(57)【要約】  本発明は、脊椎動物のＩＧＦ−Ｉ受容体に特異的に結合し、脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性を有する、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物のＩＧＦ−Ｉ受容体に特異的に結合し、脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性を有する、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項２】
脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性が、天然型ＩＧＦ−Ｉと同程度以上である、請求項１に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項３】
脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＥＣ５０値が、天然型ＩＧＦ−Ｉに対して１／２０以下である、請求項１又は２に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項４】
培養下の脊椎動物由来細胞に接触させた場合における、当該培養細胞との接触時間に対する当該培養細胞の増殖誘導作用の持続性が、天然型ＩＧＦ−Ｉと比べて改善されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項５】
天然型ＩＧＦ−Ｉが配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩＧＦ−Ｉである、請求項２から４のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項６】
脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  におけるＥＣ５０値が、０．１ｎｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項７】
脊椎動物に非経口投与されることによって、当該脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する活性を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項８】
脊椎動物へ１週間に１回以下の頻度で投与する、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項９】
脊椎動物が、ヒト、又はモルモット、サル、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌもしくはニワトリを含む非ヒト動物、さらにはヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を発現させた非ヒト動物である、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項１０】
脊椎動物由来細胞の増殖を誘導する用量において、分化筋細胞でのグルコース取込みを誘導しないことを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性を示すＥＣ５０値の１００倍以上の用量においても分化筋細胞でのグルコース取込みを誘導しないことを特徴とする、請求項１０に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項１２】
脊椎動物由来細胞がヒト又はヒト以外の哺乳動物に由来する筋芽細胞である、請求項１０又は１１に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項１３】
脊椎動物に非経口投与され、当該脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する用量において、当該脊椎動物の血糖値を低下させないことを特徴とする、請求項７から１２のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項１４】
脊椎動物に非経口投与され、当該脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する有効用量に対して１０倍以上の用量においても、当該脊椎動物の血糖値を変動させないことを特徴とする、請求項１３に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項１５】
ＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインに結合する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項１６】
ＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインに結合し、ＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−ＩＩとＩＧＦ−Ｉ受容体の結合を阻害する、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項１７】
ＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインの配列におけるＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＸ１Ｘ２ＧｌｎＳｅｒＭｅｔ（Ｘ１はＧｌｙ又はＳｅｒ、Ｘ２はＳｅｒ又はＴｈｒ）を含むエピトープ又はその近傍に結合することを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項１８】
ＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインの配列におけるＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｎＳｅｒＭｅｔを含むエピトープ又はその近傍に結合することを特徴とする、請求項１７に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項１９】
ヒト、又はモルモット、サル、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌもしくはニワトリを含む非ヒト動物のＩＧＦ−Ｉ受容体と交差反応性を有する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項２０】
当該抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体の抗原抗体反応は、解離平衡定数（ＫＤ）が１×１０−８Ｍ以下の親和性強度を有することを特徴とする、請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項２１】
当該抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、１）〜４）のうち少なくとも一つの特徴を有する、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
１）脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性を有する。
２）脊椎動物に非経口投与することによって、当該脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する活性を有する。
３）脊椎動物由来細胞の増殖を誘導する用量において、分化筋細胞でのグルコース取込みを誘導しない。
４）脊椎動物に非経口投与され、当該脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する用量において、当該脊椎動物の血糖値を変動させない。
【請求項２２】
抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、１）〜４）の少なくとも一つの特徴を有する、請求項１６から２１のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
１）ＩＧＦ−Ｉによる脊椎動物由来細胞の増殖を阻害する。
２）脊椎動物に非経口投与することによって、当該脊椎動物におけるＩＧＦ−Ｉに起因する細胞増殖性疾患における細胞増殖を抑制する。
３）ＩＧＦ−Ｉによる脊椎動物由来細胞の増殖を阻害する用量において、分化筋細胞でのグルコース取込みに影響しない。
４）脊椎動物に非経口投与され、当該脊椎動物におけるＩＧＦ−Ｉに起因する細胞増殖性疾患における細胞増殖を抑制する用量において、当該脊椎動物の血糖値を変動させない。
【請求項２３】
抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙもしくは二重特異性抗体、又はそれらの誘導体である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項２４】
重鎖可変領域のＣＤＲ−１（ＣＤＲ−Ｈ１）配列として配列番号３又は配列番号３のいずれか１か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ−２（ＣＤＲ−Ｈ２）配列として配列番号４又は配列番号４のいずれか１か所又は２か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ−３（ＣＤＲ−Ｈ３）配列として配列番号５又は配列番号５のいずれか１か所又は２か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ−１（ＣＤＲ−Ｌ１）配列として配列番号６又は配列番号６のいずれか１か所又は２か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ−２（ＣＤＲ−Ｌ２）配列として配列番号７又は配列番号７のいずれか１か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列、及び
軽鎖可変領域のＣＤＲ−３（ＣＤＲ−Ｌ３）配列として配列番号８又は配列番号８のいずれか１か所又は２か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列、
を含むアミノ酸配列からなる請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項２５】
免疫グロブリンのフレームワーク配列をさらに含む、請求項２４に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項２６】
免疫グロブリンのフレームワーク配列が、ヒト、又はモルモット、サル、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、マウスもしくはラットを含む非ヒト動物の免疫グロブリンの各クラスにおけるフレームワーク配列である、請求項２５に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項２７】
重鎖可変領域として配列番号９又は配列番号９と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び軽鎖可変領域として配列番号１０又は配列番号１０と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる請求項１から２６のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項２８】
ヒト、又はモルモット、サル、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、マウスもしくはラットを含む非ヒト動物の免疫グロブリンの各クラスにおける定常領域をさらに含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体をコードするポリヌクレオチド配列からなる核酸分子。
【請求項３０】
請求項２９に記載の核酸分子を少なくとも一つ含むクローニングベクター又は発現ベクター。
【請求項３１】
宿主細胞に請求項３０に記載のベクターが導入された組換え体細胞。
【請求項３２】
請求項３１に記載の組換え体細胞を培養し、前記組換え体細胞から産生される当該抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体を精製する工程を含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体の製造方法。
【請求項３３】
請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体、請求項２９に記載の核酸分子、請求項３０に記載のベクター、あるいは請求項３１に記載の組換え体細胞を含む医薬組成物。
【請求項３４】
請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体、請求項２９に記載の核酸分子、請求項３０に記載のベクター、あるいは請求項３１に記載の組換え体細胞以外の活性成分をさらに含む、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
活性成分が成長ホルモン又はそのアナログ、インスリン又はそのアナログ、ＩＧＦ−ＩＩ又はそのアナログ、抗ミオスタチン抗体、ミオスタチンアンタゴニスト、抗アクチビンＩＩＢ型受容体抗体、アクチビンＩＩＢ受容体アンタゴニスト、可溶性アクチビンＩＩＢ型受容体又はそのアナログ、グレリン又はそのアナログ、フォリスタチン又はそのアナログ、ベータ２アゴニスト、及び選択的アンドロゲン受容体モジュレーターから１つ以上選択される、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
活性成分がコルチコステロイド、制吐薬、オンダンセトロン塩酸、グラニセトロン塩酸、メトロクロプラミド（ｍｅｔｒｏｃｌｏｐｒａｍｉｄｅ）、ドンペリドン、ハロペリドール、シクリジン、ロラゼパム、プロクロルペラジン、デキサメタゾン、レボメプロマジン、トロピセトロン、癌ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ阻害薬、ＧＭ−ＣＳＦ  ＤＮＡワクチン、細胞に基づくワクチン、樹状細胞ワクチン、組換えウイルスワクチン、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）ワクチン、同種腫瘍ワクチン、自己腫瘍ワクチン、鎮痛薬、イブプロフェン、ナプロキセン、トリサリチル酸コリンマグネシウム、オキシコドン塩酸、抗血管形成薬、抗血栓薬、抗ＰＤ−１抗体、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、アテゾリズマブ、抗ＣＴＬＡ４抗体、イピリムマブ、抗ＣＤ２０抗体、リツキシマブ、抗ＨＥＲ２抗体、トラスツズマブ、抗ＣＣＲ４抗体、モガムリズマブ、抗ＶＥＧＦ抗体、ベバシズマブ、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性ＶＥＧＦ受容体断片、抗ＴＷＥＡＫ抗体、抗ＴＷＥＡＫ受容体抗体、可溶性ＴＷＥＡＫ受容体断片、ＡＭＧ  ７０６、ＡＭＧ  ３８６、抗増殖薬、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害薬、αｖβ３阻害薬、αｖβ５阻害薬、ｐ５３阻害薬、Ｋｉｔ受容体阻害薬、ｒｅｔ受容体阻害薬、ＰＤＧＦＲ阻害薬、成長ホルモン分泌阻害薬、アンジオポエチン阻害薬、腫瘍浸潤マクロファージ阻害薬、ｃ−ｆｍｓ阻害薬、抗ｃ−ｆｍｓ抗体、ＣＳＦ−１阻害薬、抗ＣＳＦ−１抗体、可溶性ｃ−ｆｍｓ断片、ペグビソマント、ゲムシタビン、パニツムマブ、イリノテカン、及びＳＮ−３８からなる群より選択される成分を含む、請求項３４又は３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
請求項１〜２８に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体、請求項２９に記載の核酸分子、請求項３０に記載のベクター、及び請求項３１に記載の組換え体細胞の内、いずれか一つ以上を含む、ＩＧＦ−Ｉに関連した状態の治療又は予防に用いられる医薬。
【請求項３８】
ＩＧＦ−Ｉに関連した状態が、廃用性筋萎縮、低身長症、糖尿病性腎症、慢性腎不全、ラロン症、肝硬変、肝線維化、老化、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）、神経疾患、脳卒中、脊髄損傷、心血管保護、糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、骨粗しょう症、嚢胞性線維症、創傷治癒、筋強直性ジストロフィー、エイズ筋減弱症、ＨＩＶに伴う脂肪再分布症候群、火傷、クローン病、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖性複合免疫不全症、難聴、神経性無食欲症及び未熟児網膜症、ターナー症候群、プラダー・ウィリー症候群、シルバー・ラッセル症候群、特発性低身長、肥満、多発性硬化症、線維筋痛症、潰瘍性大腸炎、低筋肉量、心筋虚血及び低骨密度から選択される、請求項３７に記載の医薬。
【請求項３９】
非経口投与される、請求項３７又は３８に記載の医薬。
【請求項４０】
非ヒト動物に投与される動物用医薬である、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項４１】
当該動物用医薬が、筋肉量及び／又は体長の増大、成長の促進、乳汁産生量の増大、繁殖の促進、又は老化の予防の目的で投与される、請求項４０に記載の医薬。
【請求項４２】
非ヒト動物が、モルモット、サル、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌ、又はニワトリである、請求項４０又は４１に記載の動物用医薬。
【請求項４３】
ＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−Ｉ受容体への作用に起因する疾患の治療又は予防に用いられる、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項４４】
ＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−Ｉ受容体への作用に起因する疾患が、肝臓がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、小児がん、先端巨大症、卵巣がん、膵臓がん、良性前立腺肥大症、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、結腸直腸がん、頚部がん、滑膜肉腫、膀胱がん、胃がん、ウィルムス腫瘍、転移性カルチノイド及び血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍に関連する下痢、ビポーマ、ウェルナー−モリソン症候群、ベックウィズ−ヴィーデマン症候群、腎臓がん、腎細胞がん、移行上皮がん、ユーイング肉腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、脳腫瘍、膠芽腫、非膠芽腫性脳腫瘍、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、脳室上衣腫、脈絡叢乳頭腫、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管の平滑筋再狭窄、不適切な微小血管増殖、糖尿病性網膜症、グレーヴズ病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺炎ならびにベーチェット病からなる群より選択される疾患である、請求項４３に記載の医薬。
【請求項４５】
脊椎動物由来の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する方法であって、培養の過程で当該脊椎動物由来の細胞を、請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体、請求項２９に記載の核酸分子、請求項３０に記載のベクター、及び請求項３１に記載の組換え体細胞のいずれか一つ以上と接触される工程を含む、培養方法。
【請求項４６】
当該接触の工程が、脊椎動物由来の細胞の増殖促進又は分化誘導の目的で行われる、請求項４５に記載の培養方法。
【請求項４７】
抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が固相に吸着又は固定されている、請求項４５又は４６に記載の培養方法。
【請求項４８】
ＩＧＦ−Ｉ受容体遺伝子のＣＲドメインに変異が導入された遺伝子組換え動物であって、当該ＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインが、遺伝子組み換えによって、ＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｎＳｅｒＭｅｔのアミノ酸配列を有することを特徴とする、遺伝子組換え動物。
【請求項４９】
異種のＩＧＦ−Ｉ受容体遺伝子が導入された遺伝子組換え動物であって、当該動物の内在的に保有するＩＧＦ−Ｉ受容体のアミノ酸配列に対して、導入されたＩＧＦ−Ｉ受容体遺伝子のコードするアミノ酸配列のＣＲドメインにおけるＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＸ１Ｘ２ＧｌｎＳｅｒＭｅｔの部分の配列のうちＸ１及び／又はＸ２のアミノ酸残基が、当該動物の内在的に保有するＩＧＦ−Ｉ受容体のアミノ酸配列と一致しないＩＧＦ−Ｉ受容体遺伝子が導入されている、遺伝子組換え動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体に関する。具体的には、脊椎動物のＩＧＦ−Ｉ受容体に特異的に結合する抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．ＩＧＦ−Ｉ
ＩＧＦ−Ｉは、インスリン様成長因子（Insulin-like growth factor)であり、主に肝臓から分泌され、ＩＧＦ−Ｉ受容体に作用することにより、各種臓器で種々の生理機能を発現する。このことからＩＧＦ−Ｉは、種々の疾患への治療が期待される。ＩＧＦ−Ｉは、プロインスリンのアミノ酸配列と比較して、約４０％と高い相同性を有することから、インスリン受容体にも結合して、インスリン様の作用を発現することがある（非特許文献１）。また、ＩＧＦ−Ｉ受容体は、インスリン受容体のアミノ酸配列と比較して、約６０％と高い相同性を有することから、両受容体はヘテロ二量体を形成することがある（非特許文献１）。なお、インスリンは、インスリン受容体に作用することにより、強力な血糖低下作用を発現することから、血糖降下薬として治療に用いられている。【０００３】
２．ＩＧＦ−Ｉ受容体
ＩＧＦ−Ｉ受容体はα鎖及びβ鎖で構成され、Ｌ１、ＣＲ、Ｌ２、Ｆｎ１、Ｆｎ２及びＦｎ３の６つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む膜貫通タンパク質である（非特許文献２）。ＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞内ドメインは、チロシンキナーゼを有する。細胞外ドメインであるＣＲ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎ）は、ＩＧＦ−ＩがＩＧＦ−Ｉ受容体に結合した時の当該受容体の立体構造の変化に伴う、細胞内のチロシンキナーゼの活性化に関与する。ＩＧＦ−Ｉ受容体は、ホモ二量体複合体（ホモ型）を形成して、ＩＧＦ−Ｉが結合すると、受容体キナーゼを活性化することにより信号を送る。また、インスリン受容体とのヘテロ二量体複合体（ヘテロ型）を形成して、インスリン又はＩＧＦ−Ｉが結合すると、受容体キナーゼを活性化することにより信号を送る（非特許文献３、４）。【０００４】
３．ＩＧＦ−Ｉの生理作用
ＩＧＦ−Ｉは、身長や体重増加等の成長促進作用、及び糖代謝促進や血糖低下作用等のインスリン様代謝作用が明らかにされている。ヒト組換えＩＧＦ−Ｉであるメカセルミンは、インスリン受容体異常症の高血糖、高インスリン血症、黒色表皮腫及び多毛といった症状を改善することが認められている。また、成長ホルモン抵抗性低身長症の成長障害を改善することが認められている（非特許文献５）。
ＩＧＦ−Ｉの成長促進作用として、ＩＧＦ−Ｉはヒト軟骨細胞のＤＮＡ合成能を亢進させることが知られている。また、ＩＧＦ−Ｉの投与は、下垂体摘除ラットの体重を増加させ、大腿骨骨長を伸長させる（非特許文献５）。【０００５】
４．ＩＧＦ−Ｉの筋肉量増加作用
ＩＧＦ−Ｉを介した細胞増殖活性の亢進は、ＩＧＦ−Ｉ受容体の持続的な活性化が必要である（非特許文献６）。ＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現させた動物では筋肉量が増加している（非特許文献７）。また、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ３の持続投与は、大腿骨近位部骨折患者の握力を亢進させ、介助なしでの座位からの立ち上がり能力を改善させる（非特許文献８）。高齢のヒト及びマウスの筋肉中のＩＧＦ−Ｉ濃度は、若齢と比較して低下することが知られているが（非特許文献９、１０）、ＩＧＦ−Ｉを筋組織特異的に強制発現させた高齢マウスでは、野生型マウスと比較して、筋肉量が改善した（非特許文献１１）。【０００６】
５．筋肉量を増加させる先行品
グレリン受容体の作動薬であるアナモレリンは、廃用性筋萎縮症であるカケキシアの臨床試験において、除脂肪量を増加させた。一方、副作用として、吐き気及び血糖値の上昇が認められる（非特許文献１２）。
ミオスタチンは、アクチビン受容体ＩＩ（ＡｃｔＲＩＩ）に作用して、Ａｋｔ／ｍＴＯＲを阻害する、骨格筋形成の負の制御因子である（非特許文献１３〜１５）。抗ミオスタチン抗体であるＬＹ２４９５６５５は、全人工股関節置換術を実施した患者及び高齢者の筋肉量を増加させる（非特許文献１６、１７）。
また、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体であるビマグルマブは、神経筋疾患患者の筋肉量を増加させる（非特許文献１８）。しかし、骨格筋の形成を促進させ、治療のために使用できる薬は現在のところ存在しない。【０００７】
６．成長を促進させる先行品
ヒト組換えＧＨ製剤（成長ホルモン製剤）はＧＨ受容体を活性化し、ＩＧＦ−Ｉを分泌させ、成長促進効果が認められる。一方、1日1回投与の皮下注射剤のため、服薬コンプライアンス（投与忘れなど）に起因した成長効果の低下が認められている（非特許文献１９）。ＧＨ製剤の動態を改善し、週1回又は２週に1回投与の持続型ＧＨ製剤が開発中である。
しかし、服薬コンプライアンスを改善し、成長促進作用を有する、治療のために使用できる薬は現在のところ存在しない。さらに、ＧＨ製剤は、ＧＨ受容体活性化に対する感受性が低下した、ＧＨ受容体異常、又はＧＨ治療に抵抗性を有する患者に対して、成長効果の低下が認められている（非特許文献２０）。
ＩＧＦ−Ｉは、ＧＨ受容体の下流で作用することから、ＧＨ受容体活性化に対する感受性が低下した患者に対しても成長促進作用を有する唯一の治療薬である。しかし、ＩＧＦ−Ｉ製剤は１日２回投与の注射剤であり、服薬コンプライアンスが悪いだけでなく、副作用として低血糖が認められている（非特許文献２１）。ＩＧＦ−Ｉの服薬コンプライアンス、及び低血糖を改善させ、治療のために使用できる薬剤は現在のところ存在しない。【０００８】
７．ＩＧＦ−Ｉの血糖低下作用
ＩＧＦ−Ｉのインスリン様作用として、血糖低下作用が知られている。ＩＧＦ−Ｉは、ラット筋肉由来細胞においてグルコース取込み作用を亢進させる（非特許文献５）。また、ＩＧＦ−Ｉの投与は、ラットの血糖値を低下させる（非特許文献５）。
ＩＧＦ−Ｉによる血糖低下作用は、臨床上の副作用として低血糖を惹起させることが報告されている（非特許文献２１）。さらに、ＩＧＦ−Ｉは、ヒトへの投与により低血糖を起こすことから、治療開始時は、低用量から順次適当量を投与し、投与後の血糖値等を含む各種臨床所見の観察が必要となる（非特許文献５）。
ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−Ｉ受容体の下流シグナルであるＡｋｔのリン酸化の亢進を介して血糖低下作用を発現する。Ａｋｔの活性型変異体は、３Ｔ３−Ｌ１細胞のグルコース取込みを亢進させる（非特許文献２２）。一方、Ａｋｔ２を欠損させたマウスは、血糖値が上昇した（非特許文献２３）。また、ラット筋肉由来細胞においてＡｋｔ阻害剤は、インスリン刺激によるグルコース取込みを阻害する（非特許文献２４）。さらに、ＩＧＦ−Ｉは、血糖低下作用に関与するインスリン受容体を活性化させることが知られている。これらのことから、ＩＧＦ−Ｉによる血糖低下作用には、Ａｋｔの過剰な活性化及びインスリン受容体の活性化が関与することが考えられる。【０００９】
８．ＩＧＦ−Ｉの短い血中半減期
ＩＧＦ−Ｉの血中半減期は、短いため治療では頻回投与が必要となる。実際に、ヒト組換えＩＧＦ−Ｉであるメカセルミンは、血中半減期が約１１時間から１６時間であり、低身長症の治療では１日１回から２回の投与が必要である（非特許文献５）。
血中のＩＧＦ−Ｉの約７０から８０％はＩＧＦＢＰ３と結合している。ＩＧＦ−Ｉの遊離体が生理活性を示す。ＩＧＦＢＰ３との結合は、ＩＧＦ−Ｉの血中半減期を約１０時間から１６時間に維持している（非特許文献１）。
ＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰ３の配合剤であるＩＰＬＥＸは、血中半減期が約２１時間から２６時間とＩＧＦ−Ｉと比較して長く、１日１回の投与を可能にした薬剤である（非特許文献２３）。しかし、ＩＰＬＥＸは市場から撤退している。
ＩＧＦ−Ｉの動態を改善させたＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉも開発が試みられたが、治療に用いられている薬剤は存在しない（特許文献１）。【００１０】
９．ＩＧＦ−Ｉの作用により期待される治療効果
ＩＧＦ−Ｉは多種の臓器に作用し、その生理機能は多岐にわたることが知られている（非特許文献２１）。
ＩＧＦ−Ｉは、中枢神経系において、ＩＧＦ−Ｉ受容体の活性化を介して、ミトコンドリアの保護及び抗酸化作用による神経保護作用があることが報告されている（非特許文献２６、２７）。ＩＧＦ−Ｉは、傷害後の神経突起の形成を促進させる（非特許文献２８）。
ＩＧＦ−Ｉは、成長促進の主要な因子である（非特許文献２９、３０）。実際に、ヒト組換えＩＧＦ−Ｉであるメカセルミンは、低身長症の治療薬として臨床で用いられている。
ＩＧＦ−Ｉは、肝硬変の治療に有用であると考えられている。肝硬変は、肝障害又は慢性肝疾患から病態進展したものであり、肝臓の線維化を伴う疾患である。肝硬変モデル動物において、ＩＧＦ−Ｉの投与は、肝臓の線維化を抑制した（非特許文献３１）。
ＩＧＦ−Ｉは、腎臓の発達、機能にも関与することが知られている。腎臓のメサンギウム細胞において、ＩＧＦ−Ｉは、糖毒性による酸化ストレス及びアポトーシスに対して保護作用がある（非特許文献３２）。ＩＧＦ−Ｉは、腎症の治療薬として期待される。【００１１】
ＩＧＦ−Ｉの投与により改善が期待される病態には、低身長症、ラロン症、肝硬変、肝線維化、老化、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）、神経疾患、脳卒中、脊髄損傷、心血管保護、糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、腎症、骨粗しょう症、嚢胞性線維症、創傷治癒、筋強直性ジストロフィー、エイズ筋減弱症、ＨＩＶに伴う脂肪再分布症候群、火傷、クローン病、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖性複合免疫不全症、難聴、神経性無食欲症及び未熟児網膜症がある（非特許文献２１）。
ＩＧＦ−Ｉは、その多彩な生理作用から、種々の疾患の治療薬として期待される。しかし、副作用である血糖低下作用、及び短い半減期による複数回の投与が臨床で用いるための課題である。【００１２】
１０．ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体
抗体製剤は、一般的に半減期が長く、月に１回から２回の投与で有効性を示す。ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受容体活性化作用が報告されているが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＩＧＦ−Ｉ受容体に対するアゴニスト活性を示した抗体の報告は無い（非特許文献３３〜３７）。
抗体３Ｂ７及び抗体２Ｄ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞のＤＮＡ合成を亢進する（非特許文献３４）。
抗体１１Ａ１、１１Ａ４、１１Ａ１１及び２４−５７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＩＧＦ−Ｉ受容体のチロシンのリン酸化を亢進する（非特許文献３５）。
抗体１６−１３、１７−６９、２４−５７、２４−６０、２４−３１、及び２６−３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞のＤＮＡ合成、及びグルコース取込みの亢進作用を有することが示されており、これらの抗体は血糖低下作用を有する可能性がある（非特許文献３６，３７）。【００１３】
しかしながら、これまで初代培養細胞、その中でもヒト筋芽細胞を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖活性を示したＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体の報告は無く、ましてやｉｎ  ｖｉｖｏでの筋肉量増加作用を示すＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体は無かった。【００１４】
１１．ＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニスト抗体
ＩＧＦ−Ｉ受容体に結合する抗体はＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−Ｉ受容体の結合を阻害するアンタゴニスト作用を利用して、悪性腫瘍等の治療への応用が試みられている。しかしながら、既存のＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニスト抗体は単独治療において高血糖等の副作用が多いだけでなく（非特許文献３８）、他の抗癌剤との併用により高血糖の発現率が上昇することから（非特許文献３９）、治療への適用は限定的なものになるものと考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】「神経筋障害の処置のためのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の使用」、特表２０１１-５１８７７８号公報（国際公開第２００９／１２１７５９号）、２０１１年
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ohlsson, C., et al., The role of liver-derived insulin-like growth factor-I. Endocr Rev, ２００９. ３０(５): p. ４９４-５３５.
【非特許文献２】Kavran, J.M., et al., How IGF-I activates its receptor. Elife, ２０１４. ３.
【非特許文献３】Bailyes, E.M., et al., Insulin receptor/IGF-I receptor hybrids are widely distributed in mammalian tissues: quantification of individual receptor species by selective immunoprecipitation and immunoblotting. Biochem J, １９９７. ３２７ ( Pt １): p. ２０９-１５.
【非特許文献４】Pandini, G., et al., Insulin/insulin-like growth factor I hybrid receptors have different biological characteristics depending on the insulin receptor isoform involved. J Biol Chem, ２００２. ２７７(４２): p. ３９６８４-９５.
【非特許文献５】オーファンパシフィック, IF. ２０１５.
【非特許文献６】Fukushima, T., et al., Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) activity bound to insulin-like growth factor-I (IGF-I) receptor, which is continuously sustained by IGF-I stimulation, is required for IGF-I-induced cell proliferation. J Biol Chem, ２０１２. ２８７(３５): p. ２９７１３-２１.
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、脊椎動物のＩＧＦ−Ｉ受容体に特異的に結合する、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体を提供することを目的とする。また本発明は、ＩＧＦ−Ｉ受容体を介して、筋肉量又は成長板軟骨の厚さを増加させ、血糖値を低下させない抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］脊椎動物のＩＧＦ−Ｉ受容体に特異的に結合し、脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性を有する、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２］脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性が、天然型ＩＧＦ−Ｉと同程度以上である、［１］に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［３］脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＥＣ５０値が、天然型ＩＧＦ−Ｉに対して１／２０以下である、［１］又は［２］に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［４］培養下の脊椎動物由来細胞に接触させた場合における、当該培養細胞との接触時間に対する当該培養細胞の増殖誘導作用の持続性が、天然型ＩＧＦ−Ｉと比べて改善されている、［１］から［３］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［５］天然型ＩＧＦ−Ｉが配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩＧＦ−Ｉである、［２］から［４］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［６］脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  におけるＥＣ５０値が、０．１ｎｍｏｌ／Ｌ以下である、［１］から［５］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［７］脊椎動物に非経口投与されることによって、当該脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する活性を有する、［１］から［６］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［８］脊椎動物へ１週間に１回以下の頻度で投与する、［１］から［７］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［９］脊椎動物が、ヒト、又はモルモット、サル、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌもしくはニワトリを含む非ヒト動物、さらにはヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を発現させた非ヒト動物である、［１］から［８］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１０］脊椎動物由来細胞の増殖を誘導する用量において、分化筋細胞でのグルコース取込みを誘導しないことを特徴とする、［１］から［９］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１１］ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性を示すＥＣ５０値の１００倍以上の用量においても分化筋細胞でのグルコース取込みを誘導しないことを特徴とする、［１０］に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１２］脊椎動物由来細胞がヒト又はヒト以外の哺乳動物に由来する筋芽細胞である、［１０］又は［１１］に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１３］脊椎動物に非経口投与され、当該脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する用量において、当該脊椎動物の血糖値を低下させないことを特徴とする、［７］から［１２］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１４］脊椎動物に非経口投与され、当該脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する有効用量に対して１０倍以上の用量においても、当該脊椎動物の血糖値を変動させないことを特徴とする、［１３］に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１５］ＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインに結合する、［１］〜［１４］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１６］ＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインに結合し、ＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−ＩＩとＩＧＦ−Ｉ受容体の結合を阻害する、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１７］ＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインの配列におけるＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＸ１Ｘ２ＧｌｎＳｅｒＭｅｔ（Ｘ１はＧｌｙ又はＳｅｒ、Ｘ２はＳｅｒ又はＴｈｒ）を含むエピトープ又はその近傍に結合することを特徴とする、［１５］又は［１６］に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１８］ＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインの配列におけるＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｎＳｅｒＭｅｔを含むエピトープ又はその近傍に結合することを特徴とする、［１７］に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１９］ヒト、又はモルモット、サル、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌもしくはニワトリを含む非ヒト動物のＩＧＦ−Ｉ受容体と交差反応性を有する、［１］から［１８］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２０］当該抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体の抗原抗体反応は、解離平衡定数（ＫＤ）が１×１０−８Ｍ以下の親和性強度を有することを特徴とする、［１］から［１９］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２１］当該抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、１）〜４）のうち少なくとも一つの特徴を有する、［１６］から［２０］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
１）脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性を有する。
２）脊椎動物に非経口投与することによって、当該脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する活性を有する。
３）脊椎動物由来細胞の増殖を誘導する用量において、分化筋細胞でのグルコース取込みを誘導しない。
４）脊椎動物に非経口投与され、当該脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する用量において、当該脊椎動物の血糖値を変動させない。
［２２］抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、１）〜４）の少なくとも一つの特徴を有する、［１６］から［２１］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
１）ＩＧＦ−Ｉによる脊椎動物由来細胞の増殖を阻害する。
２）脊椎動物に非経口投与することによって、当該脊椎動物におけるＩＧＦ−Ｉに起因する細胞増殖性疾患における細胞増殖を抑制する。
３）ＩＧＦ−Ｉによる脊椎動物由来細胞の増殖を阻害する用量において、分化筋細胞でのグルコース取込みに影響しない。
４）脊椎動物に非経口投与され、当該脊椎動物におけるＩＧＦ−Ｉに起因する細胞増殖性疾患における細胞増殖を抑制する用量において、当該脊椎動物の血糖値を変動させない。
［２３］抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙもしくは二重特異性抗体、又はそれらの誘導体である、［１］〜［２２］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２４］重鎖可変領域のＣＤＲ−１（ＣＤＲ−Ｈ１）配列として配列番号３又は配列番号３のいずれか１か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ−２（ＣＤＲ−Ｈ２）配列として配列番号４又は配列番号４のいずれか１か所又は２か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ−３（ＣＤＲ−Ｈ３）配列として配列番号５又は配列番号５のいずれか１か所又は２か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ−１（ＣＤＲ−Ｌ１）配列として配列番号６又は配列番号６のいずれか１か所又は２か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ−２（ＣＤＲ−Ｌ２）配列として配列番号７又は配列番号７のいずれか１か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列、及び
軽鎖可変領域のＣＤＲ−３（ＣＤＲ−Ｌ３）配列として配列番号８又は配列番号８のいずれか１か所又は２か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列、
を含むアミノ酸配列からなる［１］から［２３］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２５］免疫グロブリンのフレームワーク配列をさらに含む、［２４］に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２６］免疫グロブリンのフレームワーク配列が、ヒト、又はモルモット、サル、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、マウスもしくはラットを含む非ヒト動物の免疫グロブリンの各クラスにおけるフレームワーク配列である、［２５］に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２７］重鎖可変領域として配列番号９又は配列番号９と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び軽鎖可変領域として配列番号１０又は配列番号１０と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる［１］から［２６］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２８］ヒト、又はモルモット、サル、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、マウスもしくはラットを含む非ヒト動物の免疫グロブリンの各クラスにおける定常領域をさらに含む、［１］から［２７］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２９］［１］から［２８］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体をコードするポリヌクレオチド配列からなる核酸分子。
［３０］［２９］に記載の核酸分子を少なくとも一つ含むクローニングベクター又は発現ベクター。
［３１］宿主細胞に［３０］に記載のベクターが導入された組換え体細胞。
［３２］［３１］に記載の組換え体細胞を培養し、前記組換え体細胞から産生される当該抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体を精製する工程を含む、［１］から［２８］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体の製造方法。
［３３］［１］から［２８］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体、［２９］に記載の核酸分子、［３０］に記載のベクター、あるいは［３１］に記載の組換え体細胞を含む医薬組成物。
［３４］［１］から［２８］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体、［２９］に記載の核酸分子、［３０］に記載のベクター、あるいは［３１］に記載の組換え体細胞以外の活性成分をさらに含む、［３３］に記載の医薬組成物。
［３５］活性成分が成長ホルモン又はそのアナログ、インスリン又はそのアナログ、ＩＧＦ−ＩＩ又はそのアナログ、抗ミオスタチン抗体、ミオスタチンアンタゴニスト、抗アクチビンＩＩＢ型受容体抗体、アクチビンＩＩＢ受容体アンタゴニスト、可溶性アクチビンＩＩＢ型受容体又はそのアナログ、グレリン又はそのアナログ、フォリスタチン又はそのアナログ、ベータ２アゴニスト、及び選択的アンドロゲン受容体モジュレーターから１つ以上選択される、［３４］に記載の医薬組成物。
［３６］活性成分がコルチコステロイド、制吐薬、オンダンセトロン塩酸、グラニセトロン塩酸、メトロクロプラミド（ｍｅｔｒｏｃｌｏｐｒａｍｉｄｅ）、ドンペリドン、ハロペリドール、シクリジン、ロラゼパム、プロクロルペラジン、デキサメタゾン、レボメプロマジン、トロピセトロン、癌ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ阻害薬、ＧＭ−ＣＳＦ  ＤＮＡワクチン、細胞に基づくワクチン、樹状細胞ワクチン、組換えウイルスワクチン、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）ワクチン、同種腫瘍ワクチン、自己腫瘍ワクチン、鎮痛薬、イブプロフェン、ナプロキセン、トリサリチル酸コリンマグネシウム、オキシコドン塩酸、抗血管形成薬、抗血栓薬、抗ＰＤ−１抗体、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、アテゾリズマブ、抗ＣＴＬＡ４抗体、イピリムマブ、抗ＣＤ２０抗体、リツキシマブ、抗ＨＥＲ２抗体、トラスツズマブ、抗ＣＣＲ４抗体、モガムリズマブ、抗ＶＥＧＦ抗体、ベバシズマブ、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性ＶＥＧＦ受容体断片、抗ＴＷＥＡＫ抗体、抗ＴＷＥＡＫ受容体抗体、可溶性ＴＷＥＡＫ受容体断片、ＡＭＧ  ７０６、ＡＭＧ  ３８６、抗増殖薬、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害薬、αｖβ３阻害薬、αｖβ５阻害薬、ｐ５３阻害薬、Ｋｉｔ受容体阻害薬、ｒｅｔ受容体阻害薬、ＰＤＧＦＲ阻害薬、成長ホルモン分泌阻害薬、アンジオポエチン阻害薬、腫瘍浸潤マクロファージ阻害薬、ｃ−ｆｍｓ阻害薬、抗ｃ−ｆｍｓ抗体、ＣＳＦ−１阻害薬、抗ＣＳＦ−１抗体、可溶性ｃ−ｆｍｓ断片、ペグビソマント、ゲムシタビン、パニツムマブ、イリノテカン、及びＳＮ−３８からなる群より選択される成分を含む、［３４］又は［３５］に記載の医薬組成物。
［３７］［１］〜［２８］に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体、［２９］に記載の核酸分子、［３０］に記載のベクター、及び［３１］に記載の組換え体細胞の内、いずれか一つ以上を含む、ＩＧＦ−Ｉに関連した状態の治療又は予防に用いられる医薬。
［３８］ＩＧＦ−Ｉに関連した状態が、廃用性筋萎縮、低身長症、糖尿病性腎症、慢性腎不全、ラロン症、肝硬変、肝線維化、老化、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）、神経疾患、脳卒中、脊髄損傷、心血管保護、糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、骨粗しょう症、嚢胞性線維症、創傷治癒、筋強直性ジストロフィー、エイズ筋減弱症、ＨＩＶに伴う脂肪再分布症候群、火傷、クローン病、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖性複合免疫不全症、難聴、神経性無食欲症及び未熟児網膜症、ターナー症候群、プラダー・ウィリー症候群、シルバー・ラッセル症候群、特発性低身長、肥満、多発性硬化症、線維筋痛症、潰瘍性大腸炎、低筋肉量、心筋虚血及び低骨密度から選択される、［３７］に記載の医薬。
［３９］非経口投与される、［３７］又は［３８］に記載の医薬。
［４０］非ヒト動物に投与される動物用医薬である、［３７］から［３９］のいずれか一項に記載の医薬。
［４１］当該動物用医薬が、筋肉量及び／又は体長の増大、成長の促進、乳汁産生量の増大、繁殖の促進、又は老化の予防の目的で投与される、［４０］に記載の医薬。
［４２］非ヒト動物が、モルモット、サル、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌ、又はニワトリである、［４０］又は［４１］に記載の動物用医薬。
［４３］ＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−Ｉ受容体への作用に起因する疾患の治療又は予防に用いられる、［３７］〜［４２］のいずれか一項に記載の医薬。
［４４］ＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−Ｉ受容体への作用に起因する疾患が、肝臓がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、小児がん、先端巨大症、卵巣がん、膵臓がん、良性前立腺肥大症、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、結腸直腸がん、頚部がん、滑膜肉腫、膀胱がん、胃がん、ウィルムス腫瘍、転移性カルチノイド及び血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍に関連する下痢、ビポーマ、ウェルナー−モリソン症候群、ベックウィズ−ヴィーデマン症候群、腎臓がん、腎細胞がん、移行上皮がん、ユーイング肉腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、脳腫瘍、膠芽腫、非膠芽腫性脳腫瘍、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、脳室上衣腫、脈絡叢乳頭腫、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管の平滑筋再狭窄、不適切な微小血管増殖、糖尿病性網膜症、グレーヴズ病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺炎ならびにベーチェット病からなる群より選択される疾患である、［４３］に記載の医薬。
［４５］脊椎動物由来の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する方法であって、培養の過程で当該脊椎動物由来の細胞を、［１］から［２８］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体、［２９］に記載の核酸分子、［３０］に記載のベクター、及び［３１］に記載の組換え体細胞のいずれか一つ以上と接触される工程を含む、培養方法。
［４６］当該接触の工程が、脊椎動物由来の細胞の増殖促進又は分化誘導の目的で行われる、［４５］に記載の培養方法。
［４７］抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が固相に吸着又は固定されている、［４５］又は［４６］に記載の培養方法。
［４８］ＩＧＦ−Ｉ受容体遺伝子のＣＲドメインに変異が導入された遺伝子組換え動物であって、当該ＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインが、遺伝子組み換えによって、ＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｎＳｅｒＭｅｔのアミノ酸配列を有することを特徴とする、遺伝子組換え動物。
［４９］異種のＩＧＦ−Ｉ受容体遺伝子が導入された遺伝子組換え動物であって、当該動物の内在的に保有するＩＧＦ−Ｉ受容体のアミノ酸配列に対して、導入されたＩＧＦ−Ｉ受容体遺伝子のコードするアミノ酸配列のＣＲドメインにおけるＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＸ１Ｘ２ＧｌｎＳｅｒＭｅｔの部分の配列のうちＸ１及び／又はＸ２のアミノ酸残基が、当該動物の内在的に保有するＩＧＦ−Ｉ受容体のアミノ酸配列と一致しないＩＧＦ−Ｉ受容体遺伝子が導入されている、遺伝子組換え動物。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体は、脊椎動物のＩＧＦ−Ｉ受容体に特異的に結合する効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインのアミノ酸配列（アミノ酸配列は１文字表記で示す）を、マウス、ラット、ヒト、モルモット及びウサギで、比較した結果を示す図である。
【図２】ＩＧＦ１１−１６推定エピトープの変異体を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図３】ＩＧＦ１１−１６とＩＧＦ−Ｉの薬剤除去後のヒト筋芽細胞の増殖活性を示す図である。
【図４】ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ１１−１６をヒト分化筋細胞に添加した時のグルコース取込み作用を示す図である。
【図５】モルモットにＩＧＦ−Ｉを浸透圧ポンプで持続投与又は、ＩＧＦ１１−１６を単回皮下又は静脈内投与し、２週間後の長趾伸筋の重量を示す図である。
【図６】絶食条件下のモルモットに、ＩＧＦ−Ｉを単回皮下投与したときの血糖値の経時推移を示す図である。
【図７】絶食条件下のモルモットに、ＩＧＦ１１−１６を単回皮下投与したときの血糖値の経時推移を示す図である。
【図８】絶食条件下のモルモットに、ＩＧＦ１１−１６を単回静脈内投与したときの血糖値の経時推移を示す図である。
【図９】下垂体摘出モルモット（ＨＰＸ）におけるＩＧＦ１１−１６の成長板軟骨の厚さの亢進作用を示す図である。
【図１０】下垂体摘出モルモット（ＨＰＸ）におけるＩＧＦ１１−１６の脛骨の長さの亢進作用を示す図である。
【図１１】絶食条件下のモルモットに、ＩＧＦ−Ｉを単回皮下投与したときの血中動態の経時推移を示す図である。
【図１２】絶食条件下のモルモットに、ＩＧＦ１１−１６を単回皮下投与したときの血中動態の経時推移を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を具体的な実施形態に基づき説明するが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されない。なお、本明細書において引用する特許公報、特許出願公開公報、及び非特許公報を含む全ての文献は、あらゆる目的において、その全体が援用により本明細書に組み込まれる。
【００２２】
［ＩＧＦ］
ＩＧＦとはインスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）のことをいい、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩが存在する。ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩは、後述のＩＧＦ−Ｉ受容体（インスリン様成長因子―Ｉ受容体：Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｉ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合して、細胞内に細胞分裂や代謝のシグナルを入れるアゴニスト活性を有する生体内のリガンドである。ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩは、ＩＧＦ−Ｉ受容体と構造的に類似性のあるインスリン受容体（ＩＮＳＲ）にも弱く交差的に結合することが知られている。本明細書では、生理的機能等がよりよく知られているＩＧＦ−Ｉを主に扱うが、ＩＧＦ−Ｉ受容体とリガンドとの結合を介する作用や疾患等の検討を行う場合にはＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩの両者の作用を含めて記載することがある。
【００２３】
ＩＧＦ−ＩはソマトメジンＣとも呼ばれ、７０アミノ酸からなる単一ポリペプチドのホルモンである。ヒトのＩＧＦ−Ｉの配列はＥＭＢＬ−ＥＢＩのＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−アクセッション番号Ｐ５０９１９等を参照して入手できるが、配列表の配列番号１に成熟型ＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列を示す。この７０アミノ酸からなる配列は、多くの種で保存されている。本発明においては、「ＩＧＦ−Ｉ」とのみ記載された場合は、特に断りがない限り、ホルモン活性を有するＩＧＦ−Ｉタンパク質のことを意味する。
【００２４】
ＩＧＦ−Ｉは肝臓細胞をはじめ生体内の種々の細胞で産生されていて、血液やその他の体液中にも存在する。従って、天然型のＩＧＦ−Ｉは動物の体液や、動物から分離した初代培養細胞や株化細胞等を培養した培養物から精製して得ることができる。また、ＩＧＦ−Ｉは成長ホルモンによって細胞での産生が誘導されるため、成長ホルモンが投与された動物の体液や、動物から分離した初代培養細胞や株化細胞等を成長ホルモン存在下で培養した培養物からもＩＧＦ−Ｉを精製することで得られる。また、別の方法として、ＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列をコードする核酸分子を発現ベクターに組み込んで大腸菌等の原核生物や酵母、昆虫細胞又は哺乳類由来の培養細胞等の真核細胞の宿主に導入した組換え体細胞や、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を導入したトランスジェニック動物やトランスジェニック植物等を用いて、ＩＧＦ−Ｉを製造することも可能である。さらに、ヒトＩＧＦ−Ｉは研究用試薬（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔａｌｏｇ：  ＡＤＩ−９０８−０５９−０１００、Ａｂｎｏｖａ、ｃａｔａｌｏｇ：Ｐ３４５２等）、医薬品（ソマゾン（登録商標）メカセルミン、ＩＮＣＲＥＬＥＸ（登録商標）等）として入手することも可能である。用いるＩＧＦ−Ｉのｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性は、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  ＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＩＢＳＣ）のＮＩＢＳＣ  ｃｏｄｅ：９１／５５４のＩＧＦ−Ｉ標準物質での活性を１国際ユニット／マイクログラムとして比較することで、その比活性を評価することができる。本発明におけるＩＧＦ−Ｉは、当該ＮＩＢＳＣ  ｃｏｄｅ：９１／５５４のＩＧＦ−Ｉと同等の比活性を有するものとして扱うものとする。
【００２５】
［ＩＧＦ−Ｉ受容体］
ＩＧＦ−Ｉ受容体はインスリン様成長因子−Ｉ受容体（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｉ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のことをいう。本明細書において「ＩＧＦ−Ｉ受容体」は、特に断りがない限り、ＩＧＦ−Ｉ受容体タンパク質を意味する。ＩＧＦ−Ｉ受容体はα鎖とβ鎖からなるサブユニットが２つ会合した構造のタンパク質である。配列番号２に示したヒトＩＧＦ−Ｉ受容体のアミノ酸配列においては、そのアミノ酸配列のうち、３１番目から７３５番目のアミノ酸配列からなる部分がα鎖に相当し、β鎖は７４０番目以降の配列に相当する。ＩＧＦ−Ｉ受容体のα鎖はＩＧＦ−Ｉの結合部分を有し、β鎖は膜貫通型の構造であり、細胞内へのシグナルを伝える働きをする。ＩＧＦ−Ｉ受容体のα鎖は、Ｌ１、ＣＲ、Ｌ２、ＦｎＩＩＩ−１及びＦｎＩＩＩ−２ａ／ＩＤ／ＦｎＩＩＩ−２ｂのドメインに分かれる。配列番号２に示したヒトＩＧＦ−Ｉ受容体のアミノ酸配列においては、３１番目から１７９番目の部分がＬ１ドメイン、１８０番目から３２８番目の部分がＣＲドメイン、３２９番目から４９１番目の部分がＬ２ドメイン、４９２番目から６０７番目の部分がＦｎＩＩＩ−１ドメイン及び６０８番目から７３５番目までがＦｎＩＩＩ−２ａ／ＩＤ／ＦｎＩＩＩ−２ｂドメインに相当する。中でもＣＲ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎ）ドメインは、ＩＧＦ−ＩがＩＧＦ−Ｉ受容体に結合した時の当該受容体の立体構造の変化に伴う、β鎖の細胞内チロシンキナーゼの活性化に関与する。ヒトのＩＧＦ−Ｉ受容体のアミノ酸配列は、ＥＭＢＬ−ＥＢＩのＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−アクセッション番号Ｐ０８０６９等から参照することが可能であるが、配列表の配列番号２にも示す。
【００２６】
ＩＧＦ−Ｉ受容体は生体内の組織や細胞の広い範囲で発現していることが知られており、ＩＧＦ−Ｉによる細胞増殖の誘導や細胞内シグナルの活性化等の刺激を受ける。特に筋芽細胞はＩＧＦ−ＩのＩＧＦ−Ｉ受容体を介する作用を、細胞増殖活性を指標として評価可能である。このことから筋芽細胞は、ＩＧＦ−Ｉ受容体に結合する抗体の作用を解析する上で有用である。また、ヒトやその他の脊椎動物のＩＧＦ−Ｉ受容体のアミノ酸配列をコードする核酸分子を発現ベクターに組み込んで、昆虫細胞又は哺乳類由来の培養細胞等の真核細胞の宿主に導入した組換え体細胞において、その細胞膜上に導入された核酸がコードするＩＧＦ−Ｉ受容体を発現させることで、ヒトやその他の脊椎動物のＩＧＦ−Ｉ受容体を発現した細胞を人工的に製造することが可能である。当該ＩＧＦ−Ｉ受容体発現細胞は抗体の結合性の解析や細胞内へのシグナルの伝達等の検討に用いることができる。
【００２７】
［抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体］
抗体とは、ジスルフィド結合により相互結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと略される）及び重鎖定常領域を含み、重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。軽鎖の定常領域にはλ鎖及びκ鎖と呼ばれる２種類が存在する。重鎖の定常領域にはγ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖及びε鎖が存在し、その重鎖の違いによって、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥという抗体のアイソタイプが存在する。ＶＨ及びＶＬ領域は、さらにフレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存されている４つの領域（ＦＲ−１、ＦＲ−２、ＦＲ−３、ＦＲ−４）と、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の３つの領域（ＣＤＲ−１，ＣＤＲ−２，ＣＤＲ−３）に細分される。ＶＨは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ−１、ＣＤＲ−１（ＣＤＲ−Ｈ１）、ＦＲ−２、ＣＤＲ−２（ＣＤＲ−Ｈ２）、ＦＲ−３、ＣＤＲ−３（ＣＤＲ−Ｈ３）、ＦＲ−４の順番で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。ＶＬはアミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ−１、ＣＤＲ−１（ＣＤＲ−Ｌ１）、ＦＲ−２、ＣＤＲ−２（ＣＤＲ−Ｌ２）、ＦＲ−３、ＣＤＲ−３（ＣＤＲ−Ｌ３）、ＦＲ−４の順番で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【００２８】
本発明における抗体は、抗体の断片及び／又は誘導体であってもよい。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ等が挙げられる。抗体の誘導体としては、定常領域部分に人工的にアミノ酸変異を導入した抗体、定常領域のドメインの構成を改変した抗体、１分子あたり２つ以上のＦｃを持つ形の抗体、重鎖のみ又は軽鎖のみで構成される抗体、糖鎖改変抗体、二重特異性抗体、抗体又は抗体の断片化合物や抗体以外のタンパク質と結合させた抗体コンジュゲート、抗体酵素、ナノボディ、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ＶＨＨ等が挙げられる。なお、本発明において単に「抗体」という場合には、別途明記しない限り、抗体の断片及び／又は誘導体も含むものとする。
【００２９】
また、モノクローナル抗体とは、古典的には単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体分子をいうが、特定のアミノ酸配列からなるＶＨとＶＬの組み合わせを含む単一種類の抗体分子のことをいう。モノクローナル抗体は、その抗体のタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子配列を有する核酸分子を得ることも可能であり、そのような核酸分子を用いて遺伝子工学的に抗体を作製することも可能である。また、Ｈ鎖、Ｌ鎖、それらの可変領域やＣＤＲ配列等の遺伝子情報を用いて抗体の結合性や特異性の向上のための改変等を行うことや、マウス等の動物の抗体からヒト型抗体に改変することによって治療剤に用いるために適した構造の抗体を作製することは、この分野での当業者にはよく知られた技術である。また、抗原を感作する動物として、ヒト抗体遺伝子が導入された非ヒト−トランスジェニック動物を用いることによって、ヒト型のモノクローナル抗体を取得することも可能である。それ以外にも、動物への感作を必要としない方法として、ヒト抗体の抗原結合領域又はその一部を発現するファージライブラリー（ヒト抗体ファージディスプレイ）を用いて、対応する抗原と特異的に結合する抗体や特定のアミノ酸配列からなるファージクローンを取得し、その情報からヒト抗体を作製する技術も当業者であれば適宜行うことができる（例えば、Ｔａｋｅｔｏ  Ｔａｎａｋａ等、Ｋｅｉｏ  Ｊ．  Ｍｅｄ．、６０巻、ｐ３７−４６のレビュー等を参照）。また、ヒト以外の動物に投与する抗体をデザインする場合には、ヒト化の技術と同様に、適宜ＣＤＲや可変領域のアミノ酸配列情報を用いて、当業者であればデザインすることが可能である。
【００３０】
本発明において「抗原抗体反応」とは、ＩＧＦ−Ｉ受容体に対して、抗体が平衡解離定数（ＫＤ）１×１０−８Ｍ以下の親和性で結合することをいう。本発明の抗体は、ＩＧＦ−Ｉ受容体に対して、通常１×１０−８Ｍ以下、中でも１×１０−９Ｍ以下、更には１×１０−１０Ｍ以下のＫＤで結合することが好ましい。
【００３１】
抗体の特異性とは、抗体がある抗原に対して高い抗原抗体反応が起こることをいう。特に、本発明においては、ＩＧＦ−Ｉ受容体特異的抗体とは、ＩＧＦ−Ｉ受容体を発現させた細胞と有意に抗原抗体反応を示す濃度において、ＩＧＦ−Ｉ受容体の一次構造（アミノ酸配列）及び高次構造と高い類似性を有するＩＮＳＲに対する抗原抗体の反応性がＭｏｃｋ細胞に対する反応性の１．５倍以下である場合をいう。
【００３２】
抗原抗体反応の測定は、当業者であれば固相又は液相の系での結合測定を適宜選択して行うことが可能である。そのような方法としては、酵素結合免疫吸着法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、表面プラズモン共鳴法（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）、蛍光共鳴エネルギー移動法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）、発光共鳴エネルギー移動法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＬＲＥＴ）等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。また、そのような抗原抗体結合を測定する際に、抗体及び／又は抗原を酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素等で標識を行い、その標識した物質の物理的及び／又は化学的特性に適した測定方法を用いて抗原抗体反応を検出することも可能である。
【００３３】
本発明における抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、アゴニスト抗体とアンタゴニスト抗体の両方を含む。本発明のＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体は、単独で作用させた場合、筋芽細胞の増殖活性の亢進作用を有する。本発明のＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニスト抗体は、ＩＧＦ−Ｉと同時に作用させた場合、ＩＧＦ−Ｉによる筋芽細胞の増殖活性の阻害作用を有する。
【００３４】
本発明における、ＩＧＦ−Ｉ受容体の特異的なドメインに強力に結合するＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで筋芽細胞の増殖活性の亢進作用を有する。
【００３５】
また、本発明のＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体は、筋芽細胞の増殖活性を亢進させる作用濃度、より好ましくは作用濃度より１０倍高い濃度、更に好ましくは１００倍高い濃度で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化筋細胞のグルコース取込み亢進作用を有さない。
【００３６】
ＩＧＦ−Ｉの筋肉量増加作用を示す用量は、著しい血糖低下作用を有するが、本発明のＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体は、筋肉量増加作用を示す用量、より好ましくはその用量より１０倍以上高い用量でさえも、血糖低下作用を有さない。
【００３７】
さらに、モルモットへのＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体の単回投与は、ＩＧＦ−Ｉを持続投与したときの筋肉量増加作用と、同程度のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を有する。また、本発明のＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体は、血中半減期が長く、動物への単回投与により筋肉量増加作用を示す。
【００３８】
以上のことから、本発明のＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体は、ＩＧＦ−Ｉで期待される、廃用性筋萎縮及び低身長症等のＩＧＦ−Ｉ受容体が関連する種々の疾患の治療薬又は予防薬となる可能性を有し、ＩＧＦ−Ｉの問題点である、血糖低下作用を克服し、血中半減期を長期化することが可能である。
【００３９】
本発明のＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニスト抗体は、ＩＧＦ−ＩがＩＧＦ−Ｉ受容体に結合するのを阻害する。本発明のＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニスト抗体の一つの態様としては、当該抗体はＩＧＦ−Ｉ受容体を活性化するが、ＩＧＦ−ＩによるＩＧＦ−Ｉ受容体に対する作用を阻害する。この場合、当該抗体はＩＧＦ−Ｉの相加的なアゴニスト活性、例えば筋芽細胞のＩＧＦ−Ｉによる増殖誘導活性、を打ち消す作用がある。また、本発明のＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニスト抗体の別の態様としては、ＩＧＦ−Ｉ受容体と結合するがＩＧＦ−Ｉ受容体を活性化させない抗体である。このようなＩＧＦ−Ｉ受容体の架橋による活性化を起こさないアンタゴニスト抗体の例としては、Ｆａｂ，ｓｃＦｖ等の抗原結合性が１価である抗体、二重特異性抗体のように２価の結合部位を有するがその片側の結合部位のみがＩＧＦ―Ｉ受容体の特異的ドメインに結合する抗体又は２価の結合部位の距離をリンカー等で変化させた抗体等があるが、これらに限定されるものではない。本発明におけるＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニスト抗体において、ＩＧＦ−Ｉ受容体と結合するが、アゴニスト活性を持たない抗体は、抗体とＩＧＦ−Ｉ受容体との抗原抗体反応を測定する方法によりＩＧＦ−Ｉ受容体に対する結合性を有すること、筋芽細胞等の細胞での細胞増殖試験により細胞増殖の誘導活性を持たないこと、を確認できる。また、当該ＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニスト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化筋細胞のグルコース取込みやｉｎ  ｖｉｖｏでの血糖値に対して影響しない。従って、本発明のＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニスト抗体は高血糖等の副作用を示さない抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体として乳癌、大腸癌、サルコーマ、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、ミエローマ等の悪性腫瘍等の治療薬又は予防薬となる可能性を有している。
【００４０】
［抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の結合］
本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、ＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインをエピトープとする。一方、ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体は、ＩＧＦ−Ｉ受容体の一次構造（アミノ酸配列）及び高次構造と高い類似性を有するＩＮＳＲには結合性を有さない。
本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、ＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインに結合することにより、ＩＧＦ−Ｉ受容体が二量体を形成したホモ型の受容体、あるいはＩＧＦ−Ｉ受容体とＩＮＳＲが二量体を形成したヘテロ型の受容体を活性化させることが考えられる。
【００４１】
［抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の配列］
本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、脊椎動物のＩＧＦ−Ｉ受容体に特異的に結合し、細胞増殖の誘導活性を有するものであれば、配列は特に限定されない。
しかしながら、各ＣＤＲ配列として、特定のアミノ酸配列を有することが好ましい。具体的には以下のとおりである。なお、本発明においてアミノ酸配列の「同一性」（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）とは、一致するアミノ酸残基の割合を意味し、相同性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）とは、一致又は類似するアミノ酸残基の割合を意味する。相同性及び同一性は、例えばＢＬＡＳＴ法（ＮＣＢＩのＰＢＬＡＳＴのデフォルト条件）により決定することができる。
【００４２】
ここで「類似するアミノ酸残基」とは、同様の化学的特質（例えば、電荷又は疎水性）を持つ側鎖を有するアミノ酸残基を意味する。類似するアミノ酸残基としては、例えば以下の組合せが挙げられる。
１）脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン残基。
２）脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸残基：セリン及びトレオニン残基。
３）アミド含有側鎖を有するアミノ酸残基：アスパラギン及びグルタミン残基。
４）芳香族側鎖を有するアミノ酸残基：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン残基。
５）塩基性側鎖を有するアミノ酸残基：リシン、アルギニン、及びヒスチジン残基。
６）酸性側鎖を有するアミノ酸残基：アスパラギン酸及びグルタミン酸残基。
７）硫黄含有側鎖を有するアミノ酸残基：システイン及びメチオニン残基。
【００４３】
本発明において、重鎖可変領域のＣＤＲ−１（ＣＤＲ−Ｈ１）配列として配列番号３（ＳｅｒＴｙｒＴｒｐＭｅｔＨｉｓ）又は配列番号３のいずれか１か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列が好ましい。また、ＣＤＲ−Ｈ１配列としては配列番号３と８０％以上の相同性を有することが好ましい。なお、本発明において、あるアミノ酸配列中の何れかのアミノ酸残基（以下「第１のアミノ酸残基」）が別のアミノ酸残基（以下「第２のアミノ酸残基」）により置換される場合、置換前の第１のアミノ酸残基と置換後の第２のアミノ酸残基とは、構造及び／又は性質が互いに類似するものであることがより好ましい。
【００４４】
重鎖可変領域のＣＤＲ−２（ＣＤＲ−Ｈ２）配列として配列番号４（ＧｌｕＴｈｒＡｓｎＰｒｏＳｅｒＡｓｎＳｅｒＶａｌＴｈｒＡｓｎＴｙｒＡｓｎＧｌｕＬｙｓＰｈｅＬｙｓＳｅｒ）又は配列番号４のいずれか１か所又は２か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列が好ましい。また、ＣＤＲ−Ｈ２配列としては配列番号４と８２％以上、中でも８８％以上、さらに９４％以上の相同性を有することが好ましい。
【００４５】
重鎖可変領域のＣＤＲ−３（ＣＤＲ−Ｈ３）配列として配列番号５（ＧｌｙＡｒｇＧｌｙＡｒｇＧｌｙＰｈｅＡｌａＴｙｒ）又は配列番号５のいずれか１か所又は２か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列が好ましい。また、ＣＤＲ−Ｈ３配列としては配列番号５と７５％以上、より好ましくは８７％以上の相同性を有することが好ましい。
【００４６】
軽鎖可変領域のＣＤＲ−１（ＣＤＲ−Ｌ１）配列として配列番号６（ＡｒｇＡｌａＳｅｒＧｌｎＡｓｎＩｌｅＡｓｎＰｈｅＴｒｐＬｅｕＳｅｒ）又は配列番号６のいずれか１か所又は２か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列が好ましい。また、ＣＤＲ−Ｌ１配列としては配列番号６と８１％以上の相同性、中でも９０％以上の相同性を有することが好ましい。
【００４７】
軽鎖可変領域のＣＤＲ−２（ＣＤＲ−Ｌ２）配列として配列番号７（ＬｙｓＡｌａＳｅｒＡｓｎＬｅｕＨｉｓＴｈｒ）又は配列番号７のいずれか１か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列が好ましい。また、ＣＤＲ−Ｌ２配列としては配列番号７と８５％以上の相同性を有することが好ましい。
【００４８】
軽鎖可変領域のＣＤＲ−３（ＣＤＲ−Ｌ３）配列として配列番号８（ＬｅｕＧｌｎＧｌｙＧｌｎＳｅｒＴｙｒＰｒｏＴｙｒＴｈｒ）又は配列番号８のいずれか１か所又は２か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列が好ましい。また、ＣＤＲ−Ｌ３配列としては配列番号８と７７％以上、より好ましくは８８％以上の相同性を有することが好ましい。
【００４９】
特に、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、以下のＣＤＲ配列の組み合わせを有することが好ましい。
ＣＤＲ−Ｈ１配列として、配列３のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ２配列として、配列４のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ３配列として、配列５のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ１配列として、配列６のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ２配列として、配列７のアミノ酸配列、及び
ＣＤＲ−Ｌ３配列として、配列８のアミノ酸配列。
【００５０】
なお、抗体におけるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、又はＣＤＲ−Ｌ３の各配列を同定する方法としては、例えばＫａｂａｔ法（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９１、Ｖｏｌ．１４７、Ｎｏ．５、ｐｐ．１７０９−１７１９）やＣｈｏｔｈｉａ法（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９７、Ｖｏｌ．２７３、Ｎｏ．４、ｐｐ．９２７−９４８）が挙げられる。これらの方法は、この領域の当業者にとっては技術常識であるが、たとえばＤｒ．  Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．Ｒ．  Ｍａｒｔｉｎ‘ｓ  Ｇｒｏｕｐのインターネットホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／）から概要を知ることも可能である。
【００５１】
本発明の抗体である免疫グロブリンのフレームワーク配列は、脊椎動物の免疫グロブリンの各クラスにおけるフレームワーク配列であることが好ましい。特に、ヒト、又はモルモット、サル、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、マウスもしくはラットを含む非ヒト動物の免疫グロブリンの各クラスにおけるフレームワーク配列であることが好ましい。
【００５２】
本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域として、特定のアミノ酸配列を有することが好ましい。具体的には以下のとおりである。
【００５３】
重鎖可変領域として配列番号９、配列番号９のいずれか１か所又は２か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列、又は配列番号９と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列が好ましい。軽鎖可変領域として配列番号１０、配列番号１０のいずれか１か所又は２か所のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは挿入されたアミノ酸配列、又は配列番号１０と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列が好ましい。特に、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、ＩＧＦ１１−１６が好ましい。すなわち、重鎖可変領域として配列番号９、軽鎖可変領域として配列番号１０の組み合わせの配列を含むことが好ましい。
【００５４】
以上の重鎖及び軽鎖の各ＣＤＲ及び／又は各鎖可変領域のアミノ酸配列に、ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域及び／又は各定常領域のアミノ酸配列を適宜組み合わせることにより、当業者であれば本発明のヒト化抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を設計することが可能である。ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域及び／又は各定常領域のアミノ酸配列は、例えばヒトのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤの各クラス又はその変異体から選択することが可能である。
【００５５】
本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体がＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体の場合は、好ましくは、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧクラス又はその変異体、好ましくはヒトＩｇＧ４サブクラス、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はその変異体である。１つの例では、安定化ＩｇＧ４定常領域は、Ｋａｂａｔの系により、ヒンジ領域の位置２４１においてプロリンを含む。この位置は、ＥＵ付番方式（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ＤＩＡＮＥ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  １９９２、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、６３、７８−８５、１９６９）により、ヒンジ領域の位置２２８に対応する。ヒトＩｇＧ４では、この残基は一般的にセリンであり、セリンのプロリンへの置換で安定化を誘導することができる。１つの例では、ＩｇＧ１の定常領域にＮ２９７Ａ変異を組み入れてＦｃ受容体への結合及び／又は補体を固定する能力をできるだけ抑えることができる。
【００５６】
［競合結合］
本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体と、ＩＧＦ−Ｉ受容体に対して競合結合する抗体も、本発明の範囲に含まれる。本発明において「競合結合」とは、複数種のモノクローナル抗体が抗原と共存する際に、一方の抗体の抗原への結合が、他方の抗体の抗原への結合により阻害される現象を意味する。一般的には、一定量（濃度）のモノクローナル抗体に対して、別のモノクローナル抗体の量（濃度）を変えて加えていった場合に、前者の一定量のモノクローナル抗体の抗原への結合量が低下する添加量（濃度）を測定することによって測定可能である。その阻害の程度は、ＩＣ５０又はＫｉという値で表すことができる。本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体と競合結合するモノクローナル抗体とは、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体、例えばＩＧＦ１１−１６抗体を１０ｎＭで用いて抗原抗体結合を検出した際に、ＩＣ５０が通常１０００ｎＭ以下、中でも１００ｎＭ以下、更には１０ｎＭ以下の抗体をいう。競合結合の測定を行う場合、用いる抗体を酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素等で標識を行い、その標識した物質の物理的及び／又は化学的特性に適した測定方法を用いて検出することでその測定を行うことも可能である。
【００５７】
［交差反応］
本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、他の脊椎動物のＩＧＦ−Ｉ受容体に対して交差反応を有することが好ましい。交差反応とは、その抗体が抗原抗体反応をするＩＧＦ−Ｉ受容体の動物種（例えばヒト）とは異なる、他の動物種の抗原に対する抗体の結合性を示す。その抗体が抗原抗体反応をするＩＧＦ−Ｉ受容体の動物種以外である、ヒト、又はモルモット、サル、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌもしくはニワトリを含む非ヒト動物のＩＧＦ−Ｉ受容体と交差反応性を有することが好ましい。実施例７において抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体であるＩＧＦ１１−１６抗体は、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインにおけるＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｎＳｅｒＭｅｔの配列と結合することが示された。サル（カニクイザル）、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ及びイヌのＩＧＦ−Ｉ受容体の相同的な部分において、このＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｎＳｅｒＭｅｔの配列が保存されており、これらの種の間でのＩＧＦ−Ｉ受容体と結合交差性がある。また、マウス及びラットにおいては、当該相同的な部分のアミノ酸配列がＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＳｅｒＴｈｒＧｌｎＳｅｒＭｅｔとなっており、この部分に結合する抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を取得することで、マウスやラット等のＩＧＦ−Ｉ受容体と結合し、ＩＧＦ１１−１６と同様の性状や機能を有する抗体を取得することが可能である。
【００５８】
また、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体と交差反応しない動物の種を用いて、その細胞や動物を遺伝子工学的に改変させることにより、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体が交差反応するＩＧＦ−Ｉ受容体を発現する細胞や動物を作製することも可能である。
【００５９】
［脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性、筋肉量及び／又は体長の増加の誘導活性］
本発明のある態様における抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性を有する。ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体の存在はすでに知られていたものの、初代培養細胞、その中でも筋芽細胞において細胞の増殖誘導活性を示した抗体の報告は無かった。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＩＧＦ−ＩのＥＣ５０値よりも低用量で細胞の増殖誘導活性を有する抗体の報告もなかった。本発明における脊椎動物由来細胞とは、好ましくは哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類又は魚類に由来する細胞であり、より好ましくは哺乳類又は鳥類に由来する細胞であり、さらにより好ましくは、ヒト、サル、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ又はイヌに由来する細胞である。これらの種に由来する細胞で、ＩＧＦ−Ｉ受容体を発現し、当該ＩＧＦ−Ｉ受容体に本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体が交差反応する細胞であれば、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体によって細胞増殖が誘導されうる。また、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体と交差反応性がある種のＩＧＦ−Ｉ受容体を発現されるように改変された細胞や動物、又は当該改変動物に由来する細胞も、本発明における脊椎動物由来細胞に含まれる。
【００６０】
脊椎動物由来細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖誘導活性を調べるための細胞としては、初代培養細胞、株化細胞又はそれらの細胞の形質転換体細胞等を用いることが可能である。初代培養細胞とは、生物の臓器や組織から分離された細胞で、通常はある程度の継代数での継代培養が可能であるものをいう。脊椎動物由来の初代培養細胞は、脊椎動物の臓器や組織から酵素処理、物理的方法による分散又はｅｘｐｌａｎｔ法等の手法で得ることができる。また、脊椎動物から得られた臓器や組織、又はそれらの断片を用いることも可能である。それらの当該初代細胞を調製する臓器や組織としては、好ましくは甲状腺、副甲状腺や副腎等の内分泌組織、虫垂、扁桃腺、リンパ節や脾臓等の免疫組織、気管や肺等の呼吸器、胃、十二指腸、小腸や大腸等の消化器、腎臓や膀胱等の泌尿器、輸精管、睾丸や前立腺等の雄性生殖器、乳房や卵管等の雌性生殖器、心筋や骨格筋等の筋組織等が挙げられ、より好ましくは肝臓、腎臓若しくは消化器又は筋組織等であり、さらにより好ましくは筋組織である。本発明での抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の増殖誘導活性を調べるために用いられる当該初代培養細胞としては、ＩＧＦ−Ｉ受容体を発現し、そのＩＧＦ−Ｉ受容体と結合するＩＧＦ−Ｉによって増殖が誘導される細胞が用いられる。その代表としては、筋組織から分離された初代培養細胞である骨格筋筋芽細胞等が使われる。ヒトや動物由来の初代培養細胞は分譲や市販されているものを入手して使用することも可能であり、ヒト初代培養細胞は、例えばＡＴＣＣ（登録商標）、ＥＣＡＣＣ、Ｌｏｎｚａ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ等の機関や会社から入手できる。
【００６１】
株化細胞とは生物に由来する細胞が不死化されて一定の性質を保ちながら半永久的に増殖しうる培養細胞をいう。株化細胞には非腫瘍由来のものと、腫瘍由来のものが存在する。本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体による増殖誘導活性を調べるための脊椎動物由来の株化細胞としては、ＩＧＦ−Ｉ受容体を発現し、そのＩＧＦ−Ｉ受容体と結合するＩＧＦ−Ｉによって増殖が誘導される細胞が用いられる。ＩＧＦ−Ｉ受容体を発現し、ＩＧＦ−Ｉにより細胞増殖が誘導される株化細胞としては、例えばヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ヒト表皮角化細胞株ＨａＣａＴ、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株Ａ５４９、ヒト結腸腺癌細胞株Ｃａｃｏ−２、ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２、ヒト子宮頚部癌細胞株Ｈｅｌａ、ヒト子宮頚部癌細胞株ＳｉＨａ、ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ７、ヒト多能性胎生期癌ＮＴＥＲＡ−２やヒト骨肉腫細胞株Ｕ−２−ＯＳ等があるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
また、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体による増殖誘導を調べる細胞としては、初代培養細胞や株化細胞の形質転換体細胞も挙げられる。そのような形質転換細胞としては、初代培養細胞から作製したｉＰＳ細胞やそのｉＰＳ細胞から分化誘導した細胞や組織等が挙げられる。また、他の形質転換細胞としては、初代培養細胞や株化細胞に遺伝子を導入し一過的又は持続的に発現させた細胞も当該形質転換細胞に含まれる。当該細胞に導入して発現させる遺伝子としては、ヒト又は他の種のＩＧＦ−Ｉ受容体の遺伝子を含んでもよい。
【００６３】
脊椎動物由来の細胞における本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体による細胞増殖誘導を調べる方法としては、細胞数計測、ＤＮＡ合成量の測定、代謝酵素活性の変化量の測定等が挙げられる。細胞数計測の方法は、血球算定盤を用いた方法やコールターカウンター等の細胞数計測装置を用いた方法があり、ＤＮＡ合成量を測定する方法としては、［３Ｈ］−チミジンや５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込みによる測定方法、代謝酵素活性の変化量をみる方法としては、ＭＴＴ法、ＸＴＴ法やＷＳＴ法等があるが、当業者であれば適宜その他の方法等でも実施することができる。細胞増殖誘導活性は、試験に用いる培養細胞に対して、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を反応させた場合の方が、当該抗体を反応させていない場合よりも細胞の増殖が上昇していることで判定できる。この場合、当該誘導活性の対照として、同条件で本来のＩＧＦ−Ｉ受容体のリガンドであるＩＧＦ−Ｉを反応させた測定を行うと、その活性の評価に便利である。
【００６４】
試験を行う培養細胞に対して、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体及びＩＧＦ−Ｉをそれぞれの濃度を変化させて反応させたときに、最大の増殖活性の５０％を示すときの濃度をＥＣ５０値として示す。ヒト骨格筋筋芽細胞を用いて増殖活性を評価した場合、好ましくは本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の細胞増殖誘導活性はＩＧＦ−Ｉと同等のＥＣ５０値であり、より好ましくは本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体のＥＣ５０値はＩＧＦ−Ｉの１／１０以下であり、さらに好ましくは１／２０以下であり、さらにより好ましくは本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体のＥＣ５０値はＩＧＦ−Ｉの１／５０以下である。また、ヒト骨格筋筋芽細胞を用いて増殖活性を評価した場合、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体のＥＣ５０値は、好ましくは０．５ｎｍｏｌ／Ｌ以下であり、より好ましくは０．３ｎｍｏｌ／Ｌ以下であり、さらに好ましくは０．１ｎｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００６５】
脊椎動物由来細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖誘導活性を調べる方法としては、当該脊椎動物に非経口的に本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を投与して、投与された個体全体、又は投与された個体における臓器又は組織の重量、大きさ、細胞数等の変化を計測するか、当該脊椎動物細胞を移植された動物を用いて、当該移植を受けた個体において当該移植された脊椎動物細胞を含む移植片の重量、大きさ、細胞数等の変化を計測することで調べることができる。個体全体での計測では、体重、体長、四肢周囲長等の測定や、インピーダンス法による体組成測定、クレアチニン、身長係数等が用いられる。個体での臓器や組織、又は移植片の計測については、ヒト以外の動物では直接目的の臓器、組織又は移植片を回収し、重量、大きさや含まれる細胞数の算定等が行われる。また、非侵襲的に個体の臓器、組織又は移植片を計測する方法としては、Ｘ線撮影像やＣＴ、ＭＲＩによる画像解析、同位元素や蛍光物質によるトレーサーを用いた造影法等が用いられる。対象となる組織が骨格筋である場合には、筋力の変化等が指標となる。その他、当業者であれば適宜その他の方法を用いることで、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の脊椎動物由来細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖誘導活性に対する作用を調べることができる。本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞増殖誘導活性を調べるためには、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を投与した個体と、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体以外の抗体又は別の対照物質を投与された個体との間で、上に示した方法等での計測等を行った結果を比較することで評価することができる。
【００６６】
本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、細胞に接触させた時間に対して、増殖誘導する作用が天然型ＩＧＦ−Ｉに対して長いため、持続性が改善されたという特徴を有する。実施例１２でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖誘導活性において、天然型ＩＧＦ−Ｉは細胞に接触させた後でＩＧＦ−Ｉを含まない培地で洗浄すると細胞増殖誘導活性が消失してしまうのに対して、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体であるＩＧＦ１１−１６抗体は、細胞に接触させた後ＩＧＦ１１−１６抗体を含まない培地で洗浄した場合でも細胞の増殖誘導活性が持続していた。また、実施例１６において、ＩＧＦ−Ｉと本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体であるＩＧＦ１１−１６抗体の血中動態を比較しているが、天然型ＩＧＦ−Ｉは動物への投与後２４時間までに約５０％以上が血中から消失するのに対して、ＩＧＦ１１−１６抗体は動物に投与された後、４８時間後でも６０％以上が血中に存在することから、長期間にわたって血中に存在していることが示された。これらのことから、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて長い細胞増殖誘導効果を示すことがわかる。
【００６７】
また、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの効果としては、筋肉量及び／又は体長の増大効果が挙げられる。ＩＧＦ−Ｉは骨格筋において上述の筋芽細胞の増殖や分化に作用するほか、筋線維を太くする作用もあり、そのような総合的な作用として筋肉量を増大させる効果があると考えられている。本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体もＩＧＦ−Ｉと同様に動物に投与することによって、当該動物の筋肉量を増大させる効果を有する。ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体の作用として、ｉｎ  ｖｉｖｏで筋肉の増大作用
を有することが示されたのは、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体が初めてである。
【００６８】
本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体による筋肉量の増大効果を計測する方法としては、個体全体での計測では、体重、体長、四肢周囲長等の測定や、インピーダンス法による体組成測定、クレアチニン、身長係数等が用いられ、また、ＣＴ、ＭＲＩによる画像解析、同位元素や蛍光物質によるトレーサーを用いた造影法等の方法が用いられるほか、筋力の変化等も指標になる。また、ヒト以外の動物では直接筋肉を採取してその重量や大きさを計測する方法等も可能である。筋肉量の増加の効果は、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を投与された個体と当該抗体を投与されなかった個体での筋肉量の増加を比較すること、又は、一つの個体で本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を投与する前と投与した後での筋肉量の比較を行うことで評価することができる。筋肉量の増加の効果は、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体が投与により筋肉量の増加の差が見られれば、その効果を知ることができるが、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体が投与された個体と投与されなかった個体、又は、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体が投与される前と後で、好ましくは１０３％以上、より好ましくは１０４％以上の筋肉量の差が認められることで本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の投与による効果を判断することが可能である。ＩＧＦ−Ｉは骨の成長にも関与し、体長（ヒトの場合は身長）を増大させる働きもある。したがって、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体も、動物に投与することによって体長を増大させる効果を有する。本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体による体長増大の効果は、個体の体重、体長、四肢周囲長等の測定によって計測することが可能である。
【００６９】
［脊椎動物由来細胞でのグルコース取込み及び／又は動物での血糖値に対する作用］
本発明のある態様における抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、脊椎動物由来の分化筋細胞での細胞内へのグルコースの取込み作用及び／又は脊椎動物での血糖値に影響を及ぼさない特徴を有する。ＩＧＦ−ＩはＩＧＦ−Ｉ受容体へのアゴニスト作用の一部として細胞へのグルコースの取込みの上昇や血糖値の降下作用を起こすことが知られているが、ＩＧＦ―Ｉ受容体アゴニスト抗体として機能する本発明での抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体では細胞での増殖誘導活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＥＣ５０値の１００倍以上の用量においても分化筋細胞でのグルコース取込みを誘導せず、動物に非経口的に投与した場合に筋肉量の増加を誘導する有効用量のさらに１０倍以上でも血糖値を変動させないという性状を示すことは予想外の効果である。また、ＩＧＦ―Ｉ受容体アンタゴニスト抗体としての性状としても、脊椎動物由来細胞の分化筋細胞でのグルコース取込み及び／又は脊椎動物での血糖値に影響を及ぼさないという特徴は、従来のＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニスト抗体をヒトの治療で用いる際の未充足の課題であった高血糖等を回避するうえで有利な効果である。本発明における脊椎動物由来細胞とは、好ましくは哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類又は魚類に由来する細胞であり、より好ましくは哺乳類又は鳥類に由来する細胞であり、さらにより好ましくは、ヒト、サル、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ又はイヌに由来する細胞である。また、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体と交差反応性を有する脊椎動物種由来のＩＧＦ−Ｉ受容体あるいは結合性を有するように変異を導入したＩＧＦ−Ｉ受容体を発現されるように改変された細胞や動物、又は当該改変動物に由来する細胞も、本発明における脊椎動物由来細胞に含まれる。
【００７０】
本発明での抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の脊椎動物由来細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞内へのグルコース取込みに影響を及ぼさない特徴を調べるための細胞としては、初代培養細胞、株化細胞又はそれらの細胞の形質転換体細胞等を用いることが可能である。初代培養細胞とは、生物の臓器や組織から分離された細胞で、通常はある程度の継代数での継代培養が可能であるものをいう。脊椎動物由来の初代培養細胞は、脊椎動物の臓器や組織から酵素処理、物理的方法による分散又はｅｘｐｌａｎｔ法等の手法で得ることができる。当該初代細胞を調製する臓器や組織としては、好ましくは甲状腺、副甲状腺や副腎等の内分泌組織、虫垂、扁桃腺、リンパ節や脾臓等の免疫組織、気管や肺等の呼吸器、胃、十二指腸、小腸や大腸等の消化器、腎臓や膀胱等の泌尿器、輸精管、睾丸や前立腺等の雄性生殖器、乳房や卵管等の雌性生殖器、心筋や骨格筋等の筋組織等が挙げられ、より好ましくは肝臓、腎臓もしくは消化器又は筋組織等であり、さらにより好ましくは筋組織である。
【００７１】
本発明での抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の細胞内へのグルコース取込みに影響を及ぼさない特徴を調べるために用いられる当該初代培養細胞としては、ＩＧＦ−Ｉ受容体を発現し、そのＩＧＦ−Ｉ受容体と結合するＩＧＦ−Ｉによって細胞内へのグルコース取込みが誘導される細胞が用いられる。その代表としては、筋組織から分離された初代培養細胞である骨格筋筋芽細胞を分化させた、分化筋細胞が挙げられる。
【００７２】
本発明の分化筋細胞とは、分化した筋細胞をいい、完全に分化が終わっていないものも含まれる。なお、本発明における「分化筋細胞」は、便宜上、分化開始から約６日後の細胞を、分化筋細胞という。ヒトや動物由来の初代培養細胞は分譲や市販されているものを入手して使用することも可能であり、ヒト初代培養細胞は、例えばＡＴＣＣ（登録商標）、ＥＣＡＣＣ、Ｌｏｎｚａ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ等の機関や会社から入手できる。
【００７３】
株化細胞とは生物に由来する細胞が不死化されて一定の性質を保ちながら半永久的に増殖しうる培養細胞をいう。株化細胞には非腫瘍由来のものと、腫瘍由来のものが存在する。本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体による細胞内へのグルコース取込みに及ぼす影響を調べるための脊椎動物由来の株化細胞としては、ＩＧＦ−Ｉ受容体を発現し、そのＩＧＦ−Ｉ受容体と結合するＩＧＦ−Ｉによって細胞内へのグルコース取込みが誘導される細胞が用いられる。ＩＧＦ−Ｉ受容体を発現し、ＩＧＦ−Ｉにより細胞内へのグルコース取込みが誘導される細胞としては、例えば骨格筋細胞、脂肪細胞、表皮角化細胞等があるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
また、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体による細胞内へのグルコース取込みに及ぼす影響を調べる細胞としては、初代培養細胞や株化細胞の形質転換体細胞も挙げられる。そのような形質転換細胞としては、初代培養細胞から作製したｉＰＳ細胞やそのｉＰＳ細胞から分化誘導した細胞等が挙げられる。また、他の形質転換細胞としては、初代培養細胞や株化細胞に遺伝子を導入し、一過的又は持続的に発現させた細胞も当該形質転換細胞に含まれる、当該細胞に導入して発現させる遺伝子としては、ヒト又は他の種のＩＧＦ−Ｉ受容体の遺伝子を含んでもよい。
【００７５】
脊椎動物由来の細胞における本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体によるグルコース取込みに及ぼす影響を調べる方法としては、細胞内グルコース濃度の測定、グルコース類縁トレーサー物質の細胞内取込み量の測定、グルコーストランスポーターの変化の測定等が挙げられる。グルコース濃度の測定方法は、酵素法等の吸光度測定法があり、グルコース類縁トレーサー物質の細胞内取込み量を測定する方法としては、［３Ｈ］−２’−デオキシグルコースの取込み量の測定、グルコーストランスポーターの変化をみる方法としては、細胞免疫染色法、ウエスタンブロット等があるが、当業者であれば適宜その他の方法等でも実施することができる。細胞内へのグルコース取込みに及ぼす影響は、試験に用いる培養細胞に対して、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を反応させた場合の細胞内へのグルコース取込みが、当該抗体を反応させていない場合と同程度であることで判定できる。この場合、当該誘導活性の対照として、同条件で本来のＩＧＦ−Ｉ受容体のリガンドであるＩＧＦ−Ｉを反応させた測定を行うと、その活性の評価に便利である。
【００７６】
試験を行う培養細胞に対して、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体及びＩＧＦ−Ｉをそれぞれの濃度を変化させて反応させたときに、無処置群の細胞内へのグルコース取込みを１００％とした場合のグルコース取込み量として示す。ヒト分化筋細胞を用いてグルコース取込み量を評価した場合、好ましくは本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体のグルコース取込み量は同一濃度のＩＧＦ−Ｉのグルコース取込み量以下であり、より好ましくは本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体のグルコース取込み量は無処置群の１１０％以下であり、さらに好ましくは本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体のグルコース取込み量は無処置群と同等の１００％である。また、ヒト分化筋細胞を用いてグルコース取込み量を評価した場合、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を１００ｎｍｏｌ／Ｌ添加した場合のグルコース取込み量は好ましくは１１０％以下であり、より好ましくは１０５％以下であり、さらに好ましくは９５から１００％である。
【００７７】
脊椎動物由来細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるグルコース取込みを調べる方法としては、当該脊椎動物に非経口的に本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を投与して投与された個体における臓器又は組織中のグルコース含量等の変化を計測することで調べることができる。個体全体での計測では、血糖値等の測定や、糖化蛋白質を指標としたヘモグロビンＡ１Ｃ等が用いられる。個体での臓器や組織中のグルコース取込み量等の測定においては、ヒト以外の動物においては直接目的の臓器又は組織を回収し、グルコース含量又はトレーサーの算定等が行われる。また、非侵襲的に個体の臓器又は組織中のグルコース取込みを測定する方法としては、Ｘ線撮影像やＣＴ、ＭＲＩによる画像解析、同位元素や蛍光物質によるトレーサーを用いた造影法等が用いられる。対象となる組織が骨格筋である場合には、グルコースクランプ等も指標となる。その他、当業者であれば適宜その他の方法を用いることで、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の脊椎動物由来細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるグルコース取込みに及ぼす影響を調べることができる。
【００７８】
また、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は脊椎動物に非経口投与された場合、当該脊椎動物の筋肉量の増加を誘導する有効用量に対して、同一用量、好ましくは１０倍以上の用量においても、当該脊椎動物の血糖値を変動させないことを特徴とする。本発明での抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の脊椎動物での血糖値の変化を調べるための動物としては、好ましくは哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類又は魚類に属する動物であり、より好ましくは哺乳類又は鳥類に属する動物であり、さらにより好ましくは、ヒト、サル、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ又はイヌである。また、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体と交差反応性がある種のＩＧＦ−Ｉ受容体を発現されるように改変された動物も、本発明での抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の脊椎動物での血糖値の変化を調べるための動物に含まれる。血糖値の測定は、観血的方法としては比色法や電極法等が用いられ、検出のための酵素にはグルコースオキシダーゼ法（ＧＯＤ法）、グルコースデヒドロゲナーゼ法（ＧＤＨ法）等があり、非観血的方法としては光学的測定法等があるが、当業者であれば適宜その他の方法も選択することができる。血糖値はヒトの場合、空腹時血糖値の正常域は１００ｍｇ／ｄＬから１０９ｍｇ／ｄＬである。血糖値に対する薬剤投与による有害事象は（有害事象共通用語規準  ｖ４．０）、血糖値が７７ｍｇ／ｄＬ−５５ｍｇ／ｄＬの範囲より低値となる場合は低血糖、１０９ｍｇ／ｄＬ−１６０ｍｇ／ｄＬの範囲より高値となる場合は高血糖と定義されている。薬剤投与による血糖値に及ぼす影響がないとは、薬剤投与後の血糖値が５５ｍｇ／ｄＬより上で１６０ｍｇ／ｄＬ未満の範囲内となること、より好ましくは７７ｍｇ／ｄＬより上で１０９ｍｇ／ｄＬ未満の範囲内となることである。但し、血糖値は投与する動物によって正常値やその変動の幅がことなり、またヒトであっても投与時の血糖値が必ずしも正常値の範囲であるとは限らないことから、本発明において脊椎動物の血糖値を変動させないとは、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を投与された脊椎動物の血糖値が好ましくは３０％以内、より好ましくは２０％以内、さらにより好ましくは１０％以内の変化であることをいう。
【００７９】
［抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の製法］
本発明における抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明における抗体は、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体（ミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（Ｅｎｇｌａｎｄ）１９８３年１０月６日発行、３０５巻５９３４号、ｐ．５３７〜５４０）であることができる。例えば、ポリクローナル抗体は配列番号２のＩＧＦ−Ｉ受容体のペプチドを抗原として哺乳動物に感作し、当該動物の血清等から回収することができる。また、ペプチドを抗原として用いる場合には、ＢＳＡやＫＬＨ等のキャリアタンパク質やポリリジン等に結合させた形態での抗原を用いることができる。また抗原として用いるペプチドの具体的例としては、配列番号２の部分配列であるＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｎＳｅｒＭｅｔを用いることができるが、これに限定されるものではない。当該発明におけるモノクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞等と細胞融合させることにより得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から回収することができる。そのようなモノクローナル抗体の取得方法としては、実施例１に記載されており、それによって得られたモノクローナル抗体としては配列番号９のＶＨアミノ酸配列、配列番号１０のＶＬアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体（ＩＧＦ１１−１６）が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００８０】
得られたモノクローナル抗体は、その抗体のタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する核酸分子を得ることも可能であり、そのような核酸分子を用いて遺伝子工学的に抗体を作製することも可能である。当該抗体の遺伝子情報、例えばＨ鎖、Ｌ鎖、それらの可変領域やＣＤＲ配列等の情報を用いて、抗体の結合性や特異性の向上のための改変等を行うことや、マウス等の動物の抗体からヒト型抗体に改変することによって、治療剤に用いるために適した構造の抗体を作製することは、この分野での当業者にはよく知られた技術である。また、抗原を感作する動物としてヒト抗体遺伝子が導入された非ヒト−トランスジェニック動物を用いることによって、ヒト型のモノクローナル抗体を取得することも可能である。それ以外にも、動物への感作を必要としない方法として、ヒト抗体の可変領域又はその一部を発現するファージライブラリー（ヒト抗体ファージディスプレイ）を用いて、対応する抗原と特異的に結合する抗体や特定のアミノ酸配列からなるファージクローンを取得し、その情報からヒト抗体を作製する技術も当業者であれば適宜行うことができる（例えば、Ｔａｋｅｔｏ  Ｔａｎａｋａ等、Ｋｅｉｏ  Ｊ．Ｍｅｄ．、６０巻、ｐ３７−４６のレビュー等を参照）。
【００８１】
また、前述のモノクローナル抗体を製造する方法としては、それぞれ取得したい抗体を産生するハイブリドーマを培養し、得られた培養上清から常法によって抗体を精製して取得することができる。また、別の製造方法としては、取得したい抗体を産生するハイブリドーマやヒト抗体ファージディスプレイで得られたファージクローン等から抗体をコードする遺伝子、より詳細には免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖をコードする遺伝子を取得して、当該遺伝子を発現するためのベクターを作製し、宿主細胞（哺乳類細胞、昆虫細胞、微生物等）に導入して、当該抗体を産生させることも可能である。このとき、免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖をコードする遺伝子について、望む形質を導入するための遺伝子改変を実施すること、免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖の可変領域又はＣＤＲ領域の構造情報を用いてヒト型化抗体、抗体キメラタンパク質、低分子抗体やスキャフォールド抗体を作製することは、公知の技術を用いることで当業者であれば実施することができる。また、抗体の性能の向上や副作用の回避を目的に、抗体の定常領域の構造に改変を入れることや、糖鎖の部分での改変を行うことも、当業者によく知られた技術によって適宜行うことができる。
【００８２】
本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。具体的に、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、通常はモノクローナル抗体（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９８３、Ｖｏｌ．３０５、Ｎｏ．５９３４、ｐｐ．５３７−５４０）であるところ、斯かるモノクローナル抗体は、例えば以下の手法で作製することが可能である。
【００８３】
例えば、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列をコードする核酸分子を作製する。ここで、斯かる核酸分子を各種のベクター又はプラスミドに導入することにより、当該核酸分子を含むベクター又はプラスミドを作製してもよい。次いで、前記の核酸分子、ベクター、又はプラスミドで宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、若しくは植物細胞等の真核細胞、又は細菌細胞が挙げられる。次に、この形質転換された宿主細胞を、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を産生するための適切な条件下で培養する。ここで、必要に応じ、得られた本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を宿主細胞から単離してもよい。これらの手順に用いられる各種の手法は、何れも当業者には周知である。
【００８４】
また、動物への感作を用いる方法としては、抗原を感作する動物としてヒト抗体遺伝子が導入された非ヒト−トランスジェニック動物を用い、ＩＧＦ−Ｉ受容体及び／又はその部分ペプチド等を感作させ、免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞等と細胞融合させることにより得られたハイブリドーマをクローニングして、得られた培養上清から常法によって抗体を精製して回収することにより得ることができる。そのようなモノクローナル抗体の取得方法としては、例えば国際公開第２０１３／１８０２３８号に記載されている。
【００８５】
それ以外にも、所望のヒト化抗体の可変領域又はその一部を発現するファージライブラリー（ヒト抗体ファージディスプレイ）を用いて、対応する抗原と特異的に結合する抗体や特定のアミノ酸配列からなるファージクローンを取得し、その情報からヒト化抗体を作製する技術を用いることもできる（例えば、Ｔａｋｅｔｏ  Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｋｅｉｏ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．６０、ｐｐ．３７−４６のレビュー等を参照）。
【００８６】
ここで、免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖をコードする遺伝子について、望む形質を導入するための遺伝子改変を行ったり、免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖の可変領域又はＣＤＲ領域の構造情報を用いたりすることにより、抗体キメラタンパク質、低分子抗体、スキャフォールド抗体等を作製することは、当業者であれば公知の技術を用いて実施可能である。また、抗体の性能の向上や副作用の回避を目的に、抗体の定常領域の構造に改変を入れることや、糖鎖の部分での改変を行うことも、当業者によく知られた技術によって適宜行うことができる。
【００８７】
［抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を含有する薬］
本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、ＩＧＦ−Ｉに関連した状態又はＩＧＦ−Ｉ受容体への作用に起因する疾患の治療薬又は予防薬として利用可能である。具体的には、ＩＧＦ−Ｉに関連した状態又はＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体での治療又は予防の対象となる疾患としては、廃用性筋萎縮、低身長症、肝硬変、肝線維化、糖尿病性腎症、慢性腎不全、ラロン症、老化、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）、心血管保護、糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、骨粗しょう症、嚢胞性線維症、筋強直性ジストロフィー、エイズ筋減弱症、ＨＩＶに伴う脂肪再分布症候群、クローン病、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖性複合免疫不全症、難聴、神経性無食欲症及び未熟児網膜症、ターナー症候群、プラダー・ウィリー症候群、シルバー・ラッセル症候群、特発性低身長、肥満、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、低筋肉量、心筋虚血、低骨密度、ＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニスト抗体での治療又は予防の対象となる疾患としては、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、小児がん、先端巨大症、卵巣がん、膵臓がん、良性前立腺肥大症、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、結腸直腸がん、頚部がん、滑膜肉腫、膀胱がん、胃がん、ウィルムス腫瘍、転移性カルチノイド及び血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍に関連する下痢、ビポーマ、ウェルナー−モリソン症候群、ベックウィズ−ヴィーデマン症候群、腎臓がん、腎細胞がん、移行上皮がん、ユーイング肉腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、脳腫瘍、膠芽腫、非膠芽腫性脳腫瘍、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、脳室上衣腫、脈絡叢乳頭腫、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管の平滑筋再狭窄、不適切な微小血管増殖、糖尿病性網膜症、グレーヴズ病、全身性エリテマトーデス、慢性甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺炎、及びベーチェット病が挙げられる。特に、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は廃用性筋萎縮及び／又は低身長症の治療薬又は予防薬としての使用が好ましい。また、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は投与によって血糖値の変動を生じさせない点において優れている。
【００８８】
本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を含有する薬は、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の他に、医薬的に許容される担体及び／又はその他の添加剤を含有する、医薬組成物の形態として製剤化してもよい。医薬的に許容される担体及び／又はその他の添加剤を用いての製剤は、例えばＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０ｔｈ  ＥＤＩＴＩＯＮ”，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００に記載の方法で実施することが可能である。このような治療剤又は予防剤の一つの形態としては、無菌の水性液又は油性液に溶解、懸濁、又は乳化することによって調製された液剤あるいは凍結乾燥剤として供される。このような、希釈剤としての溶剤又は溶解液として、水性液としては注射用蒸留水、生理食塩水等が挙げられ、それに加えて浸透圧調節剤（例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）が添加される場合、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（例えばエタノール）、ポリアルコール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０）等が併用される場合もある。また、溶剤又は溶解液としては油性液が用いられる場合もあり、当該油性液の例としてはゴマ油、大豆油等があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等が併用される場合もある。このような製剤においては、適宜、緩衝剤（例えば、リン酸塩類緩衝剤、酢酸塩類緩衝剤）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、アスコルビン酸、エリソルビン酸及びそれらの塩等）、着色剤（例えば、銅クロロフィル、β−カロチン、赤色２号、青色１号等）、防腐剤（例えばパラオキシ安息香酸エステル、フェノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム等）、増粘剤（例えばヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びそれらの塩等）、安定化剤（例えば人血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール等）、矯臭剤（例えばメントール、柑橘香料等）の添加剤が用いられる場合がある。別の形態として、粘膜適用用治療剤又は予防剤もあげられ、この製剤においては粘膜への吸着性、滞留性等を付与することを主な目的として、添加剤として粘着剤、粘着増強剤、粘稠剤、粘稠化剤等（例えば、ムチン、カンテン、ゼラチン、ペクチン、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、ローカストビンガム、キサンタンガム、トラガントガム、アラビアゴム、キトサン、プルラン、ワキシースターチ、スクラルフェート、セルロース、及びその誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリグリセリン脂肪酸エステル、アクリル酸（メタ）アクリル酸アルキル共重合体、又はその塩、ポリグリセリン脂肪酸エステル等）が含有される場合もある。しかしながら、生体に供与される治療剤又は予防剤の形態及び溶剤や添加剤はこれらに限定されるものではな���、当業者であれば適宜選択できる。
【００８９】
本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を含有する薬は、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体の他に、既存の他の薬物（活性成分）を含んでいてもよい。また、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を含む薬を、既存の他の薬物と組み合わせ、キットの形態としてもよい。ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体と組み合わせる活性成分として、成長ホルモン又はそのアナログ、インスリン又はそのアナログ、ＩＧＦ−ＩＩ又はそのアナログ、抗ミオスタチン抗体、ミオスタチンアンタゴニスト、抗アクチビンＩＩＢ型受容体抗体、アクチビンＩＩＢ受容体アンタゴニスト、可溶性アクチビンＩＩＢ型受容体又はそのアナログ、グレリン又はそのアナログ、フォリスタチン又はそのアナログ、ベータ２アゴニスト、及び選択的アンドロゲン受容体モジュレーターが挙げられる。また、ＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニスト抗体と組み合わせる活性成分として、コルチコステロイド、制吐薬、オンダンセトロン塩酸、グラニセトロン塩酸、メトロクロプラミド（ｍｅｔｒｏｃｌｏｐｒａｍｉｄｅ）、ドンペリドン、ハロペリドール、シクリジン、ロラゼパム、プロクロルペラジン、デキサメタゾン、レボメプロマジン、トロピセトロン、癌ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ阻害薬、ＧＭ−ＣＳＦ  ＤＮＡワクチン、細胞に基づくワクチン、樹状細胞ワクチン、組換えウイルスワクチン、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）ワクチン、同種腫瘍ワクチン、自己腫瘍ワクチン、鎮痛薬、イブプロフェン、ナプロキセン、トリサリチル酸コリンマグネシウム、オキシコドン塩酸、抗血管形成薬、抗血栓薬、抗ＰＤ−１抗体、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、アテゾリズマブ、抗ＣＴＬＡ４抗体、イピリムマブ、抗ＣＤ２０抗体、リツキシマブ、抗ＨＥＲ２抗体、トラスツズマブ、抗ＣＣＲ４抗体、モガムリズマブ、抗ＶＥＧＦ抗体、ベバシズマブ、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性ＶＥＧＦ受容体断片、抗ＴＷＥＡＫ抗体、抗ＴＷＥＡＫ受容体抗体、可溶性ＴＷＥＡＫ受容体断片、ＡＭＧ  ７０６、ＡＭＧ  ３８６、抗増殖薬、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害薬、αｖβ３阻害薬、αｖβ５阻害薬、ｐ５３阻害薬、Ｋｉｔ受容体阻害薬、ｒｅｔ受容体阻害薬、ＰＤＧＦＲ阻害薬、成長ホルモン分泌阻害薬、アンジオポエチン阻害薬、腫瘍浸潤マクロファージ阻害薬、ｃ−ｆｍｓ阻害薬、抗ｃ−ｆｍｓ抗体、ＣＳＦ−１阻害薬、抗ＣＳＦ−１抗体、可溶性ｃ−ｆｍｓ断片、ペグビソマント、ゲムシタビン、パニツムマブ、イリノテカン、及びＳＮ−３８が挙げられる。配合される抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体以外の薬物の用量としては、通常の治療に用いられる用量で行うことができるが、状況に応じて増減することも可能である。
【００９０】
本発明における治療剤又は予防剤は、症状の改善を目的として、非経口的に投与することができる。非経口投与の場合には、例えば経鼻剤とすることができ、液剤、縣濁剤、固形製剤等を選択できる。また別の非経口投与の形態としては、注射剤とすることができ、注射剤としては、皮下注射剤、静脈注射剤、点滴注射剤、筋肉注射剤、脳室内注射剤又は腹腔内注射剤等を選択することができる。またその他の非経口投与に用いる製剤としては、坐剤、舌下剤、経皮剤、経鼻剤以外の経粘膜投与剤等も挙げられる。更に、ステントや血管内栓塞剤に含有もしくは塗布する態様で、血管内局所投与することもできる。
【００９１】
本発明における治療剤又は予防剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間、又は当該医薬組成物に含有される活性成分の種類等により異なるが、通常成人１人あたり、１回につき主剤を０．１ｍｇから１ｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから３００ｍｇの範囲で、１週から４週間に１回、もしくは１か月から２か月に１回投与することができる。従って、好ましくは１週間に１回以下の頻度で投与することができる。しかし、投与量及び投与回数は種々の条件により変動するため、前記投与量及び回数よりも少ない量及び回数で充分な場合もあり、また前記の範囲を超える投与量及び投与回数が必要な場合もある。
【００９２】
［ヒト以外の動物での用途］
本発明のある態様における抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、ヒト以外の動物での畜産用途又は獣医学的用途に用いることができる。本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を畜産用途又は獣医学的用途で用いることができる動物としては、好ましくはヒト以外の哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類又は魚類に属する動物であり、より好ましくはヒト以外の哺乳類又は鳥類に属する動物であり、さらにより好ましくは、サル、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ又はイヌから選択される動物である。現在、ウシ成長ホルモンやブタ成長ホルモンがウシでの乳汁産生量の増大や子ブタの成長促進のために使われているが、これらの作用は成長ホルモンによって発現が誘導されるＩＧＦ−Ｉの作用によるものと考えられている（ｈ．  ＪｉａｎｇとＸ．  Ｇｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．９２、ｐｐ２１−２９、２０１４）。従って、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、そのアゴニスト作用を利用することで、同様に動物の乳汁産生の亢進や、胎児や出生後の動物の成長促進等に用いることができる。その他、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を用いることができる用途の例としては、動物における筋肉量の増量又は脂肪重量に対する筋肉重量比の増大、摂取飼料の体組織への効率的変換、繁殖効率増大や種保存のための生殖能力の増強、動物における外傷や消耗性疾患での消耗的症状の治療等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。また、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、別の態様であるアンタゴニスト作用を利用することで、動物での悪性腫瘍の治療、繁殖頻度の制御、個体の成長の制御やその他の用途にも用いることができる。本発明における抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を用いる場合、投与する動物に合わせて抗体のフレームワークや定常領域のアミノ酸配列を改変して免疫原性を低下させる等、当業者であれば適宜その構造を改変したうえで用いることも可能である。
【００９３】
［抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を用いた細胞培養方法］
脊椎動物由来細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて維持、増殖及び／又は分化させるための細胞培養技術において、ＩＧＦ−Ｉ又はその誘導体が多く用いられており、細胞培養用の試薬として市販されている。ＩＧＦ−Ｉは安定性の問題等から長期の培養においては時間が経つにつれて効果が減弱する可能性があり、安定的な細胞培養を行うためには適宜濃度を調節する等の対応が必要になる。また、ＩＧＦ−Ｉは細胞へのグルコースの取込みを誘導することから、細胞内グルコース濃度の上昇によって細胞の代謝や特性の変化が誘導されたり、培地中のグルコース濃度が減少して培養環境が変化する可能性がある。本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体はＩＧＦ−Ｉと比較して安定性が高く、細胞に接触してからの細胞増殖を誘導する時間が長く、ＩＧＦ−Ｉより低濃度で細胞増殖誘導活性を示し、かつ、細胞内へのグルコース取込みを誘導しないという特徴を持つ。本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、細胞培養においてその培地に適量を添加して使用されるほか、培養を行う容器の固相に吸着又は固定して用いることが可能で、それによって使用量を削減したり、固相に付着する細胞に対して有効に細胞増殖誘導を行うことができる。本発明における脊椎動物由来細胞とは、好ましくは哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類又は魚類に由来する細胞であり、より好ましくは哺乳類又は鳥類に由来する細胞であり、さらにより好ましくは、ヒト、サル、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ又はイヌに由来する細胞である。また、当該細胞としては、初代培養細胞、株化細胞又はそれらの細胞の形質転換体細胞、遺伝子組み換え動物に由来する細胞等を用いることが可能である。さらに、本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体を用いた培養の対象としては、脊椎動物又はその遺伝子改変動物に由来する臓器や組織等も含まれる。本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体は、細胞を用いた物質生産のための培養や、細胞自体を用いる細胞医療・再生医療での培養工程で用いることができる。
【実施例】
【００９４】
［実施例１］マウスモノクローナル抗体の作製
マウスモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７、１９７５）のハイブリドーマ法により作製し得る。ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体は、マウスにヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を発現させた細胞を用いて免疫して、標準的なハイブリドーマ技術を使用して作製した。全ての動物実験は、施設の規則に従って実施した。マウスから採取した脾臓由来の細胞とマウスミエローマ細胞株（Ｐ３Ｕ１）との融合による標準的な方法を使用して実施した。ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有する培地を使用してハイブリドーマを選択した。ハイブリドーマの培養液を用いて、ＩＧＦ−Ｉ受容体を発現させた細胞を用いたＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡによる結合性評価、及びＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）によるＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞内チロシンキナーゼの活性化の評価を実施し、陽性ハイブリドーマ含有ウェルを選択した。このウェルに含まれるハイブリドーマを限界希釈法によってシングルクローン化した。このシングルクローン化した陽性ハイブリドーマを無血清培養して、培養液中からプロテインＡカラム（Ａｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ、プロテノバ）を使用してモノクローナル抗体を精製した。このモノクローナル抗体を使用して、ヒト筋芽細胞増殖活性評価によりＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体であるＩＧＦ１１−１６を見出した。【００９５】
［実施例２］抗体アイソタイプの決定
ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体の抗体アイソタイプを決定するために、抗体のアイソタイプに特異的な抗体を用いて、ＥＬＩＳＡを実施した。ＰＢＳにて２０００倍希釈した抗マウスＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ、６１５０）を、５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐ）に添加し、４℃で一晩静置した。９６ウェルプレートを３％ＢＳＡ／ＰＢＳに置換したものをＥＬＩＳＡに使用した。ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体を、抗マウスＩｇＧ抗体を固定化させた９６ウェルプレートに３０μＬ／ウェルで添加し、室温にて１．５時間反応させた。洗浄液にて洗浄した後、マウスＩｇＧの各種アイソタイプに特異的に反応する抗体、抗マウスＩｇＧ１抗体−ＡＬＰコンジュゲート（ＳＢＡ、１０７０−０４）、抗マウスＩｇＧ２ａ抗体−ＡＬＰコンジュゲート（ＳＢＡ、１０８０−０４）、抗マウスＩｇＧ２ｂ抗体−ＡＬＰコンジュゲート（ＳＢＡ、１０９０−０４）及び抗マウスＩｇＧ３抗体−ＡＬＰコンジュゲート（ＳＢＡ、１１００−０４）、を３０μＬ／ウェルで添加し、室温にて１時間反応させた。基質（ＰＮＰＰ）を１００μＬ／ウェルで添加し、室温にて４５分間反応させ、吸光度４０５−５５０ｎｍを算出した。吸光度４０５−５５０ｎｍの値を結合活性として評価した。
ＩＧＦ１１−１６は、抗マウスＩｇＧ１抗体に反応性を示すことから、抗体のアイソタイプはＩｇＧ１であった。【００９６】
［実施例３］抗体の配列の決定
ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体の軽鎖及び重鎖の遺伝子配列を決定するために、ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）  ＲＡＣＥ法を実施した。抗体を産生するハイブリドーマ由来のＲＮＡから開始及び終始コドンを含む抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子の断片をＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）  ＲＡＣＥ法により取得し、その塩基配列を決定した。ハイブリドーマ由来のＴｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型としてＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）  ＲＡＣＥ  ５’／３’  Ｋｉｔ（６３４８５９、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した後、ＰＣＲ反応によりｃＤＮＡを増幅させた。そのｃＤＮＡを鋳型として、キットに付属のユニバーサル配列に対するプライマーと、抗体の重鎖及び軽鎖にそれぞれ特異的なプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。マウス抗体の軽鎖（ｋａｐｐａ）はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＢＣ０８０７８７、マウス抗体のＩｇＧ１はＬＴ１６０９６６を参照してプライマーを設計した。マウス抗体の軽鎖に対するプライマーの塩基配列は、ｇｇｔｇａａｇｔｔｇａｔｇｔｃｔｔｇｔｇａｇｔｇｇを設計し、マウス抗体の重鎖に対するプライマーの塩基配列は、ｇｃｔｃｔｔｃｔｃａｇｔａｔｇｇｔｇｇｔｔｇｔｇｃを設計し、それぞれを実験に用いた。得られたＰＣＲ産物は５‘ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物としてＴＡクローニングに用いた。【００９７】
ＴＡクローニングでは、５‘ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物を電気泳動して目的とする分子量を含むｃＤＮＡをＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（２００２１、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製後のｃＤＮＡはＴａＫａＲａ−Ｔａｑ（Ｒ００１Ａ、Ｔａｋａｒａ）を用いて７２℃、５分間反応させることにより５’及び３‘末端にアデニンを付加させた。そのｃＤＮＡをＴＯＰＯ（登録商標）  ＴＡ  クローニング（登録商標）  キット（４５０６４１、Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ）を用いて添付のプロトコールに従い、Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）  ｖｅｃｔｏｒ（以下、ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ）にクローニングした。目的のｃＤＮＡがクローニングされたＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒを大腸菌ＴＯＰ１０に形質転換させ、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ含有の寒天培地で培養した。ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒへの目的とするｃＤＮＡの挿入はコロニーＰＣＲにより確認した。クローニングしたｃＤＮＡの塩基配列を同定した。同様に３’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物の塩基配列を同定し、抗体の遺伝子の全長配列を決定した。ＩＧＦ１１−１６の軽鎖の全長遺伝子配列を配列番号２７に、全長アミノ酸配列を配列番号２８に、ＩＧＦ１１−１６の重鎖の全長遺伝子配列を配列番号２９に、全長アミノ酸配列を配列番号３０に示す。また、ＩＧＦ１１−１６のＣＤＲ−Ｈ１は配列番号３、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号４、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号５、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号６、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号７、ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号８、重鎖可変領域は配列番号９、軽鎖可変領域は配列番号１０に示す。【００９８】
［実施例４］ＩＧＦ−Ｉ受容体に対する結合活性（ＥＬＩＳＡ）
ヒト（配列番号２、ＮＰ＿０００８６６）、モルモット（配列番号１１、ＸＰ＿００３４７５３１６）、カニクイザル（配列番号１２、ＮＰ＿００１２４８２８１）、ウサギ（配列番号１３、ＸＰ＿０１７１９３２７３）、ラット（配列番号１４、ＮＰ＿４９４６９４）及びマウス（配列番号１５、ＮＰ＿０３４６４３）のＩＧＦ−Ｉ受容体に対するＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体の結合活性を検討するために、各種ＩＧＦ−Ｉ受容体を発現させた細胞を用いてＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡを実施した。【００９９】
Ｐ３Ｕ１細胞にリポフェクション法によりヒト（配列番号１６）、モルモット（配列番号１７）、カニクイザル（配列番号１８）、ウサギ（配列番号１９）、ラット（配列番号２０）及びマウス（配列番号２１）のＩＧＦ−Ｉ受容体遺伝子を組込んだｐＥＦ１発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を導入した。リポフェクション後に一晩以上培養させたＰ３Ｕ１細胞を０．８×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルで９６ウェルプレート（ポリ―Ｄ―リジンコート）に添加して、１０％緩衝ホルマリン（Ｍｉｌｄｆｏｒｍ（登録商標）１０ＮＭ、Ｗａｋｏ）を用いて固定した。３％ＢＳＡを含有したリン酸緩衝液にてブロッキングしたものをＥＬＩＳＡに使用した。【０１００】
ＥＬＩＳＡは、０．１％スキムミルク／３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１０ｎＭに調製されたＩＧＦ１１−１６抗体溶液を各ウェルに３０μＬ添加して室温にて約１時間３０分反応させた。洗浄液にて２回洗浄した。０．１％スキムミルク／３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて各濃度に調製された抗マウスＩｇＧ抗体ＨＲＰコンジュゲート溶液を各ウェルに３０μＬ添加して室温にて約１時間反応させた。洗浄液にて２回洗浄した。各ウェルに基質（ＴＭＢ）を５０μＬ添加して反応を開始させた。約２０分後に各ウェルに５０μＬの０．５Ｍ硫酸を添加して４５０及び５５０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度４５０−５５０ｎｍを算出した。ＩＧＦ−Ｉ受容体遺伝子を含まないベクターを導入した細胞（Ｍｏｃｋ細胞、配列番号２２）に対する吸光度４５０−５５０ｎｍの値を１として、結合活性を算出した（表１）。【０１０１】
【表１】
2018221521.tif 000002
【０１０２】
ＩＧＦ１１−１６は、ヒト、モルモット、カニクイザル及びウサギのＩＧＦ−Ｉ受容体を発現させた細胞では、Ｍｏｃｋ細胞と比較して、結合活性を５倍以上上昇させた。一方、ＩＧＦ１１−１６のラット及びマウスのＩＧＦ−Ｉ受容体を発現させた細胞に対する結合活性は、Ｍｏｃｋ細胞と同程度であり、上昇させなかった。これらのことからＩＧＦ１１−１６は、ヒト、モルモット、カニクイザル及びウサギのＩＧＦ−Ｉ受容体に結合するが、ラット及びマウスのものには結合しないことが示された。【０１０３】
［実施例５］インスリン受容体に対する結合活性（ＥＬＩＳＡ）
インスリン受容体に対するＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体の結合活性を検討するために、ヒトインスリン受容体を発現させた細胞を用いてＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡを実施した。【０１０４】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にリポフェクション法によりヒトのインスリン受容体遺伝子を組込んだｐＥＦ１発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を導入した。リポフェクション後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を０．８×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル（約１８０μＬ／ウェル）で９６ウェルプレート（ポリ―Ｄ―リジンコート）に添加して、１０％緩衝ホルマリン（Ｍｉｌｄｆｏｒｍ（登録商標）１０ＮＭ、Ｗａｋｏ）を用いて固定した。３％ＢＳＡを含有したリン酸緩衝液にてブロッキングしたものをＥＬＩＳＡに使用した。【０１０５】
ＥＬＩＳＡは、０．１％スキムミルク／３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて各濃度に調製された抗体溶液を各ウェルに３０μＬ添加して室温にて約１時間反応させた。洗浄液（Ｔｗｅｅｎ含有トリス緩衝液）にて２回洗浄した。０．１％スキムミルク／３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて各濃度に調製された抗マウスＩｇＧ抗体ＡＬＰコンジュゲート溶液を各ウェルに３０μＬ添加して室温にて約１時間反応させた。洗浄液にて２回洗浄した。各ウェルに基質（ＰＮＰＰ）を１００μＬ添加して反応を開始させた。約３０分後に４０５及び５５０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度４０５−５５０ｎｍを算出した。ＩＧＦ−Ｉ受容体の遺伝子及びインスリン受容体の遺伝子を含まないベクターを導入した細胞（Ｍｏｃｋ細胞、配列番号２２）に対する吸光度４０５−５５０ｎｍの値を１として、結合活性を算出した（表２）。【０１０６】
【表２】
2018221521.tif 000003
【０１０７】
ＩＧＦ１１−１６の０．５ｎＭ及び５ｎＭは、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体を発現させた細胞を固定化したＥＬＩＳＡでは、吸光度４０５−５５０ｎｍを、Ｍｏｃｋ細胞と比較して約３倍以上まで上昇させた。一方、ヒトインスリン受容体を発現させた細胞を固定化したＥＬＩＳＡでは、ＩＧＦ１１−１６の０．５ｎＭ及び５ｎＭは、吸光度４０５−５５０ｎｍを１．５倍以上上昇させなかった。このことから、ＩＧＦ１１−１６は、インスリン受容体と比較して、ＩＧＦ−Ｉ受容体により強く結合した。【０１０８】
［実施例６］ＩＧＦ−Ｉ受容体の結合部位の解析（ＥＬＩＳＡ）
ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体のＩＧＦ−Ｉ受容体に対するエピトープを同定するために、ＩＧＦ−Ｉ受容体の各種ドメインを、ＩＧＦ−Ｉ受容体と類似構造を有するインスリン受容体のドメインと置換した変異体に対するＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体の結合性を測定した。【０１０９】
ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体（ＮＰ＿０００８６６）の細胞外ドメインをインスリン受容体の細胞外ドメインで置換させた置換体、又は、ヒトインスリン受容体（ＮＰ＿０００１９９）の細胞外ドメインをＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞外ドメインで置換した、以下の４つの置換体を作製した。
（置換体１）ヒトインスリン受容体のＬ１ドメインからＬ２ドメインまでを、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体のＬ１ドメインからＬ２ドメインに置換した置換体、ｈＩＧＦＩＲ［Ｌ１−Ｌ２］／ｈＩＮＳＲ。
（置換体２）ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体のＬ１ドメインからＬ２ドメインまでを、ヒトインスリン受容体のＬ１ドメインからＬ２ドメインに置換した置換体、ｈＩＮＳＲ［Ｌ１−Ｌ２］／ｈＩＧＦＩＲ。
（置換体３）ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体のＬ１ドメインを、ヒトインスリン受容体のＬ１ドメインに置換した置換体、ｈＩＮＳＲ［Ｌ１］／ｈＩＧＦＩＲ。
（置換体４）ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体のＬ２ドメインを、ヒトインスリン受容体のＬ２ドメインに置換した置換体、ｈＩＮＳＲ［Ｌ２］／ｈＩＧＦＩＲ。【０１１０】
Ｐ３Ｕ１細胞にリポフェクション法により、上記４種のヒトＩＧＦ−Ｉ受容体の置換体の遺伝子を組込んだｐＥＦ１発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を導入した。（置換体１）のｈＩＧＦＩＲ［Ｌ１−Ｌ２］／ｈＩＮＳＲの遺伝子を配列番号２３に、（置換体２）のｈＩＮＳＲ［Ｌ１−Ｌ２］／ｈＩＧＦＩＲの遺伝子を配列番号２４に、（置換体３）のｈＩＮＳＲ［Ｌ１］／ｈＩＧＦＩＲの遺伝子を配列番号２５に、（置換体４）のｈＩＮＳＲ［Ｌ２］／ｈＩＧＦＩＲの遺伝子を配列番号２６に示す。リポフェクション後に一晩以上培養したＰ３Ｕ１細胞を０．８×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルで９６ウェルプレート（ポリ−Ｄ−リジンコート）に添加して、１０％緩衝ホルマリン（Ｍｉｌｄｆｏｒｍ（登録商標）１０ＮＭ、Ｗａｋｏ）を用いて固定した。３％ＢＳＡを含有したリン酸緩衝液にてブロッキングしたものをＥＬＩＳＡに使用した。【０１１１】
ＥＬＩＳＡは、０．１％スキムミルク／３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１０ｎＭに調製された抗体溶液を各ウェルに３０μＬ添加して室温にて約１時間３０分反応させた。洗浄液にて２回洗浄した。０．１％スキムミルク／３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて５ｎＭに調製された抗マウスＩｇＧ抗体ＨＲＰコンジュゲート溶液を各ウェルに３０μＬ添加して室温にて約１時間反応させた。洗浄液にて２回洗浄した。各ウェルに基質（ＴＭＢ）を５０μＬ添加して反応を開始させた。約２０分後に０．５Ｍ硫酸を５０μＬ添加して反応を停止し、４５０及び５５０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度４５０−５５０ｎｍを算出した。各置換体の遺伝子を含まないベクターを導入した細胞（Ｍｏｃｋ細胞）に対する吸光度４５０−５５０ｎｍの値を１として、結合活性を算出した（表３）。【０１１２】
【表３】
2018221521.tif 000004
【０１１３】
ＩＧＦ１１−１６は、ｈＩＧＦＩＲ［Ｌ１−Ｌ２］／ｈＩＮＳＲ、ｈＩＮＳＲ［Ｌ１］／ｈＩＧＦＩＲ及びｈＩＮＳＲ［Ｌ２］／ｈＩＧＦＩＲを発現させた細胞を固定化したＥＬＩＳＡでは、吸光度４５０−５５０ｎｍをＭｏｃｋ細胞に対して５倍以上上昇させた。一方、ｈＩＮＳＲ［Ｌ１−Ｌ２］／ｈＩＧＦＩＲを発現させた細胞に対するＩＧＦ１１−１６の結合活性は、弱かった。このことからＩＧＦＩ１−１６は、ＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインに結合することが示された。【０１１４】
［実施例７］ＩＧＦ１１−１６のエピトープの決定
ＩＧＦ１１−１６のエピトープであるＣＲドメインから、さらに詳細なエピトープを同定するために、ＩＧＦ１１−１６のＩＧＦ−Ｉ受容体に対する結合性の種差から結合配列を推定した。図１に、それぞれの種におけるＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインのアミノ酸配列を示す。【０１１５】
ＩＧＦ１１−１６は、ヒト、モルモット及びウサギのＩＧＦ−Ｉ受容体に結合するが、マウス及びラットのＩＧＦ−Ｉ受容体には結合しない。このことから、ＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインのアミノ酸配列のうち、ヒト、モルモット及びウサギに共通して、マウス及びラットとは異なるアミノ酸配列を、ＩＧＦ１１−１６のエピトープとして推定した。【０１１６】
ＩＧＦ１１−１６がＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインのどの部位のアミノ酸に結合するのかを決定するために、ＣＲドメインの各種アミノ酸置換体に対する結合性をＥＬＩＳＡにより測定した。【０１１７】
ＣＲドメインのうち、ＩＧＦ１１−１６との結合が推定されるアミノ酸配列を変異させたＩＧＦ−Ｉ受容体を発現させた細胞を用いてＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡを実施した。【０１１８】
ＣＲドメインの各種アミノ酸置換体は、以下の３種を用いた。また、陽性対照として野生型のヒトＩＧＦ−Ｉ受容体、陰性対照として野生型のラットＩＧＦ−Ｉ受容体をｐＥＦ１発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に組込んだものを用いた。各種ＩＧＦ−Ｉ受容体の発現量は、ＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞内ドメインに付加したＦＬＡＧタグ（ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ）に対するＦＬＡＧ  Ｍ２抗体の反応性を指標とした。
（ＣＲドメインの置換体１）ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体（ＮＰ＿０００８６６、配列番号２）のアミノ酸配列、２４５番目及び２４７番目のアスパラギン酸及びアラニンを、それぞれアスパラギン及びトレオニンに置換させた。
（ＣＲドメインの置換体２）ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体（ＮＰ＿０００８６６、配列番号２）のアミノ酸配列、２９４番目のグルタミン酸を、アスパラギン酸に置換させた。
（ＣＲドメインの置換体３）ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体（ＮＰ＿０００８６６、配列番号２）のアミノ酸配列、３１５番目及び３１６番目のグリシン及びセリンを、それぞれセリン及びトレオニンに置換させた。【０１１９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９×１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルでポリ―Ｄ−リジンコートされた１０ｃｍディッシュに播種した。翌日に各プラスミドＤＮＡをリポフェクション法により細胞に導入した。その翌日に０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞を剥がして、培養液にて懸濁した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を０．８×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルで９６ウェルプレート（ポリ―Ｄ−リジンコート）に添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩インキュベートした。９６ウェルプレートから培地を除去して、１０％緩衝ホルマリン（Ｍｉｌｄｆｏｒｍ（登録商標）１０ＮＭ、Ｗａｋｏ）を用いて固定し、ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ／アジ化ナトリウム）に置換したものをＥＬＩＳＡに使用した。【０１２０】
ＥＬＩＳＡは、０．１％スキムミルク／３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１ｎＭに調製されたＩＧＦ１１−１６抗体又はＦＬＡＧ  Ｍ２抗体溶液を各ウェルに５０μＬ添加して室温にて約１時間反応させた。洗浄液にて２回洗浄した。０．１％スキムミルク／３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて各濃度に調製された抗マウスＩｇＧ抗体ＨＲＰコンジュゲート溶液を各ウェルに５０μＬ添加して室温にて約１時間反応させた。洗浄液にて２回洗浄した。各ウェルに基質（ＴＭＢ）を１００μＬ添加して反応を開始させた。約３０分後に０．５Ｍ硫酸を１００μＬ添加して、反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度４５０ｎｍの値を結合活性として評価した。【０１２１】
結果を図２に示す。ＣＲドメインの各置換体を発現させた細胞に対するＦＬＡＧ  Ｍ２抗体の反応性は同等であり、ＣＲドメインの各置換体の発現量はほぼ同じレベルであることが確認された。ＩＧＦ１１−１６は、ＣＲドメインに変異を導入していない、野生型のヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に対して、吸光度４５０ｎｍの値を２以上まで上昇させ、結合活性の亢進を示した。ＣＲドメインの置換体１及び２に対して、ＩＧＦ１１−１６は、吸光度４５０ｎｍの値を２以上まで上昇させ、結合活性の亢進を示した。一方、ＣＲドメインの置換体３の吸光度４５０ｎｍの値は約１であり、陰性対照であるラットＩＧＦ−Ｉ受容体の吸光度と同程度であり、結合性は認められなかった。これらのことから、ＩＧＦ１１−１６の、ＩＧＦ−Ｉ受容体のＣＲドメインに対する結合活性は、ＩＧＦ−Ｉ受容体の３１５番目及び３１６番目のアミノ酸が重要であることが示された。【０１２２】
以上の結果から、ＩＧＦ１１−１６のヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に対する結合部位は、３１５番目及び３１６番目のＧｌｙ（グリシン）とＳｅｒ（セリン）の近傍と推定された。一般的に抗体の認識配列はアミノ酸８残基（６から１０残基の平均値）であること、及びＩＧＦ１１−１６の交差反応性（ラットのＩＧＦ−Ｉ受容体に対する結合性なし、ウサギ及びヒトのＩＧＦ−Ｉ受容体に対する結合性を有する）から、ＩＧＦ１１−１６のヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に対する結合部位の推定配列は、ＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＧｌｙ＊Ｓｅｒ＊ＧｌｎＳｅｒＭｅｔと考えられた（Ｇｌｙ＊Ｓｅｒ＊は、３１５番目及び３１６番目のアミノ酸配列を示す）。【０１２３】
［実施例８］表面プラズモン共鳴法によるＩＧＦ−Ｉ受容体に対する結合親和性
薬剤のＩＧＦ−Ｉ受容体に対する結合特性（結合速度及び解離速度）を検討するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法により測定した。【０１２４】
センサーチップＣＭ３（ＧＥ）に、ａｎｔｉ−Ｈｉｓ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙを、Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＢＲ−１０００−５０、ＧＥ）及びＨｉｓ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（２８−９９５０−５６、ＧＥ）を使用して固定した。固定条件は、ＮＨＳ／ＥＤＣ  ７分、５０μｇ／ｍＬ  ａｎｔｉ−Ｈｉｓ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ３分、Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎ  ７分、Ｔａｒｇｅｔ：≧３０００ＲＵで実施した。アナライトは、各濃度の薬剤を使用した。リガンドは、リコンビナントヒトＩＧＦ−Ｉ受容体ヒスチジンタグ（３０５−ＧＲ−０５０、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ、以下ＩＧＦ−ＩＲ−Ｈｉｓ）を使用した。陰性対照は、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ、κ、Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｔｒｌ、Ｃｌｏｎｅ：ＭＧ２ａ−５３（４０１５０２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、以下ｃｔｒｌ  ＩｇＧ２ａ）を使用した。【０１２５】
Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙの固定化されたセンサーチップＣＭ３を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００に設置し、反応温度を３６℃に設定し、ランニングバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ＋、ＢＲ−１００６−６９、ＧＥ）を流速３０μＬ／分で流した。リガンドの結合量を約１００ＲＵとなるように設定して、ＩＧＦ−ＩＲ−Ｈｉｓを０．５〜２×１０−８ｍｏｌ／Ｌで添加して、ａｎｔｉ−Ｈｉｓ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙに補足させた。１０ｎｍｏｌ／ＬのＣｔｒｌ  ＩｇＧ２ａを１分間反応させ、ＨＢＳ−ＥＰ＋を流速３０μＬ／分で１０分以上流した。アナライト及びＨＢＳ−ＥＰ＋を、フローセル（１及び２）及びフローセル（３及び４）にそれぞれ添加して反応させた。【０１２６】
反応条件は、結合時間、６００秒及び乖離時間、６００秒に設定した。反応終了後、再生用バッファー１（０．２％ＳＤＳ）、再生用バッファー２（１００  ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２）及び再生用バッファー３（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５））で、それぞれ１分間、流速３０μＬ／分で洗浄した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒ２．０）を使用して、１：１  ＢｉｎｄｉｎｇのＭｏｄｅｌで解析し、解離速度定数（ｋａ、１／Ｍｓ）、結合速度定数（ｋｄ、１／ｓ）及び解離定数（ＫＤ、Ｍ）を算出した。結果を表４に示す。【０１２７】
【表４】
2018221521.tif 000005
【０１２８】
ＩＧＦ１１−１６のヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に対するｋａは、ＩＧＦ−Ｉの約１／５であり、結合速度は遅かった。一方、ＩＧＦ１１−１６のヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に対するｋｄは、測定機器の測定下限より低値であり、ＩＧＦ−Ｉの１／１０００より低値であることから、解離速度は非常に遅く、ＩＧＦ１１−１６はＩＧＦ−Ｉ受容体に結合すると解離しづらいことが示された。ＩＧＦ１１−１６のヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に対するＫＤは、ＩＧＦ−Ｉの１／５０より低値であり、強い結合強度を示した。ＩＧＦ１１−１６はＩＧＦ−Ｉと比較してＩＧＦ−Ｉ受容体に対して強い結合活性を有することが示された。【０１２９】
［実施例９］ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）によるＩＧＦ−Ｉ受容体あるいはインスリン受容体の活性化作用
ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体のＩＧＦ−Ｉ受容体に対する活性化作用を検出するために、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＩＧＦ１Ｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓａｙ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を用いてＩＧＦ−Ｉ受容体の下流シグナルの活性化を測定した。【０１３０】
ＩＧＦ−Ｉ受容体及びＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞内のチロシンキナーゼと結合するＳＨ２ドメインを持つアダプタープロテインＳＨＣ１−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｃｃｅｐｔｏｒ（ＥＡ）融合タンパク質を、細胞内に強制発現させた細胞株を用いた。ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体のインスリン受容体に対する活性化作用を検出するために、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＩＮＳＲ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓａｙ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を用いてインスリン受容体の下流シグナルの活性化を測定した。インスリン受容体及びインスリン受容体の細胞内のチロシンキナーゼと結合するＳＨ２ドメインを持つアダプタープロテインＰＬＣＧ１−ＥＡ融合タンパク質を、細胞内に強制発現させた細胞株を用いた。これらの細胞株は、ＩＧＦ−Ｉ受容体あるいはインスリン受容体へのリガンド結合によって受容体の二量体化が起こり、続いて受容体がリン酸化されることにより、ＳＨ２ドメインを持つアダプタープロテインがリクルートされ、受容体シグナル伝達複合体が形成され、空間的に隣接したチロシンキナーゼとＥＡの結合が促され、活性型β−ガラクトシダーゼが再構成される。このβ−ガラクトシダーゼ活性による加水分解された基質の化学発光シグナルのレベルを測定することにより、受容体型チロシンキナーゼに対する薬剤の作用を同定することが可能である。【０１３１】
ＩＧＦ−Ｉ受容体あるいはインスリン受容体を発現させた細胞を、ポリ―Ｄ―リジンコートあるいはコラーゲン―Ｉコートされた９６ウェルプレート（Ｂｌａｃｋ／ｃｌｅａｒあるいはＷｈｉｔｅ／ｃｌｅａｒ）に、９０μＬ／ウェル（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルあるいは５×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件でインキュベートした。翌日、各濃度の薬剤を１０μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件でインキュベートした。その翌日、培養上清を３０μＬで取り、１５μＬの基質溶液を添加して、６０分間反応させ、ルミノメーター（Ｔｒｉｓｔａｒ、ベルトールド）にて発光シグナルを測定した。ＩＧＦ−Ｉ受容体の活性化は、溶媒のみを処置した群の活性を１００％として算出した。結果を表５に示す。【０１３２】
【表５】
2018221521.tif 000006
【０１３３】
インスリン受容体の活性化は、溶媒のみを処置した群の活性を１００％として算出した。結果を表６に示す。【０１３４】
【表６】
2018221521.tif 000007
【０１３５】
ＩＧＦ−Ｉ受容体を発現させた細胞株を用いて、薬剤のＩＧＦ−Ｉ受容体の活性化を測定した。ＩＧＦ−Ｉ受容体を発現させた細胞株では、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ１１−１６はコントロールと比較してＩＧＦ−Ｉ受容体の活性化作用を示した。【０１３６】
インスリン受容体を発現させた細胞株を用いて、薬剤のインスリン受容体の活性化を測定した。インスリン受容体を発現させた細胞株では、インスリンによるインスリン受容体の活性化作用を示した。また、ＩＧＦ−Ｉは、インスリン受容体を濃度依存的に活性化し、５０ｎＭでは有意な活性化作用を示した。一方、ＩＧＦ１１−１６はインスリン受容体を活性化しなかった。【０１３７】
ＩＧＦ−Ｉは、インスリン受容体にも反応性を示すことが知られている。また、インスリン受容体の活性化は血糖低下作用を惹起することも知られている。ＩＧＦ１１−１６は、ＩＧＦ−Ｉ受容体に特異的に作用し、インスリン受容体を介する血糖低下作用を有さないことが示された。【０１３８】
［実施例１０］ヒト筋芽細胞における細胞増殖活性
ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体のヒト筋芽細胞に対する増殖活性を検討するため、ヒト筋芽細胞に薬剤を添加して、４日後の細胞内のＡＴＰ量を測定した。【０１３９】
正常ヒト骨格筋筋芽細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｍｙｏｂｌａｓｔ  Ｃｅｌｌｓ、ＨＳＭＭ、Ｌｏｎｚａ）を、ＳｋＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−３２４６）に１％ＢＳＡを含む培地を使用して、９６ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏａｔｅｄ）に、０．１ｍＬ／ウェル（２×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件でインキュベートした。細胞播種の翌日に各種薬剤を２５μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で４日間インキュベートした。細胞増殖の指標として細胞内のＡＴＰ量を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。４日間インキュベートした９６ウェルプレートを、培養液が５０μＬ／ウェルとなるように上清を除き、３０分以上室温にて静置した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を５０μＬ／ウェルで添加して１０分以上反応させた後にルミノメーター（Ｔｒｉｓｔａｒ、ベルトールド）にて発光シグナルを測定した。溶媒のみを添加した群の活性を１００％として算出した。結果を表７に示す。【０１４０】
【表７】
2018221521.tif 000008
【０１４１】
ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ１１−１６は、コントロール抗体（ＦＬＡＧ  Ｍ２、シグマアルドリッチ）と比較して、細胞増殖活性を亢進させた。【０１４２】
０．００００５、０．０００５、０．００５、０．０５、０．５、５、５０及び５００ｎＭのＩＧＦ１１−１６は、ヒト筋芽細胞の増殖活性を濃度依存的に亢進させた。ＩＧＦ１１−１６及びＩＧＦ−Ｉの筋芽細胞増殖活性のＥＣ５０は、それぞれ０．００４ｎＭ及び０．６１ｎＭであり、ＩＧＦ１１−１６は１００倍以上強い活性を示した。【０１４３】
非特許文献３５に記載された１６−１３抗体、及び２６−３抗体は、溶媒コントロール（アジ化ナトリウムを含む）に比べて、顕著な細胞増殖活性は認められず、ＩＧＦ１１−１６の活性と比較して弱いものであった。【０１４４】
［実施例１１］モルモット筋芽細胞における細胞増殖活性
モルモット筋芽細胞（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を、ＳｋＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−３２４６）に１％ＢＳＡを含む培地を使用して、９６ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏａｔｅｄ）に、０．１ｍＬ／ウェル（４×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件でインキュベートした。細胞播種の翌日に各種薬剤を２５μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で４日間インキュベートした。細胞増殖の指標として細胞内のＡＴＰ量を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。４日間インキュベートした９６ウェルプレートを、培養液が５０μＬ／ウェルとなるように上清を除き、３０分以上室温にて静置した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を５０μＬ／ウェルで添加して１０分以上反応させた後にルミノメーター（Ｔｒｉｓｔａｒ、ベルトールド）にて発光シグナルを測定した。【０１４５】
０．００００５、０．０００５、０．００５、０．０５、０．５、５、５０及び５００ｎＭのＩＧＦ１１−１６は、モルモット筋芽細胞の増殖活性を、濃度依存的に亢進させた。ＩＧＦ１１−１６及びＩＧＦ−ＩのＥＣ５０は、それぞれ０．００４ｎＭ及び０．７６ｎＭであり、ＩＧＦ１１−１６は１００倍以上強い活性を示した。【０１４６】
［実施例１２］ＩＧＦ−Ｉとの作用持続性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ比較
ＩＧＦ１１−１６とＩＧＦ−Ｉの作用持続性を比較するために、ＩＧＦ１１−１６又はＩＧＦ−Ｉを添加した１８時間後に培地を交換して、ＩＧＦ１１−１６及びＩＧＦ−Ｉを除去した条件でヒト筋芽細胞の増殖活性を測定した。【０１４７】
正常ヒト骨格筋筋芽細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｍｙｏｂｌａｓｔ  Ｃｅｌｌｓ、ＨＳＭＭ、Ｌｏｎｚａ）を、ＳｋＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−３２４６）に１％ＢＳＡを含む培地を使用して、９６ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏａｔｅｄ）に、０．１ｍＬ／ウェル（２×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件でインキュベートした。細胞播種の翌日にＩＧＦ１１−１６又はＩＧＦ−Ｉを２５μＬ／ウェルで添加し、添加１８時間後に、ＩＧＦ１１−１６又はＩＧＦ−Ｉの入っていない培地あるいはそれらを含有する培地と交換した。３７℃、５％ＣＯ２の条件で４日間インキュベートした。細胞増殖の指標として細胞内のＡＴＰ量を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。４日間インキュベートした９６ウェルプレートを、培養液が５０μＬ／ウェルとなるように上清を除き、３０分以上室温にて静置した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を５０μＬ／ウェルで添加して１０分以上反応させた後にルミノメーター（Ｔｒｉｓｔａｒ、ベルトールド）にて発光シグナルを測定した。溶媒のみを添加したコントロール群に対する割合（コントロール群、０％）を細胞増殖活性として算出した。結果を図３に示す。【０１４８】
ＩＧＦ−Ｉの１ｎＭ及び５ｎＭを４日間添加した群では、細胞増殖活性を、それぞれ３９％及び７５％に上昇させた。ＩＧＦ−Ｉの１ｎＭ及び５ｎＭを１８時間添加してｗａｓｈｏｕｔした群の細胞増殖活性は、それぞれ８％及び１０％であり、４日間添加した群と比較した活性は、１／５より低くなり、顕著な作用の低下を示した。【０１４９】
ＩＧＦ１１−１６の０．５ｎＭを４日間添加した群では、細胞増殖活性を、４９％に上昇させた。ＩＧＦ１１−１６の０．５ｎＭを１８時間添加してｗａｓｈｏｕｔした群の細胞増殖活性は３０％であり、４日間添加した群と比較した活性は、６割以上が保持されていた。【０１５０】
薬剤添加後にｗａｓｈｏｕｔしたＩＧＦ１１−１６の０．５ｎＭ処置群とＩＧＦ−Ｉの１ｎＭ及び５ｎＭ処置群の細胞増殖活性を比較すると、ＩＧＦ１１−１６の方が統計学的に有意に強い活性を示した。これらのことから、ＩＧＦ１１−１６は、薬剤のｗａｓｈｏｕｔ後もヒト筋芽細胞の増殖活性を維持して、ＩＧＦ−Ｉと比較して、強力な作用を有することが示された。ＩＧＦ１１−１６はｗａｓｈｏｕｔ後も細胞増殖活性を維持したことから、ＩＧＦ−Ｉの作用とは異なり、ＩＧＦ１１−１６はＩＧＦ−Ｉ受容体と強力に結合し、ＩＧＦ−Ｉ受容体の持続的な活性化作用を有することが示された。【０１５１】
［実施例１３］ヒト分化筋細胞におけるグルコース取込み
ＩＧＦ１１−１６のグルコース取込み作用を検討するために、ヒト分化筋細胞を用いて、放射標識された３Ｈ−２−Ｄｅｏｘｙ  Ｇｌｕｃｏｓｅの取込み量を測定して、ＩＧＦ−Ｉの作用と比較した。【０１５２】
正常ヒト骨格筋筋芽細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｍｙｏｂｌａｓｔ  Ｃｅｌｌｓ、ＨＳＭＭ、Ｌｏｎｚａ）を２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、３５２６）に０．５ｍＬ／ウェル（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件でインキュベートした。細胞がコンフルエントの状態になるまで培地（ＳｋＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−３２４６）にＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−４４２３Ｗ）、Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−４４２２Ｗ）、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−４４２１Ｗ）、ｒｈＥＧＦ（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−４４２０Ｗ）及びＧＡ−１０００（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−４４１９Ｗ）を添加した）を交換した。コンフルエントとなったＨＳＭＭ細胞を０．５ｍＬ／ウェルの分化用の培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Ｇｉｂｃｏ、１１３２０）に２％Ｈｏｒｓｅ  Ｓｅｒｕｍ（Ｓｉｇｍａ、Ｈ１２７０）、５０Ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０  μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、１５０７０−０６３）を含む）に交換して３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートして筋細胞への分化を開始した。分化開始から約６日後の細胞をヒト分化筋細胞としてグルコース取込みの実験に使用した。【０１５３】
ヒト分化筋細胞を０．５ｍＬ／ウェルのＳｔａｒｖａｔｉｏｎ用の培地（１ｇ／Ｌ  グルコース含有ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、１１８８５）に０．１％ＢＳＡ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  ｆｒｅｅ（生化学工業、８２−００２−５）、５０Ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０ｕｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、１５０７０−０６３）を含む）に交換して３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、０．５ｍＬ／ウェルのＳｔａｒｖａｔｉｏｎ用の培地に交換して３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。ウェルを１ｍＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄した後、０．５ｍＬ／ウェルの各種薬剤を含む処置培地を添加して３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。処置培地は、グルコース取込み用のバッファー（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ＤＯＪＩＮＤＯ、３４２−０１３７５）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ＳＩＧＭＡ、Ｓ５１５０）、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ（Ｗａｋｏ、１６３−０３５４５）、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４（Ｗａｋｏ、１３１−００４０５）、１．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４（Ｗａｋｏ、１６９−０４２４５）、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２（Ｆｌｕｋａ、２１１１４）及び２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｗａｋｏ、１９０−１４８８１）となるように注射用水にて溶解して、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整）を用いて、最終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ、０．１％ＢＳＡ、３Ｈ−２−Ｄｅｏｘｙ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（１ｕＣｉ／ｍＬ）、各濃度のヒト組換えＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体となるように調製した。ウェルに１ｍＬ／ウェルの冷却したＰＢＳを添加し、３回洗浄することによりグルコース取込みを終了させた。ウェルに０．２５ｍＬ／ウェルの１Ｎ  ＮａＯＨを添加して細胞を溶解した。細胞溶解液を、３ｍＬの液体シンチレーターＵＬＴＩＭＡ  ＧＯＬＤ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｊａｐａｎ）をあらかじめ添加したバイアルに全量添加して撹拌した。液体シンチレーションカウンターにて３Ｈの放射活性（ＤＰＭ）を３分間測定した。無処置群（コントロール群）のグルコース取込み量（ＤＰＭ）の平均値を１００％として処置群のグルコース取込み率を算出した。結果を図４に示す。【０１５４】
ＩＧＦ−Ｉの０．８、４、２０及び１００ｎＭは、濃度依存的、且つ有意にグルコース取込みを亢進させた。一方、ＩＧＦ１１−１６は、１００ｎＭまで有意な作用を示さなかった。これらのことからＩＧＦ１１−１６は、ヒト分化筋細胞でのグルコース取込み作用は極めて弱いと考えられた。【０１５５】
［実施例１４］ｉｎ  ｖｉｖｏ薬効（モルモットにおける筋肉量増加作用）
ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの薬効を確認するために、モルモットにＩＧＦ１１−１６を単回投与して、２週間後の筋肉量を測定して、ＩＧＦ−Ｉを持続投与した時の作用と比較した。筋肉量増加作用とは、モルモットの筋肉重量をコントロール群と比べて５％以上増加させることとする。【０１５６】
ＩＧＦ１１−１６（０．０３、０．１又は０．３ｍｇ／ｋｇ）を、正常モルモットの皮下あるいは静脈内に単回投与した。陽性対照としてヒト組換えＩＧＦ−Ｉ（メカセルミン）を、浸透圧ポンプ（アルゼット）を使用して皮下に埋め込み、１ｍｇ／ｋｇ／日となるように持続投与した。薬剤投与の２週間後、モルモットを麻酔下で放血致死させ、長趾伸筋の重量を測定した。結果を図５に示す。【０１５７】
ＩＧＦ１１−１６の０．０３、０．１及び０．３ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した群（ｉｖ）は、溶媒のみを処置したコントロール群と比較して、用量依存的、且つ有意に筋肉量を増加させた。また、ＩＧＦ１１−１６の０．３ｍｇ／ｋｇを皮下投与した群（ｓｃ）でも、コントロール群と比較して、有意な筋肉量の増加を示した。【０１５８】
ＩＧＦ１１−１６の０．０３から０．３ｍｇ／ｋｇの単回投与群の筋肉増加量は、ヒト組換えＩＧＦ−Ｉを１ｍｇ／ｋｇ／日で持続投与した群（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）と同程度であった。このことから、ＩＧＦ１１−１６は、静脈内あるいは皮下への単回投与により、ｉｎ  ｖｉｖｏでも薬効を有することが示された。【０１５９】
ＩＧＦ１１−１６は、単回投与により、ＩＧＦ−Ｉの持続投与と同等の薬効を有することが示された。臨床でのＩＧＦ−Ｉ（メカセルミン）の用法用量は１日１回から２回である。一方、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＩＧＦ１１−１６は２週に１回の投与でＩＧＦ−Ｉの持続投与と同等の有効性を示すことから、ＩＧＦ−Ｉと比較して持続性に優れることが示された。【０１６０】
［実施例１５］ｉｎ  ｖｉｖｏ血糖低下作用（モルモットにおける血糖低下作用）
ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの血糖低下作用の有無を確認するために、モルモットにＩＧＦ１１−１６を単回投与して、継時的に血糖値を測定して、ＩＧＦ−Ｉの単回投与時の血糖低下作用と比較した。血糖低下作用とは、血糖値を５０ｍｇ／ｄＬ以下に低下させる、又は低血糖症状を起こす作用とする。【０１６１】
ＩＧＦ−Ｉをモルモットに単回皮下投与して、血糖低下作用を検討した。モルモットを１２時間絶食させ、ヒト組換えＩＧＦ−Ｉ（メカセルミン）を、０．３、１、３及び１０ｍｇ／ｋｇで単回皮下投与した。モルモットは、投与２４時間後まで絶食させた。覚醒状態のモルモットを、投与前（０時間）、投与１、２、４、８、１０及び２４時間後に採血して、グルテストセンサー（三和化学研究所）を使用して血糖値を測定した。結果を図６に示す。【０１６２】
ＩＧＦ−Ｉは、０．３ｍｇ／ｋｇから有意な血糖低下作用を示し、１ｍｇ／ｋｇ以上では低血糖症状が認められ、３ｍｇ／ｋｇ以上では死亡例が認められた。【０１６３】
ＩＧＦ１１−１６をモルモットに単回皮下投与して、血糖低下作用を検討した。モルモットを１２時間絶食させ、ＩＧＦ１１−１６を、１０、３０及び１００ｍｇ／ｋｇで単回皮下投与した。モルモットは、投与２４時間後まで絶食させた。覚醒状態のモルモットを、投与前（０時間）、投与２、４、８、１０及び２４時間後に採血して、グルテストセンサー（三和化学研究所）を使用して血糖値を測定した。結果を図７に示す。【０１６４】
ＩＧＦ１１−１６は、溶媒のみを投与したコントロール群と比較して、１００ｍｇ／ｋｇ投与群でも、血糖値に有意な差を認めなかった。このことから、ＩＧＦ１１−１６の皮下投与は、血糖低下作用を有さず、血糖値に影響を及ぼさないことが示された。【０１６５】
ＩＧＦ１１−１６をモルモットに単回静脈内投与して、血糖低下作用を検討した。モルモットを１２時間絶食させ、ＩＧＦ１１−１６を、０．１、１．５、６及び２０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。モルモットは、投与２４時間後まで絶食させた。覚醒状態のモルモットを、投与前（０時間）、投与０．５、１、２、４、８及び２４時間後に採血して、グルテストセンサー（三和化学研究所）を使用して血糖値を測定した。結果を図８に示す。【０１６６】
ＩＧＦ１１−１６は、溶媒のみを投与したコントロール群と比較して、２０ｍｇ／ｋｇ投与群でも、血糖値に有意な差を認めなかった。このことから、ＩＧＦ１１−１６は静脈内投与でも、血糖低下作用を有さず、血糖値に影響を及ぼさないことが示された。【０１６７】
ＩＧＦ１１−１６は、皮下及び静脈内のいずれの投与法でも、ＩＧＦ−Ｉのような顕著な血糖低下作用を有さず、血糖値に影響を及ぼさないことから、ＩＧＦ−Ｉの副作用である低血糖を克服した、薬剤としての可能性が示された。【０１６８】
［実施例１６］ｉｎ  ｖｉｖｏ薬効（モルモットにおける成長促進効果）
ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの骨に対する薬効を確認するために、ＩＧＦ−Ｉを持続投与、及び成長ホルモン（ＧＨ）を1日1回反復投与した時の作用と比較した。下垂体を摘出されたモルモットにＩＧＦ１１−１６を単回投与して、２週間後の脛骨の長さ、及び成長板軟骨の厚さを、成長促進効果の指標として測定した。ＩＧＦ１１−１６（０．３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇ）を、下垂体摘出モルモットに単回皮下投与した。比較対照としてヒト組換えＩＧＦ−Ｉ（メカセルミン）を、浸透圧ポンプ（アルゼット）を使用して皮下に埋め込み、１ｍｇ／ｋｇ／日となるように持続投与した。また、別の比較対照としてヒト組換えＧＨ（ジェノトロピン（登録商標））を、１ｍｇ／ｋｇの用量で、１日１回、反復皮下投与した。薬剤投与の２週間後、モルモットを麻酔下で放血致死させ、脛骨近位部の成長板軟骨の厚さ、及び脛骨の長さを測定した。結果を図９及び図１０に示す。【０１６９】
ＩＧＦ１１−１６の０．３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇを皮下投与した群（ＩＧＦ１１−１６）は、下垂体摘出モルモットに溶媒のみを処置したコントロール群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較して、用量依存的、且つ有意に成長板軟骨の厚さ、及び脛骨の長さを伸展させ、成長促進効果が認められた。
ＩＧＦ１１−１６の０．３ｍｇ／ｋｇの単回投与群の成長促進効果は、ヒト組換えＩＧＦ−Ｉを１ｍｇ／ｋｇ／日で持続投与した群（ＩＧＦ−Ｉ）と同程度であった。また、ＩＧＦ１１−１６の１ｍｇ／ｋｇの単回投与群の成長促進効果は、ヒト組換えＧＨを１ｍｇ／ｋｇ／日で反復投与した群（ＧＨ）と同程度であった。このことから、ＩＧＦ１１−１６は、単回投与により、ＩＧＦ−Ｉの持続投与、及びＧＨの１日１回の反復投与と同等の薬効を有することが示された。臨床でのヒト組換えＩＧＦ−Ｉ（メカセルミン）及びヒト組換えＧＨ（ジェノトロピン（登録商標））の用法用量は、それぞれ１日１回から２回の皮下注射、及び週６回から７回の皮下注射である。一方、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＩＧＦ１１−１６は２週に１回の投与でＩＧＦ−Ｉの持続投与、及びＧＨの1日1回反復投与と同等の有効性を示すことから、ＩＧＦ−Ｉ及びＧＨと比較して持続性に優れることが示された。【０１７０】
［実施例１７］ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ１１−１６の血中動態
ＩＧＦ−Ｉの血中動態
モルモットを１２時間絶食させ、ヒト組換えＩＧＦ−Ｉを、０．３、１、３及び１０ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。モルモットは、投与２４時間後まで絶食させた。覚醒状態のモルモットを、投与前（０時間）、投与１、２、４、８、１０及び２４時間後に採血して、血漿中のヒトＩＧＦ−Ｉ濃度をＥＬＩＳＡ（ＤＧ１００、Ｒ＆Ｄ）により測定した。結果を図１１に示す。【０１７１】
血漿中のＩＧＦ−Ｉ濃度は投与用量に依存して上昇し、投与２４時間後の血漿中のＩＧＦ−Ｉ濃度はピーク時の約５０％以下にまで低下していた。０．３ｍｇ／ｋｇ投与群の投与２４時間後のＩＧＦ−Ｉ濃度は測定下限以下であった。また、１０ｍｇ／ｋｇ投与群は投与４時間以降に低血糖のため死亡したため血漿を採取できなかった。【０１７２】
ＩＧＦ１１−１６の血中動態
モルモットを１２時間絶食させ、ＩＧＦ−Ｉ受容体アゴニスト抗体を、０．３、１、３、１０、３０及び１００ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。モルモットは、投与２４時間後まで絶食させ、２４時間後に再給餌した。覚醒状態のモルモットを、投与前（０時間）、投与２、４、８、１０、２４、４８及び７２時間後に採血して、血漿中のＩＧＦ１１−１６濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１２に示す。
血漿中のＩＧＦ１１−１６濃度は投与用量に依存して上昇し、投与４８時間以降も血漿中のＩＧＦ１１−１６濃度は投与２４時間後と比較して約５０％以上を維持していた。ＩＧＦ１１−１６の血中動態はＩＧＦ−Ｉと比較して持続性に優れていることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１７３】
本発明は、脊椎動物のＩＧＦ−Ｉ受容体に特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉ受容体を介して、筋肉量又は成長板軟骨の厚さを増加させ、血糖値を低下させない抗体を提供することができるため、抗ＩＧＦ−Ｉ受容体抗体に関する疾患の治療、予防又は診断に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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