(57)【要約】  以下の酵素化学的性質を有するプロテイナーゼＢは、ラクターゼ製品中における熱安定性に影響を及ぼす因子であり、当該因子を指標とすることで優れた熱安定性を有するラクターゼ溶液が提供される。１）最適温度は約４０℃である。２）最適ｐＨは約８．０である。３）ｐＨ５．０〜８．０で安定である。４）ＦＩＴＣ−カゼイン及びラクターゼに高い基質特異性を有する。５）中性ラクターゼ分断作用を有する。６）分子量は約２９，７００〜３０，０００（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる）である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の酵素化学的性質を有することを特徴とするプロテイナーゼＢ。
１）最適温度は約４０℃である。
２）最適ｐＨは約８．０である。
３）ｐＨ５．０〜８．０で安定である。
４）ＦＩＴＣ−カゼイン及びラクターゼに高い基質特異性を有する。
５）中性ラクターゼ分断作用を有する。
６）分子量は約２９，７００〜３０，０００（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる）である。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）を満たすことを特徴とする請求項１記載のプロテイナーゼＢ。
（ａ）配列表の配列番号１で示されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列であって、そのアミノ酸配列と配列番号１との配列の相同性が７０％以上であり、且つ、ｐＨ５．０〜８．０で、中性ラクターゼ分断作用を有するポリペプチド
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）を満たすことを特徴とするプロテイナーゼＢの前駆体。
（ａ）配列表の配列番号２で示されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列であって、そのアミノ酸配列と配列番号１との配列の相同性が７０％以上であり、且つ、成熟タンパク質がｐＨ５．０〜８．０で、中性ラクターゼ分断作用を有するポリペプチドとなるアミノ酸配列からなるポリペプチド
【請求項４】
請求項１若しくは２のプロテイナーゼＢ、又は請求項３のプロテイナーゼＢの前駆体を構成するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載するポリヌクレオチドであって、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群、
（Ａ）配列表の配列番号３に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は
（Ｂ）配列表の配列番号３に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ｐＨ５．０〜８．０で、中性ラクターゼ分断作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列表の配列番号４に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は
（Ｄ）配列表の配列番号４に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、成熟タンパク質がｐＨ５．０〜８．０で、中性ラクターゼ分断作用を有するポリペプチドとなるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
から選ばれるポリヌクレオチド。
【請求項６】
中性ラクターゼ活性１単位あたり請求項１又は２に記載のプロテイナーゼＢを１１．５ｎｇ未満含有することを特徴とするラクターゼ溶液。
【請求項７】
中性ラクターゼ活性１単位あたり請求項１又は２に記載のプロテイナーゼＢを０．０１ｎｇ以上含有することを特徴とする請求項６に記載のラクターゼ溶液。
【請求項８】
プロテアーゼ阻害剤を含有する、請求項６又は７に記載のラクターゼ溶液。
【請求項９】
安定化剤を含有する、請求項６〜８のいずれか一項に記載のラクターゼ溶液。
【請求項１０】
前記ラクターゼ溶液が、ＵＨＴ乳又はヨーグルト用である、請求項６〜９のいずれか一項に記載のラクターゼ溶液。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか一項に記載のラクターゼ溶液の製造方法であって、
前記プロテイナーゼＢをラクターゼ溶液から除去する工程及び／又は前記プロテイナーゼＢの作用を低減する工程を含む
ことを特徴とするラクターゼ溶液の製造方法。
【請求項１２】
前記プロテイナーゼＢを除去する工程が、
前記ラクターゼ溶液に弱塩基性陰イオン交換カラムクロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いる工程である、請求項１１に記載のラクターゼ溶液の製造方法。
【請求項１３】
前記プロテイナーゼＢを除去する工程が、
前記ラクターゼ溶液を活性炭処理する工程である、請求項１１に記載のラクターゼ溶液の製造方法。
【請求項１４】
前記プロテイナーゼＢの作用を低減する工程が、
前記ラクターゼ溶液を熱処理する工程である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のラクターゼ溶液の製造方法。
【請求項１５】
ラクターゼ溶液に含まれる請求項１又は２に記載のプロテイナーゼＢのタンパク質量とラクターゼ活性を測定し、ラクターゼ活性１単位あたりの前記プロテイナーゼＢのタンパク質量を指標とすることで、ラクターゼの熱安定性を評価する方法。
【請求項１６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の２７番目〜４５番目のアミノ酸配列からなるペプチドに対するポリクローナル抗体である、請求項１６に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年３月１６日に出願した日本出願特願２０１６−０５３１３８に基づく優先権を主張し、その内容のすべては参照により本願に組み込まれるものとする。本発明は、プロテイナーゼＢ並びにその性質を利用したラクターゼ溶液及びその製造方法及びそれを用いた乳製品等に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳糖（ラクトース）不耐症は、先天的に乳糖をうまく分解することができないため、乳製品等の食品中の乳糖により腹痛や下痢等の諸症状を呈する状態をいう。乳糖は、ガラクトース及びグルコースから構成される二糖である。乳糖不耐症に対応するために、牛乳等に含まれる乳糖を、酵素ラクターゼによってガラクトースとグルコースとに予め分解することが食品製造業において行われている。【０００３】
牛乳等の乳糖を分解するために使用されるラクターゼ溶液は、従来、ラクターゼ産生微生物を培養し、細胞内からラクターゼを抽出し、培養物由来の夾雑物を除去して精製した後、安定剤を添加し、ろ過滅菌することによって製造されている。【０００４】
特許文献１（特公昭６０−１８３９４号公報）には、Kluyveromyces lactisのある株の培養物からラクターゼの製造法に係る発明が開示されている。この方法によれば、酵母菌体を自己消化させた後、得られた粗酵素溶液をＤＥＡＥセルロースカラムに通し、食塩濃度勾配による溶出を行うと、２つの活性区分（ラクターゼＡ及びラクターゼＢ）が得られる。これらの２つの活性区分は、ｐＨ安定性がわずかに異なること以外は、温度安定性を含む各種の性質にほとんど差異はなく、酵素製剤がこれらの混合物からなっていてもよいことが開示されている。また、Kluyveromyces lactisのラクターゼの遺伝子解析によれば、このラクターゼは１０２５アミノ酸からなるポリペプチドであり、分子量は１１７，６１８と推定されている（非特許文献１）。【０００５】
更に、特許文献１に記載されたラクターゼは至適温度が４０〜５０℃であること、ｐＨ７．０において５０℃、１０分間で４５％、５５℃、１０分間で１００％失活することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公昭６０−１８３９４号公報
【特許文献２】特表２００４−５３４５２７号公報
【特許文献３】特表２００９−５１７０６１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Poch et al., Gene 1992 Sep 1; 118(1):55-63
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、実際にはラクターゼ製品ごとに熱安定性が異なる事象が生じており、必ずしもこの結果が当てはまらないことが分かってきている。それに伴い、ラクターゼ製品ごとに保存中の安定性が異なることがしばしば問題となっている。従って、ラクターゼ製品中における熱安定性に影響を及ぼす因子の存在が予想されるが、これらの特許文献には、この因子については何ら記載されていない。【０００９】
そこで、本発明は、ラクターゼ製品中における熱安定性に影響を及ぼす因子を特定するとともに、当該因子を指標とすることで所望の優れた熱安定性を有するラクターゼ溶液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
市販されているラクターゼ製品は、ラクターゼ以外の夾雑タンパク質が含まれている。これらを取り除くため、様々な精製処理を施すことが一般的である。しかし、長期安定性を比較した場合、精製度が高いラクターゼ製品が必ずしも高い安定性を有するとは言えなかった。【００１１】
これら市販のラクターゼ製品をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供すると、ラクターゼは、高分子量バンド（約１２０ｋＤａ）が主である。しかしながら、ラクターゼのバンドが分断化し、複数（８０、５０、３３、３２ｋＤａ）のバンドが確認されるものが散見される。この複数にバンドが分断化しているラクターゼは、熱安定性が低い傾向にあるということが明らかとなってきた。【００１２】
そこで、本発明者らは、ラクターゼを分断化させる要因となる、ラクターゼ中に含まれるプロテイナーゼＢ（以下ＰｒＢと記載することがある）を新たに同定することに成功した。当該ＰｒＢの量や活性を調節することで、ラクターゼが分断化しにくい、所望の高い安定性を有する製品を製造することができることを見出し、本発明を完成した。【００１３】
従って、本発明によれば、
〔１〕  以下の酵素化学的性質を有することを特徴とするプロテイナーゼＢ；
１）最適温度は約４０℃である。
２）最適ｐＨは約８．０である。
３）ｐＨ５．０〜８．０で安定である。
４）ＦＩＴＣ−カゼイン及びラクターゼに高い基質特異性を有する。
５）中性ラクターゼ分断作用を有する。
６）分子量は約２９，７００〜３０，０００（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる）である。
［２］  以下の（ａ）又は（ｂ）を満たすことを特徴とする前記［１］記載のプロテイナーゼＢ；
（ａ）配列表の配列番号１で示されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列であって、そのアミノ酸配列と配列番号１との配列の相同性が７０％以上であり、且つ、ｐＨ５．０〜８．０で、中性ラクターゼ分断作用を有するポリペプチド
［３］  以下の（ａ）又は（ｂ）を満たすことを特徴とするプロテイナーゼＢの前駆体；
（ａ）配列表の配列番号２で示されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列であって、そのアミノ酸配列と配列番号１との配列の相同性が７０％以上であり、且つ、成熟タンパク質がｐＨ５．０〜８．０で、中性ラクターゼ分断作用を有するポリペプチドとなるアミノ酸配列からなるポリペプチド
［４］  前記［１］若しくは［２］のプロテイナーゼＢ、又は前記［３］のプロテイナーゼＢの前駆体を構成するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
［５］  前記［４］に記載する遺伝子であって、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群、
（Ａ）配列表の配列番号３に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は
（Ｂ）配列表の配列番号３に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ｐＨ５．０〜８．０で、中性ラクターゼ分断作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列表の配列番号４に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は
（Ｄ）配列表の配列番号４に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、成熟タンパク質がｐＨ５．０〜８．０で、中性ラクターゼ分断作用を有するポリペプチドとなるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
から選ばれるポリヌクレオチド；
［６］  中性ラクターゼ活性１単位あたり前記［１］又は［２］に記載のプロテイナーゼＢを１１．５ｎｇ未満含有することを特徴とするラクターゼ溶液；
［７］  中性ラクターゼ活性１単位あたり前記［１］又は［２］に記載のプロテイナーゼＢを０．０１ｎｇ以上含有することを特徴とする前記［６］に記載のラクターゼ溶液；
［８］  プロテアーゼ阻害剤を含有する、前記［６］又は［７］に記載のラクターゼ溶液；
［９］  安定化剤を含有する、前記［６］〜［８］のいずれかに記載のラクターゼ溶液；
［１０］  前記ラクターゼ溶液が、ＵＨＴ乳又はヨーグルト用である、前記［６］〜［９］のいずれかに記載のラクターゼ溶液；
［１１］  前記［６］〜［１０］のいずれかに記載のラクターゼ溶液の製造方法であって、
前記プロテイナーゼＢをラクターゼ溶液から除去する工程及び／又は前記プロテイナーゼＢの作用を低減する工程を含む
ことを特徴とするラクターゼ溶液の製造方法；
［１２］  前記プロテイナーゼＢを除去する工程が、
前記ラクターゼ溶液に弱塩基性陰イオン交換カラムクロマトグラフィ−又は疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いる工程である、前記［１１］に記載のラクターゼ溶液の製造方法；
［１３］  前記プロテイナーゼＢを除去する工程が、
前記ラクターゼ溶液を活性炭処理する工程である、前記［１１］に記載のラクターゼ溶液の製造方法；
［１４］  前記プロテイナーゼＢの作用を低減する工程が、
前記ラクターゼ溶液を熱処理する工程である、前記［１１］〜［１３］のいずれかに記載のラクターゼ溶液の製造方法；
［１５］  ラクターゼ溶液に含まれる前記［１］又は［２］のいずれかに記載のプロテイナーゼＢのタンパク質量とラクターゼ活性を測定し、ラクターゼ活性１単位あたりの前記プロテイナーゼＢのタンパク質量を指標とすることで、ラクターゼの熱安定性を評価する方法；
［１６］配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体；
［１７］配列番号１で示されるアミノ酸配列の２７番目〜４５番目のアミノ酸配列からなるペプチドに対するポリクローナル抗体である、［１６］に記載の抗体。
が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、プロテイナーゼＢ及びその性質を利用した、ラクターゼタンパクの分断が生じにくい所望の優れた安定性を有するラクターゼ溶液及びその製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明のプロテイナーゼBの推定アミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２は、ＹＮＬＡ及びＹＮＬBのＳＤＳ−ＰＡＧＥによるバンドの分断化の様子を示した図である。
【図３】図３は、ＹＮＬＡ及びＹＮＬBの熱安定性をラクターゼ残存活性により示した図である。
【図４】図４は、精製したＹＮＬ（中性ラクターゼ）に、ＰｒＢ及びプロテアーゼ阻害剤の添加によるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図５】図５は、精製したＹＮＬ（中性ラクターゼ）に、ＰｒＢ及びプロテアーゼ阻害剤の添加による熱安定性をラクターゼ残存活性により示した図である。
【図６】図６は、ＰｒＢの含有量の最適値を導くため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＰｒＢ添加に伴うラクターゼ分断化の様子を示す図である。
【図７】図７のパネルＡは、樹脂（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を用いた場合、パネルＢは、樹脂（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）を用いたカラムクロマトグラフィーでのＰｒＢの分離の結果を示す図である。
【図８】図８は、ウェスタンブロッティングによる工業用樹脂を用いたＰｒＢ除去の効果を示す図である。
【図９】図９は、ウェスタンブロッティングによる活性炭処理液のＰｒＢの検出結果を示す図である。
【図１０】図１０は、ウェスタンブロッティングによる熱処理前後のＰｒＢの検出結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に係るラクターゼ溶液は、プロテイナーゼＢの含有量が少ない、及び／又は、ラクターゼタンパクを分断する活性を低減させたラクターゼ溶液である。また、安定化剤やプロテアーゼ阻害剤を含んでもよい。以下、本発明について、（１）プロテイナーゼＢの性質、（２）ラクターゼ溶液の性質、（３）ラクターゼ溶液の製造方法（４）ラクターゼ溶液の用途の順に以下説明する。
【００１７】
≪プロテイナーゼＢ（ＰｒＢ）の性質≫
以下、本発明のラクターゼ溶液に含まれ、ラクターゼに対する分断活性を有する酵素であることが推定されるプロテイナーゼＢ（ＰｒＢ）について詳細に説明する。このプロテイナーゼＢをラクターゼ溶液から除去する、及び／又は、その活性を抑えることにより、ラクターゼの分断化を抑えることができると考えられる。尚、ラクターゼに含まれるプロテイナーゼＢについては、本発明にて初めて同定されたものであり、従来技術であるカゼインを基質とした測定法では検出することができなかったものである。
【００１８】
Kluyveromyces lactisの細胞抽出液より精製したラクターゼ分断活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって解析し、Ｍａｓｃｏｔ ｓｅａｒｃｈ検索を行った。図１に示すアミノ酸配列（配列番号２）の下線を引いた箇所は、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ解析で同定された箇所であり、それ以外の箇所はＭａｓｃｏｔ ｓｅａｒｃｈ検索によって推定された箇所である。更に、アミノ酸配列と既知のタンパク質配列データベースとの相同性についてＢＬＡＳＴを用いて解析した結果、ＰｒＢに相同性のあるKluyveromyces lactisの機能未知タンパク質と一致し、S.cerevisiae由来ＰｒＢとは約６８％の相同性が確認された。また、Kluyveromyces lactisのゲノムからクローニングした当該タンパク質遺伝子の塩基配列情報から変換されるアミノ酸配列とも１００％一致した。これにより、ラクターゼ分断活性を有する当該タンパク質はKluyveromyces lactis由来のＰｒＢであると結論付けた。
【００１９】
精製した本発明のＰｒＢを用いて表１に示した性質を明らかにした。本酵素はS.cerevisiae由来ＰｒＢと同様に中性プロテアーゼであると考えられる。また、表２に示すように、Azocollに対する反応速度が異なっており、また、ラクターゼに対して高い基質特異性を示し、S.cerevisiae由来ＰｒＢとは、その基質特異性が異なっていることが分かった。
【００２０】
その他、以下の表１及び２に示すような酵素学的諸性質及び基質特異性を有するものである。最適温度は約４０℃であり、最適ｐＨは約８．０であり、ｐＨ５．０〜８．０で安定である。また、ＦＩＴＣ−カゼイン及びラクターゼに高い基質特異性を有し、その分子量は、約２９，７００〜３０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）である。
【００２１】
【表１】
2017159723.tif 000002
【００２２】
【表２】
2017159723.tif 000003
【００２３】
中性プロテアーゼの遺伝子は、長いプレプロ配列を有していることが一般的である。プレ配列はタンパク質の輸送に必要であり、他方、プロ配列は酵素の活性型立体構造を形成する際に余分な配列である。本発明者らは、配列表の配列番号４で表わされるプレプロ配列を含む中性プロテアーゼ前駆体をコードする全遺伝子配列を見出し、又、配列番号２で表わされる同前駆体のアミノ酸配列を見出した。そして、この中性プロテアーゼ前駆体から、配列番号１で表わされる、菌体外に生産される本発明の中性プロテアーゼのアミノ酸配列、即ち成熟酵素のアミノ酸配列、及びこれをコードする配列番号３で表される遺伝子配列を見出した。
【００２４】
本発明に好適なKluyveromyces lactis由来のプロテイナーゼＢは、配列番号１で示される成熟酵素を構成するアミノ酸配列、又は、当該配列中の１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列、且つ、当該配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、より好適には配列番号１で示される成熟酵素を構成するアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００２５】
また、本発明のプロテイナーゼＢの別の好適な態様としては、配列番号２で示されるプロテイナーゼＢのプレ体（前駆体）を構成するアミノ酸配列、又は、当該配列中の１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、且つ、当該配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、より好適には、配列番号１で示される成熟酵素を構成するアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。この前駆体は、プロテアーゼである性質上、成熟化の過程を経て分子量が約３０，０００Ｄａの成熟タンパク質として機能する。
【００２６】
そして、本発明の中性プロテアーゼ又はその前駆体のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む遺伝子は、これに対応したヌクレオチド配列である。
【００２７】
本発明の好適なプロテイナーゼＢ、又はその前駆体のアミノ酸配列をコードする遺伝子としては、具体的には、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが挙げられる。
（Ａ）配列表の配列番号３に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は
（Ｂ）配列表の配列番号３に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ｐＨ５．０〜８．０で、中性ラクターゼ分断作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）配列表の配列番号４に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は
（Ｄ）配列表の配列番号４に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、成熟タンパク質がｐＨ５．０〜８．０で、中性ラクターゼ分断作用を有するポリペプチドとなるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
から選ばれるポリヌクレオチドである。
【００２８】
ペプチドのアミノ酸配列に関して、本明細書で使用する「１若しくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、配列番号に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であり、該配列番号に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのラクターゼ分断作用と同等か又はそれに類似のレベル（例えば５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは１００％以上）のラクターゼ分断作用を有する。このような変異体ポリペプチドはまた、配列番号に示されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の配列の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
【００２９】
また、本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd ed.」（T. Maniatisら、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、１９８９年）に記載の条件等が挙げられる。より詳細には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート、１００μｇ／ｍＬの熱変性ニシン精子ＤＮＡを含む溶液中で、プローブとともに５０〜６５℃の温度で一晩保存しハイブリダイズさせる、等の条件が挙げられる。
【００３０】
ここで、本明細書でいう、配列の相同性とは、２つのアミノ酸配列を、ギャップを導入して又はギャップを導入しないで最大の一致率となるようにアラインメントしたときに、ギャップ数を含めた総アミノ酸数に対する同一アミノ酸残基数の百分率（％）を指す。配列相同性の％は、例えば米国ＮＣＢＩが公開するＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の公知のアルゴリズムを利用することによって決定することができる。
【００３１】
本発明のプロテイナーゼＢには、中性ラクターゼ分断作用を保持するプロテイナーゼＢの断片も含むものである。その断片は、中性ラクターゼを分断する能力を保持する任意の長さでもよい。好ましくは、断片の長さは、少なくともアミノ酸２０残基の長さ、より好ましくは少なくとも２５残基、例えば３０、３５若しくは４０残基、又はそれより多数である。
【００３２】
また、特許請求の範囲及び本明細書でいう「ラクターゼ分断作用」とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける１２０ｋＤａ付近の中性ラクターゼを分断するものであればよく、好ましくは、その分断されたラクターゼの断片が中性ラクターゼ活性を示すものである。
【００３３】
本発明のＰｒＢは、成熟化された成熟タンパク質として、上述した酵素学的性質を有し、次に示されるアミノ酸配列（ｉ）〜（ｖ）から選択されるアミノ酸配列を含む、又は、次に示されるアミノ酸配列（ｉ）〜（ｖ）のアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドからなることが好適である。より好適には、本発明のＰｒＢは、下記アミノ酸配列（ｉ）〜（ｖ）のうち、２以上のアミノ酸配列を含む又はこれらのアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含む、更に好適には、３以上のアミノ酸配列を含む又はこれらのアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含む、特に好適には、４以上のアミノ酸配列を含む又はこれらのアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含む、最も好適には下記アミノ酸配列全部を含む又はこれらのアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドである。また、前記の中でも、下記アミノ酸配列（ｉ）〜（ｖ）のうち、アミノ酸残基数が多いもの又はアミノ酸残基数が多い順にそれらを含むことが好適である。
（ｉ）ＥＫＬＮＬＧＳＦＮＫＹＬＹＤＤＤＡＧＫＧＶＴＡＹＶＶＤＴＧＶＮＶＮＨＫＤＦＤＧＲ（配列番号５）
（ｉｉ）ＮＡＤＩＶＡＶＫ（配列番号６）
（ｉｉｉ）ＳＮＧＳＧＴＭＳＤＶＶＫＧＶＥＹＶＡＥＡＨＫＫ（配列番号７）
（ｉｖ）ＧＳＴＡＮＭＳＬＧＧＧＫＳＰＡＬＤＬＡＶＮＡＡＶＫ（配列番号８）
（ｖ）ＡＹＦＳＮＷＧＫ（配列番号９）
【００３４】
（ＰｒＢの精製方法）
本発明のＰｒＢの入手方法としては特に限定されないが、例えば、微生物抽出液から精製することができる。より詳細には、菌体を超音波処理によって破砕した後に遠心分離を行い、得られた上清を粗酵素溶液として、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）カラムクロマトグラフィーに供し、得られた活性画分を回収することができる。次に、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ(東ソー株式会社製)カラムクロマトグラフィーに供し、直線濃度勾配によって溶出して得られた活性画分を回収することができる。尚、ハイドロキシアパタイトカラムクロマログラフィーに供して得られた活性画分は電気泳動的に単一であることが確認されている。
【００３５】
本発明のＰｒＢは、上述したように、ラクターゼタンパク質分断活性を有する結果、ラクターゼ溶液中に含まれるとその熱安定性を損なうと考えられる一方で、特徴的なその基質特異性を利用して、様々な用途に利用することも可能である。例えば、低アレルギー食品、調味料、乳製品等の物性改変への用途が考えられる。
【００３６】
≪ラクターゼ溶液の性質≫
以下、本発明のラクターゼ溶液の性質について詳細に説明する。
【００３７】
＜ラクターゼの菌種由来＞
本発明において使用されるラクターゼは、酵母（Kluyveromyces属）由来のラクターゼである。これらのほとんどが、最適ｐＨをｐＨ＝６〜ｐＨ＝８とする、所謂、中性ラクターゼである。Kluyveromyces属のラクターゼ産生酵母としては、例えば、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Kluyveromyces marxianus等が挙げられる。
【００３８】
＜ラクターゼ溶液の活性＞
本発明のラクターゼ溶液は、１０〜１００，０００ＮＬＵ/ｇのラクターゼ活性を有することが望ましい。「ＮＬＵ」はＮｅｕｔｒａｌ Ｌａｃｔａｓｅ Ｕｎｉｔである。活性の測定方法は、以下のとおりである。基質ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を、ｏ−ニトロフェノール及びガラクトースにする加水分解によって測定される。反応は、炭酸ナトリウムの添加によって終了する。形成されたｏ−ニトロフェノールは、アルカリ媒体中で黄色になり、吸光度の変化が酵素活性（ＮＬＵ／ｇで表される）を測定するのに使用される。この手順は、米国食品化学物質規格集（FCC； Food Chemicals Codex）第４版、１９９６年７月１日、第８０１〜８０２頁／ラクターゼ（中性）（β-ガラクトシダーゼ）活性で、公表されている。
【００３９】
＜ラクターゼの熱安定性とその分断化＞
ここで、ラクターゼの熱安定性については、後述するようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによるバンドが分断化されている場合に、その熱安定性が低い傾向にあることが分かった。本発明のラクターゼ溶液は、ＰｒＢの分断活性を低減することにより、ラクターゼの分断化を抑制して熱安定性を向上させたものであると言える。
【００４０】
（分断化の確認）
まず、ラクターゼ溶液中のラクターゼの分断の様子は、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認することができる。たとえば、ラクターゼ溶液を精製水で必要に応じて希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒと１：１に混合し、１００℃、３分間の加熱処理により泳動用サンプルを調製する。次に１０％アクリルアミドゲルにスタンダード及び泳動用サンプルを供し、泳動する。スタンダードとの比較によりラクターゼの分子量も概算できる。スタンダードはＣＬＥＡＲＬＹ  Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（ＴａＫａＲａ＃３４５４Ａ）等を使用する。泳動後のゲルは、ＣＢＢ染色液（ＢＩＯ−ＲＡＤ＃１６１−０７８６）によるタンパク染色を行う。
【００４１】
染色後のゲルはＥＰＳＯＮ社製スキャナーＧＴ‐Ｘ８２０でグレースケールの画像として取り込む。更に、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）により、各バンドの濃度（タンパク質量）を測定することもできる。この各バンドの濃度のソフトウェアによる分析により、ラクターゼの分断化についてより詳細に検討することが可能となる。
【００４２】
＜ラクターゼ溶液中のＰｒＢ量＞
本発明のラクターゼ溶液は、ＰｒＢの含有量が少ないことが好適である。ＰｒＢが、ラクターゼの分断化に寄与していると考えられ、ラクターゼの分断化は、結果としてラクターゼの熱安定性を低減させると考えられるからである。即ち、ＰｒＢの含有量が少なくなるほど、ラクターゼ溶液の熱安定性が高くなる傾向にあると言える。ここで、本発明のラクターゼ溶液の含有量としては、熱安定性の向上という観点からは、中性ラクターゼ活性１単位（１ＮＬＵ）当り、本発明のプロテイナーゼＢを１１．５ｎｇ未満含むことが好適であり、より好適には３．０ｎｇ以下含有することが好適であり、更に好適には０．３０ｎｇ以下含有することが好適である。
【００４３】
本発明のラクターゼ溶液におけるＰｒＢの含有量の下限値としては、特に限定されないが、０．０１ｎｇ／ＮＬＵである。０．０１ｎｇ／ＮＬＵ未満にしても、ラクターゼの安定性についての効果はほとんど向上しないため、０．０１ｎｇ／ＮＬＵ未満に減少させることは経済的ではない。
【００４４】
（ウェスタンブロットによるＰｒＢ定量）
ＰｒＢの確認はウェスタンブロットで行うことができる。上記の方法で精製したＰｒＢ溶液をｘ１  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを用いて１０倍に希釈し、更に２倍系列で希釈した。各希釈溶液を１００℃で３分間熱処理し、泳動サンプルを調製した。ラクターゼ製品はｘ１  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒで２００ＮＬＵ／ｍＬになるように希釈して同様に泳動サンプルを調製した。各泳動サンプル１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、２０ｍＡの定電流で泳動した。泳動後のゲルは、１枚は上記と同様にＣＢＢ染色液によるタンパク質染色を行い、もう１枚はウェスタンブロットに供した。ウェスタンブロットの転写膜はＩｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ（ＢＩＯ−ＲＡＤ＃１６２−０１７４）を使用し、セミドライ式で転写した。転写後のメンブランは６％スキムミルク溶液でブロッキング操作を行った後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳにて洗浄した。
【００４５】
一次抗体は合成ペプチド（ＣＮＫＹＬＹＤＤＤＡＧＫＧＶＴＡＹＶＶＤ）を抗原としてウサギに免疫して抗ＰｒＢポリクローナル抗体を調製した。二次抗体はＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）  Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ＃１７０−６５１５）を使用した。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、Ｃｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ  Ｏｎｅ  Ｓｕｐｅｒ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ＃０２２３０−３０）を用いた化学発光法で検出した。感光は５分間行い、その後Ｘ線フィルムに現像した。現像後のフィルムはＥＰＳＯＮ社製スキャナーＧＴ−２８０でグレースケールの画像として取り込み、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）により、各バンドの濃度（タンパク質量）を測定した。定量解析は、ｉＭａｒｋマイクロプレートリーダー付属ソフトウェア（ＢＩＯ−ＲＡＤ）で行った。ＰｒＢのバンド面積を縦軸に、ＰｒＢのタンパク質量を横軸にプロットしたところ、回帰式ｙ=−０．３６６／（１＋（ｘ／３２．３）３．４７４）＋０．３６６が得られた。そこで、この式のｙにサンプルのバンド面積を代入し、１レーン当たりのタンパク質量を算出した。
【００４６】
したがって、本発明の１つの実施形態において、ＰｒＢに特異的に結合する抗体が提供される。抗体が、「特異的に結合する」とは、目的の物質と結合するが、その他の物質とは結合しないことを意味する。抗体が目的の物質と結合するか否か、及び／又はその他の物質と結合しないか否かは、サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング、及びＥＬＩＳＡなど、抗原抗体反応を認識するいずれの方法により確認されるものであってもよい。ここで、「結合しない」とは、目的の物質への結合との比較において、結合しないとされるタンパク質又はペプチドへの抗体の結合が十分区別可能な程度低いことをいう。例えば、本発明に係るＰｒＢと比較して、S.cerevisiae由来ＰｒＢとの交差反応率が、１％以下、０．５％以下、０．３％以下、０．１％以下、０．０５％以下、０．０３％以下であってもよい。
好ましい実施形態において、上記で作製した一次抗体は、配列番号１の２７番目〜４５番目のアミノ酸配列からなるペプチドに対するポリクローナル抗体である。このポリクローナル抗体は、後述する実施例において示されるように、例えば、ラクターゼの各精製工程において、残存するＰｒＢを効率よく検出することができる。
【００４７】
（分断活性の指標によるＰｒＢ評価）
ＰｒＢの分断活性へ及ぼす影響の評価方法としては、「ラクターゼ分断活性」をその指標として用いることもできる。この「ラクターゼ分断活性」とは、ラクターゼタンパクを分断する酵素活性を指し、実際の指標としては以下のように定義できる。ＰｒＢ無添加サンプルの１２０ｋＤａ付近のバンド強度を１００％としたときに、１〜４ｍＡＣＵ（１ＡＣＵは、アゾカゼインを基質として、３０℃、１時間に４２８ｎｍの吸光度を１上昇させる酵素量とする）のＰｒＢの添加したサンプルの１２０ｋＤａのバンド面積相対値を求める。次に、ＰｒＢが無添加である場合と比較して、３０℃で１時間反応させた後のラクターゼバンドが２０％減少するときの添加した酵素量をラクターゼ分断活性の１ＬＤＵ（Ｌａｃｔａｓｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ）とするものとする。
【００４８】
尚、ラクターゼに含まれるプロテイナーゼＢ及び／又はその断片のタンパク質量及びラクターゼ活性を測定し、ラクターゼ活性１単位あたりのプロテイナーゼＢ及び／又はその断片のタンパク質量を指標とすることで、ラクターゼの熱安定性を評価することもできる。
【００４９】
（熱安定性の確認）
熱処理の前後のラクターゼ溶液について、前述した方法により、ラクターゼ溶液の活性を測定し、熱処理前後の活性の比較により、熱安定性を確認することができる。各処理工程の効果については、例えば、未処理のものと、処理後のものを同条件で反応させた後、残存活性の比較をすることにより、効果を確認できる。
【００５０】
≪ラクターゼ溶液の製造方法≫
本発明のラクターゼ溶液は、以下の方法で微生物から回収され、精製、ＰｒＢ活性を調整されたものであることができる。
本発明のラクターゼ溶液の製造方法の一例は以下の５つの工程を含む。すなわち、
（１）微生物の培養工程
（２）微生物からのラクターゼ回収工程
（３）ラクターゼの精製工程
（４）ＰｒＢのラクターゼ分断活性の調整工程
（５）ラクターゼ活性の調整工程
である。
【００５１】
以下、上記５つの工程の詳細について説明するが、本発明の効果を奏する限り、これらの方法に限定はされない。
（１）微生物の培養工程
微生物の培養工程については公知の培地を使用し、公知の菌株を使用すればよい。培養条件も公知であり、必要に応じて適宜選択することができる。
（２）微生物からのラクターゼ回収工程
微生物からのラクターゼ回収工程については、細胞内酵素である場合、ラクターゼを抽出する工程を含む必要がある。この抽出工程は、ラクターゼを細胞外に移行させることができる方法であれば特に限定されず、公知の抽出方法を使用することができる。他方、遺伝子導入、変異等によりラクターゼを細胞外に分泌される酵素とすれば、その培養液にラクターゼが含まれることになるため、本抽出工程は不要である。
（３）ラクターゼの精製工程
ラクターゼの精製工程は本発明のラクターゼ溶液を得るために重要である。特許文献１、特許文献２及び特許文献３は、いずれもクロマトグラフィーによってラクターゼ溶液を精製することが共通する。このクロマトグラフィーを行うことによって、ラクターゼの精製が進みラクターゼ活性を向上させることができる。しかし、クロマトグラフィー（分配クロマトグラフィー又は分子篩クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィー等）を使用してラクターゼを精製すると、一部の手法では、本来１２０ｋＤａであるラクターゼが、８０ｋＤａ及び５０ｋＤａのラクターゼにそれぞれ分解される可能性があることが判明した。いずれの分子量のラクターゼもラクターゼ活性を有するが、ラクターゼが分解を受けることによって、特に８０ｋＤａ以下の画分の割合が増すと、ラクターゼの熱安定性が低下する結果、比較的高い温度で乳糖の分解が進みにくくなる問題が生じる可能性がある。
【００５２】
本発明のラクターゼは、精製工程に塩析と脱塩処理を使用することによっても得ることができる。すなわち、塩析によってラクターゼを沈殿させた後、その沈殿物を回収・再溶解し、沈殿物に含まれる塩を脱塩する。塩析、沈殿物の回収・再溶解及び脱塩は連続して行ってもよい。また、本発明のラクターゼが得られる限り、他の精製手段を併用することも可能である。
【００５３】
塩析を行う塩析剤としては、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムが挙げられ、これらのうち１種又は２種以上を用いることができる。
ラクターゼを含む溶液に、塩析剤としての硫酸アンモニウムを添加する場合、１０〜９０％飽和とすることが好ましく、３０〜７０％飽和とすることが更に好ましい。他の塩析剤を使用する場合、当該硫酸アンモニウムの添加量に相当する量を使用すればよい。
【００５４】
硫酸アンモニウム等の塩析剤を添加することでラクターゼを含む溶液からラクターゼを沈殿させることができる。塩析剤の添加からラクターゼを沈殿させるまでの条件は、１〜４０℃で１〜８０時間放置することが好ましい。このときのｐＨ条件は４〜９であることが好ましい。更に好ましくは、４〜２５℃（室温）、１〜４８時間、ｐＨ５〜８である。尚、温度条件の下限値については、ラクターゼを含む溶液が凝固しない温度であればよい。濾過によってラクターゼを含んでいた液体とラクターゼを含む沈殿物とを固液分離した後、固体状のラクターゼを水や緩衝液等に再溶解させ、透析や限外濃縮によって脱塩処理を行う。
【００５５】
（４）ＰｒＢのラクターゼ分断活性の調整工程
本発明のラクターゼの製造方法は、その熱安定性の向上のため、ＰｒＢの量及び／又はその活性を調整する工程を別途含むことが好適である。しかし、前記の精製工程によりＰｒＢの分断活性（作用）を十分低減できる場合は、前記精製工程が当該調整工程を兼ねてもよい。また、完成品のラクターゼ溶液に対し、これらの処理を行うこともできる。複数の工程を同時に組み合わせても良い。以下、具体的な工程についてそれぞれ説明する。
【００５６】
後述するこれらの調整工程においては、その工程の前後において、ラクターゼ活性を低減させないことが好適である。例えば、工程前のラクターゼ活性を１００％として、当該工程後のラクターゼの残存活性が、４０％以上であることが好適であり、８０％以上であることがより好適である。
【００５７】
（熱処理工程）
ＰｒＢは、熱処理により分解又は失活し易い性質があることが推定されている。ラクターゼの活性を失わない条件で、かつ、ＰｒＢ分断活性を低減できる熱処理条件で熱処理することで、本発明のラクターゼ溶液を得ることができる。このような熱処理条件としては、３５〜６０℃に１０分以上〜１８０分未満であることが好適であり、より好適には、３５℃〜５０℃に、３０分以上〜１５０分以下であることが好適である。
【００５８】
（プロテアーゼ阻害剤の添加工程）
本発明のラクターゼ溶液の製造方法は、プロテアーゼ阻害剤を添加する工程を含むことが好適である。ＰｒＢに阻害作用を有するプロテアーゼ阻害剤をラクターゼ溶液に添加することにより、ＰｒＢの活性を抑えることができる。その結果、ラクターゼの分断活性が抑えられ、より熱安定性の高いラクターゼ溶液を得ることが可能となるからである。
【００５９】
本発明に使用できるプロテアーゼ阻害剤の種類としては特に限定されないが、例えば、セリンプロテアーゼ阻害剤やＳＨ修飾試薬がある。セリンプロテアーゼ阻害剤には、活性中心をスルホニル化する阻害剤としてＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ＡＥＢＳＦ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）やアルキル化する阻害剤ＴＬＣＫ（ｔｏｓｙｌ  ｌｙｓｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ）、ＴＰＣＫ（ｔｏｓｙｌ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｙｌｋｅｔｏｎｅ）がある。その他のセリンプロテアーゼ阻害剤として、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅやペプチド系化合物のＡｐｒｏｔｉｎｉｎ、オボムコイドがある。ＳＨ修飾試薬としてＰＣＭＢ（ｐ−ｃｈｌｏｒｏｍｅｒｃｕｒｉｂｅｎｚｏａｔｅ）、ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｒｃｕｒｉｂｅｎｚｏａｔｅ、ＨｇＣｌ２が挙げられる。また、市販のプロテアーゼインヒビターカクテル（例えばＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ＃Ｐ８３４０−１ＭＬ）を用いることもできる。更に、これらプロテアーゼ阻害剤は、単独で用いてもよく、２種以上を混合させて用いることもできる。
【００６０】
プロテアーゼ阻害剤の添加量としては、本発明の効果を奏する限り限定はされないが、例えば、ＡＥＢＳＦは０．１〜１０００ｍＭ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎは０．８〜８００μＭ、を添加することが好適である。
【００６１】
（活性炭処理工程）
本発明のラクターゼ溶液の製造方法は、活性炭処理する工程を含むことが好適である。活性炭処理により、ＰｒＢを除去することができる。その結果、ラクターゼの分断活性が抑えられ、より熱安定性の高いラクターゼ溶液を得ることが可能となるからである。尚、本発明書において「ＰｒＢを除去する」とは、上述したようなラクターゼ中のＰｒＢのタンパク質量を好適な範囲又は製品として許容される範囲まで、低減させることを含むものである。
【００６２】
活性炭処理としては、本発明の効果を奏する限り限定はされない。例えば、ラクターゼ溶液（中性ラクターゼ溶液）製造工程途中のいずれかで活性炭を加え、活性炭処理液とする工程であってもよい。使用をする活性炭としては、特に限定はされないが、太閤（フタムラ化学社製）、富士炭素（セラケム社製）、又は白鷺（大阪ガスケミカル社製）、ホクエツ（味の素ファインテクノ社製）等を用いて処理することが好適である。これら活性炭は、単独で用いてもよく、２種以上を混合させて活性炭処理液として用いることもできる。
【００６３】
（クロマトグラフィー処理工程）
上述したように、ラクターゼの分断化（又は、分子鎖の亀裂）を生じさせず、ＰｒＢを除去することができる、クロマトグラフィー処理を用いることができる。このような処理として、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有した弱塩基性陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ブチル（Ｂｕｔｙｌ）基やフェニル（Ｐｈｅｎｙｌ）基等を有した疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを挙げることができる。クロマトグラフィーの基材に関しては通常用いられるものであれば問わない。
【００６４】
（樹脂による処理工程）
本発明のラクターゼ溶液の製造方法は、各種樹脂と、微生物からのラクターゼ回収後から精製過程のいずれかにあるラクターゼ溶液を混合することにより、ＰｒＢを吸着する工程を含むことが好適である。混合する方法としては、公知の方法を使用することができる。この樹脂としては、本発明の効果を奏する限り限定されないが、例えば、ＩＲＡ９６ＳＢ、ＩＲＡ９０４ＣＬ、ＨＰＡ２５Ｌ、ＦＰＬ３５００、ＸＡＤ１１８０Ｎ、ＸＡＤ７ＨＰ等が挙げられる。
【００６５】
これらＰｒＢを除去する方法では、ＰｒＢの除去と同時にラクターゼの分断化も進行する場合がある。これは、例えば、活性炭や樹脂による処理のうち、ラクターゼ溶液と樹脂を混合させ、ＰｒＢを吸着させるバッチ式においては、活性炭や樹脂の表面において吸着されたＰｒＢが、吸着後も活性を失っておらず、ラクターゼの分断化の進行に寄与するためと考えられる。従って、膜にイオン交換基等の反応基を固定化させる等により、ラクターゼ溶液を膜透過させながらＰｒＢを吸着させる方式であれば、ラクターゼ液と吸着されたＰｒＢの接触する時間はわずかとなり、ラクターゼの分断化の抑制が可能であると考えられる。そのＰｒＢとラクターゼ溶液との接触する時間という観点からは、イオン交換膜処理も本発明に好適であると考えられる。
【００６６】
（５）ラクターゼ活性の調整工程
ラクターゼ活性の調整工程は、ラクターゼの活性を調整することができるものであれば制限されない。例えば、水、塩類を含む水溶液の添加、安定剤の添加等である。
【００６７】
（安定化剤の添加）
本発明のラクターゼ溶液の製造方法は、必要に応じ、ラクターゼ活性の安定化に寄与する安定化剤を添加する工程を含むことが好適である。本発明のラクターゼ溶液には、このような各種成分を含有していてもよい。安定化剤としては、特に限定されないが、例えば、ラクターゼの安定化に寄与する金属塩類、各種糖類、アスコルビン酸、グリセリン等、使い勝手をよくするための賦形剤である澱粉、デキストリン、緩衝作用を有する無機塩類等を挙げることができる。なかでも、グリセリンが安定化効果のみならず、静菌効果もあるため、より好適である。
【００６８】
安定化剤の添加量としては、本発明の効果を奏する限り、限定はされないが、例えば、ラクターゼ溶液を基準として、１０〜５０質量％である。
【００６９】
（製造方法の選択と費用対効果）
本発明は、前述のようなＰｒＢ分断活性の調整により、優れた熱安定性を有するラクターゼ溶液を得ることができる。他方、ラクターゼ溶液の用途等によっては、高度な熱安定性を要求されず、必要以上の精製等の工程により費用対効果が低くなる場合もあり得る。そうした場合に、新たに同定されたＰｒＢに関して、そのタンパク質量及び／又は分断活性（ＬＤＵ）を指標として用い、ラクターゼ溶液の製造方法を適宜選択することで、高い費用対効果を奏することも可能である。即ち、その用途等に基づいて、ラクターゼ溶液に含有されるＰｒＢ除去（又は作用の低減）の方法及び条件等を、要求される安定性に応じて設定することで、要求される水準を超えて精製（調整）することなく、費用対効果を最大限とすることが可能となる。
【００７０】
より具体的には、まず、ラクターゼ抽出液のＰｒＢの含有量を測定し（必要に応じて、製造方法の段階ごとに）、所望の用途（例えば、ロングライフミルク）に要求される熱安定性の程度から、本発明のラクターゼ溶液を得るための精製方法、ラクターゼ分断活性の調整方法として、ＰｒＢ量の調整（低減）方法及び条件設定、及び、ＰｒＢ活性の低減方法及び条件設定等を選択し、製造方法の最適化を図ることができることとなる。
【００７１】
≪ラクターゼ溶液の用途≫
原料乳は、ラクターゼ溶液を添加する対象となるものである。本発明では、公知の原料乳を用いればよい。原料乳には、殺菌前のものも、殺菌後のものも含まれる。原料乳は乳を使用するものであればよい。原料乳を構成する材料としては、水、生乳、殺菌処理した乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、バターミルク、バター、クリーム、ホエータンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエータンパク質単離物（ＷＰＩ）、α（アルファ）−Ｌａ、β（ベータ）−Ｌｇ等があげられる。
【００７２】
本発明のラクターゼ溶液を原料乳に添加することで、当該原料乳に含まれる乳糖を分解させることができる。分解温度は１〜６０℃であり、分解時間は１０分間〜１６８時間である。
【００７３】
ラクターゼ溶液の具体的な利用形態としては、例えば、乳製品の製造において用いられる。乳糖分解した乳製品の製造方法は、１．殺菌前の乳にラクターゼを添加して乳糖の分解を行なった後、乳の加熱殺菌と同時にラクターゼを失活させる方法（特開平５−５０１１９７号公報）、２．殺菌乳にラクターゼを添加して乳糖の分解を行なった後、加熱処理によってラクターゼを失活させてから乳製品を製造する方法、３．殺菌乳にラクターゼを添加して流通段階で乳糖の分解を行なうことで、加熱処理をせずにラクターゼを失活させないで乳製品を製造する方法、４．固定化したラクターゼで乳中の乳糖を分解した後、乳製品を製造する方法（特開昭４６−１０５５９３号公報、特開昭５９−１６２８３３号公報）、５．予め乳糖分解若しくは乳糖除去した原材料を殺菌乳に用いて乳製品を製造する方法等がある。
【００７４】
本発明に係るラクターゼ溶液は、乳製品製造用として特に適している。ここで、乳製品とは、アイス、ロングライフミルク等の牛乳類、ヨーグルト、生クリーム、サワークリーム、チーズ等をいう。特に、本発明に係るラクターゼ溶液は、４０℃以上の熱負荷をかける場合に好ましく利用することができる。具体的には、新たに同定された本発明のプロテイナーゼＢの量及び／又は活性を調整することにより、より熱負荷に適したラクターゼ溶液を得ることが容易となる。このような用途としては、例えば、牛乳類、ヨーグルト又はＵＨＴ乳（ロングライフミルク）がある。
【実施例】
【００７５】
次に、本発明を実施例により、更に具体的に説明するが、本発明は、これらの例によって何ら限定されるものではない。【００７６】
１．ラクターゼの分断化と熱安定性の関係
事前の検討として、ラクターゼの分断化と熱安定性の関係について、以下の試験を実施した。市販のラクターゼ溶液である、ＧＯＤＯ−ＹＮＬ２（合同酒精社製、中性ラクターゼ活性５，０００ＮＬＵ／ｇ）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるラクターゼの分断化の確認及びそのラクターゼの残存活性の測定による熱安定性試験を行った。尚、ＧＯＤＯ−ＹＮＬ２はロットが異なる２製品（ＹＮＬＡ、ＹＮＬＢ）について試験をした。熱安定性試験の条件としては、０．２５ＮＬＵ／ｇに希釈した酵素溶液（ラクターゼ溶液）を用いて、５０℃で１０分間処理した後の活性を、未処理のものに対する残存活性（％）として算出した。そのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２及び熱安定性試験の結果を図３に示した。これらの結果から、ラクターゼがより分断化しているＹＮＬＢの方が、より熱安定性が低くなっていることが分かる。従って、ラクターゼの分断化と熱安定性の関係性が示唆された。【００７７】
２．精製したＰｒＢの添加によるラクターゼの分断化の確認及びプロテアーゼ阻害剤の添加によるラクターゼの分断化の抑制
ＹＮＬＡをゲル濾過クロマトグラフィー（HiPrep Sephacryl S-200 High Resolution、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に供し、高分子画分のみを含む分断していないラクターゼ基質を調製した（Ｆ−１）。この未分断化ラクターゼ（Ｆ−１）に精製したＰｒＢを添加して反応させたサンプル（Ｆ−１＋精製酵素）、それにプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ＃Ｐ８３４０−１ＭＬ）を添加したサンプル（Ｆ−１＋精製酵素＋Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を調製した。これらについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び熱安定性試験（条件は上記と同様）を行った。図４にＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、図５に熱安定性試験の結果をそれぞれ示す。図４の結果から、ＰｒＢの添加によりラクターゼの分断化が進み、この分断化はプロテアーゼ阻害剤により阻害を受けることが分かった。また、図５の結果から、前述のように、分断化しているサンプルほど熱安定性は低くなる傾向となった。従って、精製したＰｒＢによるラクターゼの分断化と、分断化に起因する熱安定性の関係を示すことができた。【００７８】
３．中性ラクターゼ溶液中で分断化しないＰｒＢ量の検討
ラクターゼの分断化は、ラクターゼ中のＰｒＢの量に依存することが推定される。そこで、中性ラクターゼ溶液中に存在してもラクターゼが分断化しないＰｒＢ単位（精製によって減らすべき単位）を検討した。具体的には、未分断ラクターゼ（Ｆ−１）に所定のタンパク質量（０．０１１３、０．１１３、１．１３、１１．３、１１３ｎｇ）のＰｒＢを添加して３０℃で２０時間反応させ、分断化の様子をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。その結果を図６に示す。これら分断の様子から、ラクターゼ活性１ＮＬＵに対して０．２６ｎｇ｛上記タンパク質量１１．３ｎｇ（レーン４）に対応｝であれば分断しなかった（上述したＩｍａｇｅＪソフトウェアによって分断後の画分が検出されなかった）。【００７９】
４．樹脂カラムクロマトグラフィ−を用いたＰｒＢ除去効果
超音波処理を行い、遠心分離によって不溶性画分を取り除いた粗抽出液（ＰｒＢ  ２００ＬＤＵ／ｍＬを含む）をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（弱塩基性陰イオン交換カラムクロマトグラフィー）やＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー）に供したところ、どちらの樹脂を用いてもラクターゼとＰｒＢを分離することができた。図７及び８に分離の様子を示した。表３に示すように、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ及びＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィーで得られた画分のラクターゼ活性回収率はそれぞれ１０４％、９５%であった。また、回収したラクターゼ画分のラクターゼ分断活性を調べたところ検出範囲外であった。図示はしていないが、これらを熱安定性試験（条件は上記と同様）に供したところ、その結果はそれぞれ約４５％、約４４％であり、上述のＹＮＬＢよりも高かった。【００８０】
【表３】
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【００８１】
５．樹脂との混合によるＰｒＢ除去効果
工業用樹脂と前述と同様に得られた粗抽出液を混合して反応させた。反応終了後に上清を回収し、ラクターゼ活性を測定した。続いて、ウェスタンブロッティングによるＰｒＢの検出を行った。結果を図８及び表４に示す。この結果から、合成吸着剤のＸＡＤ７ＨＰでＰｒＢを除去することができたことがわかった。【００８２】
【表４】
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【００８３】
６．活性炭処理によるＰｒＢ除去効果
前述と同様に得られた粗抽出液に（１）終濃度０．０５％太閤Ｓ添加サンプル、（２）終濃度２％太閤Ｓ添加サンプルを調製し、活性炭処理液とした。上清を回収し、ウェスタンブロッティングによるＰｒＢの検出を行った。ウェスタンブロッティングによるＰｒＢの検出結果を図９に、ＰｒＢの残存率の算出結果を表５に示す。これらが示すように、活性炭を０．０５％以上添加することでＰｒＢを除去できた。【００８４】
【表５】
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【００８５】
７．熱処理前後におけるＰｒＢの低減
前述と同様に得られた粗抽出液をサンプルとしてウェスタンブロッティングによるＰｒＢの検出を行った。その結果、熱処理（４３℃、２時間）によってＰｒＢは著しく減少していた。結果を図１０及び表６に示す。尚、ＰｒＢ残存率は、熱処理前のＰｒＢタンパク質量を１００％とした場合の熱処理後のＰｒＢタンパク質量を％の値として算出した。【００８６】
【表６】
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【００８７】
市販の中性ラクターゼ溶液（ＹＮＬＡ）をサンプルとして、ウェスタンブロッティングによるＰｒＢの検出を行った。その結果、ラクターゼ活性１ＮＬＵ当りＰｒＢ換算として、１１．５ｎｇ／ＮＬＵ含有していた。結果を表７に示す。【００８８】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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