(57)【要約】【課題】  本発明は、歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を効率的に調製する方法の提供を課題とする。【解決手段】  本発明に係る歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、（ａ）歯髄細胞を、7〜13% (V/V)で血清を含む培養液を用いて前培養する工程であって、歯髄細胞を培養ディッシュ上に付着させる工程と、（ｂ）工程（ａ）により培養ディッシュ上に付着した歯髄細胞を、7〜13% (V/V)で血清を含む培養液を用いて少なくとも１日培養する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）の後に、前記歯髄細胞を、低血清状態で培養する工程とを含む、歯髄幹細胞の調製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法であって、
（ａ）前記歯髄細胞を、7〜13%(V/V)で血清を含む培養液を用いて前培養する工程であって、前記歯髄細胞を培養ディッシュ上に付着させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）により培養ディッシュ上に付着した歯髄細胞を、7〜13%(V/V)で血清を含む培養液、または、幹細胞用無血清培地を用いて少なくとも１日培養する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後に、前記歯髄細胞を、低血清状態または無血清状態で培養する工程と
を含む、歯髄幹細胞の調製方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記工程（ｃ）が、前記歯髄細胞を、低血清状態または無血清状態、かつ、低栄養状態で培養する工程である、歯髄幹細胞の調製方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、
前記工程（ａ）の前に、前記歯髄細胞を、培養ディッシュ上で、他の細胞と接着しないように播種する工程を含み、これにより一細胞に由来する細胞コロニーを形成させる、歯髄幹細胞の調製方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程（ａ）および（ｂ）に用いる血清がFBSである、歯髄幹細胞の調製方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程（ａ）および／または（ｂ）に用いる培養液が、10〜13%(V/V)で血清を含む培養液である、SSEA-4の発現が亢進した歯髄幹細胞を含む細胞コロニーを形成させる、歯髄幹細胞の調製方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程（ａ）の前に、前記歯髄組織を酵素処理することにより前記歯髄細胞を調製する工程をさらに含む、歯髄幹細胞の調製方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程（ａ）の後であって、かつ、前記工程（ｂ）の前に、（ａ’）培養液を交換するための洗浄工程をさらに含む、歯髄幹細胞の調製方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程（ｃ）が、前記工程（ｂ）で用いた血清を含む培養液または幹細胞用無血清培地を、新しい培養液に交換せずにそのまま用いて歯髄細胞を培養する工程である、歯髄幹細胞の調製方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）および（ｃ）の培養時間の合計が、少なくとも168時間である、歯髄幹細胞の調製方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程（ａ）において、培養ディッシュ上に播種された歯髄細胞が、0.01×106〜0.1×10６cells/mlの濃度で培養液中に含まれる、歯髄幹細胞の調製方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程（ａ）の前培養時間が24〜48時間である、歯髄幹細胞の調製方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の調製方法により調製した歯髄幹細胞を用いて治療用移植材を製造する工程を含む、治療用移植材の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により得られた歯髄幹細胞であって、SSEA-4の発現が亢進している単一の細胞コロニー由来の歯髄幹細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の歯髄幹細胞であって、
前記細胞コロニーが、SSEA-4に加えて、さらにCD146またはCD34の発現が亢進したものである、歯髄幹細胞。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の歯髄幹細胞を含む、治療用移植材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯髄組織由来細胞から歯髄幹細胞を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体性幹細胞の一つである間葉系幹細胞は、骨芽細胞や脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞などの間葉系に属する細胞への分化能をもつとされる幹細胞の総称で、間葉系であるすべての組織に存在すると考えられており、骨や筋肉、血管、神経の再構築などの再生医療への応用が期待されている。
間葉系幹細胞に分類される幹細胞の一つとして歯髄組織由来の歯髄幹細胞が知られている。特に、歯髄幹細胞のうち、乳歯由来の歯髄幹細胞は、様々な疾患モデルにおいてその治療効果が実証されている（非特許文献１〜５）。このような治療効果の事実から、再生医療に用いられる幹細胞の供給源として、歯髄幹細胞が注目されている。【０００３】
ここで、幹細胞の細胞学定義は、基本性質として、自己複製能（self-renewal）を有することと多能性（pluripotency）または多分化能（multipotency）を備えていることである。この基本性質には、体性細胞とは完全に区別しうる幹細胞の性質として幹細胞特性（stemness）が含まれる。幹細胞特性とは、幹細胞が分化する事なしに多能性または多分化能や細胞分裂能を維持する能力をいう。幹細胞特性の低い幹細胞では、分裂能や多分化能の低下が知られている（非特許文献６）。
したがって、臨床での幹細胞治療を考慮に入れた場合、単離した幹細胞が保持する幹細胞特性の程度が、治療効果を左右する非常に重要なファクターと見なされる（非特許文献７）。【０００４】
歯髄幹細胞を含む間葉系幹細胞の単離方法においては、より好ましい単離条件が検討されてきた。例えば、非特許文献８は、ディスパーゼによる酵素処理によりストレスを与えた間葉組織から、多能性を有する幹細胞の単離に成功した事を報告している（非特許文献８）。また、非特許文献９〜１１では、低酸素条件下で幹細胞特性が亢進する事が報告されている。【０００５】
また、特許文献１には、間葉系幹細胞または培養間葉系細胞に、酵素処理、低酸素条件、低血清条件などの外的ストレスを与えて、SSEA-3およびCD105陽性の多能性幹細胞を得る方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１６−２８６１４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Seo et al., "SHED repair critical-size calvarial defects in mice". Oral Dis. (2008)14:428-434.
【非特許文献２】Yamaza et al., "Immunomodulatory properties of stem cells from human exfoliated deciduous teeth". Stem Cell Res Ther. (2010)1:5.
【非特許文献３】Yamaza et al., "In vivo hepatogenic capacity and therapeutic potential of stem cells from human exfoliated deciduous teeth in liver fibrosis in mice". Stem Cell Res Ther. (2015)6:171.
【非特許文献４】Ma et al., "Cryopreserved dental pulp tissues of exfoliated deciduous teeth is a feasible stem cell resource for regenerative medicine". PLoS One. (2012)
【非特許文献５】Ma et al., "Transplantation of mesenchymal stem cells ameliorates secondary osteoporosis through interleukin-17-impaired functions of recipient bone marrow mesenchymal stem cells in MRL/lpr mice". Stem Cell Res Ther. (2015) 6:104.
【非特許文献６】Bose et al., "Aging induced loss of stemness with concomitant gain of myogenic properties of a pure population of CD34(+)/CD45(-) muscle derived stem cells". IntJ Biochem Cell Biol. (2016) 70:1-12.
【非特許文献７】Tobita et al., “Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma: stem cell transplantation methods that enhance stemness”. Stem Cell Res Ther. (2015) Nov 5;6:215.
【非特許文献８】Wakao et al., Multilineage-differentiating stress-enduring (Muse) cells are a primary source of induced pluripotent stem cells in human fibroblasts". Proc Natl Acad Sci U S A. (2011) 108:9875-9880.
【非特許文献９】D'Ippolito et al., "Schiller PC.Low oxygen tension inhibits osteogenic differentiation and enhances stemness of human MIAMI cells" Bone. (2006) 39:513-22.
【非特許文献１０】Hung et al., "Hypoxia promotes proliferation and osteogenic differentiation potentials of human mesenchymal stem cells". J Orthop Res. (2012) 30:260-266.
【非特許文献１１】Berniakovich and Giorgio, "Low oxygen tension maintains multipotency, whereas normoxia increases differentiation of mouse bone marrow stromal cells". Int J MolSci. (2013) 14:2119-2134.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、歯髄組織より歯髄幹細胞を調製する方法において、より効率的に歯髄幹細胞を得る方法であって、かつ、得られた歯髄幹細胞の幹細胞特性が亢進したものである方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
近年、CD34陽性を示す歯髄幹細胞が同定された（Pisciotta et al., 2015）。当該文献によれば、CD34陽性歯髄幹細胞は、CD34陰性歯髄幹細胞と比較すると、細胞増殖率が低く、幹細胞特性の維持が長い事が報告されている。
また、ヒト骨髄間葉系幹細胞や歯髄幹細胞は、CD146が発現することが報告されている（Shi and Gronthos, 2003）。CD146（別名MUC18, MCAM）は、ヒトメラノーマ細胞で同定された113 kDaの細胞接着分子であり（Lehmann et al., 1987）、乳歯幹細胞も細胞表面で発現することが明らかとなっている（非特許文献２）。CD146陽性ヒト骨髄間葉系幹細胞や歯髄幹細胞は血管周囲に多く観察され、幹細胞ニッチ形成との関連が示唆されている（Shi and Gronthos, 2003）。また、CD146の発現低下が細胞老化を促進することが報告された（Jin et al., 2016）ことからも、CD146は間葉系幹細胞の初期のマーカーと考えられうる。
また、骨髄間葉系幹細胞で発現が明らかとなっている多能性幹細胞のマーカーとしてSSEA-4が知られている（Gang et al., 2007）。SSEA-4は、乳歯幹細胞の細胞表面で発現が報告されている（Yamaza et al., 2010）。SSEA-4 (stage specific antigen-4)は奇形がん腫細胞より同定された細胞表面分子であり（Kannagi et al., 1983）、ES細胞やiPS細胞の多能性幹細胞の初期マーカーとして知られている（Henderson et al., 2002; Takahashi et al., 2007）。よって、SSEA-4を発現する間葉系幹細胞亜集団は、非常に原始的（primitive）な集団と考えられている。
例えば、上記に列挙するような分子の発現が亢進している歯髄幹細胞を得ることができれば、優れた幹細胞特性を有する歯髄幹細胞を提供することが可能となる。
なお、特許文献１には、上述のように、SSEA-3およびCD105陽性の多能性幹細胞を得る方法を記載しているが、得られた多能性幹細胞はCD146陰性の細胞であることが記載されている。【００１０】
本発明者らは、これまでに、Colony forming unit-fibroblasts （CFU-F） コロニー形成法（Friedenstein et al., 1976）を基にし、乳歯幹細胞の単離を施行している（Yamaza et al., 2010）。例えば、非特許文献１においては、ヒト乳歯より採取した歯髄組織より歯髄幹細胞を単離する際に、15%仔牛血清（fetal bovine serum：FBS）含有培養液を用いたCFU-Fコロニー形成法により歯髄幹細胞の単離を行ったことが報告されている。上述のように非特許文献８や９は細胞にストレスを付与することで、幹細胞特性の亢進が認められたことを示す。酵素処理や低酸素状態以外の方法でストレスを与えた場合、例えば、培養液中に成長因子などを供給する血清を添加するタイミングや濃度条件の変化を加えた場合にも細胞にストレスを与え、幹細胞特性の亢進した幹細胞集団が単離可能ではないかという点に着目した。なお、これまでに歯髄幹細胞の単離時における培養液中の血清の添加のタイミングが歯髄幹細胞の幹細胞特性へ与える影響については未だ報告がない。そこで、本発明者らは、上記の課題を解決するため、非特許文献２に記載の単離プロトコールにおいて、培養液中の血清濃度が歯髄幹細胞に与える影響について着目し、培養期間中における血清の影響について鋭意検討した。【００１１】
その結果、驚くべきことに、歯髄組織から回収した歯髄幹細胞を含む細胞群を培養ディッシュ上に付着させ、歯髄幹細胞を含むコロニーを形成させるための培養における特定の培養期間を血清存在下とし、かつ、その後の培養期間においては、低血清状態または無血清状態で培養することにより、短期間で効率的に歯髄幹細胞を単離できるとともに、幹細胞特性をより維持した歯髄幹細胞を得ることに成功した。本発明は当該知見により完成されたものである。【００１２】
すなわち、本発明は、以下に記載の通り：
本発明は、一態様において、
〔１〕歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法であって、
（ａ）前記歯髄細胞を、7〜13% (V/V)で血清を含む培養液を用いて前培養する工程であって、前記歯髄細胞を培養ディッシュ上に付着させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）により培養ディッシュ上に付着した歯髄細胞を、7〜13%(V/V)で血清を含む培養液、または、幹細胞用無血清培地を用いて少なくとも１日培養する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後に、前記歯髄細胞を、低血清状態または無血清状態で培養する工程と
を含む、歯髄幹細胞の調製方法に関する。【００１３】
ここで、本発明の歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、一実施の形態において、
〔２〕上記〔１〕に記載の方法であって、
前記工程（ｃ）が、前記歯髄細胞を、低血清状態または無血清状態、かつ、低栄養状態で培養する工程であることを特徴とする。
また、本発明の歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、一実施の形態において、
〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載の方法であって、
前記工程（ａ）の前に、前記歯髄細胞を、培養ディッシュ上で、他の細胞と接着しないように播種する工程を含み、これにより単一細胞に由来する細胞コロニーを形成させることを特徴とする。
また、本発明の歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、一実施の形態において、
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程（ａ）および（ｂ）に用いる血清がFBSであることを特徴とする。【００１４】
また、本発明の歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、一実施の形態において、
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程（ａ）および／または（ｂ）に用いる培養液が、10〜13% (V/V)で血清を含む培養液であり、SSEA-4の発現が亢進した歯髄幹細胞を含む細胞コロニーを形成させることを特徴とする。
また、本発明の歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、一実施の形態において、
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程（ａ）の前に、前記歯髄組織を酵素処理することにより前記歯髄細胞を調製する工程をさらに含むことを特徴とする。
また、本発明の歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、一実施の形態において、
〔７〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程（ａ）の後であって、かつ、前記工程（ｂ）の前に、（ａ’）培養液を交換するための洗浄工程をさらに含むことを特徴とする。【００１５】
また、本発明の歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、一実施の形態において、
〔８〕上記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程（ｃ）が、前記工程（ｂ）で用いた血清を含む培養液または幹細胞用無血清培地を、新しい培養液に交換せずにそのまま用いて歯髄細胞を培養する工程であることを特徴とする。【００１６】
また、本発明の歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、一実施の形態において、
〔９〕上記〔８〕に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）および（ｃ）の培養時間の合計が、少なくとも168時間であることを特徴とする。
また、本発明の歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、一実施の形態において、
〔１０〕上記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程（ａ）において、培養ディッシュ上に播種された歯髄細胞が、0.01×106〜0.1×106 cells/mlの濃度で培養液中に含まれることを特徴とする。
また、本発明の歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、一実施の形態において、
〔１１〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程（ａ）の前培養時間が24〜48時間であることを特徴とする。【００１７】
また、本発明の別の態様は、
〔１２〕上記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法により得られた歯髄幹細胞を用いて治療用移植材を製造する工程を含む、治療用移植材の製造方法に関する。
また、本発明の別の態様は、
〔１３〕上記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法により得られた歯髄幹細胞であって、SSEA-4の発現が亢進している単一の細胞コロニー由来の歯髄幹細胞に関する。
ここで、本発明の歯髄幹細胞は、
〔１４〕上記〔１３〕に記載の歯髄幹細胞であって、
前記細胞コロニーが、SSEA-4に加えて、さらにCD146またはCD34の発現が亢進したものであることを特徴とする。
また、本発明の別の態様は、
〔１５〕上記〔１３〕または〔１４〕に記載の歯髄幹細胞を含む、治療用移植材に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法によれば、酵素処理や低酸素状態等の煩雑な操作を不要とし、簡便な方法により、歯髄細胞より歯髄幹細胞を効率的に調製することが可能となる。また、従来用いる血清濃度よりも低い血清濃度で歯髄幹細胞を得ることができるため、コストを抑えることができ、とりわけ、細胞バンクのような大量に細胞の調製が必要となる場合に好ましい。
さらに、本発明の方法は、歯髄幹細胞を効率的に調製可能なことに加えて、歯髄幹細胞の幹細胞特性を亢進した状態で調製することを可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1は、下記実施例２および３におけるコロニー形成能の解析結果を示す。乳歯歯髄より単離した有核細胞を0.1×106個で播種した。図1Aは、培養後に得られたCFU-Fコロニーをトルイジンブルー染色した画像を示す。また、図1Bは、CFU-Fコロニー形成数を示し、図1Cは、培養皿１枚あたりの細胞数を示し、図1Dは、CFU-Fコロニー当りの細胞数を示す。n=3。Bar=平均値±s.e.m (%)。*：p<0.05、***：p<0.005。
【図２】図2は、下記実施例４における細胞増殖能の解析結果を示す。具体的には、乳歯幹細胞の細胞増殖力をBrd-U取り込みアッセイにより解析した結果を示す。図2Aは、各FBS濃度で前培養し、15% FBS含有培養液下で付着コロニーの形成を行った結果を示すグラフである。図2Bは、各FBS濃度で前培養し、10% FBS含有培養液下で付着コロニーの形成を行った結果を示すグラフである。図2Cは、各FBS濃度で前培養し、5% FBS含有培養液下で付着コロニーの形成を行った結果を示すグラフである。図2Dは、統一したFBS濃度で培養を通して行った結果の比較を示すグラフである。n=3。Bar=平均値±s.e.m (%)。*：p<0.05、**：p<0.05、***：p<0.005。
【図３Ａ】図3は、下記実施例５におけるフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の解析結果を示すグラフである。図3Aは、フローサイトメトリーによる解析後のヒストグラムを示す。図3A中、黒線は表面抗原抗体染色群、グレーの線は非染色群を示す。平均値±s.e.m(%)。図3Bは、各表面抗原の陽性率を表すグラフを示す。n=3。Bar=平均値±s.e.m (%)。*：p<0.05、***：p<0.005。
【図３Ｂ】図3Bは、各表面抗原の陽性率を表すグラフを示す。n=3。Bar=平均値±s.e.m (%)。*：p<0.05、***：p<0.005。
【図４】図４は、下記実施例７のコロニー形成能の解析結果を示す。乳歯歯髄より単離した有核細胞を0.1×106個で播種した。図４Aは、培養後に得られたCFU-Fコロニーをトルイジンブルー染色した画像を示す。また、図４Bは、CFU-Fコロニー形成している細胞数を示す。n=3。15％FBS：15％ FBS単離群、13％FBS：13％ FBS単離群、10％FBS：10％ FBS単離群、7％FBS：7％ FBS単離群、5％ FBS：5％ FBS単離群。Bar=平均値±s.e.m (%)。*：p<0.05。
【図５】図５は、下記実施例８における細胞増殖能の解析結果を示す。具体的には、乳歯幹細胞の細胞増殖力をBrd-U取り込みアッセイで解析した結果を示す。図５Aは、各FBS濃度で前培養し、15% FBS培地（15% FBS-Med）を用いた解析結果を示す。図５Bは、前培養とその後の培養とで、同じFBS濃度の培地（Correspond-Med）を用いた解析結果を示す。n=3。15％FBS：15％ FBS単離群、13％FBS：13％ FBS単離群、10％FBS：10％ FBS単離群、7％FBS：7％ FBS単離群、5％FBS：5％ FBS単離群。Bar=平均値±s.e.m (%)。*：p<0.05、**：p<0.05。
【図６】図６は、下記実施例９におけるフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の解析結果を示すグラフである。（A）ヒストグラム。黒線は表面抗原抗体染色群を示し、グレーの線は非染色群を示す。平均値±s.e.m(%) 。
【図７】図７は、下記実施例９におけるフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の解析試験における陽性率を表すグラフを示す。n=3。15％ FBS：15％ FBS単離群、13％FBS：13％ FBS単離群、10％FBS：10％ FBS単離群、7％FBS：7％ FBS単離群、5％FBS：5％ FBS単離群。Bar=平均値±s.e.m (%)。***：p<0.005。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法に関するものであり、下記工程（ａ）〜（ｃ）を含むものである：
（ａ）前記歯髄細胞を、7〜13% (V/V)で血清を含む培養液を用いて前培養する工程であって、前記歯髄細胞を培養ディッシュ上に付着させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）により培養ディッシュ上に付着した歯髄細胞を、7〜13% (V/V)で血清を含む培養液、または、幹細胞用無血清培地を用いて少なくとも１日培養する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後に、前記歯髄細胞を、低血清状態または無血清状態で培養する工程。
なお、本発明の一実施の形態においては、「調製」を「単離」と読み替えることができる。すなわち、一実施の形態として、歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を単離する方法であって、上記工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法も提供する。
【００２１】
ここで、本明細書における「歯髄組織」は、乳歯及び永久歯のいずれからも採取することができ、従来医療廃棄物として処理されてきた乳歯や親知らず（智歯）などの抜去歯の歯髄から得ることが可能である。歯髄組織は、歯科医療施設において歯科処置的に抜歯された歯から取り出すことができ、自然抜歯または自然脱落された歯から取り出されてもよい。なお、歯より歯髄組織を取り出す方法は公知であり、当業者は適宜実施することができる。なお、歯科処置的に抜歯された歯など、その場ですぐに凍結処理を行うことができない場合には、輸送のため、例えば、alpha-minimum essential medium (alpha-MEM) などの培地に歯を浸し、低温（例えば、4℃）で保存することができる。
【００２２】
本明細書において、「歯髄組織より採取した歯髄細胞」には、生体から採取した歯髄組織よりすぐに回収した歯髄細胞に限られず、凍結保存後、解凍した歯髄組織より採取した歯髄細胞も含む。
【００２３】
歯髄組織の由来はヒトに限られず、その他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ）であってもよい。
歯髄組織からは歯髄細胞を得ることができ、歯髄組織由来の歯髄細胞には歯髄幹細胞が含まれる。歯髄幹細胞は、歯髄から単離できる組織幹細胞の一種である。組織幹細胞は体性幹細胞とも呼ばれ、あらゆる細胞に分化することができる胚性幹細胞に対して、組織幹細胞は分化できる細胞の種類が限られている。
【００２４】
歯髄組織から歯髄細胞を採取する方法も公知であり、例えば、下記実施例１に記載の方法に準じて実施することができる。具体的には、メスなどを用いて歯髄組織を細断した後、細断した歯髄組織をディスパーゼやコラゲナーゼ、またはそれらの混合酵素液などを用いて酵素処理する。酵素処理は、用いる酵素にもよるが、例えば、4%ディスパーゼと3％コラゲナーゼとを1:1で混合した混合酵素液を用いる場合、37℃で60分間、酵素処理することができる。酵素処理の後、血清を含む培養液にて十分に混和した後、セルストレーナーなどを用いて細胞の選別および夾雑物を取り除く。その後、遠心処理（例えば、2,000 rpm、4℃）を行い、上清を捨て、培養液中を添加することで歯髄組織より歯髄細胞を採取することができる。上記のように、歯髄組織から歯髄細胞を採取する方法は公知であり当業者であれば、適宜、使用する試薬や試験条件を設定して行うことができる。
【００２５】
また、本発明の方法により得られる「歯髄幹細胞」は、幹細胞特性が亢進した状態で単離される。
ここで本明細書において、歯髄幹細胞の幹細胞特性というとき、歯髄幹細胞が分化する事なしに、多分化能、および、細胞分裂能を維持する能力をいう。このような歯髄幹細胞の細胞特性は、CD146、SSEA-4、および、CD34からなる群から選択されるいずれか一つの発現が亢進しているか否かにより評価することができる。好ましい一実施の形態において、本発明により得られた歯髄幹細胞は、従来の歯髄幹細胞の単離方法（15%FBS含有培養液を用いたCFU-Fコロニー形成法）により得られた歯髄幹細胞と比較して、SSEA-4の発現が少なくとも亢進している。特に好ましい実施の形態においては、SSEA-4に加えて、さらに、CD146またはCD34の発現が亢進している。具体的には、(i) CD146およびSSEA-4の発現、または、(ii) SSEA-4およびCD34の発現が亢進した歯髄幹細胞を得ることができ、より好ましい実施の形態においては、CD146、SSEA-4、およびCD34の発現が亢進した歯髄幹細胞を得ることができる。
なお、本明細書において、SSEA-4などの表面抗原の発現が亢進しているとは、本発明の方法により得られる細胞群または細胞コロニーと、従来の方法（15%FBS含有培養液を用いたCFU-Fコロニー形成法）により得られる細胞群または細胞コロニーとにおいて特定の分子の発現を比較した際に、有意に発現の上昇を示すことを意味する。
【００２６】
これら幹細胞特性のマーカーの発現の亢進は、各表面抗原に対する抗体であって、蛍光標識等された抗体を用いて検出することができる。抗体による検出方法は公知の方法を用いて実施することができ、例えば、磁性ビーズを用いる方法、フローサイトメータを用いる方法などにより実施することができる。得られた歯髄細胞または歯髄幹細胞群の各タンパク質の発現を検出してもよく、公知の方法により検出することができる。なお、好ましい評価方法としては、以下の実施例に記載するように各タンパク質に対する標識抗体などを用いたフローサイトメトリーにより細胞群の発現を検出・比較する方法である。
【００２７】
本発明に係る歯髄幹細胞の単離方法は、工程（ａ）「歯髄細胞を、血清を含む培養液を用いて前培養する工程であって、歯髄細胞を培養ディッシュ上に付着させる工程」を含む。この工程では、歯髄組織等から回収した歯髄細胞を前培養により培養ディッシュ上に付着させる。
ここで、「歯髄細胞」とは、歯髄組織より採取された歯髄細胞であって、歯髄組織より酵素処理等により回収して得られたものを使用することができる。歯髄組織より回収した歯髄細胞を凍結保存しておき、解凍により得られた歯髄細胞であってもよい。または、上述のように、歯髄組織自体を凍結保存しておき、解凍後に酵素処理等を行い回収した歯髄細胞であってもよい。好ましくは、歯髄組織より酵素処理等により回収して直ぐの歯髄細胞を用いる実施形態である。すなわち、本発明の好ましい一実施の形態としては、工程（ａ）において用いる歯髄細胞は、継代培養を行っていない細胞である。また歯髄組織より採取された歯髄細胞は、歯髄組織を酵素処理した後に70μmセルストレーナーなどの濾過工程により夾雑物が除かれ、細胞が選別されているものが好ましい。この工程により以降の培養における付着細胞の選別が可能または容易となり、最終的な歯髄幹細胞の効率的な単離に寄与できる。
【００２８】
本明細書に用いられる「血清」としては、間葉系幹細胞の培養に用いられる公知の血清を用いることができ、好ましい実施形態の一つとしては、血清としてFBSを用いる形態である。
また、本明細書において、「血清を含む培養液」というとき、培養液は間葉系幹細胞や歯髄細胞、歯髄幹細胞の培養に使用される公知の基本培地を用いることができる。このような基本培地としては、以下に限定されないが、例えば、alpha-MEMなどを用いることができる。基本培地には、得られる歯髄幹細胞の幹細胞特性の亢進を阻害しない限りにおいて、血清の他、抗生物質やグルタミン酸、アスコルビン酸などを含むことができる。
【００２９】
また、「血清を含む培養液」というとき、血清は、基本培地に対して、通常用いられる濃度の範囲で使用することができる。本発明者らは、鋭意検討の結果、工程（ａ）において、7%〜13% (V/V)の血清濃度を用いることで、培養後に得られるコロニー形成数の向上、単離可能な歯髄幹細胞数の向上、または、幹細胞特性が亢進した歯髄幹細胞が得られることを見出している。なお、工程（ａ）においては、10%〜13%(V/V)の血清濃度とすることがより好ましく、とりわけ、約10%(V/V)で含まれることがさらに好ましい。
【００３０】
また、本明細書における「培養ディッシュ」とは細胞の培養に用いることのできる器具であれば特に制限されず、市販の細胞培養用のウェルなどを用いることができる。
本明細書において、「歯髄細胞を培養ディッシュ上に付着させる」とは、歯髄組織より回収した歯髄細胞を、培養液を含む培養ディッシュ上に播種して培養することにより、培養ディッシュ上に歯髄細胞を接着させることをいう。歯髄細胞が培養ディッシュ上に接着した状態となるためには、例えば、約3〜48時間、培養液中で培養することにより達成することができる。より好ましくは、約24〜48時間（48時間前後）の培養である。培養時間が短いと、付着細胞数が少なくなり、一方で培養時間が長いと、幹細胞以外の細胞も付着の可能性が生じる点において好ましくない。しかしながら、培養ディッシュ上に播種した歯髄細胞が培養ディッシュ上に接着する限りにおいて、時間は上記の範囲に限定されず、用いる歯髄細胞の状態や使用するディッシュ、培地などにより当業者は適宜好ましい時間を設定することができる。
工程（ａ）の前培養は、37℃、5% CO2条件下で行うことができる。
【００３１】
また、工程（ａ）においては、歯髄組織より回収された歯髄細胞が一細胞ごとに培養ディッシュ上に播種されることが好ましい。これにより、最終的に得られるコロニーとして単一の細胞に由来したコロニーを形成させることができる。すなわち、本発明の好ましい一実施の形態においては、「前記工程（ａ）の前に、前記歯髄細胞を、培養ディッシュ上で、他の細胞と接着しないように播種する工程を含み、これにより一細胞に由来する細胞コロニーを形成させる工程」をさらに含むことができる。
歯髄細胞を互いの細胞同士接着せずに、一細胞ごとに培養ディッシュ上に播種する方法は公知であり、当業者は適宜実施することができる。なお、具体的な一実施の形態としては、例えば、直径100 mmの培養ディッシュに対して、約0.1×106個の濃度で播種する形態を挙げることができる。また、当業者であれば、使用するディッシュ等により適宜濃度を調製して実施することができる。
【００３２】
本発明に係る歯髄幹細胞の調製方法は、工程（ｂ）「工程（ａ）により培養ディッシュ上に付着した歯髄細胞を、血清を含む培養液、または、幹細胞用無血清培地を用いて少なくとも１日培養する工程」を含む。
ここで、工程（ｂ）に用いる血清を含む培養液は、7〜13% （V/V）の範囲の血清濃度を含む培養液であることが好ましく、10%〜13% (V/V)の範囲の血清濃度を含む培養液であることがより好ましく、約10% （V/V）の範囲の血清濃度を含む培養液がさらに好ましい。培養液中の7〜13% （V/V）の血清濃度とすることで、培養後に得られるコロニー形成数、単離細胞数を向上させることができ、または、それらに加えて、幹細胞特性が亢進した歯髄幹細胞を得ることを可能とする。また、工程（ｂ）に用いる血清を含む培養液は、工程（ａ）の培養に用いた培養液を捨て、新たに添加することで置換することができる。
または、工程（ｂ）は、幹細胞用無血清培地を用いて培養を行うことができる。ここで、本発明に用いられる幹細胞用無血清培地とは、幹細胞の増殖性および幹細胞特性を維持できる培地である。幹細胞用無血清培地は、市販のものを用いることができ、特に間葉系幹細胞用の無血清培地であることが好ましい。このような幹細胞用無血清培地としては、以下に限定されないが、例えば、EXPREP MSC Medium（株式会社バイオミメティックスシンパシーズ）、STK2（登録商標）間葉系幹細胞用無血清培地（DSファーマバイオメディカル株式会社）、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF（Promo Cell）、Stemgro（登録商標） hMSC Medium （Corning）、MesenCult-SF、MesenCult-XF、MesenCult-ACF（STEMCELL Technologies）、TheraPEAK MSCGM-CD Mesenchymal Stem Cell Medium, Chemically Defined（Lonza）、PRIME-XV（登録商標） MSC Expansion XSFM、PRIME-XV（登録商標） MSC Expansion SFM（Irvine Scientific）、MSC NutriStem（登録商標）XF（Biological industries）、StemXVivo Xeno-Free Human MSC Expansion Media、StemXVivo Serum-Free Human MSC Expansion Media（R&D Systems）、StemMACS MSC Expansion Media kit XF, Human（Miltenyi Biotec）、MesenPRO MSC SFM、MesenPRO MSC SFM XenoFree（Gibco）、FibroGRO Xeno-Free Human Fibroblast Expansion Medium（Merck）、PL SOLUTION、PL SOLUTION GMP grade（PL BioScience）などを挙げることができる。
また、工程（ｂ）における、血清を含む培養液または幹細胞用無血清培地を用いた歯髄細胞の培養は、少なくとも1日（24時間）行うことができる。工程（ｂ）の培養期間は、幹細胞を調製できる限りにおいて特に限定されないが、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日とすることができる。
ここで、（ｂ）の工程で用いた血清を含む培養液または幹細胞用無血清培地を、交換せずにそのまま工程（ｃ）の培養に用いて連続的に培養を行うこともできる。このとき、用いた血清濃度等にも依るが、工程（ｂ）の培養開始時点から約3日、4日程度で、培養液は、「低血清状態」および／または「低栄養状態」になると考える。
なお、工程（ｂ）の培養は、37℃、5% CO2条件下で行うことができる。
【００３３】
また、本発明に係る歯髄幹細胞の調製方法は、工程（ｃ）「工程（ｂ）の後に、歯髄細胞を、低血清状態または無血清状態で培養する工程」を含む。この工程（ｃ）によりSSEA-4の発現が亢進した歯髄幹細胞を含む細胞コロニーを形成させることができる。
ここで、「低血清状態」とは、培養液中に含まれる血清の濃度が低く、血清の作用のうち特に、歯髄幹細胞以外の培養細胞に対する細胞増殖作用を実質的に有さず、歯髄幹細胞の幹細胞特性を維持もしくは亢進可能な程度の血清濃度しか含まない状態をいう。このような低血清状態での培養としては、以下の形態に限定されないが、例えば、血清を含む培養液を交換せずに、3日以上培養に用いた培養液でそのまま培養する形態（以下に制限されないが、例えば15%(V/V)FBS含有培地10ml中で0.1×106個の細胞を少なくとも３日以上培養した培養液で継続して培養する形態など）や、血清を含まない培養液を用いて培養する形態が含まれる。また、幹細胞用無血清培地を用いて細胞を培養した場合には、「無血清状態」となる。
また、工程（ｃ）の培養は、歯髄幹細胞の付着コロニーが得られる限りにおいて以下に限定されないが、例えば、少なくとも３日間行うことができる。工程（ｃ）の培養は、37℃、5% CO2条件下で行うことができる。
上記のような工程（ｃ）の培養を行うことで、培養ディッシュ上に、歯髄幹細胞を含む細胞コロニーを形成させることができる。
【００３４】
また、工程（ｃ）における一実施の形態においては、工程（ｃ）は、「低血清状態または無血清状態」かつ「低栄養状態」で行うことができる。
ここで、「低栄養状態」とは、栄養飢餓状態に耐性のない細胞を死滅させることが可能である一方、栄養飢餓状態に耐性のある歯髄幹細胞を生存させて、歯髄幹細胞の割合を高めることが可能な状態をいう。
工程（ｃ）において、「低血清状態または無血清状態」かつ「低栄養状態」で歯髄細胞を培養する際には、以下の形態に限定されないが、例えば、培養液を交換せずに、3日以上細胞培養に用いた培養液で培養する形態（以下に制限されないが、例えば15%(V/V)FBS含有培地10ml中で0.1×106個の細胞を少なくとも３日以上培養した培養液で継続して培養する形態など）や、血清および糖などの栄養成分を含まない、もしくは、低濃度で含む培養液（生理的等張緩衝塩溶液など）を用いて培養する形態が含まれる。このように、「低血清状態」に加えて、「低栄養状態」で歯髄細胞を培養することにより、最終的に得られる歯髄幹細胞の割合を向上させることができる点において好ましい。
本発明の一実施の形態としては、「前記工程（ｃ）が、前記工程（ｂ）で用いた血清を含む培養液を、新しい培養液に交換をせずにそのまま歯髄細胞を培養する」ことを含む。このような実施の形態によれば、培地交換の作業を不要とし、簡便に歯髄幹細胞の調製・単離を行うことができる点において好ましい。また、このとき工程（ｂ）および（ｃ）の培養は、歯髄幹細胞を調製できる限りにおいて制限されないが、例えば、約1週間（168時間）を目安に行うことができる。また、一実施の形態として、この培養期間は少なくとも168時間以上とすることができる。
【００３５】
また、本発明は、一実施の形態において、工程（ａ）、または、工程（ｂ）の後に培養液を交換するための洗浄工程を含むことができる。洗浄工程は、培養に用いる培養液を交換する目的で行われ、公知の方法により行うことができる。例えば、培養ディッシュ内の培養液を捨て、滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄することで行うことができる。洗浄工程は、繰り返し行っても良く、3回程度行うことが好ましい。
本発明の一実施の形態においては、「工程（ａ）の後であって、かつ、工程（ｂ）の前に、（ａ’）培養液を交換するための洗浄工程」、または、「工程（ｂ）の後であって、かつ、工程（ｃ）の前に、（ｂ’）培養液を交換するための洗浄工程」の少なくとも一つの工程をさらに含むことができる。「工程（ａ）の後であって、かつ、工程（ｂ）の前に、（ａ’）培養液を交換するための洗浄工程」を行うことで接着細胞をより効率的に選別できる。
【００３６】
また、本発明は、別の態様において、上述する歯髄幹細胞の調製方法により調製された歯髄幹細胞を用いて、治療用移植材を製造する方法を提供する。
治療用移植材に含まれる歯髄幹細胞は、本発明の歯髄幹細胞の調製方法により調製された歯髄幹細胞をそのまま含んでもよいし、所望の治療用途に適した状態とするため当該歯髄幹細胞をさらに特定の条件下で培養、分化誘導等した歯髄幹細胞を含んでもよい。歯髄細胞または歯髄幹細胞を治療用途の移植材等に調製する方法としては、以下に限定されないが、例えば、国際公開第2014/185470号に記載の神経損傷の治療用移植材の製造方法などを参考にして実施することもできる。
治療用移植材は、対象とする部位に注射器等により注入してもよいし、対象とする部位を切開して、直接配置してもよく、対象の疾患や部位に応じて好ましい形態で使用することができる。また、治療用移植材は、免疫抑制剤や他の医薬と併用して使用してもよい。
【００３７】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、本明細書中に引用する文献は、本明細書に参照として組み込まれる。
【実施例】
【００３８】
CFU-Fコロニー形成法（Friedenstein et al.,1976）に基づく乳歯幹細胞の単離では、従来15%濃度のFBSを含有する培養液を用いて細胞コロニーを形成させていた（Yamaza et al., 2010）。以下の実施例では、歯髄幹細胞の単離のための培養における血清の条件の変更を含め、幹細胞特性（特に表面抗原の発現と細胞増殖能）の維持に最適な培養条件を検討した。【００３９】
（実施例１．歯髄細胞単離およびCFU-Fコロニー形成法）
ドナーの異なるヒト抜去乳歯3本を準備した。ヒト抜去乳歯は、株式会社セルテクノロジー（旧株式会社再生医療推進機構）より供与された。採取した歯髄組織は、alpha-MEM中でメス（Kai Medical社製、Surgical Brade No.23）にて細断した。細断した歯髄組織を4%ディスパーゼ（合同酒精）3mLと3％コラゲナーゼ（Worthington Biochemicals）3mLの混合酵素液（ともに滅菌PBSにて溶解）（計6mL）にて37℃、60分間、酵素処理した。酵素処理の後、15％FBS（Equitech-Bio社製、SFBM30-2301)含有alpha-MEM（Life Technology社製）を6mL添加し、十分に混和した後、酵素処理液を70μmセルストレーナー（BD Bisoscience社製）で濾過し、夾雑物を取り除いた。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行い、上清を捨て、1 mLのalpha-MEMで十分に混和した。得られた溶液中の細胞は、細胞数を計測した後、下記のようにFBS濃度を変えた3種の培養液を用いて、前培養を含む二段階の培養方法により培養を行った。なお、培養液中のFBS濃度は、二段階の培養方法の間で、同一の濃度とした。【００４０】
直径100mmの培養ディッシュ（BD Bisoscience社製）に0.1×106個の濃度となるように有核細胞を播種した。培養は、5%、10%、または、15% FBS、100 mM L-ascorbic acid 2-phosphate（和光純薬）、2 mM L-glutamine（ナカライテスク社製）、および、100 U/mL ペニシリン／100 mg/mLストレプトマイシン混合液（ナカライテスク社製）含有alpha-MEMの培養液10 mLを用い、37℃、5%CO2条件下で前培養を行った。前培養の培養開始から48時間後、細胞が細胞同士で互いに接着することなく一細胞ごとに培養ディッシュ上に付着していることを確認した。細胞の付着を確認後、培地を捨て3mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄し、当該洗浄工程を3回繰り返した。洗浄工程の後、5%、10%、または、15% FBS含有alpha-MEM培地を10 mL加えた。このとき、培養液は、前培養に用いた培養液中のFBS濃度と同一の濃度のものを用いた。その後、培養の後半に、細胞の生存極限である「低血清状態」となるように、培地交換を一切行わずに、1週間、37℃、5% CO2条件下で培養した（なお培養の後半は「低栄養状態」にも相当する）。
その結果、1週間の培養を行うことで、培養ディッシュに付着した細胞から、コロニーの形成を顕微鏡下で確認することができた。得られた付着コロニーについて、以後の試験でコロニー形成数や細胞数の確認を試みた。【００４１】
（実施例２．CFU-F解析）
上記実施例１の培養により得られた付着コロニーについて、下記のように、CFU-F解析を行った。
具体的には、実施例１の培養後、培養液を捨て、3mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄し、当該洗浄工程を3回繰り返した。培養ディッシュをPBS緩衝4%パラフォルムアルデヒド（pH7.4）にて、室温、15分間固定処理を行った。固定処理の後、3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄し、洗浄工程を3回繰り返した。洗浄工程の後、PBS緩衝0.5%トルイジンブルー液で、室温、2晩染色処理を行った。染色工程の後、蒸留水で洗浄後、室温で乾燥を行った。また、培養ディッシュ中の付着コロニーを、スライドスキャナを用いてスキャニングし、付着コロニー数を計測した。【００４２】
その結果を図１に示す。15%、10%、または、5% FBS濃度の培養液を用いて、かつ、培地交換をしない培養方法により、各濃度のFBSを用いた場合にも線維芽細胞様細胞から構成されるプラスティックディッシュ付着性のコロニー（細胞集団）、Colony-forming unit-fibroblast (CFU-F)様のコロニーが観察された（図1A）。また、細胞数50以上からなる細胞集団をCFU-Fコロニーと見なし、培養ディッシュ上で形成されたCFU-Fコロニーを計測した。コロニー形成数の結果を図1Bに示す。図1Bに示すように、10% FBS濃度の培養液を用いた群では、15% FBS濃度の培養液を用いた群と比較して、有意に形成コロニー数が多かった（p=0.0009 vs.15% FBS 群）（図1B）。一方、10% FBS濃度の培養液を用いた群と5% FBS濃度の培養液を用いた群とを比べるとコロニー数に差が認められなかった。【００４３】
（実施例３．単離細胞数解析）
次に、各FBS濃度で二段階培養した際の、培養ディッシュ内に形成したCFU-Fコロニーに含まれる細胞数への影響を確認するため、以下の試験を行った。
上記実施例１の培養により付着コロニーが形成されたことを確認した後、培養液を捨て、3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄し、当該洗浄工程を3回繰り返した。洗浄工程の後、洗浄に用いたPBSを捨て、2.5g (W/V)トリプシンおよび1mM EDTAを含む混合溶液（ナカライテスク）1 mL加え、37℃、5分間、酵素処理を行った。4 mLの5%、10%、または、15% FBS含有alpha-MEM培地を加え、懸濁した。このとき、FBS含有alpha-MEM培地中のFBS濃度は、培養に用いた濃度と一致させた。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行い、遠心処理後、上清を捨て、1 mLのalpha-MEMで十分に混和した。その後、細胞数の計測を行った。以下、5%、10%、または、15% FBS含有alpha-MEM培地を用いたそれぞれの群を、5% FBS群、10% FBS群、または、15% FBS群という。その結果を図1C及び図1Dに示す。
図1Cは、培養ディッシュ１枚に含まれる細胞数の計測結果を示す。培養ティディッシュ上の細胞の総数を計測したところ、図1Cに示すように、10%FBS濃度の培養液を用いた単離群が、5%、または、15% FBS濃度の培養液を用いた群のいずれに対しても、有意に細胞数が多かった（p=0.0004 vs. 15%FBS群；p=0.000004vs. 5% FBS群）（図1C）。
図1Dは、上記で計測した培養ディッシュ上の細胞の総数をコロニー数で割った値を示す。その結果、15% FBS群、または、10% FBS群では、ほぼ同等の細胞数が得られた（図1D）。一方、5% FBS群では、15% FBS群または10% FBS群と比較すると、細胞数は有意に少なかった（p=0.0006 vs. 15%FBS群；p=0.000003vs. 10% FBS群）。【００４４】
（実施例４．細胞増殖解析）
上記実施例１に記載の培養方法により付着コロニーが形成されたことを確認した後、培養液を捨て、3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄した。当該洗浄工程は3回繰り返した。洗浄工程の後、2.5g (W/V)トリプシンおよび1mM EDTAの混合溶液（ナカライテスク）1 mL 加え、37℃、5分間、酵素処理を行った。酵素処理の後、4 mLの15% FBS含有alpha-MEM培地を加え、懸濁した。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行った。遠心処理後、上清を捨て、1mLのalpha-MEMで十分に混和した。その後、細胞数の計測を行った。15%、10%、または、5% FBS含有alpha-MEM培養液200 mLを含む96-wellプレートに対して、1 well当たり10×103個の濃度となるように有核細胞を播種した。培養は、37℃、5%CO2条件下で培養を行った。培養開始後1日目に、Brd-U試薬（Roche社製）を添加した。Brd-U試薬添加から24時間経過後、Cell Proliferation ELISA（Roche社製）を用いて培養細胞を処理し、マイクロプレートリーダーを用いて細胞増殖を解析した。【００４５】
その結果を図2に示す。図2Aは、各FBS濃度で前培養およびコロニー形成を行った細胞群に対して、15% FBS含有培養液下で細胞増殖解析のための培養を行った結果を示す。図2Aに示すように、10%FBS濃度で前培養を行った群（10% FBS前培養群）が最も高い細胞増殖能を示した。10% FBS前培養群は、15% FBS前培養群で前培養を行った群と比較して有意に（p=0.033 vs.15%FBS前培養群）細胞増殖能が上昇していた。一方、5% FBS前培養群とは差が認められなかった（図2A）。
次に、10% FBS含有培養液下で細胞増殖解析のための培養を行ったところ、10% FBS前培養群が最も高い細胞増殖能を示した。10% FBS前培養群は15% FBS前培養群と比較して有意に（p=0.006 vs. 15% FBS群）細胞増殖能が上昇していた。一方、5% FBS前培養群とは差が認められなかった（図2B）。
また、5%FBS含有培養液で細胞増殖解析のための培養を行った試験では、10%FBS前培養群が最も高い細胞増殖能を示したが、5% FBS全培養群、または15%FBS全培養群との有意差は認められなかった（図2C）。
さらに、前培養およびコロニー形成に用いたFBS濃度と同一のFBS濃度で増殖能解析のための培養を行ったところ、10%FBS群が最も高い細胞増殖能を示した。10% FBS群は15% FBS群と比較して有意に（p=0.006 vs. 15%FBS群）細胞増殖能が上昇していた。一方、5% FBS単離群とは差が認められなかった（図2D）。【００４６】
（実施例５．フローサイトメトリー解析）
上記実施例１の培養により付着コロニーが形成されたことを確認した後、培養液を捨て、3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄した。当該洗浄工程は3回繰り返した。洗浄工程の後、2.5g (W/V)トリプシンおよび1 mM EDTAの混合溶液（ナカライテスク）1 mL 加え、37℃、5 分間、酵素処理を行った。4 mLの5%、10%、または、15% FBS含有alpha-MEM培地（前培養およびコロニー形成に用いたものと同一のFBS濃度を使用）を加え、懸濁した。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行った。遠心処理後、上清を捨て、1 mLのalpha-MEM で十分に混和した。その後、細胞数の計測を行った。次に、直径100 mmの培養ディッシュに対して、0.1×106個の濃度となるように有核細胞を播種した。各単離群は、単離時に用いた培養液と同一のFBS濃度を有する培養液10 mL を用いて、37℃、5% CO2の条件下で培養を行った。培養中は、3日毎に培地交換を行った。培養開始後10日目に細胞を培養ディッシュより剥離、回収した。具体的には、下記のように行った。培養後の培養液を捨て、3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを3回洗浄し、その後、2.5g (W/V)トリプシンおよび1mM EDTAの混合溶液（ナカライテスク）1 mL 加え、37℃、5分間、酵素処理を行った。酵素処理の後、4 mLの15% FBS含有alpha-MEM培地を加え、懸濁した。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行い、上清を捨て、1 mLのalpha-MEMで十分に混和することにより細胞を回収した。回収した細胞は、FACS用チューブ（BD Bioscience）に0.1×106cells/100 micro-L PBSとなるように分注した。分注後、CD146、CD105、CD73、CD90、CD29、SSEA-4、HLA-DR、CD34、CD45、および、CD14に対する蛍光標識抗体（Biolegend）1 micro-g/mLを氷上で45分反応させ免疫染色を行い、フローサイトメータであるFACS Verseにて解析を行った。【００４７】
その結果を図3Aに示す。図3Aに示すように、各FBS濃度で二段階培養を行った際にも、造血系細胞のマーカーのCD45およびCD14は陰性を示した。一方、CD34は、15%FBS群および5%FBS群では陰性であったが、10%FBS群では、7.4±0.3%（平均値±s.e.m）と有意に増加していた（p=0.0001 vs. 15%FBS 群、10%FBS群）（図3B）。HLA-DRは各FBS濃度群で陰性を示していた（図3）。また、間葉系幹細胞のマーカーであるCD146、CD105、CD73、CD90、および、CD29は各FBS濃度群で陽性を示した。CD105、CD73、CD90、CD29は全ての群において94%以上の陽性率を示した。しかしながら、CD146の発現は、15% FBS群では15.6±0.1%、10% FBS群では14.9±0.1%、5% FBS群では9.0±0.0%であり、各FBS濃度群の間で違いが認められた。CD146の発現においては、5% FBS群は他の群と比較して有意（p=0.000001 vs. 15% FBS 群；p=0.000002 vs. 10%FBS 群）にCD146の発現が低下していた（図3B）。
多能性幹細胞のマーカーであるSSEA-4は各FBS濃度群とも陽性を示した。15% FBS群では35.06±0.12%、10% FBS群では42.23±0.23%、5% FBS濃度単離群では26.00±0.27%であり、各FBS濃度群の間で違いが認められ、10%FBS群は他のFBS濃度群と比較して有意にSSEA-4の発現が上昇（p=0.000001 vs. 15% FBS 群, 10% FBS群）していた（図3B）。【００４８】
このように、フローサイトメトリーによる表面抗原の解析では、15% FBS 培地での単離群では、The International Society for Cellular Therapyが提唱する間葉系幹細胞としての免疫学的表現型における必須条件（CD105, CD73, CD90 が陽性かつCD34,CD45, CD14, HLA-DR が陰性である）（Dominic et al., 2006）を満たしていた。
従って、CFU-F コロニー形成を基盤とした単離法で得る乳歯歯髄組織由来の細胞は、間葉系幹細胞に属する細胞であると見なされる。5% FBS培地単離群でも同様の表現型が観察された。【００４９】
一方、10% FBS 培地単離群では、CD34が他の群と比較して有意に増加していた。ヒト骨髄間葉系幹細胞ではCD34陽性細胞の存在が報告されている（Simmons and Torok-Storb, 1991）。しかし、CD34 陽性マウス骨髄造血系幹細胞hematopoietic stem cells (HSCs)では、short-term self-renewingHSCs (ST-HSCs)ではCD34陽性を示すが、long-term self-renewing HSCs (LT-HSCs)ではCD34陰性を示す（Spangrude et al., 1998）。LT-HSCsはST-HSCsと比較して、細胞周期がG0期を示し、また細胞増殖率が非常に低い（Cheshieret al., 1999）。【００５０】
なお、これまでCD34陽性乳歯幹細胞の存在は未だ明らかとなっておらず、この試験で得られたCD34陽性乳歯幹細胞集団が世界で初めて同定された。従って、CD34陽性を示す乳歯幹細胞集団は、CD34陰性を示す乳歯幹細胞集団と比較して、自己複製能や細胞増殖能が異なる幹細胞集団である可能性が示唆される。このように、15%および5% FBS単離群と比較して、10% FBS含有培地で単離することにより、CD34の発現が亢進した乳歯幹細胞群を単離する事が可能と示唆される。
また、本試験では、いずれのFBS濃度による単離細胞群においても、CD146の発現が認められた。興味あることに、10%FBS単離群が他の濃度の単離群と比べて有意に増加していた。従って、15%および5% FBS単離群と比較して、10% FBS単離乳歯幹細胞群は、早期の幹細胞をより多く含む可能性が示唆される。
また、本研究では、SSEA-4の発現が、他の濃度の単離群と比べて10% FBS 単離群において有意に増加していた。従って、10% FBS含有培地で単離することにより、従来の方法（15% FBS 使用）より、原始的で、幹細胞特性の亢進した乳歯幹細胞群を単離する事が可能と示唆される。【００５１】
これより、以下の実施例においては、血清の濃度と細胞増殖能および幹細胞特性との関係についてさらに検討を行った。具体的には、15%、13%、10%、7%、5%のそれぞれの濃度の血清を用いたときの幹細胞特性（表面抗原の発現と細胞増殖能）の評価を行った。
（実施例６．歯髄細胞単離およびCFU-Fコロニー形成法）
ドナーの異なるヒト抜去乳歯3本を準備した。ヒト抜去乳歯は、株式会社セルテクノロジーより供与された。採取した歯髄組織は、alpha-MEM中でメス（Kai Medical社製、Surgical Brade No.23）にて細断した。細断した歯髄組織を4% ディスパーゼ（合同酒精、typeII）3 mLと3％ コラゲナーゼ（Worthington Biochemicals）3 mLの混合酵素液（ともに滅菌PBSにて溶解）（計6 mL）にて37℃、60分間、酵素処理した。酵素処理の後、15％ FBS（Equitech-Bio社製、SFBM30-2301）含有alpha-MEM（Life Technology社製）を6 mL添加し、十分に混和した後、酵素処理液を70 μmセルストレーナー（BD Bisoscience社製）で濾過し、夾雑物を取り除いた。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行い、上清を捨て、1 mLのalpha-MEMで十分に混和した。得られた溶液中の細胞は、細胞数を計測した後、下記のようにFBS濃度を変えた5種の培養液を用いて、前培養を含む二段階の培養方法により培養を行った。なお、培養液中のFBS濃度は、二段階の培養方法の間で、同一の濃度とした。【００５２】
直径100 mmの培養ディッシュ（BD Bisoscience社製）に0.1×106個の濃度となるように有核細胞を播種した。培養は、5%、7%、10%、13%、または、15% FBS、100 mM L-ascorbic acid 2-phosphate（和光純薬）、2 mM L-glutamine（ナカライテスク社製）、および、100 U/mL ペニシリン／100 mg/mLストレプトマイシン混合液（ナカライテスク社製）含有alpha-MEMの培養液10 mLを用い、37℃、5% CO2条件下で前培養を行った。前培養の培養開始から48時間後、細胞が細胞同士で互いに接着することなく一細胞ごとに培養ディッシュ上に付着していることを確認した。細胞の付着を確認後、培地を捨て3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄し、当該洗浄工程を3回繰り返した。洗浄工程の後、5%、10%、または、15% FBS含有alpha-MEM培地を10 mL加えた。このとき、培養液は、前培養に用いた培養液中のFBS濃度と同一の濃度のものを用いた。その後、培地交換を一切行わずに、1週間、37℃、5% CO2条件下で培養した。
その結果、1週間の培養を行うことで、培養ディッシュに付着していた細胞から、コロニーの形成を顕微鏡下で確認することができた。得られた付着コロニーについて、以後の試験でコロニー形成数や細胞数の確認を試みた。【００５３】
（実施例７．CFUF-F解析）
上記実施例６の培養により得られた付着コロニーについて、下記のように、CFU-F解析を行った。
具体的には、実施例６の培養後、培養液を捨て、3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄し、当該洗浄工程を3回繰り返した。培養ディッシュをPBS緩衝4% パラフォルムアルデヒド（pH7.4）にて、室温、15分間固定処理を行った。固定処理の後、3mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄し、洗浄工程を3回繰り返した。洗浄工程の後、PBS緩衝0.5% トルイジンブルー液で、室温、2晩染色処理を行った。染色工程の後、蒸留水で洗浄後、室温で乾燥を行った。また、培養ディッシュ中の付着コロニーを、スライドスキャナを用いてスキャニングし、付着コロニー数を計測した。【００５４】
その結果を図４に示す。15%、13%、10%、7%、5%のいずれの濃度のFBSを用いても線維芽細胞様細胞から構成されるプラスティックディッシュ付着性の細胞集団、CFU-Fが観察された（図４A）。細胞数50 以上からなる細胞集団をCFU-Fコロニーと見なし、培養ディッシュ上で形成されたCFU-Fコロニーを計測したところ、10%および7% FBS 濃度での培地を用いた単離群では、15%および5% FBS濃度の単離群と比較して有意に形成コロニー数が多かった（図４Ｂ）。一方、13% FBS濃度培地群は、その他の培地群と比べるとコロニー数に差が認められなかった（図４Ｂ）。この結果は、10%および7% FBS濃度培地を用いることで、初期乳歯幹細胞単離数を増加させる事ができることを示す。【００５５】
（実施例８．細胞増殖解析）
上記実施例６に記載の培養方法により付着コロニーが形成されたことを確認した後、培養液を捨て、3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄した。当該洗浄工程は3回繰り返した。洗浄工程の後、2.5g (W/V)トリプシンおよび1 mM EDTAの混合溶液（ナカライテスク）1 mL 加え、37℃、5 分間、酵素処理を行った。酵素処理の後、4 mLの15% FBS含有alpha-MEM培地を加え、懸濁した。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行った。遠心処理後、上清を捨て、1 mLのalpha-MEM で十分に混和した。その後、細胞数の計測を行った。15% FBS含有alpha-MEM培養液、または、前培養に用いたFBS濃度と同じ濃度のFBS含有alpha-MEM培養液200 mLを含む96-wellプレートに対して、1 well当たり10×103個の濃度となるように有核細胞を播種した。培養は、37℃、5% CO2条件下で培養を行った。培養開始後1 日目に、Brd-U試薬（Roche社製）を添加した。Brd-U 試薬添加から24時間経過後、Cell Proliferation ELISA（Roche 社製を用いて培養細胞を処理し、マイクロプレートリーダーを用いて細胞増殖を解析した。【００５６】
各FBS濃度（15%、13%、10%、7%、または、5%）で前培養およびコロニー形成を行った細胞群を15%FBS含有培地存在下で細胞増殖解析のための培養を行った区では、13%, 10%, 7%FBS濃度での前培養群が、15%および5% FBS濃度群と比較して有意に高い細胞増殖能を示した（図５A）。一方で、前培養およびコロニー形成に用いたFBS濃度と同一の濃度のFBS含有培地を用いて１週間の細胞増殖解析のための培養を行った区において増殖能を比較したところ、15% FBS 濃度群と比較して、13%, 10%, 7% FBS濃度群が有意に高い増殖能力を示した（図５B）。
この結果は、従来の15% 濃度や5% 濃度を用いた単離方法より13%、10%、7% FBS濃度を用いた単離方法が優れた細胞増殖能を付与できることを示す。【００５７】
（実施例９．フローサイトメトリー解析）
上記実施例６の培養により付着コロニーが形成されたことを確認した後、培養液を捨て、3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄した。当該洗浄工程は3回繰り返した。洗浄工程の後、2.5g (W/V)トリプシンおよび1 mM EDTAの混合溶液（ナカライテスク）1 mL 加え、37℃、5 分間、酵素処理を行った。4 mLの5%、7%、10%、13%、または、15% FBS含有alpha-MEM培地（前培養およびコロニー形成に用いたものと同一のFBS濃度を使用）を加え、懸濁した。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行った。遠心処理後、上清を捨て、1 mLのalpha-MEM で十分に混和した。その後、細胞数の計測を行った。次に、直径100mm の培養ディッシュに対して、0.1×106個の濃度となるように有核細胞を播種した。各単離群は、コロニー形成時に用いた培養液と同一のFBS濃度を有する培養液10 mL を用いて、37℃、5%CO2の条件下で培養を行った。培養中は、3日毎に培地交換を行った。培養開始後10日目に細胞を培養ディッシュより剥離、回収した。細胞の剥離および回収は、具体的には下記のように行った。培養後の培養液を捨て、3mL滅菌PBSで培養ディッシュを3回洗浄し、その後、2.5g (W/V)トリプシンおよび1mM EDTA 溶液（ナカライテスク）1 mL 加え、37℃、5 分間、酵素処理を行った。酵素処理の後、4 mLの15% FBS含有alpha-MEM培地を加え、懸濁した。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行い、上清を捨て、1mLのalpha-MEMで十分に混和することにより細胞を回収した。回収した細胞は、FACS用チューブ（BD Bioscience）に0.1×106cells/100micro-L PBSとなるように分注した。分注後、SSEA-4に対する蛍光標識抗体（Biolegend）1 micro-g/mLを氷上で４５分反応させ免疫染色を行い、フローサイトメーターであるFACS Verseにて解析を行った。なお、標的表面抗原として、SSEA-4の抗原を解析対象とした。【００５８】
結果を図６および図７に示す。15% FBS 濃度群および5%FBS濃度群と比較すると、13% FBS濃度群および10% FBS濃度群では有意にSSEA-4 の発現が上昇していた（図７）。一方、7% FBS濃度群は有意な差は認められなかった（図７）。この結果は、13%および10% FBS 含有培地で単離することにより、従来の15% 血清濃度または5% 血清濃度を使用したCFU-F法による単離方法より、原始的で、幹細胞特性の亢進した歯髄幹細胞群を単離する事が可能であることを示す。【００５９】
以上のコロニー形成数、単離細胞数、細胞増殖能、フローサイトメトリーによる表面抗原の試験結果より、単離からのコロニー形成時に7%〜13%の血清濃度、特に10%濃度の血清を含有する培地を使用する事により、他のFBS 濃度の培地を用いた単離群と比較して、原始的で、幹細胞特性が亢進している乳歯幹細胞群が採取できる事が示された。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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