(57)【要約】  多能性幹細胞の由来に関わらず、前記多能性幹細胞の株間又はクローン間のばらつきを解消し、胚様体を形成させずに多能性幹細胞を均一に神経幹細胞に分化させる方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の由来に関わらず、前記多能性幹細胞の株間又はクローン間のばらつきを解消し、胚様体を形成させずに多能性幹細胞を均一に神経幹細胞に分化させる方法。
【請求項２】
前記多能性幹細胞をＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ２（ＦＧＦ２）、Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）阻害剤及びＬｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を有効成分として含有する培地中で培養する工程を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養する工程を低酸素条件下で行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養する工程の前に、前記多能性幹細胞を細胞１個ずつに解離させる工程を更に備える、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性幹細胞が血球由来の人工多能性幹細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記人工多能性幹細胞がＴ細胞由来である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法に使用するための、ＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤及びＬＩＦを有効成分として含有する培地。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法で作製された神経幹細胞。
【請求項９】
前脳マーカー、及び前脳／中脳マーカーを発現している、請求項８に記載の神経幹細胞。
【請求項１０】
Ｈｏｍｅｏｂｏｘ  Ｂ４（ＨＯＸＢ４）を実質的に発現していない、請求項８又は９に記載の神経幹細胞。
【請求項１１】
Ｔ細胞受容体遺伝子が再編成している、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の神経幹細胞。
【請求項１２】
多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる効率を向上させる方法であって、多能性幹細胞をＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤及びＬＩＦを有効成分として含有する培地中で培養する工程を備える、方法。
【請求項１３】
前記多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる、向上された効率が、皮膚繊維芽細胞由来の人工多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる効率と同等の効率である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養する工程を低酸素条件下で行う、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養する工程の前に、前記多能性幹細胞を細胞１個ずつに解離させる工程を更に備える、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記多能性幹細胞が血球由来の人工多能性幹細胞である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記人工多能性幹細胞がＴ細胞由来である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法に使用するための、ＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤及びＬＩＦを有効成分として含有する培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の神経幹細胞への分化用培地及びその使用に関する。より詳細には、多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる方法、多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる効率を向上させる方法、多能性幹細胞の神経幹細胞への分化用培地、神経幹細胞の製造方法及び神経幹細胞に関する。本願は、２０１６年２月１６日に、日本に出願された特願２０１６−０２７３２４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
神経疾患の研究は、患者の中枢神経を解析することが困難であることから、主に動物モデル及び不死化した神経細胞株を用いて研究されてきた。そして、近年の人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、以下、「ｉＰＳＣ」という場合がある。）技術の進歩により、患者特異的な培養神経細胞を神経疾患モデルとして利用することが可能になりつつある。【０００３】
患者特異的なｉＰＳＣは、従来、主に皮膚繊維芽細胞から作製されてきた。しかしながら、患者由来の皮膚繊維芽細胞株を得るためには皮膚の採取が必要であり、出血、感染、傷跡が残る等の問題を伴う。このため、患者特異的なｉＰＳＣは、より低侵襲な手法により作製することが好ましい。【０００４】
そこで、低侵襲な手法により採取することができる末梢血細胞からｉＰＳＣを作製する技術が検討されている。例えば、ＣＤ３陽性Ｔ細胞は、センダイウイルスベクターを用いて効果的にｉＰＳＣにリプログラムすることができることが報告されている（例えば非特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Seki T., et al., Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells., Cell Stem Cell, 7 (1), 11-14, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＣＤ３陽性Ｔ細胞は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体でコートしたプレート上で、組み換えインターロイキン（ＩＬ）−２の存在下で培養することができ、凍結保存することも可能である。このため、ＣＤ３陽性Ｔ細胞は、患者特異的なｉＰＳＣを作製する材料として理想的なもののひとつである。【０００７】
しかしながら、発明者らは、Ｔ細胞由来のｉＰＳＣは、皮膚繊維芽細胞由来のｉＰＳＣと比較して、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ、ＥＢ）形成を介した従来の分化誘導法では、神経系に分化させにくいことを見出した。【０００８】
また、ｉＰＳ細胞の株によりＥｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｍｏｒｙの残存の程度が異なっている。このため、従来の神経分化誘導方法では複数のｉＰＳ細胞株を同程度の効率で神経幹細胞、更には神経細胞に分化させることは困難であった。特にＥｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｍｏｒｙの残存が神経分化抵抗性の主たる要因となっている、血球系細胞由来のｉＰＳ細胞においては、ｉＰＳ細胞の株間の分化誘導効率を均一化させることは極めて困難な課題であった。【０００９】
そこで、本発明は、多能性幹細胞の株間における誘導効率のばらつきを解消し、多能性幹細胞を胚様体を介することなく短期間で効率よく神経幹細胞に分化誘導させる技術を提供することを目的とする。さらに、本発明は、血球由来多能性幹細胞からも、胚様体を介することなく短期間で効率よく神経幹細胞に分化誘導させる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下の態様を含む。
［１］多能性幹細胞の由来に関わらず、前記多能性幹細胞の株間又はクローン間のばらつきを解消し、胚様体を形成させずに多能性幹細胞を均一に神経幹細胞に分化させる方法。
［２］前記多能性幹細胞をＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ２（ＦＧＦ２）、Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）阻害剤及びＬｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を有効成分として含有する培地中で培養する工程を備える、［１］に記載の方法。
［３］前記培養する工程を低酸素条件下で行う、［２］に記載の方法。
［４］前記培養する工程の前に、前記多能性幹細胞を細胞１個ずつに解離させる工程を更に備える、［２］又は［３］に記載の方法。
［５］前記多能性幹細胞が血球由来の人工多能性幹細胞である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記人工多能性幹細胞がＴ細胞由来である、［５］に記載の方法。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載の方法に使用するための、ＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤及びＬＩＦを有効成分として含有する培地。
［８］［１］〜［６］のいずれかに記載の方法で作製された神経幹細胞。
［９］前脳マーカー、及び前脳／中脳マーカーを発現している、［８］に記載の神経幹細胞。
［１０］Ｈｏｍｅｏｂｏｘ  Ｂ４（ＨＯＸＢ４）を実質的に発現していない、［８］又は［９］に記載の神経幹細胞。
［１１］Ｔ細胞受容体遺伝子が再編成している、［８］〜［１０］のいずれかに記載の神経幹細胞。
［１２］多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる効率を向上させる方法であって、多能性幹細胞をＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤及びＬＩＦを有効成分として含有する培地中で培養する工程を備える、方法。
［１３］前記多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる、向上された効率が、皮膚繊維芽細胞由来の人工多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる効率と同等の効率である、［１２］に記載の方法。
［１４］前記培養する工程を低酸素条件下で行う、［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１５］前記培養する工程の前に、前記多能性幹細胞を細胞１個ずつに解離させる工程を更に備える、［１２］〜［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］前記多能性幹細胞が血球由来の人工多能性幹細胞である、［１２］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］前記人工多能性幹細胞がＴ細胞由来である、［１６］に記載の方法。
［１８］［１２］〜［１７］のいずれかに記載の方法に使用するための、ＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤及びＬＩＦを有効成分として含有する培地。【００１１】
［Ａ１］ＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤及びＬＩＦを有効成分として含有する、多能性幹細胞の神経幹細胞への分化用培地。
［Ａ２］前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［Ａ１］に記載の分化用培地。
［Ａ３］多能性幹細胞を［Ａ１］又は［Ａ２］に記載の培地中で培養する工程を備える、神経幹細胞の製造方法。
［Ａ４］前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［Ａ３］に記載の製造方法。
［Ａ５］前記培養する工程を低酸素環境下で行う、［Ａ３］又は［Ａ４］に記載の製造方法。
［Ａ６］前記培養する工程の前に、前記多能性幹細胞を細胞１個ずつに解離させる工程を更に備える、［Ａ３］〜［Ａ５］のいずれかに記載の製造方法。
［Ａ７］ＨＯＸＢ４を実質的に発現していない神経幹細胞。
［Ａ８］Ｔ細胞受容体遺伝子が再編成している、［Ａ７］に記載の神経幹細胞。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、多能性幹細胞を胚様体を介することなく、したがって簡便に効率よく短期間に神経幹細胞に分化誘導させる技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】従来法によるｉＰＳＣの神経幹細胞への分化の手順を示す図である。
【図２】（ａ）は、実験例２において皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳＣ（ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ）から形成された神経幹細胞塊の代表的な写真である。（ｂ）は、実験例２においてＴｉＰＳＣから形成された神経幹細胞塊の代表的な写真である。
【図３】実験例２で形成された神経幹細胞隗の数を測定した結果を示すグラフである。
【図４】新たな方法によるｉＰＳＣの神経幹細胞への分化の手順を示す図である。
【図５】（ａ）は、実験例３においてａＨＤＦ−ｉＰＳＣから形成された神経幹細胞塊の代表的な写真である。（ｂ）は、実験例３においてＴ細胞由来ｉＰＳＣ（ＴｉＰＳＣ）から形成された神経幹細胞塊の代表的な写真である。
【図６】実験例３で形成された神経幹細胞隗の数を測定した結果を示すグラフである。
【図７】実験例４で形成された神経幹細胞隗の数を測定した結果を示すグラフである。
【図８】（ａ）は、実験例５において、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させ、アストロサイトマーカーであるＧＦＡＰに対する抗体で蛍光免疫染色した結果を示す代表的な写真である。（ｂ）は、（ａ）と同視野の細胞を、ニューロンマーカーであるＴｕｊ１に対する抗体及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で更に染色した結果を示す写真である。（ｃ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞において、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色された細胞に対する、抗Ｔｕｊ１抗体で染色された細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。（ｄ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞において、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色された細胞に対する、抗ＧＦＡＰ抗体で染色された細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。
【図９】（ａ）は、実験例５において、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させ、ニューロンマーカーであるＭＡＰ２に対する抗体で蛍光免疫染色した結果を示す代表的な写真である。（ｂ）は、（ａ）と同視野の細胞を、別のニューロンマーカーであるＴｕｊ１に対する抗体及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で更に染色した結果を示す写真である。（ｃ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞において、抗Ｔｕｊ１抗体で染色された細胞に対する、抗ＭＡＰ２抗体で染色された細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】（ａ）は、実験例５において、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させ、ドーパミン作動性ニューロンマーカーであるｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＴＨ）に対する抗体で蛍光免疫染色した結果を示す代表的な写真である。（ｂ）は、（ａ）と同視野の細胞を、ニューロンマーカーであるＭＡＰ２に対する抗体及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で更に染色した結果を示す写真である。（ｃ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞において、抗ＭＡＰ２抗体で染色された細胞に対する、抗ＴＨ抗体で染色された細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。
【図１１】（ａ）は、実験例５において、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）に対する抗体で蛍光免疫染色した結果を示す代表的な写真である。（ｂ）は、（ａ）と同視野の細胞を、ニューロンマーカーであるＭＡＰ２に対する抗体及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で更に染色した結果を示す写真である。（ｃ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞において、抗ＭＡＰ２抗体で染色された細胞に対する、抗ＧＡＢＡ抗体で染色された細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。
【図１２】（ａ）は、実験例５において、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させ、抗ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ抗体、抗ＭＡＰ２抗体及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した結果を示す代表的な写真である。（ｂ）は、（ａ）と同視野の細胞を、ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  １（ｖＧＬＵＴ１）に対する抗体、抗ＭＡＰ２抗体及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した結果を示す写真である。（ｃ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞において、抗ＭＡＰ２抗体で染色された細胞に対する、抗ｖＧＬＵＴ１抗体で染色された細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［多能性幹細胞を直接神経幹細胞に分化させる方法］
１実施形態において、本発明は、多能性幹細胞の由来に関わらず、前記多能性幹細胞の株間又はクローン間のばらつきを解消し、胚様体を形成させずに多能性幹細胞を均一に神経幹細胞に分化させる方法を提供する。
【００１５】
本実施形態の方法において、多能性幹細胞は生体由来の多能性幹細胞であってもよく、人工多能性幹細胞であってもよい。本明細書において、「多能性幹細胞の由来に関わらず」とは、多能性幹細胞が由来する組織、人工多能性幹細胞の樹立方法、人工多能性幹細胞の樹立に用いるベクター、（人工）多能性幹細胞の培養方法等に関わらず、多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させることができることを意味する。
【００１６】
また、多能性幹細胞の株間又はクローン間のばらつきを解消し、均一に神経幹細胞に分化させるとは、多能性幹細胞の株間又はクローン間に、Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｍｏｒｙの残存の程度等のばらつきが存在する場合であっても、同程度の効率で多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させることができることを意味する。
【００１７】
従来は、多能性幹細胞の由来によっては神経幹細胞への分化効率が低い場合があった。これに対し、実施例において後述するように、本実施形態の方法によれば、多能性幹細胞の由来に関わらず、株間又はクローン間のばらつきを解消して均一に多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させることができる。
【００１８】
後述するように、本実施形態の方法は、多能性幹細胞をＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤及びＬＩＦを有効成分として含有する培地中で培養する工程を備えることが好ましい。
【００１９】
［多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる効率を向上させる方法］
１実施形態において、本発明は、多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる効率を向上させる方法であって、多能性幹細胞をＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤及びＬＩＦを有効成分として含有する培地中で培養する工程を備える、方法を提供する。
【００２０】
皮膚繊維芽細胞由来の人工多能性幹細胞は神経幹細胞への分化効率が比較的高いことが知られている。これに対し、従来、多能性幹細胞の由来によっては神経幹細胞への分化効率が低い場合があった。
【００２１】
実施例において後述するように、本実施形態の方法によれば、多能性幹細胞が皮膚繊維芽細胞由来の人工多能性幹細胞以外の多能性幹細胞である場合であっても、多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる効率を、皮膚繊維芽細胞由来の人工多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる効率と同程度の効率に向上させることができる。
【００２２】
また、本実施形態の方法によれば、従来の、胚様体を形成させて多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる方法と比較して、皮膚繊維芽細胞由来の人工多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる効率も向上させることができる。
【００２３】
後述するように、本実施形態の方法は、多能性幹細胞をＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤及びＬＩＦを有効成分として含有する培地中で培養する工程を備えることが好ましい。
【００２４】
［分化用培地］
１実施形態において、本発明は、ＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤及びＬＩＦを有効成分として含有する、多能性幹細胞の神経幹細胞への分化用培地を提供する。
【００２５】
実施例において後述するように、本実施形態の培地によれば、多能性幹細胞を効率よく神経幹細胞に分化させることができる。より具体的には、本実施形態の培地で培養することにより、従来法では神経系に分化させにくいＴ細胞由来ｉＰＳＣ（Ｔ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉＰＳＣ、以下、「ＴｉＰＳＣ」という場合がある。）を、皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳＣ（ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉＰＳＣ、以下、「ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ」という場合がある。）と同程度の効率で神経幹細胞に分化させることができる。また、本発明は不死化リンパ芽球様細胞株にも適用することができる。
【００２６】
このため、例えば、より低侵襲で採取することが可能な末梢血細胞から作製したｉＰＳＣを用いて神経系の細胞を作製し、神経疾患モデルとして利用することができる。
【００２７】
本実施形態の培地は、多能性幹細胞の由来に関わらず、胚様体を形成させずに多能性幹細胞を直接神経幹細胞に均一に分化させる用途に用いることができる。あるいは、本実施形態の培地は、多能性幹細胞（但し、皮膚繊維芽細胞由来の人工多能性幹細胞を除く。）を神経幹細胞に分化させる効率を向上させる用途に用いることができる。
【００２８】
本実施形態の培地において、分化させる対象の多能性幹細胞がヒト由来の細胞である場合には、ＦＧＦ２及びＬＩＦはヒト由来であることが好ましく、ＲＯＣＫ阻害剤もヒトＲＯＣＫを対象とするものが好ましい。また、例えば分化させる対象の多能性幹細胞がマウス由来の細胞である場合には、ＦＧＦ２及びＬＩＦはマウス由来であることが好ましく、ＲＯＣＫ阻害剤もマウスＲＯＣＫを対象とするものが好ましい。
【００２９】
なお、ヒトＦＧＦ２タンパク質のＲｅｆＳｅｑＩＤはＮＰ＿００１９９７であり、マウスＦＧＦ２タンパク質のＲｅｆＳｅｑＩＤはＮＰ＿０３２０３２である。また、ヒトＬＩＦタンパク質のＲｅｆＳｅｑＩＤはＮＰ＿００１２４４０６４であり、マウスＬＩＦタンパク質のＲｅｆＳｅｑＩＤはＮＰ＿００１０３４６２６である。
【００３０】
ＲＯＣＫの阻害剤としては、例えば、Ｙ２７６３２等が挙げられる。
【００３１】
本実施形態の培地において、分化させる対象の多能性幹細胞は、例えばＥＳ細胞であってもよく、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。
【００３２】
本実施形態の培地で多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させた場合、神経幹細胞は神経幹細胞塊（ニューロスフェア）を形成する。形成された神経幹細胞塊は、細胞１個ずつに解離させて再び本実施形態の培地中で培養することにより、神経幹細胞の状態で継代することができる。
【００３３】
本実施形態の培地は液体で供給されてもよいし、粉末で供給されてもよい。また、ＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤又はＬＩＦは、別の容器で供給され、使用時に培地に添加する形態であってもよい。
【００３４】
［神経幹細胞の製造方法］
１実施形態において、本発明は、多能性幹細胞を上述した培地中で培養する工程を備える、神経幹細胞の製造方法を提供する。
【００３５】
本実施形態の製造方法において、分化させる対象の多能性幹細胞は、例えばＥＳ細胞であってもよく、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。
【００３６】
実施例において後述するように、多能性幹細胞を上述した培地中で培養することにより、神経幹細胞を製造することができる。多能性幹細胞から神経幹細胞を作製する場合、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ、ＥＢ）形成を介した従来の分化誘導法では約１．５ヶ月を要する。これに対し、本実施形態の製造方法によれば、多能性幹細胞から神経幹細胞への分化を約１４日で行うことができる。
【００３７】
また、本実施形態の製造方法によれば、従来法では神経系に分化させにくいＴｉＰＳＣを、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣと同程度の効率で神経幹細胞に分化させ、神経幹細胞の製造することができる。
【００３８】
本実施形態の製造方法において、多能性幹細胞を上述した培地中で培養する工程は、低酸素環境下で行うことが好ましい。低酸素環境下としては、酸素濃度が例えば１〜１０％（ｖ／ｖ）、例えば１〜５％（ｖ／ｖ）である環境が挙げられる。実施例において後述するように、多能性幹細胞を上述した培地中で培養する工程を低酸素環境下で行うことにより、製造される多能性幹細胞の数を増加させることができる。
【００３９】
また、本実施形態の製造方法は、多能性幹細胞を上述した培地中で培養する工程の前に、多能性幹細胞を細胞１個ずつに解離させる工程を更に備えることが好ましい。多能性幹細胞を細胞１個ずつに解離させることにより、製造される多能性幹細胞の数を増加させることができる。
【００４０】
［神経幹細胞］
１実施形態において、本発明は、ＨＯＸＢ４を実質的に発現していない神経幹細胞を提供する。本実施形態の神経幹細胞は、上述した神経幹細胞の製造方法により製造することができる。
【００４１】
実施例において後述するように、上述した神経幹細胞の製造方法により製造した神経幹細胞は、髄脳及び脊髄で発現するマーカーであるＨＯＸＢ４をほとんど発現していないことが明らかとなった。すなわち、ＨＯＸＢ４を実質的に発現していないことは、上述した神経幹細胞の製造方法により製造した神経幹細胞であることを示す。ここで、実質的に発現していないとは、蛍光免疫染色で確認した場合にＨＯＸＢ４の発現をほとんど検出できないことを意味する。
【００４２】
なお、ヒトＨＯＸＢ４タンパク質のＲｅｆＳｅｑＩＤはＮＰ＿０７６９２０であり、マウスＨＯＸＢ４タンパク質のＲｅｆＳｅｑＩＤはＮＰ＿０３４５８９である。
【００４３】
１実施形態において、上記の神経幹細胞は、Ｔ細胞受容体遺伝子を再編成していてもよい。Ｔ細胞受容体遺伝子を再編成しているということは、当該神経幹細胞が成熟したＴ細胞由来であることを示す。
【００４４】
すなわち、成熟したＴ細胞から作製されたＴｉＰＳＣを材料に用い、上述した神経幹細胞の製造方法により製造した神経幹細胞は、Ｔ細胞受容体遺伝子が再編成している。また、上述したように、この神経幹細胞はＨＯＸＢ４を実質的に発現していないことを特徴とする。
【実施例】
【００４５】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４６】
［実験例１］
（Ｔ細胞及び皮膚繊維芽細胞からのｉＰＳＣの作製）
健常人から採取したＴ細胞及び皮膚繊維芽細胞からｉＰＳＣを作製した。まず、健常人由来のＣＤ３陽性リンパ球に、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＥＢＮＡ１、及びｐ５３に対するｓｈＲＮＡ又はドミナントネガティブｐ５３を含むエピソームベクターを導入し、ヒトＴ細胞由来ｉＰＳＣ（Ｔ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉＰＳＣ、以下、「ＴｉＰＳＣ」という場合がある。）株であるｅＴＫＡ４及びｅＴＫＡ５を樹立した。【００４７】
また、健常人由来のＣＤ３陽性リンパ球に、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣを４つのベクターにそれぞれ含むセンダイウイルスベクター（型式「Ｃｙｔｏｔｕｎｅ（商標）」、ＤＮＡＶＥＣ社）を導入し、ＴｉＰＳＣ株であるＴＫＡ７及びＴＫＡ１４を樹立した。【００４８】
また、健常人由来のＣＤ３陽性リンパ球に、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣを１つのベクターに含むセンダイウイルスベクター（産業技術総合研究所（ＡＩＳＴ）製）を導入し、ＴｉＰＳＣ株であるＴＫＡ４及びＴＫＡ９を樹立した。【００４９】
また、健常人由来の皮膚繊維芽細胞に、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣを発現するレトロウイルスを導入し、皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳＣ（ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉＰＳＣ、以下、「ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ」という場合がある。）株であるＫＡ１１及びＫＡ２３を樹立した。【００５０】
また、健常人由来の皮膚繊維芽細胞に、上述したエピソームベクターを導入し、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ株であるｅＫＡ３及びｅＫＡ４を樹立した。【００５１】
樹立した全てのＴｉＰＳＣ株は、多能性マーカーであるＴＲＡ−１−６０及びｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ４（ＳＳＥＡ４）を、樹立したａＨＤＦ−ｉＰＳＣ株と同程度に発現することを免疫化学的な解析により確認した。また、リプログラミングに使用したトランスジーンはＲＴ−ＰＣＲでは検出されなかった。また、比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイを用いた解析の結果、ＴｉＰＳＣとａＨＤＦ−ｉＰＳＣとの間でゲノム構造に顕著な違いは認められなかった。また、Ｔ細胞受容体遺伝子の再編成をＰＣＲにより検討した結果、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣでは再編成が認められなかったのに対し、ＴｉＰＳＣでは再編成していることが確認された。【００５２】
＜胚様体（ＥＢ）形成を介する従来法では、ＴｉＰＳＣは、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣと比較して神経系に分化しにくかった＞
［実験例２］
（従来法によるｉＰＳＣの神経幹細胞への分化）
発明者らは、複数種類のａＨＤＦ−ｉＰＳＣ株及び複数種類のＴｉＰＳＣ株を、従来法であるＥＢ法及びＤＳｉ−ＥＢ法により神経幹細胞に分化させた。ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ株としては、上述したＫＡ１１、ＫＡ２３、ｅＫＡ３及びｅＫＡ４を使用した。また、ＴｉＰＳＣとしては、上述したｅＴＫＡ４、ｅＴＫＡ５、ＴＫＡ７、ＴＫＡ１４、ＴＫＡ４及びＴＫＡ９を使用した。【００５３】
ＥＢ法及びＤＳｉ−ＥＢ法は、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ、ＥＢ）形成を介して、ｉＰＳＣを神経幹細胞に分化させる方法である。図１は、ＥＢ法及びＤＳｉ−ＥＢ法の手順を示す図である。ＥＢ法及びＤＳｉ−ＥＢ法では、ｉＰＳＣから神経幹細胞塊を得るまでに４０日以上を要する。【００５４】
《ＥＢ法による分化誘導》
ＥＢ法においては、まず、細胞１個ずつに解離させた各ｉＰＳＣを培養してＥＢを形成させた。続いて、ＥＢを、神経幹細胞／神経前駆細胞に分化させた。【００５５】
細胞１個ずつに解離させた各ｉＰＳＣを浮遊状態で培養した結果、全てのａＨＤＦ−ｉＰＳＣ及びＴｉＰＳＣにおいて、同程度の数のＥＢが形成された。続いて、各ＥＢを細胞１個ずつに解離させ、ＦＧＦ−２を含有する無血清培地で培養し、神経幹細胞塊（ニューロスフェア）を形成させた。【００５６】
その結果、全てのＴｉＰＳＣ株は、神経幹細胞塊をほとんど形成しなかった。これに対し、全てのａＨＤＦ−ｉＰＳＣ株は、１２日以内に神経幹細胞塊を形成した。図２（ａ）及び（ｂ）は、形成された神経幹細胞隗の光学顕微鏡写真である。図２（ａ）はａＨＤＦ−ｉＰＳＣから形成された神経幹細胞塊の代表的な写真である。図２（ｂ）はＴｉＰＳＣから形成された神経幹細胞塊の代表的な写真である。【００５７】
《ＤＳｉ−ＥＢ法による分化誘導》
続いて、ＳＭＡＤシグナル伝達経路の阻害剤である、ＳＢ４３１５４２及びＮｏｇｇｉｎの存在下でＥＢを形成させるＤＳｉ−ＥＢ法による検討を行った。ＳＢ４３１５４２及びＮｏｇｇｉｎは、デュアルＳＭＡＤ阻害（ｄｕａｌ  ＳＭＡＤ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、ＤＳｉ）を誘導することが知られている（例えば、Chambers S. M., et al., Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMADsignaling, Nat. Biotechnol., 27 (3), 275-280, 2009.を参照。）【００５８】
図３は、形成された神経幹細胞隗の数を測定した結果を示すグラフである。その結果、ＤＳｉ−ＥＢ法は、ＥＢ法と比較してａＨＤＦ−ｉＰＳＣから形成された神経幹細胞塊の数を増加させた。しかしながら、細胞株毎のばらつきが大きいことから有意な差ではなかった。これに対し、ＴｉＰＳＣ株は、ＤＳｉ−ＥＢ法を用いても神経幹細胞塊をほとんど形成しなかった。【００５９】
＜直接神経幹細胞塊を形成させる方法により、ＴｉＰＳＣは、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣと同程度の効率で神経系に分化した＞
［実験例３］
発明者らは、ｉＰＳＣの神経幹細胞への分化において、ＥＢの形成を含まない新たな方法（ｄｉｒｅｃｔ−ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法、以下、「ｄＮＳ法」という場合がある。
）を開発した。図４は、ｄＮＳ法の手順を示す図である。ｄＮＳ法では、細胞１個ずつに解離させたｉＰＳＣを、低酸素条件下において、ＦＧＦ２、Ｙ２７６３２及びＬＩＦを含有する無血清培地（以下、「ＮＳ培地」という場合がある。）で培養する。後述するように、ｄＮＳ法によれば約１４日でｉＰＳＣから神経幹細胞塊を形成することができる。具体的なＮＳ培地の組成を下記表１に示す。【００６０】
【表１】
2017141900.tif 000002
【００６１】
発明者らは、複数種類のａＨＤＦ−ｉＰＳＣ株及び複数種類のＴｉＰＳＣ株を、ｄＮＳ法により神経幹細胞に分化させた。低酸素条件は４％酸素条件とした。ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ株としては、上述したＫＡ１１、ＫＡ２３、ｅＫＡ３及びｅＫＡ４を使用した。また、ＴｉＰＳＣとしては、上述したｅＴＫＡ４、ｅＴＫＡ５、ＴＫＡ７、ＴＫＡ１４、ＴＫＡ４及びＴＫＡ９を使用した。【００６２】
その結果、ｄＮＳ法では、ＴｉＰＳＣ株からも多数の神経幹細胞塊を形成できることが明らかとなった。図５（ａ）及び（ｂ）は、形成された神経幹細胞隗の光学顕微鏡写真である。図５（ａ）はａＨＤＦ−ｉＰＳＣから形成された神経幹細胞塊の代表的な写真である。図５（ｂ）はＴｉＰＳＣから形成された神経幹細胞塊の代表的な写真である。【００６３】
また、図６は、形成された神経幹細胞隗の数を測定した結果を示すグラフである。図６に示すように、全てのＴｉＰＳＣ株及び全てのａＨＤＦ−ｉＰＳＣ株が、同程度の数の神経幹細胞塊を形成した。【００６４】
続いて、ｄＮＳ法により作製したＴｉＰＳＣ由来神経幹細胞塊と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来神経幹細胞塊の特性について免疫化学的解析により検討した。その結果、ＴｉＰＳＣ由来神経幹細胞塊及びａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来神経幹細胞塊は、いずれも、前脳マーカーであるＦｏｒｋｈｅａｄ  Ｂｏｘ  Ｇ１（ＦＯＸＧ１）及び前脳／中脳マーカーであるＯｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅ  Ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ２（ＯＴＸ２）を発現していることが明らかとなった。【００６５】
しかしながら、これらの神経幹細胞塊は、中脳及び後脳で発現するマーカーであるｇｒａｉｌｅｄ  Ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １（ＥＮ１）をほとんど発現していなかった。【００６６】
また、これらの神経幹細胞塊は、髄脳及び脊髄で発現するマーカーであるＨｏｍｅｏｂｏｘ  Ｂ４（ＨＯＸＢ４）もほとんど発現していなかった。すなわち、ｄＮＳ法により作製した神経幹細胞隗はＨＯＸＢ４を実質的に発現していないといえる。【００６７】
以上の結果は、ＴｉＰＳＣ及びａＨＤＦ−ｉＰＳＣは、いずれも、ｄＮＳ法により同じように前脳／中脳の周囲の前側の領域の神経幹細胞隗に分化したことを示す。【００６８】
＜ｄＮＳ法におけるＮＳ培地及び低酸素条件の影響の検討＞
［実験例４］
ｄＮＳ法において、ＮＳ培地の存在下又は非存在下、及び低酸素条件の存在下又は非存在下の条件で、複数種類のａＨＤＦ−ｉＰＳＣ株及び複数種類のＴｉＰＳＣ株を神経幹細胞に分化させ、ｄＮＳ法におけるＮＳ培地及び低酸素条件の影響を検討した。【００６９】
ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ株としては、上述したＫＡ１１、ＫＡ２３、ｅＫＡ３及びｅＫＡ４を使用した。また、ＴｉＰＳＣとしては、上述したｅＴＫＡ４、ｅＴＫＡ５、ＴＫＡ７、ＴＫＡ１４、ＴＫＡ４及びＴＫＡ９を使用した。【００７０】
図７は、形成された神経幹細胞塊の数を測定した結果を示すグラフである。図７において、ＮＳ培地「＋」は実験例３で使用したＮＳ培地を使用したことを示す。また、ＮＳ培地「−」は、実験例３で使用したＮＳ培地からＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）のみを除いた培地を使用したことを示す。また、低酸素条件「＋」は、４％酸素条件で培養したことを示す。また、低酸素条件「−」は、通常の酸素条件（２０％酸素条件）で培養したことを示す。【００７１】
その結果、ｄＮＳ法による神経幹細胞塊の形成には、ＮＳ培地が必須であることが明となった。また、低酸素条件は必須ではないが、低酸素条件で培養することにより、形成される神経幹細胞塊の数が顕著に増加することが明らかとなった。【００７２】
＜ｄＮＳ法により、ＴｉＰＳＣをａＨＤＦ−ｉＰＳＣと同程度に、機能的なニューロン及びにニューロンサブタイプに分化させることができた＞
［実験例５］
続いて、発明者らは、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊と同程度に機能的なニューロン及びニューロンサブタイプに分化することができるか否かについて検討した。【００７３】
具体的には、神経幹細胞塊をフィブロネクチン及びポリＬ−オルニチンコートしたプレートに播種し、神経分化誘導培地で約７０日間培養した。下記表２に、神経分化誘導培地の組成を示す。【００７４】
【表２】
2017141900.tif 000003
【００７５】
６０日後に、分化した細胞を、ニューロンマーカーであるβＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｔｕｊ１）、別のニューロンマーカーであるｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ２（ＭＡＰ２）、アストロサイトマーカーであるｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）に対する抗体で蛍光免疫染色した。【００７６】
図８（ａ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させ、アストロサイトマーカーであるＧＦＡＰに対する抗体（ＤＡＫＯ社）で蛍光免疫染色した結果を示す代表的な写真である。スケールバーは５０μｍを示す。図８（ｂ）は、図８（ａ）と同視野の細胞を、ニューロンマーカーであるＴｕｊ１に対する抗体（シグマアルドリッチ社）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（図中、「Ｈｏ」と示す。）で更に染色した結果を示す写真である。なお、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２は核を染色する試薬である。図８（ｃ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞において、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色された細胞に対する、抗Ｔｕｊ１抗体で染色された細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。図８（ｄ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞において、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色された細胞に対する、抗ＧＦＡＰ抗体で染色された細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。【００７７】
その結果、これらのマーカーを発現する細胞の比率は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊との間で同程度であった。この結果から、これらの細胞がニューロン及びアストロサイトに同程度に分化したことが明らかとなった。【００７８】
図９（ａ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させ、ニューロンマーカーであるＭＡＰ２に対する抗体（シグマアルドリッチ社）で蛍光免疫染色した結果を示す代表的な写真である。スケールバーは５０μｍを示す。図９（ｂ）は、図９（ａ）と同視野の細胞を、別のニューロンマーカーであるＴｕｊ１に対する抗体（シグマアルドリッチ社）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で更に染色した結果を示す写真である。図９（ｃ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞において、抗Ｔｕｊ１抗体で染色された細胞に対する、抗ＭＡＰ２抗体で染色された細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。【００７９】
その結果、これらのマーカーを発現する細胞の比率は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊との間で同程度であることが明らかとなった。【００８０】
図１０（ａ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させ、ドーパミン作動性ニューロンマーカーであるｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＴＨ）に対する抗体（ミリポア社）で蛍光免疫染色した結果を示す代表的な写真である。スケールバーは５０μｍを示す。図１０（ｂ）は、図１０（ａ）と同視野の細胞を、ニューロンマーカーであるＭＡＰ２に対する抗体（シグマアルドリッチ社）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で更に染色した結果を示す写真である。図１０（ｃ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞において、抗ＭＡＰ２抗体で染色された細胞に対する、抗ＴＨ抗体で染色された細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。【００８１】
その結果、ドーパミン作動性ニューロンに分化した細胞の比率は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊との間で同程度であることが明らかとなった。【００８２】
図１１（ａ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）に対する抗体（シグマアルドリッチ社）で蛍光免疫染色した結果を示す代表的な写真である。スケールバーは５０μｍを示す。図１１（ｂ）は、図１１（ａ）と同視野の細胞を、ニューロンマーカーであるＭＡＰ２に対する抗体（シグマアルドリッチ社）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で更に染色した結果を示す写真である。図１１（ｃ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞において、抗ＭＡＰ２抗体で染色された細胞に対する、抗ＧＡＢＡ抗体で染色された細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。【００８３】
その結果、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに分化した細胞の比率は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊との間で同程度であることが明らかとなった。【００８４】
図１２（ａ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させ、抗ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ抗体（シグマアルドリッチ社）、抗ＭＡＰ２抗体（シグマアルドリッチ社）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した結果を示す代表的な写真である。スケールバーは５０μｍを示す。図１２（ｂ）は、図１２（ａ）と同視野の細胞を、ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  １（ｖＧＬＵＴ１）に対する抗体（シナプティックシステムズ社）、抗ＭＡＰ２抗体（シグマアルドリッチ社）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した結果を示す写真である。図１２（ｃ）は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊を分化させた細胞において、抗ＭＡＰ２抗体で染色された細胞に対する、抗ｖＧＬＵＴ１抗体で染色された細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。【００８５】
その結果、ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎを発現するグルタミン酸作動性ニューロンに分化した細胞の比率は、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊と、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊との間で同程度であることが明らかとなった。【００８６】
以上の結果から、ＴｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊は、ａＨＤＦ−ｉＰＳＣ由来の神経幹細胞塊と同程度に機能的なニューロン及びにニューロンサブタイプに分化することができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明により、多能性幹細胞を効率よく神経幹細胞に分化誘導させる技術を提供することができる。
【図１】
2017141900.tif 000004
【図２】
2017141900.tif 000005
【図３】
2017141900.tif 000006
【図４】
2017141900.tif 000007
【図５】
2017141900.tif 000008
【図６】
2017141900.tif 000009
【図７】
2017141900.tif 000010
【図８】
2017141900.tif 000011
【図９】
2017141900.tif 000012
【図１０】
2017141900.tif 000013
【図１１】
2017141900.tif 000014
【図１２】
2017141900.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月30日(2017.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞をＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ２（ＦＧＦ２）、Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）阻害剤及びＬｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を有効成分として含有する培地中で培養する工程を備える、前記多能性幹細胞の由来に関わらず、前記多能性幹細胞の株間又はクローン間のばらつきを解消し、胚様体を形成させずに前記多能性幹細胞を均一に神経幹細胞に分化させる方法。
【請求項２】
前記多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる効率が、皮膚繊維芽細胞由来の人工多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる効率と同等の効率である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養する工程を低酸素条件下で行う、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養する工程の前に、前記多能性幹細胞を細胞１個ずつに解離させる工程を更に備える、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性幹細胞が血球由来の人工多能性幹細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記人工多能性幹細胞がＴ細胞由来である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤及びＬＩＦを有効成分として含有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法用培地。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法で作製された神経幹細胞。
【請求項９】
前脳マーカー、及び前脳／中脳マーカーを発現している、請求項８に記載の神経幹細胞。
【請求項１０】
Ｈｏｍｅｏｂｏｘ  Ｂ４（ＨＯＸＢ４）を実質的に発現していない、請求項８又は９に記載の神経幹細胞。
【請求項１１】
Ｔ細胞受容体遺伝子が再編成している、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の神経幹細胞。
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月13日(2017.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞（但し、ＴＧＦ−βファミリー阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤及びＢＭＰ阻害剤の存在下で培養された多能性幹細胞を除く。）を、有効成分がＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ２（ＦＧＦ２）、Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）阻害剤及びＬｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）からなる培地中で、低酸素条件下で培養する工程を備える、前記多能性幹細胞の由来に関わらず、前記多能性幹細胞の株間又はクローン間のばらつきを解消し、胚様体を形成させずに前記多能性幹細胞を均一に、皮膚繊維芽細胞由来の人工多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる効率と同等の効率で神経幹細胞に分化させる方法。
【請求項２】
前記多能性幹細胞が、ＲＯＣＫ阻害剤で前処理されていないものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
前記培養する工程の前に、前記多能性幹細胞を細胞１個ずつに解離させる工程を更に備える、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性幹細胞が血球由来の人工多能性幹細胞である、請求項１、２、４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記人工多能性幹細胞がＴ細胞由来である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤及びＬＩＦを有効成分として含有する、請求項１、２、４〜６のいずれか一項に記載の方法用培地。
【請求項８】
請求項１、２、４〜６のいずれか一項に記載の方法で作製され、前脳マーカー、及び前脳／中脳マーカーを発現している、神経幹細胞。
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月19日(2018.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＯＣＫ阻害剤で前処理されていない多能性幹細胞（但し、ＴＧＦ−βファミリー阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤及びＢＭＰ阻害剤の存在下で培養された多能性幹細胞を除く。）を、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ２（ＦＧＦ２）、Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）阻害剤及びＬｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を有効成分して含有する培地中で、低酸素条件下で培養する工程を備える、前記多能性幹細胞の由来に関わらず、前記多能性幹細胞の株間又はクローン間のばらつきを解消し、胚様体を形成させずに前記多能性幹細胞を均一に、皮膚線維芽細胞由来の人工多能性幹細胞を神経幹細胞に分化させる効率と同等の効率で神経幹細胞に分化させる方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
前記培養する工程の前に、前記多能性幹細胞を細胞１個ずつに解離させる工程を更に備える、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性幹細胞が血球由来の人工多能性幹細胞である、請求項１又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記人工多能性幹細胞がＴ細胞由来である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤及びＬＩＦを有効成分として含有する、請求項１、４〜６のいずれか一項に記載の方法用培地。
【請求項８】
請求項１、４〜６のいずれか一項に記載の方法で作製され、前脳マーカー、及び前脳／中脳マーカーを発現している、神経幹細胞。
【国際調査報告】
2017141900.tif 000016
2017141900.tif 000017
2017141900.tif 000018
2017141900.tif 000019