(57)【要約】  本発明は、抗原が担持された、ラテックス等の不溶性担体粒子の抗体測定における利用可能性の幅を広げること、特に、微生物由来の溶解物等の複数物質の混合物を担持させても良好な測定結果を得る手段を提供することを課題とし、物理吸着により所定の抗原が担持された不溶性担体粒子、及び、化学結合により当該抗原が担持された不溶性担体粒子、の双方を含有する不溶性担体粒子の含有液を、標的抗体を含有し得る生体から分離されたサンプルと接触させて、当該担体粒子に担持された抗原と、当該サンプル中の標的抗体との抗原抗体反応による当該担体粒子の凝集反応を検出することを特徴とする抗体測定方法、を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物理吸着により所定の抗原が担持された不溶性担体粒子、及び、化学結合により当該抗原が担持された不溶性担体粒子、の双方を含有する不溶性担体粒子の含有液を、標的抗体を含有し得る生体から分離されたサンプルと接触させて、当該担体粒子に担持された抗原と、当該サンプル中の標的抗体との抗原抗体反応による当該担体粒子の凝集反応を検出することを特徴とする、抗体測定方法。
【請求項２】
所定の抗原は、複数物質の混合物であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体測定方法。
【請求項３】
複数物質の混合物は、微生物由来の溶解物であることを特徴とする、請求項２に記載の抗体測定方法。
【請求項４】
所定の抗原は、分子量が５０００以上の物質を少なくとも１種含むことを特徴とする、請求項１−３のいずれか１項に記載の抗体測定方法。
【請求項５】
不溶性担体粒子は、ラテックス粒子であることを特徴とする、請求項１−４のいずれか１項に記載の抗体測定方法。
【請求項６】
生体から分離されたサンプル中の標的抗体との抗原抗体反応による当該担体粒子の反応を検出するための抗体の測定用試薬であって、物理吸着により所定の抗原が担持された不溶性担体粒子、及び、化学結合により当該抗原が担持された不溶性担体粒子、の双方を含有する不溶性担体粒子の含有液であることを特徴とする、抗体の測定用試薬。
【請求項７】
所定の抗原は、複数物質の混合物であることを特徴とする、請求項６に記載の測定用試薬。
【請求項８】
複数物質の混合物は、微生物由来の溶解物であることを特徴とする、請求項７に記載の測定用試薬。
【請求項９】
所定の抗原は、分子量が５０００以上の物質を少なくとも１種含むことを特徴とする、請求項６−８のいずれか１項に記載の測定用試薬。
【請求項１０】
不溶性担体粒子は、ラテックス粒子であることを特徴とする、請求項６−９のいずれか１項に記載の測定用試薬。
【請求項１１】
請求項６−１０のいずれか１項に記載の測定用試薬及び希釈液を含むことを特徴とする、測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質の測定方法に関する発明であり、更に具体的には異なる方式で抗原を固定化した抗原担持不溶性担体粒子、例えば、抗原担持ラテックス粒子、同士を混合して用いる抗体の測定手段に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
現在不溶性担体粒子を用いた診断薬においては、特に免疫学的測定方法の１つとしてラテックス凝集法を用いる試薬が汎用されている。【０００３】
ラテックス凝集法では、液相中において抗原又は抗体を担持させた（coated又はcoupled)ラテックスを用い、抗体又は抗原を検出する測定系を形成する。免疫複合体の形成によりラテックス粒子が凝集する性質に基づき、凝集の程度を目視により確認するか、光学的に濁度の増加を吸光度又は散乱光強度の変化として測定を行うことができる（以下、ラテックス法ともいう：特許文献１）。【０００４】
ＥＬＩＳＡ等のサンドイッチ免疫測定法は、測定自体は正確であり、基準法として用いることが可能であるが、測定の過程において測定サンプルに含まれる被測定物質以外の成分や測定試薬中の成分を除去する洗浄工程を含むため、測定に長時間を要し、測定操作が煩雑であるという欠点を有する。そのため、短時間での多数の測定試料の測定には適していない。【０００５】
これに対してラテックス法は、操作が簡便で、臨床検査で広く用いられている汎用の生化学自動分析装置への適用が容易であり、短時間での測定と多数の被験試料の測定が可能である。【０００６】
従って、多くの臨床検査項目において、ラテックス法が用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭５３−６２８２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明では、抗原が担持されたラテックス等の不溶性担体粒子を用いた抗体測定において測定範囲を拡大すること、及び、感度と特異性の向上、を課題とする。特に、微生物由来の溶解物等の複数物質の混合物を担持させても良好な測定結果を得る手段の提供を行うものである。【０００９】
不溶性担体粒子を用いる診断薬の開発に際しては、不溶性担体粒子に担持させる物質の分子量や、担持方式の選択が、その性能に大きく影響する。【００１０】
例えば、物理吸着法を用いる場合、つまり、不溶性担体粒子と担持蛋白質との静電的相互作用（疎水性相互作用）を利用して、直接的な接触により不溶性担体粒子に蛋白質等を担持させる場合は、比較的高分子量の物質の担持には適している。しかしながら、低分子量の物質やハプテンの担持には、不溶性担体表面における埋没や、非特異的な凝集を抑制するために用いられるブロッキング剤による埋没が起こり得るという難点がある。また、疎水性アミノ酸残基が非常に乏しい蛋白質の担持にも、物理吸着法は難点が認められる。【００１１】
化学結合法を用いる場合、つまり、不溶性担体粒子又は蛋白質表面のカルボキシル基とアミノ基をカルボジイミド等のカップリング試薬により共有結合させる方法、不溶性担体粒子表面のアルデヒド基やトシル基等と蛋白質のアミノ基とを結合させる方法等、により不溶性担体粒子に蛋白質等を担持する場合は、物理的吸着法に対しては難点がある低分子量の蛋白質やハプテンの担持も比較的容易である。さらに化学結合法を用いる場合は、不溶性担体の官能基を適宜選択することにより、共有結合を形成する蛋白質側の結合部位側のコントロール、つまり、蛋白質側の結合部位（共有結合するアミノ酸残基）を選択することが可能である。しかしながら、官能基に乏しい蛋白質（言い換えれば、疎水性の高い蛋白質）の担持が困難であるという問題が認められ、さらに、当該担持粒子の作製工程が煩雑であり、担持蛋白質の変性の問題も認められる。【００１２】
特に、微生物由来の溶解物等の「複数の物質の混合物」を担持させる場合、担持方式が物理吸着法又は化学結合法のいずれか一方のみであると、物質毎に、その大きさや、蛋白質においては親水性アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基の含有量が異なるので、担持される物質に偏りが生じてしまい、その結果、得られた抗原担持不溶性担体粒子では、良好な測定結果を得ることが困難である、という問題、つまり、捕捉される標的抗体の種類が、限られた物質に結合するものに限定されてしまい、当該標的抗体が由来する疾病等の原因となる微生物等についてのデータ取得が、十分に行われない可能性がある、という問題がある。【００１３】
また、生体内における微生物に対する抗体は、単一の抗原に対する抗体ではなく、複数の抗原に対する複数の抗体として存在するため、これらの複数の抗体を一度に捕捉できれば、より確実なデータ取得につながる。抗原として、生物由来の抗原性物質等の不特定多数の物質の混合物を担持した不溶性担体粒子を用いた例は、本願の出願時において、本発明者の知る限り存在しない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記の課題に対して検討を行い、物理吸着法により抗原物質の担持が行なわれた不溶性担体粒子と、化学結合法により当該抗原物質の担持が行われた不溶性担体粒子の双方を含有する、不溶性担体粒子の含有液を抗体測定において用いることにより、広い測定範囲と共に、高い感度と特異性を実現すること、特に抗原が、生物由来の抗原性物質等の複数物質の混合物である場合においても実現することが可能であることを見出し、本発明を完成した。【００１５】
すなわち本発明は、物理吸着により所定の抗原が担持された不溶性担体粒子（以下、物理吸着粒子ともいう）、及び、化学結合により当該抗原が担持された不溶性担体粒子（以下、化学結合粒子ともいう）、の双方を含有する不溶性担体粒子の含有液（以下、本発明の含有液ともいう）を、標的抗体を含有し得る生体から分離されたサンプルと接触させて、当該担体粒子に担持された抗原と、当該サンプル中の標的抗体との抗原抗体反応による当該担体粒子の凝集反応を検出することを特徴とする、抗体測定方法（以下、本発明の測定方法ともいう）を提供する。本発明の抗体測定方法において、好適には、本発明の含有液に加えて、希釈液が用いられる。希釈液を用いる場合、標的抗体を含有し得る生体から分離されたサンプルを希釈液で希釈した後、不溶性担体粒子の含有液と接触させるのが好ましい。【００１６】
また本発明は、物理吸着粒子、及び、化学結合粒子、の双方を含有する不溶性担体粒子の含有液（本発明の含有液）であることを特徴とする、抗体の測定用試薬（以下、本発明の測定用試薬ともいう）を提供する。
さらに本発明は、本発明の測定用試薬（本発明の含有液）及び希釈液を含むことを特徴とする、測定用キット（以下、本発明のキットともいう）を提供する。【００１７】
物理吸着粒子も化学結合粒子も、共にラテックスとして提供されることが好適である。その他、シリカコロイド、磁性粒子、金属コロイド等の不溶性担体粒子を用いることができる。含有液とは、不溶性担体粒子を含有していれば、その含有状態は特に限定されない。すなわち、含有液には、分散液、乳化液、浮遊液、沈殿液、多層分離液等が含まれる。また、含有液中の不溶性担体粒子は、必要に応じた表面処理が施されていてもよい。【００１８】
物理吸着粒子は、上記の規定通りに物理吸着法により所定の抗原が担持された不溶性担体粒子である。物理吸着粒子の平均粒径は、０．０１μｍ−１．０μｍの範囲で用いることが可能であり、好適には０．０５μｍ−０．３５μｍ、さらに好適には０．１０μｍ−０．３５μｍ、最も好適には０．２０μｍ−０．３５μｍである。物理吸着粒子は、物理吸着法を行う対象となる不溶性担体粒子の含有液に、吸着対象抗原を接触させることにより作製することができる。【００１９】
化学結合粒子は、上記の規定通りに化学結合法により所定の抗原が担持された不溶性担体粒子である。化学結合粒子の平均粒径は、０．０１μｍ−１．０μｍの範囲で用いることが可能であり、好適には０．０５μｍ−０．３５μｍ、さらに好適には０．１０μｍ−０．３５μｍ、最も好適には０．２０μｍ−０．３５μｍである。化学結合粒子は、化学結合法を行う対象となる不溶性担体粒子の含有液に、結合対象抗原を共有結合させる操作を行うことにより作製することができる。【００２０】
すなわち、本発明の含有液は、好適には、上記の「物理吸着粒子の含有液」と「化学結合粒子の含有液」を混合することにより調製することができる。【００２１】
物理吸着粒子と化学結合粒子の混合比（質量比）は、好適には１０：１−１：１０（物理吸着粒子：化学結合粒子）、さらに好適には５：１−１：５（物理吸着粒子：化学結合粒子）、極めて好適には３：１−１：３（物理吸着粒子：化学結合粒子）、最も好適には３：１−１：２（物理吸着粒子：化学結合粒子）、である。ただし、サンプル中の標的抗体の測定する際の測定用試薬中又は、希釈液を用いる場合には測定用試薬及び希釈液の混合液中の物理吸着粒子の含有量が０．０４５質量％以上であると、当該粒子の含有量の増加に見合った効果の向上が認められなくなる傾向がある。【００２２】
「所定の抗原」における「所定の」とは、例えば、「選択された」と言い換えることができる。測定の対象として選択された抗体に結合する抗原として「定められた」、又は、「選択された」、という意味であり、一旦定められ、又は、一旦選択されれば、当該抗原は一意的に確定する。【００２３】
「所定の抗原」となり得る抗原は特に限定されず、測定対象の抗体に結合する物質であれば広く選択できるが、好ましくは生体から分離されたサンプル中の抗体に結合する抗原である。すなわち、特定の疾病や体質に伴い生体内に存在する物質に対する抗体を標的抗体として、これに結合する抗原を「所定の抗原」とすることが好適である。「所定の抗原」となり得る物質は、蛋白質が代表的であるが、糖鎖、脂質等の他の物質も含まれる。【００２４】
また、「生体」は広く生物一般の体を指すが、通常は人体である。【００２５】
当該抗原を「複数物質の混合物」とすることにより、本発明の効果が好適に発揮される。当該混合物としては、生物由来の抗原性物質が挙げられ、好適には、細菌、ウイルス等の微生物由来の溶解物が挙げられる。【００２６】
また、当該抗原は、分子量が５０００以上、特に好ましくは１００００以上の物質を少なくとも１種含む場合に、本発明の効果が好適に発揮される。微生物由来の溶解物に対して、物理吸着粒子と化学結合粒子の両者を併せて用いることにより、総体として多様なエピトープ提示が可能となる。当該分子量の上限は不溶性担体粒子に対する担持が可能な限り特に限定されないが、概ね２００００００以下程度であることが好適である。上記の「複数物質の混合物」が、この特定分子量の条件に当て嵌まる場合もある。【００２７】
上記の本発明の含有液を、標的抗体を含有し得る生体から分離されたサンプルと接触させて、当該含有液の不溶性担体粒子に担持された抗原と、当該サンプル中の標的抗体との抗原抗体反応による当該担体粒子の凝集反応の程度を検出することができる。【００２８】
「標的抗体を含有し得る生体から分離されたサンプル」は、被測定抗体を含有する可能性があるものであれば特に限定されず、例えば、血液、血清、血漿、尿、リンパ液、 刺液、髄液、汗、唾液、胃液、肺洗浄液、糞便等が挙げられる。これらのうち、血液、血清、血漿が好適である。【００２９】
「抗原抗体反応による所定の抗原が担持された不溶性担体粒子の反応」として主要なものは、凝集反応であり、スライド凝集法、光学測定法、マイクロタイター法、フィルター分離法等を用いて、不溶性担体粒子の凝集を検出することにより、所望の抗体の測定を行うことができる。【００３０】
本発明の測定方法は、好適には、生化学自動分析装置を用いて行われる。生化学自動分析装置は、光学的測定方法を測定原理とするものであり、通常、用時に、血清等のサンプルを希釈液で希釈して加温した後に、試薬（本発明の場合であれば、本発明の含有液）を加えて測定を行う仕様となっている。現在提供されている生化学自動分析装置としては、例えば、日立７１８０形、ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ ００８、ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ ００６等（株式会社日立ハイテクノロジース製）；ＪＣＡ−ＢＭ６０１０、ＪＣＡ−ＢＭ６０５０、ＪＣＡ−ＢＭ９１３０等（日本電子株式会社製）；ＴＢＡ−ｃ１６０００、ＴＢＡ−２０００ＦＲ、ＴＢＡ−１２０ＦＲ等（東芝メディカルシステムズ株式会社製）；ＡＵ６８０、ＡＵ５８００等（ベックマン・コールター株式会社製）、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【発明の効果】
【００３１】
本発明により、広い測定範囲と共に、高い感度と特異性を伴って抗体を測定する手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】粒径０．１４５μｍの化学結合ラテックスと粒径０．２３５μｍの物理吸着ラテックスの混合の反応性における効果を検討した図面である。
【図２】粒径０．２３５μｍの物理吸着ラテックスに対する、粒径０．３００μｍの化学結合ラテックスの混合量を変化させることによる反応性における効果を検討した図面である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
１．本発明の含有液
上述のように本発明の含有液は、物理吸着粒子、及び、化学結合粒子、の双方を含有する含有液である。
【００３４】
（１）不溶性担体粒子の調達
上述したように、物理吸着粒子も化学結合粒子も、共にラテックスとして提供されることが好適である。ラテックスは、水性溶媒中にポリマーの微粒子（ラテックス粒子）が安定に分散したエマルジョンである。
【００３５】
ラテックスの作製方法は、乳化重合法、ソープフリー乳化重合法、シード重合法、ステージフィード乳化重合法、パワーフィード重合法、懸濁重合法等の常法を用いて行うことが可能である。粒径の調節も、これらのラテックスの調製方法の各々における常法を用いて行うことができる。例えば、乳化重合法であれば、モノマー、乳化剤、開始剤の種類と量、重合温度等を調節することにより、ラテックスの粒径の調節を行うことができる。ラテックスの市販品を用いることも当然に可能である。
【００３６】
ラテックスの種類は、物理吸着粒子の作製に用いられる物理吸着法、又は、化学結合粒子の作製に用いられる化学結合法、を適用することができる限りにおいて特に限定されず、物理吸着法及び化学結合法のそれぞれに適した種類を選択することが好適である。
【００３７】
物理吸着法に適したラテックスとしては、ポリスチレンラテックス、極低カルボン酸ラテックス、親水基局在化ラテックス等が挙げられる。
【００３８】
化学結合法に適したラテックスとしては、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、又は、トシル基等を表面に有するラテックス粒子を含有するラテックスが挙げられる。
【００３９】
物理吸着法に適したラテックスであっても、又は、化学結合法に適したラテックスであっても、着色が施された着色ラテックスや、蛍光物質が施された蛍光ラテックスを用いることも可能である。
【００４０】
前述のように、物理吸着を行うラテックス粒子も化学結合を行うラテックス粒子の粒径も特に限定されず、０．０１μｍ−１．０μｍの範囲で用いることが可能であり、好適には０．０５μｍ−０．３５μｍ、さらに好適には０．１０μｍ−０．３５μｍ、最も好適には０．２０μｍ−０．３５μｍである。
【００４１】
これら双方の担持方式のラテックス粒子のそれぞれにおいて、担持抗原と測定抗体の性質に応じた適切な感度と特異性と測定範囲を得るために、測定において用いるラテックス粒子の粒径を決定することができる。具体的には、免疫反応によるラテックスの凝集性を高めたい場合には、中程度から大きな粒径（０．２０−０．３５μｍ）を選択することが好適であるが、測定対象（抗体）の濃度が非常に高い場合には、小さな粒径（０．１０μｍ以下）を選択することが好ましい場合もある。
【００４２】
上述したように、ラテックス粒子以外の不溶性担体粒子として、シリカコロイド粒子、磁性粒子、金属コロイド粒子等が挙げられる。これらの不溶性担体粒子には、物理吸着又は化学結合に適した官能基を付加する粒子表面の改質を行うことにより、本発明において用いることが可能な不溶性担体粒子とすることが可能である。
【００４３】
（２）不溶性担体粒子への担持工程
（ア）担持抗原
不溶性担体粒子に対して担持させる抗原は、測定の標的とする抗体と結合可能である限り全く限定されないが、前述のように、「複数物質の混合物」や「大きな分子量の物質の含有物」とすることにより、本発明の効果が好適に発揮される。当該混合物としては、生物由来の抗原性物質が挙げられ、好適には、細菌、ウイルス等の微生物由来の溶解物が挙げられる。例えば、後述した実施例において用いたヘリコバクター・ピロリの溶解物には、ウレアーゼＢ（ＵｒｅａｓｅＢ）、ウレアーゼＡ（ＵｒｅａｓｅＡ）、キャグＡ（ＣａｇＡ）、フラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）、ヒートショックプロテイン（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、その他の物質、が含有されている。これらのヘリコバクター・ピロリの溶解物に含まれる物質の分子量は、大部分が１００００−２０００００程度である。
【００４４】
このヘリコバクター・ピロリのような体内における感染微生物の特定のために、当該感染微生物に特有の物質を担持抗原として用いることができる。微生物としては、このヘリコバクター・ピロリの他、Ａ群溶菌レンサ球菌、Ｂ群溶菌レンサ球菌、肺炎球菌Ｕ中抗原、大腸菌Ｏ１５７、クロストリジウムディフィシル、レジオネラ菌、コレラ菌、髄膜炎起因菌等の細菌類；インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルスＡ群、コクサッキーウイルスＢ群、ムンプスウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘・帯状ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ＥＢウイルス、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、手足口病ウイルス、急性出血性結膜炎ウイルス、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、流行性角結膜炎ウイルス、ハンターウイルス、ヒトＴリンパ球好性ウイルス、ＨＩＶ、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、レオウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス等のウイルス類；カンジダ症、アスペルギルス症、クリプトコッカス症、接合菌症、ニューモシスチス肺炎、トリコスポロン症等の深在性真菌症の原因となる真菌；ツツガムシ病、紅斑熱、発疹チフス等の原因となるリケッチア；クラジミア、原虫、寄生虫等が挙げられる。
【００４５】
微生物由来の抗原以外に本発明に用いることができる担持抗原として、抗ＴＳＨ受容体抗体、抗アセチルコリン受容体抗体、抗インスリン受容体抗体等の抗受容体抗体に対する抗原；抗サイログロブリン抗体、抗マイクロゾーム抗体等の抗甲状腺抗体に対する抗原；抗膵島細胞抗体、抗ＧＡＤ抗体、抗インスリン抗体等の抗膵島抗体に対する抗原；抗副腎皮質抗体、抗平滑筋抗体、抗ＬＫＭ抗体、抗胃壁細胞抗体、抗内因子抗体、抗横紋筋抗体、抗心筋抗体、抗皮膚デスモグレイン抗体、抗好中球細胞質抗体、抗リン脂質抗体等の臓器特異的自己抗体に対する抗原等が挙げられる。
【００４６】
さらに、本発明に用いることができる担持抗原として、ＤＮＡ、ヌクレオソーム、ヒストン、ポリＡＤＰリボース、セントロメア、Ｓｃｌ−７０、Ｋｕ等のクロマチンに分布する自己抗原；Ｕ１ＲＮＰ、Ｓｍ、ＳＳ−Ｂ／ＬＡ，ＳＳ−Ａ／Ｒｏ、ＰＣＮＡ、Ｋｉ等の核質に分布する自己抗原；Ｕ３ＲＮＰ、Ｔｈ／Ｔｏ、ＰＭ−Ｓｃｉ、ＲＮＡポリメラーゼ等の核小体に分布する自己抗原；ＡＡ−Ａ／Ｒｏ、Ｊｏ−１、リボソームＰ、ミトコンドリアＭ２、シグナル認識粒子等の細胞質に分布する自己抗原等の臓器非特異的自己抗体に対する抗原が挙げられる。
【００４７】
以上の記載は例示列挙であり、それ以外の現時点で適用可能な抗原を用いることも可能であり、さらに将来提供される抗原を用いることも可能である。
【００４８】
（イ）抗原の担持工程
抗原の不溶性担体粒子への担持は、物理吸着法、化学結合法、それぞれ常法に従って行うことができる。
【００４９】
物理吸着法は、例えば、蒸留水やＰＢＳにおいて０．１−１質量％程度で不溶性担体粒子を含有する含有液を、担持しようとする抗原と混合し、不溶性担体粒子に当該抗原を担持させることができる。さらに遠心分離を用いて未吸着の抗原と、抗原担持担体粒子を分け、水性溶媒（通常、緩衝液）中に再分散させることにより、物理吸着粒子の含有液を作製することができる。緩衝液としては、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッド緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液，グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。
【００５０】
化学結合法は、不溶性担体粒子表面の官能基を利用し、所定の抗原を共有結合で結合する。例えば、不溶性担体粒子表面の官能基が、カルボキシル基、水酸基、アミノ基の場合は、それぞれ、カルボジイミド、ブロムシアン、グルタルアルデヒドを活性剤として利用することで抗原を不溶性担体粒子表面に共有結合させることが可能である。活性化剤で事前に不溶性担体粒子表面の官能基を活性化させてから抗原と接触させることも可能であり、活性化剤と抗原を同時に不溶性担体粒子と接触させてもよい。不溶性担体粒子表面の官能基が、アルデヒド基、トシル基である場合には、活性剤を用いる必要がない。さらに、不溶性担体粒子と抗原の間に、オリゴアミノ酸やアミノカルボン酸等のスペーサー分子を入れて共有結合を行うことも可能である。
【００５１】
上記の化学結合反応は、水性溶媒（通常、緩衝液）中において行われ、得られた化学結合粒子を、水性溶媒（通常、緩衝液）中に再分散させることにより、化学結合粒子の含有液を作製することができる。緩衝液としては、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッド緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液，グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。
【００５２】
このようにして、物理吸着粒子と化学結合粒子を作製することができる。物理吸着粒子と化学結合粒子は、水性溶媒中で不溶性担体粒子の含有液として保存される。
【００５３】
（３）本発明の含有液
本発明の含有液は、物理吸着粒子、及び、化学結合粒子、の双方を含有する含有液であり、その溶媒は、通常、緩衝液である。緩衝液としては、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッド緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液，グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。例えば、本発明の含有液は、上記の物理吸着粒子の含有液として作製された物理吸着粒子と、化学結合粒子の含有液として作製された化学結合粒子とを、水性溶媒（通常、緩衝液）中で混合することにより作製することができる。物理吸着粒子、及び、化学結合粒子、の双方を含有する含有液が得られるのであれば、本発明の含有液の作製方法は、これに限定されない。
【００５４】
本発明の含有液には、必要に応じて、例えば、各種電解質、安定化剤、界面活性剤、増感剤等が含有されていてもよい。
【００５５】
本発明の含有液中における、それぞれの抗原担持担体粒子の含有比は、所望する測定範囲と感度によっても異なるが、好適には質量比で１０：１−１：１０（物理吸着粒子：化学結合粒子）、さらに好適には５：１−１：５（物理吸着粒子：化学結合粒子）、極めて好適には３：１−１：３（物理吸着粒子：化学結合粒子）、最も好適には３：１−１：２（物理吸着粒子：化学結合粒子）、である。ただし、サンプル中の標的抗体を測定する際の含有液中又は、希釈液を用いる場合には含有液及び希釈液の混合液中の物理吸着粒子の含有量が０．０４５質量％以上であると、当該粒子の含有量の増加に見合った効果の向上が認められなくなる傾向がある。
【００５６】
２．抗体の測定
本発明の測定方法では、上述した本発明の含有液を用いて抗体の測定を行う。すなわち、本発明の含有液を、標的抗体を含有し得る生体から分離されたサンプルと接触させて、当該含有液の不溶性担体粒子に担持された抗原と、当該サンプル中の標的抗体との抗原抗体反応による当該微粒子の反応を検出することができる。希釈液を用いないで本発明の測定方法を行うことも可能であるが、好適には希釈液を用いて行われる。
【００５７】
希釈液を用いて測定を行う場合、希釈液を混合して希釈した本発明の含有液を当該サンプルと接触させることもできるが、好適には、当該サンプルに希釈液を加えて希釈した当該サンプルと、本発明の含有液を接触させる。本発明の含有液に対して、容積比で９倍以下の希釈液を用いるのが好ましく、１−５倍の希釈液を用いるのが特に好ましい。
【００５８】
「標的抗体を含有し得る生体から分離されたサンプル」は、被測定抗体を含有する可能性があるものであれば特に限定されないことは、上記の通りであり、例えば、血液、血清、血漿、尿、リンパ液、刺液、髄液、汗、唾液、胃液、肺洗浄液、糞便等が挙げられ、これらのうち、血液、血清、血漿が好適である。血清等のサンプルは、必要に応じて、生理食塩水等で希釈され得る。生理食塩水等で希釈されたサンプルも、「標的抗体を含有し得る生体から分離されたサンプル」に含まれる。なお、ここでの希釈は、希釈液による希釈とは別個である。
【００５９】
３．本発明のキット
本発明のキットは、本発明の測定方法を行うための測定用キットであり、本発明の含有液及び下記の希釈液を構成要素として含むものである。
【００６０】
本発明の含有液以外の本発明のキットにおける構成要素としては、例えば、測定対象となる標的抗体の標準品、精度管理用試料、希釈液等が挙げられる。
【００６１】
希釈液は、好適には、「標的抗体を含有し得る生体から分離されたサンプル」を、本発明の含有液と接触させる前に、希釈するための液体であり、標的抗体の測定を実質的に阻害しない限り、特に限定されない。希釈液は、本発明の含有液と同様、緩衝液が典型的である。緩衝液としては、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッド緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液，グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。当該希釈液には、必要に応じて、例えば、各種電解質、安定化剤、界面活性剤、増感剤等が含有されていてもよい。当該希釈液は、本発明の含有液の溶媒と同一または類似であることが好ましい。
【００６２】
また、本発明のキットを用いて本発明の測定方法を行う場合、希釈液を用いないで測定を行うこともあり得るが、希釈液を用いる場合には、本発明の含有液に対して、容積比で好ましくは９倍以下、特に好ましくは１−５倍の希釈液を用いる。
【００６３】
後述する実施例においては、用時希釈液である第１試薬が上記の希釈液であり、ラテックス分散液である第２試薬が本発明の含有液である。これらの第１試薬と第２試薬を構成要素として含むものが、本発明のキットの具体例の一つである。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明の実施例を記載する。％は、特に断らない限り質量％である。【００６５】
［製造例］
１．ラテックス
本実施例において用いたラテックスは下記の通りである。
（１）物理吸着法を行うラテックス
・０．２３５μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス１という）
・０．２２３μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス２という）
・０．３１０μｍポリスチレンラテックス（以下、物理ラテックス３という）【００６６】
（２）化学結合法を行うラテックス
・０．１４５μｍカルボキシラテックス（以下、化学ラテックス１という）
・０．２４５μｍカルボキシラテックス（以下、化学ラテックス２という）
・０．３００μｍカルボキシラテックス（以下、化学ラテックス３という）【００６７】
２．担持抗原の調製
本実施例の細菌由来の担持抗原としては、ピロリ菌（ヘリコバクター・ピロリ）の調製抗原を用いた。当該細菌由来抗原の調製は、下記の手順で行った。【００６８】
（１）予備培養
元菌株を、ヘリコバクター・ピロリ選択分離用ポアメディア（登録商標）ＨＰ分離培地(栄研化学株式会社)を用いて、アネロパック(三菱ガス化学株式会社)により微好気環境にし、３７℃で培養した。【００６９】
（２）本培養
本培養の培養液は、パールコア（登録商標）ブレインハートインフュジョンブイヨン培地‘栄研’（栄研化学株式会社）に５％馬血清を加えた培養液２００ｍＬを用いた。この本培養液に、上記予備培地の単コロニーを釣菌した後、ＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｎｏ．１．０に調整した接種菌液を接種し、微好気ガス下で、３７℃で振盪培養を行った。【００７０】
（３）溶菌
上記本培養完了後、遠心にて集菌を行い、さらに生理食塩水にて遠心洗浄し、沈殿に溶菌液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＮａＮ3を含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４）を添加して、これを凍結融解にて溶菌を行った。【００７１】
（４）抗原調製
上記のヘリコバクター・ピロリの溶解物を、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  ＮａＮ3を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析後、遠心上清を得て、これに孔径０．４５μｍのメンブレンフィルター濾過を施した。当該濾過物を抗原として、抗原調製を完了し、これを「ヘリコバクター・ピロリ溶解物」として、以下の工程に供した。ヘリコバクター・ピロリ溶解物の抗原蛋白濃度はＢＣＡ法により測定した。【００７２】
３．ラテックスの担持工程
（１）物理吸着法による担持
０．０９％ポリスチレンラテックス含有液２１．１ｍＬに０．５Ｍ  ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ８．８）０．４８ｍＬを添加した後、８ｍｇ／ｍＬのヘリコバクター・ピロリ溶解物０．２５ｍＬを混合した。混合液を室温で３０分攪拌した後、１０％ＢＳＡ溶液１．０４ｍＬを添加し、精製水で全量を２４．０ｍＬとした。さらに、５６℃で４時間加熱処理した後、遠心分離にて未吸着抗原を除去した。遠心分離にて未吸着抗原を除去したラテックスを０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）４．０ｍＬに再分散させ、１０％ＢＳＡ溶液０．０４ｍＬを添加した後、これを５６℃で２時間加熱処理した。加熱後の抗原吸着ラテックス含有液を濾過し、ラテックス濃度０．４８％の物理吸着ラテックスを作製した。【００７３】
遠心分離による未吸着抗原除去後にラテックスの再分散に用いる０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）の容量を適宜変更することにより、作製する物理吸着ラテックスの濃度を適宜調整することができる（化学結合についても同様）。【００７４】
（２）化学結合法による担持
０．３％カルボキシラテックス含有液６．４ｍＬに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩をカルボキシル基の２モル等量添加し、１５分攪拌反応させカルボキシル基を活性化した。カルボキシル基を活性化させたラテックス含有液に、精製水６３．２ｍＬ及び０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１．２８ｍＬを添加後、８ｍｇ／ｍＬのヘリコバクター・ピロリ溶解物０．３４０ｍＬを混合し、３時間反応させた。反応混合液に１０％ＢＳＡ溶液０．７７６ｍＬを添加し、４時間反応させた後、遠心分離にて未吸着抗原を除去した。遠心分離にて未結合抗原を除去したラテックスを０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）４．０ｍＬに再分散させ、１０％ＢＳＡ溶液０．０４ｍＬを添加し、５６℃で４時間加熱処理した。加熱後の抗原結合ラテックス含有液を濾過し、ラテックス濃度０．４８％の化学結合ラテックスを作製した。【００７５】
（３）ラテックス分散液の調製
０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．８Ｍ  Ｌ−アルギニン塩酸塩及び０．２％ＮａＮ3を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）２．５ｍＬに、前記（１）で調製した物理吸着ラテックス１．５６３ｍＬ及び前記（２）で調製した化学結合ラテックス０．５２１ｍＬを添加し、精製水にて全量５．０ｍＬとして、０．１５％の物理吸着ラテックスと０．０５％の化学結合ラテックスを含むラテックス分散液を調製した。【００７６】
物理吸着ラテックスと化学結合ラテックスの添加量を適宜選択することで、種々の混合比率とすることができる。【００７７】
４．測定系
本実施例における測定は、濁度法を用いて行った。【００７８】
第１試薬は、希釈液（用時希釈液）であって、０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  Ｎａ、０．１％  ＢＳＡ、０．１％  ＰＢＣ−３４、０．１％  ＮａＮ3  ｐＨ７．４、残量は精製水である。【００７９】
第２試薬は、ラテックス分散液（本発明の含有液）であって、０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．４Ｍ  Ｌ−Ａｒｇ・ＨＣｌ、０．１％  ＮａＮ3、Ｌａｔｅｘ  ｐＨ７．４、残量は精製水である。【００８０】
測定は、生化学自動分析装置ＪＣＡ−ＢＭ２２５０（日本電子株式会社）を用いて行った。【００８１】
具体的には、当該装置にて、生理食塩水で５倍に希釈したサンプル（血清サンプル）６．０μＬに第１試薬６０μＬを混合し３７℃で５分間インキュベーションした後、この混合液に第２試薬を２０μＬ混合し３７℃で反応させ、第２試薬混合後約３分間の主波長６５８ｎｍ及び副波長８０５ｎｍの二波長での吸光度変化を測定した。すなわち、本実施例では、第２試薬に対して、容積比で３倍の第１試薬を用いた（希釈倍率：４倍）。【００８２】
基準法として、ＥＬＩＳＡ法（Ｅプレート‘栄研’Ｈ．ピロリＩＩ：栄研化学株式会社）による測定を行った。【００８３】
［実施例１］  ２種のラテックスの混合効果の検討
上記のように、異なる方式でヘリコバクター・ピロリ溶解物を担持させた、粒径０．２３５μｍの物理吸着ラテックス（物理ラテックス２）と、粒径０．１４５μｍの化学結合ラテックス（化学ラテックス１）を用いて、物理吸着ラテックスのみを使用した場合、化学結合ラテックスのみを使用した場合、及びこれらの混合物を使用した場合の反応性を、プール血清の希釈系列を用い、確認した（表１・図１）。検討に用いた第２試薬のラテックス濃度は、物理吸着ラテックスのみを使用した場合は０．１５％、化学結合ラテックスのみを使用した場合は０．３０％、混合物を使用した場合は物理吸着ラテックス、化学結合ラテックス、それぞれ０．１５％、０．３０％とした。次いで血清サンプルを測定して、それぞれの場合の特異性を検討した（表２）。なお、「表１の反応性の単位」と「図１の縦軸の単位」は、吸光度変化量（ΔＯＤ／min）を１００００倍したものである。【００８４】
また、表１に示された物理吸着ラテックス及び化学結合ラテックスの濃度は、上記の通り第２試薬における濃度であり、測定時における当該ラテックス濃度は、第１試薬による希釈により、それぞれ当該表示の１／４である。例えば、「物理ラテックス１  ０．１５％」の表示であれば、測定時における物理ラテックス１の濃度は、「０．１５×１/４＝０．０３７５％」である。【００８５】
【表１】
2018043584.tif 000002
【００８６】
【表２】
2018043584.tif 000003
【００８７】
物理吸着ラテックスに化学結合ラテックスを混合することで、高い陰性一致率を維持したまま陽性一致率が向上し特異性が向上し、物理吸着ラテックス、化学結合ラテックスの第２試薬における濃度を、それぞれ０．１５％、０．３０％（１：２）とした場合に、全体の一致率において好ましい結果が認められた（表２）。【００８８】
［実施例２］  ２種のラテックスの混合比率の検討
上記のように、異なる方式でヘリコバクター・ピロリ溶解物を担持させた、粒径０．２２３μｍの物理吸着ラテックス（物理ラテックス２）の第２試薬中の濃度を０．２０％とし、これに粒径０．１４５μｍの化学結合ラテックス粒子（化学ラテックス１）を０−０．２０％となるように添加して、血清サンプルを測定し特異性を検討した（表３）。【００８９】
また、表３における物理吸着ラテックスと化学結合ラテックスの濃度の表示と、第１試薬による４倍希釈による測定時のそれらの濃度の関係は、実施例１に記載した通りである。【００９０】
【表３】
2018043584.tif 000004
【００９１】
化学結合ラテックスを混合した場合は、化学結合ラテックスの混合量が増加することで一致率が向上した。特に、化学結合ラテックスの第２試薬中の濃度が０％、０．０５％、０．１０％、０．２０％と増加するのに伴い陽性一致率が５３％、６７％、７３％、８０％と顕著に向上し、偽陰性（見逃し）を回避することが可能であることが分かった。ただし、物理吸着ラテックスの混合量が０．２０％であり、後述する０．１８％（測定時：０．０４５％）を超えているので、一致率の伸びは抑制的であった（表３）。【００９２】
［実施例３］  ２種のラテックスの混合比率の検討（１）
上記のように、異なる方式でヘリコバクター・ピロリ溶解物を担持させた、粒径０．２３５μｍの物理吸着ラテックス粒子（物理ラテックス１）の第２試薬中の濃度を０．１２％として、これに粒径０．３００μｍの化学結合ラテックス粒子（化学ラテックス３）を０−０．１０％となるように添加した場合の、反応性をＬＺ−Ｈ．ピロリ抗体キャリブレータ‘栄研’（栄研化学株式会社）を用いて検討し（表４・図２）、次いで、血清サンプルを測定して特異性を検討した（表５）。なお、「表４の反応性の単位」と「図２の縦軸の単位」は、吸光度変化量（ΔＯＤ／min）を１００００倍したものである。【００９３】
また、表４及び表５における物理吸着ラテックスと化学結合ラテックスの濃度の表示と、第１試薬による４倍希釈による測定時のそれらの濃度の関係は、実施例１に記載した通りである。【００９４】
【表４】
2018043584.tif 000005
【００９５】
【表５】
2018043584.tif 000006
【００９６】
この結果より、物理吸着ラテックスに対する化学結合ラテックスの混合量が増加する従い、陽性一致率が向上し、偽陰性（見逃し）を回避することができた。さらに、化学結合ラテックスの混合量が増加する従い、反応性が向上し、物理吸着ラテックスと化学結合ラテックスの第２試薬中の濃度比が、１２：５−１２：１０（３：１−１：３以内）において、全体の一致率は好適であった（表５）。【００９７】
［実施例４］２種のラテックスの混合比率の検討（２）
実施例３と同趣旨の検討を、さらに測定範囲を拡大して行った。用いたラテックスは、実施例３と同様に物理ラテックス１と化学ラテックス３である。【００９８】
（１）物理ラテックス１の第２試薬中の濃度を０．１２％に固定して、化学ラテックス３の濃度を０％（物理吸着：化学結合＝７．５：０）、０．０１６％（７．５：１）、０．０４８％（７．５：３）、０．０８％（７．５：５）、０．１２％（７．５：７．５）、０．１６％（７．５：１０）とした場合の特異性を、血清サンプルを測定して検討した（表６）。Ｈ.ピロリ抗体値は、ＬＺ−Ｈ．ピロリ抗体キャリブレータ‘栄研’（栄研化学株式会社）を用いて作成した検量線から求めた。【００９９】
また、表６における物理吸着ラテックスと化学結合ラテックスの濃度の表示と、第１試薬による４倍希釈による測定時のそれらの濃度の関係は、実施例１に記載した通りである。【０１００】
【表６】
2018043584.tif 000007
【０１０１】
（２）化学ラテックス３の第２試薬中の濃度を０．０８％に固定して、物理ラテックス１の濃度を０％（物理吸着：化学結合＝０：５）、０．０２４％（１．５：５）、０．０７２％（４．５：５）、０．１２％（７．５：５）、０．１８％（１１．３：５）、０．２４％（１５：５）とした場合の特異性を、血清サンプルを測定して検討した（表７）。Ｈ.ピロリ抗体値は、ＬＺ−Ｈ．ピロリ抗体キャリブレータ‘栄研’（栄研化学株式会社）を用いて作成した検量線から求めた。【０１０２】
また、表７における物理吸着ラテックスと化学結合ラテックスの濃度の表示と、第１試薬による４倍希釈による測定時のそれらの濃度の関係は、実施例１に記載した通りである。【０１０３】
【表７】
2018043584.tif 000008
【０１０４】
上記（１）（２）において、上記実施例４よりも広い範囲における、物理吸着ラテックスと化学結合ラテックスの混合の効果が確認された。【０１０５】
すなわち、物理吸着ラテックスと化学結合ラテックスの第２試薬中の濃度比が、７．５：１−７．５：１０の範囲において検討を行った結果、７．５：１の例においては、これら２種のラテックスの混合効果が認められ、他の７．５：３−７．５：１０（３：１−１：３以内）において、全体の一致率は好適であった（表６）。【０１０６】
また、上記濃度比が、１．５：５−１５：５の範囲において検討を行った結果、１．５：５（５：１−１：５以内）、及び、４．５：５と７．５：５（３：１−１：３以内）において、全体の一致率は好適であったが、物理吸着ラテックスの第２試薬における濃度が０．１８％（測定時：０．０４５％）以上の２例（１１．３：５と１５：５の例）は、配合比自体は３：１−１：３の範囲であるものの、混合による特異性の向上効果が妨げられた（表７）。【０１０７】
なお、物理吸着ラテックスと化学結合ラテックスのいずれか一方の使用の場合は、陽性一致率と陰性一致率の差が一層極端であったが、これはサンプル数が少ないことが要因となっていると考えられる。【０１０８】
［実施例５］  ラテックス粒子の粒径についての検討
上記のように、異なる方式でヘリコバクター・ピロリ溶解物を担持した、粒径を０．２３５μｍの物理吸着ラテックス粒子（物理ラテックス１）の第２試薬中の濃度を０．１５％とし、これに粒径０．２４５μｍ又は０．３００μｍの化学結合ラテックス粒子（それぞれ化学ラテックス２（中粒径）、化学ラテックス３（大粒径））を０．０５％混合して、それぞれの特異性を、血清サンプルを測定して検討した。Ｈ.ピロリ抗体値は、ＬＺ−Ｈ．ピロリ抗体キャリブレータ‘栄研’（栄研化学株式会社）を用いて作成した検量線から求めた。その結果、全体の一致率（陽性一致率と陰性一致率を併せたもの）が、それぞれ９２％と８８％で、双方実質的な差異は認められなかった。【０１０９】
さらに物理吸着ラテックス間の粒径の測定値に与える影響を確認するため、物理ラテックス２（粒径：０．２２３μｍ（中粒径））と物理ラテックス３（粒径：０．３１０μｍ（大粒径））を、それぞれ第２試薬中０．１０％の濃度として、それぞれの特異性を、上記と同様の方法で測定したが、陽性一致率、陰性一致率、及び、全体の一致率において実質的な差異は認められなかった。
なお、本実施例５においても、物理吸着ラテックスと化学結合ラテックスの濃度の表示と、第１試薬による４倍希釈による測定時のそれらの濃度の関係は、実施例１に記載した通りである。【０１１０】
この結果より、化学結合ラテックスの粒径と物理吸着ラテックスの粒径は、少なくとも中ないし大粒径においては、共に生体から分離されたサンプルの測定の特異性には実質的に影響を及ぼさないことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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