(57)【要約】本発明は、希少疾患である血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）を含む各種腫瘍の治療剤等を提供する。本発明は、ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療剤等に係るものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療剤であって、
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む、
前記治療剤。
【請求項２】
前記腫瘍は、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化が亢進していると決定された腫瘍である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
前記タンパク質が、ＶＡＶ１タンパク質である、請求項１又は２に記載の治療剤。
【請求項４】
ＲＨＯＡ遺伝子、及び／又はＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子において遺伝子変異若しくは融合遺伝子形成が認められる腫瘍の治療剤であって、
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む、
前記治療剤。
【請求項５】
前記腫瘍が、Ｔ細胞リンパ腫、胃がん、膵がん、皮膚腫瘍、大腸がん、子宮がん、及び神経系腫瘍からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項６】
前記腫瘍が、Ｔ細胞リンパ腫である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項７】
Ｔ細胞リンパ腫が、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、又は分類不能型末梢性Ｔ細胞リンパ腫である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項８】
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療用医薬組成物。
【請求項９】
ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療用の薬剤を製造するためのダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の使用。
【請求項１０】
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を被験対象に投与することを特徴とする、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療方法。
【請求項１１】
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療用キット。
【請求項１２】
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の、投与対象とする患者における有効性を検査する方法であって、該患者から採取した検体中のＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化の程度を指標とする、前記方法。
【請求項１３】
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の、投与対象とする患者における有効性を検査する方法であって、該患者から採取した検体中のＲＨＯＡ遺伝子における遺伝子変異又は融合遺伝子形成の有無を指標とする、前記方法。
【請求項１４】
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の、投与対象とする患者における有効性を検査する方法であって、該患者から採取した検体中のＶＡＶ１遺伝子における遺伝子変異又は融合遺伝子形成の有無を指標とする、前記方法。
【請求項１５】
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の、投与対象とする患者における有効性を検査する方法であって、該患者から採取した検体中のＶＡＶ２遺伝子における遺伝子変異又は融合遺伝子形成の有無を指標とする、前記方法。
【請求項１６】
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の、投与対象とする患者における有効性を検査する方法であって、該患者から採取した検体中のＶＡＶ３遺伝子における遺伝子変異又は融合遺伝子形成の有無を指標とする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療剤や、ダサチニブ等についての投与対象とする患者における有効性を検査する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ダサチニブ（化合物については非特許文献１、臨床試験については非特許文献２を参照）は、慢性骨髄性白血病においてチロシンキナーゼＢＣＲ−ＡＢＬのＡＴＰ結合部位を阻害することにより、高い有効性を発揮する。ダサチニブはＡＢＬ以外のチロシンキナーゼに対しても阻害作用をもつが、この効果を利用した臨床開発はこれまで進められてこなかった。
血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（Ａｎｇｉｏｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ：ＡＩＴＬ）は、極めて難治性の血液がんであり、５年生存率は約２０％である。リンパ節腫大に加えて、発熱、皮疹や自己免疫疾患様の異常、高ガンマグロブリン血症等の特徴的な臨床像を呈することが多い。本発明者は、ＡＩＴＬのゲノム解析から、ＲＨＯＡ遺伝子変異（ｃ．５０Ｇ＞Ｔ）により、ＲＨＯＡタンパク質の１７番目のアミノ酸がグリシンからバリンに置換される変異（ｐ．Ｇ１７Ｖ，以下「Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異」）が、ＡＩＴＬの７０％にみられることを報告した（非特許文献３：Ｓａｋａｔａ−Ｙａｎａｇｉｍｏｔｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０１４  Ｆｅｂ；４６（２）：１７１−５．）。そこで、これらのゲノム異常による腫瘍発症の仕組みを明らかにするとともに、標的治療開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｓｈａｈ  ＮＰ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｖｅｒｒｉｄｉｎｇ  ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｒｅｓｅｓｔａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＡＢＬ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３０５，ｐ３９９−４０１，２００４
【非特許文献２】Ｔａｌｐａｚ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２００６  Ｊｕｎ１５；３５４（２４）：２５３１−４１．
【非特許文献３】Ｓａｋａｔａ−Ｙａｎａｇｉｍｏｔｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１４Ｆｅｂ；４６（２）：１７１−５．
【発明の概要】
【０００４】
このような状況下において、希少疾患である血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）を含む各種腫瘍の治療に有用な医薬製剤や治療方法等の開発が望まれていた。特に、ＡＩＴＬの治療には、従来より多剤併用化学療法が行われているが、治療抵抗性であることが多かったため、新規治療剤、治療方法の開発が待たれていた。
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療剤、該腫瘍の治療用医薬組成物、該腫瘍の治療用の薬剤を製造するためのダサチニブ等の使用、該腫瘍の治療方法、及び該腫瘍の治療用キット、並びに、ダサチニブ等の投与対象とする患者における有効性を検査する方法等を提供するものである。
（１）ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療剤であって、
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む、
前記治療剤。
（２）前記腫瘍は、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化が亢進していると決定された腫瘍である、前記（１）に記載の治療剤。
（３）前記タンパク質が、ＶＡＶ１タンパク質である、前記（１）又は（２）に記載の治療剤。
（４）ＲＨＯＡ遺伝子、及び／又はＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子において遺伝子変異若しくは融合遺伝子形成が認められる腫瘍の治療剤であって、
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む、
前記治療剤。
（５）前記腫瘍が、Ｔ細胞リンパ腫、胃がん、膵がん、皮膚腫瘍、大腸がん、子宮がん、及び神経系腫瘍からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の治療剤。
（６）前記腫瘍が、Ｔ細胞リンパ腫である、前記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の治療剤。
（７）Ｔ細胞リンパ腫が、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、又は分類不能型末梢性Ｔ細胞リンパ腫である、前記（１）〜（６）のいずれか１つに記載の治療剤。
（８）ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療用医薬組成物。
本発明においては、ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む、ＲＨＯＡ遺伝子、及び／又はＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子において遺伝子変異若しくは融合遺伝子形成が認められる腫瘍の治療用医薬組成物も包含される。
（９）ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療用の薬剤を製造するためのダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の使用。
本発明においては、ＲＨＯＡ遺伝子、及び／又はＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子において遺伝子変異若しくは融合遺伝子形成が認められる腫瘍の治療用の薬剤を製造するためのダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の使用も包含される。
（１０）ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を被験対象に投与することを特徴とする、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療方法。
本発明においては、ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を被験対象に投与することを特徴とする、ＲＨＯＡ遺伝子、及び／又はＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子において遺伝子変異若しくは融合遺伝子形成が認められる腫瘍の治療方法も包含される。
（１１）ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療用キット。
本発明においては、ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む、ＲＨＯＡ遺伝子、及び／又はＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子において遺伝子変異若しくは融合遺伝子形成が認められる腫瘍の治療用キットも包含される。
（１２）ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の、投与対象とする患者における有効性を検査する方法であって、該患者から採取した検体中のＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化の程度を指標とする、前記方法。
（１３）ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の、投与対象とする患者における有効性を検査する方法であって、該患者から採取した検体中のＲＨＯＡ遺伝子における遺伝子変異又は融合遺伝子形成の有無を指標とする、前記方法。
（１４）ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の、投与対象とする患者における有効性を検査する方法であって、該患者から採取した検体中のＶＡＶ１遺伝子における遺伝子変異又は融合遺伝子形成の有無を指標とする、前記方法。
（１５）ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の、投与対象とする患者における有効性を検査する方法であって、該患者から採取した検体中のＶＡＶ２遺伝子における遺伝子変異又は融合遺伝子形成の有無を指標とする、前記方法。
（１６）ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の、投与対象とする患者における有効性を検査する方法であって、該患者から採取した検体中のＶＡＶ３遺伝子における遺伝子変異又は融合遺伝子形成の有無を指標とする、前記方法。
発明の効果
本発明によれば、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療に有用な医薬製剤・医薬組成物、該腫瘍の治療に有用な方法、及び該腫瘍の治療用キット等を提供することができる。特に、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）などの難治性疾患の治療においては、ダサチニブは、ＲＨＯＡ遺伝子やＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子の変異等により活性化されるＶＡＶタンパク質分子自体の活性化を阻害するため、より特異性・有効性の高い治療効果が期待できる。
また本発明によれば、ダサチニブ等の投与対象とする患者における有効性を検査する方法も提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】急性Ｔ細胞白血病細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞において、Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異体がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナルの重要分子であるＶＡＶ１と結合することを示す図である。
【図２】（Ａ）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異体の発現により、ＶＡＶ１活性化指標であるＹ１７４リン酸化が亢進すること、この効果は抗ＣＤ３抗体刺激により亢進することを示す図である。（Ｂ）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異体の発現により、抗ＣＤ３抗体刺激下でＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＣ（ＰＬＣ）−ｇａｍｍａ１のリン酸化が亢進することを示す図である。
【図３】成人Ｔ細胞性白血病／リンパ腫細胞株であるＳＵ９Ｔ０１細胞において、Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異体がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナルの重要分子であるＶＡＶ１と結合することを示す図である。
【図４】（Ａ）は、ＳＵ９Ｔ０１細胞において、Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異体の発現により、ＶＡＶ１活性化指標であるＹ１７４リン酸化が亢進することを示す図である。（Ｂ）は、ＳＵ９Ｔ０１細胞において、Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異体の発現により、ＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＣ（ＰＬＣ）−ｇａｍｍａ１のリン酸化が亢進することを示す図である。
【図５】Ｊｕｒｋａｔ細胞において、Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異体の発現により、ＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ）活性は亢進することを示す図である。
【図６】Ｊｕｒｋａｔ細胞において、Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異体の発現により、インターロイキン２のｍＲＮＡ発現は亢進することを示す図である。
【図７】（Ａ）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異体の発現によるＹ１７４リン酸化が亢進はダサチニブによりキャンセルされることを示す図である。（Ｂ）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異体の発現によるＰＬＣ−ｇａｍｍａ１のリン酸化が亢進はダサチニブによりキャンセルされることを示す図である。
【図８】Ｊｕｒｋａｔ細胞において、Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異体の発現により、インターロイキン２のｍＲＮＡ発現亢進はダサチニブによりキャンセルされることを示す図である。
【図９】ＡＩＴＬおよび分類不能型末梢性Ｔ細胞リンパ腫にＶＡＶ１遺伝子変異があることを示す図である。
【図１０】Ｊｕｒｋａｔ細胞において、ＶＡＶ１変異体の発現により、Ｙ１７４リン酸化が亢進することを示す図である。
【図１１】Ｊｕｒｋａｔ細胞において、ＶＡＶ１変異体の発現により、ＰＬＣ−ｇａｍｍａ１のリン酸化が亢進することを示す図である。
【図１２】Ｊｕｒｋａｔ細胞において、ＶＡＶ１変異体の発現により、ＮＦＡＴ活性は亢進することを示す図である。
【図１３】Ｊｕｒｋａｔ細胞において、ＶＡＶ１変異体の発現により、インターロイキン２のｍＲＮＡ発現は亢進することを示す図である。
【図１４】Ｊｕｒｋａｔ細胞において、ＶＡＶ１変異体の発現により、インターロイキン２の上清への分泌は亢進する
【図１５】Ｊｕｒｋａｔ細胞において、ＶＡＶ１変異体の発現によるＹ１７４リン酸化亢進はダサチニブによりキャンセルされることを示す図である。
【図１６】Ｊｕｒｋａｔ細胞において、ＶＡＶ１変異体の発現によるＮＦＡＴ活性亢進はダサチニブによりキャンセルされることを示す図である。
【図１７】ヌードマウス（ＡＩＴＬモデルマウス）の腹腔内に、ドナーマウス腫大リンパ節由来細胞を播種し、その後、ダサチニブを投与した群（ダサチニブ群：図中の「Ｄａｓａｔｉｎｉｂ」）と、投与しなかった群（コントロール群：図中の「Ｖｅｈｉｃｌｅ」）との生存率（図中の「Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ」）を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１６−２１５５２１号明細書（２０１６年１１月２日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質、例えばＶＡＶ１は、Ｔ細胞受容体シグナルに極めて重要な分子であり、Ｓｒｃファミリーキナーゼによりリン酸化されて活性化することが知られている。本発明者は、Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異体がＶＡＶ１と結合し、そのリン酸化（チロシンリン酸化）を亢進することによりＶＡＶ１の下流シグナルを活性化すること、Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異がない症例の一部ではＶＡＶ１自体に遺伝子変異があり、これによりＶＡＶ１の活性化が生じること、さらにはこれらのＧ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異体やＶＡＶ１変異体によるＶＡＶ１活性化（異常活性化）が、ダサチニブにより阻害されることを発見した。また、本発明者は、ＶＡＶ１変異体によるＴ細胞受容体シグナル下でのＮＦＡＴ活性亢進効果が、ダサチニブにより阻害されること、さらには、Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異体によるＴ細胞受容体シグナル下でのインターロイキン２（ＩＬ−２）産生が、ダサチニブにより阻害されることを発見した。
これらの知見に基づき、本発明者は、ダサチニブを用いたＡＩＴＬの治療剤、ひいてはＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化（チロシンリン酸化）で同定される腫瘍の治療剤などに係る本発明を見出した。
２．腫瘍治療剤、医薬組成物等
本発明のＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療剤（以下、「本発明の治療剤」ということがある。）、及び、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療用医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」ということがある。）は、前述した通り、ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物（以下、「ダサチニブ等」ということがある。）を有効成分として含むことを特徴とするものである。
なお、本発明は、（ｉ）ダサチニブ等を用いること、具体的には例えばダサチニブ等の有効量を被験対象（ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の患者又はその恐れのある患者、あるいはそのような非ヒト哺乳動物）に投与することを含む、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療方法、（ｉｉ）当該腫瘍の治療用の薬剤を製造するためのダサチニブ等の使用、（ｉｉｉ）当該腫瘍の治療用のダサチニブ等の使用、並びに、（ｉｖ）当該腫瘍の治療用のダサチニブ等も含むものである。
本発明において、当該腫瘍の治療としては、具体的には、例えば、当該腫瘍の治療の進行抑制、予後改善、及び／又は再発防止等も含まれる。
本発明において、治療対象となる腫瘍は、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化（チロシンリン酸化）で同定される腫瘍である。ここで、当該タンパク質のリン酸化で同定される、とは、例えば、健常者の組織における当該タンパク質と比較して、リン酸化が亢進（又は向上）していると決定された状態の腫瘍であればよく、特に限定はされない。また、本発明において、治療対象となる腫瘍としては、ＲＨＯＡ遺伝子及び／又はＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子において遺伝子変異若しくは融合遺伝子形成が認められる腫瘍も好ましく挙げられる。これら治療対象となる腫瘍としては、より具体的には、Ｔ細胞リンパ腫（好ましくは、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、分類不能型末梢性Ｔ細胞リンパ腫等）、胃がん、膵がん、皮膚腫瘍、大腸がん、子宮がん、及び神経系腫瘍等が好ましく挙げられる。
ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質としては、ＶＡＶ１、ＶＡＶ２、ＶＡＶ３が挙げられる。特に、ＶＡＶ１は、そのリン酸化による活性化（チロシンリン酸化亢進による異常活性化）が、Ｔ細胞リンパ腫、特に血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）の一要因である。
本発明において、ＲＨＯＡ遺伝子（配列番号１（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ００１６６４．３）：１９４３塩基中、ｃＤＮＡは第２８１番目〜第８６２番目の塩基）の遺伝子変異としては、限定はされないが、ＲＨＯＡタンパク質（配列番号２）においてｐ．Ｇ１７Ｖのアミノ酸変異（Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異）をもたらす遺伝子（ＤＮＡ）変異（ｃ．５０Ｇ＞Ｔ）も含め、下記表１に示されるものなどが挙げられる。さらに、同タンパク質においてｐ．Ａ１６１Ｅ、ｐ．Ａ１６１Ｐ、ｐ．Ａ１６１Ｖ、ｐ．Ａ１１８Ｅのアミノ酸変異をもたらす遺伝子変異も挙げられる。
なお、本明細書において、遺伝子変異の表記については、例えば「ｃ．５０Ｇ＞Ｔ」であれば、ｃＤＮＡの第５０番目の塩基であるＧがＴに置換したことを意味し、また「ｃ．Ｃ５１８＿５２９ｄｅｌ」であれば、ｃＤＮＡの第５１８番目と第５２９番目のＣが欠失したことを意味する。
同様に、タンパク質のアミノ酸変異の表記については、例えば「ｐ．Ｇ１７Ｖ」であれば、ｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列の第１７番目のＧ（グリシン）がＶ（バリン）に置換したことを意味し、「ｐ．Ｅ１７５Ｖ／Ｌ」であれば、アミノ酸配列の第１７５番目のＥ（グルタミン酸）がＶ（バリン）又はＬ（ロイシン）に置換したことを意味し、「ｐ．１７３＿１７７ｄｅｌ」であれば、アミノ酸配列の第１７３番目と第１７７番目の残基が欠失したことを意味し、「ｐ．Ｒ２４＊」であれば、アミノ酸配列の第２４番目のＲ（アルギニン）をコードするコドンがストップコドンに変換したことを意味する。
【表１】
2018084053.tif 000002
また、本発明において、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子の遺伝子変異としては、限定はされないが、ＶＡＶ１遺伝子（配列番号３（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００５４２８．３）：２９４４塩基中、ｃＤＮＡは第１４１番目〜第２６７８番目の塩基）では、下記表２に示すようなＶＡＶ１タンパク質（配列番号４）のアミノ酸変異をもたらす遺伝子変異が挙げられる。さらに、同タンパク質においてｐ．Ｅ１５７Ｋ、ｐ．Ｙ１７４Ｃ、ｐ．Ｅ１７５Ｖ／Ｌ、ｐ．Ｌ１７７Ｒ、ｐ．Ｋ４９４Ｒ、ｐ．Ｑ４８７Ｋ／Ｒ，ｐ．Ｍ５０１Ｒ／Ｌ／Ｖ、ｐ．Ｅ５５６Ｋ、ｐ．Ｐ６１５Ｌ、ｐ．Ｒ７９０Ｃ、ｐ．Ｄ７９７Ｎ／Ｈ，ｐ．Ｒ７９８Ｐ，ｐ．Ｊ８１５Ｅ、ｐ．Ｒ８２２Ｌのアミノ酸変異をもたらす遺伝子変異も挙げられる。
【表２】
2018084053.tif 000003
同様に、ＶＡＶ２遺伝子（配列番号５（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ００１１３４３９８．１）：４８６５塩基中、ｃＤＮＡは第４７番目〜第２６８３番目の塩基）では、下記表３に示すようなＶＡＶ２タンパク質（配列番号６）のアミノ酸変異をもたらす遺伝子変異が挙げられる。さらに、同タンパク質においてｐ．Ｒ１０３Ｑ、ｐ．Ｒ７６Ｈ、ｐ．Ｄ７６０Ｎ、ｐ．Ｇ８５４Ｄ、ｐ．Ｐ６５７Ｓ，ｐ．Ｌ８８Ｆ，ｐ．Ｄ１７０Ｅ／Ｇ、ｐ．Ｒ７００Ｑ、ｐ．Ａ３６２Ｔ、ｐ．Ｐ１３０Ｌのアミノ酸変異をもたらす遺伝子変異も挙げられる。
【表３】
2018084053.tif 000004
同様に、ＶＡＶ３遺伝子（配列番号７（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ００６１１３．４）：４７７６塩基中、ｃＤＮＡは第５５番目〜第２５９８番目の塩基）では、下記表４に示すようなＶＡＶ３タンパク質（配列番号８）のアミノ酸変異をもたらす遺伝子変異が挙げられる。さらに、同タンパク質においてｐ．Ｒ２４＊、ｐ．Ｖ２７５Ｍ、ｐ．Ａ２１３Ｔ、ｐ．Ｅ５３Ｄ、ｐ．Ｖ６５Ｉ、ｐ．Ｗ２７７＊、Ｃ９８＊、ｐ．Ｌ１９８＊、ｐ．Ｋ１８７＊，ｐ．Ｗ１１２＊、ｐ．Ｇ７９ｆｓのアミノ酸変異をもたらす遺伝子変異も挙げられる。ここで「ｐ．Ｇ７９ｆｓ」はアミノ酸配列の第７９番目のＧ（グリシン）をコードするコドンがフレームシフトし、以下異なるコドンで翻訳されたことを意味する。
【表４】
2018084053.tif 000005
また、本発明において、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子の融合遺伝子形成としては、限定はされないが、例えば、ＶＡＶ１遺伝子では、ＶＡＶ１−ＳＴＡＰ２、ＶＡＶ１−ＧＳＳ、ＶＡＶ１−ＭＹ０１Ｆ等が挙げられる。
本発明の治療剤及び医薬組成物の有効成分である、ダサチニブは、公知の市販のものを使用することができるが、限定はされず、独自に合成、抽出及び精製等したものを使用してもよい。
なお、ダサチニブは、正式名称は、Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−［［６−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−２−メチル−４−ピリミジニル］アミノ］−５−チアゾールカルボキサミド（Ｎ−（２−ｃｈｌｏｒｏ−６−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−［［６−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］−２−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］−５−ｔｈｉａｚｏｌｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）であり、下記構造式で表されるものである。
2018084053.tif 000006
本発明の治療剤及び医薬組成物の有効成分としては、ダサチニブと共に又はダサチニブに代えて、ダサチニブ誘導体を用いることもできる。当該誘導体としては、ダサチニブ由来の化学構造を有する等、当業者の技術常識に基づいてダサチニブの誘導体と考えられるものであればよく、限定はされないが、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質（ＶＡＶ１等）のリン酸化による活性化の抑制能がダサチニブと同程度ものが好ましい。
本発明に用いるダサチニブやその誘導体としては、例えば、生体内で酸化、還元、加水分解、又は抱合などの代謝を受けるものも包含するほか、生体内で酸化、還元、又は加水分解などの代謝を受けてダサチニブやその誘導体を生成する化合物（いわゆるプロドラッグ）も含まれる。本発明において、プロドラッグとは、薬理学的に許容し得る、通常プロドラッグにおいて使用される基で親化合物を修飾した化合物をいい、例えば、安定性や持続性の改善等の特性が付与され、腸管内等で親化合物に変換されて効果を発現することが期待できる化合物をいう。例えば、ダサチニブ等の化合物のプロドラッグは、対応するハロゲン化物等のプロドラッグ化試薬を用いて、常法により、当該化合物中のプロドラッグ化の可能な基（例えば、水酸基、アミノ基、その他の基）から選択される１以上の任意の基に、常法に従い適宜プロドラッグを構成する基を導入した後、必要に応じ、単離精製することにより製造することができる。ここで、上記プロドラッグを構成する基としては、限定はされないが、例えば、低級アルキル−ＣＯ−、低級アルキル−Ｏ−低級アルキレン−ＣＯ−、低級アルキル−ＯＣＯ−低級アルキレン−ＣＯ−、低級アルキル−ＯＣＯ−、及び低級アルキル−Ｏ−低級アルキレン−ＯＣＯ−等が好ましく挙げられる。
本発明の治療剤及び医薬組成物の有効成分としては、ダサチニブやダサチニブ誘導体やそれらのプロドラッグと共に、又はダサチニブやダサチニブ誘導体やそれらのプロドラッグに代えて、それらの薬理学的に許容し得る塩を用いることもできる。
ダサチニブ及びその誘導体の薬理学的に許容し得る塩としては、限定はされないが、例えば、ハロゲン化水素酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、及びヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（例えば、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、及び重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩（例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、及びクエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えば、メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、及びカンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えば、アスパラギン酸塩、及びグルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、及びカリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム塩、及びカルシウム塩など）などが好ましく挙げられる。
本発明に用いるダサチニブ等は、化合物の構造上生じ得るすべての異性体（例えば、幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、回転異性体、立体異性体、及び互変異性体等）及びこれら異性体の２種以上の混合物をも包含し、便宜上の構造式の記載等に限定されるものではない。また、ダサチニブ等は、Ｓ−体、Ｒ−体又はＲＳ−体のいずれであってもよく、限定はされない。さらに、ダサチニブ等は、その種類により水和物や溶媒和物の形で存在する場合もあり、本発明においては当該水和物及び溶媒和物もダサチニブ等に含むものとし、本発明の治療剤及び医薬組成物の有効成分として用いることができる。当該溶媒和物としては、限定はされないが、例えば、エタノールとの溶媒和物等が挙げられる。
本発明の治療剤及び医薬組成物において、有効成分としてのダサチニブ等の含有割合は、限定はされず、適宜設定することができるが、例えば、治療剤や医薬組成物全体に対して、０．０１〜９９重量％の範囲内とすることができ、好ましくは、０．０１〜３０重量％、より好ましくは０．０５〜２０重量％、さらに好ましくは０．１〜１０重量％の範囲内としてもよい。有効成分の含有割合が上記範囲内であることにより、本発明の治療剤及び医薬組成物は、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質（ＶＡＶ１等）のリン酸化による活性化の抑制、ひいては、当該リン酸化により同定される腫瘍の治療効果を十分に発揮することができる。
本発明の治療剤及び医薬組成物は、ダサチニブ等以外にも、本発明の効果が著しく損なわれない範囲で他の成分を含んでいてもよい。例えば、本発明においては、限定はされないが、ダサチニブ等と共に、プレドニゾロン、デキサメタゾン、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、アザシチジン、ポテリジオ、ロミデプシン、アドセトリス、プララトレキセート等のＴ細胞リンパ腫治療薬として公知の又は開発中の薬剤等のうちの１種又は２種以上を、併用することもできる。さらに、本発明の治療剤及び医薬組成物は、例えば、後述する薬剤製造上一般に用いられるもの等を含むことができる。
本発明の治療剤及び医薬組成物は、被験対象としてのヒト又は非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して、種々の投与経路、具体的には、経口、又は非経口（例えば静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、直腸投与、経皮投与）で投与することができる。従って、本発明に使用するダサチニブ等は、単独で用いることも可能であるが、投与経路に応じて慣用される方法により薬学的に許容し得る担体を用いて適当な剤形に製剤化して用いることができる。
剤形としては、経口剤では、例えば、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、及びトローチ剤等が挙げられ、非経口剤では、例えば、注射剤（点滴剤を含む）、吸入剤、軟膏剤、点鼻剤、及びリポソーム剤等が挙げられる。なお、上述した各種経口剤とする場合、本発明の治療剤及び医薬組成物は、場合によりサプリメント剤（例えば機能性食品に該当する）として利用することもできる。
これら製剤の製剤化に用い得る担体としては、例えば、通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、及び矯味矯臭剤のほか、必要に応じ、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、及び無痛化剤等が挙げられ、医薬品製剤の原料として用いることができる公知の成分を配合して常法により製剤化することが可能である。
当該成分として使用可能な無毒性のものとしては、例えば、大豆油、牛脂、及び合成グリセライド等の動植物油；流動パラフィン、スクワラン、及び固形パラフィン等の炭化水素；ミリスチン酸オクチルドデシル、及びミリスチン酸イソプロピル等のエステル油；セトステアリルアルコール、及びベヘニルアルコール等の高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、及びポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤；ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、及びメチルセルロース等の水溶性高分子；エタノール、及びイソプロパノール等の低級アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、及びポリエチレングリコール等の多価アルコール（ポリオール）；グルコース、及びショ糖等の糖；無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、及びケイ酸アルミニウム等の無機粉体；塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム等の無機塩；精製水等が挙げられ、いずれもその塩またはその水和物であってもよい。
賦形剤としては、例えば、乳糖、果糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、及び二酸化ケイ素等が、結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、及びメグルミン等が、崩壊剤としては、例えば、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、及びカルボキシメチルセルロース・カルシウム等が、滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、及び硬化植物油等が、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、例えば、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、及び桂皮末等が、それぞれ好ましく挙げられ、いずれもその塩又はそれらの水和物であってもよい。
本発明の治療剤及び医薬組成物の投与量は、一般には、製剤中の有効成分（ダサチニブ等）の配合割合を考慮した上で、投与対象（患者）の年齢、体重、病気の種類・進行状況や、投与経路、投与回数（／１日）、投与期間等を勘案し、適宜、広範囲に設定することができる。
本発明の治療剤及び医薬組成物を、非経口剤又は経口剤として用いる場合について、以下に具体的に説明する。
非経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されないが、各種注射剤の場合は、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態や、使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供され得る。当該非経口剤には、有効成分となるダサチニブ等のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、各種注射剤の場合は、水、グリセロール、プロピレングリコールや、ポリエチレングリコール等の脂肪族ポリアルコール等が挙げられる。
非経口剤の投与量（１日あたり）は、限定はされないが、例えば各種注射剤であれば、一般には、有効成分となるダサチニブ等を、適用対象（被験者、患者等）の体重１ｋｇあたり、０．０１〜１０００ｍｇ、０．０５〜５００ｍｇ、又は０．１〜５０ｍｇ服用できる量とすることができ、あるいは０．５〜２０ｍｇ服用できる量や１〜１０ｍｇ服用できる量とすることもできる。
経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されず、前述した剤形のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。当該経口剤には、有効成分となるダサチニブ等のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン等）、充填材（乳糖、糖、コーンスターチ、馬鈴薯でんぷん、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等）、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ等）、崩壊剤（各種でんぷん等）、および湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）等が挙げられる。
経口剤の投与量（１日あたり）は、一般には、有効成分となるダサチニブ等を、適用対象（被験者、患者等）の体重１ｋｇあたり、０．０５〜５０００ｍｇ、０．１〜１０００ｍｇ、又は０．１〜１００ｍｇ服用できる量とすることができ、あるいは０．５〜５０ｍｇ服用できる量や１〜１０ｍｇ服用できる量とすることもできる。また、経口剤中の有効成分の配合割合は、限定はされず、１日あたりの投与回数等を考慮して、適宜設定することができる。
３．キット
ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療を行うに当たっては、ダサチニブ等を含むキット（具体例として、前述した本発明の治療剤や医薬組成物を含むキット）を用いることができる。
当該キットにおけるダサチニブ等の形態は、限定はされないが、安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮し、例えば溶解した状態で備えられていてもよい。
当該キットは、ダサチニブ等以外にも、適宜、他の構成要素を含むことができる。
当該キットは、構成要素として少なくとも前述したダサチニブ等を備えているものであればよい。従って、前記腫瘍の治療に必須となる構成要素の全てを、当該ダサチニブ等と共に備えているものであってもよいし、別々に備えているものであってもよく、限定はされない。
４．患者における薬剤有効性の検査方法
本発明においては、ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物（ダサチニブ等）の、投与対象とする患者における有効性を検査する方法（以下、「本発明の検査方法」ということがある。）が提供される。当該方法は、詳しくは、ダサチニブ等の投与が有効な患者を決定（又は判定）する検査方法である。
なお、本発明は、投与対象とする患者においてダサチニブ等の投与が有効であるかどうか（投与の有効性）を決定する又は判定する方法も提供される。
上記各方法は、医師の判断や診断を必要とするものではなく、個々の患者についてダサチニブ等の投与効果（腫瘍に対する治療効果）があるかどうかを、後述する（ｉ）〜（ｉｉｉ）の手法により、投与前に事前に検査・決定（又は判定）する方法である。
上記各方法において、有効性とは、限定はされないが、腫瘍の治療における有効性が挙げられる。
本発明の検査方法としては、例えば、（ｉ）上記患者から採取した検体中のＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質（例えば、ＶＡＶ１、ＶＡＶ２、ＶＡＶ３）のリン酸化の程度を指標とすることを特徴とする方法、（ｉｉ）当該検体中のＲＨＯＡ遺伝子における遺伝子変異又は融合遺伝子形成の有無を指標とすることを特徴とする方法、並びに、（ｉｉｉ）当該検体中のＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子（例えば、ＶＡＶ１遺伝子、ＶＡＶ２遺伝子、ＶＡＶ３遺伝子）における遺伝子変異又は融合遺伝子形成の有無を指標とすることを特徴とする方法が好ましく挙げられる。
上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の方法において、患者から採取した検体としては、限定はされないが、リンパ節や節外病変などの腫瘍組織、血清、血漿、血球、胸水、腹水、髄液等が好ましく挙げられる。
上記（ｉ）の方法の場合、検査の指標となるＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化（チロシンリン酸化）の程度は、例えば、免疫組織学的染色法、ウエスタンブロット法等の方法で測定又は決定することができる。当該リン酸化の程度が一定割合以上の細胞（例えば、細胞数基準で１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上）において陽性である場合は、検体を採取した投与対象となる患者は、ダサチニブ等の投与が有効な患者であると決定することができる。より詳しくは、当該決定は、ウェスタンブロット法でリン酸化ＶＡＶ１／ＶＡＶ２／ＶＡＶ３が検出できる場合や、免疫染色法で正常リンパ節よりも強くＶＡＶ１／ＶＡＶ２／ＶＡＶ３が染色される細胞が見出される場合、あるいは正常リンパ節より高い割合で染色陽性細胞が見出される場合なども可能である。
上記（ｉｉ）の方法の場合、検査の指標となるＲＨＯＡ遺伝子における遺伝子変異又は融合遺伝子形成の有無は、例えば、遺伝子変異の場合は、例えば、ダイレクトシーケンス法、アレル特異的ＰＣＲ法、次世代シーケンサーによるシーケンス、ＰＮＡ−ＬＮＡ  ＰＣＲ  ｃｌａｍｐ、ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ法、ＷＡＶＥ法等の方法で検出することができ、融合遺伝子形成の場合は、例えば、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）法、ｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲ法、染色体分析法、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）法、全ＲＮＡシークエンス法等の方法で検出することができる。
ＲＨＯＡ遺伝子における遺伝子変異としては、限定はされないが、例えば、下記表５に示されるものなどが挙げられる。
【表５】
2018084053.tif 000007
上記（ｉｉｉ）の方法の場合、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子（例えば、ＶＡＶ１遺伝子、ＶＡＶ２遺伝子、ＶＡＶ３遺伝子）における遺伝子変異又は融合遺伝子形成の有無は、例えば、遺伝子変異の場合は、ダイレクトシーケンス法、次世代シーケンサーによるシーケンス、ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ法、ＷＡＶＥ法等の方法で検出することができ、融合遺伝子形成の場合は、例えば、例えば、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）法、ｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲ法、染色体分析法、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）法、全ＲＮＡシークエンス法等の方法で検出することができる。
ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子の遺伝子変異としては、限定はされないが、ＶＡＶ１遺伝子では、例えば、下記表６に示すようなＶＡＶ１タンパク質のアミノ酸変異をもたらすＶＡＶ１遺伝子変異が挙げられる。
【表６】
2018084053.tif 000008
同様に、ＶＡＶ２遺伝子では、例えば、下記表７に示すようなＶＡＶ２タンパク質のアミノ酸変異をもたらすＶＡＶ２遺伝子変異が挙げられる。
【表７】
2018084053.tif 000009
同様に、ＶＡＶ３遺伝子では、例えば、下記表８に示すようなＶＡＶ３タンパク質のアミノ酸変異をもたらすＶＡＶ３遺伝子変異が挙げられる。
【表８】
2018084053.tif 000010
また、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子の融合遺伝子形成としては、限定はされないが、例えば、ＶＡＶ１遺伝子では、ＶＡＶ１−ＳＴＡＰ２、ＶＡＶ１−ＧＳＳ等が挙げられる。
本発明の検査方法は、腫瘍の治療においてダサチニブ等の使用が効果的な結果をもたらす可能性が高い患者を、治療前に事前に選択・決定することができる。そのため、結果として、患者における治療上の負担（経済的・時間的・体力的な負担）をより低減することができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異体によるＶＡＶ１活性化を示すデータ（実施例１〜４）
【実施例１】
【０００７】
（１）レンチウイルスにより、ＴＥＴ−ＯＮにより野生型ＲＨＯＡ  ｃＤＮＡあるいはコード領域の５０番目のＧがＴに置換されたＲＨＯＡのコード領域（以下、Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ  ｃＤＮＡと称する。）を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞白血病細胞株）を２×１０５／ｍＬ、１５ｃｍ  ｐｅｔｒｉ  ｄｉｓｈ、３枚ずつ、ＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ，１％ＰＳ）に播種した。ドキシサイクリンを最終濃度２μｇ／ｍＬとなるにように加えた。翌日、細胞を一旦回収し、遠心後、６×１０５／ｍＬ、１５ｃｍ  ｐｅｔｒｉ  ｄｉｓｈ、３枚ずつ、ＲＰＭＩ（無血清）へ播種した。４時間後細胞を回収、滅菌Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）により１回洗浄し、２×１０７／ｍｌにして１５ｍｌチューブへ移動、３７℃，５分インキュベートした。ＬＥＡＦＴＭｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３  Ａｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗マウスＩｇＧ抗体Ａｂ（各２μｇ／ｍｌになるよう入れる）を加えた。３７℃，５分あるいは３０分インキュベートした。冷却したＰＢＳを１０ｍｌ加え、遠心、上清を除去した。Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（事前にｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビターとＰｈｏｓＳＴＯＰ添加）を１０００μｌ／ｔｕｂｅで加えた。ｏｎ  ｉｃｅ  ２０分でインキュベートした。遠心し、上清を回収した。Ｌａｅｍｕｌｉ’ｓ  ｂｕｆｆｅｒおよびＤＴＴを添加した。９５℃で５分インキュベートした。
（２）免疫沈降
残りの上清を５００μＬ×２本とり、抗体ｆｌａｇＭ２抗体、コントロールとして抗ＨＡ抗体（５μｇ）を加え、４℃で２時間ローテートした。ｐｒｏｔｅｉｎＧをタッピングし、５０μＬを別のチューブに移した。１％ｔｒｉｔｏｎＴＢＳで２回洗浄した。
１００００ｒｐｍ，４℃，１０秒遠心、上清を捨てた（×２回）。洗浄した５０％ｐｒｏｔｅｉｎＧ５０μＬずつを上清に加え、４℃で１時間ローテートした。１７００ｒｐｍ，４℃，２分遠心し、上清は捨てた。ペレットに１％  ＴｒｉｔｏｎＴＢＳ  ５００μＬを加え、４℃で５分ローテート、１７００ｒｐｍ，４℃，２分遠心し、上清を捨てる、これを計３回繰り返した。１ｘＦｌａｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（５００μｇ／ｍｌにＴＢＳにて希釈）を５０μＬ加え、室温１０分ローテート、１７００ｒｐｍ，４℃，２分遠心した。上清を回収し、Ｌａｅｍｕｌｉｓ  ｂｕｆｆｅｒおよびＤＴＴを添加し、９５℃で５分インキュベートした。
（３）上記（１）、（２）のそれぞれの実施後、アクリルアミドゲルで電気泳動後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にブロットし、一次抗体として、抗ＶＡＶ１抗体（Ａｂｃａｍ又はＣｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＶＡＶ１  Ｙ１７４抗体、抗ＰＬＣ−ｇａｍｍａ１抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ  ＰＬＣ−ｇａｍｍａ１抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）および二次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ）、あるいは一次抗体として抗ｆｌａｇ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ）、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ）により染色し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎウェスタン化学発光ＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて発色させ撮影した。以上の結果を、図１、２に示した。
【実施例２】
【０００８】
レンチウイルスにより、ＴＥＴ−ＯＮにより野生型ＲＨＯＡあるいはＧ１７Ｖ  ＲＨＯＡ  ｃＤＮＡを発現するＳＵ９Ｔ０１細胞（成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫細胞株）を２×１０５／ｍＬ、１５ｃｍ  ｐｅｔｒｉ  ｄｉｓｈ、３枚ずつ、ＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ，１％ＰＳ）に播種した。ドキシサイクリンを最終濃度２μｇ／ｍＬとなるにように加えた。翌日、細胞を回収後、ＰＢＳで１回洗浄した。ペレットにＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを１０００μｌ／ｔｕｂｅ加えた。以後は、実施例１におけるＪｕｒｋａｔ細胞と同様に実験を行った。その結果を図３、４に示した。
【実施例３】
【０００９】
９６ｗｅｌｌ平底ｐｌａｔｅへ滅菌Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）によりＬＥＡＦＴＭ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３  Ａｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を１０μｇ／ｍｌに調整し、５０ｕＬ／ｗｅｌｌずつ分注、４℃で一晩インキュベートした。抗体液を除去後、滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。
５×１０４／ｗｅｌｌで２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＪｕｋａｔ細胞を播種した。翌日、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ＨＰ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを用いて、ＮＦＡＴ応答配列とホタルルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが挿入されたｐＧＬ４．３０ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、レニラルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが挿入されたｐｈＲＬベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、野生型あるいはＧ１７Ｖ  ＲＨＯＡ  ｃＤＮＡが挿入されたｐＥＦベクターを一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、培養していた細胞懸濁液を１５０μｌ／ｗｅｌｌで分注した。
７時間後に培養細胞液をチューブに回収し、さらに培養ｐｌａｔｅにＰＢＳ  ２００μｌ／ｗｅｌｌで分注しピペッティングしチューブへ移すことを繰り返し、細胞を完全に回収した。ＰＢＳで１回洗浄した。
Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプロトコールに沿って、ホタルルシフェラーゼ活性、レニラルシフェラーゼ活性をそれぞれ測定し、ホタルルシフェラーゼの値をレニラスリフェラーゼにより割ることでトランスフェクション効率を補正した。具体的には、細胞にＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＬＢ）を１００μｌ／ｔｕｂｅ加え、−８０℃で凍結することにより細胞を溶解した。遠心後、上清を回収した。９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１００μｌ／ｗｅｌｌでＬＡＲＩＩを分注した。２０μｌの細胞溶解液加えた。ルミノメーターに設置し、Ｓｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔを各１００μＬ添加し、ルミノメーターで再び測定した。その結果を、図５に示した。
【実施例４】
【００１０】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｔ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｖｅｒｉｔａｓ）にバッファー（ＰＢＳに０．１％ＢＳＡ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡを添加，ｐＨ７．４）を加え、マグネットラックに静置し上清を除去した。
レンチウイルスにより、ＴＥＴ−ＯＮにより野生型あるいはＧ１７Ｖ  ＲＨＯＡ  ｃＤＮＡを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を２×１０５／ｍＬ、１５ｃｍ  ｐｅｔｒｉ  ｄｉｓｈ、３枚ずつ、ＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ，１％ＰＳ）に播種した。ドキシサイクリンを最終濃度２μｇ／ｍＬとなるにように加えた。翌日、細胞を回収し、２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに細胞を播種した。上記で洗浄したＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｔ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｖｅｒｉｔａｓ）を加えた。３時間後および６時間後に細胞を回収した。ＰＢＳで１回洗浄後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）でＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりｃＤＮＡを合成した。Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｓｅｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のプライマー／プローブを用いて、ＩＬ−２  ｍＲＮＡを測定した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｒＲＮＡを測定し、これで補正した。その結果を、図６に示した。
２．Ｇ１７Ｖ  ＲＨＯＡ変異体によるＶＡＶ１活性化および下流シグナルのダサチニブによりキャンセルされることを示すデータ（実施例５、６）
【実施例５】
【００１１】
レンチウイルスにより、ＴＥＴ−ＯＮにより野生型ＲＨＯＡあるいはＧ１７Ｖ  ＲＨＯＡ  ｃＤＮＡを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を２×１０５／ｍＬ、１５ｃｍ  ｐｅｔｒｉ  ｄｉｓｈ、３枚ずつ、ＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ，１％ＰＳ）に播種した。ドキシサイクリンを最終濃度２μｇ／ｍＬとなるにように加えた。翌日、細胞を一旦回収し、遠心後、６×１０５／ｍＬ、１５ｃｍ  ｐｅｔｒｉ  ｄｉｓｈ、３枚ずつ、ＲＰＭＩ（無血清）へ播種する。３．５時間後、ダサチニブを終濃度０〜１０ｎＭで添加した。３０分後に細胞を回収した。以後は、実施例１と同様に実験を行った。その結果を、図７に示した。
【実施例６】
【００１２】
レンチウイルスにより、ＴＥＴ−ＯＮにより野生型ＲＨＯＡあるいはＧ１７Ｖ  ＲＨＯＡ  ｃＤＮＡを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を２×１０５／ｍＬ、１５ｃｍ  ｐｅｔｒｉ  ｄｉｓｈ、３枚ずつ、ＲＰＭＴ（１０％ＦＣＳ，１％ＰＳ）に播種した。ドキシサイクリンを最終濃度２μｇ／ｍＬとなるにように加えた。翌日、細胞を回収し、２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに細胞を播種した。ダサチニブを終濃度０〜１０ｎＭで添加した。実施例４と同様に洗浄したＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｔ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｖｅｒｉｔａｓ）を加えた。３時間後に細胞を回収した。ＰＢＳで１回洗浄後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）でＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりｃＤＮＡを合成した。Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｓｅｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のプライマー／プローブを用いて、ＩＬ−２ｍＲＮＡを測定した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｒＲＮＡを測定し、これで補正した。その結果を、図８に示した。
３．ゲノム解析によるＶＡＶ１遺伝子変異の発見（実施例７〜１１）
【実施例７】
【００１３】
ＶＡＶ１遺伝子のエクソンを含む領域について、ＡｍｌｉＳｅｑシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いることにより、あるいはＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてゲノムＰＣＲ法により増幅後、ＰＣＲアンプリコンについてＩｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いることにより、ライブラリを作製した。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、標準的な３００塩基対用のプロトコールを用いてシーケンシングを行った後、Ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｌｌｅｒで変異候補を解析し、これについてダイレクトシーケンス法で結果の確認を行った。その結果を、図９に示した。
【実施例８】
【００１４】
レンチウイルスにより、ＴＥＴ−ＯＮにより野生型ＶＡＶ１あるいはＶＡＶ−ＳＴＡＰ２  ｃＤＮＡを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を２×１０５／ｍＬ、１５ｃｍ  ｐｅｔｒｉ  ｄｉｓｈ、３枚ずつ、ＲＰＭＴ（１０％ＦＣＳ，１％ＰＳ）に播種した。ドキシサイクリンを最終濃度２μｇ／ｍＬとなるにように加えた。以後は、実施例１などを参照し、野生型あるいはＧ１７Ｖ  ＲＨＯＡ  ｃＤＮＡを発現するＪｕｒｋａｔ細胞と同様に実験した。その結果を、図１０、１１に示した。
【実施例９】
【００１５】
Ｊｕｋａｔ細胞にＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ＨＰ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを用いて、ＮＦＡＴ応答配列とホタルルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが挿入されたｐＧＬ４．３０ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、レニラルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが挿入されたｐｈＲＬベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、野生型あるいは変異型ＶＡＶ  ｃＤＮＡが挿入されたｐＥＦベクターをトランスフェクションした。以後は、実施例３等を参照し、野生型あるいはＧ１７Ｖ  ＲＨＯＡ  ｃＤＮＡの場合と同様にＬＥＡＦＴＭ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３  Ａｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）刺激し、ホタルルシフェラーゼおよびレニラルシフェラーゼ活性をそれぞれ測定した。その結果を、図１２に示した。
【実施例１０】
【００１６】
２４ｗｅｌｌ平底ｐｌａｔｅへＰＢＳによりＬＥＡＦＴＭ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３  Ａｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を１０μｇ／ｍｌに調整し、２００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注、４℃で一晩インキュベートした。抗体液を除去後、滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。
レンチウイルスにより、ＴＥＴ−ＯＮにより野生型ＶＡＶ１あるいは各種変異型ＶＡＶ  ｃＤＮＡを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を播種した。３時間および６時間後に細胞を回収し、以後は、実施例４などを参照し、野生型あるいはＧ１７Ｖ  ＲＨＯＡの場合と同様に実験した。その結果を、図１３に示した。
【実施例１１】
【００１７】
レンチウイルスにより、ＴＥＴ−ＯＮにより野生型ＶＡＶ１あるいはＶＡＶ−ＳＴＡＰ２  ｃＤＮＡを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を５×１０４／ｗｅｌｌで２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５００μｌ／ｗｅｌｌで細胞を播いた。Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ  ２μｇ／ｍｌを添加し２４時間後に細胞を回収し、上記実施例３と同様にＬＥＡＦＴＭ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３  Ａｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）をコートした９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに細胞懸濁液を５×１０４／５０μｌ／ｗｅｌｌで分注した。刺激後０ｈ，８ｈ，２４ｈ後に培養上清を回収した。ＢＤ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｂｅａｄｓ  ａｒｒａｙを用いて、ＩＬ−２を測定した。その結果を、図１４に示した。
４．ダサチニブによるＶＡＶ１変異活性化阻害（実施例１２、１３）
【実施例１２】
【００１８】
レンチウイルスにより、ＴＥＴ−ＯＮにより野生型ＶＡＶ１あるいはＶＡＶ１−ＳＴＰＡ２Ｇ  ｃＤＮＡを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を２×１０５／ｍＬ、１５ｃｍ  ｐｅｔｒｉ  ｄｉｓｈ、３枚ずつ、ＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ，１％ＰＳ）に播種した。ドキシサイクリンを最終濃度２μｇ／ｍＬとなるにように加えた。翌日、細胞を一旦回収し、遠心後、６×１０５／ｍＬ、１５ｃｍ  ｐｅｔｒｉ  ｄｉｓｈ、３枚ずつ、ＲＰＭＩ（無血清）へ播種した。３．５時間後、ダサチニブを終濃度０〜１０ｎＭで添加した。３０分後に細胞を回収した。以後は、上記と同様に抗ＣＤ３抗体で刺激実験を行う。その結果を、図１５に示した。
【実施例１３】
【００１９】
９６ｗｅｌｌ平底ｐｌａｔｅへＰＢＳによりＬＥＡＦＴＭ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３  Ａｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を１０μｇ／ｍｌに調整し、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注、４℃で一晩インキュベートした。抗体液を除去後、滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。
５×１０４／ｗｅｌｌで２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＪｕｋａｔ細胞を播種した。翌日、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ＨＰ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを用いて、ＮＦＡＴ応答配列とホタルルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが挿入されたｐＧＬ４．３０ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、レニラルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが挿入されたｐｈＲＬベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、野生型あるいはＧ１７Ｖ  ＲＨＯＡ  ｃＤＮＡが挿入されたｐＥＦベクターを一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、ダサチニブを終濃度０〜１０ｎＭで添加する。３０分後に細胞を回収し、以後は、上記実施例３等を参照して、ＬＥＡＦＴＭ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３  Ａｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で刺激し、ホタルルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を、図１６に示した。
５．治療モデルマウスへのダサチニブの投与による腫瘍抑制効果（実施例１４）
【実施例１４】
【００２０】
（１）モデルマウスの作製
血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ａｎｇｉｏｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ，ＡＩＴＬ）は、８０％以上でＴＥＴ２遺伝子の機能欠失型変異が認められ、同時に、全体の約７０％でＧ１７Ｖ型ＲＨＯＡ遺伝子変異が認められる。この疾患の動物モデルを作製するため、以下の遺伝子改変マウスを作製した。
マウスは受精卵の段階で、以下のように遺伝子改変を行った。
ｉ）Ｔｅｔ２遺伝子内にｌｏｘ配列が挿入されており、Ｃｒｅレコンビナーゼが働くとＴｅｔ２遺伝子が破壊されるようにデザインされている。
ｉｉ）Ｍｘプロモーター下流にＣｒｅレコンビナーゼをつないだＤＮＡ配列（Ｃｒｅ発現カセット）が導入されている。インターフェロンに反応する細胞では、インターフェロン刺激によってＭｘプロモーターが活性化され、Ｃｒｅレコンビナーゼが発現する。このため、インターフェロン産生を誘導するｐｏｌｙ−ｉｎｏｓｉｌｉｃ：ｐｏｌｙ−ｃｙｔｉｄｉｌｉｃ  ａｃｉｄ（ｐＩｐＣ）を投与すると、インターフェロンに反応する細胞（造血幹細胞もこれに含まれる）ではＣｒｅレコンビナーゼが発現する。ｉ）とｉｉ）は、すなわち、ｐＩｐＣ投与によって、造血幹細胞でＴｅｔ２遺伝子が破壊され、不活化されるようにデザインされていることを意味している。
ｉｉｉ）上記ｉ）とｉｉ）とは独立に、ＣＤ２プロモーター下にＧ１７Ｖ変異型ヒトＲＨＯＡのｃＤＮＡをつないだＤＮＡ配列（発現カセット）が導入されている。ＣＤ２プロモーターはＴ細胞で特異的に活性化されるため、Ｔ細胞でのみＧ１７Ｖ変異ＲＨＯＡタンパク質が発現する。
このようにして作製したマウスに、生後４週齢から２０ｍｇ／ｋｇのｐＩｐＣを４回、隔日で腹腔内投与したところ、約４０週齢頃から５０週齢頃にかけて、多くのマウスで多発リンパ節腫脹や脾腫が観察され、４５週齢以降死亡した。詳細な解析のため、３５週齢以降で脾腫が観察されたり衰弱したりした場合に、犠牲死させて解析を進めた。腫大リンパ節や脾臓の組織学的観察では、腫瘍細胞と思われるＴ細胞が１０〜３０％浸潤していたほか、リンパ球やその他の多彩な炎症細胞浸潤がみられ、腫瘍と炎症との区別が困難な病理像を示していた。腫瘍性に増殖しているＴ細胞は、細胞表面抗原の発現パターンから、濾胞性ヘルパーＴ細胞の特徴をもっていた。腫大リンパ節からＤＮＡを調整しＴ細胞受容体の再構成を解析したところ、単クローンまたはオリゴクローンであり、Ｔ細胞の腫瘍性増殖と考えて矛盾しない結果であった。また、一部のマウスでは、肝臓や肺などにも腫瘤を形成しており、組織学的にリンパ球様細胞の腫瘍性浸潤が確認された。
ＡＩＴＬ患者では、腫瘍細胞は濾胞性ヘルパーＴ細胞の特徴をもつことが知られている。また、腫瘍組織における腫瘍細胞比率が低く、細胞の大多数は多彩な炎症細胞であることが多い。病理学的に腫瘍と診断できず、炎症と診断されることがしばしば経験される。したがって、本実施例のマウスで生じた疾患は、ＡＩＴＬ患者の特徴を有している。（本マウスモデルは、ＡＩＴＬの完全なモデルとは言えないが、今回のような特徴を示す腫瘍がマウスでモデル化されたとする報告はなく、今回のモデルがもっともＡＩＴＬ患者に類似していることは疑いない。）
（２）移植モデル
ＡＩＴＬモデルが樹立されたと認められるが、ｐＩｐＣ投与から腫瘍形成が確認されるまでの潜伏期間が長い。このため、この遺伝子改変マウスは、治療実験に用いるには向いていない。このため、移植モデルの確立を検討した。腫大したリンパ節から全細胞を調整して浮遊させ、多数のヌードマウスの腹腔内に移植したところ、約１ヶ月でほぼ全てのホストマウスでリンパ節腫大が認められた。その組織学的検討では、概ねドナーとしたマウスの腫大リンパ節と同様で、また細胞学的検討でも濾胞性ヘルパーＴ細胞の特徴をもつＴ細胞の増加が確認された。なお、腫瘍組織に浸潤している炎症細胞は、ドナーマウス由来の細胞と、ホストマウス由来の細胞とが混在していた。
一方、ドナーマウスの腫大リンパ節細胞から、濾胞性ヘルパーＴ細胞の特徴をもつ細胞（ＣＤ４陽性ＩＣＯＳ陽性細胞）だけを分取してヌードマウスに移植しても、リンパ腫は発症しなかった（＊）。
（３）治療モデル
ドナーマウス腫大リンパ節由来の２×１０７個の全細胞をヌードマウスの腹腔内に播種し、２週間後（超音波検査で一部のマウスでリンパ節腫大が確認）から５ｍｇ／ｋｇのダサチニブをｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ：ｄｉｓｔｉｌｌ  ｗａｔｅｒを１：１に調整した溶解液に溶解して連日１４日間経口投与した（ダサチニブ群：図１７中の「Ｄａｓａｔｉｎｉｂ」）。コントロールとして、まったく同様の条件のヌードマウスに、同じ容量の溶解液（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ：ｄｉｓｔｉｌｌ  ｗａｔｅｒ＝１：１）のみを同じ日程で投与した（コントロール群：図１７中の「Ｖｅｈｉｃｌｅ」）。これら投与実験の結果を図１７に示した。コントロール群では、２０日で７７．８％（１４／１８）のマウスでリンパ腫が進行（体重減少・衰弱）したが、ダサチニブ群では１５０日間の観察期間中進行したのは３３．３％（６／１８）で、有意にダサチニブ群で進行が抑制され、生存が延長していた。
なお、ドナーマウス腫大リンパ節由来の２×１０７個の全細胞をヌードマウスの腹腔内に播種し、２週間後に上記の要領で１日３回、２日間ダサチニブまたはコントロール溶解液を投与し、翌日ヌードマウスを犠牲死させて、腫大していたリンパ節から薄切標本を作製し、抗リン酸化ＶＡＶ１抗体で染色した。その結果、コントロール溶解液を投与した群のマウスの腫大リンパ節ではリン酸化ＶＡＶ１が染色されたが、ダサチニブを投与した群のマウスの腫大リンパ節ではリン酸化ＶＡＶ１が染色されなかった（この結果は、ダサチニブの腫瘍抑制効果が、ＶＡＶ１リン酸化抑制を介するという仮説を支持するものである）。
（４）微小環境細胞の発症への関与
上記（２）の＊印をつけた記載のとおり、ドナーマウスの腫大リンパ節細胞から、濾胞性ヘルパーＴ細胞の特徴をもつ細胞（ＣＤ４陽性ＩＣＯＳ陽性細胞）だけを分取してヌードマウスに移植しても、リンパ腫は発症しなかったことが認められたが、このことは、ＡＩＴＬの発症にドナー由来の微小環境細胞が関与していることを示唆している。
上記（１）のモデルマウスの作製と並行して、そのモデルマウスとは下記ｉｉ）の部分だけが異なるマウスも作製した。すなわち、
ｉ）Ｔｅｔ２遺伝子内にｌｏｘ配列が挿入されており、Ｃｒｅレコンビナーゼが働くとＴｅｔ２遺伝子が破壊されるようにデザインされている（上記（１）のモデルマウスと全く同じ）。
ｉｉ）ＣＤ４プロモーター下流にＣｒｅレコンビナーゼをつないだＤＮＡ配列（Ｃｒｅ発現カセット）が導入されている。用いたＣＤ４プロモーターは、主にＴ細胞で活性化され、下流の遺伝子発現を誘導することが知られている。ｉ）とｉｉ）はすなわち、Ｔ細胞でＴｅｔ２遺伝子が破壊され、不活化されるようにデザインされていることを意味している。
ｉｉｉ）上記ｉ）とｉｉ）とは独立に、ＣＤ２プロモーター下にＧ１７Ｖ変異型ヒトＲＨＯＡのｃＤＮＡをつないだＤＮＡ配列（発現カセット）が導入されている。ＣＤ２プロモーターはＴ細胞で特異的に活性化されるため、Ｔ細胞でのみＧ１７Ｖ変異ＲＨＯＡタンパク質が発現する（上記（１）のモデルマウスと全く同じ）。
このマウスでは、８０週齢までの間、リンパ節腫大は全く観察されなかった。この結果は、上記（２）の＊印をつけた記載と合わせて勘案すると、Ｔｅｔ２の不活化がＴ細胞以外の炎症細胞で生じることが必要であり、これらＴｅｔ２不活化炎症細胞が組織中で腫瘍化に寄与していることを強く示唆していると考えられた。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月15日(2018.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療剤であって、
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む、
前記治療剤。
【請求項２】
前記腫瘍は、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化が亢進していると決定された腫瘍である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
前記タンパク質が、ＶＡＶ１タンパク質である、請求項１又は２に記載の治療剤。
【請求項４】
ＲＨＯＡ遺伝子、及び／又はＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子において遺伝子変異若しくは融合遺伝子形成が認められる腫瘍の治療剤であって、
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む、
前記治療剤。
【請求項５】
前記腫瘍が、Ｔ細胞リンパ腫、胃がん、膵がん、皮膚腫瘍、大腸がん、子宮がん、及び神経系腫瘍からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項６】
前記腫瘍が、Ｔ細胞リンパ腫である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項７】
Ｔ細胞リンパ腫が、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、又は分類不能型末梢性Ｔ細胞リンパ腫である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項８】
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療用医薬組成物。
【請求項９】
ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療用の薬剤を製造するためのダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の使用。
【請求項１０】
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を被験対象に投与することを特徴とする、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療方法。
【請求項１１】
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む、ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療用キット。
【請求項１２】
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の、投与対象とする患者における有効性を検査する方法であって、該患者から採取した検体中のＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化の程度を指標とする、前記方法。
【請求項１３】
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の、投与対象とする患者における有効性を検査する方法であって、該患者から採取した検体中のＲＨＯＡ遺伝子における遺伝子変異又は融合遺伝子形成の有無を指標とする、前記方法。
【請求項１４】
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の、投与対象とする患者における有効性を検査する方法であって、該患者から採取した検体中のＶＡＶ１遺伝子における遺伝子変異又は融合遺伝子形成の有無を指標とする、前記方法。
【請求項１５】
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の、投与対象とする患者における有効性を検査する方法であって、該患者から採取した検体中のＶＡＶ２遺伝子における遺伝子変異又は融合遺伝子形成の有無を指標とする、前記方法。
【請求項１６】
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物の、投与対象とする患者における有効性を検査する方法であって、該患者から採取した検体中のＶＡＶ３遺伝子における遺伝子変異又は融合遺伝子形成の有無を指標とする、前記方法。
【請求項１７】
ＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子タンパク質のリン酸化で同定される腫瘍の治療剤であって、
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含み、
前記癌原遺伝子タンパク質が、ＶＡＶ１タンパク質である、
前記治療剤。
【請求項１８】
ＲＨＯＡ遺伝子、及び／又はＶＡＶファミリーに属する癌原遺伝子において遺伝子変異若しくは融合遺伝子形成が認められる腫瘍の治療剤であって、
ダサチニブ、若しくはそのプロドラッグ、又はそれらの薬理学的に許容し得る塩、あるいはそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含み、
前記癌原遺伝子が、ＶＡＶ１遺伝子である、
前記治療剤。
【国際調査報告】
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