(57)【要約】  容器本体２と注入出用ポート３ａ，３ｂとを備える細胞培養用容器１において、容器本体２の内部をフィルタ部材４によって複数の槽１ｓｔ，２ｎｄに区画する。これにより、細胞培養に際して行われる種々の操作を簡便、かつ、効率良く行うことができるようにする。
2017183570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養の用途に供される細胞培養用容器であって、
容器本体と注入出用ポートとを備え、
前記容器本体の内部が、少なくとも一つのフィルタ部材によって複数の槽に区画されていることを特徴とする細胞培養用容器。
【請求項２】
前記容器本体の内部が、前記容器本体の天面側の第一の槽と、前記容器本体の底面側の第二の槽とに区画され、
前記天面側の第一の槽と前記底面側の第二の槽の少なくとも一方に、前記注入出用ポートを少なくとも一つ備える請求項１に記載の細胞培養用容器。
【請求項３】
前記容器本体の底面に、複数の凹部が設けられた請求項１又は２に記載の細胞培養用容器。
【請求項４】
前記容器本体の内部が、前記容器本体の天面側の第一の槽と、前記容器本体の底面側の第二の槽と、前記天面側の第一の槽と前記底面側の第二の槽との間に位置する第三の槽とに区画され、
前記天面側の第一の槽と前記底面側の第二の槽に、前記注入出用ポートを少なくとも二つ備え、
前記第三の槽に、記注入出用ポートを少なくとも一つ備える請求項１に記載の細胞培養用容器。
【請求項５】
細胞培養の用途に供される細胞培養用容器であって、
細胞培養部となる複数の凹部を有する容器本体を備え、前記凹部のそれぞれの開口部がフィルタ部材によって覆われていることを特徴とする細胞培養用容器。
【請求項６】
前記容器本体に、前記容器本体の周りを取り囲んで立ち上る側壁部が設けられている請求項５に記載の細胞培養用容器。
【請求項７】
前記フィルタ部材が、合成樹脂繊維を編んだメッシュシートである請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養用容器。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養用容器を用いて培地交換しながら細胞を培養する当該容器の使用方法であって、
前記フィルタ部材として、培養対象の細胞の通過を許容しない細孔を有するフィルタ部材を選択し、
前記フィルタ部材によって区画された一方の槽に、前記細胞を注入して培養を行い、
前記フィルタ部材によって区画された他方の槽が備える前記注入出用ポートから、培地を注入出して培地交換を行うことを特徴とする細胞培養用容器の使用方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養用容器を用いて細胞の洗浄を行う当該容器の使用方法であって、
前記フィルタ部材として、培養対象の細胞の通過を許容しない細孔を有するフィルタ部材を選択し、
前記フィルタ部材によって区画された一方の槽に、前記細胞を注入して培養を行い、
前記フィルタ部材によって区画された他方の槽が備える前記注入出用ポートから、洗浄液を注入出して培養された細胞の洗浄を行うことを特徴とする細胞培養用容器の使用方法。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の細胞培養用容器を用いて細胞の凝集塊を分割する当該容器の使用方法であって、
前記フィルタ部材として、細胞の凝集塊を分割したい大きさに応じた細孔を有するフィルタ部材を選択し、
前記フィルタ部材によって区画された一方の槽に、前記凝集塊を培地とともに圧送して前記凝集塊を分割することを特徴とする細胞培養用容器の使用方法。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の細胞培養用容器を用いて混在する大きさの異なる細胞を分離する当該容器の使用方法であって、
前記フィルタ部材として、混在する細胞のうち少なくとも一の細胞の通過を許容するが、それ以外の細胞の通過を許容しない細孔を有するフィルタ部材を選択し、
前記フィルタ部材によって区画された一方の槽に、混在する大きさの異なる細胞を注入して、
前記フィルタ部材によって区画された他方の槽から、前記フィルタ部材を通過した細胞を取り出すことを特徴とする細胞培養用容器の使用方法。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載の細胞培養用容器を用いて異なる種類の細胞を共培養する当該容器の使用方法であって、
前記フィルタ部材として、共培養されるいずれの細胞も通過を許容しない細孔を有するフィルタ部材を選択し、
前記フィルタ部材によって区画されたそれぞれの槽に、前記細胞を種類ごとに別々に注入して共培養することを特徴とする細胞培養用容器の使用方法。
【請求項１３】
請求項２又は３に記載の細胞培養用容器を用いて凝集塊を形成する細胞を培養する当該容器の使用方法であって、
前記フィルタ部材として、凝集塊を形成する前の細胞の通過は許容するが、凝集塊の通過は許容しない細孔を有するフィルタ部材を選択し、
前記細胞を、前記第一の槽に注入し、次いで、前記第二の槽に沈降させて、形成された凝集塊を前記第二の槽に留まらせた状態で培養することを特徴とする細胞培養用容器の使用方法。
【請求項１４】
請求項４に記載の細胞培養用容器を用いて細胞を培養する当該容器の使用方法であって、
前記フィルタ部材として、培養対象の細胞の通過を許容しない細孔を有するフィルタ部材を選択し、
前記第一の槽と前記第二の槽とのそれぞれに、成分組成の異なる培地を流通させながら、前記第三の槽に前記細胞を注入して培養を行うことを特徴とする細胞培養用容器の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養に際して行われる種々の操作を簡便、かつ、効率良く行うために細胞培養の用途に供される細胞培養用容器、及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産、遺伝子治療、再生医療、免疫療法などの医薬学・生化学分野において、細胞（組織、微生物、ウイルスなどを含む）を人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。【０００３】
このような要求に応えるべく、本出願人は、閉鎖系の環境を構築してコンタミネーションのリスクを低減しつつ、効率的に細胞培養を行うことができる細胞培養システムについて検討を重ねてきた。【０００４】
例えば、特許文献１において、細胞を培養するための培養容器と、培地等を貯蔵しておくための培地貯蔵容器と、細胞を注入するための細胞注入容器と、培養後の細胞懸濁液を回収する細胞回収容器とを導管によって連結し、閉鎖系の環境を構築してなる細胞培養用キットを提案している。このような細胞培養用キットによれば、細胞注入から培地追加、サンプリング、回収までをキット内で閉鎖系を維持しながら行うことが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開２０１３／１１４８４５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、特許文献１には、培養された細胞を回収するにあたり、培養容器を静置して細胞懸濁液中の細胞を沈降させた後に、細胞懸濁液の上澄みを排出し、液量を低減させてから、濃縮された細胞懸濁液を培養容器から細胞回収容器に移送する例が示されている。【０００７】
また、細胞の培養には、通常、数日〜数週間の期間を要するため、培地成分の枯渇や細胞の代謝物の蓄積によって細胞の成長が阻害されてしまわないように、培養期間中に、必要に応じて培地交換を行うことがある。培地交換を行うに際しては、細胞懸濁液の上澄みを排出することによって古い培地を取り除くとともに、それに代えて新しい培地を追加することが考えられる。【０００８】
しかしながら、このようにして細胞の回収や培地交換を行うには、細胞懸濁液の上澄みを排出するに先立って、培養容器を静置して細胞懸濁液中の細胞を沈降させておかなければならず、細胞を沈降させるまでに時間を要してしまう。一方、十分な時間をかけて細胞懸濁液中の細胞を沈降させても、排出操作によって上澄みに細胞が混入し、上澄みと一緒に細胞が排出されてしまう虞もある。特に、培地交換を行うにあたっては、古い培地ができるだけ多く取り除かれるようにして、新しい培地がより多く追加されるようにすることが望まれるが、上澄みの排出量が多くなるほど、細胞の混入が避けられなくなってしまう。【０００９】
また、培地交換を行う際に、古い培地と一緒に細胞が排出されてしまうのを防ぐには、培養容器に設けられたポートの流路にフィルタを取り付けることも考えられる。
しかしながら、ポートの流路径は、通常、１〜１０ｍｍ程度であり、フィルタの面積も比較的小さくなるため、捕捉された細胞によってフィルタに目詰まりが生じ易く、古い培地の排出を妨げてしまう虞がある。さらに、フィルタに捕捉された細胞が培養容器内に戻らずに、フィルタに捕捉されたまま死滅してしまう虞もある。【００１０】
本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであり、例えば、培地交換を行う際に、古い培地と一緒に細胞が排出されてしまうのを抑制できるなど、細胞培養に際して行われる種々の操作を簡便、かつ、効率良く行うために細胞培養の用途に供される細胞培養用容器、及びその使用方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る細胞培養用容器は、細胞培養の用途に供される細胞培養用容器であって、容器本体と注入出用ポートとを備え、前記容器本体の内部が、少なくとも一つのフィルタ部材によって複数の槽に区画されている構成としてある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、細胞培養に際して行われる種々の操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の第一実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。
【図２】本発明の第一実施形態に係る細胞培養用容器の使用例を示す説明図である。
【図３】本発明の第一実施形態に係る細胞培養用容器の他の使用例を示す説明図である。
【図４】本発明の第一実施形態に係る細胞培養用容器の他の使用例を示す説明図である。
【図５】本発明の第一実施形態に係る細胞培養用容器の他の使用例を示す説明図である。
【図６】本発明の第二実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。
【図７】本発明の第二実施形態に係る細胞培養用容器の使用例を示す説明図である。
【図８】本発明の第三実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。
【図９】本発明の第三実施形態に係る細胞培養用容器の使用例を示す説明図である。
【図１０】本発明の第四実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。
【図１１】本発明の第四実施形態に係る細胞培養用容器の使用例を示す説明図である。
【図１２】本発明の第五実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
【００１５】
［第一実施形態］
まず、本発明の第一実施形態について説明する。
なお、図１は、本実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。
【００１６】
本実施形態の一例として図１に示す容器１は、容器本体２と注入出用ポート３ａ，３ｂとを備えている。そして、容器本体２の内部は、シート状のフィルタ部材４によって、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔと、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄとに区画されており、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔと、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄのそれぞれに、注入出用ポート３ａ，３ｂが備えられている。
【００１７】
容器本体２は、培地又は培地中に細胞を懸濁させた細胞懸濁液を、培養に支障なく収容できれば、その具体的な形態は限定されない。例えば、射出成形、ブロー成形などにより所定の形状に成形された容器としてもよく、二枚のプラスチックフィルムを重ねて周辺部をシールしたパウチ状の容器としてもよい。
【００１８】
注入出用ポート３ａ，３ｂは、培地や細胞を注入、排出などする際の出入り口となる部位であり、例えば、培地や細胞などが流通可能な管状の部材を容器本体２に取り付けることによって備えることができる。
【００１９】
また、特に図示しないが、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔと底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄには、例えば、培養中の培地や細胞をサンプリングなどするための注入出用ポートを別途備えるようにしてもよい。
フィルタ部材４によって区画されたそれぞれの槽は、必要に応じて、二以上の注入出用ポートを備えることができる。
【００２０】
図１に示す一例において、容器本体２は、プラスチックフィルムからなり、周辺部がシールされ、その天面２ａ側が台地状に膨出した膨出形状を有し、平坦面とされた天面２ａの縁が傾斜して周辺部に連なるように形成されている。さらに、底面２ｂ側も台地状に膨出した膨出形状を有しており、平坦面とされた底面２ｂの縁が傾斜して周辺部に連なるように形成されている。
【００２１】
容器本体２が、このような膨出形状を有することで、培地や細胞を注入する際の変形を抑制することができる。
すなわち、二枚のプラスチックフィルムを重ねて周辺部をシールしただけの平パウチ状の容器では、容器内が内容液で満たされていくにつれて周辺部が持ち上がるように底面が変形するが、注入量を考慮して容器本体２の膨出形状を設計することで、培地や細胞を注入する際の容器本体２の変形を抑制して、容器本体２の底面２ｂを平坦面のままとすることが可能となる。
したがって、図１に示す容器１は、容器本体２の底面２ｂに培地中の細胞を均一に沈降させ、底面２ｂに沈降した細胞の密度（単位面積あたりの細胞数）に偏りが生じないようにすることが求められる場合に好適に用いられる。
【００２２】
図１に示す容器１は、例えば、次のようにして製造することができる。
まず、二枚のプラスチックフィルムとシート状のフィルタ部材４とを用意し、これらを必要に応じて裁断して、その大きさを揃える。そして、一方のプラスチックフィルムを容器本体２の天面２ａ側となる天面側プラスチックフィルムとし、他方のプラスチックフィルムを容器本体２の底面２ｂ側となる底面側プラスチックフィルムとして、これらを真空成形、圧空成形などにより、その周辺部を残して台地状に膨出するように成形する。
【００２３】
次に、成形された天面側プラスチックフィルムと底面側プラスチックフィルムとの間に、シート状のフィルタ部材４を挿入して、これらの周辺部を重ね合せる。そして、天面側プラスチックフィルムとフィルタ部材４との間と、底面側プラスチックフィルムとフィルタ部材４との間に、それぞれ周辺部の所定の位置において、注入出用ポート３ａ，３ｂを形成する管状の部材を挟み込み、その状態で周辺部を熱融着によりシールし、必要に応じて周辺部をトリミングする。これにより、図１に示す容器１が製造される。
【００２４】
容器本体２を形成するプラスチックフィルムは、ＪＩＳ  Ｋ  ７１２６のガス透過度試験方法に準拠して、試験温度３７℃で測定した酸素の透過度が、５０００ｍＬ／（ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）以上のガス透過性を有するものであるのが好ましい。
また、当該プラスチックフィルムは、細胞培養の進行状況や細胞の状態などを確認できるように、一部又は全部が透明性を有しているのが好ましい。
【００２５】
容器本体２を形成するプラスチックフィルムに用いる材料としては、特に限定されない。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリエステル、ポリアミド、シリコーン系エラストマー、ポリスチレン系エラストマー、テトラフルオロエチレン−ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）などの熱可塑性樹脂が挙げられる。これらは単層で用いても、同種又は異種の材料を積層して用いてもよいが、所定のガス透過性を有しているのが好ましい。さらに、周辺部をシールする際の熱融着性を考慮すると、シーラント層として機能する層を有しているのが好ましい。
【００２６】
また、可撓性を有しながらも、容器本体２の膨出形状が保たれる適度の形状保持性を有するように、容器本体２を形成するのに用いるプラスチックフィルムの厚みは、３０〜２００μｍであるのが好ましい。
【００２７】
また、注入出用ポート３ａ，３ｂを形成する管状の部材は、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレン系エラストマー、ＦＥＰなどの熱可塑性樹脂を用いて、射出成形、押出成形などにより、所定の形状に成形することができる。
【００２８】
また、フィルタ部材４は、少なくとも培地の通過を許容する細孔を有する多孔質体を用いて形成されるが、細胞が細孔に入り込んで抜け出せなくなってしまうようなものは不適である。このような観点から、ポリオレフィン、ポリエステル、ナイロン等のポリアミド、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂等からなる合成樹脂繊維を編んだメッシュシートなどを用いて形成するのが好ましい。
【００２９】
フィルタ部材４の細孔の大きさは、容器１の使用態様によって適宜選択することができる。フィルタ部材４には、培地の通過性を高めるために親水処理が施されているのが好ましく、親水処理を施すことで、細胞が接着し難くすることもできる。
また、フィルタ部材４は、容器１の使用態様によって要求される機能が損なわれない限り、少なくとも一部が上記したような多孔質体を用いて形成されていればよい。例えば、前述したようにして容器１を製造するに際し、上記多孔質体の周囲を枠状に裁断されたプラスチックフィルムで保持するなどしてフィルタ部材４を形成することで、天面側及び底面側プラスチックフィルムとの熱融着がより良好になされるようにすることもできる。
【００３０】
また、容器本体２の大きさは特に限定されないが、例えば、縦５０〜５００ｍｍ、横５０〜５００ｍｍとするのが好ましい。
【００３１】
次に、本実施形態の一例として図１に示す容器１の使用例について説明する。
【００３２】
［第一実施形態の使用例１］
図２は、図１に示す容器１を、培地交換などの操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる培養容器として細胞培養の用途に供する例を示している。
【００３３】
本使用例では、培地で満たされた容器本体２内に、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが備える注入出用ポート３ｂから、培養対象の細胞Ｃを注入して培養を行う。このとき、培養対象の細胞Ｃの大きさを考慮して、フィルタ部材４として、かかる細胞Ｃの通過を許容しない細孔を有するものを選択する。これにより、培養中の細胞Ｃは、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに留まり、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔには移動しないようにすることができる（図２（ａ）参照）。
【００３４】
培養期間中に培地交換を行う際には、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、古い培地を排出する（図２（ｂ）参照）。このとき、培養中の細胞Ｃを、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに留まらせることができるため、古い培地と一緒に排出されないようにすることができ、古い培地をより多く排出させることが可能になる。古い培地を排出した後は、それと同量の新しい培地を天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから注入し（図２（ｃ）参照）、培養を継続する。
【００３５】
このように、本使用例にあっては、培養期間中の培地交換、特に、古い培地の排出操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
【００３６】
また、本使用例における容器１は、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに細胞Ｃを留まらせた状態で、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、容器内の内容液を排出することができる。このため、例えば、特許文献１の細胞培養用キットの培養容器として使用すれば、特許文献１が例示する細胞の回収操作も、細胞の沈降に時間をかけずに、簡便、かつ、効率良く行うことができる。さらに、特許文献１の細胞培養用キットの細胞回収容器として使用し、培養容器から回収された細胞懸濁液を底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに移送して、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、洗浄液の注入、排出を繰り替えして細胞の洗浄操作が行われるようにすることで、特許文献１の細胞培養用キットに洗浄回収機構を導入することができる。
【００３７】
また、抗体産生細胞を底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄで培養し、産生された抗体を天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから取り出すというように、抗体産生容器としての応用も可能である。
【００３８】
このように、本使用例では、フィルタ部材４として、培養対象の細胞Ｃの通過を許容しない細孔を有するものを選択して、フィルタ部材４によって区画された一方の槽２ｎｄに細胞Ｃを注入して培養を行うことで、当該槽２ｎｄに細胞Ｃを留まらせた状態で、フィルタ部材４によって区画された他方の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、培地や洗浄液などを注入出することができる。
【００３９】
したがって、図１に示す容器１を使用するに際しては、必要に応じて、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔで細胞培養を行い、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが備える注入出用ポート３ｂから、培地や洗浄液などの注入出がなされるようにしてもよい。
【００４０】
［第一実施形態の使用例２］
図３は、図１に示す容器１を、細胞の凝集塊Ｃａｇｇを所望の大きさに分割する操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる凝集塊分割容器として細胞培養の用途に供する例を示している。
【００４１】
本使用例では、培地で満たされた容器本体２内に、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、凝集塊Ｃａｇｇを培地とともに圧送する。このとき、フィルタ部材４として、凝集塊Ｃａｇｇを分割したい大きさに応じた細孔を有するものを選択する。これにより、凝集塊Ｃａｇｇは、フィルタ部材４を通過する際に、フィルタ部材４の細孔に応じた大きさに分割されながら、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに送られていく。
所望の大きさに分割された凝集塊Ｃｄｉｖは、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが備える注入出用ポート３ｂから取り出すことができる。
【００４２】
このように、本使用例にあっては、フィルタ部材４として、細胞の凝集塊Ｃａｇｇを分割したい大きさに応じた細孔を有するものを選択し、フィルタ部材４によって区画された一方の槽１ｓｔに、凝集塊Ｃａｇｇを培地とともに圧送することで、細胞の凝集塊Ｃａｇｇを所望の大きさに分割する操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
【００４３】
したがって、図１に示す容器１を使用するに際しては、必要に応じて、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが備える注入出用ポート３ｂから、凝集塊Ｃａｇｇを培地とともに圧送するようにしてもよい。
また、特に図示しないが、容器本体２の内部を三槽以上に区画しておき、各槽を区画するフィルタ部材４の細孔の大きさを適宜調整することで、凝集塊Ｃａｇｇを段階的に分割することもできる。さらに、各槽に注入出用ポートを備えるようにすることで、異なる大きさに分割された凝集塊Ｃｄｉｖを、それぞれ取り出すようにすることもできる。
【００４４】
［第一実施形態の使用例３］
図４は、図１に示す容器１を、混在する大きさの異なる二種類の細胞、例えば、シングルセルＣｓとその凝集塊Ｃａｇｇとを分離する操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる細胞分離容器として細胞培養の用途に供する例を示している。
【００４５】
本使用例では、培地で満たされた容器本体２内に、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、大きさの異なる二種類の細胞Ｃｓ，Ｃａｇｇが混在した細胞懸濁液を注入する（ｓｔｅｐ１）。注入後は、容器１を静置し、必要に応じて振動を与える。このとき、フィルタ部材４として、分離したい二種類の細胞Ｃｓ，Ｃａｇｇのうち、小さい方の細胞Ｃｓの通過を許容するが、大きい方の細胞Ｃａｇｇの通過を許容しない細孔を有するものを選択する。これにより、小さい方の細胞Ｃｓは、フィルタ部材４の細孔を通過して、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに沈降していき、大きい方の細胞Ｃａｇｇは、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔに留まるようにすることができる。
【００４６】
底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに沈降した小さい方の細胞Ｃｓは、大きい方の細胞Ｃａｇｇと分離されて、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが備える注入出用ポート３ｂから取り出すことができる（ｓｔｅｐ２）。一方、小さい方の細胞Ｃｓと分離されて天面２ａ側の第一の槽１ｓｔに留まる大きい方の細胞Ｃａｇｇは、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから取り出すことができる（ｓｔｅｐ３）。
【００４７】
このように、本使用例にあっては、フィルタ部材４として、混在する細胞のうち少なくとも一の細胞の通過を許容するが、それ以外の細胞の通過を許容しない細孔を有するものを選択し、フィルタ部材４によって区画された一方の槽１ｓｔに、混在する大きさの異なる細胞を注入して、フィルタ部材４によって区画された他方の槽２ｎｄから、フィルタ部材４を通過した細胞を取り出すことで、混在する大きさの異なる細胞を分離する操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
【００４８】
したがって、特に図示しないが、容器本体２の内部を三槽以上に区画しておき、各槽を区画するフィルタ部材４の細孔の大きさを適宜調整するとともに、各槽に注入出用ポートを備えるようにすることで、大きさの異なる三種類以上の細胞を分離することもできる。
【００４９】
［第一実施形態の使用例４］
図５は、図１に示す容器１を、異なる種類の細胞Ｃａ，Ｃｂを同一容器内で共培養した後に、これらを別々に取り出す操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる共培養容器として細胞培養の用途に供する例を示している。
【００５０】
本使用例では、培地で満たされた容器本体２内に、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから細胞Ｃａを注入するとともに、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが備える注入出用ポート３ｂから細胞Ｃｂを注入して、細胞Ｃａと細胞Ｃｂとを共培養する。このとき、フィルタ部材４として、共培養されるいずれの細胞Ｃａ，Ｃｂも通過を許容しない細孔を有するものを選択する。これにより、一方の細胞Ｃａは天面２ａ側の第一の槽１ｓｔに、他方の細胞Ｃｂは底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに、それぞれが留まった状態で、両者が混ざり合うことなく同一容器内で共培養することができる。
【００５１】
培養終了後には、一方の細胞Ｃａは天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから取り出すことができ、他方の細胞Ｃｂは底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが備える注入出用ポート３ｂから取り出すことができる。
【００５２】
このように、本使用例にあっては、フィルタ部材４として、共培養されるいずれの細胞Ｃａ，Ｃｂも通過を許容しない細孔を有するものを選択し、フィルタ部材４によって区画されたそれぞれの槽１ｓｔ，２ｎｄに、異なる種類の細胞Ｃａ，Ｃｂを種類ごとに別々に注入することで、当該細胞Ｃａ，Ｃｂが混ざり合うことなく同一容器内で共培養することができ、培養終了後に、これらを別々に取り出す操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
【００５３】
したがって、特に図示しないが、容器本体２の内部を三槽以上に区画しておき、各槽に注入出用ポートを備えるようにすることで、三種類以上の細胞を共培養することもできる。
【００５４】
［第二実施形態］
次に、本発明の第二実施形態について説明する。
なお、図６は、本実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。
【００５５】
本実施形態の一例として図６に示す容器１は、容器本体２と注入出用ポート３ａとを備えている。そして、容器本体２の内部は、シート状のフィルタ部材４によって、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔと、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄとに区画されており、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔに、注入出用ポート３ａが備えられている。
【００５６】
図６に示す容器１は、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが注入出用ポート３ｂを備えていない点で、第一実施形態の一例として図１に示した容器１と異なっているが、その以外の構成は共通している。このような容器１は、第一実施形態の図１に示した容器１と同様にして製造することができ、その際、注入出用ポート３ｂを形成する管状の部材を省略すればよい。
【００５７】
本実施形態が、前述した第一実施形態と異なるのは、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが注入出用ポート３ｂを備えていない点にあり、これ以外の構成は、前述した第一実施形態と共通するため、重複する説明は省略する。
なお、第一実施形態と同様に、容器本体２の具体的な形態が限定されないことはいいうまでもない。
【００５８】
次に、本実施形態の一例として図６に示す容器１の使用例について説明する。
【００５９】
［第二実施形態の使用例］
図７は、図６に示す容器１を、凝集塊Ｃａｇｇを形成する細胞Ｃｓを培養するにあたり、その培地交換などの操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる培養容器として細胞培養の用途に供する例を示している。
【００６０】
本使用例では、凝集塊Ｃａｇｇを形成する細胞Ｃｓを培養対象とし、フィルタ部材４として、凝集塊Ｃａｇｇを形成する前の細胞（シングルセル）Ｃｓの通過は許容するが、凝集塊Ｃａｇｇの通過は許容しない細孔を有するものを選択する。
【００６１】
これにより、培地で満たされた容器本体２内に、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、培養対象の細胞（シングルセル）Ｃｓを注入すると、細胞Ｃｓはフィルタ部材４を通過して、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに沈降していく（図７（ａ）参照）。そして、培養が進行すると、細胞Ｃｓは凝集塊Ｃａｇｇを形成し、フィルタ部材４を通過できなくなり、これによって、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに凝集塊Ｃａｇｇを留まらせた状態で、培養を進行させることができる（図７（ｂ）参照）。
【００６２】
したがって、培養期間中に培地交換を行う際には、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、古い培地を排出するとともに、新しい培地を注入することにより（図７（ｃ）参照）、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに凝集塊Ｃａｇｇを留まらせたまま、培地交換を行うことができる。さらに、培養終了後には、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、洗浄液の注入、排出を繰り替えして行うことにより、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに凝集塊Ｃａｇｇを留まらせたまま、凝集塊Ｃａｇｇを洗浄することもできる。
【００６３】
このように、本使用例にあっては、凝集塊Ｃａｇｇを形成する細胞Ｃｓを培養するにあたり、フィルタ部材４として、凝集塊Ｃａｇｇを形成する前の細胞Ｃｓの通過は許容するが、凝集塊Ｃａｇｇの通過は許容しない細孔を有するものを選択し、細胞Ｃｓを第一の槽１ｓｔに注入し、次いで、第二の槽２ｎｄに沈降させて、形成された凝集塊Ｃａｇｇを第二の槽２ｎｄに留まらせた状態で培養することで、培養期間中の培地交換や、培養終了後の洗浄などの操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
【００６４】
そして、洗浄後は、容器本体２内に保存液などを注入することで、容器１を培養された細胞（凝集塊Ｃａｇｇ）の保管、搬送に利用することもできる。
なお、特に図示しないが、前述した第一実施形態と同様に、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが注入出用ポート３ｂを備えるようにすれば、注入出用ポート３ｂから培養された細胞（凝集塊Ｃａｇｇ）を取り出すこともできる。
【００６５】
［第三実施形態］
次に、本発明の第三実施形態について説明する。
なお、図８は、本実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。
【００６６】
本実施形態の一例として図８に示す容器１は、容器本体２と注入出用ポート３ａとを備えている。そして、容器本体２の内部は、シート状のフィルタ部材４によって、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔと、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄとに区画されており、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔに、注入出用ポート３ａが備えられているとともに、容器本体２の底面２ｂには、複数の凹部５が設けられている
【００６７】
図８に示す容器１は、容器本体２の底面２ｂに、複数の凹部５が設けられている点で、第二実施形態の一例として図６に示した容器１と異なっているが、その以外の構成は共通している。このような容器１は、第二実施形態の図６に示した容器１と同様にして製造することができ、底面側プラスチックフィルムを成形するに際して、金型などを適宜調整することで、凹部５を所望の形状、配列で成形することができる。
【００６８】
容器本体２の底面２ｂに複数の凹部５を設けることで、培地中を沈降する細胞が、それぞれの凹部５の底部に集められ、細胞密度が高められた状態で、効率良く培養することができる。それぞれの凹部５の底部に集められた細胞が、容器本体２内を移動することなく、一つの凹部５に留まって、細胞密度が高められた状態が維持されるようにするために、凹部５は、その開口径（直径）が０．３〜１０ｍｍであるのが好ましく、より好ましくは０．３〜５ｍｍ、さらに好ましくは０．５〜４ｍｍ、特に好ましくは０．５〜２ｍｍであり、深さが０．１ｍｍ以上であるのが好ましい。
また、図示する例では、凹部５を椀状に形成しているが、必要に応じて、円錐状、円錐台状などに形成することもできる。
【００６９】
本実施形態が、前述した第二実施形態と異なるのは、容器本体２の底面２ｂに複数の凹部５を設けた点にあり、これ以外の構成は、前述した第二実施形態と共通するため、重複する説明は省略する。
なお、第一及び第二実施形態と同様に、容器本体２の具体的な形態が限定されないことはいいうまでもない。
【００７０】
次に、本実施形態の一例として図８に示す容器１の使用例について説明する。
【００７１】
［第三実施形態の使用例］
図９は、図８に示す容器１を、凝集塊Ｃａｇｇを形成する細胞Ｃｓを培養するにあたり、細胞密度が高められた状態で効率良く培養するとともに、その培地交換などの操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる培養容器として細胞培養の用途に供する例を示している。
【００７２】
本使用例では、凝集塊Ｃａｇｇを形成する細胞Ｃｓを培養対象とし、フィルタ部材４として、凝集塊Ｃａｇｇを形成する前の細胞（シングルセル）Ｃｓの通過は許容するが、凝集塊Ｃａｇｇの通過は許容しない細孔を有するものを選択する。
【００７３】
これにより、培地で満たされた容器本体２内に、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、培養対象の細胞（シングルセル）Ｃｓを注入すると、細胞Ｃｓはフィルタ部材４を通過して、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに沈降していく。沈降した細胞Ｃｓは、それぞれの凹部５の底部に集められ、細胞密度が高められた状態で効率良く培養することができる。そして、培養が進行すると、細胞Ｃｓは凝集塊Ｃａｇｇを形成し、フィルタ部材４を通過できなくなり、これによって、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに凝集塊Ｃａｇｇを留まらせた状態で、培養を進行させることができる。
【００７４】
したがって、培養期間中に培地交換を行う際には、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、古い培地を排出するとともに、新しい培地を注入することにより、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに凝集塊Ｃａｇｇを留まらせたまま、培地交換を行うことができる。このとき、特に図示しないが、例えば、底面２ｂの凹部５の周囲（隣接する凹部５の間に位置する面）にフィルタ部材４を接着するなどして、凹部５の開口部を覆うようにフィルタ部材４を容器本体２内に固定しておくのが好ましい。このようにすることで、凹部５の底部に集められた細胞（凝集塊Ｃａｇｇ）の移動を抑止して、より確実に一つの凹部５に留まらせておくことができる。さらに、培養終了後には、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａから、洗浄液の注入、排出を繰り替えして行うことにより、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに凝集塊Ｃａｇｇを留まらせたまま、凝集塊Ｃａｇｇを洗浄することができる。
【００７５】
このように、本使用例にあっては、凝集塊Ｃａｇｇを形成する細胞Ｃｓを培養するにあたり、フィルタ部材４として、凝集塊Ｃａｇｇを形成する前の細胞Ｃｓの通過は許容するが、凝集塊Ｃａｇｇの通過は許容しない細孔を有するものを選択し、細胞Ｃｓを第一の槽１ｓｔに注入し、次いで、第二の槽２ｎｄに沈降させて、沈降した細胞Ｃｓを凹部５の底部に集めて、細胞密度が高められた状態で効率良く培養しつつ、形成された凝集塊Ｃａｇｇを第二の槽２ｎｄに留まらせた状態で培養することで、培養期間中の培地交換や、培養終了後の洗浄などの操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
【００７６】
そして、洗浄後は、容器本体２内に保存液などを注入することで、容器１を培養された細胞（凝集塊Ｃａｇｇ）の保管、搬送に利用することもできる。
なお、特に図示しないが、前述した第一実施形態と同様に、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが注入出用ポート３ｂを備えるようにすれば、注入出用ポート３ｂから培養された細胞（凝集塊Ｃａｇｇ）を取り出すこともできる。
【００７７】
［第四実施形態］
次に、本発明の第四実施形態について説明する。
なお、図１０は、本実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。
【００７８】
本実施形態の一例として図１０に示す容器１は、容器本体２と注入出用ポート３ａ，３ｂ，３ｃとを備えている。そして、容器本体２の内部は、二つのシート状のフィルタ部材４によって、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔと、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄと、これらの間に位置する第三の槽３ｒｄとに区画されている。
【００７９】
また、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔには、その流入出口となる注入出用ポート３ａ（ＩＮ），３ａ（ＯＵＴ）が備えられており、これと同様に、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄには、その流入出口となる注入出用ポート３ｂ（ＩＮ），３ｂ（ＯＵＴ）が備えられている。さらに、第三の槽３ｒｄには、注入出用ポート３ｃが備えられている。
【００８０】
図１０に示す容器１は、容器本体２の内部を三つの槽に区画し、それぞれの槽に注入出用ポートが備えられているとともに、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔに二つの注入出用ポート３ａ（ＩＮ），３ａ（ＯＵＴ）が備えられ、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄに二つの注入出用ポート３ｂ（ＩＮ），３ｂ（ＯＵＴ）が備えられている点で、第一実施形態の一例として図１に示した容器１と異なっているが、その以外の構成は共通している。このような容器１は、例えば、次のようにして製造することができる。
【００８１】
まず、二枚のプラスチックフィルムと二枚のシート状のフィルタ部材４とを用意し、これらを必要に応じて裁断して、その大きさを揃える。そして、一方のプラスチックフィルムを容器本体２の天面２ａ側となる天面側プラスチックフィルムとし、他方のプラスチックフィルムを容器本体２の底面２ｂ側となる底面側プラスチックフィルムとして、これらを真空成形、圧空成形などにより、その周辺部を残して台地状に膨出するように成形する。
【００８２】
次に、成形された天面側プラスチックフィルムと底面側プラスチックフィルムとの間に、二枚のシート状のフィルタ部材４を挿入して、これらの周辺部を重ね合せる。そして、天面側プラスチックフィルムとフィルタ部材４との間に、その周辺部の所定の位置において、注入出用ポート３ａ（ＩＮ），３ａ（ＯＵＴ）を形成する管状の部材を挟み込み、底面側プラスチックフィルムとフィルタ部材４との間に、その周辺部の所定の位置において、注入出用ポート３ｂ（ＩＮ），３ｂ（ＯＵＴ）を形成する管状の部材を挟み込み、二枚のシート状のフィルタ部材４の間に、その周辺部の所定の位置において、注入出用ポート３ｃを形成する管状の部材を挟み込み、その状態で周辺部を熱融着によりシールし、必要に応じて周辺部をトリミングする。これにより、図１０に示す容器１が製造される。
【００８３】
本実施形態が、前述した第一実施形態と異なるのは、容器本体２の内部が三つの槽に区画され、それぞれの槽が注入出用ポートを備えるとともに、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが二つの注入出用ポート３ａ（ＩＮ），３ａ（ＯＵＴ）を備え、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが二つの注入出用ポート３ｂ（ＩＮ），３ｂ（ＯＵＴ）を備えている点にあり、これ以外の構成は、前述した第一実施形態と共通するため、重複する説明は省略する。
なお、第一、第二、及び第三実施形態と同様に、容器本体２の具体的な形態が限定されないことはいうまでもない。
【００８４】
次に、本実施形態の一例として図１０に示す容器１の使用例について説明する。
【００８５】
［第四実施形態の使用例］
図１１は、図１０に示す容器１を、培養対象の細胞Ｃが、生体内で成長、増殖、分化する環境を再現する操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる培養容器として細胞培養の用途に供する例を示している。
【００８６】
本使用例では、第三の槽３ｒｄが備える注入出用ポート３ｃから培養対象の細胞Ｃを注入して培養を行うが、その際、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔと、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄとのそれぞれには、成分組成の異なる培地を流通させる。より詳しくは、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔが備える注入出用ポート３ａ（ＩＮ）と、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄが備える注入出用ポート３ｂ（ＩＮ）のそれぞれから流入した成分組成の異なる培地が、第三の槽３ｒｄで混ざり合いながら、それぞれの注入出用ポート３ａ（ＯＵＴ），３ｂ（ＯＵＴ）から流出するようにする。
【００８７】
このとき、培養対象の細胞Ｃの大きさを考慮して、フィルタ部材４として、かかる細胞Ｃの通過を許容しない細孔を有するものを選択する。そして、天面２ａ側の第一の槽１ｓｔと、底面２ｂ側の第二の槽２ｎｄのそれぞれに流通させる培地は、細胞の成長、増殖、分化を制御する種々の細胞外基質や、細胞に刺激を与える種々のシグナル物質などを含み、これらが第三の槽３ｒｄで混ざり合ったときに、その濃度勾配や到達方向などが生体内の環境と同等となるように、成分組成や流量・流速などが調整される。これにより、第三の槽３ｒｄに生体内の環境を再現しつつ、細胞Ｃを第三の槽３ｒｄに留まらせた状態で培養を行うことができる。
【００８８】
このように、本使用例にあっては、フィルタ部材４として、培養対象の細胞Ｃの通過を許容しない細孔を有するものを選択し、第一の槽１ｓｔと第二の槽２ｎｄとのそれぞれに、成分組成の異なる培地を流通させながら、第三の槽３ｒｄに細胞Ｃを注入して培養を行うことで、培養対象の細胞Ｃが、生体内で成長、増殖、分化する環境を再現する操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
【００８９】
［第五実施形態］
次に、本発明の第五実施形態について説明する。
なお、図１２は、本実施形態に係る細胞培養用容器の一例を示す説明図である。
【００９０】
従来、細胞培養に際しては、ウェルプレートが広く用いられている。例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から、神経幹細胞や、心筋、膵臓、肝臓、軟骨などへの分化誘導の際には、ウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）に細胞を播種し、ウェル内で凝集塊を形成させて分化誘導を進めるという方法が採られるのが一般的である。
【００９１】
しかしながら、ウェルプレートを用いて細胞を培養するに際しては、それぞれのウェルに対して培地交換を行わなければならない。このため、培養中の細胞が混入しないように気をつけながら古い培地をピペットで吸い上げて排出し、次いで、新しい培地をピペットで注入するというように、煩雑なピペット操作をウェルの数だけ何回も繰り返す必要がある。
【００９２】
本実施形態は、ウェルプレートのように、複数の細胞培養部を有する容器を用いて細胞を培養するに際し、培地交換などの操作を簡便、かつ、効率良く行うことができるようにするためのものである。
【００９３】
本実施形態の一例として図１２に示す容器１は、細胞培養部となる複数の凹部６を有する容器本体２を備えており、それぞれの凹部６の開口部が、シート状のフィルタ部材４によって覆われている。それぞれの凹部６の開口部を覆うフィルタ部材４は、凹部６の周囲（隣接する凹部６の開口部の間に位置する面）に密着するように、容器本体２に取り付ける。好ましくは、容器本体２に剥離可能に接着する。
【００９４】
本実施形態において、容器本体２は、細胞や培地などを、それぞれの凹部６に培養に支障なく収容できれば、その具体的な形態は限定されないが、容器本体２には、その周りを取り囲むようにして立ち上る側壁部７を設けておくのが好ましい。
【００９５】
また、フィルタ部材４については、前述した第一実施形態で説明した通りである。本実施形態では、凝集塊を形成する細胞を培養対象とし、フィルタ部材４として、凝集塊の通過は許容しない細孔を有するものを選択する。
【００９６】
このような容器１を用いて培養対象の細胞を培養するには、細胞培養部となるそれぞれの凹部６に、培養対象の細胞を培地とともに注入して培養を開始する。そして、培養が進行するにつれて、凹部６に注入された細胞は凝集塊を形成する。
【００９７】
培養が進行して培地を交換する時期になったら、それぞれの凹部６から古い培地を排出する。このとき、それぞれの凹部６の開口部を覆うフィルタ部材４は、凝集塊の通過を許容しないので、培地交換を行うに際しては、容器１を傾けるだけで古い培地のみを流出させることができ、ピペット操作を伴わずに、それぞれの凹部６から古い培地を排出することができる。
【００９８】
また、容器本体２に、その周りを取り囲むようにして立ち上る側壁部７を設けておけば、側壁部７の内側に新しい培地を注ぐだけで、それぞれの凹部６に新しい培地が流入していくようにすることができる。このようにすることで、ピペット操作を伴わずに、それぞれの凹部６に新しい培地を注入することができる。
【００９９】
そして、培養終了後には、フィルタ部材４を容器本体２から取り外して、凹部６の開口部を開放することで、凝集塊を崩さずに取り出すことが可能となる。
なお、培養終了後には、培地交換を行うのと同様にして、それぞれの凹部６に洗浄液を注入、排出させることで、凝集塊を洗浄することもできる。
【０１００】
このように、本実施形態によれば、凝集塊を形成する細胞を培養するに際し、その培養期間中の培地交換などの操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
【０１０１】
以上、本発明について、好ましい実施形態を示して説明したが、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲で種々の変更実施が可能であることはいうまでもない。
【０１０２】
本発明によれば、細胞培養、特に、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の継代、及びそれら幹細胞から、神経幹細胞や、心筋、膵臓、肝臓、軟骨などへの分化誘導の過程で形成させるスフェア（凝集塊）培養に際して行われる種々の操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。また、リンパ球やハイブリドーマなどの抗体産生細胞、巨核球や赤血球等の浮遊細胞の培養に関しても、種々の操作を簡便、かつ、効率良く行うことができる。
【０１０３】
この明細書に記載の文献及び本願のパリ優先権の基礎となる日本出願明細書の内容を全てここに援用する。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明は、医薬学・生化学分野において、細胞を効率良く培養する技術として利用できる。
【符号の説明】
【０１０５】
１          容器（細胞培養用容器）
２          容器本体
２ａ          天面
２ｂ          底面
３ａ，３ｂ，３ｃ          注入出用ポート
４          フィルタ部材
５          凹部
６          凹部
７          側壁部
１ｓｔ          第一の槽
２ｎｄ          第二の槽
３ｒｄ          第三の槽
【図１】
2017183570.tif 000003
【図２】
2017183570.tif 000004
【図３】
2017183570.tif 000005
【図４】
2017183570.tif 000006
【図５】
2017183570.tif 000007
【図６】
2017183570.tif 000008
【図７】
2017183570.tif 000009
【図８】
2017183570.tif 000010
【図９】
2017183570.tif 000011
【図１０】
2017183570.tif 000012
【図１１】
2017183570.tif 000013
【図１２】
2017183570.tif 000014
【国際調査報告】
2017183570.tif 000015
2017183570.tif 000016
2017183570.tif 000017
2017183570.tif 000018