(57)【要約】  血液検体の溶血を高感度で検出する新規な方法が開示されている。本発明による溶血の検出方法では、溶血している血液検体において存在量が増加する少なくとも１種のｍｉＲＮＡを溶血マーカーとして、その存在量を指標として血液検体の溶血を検出し、溶血の有無を評価する。本発明の方法によれば、溶血の程度が小さく、ヘモグロビンなどの赤血球の内容物の流出が少ない血液検体であっても、溶血を高感度に検出することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液検体中のmiR-191-5p、miR-22-3p、miR-3158-5p、miR-320a、miR-484、miR-486-5p、miR-6073、miR-6131、miR-642b-3p、miR-92a-3p及びmiR-92b-3pからなる群から選ばれる少なくとも1つのmiRNAの存在量を測定する測定工程を含む、溶血の検出方法。
【請求項２】
miR-191-5pがhsa-miR-191-5pであり、miR-22-3pがhsa-miR-22-3pであり、miR-3158-5pがhsa-miR-3158-5pであり、miR-320aがhsa-miR-320aであり、miR-484がhsa-miR-484であり、miR-486-5pがhsa-miR-486-5pであり、miR-6073がhsa-miR-6073であり、miR-6131がhsa-miR-6131であり、miR-642b-3pがhsa-miR-642b-3pであり、miR-92a-3pがhsa-miR-92a-3pであり、miR-92b-3pがhsa-miR-92b-3pである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記miRNAが、下記の(a)〜(e)のいずれかに示すポリヌクレオチドである、請求項１または２に記載の溶血の検出方法。
(a)  配列番号1〜11のいずれかで表される塩基配列又は当該塩基配列においてuがtである塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(b)  配列番号1〜11のいずれかで表される塩基配列又は当該塩基配列においてuがtである塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(c)  配列番号1〜11のいずれかで表される塩基配列又は当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(d)  配列番号1〜11のいずれかで表される塩基配列又は当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(e)  前記(a)〜(d)のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項４】
血液検体に含まれる前記miRNAの存在量の測定値を補正し、補正済み測定値を前記miRNAの発現量として取得する補正工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
血液検体中の前記miRNAの存在量若しくは発現量、該存在量若しくは発現量と標準内因性miRNA若しくは外部標準核酸の血液検体中存在量との差、又は、該存在量若しくは発現量と標準内因性miRNA若しくは外部標準核酸の血液検体中存在量との比が、溶血の有無を評価するための基準として予め定められた閾値を超える場合に、当該血液検体を溶血検体であると評価する評価工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記測定工程が、支持体上に固定化された前記miRNAから選択される少なくとも1つのmiRNAを捕捉するためのプローブと、血液検体から抽出され標識物質で標識された核酸試料とを接触させてハイブリダイゼーションを行ない、血液検体に含まれる当該miRNAの存在量を測定する工程である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記測定工程において、血液検体に含まれる前記miRNAから選択される少なくとも1つのmiRNAの存在量の測定と同時に、当該血液検体に含まれる所望の標的miRNAの存在量を測定することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
血液検体の溶血を検出するためのmiRNAであるmiR-191-5p、miR-22-3p、miR-3158-5p、miR-320a、miR-484、miR-486-5p、miR-6073、miR-6131、miR-642b-3p、miR-92a-3p及びmiR-92b-3pからなる群から選ばれる少なくとも1つのmiRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、溶血検出用チップ。
【請求項９】
血液検体の溶血を検出するためのmiRNAであるmiR-191-5p、miR-22-3p、miR-3158-5p、miR-320a、miR-484、miR-486-5p、miR-6073、miR-6131、miR-642b-3p、miR-92a-3p及びmiR-92b-3pからなる群から選ばれる少なくとも1つのmiRNAを捕捉するためのプローブ及び所望の標的miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA発現解析用チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液検体の溶血を検出し、溶血の有無を評価する方法、溶血の検出に用いるチップ及びmiRNA発現解析用チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
miRNA（マイクロRNA）は、ゲノムDNAからヘアピン様構造のRNA（前駆体）として転写されてくる。この前駆体は、特定の酵素RNase III切断活性を有するdsRNA切断酵素（Drosha、Dicer）により切断された後、二本鎖の形態へと変化し、その後一本鎖となる。そして、片方のアンチセンス鎖がRISCと称するタンパク質複合体に取り込まれ、mRNAの翻訳抑制に関与すると考えられている。このように、miRNAは、転写後、各段階においてその態様は異なるため、通常、miRNAを検出対象とする場合は、ヘアピン構造体、二本鎖構造体、一本鎖構造体等の各種形態を考慮する必要がある。miRNAは15〜25塩基のRNAからなり、様々な生物でその存在が確認されている。【０００３】
近年、miRNAは、細胞内のみならず、細胞を含まない検体である血清、血漿などの血液検体にも多く存在し、その存在量が、がんをはじめとした様々な疾患のバイオマーカー（指標）となる可能性が示唆されている。miRNAは、2016年8月現在、ヒトで2500種以上が存在し、高感度なDNAマイクロアレイ等の測定系を利用した場合、そのうちの1000種を超えるmiRNAの存在量を血清・血漿中で同時に検出することが可能である。そこで、DNAマイクロアレイ法を用いて血清・血漿を対象としたバイオマーカー探索研究が実施されており、疾患を早期に発見できるバイオマーカー検査への展開が期待されている。【０００４】
ところが、溶血した血液検体由来のmiRNAでは正確な存在量が測定できないことが知られており、測定結果の信頼性を下げてしまうことがある。疾患のバイオマーカーとして、血液検体に含まれるmiRNAの存在量を測定する検査においては、不確実性を有する存在量の測定値をもとに検査・診断してしまうと、適切な治療の機会を逃したり、間違った医療を適用することで患者に不要な経済的、体力的負担を強いたりすることになる。したがって、存在量を正確に測定するために、溶血の有無を確認し、溶血していない血液検体を検査に使用することがきわめて重要である。【０００５】
溶血とは、物理的または化学的、生物学的など様々な要因によって、血液に含まれる赤血球の細胞膜が損傷を受けて壊れ、赤血球の内部にあるヘモグロビンやmiRNAなどが血清や血漿中に流出することである。溶血が起こる原因としては、機械的刺激や化学物質、温度や熱、浸透圧の変化などの他、血液検体に対する振動や超音波などの外部力、電場や磁場などを含めた各種の直接、間接的の物理的な力、凍結融解による状態変化などが考えられるが、溶血の原因はこれらに限定されるものではない。例えば、採血の手技の影響で溶血することが知られており、注射器の不備により血液を吸引するときに泡が入ったり、真空採血管に勢いよく吸引されたりするときに強い渦を巻くことが要因となって溶血することがある。また、抗凝固剤を混ぜるときに強く振とう混和したり、血液検体を運搬するときに強い振動を与えたりすることが要因になることもある。さらには、血清または血漿を分離せずに全血のまま長時間放置しても溶血することが知られている。【０００６】
血液検体中の、赤血球から流出したmiRNAやヘモグロビンなどの量を測定すれば、溶血の程度を評価することができる。例えば、分光光度計などを用いて血液中のヘモグロビン濃度を測定する方法がある。また、肉眼観察による色見本との色調比較が簡便な方法として用いられており、これはヘモグロビンが赤色素であるヘムを持つタンパク質であることを利用している。【０００７】
近年では、上述の通りmiRNAの研究が盛んに行われている中で溶血による測定値への影響も懸念されており、そのような研究の一例として、hsa-miR-451aを血液検体の溶血マーカーとして用いることが報告されている。hsa-miR-451aの存在量と、溶血の影響を受けないhsa-miR-23a-3pの存在量との差を用いて溶血の有無を評価する方法である（非特許文献１）。一方、hsa-miR-451aは、胃癌などの癌マーカーとしても用いられることが報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2013-85542号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Methods, 59(2013), 164-169
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
疾患のバイオマーカーとして、血液検体に含まれるmiRNAの存在量を測定する検査においては、標的miRNAのわずかな存在量差が検査結果に影響を与えることから、正確な検査結果を得るために、溶血を高感度に検出して溶血の有無を評価し、溶血していない検体を使用することが重要である。しかしながら、従来の方法である肉眼観察による色見本との色調比較では、例えばヘモグロビン濃度200 mg/dL以上の溶血の程度が大きい検体でなければ、赤色を帯びていることを肉眼で容易に観察することは難しい。溶血の程度が小さい検体では、ヘモグロビン濃度0 mg/dLの検体と比較しても色調の差がわずかであり、肉眼で溶血の有無を見分けることは難しい。また、その判定結果は観察者による個人差の影響を受けやすく、信頼性に欠ける。また、分光光度計などを用いて血液中ヘモグロビン濃度を測定する方法は、miRNAの存在量の測定とは別の測定工程が増えるため、検査費用の増大と工程的な煩雑さをもたらすことから好ましくない。【００１１】
前述の溶血マーカーとして用いられているhsa-miR-451aは、本願明細書の比較例３に示すように、ヘモグロビン濃度200 mg/dLの検体でも存在量の変動が小さく、溶血の検出感度が低い。また、前記の通り、hsa-miR-451aは、胃癌などの癌マーカーとしても用いられることが報告されており、検査目的とする疾患のバイオマーカーとしても重複して用いられる場合には、これを溶血マーカーとして用いることは好ましくない。【００１２】
このように、溶血の程度が小さい検体の場合は、従来の方法では溶血を検出することが難しく、正確な遺伝子発現解析の結果を得ることが難しい。本発明が解決しようとする課題は、血液検体から正確な遺伝子発現解析の結果を得るために、例えば、ヘモグロビン濃度100 mg/dLの溶血の程度が小さい検体であっても、簡便かつ高感度に溶血を検出することができるmiRNAを新たな溶血マーカーとして溶血の有無を評価する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討の結果、溶血の程度が小さく、ヘモグロビンなどの赤血球の内容物の流出が少ない血液検体であっても、溶血を高感度に検出できるmiRNA、特に疾患バイオマーカーとして血液検体に含まれるmiRNAの存在量を測定する検査における適否を判断可能なレベルの溶血の有無を評価できるmiRNAを見出し、本発明を完成させた。【００１４】
本発明は、以下の態様からなる。
(１)  血液検体中のmiR-191-5p、miR-22-3p、miR-3158-5p、miR-320a、miR-484、miR-486-5p、miR-6073、miR-6131、miR-642b-3p、miR-92a-3p及びmiR-92b-3pからなる群から選ばれる少なくとも1つのmiRNAの存在量を測定する測定工程を含む、溶血の検出方法。
(２)  miR-191-5pがhsa-miR-191-5pであり、miR-22-3pがhsa-miR-22-3pであり、miR-3158-5pがhsa-miR-3158-5pであり、miR-320aがhsa-miR-320aであり、miR-484がhsa-miR-484であり、miR-486-5pがhsa-miR-486-5pであり、miR-6073がhsa-miR-6073であり、miR-6131がhsa-miR-6131であり、miR-642b-3pがhsa-miR-642b-3pであり、miR-92a-3pがhsa-miR-92a-3pであり、miR-92b-3pがhsa-miR-92b-3pである、(１)に記載の方法。
(３)  前記miRNAが、下記の(a)〜(e)のいずれかに示すポリヌクレオチドである、(１)または(２)に記載の溶血の検出方法。
(a)  配列番号1〜11のいずれかで表される塩基配列又は当該塩基配列においてuがtである塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(b)  配列番号1〜11のいずれかで表される塩基配列又は当該塩基配列においてuがtである塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(c)  配列番号1〜11のいずれかで表される塩基配列又は当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(d)  配列番号1〜11のいずれかで表される塩基配列又は当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(e)  前記(a)〜(d)のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
(４)  血液検体に含まれる前記miRNAの存在量の測定値を補正し、補正済み測定値を前記miRNAの発現量として取得する補正工程をさらに含む、(１)〜(３)のいずれか１項に記載の方法。
(５)  血液検体中の前記miRNAの存在量若しくは発現量、該存在量若しくは発現量と標準内因性miRNA若しくは外部標準核酸の血液検体中存在量との差、又は、該存在量若しくは発現量と標準内因性miRNA若しくは外部標準核酸の血液検体中存在量との比が、溶血の有無を評価するための基準として予め定められた閾値を超える場合に、当該血液検体を溶血検体であると評価する評価工程を含む、(１)〜(４)のいずれか１項に記載の方法。
(６)  前記測定工程が、支持体上に固定化された前記miRNAから選択される少なくとも1つのmiRNAを捕捉するためのプローブと、血液検体から抽出され標識物質で標識された核酸試料とを接触させてハイブリダイゼーションを行ない、血液検体に含まれる当該miRNAの存在量を測定する工程である、(１)〜(５)のいずれか１項に記載の方法。
(７)  前記測定工程において、血液検体に含まれる前記miRNAから選択される少なくとも1つのmiRNAの存在量の測定と同時に、当該血液検体に含まれる所望の標的miRNAの存在量を測定することを含む、(１)〜(６)のいずれか１項に記載の方法。
(８)  血液検体の溶血を検出するためのmiRNAであるmiR-191-5p、miR-22-3p、miR-3158-5p、miR-320a、miR-484、miR-486-5p、miR-6073、miR-6131、miR-642b-3p、miR-92a-3p及びmiR-92b-3pからなる群から選ばれる少なくとも1つのmiRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、溶血検出用チップ。
(９)  血液検体の溶血を検出するためのmiRNAであるmiR-191-5p、miR-22-3p、miR-3158-5p、miR-320a、miR-484、miR-486-5p、miR-6073、miR-6131、miR-642b-3p、miR-92a-3p及びmiR-92b-3pからなる群から選ばれる少なくとも1つのmiRNAを捕捉するためのプローブ及び所望の標的miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA発現解析用チップ。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、従来の方法では困難であった、溶血の程度が小さい血液検体、すなわち赤血球の内容物であるヘモグロビンやmiRNAの流出が少ない血液検体であっても、溶血を高感度に検出することができ、溶血の有無を簡便かつ高感度に評価することができる。特に、ヘモグロビン濃度が100 mg/dL程度の溶血であっても溶血を検出することができるので、標的miRNAのわずかな存在量差が結果に影響を与えるような検査、例えば疾患のバイオマーカーとして血液検体に含まれるmiRNAの存在量を測定する検査において、血液検体としての適否を判断すること（溶血の影響がない血液検体を選択して検査に供すること）が可能となり、信頼性の高い検査結果を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、血液検体の溶血を検出する方法であって、miR-191-5p、miR-22-3p、miR-3158-5p、miR-320a、miR-484、miR-486-5p、miR-6073、miR-6131、miR-642b-3p、miR-92a-3p及びmiR-92b-3pからなる群から選ばれる少なくとも1つのmiRNAを「溶血マーカー」として用いる方法である。ここで、本明細書において、血液検体の溶血の程度又は有無を検出するための指標となるmiRNAを「溶血マーカー」ということがある。
【００１７】
「miRNA」は、生体内で作られる鎖長15〜25塩基程度の短鎖RNAであるノンコーディングRNA（ncRNA）の一種であり、mRNAの発現を調節する機能を有すると考えられている。miRNAは、ゲノムDNAからからヘアピン様構造のRNA（前駆体）として転写されてくる。この前駆体は、特定の酵素RNase III切断活性を有するdsRNA切断酵素（Drosha、Dicer）により切断された後、二本鎖の形態へと変化し、その後一本鎖となる。そして、片方のアンチセンス鎖がRISCと称するタンパク質複合体に取り込まれ、mRNAの翻訳抑制に関与すると考えられている。このように、miRNAは、転写後、各段階においてその態様は異なるので、通常、miRNAを標的（検出対象）とする場合は、ヘアピン構造体、二本鎖構造体、一本鎖構造体等の各種形態を考慮する必要がある。miRNAは様々な生物でその存在が確認されている。
【００１８】
本発明を適用できる血液検体の由来となる動物種は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ブタ、サル、ハムスター、モルモット、ウシ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ等の哺乳動物などを挙げることができ、これらに限定されるものではないが、中でも、ヒトが好ましい。
【００１９】
本発明を適用できる血液検体は、生体から分離された検体であり、例えば、血清、血漿などを挙げることができる。
【００２０】
本発明においては、これらの血液検体からRNAを抽出し、このRNAを用いてmiRNAの存在量を測定することができる。RNAの抽出は、公知の方法（例えば、Favaloroらの方法（Favaloro et.al., Methods Enzymol.65: 718 (1980)）等）、そのためのキットも各種市販されている（例えば、キアゲン社のmiRNeasy、東レ社の"3D-Gene" RNA extraction reagent from liquid sample等）を適用することができる。
【００２１】
＜測定工程＞
本発明の方法は、血液検体に含まれるmiR-191-5p、miR-22-3p、miR-3158-5p、miR-320a、miR-484、miR-486-5p、miR-6073、miR-6131、miR-642b-3p、miR-92a-3p及びmiR-92b-3pからなる群から選ばれる少なくとも1つのmiRNAの存在量を測定する工程を含む。また、後述するように、血液検体に含まれる当該miRNAの存在量の測定と同時に、疾患バイオマーカーなどの所望の標的miRNAの存在量や補正用標準核酸の存在量の測定を行ってもよい。
【００２２】
一般に、溶血すると、赤血球の内容物が血清や血漿中に流出するため、血液検体におけるmiRNAを含む核酸の存在量は増加する。本発明の溶血マーカーとして用いるmiRNAは、溶血した検体では存在量が増加するmiRNAとして選択され、溶血の程度、すなわちヘモグロビン濃度と良く相関して存在量が増加するmiRNAである。溶血マーカーを選択する方法としては、例えば、後述する補正によって得られる発現量において、ヘモグロビン濃度0 mg/dLの検体とヘモグロビン濃度40 mg/dLの検体との発現量比が、好ましくは2以上、より好ましくは3以上になるようなmiRNAを選択することが好ましい。また、統計的手法を適用して、遺伝子発現解析の群間比較により、溶血検体において存在量の増加が統計学的に有意であるmiRNAを選抜することができる。例えば、一般に利用されるt検定などに基づく統計解析法を利用すればよい。例えば、統計言語「R」のパッケージ「SAM」（Tusher VG et. al., Proc Natl Acad Sic USA. 2001 98（9）5116-5121）をそのまま適用することもできる。
【００２３】
前述のとおり、溶血すると赤血球中のmiRNAなどの内容物が血清や血漿中に流出することから、溶血した検体（以下「溶血検体」ともいう。）から得られたRNAと溶血していない検体（以下「非溶血検体」ともいう。）から得られたRNAとを比べると、それぞれに含まれる各種miRNAの存在量に差が生じる。そのため、遺伝子発現解析において、溶血検体が含まれていると、検体間の相関は低下し、血液検体中の標的miRNAの存在量を正確に測定できなくなる。
【００２４】
遺伝子発現解析において、標的とするバイオマーカーの存在量比（存在量の変動）が2倍以上である場合、通常、その差は有意であると判断される。つまり、標的バイオマーカーの存在量比が2倍以上となる程度の溶血が存在する場合、その遺伝子発現解析の結果は信頼性に欠けるということになる。例えば、癌マーカーとして知られているLet-7シリーズなどのmiRNAを標的バイオマーカーとする場合において、ヘモグロビン濃度が100 mg/dLである溶血検体から得られる結果とヘモグロビン濃度0 mg/dLの非溶血検体から得られる結果とを比べると、2倍以上の存在量比が生じることがある。その結果、本来非癌であると判定されるべき検体が癌として判定されてしまうことになるなど、その検査結果は不正確で、信頼性に欠けるものとなる。このように、遺伝子発現解析などの標的バイオマーカーのわずかな存在量差が検査結果に影響を与えるような検査においては、1つの基準として、ヘモグロビン濃度が100 mg/dLの検体を溶血検体であるとして検出できることが重要である。
【００２５】
本発明の方法は、検体に含まれる遺伝子産物の存在量を測定する遺伝子発現解析、例えばマイクロアレイ等のアレイチップを用いた解析や、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法、シークエンス法による解析において、正確な解析結果を得るために用いることができる。遺伝子発現解析には、例えば、血液検体に含まれるmiRNAを標識し、1又は複数の標的miRNAを捕捉するためのプローブと、溶血マーカーのmiRNAを捕捉するためのプローブとが固定された支持体に標識miRNAを接触させ、プローブでmiRNAを捕捉することにより、各種miRNAの存在量を測定すること、1又は複数の標的miRNAを増幅するためのプローブと、溶血マーカーのmiRNAを増幅するためのプローブとを使用して増幅反応を行い、標的miRNAの存在量を測定することなどが含まれ、さらにこれらの結果を利用して遺伝子発現の解析や検査、例えば、病態を把握するために臨床検体を測定する検査を行うことが含まれる。
【００２６】
以下、溶血マーカーや、後述する標的miRNA、補正用標準核酸等の、核酸を捕捉するためのプローブを、総じて「捕捉プローブ」又は単に「プローブ」ともいい、特にmiRNAを捕捉するためのプローブを「miRNA捕捉プローブ」ともいう。
【００２７】
miRNAの存在量の測定は、例えば、対象のmiRNAに特異的に結合するプローブを支持体上に固定化したマイクロアレイ等のアレイチップを用いたハイブリダイゼーションアッセイにより行なうことができる。本発明においては、溶血を検出するためのmiRNAを捕捉するための1又は複数の「溶血マーカー捕捉プローブ」が固定化された支持体を含むアレイチップを用いることができる。また、後述する標的miRNAを捕捉するための「標的miRNA捕捉プローブ」、補正用標準核酸を捕捉するための「補正用標準核酸捕捉プローブ」がさらに固定化された支持体を含むアレイチップを用いてもよい。
【００２８】
「捕捉プローブ」又は「捕捉するためのプローブ」とは、捕捉対象のmiRNAと直接的又は間接的に、好ましくは直接的に、かつ選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。本発明においては、核酸プローブを好ましく用いることができる。核酸は、DNAやRNAのほか、PNA（ペプチド核酸）やLNA（Locked Nucleic Acid）などの核酸誘導体を用いることができる。ここで誘導体とは、核酸の場合、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド（例えば、ハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド、及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど）を含む誘導体などの化学修飾誘導体を意味する。
【００２９】
核酸プローブの鎖長は、ハイブリダイゼーションの安定性と特異性を確保する観点から、検出対象とするmiRNAの長さ以上とすることが好ましい。通常、17〜25塩基程度の鎖長とすれば、プローブが対象とするmiRNAへの選択的結合性を十分に発揮することができる。そのような鎖長の短いオリゴ核酸プローブは、周知の化学合成法等により容易に調製することができる。
【００３０】
核酸プローブは、対象のmiRNAと完全に相補的な塩基配列とすることが好ましいが、一部に相違があっても、対象のmiRNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度に相同性の高い塩基配列であれば、捕捉プローブとして使用可能である。
【００３１】
ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プローブの鎖長、プローブのヌクレオチド配列のGC含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。ストリンジェントな温度条件は、約30℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、SDS）の濃度、及びキャリアDNAの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。当業者は、所望する検体RNAの検出のために用意した捕捉プローブとしての機能を得るための条件を適宜決定することができる。
【００３２】
miRNAの配列情報は、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）等のデータベースやmiRBaseのウェブサイト（http://www.mirbase.org/）から入手することができる。溶血マーカー捕捉プローブ、標的miRNA捕捉プローブ及び補正用標準核酸捕捉プローブは、これらのサイトから入手できる配列情報に基づいて設計することができる。
【００３３】
支持体上に固定化されるmiRNA捕捉プローブの数は特に限定されない。例えば、配列が同定されている公知のmiRNAの全てを網羅する数のmiRNA捕捉プローブを支持体上に固定化したものを用いて、miRNAの存在量を測定してもよいし、検査目的等に応じて所望の数のmiRNA捕捉プローブを支持体上に固定化したものを用いてもよい。
【００３４】
捕捉プローブが整列固定化される支持体としては、公知のマイクロアレイやマクロアレイ等で使用されている支持体と同様のものを用いることができ、例えば、スライドガラスや膜、ビーズなどを用いることができる。特許第4244788号等に記載されている、表面に複数の凸部を有する形状の支持体を用いることもできる。支持体の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料;ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。
【００３５】
支持体に捕捉プローブを固定化する方法としては、支持体表面上でオリゴDNAを合成する方法と、あらかじめ合成しておいたオリゴDNAを支持体表面へ滴下し固定する方法が知られている。
【００３６】
前者の方法としては、Ronaldらの方法（米国特許第5705610号明細書）、Michelらの方法（米国特許第6142266号明細書）、Francescoらの方法（米国特許第7037659号明細書）が挙げられる。これらの方法ではDNA合成反応時に有機溶媒を用いるため、支持体は有機溶媒に耐性のある材質であることが望ましい。また、Francescoらの方法では、支持体の裏面から光を照射してDNA合成を制御するため、支持体は透光性を有する材質であることが好ましい。
【００３７】
後者の方法としては、廣田らの方法（特許第3922454号）やスポッターを用いる方法を挙げることができる。スポットの方式としては、固相へのピン先端の機械的な接触によるピン方式、インクジェットプリンターの原理を利用したインクジェット方式、毛細管によるキャピラリー方式等が挙げられる。スポット処理した後は、必要に応じてUV照射によるクロスリンキング、表面のブロッキング等の後処理が行なわれる。表面処理した支持体表面に共有結合でオリゴDNAを固定化させるため、オリゴDNAの末端にはアミノ基やSH基等の官能基が導入される。支持体の表面修飾は、通常、アミノ基等を有するシランカップリング剤処理によって行なわれる。
【００３８】
支持体上に固定化された各種miRNA捕捉プローブとのハイブリダイゼーションは、検体から抽出したRNAから、標識物質で標識された核酸試料（検体由来の核酸試料）を調製し、この標識核酸試料をプローブと接触させることにより実施する。「検体由来の核酸試料」には、検体から抽出したRNAのほか、該RNAから逆転写反応により調製されたcDNA及びcRNAが包含される。標識された検体由来の核酸試料は、検体RNAを直接的又は間接的に標識物質で標識したものでもよいし、また、検体RNAから調製されたcDNAやcRNAを直接的又は間接的に標識物質で標識したものでもよい。
【００３９】
検体由来の核酸試料に標識物質を結合させる方法としては、核酸試料の3'末端に標識物質を結合させる方法、5'末端に標識物質を結合させる方法、標識物質が結合したヌクレオチドを核酸に取り込ませる方法を挙げることができる。3'末端に標識物質を結合させる方法、5'末端に標識物質を結合させる方法では酵素反応を用いることができる。酵素反応には、T4 RNA LigaseやTerminal Deoxitidil Transferase、Poly A polymeraseなどを用いることができる。いずれの標識方法も「Shao-Yao Ying編、miRNA実験プロトコール、羊土社、2008年」に記載されている方法を参考にすることができる。また、RNAの末端に直接又は間接的に標識物質を結合させるためのキットが各種市販されている。例えば、3'末端に直接又は間接的に標識物質を結合させるキットとしては、"3D-Gene" miRNA labeling kit（東レ社）、miRCURY miRNA HyPower labeling kit（エキシコン社）、NCode miRNA Labeling system（ライフテクノロジーズ社）、FlashTag Biotin RNA Labeling Kit（ジェニスフィア社）等を例示することができる。
【００４０】
このほか、従来法と同様に、標識したデオキシリボヌクレオチド又は標識したリボヌクレオチドの存在下で検体RNAからcDNA又はcRNAを合成することにより、標識物質が取り込まれたcDNA又はcRNAを調製し、これをアレイ上のプローブとハイブリダイズさせる、という方法も可能である。
【００４１】
本発明において、使用できる標識物質としては、公知のマイクロアレイ解析においても使用されている各種の標識物質を挙げることができる。具体的には、蛍光色素、りん光色素、酵素、放射線同位体などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいのは、測定が簡便で、検出しやすい蛍光色素である。具体的には、シアニン（シアニン2）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン3）、シアニン3．5、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン5）、シアニン5．5、シアニン7、オイスターなどの公知の蛍光色素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
また、標識物質としては、発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばカドミウムセレン（CdSe）、カドミウムテルル（CdTe）、インジウムガリウムリン（InGaP）、シルバーインジウム硫化亜鉛（AgInZnS）などが挙げられる。
【００４３】
上記のようにして標識された検体由来の核酸試料を支持体上のmiRNA捕捉プローブと接触させ、核酸試料とプローブをハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーション工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、30℃〜70℃程度で1分間〜十数時間である。ハイブリダイゼーションを行ない、洗浄後、支持体上の個々のプローブ固定化領域における標識物質からのシグナル強度を検出する。シグナル強度の検出は、標識物質の種類に応じて適当なシグナル読取装置を用いて行なう。蛍光色素を標識物質として用いた場合には、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナー等を用いればよい。
【００４４】
検出された蛍光強度の測定値は、周辺ノイズと比較される。具体的には、プローブ固定化領域から得られた測定値と、それ以外の位置から得られた測定値を比較し、前者の数値が上回っている場合を検出された（有効判定陽性）とする。
【００４５】
検出された測定値に、バックグラウンドノイズが含まれている場合には、バックグラウンドノイズを減算してもよい。周辺ノイズをバックグラウンドノイズとして、検出した測定値から減算することもできる。その他、「藤淵航、堀本勝久編、マイクロアレイデータ統計解析プロトコール、羊土社、2008年」に記載されている方法を用いてもよい。
【００４６】
＜補正工程＞
測定工程で得られた溶血マーカーの存在量として、測定値をそのまま用いてもよいが、補正用標準核酸を用いて測定値を補正し、補正済み測定値を溶血マーカーの発現量として取得し、この発現量を用いて溶血の評価を行ってもよい。特に、遺伝子解析等の目的で高感度に溶血を検出しようとする場合は、補正用標準核酸を用いて測定値を補正して得た発現量を用いて評価することが好ましい。
【００４７】
補正用標準核酸は、U1snoRNA、U2snoRNA、U3snoRNA、U4snoRNA、U5snoRNA、U6snoRNA、5S rRNA、5.8S rRNAといったハウスキーピングRNA（特開2007-75095号公報; 特開2007-97429号公報など参照）や、特定の補正用内因性miRNA（Roberts, T.C.ら、2014年、PLoS ONE、第9(2)巻、e89237; Chen, X.ら、2013年、PLoS ONE、第8(11)巻、e79652; WO 2016/043170など参照）を用いて補正してもよいし、RNAの抽出時や標識時に添加した外部標準核酸を用いて補正してもよい。「内因性」とは、人工的に検体に添加されたものではなく、検体に自然に存在することを意味する。例えば「内因性miRNA」と言った場合、検体中に自然に存在している、その検体を提供した生物に由来するmiRNAを示し、hsa-miR-149-3p（配列番号12）、hsa-miR-2861（配列番号13）、hsa-miR-4463（配列番号14）などが含まれる。これら内因性miRNAは溶血検体であっても存在量が変わらないことがわかっており、本発明の方法を適用して、血液検体に含まれる疾患バイオマーカーなど所望の標的miRNAの遺伝子発現解析を行う場合は、そのような存在量が一定の内因性miRNAを利用して、この存在量の測定値を一定値に補正する方法を用いることが好ましい。本明細書では、溶血の有無にかかわらず血液検体中の存在量が一定である内因性miRNAを「標準内因性miRNA」と呼ぶことがある。また、検体に依存されないスパイクコントロールなどの外部標準核酸を利用して、この存在量の測定値を一定値に補正する方法を用いてもよい。例えば、溶血マーカーの発現量Eは、式1に示すように、溶血検体であっても存在量が変わらないことがわかっているmiRNA（標準内因性miRNA）の存在量の測定値aを一定値Aへ補正するための補正係数（A／a）を用いて、溶血マーカーの存在量の測定値eを補正して取得することができる。
E ＝ e×A／a    （式1）
【００４８】
＜評価工程＞
本発明の方法では、使用する溶血マーカーの存在量に対し、溶血の有無を評価するための基準とする閾値を予め設定しておいてよい。閾値は溶血マーカーごとに設定される。測定した溶血マーカーの存在量が予め任意に定めた閾値を超える場合に、当該検体が溶血検体であると評価することができる。より厳格な又は高精度の評価を行う場合には、溶血マーカーの存在量として、前述の補正工程で得られた発現量を用いることが好ましい。
【００４９】
1つの溶血マーカーを用いる場合には、miR-191-5p、miR-22-3p、miR-3158-5p、miR-320a、miR-484、miR-486-5p、miR-6073、miR-6131、miR-642b-3p、miR-92a-3p及びmiR-92b-3pから1つのmiRNAを任意に選択すればよいが、溶血の程度、すなわちヘモグロビン濃度に依存して存在量が顕著に増加するものを選択することが好ましく、例えば、miR-486-5p、miR-92a-3pのいずれかを選択することが好ましい。また、より厳格な又は高精度の評価を行う場合には、複数の溶血マーカーを用いることが好ましい。例えば、2〜5個の溶血マーカーを用いることがより好ましく、特に、miR-486-5p及びmiR-92a-3pの2つを選択することが好ましい。また、例えば、遺伝子発現解析を目的とする場合であって、発現解析対象とする標的miRNAが本発明の溶血マーカーのいずれかに該当する場合は、当該標的miRNAを除くmiRNAから溶血マーカーを選択すればよい。
【００５０】
本発明の溶血マーカーの中から1つのmiRNAを用いる場合には、血液検体に含まれる当該溶血マーカーの存在量、又はその発現量を用いて、この値が予め任意に定める閾値を超えるか否かによって溶血の有無を評価することができる。本発明の溶血マーカーの中から複数のmiRNAを用いる場合には、個々の溶血マーカーごとに閾値を超えるか否かを評価してもよい。この場合には、複数の溶血マーカーによる個々の評価に優先順位付けや重み付けをすること等により、さらなる判断基準を設けることが好ましい。
【００５１】
溶血の有無を評価するための閾値は、評価の目的や求める精度などに応じて任意に設定することができる。例えば、市販されている血液検体を標準検体として、標準検体における溶血マーカーの存在量を当該溶血マーカーの存在量の閾値としてもよい。また、血液検体のヘモグロビン濃度と当該溶血マーカーの存在量との関係を測定し、当該溶血マーカーの存在量又はその存在量に適当な比率を乗じた値（例えば、存在量の1〜1.2倍の値）に閾値を設定してもよい。また、前述した内因性miRNA、もしくはRNAの抽出時や標識時に添加した外部標準核酸の存在量と、本発明の溶血マーカーの存在量との差もしくは比に閾値を設定してもよい。さらに、個々の溶血マーカーごとに、存在量の個体間のバラつき（標準偏差SD）を予め測定しておき、このバラつきの値を使用して溶血マーカーの存在量の閾値に設定してもよく、例えば上限95%信頼性基準値として中央値+2SDの値を設定してもよい。個体間のバラつきを測定する際は、できるだけ多くの個体、例えば数十〜数百程度の個体から血液検体を得て測定を行なうことが望ましい。このように、血液検体を使用する測定や検査に応じて、閾値は任意に設定することができ、より厳しく設定することで、溶血の検出感度を高くすることができる。
【００５２】
血液検体に含まれる溶血マーカーの存在量に対し、溶血の有無を評価するための基準とする閾値を予め設定する場合は、存在量の測定値eもしくは発現量Eを用いて評価することができる。測定値eを用いる場合は、式2Aに示すように、測定値eが閾値t1を上回る場合に血液検体が溶血検体であると評価することができる。発現量Eを用いて評価する場合は、式2Bに示すように、発現量Eが閾値t2を上回る場合に血液検体が溶血検体であると評価することができる。閾値t1、t2は、個々の溶血マーカーごとに、評価の目的や求める精度などに応じて、それぞれ任意に設定することができる。
e＞t1    （式2A）
E＞t2    （式2B）
【００５３】
また、溶血マーカーの存在量と、溶血検体であっても存在量が変わらないことがわかっている内因性miRNA（標準内因性miRNA）や、RNAの抽出時や標識時に添加した外部標準核酸などの核酸の存在量との差に対し、溶血の有無を評価するための閾値を予め設定し、その差がその閾値を超えるか否かによって溶血の有無を評価してもよい。複数の標準内因性miRNA又は外部標準核酸を用いる場合は、溶血マーカーとして用いるmiRNAと、標準内因性miRNA又は外部標準核酸との組み合わせごとに、閾値を任意に定めればよい。血液検体に含まれる溶血マーカーの存在量として存在量の測定値eを用いる場合は、式3Aに示すように、標準内因性miRNA又は外部標準核酸の血液検体中存在量の測定値aとの差（e−a）を求め、この値の絶対値が閾値t3を上回る場合に血液検体が溶血検体であると評価することができる。血液検体に含まれる溶血マーカーの存在量として発現量Eを用いる場合は、式3Bに示すように、標準内因性miRNA又は外部標準核酸の血液検体中の存在量A（一定値となる）との差（E−A）を求め、この値の絶対値が閾値t4を上回る場合に血液検体が溶血検体であると評価することができる。
｜e−a｜＞t3    （式3A）
｜E−A｜＞t4    （式3B）
【００５４】
あるいは、溶血マーカーの存在量と、標準内因性miRNAや外部標準核酸の存在量との比に対し、溶血の有無を評価するための閾値を予め設定し、その比がその閾値を超えるか否かによって溶血の有無を評価してもよい。複数の標準内因性miRNA又は外部標準核酸を用いる場合は、溶血マーカーとして用いるmiRNAと、標準内因性miRNA又は外部標準核酸との組み合わせごとに、閾値を任意に定めればよい。血液検体に含まれる溶血マーカーの存在量の測定値eを用いる場合は、式4Aに示すように、標準内因性miRNA又は外部標準核酸の血液検体中存在量の測定値aとの比（e／a）を求め、この値が閾値t5を上回る場合に血液検体が溶血検体であると評価することができる。血液検体に含まれる溶血マーカーの存在量として発現量Eを用いる場合は、式4Bに示すように、標準内因性miRNA又は外部標準核酸の血液検体中の存在量A（一定値となる）との比（E／A）を求め、この値が閾値t6を上回る場合に血液検体が溶血検体であると評価することができる。
e／a＞t5    （式4A）
E／A＞t6    （式4B）
【００５５】
ここで、上記の式2A〜式4Bにおいて、実験の誤差等を考慮して、閾値t1〜t6に一定の誤差αの幅を持たせて、それぞれ「t1±α」〜「t6±α」としてもよい。この場合の誤差αは任意に設定すればよいが、例えば、式2Aにおいては、eの10%程度をαとして設定して閾値t1に幅を持たせることができる。
【００５６】
また、各存在量の閾値として、存在量の値を対数に変換したものを用いてもよい。この場合、その変換にあわせて適切な閾値を設定すればよい。例えば、式4Aを適用する場合に、存在量比（e／a）を対数値に変換し、その変換にあわせて閾値t5を設定すればよい。この場合、結果的に、存在量e、aの各対数値の差を求めることになる。
【００５７】
また、個々の溶血マーカーごとに血液検体に含まれる存在量を用いて、評価基準に従って溶血の有無を評価し、その結果を総合して血液検体の溶血の有無を判定することができる。具体的には、例えば、溶血マーカーごとの判定において、溶血を検出した溶血マーカーの数が、溶血を検出しなかった溶血マーカーの数又は任意の所定数を上回る場合に、血液検体を溶血検体であると評価することができる。また、より厳格な又は高精度の評価を行う場合には、特定の1種の溶血マーカーで溶血を検出した場合に、血液検体を溶血検体であると評価してもよい。
【００５８】
本発明は、血液検体の溶血を検出するためのmiRNAであるmiR-191-5p、miR-22-3p、miR-3158-5p、miR-320a、miR-484、miR-486-5p、miR-6073、miR-6131、miR-642b-3p、miR-92a-3p及びmiR-92b-3pからなる群から選ばれる少なくとも1つのmiRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、溶血検出用チップを提供する。また、本発明は、標的miRNAを捕捉するためのプローブと、血液検体の溶血を検出するためのmiRNAであるmiR-191-5p、miR-22-3p、miR-3158-5p、miR-320a、miR-484、miR-486-5p、miR-6073、miR-6131、miR-642b-3p、miR-92a-3p及びmiR-92b-3pからなる群から選ばれる少なくとも1つのmiRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA発現解析用チップを提供する。ここで、標的miRNA、溶血を検出するためのmiRNA（溶血マーカー）、これらを捕捉するためのプローブ、また、これらの捕捉プローブが固定化される支持体は、前記のとおりである。
【００５９】
本発明のmiRNA発現解析用チップは、前記の補正工程で用いるハウスキーピングRNA、特定の補正用内因性miRNA、添加する外部標準核酸等の補正用核酸、特に補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブが、さらに支持体に固定化されていてもよい。
【００６０】
本発明においては、以下に説明する配列番号１〜１１で示される塩基配列からなるmiRNAを、血液検体の溶血の程度又は有無を検出するためのmiRNA（溶血マーカー）として使用する。
【００６１】
本明細書で使用される「hsa-miR-191-5p遺伝子」又は「hsa-miR-191-5p」という用語は、配列番号１で示される塩基配列からなるhsa-miR-191-5p遺伝子（miRBase Accession No. MIMAT0000440）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-191-5p遺伝子は、Lagos-Quintana Mら、2003年、RNA、9巻、p175-179に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-191-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-191」（miRBase Accession No. MI0000465、配列番号１５）の配列を含む。
【００６２】
本明細書で使用される「hsa-miR-22-3p遺伝子」又は「hsa-miR-22-3p」という用語は、配列番号２で示される塩基配列からなるhsa-miR-22-3p遺伝子（miRBase Accession No. MIMAT0000077）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-22-3p遺伝子は、Lagos-Quintana Mら、2001年、Science、294巻、p853-858に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-22-3p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-22」（miRBase Accession No. MI0000078、配列番号１６）の配列を含む。
【００６３】
本明細書で使用される「hsa-miR-3158-5p遺伝子」又は「hsa-miR-3158-5p」という用語は、配列番号３で示される塩基配列からなるhsa-miR-3158-5p遺伝子（miRBase Accession No. MIMAT0019211）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-3158-5p遺伝子は、Creighton CJら、2010年、PLoS One、5巻に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-3158-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-3158-1、hsa-mir-3158-2」（miRBase Accession No. MI0014186、MI0014187、配列番号１７、１８）の配列を含む。
【００６４】
本明細書で使用される「hsa-miR-320a遺伝子」又は「hsa-miR-320a」という用語は、配列番号４で示される塩基配列からなるhsa-miR-320a遺伝子（miRBase Accession No. MIMAT0000510）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-320a遺伝子は、Michael MZら、2003年、Mol Cancer Res、1巻、p882-891に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-320a」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-320a」（miRBase Accession No. MI0000542、配列番号１９）の配列を含む。
【００６５】
本明細書で使用される「hsa-miR-484遺伝子」又は「hsa-miR-484」という用語は、配列番号５で示される塩基配列からなるhsa-miR-484遺伝子（miRBase Accession No. MIMAT0002174）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-484遺伝子は、Fu Hら、2005年、FEBS Lett、579巻、p3849-3854に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-484」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-484」（miRBase Accession No. MI0002468、配列番号２０）の配列を含む。
【００６６】
本明細書で使用される「hsa-miR-486-5p遺伝子」又は「hsa-miR-486-5p」という用語は、配列番号６で示される塩基配列からなるhsa-miR-486-5p遺伝子（miRBase Accession No. MIMAT0002177）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-486-5p遺伝子は、Fu Hら、2005年、FEBS Lett、579巻、p3849-3854に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-486-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-486-1、hsa-mir-486-2」（miRBase Accession No. MI0002470、MI0023622、配列番号２１、２２）の配列を含む。
【００６７】
本明細書で使用される「hsa-miR-6073遺伝子」又は「hsa-miR-6073」という用語は、配列番号７で示される塩基配列からなるhsa-miR-6073遺伝子（miRBase Accession No. MIMAT0023698）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-6073遺伝子は、Voellenkle Cら、2012年、RNA、18巻、p472-484に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-6073」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-6073」（miRBase Accession No. MI0020350、配列番号２３）の配列を含む。
【００６８】
本明細書で使用される「hsa-miR-6131遺伝子」又は「hsa-miR-6131」という用語は、配列番号８で示される塩基配列からなるhsa-miR-6131遺伝子（miRBase Accession No. MIMAT0024615）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-6131遺伝子は、Dannemann Mら、2012年、Genome Biol Evol、4巻、p552-564に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-6131」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-6131」（miRBase Accession No. MI0021276、配列番号２４）の配列を含む。
【００６９】
本明細書で使用される「hsa-miR-642b-3p遺伝子」又は「hsa-miR-642b-3p」という用語は、配列番号９で示される塩基配列からなるhsa-miR-642b-3p遺伝子（miRBase Accession No. MIMAT0018444）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-642b-3p遺伝子は、Witten Dら、2010年、BMC Biol、8巻、p58に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-642b-3p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-642b」（miRBase Accession No. MI0016685、配列番号２５）の配列を含む。
【００７０】
本明細書で使用される「hsa-miR-92a-3p遺伝子」又は「hsa-miR-92a-3p」という用語は、配列番号１０で示される塩基配列からなるhsa-miR-92a-3p遺伝子（miRBase Accession No. MIMAT0000092）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-92a-3p遺伝子は、Mourelatos Zら、2002年、Genes Dev、16巻、p720-728に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-92a-3p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-92a-1、hsa-mir-92a-2」（miRBase Accession No. MI0000093、MI0000094、配列番号２６、２７）の配列を含む。
【００７１】
本明細書で使用される「hsa-miR-92b-3p遺伝子」又は「hsa-miR-92b-3p」という用語は、配列番号１１で示される塩基配列からなるhsa-miR-92b-3p遺伝子（miRBase Accession No. MIMAT0003218）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-92b-3p遺伝子は、Cummins JMら、2006年、Proc Natl Acad Sci U S A、103巻、p3687-3692に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-92b-3p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-92b」（miRBase Accession No. MI0003560、配列番号２８）の配列を含む。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００７３】
＜実施例１＞  溶血マーカーの選択
（DNAマイクロアレイ）
東レ株式会社製の"3D-Gene" human miRNA oligo chip（miRBase release 21対応）を用いて以下の実験を行なった。【００７４】
（血清検体の調製）
健常ヒトより、真空採血管に勢いよく吸引させた場合と、真空採血管にゆっくりと吸引させた場合の2条件で採血し、それぞれ血清を調製した。真空採血管に勢いよく吸引させた血清検体は、赤色を帯びており、エイトチェック−3WP（シスメックス社）で測定した結果、ヘモグロビン濃度は200 mg/dLであり、溶血検体であった。一方、真空採血管にゆっくりと吸引させた血清検体のヘモグロビン濃度は0 mg/dLであり、非溶血検体であった。この2つの血清検体を混合して、ヘモグロビン濃度が0、40、80、100、200mg/dL、全量が400μLとなるように調整した血液検体を用意した。得られた血清検体を-80℃に設定した冷凍庫に収容し、下記に述べるRNA抽出作業まで、そのまま静置した。【００７５】
（検体RNAの調製とmiRNA発現量の測定）
上記のように調製された血清検体を同時に溶解し、血清検体に含まれるRNA（以下、検体RNAという。）を、"3D-Gene" RNA extraction reagent from liquid sample kit（東レ社）を用いて抽出した。【００７６】
得られた検体RNAを、"3D-Gene" miRNA labeling kit（東レ社）を用いて標識した。標識した検体RNAについて、"3D-Gene" miRNA chip（東レ社）を用い、その標準プロトコールに従い、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のDNAマイクロアレイをマイクロアレイスキャナー（東レ社）に供して蛍光強度を測定し、各種miRNAの存在量を取得した。スキャナーの設定は、レーザー出力100％、フォトマルチプライヤーの電圧設定をAUTO設定にした。【００７７】
DNAマイクロアレイで検出された各種miRNAの存在量を、内因性miRNAであるhsa-miR-149-3p（配列番号12）の存在量を用いて補正し、各種miRNAの発現量を取得した。【００７８】
以上のようにして、DNAマイクロアレイでの検出後、ヘモグロビン濃度0、40、80、100、200 mg/dLの各血清検体について、発現量を取得した。【００７９】
（溶血マーカーの選択）
上記のようにして得られた各血清検体のmiRNAの発現量を比較し、以下のようにして、溶血の程度に依存して発現量が変動する程度の大きいmiRNAを、溶血マーカーとして選択した。【００８０】
まず、ヘモグロビン濃度0 mg/dLの血清検体を基準として、その各種miRNAの発現量と、ヘモグロビン濃度40、80、100、200 mg/dLの各血清検体における各種miRNAの発現量との比（（40、80、100又は200 mg/dLの発現量）/（0 mg/dLの発現量））を求めた。【００８１】
次に、発現が検出されたmiRNAのうち、高発現領域で安定して検出されるmiRNAを絞り込んだ。【００８２】
さらに、絞り込んだmiRNAのなかから、溶血の程度に依存して発現量が変動する程度が大きいmiRNAを選択した。すなわち、ヘモグロビン濃度と発現量（発現量比）の増加に相関が見られ、ヘモグロビン濃度0 mg/dLの発現量と40 mg/dLの発現量との比（（ヘモグロビン濃度40 mg/dLの発現量）/（0 mg/dLの発現量））が2以上であるmiRNA（配列番号1〜11）を溶血マーカーとして選択した。選択した11種のmiRNAと、ヘモグロビン濃度40、80、100、200 mg/dLの血清検体から得られた各発現量を表１に示す。【００８３】
表１に示すmiRNA（配列番号1〜11）は、ヘモグロビン濃度すなわち溶血の程度が高くなるにつれて、発現量が増加し、その程度が大きかった。すなわち、表１に示すmiRNAは溶血マーカーとして用いることができ、その発現量（存在量）を測定することによって、血清検体の溶血を検出できることが分かった。特に、hsa-miR-486-5p（配列番号6）およびhsa-miR-92a-3p（配列番号10）は、ヘモグロビン濃度40 mg/dLの軽微な溶血検体においても鋭敏な変動を示しており、より高感度に溶血を検出できることが分かった。【００８４】
（閾値の設定）
健常と疾患を含むヒト300名よりそれぞれ採血し、血清を調製した。上記と同様に、各血清検体に含まれるRNAを抽出し、各種miRNAの存在量を取得した。内因性miRNAであるhsa-miR-149-3p（配列番号12）を用いて各種miRNAの存在量を補正し、発現量を取得した。表１に示す溶血マーカーごとに、300検体の発現量の中央値＋2SDを求め、この数値を各溶血マーカーの発現量の閾値１とした。表１は、各miRNAの発現量が閾値１を上回る場合に、その血液検体が溶血検体であると判定できることを示す。【００８５】
表１に示すとおり、本発明の配列番号1〜11で示される全てのmiRNAは、少なくともヘモグロビン濃度100 mg/dL以上の血清検体において溶血を検出することができることが示された。特に、配列番号1〜5、8、9、11で示されるmiRNAは、ヘモグロビン濃度80 mg/dL以上の血清検体において、配列番号6、10で示されるmiRNAは、ヘモグロビン濃度40 mg/dL以上の血清検体において、それぞれ高感度で溶血を検出することができることが示された。【００８６】
【表１】
2018056432.tif 000002
【００８７】
＜比較例１＞
本発明の血液検体の溶血の評価方法を、従来の方法である肉眼観察による方法と比較するため、上記実施例１で使用したヘモグロビン濃度0、40、80、100、200 mg/dLの血清検体を用いて、肉眼観察による方法によって溶血の有無の評価を実施した。【００８８】
表２に示すとおり、ヘモグロビン濃度200 mg/dLの血清検体は、肉眼で赤色を帯びていることが観察され、溶血検体であると判定できた。一方、ヘモグロビン濃度40、80、100 mg/dLの血清検体では、肉眼で赤色を観察できず、いずれもほぼ同等の色調に観察され、溶血検体であると判定できなかった。このことから、従来の肉眼観察による方法では、ヘモグロビン濃度が100 mg/dL以下である溶血を検出することができないことがわかった。【００８９】
【表２】
2018056432.tif 000003
【００９０】
＜実施例２＞
実施例１とは異なる、健常ヒト1名より、真空採血管に勢いよく吸引させた血液から、血清を調製した。この血清検体をエイトチェック−3WP（シスメックス社）で測定した結果、ヘモグロビン濃度は150 mg/dLであった。【００９１】
これ以外は、実施例１と同様にしてRNAを抽出し、各種miRNAの存在量を取得した。この存在量を、内因性miRNAであるhsa-miR-149-3p（配列番号12）の存在量を用いて補正して、血清検体由来のmiRNAの発現量を取得した。溶血マーカーとして、hsa-miR-486-5p（配列番号6）を選択し、その発現量が実施例１で得られた閾値１（275）を上回る場合に溶血検体であると評価することとした。【００９２】
その結果、表３に示すとおり、血清検体由来のhsa-miR-486-5pの発現量は1450であり、当該溶血マーカーの閾値１を上回ったことから、この血清検体は溶血検体であると評価した。【００９３】
以上より、本発明の溶血マーカーであるhsa-miR-486-5pは、ヘモグロビン濃度150 mg/dLの血清検体の溶血を正しく検出できることが確認された。【００９４】
＜実施例３＞
実施例３と同様にして、健常ヒト1名の血清検体を用意した。この血清検体をエイトチェック−3WP（シスメックス社）で測定した結果、ヘモグロビン濃度は100 mg/dLであった。以下、実施例２と同様にして、血清検体由来のmiRNAの発現量を取得した。溶血マーカーとして、hsa-miR-486-5p（配列番号6）を選択し、閾値１を用いて溶血の評価を行った。【００９５】
その結果、表３に示すとおり、血清検体由来のhsa-miR-486-5pの発現量は955であり、当該溶血マーカーの閾値１である275を上回ったことから、この血清検体は溶血検体であると評価した。【００９６】
以上より、本発明の溶血マーカーであるhsa-miR-486-5pは、ヘモグロビン濃度100 mg/dLの血清検体の溶血を正しく検出できることが確認された。一般に、ヘモグロビン濃度が100 mg/dL程度の溶血であっても、遺伝子発現解析の結果（特に、血液検体中のmiRNAの発現解析の場合）に影響があるとされている。本発明のマーカーによれば、ヘモグロビン濃度が100 mg/dLである検体でも溶血を確実に検出することができ、正確な遺伝子発現解析結果を得るために有効な方法であることがわかった。【００９７】
＜実施例４＞
健常ヒト1名より、真空採血管にゆっくりと吸引させた血液から、血清検体を調製した。この血清検体をエイトチェック−3WP（シスメックス社）で測定した結果、ヘモグロビン濃度は0 mg/dLであった。これ以外は実施例２と同様にして、血清検体由来のmiRNAの発現量を取得した。溶血マーカーとして、hsa-miR-486-5p（配列番号6）を選択し、閾値１を用いて溶血の評価を行った。【００９８】
その結果、表３に示すとおり、血清検体由来のhsa-miR-486-5pの発現量は120であり、当該溶血マーカーの閾値１である275を下回ったことから、溶血は検出されなかった。【００９９】
以上より、本発明の溶血マーカーであるhsa-miR-486-5pは、ヘモグロビン濃度0 mg/dLの血清検体を溶血検体ではないと正しく検出できることが確認された。【０１００】
【表３】
2018056432.tif 000004
【０１０１】
＜比較例２＞
実施例３で使用したものと同一のヘモグロビン濃度100 mg/dLの血清検体を用い、その検体由来のmiRNAの発現量を取得した。溶血マーカーとして、非特許文献１に記載のhsa-miR-451a（配列番号29）を使用して、実施例２と同様に閾値１を用いて溶血の評価を行った。実施例１に記載した通りにhsa-miR-451aの閾値１を求めたところ、1774であった。【０１０２】
その結果、表４に示すとおり、hsa-miR-451aの発現量は1212であり、当該miRNAの閾値１の数値1774を下回ったことから、溶血検体であることは検出できなかった。【０１０３】
このことから、hsa-miR-451aを用いて溶血を検出する方法では、遺伝子発現解析の結果に影響するとされるヘモグロビン濃度100 mg/dLの血清検体の溶血を検出できず、正確な遺伝子発現解析結果を得るために適する方法とはいえないことが確認された。【０１０４】
＜比較例３＞
実施例１で使用したヘモグロビン濃度200 mg/dLの血清検体を用い、その検体由来のmiRNAの発現量を取得した。溶血マーカーとして、非特許文献１に記載のhsa-miR-451a（配列番号29）を使用して、実施例２と同様に閾値１を用いて溶血の評価を行った。【０１０５】
その結果、表４に示すとおり、hsa-miR-451aの発現量は1182であり、当該miRNAの閾値１の数値1774を下回ったことから、溶血検体であることは検出できなかった。【０１０６】
このことから、hsa-miR-451aを用いて溶血を検出する方法では、遺伝子発現解析の結果に影響するとされるヘモグロビン濃度200 mg/dLの血清検体の溶血を検出できず、正確な遺伝子発現解析結果を得るために適する方法とはいえないことが確認された。【０１０７】
【表４】
2018056432.tif 000005
【０１０８】
＜実施例５＞
実施例２で使用したものと同一のヘモグロビン濃度150 mg/dLの血清検体を用い、その検体由来のmiRNAの発現量を取得した。溶血マーカーとしてhsa-miR-642b-3p（配列番号9）を選択して、実施例２と同様にその発現量を取得した。【０１０９】
ここで、実施例１で使用したヘモグロビン濃度80 mg/dLの血清検体から得られた発現量の1.1倍の数値を求め、これを各溶血マーカーの発現量の閾値２とし、これを上回る場合に溶血検体であると評価することとした。【０１１０】
その結果、表５に示すとおり、血清検体由来のhsa-miR-642b-3pの発現量は2686であり、当該溶血マーカーの閾値２である1711を上回ったことから、この血清検体は溶血検体であると評価した。【０１１１】
以上より、本発明の溶血マーカーであるhsa-miR-642b-3pは、ヘモグロビン濃度150 mg/dLの血清検体の溶血を正しく検出できることが確認された。【０１１２】
＜実施例６＞
実施例３で使用したものと同一のヘモグロビン濃度100 mg/dLの血清検体を用い、その検体由来のmiRNAの発現量を取得した。実施例５と同様にして、溶血マーカーとしてhsa-miR-642b-3p（配列番号9）を選択して、閾値２を用いて溶血の評価を行った。【０１１３】
その結果、表５に示すとおり、血清検体由来のhsa-miR-642b-3pの発現量は1782であり、当該溶血マーカーの閾値２である1711を上回ったことから、この血清検体は溶血検体であると評価した。【０１１４】
以上より、本発明の溶血マーカーであるhsa-miR-642b-3pは、ヘモグロビン濃度100 mg/dLの血清検体の溶血を正しく検出できることが確認された。上述した通り、一般に、ヘモグロビン濃度が100 mg/dL程度の溶血であっても、遺伝子発現解析の結果（特に、血液検体中のmiRNAの発現解析の場合）に影響があるとされている。この本発明のマーカーによれば、ヘモグロビン濃度が100 mg/dLである検体でも溶血を確実に検出できることができ、正確な遺伝子発現解析結果を得るために有効な方法であることがわかった。【０１１５】
＜実施例７＞
実施例４で使用したものと同一のヘモグロビン濃度0 mg/dLの血清検体を用い、その検体由来のmiRNAの発現量を取得した。実施例５と同様にして、溶血マーカーとしてhsa-miR-642b-3p（配列番号9）を選択して、閾値２を用いて溶血の評価を行った。【０１１６】
その結果、表５に示すとおり、血清検体由来のhsa-miR-642b-3pの発現量は512であり、当該溶血マーカーの閾値２である1711を下回ったことから、溶血は検出されなかった。【０１１７】
以上より、本発明の溶血マーカーであるhsa-miR-642b-3pは、ヘモグロビン濃度0 mg/dLの血清検体を溶血検体ではないと正しく検出できることが確認された。【０１１８】
【表５】
2018056432.tif 000006
【０１１９】
＜比較例４＞
実施例３で使用したものと同一のヘモグロビン濃度100 mg/dLの血清検体由来のmiRNAを使用し、溶血マーカーとして、非特許文献１に記載のhsa-miR-451a（配列番号29）を使用して、実施例５と同様に閾値２を用いて溶血の評価を行った。実施例５に記載した通りにhsa-miR-451aの閾値２を求めたところ、1480であった。【０１２０】
その結果、表６に示すとおり、hsa-miR-451aの発現量は1200であり、当該miRNAの閾値２の数値1480を下回ったことから、溶血検体であることは検出できなかった。【０１２１】
以上より、hsa-miR-451aを用いて溶血を検出する方法では、遺伝子発現解析の結果に影響するとされるヘモグロビン濃度100 mg/dLの血清検体の溶血を検出できず、正確な遺伝子発現解析結果を得るために適する方法とはいえないことが確認された。【０１２２】
【表６】
2018056432.tif 000007
【配列表】
2018056432000001.app
【国際調査報告】
2018056432.tif 000008
2018056432.tif 000009
2018056432.tif 000010
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