(57)【要約】  本発明は、電気化学測定法による測定において、高感度かつ安定的に測定を行うことを可能とする手段を提供することを課題とし、基質を標識するために用いられる下記一般式（１）で示される標識体、当該標識体で標識されてなる測定用基質、当該測定用基質を用いた電気化学測定法による測定方法、及び、当該標識体及び／又は当該測定用基質を構成品として含む試薬キット等を提供することにより、上記課題を解決する。2017141961.tif 000016（上記式（１）において、Ｒ１はＨ又はアルキル基（ＣｍＨ２ｍ＋１）であって、ｍは１〜４の整数であり、Ｒ２はアルキル基（ＣｎＨ２ｎ＋１）であって、ｎは１〜４の整数である。）
2017141961.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で示される構造を含み、基質を標識して電気化学測定法による測定に適した測定用基質とするために用いられる、標識体。
【化１】
2017141961.tif 000013
（上記式（１）において、Ｒ１はＨ又はアルキル基（ＣｍＨ２ｍ＋１）であって、ｍは１〜４の整数であり、Ｒ２はアルキル基（ＣｎＨ２ｎ＋１）であって、ｎは１〜４の整数である。）
【請求項２】
Ｒ１はＨ又メチル基（ＣＨ３）であり、Ｒ２はメチル基（ＣＨ３）である、請求項１に記載の標識体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の標識体で標識されてなる基質を構造として含む、電気化学測定法による測定に適した測定用基質。
【請求項４】
下記一般式（２）で示される、請求項１又は２に記載の標識体で標識されてなる基質を構造として含む、電気化学測定法による測定に適した測定用基質。
【化２】
2017141961.tif 000014
（上記式（２）において、Ｘ１は基質であり、Ｒ１はＨ又はアルキル基（ＣｍＨ２ｍ＋１）であって、ｍは１〜４の整数であり、Ｒ２はアルキル基（ＣｎＨ２ｎ＋１）であって、ｎは１〜４の整数である。）
【請求項５】
下記一般式（３）で示される、請求項１又は２に記載の標識体で標識されてなる基質を構造として含む、電気化学測定法による測定に適した、アミド結合を有する測定用基質。
【化３】
2017141961.tif 000015
（上記式（３）において、Ｘ２は基質であり、Ｒ１はＨ又はアルキル基（ＣｍＨ２ｍ＋１）であって、ｍは１〜４の整数であり、Ｒ２はアルキル基（ＣｎＨ２ｎ＋１）であって、ｎは１〜４の整数である。）
【請求項６】
基質が、ペプチドである、請求項３〜５のいずれか１項に記載の測定用基質。
【請求項７】
アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）が、ペプチドのＣ末端のカルボキシル基と、請求項１又は２に記載の標識体のアミノ基の反応により生成した共有結合である、請求項６に記載の測定用基質。
【請求項８】
ペプチドが、Ａｒｇ（Ｒ）残基をＣ末端に有するペプチドである、請求項６又は７に記載の測定用基質。
【請求項９】
ペプチドが、下記一般式（ａ）〜（ｇ）のいずれかで示されるペプチドである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の測定用基質。
Ｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｙ−ＤＰＲ）    （ａ）
Ｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｙ−ＶＰＲ）    （ｂ）
Ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（Ｙ−ＬＴＲ）    （ｃ）
Ｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（Ｙ−ＭＴＲ）    （ｄ）
Ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｙ−ＬＧＲ）    （ｅ）
Ｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｙ−ＩＥＧＲ）    （ｆ）
Ｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｙ−ＥＧＲ）    （ｇ）
（上記式（ａ）〜（ｇ）において、Ｙは存在しても存在しなくてもよく、Ｙが存在する場合は、ＹはペプチドのＮ末端のアミノ酸のアミノ基の保護基である。）
【請求項１０】
保護基が、Ｃｂｚ（ベンジルオキシカルボニル基）又はＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基）である、請求項９に記載の測定用基質。
【請求項１１】
請求項３〜１０のいずれか１項に記載の測定用基質を用いる、電気化学測定法による測定方法。
【請求項１２】
測定方法が、下記（１）及び（２）の工程を含む、測定対象物質の測定方法である、請求項１１に記載の測定方法。
（１）測定対象物質の存在下で、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の測定用基質と当該基質を分解する酵素を接触させる工程。
（２）前記（１）の測定用基質から遊離した標識体を電気化学測定法により測定する工程。
【請求項１３】
測定対象物質が、微生物由来物質である、請求項１２に記載の測定方法。
【請求項１４】
微生物由来物質が、エンドトキシン及び／又は（１→３）−β−Ｄ−グルカンである、請求項１３に記載の測定方法。
【請求項１５】
分解酵素が、カブトガニのＣ因子、Ｂ因子、Ｇ因子、及び／又はプロクロッティングエンザイムである、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１６】
測定方法が、下記（１）及び（２）の工程を含む、酵素活性の測定方法である、請求項１１に記載の測定方法。
（１）請求項３〜１０のいずれか１項に記載の測定用基質と当該基質を分解する酵素を接触させる工程。
（２）前記（１）の測定用基質から遊離した標識体を電気化学測定法により測定する工程。
【請求項１７】
電気化学測定法が、ボルタンメトリー法又はアンペロメトリー法である、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１８】
請求項１又は２に記載の標識体、及び／又は、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の測定用基質を構成品として含む、試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気化学測定法による測定を高感度かつ安定的に行うための手段に関し、具体的には、基質を標識するための標識体、当該標識体で標識されてなる測定用基質、当該測定用基質を用いた電気化学測定法による測定方法、及び、当該標識体及び／又は当該測定用基質を構成品として含む試薬キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬や食品の衛生管理やヒトを含む動物の診断において、微生物由来物質を検知し、微生物汚染の程度を測定する手段は重要である。微生物汚染の程度を測定する手段としては、リムルス試験が普及している。リムルス試験は、エンドトキシンや（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定対象物質として微生物汚染の程度を測定する技術であり、カブトガニが有するプロテアーゼ前駆体がこれらの測定対象物質により活性化される性質を利用した測定方法である。リムルス試験は一般的に、ゲル化法、比濁法、または比色法により行われているが、電気化学測定法によるリムルス試験も近年開発が行われている。【０００３】
特許文献１には、電気化学測定法によるリムルス試験において、パラメトキシアニリン等のパラアミノフェノールの誘導体が、エンドトキシンの高感度かつ安定的な検出に資することが開示されている。【０００４】
特許文献２には、電気化学測定法によるプロテアーゼ活性の測定において用いられるオリゴペプチド誘導体が開示されている。当該ペプチド誘導体のＣ末端には、アニリンの誘導体が結合している。【０００５】
しかしながら、上記いずれの文献においても、フェニレンジアミンの誘導体が電気化学測定に利用可能であることについて開示されていない。また、フェニレンジアミンの誘導体が従来用いられていた化合物よりも高感度かつ安定的にプロテアーゼ活性の測定を行うことを可能とする化合物であることについての示唆もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−１８７６０７
【特許文献２】特表２００２−５４２１５４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、電気化学測定法による測定において、高感度かつ安定的に測定を行うことを可能とする手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｎ−メチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＭＰＤＤ）またはＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＤＭＰＤ）を用いて基質を標識することにより、基質を電気化学測定法による測定に適した測定用基質とすることができ、もって電気化学測定を高感度かつ安定的に行うことが可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
前記課題は、以下の態様を包含する本発明によって解決することができる。
［１］
下記一般式（１）で示される構造を含み、基質を標識して電気化学測定法による測定に適した測定用基質とするために用いられる、標識体。
【化１】
2017141961.tif 000003
（上記式（１）において、Ｒ１はＨ又はアルキル基（ＣｍＨ２ｍ＋１）であって、ｍは１〜４の整数であり、Ｒ２はアルキル基（ＣｎＨ２ｎ＋１）であって、ｎは１〜４の整数である。）
［２］
Ｒ１はＨ又メチル基（ＣＨ３）であり、Ｒ２はメチル基（ＣＨ３）である、［１］に記載の標識体。
［３］
［１］又は［２］に記載の標識体で標識されてなる基質を構造として含む、電気化学測定法による測定に適した測定用基質。
［４］
下記一般式（２）で示される、［１］又は［２］に記載の標識体で標識されてなる基質を構造として含む、電気化学測定法による測定に適した測定用基質。
【化２】
2017141961.tif 000004
（上記式（２）において、Ｘ１は基質（残基）であり、Ｒ１はＨ又はアルキル基（ＣｍＨ２ｍ＋１）であって、ｍは１〜４の整数であり、Ｒ２はアルキル基（ＣｎＨ２ｎ＋１）であって、ｎは１〜４の整数である。）
［５］
下記一般式（３）で示される、［１］又は［２］に記載の標識体で標識されてなる基質を構造として含む、電気化学測定法による測定に適した、アミド結合を有する測定用基質。
【化３】
2017141961.tif 000005
（上記式（３）において、Ｘ２は基質（残基）であり、Ｒ１はＨ又はアルキル基（ＣｍＨ２ｍ＋１）であって、ｍは１〜４の整数であり、Ｒ２はアルキル基（ＣｎＨ２ｎ＋１）であって、ｎは１〜４の整数である。）
［６］
基質が、ペプチドである、［３］〜［５］のいずれかに記載の測定用基質。
［７］
アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）が、ペプチドのＣ末端のカルボキシル基と、［１］又は［２］に記載の標識体のアミノ基の反応により生成した共有結合である、［６］に記載の測定用基質。
［８］
ペプチドが、Ａｒｇ（Ｒ）残基をＣ末端に有するペプチドである、［６］又は［７］に記載の測定用基質。
［９］
ペプチドが、下記一般式（ａ）〜（ｇ）のいずれかで示されるペプチドである、［６］〜［８］のいずれかに記載の測定用基質。
Ｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｙ−ＤＰＲ）    （ａ）
Ｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｙ−ＶＰＲ）    （ｂ）
Ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（Ｙ−ＬＴＲ）    （ｃ）
Ｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（Ｙ−ＭＴＲ）    （ｄ）
Ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｙ−ＬＧＲ）    （ｅ）
Ｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｙ−ＩＥＧＲ）    （ｆ）
Ｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｙ−ＥＧＲ）    （ｇ）
（上記式（ａ）〜（ｇ）において、Ｙは存在しても存在しなくてもよく、Ｙが存在する場合は、ＹはペプチドのＮ末端のアミノ酸のアミノ基の保護基である。）
［１０］
保護基が、Ｃｂｚ（ベンジルオキシカルボニル基）又はＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基）である、［９］に記載の測定用基質。
［１１］
［３］〜［１０］のいずれかに記載の測定用基質を用いる、電気化学測定法による測定方法。
［１２］
測定方法が、下記（１）及び（２）の工程を含む、測定対象物質の測定方法である、［１１］に記載の測定方法。
（１）測定対象物質の存在下で、［３］〜［１０］のいずれかに記載の測定用基質と当該基質を分解する酵素を接触させる工程。
（２）前記（１）の測定用基質から遊離した標識体を電気化学測定法により測定する工程。
［１３］
測定対象物質が、微生物由来物質である、［１２］に記載の測定方法。
［１４］
微生物由来物質が、エンドトキシン及び／又は（１→３）−β−Ｄ−グルカンである、［１３］に記載の測定方法。
［１５］
分解酵素が、カブトガニのＣ因子、Ｂ因子、Ｇ因子、及び／又はプロクロッティングエンザイムである、［１２］〜［１４］のいずれかに記載の測定方法。
［１６］
測定方法が、下記（１）及び（２）の工程を含む、酵素活性の測定方法である、［１１］に記載の測定方法。
（１）［３］〜［１０］のいずれかに記載の測定用基質と当該基質を分解する酵素を接触させる工程。
（２）前記（１）の測定用基質から遊離した標識体を電気化学測定法により測定する工程。
［１７］
電気化学測定法が、ボルタンメトリー法又はアンペロメトリー法である、［１１］〜［１６］のいずれかに記載の測定方法。
［１８］
［１］又は［２］に記載の標識体、及び／又は、［３］〜［１０］のいずれかに記載の測定用基質を構成品として含む、試薬キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、電気化学測定法による測定を高感度かつ安定的に行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜１＞本発明の標識体
本発明においては、電気化学測定法による測定を高感度かつ安定的に行うことを可能とする、基質を標識して電気化学測定法による測定に適した測定用基質とするために用いられる標識体（以下「本発明の標識体」という。）が提供される。本発明の標識体は、例えば、後述する本発明の測定用基質を調製するために用いることができる。
【００１２】
本発明の標識体は、フェニレンジアミン（ＮＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＮＨ２）の片方のアミノ基が１つまたは２つのアルキル基で修飾されてなる構造を含む標識体（フェニレンジアミンの誘導体）である。言い換えると、本発明の標識体は、前記一般式（１）で示される構造を含む標識体である。本発明の標識体が２つのアルキル基で修飾されたフェニレンジアミンの誘導体である場合において、２つのアルキル基は、それぞれの構造が同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００１３】
本発明の標識体において、構造を含むという場合は、当該構造からなる場合を包含する。
【００１４】
本発明において、アルキル基は、１価のアルキル基であってよい。また、アルキル基は、分岐鎖を有しない直鎖状のアルキル基であってよい。
【００１５】
アルキル基（ＣｍＨ２ｍ＋１およびＣｎＨ２ｎ＋１）の鎖長は、水性溶媒への溶解性の観点から短鎖のアルキル基であることが好ましく、ｍ、ｎが１〜４の整数であること（ｍ、ｎが１、２、３、または４であること）が好ましい。言い換えると、アルキル基は、メチル基（ＣＨ３）、エチル基（Ｃ２Ｈ５）、プロピル基（Ｃ３Ｈ７）、またはブチル基（Ｃ４Ｈ９）であることが好ましい。アルキル基（ＣｍＨ２ｍ＋１およびＣｎＨ２ｎ＋１）は、ｍ、ｎが１〜３の整数であることがより好ましく、１〜２の整数であることがさらに好ましく、ｍ、ｎが１であることがよりさらに好ましい。ここに言うｍ、ｎの範囲または数は、同じ範囲または同じ整数であってもよいし、異なる範囲または異なる整数であってもよい。
【００１６】
本発明の標識体は、具体的には、下記一般式（４）で示されるＮ−メチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＭＰＤＤ）またはＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＤＭＰＤ）であることが好ましい。
【００１７】
【化４】
2017141961.tif 000006
【００１８】
上記式（４）において、Ｒ１はＨ又はメチル基（ＣＨ３）であり、Ｒ２はメチル基（ＣＨ３）である。
【００１９】
本発明の標識体は、下記一般式（５）で示されるＮ−メチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＭＰＤＤ）であることが特に好ましい。
【００２０】
【化５】
2017141961.tif 000007
【００２１】
上記式（５）において、Ｒ１はＨであり、Ｒ２はメチル基（ＣＨ３）である。
【００２２】
本発明の標識体は、本発明の標識体を含む試薬として提供されてもよい。本発明の標識体およびこれを含む試薬は、任意の形状であってよく、例えば、粉末等の固形状であってもよいし、任意の溶媒に溶解された状態の液状であってもよい。
【００２３】
本発明の標識体によれば、これを用いて基質を標識して電気化学測定法による測定に適した測定用基質とすることができ、電気化学測定法による測定を高感度かつ安定的に行うことが可能となる。
【００２４】
＜２＞本発明の測定用基質
前述のとおり、本発明の標識体は、基質を標識して電気化学測定法による測定に適した測定用基質とするために用いられる化合物である。基質は、好ましくは本発明の標識体のアミノ基と反応して標識体と結合して標識されることにより、電気化学測定法による測定に適した測定用基質となる。
【００２５】
本発明の標識体で標識されてなる基質を構造として含む測定用基質（以下「本発明の測定用基質」という。）は、好ましくは前記一般式（２）で示される化合物である。本発明の測定用基質は、電気化学測定法、好ましくは後述する本発明の測定対象物質の測定方法や本発明の酵素活性の測定方法を行うために用いることができる。本発明の測定用基質は、例えば、本発明の測定対象物質の測定方法に示される条件において測定対象物質と共存した時（同じ溶液中に存在した時）に本発明の標識体を遊離する性質を有する。
【００２６】
本発明の測定用基質において、本発明の標識体で標識されてなる基質を構造として含むという場合は、本発明の標識体で標識されてなる基質の構造からなる場合を包含する。
【００２７】
本発明の標識体は、好ましくは前記一般式（１）で示される化合物のアミノ基（ＮＨ２基）を介して基質に導入される。したがって、基質はアミノ基と結合する官能基を有することが好ましい。本発明の標識体のアミノ基と結合する、基質の官能基は、アミノ基との結合が可能な官能基である限り特に制限されない。そのような官能基としては、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、マレイミド基が挙げられる。官能基は、その官能基を有する他の分子との共有結合によって基質に導入された官能基であってもよく、基質が本来的に有する官能基であってもよい。ここにいう他の分子としては、具体的には、リンカーが挙げられる。ここにいう他の分子は、分子量１，０００以下、好ましくは分子量１００以下の低分子化合物であってよい。
【００２８】
本発明の標識体のアミノ基と結合する基質の官能基は、カルボキシル基であることが好ましい。よって本発明の標識体と基質との結合は、アミド結合であることが好ましい。本発明の測定用基質は、前記一般式（３）で示されるアミド結合を有する化合物であることが好ましい。
【００２９】
基質の種類は特に制限されない。基質としては、炭水化物、糖質、核酸、脂質、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸が挙げられる。
【００３０】
本発明の測定用基質において、基質はペプチドであることが好ましい。ペプチドは、例えば、プロテアーゼを用いた測定を行う場合において、基質として好適に用いられる。また、本発明の測定用基質において、アミド結合は、ペプチドのＣ末端のカルボキシル基（ペプチドがＣ末端に本来的に有するカルボキシル基）と、本発明の標識体のアミノ基との反応によって形成される共有結合であることが好ましい。
【００３１】
本発明の測定用基質が有する基質は、１種であってもよく、２種又はそれ以上であってもよい。本発明の測定用基質が有する基質は、１つであってもよく、２つ又はそれ以上であってもよい。例えば、本発明の測定用基質は、本発明の標識体のアミノ基に２つのペプチドのカルボキシル基が結合し、イミドを形成したものであってもよい。
【００３２】
ここにいうペプチドの鎖長は特に制限されない。ペプチドは、本発明の標識体を用いた標識反応（本発明の標識体と結合させる反応）により得られる化合物の収率の観点からは、短鎖であることが好ましく、オリゴペプチドであることが好ましい。ペプチドは、具体的には１０残基以下であることが好ましい。ペプチドは、１０残基以下、８残基以下、６残基以下、５残基以下、または４残基以下であることが好ましい。ペプチドは２残基以上、または３残基以上であることが好ましい。ペプチドは２〜１０残基、２〜８残基、２〜６残基、２〜５残基、２〜４残基、３〜１０残基、３〜８残基、３〜６残基、３〜５残基、または３〜４残基であることが好ましい。ペプチドは、２〜５残基であることがより好ましく、２〜４残基であることがさらに好ましく、３〜４残基であることが特に好ましい。
【００３３】
ペプチドは、Ａｒｇ（Ｒ）残基をＣ末端に有するペプチドであることが好ましい。Ａｒｇ（Ｒ）残基をＣ末端に有するペプチドは、例えば、セリンプロテアーゼを用いた測定を行う場合において、基質として好適に用いられる。そのようなペプチドとしては、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＤＰＲ）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＶＰＲ）、Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（ＬＴＲ）、Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（ＭＴＲ）、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＬＧＲ）、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＩＥＧＲ）（配列番号１）、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＥＧＲ）が挙げられる。
【００３４】
ペプチドは、Ｎ末端等に保護基を有するペプチドであってもよい。ペプチドは、Ｎ末端等のアミノ基に保護基を有していてもよく、カルボキシル基やチオール基に保護基を有していてもよい。ペプチドは、例えば、下記一般式（６）で示される化合物であってよい。
【００３５】
Ｙ−Ｘｐ    （６）
【００３６】
上記式（６）において、Ｘｐはペプチドであり、Ｙは存在しても存在しなくてもよく、Ｙが存在する場合は、ＹはペプチドのＮ末端のアミノ酸のアミノ基の保護基である。
【００３７】
上記式（６）において、ＸｐはＡｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＤＰＲ）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＶＰＲ）、Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（ＬＴＲ）、Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（ＭＴＲ）、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＬＧＲ）、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＩＥＧＲ）（配列番号１）、またはＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＥＧＲ）であることが好ましい。ＸｐはＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＬＧＲ）であることが特に好ましい。
【００３８】
本発明の測定用基質は、具体的には、下記一般式（７）で示される化合物であることが好ましい。
【００３９】
【化６】
2017141961.tif 000008
【００４０】
上記式（７）において、Ｙは存在しても存在しなくてもよく、Ｙが存在する場合は、ＹはペプチドのＮ末端のアミノ酸のアミノ基の保護基であり、Ｒ１はＨ又はアルキル基（ＣｍＨ２ｍ＋１）であって、ｍは１〜４の整数であり、Ｒ２はアルキル基（ＣｎＨ２ｎ＋１）であって、ｎは１〜４の整数である。
【００４１】
前記一般式（６）および（７）において、保護基Ｙは存在することが好ましい。また、前記一般式（６）において、ペプチドはカルボキシル基やチオール基に保護基を有するペプチドであってよい。保護基としては、Ｃｂｚ（ベンジルオキシカルボニル基）、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基）、ＯＢｚｌ（ベンジル基）、Ｂｚ（ベンゾイル基）、Ａｃ（アセチル基）が挙げられる。アミノ基を保護する保護基は、ＣｂｚまたはＢｏｃであることが好ましく、Ｃｂｚであることがより好ましい。保護基Ｙは、ＣｂｚまたはＢｏｃであることが好ましく、Ｃｂｚであることがより好ましい。また、カルボキシル基やチオール基を保護する保護基は、ＯＢｚｌであることが好ましい。例えば、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＤＰＲ）はＡｓｐ残基のカルボキシル基がＯＢｚｌで保護されたペプチド（Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｄ（ＯＢｚｌ）ＰＲ））であってもよい。また、例えば、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＩＥＧＲ）はＧｌｕ残基のカルボキシル基がＯＢｚｌで保護されたペプチド（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＩＥ（ＯＢｚｌ）ＧＲ））であってもよい。さらに、例えば、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＥＧＲ）はＧｌｕ残基のカルボキシル基がＯＢｚｌで保護されたペプチド（Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｅ（ＯＢｚｌ）ＧＲ））であってもよい。特に、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＥＧＲ）はＧｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｅ（ＯＢｚｌ）ＧＲ）であることが好ましい。
【００４２】
本発明の測定用基質は、さらに具体的には、下記一般式（８）で示される化合物であることが好ましい。
【００４３】
【化７】
2017141961.tif 000009
【００４４】
上記式（８）において、Ｃｂｚはベンジルオキシカルボニル基である。
【００４５】
前記一般式（２）、（３）、および（７）において、Ｒ１及びＲ２の好適な態様は、本発明の標識体における記載を準用して選択できる。例えば、前記一般式（２）、（３）、および（７）において、ｍおよびｎは１であることが好ましい。また、例えば、前記一般式（２）、（３）、および（７）において、Ｒ１はＨ又はＣＨ３であり、Ｒ２はＣＨ３であることが好ましい。さらに、例えば、上記式（２）、（３）、および（７）において、Ｒ１はＨであり、Ｒ２はＣＨ３であることが好ましい。
【００４６】
本発明の測定用基質は、塩であってよい。本発明の測定用基質は、例えば、アルカリ金属塩、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩、酢酸（ＡｃＯＨ）塩、または塩酸（ＨＣｌ）塩であってよい。
【００４７】
本発明の測定用基質は、本発明の測定用基質を含む試薬として提供されてもよい。本発明の測定用基質およびこれを含む試薬は、任意の形状であってよく、例えば、粉末等の固形状であってもよいし、任意の溶媒に溶解された状態の液状であってもよい。
【００４８】
本発明の測定用基質を用いることにより、電気化学測定法による測定を高感度かつ安定的に行うことが可能となる。
【００４９】
＜３＞本発明の測定対象物質の測定方法
本発明の測定対象物質の測定方法（以下「本発明の測定方法１」という。）は、本発明の測定用基質を用いることを特徴とする、電気化学測定法により測定対象物質を測定する方法である。本発明の測定方法１は、具体的には、測定対象物質の存在下、本発明の測定用基質と当該基質を分解する酵素（以下、単に「分解酵素」という。）を接触させる工程、および、当該測定用基質から遊離した標識体を測定する工程を含む、測定対象物質の測定方法である。
【００５０】
本発明において、測定は、検出、検知、及び定量を含む総称として用いられる。すなわち、本発明の測定方法１は、測定対象物質の検出方法、測定対象物質の検知方法、又は、測定対象物質の定量方法であってよい。
【００５１】
本発明の測定方法１において測定の対象となる物質は、特に制限されない。測定対象物質は、例えば、本発明の測定用基質を切断して本発明の標識体を遊離させる活性を有する分解酵素の活性に影響を与える物質である。分解酵素によって測定用基質が分解されると、本発明の標識体が遊離する。ここにいう分解酵素は、例えば、プロテアーゼである。すなわち、ペプチド等を基質として含む本発明の測定用基質から標識体が遊離することにより、試料を電気化学測定法に供した時に得られる電流値が上昇する為、プロテアーゼ等の分解酵素の活性を測定することができる。さらに、測定対象とする物質が分解酵素の活性に影響を与えるものである場合、その活性を測定することで間接的にその物質の濃度を測定することができる。分解酵素の活性に影響を与える物質とは、例えば、分解酵素の活性を亢進または抑制する作用を有する物質（活性化剤または阻害剤）である。また、分解酵素の活性に影響を与える物質とは、例えば、分解酵素の前駆体と接触した時に当該前駆体のプロペプチド配列の切断等により分解酵素を活性型酵素に変換する性質を有する物質である。ここにいう物質は、例えば、微生物由来物質である。
【００５２】
本発明の測定方法１は、例えば、微生物由来物質を測定対象物質とすることにより、微生物汚染を検出する手段として好適に用いられる。この目的においては、測定の対象となる微生物由来物質は、様々な微生物の種において共通して存在する同一の構造からなる成分であることが、微生物汚染の程度を包括的に測定する目的において好ましい。微生物由来物質は、具体的には、エンドトキシンや（１→３）−β−Ｄ−グルカン（以下、単に「グルカン」という。）であることが好ましい。
【００５３】
エンドトキシンやグルカンは、例えば、カブトガニ血球抽出液（カブトガニ・アメボサイト・ライセート）を用いて測定することができる。カブトガニ血球抽出液は、リムルス試薬またはリムルス・アメボサイト・ライセート（ＬＡＬ）試薬と呼ばれることもあり、これを用いて微生物由来物質を測定する試験はリムルス試験とも呼ばれる。
【００５４】
リムルス試験は、具体的には、微生物由来物質を含む試料（被検体）、リムルス試薬、およびリムルス試験の検出用基質（以下、単に「検出用基質」という。）を接触させることにより行うことができる。被検体中に微生物由来物質（具体的には、エンドトキシンやグルカン）が存在する場合には、リムルス試薬に含まれる各因子（Ｃ因子、Ｂ因子、Ｇ因子、プロクロッティングエンザイム。以下、個別に又は総称して「リムルス因子」という。）が逐次活性化され、カスケード反応が進行する。
【００５５】
例えば、被検体中にエンドトキシンが存在する場合には、エンドトキシンによるＣ因子の活性化（活性型Ｃ因子の生成）、活性型Ｃ因子によるＢ因子の活性化（活性型Ｂ因子の生成）、および活性型Ｂ因子によるプロクロッティングエンザイムの活性化（クロッティングエンザイムの生成）、が連続して起こるカスケード反応が進行する。また、例えば、被検体中にグルカンが存在する場合には、グルカンによるＧ因子の活性化（活性型Ｇ因子の生成）、および活性型Ｇ因子によるプロクロッティングエンザイムの活性化（クロッティングエンザイムの生成）、が連続して起こるカスケード反応が進行する。よって、活性化した任意のリムルス因子の量やカスケード反応の進行を測定することにより、リムルス試験の測定対象物質を測定することができる。カスケード反応の進行の測定は、例えば、クロッティングエンザイムの量を測定することにより行うことができる。
【００５６】
本発明の測定方法１は、例えば、カブトガニのリムルス因子（分解酵素の前駆体）を含む測定用試薬を用いて行うことができる。当該測定用試薬は、リムルス因子を含有している限り特に制限されない。そのような試薬としては、リムルス試薬が挙げられる。リムルス試薬は、カブトガニの血球を原料とし、常法に従って取得されたものであってよい。また、リムルス試薬は、当該取得物を適宜分画および／または精製等して取得されたものであってもよい。
【００５７】
本発明におけるカブトガニは、任意の種であってよい。カブトガニとしては、例えば、アジア産カブトガニであるタキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）、アメリカ産カブトガニであるリムルス・ポリフェムス（Limulus polyphemus）、ならびに東南アジア産カブトガニであるカルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Carcinoscorpius rotundicauda）およびタキプレウス・ギガス（Tachypleus gigas）が挙げられるが、これらのうち任意の種であってよい。カブトガニは、タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）またはリムルス・ポリフェムス（Limulus polyphemus）であることが好ましく、リムルス・ポリフェムス（Limulus polyphemus）であることがより好ましい。
【００５８】
リムルス試薬は、例えば、市販の試薬であってよい。例えば、リムルス試薬としては、エンドスペシー（生化学工業株式会社）、パイロクロム（アソシエーツオブケープコッドインク）、パイロテル−Ｔ（アソシエーツオブケープコッドインク）、パイロテル  マルチテスト（アソシエーツオブケープコッドインク）、カイネティック−ＱＣＬ（ロンザウォーカーズヴィルインク）、エンドクロム−Ｋ（チャールズリバーラボラトリーズインク）等が市販されており、本発明の測定方法１において用いることができる。
【００５９】
また、リムルス試薬は、例えば、任意のリムルス因子のみを含むように人為的に再構成されたリムルス試薬（以下「再構成リムルス試薬」という。）であってもよい。再構成リムルス試薬は、リムルス試験の測定対象物質と反応するリムルス因子を含むように構成されている限り、特に制限されない。
【００６０】
例えば、リムルス試験の測定対象物質がエンドトキシンである場合は、再構成リムルス試薬はリムルス因子としてＣ因子を含んでいればよく、他のリムルス因子（Ｂ因子、Ｇ因子、プロクロッティングエンザイム）は含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。また、例えば、リムルス試験の測定対象物質がグルカンである場合は、再構成リムルス試薬はリムルス因子としてＧ因子を含んでいればよく、他のリムルス因子（Ｃ因子、Ｂ因子、プロクロッティングエンザイム）は含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。
【００６１】
再構成リムルス試薬は、例えば、リムルス試薬から任意のリムルス因子を除去するように精製や分取を行うことにより調製することができる。また、例えば、リムルス試薬から単離した１種類のリムルス因子を再構成リムルス試薬としてもよいし、２種類以上の単離したリムルス因子を混合したものを再構成リムルス試薬としてもよい。
【００６２】
再構成リムルス試薬の調製は、公知の手法を適宜組合せて行われてよい。再構成リムルス試薬の調製は、例えば、文献（Nakamura T, Horiuchi T, Morita T, Iwanaga S. J Biochem. 1986 Mar; 99(3): 847-57.）に記載の方法を参照して行うことができる。
【００６３】
再構成リムルス試薬に含まれるリムルス因子は、カブトガニから得られる天然のタンパク質であってもよく、組換えのタンパク質であってもよい。
【００６４】
天然のリムルス因子は、前記カブトガニの血球抽出液から取得することができる。また、組換えのリムルス因子は、リムルス因子をコードする核酸を用いて形質転換した宿主細胞に当該リムルス因子を発現させることで取得することができる。宿主細胞の種類は特に制限されないが、例えば、哺乳類細胞や昆虫細胞を用いることができる。宿主細胞は、哺乳類細胞であることが好適である。哺乳類細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（ＣＨＯ細胞）やヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ細胞）が挙げられる。ＨＥＫ細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。
【００６５】
宿主細胞による組換えタンパク質の発現は常法に従って行うことができる。例えば、文献（国際公開第２０１２／１１８２２６号、国際公開第２０１４／０９２０７９）に記載の方法を参照して行うことができる。リムルス因子のアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子の塩基配列は、公知のデータベースから取得できる。公知のデータベースとしては、例えば、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）が挙げられる。発現された各組換えタンパク質は、例えば、宿主細胞を培養して得る培養液をそのままリムルス因子として用いてもよいし、必要に応じて所望の程度に精製したものをリムルス因子として用いてもよい。
【００６６】
再構成リムルス試薬に含まれるリムルス因子は、全てのリムルス因子が天然のタンパク質であってもよく、全てのリムルス因子が組換えタンパク質であってもよく、天然のタンパク質と組換えタンパク質が適宜組合されたものであってもよい。また、再構成リムルス試薬は、例えば、リムルス試薬そのもの、あるいはリムルス試薬を適宜分画および／または精製等したものと、天然および／または組換えのリムルス因子が適宜組合されたものであってもよい。
【００６７】
検出用基質は、活性化したリムルス因子の量やカスケード反応の進行を測定するために用いられる、リムルス因子の基質であることが好ましい。検出用基質は、リムルス因子の基質として作用するものである限り特に制限されない。検出用基質は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを基質として含む本発明の測定用基質であることが好ましい。検出用基質は、天然のタンパク質等を基質として含む本発明の測定用基質であってもよく、組換えのタンパク質等を基質として含む本発明の測定用基質であってもよい。タンパク質としては、カスケード反応の最終産物であるクロッティングエンザイムの基質であるコアギュローゲンが挙げられる。例えば、天然のコアギュローゲンは、カブトガニ血球抽出液から調製することができる。また、例えば、組換えのコアギュローゲンは、文献（宮田ら、蛋白質  核酸  酵素  別冊  No.29; P30-43; 1986）に記載の方法を参照して調製することができる。
【００６８】
また、基質がポリペプチドやペプチドである場合、基質は化学的に合成された合成基質であってもよい。合成基質は、活性化したリムルス因子の量やカスケード反応の進行を測定するのに好適な基質である限り特に制限されない。そのような基質は、クロッティングエンザイムを測定するための基質であってもよく、カスケード反応の途中段階に存在する活性化されたリムルス因子を測定するための基質であってもよい。合成基質は、ペプチドであることが好ましい。
【００６９】
合成基質を含む検出用基質としては、一般式Ｙ−Ｘｐ−Ｚ（式中、Ｙは保護基、Ｘｐはペプチド、ＺはＸｐと結合した標識物質（残基）である。）で表される基質が挙げられる。このような合成基質は、活性化されたリムルス因子によってＸｐ−Ｚ間の結合が切断され、標識物質Ｚが遊離する性質を有していればよい。Ｘｐ−Ｚ間の結合は、アミド結合であることが好ましい。
【００７０】
保護基Ｙは特に制限されず、ペプチドに適用可能な公知の保護基を好適に用いることができる。そのような保護基としては、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジル基、ベンゾイル基、アセチル基が挙げられる。ペプチドＸｐとしては、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＤＰＲ）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＶＰＲ）、Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（ＬＴＲ）、Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（ＭＴＲ）、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＬＧＲ）、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＩＥＧＲ）（配列番号１）、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＥＧＲ）が挙げられる。標識物質Ｚには、本発明の標識体における任意の化合物を用いることができる。
【００７１】
合成基質は、検出対象とするリムルス因子の種類に応じて好適なものを適宜選択して用いてよい。例えば、ペプチドＸｐとしては、基質特異性の点からは、ＬＧＲまたはＩＥＧＲを含む基質をクロッティングエンザイムの測定に、ＬＴＲまたはＭＴＲを含む基質を活性型Ｂ因子の測定に、ＶＰＲまたはＤＰＲを含む基質を活性型Ｃ因子の測定に、ＥＧＲを含む基質を活性型Ｇ因子の測定に、それぞれ好適に用いることができる。
【００７２】
再構成リムルス試薬を用いたリムルス試験において、２種類以上のリムルス因子を用いる場合は、各リムルス因子は被検体と接触させる工程の当初から反応液中に全て含まれていてもよく、逐次反応液中に添加されてもよい。
【００７３】
検出用基質は、任意の順序で反応液中に添加されてよい。例えば、検出用基質は、被検体とリムルス試薬を接触させる工程の前から反応液中に含まれていてもよく、当該工程の間または後に反応液中に添加されてもよい。また、検出用基質を予め含有しているリムルス試薬を用いる場合は、検出用基質を反応液中に別途添加しなくてもよい。
【００７４】
本発明において電気化学測定法は、任意の方法であってよい。電気化学測定法としては、ボルタンメトリー法やアンペロメトリー法が挙げられる。電気化学測定法は、アンペロメトリー法であることが好ましい。電気化学測定法は、例えば、文献（特開2015-187607）に記載の方法を参照して行うことができる。
【００７５】
本発明の測定方法１は、その他の任意の工程を含んでいてよい。例えば、本発明の測定方法１は、上述の通り、反応液中に検出用基質を添加する工程を含んでいてもよい。また、本発明の測定方法１は、例えば、反応液中にリムルス試薬を添加する工程を含んでいてもよい。本発明の測定方法１は、例えば、本発明の測定用基質である検出用基質、測定対象物質、およびリムルス試薬を接触させる工程、ならびに、当該測定用基質から遊離した標識体を電気化学測定法により測定する工程を含む、測定対象物質・BR>フ測定方法であってよい。
【００７６】
さらに、例えば、本発明の測定方法１は、測定により得られたデータを他のデータに変換する工程を含んでいてもよい。測定により得られたデータを他のデータに変換する工程としては、例えば、測定により得られたデータに基づき、測定対象物質の量を算出する工程が挙げられる。そのような工程は、具体的には、例えば、被検体を濃度既知の標準物質に置き換えて測定した時に得られる測定値と標準物質の濃度との関係（標準曲線）に基づき、被検体を測定した時に得られる測定値を測定対象物質の量に変換する工程である。
【００７７】
本発明の測定方法１において、反応は水あるいは緩衝液等の水性溶媒中で行われることが好ましい。
【００７８】
本発明の測定方法１を行うことにより、測定対象物質を高感度かつ安定的に測定することができる。
【００７９】
＜４＞本発明の酵素活性の測定方法
本発明の酵素活性の測定方法（以下「本発明の測定方法２」という。）は、本発明の測定用基質を用いることを特徴とする、電気化学測定法により分解酵素の活性を測定する方法である。本発明の測定方法２は、例えば、本発明の測定用基質と分解酵素を接触させる工程、および、当該測定用基質から遊離した標識体を測定する工程を含む、酵素活性の測定方法である。本発明の測定方法２は、本発明の測定方法１と同様、その他の任意の工程を含んでいてよい。その他の工程は、例えば、標準曲線に基づき、測定により得られたデータ（測定値）を分解酵素の量に変換する工程であってよい。本発明の測定方法２における分解酵素や各工程等の説明には、上記＜３＞本発明の測定対象物質の測定方法の記載を準用することができる。
【００８０】
＜５＞本発明の試薬キット
本発明の試薬キットは、本発明の標識体、および／または、本発明の測定用基質を構成品として含む試薬キットである。本発明の試薬キットは、例えば、本発明の測定用基質の調製、および／または、本発明の測定方法１もしくは本発明の測定方法２を行うために用いることができる。
【００８１】
本発明の試薬キットは、本発明の標識体、および／または、本発明の測定用基質を構成品として含む限り、他の構成品をさらに含んでいてよい。ここにいう他の構成品としては、例えば、縮合剤、リムルス試薬、緩衝液、蒸留水、標準物質（プロテアーゼ標準品、エンドトキシンやグルカン等の微生物由来物質等）、マイクロプレート、および製品情報を記載した添付文書が挙げられる。
【００８２】
リムルス試薬に含まれる各リムルス因子や本発明の測定用基質は、混合物として本発明の試薬キットに含まれていてもよく、それぞれ別個に、または、任意の組み合わせで別個に、本発明の試薬キットに含まれていてもよい。
【００８３】
このような本発明の試薬キットを用いることにより、本発明の測定用基質の調製や電気化学測定法による測定を簡便に行うことができる。
【実施例】
【００８４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例のみに限定されるものではない。【００８５】
＜参考例１＞標識体および測定用基質の入手
標識体である、ｐ−アミノフェノール（ｐＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＤＭＰＤ）、およびＮ−メチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＭＰＤＤ）は和光純薬工業株式会社から購入した。これら標識体とＣｂｚ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｃｂｚ−ＬＧＲ）をアミド結合させた測定用基質である、Ｃｂｚ−ＬＧＲ−ｐＡＰ、Ｃｂｚ−ＬＧＲ−ＤＭＰＤ、Ｃｂｚ−ＬＧＲ−ＭＰＤＤは渡辺化学工業株式会社に合成を委託して入手した。本願の実施例においては、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）塩として調製された測定用基質を用いた。【００８６】
以後、Ｃｂｚ−ＬＧＲ−ｐＡＰ、Ｃｂｚ−ＬＧＲ−ＤＭＰＤ、Ｃｂｚ−ＬＧＲ−ＭＰＤＤを、それぞれＬＧＲ−ｐＡＰ、ＬＧＲ−ＤＭＰＤ、ＬＧＲ−ＭＰＤＤと略して表記する。【００８７】
＜参考例２＞定量性の評価
基質と遊離分子（標識体）の混合比率を段階的に変化させてサイクリックボルタンメトリー測定を行った結果、ＬＧＲ−ｐＡＰとｐＡＰの混合溶液のボルタモグラムでは０．１５Ｖと０．４９Ｖの２つの酸化ピークが確認できた。基質分子および遊離分子の単独のボルタモグラムから、０．４９Ｖ付近のピークがＬＧＲ−ｐＡＰの酸化に由来し、０．１５Ｖ付近のピークがｐＡＰの酸化に由来すると考えられる。同様にＬＧＲ−ＤＭＰＤとＤＭＰＤの混合溶液のボルタモグラムから０．４５Ｖ付近にＬＧＲ−ＤＭＰＤ由来、０．１９Ｖ付近にＤＭＰＤ由来の酸化ピークが確認された。さらにＬＧＲ−ＭＰＤＤとＭＰＤＤの混合溶液のボルタモグラムから０．４６Ｖ付近にＬＧＲ−ＭＰＤＤ由来、０．１４Ｖ付近にＭＰＤＤ由来の酸化ピークが確認された。さらに、いずれの基質を用いた場合も、遊離分子の酸化ピーク電流値は遊離分子の割合が高くなるにつれて大きくなった。これらのことから、アンペロメトリックに０．３Ｖ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌの電位で各混合溶液中の遊離分子の濃度を定量できると考えられた。次に、各混合溶液においてクロノアンペロメトリー測定を行った。作用電極の電位を０．３Ｖ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌに変化させた直後（０秒目）からの電流値の時間変化をもとに、混合溶液中の遊離分子の濃度に対する２０秒目の電流値をプロットしたところ、それぞれの決定係数はｐＡＰでＲ２＝０．９９７３、ＤＭＰＤでＲ２＝０．９９８６、ＭＰＤＤでＲ２＝０．９９７２となり高い線形性が確認された。【００８８】
＜実施例１＞標識体および測定用基質の安定性の評価
前記＜参考例１＞で入手した標識体および測定用基質について、化合物の安定性を評価した。【００８９】
標識体（ｐＡＰ、ＭＰＤＤ、ＤＭＰＤ）および測定用基質（ＬＧＲ−ｐＡＰ、ＬＧＲ−ＭＰＤＤ、ＬＧＲ−ＤＭＰＤ）を、それぞれ０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．８）に溶解して１ｍＭとなるように調製し、３７℃のインキュベーター中に１〜２４時間静置した。以後、以下の手順に従って試験を行った。【００９０】
＜電気化学測定法＞
電気化学測定法としては、サイクリックボルタンメトリーとポテンシャルステップクロノアンペロメトリー法を用いた。測定機器、作用極、参照極、および対極には、下記の＜測定条件＞に記載したものを用いた。いずれの測定の場合にも、作用極、参照極、および対極を溶液に挿入し、それぞれをポテンショスタットの作用極、参照極および対極端子に接続した。作用極は１回計測を終えるごとに０．０５μｍ研磨用アルミナで電極表面を研磨し、超純水でよく洗浄を行った。サイクリックボルタンメトリー測定では、初期電位と終了電位を０Ｖ、第１折り返し電位を０．４Ｖ（ＬＧＲ−ｐＡＰ、ＬＧＲ−ＤＭＰＤは０．６Ｖ、ＬＧＲ−ＭＰＤＤは０．７Ｖ）、第２折り返し電位を−０．２Ｖに設定して電位走査を行い、電流をモニタリングした。ポテンシャルステップクロノアンペロメトリー測定では、作用極に０．０Ｖを１０秒間印加した後に０．３Ｖに瞬間的に電位を変化させ、３５秒間電流をモニタリングした。【００９１】
＜測定条件＞
測定機器：ポテンショスタット（コンパクトスタット、ＩＶＩＵＭ社製）
作用極：直径１ｍｍグラッシーカーボンディスク電極（ＢＡＳ社製）
参照極：銀−塩化銀電極
対極：白金電極【００９２】
＜基質および遊離分子の安定性の確認＞
各基質（ＬＧＲ−ｐＡＰ、ＬＧＲ−ＭＰＤＤ、ＬＧＲ−ＤＭＰＤ）および遊離分子（ｐＡＰ、ＭＰＤＤ、ＤＭＰＤ）の試験溶液（１．０ｍＭ）５０ｍＬを０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．８）を用いて調製し、５０ｍＬ容器のプラスチック遠沈管（イワキ社製）に入れて３７℃で遮光条件にて静置した。所定時間（０．５時間、１時間、２時間、４時間、２４時間）経過時に試験溶液から５ｍＬを採取してサイクリックボルタンメトリー測定を行った。ＭＰＤＤについては、６時間および８時間経過時の測定も行った。また、調製直後の試験溶液を使用して所定時間０時間の測定を行った。【００９３】
＜遊離分子の定量評価＞
１．０ｍＭ  ＬＧＲ−ｐＡＰ溶液と１．０ｍＭ  ｐＡＰ溶液を０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．８）を用いて調製し、これらを１００：０、７５：２５、５０：５０、２５：７５、または０：１００の比率で混合してｐＡＰの濃度が段階的に変化する混合溶液を調製した。ＬＧＲ−ＤＭＰＤ溶液とＤＭＰＤ溶液およびＬＧＲ−ＭＰＤＤ溶液とＭＰＤＤ溶液の混合溶液も同様にして調製した。これらの混合溶液に対してサイクリックボルタンメトリー測定を行った。【００９４】
３７℃で遮光条件にて静置した各合成基質および遊離分子に対してサイクリックボルタンメトリー測定を行った結果、合成基質の測定結果より、合成基質はボルタモグラムの形状が２４時間でほとんど変化せず、安定であることが分かった。実際のエンドトキシン検出における１時間の反応時間内では、合成基質は劣化しないと考えられる。一方、遊離分子の測定結果より、遊離分子は２４時間の間に徐々にボルタモグラムの形状が変化し、合成基質に比べると安定性が低いことがわかった。結果を表１に示す。【００９５】
【表１】
2017141961.tif 000010
【００９６】
表１に示した数値は、各遊離分子のボルタモグラムにおいて、調製直後（０時間）における酸化ピーク電流値を１００％とした場合における、所定時間経過後の各遊離分子のボルタモグラムにおけるピークの高さを相対的に示した数値である。エンドトキシンの検出は通常１時間以内に終わることから，調製後１時間におけるｐＡＰ、ＤＭＰＤおよびＭＰＤＤのボルタモグラムの酸化ピーク電流値を、溶液調製直後を基準として比較したところ、それぞれ９５．０％、９４．３％および１０２．３％であった。【００９７】
表１に示したとおり、リムルス反応によって測定用基質から遊離する物質である標識体のうち、ｐＡＰとＤＭＰＤの検出値は、調製後２時間以内において継時的に低下する傾向が認められた。しかしながら、ＭＰＤＤの検出値は、調製後２時間以内において低下が認められなかった。【００９８】
以上より、ＭＰＤＤはｐＡＰに比して安定であり、もって安定的に測定を行うことを可能とする標識体であることが示された。【００９９】
＜実施例２＞リムルス試験（１）
前記＜参考例１＞で入手した測定用基質を用いたリムルス試験を実施し、アンペロメトリー法によるエンドトキシンの測定を行った。リムルス試薬としては、リムルス・ポリフェムス（Limulus polyphemus）から調製したライセート試薬であるエンドスペシー  ＥＳ−２４Ｓ（生化学工業株式会社製）を使用した。以後に記載する手順においては、エンドスペシー  ＥＳ−２４ＳをＥＳ−２４Ｓと略して表記する。試験の手順を以下に示す。【０１００】
＜リムルス反応＞
日本薬局方に規定された方法に従い、標準エンドトキシン試料（ＵＳＰ−ＲＳＥ）を注射用水（大塚製薬株式会社製）に溶解し、２０，０００ＥＵ／Ｌ、２，０００ＥＵ／Ｌ、２００ＥＵ／Ｌ、２０ＥＵ／Ｌ、２ＥＵ／Ｌ、０ＥＵ／Ｌのエンドトキシン溶液を調製した。また、ＥＳ−２４Ｓに付属の緩衝液を用いて１．０ｍＭとなるようにＬＧＲ−ｐＡＰの溶液を調製し、この溶液を用いてＥＳ−２４Ｓのリムルス試薬を溶解した。各濃度のエンドトキシン溶液とＬＧＲ−ｐＡＰを含むリムルス試薬を１：１の体積比で混合し、３７℃で１時間反応させた後、クロノアンペロメトリー測定を行った。ＬＧＲ−ＤＭＰＤおよびＬＧＲ−ＭＰＤＤについても同様の手順で試験を行った。なお、２０，０００ＥＵ／Ｌの溶液は１回のみ測定を行い、２，０００ＥＵ／Ｌ、２００ＥＵ／Ｌ、２０ＥＵ／Ｌ、２ＥＵ／Ｌ、０ＥＵ／Ｌの溶液は、測定日を変えて溶液の調製から測定までの試験を３回行った。【０１０１】
＜測定条件＞
前記＜実施例１＞の＜測定条件＞に記載した条件と同じである。【０１０２】
結果を表２に示す。【０１０３】
【表２】
2017141961.tif 000011
【０１０４】
表２に示した数値は、各基質を用いてリムルス試験を３回行ったときの測定値（アンペログラムにおける２０秒後の電流値／μＡ）の平均値と標準偏差である。本実施例においては、０ＥＵ／Ｌの試料の測定値の平均値に標準偏差の３倍の値を加えて算出した値を検出限界値として、各基質を用いた場合において測定可能なエンドトキシン濃度の範囲を評価した。【０１０５】
表２より、従来の測定用基質（ＬＧＲ−ｐＡＰ）を用いた場合は、１ＥＵ／Ｌの試料の測定値は検出限界値以下であった。また、１００ＥＵ／Ｌの試料の測定値が１，０００ＥＵ／Ｌの試料の測定値よりも高くなった。すなわち、従来の測定用基質（ＬＧＲ−ｐＡＰ）を用いた場合は、エンドトキシン濃度の定量可能な範囲が１０〜１００ＥＵ／Ｌであることが示された。【０１０６】
これに対し、本発明の測定用基質（ＬＧＲ−ＭＰＤＤ、ＬＧＲ−ＤＭＰＤ）を用いた場合は、１ＥＵ／Ｌの試料の測定値が検出限界値を超え、かつ１〜１，０００ＥＵ／Ｌのエンドトキシン濃度の範囲において測定値がエンドトキシン濃度に比例して増加した。すなわち、本発明の測定用基質（ＬＧＲ−ＭＰＤＤ、ＬＧＲ−ＤＭＰＤ）を用いた場合は、エンドトキシン濃度の定量可能な範囲が１〜１，０００ＥＵ／Ｌであることが示され、従来の測定用基質（ＬＧＲ−ｐＡＰ）を用いた場合に比して広範囲のエンドトキシン濃度を定量可能であることが示された。【０１０７】
また、本発明の測定用基質（ＬＧＲ−ＭＰＤＤ、ＬＧＲ−ＤＭＰＤ）を用いて測定を行った場合の標準偏差の値は、従来の測定用基質（ＬＧＲ−ｐＡＰ）を用いて測定を行った場合の標準偏差の値に比して小さくなる傾向が認められた。すなわち、標識分子としてＭＰＤＤやＤＭＰＤを用いることにより、日間誤差が低減された安定的な測定が可能になることが示された。さらに、本発明の測定用基質（ＬＧＲ−ＭＰＤＤ、ＬＧＲ−ＤＭＰＤ）を用いて測定を行った場合、０ＥＵ／Ｌの試料の測定値は、ＬＧＲ−ｐＡＰを用いて測定を行った場合と比べて小さく、測定値のバックグラウンドを低く抑えることが可能であることが分かった。【０１０８】
＜実施例３＞リムルス試験（２）
前記＜参考例１＞で入手した測定用基質を用いたリムルス試験を実施し、ボルタンメトリー法によるエンドトキシンの測定を行った。試験の手順を以下に示す。【０１０９】
＜リムルス反応＞
クロノアンペロメトリー測定に代えてサイクリックボルタンメトリー測定を行ったことの他は、前記＜実施例２＞の＜リムルス反応＞に記載した条件と同じである。【０１１０】
＜測定条件＞
前記＜実施例１＞の＜測定条件＞に記載した条件と同じである。【０１１１】
ボルタンメトリー法による測定の結果、基質としてＬＧＲ−ｐＡＰ、ＬＧＲ−ＤＭＰＤ、およびＬＧＲ−ＭＰＤＤのいずれを用いた場合においても、エンドトキシンの非存在下（ＯＥＵ／Ｌ）では基質のみの酸化ピークが観察された。一方、エンドトキシンの存在下ではエンドトキシン濃度が上昇するに従い、遊離分子に起因する酸化ピークが大きくなることが確認された。また、基質として従来の測定用基質（ＬＧＲ−ｐＡＰ）を用いた場合は、１，０００ＥＵ／Ｌの試料を測定対象とした場合における遊離分子に起因する酸化ピークが、１００ＥＵ／Ｌの試料を測定対象とした場合のそれに比して減少した。これに対し、本発明の測定用基質（ＬＧＲ−ＭＰＤＤ、ＬＧＲ−ＤＭＰＤ）を用いた場合は、１〜１，０００ＥＵ／Ｌのエンドトキシン濃度の範囲において、遊離分子に起因する酸化ピークはエンドトキシン濃度に比例して増大した。すなわち、電気化学測定法としてボルタンメトリー法を用いた場合においても、アンペロメトリー法を用いた場合と同様にエンドトキシン濃度を測定可能であることが示された。【０１１２】
この時のボルタモグラムにおいて、１，０００ＥＵ／Ｌの試料を測定対象とした場合における遊離分子に起因する酸化ピークの電流値は、ＬＧＲ−ＤＭＰＤを基質とした場合において０．３１μＡ、ＬＧＲ−ＭＰＤＤを基質とした場合において０．６０μＡであった。一方、パラメトキシアニリン（ｐＭＡ）で標識した基質であるＬＧＲ−ｐＭＡのボルタモグラムが特許文献１の図９に開示されているところ、１，０００ＥＵ／Ｌの試料を測定対象とした場合における遊離分子に起因する酸化ピークの電流値は、約０．３μＡである。すなわち、本発明の標識体（ＭＰＤＤまたはＤＭＰＤ）を用いることにより、従来の標識体（ｐＭＡ）を用いた場合と同等以上の電流値を得られることが示された。特に標識体としてＭＰＤＤを用いた場合は、ｐＭＡを用いた場合に比して約２倍の電流値を得られることが明らかとなり、もってエンドトキシンの高感度な測定が可能となることが示された。【０１１３】
また、＜参考例２＞に示した結果より示される、０．５ｍＭのＤＭＰＤおよびＭＰＤＤに起因する酸化ピーク電流値は、それぞれ約０．９μＡおよび約１．１μＡであった。一方、特許文献１の図４において、１ｍＭのｐＭＡに起因する酸化ピーク電流値が約３．０μＡであることが示されているので、０．５ｍＭのｐＭＡに起因する酸化ピーク電流値は約１．５μＡである。すなわち、遊離分子そのものの測定結果からすると、本発明の測定用基質の調製に使用される標識体であるＭＰＤＤおよびＤＭＰＤはどちらも、従来の標識体であるｐＭＡに比して低い電流値を示すものと想定された。しかしながら、基質（ＬＧＲ）と結合させてリムルス試験に供した場合に得られる酸化ピーク電流値の最大値（上限）は、特許文献１の図８において、ＬＧＲ−ｐＭＡを用いた場合に約０．２８μＡとなることが示されているのに対し、本発明の測定用基質であるＬＧＲ−ＤＭＰＤおよびＬＧＲ−ＭＰＤＤを用いた場合は、０．３１μＡおよび０．６０μＡであった。これらの数値を表３に示す。【０１１４】
【表３】
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【０１１５】
表３において、測定値Ａは０．５ｍＭの各標識体そのものをボルタンメトリー法で測定した場合における酸化ピーク電流値を、測定値Ｂは各標識体をペプチド（ＬＧＲ）に結合させた測定用基質（０．５ｍＭ）をリムルス試験に供して得られる酸化ピーク電流値の最大値を示す。【０１１６】
すなわち、いずれの標識体を用いた場合においても、モル濃度から想定される酸化ピーク電流値に比して、ペプチドに結合させてリムルス試験に供した後に得られる酸化ピーク電流値の最大値（上限）が低くなる傾向が認められたものの、本発明の標識体であるＭＰＤＤおよびＤＭＰＤを用いた場合は従来の標識体であるｐＭＡを用いた場合に比して低下の程度が緩和されており、効率よく電気化学測定法において検知されることが示された。当業者であれば標識体単独の測定値から考えて、ｐＭＡの方が測定用基質に用いたときに効率よく電気化学測定法において検知されると予想するところ、ＭＰＤＤおよびＤＭＰＤの方が効率よく検知されるという結果は予想外であった。この結果は、ＭＰＤＤにおいて特に顕著であった。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明によれば、電気化学測定法による測定を高感度かつ安定的に行うことができる。したがって、本発明は、臨床上においても、研究上においても、極めて有用である。【０１１８】
日本国特許出願第２０１６−０２６９２５号（出願日：２０１６年２月１６日）の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2017141961.tif 000018
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