(57)【要約】  本発明の遺伝子組換え作物の検出方法は、遺伝子組換え作物をポリメラーゼ連鎖反応によって検出する方法であって、被検試料中の核酸又は前記被検試料から抽出した核酸を鋳型とし、ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子の部分配列を特異的に増幅可能なプライマーペアを用いて、前記ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子の部分配列を有する核酸を増幅する工程と、前記増幅された核酸を検出又は定量する工程とを含む。また本発明は、ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子が導入された遺伝子組換え作物を、ポリメラーゼ連鎖反応によって検出又は定量するための試薬キットも提供する。
2017163546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換え作物をポリメラーゼ連鎖反応によって検出する遺伝子組換え作物の検出方法であって、
被検試料中の核酸又は前記被検試料から抽出した核酸を鋳型とし、ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子の部分配列を特異的に増幅可能なプライマーペアを用いて、前記ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子の部分配列を有する核酸を増幅する工程と、
前記増幅された核酸を検出又は定量する工程と、
を含む遺伝子組換え作物の検出方法。
【請求項２】
前記プライマーペアが、
配列番号１に記載の塩基配列を含む核酸、
配列番号１に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸、又は  配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸と、
配列番号２に記載の塩基配列を含む核酸、
配列番号２に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸、又は  配列番号４に記載の塩基配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸とからなる、請求項１に記載の遺伝子組換え作物の検出方法。
【請求項３】
前記増幅された核酸の検出又は定量に、配列番号５に記載の塩基配列、該塩基配列と相補の塩基配列又はこれらの何れかの塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、蛍光標識、放射性物質標識又はビオチン標識されている核酸プローブを用いる、請求項１又は２に記載の遺伝子組換え作物の検出方法。
【請求項４】
遺伝子組換え作物をポリメラーゼ連鎖反応によって検出する遺伝子組換え作物の検出方法であって、
被検試料中の核酸又は前記被検試料から抽出した核酸を鋳型とし、ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の部分配列を特異的に増幅可能なプライマーペアを用いて、前記ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の部分配列を有する核酸を増幅する工程と、
前記増幅された核酸を検出又は定量する工程と、
を含む遺伝子組換え作物の検出方法。
【請求項５】
前記プライマーペアが、
配列番号６に記載の塩基配列を含む核酸、
配列番号６に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸、又は  配列番号８に記載の塩基配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸と、
配列番号７に記載の塩基配列を含む核酸、
配列番号７に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸、又は  配列番号９に記載の塩基配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸とからなる、請求項４に記載の遺伝子組換え作物の検出方法。
【請求項６】
前記増幅された核酸の検出又は定量に、配列番号１０に記載の塩基配列、該塩基配列と相補の塩基配列又はこれらの何れかの塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、蛍光標識、放射性物質標識又はビオチン標識されている核酸プローブを用いる、請求項４又は５に記載の遺伝子組換え作物の検出方法。
【請求項７】
前記遺伝子組換え作物が小麦である、請求項１〜６の何れか１項に記載の遺伝子組換え作物の検出方法。
【請求項８】
ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子が導入された遺伝子組換え作物を、ポリメラーゼ連鎖反応によって検出又は定量するための試薬キットであって、
配列番号１に記載の塩基配列を含む核酸、配列番号１に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸、又は配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸と、
配列番号２に記載の塩基配列を含む核酸、配列番号２に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸、又は配列番号４に記載の塩基配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸とからなるプライマーペアを含む、試薬キット。
【請求項９】
配列番号５に記載の塩基配列、該塩基配列と相補の塩基配列又はこれらの何れかの塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、蛍光標識、放射性物質標識又はビオチン標識されている核酸プローブを更に含む、請求項８に記載の試薬キット。
【請求項１０】
ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子が導入された遺伝子組換え作物を、ポリメラーゼ連鎖反応によって検出又は定量するための試薬キットであって、
配列番号６に記載の塩基配列を含む核酸、配列番号６に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸、又は配列番号８に記載の塩基配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸と、
配列番号７に記載の塩基配列を含む核酸、配列番号７に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸、又は配列番号９に記載の塩基配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸とからなるプライマーペアを含む、試薬キット。
【請求項１１】
配列番号１０に記載の塩基配列、該塩基配列と相補の塩基配列又はこれらの何れかの塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、蛍光標識、放射性物質標識又はビオチン標識されている核酸プローブを更に含む、請求項１０に記載の試薬キット。
【請求項１２】
前記遺伝子組換え作物が小麦である、請求項８〜１１の何れか１項に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え作物の検出方法及び遺伝子組換え作物検出用の試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術を利用して開発された遺伝子組換え作物が食品として利用されるようになっている。日本においても、トウモロコシ、ダイズ、ナタネ、綿実（ワタ）、ジャガイモ等の多くの遺伝子組換え作物について、安全性審査を経て、輸入や販売が認められている。また、遺伝子組換え作物やそれを原料とする食品について表示制度が設けられており、指定された遺伝子組換え作物及びその加工食品については、その表示が義務づけられている（非特許文献１，２）。
他方、海外においては、遺伝子組換え作物と非遺伝子組換え作物が近い場所で栽培される、または同じ加工工場内で使用される場合がある。そのため、微量の遺伝子組換え作物及びそれ由来の加工食品が混入し、非遺伝子組換え作物の原料及び非遺伝子組換え作物のみを使用した加工食品であっても遺伝子組換え作物由来の組換えＤＮＡが検出される可能性がある。【０００３】
農産物やそれを使用した食品等の被検試料中の遺伝子組換え作物の検出方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）によって組換えＤＮＡを検出する方法や、酵素結合免疫吸着法によって組換え蛋白質を検出する方法等があるが、一般的にＰＣＲによる検出が行われており、非特許文献３にも、ＰＣＲを用いた遺伝子組換え作物の検査分析が記載されている。
ＰＣＲで被検試料中に遺伝子組換え作物が混入しているか否かを調べるには、遺伝子組換え技術によって導入された組換えＤＮＡの部分塩基配列を増幅する方法が一般的であるが、導入された組換えＤＮＡの種類が不明である場合、標的とする組換えＤＮＡを代えて複数回ＰＣＲを行い、遺伝子組換え作物が含まれていないことを確認する必要がある。しかし、そのような方法は手間がかかり、実用的ではない。
そのため、農産物やそれを使用した食品等について、遺伝子組換え作物が含まれるか否かに関する表示を適切に行うためには、信頼性と実用性の高い遺伝子組換え作物の検出技術の開発が望まれる。【０００４】
また、遺伝子組換え技術により農産物に導入する外来遺伝子として、環境ストレス耐性に必要な遺伝子群の発現を制御するＤｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（以下「ＤＲＥＢ」という）遺伝子が知られている。このＤＲＥＢ遺伝子を農産物内で過剰発現させることにより、乾燥、塩、低温等の環境ストレスに対する耐性が向上することが報告されている。例えば、特許文献１には、低温等のストレス耐性を形質導入するために有用な新規のポリヌクレオチド（構造遺伝子領域およびその発現制御領域）が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「遺伝子組換えに関する表示に係る加工食品品質表示基準第７条第１項及び生鮮食品品質表示基準第７条第１項の規定に基づく農林水産大臣の定める基準」（平成１２年３月３１日農林水産省告示第５１７号）
【非特許文献２】「食品衛生法施行規則及び乳及び乳製品の成分規格等に関する省令の一部を改正する省令等の施行について」（平成１３年３月１５日厚生労働省食発第７９号）
【非特許文献３】ＪＡＳ分析試験ハンドブック  遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル改訂第２版
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−２２３７５７号公報
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、以下の（１）〜（４）を提供するものである。
（１）遺伝子組換え作物をＰＣＲによって検出する方法であって、被検試料中の核酸又は前記被検試料から抽出した核酸を鋳型とし、ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子の部分配列を特異的に増幅可能なプライマーペアを用いて、前記ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子の部分配列を有する核酸を増幅する工程と、前記増幅された核酸を検出する工程と、を含む遺伝子組換え作物の検出方法（以下、第１発明というときはこの発明をいう）。
（２）遺伝子組換え作物をＰＣＲによって検出する方法であって、被検試料中の核酸又は前記被検試料から抽出した核酸を鋳型とし、ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の部分配列を特異的に増幅可能なプライマーペアを用いて、前記ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の部分配列を有する核酸を増幅する工程と、前記増幅された核酸を検出する工程と、を含む遺伝子組換え作物の検出方法（以下、第２発明というときはこの発明をいう）。
【０００８】
（３）ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子が導入された遺伝子組換え作物を、ＰＣＲによって検出又は定量するための試薬キットであって、配列番号１に記載の塩基配列を含む核酸、配列番号１に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸、又は配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸と、配列番号２に記載の塩基配列を含む核酸、配列番号２に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸、又は配列番号４に記載の塩基配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸とからなるプライマーペアを含む、試薬キット（以下、第３発明というときはこの発明をいう）。
（４）ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子が導入された遺伝子組換え作物を、ＰＣＲによって検出又は定量するための試薬キットであって、配列番号６に記載の塩基配列を含む核酸、配列番号６に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸、又は配列番号８に記載の塩基配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸と、配列番号７に記載の塩基配列を含む核酸、配列番号７に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸、又は配列番号９に記載の塩基配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸とからなるプライマーペアを含む、試薬キット（以下、第４発明というときはこの発明をいう）。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子及びワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子それぞれのＤＮＡ配列の一部を並べた図である。
【図２】本発明の実施例１の結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例１の結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例２の結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例２の結果を示す図である。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
現在、ＤＲＥＢ遺伝子等を活用した環境ストレスに強い作物の開発が世界的に行われており、今後ＤＲＥＢ遺伝子が導入された遺伝子組換え作物の生産が拡大することが予想される。したがって、ＤＲＥＢ遺伝子が導入された遺伝子組換え作物の検出技術が重要となる。しかし、ＤＲＥＢ遺伝子が導入された遺伝子組換え作物を、高い信頼性と実用性を持って検出可能な方法は未だ提供されていなかった。特許文献１にも、ＤＲＥＢ遺伝子を特異的に検出する方法については記載されていない。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、ＤＲＥＢ遺伝子が導入された遺伝子組換え作物を、高い信頼性と実用性を持って検出可能な方法及び試薬キットを提供することにある。
【００１２】
以下、本発明をその好ましい実施形態に基づいて説明する。
本発明（第１及び第２発明）は、遺伝子組換え作物を検出する方法である。即ち、植物である作物、その作物から得られる食品素材、又は作物や食品素材を用いて得られる加工食品等の被検試料中に含まれる、組換えＤＮＡが導入された遺伝子組換え作物を検出する方法である。
植物である作物としては、穀物粒、ジャガイモ、てんさい、パイナップル等が挙げられる。穀物粒としては、例えば、麦類（小麦、大麦、エンバク、ライ麦、ハトムギ等）、コメ、トウモロコシ、マイロ、アワ、ヒエ等のイネ科植物、ダイズ、小豆、落花生、エンドウマメ、インゲンマメ等のマメ科植物の種子が挙げられ、特に麦類であることが好ましい。その作物から得られる食品素材としては、作物が小麦である場合、薄力粉、中力粉、全粒粉、準強力粉、強力粉、デュラム小麦粉等が挙げられ、作物が小麦以外の穀物粒である場合、ライ麦粉、米粉等が挙げられる。作物やその作物から得られる食品素材を使用して得られる加工食品としては、作物が小麦である場合、パンや麺類、作物がダイズである場合、豆腐等が挙げられる。
【００１３】
本発明において検出する組換えＤＮＡは、ＤＲＥＢ遺伝子である。ＤＲＥＢ遺伝子は、作物の環境ストレス耐性を向上させ得るものであり、今後ＤＲＥＢ遺伝子が導入された遺伝子組換え作物の生産が拡大することが予想される。したがって、今後、遺伝子組換え作物の検出にＤＲＥＢ遺伝子を使用すれば、比較的簡便に遺伝子組換え作物を検出できるようになる可能性がある。なお、遺伝子組換え作物であるか否かの判定に、ＤＲＥＢ遺伝子の検査に加えて、ＤＲＥＢ遺伝子以外の組換えＤＮＡの検査を行うことも好ましい。
【００１４】
第１発明においては、被検試料中のダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子をＰＣＲによって検出する。この検出は、被検試料中の核酸又は前記被検試料から抽出した核酸を鋳型とし、ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子の部分配列を特異的に増幅可能なプライマーペアを用いて、ＰＣＲにより、ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子の部分配列を有する核酸を増幅し、その増幅された核酸を検出又は定量する。
第２発明においては、被検試料中のワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子をＰＣＲによって検出する。この検出は、被検試料中の核酸又は前記被検試料から抽出した核酸を鋳型とし、ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の部分配列を特異的に増幅可能なプライマーペアを用いて、ＰＣＲにより、ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の部分配列を有する核酸を増幅し、その増幅された核酸を検出又は定量する。
【００１５】
図１に、ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子及びワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子それぞれのＤＮＡ配列の一部を並べて示した。
図１に示すように、ＤＲＥＢ遺伝子は、ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子とワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子のＤＮＡ配列が似ているため、第１発明においては、ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子に特異的なＤＮＡ配列部分にプライマーを設計し、第２発明においては、ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子に特異的なＤＮＡ配列部分にプライマーを設計することが好ましい。
【００１６】
したがって、第１及び第３発明において、好ましいプライマーペアは、以下の（１）〜（３）である。
（１）配列番号１に記載の塩基配列を含む核酸と、配列番号２に記載の塩基配列を含む核酸とからなるもの。配列番号１に記載の塩基配列は、配列番号１３に記載のダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子の全塩基配列中、図１にＲ１で示す領域の塩基配列であり、配列番号２に記載の塩基配列は、配列番号１３に記載のダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子の全塩基配列中、図１にＲ２で示す領域の相補鎖の塩基配列である。
（２）配列番号１に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸と、配列番号２に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸とからなるもの。
（３）配列番号１に記載の塩基配列と相補である配列番号３に記載の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸と、配列番号２に記載の塩基配列と相補である配列番号４に記載の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸とからなるもの。
【００１７】
また、ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子とワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子に共通なＤＮＡ配列部分にプライマーを設計することで、ダイズ由来及びワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の部分配列を有する核酸を同時に増幅することも可能である。本発明は、ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子及びワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子をそれぞれ特異的に、かつ同時に増幅させるプライマーペアを用いたＰＣＲによって、ダイズ由来又はワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子が導入された遺伝子組換え作物を検出又は定量するものであってもよい。
【００１８】
上記（１）のプライマーペアにおける、配列番号１に記載の塩基配列を含む核酸、上記（２）のプライマーペアにおける、配列番号１に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸、及び上記（３）のプライマーペアにおける、配列番号１に記載の塩基配列と相補である配列番号３に記載の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸は、それらのうちの何れか１以上と、上記（１）のプライマーペアにおける、配列番号２に記載の塩基配列を含む核酸、上記（２）のプライマーペアにおける、配列番号２に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸、及び上記（３）のプライマーペアにおける、配列番号２に記載の塩基配列と相補である配列番号４に記載の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸のうちの何れか１以上とを組み合わせて用いることもできる。本願の請求項２，８等の表現には、このような組み合わせからなるプライマーペアも含まれる。
【００１９】
同様に、第２及び第４発明において、好ましいプライマーペアは、以下の（４）〜（６）である。
（４）配列番号６に記載の塩基配列を含む核酸と、配列番号７に記載の塩基配列を含む核酸とからなるもの。配列番号６に記載の塩基配列は、配列番号１４に記載のワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の全塩基配列中、図１にＲ６で示す領域の塩基配列であり、配列番号７に記載の塩基配列は、配列番号１４に記載のワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の塩基配列中、図１にＲ７で示す領域の相補鎖の塩基配列である。
（５）配列番号６に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸と、配列番号７に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸とからなるもの。
（６）配列番号６に記載の塩基配列と相補である配列番号８に記載の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸と、配列番号７に記載の塩基配列と相補である配列番号９に記載の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸とからなるもの。
【００２０】
上記（４）のプライマーペアにおける、配列番号６に記載の塩基配列を含む核酸、上記（５）のプライマーペアにおける、配列番号６に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸、及び上記（６）のプライマーペアにおける、配列番号６に記載の塩基配列と相補である配列番号８に記載の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸は、それらのうちの何れか１以上と、上記（４）のプライマーペアにおける、配列番号７に記載の塩基配列を含む核酸、上記（５）のプライマーペアにおける、配列番号７に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸、及び上記（６）のプライマーペアにおける、配列番号７に記載の塩基配列と相補である配列番号９に記載の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸のうちの何れか１以上とを組み合わせて用いることもできる。本願の請求項５，１０等の表現には、このような組み合わせからなるプライマーペアも含まれる。
【００２１】
上述した、配列番号１，３，６又は８に記載の塩基配列中の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む各核酸は、配列番号１，３，６又は８に記載の塩基配列中の８５％以上の連続した塩基配列を含む核酸であることが好ましく、配列番号１，３，６又は８に記載の塩基配列中の９０％以上の連続した塩基配列を含む核酸であることが更に好ましい。
また、プライマーとして用いる核酸は、塩基数が１０以上であることが好ましく、１２以上であることがより好ましく、１５以上が更に好ましい。
【００２２】
上記（３）又は（６）のプライマーペアに関し、ストリンジェントな条件下とは、増幅対象のＤＮＡ配列と特異的なハイブリッドが形成され、かつ増幅対象でないＤＮＡ配列と非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。また、（３）又は（６）のプライマーペアを構成する一対の核酸は、それぞれ相補の塩基配列にハイブリダイズした状態でプライマーとして機能する。ストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。当業者であれば、当該技術分野において公知の各種プライマー設計方法及びハイブリダイゼーション条件に関する技術常識、並びに通常用いられる実験手段を通じて得られる経験則を基に、選択されたプライマーに適切な条件を容易に見つけ出し、実施することができる。
【００２３】
このようなプライマーペアを用いてＰＣＲを行うことにより、第１発明においては、図１に示すダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子のＤＮＡ配列のうち、配列番号１１に記載の部分配列（図２参照）を特異的に増幅させることができ、第２発明においては、図１に示すワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子のＤＮＡ配列のうち、配列番号１２（図３参照）に記載の部分配列を特異的に増幅させることができる。
ここでいう特異的とは、第１及び第３発明においては、ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子中の部分配列のみを増幅させることを意味し、第２及び第４発明においては、ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子中の部分配列のみを増幅させることを意味する。したがって、被験試料に含まれる、ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子が導入されたダイズ以外の遺伝子組換え作物又はワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子が導入されたワタ以外の遺伝子組換え作物をそれぞれ特異的に検出することができる。なお、第１及び第３発明において増幅させる部分配列は、配列番号１１であることが好ましいが、それに制限されるものではなく、ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子のＤＮＡ配列の他の領域を増幅させてもよい。また、第２及び第４発明において増幅させる部分配列も、配列番号１２であることが好ましいが、それに制限されるものではなく、ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子のＤＮＡ配列の他の領域を増幅させてもよい。
【００２４】
本発明において、被検試料は、例えばそのまま又は粉砕して核酸抽出に供してもよく、洗浄し乾燥させた後破砕して核酸抽出に供してもよい。被検試料から抽出して分析に用いる核酸は、通常はＤＮＡである。ＤＮＡは公知の任意の方法によって抽出してもよいが、現在は多数のＤＮＡ抽出キットが市販されており、これらを用いて抽出することができる。例えばＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、Kopellらの方法（Kopell, E. et al.; Mitteilungen aus dem Gebiete der Lebensmitteluntersuchung und Hygiene, 88, 164、出版社：Neukomm & Zimmermann）にしたがって、被検試料からＤＮＡを抽出してもよい。抽出したＤＮＡは、吸光度の測定などにより濃度を算出し、ＰＣＲに好適な濃度まで希釈して用いることが好ましい。
【００２５】
本発明において、ＰＣＲは、使用するプライマーやＤＮＡポリメラーゼを考慮して、常法にしたがって行うことができる。その際に、ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ、及びＭｇＣｌ2等の試薬は調製してもよいし、市販のＰＣＲキットを用いてもよい。また、ＰＣＲ条件は、例えば９５℃１５秒、６０℃３０秒、及び７２℃３０秒を１サイクルとして３５サイクル行い、最後に終了反応として７２℃７分間という条件が使用可能であるが、用いるプライマーのＴｍ値、増幅すべき領域の長さ、及び鋳型ＤＮＡの濃度等を考慮して、適宜変更することができる。
【００２６】
増幅された核酸（以下「ＰＣＲ産物」という）は、特定のＤＮＡ断片を同定する任意の方法で検出できる。同定する方法としては、例えばアガロースゲル電気泳動、アクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ハイブリダイゼーション、及び免疫学的方法等がある。一般的に、ＰＣＲ産物は電気泳動パターンによって同定される。例えばエチジウムブロミドを含む０．８％のアガロースゲルによる電気泳動を行い、ＰＣＲ産物をバンドとして検出してもよい。
【００２７】
また、ＰＣＲ産物は、プライマーペア及び核酸プローブの存在下でリアルタイムＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅の過程で同定することもできる。また、リアルタイムＰＣＲで使用する核酸プローブは蛍光標識、放射性物質標識、及びビオチン標識されたものを用いることができる。本発明で使用する核酸プローブは、例えば、配列番号５又は配列番号１０に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端を蛍光物質としてＦＡＭで修飾し、３’末端をクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ又はＭＧＢで修飾したものである。また、配列番号５又は配列番号１０に記載の塩基配列に代えて、配列番号５又は配列番号１０に記載の塩基配列と相補の塩基配列からなる核酸プローブや、配列番号５若しくは配列番号１０又はこれらと相補の塩基配列に対して８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、蛍光標識、放射性物質標識又はビオチン標識されている核酸プローブを用いることもできる。
【００２８】
第３発明及び第４発明は、それぞれ第１発明及び第２発明で使用したプライマーペアを含む試薬キットである。プライマーペアを構成する核酸は常法にしたがって製造することができる。また、試薬キットはプライマーペアと他の試薬とを含んでいてもよい。例えば、試薬キットはｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ2、ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）、緩衝液（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ）、グリセロール、ＤＭＳＯ、ポジティブコントロール用ＤＮＡ、ネガティブコントロール用ＤＮＡ、及び蒸留水等を包含してもよい。試薬キットは、ＰＣＲによる増幅産物の核酸の検出又は定量に使用するための、蛍光標識、放射性物質標識又はビオチン標識されている核酸プローブを含んでいてもよい。試薬キットに含まれる試薬は、それぞれ独立に梱包されていてもよいし、混合された上で梱包されていてもよい。試薬キット中のそれぞれの試薬濃度に特に制限はなく、本発明に係るＰＣＲが実施可能な濃度範囲であればよい。また、試薬キットには、好適なＰＣＲ条件等の情報がさらに添付されていてもよい。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。本発明は、以下の実施例により何ら制限されるものではない。【００３０】
〔実施例１：ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動によるダイズ由来及びワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の検出〕
（方法）
下記の３種の被検試料からそれぞれ抽出したＤＮＡを鋳型とし、下記のプライマーペアを用いてＰＣＲを行った。その後、アガロースゲル電気泳動により各試料における増幅の有無を調べた。
（試料）
小麦：国内産小麦
ダイズ：市販の国内産ダイズの乾燥種子
ワタ：市販のワタの乾燥種子
各試料をＭｕｌｔｉ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｈｏｃｋｅｒ（安井器械株式会社）で破砕した後、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いてＤＮＡを抽出した。【００３１】
（プライマーペア）
ＰＣＲに使用するプライマーを設計するために、遺伝子配列データベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を使用した。
ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子のＤＮＡ配列としてａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ５１４９０８（配列番号１３）を使用し、配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸と配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸とからなるプライマーペアを設計した。
ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子のＤＮＡ配列としてａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ５０９５０２（配列番号１４）を使用し、配列番号６に記載の塩基配列を有する核酸と配列番号７に記載の塩基配列を有する核酸とからなるプライマーペアを設計した。
プライマーの合成は、Ｏｐｅｒｏｎ社に委託した。【００３２】
（ＰＣＲによるダイズ由来及びワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の検出）
各試料から抽出したＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子の検出には配列番号１及び配列番号２のプライマーを使用した。また、ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の検出には配列番号６及び配列番号７のプライマーを使用した。
３種の被験試料のそれぞれについて、ＰＣＲの反応ミックスを調整した。１μｌのＤＮＡ（２０  ｎｇ／μｌ）、０．５μｌ（２．５Ｕ）のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ(Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)、２．５μｌの２  ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５μｌの２５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１５μｌの５０μＭ各プライマー、２．５μｌの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩを添加し、さらに、反応ミックスの液量が２５μｌとなるよう、蒸留水を添加した。
ＰＣＲにおいては、９５℃１０分のＤＮＡポリメラーゼ活性化ステップを実施した後、９５℃１５秒の変性ステップ、６０℃３０秒のアニーリングステップ及び７２℃３０秒のＤＮＡ伸長ステップを含むサイクルを３５回繰り返し、その後、７２℃５分のＤＮＡ伸長最終ステップを行った。【００３３】
ＰＣＲ終了後、ＰＣＲ反応溶液５μｌをＥ−Ｇｅｌ  ＥＸ（インビトロジェン）にて電気泳動を行い、ＵＶで増幅を確認した。
増幅が確認されたＰＣＲ産物を精製した後、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン）を使用してサイクルシーケンス反応を行った。シーケンス反応物を精製した後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３５００ジェネティックアナライザ（ライフテクノロジーズジャパン）にてＤＮＡ配列を調べた。【００３４】
（結果）
ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子の検出結果を図２に示した。図２に示すように、ダイズから抽出したＤＮＡのみ予想された長さ（９１ｂｐ）のバンドが検出され、ワタ及び小麦から抽出したＤＮＡではバンドは検出されなかった。さらに、ダイズで検出されたバンドのＤＮＡ配列は、ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子の増幅領域の配列であった。
ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の検出結果を図３に示した。図３に示すように、ワタから抽出したＤＮＡのみ予想された長さ（９４ｂｐ）のバンドが検出され、ダイズ及び小麦から抽出したＤＮＡではバンドは検出されなかった。さらに、ワタで検出されたバンドのＤＮＡ配列は、ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の増幅領域の配列であった。なお、図２及び図３の「４．ＴＥ」はネガティブコントロールである。【００３５】
これらの結果より、配列番号１、２及び配列番号６、７のプライマーペアを用いてＰＣＲを行うことで、ダイズ由来及びワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子をそれぞれ特異的に増幅できることがわかった。したがって、これらのプライマーペアを使用すれば、それぞれダイズ由来及びワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子が導入された、ダイズ以外及びワタ以外の遺伝子組換え作物を検出することができる。また、これらのプライマーペアは小麦では増幅しないことから、ダイズ由来及びワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子が導入された遺伝子組換え小麦を検出することができる。【００３６】
〔実施例２：リアルタイムＰＣＲによるダイズ由来及びワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の検出〕
（方法）
実施例１で使用したものと同じ３種の被検試料からそれぞれ抽出したＤＮＡを鋳型とし、下記のプライマーペア及び核酸プローブを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。
（プライマーペア）
ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子においては、実施例１で使用した配列番号１、２に記載の塩基配列を有する核酸からなるプライマーペアを用いた。
ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子においては、実施例１で使用した配列番号６、７に記載の塩基配列を有する核酸からなるプライマーペアを用いた。
（核酸プローブ）
ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子においては、プライマーペア（配列番号１、２）の間のＤＮＡ配列に配列番号５の核酸プローブを設計した。この核酸プローブは５’末端をＦＡＭで標識、３’末端をクエンチャーとしてＴＡＭＲＡで修飾した。
ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子においては、プライマーペア（配列番号６、７）の間のＤＮＡ配列に配列番号１０の核酸プローブを設計した。この核酸プローブは５’末端をＦＡＭで標識、３’末端をクエンチャーとしてＭＧＢで修飾した。
核酸プローブの合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社に委託した。【００３７】
（リアルタイムＰＣＲによるダイズ由来及びワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の検出）
各試料から抽出したＤＮＡを鋳型にリアルタイムＰＣＲを行った。ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子の検出には配列番号１及び配列番号２のプライマー、配列番号５のオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識された核酸プローブを使用した。また、ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の検出には配列番号６及び配列番号７のプライマー、配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識された核酸プローブを使用した。３種の被験試料のそれぞれについて、リアルタイムＰＣＲの反応ミックスを調整した。２．５μｌのＤＮＡ（２０  ｎｇ／μｌ）、１２．５μｌのＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．２５μｌの５０μＭ各プライマー、０．５μｌの１０μＭ核酸プローブを添加し、さらに、反応ミックスの液量が２５μｌとなるよう、蒸留水を添加した。
リアルタイムＰＣＲにおいては、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。５０℃２分に続いて９５℃１０分の変性ステップを実施した後、９５℃１５秒の変性ステップ及び６０℃１分のアニーリング及びＤＮＡ伸長ステップを含むサイクルを４５サイクル繰り返した。
リアルタイムＰＣＲ終了後、各試料において、ＦＡＭ由来の蛍光強度が指数関数的に増加しているか確認した。【００３８】
（結果）
ダイズ由来のＤＲＥＢ遺伝子の検出結果を図４に示した。図４に示すように、ダイズから抽出したＤＮＡのみ指数関数的に増加した蛍光強度が検出され、ワタ及び小麦から抽出したＤＮＡでは検出されなかった。
ワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子の検出結果を図５に示した。図５に示すように、ワタから抽出したＤＮＡのみ指数関数的に増加した蛍光強度が検出され、ダイズ及び小麦から抽出したＤＮＡでは検出されなかった。【００３９】
これらの結果より、配列番号１、２のプライマーペアと配列番号５のオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識された核酸プローブ、及び配列番号６、７のプライマーペアと配列番号１０のオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識された核酸プローブを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことで、ダイズ由来及びワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子をそれぞれ特異的に検出できることがわかった。したがって、これらのプライマーペア及び核酸プローブのセットを使用すれば、リアルタイムＰＣＲにおいてもそれぞれダイズ由来及びワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子が導入された、ダイズ以外及びワタ以外の遺伝子組換え作物を検出することができる。また、これらのプライマーペア及び核酸プローブのセットは小麦では増幅しないことから、ダイズ由来及びワタ由来のＤＲＥＢ遺伝子が導入された遺伝子組換え小麦を検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の遺伝子組換え作物の検出方法及び試薬キットによれば、農産物やそれを使用した食品等の被検試料中に含まれる、ＤＲＥＢ遺伝子が導入された遺伝子組換え作物を、高い信頼性及び実用性を持って検出可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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