて凝集体３０を酵素処理することで行うことができる。処理に用いる酵素の濃度は、培養細胞１６の種類に応じて適宜設定することができる。しかしながら、酵素濃度が高い場合、培養細胞１６の単離が容易になる一方、培養細胞１６の細胞表面タンパク質が損傷するおそれが高まる。このため、酵素濃度はできるだけ低いことが望ましい。
【００７８】
また、図３（Ｄ）に示すように、ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上の接着分子を含むコーティング剤を、基材１２の少なくとも一部に塗布する。これにより、基材１２の表面にコーティング剤層１４が形成される。なお、培養細胞１６の単離工程と、コーティング剤の塗布工程とは、互いに独立に実施することができる。すなわち、両工程はいずれが先に実施されてもよく、また並行して実施されてもよい。
【００７９】
そして、図３（Ｅ）に示すように、コーティング剤を塗布した基材１２に培養細胞１６を播種し、基材１２上で培養細胞１６を培養して、培養細胞１６の単層構造を形成する。培養細胞１６は、例えば約１．０×１０３〜約１．０×１０５個／ｃｍ２の細胞密度となるように基材１２に播種される。培養期間は、例えば１日以上６０日以下である。培養細胞１６は、基材１２上でコンフルエントになるまで増殖した後、コンフルエントの状態を維持する。また、培養細胞１６は、例えば培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養される。
【００８０】
［細胞支持複合体が用いられた装置］
図４（Ａ）〜図４（Ｆ）は、実施の形態に係る細胞支持複合体の採用例を模式的に示す図である。なお、図４（Ａ）〜図４（Ｆ）では、細胞支持複合体が組み込まれた構造の一部を図示している。本実施の形態に係る細胞支持複合体１０は、様々な装置に適用することができる。
【００８１】
例えば、図４（Ａ）は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ３２を備える第１装置３４に細胞支持複合体１０が組み込まれた様子を図示している。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ３２の構造は従来公知であるため、詳細な説明は省略する。第１装置３４では、培養細胞１６が配置された側に、所定物質を含む第１液体３６が供給される。第１液体３６中の所定物質は、培養細胞１６に取り込まれて細胞支持複合体１０を通過し、細胞支持複合体１０を挟んで第１液体３６とは反対側に位置する第２液体３８に移動する。第１装置３４は例えば、細胞の機能や、薬物の取込・排出を微量液量で調べる薬物評価モジュールとして使用可能である。
【００８２】
図４（Ｂ）は、基材１２として中空糸膜が用いられた細胞支持複合体１０が第２装置４０に組み込まれた様子を図示している。第２装置４０では、基材１２としての中空糸膜の管腔内にコーティング剤層１４と培養細胞１６の単層構造とが形成されている。第２装置４０は、中空糸膜の管腔内に液体を流すことによって、この液体中にある所定物質を培養細胞１６で取り込んで、中空糸膜の管腔外へ移動させることができる。第２装置４０は例えば、血液濾過器で濾過した血漿成分中から有用物質を回収するバイオ人工腎臓モジュールとして使用可能である。
【００８３】
図４（Ｃ）は、微細流路チップ４２に細胞支持複合体１０が組み込まれた様子を図示している。微細流路チップ４２では、基材１２が微細流路を構成している。そして、微細流路の内壁にコーティング剤層１４と培養細胞１６の単層構造とが形成されている。微細流路チップ４２では、流路内、すなわち培養細胞１６が配置された側に微量の液体が流される。そして、液体中の所定物質が培養細胞１６に取り込まれる。微細流路チップ４２は例えば、細胞の機能や、薬物の取込・排出を微量液量で調べる薬物評価モジュールとして使用可能である。
【００８４】
図４（Ｄ）は、細胞支持複合体１０が中空マイクロキャリア４４を構成している様子を図示している。また、図４（Ｅ）は、細胞支持複合体１０が中実マイクロキャリア４６を構成している様子を図示している。中空マイクロキャリア４４及び中実マイクロキャリア４６では、基材１２がキャリア本体を構成している。そして、基材１２の外表面にコーティング剤層１４及び培養細胞１６の単層構造が形成されている。中空マイクロキャリア４４及び中実マイクロキャリア４６では、培養細胞１６が配置された側に微量の液体が流される。そして、液体中の所定物質が培養細胞１６に取り込まれる。中空マイクロキャリア４４及び中実マイクロキャリア４６は例えば、細胞の機能や、薬物の取込・排出を微量液量で調べる薬物評価モジュールとして使用可能である。
【００８５】
図４（Ｆ）は、ウェルプレート４８に細胞支持複合体１０が組み込まれた様子を図示している。ウェルプレート４８では、細胞支持複合体１０がウェル底面に配置される。この状態で、培養細胞１６はウェルの上側を向く。ウェルプレート４８では、ウェル内に微量の液体４９が注入される。そして、液体４９中の所定物質が培養細胞１６に取り込まれる。ウェルプレート４８は例えば、細胞の機能や、薬物の取込・排出を微量液量で調べる薬物評価モジュールとして使用可能である。なお、ウェルプレート４８に代えて、培養ディッシュ（シャーレ等）に細胞支持複合体１０が組み込まれてもよい。
【００８６】
上述の、細胞支持複合体１０を組み込んだモジュールは、第２装置４０のように適宜カートリッジに収容されて使用される。
【００８７】
以上説明したように、本実施の形態に係る細胞の培養方法は、腎臓細胞２４を培養容器２６に非接着の状態で５日以上の期間培養して、培養期間中に腎臓細胞２４の凝集体３０を形成して、一部の期間は凝集体３０の状態で培養することを含む。腎臓細胞２４を浮遊状態で培養することで、凝集体３０を形成することができる。言い換えれば、本実施の形態に係る細胞の培養方法は、培養容器２６に非接着の状態で腎臓細胞２４を培養して、腎臓細胞２４の凝集体３０を形成する工程を含み、培養期間は５日以上である。凝集体３０の状態で腎臓細胞２４を培養することで、培養により低下した腎臓細胞２４の生理機能を回復させることができる。
【００８８】
したがって、本実施の形態の培養方法によれば、生理機能が従来に比べて良好な状態にある細胞を獲得することができる。また、得られた高機能細胞を用いて細胞支持複合体１０を製造することで、高性能なバイオ人工臓器やインビトロ評価系を提供することができる。なお、前記「浮遊状態」とは、細胞が培養容器２６の壁面に接着していない状態を意味する。したがって、「浮遊状態」には、細胞が培養容器２６の壁面に接触しているが、培地２８の対流等で容易に壁面から離間できる状態が含まれる。
【００８９】
また、本実施の形態の培養方法では、凝集体３０は培養１日目に形成され、腎臓細胞２４の培養期間は１０日以下である。これにより、生理機能がより強く発現した状態にある培養細胞１６を得ることができる。また、細胞は一般に、凝集状態が長く続くとその状態を記憶してしまい、凝集しやすくなる傾向にある。これに対し、培養期間を１０日以下とすることで、培養細胞１６が凝集体３０から単離し難くなることと、単離後に再凝集し易くなることとを、抑制することができる。
【００９０】
また、本実施の形態の培養方法では、凝集体３０を構成する腎臓細胞２４の数は、５００個／ウェル以上５０００個／ウェル以下である。また、凝集体３０の大きさは、１００μｍ以上３５０μｍ以下である。構成細胞数を５００個／ウェル以上、あるいは大きさを１００μｍ以上とすることで、培地交換の際などに凝集体３０が吸引されてしまうことをより確実に回避できる。これにより、細胞培養の作業性を向上させることができる。また、構成細胞数を５０００個／ウェル以下、あるいは大きさを３５０μｍ以下とすることで、腎臓細胞２４の機能をより確実に回復させることができる。すなわち、良好な生理機能を有する培養細胞１６をより確実に作製することができる。
【００９１】
また、本実施の形態の培養方法では、培養容器２６に細胞非接着処理が施されているか、培養容器２６は細胞非接着材料で構成されている。これにより、細胞の凝集体３０をより確実に形成させることができる。よって、生理機能を有する培養細胞１６をより確実に作製することができる。
【００９２】
また、本実施の形態の培養方法は、コラーゲンＩを培地２８に添加すること、言い換えればコラーゲンＩを含む細胞懸濁液を培養容器２６に添加することを含む。コラーゲンＩは、腎臓細胞２４同士の接着剤として作用する。このため、腎臓細胞２４の自己凝集能力が低い場合であっても、凝集体３０をより確実に形成させることができる。また、細胞懸濁液中のコラーゲンＩの含有量は、好ましくは０．０００５ｍｇ／ｍｌ超０．１５ｍｇ／ｍｌ未満である。これにより、コラーゲンＩが持つ凝集体３０の形成促進効果をより確実に発揮させることができる。
【００９３】
自己凝集能力が低い細胞凝集塊を形成する手法としては、膨潤性材料を含む高粘度培地中に細胞懸濁液を添加し、細胞懸濁液中の水分を高粘度培地中に移動させることで、強制的に細胞凝集塊を形成する方法が考えられる。しかしながら、この方法では、凝集塊の形成作業が複雑となる。また、高粘度培地からの凝集塊の分離が困難であり、細胞の回収ロスが生じ得る。また、凝集塊の外表面にゲルのカプセルが形成され、凝集塊、特に凝集塊内部への酸素や栄養分の供給が妨げられる。これに対し、本実施の形態のようにコラーゲンＩを培地２８に添加することで、上記課題が生じることなく、自己凝集能力が低い細胞凝集塊を形成させることができる。
【００９４】
また、本実施の形態に係る細胞支持複合体１０の製造方法は、ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上を含むコーティング剤を基材１２に塗布する工程と、培養細胞１６の凝集体３０を個々の培養細胞１６に分離する工程と、基材１２に培養細胞１６を播種し、基材１２上で培養細胞１６を培養して、培養細胞１６の単層構造を形成する工程とを含む。このように、所定の接着分子を含むコーティング剤を基材１２に塗布してコーティング剤層１４を形成することで、基材１２上に培養細胞１６の単層構造を安定的に形成することができる。よって、培養細胞１６の単層構造の安定性が向上した細胞支持複合体１０を提供することができる。また、基材１２上には、高生理機能を有する培養細胞１６からなる単層膜が形成されている。このため、高機能な細胞支持複合体１０を得ることができる。
【００９５】
本実施の形態の細胞支持複合体１０の製造方法によれば、培養細胞１６の単層構造が安定して得られる。このため、培養細胞１６が基材１２上でコンフルエントに達したことを、顕微鏡観察により確認する必要がない。また、基材１２には人工膜を利用できる。このため、所望形状の細胞支持複合体１０を容易に製造することができる。また、同一構造の細胞支持複合体１０を大量に製造することができる。
【００９６】
なお、基材として、ヒト、ヒツジ、ブタ等の小腸粘膜下組織を脱細胞化した生物学的足場を用いることも考えられる。しかしながら、このような生物学的足場は、生体由来であるため同一構造のものを大量に製造することが困難である。このため、人工腎臓等の臨床用途に不向きである。また、小腸粘膜下組織は、動物種差あるいは個体差により、個々に形状が異なる。このため、細胞の播種面積も個々に変化し得る。よって、播種細胞数の制御が難しい。また、形状が複雑であり、また透明素材でもないため、細胞の観察が困難である。よって、細胞の観察が必要な薬物評価システムへの利用に不向きである。
【００９７】
本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、当業者の知識に基づいて各種の設計変更などの変形を加えることも可能であり、そのような変形が加えられた実施の形態も本発明の範囲に含まれるものである。上述の実施の形態と以下の変形例との組合せによって生じる新たな実施の形態は、組み合わされる実施の形態及び変形例それぞれの効果をあわせもつ。
【実施例】
【００９８】
［近位尿細管上皮細胞における遺伝子発現の解析：試験１］
試験１により、近位尿細管上皮細胞における生理機能の低下を確認した。まず、ヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）を、ゼラチン溶液（シグマ社）でコーティングした６０ｍｍシャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１０００００個播種した。そして、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。【００９９】
RNeasy Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、播種直後（すなわち０時間）と培養４日（すなわち９６時間）の近位尿細管上皮細胞からｍＲＮＡを抽出し、精製した。続いて、QuantiTect Reverse Transcription Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡを鋳型とし、Thermal Cycler Dice Real Time System I（タカラバイオ株式会社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法にてＡＱＰ１、ＣＤ１３、ＳＧＬＴ２、Ｎａ／Ｋ  ＡＴＰａｓｅ、ＰＥＰＴ１、ＭＤＲ１、ＯＡＴ１、ＯＣＴＮ２、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＺＯ−１の各遺伝子の発現量を測定した。【０１００】
これらの遺伝子は、腎臓細胞の生理機能に関連する遺伝子である。具体的には、ＡＱＰ１（aquaporin 1）は、水の輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。ＣＤ１３（alanyl aminopeptidase）は、タンパク質のペプチド化に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。ＳＧＬＴ２（sodium glucose cotransporter 2）は、ナトリウム及びグルコースの輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。Ｎａ／Ｋ  ＡＴＰａｓｅは、イオンの輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。ＰＥＰＴ１（peptide transporter 1）は、ペプチドの輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。ＭＤＲ１（multiple drug resistance 1）、ＯＡＴ１（organic anion transporter 1）及びＯＣＴＮ２（organic cation transporter novel 1）は、薬剤の輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＺＯ−１（zonula occludens-1）は、細胞間結合に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。【０１０１】
各遺伝子について、播種直後の発現量に対する培養４日の発現量の比率（ｄａｙ４／ｄａｙ０）を算出した。結果を図５に示す。図５は、細胞を接着培養した場合における遺伝子発現量の経時変化を示す図である。図５に示すように、全ての遺伝子において比率は１を下回っていた。すなわち、培養４日の各遺伝子の発現量は、培養直後に比べて低下していた。この結果から、近位尿細管上皮細胞は、シャーレでの二次元培養によって遺伝子発現量が低下すること、すなわち脱分化することが示された。なお、播種直後であっても、近位尿細管上皮細胞の生理機能はある程度低下していると推察される。【０１０２】
［近位尿細管上皮細胞の非接着培養：試験２］
試験２により、近位尿細管上皮細胞を非接着培養した際の細胞の形態を確認した。まず、試験１と同様にして脱分化させたヒト近位尿細管上皮細胞の懸濁液を、細胞濃度を異ならせて複数調製した。各細胞懸濁液における濃度は、５０００、１００００、２５０００、５００００、１０００００、２５００００個／ｍｌとした。細胞非接着処理が施された９６ウェルＵ底プレート（住友ベークライト社）に、各細胞懸濁液を１００μｌ滴下して、細胞を播種した。これにより、各プレートにおける細胞数は５００個／ウェル、１０００個／ウェル、２５００個／ウェル、５０００個／ウェル、１００００個／ウェル、２５０００個／ウェルとなった。そして、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。【０１０３】
各プレートにおける、培養３，７日（すなわち７２，１６８時間）の細胞の顕微鏡像を図６（Ａ）に示す。図６（Ａ）は、非接着培養３，７日の細胞の光学顕微鏡画像である。図６（Ａ）に示すように、非接着培養によって近位尿細管上皮細胞が凝集体を形成することが確認された。【０１０４】
また、各プレートについて、播種７日の凝集体の直径を測定した。凝集体の直径は、デジタルマイクロスコープＶＨＸ−５００（ＫＥＹＥＮＣＥ社）の計測ソフトを用いて測定した。各細胞数のプレートにおける凝集体１０個の直径、すなわち最大幅を測定し、最大値と最小値とを求めた。結果を図６（Ｂ）に示す。図６（Ｂ）は、凝集体の直径の最大値と最小値とを示す図である。図６（Ｂ）に示すように、凝集体のおおよその直径は、細胞数５００個／ウェル（すなわち凝集体の構成細胞数が５００個）で１００〜１８０μｍであった。また、細胞数１０００個／ウェル（すなわち凝集体の構成細胞数が１０００個）で１５０〜２２０μｍであった。また、細胞数２５００個／ウェル（すなわち凝集体の構成細胞数が２５００個）で２２０〜３００μｍであった。また、細胞数５０００個／ウェル（すなわち凝集体の構成細胞数が５０００個）で２６０〜３５０μｍであった。また、細胞数１００００個／ウェル（すなわち凝集体の構成細胞数が１００００個）で３７０〜４８０μｍであった。また、細胞数２５０００個／ウェル（すなわち凝集体の構成細胞数が２５０００個）で４６０〜６１０μｍであった。【０１０５】
また、各プレートにおける播種３，７，１４日（すなわち７２，１６８，３３６時間）の凝集体について、凝集体を構成する細胞の数を計測した。具体的には、０．１％トリプシン溶液で凝集体の構成細胞を単一化した後、ＴＣ２０全自動セルカウンター（バイオラッド社）を用いて、凝集体２０個について細胞数を計測し、その平均値を凝集体の構成細胞数とした。結果を図６（Ｃ）に示す。図６（Ｃ）は、凝集体の構成細胞数の経時変化を示す図である。図６（Ｃ）に示すように、凝集体の構成細胞数は、１４日間ほとんど変化がないことが確認された。なお、凝集体の直径も１４日間ほとんど変化がないことが確認された。【０１０６】
［凝集体を構成する近位尿細管上皮細胞における遺伝子発現量の測定：試験３］
試験３により、近位尿細管上皮細胞の非接着培養による生理機能の回復を確認した。まず、試験２と同様にして、脱分化したヒト近位尿細管上皮細胞の懸濁液を調製し、培養した。また、ゼラチン溶液（シグマ社）でコーティングした９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に、細胞濃度を１００００個／ｍｌに調整した細胞懸濁液を１００μｌ滴下して、細胞を播種した。したがって、細胞数は１０００個／ウェルである。そして、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。これを比較例とした。比較例では、プレートにゼラチンコーティング、すなわち接着処理が施されている。また、ウェル底面が平底であるため、細胞がほぼ等間隔に播種され、これにより凝集体の形成が阻害される。このため、細胞はプレートに接着した状態で培養され、凝集体は形成されなかった。【０１０７】
RNeasy Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、播種直後（すなわち０時間）の近位尿細管上皮細胞と、培養３，７日（すなわち７２，１６８時間）の凝集体を構成する近位尿細管上皮細胞からｍＲＮＡを抽出し、精製した。続いて、QuantiTect Reverse Transcription Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡを鋳型とし、Thermal Cycler Dice Real Time System I（タカラバイオ株式会社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法にてＡＱＰ１、ＳＧＬＴ２及びＯＡＴ１の各遺伝子の発現量を測定した。【０１０８】
各遺伝子について、播種直後の発現量に対する培養３日の発現量の比率（ｄａｙ３／ｄａｙ０）と、播種直後の発現量に対する培養７日の発現量の比率（ｄａｙ７／ｄａｙ０）とを算出した。結果を図７に示す。図７は、凝集体を構成する細胞における遺伝子発現量の経時変化を示す図である。【０１０９】
図７に示すように、ＡＱＰ１遺伝子及びＳＧＬＴ２遺伝子については、いずれの細胞数及びいずれの培養日数においても、細胞を接着培養した比較例に比べて細胞を非接着培養した場合の方が発現量が多いことが確認された。特に、培養７日ではその傾向が顕著であった。ＯＡＴ１遺伝子については、培養３日では比較例の方が発現量が多いが、培養７日では、細胞数２５０００個／ウェルを除いて、細胞を非接着培養した方が発現量が多かった。したがって、細胞を接着培養する場合に比べて非接着培養する場合の方が、細胞の生理機能が回復する傾向にあることが確認された。【０１１０】
また、各遺伝子の培養７日の結果から、細胞数が５００個／ウェル以上５０００個／ウェル以下の場合に、ＡＱＰ１遺伝子とＯＡＴ１遺伝子の発現量が顕著に増大することが確認された。このことから、細胞数を上記範囲とすることで生理機能がより良好になることが確認された。【０１１１】
［凝集体を構成する近位尿細管上皮細胞における遺伝子発現量の経時変化の解析：試験４］
試験４により、近位尿細管上皮細胞の非接着培養による生理機能の回復を確認した。まず、試験２と同様にして、脱分化したヒト近位尿細管上皮細胞の懸濁液を調製し、培養した。なお、細胞濃度を１００００個／ｍｌに調整した細胞懸濁液のみを用いた（したがって、細胞数は１０００個／ウェル）。【０１１２】
RNeasy Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、播種直後（すなわち０時間）の近位尿細管上皮細胞と、培養３，４，５，６，７，８，１０，１２，１４日（すなわち７２，９６，１２０，１４４，１６８，１９２，２４０，２８８，３３６時間）の凝集体を構成する近位尿細管上皮細胞からｍＲＮＡを抽出し、精製した。続いて、QuantiTect Reverse Transcription Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡを鋳型とし、Thermal Cycler Dice Real Time System I（タカラバイオ株式会社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法にてＡＱＰ１、ＳＧＬＴ２及びＯＡＴ１の各遺伝子の発現量を測定した。【０１１３】
各遺伝子について、播種直後の発現量に対する培養Ｍ日（Ｍ＝３，４，５，６，７，８，１０，１２，１４）の発現量の比率（ｄａｙＭ／ｄａｙ０）を算出した。結果を図８に示す。図８は、凝集体を構成する細胞における遺伝子発現量の経時変化を示す図である。【０１１４】
図８に示すように、ＡＱＰ１遺伝子とＯＡＴ１遺伝子とは、培養５日で急激に発現量が上昇することが確認された。ＳＧＬＴ２遺伝子についても、培養５日で高い発現量であった。このことから、近位尿細管上皮細胞の培養期間を５日以上とすることで、生理機能の改善された細胞が得られることが確認された。また、ＡＱＰ１遺伝子とＯＡＴ１遺伝子とは、培養１０日を過ぎると発現量が減少傾向に転じることが確認された。このことから、近位尿細管上皮細胞の培養期間は１０日以下がより好ましいことが確認された。なお、ＡＱＰ１遺伝子及びＯＡＴ１遺伝子の発現量は、培養１２，１４日であっても培養直後に比べれば高い値ではあった。【０１１５】
［凝集体からの細胞の単離と再培養：試験５］
試験１と同様にして脱分化させたヒト近位尿細管上皮細胞の懸濁液を、非接着処理が施された６０ｍｍシャーレ（住友ベークライト社：培養面積２１ｃｍ２）に３ｍｌ滴下して、細胞を播種した。細胞懸濁液における細胞濃度は１０００００個／ｍｌとした。したがって、細胞密度は約１４３００個／ｃｍ２である。そして、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。培養７日（すなわち１６８時間）の凝集体を５０ｍｌチューブに回収し、ＰＢＳで洗浄した。続いて、一部の凝集体は、０．１％トリプシン／ＥＤＴＡ（Thermo Fisher社）で処理した。他の一部の凝集体は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Innovative cell technologies社）で処理した。処理条件は、３７℃で１０分間とした。その後、ピペッティング処理により凝集体を構成する細胞を分離した。【０１１６】
単一化した細胞を、ゼラチン溶液（シグマ社）でコーティングした１００ｍｍシャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に再播種した。細胞の播種密度は、１４３００個／ｃｍ２とした。そして、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。【０１１７】
再播種０，３，７日（すなわち０，７２，１６８時間）の細胞の顕微鏡像を図９に示す。図９は、凝集体から分離した細胞の再播種０，３，７日の光学顕微鏡画像である。図９に示すように、近位尿細管上皮細胞の凝集体にトリプシンやＡｃｃｕｔａｓｅ等の酵素処理を施すことで、細胞を単一化できることが確認された。また、単一化した細胞を再播種して培養することで、細胞がコンフルエントの状態まで増殖することが確認された。これにより、非接着培養により生理機能を回復させた細胞を用いて、細胞支持複合体を作製できることが確認された。【０１１８】
なお、本発明者は、非接着処理が施された６０ｍｍシャーレ（住友ベークライト社）に脱分化した近位尿細管上皮細胞を播種して３日間培養することで、シャーレ上でも培養１日目に細胞が凝集体を形成することを確認している。このときの細胞密度は、１５００個／ｃｍ２及び１５０００個／ｃｍ２とした。【０１１９】
［細胞ロット及び継代培養数と凝集体形成との関係の解析：試験６］
試験６により、細胞ロットや継代培養数によって近位尿細管上皮細胞が凝集体を形成しない場合があることを確認した。まず、ヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）のロットＡ〜Ｅを用意した。また、各ロットについて、継代培養数が２回のものと３回のものとを用意した。用意した各ロットについて、細胞濃度を２００００個／ｍｌに調整した細胞懸濁液を、９６ウェル非接着Ｖ底プレート（住友ベークライト社）に１００μｌ播種した。そして、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で浮遊培養した。これにより、各ロットの継代培養数は、２回のものは３回となり、３回のものは４回となった。【０１２０】
各ロットにおける播種から２４時間経過後の細胞の顕微鏡像を図１０に示す。図１０は、ロット及び継代培養数が異なる細胞の播種から２４時間後の光学顕微鏡画像である。図１０に示すように、近位尿細管上皮細胞の自己凝集能力がロットや継代数によって異なる、あるいは変化することが確認された。より具体的には、ロットＤでは、継代３回（Ｐ＝３）、４回（Ｐ＝４）ともに細胞の沈殿、集積は見られたが、凝集体を形成しなかった。ロットＥでは、継代３回では凝集体を形成したにもかかわらず、継代４回では凝集体を形成しなかった。【０１２１】
［凝集状態が異なる近位尿細管上皮細胞における遺伝子発現量の測定：試験７］
試験７により、近位尿細管上皮細胞の凝集体形成による生理機能の回復を確認した。まず、試験６と同様に、継代２回及び３回のロットＡ〜Ｅを用意した。各ロットについて、９６ウェル非接着Ｖ底プレート（住友ベークライト社）に細胞濃度２００００個／ｍｌの細胞懸濁液を１００μｌ播種した。そして、試験６と同条件で培養した。この結果、試験６と同様に、継代３回及び４回のロットＡ〜Ｃと継代３回のロットＥでは、凝集体が形成された。一方、継代３回及び４回のロットＤと継代４回のロットＥでは、凝集体が形成されなかった。【０１２２】
RNeasy Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、培養８日後の近位尿細管上皮細胞からｍＲＮＡを抽出し、精製した。続いて、QuantiTect Reverse Transcription Kit t（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡを鋳型とし、Thermal Cycler Dice Real Time System I（タカラバイオ株式会社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法にてＯＡＴ１遺伝子の発現量を測定した。【０１２３】
継代３回のロットＡにおけるＯＡＴ１遺伝子の発現量に対する、各継代回数の各ロットにおけるＯＡＴ１遺伝子の発現量の比率（Fold Change）を算出した。結果を図１１に示す。図１１は、凝集状態が異なる細胞におけるＯＡＴ１遺伝子の発現量を示す図である。図１１に示すように、凝集体を形成した継代３回及び４回のロットＡ〜Ｃと継代３回のロットＥでは、近位尿細管上皮細胞におけるＯＡＴ１遺伝子の発現量に大きな差はなかった。一方、凝集体を形成しなかった継代３回及び４回のロットＤと継代４回のロットＥでは、凝集体を形成する場合と比べてＯＡＴ１遺伝子の発現量が低いことが確認された。【０１２４】
［凝集体形成を促進する物質の選定：試験８］
試験８により、近位尿細管上皮細胞の自己凝集を促進する物質を選定した。具体的には、試験６，７で自己凝集化しないことを確認したロットＤ（継代培養数３回）のヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）を用い、細胞濃度２００００個/ｍｌの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を、９６ウェル非接着Ｖ底プレート（住友ベークライト社）に１００μｌ播種した。また、代表的な細胞接着因子であるコラーゲンＩ、ゼラチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン５１１−Ｅ８、コラーゲンＩＶ、ラミニン５２１及びフィブロネクチンを、各ウェルに添加した。各細胞接着因子の濃度について、コラーゲンＩ及びコラーゲンＩＶは、０．０１ｍｇ／ｍｌ及び０．３ｍｇ／ｍｌとした。ゼラチンは、０．０１ｍｇ／ｍｌ及び０．５ｍｇ／ｍｌとした。Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン５１１−Ｅ８及びフィブロネクチンは、０．０１ｍｇ／ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌとした。ラミニン５２１は、０．０１ｍｇ／ｍｌ及び０．０５ｍｇ／ｍｌとした。また、対照実験区（control）として、細胞接着因子を添加しないウェルを用意した。そして、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で浮遊培養した。【０１２５】
各ウェルにおける播種から２４時間経過後の細胞の顕微鏡像を図１２に示す。図１２は、種々の細胞接着因子を添加した細胞懸濁液の播種から２４時間後の光学顕微鏡画像である。図１２に示すように、自己凝集化しない近位尿細管上皮細胞の懸濁液に、濃度が０．０１ｍｇ／ｍｌとなるようにコラーゲンＩを添加して培養すると、細胞の自己凝集化が促進されて、凝集体が形成されることが確認された。コラーゲンＩ以外の細胞接着因子を添加した場合には、細胞接着因子を添加しなかった対象実験区と同様に、細胞凝集体は形成されなかった。【０１２６】
［コラーゲンＩの濃度の解析：試験９］
試験９により、コラーゲンＩの濃度と細胞の状態との相関を確認した。試験６，７で自己凝集化しないことを確認したロットＤ（継代培養数３回）のヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）を用い、細胞濃度の異なる複数の細胞懸濁液を調製した。各細胞懸濁液における細胞濃度は、５０００、１００００、２５０００、１０００００個/ｍｌとした。９６ウェル非接着Ｖ底プレート（住友ベークライト社）に、各細胞懸濁液を１００μｌ播種した。これにより、各プレートにおける細胞数は５００個／ウェル、１０００個／ウェル、２５００個／ウェル、１００００個／ウェルとなった。【０１２７】
また、各細胞懸濁液のウェルにコラーゲンＩを添加した。コラーゲンＩは、濃度が０．３、０．１５、０．１、０．０６、０．０３、０．０１、０．００６、０．００３、０．００１、０．０００５ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。また、対照実験区（control）として、コラーゲンＩを添加しない（０ｍｇ／ｍｌ）ウェルを用意した。そして、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で浮遊培養した。【０１２８】
コラーゲンＩ濃度が０、０．１５、０．０３、０．００３ｍｇ／ｍｌの培地で２４時間培養した近位尿細管上皮細胞の顕微鏡像を図１３（Ａ）に示す。図１３（Ａ）は、様々な濃度のコラーゲンＩを添加した細胞懸濁液の播種２４時間後の光学顕微鏡画像である。また、各コラーゲンＩ濃度で２４時間培養した後に細胞の凝集体が形成されたか否かを、顕微鏡像から確認した。結果を図１３（Ｂ）に示す。図１３（Ｂ）は、コラーゲンＩの濃度と凝集体形成の有無との関係を示す図である。図１３（Ｂ）において、「○」は凝集体が形成されたことを示し、「×」は凝集体が形成されなかったことを示す。【０１２９】
図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）に示すように、コラーゲンＩによる近位尿細管上皮細胞の自己凝集化の促進は、コラーゲンＩの濃度や細胞数に影響を受ける傾向があることが確認された。凝集体を構成する細胞数が多くなると、凝集化を促進するために必要なコラーゲンＩの量が多くなる傾向が見られた。【０１３０】
より具体的には、細胞数５００個／ウェル及び１０００個／ウェルのプレートでは、コラーゲンＩ濃度０．０００５ｍｇ／ｍｌでは凝集体が形成されず、０．００１ｍｇ／ｍｌでは凝集体が形成された。このことから、コラーゲンＩ濃度が０．０００５ｍｇ／ｍｌ超、さらには０．００１ｍｇ／ｍｌ以上で、凝集体の形成がより確実に促進されることが確認された。また、コラーゲンＩ濃度が０．０００５ｍｇ／ｍｌ以下の場合には、凝集体を形成させるために細胞数の調整などの追加条件が必要であることが確認された。【０１３１】
また、細胞数２５００個／ウェルのプレートでは、コラーゲンＩ濃度０．００３ｍｇ／ｍｌでは凝集体が形成されず、０．００６ｍｇ／ｍｌでは凝集体が形成された。このことから、コラーゲンＩ濃度が０．００３ｍｇ／ｍｌ超、さらには０．００６ｍｇ／ｍｌ以上で、より幅広い細胞数の凝集体を形成させられることが確認された。また、細胞数１００００個／ウェルのプレートでは、コラーゲンＩ濃度０．００６ｍｇ／ｍｌでは凝集体が形成されず、０．０１ｍｇ／ｍｌでは凝集体が形成された。このことから、コラーゲンＩ濃度が０．００６ｍｇ／ｍｌ超、さらには０．０１ｍｇ／ｍｌ以上で、より幅広い細胞数の凝集体を形成させられることが確認された。【０１３２】
また、いずれの細胞数のプレートにおいても、コラーゲンＩ濃度が０．１５ｍｇ／ｍｌでは凝集体が形成されず、０．１ｍｇ／ｍｌでは凝集体が形成された。コラーゲンＩ濃度が０．１５ｍｇ／ｍｌでは、コラーゲンＩが培地中でゲル化して分散しなかった。このことから、コラーゲンＩ濃度が０．１５ｍｇ／ｍｌ未満、さらには０．１ｍｇ／ｍｌ以下で、凝集体の形成がより確実に促進されることが確認された。また、コラーゲンＩ濃度が０．１５ｍｇ／ｍｌ以上の場合には、コラーゲンＩのゲル化を回避するために追加条件が必要であることが確認された。【０１３３】
［コラーゲンＩが有する凝集促進効果の確認：試験１０］
試験１０により、コラーゲンＩの添加による細胞凝集体の形成促進効果を確認した。具体的には、試験６，７と同様に、継代２回及び３回のロットＡ〜Ｅを用意した。各ロットについて、９６ウェル非接着Ｖ底プレート（住友ベークライト社）に細胞濃度２００００個／ｍｌの細胞懸濁液を１００μｌ播種した。細胞懸濁液の調製には、コラーゲンＩを添加した培地ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いた。コラーゲンＩは、濃度が０．００５ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。そして、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で浮遊培養した。【０１３４】
各プレートにおける播種から２４時間経過後の細胞の顕微鏡像を図１４に示す。図１４は、コラーゲンＩを添加した細胞懸濁液及びコラーゲンＩを非添加の細胞懸濁液の、播種から２４時間後の光学顕微鏡画像である。図１４において、上段の「in REGM」は試験６の結果であり、図１０と同一である。下段の「0.005mg/ml Collagen I in REGM」は、試験１０の結果である。図１４に示すように、継代３回及び４回のロットＤと継代４回のロットＥは、コラーゲンＩの非添加では凝集体を形成しなかったが、コラーゲンＩの添加によって凝集体を形成することが確認された。また、コラーゲンＩの非添加でも凝集体を形成した他のロットでは、コラーゲンＩの添加によって、細胞の凝集状態が向上し、より整った球状となることが確認された。【０１３５】
また、RNeasy Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、培養８日後の近位尿細管上皮細胞からｍＲＮＡを抽出し、精製した。続いて、QuantiTect Reverse Transcription Kit t（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡを鋳型とし、Thermal Cycler Dice Real Time System I（タカラバイオ株式会社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法にてＯＡＴ１遺伝子の発現量を測定した。【０１３６】
コラーゲンＩ非添加、継代３回のロットＡにおけるＯＡＴ１遺伝子の発現量に対する、各継代回数の各ロットにおけるＯＡＴ１遺伝子の発現量の比率（Fold Change）を算出した。結果を図１５（Ａ）に示す。図１５（Ａ）は、コラーゲンＩを添加して培養した細胞におけるＯＡＴ１遺伝子の発現量を示す図である。また、比較のために試験７の結果を図１５（Ｂ）に示す。図１５（Ｂ）は、コラーゲンＩを添加せずに培養した細胞におけるＯＡＴ１遺伝子の発現量を示す図である。図１５（Ｂ）は、図１１と同一である。【０１３７】
図１５（Ｂ）に示すように、凝集体を形成しなかった継代３回及び４回のロットＤと継代４回のロットＥでは、凝集体を形成するロットと比べてＯＡＴ１遺伝子の発現量が低かった。これに対し、コラーゲンＩの添加により、これらのロットでも凝集体が形成された。このため、図１５（Ａ）に示すように、継代３回及び４回のロットＤと継代４回のロットＥでも、凝集体を形成した他のロットと同程度にＯＡＴ１遺伝子が発現することが確認された。【０１３８】
つまり、コラーゲンＩの添加によって、細胞のロットや継代数にかかわらず、腎臓細胞の自己凝集化を促進して凝集体を形成させられることが確認された。また、その結果、腎臓細胞の生理機能を向上させられることが確認された。
【符号の説明】
【０１３９】
１０  細胞支持複合体、  １２  基材、  １４  コーティング剤層、  １６  培養細胞、  ２４  腎臓細胞、  ２６  培養容器、  ３０  凝集体。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明は、細胞の培養方法、細胞支持複合体の製造方法、培養細胞及び細胞支持複合体に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月28日(2019.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱分化している腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で５日以上の期間培養し、培養期間中に前記腎臓細胞の凝集体を形成して、一部の期間は凝集体の状態で前記腎臓細胞を培養することで前記腎臓細胞の生理機能を回復させる工程を含むことを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項２】
前記凝集体は、培養１日目に形成され、
前記腎臓細胞の培養期間は、１４日以下である請求項１に記載の細胞の培養方法。
【請求項３】
前記凝集体を構成する前記腎臓細胞の数は、５００個以上５０００個以下である請求項１又は２に記載の細胞の培養方法。
【請求項４】
前記凝集体の大きさは、１００μｍ以上３５０μｍ以下である請求項１乃至３のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
【請求項５】
前記培養容器は、細胞非接着処理が施されているか、細胞非接着材料で構成されている請求項１乃至４のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
【請求項６】
コラーゲンＩを含む培地で前記腎臓細胞を培養することを含む請求項１乃至５のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
【請求項７】
前記培地中の前記コラーゲンＩの濃度は、０．０００５ｍｇ／ｍｌ超０．１５ｍｇ／ｍｌ未満である請求項６に記載の細胞の培養方法。
【請求項８】
前記培地中の前記コラーゲンＩの濃度は、０．００６ｍｇ／ｍｌ以上０．１ｍｇ／ｍｌ以下である請求項６に記載の細胞の培養方法。
【請求項９】
前記腎臓細胞は、近位尿細管上皮細胞である請求項１乃至８のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
【請求項１０】
ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上を含むコーティング剤を、基材の少なくとも一部に塗布する工程と、
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の細胞の培養方法で形成された凝集体を、個々の培養細胞に分離する工程と、
前記コーティング剤を塗布した前記基材に前記培養細胞を播種し、前記基材上で前記培養細胞を培養して、前記培養細胞の単層構造を形成する工程と、
を含むことを特徴とする細胞支持複合体の製造方法。
【請求項１１】
脱分化している腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で５日以上の期間培養し、培養期間中に前記腎臓細胞の凝集体を形成して、一部の期間は凝集体の状態で前記腎臓細胞を培養することにより前記腎臓細胞の生理機能を回復させることで作製されることを特徴とする培養細胞。
【請求項１２】
基材と、
前記基材の少なくとも一部を被覆する、ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上を含むコーティング剤層と、
前記コーティング剤層を介して前記基材に付着する請求項１１に記載の培養細胞と、
を備えることを特徴とする細胞支持複合体。
【請求項１３】
脱分化している腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で培養し、培養期間中に前記腎臓細胞の凝集体を形成して、一部の期間は凝集体の状態で前記腎臓細胞を培養することで前記腎臓細胞の生理機能を回復させる工程を含むことを特徴とする細胞の培養方法。
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月27日(2019.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱分化している腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で５日以上の期間培養し、培養期間中に前記腎臓細胞の凝集体を形成して、一部の期間は凝集体の状態で前記腎臓細胞を培養することで前記腎臓細胞の生理機能を回復させる工程を含むことを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項２】
前記凝集体は、培養１日目に形成され、
前記腎臓細胞の培養期間は、１４日以下である請求項１に記載の細胞の培養方法。
【請求項３】
前記凝集体を構成する前記腎臓細胞の数は、５００個以上５０００個以下である請求項１又は２に記載の細胞の培養方法。
【請求項４】
前記凝集体の大きさは、１５０μｍ以上３５０μｍ以下である請求項１乃至３のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
【請求項５】
前記培養容器は、細胞非接着処理が施されているか、細胞非接着材料で構成されている請求項１乃至４のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
【請求項６】
コラーゲンＩを含む培地で前記腎臓細胞を培養することを含む請求項１乃至５のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
【請求項７】
前記培地中の前記コラーゲンＩの濃度は、０．０００５ｍｇ／ｍｌ超０．１５ｍｇ／ｍｌ未満である請求項６に記載の細胞の培養方法。
【請求項８】
前記培地中の前記コラーゲンＩの濃度は、０．００６ｍｇ／ｍｌ以上０．１ｍｇ／ｍｌ以下である請求項６に記載の細胞の培養方法。
【請求項９】
前記腎臓細胞は、近位尿細管上皮細胞である請求項１乃至８のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
【請求項１０】
前記腎臓細胞の生理機能を回復させる工程は、ＯＡＴ１遺伝子の発現量を増大させることを含む請求項１乃至９のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
【請求項１１】
ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上を含むコーティング剤を、基材の少なくとも一部に塗布する工程と、
請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の細胞の培養方法で形成された凝集体を、個々の培養細胞に分離する工程と、
前記コーティング剤を塗布した前記基材に前記培養細胞を播種し、前記基材上で前記培養細胞を培養して、前記培養細胞の単層構造を形成する工程と、
を含むことを特徴とする細胞支持複合体の製造方法。
【請求項１２】
脱分化している腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で５日以上の期間培養し、培養期間中に前記腎臓細胞の凝集体を形成して、一部の期間は凝集体の状態で前記腎臓細胞を培養することにより前記腎臓細胞の生理機能を回復させることで作製されることを特徴とする培養細胞。
【請求項１３】
基材と、
前記基材の少なくとも一部を被覆する、ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子及びこれらのいずれかの断片からなる群から選択される１種以上を含むコーティング剤層と、
前記コーティング剤層を介して前記基材に付着する請求項１２に記載の培養細胞と、
を備えることを特徴とする細胞支持複合体。
【請求項１４】
脱分化している腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で培養し、培養期間中に前記腎臓細胞の凝集体を形成して、一部の期間は凝集体の状態で前記腎臓細胞を培養することで前記腎臓細胞の生理機能を回復させる工程を含むことを特徴とする細胞の培養方法。
【国際調査報告】
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