(57)【要約】  卵巣機能の低下の予防及び／又は改善に有効な製剤を提供することを課題とする。プテロスチルベンからなる、卵巣機能の低下予防又は改善剤を提供する。
2018056409.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プテロスチルベンからなる、卵巣機能の低下予防又は改善剤。
【請求項２】
請求項１に記載の卵巣機能の低下予防又は改善剤を含有する、卵巣機能の低下予防又は改善用医薬組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の卵巣機能の低下予防又は改善剤を含有する、卵巣機能の低下予防又は改善用飲食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プテロスチルベンからなる卵巣機能の低下予防又は改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
女性の年齢と妊娠には密接な関係があり、加齢とともに妊娠率が低くなる傾向にある。その大きな理由の一つとして、卵巣内の卵子の数の低下及び質の低下がある。女性は生まれたときには卵巣内にすべての卵子の元がすでに存在し、加齢とともに、卵子は少なくなり、その質も低下する。女性の結婚年齢が年々高くなっている現代、明らかな不妊の原因がなくても、加齢による卵巣機能の低下、すなわち卵巣内の卵子の数の低下及び質の低下によって妊娠しにくい女性が増えているといえる。【０００３】
近年、体外受精や顕微授精などの高度生殖補助医療の技術は進歩しているが、卵巣機能の低下による妊娠率の低下に対しては、最先端の生殖医療をもってしても治療できないという現実がある。したがって、卵巣機能の低下を抑制する手段が求められている。【０００４】
プテロスチルベンは、マメ科植物のインドキノキ等に含まれるスチルベン骨格を有する化合物である。プテロスチルベンは、抗酸化作用、血栓予防治療作用（特許文献1）、LDLコレステロール低減、インスリン抵抗性改善、抗炎症作用、がん抑制作用（非特許文献1）等の生理活性を有することが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2016-44134号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Alternative Medicine Review 2010; 15: 159-163
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現代社会において、妊娠に適した年齢期と妊娠を希望する年齢期のギャップによる、妊娠を希望する年齢期における卵巣機能の低下に起因する現代型不妊症のケースが増加しており、予防及び／又は改善手段が望まれている。また、畜産分野等においても、卵巣機能の低下による妊娠率の低下を抑制する手段が求められている。これらの要望に応えるべく、本発明は、卵巣機能の低下の予防及び／又は改善に有効な製剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、プテロスチルベンが加齢等による卵巣機能の低下の予防及び／又は改善に有効であることを知見した。同知見に基づき、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。【００１０】
［１］  プテロスチルベンからなる、卵巣機能の低下予防又は改善剤。
［２］  ［１］に記載の卵巣機能の低下予防又は改善剤を含有する、卵巣機能の低下予防又は改善用医薬組成物。
［３］  ［１］に記載の卵巣機能の低下予防又は改善剤を含有する、卵巣機能の低下予防又は改善用飲食品組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、加齢等による卵巣機能の低下の予防及び／又は治療に有効な製剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、プテロスチルベンを使用した実験デザインを示す図である。
【図２】図２は、プテロスチルベン摂取の試験開始時と試験終了時の各群のマウス体重を示す図である。Aは、25週齢の各群のマウス（試験開始時）の体重を示す。Bは、47週齢の各群のマウス（試験終了時）の体重を示す。
【図３】図３は、プテロスチルベンを摂取したマウスの体外受精及び胚培養の結果を示す図である。Aは、各群のマウスの排卵卵子数を示す。Bは、各群のマウスの受精率を示す。Cは、各群のマウスの胚盤胞形成率を示す。
【図４】図４は、プテロスチルベンを摂取したマウスから得られた胚の胚移植の結果を示す図である。Aは、各群のマウスの着床率を示す。Bは、各群のマウスの生仔獲得率を示す。Cは、各群のマウスの流産率を示す。Dは、プテロスチルベン22週間摂取群の胚移植後に生まれた児と胎盤の肉眼所見を示す（写真）。
【図５】図５は、プテロスチルベンを摂取したマウスから得られた生仔体重及び胎盤重量を示す図である。Aは、各群のマウスの生仔体重を示す。Bは、各群のマウスの胎盤重量を示す。
【図６】図６は、プテロスチルベン22週間摂取群のマウスから得られた仔及びその仔供を示す図（写真）である。
【図７】図７は、レスベラトロールを使用した実験デザインを示す図である。
【図８】図８は、レスベラトロール摂取の試験開始時と試験終了時の各群のマウス体重を示す図である。Aは、25週齢の各群のマウス（試験開始時）の体重を示す。Bは、47週齢の各群のマウス（試験終了時）の体重を示す。
【図９】図９は、レスベラトロールを摂取したマウスの体外受精及び胚培養の結果を示す図である。Aは、各群のマウスの排卵卵子数を示す。Bは、各群のマウスの受精率を示す。Cは、各群のマウスの胚盤胞形成率を示す。
【図１０】図１０は、レスベラトロールを摂取したマウスから得られた胚の胚移植の結果を示す図である。Aは、各群のマウスの着床率を示す。Bは、各群のマウスの生仔獲得率を示す。Cは、各群のマウスの流産率を示す。
【図１１】図１１は、プテロスチルベンを使用した実験デザインを示す図である。
【図１２】図１２は、プテロスチルベンを摂取したマウスの排卵卵子数を示す図である。
【図１３】図１３は、プテロスチルベンを摂取したマウスの卵子内ミトコンドリア活性の解析結果を示す図である。Aは、共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す（写真）。Bは、卵子内ミトコンドリア活性の平均強度を示す。
【図１４】図１４は、プテロスチルベンを摂取したマウスの卵子内ATP量を示す図である。
【図１５】図１５は、プテロスチルベンを摂取したマウスの卵子内ミトコンドリアDNAのコピー数を示す図である。
【図１６】図１６は、プテロスチルベン又はレスベラトロールを摂取したマウスのプテロスチルベン又はレスベラトロールの血清中濃度を示す図である。Aは、プテロスチルベンを摂取したマウスのプテロスチルベンの血清中濃度を示す図である。Bは、レスベラトロールを摂取したマウスのレスベラトロールの血清中濃度を示す図である。
【図１７】図１７は、プテロスチルベンとレスベラトロールを摂取したマウスの各化合物の血清中濃度を示す図である。
【図１８】図１８は、プテロスチルベンを摂取したマウス卵巣組織のTUNEL染色像を示す図である（写真）。Aは、マウス卵巣組織のTUNEL染色像を示す。Bは、Aの拡大図を示す。
【図１９】図１９は、プテロスチルベンを摂取したマウス卵巣組織の8-OhdG染色像を示す図である（写真）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の一形態は、プテロスチルベンからなる、卵巣機能の低下予防又は改善剤に関する。本発明に用いるプテロスチルベン(4’-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシ-trans-スチルベン) (trans-1-(3,5-ジメトキシフェニル)-2-(4-ヒドロキシフェニル)エチレン)は、化学式C16H16O3で表される化合物である。
【００１４】
（プテロスチルベン）
本発明の卵巣機能の低下予防又は改善剤は、プテロスチルベンを有効成分とすることを特徴とする。本発明に用いられるプテロスチルベンは、化学的に合成されたもの又は天然物より得られるもののいずれをも用いることができる。天然物より得られるものとしては、例えばマメ科シタン属に属する植物インドキノキ（Pterocarpus marsupium）から得られるものが挙げられる。プテロスチルベンの製造方法の一例としては、インドキノキの幹、枝、葉、花、根を含む全木、あるいは、インドキノキの幹、枝、葉、花、根を常法で破砕し、破砕粉体から常法でプテロスチルベンを含有する抽出物を得る方法等が挙げられる。本発明においては、プテロスチルベンは抽出物、破砕物の状態であっても、適宜精製したものであってもよい。本発明においては、このようなプテロスチルベンを含有する抽出物、破砕粉体物、精製物、化学合成物の１種又は２種以上を組み合わせて使用することができる。また、プテロスチルベンは、市販のものを用いてもよい。
【００１５】
（卵巣機能の低下予防又は改善剤）
本発明の卵巣機能の低下予防又は改善剤は、卵巣機能の低下の予防、及び、低下した卵巣機能を改善・治療する作用を有する。卵巣機能の低下の予防又は改善・治療作用は、特に限定されないが、例えば、排卵卵子数の低下の抑制・排卵卵子数の増加、卵子内ミトコンドリア活性の低下の抑制・卵子内ミトコンドリア活性の増加、受精卵着床率の低下の抑制・受精卵着床率の増加、生児（生仔）率の低下の抑制・生児（生仔）率の増加、流産率の増加の抑制・流産率の低下、人工受精・体外受精・顕微授精成功率の増加等であり得る。
【００１６】
本発明の卵巣機能の低下予防又は改善剤は、卵巣機能の低下の予防、及び、低下した卵巣機能を改善・治療する作用を有する。したがって、本発明の卵巣機能の低下予防又は改善剤は、例えば、加齢等による卵巣機能の低下による不妊の予防、改善、治療及び人工受精・体外受精・顕微授精成功率の増加等に有効である。
【００１７】
本発明の卵巣機能の低下予防又は改善剤は、卵巣機能の低下による不妊の予防、改善、治療及び人工受精・体外受精・顕微授精成功率の増加等を必要とする哺乳類を対象とし、特に限定されない。哺乳類としては、特に限定されないが、ヒト、非ヒト動物、例えば、ブタ類、ウシ類、オビド類、ウマ類、スイギュウ類等のような肉及び酪農生産のために商業的な価値を有する動物等を含む。
【００１８】
本発明の卵巣機能の低下予防又は改善剤の製造方法は、有効成分としてプテロスチルベンを含有すれば、特に限定されない。すなわち、通常の医薬の製剤技術を用いて、製造することができる。
本発明の卵巣機能の低下予防又は改善剤は、有効成分としてのプテロスチルベン以外に、必要に応じて、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤等の医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤等を含有させて、医薬組成物とすることも可能である。
【００１９】
医薬組成物におけるプテロスチルベンの含有量は、医薬組成物の全質量に対して、通常0.01質量％〜10質量％、好ましくは0.05質量％〜5質量％、より好ましくは0.01質量％〜0.5質量％であり得る。
【００２０】
本発明の卵巣機能の低下予防又は改善剤の投与経路は、経口投与又は非経口投与のいずれであってもよい。その剤形は、投与経路に応じて適宜選択される。例えば、注射液、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、腸溶剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、湿布剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤、経腸栄養剤等が挙げられる。
【００２１】
本発明の卵巣機能の低下予防又は改善剤の投与量は、投与の目的（症状、症状の程度等）や投与対象者の状況（年齢、体重等）に応じて異なるが、通常、成人に対して、プテロスチルベン量として、経口投与の場合、1日あたり0.1ｍｇ〜1,000ｍｇ、好ましくは1ｍｇ〜100ｍｇで投与され得る。
【００２２】
投与期間は、投与の目的（症状、症状の程度等）や投与対象者の状況（年齢、体重等）に応じて異なるが、1日〜200日、好ましくは7日〜100日投与され得る。本発明の卵巣機能の低下予防又は改善剤は、生体に対する安全性が高く、症状の改善の程度によって又は発症若しくは再発の予防の目的で、上記期間を超えて長期間投与され得る。
【００２３】
（飲食品組成物等）
本発明の卵巣機能の低下予防又は改善剤は、医薬品として以外にも、医薬部外品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助剤、飲食品等として使用することができる。医薬部外品として使用する場合、必要に応じて、医薬部外品または化粧品等の技術分野で通常用いられている種々の補助剤とともに使用され得る。あるいは、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助剤、または飲食品として使用する場合、必要に応じて、例えば、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤等の食品に通常用いられる添加剤とともに使用してもよい。また、固体状、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状等の所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれるプテロスチルベンの割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。例えば、医薬部外品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助剤、飲食物におけるプテロスチルベンの含有量は、組成物の全質量に対して、通常0.01質量％〜10質量％、好ましくは0.05質量％〜5質量％、より好ましくは0.01質量％〜0.5質量％であり得る。医薬部外品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助剤、飲食品等は、各分野の通常の製造方法を用いて製造することができる。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例を挙げて本発明の詳細を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００２５】
＜実施例１＞
（実験動物）
25週齢のICR雌マウス（日本クレア, Tokyo, Japan）20匹をランダムに5匹ずつ、4ケージに分けた。マウスは室温22℃、湿度55％、12時間ごとの明暗環境下で飼育された。マウス飼料はMFコントロール飼料（オリエンタル酵母, Tokyo, Japan）もしくはプテロスチルベン（シルビノール90%, サビンサジャパンコーポレーション, Tokyo, Japan）含有飼料（プテロスチルベン0.04質量%含有）マウス一匹あたり一日6 gを、図1の実験デザインに示されるスケジュールで与えた。水分は随時自由に摂取できる状態とした。飼育中は週に一回の体重測定を行った。25週における各群のマウスの体重（群平均値）、及び、47週における各群のマウスの体重（群平均値）を図2に示す。
全てのマウスの取り扱いや飼育に関しては聖マリアンナ医科大学の実験動物施設の基準に準じた。【００２６】
図2に示すように、試験開始時の25週齢のコントロール群と22週間プテロスチルベン投与群間のマウスの体重に有意差は認められなかった。また、試験終了時の47週齢のコントロール群と22週間プテロスチルベン投与群間のマウスの体重においても有意差は認められなかった。【００２７】
（体外受精及び胚培養）
47週齢を過ぎたマウスは膣スメアにより性周期を確認した。発情前期のタイミングでゴナトロピン(ASKA Pharmaceutical. Co., Tokyo, Japan) 10 IUを腹腔内投与した。投与後15時間で卵子卵丘細胞複合体（COCs：Cumulus Oocyte Complexes）を卵管内から回収し、100mL TYH medium（LSI Medience corporation, Tokyo, Japan）内で30分間前培養した。その間にICR雄マウス（10-12週齢）にソムノペンチル麻酔薬（共立製薬, Tokyo, Japan）で全身麻酔を施し、精巣上体尾部を摘出した。精巣上体尾部の一部を切開し内部の精子を押し出すように回収した。回収した精子塊を400mL TYH mediumが入った1.5 mLマイクロチューブに沈めてCO2 incubator 内で10分間swim upした（37℃、5％ CO2、95% in air）。Swim up後の精子をCOCsが入った100mL TYH mediumに最終濃度2-3×105/mLとなるように加え、CO2 incubator (37℃、5％ CO2、95% in air)内で5-6時間培養した。培養後の卵子は30mL KSOM Medium（Merck Millipore, Darmstadt, Germany）内で精子の除去を行い、その際に正確な排卵卵子数を算出した。その後、別の30mL KSOM Mediumに移し、CO2 incubator 内で4日間培養した。受精率と胚盤胞形成率はそれぞれ、二細胞期胚数/第二減数分裂中期(MII)卵子数、胚盤胞数/二細胞期胚数で算出した。結果を図3に示す。【００２８】
図3に示すように、コントロール群と22週間プテロスチルベン投与群間の排卵卵子数に有意差が認められた（P<0.05；One-way ANOVA, Post hoc test: Dunnett法）。22週間のプテロスチルベン投与により、排卵卵子数の増加効果が認められた。【００２９】
（胚移植及び帝王切開）
4日間の培養後、胚盤胞期胚に到達した胚を胚移植した。Recipientマウスは6-10週齢のICR雌マウスで、採卵日の前日に精管結紮されたICR雄マウスと交配させ、翌日膣栓が確認できた個体を使用した。ソムノペンチル麻酔薬で全身麻酔を施し、後背部切開により子宮を露出させた。子宮をピンセットで固定し30G の注射針（Dentronics, Tokyo, Japan）で卵管接合部に穴を開け、胚盤胞を吸引したガラスキャピラリーを挿入し子宮内部に胚を移植した。移植後、子宮を慎重に体内に戻し、後腹膜及び皮膚を縫合した。移植に際しては、各群のマウスから得られた胚盤胞を個体毎にそれぞれRecipientマウスに移植した。採卵の翌日を1日目として、19日目で帝王切開を実施した。Recipientマウスを安楽死させ開腹、子宮を摘出して胎仔及び胎盤を取り出した。着床率は着床痕数/胚移植数、生仔獲得率は生仔数/胚移植数、流産率は1-生仔獲得率で算出した。結果を図4に示す。また、生仔体重及び胎盤重量を測定した。結果を図5に示す。【００３０】
図4に示すように、コントロール群と22週間プテロスチルベン投与群間の着床率、生仔獲得率、流産率に有意差が認められた（P<0.05；One-way ANOVA, Post hoc test: Dunnett法）。22週間のプテロスチルベン投与により、着床率の増加、生仔獲得率の増加、流産率の低減効果が認められた。なお、図5に示すように、コントロール群と22週間プテロスチルベン投与群間の生仔体重及び胎盤重量に有意差は認められなかった。【００３１】
22週間プテロスチルベン投与群から得られた仔を成体まで育て、交配試験を実施した。22週間プテロスチルベン投与群から得られた仔に特記すべき異常はなく、正常に妊娠、出産に至った。したがって、繁殖能力も正常である事が確認できた。結果を図6に示す。【００３２】
＜比較例１＞
プテロスチルベンと同じくスチルベン誘導体であるレスベラトロールを用いて実験を行った。
（実験動物）
25週齢のICR雌マウス（日本クレア, Tokyo, Japan）15匹をランダムに5匹ずつ、3ケージに分けた。マウスは室温22℃、湿度55％、12時間ごとの明暗環境下で飼育された。マウス飼料はMFコントロール飼料（オリエンタル酵母, Tokyo, Japan）もしくはレスベラトロール（3,4',5-トリヒドロキシ-trans-スチルベン（trans-1,2-(3,4',5-トリヒドロキシジフェニル)エチレン）,東京化成工業株式会社, Tokyo, Japan）含有飼料（レスベラトロール0.04質量%含有）マウス一匹あたり一日6 gを、図7の実験デザインに示されるスケジュールで与えた。水分は随時自由に摂取できる状態とした。飼育中は週に一回の体重測定を行った。25週における各群のマウスの体重（群平均値）、及び、47週における各群のマウスの体重（群平均値）を図8に示す。
全てのマウスの取り扱いや飼育に関しては聖マリアンナ医科大学の実験動物施設の基準に準じた。【００３３】
図8に示すように、試験開始時の25週齢のコントロール群と22週間レスベラトロール投与群間のマウスの体重に有意差は認められなかった。また、試験終了時の47週齢のコントロール群と22週間レスベラトロール投与群間のマウスの体重においても有意差は認められなかった。【００３４】
（体外受精及び胚培養）
実施例1に記載の方法に基づき、47週齢を過ぎた各群のマウスについて、体外受精及び胚培養を行った。排卵卵子数、受精率及び胚盤胞形成率を算出した。結果を図9に示す。【００３５】
図9に示すように、コントロール群と22週間レスベラトロール投与群間の排卵卵子数、受精率、胚盤胞形成率に有意差は認められなかった。【００３６】
（胚移植及び帝王切開）
実施例1に記載の方法に基づき、胚盤胞期胚に到達した胚の胚移植及び帝王切開を行った。着床率、生仔獲得率、流産率を算出した。結果を図10に示す。【００３７】
図10に示すように、コントロール群と22週間レスべラトロール投与群間の着床率に有意差が認められた（P<0.05；One-way ANOVA, Post hoc test: Dunnett法）。22週間のレスベラトロール投与により、着床率の増加が認められた。一方で、生仔獲得率及び流産率に統計学的に有意な差は認められなかったが、生仔獲得率の増加傾向、流産率の低減傾向が確認された。【００３８】
プテロスチルベンは、スチルベン誘導体であるレスベラトロールと比較して、排卵卵子数の増加、生仔率の増加、流産率の低下等の効果に優れており、優れた卵巣機能の低下の予防又は改善・治療作用を有することが示された。【００３９】
＜実施例２＞
（実験動物）
25週齢のICR雌マウス（日本クレア, Tokyo, Japan）20匹をランダムに5匹ずつ、4ケージに分けた。マウスは室温22℃、湿度55％、12時間ごとの明暗環境下で飼育された。マウス飼料はMFコントロール飼料（オリエンタル酵母, Tokyo, Japan）もしくはプテロスチルベン（シルビノール90%, サビンサジャパンコーポレーション, Tokyo, Japan）含有飼料（プテロスチルベン0.04質量%含有）マウス一匹あたり一日6 gを、図11の実験デザインに示されるスケジュールで与えた。水分は随時自由に摂取できる状態とした。本試験は3回繰り返しおこない、各群総計30匹のマウスを実験に用いた。
全てのマウスの取り扱いや飼育に関しては聖マリアンナ医科大学の実験動物施設の基準に準じた。【００４０】
（排卵卵子の回収）
47週齢を過ぎたマウスは膣スメアにより性周期を確認した。発情前期のタイミングでゴナトロピン(ASKA Pharmaceutical. Co., Tokyo, Japan) 10 IUを腹腔内投与した。投与後15時間で卵子卵丘細胞複合体（COCs：Cumulus Oocyte Complexes）を卵管内から回収し、M16 medium + ヒアルロニダーゼにて卵丘細胞を剥離、卵子を単離した。その際、各群の排卵数を記録した。結果を図12に示す。【００４１】
図12に示すように、コントロール群とプテロスチルベン投与群間の排卵卵子数に有意差が認められた（P<0.05；ｔ-test）。22週間のプテロスチルベン投与により、排卵卵子数の増加効果が認められた。【００４２】
（卵子内ミトコンドリア活性の解析）
単離した卵子をMitotracker 及びHoechst33342を加えたM16 mediumにて10分処理した。その後、M16 mediumにて3回洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡(LSM 510: Zeiss)にて観察・蛍光強度の測定を行った。結果を図13に示す。【００４３】
図13に示すように、コントロール群とプテロスチルベン投与群間の卵子内ミトコンドリア活性に有意差が認められた（P<0.05；ｔ-test）。22週間のプテロスチルベン投与により、卵子内のミトコンドリア活性の増強効果が認められた。【００４４】
（卵子内ATP量測定）
単離した卵子をAcidified Tyrode's solutionで処理し、透明帯を除去した。得られた卵細胞質を5μLのM16 mediumと共に、1.5mLマイクロチューブに移し-20℃にて保存した。後日、ATP-Glo assay kitを用いて、マルチスペクトロマイクロプレートリーダー(Varioskan Flash : Thermo Scientific)により発光を測定することでATP量を測定した。結果を図14に示す。【００４５】
図14に示すように、コントロール群とプテロスチルベン投与群間の卵子内ATP含量に統計学的な有意差は認められなかった。しかし、プテロスチルベン投与群の方が、コントロール群と比較してATP含量が高い傾向を示した。【００４６】
（卵子内ミトコンドリアDNAコピー数解析）
単離した卵子をAcidified Tyrode's solutionで処理し、透明帯を除去した。得られた卵細胞質を10μL のLysis bufferと共に、1.5mLマイクロチューブに移し-20℃にて保存した。後日、細胞ライセートそれをtemplateにリアルタイムPCRを実施した。得られた結果から、ミトコンドリアDNAコピー数を算出した。結果を図15に示す。【００４７】
コントロール群とプテロスチルベン投与群間の卵子内ミトコンドリアDNAコピー数、ATP含量に統計学的な有意差は認められなかった。22週間のプテロスチルベン投与による、卵子内ミトコンドリアDNAコピー数の増加効果は認められなかった。【００４８】
＜実施例３＞
（血中プテロスチルベン及びレスベラトロール濃度測定）
実施例1及び比較例1における妊孕性試験実施時に回収して、-80℃にて保存していた血清サンプルを用いて実施した。血清サンプルは凍結状態のまま、株式会社住化分析センターに送付した。LC-MSとHPLCにより解析を依頼した。結果を図16に示す。【００４９】
図16に示すように、プテロスチルベンを投与した各群では血清中からプテロスチルベンが検出された。また、非投与群（コントロール）では、全く検出されなかった。レスベラトロールも同様に投与群でのみ検出された。プテロスチルベン試験群では投与群間における血中濃度に有意な差はなく、投与期間に関係なく安定的にプテロスチルベンが血中に存在したと考えられる。一方で、レスベラトロール試験群では長期投与群（22wk）の血中濃度は短期投与群（1wk）に比べて有意に減少していた(P<0.05；ｔ-test)。【００５０】
＜参考例＞
（トランスレスベラトロール投与実験）
プテロスチルベンはレスベラトロールのメチル化構造体であり、一般的によく用いられているトランスレスベラトロールよりも安定した構造体である。実施例２のプテロスチルベン投与の添加実験デザインと全く同じデザインで、トランスレスベラトロール添加投与実験を実施し血中濃度を比較することで生体内での安定性を検討した。結果を図17に示す。【００５１】
図17に示すように、プテロスチルベン投与群の血清中濃度は、トランスレスベラトロール投与群の血清中濃度の約70倍であった(P<0.05；ｔ-test)。全く同じ物質ではないので一概には言えないが、同条件で投与した場合プテロスチルベンの方が血中に、より安定的に存在する事が確認され、プテロスチルベンの有用性が示された。【００５２】
＜実施例４＞
（卵巣組織解析）
実施例１における妊孕性試験実施時に回収しホルマリン固定後、保存していた卵巣組織（コントロール及び22wk）を用いて組織解析を実施した。卵巣組織はパラフィン包埋し、ミクロトームにて4μmの厚さの切片を作製した。作製した切片を用いて、TUNEL染色及び8-OHdG染色を実施し、蛍光顕微鏡(BZ-X710:KEYENCE)にて観察した。TUNEL染色では細胞のアポトーシスを検出し、8-OHdG染色では細胞DNAの酸化ダメージを検討した。結果を図18及び19に示す。【００５３】
図18、19に示すように、プテロスチルベン投与群の卵巣では、非投与群であるコントロールの卵巣に比べて、アポトーシス及び酸化ダメージが減少している可能性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、医薬、飲食品等に適用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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