(57)【要約】  本発明の単核球分離装置は、血液試料が貯留した容器100の底面から遠心分離媒体を注入する注入手段210と、遠心分離媒体と血液試料とが底面側からこの順にて積層されている容器100を遠心分離させる遠心分離手段300と、遠心分離後に単核球層に存在する凝血塊を検出する検出手段400と、検出された凝血塊を除去する除去手段220と、単核球を採取する採取手段230と、を有する。また本発明の単核球分離方法は、本発明の単核球分離装置の各部構成要素に対応する、注入工程と、遠心分離工程と、検出工程と、除去工程と、採取工程とを有する。
2018139583.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料が貯留した容器(100)の底面から遠心分離媒体を注入する注入手段(210)と、
遠心分離媒体と血液試料とが底面側からこの順にて積層されている容器(100)を遠心分離させる遠心分離手段(300)と、
遠心分離後に単核球層に存在する凝血塊を検出する検出手段(400)と、
検出された凝血塊を除去する除去手段(220)と、
単核球を採取する採取手段(230)と、
を有する単核球分離装置。
【請求項２】
前記検出手段(400)は、容器(100)内の単核球層を鉛直上方方向から撮影する上部撮影手段(410)と、容器(100)内の単核球層を水平方向から撮影する側部撮影手段(420)と、を有することを特徴とする請求項１に記載の単核球分離装置。
【請求項３】
前記検出手段(400)は、前記凝血塊を回転楕円体で近似した形状における赤道半径又は極半径の何れかが５mm以上の場合に除去対象となる凝血塊と検出することを特徴とする請求項１又は２に記載の単核球分離装置。
【請求項４】
前記除去手段(220)で凝血塊を除去する前に、遠心分離後に単核球層の上部にある血漿層を除去する血漿層除去手段を有することを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の単核球分離装置。
【請求項５】
前記血漿層除去手段は、前記血漿層の上部から該血漿層を吸引除去することを特徴とする請求項４に記載の単核球分離装置。
【請求項６】
前記血漿層除去手段は、前記血漿層の液量の10〜20％を残して該血漿層を吸引除去することを特徴とする請求項４又は５に記載の単核球分離装置。
【請求項７】
前記注入手段(210)は、0.05〜1.0 mL/秒にて遠心分離媒体を注入することを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載の単核球分離装置。
【請求項８】
血液試料が貯留された容器の底面に遠心分離媒体を注入する注入工程と、
遠心分離媒体と血液試料とが底面側からこの順にて積層されている容器を遠心分離させる遠心分離工程と、
遠心分離後に単核球層に存在する凝血塊を検出する検出工程と、
検出された凝血塊を除去する除去工程と、
単核球を採取する採取工程と、
を有する単核球分離方法。
【請求項９】
前記除去工程では、単核球層の上部に存在する凝血塊を除去することを特徴とする請求項８に記載の単核球分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単核球分離装置及び単核球分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、虚血性疾患患者の骨髄液を採取し、比重遠心法にて骨髄液中に存在する単核球細胞を分離し、分離した単核球細胞を虚血の局所にあるいは血管内に移植することにより、血管の再生を促進する細胞治療が開始されている。骨髄液から比重遠心法を用いて単核球細胞を分離する目的は、骨髄液中に含まれる顆粒球細胞及び赤血球細胞を除去することであり、これらの細胞を除去することにより細胞治療の治療効果が向上すると考えられている。【０００３】
一方、骨髄液は極めて凝固しやすいため、患者からの骨髄液採取に際し、抗凝固薬を十分に使用しても、凝血塊の形成を完全に防止することは非常に困難である。凝血塊とは、フィブリンが集まって網目構造をつくり、そこに赤血球が絡まるようにして生じたものであり、凝血塊の主成分はフィブリン、血小板及び赤血球である。骨髄細胞を用いた治療において、凝血塊は治療の妨げになることが多いため、例えば、白血病患者に対する他家骨髄細胞移植に際しては、500ml以上の骨髄液を採取し、まずポアサイズの違う3種類の骨髄移植用フィルターを通して、凝血塊を除去した後に、比重遠心法にて骨髄液中に存在する単核球細胞を分離する。四肢虚血患者に対する自己骨髄液を用いた再生治療は血管再生を促進することが示されているが(非特許文献１)、白血病患者に対する他家骨髄細胞移植と同様に、500ml以上の骨髄液を採取し、ポアサイズの違う3種類の骨髄移植用フィルターを通して、凝血塊を除去した後に、細胞分離機器を使用し比重遠心法にて骨髄液中に存在する単核球細胞を分離し、患者に移植している。また、脳梗塞患者に対する自己骨髄液を用いた再生治療は神経機能回復を促進することが示唆されているが(非特許文献２)、白血病患者や四肢虚血患者と比較すると少量である25mlあるいは50mlの骨髄液を採取し、セルプロセッシングセンター内において手作業で単核球細胞の分離を行い、単核球細胞が含まれる層に混入した凝血塊は、手作業で除去した後、患者に移植している。なお、四肢虚血患者と比較し、脳梗塞患者で比較的少量の骨髄液を用いる理由は、少量でも十分な効果が期待できること(非特許文献３)及び、大量の骨髄採取による血圧低下が脳梗塞症状の悪化を引き起こす可能性があるからである。また、比較的少量の骨髄液の分離精製時にフィルターを用いて凝血塊の除去を行うと、フィルター部分におけるボリュームロスが多く、骨髄液量が著しく減少するため、フィルターを使用することは困難である。我々と同様に、手作業で骨髄単核球を分離し心筋梗塞患者に投与した試験においては細胞移植の有効性が示されているものの(非特許文献４)、凝血塊の除去機能のない細胞分離機器により分離した細胞を用いた臨床試験では有効性が認められなかった(非特許文献５)ことが報告されている。ただ、セルプロセッシングセンター内で手作業での単核球細胞の分離は、その煩雑な操作に加えて、セルプロセッシングセンターの構築及び維持に多大な費用が掛かる。そこで、既存の機器以外にも特許文献１のようにセルプロセッシングセンターが不要な骨髄単核球細胞の分離装置が考案されているが、凝血塊の除去機能は有していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／００１９３６
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Taguchi et al. Eur J Vasc Endovasc Surg. 2003 Mar;25(3):276-8
【非特許文献２】Taguchi et al. Stem Cells Dev. 2015 Oct 1;24(19):2207-18
【非特許文献３】Uemura et al. Curr Vasc Pharmacol. 2012 May;10(3):285-8.
【非特許文献４】Schachinger V  N Engl J Med. 2006 Sep 21;355(12):1210-21
【非特許文献５】Traverse JH、JAMA. 2012 Dec 12;308(22):2380-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、取得する単核球成分へ赤血球等を含む凝血塊由来細胞の混入が発生しにくい単核球細胞分離装置及び単核球分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明にかかる単核球分離装置は、血液試料が貯留した容器の底面から遠心分離媒体を注入する注入手段と、遠心分離媒体と血液試料とが底面側からこの順にて積層されている容器を遠心分離させる遠心分離手段と、遠心分離後に骨髄単核球層に存在する凝血塊を検出する検出手段と、検出された凝血塊を除去する除去手段と、骨髄単核球を採取する採取手段と、を有する。【０００８】
また本発明にかかる単核球分離方法は、血液試料が貯留された容器の底面に遠心分離媒体を注入する注入工程と、遠心分離媒体と血液試料とが底面側からこの順にて積層されている容器を遠心分離させる遠心分離工程と、遠心分離後に単核球層に存在する凝血塊を検出する検出工程と、検出された凝血塊を除去する除去工程と、単核球を採取する採取工程と、を有する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、分離取得された単核球成分へ赤血球等を含む凝血塊由来細胞の混入が発生しにくい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本実施形態にかかる単核球分離装置の外観図である。
【図２】図２は、凝血塊の撮影手段を説明する概念図であり、そのうち（Ａ）は側部撮影手段を説明する図であり、（Ｂ）は上部撮影手段を説明する図である。
【図３】図３は、容器に血液試料を貯留してから、ノズル開口端を容器底部に移動させるまでの工程の説明図である。
【図４】図４は、容器底部への遠心分離媒体の注入開始から、遠心分離完了までの工程の説明図である。
【図５】図５は、血漿の吸引開始から吸引完了までの工程の説明図である。
【図６】図６は、単核球層の上部に存在する凝血塊の除去開始から、凝血塊の除去完了までの工程の説明図である。
【図７】図７は、単核球層の採取開始から、採取完了までの工程の説明図である。
【図８】図８は、Atrophy indexの測定方法の説明図である。
【図９】図９は、本実施例にかかる方法により分離した骨髄単核球細胞の虚血障害抑制効果を示す図である。
【図１０】図１０は、本実施例にかかる方法により分離した骨髄単核球細胞投与の大脳皮質機能回復促進効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１２】
図１に示されるように、本実施形態にかかる単核球分離装置900は、血液試料が貯留した容器100の底面から遠心分離媒体を注入する注入手段210と、遠心分離媒体と血液試料とが底面側からこの順にて積層されている容器100を遠心分離させる遠心分離手段300と、遠心分離後に単核球層に存在する凝血塊を検出する検出手段400と、検出された凝血塊を除去する除去手段220と、単核球を採取する採取手段230と、を有する。
【００１３】
容器100は、例えばガラス又はプラスチック製の遠沈管である。血液試料は特に限定されるものではないが、例えば骨髄液である。骨髄液は、例えば、脊椎動物（ヒトを含む）を麻酔し（局所又は全身麻酔）、骨に針を刺し、シリンジで吸引することにより採取することが可能である。骨としては、例えば大腿骨、胸骨、骨盤を形成している腸骨等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
遠心分離媒体を注入する注入手段210は、図示しない遠心分離媒体供給機構に接続され容器100内に遠心分離媒体を注入可能なノズルと、このノズルの開口端を血液試料が貯留した容器100の底面に移動させる図示しない移動機構と、を備える。遠心分離媒体供給機構は公知の液体供給機構を採用することができ、例えば遠心分離媒体を収容するタンク、送液シリンジ、流路、電磁弁等から構成される。遠心分離媒体は特に限定されるものではなく例えばPercoll（登録商標）、Lymphoprep（登録商標）等の密度勾配形成用として市販されている媒体が使用でき、またFicoll-Paque（登録商標）やNycoprep（登録商標）等も使用できるが好ましくはFicoll-Paque PREMIUM （Ficollは、登録商標）である。
【００１５】
注入手段210からの遠心分離媒体の注入は、急激に行うと遠心分離媒体と血液試料との界面が乱れる虞があるため、所定速度以下にて注入することが望ましく、具体的には容器100が50 mLの遠沈管の場合、0.05 mL/秒〜1.0 mL/秒にて遠心分離媒体を注入することが可能である。
【００１６】
遠心分離手段300は、公知の遠心分離機構を使用することができ、遠心分離媒体と血液試料とが底面側からこの順にて積層されている容器100を遠心分離させる。遠心分離手段300は、モータによって回転する回転軸に設けられた例えば４つのバケットを備え、このバケットに容器100が収容されるようになっている。
【００１７】
遠心分離を行う際、血液試料を収容した容器100に対向する位置に収容するカウンターウェイトは、上述の注入手段210において別の容器100にPBSあるいは血液試料及び遠心分離媒体を注入させて作成することができる。
【００１８】
遠心分離後は、容器100内にて容器底部から順に、赤血球層、遠心分離媒体層、単核球層、血漿層ができるが、検出手段400は、遠心分離後に単核球層に存在し、除去対象となる凝血塊を検出する。ここで単核球層に存在し、除去対象となる凝血塊とは、単核球層中に存在する凝血塊と、単核球層上に存在する凝血塊とを包含するものとする。
【００１９】
検出手段400は、容器100内の単核球層を鉛直上方方向から撮影する上部撮影手段410と、容器100内の単核球層を水平方向から撮影する側部撮影手段420と、上部撮影手段により撮影して得られた画像及び側部撮影手段により撮影して得られた画像から得られる色彩情報に基づいて単核球層に存在する凝血塊の位置情報を検知する図示しない位置情報検知手段と、を備える。上部撮影手段410及び側部撮影手段420は例えばCCDカメラであり、これらCCDカメラにより撮影した画像は、カラー画像として図示しないモニターにて表示される。
【００２０】
図２（Ａ）に示されるように、遠心分離後においては、赤血球層40を最下層に、単核球層20は血漿層10と遠心分離媒体30との中間におよそ白色の帯状層として観察され、凝血塊90（図２においては、凝血塊90は、例えば、90a、90b、90c、90dからなるものとする。）は主として赤血球にて構成されるためおよそ赤色の異物として観察される。
【００２１】
図２（Ｂ）に示されるように、上部撮影手段410により単核球層20(白色)を背景とする凝血塊90a、及び90dと、単核球層20の下部に位置する凝血塊90b及び90c並びに、図示されていない単核球層内の凝血塊が撮影される。そして位置情報検知手段は、上部撮影手段410の撮影した画像に対して空間フィルター等を適用して輝度が変化する部分を強調し、この強調した部分を例えば２値化することによって、単核球層20(白色)を背景とする凝血塊90a及び90dと、単核球層20の下部に位置する凝血塊90b及び90c並びに単核球層内の凝血塊の平面視における位置情報を検知する。
【００２２】
しかしながら上部撮影手段410により撮影された画像のみでは、単核球層20の上部に位置する凝血塊90a、90dと、単核球層20の下部に位置する凝血塊90b、90c並びに単核球層内の凝血塊との区別が困難である。
【００２３】
そこで本実施形態にかかる発明では、図２（Ａ）に示されるように、側部撮影手段420により水平方向からも凝血塊90を撮影し、位置情報検知手段は、側部撮影手段420の撮影した画像に基づいて、単核球層20の上部に位置する凝血塊90a、90dと、単核球層20の下部に位置する凝血塊90b、90c並びに単核球層内の凝血塊との区別を行う。これにより位置情報検知手段は、単核球層20に存在する除去対象となる凝血塊（図２においては単核球層20の上部に存在する凝血塊90a、90d）を検出することができる。
【００２４】
また、作業効率の観点から、単核球層20の上部に存在する凝血塊の全てを検出して除去するのではなく、単核球層20の上部に存在する凝血塊のうち所定大きさの凝血塊のみを検出して除去することも可能である。例えば検出手段400は凝血塊を回転楕円体に近似する形状ととらえた場合、赤道半径又は極半径の何れかが5mm以上の場合に除去対象となる凝血塊として検出することが可能である。また、例えば検出手段400は、単核球層20の上に存在する凝血塊のうち、上部撮影手段410により撮影された凝血塊の平面視での面積を計算し、所定面積以上のものを除去対象となる凝血塊と検出することが可能である。
【００２５】
除去手段220は位置情報検知手段により検出された、単核球層20に存在し、除去対象となる凝血塊（図２においては単核球層20の上部に存在する凝血塊90a、90d）を除去する。除去手段220は、図示しない凝血塊吸引機構に接続され凝血塊を吸引可能なノズルと、このノズルの開口端を単核球層20に存在する凝血塊に移動させる図示しない移動機構と、を備える。
【００２６】
検出された凝血塊を除去し易くするために、凝血塊を除去する前に血漿層10を除去する血漿層除去手段を設けることが可能である。血漿層除去手段は公知の液体吸引機構を採用することができ、例えば吸引ノズル、吸引した血漿層を収容するタンク、吸引ポンプ、流路等から構成される。血漿層10は後述する理由により少量の血漿層10を残して吸引を完了するのが好ましく、具体的には容器100内の血漿層10の液量の10％〜20％を残して吸引を完了するのが好ましい。なお、血漿層を除去した後に凝血塊を除去する構成に限定されず、血漿層の吸引除去と同時に凝血塊の除去を行うことも可能であり、また血漿層10を除去すること無く凝血塊の除去を行うことも可能である。
【００２７】
採取手段230は、図示しない単核球採取バックに接続され単核球を採取可能なノズルと、このノズルの開口端を単核球層20に移動させる移動機構と、を備える。採取した単核球はそのまま使用することも可能であるし、また使用する前に例えば生理食塩水を加えて遠心分離機により複数回洗浄を行うことも可能である。少量の血漿層10を残して血漿層の吸引を完了している場合には、単核球層を採取する際に残存血漿層も吸引する可能性があるが、使用前に洗浄を行うことにより残存血漿層の混入を排除できる。
【００２８】
次に上述の構成を備える本実施形態にかかる単核球分離装置900の使用態様の一具体例について説明する。
【００２９】
図３左側に示されるように、被験者から採取した血液試料50を容器100に貯留する。次に図３中央に示されるように、遠心分離媒体を注入可能なノズルの開口端が、血液試料が貯留した容器100内に投入される。次に図３右側に示されるように、ノズルの開口端は血液試料が貯留した容器100の底面へ移動させられる。
【００３０】
図４左側に示されるように、注入手段210により遠心分離媒体30の注入が開始され、そして図４中央に示されるように、遠心分離媒体30が容器100の底面側に貯留される。その後、図４右側に示されるように、遠心分離後は、容器100内にて容器底部から順に、赤血球層40、遠心分離媒体30、単核球層20、血漿層10ができ、更に異物である凝血塊90a、90b、90c、90dも存在することがある。
【００３１】
図５左側に示されるようにノズルにより血漿層10の吸引が開始される。ここではノズルは血漿層10の上部に位置する。即ち、ノズルは血漿層10と単核球層20の境界部分から離れた位置にて血漿層10の除去を開始する。ノズルの先であるノズル開口端が該境界部分に近いと、血漿層10を吸引除去する時にできる流れに骨髄単核球が巻き込まれて、収率が低下する虞があるからである。
【００３２】
そして図５中央に示されるように残りわずかとなるまで血漿層10の吸引が継続され、その後図５右側に示されるように少量の血漿層10を残して血漿層の吸引が完了する。血漿層10を全て除去することも可能であるが、血漿層10を除去する際に単核球層20内に存在する単核球も吸引して除去する虞があるため、少量の血漿層10を残して血漿層の吸引を完了するのが好ましい。
【００３３】
図６左側に示されるように、本実施形態では単核球層20の上部に存在する凝血塊90a、90dの除去が開始される。そして図６中央に示されるように、除去手段220によりまずは凝血塊90dが除去され、その後図６右側に示されるように、凝血塊90aが除去される。
【００３４】
図７左側に示されるように、単核球を採取可能なノズルの開口端が単核球層20内に導入され、次に図７中央に示されるようにノズルにより単核球層20の吸引が開始され、その後図７右側に示されるように全ての単核球層20の採取が完了する。
【実施例】
【００３５】
（実施例１）骨髄単核球細胞の虚血障害抑制効果
凝血塊の混入を抑制した本実施例にかかる単核球分離方法により分離した骨髄単核球細胞による虚血障害抑制効果を検証するために、発明者らが開発した再現性の高い虚血モデルマウス(Taguchi et al. J Exp Stroke Transl Med. 2010;3:28-33)を用いた実験を行った。脳梗塞作成48時間後に、尾静脈より1x105個の分離した骨髄単核球細胞を投与し、細胞投与30日後における虚血障害抑制効果に関する評価法として、マクロ標本による脳萎縮スコア(Taguchi et al. Eur J Neurosci. 2007;26(1):126-133.)を使用した。非治療コントロール群では、細胞投与群と同量(100μl)の生理食塩水を尾静脈より投与した。実験には各群6匹の虚血マウスを使用した。【００３６】
骨髄細胞投与の微小血管に与える作用を検証する虚血モデルは下記の手法で作成した。
8週齢のSCIDマウス(severe combined immunodeficiency mouse: 重度複合免疫不全マウス)をハロセン麻酔により全身麻酔し、左頬骨部よりアプローチして左中大脳動脈に直達できるよう頭蓋底に1.5mm程度の穿孔を行った。嗅索を通過した直後(嗅索交差部の遠位側)の左中大脳動脈を、バイポーラ電気メスを用いて凝固させ、凝固後切断することにより、左中大脳動脈を永久に閉塞し、左中大脳動脈領域の皮質に限局する虚血部位及び虚血強度の再現性に優れた虚血モデルを作成した。【００３７】
次にヒト骨髄液を購入し、骨髄細胞の入ったチューブ(容器)の底面よりFicoll-Paque PREMIUM(Ficollは、登録商標)液を注入した後、400Gで40分間遠心を行った。単核球層の上部に混在する長径5mm以上の凝血塊を除去した後、単核球層成分を吸引し、新しいチューブに移した。細胞は投与前に、アルブミン入り生理食塩水(最終アルブミン濃度2％)を用いて、遠心分離機を用いて洗浄を2度行った。【００３８】
マクロ標本による虚血障害スコアの詳細は下記の通りである。本研究で使用した脳虚血モデルは左中大脳動脈が潅流する大脳皮質に限局したものであるが、虚血後は炎症細胞の浸潤等により、対側(脳虚血を作成しない側)に比し、虚血側では明らかな組織の委縮が生じる。我々はその委縮の程度の定量的な評価にAtrophy indexが有用であることを示してきた(Taguchi et al. Eur J Neurosci. 2007;26(1):126-133.)。Atrophy indexの測定方法を図８に示す。なお、Atrophy indexはX/Y×100(％)にて示される。【００３９】
虚血障害軽減に関する治療効果を図９に示す。Atrophy indexは脳萎縮を示す指標である。Controlとは生理食塩水を投与された群である。実施例とは骨髄単核球細胞を投与された群である。1ｘ105個の骨髄単核球細胞の投与により、生理食塩水投与群と比し、統計学的にも有意に虚血障害軽減効果があることが示された。＊印は、Control群と骨髄単核球細胞群との間に統計学的有意差が存在することを示す。【００４０】
以上の結果より、本実施例にかかる方法により分離した骨髄単核球細胞の優れた虚血障害抑制効果が明らかになった。【００４１】
（実施例２）骨髄単核球細胞の虚血障害からの機能回復促進効果
凝血塊の混入を抑制した本実施例にかかる単核球分離方法により分離した骨髄単核球細胞による虚血障害からの機能回復促進効果を検証するために、発明者らが開発した再現性の高い虚血モデルマウスを用いた(Taguchi et al. J Exp Stroke Transl Med. 2010;3:28-33)。脳梗塞作成48時間後に、尾静脈より1x105個の分離した骨髄単核球細胞を投与し、細胞投与30日後における虚血障害からの機能回復促進効果に関する評価法として、オープンフィールドテストによる明暗条件に対する反応性(Taguchi et al. J Clin Invest. 2004;114:330-338)を使用した。実験には各群6匹の虚血マウスを使用した。骨髄細胞投与の機能回復促進効果を検証する虚血モデルは、実施例１と同様の手法を用いた。投与細胞の処理は、実施例１と同様の手法を用いた。【００４２】
機能回復促進効果に関する評価法として、オープンフィールドテストを実施した。その測定原理及び測定法は下記の通りである。マウスは夜行性であるため、正常のマウスにおいては、明条件では行動量が低下し、環境を暗くすることにより行動量が増加することが知られている。明条件下における行動抑制においては大脳皮質機能が重要であり、また細胞治療により大脳皮質機能が回復し、明条件下における行動抑制機能が回復することが示されてきた(Taguchi et al. J Clin Invest. 2004;114:330-338)。本研究では、マウスをオープンフィールド測定装置((株)行医研製、自由移動空間40cmｘ40cm)にて明条件下で30分間立ち上がり反応(rearing)の回数を自動カウントし、その後暗条件下で30分間立ち上がり反応の回数をカウントした。明条件から暗条件に変化した時の運動量の増加を、機能回復の指標として用いた。【００４３】
骨髄単核球細胞投与による虚血障害からの機能回復促進効果の結果を図１０に示す。Controlとは生理食塩水を投与された群である。実施例とは骨髄単核球細胞を投与された群である。図１０では、生理食塩水が投与された場合、及び、骨髄単核球細胞が投与された場合のそれぞれにつきrearing(立ち上がり)の回数が示されており、白色は明条件での立ち上がり回数、黒色は暗条件での立ち上がり回数を示す。生理食塩水が投与された群では暗条件への変化によって有意な運動量の増加を認めなかったが、骨髄単核球細胞の投与により、統計学的に有意な暗反応に対する行動量の増加が観察されるようになった。＊印は骨髄単核球細胞群において、明条件から暗条件への変化で、立ち上がり回数の統計学的に有意な増加が認められたことを示す。即ち骨髄単核球細胞の投与で脳神経機能回復促進効果があることが示された。【００４４】
以上の結果より、本実施例にかかる方法により分離した骨髄単核球細胞投与の優れた大脳皮質機能回復促進効果が明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は、骨髄単核球の分離に利用できる。【００４６】
本出願は、日本で出願された特願2017−012742（出願日：2017年1月27日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含される。
【符号の説明】
【００４７】
10      血漿層
20      単核球層
30      遠心分離媒体
40      赤血球層
50      血液試料
90      凝血塊
100      容器
210      注入手段
220      除去手段
230      採取手段
300      遠心分離手段
400      検出手段
410      上部撮影手段
420      側部撮影手段
900      単核球分離装置
【図１】
2018139583.tif 000003
【図２】
2018139583.tif 000004
【図３】
2018139583.tif 000005
【図４】
2018139583.tif 000006
【図５】
2018139583.tif 000007
【図６】
2018139583.tif 000008
【図７】
2018139583.tif 000009
【図８】
2018139583.tif 000010
【図９】
2018139583.tif 000011
【図１０】
2018139583.tif 000012
【国際調査報告】
2018139583.tif 000013
2018139583.tif 000014
2018139583.tif 000015
2018139583.tif 000016