(57)【要約】  骨減少性疾患の予防及び/又は治療が可能な天然に存在する化合物に基づく薬剤が望まれていた。下記化学式(I)で示される化合物を含有する、骨減少性疾患を予防及び/又は治療する医薬組成物が提供される。【化１７】2017175625.tif 000019(式(I)中、R1は、1個の官能基又は2〜4個の互いに同一又は異なる官能基であって、水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選択される官能基であり、R2及びR3は、水素原子又はケトン基であり、R2及びR3は、いずれかがケトン基である)
2017175625.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式(I)で示される化合物を含有する、骨減少性疾患を予防及び/又は治療するための医薬組成物。
【化１０】
2017175625.tif 000012
(式(I)中、
R1は、1個の官能基又は2〜4個の互いに同一又は異なる官能基であって、水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選択される官能基であり、
R2及びR3は、水素原子又はケトン基であり、R2及びR3は、いずれかがケトン基である)
【請求項２】
前記化学式(I)に示される化合物は、下記化学式(II)から(V)の群より少なくとも1つ選択される化合物である、請求項1に記載の医薬組成物。
【化１１】
2017175625.tif 000013
【化１２】
2017175625.tif 000014
【化１３】
2017175625.tif 000015
【化１４】
2017175625.tif 000016
【請求項３】
下記化学式(I)で示される化合物を含有する、骨代謝調節用医薬製剤。
【化１５】
2017175625.tif 000017
(式(I)中、
R1は、1個の官能基又は2〜4個の互いに同一又は異なる官能基であって、水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選択される官能基であり、
R2及びR3は、水素原子又はケトン基であり、R2及びR3は、いずれかがケトン基である)
【請求項４】
請求項３に記載の骨代謝調節用医薬製剤を含む、骨減少性疾患治療薬。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の化合物を含有する、生体適合性素材。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の化合物を含有する、骨減少性疾患を予防又は改善するための機能性食品。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の化合物を含有する、骨減少性疾患を予防又は改善するための健康食品。
【請求項８】
骨減少性疾患を予防及び/又は治療するための方法であって、上記方法は、
上記骨減少性疾患を患っている対象者に、下記化学式(I)で示される化合物を含有する医薬組成物又は骨代謝調節用医薬製剤を投与するステップを含む、方法。
【化１６】
2017175625.tif 000018
(式(I)中、
R1は、1個の官能基又は2〜4個の互いに同一又は異なる官能基であって、水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選択される官能基であり、
R2及びR3は、水素原子又はケトン基であり、R2及びR3は、いずれかがケトン基である)
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジフェニルエーテルラクトンの骨代謝調節作用に基づく各種骨減少性疾患の予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨減少性疾患は、外傷性骨折や疲労骨折等に代表される外因性疾患と、骨多孔症、骨粗鬆症、高カルシウム血症、高副甲状腺ホルモン（以下、「PTH」ということがある。）血症、骨ページェット病、関節炎、リウマチ、乳ガンの骨転移、骨軟化症、悪性腫瘍その他の疾病に起因する骨組織の脆弱化、及び栄養障害による骨組織の脆弱化といった内因性の疾患とに大別される。本明細書中においては、「骨減少性疾患」という用語には、上述した外因性疾患及び内因性疾患以外に、歯槽骨の吸収及びそれに起因する疾患が含まれるものとする。【０００３】
ヒトの骨は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とを絶えず繰り返しつつ、恒常性を維持している。しかし、加齢や炎症等により、恒常性が維持できなくなり、骨吸収が過剰になると、骨粗鬆症や関節リウマチ等の病態が生じる。【０００４】
こうした内因性の骨疾患の中でも、骨粗鬆症の患者数は高齢者数の増加につれて増加しつつある。また、食生活の変化と運動量の低下に伴って、カルシウムの摂取量の低下や骨組織への定着率の低下が生じ、骨組織の脆弱化が加速されているといわれている。【０００５】
骨折は、骨組織のある部分の連絡が外力によって断たれた状態をいい、骨折部位に著明な疼痛を伴う。健常人の場合には、例えば、交通事故等によってかなり大きな外力がかからない限り骨折は起こらないが、骨量が低下して骨組織が弱くなると、歩いたり走ったりしている最中にころんだ等、さほど大きくない外力がかかっただけでも骨折が起こる。また、上記のような骨粗鬆症等の内因性の疾患に起因して骨量が低下している場合には、階段で躓いたり、咳込んだりしたときにかかるわずかな外力によっても骨折が生じるようになる。【０００６】
骨折が起こった場合には、一般的には、ずれている骨の位置を牽引等によって修正し、ボルトやピンで固定できる場合には固定し、その後は患者の自然治癒力に委ねるという治療方法が採用されている。【０００７】
一方で、骨粗鬆症等の内因性の疾患では骨の石灰質と骨基質とがともに減少しているため自然治癒が遅れることが多く、高齢者の場合にはその間に骨折部位以外の関節が固まって動かなくなり、寝たきりになるといったケースも少なくない。【０００８】
また、歯周病は３０歳を超えた日本人の８０％が罹患する国民病ともいえる病気であるが、かなりひどい状態にならないと痛みを感じない。このため、重篤な疾患となりやすい特徴をもつ病気としてとらえられる。進行した歯周病においては、咀嚼時に生じる痛みや不快感に起因する摂食障害、悪臭を伴う口臭などが生じる結果、栄養状態の不良やコミュニケーション障害などがもたらされる恐れがある。このような場合、歯科による専門的な治療法が施されるが、症状の進行を食い止めることができず抜歯に至ることが多い。一方で、健康な高齢者では残存歯の数が多いことが知られている。【０００９】
近年では、ヒトだけではなく、柔らかな食物を与えられて家庭内で飼育されているイヌやネコなどのペットにおいても歯周病が蔓延しつつあり、問題視されている。【００１０】
歯周病に罹患すると、歯周組織を構成するセメント質、歯根膜及び歯槽骨が破壊される。このため、ヒトの歯周病の治療は、従来、歯石や壊死セメント質等の炎症を惹起させる原因物質を除去し、組織の治癒を促すという方法で行われてきた。しかし、この方法では既に破壊されてしまった歯周組織の再生は困難であった。【００１１】
骨粗鬆症及び歯周病はともに患者数が１，０００万人以上いるといわれており、潜在的な市場規模は極めて大きい。臨床応用されている骨粗鬆症において、骨吸収抑制剤は多数あるものの、投与法や副作用、有効性において必ずしも満足を得られていない。骨形成促進剤として、副甲状腺ホルモン製剤が実用化されている。特許文献１には、組換えヒト副甲状腺ホルモンを投与することにより、好ましくは皮質骨である骨の靭性、及び、剛性を増加させる方法、並びに/又は、骨折の発生、及び/若しくは、重篤さを減少させる方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２００２−５２３３７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、副甲状腺ホルモン製剤は、高額である点や長期使用の制限等まだまだ問題を抱えている。骨形成促進作用のみならず骨吸収抑制作用も併せ持つ低分子医薬が開発されれば、画期的な新薬となる可能性がある。【００１４】
本発明は以上の事情に鑑みてなされたものであり、天然に存在する化合物に基づく薬剤又はその薬剤を用いた骨減少性疾患の予防及び/若しくは治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本願発明者らは、安全性が高い天然に存在する化合物を用いた骨減少性疾患の予防及び/又は治療方法に関する研究を行う中で、下記化学式(I)で示される化合物が骨減少性疾患を予防及び/又は治療することを発見し、本発明を完成させるに至った。【００１６】
本発明によれば、
下記化学式(I)で示される化合物を含有する、骨減少性疾患を予防及び/又は治療する医薬組成物が提供される。
【化１】
2017175625.tif 000003
(式(I)中、
R1は、1個の官能基又は2〜4個の互いに同一又は異なる官能基であって、水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選択される官能基であり、
R2及びR3は、水素原子又はケトン基であり、R2及びR3は、いずれかがケトン基である)【００１７】
後述する実施例において実証されている通り、上記化学式(I)で示される化合物は、骨芽細胞の分化促進、破骨細胞の分化抑制、骨形成の促進、骨吸収の抑制及び歯や歯槽骨の成長・形成を示した。従って、この医薬組成物を用いることで、骨減少性疾患を予防及び/又は治療することができる。【００１８】
本願発明によれば、
下記化学式(I)で示される化合物を含有する、骨代謝調節用医薬製剤が提供される。
【化２】
2017175625.tif 000004
(式(I)中、
R1は、1個の官能基又は2〜4個の互いに同一又は異なる官能基であって、水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選択される官能基であり、
R2及びR3は、水素原子又はケトン基であり、R2及びR3は、いずれかがケトン基である)【００１９】
後述する実施例において実証されている通り、上記化学式(I)で示される化合物は、骨芽細胞の分化促進、破骨細胞の分化抑制、骨形成の促進、骨吸収の抑制及び歯や歯槽骨の成長・形成を示した。従って、この骨代謝調節用医薬製剤を用いることで、骨減少性疾患を予防及び/又は治療することができる。【００２０】
本発明によれば、
上記骨代謝調節用医薬製剤を含む、骨減少性疾患治療薬が提供される。【００２１】
後述する実施例において実証されている通り、上記化学式(I)で示される化合物は、骨芽細胞の分化促進、破骨細胞の分化抑制、骨形成の促進、骨吸収の抑制及び歯や歯槽骨の成長・形成を示した。従って、上記化学式(I)で示される化合物を含む骨代謝調節用医薬製剤を含む治療薬を用いることで、骨減少性疾患を治療することができる。従って、この治療薬を、骨減少性疾患を患っている患者に施すことによって、骨減少性疾患を治療することが可能になる。【００２２】
本願発明によれば、
骨減少性疾患を予防及び/又は治療するための方法であって、上記方法は、
上記骨減少性疾患を患っている対象者に、下記化学式(I)で示される化合物を含有する医薬組成物又は骨代謝調節用医薬製剤を投与するステップを含む、方法が提供される。
【化３】
2017175625.tif 000005
(式(I)中、
R1は、1個の官能基又は2〜4個の互いに同一又は異なる官能基であって、水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選択される官能基であり、
R2及びR3は、水素原子又はケトン基であり、R2及びR3は、いずれかがケトン基である)【００２３】
後述する実施例において実証されている通り、上記化学式(I)で示される化合物は、骨芽細胞の分化促進、破骨細胞の分化抑制、骨形成の促進、骨吸収の抑制及び歯や歯槽骨の成長・形成を示した。上記化学式(I)で示される化合物を含む医薬組成物又は骨代謝調節剤を投与することによって、骨減少性疾患が改善した。従って、この方法を、骨減少性疾患を患っている患者に施すことによって、骨減少性疾患を予防又は改善させることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、コンブレタスタチンD-4の構造式を示している。
【図２】図２は、コンブレタスタチンD-4を用いて処理したMC3T3-E1細胞のALP活性を示すグラフである。
【図３】図３は、コンブレタスタチンD-4を用いて処理したMC3T3-E1細胞培養上清中のオステオカルシン量を示すグラフである。
【図４】図４は、コンブレタスタチンD-4処理したMC3T3-E1細胞のALP染色とアリザリン染色を示す写真である。
【図５】図５は、各サンプルで処理したMC3T3-E1細胞のALP活性を示すグラフである。
【図６】図６は、各サンプルで処理したMC3T3-E1細胞のアリザリン染色の写真である。
【図７】図７は、RAW264細胞の破骨細胞分化に対するコンブレタスタチンD-4の作用を示す写真である。
【図８】図８は、骨髄細胞と骨芽細胞株の共存培養による破骨細胞分化に対するコンブレタスタチンD-4の作用を示す写真である。
【図９】図９は、骨片上における共存培養による破骨細胞分化に伴う骨吸収窩形成に対するコンブレタスタチンD-4の作用を示す写真である。
【図１０】図１０は、RAW264細胞の破骨細胞分化に対するコンブレタスタチンD-4とその誘導体の作用を示すグラフである。
【図１１】図１１は、PBS及びコンブレタスタチンD-4の歯胚移植3週間後のμCT画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
骨減少性疾患
骨減少性疾患は、外傷性骨折や疲労骨折等に代表される外因性疾患と、骨多孔症、骨粗鬆症、高カルシウム血症、高副甲状腺ホルモン（以下、「PTH」ということがある。）血症、ページェット病、関節炎、関節リウマチ、ガンの骨転移、骨軟化症、悪性腫瘍、歯周病、その他の疾病に起因する骨組織の脆弱化、及び栄養障害による骨組織の脆弱化といった内因性の疾患とに大別される。本明細書中においては、「骨減少性疾患」という用語には、上述した外因性疾患及び内因性疾患以外に、歯槽骨の吸収及びそれに起因する疾患が含まれるものとする。骨芽細胞の分化促進、破骨細胞の分化抑制、骨形成の促進、骨吸収の抑制、歯や歯槽骨の成長・形成、歯槽骨並びに歯周組織の破壊の予防及び骨並びに歯の再生は、「骨減少性疾患」を予防、治療及び/又は改善させる原因に含まれる。
【００２６】
骨代謝調節作用
骨代謝調節作用には、破骨細胞分化抑制作用及び骨芽細胞分化促進作用が含まれる。破骨細胞は、種々の細胞外刺激を受けた骨髄系前駆細胞から分化する。破骨細胞は、骨基質を吸収し、骨を溶かするため、破骨細胞による骨吸収が異常に亢進すると、骨がもろくなる。一方、骨芽細胞は、間葉系前駆細胞から分化し、骨形成の役割を担っている。骨代謝では、破骨細胞と骨芽細胞とが協調して、骨吸収と骨形成を繰り返し、恒常性を維持している。
【００２７】
概要
以下、本発明の実施の形態について、詳しく説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑をさけるために、摘示説明を省略する。
【００２８】
＜実施形態１：医薬組成物＞
本発明によれば、
下記化学式(I)で示される化合物を含有する、骨減少性疾患を予防及び/又は治療する医薬組成物が提供される。
【化４】
2017175625.tif 000006
(式(I)中、
R1は、1個の官能基又は2〜4個の互いに同一又は異なる官能基であって、水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選択される官能基であり、
R2及びR3は、水素原子又はケトン基であり、R2及びR3は、いずれかがケトン基である)
この医薬組成物を用いることで、骨減少性疾患を予防及び/又は治療することができる。
【００２９】
本発明によれば、
上記化学式(I)に示される化合物は、下記化学式(II)から(V)の群より少なくとも1つ選択される化合物である、骨減少性疾患を予防及び/又は治療する医薬組成物が提供される。
【化５】
2017175625.tif 000007
【化６】
2017175625.tif 000008
【化７】
2017175625.tif 000009
【化８】
2017175625.tif 000010
この医薬組成物を用いることで、骨減少性疾患を予防及び/又は治療することができる。
【００３０】
上記化学式(II)から(V)で示される化合物は、それぞれ、コンブレタスタチンD-4(CAS=126191-24-0)、O-メチルコンブレタスタチンD-4(CAS=1358550-64-7)、イソコルニクラトリドA(CAS=1360058-54-3)及びO-メチルイソコルニクラトリドA(CAS-1358550-62-5)と称される。本願明細書においては、化学式(II)とコンブレタスタチンD-4は、互いに置換可能であり、化学式(III)とO-メチルコンブレタスタチンD-4は、互いに置換可能であり、化学式(IV)とイソコルニクラトリドAは、互いに置換可能であり、化学式(V)とO-メチルイソコルニクラトリドAは、互いに置換可能である。
【００３１】
上記化合物は、精製された化合物であってよく、合成された化合物であってもよい。また、上記化合物は、植物の粗抽出物中に含まれた形態であってもよい。上記植物としては、例えば、Getonia floribunda(コンブレタスタチンD-4を含有)、Aegiceras corniculatum(コンブレタスタチンD-4、O-メチルコンブレタスタチン、イソコルニクラトリドA及びO-メチルイソコルニクラトリドAを含有)及びCelastrus hindsii(イソコルニクラトリドAを含有)等が挙げられる。また、上述した植物から単離された任意の化合物に化学的処理を施して、上記化合物を合成してもよい。上記化合物は、水和物であってもよく、塩であってもよい。
【００３２】
＜実施形態２：製剤＞
本願発明によれば、
下記化学式(I)で示される化合物を含有する、骨代謝調節用医薬製剤が提供される。
【化９】
2017175625.tif 000011
(式(I)中、
R1は、1個の官能基又は2〜4個の互いに同一又は異なる官能基であって、水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選択される官能基であり、
R2及びR3は、水素原子又はケトン基であり、R2及びR3は、いずれかがケトン基である)
【００３３】
上記化合物、上記化合物の水和物又は塩を医薬組成物又は医薬製剤とする場合には、その結晶を常法に従って処理し、後述する賦形剤等と混合すればよい。かかる化合物を有効成分とする医薬製剤としては、注射剤、坐剤、エアゾール剤、経皮吸収剤、軟膏剤、硬膏剤、スプレー剤その他の非経口剤、錠剤、散剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤、液剤その他の経口剤等を挙げることができる。
【００３４】
ここで、上記の錠剤には、糖衣錠、コーティング錠、バッカル剤が含まれ、カプセル剤には、硬カプセル剤、軟カプセル剤の双方が含まれる。また顆粒剤にはコーティングされた顆粒剤も含まれる。また、上記の液剤には、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等が含まれ、シロップ剤にはドライシロップも含まれる。なお、上述した各製剤には、徐放化されてないものばかりでなく、徐放化されたものも含まれる。こうした製剤は、公知の製剤学的製法に従い、製剤の製法に際して薬理学的に許容できる日本薬局方に記載の基剤、担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤等を用いて製造することができる。こうした担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等を挙げることができる。
【００３５】
上記医薬組成物又は結合剤としては、例えば、デンプン、トラガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース等を挙げることができる。上記崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース等を挙げることができる。上記滑沢剤としては、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム等を挙げることができる。上記着色剤としては、医薬品に添加することが許容されているものであれば使用することができ、特に限定されない。また、これら以外に、矯味剤、矯臭剤等も、必要に応じて適宜使用することができる。
【００３６】
錠剤又は顆粒剤とする場合には、必要に応じて、白糖、ゼラチン、精製セラック、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、メタアクリル酸重合体等を用いてコーティングしても良く、複数層でコーティングすることもできる。さらに顆粒剤や粉剤をエチルセルロースやゼラチンのようなカプセルに詰めてカプセル剤とすることもできる。
【００３７】
上記化合物を含む医薬組成物若しくは医薬製剤又は上記化合物の水和物を含む医薬組成物若しくは医薬製剤を用いて、注射剤を調製する場合は、必要に応じて、pH調整剤、緩衝材、安定化剤、可溶化剤などを添加することもできる。
【００３８】
本実施形態の骨代謝調節用医薬製剤は、骨減少性疾患を予防又は治療するために使用されてもよい。上記骨減少性疾患は、自覚症状を伴うものであっても、伴わないものであってもよく、医師の診断に基づくものであってもよい。
【００３９】
＜実施形態３：治療薬＞
本願発明によれば、
上記骨代謝調節用医薬製剤を含む、骨減少性疾患治療薬が提供される。
この治療薬を用いることで骨減少性疾患を治療することが可能になる。ある骨減少性疾患治療薬は、骨減少性疾患の予防及び/又は改善に用いることができる。
【００４０】
上記治療薬は、単独投与又は他の治療薬との併用投与のいずれであれ、骨減少性疾患が治療される有効量で投与される。しかしながら、上記化合物の総投与量は、担当医によって、健全な医学的判断の範囲内で決定される。骨減少性疾患を患っている患者に対する有効量は、骨減少性疾患の重症度；患者の年齢、体重、総体的健康、性別及び食餌；投与時間；投与経路；上記化合物の排出速度；治療期間；上記治療薬と併用している又は同時使用している薬物に依存する。上記化合物の投与量は、投与毎に一定量でなくてもよい。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要な投与量よりも低い投与量で投与し、所望の効果が得られるまで投与量を次第に増大させてもよい。
【００４１】
必要に応じて、1日当たりの有効投与量は、投与目的に応じて、複数投与量に分割してもよい。当業者であれば、良好な医療行為及び個々の患者の臨床症状によって、有効投与量及び併用投与処方を容易に最適化することができるだろう。
【００４２】
上記治療薬の1日当たりの投与量(日用量)は、コンブレタスタチンD-4、O-メチルコンブレタスタチンD-4、イソコルニクラトリドA及び/又はO-メチルイソコルニクラトリドA換算で、0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 150及び200 mg/kg体重からなる群より選択される2点間の範囲内であってもよい。投与形態としては、経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、非経口、鼻腔内又は皮内投与が挙げられる。また、基材(例えば、コラーゲンやアガロースゲル)に上記治療薬を含ませて患者(特に、患者の患部)に埋入(インプラント)してもよい。上記治療薬は、一定期間、すなわち3日以上、好ましくは1週間以上、より好ましくは2週間以上、さらに好ましくは1ヶ月以上、例えば6ヶ月又は1年以上にわたって継続的に投与することが好ましい。上記治療薬の投与は、毎日行うことが好ましいが、期間中継続的に投与する限り、毎日投与しなくてもよい。上記治療薬は、日用量を1日に1回投与してもよいし、1日に日用量を数回に分割して投与してもよい。上記治療薬の投与は、医師による判断により終了してもよいし、患者の自己判断で終了してもよい。
【００４３】
＜実施形態４：生体適合性素材＞
本願発明によれば、
上記化学式(I)で示される化合物を含有する又は上記化学式(II)から(V)の群より選択される少なくとも１つの化合物を含有する、生体適合性素材が提供される。
この生体適合性素材を用いることで、骨減少性疾患の患部に直接接触させることが可能になる。
【００４４】
本明細書において「生体適合性」とは、生体組織や細胞に対して炎症反応、免疫反応、中毒反応といった負の反応を引き起こさないか、そのような反応が小さいことを意味する。「生体適合性素材」には、生分解性素材や非生分解性素材が含まれる。「生分解性素材」は、生体内で分解され得る素材や生体内で吸収され得る素材であり、例えば、コラーゲン、アテロコラーゲン、ヒアルロン酸、ハイドロキシアパタイト、TCP、ポリ乳酸（PLLA）、ポリグリコール酸（PGA）、PLGA、ポリエチレングリコール（PEG）、MPCポリマー、アガロースゲルを挙げることができる。「非生分解性素材」は、生体内で分解及び吸収されない、又は、実質的に分解及び吸収されない素材であり、例えば、チタン、チタン合金、ステンレス、セラミックスが挙げられる。また、生体適合性素材は、細胞の足場材(スキャフォールド)であってもよく、更には、所望の細胞が接着した足場材(例えば、細胞シート、細胞塊)であってもよい。生体適合性素材として非生分解性素材を用いる場合、非生分解性素材は、その表面に、例えば、上記化合物を含有する上記生分解性素材が付着していてもよい。生体適合性素材は、当業者にとって公知の方法により、徐放性を有していてもよい。
【００４５】
生体適合性素材は、骨減少性疾患の患部に埋設することができ、骨及び歯(歯槽骨を含む)の形成又は再生、歯周組織の再生、骨折部位の修復に利用することができ、インプラント歯の埋入の前処理に利用することもできる。
【００４６】
＜実施形態５：機能性食品又は健康食品＞
本願発明によれば、
上記化学式(I)で示される化合物を含有する又は上記化学式(II)から(V)の群より選択される少なくとも１つの化合物を含有する、骨減少性疾患を予防又は改善するための機能性食品又は健康食品が提供される。
上記化合物又は上記化合物の水和物を必要に応じて適宜添加することにより、骨減少性疾患を予防効果又は改善効果を有する機能性食品若しくは健康食品を提供することができる。
【００４７】
本明細書において「機能性食品」とは、その食品自体が本来含有している栄養素によって、その食品を摂取した者に供与できる以上の利益を与え得る成分を含有する食品をいう。
【００４８】
また、本明細書において「健康食品」とは、一般に、健康の保持増進に資する食品として販売・利用されるものの総称であり、日頃不足しがちな栄養成分の摂取を補助するサプリメントも含む。
【００４９】
上記化合物又は上記化合物の水和物を、例えば、パン、クッキー及びビスケット、米飯添加用麦及び雑穀、うどん、そば、パスタ、その他の麺類、チーズ、ヨーグルトその他の乳製品、ジャム、マヨネーズ、味噌、醤油その他の大豆製品、茶、コーヒー及びココア、清涼飲料、果実飲料その他の非アルコール性飲料、薬用酒、その他のアルコール性飲料、キャンディー、チョコレートその他のスナック菓子、チューインガム、せんべい、羊羹その他の大豆を原料とする菓子等に添加して機能性食品とすることができる。あるいは動物用餌に添加して機能性配合飼料とすることができる。なお、上記のヨーグルト、醤油、飲料等に添加する場合には、これらの中で本発明の化合物が結晶化して沈殿しないようにするために、溶解助剤や安定化剤を適宜加えることもできる。
【００５０】
また、上記化合物又は上記化合物の水和物を単独で、又は２種以上を混合し、常法に従って粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤とすることにより、健康食品とすることができる。ここで、本発明の化合物を粉末とするためには、生成過程で得られた抽出物を濃縮し、凍結乾燥、スプレードライ、真空乾燥等の方法を用いて乾燥させ、サンプルミル、ブレンダー、ミキサー等によって乾燥固体を粉砕すればよい。また、必要に応じて、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、デキストリン、牡蠣殻粉末などを添加してもよい。
【００５１】
また、上記のようにして得た粉末に、適宜、上述した結合剤を加えて打錠し、錠剤とすることもできる。錠剤とした後に、上述した白糖又はゼラチン等のコーティング剤を用いて、糖衣錠としてもよく、他のコーティング剤を用いて腸溶剤等にすることもできる。さらに上述したようにして得た粉末を常法に従って顆粒とし、顆粒剤を製造することもできる。また、上記の粉末や顆粒を上述したカプセルに適当量充填することによって、カプセル剤とすることもできる。
【００５２】
1食分の上記機能性食品及び健康食品中に含まれるコンブレタスタチンD-4、O-メチルコンブレタスタチンD-4、イソコルニクラトリドA及び/又はO-メチルイソコルニクラトリドA量は、0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 150及び200 mg/kg体重からなる群より選択される2点間の範囲内となるように調節することができる。
【００５３】
＜実施形態６：骨減少性疾患を予防又は治療するための方法＞
本願発明によれば、
骨減少性疾患を予防又は治療するための方法であって、上記方法は、
上記骨減少性疾患を患っている対象者に、下記化学式(I)で示される化合物を含有する医薬組成物又は骨代謝調節用医薬製剤を投与するステップを含む、
方法が提供される。
上記医薬組成物又は骨代謝調節用医薬製剤を患者に投与する場合には、投与量は、患者の症状の重篤さ、年齢、体重、PSA値、尿流量及び健康状態等の諸条件によって異なる。一般的には、上述した用量及び用法で、1日1回若しくはそれ以上の回数にわたって投与すればよく、以上のような諸条件に応じて、投与の回数及び量を適宜増減すればよい。
【００５４】
上記医薬組成物又は骨代謝調節用医薬製剤の１日当たりの投与量、投与期間及び投与回数は、上述した治療薬と同様であってもよい。上記医薬組成物又は骨代謝調節用医薬製剤の投与は、医師による判断により終了してもよいし、患者の自己判断で終了してもよい。
【００５５】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる：例えば、ヒト及び動物の多くの硬組織（骨や歯）減少性疾患（骨粗鬆症、関節リウマチ、歯周病、ページェット病、がんの骨転移等）の予防・治療のための、食品組成物、健康食品、医薬組成物、衛生用品とその方法；骨折、事故、手術、その他要因による硬組織（骨や歯）減少・欠損部位における骨形成・骨再生の誘導剤、促進剤とその方法；インプラント歯埋入前処理としての歯槽骨形成・歯槽骨再生促進剤とその方法；歯周病における歯槽骨・歯周組織の破壊の予防・再生剤とその方法；上記組成物を用いて作成した骨・歯・歯周組織再生促進用細胞とその使用、作成方法が挙げられる。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例及び図面によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。機器の操作及びキットの使用は、各メーカーの製造元プロトコールに従った。【００５７】
試験サンプルとしてのコンブレタスタチン(combretastatin)D-4(CAS=126191-24-0)、O-メチルコンブレタスタチン(methylcombretastatin)D-4(CAS=1358550-64-7)、イソコルニクラトリド(isocorniculatolide)A(CAS=1360058-54-3)及びO-メチルイソコルニクラトリド(methylisocorniculatolide)A(CAS=1358550-62-5)は、慶応義塾大学西山研究室で合成した。【００５８】
＜実施例１＞
骨芽細胞分化促進作用
（１）材料
MC3T3-E1細胞（マウス胎児頭蓋骨由来前骨芽細胞株、cell番号RCB1126）は、RIKEN Cell Bankより購入した。また、α−MEMは、INVITROGEN社（カタログ番号11900-024）より購入した。96ウェルマイクロプレートは、Nunc社（カタログ番号161093）より購入した。【００５９】
ｐ−ニトロフェニルリン酸、ナフトールAS-MXリン酸、ファストブルーBB塩及びアリザリンレッドSはSIGMA社より購入した。アスコルビン酸、β−グリセロリン酸、トリス−塩酸、メタノール、塩化マグネシウム、水酸化ナトリウム及びエタノールは、和光純薬工業（株）より購入した。オステオカルシン(osteocalcin)量を測定するためのEIAキットは、Biomedical Technologies Inc.より購入した。【００６０】
（２）骨芽細胞分化に対する検討
MC3T3-E1細胞を、10％ウシ胎児血清を含むα−MEMにｋ円抱くして96ウェルマイクロプレートの各ウェルに、4×103細胞/ウェルとなるようにまき、37℃、5%CO2インキュベータ中にて2日間前培養した。前培養開始3日目に、各濃度の試験サンプルと、50μg/mlアスコルビン酸及び10mMのβ−グリセロリン酸を含むα−MEMに培地を交換して7日間から21日間、本培養した。また、本培養中も、3〜4日ごとに培地を交換した。【００６１】
培養終了後、メタノールで細胞を固定してディッシュを乾燥後、骨芽細胞の初期の分化マーカー酵素であるアルカリホスファターゼ（ALP）の活性を測定するとともに、ALP染色を行った。骨芽細胞の石灰化は、アリザリンレッドS染色にて確認した。また、分化が進んだ骨芽細胞のマーカーとして知られるオステオカルシンの発現量を、上記のEIA測定キットを用いて測定した。【００６２】
ALP活性の測定には、6.7mMのp−ニトロフェニルリン酸を基質として含み、2mMの塩化マグネシウム及び100mMのトリス−塩酸を含有するpH8.5の緩衝液を使用した。この緩衝液を各ウェルに100μlずつ入れて、37℃にて、30分反応させた後に、100μlの0.1N水酸化ナトリウムを加えて反応を停止させた。プレートリーダーにて405nmの吸光度を測定し、その吸光度をALP活性とした。【００６３】
ALP染色は0.1mg/mlナフトールAS-MXリン酸、0.6mg/mlのファストブルーBB塩を含み2mMの塩化マグネシウム及び100mMのトリス−塩酸を含有するpH8.5の緩衝液を、各ウェルに50μlずつ入れて、室温にて30分から1時間反応させて染色した。【００６４】
骨芽細胞の石灰化は、アリザリンレッドS染色にて確認した。培養終了後、70%エタノールで細胞を固定してディッシュを乾燥させ、1%アリザリンレッドS溶液にて、沈着したカルシウムを染色した。【００６５】
オステオカルシン濃度の測定には、上記の条件にて7日間から21日間日間培養して得られたMC3T3-E1細胞の培養上清を用いた。この培養上清中のオステオカルシンの量を、上述したEIAキットを用い、添付の取扱説明書の方法に従って測定した。【００６６】
（３）結果
コンブレタスタチンD-4（図1）は、マウス前骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞において、骨芽細胞分化初期のマーカーとして知られるアルカリフォスファターゼ（ALP）の活性を濃度依存的に促進した（図2、コントロールは、コンブレタスタチンD-4未処理）。また、コンブレタスタチンD-4は、後期分化のマーカーとして知られる基質タンパク質のオステオカルシンの蛋白質発現を有意に増加させた（図3、コントロールは、コンブレタスタチンD-4未処理）。さらに、コンブレタスタチンD-4は、アリザリンレッド染色によって赤色に染まる石灰化も顕著に亢進した（図4、コントロールは、コンブレタスタチンD-4未処理）このことは、コンブレタスタチンD-4が、骨芽細胞の初期分化及び後期分化を促進して石灰化を誘導し、骨形成を促進することを示している。【００６７】
＜実施例２＞
誘導体の骨芽細胞分化促進作用
（１）材料
骨芽細胞分化実験には、マウス由来前骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞（理化学研究所より購入）を使用した。MC3T3-E1細胞の培養には、10％ウシ胎児血清を含むα−MEMを使用した。10%のウシ胎児血清は、旭テクノグラス株式会社（IWAKI）から購入した。ここで使用した他の材料は、実施例１で使用したものと同じである。【００６８】
（２）骨芽細胞分化誘導試験
骨芽細胞分化に対する作用を評価する方法として、MC3T3-E1細胞の骨芽細胞分化誘導法を用いた。この試験において、骨芽細胞の分化に対する影響を評価するために、骨芽細胞の初期分化のマーカー酵素であるアルカリホスファターゼ（ALP）の活性の測定とその活性を利用した染色（ALP染色）を行った。【００６９】
（３）骨芽細胞の分化誘導
MC3T3-E1細胞を96ウェルマイクロプレートに4×103細胞/ウェルとなるように接種し、コンフルエントになるまで、37℃、5%CO2インキュベータ中にて、2日間培養した。次いで、骨芽細胞の分化を誘導するために、50μg/mlのL−アスコルビン酸及び10mMのβ−グリセロリン酸と、濃度の試験サンプルを含むα−MEMで7日間又は14日間培養した。その際、3日又は４日毎に培地交換をした。【００７０】
（４）骨芽細胞の分化誘導の評価
ALP活性の測定
ALP活性の測定は以下のように行った。まず、MC3T3-E1細胞を上述したと同じ条件で7日間培養した後、培養液を除去し、PBSでウェルを洗浄後、メタノールで細胞を固定してディッシュを乾燥した。次いで、6.7mMのp−ニトロフェニルリン酸を基質として含み、2mMの塩化マグネシウム及び100mMのトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）を各ウェルに100μL加え、37℃にて30分間反応させた。【００７１】
100μlの0.1N水酸化ナトリウムを加えて反応を停止し、プレートリーダーにて405nmの吸光度を測定して遊離したp−ニトロフェノールを測定し、ALP活性を求めた。骨芽細胞分化試験の結果は対照群のALP活性を100としたときの対照群に対する相対値（%）で表した。【００７２】
ALP染色
ALP染色には、0.1mg/mlのナフトールAS-MXリン酸、0.6 mg/mlファストブルーBB塩、2mMの塩化マグネシウム、及び100mMのトリス-塩酸を含有する緩衝液（pH 8.5）を染色液として用いた。上述のようにしてALP活性を測定した後、各ウェルを蒸留水にて洗浄し、各ウェルに上記のALP染色液を100μＬ添加し、室温で30分から1時間反応させて染色した。【００７３】
また、骨芽細胞の石灰化は、アリザリンレッドS染色にて確認した。培養終了後、70%エタノールで細胞を固定してディッシュを乾燥させ、1%アリザリンレッドS溶液にて、沈着したカルシウムを染色した。【００７４】
（５）結果
コンブレタスタチンD-4（以下、D-4）とその異性体であるイソコルニクラトリドA（以下、Iso-D-4）、さらにそれら化合物のフェノール性水酸基がメチル化した誘導体であるO-メチルコンブレタスタチンD-4及びO-メチルイソコルニクラトリドA（以下、それぞれ、Me-D-4及びMe-Iso-D-4）の計4化合物について、MC3T3-E1細胞の通常培養条件におけるALP活性に対する作用を検討した。その結果、D-4はこれまでと同様に30μMをピークとして濃度依存的なALP活性促進作用を示した（図5）。D-4の異性体であるIso-D-4については、100μMをピークにALP活性促進作用が認められた（図5）。さらにそれらの11位水酸基のメチル化誘導体であるMe-D-4及びMe-Iso-D-4は、D-4及びIso-D-4と比較して弱いもののALP活性を有意に促進した（図5）。また、いずれの化合物においてもコントロールと比較して強くアリザリンレッドで染色され、石灰化も促進された（図6）。以上の結果から、これら4化合物は全て骨芽細胞分化を促進し、骨形成を促進することが示された。【００７５】
＜実施例３＞
破骨細胞分化抑制作用（RAW264細胞）
（１）材料
破骨細胞の初期分化阻害試験には、破骨細胞様細胞に分化する、マクロファージRAW264細胞株（理化学研究所、cell番号RCB0535、以下、「MφRAW264」ということがある。）を使用した。MφRAW264の培養には、10％のウシ胎児血清（旭テクノグラス株式会社（IWAKI）、カタログ番号IWK-500）を含むα-MEM（INVITROGEN社製、カタログ番号11900-024）を使用した。また、破骨細胞分化誘導因子（RANKL）はPEPRO TECH INC社製、カタログ番号310-01を使用した。【００７６】
96ウェルマイクロプレート及び100mmφディッシュは、INVITROGEN社製、カタログ番号161093及び172958をそれぞれ使用した。【００７７】
エタノール、アセトン、ホルムアルデヒド、塩化ナトリウムは和光純薬工業より購入して使用した。【００７８】
（２）破骨細胞の初期分化阻害試験
骨吸収の抑制を評価するin vitro試験法として、MφRAW264細胞株からの破骨細胞の初期分化阻害試験を行った。破骨細胞試験の評価は、初期分化マーカーである酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）染色によって行った。【００７９】
MφRAW264細胞株を10％のウシ胎児血清（FBS）を添加したα−MEM培地（以下、「10%FBS−MEM」ということがある。）に懸濁し、100mm径のディッシュに１×105細胞/10ｍLで接種し、5%CO2存在下、37℃にて3日間培養し、ディッシュ内で当該細胞が集密的（confluent、コンフルエント）になっていることを確認して培養を終了した。ついで、その後、コンフレントになった細胞をディッシュから0.05%のトリプシン、0.53ｍMのEDTAを含むハンクスバッファー（0.05% Trypsin-0.53 mM EDTA/HBSS（INVITROGEN社製、カタログ番号25300-054）で処理してはがし、10％FBS-MEMに懸濁して、96ウェルマイクロプレートの各ウェルに0.4×104細胞/0.1ｍLで接種し、上記と同様の条件で１日間培養した。【００８０】
破骨細胞分化誘導因子(RANKL)を10％FBS-MEMに溶解し、100ng/mLの溶液を調製した。また、コンブレタスタチンD-4を10mMの濃度でDMSOに溶解したものを、ストック溶液として調製し、−20℃で保管した。コンブレタスタチンD-4による処理を行うに際して、ストック溶液を希釈し、処理濃度のそれぞれの100倍濃度の溶液を調製し、溶媒に対して終濃度が１％未満になるように、各ウェルに（2μLずつ）添加した。各ウェル中のコンブレタスタチンD-4の濃度は、25、50、100μMとした。対照群には、等量のDMSOを添加した。【００８１】
RANKLを96ウェルすべてに0.1mLずつ添加（RANKLの終濃度50ng/mL）するとともに、コンブレタスタチンD-4溶液をウェルに添加した（コンブレタスタチンD-4の終濃度は、それぞれ、25、50、100μM）。対照群(control)となるウェルには、コンブレタスタチンD-4を含まないDMSOを等量添加した。【００８２】
5%CO2存在下、37℃にて3日間培養した後に、96ウェルマイクロプレートの各ウェルの培養液を捨て、このプレートをリン酸緩衝生理食塩水溶液（PBS）で洗浄したのち、10％ホルマリン-PBS（以下、「約3.7％ホルムアルデヒド-PBS」ということがある。）を各ウェルに満たし、細胞を室温で15分間固定した。さらに、エタノール−アセトン溶液（1：1）を用いて室温で1分間固定した。固定終了後、固定液を捨て、室温で乾燥させた。【００８３】
乾燥後、各ウェル内における細胞内の酒石酸耐性酸ホスファターゼの状態をTRAP染色法により確認した。TRAP染色液は基質としてNaphtol AS-MX phosphate(SIGMA社製、カタログ番号N-4875)5mgを0.5mlのN,N-ジメチルホルムアミドに溶解し、さらに、色素としてFast red violet LB salt(SIGMA社製、カタログ番号F-1625)30mgを50mlの50mM酒石酸ナトリウム/0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に溶解したものを合わせて使用した。すなわち、TRAPアッセイの場合と同様に、培養後、培地を除去した。PBSで細胞層を洗浄したのち、約3.7％ホルムアルデヒド-PBSを用いて細胞を室温で15分間固定した。ついで、エタノール−アセトン溶液（1：1）を用いて室温でさらに１分間固定した。固定終了後、固定液を捨て、室温で乾燥させた。乾燥後、TRAP染色液を加え、室温にて20〜30分間染色した。染色後、染色液を捨て、流水により洗浄し、乾燥させた後、顕微鏡で観察した。【００８４】
（３）結果
マウスマクロファージ系細胞株であるRAW264細胞を破骨細胞分化誘導因子であるRANKL存在下で培養すると、破骨細胞のマーカー酵素である酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）の活性を利用した染色によって赤色に染色される破骨細胞が多数誘導され、さらに細胞融合による多核破骨細胞も多数認められた。コンブレタスタチンD-4を添加すると多核・単核破骨細胞が減少した（図7）。このことは、コンブレタスタチンD-4が破骨細胞分化を抑制することを示す。【００８５】
＜実施例４＞
破骨細胞分化抑制作用（骨髄細胞と骨芽細胞株の共存培養）
（１）材料
4週齢の雄ddyマウスは、中部科学資材(株)より購入した。また、26G注射針と2.5ml注射筒とは、テルモより購入した。α−MEMは、実施例1と同様のものを使用した。また、骨芽細胞株のUAMS-32細胞は、昭和大学歯学部高見正道博士より分与していただいた。ビタミンD3及びPGE2は和光純薬工業 (株)より購入した。【００８６】
（２）共存培養による破骨細胞分化
ddyマウスの大腿骨を採取し、26G注射針と2.5ml注射筒を用いて、大腿骨にα−MEMを注入して骨髄細胞を取り出した。骨髄細胞を2X105細胞/ウェル、UAMS-32細胞を1X104細胞/ウェル、となるように96ウェルマイクロプレートの各ウェルにまき、各濃度の試験サンプルとビタミンD3(1μΜ)及びPGE2(1μΜ)を含む(α−MEMで、37°C、5%CO2インキュベータ中にて、5日間培養した。【００８７】
培養後、10%ホルマリン溶液で細胞を固定し、100%エタノールにて再固定した。ディッシュを乾燥後、破骨細胞のマーカー酵素である酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP）染色を行った。TRAP染色については、実施例3と同じ方法に従った。
（３）結果
マウス骨髄細胞と骨芽細胞株であるUAMS-32細胞をVitamin D3及びPGE2存在下で培養すると、TRAP染色によって赤色に染色される破骨細胞が誘導され、さらに細胞融合による多核破骨細胞も多数認められる。コンブレタスタチンD-4を添加すると多核・単核破骨細胞が減少した（図8）。このことは、生体により近い骨芽細胞誘導性の破骨細胞分化も、コンブレタスタチンD-4が抑制することを示す。【００８８】
＜実施例５＞
骨吸収抑制作用（骨髄細胞と骨芽細胞株の共存培養）
（１）材料
4週齢の雄ddyマウスは、中部科学資材 (株)より購入した。また、26G注射針と2.5ml注射筒とは、テルモより購入した。α−MEMは、実施例1と同様のものを使用した。また、骨芽細胞株のUAMS-32細胞は、昭和大学歯学部高見正道博士より分与していただいた。ビタミンD3及びPGE2は和光純薬工業 (株)より購入した。トルイジンブルーは、SIGMA社より購入した。象牙切片は、象牙を約0.7mmの厚さに切断し、この象牙シートから穴あけポンチを用いて直径4mmの切片を作製し、エタノールにて消毒後乾燥して調整した。【００８９】
（２）共存培養による破骨細胞分化
ddyマウスの大腿骨を採取し、26G注射針と2.5ml注射筒を用いて、大腿骨にα−MEMを注入して骨髄細胞を取り出した。骨髄細胞を2X105細胞/ウェル、UAMS-32細胞を1X104細胞/ウェル、となるように96ウェルマイクロプレートの各ウェルにまき、各濃度の試験サンプルとビタミンD3(1μΜ)及びPGE2(1μΜ)を含む(α−MEMで、37°C、5%CO2インキュベータ中にて、5日間培養した。【００９０】
また、象牙切片上において上記と同じ条件でこれらの細胞を培養した後、象牙切片上の破骨細胞によって溶力された部分(骨吸収窩、以下、「ピット」ということがある)が、どの程度形成されているかを1%トルイジンブルー染色液で染色した。【００９１】
（３）結果
マウス骨髄と骨芽細胞株であるUAMS-32細胞をVitamin D3及びPGE2存在下で象牙切片上にて培養すると、骨表面が溶けて穴があき、トルイジンブルー染色により紫色に染まる骨吸収窩（ピット）が多数形成される。コンブレタスタチンD-4を添加するとこの骨吸収窩形成が抑制された（図9）。このことはコンブレタスタチンD-4が破骨細胞分化を抑制し、骨吸収を抑制したことを示す。【００９２】
＜実施例６＞
破骨細胞分化抑制作用（RAW264細胞）
材料及び試験方法は、実施例3と同じとした。【００９３】
破骨細胞分化誘導因子(RANKL)を10％FBS-MEMに溶解し、100ng/mLの溶液を調製した。また、D-4、Iso-D-4、Me-D-4及びMe-Iso-D-4を、それぞれ、100mMの濃度でDMSOに溶解したものを、ストック溶液として調製し、−20℃で保管した。D-4、Iso-D-4、Me-D-4及びMe-Iso-D-4による処理を行うに際して、ストック溶液を希釈し、処理濃度のそれぞれの100倍濃度の溶液を調製し、溶媒に対して終濃度が１％未満になるように、各ウェルに（２μＬずつ）添加した。各ウェル中のD-4、Iso-D-4、Me-D-4及びMe-Iso-D-4の濃度は、いずれも、15、50、150μMとした。対照群(CON)には、等量のDMSOを添加した。【００９４】
RANKLを96ウェルすべてに0.1mLずつ添加（RANKLの終濃度50ng/mL）するとともに、D-4、Iso-D-4、Me-D-4及びMe-Iso-D-4溶液をウェルに添加した（D-4、Iso-D-4、Me-D-4及びMe-Iso-D-4の終濃度は、いずれも、15、50、150μM）。対照群となるウェルには、D-4、Iso-D-4、Me-D-4及びMe-Iso-D-4を含まないDMSOを等量添加した。【００９５】
５％CO2存在下、37℃にて３日間培養した後に、酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）活性を以下のようにして測定した。96ウェルマイクロプレートの各ウェルの培養液を捨て、このプレートをリン酸緩衝生理食塩水溶液（PBS）で洗浄したのち、約3.7％ホルムアルデヒド-PBSを各ウェルに満たし、細胞を室温で15分間固定した。さらに、エタノール−アセトン溶液（１：１）を用いて室温で１分間固定した。固定終了後、固定液を捨て、室温で乾燥させた。乾燥後、各ウェル内における細胞の酒石酸耐性酸ホスファターゼ活性の測定（以下、「TRAPアッセイ」ということがある。）と、染色とを行った。【００９６】
培養細胞内のTRAP活性の測定は、3.7ｍＭのｐ−ニトロフェノール−リン酸水素二ナトリウム及び10ｍＭの酒石酸を含有する50ｍＭのクエン酸緩衝液（pH4.6）を用いて行った。この緩衝液を各ウェル当たり、0.1mLずつ添加し、37℃で30分間反応させた。30分後に、0.1ＭのNaOHを0.1mLずつ添加することにより反応を停止させ、遊離したｐ−ニトロフェノールを分光光度計（大日本製薬（株）製）を用いて、測定波長405nmで測定した。【００９７】
尚、破骨細胞の初期分化阻害試験の結果は、対照群（コントロール）のTRAP活性を100としたときの対照群に対する相対値（%）で表した。【００９８】
（３）結果
D-4とその異性体であるIso-D-4、さらにそれら化合物のフェノール性水酸基がメチル化した誘導体であるMe-D-4及びMe-Iso-D-4の計4化合物について、マウスマクロファージ系細胞株であるRAW264細胞における破骨細胞分化に対する作用を、破骨細胞のマーカー酵素である酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）の活性を測定することで評価した。その結果、いずれの化合物によってもTRAP活性が減少した（図10）。このことは、コンブレタスタチンD-4及びその誘導体が破骨細胞分化を抑制することを示す。【００９９】
＜実施例７＞
歯胚の成長促進作用
（１）材料
ダルベッコ変法リン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco's phosphate buffered saline, 以下「D-PBS」ということがある。）は、大日本製薬（株）より購入した。Affi-Gelアガロースビーズ（アフィゲルヘパリン  カタログ番号：15306173）は、BioRad社より購入した。生後5日齢のC57BL/6マウスは、三協ラボサービス（株）より購入した。また、ホストマウスとしては、三協ラボサービス（株）より購入した生後10〜15週齢のC57BL/6マウス（雌）を2匹一群として使用した。【０１００】
（２）D-4含浸アガロースビーズの調製
D-4を含浸させたアガロースビーズ（以下、「D-4含浸ビーズ」という。）を、以下のようにして調製した。D-4を100μＭ（終濃度）となるように、D-PBSを用いて希釈した。Affi-Gelアガロースビーズを、PBSを用いて洗浄した。洗浄後のアガロースビーズを1.5ml角底エッペンドルフ型チューブに入れ、上記のように希釈した前記D-4溶液を100μlの量で添加した。室温で30分以上、インキュベートすることにより、D-4をアガロースビーズに含浸させた。得られたD-4含浸アガロースビーズを下記の歯髄への埋入に供した。また、陰性対照として、D-4を含まないD-PBSに含浸した以外は、D-4含浸ビーズと同様にして調整したアガロースビーズ（以下、「D-PBS含浸ビーズ」という。）を使用した。【０１０１】
（３）歯髄への埋入
歯根-歯周組織形成直前の、生後5日齢のC57BL/6マウスを、エーテル麻酔後に断頭屠殺した。下顎を摘出後、下顎第一臼歯を、歯小嚢ごと摘出した。試料投与群には、D-4含浸アガロースビーズを、摘出歯（下顎第一臼歯）の歯髄に埋入した。また、対照群には、D-PBS含浸ビーズを、摘出歯（下顎第一臼歯）の歯髄に埋入した。【０１０２】
（４）移植培養
D-4含浸ビーズを埋入した摘出歯、及び、陰性対照としてD-PBS含浸ビーズを埋入した摘出歯を、ホストマウスの腎臓皮膜下に移植して培養した。ホストマウスは、12時間点灯、室温25℃の条件下におき、水と飼料は自由に摂取させて3週間飼育した。上記の摘出歯の移植3週間後、ホストマウスを頸椎脱臼にて屠殺し、腎臓を摘出して、各群の培養後の摘出歯（移植歯）を回収した。回収された培養後の移植歯における歯根-歯周組織形成（伸長）、歯根膜、及び骨を、実体顕微鏡下にて観察し、μCTで撮像した。前記移植培養後の各群における移植歯の観察結果を、図11に示す。【０１０３】
（５）結果
生後5日齢のマウスの第一臼歯を採取後、化合物を浸潤させたアガロースビーズを埋め込んでホストマウスの腎被膜下に移植して３週間飼育後μCT撮影することで、歯胚の成長に対する作用を検討した。その結果、D-4含浸アガロースビーズを埋入した移植歯では、陰性対照と比較して、顕著に歯の成長を進展させ、歯根の伸長が促進されていることが示された（図11）。このことは、歯や歯槽骨の成長・形成をD-4が促進することを示している。【０１０４】
＜まとめ＞
D-4とその誘導体は、骨芽細胞の初期から後期の分化を促進して石灰化も亢進させることから、骨形成促進作用があると考えられる。また、歯や歯槽骨の成長促進作用も認められた。一方、骨吸収を行う破骨細胞の分化は抑制し、骨吸収抑制作用も認められた。したがって、骨減少性のヒト及び動物の多くの硬組織（骨や歯）減少性疾患（骨粗鬆症、関節リウマチ、歯周病、ページェット病、がんの骨転移等）の予防・治療等に有用である。また、骨折、事故、手術、その他要因による硬組織（骨や歯）減少・欠損部位における骨形成・骨再生の誘導・促進も可能である。さらに、歯周病における歯槽骨・歯周組織の破壊の予防や再生にも使用することができる。これらの予防や治療用の細胞の作製にも有用である。【０１０５】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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