(57)【要約】  幹細胞を新規の組換えフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養することにより、幹細胞が効率的に増殖する。
2018021543.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を、
（ａ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１〜７から成る群より選択されるリピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１〜７から成る群より選択されるリピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
（ｂ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−８〜１０リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−８〜１０リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、及び
（ｃ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１２〜１４リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１２〜１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
の存在下で培養する工程を包含する、幹細胞の製造方法。
【請求項２】
幹細胞を、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の組換えポリペプチドを同一分子内に含む組換えポリペプチドの存在下で培養する工程を包含する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
（ａ）の組換えポリペプチドが、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１〜３リピート又はＩＩＩ−４〜６リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１〜３リピート又はＩＩＩ−４〜６リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
組換えポリペプチドが、配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドであるか、あるいは配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
組換えポリペプチドの存在下で幹細胞を培養する工程が、組換えポリペプチドがコートされた固相と幹細胞とが接触した状態で実施される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
固相が、細胞培養用器材又は細胞培養用担体である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
固相が、ディッシュ、プレート、フラスコ、バッグ、ビーズ、メンブレン又はスライドガラスである、請求項５に記載の製造方法。
【請求項８】
幹細胞が、ヒト由来の多能性幹細胞又は神経幹細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
（ａ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１〜７から成る群より選択されるリピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１〜７から成る群より選択されるリピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
（ｂ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−８〜１０リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−８〜１０リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、及び
（ｃ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１２〜１４リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１２〜１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
を同一分子内に含む組換えポリペプチド。
【請求項１１】
（ａ）の組換えポリペプチドが、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１〜３リピート又はＩＩＩ−４〜６リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１〜３リピート又はＩＩＩ−４〜６リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドであるか、あるいは配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、請求項１０に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組換えポリペプチドがコートされた固相。
【請求項１４】
組換えポリペプチドがコートされた細胞培養用器材又は細胞培養用担体である、請求項１３に記載の固相。
【請求項１５】
組換えポリペプチドがコートされたディッシュ、プレート、フラスコ、バッグ、ビーズ、メンブレン又はスライドガラスである、請求項１３に記載の固相。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の細胞への分化能力を保持した幹細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、分裂して自分と同じ細胞を作る能力（自己複製能）と、別の種類の細胞に分化する能力を持ち、際限なく増殖できる細胞と定義されている。幹細胞から生じた二つの娘細胞のうち、少なくとも一方が同じ幹細胞でありつづけることによって分化細胞を供給することができる。【０００３】
現在、幹細胞の作製方法に関して、盛んに研究が進められている。例えば、幹細胞の培養用基材として、マウス由来のフィーダー細胞、マトリゲル、ラミニンやフィブロネクチンなどの細胞外基質（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ）、などが利用できる。【０００４】
フィブロネクチンやフィブロネクチンフラグメントを利用した、幹細胞の作製方法の研究として、例えば、非特許文献１が挙げられる。非特許文献１には、１２０ｋＤａのフィブロネクチンフラグメント（以下、１２０ｋ−ｆｒとする）上でヒト胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）を培養することにより、多分化能を維持したままで、ヒトＥＳ細胞を増殖させる方法が開示されている。しかし、１２０ｋ−ｆｒ上での細胞の増殖速度は、全長（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）フィブロネクチン上での増殖速度に比べると遅かった。また、幹細胞が再生医療において使用されるには、品質及び安全性が確保される必要があるが、全長フィブロネクチンや市販の１２０ｋ−ｆｒは天然のフィブロネクチン由来のため、起源生物が保有していたウイルス等が持ち込まれる危険性が高い。【０００５】
このように、フィブロネクチンやフィブロネクチンフラグメントを利用し、短期間で充分な量の幹細胞を製造する技術は未だ確立していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ジャーナル  オブ  ザ  ロイヤル  ソサエティー  インターフェース（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）、第１０巻、第８３号、２０１３０１３９（２０１３年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来の幹細胞の製造方法が有していた問題を解決しようとするものであり、フィブロネクチンフラグメントを用いて、短期間に大量の幹細胞を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究した結果、幹細胞を新規の組換えフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養することにより、幹細胞が効率的に増殖することを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］  幹細胞を、
（ａ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１〜７から成る群より選択されるリピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１〜７から成る群より選択されるリピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
（ｂ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−８〜１０リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−８〜１０リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、及び
（ｃ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１２〜１４リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１２〜１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
の存在下で培養する工程を包含する、幹細胞の製造方法、
［２］  幹細胞を、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の組換えポリペプチドを同一分子内に含む組換えポリペプチドの存在下で培養する工程を包含する、［１］に記載の製造方法、
［３］  （ａ）の組換えポリペプチドが、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１〜３リピート又はＩＩＩ−４〜６リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１〜３リピート又はＩＩＩ−４〜６リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、［１］又は［２］に記載の製造方法、
［４］  組換えポリペプチドが、配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドであるか、あるいは配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、［３］に記載の製造方法、
［５］  組換えポリペプチドの存在下で幹細胞を培養する工程が、組換えポリペプチドがコートされた固相と幹細胞とが接触した状態で実施される、［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法、
［６］  固相が、細胞培養用器材又は細胞培養用担体である、［５］に記載の製造方法、
［７］  固相が、ディッシュ、プレート、フラスコ、バッグ、ビーズ、メンブレン又はスライドガラスである、［５］に記載の製造方法、
［８］  幹細胞が、ヒト由来の多能性幹細胞又は神経幹細胞である、［１］〜［７］のいずれかに記載の製造方法、
［９］  幹細胞が、人工多能性幹細胞である、［８］に記載の製造方法、
［１０］  （ａ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１〜７から成る群より選択されるリピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１〜７から成る群より選択されるリピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
（ｂ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−８〜１０リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−８〜１０リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、及び
（ｃ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１２〜１４リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１２〜１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
を同一分子内に含む組換えポリペプチド、
［１１］  （ａ）の組換えポリペプチドが、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１〜３リピート又はＩＩＩ−４〜６リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１〜３リピート又はＩＩＩ−４〜６リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、［１０］に記載のポリペプチド、
［１２］  配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドであるか、あるいは配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドでる、［１０］に記載の組換えポリペプチド、
［１３］  ［１０］〜［１２］のいずれかに記載の組換えポリペプチドがコートされた固相、
［１４］  組換えポリペプチドがコートされた細胞培養用器材又は細胞培養用担体である、［１３］に記載の固相、
［１５］  組換えポリペプチドがコートされたディッシュ、プレート、フラスコ、バッグ、ビーズ、メンブレン又はスライドガラスである、［１３］に記載の固相、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、幹細胞の製造方法が提供される。本発明の方法によれば、幹細胞を効率よく増殖させること、幹細胞の未分化状態を維持すること、及び幹細胞を効率よく誘導することができる。当該方法は細胞増殖率が高く、本発明により得られる幹細胞は所望の細胞への分化能を有していることから、例えば、再生医療に好適に使用される。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。また、本発明により、新規の組換えフィブロネクチンフラグメントが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】フィブロネクチンのドメイン構造を示す模式図である。
【図２】実施例５における、細胞増殖を示す図である。
【図３】実施例６における、細胞増殖を示す図である。
【図４】実施例７における、細胞増殖を示す図である。
【図５】実施例８における、細胞増殖を示す図である。
【図６】フィブロネクチンフラグメントのドメイン構造を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明について詳細に説明する。
＜フィブロネクチン＞
ヒト由来や哺乳動物由来のフィブロネクチンがよく研究されており、以下は、主にヒト由来血漿フィブロネクチンについての知見である。
【００１３】
フィブロネクチンは血液中、細胞表面、細胞外マトリックスなどに存在する分子量約２５０ｋＤａ（単量体）の巨大な糖タンパク質で、細胞接着などの多彩な機能を持つことが知られている。フィブロネクチンはドメイン構造から成り（以下、図１参照）、またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれている。３種類の類似の配列は、それぞれＩ型リピート、ＩＩ型リピート、ＩＩＩ型リピートと呼ばれ、このうち、ＩＩＩ型リピートは８７〜９６個のアミノ酸残基で構成されており、各リピート間でのアミノ酸配列の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は１７〜４０％である。フィブロネクチン中には１５個のＩＩＩ型リピートが存在するが、そのうち、１番目、２番目、３番目（以下、それぞれＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２、ＩＩＩ−３と称する）は自己会合ドメインに、４番目、５番目、６番目（以下、それぞれＩＩＩ−４、ＩＩＩ−５、ＩＩＩ−６と称する）はＤＮＡ結合ドメインに、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０と称する）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目、１４番目（以下、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４と称する）はヘパリン結合ドメインに含有されている。ＩＩＩ−１０にはインテグリンα５β１（ＶＬＡ−５ともいう）に対して結合活性を有する領域が含まれており、このコア配列はＲＧＤである。また、フィブロネクチンのＣ末端側寄りの部位にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳにはＣＳ−１と呼ばれる２５アミノ酸からなる配列が含まれており、当該配列はインテグリンα４β１（ＶＬＡ−４ともいう）に対して結合活性を示す。
【００１４】
ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１〜１４及びＣＳ−１のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１〜１４及び１５として、本明細書の配列表に示す。
【００１５】
１．本発明の幹細胞の製造方法
本発明の幹細胞の製造方法は、幹細胞を組換えフィブロネクチンフラグメントであるポリペプチドの存在下で培養する工程を包含することを特徴とする。
【００１６】
本発明に使用される幹細胞は、分裂して自分と同じ細胞を作る能力（自己複製能）と、別の種類の細胞に分化する能力を持つ細胞であれば限定されない。幹細胞は分化能力の違いによって、以下のように分類されるが、本発明に使用される幹細胞はいずれでもよい。
【００１７】
（１）分化全能性幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）：胎盤などの生体外組織を含む、一個体を形成するすべての細胞種への分化が可能な幹細胞を指す。受精卵（および４〜８回の卵割まで）が例示される。
（２）多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）：個体は形成しないが、三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に属する細胞系列すべてへ分化し得る幹細胞を指す。特に限定されないが、例えば、胚盤胞期の内部細胞隗や、そこから樹立された胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）などが挙げられる。多能性幹細胞は万能細胞と呼称されることがある。
（３）多分化能幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）：分化可能な細胞系列が限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な幹細胞を指す。特に限定されないが、例えば、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞などが挙げられる。一般的に胚葉を超えた分化は行えないが、例外もある。
（４）オリゴポテント幹細胞（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）：数種の細胞種にのみ分化可能な幹細胞を指す。特に限定されないが、例えば、神経幹細胞などが挙げられる。
（５）単分化能幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）：分化可能な細胞種が一種類に限定されている幹細胞を指す。幹細胞として分裂増殖するか、分化して幹細胞以外の別の細胞種に変化することができる。特に限定されないが、例えば、筋幹細胞、生殖幹細胞（卵祖細胞、精原細胞）などが挙げられる。単分化能幹細胞は前駆細胞と呼ばれることもある。
【００１８】
本発明に使用される幹細胞の起源は特に限定されず、任意の生物、好ましくは哺乳動物に由来する幹細胞を使用することができる。生物の年齢、性別は特に限定されない。１つの実施形態において、霊長目（例えば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が使用される。最も好ましくは、ヒト由来の細胞が使用されるが、本発明はそれに限定されない。
【００１９】
本発明の好適な態様において、幹細胞は好ましくは多能性幹細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞であり、さらに好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞の作製に関しては種々の方法が知られているが、本発明の方法は特定の方法で作製されたｉＰＳ細胞にのみ使用可能なものではない。株化されたｉＰＳ細胞、例えば樹立されたヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１株）等にも適用できる。
【００２０】
ヒトへの投与を目的として本発明の方法により幹細胞を製造する場合、好ましくはレシピエントと組織適合性抗原のタイプが一致又は類似したドナーより採取された細胞が、幹細胞の製造に供される。例えばレシピエント自身より採取された細胞が、幹細胞の製造に供される。
【００２１】
本発明の幹細胞の製造方法は、後述のポリペプチドの存在下での培養工程（以下、本発明の培養工程と称することがある）を包含することを特徴とする、幹細胞の製造方法である。
【００２２】
本発明の幹細胞の製造方法では、ポリペプチド（ａ）、ポリペプチド（ｂ）、及びポリペプチド（ｃ）の存在下に幹細胞の培養が実施される。本発明の方法は、ポリペプチド（ａ）、ポリペプチド（ｂ）、及びポリペプチド（ｃ）の存在下に実施することができる。さらに、（ａ）及び（ｂ）を同一分子内に含むポリペプチドとポリペプチド（ｃ）の２種類のポリペプチドの混合物の存在下に、（ｂ）及び（ｃ）を同一分子内に含むポリペプチドとポリペプチド（ａ）の２種類のポリペプチドの混合物の存在下に、（ａ）及び（ｂ）を同一分子内に含むポリペプチドと（ｂ）及び（ｃ）を同一分子内に含むポリペプチドの２種類のポリペプチドの混合物の存在下に、又は、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を同一分子内に含む１種のポリペプチドの存在下に幹細胞の培養を実施してもよい。ただし、前記の（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を同一分子内に含む１種のポリペプチドは、全長フィブロネクチンとは異なる。
【００２３】
ポリペプチド（ａ）は、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１〜７から成る群より選択されるリピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１〜７から成る群より選択されるリピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである。当該ポリペプチド（ａ）において、「ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１〜７から成る群より選択されるリピート」は、少なくとも１つのリピート、好適には３つのリピートであればよく、７つすべてのリピートであってもよい。当該ポリペプチド（ａ）は、特に好適には、ＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２及びＩＩＩ−３リピートを含むポリペプチド、又は、ＩＩＩ−４、ＩＩＩ−５及びＩＩＩ−６リピートを含むポリペプチド、あるいはＩＩＩ−１〜３リピート又はＩＩＩ−４〜６リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００２４】
ポリペプチド（ｂ）は、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−８〜１０リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−８〜１０リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである。すなわち、当該ポリペプチド（ｂ）は、ＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０をすべて含むポリペプチドである。
【００２５】
ポリペプチド（ｃ）は、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１２〜１４リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１２〜１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである。すなわち、当該ポリペプチド（ｃ）は、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４をすべて含むポリペプチドである。
【００２６】
同一分子内に（ａ）と（ｂ）を含むポリペプチドとして、１２０ｋＤａのフィブロネクチンフラグメント（１２０ｋ−ｆｒ）が例示される。１２０ｋ−ｆｒは、Ｎ末端側から順にＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２、ＩＩＩ−３、ＩＩＩ−４、ＩＩＩ−５、ＩＩＩ−６、ＩＩＩ−７、ＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０を含む、分子量約１２０ｋＤａのタンパク質である。１２０ｋ−ｆｒの予想されるアミノ酸配列（９３２アミノ酸残基）を、配列番号１６として、本明細書の配列表に示す。１２０ｋ−ｆｒのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを作製して適切な宿主−ベクター系と組み合わせることにより、１２０ｋ−ｆｒを組換えポリペプチドとして製造することができる。また、市販の１２０ｋ−ｆｒを使用してもよい。
【００２７】
同一分子内に（ｂ）と（ｃ）を含むポリペプチドとして、ＣＨ−２７１やＣＨ−２９６が例示される。
【００２８】
ＣＨ−２７１は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４を含む、分子量約６０ｋＤａ（５４９アミノ酸残基）の組換えタンパク質である。ＣＨ−２７１のアミノ酸配列を、配列番号１７として、本明細書の配列表に示す。
【００２９】
ＣＨ−２９６は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１を含む、分子量約６３ｋＤａ（５７４アミノ酸残基）の組換えタンパク質である。ＣＨ−２９６のアミノ酸配列を、配列番号１８として、本明細書の配列表に示す。ＣＨ−２９６は、レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）として市販されている。
【００３０】
例えば、前記の１２０ｋ−ｆｒと、ＣＨ−２７１又はＣＨ−２９６とを組み合わせて使用することにより、本発明の幹細胞の製造方法を実施することができる。
【００３１】
同一分子内に（ａ）と（ｂ）と（ｃ）を有するポリペプチドも本発明の幹細胞の製造方法に使用することができる。本発明を特に限定するものではないが、同一分子内に（ａ）と（ｂ）と（ｃ）を含むポリペプチドとして、下記のＦＣＨ−２９６、ＤＣＨ−２９６が例示される。
【００３２】
ＦＣＨ−２９６は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２、ＩＩＩ−３、ＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１を含む、分子量約９６ｋＤａ（８８１アミノ酸残基）の組換えポリペプチドである。ＦＣＨ−２９６のアミノ酸配列を、配列番号１９として、本明細書の配列表に示す。配列番号１９のうち、アミノ酸番号１〜２９８が（ａ）に該当し、アミノ酸番号２９９〜３０７がＧＳ  ｌｉｎｋｅｒに該当し、アミノ酸番号３０８〜５８５が（ｂ）に該当し、アミノ酸番号５８６〜８５６が（ｃ）に該当し、アミノ酸番号８５７〜８８１がＣＳ−１に該当する。なお、配列番号１９のアミノ酸番号９４〜１１１は、ＩＩＩ−１とＩＩＩ−２との間に存在する、ＩＩＩ型リピート以外の領域である。ＦＣＨ−２９６は、本発明において初めて製造された新規なポリペプチドである。
【００３３】
ＤＣＨ−２９６は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ−４、ＩＩＩ−５、ＩＩＩ−６、ＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１を含む、分子量約９３ｋＤａ（８５１アミノ酸残基）の組換えポリペプチドである。ＤＣＨ−２９６のアミノ酸配列を、配列番号２０として、本明細書の配列表に示す。配列番号２０のうち、アミノ酸番号１〜２６８が（ａ）に該当し、アミノ酸番号２６９〜２７７がＧＳ  ｌｉｎｋｅｒに該当し、アミノ酸番号２７８〜５５５が（ｂ）に該当し、アミノ酸番号５５６〜８２６が（ｃ）に該当し、アミノ酸番号８２７〜８５１がＣＳ−１に該当する。ＤＣＨ−２９６は、本発明において初めて製造された新規なポリペプチドである。
【００３４】
本発明に使用されるポリペプチド（ａ）〜（ｃ）は、機能的に同等であれば、あるいは幹細胞を増殖させる機能、幹細胞の未分化状態を維持する機能、又は幹細胞を誘導する機能を保持するかぎり、ＩＩＩ−１〜７から成る群より選択されるリピート、ＩＩＩ−８〜１０リピート、又はＩＩＩ−１２〜１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでいてもよい。本明細書において、「１もしくは数個」とは、特に限定はされないが、１〜１５個の範囲、好ましくは１〜１０個の範囲、更に好ましくは１〜５個の範囲、特に好ましくは１〜３個の範囲である。特には限定されないが、例えば、ＩＩＩ−１（配列番号１）を含む代わりに、ＩＩＩ−１のＮ末９アミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号２３）、ＩＩＩ−１のＮ末５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号２４）、又はＩＩＩ−１のＮ末３アミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号２５）を含むポリペプチドも、当該ポリペプチドに含まれる。更に、（ａ）〜（ｃ）を含むポリペプチドとして、ＦＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１９）又はＤＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号２０）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが例示され、より具体的には、限定するものではないが、Ｎ末９アミノ酸欠損のＦＣＨ−２９６（配列番号２９）、Ｎ末６アミノ酸欠損のＦＣＨ−２９６（配列番号３０）、Ｎ末５アミノ酸欠損のＦＣＨ−２９６（配列番号３１）、Ｎ末３アミノ酸欠損のＦＣＨ−２９６（配列番号３２）、Ｎ末３アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３３）、Ｎ末６アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３４）、Ｎ末９アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３５）、Ｎ末１１アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３６）、Ｎ末１２アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３７）、Ｎ末１４アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３８）、Ｎ末１５アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３９）、Ｎ末ＨＫＲＨＥＥＧＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号４０）、Ｎ末ＨＫＲＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号４１）、Ｎ末ＨＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号４２）、Ｎ末ＨＨＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号４３）、Ｎ末にＨｉｓ−ｔａｇを有するＦＣＨ−２９６（配列番号２１）、及びＮ末にＨｉｓ−ｔａｇを有するＤＣＨ−２９６（配列番号２２）が、例示される。
【００３５】
また、本発明に使用されるポリペプチド（ａ）〜（ｃ）は、機能的に同等であれば、あるいは幹細胞を増殖させる機能、幹細胞の未分化状態を維持する機能、又は幹細胞を誘導する機能を保持するかぎり、ＩＩＩ−１〜７から成る群より選択されるリピート、ＩＩＩ−８〜１０リピート、又はＩＩＩ−１２〜１４リピートのアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。特に限定はされないが、ＩＩＩ−１〜７から成る群より選択されるリピート、ＩＩＩ−８〜１０リピート、又はＩＩＩ−１２〜１４リピートのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが例示される。
【００３６】
アミノ酸の置換、欠失、挿入または付加（以下、「アミノ酸の置換等」と称する場合がある）は、本来のポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度が好ましい。例えば、アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの持つ性質（例えば、疎水性、親水性、電荷、ｐＫ等）を実質的に変化させない範囲の保存的なものが好ましい。例えば、アミノ酸の置換は、１．グリシン、アラニン；２．バリン、イソロイシン、ロイシン；３．アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；４．セリン、スレオニン；５．リジン、アルギニン；６．フェニルアラニン、チロシンの各グループ内での置換であり、アミノ酸の欠失、付加、挿入は、ポリペプチドにおけるそれらの対象部位周辺の性質に類似した性質を有するアミノ酸の、対象部位周辺の性質を実質的に変化させない範囲での欠失、付加、挿入が好ましい。
【００３７】
アミノ酸の置換等は種差や個体差に起因して天然に生じたものであってもよく、また、人工的に導入されたものであってもよい。人工的な導入は公知の方法により行えばよく、特に限定はないが、例えば、公知の手法により、塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入を前述のポリペプチドをコードする核酸に導入した核酸を使用することにより、当該ポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸置換等を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを製造することができる。
【００３８】
本明細書において「機能的に同等」または「同等な機能」とは、アミノ酸置換等を導入されていない対応するポリペプチドと機能的に同等または同等な機能を意味し、すなわち、比較対象であるポリペプチドを使用して後述の幹細胞の製造を実施した場合、アミノ酸置換等を導入されていない対応するポリペプチドを使用した場合と同等の幹細胞の細胞増殖率が得られること、同等の幹細胞の未分化状態が維持されていること、又は同等の幹細胞の誘導率が得られることをいう。すなわち、後述の実施例に記載の方法に沿ってその性質の評価を実施することにより、ポリペプチドの機能を適宜確認することができる。
【００３９】
本発明に使用されるポリペプチドは、幹細胞の培養における有用性を失わない範囲で、上記のＩＩＩ型リピート以外のペプチドやアミノ酸残基、及び／又は上記のＩＩＩ型リピート以外のフィブロネクチン中に存在する領域、例えば、ＣＳ−１等を含んでいてもよい。例えば、上記のＩＩＩ型リピート以外の領域に任意のペプチドやアミノ酸残基を導入することができ、各リピートの間にリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）としてアミノ酸残基やペプチドが挿入された本発明のポリペプチドや、組換えポリペプチドの精製に有用なペプチド（ｔａｇ）が付加された本発明のポリペプチドが例示される。ｌｉｎｋｅｒとして、ｇｌｙｃｉｎｅ−ｓｅｒｉｎｅ  ｌｉｎｋｅｒ（ＧＳ  ｌｉｎｋｅｒ）が例示されるが、これらに限定されない。ｔａｇとして、ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｆｌａｇ−ｔａｇやＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｔａｇ（ＧＳＴ−ｔａｇ）が例示されるが、これらに限定されない。特に限定されないが、例えば、Ｎ末にＨｉｓ−ｔａｇを有するＦＣＨ−２９６ポリペプチド（配列番号２１）やＮ末にＨｉｓ−ｔａｇを有するＤＣＨ−２９６ポリペプチド（配列番号２２）は、本発明に使用されるポリペプチドに含まれる。
【００４０】
本発明の培養工程では、幹細胞が、未分化状態を維持したままで、かつ、高い細胞増殖率で培養される。後述の実施例にも記載のとおり、本発明の幹細胞の製造方法は、公知のフィブロネクチンフラグメントである１２０ｋ−ｆｒ、ＣＨ−２７１又はＣＨ−２９６をそれぞれ単独で使用する方法と比較して、明らかに細胞増殖率が高いこと、未分化状態を高く維持できることから、非常に有用である。さらに、前記の方法を幹細胞の拡大培養に使用することにより、フィーダー細胞を使用しなくとも高い細胞増殖率、未分化状態の維持が実現できるという、大きな利点がある。
【００４１】
ポリペプチドの調製に関して、フィブロネクチンに関する情報は、キミヅカ  Ｆ．ら〔Ｋｉｍｉｄｕｋａ  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、２８４〜２９１頁（１９９１）〕、コーンブリット  Ａ．Ｒ．ら〔Ｋｏｒｎｂｒｉｈｔｔ  Ａ．  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）、第４巻、第７号、１７５５〜１７５９（１９８５）〕、およびセキグチ  Ｋ．ら〔Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第１７号、４９３６〜４９４１（１９８６）〕等を参照することができる。また、フィブロネクチンをコードする核酸配列又はフィブロネクチンのアミノ酸配列については、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７に開示されている。
【００４２】
本発明に使用されるポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により製造される。組換え体の製造、あるいは、取扱いの点で、本発明に使用されるポリペプチドの分子量は１００ｋＤａ以下が望ましい。本明細書におけるポリペプチドにはアセチル化などの化学修飾体も包含される。
【００４３】
本発明の好適な態様において、幹細胞の培養は、前記のポリペプチドがコートされた固相と幹細胞とが接触した状態で実施される。前記の固相としては、例えば細胞培養に使用される容器又は担体（マイクロビーズ等）が挙げられる。前記のポリペプチドがコートされた固相は幹細胞を安定に保持する能力を有しており、当該細胞の培養に有用である。培養容器は、細胞の維持・生存・分化・成熟・自己複製を阻害するものでなければいかなる素材、形状のものを用いることが出来る。培養容器の素材としては、例えばガラス、不織布を含む合成樹脂や天然樹脂又は金属等がある。また、培養容器の形状としては、三角柱、立方体、直方体などの多角柱や円柱、三角錐、四角錐などの多角錘や円錐、ひょうたんのような任意の形状、球形、半球形、円形、楕円形、半円形等がある。
【００４４】
幹細胞の培養に使用される細胞培養用器材としては、特に限定はないが、例えば、ディッシュ、プレート、フラスコ、バッグ、メンブレン、スライドガラス、大型培養槽、バイオリアクター、中空糸型の培養装置等を使用することができる。好適には、プレートが使用され、さらに好適には、Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｐｌａｔｅが使用される。
【００４５】
なお、バッグとしては、例えば、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量の幹細胞を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれでも実施することができるが、好適には得られる幹細胞の安全性の観点から閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
【００４６】
固相のコーティング、すなわちポリペプチドの固相表面への固定化は、公知の手法によって実施すればよく、例えば国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、ならびに国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載のフィブロネクチンフラグメントの固定化と同様の方法により実施することができる。ポリペプチドを固相に固定化しておけば、本発明の方法により幹細胞を得た後、該細胞と固相とを分離するのみで、該細胞と本発明のポリペプチドとを容易に分離することができ、幹細胞へのポリペプチド等の混入を防ぐことができる。
【００４７】
より具体的には、ポリペプチドを滅菌蒸留水、緩衝液あるいは生理食塩水等に溶解したコーティング溶液を調製しておき、固定化に使用することができる。好適にはリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、特に好適には、ポリペプチドをダルベッコＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ：Ｄ−ＰＢＳ）を溶媒に用いたコーティング溶液が使用される。
【００４８】
コーティング溶液中のポリペプチドのモル濃度としては、特に限定はないが、例えば１〜１０００００ｎＭ、好適には１０〜２０００ｎＭ、さらに好適には３０〜１０００ｎＭが例示される。ポリペプチドとしてＦＣＨ−２９６を使用する場合、上記のモル濃度を重量濃度で表すと０．１〜１０００μｇ／ｍＬ、好適には１〜２００μｇ／ｍＬ、さらに好適には３〜１００μｇ／ｍＬとなる。
【００４９】
上記コーティング溶液を培養容器に添加し、適当な時間保持することでコーティングを実施することができる。コーティング溶液を保持する際の条件は適宜設定すればよいが、例えば室温で１時間、あるいは４℃で一晩、といった条件が挙げられる。
【００５０】
フィブロネクチンフラグメントがコートされた容器は、そのまま使用するか又は使用時まで低温、例えば０〜１０℃で保存することができる。使用直前にはこれらの培養器材からコーティング溶液を除去し、例えばＤ−ＰＢＳで２回、次いで、必要に応じて細胞培養用培地で１回洗浄してから細胞培養に供する。
【００５１】
本発明の幹細胞の製造方法は、幹細胞製造における培養の全期間、もしくは任意の一部の期間において、前記のポリペプチドの存在下での培養の工程を実施することにより行われる。すなわち、幹細胞の製造工程の一部に前記培養工程を含むものであれば本発明に包含される。
【００５２】
本発明の培養工程は、幹細胞の誘導、幹細胞の維持、及び幹細胞の拡大培養、又は幹細胞の維持及び幹細胞の拡大培養を含む。したがって、本発明は、上記の組換えポリペプチド（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の存在下に、幹細胞を誘導し、維持し、拡大培養することを含む幹細胞の製造方法、ならびに上記の組換えポリペプチド（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の存在下に、幹細胞を維持及び拡大培養することを含む幹細胞の製造方法を提供する。本発明の幹細胞の製造方法においては、該方法に供する細胞の種類や、培養の条件等を適宜調整して幹細胞の培養を行うことにより、再生医療等に有用な幹細胞を製造することができる。なお、本明細書において幹細胞とは幹細胞を含有する細胞集団を意味する。
【００５３】
幹細胞の誘導を目的とする場合、本発明の培養工程において、培養開始時の細胞の種類や、幹細胞の誘導方法に特に限定はない。培養開始時の細胞は、繊維芽細胞、肝細胞、脂肪細胞、心筋細胞、血球系細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞等）などの分化した細胞（体細胞ともいう）であってもよいし、誘導後の幹細胞とは異なる種類の幹細胞であってもよい。また、幹細胞の誘導方法は、既知の方法であれば特に限定はされず、例えば、低分子化合物を細胞に接触又は導入する方法、リプログラミング因子を細胞に導入する方法、細胞に核を移植する方法、などが挙げられる。リプログラミング因子をタンパク質として細胞に導入することもできるし、リプログラミング因子をコードする核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）を直接又はベクターを利用して細胞に導入することもできる。上記ベクターとして、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、センダイウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、エピソーマルベクター、などが挙げられる。
【００５４】
幹細胞の維持及び拡大培養を目的とする場合、本発明の培養工程において、培養開始時の細胞濃度としては、特に限定はないが、例えば０．００５〜２０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には０．０２〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には０．０５〜２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。
【００５５】
本発明の培養工程には、幹細胞の培養に用いられる種々の培地を使用することができる。多能性幹細胞を培養する場合は、例えばＣｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）  ＤＥＦ−ＣＳ培地（タカラバイオ社製）を使用することができる。好適には、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ又はｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）やヒツジ血清などの異種由来成分を含まない培地、無血清培地、未知成分を含有しない培地（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）等が挙げられる。このような異種由来成分不含（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）培地は適宜調製することができるが、公知の培地や市販の培地をそのまま、あるいは改変して使用してもよい。市販の異種由来成分不含培地としては、例えばＣｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）  ＤＥＦ−ＣＳ  ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ培地（タカラバイオ社製）やＤＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）、ＴｅＳＲ−Ｅ８培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用することができる。神経幹細胞を培養する場合は、例えばＲＨＢ−Ａ培地（タカラバイオ社製）を使用することができる。
【００５６】
細胞の培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養条件を採用できる。前記培養条件として、温度３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。例えば、温度３０〜４０℃、湿度９０〜９８％、ＣＯ２濃度３〜７％、での培養が例示されるが、所望の細胞の増殖が達成できる温度であれば前記の範囲以外の温度、湿度、ＣＯ２濃度で実施してもよい。培養中は、適当な時間間隔で細胞培養液に新鮮な培地を加えて希釈したり、培地を新鮮なものに交換したり、細胞培養用器材を交換することが好ましい。使用される培地や、同時に使用されるその他の成分等は、適宜設定することができる。
【００５７】
本発明の好適な態様において、幹細胞の維持及び拡大培養を目的とする場合、幹細胞は本発明に使用されるポリペプチドがコートされた容器中で適切な培地を使用し、培地交換と継代を行いながら、例えば５日以上、好ましくは１０日以上培養される。この培養により、幹細胞を増殖させることができる。すなわち、この培養で得られた細胞集団の８０％以上、好ましくは９０％以上が幹細胞である。
【００５８】
また、本発明の好適な態様において、幹細胞のシングルセルクローニングを目的とする場合、段階希釈された幹細胞は本発明に使用されるポリペプチドがコートされた容器中に播種される。その後、適切な培地を使用し、培地交換を行いながら、例えば５日以上、好ましくは１０日以上、コロニーが出現するまで培養される。コロニーを取得することにより、幹細胞のシングルセルクローニングをすることができる。すなわち、この培養で得られたコロニー中の細胞の８０％以上、好ましくは９０％以上が幹細胞である。
【００５９】
本発明の培養工程により得られた幹細胞は、その形態上の特徴に基づいてそれ以外の細胞と区別することが可能である。また、多能性幹細胞の場合、アルカリフォスファターゼ、段階特異的胎児抗原（ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＳＳＥＡ、例えばＳＳＥＡ−４等）、腫瘍拒絶抗原（ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＴＲＡ）−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＯＣＴ４又はＮＡＮＯＧ等の未分化状態の指標となるマーカー分子の発現に基づいて確認することもできる。前記の分子（ポジティブマーカー）の発現は、例えば前記の分子を認識する抗体を用いて確認することができる。アルカリフォスファターゼに関してはその酵素活性に基づいて発現を確認することもできる。一方、神経幹細胞の場合、特に限定されないが、例えばＮｅｓｔｉｎ等の神経幹細胞マーカー分子の発現に基づいて確認することもできる。
【００６０】
本発明の培養工程により得られた幹細胞は、８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上が上記ポジティブマーカーを発現している。
【００６１】
更に、本発明の培養工程により得られる細胞集団より幹細胞を単離し、他の細胞と分離された幹細胞を取得することができる。幹細胞に特徴的な分子を認識する抗体は、本発明により得られた幹細胞を単離、精製するうえで有用である。こうして単離された幹細胞は、公知の方法により細胞株として樹立することができる。すなわち、本発明の態様の一つとして、本発明の幹細胞を含有する細胞集団の製造方法の工程及び得られた細胞集団より幹細胞を単離する工程を包含する幹細胞の製造方法が挙げられる。さらに、こうして得られた幹細胞を公知の方法で分化させることにより、種々の分化細胞を製造することも可能である。
【００６２】
本発明で得られる幹細胞や当該細胞から得られる分化細胞は、例えば幹細胞の分化に関する研究や種々の疾患に関する医薬スクリーニング、医薬候補化合物の効能・安全性評価等に使用することもできる。本発明によれば、一度の操作で多くの幹細胞を取得することができることから、これまでのように細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能となる。
【００６３】
２．本発明のポリペプチド
本発明は、幹細胞の製造に有用な、新規な組換えポリペプチドを提供する。当該ポリペプチドは、「１．本発明の幹細胞の製造方法」に記載する（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドを同一分子内に含む組換えポリペプチドであり、当該方法に有用である。本発明のポリペプチドは、幹細胞を増殖させる機能、幹細胞の未分化状態を維持する機能、及び／又は幹細胞を誘導する機能を有する。本発明のポリペプチドは、全長フィブロネクチンと同等な機能又は既存のフィブロネクチンフラグメントより高い機能を有する。
【００６４】
本発明のポリペプチドは、下記（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドを同一分子内に含む組換えポリペプチドである：
（ａ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１〜７から成る群より選択されるリピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１〜７から成る群より選択されるリピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
（ｂ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−８〜１０リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−８〜１０リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、及び
（ｃ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ−１２〜１４リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ−１２〜１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド。
【００６５】
上記組換えポリペプチド（ａ）、（ｂ）および（ｃ）については、「１．本発明の幹細胞の製造方法」に記載のとおりである。
【００６６】
特に本発明を限定するものではないが、例えばＮ末端側から（ａ）、（ｂ）、（ｃ）を有するポリペプチドが挙げられる。また、（ｂ）、及び（ｃ）はそれぞれインテグリンα５β１（ＶＬＡ−５ともいう）への結合活性、及びヘパリンへの結合活性を有していることが好ましい。
【００６７】
本発明のポリペプチドの特に好適な態様は、配列表の配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。さらに、配列表の配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドであって、かつ配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドと同等な機能を有する、あるいは幹細胞を増殖させる機能、幹細胞の未分化状態を維持する機能、及び／又は幹細胞を誘導する機能を保持するポリペプチドも本発明に包含される。特には限定されないが、例えば、ＩＩＩ−１（配列番号１）を含む代わりに、ＩＩＩ−１のＮ末９アミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号２３）、ＩＩＩ−１のＮ末５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号２４）、又はＩＩＩ−１のＮ末３アミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号２５）を含むポリペプチドも、当該ポリペプチドに含まれる。より具体的には、Ｎ末９アミノ酸欠損のＦＣＨ−２９６（配列番号２９）、Ｎ末６アミノ酸欠損のＦＣＨ−２９６（配列番号３０）、Ｎ末５アミノ酸欠損のＦＣＨ−２９６（配列番号３１）、Ｎ末３アミノ酸欠損のＦＣＨ−２９６（配列番号３２）、Ｎ末３アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３３）、Ｎ末６アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３４）、Ｎ末９アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３５）、Ｎ末１１アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３６）、Ｎ末１２アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３７）、Ｎ末１４アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３８）、Ｎ末１５アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３９）、Ｎ末ＨＫＲＨＥＥＧＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号４０）、Ｎ末ＨＫＲＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号４１）、Ｎ末ＨＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号４２）、Ｎ末ＨＨＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号４３）、Ｎ末にＨｉｓ−ｔａｇを有するＦＣＨ−２９６（配列番号２１）、及びＮ末にＨｉｓ−ｔａｇを有するＤＣＨ−２９６（配列番号２２）が、例示される。
【００６８】
本発明のポリペプチドは公知の組換えＤＮＡ技術を使用して製造することができる。宿主やベクターには公知のものが使用できる。例えば細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、糸状菌、昆虫細胞、動物細胞（ヒト細胞を含む哺乳動物細胞等）を宿主とし、各宿主に適合するベクターを使用すればよい。前記ベクターには本発明のポリペプチドをコードする核酸が搭載される。前記核酸は天然の核酸（例えばヒトフィブロネクチンをコードするＤＮＡ）を改変して、あるいは化学合成して作製することができる。当該核酸を搭載したベクターが導入された宿主内で発現された、あるいは宿主の培養上清に分泌された本発明のポリペプチドは、公知のタンパク質精製方法によって所望の純度にまで精製することができる。
【００６９】
３．本発明のポリペプチドがコートされた固相
本発明は、本発明のポリペプチドがコートされた固相を提供する。当該固相は、「１．本発明の幹細胞の製造方法」に記載される固相であり、当該方法に有用である。
【００７０】
本発明の固相は、前記のポリペプチドが適切な固相の表面に固定化されたものである。前記固相としては細胞培養用器材又は細胞培養用担体、具体的にはディッシュ、プレート、フラスコ、バッグ、ビーズ、メンブレン、スライドガラスが例示される。これらは、本発明の幹細胞の製造方法に利用可能なものであれば特に限定はない。さらに、ポリペプチドの固相への固定化は、本発明の幹細胞の製造方法について述べた方法を利用することができる。
【００７１】
本発明の固相は、幹細胞を固相表面に安定して維持することができるため、培地交換のような培養上の操作の効率を向上させることができる。また、本発明の固相を前もって調製しておくことにより、即時に本発明の幹細胞の製造方法を実施することが可能となる。
【実施例】
【００７２】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されない。【００７３】
実施例１  ＦＣＨ−２９６の調製
Ｎ末にメチオニン残基及び６個のヒスチジン残基から成るＨｉｓ−ｔａｇを有するＦＣＨ−２９６ポリペプチド（配列番号２１）を、以下の操作により調製した。【００７４】
前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを人工合成し、発現プラスミドに組み込んだ。当該プラスミドで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を前記ポリペプチドが発現する条件で培養した。培養物より集めた菌体を、超音波破砕機（Ｋｕｂｏｔａ社製）で破砕し、無細胞抽出液を得た。この抽出液を出発材料とし、Ｎｉ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（４０μｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、の一連のカラムクロマトグラフィーにより、ＦＣＨ−２９６を精製した。精製過程におけるＦＣＨ−２９６の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色により実施した。得られたサンプルのＢｕｆｆｅｒを〔０．２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、０．２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１．１５ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４〕に置換し、ＦＣＨ−２９６標品６ｍＬを得た。【００７５】
ＦＣＨ−２９６標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色で単一のバンドを示した。ＢＣＡタンパク質定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて、ＦＣＨ−２９６標品のタンパク質濃度を測定したところ、１．２１ｍｇ／ｍＬ（分子量から計算すると１２．４μＭ）だった。【００７６】
実施例２  ＤＣＨ−２９６の調製
Ｎ末にメチオニン残基及び６個のヒスチジン残基から成るＨｉｓ−ｔａｇを有するＤＣＨ−２９６ポリペプチド（配列番号２２）を、以下の操作により調製した。【００７７】
前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを人工合成し、発現プラスミドに組み込んだ。当該プラスミドで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を前記ポリペプチドが発現する条件で培養した。培養物より集めた菌体を、超音波破砕機で破砕し、無細胞抽出液を得た。この抽出液を出発材料とし、Ｎｉ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、の一連のカラムクロマトグラフィーにより、ＤＣＨ−２９６を精製した。精製過程におけるＤＣＨ−２９６の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色により実施した。得られたサンプルのＢｕｆｆｅｒを〔０．２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、０．２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１．１５ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４〕に置換し、ＤＣＨ−２９６標品３ｍＬを得た。【００７８】
ＤＣＨ−２９６標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色で単一のバンドを示した。ＢＣＡタンパク質定量キットを用いて、ＤＣＨ−２９６標品のタンパク質濃度を測定したところ、１．０３ｍｇ／ｍＬ（分子量から計算すると１１．０μＭ）だった。【００７９】
実施例３  各種フィブロネクチンフラグメントのヒトｉＰＳ細胞に対する接着性の評価
全長フィブロネクチン（ヒト血漿由来；ＳＩＧＭＡ社製、Ｆ０８９５、終濃度５０μｇ／ｍｌ）、１２０ｋ−ｆｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｆ１９０４、終濃度４０μｇ／ｍｌ）、ＣＨ−２７１（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．  １１０，  ｐ２８４−２９１  （１９９１）、終濃度２５μｇ／ｍｌ）及びＣＨ−２９６（レトロネクチン：タカラバイオ社製、終濃度２０μｇ／ｍｌ）をそれぞれＤ−ＰＢＳ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社製、Ｃ−４０２３２）に溶解し、コーティング溶液を調製した。１２  ｗｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、３５１３）にコーティング溶液を０．４ｍＬ／ｗｅｌｌで加えた後、プレートに蓋をし、４℃で一晩放置した。翌日、コーティング溶液を除去したプレートを１ｍＬ／ｗｅｌｌのＤ−ＰＢＳで２回洗浄し、各ポリペプチドでコートされたプレートを得た。２種のフィブロネクチンフラグメントでコーティングを行う場合には、１回目のコーティングを終えたプレートに第２のコーティング溶液を０．４ｍＬ／ｗｅｌｌで加え、１回目のコーティングと同様に４℃での一晩放置と洗浄を行った。調製したプレートに蓋をし、使用時まで４℃で保存した。【００８０】
Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）  ＤＥＦ−ＣＳ培地（タカラバイオ社製、Ｙ３００１０）で継代培養したヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）（京都大学ｉＰＳ細胞研究所製）を、８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでプレートに播種し、同じ培地中で３７℃、５％ＣＯ２で培養した。翌日から培地を毎日交換し、培養開始後６日目に細胞を観察した。結果を表１に示す。【００８１】
【表１】
2018021543.tif 000003
【００８２】
１２０ｋ−ｆｒ／ＣＨ−２７１及び１２０ｋ−ｆｒ／ＣＨ−２９６でコートされたプレートでは、細胞剥離が認められなかった。これらの結果より、既存のフィブロネクチンフラグメントを組み合わせることで、プレートへの細胞の接着を増強できることが示された。【００８３】
実施例４  ＦＣＨ−２９６及びＤＣＨ−２９６のヒトｉＰＳ細胞に対する接着性の評価
全長フィブロネクチン、１２０ｋ−ｆｒ、ＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、ＦＣＨ−２９６又はＤＣＨ−２９６をそれぞれＤ−ＰＢＳに溶解し、コーティング溶液を調製した。また、ＣＨ−２９６については高濃度のコーティング溶液、ＦＣＨ−２９６とＤＣＨ−２９６については低濃度のコーティング溶液も調製した。これらのコーティング溶液を使用し、実施例３と同様の操作で１２  ｗｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｐｌａｔｅのコーティングを実施した。【００８４】
ＤＥＦ−ＣＳ培地で継代培養したヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）を、８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。翌日から培地を毎日交換し、培養開始後５、８、１１日目に細胞を観察した。結果を表２に示す。【００８５】
【表２】
2018021543.tif 000004
【００８６】
８日目には、既存のフィブロネクチンフラグメント（１２０ｋ−ｆｒ、ＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６）でコーティングしたプレートで細胞剥離が認められた。一方、ＤＣＨ−２９６とＦＣＨ−２９６でコーティングしたプレートでは８日目に細胞剥離は認められなかった。特に、ＦＣＨ−２９６の場合、低濃度のコーティング溶液でコートされたウェルでも１１日目の時点でまったく細胞剥離が認められなかった。以上より、ＦＣＨ−２９６はヒトｉＰＳ細胞の培養において、全長フィブロネクチンと同等の細胞接着性をもつことが示された。【００８７】
実施例５  ヒトｉＰＳ細胞の長期培養（ＤＥＦ−ＣＳ培地）
全長フィブロネクチン又はＦＣＨ−２９６をそれぞれＤ−ＰＢＳに溶解し、各濃度のコーティング溶液を調製した。これらのコーティング溶液を使用し、実施例３と同様の操作で２４  ｗｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のコーティングを実施した。【００８８】
ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）をＤＥＦ−ＣＳ培地で懸濁した後、プレートに播種した。翌日から培地を毎日交換するとともに、３〜４日毎に細胞を継代した。細胞増殖の結果を図２に示す。また、培養開始後３５日目（１０継代目）に、ＴＲＡ−１−６０陽性細胞率及びＳＳＥＡ４陽性細胞率をフローサイトメトリーにて測定した。その結果を表３に示す。ＴＲＡ−１−６０及びＳＳＥＡ４は、多能性幹細胞マーカーである。【００８９】
【表３】
2018021543.tif 000005
【００９０】
ＦＣＨ−２９６でコートされたプレート上でも、フィブロネクチンでコートされたプレートと同様に、ヒトｉＰＳ細胞は多能性を保持したまま増殖した。以上より、ＦＣＨ−２９６でコートされたプレート上で、ヒトｉＰＳ細胞を長期培養できることが示された。【００９１】
実施例６  ヒトｉＰＳ細胞の長期培養（ＤＥＦ−ＣＳゼノフリー培地）
動物やヒト由来の成分を含まない培地、すなわちゼノフリー培地中でも、ＦＣＨ−２９６でコートされたプレート上でヒトｉＰＳ細胞を長期培養できるかどうかを調べた。【００９２】
全長フィブロネクチン又はＦＣＨ−２９６をそれぞれＤ−ＰＢＳに溶解し、各濃度のコーティング溶液を調製した。これらのコーティング溶液を使用し、実施例３と同様の操作で２４  ｗｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｐｌａｔｅのコーティングを実施した。また、ＤＥＦ−ＣＳゼノフリー培地（タカラバイオ社製）で推奨されているＳｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）  ＩＩ−ＳＣ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（コーニング社製）を使用し、コーティングを実施した。【００９３】
ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）をＤＥＦ−ＣＳゼノフリー培地で懸濁した後、プレートに播種した。翌日から培地を毎日交換するとともに、３〜４日毎に細胞を継代した。細胞増殖の結果を図３に示す。培養開始後３５日目（１０継代目）に、ＴＲＡ−１−６０陽性細胞率及びＳＳＥＡ４陽性細胞率をフローサイトメトリーにて測定した。その結果を表４に示す。ＴＲＡ−１−６０及びＳＳＥＡ４は、多能性幹細胞マーカーである。【００９４】
【表４】
2018021543.tif 000006
【００９５】
ＦＣＨ−２９６でコートされたプレート上では、フィブロネクチン又はＳｙｎｔｈｅｍａｘでコートされたプレートと同様に、ヒトｉＰＳ細胞は多能性を保持したまま増殖した。以上より、ＤＥＦ−ＣＳゼノフリー培地中でも、ＦＣＨ−２９６でコートされたプレート上でヒトｉＰＳ細胞を長期培養できることが示された。【００９６】
実施例７  ヒトｉＰＳ細胞の長期培養（ＴｅＳＲ−Ｅ８培地）
ＴｅＳＲ−Ｅ８培地は、ヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞の維持に必要な最低限の８要素だけを含むゼノフリー培地である。ＴｅＳＲ−Ｅ８培地中でも、ＦＣＨ−２９６でコートされたプレート上でヒトｉＰＳ細胞を長期培養できるかどうかを調べた。【００９７】
全長フィブロネクチン又はＦＣＨ−２９６をそれぞれＤ−ＰＢＳに溶解し、各濃度のコーティング溶液を調製した。これらのコーティング溶液を使用し、実施例３と同様の操作で２４  ｗｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｐｌａｔｅのコーティングを実施した。また、ＴｅＳＲ−Ｅ８培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で推奨されているＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  ＸＦ（コーニング社製）を使用し、コーティングを実施した。【００９８】
ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）をＴｅＳＲ−Ｅ８培地で懸濁した後、プレートに播種した。翌日から培地を毎日交換するとともに、３〜４日毎に細胞を継代した。細胞増殖の結果を図４に示す。培養開始後２７日目（７継代目）に、ＴＲＡ−１−６０陽性細胞率及びＳＳＥＡ４陽性細胞率をフローサイトメトリーにて測定した。その結果を表５に示す。ＴＲＡ−１−６０及びＳＳＥＡ４は、多能性幹細胞マーカーである。【００９９】
【表５】
2018021543.tif 000007
【０１００】
ＦＣＨ−２９６でコートされたプレート上では、フィブロネクチン又はＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎでコートされたプレートと同様に、ヒトｉＰＳ細胞は多能性を保持したまま増殖した。以上より、ＴｅＳＲ−Ｅ８培地中でも、ＦＣＨ−２９６でコートされたプレート上でヒトｉＰＳ細胞を長期培養できることが示された。【０１０１】
実施例８  ヒト神経幹細胞の長期培養
ＦＣＨ−２９６でコートされたプレート上でヒト神経幹細胞を長期培養できるかどうかを調べた。【０１０２】
ＦＣＨ−２９６をＤ−ＰＢＳに溶解し、３０μｇ／ｍｌのコーティング溶液を調製した。このコーティング溶液を使用し、実施例３と同様の操作で１２  ｗｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｐｌａｔｅのコーティングを実施した。また、ＲＨＢ−Ａ培地（タカラバイオ社製）で推奨されているＬａｍｉｎｉｎ（ｇｉｂｃｏ社製、１０μｇ／ｍｌ）を使用し、コーティングを実施した。ヒト神経幹細胞を、１．５〜２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで上記のコーティングしたプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。翌日から培地を２日毎に交換するとともに、４〜８日毎に細胞を継代した。細胞増殖の結果を図５に示す。【０１０３】
また、培養開始後２８日目（５継代目）に、神経幹細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎの発現を免疫染色にて確認したところ、ＦＣＨ−２９６でコートされたプレート上でも、Ｌａｍｉｎｉｎでコートされたプレートと同様に、細胞はＮｅｓｔｉｎの発現を保持していた。以上より、ＦＣＨ−２９６でコートされたプレート上で、ヒト神経幹細胞を長期培養できることが示された。【０１０４】
実施例９  ヒトｉＰＳ細胞のシングルセルクローニング
全長フィブロネクチン又はＦＣＨ−２９６をそれぞれＤ−ＰＢＳに溶解し、各濃度のコーティング溶液を調製した。これらのコーティング溶液を使用し、実施例３と同様の操作で９６  ｗｅｌｌ  Ｈａｌｆ  ａｒｅａ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のコーティングを実施した。【０１０５】
ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）をＤＥＦ−ＣＳ培地で懸濁した後、１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌでプレートに播種し、２日後から培地を２日毎に交換した。１０日目に得られたコロニーの出現率を表６に示す。【０１０６】
【表６】
2018021543.tif 000008
【０１０７】
ＦＣＨ−２９６でコートされたプレート上でも、フィブロネクチンでコートされたプレートと同様に、ヒトｉＰＳ細胞のシングルセル由来のコロニーを取得することができた。また、一部のコロニーを継代、拡大培養し、１６日目にＴＲＡ−１−６０陽性細胞率及びＳＳＥＡ４陽性細胞率をフローサイトメトリーにて測定したところ、すべて９０％以上であった。以上より、ＦＣＨ−２９６でコートされたプレート上で、ヒトｉＰＳ細胞のシングルセルクローニングが可能であることが示された。【０１０８】
実施例１０  ヒトｉＰＳ細胞に対する接着性の評価（Ｆ１ＣＨ−２９６、Ｆ２ＣＨ−２９６、Ｆ３ＣＨ−２９６）
ＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２、ＩＩＩ−３のうち、どのリピートが重要であるかを調べるために、図６に示すような、３種のポリペプチド（Ｆ１ＣＨ−２９６、Ｆ２ＣＨ−２９６、及びＦ３ＣＨ−２９６）を調製した。すなわち、実施例１と同様の操作で、Ｎ末にメチオニン残基及び６個のヒスチジン残基から成るＨｉｓ−ｔａｇを有する、Ｆ１ＣＨ−２９６（配列番号２６）、Ｆ２ＣＨ−２９６（配列番号２７）、及びＦ３ＣＨ−２９６（配列番号２８）を調製した。【０１０９】
全長フィブロネクチン、ＣＨ−２９６、ＦＣＨ−２９６、Ｆ１ＣＨ−２９６、Ｆ２ＣＨ−２９６又はＦ３ＣＨ−２９６をそれぞれＤ−ＰＢＳに溶解し、各濃度のコーティング溶液を調製した。これらのコーティング溶液を使用し、実施例３と同様の操作で２４  ｗｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｐｌａｔｅのコーティングを実施した。なお、５０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンは約２００ｎＭであり、２０μｇ／ｍｌのＣＨ−２９６、３０μｇ／ｍｌのＦＣＨ−２９６、及び２４μｇ／ｍｌのＦ１ＣＨ−２９６は約３２０ｎＭである。【０１１０】
ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）をＤＥＦ−ＣＳ培地で懸濁した後、プレートに播種した。翌日から培地を毎日交換し、培養開始後３、６、８、１０日目に細胞を観察した。結果を表７に示す（細胞剥離なし：−、細胞剥離あり：＋）。【０１１１】
【表７】
2018021543.tif 000009
【０１１２】
３種のポリペプチド（Ｆ１ＣＨ−２９６、Ｆ２ＣＨ−２９６、及びＦ３ＣＨ−２９６）は同様の傾向を示した。すなわち、例えば、２４μｇ／ｍｌの条件では８日目に細胞剥離が観察される。一方、ＣＨ−２９６では３日目に細胞剥離が観察され、ＦＣＨ−２９６では細胞剥離が観察されなかった。このことは、３種のポリペプチド（Ｆ１ＣＨ−２９６、Ｆ２ＣＨ−２９６、及びＦ３ＣＨ−２９６）の接着活性が、ＣＨ−２９６よりも高く、ＦＣＨ−２９６よりも低いことを示す。以上より、３つのＩＩＩ型リピート（ＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２、ＩＩＩ−３）が同等の細胞接着性をもつこと、及び、３つのＩＩＩ型リピートをすべて含む場合に細胞接着活性が最も高くなることが示された。【０１１３】
実施例１１  様々なＮ末配列をもつＦＣＨ−２９６の評価
様々なＮ末配列をもつＦＣＨ−２９６を調製した。すなわち、Ｎ末９アミノ酸欠損のＦＣＨ−２９６（配列番号２９）、Ｎ末６アミノ酸欠損のＦＣＨ−２９６（配列番号３０）、Ｎ末５アミノ酸欠損のＦＣＨ−２９６（配列番号３１）、Ｎ末３アミノ酸欠損のＦＣＨ−２９６（配列番号３２）、ＦＣＨ−２９６（配列番号１９）、Ｎ末３アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３３）、Ｎ末６アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３４）、Ｎ末９アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３５）、Ｎ末１１アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３６）、Ｎ末１２アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３７）、Ｎ末１４アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３８）、Ｎ末１５アミノ酸挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号３９）、Ｎ末ＨＫＲＨＥＥＧＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号４０）、Ｎ末ＨＫＲＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号４１）、Ｎ末ＨＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号４２）、及びＮ末ＨＨＨ挿入のＦＣＨ−２９６（配列番号４３）を調製した。【０１１４】
実施例５〜９で使用したＦＣＨ−２９６（Ｈｉｓ−ｔａｇ付き、配列番号２１）に代えて、上記の様々なＮ末配列をもつＦＣＨ−２９６のいずれかを使用して、実施例５〜９に記載された内容を実施する。様々なＮ末配列をもつＦＣＨ−２９６は、ＦＣＨ−２９６と同様の効果を有する。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明により、短期間に大量の幹細胞を製造する方法及びその方法に使用するポリペプチドが提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０１１６】
SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named III-1
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-2
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin named III-3
SEQ ID NO:4 ; Partial region of fibronectin named III-4
SEQ ID NO:5 ; Partial region of fibronectin named III-5
SEQ ID NO:6 ; Partial region of fibronectin named III-6
SEQ ID NO:7 ; Partial region of fibronectin named III-7
SEQ ID NO:8 ; Partial region of fibronectin named III-8
SEQ ID NO:9 ; Partial region of fibronectin named III-9
SEQ ID NO:10 ; Partial region of fibronectin named III-10
SEQ ID NO:11 ; Partial region of fibronectin named III-11
SEQ ID NO:12 ; Partial region of fibronectin named III-12
SEQ ID NO:13 ; Partial region of fibronectin named III-13
SEQ ID NO:14 ; Partial region of fibronectin named III-14
SEQ ID NO:15 ; Partial region of fibronectin named CS-1
SEQ ID NO:16 ; Fibronectin fragment named 120k-fr
SEQ ID NO:17 ; Fibronectin fragment named CH-271
SEQ ID NO:18 ; Fibronectin fragment named CH-296 (RetroNectin)
SEQ ID NO:19 ; Fibronectin fragment named FCH-296
SEQ ID NO:20 ; Fibronectin fragment named DCH-296
SEQ ID NO:21 ; His-tag FCH-296
SEQ ID NO:22 ; His-tag DCH-296
SEQ ID NO:23 ; N-terminal 9a.a. deletion of III-1
SEQ ID NO:24 ; N-terminal 5a.a. deletion of III-1
SEQ ID NO:25 ; N-terminal 3a.a. deletion of III-1
SEQ ID NO:26 ; His-tag F1CH-296
SEQ ID NO:27 ; His-tag F2CH-296
SEQ ID NO:28 ; His-tag F3CH-296
SEQ ID NO:29 ; N-terminal 9a.a. deletion of FCH-296
SEQ ID NO:30 ; N-terminal 6a.a. deletion of FCH-296
SEQ ID NO:31 ; N-terminal 5a.a. deletion of FCH-296
SEQ ID NO:32 ; N-terminal 3a.a. deletion of FCH-296
SEQ ID NO:33 ; N-terminal 3a.a. insertion of FCH-296
SEQ ID NO:34 ; N-terminal 6a.a. insertion of FCH-296
SEQ ID NO:35 ; N-terminal 9a.a. insertion of FCH-296
SEQ ID NO:36 ; N-terminal 11a.a. insertion of FCH-296
SEQ ID NO:37 ; N-terminal 12a.a. insertion of FCH-296
SEQ ID NO:38 ; N-terminal 14a.a. insertion of FCH-296
SEQ ID NO:39 ; N-terminal 15a.a. insertion of FCH-296
SEQ ID NO:40 ; N-terminal HKRHEEGH insertion of FCH-296
SEQ ID NO:41 ; N-terminal HKRH insertion of FCH-296
SEQ ID NO:42 ; N-terminal HH insertion of FCH-296
SEQ ID NO:43 ; N-terminal HHH insertion of FCH-296
【図１】
2018021543.tif 000010
【図２】
2018021543.tif 000011
【図３】
2018021543.tif 000012
【図４】
2018021543.tif 000013
【図５】
2018021543.tif 000014
【図６】
2018021543.tif 000015
【配列表】
2018021543000001.app
【国際調査報告】
2018021543.tif 000016
2018021543.tif 000017
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