(57)【要約】  本発明は、実用化に適した変異型トリプトファン酸化酵素を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、野生型トリプトファン酸化酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異しており、トリプトファン酸化酵素活性および／または安定性が野生型トリプトファン酸化酵素よりも高い、変異型トリプトファン酸化酵素、およびその用途を提供する。変異型トリプトファン酸化酵素は、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）のうち少なくとも１つを有する野生型トリプトファン酸化酵素に由来することが好ましく、これらのいずれかのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異を有していることが好ましい。変異型トリプトファン酸化酵素は、配列番号２で表されるアミノ酸配列およびこれと相同な配列において、１以上のアミノ酸残基の変異を有していることも好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型トリプトファン酸化酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異しており、
トリプトファン酸化酵素活性および／または安定性が野生型トリプトファン酸化酵素よりも高い、変異型トリプトファン酸化酵素。
【請求項２】
野生型トリプトファン酸化酵素は、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有し、
少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれるモチーフに対する少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含む、
請求項１に記載の酵素。
モチーフ（２）：Ｒ６４−Ｙ６５−Ｓ６６−Ｐ６７−Ｑ６８−Ｌ６９−Ｈ７０
モチーフ（３）：Ｙ８７−Ｐ８８−Ｆ８９−Ｔ９０
モチーフ（５）：Ｇ１４２−Ｙ１４３−Ｄ１４４−Ａ１４５−Ｌ１４６
モチーフ（７）：Ｍ１５５−Ａ１５６−Ｙ１５７−Ｄ１５８−Ｉ１５９
モチーフ（９）：Ｓ２６４−Ｌ２６５
モチーフ（１１）：Ｒ２９６−Ｋ２９７−Ｉ２９８−Ｙ２９９−Ｆ３００−Ｋ３０１
モチーフ（１３）：Ｇ３６２−Ｖ３６３−Ｅ３６４−Ｆ３６５
モチーフ（１４）：Ｈ３９４−Ｃ３９５−Ｇ３９６−Ｗ３９７−Ｍ３９８−Ｅ３９９−Ｇ４００
【請求項３】
モチーフ（９）中のＬ２６５の変異を少なくとも含む、請求項２に記載の酵素。
【請求項４】
Ｌ２６５の変異は、Ｌ２６５ＩまたはＬ２６５Ｍである、請求項３に記載の酵素。
【請求項５】
モチーフ（１４）中のＣ３９５の変異を少なくとも含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項６】
Ｃ３９５の変異は、Ｃ３９５Ｓ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ３９５Ｐ、Ｃ３９５ＱまたはＣ３９５Ｙである、請求項５に記載の酵素。
【請求項７】
野生型トリプトファン酸化酵素は、モチーフ（１）、（４）、（６）、（８）、（１０）および（１２）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフをさらに有する、請求項２〜６のいずれか１項に記載の酵素。
モチーフ（１）：Ｅ５９−Ｌ６０−Ｇ６１
モチーフ（４）：Ｌ１０２−Ｋ１０３
モチーフ（６）：Ｌ１４８−Ｐ１４９
モチーフ（８）：Ｋ１６２−Ｈ１６３−Ｐ１６４−Ｅ１６５
モチーフ（１０）：Ｐ２６６−Ｌ２６７−Ｆ２６８−Ｋ２６９−Ｇ２７０
モチーフ（１２）：Ｆ３０８−Ｙ３０９
【請求項８】
野生型トリプトファン酸化酵素は、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
を有するタンパク質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項９】
Ｃ２９、Ｓ５７、Ｇ６３、Ｌ９２、Ｋ９５、Ａ１０５、Ｇ１３６、Ｅ１８１、Ｇ１９０、Ｃ３２１、Ｒ３６７、Ｙ８０、Ｇ１９０、Ｋ８３、Ｈ２２、Ｓ４０９、Ｎ１７５、Ｓ８４、Ｆ１７８、Ａ１７９、Ｖ９８、Ｓ１４０、Ｍ１４１、Ｉ１６６、Ｔ２７３、Ｌ３５２、Ｔ３１０からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含む、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項１０】
少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、さらに、モチーフ（２）、（３）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれるモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基のシステインへの変異を含む、請求項２〜９のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項１１】
モチーフ（２）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＱ６８である、
モチーフ（３）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＹ８７である、
モチーフ（１１）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＲ２９６である、
モチーフ（１３）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＶ３６３である、または
モチーフ（１４）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＧ３９６である、
請求項１０に記載の酵素。
【請求項１２】
少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、Ｙ８０Ｃ／Ｇ１９０Ｃ、Ｋ８３Ｃ／Ｅ１８１Ｃ、Ｈ２２Ｃ／Ｓ４０９Ｃ、Ｑ６８Ｃ／Ｎ１７５Ｃ、Ｓ８４Ｃ／Ｆ１７８Ｃ、Ｙ８７Ｃ／Ａ１７９Ｃ、Ｖ９８Ｃ／Ｓ１４０Ｃ、Ｍ１４１Ｃ／Ｉ１６６Ｃ、Ｔ２７３Ｃ／Ｌ３５２Ｃ、Ｒ２９６Ｃ／Ｔ３１０ＣおよびＶ３６３Ｃ／Ｇ３９６Ｃから選ばれる少なくとも１つの組み合わせを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の酵素をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の酵素を含むトリプトファン分析用キット。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の酵素を用いる、検体中のトリプトファンの検出方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の形質転換体を用いる、変異型トリプトファン酸化酵素の製造方法。
【請求項１９】
デバイス、および請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酵素を含む、トリプトファン分析用検出系。
【請求項２０】
検出用電極、および検出用電極に固定または配置された、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酵素を含む、トリプトファン分析用酵素センサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリプトファン酸化酵素およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸は生体の構成要素として非常に重要であり、幾つかのアミノ酸が健康状態の指標となり得ることが知られている。アミノ酸の測定方法としては、アミノ酸アナライザー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やＬＣ−ＭＳなどの機器を用いた方法、特定のアミノ酸に対する特定の反応を触媒する酵素を用いたアミノ酸の分析法がある。特許文献１には、トリプトファンの測定方法としては、トリプトファン酸化酵素を利用する方法が記載されている。【０００３】
酵素法としては例えば、トリプトファン酸化酵素を用いるトリプトファンの定量が知られている（特許文献１等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５２１２９９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、機器を用いた方法においては、大型で高価な機器を使う必要があり、しかも機器の維持とオペレーションに専門知識と習熟を必要とするため、導入、維持、利用に高額のコストを必要とする。また、原理上、各検体をシーケンシャルに分析する必要があるため、多検体を分析する際には長時間を必要とする。また、トリプトファン酸化酵素を利用する方法においては、実用化に際しより高い安定性および活性を有する酵素が求められている。【０００６】
本発明は、実用化に適した変異型トリプトファン酸化酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下を提供する。
〔１〕野生型トリプトファン酸化酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異しており、
トリプトファン酸化酵素活性および／または安定性が野生型トリプトファン酸化酵素よりも高い、変異型トリプトファン酸化酵素。
〔２〕野生型トリプトファン酸化酵素は、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有し、
少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれるモチーフに対する少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含む、
〔１〕に記載の酵素。
モチーフ（２）：Ｒ６４−Ｙ６５−Ｓ６６−Ｐ６７−Ｑ６８−Ｌ６９−Ｈ７０
モチーフ（３）：Ｙ８７−Ｐ８８−Ｆ８９−Ｔ９０
モチーフ（５）：Ｇ１４２−Ｙ１４３−Ｄ１４４−Ａ１４５−Ｌ１４６
モチーフ（７）：Ｍ１５５−Ａ１５６−Ｙ１５７−Ｄ１５８−Ｉ１５９
モチーフ（９）：Ｓ２６４−Ｌ２６５
モチーフ（１１）：Ｒ２９６−Ｋ２９７−Ｉ２９８−Ｙ２９９−Ｆ３００−Ｋ３０１
モチーフ（１３）：Ｇ３６２−Ｖ３６３−Ｅ３６４−Ｆ３６５
モチーフ（１４）：Ｈ３９４−Ｃ３９５−Ｇ３９６−Ｗ３９７−Ｍ３９８−Ｅ３９９−Ｇ４００
〔３〕モチーフ（２）中、Ｑ６８の変異を少なくとも含む、〔２〕に記載の酵素。
〔４〕Ｑ６８の変異は、Ｑ６８Ｃである、〔３〕に記載の酵素。
〔５〕モチーフ（３）中、Ｙ８７の変異を少なくとも含む、〔２〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔６〕Ｙ８７の変異は、Ｙ８７Ｃである、〔５〕に記載の酵素。
〔７〕モチーフ（５）中、Ａ１４５の変異を少なくとも含む、〔２〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔８〕Ａ１４５の変異は、Ａ１４５Ｃ、Ａ１４５Ｖ、Ａ１４５Ｔ、Ａ１４５Ｉ、Ａ１４５Ｓ、Ａ１４５Ｌ、Ａ１４５ＭまたはＡ１４５Ｙである、〔７〕に記載の酵素。
〔９〕モチーフ（７）中のＭ１５５および／またはＩ１５９の変異を少なくとも含む、〔２〕〜〔８〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔１０〕Ｍ１５５の変異は、Ｍ１５５Ａ、Ｍ１５５ＧまたはＭ１５５Ｖである、〔９〕に記載の酵素。
〔１１〕Ｉ１５９の変異は、Ｉ１５９Ｆである、〔９〕または〔１０〕に記載の酵素。
〔１２〕モチーフ（９）中のＬ２６５の変異を少なくとも含む、〔２〕〜〔１１〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔１３〕Ｌ２６５の変異は、Ｌ２６５ＩまたはＬ２６５Ｍである、〔１２〕に記載の酵素。
〔１４〕モチーフ（１１）中のＲ２９６の変異を少なくとも含む、〔２〕〜〔１３〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔１５〕Ｒ２９６の変異は、Ｒ２９６Ｃである、〔１４〕に記載の酵素。
〔１６〕モチーフ（１３）中のＶ３６３の変異を少なくとも含む、〔２〕〜〔１５〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔１７〕Ｖ３６３の変異は、Ｖ３６３Ｆ、Ｖ３６３Ｗ、Ｖ３６３Ｉ、Ｖ３６３Ｈ、Ｖ３６３Ｔ、またはＶ３６３Ｃである、〔１６〕に記載の酵素。
〔１８〕モチーフ（１４）中のＣ３９５の変異を少なくとも含む、〔２〕〜〔１７〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔１９〕Ｃ３９５の変異は、Ｃ３９５Ｓ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ３９５Ｐ、Ｃ３９５ＱまたはＣ３９５Ｙである、〔１８〕に記載の酵素。
〔２０〕野生型トリプトファン酸化酵素は、モチーフ（１）、（４）、（６）、（８）、（１０）および（１２）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフをさらに有する、〔２〕〜〔１９〕のいずれか１項に記載の酵素。
モチーフ（１）：Ｅ５９−Ｌ６０−Ｇ６１
モチーフ（４）：Ｌ１０２−Ｋ１０３
モチーフ（６）：Ｌ１４８−Ｐ１４９
モチーフ（８）：Ｋ１６２−Ｈ１６３−Ｐ１６４−Ｅ１６５
モチーフ（１０）：Ｐ２６６−Ｌ２６７−Ｆ２６８−Ｋ２６９−Ｇ２７０
モチーフ（１２）：Ｆ３０８−Ｙ３０９
〔２１〕野生型トリプトファン酸化酵素は、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
を有するタンパク質である、〔１〕〜〔２０〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔２１´〕Ｃ２９、Ｓ５７、Ｇ６３、Ｌ９２、Ｋ９５、Ａ１０５、Ｇ１３６、Ｅ１８１、Ｇ１９０、Ｃ３２１、Ｒ３６７、Ｙ８０、Ｇ１９０、Ｋ８３、Ｈ２２、Ｓ４０９、Ｎ１７５、Ｓ８４、Ｆ１７８、Ａ１７９、Ｖ９８、Ｓ１４０、Ｍ１４１、Ｉ１６６、Ｔ２７３、Ｌ３５２、Ｔ３１０からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含む、
〔１〕〜〔２０〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔２２〕トリプトファン酸化酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、Ｃ２９Ｖ、Ｓ５７Ｔ、Ｇ６３Ｑ、Ｌ９２Ａ、Ｋ９５Ａ、Ａ１０５Ｇ、Ｇ１３６Ｋ、Ｇ１３６Ｑ、Ｇ１３６Ｒ、Ｇ１９０Ｃ、Ｃ３２１Ｓ、Ｃ３２１Ａ、およびＲ３６７Ｋからなる群より選ばれる少なくとも１つの変異である、〔１〕〜〔２１´〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔２３〕トリプトファン酸化酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、Ｙ８０Ｃ、Ｇ１９０Ｃ、Ｋ８３Ｃ、Ｅ１８１Ｃ、Ｈ２２Ｃ、Ｓ４０９Ｃ、Ｎ１７５Ｃ、Ｓ８４Ｃ、Ｆ１７８Ｃ、Ａ１７９Ｃ、Ｖ９８Ｃ、Ｓ１４０Ｃ、Ｍ１４１Ｃ、Ｉ１６６Ｃ、Ｔ２７３Ｃ、Ｌ３５２Ｃ、またはＴ３１０Ｃからなる群より選ばれる少なくとも１つの変異である、〔１〕〜〔２２〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔２４〕少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、さらに、モチーフ（２）、（３）、（１１）、（１３）および（１４）から選ばれるモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基のシステインへの変異を含む、〔１〕〜〔２３〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔２５〕モチーフ（２）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＱ６８である、
モチーフ（３）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＹ８７である、
モチーフ（１１）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＲ２９６である、
モチーフ（１３）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＶ３６３である、または
モチーフ（１４）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＧ３９６である、
〔２４〕に記載の酵素。
〔２６〕少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、Ｙ８０Ｃ／Ｇ１９０Ｃ、Ｋ８３Ｃ／Ｅ１８１Ｃ、Ｈ２２Ｃ／Ｓ４０９Ｃ、Ｑ６８Ｃ／Ｎ１７５Ｃ、Ｓ８４Ｃ／Ｆ１７８Ｃ、Ｙ８７Ｃ／Ａ１７９Ｃ、Ｖ９８Ｃ／Ｓ１４０Ｃ、Ｍ１４１Ｃ／Ｉ１６６Ｃ、Ｔ２７３Ｃ／Ｌ３５２Ｃ、Ｒ２９６Ｃ／Ｔ３１０ＣおよびＶ３６３Ｃ／Ｇ３９６Ｃから選ばれる少なくとも１つの組み合わせを含む、〔１〕〜〔２５〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔２７〕〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項に記載の酵素をコードするポリヌクレオチド。
〔２８〕〔２７〕に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔２９〕〔２８〕に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
〔３０〕形質転換体が微生物である、〔２９〕に記載の形質転換体。
〔３１〕微生物がエシェリヒア・コリである、〔３０〕に記載の形質転換体。
〔３２〕〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項に記載の酵素を含むトリプトファン分析用キット。
〔３３〕反応用緩衝液または緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬およびトリプトファンオキシレート検出試薬の少なくとも一つをさらに含む、〔３２〕に記載のキット。
〔３４〕〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項に記載の酵素を用いる、検体中のトリプトファンの検出方法。
〔３５〕〔２９〕〜〔３１〕のいずれか１項に記載の形質転換体を用いる、変異型トリプトファン酸化酵素の製造方法。
〔３６〕デバイス、および〔１〕〜〔２６〕のいずれか一項に記載の酵素を含む、トリプトファン分析用検出系。
〔３７〕反応用緩衝液または緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬およびトリプトファンオキシレート検出試薬の少なくとも一つをさらに含み、かつデバイスがマイクロ流路チップである、〔３６〕に記載のトリプトファン分析用検出系。
〔３８〕検出用電極、および検出用電極に固定または配置された、〔１〕〜〔２６〕のいずれか一項に記載の酵素を含む、トリプトファン分析用酵素センサー。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、トリプトファン酸化酵素活性、安定性等の特性が野生型トリプトファン酵素と比較して良好な変異型トリプトファン酸化酵素が提供される。斯かる酵素は、トリプトファンの迅速かつ高感度な測定、および／またはトリプトファンオキシレートの製造に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、各温度で１５分間インキュベートしたＴｒｐＯＸの残存活性を示した図である；Ａ：野生型ＴｒｐＯＸ；Ｂ：ＴｒｐＯＸ（Ｃ３９５Ａ）；Ｃ：ＴｒｐＯＸ（Ｓ５７Ｔ／Ｙ８０Ｃ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｇ１９０Ｃ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
変異型トリプトファン酸化酵素とは、野生型トリプトファン酸化酵素に対し少なくとも１つの変異を有する（改変されている）トリプトファン酸化酵素である。トリプトファン酸化酵素は、トリプトファン酸化酵素活性を有し、トリプトファン酸化酵素活性とは、トリプトファン（通常はＬ−トリプトファン）、水および酸素から、トリプトファンオキシレート（トリプトファンのアミノ基がケトン基に置換されてなる２−オキソ酸）、アンモニアおよび過酸化水素を生成する可逆反応に関与する酵素活性である。
【００１１】
野生型トリプトファン酸化酵素とは、変異型トリプトファン酸化酵素の基礎としての変異前のトリプトファン酸化酵素を意味する。野生型トリプトファン酸化酵素は、生物（例えば、細菌、放線菌および真菌等の微生物、昆虫、魚類、動物、植物等）に由来するものであってもよいし、上記モチーフを有するタンパク質をコードする遺伝子をその遺伝子を本来有しない他の生物（例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリ））を宿主として発現させて得られる酵素タンパク質であってもよい。斯かる生物としては例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．等のストレプトマイセス属細菌、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ等のクロモバクテリウム属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｇｕｌｂｅｎｋｉａｎｉａ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ等のシュードガルベンキアニア属細菌、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｖｉｄｕｍ、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｇａｒｉｃｉｄａｍｎｏｓｕｍ、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．等のジャンチノバクテリウム属細菌、Ｃｏｌｌｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．等のコリモナス属細菌、Ｄｕｇａｎｅｌｌａ  ｓｐ．等のデュガネラ属細菌、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ等のミクソコッカス属細菌、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｔｕｎｉｃａｔａ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｌｕｔｅｏｖｉｏｌａｃｅａ等のシュードアルテロモナス属細菌、ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍなどが挙げられる。
【００１２】
野生型トリプトファン酸化酵素としては例えば、以下のモチーフ（１）〜（１４）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有する野生型トリプトファン酸化酵素が挙げられるが、以下のモチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有する野生型トリプトファン酸化酵素が好ましい。斯かる酵素は、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれる１つのモチーフ、または２つ以上のモチーフの組み合わせを有することが好ましく、少なくともモチーフ（１４）を含むことがより好ましく、少なくともモチーフ（５）、（７）、（９）および（１０）からなる群より選ばれる１以上のモチーフとモチーフ（１４）とを有することがさらに好ましく、すべてのモチーフを有することがさらにより好ましい。変異前のトリプトファン酸化酵素は、モチーフ（１）、（４）、（６）、（８）、（１０）および（１２）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフをさらに有していてもよく、すべてのモチーフを有することが好ましい。
モチーフ（１）：Ｅ５９−Ｌ６０−Ｇ６１
モチーフ（２）：Ｒ６４−Ｙ６５−Ｓ６６−Ｐ６７−Ｑ６８−Ｌ６９−Ｈ７０
モチーフ（３）：Ｙ８７−Ｐ８８−Ｆ８９−Ｔ９０
モチーフ（４）：Ｌ１０２−Ｋ１０３
モチーフ（５）：Ｇ１４２−Ｙ１４３−Ｄ１４４−Ａ１４５−Ｌ１４６
モチーフ（６）：Ｌ１４８−Ｐ１４９
モチーフ（７）：Ｍ１５５−Ａ１５６−Ｙ１５７−Ｄ１５８−Ｉ１５９
モチーフ（８）：Ｋ１６２−Ｈ１６３−Ｐ１６４−Ｅ１６５
モチーフ（９）：Ｓ２６４−Ｌ２６５
モチーフ（１０）：Ｐ２６６−Ｌ２６７−Ｆ２６８−Ｋ２６９−Ｇ２７０
モチーフ（１１）：Ｒ２９６−Ｋ２９７−Ｉ２９８−Ｙ２９９−Ｆ３００−Ｋ３０１
モチーフ（１２）：Ｆ３０８−Ｙ３０９
モチーフ（１３）：Ｇ３６２−Ｖ３６３−Ｅ３６４−Ｆ３６５
モチーフ（１４）：Ｈ３９４−Ｃ３９５−Ｇ３９６−Ｗ３９７−Ｍ３９８−Ｅ３９９−Ｇ４００
【００１３】
各モチーフは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と細菌由来のトリプトファン酸化酵素の解析により特定されたモチーフであり、各モチーフの数字は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸残基番号を表し、具体的には以下のとおりである。
【００１４】
モチーフ（１）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の５９〜６１位のグルタミン酸（Ｅ５９）−ロイシン（Ｌ６０）−グリシン（Ｇ６１）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（２）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の６４〜７０位のアルギニン（Ｒ６４）−チロシン（Ｙ６５）−セリン（Ｓ６６）−プロリン（Ｐ６７）−グルタミン（Ｑ６８）−ロイシン（Ｌ６９）−ヒスチジン（Ｈ７０）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（３）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の８７〜９０位のチロシン（Ｙ８７）−プロリン（Ｐ８８）−フェニルアラニン（Ｆ８９）−スレオニン（Ｔ９０）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（５）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１４２〜１４６位のグリシン（Ｇ１４２）−チロシン（Ｙ１４３）−アスパラギン酸（Ｄ１４４）−アラニン（Ａ１４５）−ロイシン（Ｌ１４６）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（６）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１４８〜１４９位のロイシン（Ｌ１４８）−プロリン（Ｐ１４９）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（７）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１５５〜１５９位のメチオニン（Ｍ１５５）−アラニン（Ａ１５６）−チロシン（Ｙ１５７）−アスパラギン酸（Ｄ１５８）−イソロイシン（Ｉ１５９）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（９）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の２６４〜２６５位のセリン（Ｓ２６４）−ロイシン（Ｌ２６５）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（１１）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の２９６〜３０１位のアルギニン（Ｒ２９６）−リジン（Ｋ２９７）−イソロイシン（Ｉ２９８）−チロシン（Ｙ２９９）−フェニルアラニン（Ｆ３００）−リジン（Ｋ３０１）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（１４）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の３９４〜４００位のヒスチジン（Ｈ３９４）−システイン（Ｃ３９５）−グリシン（Ｇ３９６）−トリプトファン（Ｗ３９７）−メチオニン（Ｍ３９８）−グルタミン酸（Ｅ３９９）−グリシン（Ｇ４００）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。これらのモチーフは、表１に示す各生物由来のトリプトファン酸化酵素の配列の比較解析により特定され得る。表１に、各生物由来のトリプトファン酸化酵素遺伝子のアクセッション番号、各モチーフに対応する配列部分も併せて示す。
【００１５】
【表１】
2018047976.tif 000002
【００１６】
モチーフ（４）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１０２〜１０３位のロイシン（Ｌ１０２）−リジン（Ｋ１０３）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（８）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１６２〜１６５位のリジン（Ｋ１６２）−ヒスチジン（Ｈ１６３）−プロリン（Ｐ１６４）−グルタミン酸（Ｅ１６５）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（４）および（８）は、表２に示す各生物由来のトリプトファン酸化酵素の配列の比較解析により特定され得る。表２に、各生物由来のトリプトファン酸化酵素遺伝子のアクセッション番号、各モチーフに対応する配列部分も併せて示す。
【００１７】
【表２】
2018047976.tif 000003
【００１８】
モチーフ（１０）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の２６６〜２７０位のプロリン（Ｐ２６６）−ロイシン（Ｌ２６７）−フェニルアラニン（Ｆ２６８）−リジン（Ｋ２６９）−グリシン（Ｇ２７０）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（１２）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の３０８〜３０９位のフェニルアラニン（Ｆ３０８）−チロシン（Ｙ３０９）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（１３）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の３６２〜３６５位のグリシン（Ｇ３６２）−バリン（Ｖ３６３）−グルタミン酸（Ｅ３６４）−フェニルアラニン（Ｆ３６５）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（１０）、（１２）および（１３）は、表３に示す各生物由来のトリプトファン酸化酵素の配列の比較解析により特定され得る。表３に、各生物由来のトリプトファン酸化酵素遺伝子のアクセッション番号、各モチーフに対応する配列部分も併せて示す。
【００１９】
【表３】
2018047976.tif 000004
【００２０】
一方、変異前のトリプトファン酸化酵素（野生型トリプトファン酸化酵素）は、以下のアミノ酸配列（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有するトリプトファン酸化酵素であってもよい。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００２１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ由来トリプトファン酸化酵素であり、配列番号１で表される塩基配列、すなわち、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ由来トリプトファン酸化酵素遺伝子の完全長の塩基配列によりコードされる。
【００２２】
本発明において置換、欠失、挿入、付加等の変異の対象であるアミノ酸残基は、通常は天然のＬ−α−アミノ酸である、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−アスパラギン（Ｎ）、Ｌ−システイン（Ｃ）、Ｌ−グルタミン（Ｑ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ）、Ｌ−メチオニン（Ｍ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ−プロリン（Ｐ）、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）、Ｌ−バリン（Ｖ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アルギニン（Ｒ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、またはＬ−リジン（Ｋ）、あるいはグリシン（Ｇ）である。変異が置換、付加または挿入である場合、置換、付加または挿入されるアミノ酸残基は、上述した変異されるアミノ酸残基と同様である。以下、アミノ酸の表記について、Ｌおよびαを省略することがある。
【００２３】
上記（ｂ）のアミノ酸配列は、１または数個のアミノ酸残基の変異（例、置換、欠失、挿入、および付加）を含んでいてもよい。変異の数は、例えば１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、さらにより好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個（例、１、２、３、４または５個）である。
【００２４】
上記（ｃ）のアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。
【００２５】
（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列で特定されるタンパク質は、同一条件で測定された場合、上記（ａ）のアミノ酸配列を有するタンパク質のトリプトファン酸化酵素活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。
【００２６】
本明細書においてアミノ酸配列の同一性は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列の同一性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の同一性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列の同一性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
【００２７】
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列の調製のため、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して変異が導入され得るアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸配列のアライメントを参考にして変異を導入することができる。具体的には、当業者は、１）複数のホモログのアミノ酸配列（例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列、および他のホモログのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、熱安定性を向上させる１以上のアミノ酸残基の変異が導入される、（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列を決定することができる。
【００２８】
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列の調製のため、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の変異が導入され、かつ当該アミノ酸残基の変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。本明細書において用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸および非極性側鎖を有するアミノ酸を包括的に、中性アミノ酸と呼称することがある。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００２９】
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、上記第１の例で挙げたモチーフ（１）〜（１４）を含む。上記（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列も、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフが保存されていることが好ましく、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）が保存されていることが好ましく、少なくともモチーフ（１４）を含むことがより好ましく、少なくともモチーフ（５）、（７）、（９）および（１０）からなる群より選ばれる１以上のモチーフとモチーフ（１４）とを有することがさらに好ましく、すべてのモチーフを有することがさらにより好ましい。変異前のトリプトファン酸化酵素、例えば上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有するトリプトファン酸化酵素は、モチーフ（１）、（４）、（６）、（８）、（１０）および（１２）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフをさらに有していてもよく、モチーフ（１）〜（１４）が保存されていることが好ましい。
【００３０】
本発明において変異型トリプトファン酸化酵素は、上記変異前のトリプトファン酸化酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させたものであり得る。
【００３１】
変異型トリプトファン酸化酵素は通常、変異前のトリプトファン酸化酵素と比較してその特性の少なくとも１つが良好である。斯かる特性としては例えば、トリプトファン酸化酵素活性、トリプトファン酸化酵素の安定性（例えば、熱安定性）が挙げられる。変異型トリプトファン酸化酵素は、野生型と比較して、トリプトファン酸化酵素活性、トリプトファン酸化酵素の安定性のいずれかが良好であることが好ましく、両方が良好であることがより好ましい。各特性の確認は、後段の実施例の評価方法に従い所定の温度における野生型と変異型トリプトファン酸化酵素の活性を比較し、相対活性を算出することにより行えばよい。変異型トリプトファン酸化酵素の相対活性（野生型の活性を１００％とした場合）は、１００％を超えることが好ましく、１０１％、１０３％、１０４％、１０５％または１１０％をそれぞれ超えることがより好ましく、１２０％、１３０％、１４０％または１５０％をそれぞれ超えることがさらにより好ましい。トリプトファン酸化酵素の熱安定性の改善の確認は、所定の濃度における野生型と変異型トリプトファン酸化酵素の高温における残存活性（例えば、４０℃以上（好ましくは、４５℃、５０℃又は５５℃）で１５分加熱後の残存活性）を比較し、相対残存活性を算出するにより行うことができる。変異型トリプトファン酸化酵素の残存活性（野生型の残存活性を１００％とした場合）は、１００％を超えることが好ましく、１０１％、１０３％、１０４％、１０５％、１１０％、１２０％、１３０％または１４０％をそれぞれ超えることがより好ましく、１５０％、１６０％、１７０％または１８０％をそれぞれ超えることがさらにより好ましい。
【００３２】
変異型トリプトファン酸化酵素が有するアミノ酸の変異としては例えば、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、ならびに、他のアミノ酸残基への置換、付加および挿入が挙げられ、通常は他のアミノ酸残基への置換である。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。変異型トリプトファン酸化酵素が有する変異の数は少なくとも１つであればよく、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個又は１〜５個である。
【００３３】
野生型トリプトファン酸化酵素がモチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）中の少なくとも１つを含む場合、これらのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異していることが好ましい。すなわち、モチーフ（５）中の１つのアミノ酸残基の変異又は２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（７）中の１つのアミノ酸残基の変異又は２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（９）中の１つのアミノ酸残基の変異又は２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（１３）中の１つのアミノ酸残基の変異又は２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、およびモチーフ（１４）中の１つのアミノ酸残基の変異又は２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせからなる群より選ばれる１つ以上を有することが好ましい。
【００３４】
変異型トリプトファン酸化酵素は、モチーフ（１４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含むか、もしくは、モチーフ（５）中の少なくとも１つのアミノ酸残基、モチーフ（７）中の少なくとも１つのアミノ酸残基、モチーフ（９）中の少なくとも１つのアミノ酸残基から選ばれる１以上の変異、モチーフ（１１）中の少なくとも１つのアミノ酸残基から選ばれる１以上の変異、およびモチーフ（１３）中の少なくとも１つのアミノ酸残基から選ばれる１以上の変異と、モチーフ（１４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含むことが好ましく、
モチーフ（５）中の少なくとも１つのアミノ酸残基、モチーフ（９）中の少なくとも１つのアミノ酸残基から選ばれる１以上の変異、およびモチーフ（１４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含むことがより好ましい。
変異型トリプトファン酸化酵素は、モチーフ（１４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異（例えばＣ３９５の変異）を含むか、又は、モチーフ（１４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異（例えばＣ３９５の変異）と他の変異の組み合わせを含むことが好ましい。
【００３５】
モチーフ（２）に含まれるアミノ酸残基の変異は、少なくともＱ６８の変異を含むことが好ましい。Ｑ６８の変異は、システインへの置換（Ｑ６８Ｃ）が好ましい。Ｑ６８Ｃは、他のシステイン残基との間でＳＳ結合を形成することが好ましい。
【００３６】
モチーフ（３）に含まれるアミノ酸残基の変異は、少なくともＹ８７の変異を含むことが好ましい。Ｙ８７の変異は、システインへの置換（Ｙ８７Ｃ）が好ましい。
【００３７】
モチーフ（５）に含まれるアミノ酸残基の変異は、少なくともＡ１４５の変異を含むことが好ましい。Ａ１４５の変異は、システイン、バリン、スレオニン、イソロイシン、セリン、ロイシン、メチオニンまたはチロシンへの置換（Ａ１４５Ｃ、Ａ１４５Ｖ、Ａ１４５Ｔ、Ａ１４５Ｉ、Ａ１４５Ｓ、Ａ１４５Ｌ、Ａ１４５Ｍ、Ａ１４５Ｙ）が好ましく、Ａ１４５ＣまたはＡ１４５Ｖがより好ましく、Ａ１４５Ｖがさらに好ましい。
【００３８】
モチーフ（７）に含まれるアミノ酸残基の変異は、少なくともＭ１５５の変異および／またはＩ１５９の変異を含むことが好ましく、少なくともＭ１５５の変異を含むことがより好ましい。Ｍ１５５の変異は、アラニン、グリシンまたはバリンへの置換（Ｍ１５５Ａ、Ｍ１５５Ｇ、Ｍ１５５Ｖ）が好ましく、Ｍ１５５Ａがより好ましい。Ｉ１５９の変異は、フェニルアラニンへの置換（Ｉ１５９Ｆ）が好ましい。
【００３９】
モチーフ（９）に含まれるアミノ酸残基の変異は、少なくともＬ２６５の変異を含むことが好ましい。Ｌ２６５の変異は、イソロイシンへの置換（Ｌ２６５Ｉ）またはメチオニンへの置換（Ｌ２６５Ｍ）が好ましく、Ｌ２６５Ｉがより好ましい。
【００４０】
モチーフ（１１）に含まれるアミノ酸残基の変異は、少なくともＲ２９６の変異を含むことが好ましい。Ｒ２９６の変異は、システインへの置換（Ｒ２９６Ｃ）が好ましい。
【００４１】
モチーフ（１３）に含まれるアミノ酸残基の変異は、少なくともＶ３６３の変異を含むことが好ましい。Ｖ３６３の変異は、フェニルアラニン、トリプトファン、イソロイシン、ヒスチジン、スレオニン、またはシステインへの置換（Ｖ３６３Ｆ、Ｖ３６３Ｗ、Ｖ３６３Ｉ、Ｖ３６３Ｈ、Ｖ３６３Ｔ、Ｖ３６３Ｃ）が好ましく、Ｖ３６３ＦまたはＶ３６３Ｗがより好ましい。
【００４２】
モチーフ（１４）に含まれるアミノ酸残基の変異は、少なくともＣ３９５またはＧ３９６の変異を含むことが好ましく、Ｃ３９５の変異を含むことがより好ましい。Ｃ３９５の変異は、セリンへの置換（Ｃ３９５Ｓ）、アラニンへの置換（Ｃ３９５Ａ）、ヒスチジンへの置換（Ｃ３９５Ｈ）、プロリンへの置換（Ｃ３９５Ｐ）、グルタミンへの置換（Ｃ３９５Ｑ）、スレオニンへの置換（Ｃ３９５Ｔ）、メチオニンへの置換（Ｃ３９５Ｍ）、グリシンへの置換（Ｃ３９５Ｇ）、フェニルアラニンへの置換（Ｃ３９５Ｆ）、チロシンへの置換（Ｃ３９５Ｙ）、アスパラギン酸への置換（Ｃ３９５Ｄ）、グルタミン酸への置換（Ｃ３９５Ｅ）、リジンへの置換（Ｃ３９５Ｋ）、アスパラギンへの置換（Ｃ３９５Ｎ）、アルギニンへの置換（Ｃ３９５Ｒ）またはバリンへの置換（Ｃ３９５Ｖ）であることが好ましく、Ｃ３９５Ｓ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ３９５Ｐ、Ｃ３９５ＱまたはＣ３９５Ｙがより好ましく、Ｃ３９５Ｓ又はＣ３９５Ａがさらに好ましい。Ｇ３９６の変異は、システインへの置換（Ｇ３９６Ｃ）が好ましい。
【００４３】
変異型トリプトファン酵素は、各モチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異により、好ましくはモチーフ（２）、（３）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれる１以上のモチーフ中のアミノ酸残基の変異により、ＳＳ結合を有してもよい。ＳＳ結合導入の変異としては例えば、Ｑ６８Ｃ（モチーフ（２））、Ｙ８７Ｃ（モチーフ（３）），Ｒ２９６Ｃ（モチーフ（１１））、Ｃ３６３Ｃ（モチーフ（１３））、Ｇ３９６Ｃ（モチーフ（１４））が挙げられ、これらのうち、Ｃ３６３Ｃ／Ｇ３９６Ｃの変異導入により両者の間にＳＳ結合が形成され得る。
【００４４】
変異型トリプトファン酸化酵素が、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有するトリプトファン酵素の変異型である場合の変異箇所は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち２９位のシステイン（Ｃ２９）、５７位のセリン（Ｓ５７）、６３位のグリシン（Ｇ６３）、９２位のロイシン（Ｌ９２）、９５位のリジン（Ｋ９５）、１０５位のアラニン（Ａ１０５）、１３６位のグリシン（Ｇ１３６）、１８１位のグルタミン酸（Ｅ１８１）、１９０位のグリシン（Ｇ１９０）、３２１位のシステイン（Ｃ３２１）、３６７位のアルギニン（Ｒ３６７）、８３位のリジン（Ｋ８３）、８０位のチロシン（Ｙ８０）、１９０位のグリシン（Ｇ１９０）、２２位のヒスチジン（Ｈ２２）、４０９位のセリン（Ｓ４０９）、１７５位のアスパラギン（Ｎ１７５）、８４位のセリン（Ｓ８４）、１７８位のフェニルアラニン（Ｆ１７８）、１７９位のアラニン（Ａ１７９）、９８位のバリン（Ｖ９８）、１４０位のセリン（Ｓ１４０）、１４１位のメチオニン（Ｍ１４１）、１６６イソロイシン（Ｉ１６６）、２７３位のトリプトファン（Ｔ２７３）、３５２位のロイシン（Ｌ３５２）、３１０位のスレオニン（Ｔ３１０）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基に相当する残基の変異（好ましくは他のアミノ酸残基への置換）を有することが好ましい。上記群より選ばれる１つの変異でもよいし、２つ以上の組み合わせでもよい。
【００４５】
Ｃ２９、Ｓ５７、Ｇ６３、Ｌ９２、Ｋ９５、Ａ１０５、Ｇ１３６、Ｅ１８１、Ｇ１９０、Ｃ３２１、およびＲ３６７の変異は、それぞれの他のアミノ酸への置換が好ましい。Ｃ２９の変異は、バリンへの置換（Ｃ２９Ｖ）が好ましい。Ｓ５７の変異は、スレオニン、トリプトファン、メチオニン、アラニン、バリン、チロシン、システイン、イソロイシン、またはロイシンへの置換（Ｓ５７Ｔ、Ｓ５７Ｗ、Ｓ５７Ｍ、Ｓ５７Ａ、Ｓ５７Ｖ、Ｓ５７Ｙ、Ｓ５７Ｃ、Ｓ５７ＩまたはＳ５７Ｌ）が好ましく、Ｓ５７Ｔがより好ましい。Ｇ６３の変異は、グルタミンへの置換（Ｇ６３Ｑ）が好ましい。Ｌ９２の変異は、アラニンへの置換（Ｌ９２Ａ）が好ましい。Ｋ９５の変異は、アラニンへの置換（Ｋ９５Ａ）が好ましい。Ｇ１３６の変異は、リジン、グルタミン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン酸への置換（Ｇ１３６Ｋ、Ｇ１３６Ｑ、Ｇ１３６Ｒ、Ｇ１３６ＮまたはＧ１３６Ｅ）が好ましく、Ｇ１３６Ｋがより好ましい。Ａ１０５の変異は、グリシンへの置換（Ａ１０５Ｇ）が好ましい。Ｇ１９０の変異は、システインへの置換（Ｇ１９０Ｃ）が好ましい。Ｃ３２１の変異は、セリンまたはアラニンへの置換（Ｃ３２１ＳまたはＣ３２１Ａ）が好ましい。Ｒ３６７の変異は、リジンへの置換（Ｒ３６７Ｋ）が好ましい。変異型トリプトファン酸化酵素は、Ｓ５７、Ｇ１３６、およびＧ１９０からなる群より選ばれる変異を少なくとも含むことが好ましい。
【００４６】
Ｙ８０、Ｇ１９０、Ｋ８３、Ｅ１８１、Ｈ２２、Ｓ４０９、Ｎ１７５、Ｓ８４、Ｆ１７８、Ａ１７９、Ｖ９８、Ｓ１４０、Ｍ１４１、Ｉ１６６、Ｔ２７３、Ｌ３５２、またはＴ３１０の変異は、それぞれのシステインへの置換が好ましい。これらの変異と共にまたは独立して、変異型トリプトファン酸化酵素のモチーフ（２）、（３）、（１１）、（１３）および（１４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基のシステインへの変異、好ましくはＱ６８Ｃ（モチーフ（２））、Ｙ８７Ｃ（モチーフ（３））、Ｒ２９６Ｃ（モチーフ（１１））、Ｖ３６３Ｃ（モチーフ（１３））、およびＧ３９６Ｃ（モチーフ（１４））から選ばれる少なくとも１つの置換を有してもよい。これらのいずれかにより、置換後のシステイン残基と他のシステイン残基との間に、または置換後のシステイン残基の間にＳＳ結合が導入され得るので、遊離のシステイン量を低下させて安定性を改善することができる。結合が導入されるアミノ酸残基の組み合わせとしては例えば、Ｙ８０Ｃ／Ｇ１９０Ｃ、Ｋ８３Ｃ／Ｅ１８１Ｃ、Ｈ２２Ｃ／Ｓ４０９Ｃ、Ｑ６８Ｃ／Ｎ１７５Ｃ、Ｓ８４Ｃ／Ｆ１７８Ｃ、Ｙ８７Ｃ／Ａ１７９Ｃ、Ｖ９８Ｃ／Ｓ１４０Ｃ、Ｍ１４１Ｃ／Ｉ１６６Ｃ、Ｔ２７３Ｃ／Ｌ３５２Ｃ、Ｒ２９６Ｃ／Ｔ３１０Ｃ、Ｖ３６３Ｃ／Ｇ３９６Ｃ（それぞれのシステインへの置換の組み合わせ）が挙げられ、Ｙ８０Ｃ／Ｇ１９０Ｃ、および／または、Ｋ８３Ｃ／Ｅ１８１Ｃがより好ましい。
【００４７】
なお、好ましい変異後のアミノ酸残基は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられてもよい。類似の側鎖を有するアミノ酸残基としては例えば、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基含有側鎖（例、アルコール、フェノキシ基含有側鎖）を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。
【００４８】
変異型トリプトファン酸化酵素が、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有する変異前（野生型）トリプトファン酸化酵素に対する変異を有する場合には、それぞれのモチーフの変異と上記点変異（ＳＳ結合導入変異も含む）との組み合わせを有していてもよい。
【００４９】
変異型トリプトファン酸化酵素が有する、変異前のトリプトファン酸化酵素における２以上の変異の組み合わせとしては、以下の例が挙げられる。以下のうち変異組み合わせ例１〜８が好ましく、変異例１〜６がより好ましく、変異例１および２がさらに好ましい。
【００５０】
変異例１：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｓ５７Ｔ／Ｙ８０Ｃ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｇ１９０Ｃ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ、より好ましくは、Ｓ５７Ｔ／Ｙ８０Ｃ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｇ１９０Ｃ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ
・モチーフ（５）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（９）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・必要に応じて、Ｓ５７の変異、Ｇ１３６の変異、Ｙ８０の変異、Ｇ１９０の変異、およびＲ３６７の変異からなる群より選ばれる少なくとも１つの変異の組み合わせ
【００５１】
変異例２：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｓ５７Ｔ／Ｋ８３Ｃ／Ａ１４５Ｖ／Ｅ１８１Ｃ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ
・モチーフ（５）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１０）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・Ｓ５７の変異、Ｋ８３の変異、およびＥ１８１の変異からなる群より選ばれる少なくとも１つの変異の組み合わせ
【００５２】
変異例３：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｓ５７Ｔ／Ｃ３９５Ａ、Ｋ９５Ａ／Ｃ３９５Ａ、Ｒ３６７Ｋ／Ｃ３９５Ａ、Ｇ１３６Ｋ／Ｃ３９５Ａ、Ｇ１３６Ｑ／Ｃ３９５Ａ、Ｇ１３６Ｒ／Ｃ３９５Ａ、Ｇ６３Ｑ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１０５Ｇ／Ｃ３９５Ａ、Ｌ９２Ａ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ｇ６３Ｑ／Ｃ３９５Ａ、Ｈ２２Ｃ／Ｓ４０９Ｃ／Ｃ３９５Ａ、Ｙ８０Ｃ／Ｇ１９０Ｃ／Ｃ３９５Ａ、Ｋ８３Ｃ／Ｅ１８１Ｃ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ８４Ｃ／Ｆ１７８Ｃ／Ｃ３９５Ａ、Ｖ９８Ｃ／Ｓ１４０Ｃ／Ｃ３９５Ａ、Ｍ１４１Ｃ／Ｉ１６６Ｃ／Ｃ３９５Ａ、およびＴ２７３Ｃ／Ｌ３５２Ｃ／Ｃ３９５Ａ、より好ましくは、Ｓ５７Ｔ／Ｃ３９５Ａ、Ｋ９５Ａ／Ｃ３９５Ａ、Ｒ３６７Ｋ／Ｃ３９５Ａ、Ｇ１３６Ｋ／Ｃ３９５Ａ、Ｇ６３Ｑ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１０５Ｇ／Ｃ３９５Ａ、およびＬ９２Ａ／Ｃ３９５Ａ
・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・必要に応じて、Ｈ２２の変異、Ｓ５７の変異、Ｇ６３の変異、Ｙ８０の変異、Ｋ８３の変異、Ｓ８４の変異、Ｌ９２の変異、Ｋ９５の変異、Ｖ９８の変異、Ａ１０５の変異、Ｇ１３６の変異、Ｓ１４０の変異、Ｍ１４１の変異、Ｉ１６６の変異、Ｆ１７８の変異、Ｅ１８１の変異、Ｇ１９０の変異、Ｔ２７３の変異、Ｌ３５２の変異、Ｒ３６７の変異、およびＳ４０９の変異からなる群より選ばれる少なくとも１つの変異の組み合わせ
【００５３】
変異例４：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ａ１４５Ｃ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｔ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｉ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｓ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｌ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｍ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｙ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ｇ６３Ｑ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ｇ６３Ｑ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｇ６３Ｑ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１０５Ｇ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ｌ９２Ａ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ａ１０５Ｇ／Ａ１４５Ｖ、Ｓ５７Ｔ／Ｋ９５Ａ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ｋ９５Ａ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、およびＳ５７Ｔ／Ｇ６３Ｑ／Ａ１４５Ｖ／Ｒ３６７Ｋ／Ｃ３９５Ａ、より好ましくは、Ａ１４５Ｃ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ｇ６３Ｑ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、およびＳ５７Ｔ／Ｇ６３Ｑ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ
・モチーフ（５）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・必要に応じて、Ｓ５７の変異、Ｇ６３の変異、Ｌ９２の変異、Ｋ９５の変異、およびＡ１０５の変異、およびＲ３６７の変異からなる群より選ばれる１つ以上の変異
【００５４】
変異例５：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ、Ｌ２６５Ｍ／Ｃ３９５Ａ、またはＳ５７Ｔ／Ｌ２６５Ｍ／Ｃ３９５Ａ、より好ましくは、Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ、またはＬ２６５Ｍ／Ｃ３９５Ａ
・モチーフ（９）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・必要に応じて、Ｓ５７の変異
【００５５】
変異例６：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｍ１５５Ａ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ｍ１５５Ａ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ、またはＧ１３６Ｋ／Ｍ１５５Ａ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ、より好ましくは、Ｍ１５５Ａ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ
・モチーフ（７）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（９）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・必要に応じて、Ｓ５７の変異、およびＧ１３６の変異からなる群より選ばれる１以上の変異
【００５６】
変異例７：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｉ１５９Ｆ／Ｃ３９５Ａ、Ｍ１５５Ａ／Ｃ３９５Ａ、Ｍ１５５Ｇ／Ｃ３９５Ａ、Ｍ１５５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｌ９２Ａ／Ｍ１５５Ａ／Ｃ３９５Ａ、またはＫ９５Ａ／Ｍ１５５Ａ／Ｃ３９５Ａ、より好ましくは、Ｉ１５９Ｆ／Ｃ３９５Ａ、Ｍ１５５Ａ／Ｃ３９５Ａ
・モチーフ（７）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・必要に応じて、Ｌ９２の変異、およびＫ９５の変異から選ばれる少なくとも１つの変異
【００５７】
変異例８：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｖ３６３Ｗ／Ｃ３９５Ａ、Ｖ３６３Ｆ／Ｃ３９５Ａ、Ｖ３６３Ｉ／Ｃ３９５Ａ、Ｖ３６３Ｈ／Ｃ３９５Ａ、Ｖ３６３Ｔ／Ｃ３９５Ａ、Ｖ３６３Ｃ／Ｇ３９６Ｃ／Ｃ３９５Ａ、Ｖ３６３Ｃ／Ｇ３９６Ｃ／Ｃ３９５Ａ、またはＳ５７Ｔ／Ｖ３６３Ｗ／Ｃ３９５Ａ、より好ましくは、Ｖ３６３Ｗ／Ｃ３９５Ａ、またはＶ３６３Ｆ／Ｃ３９５Ａ
・モチーフ（１３）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・必要に応じて、Ｓ５７の変異
【００５８】
変異例９：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｑ６８Ｃ／Ｎ１７５Ｃ／Ｃ３９５Ａ
・モチーフ（２）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・必要に応じて、Ｎ１７５の変異
【００５９】
変異例１０：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｙ８７Ｃ／Ａ１７９Ｃ／Ｃ３９５Ａ
・Ａ１７９の変異
・モチーフ（３）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
【００６０】
変異例１１：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｒ２９６Ｃ／Ｔ３１０Ｃ／Ｃ３９５Ａ
・モチーフ（１１）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・必要に応じて、Ｔ３１０の変異
【００６１】
変異例１２：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ａ１４５Ｖ／Ｉ１５９Ｆ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｃ／Ｍ１５５Ａ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ａ１４５Ｖ／Ｉ１５９Ｆ／Ｃ３９５Ａ、またはＳ５７Ｔ／Ａ１４５Ｖ／Ｍ１５５Ａ
・モチーフ（５）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（７）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・必要に応じて、Ｓ５７の変異
【００６２】
変異例１３：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ａ１４５Ｖ／Ｖ３６３Ｗ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ａ１４５Ｖ／Ｖ３６３Ｗ／Ｃ３９５Ａ、またはＳ５７Ｔ／Ｇ６３Ｑ／Ａ１４５Ｖ／Ｖ３６３Ｆ／Ｃ３９５Ａ
・モチーフ（５）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１３）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・必要に応じて、Ｓ５７の変異、およびＧ６３の変異からなる群より選ばれる１以上の変異
【００６３】
変異例１４：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｇ６３Ｑ／Ｍ１５５Ａ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ
・モチーフ（７）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（９）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・必要に応じて、Ｇ６３の変異
【００６４】
変異例１５：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ａ１４５Ｖ／Ｍ１５５Ａ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ
・モチーフ（５）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（７）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（９）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
【００６５】
変異例１６：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｓ５７Ｔ／Ａ１４５Ｖ／Ｌ２６５Ｉ／Ｖ３６３Ｆ／Ｃ３９５Ａ
・モチーフ（５）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（９）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１３）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
・必要に応じて、Ｓ５７の変異
【００６６】
変異型トリプトファン酸化酵素は、Ｃ末端またはＮ末端に、他のペプチド成分（例えば、タグ部分）を有していてもよい。他のペプチド成分としては例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に汎用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ−ｔａｇ）；シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）；他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分が挙げられる。変異型トリプトファン酸化酵素は、Ｎ末端に開始メチオニン残基を有していてもよい。
【００６７】
変異型トリプトファン酸化酵素は、上述した特性が保持される限り、上記変異に加え、１または数個のアミノ酸残基の追加変異（例えば、置換、欠失、挿入および付加）を有していてもよい。追加変異の数は、例えば１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜４０個、さらにより好ましくは１〜３０個、最も好ましくは１〜２０個または１〜１０個（例、１、２、３、４または５個）である。当業者は、上述した特性を保持するこのような変異型酵素を適宜作製することができる。
【００６８】
したがって、変異型トリプトファン酸化酵素は、以下のいずれかであってもよい：
（ｉ）モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有する変異前トリプトファン酸化酵素のアミノ酸配列において、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異（例えば、置換）したアミノ酸配列を含み、かつ、トリプトファン酸化酵素活性および／または安定性が変異前トリプトファン酸化酵素よりも高い、変異型トリプトファン酸化酵素
（ｉｉ）（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異前トリプトファン酸化酵素のアミノ酸配列におけるＨ２２、Ｃ２９、Ｓ５７、Ｇ６３、Ｌ９２、Ｋ９５、Ａ１０５、Ｇ１３６、Ｅ１８１、Ｇ１９０、Ｃ３２１、Ｒ３６７、Ｙ８０、Ｇ１９０、Ｋ８３、Ｈ２２、Ｓ４０９、Ｎ１７５、Ｓ８４、Ｆ１７８、Ａ１７９、Ｖ９８、Ｓ１４０、Ｍ１４１、Ｉ１６６、Ｔ２７３、Ｌ３５２、およびＴ３１０からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が変異（例えば、置換）したアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の追加変異を有するアミノ酸配列を有し、かつ、トリプトファン酸化酵素活性および／または安定性が変異前トリプトファン酸化酵素よりも高い変異型トリプトファン酸化酵素
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異前トリプトファン酸化酵素のアミノ酸配列における、Ｈ２２、Ｃ２９、Ｓ５７、Ｇ６３、Ｌ９２、Ｋ９５、Ａ１０５、Ｇ１３６、Ｅ１８１、Ｇ１９０、Ｃ３２１、Ｒ３６７、Ｙ８０、Ｇ１９０、Ｋ８３、Ｈ２２、Ｓ４０９、Ｎ１７５、Ｓ８４、Ｆ１７８、Ａ１７９、Ｖ９８、Ｓ１４０、Ｍ１４１、Ｉ１６６、Ｔ２７３、Ｌ３５２、およびＴ３１０からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基、およびモチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異（例えば、置換）したアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の追加変異を有するアミノ酸配列を有し、かつ、トリプトファン酸化酵素活性および／または安定性が変異前トリプトファン酸化酵素よりも高い変異型トリプトファン酸化酵素。
【００６９】
変異型トリプトファン酸化酵素は、上述した変異および追加変異の双方を有することにより、変異前の（野生型）トリプトファン酸化酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。アミノ酸配列の同一性の定義および例は、前述したとおりである。
【００７０】
アミノ酸配列において追加変異が導入され得るアミノ酸残基の位置の特定に関しては、前述のとおりである。追加変異が導入される部位は、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）中のアミノ酸残基、およびＨ２２、Ｃ２９、Ｓ５７、Ｇ６３、Ｌ９２、Ｋ９５、Ａ１０５、Ｇ１３６、Ｅ１８１、Ｇ１９０、Ｃ３２１、Ｒ３６７、Ｙ８０、Ｇ１９０およびＫ８３以外のアミノ酸残基であってもよい。
【００７１】
アミノ酸残基の追加変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」の定義および例については前述のとおりである。
【００７２】
変異型トリプトファン酸化酵素は、変異型トリプトファン酸化酵素を発現する形質転換体を用いて、または無細胞系等を用いて、調製することができる。変異型トリプトファン酸化酵素を発現する形質転換体は、例えば、変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製できる。変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。
【００７３】
発現ベクターは、変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含んでいればよく、例えば、宿主においてタンパク質を発現させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクター、または人工染色体であってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、本発明の変異型トリプトファン酸化酵素をコードする本発明のポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。
【００７４】
発現ベクターは、変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドに加えて、プロモーター、ターミネーターおよび薬剤（例、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン）耐性遺伝子をコードする領域等の領域をさらに含んでもよい。発現ベクターは、プラスミドであっても組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。発現ベクターは、ウイルスベクターであっても無細胞系用ベクターであってもよい。発現ベクターは、変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドに対して３’または５’末端側に、本発明の変異型トリプトファン酸化酵素に付加され得る他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、上述したような目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、上述したような目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む種々の発現ベクターが利用可能である。したがって、変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの作製のため、このような発現ベクターを利用してもよい。例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−５１ｂ、ｐＥＴ−４１ａ、ｐＭＡＬ−ｐ５Ｇ）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ−５０ｂ）、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＣｏｌｄ  ＴＦ）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを利用することができる。発現ベクターは、プロテアーゼによる切断部位をコードする領域を、変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとの間に含んでいてもよい。これにより、変異型トリプトファン酸化酵素とそれに付加された他のペプチド成分との切断がタンパク質発現後に可能となる。
【００７５】
変異型トリプトファン酸化酵素を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌〔例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、およびバチルス属細菌〔例、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス属細菌〔例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、ピヒア属細菌〔例、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）〕、アスペルギルス属細菌〔例、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）〕をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。宿主としては、所定の遺伝子を欠損する株を用いてもよい。形質転換体としては、例えば、細胞質中に発現ベクターを保有する形質転換体、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換体が挙げられる。
【００７６】
変異型トリプトファン酸化酵素を発現する形質転換体は、所定の培養装置（例、試験管、フラスコ、ジャーファーメンター）を用いて、例えば後述の組成を有する培地において培養することができる。培養条件は適宜設定することができる。具体的には、培養温度は１０℃〜３７℃であってもよく、ｐＨは６．５〜７．５であってもよく、培養時間は１時間〜１００時間であってもよい。また、溶存酸素濃度を管理しつつ培養を行ってもよい。この場合、培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ値）を制御の指標として用いることがある。大気中の酸素濃度を２１％とした場合の相対的な溶存酸素濃度ＤＯ値が、例えば１〜１０％を、好ましくは３〜８％を下回らない様に、通気・攪拌条件を制御することが出来る。また、培養はバッチ培養であっても、フェドバッチ培養であっても良い。フェドバッチ培養の場合は糖源となる溶液やリン酸を含む溶液を培養液に連続的あるいは不連続的に逐次添加して、培養を継続することもできる。
【００７７】
形質転換される宿主は、上述したとおりであるが、大腸菌について詳述すると、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
【００７８】
変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させるプロモーターとしては、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ５プロモーター等の強力なプロモーターが挙げられ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、ｌａｃが好ましい。ベクターとしては例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体等が挙げられる。他のベクターとしては、ファージＤＮＡのベクターを利用してもよい。さらに、プロモーターを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用してもよい。好ましくは、ベクターは、ｐＵＣ、ｐＳＴＶ、ｐＭＷであってもよい。
【００７９】
変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドの下流に転写終結配列であるターミネーターを連結してもよい。このようなターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターが挙げられる。
【００８０】
変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入および／または付加などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。
【００８１】
形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている〔例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）〕。
【００８２】
得られた発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養することにより、変異型トリプトファン酸化酵素を得ることができる。
【００８３】
培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。培地は、所定の炭素源、窒素源、補酵素（例、塩酸ピリドキシン）を含有していてもよい。具体的には、ペプトン、酵母エキス、ＮａＣｌ、グルコース、ＭｇＳＯ４、硫酸アンモニウム、リン酸２水素カリウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、などを用いても良い。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿主菌等の種類に応じて適宜選択される。
【００８４】
変異型トリプトファン酸化酵素を回収するには、以下の方法などがある。変異型トリプトファン酸化酵素は、形質転換体を回収した後、菌体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、本発明の変異型トリプトファン酸化酵素を得ることができる。
【００８５】
変異型トリプトファン酸化酵素は、トリプトファンの分析に用いることができる。斯かる分析方法は、変異型トリプトファン酸化酵素を用いて被検試料中に含まれるトリプトファンを測定することを含み得る。  
【００８６】
被検試料としては、トリプトファンを含有すると疑われる試料である限り特に限定されず、例えば、生体由来試料（例、血液、尿、唾液、涙など）や食飲料品（例、栄養ドリンクやアミノ酸飲料など）が挙げられる。被検試料中のトリプトファンは、低濃度（例、１μＭ以上１ｍＭ未満等の１ｍＭ未満の濃度）であっても、高濃度（例、１ｍＭ以上１Ｍ未満等の１ｍＭ以上の濃度）であってもよい。  
【００８７】
トリプトファンの分析における検出対象は、トリプトファンを測定できる限り特に限定されず、生成するトリプトファンオキシレート、および副生するＮＨ3またはＨ2Ｏ2のいずれでもよい。あるいは、他の反応と共役させて、共役反応の生成物を検出してもよい。このような共役反応としては、例えば、以下の共役反応が挙げられる。  
【００８８】
トリプトファン酸化反応）トリプトファン酸化酵素により触媒される反応
トリプトファン＋Ｈ2Ｏ＋Ｏ2→トリプトファンオキシレート＋ＮＨ3＋Ｈ2Ｏ2
共役反応）ペルオキシダーゼにより触媒される反応
２Ｈ2Ｏ2＋４−アミノアンチピリン＋フェノール→キノンイミン色素＋４Ｈ2Ｏ  
【００８９】
上記共役反応を利用する場合、トリプトファンの測定は、変異型トリプトファン酸化酵素に加えて、４−アミノアンチピリンおよびフェノール、ならびにペルオキシダーゼを用いて行うことができる。具体的には、水溶液（例、緩衝液）中において、被検試料を４−アミノアンチピリン（４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ）およびフェノール、ならびにペルオキシダーゼと混合し、次いで、混合試料を上記の酵素反応に供し、最後に、生成したキノンイミン色素（ｑｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ  ｄｙｅ）の吸光度（約５００ｎｍ）を検出することにより、トリプトファンが測定される。測定は、定性的または定量的に行うことができる。測定は、例えば、全ての基質が反応するまで測定を行うエンドポイント法に基づいて行われてもよいし、レート法（初速度法）に基づいて行われてもよい。なお、酸化反応において必要とされる酸素量は微量であるため、反応系中の溶存酸素により必要な酸素量が賄えることから、通常、反応系中へ酸素や酸素を含む気体を強制的に供給する必要はない。  
【００９０】
変異型トリプトファン酸化酵素は、トリプトファン以外のアミノ酸（例、Ｌ−α−アミノ酸）に対して反応しないか、またはそれに対する反応性が極めて低い。したがって、被験試料中にトリプトファン以外のアミノ酸が含まれている場合も、変異型トリプトファン酸化酵素を用いることで、被験試料中のトリプトファンの量を特異的に評価することができる。
【００９１】
また、変異型トリプトファン酸化酵素は過酸化水素電極に用いることができる。斯かる過酸化水素電極を用いることで、被験試料中のトリプトファンの量を特異的に評価することができる。  
【００９２】
さらに、変異型トリプトファン酸化酵素は、トリプトファン分析用キットに含めることができる。トリプトファン分析キットは、他の試薬、例えば反応用緩衝液または緩衝塩、、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬およびトリプトファンオキシレート検出試薬（インドールピルビン酸検出試薬）の少なくとも一つをさらに含むことができる。  
【００９３】
反応用緩衝液または緩衝塩は、反応液中のｐＨを目的の酵素反応に適した値に維持するために利用できる。
【００９４】
過酸化水素検出用試薬は、過酸化水素の検出を例えば発色や蛍光などによって行う場合に利用できる。斯かる試薬としては例えば、ペルオキシダーゼとその基質となり得る発色剤の組み合わせが挙げられ、具体的には、例えば西洋わさびペルオキシダーゼと４−アミノアンチピリンおよびフェノールの組み合わせなどが挙げられるが、この組み合わせに限定されない。  
【００９５】
アンモニア検出試薬としては、例えばフェノールと次亜塩素酸を組み合わせたインドフェノール法などが挙げられる。  
【００９６】
トリプトファンオキシレート検出試薬としては、例えば２−オキソ酸還元酵素などが挙げられる。  
【００９７】
変異型トリプトファン酸化酵素は、デバイスと共に、トリプトファン分析用検出系の構成要素とすることができる。変異型トリプトファン酸化酵素は、使用の際にデバイス中に供給され得るマイクロデバイスとは独立したユニットとして存在していてもよいが、予めデバイスに、注入、固定または配置されていてもよい。好ましくは、変異型トリプトファン酸化酵素は、予めデバイスに注入、固定または配置された形態で提供される。トリプトファン酸化酵素のデバイスへの固定または配置は、直接的または間接的に行われる。デバイスとしては、例えば、流路を備えるマイクロ流路チップ等のマイクロデバイスを好適に用いることができる。  
【００９８】
トリプトファン分析用検出系は、他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては例えば、反応用緩衝液または緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬およびトリプトファンオキシレート検出試薬の少なくとも一つが挙げられる。トリプトファン分析用検出系では、上記他の構成要素の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、上記他の構成要素の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない要素は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。
【００９９】
デバイスとしては、例えば、１）試料と（ｃ）の構成要素とを混合して混合液を調製するための第１区域、および調製された混合液を、変異型トリプトファン酸化酵素と接触させて、トリプトファンを検出するための第２区域を備えるデバイス（混合および検出の各工程が異なる区域中で行われるデバイス）；２）試料と（ｃ）の構成要素と変異型トリプトファン酸化酵素とを混合して、変異型トリプトファン酸化酵素によりトリプトファンを検出するための区域を備えるデバイス（混合および検出の各工程が同一区域中で行われるデバイス）；ならびに３）試料と（ｃ）の構成要素と（および必要に応じて変異型トリプトファン酸化酵素と）の混合を可能にする流路、および変異型トリプトファン酸化酵素によりトリプトファンを検出するための区域を備えるデバイス（デバイスの注入口に試料を注入すると、流路を介して送液されて試料等が自動的に混合され、得られた混合液中のトリプトファンが検出区域中で自動検出されるデバイス）が挙げられる。自動化の観点からは、３）のデバイス、特にマイクロ流路デバイスの形態である３）のデバイスが好ましい。３）のデバイスでは、変異型トリプトファン酸化酵素は、流路を流れる送液中に提供されても、検出区域に固定または配置された形態で提供されてもよいが、好ましくは検出区域に固定または配置された形態で提供される。  
【０１００】
変異型トリプトファン酸化酵素は、トリプトファン分析用酵素センサーとして利用することもできる。トリプトファン分析用酵素センサーは例えば、検出用電極、および検出用電極に固定または配置された変異型トリプトファン酸化酵素を含む。変異型トリプトファン酸化酵素は、電極に直接または間接的に固定または配置される。  
【０１０１】
検出用電極としては例えば、過酸化水素検出用電極が挙げられ、より具体的には例えば、酵素式過酸化水素検出用電極や隔膜式過酸化水素検出用電極が挙げられる。これにより、トリプトファン酸化酵素活性によりトリプトファンが酸化された際に生じる過酸化水素を検出することで、トリプトファンの分析が可能となる。それ以外の構成は、公知のセンサーで採用されている構成をそのまま、あるいは適宜改変して利用することができる。
【実施例】
【０１０２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１０３】
以下の実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１０４】
〔実施例１〕ＴｒｐＯＸの発現と精製
大腸菌を用いたＴｒｐＯＸの組替え発現系を構築した。まず、組換え発現用のプラスミドを構築した。ＴｒｐＯＸ遺伝子の塩基配列（配列番号１）をＤＮＡプライマー１（配列番号３）およびＤＮＡプライマー（配列番号４）を用いて、標準的なＰＣＲ法に従って目的遺伝子を増幅した。続いて、ＮｄｅＩ（タカラバイオ株式会社）とＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲ産物とｐＥＴ２４ａ（メルク株式会社）を制限酵素消化し、ＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス株式会社）を用いて除タンパク質および不要なＤＮＡ断片を除去した。得られた産物を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（東洋紡績株式会社）を用いてライゲーションし、標準的な方法に従ってライゲーション産物による大腸菌ＸＬ−１０  ｇｏｌｄの形質転換体を取得した。大腸菌ＸＬ−１０  ｇｏｌｄの形質転換体からプラスミドを抽出し、標準的なＤＮＡ配列の解析法を用いて、プラスミドへの目的遺伝子の挿入を確認した。目的遺伝子が挿入されたプラスミドを、以後、ｐＥＴ２４ａ−ＴｒｐＯＸ、ｐＥＴ２４ａ−ＴｒｐＯＸによるＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体をｐＥＴ２４ａ−ＴｒｐＯＸ−ＢＬ２１（ＤＥ３）と呼ぶ。【０１０５】
ＴｒｐＯＸの調製は、下記のようにして行った。まず、ｐＥＴ２４ａ−ＴｒｐＯＸ−ＢＬ２１（ＤＥ３）のグリセロールストックから５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレートへ植菌し、３７℃で一晩、静置培養した。５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ液体培地６ｍｌを５０ｍｌ容量のチューブに入れ、ＬＢプレート上のシングルコロニーを植菌し、３７℃でＯＤ６００の値が０．６程度になるまで旋回振盪にて培養した。続いて、１６℃の下３０分間静置し、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭとなるように添加し、１６℃で旋回振盪にて一晩培養した後に２．０ｍｌチューブに集菌した。破砕用バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，７５ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０)にて菌体を懸濁し、超音波破砕機（ＢＩＯＬＵＰＴＥＲ、コスモ・バイオ株式会社）を用いて強度Ｈ、インターバル３０秒、１０分間で２回破砕した。この破砕液を１３０００×ｇで１５分間遠心し上清を回収した後、Ｈｉｓ  Ｓｐｉｎ  Ｔｒａｐ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）もしくはＴＡＬＯＮ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（タカラバイオ株式会社）を用いて精製を行った。精製は製品添付のプロトコルに従ったが、Ｈｉｓ  Ｓｐｉｎ  Ｔｒａｐを用いる場合、洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，７５ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０）、溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，５００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０)を使用した。一方、ＴＡＬＯＮ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓを使用する場合は破砕用バッファーおよび洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ）、溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，５００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０）を用いた。洗浄、溶出はそれぞれ２回ずつ行い、回収した溶出画分は氷上で保存した。【０１０６】
〔実施例２〕ＴｒｐＯＸ変異体の調製
ＴｒｐＯＸ変異体を、下記のようにして調製した。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔｓ（アジレント・テクノロジー株式会社)を用いて、ｐＥＴ２８ａ−ＴｒｐＯＸを鋳型として製品添付のプロトコルに従い、ＴｒｐＯＸ遺伝子への変異導入を行った。変異を複数導入する際には、変異を入れたプラスミドを鋳型として用い変異を追加していくことで行った。この変異導入済みプラスミドを用いて、実施例１に記載の方法に従って、組換え発現、精製を行うことで様々なＴｒｐＯＸ変異体を取得した。【０１０７】
〔実施例３〕活性および熱安定性の評価（１）
実施例１および実施例２で調製したＴｒｐＯＸの野生型および変異体の活性および熱安定性の評価は、下記手順にて行った。０．１ｍｇ／ｍｌに調製した各ＴｒｐＯＸをマイクロチューブへ分注し、４℃、４５℃のいずれかの温度で１５分間インキュベートした後に、ＴｒｐＯＸを０．０２ｍｇ／ｍｌとなるように１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０で希釈した。【０１０８】
下記反応液ＡおよびＢを調製した。
反応液Ａ：２ｍＭ  フェノール、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０
反応液Ｂ：１００ｍＭ  ４−アミノアンチピリン、１５００Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ【０１０９】
９６穴マイクロプレートに反応液Ａを４９μｌ、反応液Ｂを２μｌ、超純水を２９μｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｐを１０μｌ混合した溶液に対して０．０２ｍｇ／ｍｌに調製したＴｒｐＯＸを１０μｌ加えた溶液の、波長５０５ｎｍにおける吸光度の経時変化をマイクロプレートリーダー（ｘＭａｒｋ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で測定した。表４は、各ＴｒｐＯＸ変異体の相対活性および残存活性である。表４中、コントロールと比較した相対活性は、コントロール（野生型ＴｒｐＯＸ）の４℃で１５分間処理後の活性１００％に対する各ＴｒｐＯＸ変異体の４℃で１５分間処理後の活性の比である。表４中、熱処理後の残存活性は、各ＴｒｐＯＸ変異体の４℃で１５分間処理後の活性１００％に対する加熱処理（４５℃で１５分間処理）後の各ＴｒｐＯＸ変異体の活性の比である。
表５および表６は、ＴｒｐＯＸ（Ｃ３９５Ａ）の遺伝子を鋳型として変異を導入した各ＴｒｐＯＸ変異体の相対活性および残存活性である。表６のＴｒｐＯＸ変異体は、ＳＳ結合導入を目的とした変異がＴｒｐＯＸ（Ｃ３９５Ａ）に導入された変異体である。表５及び６中、コントロールと比較した相対活性は、コントロール（ＴｒｐＯＸ（Ｃ３９５Ａ））の４℃で１５分間処理後の活性１００％に対する各ＴｒｐＯＸ変異体の４℃で１５分間処理後の活性の比である。熱処理後の残存活性は、各ＴｒｐＯＸ変異体の４℃で１５分間処理後の活性１００％に対する加熱処理（４５℃で１５分間処理）後の各ＴｒｐＯＸ変異体の活性の比である。表４中のコントロールは、野生型の結果であり、表５および６中のコントロールは、ＴｒｐＯＸ（Ｃ３９５Ａ）の結果である。【０１１０】
【表４】
2018047976.tif 000005
【０１１１】
【表５】
2018047976.tif 000006
【０１１２】
【表６】
2018047976.tif 000007
【０１１３】
表４の結果から、Ｃ２９への変異導入（Ｃ２９Ｖなど）、Ｓ５７への変異導入（Ｓ５７Ｔなど）、Ｇ６３への変異導入（Ｇ６３Ｑなど）、Ｇ１３６への変異導入（Ｇ１３６Ｋなど）、モチーフ（５）への変異導入（Ａ１４５Ｖなど）、モチーフ（９）への変異導入（Ｌ２６５Ｉなど）、Ｃ３２１への変異導入（例えばＣ３２１Ａ）、モチーフ（１３）への変異導入（Ｖ３６３Ｗなど）、および、モチーフ（１４）への変異導入（Ｃ３９５Ａなど）により、トリプトファン酸化酵素活性および／または熱安定性を向上させることができることが分かる。【０１１４】
表５の結果から、Ｓ５７への変異導入（Ｓ５７Ｔなど）、Ｇ１３６への変異導入（Ｇ１３６Ｑ、Ｇ１３６Ｒ、Ｇ１３６Ｋなど）、モチーフ（５）への変異導入（Ａ１４５Ｉ、Ａ１４５Ｓ、Ａ１４５Ｃなど）、モチーフ（１３）への変異導入（Ｖ３６３Ｆ、Ｖ３６３Ｉなど）、モチーフ（１３）への変異導入（Ｖ３６３Ｗなど）、Ｇ６３への変異導入（Ｇ６３Ｑなど）、モチーフ（５）への変異導入（Ａ１４５Ｔ、Ａ１４５Ｖなど）、モチーフ（７）への変異導入（Ｍ１５５Ａ、Ｍ１５５Ｇ、Ｍ１５５Ｖなど）と、モチーフ（１４）への変異導入（Ｃ３９５Ａなど）とを組み合わせることにより、トリプトファン酸化酵素活性および／または熱安定性を向上させることができることが分かる。【０１１５】
表６の結果より、Ｈ２２Ｃ／Ｓ４０９Ｃ、モチーフ（２）中のアミノ酸残基（Ｑ６８Ｃなど）／Ｎ１７５Ｃ、Ｙ８０Ｃ／Ｇ１９０Ｃ、Ｋ８３Ｃ／Ｅ１８１Ｃ、Ｓ８４Ｃ／Ｆ１７８Ｃ、モチーフ（３）から選ばれるアミノ酸残基（Ｙ８７Ｃなど）／Ａ１７９Ｃ、Ｖ９８Ｃ／Ｓ１４０Ｃ、Ｍ１４１Ｃ／Ｉ１６６Ｃ、Ｔ２７３Ｃ／Ｌ３５２Ｃ、またはモチーフ（１３）中のアミノ酸残基（Ｖ３６３Ｃなど）／Ｇ３９６Ｃ、またはモチーフ（１１）中のアミノ酸残基（Ｒ２９６Ｃなど）／Ｔ３１０Ｃと、モチーフ（１４）への変異導入（Ｃ３９５Ａなど）とを組み合わせることにより、トリプトファン酸化酵素の熱安定性を向上させることができ、さらにトリプトファン酸化酵素活性も向上させ得ることが分かる。これらの組み合わせの変異後のシステイン間にはＳＳ結合が導入され、これにより遊離システイン量が減少し、トリプトファン酸化酵素の特性が向上したものと考えられる。【０１１６】
〔実施例４〕ＴｒｐＯＸ多重変異体の調製と活性および熱安定性の評価
実施例２に記載に記載の方法で目的とするＴｒｐＯＸに対して複数変異点を導入することで調製したＴｒｐＯＸの発現は、実施例１に記載の方法に従い行った。ＴｒｐＯＸの精製は、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレートへ植菌し、３７℃で一晩静置培養した菌体を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ液体培地２ｍｌを１２ｍｌ容量のチューブに入れて、３７℃で旋回振盪にて培養した。続いて、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ液体培地１５０ｍｌ容量のフラスコに培養液を１．５ｍｌ加え３７℃でＯＤ６００の値が０．６程度になるまで旋回振盪にて培養した。続いて、１６℃の下３０分間静置し、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭとなるように添加し、１６℃で旋回振盪にて一晩培養した後に５０ｍｌチューブに入れ、菌体洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）にて菌体を洗浄した後に集菌した。【０１１７】
破砕用バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０）にて菌体を懸濁し、超音波破砕機（ＩＳＯＮＡＴＯＲ  ２０１Ｍ、久保田商事株式会社)を用いて１８０Ｗ，２０分間破砕した。この破砕液を１５０００×ｇで１５分間遠心し上清を回収した後，０．２２μｍフィルターに通し、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０ＳとＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ  ｃｒｕｄｅ  １ｍｌ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製を行った。用いたバッファーは、カラム平衡化および洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．０)と、溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，５００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０)で、流速は１ｍＬ／ｍｉｎとした。サンプルを供与後に、カラム平衡化および洗浄バッファーにて洗浄を行い、ｉｍｉｄａｚｏｌｅ濃度２０−５００ｍＭのグラジエント５ｍＬで溶出した。サンプリングは０．５ｍＬずつ行い、回収した溶出画分は氷上で保存した。【０１１８】
次に、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０ＳとＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ  １ｍＬを用いて、陰イオン交換カラムによる精製を行った。ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰでの精製に用いたバッファーは、カラム平衡化および洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）と、溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で、流速は１ｍＬ／ｍｉｎとした。サンプルを平衡化および洗浄バッファーで２０倍希釈し、陰イオン交換カラムに供した後、カラム平衡化および洗浄バッファーにて洗浄を行い、ＮａＣｌ濃度０−５００ｍＭのグラジエント５ｍＬで溶出した。サンプリングは０．５ｍＬずつ行い回収した溶出画分は透析バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）にて溶液交換を行い４℃に保存した。【０１１９】
活性および熱安定性の評価は、４５℃の代わりに５０℃、５５℃でインキュベートを行った以外は、実施例３に従った。表７は、ＴｒｐＯＸ（Ｃ３９５Ａ）の遺伝子を鋳型として変異を複数導入した変異体の活性および耐熱性を評価した結果である。表７中、コントロールと比較した相対活性、及び、熱処理後の残存活性は、加熱処理の温度が５０℃または５５℃であるほかは、表５および６のそれぞれと同義である。表７中のコントロールは、ＴｒｐＯＸ（Ｃ３９５Ａ）の結果である。【０１２０】
【表７】
2018047976.tif 000008
【０１２１】
表７より、上述した変異例１〜１６で示した変異型トリプトファン酸化酵素はいずれも、トリプトファン酸化酵素活性および／または熱安定性が向上していることが分かる。【０１２２】
〔実施例５〕活性および熱安定性の評価（２）
実施例１で調製した野生型ＴｒｐＯＸに対し実施例２と同様にして表８に示す変異を導入して変異体を調整した。各変異体の活性および熱安定性を、４５℃の代わりに５０℃でインキュベートを行った以外は、実施例３と同様にして評価した。表８に、変異体の相対活性および５０℃、１５分間加熱後の相対残存活性を示した。表８中、コントロールと比較した相対活性は、コントロール（野生型ＴｒｐＯＸ）の４℃で１５分間処理後の活性１００％に対する、各ＴｒｐＯＸ変異体の４℃で１５分処理後の活性の比である。相対残存活性は、コントロール（野生型ＴｒｐＯＸ）の加熱処理（５０℃で１５分間処理）後の残存活性１００％に対する、加熱処理（５０℃で１５分間処理）後の各ＴｒｐＯＸ変異体の残存活性の比である。【０１２３】
【表８】
2018047976.tif 000009
【０１２４】
表８の結果から、モチーフ（１４）への変異導入によりトリプトファン酸化酵素活性を向上させることができること、モチーフ（１４）の中でもＣ３９５への変異導入によりトリプトファン酸化酵素活性および熱安定性を向上させることができることが分かる。【０１２５】
〔実施例６〕温度依存性の評価
Ａ．野生型ＴｒｐＯＸと、Ｂ．ＴｒｐＯＸ（Ｃ３９５Ａ）、および、Ｃ．ＴｒｐＯＸ（Ｓ５７Ｔ／Ｙ８０Ｃ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｇ１９０Ｃ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ）について温度依存性を確認した。反応、測定は９６穴マイクロプレートを用いて行った。１．０ｍｇ／ｍｌに調製した各ＴｒｐＯＸをマイクロチューブへ分注し、４℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃でそれぞれ１５分間インキュベートした後に、ＴｒｐＯＸを０．０２ｍｇ／ｍｌとなるように１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０で希釈した。実施例３の反応液Ａと反応液Ｂを用いて、反応液Ａを４９μｌ、反応液Ｂを２μｌ、超純水を２９μｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｐを１０μｌ混合した溶液に対して０．０２ｍｇ／ｍｌに調製したＴｒｐＯＸを１０μｌ加えた溶液の、波長５０５ｎｍにおける吸光度の経時変化をマイクロプレートリーダー（ｘＭａｒｋ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．)で測定した。一定時間経過した後の各温度でインキュベートした酵素の残存活性を図１に示す。野生型ＴｒｐＯＸは４５℃から５０℃において顕著な活性低下を示すのに対してＴｒｐＯＸ（Ｓ５７Ｔ／Ｙ８０Ｃ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｇ１９０Ｃ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ）は５５℃でインキュベート後も高い活性を示し、熱安定性が大きく改善されていた。【０１２６】
〔実施例７〕血漿中Ｔｒｐの定量分析
ＴｒｐＯＸ（Ｓ５７Ｔ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ）変異体を用いて、ヒト血漿中のＴｒｐを定量分析した。反応、測定は９６穴プレートを用いて３７℃で行った。ＴｒｐＯＸ（Ｓ５７Ｔ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ）変異体を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，３００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液で０．５ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。下記反応液Ａおよび反応液Ｂを調製した。【０１２７】
反応液Ａ：０．２Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０
反応液Ｂ：１００ｍＭ  ＴＯＯＳ，１００ｍＭ  ４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ，１５００Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ，２Ｍ  ＮａＣｌ【０１２８】
９６穴マイクロプレートに反応液Ａを１５０μｌ、反応液Ｂを３９μｌ、超純水を５１μｌ、検体（Ｔｒｐ水溶液もしくは血漿）を３０μｌ加えた溶液に対して０．５ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。検体を添加する際は各希釈倍率（１０倍、２０倍、２５倍)に応じて添加量を調製した。ＴｒｐＯＸを３０μｌ加え混合する前および混合後一定時間の５５５ｎｍおよび８００ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ  ５５５ｎｍ（前）、Ａｂｓ  ５５５ｎｍ（後）、Ａｂｓ  ８００ｎｍ（前）、Ａｂｓ  ８００ｎｍ（後）)をマイクロプレートリーダー（Ｍ２ｅ，モレキュラーデバイス社）にて測定した。【０１２９】
反応前後の各測定ポイントにおける吸光度の値を用いて、酵素液添加の前後における吸光度の変化量（ΔＡｂｓ）は、（Ａｂｓ  ５５５ｎｍ（後）−Ａｂｓ  ８００ｎｍ（後）)−（Ａｂｓ  ５５５ｎｍ（前）−Ａｂｓ  ８００ｎｍ（前））×２７０÷３００として求めた。検体としてＴｒｐ水溶液を用いた際のΔＡｂｓとＴｒｐ濃度との関係から検量線を作成し、検体としてヒト血漿を用いた際のΔＡｂｓから、ヒト血漿中のＴｒｐ濃度を求めた。検量線は、各Ｔｒｐ濃度において３回実験を行った際の平均値を用いて作成し、同一ロットのヒト血漿を３回測定して、アミノ酸アナライザーによる分析値（４５．４μＭ）と比較した。結果を表９として示す。【０１３０】
【表９】
2018047976.tif 000010
【０１３１】
実施例の結果は、本発明による変異型トリプトファン酸化酵素はトリプトファン酸化酵素活性が野生型より向上しているため、トリプトファンの迅速かつ高感度な測定、および／またはトリプトファンオキシレートの製造に有用であることを示している。また、野生型より良好な熱安定性を示し、中でも水溶液中で良好な熱安定性を示し得ることから、トリプトファン検査試薬、中でも液状の検査試薬として有用であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明によれば、トリプトファンの迅速、高感度、かつ特異的な測定に、またはトリプトファンオキシレートの製造に有用な変異型トリプトファン酸化酵素およびその用途が提供される。従って本発明は、生体研究、健康栄養、医療、食品製造などの広範な分野において有用である。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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