(57)【要約】  この細胞培養装置は、１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備える。前記細胞培養ユニットは、細胞の培養液が流通する流通空間を有する主培養液室と、前記細胞が接着可能な一方の面が前記流通空間に臨む透過性の隔膜と、前記培養液が貯留される気密構造の第１培養液貯留室と、前記培養液が貯留される第２培養液貯留室と、前記培養液を前記第１培養液貯留室から前記主培養液室の前記流通空間に導く培養液導入流路と、前記培養液を前記流通空間から前記第２培養液貯留室に導く培養液導出流路と、を有する。前記貯留槽は、前記第１培養液貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、
前記細胞培養ユニットは、細胞の培養液が流通する流通空間を有する主培養液室と、
前記細胞が接着可能な一方の面が前記流通空間に臨む透過性の隔膜と、
前記培養液が貯留される気密構造の第１培養液貯留室と、
前記培養液が貯留される第２培養液貯留室と、
前記培養液を前記第１培養液貯留室から前記主培養液室の前記流通空間に導く培養液導入流路と、
前記培養液を前記流通空間から前記第２培養液貯留室に導く培養液導出流路と、を有し、
前記貯留槽は、前記第１培養液貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する、細胞培養装置。
【請求項２】
複数の前記細胞培養ユニットの前記第１培養液貯留室のうち少なくとも２つは、気体が流通可能となるように互いに連通されている、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記細胞培養ユニットは、液体が貯留される気密構造の第１液体貯留室と、
前記液体が貯留される第２液体貯留室と、
前記第１液体貯留室を供給源とする前記液体を、前記隔膜の他方の面側の空間から前記第２液体貯留室に導く液体導出流路と、を有し、
前記貯留槽は、前記第１液体貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する、請求項１または２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
複数の前記細胞培養ユニットの前記第１液体貯留室のうち少なくとも２つは、気体が流通可能となるように互いに連通されている、請求項３に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
前記第１培養液貯留室と、前記第２培養液貯留室とは、播種された細胞が保持される細胞保持部を有する、請求項１〜４のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記培養液導出流路から前記第２培養液貯留室への前記培養液の流れを制御する逆流防止機構をさらに備えている、請求項１〜５のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記逆流防止機構は、前記培養液導出流路から前記第２培養液貯留室へ向かう方向の前記培養液の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁である、請求項６に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記第１培養液貯留室から前記培養液導入流路への前記培養液の流れを制御する逆流防止機構をさらに備えている、請求項１〜５のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記逆流防止機構は、前記第１培養液貯留室から前記培養液導入流路への前記培養液の流れを許容し、かつ前記第１培養液貯留室から前記培養液導入流路への気体の流れを阻止するラプラス弁である、請求項８に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
前記培養液導入流路と培養液導出流路のうち少なくともいずれか一方は、流路断面積が他の部位に比べて１／１０以下である抵抗流路部位を有する、請求項１〜９のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
前記流通空間は、前記隔膜の厚さ方向の距離が１μｍ〜１０００μｍである、請求項１〜１０のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
前記貯留槽は、前記主培養液室、前記第１培養液貯留室および前記第２培養液貯留室が形成された容器状の槽本体と、前記主培養液室、前記第１培養液貯留室および前記第２培養液貯留室の開口を開閉自在かつ気密に閉止する蓋部とを有する、請求項１〜１１のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
前記蓋部を前記槽本体に向けて押さえつけて保持する蓋部押圧部をさらに備え、
前記蓋部押圧部は、前記槽本体に向けて前記蓋部を押圧する押圧部材を有する、請求項１２に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
前記槽本体は、前記液体導出流路を有する底部プレートと、前記底部プレートの一方の面に設けられた壁部とを備え、
前記主培養液室、前記第１培養液貯留室および前記第２培養液貯留室は、前記底部プレートと前記壁部とによって区画された空間である、請求項１２または１３に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
前記壁部を前記底部プレートに向けて押さえつけて保持する壁部押圧部をさらに備え、
前記壁部押圧部は、前記底部プレートに向けて前記壁部を押圧する押圧部材を有する、請求項１４に記載の細胞培養装置。
【請求項１６】
前記第１培養液貯留室内を加圧可能な加圧手段をさらに備えている、請求項１〜１５のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１７】
１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、細胞の培養液が流通する流通空間を有する主培養液室と、前記細胞が接着可能な一方の面が前記流通空間に臨む透過性の隔膜と、前記培養液が貯留される気密構造の第１培養液貯留室と、前記培養液が貯留される第２培養液貯留室と、前記培養液を前記第１培養液貯留室から前記主培養液室の前記流通空間に導く培養液導入流路と、前記培養液を前記流通空間から前記第２培養液貯留室に導く培養液導出流路と、を有し、前記貯留槽は、前記第１培養液貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する細胞培養装置を使用し、前記第１培養液貯留室に前記通気孔を通して気体を供給して前記第１培養液貯留室を加圧し、前記第１培養液貯留室内の圧力上昇によって、前記第１培養液貯留室内の培養液を前記培養液導入流路を通して前記主培養液室に導くとともに、前記主培養液室内の培養液を前記培養液導出流路を通して前記第２培養液貯留室に導く、細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養する装置およびこの装置を用いて細胞を培養する方法に関する。
本願は、２０１６年３月８日に日本に出願された特願２０１６−４５０２４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１，２に見られるように、近年の医薬品開発コストは指数関数的に増加しており、臨床試験の成功率も年々低下している。また、化粧品等の化成品開発においても同様に、開発コストの増加が起きている。かかる原因として、動物とヒトの種差のため、動物実験結果を臨床試験に直接的に外挿できないことが挙げられる。また、化粧品等の化成品開発では、欧州を中心に実験動物の使用が困難となってきていることもある。このような状況の中で、ヒト由来の培養細胞を用いた医薬品候補化合物や化成品のin vitro細胞アッセイに対する期待が高まっている。【０００３】
一方、従来の細胞アッセイで利用されてきた単層培養は、細胞を取り巻く環境が生体内と大きく異なり、培養細胞では体内で発現している機能の多くが失われている点がしばしば問題となる。近年の微細加工技術や三次元培養技術の進歩により、この問題が克服され、細胞アッセイのスループットと信頼性が同時に向上されると期待されている（例えば、非特許文献３，４）。特に、生理学的な三次元培養環境をin vitroで再現したマイクロ流体デバイスを１つの臓器のように取り扱うOrgan-on-a-chipという概念が広がり、医薬品開発への応用を意識した研究が世界的に広く展開されつつある（例えば、非特許文献５，６）。さらに、in vitroで再構成した複数の臓器モデルをマイクロ流路等で接続し、個体応答の再現を目指すBody-on-a-chipという概念も提唱され、急速な注目を集めている（例えば、非特許文献７）。【０００４】
以上の様に、ヒト由来の培養細胞によって構成される臓器モデルを生体外で再構成し、生理学的な機能を再現することで、細胞アッセイの信頼性が向上すると期待されている。
ここで、生体を構成する臓器の多くは隔膜型の構造をしている。例えば、小腸では腸間膜を隔てて栄養分が吸収され、腎臓では腎尿細管上皮細胞膜を介して代謝産物や老廃物を排泄している。また全身を巡る血管においても血管壁を介して周囲の組織に酸素や栄養素が供給され、老廃物が排泄されている。このような隔膜型の臓器機能を生体外で再構成するために、ボイデンチャンバーやトランズウェルといった隔膜型の培養容器が利用されてきた。しかしながら、これらの培養容器では、隔膜の一方の面側および他方の面側に液を流すことができないため、生理的な機能が発現しない、膜下部における細胞の状態の悪化、複数臓器を連結したBody-on-a-chipに適用できないといった問題がある。【０００５】
この問題を解決すべく、マイクロ流路の中に隔膜を配置した、Organ-on-a-chipが報告されている。例えば、腸（非特許文献８，９）、腎臓（非特許文献１０）、および脳内血管（非特許文献１１）に関する生体外モデルが報告されている。マイクロ流路の中に隔膜を配置し、生理学的なシェアストレスを付加しながら培養することでこれらの臓器モデルのバリア能が向上し、より精度の高いアッセイが可能となることが報告されている（非特許文献１０，１１）。このような隔膜を内蔵したOrgan-on-a-chipを、動物実験の代替として創薬に利用していくためには、多種類の化合物を同時に評価できるシステムが必要である。一方で、上述の先行研究では送液のためにシリンジポンプやペリスタポンプを用いているために培養システムの並列化が困難である。【０００６】
本発明者等は、既に、これまでの研究で多数の薬剤溶液を簡便に取り扱える「圧力駆動型の灌流培養マイクロチャンバーアレイ」を開発し（非特許文献１２，１３）、その後、使い勝手の良いプラットフォームを備えた循環培養システムを開発して実用化のためのユーザー評価を実施するに至っている（非特許文献１４および特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１５−０７３４６８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Scannell, J. W. et al. Nat. Rev. Drug Discov., 11, 191 (2012)
【非特許文献２】Pammolli, F. et al. Nat. Rev. Drug Discov., 10, 428 (2011)
【非特許文献３】van Midwoud, P. M. et al. Integr. Biol., 3, 509 (2012)
【非特許文献４】Ghaemmaghami, A. M. et al. Drug Discov. Today, 17, 173 (2012)
【非特許文献５】Bhatia, S. N. et al. Nat. Biotechnol., 32, 760 (2014)
【非特許文献６】Baker, M. Nature, 471, 661 (2011)
【非特許文献７】Sung, J. H. et al. Lab Chip, 13, 1201 (2013)
【非特許文献８】H. J. Kim, D. Huh, G. Hamilton and D. E. Ingber,, Lab Chip,12, 2165-2174 (2012).
【非特許文献９】M. B. Esch, J. H. Sung, J. Yang, C. H. Yu, J. J. Yu, J. C. March and M. L. Shuler, Biomed. Microdevices, 14, 895-906 (2012).
【非特許文献１０】K.-J. Jang, A. P. Mehr, G. A. Hamilton, L. A. McPartlin, S. Chung, K.-Y. Suh and D. E. Ingber, Integr. Biol., 5, 1119-1129 (2013).
【非特許文献１１】R. Booth and H. Kim, Lab Chip, 12, 1784-1792 (2012).
【非特許文献１２】S.Sugiura, et al., Anal.Chem., 82, 8278 (2010)
【非特許文献１３】S.Sugiura, et al., Biotechnol.Bioeng., 100, 1156 (2008)
【非特許文献１４】K.Hattori, et al., J.Biosci.Bioeng., 118, 327 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来の細胞培養装置においては、配管等の構造が複雑であるため、装置が大型化し、また、操作が煩雑であるなどの多くの問題があった。【００１０】
本発明は、簡略な装置構造であって、操作の容易な細胞培養装置および細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（１）１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、細胞の培養液が流通する流通空間を有する主培養液室と、前記細胞が接着可能な一方の面が前記流通空間に臨む透過性の隔膜と、前記培養液が貯留される気密構造の第１培養液貯留室と、前記培養液が貯留される第２培養液貯留室と、前記培養液を前記第１培養液貯留室から前記主培養液室の前記流通空間に導く培養液導入流路と、前記培養液を前記流通空間から前記第２培養液貯留室に導く培養液導出流路と、を有し、前記貯留槽は、前記第１培養液貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する、細胞培養装置。
（２）複数の前記細胞培養ユニットの前記第１培養液貯留室のうち少なくとも２つは、気体が流通可能となるように互いに連通されている（１）に記載の細胞培養装置。
（３）前記細胞培養ユニットは、液体が貯留される気密構造の第１液体貯留室と、前記液体が貯留される第２液体貯留室と、前記第１液体貯留室を供給源とする前記液体を、前記隔膜の他方の面側の空間から前記第２液体貯留室に導く液体導出流路と、を有し、前記貯留槽は、前記第１液体貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する（１）または（２）に記載の細胞培養装置。
（４）複数の前記細胞培養ユニットの前記第１液体貯留室のうち少なくとも２つは、気体が流通可能となるように互いに連通されている（３）に記載の細胞培養装置。
（５）前記第１培養液貯留室と、前記第２培養液貯留室とは、播種された細胞が保持される細胞保持部を有する（１）〜（４）のうちいずれか１つに記載の細胞培養装置。
（６）前記培養液導出流路から前記第２培養液貯留室への前記培養液の流れを制御する逆流防止機構をさらに備えている（１）〜（５）のうちいずれか１つに記載の細胞培養装置。
（７）前記逆流防止機構は、前記培養液導出流路から前記第２培養液貯留室へ向かう方向の前記培養液の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁である（６）に記載の細胞培養装置。
（８）前記第１培養液貯留室から前記培養液導入流路への前記培養液の流れを制御する逆流防止機構をさらに備えている、（１）〜（５）のうちいずれか１つに記載の細胞培養装置。
（９）前記逆流防止機構は、前記第１培養液貯留室から前記培養液導入流路への前記培養液の流れを許容し、かつ前記第１培養液貯留室から前記培養液導入流路への気体の流れを阻止するラプラス弁である（８）に記載の細胞培養装置。
（１０）前記培養液導入流路と培養液導出流路のうち少なくともいずれか一方は、流路断面積が他の部位に比べて１／１０以下である抵抗流路部位を有する（１）〜（９）のうちいずれか１つに記載の細胞培養装置。
（１１）前記流通空間は、前記隔膜の厚さ方向の距離が１μｍ〜１０００μｍである、（１）〜（１０）のうちいずれか１つに記載の細胞培養装置。
（１２）前記貯留槽は、前記主培養液室、前記第１培養液貯留室および前記第２培養液貯留室が形成された容器状の槽本体と、前記主培養液室、前記第１培養液貯留室および前記第２培養液貯留室の開口を開閉自在かつ気密に閉止する蓋部とを有する（１）〜（１１）のうちいずれか１つに記載の細胞培養装置。
（１３）前記蓋部を前記槽本体に向けて押さえつけて保持する蓋部押圧部をさらに備え、前記蓋部押圧部は、前記槽本体に向けて前記蓋部を押圧する押圧部材を有する（１２）に記載の細胞培養装置。
（１４）前記槽本体は、前記液体導出流路を有する底部プレートと、前記底部プレートの一方の面に設けられた壁部とを備え、前記主培養液室、前記第１培養液貯留室および前記第２培養液貯留室は、前記底部プレートと前記壁部とによって区画された空間である（１２）または（１３）に記載の細胞培養装置。
（１５）前記壁部を前記底部プレートに向けて押さえつけて保持する壁部押圧部をさらに備え、前記壁部押圧部は、前記底部プレートに向けて前記壁部を押圧する押圧部材を有する、（１４）に記載の細胞培養装置。
（１６）前記第１培養液貯留室内を加圧可能な加圧手段をさらに備えている、（１）〜（１５）のうちいずれか１つに記載の細胞培養装置。
（１７）１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、細胞の培養液が流通する流通空間を有する主培養液室と、前記細胞が接着可能な一方の面が前記流通空間に臨む透過性の隔膜と、前記培養液が貯留される気密構造の第１培養液貯留室と、前記培養液が貯留される第２培養液貯留室と、前記培養液を前記第１培養液貯留室から前記主培養液室の前記流通空間に導く培養液導入流路と、前記培養液を前記流通空間から前記第２培養液貯留室に導く培養液導出流路と、を有し、前記貯留槽は、前記第１培養液貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する細胞培養装置を使用し、前記第１培養液貯留室に前記通気孔を通して気体を供給して前記第１培養液貯留室を加圧し、前記第１培養液貯留室内の圧力上昇によって、前記第１培養液貯留室内の培養液を前記培養液導入流路を通して前記主培養液室に導くとともに、前記主培養液室内の培養液を前記培養液導出流路を通して前記第２培養液貯留室に導く、細胞培養方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の一態様によれば、第１培養液貯留室を加圧することによって、培養液を第１培養液貯留室から培養液導入流路を通して主培養液室に導くとともに、主培養液室において、隔膜上の細胞を流体シェアストレスに暴露しつつ培養し、主培養液室内の培養液を培養液導出流路を通して第２培養液貯留室に導くことができる。そのため、送液のための流路の構造を簡略にすることができる。よって、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、操作を容易にすることができる。
複数の細胞培養ユニットを有する細胞培養装置によれば、容易な操作で、複数の試験を並列的に行うことができる。そのため、多数の被検体（薬剤等）を効率よく評価できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】第１実施形態の細胞培養装置を模式的に示す断面図である。
【図２】図１の細胞培養装置を模式的に示す斜視図である。
【図３】第２実施形態の細胞培養装置を模式的に示す斜視図である。
【図４】第３実施形態の細胞培養装置を模式的に示す断面図である。
【図５】第４実施形態の細胞培養装置を模式的に示す断面図である。
【図６】第３実施形態の細胞培養装置を示す斜視図である。
【図７】図６の細胞培養装置を示す分解斜視図である。
【図８Ａ】図６の細胞培養装置の分解状態の正断面図である。
【図８Ｂ】図６の細胞培養装置の正断面図である。
【図９Ａ】図６の細胞培養装置の分解状態の側断面図である。
【図９Ｂ】図６の細胞培養装置の側断面図である。
【図１０Ａ】ラプラス弁の説明図である。詳しくは、ラプラス弁が設けられた液体貯留室の部分拡大図である。
【図１０Ｂ】ラプラス弁の説明図である。詳しくは、ラプラス弁を介して下流口から連絡流路に培地が流入する場合の模式図である。
【図１０Ｃ】ラプラス弁の説明図である。詳しくは、下流口に空気が流入した際に、ラプラス弁が機能している際の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（第１実施形態）
［細胞培養装置］
第１実施形態の細胞培養装置１０について、図面を参照して説明する。
図１は、細胞培養装置１０を模式的に示す断面図である。図２は、細胞培養装置１０を模式的に示す斜視図である。
図１および図２に示すように、細胞培養装置１０は、貯留槽１１と、加圧ポンプ１４とを備えている。貯留槽１１は、１つの細胞培養ユニット９を備えている。貯留槽１１は、容器状の槽本体１２と、蓋部１３と、を備えている。
【００１５】
細胞培養ユニット９は、主培養液室３と、第１培養液貯留室１と、第２培養液貯留室２と、隔膜４と、培養液導入流路５と、培養液導出流路６と、連絡流路７とを有する。
主培養液室３は、主室３ｃと、主室３ｃの底面３ｅに形成された凹部３ｄとを有する。
主室３ｃの内部空間は培養液Ｃ１が流通する流通空間３ａである。凹部３ｄの内部空間のうち隔膜４の内面４ａ側の空間は流通空間３ａの一部である。凹部３ｄの内部空間のうち隔膜４の外面４ｂ側の空間は、外面側空間３ｂである。図１において、外面側空間３ｂは流通空間３ａの下方に位置している。貯留槽１１には、外面側空間３ｂに連通するサンプリング孔（図示略）を形成することができる。これによって、サンプリング孔を通して外面側空間３ｂ内の液体を採取することができる。主培養液室３は、貯留槽１１内に形成された中空部である。
【００１６】
（シェアストレスに関する設計）
流通空間３ａの高さ（隔膜４の厚さ方向の距離）は、次のように定めることによって、流通空間３ａを流れる培養液Ｃ１の流速を高め、隔膜４上の細胞２０に対して十分なシェアストレスを付加することが可能となる。
図２に示すように、付加されるシェアストレス（τ）は、流通空間３ａの幅（ｗ０）、高さ（ｈ０）、培養液Ｃ１の流量（Ｑ）、および培養液Ｃ１の粘度（μ）に基づいて、式（１）により推算できる（非特許文献１５：F. M. White, Viscous Fluid Flow, McGraw-Hill Companies, Inc, Boston, 2006.を参照）。
【００１７】
【数１】
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【００１８】
細胞機能を向上させるために適切なシェアストレスは細胞によって異なるが、例えば血管内皮細胞の場合は、１〜１０ｄｙｎ／ｃｍ２であることが知られており（非特許文献１６：K. Hattori, Y. Munehira, H. Kobayashi, T. Satoh, S. Sugiura and T. Kanamori, "Microfluidic perfusion culture chip providing different strengths of shear stress for analysis of vascular endothelial function", J. Biosci. Bioeng., 118, 327-332 (2014).を参照）、腎上皮細胞の場合は０．２ｄｙｎ／ｃｍ２であることが知られている（非特許文献１０を参照）。
一方、医薬品候補化合物や化成品のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイに使用する際の１アッセイあたりの培養液量は培養液のコストとハンドリングを考えると１０μｌ〜１０ｍｌ程度が現実的である。よって、適切なシェアストレスを実現するためには、上記（１）式より、流通空間３ａの高さは、１μｍ〜１０００μｍの範囲にあることが好ましい。
なお、流通空間３ａの高さｈ０は、隔膜４の内面４ａ（上面）と、流通空間３ａの内天面との距離（隔膜４の厚さ方向の距離）である。
【００１９】
隔膜４は、所定の大きさ以下の物質が厚さ方向に透過可能である。隔膜４を透過する物質移動は、例えば拡散により起きる。物質移動は、隔膜４に付着した細胞２０の作用により促進されることもある。隔膜４は例えば多孔質膜であってよい。隔膜４の平均細孔径は例えば０．１μｍ〜１０μｍである。隔膜４の材質は、ポリカーボネート、ポリエステル、シリコーン樹脂のいずれか１つであってよい。隔膜４は、例えば半透膜であってもよい。なお、細胞２０は隔膜４を透過できない。隔膜４は、内面４ａが細胞接着性材料でコーティングされていることが好ましい。細胞接着性材料は、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、マトリゲル、およびポリリジンのうち１または２以上が好ましい。
【００２０】
隔膜４は、凹部３ｄ内に、流通空間３ａと外面側空間３ｂとを隔てるように設置されている。隔膜４は、凹部３ｄの底面より高い位置にあり、主室３ｃの底面３ｅと平行に、凹部３ｄを塞ぐように設置することができる。隔膜４の内面４ａ（一方の面）は流通空間３ａに臨み、外面４ｂ（他方の面）は外面側空間３ｂに臨んでいる。
【００２１】
第１培養液貯留室１および第２培養液貯留室２は、貯留槽１１の槽本体１２の上面に形成された凹部によって形成された空間であり、培養液Ｃ１を貯留可能である。
第１培養液貯留室１は、主室１ｃと、主室１ｃの底面１ｅに形成された細胞保持凹部１ｄ（細胞保持部）とを有する。第１培養液貯留室１の内部空間は培養液貯留空間１ａである。
第２培養液貯留室２は、主室２ｃと、主室２ｃの底面２ｅに形成された細胞保持凹部２ｄ（細胞保持部）とを有する。第２培養液貯留室２の内部空間は培養液貯留空間２ａである。
【００２２】
培養液導入流路５は、一端が第１培養液貯留室１の主室１ｃの底部に接続され、他端が主培養液室３の主室３ｃの底部に接続されている。培養液導入流路５は、培養液Ｃ１を第１培養液貯留室１から主培養液室３の流通空間３ａに導くことができる。
培養液導出流路６は、一端が主培養液室３の主室３ｃの底部に接続され、他端が第２培養液貯留室２の主室２ｃの底部に接続されている。培養液導出流路６は、培養液Ｃ１を主培養液室３の流通空間３ａから第２培養液貯留室２に導くことができる。
連絡流路７は、一端が第２培養液貯留室２の主室２ｃの底部に接続され、他端が第１培養液貯留室１の主室１ｃの底部に接続されている。連絡流路７は、培養液Ｃ１を第２培養液貯留室２から第１培養液貯留室１に導くことができる。
【００２３】
蓋部１３は、槽本体１２の開口を開閉自在かつ気密に閉止可能である。詳しくは、蓋部１３は、第１培養液貯留室１および第２培養液貯留室２の上部開口１ｂ，２ｂをそれぞれ気密に閉止可能である。蓋部１３が上部開口１ｂ，２ｂを気密に閉止する構造としては、例えば、蓋部１３が、上部開口１ｂ，２ｂのそれぞれを包囲するように与えられたパッキン１５を介して槽本体１２の上面に当接する構造を例示できる。なお、図１では、蓋部１３は、槽本体１２から離間して示されている。
【００２４】
蓋部１３は、第１培養液貯留室１、第２培養液貯留室２に相当する位置に、それぞれ通気孔１ｈ，２ｈを有する。通気孔１ｈ，２ｈは、それぞれ第１培養液貯留室１および第２培養液貯留室２に対して気体（例えば空気）を供給、および、第１培養液貯留室１および第２培養液貯留室２から気体（例えば空気）を排出することができる。通気孔１ｈ，２ｈにはそれぞれエアフィルタ１６が設けられることが好ましい。エアフィルタ１６によって、第１培養液貯留室１および第２培養液貯留室２に異物が混入するのを防ぐことができる。
【００２５】
第１培養液貯留室１には、培養液導入流路５の一端に、第１培養液貯留室１から培養液導入流路５への液体の流れを許容し、かつ第１培養液貯留室１から培養液導入流路５への気体の流入を阻止するラプラス弁３１が設けられている。
第１培養液貯留室１には、連絡流路７の他端に、連絡流路７から第１培養液貯留室１へ向かう方向の液体の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁３２が設けられている。
第２培養液貯留室２には、培養液導出流路６の他端に、培養液導出流路６から第２培養液貯留室２へ向かう方向の液体の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁３４が設けられている。
【００２６】
（逆止弁）
逆止弁３２，３４としては、例えば弁孔を有する弁座と、弁体とを備えた構造の逆止弁を例示できる。この逆止弁は、液が順方向に流れる際には、弁体が弁座から離れることにより弁孔が開かれるため、液は弁孔を通過して順方向に流れる。液が逆方向に流れる際には、弁体が弁座に当接して弁孔が閉止されるため、当該方向の液の流れは阻止される。
逆止弁３２，３４は、液体の流れを制御する逆流防止機構の例である。
【００２７】
（ラプラス弁）
ラプラス弁３１の構造と機能を、図１０Ａ〜図１０Ｃを用いて説明する。図１０Ａは、ラプラス弁１１７が設けられた液体貯留室の部分拡大図を示す。図１０Ｂは、ラプラス弁１１７を介して下流口１１４から連絡流路１１５に培地１３１が流入する場合の模式図を示す。図１０Ｃは、下流口１１４に空気が流入した際に、ラプラス弁１１７が機能している際の模式図を示す。図１０Ｃに示すように、微細な流路内において、培地１３１と空気との間には界面張力による圧力差、すなわちラプラス圧が発生する。流路の表面が液体培地で濡れている場合は、ラプラス圧未満の空気圧条件下において液体が満たされた微細流路に空気は流入しえない。このような条件下で微細流路は受動的な空気流入防止機構として扱うことができる。
【００２８】
ラプラス弁の設計について、以下に説明する。
ラプラス弁に空気が流入してしまう圧力（ラプラス圧、限界圧力）（ΔＰＬａｐ）は界面張力（γ）およびラプラス弁を構成するマイクロ流路の幅（ｗＬ）および深さ（ｈＬ）によって以下の式（２）で計算できる。
【００２９】
【数２】
2017154880.tif 000004
【００３０】
細胞培養装置を駆動するための現実的な圧力範囲は市販の圧力制御装置で調整可能な圧力範囲および細胞の耐圧性によって決定されると考えられる。
仮に細胞の耐圧性を生体内の血圧の上限程度（３０ｋＰａ＝２２５ｍｍＨｇ）とすると、実施形態の細胞培養装置を駆動するために現実的な圧力範囲は１ｋＰａ〜３０ｋＰａ程度となる。培養液の界面張力は６０ｍＮ／ｍ程度であり、ラプラス弁を構成するマイクロ流路の断面が正方形の場合、つまりｗＬ＝ｈＬの場合、３０ｋＰａで空気が流入するマイクロ流路の寸法は上記式（２）よりｗＬ＝ｈＬ＝８μｍ程度、１ｋＰａで空気が流入するマイクロ流路の寸法はｗＬ＝ｈＬ＝２４０μｍ程度と推算される。
ラプラス弁を構成するマイクロ流路の寸法を上記寸法（３０ｋＰａのときのｗＬ＝ｈＬ＝８μｍ、１ｋＰａのときのｗＬ＝ｈＬ＝２４０μｍ）よりも小さくすることで、想定する圧力で運用した際にラプラス弁に空気が流入してしまうことを防ぐことができる。
すなわち、ラプラス弁が機能するための限界の圧力であるラプラス圧ΔＰＬａｐが、実施形態の細胞培養装置で使用する圧力範囲よりも大きくなるように、ラプラス弁を構成するマイクロ流路を形成すれば、ラプラス弁に空気が流入してしまうことを防ぐことができる。
なお、ｗＬとｈＬの比率が１：１でない場合も同様に式（２）に基づいて流路の寸法を設計することが可能である。
細胞培養装置１０では、例えば、培養液導入流路５の幅および深さをそれぞれ２００μｍおよび２５μｍと設計し、ラプラス圧が５．４ｋＰａと推算して、圧力がこの値以下となるように液体を培養液導入流路５に流すことができる。
ラプラス弁３１は、液体の流れを制御する逆流防止機構の例である。
【００３１】
（抵抗流路）
断面が矩形のマイクロ流路を流れる液体の流量（Ｑ）と圧力損失（ΔＰ）には以下の関係がある（F. M. White, Viscous Fluid Flow, McGraw-Hill Companies, Inc, Boston, 2006を参照）。
【００３２】
【数３】
2017154880.tif 000005
【００３３】
【数４】
2017154880.tif 000006
【００３４】
上記式（３）および式（４）において、ΔＰはマイクロ流路の入口と出口の圧力差、Ｒは流路抵抗、μは流体の粘度、ｌはマイクロ流路の長さ、ｗはマイクロ流路の幅、ｈはマイクロ流路の深さである。当該式（３）および式（４）はｗ＞ｈの条件で成立する。
例えば、細胞培養装置１０では、培養液導入流路５、培養液導出流路６、および連絡流路７は、流量を調節するために流路断面積が１／１０以下となっている抵抗流路部位５ａ，６ａ，７ａを備えていてもよい。
流路５，６，７において、抵抗流路部位と、それ以外の部分の部位との長さが等しい場合を考える。抵抗流路の断面積が他の部位の断面積の１／１０となると、幅ｗ、深さｈが１／１００．５となり、式（４）の抵抗流路の流路抵抗Ｒが、抵抗流路以外の部位の流路抵抗Ｒの１００倍となる。
式（３）より、圧力損失についても抵抗流路の圧力損失が、抵抗流路以外の部位の圧力損失の１００倍となる。流路全体を流れる流量を推算する際に、抵抗流路の抵抗と流路全体にかかる圧力のみを考慮して流量を推算した場合の推算誤差が１／１００となり、これは許容できる誤差と言える。
すなわち、流路の一部に流量を調節するために流路断面積が１／１０以下となっている抵抗流路部位が設けられた場合には、抵抗流路の圧力損失のみを考慮して流路設計をすることで流路網の設計が容易になるという利点がある。
なお、抵抗流路部位は、培養液導入流路５および培養液導出流路６の一方にのみ形成してもよい。
加圧ポンプ１４は、例えばコンプレッサである。
【００３５】
［細胞培養方法］
次に、細胞培養装置１０を用いて細胞を培養する方法の一例について説明する。
【００３６】
なお、本実施形態において培養する細胞は、特に限定されず、例えばヒトを含む動物由来の細胞、植物由来の細胞、微生物由来の細胞等を目的に応じて使用できる。
【００３７】
（１）工程１
図１および図２に示すように、細胞２０を隔膜４の内面４ａに播種して接着させる。主培養液室３の流通空間３ａには培養液Ｃ１を導入してもよい。
隔膜４に播種する細胞２０としては、尿細管細胞、脳血管内皮細胞などが使用できる。尿細管細胞を用いることによって、腎臓モデルが得られる。脳血管内皮細胞を用いることによって、血液脳関門モデルが得られる。
【００３８】
培養液Ｃ１を第１培養液貯留室１に導入する。第１培養液貯留室１の凹部１ｄには細胞を播種してもよい。培養液Ｃ１は第２培養液貯留室２にも導入してもよい。第２培養液貯留室２の凹部２ｄには細胞を播種してもよい。その上で、蓋部１３をパッキン１５に押し当てるようにして閉じ、少なくとも第１培養液貯留室１の上部開口１ｂを気密に閉止する。
【００３９】
（２）工程２
加圧ポンプ１４を稼働させ、通気孔１ｈを通して第１培養液貯留室１に気体（例えば空気）を供給して第１培養液貯留室１内を加圧する。この際、第２培養液貯留室２は通気孔２ｈを通して大気に開放しておくことが好ましい。
第１培養液貯留室１内の圧力上昇によって、第１培養液貯留室１内の培養液Ｃ１は、培養液導入流路５を通って主培養液室３の流通空間３ａに導入される。流通空間３ａ内の培養液Ｃ１は、培養液導出流路６を通って第２培養液貯留室２に導入される。
培養液Ｃ１は、第１培養液貯留室１から主培養液室３の流通空間３ａを経て第２培養液貯留室２に流れるため、シェアストレスが加えられる環境下で細胞２０の培養を行うことができる。
【００４０】
（３）工程３
加圧ポンプ１４によって、通気孔２ｈを通して第２培養液貯留室２に気体（例えば空気）を供給して各室内を加圧すると、第２培養液貯留室２内の圧力上昇によって、第２培養液貯留室２内の培養液Ｃ１は、連絡流路７を通って第１培養液貯留室１に導入される。なお、この際、第１培養液貯留室１は大気に開放しておくことが好ましい。
工程２，３を繰り返すことによって、第１培養液貯留室１、主培養液室３（流通空間３ａ）、第２培養液貯留室２の間で培養液Ｃ１を循環させることができる。
【００４１】
被検体となる物質を系内（例えば主培養液室３の流通空間３ａ）に添加することによって、この物質の、細胞２０に対する影響を評価することができる。被検体となる物質としては医薬品候補化合物、食品添加物、化粧品原料、塗料、農薬といった、各種化成品に利用される化学物質が挙げられる。なお、被検体はこれらに限定されない。
【００４２】
細胞培養装置１０では、送液のための流路の構造を簡略にすることができるため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。例えば、非特許文献８，１０，１１等に示す装置では、それぞれ、シリンジポンプ、カートリッジ式のペリスタポンプを用いて送液する構造が採用されており、送液のための配管接続が本実施形態よりも複雑となるとともに、装置が大型化し、試験の操作もより複雑である。
【００４３】
（第２実施形態）
［細胞培養装置］
第２実施形態の細胞培養装置１０Ａについて、図面を参照して説明する。以下、既出の構成と同じ構成については、同じ符号を付して説明を省略する。
図３に示すように、細胞培養装置１０Ａにおいて、貯留槽１１Ａは、複数の細胞培養ユニット９を有する。細胞培養ユニット９の数は、２以上の任意の数であってよい。
複数の細胞培養ユニット９のうち、隣り合う２つの細胞培養ユニット９，９の第１培養液貯留室１，１は、気体流路１８（接続流路）によって互いに連通されている。
気体流路１８の一端および他端は、第１培養液貯留室１，１内の上部気相空間１ｆ，１ｆに接続されているため、気体流路１８は、気体が流通可能となるように第１培養液貯留室１，１を接続している。
細胞培養ユニット９の数が３以上である場合には、少なくとも２つの細胞培養ユニット９の第１培養液貯留室１が気体流路１８によって互いに連通されていればよい。
【００４４】
細胞培養装置１０Ａでは、複数の第１培養液貯留室１のうち一部の第１培養液貯留室１を加圧することによって、気体流路１８を介して接続されたすべての第１培養液貯留室１を一括的に加圧し、培養液Ｃ１を第１培養液貯留室１から主培養液室３の流通空間３ａを経て第２培養液貯留室２に送ることができる。そのため、細胞培養装置１０Ａでは、容易な操作で、複数の試験を並列的に行うことができる。
また、少ない数の加圧ポンプ１４（図１参照）によって送液が可能となるため、装置の構造を簡略にすることができる。そのため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
上述の非特許文献８，１０，１１等に示す装置では、それぞれ、シリンジポンプ、カートリッジ式のペリスタポンプを用いて送液する構造が採用されており、１つの被検体を評価するために１台のポンプと１つのOrgan-on-a-chipを使用している。
この構造で複数の被検体を評価しようとすると、対象となる被検体の数だけポンプやペリスタポンプのカートリッジを増設する必要があるため、送液のための配管接続が増えてしまう。
図３に示す細胞培養装置１０Ａは、容易な操作で、多数の被検体（薬剤等）を効率よく評価できる点で、非特許文献８，１０，１１等に示す装置より優れている。
【００４５】
（第３実施形態）
［細胞培養装置］
第３実施形態の細胞培養装置１０Ｂについて、図面を参照して説明する。
図４は、細胞培養装置１０Ｂを模式的に示す断面図である。
図４に示すように、細胞培養装置１０Ｂは、貯留槽１１Ｂと、加圧ポンプ（図示略）とを備えている。貯留槽１１Ｂは、１つの細胞培養ユニット９Ｂを備えている。貯留槽１１Ｂは、槽本体１２Ｂと、蓋部１３Ｂと、を備えている。
細胞培養ユニット９Ｂは、主培養液室３と、第１培養液貯留室１と、第２培養液貯留室２と、隔膜４と、培養液導入流路５と、培養液導出流路６と、連絡流路７と、第１液体貯留室２１と、第２液体貯留室２２と、液体導入流路２５と、液体導出流路２６と、連絡流路２７と、を有する。
【００４６】
第１液体貯留室２１および第２液体貯留室２２は、貯留槽１１Ｂの槽本体１２Ｂの上面に形成された凹部によって形成された空間であり、培養液Ｃ２を貯留可能である。
第１液体貯留室２１は、主室２１ｃと、主室２１ｃの底面２１ｅに形成された細胞保持凹部２１ｄ（細胞保持部）とを有する。第１液体貯留室２１の内部空間は培養液貯留空間２１ａである。
第２液体貯留室２２は、主室２２ｃと、主室２２ｃの底面２２ｅに形成された細胞保持凹部２２ｄ（細胞保持部）とを有する。第２液体貯留室２２の内部空間は培養液貯留空間２２ａである。
【００４７】
第１液体貯留室２１および第２液体貯留室２２では、主培養液室３の細胞２０と異なる細胞を培養することも可能である。例えば、主培養液室３において血管内皮細胞を培養し、第１液体貯留室２１において肝実質細胞を培養し、第２液体貯留室２２において神経細胞を培養し、第１培養液貯留室１に被検体物質を添加することで、所定の生理学的な条件（例えば、シェアストレス負荷条件）下で培養された血管壁を透過した被検体物質が肝臓や神経に及ぼす影響を評価することが可能となる。
【００４８】
液体導入流路２５は、一端が第１液体貯留室２１の主室２１ｃの底部に接続され、他端が主培養液室３の凹部３ｄの底部に接続されている。液体導入流路２５は、培養液Ｃ２を第１液体貯留室２１から主培養液室３の外面側空間３ｂに導くことができる。
液体導出流路２６は、一端が主培養液室３の凹部３ｄの底部に接続され、他端が第２液体貯留室２２の底部に接続されている。液体導出流路２６は、培養液Ｃ２を主培養液室３の外面側空間３ｂから第２液体貯留室２２に導くことができる。
連絡流路２７は、一端が第２液体貯留室２２の主室２２ｃの底部に接続され、他端が第１液体貯留室２１の主室２１ｃの底部に接続されている。連絡流路２７は、培養液Ｃ２を第２液体貯留室２２から第１液体貯留室２１に導くことができる。
【００４９】
蓋部１３Ｂは、槽本体１２Ｂの開口を開閉自在かつ気密に閉止可能である。例えば、蓋部１３Ｂは、第１培養液貯留室１および第２培養液貯留室２の上部開口１ｂ，２ｂと、第１液体貯留室２１および第２液体貯留室２２の上部開口２１ｂ，２２ｂと、を、それぞれ気密に閉止可能である。
蓋部１３Ｂが上部開口１ｂ，２ｂ，２１ｂ，２２ｂを気密に閉止する構造としては、例えば、蓋部１３が、上部開口１ｂ，２ｂ，２１ｂ，２２ｂのそれぞれを包囲するように与えられたパッキン１５を介して槽本体１２Ｂの上面に当接する構造を例示できる。
【００５０】
蓋部１３Ｂは、第１培養液貯留室１、第２培養液貯留室２、第１液体貯留室２１、および第２液体貯留室２２に相当する位置に、それぞれ通気孔１ｈ，２ｈ，２１ｈ，２２ｈを有する。通気孔１ｈ，２ｈ，２１ｈ，２２ｈは、それぞれ貯留室１，２，２１，２２に対して気体（例えば空気）を供給、および、貯留室１，２，２１，２２から気体（例えば空気）を排出することができる。通気孔１ｈ，２ｈ，２１ｈ，２２ｈにはそれぞれエアフィルタ１６が設けられることが好ましい。
【００５１】
第１液体貯留室２１には、液体導入流路２５の一端に、第１液体貯留室２１から液体導入流路２５への液体の流れを許容し、かつ第１液体貯留室２１から液体導入流路２５への気体の流入を阻止するラプラス弁３５が設けられている。
第１液体貯留室２１には、連絡流路２７の他端に、連絡流路２７から第１液体貯留室２１へ向かう方向の液体の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁３６が設けられている。
【００５２】
第２液体貯留室２２には、連絡流路２７の一端に、第２液体貯留室２２から連絡流路２７への液体の流れを許容し、かつ第２液体貯留室２２から連絡流路２７への気体の流入を阻止するラプラス弁３７が設けられている。
第２液体貯留室２２には、液体導出流路２６の他端に、液体導出流路２６から第２液体貯留室２２へ向かう方向の液体の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁３８が設けられている。
液体導入流路２５、液体導出流路２６、および連絡流路２７には、それぞれ抵抗流路部位２５ａ，２６ａ，２７ａが形成されている。
【００５３】
［細胞培養方法］
次に、細胞培養装置１０Ｂを使用した細胞培養方法の一例について説明する。
【００５４】
（１）工程１
細胞２０Ａを主培養液室３の隔膜４の内面４ａに播種して接着させる。細胞２０Ｂを第２液体貯留室２２の凹部２２ｄに播種する。
【００５５】
（２）工程２
第２培養液貯留室２に培養液Ｃ１を導入するとともに、第２液体貯留室２２に培養液Ｃ２を導入し、蓋部１３Ｂを閉じる。
【００５６】
（３）工程３
通気孔２ｈ、２２ｈを通して第２培養液貯留室２および第２液体貯留室２２に気体（例えば空気）を供給して各室内を加圧する。この際、第１培養液貯留室１および第１液体貯留室２１は大気に開放しておくことが好ましい。
第２培養液貯留室２内の圧力上昇によって、第２培養液貯留室２内の培養液Ｃ１は、連絡流路７を通って第１培養液貯留室１に導入される。第２液体貯留室２２内の圧力上昇によって、第２液体貯留室２２内の培養液Ｃ２は、連絡流路２７を通って第１液体貯留室２１に導入される。
【００５７】
（４）工程４
通気孔１ｈ、２１ｈを通して第１培養液貯留室１および第１液体貯留室２１に気体（例えば空気）を供給して各室内を加圧する。この際、第２培養液貯留室２および第２液体貯留室２２は大気に開放しておくことが好ましい。
第１培養液貯留室１内の圧力上昇によって、第１培養液貯留室１内の培養液Ｃ１は、培養液導入流路５を通り、主培養液室３の流通空間３ａを経て第２培養液貯留室２に流れる。第１液体貯留室２１内の圧力上昇によって、第１液体貯留室２１内の培養液Ｃ２は、液体導入流路２５を通り、主培養液室３の外面側空間３ｂを経て第２液体貯留室２２に流れる。
【００５８】
工程３，４を繰り返すことによって、第１培養液貯留室１、主培養液室３（流通空間３ａ）、第２培養液貯留室２の間で培養液Ｃ１を循環させることができる。また、第１液体貯留室２１、主培養液室３（外面側空間３ｂ）、培養液導出流路２２の間で培養液Ｃ２を循環させることができる。このように、培養液Ｃ１，Ｃ２を循環させることができるため、シェアストレスが加えられる環境下で細胞２０Ａ，２０Ｂの培養を行うことができる。
【００５９】
細胞培養装置１０Ｂでは、送液のための流路の構造を簡略にすることができるため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
細胞培養装置１０Ｂは、細胞２０Ａに脳血管内皮細胞を用い、細胞２０Ｂに脳神経細胞を用いることで脳への薬物輸送・薬効発現評価モデルとして使用できる。
【００６０】
（第４実施形態）
［細胞培養装置］
第４実施形態の細胞培養装置１０Ｃについて、図面を参照して説明する。
図５は、細胞培養装置１０Ｃを模式的に示す断面図である。
図５に示すように、細胞培養装置１０Ｃは、貯留槽１１Ｃと、加圧ポンプ（図示略）とを備えている。貯留槽１１Ｃは、１つの細胞培養ユニット９Ｃを備えている。貯留槽１１Ｃは、槽本体１２Ｃと、蓋部１３Ｃと、を備えている。
【００６１】
細胞培養ユニット９Ｃは、主培養液室３と、第１培養液貯留室１と、第２培養液貯留室２と、第３培養液貯留室８と、主培養液室３内の隔膜４（４Ｃ１）と、第３培養液貯留室８内の隔膜４（４Ｃ２）と、培養液導入流路５Ｃと、培養液導出流路６と、第１連絡流路７Ｃ１と、第２連絡流路７Ｃ２と、第１液体貯留室２１と、第２液体貯留室２２と、液体導入流路２５と、液体導出流路２６と、連絡流路２７と、を有する。
【００６２】
第３培養液貯留室８は、主室８ｃと、主室８ｃの底面８ｅに形成された凹部８ｄとを有する。主室８ｃの内部空間は培養液Ｃ３が貯留される貯留空間８ａである。凹部８ｄの内部空間のうち、凹部８ｄ内に設けられた隔膜４（４Ｃ２）の内面４ａ側の空間は貯留空間８ａの一部である。凹部８ｄの内部空間のうち隔膜４（４Ｃ２）の外面４ｂ側の空間は、外面側空間８ｂである。
隔膜４（４Ｃ２）は、貯留空間８ａと外面側空間８ｂとを隔てるように設置されている。隔膜４（４Ｃ２）の内面４ａ（一方の面）は貯留空間８ａに臨み、外面４ｂ（他方の面）は外面側空間８ｂに臨んでいる。
【００６３】
培養液導入流路５Ｃは、一端が第３培養液貯留室８の凹部８ｄの底部に接続され、他端が主培養液室３の主室３ｃの底部に接続されている。培養液導入流路５Ｃは、培養液Ｃ１を第３培養液貯留室８の外面側空間８ｂから主培養液室３の流通空間３ａに導くことができる。
第１連絡流路７Ｃ１は、一端が第２培養液貯留室２の主室２ｃの底部に接続され、他端が第１培養液貯留室１の主室１ｃの底部に接続されている。第１連絡流路７Ｃ１は、培養液Ｃ１を第２培養液貯留室２から第１培養液貯留室１に導くことができる。
第２連絡流路７Ｃ２は、一端が第１培養液貯留室１の主室１ｃの底部に接続され、他端が第３培養液貯留室８の凹部８ｄの底部に接続されている。第２連絡流路７Ｃ２は、培養液Ｃ１を第２培養液貯留室２から第３培養液貯留室８の外面側空間８ｂに導くことができる。
培養液導入流路５Ｃ、第１連絡流路７Ｃ１、および第２連絡流路７Ｃ２には、それぞれ抵抗流路部位５Ｃａ，７Ｃ１ａ，７Ｃ２ａが形成されている。
【００６４】
次に、細胞培養装置１０Ｃを使用した細胞培養方法の一例について説明する。
（１）工程１
細胞２０Ａを第３培養液貯留室８の隔膜４（４Ｃ２）の内面４ａに播種して接着させる。細胞２０Ｂを第１培養液貯留室１の凹部１ｄに播種する。細胞２０Ｃを第２培養液貯留室２の凹部２ｄに播種する。細胞２０Ｄを主培養液室３の隔膜４（４Ｃ１）の内面４ａに播種して接着させる。
（２）工程２
第２培養液貯留室２に培養液Ｃ１を導入するとともに、第２液体貯留室２２に液体培地Ｍ１（液体）を導入し、蓋部１３Ｃを閉じる。
【００６５】
（３）工程３
第２培養液貯留室２および第２液体貯留室２２に気体を供給して各室内を加圧する。
培養液Ｃ１は、第２培養液貯留室２、第１連絡流路７Ｃ１、第１培養液貯留室１の順に流れる。
液体培地Ｍ１は、第２液体貯留室２２、連絡流路２７、第１液体貯留室２１の順に流れる。
【００６６】
（４）工程４
第１培養液貯留室１および第１液体貯留室２１に気体を供給して各室内を加圧する。
培養液Ｃ１は、第１培養液貯留室１、第３培養液貯留室８の外面側空間８ｂ、主培養液室３の流通空間３ａ、第２培養液貯留室２の順に流れる。
液体培地Ｍ１は、第１液体貯留室２１、主培養液室３の外面側空間３ｂ、第２液体貯留室２２の順に流れる。
【００６７】
工程３，４を繰り返すことによって、第２培養液貯留室２、第１培養液貯留室１、第３培養液貯留室８（外面側空間８ｂ）、主培養液室３（流通空間３ａ）の間で培養液Ｃ１を循環させることができる。また、第２液体貯留室２２、第１液体貯留室２１、主培養液室３（外面側空間３ｂ）の間で培養液を循環させることができる。そのため、シェアストレスが加えられる環境下で細胞２０Ａ〜２０Ｄの培養を行うことができる。
【００６８】
細胞培養装置１０Ｃでは、送液のための流路の構造を簡略にすることができるため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
【００６９】
細胞培養装置１０Ｃは、細胞２０Ａに腸管上皮細胞（小腸モデル）を用い、細胞２０Ｂに肝細胞（肝臓モデル）を用い、細胞２０Ｃにがん細胞（がんモデル）を用い、細胞２０Ｄに尿細管細胞（腎臓モデル）を用いることで、腸で吸収され、肝臓で代謝され、腎臓で排泄される薬剤の薬物動態評価、全身性の抗がん作用発現評価モデルとして使用できる。
【００７０】
第３実施形態の細胞培養装置１０Ｂの具体例について、図面を参照して説明する。
図６は、細胞培養装置１０Ｂを示す斜視図である。図７は、細胞培養装置１０Ｂの分解斜視図である。図８Ａは細胞培養装置１０Ｂの分解状態の正断面図である。図８Ｂは細胞培養装置１０Ｂの正断面図である。図９Ａは細胞培養装置１０Ｂの分解状態の側断面図である。図９Ｂは細胞培養装置１０Ｂの側断面図である。
【００７１】
図６〜図９Ｂに示すように、細胞培養装置１０Ｂの貯留槽１１Ｂは、複数の細胞培養ユニット９Ｂ（図４参照）を備えている。
貯留槽１１Ｂは、槽本体１２Ｂと、蓋部１３Ｂと、基体部４０と、蓋部押圧部４１と、壁部押圧部４７と、を備えている。
基体部４０は、底板５１と、底板５１の側縁から上方に突出して形成された厚肉部５２，５２と、底板５１の端縁から上方に突出して形成された端壁部５３，５３と、を備えている。底板５１と、厚肉部５２，５２と、端壁部５３，５３とは、底部プレート４５を収容する収容空間５４を画成している。厚肉部５２の両端面には、押圧バー４３の端部が挿入される挿入穴５２ａ、および押圧バー４８の端部が挿入される挿入穴５２ｂが形成されている。基体部４０は、底板５１上に置かれた槽本体１２Ｃを支持する。
【００７２】
蓋部押圧部４１は、槽本体１２Ｂに向けて蓋部１３を押圧する一対の押圧バー４３（押圧部材）を有する。押圧バー４３は、両端部を挿入穴５２ａに挿入した状態で、この挿入部分を支点として、厚肉部５２に沿う中心軸の軸周り方向に回動可能となっている。押圧バー４３は、蓋部１３Ｂの上面の両側部に形成された係止凹部５５に係止させることができる。これによって、蓋部１３Ｂを槽本体１２Ｂに対して押さえつけた状態で保持するとともに、槽本体１２Ｂの内部空間を密閉することができる。
【００７３】
槽本体１２Ｂは、底部プレート４５と、底部プレート４５の上面４５ａ（一方の面）に設けられたブロック状の壁部４６と、を備えている。
壁部４６は、厚さ方向に貫通して形成された複数の貫通孔部５０を有する。第１培養液貯留室１、第２培養液貯留室２、主培養液室３、第１液体貯留室２１、および第２液体貯留室２２は、貫通孔部５０と、底部プレート４５とによって区画される空間であり、平面視形状はそれぞれ長円形である。
【００７４】
底部プレート４５には、培養液導入流路５と、培養液導出流路６と、連絡流路７と、液体導入流路２５と、液体導出流路２６と、連絡流路２７とが形成されている（図４参照）。
壁部押圧部４７は、底部プレート４５に向けて壁部４６を押圧する押圧バー４８（押圧部材）を有する。押圧バー４８は、例えば金属などで構成されており、両端部を挿入穴５２ｂに挿入した状態で、この挿入部分を支点として、厚肉部５２に沿う中心軸の軸周り方向に回動可能となっている。押圧バー４８は、壁部４６の両側部に形成された係止凹部５６に係止させることができる。これによって、壁部４６を底部プレート４５に対して押圧し、底部プレート４５に隙間なく密着させることができる。壁部押圧部４７は、押圧バー４８によって、壁部４６を底部プレート４５に向けて押さえつけた状態で保持することができる。
【００７５】
図８Ａおよび図８Ｂに示すように、細胞培養装置１０Ｂでは、複数の細胞培養ユニット９Ｂの第１培養液貯留室１のうち少なくとも２つは気体流路１８によって互いに連通されていることが好ましい。また、複数の細胞培養ユニット９Ｂの第２培養液貯留室２のうち少なくとも２つは気体流路（図示略）によって互いに連通されていることが好ましい。また、複数の細胞培養ユニット９Ｂの第１液体貯留室２１のうち少なくとも２つは気体流路（図示略）によって互いに連通されていることが好ましい。また、複数の細胞培養ユニット９Ｂの第２液体貯留室２２のうち少なくとも２つは気体流路（図示略）によって互いに連通されていることが好ましい。
【００７６】
細胞培養装置１０Ｂでは、複数の細胞培養ユニット９Ｂが、蓋部１３Ｂに形成された気体流路１８によって互いに連通されているため、複数の細胞培養ユニット９Ｂの貯留室を一括的に加圧することができる。例えば、複数の第１培養液貯留室１を一括的に加圧することができる。同様に、第２培養液貯留室２、第１液体貯留室２１、および第２液体貯留室２２についても一括的な加圧が可能である。そのため、細胞培養装置１０Ｂでは、容易な操作で、複数の細胞培養ユニット９Ｂにおける試験を並列的に行うことができる。
【００７７】
槽本体１２Ｂおよび蓋部１３Ｂは、例えば樹脂（プラスチック）、ガラス等が使用できる。細胞を光学的に観察することが容易であることから、前記材料は透明材料であることが好ましく、具体的には樹脂およびガラスが好ましい。
樹脂としては、シリコーン系樹脂（例えばポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ）)、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ））、スチレン系樹脂（例えばポリスチレン）、ポリビニルピリジン系樹脂（ポリ（４−ビニルピリジン）、４−ビニルピリジン−スチレン共重合体等）、ポリオレフィン系樹脂（例えばポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂）、ポリエステル樹脂（ポリエチレンテレフタレート樹脂（ＰＥＴ））、ポリカーボネート系樹脂、エポキシ系樹脂等がある。
なかでも、シリコーン系樹脂（例えばポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ）)、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ））、スチレン系樹脂（例えばポリスチレン）は、高い透明性を有するため好ましい。
【００７８】
細胞培養装置１０Ｂでは、複数の細胞培養ユニット９Ｂを有するため、複数の試験を並列的に行うことができる。また、装置の構造を簡略にすることができるため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
細胞培養装置１０Ｂは、容易な操作で、多数の被検体の影響を効率よく評価できる点で優れている。
【００７９】
上述の実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
例えば、図４等に示す細胞培養装置１０Ｂの貯留槽１１Ｂは、槽本体１２Ｂと蓋部１３Ｂとを有するが、これに限らず、一体型の貯留槽を採用してもよい。
本実施形態は、細胞工学分野、再生医療分野、バイオ関連工業分野、組織工学分野などにおいて有用である。特に、医薬品の開発、細胞生物学の基礎研究に有用である。
【符号の説明】
【００８０】
１    第１培養液貯留室
１ｄ，２ｄ，３ｄ，２１ｄ，２２ｄ    細胞保持凹部（細胞保持部）
１ｈ，２ｈ，２１ｈ，２２ｈ    通気孔
２    第２培養液貯留室
３    主培養液室
３ａ    流通空間
４    隔膜
４ａ    内面（一方の面）
５    培養液導入流路
６    培養液導出流路
５ａ，６ａ    抵抗流路部位
９，９Ｂ，９Ｃ    細胞培養ユニット
１０，１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ    細胞培養装置
１１，１１Ａ，１１Ｂ，１１Ｃ    貯留槽
１２，１２Ｂ，１２Ｃ    槽本体
１３，１３Ｂ，１３Ｃ    蓋部
１４    加圧ポンプ（加圧手段）
２１    第１液体貯留室
２２    第２液体貯留室
２５    液体導入流路
２６    液体導出流路
３２，３４，３６，３８    逆止弁
３１，３５，３７    ラプラス弁
４１    蓋部押圧部
４３    押圧バー（押圧部材）
４５    底部プレート
４６    壁部
４７    壁部押圧部
４８    押圧バー（押圧部材）
Ｃ１，Ｃ２    培養液
Ｍ１    液体培地（液体）
【図１】
2017154880.tif 000007
【図２】
2017154880.tif 000008
【図３】
2017154880.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2017154880.tif 000013
【図８Ａ】
2017154880.tif 000014
【図８Ｂ】
2017154880.tif 000015
【図９Ａ】
2017154880.tif 000016
【図９Ｂ】
2017154880.tif 000017
【図１０Ａ】
2017154880.tif 000018
【図１０Ｂ】
2017154880.tif 000019
【図１０Ｃ】
2017154880.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月7日(2018.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養装置であって、
複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、
前記複数の前記細胞培養ユニットの各々は、
細胞の培養液が流通する流通空間を有する主培養液室と、
前記細胞が接着可能な一方の面が前記流通空間に臨む透過性の隔膜と、
前記培養液が貯留される気密構造の第１培養液貯留室と、
前記培養液が貯留される第２培養液貯留室と、
前記培養液を前記第１培養液貯留室から前記主培養液室の前記流通空間に導く培養液導入流路と、
前記培養液を前記流通空間から前記第２培養液貯留室に導く培養液導出流路と、を有し、
前記貯留槽は、前記第１培養液貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有し、
前記複数の前記細胞培養ユニットにおける複数の前記第１培養液貯留室のうち少なくとも２つには、気体が流通可能となるように互いに連通された気体流路が設けられており、
前記気体流路は、前記複数の前記細胞培養ユニットの間において、前記気体流路を用いて、前記培養液を一括的に送ることが可能なように構成されている、
細胞培養装置。
【請求項２】
前記複数の前記細胞培養ユニットの各々は、
液体が貯留される気密構造の第１液体貯留室と、
前記液体が貯留される第２液体貯留室と、
前記第１液体貯留室を供給源とする前記液体を、前記隔膜の他方の面側の空間から前記第２液体貯留室に導く液体導出流路と、を有し、
前記貯留槽は、前記第１液体貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記複数の前記細胞培養ユニットにおける前記第１液体貯留室のうち少なくとも２つは、気体が流通可能となるように互いに連通されている、請求項２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記第１培養液貯留室と、前記第２培養液貯留室とは、播種された細胞が保持される細胞保持部を有する、請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
前記培養液導出流路から前記第２培養液貯留室への前記培養液の流れを制御する逆流防止機構をさらに備えている、請求項１〜４のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記逆流防止機構は、前記培養液導出流路から前記第２培養液貯留室へ向かう方向の前記培養液の流れを許容し、かつ前記流れの逆の方向の流れを阻止する逆止弁である、請求項５に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記第１培養液貯留室から前記培養液導入流路への前記培養液の流れを制御する逆流防止機構をさらに備えている、請求項１〜４のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記逆流防止機構は、前記第１培養液貯留室から前記培養液導入流路への前記培養液の流れを許容し、かつ前記第１培養液貯留室から前記培養液導入流路への気体の流れを阻止するラプラス弁である、請求項７に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記培養液導入流路と培養液導出流路のうち少なくともいずれか一方は、流路断面積が他の部位に比べて１／１０以下である抵抗流路部位を有する、請求項１〜８のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
前記流通空間は、前記隔膜の厚さ方向の距離が１μｍ〜１０００μｍである、請求項１〜９のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
前記貯留槽は、前記主培養液室、前記第１培養液貯留室および前記第２培養液貯留室が形成された容器状の槽本体と、前記主培養液室、前記第１培養液貯留室および前記第２培養液貯留室の開口を開閉自在かつ気密に閉止する蓋部とを有する、請求項１〜１０のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
前記蓋部を前記槽本体に向けて押さえつけて保持する蓋部押圧部をさらに備え、
前記蓋部押圧部は、前記槽本体に向けて前記蓋部を押圧する押圧部材を有する、請求項１１に記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
前記槽本体は、前記液体導出流路を有する底部プレートと、前記底部プレートの一方の面に設けられた壁部とを備え、
前記主培養液室、前記第１培養液貯留室および前記第２培養液貯留室は、前記底部プレートと前記壁部とによって区画された空間である、請求項１１または１２に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
前記壁部を前記底部プレートに向けて押さえつけて保持する壁部押圧部をさらに備え、
前記壁部押圧部は、前記底部プレートに向けて前記壁部を押圧する押圧部材を有する、請求項１３に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
前記第１培養液貯留室内を加圧可能な加圧手段をさらに備えている、請求項１〜１４のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１６】
細胞培養方法であって、
複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記複数の前記細胞培養ユニットの各々は、細胞の培養液が流通する流通空間を有する主培養液室と、前記細胞が接着可能な一方の面が前記流通空間に臨む透過性の隔膜と、前記培養液が貯留される気密構造の第１培養液貯留室と、前記培養液が貯留される第２培養液貯留室と、前記培養液を前記第１培養液貯留室から前記主培養液室の前記流通空間に導く培養液導入流路と、前記培養液を前記流通空間から前記第２培養液貯留室に導く培養液導出流路と、を有し、前記貯留槽は、前記第１培養液貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有し、前記複数の前記細胞培養ユニットにおける複数の前記第１培養液貯留室のうち少なくとも２つには、気体が流通可能となるように互いに連通された気体流路が設けられており、
前記気体流路は、前記複数の前記細胞培養ユニットの間において、前記気体流路を用いて、前記培養液を一括的に送ることが可能なように構成されている細胞培養装置を使用し、
前記第１培養液貯留室に前記通気孔を通して気体を供給して前記第１培養液貯留室を加圧し、前記第１培養液貯留室内の圧力上昇によって、前記第１培養液貯留室内の培養液を前記培養液導入流路を通して前記主培養液室に導くとともに、前記主培養液室内の培養液を前記培養液導出流路を通して前記第２培養液貯留室に導く、細胞培養方法。
【国際調査報告】
2017154880.tif 000021
2017154880.tif 000022
2017154880.tif 000023
2017154880.tif 000024