(57)【要約】  化学合成法、特に酵素重合法及びブロック共重合法を使用するタンパク質の製造方法を確立し、本方法によって製造される天然シルクタンパク質に類似又は向上した特性を有するタンパク質、さらに、該タンパク質より製造される樹脂、繊維及びフィルム等の製品を提供する。  本発明は、単一のアミノ酸からなるポリアミノ酸及び／又は複数種のアミノ酸からなるポリペプチドを含むタンパク質であって、アミノ酸の種類及び／又は組成比が相違する前記ポリアミノ酸及び前記ポリペプチドの少なくとも2種がブロック共重合により反復配列しているブロック共重合体であるタンパク質、及び、該タンパク質から製造される製品を提供する。
2018043631.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一のアミノ酸からなるポリアミノ酸及び／又は複数種のアミノ酸からなるポリペプチドを含むタンパク質であって、アミノ酸の種類及び／又は組成比が相違する前記ポリアミノ酸及び前記ポリペプチドから選択される少なくとも2種がブロック共重合により反復配列していることを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
前記ポリアミノ酸又は前記ポリペプチドが、タンパク質の二次構造において、βシート構造、へリックス構造及び／又はランダムコイル構造を形成することを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質が、シルクタンパク質であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記ポリアミノ酸又は前記ポリペプチドを構成するアミノ酸が、
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン及び一般式（１）で表されるアミノ酸からなる群から選択されるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【化１】
2018043631.tif 000022
（式（１）中、Ｒは、式（２）、（３）又はそれらの組み合わせからなる２価の基である。）
【化２】
2018043631.tif 000023
（式（２）及び（３）のＲ１は、互いに独立に、水素原子又は置換基を有してもよい炭素数１〜２０のアルキル基もしくは炭素数６〜２０のアリール基であり、ｎは１〜１０の整数である。）
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質を製造する方法であって、化学合成法によって製造されることを特徴とする、方法。
【請求項６】
前記化学合成法において、前記ポリアミノ酸及び／又は前記ポリペプチドが、化学酵素重合法で製造されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記化学合成法において、前記タンパク質が、前記ポリアミノ酸及び／又は前記ポリペプチドを単量体として、縮合剤の共存下、ブロック共重合によって製造されることを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記化学酵素重合法が、パパイン、ブロメライン、プロテイナーゼＫ、カンジダアンタルクティカリパーゼ（candida antarctica lipase：CALB）及びエキソペプチダーゼ  カルボキシペプチダーゼＹ（exopeptidase carboxypeptidase Y：CPDY)からなる群から選択される少なくとも１種の酵素を使用することを特徴とする、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質、又は、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法で製造されるタンパク質を使用して製造されることを特徴とする、タンパク質製品。
【請求項１０】
前記タンパク質製品が、樹脂、フィルム又は繊維から選択されることを特徴とする、請求項９に記載のタンパク質製品。
【請求項１１】
下記式(6-1)で表されるペプチドユニットを含むポリペプチド。
式(6-1)： -(Y-r-Z)m- 
［式(6-1)中、Yはロイシン、アラニン、グリシン及びグルタミン酸からなる群から選ばれるアミノ酸残基を示し、Zは式（２−２−１）：
【化３】
2018043631.tif 000024
（式（２−２−１）中、ｎ１は２〜１０の整数である。）
で表されるアミノ酸残基を示し、ｍは２以上の整数である。］
【請求項１２】
下記式(8-1)で表されるペプチドユニットを含むポリペプチド。
式(8-1)： -(YZY)m- 
［式(8-1)中、Yはアラニン、リシン、グリシン、ロイシン、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンからなる群から選ばれるアミノ酸残基であり、Zは式（２−１−１）：
【化４】
2018043631.tif 000025
（式（２−１−１）中、Ｒ２は、互いに独立に、置換基を有してもよい炭素数１〜２０のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基であり、ｎは１〜１０の整数である。）
で表されるアミノ酸残基を示し、ｍは２以上の整数である。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリアミノ酸又はポリペプチドが反復配列したタンパク質、及びその化学合成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然のクモやカイコのシルクは、引っ張り強度(tensile strength)、靱性（toughness)及び伸展性(extensibility)等の物理的な変化に対する特性に優れ、特に、クモのシルクは同一重量の鉄と比較して約５倍の靭性を有するポリペプチド繊維である。また、天然のクモやカイコのシルクは、耐熱性にも優れ、さらに、ポリペプチドで形成されていることから、高い生体適合性(biocompatibility)及び生分解性(biodegradability)を有する。しかし、クモは大量飼育が困難であるところから、クモの糸を模倣した人工合成繊維の製造が試みられている（特許文献１〜５）。【０００３】
天然のクモのシルクは、その構造中にβシート構造を形成するポリアラニンとグリシンを多く含む極性領域とが繰り返されてコア部分となり、その両側に高度に保存された非反復型のアミノ末端とカルボキシル末端ドメインが配置されることにより、ランダムコイル構造、βシート構造及びへリックス構造を有し、これらの構造の混在が天然のクモシルクの優れた特性の理由と考えられ、その構造的特性が検討されている（非特許文献１〜３）。【０００４】
一方、パパイン、プロテイナーゼKなどの酵素を使用して、化学酵素重合法によるポリアミノ酸、オリゴペプチド及びポリペプチドの製造、並びに、さらにこれらの重合体の製造が報告されている（非特許文献４〜１５）。従来より、ペプチドやタンパク質の製造は、遺伝子組換え法での微生物による製造、Fmoc(Fluorenyl-MethOxy-Carbonyl)固相合成法などの化学合成法が使用されているが、これらの従来の方法と比較して、化学酵素重合法は、立体異性体選択性に優れ、高い収率で、低コストで、原子−経済的であり、グリーン化学合成法としてその応用が期待されている。しかし、化学酵素重合法を使用して、上記シルク由来の製品を製造可能な程度に分子量が大きいタンパク質の合成は、成功していなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開公報WO2007/078239
【特許文献２】国際公開公報WO2010/123450
【特許文献３】国際公開公報WO2011/112046
【特許文献４】国際公開公報WO2012/165476
【特許文献５】国際公開公報WO2013/065650
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Numata Kら、Soft Matter 2015年6月30日、11、6335-6342
【非特許文献２】Hagn Fら、Nature. 2010; 465(7295): 239-242
【非特許文献３】Teule Fら、Nature Protocols 2009; 4: 341-355
【非特許文献４】Baker J. P.ら、Biomacromolecules 2012; 13: 947-951
【非特許文献５】Fagerland J.ら、Biomacromolecules 2014; 15: 735-743
【非特許文献６】Yazawa K.ら、Polymers 2016; 8: 194
【非特許文献７】Numata K.ら、Biomacromolecules 2014; 15: 3206-3212
【非特許文献８】Ageitos M.J.ら、Macromol. Biosci. 2015; 15: 990-1003
【非特許文献９】Tsuchiya K.ら、Macromol. Biosci. 2016; 16: 1001-1008
【非特許文献１０】Ageitos M. J.ら、Biomacromolecules 2013; 14: 3635-3642
【非特許文献１１】Ageitos M. J.ら、Macromol. Biosci. 2015; 15: 990-1003
【非特許文献１２】Ma Y.ら、Macromol. Biosci. 2016; 16: 151-159
【非特許文献１３】Nitta S.ら、Polymer Journal 2016; 1-7
【非特許文献１４】Yazawa K.ら、Molecules 2014; 19: 13755-13774
【非特許文献１５】Numata K.ら、Polymer Journal, 2015; 47: 537-545
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
化学合成法、特に酵素重合法及びブロック共重合法を使用するタンパク質の製造方法を確立し、本方法によって製造される天然シルクタンパク質に類似又は向上した特性を有するタンパク質、さらに、該タンパク質より製造される樹脂、繊維及びフィルム等の製品を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、単一のアミノ酸からなるポリアミノ酸及び／又は複数種のアミノ酸からなるポリペプチドを含むタンパク質であって、アミノ酸の種類及び／又は組成比が相違する前記ポリアミノ酸及び前記ポリペプチドから選択される少なくとも2種がブロック共重合により反復配列するブロック共重合体であるタンパク質を提供する。【０００９】
本発明の前記タンパク質は、前記ポリアミノ酸又は前記ポリペプチドが、タンパク質の二次構造において、βシート構造、へリックス構造及び／又はランダムコイル構造を形成するタンパク質の場合がある。【００１０】
本発明の前記タンパク質は、前記βシート構造を形成するポリアミノ酸及び／又は前記ポリペプチドが、ポリアラニン(polyAla)、ポリシステイン(polyCys)、ポリバリン(polyVal)、ポリロイシン(polyLeu)、ポリイソロイシン(polyIle)、ポリチロシン(polyTyr)、ポリトリプトファン(polyTrp)、ポリグルタミン(polyGln)及びポリメチオニン(polyMet)からなる群から選択される少なくとも1種であるタンパク質である場合がある。【００１１】
本発明の前記タンパク質が、シルクタンパク質である場合がある。【００１２】
本発明の前記タンパク質は、前記ポリアミノ酸又は前記ポリペプチドを構成するアミノ酸が、
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン及び一般式（１）で表されるアミノ酸からなる群から選択されるタンパク質である場合がある。
【化１】
2018043631.tif 000003
式（１）中、Ｒは、式（２）、（３）又はそれらの組み合わせからなる２価の基である。
【化２】
2018043631.tif 000004
式（２）及び（３）のＲ１は、互いに独立に、水素原子又は置換基を有してもよい炭素数１〜２０のアルキル基もしくは炭素数６〜２０のアリール基であり、ｎは１〜１０の整数である。【００１３】
また、本発明の前記タンパク質は、X、Y及びZを独立した任意のアミノ酸とした場合に、
NH2-{-[(X)l]p-b-[(YZ)m]q-}s-COOH          式(9)
NH2-{-[(X)l]p-b-[(Y-r-Z)m]q-}s-COOH       式(10)
NH2-{-[(X)l]p-b-[(YYZ)m]q-}s-COOH         式(11)
又は
NH2-{-[(X)l]p-b-[(YZY)m]q-}s-COOH         式(12)
(l、m、p、q及びsはそれぞれ2以上の整数である。また、-NH2は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ末端を表し、-COOHは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のカルボキシ末端を表し、カルボキシ末端の水素原子はメチル基及びエチル基等のアルキル基で置換されたエステル末端であってもよい（以下、同様）。）
と表される場合がある。【００１４】
また、本発明は、アミノ酸の種類及び／又は組成比が相違するポリアミノ酸及び／又はペプチドの少なくとも2種の反復配列を有するタンパク質を製造する方法であって、化学合成法によって製造する方法を提供する。【００１５】
本発明の製造方法の前記化学合成法において、前記ポリアミノ酸及び／又は前記ポリペプチドが、化学酵素重合法で製造される方法である場合がある。【００１６】
本発明の製造方法において、前記タンパク質が、前記ポリアミノ酸及び／又は前記ポリペプチドを単量体として、縮合剤の共存下、ブロック共重合によって製造される方法である場合がある。【００１７】
本発明の製造方法において、前記化学酵素重合法が、パパイン、ブロメライン、プロテイナーゼＫ、カンジダアンタルクティカリパーゼ（candida antarctica lipase：CALB）及びエキソペプチダーゼ  カルボキシペプチダーゼＹ（exopeptidase carboxypeptidase Y：CPDY)からなる群から選択される少なくとも1種の酵素を使用する製造方法である場合がある。【００１８】
本発明の製造方法において、前記縮合剤が、
N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド （EDCまたはWSCD）、及び、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）からなる群から選択されるカルボジイミド系縮合剤；
ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリスジメチルアミノホスホニウム塩（BOP）、ヘキサフルオロリン酸(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウム塩（PyBOP）、2-(1H-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HATU）、及び、(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキシエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノモルホリノカルベニウムヘキサフルオロホスフェート（COMU）からなる群から選択されるウロニウム系縮合剤；
ポリリン酸（PPA）、五酸化リン-メタンスルホン酸（PPMAまたはEaton試薬）、亜リン酸トリフェニル、ジフェニルリン酸アジド（DPPA）及びジフェニル（2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-3-ベンゾオキサゾリル）ホスホナート（DBOP）からなる群から選択されるリン酸誘導体の縮合剤；並びに、
カルボニルジイミダゾール、及び、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド（DMT-MM）からなる群から選択される縮合剤；
から選択される少なくとも1種を使用する製造方法である場合がある。【００１９】
本発明の製造方法において、前記タンパク質が、シルクタンパク質の場合がある。【００２０】
また、本発明は、前記タンパク質、又は、前記の方法で製造されるタンパク質を使用して製造されるタンパク質製品を提供する。【００２１】
本発明の前記タンパク質製品が、樹脂、フィルム又は繊維から選択されるタンパク質製品の場合がある。【００２２】
また、前記タンパク質製品が、タンパク質組成物である場合がある。【００２３】
また、本発明は、Y及びZを独立した任意のアミノ酸とした場合に、
式(6-1)： -(Y-r-Z)m- 
［式(6-1)中、Yはロイシン、アラニン、グリシン及びグルタミン酸からなる群から選ばれるアミノ酸残基を示し、Zは式（２−２−１）：
【化３】
2018043631.tif 000005
（式（２−２−１）中、ｎ１は２〜１０の整数である。）
で表されるアミノ酸残基を示し、ｍは２以上の整数である。］
で表されるポリペプチドを提供する。【００２４】
さらに、本発明は、Y及びZを独立した任意のアミノ酸とした場合に、
式(8-1)： -(YZY)m- 
［式(8-1)中、Yはアラニン、リシン、グリシン、ロイシン、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンからなる群から選ばれるアミノ酸残基であり、Zは式（２−１−１）：
【化４】
2018043631.tif 000006
（式（２−１−１）中、Ｒ２は、互いに独立に、置換基を有してもよい炭素数１〜２０のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基であり、ｎは１〜１０の整数である。）
で表されるアミノ酸残基を示し、ｍは２以上の整数である。］
で表されるポリペプチドを提供する。【００２５】
本発明のポリペプチドは、パパイン、ブロメライン、プロテイナーゼＫ、カンジダアンタルクティカリパーゼ（candida antarctica lipase：CALB）及びエキソペプチダーゼ  カルボキシペプチダーゼＹ（exopeptidase carboxypeptidase Y：CPDY)からなる群から選択される少なくとも1種の酵素を使用する化学酵素重合法により製造される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】化学酵素重合法で得られたpolyAlaの1H-NMRスペクトルを表す。
【図２】化学酵素重合法で得られたpoly(Gly-r-Leu)の1H-NMRスペクトルを表す。
【図３】化学酵素重合法で得られたpoly(AlaAibAla)の1H-NMRスペクトルを表す。
【図４】化学酵素重合法で得られたpolyLeuの1H-NMRスペクトルを表す。
【図５】化学酵素重合法で得られたpoly(Leu-r-nylon)の1H-NMRスペクトルを表す。
【図６】［図６(a)］本発明の方法で得られたpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu) [polyAla/poly(Gly-r-Leu)=50/50]の1H-NMRスペクトルを表す。［図６(b)］polyAla-b-poly(Gly-r-Leu) [polyAla/poly(Gly-r-Leu)=33/67]の1H-NMRスペクトルを表す。
【図７】化学酵素重合法で得られたpolyAlaのMSスペクトルを表す。
【図８】化学酵素重合法で得られたpoly(Gly-r-Leu)のMSスペクトルを表す。
【図９】化学酵素重合法で得られたpoly(AlaAibAla)のMSスペクトルを表す。
【図１０】化学酵素重合法で得られたpolyLeuのMSスペクトルを表す。
【図１１】化学酵素重合法で得られたpoly(Leu-r-nylon)のMSスペクトルを表す。
【図１２】化学酵素重合法で得られたpoly(Lys(Boc)AibLys(Boc))のMSスペクトルを表す。
【図１３】polyAla、poly(Gly-r-Leu)及びpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)のゲル浸透クロマトグラムを表す。
【図１４】polyAla、poly(Gly-r-Leu)及びpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)の広角Ｘ線回折（WAXD）の測定結果を表す。
【図１５】polyLeu及びpoly(Leu-r-nylon)の広角Ｘ線回折（WAXD）の測定結果を表す。
【図１６】本発明の方法で得られたpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)のAFM画像を表す。
【図１７】[図１７(a)] Nephila clavata由来のクモ糸シルクファイバーのIRスペクトルを表す。[図１７(b)]本発明の方法で得られたpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)のIRスペクトルを表す。
【図１８】化学酵素重合法で得られたpolyAla及びpoly(AlaAibAla)のIRスペクトルを表す。
【図１９】化学酵素重合法で得られたpolyLeu及びpoly(Leu-r-nylon)のIRスペクトルを表す。
【図２０】化学酵素重合法で得られたpolyAla及びpoly(AlaAibAla)のCDスペクトルを表す。
【図２１】[図２１(a)]化学酵素重合法で得られたpolyLeu及びpoly(Leu-r-nylon)のDSC曲線を表す。[図２１(b)]化学酵素重合法で得られたpolyLeu及びpoly(Leu-r-nylon)のTGA曲線を表す。[図２１(c)]図２１(b)の部分拡大図を表す。[図２１(d)]図２１(b)の一次微分曲線を表す。
【図２２】[図２２(a)]化学酵素重合法で得られたpoly(Leu-r-nylon4)OEtの各温度におけるWAXD測定結果を表す。[図２２(b)]化学酵素重合法で得られたpolyLeu及びpoly(Leu-r-nylon)の結晶化度の温度依存性を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
１．本発明のタンパク質
本発明の実施形態の１つは、単一のアミノ酸からなるポリアミノ酸及び／又は複数種のアミノ酸からなるポリペプチドを含むタンパク質であって、アミノ酸の種類及び／又は組成比が相違する前記ポリアミノ酸及び前記ポリペプチドの少なくとも2種がブロック共重合によりブロック共重合体として反復配列しているタンパク質である。
【００２８】
本明細書において、ポリアミノ酸、ポリペプチド及びタンパク質の構造は、当業者に周知慣用のアミノ酸の3文字又は１文字による表記法で記述される。本明細書においてアミノ酸は、L体及びD体のいずれも含むが、特に記載のない限りL体である。
【００２９】
本明細書において、「アミノ酸」とは、アミノ基及びカルボキシル基を有する化合物を言い、具体的には、天然のタンパク質を構成する２０種類のα−アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン）のみならず、これら以外のアミノ酸も挙げられる。本明細書において、上記２０種類のα−アミノ酸を「標準アミノ酸」、標準アミノ酸以外のアミノ酸を「非天然のアミノ酸」と記載する。アミノ酸は天然に存在するものであってもよく、人工的に合成又は改変されたアミノ酸又はアミノ酸誘導体であってもよい。
【００３０】
非天然のアミノ酸としては、具体的に下記一般式（１）で表される化合物が挙げられる。
【化５】
2018043631.tif 000007
【００３１】
式（１）中、Ｒは、式（２）、（３）又はそれらの組み合わせからなる２価の基である。
【化６】
2018043631.tif 000008
【００３２】
式（２）及び（３）のＲ１は、互いに独立に、水素原子又は置換基を有してもよい炭素数１〜２０のアルキル基もしくは炭素数６〜２０のアリール基であり、ｎは１〜１０の整数である。
Ｒ１で表される炭素数１〜２０のアルキル基は、直鎖状、分岐状、環状のいずれであってもよく、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基等が挙げられる。
Ｒ１で表される炭素数６〜２０のアリール基は、単環式であっても多環式であってもよく、具体的には、フェニル基、ベンジル基、トリル基、キシリル基、ナフチル基等が挙げられる。
Ｒ１が有する置換基としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等のハロゲン原子；ヒドロキシ基；アミノ基；カルボキシル基；tert−ブトキシカルボニル(Boc)基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基、ベンジルオキシカルボニル（Cbz）基、トリチル基、ベンジル基等の保護基等が挙げられる。
【００３３】
より具体的な非天然のアミノ酸としては、下記一般式（２−１）、（２−２）及び（３−１）で表される化合物が挙げられる。
【化７】
2018043631.tif 000009
【００３４】
式（２−１）、（２−２）及び（３−１）中のＲ１及びｎは、式（２）及び（３）におけるＲ１及びｎとそれぞれ同義である。また、式（２−１）中のＲ２は、互いに独立に、置換基を有してもよい炭素数１〜２０のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基であり、具体的にはＲ１として例示したものと同じ基が挙げられるが、特にメチル基が好ましい。また、式（２−２）中のｎ１は２〜１０の整数であり、２〜５の整数であることが好ましい。
【００３５】
さらに具体的な非天然のアミノ酸としては、下記化合物が挙げられる。なお、本発明書において、下記化合物を表すのに、化合物の下に記載されたかっこ書きで示される略号を用いる場合がある。
【化８】
2018043631.tif 000010
【００３６】
上述した非天然のアミノ酸をポリペプチド単位に導入することにより、分子間水素結合が阻害され、融点の付与、熱加工性の向上が期待される。また、ポリペプチドの結晶性の低下により、破断伸びの向上、タフネスの改善等の可能性も期待される。
【００３７】
本発明のポリアミノ酸又はポリペプチドは、上述したアミノ酸を用いて、化学合成法、特に化学酵素重合法によって製造できる。
【００３８】
本明細書において、「化学合成」とは、化学反応を利用して目的の化合物を生成することをいい、生きた微生物等の生物を利用して行う反応、例えば、組換え遺伝子を導入して微生物によってポリペプチド又はタンパク質を生成する方法を含まない。また、生物から単離又は分離された酵素、又は、生物由来の組成物に含まれる酵素により所望とする化合物を製造することは、本明細書において「化学合成」に含まれる。本明細書において「化学合成法」とは、前記「化学合成」を行うための方法をいう。
【００３９】
本明細書において、「化学酵素重合」とは、生きた微生物等の生物を使用せずに、酵素によって触媒される重合反応をいい、該反応における基質、生成物及び／又は反応条件は、生きた生物内で行われる酵素反応とは、必ずしも一致するとは限らない。また、本明細書において、「化学酵素重合法」とは、「化学酵素重合」を行う方法をいう。例えば、エンドペプチダーゼで、システインプロテアーゼの一種であるパパインは、タンパク質のペプチド結合を切断する反応（アミノリシス）を触媒、すなわちペプチド結合を加水分解する反応を行うところから、その名前の由来となっている。この加水分解反応は、パパインの触媒サイトにペプチドが配位し、アシル−酵素中間体を形成し、ここに前記H2Oが求核反応を行うことにより、ペプチド結合が切断され、アミンとカルボン酸を生成する。しかし、パパインは、アミノ酸エステル誘導体共存下においては、前記アシル−酵素中間体に対して、H2Oの代わりにアミノ酸エステル誘導体のアミノ基が求核反応を行うことにより、基質である前記アミノ酸誘導体の異なる分子のアミノ基とアシル基とが結合し、ペプチド結合を生成する。パパイン以外の酵素を含む「化学酵素重合法」に関して、非特許文献４〜１５に説明されている。
【００４０】
本明細書において、「重合」は当業者に慣用の広義の意味で使用され、「重縮合」及び「縮重合」も含まれる。したがって、前記の「化学酵素重合」は「化学酵素重縮合」を含む意味として使用される。また、本明細書において、「重合体」は、「重縮合体」、「縮重合体」を含む。
【００４１】
本明細書において、重合体、特に共重合体であるポリペプチド又はタンパク質を化学式で表す場合に、ランダム重合による重合体を表す場合に「-r-」と、ブロック共重合による重合体を表す場合に「-b-」と表し、それらの記載の前後に重合体を形成する単量体を表記する場合がある。
【００４２】
本明細書において、「ポリアミノ酸」とは、単一の前記アミノ酸がペプチド結合により２つ以上重合したものをいう。また、本明細書において、「ポリペプチド」とは、複数種の前記アミノ酸がペプチド結合により２つ以上重合したものをいう。
なお、本明細書においては、「ポリアミノ酸」や「ポリペプチド」には、アミノ酸のオリゴマー（オリゴペプチド）も含まれる。
ポリアミノ酸又はポリペプチドの重合度、即ちアミノ酸残基数は、2以上であり、5〜50であることが好ましく、10〜20であることがより好ましい。
【００４３】
前記化学酵素重合法に使用できる酵素の例として、パパイン、ブロメライン、α−キモトリプシン、プロテイナーゼK、トリプシン、サブチリシン（アルカラーゼ）、カンジダアンタルクティカリパーゼ（candida antarctica lipase：CALB）、エキソペプチダーゼ  カルボキシペプチダーゼＹ（exopeptidase carboxypeptidase Y：CPDY)及びリパーゼ、並びに、これらの酵素を改変した変異体等が挙げられ、公知の条件及び方法によって使用できる（非特許文献４〜１５）。
【００４４】
例えば、システインプロテアーゼであるパパインを使用してpH 4〜10、最大温度80℃の条件でL-アラニン(L-Ala:A)エチルエステルを原料として、ポリアラニン（polyAla）を製造できる。このときに、アルカリ条件の方が、より高い重合度のポリアラニンが製造される。また、L-Ala以外でも、パパインによる化学酵素重合法で、例えば、L-ロイシン(L-Leu）、L-バリン(L-Val)、L-チロシン(L-Tyr)、L-グルタミン酸（L-Glu）、L-リシン(L-Lys）、L-フェニルアラニン(L-Phe）及びL-トリプトファン(L-Trp）などのアミノ酸のオリゴマーを製造できる。さらに、パパインを使用して、Ala-Glyのジペプチドを単量体として、ポリペプチドを製造する場合には、Ala-Glyエチルエステルを原料として、pH 7.5で反応させることにより収率80%で、平均重合度（DPavg）=9.4のオリゴペプチドが製造できる（非特許文献１４）。
【００４５】
また、セリンプロテアーゼであるプロテイナーゼＫを使用して、pH7.5〜12.0の範囲で、60℃の反応温度でL-フェニルアラニンエチルエステルを原料として、オリゴ（L-フェニルアラニン）の製造が可能である（非特許文献１０）。
【００４６】
前記化学酵素重合法におけるアミノ酸の種類及び組成割合によって、所望とするタンパク質にタンデム配列で組み込まれるアミノ酸組成及びその組成割合を有するポリアミノ酸及び／又はポリペプチドを製造できる。また、前記化学酵素重合法の温度、反応時間等の条件を種々設定することによって、平均重合度が相違するポリアミノ酸及び／又はポリペプチドを製造できる。
【００４７】
なお、アミノ酸がその側鎖にアミノ基又はカルボキシル基を有する場合、即ち、アミノ酸としてアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンを用いる場合、又は式（２）もしくは式（３）におけるＲ１が置換基としてアミノ基もしくはカルボキシル基を有する非天然のアミノ酸を用いる場合、該アミノ酸中の側鎖のアミノ基又はカルボキシル基を、上述したtert−ブトキシカルボニル(Boc)基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基、ベンジルオキシカルボニル（Cbz）基、エチル基、トリチル基、ベンジル基、tert-ブチル基等の保護基で保護することが好ましい。
【００４８】
例えば、X、Y及びZを独立した任意のアミノ酸とする場合、本発明のポリアミノ酸又はポリペプチドは以下の一般式(4)〜(8)で表される。
単一のアミノ酸Xがペプチド結合により２つ以上重合したポリアミノ酸は、式(4)で表される。
NH2-(X)l-COOH               式(4)
(lは2以上の整数である。また、-NH2は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ末端を表し、-COOHは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のカルボキシ末端を表し、カルボキシ末端の水素原子はメチル基及びエチル基等のアルキル基で置換されたエステル末端であってもよい（以下、同様）。）
【００４９】
例えば、２種のアミノ酸Y及びZからなるジペプチド（NH2-YZ-COOH）がペプチド結合により２つ以上重合したポリペプチドは、式(5)で表される。
NH2-(YZ)m-COOH              式(5)
（mは2以上の整数である。）
【００５０】
例えば、Y及びZを単量体として、化学酵素重合法によりポリペプチドを製造した場合、ポリペプチドはYとZがランダムに配列した式(6)で表されるポリペプチドとなる。
NH2-(Y-r-Z)m-COOH           式(6)
（mは2以上の整数である。）
【００５１】
さらに、２種のアミノ酸Y及びZからなるトリペプチド（NH2-YYZ-COOH）がペプチド結合により２つ以上重合したポリペプチドは、(YYZ)が交互に配列した式(7)で表されるポリペプチドである。
NH2-(YYZ)m-COOH             式(7)
（mは2以上の整数である。）
【００５２】
また、２種のアミノ酸Y及びZからなるトリペプチド（NH2-YZY-COOH）がペプチド結合により２つ以上重合したポリペプチドは、(YZY)が交互に配列した式(8)で表されるポリペプチドである。
NH2-(YZY)m-COOH             式(8)
（mは2以上の整数である。）
【００５３】
式(4)〜(8)におけるX、Y及びZは、上述したアミノ酸から適宜選択することができる。
【００５４】
例えば、パパインを使用した化学酵素重合法によって、式(4)において、Xがアラニンであるポリアミノ酸、Xがロイシンであるポリアミノ酸を製造することができる。
【００５５】
また例えば、パパインを使用した化学酵素重合法によって、式(6)において、Y及びZが以下の組み合わせであるポリペプチドを製造することができる。
【表１】
2018043631.tif 000011
【００５６】
さらに例えば、パパインを使用した化学酵素重合法によって、式(8)において、Y及びZが以下の組み合わせであるポリペプチドを製造することができる。
【表２】
2018043631.tif 000012
【００５７】
本明細書において、「タンパク質」とは、アミノ酸の種類及び／又は組成比が相違するポリアミノ酸及びポリペプチドから選ばれる少なくとも２種がブロック共重合により反復配列しているものである。本発明の「タンパク質」は、GPC測定によるポリスチレン換算の重量平均分子量が3500以上であり、好ましくは、平均分子量が4000以上であり、より好ましくは、平均分子量が5000以上であり、もっとも好ましくは、平均分子量が10000以上である。平均分子量の上限は特に限定されない。
【００５８】
本明細書において、「反復配列」とは、例えば、タンパク質の一次構造において、同じアミノ酸配列が繰り返して配列することをいう。したがって、例えば、単一のアミノ酸が重合したポリアミノ酸、及び、複数種のアミノ酸が重合してなるペプチドがさらに重合したポリペプチドは反復配列を有する。さらに、前記ポリアミノ酸、前記ペプチド及び前記ポリペプチドをブロック共重合させたタンパク質も、反復配列を有すると理解される。本明細書において、反復する配列の複数の配列の間に他の配列が挿入された配列も「反復配列」に含まれる。
【００５９】
前記化学酵素重合法によって製造されるポリアミノ酸及び／又はポリペプチドを単量体として、縮合剤の共存下、ブロック共重合によって、前記ポリアミノ酸及び／又はポリペプチドが反復配列しているタンパク質を製造できる。
【００６０】
前記ブロック共重合の際に使用する縮合剤の例としては、以下の縮合剤から選択される少なくとも1種を使用して、当業者に慣用の濃度及び条件で、重合反応を実施できる：
・N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド （EDCまたはWSCD）、及び、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）からなる群から選択されるカルボジイミド系縮合剤；
・ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリスジメチルアミノホスホニウム塩（BOP）、ヘキサフルオロリン酸(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウム塩（PyBOP）、2-(1H-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HATU）、及び、(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキシエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノモルホリノカルベニウムヘキサフルオロホスフェート（COMU）からなる群から選択されるウロニウム系縮合剤；
・ポリリン酸（PPA）、五酸化リン-メタンスルホン酸（PPMAまたはEaton試薬）、亜リン酸トリフェニル、ジフェニルリン酸アジド（DPPA）及びジフェニル（2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-3-ベンゾオキサゾリル）ホスホナート（DBOP）からなる群から選択されるリン酸誘導体の縮合剤；並びに、
・カルボニルジイミダゾール、及び、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド（DMT-MM）。
【００６１】
前記の製造方法によって、前記ポリアミノ酸及び／又は前記ポリペプチドが、タンパク質中でタンデム状に配列されているタンパク質を製造できる。
【００６２】
本発明のタンパク質において、タンパク質を構成するポリアミノ酸又はポリペプチドが、タンパク質の二次構造において、βシート構造、へリックス構造又はランダムコイル構造を形成することが好ましい。
【００６３】
本明細書において、「βシート構造」とは、特に説明のない限り、当業者に周知慣用の「βシート構造」と同義で使用され、「平行βシート構造」及び「逆平行βシート構造」の両方を含む。
【００６４】
前記βシート構造を形成するポリアミノ酸としては例えば、ポリアラニン(polyAla)、ポリシステイン(polyCys)、ポリバリン(polyVal)、ポリロイシン(polyLeu)、ポリイソロイシン(polyIle)、ポリチロシン(polyTyr)、ポリトリプトファン(polyTrp)、ポリグルタミン(polyGln)及びポリメチオニン(polyMet)を挙げることができる。また、前記βシート構造を形成するポリペプチドとしては、例えば、poly(Leu-nylon3)、poly(Leu-nylon4)及びpoly(Leu-nylon6)等を挙げることができる。
【００６５】
本明細書において、「へリックス構造」とは、特に説明のない限り、当業者に周知慣用の「へリックス構造」と同義で使用され、「αへリックス構造」を含む。
【００６６】
前記へリックス構造は、へリックス構造を形成する限り、任意のアミノ酸からなるペプチドによって形成される。へリックス構造は、例えば、αへリックス構造、310へリックス構造及びπへリックス構造が知られているが、これらの中で、αへリックス構造が好ましい。
【００６７】
ポリペプチド鎖は平面構造のペプチド結合が繋がっており、αへリックスは、ペプチド結合面同士の二面角（ねじれ角）で表すことができ、Cα-N結合角をφ、Cα-C結合角をψと規定し、それぞれの角度はCαから見て時計回りに回ると値が大きくなると規定されている。
【００６８】
へリックス構造の形成において、メチオニン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸、リシンは特にヘリックスを作る傾向が強い。
【００６９】
L-アミノ酸で作られるαヘリックス構造は、平均値として、φ=-57°、ψ=-47°、1回転あたりの残基数（n：右巻きは正、左巻きは負）：n=3.6、1回転で軸方向に進む距離（ピッチ）：p=5.4Åである。すなわち、トランス型のＬ−アミノ酸で構成される、理想的なαへリックスは、そのペプチド鎖は右巻きの螺旋構造を構成しており、各アミノ酸残基の２面角(φ,ψ)は、（-57°,-47°）≒-104°となっており、すべてのN-H基が4残基離れたアミノ酸のC=O基へ水素結合をしている。このときのN…O間の距離は2.8Åで、水素結合には適当であり、会合エネルギーも最大となる。
【００７０】
本発明のへリックス構造がαへリックス構造である場合、各アミノ酸残基の2面角(φ,ψ)は、（-90°,-14°）〜（-34°,-70°）の範囲から選択される。
【００７１】
αへリックス構造を形成するペプチドの例として、具体的には、塩基性アミノ酸が3アミノ酸残基毎に配置されてなるポリペプチドが知られている。より具体的には、このαへリックス構造は、(BXY) (Bは塩基性アミノ酸残基、X及びYは、同一又は異なっていてもよい塩基性アミノ酸以外の任意のアミノ酸残基）を単位とした繰り返し構造を有するペプチドによって形成され、塩基性アミノ酸残基としては、アルギニン残基、リシン残基及びヒスチジン残基が挙げられる。また、前記繰り返し回数は、2以上であればよく、上限は制限されないが、例えば、2〜40、好ましくは2〜15、より好ましくは2〜7が例示される（特開2011-219453 号公報）。
また、アラニン(Ala)及び2-アミノイソ酪酸(Aib)からなるトリペプチド(AlaAibAla)を単量体とするポリペプチド、即ち、式(8)において、Yがアラニン(Ala)であり、Zが2-アミノイソ酪酸(Aib)であるポリペプチド（ポリ(AlaAibAla）)も、αヘリックス構造を形成するポリペプチドの例として挙げられる。
【００７２】
310へリックス構造は、ｉ番目のアミノ酸残基のC=Oと、(i+3)番目のアミノ酸残基の-NH-との間で水素結合を形成している。トランス型のＬ−アミノ酸で構成される、理想的な310へリックスは、そのペプチド鎖は右巻きの螺旋構造を構成しており、各アミノ酸残基の2面角(φ,ψ)は(-49°,-26°)≒-75°であり、p=6.0Åである。
【００７３】
本発明において、へリックス構造を形成するペプチドが、310へリックス構造を形成する場合、φ及びψは、それぞれ前記理想的な2面角の角度の値の±30%以内の範囲であり、好ましくは±20％以内の範囲であり、より好ましくは±10％以内の範囲であり、もっとも好ましくは±5％以内の範囲である。
【００７４】
πへリックスのｉ番目のアミノ酸残基のC=Oと、(i+5)番目のアミノ酸残基の-NH-との間で水素結合を形成している。トランス型のＬ−アミノ酸で構成される、理想的なπへリックスは、そのペプチド鎖は右巻きの螺旋構造を構成しており、各アミノ酸残基の2面角(φ,ψ)は、(-57°,-70°)≒-127°である。
【００７５】
本発明において、へリックス構造を形成するペプチドが、πへリックス構造を形成する場合、φ及びψは、それぞれ前記理想的な2面角の角度の値の±30%以内の範囲であり、好ましくは±20％以内の範囲であり、より好ましくは±10％以内の範囲であり、もっとも好ましくは±5％以内の範囲である。
【００７６】
また、これらのへリックス構造を有するペプチドが、へリックスを形成しうるか否かについては、X線回折、核磁気共鳴分析法（NMR）、波長170〜250nmの紫外線による円偏光二色性スペクトル等を利用した定法に従って実験的に検出することができる。さらに、そのペプチドのアミノ酸配列に基づいて、例えば、シミュレーションソフトを使用して予測することもできる。例えば、New Joint法によれば二次構造を予測することができる。New Joint法とは、5種類の異なる方法論の二次構造予測法を組み合わせ、それぞれの予測結果から、最終的な二次構造を予測する方法である。具体的にはQian-Sejnowski法、長野法、Ptitsyn-Finkelstein法、西川−大井法、及びGibrat-Garinier-Robson法の5つのアルゴリズムに対して同じ配列をサブミットし、5つのアルゴリズムからの回答を合わせて評価することにより予測できる（K. Nishikawa and T. Noguchi: "Predicting protein secondary structure based on amino acid sequence", Methods in Enzymology, Vol.202, pp.31-44(1991).；M. Ito, Y. Matsuo and K. Nishikawa: "Prediction of protein secondary structure using the 3D-1D compatibility algorithm.", Comput. Appl. Biosci. vol.13, pp.415-424 (1997).）。
【００７７】
本明細書において、「ランダムコイル構造」とは、特に説明のない限り、当業者に周知慣用の「ランダムコイル構造」と同義で使用され、タンパク質の二次構造において、βシート構造やへリックス構造などの一定の立体構造をとらずランダムに配向した構造をいい、「非繰り返し構造」又は「ループ構造」ともいわれる。
【００７８】
前記ランダムコイル構造を形成するポリアミノ酸及び／又はペプチドが、ランダムコイル構造を形成する限り、任意のアミノ酸より形成される。例えば、ランダムコイル構造を形成するポリアミノ酸として、ポリグリシン(polyGly)、ポリアスパラギン(polyAsn)、ポリアスパラギン酸(polyAsp)、ポリプロリン(polyPro)及びポリセリン(polySer)が挙げられ、ランダムコイル構造を形成するポリペプチドとして、ポリ（Gly-r-Leu）が挙げられる。
【００７９】
さらに、例えば、プロリンおよびアラニン等のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むランダム構造を有するペプチドが知られている(国際公開公報WO2011/144756)。また、αへリックス構造を有するポリペプチドに、βシート形成アミノ酸などの構造的に異なるアミノ酸の組み込みによって、又は異なる立体配置を持つアミノ酸（例えば、D立体異性体とL体異性体との混合物）の組み込みによってランダムコイル構造を有するポリアミノ酸を生じることが知られている（Sakai,R.ら、Bull Chem.Soc.Japan 1969,42,1332-1336；Paolillo,L.ら、Biopolymers 1972,11,2043-2052；及びCho,I.ら、Polymer 2003,44,5497-5500を参照のこと）。
【００８０】
本発明のタンパク質は、シルクタンパク質であることが好ましい。
本明細書において、「シルク」とは、アラニンが多く存在し、βシート構造を誘起する繰り返し配列が存在するポリペプチド又はタンパク質が連続した繊維をいう。
【００８１】
クモ由来のシルクは、顆粒状構造体を伴って構成される。本明細書において、ナノ小繊維を構成する小型の顆粒状構造体をナノ顆粒状構造体と記載する。「顆粒状(granular)構造体」は、高いアスペクト比を有する顆粒状の形態を有し、シルクに特徴的なグリシン及びアラニンを多く含み、βシート構造を含むペプチド又はポリペプチドを主成分とする構造体をいう。Nephila edulisのクモシルクの場合、17％±4％のβシート構造を有すると報告されている(Ling Sら、Biomacromolecules, 2011, 12, 3344-3349)。また、もっとも強いクモ牽引糸は、45〜65%がβシートドメインと報告されている（Vollrathら、polymer, 2009, 50, 5623-5632)。
【００８２】
クモ由来のシルクタンパク質の例として、代表的には、スピドロインタンパク質が挙げられる。スピドロインタンパク質は、フィブロインともいわれ、天然のクモの大瓶状腺等で紡糸され、主にスピドロインＩ（MaSp1）とスピドロインII（MaSp2）とが知られる。分子量は250〜350kDaであり、30〜40アミノ酸単位の100回繰り返し構造で全長の90％を占め、そのアミノ酸組成は、グリシン及びアラニンを多く含むコンセンサス配列の繰り返し構造からなる特徴的な構造を有する。アラニンは短いポリアラニン構造を形成し、スピドロインタンパク質中で繰り返し構造を有し、クモのシルク繊維中で結晶状構造としてβシート構造の形成に関与する。グリシンは、GGX, GPGXX (X=A, L, Q, Y)の配列を基本単位として、スピドロインタンパク質中で繰り返し構造を有し、クモのシルク繊維中で非晶質のランダムコイル構造の形成に関与する。
【００８３】
本明細書において「シルクタンパク質」とは、化学合成法で、好ましくは化学酵素重合法で、より好ましくはパパインを用いた化学酵素重合法で製造される任意のアミノ酸、好ましくは任意のL-アミノ酸によって構成されるタンパク質であって、アラニンを多く含むタンパク質をいう。
【００８４】
また、本明細書において、βシート構造の形成は、張力を負荷しない非延伸状態で、材料全体の電子の量のうち、結晶に存在する電子の量として表した場合に、クモシルク由来のポリペプチドの全体中の15〜30％を含むポリペプチドが好ましいが、本発明の製造方法で製造されるクモシルク由来のポリペプチド繊維は、10〜50％又は5〜80％のβシート構造を有する場合がある。
【００８５】
前記本発明の実施形態において、前記タンパク質は、アミノ酸の種類及びその組成割合が相違する少なくとも2種類のポリアミノ酸及び／又はポリペプチドを化学酵素重合法で製造し、次に、このポリアミノ酸及び／又はポリペプチドを単量体として、縮合剤の共存下、ブロック共重合を行うことにより、前記ポリアミノ酸及び／又はポリペプチドが反復配列しているタンパク質として、製造できる。
【００８６】
本発明は、前記の単一のアミノ酸が重合してなるポリアミノ酸、及び、複数種のアミノ酸からなるペプチドが重合してなるポリペプチドから選択される少なくとも2種を単量体として、前記縮合剤の共存下、ブロック共重合して、前記単量体がタンデム配列したタンパク質が製造される。
【００８７】
従来より、ポリペプチド及びタンパク質の製造には、Fmoc法などの固相重合法や組換え遺伝子で大腸菌などの微生物で製造する方法が汎用されている。固相重合法は、製造する配列を正確に制御したポリペプチド及びタンパク質の製造が可能であるが、保護基による保護及びその脱保護等の厳格な操作が必要であり、また、毒性の強い試薬を使用し、製造コストが高いとの欠点を有する。また、組換え体を使用して微生物でポリペプチド及びタンパク質を製造する場合は、製造されるポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を、ほぼ厳格に規定して製造でき、翻訳後修飾が可能との利点を有する。しかし、収率は低く、製造したポリペプチド又はタンパク質の単離に、多くの時間と費用が必要である。
【００８８】
一方、本発明の化学酵素重合法に使用する酵素は、容易に入手可能なタンパク質分解酵素等を使用して、その逆反応であるペプチド重合を行うものであり、立体異性体選択的なペプチド反応が可能であり、したがって、ラセミ化の問題はなく、保護−脱保護反応の必要もなく、比較的温和な反応条件で使用でき、グリーン化学合成法ともいわれる。
【００８９】
例えば、X、Y及びZを独立した任意のアミノ酸とする場合、本発明のタンパク質は、以下の一般式(9)〜(12)で表すことができる。
【００９０】
単量体として、前記式(4)のポリアミノ酸と、前記式(5)のポリペプチドとを用いた場合、本発明のタンパク質は、以下の式(9)と表される。
NH2-{-[(X)l]p-b-[(YZ)m]q-}s-COOH          式(9)
(l、m、p、q及びsはそれぞれ2以上の整数である。）
【００９１】
単量体として、前記式(4)のポリアミノ酸と、前記式(6)のポリペプチドとを用いた場合、本発明のタンパク質は、以下の式(10)と表される。
NH2-{-[(X)l]p-b-[(Y-r-Z)m]q-}s-COOH       式(10)
(l、m、p、q及びsはそれぞれ2以上の整数である。）
【００９２】
単量体として、前記式(4)のポリアミノ酸と、前記式(7)のポリペプチドとを用いた場合、本発明のタンパク質は、以下の式(11)と表される。
NH2-{-[(X)l]p-b-[(YYZ)m]q-}s-COOH         式(11)
(l、m、p、q及びsはそれぞれ2以上の整数である。）
【００９３】
単量体として、前記式(4)のポリアミノ酸と、前記式(8)のポリペプチドとを用いた場合、本発明のタンパク質は、以下の式(12)と表される。
NH2-{-[(X)l]p-b-[(YZY)m]q-}s-COOH         式(12)
(l、m、p、q及びsはそれぞれ2以上の整数である。）
【００９４】
前記式(9)〜(12)において、l、m、p、q及びsは、平均重合度として、ｌは2〜17、好ましくは3〜14、より好ましくは5〜11、mは2〜100、好ましくは3〜80、より好ましくは5〜50、p/(p+q)は0.01〜0.5、好ましくは0.02〜0.4、より好ましくは0.03〜0.3、sは2以上の整数である。
【００９５】
式(9)〜(12)において、各単量体の構成割合を示すpとqは、ブロック共重合反応を行う際の反応液に含まれるそれぞれの単量体の含有割合に基づく場合がある。しかし、反応基である-NH2基及び-COOH基の単量体の3次構造における立体的配置によって、縮合反応の反応性が相違することに起因し、ブロック共重合体として製造されるタンパク質中の各単量体の構成割合p及びｑとが、ブロック共重合反応液中における各ブロック単量体の含有割合に一致するとは限らない。
【００９６】
したがって、複数種のアミノ酸又はその誘導体を原料として、化学酵素重合法を行って本発明のタンパク質を製造する場合、ランダム共重合により、その原料として使用したアミノ酸の種々の配列（以下、「ランダム配列」と記載）のペプチドが製造され、厳格にアミノ酸配列を制御したポリペプチド又はタンパク質を製造することは困難である。また、本発明のタンパク質は、ポリアミノ酸及び／又はポリペプチドが、化学酵素重合法によって製造されるため、平均重合度は、反応条件によって制御可能であるものの、完全に単一の重合度のものを製造することは困難である。また、本発明のタンパク質は、さらにブロック共重合反応によって製造するため、そのタンデム配列を厳格に制御することは困難である。
【００９７】
すなわち、本発明のタンパク質を、構造式で一義的に規定することは困難である。また、製造されるタンパク質も、固相合成法や遺伝子組換え法では、アミノ酸配列をほぼ厳格に規定されたタンパク質であるのに対して、化学酵素重合法によって製造されるタンパク質は、重合度の相違するタンパク質が混在するため、製造方法によって、製造されるタンパク質の実体的な構造及び特性が相違する。したがって、本願発明のタンパク質をその構造及び特性によって正確に特定することは、不可能又は非実際的である。
【００９８】
２．本発明のタンパク質の製造方法
本発明のもう1つの実施形態は、前記の本発明のタンパク質を化学合成法で製造する方法である。より具体的には、アミノ酸の種類及び／又は組成比が相違するポリアミノ酸及びポリペプチドから選択される少なくとも2種の反復配列を有するタンパク質を製造する方法であって、化学合成法によって製造する方法である。
【００９９】
前記の化学合成法は、好ましくは化学酵素重合法である。前記のとおり、本発明の製造方法は、化学酵素重合法によりポリアミノ酸又はポリペプチドを製造するステップと、次に、このポリアミノ酸又はポリペプチドを組成するアミノ酸の種類及び／又は組成割合が相違するポリアミノ酸又はポリペプチドの少なくとも2種を、ブロック共重合させるステップを含む製造方法である。
【０１００】
例えば、X、Y及びZを独立した任意のアミノ酸とする場合、式(9)で表されるタンパク質は、次の通り製造することができる。
NH2-{-[(X)l]p-b-[(YZ)m]q-}s-COOH          式(9)
(l、m、p、q及びsはそれぞれ2以上の整数である。）
【０１０１】
まず、式(4)で表されるポリアミノ酸及び式(5)で表されるポリペプチドをそれぞれ製造する。式(4)で表されるポリアミノ酸は、アミノ酸Xを単量体として、式(5)で表されるポリペプチドは、(NH2-YZ-COOH)からなるジペプチドを単量体として、それぞれ製造できる。このとき、好ましくは、化学酵素重合法を用いる。
NH2-(X)l-COOH               式(4)
NH2-(YZ)m-COOH              式(5)
(l及びmはそれぞれ2以上の整数である。）
【０１０２】
次に、式(4)で表されるポリアミノ酸と、式(5)で表されるポリペプチドとを単量体として、縮合剤の共存下、ブロック共重合反応を行い、生成したタンパク質を単離・精製することにより、式(9)のタンパク質を取得できる。
【０１０３】
また、例えば、X、Y及びZを独立した任意のアミノ酸とする場合、式(10)で表されるタンパク質は、以下の通り製造することができる。
NH2-{-[(X)l]p-b-[(Y-r-Z)m]q-}s-COOH       式(10)
(l、m、p、q及びsはそれぞれ2以上の整数である。）
【０１０４】
まず、式(4)で表されるポリアミノ酸及び式(6)で表されるポリペプチドをそれぞれ製造する。式(4)で表されるポリアミノ酸は、アミノ酸Xを単量体として、式(6)で表されるポリペプチドは、Y及びZを単量体として、それぞれ製造できる。このとき、好ましくは、化学酵素重合法を用いる。
NH2-(X)l-COOH               式(4)
NH2-(Y-r-Z)m-COOH           式(6)
（l及びmはそれぞれ2以上の整数である。）
【０１０５】
次に、式(4)で表されるポリアミノ酸と、式(6)で表されるポリペプチドとを単量体として、縮合剤の共存下、ブロック共重合を行い、生成したタンパク質を単離・精製することにより、式(10)のタンパク質を取得できる。
【０１０６】
また、例えば、X、Y及びZを独立した任意のアミノ酸とする場合、式(11)で表されるタンパク質は、以下の通り製造することができる。
NH2-{-[(X)l]p-b-[(YYZ)m]q-}s-COOH         式(11)
(l、m、p、q及びsそれぞれ2以上の整数である。）
【０１０７】
まず、式(4)で表されるポリアミノ酸及び式(7)で表されるポリペプチドをそれぞれ製造する。式(4)で表されるポリアミノ酸は、アミノ酸Xを単量体として、式(7)で表されるポリペプチドは、(NH2-YYZ-COOH)からなるトリペプチドを単量体として、それぞれ製造できる。このとき、好ましくは、化学酵素重合法を用いる。
NH2-(X)l-COOH               式(4)
NH2-(YYZ)m-COOH             式(7)
（l及びmは2以上の整数である。）
【０１０８】
次に、式(4)で表されるポリアミノ酸と、式(7)で表されるポリペプチドとを単量体として、縮合剤の共存下、ブロック共重合を行い、生成したタンパク質を単離・精製することにより、式(11)のタンパク質を取得できる。
【０１０９】
また、例えば、X、Y及びZを独立した任意のアミノ酸とする場合、式(12)で表されるタンパク質は、以下の通り製造することができる。
NH2-{-[(X)l]p-b-[(YZY)m]q-}s-COOH         式(12)
(l、m、p、q及びsそれぞれ2以上の整数である。）
【０１１０】
まず、式(4)で表されるポリアミノ酸及び式(8)で表されるポリペプチドをそれぞれ製造する。式(4)で表されるポリアミノ酸は、アミノ酸Xを単量体として、式(8)で表されるポリペプチドは、(NH2-YZY-COOH)からなるトリペプチドを単量体として、それぞれ製造できる。このとき、好ましくは、化学酵素重合法を用いる。
NH2-(X)l-COOH               式(4)
NH2-(YZY)m-COOH             式(8)
（l及びmは2以上の整数である。）
【０１１１】
次に、式(4)で表されるポリアミノ酸と、式(8)で表されるポリペプチドとを単量体として、縮合剤の共存下、ブロック共重合を行なう。生成したタンパク質を単離・精製することにより、式(12)で表されるタンパク質を取得できる。
【０１１２】
前記式(9)〜(12)において、l、m、p、q及びsは、平均重合度として、ｌは2〜17、好ましくは3〜14、より好ましくは5〜11、mは2〜100、好ましくは3〜80、より好ましくは5〜50、p/(p+q)は0.01〜0.5、好ましくは0.02〜0.4、より好ましくは0.03〜0.3、sは特に上限が限定されないタンパク質を製造できる。
【０１１３】
前記化学酵素重合法に使用できる酵素の例として、パパイン、ブロメライン、α−キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、トリプシン、サブチリシン（アルカラーゼ）、カンジダアンタルクティカリパーゼ（candida antarctica lipase：CALB）、エキソペプチダーゼ  カルボキシペプチダーゼＹ（exopeptidase carboxypeptidase Y：CPDY)及びリパーゼ、並びに、これらの酵素を改変した変異体等を使用でき、公知の方法によって製造できる（非特許文献４〜１５）。
【０１１４】
前記ブロック共重合の際に使用する縮合剤の例としては、以下の縮合剤から選択される少なくとも1種を使用して、当業者に慣用の濃度及び条件で、重合反応を実施できる：
・N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド （EDCまたはWSCD）、及び、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）からなる群から選択されるカルボジイミド系縮合剤；
・ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリスジメチルアミノホスホニウム塩（BOP）、ヘキサフルオロリン酸(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウム塩（PyBOP）、2-(1H-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HATU）、及び、(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキシエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノモルホリノカルベニウムヘキサフルオロホスフェート（COMU）からなる群から選択されるウロニウム系縮合剤；
・ポリリン酸（PPA）、五酸化リン-メタンスルホン酸（PPMAまたはEaton試薬）、亜リン酸トリフェニル、ジフェニルリン酸アジド（DPPA）及びジフェニル（2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-3-ベンゾオキサゾリル）ホスホナート（DBOP）からなる群から選択されるリン酸誘導体の縮合剤；並びに、
・カルボニルジイミダゾール、及び、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド（DMT-MM）。
【０１１５】
また、ブロック共重合反応で生成した所望とするタンパク質を単離精製するには、当業者に周知慣用の方法を使用でき、例えば、塩沈法、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【０１１６】
３．本発明のタンパク質を使用した製品
さらに、本発明のもう1つの実施形態は、前記の本発明のタンパク質、又は、前記の本発明の製造方法で製造されるタンパク質を使用して製造される樹脂、繊維及びフィルムである。
【０１１７】
本発明の樹脂を製造する場合は、前記の本発明のタンパク質又は本発明の製造方法で製造されるタンパク質を溶媒に溶解したドープ液を調整し、公知の方法（例えば、国際公開公報WO94/17132、特開2001-49134号公報等）で、このドープ液のタンパク質を不溶化することにより、本発明の樹脂を製造できる。本発明のタンパク質を不溶化する方法として、ドープ液の溶媒の留去、溶媒中の塩の種類及び／又は濃度の変化、イオン強度の変化、及び／又はpHの変化等が挙げられる。
【０１１８】
本発明の繊維を製造する場合は、前記の本発明のタンパク質又は本発明の製造方法で製造されるタンパク質を溶媒に溶解したドープ液を調整し、公知の方法(例えば、国際公開公報WO2006/008163、国際公開公報WO2006/002827等）を用い、本発明のタンパク質を不溶化することにより、前記ドープ液より本発明の繊維を製造できる。
【０１１９】
本発明のフィルムを製造する場合は、前記の本発明のタンパク質又は本発明の製造方法で製造されるタンパク質を溶媒に溶解したドープ液を調整し、このドープ液よりスピン・コーティング法、ディッピング法、スプレー・コーティング法、電界重合法、蒸着法、蒸着重合法、ブラシコーティング法、ブレードコーティング法、ローラコーティング法及びロール・ツー・ロール法等の公知の方法を用いて、基体上にコーティング後、乾燥等によりタンパク質を不溶化後、基体よりフィルムを剥離することにより、本発明のフィルムを製造できる。また、公知の方法(例えば、国際公開公報WO2006/008163、国際公開公報WO2006/002827等）を用いて、本発明のフィルムを製造できる。
【０１２０】
例えば、実施例に記載されているβシート構造を形成するポリアミノ酸又はポリペプチドと、ランダム構造を有するポリアミノ酸又はポリペプチドがタンデムに反復配列するタンパク質の場合、クモの牽引糸に類似し、高い引張強度や靭性や高伸展性を付与することが可能と考えられる。また、アミノ酸が重合したタンパク質であることから高い生体適合性及び生分解性を有するものと考えられる。そこで、その特性を活かし、前記の本発明の樹脂、繊維又はフィルムは、例えば、これを使用する糸、敷布、不敷布、メッシュ及びネット等を製造することができる。さらに、前記の高い引張強度や靭性や高伸展性等の特性を活かし、例えば、防弾衣、パラシュート、自動車の車体等の高い耐衝撃性が必要な材料の製造に利用できる。また、高強度、高伸展性及び高靱性並びに生分解性及び生互換性を利用した創傷閉止材、縫合糸、絆創膏、再生医療用の足場材料等の医療材料として使用できる。
【０１２１】
４．ポリペプチド
さらに、本発明のもう1つの実施形態は、複数種のアミノ酸からなるポリペプチドである。前記ポリペプチドは、化学酵素重合法により製造されることが好ましい。
【０１２２】
前記ポリペプチドとして、具体的に式(6-1)又は式(8-1)で表されるペプチドユニットを含むポリペプチドを挙げることができる。
【０１２３】
-(Y-r-Z)m-           式(6-1)
式(6-1)中、Yはロイシン、アラニン、グリシン及びグルタミン酸からなる群から選ばれるアミノ酸残基を示し、Zは式（２−２−１）：
【化９】
2018043631.tif 000013
（式（２−２−１）中、ｎ１は２〜１０の整数である。）
で表されるアミノ酸残基を示し、ｍは２以上の整数である。
【０１２４】
-(YZY)m-             式(8-1)
式(8)中、Yはアラニン、リシン、グリシン、ロイシン、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンからなる群から選ばれるアミノ酸残基を示し、Zは式（２−１−１）：
【化１０】
2018043631.tif 000014
（式（２−１−１）中、Ｒ２は、互いに独立に、置換基を有してもよい炭素数１〜２０のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基であり、ｎは１〜１０の整数である。）
で表されるアミノ酸残基を示し、ｍは２以上の整数である。
【０１２５】
式(6-1)で表されるペプチドユニットを有するポリペプチドとして、より具体的には下記式(6)で表されるポリペプチド、その塩、又はそのエステルを挙げることができる。
【０１２６】
NH2-(Y-r-Z)m-COOH           式(6)
式(6)中、Yはロイシン、アラニン、グリシン及びグルタミン酸からなる群から選ばれるアミノ酸残基を示し、Zは上記式（２−２−１）と同じアミノ酸残基を示し、-NH2は、ポリペプチドのアミノ末端を表し、-COOHは、ポリペプチドのカルボキシ末端を表し、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端はそれぞれ、塩もしくはエステル（例えば、カルボキシ末端の水素原子はメチル基及びエチル基等のアルキル基で置換されたエステル末端）であってもよく、ｍは２以上の整数である。
【０１２７】
式(8-1)で表されるペプチドユニットを有するポリペプチドとして、より具体的には下記式(8)で表されるポリペプチド、その塩、又はそのエステルを挙げることができる。
【０１２８】
NH2-(YZY)m- COOH             式(8)
式(8)中、Yはアラニン、リシン、グリシン、ロイシン、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンからなる群から選ばれるアミノ酸残基を示し、Zは上記式（２−１−１）と同じアミノ酸残基を示し、-NH2は、ポリペプチドのアミノ末端を表し、-COOHは、ポリペプチドのカルボキシ末端を表し、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端はそれぞれ、塩もしくはエステル（例えば、カルボキシ末端の水素原子はメチル基及びエチル基等のアルキル基で置換されたエステル末端）であってもよく、ｍは２以上の整数である。
【０１２９】
前記化学酵素重合法に使用できる酵素の例として、パパイン、ブロメライン、α−キモトリプシン、プロテイナーゼK、トリプシン、サブチリシン（アルカラーゼ）、カンジダアンタルクティカリパーゼ（candida antarctica lipase：CALB）、エキソペプチダーゼ  カルボキシペプチダーゼＹ（exopeptidase carboxypeptidase Y：CPDY)及びリパーゼ、並びに、これらの酵素を改変した変異体等が挙げられ、公知の条件及び方法によって使用できる（非特許文献４〜１５）。上述した酵素の中でも、特にパパインが好ましい。
【０１３０】
なお、本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【実施例】
【０１３１】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。【０１３２】
１．実験材料及び方法
（１）試薬
パパイン（EC番号3.4.22.2）は、和光純薬工業株式会社（大阪）から購入し、そのまま使用した。パパインの酵素活性は約0.5 U g-1であった（pH7.5、25℃の条件下、１分間に1μmolのN-ベンゾイル-DL-アルギニンp-ニトロアニリドを分解する酵素量を１ユニットと定義する）。
N-メチル-2-ピロリドン（NMP）、N,N-ジメチルアセトアミド（DMAc）、ジエチルエーテル及びトリエチルアミンは、4Åモレキュラーシーブで乾燥後使用した。
以下の試薬は、Sigma-Aldrich社（米国）から購入した。
・L−ロイシンエチルエステル塩酸塩（LeuEt）
・4-アミノ酪酸メチル塩酸塩（nylon4Me）
・4-アミノ酪酸エチル塩酸塩（nylon4Et）
・β-アラニンメチル塩酸塩（nylon3Me）
・β-アラニンエチル塩酸塩（nylon3Et）
・6-アミノヘキサン酸メチル塩酸塩（nylon6Me）
他の試薬は、東京化成工業株式会社（東京）から購入し、特にことわりのない限り、精製せず、そのまま使用した。【０１３３】
（３）1H-NMRの測定
1H-核磁気共鳴（NMR）スペクトルは、バリアンNMRシステム500（バリアン・メディカル・システムズ、米国）により、25℃で500 MHzの周波数で、又はJNM-EX270（270 MHz、日本電子株式会社、東京）により、25℃で270 MHzの周波数で測定した。polyLeu及びpoly(Leu-r-nylon)ではジメチルスルホキシド-d6（DMSO-d6）を溶媒として使用し、それ以外のポリアミノ酸、ポリペプチド及びタンパク質では内部標準としてテトラメチルシランを含むジメチルスルホキシド-d6（DMSO-d6）／トリフルオロ酢酸-d（TFA-d）（体積で5/1）を溶媒として使用した。【０１３４】
（４）MALDI-TOF MSの測定
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）質量分析は、polyLeu及びpoly(Leu-r-nylon)以外の試料についてはultrafleXtreme MALDI-TOF分光光度計（ブルカー・ダルトニクス、米国）により、15 kVの加速電圧で、反射モードで測定した。polyLeu及びpoly(Leu-r-nylon)のMALDI-TOF MSの測定は、Autoflex Speed MALDI-TOF-MS システム分光光度計（ブルカー社、ドイツ）により、リニア・ポジティブイオンモードで測定した。
試料は、0.1％TFAを含む水/アセトニトリル（0.8 mg mL-1）に溶解し、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）の水/アセトニトリル溶液（10 mg mL-1）と混合し、MTP 384 ground steel BC ターゲットプレート上に滴下した。【０１３５】
（５）GPCの測定
ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）は、Shodex KD-804（昭和電工株式会社、東京）カラムを備えたJASCO HPLCシステム（PU-2086、DG-2080-54、AS-2057、CO-2065；日本分光株式会社、東京）及びUV検出器（UV-2075）を用いて行なった。測定は、試料（2 mg mL-1）を、10 mMの臭化リチウムを含有するNMPを流出液として、1.0 mL min-1の流速で行なった。数平均分子量（Mn）、重量平均分子量（Mw）及び分子量分布（Mw / Mn）は、以下の分子量のポリスチレン標準を用いて算出した： 1.32 x 103、 3.25 x 103、 1.01 x 104、 2.85 x 104、6.60 x 104、及び1.56 x 105。【０１３６】
（６）WAXDの測定
シンクロトロン広角X線回折（WAXD）測定は、ポリペプチド粉末試料に対して、SPring-8のBL45XUビームラインにより、12.4 keVのX線エネルギー（波長：0.1 nm）で行なった。【０１３７】
（７）赤外分光(IR)スペクトルの測定
赤外分光（IR）測定は、１回反射ATR付属装置（MIRacle A、Geプリズム）を搭載したフーリエ変換赤外分光光度計IRPrestige-21（株式会社島津製作所製、京都）を用いて行なった。【０１３８】
（８）原子間力顕微鏡(AFM)観察
原子間力顕微鏡（AFM）観察は、カンチレバーSI-DF3（共鳴周波数29 kHz、バネ定数1.9 Nm-1）を備えたAFM5300E（株式会社日立ハイテクサイエンス、東京）を用いて行なった。雲母基板に試料を載せた。【０１３９】
（９）円偏光二色性(CD)スペクトルの測定
円偏光二色性（CD）分光分析は、Jasco J-820 CD分光偏光計（日本分光株式会社、東京）を用いて行なった。測定は、試料の2,2,2-トリフルオロエタノール（TFE）溶液（100 μM）を光路長0.1 cmの石英セルに入れて行なった。各スペクトルは、測定波長範囲190〜290 nm、分解能1 nm、走査速度200 nm/分の条件で、積算回数10回の平均として得た。【０１４０】
（１０）熱重量分析(TGA)及び示唆走査熱量(DSC)の測定
熱重量分析（TGA）及び示唆走査熱量測定（DSC）は、TGA/DSC2（メトラー・トレド社、スイス）を用いて行なった。試料（3〜5 mg）を秤量し、アルミニウムパンに密封した。アルミパンの蓋には加熱過程において内圧の上昇によりパンが破裂するのを防止するためのピンホールを設けた。試料を窒素雰囲気下で、30℃から500℃まで昇温速度10℃/分で、３回加熱した。装置は、ベースラインを入力するため空のセルで、そして装置の熱流と温度を特徴づけるためインジウムで校正した。【０１４１】
（１１）AlaAibAlaエチルエステル（AlaAibAla-OEt）塩酸塩の合成
まず、Aib含有ジペプチド（AibAla-OEt）を次に示す方法で合成した。
滴下漏斗及び撹拌子を備えたフラスコに、α-（Bocアミノ）イソ酪酸（10.16 g、50 mmol）、L-アラニンエチルエステル塩酸塩（7.68 g, 50 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）一水和物（6.76 g、50 mmol）、トリエチルアミン（7.0 mL、50 mmol）及びクロロホルム（50 mL）を、-10℃、窒素雰囲気下で加えた。該フラスコに、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（水溶性カルボジイミド、WSCI）塩酸塩（9.59 g、50 mmol）のクロロホルム（50 mL）溶液を、30分かけて滴下し、得られた混合物を-10℃で30分間、次いで25℃で24時間撹拌した。得られた混合物を水、5％ NaHCO3水溶液及び飽和食塩水で連続して洗浄した。洗浄後の有機層をNa2SO4で乾燥し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。得られた生成物を真空下で乾燥し、Boc-AibAla-OEtを収量13.9 g（92％）で得た。
続いて得られたBoc-AibAla-OEtをBoc基の脱保護に供した。
得られたBoc-AibAla-OEt（7.56 g、25 mmol）のジクロロメタン（15 mL）溶液に、窒素雰囲気下、0℃でトリフルオロ酢酸（9.6 mL、0.125 mol）をゆっくり加えた。この混合物を0℃で10分間、次いで25℃で24時間撹拌した。減圧下で混合物から溶媒を留去した後、得られた粗生成物をジオキサン/塩酸（4 M、10 mL）に溶解し、該溶液をジエチルエーテルに注いだ。生じた沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥して、白色吸湿性固体としてAibAla-OEt塩酸塩を得た。収量は5.47 g（92％）であった。【０１４２】
次に、上記で得られたAib含有ジペプチド（AibAla-OEt）からAib含有トリペプチド（AlaAibAla-OEt）を以下に示す方法で合成した。
滴下漏斗及び撹拌子を備えたフラスコに、N-Boc-L-アラニン（1.59 g、8.4 mmol）、上記で得られたAibAla-OEt塩酸塩（2.0 g、8.4 mmol）、HOBt一水和物（1.28 g、8.4 mmol）、トリエチルアミン（1.2 mL、8.4 mmol）及びクロロホルム（10 mL）を-10℃、窒素雰囲気下で加えた。該フラスコに、WSCI塩酸塩（1.61 g、8.4 mmol）のクロロホルム（10 mL）溶液を、30分かけて滴下し、得られた混合物を-10℃で30分間、次いで25℃で24時間撹拌した。得られた混合物を水、5％NaHCO3水溶液及び飽和食塩水で連続して洗浄した。洗浄後の有機層をNa2SO4で乾燥し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。得られた生成物を真空下で乾燥し、Boc-AlaAibAla-OEtを収量2.45 g（78％）で得た。
続いて得られたBoc-AlaAibAla-OEtを、Boc基の脱保護に供した。
得られたBoc-AlaAibAla-OEt（2.45 g、6.6 mmol）のジクロロメタン（6.0 mL）溶液に、窒素雰囲気下、0℃でトリフルオロ酢酸（9.6 mL、0.125 mol）をゆっくり加えた。この混合物を0℃で10分間、次いで25℃で24時間撹拌した。減圧下で混合物から溶媒を留去した後、得られた粗生成物をジオキサン/塩酸（4 M、3 mL）に溶解し、該溶液をジエチルエーテルに注いだ。生じた沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥して、白色吸湿性固体としてAlaAibAla-OEt塩酸塩を得た。収量は1.98 g（97％）であった。【０１４３】
（１２）Lys(Boc)AibLys(Boc)メチルエステル（Lys(Boc)AibLys(Boc)-OMe）塩酸塩の合成
まず、Aib含有ジペプチド（AibLys(Boc)-OMe）を次に示す方法で合成した。
滴下漏斗及び撹拌子を備えたフラスコに、N-α-（カルボベンゾキシ）-α-アミノイソ酪酸（6.17 g、26 mmol）、N-ε-(t-ブトキシカルボニル)-L-リジンメチルエステル塩酸塩（7.71 g, 26 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）一水和物（3.86 g、29 mmol）、トリエチルアミン（3.6 mL、26 mmol）及びクロロホルム（25 mL）を、0℃、窒素雰囲気下で加えた。該フラスコに、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（水溶性カルボジイミド、WSCI）塩酸塩（5.48 g、29 mmol）のクロロホルム（25 mL）溶液を、30分かけて滴下し、得られた混合物を0℃で30分間、次いで25℃で24時間撹拌した。得られた混合物を5％NaHCO3水溶液で洗浄した。洗浄後の有機層をMgSO4で乾燥し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。得られた生成物を真空下で乾燥し、Z-AibLys(Boc)-OMeを定量的に得た。
続いて得られたZ-AibLys(Boc)-OMeをZ基の脱保護に供した。
得られたZ-AibLys(Boc)-OMe（12.47 g、26 mmol）のエタノール（26 mL）溶液に、窒素雰囲気下、25℃でPd/C（1.25 g、10wt%）をゆっくり加えた。この容器内を水素ガスで置換し、次いで水素雰囲気下で25℃、48時間撹拌した。セライト粉末を用いて溶媒を濾過後、得られた濾液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。得られた生成物を真空下で乾燥し、AibLys(Boc)-OMeを定量的に得た。【０１４４】
次に、上記で得られたAib含有ジペプチド（AibLys(Boc)-OMe）からAib含有トリペプチド（Lys(Boc)AibLys(Boc)-OMe）を以下に示す方法で合成した。
滴下漏斗及び撹拌子を備えたフラスコに、N-α-（カルボベンゾキシ）-N-ε-(t-ブトキシカルボニル)-L-リジン（1.04 g、3 mmol）、上記で得られたAibLys(Boc)-OMe塩酸塩（1.04 g、3 mmol）、HOBt一水和物（0.41 g、3 mmol）及びクロロホルム（3 mL）を0℃、窒素雰囲気下で加えた。該フラスコに、WSCI塩酸塩（0.58 g、3 mmol）のクロロホルム（3 mL）溶液を、30分かけて滴下し、得られた混合物を0℃で30分間、次いで25℃で24時間撹拌した。得られた混合物を5％NaHCO3水溶液で洗浄した。洗浄後の有機層をMgSO4で乾燥し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。得られた生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、Z- Lys(Boc)AibLys(Boc)-OMeを得た。
続いて得られたZ- Lys(Boc)AibLys(Boc)-OMeを、Z基の脱保護に供した。
得られたZ- Lys(Boc)AibLys(Boc)-OMe（1.50 g、2.1 mmol）のエタノール（10 mL）溶液に、窒素雰囲気下、25℃でPd/C（0.15 g、10wt%）をゆっくり加えた。この容器内を水素ガスで置換し、次いで水素雰囲気下で25℃、48時間撹拌した。セライト粉末を用いて溶媒を濾過後、得られた濾液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。得られた生成物を真空下で乾燥し、Lys(Boc)AibLys(Boc)-OMeを定量的に得た。得られた粗生成物をジオキサン/塩酸（4 M、3 mL）に溶解し、該溶液をジエチルエーテルに注いだ。生じた沈殿物を濾別し、可溶部をロータリーエバポレーターを用いて濃縮し、真空下で乾燥して、白色吸湿性固体としてLys(Boc)AibLys(Boc)-OMe塩酸塩を得た。収量は1.00 g（77％）であった。【０１４５】
２．化学酵素重合法によるポリアミノ酸及びペプチドの合成
２−１．化学酵素重合法によるpolyAlaの合成
アラニンエチルエステル塩酸塩（5.53 g、36 mmol）を含むリン酸緩衝液（12 mL、1.0 M、pH=8.0）及びメタノール（3.0 mL）を、撹拌子を備えたガラス管に入れた。これに、パパイン（1.80 g）を含むリン酸緩衝液（12.8 mL）を加えた。アラニン及びパパインの最終濃度は、36 mLの総体積で、それぞれ1.0 M及び50 mg mL-1であった。混合物をEYELA ケミステーション PPS-5511（東京理化器械株式会社、東京）を用いて、800 rpm、40℃で2時間撹拌した。室温に冷却後、7000 rpm、4℃で10分間遠心分離することによって沈殿物を収集した。粗生成物を純水で2回洗浄し、遠心分離し、凍結乾燥し、エチルエステル末端ポリアラニン（polyAla）を白色粉末として得た。収量は0.678 g（27％）であった。【０１４６】
２−２．化学酵素重合法によるpoly(Gly-r-Leu)の合成
２−２−１．Gly/Leu=90/10のpoly(Gly-r-Leu)の合成
グリシンエチルエステル塩酸塩（0.754 g、5.4 mmol）及びロイシンエチルエステル塩酸塩（0.117 g、0.6 mmol）を含むリン酸緩衝液（3.0 mL、1.0 M、pH=8.0）を、撹拌子を備えたガラス管に入れた。これに、パパイン（0.3 g）を含むリン酸緩衝液（2.0 mL）を加えた。パパインの濃度は、6.0 mLの総体積で、50 mg mL-1であった。
混合物を800 rpm、40℃で24時間撹拌した。室温に冷却後、7000 rpm、4℃で15分間遠心分離することによって沈殿物を収集してpoly(Gly-r-Leu）を得た。収量は0.093 g（25％）であった。【０１４７】
２−２−２．Gly/Leu=80/20のpoly(Gly-r-Leu)の合成
グリシンエチルエステル塩酸塩及びロイシンエチルエステル塩酸塩の量をそれぞれ0.670 g（4.8 mmol）及び 0.235 g（1.2 mmol）とした以外は２−２−１と同様にして、アミノ酸の最終濃度は1.0 Mに保ちつつ、重合反応を行なった。収量は0.182 g（44％）であった。【０１４８】
２−２−３．Gly/Leu=70/30のpoly(Gly-r-Leu)の合成
グリシンエチルエステル塩酸塩及びロイシンエチルエステル塩酸塩の量をそれぞれ0.586 g（4.2 mmol）及び 0.352 g（1.8 mmol）とした以外は２−２−１と同様にして、アミノ酸の最終濃度は1.0 Mに保ちつつ、重合反応を行なった。収量は0.233 g（53％）であった。【０１４９】
２−２−４．Gly/Leu=50/50のpoly(Gly-r-Leu)の合成
グリシンエチルエステル塩酸塩及びロイシンエチルエステル塩酸塩の量をそれぞれ0.419 g（3.0 mmol）及び 0.587 g（3.0 mmol）とした以外は２−２−１と同様にして、アミノ酸の最終濃度は1.0 Mに保ちつつ、重合反応を行なった。収量は0.109 g（21％）であった。【０１５０】
２−３．化学酵素重合法によるpoly(AlaAibAla)の合成
２−３−１．poly(AlaAibAla)の合成（AlaAibAla-OEt濃度0.17 M）
AlaAibAla-OEt塩酸塩（0.102 g、0.33 mmol）を含むリン酸緩衝液（1 mL、1.0 M、pH = 8.0）を、撹拌子を備えたガラス管に入れ、AlaAibAla-OEt塩酸塩がすべて完全に溶解するまで、40℃で撹拌した。これに、パパイン（0.100 g）を含むリン酸緩衝液（0.5 mL）を一度に加えた。AlaAibAla-OEt及びパパインの最終濃度は、3.0 mLの総体積で、それぞれ0.17 M及び50 mg mL-1であった。
混合物を800 rpm、40℃で2時間撹拌した。混合物を室温に冷却後、7000 rpm、4℃で10分間遠心分離することによって沈殿物を収集し、得られた粗生成物を脱イオン水で2回洗浄し、凍結乾燥して、poly(AlaAibAla)を白色固体として得た。収量は0.026 g（25％）であった。【０１５１】
２−３−２．poly(AlaAibAla)の合成（AlaAibAla-OEt濃度0.25 M）
AlaAibAla-OEt塩酸塩の量を0.155 g（0.5 mmol）とし、AlaAibAla-OEtの最終濃度が0.25 Mとなるようにした以外は２−３−１と同様にして、重合反応を行なった。収量は0.037g（33％）であった。【０１５２】
２−３−３．poly(AlaAibAla)の合成（AlaAibAla-OEt濃度0.33 M）
AlaAibAla-OEt塩酸塩の量を0.208 g（0.67 mmol）とし、AlaAibAla-OEtの最終濃度が0.33 Mとなるようにした以外は２−３−１と同様にして、重合反応を行なった。収量は0.028 g（18％）であった。【０１５３】
２−３−４．poly(AlaAibAla)の合成（AlaAibAla-OEt濃度0.50 M）
AlaAibAla-OEt塩酸塩の量を0.310 g（1.0 mmol）とし、AlaAibAla-OEtの最終濃度が0.50 Mとなるようにした以外は２−３−１と同様にして、重合反応を行なった。収量は0.023 g（10％）であった。【０１５４】
２−４．化学酵素重合法によるpolyLeuの合成
ロイシンエチルエステル（0.59 g、3 mmol）を含むリン酸緩衝液（4 mL、1.0 M、pH=8.0）を、撹拌子を備えたガラス管に入れた。これに、パパイン（0.25 g）を含むリン酸緩衝液（1 mL）を加えた。ロイシン及びパパインの最終濃度は、5 mLの総体積で、それぞれ0.6 M及び50mg mL-1であった。混合物をEYELA ケミステーション PPS-5511（東京理化器械株式会社、東京）を用いて、1000 rpm、40℃で12時間撹拌した。混合物を室温に冷却後、12000 rpmで5分間遠心分離することによって沈殿物を収集した。粗生成物を希塩酸（pH 2.0）で2回及びMilli-Q水で洗浄し、凍結乾燥し、アルキルエステル末端ポリロイシン（polyLeu）を得た。収量は0.05 g（15 ％）であった。【０１５５】
２−５．化学酵素重合法によるpoly(Leu-r-nylon)の合成
下記表３に示すナイロンモノマーを用いて、以下の方法でpoly(Leu-r-nylon)の合成の合成を行った。
ナイロンモノマー（27 mmol）及びロイシンエチルエステル（0.59 g、3 mmol）を含むリン酸緩衝液（4 mL、1.0 M、pH=8.0）を、撹拌子を備えたガラス管に入れた。これに、パパイン（0.25 g）を含むリン酸緩衝液（1 mL）を加えた。ナイロンモノマー、ロイシン及びパパインの最終濃度は、5 mLの総体積で、それぞれ5.4 M、0.6 M及び50mg mL-1であった。混合物をEYELA ケミステーション PPS-5511（東京理化器械株式会社、東京）を用いて、1000 rpm、40℃で12時間撹拌した。混合物を室温に冷却後、12000 rpmで5分間遠心分離することによって沈殿物を収集した。粗生成物を希塩酸（pH 2.0）で2回及びMilli-Q水で洗浄し、凍結乾燥し、アルキルエステル末端ポリロイシン−r−ナイロン（poly(Leu-r-nylon)）を得た。各生成物の収率を表３に示す。【０１５６】
【表３】
2018043631.tif 000015
【０１５７】
２−６．化学酵素重合法によるpoly(Lys(Boc)AibLys(Boc))の合成
Lys(Boc)AibLys(Boc)-OMe塩酸塩（0.061 g、0.1 mmol）を含むリン酸緩衝液（1 mL、1.0 M、pH = 8.0）を、撹拌子を備えたガラス管に入れ、Lys(Boc)AibLys(Boc)-OMe塩酸塩がすべて完全に溶解するまで、40℃で撹拌した。これに、パパイン（0.1 g）を含むリン酸緩衝液（1 mL）を一度に加えた。Lys(Boc)AibLys(Boc)-OMe及びパパインの最終濃度は、2 mLの総体積で、それぞれ0.05 M及び50 mg mL-1であった。
混合物を800 rpm、40℃で4時間撹拌した。混合物を室温に冷却後、7000 rpm、4℃で10分間遠心分離することによって沈殿物を収集し、得られた粗生成物を脱イオン水で2回洗浄し、凍結乾燥して、poly(Lys(Boc)AibLys(Boc))を得た。収量は0.0103 g（13.1％）であった。【０１５８】
３．タンパク質の合成
３−１．polyAla/poly(Gly-r-Leu)=50/50のpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)の合成
２−１で得られたpolyAla（50 mg）及び２−２−３で得られたpoly(Gly-r-Leu)（50 mg）（合計100 mg）を、臭化リチウム（0.0868 g、1 mmol）を含むNMP（1 mL）に溶解し、窒素下、ポリリン酸（0.15 g）を含む、撹拌子及びコックを備えた10mLフラスコに入れた。窒素下、120℃で24時間溶液を撹拌した。室温に冷却後、混合物を水に注ぎ、1時間撹拌した。沈殿物を9000 rpmで15分間、4℃で遠心分離により回収した。粗生成物を、水で洗浄し、二回遠心分離し、凍結乾燥し、やや褐色の粉末を得た。【０１５９】
３−２．polyAla/poly(Gly-r-Leu)=33/67のpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)の合成
polyAla及びpoly(Gly-r-Leu)の量を、それぞれ33 mg及び67 mgとした以外は３−１と同様にして、polyAla-b-poly(Gly-r-Leu)を得た。【０１６０】
３−３．polyAla/poly(Gly-r-Leu)=33/67のpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)の合成
反応時間を48時間とした以外は３−２と同様にして、polyAla-b-poly(Gly-r-Leu)を得た。【０１６１】
３−４．polyAla/poly(Gly-r-Leu)=14/86のpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)の合成
polyAla及びpoly(Gly-r-Leu)の量を、それぞれ14 mg及び86 mgとした以外は３−３と同様にして、polyAla-b-poly(Gly-r-Leu)を得た。【０１６２】
３−５．polyAla/poly(Gly-r-Leu)=33/67のpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)の合成
反応温度を140℃とした以外は３−３と同様にして、polyAla-b-poly(Gly-r-Leu)を得た。【０１６３】
３−６．polyAla/poly(Gly-r-Leu)=10/90のpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)の合成
polyAla及びpoly(Gly-r-Leu)の量を、それぞれ10 mg及び90 mgとした以外は３−５と同様にして、polyAla-b-poly(Gly-r-Leu)を得た。【０１６４】
３−７．polyAla/poly(Gly-r-Leu)=50/50のpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)の合成
溶媒にDMAcを用い、反応温度を140℃、反応時間を48時間とした以外は３−１と同様にして、polyAla-b-poly(Gly-r-Leu)を得た。【０１６５】
３−８．polyAla/poly(Gly-r-Leu)=33/67のpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)の合成
polyAla及びpoly(Gly-r-Leu)の量を、それぞれ33 mg及び67 mgとした以外は３−７と同様にして、polyAla-b-poly(Gly-r-Leu)を得た。【０１６６】
３−９．polyAla/poly(Gly-r-Leu)=10/90のpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)の合成
polyAla及びpoly(Gly-r-Leu)の量を、それぞれ10 mg及び90 mgとした以外は３−７と同様にして、polyAla-b-poly(Gly-r-Leu)を得た。【０１６７】
４．評価
（１）1H-NMR
２−１で得られたpolyAlaの1H-NMRスペクトルを図１に示す。アラニン骨格のピークに加えて、エチルエステル末端の２つのピーク（図１中のａ，ｂ）が確認された。また、繰り返し単位中のα水素及び末端エチル基のピークの積分値の比より、数平均分子量Mnは810と算出された。【０１６８】
２−２−３で得られたpoly(Gly-r-Leu)の1H-NMRスペクトルを図２に示す。また、２−２−１〜２−２−４で得られた各poly(Gly-r-Leu)について、1H-NMR測定結果より算出した数平均分子量及びGly/Leuのモル比を、収率と共に表４に示す。【０１６９】
【表４】
2018043631.tif 000016
【０１７０】
２−３−２で得られたpoly(AlaAibAla)の1H-NMRスペクトルを図３に示す。また、２−３−１〜２−３−４で得られた各poly(AlaAibAla)について、1H-NMR測定結果より算出したAib含有量(mol%)を、収率と共に表５に示す。【０１７１】
【表５】
2018043631.tif 000017
【０１７２】
２−４で得られたpolyLeuの1H-NMRスペクトルを図４に示す。【０１７３】
２−５で得られた各poly(Leu-r-nylon)の1H-NMRスペクトルを図５に示す。また、２−５で得られた各poly(Leu-r-nylon)について、1H-NMR測定結果より算出したナイロン含有量及び重合度（DP）を、収率と共に表６に示す。【０１７４】
【表６】
2018043631.tif 000018
【０１７５】
３−７及び３−８で得られたpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)の1H-NMRスペクトルをそれぞれ図６（ａ）及び（ｂ）に示す。更に、３−１〜３−８で得られた各polyAla-b-poly(Gly-r-Leu)について、1H-NMR測定結果より算出したpolyAla含有量を、表７に示す。【０１７６】
【表７】
2018043631.tif 000019
【０１７７】
（２）MALDI-TOF MS
２−１で得られたpolyAlaのMSスペクトルを図７に示す。重合度（DP）が５〜１１の重合体に相当するピークが観察された。
また、２−２−３で得られたpoly(Gly-r-Leu)のMSスペクトルを図８に示す。図８（ｂ）は、図８（ａ）の部分拡大図である。Gly/Leu比が種々の、全体として重合度（DP）が７〜１２の重合体に相当するピークが観察された。【０１７８】
２−３で得られたpoly(AlaAibAla)のMSスペクトルを図９に示す。重合度（DP）が４〜５の重合体に相当するピークが観察された。
また、重合度（DP）が４〜５の重合体に相当するピークに加えて、Alaの１単位分（71 m/z）に相当する間隔を有する一連のピークも観察された。この(AlaAibAla)単位へのAla単位の挿入は、重合中のアミド交換によって起こり得る。重合反応における反応基質である(AlaAibAla)の仕込み量の増加に伴い、Ala単位が挿入された(AlaAibAla)に相当するピークが強くなることから、重合反応における基質濃度が高いほどアミド交換反応が起こりやすくなることが示唆された。【０１７９】
２−４で得られたpolyLeuのMSスペクトルを図１０に示す。ピーク上に示す数値は重合度（DP）を示し、重合度（DP）が５〜８の重合体に相当するピークが観察された。【０１８０】
２−５で得られた各poly(Leu-r-nylon)のMSスペクトルを図１１に示す。ピーク上に示す数値は重合度（DP）を示し、ピーク上の黒丸印はpolyLeuに帰属されるピークを示し、ピーク上の黒四角印はpoly(Leu-r-nylon)に帰属されるピークを示す。全体として重合度（DP）が５〜９の重合体に相当するピークが観察された。【０１８１】
２−６で得られたpoly(Lys(Boc)AibLys(Boc))のMSスペクトルを図１２に示す。重合度（DP）が２の重合体に相当するピークが観察された。【０１８２】
（３）GPC
２−１で得られたpolyAla、２−２−３で得られたpoly(Gly-r-Leu)、３−７及び３−８で得られたpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)のGPC測定結果を図１３に示す。polyAla-b-poly(Gly-r-Leu)のピークは、polyAla及びpoly(Gly-r-Leu)の各ピークよりも高分子量側にシフトしており、ブロック共重合体を形成していることを示している。また、３−１〜３−９で得られた各polyAla-b-poly(Gly-r-Leu)について、GPC測定より算出した数平均分子量（Mn）及び重量平均分子量（Mw）を、表８に記載した。【０１８３】
【表８】
2018043631.tif 000020
【０１８４】
（４）WAXD
２−１で得られたpolyAla、２−２−３で得られたpoly(Gly-r-Leu)、３−７で得られたpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)及び３−８で得られたpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)のWAXD測定結果を図１４に示す。polyAlaでは、逆平行βシート構造にみられる３つのピークが観察され、結晶化度は75.9％であった。poly(Gly-r-Leu)では、α−ヘリックス構造に由来する回折ピークが観察された。polyAla-b-poly(Gly-r-Leu)では、polyAla及びpoly(Gly-r-Leu)のピークと同様のピークが観察され、結晶化度は３−７のpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)では19.7％（polyAla含有量26 wt%）、３−８のpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)では12.8％（polyAla含有量21 wt%）であった。
本発明のpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)のβシート結晶領域の含有量（結晶化度）は、J.M. Goslineらの報告（The Jounal of Experimental Biology 202, 3295-3303）に記載された天然のクモ糸シルクの結晶化度（15〜25％）に匹敵することがわかった。なお、広角X散乱測定により算出した、アモルファスと結晶の存在比率から、結晶化度を算出した。【０１８５】
２−４で得られたpolyLeu及び２−５で得られた各poly(Leu-r-nylon)のWAXD測定結果を図１５に示す。いずれのpoly(Leu-r-nylon)においても、(020)、(210)及び(211)面に起因する３つの鋭いピーク（それぞれ面間隔1.07 nm、0.45 nm及び0.36 nm）が観察され、これらはpolyLeuのWAXDデータと一致することから、poly(Leu-r-nylon)においてもβシート結晶構造の形成が確認された。面間隔が0.45 nmに対応するピークの半値全幅を用いて、シェラーの式より結晶サイズを算出した。その結果を広角X散乱測定により算出した、アモルファスと結晶の存在比率から算出した結晶化度と共に表９に示す。【０１８６】
【表９】
2018043631.tif 000021
【０１８７】
（５）AFM
３−７で得られたpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)のAFMトポグラフィ像を図１６（ａ）及び（ｂ）に、３−８で得られたpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)のAFMトポグラフィ像を図１６（ｃ）に示す。
Ala含有量が多く（26 wt％）、天然のクモ糸シルクに匹敵する結晶化度（19.7 ％）を有する、３−７で得られたpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)では、ナノフィブリル様構造がみられた。一方、Ala含有量がより少なく（21 wt％）、より低い結晶化度（12.8 ％）を有する、３−８で得られたpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)では、大きな凝集体がみられた。【０１８８】
（６）IR
Nephila clavata由来の天然のクモ糸シルクファイバーのIRスペクトルを図１７（ａ）に、本発明の３−７及び３−８で得られたpolyAla-b-poly(Gly-r-Leu)のIRスペクトルを図１７（ｂ）に示す。
天然のクモ糸シルクナノファイバーと同様に、polyAla-b-poly(Gly-r-Leu)では1630 cm-1及び1535 cm-1に逆並行βシート構造に帰属される強いピークが観察された。【０１８９】
２−１で得られたpolyAla及び２−３−１で得られたpoly(AlaAibAla)のIRスペクトルを図１８に示す。polyAlaは1630 cm-1にβシート構造に帰属される強いピークが観察された。一方、poly(AlaAibAla)は1660 cm-1にαヘリックス構造に帰属されるピークが観察された。【０１９０】
２−４で得られたpolyLeu及び２−５で得られた各poly(Leu-r-nylon)のIRスペクトルを図１９に示す。polyLeu及びpoly(Leu-r-nylon)で、3300 cm-1付近にペプチド骨格中のアミド基間の水素結合に帰属されるピークが観察された。また、poly(Leu-r-nylon)でのみ3700 cm-1付近にペプチド骨格中のアミド結合と水分子との水素結合に帰属されるピークが観察された。この結果から、polyLeuにナイロン単位を導入することにより、アミド−アミド間の水素結合からアミド−水分子間の水素結合に変化する、即ち、ペプチド分子内の水素結合が阻害されることがわかった。【０１９１】
（７）CD
２−１で得られたpolyAla及び２−３−１で得られたpoly(AlaAibAla)のCDスペクトルを図２０に示す。polyAlaは218 nmに負のピークを示し、193 nmに正のピークを示し、βシート構造の形成を示した。一方、poly(AlaAibAla)は218 nm及び208 nmに2つの負のピークを示し、191 nmに正のピークを示し、αヘリックス構造の形成を示した。
一般に、2,2,2-トリフルオロエタノールのようなαヘリックス構造を安定化させる溶媒中でさえもpolyAlaはβシート構造を形成するが、Aib単位をpolyAla骨格に導入することにより、二次構造がβシートからαヘリックス構造に特異的に変化した。【０１９２】
（８）TG-DSC
２−４で得られたpolyLeu及び２−５で得られた各poly(Leu-r-nylon)のDSC曲線を図２１（ａ）に、TGA曲線を図２１（ｂ）〜（ｄ）に示す。polyLeuでは170℃〜250℃の吸熱ピークがみられなかったが、poly(Leu-r-nylon)では170℃〜250℃の吸熱ピークがみられた。TGAの結果によると、この温度間（170℃〜250℃）で重量減少がみられなかったことから、poly(Leu-r-nylon)でみられた170℃〜250℃の吸熱ピークは融解転移によるものと考えられる。
また、DSC及びTGAの結果から、50℃〜120℃の吸熱ピークはペプチドからの脱水によるもの、270℃以上での吸熱ピークはペプチドの熱分解によるものと考えられる。【０１９３】
（９）温度依存性WAXD
２−５で得られた各poly(Leu-r-nylon)について、WAXDデータの温度依存性を調べた。測定は、3 mgの試料に対して、50℃から300℃までDSCのスキャン速度10℃/分で行なった。代表して、２−４−３で得られたpoly(Leu-r-nylon4)OEtの温度依存性WAXDの結果を図２２（ａ）に示す。また、各poly(Leu-r-nylon)について、温度に対する結晶化度の変化をまとめたグラフを図２２（ｂ）に示す。
図２２（ｂ）において、各poly(Leu-r-nylon)でみられる170℃から250℃の範囲における結晶化度の緩やかな減少は、DSCの結果より、poly(Leu-r-nylon)の融解転移によるものと考えられる。【０１９４】
化学酵素重合法により、種々のポリアミノ酸及びポリペプチドを合成した。さらに、polyAla及びpoly(Gly-r-Leu)より、PPAを用いて重縮合してタンパク質polyAla-b-poly(Gly-r-Leu)を合成した。このタンパク質は17200もの高い重量平均分子量を示した。また、このタンパク質は天然のクモ糸の二次構造に類似した、逆平行βシート及び非晶質ドメインを有することがWAXD測定より明らかになり、その結晶化度も天然のクモ糸の結晶化度に匹敵するものであった。【０１９５】
さらに、化学酵素重合法により、天然のアミノ酸と非天然のアミノ酸とからなるポリペプチドを合成した。特に、パパインによる化学酵素重合法により、(YAibY)を構成単位とするpoly(YAibY)（YはAla又はLys(Boc)である）の合成に成功した。また、パパインによる化学酵素重合法により、polyLeuにナイロンを導入したpoly(Leu-r-nylon)の合成に成功した。これらのポリペプチドでは、分子間水素結合が阻害され、二次構造の変化、融点の発現などが確認された。【０１９６】
上記実施例で製造したタンパク質を、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)又はジメチルスルホキシド(DMSO)等の溶媒に溶解し、ドープ液を調製し、常法によりドープ液中のタンパク質を不溶化して樹脂を製造できる。得られた樹脂は、種々の材料の原料として使用可能な強度を有する。【０１９７】
また、上記実施例で製造したタンパク質を、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)又はジメチルスルホキシド(DMSO)等の溶媒に溶解し、ドープ液を調製し、当該ドープ液をキャスティング法、スピン・コーティング法及びディッピング法等の常法により基体表面に塗布し、乾燥してタンパク質を不溶化し、その後、基体から剥離して、フィルムを得ることができる。このフィルムは種々の用途可能な強度を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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