(57)【要約】  癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法を提供する。  ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ−３の結合の抑制を検出できる系に試験化合物を接触させる工程、ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ−３の結合を抑制する化合物を選択する工程、を含む、スクリーニング方法により、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物をスクリーニングできる。
2018139386.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法であって、
前記スクリーニング方法が、
ＲＯＲ１タンパク質及びＣａｖｉｎ−３タンパク質の結合の抑制を検出できる系に試験化合物を接触させる工程、
ＲＯＲ１タンパク質及びＣａｖｉｎ−３タンパク質の結合を抑制する化合物を選択する工程、
を含む、スクリーニング方法。
【請求項２】
前記癌細胞の生存シグナルが、ＡＫＴによる生存シグナルである、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＲＯＲ１タンパク質、
Ｃａｖｉｎ−３タンパク質、及び
前記ＲＯＲ１タンパク質、並びに、前記Ｃａｖｉｎ−３タンパク質の少なくとも一方と結合する担体、
を少なくとも含む、ＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ−３タンパク質の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
【請求項４】
前記担体が、金属膜、金属ナノ粒子、及びビーズから選択される少なくとも１つである、請求項３に記載のＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ−３タンパク質の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
【請求項５】
前記担体が、
光照射によって励起され、周囲の酸素分子を一重項状態に変換する光感受性物質を含むドナービーズ、及び、
前記一重項酸素と反応し発光する化学発光伝達物質を含むアクセプタービーズ、
であり、
前記ＲＯＲ１タンパク質が、前記ドナービーズ又は前記アクセプタービーズの一方に結合し、
前記Ｃａｖｉｎ−３タンパク質が、前記ドナービーズ又は前記アクセプタービーズの他方に結合している、
請求項３に記載のＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ−３タンパク質の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
【請求項６】
ヒトＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８〜９３７番の内、少なくとも４７３〜５６４番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、及び、
ヒトＣａｖｉｎ−３のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、
を導入した形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を含む、ＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ−３タンパク質の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
【請求項８】
ヒトＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８〜９３７番の内、少なくとも４７３〜５６４番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター。
【請求項９】
被検体から癌細胞を取得する工程、
前記癌細胞中の、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の発現を測定する工程、
を含むことを特徴とする分子標的薬の適応患者の選択方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングキット、形質転換体、組み換えベクター、並びに、分子標的薬の適応患者の選択方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、経済的に良く発展した国々における癌による死亡の主たる原因であり、その中でも肺腺癌は最も頻度の高い組織学的サブタイプである。【０００３】
肺腺癌は、肺における分岐形態形成及び生理学的機能に必要な系譜特異的転写因子（ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）であるＴＴＦ−１（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−１）の持続的な発現と密接に結びついていることが知られている(非特許文献１参照)。また、ＴＴＦ−１は系譜生存的癌遺伝子（ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ）であるということも知られている（非特許文献２〜４参照）。ＴＴＦ−１がサーファクタントタンパク質の産生、並びに正常な成人の肺における生理学的機能に欠かせないことから、ＴＴＦ−１の系譜特異的生存シグナルに関与する下流分子の同定は、新たな治療方法の開発に必要である。【０００４】
ＴＴＦ−１により発現が誘導される下流分子としては、ＲＯＲ１（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）遺伝子が知られている。そして、このＲＯＲ１遺伝子の発現を抑制することにより、特定の癌細胞の増殖が阻害できることも知られている（特許文献１参照）。【０００５】
更に、ＲＯＲ１を標的とすると、癌細胞のアポトーシスの誘導のみならず、ＥＧＦＲやＭＥＴなどの受容体型チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ、以下、受容体型チロシンキナーゼのことを「ＲＴＫ」と記載することがある。）が伝達する癌細胞の生存促進性シグナルの抑制が可能であること、そのため、ＲＯＲ１が、癌細胞の増殖抑制剤の開発の重要な標的となりうることも知られている（特許文献２参照、非特許文献５参照）。【０００６】
ところで、上記特許文献２等に記載されているように、これまでの開発されてきた多くの分子標的薬は、キナーゼ活性の阻害剤である。前記キナーゼ活性の阻害剤とは、肺癌を始めとするヒトがんの増殖・生存に関わるＲＴＫの活性化を抑制する化合物のことである。しかしながら、キナーゼ活性の阻害剤を患者に投与すると、治療中にキナーゼ遺伝子に耐性を付与する変異が生じたり、癌細胞の生存シグナルを他のレセプターに依存するバイパス経路が生じることで、癌細胞が当該キナーゼ活性の阻害剤に対して耐性を獲得するという問題がある。【０００７】
また、上記特許文献２に記載されているＥＧＦＲ、ＭＥＴ等、癌細胞の一つのレセプターを分子標的とした場合、他のレセプターからのシグナルが遮断できず十分な効果が得られないことがあり、各々のレセプターを標的とする阻害剤の併用が試みられている。しかしながら、複数の阻害剤を併用したとしても、更にバイパス経路が生じたり、複数の阻害剤投与による副作用が拡大する恐れがあるという問題がある。【０００８】
以上のことから、正常細胞や癌細胞は様々な生存シグナルを駆使し自身が生き延びることを可能としているが、これらの生存シグナルは細胞膜に存在する多くのＲＴＫを介して伝わる。これまでの研究から、癌細胞では個々のＲＴＫをターゲットとした分子標的薬（ＥＧＦＲを対象としたイレッサなど）が開発され、上記のように複数のＲＴＫに対する阻害剤の併用が試みられているが、更に異なるＲＴＫを介したバイパス経路の出現やこれらのＲＴＫは正常細胞でも生存シグナルを伝える重要な役割を担っているため、副作用が非常に大きな問題となっている。そのため、癌細胞の個々のＲＴＫをターゲットとするのではなく、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１又はＲＯＲ１とＣａｖｅｏｌｉｎ１（以下、「ＣＡＶ１」と記載することがある。）の結合を抑制することで、各種増殖因子が結合し細胞内にシグナルを伝達するＲＴＫが集積しているカベオラの形成自体を抑制できること、そして、カベオラの形成を特異的に抑制することで、各種ＲＴＫの活性を一網打尽にできることも知られている（特許文献３、非特許文献６参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１０／００８０６９号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０９０９３９号
【特許文献３】国際公開第２０１６／０６３６３７号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｔａｎａｋａ．Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００７，Ｖｏｌ．６７，  ｐ６００７〜６０１１
【非特許文献２】Ｋｅｎｄａｌｌ．Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００７，  Ｖｏｌ．１０４，  ｐ１６６６３〜１６６６８
【非特許文献３】Ｗｅｉｒ，ＢＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００７，  Ｖｏｌ．４５０，  ｐ８９３〜８９８
【非特許文献４】Ｋｗｅｉ，ＫＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００８，  Ｖｏｌ．２７，  ｐ３６３５〜３６４０
【非特許文献５】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ．Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２０１２，  Ｖｏｌ．２１，  ｐ３４８〜３６１
【非特許文献６】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ．Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎ，２０１６，Ｖｏｌ．７，１００６０（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１００６０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記のとおり、特許文献３に記載されている発明は、カベオラの形成を特異的に抑制することで、各種ＲＴＫの活性を一網打尽にできる化合物の探索に非常に有効である。一方、有効な抗癌剤の開発には、カベオラに集積する様々な受容体が癌細胞に生存シグナルを伝達する詳細な分子機序についても併せて解明することが望ましい。具体的には、カベオラの生理的機能に鑑み、その形成は抑制せずに、カベオラに集積する様々な受容体が伝える生存シグナルをより特異的に阻害できるような分子機序を解明することが望ましい。【００１２】
本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、（１）癌細胞に特有のタンパク質であるＲＯＲ１に着目し、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合の阻害が、セリン・スレオニンキナーゼ（ＡＫＴ）による生存シグナルを抑制すること、（２）ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合を標的とする化合物をスクリーニングすることで、新たな抗癌剤の開発が期待できること、を新たに見出した。なお、以下において、「ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合」とは、「ＲＯＲ１タンパク質」と「Ｃａｖｉｎ−３タンパク質」の結合を意味し、タンパク質の記載を省略する場合もある。【００１３】
すなわち、本発明の目的は、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングキット、形質転換体、組み換えベクター、並びに、分子標的薬の適応患者の選択方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、以下に示す、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングキット、形質転換体、組み換えベクター、並びに、分子標的薬の適応患者の選択方法に関する。【００１５】
（１）癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法であって、
前記スクリーニング方法が、
ＲＯＲ１タンパク質及びＣａｖｉｎ−３タンパク質の結合の抑制を検出できる系に試験化合物を接触させる工程、
ＲＯＲ１タンパク質及びＣａｖｉｎ−３タンパク質の結合を抑制する化合物を選択する工程、
を含む、スクリーニング方法。
（２）前記癌細胞の生存シグナルが、ＡＫＴによる生存シグナルである、上記（１）に記載のスクリーニング方法。
（３）ＲＯＲ１タンパク質、
Ｃａｖｉｎ−３タンパク質、及び
前記ＲＯＲ１タンパク質、並びに、前記Ｃａｖｉｎ−３タンパク質の少なくとも一方と結合する担体、
を少なくとも含む、ＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ−３タンパク質の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
（４）前記担体が、金属膜、金属ナノ粒子、及びビーズから選択される少なくとも１つである、上記（３）に記載のＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ−３タンパク質の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
（５）前記担体が、
光照射によって励起され、周囲の酸素分子を一重項状態に変換する光感受性物質を含むドナービーズ、及び、
前記一重項酸素と反応し発光する化学発光伝達物質を含むアクセプタービーズ、
であり、
前記ＲＯＲ１タンパク質が、前記ドナービーズ又は前記アクセプタービーズの一方に結合し、
前記Ｃａｖｉｎ−３タンパク質が、前記ドナービーズ又は前記アクセプタービーズの他方に結合している、
上記（３）に記載のＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ−３タンパク質の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
（６）ヒトＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８〜９３７番の内、少なくとも４７３〜５６４番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、及び、
ヒトＣａｖｉｎ−３のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、
を導入した形質転換体。
（７）上記（６）に記載の形質転換体を含む、ＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ−３タンパク質の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
（８）ヒトＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８〜９３７番の内、少なくとも４７３〜５６４番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター。
（９）被検体から癌細胞を取得する工程、
前記癌細胞中の、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の発現を測定する工程、
を含むことを特徴とする分子標的薬の適応患者の選択方法。
【発明の効果】
【００１６】
本願で開示する癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法により、通常の細胞には影響を与えず、癌細胞を特異的に抑制する化合物を発見できる可能性が有る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、癌細胞の生存シグナルの一例を表す図である。
【図２】図２は、図１と同様、癌細胞の生存シグナルの一例を表す図である。
【図３】図３は、Ｃａｖｉｎ−３とＲＯＲ１との結合を標的としたスクリーニングキットの実施形態の一例を示す図である。
【図４】図４Ａ乃至Ｄは、図面代用写真で、肺腺癌細胞株において、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３が結合することを示している。図４Ａは、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５において、内因性のＲＯＲ１と内因性のＣａｖｉｎ−３が結合することを、ウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図４Ｂは、肺腺癌細胞株であるＳＫ−ＬＵ−１において、内因性のＲＯＲ１と内因性のＣａｖｉｎ−３が結合することを、ウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図４Ｃは、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５の細胞抽出液およびリコンビナント精製タンパク質であるＧＳＴ、ＧＳＴ−ＲＯＲ１を用いて、内因性のＣａｖｉｎ−３がＧＳＴ−ＲＯＲ１と結合することをＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ法およびウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図４Ｄは、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５の細胞抽出液およびリコンビナント精製タンパク質であるＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｃａｖｉｎ−３を用いて、内因性のＲＯＲ１がＧＳＴ−Ｃａｖｉｎ−３と結合することをＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ法およびウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。
【図５】図５Ａ乃至Ｄは、図面代用写真で、共焦点レーザー顕微鏡において、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３が共局在することを細胞染色法によって分析した結果を示す写真である。図５ＡはＲＯＲ１の写真、図５ＢはＣａｖｉｎ−３の写真、図５ＣはＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３をマージした写真、図５Ｄは図５Ｃの長方形で囲った部分を拡大した写真である。
【図６】図６は、Ｃａｖｉｎ−３のＲＯＲ１結合部位を同定したことを示す図である。図６Ａは、ＲＯＲ１のキナーゼドメイン、２箇所のセリン・スレオニンリッチドメイン、プロリンリッチドメインのそれぞれの欠損変異体の模式図を示している。また、図６Ｂは、図面代用写真で、Ｃａｖｉｎ−３がＲＯＲ１のキナーゼドメイン内で結合していることを免疫沈降法およびウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。Ｃａｖｉｎ−３はＲＯＲ１タンパク質のキナーゼドメイン内の４７３アミノ酸から５６４アミノ酸のキナーゼドメイン内の領域で結合していることを示している。
【図７】図７は、肺腺癌細胞株においてＣａｖｉｎ−３によるＲＯＲ１の結合領域はＣａｖｉｎ−３の適切な細胞内での局在化に必要不可欠であるが、カベオラ形成そのものには影響が認められないことを示している。図７Ａは、図面代用写真で、ｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持ったＲＯＲ１の野生型（ＷＴｍ）、及び、Ｃａｖｉｎ−３の結合部位を欠損させたＲＯＲ１（ＴＫΔ１ｍ）をＮＣＩ−Ｈ１９７５肺腺癌細胞株に発現させ、ｓｉＲＯＲ１処理を行うことで細胞内のＲＯＲ１をＷＴｍ、及び、ＴＫΔ１ｍに置換させた際のショ糖濃度勾配遠心法によるＣａｖｉｎ−３の局在変化をウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図７Ｂは、図面代用写真で、同様の条件においてＲＯＲ１のＴＫΔ１ｍを発現させた肺腺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９７５においてＣａｖｉｎ−３の細胞内局在が変化することを細胞染色法によって分析した結果を示す写真である。図７Ｃは、図面代用写真で、ＲＯＲ１のＷＴｍあるいはＴＫΔ１ｍを発現させた肺腺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９７５では、カベオラの形成数に変化が見られないことを超薄切片法により電子顕微鏡解析によって分析した結果を示す写真である。図７Ｄは、分析した結果を示すグラフである。
【図８】図８は、肺腺癌細胞株において、Ｃａｖｉｎ−３によるＲＯＲ１の結合領域はリガンド刺激による生存シグナルの活性化に必要不可欠であることを示している。図８Ａは、図面代用写真で、ｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持たないＲＯＲ１の野生型（ＷＴ）、ｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持ったＲＯＲ１の野生型（ＷＴｍ）、及び、Ｃａｖｉｎ−３の結合部位を欠損させたＲＯＲ１（ＴＫΔ１ｍ）をＮＣＩ−Ｈ１９７５肺腺癌細胞株に発現させ、ｓｉＲＯＲ１処理を行うことで細胞内のＲＯＲ１をＷＴｍ、及びＴＫΔ１ｍに置換させ、そして、ＩＧＦ−Ｉ刺激によるＡＫＴのリン酸化（活性化）をウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図８Ｂは、ＩＧＦ−Ｉ刺激に換え、ＥＧＦ刺激によるＡＫＴのリン酸化（活性化）をウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。
【図９】図９は、肺腺癌細胞株において、Ｃａｖｉｎ−３の発現抑制はＲＯＲ１の発現抑制と同様に、細胞増殖の低下が認められることを示している。図９Ａの上段は、図面代用写真で、肺腺癌細胞株ＰＣ−９においてｓｉＲＯＲ１あるいはｓｉＣａｖｉｎ−３を処理した際の各々の発現抑制の効率をウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図９Ａの下段は、ＭＴＴ  ａｓｓａｙによる細胞増殖への影響を示したグラフである。図９Ｂの上段は、肺腺癌細胞株ＰＣ−９に換え、肺腺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９７５を用いた時のウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真で、図９Ｂの下段はＭＴＴ  ａｓｓａｙによる細胞増殖への影響を示したグラフである。
【図１０】図１０は、図面代用写真で、ＧＳＴ−ＲＯＲ１およびＨｉｓ−Ｃａｖｉｎ−３のリコンビナント精製タンパク質同士が結合することをＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ法およびウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングキット、形質転換体、組み換えベクター、並びに、分子標的薬の適応患者の選択方法について詳しく説明する。
【００１９】
図１および図２は、癌細胞の生存シグナルの一例を表す図である（非特許文献５および非特許文献６参照）。図１に示すように、（１）ＲＯＲ１は生存シグナル（ＡＫＴシグナル）とアポトーシスシグナル（ｐ３８シグナル）のバランスを制御、（２）ＲＯＲ１はｃ−Ｓｒｃを活性化し、ＰＴＥＮを介して、あるいは直接的に、ＡＫＴによる生存シグナルを制御、（３）ＲＯＲ１はＥＧＦＲと結合することで、ＥＧＦＲとＥＲＢＢ３とのヘテロダイマー形成を惹起させ、ＥＲＢＢ３のリン酸化やホスファチジルイノシトール  ３−キナーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３−ｋｉｎａｓｅ；ＰＩ３Ｋ）のサブユニットであるｐ８５によるＥＲＢＢ３への結合、さらにはＰＩ３Ｋ（ｐ８５とｐ１１０の複合体）の活性化を通じてＡＫＴによる生存シグナルの維持にも関与、することが知られている。また図２に示すように、ＲＯＲ１は、カベオラ構成分子であるＣＡＶ１やＣａｖｉｎ−１と相互作用するスキャフォールドタンパク質として機能することで、細胞膜でのＣＡＶ１とＣａｖｉｎ−１の結合を促進させ、カベオラ形成を安定化させることで、そこに集積する様々なタイプの受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のリガンド刺激等による活性化を維持させ、ＲＴＫからの生存シグナルの維持に関与、することが知られている。
【００２０】
なお、本願において、「生存シグナル」とは、癌細胞における遺伝子発現や代謝などの細胞内環境を、アポトーシスを抑制し生存を促進する状況に誘導するシグナルを意味する。例えば、種々の増殖因子（ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、インスリン様増殖因子など）がチロシンキナーゼ活性をもつ受容体（受容体型チロシンキナーゼ）に結合することによって惹起される、受容体型チロシンキナーゼ及び一連の下流分子のリン酸化反応によって伝達されるシグナルが挙げられる。また、「癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物」とは、通常細胞には影響を与えず、癌細胞の生存シグナルのみを特異的に抑制できる化合物を意味する。本発明者らは、図１および図２に示す各種シグナルの中で、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合が、ＡＫＴによる生存シグナルを抑制すること新たに見出した。ＲＯＲ１は癌細胞に特異的なタンパク質であることから、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合の抑制は、通常細胞には影響を与えず、癌細胞の生存シグナルのみを特異的に抑制することができる。
【００２１】
本願のスクリーニング方法のターゲットとなる化合物は、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、抗体、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。また、「抑制」とは、完全に抑制すること（すなわち、阻害すること）のみならず、部分的に抑制することも含む。例えば、「生存シグナルを特異的に抑制」には、生存シグナルの生成を阻害および生存シグナル活性の抑制の双方が含まれる。また、「ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ−３の結合の抑制」には、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合の完全な阻害、及び結合の部分的な阻害の双方が含まれる。
【００２２】
ヒトＲＯＲ１の遺伝子情報、ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４９１９の遺伝子情報、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５０１２に記載のｃＤＮＡおよびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５００３に記載のアミノ酸配列情報を入手することができる。
【００２３】
Ｃａｖｉｎ−３は別名ＰＲＫＣＤＢＰとも呼ばれ、Ｃａｖｉｎ−１、２、４とともに、Ｃａｖｉｎファミリータンパク質として知られ、カベオラに局在することが知られている。なお、カベオラとは、癌細胞の上皮細胞と内皮細胞膜表面にある窪みを持った構造を意味している。カベオラには、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩＲ）など各種の増殖因子が結合することで細胞内にシグナルを伝達するＲＴＫが集積しており、癌細胞へのシグナル伝達、脂質の取り込みや体内に侵入した細菌などの排除として機能している。
【００２４】
ヒトＣａｖｉｎ−３の遺伝子情報、ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は公知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１１２４６４の遺伝子情報、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１４５０４０に記載のｃＤＮＡおよびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６５９４７７に記載のアミノ酸配列情報を入手することができる。
【００２５】
ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ−３は、カベオラおよびカベオラに起因する細胞内構造物に局在することから、癌細胞としては、カベオラおよびカベオラに起因する細胞内構造物を形成するものであればよい。そのような癌細胞としては、例えば、肺癌（肺腺癌、肺小細胞癌、肺扁平上皮癌、肺大細胞癌を含む）、膵癌、悪性中皮腫、乳癌、胃癌、大腸癌、口腔癌、食道癌、子宮癌、腎臓癌、膀胱癌、卵巣癌、精巣癌などの癌の細胞が挙げられるが、これらに制限されない。癌細胞の由来する生物種としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられるが、これらに制限されない。
【００２６】
スクリーニング方法は、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制することができるか否かを直接又は間接的に検出し得る系に試験化合物を接触させ、接触前後の機能の変化を検出できれば特に制限は無い。
【００２７】
例えば、ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ−３が発現している系等に、試験化合物を接触させ、次いで、ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ−３の結合の抑制の有無について調べればよい。
【００２８】
検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）、免疫沈降−ウェスタンブロット（ＩＰ−ＷＢ）法、プルダウンアッセイ法、架橋タンパク質相互作用解析法（クロスリンク法）、Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法、蛍光消光法、標識転写タンパク質相互作用解析法、ファーウエスタンブロット解析法などによって実施することができる。試験化合物の非存在下で検出した場合と比較して、ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ−３の結合量の低下が検出されれば、試験化合物は、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制すると評価される。
【００２９】
上記の検出方法の他、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物は、タンパク質の蛍光輝度や光分子の屈折率としてスクリーニングすることもできる。具体的には、少なくともＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ−３タンパク質を含み、両者が結合する場合と結合しない場合に、蛍光輝度や光分子の屈折率などに差がでる系を構築すればよい。例えば、金、銀等の金属膜表面又は金属ナノ粒子表面に、ＲＯＲ１タンパク質又はＣａｖｉｎ−３タンパク質の一方を固定し、他方のタンパク質と試験化合物を混合し、ここにレーザーを照射することで、タンパク質とタンパク質との結合、すなわち複合体が形成された際の、レーザーの屈折率を検出する、表面プラズモン共鳴法を使った方法が挙げられる。また、２種類の蛍光分子を使用することで、励起スペクトルが短波長側にある一方の蛍光分子に励起光を照射すると生じる蛍光スペクトルが、もう一方の蛍光分子の励起スペクトルト重なる場合（タンパク質同士が近距離で相互作用する場合）、光分子が検出する蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）法などが挙げられる。
【００３０】
図３は、Ｃａｖｉｎ−３とＲＯＲ１との結合を標的としたスクリーニングキットの実施形態の一例を示す図で、ＧＳＴ−ＲＯＲ１およびＨｉｓ−Ｃａｖｉｎ−３のリコンビナント精製タンパク質を用いたアルファスクリーン（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）技術を用いた例を示している。アルファスクリーン技術とは、ドナービーズ及びアクセプタービーズを含み、両ビーズの上に捕捉された分子同士の結合により、ビーズの一方からもう一方にエネルギーの伝達が起き（一重項酸素の発生）、蛍光シグナルが発生する原理を用いている。ＲＯＲ１タンパク質をドナービーズ又はアクセプタービーズの一方に結合し、Ｃａｖｉｎ−３タンパク質をドナービーズ又はアクセプタービーズの他方に結合しておく。そして、両ビーズを試験化合物と混合することで、試験化合物がＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ−３の結合を抑制する場合は、蛍光輝度の変化として測定することができる。
【００３１】
ドナービーズおよびアクセプタービーズについて、より具体的に説明する。ドナービーズには、光感受性物質が含まれ、レーザー光等の光照射によって励起され、周囲の酸素分子を一重項状態に変換する。光感受性物質としては、例えば、ポルフィリン類、フタロシアニン類、塩素類、テトラフェニルポルフィリン類、ベンゾルポルフィリン誘導体類、プルプリン類、フェオフォルバイド類及びその金属錯体類等が挙げられるが、周囲の酸素分子を一重項状態に変換できれば、他の物質でもよい。アクセプタービーズには、一重項酸素と反応し発光する化学発光伝達物質が含まれている。化学発光伝達物質としては、例えば、チオキサン、等が挙げられるが、一重項酸素と反応し発光できるものであれば、他の物質でもよい。ビーズを形成する材料は、光感受性物質、化学発光伝達物質を分散することができれば特に制限はなく、バイオ分野で一般的に用いられているポリマー等を用いればよい。ドナービーズおよびアクセプタービーズの具体例は、株式会社パーキンエルマージャパン社の「Ａｌｐｈａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ユーザーガイド」を参照すればよい。
【００３２】
なお、図３に示す例では、グルタチオンコートドナービーズに結合しやすくするために、ＲＯＲ１としてグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＧＳＴ）とのリコンビナントタンパク質が用いられているが、ビーズの種類（ビーズ表面のコート材料の種類）に応じてＧＳＴを用いずに直接固定、又は、他のタンパク質タグを用いてもよい。他のタンパク質タグとしては、ニッケルなどの金属イオンと結合し易いヒスチジン（Ｈｉｓ）の他、ＨＡ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、ＤＩＧ、ＦＩＴＣ、Ｖ５、ＧＦＰ、ＭＢＰ等が挙げられる。さらに、ビオチン−ストレプトアビジンの反応を用いた系で固定してもよい。Ｃａｖｉｎ−３についてもＲＯＲ１と同様、ヒスチジンを用いずに直接固定、又は、他のタンパク質タグを用いてもよい。
【００３３】
また、タンパク質へのタグ付加法を用いない、タンパク質そのものを抗体で捕獲（キャプチャー）する方法もある。例えば、ＲＯＲ１およびＣａｖｉｎ−３と反応する抗ＲＯＲ１抗体および抗Ｃａｖｉｎ−３抗体を用い、光感受性物質と化学発光伝達物質を含むビーズとしてプロテインＡやプロテインＧ、あるいはプロテインＬを用いて、各種二次抗体（ヒト、マウス、ラビット、羊、ウシ、チキンなど）を使用することで、アルファスクリーン系を構築することが可能である。上記スクリーニングキットを用いることで、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合を抑制する化合物のスクリーニングを簡単に行うことができる。
【００３４】
上記のとおり、スクリーニングキットの実施形態の一例としては、ＲＯＲ１タンパク質及びＣａｖｉｎ−３タンパク質、並びに、両タンパク質の少なくとも一方を固定するための、金属膜、金属ナノ粒子、ビーズ等の担体を少なくとも含めば良い。そして、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合の抑制の検出方法に応じて、適宜、リコンビナントタンパク質や抗体を用いたり、担体の選択をすればよい。
【００３５】
また、後述する実施例で示すとおり、本発明では、Ｃａｖｉｎ−３と結合するＲＯＲ１の結合部位が、ＲＯＲ１の細胞内領域（ＲＯＲ１−ＩＣＤ：アミノ酸配列４２８〜９３７番）の内、キナーゼドメイン内の４７３〜５６４番のアミノ酸領域であることを新たに特定した。Ｃａｖｉｎ−３はＲＯＲ１の細胞内領域に結合することから、ＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列の内、少なくともアミノ酸配列４７３〜５６４番のアミノ酸領域及びＣａｖｉｎ−３が発現している細胞を作製し、発現しているタンパク質同士の結合を細胞内で蛍光輝度として検出できる系を構築することで、スクリーニングキットの他の実施形態とすることもできる。
【００３６】
ＲＯＲ１の４７３〜５６４番のアミノ酸領域及びＣａｖｉｎ−３の両方が発現している細胞は、次の手順で作製することができる。
（１）ＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８〜９３７番の内、少なくとも４７３〜５６４番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクターを作製する。
（２）ヒトＣａｖｉｎ−３のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクターを作製する。
（３）細胞に、（１）及び（２）のベクターを導入して形質転換体を作製する。組み換えベクターの作製及び細胞への組み換えベクターの導入は、公知の方法で行えばよい。また、細胞としては、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞等を用いることができる。
（４）これらの細胞を用いて（１）および（２）の組み換えベクターを導入した形質転換体として恒常的に発現することができる細胞株を作製する。
【００３７】
次いで、例えば、Ｉｍａｇｅ−ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｆｌｕｏｐｐｉ）、Ｆｌｕｏ−ｃｈａｓｅ等、発現しているタンパク質同士の結合を細胞内で蛍光輝度として検出できる公知のキットに上記の形質転換体を用いることで、スクリーニングキットを作製することができる。発現しているＲＯＲ１のＣａｖｉｎ−３への結合部位とＣａｖｉｎ−３が結合する時には蛍光輝度（ｆｏｃｉ：ドット状の構造物）として検出することができ、試験化合物がＲＯＲ１の結合部位とＣａｖｉｎ−３が結合することを抑制できるときには蛍光輝度として検出しないことで、試験化合物の選択を簡単に行うことができる。
【００３８】
なお、一般的に、Ｉｍａｇｅ−ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓに膜タンパク質（例えばＲＯＲ１タンパク質など）や細胞内で通常ドット状に局在、或いは、散在するするタンパク質（例えばＣａｖｉｎ−３タンパク質など）等を組み込む場合、当該タンパク質をコードする核酸の全長をベクターに組み込むと検出系が安定しないと言われている。ＲＯＲ１がＣａｖｉｎ−３と結合する領域が細胞内領域の部分であることが判明したため、上記手順では、ＲＯＲ１の細胞外領域部分であるアミノ酸配列１〜４２７番部分を組み込んでいない。しかしながら、検出系が安定する範囲内であれば、細胞外領域部分のアミノ酸配列をコードする核酸部分についてもベクターに組み込んでもよい。その他の検出方法としては、免疫沈降法、酵母ツーハイブリッドシステム、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、表面プラズモン共鳴法を利用した方法などを用いることもできる。なお、上記のスクリーニング方法の実施形態は、試験化合物を実際に接触させる実施形態を示しているが、試験化合物を接触させる工程は、インシリコで実施してもよい。後述する実施例のとおり、Ｃａｖｉｎ−３タンパク質と結合するＲＯＲ１タンパク質の結合部位が判明した。そのため、スクリーニング方法は、ＲＯＲ１タンパク質及びＣａｖｉｎ−３タンパク質の立体構造に基づき、ＲＯＲ１タンパク質及びＣａｖｉｎ−３タンパク質の結合を抑制する試験化合物をインシリコで接触（計算）し、結合を抑制する化合物を選択する実施形態としてもよい。
【００３９】
また、分子標的薬の適応患者の選択方法は、被検体から癌細胞サンプルを取得し、サンプル中の、ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ−３の発現を測定することで、上記癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法でスクリーニングされた化合物の適応患者の選択をすることができる。発現は、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡの発現の何れであってもよい。
【００４０】
サンプル中の、ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ−３の発現は、ＥＬＩＳＡ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法、ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ法等、公知の方法を用いればよい。
【００４１】
以下に実施例を掲げ、実施形態を具体的に説明するが、本願で開示する発明の範囲を限定、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【００４２】
＜材料と方法＞
（１）細胞株と試薬
ヒト肺腺癌細胞株、ＮＣＩ−Ｈ１９７５（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ−５９０８）、および、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ−１６５１）細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入した。ＰＣ−９細胞株（ＲＣＢ４４５５）は、ＲＩＫＥＮのＣｅｌｌ  Ｂａｎｋより入手した。ＳＫ−ＬＵ−１細胞株は、Ｌｌｏｙｄ  Ｊ．Ｏｌｄ（メモリアル・スローン・ケタリング癌センター）から提供を受けた。そして、これらの細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により維持した。【００４３】
組換えＩＧＦ−Ｉは、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社から入手した。組み換えＥＧＦは、Ｓｉｇｍａ社から入手した。【００４４】
下記抗体は、各々下記会社から購入した。
・ａｎｔｉ−ＲＯＲ１（ウェスタンブロッティング用）は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。
・ａｎｔｉ−ＲＯＲ１（免疫沈降用）は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社から購入した。
・ａｎｔｉ−ＲＯＲ１（細胞染色用）は、ａｂｃａｍ社から購入した。
・ａｎｔｉ−Ｃａｖｉｎ−１、ａｎｔｉ−Ｃａｖｉｎ−２はａｂｃａｍ社から購入した。
・ａｎｔｉ−Ｃａｖｉｎ−３は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。
・ａｎｔｉ−α−ｔｕｂｕｌｉｎは、Ｓｉｇｍａ社から購入した。
・ａｎｔｉ−ＣＡＶ１は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。
・ａｎｔｉ−ＧＳＴは、ＭＢＬ社から購入した。
・ａｎｔｉ−ＡＫＴ、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。
・ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ、及びａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧは、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。
・ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧは、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社から購入した。【００４５】
（２）コンストラクト
ヒトＲＯＲ１全長ｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）はｐＣＭＶ−ｐｕｒｏベクターに挿入した。そして得られたコンストラクト（ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１）のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の配列を正確に確認した。ヒトＣａｖｉｎ−３全長ｃＤＮＡ（かずさＤＮＡ研究所）はｐＣＭＶ−ｐｕｒｏベクターに挿入した。そして得られたコンストラクト（ｐＣＭＶｐｕｒｏ−Ｃａｖｉｎ−３）のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の配列を正確に確認した。また、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＴＫΔ４７３−５６４（ＴＫΔ１）、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＴＫΔ５６４−６５５（ＴＫΔ２）、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＴＫΔ６５５−７４６（ＴＫΔ３）、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−Δ７４８−７８２（ΔＳ／Ｔ１）、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−Δ７８４−８５１（ΔＰ）、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−Δ８５３−８７６（ΔＳ／Ｔ２）については、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行い、作製した。【００４６】
以下に、各々の作製に用いたプライマーを示す。
・ＲＯＲ１−ＴＫΔ１−Ｆ：５’−ＣＧＧＴＣＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＣＴＣＴＣＡＡＧＴＣ−３’（配列番号：１）、
・ＲＯＲ１−ＴＫΔ１−Ｒ：５’−ＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＴＡＧＣＣ−３’（配列番号：２）、
・ＲＯＲ１−ＴＫΔ２−Ｆ：５’−ＡＴＣＡＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＡＣＡＣＴＣＴＧＡＴＧ−３’（配列番号：３）、
・ＲＯＲ１−ＴＫΔ２−Ｒ：５’−ＧＡＧＧＡＡＣＴＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＣＣＣＣＴＧＡ−３’（配列番号：４）、
・ＲＯＲ１−ＴＫΔ３−Ｆ：５’−ＡＴＴＣＧＣＴＧＧＡＴＧＣＣＣＣＣＴＧＡＡＧＣＣＡ−３’（配列番号：５）、
・ＲＯＲ１−ＴＫΔ３−Ｒ：５’−ＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴＴＡＣＴＣＴＧＧＡＣＣ−３’（配列番号：６）、
・ＲＯＲ１−ΔＳ／Ｔ１−Ｆ：５’−ＡＡＣＣＣＣＡＧＡＴＡＴＣＣＴＡＡＴＴＡＣＡＴＧＴ−３’（配列番号：７）、
・ＲＯＲ１−ΔＳ／Ｔ１−Ｒ：５’−ＣＣＧＡＡＧＣＣＧＧＡＣＧＴＧＡＡＴＡＴＣＴＴＴＡ−３’（配列番号：８）、
・ＲＯＲ１−ΔＰ−Ｆ：５’−ＡＡＧＡＧＴＣＧＧＴＣＣＣＣＡＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡ−３’（配列番号：９）、
・ＲＯＲ１−ΔＰ−Ｒ：５’−ＧＴＴＡＣＴＧＡＧＡＴＴＡＣＴＣＡＣＴＧＧＧＣＴＧ−３’（配列番号：１０）、
・ＲＯＲ１−ΔＳ／Ｔ２−Ｆ：５’−ＡＡＴＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣＣＴＴＴＡＣ−３’（配列番号：１１）、
・ＲＯＲ１−ΔＳ／Ｔ２−Ｒ：５’−ＣＴＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＡＡＴＣ−３’（配列番号：１２）。【００４７】
（３）ウェスタンブロッティング分析、及び免疫沈降−ウェスタンブロッティング分析（ＩＰ−ＷＢ分析）
ウェスタンブロッティング分析、及び免疫沈降−ウェスタンブロッティング分析は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）及び化学発光増強システム（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、標準的な方法により施行した。ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合部位を特定するために、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−Ｃａｖｉｎ−３−ＷＴ、とともに、ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ（ＷＴ）、ＴＫΔ４７３−５６４（ＴＫΔ１）、ＴＫΔ５６４−６５５（ＴＫΔ２）、ＴＫΔ６５５−７４６（ＴＫΔ３）、Δ７４８−７８２（ΔＳ／Ｔ１）、Δ７８４−８５１（ΔＰ）、Δ８５３−８７６（ΔＳ／Ｔ２）、といった様々なＲＯＲ１発現コンストラクトと一緒に共発現を行った。これらはＣＯＳ−７細胞を用いて、ＦｕＧｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によるトランスフェクション後２４時間で細胞を回収し、免疫沈降−ウェスタンブロッティング分析を行った。【００４８】
またＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１、２、３との結合を確認するため、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５及びＳＫ−ＬＵ−１細胞株を用いて、オクチルグルコシド含有のｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、６０ｍＭ  Ｏｃｔｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）で細胞を懸濁した後、免疫沈降−ウェスタンブロッティング分析を行った。【００４９】
（４）ヒトＲＯＲ１およびヒトＣａｖｉｎ−３に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
ＲＮＡｉを行うため、下記ＲＮＡオリゴマーをＱＩＡＧＥＮ社及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した。
・５’−ＣＡＧＣＡＡＵＧＧＡＵＧＧＡＡＵＵＵＣＡＡ−３’：ｓｉＲＯＲ１＃１（配列番号：１３）、
・５’−ＣＣＣＡＧＵＧＡＧＵＡＡＵＣＵＣＡＧＵ−３’：ｓｉＲＯＲ１＃２（配列番号：１４）、
・５’−ＣＵＣＵＧＡＧＵＣＧＣＡＧＣＣＡＣＧＡ−３’：ｓｉＣａｖｉｎ−３＃１（配列番号：１５）。
また、コントロールとして、ＡｌｌＳｔａｒｓ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ＃１）はＱＩＡＧＥＮ社から入手した。【００５０】
ｓｉＲＮＡ（各々２０ｎＭ）のトランスフェクションは、リポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、そのメーカーの使用説明書に従って行った。そして、細胞は、ウェスタンブロッティング分析のため、トランスフェクションをしてから３日後に回収した。細胞増殖への影響については、トランスフェクションをしてから５日後にＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学社製）を用いて測定を行った。【００５１】
（５）Ｃａｖｉｎ−３結合部位を欠損したｓｉＲＯＲ１抵抗性のＲＯＲ１変異体の作成
ｓｉＲＯＲ１＃２に抵抗性を持ったｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＷＴｍ（ｓｉＲＯＲ１＃２）やｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍ（ｓｉＲＯＲ１＃２）については、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行い、作製した。作製にはアミノ酸の置換を伴わない、
・５’−ＣＣＣＧＧＴＡＡＧＣＡＡＣＣＴＡＡＧＣ−３’（ｓｉＲＯＲ１＃２）（配列番号：１６）、
のプライマーを用いた。【００５２】
野生型のＲＯＲ１（ＲＯＲ１−ＷＴ）、あるいはｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持った野生型のＲＯＲ１（ＲＯＲ１−ＷＴｍ）、またはｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持ったＣａｖｉｎ−３の結合部位を欠失したＲＯＲ１（ＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍ）をＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞にトランスフェクションを行い、２４時間後、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎでセレクション（１．０μｇ／ｍｌ）を行った上で、シングルクローンを採取し、それぞれのＲＯＲ１を発現したｓｔａｂｌｅ  ｃｌｏｎｅ（恒常的ＲＯＲ１発現細胞株）を作製した。これらのｓｔａｂｌｅ  ｃｌｏｎｅは、その後、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌあるいはｓｉＲＯＲ１で処理の後、ショ糖濃度勾配遠心法や細胞染色法、電子顕微鏡解析、リガンド刺激によるウェスタンブロッティング分析を行った。【００５３】
（６）免疫細胞染色法
肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株を、カバーガラスを敷いた６−ｗｅｌｌプレートで培養し、培養液を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、３．７％ホルムアルデヒドを含んだＰＢＳで室温固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含んだＰＢＳで透過処理を行った。非特異結合を防ぐために１．０％ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含むＰＢＳで３０分間静置させた後、１．０％ＢＳＡを含んだＰＢＳで希釈した１次抗体で１時間、特異的なＡｌｅｘａ  ｄｙｅｓが共役された２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１時間反応させ、ＰＢＳで洗浄後、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社製）でスライドガラス上にマウントし、共焦点レーザー顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社製）を用いて細胞内のＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の局在を観察した。また、ｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持った野生型のＲＯＲ１（ＲＯＲ１−ＷＴｍ）あるいはｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持ったＣａｖｉｎ−３の結合部位を欠失したＲＯＲ１（ＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍ）を恒常的に発現させたＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞については、細胞を播種した次の日に、ｓｉＲＯＲ１処理を行った。トランスフェクション後２４時間で室温固定し、同様にプレパラートを作製し、ＣＡＶ１やｃａｖｉｎ−１、ｃａｖｉｎ−３の細胞内局在について共焦点レーザー顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社製）を用いて観察した。【００５４】
（７）超薄切片法を用いた電子顕微鏡解析によるＲＯＲ１−ＷＴｍおよびＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍの発現細胞でのカベオラ形成への影響ついての検討
培養ディッシュ内に細かく刻んだガラスを敷き、その上でＲＯＲ１−ＷＴｍおよびＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍの恒常的発現細胞（ＮＣＩ−Ｈ１９７５）を培養し、ｓｉＲＯＲ１のトランスフェクションを行った。トランスフェクション後７２時間で各々の細胞は、２％ホルムアルデヒド、２．５％グルタルアルデヒド、０．１Ｍのｓｏｄｉｕｍ  ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で２時間以上固定し、その後、１％のｏｓｍｉｕｍ  ｔｅｔｒｏｘｉｄｅと０．１％ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅで処理を行った。超薄切片はＪＥＯＬ  ＪＥＭ１０１１電子顕微鏡を用いて観察した。また、細胞膜におけるカベオラ分布密度計測については、電子顕微鏡下でランダムに選択した領域（ＷＴｍ；ｎ＝２１、ＴＫΔ１ｍ；ｎ＝２１、ただし、ｎとは細胞膜の１００マイクロメートルのランダムな細胞膜上の領域）を測定し、それぞれの電子顕微鏡写真の細胞膜の領域は、ＩｍａｇｅＪを用いて測定した。【００５５】
（８）ＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ  ａｓｓａｙ法
肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５を用いて、オクチルグルコシド含有のｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、６０ｍＭ  Ｏｃｔｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）で懸濁し、その細胞抽出液に対して、昆虫細胞Ｓｆ９で精製したリコンビナント精製タンパク質であるＧＳＴ、ＧＳＴ−ＲＯＲ１、ＧＳＴ−Ｃａｖｉｎ−３を各々添加しインキュベーションさせた後、グルタチオンセファロースビーズ（ＧＥヘルスヘア・ジャパン社製）を加えてプルダウンさせ、沈降物に対してＳＤＳサンプルバッファーで処理し、ウェスタンブロッティング分析を行った。また、アルファスクリーン（ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）のための、ＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ  ａｓｓａｙでは、昆虫細胞Ｓｆ９で精製したリコンビナント精製タンパク質であるＧＳＴ、ＧＳＴ−ＲＯＲ１、ＧＳＴ−Ｃａｖｉｎ−３をそれぞれの組み合わせで混合し、同様にインキュベーションさせた後、グルタチオンセファロースビーズ（ＧＥヘルスヘア・ジャパン社製）を加えてプルダウンさせ、沈降物に対してＳＤＳサンプルバッファーで処理し、ウェスタンブロッティング分析を行った。【００５６】
（９）ショ糖濃度勾配遠心法
ＲＯＲ１−ＷＴｍ及びＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍの発現細胞株を１０ｃｍ  ｄｉｓｈに１×１０６個播種し、次の日にｓｉＲＯＲ１処理を行い、２４時間後にＴＮ  ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＮａＨＳＯ３、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えたｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒにそれぞれ懸濁させた。この可溶化液を氷上で３０分静置させた後、１ｍｌのＴＮ  Ｂｕｆｆｅｒで溶解した８０％スクロースと混和させ、遠心用チューブ（Ｕｌｔｒａ  Ｃｌｅａｒ，  Ｂｅｃｋｍａｎ社製）に移した。その上に、５．５ｍｌの３０％スクロースと３．５ｍｌの５％スクロース溶液を重層し、ＳＷ４１Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて、２００，０００ｇで４℃、２２時間、超遠心を行った。その後、それぞれの試料を１１サンプルごとに分画し、アセトン沈殿の後、ＳＤＳサンプルバッファーで処理し、ウェスタンブロッティング分析を行った。【００５７】
（１０）ＲＯＲ１−ＷＴｍおよびＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍの発現細胞でのリガンド刺激による生存シグナルへの影響の検討
ＲＯＲ１−ＷＴｍおよびＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍの発現細胞でのリガンド刺激によるＡＫＴのリン酸化（活性化）への影響を検討するために、ＲＯＲ１−ＷＴ、ＲＯＲ１−ＷＴｍおよびＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍの発現細胞は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ、ｓｉＲＯＲ１のトランスフェクション後２４時間で培養液を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ：ウシ胎児血清）を含まない培養液に置換し、さらに２４時間培養し、その後、２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉ、ＥＧＦで３０分処理したのち、細胞を回収し、ウェスタンブロッティング分析を行った。【００５８】
［実施例１］
＜肺腺癌細胞株でのＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合に関する検証＞
上記（３）に記載の方法で、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５、及びＳＫ−ＬＵ−１細胞株を用いた免疫沈降法による検討を行った。図４Ａ及び図４Ｂに示すように、内因性のＲＯＲ１と内因性のＣａｖｉｎ−３が結合することが分かった。ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の相互作用についてはこれまで報告はなく、新しい知見といえる。また今回の検証において、特許文献３及び非特許文献６において検証された、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１の結合に関しても確認できた。さらに本検証によって、カベオラの生理的機能に深く関わるとされるＣａｖｉｎ  ｆａｍｉｌｙ（Ｃａｖｉｎ−１、Ｃａｖｉｎ−２、Ｃａｖｉｎ−３）のうち、ＲＯＲ１はＣａｖｉｎ−１およびＣａｖｉｎ−３とは結合するが、Ｃａｖｉｎ−２とは結合しないという、相互作用の特異性があることが判明した。【００５９】
次に、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合について詳細に検討を行うために、上記（８）に記載の方法で、各々の精製タンパク質を用いたＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ  ａｓｓａｙによる検討を行った。図４Ｃ及び図４Ｄに示すように、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３は、タンパク質同士の相互作用が認められることが明らかとなった。以上のことから、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１の結合に関しては、特許文献３及び非特許文献６においてカベオラの形成に関わることが示されたが、今回の検証から、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合が肺腺癌細胞において何らかの生理機能を担っている可能性を示唆する結果が得られた。【００６０】
［実施例２］
＜肺腺癌細胞でのＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の細胞内局在に関する検討＞
［実施例１］の検討から、肺腺癌細胞においてＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３が結合することが判明したため、上記（６）に記載の方法で、細胞内での両者の局在について免疫細胞染色法を用いて検討を行った。図５Ａ乃至Ｄは、共焦点レーザー顕微鏡において、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３が共局在することを免疫細胞染色法によって分析した結果を示す写真である。図５Ａは内因性のＲＯＲ１の細胞内局在を示しており、図５Ｂは内因性のＣａｖｉｎ−３の細胞内局在を示している。また、図５ＣはＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３をマージした写真で、図５Ｄは図５Ｃの長方形で囲った部分を拡大した写真である。図５Ｃ及び図５Ｄに示すように、内因性のＲＯＲ１と内因性のＣａｖｉｎ−３は、細胞内および細胞膜で一部共局在していることが明らかとなった。さらに、Ｃａｖｉｎ−３はカベオラの生理機能に関わっていることから、細胞膜においてＣＡＶ１とともに濃縮して局在していることも分かっているが、そのカベオラが濃縮している部分（拡大領域）においてもＲＯＲ１と非常に顕著に共局在していることが判明した。【００６１】
［実施例３］
＜Ｃａｖｉｎ−３によるＲＯＲ１の結合領域の同定に関する検討＞
［実施例１］および［実施例２］の検討から、肺腺癌細胞においてＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３は結合し、細胞内で共局在していることが分かった。そこで、次にＣａｖｉｎ−３によるＲＯＲ１の結合領域の同定を、上記（２）に記載の方法で、様々なＲＯＲ１の機能ドメイン領域を欠損させた欠損変異体を作製し、上記（３）に記載の方法で、免疫沈降法によってＣａｖｉｎ−３の結合領域の特定を行った。図６Ａは、ＲＯＲ１のキナーゼドメイン、２箇所のセリン・スレオニンリッチドメイン、プロリンリッチドメインのそれぞれの欠損変異体の模式図を示している。また、図６Ｂは、図面代用写真で、Ｃａｖｉｎ−３がＲＯＲ１のキナーゼドメイン内で結合していることを免疫沈降法およびウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図６Ａ及び図６Ｂに示すとおり、Ｃａｖｉｎ−３はＲＯＲ１のキナーゼドメイン内のＮ末側の３分の１の領域（４７３アミノ酸から５６４アミノ酸）と結合することが判明した。特許文献３及び非特許文献６に記載のとおり、ＲＯＲ１はカベオラ関連分子であるＣａｖｉｎ−１やＣＡＶ１と結合することが分かっているが、それらが結合する領域は、ＲＯＲ１のキナーゼドメイン内のＣ末側の３分の２の領域やＲＯＲ１のＣ末側に存在するセリン・スレオニンリッチ領域であり、Ｃａｖｉｎ−３が結合する部位とは全く別の領域であることも今回の検証から明らかとなった。さらに、Ｃａｖｉｎ−３によるＲＯＲ１の結合領域が特定できたことから、この結合領域をターゲットとした、タンパク質−タンパク質間の相互作用を標的とした低分子化合物等のハイスループットスクリーニングができる可能性が示唆される。なお、上記特許文献３では、Ｃａｖｉｎ−１の結合領域部分を含む形質転換体、組み換えベクター、化合物のスクリーニングキットの具体的な実施例を開示している。Ｃａｖｉｎ−３とＲＯＲ１の結合を特異的に抑制する化合物のスクリーニングキットも、特許文献３と同様に作製すればよい。【００６２】
［実施例４］
＜肺腺癌細胞株でのＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合がＣａｖｉｎ−３の細胞内での適切な局在化及びカベオラ形成に与える影響の検討＞
肺腺癌細胞においてＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合が与える影響について詳細に検討を行うために、肺腺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９７５を用いて、内因性のＲＯＲ１の発現を抑制させ、新たにＣａｖｉｎ−３の結合領域を欠損させたＲＯＲ１を発現させるという、細胞内での再構築系の実験系を構築した。具体的には、上記（５）に記載の方法で、ＲＯＲ１−ＷＴｍ（ｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持った野生型のＲＯＲ１）、ＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍ（ｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持ったＣａｖｉｎ−３の結合領域を欠損したＲＯＲ１）を恒常的に発現させた肺腺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９７５を樹立した。これらの樹立した細胞株はｓｉＲＯＲ１処理を行うことで、もともとＮＣＩ−Ｈ１９７５に存在する内因性のＲＯＲ１を消失させ、新たに野生型のＲＯＲ１、あるいはＣａｖｉｎ−３の結合領域を欠損したＲＯＲ１を発現させることができる。そのため、両者を比較することで、肺腺癌細胞株でのＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合が与える重要な生理的機能を明らかにすることが可能となる。そこで、まずこれらの樹立した細胞株を用いて、Ｃａｖｉｎ−３のカベオラへの局在変化について、上記（９）に記載のショ糖濃度勾配遠心法、及び、上記（６）に記載の免疫細胞染色法を用いて検討を行った。【００６３】
図７Ａは、ショ糖濃度勾配遠心法によるＣａｖｉｎ−３の局在変化をウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。ＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍを発現した細胞株では、ＲＯＲ１−ＷＴｍを発現した細胞株と比較して、カベオラを含む不溶性画分（Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ：ＤＲＭ、６および７画分）でのＣａｖｉｎ−３の消失が認められた。また、カベオラ構成分子であるＣＡＶ１の発現には影響が認められなかった。【００６４】
図７Ｂは、免疫細胞染色法による分析した結果を示す写真である。ＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍを発現した細胞株では、ＲＯＲ１−ＷＴｍを発現した細胞株と比べて、Ｃａｖｉｎ−３の細胞内の局在に大きな変化が認められた。具体的には、ＲＯＲ１−ＷＴｍを発現した細胞株では、ドット状に細胞質および細胞膜に局在しているのに対して、ＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍを発現した細胞株では、細胞質の中央に集積している様相を呈し、明らかに異なる局在を示していた。しかしながら、カベオラ関連分子であるＣＡＶ１やＣａｖｉｎ−１の細胞内局在には変化が見られなかった。以上のことから、肺腺癌細胞においてＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合は、Ｃａｖｉｎ−３のＣＡＶ１を含むカベオラへの適切な局在化、配置化に必要であることが判明した。【００６５】
次に、上記（７）に記載の方法により、電子顕微鏡を用いて実際に、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合がカベオラ形成に影響を与えるかどうかについて検討を行った。図７Ｃは、超薄切片法により電子顕微鏡によって撮像した写真である。細胞膜の１００マイクロメートルのランダムな細胞膜上の領域にどれだけのカベオラが形成されているか解析を行ったところ、ＲＯＲ１−ＷＴｍを発現した細胞株とＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍを発現した細胞株、どちらにおいてもカベオラの形成は認められた。図７Ｄは、解析した結果を示すグラフである（平均値±標準偏差（ＷＴｍ；ｎ＝２１、ＴＫΔ１ｍ；ｎ＝２１、ただし、ｎとは細胞膜の１００マイクロメートルのランダムな細胞膜上の領域である。））。図７Ｃ及びＤに示すとおり、カベオラ形成数についても有意な差は認められなかった。以上の結果から、ＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍを発現した細胞株では、肺腺癌細胞におけるＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合はカベオラ形成には影響を及ぼさないことが判明した。【００６６】
［実施例５］
＜肺腺癌細胞株でのＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合が与えるリガンド刺激による生存シグナルへの影響の検討＞
実施例１〜４の検討から、肺腺癌細胞株においてＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３は結合・共局在し、Ｃａｖｉｎ−３の適切な局在化に重要であるが、カベオラ形成には関与しないことを見出した。特許文献３及び非特許文献６においては、ＲＯＲ１がＣＡＶ１やＣａｖｉｎ−１と相互作用し、カベオラ形成に寄与することで、カベオラに集積する様々な受容体の活性化に重要であることを明らかにしてきた。しかしながら、これらの受容体の活性化に伴って、どのように生存シグナルが伝達されているのかについての詳細な分子機序については全く理解されていない。そこで、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合が肺腺癌細胞の生存に関与するのかどうかについて、上記（１０）に記載の方法により、検討を行った。同様にＲＯＲ１−ＷＴやＲＯＲ１−ＷＴｍあるいは、ＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍを発現した細胞株を用いて、ＩＧＦ−ＩやＥＧＦなどのリガンド刺激を行った際のＡＫＴのリン酸化（活性化）を解析した。【００６７】
図８Ａは、ｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持たないＲＯＲ１の野生型（ＷＴ）、ｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持ったＲＯＲ１の野生型（ＷＴｍ）、及び、Ｃａｖｉｎ−３の結合部位を欠損させたＲＯＲ１（ＴＫΔ１ｍ）をＮＣＩ−Ｈ１９７５肺腺癌細胞株に発現させ、ｓｉＲＯＲ１処理を行うことで細胞内のＲＯＲ１をＷＴｍ又はＴＫΔ１ｍに置換させ、そして、ＩＧＦ−Ｉ刺激によるＡＫＴのリン酸化（活性化）をウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図８Ａから明らかなように、ＩＧＦ−Ｉ刺激によるＡＫＴのリン酸化は、ＲＯＲ１−ＷＴを発現した細胞株では低下し、ＲＯＲ１−ＷＴｍを発現した細胞株ではＡＫＴのリン酸化の低下が回復することを確認した。しかしながら、ＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍを発現した細胞株では、ＲＯＲ１−ＷＴを発現した細胞株と同様に、顕著にＡＫＴのリン酸化の低下が認められた。またコントロールとしてのｓｉＣｏｎｔｒｏｌ処理では、すべての発現細胞株においてＩＧＦ−Ｉ刺激によるＡＫＴのリン酸化の上昇が認められた。【００６８】
図８Ｂは、ＩＧＦ−Ｉ刺激に換え、ＥＧＦ刺激によるＡＫＴのリン酸化（活性化）をウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図８Ｂから明らかなように、ＥＧＦ刺激によるＡＫＴのリン酸化についても、ＲＯＲ１−ＷＴを発現した細胞株では低下し、ＲＯＲ１−ＷＴｍを発現した細胞株ではＡＫＴのリン酸化の低下が回復することを確認した。しかしながら、ＲＯＲ１−ＴＫΔ１ｍを発現した細胞株では、ＲＯＲ１−ＷＴを発現した細胞株と同様に、顕著にＡＫＴのリン酸化の低下が認められた。またコントロールとしてのｓｉＣｏｎｔｒｏｌ処理では、すべての発現細胞株においてＥＧＦ刺激によるＡＫＴのリン酸化の上昇が認められた。【００６９】
以上の結果から、肺腺癌細胞株におけるＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合は、リガンド刺激によるＡＫＴによる生存シグナルを制御する非常に重要な相互作用であることが判明した。【００７０】
［実施例６］
＜肺腺癌細胞株におけるＣａｖｉｎ−３発現抑制による細胞増殖への影響の検討＞
［実施例５］において、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合は、ＩＧＦ−ＩやＥＧＦなどのリガンド刺激によるＡＫＴによる生存シグナルを制御する必要不可欠な結合であることが分かった。Ｃａｖｉｎ−３は別名ＰＲＫＣＤＢＰとも言われ、ＰＫＣδ結合タンパク質として同定された細胞内タンパク質である。近年になりカベオラの生理機能に関与する分子であることが分かってきた。そこで、実際に肺腺癌細胞株においてＣａｖｉｎ−３が生存に関わっているかどうかを、上記（４）に記載の方法により検討した。【００７１】
図９Ａの上段は、肺腺癌細胞株であるＰＣ−９を用いた際のウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真、図９Ａの下段は、ＭＴＴ  ａｓｓａｙによる細胞増殖への影響を示したグラフである。図９Ａから明らかなように、ＲＮＡ干渉法によって細胞内のＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の発現を抑制させたところ、ＲＯＲ１の発現を抑制させた時と同様に有意な細胞増殖の低下が認められた。図９Ｂは、ＰＣ−９に換え、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５を用いた時の結果を示している。ＮＣＩ−Ｈ１９７５において、ＲＮＡ干渉法によって細胞内のＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の発現を抑制させたところ、ＲＯＲ１の発現を抑制させた時と同様に有意な細胞増殖の低下が認められた。なお、肺腺癌細胞株であるＰＣ−９及びＮＣＩ−Ｈ１９７５におけるＲＯＲ１抑制による細胞増殖の低下については、既に特許文献３及び非特許文献６において示している。【００７２】
以上のことから、肺腺癌細胞においてＣａｖｉｎ−３はＲＯＲ１と同様に生存に関与していることが判明した。このことは、［実施例５］において証明した、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合の生存シグナルへの重要性の結果を支持するものである。【００７３】
［実施例７］
＜ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合を標的とし、その結合を阻害するための阻害剤スクリーニング法＞
［実施例１］乃至［実施例６］の検討から、肺腺癌細胞においてＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合は、ＡＫＴによる生存シグナルを制御する非常に重要な相互作用であることから、この両者のタンパク質同士の結合を阻害することが出来れば、ＲＯＲ１陽性およびＣａｖｉｎ−３陽性の肺腺癌細胞の細胞増殖を特異的に抑えることができ、死滅させることが可能となる。そこで、分子間相互作用をマイクロプレートフォーマットで検出するビーズベースの高感度かつ低バックグラウンドを示すＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を利用して、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合を標的としたスクリーニング系を構築した。スクリーニング系の概略は図２に示すとおりで、具体的には、グルタチオンコートされたドナービーズには、ＧＳＴ−ＲＯＲ１タンパク質を結合させ、ニッケルキレートのアクセプタービーズにはＨｉｓ−Ｃａｖｉｎ−３タンパク質を結合させた。これらタンパク質を吸着させた各々のビーズは１つのウェルで混合し、それぞれの中に様々な低分子化合物を添加させることで、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−３の結合を阻害する阻害剤を見つけ出すことが可能となる。このスクリーニング系を用いることで、低コストかつ簡便に一度に多くの低分子化合物を反応させることができるため、網羅的なハイスループットスクリーニングが実現できる。実際にアルファスクリーンで使用するＧＳＴ−ＲＯＲ１とＨｉｓ−Ｃａｖｉｎ−３の結合について、上記（８）に記載したＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ  ａｓｓａｙ法を用いて、両者の結合を調べた。図１０は、ウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図１０に示すように、Ｈｉｓ−Ｃａｖｉｎ−３はＧＳＴとは結合せず、ＧＳＴ−ＲＯＲ１と結合することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法により、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制できる化合物を探索できる可能性が有る。したがって、副作用等の少ない画期的な医薬品開発が可能である。したがって、分子標的薬に効果がある患者のみに医薬品を処方できるので、医療機関における副作用の少ない癌治療に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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