(57)【要約】  本発明は、萎縮型加齢黄斑変性の診断マーカーとなり、かつ、萎縮型加齢黄斑変性の治療薬のターゲットなるAlu RNAを、血液を試料として正確かつ簡便に測定できる方法を提供することを目的とする。  本発明によれば、以下の工程：（1）被験体より採取した血液試料から抽出したRNAを鋳型として、ポリdT配列と、該ポリdT配列の5’側にユニバーサルタグ配列を有する逆転写プライマーを用いて逆転写反応を行ってcDNAを合成する工程、及び（2）工程(1)で合成したcDNAを鋳型として、配列番号１に示す塩基配列の第1番から第117番までの塩基配列におけるウラシルがチミンで置換された塩基配列のうちの連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなるフォワードプライマーと、前記ユニバーサルタグ配列の相補配列またはその部分配列からなるリバースプライマーとを用いてPCR増幅を行い、増幅産物の量に基づき血液中のAlu RNA量を測定する工程を含む、血液中のAlu RNA量を測定する方法が提供される。
2017164353.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(c)のプライマーを含む、萎縮型加齢黄斑変性の検査用キット。
（a）ポリdT配列と、該ポリdT配列の5’側にユニバーサルタグ配列を有する逆転写プライマー
（b）配列番号１に示す塩基配列の第1番から第117番までの塩基配列におけるウラシルがチミンで置換された塩基配列のうちの連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなるフォワードプライマー
(c)（a）のユニバーサルタグ配列の相補配列またはその部分配列からなるリバースプライマー
【請求項２】
前記逆転写プライマーが、前記ポリdT配列の3’末端に5塩基以下の縮重塩基を含む配列を有する、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記縮重塩基を含む配列が、5’-WG-3’(WはA又はTを示す）である、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記ポリdT配列の長さが10〜40塩基である、請求項１〜３のいずれかに記載のキット。
【請求項５】
前記逆転写プライマーが、配列番号３または４に示す塩基配列からなるプライマーである、請求項１〜４のいずれかに記載のキット。
【請求項６】
前記フォワードプライマーが、配列番号５に示す塩基配列または配列番号５に示す塩基配列における少なくとも15塩基以上の塩基配列からなるプライマーである、請求項１〜５のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
前記フォワードプライマーが、配列番号６に示す塩基配列または配列番号６に示す塩基配列における少なくとも15塩基以上の塩基配列からなるプライマーである、請求項１〜５のいずれかに記載のキット。
【請求項８】
以下の工程を含む、血液中のAlu RNA量を測定する方法。
（1）被験体より採取した血液試料から抽出したRNAを鋳型として、ポリdT配列と、該ポリdT配列の5’側にユニバーサルタグ配列を有する逆転写プライマーを用いて逆転写反応を行ってcDNAを合成する工程
（2）工程(1)で合成したcDNAを鋳型として、配列番号１に示す塩基配列の第1番から第117番までの塩基配列におけるウラシルがチミンで置換された塩基配列のうちの連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなるフォワードプライマーと、前記ユニバーサルタグ配列の相補配列またはその部分配列からなるリバースプライマーとを用いてPCR増幅を行い、増幅産物の量に基づき血液中のAlu RNA量を測定する工程
【請求項９】
以下の工程を含む、萎縮型加齢黄斑変性の検査方法。
（1）被験体より採取した血液試料から抽出したRNAを鋳型として、ポリdT配列と、該ポリdT配列の5’側にユニバーサルタグ配列を有する逆転写プライマーを用いて逆転写反応を行ってcDNAを合成する工程
（2）工程(1)で合成したcDNAを鋳型として、配列番号１に示す塩基配列の第1番から第117番までの塩基配列におけるウラシルがチミンで置換された塩基配列のうちの連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなるフォワードプライマーと、前記ユニバーサルタグ配列の相補配列またはその部分配列からなるリバースプライマーとを用いてPCR増幅を行い、増幅産物の量に基づき血液中のAlu RNA量を測定する工程
（3）測定した被験体の血液中のAlu RNA量を対照の血液中のAlu RNA量と比較し、その結果に基づいて、該被験体の萎縮型加齢黄斑変性の程度を判定する工程
【請求項１０】
前記工程(1)において、逆転写反応の際または前に、被験体より採取した血液試料から抽出したRNAに対してポリアデニル化反応を施す工程をさらに含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記逆転写プライマーが、前記ポリdT配列の3’末端に5塩基以下の縮重塩基を含む配列を有する、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記縮重塩基を含む配列が、5’-WG-3’(WはA又はTを示す）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリdT配列の長さが10〜40塩基である、請求項８〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記逆転写プライマーが、配列番号３または４に示す塩基配列からなるプライマーである、請求項８〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記フォワードプライマーが、配列番号５に示す塩基配列または配列番号５に示す塩基配列における少なくとも15塩基以上の塩基配列からなるプライマーである、請求項８〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記フォワードプライマーが、配列番号６に示す塩基配列または配列番号６に示す塩基配列における少なくとも15塩基以上の塩基配列からなるプライマーである、請求項８〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅産物の長さが70〜120bpである、請求項８〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項８に記載の方法を用いて萎縮型加齢黄斑変性患者の血液中のAlu RNA量を測定し、該Alu RNA量に基づいてAlu RNA阻害物質の投与が有効な患者群を選別する方法。
【請求項１９】
請求項８に記載の方法を用いて萎縮型加齢黄斑変性患者の血液中のAlu RNA量を測定し、該Alu RNA量が対照となる健常者の血液中のAlu RNA量と比較して多い萎縮型加齢黄斑変性患者にAlu RNA阻害物質を投与することを含む、萎縮型加齢黄斑変性の治療方法。
【請求項２０】
請求項８に記載の方法によって測定した血液中のAlu RNA量が対照となる健常者の血液中のAlu RNA量と比較して多い萎縮型加齢黄斑変性患者に投与するための、Alu RNA阻害物質を有効成分として含有する萎縮型加齢黄斑変性の治療薬。
【請求項２１】
請求項８に記載の方法によって測定した血液中のAlu RNA量が対照となる健常者の血液中のAlu RNA量と比較して多い萎縮型加齢黄斑変性患者を対象とする萎縮型加齢黄斑変性の治療において使用するための、Alu RNA阻害物質。
【請求項２２】
請求項８に記載の方法によって測定した血液中のAlu RNA量が対照となる健常者の血液中のAlu RNA量と比較して多い萎縮型加齢黄斑変性患者の萎縮型加齢黄斑変性を治療するための、Alu RNA阻害物質の使用。
【請求項２３】
請求項８に記載の方法によって測定した血液中のAlu RNA量が対照となる健常者の血液中のAlu RNA量と比較して多い萎縮型加齢黄斑変性患者を対象とする萎縮型加齢黄斑変性の治療薬を製造するための、Alu RNA阻害物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、萎縮型加齢黄斑変性の検査用キット、および当該キットを用いて萎縮型加齢黄斑変性を検査する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢黄斑変性（Age-related Macular Degeneration：AMD）は、現在、先進国における失明の主要原因疾患の一つである。加齢黄斑変性は、加齢により眼底中央部にあたる黄斑の網膜視細胞が障害される疾患であり、萎縮型加齢黄斑変性（atrophic AMD）と滲出型加齢黄斑変性（exudative AMD)の２つのタイプに大別される。萎縮型加齢黄斑変性(萎縮型AMD)は、視細胞とそれに隣接する網膜色素上皮細胞、脈絡膜毛細血管の地図状萎縮や、起炎物質を含むドルーゼンの蓄積を伴う疾患であり、加齢黄斑変性の90％を占めると言われている。一方、滲出型加齢黄斑変性(滲出型AMD)は高齢者の黄斑に脈絡膜から新生血管が発生し、網膜色素上皮下または網膜下に出血や滲出性病変を生じ、ついには瘢痕組織を形成する疾患である。【０００３】
滲出型AMDの基本となる病態は、脈絡膜新生血管の発生であるのに対し、萎縮型AMDは、脈絡膜新生血管を伴わないことが知られている。また、萎縮型AMDは滲出型AMDに比べてその進行度合いが遅く、徐々に視力の低下が起こるので早期発見をしにくいという特徴を有する。加齢黄斑変性の症状は、変視症、中心暗点であり、症状が進行すると高度の視力低下を起こす。加齢黄斑変性は中途失明原因の第１位であり、高齢化社会に伴い、患者数は今後ますます増加する傾向にあるため、発症機序の解明や新薬開発が精力的に進められている。【０００４】
加齢黄斑変性の治療方法も近年非常に進歩しているものの、ある程度の視力の維持や改善が認められても、完全な治癒に至らない場合が多い。滲出型AMDの治療方法は主には脈絡膜新生血管の閉塞を基盤とするもので、レーザー光凝固法、脈絡膜新生血管除去法、光線力学的療法、抗VEGF剤の硝子体内注射などがある。これに対し、萎縮型AMDは、有効な治療方法がないのが現状である。よって、萎縮型AMDの治療方法の早期の確立が望まれるところである。【０００５】
近年、萎縮型AMD ヒト患者の網膜色素上皮（RPE)において、マイクロRNA (miRNA)-プロセッシング酵素であるDICER1の減少と内在性レトロエレメントであるAlu RNAの蓄積が正常RPEに比べて顕著に認められること、Alu RNAのアンチセンスオリゴヌクレオチドによってDICER1の減少により誘導されるRPE変性が抑制されることから、Alu RNAがDICER1の減少に起因してRPE細胞内に蓄積することにより、萎縮型AMDが発症している可能性が高いことが報告されている（非特許文献１、２および特許文献１等）。これらの報告は、Alu RNAが萎縮型AMDの診断マーカーとなりうること、Alu RNA増加の抑制またはAlu RNAにより惹起される細胞死シグナル経路が萎縮型AMDの治療薬のターゲットになることが示すもので、萎縮型AMDの治療薬の開発に結び付く新たな知見として期待されるものである。実際、かかる知見に基づき、Alu RNAを標的とするsiRNAを用いてRPE細胞を保護する方法（特許文献１）、Alu RNA阻害剤としてMyD88等のインフラマソームを用いてRPE細胞を保護する方法（特許文献２）、Alu RNA逆転写阻害剤を用いて網膜損傷を治療する方法（特許文献３）などが報告されている。【０００６】
また、AMD患者のRPE細胞だけでなく、血液中のAlu RNAを測定したところ、同年代の健常者に比べて顕著に増加していることも報告されているが（非特許文献３）、その具体的な測定方法について記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】Ambati et al., US 8,809,517 B2, Method of inhibiting Alu RNA and therapeutic uses thereof
【特許文献２】Ambati et al., US 2014/0178309 A1, Protection of cells from alu-rna-induced degeneration and inhibitors for protecting cells
【特許文献３】Ambati et al., US 2015/0038446 A1, Compositions and methods for treating retinal degradation
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hiroko Kaneko et al., "DICER1 deficit induces Alu RNA toxicity in age-related macular degeneration" Nature 471, 325-330 (2011)
【非特許文献２】Valeria Tarallo et al., "DICER1 Loss and Alu RNA Induce Age-Related Macular Degeneration via the NLRP3 Inflammasome and MyD88" Cell Vol. 149, Issue 4, 847-859 (2012)
【非特許文献３】B.Fowler et al., "Alu retrotransposon quantification in the retina and plasma: Mechanism-based risk assessment in age-related macular degeneration", Acta Ophthalmologica, Special Issue, Vol. 91, Issue Supplement s 252 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
萎縮型AMDの診断マーカーまたはAlu RNAの蓄積を伴う萎縮型AMD患者の層別化マーカーとなり、かつ、萎縮型AMDの治療薬のターゲットなるAlu RNAを、血液を試料として簡便に測定できれば、被験者の負担も少なく有利である。ところが、Alu RNAは、約300bpの長鎖ノンコーディングRNA(long non-coding RNA：Lnc RNA）分子であるが、一般に血液中の遊離RNAは不安定であり、大部分が既存のリアルタイムPCR法で要求されている80〜100bp以下に分解されてしまうことが容易に想定できること、また、Alu配列はゲノム中に100万コピー存在すると言われており、一般的な遺伝子を対象としたPCRに比べてDNAの混入の影響を強く受けるため、ほとんどのシグナルが混入したDNAに由来するものであることなど、血液中のAlu RNA量の測定には特有の課題があることが見出された。しかも、混入したDNAは、通常のDNase処理では完全に除去できず、実際、本発明者の検討では、Alu RNA中に存在する配列（Alu RNA特異的配列）に基づいて設計された従来のフォワードプライマーとリバースプライマー（非特許文献１等）を用いたRT-PCRでは、通常のDNaseで処理をしても不十分で、混入したDNA由来のシグナルが消失しないか、または、高活性なDNaseを用いて処理すると混入したDNA由来のシグナルは消失するが、RNAが分解されてRNA由来のシグナルが得られない場合があることが確認された（後記参考例参照）。
従って、本発明の課題は、上記事情に鑑み、分解の進んだ血液中のAlu RNAを、正確かつ簡便に測定できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、血液中のAlu RNAをRT-PCR法にて定量するにあたり、Alu RNAの一次構造上の中央部に位置するMiddle-A stretch配列を含む領域に着目し、当該領域にアニーリング可能であり、かつAlu RNAに非相補的なユニバーサルタグ配列を5’側に有する逆転写プライマーを用いて逆転写反応を行った後、得られたcDNAを鋳型とし、Alu RNAに特異的な配列を有するプライマーと前記ユニバーサルタグ配列に相補的な配列を有するプライマーにてPCRを行うことによって、混入したDNA由来のシグナルを生じることなく、血液中のAlu RNAを測定できることが見出した。本発明はかかる知見により完成されたものである。【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］  以下の(a)〜(c)のプライマーを含む、萎縮型加齢黄斑変性の検査用キット。
（a）ポリdT配列と、該ポリdT配列の5’側にユニバーサルタグ配列を有する逆転写プライマー
（b）配列番号１に示す塩基配列の第1番から第117番までの塩基配列におけるウラシルがチミンで置換された塩基配列のうちの連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなるフォワードプライマー
(c)（a）のユニバーサルタグ配列の相補配列またはその部分配列からなるリバースプライマー
［２］  前記逆転写プライマーが、前記ポリdT配列の3’末端に5塩基以下の縮重塩基を含む配列を有する、［１］に記載のキット。
［３］  前記縮重塩基を含む配列が、5'-WG-3'(WはA又はTを示す）である、［２］に記載のキット。
［４］  前記ポリdT配列の長さが10〜40塩基である、［１］〜［３］のいずれかに記載のキット。
［５］  前記逆転写プライマーが、配列番号３または４に示す塩基配列からなるプライマーである、［１］〜［４］のいずれかに記載のキット。
［６］  前記フォワードプライマーが、配列番号５に示す塩基配列または配列番号５に示す塩基配列における少なくとも15塩基以上の塩基配列からなるプライマーである、［１］〜［５］のいずれかに記載のキット。
［７］  前記フォワードプライマーが、配列番号６に示す塩基配列または配列番号６に示す塩基配列における少なくとも15塩基以上の塩基配列からなるプライマーである、［１］〜［５］のいずれかに記載のキット。
［８］  以下の工程を含む、血液中のAlu RNA量を測定する方法。
（1）被験体より採取した血液試料から抽出したRNAを鋳型として、ポリdT配列と、該ポリdT配列の5’側にユニバーサルタグ配列を有する逆転写プライマーを用いて逆転写反応を行ってcDNAを合成する工程
（2）工程(1)で合成したcDNAを鋳型として、配列番号１に示す塩基配列の第1番から第117番までの塩基配列におけるウラシルがチミンで置換された塩基配列のうちの連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなるフォワードプライマーと、前記ユニバーサルタグ配列の相補配列またはその部分配列からなるリバースプライマーとを用いてPCR増幅を行い、増幅産物の量に基づき血液中のAlu RNA量を測定する工程
［９］  以下の工程を含む、萎縮型加齢黄斑変性の検査方法。
（1）被験体より採取した血液試料から抽出したRNAを鋳型として、ポリdT配列と、該ポリdT配列の5’側にユニバーサルタグ配列を有する逆転写プライマーを用いて逆転写反応を行ってcDNAを合成する工程
（2）工程(1)で合成したcDNAを鋳型として、配列番号１に示す塩基配列の第1番から第117番までの塩基配列におけるウラシルがチミンで置換された塩基配列のうちの連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなるフォワードプライマーと、前記ユニバーサルタグ配列の相補配列またはその部分配列からなるリバースプライマーとを用いてPCR増幅を行い、増幅産物の量に基づき血液中のAlu RNA量を測定する工程
（3）測定した被験体の血液中のAlu RNA量を対照の血液中のAlu RNA量と比較し、その結果に基づいて、該被験体の萎縮型加齢黄斑変性の程度を判定する工程
［１０］  前記工程(1)において、逆転写反応の際または前に、被験体より採取した血液試料から抽出したRNAに対してポリアデニル化反応を施す工程をさらに含む、［８］または［９］に記載の方法。
［１１］  前記逆転写プライマーが、前記ポリdT配列の3’末端に5塩基以下の縮重塩基を含む配列を有する、［８］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］  前記縮重塩基を含む配列が、5'-WG-3'(WはA又はTを示す）である、［１１］に記載の方法。
［１３］  前記ポリdT配列の長さが10〜40塩基である、［８］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］  前記逆転写プライマーが、配列番号３または４に示す塩基配列からなるプライマーである、［８］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］  前記フォワードプライマーが、配列番号５に示す塩基配列または配列番号５に示す塩基配列における少なくとも15塩基以上の塩基配列からなるプライマーである、［８］〜［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］  前記フォワードプライマーが、配列番号６に示す塩基配列または配列番号６に示す塩基配列における少なくとも15塩基以上の塩基配列からなるプライマーである、［８］〜［１４］のいずれかに記載の方法。
［１７］  前記増幅産物の長さが70〜120bpである、［８］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］  ［８］に記載の方法を用いて萎縮型加齢黄斑変性患者の血液中のAlu RNA量を測定し、該Alu RNA量に基づいてAlu RNA阻害物質の投与が有効な患者群を選別する方法。
［１９］  ［８］に記載の方法を用いて萎縮型加齢黄斑変性患者の血液中のAlu RNA量を測定し、該Alu RNA量が対照となる健常者の血液中のAlu RNA量と比較して多い萎縮型加齢黄斑変性患者にAlu RNA阻害物質を投与することを含む、萎縮型加齢黄斑変性の治療方法。
［２０］  ［８］に記載の方法によって測定した血液中のAlu RNA量が対照となる健常者の血液中のAlu RNA量と比較して多い萎縮型加齢黄斑変性患者に投与するための、Alu RNA阻害物質を有効成分として含有する萎縮型加齢黄斑変性の治療薬。
［２１］  ［８］に記載の方法によって測定した血液中のAlu RNA量が対照となる健常者の血液中のAlu RNA量と比較して多い萎縮型加齢黄斑変性患者を対象とする萎縮型加齢黄斑変性の治療において使用するための、Alu RNA阻害物質。
［２２］  ［８］に記載の方法によって測定した血液中のAlu RNA量が対照となる健常者の血液中のAlu RNA量と比較して多い萎縮型加齢黄斑変性患者の萎縮型加齢黄斑変性を治療するための、Alu RNA阻害物質の使用。
［２３］  ［８］に記載の方法によって測定した血液中のAlu RNA量が対照となる健常者の血液中のAlu RNA量と比較して多い萎縮型加齢黄斑変性患者を対象とする萎縮型加齢黄斑変性の治療薬を製造するための、Alu RNA阻害物質の使用。
本願は、２０１６年３月２５日に出願された日本国特許出願２０１６−０６１８３９号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、血液中のAlu RNA量を、正確かつ簡便に測定できるキットおよび方法が提供される。よって、本発明のキットを用いることにより、萎縮型加齢黄斑変性の有無や症状の程度を被験者に負担をかけることなく迅速に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の萎縮型加齢黄斑変性の検査用キット（配列番号５に示す塩基配列からなるAlu RNA（95-117)フォワードプライマーを使用）を用いて健常人群および萎縮型AMD患者群の血清Alu RNA濃度を測定した結果を示す（◇：健常人群の血清中Alu RNA濃度、×：萎縮型AMD患者群の血清中Alu RNA濃度、バー：各群の平均値、破線（1.52 x 109 コピー/mL 血清）は、健常人群の99.74 %信頼区間を示す）。
【図２】本発明の萎縮型加齢黄斑変性の検査用キット（配列番号６に示す塩基配列からなるAlu RNA 72-87）フォワードプライマーを使用）を用いて健常人群および萎縮型AMD患者群の血清Alu RNA濃度を測定した結果を示す（◇：健常人群の血清中Alu RNA濃度、×：萎縮型AMD患者群の血清中Alu RNA濃度、バー：各群の平均値、破線（1.02 x 109  コピー/mL 血清）は、健常人群の99.74 %信頼区間を示す）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明について詳細に説明する。
１．萎縮型加齢黄斑変性の検査用キット
本発明の萎縮型加齢黄斑変性（以下、「萎縮型AMD」と記載する）の検査用キットは、血液試料中のAlu RNAを測定するための以下のプライマー：
（a）ポリdT配列と、該ポリdT配列の5’側にユニバーサルタグ配列を有する逆転写プライマー、
（b）配列番号１に示す塩基配列の第1番から第117番までの塩基配列におけるウラシルがチミンで置換された塩基配列のうちの連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなるフォワードプライマー、および
(c)（a）のユニバーサルタグ配列の相補配列またはその部分配列からなるリバースプライマーを含む。
【００１５】
Alu RNAは、約300bpの鎖長をもつRNA分子であり、タンパク質をコードしていない長鎖ノンコーディングRNA(long non-coding RNA:LncRNA）に分類される。Alu RNAは、幾つかのサブファミリーが存在し、共通配列として、例えば、Human Alu-Sq subfamily Consensus Sequence (Genbank accession No. HSU14573：配列番号１)、Human Alu-J subfamily Consensus Sequence (Genbank accession No. HSU14567：配列番号２)が知られている。
【００１６】
本発明のキットを構成する（a）の「ポリdT配列と、該ポリdT配列の5’側にユニバーサルタグ配列を有する逆転写プライマー」は、Alu RNAのMiddle-A stretch部分にアニーリングして、Alu RNAの逆転写反応に用いるプライマーであって、「ユニバーサルタグ配列」とは、ヒトゲノム上に存在せず、Alu RNA配列に相補的でない任意のユニーク配列をいう。ユニバーサルタグ配列は、Alu RNAの逆転写産物（Alu cDNA）のPCR増幅のプライマー配列として利用するため、その長さは、15〜40塩基が好ましく、20〜35塩基がより好ましく、25〜30塩基がさらに好ましい。また当該逆転写プライマーはその3’末端に5塩基以下の縮重塩基を含む配列を有していてもよく、この3’末端を合成起点とした逆転写反応により、Alu RNAに相補的なcDNAが合成される。前記縮重塩基を含む配列としては、5’-WG-3’(WはA又はTを示す）が好ましい。
【００１７】
ポリdT配列は、Alu RNAの塩基配列（配列番号１）の121番目〜136番目までの塩基配列中に存在するMiddle-A stretch部分にアニールする限り、5塩基以上であればその長さは限定がされないが、約70bp〜120bpのDNA断片を増幅させる上で、10〜40塩基が好ましく、20〜30塩基がより好ましい。
【００１８】
上記の条件を満たす本発明の逆転写プライマーの例としては、5’-GTG CAG GGT CCG AGG TTC ACT ATA GGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA G-3’（配列番号３）、または、5’-GTG CAG GGT CCG AGG TTC ACT ATA GGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GT-3’（配列番号４）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００１９】
本発明のキットを構成する（b）の「配列番号１に示す塩基配列の第1番から第117番までの塩基配列におけるウラシルがチミンで置換された塩基配列のうちの連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなるフォワードプライマー」は、上記の逆転写反応で合成されたAlucDNA 領域にアニールし、Alu cDNAをPCR増幅するのに用いるプライマーであって、例えば、下記の配列番号５または配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーが挙げられる。
Alu RNA (95-117) フォワードプライマー：
5’-CAA CAT RGT GAA ACC CCG TCT CT-3’（R=G/A, 配列番号５）
Alu RNA (72-87) フォワードプライマー：
5’-CAG GAG TTC GAG ACC A-3’ （配列番号６）
【００２０】
また、上記の配列番号５または配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーは、配列番号５または配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーと実質的に同一の機能を有する範囲で、その塩基配列に改変を加えたプライマーであってもよく、そのような改変プライマーとしては、例えば、配列番号５または配列番号６に示す塩基配列における連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなるプライマーが挙げられる。改変プライマーは、配列番号５または配列番号６に示す塩基配列における連続する少なくとも15塩基を含めばよいが、全長は35塩基以下が好ましく、30塩基以下がより好ましく、27塩基以下がさらに好ましい。連続する少なくとも15塩基のプライマー中の存在部位（3’末端側、5’末端側）についても特に限定はされない。また、改変プライマーの他の例としては、配列番号５または配列番号６に示す塩基配列に対して90％以上、好ましくは95％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーが挙げられる。改変には、欠失、置換、挿入、または付加が含まれ、改変させる塩基の数は、３個以下、好ましくは２個以下、より好ましくは１個である。また、塩基の付加は、3’側でも5’側でもよい。
【００２１】
本発明のキットを構成する（c）の「ユニバーサルタグ配列の相補配列またはその部分配列からなるリバースプライマー」は、(b)のフォワードプライマーとセットにしてAlu cDNAのPCR増幅に用いるプライマーで、その長さは、ユニバーサルタグ配列にアニーリングし、プライマーとして機能しうる限り特に制限はなく、ユニバーサルタグ配列に応じて適宜設定すればよい。
【００２２】
本発明のキットに含まれる上記プライマーは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホロアミダイト法、H−ホスホネート法等により、通常用いられるDNA自動合成装置（例えば、Applied Biosystems社製Model 394など)を利用して合成することが可能である。
【００２３】
本発明のキットには、必要に応じて、RNA抽出用試薬、逆転写反応用試薬（逆転写酵素、dNTP、DTT、逆転写反応用バッファー、RNase Inhibitor、および反応用チューブ等）、PCR増幅用試薬（DNAポリメラーゼ、およびPCR増幅用バッファー等）、PCRの陽性コントロールとなる標的配列を含むDNA分子、標識物質、染色剤や電気泳動用ゲル等の検査用試薬、説明書などを含んでいてもよい。
【００２４】
２．血液中のAlu RNAの測定方法および萎縮型加齢黄斑変性の検査方法
本発明のAlu RNAの測定方法は、以下の工程：
（1）被験体より採取した血液試料から抽出したRNAを鋳型として、ポリdT配列と、該ポリdT配列の5’側にユニバーサルタグ配列を有する逆転写プライマーを用いて逆転写反応を行ってcDNAを合成する工程、および
（2）工程（1）で合成したcDNAを鋳型として、配列番号１に示す塩基配列の第1番から第117番までの塩基配列におけるウラシルがチミンで置換された塩基配列のうちの連続する少なくとも15塩基を含む塩基配列からなるフォワードプライマーと、前記ユニバーサルタグ配列の相補配列またはその部分配列からなるリバースプライマーとを用いてPCR増幅を行い、増幅産物の量に基づき血液中のAlu RNA量を測定する工程を含む。
【００２５】
また、本発明の萎縮型加齢黄斑変性の検査方法は、上記の工程（1）（2）の後、測定した被験体の血液中のAlu RNA量を対照の血液中のAlu RNA量と比較し、該被験体の縮型加齢黄斑変性の程度を判定する工程（3）を行う。ここで、縮型加齢黄斑変性の程度の判定には、萎縮型加齢黄斑変性の罹患の有無の判定、萎縮型加齢黄斑変性の進行の程度の判定を含む。
【００２６】
工程（1）で使用する逆転写プライマー、工程（2）で使用するフォワードプライマーおよびリバースプライマーは前記のとおりである。
以下、各工程について説明する。
工程（1）：
工程（1）では、被験体より採取した血液試料から抽出したRNAを鋳型として、ポリdT配列と、該ポリdT配列の5’側にユニバーサルタグ配列を有する逆転写プライマーを用いて逆転写反応を行ってcDNAを合成する。
【００２７】
Alu RNA量の測定対象となる被験体は、ヒトが典型的であるが、マウス、ラット、ウサギなどの実験動物を含むあらゆる哺乳動物が含まれる。
【００２８】
血液中に存在するAlu RNAは、萎縮型AMDに伴って放出される遊離RNA分子であって、長鎖ノンコーディングRNA(long non-coding RNA）である。血液中に存在するAlu RNAには、完全長Alu RNAや、生合成過程に存在するAlu RNA前駆体、また血液中に遊離して存在する間に一部が分解を受けたRNA分解物が包含される。
【００２９】
前記被験体から採取された血液試料としては、例えば、萎縮型AMDの疑いのある被験体から採取された血液試料、萎縮型AMDの治療薬として期待されるAlu RNA阻害剤の投与前後の血液試料などが挙げられる。血液試料としては、具体的には、例えば、血漿試料、血清試料などが挙げられるが、簡便性の点から血漿試料が好ましい。
【００３０】
血液試料からのRNAの抽出は、グアニジン−塩化セシウム法、酸性フェノール法等により行うことができる。また、miRNeasy Serum/Plasma kit（キアゲン）やNucleoSpin miRNA plasma(Macherey Nagel)等の市販のキットを用いることもできる。
【００３１】
本工程の逆転写反応は、前記の逆転写プライマーを用いる以外は、dNTPsの存在下で、通常の逆転写酵素を使用した一般的な手法によって適宜実施することが可能である。逆転写酵素としては、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（M-MLV）由来逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）由来逆転写酵素等を用いることができる。逆転写反応のための市販の試薬またはキット等も適宜利用することができる。
【００３２】
逆転写反応の反応条件は使用する逆転写酵素に応じて適宜設定することができる。例えば、M-MLV由来逆転写酵素を使用する場合は、42℃で40〜60分間保持する反応条件で行うことができる。また、逆転写反応後、逆転写酵素を失活させても良い。逆転写酵素の失活は熱処理または化学的処理により行うことができる。
【００３３】
以上の逆転写反応により、5’側から3’側へユニバーサルタグ配列、ポリdT配列、およびAlu RNAに相補的なDNA配列を含む構造のcDNAが合成される。
【００３４】
なお、本発明のAlu RNAの測定方法は、本工程（1）の逆転写反応の際または前に、被験体より採取した血液試料から抽出したRNAに対してポリアデニル化反応を施す工程をさらに含むことが好ましい。
【００３５】
工程（2）：
工程（2）では、工程（1）によって合成されたcDNAを定量して、血液試料より抽出したRNAに含まれる目的のAlu RNA量を測定する。cDNAの定量は、PCR法が好ましく、リアルタイムPCR法がより好ましい。具体的には、工程（1）によって合成されたcDNAを鋳型として、前記のフォワードプライマーとリバースプライマーより構成されるプライマーセットを用いてPCR増幅を行い、増幅産物の量に基づき血液中のAlu RNA量を測定する。PCR増幅される領域の長さは、70塩基以上、好ましくは70〜120塩基である。
【００３６】
PCR増幅は前記のフォワードプライマーとリバースプライマーより構成されるプライマーセットを用いる以外は特に制限はなく、常法に従って行えばよい。具体的には、鋳型DNAの変性、プライマーへの鋳型へのアニーリング、および耐熱性酵素（TaqポリメラーゼやThermus themophilis由来のTth DNAポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼ）を用いたプライマーの伸長反応を含むサイクルを繰り返すことにより、目的とする遺伝子の特定の遺伝子配列を含む断片を増幅させる。PCR反応液の組成（鋳型DNA量、緩衝液の種類、プライマー濃度、DNAポリメラーゼの種類や濃度、dNTP濃度等）、PCR反応条件（温度サイクル、サイクルの回数等）は、当該プライマーセットを用いたPCRにおいて高感度でPCR増幅産物が得られるような条件を予備実験等により当業者であれば適切に選択および設定することができる。プライマーのTmに基づいて適当なPCR反応条件を選択する方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、最初に94℃で5分間の変性反応、次に94℃で50秒間（変性）、55℃で50秒間（アニーリング）、72℃で1分間（伸長）を1サイクルとして30サイクル、最後に72℃で1分間の伸長反応により実施することができる。但し、ここに示した条件は一例に過ぎず、用いる酵素、反応温度、反応時間、サイクル数などは適宜変更することも可能である。このようなPCRの一連の操作は、市販のPCRキットやPCR装置を利用して、その操作説明書に従って行うことができる。PCR装置は、例えば、GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems社製)などが使用できる。
【００３７】
リアルタイムPCRは、リアルタイムPCR装置を用いてPCRを行い、PCRによる増幅を継時的に測定することで、増幅率に基づいて鋳型となるDNAの定量を行う手法である。この方法には、通常、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムPCR専用の装置を用いる。まず、段階希釈した既知量のDNAを標準（スタンダード）としてPCRを行い、これをもとに、増幅が指数関数的に起こる領域で一定の増幅産物量になるサイクル数（threshold cycle；Ct値）を縦軸に、初発のDNA量を横軸にプロットし、検量線を作成する。未知濃度の試料についても、同じ条件下で反応を行い、Ct値を求め、この値と検量線から、試料中の目的のDNA量を測定することができる。リアルタイムPCR法には、遺伝子増幅産物の検査法の違いにより、蛍光試薬を用いる方法と、蛍光標識プローブを用いる方法が含まれる。蛍光試薬を用いる方法としては、プライマーセットとともに二本鎖DNAに結合することによって蛍光を発する化合物であるSYBR Green IなどのインターカレーターをPCR反応系に加えるインターカレーター法、また、蛍光標識プローブを用いる方法としては、TaqManプローブ、モレキュラービーコンプローブ、サイクリングプローブをそれぞれ用いるTaqMan法、モレキュラービーコン法、サイクリングプローブ法が挙げられるが、本発明においてはインターカレーター法が好ましい。TaqMan法は、5’末端を蛍光物質（FAM、JOE、FITCなど）で、3’末端をクエンチャー物質（TAMRA、DABCYL、BHQなど）で修飾したオリゴヌクレオチドプローブをPCR反応系に添加してPCRを行う。TaqMan法では、TaqManプローブがPCRによる増幅反応においてポリメラーゼの伸長反応に使用される条件下で鋳型DNAに特異的にハイブリダイズし、DNA鎖の伸長、すなわち鋳型DNAの増幅に伴って分解され、蛍光物質を遊離することによりPCR溶液中の蛍光量が増加する。この蛍光量の増加が鋳型DNAの増幅の指標となり、PCRにおける増幅の様子をリアルタイムで簡便に検査することができる。リアルタイムPCR法は、当業者に知られている通常の方法に基づいて、市販のリアルタイムPCRキットやリアルタイムPCR装置を用い、それらに添付の操作説明書に従って行なえばよい。市販のリアルタイムPCR装置としては、例えば、QuantiTect SYBR Green Master Mix（キアゲン社製）、ABI Prism 7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems社製）等を用いることができる。
【００３８】
工程（3）：
工程（3）では、被験体の血液中のAlu RNA量を対照試料におけるAlu RNA量と比較する。対照試料とは、比較の基準となる試料をいい、例えば、健常者の血液試料（ネガティブコントロール）、萎縮型AMD患者の血液試料（ポジティブコントロール）のいずれであってもよい。被験体の血液中のAlu RNA量がネガティブコントロールのAlu RNA量よりも優位に多い場合、当該被験体は萎縮型AMDに罹患していると判定され、ネガティブコントロールのAlu RNA量と同等である場合は、当該被験体は萎縮型AMDに罹患していないと判定される。また、被験体の血液中のAlu RNA量が、ポジティブコントロールのAlu RNA量よりも優位に少ない場合、当該被験体は萎縮型AMDに罹患していない、あるいは、治療により症状が改善されたと判定できる。被験体の血液中のAlu RNAの量の測定は、対照試料のAlu RNA量との比較などにより絶対量を測定してもよいが、必ずしもAlu RNAの絶対的な量を測定する必要はなく、対照試料のAlu RNA量との相対的な関係が明らかになれば十分である。
【００３９】
対照試料におけるAlu RNA量に対する被験体の血液中のAlu RNA量の増加（減少）率は、通常２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは４倍以上、最も好ましくは５倍以上であるが、増加（減少）率が３倍以上であれば信頼度があるといえる。
【００４０】
本発明において「検査」または「診断」とは、典型的には、被験体が萎縮型AMDに罹患しているか否かの判定を意味するが、これには限定されず、該疾患の症状の度合または進行度の判定、該疾患に対する治療効果の判定、および治療後に該疾患を再発する危険性が存在するか否かの判定などを包含する。また、「検査」または「診断」は、医師による診断を包含しない「検査の補助」または「診断の補助」という語で置き換えることができ、具体的には、「検査」または「診断」のためのデータを取得することをいう。
【００４１】
３．Alu RNA阻害物質の投与が有効な患者群を選別する方法および萎縮型AMDの治療方法
本発明によればまた、前記測定方法によって測定された萎縮型AMD患者の血液中のAlu RNA量に基づいてAlu RNA阻害物質の投与が有効な患者群を選別する方法、ならびに、その血液中のAlu RNA量が対照となる健常者の血液中のAlu RNA量として比較して多い萎縮型AMD患者にAlu RNA阻害物質を投与することによって萎縮型AMDを治療する方法、および当該萎縮型AMD患者に投与するためのAlu RNA阻害物質を有効成分とする治療薬が提供される。具体的には、血液中のAlu RNA量が有意に高い萎縮型加齢黄斑変性患者は、Alu RNA阻害物質を投与することによって血液中Alu RNAの増加が抑制され、病態の改善や治癒が期待できる患者群として選別することができ、また、当該患者群にAlu RNA阻害物質の投与による治療を行うことができる。本発明において「Alu RNA阻害物質」とは、Alu RNAの転写を直接または間接に抑制すること等により血清中のAlu RNA量を減少させる低分子化合物、ペプチド、蛋白質、核酸誘導体などを意味する。具体例としては、Alu RNAに対するアンチセンス核酸などが挙げられる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明を限定するものでない。【００４３】
（参考例）従来法による血清中Alu RNAの測定
(1) RNA精製
健常人血清10サンプルおよび地図状萎縮を伴う萎縮型加齢黄斑変性（以下、「萎縮型AMD」という）患者血清8サンプル（Bioreclamation IVT）それぞれ600 μLから、NucleoSpin miRNA plasma（Macherey Nagel Gmbh & Co. KG）キットを用い、キット添付のプロトコール（一般的なrDNaseI処理あり）に従って血清遊離RNAを精製した。なお、サンプル間の精製操作および逆転写効率の標準化の為、外因性のsmall RNAである線虫Cel-miR-39_1 spike-in control（キアゲン）4.8 x 108コピーを溶解バッファー添加後の各サンプルに加えた。【００４４】
(2) ワンステップリアルタイムPCR
(1)で得られた血清遊離RNAサンプルをワンステップリアルタイムPCRに供し、DNA混入に起因する増幅シグナルの有無を確認した。試験は、遺伝子改変DNase（活性が通常の250倍のDNase）を含むTURBO DNA-free kit（Ambion）を用いた追加DNase処理の有無および逆転写酵素添加の有無の組み合わせにより以下の４つの条件で行った。陽性対照としては、化学合成した下記のAlu RNAの部分配列を設定した。
Alu RNA （95−188） RNA 陽性対照：
5’-CAA CAU GGU GAA ACC CCG UCU CUA CUA AAA AUA CAA AAA UUA GCC GGG CGU GGU GGC GGG CGC CUG UAA UCC CAG CUA CUC GGG AGG CUG AGG C-3’（配列番号７）【００４５】
条件1: 追加DNase処理無し(-),逆転写酵素添加(+)
条件2: 追加DNase処理無し(-),逆転写酵素未添加(-) 
条件3: 追加DNase処理有り(+),逆転写酵素添加(+)
条件4: 追加DNase処理有り(+),逆転写酵素未添加(-)【００４６】
血清遊離RNAサンプルおよび陽性対照はTURBO DNA-free kitのプロトコールに従い追加DNase処理を行った。なお、追加DNase処理なしのサンプルに関してはキットに含まれるTURBO DNaseに替えてRNase-free waterを同量添加した。上記で調製したサンプルを鋳型とし、Alu RNAに対する下記のAlu RNA (95-117)フォワードプライマー：5’-CAA CAT RGT GAA ACC CCG TCT CT-3’（R=G/A,配列番号５）とAlu RNA (170-188)リバースプライマー：5’-GCC TCA GCC TCC CGA GTA G-3’（配列番号８）からなるプライマーセットおよびQuantiTect SYBR Green RT-PCR kit（キアゲン）を用いてPCR反応液を調製した。なお、逆転写酵素未添加のサンプルは逆転写酵素に替えて同量のRNase-free waterを添加した。【００４７】
調製したPCR反応液を含むプレートをABI Prism 7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）にセットし、ワンステップリアルタイムPCRを行った。PCRは、50℃30分間の逆転写反応と、95℃15分のホットスタートの後、40サイクルの94℃15秒、58℃30秒、72℃30秒の条件で行った。なお、検量線用サンプルとして化学合成した濃度既知の下記のAlu RNA (95-188) DNA standard for 1-step RT-PCR DNAを用いた検量線法によりPCR反応液中のコピー数を算出した。【００４８】
Alu RNA (95-188) DNA standard for 1-step RT-PCR：
5’-GCC TCA GCC TCC CGA GTA GCT GGG ATT ACA GGC GCC CGC CAC CAC GCC CGG CTA ATT TTT GTA TTT TTA GTA GAG ACG GGG TTT CAC TAT GTT G-3’（配列番号９）【００４９】
結果を下記表１に示す。なお、コピー数は、検量線下限値1000 copies/wellを検出限界値とし、検出限界未満を<1000とした。【００５０】
【表１】
2017164353.tif 000003
【００５１】
表１に示すように、追加DNase処理無し、逆転写酵素未添加の条件（条件２）では、健常人・萎縮型AMD患者のいずれの血清サンプルのPCRにおいても増幅シグナルが認められた。即ちこの増幅シグナルはゲノムDNA由来の増幅であり、精製キットに含まれるrDNase I処理で十分にゲノムDNAが除去されないことを示すものである。また、この増幅シグナルは、追加DNase処理無し、逆転写酵素添加の条件（条件１）でも同程度認められたことから、ほとんどがゲノムDNA由来のシグナルでRNA由来シグナルがマスクされていると考えられた。この原因としては、Alu elementはヒトゲノム上におよそ100万コピーと大量に存在することが考えられる。一方、追加DNase処理有り、逆転写酵素未添加の条件（条件４）では、健常人・萎縮型AMD患者のいずれの血清サンプルのPCRにおいても増幅シグナルは消失しており、追加DNase処理によってゲノムDNAの影響は除けるものと考えられるが、追加DNase処理有り、逆転写酵素添加の条件（条件３）では、試料によってはRNA由来の増幅シグナルも認められなかった。その理由の一つとして、陽性対照とした合成Alu RNAにおいても追加DNase処理によって増幅シグナルが減じていることから、追加DNase処理中にRNA品質が低下していることが示唆された。また、一般にRNAは血液中で不安定であることから、Alu RNAは血液循環中または血液採取から血清採取に至るまでの処理過程において分解を受けており、増幅ターゲットである94塩基長の配列が保持されていないという可能性も考えられた。【００５２】
（実施例１）本発明方法による血清中Alu RNAの測定
参考例と同様にして健常人血清および萎縮型AMD患者血清より血清遊離RNAを精製した。精製した血清遊離RNA、逆転写効率算出のための逆転写コントロールとして2.5 x 107コピーのCel-miR39（キアゲン）および2.5 x 107コピーの下記Alu Sq consensus配列の72-120を鋳型として逆転写反応を行った。（逆転写効率が100 %の場合には、PCR反応液中鋳型コピー数は5 x 105コピーとなる。）
Alu RNA (72-120) RNA positive control：
5’-CAG GAG UUC GAG ACC AGC CUG GCC AAC AUG GUG AAA CCC CGU CUC UAC U-3’(配列番号１０）【００５３】
逆転写反応は、精製した血清遊離RNAを鋳型とする場合は、M-MLV逆転写酵素（ニッポンジーン）、Poly (A) polymerase（タカラバイオ）、ヒトゲノム中には存在しない配列を5’領域に有し、中央部にポリdT配列、3’端にはアニーリングポジションを決定する2塩基を有するAlu RT プライマー（5’-GTG CAG GGT CCG AGG TTC ACT ATA GGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA G-3’：配列番号３）、Alu J RT プライマー（5’-GTG CAG GGT CCG AGG TTC ACT ATA GGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GT-3’：配列番号４）を用い、TAKARA Thermal Cycler Dice（タカラバイオ）を用いて37℃60分間実施した。【００５４】
また、Cel-miR39（キアゲン）を鋳型とする場合は、Cel-miR39 RT プライマー（5’-GTG CAG GGT CCG AGG TTC ACT ATA GGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTC A-3’：配列番号１１）を用いる以外は、上記と同様の条件で逆転写反応を行った。【００５５】
得られたcDNAを鋳型とし、ABI Prism 7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を用いてリアルタイムPCRを行い、血清中のAlu RNAおよびコントロールのCel-miR-39定量を行った。【００５６】
Alu RNAの定量のためのリアルタイムPCR反応は、Alu RNAに特異的な配列からなる下記のAlu RNA (95-117) フォワードプライマーまたはAlu RNA (72-87) フォワードプライマーと、前記の逆転写プライマーの5’領域に相補的な配列を有する下記のユニバーサルリバースプライマーを用い、QuantiTect SYBR Green Master Mix（キアゲン）を用いて95℃15分、40サイクルの94℃15秒、55℃30秒、70℃30秒の条件で行った。
Alu RNA (95-117) フォワードプライマー：
5’-CAA CAT RGT GAA ACC CCG TCT CT-3’（R=G/A,配列番号５）
Alu RNA (72-87) フォワードプライマー：
5’-CAG GAG TTC GAG ACC A-3’ （配列番号６）
ユニバーサルリバースプライマー：
5’-GTG CAG GGT CCG AGG T-3’ （配列番号１２）【００５７】
Cel-miR-39定量のためのリアルタイムPCR反応は、フォワードプライマーに、Cel-miR39に特異的なフォワードプライマー（5’-TCA CCG GGT GTA AAT CAG C-3’：配列番号１３）を用いる以外は、上記と同条件にして行った。【００５８】
また、Alu RNAおよびCel-miR-39のいずれの定量も、化学合成した濃度既知のDNA（Alu (72-120+50) DNA standard、Cel-miR39 DNA standard）を検量線用サンプルとし、それぞれ上記のプライマーのセットを用いてPCRを行い、作成した検量線からPCR反応液中のコピー数を算出した。なお、逆転写効率は、上述の化学合成したAlu RNA (72-120) RNA positive control(配列番号１０）及びCel-miR-39_1 spike-in control（キアゲン）を被験試料と同様に逆転写反応およびリアルタイムPCR反応に供し、検量線より実測値を算出して理論値を基に算出した。【００５９】
Alu (72-120+50) DNA standard：
5’-GTG CAG GGT CCG AGG TTC ACT ATA GGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA GTA GAG ACG GGG TTT CAC CAT GTT GGC CAG GCT GGT CTC GAA CTC CTG-3’（配列番号１４）
Cel-miR39 DNA standard：
5’-GTG CAG GGT CCG AGG TTC ACT ATA GGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTC AAG CTG ATT TAC ACC CGG TGA-3’ （配列番号１５）【００６０】
血清600 μLに対して4.8 x 108コピーのCel-miR-39を内標準として添加したことから、血清1 mL当たりのCel-miR-39は8 x 108コピーとなる。よって、測定した各PCR反応液中のCel-miR-39およびAlu RNAのコピー数から、下記の計算式（1）を用いて血清1 mL当たりのAlu RNAコピー数を算出した。なお、逆転写効率は、下記の計算式（2）を用いて算出した。【００６１】
血清1 mL中Alu RNA コピー数＝
8 x 108 x（PCR反応液中Alu RNAコピー数/Alu RNA逆転写効率）/（PCR反応液中Cel-miR-39コピー数/Cel-miR39逆転写効率） (1)【００６２】
各測定対象分子の逆転写効率(%)＝
100 x (検量線より算出された逆転写コントロールの実測値/500,000)  (2)
（式中、500,000は、逆転写効率が100 %の場合の理論上のPCR反応液中鋳型コピー数を示す。）【００６３】
Alu RNAの塩基配列95-117に対するフォワードプライマー（配列番号５）を用いた場合の測定結果を図１に、Alu RNAの塩基配列72-87に対するフォワードプライマー（配列番号６）を用いた場合の測定結果を図２に示す。【００６４】
図１および図２に示すように、本発明の方法によれば、Alu RNAが高感度で検出され、いずれのフォワードプライマーを用いた場合であっても、AMD患者血清中Alu RNAは健常人血清に比較して高濃度であることが示された。また、例えば図中に示した健常人群の99.74 %信頼区間値をカットオフ値として設定することで、Alu RNAが亢進している患者を選別することが可能となり、例えば、薬剤が奏功する患者層を選別するバイオマーカーとして本方法は有用であるものと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、萎縮型加齢黄斑変性の検査薬および治療薬の製造開発分野において利用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【図１】
2017164353.tif 000004
【図２】
2017164353.tif 000005
【配列表】
2017164353000001.app
【国際調査報告】
2017164353.tif 000006
2017164353.tif 000007
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