(57)【要約】  本発明は、生体組織において、血管内皮ネットワークの形成を促進するためのＬＹＰＤ１阻害剤を提供する。また、本発明は、ＬＹＰＤ１阻害剤を有効成分として含む、血管新生障害を治療及び／又は予防するための医薬組成物を提供する。また、本発明は、（ａ１）ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞と、血管内皮細胞を含む細胞群を提供する工程；（ａ２）前記工程（ａ１）により得られた細胞群を、ＬＹＰＤ１阻害剤で処理する工程；（ａ３）前記工程（ａ２）により得られた細胞群を培養する工程、を含む方法を提供する。
2018164141.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織において、血管内皮ネットワークの形成を促進するためのＬＹＰＤ１阻害剤。
【請求項２】
血管新生障害の治療及び／又は予防のための、請求項１に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。
【請求項３】
前記血管新生障害が、脳血管疾患、脳梗塞、一過性脳虚血発作、モヤモヤ病、狭心症、（末梢）動脈閉塞症、動脈硬化症、バージャー病、心筋梗塞、虚血、心筋症、鬱血性心不全、冠動脈疾患、遺伝性出血性毛細血管拡張症、虚血性心疾患、血管内膜肥厚、血管閉塞、動脈硬化性末梢血管疾患、門脈圧亢進症、リウマチ性心疾患、高血圧、血栓塞栓症、アテローム性動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、肺動脈高血圧、静脈移植片疾患、高血圧性心疾患、心臓弁膜症、川崎病、拡張型心筋症、肥大型心筋症、サルコイドーシス、全身性強皮症、大動脈炎症候群、無症候性心筋虚血、内頚動脈狭窄症、椎骨動脈狭窄症、透析心筋症、糖尿病性心筋症、肺動脈性肺高血圧、虚血性心筋症、冠動脈バイパス術後、経皮的冠動脈形成術後、急性心筋梗塞、亜急性心筋梗塞、陳旧性心筋梗塞、労作性狭心症、不安定狭心症、急性冠症候群、冠攣縮性狭心症、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全、僧房弁閉鎖不全及び僧房弁狭窄症からなる群から選択される、請求項２に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。
【請求項４】
前記生体組織が、ＬＹＰＤ１を発現する生体組織である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。
【請求項５】
前記ＬＹＰＤ１阻害剤が、ＬＹＰＤ１の選択的阻害剤である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。
【請求項６】
前記ＬＹＰＤ１の選択的阻害剤が、有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメント及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項５に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。
【請求項７】
前記ＬＹＰＤ１阻害剤が、ＬＹＰＤ１発現の阻害剤及び／又はＬＹＰＤ１発現の阻害剤で処理された細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。
【請求項８】
前記細胞が、細胞懸濁液又は細胞シートの形態で提供される、請求項７に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。
【請求項９】
前記ＬＹＰＤ１発現の阻害剤が、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子、ＲＮＡｉ誘導性核酸、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ゲノム編集核酸及びそれらの発現ベクター、有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメント、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項７又は８に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のＬＹＰＤ１阻害剤を有効成分として含む、血管新生障害を治療及び／又は予防するための医薬組成物。
【請求項１１】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、アンギオポエチン、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、それらのファミリータンパク質及びそれらの組合せからなる群から選択される１以上の血管新生誘導因子をさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
血管内皮ネットワークの形成が促進された生体組織を製造する方法であって、
以下の工程：
（ａ１）ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞と、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とを含む細胞群を提供する工程；
（ａ２）前記工程（ａ１）により得られた細胞群を、ＬＹＰＤ１阻害剤で処理する工程；並びに
（ａ３）前記工程（ａ２）により得られた細胞群を、培養する工程、
或いは、
（ｂ１）ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞を含む細胞群を、ＬＹＰＤ１阻害剤で処理する工程；
（ｂ２）前記工程（ｂ１）により得られた細胞群に、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞を接触させる工程；並びに
（ｂ３）前記工程（ｂ２）により得られた細胞群を、培養する工程、
を含む、方法。
【請求項１３】
前記第１の細胞が、心臓、筋肉、腎臓及び／又は脳由来の細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＬＹＰＤ１阻害剤が、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子、ＲＮＡｉ誘導性核酸、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ゲノム編集核酸、それらの発現ベクター、それらの発現ベクターが導入された細胞、前記第１の細胞のＬＹＰＤ１発現量よりもＬＹＰＤ１発現量が低い若しくは発現していない第２の細胞、有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメント及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の細胞が、皮膚、食道、肺、及び／又は肝臓由来の細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＬＹＰＤ１阻害剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ｉ−１）ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞と、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とを含む細胞群を提供する工程；
（ｉ−２）前記工程（ｉ−１）により得られた細胞群を、候補物質で処理する工程；
（ｉ−３）前記工程（ｉ−２）により得られた細胞群を培養する工程；並びに
（ｉ−４）前記工程（ｉ−３）により得られた細胞群における血管内皮ネットワークの形成を評価する工程、
或いは、
（ｉｉ−１）ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞を含む細胞群を、候補物質で処理する工程；
（ｉｉ−２）前記工程（ｉｉ−１）により得られた細胞群に、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞を接触させる工程；
（ｉｉ−３）前記工程（ｉｉ−２）により得られた細胞群を培養する工程；並びに
（ｉｉ−４）前記工程（ｉｉ−３）により得られた細胞群における血管内皮ネットワークの形成を評価する工程、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織において血管内皮ネットワークの形成を促進するためのＬＹＰＤ１の阻害剤に関する。また、本発明は、血管内皮ネットワークの形成が促進された生体組織を製造する方法に関する。なお、本出願は日本国特許庁に２０１７年３月６日に出願した特願２０１７−４２２００を基礎とする優先権を主張出願であり、参照によってその明細書全体が本明細書中に取り込まれる。
【背景技術】
【０００２】
虚血性心疾患は、日本の死因第２位であり、現在も解決すべき重要な疾患の１つである。従来、虚血性心疾患に対する血管新生療法としては、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの血管新生誘導因子の投与や、血管内皮前駆細胞の移植など、血管新生を促進する治療法が広く開発されてきた。一方で、これらの治療法は、全身における血管新生を促進する懸念があり、担癌患者へ適用することが困難であった。また、血管新生増殖因子を用いる場合は、血管浮腫などの副作用が起こってしまい、臨床に応用するためには課題を有していた。【０００３】
全身の臓器又は組織において血管新生を促進することなく、治療の対象となる臓器又は組織の血管新生のみを促進する治療法として、細胞シートを用いた治療法が開発されている。例えば、虚血性心疾患を含む心臓疾患を治療する治療法として、細胞シートによる治療法が開発されており、一部は臨床で使用されている（特許文献１〜３参照）。【０００４】
しかしながら、特許文献１〜３に記載の細胞シートは、適用した患部に当該細胞シートから分泌されるサイトカイン等の作用により治療効果を発揮する治療法であり、重度の疾患により不可逆的な損傷を受けた臓器又は組織の治療には不十分な治療法であると考えられている。そのため、このような臓器又は組織を治療するためには、その部位を代替する機能を有する生体組織と置換する（移植する）必要があると考えられている。【０００５】
疾患を有する臓器又は組織と置換可能な生体組織を作製する手法として、種々のティッシュエンジニアリング技術が開発されている。特に、厚みをもった生体組織を構築する方法の開発が試みられている。厚みを持った生体組織を構築させるためには、当該生体組織内に血管内皮ネットワークを構築し、機能的な血管網を構築させる必要がある。例えば、インビトロにおいて、機能的な血管網を有し、厚みをもった生体組織を構築する方法として、特許文献４及び５に記載の方法が開示されている。【０００６】
生体組織において、機能的な血管網を構築した生体組織を得るためには、上述の方法のみでは十分ではなく、より簡便に機能的な血管網を構築する新たな方法の開発が希求されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００５／０１１５２４号
【特許文献２】国際公開第２０１１／０６７９８３号
【特許文献３】国際公開第２０１４／１４８３２１号
【特許文献４】国際公開第２０１２／０３６２２４号
【特許文献５】国際公開第２０１２／０３６２２５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述のような、簡便に、生体組織において血管内皮ネットワークの形成を促進させるための問題点を解決することを課題としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、驚くべきことに、ＬＹＰＤ１を阻害することにより、生体組織において血管内皮ネットワークの形成が促進されることを見出した。すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。【００１０】
［１］  生体組織において、血管内皮ネットワークの形成を促進するためのＬＹＰＤ１阻害剤。
［２］  血管新生障害の治療及び／又は予防のための、［１］に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。
［３］  前記血管新生障害が、脳血管疾患、脳梗塞、一過性脳虚血発作、モヤモヤ病、狭心症、（末梢）動脈閉塞症、動脈硬化症、バージャー病、心筋梗塞、虚血、心筋症、鬱血性心不全、冠動脈疾患、遺伝性出血性毛細血管拡張症、虚血性心疾患、血管内膜肥厚、血管閉塞、動脈硬化性末梢血管疾患、門脈圧亢進症、リウマチ性心疾患、高血圧、血栓塞栓症、アテローム性動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、肺動脈高血圧、静脈移植片疾患、高血圧性心疾患、心臓弁膜症、川崎病、拡張型心筋症、肥大型心筋症、サルコイドーシス、全身性強皮症、大動脈炎症候群、無症候性心筋虚血、内頚動脈狭窄症、椎骨動脈狭窄症、透析心筋症、糖尿病性心筋症、肺動脈性肺高血圧、虚血性心筋症、冠動脈バイパス術後、経皮的冠動脈形成術後、急性心筋梗塞、亜急性心筋梗塞、陳旧性心筋梗塞、労作性狭心症、不安定狭心症、急性冠症候群、冠攣縮性狭心症、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全、僧房弁閉鎖不全及び僧房弁狭窄症からなる群から選択される、［２］に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。
［４］  前記血管新生障害が、狭心症、心筋梗塞、心筋症、鬱血性心不全、冠動脈疾患、虚血性心疾患、リウマチ性心疾患、心臓血管形成術後の再狭窄、高血圧性心疾患、心臓弁膜症、川崎病、拡張型心筋症、肥大型心筋症、全身性強皮症、大動脈炎症候群、無症候性心筋虚血、内頚動脈狭窄症、椎骨動脈狭窄症、透析心筋症、糖尿病性心筋症、肺動脈性肺高血圧、虚血性心筋症、冠動脈バイパス術後、経皮的冠動脈形成術後、急性心筋梗塞、亜急性心筋梗塞、陳旧性心筋梗塞、労作性狭心症、不安定狭心症、急性冠症候群、冠攣縮性狭心症、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全、僧房弁閉鎖不全及び僧房弁狭窄症からなる群から選択される、［２］に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。
［５］  前記生体組織が、ＬＹＰＤ１を発現する生体組織である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。
［６］  前記ＬＹＰＤ１阻害剤が、ＬＹＰＤ１の選択的阻害剤である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。
［７］  前記ＬＹＰＤ１の選択的阻害剤が、有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメント及びそれらの組合せからなる群から選択される、［６］に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。
［８］  前記ＬＹＰＤ１阻害剤が、ＬＹＰＤ１発現の阻害剤及び／又はＬＹＰＤ１発現の阻害剤で処理された細胞である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。
［９］  前記細胞が、細胞懸濁液又は細胞シートの形態で提供される、［８］に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。
［１０］  前記ＬＹＰＤ１発現の阻害剤が、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子、ＲＮＡｉ誘導性核酸、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ゲノム編集核酸及びそれらの発現ベクター、有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメント、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、［８］又は［９］に記載のＬＹＰＤ１阻害剤。【００１１】
［１１］  ［１］〜［１０］のいずれか１項に記載のＬＹＰＤ１阻害剤を有効成分として含む、血管新生障害を治療及び／又は予防するための医薬組成物。
［１２］  血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、アンギオポエチン、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、それらのファミリータンパク質及びそれらの組合せからなる群から選択される１以上の血管新生誘導因子をさらに含む、［１１］に記載の医薬組成物。【００１２】
［１３］  血管内皮ネットワークの形成が促進された生体組織を製造する方法であって、
以下の工程：
（ａ１）ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞と、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とを含む細胞群を提供する工程；
（ａ２）前記工程（ａ１）により得られた細胞群を、ＬＹＰＤ１阻害剤で処理する工程；並びに
（ａ３）前記工程（ａ２）により得られた細胞群を、培養する工程、
或いは、
（ｂ１）ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞を含む細胞群を、ＬＹＰＤ１阻害剤で処理する工程；
（ｂ２）前記工程（ｂ１）により得られた細胞群に、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞を接触させる工程；並びに
（ｂ３）前記工程（ｂ２）により得られた細胞群を、培養する工程、
を含む、方法。
［１４］  前記第１の細胞が、心臓、筋肉、腎臓及び／又は脳由来の細胞である、［１３］に記載の方法。
［１５］  前記ＬＹＰＤ１阻害剤が、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子、ＲＮＡｉ誘導性核酸、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ゲノム編集核酸、それらの発現ベクター、それらの発現ベクターが導入された細胞、前記第１の細胞のＬＹＰＤ１発現量よりもＬＹＰＤ１発現量が低い若しくは発現していない第２の細胞、有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメント及びそれらの組合せからなる群から選択される、［１３］又は［１４］に記載の方法。
［１６］  前記第２の細胞が、皮膚、食道、肺、及び／又は肝臓由来の細胞である、［１５］に記載の方法。【００１３】
［１７］  血管新生障害を治療及び／又は予防するための医薬品組成物を製造するための、［１］〜［１０］のいずれか１項に記載のＬＹＰＤ１阻害剤の使用。【００１４】
［１８］  ＬＹＰＤ１阻害剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ｉ−１）ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞と、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とを含む細胞群を提供する工程；
（ｉ−２）前記工程（ｉ−１）により得られた細胞群を、候補物質で処理する工程；
（ｉ−３）前記工程（ｉ−２）により得られた細胞群を培養する工程；並びに
（ｉ−４）前記工程（ｉ−３）により得られた細胞群における血管内皮ネットワークの形成を評価する工程、
或いは、
（ｉｉ−１）ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞を含む細胞群を、候補物質で処理する工程；
（ｉｉ−２）前記工程（ｉｉ−１）により得られた細胞群に、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞を接触させる工程； 
（ｉｉ−３）前記工程（ｉｉ−２）により得られた細胞群を培養する工程；並びに
（ｉｉ−４）前記工程（ｉｉ−３）により得られた細胞群における血管内皮ネットワークの形成を評価する工程、
を含む、方法。
［１９］  前記第１の細胞が、心臓、筋肉、腎臓及び／又は脳由来の細胞、或いは、ＬＹＰＤ１を発現するベクターが導入された細胞である、［１８］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、生体組織において、血管内皮ネットワークの形成を促進することが可能となる。特に、本発明によれば、ＬＹＰＤ１が高発現し、血管新生障害を有する生体組織において、血管新生を促進することが可能となる。また、本発明によれば、血管新生障害を有する被験体において、血管内皮ネットワークの構築を促進することが可能となる。さらにまた、本発明によれば、血管内皮ネットワークの形成が促進された生体組織を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、心臓線維芽細胞が血管内皮ネットワーク形成を阻害することを示す図である。（Ａ）本実施例の手順を示す図である。（Ｂ）ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）又は心臓線維芽細胞（心房はＮＨＣＦ−ａ、心室はＮＨＣＦ−ｖ）とヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とを共培養後、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した図を示す。緑はＣＤ３１陽性細胞を示す。（Ｃ）（Ｂ）で示された血管内皮ネットワークの全長を示すグラフである。（Ｄ）（Ｂ）で示された血管内皮ネットワークの分岐点数を示すグラフである。
【図２】図２は、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）又はヒト心臓線維芽細胞（心房はＮＨＣＦ−ａ、心室はＮＨＣＦ−ｖ）と、ｉＰＳ細胞由来血管内皮細胞（ｉＰＳ−ＣＤ３１＋）又はヒト心臓由来微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｃ）とを共培養後の、血管内皮ネットワークを示す図である。
【図３】図３は、マウス心臓線維芽細胞が血管内皮ネットワーク形成を阻害することを示す図である。（Ａ）本実施例の手順を示す図である。（Ｂ）マウス皮膚線維芽細胞（ＤＦ）又はマウス心臓線維芽細胞（ＣＦ）と、マウスＥＳ細胞由来心筋細胞、マウスＥＳ細胞由来血管内皮細胞とを共培養後の心筋細胞（緑）及びＣＤ３１陽性細胞（赤）を示す図である。
【図４】図４は、ラット心臓線維芽細胞が血管内皮ネットワーク形成を阻害することを示す図である。（Ａ）本実施例の手順を示す図である。（Ｂ）新生仔ラット皮膚線維芽細胞（ＲＤＦ）又は心臓線維芽細胞（ＲＣＦ）と、ラット新生仔心臓由来血管内皮細胞とを共培養後の血管内皮ネットワークを示す図である。ＣＤ３１陽性細胞（緑）及び核（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青））を表す。（Ｃ）（Ｂ）で示された血管内皮ネットワークの全長を示すグラフである。（Ｄ）（Ｂ）で示された血管内皮ネットワークの分岐点数を示すグラフである。
【図５】図５は、皮膚線維芽細胞と心臓線維芽細胞の遺伝子発現を比較した図である。（Ａ）糖タンパク質関連遺伝子についてのヒートマップを示す。（Ｂ）血管新生に関連する遺伝子についてのヒートマップを示す。
【図６】図６は、ＬＹＰＤ１が発現する部位を示す図である。（Ａ）ラット由来の各臓器におけるＬＹＰＤ１の相対的発現量をｑＰＣＲにより評価したグラフである。（Ｂ）ラット心臓組織の免疫染色画像を示す図である（ｃＴｎＴ：心筋トロポニンＴ（緑）、ＬＹＰＤ１（赤）、ＤＡＰＩ：核（青）、Ｍｅｒｇｅｄ：マージ）。
【図７】図７は、ヒト及びラットの初代培養細胞におけるＬＹＰＤ１遺伝子発現を比較した図である。（Ａ）ヒト初代皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）及びヒト初代心臓線維芽細胞（心房：ＮＨＣＦ−ａ、心室：ＮＨＣＦ−ｖ）のＬＹＰＤ１の相対的発現量をｑＰＣＲにより評価したグラフである。（Ｂ）ラット初代皮膚線維芽細胞及びラット初代心臓線維芽細胞のＬＹＰＤ１の相対的発現量をｑＰＣＲにより評価したグラフである。
【図８】図８は、血管ネットワーク形成がＬＹＰＤ１の阻害（ｓｉＲＮＡ）により回復することを示す図である。（Ａ）本実施例の手順を示す図である。（Ｂ）ヒト心臓線維芽細胞にＬＹＰＤ１に対するｓｉＲＮＡを導入した後にＨＵＶＥＣと共培養後、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した図を示す。緑はＣＤ３１陽性細胞を示す。（Ｃ）ヒト心臓線維芽細胞にコントロールｓｉＲＮＡを導入した後にＨＵＶＥＣと共培養後、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した図を示す。緑はＣＤ３１陽性細胞を示す。（Ｄ）（Ｂ）及び（Ｃ）で示された血管内皮ネットワークの全長を示すグラフである。
【図９】図９は、血管ネットワーク形成がＬＹＰＤ１の阻害（抗ＬＹＰＤ１抗体）により回復することを示す図である。（Ａ）ヒト心臓線維芽細胞とＨＵＶＥＣとを抗ＬＹＰＤ１抗体存在下で共培養後、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した図を示す。緑はＣＤ３１陽性細胞を示す。（Ｂ）ヒト心臓線維芽細胞とＨＵＶＥＣとをコントロールＩｇＧ存在下にて共培養後、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した図を示す。緑はＣＤ３１陽性細胞を示す。（Ｃ）（Ａ）及び（Ｂ）で示された血管内皮ネットワークの全長を示すグラフである。（Ｄ）（Ａ）及び（Ｂ）で示された血管内皮ネットワークの分岐点数を示すグラフである。
【図１０】図１０は、血管ネットワーク形成がＬＹＰＤ１の阻害（抗ＬＹＰＤ１抗体）により回復することを示す図である。（Ａ）ラット新生仔心臓線維芽細胞とラット新生仔心臓由来血管内皮細胞とを抗ＬＹＰＤ１抗体存在下で共培養後、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した図を示す。緑はＣＤ３１陽性細胞を示す。（Ｂ）ラット新生仔心臓線維芽細胞とラット新生仔心臓由来血管内皮細胞とをコントロールＩｇＧ存在下にて共培養後、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した図を示す。緑はＣＤ３１陽性細胞を示す。（Ｃ）（Ａ）及び（Ｂ）で示された血管内皮ネットワークの全長を示すグラフである。（Ｄ）（Ａ）及び（Ｂ）で示された血管内皮ネットワークの分岐点数を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ヒト皮膚芽細胞（ＮＨＤＦ）及びヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）、ｉＰＳ由来間質細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）における遺伝子発現をマイクロアレイで解析した結果を示した図である。クラスター解析を右に示す。
【図１２】図１２は、ヒトｉＰＳ由来間質細胞（ｉＰＳ  ｆｉｂｒｏ−ｌｉｋｅ）がヒトｉＰＳ  ＣＤ３１陽性細胞（ｉＰＳ  ＣＤ３１＋）由来の血管内皮ネットワーク形成を阻害することを示す図である。（Ａ）本実施例の手順を示す図である。（Ｂ）ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）又はヒトｉＰＳ由来間質細胞を、ヒトｉＰＳ  ＣＤ３１陽性細胞と共培養後、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した図を示す。赤は、ＣＤ３１陽性細胞を示す。（Ｃ）ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦａ）及びヒトｉＰＳ由来間質細胞（ｉＰＳ  ｆｉｂｒｏ−ｌｉｋｅ）におけるＬＹＤＰ１の発現をｑＰＣＲで評価したグラフを示す。
【図１３】図１３は、リコンビナントＬＹＰＤ１が、血管内皮ネットワーク形成を阻害することを示す図である。（Ａ）抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ抗体磁気ビーズを用いて精製したＦＬＡＧ−ＬＹＰＤ１タンパク質をドデシル硫酸−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び免疫ブロッティングに供し、ペルオキシダーゼ結合抗−ＤＹＫＤＤＤＤＫタグモノクローナル抗体（上段）及びウサギポリクローナル抗−ＬＹＰＤ１抗体（下段）で検出した。（Ｂ）リコンビナントＬＹＰＤ１タンパク質で処理した後の血管内皮ネットワーク（チューブ）形成の様子を示す。ＣＤ３１（緑）及び核（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青））を染色した。スケールバーは４００μｍを表す。（Ｃ）リコンビナントＬＹＰＤ１タンパク質で処理した後の血管内皮ネットワーク（チューブ）の長さの合計を示す。ＣＤ３１陽性細胞が形成するチューブの長さを合計して算出した。値は、３回の独立した実験から、平均値±標準偏差を算出した。Ｐ＜０．０５。
【図１４】図１４は、血管内皮ネットワーク形成回復が、ＬＹＰＤ１の抑制を介していることを示す図である。（Ａ）コントロールｓｉＲＮＡ又はＬＹＰＤ１  ｓｉＲＮＡを遺伝子導入したヒト心臓線維芽細胞（２．４×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とＨＵＶＥＣ（２×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とを共培養し、３日間培養後に固定後、ＣＤ３１抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。ｒＬＹＰＤ１は、１．５ｕｇ／ｍＬ濃度で添加した。−ｒＬＹＰＤ１では、等量の緩衝液（組成：５００ｕｇ／ｍｌ  ＤＹＫＤＤＤＤＫペプチド、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を添加した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｕｌｔｒａ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅ）を用いて取得した画像を示す。青：Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（核）、緑：ＣＤ３１。（Ｂ）（Ａ）で取得した画像をＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗｅａｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を用いてＣＤ３１陽性細胞の長さを測定し、合計の長さをグラフとして示した。
【図１５】図１５は、マトリゲル（登録商標）上におけるＨＵＶＥＣの管腔形成に対するｒＬＹＰＤ１の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
１−１．ＬＹＰＤ１タンパク質
本明細書において、用語「ＬＹＰＤ１」は、当該技術分野において一般的に使用される意味と同義のものとして使用され、ＬＹ６／ＰＬＡＵＲ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １、ＰＨＴＳ、ＬＹＰＤＣ１とも称されるタンパク質をいう（以下、「ＬＹＰＤ１」という）。ＬＹＰＤ１は、哺乳動物において広く保存されているタンパク質であり、例えば、ヒト、サル、イヌ、ウシ、マウス、ラット等においても見出されている。天然のヒトＬＹＰＤ１のｍＲＮＡ及びアミノ酸の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースにおいて、受入番号ＮＭ＿００１０７７４２７（配列番号１）及びＮＰ＿００１０７０８９５（配列番号２）、ＮＭ＿１４４５８６（配列番号３）、及びＮＰ＿６５３１８７（配列番号４）、ＮＭ＿００１３２１２３４（配列番号５）及びＮＰ＿００１３０８１６３（配列番号６）、並びにＮＭ＿００１３２１２３５（配列番号７）及びＮＰ＿００１３０８１６４（配列番号８）として提供される。また、天然のマウスＬＹＰＤ１のｍＲＮＡ及びアミノ酸の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースにおいて、受入番号ＮＭ＿１４５１００（配列番号９）及びＮＰ＿６５９５６８（配列番号１０）、ＮＭ＿００１３１１０８９（配列番号１１）及びＮＰ＿００１２９８０１８（配列番号１２）、並びに、ＮＭ＿００１３１１０９０（配列番号１３）及びＮＰ＿００１２９８０１９（配列番号１４）として提供されている。
【００１８】
本明細書において、用語「ＬＹＰＤ１」は、天然に存在するＬＹＰＤ１並びにその変異体及びその修飾体が含まれてもよい。この用語はまた、少なくとも１種のＬＹＰＤ１活性を保持したＬＹＰＤ１のドメインが、例えば、他のポリペプチドと融合した融合タンパク質を意味するものであってもよい。ＬＹＰＤ１はいかなる生物由来であってもよいが、好ましくは、哺乳動物由来（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、ヤギ、ヒツジ等）、より好ましくは、ヒト及びヒト以外の霊長類由来、特に好ましくはヒトのＬＹＰＤ１である。
【００１９】
ＬＹＰＤ１は、脳において高発現しているタンパク質として知られているが、その機能についてはほとんど知られていない。ＬＹＰＤ１のアミノ酸モチーフから、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型のタンパク質であると考えられている。
【００２０】
発明者らは、組織工学的に三次元生体組織を構築する研究を行う過程において、マウス、ラット及びヒトのいずれの哺乳動物由来の心臓線維芽細胞と血管内皮細胞を共培養した場合、血管内皮細胞のネットワーク形成を著しく抑制する現象を見出した。その原因について詳細に調べた結果、ＬＹＰＤ１を阻害することにより、血管網の形成不全が改善されることを見出した。本発明は、当該知見を基にして完成したものである。
【００２１】
１−２．血管内皮ネットワーク
本明細書において、用語「血管内皮ネットワーク」とは、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞が生体組織において構築する毛細血管様のネットワークである。血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞の細胞表面マーカーとしてはＣＤ３１タンパク質が知られており、任意の方法によってＣＤ３１タンパク質を検出することで、生体組織における血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞の存在を検出することができる。血管内皮ネットワークは、管腔構造を構築し、流体、特に血液が通る血管網となる。生体組織が生存するためには、栄養や酸素が含まれる血液をその隅々まで行き渡らせる必要があり、そのためには密度の高い血管網を構築する必要がある。生体組織では、血管内皮ネットワークの網目構造の密度が高い程、血液等を当該組織内に運搬する能力が高く好ましい。本発明のＬＹＰＤ１阻害剤が、血管内皮ネットワークの形成が促進されているか否かについては、上述のように構築された血管内皮ネットワークの長さ及び／又は分岐点を評価することに判断することができる。血管内皮ネットワークの長さとは、単位面積あたりの血管内皮ネットワークを総合した長さをいい、血管内皮ネットワークの分岐点とは、単位面積あたりに存在する血管内皮ネットワーク同士が繋がった部位の総数をいう。すなわち、上記のＬＹＰＤ１阻害剤のスクリーニングにおいて、ＬＹＰＤ１阻害剤を用いない場合（又はネガティブコントロールとしての化合物）と比較して、血管内皮ネットワークの長さ及び／又は分岐点が高い程、血管内皮ネットワークの形成を促進する能力が高いＬＹＰＤ１阻害剤と評価することができる。血管内皮ネットワークの長さ及び／又は分岐点は、共焦点蛍光顕微鏡等により取得した画像を、例えば、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて、ＣＤ３１陽性領域を血管内皮細胞として、血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出することができる。
【００２２】
１−３．生体組織
本明細書において、用語「生体組織」とは、哺乳動物を構成する任意の部分をいい、一般に２以上の細胞が集合して構成されている組織をいう。本発明において、「生体組織」は、被験体の任意の部分であってもよく、被験体から採取された生体組織であってもよく、生体外（エクスビボ）若しくは生体内（インビボ）において組織工学的に作製された生体組織であってもよい。本明細書において、用語「被験体」は、哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、齧歯類（ラット、マウスなど）、ネコ、イヌ及び霊長類などを意味する。好ましくは、本発明による被験体は、ヒトである。本発明において、生体組織は、好ましくは血管内皮細胞及び／又は血管内皮細胞が含まれる。
【００２３】
生体外（エクスビボ）又は生体内インビボにおいて、組織工学的に生体組織を作製する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、血管床上において細胞シートを積層して生体組織を構築する方法（国際公開第２０１２／０３６２２４号及び国際公開第２０１２／０３６２２５号を参照）、三次元プリンター技術を用いて生体組織を構築する方法（国際公開第２０１２／０５８２７８号を参照）、接着膜で被覆された細胞を用いて三次元構造体を作製する方法（特開第２０１２−１１５２５４号公報を参照）、生体内において臓器を構築する方法（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｔ．，Ｎａｋａｕｃｈｉ  Ｈ．［Ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｏｒｇａｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｒｇａｎｓ  ｆｒｏｍ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ］．Ｎｉｈｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ．２０１１  Ｄｅｃ；６９（１２）：２１４８−５５；国際公開第２０１０／０２１３９０号;国際公開第２０１０／０９７４５９号を参照）の他、公知の製造方法により得られる生体組織も、本発明に適用することが可能であり、本発明の範囲に含まれる。
【００２４】
生体外（エクスビボ）において、組織工学的に生体組織を作製する際に用いられる「細胞シート」とは、複数の任意の細胞を含む細胞群を細胞培養基材上で培養し、細胞培養基材上から剥離することで得られる１層又は複数層のシート状の細胞群をいう。細胞シートを得る方法としては、例えば、温度、ｐＨ、光等の刺激によって分子構造が変化する高分子を被覆した刺激応答性培養基材上で細胞を培養し、温度、ｐＨ、光等の刺激の条件を変えて刺激応答性培養基材表面を変化させることで、細胞同士の接着状態は維持しつつ、刺激応答性培養基材から細胞をシート状に剥離する方法や、任意の培養基材上で細胞培養し、物理的にピンセット等により剥離して得る方法等が挙げられる。細胞シートを得るための刺激応答性培養基材としては、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した温度応答性培養基材が知られている。温度応答性培養基材上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで細胞をシート状に剥離して回収することができる。
【００２５】
細胞シートを得るために用いられる温度応答性培養基材は、細胞が培養可能な温度域でその表面の水和力を変化させる基材であることが好ましい。その温度域は、一般に細胞を培養する温度、例えば３３℃〜４０℃であることが好ましい。細胞シートを得るために用いられる培養基材に被覆される温度応答性高分子は、ホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。
【００２６】
刺激応答性高分子、特に温度応答性高分子としてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を用いた場合を例（温度応答性培養皿）に説明する。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集して白濁する。逆に３１℃未満の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明では、このポリマーがシャーレなどの基材表面に被覆されて固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、培養基材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が培養基材表面に固定されているため、培養基材表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃未満の温度では、培養基材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が培養基材表面に被覆されているため、培養基材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着し、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できない表面となる。そのため、該基材を３１℃未満に冷却すると、細胞が基材表面から剥離する。細胞が培養面一面にコンフルエントになるまで培養されていれば、該基材を３１℃未満に冷却することによって細胞シートを回収できる。温度応答性培養基材は、同一の効果を有するものであれば限定されるものではないが、例えば、セルシード社（東京、日本）が市販するＵｐＣｅｌｌ（登録商標）などを使用することができる。
【００２７】
本発明で用いられる生体組織は、複数枚の細胞シートを積層した細胞シート（積層化細胞シート）であってもよい。積層化細胞シートを作製する方法としては、ピペット等によって培養液中に浮かんでいる細胞シートを培養液ごと吸い取り、別の培養皿の細胞シート上に放出して液流によって積層する方法や、細胞移動治具を用いて積層する方法等が挙げられる。その他、公知の方法によって積層化細胞シートを含む生体組織が得られる。
【００２８】
２．ＬＹＰＤ１阻害剤
本明細書において、用語「ＬＹＰＤ１阻害剤」は、広義に理解される用語であり、直接的及び／又は間接的にＬＹＰＤ１の活性を阻害する、又は有意に抑制する生物学的効果を示す、天然の、又は合成された化合物或いは細胞（例えば、細胞懸濁液又は細胞シートの形態で提供される細胞）を意味する。例えば、ＬＹＰＤ１阻害剤は、以下に説明するＬＹＰＤ１の選択的阻害剤及びＬＹＰＤ１発現の阻害剤を含む。特に、本発明において、ＬＹＰＤ１阻害剤は、血管内皮ネットワークの形成が阻害されていた生体組織で発現しているＬＹＰＤ１に直接的及び／又は間接的に作用し、血管内皮ネットワークの形成を促進する物質である。一実施態様において、本発明のＬＹＰＤ１阻害剤は、その医薬的に許容される塩であってもよい。本明細書において「医薬的な」又は「医薬的に許容される」とは、哺乳動物、特にヒトに適切に投与されたとき、副作用、アレルギー作用又はその他の有害作用を生じない分子及び組成物を意味する。医薬的に許容される担体又は賦形剤とは、非毒性の固形、半固形又は液体の注入剤、希釈剤、カプセル化物質又は任意の種類の製剤補助物を意味する。また、ＬＹＰＤ１阻害剤は、ＬＹＰＤ１が低発現の細胞、例えば、心臓由来の線維芽細胞よりもＬＹＰＤ１が低発現の細胞（例えば、食道、精巣、皮膚、腎臓、肺、肝臓、筋肉由来の細胞、好ましくは、食道、精巣、皮膚、肺、肝臓由来の細胞、さらに好ましくは、食道、精巣、皮膚、肺、肝臓由来の線維芽細胞、最も好ましくは皮膚由来の線維芽細胞）を含んでもよい。
【００２９】
本明細書において、「ＬＹＰＤ１の選択的阻害剤」という用語は、ＬＹＰＤ１以外のＬＹＰＤタンパク質（例えば、ＬＹＰＤ２、ＬＹＰＤ３、ＬＹＰＤ４、ＬＹＰＤ５、ＬＹＰＤ６）と比較して、ＬＹＰＤ１を選択的に阻害する阻害剤を意味する。「選択的」とは、阻害剤のＬＹＰＤ１に対するＫｉがその他のタンパク質に対するＫｉ値の１／５倍、好ましくは１／１０倍、より好ましくは１／２５倍、さらに好ましくは１／１００倍以下であることを意味する。ＬＹＰＤ１の阻害剤のＫｉ値は、当技術分野で周知の種々の方法を使用して測定することができる。ＬＹＰＤ１の選択的阻害剤とは、例えば、有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメント及びそれらの組合せであってもよい。
【００３０】
２−１．有機低分子
本明細書において、用語「有機低分子」は、医薬品で一般的に使用される有機分子と同程度の大きさの分子のことである。本発明において用いることができるＬＹＰＤ１阻害剤としての有機低分子の大きさは、好ましくは、約５０００Ｄａ以下、より好ましくは約２０００Ｄａ以下、最も好ましくは約１０００Ｄａ以下の範囲である。本発明において、ＬＹＰＤ１阻害剤としての有機低分子とは、ＬＹＰＤ１に直接的及び／又は間接的に作用し、生体組織における血管内皮ネットワークの形成を促進するものをいい、後述のスクリーニング方法によって選択することが可能である。
【００３１】
２−２．アプタマー
本明細書において、用語「アプタマー」は、特異的に標的物質に結合する能力を持つ合成ＤＮＡ又はＲＮＡ分子及びペプチド性分子をいい、試験管内において化学的に短時間で合成することができる。本発明に用いられるアプタマーは、ＬＹＰＤ１に結合し、ＬＹＰＤ１の活性を阻害し得るものである。本発明に用いられるアプタマーは、例えば、ＳＥＬＥＸ法を用い、小分子、タンパク質、核酸など各種の分子標的への結合を、インビトロで反復して選択することにより得ることができる（Ｔｕｅｒｋ  Ｃ．，Ｇｏｌｄ  Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４９（４９６８），５０５−５１０；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ＡＤ，Ｓｚｏｓｔａｋ  ＪＷ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４６（６２８７）：８１８−８２２；米国特許第６，８６７，２８９号明細書；米国特許第５，５６７，５８８号明細書；米国特許第６，６９９，８４３号明細書を参照）。本発明において、ＬＹＰＤ１阻害剤としてのアプタマーは、ＬＹＰＤ１に直接的及び／又は間接的に作用し、生体組織における血管内皮ネットワークの形成を促進するものであってもよく、後述のスクリーニング方法によって選択することが可能である。
【００３２】
本発明に用いることができる核酸アプタマーは、血流中ではヌクレアーゼにより速やかに分解及び除去されるため、必要に応じてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖などによる分子修飾を行って半減期を延ばしておくことが好ましい。
【００３３】
２−３．抗体、抗体フラグメント
本発明に用いることができるＬＹＰＤ１阻害剤は、ＬＹＰＤ１に結合し、ＬＹＰＤ１活性を部分的に、又は完全に阻害できる抗体若しくは抗体フラグメントであってもよい。本発明において用いることができるＬＹＰＤ１に対する抗体又は抗体フラグメントは、ＬＹＰＤ１に結合し、ＬＹＰＤ１活性を阻害するものであれば、ヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、ウサギ由来抗体又はヤギ由来抗体のいずれの抗体でもよく、さらにそれらのポリクローナル若しくはモノクローナル抗体、完全型若しくは短縮型（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦｖフラグメント）抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト型抗体のいずれのものでもよい。本明細書において、抗体フラグメントとは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ抗体フラグメントであり、プロテアーゼ酵素により処理し、場合により還元して得ることができる。
【００３４】
本発明に用いることができる抗体又は抗体フラグメントは、ＬＹＰＤ１タンパク質又はその一部を抗原として、公知の抗体又は抗血清の製造法に従って製造することができる。ＬＹＰＤ１タンパク質又はその一部は、公知のタンパク質発現法及び精製法によって調製することができる。また、本発明に用いることができる抗体又は抗体フラグメントは、ファージ・ディスプレー法（例えば、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ，１９９８年，第４４１巻，ｐ．２０−２４を参照）を介して作製することもできる。この方法は、環状一本鎖ＤＮＡにヒト抗体遺伝子を組み込んだファージを利用して、ファージを構成する外殻タンパク質と融合した形で、ヒト型抗体をファージの表面に発現される。
【００３５】
本発明において、ＬＹＰＤ１阻害剤としての抗体又は抗体フラグメントは、ＬＹＰＤ１に直接的及び／又は間接的に作用し、生体組織における血管内皮ネットワークの形成を促進するものであってもよく、後述のスクリーニング方法によって選択することが可能である。
【００３６】
３．ＬＹＰＤ１発現の阻害剤
本発明において用いられる「発現の阻害剤」とは、直接的及び／又は間接的に遺伝子の発現を阻害する、又は有意に抑制する生物学的効果を示す天然の、又は合成された化合物を意味する。従って、「ＬＹＰＤ１発現の阻害剤」とは、直接的及び／又は間接的にＬＹＰＤ１遺伝子をコードする遺伝子の発現を阻害する、又は有意に抑制する生物学的効果を有する天然の、又は合成された化合物を意味する。また、本発明のＬＹＰＤ１阻害剤は、ＬＹＰＤ１発現の阻害剤により処理され、ＬＹＰＤ１発現が阻害された細胞であってもよい。
【００３７】
ＬＹＰＤ１発現の阻害剤としては、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子、ＲＮＡｉ誘導性核酸（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ゲノム編集核酸及びそれらの発現ベクター、並びにそれらの組合せを適用することができる。また、ＬＹＰＤ１発現の阻害剤は、直接的及び／又は間接的にＬＹＰＤ１遺伝子の発現を阻害する、又は有意に抑制する生物学的効果を示す有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメント並びにそれらの組合せを適用することもできる。さらに、ＬＹＰＤ１阻害剤は、上記のＬＹＰＤ１発現の阻害剤により処理された細胞であってもよい。
【００３８】
３−１．アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子
本発明にアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子とは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）など、ある機能を持つＲＮＡ（センスＲＮＡ）と相補的な塩基配列を持ち、センスＲＮＡと２本鎖を形成することで、そのセンスＲＮＡが担うべきタンパク質の合成を阻害する機能を有する分子である。本発明において、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＹＰＤ１のｍＲＮＡに結合することによってタンパク質に翻訳されることを阻害する。それにより、ＬＹＰＤ１の発現量を低減させ、ＬＹＰＤ１の活性を阻害することができる。アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子を合成する方法は、当該技術分野で周知であり、本発明に用いることができる。
【００３９】
３−２．ＲＮＡｉ誘導性核酸
本発明で用いることができるＲＮＡｉ誘導性核酸は、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、通常、１９〜３０ヌクレオチド、好ましくは１９〜２５ヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３ヌクレオチドを含むＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡのキメラ分子であってよく、任意の修飾が施されていてもよい。ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡに対して生じてもよいし、プロセッシング前の転写直後のＲＮＡ、すなわちエキソン、イントロン、３’非翻訳領域、及び５’非翻訳領域を含むヌクレオチド配列のＲＮＡであってもよい。本発明で使用可能なＲＮＡｉ法は、（１）短い二重鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞内に直接導入するか、（２）低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を各種発現ベクターに組み込み、そのベクターを細胞内に導入するか、或いは（３）対立方向に並ぶ２個のプロモーターを持つベクターに、ｓｉＲＮＡに対応する短い二重鎖ＤＮＡをプロモーター間に挿入してｓｉＲＮＡを発現させるベクターを作製し、細胞内に導入する、などの手法によりＲＮＡｉを誘導させてもよい。ＲＮＡｉ誘導性核酸は、ＬＹＰＤ１のＲＮＡの切断又はその機能抑制を可能にするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを含んでもよく、これらのＲＮＡｉ核酸は、リポソームなどを用いて直接導入されてもよいし、これらのＲＮＡｉ核酸を誘導する発現ベクターを用いて導入されてもよい。
【００４０】
本発明で用いられるＬＹＰＤ１に対するＲＮＡｉ誘導性核酸は、ＲＮＡｉ誘導性核酸の標的となるＬＹＰＤ１配列に基づいて、周知の化学合成技術を用いて合成することができる。例えば、固相ホスホアミダイト法などのＤＮＡ合成技術を利用したＤＮＡ（／ＲＮＡ）自動合成装置を使用して化学的に合成するか、或いは、ｓｉＲＮＡ関連の受託合成会社（例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社など）に委託して合成することも可能である。本発明の実施形態によれば、本発明に用いられるｓｉＲＮＡは、その前駆体であるｓｈｏｒｔ−ｈａｉｒｐｉｎ型二本鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から、細胞内ＲＮａｓｅであるダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によるプロセシングを介して誘導されてもよい。本発明において、使用されるＲＮＡｉ誘導性核酸は、配列番号１５又はその相補配列（配列番号１６）に由来の連続する１９〜３０ヌクレオチド、好ましくは１９〜２５ヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３ヌクレオチドを含むＲＮＡである。このようなＲＮＡは、５’又は３’末端に１又は数個、例えば２個の付加配列（例えば、ｔｔ、ｕｕ、ｔｇなど）が追加されてもよく、それにより細胞内で分解を妨げ、安定性を高めることができる。本発明で用いられるＬＹＰＤ１に対するＲＮＡｉ誘導性核酸は、ＬＹＰＤ１の発現を阻害する、又は有意に抑制する生物学的効果を示す核酸であればよく、当業者であれば、ＬＹＰＤ１の塩基配列を参考に合成することが可能である。例えば、以下の配列を含むＬＹＰＤ１のｓｉＲＮＡとして使用することができるが、以下のものに限定されることを意図するものではなく、下記の配列に相補する配列を用いてもよい：
５’−ＧＧＣＵＵＵＧＣＧＣＵＧＣＡＡＡＵＣＣ−３’（配列番号１５）
５’−ＧＧＡＵＵＵＧＣＡＧＣＧＣＡＡＡＧＣＣ−３’（配列番号１６）
【００４１】
３−３．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は２１〜２５塩基長の１本鎖ＲＮＡ分子であり、真核生物において遺伝子の転写後発現調節に関与する。ｍｉＲＮＡは、一般にｍＲＮＡの３’ＵＴＲを認識して、標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制し、タンパク質産生を抑制する。従って、ＬＹＰＤ１の発現量を直接的及び／又は間接的に低減させることができるｍｉＲＮＡも、本発明の範囲に含まれる。
【００４２】
３−４．リボザイム
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子の総称である。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ  Ｐに含まれるＭ１  ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（例えば、小泉誠及び大塚栄子、タンパク質核酸酵素、１９９０、３５、２１９１を参照）。
【００４３】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５又はＵ１５でも切断され得ることが示されている（例えば、Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９８８，２２８，２２８．を参照）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵ又はＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを得ることが可能であり、当業者であれば、以下の文献を参考に製造可能である：Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９８８，２３９，２８５．；小泉誠及び大塚栄子，タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．；Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８９，１７，７０５９．。
【００４４】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明に用いることができる。このリボザイムは、例えば、タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ，ＪＭ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２３，３４９．）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（例えば、Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．＆Ｓａｓａｋｉ，Ｎ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１９９１，１９，６７５１．；菊池洋，化学と生物，１９９２，３０，１１２．を参照）。リボザイムを用いてＬＹＰＤ１をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、ＬＹＰＤ１遺伝子の発現を阻害することができる。従って、ＬＹＰＤ１を対象とするリボザイムも、本発明の範囲に含まれる。
【００４５】
３−５．ゲノム編集核酸
本発明の一実施形態において、ＬＹＰＤ１発現の阻害剤は、直接的及び／又は間接的にＬＹＰＤ１遺伝子の発現を阻害する、又は有意に抑制する生物学的効果を示すゲノム編集核酸を用いることができる。本明細書において、ゲノム編集核酸とは、遺伝子ターゲッティングに用いられるヌクレアーゼを利用したシステムにおいて、所望の遺伝子を編集するために用いられる核酸をいう。遺伝子ターゲッティングに用いられるヌクレアーゼは、公知のヌクレアーゼの他、今後遺伝子ターゲッティングのために使用される新たなヌクレアーゼも包含される。例えば、公知のヌクレアーゼとしては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，１５４，１３８０−１３８９）、ＴＡＬＥＮ（Ｍａｈｆｏｕｚ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１１，１０８，２６２３−２６２８）、ＺＦＮ（Ｕｒｎｏｖ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３５，６４６−６５１）等が挙げられる。
【００４６】
本発明の一実施態様に用いることができる、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムについて説明する。
【００４７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ＤＮＡの任意の部位に二本鎖切断を導入することを可能とする。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いるためには、少なくとも、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ配列）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ，Ｃａｓ９）の３つの要素を必要とする。
【００４８】
ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ）に隣接する標的部位に相補的な配列を形成するようにｇＲＮＡを設計し、所望の細胞にＣａｓタンパク質と共に導入する。導入されたｇＲＮＡとＣａｓタンパク質は複合体を形成する。ｇＲＮＡがゲノム上の標的配列に結合し、Ｃａｓタンパク質がそのヌクレアーゼ活性によって標的のゲノムＤＮＡの二重鎖を切断する。
【００４９】
その後、ヌクレアーゼによる二本鎖切断を受けた細胞では、相同組換え型修復（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｒｅｐａｉｒ（ＨＤＲ））、又は非相同性末端結合修復（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＨＥＪ））が生じる。当該細胞内に適切なＤＮＡ断片（例えば、ＨＤＲ修復用鋳型）が存在する場合には、相同組換えが生じ、任意のゲノムにおいて欠失、挿入、破壊などの改変を行うことができる。ＨＤＲ修復用鋳型が存在しない場合は、ＮＨＥＪの過程で数塩基の欠失又は追加が生じる場合がある。これにより、タンパク質をコードする領域においてフレームシフトが生じ、タンパク質の読み取り枠が崩壊したり、未成熟な終止コドンが導入され、結果として、所望のタンパク質をノックアウトすることが可能となる。
【００５０】
本発明の一実施態様において、ゲノム編集核酸は、ＬＹＰＤ１遺伝子をターゲティングするｇＲＮＡであってもよく、該ｇＲＮＡを発現するベクターであってもよい。他の実施態様において、ゲノム編集核酸は、さらに、遺伝子ターゲッティングに用いられるヌクレアーゼを発現する核酸を含んでもよい。ｇＲＮＡと遺伝子ターゲッティングに用いられるヌクレアーゼ（好ましくは、Ｃａｓタンパク質）は、同一のベクターにコードされたものであってもよく、別々にコードされたベクターを用いてもよい。他の実施態様において、ゲノム編集核酸は、さらに、ＨＤＲ修復用鋳型核酸を含んでも良い。ゲノム編集核酸は、プラスミドベクターであってもよく、ウイルスベクターであってもよい。ゲノム編集核酸によって、任意の細胞に導入する方法については、公知の方法を用いることができ、特に限定されない。
【００５１】
３−６．ＬＹＰＤ１発現の阻害剤としての有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメント
本発明の一実施形態において、ＬＹＰＤ１発現の阻害剤は、直接的及び／又は間接的にＬＹＰＤ１遺伝子の発現を阻害する、又は有意に抑制する生物学的効果を示す有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメント又はそれらの組合せとして提供される。そのような物質の例としては、例えば、ＮＦ−κＢの阻害剤を用いることができる。ＮＦ−κＢの阻害剤であるパルテノライド誘導体、特にジメチルアミノパルテノライド（ＤＭＡＰＴ）は、ＬＹＰＤ１の発現を抑制することが知られている（Ｂｕｒｎｅｔｔ  ＲＭ．，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ６：１２６８２−１２６９６（２０１５））。すなわち、一実施態様において、本発明のＬＹＰＤ１阻害剤は、以下のパルテノライド誘導体であってもよく、これに限定されない：１１βＨ，１３−ジメチルアミノパルテノライド（ＤＭＡＰＴ）；１１βＨ，１３−ジエチルアミノパルテノライド；１１βＨ，１３−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）パルテノライド；１１βＨ，１３−（ピロリジン−１−イル）パルテノライド；１１βＨ，１３−（ピペリジン−１−イル）パルテノライド；１１βＨ，１３−（モルホリン−１−イル）パルテノライド；１１βＨ，１３−（４−メチルピペリジン−１−イル）パルテノライド；１１βＨ，１３−（４−メチルピペラジン−１−イル）パルテノライド；１１βＨ，１３−（ホモピペリジン−１−イル）パルテノライド；１１βＨ，１３−（ヘプタメチレンイミン−１−イル）パルテノライド、１１βＨ，１３−（アゼチジン−１−イル）パルテノライド；１１βＨ，１３−ジアリルアミノパルテノライド；及びこれらの医薬的に許容される塩。本発明の一実施形態において用いることができるこれらのパルテノライド誘導体は、国際公開第２００５／００７１０３号を参照して得ることができ、本発明の範囲に含まれる。
【００５２】
３−７．ＬＹＰＤ１発現の阻害剤の発現ベクター
本発明の一実施態様において、ＬＹＰＤ１阻害剤としてのＬＹＰＤ１発現の阻害剤は、上述のアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子、ＲＮＡｉ誘導性核酸、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム又はゲノム編集核酸が任意のベクターにコードされた発現ベクターとして提供されてもよい。本発明において、ＬＹＰＤ１発現の阻害剤を発現させるために使用されるベクターは特に限定されず、公知のものを適宜選択可能である。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクターなどが挙げられる。ＬＹＰＤ１発現の阻害剤をベクターに導入する方法は、公知の遺伝子組換え技術を用いて導入することが可能であり、特に限定されない。
【００５３】
３−８．ＬＹＰＤ１発現の阻害剤で処理された細胞
本発明の一実施態様において、ＬＹＰＤ１阻害剤は、上述のアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子、ＲＮＡｉ誘導性核酸、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム又はゲノム編集核酸が、任意のベクターにコードされた発現ベクターによって処理された細胞であってもよい。また、本発明の一実施態様において、ＬＹＰＤ１阻害剤は、ＬＹＰＤ１発現の阻害剤の発現ベクターで細胞を処理した結果、ＬＹＰＤ１発現の阻害剤の発現ベクターが導入された細胞であってもよい。ＬＹＰＤ１発現の阻害剤の発現ベクターを細胞へ導入する方法についても公知の方法に従えばよく、特には限定されない。また、当該発現ベクターが導入されて、ＬＹＰＤ１発現の阻害剤を一時的又は持続的に発現する細胞を選択する方法も限定されず、例えば、発現ベクターにコードされている薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤（例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン等）を使用して選択すればよい。
【００５４】
また、本発明の一実施態様において、ＬＹＰＤ１阻害剤は、上述の有機低分子、アプタマー、抗体、抗体フラグメントによって処理された細胞であってもよい。
【００５５】
４．医薬組成物
本発明は、ＬＹＰＤ１阻害剤を有効成分として含む、血管新生障害を治療及び／又は予防するための医薬組成物であってもよい。
【００５６】
本発明において用いられるＬＹＰＤ１阻害剤又はＬＹＰＤ１阻害剤を有効成分として含む医薬組成物は、ＬＹＰＤ１を発現する生体組織、例えば、ＬＹＰＤ１を高発現する脳、心臓、腎臓又は筋肉の生体組織において、血管内皮ネットワークの形成を促進する。それにより、ＬＹＰＤ１阻害剤又はＬＹＰＤ１阻害剤を有効成分として含む医薬組成物は、血管内皮ネットワークの形成を促進し、血管新生障害を治療及び／又は予防することを可能とする。本発明のＬＹＰＤ１阻害剤又はＬＹＰＤ１阻害剤を有効成分として含む医薬組成物により、治療及び／又は予防することができる血管新生障害は、例えば、脳血管疾患、脳梗塞、一過性脳虚血発作、モヤモヤ病、狭心症、（末梢）動脈閉塞症、動脈硬化症、バージャー病、心筋梗塞、虚血、心筋症、鬱血性心不全、冠動脈疾患、遺伝性出血性毛細血管拡張症、虚血性心疾患、血管内膜肥厚、血管閉塞、動脈硬化性末梢血管疾患、門脈圧亢進症、リウマチ性心疾患、高血圧、血栓塞栓症、アテローム性動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、肺動脈高血圧、静脈移植片疾患、高血圧性心疾患、心臓弁膜症、川崎病、拡張型心筋症、肥大型心筋症、サルコイドーシス、全身性強皮症、大動脈炎症候群、無症候性心筋虚血、内頚動脈狭窄症、椎骨動脈狭窄症、透析心筋症、糖尿病性心筋症、肺動脈性肺高血圧、虚血性心筋症、冠動脈バイパス術後、経皮的冠動脈形成術後、急性心筋梗塞、亜急性心筋梗塞、陳旧性心筋梗塞、労作性狭心症、不安定狭心症、急性冠症候群、冠攣縮性狭心症、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全、僧房弁閉鎖不全及び僧房弁狭窄症、などが挙げられる。
【００５７】
一実施態様において、本発明の医薬組成物には、さらに、血管新生誘導因子を含んでいても良い。例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、アンギオポエチン、トランスフォーミング増殖因子-β（ＴＧＦ−β）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、又はそれらのファミリータンパク質等が挙げられる。これらの血管新生誘導因子は、上述の中から１つを選択しても良く、２以上の組み合わせであっても良い。
【００５８】
本発明のＬＹＰＤ１阻害剤又はＬＹＰＤ１阻害剤を有効成分として含む医薬組成物は、それを必要とする被験体に適用し、血管新生障害の治療及び／又は予防が可能となる。
【００５９】
ＬＹＰＤ１の選択的阻害剤は、以下に定義したように、医薬組成物の形態で投与することができる。
【００６０】
好ましくは、ＬＹＰＤ１阻害剤は被験体に治療有効量で投与される。「治療有効量」とは、血管新生障害を治療及び／又は予防する所望の効果を発揮するのに必要かつ十分なＬＹＰＤ１阻害剤の量を意味する。
【００６１】
本発明に含まれるＬＹＰＤ１阻害剤の一日の使用量は、医者による医学的判断の範囲で、決定される。治療有効用量は、治療及び／又は予防の対象となる障害及びその障害の重症度、使用する化合物の活性、使用する組成物、患者の年齢、体重、患者の健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路並びに使用する化合物の排泄率、治療期間、同時に使用される薬剤、及びその他医療分野で周知のファクターによって変化する。例えば、所望する治療効果を実現するために必要な量よりも低い量でＬＹＰＤ１阻害剤の投与を開始し、所望する効果が実現するまで投薬量を徐々に増加させることは当業者が実現可能な範囲である。ＬＹＰＤ１阻害剤の用量は、成人１日当たり０．０１〜１０００ｍｇの広い範囲で変化させることができる。好ましくは、ＬＹＰＤ１阻害剤を有効成分として含む医薬組成物は、治療する患者の症状に合わせて投薬するために、活性成分を０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００ｍｇを含有する。医薬組成物は、通常、活性成分を約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、好ましくは活性成分を１ｍｇ〜約１００ｍｇ含有する。薬物の有効量は通常、１日当たり０．０００２ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、特に１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜７ｍｇ／ｋｇ体重までの投薬量で供給される。
【００６２】
５．血管内皮ネットワークの形成が促進された生体組織を製造する方法
本発明のＬＹＰＤ１阻害剤を適用することにより、生体組織内に血管内皮ネットワークの形成が促進される。これにより、生体組織内に、機能的な血管網が構築され、厚みをもった三次元生体組織を得ることが可能となる。
【００６３】
一実施態様において、本発明は、血管内皮ネットワークの形成が促進された生体組織を製造する方法を提供する。該方法は、以下の工程：
（ａ１）ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞と、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とを含む細胞群を提供する工程；
（ａ２）前記工程（ａ１）により得られた細胞群を、ＬＹＰＤ１阻害剤で処理する工程；並びに
（ａ３）前記工程（ａ２）により得られた細胞群を、培養する工程、
或いは、
（ｂ１）ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞を含む細胞群を、ＬＹＰＤ１阻害剤で処理する工程；
（ｂ２）前記工程（ｂ１）により得られた細胞群に、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞を接触させる工程；並びに
（ｂ３）前記工程（ｂ２）により得られた細胞群を、培養する工程、
を含む、方法である。
【００６４】
ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞とは、例えば、ＬＹＰＤ１が発現することにより、血管内皮ネットワークの形成を阻害する活性を有する細胞であり、例えば、ＬＹＰＤ１を発現する生体組織由来、好ましくはＬＹＰＤ１を高発現する脳、心臓、腎臓又は筋肉の生体組織由来の細胞、特に好ましくは、脳、心臓、腎臓又は筋肉の生体組織に存在する間質細胞又は線維芽細胞である。ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞は、多能性幹細胞から誘導された細胞であってもよい。本発明において、多能性幹細胞とは、自己複製能と多分化能を有する細胞であり、体を構成するあらゆる細胞を形成する能力（ｐｌｕｒｉｏｐｏｔｅｎｔ）を備える細胞をいう。自己複製能とは、１つの細胞から自分と同じ未分化な細胞を２つ作る能力のことをいう。本発明で用いられる多能性幹細胞は、例えば、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、胚性癌腫細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ：ＥＣ細胞）、栄養芽幹細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＴＳ細胞）、エビブラスト幹細胞（ｅｐｉｂｌａｓｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥｐｉＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ｍＧＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）などが含まれる。これらの多能性幹細胞を分化誘導する方法としては、例えば、Ｍａｔｓｕｕｒａらの方法（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｅｌｌ  ｓｈｅｅｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１２  Ａｕｇ．２４；４２５（２）：３２１−３２７）に従って実施できる。
【００６５】
本発明に用いることができる血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞は、血管を構成する細胞であれば使用することが可能であり、例えば、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト心臓由来微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｃ）又は多能性幹細胞由来血管内皮細胞、或いは、ヒト以外の哺乳動物の血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞も用いることが可能である。適用する被験体がヒトである場合、ヒト由来の血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞であることが好ましい。
【００６６】
一実施態様において、該工程（ａ１）の「ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞と、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とを含む細胞群」とは：
ｉ）少なくとも該第１の細胞と、少なくとも血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とを含む細胞群；
ｉｉ）少なくとも該第１の細胞と、少なくとも血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とを含む細胞群を含む、被験体由来の生体組織；又は
ｉｉｉ）組織工学的に作製された、少なくとも該第１の細胞と、少なくとも血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とを含む細胞群を含む、生体組織
であってもよい。
【００６７】
該工程（ａ１）により得られた上記の細胞群に対し、ＬＹＰＤ１阻害剤で処理し（工程（ａ２））、数日間（例えば、１日、２日、３日、４日、又は５日以上）培養することにより（工程（ａ３））、血管内皮ネットワークの形成が促進された生体組織を製造することが可能となる。すなわち、本実施態様では、ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞と、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とが共に存在する状態において、ＬＹＰＤ１阻害剤で処理する方法である。工程（ａ３）において培養する期間は、細胞数、細胞密度、細胞の種類などによって適宜変更される。
【００６８】
一実施態様において、血管内皮ネットワークの形成が促進された生体組織を製造する方法は、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞と共培養する前に、ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞を含む細胞群をＬＹＰＤ１阻害剤で処理する方法であってもよい（工程（ｂ１））。工程（ｂ１）に得られた細胞群に、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞を接触させ（工程（ｂ２））、数日間（例えば、１日、２日、３日、４日、又は５日以上）培養することにより（工程（ｂ３））、血管内皮ネットワークの形成が促進された生体組織を製造することが可能となる。工程（ａ３）において培養する期間は、細胞数、細胞密度、細胞の種類などによって適宜変更される。
【００６９】
本発明において、「ＬＹＰＤ１阻害剤で処理する」とは、前述のＬＹＰＤ１阻害剤を、公知の方法によって、第１の細胞に発現するＬＹＰＤ１又はＬＹＰＤ１遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ）に作用させ、ＬＹＰＤ１の活性を阻害することを指す。例えば、ＬＹＰＤ１阻害剤を添加した培地で培養する方法；ＬＹＰＤ１阻害剤(例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子、ＲＮＡｉ誘導性核酸、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びそれらの発現ベクター）を含むリポソームやウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター）に曝露させる方法；ＬＹＰＤ１阻害剤(例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子、ＲＮＡｉ誘導性核酸、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びそれらの発現ベクター）をリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法又はリポフェクション法により導入する方法、などを適用できる。ＬＹＰＤ１阻害剤の種類や特性に応じて、最適な方法を選択すればよい。
【００７０】
一実施態様において、本発明の「ＬＹＰＤ１阻害剤で処理する」とは、該第１の細胞のＬＹＰＤ１発現量よりもＬＹＰＤ１発現量が低い若しくは発現していない第２の細胞を、該第１の細胞と混合させて、又は、接触させて培養する方法であってもよい。例えば、第１の細胞と第２の細胞とを混合して培養してもよく；第１の細胞を含む細胞群と、第２の細胞を含む細胞群をそれぞれシート状の細胞（細胞シート）にして、それらを積層して接触させる方法であってもよい。第１の細胞：第２の細胞の比率は、例えば、１９９：１、９９：１、９５：５、９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０、１０：９０、５：９５、１：９９、１：１９９であってもよく、これに限定されない。使用する細胞の種類、ＬＹＰＤ１の発現量などに応じて適宜変更される。
【００７１】
さらに、一実施形態において、本発明の方法は、ＬＹＰＤ１阻害剤を添加した培地で灌流培養する方法であってもよい。これにより、継続的にＬＹＰＤ１阻害剤が供給され、血管内皮ネットワークの形成が促進される。
【００７２】
一実施態様において、該第２の細胞は、例えば、皮膚、食道、肺、及び／又は肝臓由来の細胞である。これらの細胞は、心臓、筋肉、腎臓又は脳由来の細胞と比較して、ＬＹＰＤ１の発現量が低い。好ましくは、皮膚由来の線維芽細胞である。
【００７３】
一実施態様において、第１の細胞のＬＹＰＤ１発現量よりもＬＹＰＤ１発現が低い又は発現していない第２の細胞は、第１の細胞のＬＹＰＤ１発現量の１／２倍以下、好ましくは１／５倍以下、より好ましくは１／１０倍以下、さらに好ましくは１／５０倍以下である。本発明において、ＬＹＰＤ１発現量は、例えば、定量的ＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）、ウエスタンブロット法、フローサイトメータ法（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ法、免疫組織化学法など、周知の技術を用いて評価することができる。
【００７４】
６．医薬品組成物を製造するためのＬＹＰＤ１阻害剤の使用
一実施態様において、本発明のＬＹＰＤ１阻害剤は、血管新生障害を治療及び／又は予防するための医薬品組成物を製造するために使用することができる。
【００７５】
７．ＬＹＰＤ１阻害剤のスクリーニング法
本発明のＬＹＰＤ１阻害剤はさらに、公知のスクリーニング方法を応用することによって候補物質の中から同定することができる。例えば、以下のような方法が挙げられる。
【００７６】
スクリーニング方法は、候補化合物に直接的に、又は間接的に結合させた標識によって、候補化合物のＬＹＰＤ１又はＬＹＰＤ１を有する細胞若しくは膜、又はそれらの融合タンパク質に対する結合を評価することにより選択することができる。或いは、スクリーニング方法には、候補化合物と標識した競合物質（例えば、阻害剤又は基質）について、ＬＹＰＤ１に対する競合結合の測定又は定性的若しくは定量的な検出によって選択することができる。
【００７７】
例えば、ＬＹＰＤ１のｃＤＮＡが挿入された発現ベクターを、宿主細胞に導入した、ベクター／宿主細胞を用いることができる。例えば、バキュロウイルス／Ｓｆ９昆虫細胞や、レトロウイルス／哺乳動物細胞系、発現ベクター／哺乳動物細胞系などを使用することができる。使用する細胞としては、例えば、ＨｅＬａ、ＨｅｐＢ３、ＬＬＣ−ＰＫ１、ＭＤＣＫＩＩ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３などを用いることができるが、これに限定されない。また、本発明のＬＹＰＤ１阻害剤のスクリーニング方法においては、ＬＹＰＤ１の発現量が高い組織由来の細胞、例えば、脳由来、心臓由来、筋肉由来又は腎臓由来の細胞、特に心臓由来の線維芽細胞を用いることもできる。
【００７８】
本発明において用いられるＬＹＰＤ１阻害剤は、前述のように得られた細胞又はＬＹＰＤ１を高発現する細胞（例えば、２．４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）と、血管網を構築する血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞（例えば、２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）と、候補物質とを予めインキュベートし、培養皿に播種して３７℃、５％ＣＯ2にて数日間培養し、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞が形成する血管内皮ネットワークを顕微鏡（好ましくは蛍光顕微鏡）にて観察し、血管内皮ネットワークの長さ及び分岐点の数を評価することにより選択することができる。候補物質は、前述のように得られた細胞又はＬＹＰＤ１を高発現する細胞と、血管網を構築する血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とを混合して予め播種された細胞群に、後から添加して培養してもよい。
【００７９】
血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞が形成する血管内皮ネットワークは、蛍光標識された抗ＣＤ３１抗体又は血管内皮細胞特異的抗体を用いて検出して評価してもよい。また、例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質を発現する血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞を用い、蛍光を検出することにより評価してもよい。
【００８０】
一実施態様において、ＬＹＰＤ１阻害剤をスクリーニングする方法は、例えば、以下の工程を含んでもよい：
（ｉ−１）ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞と、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とを含む細胞群を提供する工程；
（ｉ−２）前記工程（ｉ−１）により得られた細胞群を、候補物質で処理する工程；
（ｉ−３）前記工程（ｉ−２）により得られた細胞群を培養する工程；並びに
（ｉ−４）前記工程（ｉ−３）により得られた細胞群における血管内皮ネットワークの形成を評価する工程、
或いは、
（ｉｉ−１）ＬＹＰＤ１を発現する第１の細胞を含む細胞群を、候補物質で処理する工程；
（ｉｉ−２）前記工程（ｉｉ−１）により得られた細胞群に、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞を接触させる工程；
（ｉｉ−３）前記工程（ｉｉ−２）により得られた細胞群を培養する工程；並びに
（ｉｉ−４）前記工程（ｉｉ−３）により得られた細胞群における血管内皮ネットワークの形成を評価する工程。
【００８１】
本実施態様に用いることができる第１の細胞は、例えば、ＬＹＰＤ１が比較的高発現している、心臓、筋肉、腎臓及び／又は脳由来の細胞を用いてもよい。また、ＬＹＰＤ１を発現するベクターが導入された細胞を用いてもよい。
【００８２】
また、一実施態様において、ＬＹＰＤ１阻害剤をスクリーニングする方法は、例えば、ＬＹＰＤ１が比較的高発現している、心臓、筋肉、腎臓及び／又は脳由来の細胞を、候補物質で処理し、ＬＹＰＤ１の発現を低下させる候補物質を選択する工程、を実施するものであってもよく、上記方法と組み合わせた方法であってもよい。ＬＹＰＤ１の発現は、公知の方法を用いて検出することが可能であり、例えば、定量的ＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）、ウエスタンブロット法、フローサイトメータ法（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ法、免疫組織化学法など、周知の技術を用いて検出することができる。
【実施例】
【００８３】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００８４】
＜使用した細胞及び調整方法＞
以下の実施例中で使用した細胞は以下の通りである。
・ヒト皮膚線維芽細胞（Ｌｏｎｚａより購入。ＮＨＤＦ−Ａｄ  正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＣＣ−２５１１））
・ヒト心臓線維芽細胞（Ｌｏｎｚａより購入。ＮＨＣＦ−ａ（正常ヒト心臓線維芽細胞−心房（ＣＣ−２９０３））、ＮＨＣＦ−ｖ（正常ヒト心臓線維芽細胞−心室（ＣＣ−２９０４））
・ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｌｏｎｚａより購入。Ｃａｔ．＃Ｃ２５１７Ａ））
・正常ヒト心臓微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｃ）（Ｌｏｎｚａより購入。Ｃａｔ．＃ＣＣ−７０３０）
・ヒトｉＰＳ由来間質細胞：ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞を分化誘導する際に得られる細胞群より培養皿への接着性が心筋細胞よりも高い細胞群を分取すると線維芽様の細胞が得られる。これをヒトｉＰＳ由来間質細胞とした（図１２（Ａ）参照）。ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化は、Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｅｌｌ  ｓｈｅｅｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１２  Ａｕｇ  ２４；４２５（２）：３２１−７．に記載の方法により行った。
・ヒトｉＰＳ細胞由来血管内皮細胞（ｉＰＳ−ＣＤ３１＋）は、以下を参照して、調製することにより得た（Ｗｈｉｔｅ  ＭＰ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２０１３  Ｊａｎ；３１（１）：９２−１０３）。
・Ｃｏｓ−７細胞（国立研究開発法人  医薬基盤・健康・栄養研究所  ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）【００８５】
＜実施例１＞
心臓線維芽細胞は血管内皮ネットワーク形成を阻害する（図１）
ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）又は心臓線維芽細胞（心房由来：ＮＨＣＦ−ａ、心室由来：ＮＨＣＦ−ｖ）（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）と、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とを３日間、５％ＣＯ２、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１  ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｕｌｔｒａ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した。【００８６】
血管内皮ネットワーク形成はヒト皮膚線維芽細胞との共培養で促進されるが、ヒト心臓線維芽細胞との共培養では阻害された。【００８７】
＜実施例２＞
心臓線維芽細胞は血管内皮ネットワーク形成を阻害する（図２）
ヒト皮膚線維芽細胞又は心臓線維芽細胞（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）と、ｉＰＳ細胞由来血管内皮細胞（ｉＰＳ−ＣＤ３１＋）又は正常ヒト心臓微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｃ）（２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とを３日間、５％ＣＯ２、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１  ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｕｌｔｒａ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した。【００８８】
ヒトｉＰＳ由来血管内皮細胞やヒト心臓微小血管内皮細胞の血管内皮ネットワーク形成でもヒト皮膚線維芽細胞との共培養による促進、ヒト心臓線維芽細胞との共培養による阻害がみられた。【００８９】
＜実施例３＞
心臓線維芽細胞は血管内皮ネットワーク形成を阻害する（図３）
マウス皮膚線維芽細胞又は心臓線維芽細胞（６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）と、マウスＥＳ細胞由来心筋細胞（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）と、マウスＥＳ細胞由来血管内皮細胞（２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とを３日間、５％ＣＯ２、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（ＰＥ  Ｒａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ３１，５５３３７３，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｕｌｔｒａ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した。【００９０】
マウスＥＳ細胞由来血管内皮細胞の血管内皮ネットワーク形成はマウス皮膚線維芽細胞の存在下で促進されるが、マウス心臓線維芽細胞の存在下では阻害された。【００９１】
＜実施例４＞
心臓線維芽細胞は血管内皮ネットワーク形成を阻害する（図４）
ＳＤラット（Ｊｃｌ：ＳＤ、三共ラボ、日本）より採取したプライマリーの新生仔ラット皮膚線維芽細胞（ＲＤＦ）又は心臓線維芽細胞（ＲＣＦ）（２．４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）と、ラット新生仔心臓由来血管内皮細胞（２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）とを３日間、５％ＣＯ2、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ  Ｒａｔ  ＣＤ３１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＭＣＡ１３３４Ｇ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｕｌｔｒａ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した。【００９２】
血管内皮ネットワーク形成はラット皮膚線維芽細胞との共培養で促進されるが、ラット心臓線維芽細胞との共培養では阻害された。【００９３】
＜実施例５＞
皮膚線維芽細胞と心臓線維芽細胞の遺伝子発現比較（図５）
ヒト皮膚線維芽細胞及び心臓線維芽細胞（心房由来及び心室由来）よりトータルＲＮＡを抽出し遺伝子発現をマイクロアレイで解析した（ＤＮＡチップ研究所（日本）へ委託）。糖タンパク質関連遺伝子及び血管新生関連遺伝子についてヒートマップを示した（図５）。【００９４】
ヒト皮膚線維芽細胞及び心臓線維芽細胞における遺伝子発現パターンは大きく異なっていた。アレイの結果を元に候補分子のスクリーニングを行い、心臓線維芽細胞に高発現する血管新生抑制因子ＬＹＰＤ１（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ受入番号：ＮＭ＿１４４５８６．６、配列番号１）を同定した。【００９５】
＜実施例６＞
ＬＹＰＤ１はラット心臓間質に発現する（図６）
ラット由来の各臓器におけるＬＹＰＤ１の発現をｑＰＣＲで評価した。ラット各臓器よりトータルＲＮＡを抽出し、トータルＲＮＡ画分に含まれるｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、ｑＰＣＲの鋳型とした。ｑＰＣＲはＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ｒｎ０１２９５７０１＿ｍ１，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて比較ＣＴ法により行った（図６（Ａ））。ラット由来の各臓器におけるＬＹＰＤ１の発現を評価したところ心臓で高発現していた。【００９６】
図６（Ｂ）はラット心臓組織の免疫染色画像を示す。抗ｃＴｎＴ（ｃａｒｄｉａｃ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ抗体（Ａｎｔｉ−Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ，Ｃａｒｄｉａｃ  Ｉｓｏｆｏｒｍ，Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｎｏ（１３−１１），ＡＢ−１，ＭＳ−２９５−Ｐ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、抗ＬＹＰＤ１抗体（ａｂ１５７５１６，ａｂｃａｍ）及びＤＡＰＩ（核）を染色した。【００９７】
ラット心臓組織における発現を免疫染色により評価したところ、ｃａｒｄｉａｃ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ陽性の心筋細胞とは共染されず、心臓間質に発現していた。【００９８】
＜実施例７＞
ヒト及びラット初代培養細胞におけるＬＹＰＤ１の遺伝子発現比較（図７）
ヒト及び新生仔ラット由来の皮膚線維芽細胞及び心臓線維芽細胞におけるＬＹＰＤ１の発現をｑＰＣＲで評価した。各細胞よりトータルＲＮＡを抽出し、トータルＲＮＡ画分に含まれるｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成しｑＰＣＲの鋳型とした。ｑＰＣＲはＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ｈｓ００３７５９９１＿ｍ１（ｈｕｍａｎ），Ｒｎ０１２９５７０１＿ｍ１（ｒａｔ），Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて比較ＣＴ法により行った。【００９９】
ヒト及び新生仔ラット由来の皮膚線維芽細胞ではＬＹＰＤ１はほとんど検出されなかったが、心臓線維芽細胞では高発現していた。【０１００】
＜実施例８＞
血管ネットワーク形成はＬＹＰＤ１の阻害により回復する（図８）
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてヒト心臓線維芽細胞にＬＹＰＤ１に対するｓｉＲＮＡ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ  ｓｉＲＮＡ，Ｃａｔ．＃４３９２４２０，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１ｎＭ）又はコントロールＳｉＲＮＡ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｎｏ．２  ｓｉＲＮＡ，Ｃａｔ．＃４３９０８４６）（１ｎＭ）を導入し２日間培養した後、ｓｉＲＮＡを導入したヒト心臓線維芽細胞（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とＨＵＶＥＣ（２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）とを３日間、５％ＣＯ2、３７℃で共培養し、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１  ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｕｌｔｒａ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さを算出した。【０１０１】
ＬＹＰＤ１に対するＳｉＲＮＡの配列は以下の通りである。
【表１】
2018164141.tif 000003
【０１０２】
ｓｉＲＮＡによりＬＹＰＤ１の発現を抑制したヒト心臓線維芽細胞ではＬＹＰＤ１による血管新生抑制効果が阻害され、共培養したＨＵＶＥＣの血管ネットワーク形成がみられた（図８（Ｂ）〜（Ｄ）参照）。【０１０３】
＜実施例９＞
血管ネットワーク形成はＬＹＰＤ１の阻害により回復する（図９）
ヒト心臓線維芽細胞（２．４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）とＨＵＶＥＣ（２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）とを抗ＬＹＰＤ１抗体（５μｇ／ｍＬ）（ａｂ１５７５１６，ａｂｃａｍ）存在下又はコントロール抗体の存在下（５μｇ／ｍＬ）（正常ウサギＩｇＧ、Ｗａｋｏ、日本、Ｃａｔ．＃１４８−０９５５１）にて４日間、５％ＣＯ2、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１  ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した（図９（Ａ）及び（Ｂ））。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｕｌｔｒａ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて、抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した（図９（Ｃ）及び（Ｄ））。【０１０４】
ＬＹＰＤ１に対する抗体の存在下では、ヒト心臓線維芽細胞に発現するＬＹＰＤ１による血管新生抑制効果が阻害され、共培養したＨＵＶＥＣの血管ネットワーク形成がみられた。【０１０５】
＜実施例１０＞
血管ネットワーク形成はＬＹＰＤ１の阻害により回復する（図１０）
ラット新生仔心臓線維芽細胞（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とラット新生仔心臓由来血管内皮細胞（２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とをＬＹＰＤ１抗体（ａｂ１５７５１６，ａｂｃａｍ）存在下（５μｇ／ｍＬ）又はコントロール抗体の存在下（５μｇ／ｍＬ）（正常ウサギＩｇＧ、Ｗａｋｏ、日本、Ｃａｔ．＃１４８−０９５５１）にて４日間、５％ＣＯ２、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ  Ｒａｔ  ＣＤ３１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＭＣＡ１３３４Ｇ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で免疫染色した（図１０（Ａ）及び（Ｂ））。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｕｌｔｒａ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した（図１０（Ｃ）及び（Ｄ））。【０１０６】
ＬＹＰＤ１に対する抗体の存在下ではラット心臓線維芽細胞に発現するＬＹＰＤ１による血管新生抑制効果が阻害され、共培養したラット心臓由来血管内皮細胞の血管ネットワーク形成がみられた。【０１０７】
＜実施例１１＞
ｉＰＳ由来間質細胞は心臓線維芽細胞と同一のクラスターに分類される（図１１）
ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）及びヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）、ヒトｉＰＳ由来間質細胞、ヒト間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ．＃ＰＴ−２５０１）における遺伝子発現をマイクロアレイで解析しクラスタリングした。ｉＰＳ由来間質細胞は心臓線維芽細胞と同一のクラスターに分類された。【０１０８】
＜実施例１２＞
ｉＰＳ由来間質細胞はｉＰＳ ＣＤ３１陽性細胞の血管内皮ネットワーク形成を阻害する（図１２）
ヒトｉＰＳ由来間質細胞をヒトｉＰＳ ＣＤ３１陽性細胞と共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１  ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｕｌｔｒａ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得した（図１２（Ｂ））。【０１０９】
ヒトｉＰＳ ＣＤ３１陽性細胞の血管内皮ネットワーク形成はヒト皮膚線維芽細胞との共培養で促進されるが、ヒトｉＰＳ由来間質細胞との共培養では阻害された。【０１１０】
ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦａ）及びヒトｉＰＳ由来間質細胞（ｉＰＳ  ｆｉｂｒｏ−ｌｉｋｅ）のＬＹＰＤ１の発現をｑＰＣＲで評価した。各細胞よりトータルＲＮＡを抽出し、トータルＲＮＡ画分に含まれるｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成しｑＰＣＲの鋳型とした。ｑＰＣＲはＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ｈｓ００３７５９９１＿ｍ１，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて比較ＣＴ法により行った（図１２（Ｃ））。【０１１１】
ヒトｉＰＳ由来間質細胞はヒト心臓線維芽細胞と同様、ＬＹＰＤ１の発現が高かった。【０１１２】
＜実施例１３＞
組換えＬＹＰＤ１発現及び精製、並びに血管内皮ネットワークの阻害効果の確認（図１３）
ヒトＬＹＰＤ１  ｃＤＮＡ配列をコードするタンパク質を、公表された配列データに従って選択した。シグナル配列の後に挿入されたＦＬＡＧ配列を有するヒトＬＹＰＤ１を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）によって合成し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（以下、「ｐＦＬＡＧ−ＬＹＰＤ１」という。）に挿入した。【０１１３】
ＣＯＳ−７細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で維持培養した。ｐＦＬＡＧ−ＬＹＰＤ１を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従ってＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＲＩＰＡ緩衝液（Ｗａｋｏ、日本）で溶解した。【０１１４】
ＦＬＡＧ−ＬＹＰＤ１タンパク質を、抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ抗体磁気ビーズ（Ｗａｋｏ、日本）を用いて４℃で３時間免疫沈降させた。続いてビーズをＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄し、ＦＬＡＧ−ＬＹＰＤ１タンパク質を、ＤＹＫＤＤＤＤＫペプチド（Ｗａｋｏ、日本）を添加することによってビーズから溶出させた。溶出液を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）にブロットした。【０１１５】
ＦＬＡＧ−ＬＹＰＤ１タンパク質を、ペルオキシダーゼ結合−抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグモノクローナル抗体（Ｗａｋｏ、日本）及びウサギポリクローナル抗ＬＹＰＤ１抗体（ａｂｃａｍ）を用いて検出した。【０１１６】
ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．、英国）を製造者の指示に従って使用し、バンドを可視化し、ｄｉｇ  ｔａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ＬＡＳ３０００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ）によって検出した。標準としてウシ血清アルブミンを用いて、クーマシー（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）プロテインアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州、米国）によりタンパク質収量を測定した（図１３Ａ）。【０１１７】
ヒト皮膚線維芽細胞（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とＨＵＶＥＣ（２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）を混合した細胞群に、ＦＬＡＧ−ＬＹＰＤ１タンパク質（１．２５μｇ／ｍＬ）又はコントロールＩｇＧ（１．２５μｇ／ｍＬ、正常ウサギＩｇＧ、Ｗａｋｏ、日本、Ｃａｔ．＃１４８−０９５５１）を添加し、１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（５％ＣＯ２、３７℃）で培養した。抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１  ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｕｌｔｒａ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さを算出した。【０１１８】
その結果、リコンビナントＬＹＰＤ１タンパク質を添加することによって、血管内皮ネットワーク形成が阻害されることが明らかとなった（図１３Ｂ及びＣ）。【０１１９】
＜実施例１４＞
血管内皮ネットワーク形成回復は、ＬＹＰＤ１の抑制を介する（図１４）。
実施例８と同様の方法により、ＬＹＰＤ１  ｓｉＲＮＡを遺伝子導入したヒト心臓線維芽細胞（２．４×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）に、ＨＵＶＥＣ（２×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）を混合し、播種した。さらに、実施例１３のリコンビナントＬＹＰＤ１（１．５ｕｇ／ｍＬ）又は等量の緩衝液（組成：５００ｕｇ／ｍｌ  ＤＹＫＤＤＤＤＫペプチド、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を添加し、３日間培養した。コントロールとして、実施例８と同様の方法により、コントロールｓｉＲＮＡを遺伝子導入したヒト心臓線維芽細胞（２．４×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）に、ＨＵＶＥＣ（２×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）を混合し、３日間培養した。【０１２０】
培養後に固定し、ＣＤ３１抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｕｌｔｒａ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅ）を用いて画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗｅａｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を用いてＣＤ３１陽性細胞の長さを測定した。【０１２１】
その結果、ヒト心臓線維芽細胞にＬＹＰＤ１  ｓｉＲＮＡを遺伝子導入することで認められた血管内皮細胞ネットワーク形成回復が、リコンビナントＬＹＰＤ１の添加によって、再抑制された。この結果は、ＬＹＰＤ１  ｓｉＲＮＡ遺伝子導入で認められた作用が、ＬＹＰＤ１の抑制を介していることを説明するものである。【０１２２】
＜実施例１５＞
ＨＵＶＥＣの管腔形成に対するｒＬＹＰＤ１の効果（図１５）
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の１ウェル（０．３２ｃｍ２）あたり、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３５６２３１）４６．２ｕＬを添加してコーティングした。ＨＵＶＥＣ（１×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）をＥＧＭ−２（Ｌｏｎｚａ）１００ｕＬに懸濁し、ｒＬＹＰＤ１の存在下（１、２又は５μｇ／ｍＬ）又は非存在下で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上に播種した。２０時間後に顕微鏡観察を行った。【０１２３】
１μｇ／ｍＬのｒＬＹＰＤ１添加は、血管内皮細胞の管腔形成に影響しないが、２μｇ／ｍＬの濃度では血管内皮細胞の遊走抑制が認められ、５μｇ／ｍＬでは、血管内皮細胞の管腔形成が完全に抑制された。このことは、ＬＹＰＤ１タンパク自体に血管内皮細胞の管腔形成、遊走抑制作用を有することを説明するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2018164141.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2018164141.tif 000016
【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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