(57)【要約】  本発明は、以下の一般式（Ｉ）で示す層状複水酸化物を用いて、標的蛋白質を精製する方法に関する。  一般式（Ｉ）：[M2+1-xM3+x(OH)2][An-x/n・mH2O]（上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。 ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]）で示され、ｘは0.1〜0.9であり、ｎは1〜3であり、ｍは0〜100である。）【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）で示す層状複水酸化物を用いて、標的蛋白質を精製する方法：
一般式（Ｉ）：[M2+1-xM3+x(OH)2][An-x/n・mH2O]
（上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。 ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]）で示され、ｘは0.1〜0.9であり、ｎは1〜3であり、ｍは0〜100である。）
【請求項２】
以下の工程を含む、請求項１に記載の標的蛋白質を精製する方法：
１）標的蛋白質と不純物とを含む溶液と、層状複水酸化物とを接触させる工程；
２）層状複水酸化物と溶液とを分離する工程。
【請求項３】
一般式（Ｉ）において、An-がPO43-, CO32-, OH-, F-, Cl-, Br-, NO3-及び核酸からなる群より選択される少なくとも１種以上である、請求項１又は２に記載の標的蛋白質を精製する方法。
【請求項４】
一般式（Ｉ）において、M2+がMg2+, Fe2+, Zn2+, Ca2+, Li2+, Ni2+, Co2+及び Cu2+からなる群より選択される少なくとも１種以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
【請求項５】
一般式（Ｉ）において、M3+がAl3+, Fe3+, Mn3+及びCr3+からなる群より選択されるいずれか１種以上である、請求項１〜４のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
【請求項６】
一般式（Ｉ）において、An-がPO43-である、請求項１〜５のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
【請求項７】
標的蛋白質が、抗原又は抗体を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
【請求項８】
標的蛋白質が、肺炎球菌ワクチン、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチン、ジフテリアワクチン、百日咳ワクチン、破傷風ワクチン、ｂ型インフルエンザ菌ワクチン、及びＢ型肝炎ワクチンから選択される少なくとも１種以上のワクチンに含まれる成分を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
【請求項９】
以下の工程を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法：
１）標的蛋白質と不純物とを含む溶液と層状複水酸化物とを接触させ、層状複水酸化物に蛋白質を吸着させる工程；
２）層状複水酸化物と溶液とを分離する工程；
３）標的蛋白質を回収する工程。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法を用いて、ワクチンを製造する方法。
【請求項１１】
以下の一般式（Ｉ）で示す層状複水酸化物を表面に担持した、標的蛋白質精製用担体：
一般式（Ｉ）：[M2+1-xM3+x(OH)2][An-x/n・mH2O]
（上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。 ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]））で示され、ｘは0.1〜0.9であり、ｎは1〜3であり、ｍは0〜100である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、層状複水酸化物（Layered Double Hydroxide：以下LDH）を用いて多様な蛋白質が混在する溶液の中から目的の蛋白質（標的蛋白質）を精製する方法に関し、さらに当該精製方法を用いたワクチンの製造方法に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願２０１６−５６７８０号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
蛋白質は、アミノ酸から構成されるポリペプチドを主体とする高分子化合物であり、多種多様な種類・機能がある。蛋白質は生命科学における重要な研究対象となるだけでなく、医療分野を含む様々な分野において応用されている。【０００４】
蛋白質は人工的に大量生産され、医薬として生体に投与されて利用されている。蛋白質医薬としては例えば、糖尿病治療薬のインスリン、貧血治療薬のエリスロポエチン、ウイルス性肝炎の治療薬のインターフェロン類などが挙げられる。さらに、ヒトの免疫機能を利用した抗体医薬として、リツキシマブやトラスツズマブ等の抗癌剤が、がん治療に用いられている。また、蛋白質は生体内で免疫惹起機能を有する抗原としても機能することから、ワクチンとして利用される。ワクチン接種は、細菌やウイルス等の病原体の感染により引き起こされる感染症予防のための最も重要な手段である。ワクチンの製造においては、蛋白質などの抗原を安定的かつ大量に製造することが必要とされている。【０００５】
蛋白質を大量に生産した後、ワクチン等の医薬を製造するためには、標的蛋白質を精製して回収する必要がある。従来、蛋白質を精製するには、固定の電荷を持った粒子体、例えばDEAEなどの陰イオン交換カラム、リン酸アルミニウムもしくはリン酸カルシウム等が用いられていた。リン酸カルシウムの結晶の一つであるハイドロキシアパタイトを充填剤とする液体クロマトグラフィーも蛋白質の精製に用いられている。しかし標的蛋白質のみを精製するには、多数の精製工程が必要であり、複雑かつ煩雑であるという問題があった。
標的蛋白質を選択的に精製する方法として、アフィニティー精製が知られている。アフィニティー精製とは、抗体等の目的物質に対して特異的に吸着し得る蛋白質を担体に結合させて、目的物質を精製する方法である。しかし、アフィニティー精製には、抗体以外への適用が困難であるという問題があり、また蛋白質を結合させた担体は非常に高価である。【０００６】
LDHは、陰イオン交換能を有する無機の骨格（金属水酸化物層）を持った層状化合物である。
LDHは独立行政法人産業技術総合研究所ホームページ（https://unit.aist.go.jp/emtech-ri/ci/e-keyword/LDH/ldh.html）において、構造等も含め、詳細に説明されている。LDHは天然での産出は多くはないが、合成が比較的簡単なことから、合成物を用いて多くの研究・検討がなされており、制酸剤として胃腸薬に使用されたり、塩化ビニールの安定剤として使用されている。特許文献１には、LDH粒子群およびその製造方法、LDH分散液、並びにLDH添加樹脂が開示されている。特許文献２には、LDHに水中の微生物を吸着させ、水から微生物を除去して浄化する方法が開示されている。【０００７】
LDHは陰イオン交換能を有することから、陰イオン回収・除去を目的として検討がなされている。非特許文献１にはLDHによりクロム酸塩を吸着できることが開示されている。特許文献３には、低分子化合物である色素を、ハイドロタルサイトを含む層状無機化合物により吸着させることが開示されている。非特許文献２には、合成ハイドロタルサイトにより、ヘモグロビンやヒト血清アルブミンを吸着可能であること、pH10の炭酸バッファーにより吸着した蛋白質を溶出できることが開示されている。しかし、LDHが多様な蛋白質が混在する溶液の中から、標的蛋白質を選択的に精製できることは、知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Lazaridis NK, Matis KA, Webb M.,  Chemosphere. 2001 Feb;42(4):373-8.
【非特許文献２】Ralla K, Sohling U, Suck K, Sander F, Kasper C, Ruf F, Scheper T.,  Colloids Surf B Biointerfaces. 2011 Oct 15;87(2):217-25. doi: 10.1016/j.colsurfb.2011.05.021. Epub 2011 May 19.
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１３−１１２５６０号公報
【特許文献２】国際公報ＷＯ２００２／０７６５７７号
【特許文献３】特許第３４４６７９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、効率良くかつ簡便に標的蛋白質を精製する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、LDHの持つ陽イオンの含量比率が変化すると蛋白質吸着能に差が出ることを発見し、LDHに蛋白質を選択的に吸着させることで、標的蛋白質の精製に利用できることを見出し、本発明を完成した。【００１２】
本発明は、すなわち以下よりなる。
１．以下の一般式（Ｉ）で示すLDHを用いて、標的蛋白質を精製する方法：
一般式（Ｉ）：[M2+1-xM3+x(OH)2][An-x/n・mH2O]
（上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。 ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]）で示され、ｘは0.1〜0.9であり、ｎは1〜3であり、ｍは0〜100である。）
２．以下の工程を含む、前項１に記載の標的蛋白質を精製する方法：
１）標的蛋白質と不純物とを含む溶液と、LDHとを接触させる工程；
２）LDHと溶液とを分離する工程。
３．一般式（Ｉ）において、An-がPO43-, CO32-, OH-, F-, Cl-, Br-, NO3-及び核酸からなる群より選択される少なくとも１種以上である、前項１又は２に記載の標的蛋白質を精製する方法。
４．一般式（Ｉ）において、M2+がMg2+, Fe2+, Zn2+, Ca2+, Li2+, Ni2+, Co2+及び Cu2+からなる群より選択される少なくとも１種以上である、前項１〜３のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
５．一般式（Ｉ）において、M3+がAl3+, Fe3+, Mn3+及びCr3+からなる群より選択されるいずれか１種以上である、前項１〜４のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
６．一般式（Ｉ）において、An-がPO43-である、前項１〜５のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
７．標的蛋白質が、抗原又は抗体を含む、前項１〜６のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
８．標的蛋白質が、肺炎球菌ワクチン、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチン、ジフテリアワクチン、百日咳ワクチン、破傷風ワクチン、ｂ型インフルエンザ菌ワクチン、及びＢ型肝炎ワクチンから選択される少なくとも１種以上のワクチンに含まれる成分を含む、前項１〜７のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
９．以下の工程を含む、前項１〜８のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法：
１）標的蛋白質と不純物とを含む溶液とLDHとを接触させ、LDHに蛋白質を吸着させる工程；
２）LDHと溶液とを分離する工程；
３）標的蛋白質を回収する工程。
１０．前項１〜９のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法を用いて、ワクチンを製造する方法。
１１．以下の一般式（Ｉ）で示すLDHを表面に担持した、標的蛋白質精製用担体：
一般式（Ｉ）：[M2+1-xM3+x(OH)2][An-x/n・mH2O]
（上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。 ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]））で示され、ｘは0.1〜0.9であり、ｎは1〜3であり、ｍは0〜100である。）
【発明の効果】
【００１３】
本発明の標的蛋白質の精製方法によれば、標的蛋白質を不純物から選択的に分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】LDH（MAP46）によるPspA融合蛋白質の選択的吸着能を確認した結果を示す写真である。（実施例２）
【図２】LDH（MAP又はCAP）の陽イオンの含量比率によるPspA融合蛋白質の選択的吸着能への影響を確認した結果を示す写真である。（実施例３）
【図３】LDH（MAC又はCAC）の陽イオンの含量比率によるPspA融合蛋白質の選択的吸着能への影響を確認した結果を示す写真である。（実施例４）
【図４】LDH（MAP）によるPspA単抗原の選択的吸着能を確認した結果を示す写真である。（実施例５）
【図５】LDH（MAP、CAP、MAC、又はCAC）によるマイコプラズマ由来P30蛋白質の選択的吸着能を確認した結果を示す写真である。（実施例８）
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、下記一般式（Ｉ）に示すLDHを用いた標的蛋白質の精製方法に関する。
一般式（Ｉ）：[M2+1-xM3+x(OH)2][An-x/n・mH2O]
（上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]）で示され、ｘは0.1〜0.9であり、ｎは1〜3である。ｍは0〜100であり、好ましくはｍは1〜100である。）
【００１６】
本明細書において一般式（Ｉ）で示すｘは、上述の如く0.1〜0.9である。LDHは一般的に、ｘが0.2〜0.33の範囲とされている。しかし本発明者は、驚くべきことに、LDHを蛋白質の精製に使用する場合には、一般的なLDHのｘの範囲より広範な、ｘが0.1〜0.9の範囲が好ましいことを見出した。なお、[M2+]はM2+のモル数又はモル濃度、[M3+]はM3+のモル数又はモル濃度を表す。
【００１７】
本明細書において一般式（Ｉ）で示されるLDHとは、２価の金属水酸化物に３価の金属イオンが固溶した複水酸化物であり、金属水酸化物層（ホスト層）が正電荷を持つため、ホスト層とホスト層の間（層間）に負に帯電するゲスト物質を挟んだ積層構造の化合物をいう。一般式前半部 [M2+1-xM3+x(OH)2]がホスト層で、ｘは正に帯電している。この正電荷を補償して、これら層間にゲスト物質である陰イオンと水分子が存在している。LDHには、３価金属の一部を４価金属で置き換えた組成や、１価〜３価の組み合わせである [Li1/3Al2/3(OH)2][An-1/(3 × n)・mH2O] などもある。ホスト層中の金属は３種以上の多元系の構成も可能である。「ホスト−ゲスト反応」により、ホスト層を保持したまま、層間に原子・分子・イオン等のゲスト物質を取り込むことを「インターカレーション」という。
【００１８】
本明細書において、一般式（Ｉ）に示すM2+は、Mg2+，Fe2+，Zn2+，Ca2+，Li2+，Ni2+，Co2+及び Cu2+からなる群より選択することができ、好ましくはMg2+，Fe2+，Zn2+，及びCa2+からなる群より選択することができ、さらに好ましくはMg2+又はCa2+、より好ましくはMg2+である。M2+は、上記より選択されるいずれか１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００１９】
本明細書において、一般式（Ｉ）に示すM3+は、Al3+，Fe3+，Mn3+及びCr3+からなる群より選択することができ、好ましくはAl3+又はFe3+、より好ましくはAl3+である。M3+は、上記より選択されるいずれか１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２０】
本明細書において、一般式（Ｉ）に示すAn-は、層間に取り込まれたゲスト物質である。層間にはゲスト物質として陰イオンや負電荷を持たない有機分子等をインターカレーションすることができる。ゲスト物質としては陰イオンが含まれていればよく、陰イオンの種類は特に限定されない。An-は、例えばPO43-, CO32-, OH-, F-, Cl-, Br-, NO3- 及び核酸からなる群より選択することができる。核酸の例としてはDNAやRNAを挙げることができ、より具体的にはpoly I:C（TLR3リガンド）、DNAの非メチル化CpGのオリゴヌクレオチド（CpG ODN）などが挙げられる。一般式（Ｉ）に示すAn-は、好ましくはPO43-，CO32-及びOH-からなる群より選択することができ、より好ましくはPO43-又はCO32-、最も好ましくはPO43-である。An-は上記より選択されるいずれか１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。同じ層間に存在することもあれば、規則的に別の層間に存在する場合もある。
【００２１】
一般式（Ｉ）に示すLDHの吸着能は、標的蛋白質の種類に応じて、M2+、M3+、An-の種類や比率を適宜変更することにより調節できる。例えばAn-がPO43-の場合は、ｘが0.1〜0.9、好ましくは0.3〜0.9、より好ましくは0.5〜0.7であるときに、標的蛋白質をより選択的に精製することができる。An-がCO32-の場合には、ｘが0.1〜0.9、好ましくは0.1〜0.7、より好ましくは0.1〜0.3であるときに、標的蛋白質をより選択的に精製することができる。また不純物をLDHに吸着させる場合は、An-がPO43-の場合、ｘが0.1〜0.9、好ましくは0.6〜0.9であるLDHを用いることができ、An-がCO32-の場合、ｘが0.1〜0.9、好ましくは0.6〜0.9、より好ましくは0.6〜0.7であるLDHを用いることができる。
【００２２】
本明細書におけるLDHは、標的蛋白質の種類に応じて、一般式（Ｉ）においてM2+がMg2+又はCa2+であり、M3+がAl3+であり、かつAn-がPO43-又はCO32-であることが好ましく、さらにM2+がMg2+又はCa2+であり、M3+がAl3+であり、An-がPO43-であることがより好ましい。M2+とM3+の比率は、LDHに吸着させる蛋白質の種類に応じて適宜変更することができる。
【００２３】
本明細書における標的蛋白質を精製する方法は、以下の工程１）及び工程２）を含むものである。
１）標的蛋白質と不純物とを含む溶液と、LDHとを接触させる工程。
２）LDHと溶液とを分離する工程。
【００２４】
標的蛋白質とは、精製の対象となる蛋白質である。蛋白質とは、アミノ酸からなるポリペプチドを主体とする高分子化合物である。本明細書における蛋白質には、アミノ酸のみからなる蛋白質に加えて、他の物質、例えば、核酸、リン酸、脂質、糖、金属等を結合した蛋白質も含まれる。本明細書における標的蛋白質は、溶液中においてマイナス電荷を有するものであり、標的蛋白質の分子量は特に限定されない。標的蛋白質は、天然に存在するものであっても、遺伝子組み換えにより作製された組換え蛋白質であってもよい。標的蛋白質は抗原、抗体、酵素、色素、膜構成成分、輸送蛋白、構造蛋白、運動蛋白、結合蛋白、受容体など、いかなる機能を持つものであってもよい。本明細書における標的蛋白質は、医薬に配合する成分であることが好ましく、抗原、抗体等がより好ましく、抗原であることが特に好ましい。
【００２５】
工程１）では、標的蛋白質と不純物とを含む溶液を、LDHと接触させる。不純物とは、標的蛋白質以外の夾雑物を意味する。不純物には、標的蛋白質以外の蛋白質が含まれる。本発明の精製方法によれば、多種の蛋白質の中から標的蛋白質を選択的に精製することができる。不純物である蛋白質としては、微生物、植物、もしくは動物由来のもの、宿主細胞由来のもの、又は溶液に溶存しているものが挙げられる。本発明の精製方法によれば、不純物の一部又は全部を除去することができる。本発明の精製方法は選択性を有することから、全蛋白質中の標的蛋白質を90〜95%程度の純度にまで精製することができる。
【００２６】
工程１）では、標的蛋白質か不純物のいずれかをLDHに吸着させ、工程２）においてLDHと溶液とを分離する。工程２）により標的蛋白質を不純物から分離し精製することができる。標的蛋白質をLDHに吸着させた場合は、工程２）の後に、LDHから標的蛋白質を溶出して回収すればよい。あるいは、不純物をLDHに吸着させた場合は、LDHを除去して、溶液を回収すればよい。
【００２７】
LDHから標的蛋白質を溶出する手段は、特に限定されず、自体公知の手段又は今後開発される手段を用いることができる。例えば、pH6.0〜8.0の緩衝液をLDHに接触させることにより、標的蛋白質を溶出させることができる。pH6.0〜8.0の緩衝液としては、クエン酸緩衝液、高塩濃度溶液、又は多価カルボン酸を有する有機物を含む溶液が例示される。多価カルボン酸を有する有機物としては、EDTAが例示される。本発明においては、生体に悪影響を及ぼさない物質を用いてLDHから標的蛋白質を溶出することができるため、有利である。
【００２８】
標的蛋白質の精製では、本明細書の精製方法の工程１）及び工程２）の前後に、他の精製工程や処理工程が含まれていてもよい。工程１）及び工程２）以外の他の精製工程や処理工程としては、フィルターろ過、限外ろ過、限外濃縮、遠心分離、密度勾配遠心分離、カラムクロマトグラフィ、メンブレンクロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、又は薬品添加による分離等が例示される。
【００２９】
ワクチンは、抗原を精製することでワクチン原液を作製し、これを製剤化することにより製造される。抗原は、投与されることにより生体に免疫応答を誘導し得るものであり、ワクチンの有効成分となるものである。なお本明細書において、一般的に抗原という場合は、ワクチンも包含される意味で使用される場合がある。本明細書の精製方法は、一般的なワクチンの製造における抗原精製過程に適用することにより、精製工程を簡略化し、短時間での抗原の精製を可能とする。
【００３０】
ワクチンに含まれる抗原は、例えば細菌由来、ウイルス由来、真菌由来、原生動物由来、寄生虫由来（例えば、マイコプラズマ由来等）、又は感染性因子由来（例えば、プリオン由来等）の蛋白質のいずれであってもよい。本明細書における抗原は、自体公知のワクチンに含まれる有効成分又は今後開発されるワクチンに含まれる有効成分のいずれであってもよく、特に限定されない。例えば、生ワクチン、不活化ワクチン又は成分ワクチンのいずれに含まれる有効成分であってもよい。ワクチンとしては、例えば日本脳炎ワクチン、ジフテリアワクチン、百日咳ワクチン、破傷風ワクチン、ｂ型インフルエンザ菌ワクチン、肺炎球菌ワクチン、インフルエンザワクチン及びＢ型肝炎ワクチンから選択されるいずれか１種のワクチン、あるいは２種以上のワクチンの組み合わせからなるワクチンであってもよい。
【００３１】
標的蛋白質と不純物とを含む溶液とは、例えばワクチン原液を作製するための原料となる溶液である。ワクチンの製造では、ふ化鶏卵培養法や、動物接種法、細胞培養法、菌体培養法、又は遺伝子組み換えにより標的蛋白質を発現させる方法等により、抗原を増殖させる。ふ化鶏卵培養法では、ふ化鶏卵のしょう尿膜腔液に抗原が含まれ、細胞培養法では、細胞の培養溶液や細胞内に抗原が含まれており、抗原を含む細胞破砕液が調製される。このように、抗原を増殖させる過程ではいずれも、抗原以外に不純物を含むことから、抗原を不純物から分離してワクチン原液を調製する必要がある。標的蛋白質と不純物とを含む溶液は、しょう尿膜腔液や細胞培養溶液、細胞や菌体の細胞破砕液そのままであってもよいし、遠心分離や他のクロマトグラフィー等を用いた精製工程により、不純物の一部が除去された粗抗原溶液であってもよい。本明細書における精製方法により得られた標的蛋白質を含む溶液は、さらに他のクロマトグラフィー等の精製工程に供されてもよい。
【００３２】
ワクチン原液からのワクチン製剤の製造は、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法により製造できる。ワクチン製剤は、抗原のほか、アジュバントや、薬理学的に許容しうる担体、希釈液及び／又は賦形剤等を含めることで、免疫組成物として製剤化することができる。本発明のワクチン製剤は、経口、直腸、鼻、局所（頬および舌下を含む）、経皮、膣または非経口（筋肉内、皮下および静脈内を含む）の投与に適するもの、あるいは吸入またはガス注入による投与に適する形態のものを含むことができる。剤形としては、例えば液剤、懸濁剤、粉末剤などとすることができる。液剤としては、精製水、緩衝液などに溶解したものなどが挙げられる。懸濁剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、カゼインなどと共に精製水、緩衝液などに懸濁させたものなどが挙げられる。粉末剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどとともに混合したものなどが挙げられる。これらのワクチン製剤には、通常使用されている吸収促進剤、界面活性剤、保存剤、安定化剤、防湿剤、保湿剤、溶解剤などを必要に応じて添加することができる。本発明の精製方法で調製されたワクチン製剤は、薬学の技術分野でよく知られている任意の方法により調製することができる。
【００３３】
本発明のワクチン製剤の投与量は、投与対象、投与部位、投与方法及び投与間隔、例えば対象がヒトの場合は、年齢、性別、体重、ならびに医師に公知の他の因子を考慮して適宜設定できる。本発明のワクチン製剤を感染症の予防及び／又は治療のために使用するときの薬学的に有効な量は、医療分野において公知であるこのような考慮すべき事柄によって決定される。投与対象は、ワクチン製剤に含まれる抗原の種類に応じて適宜決定することができる。例えばヒトのほか、ヒト以外の哺乳類、鳥類、甲殻類などに投与することができる。
【００３４】
また、本発明は一般式（Ｉ）で示すLDHを表面に担持した、標的蛋白質精製用担体にも及ぶ。かかる担体は、液体クラマトグラフィに用いることができる。本発明は、一般式（Ｉ）で示すLDHを表面に担持した標的蛋白質精製用担体を含む組成物にも及ぶ。さらに本発明は、標的蛋白質精製用担体又は当該担体を含む組成物を用いた標的蛋白質を精製する方法にも及ぶ。
【実施例】
【００３５】
本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。【００３６】
（実施例１）
本実施例では、下記一般式（Ｉ）に示すLDHを作製した。
一般式（Ｉ）：[M2+1-xM3+x(OH)2][An-x/n・mH2O]
（上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。 ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]）で示される。）
LDHは、特許文献１に開示される方法に従って作製し、アルミニウム含量を確認した。具体的には、0.1mol/L  MgCl2・6H2Oと0.1mol/L  AlCl3・6H2Oを９：１〜１：９の割合で混合し、得られた混合液の総量と等量の0.1mol/L  Na2HPO4・12H2Oを混合した。その後、1/500mol/L  PBSにより遠心して洗浄し、マグネシウム−アルミニウム−リン酸系のLDH（以下MAP）を作製した。0.1mol/L  MgCl2・6H2Oを0.1mol/L  CaCl2・6H2Oに変更した以外は上記と同様の手法により、カルシウム−アルミニウム−リン酸系のLDH（以下CAP）を作製した。また、0.1mol/L  Na2HPO4・12H2Oを0.1mol/L  Na2CO3に変更した以外は同様の手法により、マグネシウム−アルミニウム−炭酸系のLDH（以下MAC）又はカルシウム−アルミニウム−炭酸系のLDH（以下CAC）を作製した。【００３７】
（実施例２）
実施例１で作製したLDHについて標的蛋白質の吸着能を確認した。本実施例では、LDHとしてマグネシウムとアルミニウムのモル比が4:6であるMAP（以下MAP46）を用い、標的蛋白質として国際公開公報WO2014/045621号に記載されている肺炎球菌表面蛋白質Ａ（PspA）の２つのクレードが融合した蛋白質（PspA融合蛋白質）を用いた（図１）。【００３８】
常法に従って、大腸菌にて遺伝子組み換えにより標的蛋白質を発現させ、標的蛋白質を含む大腸菌破砕液を作製した。実施例１で作製したLDH（アルミニウム含量約10mg/mL）と、大腸菌破砕液（全蛋白質含量約1.5mg/mL）とを等量混合し、撹拌後１時間放置した。LDHの代わりに、ハイドロキシアパタイト処理をしたサンプルをコントロールとした。ハイドロキシアパタイト処理は、塩濃度（PBS濃度）及びpHを変えて実験を行い、吸着能の確認を行った。塩濃度及びpHは図１に示す通りである。ハイドロキシアパタイトは、アミノ酸、タンパク質、脂質、糖と高い吸着性を示すことが知られている。このような特性を利用し、ハイドロキシアパタイトは、生体分子等の分離に用いるカラムクロマトグラフィの充填剤や余分な脂質や老廃物を吸着し除去することを目的とした化粧品等に利用されている。
LDHによる処理又はハイドロキシアパタイト処理を行った後、遠心分離した上清をサンプルとして回収した。サンプルについてATTO社製のE-T/R1020L（10〜20%）ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、標的蛋白質の挙動を確認した。ゲルの各レーンには、全蛋白質の質量が等しくなるようにサンプルをアプライした。【００３９】
図１において、四角で囲った分子量のバンドが標的蛋白質に該当する。図１のサンプル番号２〜１０はハイドロキシアパタイト処理を行った後の上清、サンプル番号１１はLDH処理を行った後の上清をアプライした。またサンプル番号１は、各処理を行う前のサンプルをアプライしたものである。いかなる塩濃度、pHであっても、ハイドロキシアパタイトでは、標的蛋白質のバンドとそれ以外の蛋白質のバンドの両方が検出され、標的蛋白質を選択的に吸着することができないことがわかった。一方、LDH処理した場合には、標的蛋白質のバンドがほとんど確認できず、それ以外の蛋白質のバンドが検出されたことから、LDHが標的蛋白質に対する選択的な吸着能を持つことがわかった。【００４０】
（実施例３）
実施例１で作製したLDHについて、金属の組成を変化させた場合の標的蛋白質の吸着能を確認した。本実施例ではLDHとしてMAP又はCAPを用い、標的蛋白質としてPspA融合蛋白質を用いた。【００４１】
実施例２と同様の手法により、標的蛋白質を含む大腸菌破砕液を調製し、MAP又はCAPと大腸菌破砕液を混合することによりLDH処理を行った。MAPのマグネシウムとアルミニウムの含量比率（モル比）、CAPのカルシウムとアルミニウムの含量比率（モル比）は、図２に示す通りである。【００４２】
図２において、矢印で示す分子量のバンドが標的蛋白質に該当する。図２の各レーンには、LDH処理を行った後、遠心分離した上清をサンプルとしてアプライした。なお、サンプル番号１は、LDHの代わりにCa3(PO4)2により処理を行ったものであり、サンプル番号１０は、LDHの代わりにAlPO4により処理を行ったものである。
CAP（サンプル番号２〜５）では、アルミニウム含量比率が上昇するにつれて、不純物のバンドが検出されるようになり、標的蛋白質と不純物とを分離可能となることがわかった。MAP（サンプル番号６〜９）では、アルミニウム含量比率が上昇するにつれて標的蛋白質が吸着すること、不純物である低分子蛋白質は吸着しないことがわかった。MAPの場合は、マグネシウムとアルミニウムの含量比率が５：５〜３：７の場合に、標的蛋白質を選択的に吸着することがわかった。陰イオンがリン酸であるリン酸系のLDHを用いてPspA融合蛋白質を精製できることが示された。【００４３】
（実施例４）
実施例１で作製したLDHについて、金属の組成を変化させた場合の標的蛋白質の吸着能について確認した。本実施例ではLDHとしてMAC又はCACを用い、標的蛋白質としてPspA融合蛋白質を用いた。【００４４】
MAP又はCAPの代わりに、MAC又はCACを用いた以外は、実施例３と同様の手法により実験を行った。MACのマグネシウムとアルミニウムの含量比率、CACのカルシウムとアルミニウムの含量比率（モル比）は、図３に示す通りである。【００４５】
図３において、矢印で示す分子量のバンドが標的蛋白質に該当する。図３の各レーンには、LDH処理を行った後、遠心分離した上清をサンプルとしてアプライした。なお、サンプル番号１の精製前液とは、LDH処理を行う前のサンプルである。サンプル番号２は、LDHの代わりにCaCO3処理を行ったものである。
CAC（サンプル番号３〜７）の場合は、カルシウムとアルミニウムの含量比率が７：３の場合に標的蛋白質を選択的に吸着することがわかった。MAC（サンプル番号８〜１２）の場合は、マグネシウムとアルミニウムの含量比率が９：１の場合に、標的蛋白質を選択的に吸着することがわかった。陰イオンが炭酸である炭酸系のLDHを用いて標的蛋白質であるPspA融合蛋白質を精製できることが示された。【００４６】
（実施例５）
実施例１で作製したLDHについて、標的蛋白質の吸着能を確認した。本実施例では、LDHとしてMAPを用い、標的蛋白質として、PspAクレード２であって他のクレードと融合していない蛋白質（PspA単抗原）を用いた。【００４７】
標的蛋白質としてPspA単抗原を用いた以外は、実施例２と同様の手法により、標的蛋白質を含む大腸菌破砕液を調製し、MAPと大腸菌破砕液を混合することによりLDH処理を行った。MAPのマグネシウムとアルミニウムの含量比率（モル比）は、図４に示す通りである。【００４８】
図４の各レーンには、LDH処理を行った後、遠心分離した上清をサンプルとしてアプライした。なお、サンプル番号１は、LDH処理を行う前のサンプルである。
アルミニウム含量比率が大きいLDHは、標的蛋白質以外の蛋白質も吸着されてしまうことがわかった。マグネシウムとアルミニウムの含量比率が７：３のLDHは、標的蛋白質を選択的に吸着することがわかった。リン酸系のLDHを用いてPspA単抗原を精製できることが示された。【００４９】
（実施例６）
実施例１と同様に、以下の表１に従ってLDHを作製した。LDHは、特許文献１に開示される方法に従って作製し、アルミニウム含量を確認した。【００５０】
【表１】
2017164121.tif 000002
【００５１】
（実施例７）
実施例６で作製したLDHを用いて日本脳炎ウイルス抗原の吸着能を確認した。LDH（アルミニウム含量500μg/mL）と、標的蛋白質である日本脳炎ウイルス含有液（蛋白質含量101μg/mL）とを等量混合し、撹拌して３時間放置した後、LDHに吸着されなかった上清中の蛋白質量を吸光度（波長280nm）で測定した。【００５２】
その結果を表２に示す。LDHは、日本脳炎ウイルス抗原に対する吸着能が高いことが確認された。【００５３】
【表２】
2017164121.tif 000003
【００５４】
（実施例８）
0.1mol/L  CaCl2・6H2Oの代わりに0.1mol/L  CaCl2・2H2Oを用いた以外は、実施例１と同様にしてLDH（MAP、CAP、MAC、CAC）を作製し、アルミニウム含量を確認した。【００５５】
（実施例９）
実施例８で作製したLDHについて、マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）由来の蛋白質への吸着能について確認した。本実施例ではLDHとしてMAP、CAP、MAC、又はCACを用い、標的蛋白質としてマイコプラズマ由来のP30蛋白質を用いた。【００５６】
マイコプラズマP30蛋白質を発現するプラスミドを常法に沿って大腸菌に導入し、標的蛋白質を発現させた。凍結させた大腸菌をPBS中に浮遊させて超音波により破砕した。破砕後、最大遠心加速度14310（×g）で15分間遠心分離を行った。遠心分離後の上清に、硫酸アンモニウムを10%飽和となるように添加して、最大遠心加速度14310（×g）で15分間遠心分離を行った。遠心分離後の上清に、硫酸アンモニウムを30%飽和となるように添加して、最大遠心加速度14310（×g）で15分間遠心分離を行った。遠心分離後の沈殿物をPBSにて懸濁し、以下のLDHによる処理の精製前原料とした。【００５７】
実施例８で作製したLDH（アルミニウム含量約10mg/mL）と、精製前原料（全蛋白質含量約1.5mg/mL）とを等量混合し、撹拌後１時間放置した。LDHによる処理を行った後、遠心分離した上清をサンプルとして回収した。サンプルについてATTO社製のE-T/R1020L（10〜20%）ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、標的蛋白質の挙動を確認した。ゲルの各レーンには、全蛋白質量が等量となるようにサンプルをアプライした。【００５８】
結果を図５に示す。図５において、矢印で示す分子量のバンドが標的蛋白質に該当する。図５中、SMのレーンにはサイズマーカーを、未処理のレーンにはLDHによる処理を行っていない、精製前原料をアプライした。それ以外のレーンには、各レーンに示す金属組成のLDHで精製前原料を処理した後の上清をアプライした。【００５９】
LDHがMACの場合、アルミニウムとマグネシウムの含量比率が１：９〜４：６のLDHでは、蛋白質の特異的な吸着は認められなかった。５：５のLDHでは僅かに不純物蛋白質の吸着が認められた。６：４〜９：１のLDHでは、全ての蛋白質の吸着が認められた。
LDHがMAPの場合、アルミニウムとマグネシウムの含量比率が１：９〜５：５のLDHでは、アルミニウム含量が増加するとともに全ての蛋白質の吸着が認められた。６：４〜９：１のLDHでは、標的蛋白質の吸着能が低くなり、不純物蛋白質の特異的な吸着が認められた。
LDHがCACの場合、アルミニウムとカルシウムの含量比率が１：９〜５：５のLDHでは、不純物蛋白質の吸着が認められた。６：４及び７：３のLDHでは、不純物蛋白質の特異的な吸着が認められた。８：２及び９：１で吸着が認められなかったのは、LDH量が少なく吸着が不十分であったためと考えられる。
LDHがCAPの場合、アルミニウムとカルシウムの含量比率が１：９〜３：７のLDHでは、不純物蛋白質の吸着能が僅かに認められた。４：６及び５：５のLDHでは、全ての蛋白質の吸着が認められた。６：４〜９：１のLDHでは、標的蛋白質の吸着とともに、不純物蛋白質の強い吸着能が認められた。【００６０】
従って、LDHの組成を変動させることにより、標的蛋白質をLDHに特異的に吸着させることもできるが、逆に不純物蛋白質をLDHに特異的に吸着させて、標的蛋白質を精製することもできることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の蛋白質の精製方法によれば、LDHを用いることにより、標的蛋白質を不純物から選択的に分離することができる。LDHは、M2+、M3+、An-の種類や比率を調節することにより、様々なLDHを合成して多様な吸着能を付与することが可能となる。したがって、本発明の蛋白質の精製方法は、様々な標的蛋白質の精製に応用できる。従来の蛋白質の精製方法では、標的蛋白質を選択的に分離することが困難であったため、複数回精製する必要があった。本発明の標的蛋白質の精製方法では、精製工程が減少し、効率良くかつ簡便に標的蛋白質の精製が可能となり、有用である。また、本発明の標的蛋白質の精製方法は、生体に害のない物質を用いることから、安全性に優れている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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