(57)【要約】  本発明は、細胞外小胞含有試料から高純度の細胞外小胞を回収することを提供する。具体的には、本発明は、以下を含む、細胞外小胞の回収方法を提供する：（１）細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理すること；および（２）キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること。
2018070479.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、細胞外小胞の回収方法：
（１）細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理すること；および
（２）キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること。
【請求項２】
キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、シュウ酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）、およびそれらの塩、並びにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞外小胞含有試料が、１〜２００ｍＭのキレート剤で処理される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細胞外小胞含有試料が、２０〜２００ｍＭのキレート剤で処理される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞外小胞がエクソソームである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
分離が、細胞外小胞膜結合物質を用いた沈降法、又は細胞外小胞含有試料の超遠心法により行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞外小胞膜結合物質がＣＤ９に対する抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞外小胞含有試料が体液または培養上清である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞外小胞含有試料が血液試料、尿、または乳汁である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
以下を含む、細胞外小胞の分析方法：
（１）細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理すること；
（２）キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
（３）分離された細胞外小胞を分析すること。
【請求項１１】
分離された細胞外小胞中のタンパク質が分析される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
キレート剤および細胞外小胞膜結合物質を含む、キット。
【請求項１３】
細胞外小胞と細胞外小胞吸着タンパク質との結合の抑制方法であって、
細胞外小胞吸着タンパク質が結合した細胞外小胞をキレート剤で処理して、細胞外小胞から細胞外小胞吸着タンパク質を解離させることを含み、
細胞外小胞吸着タンパク質が、アルブミン、シナプトタグミン様タンパク質４、ビトロネクチン、細胞分裂制御タンパク質２ホモログ、トリプシン−２、免疫グロブリンμ重鎖疾患タンパク質、α−１Ｂ−糖タンパク質、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＷＯＬ、ヘモペキシン、アンチトロンビン−ＩＩＩ、プロトロンビン、ゲルソリン、補体Ｃ１サブ成分、補体因子Ｂ、補体成分Ｃ９、フィコリン−２、血清パラオキソナーゼ／アリレステラーゼ１、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−Ｉ領域Ｄａｕｄｉ、および免疫グロブリン重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＴＵＲからなる群より選ばれる１以上のタンパク質である、方法。
【請求項１４】
アルブミン、シナプトタグミン様タンパク質４、ビトロネクチン、細胞分裂制御タンパク質２ホモログ、トリプシン−２、免疫グロブリンμ重鎖疾患タンパク質、α−１Ｂ−糖タンパク質、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＷＯＬ、ヘモペキシン、アンチトロンビン−ＩＩＩ、プロトロンビン、ゲルソリン、補体Ｃ１サブ成分、補体因子Ｂ、補体成分Ｃ９、フィコリン−２、血清パラオキソナーゼ／アリレステラーゼ１、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−Ｉ領域Ｄａｕｄｉ、および免疫グロブリン重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＴＵＲからなる群より選ばれる１以上の細胞外小胞吸着タンパク質が解離している、遊離した天然の細胞外小胞。
【請求項１５】
前記群より選ばれる全ての細胞外小胞吸着タンパク質が解離している、請求項１４に記載の細胞外小胞。
【請求項１６】
前記細胞外小胞からの細胞外小胞吸着タンパク質の解離度が５０％以上である、請求項１４または１５に記載の細胞外小胞。
【請求項１７】
前記細胞外小胞が単離または精製されている、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項１８】
前記細胞外小胞がエクソソームである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項１９】
前記細胞外小胞が、以下：
（１）細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理すること；および
（２）キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；
を含む方法により得られるものである、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項２０】
（Ａ）アルブミン、シナプトタグミン様タンパク質４、ビトロネクチン、細胞分裂制御タンパク質２ホモログ、トリプシン−２、免疫グロブリンμ重鎖疾患タンパク質、α−１Ｂ−糖タンパク質、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＷＯＬ、ヘモペキシン、アンチトロンビン−ＩＩＩ、プロトロンビン、ゲルソリン、補体Ｃ１サブ成分、補体因子Ｂ、補体成分Ｃ９、フィコリン−２、血清パラオキソナーゼ／アリレステラーゼ１、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−Ｉ領域Ｄａｕｄｉ、および免疫グロブリン重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＴＵＲからなる群より選ばれる１以上の細胞外小胞吸着タンパク質が解離している、遊離した天然の細胞外小胞を含み、
（Ｂ）前記１以上の細胞外小胞吸着タンパク質を含まない、溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外小胞の回収方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）は、さまざまな種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞であり、血液などの体液中に存在する。細胞外に分泌される細胞外小胞には、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）、アポトーシス胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｂｌｅｂ）が含まれる。細胞外小胞は、細胞間の情報伝達等の機能を担う種々の物質を含むことから、診断、創薬等の目的のために解析されている。よって、このような解析に有用な細胞外小胞の処理方法の開発が求められている。例えば、特許文献１には、細胞外小胞の安定化のためにキレート剤（例、ＥＤＴＡ）を使用することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１５／０１２５８６４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
細胞外小胞含有試料から高純度の細胞外小胞を回収することができれば、診断、創薬等の応用に有望である。細胞外小胞は主に、細胞外小胞マーカーに対する抗体を用いる免疫沈降法、または超遠心法により回収されている。しかし、このような方法により回収される細胞外小胞は必ずしも高純度ではなく、また、品質にばらつきがある。【０００５】
したがって、本発明の目的は、細胞外小胞を高純度で回収できる方法を開発することである。【０００６】
また、本発明の別の目的は、より均一な品質の細胞外小胞を回収できる方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理した後に回収することにより、細胞外小胞を高純度で回収できること等を見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、細胞外小胞の回収方法：
（１）細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理すること；および
（２）キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること。
〔２〕キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、シュウ酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）、およびそれらの塩、並びにそれらの混合物からなる群から選択される、〔１〕に記載の方法。
〔３〕細胞外小胞含有試料が、１〜２００ｍＭのキレート剤で処理される、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕細胞外小胞含有試料が、２０〜２００ｍＭのキレート剤で処理される、〔３〕に記載の方法。
〔５〕細胞外小胞がエクソソームである、〔１］〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕分離が、細胞外小胞膜結合物質を用いた沈降法、又は細胞外小胞含有試料の超遠心法により行われる、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕細胞外小胞膜結合物質がＣＤ９に対する抗体である、〔６〕に記載の方法。
〔８〕細胞外小胞含有試料が体液または培養上清である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕細胞外小胞含有試料が血液試料、尿、または乳汁である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕以下を含む、細胞外小胞の分析方法：
（１）細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理すること；
（２）キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
（３）分離された細胞外小胞を分析すること。
〔１１〕分離された細胞外小胞中のタンパク質が分析される、〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕キレート剤および細胞外小胞膜結合物質を含む、キット。
〔１３〕細胞外小胞と細胞外小胞吸着タンパク質との結合の抑制方法であって、
細胞外小胞吸着タンパク質が結合した細胞外小胞をキレート剤で処理して、細胞外小胞から細胞外小胞吸着タンパク質を解離させることを含み、
細胞外小胞吸着タンパク質が、アルブミン、シナプトタグミン様タンパク質４、ビトロネクチン、細胞分裂制御タンパク質２ホモログ、トリプシン−２、免疫グロブリンμ重鎖疾患タンパク質、α−１Ｂ−糖タンパク質、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＷＯＬ、ヘモペキシン、アンチトロンビン−ＩＩＩ、プロトロンビン、ゲルソリン、補体Ｃ１サブ成分、補体因子Ｂ、補体成分Ｃ９、フィコリン−２、血清パラオキソナーゼ／アリレステラーゼ１、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−Ｉ領域Ｄａｕｄｉ、および免疫グロブリン重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＴＵＲからなる群より選ばれる１以上のタンパク質である、方法。
〔１４〕アルブミン、シナプトタグミン様タンパク質４、ビトロネクチン、細胞分裂制御タンパク質２ホモログ、トリプシン−２、免疫グロブリンμ重鎖疾患タンパク質、α−１Ｂ−糖タンパク質、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＷＯＬ、ヘモペキシン、アンチトロンビン−ＩＩＩ、プロトロンビン、ゲルソリン、補体Ｃ１サブ成分、補体因子Ｂ、補体成分Ｃ９、フィコリン−２、血清パラオキソナーゼ／アリレステラーゼ１、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−Ｉ領域Ｄａｕｄｉ、および免疫グロブリン重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＴＵＲからなる群より選ばれる１以上の細胞外小胞吸着タンパク質が解離している、遊離した天然の細胞外小胞。
〔１５〕前記群より選ばれる全ての細胞外小胞吸着タンパク質が解離している、〔１４〕に記載の細胞外小胞。
〔１６〕前記細胞外小胞からの細胞外小胞吸着タンパク質の解離度が５０％以上である、〔１４〕または〔１５〕に記載の細胞外小胞。
〔１７〕前記細胞外小胞が単離または精製されている、〔１４〕〜〔１６〕のいずれかに記載の細胞外小胞。
〔１８〕前記細胞外小胞がエクソソームである、〔１４〕〜〔１７〕のいずれかに記載の細胞外小胞。
〔１９〕前記細胞外小胞が、以下：
（１）細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理すること；および
（２）キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；
を含む方法により得られるものである、〔１４〕〜〔１６〕のいずれかに記載の細胞外小胞。
〔２０〕（Ａ）アルブミン、シナプトタグミン様タンパク質４、ビトロネクチン、細胞分裂制御タンパク質２ホモログ、トリプシン−２、免疫グロブリンμ重鎖疾患タンパク質、α−１Ｂ−糖タンパク質、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＷＯＬ、ヘモペキシン、アンチトロンビン−ＩＩＩ、プロトロンビン、ゲルソリン、補体Ｃ１サブ成分、補体因子Ｂ、補体成分Ｃ９、フィコリン−２、血清パラオキソナーゼ／アリレステラーゼ１、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−Ｉ領域Ｄａｕｄｉ、および免疫グロブリン重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＴＵＲからなる群より選ばれる１以上の細胞外小胞吸着タンパク質が解離している、遊離した天然の細胞外小胞を含み、
（Ｂ）前記１以上の細胞外小胞吸着タンパク質を含まない、溶液。
【発明の効果】
【０００９】
細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理することにより、回収される細胞外小胞への夾雑物の吸着を低減することができる。したがって、本発明によれば、細胞外小胞を高純度で回収することができる。また、細胞外小胞含有試料に含まれる細胞外小胞吸着タンパク質の種類および量は、細胞外小胞含有試料の種類、細胞外小胞含有試料が由来する生物の種類、並びに細胞外小胞含有試料が由来する生物の状態によって異なると考えられるが、本発明によれば、細胞外小胞への種々の吸着タンパク質の結合を抑制することができる。したがって、本発明によれば、より均一な品質の細胞外小胞の回収が可能になると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例１におけるＰＢＳ（「ｃｏｎｔｒｏｌ」）またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（「ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ」）で希釈した血清検体の免疫沈降法（ＩＰ）で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウェスタンブロッティング（ＷＢ）を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例２における各濃度の各キレート剤で希釈した血清検体の免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウェスタンブロッティングを示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例２における各濃度の各キレート剤で希釈した血漿検体の免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウェスタンブロッティングを示す図である。
【図３】図３は、実施例３におけるＰＢＳ（「ｃｏｎｔｒｏｌ」）またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（「ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ」）で希釈した血清検体の超遠心法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウェスタンブロッティングを示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例４においてヒト結腸腺癌細胞ＬｏＶｏの培養上清を超遠心し、得られた沈殿物を再懸濁させ、再度超遠心し、得られた沈殿物を再懸濁することにより得られたサンプルの抗ＣＤ９抗体および抗ＣＥＡ抗体によるウェスタンブロッティングを示す図である。再懸濁は、ＰＢＳ（「ｃｏｎｔｒｏｌ」）またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（「ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ」）で行った。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例４においてヒト結腸腺癌細胞ＬｏＶｏの培養上清を超遠心し、得られた沈殿物を再懸濁させ、再度超遠心し、得られた沈殿物を再懸濁することにより得られたサンプルの粒子数および粒子径分布の測定を示す図である。再懸濁は、ＰＢＳ（「ｃｏｎｔｒｏｌ」）またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（「ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ」）で行った。
【図５】図５は、実施例５における、ヒト膵臓腺癌細胞ＢｘＰＣ−３の培養上清からの免疫沈降法によるエクソソーム回収サンプルにおける粒子数および粒子径分布を示す図である。夾雑物（アルブミン）を添加しない培養上清（ａおよびｂ）および夾雑物（アルブミン）を添加した培養上清（ｃおよびｄ）、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡを添加した培養上清（ｂおよびｄ）およびＥＤＴＡ／ＥＧＴＡを添加しない培養上清（ａおよびｃ）を示す図である。
【図６】図６は、実施例７におけるＰＢＳ（「ｃｏｎｔｒｏｌ」）またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（「ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ」）で希釈した血清検体の免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウェスタンブロッティング（ＷＢ）を示す図である。
【図７】図７は、実施例８において酢酸処理した牛乳の上清を超遠心し、得られた沈殿物を再懸濁させ、再度超遠心し、得られた沈殿物を再懸濁することにより得られたサンプルの粒子数および粒子径分布の測定を示す図である。再懸濁は、ＰＢＳ（「ｃｏｎｔｒｏｌ」）またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（「ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ」）で行った。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、細胞外小胞の回収方法を提供する。
【００１２】
細胞外小胞は、さまざまな種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞である。細胞外小胞としては、例えば、エクソソーム、エクトソーム、およびアポトーシス胞が挙げられる。好ましくは、細胞外小胞は、エクソソームである。細胞外小胞はまた、そのサイズにより規定することができる。細胞外小胞のサイズは、例えば、３０〜１０００ｎｍであり、好ましくは５０〜３００ｎｍ、より好ましくは８０〜２００ｎｍである。細胞外小胞のサイズの測定は、例えば、細胞外小胞のブラウン運動に基づく方法、光散乱法、および電気抵抗法などにより行うことができる。好ましくは、細胞外小胞のサイズの測定は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）により行われる。
【００１３】
本発明の回収方法は、以下の工程を含む：
（１）細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理すること；および
（２）キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること。
【００１４】
細胞外小胞含有試料は、細胞外小胞を含有する任意の試料である。好ましくは、細胞外小胞含有試料は、生物学的な液体試料である。細胞外小胞含有試料は、本発明の方法に用いられる前に、他の処理に付されてもよい。このような処理としては、例えば、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、および攪拌が挙げられる。
【００１５】
一実施形態では、細胞外小胞含有試料は、培養上清である。培養上清は、細胞培養上清であっても組織培養上清であってもよい。培養される細胞または組織が由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル等の霊長類；マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類；ウシ、ブタ、ヤギ等の家畜；およびウマ、ヒツジ等の使役動物）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物（例、細菌類）、植物、および魚類が挙げられる。好ましくは、生物は、ヒト等の哺乳動物である。
【００１６】
別の実施形態では、細胞外小胞含有試料は、体液である。体液は、上述したような生物に由来する体液である。体液としては、例えば、血液試料（例、全血、血清および血漿）、リンパ液、組織液、脳脊髄液、腹水、唾液、汗、精液、尿、涙液、粘液、乳汁、胸腔液、気管支肺胞洗浄液および羊水が挙げられる。好ましくは、体液は、血液である。一般に、細胞外小胞の回収は、培養上清に比し、培養上清よりも多量のタンパク質（例、アルブミン、カゼイン、ラクトアルブミン、ラクトフェリン）が混在している体液（例、血液、尿、乳汁）において困難であるが、本発明の方法によれば、このような体液からであっても細胞外小胞を高純度で回収することができる。
【００１７】
さらに別の実施形態では、細胞外小胞含有試料は、細胞外小胞に加えて、夾雑物として１以上の細胞外小胞吸着タンパク質をさらに含む試料である。細胞外小胞吸着タンパク質とは、細胞外小胞に直接的に吸着する能力を有するタンパク質、または他の因子（例、タンパク質）を介して細胞外小胞に間接的に吸着する能力を有するタンパク質を意味する。細胞外小胞吸着タンパク質としては、例えば、アルブミン、シナプトタグミン様タンパク質４、ビトロネクチン、細胞分裂制御タンパク質２ホモログ、トリプシン−２、免疫グロブリンμ重鎖疾患タンパク質、α−１Ｂ−糖タンパク質、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＷＯＬ、ヘモペキシン、アンチトロンビン−ＩＩＩ、プロトロンビン、ゲルソリン、補体Ｃ１サブ成分、補体因子Ｂ、補体成分Ｃ９、フィコリン−２、血清パラオキソナーゼ／アリレステラーゼ１、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−Ｉ領域Ｄａｕｄｉ、および免疫グロブリン重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＴＵＲが挙げられる。細胞外小胞含有試料に含まれる細胞外小胞吸着タンパク質の種類および量は、細胞外小胞含有試料の種類（例、血液等の体液、および培養上清）、細胞外小胞含有試料が由来する生物の種類、並びに細胞外小胞含有試料が由来する生物の状態（例、健常状態、特定疾患等の異常状態）によって異なると考えられるが、本発明によれば、細胞外小胞への種々の吸着タンパク質の結合を抑制することができる。よって、本発明によれば、より均一な品質の細胞外小胞の回収が可能になると考えられる。
【００１８】
キレート剤は、金属イオンとの配位結合が可能である配位部分を有する化合物またはその塩である。配位部分の数は、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上（例、３個または６個）である。配位部分としての配位原子としては、例えば、酸素原子、リン原子、窒素原子、硫黄原子、および塩素原子が挙げられる。配位原子は、好ましくは酸素原子又はリン原子であり、より好ましくは酸素原子である。配位部分としての配位基としては、例えば、上記配位原子を有する基が挙げられる。配位基は、好ましくはカルボン酸基またはリン酸基であり、より好ましくはカルボン酸基である。
【００１９】
キレート剤としては、例えば、シュウ酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、並びにそれらの塩が挙げられる。塩としては、例えば、金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩等の一価の金属塩、およびカルシウム塩、マグネシウム塩等の二価の金属塩）、無機塩（例、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物等のハロゲン化物塩、およびアンモニウム塩）、有機塩（例、アルキル基で置換されたアンモニウム塩）、および酸付加塩（例、硫酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩、および酢酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸等の塩）が挙げられる。本発明では、２種以上（例、２種、３種、４種、５種）のキレート剤の混合物を細胞外小胞含有試料の処理に用いてもよい。本発明では、細胞外小胞含有試料の処理前に、細胞外小胞含有試料にキレート剤を添加することを含んでいてもよい。
【００２０】
細胞外小胞含有試料の処理におけるキレート剤の濃度は、細胞外小胞への夾雑物の吸着を抑制でき、かつ処理で用いられる溶液中にキレート剤が溶解できる濃度である限り特に限定されない。このような濃度は、キレート剤の種類によっても異なるが、例えば、１ｍＭ〜２００ｍＭである。好ましくは、キレート剤の濃度は、１０ｍＭ以上、１５ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、または５０ｍＭ以上であってもよい。このような濃度はまた、キレート剤の種類によっても異なるが、２００ｍＭ以下、１８０ｍＭ以下、１６０ｍＭ以下、１４０ｍＭ以下、１２０ｍＭ以下、または１００ｍＭ以下であってもよい。
【００２１】
細胞外小胞含有試料の処理における温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは、１５〜３０℃であってもよい。処理における時間は、細胞外小胞への夾雑物の吸着を抑制するために十分な時間である限り特に限定されず、例えば、１分以上、５分以上、１０分以上、または２０分以上であってもよい。このような時間はまた、４時間以下、２時間以下、または１時間以下であってもよい。細胞外小胞含有試料の処理では、細胞外小胞含有試料およびキレート剤の混合後に、混合液が放置されてもよい。
【００２２】
キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料からの細胞外小胞の分離は、例えば、細胞外小胞膜結合物質を用いた沈降法、または超遠心法により行うことができる。沈降法または超遠心法により細胞外小胞を沈殿させ、次いで、沈殿物を回収することにより、または上清を廃棄することにより、細胞外小胞を回収することができる。分離は、好ましくは、単離または精製である。したがって、本発明の回収方法は、単離または精製方法として利用することができる。
【００２３】
沈降法において用いられる細胞外小胞膜結合物質は、細胞外小胞マーカーに親和性を有する物質である。細胞外小胞マーカーとしては、例えば、ＣＤ９、癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）、ＣＤ８１、ＣＤ６３、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、ＨＳＰ９０、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ、腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）１、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）−１、インテグリン、セラミド、コレステロール、ホスファチジルセリン、ＡＬＩＸ、Ａｎｎｅｘｉｎｓ、Ｃａｖｅｏｌｉｎ‐I、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ‐Ｉ、Ｒａｂタンパク、ＥｐＣＡＭなどが挙げられる。細胞外小胞膜結合物質としては、例えば、抗体（例、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）、アプタマー、ホスファチジルセリン結合タンパク質、セラミド結合タンパク質が挙げられる。細胞外小胞膜結合物質は、好ましくは抗体であり、より好ましくはモノクローナル抗体である。細胞外小胞膜結合物質として抗体が用いられる場合、沈降法は免疫沈降法である。細胞外小胞膜結合物質は、凝集を容易にするための固相（例、磁性ビーズ）と結合していてもよい。
【００２４】
超遠心は、超遠心機を使用して行うことができる。超遠心で印加される重力は、例えば、１０，０００×ｇ〜２００，０００×ｇであり、好ましくは、７０，０００×ｇ〜１５０，０００×ｇであってもよい。超遠心の時間は、例えば、０．５〜２４時間であり、好ましくは１〜５時間である。超遠心での温度は、例えば、４〜３０℃である。超遠心は、１回または複数回（例、２回、３回）行ってもよい。
【００２５】
本発明はまた、細胞外小胞の分析方法を提供する。
【００２６】
本発明の分析方法は、以下を含む：
（１）細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理すること；
（２）キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
（３）分離された細胞外小胞を分析すること。
【００２７】
本発明の分析方法における（１）および（２）は、本発明の回収方法における（１）および（２）と同様にして行うことができる。
【００２８】
（３）では、分離された細胞外小胞が分析される。分析される対象としては、例えば、細胞外小胞中に含まれる成分（例、細胞外小胞の内部に含まれる成分、細胞外小胞の膜成分、細胞外小胞の膜表面に存在している成分）、および細胞外小胞自体（粒子）が挙げられる。
【００２９】
細胞外小胞中に含まれる成分が分析される場合、分析は、成分の検出または定量である。このような分析はまた、一成分または複数成分の分析である。分析される成分としては、例えば、タンパク質、核酸（例、ＲＮＡ、ＤＮＡ）、糖、脂質、アミノ酸、ビタミン類、ポリアミン、およびペプチドが挙げられる。キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から分離された細胞外小胞は、特にタンパク質夾雑物が除去されている。したがって、本発明の分析方法によれば、タンパク質夾雑物の影響を排除することにより、細胞外小胞中のタンパク質を高精度で分析することができる。
【００３０】
成分の分析は、当該分野において公知である任意の方法により行うことができる。
分析される成分がタンパク質である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。イムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、およびサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）〔例、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）〕、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、およびイムノクロマトグラフィー法、ウェスタンブロッティング、免疫染色、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）が挙げられる。複数成分が分析される場合、プロテオーム分析が行われてもよい。
分析される成分が核酸である場合、分析方法としては、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法、プライマー（例、２、３、または４個のプライマー）を用いる遺伝子増幅法、質量分析法が挙げられる。
分析される成分がタンパク質および核酸以外の成分である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。複数成分が分析される場合、メタボローム分析が行われてもよい。
【００３１】
細胞外小胞自体（粒子）の分析は、例えば、粒子分析機器、電子顕微鏡、フローサイトメーター等の機器により行うことができる。この場合、細胞外小胞の粒子数、粒子の大きさおよび形状、並びにそれらの分布を分析することができる。
【００３２】
細胞外小胞は、癌等の種々の疾患に関与し得ることが報告されている（国際公開第２０１４／００３０５３号；国際公開第２０１４／１５２６２２号；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ    ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌ，１００（２００８）  ｐｐ１３−２１）。したがって、本発明の回収方法および分析方法は、例えば、細胞外小胞に基づく診断および創薬に有用である。
【００３３】
本発明はまた、細胞外小胞と細胞外小胞吸着タンパク質との結合の抑制方法を提供する。
【００３４】
本発明の抑制方法は、細胞外小胞吸着タンパク質が結合した細胞外小胞をキレート剤で処理して、細胞外小胞から細胞外小胞吸着タンパク質を解離させることを含む。細胞外小胞吸着タンパク質としては、例えば、アルブミン、シナプトタグミン様タンパク質４、ビトロネクチン、細胞分裂制御タンパク質２ホモログ、トリプシン−２、免疫グロブリンμ重鎖疾患タンパク質、α−１Ｂ−糖タンパク質、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＷＯＬ、ヘモペキシン、アンチトロンビン−ＩＩＩ、プロトロンビン、ゲルソリン、補体Ｃ１サブ成分、補体因子Ｂ、補体成分Ｃ９、フィコリン−２、血清パラオキソナーゼ／アリレステラーゼ１、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−Ｉ領域Ｄａｕｄｉ、および免疫グロブリン重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＴＵＲが挙げられる。上述したように、より均一な品質の細胞外小胞の回収が可能になると考えられることから、本発明の抑制方法は、例えば、本発明の回収方法および分析方法の実施、並びに細胞外小胞を用いた医薬のスクリーニングに有用である。
【００３５】
本発明はまた、上述したようなキレート剤および細胞外小胞膜結合物質を含むキットを提供する。本発明のキットは、例えば、本発明の回収方法、分析方法および抑制方法の簡便な実施、ならびに後述する本発明の細胞外小胞および溶液の簡便な調製に有用である。
【００３６】
本発明はまた、遊離した天然の細胞外小胞を提供する。本発明の細胞外小胞には、上記１以上の細胞外小胞吸着タンパク質が吸着しているが、本発明の細胞外小胞は、これらの細胞外小胞吸着タンパク質のうち、１以上、好ましくは、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、または全ての細胞外小胞吸着タンパク質が解離したものであってもよい。
【００３７】
本発明の細胞外小胞はまた、細胞外小胞からの細胞外小胞吸着タンパク質の解離度（％）で規定することができる。前記細胞外小胞からの細胞外小胞吸着タンパク質の解離度（％）は、〔（細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞をキレート剤で処理することにより、当該細胞外小胞から解離した細胞外小胞吸着タンパク質の総量）／（細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞に天然に吸着している細胞外小胞吸着タンパク質の総量）〕×１００％で算出することができる。ここで、「（細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞をキレート剤で処理することにより、当該細胞外小胞から解離した細胞外小胞吸着タンパク質の総量）／（細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞に天然に吸着している細胞外小胞吸着タンパク質の総量）」の比率値は、例えば、免疫学的方法（例、ウェスタンブロッティング）により間接的に評価することができる。これは、細胞外小胞からの細胞外小胞吸着タンパク質の解離量に比例して、細胞外小胞吸着タンパク質による細胞外小胞のマスキングが解除され、細胞外小胞マーカーに対する抗体が細胞外小胞に結合する量、ひいては、細胞外小胞マーカーに対する抗体による細胞外小胞マーカーの免疫染色強度が増加すると考えられるためである。
具体的には、以下のとおりである。まず、細胞外小胞のキレート剤処理後の細胞外小胞マーカー免疫染色強度がプラトーに到達するまでキレート剤濃度を増加させていき、プラトーに到達した免疫染色強度（ａ）を測定する。したがって、（ａ）は解離度１００％のときの値となる。つぎに、対象となる濃度のキレート剤処理後の細胞外小胞マーカー免疫染色強度（ｂ）を測定する。そして、（ｂ）／（ａ）を算出することにより、上記比率値を間接的に算定することができる。
上記解離度について、図２ＡにおけるＥＤＴＡ処理の免疫染色の結果を参照して、より具体的に説明する。１０ｍＭ  ＥＤＴＡ処理と５０ｍＭ  ＥＤＴＡ処理後の免疫染色強度はほぼ一致することから、細胞外小胞マーカー（ＣＤ９）に基づく免疫染色強度はプラトーに到達していることが理解できる。よって、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ処理により、ほぼ全ての細胞外小胞中着タンパク質（細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞に天然に吸着している細胞外小胞吸着タンパク質の総量）が細胞外小胞から解離していると見積もることができる。そして、１ｍＭ  ＥＤＴＡ処理後の免疫染色強度は１０ｍＭまたは５０ｍＭ  ＥＤＴＡ処理後の免疫染色強度の約３０％であるから、１ｍＭ  ＥＤＴＡ処理後では、細胞外小胞からの細胞外小胞吸着タンパク質の解離度は、約３０％であると評価することができる。
【００３８】
本発明の細胞外小胞について、細胞外小胞からの細胞外小胞吸着タンパク質の解離度（％）は、解離のために用いられるキレート剤の種類および濃度等の条件によっても異なるが、例えば、３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上である。
【００３９】
用語「遊離」とは、細胞外小胞が固相（例、支持体、容器、粒子）に固定されていないことを意味する。したがって、直接的または間接的（例、抗体等の親和性物質を介する場合）に固相に固定されている細胞外小胞は、遊離した細胞外小胞ではない。
【００４０】
用語「天然」とは、細胞外小胞が人工物質または外来物質（例、細胞外小胞が由来する培養上清、体液または生物に対してそれぞれ異種の培養上清、体液または生物由来の抗体、および抗体断片；ならびに色素、蛍光物質等の標識物質）で改変されていないことを意味する。したがって、人工物質で標識されている細胞外小胞（例、人工物質を取り込んでいる細胞外小胞、人工物質で膜表面が修飾されている細胞外小胞）は、天然の細胞外小胞ではない。一方、細胞外小胞から細胞外小胞吸着タンパク質が解離した細胞外小胞は、人工物質または外来物質で標識されていないことから、天然の細胞外小胞と解するものとする。
【００４１】
一実施形態では、本発明の細胞外小胞は、培養上清に由来する。培養上清は、細胞培養上清であっても組織培養上清であってもよい。培養される細胞または組織が由来する生物の例および好ましい例は、上述したとおりである。
【００４２】
別の実施形態では、本発明の細胞外小胞は、体液に由来する。体液は、上述したような生物に由来する体液である。体液の例および好ましい例は、上述したとおりである。
【００４３】
本発明の細胞外小胞の例および好ましい例は、上述したとおりである。本発明の細胞外小胞は、上述したようなサイズを有していてもよい。本発明の細胞外小胞はまた、上述したような細胞外小胞マーカーを有していてもよい。
【００４４】
本発明の細胞外小胞は、単離または精製されたものであってもよい。細胞外小胞の単離または精製は、例えば、キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を超遠心により分離することにより行うことができる。また、細胞外小胞の単離または精製は、細胞外小胞膜結合物質を用いた沈降法により、キレート剤で処理された細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を超遠心により分離し、次いで、細胞外小胞（当該沈降法において細胞外小胞膜結合物質に結合している）を細胞外小胞膜結合物質から解離させることにより行うことができる。
【００４５】
本発明の細胞外小胞は、例えば、上述した本発明の回収方法により調製することができる。本発明の細胞外小胞は、高純度かつ均一な品質であることから、例えば、細胞外小胞を用いた医薬のスクリーニングに有用である。
【００４６】
本発明はまた、（Ａ）アルブミン、シナプトタグミン様タンパク質４、ビトロネクチン、細胞分裂制御タンパク質２ホモログ、トリプシン−２、免疫グロブリンμ重鎖疾患タンパク質、α−１Ｂ−糖タンパク質、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＷＯＬ、ヘモペキシン、アンチトロンビン−ＩＩＩ、プロトロンビン、ゲルソリン、補体Ｃ１サブ成分、補体因子Ｂ、補体成分Ｃ９、フィコリン−２、血清パラオキソナーゼ／アリレステラーゼ１、免疫グロブリンκ鎖Ｖ−Ｉ領域Ｄａｕｄｉ、および免疫グロブリン重鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＴＵＲからなる群より選ばれる１以上の細胞外小胞吸着タンパク質が解離している、遊離した天然の細胞外小胞を含み、（Ｂ）上記１以上の細胞外小胞吸着タンパク質を含まない溶液を提供する。
【００４７】
溶液は、好ましくは水溶液である。水溶液としては、例えば、例えば、水（例、蒸留水、滅菌水、滅菌蒸留水、純水）、および緩衝液が挙げられる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液（例、ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）緩衝液等のＴｒｉｓベースの緩衝液、炭酸緩衝液が挙げられる。緩衝液のｐＨは、中性付近のｐＨが適切である。このようなｐＨは、例えばｐＨ５．０〜９．０、好ましくは５．５〜８．５、より好ましくは６．０〜８．０、さらにより好ましくは６．５〜７．５である。水溶液は、少量の有機溶媒（例、アルコール）、他の成分を含んでいてもよい。特定の実施形態では、水溶液は、好ましくは、リン酸緩衝液以外の水溶液であり、より好ましくは、リン酸緩衝液以外の緩衝液である。溶液は、液体または凍結のいずれの状態で提供されてもよいが、好ましくは液体の状態で提供される。
【００４８】
溶液の容量は、例えば、１０μＬ〜１０ｍＬであってもよい。好ましくは、容量は、２０μＬ以上、４０μＬ以上、５０μＬ以上、または１００μＬ以上であってもよい。容量はまた、５ｍＬ以下、１ｍＬ以下、または２００μＬ以下であってもよい。
【００４９】
（Ａ）において、遊離した天然の細胞外小胞、および細胞外小胞からの細胞外小胞吸着タンパク質の種類の解離数の詳細（定義、例、および好ましい例など）は、上述したとおりである。
【００５０】
本発明の溶液は、遊離した天然の細胞外小胞を所定の濃度で含んでいてもよい。このような所定の濃度は、例えば、１．０×１０２〜１．０×１０１０粒子／ｍＬであってもよい。好ましくは、濃度は、１．０×１０２以上、１．０×１０３以上、１．０×１０４以上、１．０×１０５以上、または１．０×１０６以上であってもよい。濃度はまた、１．０×１０９粒子／ｍＬ以下、１．０×１０８粒子／ｍＬ以下、または１．０×１０７粒子／ｍＬ以下であってもよい。細胞外小胞の濃度の測定は、例えば、細胞外小胞のブラウン運動の速度に基づく方法、光散乱法、および電気抵抗法などにより行うことができる。好ましくは、細胞外小胞のサイズの測定は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）により行われる。
【００５１】
（Ｂ）において、溶液に含まれない細胞外小胞吸着タンパク質の数および種類は、（Ａ）において細胞外小胞から解離している細胞外小胞吸着タンパク質の数および種類と同じである。例えば、（Ａ）において細胞外小胞から解離している１以上の細胞外小胞吸着タンパク質がアルブミン、シナプトタグミン様タンパク質４、ビトロネクチンである場合、（Ｂ）において、溶液に含まれない１以上の細胞外小胞吸着タンパク質は、アルブミン、シナプトタグミン様タンパク質４、ビトロネクチンである。（Ｂ）において、溶液に含まれない細胞外小胞吸着タンパク質は、好ましくは、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、または全てであってもよい。
【００５２】
本発明の溶液はまた、上述した細胞外小胞吸着タンパク質に加えて、キレート剤、標識物質（例、色素、蛍光物質）、抗体等の物質を含まないものであってもよい。
【００５３】
本発明の溶液は、適宜調製することができる。例えば、本発明の溶液の調製は、本発明の細胞外小胞の単離または精製後、本発明の細胞外小胞を所望の溶液中に添加することにより行うことができる。本発明の溶液は、高純度かつ均一な品質の細胞外小胞を含むことから、例えば、細胞外小胞を用いた医薬のスクリーニングに有用である。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００５５】
（実施例１）
キレート剤の効果を確認するために免疫沈降法による細胞外小胞の一種であるエクソソームの沈降量への影響を検討した。
３００μＬの血清検体を、６００μＬのＰＢＳまたはＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ含有ＰＢＳ（ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの終濃度はそれぞれ５０ｍＭ）で希釈し、室温で３０分放置した後、２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。その上清を新しいチューブに移し、そこにエクソソームの表面マーカーであるＣＤ９を認識するモノクローナル抗体（自社モノクローナル抗体および市販モノクローナル抗体（コスモバイオ社製））をそれぞれ２μｇ固定した磁性ビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ライフテクノロジーズ社製））を添加した。４℃で一晩、回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、サンプルを磁性ビーズから溶出させ、ＳＤＳを含有するサンプルバッファー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で希釈してウェスタンブロッティング用サンプルとした。ウェスタンブロッティング用サンプルでは、エクソソームを含むサンプルがＳＤＳで処理されることにより、エクソソームが破壊され、エクソソームのマーカータンパク質（例、ＣＤ９）がサンプル溶液中に放出されている。ＰＢＳで希釈した血清検体に由来するサンプルをｃｏｎｔｒｏｌ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳで希釈した血清検体に由来するサンプルをＥＤＴＡ／ＥＧＴＡとし、両サンプルを自社製ビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウェスタンブロッティングで分析した。
その結果、自社抗体および市販抗体において、キレート剤（ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ）添加条件でエクソソーム（ＣＤ９）の免疫沈降量が大幅に増加した（図１）。
この結果から、キレート剤が免疫沈降法によるエクソソーム回収の効率を向上させる効果を有することが示された。【００５６】
（実施例２）
キレート剤の種類および濃度とエクソソームの免疫沈降量との関係を検討した。
キレート剤として、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、シュウ酸二水和物、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）（ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＥＧＴＡは同仁化学研究所社製、ＨＥＤＴＡ、ＨＩＤＡ、ＮＴＡ、ＥＤＴＭＰは東京化成工業社製、シュウ酸二水和物は和光純薬工業社製）を使用した。各キレート剤のエクソソームの沈降量への影響を検討した。
３００μＬの血清検体または血漿検体を、６００μＬのＰＢＳまたは各キレート剤添加ＰＢＳで希釈した。各キレート剤の濃度はそれぞれ終濃度で１、１０および５０ｍＭとなるように使用した（ただし、ＥＤＴＭＰのみは１、１０および３０ｍＭ）。次いで、溶液を室温で３０分放置した後、２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。その上清を新しいチューブに移し、そこに、ＣＤ９を認識する自社モノクローナル抗体を２μｇ固定した磁性ビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を添加した。４℃で一晩反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、サンプルをサンプルバッファー（ＳＤＳ含有）で磁性ビーズから溶出し、ウェスタンブロッティング用サンプルとした。これらのサンプルをビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウェスタンブロッティングで分析した。
その結果、血清（図２Ａ）および血漿（図２Ｂ）の両方において、使用したキレート剤はいずれも、免疫沈降法によるエクソソームの回収を示し、また、濃度が高くなるにつれてエクソソームの免疫沈降量が増加した。特に、３０ｍＭのＥＤＴＭＰ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＨＥＤＴＡ、ＮＴＡ、シュウ酸で、エクソソームの免疫沈降量が大幅に増加した（図２Ａ、２Ｂ）。
これらの結果から、使用したキレート剤はいずれも、免疫沈降法によるエクソソームの回収を示し、また、キレート剤の濃度が高くなるにつれて免疫沈降法によるエクソソーム回収の効率を向上させる効果を有することが示された。【００５７】
（実施例３）
超遠心法によるエクソソーム調製におけるキレート剤のエクソソーム回収効率に対する効果を検討した。
３００μＬの血漿検体（＃１および＃２の２種類）を、６００μＬのＰＢＳまたはＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ含有ＰＢＳ（ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの終濃度はそれぞれ５０ｍＭ）で希釈し、室温で３０分放置した後、２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。次に、その上清を、１００，０００×ｇ、４℃で３時間遠心した。上清を捨て、新たにＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁した後、１５０，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、新たにＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁してサンプルを得た。サンプルのタンパク質定量をＢＣＡ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック社製）により行った。サンプルをサンプルバッファー（ＳＤＳ含有）で希釈してウェスタンブロッティング用サンプルとした、ウェスタンブロッティングには各サンプルをタンパク質の量として１．５μｇ使用した。サンプル中のＣＤ９をビオチン化抗ＣＤ９抗体により、検出した。
その結果、キレート剤を用いた回収条件で、等量タンパク質中におけるＣＤ９の量が増加した（表１および図３）。
この結果から、超遠心法においても、キレート剤での処理によって回収産物中のエクソソームの純度が増し、エクソソーム回収効率が向上したことが示された。このことは、キレート剤での処理によって、エクソソーム表面の夾雑物が減少したことによると考えられる。【００５８】
【表１】
2018070479.tif 000003
【００５９】
（実施例４）
超遠心法による培養細胞由来のエクソソームの回収において、キレート剤での処理によるエクソソーム回収効率に対する効果を検討した。
３日間無血清培地で培養したヒト結腸腺癌細胞ＬｏＶｏの培養上清を、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（ミリポア社製）を用いて濃縮した。濃縮したサンプルを２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。次に、その上清を、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、ＰＢＳまたは５０ｍＭ  ＥＤＴＡ／５０ｍＭ  ＥＧＴＡ／ＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、１５０，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、新たにＰＢＳまたは５０ｍＭ  ＥＤＴＡ／５０ｍＭ  ＥＧＴＡ／ＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁させてサンプルを得た。サンプルの粒子数および分布の測定をＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）により行った。サンプル中のＣＤ９およびエクソソームに存在すると報告されているＣＥＡ（Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００５  Ｏｃｔ  １５；１１（２０）：７５５４―６３）の検出を、ビオチン化抗ＣＤ９抗体および抗ＣＥＡ抗体（アブカム社製）でのウェスタンブロッティングにて行った。
その結果、ウェスタンブロッティングの結果から、エクソソームマーカー（ＣＤ９およびＣＥＡ）のタンパク質の量が、キレート剤を用いた回収条件で増加した（図４Ａ）。ＮａｎｏＳｉｇｈｔの結果から、１００〜２００ｎｍの粒子（エクソソームを示すと考えられる）が、キレート剤を用いた回収条件で顕著に増加した（表２、図４Ｂ）。
これらの結果から、超遠心法によるエクソソームの回収において、再懸濁時におけるキレート剤での処理がエクソソームの回収量を飛躍的に改善させたことが示された。これは、キレート剤での処理によって、夾雑物が減少し、エクソソームの再懸濁を促進したため、エクソソーム回収効率が増加したと考えられる。【００６０】
【表２】
2018070479.tif 000004
【００６１】
（実施例５）
免疫沈降法によるエクソソームの回収における、キレート剤による処理の効果および夾雑物混入の影響を検討した。
３日間無血清培地で培養したヒト膵臓腺癌細胞ＢｘＰＣ−３の培養上清と、その培養上清に２０ｍｇ／ｍＬアルブミン（ミリポア社製）を添加したサンプルを調製した。５００μＬのこれらのサンプルを、等量のＰＢＳまたはＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ含有ＰＢＳ（ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの終濃度はそれぞれ５０ｍＭ）で希釈し、室温で３０分放置した後、２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。その上清を新しいチューブに移し、そこにＣＤ９を認識する自社モノクローナル抗体を２μｇ固定した磁性ビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を添加した。
４℃で一晩、回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、ＢＲＵＢ（Ｂｒｉｔｔｏｎ  ＆  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）を４０μＬ添加して粒子を磁性ビーズから溶出させた。室温で１０分放置した後、磁性ビーズを集磁し、回収した上清をＰＢＳで希釈し、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）にて粒子数および分布の測定を行った。
その結果、アルブミン非存在下では、キレート剤非添加条件と比較してキレート剤添加条件で回収された粒子数が増加した（表３、図５ａおよびｂ）。アルブミン存在下でも、キレート剤非添加条件と比較してキレート剤添加条件で回収された粒子数が増加した（表３、図５ｃおよびｄ）。キレート剤非添加条件では、アルブミン非存在下と比較してアルブミン存在下で回収された粒子数が約１０％程度にまで減少した（表３、図５ａおよびｃ）。しかし、キレート剤添加条件では、アルブミン非存在下と比較してのアルブミン存在下で回収された粒子数の減少が約４０％程度であった（表３、図５ｂおよびｄ）。
これらの結果から、夾雑物としてのアルブミンの存在下または非存在下のいずれにおいても、キレート剤がエクソソーム回収効率を上昇させる効果を有することが示された。このことは、エクソソームの周囲のアルブミンはエクソソーム回収の妨げとなるが、キレート剤にはその妨げを抑制する効果があり、その結果エクソソームの回収効率が上昇したと考えられる。【００６２】
【表３】
2018070479.tif 000005
【００６３】
（実施例６）
キレート剤によるエクソソーム含有試料の処理によるエクソソームへの夾雑物の吸着の抑制を、プロテオミクス分析により確認した。
３００μＬの血清検体を６００μＬのＰＢＳまたはＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ含有ＰＢＳ（ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの終濃度はそれぞれ５０ｍＭ）で希釈し、室温で３０分放置した後、２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。その上清を新しいチューブに移し、そこにＣＤ９を認識する自社抗体を２μｇ固定した磁性ビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）または、抗体を固定化していない磁性ビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を添加した。４℃で一晩、回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、溶出液を磁性ビーズから溶出させ、サンプルバッファー（ＳＤＳ含有）を添加後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
泳動後のゲルから１１バンド／レーンを切り出した後、水で洗浄し、アセトニトリル（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で脱水した。ゲルを遠心エバポレーター（東京理化器械株式会社製）で完全に乾燥させた後、５０μＬの０．０１Ｍ  ＤＴＴ／１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（シグマアルドリッチ社製）で５６℃、４５分還元した。ゲルを室温に戻し、２μＬの０．２５Ｍヨードアセトアミド（和光純薬社製）／１００ｍＭ重炭酸アンモニウムを添加し、暗所で１５分室温で反応させた。上清を除去後、ゲルを５０μＬの１００ｍＭ重炭酸アンモニウムで洗浄した。さらに５０μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム／５０％アセトニトリルで洗浄後、３０μＬの１００％アセトニトリルで洗浄し、遠心エバポレーターで乾燥させた。
得られたゲルに２０μＬの０．１％Ｒａｐｉｇｅｓｔ  ＳＦ試薬（Ｗａｔｅｒｓ社製）／５０ｍＭ重炭酸アンモニウムを添加し、３７℃、１０分反応させた後、上清を除去し、遠心エバポレーターで乾燥させた。乾燥させたゲルに５０ｍＭ重炭酸アンモニウムで希釈した２０ｎｇ／μＬのＴｒｙｐｓｉｎ／Ｌｙｓ−Ｃ  Ｍｉｘ，  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ  Ｇｒａｄｅ（プロメガ社製）を２０μＬ加え、氷上で１５分ゲルに浸透させた。ゲルが乾燥しないように５０ｍＭ重炭酸アンモニウムを２０μＬ加えた後、ゲルを３７℃で１８時間インキュベートした。反応後のゲルに５０μＬの５０％アセトニトリル／１％ＴＦＡ（サーモサイエンティフィック社製）を添加し、３７℃１０分間インキュベート後、抽出液を回収した。これを二度繰り返した。最後に８０％アセトニトリル５０μＬを加え、ゲルを３７℃２分インキュベートした後、抽出液を回収した。すべての抽出液を一つにまとめた後、遠心エバポレーターで濃縮乾固し、ペプチドを含むサンプルを得た。
得られたペプチドを含むサンプルに１０μＬの０．１％ギ酸水（サーモサイエンティフィック社製）を加えて溶解したのち、ＬＣ−ＭＳ（ＬＣ：ｅｋｓｉｇｅｎｔ社製、質量分析装置：Ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ  ５６００＋、エービーサイエックス社製）で質量分析測定を行った。タンパク質の同定はＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔＶｅｒ４．５ｂｅｔａ（エービーサイエックス社製）で行った。
質量分析測定の結果、ＰＢＳ希釈かつＣＤ９抗体結合ビーズ条件で同定されたタンパク質から、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ希釈かつＣＤ９抗体結合ビーズ条件で同定されたタンパク質およびＰＢＳ希釈かつ抗体非結合ビーズ条件で同定されたタンパク質を除いたタンパク質を表４に示す。表４に示される種々のタンパク質がキレート材処理によりエクソソームへの吸着が抑制されたことが示された。
この結果から、キレート剤での処理により種々のタンパク質のエクソソームへの吸着を抑制できることから、エクソソームのより高精度のプロテオミクスが可能になることが示された。また、かかる吸着の抑制により、より均一な品質のエクソソームの提供が可能になると期待される。【００６４】
【表４】
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【００６５】
（実施例７）
免疫沈降法による尿中エクソソームの回収における、キレート剤による処理の効果を検討した。
３００μＬの尿検体を、６００μＬのＰＢＳまたはＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ含有ＰＢＳ（ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの終濃度はそれぞれ５０ｍＭ）で希釈し、室温で３０分放置した後、２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。その上清を新しいチューブに移し、そこにエクソソームの表面マーカーであるＣＤ９を認識する自社モノクローナル抗体を２μｇ固定した磁性ビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ライフテクノロジーズ社製））を添加した。４℃で一晩、回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、サンプルを磁性ビーズから溶出させ、ＳＤＳを含有するサンプルバッファー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で希釈してウエスタンブロッティングのサンプルとした。
ＰＢＳにて希釈したサンプルをｃｏｎｔｒｏｌ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳで希釈したサンプルをＥＤＴＡ／ＥＧＴＡとし、ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングで分析した。
その結果、キレート剤（ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ）添加条件でエクソソーム（ＣＤ９）の免疫沈降量が増加した（図６）。
この結果から、尿検体においても、キレート剤が免疫沈降法によるエクソソーム回収の効率を向上させる効果を有し、本発明が尿検体にも利用可能であることが示された。【００６６】
（実施例８）
超遠心法による牛乳由来のエクソソームの回収において、キレート剤での処理によるエクソソーム回収効率に対する効果を検討した。
市販牛乳２０ｍＬに酢酸を１／１０ｖｏｌ加え、転倒混和したのち、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心した。上清を０．４５μｍフィルター（ミリポア社製）、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で順に濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（ミリポア社製）を用いて濃縮した。濃縮したサンプルを２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。次に、その上清を、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、ＰＢＳまたは５０ｍＭ  ＥＤＴＡ／５０ｍＭ  ＥＧＴＡ／ＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、１５０，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、新たにＰＢＳまたは５０ｍＭ  ＥＤＴＡ／５０ｍＭ  ＥＧＴＡ／ＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁させてサンプルを得た。２．０Ｍ、１．５Ｍ、１．０Ｍ、０Ｍの各濃度のｓｕｃｒｏｓｅ／ＰＢＳを調製し、２．０Ｍ、１．５Ｍ、１．０Ｍ、０Ｍの順に、１．４ｍＬ、１．０ｍＬ、１．４ｍＬ、０．８ｍＬずつ超遠心用チューブに充填した。その上層に再懸濁したサンプルを２００μＬアプライし、１５０，０００×ｇ、４℃で１６時間超遠心した。遠心後、回収したサンプルの粒子数および分布の測定をＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）により行った。ＮａｎｏＳｉｇｈｔの結果から、１００〜２００ｎｍの粒子（エクソソームを示すと考えられる）が、キレート剤を用いた回収条件で顕著に増加した（表５、図７）。
この結果から、超遠心法による牛乳中エクソソームの回収において、再懸濁時におけるキレート剤での処理がエクソソームの回収量を飛躍的に改善させたことが示された。これは、キレート剤での処理によって、夾雑物が減少し、エクソソームの再懸濁を促進したため、エクソソーム回収効率が増加したと考えられる。【００６７】
【表５】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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