(57)【要約】  本発明は、複数の式（１）で表される基を含み、正常細胞と比較して過剰に発現している癌細胞のグルタミントランスポーターと多価結合することができる、リガンドに関する。
2018037996.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常細胞と比較して過剰に発現している癌細胞のグルタミントランスポーターと多価結合することができるリガンドであって、複数の、以下の式（１）：
【化１】
2018037996.tif 000027
［式中、矢印はリガンドのその他の部分との連結を示す］
で表される基を含む、リガンド。
【請求項２】
１０個以上の前記式（１）の基が直接的に又はリンカーを介して連結している、ポリマー主鎖を含む、請求項１に記載のリガンド。
【請求項３】
数平均分子量が５，０００Ｄａ以上である、請求項２に記載のリガンド。
【請求項４】
前記ポリマー主鎖が、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリペプチド及びそれらの共重合体から成る群から選択される、請求項２又は３に記載のリガンド。
【請求項５】
前記ポリマー主鎖がポリペプチドである、請求項２〜４のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項６】
前記ポリペプチド中の１０個以上のアミノ酸の側鎖に、以下の式（２）：
【化２】
2018037996.tif 000028
［式中、
矢印は、前記側鎖への連結を示し、
Ｘは、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｓ−及び−Ｓ−Ｓ−から成る群から選択される基であるか、又は存在せず、
Ｗは、Ｃ1-6アルキレン基、ポリオキシアルキレン基及びポリアミノアルキレン基から成る群から選択されるリンカーであるか、又は存在しない］
で表される基が連結している、請求項５に記載のリガンド。
【請求項７】
前記ポリペプチドがα−ポリリシンである、請求項５又は６に記載のリガンド。
【請求項８】
前記α−ポリリシン中の１０個以上のリシンの側鎖アミノ基に、以下の式（３）：
【化３】
2018037996.tif 000029
［式中、矢印はリシンの側鎖アミノ基との連結を示す］
で表される基が連結している、請求項７に記載のリガンド。
【請求項９】
複数の式（１）で表される基のうち、一部の基の末端の一級アミノ基が低ｐＨ環境で脱離する保護基によりキャッピングされている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項１０】
前記低ｐＨ環境で脱離する保護基が、フタロイル基、マレオイル基、２−カルボキシ−ベンゾイル基及び（２Ｚ）−３−カルボキシ−２−プロペノイル基から成る群から選択される、請求項９に記載のリガンド。
【請求項１１】
少なくとも１つの検出可能な標識又は抗癌剤を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項１２】
前記検出可能な標識が、蛍光標識、発光標識、造影剤、金属原子、１種または２種以上の金属原子を含む化合物、放射性同位体、１種または２種以上の放射性同位体を含む化合物、ナノ粒子、またはリポソームである、請求項１１に記載のリガンド。
【請求項１３】
以下の式（４）
【化４】
2018037996.tif 000030
［式中、ｎは１０以上の整数である］
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載のリガンド。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のリガンドを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正常細胞と比較して過剰に発現している癌細胞のグルタミントランスポーターと多価結合することができるリガンド、及び当該リガンドを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．ターゲティング治療
近年、癌疾病は重大な問題となっている。ＷＨＯからの報告によると２０１２年には、８２０万人が癌疾病で亡くなっており、これは死因の１３．２％を占める。癌の治療法の一つとして、化学療法がある。化学療法とは、体中に抗癌剤を行き渡らせることにより、癌細胞を殺傷する治療法である。化学療法は低侵襲であるという利点がある一方、副作用による患者の身体への負担が大きく、投与方法においても様々な制約が存在する。そのため副作用を抑制しつつ、癌を殺傷出来、患者への負担が減らし、Quality of life(QOL)を向上させつつ、治療が行える抗癌剤の開発が求められている。【０００３】
現在一般的に用いられている低分子化合物を用いた化学療法では、正常細胞にもダメージを与えてしまい、重篤な副作用が生じてしまう。この問題を解決する方法として、ターゲティング治療が挙げられる。ターゲティング治療とは、癌細胞のみに特異的に存在する受容体に結合する標的指向性物質（リガンド）に薬剤を修飾させることで、癌組織にのみ選択的に薬剤を送達出来るようになり、治療効果の向上および副作用の軽減を狙うものである。現在リガンドとして、葉酸や炭化水素物のような低分子、ペプチドやタンパク質、アプタマー、抗体などの生化合物を用いたものが知られている。この治療法の利点は、様々な種類のリガンドと薬剤を組み合わせることで、薬理効果の最大化および副作用の緩和や、今まで毒性が強く臨床応用されなかった薬剤を使用できる可能性がある点である。ターゲティング治療薬の一例として癌細胞に特異的に存在する抗原と結合する抗体に薬剤を導入した抗体−薬剤コンジュゲート（ADCs, Antibody Drug Conjugates）がある。現在、トラスツズマブ エムタンシン（trastuzumab emtansine） とブレンツキシマブ ベドチン（brentuximab vedotin）の２種類のＡＤＣｓが臨床応用されており、副作用の軽減および治療効果の向上が確認されている（非特許文献１、２）。また抗体以外にも、癌細胞に過剰に発現している葉酸レセプター（ＦＲ）をターゲティングする葉酸などをリガンドとして用いた治療薬も臨床試験されている（非特許文献３）。このように、リガンドに薬剤を導入したターゲティング治療薬は抗癌剤の薬理効果の向上において非常に有用であると考えられている。【０００４】
２．トランスポーター
細胞は癌化することによって、解糖系が促進され、グルコースを大量に消費する。そのため、癌細胞にはグルコースを取り込むグルコーストランスポーターが細胞表面に過剰に発現しており、グルコースの過剰な取り込みがなされる。癌細胞におけるグルコースの取り込みの亢進を利用して、グルコースの水素の一部を18Ｆに変えた18Ｆ−フルオロデオキシグルコース−ポジトロン断層法（18F-fluorodeoxyglucose-positron emission tomography） ([18F]FDG-PET)が、がん診断に実用化されている（非特許文献４）。【０００５】
また、癌化した細胞において、アミノ酸の取り込みも同様に亢進している。これは、癌細胞が急激な増殖とタンパク質の合成を行うため、正常細胞と比べて多量のアミノ酸を必要とするからである。癌細胞には様々なアミノ酸を取り込むトランスポーターが過剰発現している。【０００６】
アミノ酸のなかでも、グルタミンの取り込みが癌細胞において特に活性化されている。癌細胞におけるグルタミンの取り込みは、正常細胞と比較して１０〜３０倍亢進していることが知られている。グルタミンは、グルタミントランスポーターを介して取り込まれ、細胞内でグルタミナーゼ（ＧＬＳ）などの酵素によって、グルタミン酸、αケトグルタル酸に異化され、ＴＣＡ経路に組み込まれ、ＡＴＰを産出している。グルタミンをグルタミン酸に異化する酵素ＧＬＳを阻害する薬剤は、一定の増殖抑制効果を示している。また、グルタミンはアスパラギンに異化されＤＮＡ合成に用いられている。グルタミンの取り込みは解糖系を促進するＭＹＣなどのシグナルによって促進される。これらの働きによって、ＴＣＡサイクルを維持することが出来る。このように、グルタミンの過剰取り込みは癌環境維持に大きく影響を及ぼしている。【０００７】
グルタミンを輸送する様々なグルタミントランスポーターは様々ある。グルタミントランスポーターは大きく分けて、Ｎａ+依存型とＮａ+非依存型があり、システムＡ、Ｎ、ＡＳＣとＢ０ＡＴ２がＮａ+依存型、システムＬはＮａ+非依存型である。この中で、癌細胞内へのグルタミン取り込みに大きな役割を担っていると考えられているのが、システムＡＳＣに属するＡＳＣＴ２である。ＡＳＣＴ２はアラニン、セリン、システインと高い親和性（Ｋm＝３０〜９０μＭ）を持っており、様々なアミノ酸の取り込みに関連している。特にグルタミンの取り込みに大きく関わっており、グルタミンとの親和性は特に高い（Ｋm＝２０μＭ）。これは、グルタミンのα位炭素部分のキラリティー（Ｌ型）、アミノ基とカルボキシル基間の炭素数が１つであることによって、ＡＳＣＴ２との間で強い静電相互作用と水素結合が生まれているからである。【０００８】
癌特異的なグルタミンの取り込み、特にＡＳＣＴ２によるグルタミンの取り込みの亢進に着目し、グルタミンを用いたＰＥＴプローブが開発されている（非特許文献５、６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Mallory R. Gordon et al., Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2198-2215
【非特許文献２】Enrico Mastrobattista, et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 40, 103-127(1999)
【非特許文献３】Nikki Parker, et al., Analytical Biochemistry 338 284-293(2005)
【非特許文献４】Ashley M Groves, et al., Lancet Oncol, 8, 822-830(2007)
【非特許文献５】Zehui Wu, et al., Mol. Pharmaceutics, 11, 3852-3866 (2014)
【非特許文献６】Wenchao Qu, et al., J. Am. Chem. Soc., 133, 1122-1133 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ターゲティング治療薬は一定の治療効果を示しているものの、幾つかの問題点が存在する。１つ目の問題点は癌の多様性である。例えば、葉酸レセプター（ＦＲ）は、癌種によって受容体の発現量が大きく異なることが知られている（非特許文献３）。また、抗体の場合も同様に癌種によって、過剰発現している抗原の種類は異なる（非特許文献２）。そのため、癌の種類が異なると１種類のリガンドではターゲティングできなくなってしまい、治療に制限が生じてしまう。【００１１】
２つ目の問題点は癌の不均一性である。これは同じ癌組織でも１つ１つ癌細胞によって表現形が異なるため、受容体の発現量に差および有無がある。そのため、受容体を発現していない癌細胞はリガンドでターゲティング出来ず、残存した癌細胞による再発のリスクが生じる。これらの問題を解決するためには、癌種、細胞によらず十分に発現している受容体の探索、そしてそれらをターゲティングできるリガンドの開発が重要である。【００１２】
また、３つ目の問題点として副作用がある。現在、臨床応用されているリガンドは受容体との結合力が非常に高く、単体の受容体と結合することが可能であり、またターゲティングする受容体の発現量も非常に多い。しかし、これらの受容体は正常細胞表面にも癌細胞の１／３〜１／４倍程度発現しているため、従来の抗癌剤に比べて副作用は緩和されたものの正常細胞へも結合してしまい副作用を生じさせてしまう。このように、受容体との結合力が強いリガンドで受容体の有無で結合を選択する従来の方法を用いると、受容体が発現している正常細胞とも結合してしまい、副作用が生じてしまう。この問題を解決するためには、受容体の有無ではなく発現量でターゲティングを選択できるリガンドが有用であると考えられる。このようなリガンドであれば、受容体の発現量の少ない正常細胞はターゲティングせず、発現量の多い癌細胞のみのターゲティングを実現でき、副作用の更なる緩和が狙える。【００１３】
さらに、抗体−薬剤コンジュゲートを用いる場合には、抗体分子に搭載できる薬物は１抗体あたり３〜４分子程度と非常に少ない。また、抗体を使用するために大量合成が困難であり、極めて高価であるという問題点がある。【００１４】
癌細胞がグルタミントランスポーターを過剰に発現し、正常細胞と比較して１０〜３０倍ほどグルタミンの取り込みが亢進していることから、グルタミンは癌細胞を標的化できる新規リガンドとして非常に有用であると考えられる。【００１５】
しかし、グルタミン単体をリガンドとして用いることを考えた場合、グルタミンとトランスポーターとの結合力は一般にリガンド分子に求められる結合力よりも弱いため、リガンドとして機能できないと予想される。例えば、ＡＳＣＴ２とグルタミンの親和性の指標であるミカエリス定数Ｋmは２０μＭである。一方、リガンドの結合力の指標としては解離定数Ｋdが用いられており、Ｋm、Ｋdともに値が小さいほど親和性や結合力が高い。その定義上、ＡＳＣＴ２とグルタミンの解離定数は上記のミカエリス定数である２０μＭよりも小さい値をとると考えられるが、その値が一般にリガンド分子に求められる１０ｎＭオーダーまで到達するとは考えにくい。【００１６】
従って本発明は、あらゆる癌を選択的に標的化できるリガンドの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、グルタミントランスポーターを介したグルタミンの取り込みに際して、当該トランスポーターが認識するグルタミンの部分構造を複数有するリガンドが、癌細胞上で当該トランスポーターと多価結合することにより、癌細胞に特異的に取り込まれることを見出し、本発明に至った。【００１８】
すなわち本発明は、以下の態様を有する。
［１］正常細胞と比較して過剰に発現している癌細胞のグルタミントランスポーターと多価結合することができるリガンドであって、複数の、以下の式（１）：
【化１】
2018037996.tif 000003
［式中、矢印はリガンドのその他の部分との連結を示す］
で表される基を含む、リガンド。
［２］
１０個以上の前記式（１）の基が直接的に又はリンカーを介して連結している、ポリマー主鎖を含む、［１］に記載のリガンド。
［３］
数平均分子量が５，０００Ｄａ以上である、［２］に記載のリガンド。
［４］
前記ポリマー主鎖が、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリペプチド及びそれらの共重合体から成る群から選択される、［２］又は［３］に記載のリガンド。
［５］
前記ポリマー主鎖がポリペプチドである、［２］〜［４］のいずれか１つに記載のリガンド。
［６］
前記ポリペプチド中の１０個以上のアミノ酸の側鎖に、以下の式（２）：
【化２】
2018037996.tif 000004
［式中、
矢印は、前記側鎖への連結を示し、
Ｘは、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｓ−及び−Ｓ−Ｓ−から成る群から選択される基であるか、又は存在せず、
Ｗは、Ｃ1-6アルキレン基、ポリオキシアルキレン基及びポリアミノアルキレン基から成る群から選択されるリンカーであるか、又は存在しない］
で表される基が連結している、［５］に記載のリガンド。
［７］
前記ポリペプチドがα−ポリリシンである、［５］又は［６］に記載のリガンド。
［８］
前記α−ポリリシン中の１０個以上のリシンの側鎖アミノ基に、以下の式（３）：
【化３】
2018037996.tif 000005
［式中、矢印はリシンの側鎖アミノ基との連結を示す］
で表される基が連結している、［７］に記載のリガンド。
［９］
複数の式（１）で表される基のうち、一部の基の末端の一級アミノ基が低ｐＨ環境で脱離する保護基によりキャッピングされている、［１］〜［８］のいずれか１つに記載のリガンド。
［１０］
前記低ｐＨ環境で脱離する保護基が、フタロイル基、マレオイル基、２−カルボキシ−ベンゾイル基及び（２Ｚ）−３−カルボキシ−２−プロペノイル基から成る群から選択される、［９］に記載のリガンド。
［１１］
少なくとも１つの検出可能な標識又は抗癌剤を含む、［１］〜［１０］のいずれか１つに記載のリガンド。
［１２］
前記検出可能な標識が、蛍光標識、発光標識、造影剤、金属原子、１種または２種以上の金属原子を含む化合物、放射性同位体、１種または２種以上の放射性同位体を含む化合物、ナノ粒子、またはリポソームである、［１１］に記載のリガンド。
［１３］
以下の式（４）
【化４】
2018037996.tif 000006
［式中、ｎは１０以上の整数である］
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、［１］に記載のリガンド。
［１４］
［１］〜［１３］のいずれか１つに記載のリガンドを含む、組成物。
［１５］
それを必要とする対象に、有効量の［１１］又は［１２］に記載のリガンドを投与することを含む、癌の診断又は検出方法であって、前記リガンドは少なくとも１つの検出可能な標識を含む、方法。
［１６］
癌を診断又は検出するための、［１１］又は［１２］に記載のリガンドであって、少なくとも１つの検出可能な標識を含む、リガンド。
［１７］
癌を診断又は検出するための医薬の製造における、［１１］又は［１２］に記載のリガンドの使用であって、前記リガンドは少なくとも１つの検出可能な標識を含む、使用。
［１８］
それを必要とする対象に、有効量の［１１］に記載のリガンドを投与することを含む、癌の治療方法であって、前記前記リガンドは少なくとも１つの抗癌剤を含む、方法。
［１９］
癌を治療するための［１１］に記載のリガンドであって、少なくとも１つの抗癌剤を含む、リガンド。
［２０］
癌を治療するための医薬の製造における、［１１］に記載のリガンドの使用であって、前記前記リガンドは少なくとも１つの抗癌剤を含む、使用。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のリガンドを用いることで、あらゆる癌を選択的にターゲティングすることができる。本発明のリガンドと薬物とを複合化することで、癌のターゲティング治療に有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｂｘ−ＰＣ３細胞のリガンドの取り込み量の経時変化を示す図である（ｎ＝３）。高分子リガンド濃度：１０μＭ，インキュベーション温度：３７℃。
【図２】インキュベーションを１時間行った場合における、細胞の高分子リガンドの取り込み量の比較を示す図である（各ｎ＝３）。（ａ）Ｂｘ−ＰＣ３細胞、（ｂ）ＨｅｐＧ２細胞、（ｃ）ＨＵＶＥＣ細胞。高分子リガンド濃度：１０μＭ、インキュベーション温度：３７℃。
【図３】インキュベーションを６時間行った場合における、細胞の高分子リガンドの取り込み量の比較を示す図である（各ｎ＝３）。（ａ）Ｂｘ−ＰＣ３細胞、（ｂ）ＨｅｐＧ２細胞、（ｃ）ＨＵＶＥＣ細胞。高分子リガンド濃度：１０μＭ、インキュベーション温度：３７℃。
【図４】阻害剤の存在下又は非存在下における、高分子リガンドのＢｘ−ＰＣ３細胞内への取り込み率（各ｎ＝３）を示す図である。高分子リガンド側鎖のＧｌｎ（Ｇｌｕ）濃度：１ｍＭ、温度：３７℃、インキュベーション時間：１時間、高分子リガンド溶液中での取り込み量を１００％として算出。
【図５】阻害剤の存在下又は非存在下における、高分子リガンドのＨｅｐＧ２細胞内への取り込み率（各ｎ＝３）を示す図である。高分子リガンド側鎖のＧｌｎ（Ｇｌｕ）濃度：１ｍＭ、温度：３７℃、インキュベーション時間：１時間、高分子リガンド溶液中での取り込み量を１００％として算出。
【図６】阻害剤の存在下又は非存在下における、高分子リガンドのＨＵＶＥＣ細胞内への取り込み率（各ｎ＝３）を示す図である。高分子リガンド側鎖のＧｌｎ（Ｇｌｕ）濃度：１ｍＭ、温度：３７℃、インキュベーション時間：１時間、高分子リガンド溶液中での取り込み量を１００％として算出。
【図７】抗ＡＳＣＴ２抗体（Ｈ−５２）の存在下又は非存在下における、高分子リガンドのＢｘ−ＰＣ３細胞内への取り込み率（各ｎ＝３）を示す図である。高分子リガンド側鎖のＧｌｎ（Ｇｌｕ）濃度：１０ｍＭ、温度：３７℃。高分子リガンドのみの取り込み量を１００％として算出。
【図８】３７℃及び４℃における、Ｂｘ−ＰＣ３細胞への高分子リガンドの取り込み量を示す図である（各ｎ＝３）。高分子リガンド濃度：１０μＭ。
【図９】重合度の異なる高分子リガンドのＢｘ−ＰＣ３細胞への取り込み量を示す（各ｎ＝３）。高分子リガンド濃度：１０μＭ、温度：３７℃。
【図１０】重合度の異なる高分子リガンドのＨｅｐＧ２細胞への取り込み量を示す（各ｎ＝３）。高分子リガンド濃度：１０μＭ、温度：３７℃。
【図１１】３７℃における、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６のＢｘ−ＰＣ３細胞内への取り込みを示すＣＬＳＭ画像である。（ａ）赤：Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６（Ｃｙ５）。（ｂ）緑：ＡＳＣＴ２（ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８）。（ｃ）青：細胞核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）。（ｄ）マージ（Ｍｅｒｇｅ）。Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６濃度：１０μＭ、インキュベーション時間：１時間、レンズ倍率：６３倍。
【図１２】３７℃における、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６のＢｘ−ＰＣ３細胞内への取り込みを示す３Ｄモデルである。赤：Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６（Ｃｙ５）。緑：ＡＳＣＴ２（ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８）。青：細胞核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）。黄：赤と緑の非局在部分。
【図１３】４℃における、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６のＢｘ−ＰＣ３細胞内への取り込みを示すＣＬＳＭ画像である。（ａ）赤：Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６（Ｃｙ５）。（ｂ）緑：ＡＳＣＴ２（ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８）。（ｃ）青：細胞核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）。（ｄ）マージ（Ｍｅｒｇｅ）。Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６濃度：１０μＭ、インキュベーション時間：１時間、レンズ倍率：６３倍。
【図１４】４℃における、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６のＢｘ−ＰＣ３細胞内への取り込みを示す３Ｄモデルである。赤：Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６（Ｃｙ５）。緑：ＡＳＣＴ２（ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８）。青：細胞核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）。黄：赤と緑の非局在部分。
【図１５】Ｂｘ−ＰＣ３細胞移植マウスの腫瘍へ高分子リガンドを局部注射した際の蛍光強度の変化を示す図である（ｎ＝２）。高分子リガンド濃度：４μＭ、腫瘍へ高分子リガンドを投与してから３０分後の蛍光強度を１００％かつスタートポイントとした。
【図１６】ＨｅｐＧ２細胞移植マウスの腫瘍へ高分子リガンドを局部注射した際の蛍光強度の変化を示す図である（ｎ＝２）。高分子リガンド濃度：４μＭ、腫瘍へ高分子リガンドを投与してから３０分後の蛍光強度を１００％かつスタートポイントとした。
【図１７】実施例１の化合物（ｅ）（ｎ＝２５、４６、１０６）のＧＰＣスペクトルを示す。（溶出液：１０ｍＭ ＰＢ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４，流速：０．７５ｍｌ／分、検出器：ＵＶ２２０ｎｍ）
【図１８】Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎ（ｎ＝２５、４６、１０６）の蛍光スペクトルを示す。励起波長：５５０ｎｍ。
【図１９】Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］ｎ（ｎ＝４６、１０６）の蛍光スペクトルを示す。励起波長：５５０ｎｍ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一態様は、正常細胞と比較して過剰に発現している癌細胞のグルタミントランスポーターと多価結合することができるリガンドであって、複数の、以下の式（１）：
【化５】
2018037996.tif 000007
［式中、矢印はリガンドのその他の部分との連結を示す］
で表される基を含む、リガンドに関する。以下で「本発明のリガンド」とも呼ぶ。
【００２２】
本明細書において「リガンド」とは、細胞の特定の標的部位に特異的に結合することができる物質のことである。本発明のリガンドの形態は特に限定されず、例えば１つの分子に複数の式（１）で表される基が含まれる分子（以下で「リガンド分子」とも呼ぶ）であってもよいし、１つの分子に少なくとも１つの式（１）で表される基を含む分子の複合体（以下で「リガンド複合体」とも呼ぶ）であってもよい。リガンド複合体としては、特に限定されないが、例えば、標的部位への結合部を有するミセル、リポソームなどが挙げられる。
【００２３】
本発明のリガンドは、正常細胞と比較して過剰に発現している癌細胞のグルタミントランスポーターを標的とする。ここで「正常細胞」とは、標的である癌細胞と同種の細胞であって、癌化していないもののことである。そのようなグルタミントランスポーターとしては、例えば、システムＡＳＣに属するＡＳＣＴ２、システムＬに属するＬＡＴ１、システムＮに属するＳＮＡＴ５などが挙げられる。本発明のリガンドは、特に癌細胞のＡＳＣＴ２を標的とする。過剰発現の程度は、正常細胞と比較して多く発現している限り特に限定されない。グルタミントランスポーターの種類や当該トランスポーターが発現する癌細胞の属する組織の種類によって異なるが、本発明のリガンドは、例えば、正常細胞と比較して１．１倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上又は３倍以上発現している癌細胞のグルタミントランスポーターを標的とする。
【００２４】
本明細書において「多価結合」とは、リガンドが細胞上の少なくとも２つの標的部位（すなわちグルタミントランスポーター）と、複数の式（１）の基を介して結合することである。グルタミン単体ではトランスポーターとの結合能が極めて低く、リガンドとして機能できないが、グルタミンを複数含む本発明のリガンドは、グルタミン単体と比較してグルタミントランスポーターへの結合力が大幅に増大している。
【００２５】
本発明のリガンドは、グルタミントランスポーターへの結合の後、エンドサイト―シスによって細胞内に取り込まれ得る。
【００２６】
式（１）の基の立体構造は、本発明のリガンドが、正常細胞と比較して過剰に発現している癌細胞のグルタミントランスポーターと多価結合することができる限り特に限定されず、以下の式（１ａ）又は（１ｂ）のいずれの立体構造を有していても良い。天然に存在するＬ−グルタミンと同一の立体構造を有する式（１ａ）の基が好ましい。
【化６】
2018037996.tif 000008
［式中、矢印はリガンドのその他の部分との連結を示す］
【００２７】
本発明のリガンド中の式（１）の基の数は、当該リガンドが、正常細胞と比較して過剰に発現している癌細胞のグルタミントランスポーターと多価結合することができる限り、特に限定されない。当該基の数の下限は、例えば、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、又は１００個であり、当該基の数の上限は、例えば、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、３０００個又は５０００個である。当該基の数は、例えば１０〜５０００個であり、好ましくは１０〜５００個であり、より好ましくは２０〜２００個である。当該基の好適な数は、当該基と結合する物質の物理的構造や化学的特性などに依存して変化する。
【００２８】
一の実施形態において、本発明のリガンドは、複数の式（１）の基が直接的に又はリンカーを介して連結する、ポリマー主鎖を含む。この場合、式（１）の基の数については上記の通りである。好ましくは、本発明のリガンドは、１０個以上の式（１）の基が直接的に又はリンカーを介して連結する、ポリマー主鎖を含む。当該ポリマー主鎖は、グルタミントランスポーターとの多価結合を阻害しない限り特に限定されないが、例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリシロキサン、ポリビニル、ポリペプチド、ポリヌクレオチド及びそれらの共重合体などが挙げられる。好ましくは、当該ポリマー主鎖は、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリペプチド及びそれらの共重合体である。本発明の一の実施形態において、ポリマー主鎖は、カルボン酸と縮合可能な１級又は２級アミノ基を含む。また本発明の一の実施形態において、ポリマー主鎖はポリペプチドである。また本発明の一の実施形態において、ポリマー主鎖は複数のリシンを含むポリペプチドであり、例えばα−ポリリシンである。本発明のリガンドがポリマー主鎖を有する場合において、その数平均分子量の下限は、例えば３，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ又は７，０００Ｄａであり（好ましくは５，０００Ｄａであり）、その上限は、特に限定されないが、例えば１，５００，０００Ｄａ、１，０００，０００Ｄａ、５００，０００Ｄａ、３００，０００Ｄａ、１００，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ又は５０，０００Ｄａである。本発明のリガンドがポリマー主鎖を有する場合において、その数平均分子量は、好ましくは５，０００Ｄａ〜１５０，０００Ｄａであり、より好ましくは６，０００Ｄａ〜７０，０００Ｄａである。
【００２９】
一の実施形態において、本発明のリガンドのポリマー主鎖はポリペプチド（例えばα−ポリリシン）であり、前記ポリペプチド中の複数のアミノ酸の側鎖に、以下の式（２）：
【化７】
2018037996.tif 000009
［式中、
矢印は、前記側鎖への連結を示し、
Ｘは、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｓ−及び−Ｓ−Ｓ−から成る群から選択される基であるか、又は存在せず、
Ｗは、Ｃ1-6アルキレン基、ポリオキシアルキレン基及びポリアミノアルキレン基から成る群から選択されるリンカーであるか、又は存在しない］
で表される基が連結している。この場合、リガンド中の式（２）の基の数については、上記の式（１）の基の数が同様に適用される。好ましくは、前記ポリペプチド中の１０個以上のアミノ酸の側鎖に、上記式（２）で表される基が連結している。Ｘ及びＷの組み合わせとしては、Ｘが−ＮＨ−又は−ＮＨ−ＣＯ−であってＷがリンカーである場合、あるいはＸ及びＷが共に存在しない場合が好ましい。
【００３０】
本明細書において「アルキレン基」は、直鎖若しくは分枝鎖状のアルキレン基のことである。本明細書において「Ｃ1-6アルキレン基」とは、炭素数１〜６の直鎖若しくは分枝鎖状のアルキレン基のことであり、例えばメチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、へキシレン基及びそれらの異性体が挙げられる。本明細書において「ポリオキシアルキレン基」は、特に限定されないが、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン又はこれらの共重合体である。本明細書において「ポリアミノアルキレン基」は、特に限定されないが、例えばポリアミノエチレン、ポリアミノプロピレン、ポリアミノブチレン又はこれらの共重合体である。
【００３１】
一の実施形態において、本発明のリガンドのポリマー主鎖はポリペプチド（例えばα−ポリリシン）であり、ここで前記ポリペプチド中の複数のリシンの側鎖アミノ基に、式（１）で表される基がリンカーを介して連結しているか、又はポリペプチド中のリシンの側鎖アミノ基に、以下の式（３）：
【化８】
2018037996.tif 000010
［式中、矢印はリシンの側鎖アミノ基との連結を示す］
で表される基が連結している。この場合、リガンド中の式（３）の基の数については、上記の式（１）の基の数が同様に適用される。好ましくは、前記ポリペプチド中の１０個以上のリシンの側鎖アミノ基に、上記式（３）で表される基が連結している。より好ましくは、前記ポリペプチド中の全てのリシンの側鎖アミノ基に、上記式（３）で表される基が連結している。
【００３２】
一の好ましい実施形態において、本発明のリガンドのポリマー主鎖はα−ポリリシンであり、ここで前記α−ポリリシン中の１０個以上の（より好ましくは全ての）リシンの側鎖アミノ基に、以下の式（３）：
【化９】
2018037996.tif 000011
［式中、矢印はリシンの側鎖アミノ基との連結を示す］
で表される基が連結している。
【００３３】
式（１）の基が、ポリマー主鎖にリンカーを介して連結する場合、リンカーの構造はグルタミントランスポーターとの多価結合を阻害しない限り特に限定されない。例えば、リンカーは、Ｃ1-6アルキレン基、ポリオキシアルキレン基又はポリアミノアルキレン基であり、好ましくはポリオキシエチレン基である。
【００３４】
一の実施形態において、本発明のリガンドは、少なくとも１つの式（１）で表される基が直接的に又はリンカーを介して連結する親水性ポリマーセグメントと、疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマーを含んで成るポリマーミセルである。
【００３５】
親水性のセグメントとしては、ミセルの形成を阻害しない限り特に限定されないが、例えばポリエチレンオキシド及びポリプロピレンオキシドなどのポリアルキレンオキシド、ポリリンゴ酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリシン、ポリサッカライド、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミノ酸あるいはこれらの誘導体由来のセグメントが挙げられる。
【００３６】
疎水性セグメントとしては、ミセルの形成を阻害しない限り特に限定されないが、例えばポリ（β−ベンジルＬ−アスパルテート）、ポリ（γ−ベンジルＬ−グルタメート）、ポリ（β−置換アスパルテート）、ポリ（γ−置換グルタメート）、ポリ（Ｌ−ロイシン）、ポリ（Ｌ−バリン）、ポリ（Ｌ−フェニルアラニン）、疎水性ポリアミノ酸、ポリスチレン、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸アミド、ポリアクリル酸アミド、ポリアミド、ポリエステル、ポリアルキレンオキシド、疎水性のポリオレフィンが挙げられる。
【００３７】
特に限定されないが、親水性セグメントと疎水性セグメントと含むブロックコポリマーの例としては、次のものが挙げられる。ポリエチレンオキシド−ポリスチレンブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリブタジエンブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリイソプレンブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリエチレンブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリ（β−ベンジルアスパルテート）ブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリ（γ−ベンジルグルタメート）ブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリ（アラニン）ブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリ（フェニルアラニン）ブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリ（ロイシン）ブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリ（イソロイシン）ブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリ（バリン）ブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリスチレンブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリブタジエンブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリイソプレンブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリプロピレンブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリエチレンブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリ（β−ベンジルアスパルテート）ブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリ（γ−ベンジルグルタメート）ブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリ（アラニン）ブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリ（フェニルアラニン）ブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリ（ロイシン）ブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリ（イソロイシン）ブロックコポリマー、ポリアクリル酸−ポリ（バリン）ブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリスチレンブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリブタジエンブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリイソプレンブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリプロピレンブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリエチレンブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリ（β−ベンジルアスパルテート）ブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリ（γ−ベンジルグルタメート）ブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリ（アラニン）ブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリ（フェニルアラニン）ブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリ（ロイシン）ブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリ（イソロイシン）ブロックコポリマー、ポリメタクリル酸−ポリ（バリン）ブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリスチレンブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリブタジエンブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリイソプレンブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリプロピレンブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレンブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリ（β−ベンジルアスパルテート）ブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリ（γ−ベンジルグルタメート）ブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリ（アラニン）ブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニ��ピロリドン）−ポリ（フェニルアラニン）ブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリ（ロイシン）ブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリ（イソロイシン）ブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリ（バリン）ブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリスチレンブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリブタジエンブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリイソプレンブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリプロピレンブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリエチレンブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリ（β−ベンジルアスパルテート）ブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリ（γ−ベンジルグルタメート）ブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリ（アラニン）ブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリ（フェニルアラニン）ブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリ（ロイシン）ブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリ（イソロイシン）ブロックコポリマー、ポリ（アスパラギン酸）−ポリ（バリン）ブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリスチレンブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリブタジエンブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリイソプレンブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリプロピレンブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリエチレンブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリ（β−ベンジルアスパルテート）ブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリ（γ−ベンジルグルタメート）ブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリ（アラニン）ブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリ（フェニルアラニン）ブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリ（ロイシン）ブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリ（イソロイシン）ブロックコポリマー、ポリ（グルタミン酸）−ポリ（バリン）ブロックコポリマー。
【００３８】
式（１）の基が、親水性セグメントにリンカーを介して連結する場合、リンカーの構造はグルタミントランスポーターとの多価結合を阻害しない限り特に限定されない。例えば、リンカーはポリオキシアルキレン基であり、好ましくはポリオキシエチレン基である。
【００３９】
本発明のリガンドは、少なくとも１つの検出可能な標識を含んでもよい。本明細書において、「検出可能な標識」とは、既存の任意の検出手段により検出し得る任意の原子又は化合物のことである。検出手段としては、特に限定されないが、例えば、肉眼、光学検査装置（例えば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、位相差顕微鏡、in vivoイメージング装置）、Ｘ線装置（例えば、単純Ｘ線装置、ＣＴ（コンピュータ断層撮影）装置）、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）装置、核医学検査装置（例えば、シンチグラフ装置、ＰＥＴ（positron emission tomography）装置、ＳＰＥＣＴ（single photon emission computed tomography）装置）、超音波検査装置およびサーモグラフィー装置などが挙げられる。各検出手段に適した標識は当業者に知られており、例えば、Lecchi et al., Q J Nucl Med Mol Imaging. 2007;51（2）:111-26などに記載されている。検出可能な標識としては、特に限定されないが、例えば、蛍光標識、発光標識、造影剤、金属原子、１種または２種以上の金属原子を含む化合物、放射性同位体、１種または２種以上の放射性同位体を含む化合物、ナノ粒子、及びリポソームが挙げられる。
【００４０】
肉眼および光学検査装置での検出に適した標識としては、例えば、種々の蛍光標識および発光標識が挙げられる。具体的な蛍光標識としては、特に限定されないが、例えば、Ｃｙ（商標）シリーズ（例えば、Ｃｙ（商標）２、３、５、５．５、７など）、DyLight（商標）シリーズ（例えば、DyLight（商標） 405、488、549、594、633、649、680、750、800など）、Alexa Fluor（登録商標）シリーズ（例えば、Alexa Fluor（登録商標）405、488、549、594、633、647、680、750など）、HiLyte Fluor（商標）シリーズ（例えば、HiLyte Fluor（商標） 488、555、647、680、750など）、ATTOシリーズ（例えば、ATTO488、550、633、647N、655、740など）、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、テキサスレッド、ＧＦＰ、ＲＦＰ、Ｑｄｏｔなどを用いることができる。
【００４１】
また、具体的な発光標識としては、特に限定されないが、例えば、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン、イクオリンなどを用いることができる。
【００４２】
Ｘ線装置での検出に適した標識としては、例えば、種々の造影剤が挙げられる。具体的な造影剤としては、特に限定されないが、例えば、ヨウ素原子、ヨウ素イオン、ヨウ素含有化合物などを用いることができる。
【００４３】
ＭＲＩ装置での検出に適した標識としては、例えば、種々の金属原子や１種または２種以上の該金属原子を含む化合物、例えば１種または２種以上の該金属原子の錯体などが挙げられる。具体的には、特に限定されないが、例えば、ガドリニウム（ＩＩＩ）（Ｇｄ（ＩＩＩ））、イットリウム−８８（88Ｙ）、インジウム−１１１（111Ｉｎ）、およびこれらと、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、（１，２−エタンジイルジニトリロ）四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン、２，２’−ビピリジン（ｂｉｐｙ）、１，１０−フェナントロリン（ｐｈｅｎ）、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ＤＰＰＥ）、２，４−ペンタンジオン（ａｃａｃ）、シュウ酸塩（ｏｘ）などの配位子との錯体、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、酸化マンガン（ＭｎＯ）などを用いることができる。
【００４４】
核医学検査装置での検出に適した標識としては、例えば、種々の放射性同位体や１種または２種以上の該放射性同位体を含む化合物、例えば１種または２種以上の該放射性同位体の錯体などが挙げられる。放射性同位体としては、特に限定されないが、例えば、テクネチウム−９９ｍ（99mＴｃ）、インジウム−１１１（111Ｉｎ）、ヨウ素−１２３（123Ｉ）、ヨウ素−１２４（124Ｉ）、ヨウ素−１２５（125Ｉ）、ヨウ素−１３１（131Ｉ）、タリウム−２０１（201Ｔｌ）、炭素−１１（11Ｃ）、窒素−１３（13Ｃ）、酸素−１５（15Ｏ）、フッ素−１８（18Ｆ）、銅−６４（64Ｃｕ）、ガリウム−６７（67Ｇａ）、クリプトン−８１ｍ（81mＫｒ）、キセノン−１３３（133Ｘｅ）、ストロンチウム−８９（89Ｓｒ）、イットリウム−９０（90Ｙ)などを用いることができる。また、放射性同位体を含む化合物としては、特に限定されないが、例えば、123Ｉ−ＩＭＰ、99mＴｃ−ＨＭＰＡＯ、99mＴｃ−ＥＣＤ、99mＴｃ−ＭＤＰ、99mＴｃ−テトロフォスミン、99mＴｃ−ＭＩＢＩ、99mＴｃＯ4−、99mＴｃ−ＭＡＡ、99mＴｃ−ＭＡＧ３、99mＴｃ−ＤＴＰＡ、99mＴｃ−ＤＭＳＡ、18Ｆ−ＦＤＧなどが挙げられる。
【００４５】
超音波検査装置での検出に適した標識としては、特に限定されないが、例えば、ナノ粒子、リポソームなどを用いることができる。
【００４６】
例えば本発明のリガンドがポリマー主鎖を含む場合、検出可能な標識は当該ポリマー主鎖に直接的に又はリンカーを介して連結してもよい。また例えば、本発明のリガンドがポリマーミセルである場合には、検出可能な標識は当該ポリマーミセルを構成するブロックコポリマーに直接的に又はリンカーを介して連結してもよい。また、当該ポリマーミセルの内部に検出可能な標識が封入されてもよい。リンカーの種類は特に限定されないが、例えば、Ｃ1-6アルキレン基、ポリオキシアルキレン基（ポリオキシエチレン基などを含む）又はポリアミノアルキレン基である。
【００４７】
本発明のリガンドは、少なくとも１つの抗癌剤を含んでもよい。例えば本発明のリガンドがポリマー主鎖を含む場合、抗癌剤は当該ポリマー主鎖に直接的に又はリンカーを介して連結してもよい。また例えば、本発明のリガンドがポリマーミセルである場合には、当該ポリマーミセルを構成するブロックコポリマーに直接的に又はリンカーを介して連結してもよい。また、当該ポリマーミセルの内部に封入されてもよい。リンカーの種類は特に限定されないが、例えば、Ｃ1-6アルキレン基、ポリオキシアルキレン基（ポリオキシエチレン基などを含む）又はポリアミノアルキレン基である。
【００４８】
本発明のリガンドに使用され得る抗癌剤としては、特に限定されないが、例えば、アドリアマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、マイトマイシン−Ｃ、ダウノマイシン、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、塩酸ゲムシタビン、エムタンシン、カリキアマイシン、毒素（例えば、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素などの細胞毒素）、含ホウ素医薬（例えばボルテゾミブ、或いは、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）に使用され得るｐ−ボロノフェニルアラニンなどの薬剤）、核酸医薬（例えば、デコイ核酸、アンチセンス核酸、siRNA、miRNA、リボザイム、アプタマー）、光線力学的療法（ＰＤＴ）に使用され得る光増感剤（例えばポルフィリン誘導体）などが挙げられる。
【００４９】
本発明のリガンド中の複数の式（１）で表される基のうち、少なくとも１つの（好ましくは一部の）基の末端の一級アミノ基は、低ｐＨ環境で脱離する保護基によりキャッピングされていてもよい。上記保護基を、以下で「キャッピング基」とも呼ぶ。正常組織周辺のｐＨ（約７．４）と比較して、癌組織周辺のｐＨ（６．５〜６．８）は低いことが知られている。例えば、正常組織周辺のｐＨでは除去されないが、癌組織周辺のｐＨでは除去されるようなキャッピング基を式（１）の基の末端の一級アミノ基に連結させることで、癌細胞においてのみグルタミントランスポーターの認識部位が曝露されるリガンドとすることが可能である。これにより、リガンドの癌細胞への特異性を向上させることが可能である。上記キャッピング基としては、低ｐＨ環境で脱離する限りにおいて特に限定されないが、例えば、ｐＨ６．８以下で脱離する保護基であり、例えば、フタロイル基、マレオイル基、２−カルボキシ−ベンゾイル基、（２Ｚ）−３−カルボキシ−２−プロペノイル基などが挙げられる。
【００５０】
本発明の一実施形態において、本発明のリガンドは、以下の式（４）
【化１０】
2018037996.tif 000012
［式中、ｎは１０以上の整数である］
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である。ｎは重合度であり、その下限は１０であるが、好ましくは、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００である。ｎの上限は、特に限定されないが、例えば、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、３０００又は５０００である。ｎは、例えば１０〜５０００の整数であり、好ましくは１０〜５００の整数であり、より好ましくは２０〜２００の整数である。上記重合度は、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分値に基づく末端基定量法により算出することができる。
【００５１】
本明細書において「薬学的に許容される塩」とは、薬学的に許容され、かつ所望の薬理学的活性を有する、遊離体化合物の塩である。「薬学的に許容される塩」としては、特に限定されないが、例えば、硫酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸などの無機酸との塩、酢酸、シュウ酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、エタンスルホン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、ガラクタル酸、ナフタレン−２−スルホン酸などの有機酸との塩、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、アルミニウムイオンなどの１種または複数の金属イオンとの塩、アンモニア、アルギニン、リシン、ピペラジン、コリン、ジエチルアミン、４−フェニルシクロヘキシルアミン、２−アミノエタノール、ベンザチンなどのアミンとの塩が挙げられる。
【００５２】
本発明のリガンドは、種々の公知の方法を適用して、複数の式（１）の基を分子又は複合体に導入することで製造することができる。例えば、本発明のリガンドがポリマー主鎖を含み、かつ当該ポリマー主鎖がカルボン酸と縮合可能な１級又は２級アミノ基を含む場合（例えばポリマー主鎖が、リシンのように側鎖にアミノ基を有するアミノ酸を複数含むポリペプチドである場合）、当該ポリマー主鎖に以下の式（５）：
【化１１】
2018037996.tif 000013
［式中、
Ｒ1はアミノ基の保護基（例えばＢｏｃ基）であり、Ｒ2はカルボン酸の保護基（例えばベンジル基）である］
で表される化合物を、公知の縮合条件にて縮合し、その後保護基を除去することにより製造されてもよい。適切な保護基及びその脱保護条件は、例えば、T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, New York, 1999に記載されたものを使用できる。また、例えば本発明のリガンドが、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマーを含んで成るポリマーミセルであって、親水性ポリマーセグメント中にカルボン酸と縮合可能な１級又は２級アミノ基が存在する場合には、上記と同様の方法を適用して式（１）の基を親水性ポリマーセグメントに導入することができる。
【００５３】
また、本発明のリガンドが親水性ポリマーセグメントと、疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマーを含んで成るポリマーミセルである場合には、そのミセル形成方法はポリマーミセルが形成できる限り特に限定されない。例えば、水性媒体中にブロックコポリマーを溶解または分散後撹拌することによってポリマーミセルを調製することができる。その際、超音波、圧力、剪断力またはそれらを組み合せた物理的エネルギーを与えてもよい。また、ブロックコポリマーを揮発性の有機溶媒に溶解後、有機溶媒を揮発させて乾固し、そこに水性媒体を加えて撹拌し、超音波、圧力、剪断力またはそれらを組み合せた物理的エネルギーを与えるか、ブロックコポリマーに水性媒体を添加し、上記のごとき物理的エネルギーを与えることによって調製することができる。ここで揮発性の有機溶媒とは、メタノール、エタノール、アセトン、クロロホルム、アセトニトリル、テ卜ラヒドロフラン、ジクロロメタン等を挙げることができる。ここで水性媒体とは、水、生理食塩水、緩衝液等を挙げることができ、高分子ミセルの形成に影響を及ぼさない限り、少量の有機溶媒を含有してもよい。
【００５４】
本発明の一態様は、本発明のリガンドを含む組成物に関する。以下で「本発明の組成物」とも呼ぶ。本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、緩衝剤、賦形剤又はこれらの組み合わせをさらに含んでも良い。例えば本発明のリガンドが検出可能な標識を含む場合、本発明の組成物は癌の診断用又は検出用の組成物として使用することができる。また、例えば本発明のリガンドが抗癌剤を含む場合、本発明の組成物は癌の治療用組成物として使用することができる。本発明の組成物を生体内に投与する場合は、その投与経路は特に限定されないが、例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、関節内投与、腹腔内投与、眼内投与などが挙げられる。また、投与量は疾患の種類、対象の年齢、体重、性別などにより適宜選択される。
【００５５】
本明細書において「対象」とは、任意の哺乳動物のことである。「対象」としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダを挙げることができる。好ましくは、対象はヒトである。
【００５６】
本発明の一態様は、それを必要とする対象に、有効量の本発明のリガンドを投与することを含む、癌の診断又は検出方法であって、ここで前記リガンドは、少なくとも１つの検出可能な標識を含む、前記方法に関する。
【００５７】
本発明の一態様は、癌を診断又は検出するための、本発明のリガンドであって、少なくとも１つの検出可能な標識を含む、前記リガンドに関する。
【００５８】
本発明の一態様は、癌を診断又は検出するための医薬の製造のための、本発明のリガンドの使用であって、ここで前記リガンドは、少なくとも１つの検出可能な標識を含む、前記使用に関する。
【００５９】
本発明の一態様は、それを必要とする対象に、有効量の本発明のリガンドを投与することを含む、癌の治療方法であって、ここで前記リガンドは、少なくとも１つの抗癌剤を含む、前記方法に関する。
【００６０】
本発明の一態様は、癌を治療するための本発明のリガンドであって、少なくとも１つの抗癌剤を含む、前記リガンドに関する。
【００６１】
本発明の一態様は、癌を治療するための医薬の製造のための、本発明のリガンドの使用であって、ここで前記リガンドは、少なくとも１つの抗癌剤を含む、前記使用に関する。
【実施例】
【００６２】
以下に示す実施例及び比較例を参照して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の範囲は、実施例によって限定されるものでないことは言うまでもない。【００６３】
＜試薬＞
Ｎ−ε−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシン−Ｎ−カルボキシ無水物（Ｌｙｓ（ＴＦＡ）−ＮＣＡ）・・・中央化成
１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミン・・・Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）・・・関東化学
Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＢｚｌ・・・Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ
Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ・・・Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ
４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）・・・ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ
トリエチルアミン（ＴＥＡ）・・・関東化学
５Ｎ  ＨＣｌ・・・和光純薬
メタノール・・・関東化学
５Ｎ  ＮａＯＨ・・・和光純薬
酢酸  （ＡｃＯＨ）・・・和光純薬
Ｃｙ５−ＤＢＣＯ・・・Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ
ＮａＨＣＯ3・・・和光純薬
ＮａＣｌ・・・ＶＥＴＥＣ
Ｎ−メチルピロリドン  （ＮＭＰ）・・・関東化学
臭化リチウム（ＬｉＢｒ）・・・Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ
Ｄ−ＰＢＳ（−）（ＰＢＳ）・・・和光純薬
トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｔｒｐ）・・・Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）
ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）
ウシ胎児血清（Fetal bovine serum：ＦＢＳ）・・・Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）・・・Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ
ＥＧＭ（商標）−２ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）・・・Ｌｏｎｚａ
Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン（Ｂｚｌ−Ｓｅｒ）・・・東京化成工業
Ｌ−グルタミン（Ｇｌｎ）・・・和光純薬
抗ＡＳＣＴ２抗体（Ｈ−５２）・・・Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ
ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８）・・・ａｂｃａｍ
ウシ血清アルブミン（Bovine serum albumin：  ＢＳＡ）
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２・・・Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
ｐ−ホルムアルデヒド・・・和光純薬
トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）・・・Ｓｉｇｍａ
Ｔｗｅｅｎ２０・・・ＢＥＴＨＹＬ
ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ封入剤（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ）・・・ＶＥＣＴＯＲ
アセタール−ＰＥＧ−ＮＨ2（Ｍｗ：１０ｋＤａ）・・・日油
無水酢酸・・・和光純薬
Ｃｙ５−ＮＨ2・・・Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）・・・関東化学
２−ピコリンボラン（Ｐｉｃ−ＢＨ3）・・・和光純薬
ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ・・・Ｐｒｏｍｅｇａ
ヘパリン・・・和光純薬【００６４】
＜細胞種及び動物＞
Ｂｘ−ＰＣ３細胞（ヒト膵臓癌細胞株）
ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝臓癌細胞株）
ＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞株）
ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ  ヌードマウス（雌）・・・オリエンタル酵母【００６５】
＜測定機器及び解析ソフト＞
ＮＭＲ・・・Ｂｒｕｋｅｒ  ４００ＭＨｚ
ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）・・・Ｊａｓｃｏ（カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｉｎｃｒｅａｓｅ、検出器：ＵＶ２２０ｎｍ）
蛍光分光光度計（ＦＰ８３００）・・・Ｊａｓｃｏ
ｇｕａｖａ  ｅａｓｙ  Ｃｙｔｅ６−２Ｌ・・・ＭＥＲＣＫ，励起波長：６４２ｎｍ，吸収波長：６６１ｎｍ
共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＬＳＭ７１０）・・・ＺＥＩＳＳ
蛍光分光光度計（ＦＰ８３００）・・・Ｊａｓｃｏ
ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ・・・ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、励起波長：６４０ｎｍ、測定吸収波長：７００ｎｍ
ＺＥＮ２０１２・・・ＺＥＩＳＳ
ＩＭＡＬＩＳ・・・ＺＥＩＳＳ【００６６】
＜略称＞
以下の式（４）で表される化合物を、以下で「Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎ」とも呼ぶ。ポリリシンの側鎖のアミノ基がグルタミン酸のγ位カルボキシル基と縮合した構造をしている。また、ポリリシンの末端に、リンカーを介して蛍光色素であるＣｙ５が連結している。
【化１２】
2018037996.tif 000014
ここで、ｎ＝２５のものを「Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］２５」と呼び、ｎ＝４６のものを「Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］４６」と呼び、ｎ＝１０６のものを「Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６」と呼ぶ。【００６７】
以下の式（６）で表される化合物を、以下で「Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］ｎ」とも呼ぶ。Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎとの違いは、ポリリシンの側鎖のアミノ基がグルタミン酸のα位カルボキシル基と縮合した構造をしている点である。
【化１３】
2018037996.tif 000015
ここで、ｎ＝４６のものを「Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］４６」と呼び、ｎ＝１０６のものを「Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］１０６」と呼ぶ。【００６８】
ＤＭＥＭ ５００ｍｌに５０ｍｌ ＦＢＳ及び５ｍｌ ペニシリン−ストレプトマイシン(ＰＳ)を混合したものを、以下で単に「ＤＭＥＭ培地」と呼ぶ。また、ＲＰＭＩ ５００ｍｌに５０ｍｌ ＦＢＳ及び５ｍｌ ＰＳを混合したものを、以下で単に「ＤＭＥＭ培地」と呼ぶ。また、ＰＢＳ ５００ｍｌに５０ｍｌ ＦＢＳを混合したものを「ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ」と呼ぶ。【００６９】
実施例１
Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎ（ｎ＝２５、４６、１０６）の合成
（１）化合物（ｂ）（ｎ＝２５、４６、１０６）の合成
【化１４】
2018037996.tif 000016
ｎ＝１０６の場合、Ｌｙｓ（ＴＦＡ）−ＮＣＡ ２ｇ（１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミンに対して１００当量）をＡｒ置換したフラスコに入れ、蒸留したＤＭＳＯ ２０ｍｌに溶解させた。１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミンを１６ｕｌ加え、室温で３日間撹拌した。反応終了後、メタノールを用いて透析（ＭＷＣＯ：６〜８ｋＤａ）を４回行った後、減圧乾燥を行い、化合物（ｂ）（ｎ＝１０６）を回収した。ｎ＝４６の場合、及び２５の場合は、１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミンをそれぞれ３２ｕｌ、６４μｌ加えた以外は上記と同様にして化合物（ｂ）（ｎ＝４６、２５）を得た。収率はいずれにおいても約７５％だった。【００７０】
（２）化合物（ｃ）（ｎ＝２５、４６、１０６）の合成
【化１５】
2018037996.tif 000017
化合物（ｂ）（ｎ＝２５、４６、１０６）を、５Ｎ ＮａＯＨａｑ／ＭｅＯＨ（１／４（ｖｏｌ））２５ｍｌ中に溶解し、８時間撹拌した後、透析（ＭＷＣＯ：６〜８ｋＤａ、希塩酸溶液２回→純水２回）を行った。その後、凍結乾燥を行い、化合物（ｃ）（ｎ＝２５、４６、１０６）を回収した。収率はいずれにおいても約８０％だった。【００７１】
（３）化合物（ｄ）（ｎ＝２５、４６、１０６）の合成
【化１６】
2018037996.tif 000018
化合物（ｃ）（ｎ＝２５、４６、１０６）１００ｍｇ（１当量）とＢｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＢｚｌ ３６０ｍｇ（ｎ×１．５当量）、ＤＭＴ−ＭＭ ３２５ｍｇ（ｎ×１．５当量）をＤＭＳＯ／ＴＥＡ（１０／１（ｖｏｌ））に溶解させ、１日、常温で撹拌した。ＭｅＯＨ中で透析（ＭＷＣＯ：６〜８ｋＤａ）を４回行い、エバポレーターで溶媒を留去した後に減圧乾燥を行い、化合物（ｄ）（ｎ＝２５、４６、１０６）を回収した。収率はいずれにおいても約７０％だった。【００７２】
（４）化合物（ｅ）（ｎ＝２５、４６、１０６）の合成
【化１７】
2018037996.tif 000019
化合物（ｄ）（ｎ＝２５、４６、１０６）を１Ｎ ＮａＯＨ／ＭｅＯＨ（１／１（ｖｏｌ．））１０ｍｌに溶解させ、常温で１８時間撹拌した。撹拌後、ＭｅＯＨを用いて透析（ＭＷＣＯ：６〜８ｋＤａ）を４回行い、エバポレーターで溶媒を留去した後、減圧乾燥を行い、脱ベンジル体を回収した。収率はいずれにおいても約８５％だった。【００７３】
上記脱ベンジル体を3 Ｎ ＨＣｌ／ＡｃＯＨ（１／１（ｖｏｌ））１５ｍｌに溶解し、常温で１８時間撹拌した。撹拌後、純水を用いて透析（ＭＷＣＯ：６〜８ｋＤａ）を４回行い、凍結乾燥で水を除去し、化合物（ｅ）（ｎ＝２５、４６、１０６）を回収した。収率はいずれにおいても約８５％だった。得られた化合物（ｅ）（ｎ＝２５、４６、１０６）のＧＰＣスペクトルデータを図１７に示す。【００７４】
化合物（ｅ）（ｎ＝２５）
【化１８】
2018037996.tif 000020
【００７５】
化合物（ｅ）（ｎ＝４６）
【化１９】
2018037996.tif 000021
【００７６】
化合物（ｅ）（ｎ＝１０６）
【化２０】
2018037996.tif 000022
【００７７】
（５）Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎ（ｎ＝２５、４６、１０６）の合成
【化２１】
2018037996.tif 000023
化合物（ｅ）（ｎ＝２５、４６、１０６）（１．７当量）とＣｙ５−ＤＢＣＯ／ＤＭＳＯ（５ｍｇ／ｍｌ）２００μｌ（１当量）を、１０ｍＭ ＮａＨＣＯ3、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍｌに溶解させ、常温で一晩撹拌した。撹拌後、純水を用いて透析（ＭＷＣＯ：６〜８ｋＤａ）を４回行った後、凍結乾燥をした。その後ＰＤ−１０カラム（溶媒は１Ｍ ＮａＣｌ）で未反応のＣｙ５−ＤＢＣＯを除去した後、水中で透析（ＭＷＣＯ：６〜８ｋＤａ）を３回行った。最後に凍結乾燥を行いＣｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎ（ｎ＝２５、４６、１０６）を回収した。収率はいずれにおいても約６５％だった。得られた化合物の蛍光スペクトルを図１８に示す。【００７８】
比較例１
Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］（ｎ＝４６、１０６）の合成
（１）化合物（ｆ）（ｎ＝４６、１０６）の合成
【化２２】
2018037996.tif 000024
Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＢｚｌの代わりにＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯＨを用いて、実施例１（３）及び（４）と同様の方法により調製した。【００７９】
化合物（ｆ）（ｎ＝４６）
【化２３】
2018037996.tif 000025
【００８０】
化合物（ｆ）（ｎ＝１０６）
【化２４】
2018037996.tif 000026
（２）Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］（ｎ＝４６、１０６）の合成
化合物（ｆ）（ｎ＝４６、１０６）を用いて、実施例１（５）と同様の方法により調製した。得られた化合物の蛍光スペクトルを図１９に示す。【００８１】
比較例２
Ｃｙ５−ＰＥＧ−Ａｃの合成
アセタール−ＰＥＧ−ＮＨ2（Ｍｗ：１０ｋＤａ）をＤＭＦ中で無水酢酸と反応させ、アミノ基をアセチル基で保護した。その後、０．１Ｎ ＨＣｌ中でアセタール基を脱保護し、アルデヒド基とした。その後、このポリマーとＣｙ５−ＮＨ2および還元剤Ｐｉｃ−ＢＨ3をＭｅＯＨ／酢酸（１０／１（ｖｏｌ））中で反応させ、Ｃｙ５を還元的アミノ化により導入することでＣｙ５−ＰＥＧ−Ａｃを調製した。【００８２】
実施例２
リガンドと所定時間接触させた際の細胞内取り込み量の変化
実施例１で合成した化合物がリガンド機能を示すか否かを評価するため、グルタミントランスポーターであるＡＳＣＴ２が過剰発現している癌細胞種（ＢｘＰＣ−３細胞）と実施例１、比較例１及び２の化合物を所定時間接触させた際の取り込み量の変化を、フローサイトメトリーによって細胞内の蛍光強度から評価を行った。【００８３】
Ｂｘ−ＰＣ３細胞をＲＰＭＩ培地に懸濁させ、１．２５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液４００μｌを２４ウェルプレートに播き（１ウェル当たり５．０×１０4ｃｅｌｌｓ）、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を除去後、ＰＢＳで１回洗浄した後、実施例１で合成したＣｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］４６及びＣｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６、比較例１で合成したＣｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］４６及びＣｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］１０６、並びにＣｙ５−ＰＥＧ−Ａｃを、１０μＭの濃度で４００μｌ加え、３７℃で１、２、４、６、８、１２又は２４時間インキュベートした。所定時間インキュベートした後、溶液を除去してＰＢＳで洗浄を２回行い、Ｔｒｐを１５０μｌ加え３７℃で７分間インキュベートした後、ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳを１５０μｌ加えてフローサイトメーター（ＦＣＭ）で測定した。【００８４】
各高分子リガンドと所定時間接触させた際の取り込み量の変化を図１に示す。Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６は８時間、Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］４６は１２時間で取り込み量が一定に達したことが確認された。これはＣｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６がＣｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］４６と比べて細胞との結合力が強いため取り込まれやすく、短時間で取り込み量が飽和に達したと考えられる。一方、Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］４６及びＣｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］１０６では、２４時間まで取り込み量が増加し続けているが、これは細胞との結合力が弱く、取り込み量が２４時間では飽和に達しないためと考えられる。【００８５】
実施例３
異なる細胞種に対する細胞内取り込み量の評価
Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎの標的であるＡＳＣＴ２は、種々の癌細胞に過剰発現しており、特に膵臓癌細胞と肝臓癌細胞での過剰発現が報告されている。Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎの膵臓癌細胞（Ｂｘ−ＰＣ３）におけるリガンド能評価は、実施例２で確認されたが、肝臓癌細胞においても同様にリガンド能を示すのかを確認するため、及び正常細胞と比較して取り込み量に差異が生じるかを確認するため、Ｂｘ−ＰＣ３（膵臓癌細胞）、ＨｅｐＧ２（肝臓癌細胞）、ＨＵＶＥＣ細胞（正常細胞）を用いて、リガンドの取り込み量の評価を行った。【００８６】
Ｂｘ−ＰＣ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＵＶＥＣ細胞をそれぞれの培地（Ｂｘ−ＰＣ３細胞はＲＰＭＩ培地、ＨｅｐＧ２細胞はＤＭＥＭ培地、ＨＵＶＥＣ細胞はＥＧＭ（商標）−２ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標））に懸濁させ、１．２５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液４００μｌを２４ウェルプレートに播き（１ウェル当たり５．０×１０4ｃｅｌｌｓ）、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を除去後、ＰＢＳで１回洗浄した後、Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎ（ｎ＝４６及び１０６）、Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］ｎ（ｎ＝４６及び１０６）及びＣｙ５−ＰＥＧ−Ａｃを、それぞれ１μＭの濃度で４００μｌ加え、３７℃で１時間あるいは６時間インキュベートした。所定時間のインキュベート後、溶液を除去してＰＢＳで洗浄を２回行い、Ｔｒｐを１５０μｌ加え３７℃で７分間インキュベートした後、ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳを１５０μｌ加えてフローサイトメーター（ＦＣＭ）で測定した。結果を図２及び３に示す。【００８７】
インキュベーションを１時間行った場合、癌細胞（Ｂｘ−ＰＣ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞）及び正常細胞（ＨＵＶＥＣ細胞）のいずれにおいても、Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎ（ｎ＝４６及び１０６）は、Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］ｎ（ｎ＝４６及び１０６）及びＣｙ５−ＰＥＧ−Ａｃと比較して取り込み量が多かった。【００８８】
インキュベーションを６時間行った場合、癌細胞（Ｂｘ−ＰＣ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞）では、Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎ（ｎ＝４６及び１０６）は、Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］ｎ（ｎ＝４６及び１０６）及びＣｙ５−ＰＥＧ−Ａｃと比較して取り込み量が多かった。一方、正常細胞（ＨＵＶＥＣ細胞）では、癌細胞における高分子リガンドの取り込みと比較して、高分子リガンドの取り込み量に差が認められなかった。この事から、正常細胞と癌細胞で取り込みに違いがあることが明らかとなった。【００８９】
実施例４
阻害剤を添加した場合における、高分子リガンドの細胞内取り込み量の変化
本実験では、ＡＳＣＴ２を含むシステムＡＳＣトランスポーターの阻害剤として用いられるＢｚｌ−Ｓｅｒ、システムＮのトランスポーターの阻害剤として用いられているグルタミン（Ｇｌｎ）の２種類を阻害剤として用いて、高分子リガンドの取り込み量の評価を行った。【００９０】
Ｂｘ−ＰＣ３細胞をＲＰＭＩ培地（ＨｅｐＧ２細胞はＤＭＥＭ培地、ＨＵＶＥＣ細胞はＥＧＭ（商標）−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標））に懸濁し、１．２５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液４００μｌを２４ウェルプレートに播き（１ウェル当たり５．０×１０4ｃｅｌｌｓ）、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を除去後、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳに溶解させた５０ｍＭ Ｂｚｌ−Ｓｅｒ溶液および５０ｍＭ Ｇｌｎ溶液、ＰＢＳ＋１０％ ＦＢＳ溶液をそれぞれ３５０μｌ播き、３７℃で１時間インキュベートした。Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］４６、Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６、Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］４６、Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］１０６、及びＣｙ５−ＰＥＧ−Ａｃを、それぞれの溶液に０．３ｍｇ／ｍｌの濃度で１５０μｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした。所定時間のインキュベート後、溶液を除去してＰＢＳで洗浄を２回行い、Ｔｒｐを１５０μｌ加え３７℃で７分間インキュベートした後、ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳを１５０μｌ加えてフローサイトメーター（ＦＣＭ）で測定した。【００９１】
ＢｘＰＣ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞及びＨＵＶＥＣ細胞を用いた場合における、阻害剤の添加によるリガンドの取り込み率の変化をそれぞれ図４〜６に示す。なお、取り込み率は細胞を高分子リガンド溶液中でインキュベーションした際の蛍光強度を１００％として算出した。【００９２】
Ｂｚｌ−Ｓｅｒは、ＡＳＣＴ２などのシステムＡＳＣと結合する。またＧｌｎは、ＳＮＡＴ５などのシステムＮと結合する。Ｂｚｌ−Ｓｅｒ溶液を添加した場合において、癌細胞（Ｂｘ−ＰＣ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞）へのＣｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］４６及びＣｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６の取り込み量は大幅に減少した（図４及び５）。また、Ｂｚｌ−Ｓｅｒ溶液を添加した場合において、Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］４６及びＣｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］１０６の取り込み量も減少した。一方、Ｇｌｎ溶液を添加した場合では、Ｂｚｌ−Ｓｅｒ溶液を添加した場合と比較してリガンドの取り込み量は減少しなかった。また、非特異的吸着によって細胞内に取り込まれるＣｙ５−ＰＥＧ−Ａｃにおいては、Ｂｚｌ−Ｓｅｒ溶液を添加した場合及びＧｌｎ溶液を添加した場合のいずれにおいても、取り込み量の減少は見られなかった。【００９３】
実施例５
抗ＡＳＣＴ２抗体（Ｈ−５２）による高分子リガンドの取り込み阻害実験
Ｂｘ−ＰＣ３細胞をＲＰＭＩ培地に懸濁させ、１．２５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液４００μｌを２４ウェルプレートに播き（１ウェル当たり５．０×１０4ｃｅｌｌｓ）、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を除去後、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳで１／２５倍に抗ＡＳＣＴ２抗体を希釈させた抗体溶液およびＰＢＳを１６０μｌ各ウェルに播き、３７℃、８０分インキュベートした。インキュベート後、Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎ（ｎ＝４６、１０６）、Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］ｎ（ｎ＝４６、１０６）及びＣｙ−ＰＥＧをそれぞれ、各溶液に０．３ｍｇ／ｍｌ、８０μｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした。所定時間のインキュベート後、溶液を除去してＰＢＳで洗浄を２回行い、Ｔｒｐを１５０μｌ加え、３７℃、７分間インキュベートした後、ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳを１５０μｌ加えてセルストレーナーを通し、フローサイトメーター（ＦＣＭ）で測定した。結果を図７に示す。【００９４】
抗ＡＳＣＴ２抗体（Ｈ−５２）によって、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎ（ｎ＝４６、１０６）及びＣｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］ｎ（ｎ＝４６、１０６）の取り込みは阻害された。一方、非特異的吸着によって細胞内に取り込まれるＣｙ−ＰＥＧについては、取り込みが阻害されなかった。また、システムＡＳＣトランスポーター阻害剤であるＢｚｌ−Ｓｅｒより阻害率が低いのは、抗ＡＳＣＴ２抗体（Ｈ−５２）はＡＳＣＴ２のＧｌｎ認識部位と結合しているわけではなく、ＡＳＣＴ２の一部と結合しているため、リガンド高分子を立体構造的に阻害しているだけであり、認識部位の阻害ではないからであると推察される。実際に、５０ｍＭ Ｂｚｌ−Ｓｅｒ溶液中とＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ中でインキュベーションしたＢｘ−ＰＣ３細胞の抗体標識は差が見られなかった。【００９５】
実施例６
低温中における細胞内取り込み量の変化
Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎは比較的大きな分子のため、細胞膜上のＡＳＣＴ２と結合した後、主にエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれると推察される。それを確かめるべく、エンドサイトーシスが抑制される低温中（４℃）における高分子リガンドの取り込み量を、エンドサイトーシスが働く３７℃での取り込み量と比較した。【００９６】
Ｂｘ−ＰＣ３細胞をＲＰＭＩ培地に懸濁させ、１．２５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液４００μｌを２４ウェルプレートに播き（１ウェル当たり５．０×１０4ｃｅｌｌｓ）、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を除去後、ＰＢＳで１回洗浄した後、Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎ（ｎ＝４６及び１０６）、Ｃｙ５-Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］ｎ（ｎ＝４６及び１０６）及びＣｙ５−ＰＥＧ−Ａｃを、１０μＭの濃度で４００μｌ加え、３７℃および４℃で１時間インキュベートした。なお、４℃でインキュベートを行うウェルは、培地を除去する前、４℃で１０分間静置した。所定時間インキュベート後、溶液を除去してＰＢＳで洗浄を２回行い、Ｔｒｐを１５０μｌ加え３７℃、７分間インキュベートした後、ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳを１５０μｌ加えてフローサイトメーター（ＦＣＭ）で測定した。結果を図８に示す。【００９７】
４℃でインキュベートした際、すべての高分子リガンドにおいて取り込み量が大幅に減少することが確認された。４℃の状態では、ＡＴＰ合成酵素の働きが鈍くなり、ＡＴＰによって駆動しているエンドサイトーシスが抑制される。よって、細胞膜表面のトランスポーターなどに結合した高分子リガンドは、細胞膜ごと大きな小胞に包まれ、初期エンドソームからリソソームに移行して細胞内に取り込むエンドサイトーシスを介していることが示唆された。Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎは、ＡＳＣＴ２によって取り込まれるのではなく、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれていると推測される。【００９８】
実施例７
重合度の異なるリガンドを用いた場合における細胞内取り込み量の評価
本実験では、重合度の異なるリガンドを用いた場合における細胞への取り込み能を評価するため、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］２５、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］４６及びＣｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６を用いて評価を行った。【００９９】
Ｂｘ−ＰＣ３細胞をＲＰＭＩ培地に懸濁し、１．２５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液４００μｌを２４ウェルプレートに播き（１ウェル当たり５．０×１０4ｃｅｌｌｓ）、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を除去後、ＰＢＳで１回洗浄した後、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎ（ｎ＝２５、４６、１０６）及びＣｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］１０６を、それぞれ１０μＭで４００μｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした。所定時間のインキュベート後、溶液を除去してＰＢＳで洗浄を２回行い、Ｔｒｐを１５０μｌ加え３７℃で７分間インキュベートした後、ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳを１５０μｌ加えてフローサイトメーター（ＦＣＭ）で測定した。ＨｅｐＧ２細胞を用いた実験は、ＤＭＥＭ培地を用いて行った以外は上記と同様にして行った。結果を図９及び１０に示す。【０１００】
Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６とＣｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］４６とを比較すると、重合度の高いＣｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６の方が取り込み量は多い。一方。Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］４６とＣｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］２５とを比較すると、両者の取り込み量に大きな違いは観察されなかった。【０１０１】
実施例７
共焦点レーザー顕微鏡(Confocal Laser Scanning Microscope: CLSM)を用いた細胞内取り込み評価
インキュベーション温度を変えた際の高分子リガンドの細胞への取り込みを、ＣＬＳＭを用いて評価した。Ｂｘ−ＰＣ３細胞をＲＰＭＩ培地に懸濁させ、１．２５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液２００μｌを８ウェルグラスディッシュに播き（１ウェル当たり１．０×１０4ｃｅｌｌｓ）、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を除去後、ＰＢＳで１回洗浄した後、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６を１μＭの濃度で２００μｌ加え、３７℃および４℃で１時間インキュベートした。なお、４℃でインキュベートを行うディッシュは培地除去前、４℃で１０分間静置した。所定時間インキュベート後、溶液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、４％ｐ−ホルムアルデヒドを加え、３分静置後、除去し、ＰＢＳで１回洗浄した。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、５％ＢＳＡ溶液を加え、１０分静置して、ブロッキングをした。ブロッキング後、ＰＢＳで１回洗浄を行った。その後、１％ＢＳＡで５０倍に希釈した抗ＡＳＣＴ２抗体溶液を各ウェルに７０μｌ加え、常温で２時間静置した。溶液を除去後、ＰＢＳで３回洗浄を経て、ＰＢＳで８００倍に希釈したＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８溶液を１００μｌ加え、常温で１時間静置した。溶液を除去後、ＰＢＳで３回洗浄を経て、ＰＢＳで１０００倍に希釈したＨｏｅｃｈｓｔ溶液を加え、３分常温で静置した。Ｈｏｅｃｈｓｔ溶液を除去後、ＰＢＳで１回洗浄を経てＰＢＳ２００μｌ、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤを１滴加えＣＬＳＭで観察した。ＣＬＳＭ測定は６３倍レンズを用い、検出は４０５ｎｍ（Ｄｉｏｄｅ  ＣＷ／Ｐｕｌｓｅ）、４８８ｎｍ（Ａｒレーザー）、６４０ｎｍ（ＨｅＮｅレーザー）を用いた。そのＣＬＳＭ画像を解析ソフトＩＭＡＬＩＳで３Ｄモデル化した。結果を図１１〜１４に示す。【０１０２】
３７℃において、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６由来であるＣｙ５（赤）は、細胞内に存在していることが確認された（図１１及び１２）。また、抗ＡＳＣＴ２抗体の二次抗体であるＤｙＬｉｇｈｔ４８８（緑）の蛍光から、ＡＳＣＴ２は細胞膜の内側全体に分布していることが確認された（図１１及び１２）。【０１０３】
４℃において、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６由来であるＣｙ５（赤）は、細胞表面に多く存在していることが確認された。また、ＡＳＣＴ２由来であるＤｙＬｉｇｈｔ４８８（緑）は、細胞膜表面に多く存在していることが確認された（図１３及び１４）。これらの結果から、４℃においてエンドサイト―シスが抑制され、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６の取り込みも抑制されていると考えられる。【０１０４】
実施例８
高分子リガンドの腫瘍滞留率の評価
ヌードマウスにＢｘＰＣ３細胞とＨｅｐＧ２細胞の懸濁液それぞれを皮下移植した。細胞懸濁液の条件は１．０×１０8ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、５０μｌである。ＨｅｐＧ２およびＢｘＰＣ３皮下移植マウスの腫瘍の大きさが２００ｍｍ3に成長した後に、腫瘍部分に、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎ（ｎ＝４６、１０６）及びＣｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］ｎ（ｎ＝４６、１０６）、４０μＭ（Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６及びＣｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］１０６は１．２ｍｇ／ｍｌ、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］４６及びＣｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］４６は０．６ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ２０μｌ投与した。投与してから３０分後を０時間として、０、８、２４、４８時間後にＩＶＩＳで腫瘍部分の蛍光強度を測定した。蛍光強度は腫瘍部分の面積当たりのＲａｄｉａｎｔ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙから算出した（励起波長：６４０ｎｍ、吸収波長：７００ｎｍ）。結果を図１５及び１６に示す。【０１０５】
２４時間以降において、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］ｎ（ｎ＝４６、１０６）は、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（α−Ｇｌｕ）］ｎ（ｎ＝４６、１０６）に比べて高い腫瘍滞留率を示した。ここで、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］１０６と、Ｃｙ５−Ｐ［Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）］４６とで腫瘍滞留率にほとんど差が見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明のリガンドを用いることで、あらゆる癌を選択的にターゲティングすることができる。本発明のリガンドと薬物とを複合化することで、癌のターゲティング治療に有効に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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