(57)【要約】  本発明は、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する新規な抗体、あるいは、該抗体を含む抗原結合性を有する分子を提供する。  ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する新規な抗体、該抗体を含む抗原結合性を有する分子、該抗体又は該分子を有効成分として含む抗腫瘍医薬組成物の提供等。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）：
（ＩＩ）
配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号５７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５９に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
（Ｉ）
配列番号４５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４７に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
（ＩＩＩ）  
配列番号５１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
のいずれか１つに記載の重鎖可変領域並びに軽鎖可変領域を含み、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項２】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、（ＩＩ）に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である請求項１に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項３】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、（Ｉ）に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である請求項１に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項４】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、（ＩＩＩ）に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である請求項１に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項５】
キメラ化抗体又は該抗体の抗原結合性断片である、請求項１乃至４のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項６】
ヒト化抗体又は該抗体の抗原結合性断片である、請求項１乃至４のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項７】
ヒト抗体又は該抗体の抗原結合性断片である、請求項１乃至４のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項８】
配列番号６４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基、
配列番号６６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基、
配列番号６８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基、
配列番号７０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基、及び
配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
配列番号７４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、
配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、
配列番号７８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、及び
配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む請求項１、２、又は６のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項９】
・配列番号７４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
・配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
のいずれか１つの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組み合わせを含む、請求項１、２、６、又は８のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項１０】
配列番号８２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基、又は
配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
配列番号８６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、
配列番号８８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、
配列番号９０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、及び
配列番号９２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む請求項１、４、又は６のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。  
【請求項１１】
・配列番号８６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号８８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号９０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号８２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号９０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
・配列番号９２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号８２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
のいずれか１つの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組み合わせを含む、請求項１、４、６、又は１０のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項１２】
Ｆｃを含む、請求項１乃至１１のいずれか１つに記載の抗体。  
【請求項１３】
ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合し、下記<１>乃至<４>のいずれか１つに記載の重鎖可変領域並びに軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片；
<１>  
配列番号１１１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１１２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号１１４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１１５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
<２>
配列番号１１７に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１１８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号１２０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１２１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１２２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
<３>
配列番号１２３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１２４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１２５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号１２６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１２７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１２８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
<４>
配列番号１２９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１３１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号１３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
【請求項１４】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、<１>に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である請求項１３に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項１５】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、<２>に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である請求項１３に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項１６】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、<３>に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である請求項１３に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項１７】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、<４>に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である請求項１３に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項１８】
配列番号９７に示されるアミノ酸配列、
配列番号１０１に示されるアミノ酸配列、
配列番号１０５に示されるアミノ酸配列、及び
配列番号１０９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号９９に示されるアミノ酸配列、
配列番号１０３に示されるアミノ酸配列、
配列番号１０７に示されるアミノ酸配列、及び
配列番号１３５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む軽鎖可変領域
を含む請求項１３乃至１７のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項１９】
・配列番号９７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号９９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号１０１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
・配列番号１０９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号１３５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
のいずれか１つの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組み合わせを含む、請求項１３乃至１８に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項２０】
・配列番号１４４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号１４５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、
・配列番号１４６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号１４７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、
・配列番号１４８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号１４９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、又は、
・配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号１５１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖
のいずれか１つの重鎖及び軽鎖の組み合わせを含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項２１】
請求項８乃至１２、１８乃至２０のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項２２】
請求項８乃至１２、１８乃至２０のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項２３】
請求項８乃至１２、１８乃至２０のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されてなるアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項２４】
請求項１乃至２０のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片が結合するヒトＧＰＲＣ５Ｄ上の部位に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項２５】
請求項１乃至２０のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とヒトＧＰＲＣ５Ｄ上への結合において競合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項２６】
カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに結合する、請求項１乃至２５のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合性断片。
【請求項２７】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又は、ｓｄＡｂである請求項１乃至２６のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項２８】
請求項２、８、又は、９に記載の重鎖可変領域、及び、軽鎖可変領域、並びに、
ｉ）配列番号１９９に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０３に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉ）配列番号２０１に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０５に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、  
ｉｉｉ）配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域  
又は、
ｉｖ）配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項２９】
配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
ｉ）配列番号１９９に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０３に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉ）配列番号２０１に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０５に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉｉ）配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
又は、
ｉｖ）配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。  
【請求項３０】
請求項２、８、又は、９に記載の重鎖可変領域、及び、軽鎖可変領域、並びに、変異型Ｆｃを含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項３１】
配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、変異型Ｆｃを含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項３２】
請求項１乃至３１のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項３２に記載のいずれか１つのポリヌクレオチドを含むベクター
【請求項３４】
請求項３２に記載のいずれか１つのポリヌクレオチド、又は、請求項３３に記載のベクターを含むか、又は、請求項１乃至３１のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を産生する細胞。
【請求項３５】
請求項３２に記載のいずれか１つのポリヌクレオチド、又は、請求項３３に記載のベクターを含むか、又は、請求項１乃至３１のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を細胞表面上に発現する人工免疫細胞。
【請求項３６】
請求項３４に記載の細胞を培養する工程、及び、該培養物からヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を回収する工程を含む、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片の製造方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法により得られる、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
【請求項３８】
請求項１乃至３１、３７のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片、請求項３２に記載のポリヌクレオチド、請求項３３に記載のベクター、又は、請求項３５に記載の人工免疫細胞を有効成分として含有する治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
【請求項３９】
癌の治療、及び／又は、予防のための請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
癌が、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質を発現している、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、腎癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、食道癌、膀胱癌、子宮頚癌、血液癌、リンパ腫、又は、悪性黒色腫である請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
癌が、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質を発現している多発性骨髄腫である請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
請求項１乃至３１、３７のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む抗原結合性を有する分子。
【請求項４３】
多重特異的である請求項４２に記載の分子。
【請求項４４】
請求項１乃至３１、３７のいずれか１つに記載のヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、
配列番号１８３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２３８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び、
配列番号１８５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに、
配列番号１８６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２３９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び、
配列番号１８８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
を含み；且つヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む請求項４２又は４３に記載の分子。
【請求項４５】
前記重鎖ＣＤＲ２の
１番目のＸａａは、（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され
且つ２番目のＸａａはＳであるか、又は、
１番目のＸａａはＮであり、
且つ２番目のＸａａは、（Ｅ、Ｒ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｋ、Ｔ）からなる群より選択され、
前記軽鎖ＣＤＲ２の
Ｘａａは、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択され、
ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合することを特徴とする請求項４４に記載の分子。
【請求項４６】
前記重鎖ＣＤＲ２の
１番目のＸａａは、（Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、２番目のＸａａはＳであり、且つ
前記軽鎖ＣＤＲ２の
Ｘａａは、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択される、
ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合することを特徴とする請求項４４又は４５に記載の分子。
【請求項４７】
配列番号２４０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４１、２４２、及び２４３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、
配列番号２４０で示されるアミノ酸配列の１番目のＸａａは、（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、且つ、２番目のＸａａはＳであるか、又は、
１番目のＸａａはＮであり、且つ、２番目のＸａａは、（Ｅ、Ｒ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｋ、Ｔ）からなる群より選択され、
配列番号２４１、２４２、及び、２４３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列の
Ｘａａは、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択される、
請求項４２乃至４５のいずれか１つに記載の分子。
【請求項４８】
配列番号２４０の
１番目のＸａａは、（Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、
２番目のＸａａはＳであり、且つ、
配列番号２４１、２４２、及び、２４３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列の
Ｘａａは、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択される、
請求項４７に記載の分子。
【請求項４９】
請求項１乃至３１、３７のいずれか１つに記載のヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、
配列番号１８３に示される重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
配列番号１８４に示される重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、及び、
配列番号１８５に示される重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；並びに、
配列番号１８６に示される軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
配列番号１８７に示される軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、及び、
配列番号１８８に示される軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
を含み、且つヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む請求項４２乃至４４のいずれか１つに記載の分子。
【請求項５０】
前記ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、配列番号１５５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５６、１５８、及び、１６０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片である、請求項４９に記載の分子。
【請求項５１】
前記ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又は、ｓｄＡｂである、請求項４４乃至５０のいずれか１つに記載の分子。  
【請求項５２】
前記ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体が、ヒト免疫グロブリン定常領域又はＦｃもしくは変異型Ｆｃを含むヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項４４乃至５１のいずれか１つに記載の分子。
【請求項５３】
前記ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、配列番号１８０、１８１、及び、１８２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片である請求項４４乃至５２のいずれか１つに記載の分子。
【請求項５４】
前記ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、請求項１乃至３１、３７のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とが、リンカーにより結合してなる、あるいはリンカーなしで結合してなる請求項４０乃至４４のいずれか１つに記載の分子。
【請求項５５】
請求項２、８、又は、９に記載のヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、以下に示す群から選ばれるいずれかひとつの重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組合せを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む請求項４２乃至４４のいずれか１つに記載の分子：
・配列番号２０７に示されるアミノ酸配列の２５乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２０９に示されるアミノ酸配列の２４乃至１３２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２１１に示されるアミノ酸配列の２５乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列の２４乃至１３０番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２４４の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４４の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２４５の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４５の１３５乃至２４１のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、  
・配列番号２４６の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４６の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２４７の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４７の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２４８の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４８の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、  
・配列番号２４９の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号２４９の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２５０の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５０の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２５１の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５１の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２５２の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５２の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２５３の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５３の１３５乃至２４２のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２５４の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５４の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
又は、
・配列番号２５５の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５５の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、且つヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む請求項４２乃至４４のいずれか１つに記載の分子。
【請求項５６】
ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
ｉ）配列番号１９９に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０３に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉ）配列番号２０１に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０５に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉｉ）配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
又は、
ｉｖ）配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含み、
ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、さらに変異型Ｆｃを含む、請求項５５に記載の分子。
【請求項５７】
ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
ｉｉｉ）配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
又は、
ｉｖ）配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含み、
ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、さらに変異型Ｆｃを含む、請求項５５に記載の分子。
【請求項５８】
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２１に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６４番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２５に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６４番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２９に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３１に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６４番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、又は、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む請求項５５に記載の分子。
【請求項５９】
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２５に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６４番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２９に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３１に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６４番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、又は、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む請求項５５に記載の分子。
【請求項６０】
ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
ｉ）配列番号１９９に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０３に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉ）配列番号２０１に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０５に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉｉ）配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
又は、
ｉｖ）配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含み、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、さらに、
ｖ）配列番号２０７に示されるアミノ酸配列の１４３乃至４７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０９に示されるアミノ酸配列の１３３乃至２３８番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、又は、
ｖｉ）配列番号２１１に示されるアミノ酸配列の１４３乃至４７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む請求項５５に記載の分子。  
【請求項６１】
ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
ｉｉｉ）配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
又は、
ｉｖ）配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含み、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、さらに、
ｖ）配列番号２０７に示されるアミノ酸配列の１４３乃至４７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０９に示されるアミノ酸配列の１３３乃至２３８番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、又は、
ｖｉ）配列番号２１１に示されるアミノ酸配列の１４３乃至４７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項５５に記載の分子。
【請求項６２】
配列番号１９９に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２０７に示されるアミノ酸配列の２５乃至４７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０９に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３８番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片
又は、
配列番号２０１に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０５に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２１１に示されるアミノ酸配列の２５乃至４７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む請求項５５に記載の分子。
【請求項６３】
ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、さらに変異型Ｆｃを含み、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、さらに変異型Ｆｃを含む、請求項５５に記載の分子。
【請求項６４】
配列番号２２３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片
又は、
配列番号２２３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２１に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６４番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む請求項５５に記載の分子。
【請求項６５】
前記ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、請求項１９に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とが、リンカーにより結合してなる、あるいはリンカーなしで結合してなる請求項５３に記載の分子。
【請求項６６】
配列番号１７１乃至１７９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、請求項５４又は６５に記載の、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３、並びに、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する分子。  
【請求項６７】
請求項５０、５３、５８、５９、６２、６４、６５、及び６６のいずれか１つに記載の分子に含まれる、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３、並びに、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する分子。
【請求項６８】
請求項５０、５３、５８、５９、６２、６４、６５、及び６６のいずれか１つに記載のヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３、並びに、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する分子。
【請求項６９】
請求項５０、５３、５８、５９、６２、６４、６５、及び６６のいずれか１つに記載の分子に含まれるヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されてなるアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３、並びに、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する分子。
【請求項７０】
カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに結合する、請求項４２乃至６９のいずれか１つに記載の分子。
【請求項７１】
二重特異的である請求項４３乃至７０のいずれか１つに記載の分子。
【請求項７２】
ポリペプチドである請求項４２乃至７１のいずれか１つに記載の分子。
【請求項７３】
請求項７２に記載の分子の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項７４】
請求項７３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７５】
請求項７３に記載のポリヌクレオチド若しくは請求項７４に記載のベクター、又は、請求項７１に記載の分子を産生する細胞。
【請求項７６】
請求項７５に記載の細胞を培養する工程、及び、該培養物からヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３、並びに／又は、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する分子を回収する工程を含む、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３、並びに、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する分子の製造方法。
【請求項７７】
請求項７６に記載の方法により得られる、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３、並びに、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する分子。
【請求項７８】
カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに結合する、請求項７７に記載の分子。
【請求項７９】
請求項４２乃至７２、７７及び７８のいずれか１つに記載の分子、請求項７３に記載のポリヌクレオチド、又は請求項７４に記載のベクターを有効成分として含有する治療及び／又は予防のための医薬組成物。
【請求項８０】
癌の治療、及び／又は、予防のための請求項７９に記載の医薬組成物。
【請求項８１】
癌が、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質を発現している、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、腎癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、食道癌、膀胱癌、子宮頚癌、血液癌、リンパ腫、又は、悪性黒色腫である請求項８０に記載の医薬組成物。
【請求項８２】
癌が、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質を発現している多発性骨髄腫である請求項７９又は８０に記載の医薬組成物。
【請求項８３】
請求項４２乃至７２、７７及び７８のいずれか１つに記載の分子、又は、請求項７９乃至８２のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与することを特徴とする癌の治療及び／又は予防方法。
【請求項８４】
ＧＰＲＣ５Ｄを発現している細胞へのＴ細胞リダイレクションによって、該細胞への細胞傷害を誘導することを特徴とする、請求項７９乃至８２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項８５】
ＧＰＲＣ５Ｄを発現している細胞へのＴ細胞リダイレクションによって、該細胞への細胞傷害を誘導することを特徴とする、請求項８３に記載の方法。  
【請求項８６】
請求項４２乃至７２、７７及び７８のいずれか１つに記載の分子、又は、請求項７９乃至８２のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与する工程を含む、ＧＰＲＣ５Ｄを発現している細胞へのＴ細胞リダイレクションによって該細胞への細胞傷害を誘導する方法。
【請求項８７】
請求項４２乃至７２、７７及び７８のいずれか１つに記載の分子、又は、請求項７９乃至８２のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与する工程を含む、ＧＰＲＣ５Ｄを発現している細胞へＴ細胞をリダイレクションする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、及び、該抗体を含む分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  Ｃ  ｇｒｏｕｐ  ５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｄ（ＧＰＲＣ５Ｄ）は、一連のヒトＧＰＣＲのアミノ酸配列を用いたＥＳＴデータベースのホモロジー検索により発見されたＧタンパク質共役受容体の１つである（非特許文献１）。ＧＰＣＲ  ｆａｍｉｌｙ  Ｃ  ｇｒｏｕｐ  ５受容体（ＧＰＲＣ５受容体）には、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＧＰＲＣ５Ｃ、ＧＰＲＣ５Ｄの４つのサブタイプが存在し、レチノイン酸刺激により発現誘導が行われることから、レチノイン酸誘導性オーファンＧタンパク質共役受容体（ＲＡＩＧ）としても知られている（非特許文献２）。しかしながら、ＧＰＲＣ５Ｄの生理機能や生理的リガンド、共役するＧタンパク質のサブタイプ等については明らかになっていない。
ＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子と癌との関連性に関しては、ＧＰＲＣ５Ｄが多発性骨髄腫で高発現していることが知られている。具体的には、ＧＰＲＣ５Ｄの過剰発現が多発性骨髄腫患者の予後不良と相関すること（非特許文献３）、多発性骨髄腫患者への薬物治療によりＧＰＲＣ５Ｄを発現している細胞の割合が減少することなどが知られている（非特許文献４）。  以上のように、ＧＰＲＣ５Ｄの過剰発現と癌との関連性から、ＧＰＲＣ５Ｄが癌に対する優れた標的治療となる可能性が示唆されている。そして、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、及び、該抗体と抗ＣＤ３抗体とを含み、ＧＰＲＣ５Ｄを外因的に発現させている３Ｔ３細胞に結合性を示す二重特異性抗体の報告もある（特許文献１）。しかし、ＧＰＲＣ５Ｄを標的とした医療用医薬品は開発されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０９０３２９号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ブラウナー他（Ｈ  Ｂｒａｕｎｅｒ−Ｏｓｂｏｒｎｅ，  ｅｔ  ａｌ．）、バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．）、２００１年４月刊、１５１８巻（３号）、２３７乃至２４８頁
【非特許文献２】井上他（Ｓ  Ｉｎｏｕｅ，  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・インベスティゲーティブ・デマトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．）、２００４年３月刊、１２２巻（３号）、５６５乃至５７３頁
【非特許文献３】アタマニウク他（Ｊ  Ａｔａｍａｎｉｕｋ，  ｅｔ  ａｌ．）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．）、２０１２年５月刊、４２巻（９号）、９５３乃至９６０頁
【非特許文献４】コッヘン他（Ｙ  Ｃｏｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．）、ヘマトロジー（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）、２０１３年１１月刊、１８巻（６号）、３４８乃至３５１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の１つの課題は、抗癌作用を有するＧＰＲＣ５Ｄに対する抗体、該抗体の抗原結合性断片、及び、該抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含有する分子を提供することである。
本発明の他の１つの課題は、該抗体、該抗体の抗原結合性断片、又は、該分子を含有する医薬組成物等を提供することである。
また、本発明の課題には、該抗体、該抗体の抗原結合性断片、及び、該分子の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドが挿入されたベクター、該ポリヌクレオチド又はベクターが導入された細胞、該細胞を培養する工程を含む該抗体、該抗体の抗原結合性断片、及び、該分子の製造方法が含まれる。さらに、本発明の他の１つの課題は、該抗体、該抗体の抗原結合性断片、又は、該分子を用いた癌の治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行い、新規な抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体を創出し、該抗体が抗癌作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
本発明は、
（１）  下記（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）：
（ＩＩ）
配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号５７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５９に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
（Ｉ）
配列番号４５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４７に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
（ＩＩＩ）  
配列番号５１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
のいずれか１つに記載の重鎖可変領域並びに軽鎖可変領域を含み、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２）  重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、（ＩＩ）に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である前記（１）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（３）  重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、（Ｉ）に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である前記（１）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（４）  重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、（ＩＩＩ）に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である前記（１）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（５）  キメラ化抗体又は該抗体の抗原結合性断片である、前記（１）乃至（４）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（６）  ヒト化抗体又は該抗体の抗原結合性断片である、前記（１）乃至（４）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（７）  ヒト抗体又は該抗体の抗原結合性断片である、前記（１）乃至（４）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（８）配列番号６４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基、
配列番号６６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基、
配列番号６８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基、
配列番号７０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基、及び
配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
配列番号７４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、
配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、
配列番号７８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、及び
配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む前記（１）、（２）、又は（６）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（９）・配列番号７４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
・配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
のいずれか１つの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組み合わせを含む、前記（１）、（２）、又は（６）又は（８）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（１０）配列番号８２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基、又は
配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
配列番号８６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、
配列番号８８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、
配列番号９０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、及び
配列番号９２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む前記（１）、（２）、又は（６）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。  
（１１）・配列番号８６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号８８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号９０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号８２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号９０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
・配列番号９２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号８２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
のいずれか１つの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組み合わせを含む、前記（１）、（４）、（６）、又は（１０）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（１２）  Ｆｃを含む、前記（１）乃至（１１）のいずれか１つに記載の抗体。  
（１３）  ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合し、下記<１>乃至<４>のいずれか１つに記載の重鎖可変領域並びに軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片；
<１>  
配列番号１１１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１１２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号１１４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１１５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
<２>
配列番号１１７に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１１８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号１２０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１２１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１２２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
<３>
配列番号１２３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１２４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１２５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号１２６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１２７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１２８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
<４>
配列番号１２９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１３１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号１３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
（１４）  重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、<１>に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である前記（１３）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（１５）  重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、<２>に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である前記（１３）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（１６）  重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、<３>に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である前記（１３）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（１７）  重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、<４>に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である前記（１３）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（１８）配列番号９７に示されるアミノ酸配列、
配列番号１０１に示されるアミノ酸配列、
配列番号１０５に示されるアミノ酸配列、及び
配列番号１０９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号９９に示されるアミノ酸配列、
配列番号１０３に示されるアミノ酸配列、
配列番号１０７に示されるアミノ酸配列、及び
配列番号１３５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む軽鎖可変領域
を含む前記（１３）乃至（１７）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（１９）・配列番号９７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号９９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号１０１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
・配列番号１０９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号１３５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
のいずれか１つの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組み合わせを含む、前記（１３）乃至（１８）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２０）・配列番号１４４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号１４５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、
・配列番号１４６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号１４７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、
・配列番号１４８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号１４９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、又は、
・配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号１５１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖
のいずれか１つの重鎖及び軽鎖の組み合わせを含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２１）  前記（８）乃至（１２）、（１８）乃至（２０）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２２）  前記（８）乃至（１２）、（１８）乃至（２０）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２３）  前記（８）乃至（１２）、（１８）乃至（２０）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されてなるアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２４）  前記（１）乃至（２０）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片が結合するヒトＧＰＲＣ５Ｄ上の部位に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２５）  前記（１）乃至（２０）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とヒトＧＰＲＣ５Ｄ上への結合において競合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２６）  カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに結合する、前記（１）乃至（２５）のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合性断片。
（２７）  Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又は、ｓｄＡｂである前記（１）乃至（２６）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２８）  前記（２）、（８）、又は、（９）に記載の重鎖可変領域、及び、軽鎖可変領域、並びに、
ｉ）配列番号１９９に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０３に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉ）配列番号２０１に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０５に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、  
ｉｉｉ）配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域  
又は、
ｉｖ）配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（２９）  配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
ｉ）配列番号１９９に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０３に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉ）配列番号２０１に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０５に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉｉ）配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
又は、
ｉｖ）配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。  
（３０）  前記（２）、（８）、又は、（９）に記載の重鎖可変領域、及び、軽鎖可変領域、並びに、変異型Ｆｃを含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（３１）  配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、変異型Ｆｃを含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（３２）  前記（１）乃至（３１）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
（３３）  前記（３２）に記載のいずれか１つのポリヌクレオチドを含むベクター
（３４）  前記（３２）に記載のいずれか１つのポリヌクレオチド、又は、前記（３３）に記載のベクターを含むか、又は、前記（１）乃至（３１）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を産生する細胞。
（３５）  前記（３２）に記載のいずれか１つのポリヌクレオチド、又は、前記（３３に記載のベクターを含むか、又は、前記（１）乃至（３１）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を細胞表面上に発現する人工免疫細胞。
（３６）  前記（３４）に記載の細胞を培養する工程、及び、該培養物からヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を回収する工程を含む、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片の製造方法。
（３７）  前記（３６）に記載の方法により得られる、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
（３８）  前記（１）乃至（３１）、（３７）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片、前記（３２）に記載のポリヌクレオチド、前記（３３）に記載のベクター、又は、前記（３５）に記載の人工免疫細胞を有効成分として含有する治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
（３９）癌の治療、及び／又は、予防のための前記（３８）に記載の医薬組成物。
（４０）  癌が、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質を発現している、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、腎癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、食道癌、膀胱癌、子宮頚癌、血液癌、リンパ腫、又は、悪性黒色腫である前記（３９）に記載の医薬組成物。
（４１）  癌が、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質を発現している多発性骨髄腫である前記（４０）に記載の医薬組成物。
（４２）  前記（１）乃至（３１）、（３７）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む抗原結合性を有する分子。
（４３）  多重特異的である前記（４２）に記載の分子。
（４４）  前記（１）乃至（３１）、（３７）のいずれか１つに記載のヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、
配列番号１８３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２３８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び、
配列番号１８５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに、
配列番号１８６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２３９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び、
配列番号１８８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
を含み；且つヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む前記（４２）又は（４３）に記載の分子。
（４５）前記重鎖ＣＤＲ２の
１番目のＸａａは、（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され
且つ２番目のＸａａはＳであるか、又は、
１番目のＸａａはＮであり、
且つ２番目のＸａａは、（Ｅ、Ｒ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｋ、Ｔ）からなる群より選択され、
前記軽鎖ＣＤＲ２の
Ｘａａは、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択され、
ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合することを特徴とする前記（４４）に記載の分子。
（４６）前記重鎖ＣＤＲ２の
１番目のＸａａは、（Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、２番目のＸａａはＳであり、且つ
前記軽鎖ＣＤＲ２の
Ｘａａは、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択される、
ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合することを特徴とする前記（４４）又は(４５)に記載の分子。
（４７）  配列番号２４０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４１、２４２、及び２４３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、
配列番号２４０で示されるアミノ酸配列の１番目のＸａａは、（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、且つ、２番目のＸａａはＳであるか、又は、
１番目のＸａａはＮであり、且つ、２番目のＸａａは、（Ｅ、Ｒ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｋ、Ｔ）からなる群より選択され、
配列番号２４１、２４２、及び、２４３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列の
Ｘａａは、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択される、
前記（４２）乃至（４５）のいずれか１つに記載の分子。
（４８）  配列番号２４０の
１番目のＸａａは、（Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、
２番目のＸａａはＳであり、且つ、
配列番号２４１、２４２、及び、２４３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列の
Ｘａａは、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択される、
前記（４７）に記載の分子。
（４９）  前記（１）乃至（３１）、（３７）のいずれか１つに記載のヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、
配列番号１８３に示される重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
配列番号１８４に示される重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、及び、
配列番号１８５に示される重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；並びに、
配列番号１８６に示される軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
配列番号１８７に示される軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、及び、
配列番号１８８に示される軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
を含み、且つヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む前記（４２）乃至（４４）のいずれか１つに記載の分子。
（５０）  前記ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、配列番号１５５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５６、１５８、及び、１６０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片である、前記（４９）に記載の分子。
（５１）  前記ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又は、ｓｄＡｂである、前記（４４）乃至（５０）のいずれか１つに記載の分子。  
（５２）  前記ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体が、ヒト免疫グロブリン定常領域又はＦｃもしくは変異型Ｆｃを含むヒト化抗体又はヒト抗体である、前記（４４）乃至（５１）のいずれか１つに記載の分子。
（５３）  前記ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、配列番号１８０、１８１、及び、１８２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片でる前記（４４）乃至（５２）のいずれか１つに記載の分子。
（５４）  前記ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、前記（１）乃至（３１）、（３７）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とが、リンカーにより結合してなる、あるいはリンカーなしで結合してなる前記（４０）乃至（４４）のいずれか１つに記載の分子。
（５５）  前記（２）、（８）、又は、（９）に記載のヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、
・配列番号２０７に示されるアミノ酸配列の２５乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２０９に示されるアミノ酸配列の２４乃至１３２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２１１に示されるアミノ酸配列の２５乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列の２４乃至１３０番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２４４の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４４の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２４５の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４５の１３５乃至２４１のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、  
・配列番号２４６の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４６の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２４７の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４７の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２４８の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４８の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、  
・配列番号２４９の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号２４９の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２５０の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５０の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２５１の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５１の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２５２の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５２の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２５３の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５３の１３５乃至２４２のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２５４の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５４の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
又は、
・配列番号２５５の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５５の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、且つヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む前記（４２）乃至（４４）のいずれか１つに記載の分子。
（５６）  ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
ｉ）配列番号１９９に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０３に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉ）配列番号２０１に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０５に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉｉ）配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
又は、
ｉｖ）配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含み、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、さらに変異型Ｆｃを含む、前記（５５）に記載の分子。適用可能な形態には、Ｈｙｂｒｉｄ型の二重特異的分子が含まれる。
（５７）  ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
ｉｉｉ）配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
又は、
ｉｖ）配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含み、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、さらに変異型Ｆｃを含む、前記（５５）に記載の分子。適用可能な形態には、Ｈｙｂｒｉｄ型の二重特異的分子が含まれる。
（５８）  配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２１に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６４番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２５に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６４番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２９に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３１に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６４番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、又は、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む前記（５５）に記載の分子。
（５９）  配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２５に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６４番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２９に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３１に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６４番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、又は、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む前記（５５）に記載の分子。適用可能な形態には、Ｈｙｂｒｉｄ型の二重特異的分子が含まれる。
（６０）  ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
ｉ）配列番号１９９に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０３に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉ）配列番号２０１に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０５に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉｉ）配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
又は、
ｉｖ）配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含み、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、さらに、
ｖ）配列番号２０７に示されるアミノ酸配列の１４３乃至４７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０９に示されるアミノ酸配列の１３３乃至２３８番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、又は、
ｖｉ）配列番号２１１に示されるアミノ酸配列の１４３乃至４７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む前記（５５）に記載の分子。  適用可能な形態には、ＦＳＡ型の二重特異的分子が含まれる。
（６１）  ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
ｉｉｉ）配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
又は、
ｉｖ）配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含み、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、さらに、
ｖ）配列番号２０７に示されるアミノ酸配列の１４３乃至４７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０９に示されるアミノ酸配列の１３３乃至２３８番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、又は、
ｖｉ）配列番号２１１に示されるアミノ酸配列の１４３乃至４７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む前記（５５）に記載の分子。適用可能な形態には、ＦＳＡ型の二重特異的分子が含まれる。
（６２）  配列番号１９９に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２０７に示されるアミノ酸配列の２５乃至４７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０９に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３８番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片
又は、
配列番号２０１に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０５に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２１１に示されるアミノ酸配列の２５乃至４７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む前記（５５）に記載の分子。適用可能な形態には、ＦＳＡ型の二重特異的分子が含まれる。
（６３）  ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、さらに変異型Ｆｃを含み、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、さらに変異型Ｆｃを含む、前記（５５）に記載の分子。適用可能な形態には、Ｄｕａｌ型の二重特異的分子が含まれる。
（６４）  配列番号２２３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片
又は、
配列番号２２３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２１に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６４番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む前記（５５）に記載の分子。適用可能な形態には、Ｄｕａｌ型の二重特異的分子が含まれる。
（６５）  前記ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、前記（１９）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とが、リンカーにより結合してなる、あるいはリンカーなしで結合してなる前記（５３）に記載の分子。
（６６）  配列番号１７１乃至１７９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、前記（５４）又は（６５）に記載の、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３、並びに、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する分子。  
（６７）  前記（５０）、（５３）、（５８）、（５９）、（６２）、（６４）、（６５）、及び（６６）のいずれか１つに記載の分子に含まれる、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３、並びに、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する分子。
（６８）  前記（５０）、（５３）、（５８）、（５９）、（６２）、（６４）、（６５）、及び（６６）のいずれか１つに記載のヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３、並びに、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する分子。
（６９）  前記（５０）、（５３）、（５８）、（５９）、（６２）、（６４）、（６５）、及び（６６）のいずれか１つに記載の分子に含まれるヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されてなるアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３、並びに、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する分子。
（７０）  カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに結合する、前記（４２）乃至（６９）のいずれか１つに記載の分子。
（７１）  二重特異的である前記（４３）乃至（７０）のいずれか１つに記載の分子。
（７２）  ポリペプチドである前記（４２）乃至（７１）のいずれか１つに記載の分子。
（７３）  前記（７２）に記載の分子の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
（７４）  前記（７３）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（７５）  前記（７３）に記載のポリヌクレオチド若しくは前記（７４）に記載のベクター、又は、前記（７１）に記載の分子を産生する細胞。
（７６）  前記（７５）に記載の細胞を培養する工程、及び、該培養物からヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３、並びに／又は、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する分子を回収する工程を含む、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３、並びに、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する分子の製造方法。
（７７）  前記（７６）に記載の方法により得られる、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３、並びに、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する分子。
（７８）  カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに結合する、前記（７７）に記載の分子。
（７９）  前記（４２）乃至（７２）、（７７）及び（７８）のいずれか１つに記載の分子、前記（７３）に記載のポリヌクレオチド、又は前記（７４）に記載のベクターを有効成分として含有する治療及び／又は予防のための医薬組成物。
（８０）  癌の治療、及び／又は、予防のための前記（７９）に記載の医薬組成物。
（８１）  癌が、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質を発現している、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、腎癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、食道癌、膀胱癌、子宮頚癌、血液癌、リンパ腫、又は、悪性黒色腫である前記（８０）に記載の医薬組成物。
（８２）  癌が、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質を発現している多発性骨髄腫である前記（７９）又は（８０）に記載の医薬組成物。
（８３）  前記（４２）乃至（７２）、（７７）及び（７８）のいずれか１つに記載の分子、又は、前記（７９）乃至（８２）のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与することを特徴とする癌の治療及び／又は予防方法。
（８４）  ＧＰＲＣ５Ｄを発現している細胞へのＴ細胞リダイレクションによって、該細胞への細胞傷害を誘導することを特徴とする、前記（７９）乃至（８２）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（８５）  ＧＰＲＣ５Ｄを発現している細胞へのＴ細胞リダイレクションによって、該細胞への細胞傷害を誘導することを特徴とする、前記（８３）に記載の方法。  
（８６）  前記（４２）乃至（７２）、（７７）及び（７８）のいずれか１つに記載の分子、又は、前記（７９）乃至（８２）のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与する工程を含む、ＧＰＲＣ５Ｄを発現している細胞へのＴ細胞リダイレクションによって該細胞への細胞傷害を誘導する方法、及び、
（８７）  前記（４２）乃至（７２）、（７７）及び（７８）のいずれか１つに記載の分子、又は、前記（７９）乃至（８２）のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与する工程を含む、ＧＰＲＣ５Ｄを発現している細胞へＴ細胞をリダイレクションする方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する新規な抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、該抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含み抗原結合性を有する新規な分子が得られる。該分子には、抗ＣＤ３抗体を含むことができる。
本発明の提供する該抗体、該抗体の抗原結合性断片、及び、該分子を用いることによりＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質を発現している各癌種の治療又は予防、好適には多発性骨髄腫の治療又は予防が可能になる。  
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（２Ａ４、２Ｂ１、７Ｂ４）のヒトＧＰＲＣ５Ｄに対する結合性をフローサイトメトリー法により検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度の相対値を示す。
【図２】ヒトＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端アミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１）。
【図３】ヒトＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端アミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号２）。
【図４】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（２Ａ４、２Ｂ１、７Ｂ４）のヒトＧＰＲＣ５Ｄに対する結合性を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いて検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度の相対値を示す。ペプチドの分子内ジスルフィド結合については、ジスルフィド結合あり（Ａ）、なし（Ｂ）である。
【図５】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（２Ａ４、２Ｂ１、７Ｂ４）がＡＤＣＣ活性を有することを示した図である。
【図６】２Ａ４の重鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号３）。
【図７】２Ａ４の軽鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１０）。
【図８】２Ａ４の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号４）。
【図９】２Ａ４の重鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号５）。
【図１０】２Ｂ１の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号６）。
【図１１】２Ｂ１の重鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号７）。
【図１２】７Ｂ４の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号８）。
【図１３】７Ｂ４の重鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号９）。
【図１４】２Ａ４の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１１）。
【図１５】２Ａ４の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１２）。
【図１６】２Ｂ１の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１３）。
【図１７】２Ｂ１の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１４）。
【図１８】７Ｂ４の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１５）。
【図１９】７Ｂ４の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１６）。
【図２０】ヒトκ鎖分泌シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１７）。
【図２１】軽鎖発現ベクタープライマーＦのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１８）。
【図２２】軽鎖発現ベクタープライマーＲのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１９）。
【図２３】ヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号２０）。
【図２４】ヒトキメラ化２Ａ４（ｃ２Ａ４）軽鎖のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号２１）
【図２５】ヒトキメラ化２Ａ４（ｃ２Ａ４）軽鎖のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−２０）、可変領域（２１−１２７）、定常領域（１２８−２３４））（配列表の配列番号２２）
【図２６】ヒトキメラ化２Ａ４（ｃ２Ａ４）軽鎖用プライマーセットＦのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号２３）。
【図２７】ヒトキメラ化２Ａ４（ｃ２Ａ４）軽鎖用プライマーセットＲのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号２４）。
【図２８】ヒトキメラ化２Ａ４（ｃ２Ａ４）重鎖のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号２５）
【図２９】ヒトキメラ化２Ａ４（ｃ２Ａ４）重鎖のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−１９）、可変領域（２０−１４１）、定常領域（１４２−４７１））（配列表の配列番号２６）
【図３０】ヒトキメラ化２Ａ４（ｃ２Ａ４）重鎖用プライマーセットＦのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号２７）。
【図３１】ヒトキメラ化２Ａ４（ｃ２Ａ４）重鎖用プライマーセットＲのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号２８）。
【図３２】ヒトキメラ化２Ｂ１（ｃ２Ｂ１）軽鎖のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号２９）
【図３３】ヒトキメラ化２Ｂ１（ｃ２Ｂ１）軽鎖のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−２０）、可変領域（２１−１２７）、定常領域（１２８−２３４））（配列表の配列番号３０）
【図３４】ヒトキメラ化２Ｂ１（ｃ２Ｂ１）軽鎖用プライマーセットＦのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号３１）。
【図３５】ヒトキメラ化２Ｂ１（ｃ２Ｂ１）軽鎖用プライマーセットＲのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号３２）。
【図３６】ヒトキメラ化２Ｂ１（ｃ２Ｂ１）重鎖のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号３３）
【図３７】ヒトキメラ化２Ｂ１（ｃ２Ｂ１）重鎖のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−１９）、可変領域（２０−１４２）、定常領域（１４３−４７２））（配列表の配列番号３４）
【図３８】ヒトキメラ化２Ｂ１（ｃ２Ｂ１）重鎖用プライマーセットＦのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号３５）。
【図３９】ヒトキメラ化２Ｂ１（ｃ２Ｂ１）重鎖用プライマーセットＲのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号３６）。
【図４０】ヒトキメラ化７Ｂ４（ｃ７Ｂ４）軽鎖のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号３７）
【図４１】ヒトキメラ化７Ｂ４（ｃ７Ｂ４）軽鎖のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−２０）、可変領域（２１−１２６）、定常領域（１２７−２３３））（配列表の配列番号３８）
【図４２】ヒトキメラ化７Ｂ４（ｃ７Ｂ４）軽鎖用プライマーセットＦのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号３９）。
【図４３】ヒトキメラ化７Ｂ４（ｃ７Ｂ４）軽鎖用プライマーセットＲのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号４０）。
【図４４】ヒトキメラ化７Ｂ４（ｃ７Ｂ４）重鎖のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号４１）
【図４５】ヒトキメラ化７Ｂ４（ｃ７Ｂ４）重鎖のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−１９）、可変領域（２０−１４２）、定常領域（１４３−４７２））（配列表の配列番号４２）
【図４６】ヒトキメラ化７Ｂ４（ｃ７Ｂ４）重鎖用プライマーセットＦのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号４３）。
【図４７】ヒトキメラ化７Ｂ４（ｃ７Ｂ４）重鎖用プライマーセットＲのヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号４４）。
【図４８】ヒトキメラ化抗体（ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１、ｃ７Ｂ４）のヒトＧＰＲＣ５Ｄに対する結合性を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いて検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度の相対値を示す。
【図４９】ヒトキメラ化抗体（ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１、ｃ７Ｂ４）のカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに対する結合性を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いて検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度の相対値を示す。
【図５０】ヒトキメラ化抗体（ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１、ｃ７Ｂ４）が、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに対して、ＡＤＣＣ活性を有することを示した図である。
【図５１】ヒトキメラ化２Ａ４（ｃ２Ａ４）の、ＧＰＲＣ５Ｄを発現しているヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＨＭ−１Ｂ移植ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖抑制活性を示した図である。
【図５２】ヒトキメラ化２Ｂ１（ｃ２Ｂ１）の、ＧＰＲＣ５Ｄを発現しているヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＨＭ−１Ｂ移植ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖抑制活性を示した図である。
【図５３】ヒトキメラ化７Ｂ４（ｃ７Ｂ４）の、ＧＰＲＣ５Ｄを発現しているヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＨＭ−１Ｂ移植ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖抑制活性を示した図である。
【図５４】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ａ４の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号４５）。
【図５５】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ａ４の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号４６）。
【図５６】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ａ４の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号４７）。
【図５７】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ｂ１の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号４８）。
【図５８】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ｂ１の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号４９）。
【図５９】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ｂ１の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号５０）。
【図６０】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体７Ｂ４の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号５１）。
【図６１】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体７Ｂ４の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号５２）。
【図６２】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体７Ｂ４の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号５３）。
【図６３】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ａ４の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号５４）。
【図６４】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ａ４の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号５５）。
【図６５】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ａ４の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号５６）。
【図６６】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ｂ１の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号５７）。
【図６７】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ｂ１の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号５８）。
【図６８】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ｂ１の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号５９）。
【図６９】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体７Ｂ４の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号６０）。
【図７０】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体７Ｂ４の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号６１）。
【図７１】ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体７Ｂ４の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号６２）。
【図７２】ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ１）のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号６３）
【図７３】ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ１）のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−２０）、可変領域（２１−１２７）、定常領域（１２８−２３４））（配列表の配列番号６４）
【図７４】ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ２）のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号６５）
【図７５】ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ２）のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−２０）、可変領域（２１−１２７）、定常領域（１２８−２３４））（配列表の配列番号６６）
【図７６】ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ３）のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号６７）
【図７７】ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ３）のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−２０）、可変領域（２１−１２７）、定常領域（１２８−２３４））（配列表の配列番号６８）
【図７８】ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ４）のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号６９）
【図７９】ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ４）のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−２０）、可変領域（２１−１２７）、定常領域（１２８−２３４））（配列表の配列番号７０）
【図８０】ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ５）のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号７１）
【図８１】ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ５）のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−２０）、可変領域（２１−１２７）、定常領域（１２８−２３４））（配列表の配列番号７２）
【図８２】ヒト化２Ｂ１重鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｈ１）のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号７３）
【図８３】ヒト化２Ｂ１重鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｈ１）のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−１９）、可変領域（２０−１４２）、定常領域（１４３−４７２））（配列表の配列番号７４）
【図８４】ヒト化２Ｂ１重鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｈ２）のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号７５）
【図８５】ヒト化２Ｂ１重鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｈ２）のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−１９）、可変領域（２０−１４２）、定常領域（１４３−４７２））（配列表の配列番号７６）
【図８６】ヒト化２Ｂ１重鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｈ３）のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号７７）
【図８７】ヒト化２Ｂ１重鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｈ３）のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−１９）、可変領域（２０−１４２）、定常領域（１４３−４７２））（配列表の配列番号７８）
【図８８】ヒト化２Ｂ１重鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｈ４）のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号７９）
【図８９】ヒト化２Ｂ１重鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｈ４）のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−１９）、可変領域（２０−１４２）、定常領域（１４３−４７２））（配列表の配列番号８０）
【図９０】ヒト化７Ｂ４軽鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｌ１）のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号８１）
【図９１】ヒト化７Ｂ４軽鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｌ１）のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−２０）、可変領域（２１−１２６）、定常領域（１２７−２３３））（配列表の配列番号８２）
【図９２】ヒト化７Ｂ４軽鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｌ２）のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号８３）
【図９３】ヒト化７Ｂ４軽鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｌ２）のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−２０）、可変領域（２１−１２６）、定常領域（１２７−２３３））（配列表の配列番号８４）
【図９４】ヒト化７Ｂ４重鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｈ１）のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号８５）
【図９５】ヒト化７Ｂ４重鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｈ１）のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−１９）、可変領域（２０−１４２）、定常領域（１４３−４７２））（配列表の配列番号８６）
【図９６】ヒト化７Ｂ４重鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｈ２）のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号８７）
【図９７】ヒト化７Ｂ４重鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｈ２）のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−１９）、可変領域（２０−１４２）、定常領域（１４３−４７２））（配列表の配列番号８８）
【図９８】ヒト化７Ｂ４重鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｈ３）のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号８９）
【図９９】ヒト化７Ｂ４重鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｈ３）のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−１９）、可変領域（２０−１４２）、定常領域（１４３−４７２））（配列表の配列番号９０）
【図１００】ヒト化７Ｂ４重鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｈ５）のヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号９１）
【図１０１】ヒト化７Ｂ４重鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｈ５）のアミノ酸配列を示した図である。（シグナル配列（１−１９）、可変領域（２０−１４２）、定常領域（１４３−４７２））（配列表の配列番号９２）
【図１０２】ヒト化２Ｂ１のヒトＧＰＲＣ５Ｄに対する結合性を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いて検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度の相対値を示す。
【図１０３】ヒト化７Ｂ４のヒトＧＰＲＣ５Ｄに対する結合性を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いて検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度の相対値を示す。
【図１０４】ヒト化２Ｂ１、ヒト化７Ｂ４がＡＤＣＣ活性を有することを示した図である。
【図１０５】カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ  アミノ末端ペプチドのアミノ酸配列を示した図である（配列番号９３）
【図１０６】ｓｃＦｖの配列解析に用いたプライマーＡのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号９４）。
【図１０７】ｓｃＦｖの配列解析に用いたプライマーＢのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号９５）。
【図１０８】ヒト抗体Ｃ２０３７重鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号９６）。
【図１０９】ヒト抗体Ｃ２０３７重鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号９７）。
【図１１０】ヒト抗体Ｃ２０３７軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号９８）。
【図１１１】ヒト抗体Ｃ２０３７軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号９９）。
【図１１２】ヒト抗体Ｃ３０４８重鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１００）。
【図１１３】ヒト抗体Ｃ３０４８重鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１０１）。
【図１１４】ヒト抗体Ｃ３０４８軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１０２）。
【図１１５】ヒト抗体Ｃ３０４８軽鎖の可変領域のアミノ酸配列示した図である（配列表の配列番号１０３）。
【図１１６】ヒト抗体Ｃ３０１５重鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１０４）。
【図１１７】ヒト抗体Ｃ３０１５重鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１０５）。
【図１１８】ヒト抗体Ｃ３０１５軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列示した図である（配列表の配列番号１０６）。
【図１１９】ヒト抗体Ｃ３０１５軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１０７）。
【図１２０】ヒト抗体Ｃ３０２２重鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１０８）。
【図１２１】ヒト抗体Ｃ３０２２重鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１０９）。
【図１２２】ヒト抗体Ｃ３０２２軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列示した図である（配列表の配列番号１１０）。
【図１２３】ヒト抗体Ｃ３０２２軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１３５）。
【図１２４】ヒト抗体Ｃ２０３７重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１１１）。
【図１２５】ヒト抗体Ｃ２０３７重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１１２）。
【図１２６】ヒト抗体Ｃ２０３７重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１１３）。
【図１２７】ヒト抗体Ｃ２０３７軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１１４）。
【図１２８】ヒト抗体Ｃ２０３７軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１１５）。
【図１２９】ヒト抗体Ｃ２０３７軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１１６）。
【図１３０】ヒト抗体Ｃ３０４８重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１１７）。
【図１３１】ヒト抗体Ｃ３０４８重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１１８）。
【図１３２】ヒト抗体Ｃ３０４８重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１１９）。
【図１３３】ヒト抗体Ｃ３０４８軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１２０）。
【図１３４】ヒト抗体Ｃ３０４８軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１２１）。
【図１３５】ヒト抗体Ｃ３０４８軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１２２）。
【図１３６】ヒト抗体Ｃ３０１５重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１２３）。
【図１３７】ヒト抗体Ｃ３０１５重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１２４）。
【図１３８】ヒト抗体Ｃ３０１５重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１２５）。
【図１３９】ヒト抗体Ｃ３０１５軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１２６）。
【図１４０】ヒト抗体Ｃ３０１５軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１２７）。
【図１４１】ヒト抗体Ｃ３０１５軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１２８）。
【図１４２】ヒト抗体Ｃ３０２２重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１２９）。
【図１４３】ヒト抗体Ｃ３０２２重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１３０）。
【図１４４】ヒト抗体Ｃ３０２２重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１３１）。
【図１４５】ヒト抗体Ｃ３０２２軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１３２）。
【図１４６】ヒト抗体Ｃ３０２２軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１３３）。
【図１４７】ヒト抗体Ｃ３０２２軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示した図である（配列表の配列番号１３４）。
【図１４８】ヒト抗体Ｃ２０３７のＩｇＧ化体重鎖ヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１３６）。
【図１４９】ヒト抗体Ｃ２０３７のＩｇＧ化体軽鎖ヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１３７）。
【図１５０】ヒト抗体Ｃ３０４８のＩｇＧ化体重鎖ヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１３８）。
【図１５１】ヒト抗体Ｃ３０４８のＩｇＧ化体軽鎖ヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１３９）
【図１５２】ヒト抗体Ｃ３０１５のＩｇＧ化体重鎖ヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１４０）
【図１５３】ヒト抗体Ｃ３０１５のＩｇＧ化体軽鎖ヌクレオチド配列を示した図である。（配列表の配列番号１４１）。
【図１５４】ヒト抗体Ｃ３０２２のＩｇＧ化体重鎖ヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１４２）。
【図１５５】ヒト抗体Ｃ３０２２のＩｇＧ化体軽鎖ヌクレオチド配列を示した図である（配列表の配列番号１４３）。
【図１５６】ヒト抗体Ｃ２０３７のＩｇＧ化体重鎖アミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−１９）、可変領域（２０−１３４）、定常領域（１３５−４６４））（配列表の配列番号１４４）。
【図１５７】ヒト抗体Ｃ２０３７のＩｇＧ化体軽鎖アミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２０）、可変領域（２１−１３０）、定常領域（１３１−２３６））（配列表の配列番号１４５）。
【図１５８】ヒト抗体Ｃ３０４８のＩｇＧ化体重鎖アミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−１９）、可変領域（２０−１４２）、定常領域（１４３−４７２））（配列表の配列番号１４６）。
【図１５９】ヒト抗体Ｃ３０４８のＩｇＧ化体軽鎖アミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２０）、可変領域（２１−１３０）、定常領域（１３１−２３６））（配列表の配列番号１４７）。
【図１６０】ヒト抗体Ｃ３０１５のＩｇＧ化体重鎖アミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−１９）、可変領域（２０−１４０）、定常領域（１４１−４７０））（配列表の配列番号１４８）。
【図１６１】ヒト抗体Ｃ３０１５のＩｇＧ化体軽鎖アミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２０）、可変領域（２１−１２６）、定常領域（１２７−２３２））（配列表の配列番号１４９）。
【図１６２】ヒト抗体Ｃ３０２２のＩｇＧ化体重鎖アミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−１９）、可変領域（２０−１３４）、定常領域（１３５−４６４））（配列表の配列番号１５０）。
【図１６３】ヒト抗体Ｃ３０２２のＩｇＧ化体軽鎖アミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２０）、可変領域（２１−１３０）、定常領域（１３１−２３６））（配列表の配列番号１５１）。
【図１６４】ヒト抗体ｓｃＦｖのヒト（Ａ）、カニクイザル（Ｂ）ビオチン化ＧＰＲＣ５Ｄ  アミノ末端に対する結合性を、ＥＬＩＳＡ法により検証した図である。縦軸はＥＬＩＳＡ法により測定された発光強度を示す。
【図１６５】ヒト抗体ＩｇＧ化体の、ヒト又はカニクイザル  ビオチン化ＧＰＲＣ５Ｄ  アミノ末端に対する結合性を、ＥＬＩＳＡ法により検証した図である。縦軸はＥＬＩＳＡ法により測定された発光強度を示す。
【図１６６】ヒト抗体ｓｃＦｖの、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現癌細胞株に対する結合性を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いて検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度の相対値を示す。
【図１６７】ヒト抗体ＩｇＧ化体の、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現癌細胞株に対する結合性を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いて検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度の相対値を示す。
【図１６８】ラット抗ＣＤ３抗体Ｃ３−１４７の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示した図である（配列番号１５２）。
【図１６９】ラット抗ＣＤ３抗体Ｃ３−１４７の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示した図である（配列番号１５３）。
【図１７０】Ｃ３Ｅ−７０００（５８−８６７）をコードするヌクレオチド配列を示した図である（シグナル配列（１−５７）、ｓｃＦｖ（５８−７８３）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（７９３−８６７））（配列番号１５４）。
【図１７１】Ｃ３Ｅ−７０３４の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列番号１５５）。
【図１７２】Ｃ３Ｅ−７０３４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列番号１５６）。
【図１７３】Ｃ３Ｅ−７０３４（５８−８６４）をコードするヌクレオチド配列を示した図である（シグナル配列（１−５７）、ｓｃＦｖ（６１−７８６）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（７９０−８６４））（配列番号１５７）。
【図１７４】Ｃ３Ｅ−７０３５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列番号１５８）。
【図１７５】Ｃ３Ｅ−７０３５（５８−８６４）をコードするヌクレオチド配列を示した図である（シグナル配列（１−５７）、ｓｃＦｖ（６１−７８６）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（７９０−８６４））（配列番号１５９）。
【図１７６】Ｃ３Ｅ−７０３６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列番号１６０）。
【図１７７】Ｃ３Ｅ−７０３６（５８−８５８）をコードするヌクレオチド配列を示した図である（シグナル配列（１−５７）、ｓｃＦｖ（６１−７８０）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（７８４−８５８））（配列番号１６１）。
【図１７８】発現ベクターｐＣ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３４のＯＲＦをコードするヌクレオチド配列を示した図である（配列番号１６２）。
【図１７９】発現ベクターｐＣ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３４のＯＲＦをコードするヌクレオチド配列を示した図である（配列番号１６３）。
【図１８０】発現ベクターｐＣ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３４のＯＲＦをコードするヌクレオチド配列を示した図である（配列番号１６４）。
【図１８１】発現ベクターｐＣ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３５のＯＲＦをコードするヌクレオチド配列を示した図である（配列番号１６５）。
【図１８２】発現ベクターｐＣ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３５のＯＲＦをコードするヌクレオチド配列を示した図である（配列番号１６６）。
【図１８３】発現ベクターｐＣ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３５のＯＲＦをコードするヌクレオチド配列を示した図である（配列番号１６７）。
【図１８４】発現ベクターｐＣ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３６のＯＲＦをコードするヌクレオチド配列を示した図である（配列番号１６８）。
【図１８５】発現ベクターｐＣ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３６のＯＲＦをコードするヌクレオチド配列を示した図である（配列番号１６９）。
【図１８６】発現ベクターｐＣ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３６のＯＲＦをコードするヌクレオチド配列を示した図である（配列番号１７０）。
【図１８７】Ｃ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３４のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−１９）、Ｃ２０３７（２１−２６０）、Ｃ３Ｅ−７０３４（２６６−５０７））（配列番号１７１）。
【図１８８】Ｃ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３４のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−１９）、Ｃ３０４８（２１−２６８）、Ｃ３Ｅ−７０３４（２７４−５１５））（配列番号１７２）。
【図１８９】Ｃ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３４のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−１９）、Ｃ３０２２（２１−２６０）、Ｃ３Ｅ−７０３４（２６６−５０７））（配列番号１７３）。
【図１９０】Ｃ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３５のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−１９）、Ｃ２０３７（２１−２６０）、Ｃ３Ｅ−７０３５（２６６−５０７））（配列番号１７４）。
【図１９１】Ｃ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３５のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−１９）、Ｃ３０４８（２１−２６８）、Ｃ３Ｅ−７０３５（２７４−５１５））（配列番号１７５）。
【図１９２】Ｃ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３５のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−１９）、Ｃ３０２２（２１−２６０）、Ｃ３Ｅ−７０３５（２６６−５０７））（配列番号１７６）。
【図１９３】Ｃ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３６のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−１９）、Ｃ２０３７（２１−２６０）、Ｃ３Ｅ−７０３６（２６６−５０５））（配列番号１７７）。
【図１９４】Ｃ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３６のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−１９）、Ｃ３０４８（２１−２６８）、Ｃ３Ｅ−７０３６（２７４−５１３））（配列番号１７８）。
【図１９５】Ｃ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３６のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−１９）、Ｃ３０２２（２１−２６０）、Ｃ３Ｅ−７０３６（２６６−５０５））（配列番号１７９）。
【図１９６】抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の内因性ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞（ヒトリンパ細胞株Ａ４／ＦｕＫ細胞）に対する結合性を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いて検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度の相対値を示す。
【図１９７】抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に対する結合性を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いて検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度の相対値を示す。
【図１９８】抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のヒトＣＤ３（ＰＢＭＣ）に対する結合性を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いて検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度の相対値を示す。
【図１９９】抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のカニクイザルＣＤ３（ＰＢＭＣ）に対する結合性を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いて検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度の相対値を示す。
【図２００】抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子が、内因性ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞（ヒトリンパ腫細胞株Ａ４／ＦｕＫ細胞）に対して細胞傷害活性を有することを示した図である。
【図２０１】ヒト化２Ｂ１のカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに対する結合性を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いて検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度の相対値を示す。
【図２０２】ヒト化７Ｂ４カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに対する結合性を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いて検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度の相対値を示す。
【図２０３】Ｃ３Ｅ−７０３４（１−２６９）のアミノ酸配列を示した図である。ＶＨ（２−１１９）、ＶＬ（１３５−２４３）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（２４４−２６９）。（配列番号１８０）。
【図２０４】Ｃ３Ｅ−７０３５（１−２６９）のアミノ酸配列を示した図である。ＶＨ（２−１１９）、ＶＬ（１３５−２４３）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（２４４−２６９）。（配列番号１８１）。
【図２０５】Ｃ３Ｅ−７０３６（１−２６７）のアミノ酸配列を示した図である。ＶＨ（２−１１９）、ＶＬ（１３５−２４１）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（２４２−２６７）。（配列番号１８２）。
【図２０６】Ｃ３Ｅ−７０００の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示した図である（配列番号１８３）。
【図２０７】Ｃ３Ｅ−７０００の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示した図である（配列番号１８４）。
【図２０８】Ｃ３Ｅ−７０００の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示した図である（配列番号１８５）。
【図２０９】Ｃ３Ｅ−７０００の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示した図である（配列番号１８６）。
【図２１０】Ｃ３Ｅ−７０００の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示した図である（配列番号１８７）。
【図２１１】Ｃ３Ｅ−７０００の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示した図である（配列番号１８８）。
【図２１２】ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列を示した図である（配列番号１８９）。
【図２１３】Ｅ１０１８重鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号１９０）。
【図２１４】Ｅ１０１８重鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列番号１９１）。
【図２１５】Ｅ１０１８軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号１９２）。
【図２１６】Ｅ１０１８軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列番号１９３）。
【図２１７】Ｄ１０１２重鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号１９４）。
【図２１８】Ｄ１０１２重鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列番号１９５）。
【図２１９】Ｄ１０１２軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号１９６）。
【図２２０】Ｄ１０１２軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示した図である（配列番号１９７）。
【図２２１】抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（Ｃ３０２２、Ｅ１０１８、Ｃ３０４８、Ｄ１０１２）のヒトＧＰＲＣ５Ｄに対する結合活性をＳＰＲ法で測定し、結合解離定数を示した図である。
【図２２２】ｈ２Ｂ１＿Ｆａｂ＿ＨＣ＿１のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号１９８）。
【図２２３】ｈ２Ｂ１＿Ｆａｂ＿ＨＣ＿１のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、可変領域（２４−１４６）、定常領域（１４７−４７５））（配列番号１９９）。
【図２２４】ｈ２Ｂ１＿Ｆａｂ＿ＨＣ＿２のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号２００）。
【図２２５】ｈ２Ｂ１＿Ｆａｂ＿ＨＣ＿２のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、可変領域（２４−１４６）、定常領域（１４７−４７５））（配列番号２０１）。
【図２２６】ｈ２Ｂ１＿Ｆａｂ＿ＬＣ＿１のヌクレオチド配列を示した図である。（配列番号２０２）。
【図２２７】ｈ２Ｂ１＿Ｆａｂ＿ＬＣ＿１のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、可変領域（２４−１３０）、定常領域（１３１−２３７））（配列番号２０３）。
【図２２８】ｈ２Ｂ１＿Ｆａｂ＿ＬＣ＿２のヌクレオチド配列を示した図である。（配列番号２０４）。
【図２２９】ｈ２Ｂ１＿Ｆａｂ＿ＬＣ＿２のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、可変領域（２４−１３０）、定常領域（１３１−２３７））（配列番号２０５）。
【図２３０】Ｃ３Ｅ−７０３４＿Ｆａｂ＿ＨＣのヌクレオチド配列を示した図である。（配列番号２０６）。
【図２３１】Ｃ３Ｅ−７０３４＿Ｆａｂ＿ＨＣのアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、可変領域（２５−１４２）、定常領域（１４３−４７１））（配列番号２０７）。
【図２３２】Ｃ３Ｅ−７０３４＿Ｆａｂ＿ＬＣのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号２０８）。
【図２３３】Ｃ３Ｅ−７０３４＿Ｆａｂ＿ＬＣのアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、可変領域（２４−１３２）、定常領域（１３３−２３８））（配列番号２０９）。
【図２３４】Ｃ３Ｅ−７０３６＿Ｆａｂ＿ＨＣのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号２１０）。
【図２３５】Ｃ３Ｅ−７０３６＿Ｆａｂ＿ＨＣのアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、可変領域（２５−１４２）、定常領域（１４３−４７１））（配列番号２１１）。
【図２３６】Ｃ３Ｅ−７０３６＿Ｆａｂ＿ＬＣのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号２１２）。
【図２３７】Ｃ３Ｅ−７０３６＿Ｆａｂ＿ＬＣのアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、可変領域（２４−１３０）、定常領域（１３１−２３６））（配列番号２１３）。
【図２３８】ｈ２Ｂ１＿Ｆａｂ＿ＨＣ＿３のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号２１４）。
【図２３９】ｈ２Ｂ１＿Ｆａｂ＿ＨＣ＿３のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、可変領域（２４−１４６）、定常領域（１４７−４７５））（配列番号２１５）。
【図２４０】ｈ２Ｂ１＿Ｆａｂ＿ＬＣ＿３のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号２１６）。
【図２４１】ｈ２Ｂ１＿Ｆａｂ＿ＬＣ＿３のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、可変領域（２４−１３０）、定常領域（１３１−２３７））（配列番号２１７）。
【図２４２】Ｃ３Ｅ−７０３４＿ｓｃＦｖ＿Ｆｃのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号２１８）。
【図２４３】Ｃ３Ｅ−７０３４＿ｓｃＦｖ＿Ｆｃのアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、ｓｃＦｖ（２４−２６６））（配列番号２１９）。
【図２４４】Ｃ３Ｅ−７０３６＿ｓｃＦｖ＿Ｆｃのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号２２０）。
【図２４５】Ｃ３Ｅ−７０３６＿ｓｃＦｖ＿Ｆｃのアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、ｓｃＦｖ（２４−２６４））（配列番号２２１）。
【図２４６】ヒト化２Ｂ１＿ｓｃＦｖ＿Ｆｃ（ｈ２Ｂ１＿ｓｃＦｖ＿Ｆｃ）のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号２２２）。
【図２４７】ヒト化＿２Ｂ１＿ｓｃＦｖ＿Ｆｃ（ｈ２Ｂ１＿ｓｃＦｖ＿Ｆｃ）のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、ｓｃＦｖ（２４−２７１））（配列番号２２３）。
【図２４８】Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の内因性ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。ＡはＦＳＡ型、ＢはＨｙｂｒｉｄ型、ＣはＤｕａｌ型の二重特異性分子の結合活性を示した図である。
【図２４９】Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。ＡはＦＳＡ型、ＢはＨｙｂｒｉｄ型、ＣはＤｕａｌ型の二重特異性分子の結合活性を示した図である。
【図２５０】Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のヒトＣＤ３発現細胞に対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。ＡはＦＳＡ型、ＢはＨｙｂｒｉｄ型、ＣはＤｕａｌ型の二重特異性分子の結合活性を示した図である。
【図２５１】Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のカニクイザルＣＤ３発現細胞に対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。ＡはＦＳＡ型、ＢはＨｙｂｒｉｄ型、ＣはＤｕａｌ型の二重特異性分子の結合活性を示した図である。
【図２５２−１】Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の細胞障害活性を示した図である。ＡはＦＳＡ型、ＢはＨｙｂｒｉｄ型の二重特異性分子の殺細胞活性を示した図である。
【図２５２−２】Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の細胞障害活性を示した図である。ＣはＤｕａｌ型の二重特異性分子の殺細胞活性を示した図である。
【図２５３】Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のヒトＰＢＭＣとがん細胞の共移植モデルにおける抗腫瘍活性を示した図である。
【図２５４】Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のヒトＰＢＭＣ移入モデルにおける抗腫瘍活性を示した図である。
【図２５５】Ｃ３Ｅ−８０１５のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号２２４）。
【図２５６】Ｃ３Ｅ−８０１５のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、ｓｃＦｖ（２４−２６４））（配列番号２２５）。
【図２５７】Ｃ３Ｅ−８０１７のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号２２６）。
【図２５８】Ｃ３Ｅ−８０１７のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、ｓｃＦｖ（２４−２６６））（配列番号２２７）。
【図２５９】Ｃ３Ｅ−８０１８のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号２２８）。
【図２６０】Ｃ３Ｅ−８０１８のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、ｓｃＦｖ（２４−２６６））（配列番号２２９）。
【図２６１】Ｃ３Ｅ−８０２５のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号２３０）。
【図２６２】Ｃ３Ｅ−８０２５のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、ｓｃＦｖ（２４−２６４））（配列番号２３１）。
【図２６３】Ｃ３Ｅ−８０２７のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号２３２）。
【図２６４】Ｃ３Ｅ−８０２７のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、ｓｃＦｖ（２４−２６６））（配列番号２３３）。
【図２６５】Ｃ３Ｅ−８０２８のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号２３４）。
【図２６６】Ｃ３Ｅ−８０２８のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、ｓｃＦｖ（２４−２６６））（配列番号２３５）。
【図２６７】ｈ２Ｂ１＿Ｆａｂ＿ＨＣ＿４のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号２３６）。
【図２６８】ｈ２Ｂ１＿Ｆａｂ＿ＨＣ＿４のアミノ酸配列を示した図である（シグナル配列（１−２３）、可変領域（２４−１４６）、定常領域（１４７−４７６））（配列番号２３７）。
【図２６９】Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型、ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の内因性ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。ＡはＣ５Ｄ−０００４とＣ５Ｄ−００１４、ＢはＣ５Ｄ−０００５とＣ５Ｄ−００１５、ＣはＣ５Ｄ−０００６とＣ５Ｄ−００１６の結合活性を示した図である。
【図２７０】Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型、ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。ＡはＣ５Ｄ−０００４とＣ５Ｄ−００１４、ＢはＣ５Ｄ−０００５とＣ５Ｄ−００１５、ＣはＣ５Ｄ−０００６とＣ５Ｄ−００１６の結合活性を示した図である。
【図２７１】Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型、ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のヒトＣＤ３発現細胞に対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。ＡはＣ５Ｄ−０００４とＣ５Ｄ−００１４、ＢはＣ５Ｄ−０００５とＣ５Ｄ−００１５、ＣはＣ５Ｄ−０００６とＣ５Ｄ−００１６の結合活性を示した図である。
【図２７２】Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型、ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のヒトＣＤ３発現細胞に対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。ＡはＣ５Ｄ−０００４とＣ５Ｄ−００１４，ＢはＣ５Ｄ−０００５とＣ５Ｄ−００１５，ＣはＣ５Ｄ−０００６とＣ５Ｄ−００１６の結合活性を示した図である。
【図２７３−１】Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型、ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の細胞障害活性を示した図である。ＡはＣ５Ｄ−０００４、ＢはＣ５Ｄ−００１４の殺細胞活性を示した図である。
【図２７３−２】Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型、ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の細胞障害活性を示した図である。ＣはＣ５Ｄ−０００５、ＤはＣ５Ｄ−００１５の殺細胞活性を示した図である。
【図２７３−３】Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型、ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の細胞障害活性を示した図である。ＥはＣ５Ｄ−０００６、ＦはＣ５Ｄ−００１６の殺細胞活性を示した図である。
【図２７４】ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のヒトＰＢＭＣとがん細胞の共移植モデルにおける抗腫瘍活性を示した図である。
【図２７５】Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型、ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のヒトＰＢＭＣ移入モデルにおける抗腫瘍活性を示した図である。ＡはＣ５Ｄ−０００４、ＢはＣ５Ｄ−００１４の抗腫瘍活性を示した図である。
【図２７６】ＣＤＲ改変体の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である（配列番号２３８）。
【図２７７】ＣＤＲ改変体の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である（配列番号２３９）。
【図２７８】Ｃ３Ｅ−７０３４のＣＤＲ改変体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である（配列番号２４０）。
【図２７９】Ｃ３Ｅ−７０３４のＣＤＲ改変体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である（配列番号２４１）。
【図２８０】Ｃ３Ｅ−７０３５のＣＤＲ改変体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である（配列番号２４２）。
【図２８１】Ｃ３Ｅ−７０３６のＣＤＲ改変体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である（配列番号２４３）。
【図２８２】Ｃ３Ｅ−７０７８（１−２６９）のアミノ酸配列を示した図である。ＶＨ（２−１１９）、ＶＬ（１３５−２４３）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（２４４−２６９）。（配列番号２４４）
【図２８３】Ｃ３Ｅ−７０８５（１−２６７）のアミノ酸配列を示した図である。ＶＨ（２−１１９）、ＶＬ（１３５−２４１）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（２４２−２６７）。（配列番号２４５）。
【図２８４】Ｃ３Ｅ−７０８６（１−２６９）のアミノ酸配列を示した図である。ＶＨ（２−１１９）、ＶＬ（１３５−２４３）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（２４４−２６９）。（配列番号２４６）。
【図２８５】Ｃ３Ｅ−７０８７（１−２６９）のアミノ酸配列を示した図である。ＶＨ（２−１１９）、ＶＬ（１３５−２４３）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（２４４−２６９）。（配列番号２４７）。
【図２８６】Ｃ３Ｅ−７０８８（１−２６９）のアミノ酸配列を示した図である。ＶＨ（２−１１９）、ＶＬ（１３５−２４３）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（２４４−２６９）。（配列番号２４８）。
【図２８７】Ｃ３Ｅ−７０８９（１−２６９）のアミノ酸配列を示した図である。ＶＨ（２−１１９）、ＶＬ（１３５−２４３）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（２４４−２６９）。（配列番号２４９）。
【図２８８】Ｃ３Ｅ−７０９０（１−２６９）のアミノ酸配列を示した図である。ＶＨ（２−１１９）、ＶＬ（１３５−２４３）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（２４４−２６９）。（配列番号２５０）。
【図２８９】Ｃ３Ｅ−７０９１（１−２６９）のアミノ酸配列を示した図である。ＶＨ（２−１１９）、ＶＬ（１３５−２４３）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（２４４−２６９）。（配列番号２５１）。
【図２９０】Ｃ３Ｅ−７０９２（１−２６９）のアミノ酸配列を示した図である。ＶＨ（２−１１９）、ＶＬ（１３５−２４３）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（２４４−２６９）。（配列番号２５２）。
【図２９１】Ｃ３Ｅ−７０９３（１−２６９）のアミノ酸配列を示した図である。ＶＨ（２−１１９）、ＶＬ（１３５−２４３）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（２４４−２６９）。（配列番号２５３）。
【図２９２】Ｃ３Ｅ−７０９４（１−２６９）のアミノ酸配列を示した図である。ＶＨ（２−１１９）、ＶＬ（１３５−２４３）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（２４４−２６９）。（配列番号２５４）。
【図２９３】Ｃ３Ｅ−７０９５（１−２６９）のアミノ酸配列を示した図である。ＶＨ（２−１１９）、ＶＬ（１３５−２４３）、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（２４４−２６９）。（配列番号２５５）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．定義
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド又はその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれるポリヌクレオチド又はその相補鎖であるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等は「遺伝子」の意味に含まれる。かかる遺伝子は一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するもの及びそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチドも「遺伝子」の意味に含まれる。本発明において塩基配列とヌクレオチド配列は同義である。  
本発明において、「ポリヌクレオチド」、「核酸」及び「核酸分子」は同義であり、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、プライマー等も「ポリヌクレオチド」の意味に含まれる。かかるポリヌクレオチドは一本鎖、二本鎖又は三本以上の鎖からなるポリヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のポリヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するもの及びそのようなポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖又は三本以上の鎖の会合体も「ポリヌクレオチド」の意味に含まれる。  
本発明において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「蛋白質」は同義である。  
本発明において、「抗原」を「免疫原」の意味に用いることがある。  
本発明において、「細胞」には、動物個体に由来する各種細胞、継代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、組換え細胞及び微生物等も含まれる。  
本発明において、「抗体」は免疫グロブリンと同義である。ただし、本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、あるいは、本発明の抗ＣＤ３抗体という場合の「抗体」は、定常領域と可変領域とを有する免疫グロブリンの意味で用いる。抗体は、天然のものであるか、又は、部分的もしくは完全合成により製造された免疫グロブリンであるかは特に限定されない。本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、及び／又は、抗ＣＤ３抗体は、部品（parts）として後述の「分子」に含まれる。      
【００１０】
基本的な４鎖抗体の構造は、２つの同一な軽（Ｌ）鎖、及び、２つの同一な重（Ｈ）鎖から構成される。軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合する。２つの重鎖は、重鎖のアイソタイプに応じて１つ又は複数のジスルフィド結合により互いに結合している。それぞれの軽鎖、重鎖は規則的な間隔を持つ鎖内ジスルフィド結合を持つ。重鎖と軽鎖には、アミノ酸配列が非常に高い類似性を示す定常領域とアミノ酸配列の類似性が低い可変領域とが存在する。軽鎖は、定常領域（ＣＬ）が続く可変領域（ＶＬ）をアミノ末端に有する。重鎖は３つの定常領域（ＣＨ１／ＣＨ２／ＣＨ３）が続く可変領域（ＶＨ）をアミノ末端に有する。ＶＬとＶＨは対となり、ＣＬは重鎖の第一定常領域（ＣＨ１）と並んでいる。ＶＬとＶＨは対となって、単一の抗原結合部位を形成する。  
Ｆａｂは、重鎖のＣＨ１とそれに続くＶＨ、及び、軽鎖のＣＬとそれに続くＶＬからなる。ＶＨとＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。  
Ｆｃは、重鎖の定常領域のカルボキシル末端領域であって、ＣＨ２とＣＨ３を含み、二量体である。本発明のＦｃは、天然の配列のＦｃ（天然型Ｆｃとも記す）であっても、天然の配列に変異が加わった変異型のＦｃ（変異型Ｆｃとも記す）であってもよい。
変異型Ｆｃとしては、ＷＯ２０１３／０６３７０２に開示される、向上した安定性を有するヘテロ多量体に含まれる改変Ｆｃ領域（ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む）、ＷＯ９６／２７０１１に開示される異種多量体に含まれる、「突起」及び「空隙」を有するＩｇＧ抗体から誘導されるイムノグロブリンのＣＨ３領域を含むＦｃ、ＷＯ２００９／０８９００４に開示される、１以上のアミノ酸残基を荷電アミノ酸に置換することで静電的に有利であるヘテロ二量体に含まれるＣＨ３ドメインを含むＦｃ、ＷＯ２０１４／１１０６０１に開示される、立体構造変異及び／又はｐＩ（等電点）変異を用いた異種二量体に含まれる異種二量体Ｆｃ領域、ＷＯ２０１０／１５１７９２に開示される、プロテインＡへの結合を無くすかまたは減少させる改変を含むＣＨ３ドメインを含む、ヘテロ二量体のＦｃ等が例示されるが、これらに限定されるものではない。
可変領域は、超可変領域（ＨＶＲ：ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）と称される極度の可変性を有する領域と、その領域により分離されたフレームワークリージョン（ＦＲ：Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる比較的不変の領域からなる。天然の重鎖と軽鎖の可変領域は、３つの超可変領域により接続される４つのＦＲを含み、各鎖の超可変領域はＦＲにより他の鎖の超可変領域とともに極近傍に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。
抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、通常、それぞれ３ヶ所に分離している。本発明においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側から重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）、重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側から軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
本発明において、ＣＤＲの位置と長さは、ＩＭＧＴの定義（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２７  （２００３）  ５５−７７）により決定した。
フレームワークリージョン（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変領域である。可変領域は、一般にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の４つのＦＲを持ち、重鎖並びに軽鎖のＦＲを、そＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３及びＦＲＨ４、並びに、ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３及びＦＲＬ４とそれぞれ表記する。  
重鎖並びに軽鎖に含まれるＣＤＲとＦＲは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ＦＲＨ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４、並びに、ＦＲＬ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４、の順にそれぞれ配置される。  
ＣＤＲとＦＲの位置は、当技術分野で周知の様々な定義、例えば、ＩＭＧＴ以外にも、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ｃｏｎｔａｃｔ等の定義により決定することもできる。
【００１１】
本発明において、「抗体の抗原結合性断片」とは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域から構成される、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味する。「抗体の抗原結合性断片」としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｓｄＡｂ）等の抗原結合断片を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。かかる抗体の抗原結合性断片は、抗体蛋白質の全長分子をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することによって得られたものに加え、組換え遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された組換え蛋白質であってもよい。
本発明において、抗体が結合する「部位」、すなわち抗体が認識する「部位」とは、抗体が結合又は認識する抗原上の部分ペプチド又は部分高次構造を意味する。
本発明においては、かかる部位のことをエピトープ、抗体の結合部位とも呼ぶ。
本発明において、「抗体変異体」とは、元の抗体が有するアミノ酸配列においてアミノ酸が置換、欠失、付加（付加には挿入が含まれる）（以下、「変異」と総称する）してなるアミノ酸配列を有し、且つ抗原に結合するポリペプチドを意味する。かかる抗体変異体における変異アミノ酸の数は、１乃至２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０又は５０個である。かかる抗体変異体も本発明の「抗体」に包含される。  
本発明において、「１乃至数個」における「数個」とは、２乃至１０個を指す。
本明細書中において、「分子」は、上述の抗体、抗体の抗原結合性断片を含む分子であり、さらに抗体又はそれらに由来する複数の抗原結合性断片より形成された多重特異的である分子であってもよい。
本明細書中において、「多重特異的である分子」「多重特異的（な）分子」及び「多重特異性分子」は同義であり、１つの分子上の複数の互いに異なるエピトープ、及び／又は、２つ以上の分子上の互いに異なるエピトープに結合することが可能な分子であれば特に限定されない。多重特異的である分子としては、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体も含まれる。このような多重特異的な分子には、異なる２種類以上の重鎖及び軽鎖を有する完全長抗体分子、すなわちＩｇＧ型多重特異性分子、及び２種類以上のＶＬ及びＶＨを有する抗原結合性断片からなる分子、すなわち、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ等を組み合わせて派生する分子、すなわちタンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、トリアボディ等を含むが、これらに限定されない。その他抗原結合性断片に免疫グロブリン骨格を有さないで抗原結合性を有する蛋白質を遺伝子的、あるいは化学的に連結させることにより生じる分子も多重特異性分子として含まれる。
本発明の抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片、あるいは、本発明の多重特異的である分子が有する活性・性質としては、例えば、生物学的活性、理化学的性質等を挙げることができ、具体的には、各種生物活性、抗原やエピトープに対する結合活性、製造や保存時における安定性、熱安定性等をあげることができる。
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、５×ＳＳＣを含む溶液中で６５℃にてハイブリダイゼーションを行い、ついで２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、０．５×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、ならびに、０．２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、それぞれ洗浄する条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることを意味する。ＳＳＣとは１５０ｍＭＮａＣｌ−１５ｍＭクエン酸ナトリウムの水溶液であり、ｎ×ＳＳＣはｎ倍濃度のＳＳＣを意味する。
本発明において「細胞傷害」とは、何らかの形で、細胞に病理的な変化をもたらすことを指し、直接的な外傷にとどまらず、ＤＮＡの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷を意味する。
本発明において「細胞傷害活性」とは上記細胞傷害を引き起こすことを意味する。
本発明において「抗体依存性細胞傷害活性」とは、「ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｕｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）活性」を指し、ＮＫ細胞が抗体を介して腫瘍細胞等の標的細胞を傷害する作用活性を意味する。
本発明において「Ｔ細胞リダイレクションによる細胞傷害活性」とは抗腫瘍抗原等の抗標的抗原抗体と抗ＣＤ３抗体とを含む多重特異的な分子を介して上記細胞傷害を引き起こすことを意味する。好適には、抗腫瘍抗原抗体が標的腫瘍細胞と結合し、抗ＣＤ３抗体がＴ細胞に結合することにより標的腫瘍細胞とＴ細胞の距離を近づけ、Ｔ細胞活性化を介して細胞傷害を誘導することを意味する。該分子は、医薬組成物に含めることができる。
本発明において「天然に存在するアミノ酸」及び「天然に存在するアミノ酸残基」とは、Ａｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）及びＶａｌ（Ｖ）及びそれらの残基を意味し、「天然のアミノ酸」又は「天然のアミノ酸残基」ともいう。
【００１２】
２．抗原蛋白質
２−１．ＧＰＲＣ５Ｄ抗原  
本発明において、「ＧＰＲＣ５Ｄ」は、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質と同じ意味で用いている。
ＧＰＲＣ５Ｄは、代謝型グルタミン酸レセプター様ファミリーＣ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  Ｃ）の第５群に分類される一連のヒトＧＰＣＲのアミノ酸配列を用いたＥＳＴデータベースのホモロジー検索により新たに見出された、ヒトＧＰＣＲ蛋白質の１つである（非特許文献１）。ＧｅｎＢａｎｋに受託番号：ＡＦ２０９９２３、ＮＭ＿０１８６５４、ＮＰ＿０６１１１２４として登録されている。しかしながら、ＧＰＲＣ５Ｄの生理機能や生理的リガンド、共役するＧ蛋白質（αサブユニット）のサブタイプ等については明らかになっていない。
【００１３】
２−２．ＣＤ３抗原
本発明において、「ＣＤ３」は、ＣＤ３蛋白質と同じ意味で用いている。
ＣＤ３は、多分子Ｔ細胞レセプター複合体の一部分としてＴ細胞上に発現され、γ鎖、δ鎖、ε鎖、ζ鎖、η鎖の５種類のポリペプチド（分子量は順に２５０００−２８０００、２１０００、２００００、１６０００、２２０００）の複合体である。
ＣＤ３複合体としては、γ、δ、ε、ζ、η鎖が挙げられる。これらはサブユニットとも称される。抗ＣＤ３抗体がＴ細胞に結合することにより、Ｔ細胞活性化を介して細胞傷害を誘導する。多くの抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３εに結合する。
ヒトＣＤ３εをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＭ＿０００７３３．３で登録されている。カニクイザルＣＤ３をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＭ＿００１２８３６１５．１で登録されている。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は配列表の配列番号１８９に記載されている。
【００１４】
２−３．抗原蛋白質の調製
本発明で用いる上述の抗原蛋白質；ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ３（以下、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ３をまとめて、該抗原蛋白質とも記す）は、動物組織（体液を含む）、該組織由来の細胞もしくは該細胞培養物からの精製及び単離、遺伝子組換え、インビトロ翻訳、化学合成等により調製することができる。
該抗原蛋白質のｃＤＮＡは、例えば、該抗原蛋白質のｍＲＮＡを発現している臓器のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、該抗原蛋白質のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，４８７−４９）を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。
ヒト又はラットに発現している該抗原蛋白質をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、該抗原蛋白質と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドも該抗原蛋白質のｃＤＮＡに含まれる。
さらに、ヒト又はラットに発現している該抗原蛋白質遺伝子座から転写されるスプライシングバリアント又はこれにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、且つ、該抗原蛋白質と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドも該抗原蛋白質のｃＤＮＡに含まれる。
ヒト又はラットの該抗原蛋白質のアミノ酸配列、又はこれらの配列からシグナル配列が除かれたアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、該抗原蛋白質と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列も、該抗原蛋白質遺伝子のヌクレオチド配列に含まれる。
ヒト又はラットの該抗原蛋白質の遺伝子座から転写されるスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が、置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、該抗原蛋白質と同等の生物活性を有する蛋白質も該抗原蛋白質に含まれる。
【００１５】
２−４  抗原蛋白質への結合特異性
本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、及び、その抗原結合性断片等は、ヒトＧＰＲＣ５Ｄをに認識する。すなわち、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合し、好適にはヒトＧＰＲＣ５Ｄ及びサルＧＰＲＣ５Ｄに結合し、より好適にはヒト及びカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに結合する。後述する本発明のヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のｈ２Ｂ１抗体及び、ヒト抗体のＣ３０４８は、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに加え、さらにカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄにも結合する。
本発明の多重特異的分子に含まれる抗ＣＤ３抗体、及び、その抗原結合性断片等は、ＣＤ３抗原を認識する。すなわち、結合する。本発明の多重特異的分子に含まれる抗ＣＤ３抗体、及び、その抗原結合性断片等は、好適には、ヒトＣＤ３、サルＣＤ３等に結合し、より好適には、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する。
【００１６】
ヒト及びカニクイザルの抗原蛋白質に結合する抗体やその抗原結合性断片は、医薬品の非臨床開発（前臨床開発）に有用な霊長類、特にカニクイザルを用いた有効性や安全性に関する各種試験に供することができ好ましい。
一方、本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、好適にはマウス及び／又はラットのＧＰＲＣ５Ｄには結合しないので、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子が導入されたマウスの細胞、組織、個体（トランスジェニック動物、ノックアウト動物、ノックイン動物を含む）及び該抗体又は本発明の多重特異的分子等を用いた各種アッセイ、免疫組織化学等を、宿主であるマウス及び／又はラットのＧＰＲＣ５Ｄによる影響無しに実施することができ、該抗体又は本発明の多重特異的分子等を含む医薬、動物薬又は診断薬等のマウスを用いた研究及び非臨床開発上好ましい。
同様に、本発明の多重特異的分子に含まれる抗ＣＤ３抗体は、好適にはマウス及び／又はラットのＣＤ３には結合しないので、ヒトＣＤ３遺伝子が導入されたマウスの細胞、組織、個体（トランスジェニック動物、ノックアウト動物、ノックイン動物を含む）及び該抗体又は本発明の多重特異的分子等を用いた各種アッセイ、免疫組織化学等を、宿主であるマウス及び／又はラットのＣＤ３による影響無しに実施することができ、該抗体又は本発明の多重特異的分子等を含む医薬、動物薬又は診断薬等のマウスを用いた研究及び非臨床開発上好ましい。
【００１７】
本発明において「認識」、すなわち「結合」とは、非特異的な吸着ではない結合を意味する。認識しているか否か、すなわち、結合しているか否の判定基準としては、例えば、解離定数（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ：以下、「ＫＤという」）を挙げることができる。本発明の好適な抗体等のＣＤ３に対するＫＤ値は１×１０−５Ｍ以下、５×１０−６Ｍ以下、２×１０−６Ｍ以下又は１×１０−６Ｍ以下である。
本発明における抗原と抗体の結合は、ＳＰＲ法、ＢＬＩ法等の生体分子間相互作用解析システム、あるいはＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等により測定又は判定することができる。細胞表面上の発現している抗原と抗体との結合は、フローサートメトリー法等により測定することができる。
ＳＰＲ法（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ解析法）は、反応速度論的（カイネティクス）解析により結合速度定数（Ｋａ値）と解離速度定数（Ｋｄ値）を計測することによりアフィニティーの指標となる解離定数（ＫＤ値）等を求める分析手法として用いられている。ＳＰＲ解析に用いる機器としては、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥヘルスケア社製）、ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）（ＢｉｏＲａｄ社製）、ＳＰＲ−Ｎａｖｉ（商標）（ＢｉｏＮａｖｉｓ社製）、Ｓｐｒｅｅｔａ（商標）（Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）、ＳＰＲｉ−ＰｌｅｘＩＩ（商標）（ホリバ社製）、Ａｕｔｏｌａｂ  ＳＰＲ（商標）（Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）等を例示することができる。  
ＢＬＩ法（ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）は、バイオレイヤー干渉を用いた生体分子間相互作用を計測する方法である。ＢＬＩ法を用いた相互作用解析に用いる機器としては、Ｏｃｔｅｔシステム（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）等を例示することができる。
ＥＬＩＳＡ法は、試料溶液中に含まれる目的の抗原あるいは抗体を、特異抗体あるいは抗原で捕捉するとともに、酵素反応を利用して検出・定量する方法である。酵素標識した抗原あるいは抗体を反応系に組込んで、酵素活性を検出する。酵素活性の検出には、反応によって吸光スペクトルが変化する基質が用いられ、吸光度測定で数値化する。
Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡでは、細胞表面にある測定対象を細胞ごと捕捉するとともに、酵素反応を利用して検出・定量する方法である。
ＲＩＡ法（Ｒａｄｉｏ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ法）では、放射性物質を使って抗体を標識し、抗体からの放射能を測定することで、抗体の定量をすることができる。
フローサイトメトリーは、細胞を流体中に分散させ、その流体を細く流して、個々の細胞を光学的に分析する手法である。蛍光色素で標識された抗体が、抗原抗体反応により細胞表面抗原に結合し、細胞に結合した標識された抗体による蛍光強度を測定することにより、抗体の抗原結合性を定量する。
【００１８】
３．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体
３−１．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の種類
本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれであってもよい。ポリクローナル抗体としては、ＣＤＲセットの一部又は全部が異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。モノクローナル抗体としては、非ヒト動物由来の抗体（非ヒト動物抗体）、ヒト抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体等を挙げることができる。
非ヒト動物抗体としては、哺乳類、鳥類等の脊椎動物に由来する抗体などを挙げることができる。哺乳類由来の抗体としては、マウス抗体、ラット抗体などのげっ歯類由来の抗体などを挙げることができる。鳥類由来の抗体としては、ニワトリ抗体等を挙げることができる。抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄラットモノクローナル抗体としては、本発明の２Ａ４、２Ｂ１、７Ｂ４（実施例１）等を挙げることができる。
２Ａ４の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号５に、２Ｂ１の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号７に、７Ｂ４の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号９に、それぞれ示されている。
２Ａ４の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１２に、２Ｂ１の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１４に、７Ｂ４の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１６に、それぞれ示されている。  
２Ａ４、２Ｂ１、７Ｂ４は、ＡＤＣＣ活性を有している（実施例２）。
【００１９】
キメラ化抗体としては、非ヒト動物抗体由来の可変領域とヒト抗体（ヒト免疫グロブリン）定常領域とを結合してなる抗体などを挙げることができる。
ラット抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ａ４由来のキメラ化抗体は、配列番号２２の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖と、配列番号２６の２０乃至１４１番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体を挙げることができる。このような２Ａ４由来のキメラ化抗体の一例として、配列番号２２の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖と、配列番号２６の２０乃至４７１番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体を挙げることができる。本明細書において、該抗体をｃ２Ａ４と呼ぶ。
ラット抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ｂ１由来のキメラ化抗体は、配列番号３０の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖と、配列番号３４の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体を挙げることができる。このような２Ｂ１由来のキメラ化抗体の一例として、配列番号３０の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖と、配列番号３４の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体を挙げることができる。本明細書において、該抗体をｃ２Ｂ１と呼ぶ。
ラット抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体７Ｂ４由来のキメラ化抗体は、配列番号３８の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖と、配列番号４２の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域を含む重鎖からなる抗体を挙げることができる。このような７Ｂ４由来のキメラ化抗体の一例として、配列番号３８の２１乃至２３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖と、配列番号４２の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基からなる重鎖からなる抗体を挙げることができる。本明細書において、該抗体をｃ７Ｂ４と呼ぶ。
【００２０】
ヒト化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，５２２−５２５）、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際特許公開ＷＯ１９９０／００７８６１号））、それらのいずれかの非ヒト動物抗体由来の１つ又は２つ以上のアミノ酸をヒト型のアミノ酸で置換したものなどを挙げることができる。
上述のキメラ化抗体由来のヒト化抗体は、上述のキメラ化抗体、ひいてはラット抗体に由来する６種全てのＣＤＲ配列を保持し、ＡＤＣＣ活性を有している。したがって、以下に示す６種全てのＣＤＲ配列を保持する抗体としては、ラット抗体、キメラ化抗体、あるいは、ヒト化抗体が例示される。
上述の２Ａ４由来のヒト化抗体の重鎖可変領域は、
配列番号４５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１（ＧＹＴＦＴＳＹＹ）
配列番号４６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２（ＶＹＰＧＹＧＧＴ）
配列番号４７に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３（ＡＲＲＫＧＩＩＲＧＰＧＹＦＤＹ）
を保持しており、軽鎖可変領域は、
配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１（ＥＧＩＳＮＳ）
配列番号５５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２（ＧＡＳ）
配列番号５６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３（ＱＱＧＹＫＹＰＰＴ）
を保持している。
上述の２Ｂ１由来のヒト化抗体の重鎖可変領域は、
配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１（ＧＦＳＬＮＴＹＤＭＧ）
配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２（ＩＷＷＤＤＤＫ）
配列番号５０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３（ＡＲＩＥＴＶＲＶＳＲＫＧＦＡＨ）
を保持しており、軽鎖可変領域は、
配列番号５７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１（ＱＳＶＧＩＮ）
配列番号５８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２（ＧＡＳ）
配列番号５９に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３（ＬＱＨＧＳＩＰＰＴ）
を保持している。
上述の７Ｂ４由来のヒト化抗体の重鎖可変領域は、
配列番号５１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１（ＧＹＴＩＴＳＧＹＤ）
配列番号５２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２（ＭＳＹＲＧＳＴ）
配列番号５３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３（ＡＬＴＲＴＹＷＹＮＹＹＹＶＬＤＡ）
を保持しており、軽鎖可変領域は、
配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１（ＱＮＩＮＫＹ）
配列番号６１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２（ＮＴＮ）
配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３（ＬＱＲＮＳＷＹＴ）
を保持している。
上述のＣＤＲのアミノ酸配列は、図５４乃至７１にも記載されている。
本発明において、ＣＤＲの位置と長さは、ＩＭＧＴの定義（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２７  （２００３）  ５５−７７）により決定した。
【００２１】
ヒト化抗体の好適例としては、
配列番号６４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基、
配列番号６６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基、
配列番号６８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基、
配列番号７０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基、及び
配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
配列番号７４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、
配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、
配列番号７８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、及び
配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体を挙げることができる。
【００２２】
また、他のヒト化抗体の好適例としては、
配列番号８２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基、又は
配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
配列番号８６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、
配列番号８８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、
配列番号９０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基、及び
配列番号９２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体を挙げることができる。
【００２３】
ヒト化抗体の具体的な好適例としては、
・配列番号７４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号７８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号６８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
・配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
のいずれか１つの、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組み合わせを含む抗体を挙げることができる。
【００２４】
また、他のヒト化抗体の具体的な好適な例としては、
・配列番号８６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号８８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号９０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号８２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号９０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
・配列番号９２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号８２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
のいずれか１つの、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組み合わせを含む抗体を挙げることができる。
【００２５】
ヒト化抗体のさらに好適な具体例としては、
・配列番号７４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号６４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基を含む軽鎖、
・配列番号７４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号６６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基を含む軽鎖、
・配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号６６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基を含む軽鎖、
・配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号６８に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基を含む軽鎖、
・配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号７０に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基を含む軽鎖、
・配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基を含む軽鎖、
・配列番号７８に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号６８に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基を含む軽鎖、
・配列番号７８に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号７０に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基を含む軽鎖、
・配列番号７８に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基を含む軽鎖、
・配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号６４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基を含む軽鎖、
・配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号６８に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基を含む軽鎖、
・配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、又は、配列番号７０に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基を含む軽鎖、及び、  
・配列番号８０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基を含む軽鎖
のいずれか１つの、重鎖及び軽鎖の組み合わせを含む抗体を挙げることができる。
【００２６】
また、他のヒト化抗体のさらに好適な具体例としては、
・配列番号８６に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３３番目のアミノ酸残基を含む軽鎖、
・配列番号８８に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３３番目のアミノ酸残基を含む軽鎖、
・配列番号９０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号８２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３３番目のアミノ酸残基を含む軽鎖、
・配列番号９０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３３番目のアミノ酸残基を含む軽鎖、又は、
・配列番号９２に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基を含む重鎖、及び、配列番号８２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３３番目のアミノ酸残基を含む軽鎖のいずれか１つの、重鎖及び軽鎖の組み合わせを含む抗体を挙げることができる。
上述のラット抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体は、Ｆｃを含んでいてもよい。
また、上述のラット抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域を含んでいてもよい。
【００２７】
ヒト化抗体のよりさらに好適な例としては、上述の重鎖可変領域と軽鎖可変領域、好ましくは、２Ｂ１由来のヒト化抗体の重鎖可変領域、及び、軽鎖可変領域、並びに、
ｉ）配列番号１９９に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０３に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉ）配列番号２０１に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０５に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、  
ｉｉｉ）配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域  
又は、
ｉｖ）配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
を含む抗体を挙げることができる。
ヒト化抗体の特に好適な例としては、配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
ｉ）配列番号１９９に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０３に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉ）配列番号２０１に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０５に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉｉ）配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
又は、
ｉｖ）配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
を含む抗体を挙げることができる。  
これらの中でも、配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
ｉｉｉ）配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
又は、
ｉｖ）配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
を含む抗体がより好ましい。
【００２８】
このような抗体の具体的な例としては、  
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、又は
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、
を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体を挙げることができる。
ヒト化抗体の他のよりさらに好適な例としては、上述の重鎖可変領域と軽鎖可変領域、好ましくは、２Ｂ１由来のヒト化抗体の重鎖可変領域、及び、軽鎖可変領域、並びに、天然型又は変異型Ｆｃを含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体を挙げることができる。
このような抗体の特に好適な例としては、配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、天然型又は変異型Ｆｃを含む抗体を挙げることができる。より具体的には、配列番号２２３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と天然型又は変異型Ｆｃを含む抗体を挙げることができる。
【００２９】
ヒト抗体としては、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体であれば特に限定されるものではない。本発明のヒト化抗体と同一の部位に結合するヒト抗体等も例示することができる。たとえば、ｈ２Ｂ１Ｈ２Ｌ５と同一の部位に結合するヒト抗体が例示される。
本発明のヒト抗体としては、下記（１）乃至（４）のいずれか１つに記載の重鎖可変領域、並びに、軽鎖可変領域を含む抗体が例示される；
（１）
配列番号１１１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１１２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号１１４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１１５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
（２）配列番号１１７に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１１８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号１２０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１２１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１２２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
（３）
配列番号１２３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１２４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１２５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号１２６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１２７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１２８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
（４）
配列番号１２９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１３１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号１３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
なお、上述のＣＤＲのアミノ酸配列は、図１２４乃至１４７にも記載されている。
【００３０】
ヒト抗体の好適例としては、
配列番号９７に示されるアミノ酸配列、
配列番号１０１に示されるアミノ酸配列、
配列番号１０５に示されるアミノ酸配列、及び
配列番号１０９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む重鎖可変領域、
並びに、
配列番号９９に示されるアミノ酸配列、
配列番号１０３に示されるアミノ酸配列、
配列番号１０７に示されるアミノ酸配列、及び
配列番号１３５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む軽鎖可変領域
を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片を挙げることができる。
【００３１】
ヒト抗体の具体的な好適な例としては、
・配列番号９７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号９９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号１０１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
・配列番号１０９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号１３５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
のいずれか１つの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組み合わせを含む抗体を挙げることができる。このような抗体としては、１本鎖抗体（ｓｃＦｖとも記載する）が含まれる（実施例１０）−４）。
【００３２】
また、ヒト抗体としては、上述の軽鎖可変領域と重鎖可変領域に、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域（ＣＨ１とＦｃ領域）、若しくは、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）が連結されたＩｇＧ型の抗体が挙げられる。このようなＩｇＧ型のヒト抗体としては、
・配列番号１４４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号１４５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、
・配列番号１４６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号１４７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、
・配列番号１４８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号１４９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、又は、
・配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号１５１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖
のいずれか１つの重鎖及び軽鎖の組み合わせを含む抗体が挙げられる。
【００３３】
本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合するならば、複数の異なる抗体に由来する部分から構成される抗体であってもよく、例えば、複数の異なる抗体間で重鎖及び／又は軽鎖を交換したもの、重鎖及び／又は軽鎖の全長を交換したもの、可変領域のみ又は定常領域のみを交換したもの、ＣＤＲの全部又は一部のみを交換したもの等を挙げることができる。キメラ化抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、異なる本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体に由来してもよい。ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域中の重鎖ＣＤＲ１乃至重鎖ＣＤＲ３並びに軽鎖ＣＤＲ１乃至軽鎖ＣＤＲ３は、２種又はそれ以上の本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体に由来してもよい。ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域中の重鎖ＣＤＲ１乃至重鎖ＣＤＲ３並びに軽鎖ＣＤＲ１乃至軽鎖ＣＤＲ３は、２種又はそれ以上の本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が有するＣＤＲの組合せであってもよい。
本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体には、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結した一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）が含まれる（Ｌｅｅ，Ｈ−Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）３６，６１−７１；Ｓｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１０），２（１），１−４）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。
【００３４】
本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又は該抗体の抗原結合性断片には、本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片も含まれる。
本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又は該抗体の抗原結合性断片としては、重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び／又は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、前記（８）乃至（１２）、（１８）乃至（２０）のいずれか１つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列と、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上同一であって、且つヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片であってもよい。
【００３５】
軽鎖可変領域の位置と長さは、ＩＭＧＴの定義により決定する場合と比べ、ＩＭＧＴとは異なる定義を用いて決定した場合、ＩＭＧＴの定義により決定した該軽鎖可変領域アミノ酸配列のカルボキシル末端に、さらに、１つ又は２つ以上のアミノ酸、例えば、アルギニン（Ｒ）やグリシン（Ｇ）が含まれることがある。このような軽鎖可変領域を有する抗体又はその抗原結合性断片も本発明の抗体又はその抗原結合性断片に包含される。
本発明の抗体等としては、本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の抗原結合性断片に変異を導入して、ＧＰＲＣ５Ｄ、特にヒト及び／又はカニクイザルのＧＰＲＣ５Ｄに対する結合能を最適化させたものであっても良い。変異を導入する具体的な方法として、エラープローンＰＣＲ法を用いたランダム突然変異誘発法、ＮＮＫライブラリーを用いた部位特異的アミノ酸変異導入、構造情報を利用した部位特異的変異導入、及びそれら組み合わせを挙げることができる。
【００３６】
３−２．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の抗体変異体
本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の抗体変異体には、好適には、蛋白質の分解もしくは酸化に対する感受性の低下、生物活性や機能の維持、改善もしくは低下や変化の抑制、抗原結合能の改善もしくは調節、又は理化学的性質もしくは機能的性質の付与等がなされ得る。蛋白質は、その表面にある特定のアミノ酸側鎖が変化して当該蛋白質の機能や活性が変化することが知られ、そのような例には、アスパラギン側鎖の脱アミド化、アスパラギン酸側鎖の異性化等が含まれる。そのようなアミノ酸側鎖の変化を防ぐために別のアミノ酸に置き換えたものも、本発明の抗体変異体の範囲に含まれる。
本発明の抗体変異体の例として、抗体の有するアミノ酸配列において保存的アミノ酸置換されてなるアミノ酸配列を有する抗体を挙げることができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸側鎖に関連のあるアミノ酸グループ内で生じる置換である。
好適なアミノ酸グループは、以下のとおりである：酸性グループ＝アスパラギン酸、グルタミン酸；塩基性グループ＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；非極性グループ＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び非帯電極性ファミリー＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。他の好適なアミノ酸グループは次のとおりである：脂肪族ヒドロキシグループ＝セリン及びスレオニン；アミド含有グループ＝アスパラギン及びグルタミン；脂肪族グループ＝アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；並びに芳香族グループ＝フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン。かかる抗体変異体におけるアミノ酸置換は、元の抗体が有する抗原結合活性を低下させない範囲で行うのが好ましい。
２Ａ４、２Ｂ１、あるいは、７Ｂ４等の本発明の抗体が有するアミノ酸配列において保存的アミノ酸置換及び／又はその他の変異がなされたアミノ酸配列を有し、且つ、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体変異体、それらの抗原結合断片、それらを含む分子等；２Ａ４、２Ｂ１、あるいは、７Ｂ４等を含む本発明の抗体由来のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３のいずれかのアミノ酸配列において保存的アミノ酸置換及び／又はそも他の変異がなされたアミノ酸配列を有し、且つ、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する該ＣＤＲを含むマウス抗体、ラット抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、それらの抗原結合断片、それらを含む分子等；並びに、Ｃ２０３７、Ｃ３０４８、Ｃ３０１５、あるいは、Ｃ３０２２等の本発明の抗体が有するアミノ酸配列において保存的アミノ酸置換がなされたアミノ酸配列を有し、且つ、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体変異体、それらの結合断片、それらを含む分子等；Ｃ２０３７、Ｃ３０４８、Ｃ３０１５、あるいは、３０２２等の本発明の抗体由来のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３のいずれかのアミノ酸配列において保存的アミノ酸変異がなされたアミノ酸配列を有し、且つ、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する該ＣＤＲを含むキメラ抗体、ヒト抗体、それらの抗原結合断片、それらを含む分子等も本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、その抗原結合断片、その変異体、又は本発明の分子に包含される。
【００３７】
３−３．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の抗原結合性断片  
本発明の一つの態様として、本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の抗原結合性断片を提供する。本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の抗原結合性断片には、キメラ化抗体、ヒト化抗体、又は、ヒト抗体の抗原結合性断片が包含される。抗体の抗原結合性断片とは、該抗体の有する機能のうち少なくとも抗原結合性を保持する断片又はその修飾物を意味する。かかる抗体の機能としては、一般的には、抗原結合活性、抗原の活性を調節する活性（例えばアゴニスト活性）、抗原を細胞内に内在化させる活性、抗原と相互作用する物質との相互作用を阻害もしくは促進する活性等を挙げることができる。
抗体の抗原結合性断片としては、該抗体の有する活性のうち少なくとも抗原結合性を保持している該抗体の断片であれば特に限定されない。このような抗体の抗原結合性断片として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ軽鎖のカルボキシル末端とＦａｂ重鎖のアミノ末端とが適当なリンカーで連結された一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、Ｆｖ、重鎖及び軽鎖のＦｖが適当なリンカーで連結された一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一の重鎖可変領域を有し軽鎖配列を有さない単一ドメイン抗体｛（ｓｄＡｂ）、又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）とも呼ばれる。（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ  Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，（１９９４）７（９），１１２９−３５，Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８），４４６−４４８）］等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。リンカー部分を保有するｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖのように、本発明の抗体の抗原結合性断片以外の部分を含む分子も、本発明の抗体の抗原結合性断片の意味に包含される。
【００３８】
３−４  抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又はその抗原結合性断片の修飾体、複合体
本発明は、抗体又はその抗原結合性断片の修飾体を提供する。本発明の抗体又はその抗原結合性断片の修飾体とは、本発明の抗体又はその抗原結合性断片に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ−結合又はＯ−結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、Ｎ−結合又はＯ−結合への糖鎖付加、アミノ末端領域又はカルボキシル末端領域のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化）されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによりアミノ末端にメチオニン残基が付加したもの等が含まれる。また、本発明の抗体又は抗原の検出又は単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティー標識体もかかる修飾物の意味に含まれる。このような本発明の抗体又はその抗原結合性断片の修飾物は、元の本発明の抗体又はその抗原結合性断片の安定性及び血中滞留性の改善、抗原性の低減、かかる抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。  
化学的修飾体に含まれる化学部分としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等の水溶性ポリマーを例示することができる。  
生物学的な修飾物としては、酵素処理や細胞処理等により修飾が施されたもの、遺伝子組換えによりタグ等他のペプチドが付加された融合体、ならびに内因性又は外来性の糖鎖修飾酵素を発現する細胞を宿主として調製されたもの等を挙げることができる。
かかる修飾は、抗体又はその抗原結合性断片における任意の位置に、又は所望の位置において施されてもよく、１つ又は２つ以上の位置に同一又は２種以上の異なる修飾がなされてもよい。
しかし、これらの重鎖配列の欠失、或いは、重鎖又は軽鎖配列の修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞傷害作用など）にはあまり影響を及ぼさない。
従って、本発明には当該欠失又は修飾を受けた抗体も含まれる。例えば、重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，７０５：１２９−１３４（１９９５））、重鎖カルボキシル末端のグリシン、リジンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化された当該欠失体（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５−８３（２００７））、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端のグルタミン又はグルタミン酸残基がピログルタミル化修飾された抗体（国際特許公開ＷＯ２０１３／１４７１５３号）等を挙げることができる（それらをまとめて「欠失体」と呼ぶ）。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖及び軽鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体が２本以上の鎖（例えば重鎖）を含む場合、当該２本以上の鎖（例えば重鎖）は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか二種を組み合わせたものであっても良い。各欠失体の量比又は分子数比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
さらに、本発明の抗体又はその抗原結合断片（本発明の分子、多重特異的分子、二重特異的分子等に含まれるもの等）に、発現ベクター及び／又はシグナル配列等に由来する１乃至数個のアミノ酸がアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に付加され（且つその一部又は全部が前記のように修飾され）ていても、所望の抗原結合活性が維持されていれば、本発明の抗体の修飾体又はその抗原結合断片の修飾体の範囲に包含され、そのような抗体又は抗原結合断片の修飾体を含む分子も本発明の分子の範囲に包含される。
本発明において「抗体又はその抗原結合性断片」は「抗体又はその抗原結合断片の修飾体」もその意味に含むものである。また、本発明のの分子、多重特異的な分子、二重特異的な分子等に含まれる「抗体又はその抗原結合断片」はかかる「抗体又はその抗原結合断片の修飾体」もその意味に含むものである。
また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節すること（グリコシル化、脱フコース化等）によって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、国際特許公開ＷＯ９９／５４３４２号、ＷＯ００／６１７３９号、ＷＯ０２／３１１４０号等が知られているが、これらに限定されるものではない。
本発明には、上述の抗体と他の分子がリンカーでつながれた複合体（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）も含まれる。該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物（薬物）と結合している抗体−薬物複合体の例としては、ＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を挙げることができ（［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（２０１３）１０４５：１−２７；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７−１１４６））。
更に本発明には、これらの抗体と他の機能性ポリペプチドを繋げた複合体も含まれる。このような抗体−ペプチド複合体の例としては、該抗体がアルブミン結合ポリペプチドと複合体を挙げることができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．  （２０１２）（２）：８１−８）。
上述の抗体の修飾体、糖鎖修飾を調節された抗体、複合体は、本発明の抗体に包含され、上述の抗体の修飾体、糖鎖修飾を調節された抗体、複合体の抗原結合性断片は、本発明の抗体の抗原結合性断片に包含される。
【００３９】
３−５．同一の部位に結合する抗体
本発明の提供する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が結合するヒトＧＰＲＣ５Ｄ上の部位に結合する抗体も本発明の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる。ある抗体と、同じヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗原の部位に結合する抗体とは、該抗体が認識する抗原分子上の同一の部位に結合する他の抗体を意味する。第一抗体が結合する抗原分子上の部分ペプチド又は部分立体構造に第二抗体が結合すれば、第一抗体と第二抗体は同一の部位に結合すると判定することができる。
また、第一抗体の抗原に対する結合に対して第二抗体が競合する、すなわち、第二抗体が第一抗体と抗原の結合を妨げることを確認することによって、具体的な結合部位のペプチド配列又は立体構造が決定されていなくても、第一抗体と第二抗体が同一の部位に結合すると判定することができる。
第一抗体と第二抗体が同一の部位に結合する場合、第二抗体は第一抗体と同様の活性を有する蓋然性は極めて高い。  
抗体の結合部位は、免疫アッセイ法など当業者に周知の方法により決定することができる。例えば、抗原のアミノ酸配列をカルボキシル末端又はアミノ末端から適宜削ってなる一連のペプチドを作製し、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、さらに短いペプチドを合成してそれらのペプチドへの抗体の反応性を検討することにより、結合部位を決定することができる。抗原断片ペプチドは、遺伝子組換、ペプチド合成等の技術を用いて調製することができる。
【００４０】
３−６．本発明のポリヌクレオチド、ベクター、細胞
本発明は、本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又はその抗原結合性断片の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１等）を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ポリヌクレオチド又は該ベクターを含む細胞、本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又はその抗原結合性断片を産生する細胞等も提供する。かかるポリヌクレオチド、ベクター（プラスミド等の環状の形態、並びに、染色体にインテグレートされた場合を含めた非環状の形態）及び細胞は、後述する抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又はその抗原結合性断片の製造に有用である。
本発明のポリヌクレオチドは、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又はその抗原結合性断片の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列以外に、任意のヌクレオチド配列を含んでいてよい。例えば、本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又はその抗原結合性断片の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列表の配列番号６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１等）に加え、活性シグナル伝達分子であるペプチドの有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、及び／又は、補助刺激分子の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むものは、本発明のポリヌクレオチドの態様の一部である。かかるポリヌクレオチドを免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、モノサイト等）に導入して発現したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）により、腫瘍細胞に対する結合活性を有する人工免疫細胞（以下、本発明の人工免疫細胞とも記す）も提供する。
ＣＡＲとは、腫瘍細胞の表面抗原を認識するモノクローナル抗体由来の軽鎖と重鎖と直列に結合させたｓｃＦｖと、Ｔ細胞受容体のＣＤ３ζや免疫グロブリン分子に対する受容体のＦｃＲγ等活性シグナル伝達分子を、それぞれアミノ末端とカルボキシル末端にもつキメラ蛋白質で、その間に細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、免疫細胞を活性化させる補助刺激分子等が連結されている。本発明の細胞では、腫瘍細胞の表面抗原を認識するモノクローナル抗体は、本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体である。ＣＡＲを発現した本発明の免疫細胞は、ｓｃＦｖの形状をとる本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体を介して腫瘍の表面のＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質を認識するとともに、細胞内の活性シグナル伝達分子により免疫細胞自体の活性化を誘導し、腫瘍細胞を攻撃する。  
本発明のポリヌクレオチドを導入する免疫細胞としてＴ細胞を用いた場合、かかるポリヌクレオチドをＴ細胞に導入して細胞表面に発現させたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）により、ＧＰＲＣ５Ｄを発現する細胞とＴ細胞の距離を近づけ、ＧＰＲＣ５Ｄを発現する細胞に対し、Ｔ細胞活性化を介して細胞傷害を誘導すること、すなわちＴ細胞リダイレクションにより細胞傷害を誘導することができる。そのようなＣＡＲを発現するＴ細胞（以下、本発明のＴ細胞とも記す）も提供する。
言い換えれば、本発明のＴ細胞を、ＧＰＲＣ５Ｄを発現している腫瘍細胞にリダイレクションすることにより、該腫瘍細胞に細胞傷害を誘導することができる。
活性シグナル伝達分子は、免疫細胞レセプターからのシグナルを細胞内に伝達するために免疫細胞内に導入される。免疫細胞として、例えば、Ｔ細胞を用いる場合、活性シグナル伝達分子としては、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγ等が挙げられる。
補助刺激分子は、免疫細胞をより強く活性化させるために免疫細胞内に導入される。免疫細胞として、例えば、Ｔ細胞を用いる場合、補助刺激分子としては、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３４、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＲＡＮＫＬ等が挙げられる。
【００４１】
４．抗原結合性を有する分子
本発明の分子は、本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又はその抗原結合性断片を含む。
さらに、本発明の分子は、後述する、シグナル配列、精製等のためのタグ、アミノ末端のＧｌｙ、ＡＤＣのドラッグリンカー部分、アルブミン結合ポリペプチド、ＰＥＧ等のポリマー、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体以外の抗体、その抗原結合性断片、免疫グロブリン骨格を有さないで抗原結合性を有する蛋白質等を範囲として含むことができる。抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体以外の抗体として、抗ＣＤ３抗体が挙げられる。本発明の分子の範囲には、後述する多重特異的な分子が含まれる。  
【００４２】
４−１．多重特異的な分子
本発明の多重特異的な分子は、２つ以上の抗原結合部位を持つ分子である。すなわち、１つの分子上の２つ以上の互いに異なるエピトープ又は２つ以上の分子上の互いに異なるエピトープに結合することが可能な分子であり、複数の互いに異なる抗原結合性断片を包む。このような多重特異的な分子には、ＩｇＧ型多重特異性分子、２種類以上の可変領域を有する多重特異性分子、例えばタンデムｓｃＦｖ、一本鎖ダイアボディ、ダイアボディ、及びトリアボディのような抗体断片、共有結合又は非共有結合して連結されている抗体断片を含むが、これらに限定されない。多重特異的な分子はＦｃを含んでいてもよい。  
本発明の多重特異的な分子は、本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む。本発明の多重特異的な分子は、本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又はその抗原結合性断片、及び、１つ又は２つ以上の、ＧＰＲＣ５Ｄは有さず他の抗原にあるエピトープに結合する、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体とは異なる抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む。
抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂを挙げることができる。
本発明の多重特異的な分子は、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合し、あるいは更に、エフェクター細胞上のＦｃ受容体といった標的に結合してもよい。
本発明の多重特異的な分子に含みうる、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体とは異なる抗体としては、例えば抗ＣＤ３抗体が挙げられる。
本発明の多重特異的な分子に含みうる抗ＣＤ３抗体、又はその抗原結合性断片の好ましい例としては、
配列番号１８３（図２０６）に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＧＶＴＦＮＹＹＧ）、
配列番号２３８（図２７６）に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＩＴＸａａＸａａＧＧＲＩ）（ここで、１番目のＸａａと２番目のＸａａは、それぞれ、任意の天然のアミノ酸残基である。以下、重鎖ＣＤＲ２の１番目のＸａａをＸ１、２番目のＸａａを、それぞれＸ１、Ｘ２とも記す。）、
及び、
配列番号１８５（図２０８）に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３（ＴＬＤＧＲＤＧＷＶＡＹ）を保有している。  
また、本発明の好適なヒト化抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる軽鎖可変領域は、
配列番号１８６（図２０９）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＴＧＮＩＧＳＮＹ）、
配列番号２３９（図２７７）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＲＸａａＤ）（ここで、Ｘａａは、任意の天然のアミノ酸残基である。以下、軽鎖ＣＤＲ２のＸａａをＸ３とも記す。）、  
及び、
配列番号１８８（図２１１）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＱＳＹＳＳＧＦＩ）を保有している。
上述の重鎖ＣＤＲ２（ＩＴＸ１Ｘ２ＧＧＲＩ）において、好ましくは、Ｘ１は、（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、且つ、Ｘ２はＳであるか；又は、Ｘ１はＮであり、且つＸ２は、（Ｅ、Ｒ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｋ、Ｔ）からなる群より選択され、
上述の軽鎖ＣＤＲ２（ＲＸ３Ｄ）において、好ましくは、Ｘ３は、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択される。
上述の重鎖ＣＤＲ２（ＩＴＸ１Ｘ２ＧＧＲＩ）において、更に好ましくは、Ｘ１は、（Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、且つ、Ｘ２はＳであり、
上述の軽鎖ＣＤＲ２（ＲＸ３Ｄ）において、更に好ましくは、Ｘ３は、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択される。  
本発明の多重特異的な分子の好ましい例としては、配列番号２４０（図２７８）に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４１（図２７９）、２４２（図２８０、及び２４３（図２８１）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、
配列番号２４０で示されるアミノ酸配列の１番目のＸａａは、（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、且つ、２番目のＸａａはＳであるか、又は、
１番目のＸａａはＮであり、且つ、２番目のＸａａは、（Ｅ、Ｒ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｋ、Ｔ）からなる群より選択され、
配列番号２４１、２４２、及び、２４３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のＸａａは、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択される分子が挙げられる。
本発明の多重特異的な分子に含みうる抗ＣＤ３抗体、又はその抗原結合性断片のより好ましい例としては、配列番号２４０の１番目のＸａａは、（Ｒ、Ｓ）からなる群より選択され、
２番目のＸａａはＳであり、且つ、配列番号２４１、２４２、及び、２４３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のＸａａは、（Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）からなる群より選択される
分子が挙げられる。
本発明の好適なヒト化抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片の具体例として、
配列番号１８３に示される重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（ＧＶＴＦＮＹＹＧ）、
配列番号１８４に示される重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（ＩＴＮＳＧＧＲＩ）、及び、
配列番号１８５に示される重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（ＴＬＤＧＲＤＧＷＶＡＹ）
を含む重鎖可変領域；並びに、
配列番号１８６に示される軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（ＴＧＮＩＧＳＮＹ）、
配列番号１８７に示される軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（ＲＤＤ）、及び、
配列番号１８８に示される軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（ＱＳＹＳＳＧＦＩ）
を含む軽鎖可変領域；
を含み、且つヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が挙げられる。上記抗ＣＤ３抗体のＣＤＲの位置と長さは、ＩＭＧＴの定義により決定した。
上述のＣＤＲを有する本発明の多重特異的な分子に含まれる抗ＣＤ３抗体、その抗原結合性断片及びその可変領域（以下、本発明の抗ＣＤ３抗体等とも記す）は、ヒトＣＤ３複合体のε鎖の細胞外領域に存在するＩｇ−ｌｉｋｅドメインに結合する。さらにカニクイザルＣＤ３複合体のε鎖の細胞外領域に存在するＩｇ−ｌｉｋｅドメインにも結合する。
本発明の多重特異的な分子に含まれる抗ＣＤ３抗体等が結合するヒトＣＤ３複合体のε鎖の細胞外領域に存在するエピトープは、次のアミノ酸を含む；
Ｓｅｒ５５、Ｇｌｕ５６、Ｌｅｕ５８、Ｔｒｐ５９、Ａｓｎ６５、Ｉｌｅ６６、Ｓｅｒ７７、Ａｓｐ７８、Ａｒｇ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｓｅｒ１０３、Ｌｙｓ１０４、及びＰｒｏ１０５。
本発明の多重特異的な分子に含まれる抗ＣＤ３抗体等は、好ましくは、これらの１３個のアミノ酸から選択される少なくとも７個のアミノ酸を含むエピトープ領域に結合することでヒトＣＤ３と結合を維持することができる。
抗体が、上述のアミノ酸と４Å以内の距離で隣接している場合、そのような抗体は本発明の多重特異的な分子に含まれる抗ＣＤ３抗体等と同一のエピトープ特異性を有すると判断することができる。一方、上述のエピトープのアミノ酸のうち、Ａｒｇ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｓｅｒ１０３、Ｌｙｓ１０４、及びＰｒｏ１０５は、公知の抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３やＵＣＨＴ１と相互作用するエピトープ残基でもある（Ｌａｒｓ  Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００４）（Ｋｅｌｌｙ  Ｌ  Ａｒｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００４））。しかし、ＯＫＴ３とＵＣＨＴ１はヒトＣＤ３に結合するが、カニクイザルＣＤ３には結合しない。
このような本発明の多重特異的な分子に含まれるヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体及び該抗体の抗原結合性断片は、医薬品の非臨床開発（前臨床開発）に有用な霊長類、特にカニクイザルを用いた有効性や安全性に関する各種試験に供することができ好ましい。また、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体等は、細胞傷害活性を有し、単独で又は本発明の分子として、カニクイザルにおける癌等の疾患の治療又は予防に有用である。医薬組成物については後述する。
上記抗ＣＤ３抗体は、非ヒト動物抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体であってもよい。好ましくは、ヒト化抗体又はヒト抗体である。
上記抗ＣＤ３抗体の抗原結合性断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又は、ｓｄＡｂが例示される。
上記ＣＤＲを含む抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片の例としては、配列番号２４０（図２７８）に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４１（図２７９）、配列番号２４２（図２８０）、配列番号２４３（図２８１）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むヒト化抗体又は該抗体の抗原結合性断片、具体的には、たとえば、配列番号１５５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５６、１５８、及び、１６０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むヒト化抗体又は該抗体の抗原結合性断片が挙げられる。
上記抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片の具体例としては、配列番号１８０、１８１、及び、１８２に示されるアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片が挙げられる。より詳細には、
配列番号１８０の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号１８１の２乃至２４３番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号１８２の２乃至２４１番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片
に示されるアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片が挙げられる。
【００４３】
上記抗ＣＤ３抗体は、ヒト免疫グロブリン定常領域又はＦｃを含むヒト化抗体又はヒト抗体であってもよい。Ｆｃは変異型Ｆｃであってもよい。
本発明の多重特異的な分子で、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又は該抗体の抗原結合性断片と抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む分子の好適例として、前述の２Ｂ１由来のヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、さらに、抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片として、
・配列番号２０７に示されるアミノ酸配列の２５乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２０９に示されるアミノ酸配列の２４乃至１３２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２１１に示されるアミノ酸配列の２５乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列の２４乃至１３０番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２４４の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４４の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２４５の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４５の１３５乃至２４１のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、  
・配列番号２４６の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４６の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２４７の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４７の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２４８の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４８の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、  
・配列番号２４９の２乃至１１９のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号２４９の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２５０の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５０の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２５１の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５１の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２５２の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５２の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２５３の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５３の１３５乃至２４２のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
・配列番号２５４の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５４の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
又は、
・配列番号２５５の２乃至１１９のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５５の１３５乃至２４３のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、且つヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む分子を挙げることができる。  
これらの分子の中でも、より好ましい分子としては、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに、
ｉ）配列番号１９９に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０３に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉ）配列番号２０１に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０５に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、
ｉｉｉ）配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域
又は、
ｉｖ）配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の１４７乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含み、
ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、さらに変異型Ｆｃを含む分子を挙げることができる。
これらの分子の中でも、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、上記ｉｉｉ）又はｉｖ）に示す定常領域を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片である分子が、より更に好ましい。
かかる本発明の多重特異的な分子の具体的な好適例として、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列の２４乃至４９９番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２１に示されるアミノ酸配列の２４乃至４９７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４９７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４９９番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２９に示されるアミノ酸配列の２４乃至４９９番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３１に示されるアミノ酸配列の２４乃至４９８番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３３に示されるアミノ酸配列の２４乃至５００番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片、又は、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列の２４乃至５００番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片を含む分子を挙げることができる。
これらの中でも、より好適な具体例としては、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４９７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４９９番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片、
配列番号２１５に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２９に示されるアミノ酸配列の２４乃至４９９番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３１に示されるアミノ酸配列の２４乃至４９８番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３３に示されるアミノ酸配列の２４乃至５００番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片、又は、
配列番号２３７に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列の２４乃至５００番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片を含む分子を挙げることができる。
これらの分子の適用可能な形態には、後述するＨｙｂｒｉｄ型の二重特異的な分子が含まれる。
【００４４】
本発明の多重特異的な分子の別のより好ましい分子の例としては、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、前述の２Ｂ１由来のヒト化抗体又は該抗体の抗原結合性断片、好ましくは、配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、さらに前述のｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）又はｉｖ）に記載の定常領域を含み、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、さらに
ｖ）配列番号２０７に示されるアミノ酸配列の１４３乃至４７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２０９に示されるアミノ酸配列の２４乃至１３２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、又は、
ｖｉ）配列番号２１１に示されるアミノ酸配列の１４３乃至４７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列の１３１乃至２３６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む分子を挙げることができる。
これらの分子の中でも、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、上記ｉｉｉ）又はｉｖ）に示す定常領域を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片である分子が、より好ましい。
かかる本発明の多重特異的な分子の具体的な好適例として、
配列番号１９９に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２０７に示されるアミノ酸配列の２５乃至４７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０９に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３８番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片
又は、
配列番号２０１に示されるアミノ酸配列の２４乃至４７５番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０５に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２１１に示されるアミノ酸配列の２５乃至４７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２１３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２３６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体の抗原結合性断片
を含む分子を挙げることができる。
これらの分子の適用可能な形態には、後述するＦＳＡ型の二重特異的な分子が含まれる。
【００４５】
本発明の多重特異的な分子のさらに別の好適例として、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、配列番号７６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号７２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２７番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、さらに変異型Ｆｃを含み、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片が、さらに変異型Ｆｃを含む、請求項５５に記載の分子を挙げることができる。
かかる本発明の多重特異的な分子の具体的な好適例として、
配列番号２２３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６６番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片
又は、
配列番号２２３に示されるアミノ酸配列の２４乃至２７１番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片、及び、配列番号２２１に示されるアミノ酸配列の２４乃至２６４番目のアミノ酸残基で示されるアミノ酸配列と変異型Ｆｃを含むヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む分子を挙げることができる。
これらの分子の適用可能な形態には、後述するＤｕａｌ型の二重特異的な分子が含まれる。
本発明の分子には、上記抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗ＣＤ３抗体又はその抗原下都合断片の部分、並びに、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合し、好ましくは、さらにカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又はその抗原結合断片の部分を含む分子も包含する。
また、本発明の分子には、上記抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び／又は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上同一な重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び／又は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片の部分、並びに、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合し、好ましくは、さらにカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又はその抗原結合断片の部分を含む分子も包含する。
本発明の分子には、上記抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換、欠失又は修飾を受けているアミノ酸配列を有する抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片であって、且つ、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３、並びに、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合し、好ましくは、さらにカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに結合する分子も包含する。かかる抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片の例としては、重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，７０５：１２９−１３４（１９９５））、重鎖カルボキシル末端のグリシン、リジンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化された当該欠失体（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５−８３（２００７））、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端のグルタミン又はグルタミン酸残基がピログルタミル化修飾された抗体（国際特許公開ＷＯ２０１３／１４７１５３号）等を挙げることができる（それらをまとめて「欠失体」と呼ぶ）。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明の分子に含まれる抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片の重鎖及び軽鎖のカルボキシル末端の欠失体としては、上記の種類に限定されない。本発明の分子に含まれる抗体が２本以上の鎖（たとえば重鎖をを含む場合、当該２本以上の鎖（例えば重鎖）は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか２種以上を組み合わせたものであっても良い。各欠失体の量比又は分子数比は本発明の分子を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明の分子の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
【００４６】
４−２．  本発明の二重特異的な分子  
本発明の多重特異的な分子の好適な例として、二重特異的な分子を挙げることができる。
「二重特異的」とは、同一分子の２つの互いに異なるエピトープ又は２つ以上の分子上の互いに異なるエピトープに結合することが可能であることを意味し、このような二重特異性を有する抗体又は抗原結合性断片を包含する。  
本発明の二重特異的な分子は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合し、且つＧＰＲＣ５Ｄは有さず他の抗原にあるエピトープに結合する。より具体的には、かかる二重特異的な分子は、（ｉ）ＧＰＲＣ５Ｄ上のあるエピトープ（エピトープ１）に結合し、且つ、（ｉｉ）ＧＰＲＣ５Ｄにあるエピトープ１とは異なるエピトープ（エピトープ２）に結合するか、又は、ＧＰＲＣ５Ｄ以外の抗原にあるエピトープ（エピトープ３）に結合する。  
たとえばＢｉＴＥに代表されるタンデムｓｃＦｖ型の二重特異性分子では、第一の抗体の重鎖可変領域の抗原結合部位と、第一の抗体の軽鎖可変領域の抗原結合部位とが、リンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されて第一のポリペプチドを形成しており、また、第二の抗体の重鎖可変領域の抗原結合部位と、第二の抗体の軽鎖可変領域の抗原結合部位とが、リンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されて第二のポリペプチドを形成しており、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとが、リンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されている。また、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドが別の分子を介して結合されていても良い。
ダイアボディ型の二重特異性分子では、第一の抗体の重鎖可変領域の抗原結合部位と第二の抗体の軽鎖可変領域の抗原結合部位がリンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されており、また、第一の抗体の軽鎖可変領域の抗原結合部位と第二の抗体の重鎖可変領域の抗原結合部位とが、リンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されている。またダイアボディ型二重特異性分子をさらに二量体化させた二重特異性分子も作製しうる。その他ダイアボディ型二重特異性分子をＦｃの一方の単鎖のみあるいは両鎖とリンカーにて連結させても良い（ダイアボディ−Ｆｃ型二重特異性分子）。
デュアルｓｃＦｖ型の二重特異性分子では、異なるエピトープに結合する２種のｓｃＦｖが、二量体のＦｃの一方とそれぞれリンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されている。あるいは、異なるエピトープに結合する２種類のｓｃＦｖがそれぞれＣＨ、ＣＬにリンカーにて連結され、さらに二量体のＦｃの一方とそれぞれリンカーにて連結されている。デュアルｓｃＦｖ型の二重特異性分子を、以下Ｄｕａｌ型二重特異性分子、又は単にＤｕａｌ型とも記す。
ＩｇＧ型の二重特異性分子では、異なるエピトープに結合する２種のＦａｂが、二量体のＦｃの一方とそれぞれリンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されている。ＩｇＧ型の二重特異性分子を、以下、Ｆｕｌｌ−Ｓｉｚｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＦＳＡ）型二重特異性分子、又は単にＦＳＡ型とも記す。
あるいは二量体のＦｃの一方に第一の抗体のＦａｂ，もう一方に第二の抗体のｓｃＦｖをリンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合させた二重特異性分子であっても良い。このような二重特異性分子を、以下Ｈｙｂｒｉｄ型二重特異性分子、又はＨｙｂｒｉｄ型とも記す。
本発明の二重特異性分子に含まれるｓｃＦｖ及びＦａｂは、好ましくは、ヒト化抗体又はヒト抗体のｓｃＦｖ及びＦａｂであり、Ｆｃは、好ましくは、ヒト抗体のＦｃである。
リンカーは、一本鎖ポリペプチド又は一本鎖オリゴペプチド、あるいは、ＰＥＧ、ヌクレオチド、糖鎖、化合物等の合成品も含まれる。その他、二つのポリペプチドを結合するものであれば特に限定されず、公知のリンカーを使用することが可能である。
リンカーの長さとしては、たとえばペプチドリンカーの場合５〜３０アミノ酸である。二重特異性分子に複数のリンカーが含まれる場合、すべて同じ長さのペプチドリンカーを用いてもよいし、異なる長さのペプチドリンカーを用いてもよい。
ペプチドリンカーとしては、たとえば、（Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ）の繰り返しが例示されるが、これらに１乃至数個のＧｌｙ、Ｓｅｒとは異なるアミノ酸残基が付加していてもよい。
本発明の二重特異的な分子に含まれる、ＧＰＲＣ５Ｄ以外の抗原にあるエピトープ（エピトープ３）に結合する抗体、又はその抗原結合性断片の例としては、上記抗ＣＤ３抗体、又はその抗原結合性断片を挙げることができる。
本発明の二重特異的な分子の例として、上記抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又は該抗体の抗原結合性断片とが、リンカーにより結合してなる、あるいはリンカーなしで結合してなる分子を示すことができる。このような分子の好ましい例としては、上記抗ＣＤ３抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又は該抗体の抗原結合性断片とが、おのおのｓｃＦｖであり、リンカーにより結合してなる、あるいはリンカーなしで結合してなる分子を示すことができる。
かかる分子の好適な具体例として、配列番号１７１乃至１７９に示されるアミノ酸配列を有する、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３、並びに、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合し、好ましくは、さらにカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに結合する分子を示すことができる。
【００４７】
５．抗体及び分子の製造
５−１．ハイブリドーマを用いる方法
本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、常法を用いて、ＧＰＲＣ５Ｄ又はＧＰＲＣ５Ｄのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  （１９７５）２５６，ｐ．４９５−４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５−３６７，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、ＧＰＲＣ５Ｄに対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。このような方法の具体的な例は、国際公開第ＷＯ０９／４８０７２号パンフレット（２００９年４月１６日公開）等に記載されている。
抗原となるＧＰＲＣ５Ｄの生物種はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来するＧＰＲＣ５Ｄを動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体とヒトＧＰＲＣ５Ｄとの交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
本発明の分子に含まれうる抗ＣＤ３抗体も、同様に、常法を用いて、ＣＤ３又はＣＤ３のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法に従って、ＣＤ３に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
抗原となるＣＤ３の生物種もヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来するＣＤ３を動物に免疫することもでき、取得された異種ＣＤ３に結合する抗体とヒトＣＤ３との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
【００４８】
５−２．細胞免疫法
天然型の抗原を発現する細胞、組換え型抗原又はその断片を発現する細胞等を免疫原として使用することにより、前記のハイブリドーマ法により抗体を調製することができる。    
天然型のＧＰＲＣ５Ｄを発現する細胞としては、ヒト形質細胞、ヒト多発性骨髄腫患者由来初代培養細胞、ヒト多発性骨髄腫患者由来培養細胞株等を挙げることができる。天然型のＣＤ３を発現する細胞としては、ヒト胸腺細胞、Ｔリンパ球等を挙げることができる。
かかる細胞は、１×１０５乃至１×１０９個、好適には１×１０６乃至１×１０８個、より好適には０．５乃至２×１０７個、より一層好適には１×１０７個を１回の免疫に用いるが、抗原の発現量に応じて免疫に供する細胞数を変えることができる。かかる免疫源は、一般的には腹腔内に投与するが、皮内等に投与することもできる。
【００４９】
５−３．ＤＮＡ免疫法
本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、及び、本発明の分子に含まれ得る抗ＣＤ３抗体（以下、まとめて本発明の抗体とも記す）は、ＤＮＡ免疫法を使用して得ることもできる。抗原発現プラスミドをマウスやラットなどの動物個体に遺伝子導入し、抗原を個体内で発現させることによって、抗原に対する免疫を誘導する。遺伝子導入の手法には、直接プラスミドを筋肉に注射する方法や、リポソームやポリエチレンイミンなどの導入試薬を静脈注射する方法、ウイルスベクターを用いる手法、プラスミドを付着させた金粒子をＧｅｎｅ  Ｇｕｎにより射ち込む手法、急速に大量のプラスミド溶液を静脈注射するＨｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ法などが存在する。  
このようにして樹立されたラット抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体の実例として、２Ａ４、２Ｂ１、及び、７Ｂ４を挙げることができる。２Ａ４の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５に示されている。また２Ａ４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２に示されている。２Ｂ１の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７に示されている。また２Ｂ１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４に示されている。７Ｂ４の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９に示されている。また７Ｂ４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６に示されている。  
【００５０】
５−４．ヒト化抗体のデザイン
ヒト化抗体としては、非ヒト動物抗体のＣＤＲのみがヒト由来の抗体に組込まれ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２−５２５参照）、ＣＤＲ移植法によりＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（ＷＯ９０／０７８６１号、ＵＳ６９７２３２３号公報参照）、それらのいずれかにおける非ヒト動物抗体の１つ又は２つ以上のアミノ酸がヒト型のアミノ酸で置換されてなる抗体等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【００５１】
５−５．ヒト抗体のデザイン
ヒト抗体とは、ヒト由来の抗体のアミノ酸配列からなる抗体を意味する。ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒトゲノムＤＮＡ断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，１３３−１４３，；  Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９８）２６，３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｖｏｌ．１０，６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，  Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，７２２−７２７等を参照。）によって取得することができる。
このようなヒト抗体産生動物は、具体的には、非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座を破壊し、代わりに酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクターなどを介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が導入することによって作製することができる。また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。
ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞を用いることができる。
また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域をｓｃＦｖとしてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法を用いることができる。抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，４３３−４５５）。
ヒト抗体ファージライブラリーの構築方法は周知であり、ヒト抗体可変領域の遺伝子は、ヒト血液、脾臓、リンパ節から採取されたｃＤＮＡをテンプレートとして、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７４（２６），１８２１８−３０，（１９９９）やＭｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１７８，５９−７１，（２００２）などを参考にしたプライマーを用いて増幅する。増幅した可変領域は、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１（１），３５−５５（１９９７）を参考にしてｓｃＦｖにすることができる。
【００５２】
５−６．抗体の抗原結合性断片の製造
抗体の抗原結合性断片は、抗体を遺伝子工学的な手法によって改変し適当な培養細胞において発現させることによって製造することができる。
抗体の抗原結合性断片として、例えば、ｓｃＦｖを作成する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。ｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９８８），８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。
可変領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば５乃至３０残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、及び軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。あるいは、ｓｃＦｖ全領域をコードするＤＮＡを全合成で得ることもある。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを用いて、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を常法に従って調製することができ、また、その宿主細胞を培養することにより、常法に従ってかかる培養物から該ｓｃＦｖを回収することができる。
その他の抗体の抗原結合性断片も、上述の方法に準じて抗原結合性断片をコードする遺伝子を取得して細胞に導入し、該細胞の培養物から該抗原結合性断片を回収することにより、得ることができる。
本発明の抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックス−ターン−へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。
【００５３】
５−７．遺伝子組換え
本発明の抗体は、その重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるポリヌクレオチド（重鎖ヌクレオチド）及びその軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるポリヌクレオチド（軽鎖ヌクレオチド）、又は、かかる重鎖ヌクレオチドが挿入されたベクター及び軽鎖ヌクレオチドが挿入されたベクターを宿主細胞に導入し、該細胞を培養した後その培養物からかかる抗体を回収することにより調製することができる。一つのベクターに重鎖ヌクレオチド及び軽鎖ヌクレオチドが挿入されていてもよい。
宿主細胞としては、原核細胞又は真核細胞を用いることができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。
動物細胞としては、例えば、哺乳類由来の細胞、すなわち、ヒト胎児由来腎臓細胞ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｓｕｂｅｄｉ  ＧＰ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．（２０１５）１０６）ザル腎．  由来のＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，  Ｙ．  Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，１７５−１８２、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、そのジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（ＣＨＯｄｈｆｒ−：Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．  ＰＮＡＳ（１９８０）７７，４１２６−４２２０）、ニワトリ等鳥類由来の細胞、昆虫由来の細胞等を挙げることができる。
また、糖鎖構造の改変により、抗体の生物活性を高められるよう改変された細胞も宿主として用いることができる。例えば、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上になるよう改変されたＣＨＯ細胞を用いることにより、ＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性が高められた抗体を調製することが可能である（国際特許公開ＷＯ０２／３１１４０号）。
真核微生物としては、例えば、酵母等を挙げることができる。原核細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等を挙げることができる。
本発明の抗体（各種動物由来のモノクローナル抗体、ラット抗体、マウス抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等）を分泌させるためのシグナルペプチドとしては、当該抗体と同種、同タイプ及び同サブタイプの抗体の分泌シグナル、ならびに、当該抗体自体の分泌シグナルに限定されるものではなく、他のタイプもしくはサブタイプの抗体の分泌シグナル、又は、他の真核生物種もしくは原核生物由来の蛋白質の分泌シグナルであれば、任意のものを選択して利用することができる。シグナルペプチドは、通常大部分の成熟軽鎖又は成熟重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列にはそれぞれ含まれないが、シグナルペプチドを含んで分泌された抗体等も、本発明の抗体等又は本発明の分子に包含される。
得られた抗体、抗体の抗原結合性断片、分子は、他の蛋白質を含まないよう均一に精製することができる。抗体、抗体の抗原結合性断片、分子の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。  
例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができるが、これらに限定されるものではない。
好適な分離・精製法としては、たとえば、ＨｉｓタグやＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡ配列を抗体可変領域のカルボキシル末端に付加させて発現ベクターを作製し、このベクターで細胞を形質転換させ、さらに細胞を培養することで当該抗体及び抗体の抗原結合性断片発現させ、培養終了後、培養上清を抽出し、Ｎｉ、Ｃｏ等の金属アフィニティークロマトグラフィー、抗ＦＬＡＧタグ抗体カラム、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー等で精製することができる。
ＨｉｓタグやＦＬＡＧタグ等のタグのアミノ酸配列を含んで発現された抗体及び抗体の抗原結合性断片も、本発明の抗体、該抗体の抗原結合性断片、又は、本発明の分子に包含される。
【００５４】
５−８．ポリクローナル抗体の製造
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体は、異なる抗体の産生細胞を混合培養し、該培養物から回収することができる（ＷＯ２００４／０６１１０４号）。また、別個に調製した抗体を混合することも可能である。さらに、ポリクローナル抗体の一つの態様である抗血清は、動物を所望の抗原で免疫し、定法に従って、該動物から血清を回収することにより調製することができる。
【００５５】
５−９．腫瘍細胞に対する結合特異性を付与された人工免疫細胞の製造
腫瘍細胞に対する結合特異性を付与された人工免疫細胞は、免疫細胞に本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の遺伝子等を導入して抗原特異性を付与することにより製造することができる。免疫細胞としては、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、モノサイト等が例示される。
免疫細胞としてＴ細胞を用いる場合を例示する。Ｔ細胞は、ヒトの末梢血から比重遠心法等の方法により回収した単核球を、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、あるいは更に抗ＩＬ−４抗体やＩＦＮ−γの存在下に、培地で培養して誘導することができる。  
次に、このＴ細胞に対して本発明の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の遺伝子を構成要素とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子を導入する。代表的なＣＡＲ遺伝子は、腫瘍細胞の表面抗原を認識する抗体（本発明では抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体）の遺伝子と、Ｔ細胞活性化に必要な補助刺激分子（例えば、Ｔ細胞受容体ζ鎖とＣＤ２８などの共刺激分子）をコードする遺伝子から構成される。抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の遺伝子を含むＣＡＲ遺伝子は、種々のウイルスベクターを用いてＴ細胞に導入することができる。このようなベクターとしては、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター、リポソーム等が挙げられる。抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の遺伝子を組み込んだウイルスベクターから組み換えウイルスを調製し、上述の抗原非特異的に活性化したＴ細胞に導入することができる。遺伝子導入後のＴ細胞を培養して、腫瘍細胞に対する特異性を付与されたＴ細胞を得ることができる。
本発明の方法により得られた、リダイレクションにより細胞傷害を誘導し得る本発明のＴ細胞が抗原特異性を付与されたことは、Ｔ細胞を、ＧＰＲＣ５Ｄを発現することが知られている抗原陽性腫瘍細胞をマイトマイシンＣ処理して不活性化したものと共培養した後、培養上清中のＩＦＮ−γまたはＩＬ−２の量を測定することにより、判定することができる。
【００５６】
５−１０．多重特異的な分子、二重特異的な分子の製造
本発明の多重特異的な分子、二重特異的な分子は、宿主細胞へ発現プラスミドを導入し、一過性で発現させる方法、宿主細胞にプラスミドを導入後、薬剤選択により安定発現細胞株選び、恒常的に発現させる方法、それぞれの抗体あるいは抗原結合性断片を上記の方法で作製後、合成ペプチドリンカーを用いて化学的に結合させる方法が挙げられる。
１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）では、２つのｓｃＦｖをペプチドリンカーで結合させる（タンデムｓｃＦｖ）、特異性の異なる２つの抗体におけるお互いのドメインを入れ替えて非共有結合的に二量体を形成する（ダイアボディ）、特異性の異なる２つの抗体におけるお互いのドメインを入れ替え、一本鎖化する（一本鎖ダイアボディ）、ダイアボディを１本鎖化した上で非共有結合的に二量体を形成する（ＴａｎｄＡｂ、米国特許  ＵＳ７１２９３３０）等の方法がある。
本発明は、本発明の抗体若しくは該抗体の抗原結合性断片、又は抗原等の修飾物をコードする遺伝子、該遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子又はベクターが導入された細胞、その他本発明の抗体を産生する細胞をも提供する。
【００５７】
６．医薬組成物
本発明は、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、その抗原結合性断片、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、細胞、人工免疫細胞、及び／又は、これらの少なくとも１つを含む分子を有効成分として含む医薬組成物（以下、本発明の医薬組成物とも記す）を提供する。
本発明の医薬組成物は、ＧＰＲＣ５Ｄ若しくはそのリガンドの過剰発現、又は、ＧＰＲＣ５Ｄの変異若しくは遺伝子増幅による、ＧＰＲＣ５Ｄシグナル異常又は亢進に関わる各種疾患（以下、「ＧＰＲＣ５Ｄに関わる疾患」という）、とりわけ各種癌の治療又は予防に有用である。
かかる治療又は予防の対象となる癌の惹起又は増悪化の原因としては、ＧＰＲＣ５Ｄの高発現、ＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子のイントロン内の一塩基置換（ＳＮＰ）、ＧＰＲＣ５Ｄを恒常的に活性化するミスセンス変異、ＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子の増幅又は過剰発現等を例示することができる。
また、本発明の分子、又は、本発明の医薬組成物は、ＧＰＲＣ５Ｄを発現している細胞へのＴ細胞等の免疫細胞のリダイレクションによって、該細胞への細胞傷害を誘導することができ、そのため、本発明の分子、又は、本発明の医薬組成物を投与する工程を含む、ＧＰＲＣ５Ｄを発現している細胞へのＴ細胞等の免疫細胞リダイレクションによって該細胞への細胞傷害を誘導する方法を、本発明は提供する。
本発明の医薬組成物の治療又は予防の対象となる癌種としては、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質を発現している癌、例えば、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、非小細胞肺癌などの肺癌、胃癌、前立腺癌、腎癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、食道癌、膀胱癌、子宮頚癌、血液癌、リンパ腫、悪性黒色腫等を挙げることができ、好適には、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質を発現している多発性骨髄腫を挙げることができる。
ＧＰＲＣ５Ｄに関わる疾患の治療又は予防には、ＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質を発現している個体におけるかかる疾患の発症の予防、増悪化若しくは進行の抑制、又は、阻害；かかる疾患に罹患した個体が呈する１つ又は２つ以上の症状の軽減、増悪化若しくは進行の抑制、又は、寛解；かかる疾患に罹患した個体における二次性疾患の治療又は予防等が含まれるが、それらに限定されるものではない。
本発明の医薬組成物には、治療又は予防に有効な量の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、その抗原結合性断片、及び／又は、これらの少なくとも１つを含む分子を有効成分として含み、さらに、薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含有せしめることができる。
「治療又は予防に有効な量」とは、特定の疾患、投与形態および投与径路につき治療又は予防効果を奏する量を意味し、「薬理学的に有効な量」と同義である。
本発明の医薬組成物には、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、該組成物又はそれに含まれる抗体の安定性、溶解性、徐放性、吸収性、浸透性、剤型、強度、性状、形状等を変化させたり、維持したり、保持したりするための物質（以下、「製剤用の物質」という）を含有せしめることができる。製剤用の物質としては、薬理学的に許容される物質であれば特に限定されるものではない。例えば、非毒性又は低毒性であることは、製剤用の物質が好適に具備する性質である。
製剤用の物質として、例えば、以下のものをあげることができるが、これらに限定されるものではない；グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β−シクロデキストリンやヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類やグルコース、マンノースやデキストリン等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルビテート２０やポリソルビテート８０等ポリソルビテート、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトールやソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。
これらの製剤用の物質の添加量は、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、その抗原結合性断片、及び／又は、これらの少なくとも１つを含む分子の重量に対して０．００１乃至１０００倍、好適には０．０１乃至１００倍、より好適には０．１乃至１０倍である。
抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、その抗原結合性断片、及び／又は、これらの少なくとも１つを含む分子をリポソーム中に含有せしめたイムノリポソーム、抗体とリポソームとが結合してなる抗体修飾体（米国特許第６２１４３８８号等）を含有する医薬組成物も、本発明の医薬組成物に含まれる。
賦形剤や担体は、通常液体又は固体であり、注射用の水、生理食塩水、人工脳脊髄液、その他の、経口投与又は非経口投与用の製剤に用いられる物質であれば特に限定されない。生理食塩水としては、中性のもの、血清アルブミンを含むもの等をあげることができる。
緩衝剤としては、医薬組成物の最終ｐＨが７．０乃至８．５になるように調製されたＴｒｉｓバッファー、同じく４．０乃至５．５になるように調製された酢酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたクエン酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたヒスチジンバッファー等を例示することができる。
本発明の医薬組成物は、固体、液体、懸濁液等である。凍結乾燥製剤をあげることができる。凍結乾燥製剤を成型するには、スクロース等の賦形剤を用いることができる。
本発明の医薬組成物の投与径路としては、経腸投与、局所投与及び非経口投与のいずれでもよく、例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、骨内投与、関節内投与等をあげることができる。
かかる医薬組成物の組成は、投与方法、抗体のＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質結合親和性等に応じて決定することができる。  
本発明の医薬組成物の投与量は、薬理学的に有効な量であれば限定されず、個体の種、疾患の種類、症状、性別、年齢、持病、該抗体のＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質結合親和性又はその生物活性、その他の要素に応じて適宜決定することができるが、通常、０．０１乃至１０００ｍｇ／ｋｇ、好適には０．１乃至１００ｍｇ／ｋｇを、１乃至１８０日間に１回、又は１日２回若しくは３回以上投与することができる。
医薬組成物の形態としては、注射剤（凍結乾燥製剤、点滴剤を含む）、坐剤、経鼻型吸収製剤、経皮型吸収製剤、舌下剤、カプセル、錠剤、軟膏剤、顆粒剤、エアーゾル剤、丸剤、散剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、生体埋め込み型製剤等を例示することができる。
本発明の医薬組成物は、他の医薬と同時にあるいは個々に投与することができる。例えば、他の医薬を投与した後に、本発明の医薬組成物を投与するか、かかる医薬組成物を投与した後に、他の医薬を投与するか、又は、当該医薬組成物と他の医薬とを同時に投与してもよい。他の医薬としては、化学療法剤、放射線療法剤など各種抗癌剤等をあげることができる。それらをまとめて本発明の抗体と「他の薬剤との併用」と呼び、本発明の医薬組成物の有効成分に加えてさらなる薬剤を含む医薬組成物も本発明に含まれる。
本発明は癌などＧＰＲＣ５Ｄに関わる疾患の治療方法又は予防方法、該疾患の治療用又は予防用医薬組成物を調製するための本発明の抗体の使用、該疾患の治療又は予防のための本発明の抗体の使用、をも提供する。本発明の抗体を含む治療用又は予防用キットも本発明に含まれる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例において本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年発行）に記載の方法及びその他の当業者が使用する実験書に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って行った。【００５９】
（実施例１）  ラット抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体の作製
１）−１  ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現ベクターを用いた免疫
１）−１−１  ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ−ｈＧＰＲＣ５Ｄ）の構築
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）をＧａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｎｖｅｎｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｆｔｉｆｉｃ社）によりＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒに改変したｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴを作製した。Ｇａｔａｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質（ＮＰ＿０６１１２４．１）をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴベクターにクローニングし、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ−ｈＧＰＲＣ５Ｄを構築した。ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現ベクターの大量調製には、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。【００６０】
１）−１−２  ラット免疫
免疫にはＷＫＹ／Ｉｚｍラットの雌（日本エスエルシー社）を使用した。まずラット両足下腿部をＨｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）にて前処理後、同部位にｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ−ｈＧＰＲＣ５Ｄを筋注した。続けて、ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ社）を使用し、ニードル電極を用いて、同部位にインビボエレクトロポレーションを実施した。約２週間に１度、同様のインビボエレクトロポレーションを繰り返した後、ラットのリンパ節又は脾臓を採取しハイブリドーマ作製に用いた。
１）−２  ハイブリドーマ作製
リンパ節細胞あるいは脾臓細胞とマウスミエローマＳＰ２／０−ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ，  Ｎｏ．ＣＲＬ−１  ５８１）とをＬＦ３０１  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｕｎｉｔ（ＢＥＸ社）を用いて電気細胞融合し、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に希釈して培養した。出現したハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマを作製した。回収された各ハイブリドーマコロニーをＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて培養し、得られたハイブリドーマ培養上清を用いて抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。【００６１】
１）−３  Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法による抗体スクリーニング
１）−３−１  Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法による一次スクリーニング
インテグリンαｖ及びインテグリンβ３発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞内に安定形質移入した細胞株ＨＥＫ２９３α細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中５×１０５細胞／ｍＬになるよう調整した。それに対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた形質移入手順に従い、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ−ｈＧＰＲＣ５ＤもしくはコントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴを導入し、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１００μＬずつ分注し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡに使用した。【００６２】
１）−３−２  Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ
実施例１）−１−１で調製した発現ベクター導入ＨＥＫ２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ−ｈＧＰＲＣ５ＤまたはｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ導入ＨＥＫ２９３α細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を添加し、４℃で１時間静置した。ｗｅｌｌ中の細胞を５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｔ  ＩｇＧ，  ＨＲＰ−
Ｌｉｎｋｅｄ  Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  Ｇｏａｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を加えて、４℃で１時間静置した。ｗｅｌｌ中の細胞を５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、ＯＰＤ発色液（ＯＰＤ溶解液（０．０５Ｍ  クエン酸３ナトリウム、０．１Ｍ  リン酸水素２ナトリウム・１２水  ｐＨ４．５）にｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（和光純薬社）、Ｈ２Ｏ２をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６％（ｖ／ｖ）になるように溶解）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、１Ｍ  ＨＣＬを１００μＬ／ｗｅｌｌを添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するヒトＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、コントロールのｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ導入ＨＥＫ２９３α細胞と比較し、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ−ｈＧＰＲＣ５Ｄ発現ベクター導入ＨＥＫ２９３α細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体産生陽性として選択した。【００６３】
１）−４  フローサイトメトリーによる抗体スクリーニング
１）−４−１  フローサイトメトリー解析用抗原遺伝子発現細胞の調製
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を４×１０５細胞／ｍＬの濃度で２２５ｃｍ２フラスコに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ−ｈＧＰＲＣ５ＤとコントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴをそれぞれＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて導入し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｆｔｉｆｉｃ社）で処理し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで５×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。【００６４】
１）−４−２  フローサイトメトリー解析
実施例１）−３のＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡで陽性と判定されたハイブリドーマが産生する抗体のヒトＧＰＲＣ５Ｄに対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。実施例１）−４−１で調製したＨＥＫ２９３Ｔ細胞懸濁液を１００μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ−ｈＧＰＲＣ５Ｄ導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１回洗浄した後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１００倍に希釈したＰＥ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｔ  Ａｂ（ＢＤ社）を加えて懸濁し、４℃で３０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ：ＢＤ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）で行った。細胞画分のＰＥ蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ−ｈＧＰＲＣ５Ｄ導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマを抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体産生ハイブリドーマとして取得した。【００６５】
１）−５  ＡＤＣＣアッセイによる抗体スクリーニング
１）−５−１  β―ガラクトシダーゼ安定発現細胞の作製
ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺ、及びＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添付プロトコールに従ってＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にトランスフェクションすることにより、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現する組換えレンチウイルスを作製した。得られた組換えレンチウイルスをＶｉｒａＰｏｗｅｒ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のプロトコールに従ってＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染させ、１０μｇ／ｍＬのブラストサイジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でウイルス感染細胞を選択することにより、β−ガラクトシダーゼの安定発現株を取得した。このβ−ガラクトシダーゼを安定発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（以下「２９３Ｔ−ｌａｃＺ細胞」と表記）を標的細胞としてＡＤＣＣ活性を測定した。【００６６】
１）−５−２  標的細胞の調製
実施例１）−５−１で取得した２９３Ｔ−ｌａｃＺ細胞を５×１０５細胞／ｍＬの濃度で７５ｃｍ２フラスコに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ−ｈＧＰＲＣ５ＤとコントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴをそれぞれ２９３Ｔ−ｌａｃＺ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて導入し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入２９３Ｔ−ｌａｃＺ細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｆｔｉｆｉｃ社）で処理し、５％ＦＢＳ含有フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）（以下「ＡＤＣＣ用培地」と略す）にて細胞を２回洗浄し、生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測し、ＡＤＣＣ用培地で１×１０５細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。【００６７】
１）−５−３  エフェクター細胞の調製
ボランティアの血液からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して定法に従い採取したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１０％ＦＢＳ含有フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に懸濁し、遠心後再懸濁して生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測した。遠心後培地を除去し、ＡＤＣＣ用培地に懸濁し、２×１０６細胞／ｍＬになるよう調製し、エフェクター細胞とした。【００６８】
１）−５−４  ハイブリドーマ培養上清の調製
実施例１）−４で取得したラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体産生ハイブリドーマ培養上清の濃度をＦａｓｔＥＬＩＳＡ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＲＤ−Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて測定し、終濃度で１０μｇ／ｍＬになるようＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で調製した。【００６９】
１）−５−５  ＡＤＣＣアッセイ
実施例１）−５−２で取得した２９３Ｔ−ｌａｃＺ細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに添加した。そこに実施例１）−５−４で調製したハイブリドーマ培養上清、または終濃度で１０μｇ／ｍＬになるよう調製したポジティブコントロール用のマウス抗ＧＰＲＣ５Ｄ  ＩｇＧ２ｂ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）またはネガティブコントロール用マウスコントロール抗体（ｍＩｇＧ２ｂ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で１時間静置した。さらに、実施例１）−５−３で調製したエフェクター細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１２００ｒｐｍ×５分間遠心の後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間培養した。上清５０μＬを白色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に回収し、β−Ｇｌｏアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）溶液５０μＬを添加し、発光量をプレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。ＡＤＣＣ活性による細胞溶解率は次式で算出した。
細胞溶解率（％）＝（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルのカウント。
Ｂ：自然放出（抗体・エフェクター細胞非添加ウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。
ハイブリドーマ培養上清添加時とエフェクター細胞添加時にＡＤＣＣ用培地を５０μＬ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
Ｃ：最大放出（標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。ハイブリドーマ培養上清添加時とエフェクター細胞添加時にＡＤＣＣ用培地を５０μＬ添加した。測定時には、細胞を含むウェルに１５０μＬのβ−Ｇｌｏアッセイシステム溶液を添加して混和し、そのうち１００μＬ分を白色プレートに加えて測定を実施した。
上記の方法に従ってｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ−ｈＧＰＲＣ５Ｄ導入２９３Ｔ−ｌａｃＺ細胞とｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ導入２９３Ｔ−ｌａｃＺ細胞に対するＡＤＣＣ活性をそれぞれ算出し、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ−ｈＧＰＲＣ５Ｄ導入２９３Ｔ−ｌａｃＺ細胞特異的にＡＤＣＣ活性を示し、且つポジティブコントロール抗体以上のＡＤＣＣ活性を示す抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択した。【００７０】
１）−６  抗体のアイソタイプ決定
実施例１）−４で取得したラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体産生ハイブリドーマの中から、強くヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合し、かつ実施例１）−５から高いＡＤＣＣ活性を有することが示唆された２Ａ４、２Ｂ１及び７Ｂ４を選抜し、抗体アイソタイプを同定した。アイソタイプは、Ｒａｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  ｔｅｓｔ  ｋｉｔ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社）により決定された。その結果、ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄモノクローナル抗体２Ａ４、２Ｂ１及び７Ｂ４のアイソタイプはどれもＩｇＧ２ｂ、κ鎖であることが確認された。【００７１】
１）−７  モノクローナル抗体の調製
ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清から精製した。まず、２Ａ４、２Ｂ１及び７Ｂ４産生ハイブリドーマをＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で十分量まで増殖させた後、Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を２０％添加した、５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）入りＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に培地交換し、５日間培養した。本培養上清を回収し、０．４５μｍのフィルターを通して滅菌した。
抗体は、上記のハイブリドーマ上清からＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇアフィニティークロマトグラフィー（４〜６℃下）１段階工程で精製した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇアフィニティークロマトグラフィー精製後のバッファー置換工程は４〜６℃下で実施した。最初に、ＰＢＳで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）が充填されたカラムにハイブリドーマの培養上清をアプライした。培養上清液がカラムに全て入ったのち、カラム容量２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に０．１Ｍグリシン／塩酸水溶液（ｐＨ２．７）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。集めた画分に１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐｈ９．０）を加えてｐＨ７．０〜７．５に調製した後に、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ＵＦ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ３０Ｋ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社，４〜６℃下）にてＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ  ヒスチジン／５％ソルビトール、ｐＨ６．０）へのバッファー置換を行うとともに濃縮を行い、抗体濃度を１ｍｇ／ｍｌ以上に調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ−Ｐｌｕｓ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。【００７２】
（実施例２）  ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（２Ａ４、２Ｂ１、７Ｂ４）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
２）−１  取得ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（２Ａ４、２Ｂ１、７Ｂ４）のフローサイトメトリーによるヒトＧＰＲＣ５Ｄへの結合性検討
ＧＰＲＣ５Ｄを発現しているヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＨＭ−１Ｂ細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク）を５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで５×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。０．３２ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬに実施例１）−７で調製したラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（２Ａ４、２Ｂ１、７Ｂ４）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で１時間静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１００倍希釈したＰＥ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｔ  Ａｂ（ＢＤ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で１時間静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ：ＢＤ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）で行った。細胞画分のＰＥ蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。図１に示すとおり、２Ａ４、２Ｂ１及び７Ｂ４はヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合することが示された（２Ａ４ＭＦＩ（ｍａｘ）：１１５３、  ２Ａ４Ｋｄ：０．５ｎＭ、２Ｂ１ＭＦＩ（ｍａｘ）：２３８６、２Ｂ１Ｋｄ：１４．８ｎＭ、  ７Ｂ４ＭＦＩ（ｍａｘ）：２４９２、７Ｂ４Ｋｄ：１．３ｎＭ）。ＧＰＲＣ５Ｄを発現しているヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−３４細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク）でもフローサイトメトリーを実施し、同様の結果を得た（２Ａ４ＭＦＩ（ｍａｘ）：２０６４、２Ａ４Ｋｄ：１．４ｎＭ、２Ｂ１ＭＦＩ（ｍａｘ）：３１５７、２Ｂ１Ｋｄ：１２．７ｎＭ、７Ｂ４ＭＦＩ（ｍａｘ）：４４７１、７Ｂ４Ｋｄ：２．１ｎＭ）。【００７３】
２）−２  取得ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（２Ａ４、２Ｂ１、７Ｂ４）のエピトープの同定
２）−２−１  ＥＬＩＳＡによるエピトープの同定
カルボキシル末端側のペプチドをビオチン化し、分子内でジスルフィド結合を形成していないヒトＧＰＲＣ５Ｄ  アミノ末端ペプチドＭＹＫＤＣＩＥＳＴＧＤＹＦＬＬＣＤＡＥＧＰＷＧＩＩＬＥ（Ｂｉｏｔｉｎ）−ＮＨ２（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）（配列表の配列番号１：図２）と、カルボキシル末端にリジンを入れてビオチン化し、分子内でジスルフィド結合を形成させたヒトＧＰＲＣ５Ｄ  アミノ末端ペプチドＭＹＫＤＣＩＥＳＴＧＤＹＦＬＬＣＤＡＥＧＰＷＧＩＩＬＥ−Ｋ（Ｂｉｏｔｉｎ）−ＮＨ２（ペプチド研究所）（配列表の配列番号２：図３）を用いて、取得ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（２Ａ４、２Ｂ１、７Ｂ４）が結合するエピトープを同定した。ＰＢＳで希釈したペプチドをＮｕｎｃ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＦＢＳを添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＰＢＳで０．１ｎｇ／ｍＬ−１μｇ／ｍＬに希釈した実施例１）−７で調製したラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（２Ａ４、２Ｂ１、７Ｂ４）を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＰＢＳで５００倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｔ  ＩｇＧ，  ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ  Ｇｏａｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、プレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で発光を測定した。その結果、ジスルフィド結合の有無に関わらず、２Ｂ１抗体はヒトＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端ペプチド配列に結合したが、２Ａ４及び７Ｂ４抗体は結合しなかった。従って、２Ｂ１抗体のエピトープはヒトＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端領域に存在し、一方、２Ａ４及び７Ｂ４抗体のエピトープはアミノ末端以外の領域に存在することが示唆された。【００７４】
２）−２−２  フローサイトメトリーによるエピトープの同定
ＧＰＲＣ５Ｄを発現しているヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−３４細胞を５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。７．５μｇ／ｍＬに実施例１）−７で調製したラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（２Ａ４、２Ｂ１、７Ｂ４）またはＲａｔ  ＩｇＧ２ｂ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（ＭＢＬ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、実施例２）−２−１で使用した２種類のペプチドをＰＢＳで１７ｎｇ／ｍＬ〜３４μｇ／ｍＬに調製し、抗体希釈液の入ったｗｅｌｌに１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して、４℃で１時間静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１００倍希釈したＰＥ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｔ  Ａｂ（ＢＤ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で１時間静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ：ＢＤ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）で行った。細胞画分のＰＥ蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出し、ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のＭＦＩ値からｃｏｎｔｒｏｌ抗体のＭＦＩ値を引いて、ＭＦＩの相対値（ｒＭＦＩ）を算出した。図４（分子内ジスルフィド結合あり（Ａ）、なし（Ｂ））に示すとおり、ジスルフィド結合の有無に関わらず、２Ｂ１はヒトＧＰＲＣ５Ｄ  アミノ末端ペプチドを添加すると結合が阻害されることが示された。一方、２Ａ４及び７Ｂ４抗体はヒトＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端ペプチドの添加では結合が阻害されないことが示された。以上の結果から、２Ｂ１抗体のエピトープはヒトＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端領域に存在し、２Ａ４及び７Ｂ４抗体のエピトープはアミノ末端以外の領域に存在することが示唆された。【００７５】
２）−３  取得ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（２Ａ４、２Ｂ１、７Ｂ４）のＡＤＣＣ活性評価
２）−３−１  標的細胞の調製
ヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＨＭ−１Ｂ細胞を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で２×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、細胞懸濁液１ｍＬあたり１００μＬのＣｈｒｏｍｉｕｍ−５１  Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間培養した。１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で２×１０５細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。【００７６】
２）−３−２  エフェクター細胞の調製
実施例１）−５−３で調製したＰＢＭＣを、ＢＩＮＫＩＴ（日本バイオセラピー研究所社）を用いてＮＫ細胞に分化させた。１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０６細胞／ｍＬになるよう調製し、エフェクター細胞とした。【００７７】
２）−３−３  ＡＤＣＣアッセイ
実施例２）−３−１で調製したＫＨＭ−１Ｂ細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに添加した。そこに終濃度で０．５０８１ｎｇ／ｍＬ−１０μｇ／ｍＬになるよう調製した取得ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（２Ａ４、２Ｂ１、７Ｂ４）及びラットコントロール抗体（ｒＩｇＧ２ｂ）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で３０分静置した。さらに、実施例２）−３−２で調製したエフェクター細胞を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１２００ｒｐｍ×３分間遠心の後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。上清５０μＬをＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に回収し、５０℃で一晩乾燥させ、プレートリーダー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。ＡＤＣＣ活性による細胞溶解率は実施例１）−５−５  に倣って算出した。図５に示すとおり、２Ａ４、２Ｂ１及び７Ｂ４はＡＤＣＣ活性を有することが示された。【００７８】
（実施例３）  ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（２Ａ４、２Ｂ１、７Ｂ４）の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
３）−１  ２Ａ４の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
３）−１−１  ２Ａ４産生ハイブリドーマからのｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製
２Ａ４の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅するため、２Ａ４産生ハイブリドーマよりＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。【００７９】
３）−１−２  ｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）の合成
ｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）の合成は実施例３）−１−１で調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡの約１μｇを用い、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて実施した。【００８０】
３）−１−３  ５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによる２Ａ４の重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
２Ａ４の重鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ  （Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）、及び、５’−ＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣ−３’（ＲＧ２ＡＲ３；配列番号３（図６））の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＵＰＭはＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に付属のものを使用し、ＲＧ２ＡＲ３はデータベースのラット重鎖の定常領域の配列から設計した。
このプライマーの組み合わせと、実施例３）−１−２で合成したｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）を鋳型とした５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲにより２Ａ４の重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲはＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のマニュアルに従い、タッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。
５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲで増幅した重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、クローニングした重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
決定された２Ａ４の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号４（図８）に示し、アミノ酸配列を配列番号５（図９）に示した。【００８１】
３）−１−４  ５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによる２Ａ４の軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
２Ａ４の軽鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）、及び、５’−ＴＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣ−３’（ＲＫＲ５；配列番号１０（図７））の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＵＰＭはＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に付属のものを使用し、ＲＫＲ５はデータベースのラット軽鎖の定常領域の配列から設計した。
このプライマーの組み合わせと、実施例３）−１−２で合成したｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）を鋳型とした５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲにより２Ａ４の軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲはＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のマニュアルに従い、タッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。
５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲで増幅した軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、クローニングした軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
決定された２Ａ４の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１１（図１４）に示し、アミノ酸配列を配列番号１２（図１５）に示した。【００８２】
３）−２  ２Ｂ１の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
実施例３）−１と同様の方法で配列を決定した。
決定された２Ｂ１の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号６（図１０）に示し、アミノ酸配列を配列番号７（図１１）に示した。軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１３（図１６）に示し、アミノ酸配列を配列番号１４（図１７）に示した。【００８３】
３）−３  ７Ｂ４の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
実施例３）−１と同様の方法で配列を決定した。
決定された７Ｂ４の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号８（図１２）に示し、アミノ酸配列を配列番号９（図１３）に示した。軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１５（図１８）に示し、アミノ酸配列を配列番号１６（図１９）に示した。【００８４】
（実施例４）  ヒトキメラ化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１、ｃ７Ｂ４）の作製
４）−１  キメラ化及びヒト化軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ−ＬＫの構築
プラスミドｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、配列表の配列番号１７（図２０）に示すヒト軽鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲクローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを作製した。
ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを鋳型として、下記プライマーセットでＰＣＲを行い、得られた約３．８ｋｂのフラグメントをリン酸化後セルフライゲーションすることによりＣＭＶプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、及びヒトκ鎖定常領域を持つ、キメラ化及びヒト化軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ−ＬＫを構築した。
プライマーセット
５’−ＴＡＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣ−３’（３．３−Ｆ１：配列表の配列番号１８：図２１）
５’−ＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＧＴＴＧ−３’（３．３−Ｒ１：配列表の配列番号１９：図２２）【００８５】
４）−２  キメラ化及びヒト化ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ−Ｇ１の構築
ｐＣＭＡ−ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して軽鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたＤＮＡ断片と、配列表の配列番号２０（図２３）で示されるヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲクローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて結合して、ＣＭＶプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を持つキメラ化及びヒト化ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ−Ｇ１を構築した。【００８６】
４）−３  ｃ２Ａ４軽鎖発現ベクターの構築
実施例３）で得られた２Ａ４軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、下記のプライマーセットでＰＣＲを行うことにより軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅し、キメラ化及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ−ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することにより、ｃ２Ａ４軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ−ＬＫ／ｃ２Ａ４」と命名した。ｃ２Ａ４軽鎖のヌクレオチド配列及び該軽鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号２１及び２２（図２４及び２５）にそれぞれ示す。
ｃ２Ａ４軽鎖用プライマーセット
５’−ＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣ−３’（ｃ２Ａ４−ＬＦ：配列表の配列番号２３：図２６）
５’−ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＴＴＣＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＣ−３’（ｃ２Ａ４−ＬＲ：配列表の配列番号２４：図２７）【００８７】
４）−４  ｃ２Ａ４重鎖発現ベクターの構築
実施例３）で得られた２Ａ４重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、下記プライマーセットでＰＣＲを行うことにより重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅し、キメラ化及びヒト化抗体重鎖発現ベクターｐＣＭＡ−Ｇ１を制限酵素ＢＩｐＩで切断した箇所にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することにより、ｃ２Ａ４重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ−Ｇ１／ｃ２Ａ４」と命名した。ｃ２Ａ４重鎖のヌクレオチド配列及び該重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号２５及び２６（図２８及び２９）にそれぞれ示す。
ｃ２Ａ４重鎖用プライマーセット
５’−ＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＧＣＡＧＣＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧ−３’（ｃ２Ａ４−ＨＦ：配列表の配列番号２７：図３０）
５’−ＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧ−３’（ｃ２Ａ４−ＨＲ：配列表の配列番号２８：図３１【００８８】
４）−５  ｃ２Ｂ１軽鎖発現ベクターの構築
実施例３）で得られた２Ｂ１軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、下記プライマーセットでＰＣＲを行うことにより軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。実施例４）−３と同様の方法でｃ２Ｂ１軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ−ＬＫ／ｃ２Ｂ１」と命名した。ｃ２Ｂ１軽鎖のヌクレオチド配列及び該軽鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号２９及び３０（図３２及び３３）にそれぞれ示す。
ｃ２Ｂ１軽鎖用プライマーセット
５’−ＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＡＡＣＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＣＡＣ−３’（ｃ２Ｂ１−ＬＦ：配列表の配列番号３１：図３４）
５’−ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＴＴＣＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＣ−３’（ｃ２Ｂ１−ＬＲ：配列表の配列番号３２：図３５）【００８９】
４）−６  ｃ２Ｂ１重鎖発現ベクターの構築
実施例３）で得られた２Ｂ１重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、下記のプライマーセットでＰＣＲを行うことにより重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。実施例４）−４と同様の方法でｃ２Ｂ１重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ−Ｇ１／ｃ２Ｂ１」と命名した。ｃ２Ｂ１重鎖をコードするヌクレオチド配列及び該重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号３３及び３４（図３６及び３７）にそれぞれ示す。
ｃ２Ｂ１重鎖用プライマーセット
５’−ＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＴＡＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧ−３’（ｃ２Ｂ１−ＨＦ：配列表の配列番号３５：図３８）
５’−ＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧ−３’（ｃ２Ｂ１−ＨＲ：配列表の配列番号３６：図３９）【００９０】
４）−７  ｃ７Ｂ４軽鎖発現ベクターの構築
実施例３）で得られた７Ｂ４軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、下記プライマーセットでＰＣＲを行うことにより軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。実施例４）−３と同様の方法でｃ７Ｂ４軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ−ＬＫ／ｃ７Ｂ４」と命名した。ｃ７Ｂ４軽鎖のヌクレオチド配列及び該軽鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号３７及び３８（図４０及び４１）にそれぞれ示す。
ｃ７Ｂ４軽鎖用プライマーセット
５’−ＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＴＣ−３’（ｃ７Ｂ４−ＬＦ：配列表の配列番号３９：図４２）
５’−ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＡＧ−３’（ｃ７Ｂ４−ＬＲ：配列表の配列番号４０：図４３）【００９１】
４）−８  ｃ７Ｂ４重鎖発現ベクターの構築
実施例３）で得られた７Ｂ４重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、下記のプライマーセットでＰＣＲを行うことにより重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。実施例４）−４と同様の方法でｃ７Ｂ４重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ−Ｇ１／ｃ７Ｂ４」と命名した。ｃ７Ｂ４重鎖のヌクレオチド配列及び該重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号４１及び４２（図４４及び４５）にそれぞれ示す。
ｃ７Ｂ４重鎖用プライマーセット
５’−ＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧ−３’（ｃ７Ｂ４−ＨＦ：配列表の配列番号４３：図４６）
５’−ＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＡＣＴＧＡＡＧＣＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＣＡＧ−３’（ｃ７Ｂ４−ＨＲ：配列表の配列番号４４：図４７）【００９２】
４）−９  ヒトキメラ化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の調製
４）−９−１  ヒトキメラ化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の産生
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の１．２×１０９個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３Ｌ  Ｆｅｒｎｂａｃｈ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  Ｆｌａｓｋ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して２．０×１０６細胞／ｍｌに調製したのちに、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーター内で９０ｒｐｍで１時間振とう培養した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  ＃２４７６５）１．８ｍｇをＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２０ｍｌに溶解し、次にＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ（ＴａＫａＲａ社）を用いて調製した重鎖発現ベクター（０．２４ｍｇ）及び軽鎖発現ベクター（０．３６ｍｇ）を２０ｍｌのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に添加した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ混合液２０ｍｌに、発現ベクター／Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ混合液２０ｍｌを加え穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで４時間、９０ｒｐｍで振とう培養後に６００ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ  ＶＰＲＯ培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１８ｍｌのＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（ＧＩＢＣＯ社）、及び３０ｍｌのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社）を添加し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｃａｐｓｕｌｅ  Ｆｉｌｔｅｒ（Ａｄｖａｎｔｅｃ  ＃ＣＣＳ−０４５−Ｅ１Ｈ）でろ過した。
ｐＣＭＡ−Ｇ１／ｃ２Ａ４とｐＣＭＡ−ＬＫ／ｃ２Ａ４との組合せによって取得されたヒトキメラ化２Ａ４を「ｃ２Ａ４」、ｐＣＭＡ−Ｇ１／ｃ２Ｂ１とｐＣＭＡ−ＬＫ／ｃ２Ｂ１との組合せによって取得されたヒトキメラ化２Ｂ１を「ｃ２Ｂ１」、ｐＣＭＡ−Ｇ１／ｃ７Ｂ４とｐＣＭＡ−ＬＫ／ｃ７Ｂ４との組合せによって取得されたヒトキメラ化７Ｂ４を「ｃ７Ｂ４」と命名した。【００９３】
４）−９−２  ヒトキメラ化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の精製
実施例４）−９−１で得られた培養上清から抗体をｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィー（４−６℃下）１段階工程で精製した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィー精製後のバッファー置換工程は４−６℃下で実施した。培養上清をＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）が充填されたカラムにアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、カラム容量２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ  ヒスチジン／５％ソルビトール、ｐＨ６．０）へのバッファー置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ＵＦ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社，４℃下）にて濃縮し、ＩｇＧ濃度を１０ｍｇ／ｍｌ以上に調製し精製サンプルとした。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ−Ｐｌｕｓ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。【００９４】
（実施例５）  ヒトキメラ化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１、ｃ７Ｂ４）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
５）−１  ヒトキメラ化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１、ｃ７Ｂ４）のフローサイトメトリーによるヒトＧＰＲＣ５Ｄへの結合性検討
ＧＰＲＣ５Ｄを発現しているヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＨＭ−１Ｂ細胞を５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで５×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。１．２ｎｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬに調製したヒトキメラ化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１、ｃ７Ｂ４）またはＨｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で１時間静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１００倍希釈したＲ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ、Ｆｃγ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で１時間静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ：ＢＤ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）で行った。細胞画分のＰＥ蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出し、ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のＭＦＩ値からｃｏｎｔｒｏｌ抗体のＭＦＩ値を引いて、ＭＦＩ値の相対値（ｒＦＭＩ）を算出した。図４８に示すとおり、ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１及びｃ７Ｂ４はヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合することが示された。【００９５】
５）−２  ヒトキメラ化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１、ｃ７Ｂ４）のカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄへの交差性検討
５）−２−１  カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ−ｃＧＰＲＣ５Ｄ）の構築
実施例１）−１−１で調製したｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴに、Ｇａｔａｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ蛋白質（ＸＰ＿００５５７０２４９．１）をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴベクターにクローニングし、カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ−ｃＧＰＲＣ５Ｄを構築した。カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ発現ベクターの大量調製には、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。【００９６】
５）−２−２  カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞株の作製
ヒトＧＰＲＣ５Ｄを発現していない多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−１１（ＪＣＲＢ細胞バンク）を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を使用して３．７×１０５細胞／ｍＬの濃度で７５ｃｍ２フラスコに播種し、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＥＳＴ−ｃＧＰＲＣ５ＤをＫＭＳ−１１細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて導入し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。培養した発現ベクター導入ＫＭＳ−１１細胞を、１ｍｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）入り１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０６細胞／ｍＬの濃度で培養し、薬剤スクリーニングを行った。バルクの細胞を１ｍｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）入りＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して限界希釈法を用いてシングルクローン化し、カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ発現多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−１１＿ｃＧＰＲＣ５Ｄを樹立した。【００９７】
５）−２−３  ヒトキメラ化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１、ｃ７Ｂ４）のフローサイトメトリーによるカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄへの結合性検討  
実施例５）−２−２で作製したＫＭＳ−１１＿ｃＧＰＲＣ５Ｄ細胞を５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで５×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。１．２ｎｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬに調製したヒトキメラ化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１、ｃ７Ｂ４）またはＨｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で１時間静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１００倍希釈したＲ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，  Ｆｃγ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で１時間静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ：ＢＤ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）で行った。細胞画分のＰＥ蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出し、ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のＭＦＩ値からｃｏｎｔｒｏｌ抗体のＭＦＩ値を引いて、ＭＦＩ値の相対値（ｒＦＭＩ）を算出した。図４９に示す通り、ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１及びｃ７Ｂ４はカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに結合することが示された。ヒトＧＰＲＣ５Ｄ及びカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体等は、医薬品の非臨床開発（前臨床開発）に有用な霊長類、特にカニクイザルを用いた有効性や安全性に関する各種試験に供することができ好ましい。また、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ及びカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体等は、細胞傷害活性を有し、単独で又は本発明の分子として、カニクイザルにおける癌等の疾患の治療又は予防に有用である。
なお、５）−２と同様の方法で、ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１及びｃ７Ｂ４のラットＧＰＲＣ５Ｄ、及び、マウスＧＰＲＣ５Ｄへの交差性を検討したところ、ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１及びｃ７Ｂ４はいずれもラットＧＰＲＣ５Ｄ、及び、マウスＧＰＲＣ５Ｄに結合しなかった。かかるｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１及びｃ７Ｂ４は、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子が導入されたマウスやラットの細胞、組織、個体（トランスジェニック動物、ノックアウト動物、ノックイン動物を含む）及び該抗体等を用いた各種アッセイ、免疫組織化学等を、宿主であるマウスのＧＰＲＣ５Ｄによる影響無しに実施することができ、該抗体等を含む医薬、動物薬又は診断薬等のマウスやラットを用いた研究及び非臨床開発上好ましい。【００９８】
５）−３  ヒトキメラ化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１、ｃ７Ｂ４）のＡＤＣＣ活性
実施例２）−３−１で取得したＫＨＭ−１Ｂ細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに添加した。そこに終濃度で０．６４ｎｇ／ｍＬ−２μｇ／ｍＬになるよう調製した実施例４で調製した精製ヒトキメラ化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１、ｃ７Ｂ４）及びヒトコントロール抗体（ｈＩｇＧ１）（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で３０分静置した。さらに、実施例１）−５−３で調製（３×１０６細胞／ｍＬになるよう調製）したエフェクター細胞を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１２００ｒｐｍ×３分間遠心の後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。上清５０μＬをＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に回収し、５０℃で一晩乾燥させ、プレートリーダー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。ＡＤＣＣ活性による細胞溶解率は実施例１）−５−５  に倣って算出した。図５０に示すとおり、ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１及びｃ７Ｂ４はＡＤＣＣ活性を有することが示された。【００９９】
（実施例６）  ヒトキメラ化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１、ｃ７Ｂ４）のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
１×１０７細胞のヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＨＭ−１Ｂ細胞を１００％マトリゲル（ＢＤ社）で懸濁し、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（ＣａｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ、日本チャールズリバー社より購入）の腋窩部皮下に移植した。移植の３、１０日後にヒトキメラ化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｃ２Ａ４、ｃ２Ｂ１、ｃ７Ｂ４）を１０ｍｇ／ｋｇで担癌マウスの尾静脈に投与した（ｎ＝１２または１１）。移植腫瘍の長径及び短径を週２回、電子デジタルノギス（株式会社ミツトヨ製）を用いて測定し、以下に示す計算式により腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝１／２×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×長径（ｍｍ）
ｃ２Ａ４抗体の結果を図５１に示した。移植２１日後における腫瘍増殖抑制率は９６％であった。
ｃ２Ｂ１抗体の結果を図５２に示した。移植２１日後における腫瘍増殖抑制率は９５％であった。
ｃ７Ｂ４抗体の結果を図５３に示した。移植２１日後における腫瘍増殖抑制率は９４％であった。【０１００】
（実施例７）  ヒトキメラ化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｃ２Ｂ１、ｃ７Ｂ４）のヒト化バージョン（ｈ２Ｂ１、ｈ７Ｂ４）の設計
７）−１  抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ｂ１のヒト化体デザイン
７）−１−１  ２Ｂ１の可変領域の分子モデリング
２Ｂ１の可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１−１５３，（１９９１））によって実行された。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３５，Ｄ３０１−Ｄ３０３（２００７））に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の１次配列（Ｘ線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である）を、上で決定された２Ｂ１の可変領域と比較した。結果として３ＭＢＸが２Ｂ１の重鎖と軽鎖の可変領域に対して最も高い配列同一性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、２Ｂ１の重鎖及び軽鎖に対応する３ＭＢＸの座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。次いで、それぞれのＣＤＲについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。最後に、エネルギーの点で２Ｂ１の可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くためのエネルギー計算を行った。上記手順を、市販のタンパク質立体構造解析プログラムＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社製）を用いて行った。【０１０１】
７）−１−２  ヒト化ｈ２Ｂ１に対するアミノ酸配列の設計
ヒト化ｈ２Ｂ１の構築を、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１００２９−１００３３（１９８９））として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸同一性に基づいて選択された。
２Ｂ１のフレームワーク領域の配列を、ＫＡＢＡＴ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））において既定されるヒトのサブグループ・コンセンサス配列やＧｅｒｍｌｉｎｅ配列のフレームワーク領域と比較した。結果として、重鎖についてはヒトＧｅｒｍｌｉｎｅ配列ＩＧＨＶ２＿５ｘ０８とＩＧＨＪ１ｘ０１とヒトｇａｍｍａ鎖サブグループ２のコンセンサス配列が、軽鎖についてはヒトＧｅｒｍｌｉｎｅ配列ＩＧＫＶ１＿８ｘ０１とＩＧＫＪ４ｘ０１とヒトｋａｐｐａ鎖サブグループ４のコンセンサス配列が、そのフレームワーク領域において高い配列同一性に有することに起因して、アクセプターとして選択された。アクセプターについてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、２Ｂ１についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築された２Ｂ１の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１００２９−１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択された。選択された幾つかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化ｈ２Ｂ１の配列を以下の実施例に記載されるように構築した。なお、重鎖に関してはドナー残基に限らず、箇所によってはｇａｍｍａ鎖サブグループ１のコンセンサス配列の残基を移入した。【０１０２】
７）−１−３  ２Ｂ１重鎖のヒト化
７）−１−３−１  ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｈ１タイプ重鎖
配列番号３４に示されるキメラｃ２Ｂ１の重鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号３目のスレオニンをグルタミンに、アミノ酸番号５目のリジンをバリンに、アミノ酸番号９目のプロリンをグリシンに、アミノ酸番号１１目のイソロイシンをロイシンに、アミノ酸番号１２目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１３目のグルタミンをリジンに、アミノ酸番号４３目のセリンをプロリンに、アミノ酸番号５０目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号５１目のアラニンをグリシンに、アミノ酸番号６６目のアルギニンをリジンに、アミノ酸番号６７目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号６９目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号７３目のリジンをバリンに、アミノ酸番号７７目のアスパラギンをリジンに、アミノ酸番号８１目のフェニルアラニンをセリンに、アミノ酸番号８４目のイソロイシンをロイシンに、アミノ酸番号８５目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号８６目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号８８目のアスパラギン酸をスレオニンに、アミノ酸番号８９目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号９４目のスレオニンをバリンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ２Ｂ１重鎖を「ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｈ１タイプ重鎖」（「ｈ２Ｂ１＿Ｈ１」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｈ１タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７４（図８３）に記載されている。配列番号７４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号７３（図８２）に記載されている。【０１０３】
７）−１−３−２  ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｈ２タイプ重鎖
配列番号３４に示されるキメラｃ２Ｂ１の重鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号３目のスレオニンをグルタミンに、アミノ酸番号５目のリジンをバリンに、アミノ酸番号９目のプロリンをグリシンに、アミノ酸番号１１目のイソロイシンをロイシンに、アミノ酸番号１２目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１３目のグルタミンをリジンに、アミノ酸番号４３目のセリンをプロリンに、アミノ酸番号５０目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号５１目のアラニンをグリシンに、アミノ酸番号６６目のアルギニンをリジンに、アミノ酸番号６７目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号６９目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号８１目のフェニルアラニンをセリンに、アミノ酸番号８４目のイソロイシンをロイシンに、アミノ酸番号８５目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号８６目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号８８目のアスパラギン酸をスレオニンに、アミノ酸番号８９目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号９４目のスレオニンをバリンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ２Ｂ１重鎖を「ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｈ２タイプ重鎖」（「ｈ２Ｂ１＿Ｈ２」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｈ２タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７６（図８５）に記載されている。配列番号７６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号７５（図８４）に記載されている。【０１０４】
７）−１−３−３  ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｈ３タイプ重鎖
配列番号３４に示されるキメラｃ２Ｂ１の重鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号３目のスレオニンをグルタミンに、アミノ酸番号５目のリジンをバリンに、アミノ酸番号９目のプロリンをグリシンに、アミノ酸番号１１目のイソロイシンをロイシンに、アミノ酸番号１２目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１３目のグルタミンをリジンに、アミノ酸番号４３目のセリンをプロリンに、アミノ酸番号５０目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号６６目のアルギニンをリジンに、アミノ酸番号６７目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号６９目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号８１目のフェニルアラニンをセリンに、アミノ酸番号８４目のイソロイシンをロイシンに、アミノ酸番号８５目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号８６目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号８８目のアスパラギン酸をスレオニンに、アミノ酸番号８９目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号９４目のスレオニンをバリンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ２Ｂ１重鎖を「ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｈ３タイプ重鎖」（「ｈ２Ｂ１＿Ｈ３」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｈ３タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７８（図８７）に記載されている。配列番号７８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号７７（図８６）に記載されている。【０１０５】
７）−１−３−４  ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｈ４タイプ重鎖
配列番号３４に示されるキメラｃ２Ｂ１の重鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１０目のグリシンをアラニンに、アミノ酸番号１１目のイソロイシンをロイシンに、アミノ酸番号１２目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１３目のグルタミンをリジンに、アミノ酸番号１５目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号１９目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号４３目のセリンをプロリンに、アミノ酸番号６２目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号６６目のアルギニンをリジンに、アミノ酸番号６７目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号７２目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号８１目のフェニルアラニンをバリンに、アミノ酸番号８３目のリジンをスレオニンに、アミノ酸番号８４目のイソロイシンをメチオニンに、アミノ酸番号８７目のバリンをメチオニンに、アミノ酸番号８９目のスレオニンをプロリンに、アミノ酸番号９０目のアラニンをバリンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ２Ｂ１重鎖を「ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｈ４タイプ重鎖」（「ｈ２Ｂ１＿Ｈ４」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｈ４タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８０（図８９）に記載されている。配列番号８０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号７９（図８８）に記載されている。【０１０６】
７）−１−４  ２Ｂ１軽鎖のヒト化
７）−１−４−１  ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｌ１タイプ軽鎖
配列番号３０に示されるキメラｃ２Ｂ１の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１目のグルタミン酸をアスパラギン酸に、アミノ酸番号９目のスレオニンをアスパラギン酸に、アミノ酸番号１１目のメチオニンをロイシンに、アミノ酸番号１２目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号１３目のスレオニンをバリンに、アミノ酸番号１５目のイソロイシンをロイシンに、アミノ酸番号１９目のバリンをアラニンに、アミノ酸番号２１目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号３９目のスレオニンをリジンに、アミノ酸番号４３目のセリンをプロリンに、アミノ酸番号６３目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号６７目のフェニルアラニンをセリンに、アミノ酸番号７７目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号７８目のバリンをロイシンに、アミノ酸番号７９目のグルタミン酸をグルタミンに、アミノ酸番号８３目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１００目のグリシンをグルタミンに、アミノ酸番号１０４目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１０６目のロイシンをイソロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ２Ｂ１軽鎖を「ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｌ１タイプ軽鎖」（「ｈ２Ｂ１＿Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｌ１タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６４（図７３）に記載されている。配列番号６４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号６３（図７２）に記載されている。【０１０７】
７）−１−４−２  ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｌ２タイプ軽鎖
配列番号３０に示されるキメラｃ２Ｂ１の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１目のグルタミン酸をアスパラギン酸に、アミノ酸番号９目のスレオニンをアスパラギン酸に、アミノ酸番号１１目のメチオニンをロイシンに、アミノ酸番号１２目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号１３目のスレオニンをバリンに、アミノ酸番号１５目のイソロイシンをロイシンに、アミノ酸番号１９目のバリンをアラニンに、アミノ酸番号２１目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号３９目のスレオニンをリジンに、アミノ酸番号４３目のセリンをプロリンに、アミノ酸番号６３目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号６９目のアルギニンをスレオニンに、アミノ酸番号７７目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号７８目のバリンをロイシンに、アミノ酸番号７９目のグルタミン酸をグルタミンに、アミノ酸番号８３目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１００目のグリシンをグルタミンに、アミノ酸番号１０４目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１０６目のロイシンをイソロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ２Ｂ１軽鎖を「ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｌ２タイプ軽鎖」（「ｈ２Ｂ１＿Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｌ２タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６６（図７５）に記載されている。配列番号６６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号６５（図７４）に記載されている。【０１０８】
７）−１−４−３  ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｌ３タイプ軽鎖
配列番号３０に示されるキメラｃ２Ｂ１の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１目のグルタミン酸をアスパラギン酸に、アミノ酸番号９目のスレオニンをアスパラギン酸に、アミノ酸番号１１目のメチオニンをロイシンに、アミノ酸番号１２目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号１３目のスレオニンをバリンに、アミノ酸番号１５目のイソロイシンをロイシンに、アミノ酸番号１９目のバリンをアラニンに、アミノ酸番号２１目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号３９目のスレオニンをリジンに、アミノ酸番号４３目のセリンをプロリンに、アミノ酸番号６３目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号７７目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号７８目のバリンをロイシンに、アミノ酸番号７９目のグルタミン酸をグルタミンに、アミノ酸番号８３目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１００目のグリシンをグルタミンに、アミノ酸番号１０４目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１０６目のロイシンをイソロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ２Ｂ１軽鎖を「ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｌ３タイプ軽鎖」（「ｈ２Ｂ１＿Ｌ３」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｌ３タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６８（図７７）に記載されている。配列番号６８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号６７（図７６）に記載されている。【０１０９】
７）−１−４−４  ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｌ４タイプ軽鎖
配列番号３０に示されるキメラｃ２Ｂ１の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１目のグルタミン酸をアスパラギン酸に、アミノ酸番号９目のスレオニンをアスパラギン酸に、アミノ酸番号１１目のメチオニンをロイシンに、アミノ酸番号１２目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号１３目のスレオニンをバリンに、アミノ酸番号１５目のイソロイシンをロイシンに、アミノ酸番号１９目のバリンをアラニンに、アミノ酸番号２１目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号３９目のスレオニンをリジンに、アミノ酸番号６３目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号７７目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号７８目のバリンをロイシンに、アミノ酸番号７９目のグルタミン酸をグルタミンに、アミノ酸番号８３目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１００目のグリシンをグルタミンに、アミノ酸番号１０４目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１０６目のロイシンをイソロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ２Ｂ１軽鎖を「ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｌ４タイプ軽鎖」（「ｈ２Ｂ１＿Ｌ４」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｌ４タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７０（図７９）に記載されている。配列番号７０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号６９（図７８）に記載されている。【０１１０】
７）−１−４−５  ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｌ５タイプ軽鎖
配列番号３０に示されるキメラｃ２Ｂ１の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１目のグルタミン酸をアラニンに、アミノ酸番号３目のバリンをアルギニンに、アミノ酸番号９目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号１１目のメチオニンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号１３目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号１５目のイソロイシンをスレオニンに、アミノ酸番号１７目のグルタミン酸をアスパラギン酸に、アミノ酸番号２１目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号２２目のアスパラギンをスレオニンに、アミノ酸番号３９目のスレオニンをリジンに、アミノ酸番号４２目のグルタミンをリジンに、アミノ酸番号６０目のアスパラギン酸をセリンに、アミノ酸番号６３目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号７７目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号７８目のバリンをロイシンに、アミノ酸番号７９目のグルタミン酸をグルタミンに、アミノ酸番号８０目のアラニンをセリンに、アミノ酸番号８３目のロイシンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号８５目のバリンをスレオニンに、アミノ酸番号１０４目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１０６目のロイシンをイソロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ２Ｂ１軽鎖を「ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｌ５タイプ軽鎖」（「ｈ２Ｂ１＿Ｌ５」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ２Ｂ１＿Ｌ５タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７２（図８１）に記載されている。配列番号７２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号７１（図８０）に記載されている。【０１１１】
７）−２  抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体７Ｂ４のヒト化体デザイン
７）−２−１  ７Ｂ４の可変領域の分子モデリング
７Ｂ４の可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１−１５３，（１９９１））によって実行された。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３５，Ｄ３０１−Ｄ３０３（２００７））に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の１次配列（Ｘ線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である）を、上で決定された７Ｂ４の可変領域と比較した。結果として１ＢＧＸが７Ｂ４の重鎖と軽鎖の可変領域に対して最も高い配列同一性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、７Ｂ４の重鎖及び軽鎖に対応する１ＢＧＸの座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。次いで、それぞれのＣＤＲについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。最後に、エネルギーの点で７Ｂ４の可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くためのエネルギー計算を行った。上記手順を、市販のタンパク質立体構造解析プログラムＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社製）を用いて行った。【０１１２】
７）−２−２  ヒト化ｈ７Ｂ４に対するアミノ酸配列の設計
ヒト化ｈ７Ｂ４の構築を、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１００２９−１００３３（１９８９））として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸同一性に基づいて選択された。
７Ｂ４のフレームワーク領域の配列を、ＫＡＢＡＴ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））において既定されるヒトのサブグループ・コンセンサス配列やＧｅｒｍｌｉｎｅ配列のフレームワーク領域と比較した。結果として、重鎖についてはヒトｇａｍｍａ鎖サブグループ２のコンセンサス配列が、軽鎖についてはヒトｋａｐｐａ鎖サブグループ３のコンセンサス配列が、そのフレームワーク領域において高い配列同一性に有することに起因して、アクセプターとして選択された。アクセプターについてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、７Ｂ４についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築された７Ｂ４の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１００２９−１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択された。選択された幾つかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化ｈ７Ｂ４の配列を以下の実施例に記載されるように構築した。なお、軽鎖に関してはドナー残基に限らず、箇所によってはｋａｐｐａ鎖サブグループ１のコンセンサス配列の残基を移入した。【０１１３】
７）−２−３  ７Ｂ４重鎖のヒト化
７）−２−３−１  ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｈ１タイプ重鎖
配列番号４２に示されるキメラｃ７Ｂ４の重鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１目のグルタミン酸をグルタミンに、アミノ酸番号２目のイソロイシンをバリンに、アミノ酸番号３目のヒスチジンをグルタミンに、アミノ酸番号１７目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号２３目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号２５目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号４０目のリジンをグルタミンに、アミノ酸番号４１目のフェニルアラニンをプロリンに、アミノ酸番号４４目のアスパラギンをリジンに、アミノ酸番号４５目のリジンをグリシンに、アミノ酸番号４６目のメチオニンをロイシンに、アミノ酸番号４９目のメチオニンをイソロイシンに、アミノ酸番号６８目のイソロイシンをバリンに、アミノ酸番号６９目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号７１目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号８０目のフェニルアラニンをセリンに、アミノ酸番号８２目のグルタミンをリジンに、アミノ酸番号８４目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号８８目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号８９目のグルタミン酸をアラニンに、アミノ酸番号９３目のスレオニンをバリンに、アミノ酸番号１１７目のアラニンをスレオニンに、アミノ酸番号１１８目のセリンをロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ７Ｂ４重鎖を「ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｈ１タイプ重鎖」（「ｈ７Ｂ４＿Ｈ１」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｈ１タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８６（図９５）に記載されている。配列番号８６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号８５（図９４）に記載されている。【０１１４】
７）−２−３−２  ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｈ２タイプ重鎖
配列番号４２に示されるキメラｃ７Ｂ４の重鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号３目のヒスチジンをグルタミンに、アミノ酸番号１７目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号２３目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号２５目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号４０目のリジンをグルタミンに、アミノ酸番号４１目のフェニルアラニンをプロリンに、アミノ酸番号４４目のアスパラギンをリジンに、アミノ酸番号４５目のリジンをグリシンに、アミノ酸番号４６目のメチオニンをロイシンに、アミノ酸番号４９目のメチオニンをイソロイシンに、アミノ酸番号５０目のアラニンをグリシンに、アミノ酸番号６８目のイソロイシンをバリンに、アミノ酸番号６９目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号７１目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号８０目のフェニルアラニンをセリンに、アミノ酸番号８２目のグルタミンをリジンに、アミノ酸番号８４目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号８８目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号８９目のグルタミン酸をアラニンに、アミノ酸番号９３目のスレオニンをバリンに、アミノ酸番号１１７目のアラニンをスレオニンに、アミノ酸番号１１８目のセリンをロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ７Ｂ４重鎖を「ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｈ２タイプ重鎖」（「ｈ７Ｂ４＿Ｈ２」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｈ２タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８８（図９７）に記載されている。配列番号８８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号８７（図９６）に記載されている。【０１１５】
７）−２−３−３  ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｈ３タイプ重鎖
配列番号４２に示されるキメラｃ７Ｂ４の重鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号３目のヒスチジンをグルタミンに、アミノ酸番号１７目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号２３目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号２５目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号４０目のリジンをグルタミンに、アミノ酸番号４１目のフェニルアラニンをプロリンに、アミノ酸番号４４目のアスパラギンをリジンに、アミノ酸番号４５目のリジンをグリシンに、アミノ酸番号４６目のメチオニンをロイシンに、アミノ酸番号４９目のメチオニンをイソロイシンに、アミノ酸番号６８目のイソロイシンをバリンに、アミノ酸番号６９目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号７１目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号８０目のフェニルアラニンをセリンに、アミノ酸番号８２目のグルタミンをリジンに、アミノ酸番号８４目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号８８目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号８９目のグルタミン酸をアラニンに、アミノ酸番号９３目のスレオニンをバリンに、アミノ酸番号１１７目のアラニンをスレオニンに、アミノ酸番号１１８目のセリンをロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ７Ｂ４重鎖を「ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｈ３タイプ重鎖」（「ｈ７Ｂ４＿Ｈ３」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｈ３タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９０（図９９）に記載されている。配列番号９０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号８９（図９８）に記載されている。【０１１６】
７）−２−３−４  ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｈ５タイプ重鎖
配列番号４２に示されるキメラｃ７Ｂ４の重鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号３目のヒスチジンをグルタミンに、アミノ酸番号１７目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号２３目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号２５目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号４１目のフェニルアラニンをプロリンに、アミノ酸番号４９目のメチオニンをイソロイシンに、アミノ酸番号６８目のイソロイシンをバリンに、アミノ酸番号６９目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号７１目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号８０目のフェニルアラニンをセリンに、アミノ酸番号８２目のグルタミンをリジンに、アミノ酸番号８４目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号８８目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号８９目のグルタミン酸をアラニンに、アミノ酸番号９３目のスレオニンをバリンに、アミノ酸番号１１７目のアラニンをスレオニンに、アミノ酸番号１１８目のセリンをロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ７Ｂ４重鎖を「ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｈ５タイプ重鎖」（「ｈ７Ｂ４＿Ｈ５」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｈ５タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９２（図１０１）に記載されている。配列番号９２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号９１（図１００）に記載されている。【０１１７】
７）−２−４  ７Ｂ４軽鎖のヒト化
７）−２−４−１  ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｌ１タイプ軽鎖
配列番号３８に示されるキメラｃ７Ｂ４の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１目のアスパラギン酸をグルタミン酸に、アミノ酸番号３目のグルタミンをバリンに、アミノ酸番号４目のメチオニンをロイシンに、アミノ酸番号９目のセリンをグリシンに、アミノ酸番号１０目のフェニルアラニンをスレオニンに、アミノ酸番号１３目のアラニンをロイシンに、アミノ酸番号１５目のバリンをプロリンに、アミノ酸番号１９目のバリンをアラニンに、アミノ酸番号４０目のロイシンをプロリンに、アミノ酸番号４２目のグルタミン酸をグルタミンに、アミノ酸番号４５目のリジンをアルギニンに、アミノ酸番号６０目のセリンをアスパラギン酸に、アミノ酸番号７７目のグリシンをアルギニンに、アミノ酸番号７９目のグルタミンをグルタミン酸に、アミノ酸番号８３目のバリンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号８５目のスレオニンをバリンに、アミノ酸番号８７目のフェニルアラニンをチロシンに、アミノ酸番号９９目のアラニンをグルタミンに、アミノ酸番号１０３目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１０５目のロイシンをイソロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ７Ｂ４軽鎖を「ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｌ１タイプ軽鎖」（「ｈ７Ｂ４＿Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｌ１タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８２（図９１）に記載されている。配列番号８２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号８１（図９０）に記載されている。【０１１８】
７）−２−４−２  ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｌ２タイプ軽鎖
配列番号３８に示されるキメラｃ７Ｂ４の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１０目のフェニルアラニンをセリンに、アミノ酸番号１３目のアラニンをロイシンに、アミノ酸番号１５目のバリンをプロリンに、アミノ酸番号１９目のバリンをアラニンに、アミノ酸番号４０目のロイシンをプロリンに、アミノ酸番号４２目のグルタミン酸をグルタミンに、アミノ酸番号４５目のリジンをアルギニンに、アミノ酸番号６０目のセリンをアスパラギン酸に、アミノ酸番号７７目のグリシンをアルギニンに、アミノ酸番号７９目のグルタミンをグルタミン酸に、アミノ酸番号８３目のバリンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号８５目のスレオニンをバリンに、アミノ酸番号８７目のフェニルアラニンをチロシンに、アミノ酸番号９９目のアラニンをグルタミンに、アミノ酸番号１０３目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１０５目のロイシンをイソロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈ７Ｂ４軽鎖を「ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｌ２タイプ軽鎖」（「ｈ７Ｂ４＿Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。
ヒト化ｈ７Ｂ４＿Ｌ２タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８４（図９３）に記載されている。配列番号８４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号８３（図９２）に記載されている。【０１１９】
（実施例８）  ラット抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体（２Ｂ１、７Ｂ４）のヒト化抗体（ｈ２Ｂ１、ｈ７Ｂ４）の発現ベクターの構築と抗体の調製
８）−１  ｈ２Ｂ１の重鎖発現ベクターの構築
８）−１−１  ｈ２Ｂ１＿Ｈ１タイプ重鎖の構築
配列番号７３に示すｈ２Ｂ１＿Ｈ１のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号５８乃至４２６に示されるｈ２Ｂ１＿Ｈ１の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  人工遺伝子合成サービス）。実施例８）−１−１と同様の方法でｈ２Ｂ１＿Ｈ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ１」と命名した。【０１２０】
８）−１−２  ｈ２Ｂ１＿Ｈ２タイプ重鎖の構築
配列番号７５に示すｈ２Ｂ１＿Ｈ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号５８乃至４２６に示されるｈ２Ｂ１＿Ｈ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、キメラ及びヒト化抗体重鎖発現ベクターｐＣＭＡ−Ｇ１を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することによりｈ２Ｂ１＿Ｈ２発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ２」と命名した。【０１２１】
８）−１−３  ｈ２Ｂ１＿Ｈ３タイプ重鎖の構築
配列番号７７に示すｈ２Ｂ１＿Ｈ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号５８乃至４２６に示されるｈ２Ｂ１＿Ｈ３の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  人工遺伝子合成サービス）。実施例８）−１−１と同様の方法でｈ２Ｂ１＿Ｈ３発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ３」と命名した。【０１２２】
８）−１−４  ｈ２Ｂ１＿Ｈ４タイプ重鎖の構築
配列番号７９に示すｈ２Ｂ１＿Ｈ４のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号５８乃至４２６に示されるｈ２Ｂ１＿Ｈ４の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  人工遺伝子合成サービス）。実施例８）−１−１と同様の方法でｈ２Ｂ１＿Ｈ４発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ４」と命名した。【０１２３】
８）−２  ｈ２Ｂ１の軽鎖発現ベクターの構築
８）−２−１  ｈ２Ｂ１＿Ｌ１タイプ軽鎖の構築
配列番号６３に示すｈ２Ｂ１＿Ｌ１のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号６１乃至３８１に示されるｈ２Ｂ１＿Ｌ１の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ−ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することによりｈ２Ｂ１＿Ｌ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ１」と命名した。【０１２４】
８）−２−２  ｈ２Ｂ１＿Ｌ２タイプ軽鎖の構築
配列番号６５に示すｈ２Ｂ１＿Ｌ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号６１乃至３８１に示されるｈ２Ｂ１＿Ｌ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  遺伝子合成サービス）。実施例８）−２−１と同様の方法でｈ２Ｂ１＿Ｌ２発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ２」と命名した。【０１２５】
８）−２−３  ｈ２Ｂ１＿Ｌ３タイプ軽鎖の構築
配列番号６７に示すｈ２Ｂ１＿Ｌ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号６１乃至３８１に示されるｈ２Ｂ１＿Ｌ３の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  遺伝子合成サービス）。実施例８）−２−１と同様の方法でｈ２Ｂ１＿Ｌ３発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ３」と命名した。【０１２６】
８）−２−４  ｈ２Ｂ１＿Ｌ４タイプ軽鎖の構築
配列番号６９に示すｈ２Ｂ１＿Ｌ４のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号６１乃至３８１に示されるｈ２Ｂ１＿Ｌ４の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  遺伝子合成サービス）。実施例８）−２−１と同様の方法でｈ２Ｂ１＿Ｌ４発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ４」と命名した。【０１２７】
８）−２−５  ｈ２Ｂ１＿Ｌ５タイプ軽鎖の構築
配列番号７１に示すｈ２Ｂ１＿Ｌ５のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号６１乃至３８１に示されるｈ２Ｂ１＿Ｌ５の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  遺伝子合成サービス）。実施例８）−２−１と同様の方法でｈ２Ｂ１＿Ｌ５発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ５」と命名した。【０１２８】
８）−３  ｈ７Ｂ４の重鎖発現ベクターの構築
８）−３−１  ｈ７Ｂ４＿Ｈ１タイプ重鎖の構築
配列番号８５に示すｈ７Ｂ４＿Ｈ１のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号５８乃至４２６に示されるｈ７Ｂ４＿Ｈ１の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  人工遺伝子合成サービス）。実施例８）−１−１と同様の方法でｈ７Ｂ４＿Ｈ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｈ１」と命名した。【０１２９】
８）−３−２  ｈ７Ｂ４＿Ｈ２タイプ重鎖の構築
配列番号８７に示すｈ７Ｂ４＿Ｈ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号５８乃至４２６に示されるｈ７Ｂ４＿Ｈ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  人工遺伝子合成サービス）。実施例８）−１−１と同様の方法でｈ７Ｂ４＿Ｈ２発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｈ２」と命名した。【０１３０】
８）−３−３  ｈ７Ｂ４＿Ｈ３タイプ重鎖の構築
配列番号８９に示すｈ７Ｂ４＿Ｈ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号５８乃至４２６に示されるｈ７Ｂ４＿Ｈ３の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  人工遺伝子合成サービス）。実施例８）−１−１と同様の方法でｈ７Ｂ４＿Ｈ３発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｈ３」と命名した。【０１３１】
８）−３−４  ｈ７Ｂ４＿Ｈ５タイプ重鎖の構築
配列番号９１に示すｈ７Ｂ４＿Ｈ５のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号５８乃至４２６に示されるｈ７Ｂ４＿Ｈ５の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  人工遺伝子合成サービス）。実施例８）−１−１と同様の方法でｈ７Ｂ４＿Ｈ５発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｈ５」と命名した。【０１３２】
８）−４  ｈ７Ｂ４の軽鎖発現ベクターの構築
８）−４−１  ｈ７Ｂ４＿Ｌ１タイプ軽鎖の構築
配列番号９０に示すｈ７Ｂ４＿Ｌ１のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号６１乃至３７８に示されるｈ７Ｂ４＿Ｌ１の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  遺伝子合成サービス）。実施例８）−２−１と同様の方法でｈ７Ｂ４＿Ｌ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｌ１」と命名した。【０１３３】
８）−４−２  ｈ７Ｂ４＿Ｌ２タイプ軽鎖の構築
配列番号９２に示すｈ７Ｂ４＿Ｌ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号６１乃至３７８に示されるｈ７Ｂ４＿Ｌ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  遺伝子合成サービス）。実施例８）−２−１と同様の方法でｈ７Ｂ４＿Ｌ２発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｌ２」と命名した。【０１３４】
８）−５  ヒト化抗体（ｈ２Ｂ１、ｈ７Ｂ４）の調製（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞）
８）−５−１  ヒト化抗体（ｈ２Ｂ１、ｈ７Ｂ４）の小スケール生産
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。
対数増殖期の１×１０７個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で９．６ｍＬに希釈した後に、３０ｍＬ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｂｏｔｔｌｅ（Ｎａｌｇｅｎｅ社）に播種し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーター内で９０ｒｐｍで一時間振とう培養した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  ＃２４７６５）３０μｇをＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２００μＬに溶解し、次にＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＨｉＰｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて調製した重鎖発現ベクター（４μｇ）及び軽鎖発現ベクター（６μｇ）をＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２００μＬに添加した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ混合液２００μＬに、発現ベクター／Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ混合液２００μＬを加え穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＭｉｎｉｓａｒｔ−Ｐｌｕｓ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過して評価用のサンプルとした。
ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ１とｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ１の組み合わせでｈ２Ｂ１＿Ｈ１／Ｌ１を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ１とｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ２の組み合わせでｈ２Ｂ１＿Ｈ１／Ｌ２を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ２とｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ２の組み合わせでｈ２Ｂ１＿Ｈ２／Ｌ２を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ２とｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ３の組み合わせでｈ２Ｂ１＿Ｈ２／Ｌ３を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ２とｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ４の組み合わせでｈ２Ｂ１＿Ｈ２／Ｌ４を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ２とｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ５の組み合わせでｈ２Ｂ１＿Ｈ２／Ｌ５を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ３とｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ３の組み合わせでｈ２Ｂ１＿Ｈ３／Ｌ３を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ３とｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ４の組み合わせでｈ２Ｂ１＿Ｈ３／Ｌ４を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ３とｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ５の組み合わせでｈ２Ｂ１＿Ｈ３／Ｌ５を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ４とｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ１の組み合わせでｈ２Ｂ１＿Ｈ４／Ｌ１を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ４とｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ３の組み合わせでｈ２Ｂ１＿Ｈ４／Ｌ３を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ４とｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ４の組み合わせでｈ２Ｂ１＿Ｈ４／Ｌ４を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ４とｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ５の組み合わせでｈ２Ｂ１＿Ｈ４／Ｌ５を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｈ１とｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｌ２の組み合わせでｈ７Ｂ４＿Ｈ１／Ｌ２を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｈ２とｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｌ２の組み合わせでｈ７Ｂ４＿Ｈ２／Ｌ２を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｈ３とｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｌ１の組み合わせでｈ７Ｂ４＿Ｈ３／Ｌ１を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｈ３とｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｌ２の組み合わせでｈ７Ｂ４＿Ｈ３／Ｌ２を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｈ５とｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｌ１の組み合わせでｈ７Ｂ４＿Ｈ５／Ｌ１を取得した。【０１３５】
８）−５−２  ヒト化抗体（ｈ２Ｂ１、ｈ７Ｂ４）の生産
実施例４）−９−１と同様の方法で生産した。すなわち、ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ１とｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ１の組み合わせでｈ２Ｂ１＿Ｈ１／Ｌ１を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ２とｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ５の組み合わせでｈ２Ｂ１＿Ｈ２／Ｌ５を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｈ４とｐＣＭＡ／ｈ２Ｂ１＿Ｌ５の組み合わせでｈ２Ｂ１＿Ｈ４／Ｌ５を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｈ１とｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｌ２の組み合わせでｈ７Ｂ４＿Ｈ１／Ｌ２を取得した。ｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｈ３とｐＣＭＡ／ｈ７Ｂ４＿Ｌ１の組み合わせでｈ７Ｂ４＿Ｈ３／Ｌ１を取得した。【０１３６】
８）−５−３  ヒト化抗体（ｈ２Ｂ１、ｈ７Ｂ４）の精製
実施例８）−５−２で得られた培養上清から抗体をｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィー（４−６℃下）とセラミックハイドロキシアパタイト（室温下）の２段階工程で精製した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックハイドロキシアパタイト精製後のバッファー置換工程は４−６℃下で実施した。ＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＨｉＴｒａｐカラム）に培養上清をアプライした。培養上清がカラムに全て入ったのち、カラム容量２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳに置換した後、５ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭ  ＭＥＳ／ｐＨ７．０のバッファーで５倍希釈した抗体溶液を、５ｍＭ  ＮａＰｉ／５０ｍＭ  ＭＥＳ／３０ｍＭ  ＮａＣｌ／ｐＨ７．０のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシアパタイトカラム（日本バイオラッド、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ  ＣＨＴ  Ｔｙｐｅ―１  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｃｏｌｕｍｎ）にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓｈａ，Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ  ヒスチジン／５％ソルビトール、ｐＨ６．０）へのバッファー置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ＵＦ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、４℃下）にて濃縮し、ＩｇＧ濃度を１０ｍｇ／ｍｌ以上に調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ−Ｐｌｕｓ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。【０１３７】
（実施例９）  ヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性評価
９）−１  ヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｈ２Ｂ１＿Ｈ１／Ｌ１、乃至ｈ２Ｂ１＿Ｈ４／Ｌ５またはｈ７Ｂ４＿Ｈ１／Ｌ２乃至ｈ７Ｂ４＿Ｈ５／Ｌ１）のフローサイトメトリーによるヒトＧＰＲＣ５Ｄへの結合性評価
ＧＰＲＣ５Ｄを発現しているヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＨＭ−１Ｂ細胞を５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。実施例８）−３−１で得られたヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の培養上清またはＨｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）を１４ｎｇ／ｍＬ〜３０μｇ／ｍＬに調製したものを１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で１時間静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１００倍希釈したＲ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，  Ｆｃγ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で１時間静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ：ＢＤ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）で行った。細胞画分のＰＥ蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出し、ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のＭＦＩ値からｃｏｎｔｒｏｌ抗体のＭＦＩ値を引いて、ＭＦＩ値の相対値（ｒＦＭＩ）を算出した。図１０２がヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体ｈ２Ｂ１＿Ｈ１／Ｌ１乃至ｈ２Ｂ１＿Ｈ４／Ｌ５、図１０３がヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体ｈ７Ｂ４＿Ｈ１／Ｌ２乃至ｈ７Ｂ４＿Ｈ５／Ｌ１の結果である。図１０２と図１０３に示すとおり、ヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体はヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合することが示された。【０１３８】
９）−２  ヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｈ２Ｂ１＿Ｈ１／Ｌ１、乃至ｈ２Ｂ１＿Ｈ４／Ｌ５またはｈ７Ｂ４＿Ｈ１／Ｌ２乃至ｈ７Ｂ４＿Ｈ５／Ｌ１）のフローサイトメトリーによるカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄへの結合性評価
実施例５）−２−２で作製したＫＭＳ−１１＿ｃＧＰＲＣ５Ｄ細胞を用いて、実施例９）−１と同様の方法で染色・解析を実施した。図２０１と図２０２に示すとおり、ヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体はカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに結合することが示された。９）−３  ヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｈ２Ｂ１＿Ｈ１／Ｌ１、ｈ２Ｂ１＿Ｈ２／Ｌ５、ｈ２Ｂ１＿Ｈ４／Ｌ５、ｈ７Ｂ４＿Ｈ１／Ｌ２及びｈ７Ｂ４＿Ｈ３／Ｌ１）のＡＤＣＣ活性評価
実施例２）−３−１で取得したＫＨＭ−１Ｂ細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに添加した。そこに終濃度で０．１５ｎｇ／ｍＬ−１５μｇ／ｍＬになるよう調製したヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｈ２Ｂ１＿Ｈ１／Ｌ１、ｈ２Ｂ１＿Ｈ２／Ｌ５、ｈ２Ｂ１＿Ｈ４／Ｌ５、ｈ７Ｂ４＿Ｈ１／Ｌ２及びｈ７Ｂ４＿Ｈ３／Ｌ１）及びヒトコントロール抗体（ｈＩｇＧ１）（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で３０分静置した。さらに、実施例１）−５−３で調製したエフェクター細胞を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１２００ｒｐｍ×３分間遠心の後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。上清５０μＬをＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に回収し、５０℃で一晩乾燥させ、プレートリーダー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。ＡＤＣＣ活性による細胞溶解率は実施例１）−５−５  に倣って算出した。図１０４に示すとおり、ｈ２Ｂ１＿Ｈ１／Ｌ１、ｈ２Ｂ１＿Ｈ２／Ｌ５、ｈ２Ｂ１＿Ｈ４／Ｌ５、ｈ７Ｂ４＿Ｈ１／Ｌ２及びｈ７Ｂ４＿Ｈ３／Ｌ１はＡＤＣＣ活性を有することが示された。【０１３９】
（実施例１０）  ヒト抗体ファージライブラリー由来抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の取得、結合活性評価
１０）−１  ＧＰＲＣ５Ｄ結合活性を有するｓｃＦｖの単離
ヒト抗体ファージライブラリーから、ヒト及びカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄに結合するｓｃＦｖを単離した。カルボキシル末端をビオチン化した、ヒト（配列表の配列番号２：図３）またはカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端ペプチド（ペプチド研究所にて合成）を固相化したＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍ−２８０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にファージを添加し、結合しないファージをマグネットスタンド（ＤｙｎａＭａｇ‐２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた洗浄操作により除去した。用いたカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端ペプチドの配列は以下のとおりである。
カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端ペプチド：  ＭＹＫＤＣＩＥＳＴＧＤＹＦＬＰＣＤＳＥＧＰＷＧＩＶＬＥＫ（Ｂｉｏｔｉｎ）−ＮＨ２（配列表の配列番号９３：図１０５）
その後、ＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端ペプチドに結合したファージを大腸菌  （ＸＬ‐１  Ｂｌｕｅ、アジレント・テクノロジー社）に感染させ、ＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端ペプチドに結合するファージを回収・増幅した。もしくは、１）−１−１および５）−２−１で調製したＧＰＲＣ５Ｄ発現ベクターを用いて、ヒトまたはカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄを一過性に発現させたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にファージを添加し、結合しないファージを洗浄操作により除去した。その後、ＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端ペプチドに結合したファージを大腸菌に感染させ、ＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端ペプチドに結合するファージを回収・増幅した。ペプチドまたはヒトまたはカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄを一過性に発現させたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に対する計３回のパニングを実施し、ポリクローナルなファージミドから、ｓｃＦｖのカルボキシル末端にＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグを付加する大腸菌用の発現ベクターに載せ換えた後、大腸菌を形質転換し、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）存在下でｓｃＦｖを発現させ、ＥＬＩＳＡによるスクリーニングに供した。【０１４０】
１０）−２  ＥＬＩＳＡによるＧＰＲＣ５Ｄ結合ｓｃＦｖのスクリーニング
３８４ウェルＭａｘｉ−ｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅ（Ｂｌａｃｋ、Ｎｕｎｃ社）にＰＢＳ（０．１３８Ｍ塩化ナトリウム、０．００２７Ｍ塩化カリウムを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で１μｇ／ｍＬに希釈したＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を５０μＬずつ添加し、４℃で一晩静置し固相化した。Ｔｗｅｅｎ‐２０（バイオ・ラッド社）を０．０５％含むＰＢＳ（ＥＬＩＳＡバッファー）で３回洗浄後、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈した、実施例１０）−１でも用いたヒトまたはカニクイザル  ビオチン化ＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端ペプチドを添加して１時間室温で振とうした。ＥＬＩＳＡバッファーで３回洗浄後、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でブロッキングし、ＥＬＩＳＡバッファーで３回洗浄した。その後、ｓｃＦｖを発現させた大腸菌の培養液を添加し、室温にて２時間反応させた。ＥＬＩＳＡバッファーで３回洗浄後、ＥＬＩＳＡバッファーで５０００倍に希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡバッファーで５回洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ  ＥＬＩＳＡ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、１０分後の化学発光をプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０４  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定し、ＧＰＲＣ５Ｄ結合ｓｃＦｖを分離した。【０１４１】
１０）−３  ＥＬＩＳＡ陽性クローンのヌクレオチド配列の決定
ＥＬＩＳＡ陽性クローン（Ｃ２０３７、Ｃ３０４８、Ｃ３０１５、Ｃ３０２２）の重鎖及び軽鎖可変領域のヌクレオチド配列の解析は、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法（ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で実施した。配列解析に用いたプライマー配列は、以下の通りである。
Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ：５’−ＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＡ−３’（配列表の配列番号９４：図１０６）
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｂ：５’−ＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡ−３’（配列表の配列番号９５：図１０７）
上記解析により、Ｃ２０３７抗体、Ｃ３０４８抗体、Ｃ３０１５抗体、及びＣ３０２２抗体の遺伝子の可変領域のヌクレオチド配列を決定した。
決定されたＣ２０３７の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号９６（図１０８）に示し、アミノ酸配列を配列番号９７（図１０９）に示した。
決定されたＣ２０３７の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号９８（図１１０）に示し、アミノ酸配列を配列番号９９（図１１１）に示した。
決定されたＣ３０４８の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１００（図１１２）に示し、アミノ酸配列を配列番号１０１（図１１３）に示した。
決定されたＣ３０４８の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１０２（図１１４）に示し、アミノ酸配列を配列番号１０３（図１１５）に示した。
決定されたＣ３０１５の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１０４（図１１６）に示し、アミノ酸配列を配列番号１０５（図１１７）に示した。
決定されたＣ３０１５の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１０６（図１１８）に示し、アミノ酸配列を配列番号１０７（図１１９）に示した。
決定されたＣ３０２２の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１０８（図１２０）に示し、アミノ酸配列を配列番号１０９（図１２１）に示した。
決定されたＣ３０２２の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１１０（図１２２）に示し、アミノ酸配列を配列番号１３５（図１２３）に示した。【０１４２】
１０）−４  ｓｃＦｖの発現精製
Ｃ２０３７抗体、Ｃ３０４８抗体、Ｃ３０１５抗体またはＣ３０２２抗体のｓｃＦｖをｐｃＤＮＡ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等の動物細胞用発現ベクターに挿入し、動物細胞用ｓｃＦｖ発現ベクターを構築した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に上記の動物細胞用ｓｃＦｖ発現ベクターを導入して一過性発現させ、必要に応じて培養上清からｓｃＦｖをＨｉｓ  Ｔｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）及び、ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で精製し、ｓｃＦｖが溶解している緩衝液をＰＢＳに置換し、以下の工程「１０）−６」に供した。【０１４３】
１０）−５  完全長ＩｇＧ化とＩｇＧの発現精製
Ｃ２０３７、Ｃ３０４８、Ｃ３０１５及びＣ３０２２を含む完全長ＩｇＧ化体の作製は以下の方法で実施した。
上記１０）−３で特定した各抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域に相当するヌクレオチド配列を、常法により、ヒトＩｇＧ１の重鎖の定常領域（ＣＨ１＋Ｆｃ領域：配列表の配列番号１４４（図１５６）に示されるアミノ酸配列の１３５から４６４番目のアミノ酸配列）をコードするヌクレオチド配列、もしくは、ヒトＩｇＧ１の軽鎖の定常領域（ＣＬ：配列表の配列番号１４５（図１５７）に示されるアミノ酸配列の１３１から２３６番目のアミノ酸配列）をコードするヌクレオチド配列と連結し、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等の動物細胞用発現ベクターに挿入し、動物細胞用ＩｇＧ発現ベクターを構築した。
構築したＩｇＧ発現ベクターのヌクレオチド配列を再解析し、Ｃ２０３７抗体の重鎖全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１３６（図１４８）に示されるヌクレオチド配列であり、軽鎖全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１３７（図１４９）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。
Ｃ３０４８抗体の重鎖全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１３８（図１５０）に示されるヌクレオチド配列であり、軽鎖全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１３９図１５１に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。
Ｃ３０１５抗体の重鎖全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１４０（図１５２）に示されるヌクレオチド配列であり、軽鎖全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１４１図１５３に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。
Ｃ３０２２抗体の重鎖全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１４２（図１５４）に示されるヌクレオチド配列であり、軽鎖全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１４３図１５５に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。
また、上記ヌクレオチド配列から、当該配列がコードするＣ２０３７、Ｃ３０４８、Ｃ３０１５及びＣ３０２２抗体の重鎖及び軽鎖全長のアミノ酸配列を決定した。
Ｃ２０３７抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号１４４（図１５６）に示されるアミノ酸配列であり、軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号１４５（図１５７）に示されるアミノ酸配列であった。
Ｃ３０４８抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号１４６（図１５８）に示されるアミノ酸配列であり、軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号１４７（図１５９）に示されるアミノ酸配列であった。
Ｃ３０１５抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号１４８（図１６０）に示されるアミノ酸配列であり、軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号１４９（図１６１）に示されるアミノ酸配列であった。
Ｃ３０２２抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号１５０（図１６２）に示されるアミノ酸配列であり、軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号１５１（図１６３）に示されるアミノ酸配列であった。
Ｃ２０３７、Ｃ３０４８、Ｃ３０１５及びＣ３０２２抗体のＩｇＧ化体は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に上記の動物細胞用ＩｇＧ発現ベクターを挿入することにより一過性発現させ、必要に応じてＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ａｆｆｉｎｉｔｙカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で精製後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０（７ｋ  ＭＷＣＯ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により、ＩｇＧが溶解している緩衝液をＰＢＳに置換し、以下の工程１０）−７−７および１０）−９に供した。【０１４４】
１０）−６  ｓｃＦｖを用いたＥＬＩＳＡによるＧＰＲＣ５Ｄへの結合確認
９６ウェルＭａｘｉ−ｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅ  （Ｂｌａｃｋ、Ｎｕｎｃ社）に、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎを５０μＬずつ添加し、４℃で一晩静置し固相化した。ＥＬＩＳＡバッファーで３回洗浄後、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈した、実施例１０）−１で用いたヒトまたはカニクイザル  ビオチン化ＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端ペプチドを添加して１時間室温で振とうした。ＥＬＩＳＡバッファーで３回洗浄後、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎでブロッキングし、ＥＬＩＳＡバッファーで３回洗浄した。その後、Ｃ２０３７、Ｃ３０４８、Ｃ３０１５又はＣ３０２２  ｓｃＦｖを添加し、室温にて２時間反応させた。ＥＬＩＳＡバッファーで３回洗浄後、ＥＬＩＳＡバッファーで５０００倍に希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗ＦＬＡＧ抗体を５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡバッファーで５回洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ  ＥＬＩＳＡ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅを添加し、１０分後の化学発光をプレートリーダーで測定した。
その結果、Ｃ２０３７、Ｃ３０４８、Ｃ３０１５及びＣ３０２２  ｓｃＦｖは、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ（図１６４Ａ）、カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ（図１６４Ｂ）のアミノ末端ペプチドに結合することが示された。【０１４５】
１０）−７  ＩｇＧを用いたＥＬＩＳＡによるＧＰＲＣ５Ｄへの結合確認
９６ウェルＭａｘｉ−ｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅに、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎを５０μＬずつ添加し、４℃で一晩静置し固相化した。ＥＬＩＳＡバッファーで３回洗浄後、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈した、実施例１０）−１で用いたヒトまたはカニクイザル  ビオチン化ＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端ペプチドを添加して１時間室温で振とうした。ＥＬＩＳＡバッファーで３回洗浄後、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎでブロッキングし、ＥＬＩＳＡバッファーで３回洗浄した。その後、ＩｇＧを発現させたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞の培養液を添加し、室温にて２時間反応させた。ＥＬＩＳＡバッファーで３回洗浄後、ＥＬＩＳＡバッファーで２５００倍に希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＦａｂ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡバッファーで５回洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ  ＥＬＩＳＡ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅを添加し、１０分後の化学発光をプレートリーダーで測定した。
その結果、Ｃ２０３７、Ｃ３０４８、Ｃ３０１５及びＣ３０２２  ＩｇＧは、ヒト及びカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端ペプチドに結合することが示された（図１６５）。【０１４６】
１０）−８  ｓｃＦｖの内因性ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞（ＫＭＳ−３４）への結合
ＫＭＳ−３４細胞を遠心分離により回収し、ＦＡＣＳバッファー（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で２回洗浄後、同溶液に懸濁した。得られた細胞懸濁液へ、Ｃ２０３７、Ｃ３０４８、Ｃ３０１５またはＣ３０２２  ｓｃＦｖを添加し、４℃で２時間静置した。ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄後、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を加えて懸濁し、さらに４℃で１時間静置した。ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄後、Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を加えて懸濁し、さらに４℃で１時間静置した。ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄後、１％ＰＦＡ（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  ３２％溶液（ＥＬＥＣＴＲＯＮ  ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ社）より調製）で細胞を固定し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ：ＢＤ社）を用いて検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社）で行った。
その結果、Ｃ２０３７、Ｃ３０４８、Ｃ３０１５及びＣ３０２２  ｓｃＦｖは、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に結合することが示された（図１６６）。【０１４７】
１０）−９  ＩｇＧの内因性ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞（ＫＨＭ−１Ｂ）への結合
ＧＰＲＣ５Ｄを発現しているヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＨＭ−１Ｂ細胞を５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。実施例１０）−５で得られたヒト抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（Ｃ２０３７、Ｃ３０４８、Ｃ３０１５及びＣ３０２２を含む完全長ＩｇＧ化体）の培養上清、またはＨｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）を１４ｎｇ／ｍＬ〜３０μｇ／ｍＬに調製したものを１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で１時間静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１００倍希釈したＲ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，  Ｆｃγ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で１時間静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ(商標)ＩＩ：ＢＤ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）で行った。細胞画分のＰＥ蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出し、ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のＭＦＩ値からｃｏｎｔｒｏｌ抗体のＭＦＩ値を引いて、ＭＦＩ値の相対値（ｒＦＭＩ）を算出した。その結果、Ｃ２０３７、Ｃ３０４８、Ｃ３０１５及びＣ３０２２  ＩｇＧは、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に結合することが示された（図１６７）。【０１４８】
１０）−１０  Ｃ３０２２およびＣ３０４８改変体の作製および評価
１０）−１０−１  改変体の取得
Ｃ３０２２およびＣ３０４８遺伝子を鋳型として、ＰＣＲを利用して変異を導入する方法（Ｚａｃｃｏｌｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）２５５，５８９−６０３）または、ＣＤＲの全残基について、各残基毎に、野生型のアミノ酸以外の１９種類のアミノ酸に変異させたオリゴマーを合成し、ライブラリーを構築する方法（ｏｌｉｇｏ‐ｂａｓｅｄライブラリー）を用いてライブラリーを構築し、高結合能クローンのスクリーニングを行い、ヌクレオチド配列を決定した。同定した高結合性変異を組合せ、Ｃ３０２２の高結合性変異体Ｅ１０１８、Ｃ３０４８の高結合性変異体Ｄ１０１２を取得した。
取得したＥ１０１８の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１９０（図２１３）に示し、アミノ酸配列を配列番号１９１（図２１４）に示した。
取得したＥ１０１８の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１９２（図２１５）に示し、アミノ酸配列を配列番号１９３（図２１６）に示した。
取得したＤ１０１２の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１９４（図２１７）に示し、アミノ酸配列を配列番号１９５（図２１８）に示した。
取得したＤ１０１２の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１９６（図２１９）に示し、アミノ酸配列を配列番号１９７（図２２０）に示した。【０１４９】
１０）−１０−２  ＢｉａｃｏｒｅによるＧＰＲＣ５Ｄへの結合確認
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００を用い、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のヒトＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端ペプチドへの結合活性を、ＳＰＲ法で検証した。Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＡＰ（ＧＥヘルスケア社製）に、ＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥヘルスケア社製）で２ｎＭに希釈したヒト  ビオチン化ＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端ペプチドを１０μＬ／ｍｉｎで１８０秒間接触させて固定化した。その後、ＨＢＳ−ＥＰ＋で希釈した複数濃度のｓｃＦｖをアナライトとしてカイネティクス解析によりＫdを算出した。その結果、Ｅ１０１８、Ｄ１０１２  ｓｃＦｖは、それぞれＣ３０２２、Ｃ３０４８よりも、ヒトＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端ペプチドに対する結合が強くなっていることが示された。（図２２１）【０１５０】
（実施例１１）  抗ＣＤ３抗体発現ベクターの構築
１１）−１  ラット抗ＣＤ３ｓｃＦｖ抗体発現ベクターの構築
ＤＮＡ免疫法により免疫したラットのリンパ節又は脾臓を使ってラット抗ＣＤ３モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製した。そのハイブリドーマからモノクローナル抗体のＶＨ、ＶＬをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定し、一本鎖抗体発現ベクターを作製した。すなわち、配列番号１５２（図１６８）のＶＨをＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片、ＶＨとＶＬの間に挿入するリンカー断片、配列番号１５３（図１６９）のＶＬを含む領域にＦＬＡＧ−ＨｉｓタグをコードするＤＮＡ配列をカルボキシル末端に付加させＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて結合させ、配列番号１５４（図１７０）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含む一本鎖抗体発現ベクターｐＣ３Ｅ−７０００を作製した。【０１５１】
１１）−２  ヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖ抗体発現ベクターｐＣ３Ｅ−７０３４の構築
配列番号１５５（図１７１）のカルボキシル末端に１５アミノ酸フレキシブルリンカーを介して配列番号１５６（図１７２）を含む領域をつなげたｓｃＦｖＤＮＡ配列、及び前後１５塩基の付加配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  人工遺伝子合成サービス）。これを鋳型としてＣ３Ｅ−７０３４と前後の付加配列を含む領域をＰＣＲ法を用いて増幅し、インサートＤＮＡ断片を得た。また実施例１１）−１で作製した発現ベクターｐＣ３Ｅ−７０００を鋳型として、ｓｃＦｖ領域を除いたベクター領域をＰＣＲ法を用いて増幅し、ベクター断片を得た。それぞれのＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて結合させ、配列番号１５７（図１７３）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含む発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣ３Ｅ−７０３４」と命名した。【０１５２】
１１）−３  ヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖ抗体発現ベクターｐＣ３Ｅ−７０３５の構築
配列番号１５５（図１７１）のカルボキシル末端に１７アミノ酸から成るフレキシブルリンカーを介して配列番号１５８（図１７４）をつなげたｓｃＦｖＤＮＡ配列及び前後１５塩基の付加配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  人工遺伝子合成サービス）。実施例１１）−２と同様の方法で配列番号１５９（図１７５）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含む発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣ３Ｅ−７０３５」と命名した。【０１５３】
１１）−４  ヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖ抗体発現ベクターｐＣ３Ｅ−７０３６の構築
配列番号１５５（図１７１）のカルボキシル末端に１５アミノ酸から成るフレキシブルリンカーを介して配列番号１６０（図１７６）をつなげたｓｃＦｖＤＮＡ配列及び前後１５塩基の付加配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社  人工遺伝子合成サービス）。実施例１１）−２と同様の方法で配列番号１６１（図１７７）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含むＣ３Ｅ−７０３６発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣ３Ｅ−７０３６」と命名した。【０１５４】
（実施例１２）  抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の作製
１２）−１  抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターの作製
実施例１０）−４で作製したＣ２０３７抗体のｓｃＦｖを鋳型としてＣ２０３７抗体のｓｃＦｖとヒト抗体重鎖シグナル配列の一部、ｓｃＦｖ間を繋ぐリンカーを付加させた領域をＰＣＲ法を用いて増幅し、インサートＤＮＡを得た。また実施例１１）−２で作製した発現ベクターｐＣ３Ｅ−７０３４を鋳型として、シグナル配列、及びＣＤ３ｓｃＦｖ抗体のアミノ末端配列をコードするプライマーを用いてＣＤ３ｓｃＦｖを含むベクター全領域をＰＣＲ法を用いて増幅し、ベクター断片を得た。それぞれのＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて結合させ、配列番号１６２（図１７８）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３４」と命名した。
上記と同様の方法でＣ３０４８抗体のｓｃＦｖとｐＣ３Ｅ−７０３４を鋳型として、配列番号１６３（図１７９）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３４」と命名した。
上記と同様の方法でＣ３０２２抗体のｓｃＦｖとｐＣ３Ｅ−７０３４を鋳型として、配列番号１６４（図１８０）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３４」と命名した。
上記と同様の方法でＣ２０３７抗体のｓｃＦｖとｐＣ３Ｅ−７０３５を鋳型として、配列番号１６５（図１８１）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３５」と命名した。
上記と同様の方法でＣ３０４８抗体のｓｃＦｖとｐＣ３Ｅ−７０３５を鋳型として、配列番号１６６（図１８２）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３５」と命名した。
上記と同様の方法でＣ３０２２抗体のｓｃＦｖとｐＣ３Ｅ−７０３５を鋳型として、配列番号１６７（図１８３）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３５」と命名した。
上記と同様の方法でＣ２０３７抗体のｓｃＦｖとｐＣ３Ｅ−７０３６を鋳型として、配列番号１６８（図１８４）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３６」と命名した。
上記と同様の方法でＣ３０４８抗体のｓｃＦｖとｐＣ３Ｅ−７０３６を鋳型として、配列番号１６９（図１８５）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３６」と命名した。
上記と同様の方法でＣ３０２２抗体のｓｃＦｖとｐＣ３Ｅ−７０３６を鋳型として、配列番号１７０（図１８６）のヌクレオチド配列をＯＲＦに含む抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３６」と命名した。【０１５５】
１２）−２  抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の発現・精製
Ｃ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３４乃至Ｃ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３６の発現・精製は実施例１０）−４と同様の方法で行った。Ｃ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３４のアミノ酸配列は配列番号１７１（図１８７）に記載されている。Ｃ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３４のアミノ酸配列は配列番号１７２（図１８８）に記載されている。Ｃ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３４のアミノ酸配列は配列番号１７３（図１８９）に記載されている。Ｃ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３５のアミノ酸配列は配列番号１７４（図１９０）に記載されている。Ｃ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３５のアミノ酸配列は配列番号１７５（図１９１）に記載されている。Ｃ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３５のアミノ酸配列は配列番号１７６（図１９２）に記載されている。Ｃ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３６のアミノ酸配列は配列番号１７７（図１９３）に記載されている。Ｃ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３６のアミノ酸配列は配列番号１７８（図１９４）に記載されている。Ｃ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３６のアミノ酸配列は配列番号１７９（図１９５）に記載されている。【０１５６】
（実施例１３）  抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性評価
１３）−１  抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のフローサイトメトリーによる結合活性評価
１３）−１−１  抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の内因性ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞（Ａ４／Ｆｕｋ）への結合
リンパ腫細胞株Ａ４／Ｆｕｋ細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク）を５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで適当な濃度に調製し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔを添加し、４℃で３０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した実施例１２で調製した抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子Ｃ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３４乃至Ｃ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３６を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で６０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８を３０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で３０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏで行い、死細胞を除去した画分のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出し、抗体添加サンプルのＭＦＩ値から抗体未添加サンプルのＭＦＩ値を引いて、ＭＦＩ値の相対値（ｒＦＭＩ）を計算した。図１９６に示す通り、抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子は内因性ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に結合することが示された。【０１５７】
１３）−１−２  抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞への結合
実施例５）−２−２で作製したＫＭＳ−１１＿ｃＧＰＲＣ５Ｄ細胞を用いて、実施例１３）−１−１と同様の方法で染色・解析を実施した。図１９７に示す通り、抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子はカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に結合することが示された。【０１５８】
１３）−１−３  抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のヒトＣＤ３（ＰＢＭＣ）への結合
市販ヒトＰＢＭＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで適当な濃度に調製し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と抗ＣＤ１９抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を添加し、４℃で３０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した実施例１２で調製した抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子Ｃ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３４乃至Ｃ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３６を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で６０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＱＩＡＧＥＮ社）を３０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で３０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ：ＢＤ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）で行い、死細胞とＣＤ１９陽性細胞を除去した画分のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出し、抗体添加サンプルのＭＦＩ値から抗体未添加サンプルのＭＦＩ値を引いて、ＭＦＩ値の相対値（ｒＦＭＩ）を計算した。図１９８に示す通り、抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子はヒトＣＤ３発現細胞に結合することが示された。【０１５９】
１３）−１−４  抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のカニクイザルＣＤ３（ＰＢＭＣ）への結合
ＳｅｐＭａｔｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）とＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライ社）を使用して、カニクイザルの血液からＰＢＭＣを定法に従い採取した。採取したカニクイザルＰＢＭＣを用いて、実施例１３）−１−３と同様の方法で染色・解析を実施した。図１９９に示す通り、抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子はカニクイザルＣＤ３発現細胞に結合することが示された。【０１６０】
１３）−２  抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の細胞障害活性評価
１３）−２−１  標的細胞の調製
Ａ４／Ｆｕｋ細胞を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で１×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、細胞懸濁液１ｍＬあたり１００μＬのＣｈｒｏｍｉｕｍ−５１  Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間培養した。１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０５細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。【０１６１】
１３）−２−２  エフェクター細胞の調製
市販の凍結ＰＢＭＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を３７℃で解凍し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にＡｎｔｉ−ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｗａｓｈ試薬（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を添加した溶液に移して２回洗浄した後に１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０６細胞／ｍＬになるよう調製し、エフェクター細胞とした。【０１６２】
１３）−２−３  細胞障害アッセイ
実施例１３）−２−１で取得したＡ４／Ｆｕｋ細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに添加した。そこに各種濃度に調製した実施例１２で調製した各種抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、実施例１３）−２−２で調製したエフェクター細胞を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１０００ｒｐｍ×１分間遠心後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２０−２４時間培養した。上清５０μＬをＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に回収し、５０℃で約２時間乾燥させた後、プレートリーダー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。細胞溶解率は次式で算出した。細胞溶解率（％）＝（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルのカウント。
Ｂ：バックグラウンド（抗体非添加ウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ用培地を５０μＬ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
Ｃ：最大放出（標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ培地を５０μＬ添加した。界面活性剤は１００μＬ添加し、サンプルウェルと同様に５０μＬ分をＬｕｍａＰｌａｔｅに移して測定を実施した。
図２００に示す通り、Ａ４／Ｆｕｋ細胞に対する各種抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の細胞障害活性が示された。【０１６３】
（実施例１４）  Ｆｃ付きＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の作製
１４）−１  Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターの作製
１４）−１−１  Ｆｕｌｌ−Ｓｉｚｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＦＳＡ）型二重特異性分子発現ベクターの作製
実施例８）−１−２において構築したヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｈ２Ｂ１）Ｈ２タイプ重鎖可変領域をコードするＤＮＡを全合成した（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ社、カスタム遺伝子合成サービス）。「ｐＣＬ＿＃１３５４０」、「ｐＣＬ＿＃１３５４３」は、得られた重鎖可変領域、および２種類のヒトＩｇＧ由来ＣＨ１、エフェクター機能を低下させ、かつヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ領域（ＷＯ２０１４／１９０４４１）を哺乳類細胞用発現ベクターｐＴＴ５（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，ＷＯ２００９／１３７９１１）に導入したものである。また実施例８）−２−５において構築したヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｈ２Ｂ１）Ｌ５タイプ軽鎖可変領域を全合成した。「ｐＣＬ＿＃１２２９０」、「ｐＣＬ＿＃１２３１３」は、得られた軽鎖可変領域、および２種類のヒトＩｇＧ由来ＣＬをコードするＤＮＡを哺乳類細胞用発現ベクターｐＴＴ５に導入したものである。
次に実施例１１）−２において構築したヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ−７０３４）の重鎖をコードするＤＮＡ断片を全合成した。「ｐＣＬ＿＃１３５５２」は得られたｓｃＦｖ重鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ由来のＣＨ１、およびエフェクター機能を低下させ、ヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ領域を哺乳類細胞用発現ベクターｐＴＴ５に導入したものである。また、実施例１１）−２において構築したヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ−７０３４）の軽鎖をコードするＤＮＡ断片を全合成した。「ｐＣＬ＿＃１２２８７」は、得られたｓｃＦｖ軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ由来のＣＬを哺乳類細胞用発現ベクターｐＴＴ５に導入したものである。同様に実施例１１）−４において構築したヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ−７０３６）の重鎖をコードするＤＮＡ配列を全合成した。「ｐＣＬ＿＃１３５４１」は得られたｓｃＦｖ重鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ由来のＣＨ１、およびエフェクター機能を低下させ、ヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を哺乳類細胞用発現ベクターｐＴＴ５に導入したものである。また、実施例１１）−４において構築したヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ−７０３６）の軽鎖をコードするＤＮＡ断片を全合成した。「ｐＣＬ＿＃１２３２１」は得られたｓｃＦｖ軽鎖、およびヒトＩｇＧ由来のＣＬをコードするＤＮＡ断片を哺乳類細胞用発現ベクターｐＴＴ５に導入したものである。
ｐＣＬ＿＃１３５４０、ｐＣＬ＿＃１３５４３、ｐＣＬ＿＃１２２９０、ｐＣＬ＿＃１２３１３、ｐＣＬ＿＃１３５５２、ｐＣＬ＿＃１２２８７、ｐＣＬ＿＃１３５４１、ｐＣＬ＿＃１２３２１のＯＲＦ配列をそれぞれ配列表の配列番号１９８（図２２２）、配列番号２００（図２２４）、配列番号２０２（図２２６）配列番号２０４（図２２８）、配列番号２０６（図２３０）、配列番号２０８（図２３２）、配列番号２１０（図２３４）、配列番号２１２（図２３６）に示す。【０１６４】
１４）−１−２  Ｈｙｂｒｉｄ型二重特異性分子発現ベクターの作製
ヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｈ２Ｂ１）Ｈ２タイプの重鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ由来ＣＨ１領域、およびエフェクター機能を低下させ、かつヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ領域をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた哺乳類細胞用発現ベクターを作製し、「ｐＣＬ＿＃１３５５５」と命名した。またヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｈ２Ｂ１）Ｌ５タイプ軽鎖可変領域、ヒトＩｇＧ由来ＣＬ領域をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた哺乳類細胞用発現ベクターを作製し、「ｐＣＬ＿＃１２１２３」と命名した。
次にヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ−７０３４）、およびエフェクター機能を低下させ、かつヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ領域をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳類細胞用発現ベクターを作製し、「ｐＣＬ＿＃１３５５７」と命名した。また、ヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ−７０３６）、およびエフェクター機能を低下させ、ヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ領域をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた哺乳類細胞用発現ベクター「ｐＣＬ＿＃１３５６１」を作製した。
ｐＣＬ＿＃１３５５５、ｐＣＬ＿＃１２１２３、ｐＣＬ＿＃１３５５７、ｐＣＬ＿＃１３５６１のＯＲＦ配列をそれぞれ配列表の配列番号２１４（図２３８）、配列番号２１６（図２４０）、配列番号２１８（図２４２）、配列番号２２０（図２４４）に示す。【０１６５】
１４）−１−３  Ｄｕａｌ型二重特異性分子発現ベクターの作製
実施例８）−１−２において構築したヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ｈ２Ｂ１）Ｈ２タイプの重鎖可変領域とＬ５タイプの軽鎖可変領域をＧＧＧＧＳの3回繰り返し配列から成るフレキシブルリンカーで連結し一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）とした。「ｐＣＬ＿＃１３５６３」はこの抗ＧＰＲＣ５ＤｓｃＦｖと、エフェクター機能を低下させ、かつヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ領域をコードするＤＮＡ断片を哺乳類細胞用発現ベクターｐＴＴ５に導入したものである。ｐＣＬ＿＃１３５６３のＯＲＦ配列を配列表の配列番号２２２（図２４６）に示す。【０１６６】
１４）−２  Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の生産
ＣＨＯ−３Ｅ７細胞はマニュアルに従い、継代、培養を行った（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ，  Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．,  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１１）  ５５（１）,  ４４−５１）。対数増殖期にあるＣＨＯ−３Ｅ７細胞培養液を２×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ になるよう４  ｍＭ  グルタミン、０．１％  Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  （ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社）含有ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈し、各種二重特異性分子の生産に用いた。【０１６７】
１４）−２−１  Ｆｕｌｌ−Ｓｉｚｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＦＳＡ）型二重特異性分子の生産
分注したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｆ１７培地にＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ ｍａｘ（ＰＥＩｍａｘ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社）８０００ μｇを溶解し、ＰＥＩｍａｘ溶液とした。また分注した別のＦ１７培地にベクターｐＣＬ＿＃１３５５２、ｐＣＬ＿＃１２２８７、ｐＣＬ＿＃１３５４０、ｐＣＬ＿＃１２２９０を１５：１５：５３：１７の比率で混合したベクター混合物、あるいはベクターｐＣＬ＿＃１３５４１、ｐＣＬ＿＃１２３２１、ｐＣＬ＿＃１３５４３、ｐＣＬ＿＃１２３１３を２２：８：１７：５３の比率で混合したベクター混合物を１０００ μｇ加え、ベクター混合物とした。さらに分注した別のＦ１７培地に、ｐＡＫＴ、ｐＧＦＰ（共にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）、断片処理済みのサケ精子ＤＮＡ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社）を混合したＤＮＡ混合物を１０００ μｇを添加し、ＤＮＡ溶液とした。ＰＥＩｍａｘ溶液とベクター混合物、ＤＮＡ溶液を合わせて穏やかに攪拌し、５分間放置した後に２ＬのＣＨＯ−３Ｅ７細胞培養液に添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１日振とう培養したのち、０．５  ｍＭ  ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社）、０．１％  （ｗ／ｖ）  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１（ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ社）を加え、３２℃でさらに６日間振とう培養した。培養開始後7日目に培養上清を回収し、０．２μｍ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過して評価用のサンプルとした。
Ｃ３Ｅ−７０３４とｈ２Ｂ１とのＦＳＡ型二重特異性分子（ｖ１９１５９）の発現調製には、ｐＣＬ＿＃１３５５２、ｐＣＬ＿＃１２２８７、ｐＣＬ＿＃１３５４０、ｐＣＬ＿＃１２２９０を用いた。Ｃ３Ｅ−７０３６とｈ２Ｂ１とのＦＳＡ型二重特異性分子（ｖ１９１４０）の発現調製には、ｐＣＬ＿＃１３５４１、ｐＣＬ＿＃１２３２１、ｐＣＬ＿＃１３５４３、ｐＣＬ＿＃１２３１３を用いた。
ｖ１９１５９を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号２０７（図２３１）、２０９（図２３３）、１９９（図２２３）、２０３（図２２７）に示す。また、ｖ１９１４０を構成するアミノ酸の配列を配列表の配列番号２１１（図２３５）、２１３（図２３７）、２０１（図２２５）、２０５（図２２９）にそれぞれ示す。【０１６８】
１４）−２−２    Ｈｙｂｒｉｄ型二重特異性分子の生産
分注したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｆ１７培地にＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ ｍａｘ（ＰＥＩｍａｘ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社）８０００ μｇを溶解し、ＰＥＩｍａｘ溶液とした。また分注した別のＦ１７培地にｐＣＬ＿＃１３５５７、ｐＣＬ＿＃１３５５５、およびｐＣＬ＿＃１２１２３を１：１：１．５の比率で混合したベクター混合物、あるいはｐＣＬ＿＃１３５６１、ｐＣＬ＿＃１３５５５、ｐＣＬ＿＃１２１２３を１：１：１．５の比率で混合したベクター混合物を１０００ μｇ加え、ベクター混合物とした。さらに分注した別のＦ１７培地にｐＡＫＴ、ｐＧＦＰ（共にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）、断片処理済みのサケ精子ＤＮＡ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社）を混合したＤＮＡ混合物を１０００ μｇを添加し、ＤＮＡ溶液とした。ＰＥＩｍａｘ溶液とベクター混合物、ＤＮＡ溶液を合わせて穏やかに攪拌し、５分間放置した後に２ＬのＣＨＯ−３Ｅ７細胞培養液に添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１日振とう培養したのち、０．５  ｍＭ  ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社）、０．１％  （ｗ／ｖ）  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１（ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ社）を加え、３２℃でさらに６日間振とう培養した。培養開始後7日目に培養上清を回収し、０．２μｍ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過して評価用のサンプルとした。
Ｃ３Ｅ−７０３４とｈ２Ｂ１とのＨｙｂｒｉｄ型二重特異性分子（ｖ１９１２６）の発現調製には、ｐＣＬ＿＃１３５５７、ｐＣＬ＿＃１３５５５、ｐＣＬ＿＃１２１２３を用いた。Ｃ３Ｅ−７０３６とｈ２Ｂ１とのＨｙｂｒｉｄ型二重特異性分子（ｖ１９１２５）の発現調製には、ｐＣＬ＿＃１３５６１、ｐＣＬ＿＃１３５５５、ｐＣＬ＿＃１２１２３を用いた。
ｖ１９１２６を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号２１９（図２４３）、２１５（図２３９）、２１７（図２４１）に示す。また、ｖ１９１２５を構成するアミノ酸の配列を配列表の配列番号２２１（図２４５）、２１５（図２３９）、２１７（図２４１）にそれぞれ示す。【０１６９】
１４）−２−３    Ｄｕａｌ型二重特異性分子の生産
分注したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｆ１７培地にＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ ｍａｘ（ＰＥＩｍａｘ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社）８０００ μｇを溶解し、ＰＥＩｍａｘ溶液とした。また分注した別のＦ１７培地にＣＬ＿＃１３５５７、ｐＣＬ＿＃１３５６３を４：３の比率で混合したベクター混合物、あるいはｐＣＬ＿＃１３５６１とｐＣＬ＿＃１３５６３を１：１の比率で混合したベクター混合物を１０００ μｇ加え、ベクター混合物とした。さらに分注した別のＦ１７培地にｐＡＫＴ、ｐＧＦＰ（共にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）、断片処理済みのサケ精子ＤＮＡ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社）を混合したＤＮＡ混合物を１０００ μｇ添加し、ＤＮＡ溶液とした。ＰＥＩｍａｘ溶液とベクター混合物、ＤＮＡ溶液を合わせて穏やかに攪拌し、５分間放置した後に２  ＬのＣＨＯ−３Ｅ７細胞培養液に添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１日振とう培養したのち、０．５  ｍＭ  ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社）、０．１％  （ｗ／ｖ）  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１（ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ社）を加え、３２℃でさらに６日間振とう培養した。培養開始後7日目に培養上清を回収し、０．２μｍ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過して評価用のサンプルとした。
Ｃ３Ｅ−７０３４とｈ２Ｂ１とのＤｕａｌ―ｓｃＦｖ（Ｄｕａｌ）型二重特異性分子（ｖ１９１２２）の発現調製には、ｐＣＬ＿＃１３５５７とｐＣＬ＿＃１３５６３を用いた。Ｃ３Ｅ−７０３６とｈ２Ｂ１とのＤｕａｌ型二重特異性分子（ｖ１９１２１）の発現調製には、ｐＣＬ＿＃１３５６１とｐＣＬ＿＃１３５６３を用いた。
ｖ１９１２２を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号２１９（図２４３）、２２３（図２４７）に示す。また、ｖ１９１２１を構成するアミノ酸の配列を配列表の配列番号２２１（図２４５）、２２３（図２４７）にそれぞれ示す。【０１７０】
１４）−３  Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の精製
１４）−２で得られた培養上清から各種二重特異性分子をＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティクロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーの２段階工程で精製した。
ＰＢＳ  ｐＨ７．４で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に培養上清をアプライし、目的の二重特異性分子を吸着させた。非吸着成分をＰＢＳで除去したのち、酢酸バッファ  ｐＨ３．６で吸着成分を溶出した。溶出画分はＴｒｉｓバッファｐＨ１１でｐＨを中性に調製したのち、濃縮し、予めＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化したゲルろ過カラム Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に供した。ゲルろ過クロマトグラフィーで得られたピーク画分をＳＤＳキャピラリー電気泳動（ＬａｂＣｈｉｐ−Ｃａｌｉｐｅｒ）で解析し、目的のヘテロダイマーに相当する画分を回収した。Ｄｕａｌ型二重特異性分子は、回収した画分をさらにＨＢｓｏｒ（２５  ｍＭ  ヒスチジン, ５％  ソルビトール）ｐＨ６．０で予め平衡化した脱塩カラムＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に供し、バッファをＨＢｓｏｒに交換した。最後に回収した画分を０．２  μｍのフィルターでろ過し、精製サンプルとした。精製サンプルは質量分析とＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、目的の抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子が間違いなく形成されていることを確認した。【０１７１】
（実施例１５）  Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性評価
１５）−１  Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のフローサイトメトリーによる結合活性評価
１５）−１−１  Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の内因性ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞（ＫＨＭ−１Ｂ）への結合
ＧＰＲＣ５Ｄを発現しているヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＨＭ−１Ｂを５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで適当な濃度に調製し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔを添加し、４℃で３０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した実施例１４で調製したＦｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で６０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１００倍希釈したＲ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，  Ｆｃγ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で１時間静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏで行い、死細胞を除去した画分のＰＥ蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。その結果、Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子は、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に結合することが示された（図２４８）。【０１７２】
１５）−１−２  Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞への結合
実施例５）−２−２で作製したＫＭＳ−１１＿ｃＧＰＲＣ５Ｄ細胞を用いて、実施例１５）−１−１と同様の方法で染色・解析を実施した。図２４９に示す通り、Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子はカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に結合することが示された。【０１７３】
１５）−１−３  Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のヒトＣＤ３（ＰＢＭＣ）への結合
市販ヒトＰＢＭＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで適当な濃度に調製し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と抗ＣＤ１９抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を添加し、４℃で３０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した実施例１４で調製したＦｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で６０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１００倍希釈したＲ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，  Ｆｃγ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で１時間静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏで行い、死細胞を除去した画分のＰＥ蛍光強度のヒストグラムを作成し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。その結果、Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子は、ヒトＣＤ３発現細胞に結合することが示された（図２５０）。【０１７４】
１５）−１−４  Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のカニクイザルＣＤ３（ＰＢＭＣ）への結合
実施例１３）−１−４と同様の方法で採取したカニクイザルＰＢＭＣを用いて、実施例１５）−１−３と同様の方法で染色・解析を実施した。図２５１に示す通り、Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子はカニクイザルＣＤ３発現細胞に結合することが示された。【０１７５】
１５）−２  Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の細胞障害活性評価
１５）−２−１  標的細胞の調製
ＫＨＭ−１Ｂ細胞を実施例１３）−２−１と同様の方法で調製したものを標的細胞として用いた。【０１７６】
１５）−２−２  エフェクター細胞の調製
市販の凍結ＰＢＭＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を３７℃で解凍し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にＡｎｔｉ−ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｗａｓｈ試薬（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を添加した溶液に移して２回洗浄した後に１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１．５×１０５細胞／ｍＬになるよう調製し、エフェクター細胞とした。【０１７７】
１５）−２−３  細胞障害アッセイ
実施例１５）−２−１で取得したＫＨＭ−１Ｂ細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌ  Ｕ底マイクロプレートに添加した。そこに各種濃度に調製した実施例１４で調製したＦｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、実施例１５）−２−２で調製したエフェクター細胞を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１０００ｒｐｍ×１分間遠心後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４−４８時間培養した。上清５０μＬをＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に回収し、５０℃で約２時間乾燥させた後、プレートリーダー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。細胞溶解率は次式で算出した。細胞溶解率（％）＝（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルのカウント。
Ｂ：バックグラウンド（抗体非添加ウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ用培地を５０μＬ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
Ｃ：最大放出（標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ培地を５０μＬ添加した。界面活性剤は１００μＬ添加し、サンプルウェルと同様に５０μＬ分をＬｕｍａＰｌａｔｅに移して測定を実施した。
図２５２に示す通り、ＫＨＭ−１Ｂ細胞に対するＦｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の細胞障害活性が示された。【０１７８】
（実施例１６）  Ｆｃ付き抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価
１６）−１  ヒトＰＢＭＣとがん細胞の共移植モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価
ヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＨＭ−１Ｂ（ＪＣＲＢ）、及びヒトＰＢＭＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）含有ＰＢＳでそれぞれ５×１０７細胞／ｍＬになるよう調製し、ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウス（雌性、５週齢）の皮下に０．１ｍＬ共移植した。移植後に群分けを実施し、各種抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子を尾静脈内投与（０．１ｍｇ／ｋｇ）した。投与は移植日（Ｄａｙ０）からＤａｙ２まで毎日３回実施した。１週間後（Ｄａｙ７）より経時的に腫瘍の長径（ｍｍ）及び短径（ｍｍ）を電子デジタルノギスで計測し、以下に示す計算式により推定腫瘍体積を算出した。【０１７９】
Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｏｌｕｍｅ（ｍｍ３）＝各個体の推定腫瘍体積の平均値
各個体の推定腫瘍体積＝長径×短径２／２
各種抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子投与群において抗腫瘍効果が確認された。（図２５３）。【０１８０】
１６）−２  ヒトＰＢＭＣ移入モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価
ヒトＰＢＭＣをＰＢＳで５×１０７細胞／ｍＬになるよう調製し、ＮＯＧマウス（雌性、６週齢）に０．２ｍＬ尾静脈内移植した（Ｄａｙ−４）。Ｄａｙ０にＫＨＭ−１Ｂを５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ含有ＰＢＳでそれぞれ３×１０７細胞／ｍＬになるよう調製し、ＮＯＧマウスの皮下に０．１ｍＬ移植した。マウスの推定腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達した時点（Ｄａｙ１２）で腫瘍体積による群分けを実施し、各種抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子を尾静脈内投与（１ｍｇ／ｋｇ）した。投与はＤａｙ１２、Ｄａｙ１５、Ｄａｙ１８に実施し、経時的に腫瘍の長径（ｍｍ）及び短径（ｍｍ）を電子デジタルノギスで計測し、推定腫瘍体積を算出した。図に示す通り、各種抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子投与群において腫瘍の退縮が確認された。特にｖ１９１２５処置群で強い腫瘍退縮効果が確認された（図２５４）。【０１８１】
（実施例１７）  ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の作製
１７）−１  ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターの作製
１７）−１−１  ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子（Ｃ５Ｄ−０００４、Ｃ５Ｄ−０００５、Ｃ５Ｄ−０００６）発現ベクターの作製
実施例１４）−１−２において構築したＨｙｂｒｉｄ型二重特異性分子（ｖ１９１２５）発現ベクターのうち、ヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ＦｃをコードするｐＣＬ＿＃１３５６１を鋳型にし、部位特異的変異導入法によりＨ鎖ＣＤＲ２のＡｓｎ５３をＡｒｇに改変したＣＤＲ改変ベクターｐＣ３Ｅ−８０１５を作製した。同様にＨｙｂｒｉｄ型二重特異性分子（ｖ１９１２６）発現ベクターのうち、ヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−ＦｃをコードするｐＣＬ＿＃１３５５７を鋳型にし、部位特異的変異導入法によりＨ鎖ＣＤＲ２のＡｓｎ５３をＡｒｇに、L鎖Ａｓｐ５２をＡｓｎに改変したＣＤＲ改変ベクターｐＣ３Ｅ−８０１７を作製した。同じく、ｐＣＬ＿＃１３５５７を鋳型にし、部位特異的変異導入法によりＨ鎖ＣＤＲ２のＡｓｎ５３をＳｅｒに、L鎖Ａｓｐ５２をＡｓｎに改変したＣＤＲ改変ベクターｐＣ３Ｅ−８０１８を作製した。
ｐＣ３Ｅ−８０１５、ｐＣ３Ｅ−８０１７、ｐＣ３Ｅ−８０１８のＯＲＦ配列をそれぞれ配列表の配列番号２２４（図２５５）、配列番号２２６（図２５７）、配列番号２２８（図２５９）に示す。【０１８２】
１７）−１−２  Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子（Ｃ５Ｄ−００１４、Ｃ５Ｄ−００１５、Ｃ５Ｄ−００１６）発現ベクターの作製
実施例１７）−１−１にて構築したＨｙｂｒｉｄ型二重特異性分子（Ｃ５Ｄ−０００４）発現ベクターのうち、ＣＤＲ改変型ヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖ―ＦｃをコードするｐＣ３Ｅ−８０１５を鋳型にし、部位特異的変異導入法によりＦｃのＣ末端にＬｙｓを挿入したＫ付加型ＣＤＲ改変ベクターｐＣ３Ｅ−８０２５を作製した。同様にｐＣ３Ｅ−８０１７、ｐＣ３Ｅ−８０１８を鋳型にし、部位特異的変異導入法によりＦｃのＣ末端にＬｙｓを挿入したＫ付加型ＣＤＲ改変ベクターｐＣ３Ｅ−８０２７、ｐＣ３Ｅ−８０２８を作製した。
実施例１４）−１−２にて構築したＨｙｂｒｉｄ型二重特異性分子（ｖ１９１２５、ｖ１９１２６）発現ベクターのうち、抗ＧＰＲＣ５ＤＦａｂ−ＦｃをコードするｐＣＬ−＃１３５５５を鋳型にし、部位特異的変異導入法によりＦｃのＣ末端にＬｙｓを挿入したＫ付加型ベクターｐＴＡＡ−＃２を作製した。
ｐＣ３Ｅ−８０２５、ｐＣ３Ｅ−８０２７、ｐＣ３Ｅ−８０２８、ｐＴＡＡ−＃２のＯＲＦ配列をそれぞれ配列表の配列番号２３０（図２６１）、配列番号２３２（図２６３）、配列番号２３４（図２６５）、配列番号２３６（図２６７）に示す。【０１８３】
１７）−２  ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の生産
ＣＨＯ−３Ｅ７細胞はマニュアルに従い、継代、培養を行った（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ，  Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．,  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１１）  ５５（１）,  ４４−５１）。対数増殖期にあるＣＨＯ−３Ｅ７細胞培養液を２×１０＾６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ になるよう、４ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ含有ＢａｌａｎＣＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒｙ  ＣＨＯ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で希釈し、各種二重特異性分子の生産に用いた。
ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞はマニュアルに従い継代、培養を行った（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。対数増殖期にあるＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞培養液を６×１０＾６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ になるようＥｘｐｉＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で希釈し、各種二重特異性分子の生産に用いた。【０１８４】
１７）−２−１  ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子（Ｃ５Ｄ−０００４、Ｃ５Ｄ−０００５、Ｃ５Ｄ−０００６）の生産
Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子Ｃ５Ｄ−０００４、Ｃ５Ｄ−０００５、Ｃ５Ｄ−０００６の発現培養はＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞を宿主として行った。細胞への発現ベクターのトランスフェクション方法、培養条件は全て製品に付随するマニュアル従って実施した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。培養は７５０  ｍＬスケールで行い、フィード添加と培養温度はマニュアルに記載のＭａｘ  ｔｉｔｅｒ  ｐｒｏｔｏｃｏｌの条件を採用した。培養開始後１３日目に培養上清を回収し、０．２μｍ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過して評価用のサンプルとした。
ｐＣ３Ｅ−８０１５、ｐＣＬ＿＃１３５５５、ｐＣＬ＿＃１２１２３の組み合わせからＨｙｂｒｉｄ型二重特異性分子Ｃ５Ｄ−０００４を、ｐＣ３Ｅ−８０１７、ｐＣＬ＿＃１３５５５、ｐＣＬ＿＃１２１２３の組み合わせからＨｙｂｒｉｄ型二重特異性分子Ｃ５Ｄ−０００５を、ｐＣ３Ｅ−８０１８、ｐＣＬ＿＃１３５５５、ｐＣＬ＿＃１２１２３の組み合わせからＨｙｂｒｉｄ型二重特異性分子Ｃ５Ｄ−０００６を取得した。
Ｃ５Ｄ−０００４を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号２２５（図２５６）、２１５（図２３９）、２１７（図２４１）に、Ｃ５Ｄ−０００５を構成するアミノ酸の配列を配列表の配列番号２２７（図２５８）、２１５（図２３９）、２１７（図２４１）に、Ｃ５Ｄ−０００６を構成するアミノ酸の配列を配列表の配列番号２２９（図２６０）、２１５（図２３９）、２１７（図２４１）にそれぞれ示す。【０１８５】
１７）−２−２  Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子（Ｃ５Ｄ−００１４、Ｃ５Ｄ−００１５、Ｃ５Ｄ−００１６）の生産
Ｏｐｔｉ−ＰＲＯ  ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）３  ｍＬにＰＥＩｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社）８００μｇを溶解し、ＰＥＩｍａｘ溶液とした。またＯｐｔｉ−ＰＲＯ  ＳＦＭ培地  ３  ｍＬにｐＣ３Ｅ−８０２５、ｐＴＡＡ＿＃２、およびｐＣＬ＿＃１２１２３を１：１：１．５の比率で混合したベクター混合物を１００  μｇ、ｐＡＫＴ、ｐＧＦＰ、断片処理済みのサケ精子ＤＮＡを混合したＤＮＡ混合物を１００  μｇをそれぞれ添加した。ＰＥＩｍａｘ溶液とベクター混合物、ＤＮＡ溶液を合わせて穏やかに攪拌し、５分間放置した後に２００  ｍＬのＣＨＯ−３Ｅ７細胞培養液に添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１日振とう培養したのち、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）２２  ｍＬ，  Ａｎｔｉ  ｃｌｕｍｐｉｎｇ  ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）  ４８０  μＬ，  ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社）５００  μＬを加え、３２℃でさらに９日間振とう培養した。培養開始後１０日目に培養上清を回収し、０．２μｍ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過して評価用のサンプルとした。
ｐＣ３Ｅ−８０２５、ｐＴＡＡ＿＃２、ｐＣＬ＿１２１２３の組み合わせからＨｙｂｒｉｄ型二重特異性分子Ｃ５Ｄ−００１４を、ｐＣ３Ｅ−８０２７、ｐＴＡＡ＿＃２、ｐＣＬ＿＃１２１２３の組み合わせからＨｙｂｒｉｄ型二重特異性分子Ｃ５Ｄ−００１５を、ｐＣ３Ｅ−８０２８、ｐＴＡＡ＿＃２、ｐＣＬ＿＃１２１２３の組み合わせからＨｙｂｒｉｄ型二重特異性分子Ｃ５Ｄ−００１６を取得した。
Ｃ５Ｄ−００１４を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号２３１（図２６２）、２３７（図２６８）、２１７（図２４１）に、Ｃ５Ｄ−００１５を構成するアミノ酸の配列を配列表の配列番号２３３（図２６４）、２３７（図２６８）、２１７（図２４１）に、Ｃ５Ｄ−００１６を構成するアミノ酸の配列を配列表の配列番号２３５（図２６６）、２３７（図２６８）、２１７（図２４１）にそれぞれ示す。【０１８６】
１７）−３  ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の精製
１７）−３−１  ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子（Ｃ５Ｄ−０００４、Ｃ５Ｄ−０００５、Ｃ５Ｄ−０００６）の精製
１７）−２−１で得られた培養上清から各種二重特異性分子をＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーの３段階工程で精製した。詳細には、ＰＢＳ  ｐＨ７．４で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に培養上清をアプライし、目的の二重特異性分子を吸着させた。非吸着成分をＰＢＳで除去したのち、１００  ｍＭ  酢酸バッファ  ｐＨ３．５で吸着成分を溶出した。溶出画分は直ちにＴｒｉｓバッファｐＨ９．０でｐＨを中性に調製したのち、５０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  １０  ｍＭ  リン酸カリウム，  １００  ｍＭ  塩化ナトリウム溶液に透析し、ヒドロキシアパタイトカラム Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ  ＣＨＴ  Ｔｙｐｅ−Ｉ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）にアプライした。直線的濃度勾配法により溶媒中の塩化ナトリウム濃度を０．１  Ｍから１  Ｍまで変化させることにより、吸着した目的の二重特異性分子を溶出した。得られたピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、目的の二重特異性分子に相当する画分を回収した。次に回収した画分のバッファを５０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０，２０  ｍＭ  塩化ナトリウム溶液に交換したのち、陽イオン交換カラム  Ｍｏｎｏ  Ｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）にアプライした。直線的濃度勾配法により溶媒中の塩化ナトリウム濃度を２０  ｍＭから１  Ｍまで変化させることにより、吸着した目的の二重特異性分子を溶出した。得られたピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、目的の二重特異性分子に相当する画分を回収した。最後に回収した画分をＨＢｓｏｒ（２５  ｍＭ  ヒスチジン, ５％  ソルビトール）ｐＨ６．０で透析し、フィルターろ過したのち、精製サンプルとした。精製サンプルは質量分析とＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ分析によって、目的の抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子に間違いないことを確認した。【０１８７】
１７）−３−２  Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子（Ｃ５Ｄ−００１４、Ｃ５Ｄ−００１５、Ｃ５Ｄ−００１６）の精製
１７）−２−２で得られた培養上清から各種二重特異性分子をＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの２段階工程で精製した。詳細には、ＰＢＳ  ｐＨ７．４で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に培養上清をアプライし、目的の二重特異性分子を吸着させた。非吸着成分をＰＢＳで除去したのち、１００  ｍＭ  酢酸バッファ  ｐＨ３．０で吸着成分を溶出した。溶出画分は直ちにＴｒｉｓバッファｐＨ９．５でｐＨを中性に調製したのち、５０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  １０  ｍＭ  リン酸カリウム，  １００  ｍＭ  塩化ナトリウム溶液に透析し、ヒドロキシアパタイトカラム Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ  ＣＨＴ  Ｔｙｐｅ−Ｉ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）にアプライした。直線的濃度勾配法により溶媒中の塩化ナトリウム濃度を０．１  Ｍから１  Ｍまで変化させることにより、吸着した目的の二重特異性分子を溶出した。得られたピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、目的の二重特異性分子に相当する画分を回収した。最後に回収した画分をＨＢｓｏｒ（２５  ｍＭ  ヒスチジン, ５％  ソルビトール）ｐＨ６．０で透析し、フィルターろ過したのち、精製サンプルとした。精製サンプルは質量分析とＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ分析によって、目的の抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子に間違いないことを確認した。【０１８８】
（実施例１８）  Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型、ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性評価
１８）−１  Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型、ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のフローサイトメトリーによる結合活性評価
１８）−１−１  Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型、ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の内因性ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞（ＫＨＭ−１Ｂ）への結合
実施例１５）−１−１と同様の方法で細胞調製・染色・解析を実施した。その結果、抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子は、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に結合することが示された（図２６９）。【０１８９】
１８）−１−２−２  Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型、ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞への結合
実施例１５）−１−２と同様の方法で細胞調製・染色・解析を実施した。図２７０に示す通り、抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子はカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に結合することが示された。【０１９０】
１８）−１−３  Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型、ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のヒトＣＤ３（ＰＢＭＣ）への結合
実施例１５）−１−３と同様の方法で細胞調製・染色・解析を実施した。その結果、抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子は、ヒトＣＤ３発現細胞に結合することが示された（図２７１）。【０１９１】
１８）−１−４  Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型、ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のカニクイザルＣＤ３（ＰＢＭＣ）への結合
実施例１５）−１−４と同様の方法で細胞調製・染色・解析を実施した。図２７２に示す通り、抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子はカニクイザルＣＤ３発現細胞に結合することが示された。【０１９２】
１８）−２  Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型、ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の細胞障害活性評価
実施例１５）−２−３と同様の方法で細胞障害活性の測定を実施した。ただし、培養時間は２４−７２時間である。図２７３に示す通り、ＫＨＭ−１Ｂ細胞に対する抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子の細胞障害活性が示された。【０１９３】
（実施例１９）  ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型、Ｃ末端Ｌｙｓ付加ＣＤＲ改変Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価
１９）−１  ヒトＰＢＭＣとがん細胞の共移植モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価
ＫＨＭ−１Ｂ、及びヒトＰＢＭＣを５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ含有ＰＢＳでそれぞれ５×１０７細胞／ｍＬになるよう調製し、ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウス（雌性、５週齢）の皮下に０・１ｍＬ共移植した。移植後に群分けを実施し、各種抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子を尾静脈内投与（１μｇ／ｋｇ）した。投与は移植日（Ｄａｙ０）からＤａｙ２まで毎日３回実施した。１週間後（Ｄａｙ７）より経時的に腫瘍の長径（ｍｍ）及び短径（ｍｍ）を電子デジタルノギスで計測し、以下に示す計算式により推定腫瘍体積を算出した。
Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｏｌｕｍｅ（ｍｍ３）＝各個体の推定腫瘍体積の平均値
各個体の推定腫瘍体積＝長径×短径２／２
各種抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子投与群において抗腫瘍効果が確認された。（図２７４）。【０１９４】
１９）−２  ヒトＰＢＭＣ移入モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価
ヒトＰＢＭＣをＰＢＳで５×１０７細胞／ｍＬになるよう調製し、ＮＯＧマウス（雌性、６週齢）に０・２ｍＬ尾静脈内移植した（Ｄａｙ−４）。Ｄａｙ０にＫＨＭ−１Ｂを５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ含有ＰＢＳでそれぞれ３×１０７細胞／ｍＬになるよう調製し、ＮＯＧマウスの皮下に０・１ｍＬ移植した。マウスの推定腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達した時点（Ｄａｙ１１）で腫瘍体積による群分けを実施し、各種抗ＧＰＲＣ５Ｄ−抗ＣＤ３二重特異性分子を尾静脈内投与（１ｍｇ／ｋｇ）した。投与はＤａｙ１１、Ｄａｙ１４、Ｄａｙ１７に実施し、経時的に腫瘍の長径（ｍｍ）及び短径（ｍｍ）を電子デジタルノギスで計測し、推定腫瘍体積を算出した。図に示す通り、Ｃ５Ｄ−０００４投与群（図２７５Ａ）、及びＣ５Ｄ−００１４投与群（図２７５Ｂ）において腫瘍の退縮が確認された。
【配列表フリーテキスト】
【０１９５】
配列番号１：ヒトＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端配列（図２）
配列番号２：ヒトＧＰＲＣ５Ｄのアミノ末端配列（図３）
配列番号３：２Ａ４の重鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマー
配列番号４：２Ａ４の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図８）
配列番号５：２Ａ４の重鎖の可変領域のアミノ酸配列（図９）。
配列番号６：２Ｂ１の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図１０）
配列番号７：２Ｂ１の重鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１１）
配列番号８：７Ｂ４の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図１２）
配列番号９：７Ｂ４の重鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１３）
配列番号１０：２Ａ４の軽鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマー
配列番号１１：２Ａ４の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図１４）
配列番号１２：２Ａ４の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１５）
配列番号１３：２Ｂ１の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図１６）
配列番号１４：２Ｂ１の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１７）
配列番号１５：７Ｂ４の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図１８）
配列番号１６：７Ｂ４の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１９）
配列番号１７：ヒトκ鎖分泌シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片（図２０）
配列番号１８：軽鎖発現ベクタープライマーＦ（図２１）
配列番号１９：軽鎖発現ベクタープライマーＲ（図２２）
配列番号２０：ヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片（図２３）
配列番号２１：ヒトキメラ化２Ａ４（ｃ２Ａ４）軽鎖のヌクレオチド配列（図２４）
配列番号２２：ヒトキメラ化２Ａ４（ｃ２Ａ４）軽鎖のアミノ酸配列（図２５。
配列番号２３：ヒトキメラ化２Ａ４軽鎖用プライマーセットＦ（図２６）
配列番号２４：ヒトキメラ化２Ａ４軽鎖用プライマーセットＲ（図２７）
配列番号２５：ヒトキメラ化２Ａ４（ｃ２Ａ４）重鎖のヌクレオチド配列（図２８）
配列番号２６：ヒトキメラ化２Ａ４（ｃ２Ａ４）重鎖のアミノ酸配列（図２９）
配列番号２７：ヒトキメラ化２Ａ４重鎖用プライマーセットＦ（図３０）
配列番号２８：ヒトキメラ化２Ａ４重鎖用プライマーセットＲ（図３１）
配列番号２９：ヒトキメラ化２Ｂ１（ｃ２Ｂ１）軽鎖のヌクレオチド配列（図３２）
配列番号３０：ヒトキメラ化２Ｂ１（ｃ２Ｂ１）軽鎖のアミノ酸配列（図３３）
配列番号３１：ヒトキメラ化２Ｂ１軽鎖用プライマーセットＦ（図３４）
配列番号３２：ヒトキメラ化２Ｂ１軽鎖用プライマーセットＲ（図３５）
配列番号３３：ヒトキメラ化２Ｂ１（ｃ２Ｂ１）重鎖のヌクレオチド配列（図３６）
配列番号３４：ヒトキメラ化２Ｂ１（ｃ２Ｂ１）重鎖のアミノ酸配列（図３７）
配列番号３５：ヒトキメラ化２Ｂ１重鎖用プライマーセットＦ（図３８）
配列番号３６：ヒトキメラ化２Ｂ１重鎖用プライマーセットＲ（図３９）
配列番号３７：ヒトキメラ化７Ｂ４（ｃ７Ｂ４）軽鎖のヌクレオチド配列（図４０）
配列番号３８：ヒトキメラ化７Ｂ４（ｃ７Ｂ４）軽鎖のアミノ酸配列（図４１）
配列番号３９：ヒトキメラ化７Ｂ４軽鎖用プライマーセットＦ（図４２）
配列番号４０：ヒトキメラ化７Ｂ４軽鎖用プライマーセットＲ（図４３）
配列番号４１：ヒトキメラ化７Ｂ４（ｃ７Ｂ４）重鎖のヌクレオチド配列（図４４）
配列番号４２：ヒトキメラ化７Ｂ４（ｃ７Ｂ４）重鎖のアミノ酸配列（図４５）
配列番号４３：ヒトキメラ化７Ｂ４重鎖用プライマーセットＦ（図４６）
配列番号４４：ヒトキメラ化７Ｂ４重鎖用プライマーセットＲ（図４７）
配列番号４５：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ａ４の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図５４）
配列番号４６：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ａ４の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図５５）
配列番号４７：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ａ４の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図５６）
配列番号４８：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ｂ１の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図５７）
配列番号４９：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ｂ１の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図５８）
配列番号５０：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ｂ１の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図５９）
配列番号５１：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体７Ｂ４の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図６０）
配列番号５２：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体７Ｂ４の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図６１）
配列番号５３：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体７Ｂ４の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図６２）
配列番号５４：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ａ４の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図６３）
配列番号５５：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ａ４の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図６４）
配列番号５６：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ａ４の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図６５）
配列番号５７：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ｂ１の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図６６）
配列番号５８：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ｂ１の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図６７）
配列番号５９：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体２Ｂ１の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図６８）
配列番号６０：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体７Ｂ４の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図６９）
配列番号６１：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体７Ｂ４の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図７０）
配列番号６２：ラット抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体７Ｂ４の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図７１）
配列番号６３：ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ１）のヌクレオチド配列（図７２）、うちヌクレオチド番号１乃至６０はシグナル配列であり、通常大部分の成熟ｈ２Ｂ１＿Ｌ１のヌクレオチド配列には含まれない。
配列番号６４：ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ１）のアミノ酸配列（図７３）
配列番号６５：ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ２）のヌクレオチド配列（図７４）
配列番号６６：ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ２）のアミノ酸配列（図７５）
配列番号６７：ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ３）のヌクレオチド配列（図７６）
配列番号６８：ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ３）のアミノ酸配列（図７７）
配列番号６９：ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ４）のヌクレオチド配列（図７８）
配列番号７０：ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ４）のアミノ酸配列（図７９）
配列番号７１：ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ５）のヌクレオチド配列（図８０）
配列番号７２：ヒト化２Ｂ１軽鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｌ５）のアミノ酸配列（図８１）
配列番号７３：ヒト化２Ｂ１重鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｈ１）のヌクレオチド配列（図８２）
配列番号７４：ヒト化２Ｂ１重鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｈ１）のアミノ酸配列（図８３）
配列番号７５：ヒト化２Ｂ１重鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｈ２）のヌクレオチド配列（図８４）
配列番号７６：ヒト化２Ｂ１重鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｈ２）のアミノ酸配列（図８５）
配列番号７７：ヒト化２Ｂ１重鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｈ３）のヌクレオチド配列（図８６）
配列番号７８：ヒト化２Ｂ１重鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｈ３）のアミノ酸配列（図８７）
配列番号７９：ヒト化２Ｂ１重鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｈ４）のヌクレオチド配列（図８８）
配列番号８０：ヒト化２Ｂ１重鎖（ｈ２Ｂ１＿Ｈ４）のアミノ酸配列（図８９）
配列番号８１：ヒト化７Ｂ４軽鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｌ１）のヌクレオチド配列（図９０
配列番号８２：ヒト化７Ｂ４軽鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｌ１）のアミノ酸配列（図９１）
配列番号８３：ヒト化７Ｂ４軽鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｌ２）のヌクレオチド配列（図９２）
配列番号８４：ヒト化７Ｂ４軽鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｌ２）のアミノ酸配列（図９３）
配列番号８５：ヒト化７Ｂ４重鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｈ１）のヌクレオチド配列（図９４）
配列番号８６：ヒト化７Ｂ４重鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｈ１）のアミノ酸配列（図９５）
配列番号８７：ヒト化７Ｂ４重鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｈ２）のヌクレオチド配列（図９６）
配列番号８８：ヒト化７Ｂ４重鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｈ２）のアミノ酸配列（図９７）
配列番号８９：ヒト化７Ｂ４重鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｈ３）のヌクレオチド配列（図９８）
配列番号９０：ヒト化７Ｂ４重鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｈ３）のアミノ酸配列（図９９）
配列番号９１：ヒト化７Ｂ４重鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｈ５）のヌクレオチド配列（図１００）
配列番号９２：ヒト化７Ｂ４重鎖（ｈ７Ｂ４＿Ｈ５）のアミノ酸配列（図１０１）
配列番号９３：カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ  アミノ末端ペプチド（図１０５）のアミノ酸配列
配列番号９４：ｓｃＦｖの配列解析に用いたプライマーＡ（図１０６）のヌクレオチド配列
配列番号９５：ｓｃＦｖの配列解析に用いたプライマーＢ（図１０７）のヌクレオチド配列
配列番号９６：Ｃ２０３７重鎖の可変領域のヌクレオチド配列（図１０８）
配列番号９７：Ｃ２０３７重鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１０９）
配列番号９８：Ｃ２０３７軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列（図１１０）
配列番号９９：Ｃ２０３７軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１１１）
配列番号１００：Ｃ３０４８重鎖の可変領域のヌクレオチド配列（図１１２）
配列番号１０１：Ｃ３０４８重鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１１３）
配列番号１０２：Ｃ３０４８軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列（図１１４）
配列番号１０３：Ｃ３０４８軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１１５）
配列番号１０４：Ｃ３０１５重鎖の可変領域のヌクレオチド配列（図１１６）
配列番号１０５：Ｃ３０１５重鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１１７）
配列番号１０６：Ｃ３０１５軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列（図１１８）
配列番号１０７：Ｃ３０１５軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１１９）
配列番号１０８：Ｃ３０２２重鎖の可変領域のヌクレオチド配列（図１２０）
配列番号１０９：Ｃ３０２２重鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１２１）
配列番号１１０：Ｃ３０２２軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列（図１２２）
配列番号１１１：Ｃ２０３７重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図１２４）
配列番号１１２：Ｃ２０３７重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図１２５）
配列番号１１３：Ｃ２０３７重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図１２６）
配列番号１１４：Ｃ２０３７軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図１２７）
配列番号１１５：Ｃ２０３７軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図１２８）
配列番号１１６：Ｃ２０３７軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図１２９）
配列番号１１７：Ｃ３０４８重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図１３０）
配列番号１１８：Ｃ３０４８重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図１３１）
配列番号１１９：Ｃ３０４８重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図１３２）
配列番号１２０：Ｃ３０４８軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図１３３）
配列番号１２１：Ｃ３０４８軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図１３４）
配列番号１２２：Ｃ３０４８軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図１３５）
配列番号１２３：Ｃ３０１５重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図１３６）
配列番号１２４：Ｃ３０１５重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図１３７）
配列番号１２５：Ｃ３０１５重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図１３８）
配列番号１２６：Ｃ３０１５軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図１３９）
配列番号１２７：Ｃ３０１５軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図１４０）
配列番号１２８：Ｃ３０１５軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図１４１）
配列番号１２９：Ｃ３０２２重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図１４２）
配列番号１３０：Ｃ３０２２重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図１４３）
配列番号１３１：Ｃ３０２２重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図１４４）
配列番号１３２：Ｃ３０２２軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図１４５）
配列番号１３３：Ｃ３０２２軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図１４６）
配列番号１３４：Ｃ３０２２軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図１４７）
配列番号１３５：Ｃ３０２２軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１２３）
配列番号１３６：Ｃ２０３７のＩｇＧ化体重鎖ヌクレオチド配列（図１４８）
配列番号１３７：Ｃ２０３７のＩｇＧ化体軽鎖ヌクレオチド配列（図１４９）
配列番号１３８：Ｃ３０４８のＩｇＧ化体重鎖ヌクレオチド配列（図１５０）
配列番号１３９：Ｃ３０４８のＩｇＧ化体軽鎖ヌクレオチド配列（図１５１）
配列番号１４０：Ｃ３０１５のＩｇＧ化体重鎖ヌクレオチド配列（図１５２）
配列番号１４１：Ｃ３０１５のＩｇＧ化体軽鎖ヌクレオチド配列（図１５３）
配列番号１４２：Ｃ３０２２のＩｇＧ化体重鎖ヌクレオチド配列（図１５４）
配列番号１４３：Ｃ３０２２のＩｇＧ化体軽鎖ヌクレオチド配列（図１５５）
配列番号１４４：Ｃ２０３７のＩｇＧ化体重鎖アミノ酸配列（図１５６）
配列番号１４５：Ｃ２０３７のＩｇＧ化体軽鎖アミノ酸配列（図１５７）
配列番号１４６：Ｃ３０４８のＩｇＧ化体重鎖アミノ酸配列（図１５８）
配列番号１４７：Ｃ３０４８のＩｇＧ化体軽鎖アミノ酸配列（図１５９）
配列番号１４８：Ｃ３０１５のＩｇＧ化体重鎖アミノ酸配列（図１６０）
配列番号１４９：Ｃ３０１５のＩｇＧ化体軽鎖アミノ酸配列（図１６１）
配列番号１５０：Ｃ３０２２のＩｇＧ化体重鎖アミノ酸配列（図１６２）
配列番号１５１：Ｃ３０２２のＩｇＧ化体軽鎖アミノ酸配列（図１６３）
配列番号１５２：ラット抗ＣＤ３抗体重鎖可変領域のヌクレオチド配列（図１６８）
配列番号１５３：ラット抗ＣＤ３抗体軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（図１６９）
配列番号１５４：  Ｃ３Ｅ−７０００のヌクレオチド配列（図１７０）
配列番号１５５：  Ｃ３Ｅ−７０３４の重鎖可変領域のアミノ酸配列（図１７１）
配列番号１５６：  Ｃ３Ｅ−７０３４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図１７２）
配列番号１５７：  Ｃ３Ｅ−７０３４のヌクレオチド配列（図１７３）
配列番号１５８：  Ｃ３Ｅ−７０３５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図１７４）
配列番号１５９：  Ｃ３Ｅ−７０３５のヌクレオチド配列（図１７５）
配列番号１６０：  Ｃ３Ｅ−７０３６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図１７６）
配列番号１６１：  Ｃ３Ｅ−７０３６のヌクレオチド配列  （図１７７）
配列番号１６２：Ｃ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３４のヌクレオチド配列（図１７８）
配列番号１６３：Ｃ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３４のヌクレオチド配列（図１７９）
配列番号１６４：Ｃ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３４のヌクレオチド配列（図１８０）
配列番号１６５：Ｃ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３５のヌクレオチド配列（図１８１）
配列番号１６６：Ｃ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３５のヌクレオチド配列（図１８２）
配列番号１６７：Ｃ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３５のヌクレオチド配列（図１８３）
配列番号１６８：Ｃ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３６のヌクレオチド配列（図１８４）
配列番号１６９：Ｃ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３６のヌクレオチド配列（図１８５）
配列番号１７０：Ｃ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３６のヌクレオチド配列（図１８６）
配列番号１７１：Ｃ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３４のアミノ酸配列（図１８７）
配列番号１７２：Ｃ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３４のアミノ酸配列（図１８８）
配列番号１７３：Ｃ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３４のアミノ酸配列（図１８９）
配列番号１７４：Ｃ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３５のアミノ酸配列（図１９０）
配列番号１７５：Ｃ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３５のアミノ酸配列（図１９１）
配列番号１７６：Ｃ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３５のアミノ酸配列（図１９２）
配列番号１７７：Ｃ２０３７−Ｃ３Ｅ−７０３６のアミノ酸配列（図１９３）
配列番号１７８：Ｃ３０４８−Ｃ３Ｅ−７０３６のアミノ酸配列（図１９４）
配列番号１７９：Ｃ３０２２−Ｃ３Ｅ−７０３６のアミノ酸配列（図１９５）
配列番号１８０：Ｃ３Ｅ−７０３４のアミノ酸配列（図２０３）
配列番号１８１：Ｃ３Ｅ−７０３５のアミノ酸配列（図２０４）
配列番号１８２：Ｃ３Ｅ−７０３６のアミノ酸配列（図２０５）
配列番号１８３：Ｃ３Ｅ−７０００の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図２０６）
配列番号１８４：Ｃ３Ｅ−７０００の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図２０７）
配列番号１８５：Ｃ３Ｅ−７０００の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図２０８）
配列番号１８６：Ｃ３Ｅ−７０００の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図２０９）
配列番号１８７：Ｃ３Ｅ−７０００の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図２１０）
配列番号１８８：Ｃ３Ｅ−７０００の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図２１１）
配列番号１８９：ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列（図２１２）
配列番号１９０：Ｅ１０１８重鎖の可変領域のヌクレオチド配列（図２１３）
配列番号１９１：Ｅ１０１８重鎖の可変領域のアミノ酸配列（図２１４）
配列番号１９２：Ｅ１０１８軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列（図２１５）
配列番号１９３：Ｅ１０１８軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（図２１６）
配列番号１９４：Ｄ１０１２重鎖の可変領域のヌクレオチド配列（図２１７）
配列番号１９５：Ｄ１０１２重鎖の可変領域のアミノ酸配列（図２１８）
配列番号１９６：Ｄ１０１２軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列（図２１９）
配列番号１９７：Ｄ１０１２軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（図２２０）
配列番号１９８：ｈ２Ｂ１  Ｆａｂ  ＨＣ＿１のヌクレオチド配列（図２２２）
配列番号１９９：ｈ２Ｂ１  Ｆａｂ  ＨＣ＿１のアミノ酸配列（図２２３）
配列番号２００：ｈ２Ｂ１  Ｆａｂ  ＨＣ＿２のヌクレオチド配列（図２２４）
配列番号２０１：ｈ２Ｂ１  Ｆａｂ  ＨＣ＿２のアミノ酸配列（図２２５）
配列番号２０２：ｈ２Ｂ１  Ｆａｂ  ＬＣ＿１のヌクレオチド配列（図２２６）
配列番号２０３：ｈ２Ｂ１  Ｆａｂ  ＬＣ＿１のアミノ酸配列（図２２７）
配列番号２０４：ｈ２Ｂ１  Ｆａｂ  ＬＣ＿２のヌクレオチド配列（図２２８）
配列番号２０５：ｈ２Ｂ１  Ｆａｂ  ＬＣ＿２のアミノ酸配列（図２２９）
配列番号２０６：Ｃ３Ｅ−７０３４  Ｆａｂ  ＨＣのヌクレオチド配列（図２３０）
配列番号２０７：Ｃ３Ｅ−７０３４  Ｆａｂ  ＨＣのアミノ酸配列（図２３１）
配列番号２０８：Ｃ３Ｅ−７０３４  Ｆａｂ  ＬＣのヌクレオチド配列（図２３２）
配列番号２０９：Ｃ３Ｅ−７０３４  Ｆａｂ  ＬＣのアミノ酸配列（図２３３）
配列番号２１０：Ｃ３Ｅ−７０３６  Ｆａｂ  ＨＣのヌクレオチド配列（図２３４）
配列番号２１１：Ｃ３Ｅ−７０３６  Ｆａｂ  ＨＣのアミノ酸配列（図２３５）
配列番号２１２：Ｃ３Ｅ−７０３６  Ｆａｂ  ＬＣのヌクレオチド配列（図２３６）
配列番号２１３：Ｃ３Ｅ−７０３６  Ｆａｂ  ＬＣのアミノ酸配列（図２３７）
配列番号２１４：ｈ２Ｂ１  Ｆａｂ  ＨＣ＿３のヌクレオチド配列（図２３８）
配列番号２１５：ｈ２Ｂ１  Ｆａｂ  ＨＣ＿３のアミノ酸配列（図２３９）
配列番号２１６：ｈ２Ｂ１  Ｆａｂ  ＬＣ＿３のヌクレオチド配列（図２４０）
配列番号２１７：ｈ２Ｂ１  Ｆａｂ  ＬＣ＿３のアミノ酸配列（図２４１）
配列番号２１８：Ｃ３Ｅ−７０３４  ｓｃＦｖ  Ｆｃのヌクレオチド配列（図２４２）
配列番号２１９：Ｃ３Ｅ−７０３４  ｓｃＦｖ  Ｆｃのアミノ酸配列（図２４３）
配列番号２２０：Ｃ３Ｅ−７０３６  ｓｃＦｖ  Ｆｃのヌクレオチド配列（図２４４）
配列番号２２１：Ｃ３Ｅ−７０３６  ｓｃＦｖ  Ｆｃのアミノ酸配列（図２４５）
配列番号２２２：ｈ２Ｂ１  ｓｃＦｖ  Ｆｃのヌクレオチド配列（図２４６）
配列番号２２３：ｈ２Ｂ１  ｓｃＦｖ  Ｆｃのアミノ酸配列（図２４７）
配列番号２２４：Ｃ３Ｅ−８０１５のヌクレオチド配列（図２５５）
配列番号２２５：Ｃ３Ｅ−８０１５のアミノ酸配列（図２５６）
配列番号２２６：Ｃ３Ｅ−８０１７のヌクレオチド配列（図２５７）
配列番号２２７：Ｃ３Ｅ−８０１７のアミノ酸配列（図２５８）
配列番号２２８：Ｃ３Ｅ−８０１８のヌクレオチド配列（図２５９）
配列番号２２９：Ｃ３Ｅ−８０１８のアミノ酸配列（図２６０）
配列番号２３０：Ｃ３Ｅ−８０２５のヌクレオチド配列（図２６１）
配列番号２３１：Ｃ３Ｅ−８０２５のアミノ酸配列（図２６２）
配列番号２３２：Ｃ３Ｅ−８０２７のヌクレオチド配列（図２６３）
配列番号２３３：Ｃ３Ｅ−８０２７のアミノ酸配列（図２６４）
配列番号２３４：Ｃ３Ｅ−８０２８のヌクレオチド配列（図２６５）
配列番号２３５：Ｃ３Ｅ−８０２８のアミノ酸配列（図２６６）
配列番号２３６：ｈ２Ｂ１  Ｆａｂ  ＨＣ＿４のヌクレオチド配列（図２６７）
配列番号２３７：ｈ２Ｂ１  Ｆａｂ  ＨＣ＿４のアミノ酸配列（図２６８）
配列番号２３８：ＣＤＲ改変体の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図２７６）、Ｘは任意の天然のアミノ酸である。
配列番号２３９：ＣＤＲ改変体の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図２７７）、Ｘは任意の天然のアミノ酸である。
配列番号２４０：Ｃ３Ｅ−７０３４のＣＤＲ改変体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（図２７８）、Ｘは任意の天然のアミノ酸である。
配列番号２４１：Ｃ３Ｅ−７０３４のＣＤＲ改変体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図２７９）、Ｘは任意の天然のアミノ酸である。
配列番号２４２：Ｃ３Ｅ−７０３５のＣＤＲ改変体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図２８０）、Ｘは任意の天然のアミノ酸である。
配列番号２４３：Ｃ３Ｅ−７０３６のＣＤＲ改変体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図２８１）、Ｘは任意の天然のアミノ酸である。
配列番号２４４：Ｃ３Ｅ−７０７８のアミノ酸配列（図２８２）。
配列番号２４５：Ｃ３Ｅ−７０８５のアミノ酸配列（図２８３）。
配列番号２４６：Ｃ３Ｅ−７０８６のアミノ酸配列（図２８４）。
配列番号２４７：Ｃ３Ｅ−７０８７のアミノ酸配列（図２８５）。
配列番号２４８：Ｃ３Ｅ−７０８８のアミノ酸配列（図２８６）。
配列番号２４９：Ｃ３Ｅ−７０８９のアミノ酸配列（図２８７）。
配列番号２５０：Ｃ３Ｅ−７０９０のアミノ酸配列（図２８８）。
配列番号２５１：Ｃ３Ｅ−７０９１のアミノ酸配列（図２８９）。
配列番号２５２：Ｃ３Ｅ−７０９２のアミノ酸配列（図２９０）。
配列番号２５３：Ｃ３Ｅ−７０９３のアミノ酸配列（図２９１）。
配列番号２５４：Ｃ３Ｅ−７０９４のアミノ酸配列（図２９２）。
配列番号２５５：Ｃ３Ｅ−７０９５のアミノ酸配列（図２９３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９９】
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【図１０１】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【図１２４】
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【図１２５】
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【図１２６】
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【図１２７】
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【図１２８】
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【図１２９】
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【図１３０】
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【図１３１】
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【図１３２】
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【図１３３】
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【図１３４】
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【図１３５】
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【図１３６】
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【図１３７】
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【図１３９】
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【図１４０】
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【図１４４】
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【図１９０】
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【図２００】
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【図２０２】
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【図２１０】
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【図２１１】
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【図２１２】
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【図２１４】
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【図２１５】
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【図２１６】
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【図２１７】
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【図２１８】
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【図２１９】
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【図２２０】
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【図２２１】
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【図２２２】
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【図２２３】
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【図２２４】
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【図２２５】
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【図２２７】
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【図２２８】
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【図２２９】
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【図２３０】
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【図２３１】
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【図２３２】
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【図２３３】
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【図２３４】
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【図２３５】
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【図２３６】
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【図２３７】
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【図２３８】
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【図２３９】
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【図２４０】
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【図２４１】
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【図２４２】
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【図２４３】
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【図２４４】
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【図２４５】
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【図２４６】
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【図２４７】
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【図２４８】
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【図２４９】
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【図２５０】
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【図２５１】
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【図２５２−１】
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【図２５２−２】
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【図２５３】
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【図２５４】
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【図２５５】
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【図２５６】
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【図２５７】
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【図２５８】
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【図２５９】
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【図２６０】
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【図２６１】
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【図２６２】
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【図２６３】
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【図２６４】
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【図２６５】
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【図２６６】
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【図２６７】
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【図２６８】
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【図２６９】
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【図２７０】
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【図２７１】
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【図２７２】
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【図２７３−１】
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【図２７３−２】
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【図２７３−３】
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【図２７４】
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【図２７５】
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【図２７６】
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【図２７７】
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【図２７８】
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【図２７９】
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【図２８０】
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【図２８１】
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【図２８２】
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【図２８３】
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【図２８４】
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【図２８５】
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【図２８６】
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【図２８７】
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【図２８８】
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【図２８９】
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【図２９０】
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【図２９１】
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【図２９２】
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【図２９３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018147245.tif 000299
2018147245.tif 000300