(57)【要約】  本発明は、簡単な工程で製造でき、小粒径であってもカラムの圧力損失が小さく、大量処理を必要とする分取目的のサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤として使用するのに好適な充填剤、およびその充填剤の製造方法を提供することを課題とする。本発明では、グリセリン−１，３−ジメタクリレートとグリシジルメタクリレートを、重合開始剤の存在下で重合する工程、得られた共重合体からなる多孔質粒子を糖アルコールで親水化する工程、その後に残グリシジル基を鉱酸により開環する工程を含む製造工程により、サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤を得る。
2018155241.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともグリセリン−１，３−ジメタクリレートとグリシジルメタクリレートをモノマー単位とする共重合体の表面に、下記式（Ｉ）で表わされる構造を有する多孔質粒子であって、
【化１】
2018155241.tif 000007
（但し、Ｒ1は多孔質粒子の部分構造、Ｒ2は、水素原子または多孔質粒子の部分構造を意味し、ｎは１〜５の整数を意味する。）
前記多孔質粒子のグリシジジル基の開環率が９５％以上となっていることを特徴とする、サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤。
【請求項２】
前記共重合体が、グリセリン−１，３−ジメタクリレート  ６モル％〜２９モル％、グリシジルメタクリレート  ７１モル％〜９４モル％をモノマー単位として含有する、請求項１に記載のサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤。
【請求項３】
式（Ｉ）のｎが４である請求項１または２に記載のサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤。
【請求項４】
下記（１）〜（３）の工程を含むサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤の製造方法。
（１）モノマーとして、少なくともグリセリン−１，３−ジメタクリレートとグリシジルメタクリレートに、希釈剤を加え、ラジカル重合開始剤を用いて水性媒体中で重合して、グリシジル基を有する多孔質粒子を得る第１の工程。
（２）第１の工程で得たグリシジル基を有する多孔質粒子を、糖アルコールが溶解した水溶液中に分散し、アルカリ金属水酸化物を含んだ水溶液を添加し、加熱撹拌してグリシジル基に糖アルコールを結合させる第２の工程。
（３）第２の工程で得た糖アルコールが結合された多孔質粒子を、鉱酸を含む水溶液中に分散し、加熱撹拌して残存するグリシジル基を開環する第３の工程。
【請求項５】
第３の工程終了後のグリシジル基の開環率が９５％以上である請求項４に記載の充填剤の製造方法。
【請求項６】
グリシジル基を有する多孔質粒子が、グリセリン−１，３−ジメタクリレート  ６モル％〜２９モル％、グリシジルメタクリレート  ７１モル％〜９４モル％をモノマー単位として含有する共重合体からなる、請求項４または５に記載の充填剤の製造方法。
【請求項７】
糖アルコールが、ソルビトールである請求項４〜６のいずれかに記載の充填剤の製造方法。
【請求項８】
体積換算平均粒径が８〜１５μｍの親水性多孔質粒子からなり、
カラムに充填し、水を線流速１００ｃｍ/ｈで流した時の、充填剤長３０ｃｍ当たりの圧力損失が１．２ＭＰａ以下であり、
１-ブタノールとエチレングリコールとの溶出容量の比で示される親水性の値が１．０から１．４であり、
リゾチームとミオグロビンとの溶出容量の比で示されるイオン性の値が０．８から１．２であり、
プルランの排除限界分子量が１００万以上であることを特徴とする、
サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載の充填剤が液体クロマトグラフィー用筐体に充填された、サイズ排除クロマトグラフィー用カラム。
【請求項１０】
請求項９に記載の前記サイズ排除クロマトグラフィー用カラムを備えたクロマトグラフィー装置。
【請求項１１】
請求項９に記載の前記サイズ排除クロマトグラフィー用カラムを用いて水系溶離液で生体高分子を分離することを特徴とする生体高分子の分離、分取方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体高分子を分取するための充填剤に関する。さらに詳しくは、多糖類、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡのような生体由来高分子を水系溶離液でサイズ排除クロマトグラフィーの原理に基づき、分離、分取するのに適した充填剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子の大きさの順に分離するサイズ排除クロマトグラフィーは多糖類、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡの様な水溶性高分子を分離する際に広く利用されている。サイズ排除クロマトグラフィーは、とりわけタンパク質等の生体高分子の分離、分取においては、生体高分子を穏和な条件で処理できるため、生体高分子の変性が少ない状態で分離、分取できるといった利点がある。分離、分取された生体高分子は生化学反応への応用や食品、製薬、化学等の工業的用途に使用され、近年市場が著しく拡大成長している。その需要に対応するため工業スケールに即した大量処理可能な分離、分取用の充填剤が望まれている。特に、生体に含まれる抗体である、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）といったタンパク質は、その医薬品として用途が注目され、こうしたタンパク質の分離、分取が効率よく行うことのできる充填剤が強く望まれている。【０００３】
既に、分析用途では、多種多様のサイズ排除クロマトグラフィー用充填剤がカラムに充填されたものが販売されている。分析用途に使用される充填剤粒子は、およそ３μｍから１５μｍの平均粒径を有する。これらの充填剤は、分取したい生体高分子の量が少量の時には、分取用の充填剤として使用することもできる。しかし、工業用スケールで大量処理に用いるためには、充填剤を大きなカラムに充填する必要があり、この場合には、分析用途の充填剤では充填剤の平均粒径が小さすぎるため、装置にかかる背圧が高くなりすぎるという問題を有していた。【０００４】
一方、分取用の充填剤として、既に販売されている充填剤では、充填剤の機械的強度が十分でない場合が多い。こうした充填剤において、平均粒径が小さい場合は機械的強度不足により圧密化が進行し、カラム圧力損失の上昇、閉塞が起こりやすくなる問題があった。このため、多くの市販されている分取用の充填剤は、例えば、主に５０μｍ以上といった、より平均粒径の大きな充填剤として販売されている。平均粒径が大きい場合は、背圧が高くなることがなく、大量の生体高分子を分離、分取することができる。しかし、平均粒径が大きい充填剤では、サイズ排除の原理に基づく分離性能が低下してしまう問題があり、分離性能を確保するため低線流速下での使用が余儀なくされ、操作が長時間化してしまう課題がある。【０００５】
機械的強度の高い充填剤を得るための技術として、以下の例などが提案されている。
特許文献１には、エチレングリコールジメタクリレートとグリシジルメタクリレートからなる基材に、ジメチルスルホキシドや１，４−ジオキサン中で、エチレングリコールやグリセリンなどを、塩基の存在下で反応させることにより、圧密化が起こらず機械的強度が十分な多孔質担体が得られることが開示されている。【０００６】
イオン交換基を導入した合成ポリマー系の充填剤において、高いタンパク質の保持容量を付与するために、充填剤に超枝分れ親水性ポリヒドロキシ官能性のポリマーを共有結合で結合することが、特許文献２に開示されている。この技術により、充填剤は化学的安定性及び堅牢性に関しても十分な特性を示すと報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−１４１２１２号公報
【特許文献２】特許第４４４０７７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、様々な報告があるが、依然として、機械的強度の十分な、分取に適した充填剤が望まれていた。特に、十分な機械的強度を持ち、１０〜１５μｍ程度の平均粒径であっても充填した時にカラムにかかる背圧の小さな充填剤が望まれていた。【０００９】
本発明は上記に見られる問題点を解決することを課題とする。より特定すれば、本発明の課題は、簡単な工程で製造でき、小粒径であってもカラムの圧力損失が小さく、大量処理を必要とする分離、分取目的に好適に使用できるサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤、およびその充填剤の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、グリシジル基を持った単量体と架橋剤とを重合開始剤の存在下で重合し、得られた共重合体からなる多孔質粒子を糖アルコールで親水化し、その後に残グリシジル基を鉱酸により開環する工程を経ることで目的とする充填剤が得られることを見出し、本発明を成すに至った。すなわち本発明は以下の事項に関する。【００１１】
[１] 少なくともグリセリン−１，３−ジメタクリレートとグリシジルメタクリレートをモノマー単位とする共重合体の表面に、下記式（Ｉ）で表わされる構造を有する多孔質粒子であって、
【化１】
2018155241.tif 000003
（但し、Ｒ1は多孔質粒子の部分構造、Ｒ2は、水素原子または多孔質粒子の部分構造を意味し、ｎは１〜５の整数を意味する。）
前記多孔質粒子のグリシジジル基の開環率が９５％以上となっていることを特徴とするサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤。
[２] 前記共重合体が、グリセリン−１，３−ジメタクリレート  ６モル％〜２９モル％、グリシジルメタクリレート  ７１モル％〜９４モル％をモノマー単位として含有する[１]に記載のサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤。
[３] 式（Ｉ）のｎが４である[１]または[２]に記載のサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤。【００１２】
[４] 下記（１）〜（３）の工程を含むサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤の製造方法。
（１）モノマーとして少なくともグリセリン−１，３−ジメタクリレートとグリシジルメタクリレートに、希釈剤を加え、ラジカル重合開始剤を用いて水性媒体中で重合して、グリシジル基を有する多孔質粒子を得る第１の工程。
（２）グリシジル基を有する多孔質粒子を、糖アルコールが溶解した水溶液中に分散し、アルカリ金属水酸化物を含んだ水溶液を添加し、加熱撹拌してグリシジル基に糖アルコールを結合させる第２の工程。
（３）（２）で得た糖アルコールが結合された多孔質粒子を、鉱酸を含む水溶液中に分散し、加熱撹拌して残存するグリシジル基を開環する第３の工程。
[５] 第３の工程終了後のグリシジル基の開環率が９５％以上である[４]に記載の充填剤の製造方法。
[６] グリシジル基を有する多孔質粒子が、グリセリン−１，３−ジメタクリレート  ６モル％〜２９モル％、グリシジルメタクリレート  ７１モル％〜９４モル％をモノマー単位として含有する共重合体からなる、[４]または[５]に記載の充填剤の製造方法。
[７] 糖アルコールが、ソルビトールである[４]〜[６]のいずれかに記載の充填剤の製造方法。【００１３】
[８] 体積換算平均粒径が８〜１５μｍの親水性多孔質粒子からなり、
カラムに充填し、水を線流速１００ｃｍ/ｈで流した時の、充填剤長３０ｃｍ当たりの圧力損失が１．２ＭＰａ以下であり、
１−ブタノールとエチレングリコールとの溶出容量の比で示される親水性の比が１．０から１．４であり、
リゾチームとミオグロビンとの溶出容量で示されるイオン性の比が０．８から１．２であり、
プルランの排除限界分子量が１００万以上であることを特徴とする、
サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤。【００１４】
[９] [１]〜[３]のいずれかに記載の充填剤が液体クロマトグラフィー用筐体に充填された、サイズ排除クロマトグラフィー用カラム。
[１０] [９]に記載のサイズ排除クロマトグラフィー用カラムを備えたクロマトグラフィー装置。
[１１] [９]に記載のサイズ排除クロマトグラフィー用カラムを用いて水系溶離液で生体高分子を分離することを特徴とする生体高分子の分離、分取方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、分離性能の高い、小さな平均粒径の充填剤をサイズの大きなカラムに使用できる。このことにより分離処理の高速化が可能である。さらに、該充填剤は、安価な原料、簡便な工程で製造することが可能であり、大量の充填剤を使用する工業用スケールにおいても適用が容易である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、実施例１の充填剤を用いた時のＩｇＭとＩｇＧの分離の様子を示すクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下の説明において例示される材料、寸法等は一例であって、本発明はそれらに限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施することが可能である。
【００１８】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤は、少なくともグリセリン−１，３−ジメタクリレートとグリシジルメタクリレートをモノマー単位とする共重合体の表面に、下記式（Ｉ）で表わされる構造を有する多孔質粒子であって、
【化２】
2018155241.tif 000004
（但し、Ｒ1は多孔質粒子の部分構造、Ｒ2は、水素原子または多孔質粒子の部分構造を意味し、ｎは１〜５の整数を意味する。）
前記多孔質粒子のグリシジジル基の開環率が９５％以上となっていることを特徴とする。
本発明のサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤は、例えば下記（１）〜（３）の工程を含むサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤の製造方法によって製造することができる。
［第１の工程］
＜グリシジル基を有する多孔質粒子の作製＞
本発明においては、少なくとも、グリセリン−１，３−ジメタクリレートとグリシジルメタクリレートをモノマー単位とする共重合体からなるグリシジル基を有する多孔質粒子を基材として利用する。多孔質粒子は、親水性架橋性単量体であるグリセリン−１，３−ジメタクリレートとグリシジル基を持つ単量体であるグリシジルメタクリレートを希釈剤の存在下で共重合することによって得られる。これらの、多孔質粒子は、特開２００７／１７０９０７、ＷＯ２００６／１３２３３３等の記載の方法を参考に製造することができる。
【００１９】
前記共重合体は、モノマー単位として、グリセリン−１，３−ジメタクリレートとグリシジルメタクリレートを合計で９５モル％以上含めば、多孔質粒子の性質を大幅に変化させない範囲で、他のモノマー単位を含んでも構わない。他のモノマーとして、グリシジル基を持つ単量体としては、３、４−エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル等があげられる。また、親水性架橋性単量体として、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、グリセリン−１，３−ジアクリレート、グリセリンメタクリレートアクリレートから選ばれる多価アルコールの（メタ）アクリル酸エステルなどが好ましく用いられる。その他、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレートなども使用できる。なお、本明細書において、「（メタ）アクリレート」は、アクリレート及びメタクリレートを意味する。
【００２０】
グリシジルメタクリレートは、共重合に用いられる単量体の混合物の総量に対し７０〜９５モル％、好ましくは８０〜９０モル％用いられる。グリシジルメタクリレートが７０モル％以上であると、サイズ排除クロマトグラフィー用充填剤として親水性が十分であり、また９５モル％以下であると機械的強度が維持されカラム内の充填剤の圧密化を防ぐことができる。
【００２１】
グリセリン−１，３−ジメタクリレートは、共重合に用いられる単量体の混合物の総量に対し５〜３０モル％、好ましくは１０〜２０モル％用いられる。グリセリン−１，３−ジメタクリレートが３０モル％以下であると、サイズ排除クロマトグラフィー用充填剤として親水性が十分であり、また５モル％以上であると機械的強度が維持されカラム内の充填剤の圧密化を防ぐことができる。
【００２２】
前記多孔質粒子は細孔を有する。多孔性を付与する目的で前記単量体混合物に希釈剤を添加し重合する。希釈剤とは、単量体混合物に溶解するが重合反応には不活性で、さらに生成した共重合体を溶解しない性質の有機溶媒である。重合終了後、希釈剤を洗浄等により取り除くことで希釈剤部分が空洞になり粒子中に多孔を形成する。
【００２３】
希釈剤としては、例えばトルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン、クロロベンゼンのような芳香族系炭化水素類；ヘキサン、ヘプタン、ペンタン、オクタン、ノナン、デカンのような飽和炭化水素類；イソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、へプチルアルコール、オクチルアルコール、ノニルアルコールのようなアルコール類；ジクロルメタン、ジクロルエタン、トリクロルエタンのような脂肪族ハロゲン化炭化水素類；酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸ペンチル、安息香酸メチル、安息香酸エチル、安息香酸プロピルのような脂肪族あるいは芳香族エステルなどを用いることができる。これらの希釈剤は単独でまたは２種類以上混合して使用することができる。
【００２４】
その希釈剤の添加量は充填剤の排除限界分子量や細孔容積の体積％（充填剤粒子の全容積に対する細孔容積の割合を示す）に影響を与える。このため、適宜その量を調節して加えられる。これらの希釈剤の添加量は単量体の総量１００質量部に対して１００〜３００質量部が好ましい。
【００２５】
単量体混合物に希釈剤を加えたものには、重合開始剤が加えられる。重合開始剤は、ラジカルを発生する公知のラジカル重合開始剤であれば特に限定されないが、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス(イソ酪酸メチル)のようなアゾ系開始剤を挙げることができる。この内、化学構造の親和性から、２，２’−アゾビス(イソ酪酸メチル)を用いることが望ましい。重合開始剤の濃度に特に限定はないが単量体の総量１００質量部に対して０．１〜５質量部が好ましい。
【００２６】
単量体混合物、希釈剤、重合開始剤によって、単量体を含む油相が準備される。油相は、適当な分散安定剤を含んだ水性媒体中で撹拌懸濁させ、油滴の状態にする。その状態で重合（懸濁重合）することにより、共重合体が適当な粒径を持つ多孔質粒子として生成される。油滴の作製方法には、上記の撹拌によるものの他に、希釈剤を含む単量体溶媒を多孔質膜、あるいは石英基板に形成されたマイクロ流路を通じて水性媒体中に滴下する方法を適用することができる。
【００２７】
水性媒体に含まれる分散安定剤としては公知のものが使用できる。通常、ゼラチン、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコールなどの水溶性高分子化合物が用いられる。一般には、ポリビニルアルコールが用いられる。分散安定剤の濃度は、水性媒体に対して０．１〜５質量％が好ましい。
【００２８】
水性媒体は、水のほかに塩類その他の水溶性成分を含んでもよい。塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウムなど一般に用いられるものが挙げられる。使用する塩類により溶解度に違いがあるため、濃度は一概に規定できないが、例えば塩化ナトリウムでは０．１〜１５質量％、塩化カルシウムでは１〜４０質量％溶解して使用することが好ましい。
【００２９】
油滴状態での重合反応は窒素ガス置換後、通常、撹拌下で４０〜１００℃に加熱し、大気圧下で５〜１６時間反応を行う。このときそれぞれの油滴に含まれる単量体は、希釈剤を含んだ状態で重合し、網状に重合体が成長するため、あとで希釈剤を除去することにより多孔質粒子が得られる。反応後、多孔質粒子はろ過等によって水性媒体から容易に分離することができる。さらに、アセトン、メタノールのような溶媒で洗浄し、希釈剤の除去を行う。乾燥後、得られたグリシジル基を有する多孔質粒子は、篩や風力分級装置によって分級される。
【００３０】
粒子の平均粒径は、体積換算平均粒子径で表される。体積換算平均粒子径とは、画像解析式粒度分布測定装置によって得られた値である。粒子の体積平均粒子径に画像解析式粒度分布測定装置を用いる場合、２０００個以上の架橋重合体粒子を画像解析式粒度分布測定装置で撮像して得られた二次元の粒子像（静止画像が好ましい）から各粒子の円相当径（粒子像の投影面積と同じ面積を持つ円の直径）を得て、その円相当径から各粒子の体積を算出して、体積を基準に平均化した粒子径である。このとき、各粒子は、上記の円相当径と同一の直径を有する球体とみなす。画像解析式粒度分布測定装置としては、例えば、フロー式粒子像分析装置（商品名：ＦＰＩＡ−３０００、シスメックス株式会社製）を用いることができる。
好ましい多孔質粒子の平均粒径は、８〜１５μｍであり、より好ましくは１０〜１３μｍである。
【００３１】
［第２の工程］
＜グリシジル基を有する多孔質粒子と糖アルコールとの反応＞
このようにして得られたグリシジル基を有する多孔質粒子に対し、親水化及び架橋処理を目的として、アルカリ金属水酸化物を含んだ水溶液の存在下、糖アルコールを反応させる。糖アルコールは、主に１級水酸基の部分で、多孔質粒子の表面の部分構造に存在するグリシジル基と反応し、エーテル結合により多孔質粒子に結合し、多孔質粒子表面に親水性を付与する。結合した糖アルコール由来の構造には他末端に１級水酸基が存在する。この１級水酸基の近くに、反応可能な別のグリシジル基がある場合には、さらに、反応が起こり、架橋が起こる。こうした糖アルコールとの反応によって、多孔質粒子の機械的強度が大きくなる。また、多孔質粒子の化学安定性が向上し、後に残存するグリシジル基を開環する際に単量体を構成するエステル基やアミド基等の加水分解が進行しにくくなり、充填剤においてイオン性官能基が発生することを抑制し、充填剤を非イオン性に保つことが出来る。このように糖アルコールとの反応によりこれまでは不十分であった機械強度の向上と粒子特性の改善を同時に行うことが出来る。
【００３２】
糖アルコールとの反応の結果、多孔質粒子表面に形成される構造を、化学式であらわすと、式（Ｉ）のように表現できる。Ｒ1が示す多孔質粒子の部分構造としては、多孔質表面のグリシジル基に由来する、●−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−等である。但し「●」は多孔質粒子体を意味する。式（Ｉ）のＲ2が多孔質粒子の部分構造である時は、同様の部分構造が例示できる。この場合は、糖アルコールが２か所で多孔質粒子と結合していることを意味する。
【化３】
2018155241.tif 000005
（但し、Ｒ1は多孔質粒子の部分構造、Ｒ2は、水素原子または多孔質粒子の部分構造を意味し、ｎは１〜５の整数を意味する。）
【００３３】
多孔質粒子と糖アルコールとの反応は、イオン交換水にて湿潤状態の前記多孔質粒子（水湿潤ゲルと呼ぶことがある。）と糖アルコールとを水溶媒中に共存させたところに、アルカリ金属水酸化物を添加し、加熱撹拌することにより行うことができる。水湿潤ゲルは乾燥させた際の多孔質粒子質量に対して１倍から３倍質量の水を含む。その重量は、乾燥時のゲルのおよそ２．６倍と換算できる。
【００３４】
糖アルコールとしては種々の公知のものを特に制限なく使用できる。例えば、グリセリンのようなトリトール類；エリトリトール、トレイトールのようなテトリトール類；アラビニトール、キシリトールのようなペンチトール類；ソルビトール、マンニトールのようなヘキシトール類；ボレミトール、ペルセイトールのようなヘプチトール類などが挙げられる。この内、キシリトール、ソルビトールが好ましく、ソルビトールが最も好ましい。糖アルコールは単独で使用することも、２種以上のものを組み合わせて使用することもできる。この内、炭素数が６個〜７個である糖アルコールが好ましく、ソルビトールが最も好ましい。即ち式（Ｉ）においてｎ＝４〜５が好ましく、ｎ＝４がさらに好ましい。
【００３５】
糖アルコールの使用量としては、多孔質粒子１００質量部に対して２００質量部から３０００質量部とすることが好ましい。糖アルコールが２００質量部未満では、導入量が少なく親水性が不十分となる傾向があり、また糖アルコールが３０００質量部を超えると、溶解に必要な溶媒量が増えることがある。
【００３６】
アルカリ金属水酸化物としては、種々の公知のものを特に制限なく使用できるが、一例として、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物を例示することができる。その使用量としては、多孔質粒子１００質量部に対して０．２質量部から６０質量部であることが好ましく、２質量部から３０質量部とすることが特に好ましい。アルカリ金属水酸化物が０．２質量部以上であれば、親水性が十分付与され、またアルカリ金属水酸化物が６０質量部以下であれば、多孔質粒子のエステル基やアミド基が加水分解され、イオン性の官能基が生成する不都合を防ぐことができる。アルカリ金属水酸化物は単独で使用することも、２種以上のものを組み合わせて使用することもできる。得られた粒子は水で洗浄することにより、余分な糖アルコール、アルカリ金属水酸化物が取り除かれる。
【００３７】
［第３の工程］
＜残存するグリシジル基の開環＞
糖アルコールを反応させた多孔質粒子中には未反応のグリシジル基が残存している。グリシジル基が残存すると多孔質粒子の疎水性が上がり、例えばタンパク質のような疎水性の高い水溶性化合物を疎水的吸着する懸念がある。そのため親水性をより高めるために残存するグリシジル基を鉱酸で開環することが望ましい。
【００３８】
グリシジル基が残存していることは、以下の操作により確認できる。即ち、糖アルコールを反応させた多孔質粒子の一部を、臭化カリウムと混合し、圧力をかけペレット化した後にＦＴ−ＩＲ（商品名：Ｎｉｃｏｌｅｔ（登録商標）  ｉＳ１０、サーモサイエンティフィック社製）で測定し、赤外吸収スペクトルにおける９０８ｃｍ-1と８４８ｃｍ-1の吸光度のピーク高さを確認する。これらのピークは、エポキシ構造に起因する吸収である。糖アルコールを反応させた後の多孔質粒子におけるこれらのピーク高さは、反応前の多孔質粒子の時の該当ピークに対し、８０〜９５％のピーク高さであることが多い。実際に、ピーク高さを比較する場合には、ベースラインが平らで計測しやすいため、９０８ｃｍ-1のピークを用いることができる。
グリシジル基の残存率（％）は下記式（１）で計算される。
（グリシジル基の残存率）＝１００×（反応後のピーク高さ）／（糖アルコールとの反応前の多孔質粒子のピーク高さ）      （１）
グリシジル基の開環率（％）は式（２）により得られる。
（グリシジル基の開環率）＝１００−（グリシジル基の残存率）      （２）
【００３９】
この糖アルコールを反応させた多孔質粒子に対し、鉱酸で開環を行い、同様の測定を行うと、反応前の多孔質粒子の時には確認された２つのピークがほとんど消失した。残グリシジル基の鉱酸による開環は前記粒子を水溶媒中に懸濁させたところに鉱酸を添加し、加熱撹拌することにより行うことができる。
【００４０】
鉱酸としては、一例として、硫酸、硝酸、塩酸等を例示することができる。この内、硫酸が特に好ましい。使用される鉱酸の濃度は、０．０１Ｍから１．０Ｍ程度であれば良く、０．１から０．５Ｍ程度とすることが特に好ましい。鉱酸が０．０１Ｍ以上であれば、開環が十分に行われ、また鉱酸が１．０Ｍ以下であれば、糖アルコール反応後の多孔質粒子のエステル基等が加水分解されイオン性の官能基が生成する恐れが無いため好ましい。得られた粒子は水で洗浄することにより、余分な鉱酸が容易に取り除かれる。この処理により、グリシジル基の開環率を９５％以上にすることができる。
【００４１】
疎水性によるタンパク質の吸着が起こらないで、十分な性能を示すためには、重合後に得られた多孔質粒子でＦＴ−ＩＲにおいて観測された吸光度ピークと比べ、充填剤の該当する９０８ｃｍ-1のピーク高さが５％以下になっていることが必要である。（グリシジル基の残存量が５％以下。）即ち、グリシジル基の開環率は、９５％以上であることが必要である。開環率が９５％未満の時は、充填剤の疎水性のため、分離剤としての使用の際に、疎水性タンパク質の充填剤への吸着が観測されることがある。
【００４２】
上記のようにして得られた充填剤は、下記のとおり、低い圧力損失、好適な親水性、低いイオン性、および好適な排除限界分子量を有する。このため、この充填剤を液体クロマトグラフィー用筐体に充填することにより高性能のサイズ排除クロマトグラフィー用カラムを得ることができ、さらにこのサイズ排除クロマトグラフィー用カラムを備えたクロマトグラフィー装置を得ることができる。また、このサイズ排除クロマトグラフィー用カラムを用いることにより、水系溶離液で生体高分子を精度よく分離し、さらに分取することができる、生体高分子の分離方法および分取方法を提供することができる。
＜カラムの圧力損失＞
圧力損失は、充填剤を充填したカラムに溶離液を流した時に、カラム入口にどれだけの圧力が生じるかを示すものである。本発明では、カラムの圧力損失を、体積換算平均粒径が８〜１５μｍの充填剤を、カラムに充填し、水を線流速１００ｃｍ/ｈで流した時の充填剤長３０ｃｍ当たりの圧力損失を持って表現する。具体的な測定法は、後述する参考例１に示した。圧力損失の値が小さいことは、通液による粒子の破損、変形が起こりにくく機械的強度が高いことを意味する。さらに、圧力損失の値が小さいと、より大きな線流速条件下で使用できるので、迅速な分離、分取が期待できる。圧力損失の値は、糖アルコールとの反応工程を取り入れることで著しく低下する。圧力損失は、１．２ＭＰａ以下であることが望ましく、１．０ＭＰａ以下であることがより好ましい。
【００４３】
＜親水性＞
親水性は、後述する参考例２に示す条件で測定された、エチレングリコールと１−ブタノールの溶出容量をもとに、式（３）により求める。
（親水性）＝（１−ブタノールの溶出容量）／（エチレングリコールの溶出容量）  (３)
１−ブタノールはエチレングリコールよりも疎水性が高い。このため、充填剤の親水性が低い場合は充填剤との疎水性相互作用により、１−ブタノールの溶出がエチレングリコールよりも遅れる。親水性の値が１に近づくほど、粒子は親水性であると判断できる。生体分子分離用としては１．０〜１．４の値である事が好ましい。１．５以上であると生体高分子との間に非特異吸着が起こり、回収率が低下する懸念がある。残存するグリシジル基の開環の工程の効果により、親水性が好ましい充填剤が得られるようになる。
【００４４】
＜イオン性＞
充填剤がイオン性を有すると、生体高分子の分離、分取において、電荷を持つ生体高分子と充填剤との間に、イオン的相互作用が働き、サイズ排除クロマトグラフィーの利点の一つである分子の大きさの順に分離することが出来なくなるといった問題がある。このため、充填剤はイオン性ができるだけ低いことが好ましい。イオン性に関しては、イオン性を測定して評価する。イオン性は、式（４）によって求められる。リゾチームやミオグロビンの溶出容量は、後述する参考例３に示す方法によって求めることができる。
（イオン性）＝（リゾチームの溶出容量）／（ミオグロビンの溶出容量）  （４）
充填剤にイオン性が有る場合、塩基性のリゾチームは充填剤と相互作用する。このため、同程度の分子サイズである中性タンパク質のミオグロビンの溶出時間と比較した場合に、差が生じる。値が１に近づくほど、粒子は非イオン性であると判断できる。
非イオン性の数値は０．８〜１．２であることが好ましい。糖アルコールの反応を行わず、グリシジル基の開環反応のみを行った充填剤では、この値が大きくなってしまうため、不都合が生じる。
【００４５】
＜排除限界分子量＞
排除限界分子量は、後述する参考例４に従って測定される。巨大なタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーで分離するためには排除限界分子量が１００万以上であることが好ましい。例えば分子量約９０万のＩｇＭと分子量約１５万のＩｇＧといった巨大なタンパク質を分離する際、排除限界が１００万以下であるとＩｇＭが排除限界領域に入ってしまい分離が不可能となる。
【００４６】
＜ＩｇＭとＩｇＧの分離度＞
ＩｇＭとＩｇＧの分離の様子は、後述する実施例1に記載の方法で確認できる。測定結果から、ＩｇＭとＩｇＧの分離度が計算される。分離度は、式（５）で計算される。
分離度＝１．１８×［（Ｔ2−Ｔ1）／（Ｗ2＋Ｗ1）］        （５）
（Ｔ1はＩｇＭの溶出時間、Ｔ2はＩｇＧの溶出時間、Ｗ1はＩｇＭのピークの半値幅（ピーク高さ１／２の部分でのピーク幅）、Ｗ2はＩｇＧのピーク半値幅を表す。）
分離度は完全分離とされる１．５以上が好ましい。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例により本発明の効果をより明らかなものとする。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施することができる。【００４８】
（参考例１  圧力損失測定条件）
水に分散した湿潤状態の充填剤を、８ｍｍ内径×３００ｍｍ長のステンレスカラムに平衡スラリー法で満充填した。ポンプを接続したラインに圧力計と上記、充填剤を充填したカラム入り口を直列に接続した。カラムの出口は解放あるいは、圧力損失が無視できる様な内径の大きな配管を接続した。ポンプにより、イオン交換水を０．８５ｍＬ／ｍｉｎで流した。このとき溶離液に相当する水の線速度は、１００ｃｍ／ｈｒとなった。送液を開始して５分後圧力が安定したことを確認して圧力を読み取り、その圧力をカラムの圧力損失とした。【００４９】
（参考例２  親水性測定条件）
参考例１と同様に充填したカラムを高速液体クロマトグラフに接続し、イオン交換水を移動相として１．０ｍＬ毎分の流速で流し、イオン交換水を溶媒として作製したエチレングリコール（５ｍｇ／ｍＬ）、１−ブタノール（５ｍｇ／ｍＬ）を含有する試料を１０μＬカラムに注入して測定を行った。示差屈折率検出器（商品名：ＲＩ−２０１Ｈ、昭和電工社製）を用いて得られたクロマトグラムから各成分の溶出時間を測定し、溶出容量を求め、溶出容量比、（１−ブタノールの溶出容量）／（エチレングリコールの溶出容量）を求め、その値を、親水性を示す指標とした。【００５０】
（参考例３  イオン性測定条件）
参考例１と同様に充填したカラムを高速液体クロマトグラフに接続し、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）＋０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液を移動相として１．０ｍＬ毎分の流速で流し、リゾチーム（型番Ｌ６８７６  シグマアルドリッチ社製）１ｍｇ／ｍＬを含む試料１０μＬ、ミオグロビン（型番Ｍ０６３０  シグマアルドリッチ社製）５ｍｇ／ｍＬを含む試料１０μＬを、各々カラムに注入した。（リゾチームとミオグロビンの試料作製には、移動相を溶媒として用いた。）波長２８０ｎｍの紫外吸光光度検出器（商品名：ＳＰＤ−２０Ａ、島津製作所製）を用いて得られたクロマトグラムから各成分の溶出時間を測定し、溶出容量を求め、溶出容量比、（リゾチームの溶出容量）／（ミオグロビンの溶出容量）を求め、その値を、イオン性を示す指標とした。【００５１】
（参考例４  プルランによる排除限界分子量の測定）
参考例１と同様に充填したカラムを高速液体クロマトグラフに接続し、イオン交換水を移動相として１．０ｍＬ毎分の流速で、種々の分子量の標準物質をカラムに注入し、その溶出容量を用いて、一般に知られた方法により、排除限界分子量を求めた。検出には示差屈折率検出器（商品名：ＲＩ−２０１Ｈ、昭和電工社製）を使用し、標準物質にはプルランスタンダード（商品名：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標） ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２、昭和電工社製）を使用した。【００５２】
［実施例１］
＜グリシジル基を有する多孔質粒子の合成（第１の工程）＞
グリシジルメタクリレート（商品名：ブレンマーＧ（登録商標）  日本油脂製）  ２７．７ｇ、グリセリン−１，３−ジメタクリレート（商品名：ＮＫエステル７０１、新中村化学工業）  １１．４ｇおよびクロロベンゼン  ６１.９ｇに２，２’−アゾビス(イソ酪酸メチル)を加え、撹拌溶解して有機相を準備した。グリシジルメタクリレートの使用量は、単量体総量に対し８０モル％、グリセリン−１，３−ジメタクリレートの使用量は単量体総量に対し２０モル％、希釈剤の使用量は、単量体総量１００質量部に対して１５８質量部であった。イオン交換水５００ｇ、ポリビニルアルコール１５ｇ、塩化ナトリウム１５ｇを撹拌溶解して水性媒体を準備した。この水性媒体中に前記有機相を加え、エクセルオートホモジナイザー（株式会社 日本精機製作所製）を用い５分間、１８００ｒｐｍで高速撹拌して油滴を１〜５０μｍに調整した後、１Ｌセパラブルフラスコに移し、水浴中で窒素ガス雰囲気下１００ｒｐｍにて撹拌しながら６０℃へ昇温して１５時間反応を行った。冷却後、生成した共重合体粒子をろ別した後、イオン交換水１Ｌ、更にアセトン１Ｌ、再度イオン交換水１Ｌで洗浄した。得られた多孔質粒子を篩にて１０〜１５μｍに分級し、４０．５ｇのグリシジル基を有する多孔質粒子を得た。【００５３】
＜グリシジル基を有する多孔質粒子と糖アルコールとの反応（第２の工程）＞
上記多孔質粒子３９．１ｇ（１００質量部）をイオン交換水１Ｌ中に分散し、ろ別することにより、多孔質粒子を水で湿潤状態にした。湿潤状態の多孔性粒子は、１０２．７ｇであった。（６３．６ｇのイオン交換水を含む。）イオン交換水１５０ｍＬ、ソルビトールとして、Ｄ−ソルビトール（関東化学社製）２５０ｇ（６４０質量部）および前記湿潤状態の多孔性粒子を１Ｌセパラブルフラスコに移し、撹拌分散した。その後、水酸化カリウム２．５ｇ（６．４質量部）を加え２００ｒｐｍにて撹拌しながら６０℃へ昇温して１５時間反応を行った。冷却後、多孔質粒子をろ別した後、イオン交換水１Ｌで洗浄した。乾燥後、糖アルコール反応後の多孔質粒子３９．８ｇを得た。【００５４】
＜残存するグリシジル基の開環反応（第３の工程）＞
上記糖アルコールを反応させた多孔質粒子３８．４ｇをイオン交換水１Ｌ中に分散し、ろ別することにより、水に湿潤状態の多孔質粒子を得た。イオン交換水７００ｍＬ、４７質量％硫酸２４．７ｇを１Ｌセパラブルフラスコに移し０．１５Ｍ硫酸水溶液を調製した。上記、水に湿潤状態の多孔質粒子約１００ｇを、前記硫酸水溶液に加え２００ｒｐｍにて撹拌しながら６０℃へ昇温して２時間反応を行った。冷却後、多孔質粒子をろ別した後、イオン交換水１Ｌで洗浄した。乾燥後、充填剤として、４０．５ｇを得た。【００５５】
得られた充填剤を参考例１から４に従い測定した結果、圧力損失は０．６ＭＰａ、親水性は１．２、イオン性は１．１、排除限界分子量は１１０万であった。また、ＦＴ−ＩＲによる９０８ｃｍ-1の吸光度ピークは観測されなかった。前記［第３の工程］の項で示したグリシジル基の開環率の求め方に従って算出されたグリシジル基の開環率は１００％であった。【００５６】
上記充填剤を、８ｍｍ内径×３００ｍｍ長のステンレスカラムに平衡スラリー法で充填した。カラムを高速液体クロマトグラフに接続し、生体高分子の分離を評価した。０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）＋０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液を移動相として１．０ｍＬ毎分の流速で流し、移動相を溶媒として作製した、１ｍｇ／ｍＬのＩｇＭ（型番Ｉ８１３５  シグマアルドリッチ社製）と１ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ（社製 型番Ｉ４５０６  シグマアルドリッチ社製）を含む試料１０μＬを注入して測定を行った。波長２８０ｎｍの紫外吸光光度検出器（商品名：ＳＰＤ−２０Ａ、島津製作所製）を用いて得られたクロマトグラムを図１に示す。前述の方法によりＩｇＭとＩｇＧの分離度を計算すると１．６５であり良好な分離を示した。【００５７】
［実施例２〜１０］
実施例１に記述の充填剤を作製する過程において、表１に示した通りに、水酸化カリウムの使用量、硫酸の濃度、グリシジルメタクリレートの使用量とグリセリン−１，３−ジメタクリレートの使用量、希釈剤の量、糖アルコールの種類を変更した以外は、実施例と同様にしてそれぞれ充填剤を得た。評価結果を表１に示す。（実施例１０のキシリトールは、和光純薬社製のものを用いた。）【００５８】
［比較例１］
糖アルコールの反応を省略した以外は実施例１と同様に実施し、充填剤を得た。評価結果を表１に示す。糖アルコールの反応を行わないと、圧力損失が高く、イオン性が大きく、好ましくない充填剤が得られた。【００５９】
［比較例２］
グリシジル基の開環反応を省略した以外は、実施例１と同様に反応を行い、充填剤を得た。評価結果を表１に示す。鉱酸による開環反応を行わないと、親水性の値が好ましくない充填剤が得られた。【００６０】
［比較例３］
実施例１と同様の方法で重合して得た多孔質粒子について、糖アルコールの反応、グリシジル基の開環反応を行わず、充填剤とした。評価の結果を表１に示す。
イオン性については測定に用いるリゾチーム及びミオグロビンが非特異吸着のため溶出せず、測定が出来なかった。親水性も好ましくない充填剤が得られた。【００６１】
［比較例４］
市販品であるＳｈｏｄｅｘ（登録商標）  ＯＨｐａｋ（登録商標）  ＳＢ−８０４ＨＱ（昭和電工株式会社製、粒径カタログ値１０μｍ）に関して、評価を行った。結果を表１に示す。
圧力損失の値は分析用途では何ら問題の無いレベルであるが、実施例１〜１０の充填剤の方が、圧力損失がより低く、分取目的には優れていることがわかる。【００６２】
表１では、グリセリン−１，３−ジメタクリレートをＧＤＭ、グリシジルメタクリレートをＧＭＡとして表した。希釈剤の使用量は、単量体総量１００質量部に対する希釈剤の質量部を示す。水酸化カリウムの使用量は、多孔質粒子１００質量部に対する質量部を表す。【００６３】
生体高分子精製の際には本測定方法において、圧力損失１．２ＭＰａ以下、親水性１．０から１．４以下、イオン性０．８から１．２、排除限界分子量１００万以上が好ましいが、実施例１から１０においては全ての項目を満たした。【００６４】
【表１】
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【図１】
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【国際調査報告】
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