(57)【要約】本発明は癌特異的で副作用の少ない新たな医薬組成物の提供を目的とする。  本発明は、ネイティブなＭＣＴ５の細胞外領域のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を含む医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＣＴ５又はその断片に対するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ＭＣＴ５の断片が、ＭＣＴ５の細胞外領域の断片である請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＭＣＴ５の細胞外領域の断片が、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるものである請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体が結合する抗原決定基に結合する抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体の断片。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又は請求項６に記載の断片を含む、癌治療用医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又は請求項６に記載の断片と、化学療法剤、トキシン又はラジオアイソトープとの組み合わせを含む、癌治療用医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又は請求項６に記載の断片に化学療法剤、トキシン又はラジオアイソトープが結合した複合体を含む、癌治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌、大腸癌をはじめとする癌に対し、ＭＣＴ５の細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体を、癌などの過剰増殖性疾患に対して活性を有する化合物とコンジュゲートさせた抗体コンジュゲートからなる治療用医薬組成物に関する。また、本発明は、抗体と該化合物の併用、又は抗体コンジュゲートと該化合物の併用による治療のための使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界の死因の上位は、癌である。特に乳癌は、英国、米国及び日本において、最も一般的にみられる女性の癌である。現在国内の乳癌罹患者数は４万人を超えており、その数は未だに増加傾向にある。近年、マンモグラフィー又は他の画像診断法を用いた医療機器の進歩により、乳癌の早期診断が可能になり、乳癌の治癒率は徐々に上昇していくことが見込まれている。【０００３】
早期診断により、乳癌の初期ステージで外科的摘出や放射線治療を受けたにもかかわらず、再発又は転移に至る患者は少なくない。実際、初発乳癌の切除手術後の５年生存率が９０％以上であるにも関わらず、乳癌罹患者の約４０％は死に至ることが報告されている（非特許文献１：Ｗｅｉｇｅｌｔ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００５，５，５９１−６０２）。また、生存が２０年を越え寛解したと判断される患者は、全体で２〜３％に過ぎないことも報告されている。すなわち、乳癌の治療には、再発又は転移を抑制できる新しい医薬品の開発が望まれている。【０００４】
乳癌の中には、再発又は転移しないケースも存在するが、あらかじめ予測することが難しいため、再発又は転移のリスクを抑える目的で、多くの患者に治療薬の投与が行われている。このことは、再発又は転移をしない患者にとっては副作用のある不要な治療を受けていることになる。
この一方で、乳癌手術においては、術後の生活の質（クオリティ・オブ・ライフ、ＱＯＬ）を高めることを目的として、温存治療が行われている。２００１年の時点でも、全体の４０％以上の患者で実施されているが、温存療法を実施した患者の中には再発又は転移のリスクが高い患者も含まれている。【０００５】
癌の「再発」とは、原発巣を手術で摘出した後に、取りきれなかった目に見えない小さな癌が残されて再び腫瘍を形成する場合や、薬物療法（抗癌剤治療）や放射線治療でいったん縮小した癌が再び大きくなる場合を言い、最初に発生した癌の近傍で起きる。一方、「転移」は、癌細胞が原発巣とは異なる臓器に達し、同一種類の癌を二次的に生じさせることを言う。例えば、乳癌が乳房で再び腫瘍を形成した場合は「再発」であり、肺に転移した二次癌は悪性の乳癌細胞によって形成された乳癌肺「転移」である。
「再発」又は「転移」が起きるメカニズムとしては、浸潤能の高い癌細胞が原発巣と同じ組織内の別の部位又は癌周辺組織に局所的に浸潤し、手術等を行っても取り残されることが大きな原因と考えられる。【０００６】
癌部を外科的に除去した後でも、癌細胞が再発又は転移する場合には、癌細胞が有する性質が重要である。癌細胞の性質の悪さや進行の程度を表す指標としては、異型度と深達度が用いられている。異型度は癌細胞が正常な細胞と形態的にどの程度異なっているかを表したものである。一方、深達度は、癌の深さを示しており、癌細胞の浸潤能が高い場合は深達度が深まり、より悪性度の高い癌細胞として分類され、悪性腫瘍の病期分類に用いられている。よって、浸潤能の高い癌細胞は悪性度が高く、再発又は転移リスクの高い癌と考えられている。すなわち、高い浸潤能を有する癌細胞は、再発や転移のリスクが上昇する。よって、浸潤能の高い癌細胞を標的とした治療を行えば、再発や転移の症例を減少させることが可能になり、死亡率を低下させることが期待できる。【０００７】
乳癌や大腸癌等の様々な癌に関しては、外科治療と化学療法が一般的であるが、近年の分子標的薬の出現によって、癌特異的な新たな治療法が模索されるようになった。
乳癌に対する分子標的薬として日本で承認された抗体医薬品としてはハーセプチンが知られている。ハーセプチンは、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２，Ｈｅｒ２／ｎｅｕとも呼ばれる）という受容体をターゲットとした抗体医薬品であり、ＨＥＲ２過剰発現が確認された転移性乳癌に対する治療薬での使用が承認されており、細胞膜上のＨＥＲ２に結合し、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどによる抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）により癌細胞を死滅させる作用機序で細胞を死滅させていると考えられている。
大腸癌に対する抗体医薬品としては、アバスチンやアービタックスが知られている。これらは、ＶＥＧＦやＥＧＦという増殖因子をターゲットとした抗体医薬品である。アバスチンは治癒切除が不可能な進行・再発の大腸癌での使用が承認されており、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ受容体との結合を抑制することで血管新生を抑制して、腫瘍組織への栄養を絶つという作用機序で抗癌作用を発揮する。アービタックスは、ＥＧＦ受容体に結合し、ＥＧＦによる細胞増殖シグナルが働かないようにすることで癌細胞の増殖を停止させるのが狙いである。【０００８】
このように、抗体に代表される分子標的薬は、癌を特異的に認識すれば癌細胞を殺傷する点で優れた物質である。しかし、抗体が正常細胞にも結合した場合、重篤な副作用を示す場合がある。例えば、乳癌治療薬であるハーセプチンは頭痛や無力症、吐き気・嘔吐だけでなく、間質性肺炎や骨髄抑制、肝障害、腎障害、脳血管障害を引き起こす場合がある。また、組織染色では、正常な心筋細胞とも強く反応し重篤な心障害を引き起こすことが知られている（非特許文献２：Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，９４，１０１６−１０２０，２００６）。さらに、ハーセプチンはＨＥＲ２を標的とした抗体医薬品であるため、ＨＥＲ２を発現している患者にしか奏効性を示さないという課題が残されている。【０００９】
大腸癌治療薬であるアバスチンでは、副作用として出血、血栓症、消化管穿孔、創傷治療の遅延、血圧上昇などが挙げられ、このうち血栓症と消化管穿孔は生命にかかわる副作用である（非特許文献３：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７，４５９３−４５９９，１９９７）。アービタックスでは、副作用としては皮膚障害等が知られており、生命を脅かすものではないが痒みや白色の膿泡等が起き、患者への精神的、肉体的な負担が存在する（非特許文献４：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２２，１２０１−１２０８，２００４）。また、ＥＧＦ受容体下流のシグナル変化（例えばＫ−ｒａｓ変異）による癌化には作用を示さないという問題も存在している。【００１０】
したがって、癌に対する抗体医薬品は、重篤な副作用が発生することや、奏効性を示す患者が限定されるなどの課題が残されており、癌特異的な分子標的及び副作用が少ない医薬品の新たな開発が求められている。【００１１】
癌細胞は、正常細胞に比べ、高い増殖力を有するとともに細胞分裂の回数に制限がなく、周辺組織への浸潤や転移を起こすという特徴を持っている。近年、癌組織の中の癌細胞全てがこのような性質を持つのではなく、一部の限られた細胞がこのような性質を持つと考えられるようになった。すなわち、これらの一部の癌細胞は、自らと全く同じ細胞を作り出す自己複製能と、多種類の細胞に分化しうる多分化能という、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞に共通して見られる特徴を有し、これらの特徴によって癌組織中で自己複製により自分と同じ細胞を維持しながら、分化によって周辺の大多数の癌細胞を生み出すもとになっていると考えられている。このような一部の癌細胞は、癌幹細胞と呼ばれており、癌はこの幹細胞様の細胞から発生・進行するという仮説（癌幹細胞仮説）が提唱されている。【００１２】
現在、癌幹細胞マーカーとしては、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４４などの分子マーカーが知られている（非特許文献５：ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ，１３８，２１５１−２１６２，２０１０）が、これらに対する抗体は、一部の癌幹細胞に結合するに過ぎず、治療薬として有効性がないといわれている。また、ＬＧＲ５と呼ばれるマーカーが知られている。このマーカーはＲ−スポンジンと相互作用し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナルを活性化する機構を持っており、癌幹細胞マーカーとして利用できる可能性が示唆されている（特許文献１：特表２０１０−５３２１６９公報）。【００１３】
癌幹細胞は、癌の再発や転移の主要な原因と考えられており、癌治療において癌幹細胞を標的にすることの重要性が指摘されている。しかし、腫瘍組織内における癌幹細胞の比率はわずかしかなく、癌幹細胞のみをターゲットとした治療薬では、癌細胞全体を殺傷することが出来ないとも考えられている。すなわち、正常組織に比べ、癌幹細胞で極めて高く発現しており、かつ、一般的な癌細胞でも発現しているようなマーカーを標的とする新たな治療法の開発が、癌医療にとって重要な課題である。【００１４】
特定の癌細胞に特異的に発現する分子に対するモノクローナル抗体が、抗体細胞表面上の抗原である膜タンパク質に結合した後、細胞内に取り込まれる機構が存在する。この現象はインターナリゼーション（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）と呼ばれる。インターナリゼーションは本来、リガンドが受容体に結合した際に生じる細胞シグナル伝達機構の一種であり、ホルモンやサイトカイン受容体の他、トランスポーターでも報告されている。抗体が結合することによってインターナリゼーションが起きる事を利用し、抗体に薬物を結合させることで、標的分子を特異的に発現する細胞を標的とした、新たな分子標的薬−薬剤混合医薬の開発が進められ、これらはＡｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＡＤＣ）と呼ばれる。【００１５】
ＡＤＣの中では、ハーセプチン（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とＤＭ１（ｆａｘａｎｅ系薬剤）を結合させたｋａｄｃｙｌａ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ又はＴ−ＤＭ１）がＨＥＲ２陽性進行乳癌に対する治療薬として承認されている。この治療メカニズムとして、抗癌剤であるＤＭ１が細胞内に取り込まれることにより、ＨＥＲ２陽性細胞を効果的に殺傷することが出来ると報告されている（非特許文献６：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；６８：（２２）．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １５，２００８）。【００１６】
膜タンパク質には、リガンドと結合する受容体だけでなく、アミノ酸や糖等の低分子化合物を能動的あるいは受動的に輸送する輸送タンパク質（以下、トランスポーターと記載する）も存在する。これらの分子は、細胞の内外の分子を透過させる役割を持つため、Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを起こさないと考えられてきた。しかし、非特許文献７（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８５，２７２８９−２７３０１，２０１０）に示されるように、ＳＬＣ６Ａ３（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｐｅｎｄｅｄ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）は恒常的にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを引き起こしていることが報告されており、受容体だけでなくトランスポーターも抗体に結合させた薬剤を効率良く細胞内へ輸送できる可能性がある。【００１７】
ＭＣＴ５（Ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ５）は、４８７アミノ酸からなる膜タンパク質であり、ＮＣＢＩ（米国生物工学情報センター）Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［ＲｅｆＳｅｑ］ＩＤ：ＮＭ＿００４６９６．２、ＮＰ＿００４６８７．１として登録されている（配列番号１：塩基配列、配列番号２：アミノ酸配列）。ＭＣＴ５は輸送する物質が同定されていないオーファントランスポーターであり、アミノ酸配列の相同性からＭＣＴグループに分類されている。【００１８】
［特許文献］
特許文献１：特表２０１０−５３２１６９公報【００１９】
［非特許文献］
非特許文献１：Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５，５９１−６０２，２００５
非特許文献２：Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，９４，１０１６−１０２０，２００６
非特許文献３：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７，４５９３−４５９９，１９９７
非特許文献４：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２２，１２０１−１２０８，２００４
非特許文献５：ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ，１３８，２１５１−２１６２，２０１０
非特許文献６：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６８，９２８０−９０，２００８
非特許文献７：Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８５，２７２８９−２７３０１，２０１０
【発明の開示】
【００２０】
一般的に癌の手術による治療は、転移巣の治療が困難であるばかりでなく、侵襲と合併症の併発を伴うことが問題である。また、化学療法や放射線治療は副作用が問題となっている。さらに、既存の抗体医薬品は副作用の発生に加えて、奏効性を全く示さない癌が存在する。そこで、癌特異的な分子標的及び副作用の少ない新たな医薬品の開発が求められていた。
【００２１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、通常の癌細胞よりも浸潤能の高い癌に高く発現しているＭＣＴ５の細胞外ドメインを認識する抗ＭＣＴ５モノクローナル抗体を細胞と反応させた場合に、少なくともクラスリン経路を通して細胞内にインターナリゼーションすることを見出した。すなわち、抗ＭＣＴ５モノクローナル抗体と抗癌剤とをコンジュゲートすることで効果的に癌細胞を殺傷することができることを見出し、本発明を完成させた。
【００２２】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）  ＭＣＴ５又はその断片に対するモノクローナル抗体。
（２）  ＭＣＴ５の断片が、ＭＣＴ５の細胞外領域の断片である（１）に記載の抗体。
（３）  ＭＣＴ５の細胞外領域の断片が、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるものである（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）  抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の抗体。
（５）  （１）〜（４）のいずれか１項に記載の抗体が結合する抗原決定基に結合する抗体。
（６）  （１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体の断片。
（７）  （１）〜（４）のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
（８）  （１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体又は（６）に記載の断片を含む、癌治療用医薬組成物。
（９）  （１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体又は（６）に記載の断片と、化学療法剤、トキシン又はラジオアイソトープとの組み合わせを含む、癌治療用医薬組成物。
（１０）  （１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体又は（６）に記載の断片に化学療法剤、トキシン又はラジオアイソトープが結合した複合体を含む、癌治療用医薬組成物。
【００２３】
本発明により、ＭＣＴ５モノクローナル抗体又は抗原結合断片、当該抗体又は抗原結合断片と抗癌剤をコンジュゲートさせた物質を含む医薬組成物が提供される。当該医薬組成物は、特に乳癌、大腸癌治療用医薬組成物として有用である。
【００２４】
また、ＭＣＴ５は、正常組織に比べ、浸潤能の高い癌細胞で高く発現しているため、本発明によって、悪性度の高いがん細胞を標的とすることができ、癌の進行、転移、再発を抑制する新たな癌の治療薬又は治療法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ハイブリドーマ細胞が生産するモノクローナル抗体が、マウスを免疫した抗原であるＩＣＤ４に反応するか解析した結果を示す図である。
【図２】ヒト乳癌細胞であるＭＣＦ７細胞にＭＣＴ５を過剰発現させた細胞（ＭＣＦ７−ＭＣＴ５細胞）、高転移性のヒト乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞及びヒト大腸癌細胞であるＨＣＴ１１６細胞と、抗ＭＣＴ５抗体との反応を細胞免疫染色で解析した結果を示す図である。ＭＣＦ７−ＭＣＴ５細胞の場合は、二次抗体としてＡｌｅｘａ５５５標識された二次抗体を、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞及びＨＣＴ１１６細胞では、Ａｌｅｘａ４８８標識された二次抗体を用いて解析を行った。ＭＣＦ７−ＭＣＴ５細胞は、ＭＣＴ５と同時にＥＧＦＰが発現するよう設計した遺伝子が組み込まれているため、４８８ｎｍの励起ではＥＧＦＰの蛍光が見られた。
【図３】抗ＭＣＴ５モノクローナル抗体であるクローン番号ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体が、ヒト大腸癌細胞であるＨＣＴ１１６細胞の細胞表面に結合することを、Ｆｌｏｗ−ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いて解析した結果である。細胞と抗体とを反応後、Ａｌｅｘａ４８８標識された二次抗体を反応させ、解析した結果を示す図である。
【図４】ヒト乳癌細胞であＳＫ−ＢＲ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞及びヒト大腸癌細胞であるＨＣＴ１１６細胞とＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を反応させ、Ａｌｅｘａ４８８標識された二次抗体と反応後、抗体の細胞内への取り込みを継時的に解析した結果を示す図である。図左側に示した時間は、抗体と反応させた後の培養時間を示している。また、図右はハーセプチンとＳＫ−ＢＲ３細胞とを同様に解析した結果を示す図である。抗体（緑の蛍光）が継時的に細胞の内部に取り込まれることが示されている。また、Ｌｙｓｏｓｏｍｅ（赤の蛍光）は、ｐＨ感受性の蛍光色素であるＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  ＤＮＤ−９９で染色された部分である。
【図５】ＨＣＴ１１６細胞を図上部に示した濃度のＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａで１時間処理した後、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体と反応させ、継時的な細胞内の取り込みを解析した結果を示す図である。
【図６】ＨＣＴ１１６細胞を０．５ｍｇ／ｍｌのＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａで１時間処理した後、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体、１０７抗体、２１７抗体、２２１抗体、２２３抗体、３０３抗体、３０６抗体、及び３０１抗体と反応させ、細胞内への取り込みを阻害した状態で、抗体と細胞との反応性を解析した結果を示す図である。
【図７】抗体−ｓａｐｏｒｉｎ複合体によりＭＣＦ７−ＭＣＴ５細胞の増殖が抑制されるか解析を行った結果を示す図である。図下に記載の濃度は、培地中に添加したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＺＡＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｓａｐｏｒｉｎ複合体）の濃度を示した。また、使用したビオチン化抗体は全て５０ｎＭである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。なお。本発明は、以下の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で適宜変形して実施することができる。
【００２７】
本発明は、ＭＣＴ５に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片に関する。また、本発明は、当該抗体、抗原結合断片、及びそれらを含有する医薬組成物、並びに当該抗体を産生するハイブリドーマ細胞、当該抗体及び断片を製造するための核酸、組換え発現ベクター、及び細胞に関する。
本発明者は、以前の研究において、ＭＣＴ５が乳癌及び大腸癌に発現すること、並びに、ＭＣＴ５を認識するモノクローナル抗体が大腸癌の検出薬及び診断薬として利用できることを見出した。さらに、従来、細胞内ドメインと考えられていたＭＣＴ５の塩基配列７５１〜７７４の領域（ＡＡＴＴＴＡＡＣＡＧＴＣＴＣＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡ（配列番号３））、アミノ酸残基２５１〜２５８の領域（ＮＬＴＶＳＱＮＱ（配列番号４））が、細胞外に存在している事を示した。加えて、ＭＣＴ５を過剰発現させたヒト乳癌細胞の浸潤能が増加すること、抗ＭＣＴ５抗体（クローン番号ＩＭＩ４Ｃ４ａ）は腫瘍組織の一部のみに結合すること、及び抗ＭＣＴ５抗体陽性組織は、乳癌組織の進行ステージが進むにつれて発現する割合が上昇することから、ＭＣＴ５は浸潤能の高い乳癌に特異的に発現し、抗ＭＣＴ５抗体は悪性度の高い乳癌を検出することが出来る事を示した。さらに、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体はＭＣＴ５タンパク質の２５１〜２５８番目（配列番号４：アミノ酸配列）をエピトープとしていることを示した。
【００２８】
本発明は、ＭＣＴ５に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片に抗癌剤を結合させた、抗体−抗癌剤複合体を含有する医薬組成物に関する。
【００２９】
ＭＣＴ５（Ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ５）は、複数回膜貫通型の膜タンパク質であり、輸送する物質が確定していないオーファントランスポーターである。細胞内外の乳酸濃度の調節に関係するＭＣＴ１及びＭＣＴ４とのアミノ酸配列の相同性から、同様な機能を有すると予測されている。
【００３０】
本発明は、膜タンパク質であるＭＣＴ５が、癌の組織において過剰発現されるタンパク質であり、通常の癌細胞よりも、癌の再発や転移の主要な原因である浸潤性の高い癌細胞に高く発現しているという知見に基づくものである。
【００３１】
本発明は、ＭＣＴ５の細胞外領域を認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。ＭＣＴ５は乳癌及び大腸癌等の癌細胞で発現するため、この抗体は、乳癌及び大腸癌等の癌細胞に特異的に結合する。
【００３２】
１．本発明の抗ＭＣＴ５抗体
本発明のモノクローナル抗体（以下「本発明の抗ＭＣＴ５抗体」ともいう）は、ネイティブなＭＣＴ５を認識することができる。「ネイティブな」とは、そのタンパク質が生体内の環境で有するインタクトな立体構造の状態にあることをいう。
【００３３】
また、本発明の別の態様において、本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、ＭＣＴ５の細胞外領域を認識することができる。詳しくは、本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、ＭＣＴ５の細胞外領域内の立体構造の少なくとも一部をエピトープとして認識する。特に、細胞外領域は、ＭＣＴ５遺伝子の塩基配列７５１〜７７４の領域の塩基配列（配列番号３）によりコードされ、アミノ酸残基２５１〜２５８の領域（配列番号４）を認識することができる。
【００３４】
本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれる範囲、すなわち結合対象のポリペプチドがＭＣＴ５の細胞外領域としての機能を有する限りにおいて、配列番号４に示すアミノ酸配列の１個若しくは数個（例えば２、３、４又は５個）のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入が行われている変異型ポリペプチド、配列番号４に示すアミノ酸配列に５０％以上、好ましくは６２．５％以上、７５％以上、あるいは８７．５％以上の同一性を有する変異型ポリペプチドを認識するものであってもよい。
【００３５】
また、本発明の別の態様において、本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、ＭＣＴ５の細胞外領域としての機能を有するポリペプチドであって、配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドでコードされるポリペプチド、配列番号３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドでコードされるポリペプチド、配列番号３に記載の塩基配列に７０％以上、好ましくは７５％以上、７９％以上、８３％以上、８７．５％以上、９１％以上、あるいは９５％以上の同一性を有するポリヌクレオチドでコードされる変異型ポリペプチド又は配列番号３に記載の塩基配列と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドでコードされる変異型ポリペプチドを認識するものであってもよい。ここで、ハイブリダイゼーションは、公知の方法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に従って行うことができる。高ストリンジェントな条件は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ナトリウム濃度が１０ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜１００ｍＭであり、温度が２５℃〜７０℃、好ましくは４２℃〜５５℃での条件をいう。あるいは、本発明の抗ＭＣＴ５抗体はＭＣＴ５に結合するものであるから、上記変異型ポリペプチドにおいて、本発明の抗ＭＣＴ５抗体が結合することができるものは、抗体の配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれることを示し、すなわちＭＣＴ５の細胞外領域としての機能を有するポリペプチドに含まれる。
【００３６】
変異型ポリペプチドがＭＣＴ５の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、動物細胞などで変異型ポリペプチドを強制発現させ、浸潤能が増加するかどうかを、マトリゲルインベージョンチャンバー等の浸潤アッセイを用いることにより確認することができる。また、ＭＣＴ５の細胞外領域は、浸潤能の高い癌細胞において発現が上昇するマーカータンパク質の細胞表面部位である。変異型ポリペプチドがＭＣＴ５の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、正常細胞と癌細胞における変異型ポリペプチドの発現を、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙなどで比較することにより確認することができる。
【００３７】
本発明の抗ＭＣＴ５抗体とエピトープ又は変異型ポリペプチドとの結合は、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
【００３８】
また、本発明の別の態様において、本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、ＭＣＴ５のｍＲＮＡバリアントがコードするタンパク質をも認識する。全長のＭＣＴ５だけでなく、一部を欠損した変異体にも結合することができるため、ＭＣＴ５を発現する癌細胞と広範に結合することが可能である。
【００３９】
本発明において、「抗体」は、２つの重鎖及び２つの軽鎖よりなる免疫グロブリン分子である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）よりなる。この重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３よりなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）よりなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬよりなる。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、更に、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的保存されている領域と相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域よりなる。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲよりなり、アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配置されている。本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、完全長であってもよいし、抗原結合断片であってもよい。
【００４０】
本発明において、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）は、抗原（例えば、ＭＣＴ５）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片をいう。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により遂行され得ることが知られている。抗体の「抗原結合部分」の例として、限定されるわけではないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ、ｄＡｂ、ＣＤＲ、ｓｃＦｖ、ディアボディなどが挙げられる。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ′）２断片等の抗体部分は、慣用の技術、例えば、それぞれ、全抗体のパパイン又はペプシン消化を用いて、完全長抗体から調製することができる。また、抗体及び抗原結合断片は、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。
【００４１】
本発明においては、種々の遺伝子工学的及びタンパク質工学的な手法により、モノクローナル抗体の一部である抗原結合断片若しくは抗体断片、低分子化抗体、遺伝子組換え抗体、抗体修飾物などの抗体様分子、又はモノクローナル抗体が融合したタンパク質を作製することができる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、（ｓｃＦｖ）２、ディアボディ、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体などの多重特異性抗体などが挙げられる。いずれも、ＭＣＴ５の細胞外領域への結合能を有している分子であれば、本発明の抗ＭＣＴ５抗体に含まれる。
【００４２】
本発明の抗ＭＣＴ５抗体が認識するＭＣＴ５は、検出対象となる細胞集団において、正常細胞では発現せず、浸潤能の高い癌細胞で発現の高い分子マーカーである。したがって、当該抗体は、悪性度の高い癌細胞に結合する。
【００４３】
本発明における「癌細胞」とは、正常細胞に比べ、高い増殖力や細胞分裂の回数に制限がない、周辺組織への浸潤や転移を起こすなどの特徴を持っている細胞集団のことをいう。
【００４４】
本発明における「浸潤能の高い癌細胞」とは、癌細胞のうち当初の存在場所から離れた部位へ浸潤する能力を持つ細胞をいう。例えば、ヒト乳癌細胞であるＭＣＦ７細胞の浸潤能は極めて低いかほとんどない。一方、ＭＣＦ７細胞から浸潤能を亢進させたＭＣＦ７−１４細胞は浸潤能が高く、移植部位から他の臓器へと浸潤するため、浸潤能の高い性質を有する細胞である（ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ（２０１０），１０，４１４）。浸潤能の高い細胞は、マトリゲルインベージョンチャンバー等を用いた浸潤能試験により評価することが出来る。マトリゲルは基底膜を模倣しており、マトリゲル層の上部に細胞を播種し、培養することで、マトリゲル層を通過（浸潤）しやすい細胞集団として検出することが出来る。
【００４５】
本発明における「正常細胞」とは、生体又は組織の活動において、正常な機能を有する細胞のことを指す。正常細胞は、体性幹細胞を含んでもよいが、好ましくは成熟細胞である。
【００４６】
本発明の別の態様において、本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、浸潤能の高い癌細胞に強く結合するとともに、１又は複数の癌種の癌細胞に結合することが出来る。好ましくは、当該癌種及び癌細胞は、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、白血球、結腸、胃、骨髄、大腸及び末梢血単核球などの細胞または組織由来の１又は複数の癌種であり、より好ましくは乳癌、大腸癌の癌細胞である。
【００４７】
さらに、本発明の別の態様において、本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、正常細胞には結合しない。好ましくは、例えば、心臓、脳、胎盤、肺、骨格筋、腎臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、白血球、結腸、骨髄、大腸及び末梢血単核球などの少なくとも１つ以上において、正常細胞に結合しない。
【００４８】
本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、下記ハイブリドーマにより産生される抗ＭＣＴ５モノクローナル抗体が好ましい。本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株（ハイブリドーマ）としては、例えば、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＩＭＩ４Ｃ４ａ」（以下「ＩＭＩ４Ｃ４ａ」という）、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＩＭＩ４Ｃ１２ａ」（以下「ＩＭＩ４Ｃ１２ａ」という）が挙げられる。
【００４９】
本発明の別の態様において、本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、キメラ抗体である。「キメラ抗体」は、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域がヒトに由来し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がヒト以外（例、マウス）に由来する抗体を意味する。本明細書において、定常領域がヒトに由来し、可変領域がマウスに由来する抗体又は抗原結合断片を、マウス−ヒトキメラ抗体又は抗原結合断片と称することもある。
【００５０】
これらの特徴を有する本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、ＭＣＴ５の細胞外ドメインの部分タンパク質を用いて免疫することで得る事が出来る。データベースにおけるＭＣＴ５は１２回膜貫通型のタンパク質であり、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体の抗原であるＩＣＤ４は細胞内ドメインと予測されていた。しかしながら、特願２０１４−２０３１６２号公報に開示されるように、ＭＣＴ５の膜貫通回数及び／又は細胞外ドメインはデータベースと一致せず、少なくともＩＣＤ４は細胞外に露出されている。すなわち、ＭＣＴ５の細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体は、細胞外ドメインである領域を同定し、その部分に対するモノクローナル抗体を作製することが必要である。このようにして新たに予測された細胞外ドメインを含むアミノ酸配列を抗原として作製したモノクローナル抗体は抗ＭＣＴ５抗体として利用できる。
【００５１】
本発明の一態様において、本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、以下の特徴を有する。
本発明の抗体は、ＭＣＴ５の立体構造がデータベースとは異なる事を見出したことにより、新たに得られた抗体であるために、細胞表面上のネイティブなＭＣＴ５を認識することができる。また、抗ＭＣＴ５抗体であるＩＭＩ４Ｃ４ａのエピトープの近傍を抗原とした従来のモノクローナル抗体（ＨＰＡ０４６９８６）は、ネイティブなＭＣＴ５を認識することが出来ず、細胞表面上のＭＣＴ５に結合しない。これに対して、本発明の抗体の認識部位はＭＣＴ５の細胞外ドメインに結合し、生きた細胞に結合することができる。そのため、本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、ＭＣＴ５を発現する癌細胞を標的とする治療薬として有効である。
【００５２】
加えて、従来の抗体はポリクローナル抗体であり、均質な抗体を継続的に生産することが困難であったが、本発明の抗体はモノクローナル抗体であるため、再現性よく量産することが可能である。これらの特徴から、本発明の抗体は、癌の治療に利用することが出来る。
【００５３】
また、ＭＣＴ５に対する抗体又は抗原結合断片は、上記ハイブリドーマＩＭＩ４Ｃ４ａにより産生されるＭＣＴ５に対するマウスモノクローナル抗体そのものに限られず、これらのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する限り、本発明の抗ＭＣＴ５抗体に含まれる。ここでいう「エピトープ」とは、上記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が認識するエピトープ（ＭＣＴ５のアミノ酸配列のうち、第１９６番目から第２９９番目までのアミノ酸残基のほか、これらの領域の一部であってもよい。）を指す。さらに、ＭＣＴ５の領域、第３８番目から第８７番目までのアミノ酸残基のほか、これらの領域の一部、又は第４１６番目から第４５８番目までのアミノ酸残基のほか、これらの領域の一部、であってもよい。
【００５４】
本発明の抗体は、組換え手段により調製され、発現される遺伝子組換え抗体又は抗原結合断片であってもよい。例えば、本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であってもよい。本発明の組換え抗体は、重鎖及び軽鎖の組換え発現によって製造することができる。例えば、マウス−ヒトキメラ抗体であれば、ＭＣＴ５タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、その重鎖（Ｈ鎖）定常領域をヒトＩｇＧのＨ鎖定常領域遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞に導入することにより調製できる。ヒト化抗体は、例えば、ＭＣＴ５タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から単離した抗体の抗原結合部位の遺伝子をヒト由来の抗体分子に移植することにより調製できる。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスをＭＣＴ５タンパク質で免疫することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体が融合したタンパク質は、抗原に結合する抗体の可変領域とその他のタンパク質を既存の遺伝子組み換えの手法を用いることにより作製することが出来る。あるいは、モノクローナル抗体とタンパク質とをクロスリンカーを用いて架橋することにより作製することが出来る。
【００５５】
遺伝子組換え抗体を発現させるには、例えば、該抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸を有する組換え発現ベクターを、宿主細胞に導入し、当該ベクターが導入された宿主細胞を培養する。当該宿主細胞の培養物から目的の抗体を回収することができる。これらの核酸、組換え発現ベクター、当該ベクターが導入された宿主細胞、当該宿主細胞を用いる抗体又は抗原結合断片の製造方法は、本発明に含まれる。抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子を入手し、これらの核酸を発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入するには、当分野で標準的な組換えＤＮＡ方法（Ｓａｍｂｒｏｏｃｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．など）を採用することができる。
【００５６】
ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片は、当分野で標準的な組換えＤＮＡ方法によって、例えば、Ｆａｂ遺伝子、ｓｃＦｖ遺伝子、完全長抗体遺伝子とするために、さらに操作することができる。
【００５７】
また、ＶＨをコードする核酸（例えばＤＮＡ）は、ＶＨをコードするＤＮＡと重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードするＤＮＡと発現可能に結合することによって、完全長の重鎖遺伝子へと変換することができる。ヒト、マウス等由来の重鎖定常領域の核酸配列は、当分野で公知である。
【００５８】
本発明の抗ＭＣＴ５抗体としては、例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号７、８、及び９で示されるアミノ酸配列を含むもの若しくは当該アミノ酸配列からなるもの、及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１２、１３及び１４で示されるアミノ酸配列を含むもの若しくは当該アミノ酸配列からなるものが好ましい。また別の態様において、本発明の抗ＭＣＴ５抗体としては、例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列が、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むもの若しくは当該アミノ酸配列からなるもの（配列番号５に示す塩基配列によりコードされる）、及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列が、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むもの若しくは当該アミノ酸配列からなるもの（配列番号１０に示す塩基配列によりコードされる）が好ましい。
【００５９】
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【００６０】
2017175874.tif 000003
【００６１】
2017175874.tif 000004
【００６２】
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【００６３】
2017175874.tif 000006
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【００６４】
2017175874.tif 000008
【００６５】
ここで、ＶＨ及びＶＬコードする核酸が、例えばマウスに由来する核酸であり、重鎖及び軽鎖定常領域をコードする核酸がヒトに由来する核酸を使用すれば、マウス−ヒトキメラの抗体又は抗原結合断片を取得することができる。
【００６６】
本発明の抗体又は抗原結合断片を発現するには、上記のとおり得た部分又は完全長の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を発現ベクターに挿入する。重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入するか、あるいは、両遺伝子とも同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は標準的な方法によって、発現ベクター内に挿入することができる。また、発現ベクターには、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促すシグナルペプチドをコードさせることもできる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであってもよいし、異種のシグナルペプチドであってもよい。また、発現ベクターはその他の調節配列を含有していてもよく、当業者であれば公知の技術に基づき、調節配列を選択し、発現ベクターに導入することができる。
【００６７】
抗ＭＣＴ５抗体のエピトープ
本発明の抗ＭＣＴ５抗体のエピトープ（抗原決定基）は、抗原であるＭＣＴ５の少なくとも一部であればよく限定はされないが、ＭＣＴ５の細胞外領域の少なくとも一部が好ましく、例えば、配列番号２で示されるＭＣＴ５のアミノ酸配列のうち、第１９６番目〜第２９９番目のアミノ酸からなる領域（配列番号１５）の少なくとも一部であることが好ましい。なかでも、第２２７番目〜第２５８番目のアミノ酸からなる領域（配列番号１６）の少なくとも一部がより好ましく、特に好ましくは、第２５１番目〜第２５８番目のアミノ酸（配列番号４）からなる領域の少なくとも一部である。当該領域を認識する（当該領域と結合する）抗ＭＣＴ５抗体は、例えば、生体試料中のＭＣＴ５の検出感度が高く、後述する癌の検出及び診断の用途に極めて有用なものである。
【００６８】
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【００６９】
また、ＭＣＴ５にはｍＲＮＡのスプライシングの違いにより、６種類のアイソフォームが存在する。具体的には、ヒトＭＣＴ５の場合、（ｉ）ＭＣＴ５の代表的な配列であり、最も長いアミノ酸配列を持つｉｓｏｆｏｒｍ１（配列番号２）、（ｉｉ）ｉｓｏｆｏｒｍ１の第７４番目から第１２１番目までのアミノ酸が欠如したペプチド（ｉｓｏｆｏｒｍ２）、（ｉｉｉ）ｉｓｏｆｏｒｍ１におけるＮ末端から第６２番目までのアミノ酸が欠如し、ｉｓｏｆｏｒｍ１の第６３番目から第７３番目のアミノ酸配列（配列番号１７）とは異なるアミノ酸配列（配列番号１８）を有するペプチド（ｉｓｏｆｏｒｍ３）、（ｉｖ）ｉｓｏｆｏｒｍ１におけるＮ末端から第１１０番目までのアミノ酸が欠如し、ｉｓｏｆｏｒｍ１の第１１１番目から第１２０番目のアミノ酸配列とは異なる配列（配列番号１９）を有し、及び第４４６番目からＣ末端のアミノ酸配列がｉｓｏｆｏｒｍ１（配列番号２）とは異なる配列（配列番号２０）を有するペプチド（ｉｓｏｆｏｒｍ４）、（ｖ）ｉｓｏｆｏｒｍ１の第１７６番目から第３４３番目のアミノ酸配列が欠如したペプチド（ｉｓｏｆｏｒｍ５）、（ｖｉ）ｉｓｏｆｏｒｍ１におけるＮ末端から第６２番目までのアミノ酸が欠如し、ｉｓｏｆｏｒｍ１の第６３番目から第７３番目のアミノ酸配列（配列番号１７）とは異なるアミノ酸配列（配列番号１８）を有し、ｉｓｏｆｏｒｍ１の第１７６番目から３４３番目が欠如したペプチド（ｉｓｏｆｏｒｍ６）、などが存在する。
【００７０】
これらのペプチドの中でｉｓｏｆｏｒｍ２、ｉｓｏｆｏｒｍ３およびｉｓｏｆｏｒｍ４の３種類は、配列番号２で示されるＭＣＴ５のｉｓｏｆｏｒｍ１のアミノ酸配列のうち、第１９６番目〜第２９９番目のアミノ酸からなる領域において、ＭＣＴ５のｉｓｏｆｏｒｍ１と共通する。従って、本発明の抗体はｉｓｏｆｏｒｍ１以外のこれら３種のｉｓｏｆｏｒｍも検出することができる。
また、配列番号１７を含む抗原を用いて作製した抗体は、ｉｓｏｆｏｒｍ１に加え、ｉｓｏｆｏｒｍ２及びｉｓｏｆｏｒｍ５も検出することが出来る。さらに、配列番号１９を用いて作製した抗体は、ｉｓｏｆｏｒｍ３、ｉｓｏｆｏｒｍ４及びｉｓｏｆｏｒｍ６も検出することが出来る。
【００７１】
また、本発明の抗ＭＣＴ５抗体のエピトープ（抗原決定基）には、他の動物由来のＭＣＴ５における上記領域に相当する領域の少なくとも一部が含まれる。
本発明のＭＣＴ５に対する抗体には、当該抗体が結合する部位（例えばエピトープ）に結合する抗体、例えば、本発明のハイブリドーマが産生する抗体が結合する部位に結合する抗体が含まれる。
【００７２】
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【００７３】
遺伝子組換え抗体の作製
本発明の抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト化抗体等が挙げられる。
キメラ抗体（すなわちヒト型キメラ抗体）は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結（接合）した抗体であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１．６８５１−６８５５，（１９８４）等を参照）、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。
【００７４】
ここで、マウス由来抗体の可変領域としては、重鎖可変領域が、例えば配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むもの若しくは当該アミノ酸配列からなるものが好ましく、軽鎖可変領域が、例えば配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むもの若しくは当該アミノ酸配列からなるものが好ましい。
マウス−ヒトキメラ抗体としては、重鎖可変領域をヒトの定常領域と結合させたアミノ酸配列（配列番号２９）、軽鎖可変領域をヒトの定常領域と結合させたアミノ酸配列（配列番号３２）を含むもの若しくは当該アミノ酸からなるものが好ましい。
【００７５】
ヒト型化抗体を作製する場合は、いわゆるＣＤＲグラフティング（ＣＤＲ移植）と呼ばれる手法を採用することができる。ＣＤＲグラフティングとは、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（ＦＲ）はヒト由来のものでＣＤＲはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する方法である。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７）；Ｑｕｅｅｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３３（１９８９）；特許第２８２８３４０号公報等を参照）。ここで、本発明のヒト型化抗ＭＣＴ５抗体に用いることができるマウス由来のＣＤＲのアミノ酸配列としては、限定されるものではないが、例えば、重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３として、それぞれ配列番号７、８及び９で示されるアミノ酸配列が好ましく、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３として、それぞれ配列番号１２、１３及び１４で示されるアミノ酸配列が好ましい。
【００７６】
ヒト抗体（完全ヒト抗体）は、一般に可変領域（Ｖ領域）の抗原結合部位である超可変領域（ｈｙｐｅｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）、Ｖ領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。ヒト抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体の重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９７７）１６，１３３−１４３；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（１９９８）２６，３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ，（１９９９）１０，６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２０００）９７，７２２−７２７等を参照）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．，（２００２）４３（７），２３０１−８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，（２００２）１（２），１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，（２００２）１０９（３），４２７−４３１等を参照）により取得することができる。
【００７７】
また、本発明においては、ハイブリドーマ又は当該ハイブリドーマから抽出したＤＮＡ若しくはＲＮＡなどを原料として、上述した周知の方法に準じてキメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト化抗体を作製することができる。
さらに、本発明の抗体が融合したタンパク質は、抗体の可変領域とその他のタンパク質を公知の遺伝子組換え方法を用いることにより作製することができる。また、当該融合タンパク質は、モノクローナル抗体と他のタンパク質とをクロスリンカーを用いて架橋することにより作製することができる。
【００７８】
抗体断片の作製
本発明で使用されるＭＣＴ５に対する抗体の断片は、ＭＣＴ５に特異的に結合する。
抗体の断片は、本発明の抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉｂｏｄｉｅｓ）、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）などが挙げられる。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。
例えば、Ｆａｂは、抗体分子をパパインで処理することにより、Ｆ（ａｂ′）２は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、Ｆａｂ′は、上記Ｆ（ａｂ′）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。
【００７９】
ｓｃＦｖの場合は、抗体の重鎖可変領域（Ｈ鎖Ｖ領域）及び軽鎖可変領域（Ｌ鎖Ｖ領域）をコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｓｃＦｖを製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙの場合は、抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるようにｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｄｉａｂｏｄｙを製造することができる。
【００８０】
ｄｓＦｖの場合は、抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｄｓＦｖを製造することができる。
本発明において、重鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号５で示される塩基配列を含むもの又は当該塩基配列からなるものが挙げられ、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１０で示される塩基配列を含むもの又は当該塩基配列からなるものが挙げられる。
【００８１】
また、本発明の抗体断片の具体例としては、限定されるものではないが、例えば、ＶＨ  ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列としてそれぞれ配列番号７、８及び９で示されるアミノ酸配列を含み、かつ／又はＶＬ  ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列としてそれぞれ配列番号１２、１３及び１４で示されるアミノ酸配列を含む、抗体断片が挙げられる。さらに、ＶＨとして配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、かつ／又はＶＬとして配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む、抗体断片が挙げられる。
【００８２】
ＣＤＲを含む抗体断片（ペプチド）は、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３）の少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含む抗体断片は、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。ＣＤＲを含む抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
【００８３】
ＶＨのＣＤＲ１〜３をコードする塩基配列としては、例えば、それぞれ配列番号２１、２２及び２３で示される塩基配列が好ましく、ＶＬのＣＤＲ１〜３をコードする塩基配列としては、例えば、それぞれ配列番号２４、２５及び２６で示される塩基配列が好ましい。
【００８４】
2017175874.tif 000011
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【００８５】
2017175874.tif 000013
【００８６】
2017175874.tif 000014
2017175874.tif 000015
【００８７】
2017175874.tif 000016
【００８８】
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【００８９】
2017175874.tif 000018
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【００９０】
結合親和性
結合親和性は、結合定数（ＫＡ）及び解離定数（ＫＤ）により決定することができる。親和性平衡定数（Ｋ）はＫＡ／ＫＤの比で表される。その結合親和性は、以下のようにして検出することができる。
結合親和性は、少なくとも１×１０−１０Ｍの解離定数（ＫＤ）を有しており、この解離定数に対し、例えば２〜５倍、５〜１０倍、１０〜１００倍、１００〜１０００倍又は１０００〜１０，０００倍高い親和性を有する。具体的には、本発明の抗体は、ＭＣＴ５の結合親和性に関する解離定数（ＫＤ）が、１×１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１×１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１×１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１×１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１×１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１×１０−１５Ｍであり、１×１０−１０Ｍ〜１×１０−１３Ｍであることがより好ましい。あるいはこれらのＫＤよりも低い値であり高親和性であってもよい。
【００９１】
ここで、親和性の測定対象となる抗体の解離定数（ＫＤ）が、本発明の抗体のＫＤの約１〜１００倍以内であるときは、当該抗体は、本発明の抗体と実質的に同一であるとして本発明に含まれる。
結合定数（ＫＡ）及び解離定数（ＫＤ）は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定することができ、結合率をリアルタイムで検出し、さらにモニタリングする公知の機器及び方法を採用することができる（例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ＰｒｏｔｅＯＮ  ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）など）。
【００９２】
癌の治療用試薬（抗癌剤）
本発明の組換え抗体を発現するのに好ましい哺乳動物細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、３Ｔ３細胞などが挙げられる。抗体重鎖及び軽鎖をコードする組換え発現ベクターを公知の遺伝子導入方法によって、好ましい宿主細胞に導入する。得られた形質転換体を培養し、培養物から目的の抗体又は抗原結合断片を回収する。公知の精製技術により、抗体又は抗原結合断片を精製してもよい。
【００９３】
本発明の別の態様において、本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、キメラ抗体である。「キメラ抗体」は、重鎖定常領域及び軽鎖の定常領域がヒトに由来し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がヒト以外（例、マウス）に由来する抗体を意味する。本明細書において、定常領域がヒトに由来し、可変領域がマウスに由来する抗体又は抗原結合断片を、ヒト−マウスキメラ抗体又は抗原結合断片と称することもある。
【００９４】
本発明の抗体コンジュゲート
本発明の別の態様において、本発明のモノクローナル抗体（その抗原結合断片を含む）は、少なくとも１種類の化学療法剤（抗がん剤を含む）、トキシン、又はラジオアイソトープをコンジュゲートして複合体とすることができ、そのような複合体（本発明の抗体コンジュゲートともいう）も、本発明の範囲に含まれる。
【００９５】
例えば、本発明の別の態様において、本発明のモノクローナル抗体とラジオアイソトープを含む抗体コンジュゲートであって、本発明のモノクローナル抗体が検出可能なラジオアイソトープとコンジュゲート形成している抗体コンジュゲートが提供される。検出可能なラジオアイソトープは、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ又は１５３Ｓｍである。
【００９６】
例えば、本発明の別の態様において、本発明のモノクローナル抗体と抗がん剤又はトキシンとを含む抗体コンジュゲートであって、本発明のモノクローナル抗体が抗がん剤またはトキシンと複合体を形成している抗体コンジュゲートが提供される。前記化学療法剤は好ましくは抗がん剤である。また、トキシンは、好ましくはサポニン、ＤＭ１（Ｎ２′−Ｄｅａｃｅｔｙｌ−Ｎ２′−（３−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）−ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、ＤＭ４（Ｎ２′−Ｄｅａｃｅｔｙｌ−Ｎ２′−（４−ｍｅｒｃａｐｔｏ−４−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｏｘｏｐｅｎｔｙｌ）−ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、ＭＭＡＥ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  Ｅ）、ＳＮ３８である。
【００９７】
癌の化学療法を実施する場合の化学療法剤の作用機構には限定されず、「化学療法剤」は癌の治療において有用な化学化合物である。化学療法剤の種類には、限定するものではないが、アルキル化剤（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、アンチメタボライ、紡錘体阻害剤植物アルカロイド、細胞障害性／抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害薬、抗体、光増感剤及びキナーゼ阻害薬が含まれる。化学療法剤は、「ターゲティング療法」と従来の化学療法とに用いられる化合物を含む。化学療法剤の例には、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩＰｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５‐フルオロウラシル、ＣＡＳ番号５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標），Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号３９１２１０−１０−９，Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（シス−ジアミン、ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号１５，６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペントアザ二環式［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキシアミド、ＣＡＳ番号８５６２２−９３−１，ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標），ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標），Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブト−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−エタンアミド，ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標），ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標），ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））、及びドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、Ａｋｔｉ−１／２、ＨＰＰＤ及びラパマイシンが含まれる。
【００９８】
化学療法剤の他の例には、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標），Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標），ＳＵ１１２４８，Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋインヒビター，Ｅｘｅｌｉｘｉｓ，国際公開２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋインヒビター，ＡＺＤ６２４４，Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ，Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋインヒビター，Ｓｅｍａｆｏｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋインヒビター，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋインヒビター，Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、リューコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス，ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標），ＧＳＫ５７２０１６，Ｇｌａｘｏ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ  ＴＭ，ＳＣＨ  ６６３３６，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標），ＢＡＹ４３−９００６，Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標），ＣＰＴ−１１，Ｐｆｉｚｅｒ）、ティピファニブ（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ  ＴＭ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ  ＴＭ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｆｒｅｅ）、パクリタキセルのアルブミン−変更ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉ１）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ，ＺＤ６４７４，ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンフォスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標），Ｔｅｌｉｋ）、チオテパ、及びシクロフォスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）のようなアジリジン類；アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド
（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）及びトリメチローロメラミン
（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（ａｃｅｔｏｇｅｎｉｎｓ）（特にブラタシン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎ）及びブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；カンプトセシン（合成類似体トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）及びバイゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）合成類似体を含む）；クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）；デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢＩ−ＴＭ１を含む）；エレトロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン
（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコディクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロランブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、チョロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、例えばカルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、カリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Ａｇｎｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照のこと；ダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ダイネミシンＡ（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎＡ）；クロドロネート（ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ）などのビスホスホネート（ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）；エスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）抗生物質発光団）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｓ）、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎｓ）、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような抗−代謝産物；デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキセート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）のような葉酸類似体；フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）のようなピリミジン類似体；カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）のような葉酸リプレニッシャー（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル（ｅｎｉｌｕｒａｃｉｌ）；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルニチン
（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）及びアンサマイトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）のようなメイタンシノイド
（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２′，２′′−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）（Ｔ−２トキシン、ベラキュリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ  Ａ）、ロリデンＡ（ｒｏｒｉｄｉｎ  Ａ）及びアングイデン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）；ミトブロニトール；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ−１６）；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ナベルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標），Ｒｏｃｈｅ）；イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド類；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類及び誘導体が含まれる。
【００９９】
また、「化学療法剤」の定義には、（ｉ）腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、抗エストロゲン及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭ）など、例えばタモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンクエン酸塩）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（クエン酸トレミフェン）；（ｉｉ）アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、それらは副腎でのエストロゲン産生を調節するものであり、例えば４（５）−イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（メゲストロールアセテート）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン，Ｐｆｉｚｅｒ）、ホルメスタイン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ゾロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ））、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；（ｉｉｉ）抗アンドロゲン、例えばフルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド
（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；（ｉｖ）プロテインキナーゼインヒビター、例えばＭＥＫインヒビター（国際公開２００７／０４４５１５）；（ｖ）脂質キナーゼインヒビター；（ｖｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に不粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ及びＨ−Ｒａｓ、オブリメルセン（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標），Ｇｅｎｔａ  Ｉｎｃ．）；（ｖｉｉ）リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現インヒビター（例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標））及びＨＥＲ２発現インヒビター；（ｖｉｉｉ）遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）及びＶＡＸＩＤ（登録商標）などのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）などのトポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；（ｉｘ）ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などの抗血管形成剤；並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。また、「化学療法剤」の定義には、治療的抗体、例として、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標），Ｉｍｃｌｏｎｅ）；パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標），Ａｍｇｅｎ）、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、ペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ  ＴＭ，２Ｃ４，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ，Ｃｏｒｉｘｉａ）、及び抗体薬剤コンジュゲート、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ）が含まれる。
【０１００】
ＭＣＴ５モノクローナル抗体及びそれと組み合わされる化学療法剤としての治療的能力を有するヒト化モノクローナル抗体には、アレムツズマブ、アポリズマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、バピネオズマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ・メルタンシン、カンツズマブ・メルタンシン、セデリズマブ、セルトリズマブ・ペゴール、シドフシツズマブ、シドツズマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エピラツズマブ、エルリズマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イノツズマブ・オゾガマイシン、イピリムマブ、ラベツズマブ、リンツズマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、モトビズマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、ノロビズマブ、ヌマビズマブ、オクレリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パスコリズマブ、ペクフシツズマブ、ペクツズマブ、パーツズマブ、パキセリズマブ、ラリビズマブ、ラニビズマブ、レスリビズマブ、レスリズマブ、レシビズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、シブロツズマブ、シプリズマブ、ソンツズマブ、タカツズマブ・テトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、テフィバズマブ、トシリズマブ、トラリズマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ・セルモロイキン、ツクシツズマブ、ウマビズマブ、ウルトキサズマブ及びビシリズマブが含まれる。
【０１０１】
「代謝産物」は、特定の化合物又は塩の体内の代謝によって生産される生成物である。化合物の代謝産物は当分野で公知の慣例技術を使用して同定されてもよく、それらの活性は本明細書中に記載のものなどの試験を用いて決定されてもよい。このような生成物は、例えば、投与される化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、アミド分解、エステル化、エステル分解、酵素の切断などから生じうる。したがって、本発明は、代謝産物が得られるために十分な時間、本発明の化合物を哺乳動物と接触させることを含む方法によって産生される化合物を含む、本発明の化合物の代謝産物を含む。
【０１０２】
本発明のモノクローナル抗体は、化学療法剤（抗がん剤を含む）、トキシン又はラジオアイソトープと直接又は間接的に結合（コンジュゲーション）することができる。間接的な結合には、リンカーを介した結合や本発明のモノクローナル抗体に結合する抗体または抗体断片を介する結合が含まれる。例えば、蛍光標識などの標識物質でコンジュゲートされた抗体と本発明のモノクローナル抗体との結合によって形成された抗体コンジュゲートも、本発明に含まれる。
【０１０３】
さらに、本発明のモノクローナル抗体は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどの、殺腫瘍活性又は腫瘍抑制活性を有するエフェクター細胞に対して特異的な抗原結合領域を含むことが望ましい。
ここで、「殺腫瘍活性」とは、腫瘍細胞を破壊又は死滅させる活性を意味し、「腫瘍抑制活性」とは腫瘍細胞の数を減少させる活性又は腫瘍細胞の増殖速度を抑制させる活性を意味する。
エフェクター細胞に対して特異的な抗原結合領域を含む本発明のモノクローナル抗体ががん細胞に結合すると、エフェクター細胞が当該抗体に結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性によりがん細胞を死滅させることが可能となる。
同様に、このような領域を含む本発明のモノクローナル抗体ががん細胞に結合すると、補体系が活性化し、ＣＤＣ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：補体依存性細胞傷害）活性によってがん細胞を死滅させることが可能となる。
【０１０４】
本発明の医薬組成物
本発明において、本発明の抗ＭＣＴ５抗体（抗原結合断片を含む）を含む医薬組成物が提供される。本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、がん細胞に発現するＭＣＴ５を認識する。本発明の抗ＭＣＴ５抗体を含む本発明の医薬組成物は、ＭＣＴ５を発現するがん細胞を殺傷するために使用することが可能である。すなわち、本発明の医薬組成物は、がん治療用医薬組成物、好ましくは大腸がん治療用医薬組成物として有用である。また、本発明の医薬組成物は、がん治療剤として使用することができる。
【０１０５】
本発明のモノクローナル抗体は、化学療法剤、トキシン又はラジオアイソトープとコンジュゲートされていてもよい。したがって、本発明の別の態様において、本発明の抗体コンジュゲートを含む、医薬組成物が提供される。
【０１０６】
本発明のモノクローナル抗体はがん細胞に発現するＭＣＴ５を認識するため、本発明のモノクローナル抗体（抗体コンジュゲートを含む）を含む本発明の医薬組成物は、がん治療用医薬組成物、好ましくは大腸がん治療用医薬組成物として有用である。
【０１０７】
また、本発明の医薬組成物は、がん治療剤としても使用することができる。本発明のがん治療剤には、抗ＭＣＴ５抗体単独、あるいは、必要に応じて薬学的に許容される抗がん剤や担体を適宜抗ＭＣＴ５抗体に結合させたものが含まれる。あるいは本発明の癌治療剤は他の治療様式と組み合わせて用いることができる。
【０１０８】
また、本発明のモノクローナル抗体は、がん細胞に発現するＭＣＴ５を認識し、かつ、細胞膜上のＭＣＴ５に結合した後、Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ（内在化）機構を介して、細胞内に取り込まれる。したがって、本発明の医薬組成物は、ＭＣＴ５を発現するがん細胞を殺傷するために使用することが可能である。特に、化学療法剤と本発明のモノクローナル抗体を含む抗体コンジュゲートを含む場合、抗体にコンジュゲートした化学療法剤もがん細胞に取り込まれ得るため、本発明の医薬組成物は、がん患者におけるがん細胞を殺傷するために有用である。
【０１０９】
本発明において、がんの治療には、がん細胞を殺傷すること、がんの大きさを減少させること、がんの増殖速度を抑制若しくは停止させること、又はがんの進行を抑制もしくは停止させることなどが含まれる。
【０１１０】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体と、化学療法剤、トキシン又はラジオアイソトープとを組み合わせた医薬組成物とすることができる。併用させる抗がん剤として、本発明の医薬組成物に含まれる化学療法剤と同じものを用いてもよいし、あるいは異なる化学療法剤を用いてもよい。抗がん剤の投与量及び投与方法は、当業者であれば適宜設定することができる。
【０１１１】
本発明の医薬組成物の治療対象のがんの種類は特に限定されず、ＭＣＴ５を発現していればよく、例えば、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器がん、肺がん、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、尿管腫瘍、胆嚢がん、胆管がん、胆道がん、乳がん、肝がん（肝臓がん）、膵臓がん、睾丸腫瘍、上顎がん、舌がん、口唇がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、腎臓がん、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、甲状腺がん、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚がん、基底細胞がん、皮膚付属器がん、皮膚転移がん、皮膚黒色腫などが挙げられる。好ましくは、大腸がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、子宮がん、乳がんであり、さらに好ましくは大腸がん、乳がん、子宮がんである。
【０１１２】
本発明の医薬組成物の投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、又は患部への直接投与などが挙げられる。
【０１１３】
本発明の医薬組成物の投与量は、一般には、投与対象（患者）の年齢、体重、病気の種類・進行状況や、投与経路、投与回数、投与期間等を勘案し、適宜設定することができる。
【０１１４】
本発明の医薬組成物の投与量は、一般には、製剤中の有効成分の配合割合を考慮した上で、投与対象（患者）の年齢、体重、病気の種類・進行状況や、投与経路、投与回数、投与期間等を勘案し、適宜設定することができる。有効成分としては、本発明のモノクローナル抗体にコンジュゲートされる化学療法剤、トキシン又はラジオアイソトープ等が挙げられる。
【０１１５】
本発明の医薬組成物を非経口剤として用いる場合について、以下に具体的に説明する。
非経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されるものではなく、例えば、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等のいずれであってもよい。
【０１１６】
各種注射剤の場合は、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態や、使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供され得る。当該非経口剤には、前述した活性成分（本発明の抗ＭＣＴ５抗体又はその抗原結合断片）のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形剤や添加剤を上記活性成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、各種注射剤の場合は、水、グリセロール、プロピレングリコールや、ポリエチレングリコール等の脂肪族ポリアルコール等が挙げられる。
【０１１７】
非経口剤の投与量（１日あたり）は、限定はされないが、例えば各種注射剤であれば、一般には、前述した活性成分は、適用対象（患者）の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１５ｍｇ／日であることが好ましく、より好ましくは２〜１２ｍｇ／日である。
【０１１８】
経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。
【０１１９】
本発明の医薬組成物は、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、及び希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤及び／又は薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
本発明は、がん、例えば大腸がんを治療するための本発明の抗ＭＣＴ５抗体を含むキットを提供する。本発明のキットは、本発明の抗ＭＣＴ５抗体を含むものであれば、それを構成する材料は特に限定されない。本発明の抗ＭＣＴ５抗体のほか、水、緩衝液、容器、シリンジ、取扱説明書などを具備すればよい。本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、水溶液、凍結乾燥状態などにて提供され、使用前に適切な状態に調製してもよい。本発明のキットを用いることにより、がんを効果的に治療することが可能となる。
【０１２１】
また、本発明は、本発明の抗ＭＣＴ５抗体を対象（例えば、ヒト）に投与することを含む、がんの治療方法も提供する。また、本発明は、がんの治療に使用するための本発明の抗ＭＣＴ５抗体をも提供する。抗ＭＣＴ５抗体の投与量、投与方法などは、本発明の医薬組成物の記載を参照することができる。
【０１２２】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体を対象に投与することを含む、がんの治療方法も提供する。本発明の治療方法において、本発明のモノクローナル抗体は化学療法剤、トキシン又はラジオアイソトープとコンジュゲートを形成していてもよい。すなわち、本発明の治療方法は、本発明の抗体コンジュゲートを対象に投与することを含むものであってもよい。また、本発明のがん治療方法において、さらなる抗がん剤を併用してもよい。
【０１２３】
本発明の医薬組成物の投与量は、一般には、投与対象（患者）の年齢、体重、病気の種類・進行状況や、投与経路、投与回数、投与期間等を勘案し、適宜設定することができる。
【０１２４】
本発明の医薬組成物を非経口剤として用いる場合について、以下に具体的に説明する。
非経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されるものではなく、例えば、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等のいずれであってもよい。
【０１２５】
各種注射剤の場合は、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態や、使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供され得る。当該非経口剤には、前述した活性成分（本発明の抗ＭＣＴ５抗体又はその抗原結合断片）のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形剤や添加剤を上記活性成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、各種注射剤の場合は、水、グリセロール、プロピレングリコールや、ポリエチレングリコール等の脂肪族ポリアルコール等が挙げられる。
【０１２６】
非経口剤の投与量（１日あたり）は、限定はされないが、例えば各種注射剤であれば、一般には、前述した活性成分は、適用対象（患者）の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１５ｍｇ／日であることが好ましく、より好ましくは２〜１２ｍｇ／日である。
【０１２７】
経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。
【実施例】
【０１２８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【０１２９】
実施例１
（１）細胞
ＨＣＴ１１６はＤＳファーマより、ＭＤＡ−ＭＢ２３１はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＴＢ−２６）より入手した。ＭＣＦ７細胞にＭＣＴ５を過剰発現させた細胞は、特願２０１４−２０３１６２公報に記載された細胞を用いた。【０１３０】
（２）モノクローナル抗体
（ｉ）抗体産生細胞の採取
ＭＣＴ５と結合するモノクローナル抗体であるクローン番号ＩＭＩ４Ｃ４ａは、ＭＣＴ５又は部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体及び希釈剤と共に哺乳動物に投与することにより免疫し得ることが出来る。例えばＭＣＴ５の第１９６番目〜第２９９番目のアミノ酸からなる領域（配列番号３２）が利用できる。この領域を以下では「ＩＣＤ４」と称す。動物１匹当たりの抗原の投与量、用いられるアジュバントの種類、免疫方法、免疫の間隔はポリクローナル抗体の作製と同様である。最終の免疫日から１〜３０日後、好ましくは２〜５日後に、抗体価の認められた個体を選択し抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又はリンパ節細胞が好ましい。【０１３１】
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【０１３２】
（ｉｉ）細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。融合操作は既知の方法、例えばＫｏｈｌｅｒらの方法に従い実施できる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ．１、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＰＡＩ、Ｐ３Ｕ１、ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、ＮＳＯ／１などのマウスミエローマ細胞株、ＹＢ２／０などのラットミエローマ細胞株などが挙げられる。【０１３３】
上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞との細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０８〜５×１０８個の抗体産生細胞と２×１０７〜１０×１０７個のミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比１０：１〜１：１）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール又はセンダイウイルス等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。【０１３４】
（ｉｉｉ）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えば１０〜２０％のウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に限界希釈法で計算上０．３個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウェルにＨＡＴ培地などの選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１０日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。【０１３５】
次に、生育してきたハイブリドーマをさらにスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマを培養したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、スクリーニングすることができる。具体的には、９６ウェルプレートに抗原を吸着させた後、仔牛血清、スキムミルク等でブロッキングする。ハイブリドーマ細胞の培養上清を固相化した抗原に３７℃で１時間反応させた後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧを３７℃で１時間反応させ、オルトフェニレンジアミンを基質として用いて発色させる。酸で反応を停止させた後、４９０ｎｍの波長における吸光度を測定することにより、スクリーニングすることができる。【０１３６】
上記測定法により陽性を示したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法等によりクローニングする。そして、最終的に、ＭＣＴ５に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立する。【０１３７】
（ｉｖ）モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物、例えばマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の腹腔内にハイブリドーマを約５×１０６〜２×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採取する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。【０１３８】
（３）ＥＬＩＳＡ
マウスの尾静脈より採取した血液をＰＢＳ（−）で１／１６０，０００に希釈したサンプル、あるいはハイブリドーマが増殖してきたウェルの培養上清を回収し、抗体の力価を解析した。ＩＣＤ４をＰＢＳ（−）で希釈し、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社）に１ウェル当たり５０ｎｇとなるよう分注して、室温で１時間放置することでプレート表面に結合させた。次に、ＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）３５０μＬで３回洗浄した後、５％スキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔを３００μＬずつ各ウェルに分注し、１時間、室温でブロッキングした。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、希釈した血液あるいは培養上清をＩＣＤ４結合ＥＬＩＳＡプレートに分注し、１時間、室温で反応させた。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、ペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと記載する）標識抗マウス免疫グロブリン抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）を１０，０００倍希釈したものを各ウェル１００μＬ分注し、１時間、室温で反応させた。同様の洗浄を行った後、０．５ｍｇ／ｍＬ  ＰＯＤとなるよう調製したＯＰＤ基質を加え、室温、５分間発色させた。１．５Ｎの硫酸で反応を停止した後、４９０ｎｍの吸収を、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて測定した。ＩＣＤ４を抗原として作製したモノクローナル抗体に関して、それぞれのハイブリドーマ細胞の培養上清を用いてＥＬＩＳＡで解析した結果を図１に示した。これらのクローンの中から、限界希釈法により細胞を単クローン化し、以後の実験を行った。【０１３９】
（４）免疫細胞染色
ＭＣＦ７−ＭＣＴ５、ＭＤＡ−ＭＢ２３１及びＨＣＴ１１６細胞を８０％コンフルエントとなるよう培養し、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  ｔｙｐｅ  Ｉ−Ａ（新田ゼラチン社）でコートしたＧｌａｓｓ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｄｉｓｈ（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社）上に、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう播種した。１日間培養後、上記（２）に記載したＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を１０μｇ／ｍＬとなるよう培地に希釈した溶液を細胞へ添加し、氷上で１時間反応させた。１０％ＦＢＳを含む培地で洗浄した後、二次抗体として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識あるいは抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５標識で氷上、３０分間反応させた。培地で３回洗浄した後、ＰＢＳ（−）で洗浄し、蛍光顕微鏡（ＢＺ−８０００、キーエンス社）で解析した。【０１４０】
図２は、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体で、インタクトな細胞をそれぞれ染色した結果を示す。ＭＣＦ７−ＭＣＴ５細胞は、ＭＣＴ５を過剰発現させる際に、ＥＧＦＰも同時に過剰発現させているため、４８８ｎｍの励起では細胞内のＥＧＦＰによる蛍光が見られる。このため、ＭＣＦ７−ＭＣＴ５細胞の場合には、二次抗体に抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５標識を用いた。全ての細胞の場合で、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体は細胞表面に結合していることが示された。【０１４１】
（５）Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ解析
ヒト大腸がん細胞であるＨＣＴ１１６細胞を９０％コンフルエントとなるよう培養した。細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて回収し、４×１０５ｃｅｌｌｓとなるよう１％ＦＢＳを含むＰＢＳ（−）  １００ｍＬに懸濁した。この溶液に、最終濃度１０ｍｇ／ｍＬとなるようＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を添加し、氷上で６０分間反応させた。比較対象として、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を含まない溶液を添加した細胞を準備した。細胞をＰＢＳ＋１％ＰＢＳで２回洗浄後、二次抗体として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識を１／１，１０００倍に希釈した溶液を添加し、氷上で３０分間反応させた１％ＦＢＳを含むＰＢＳで２回洗浄後、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ社）で解析を行った。結果を図３に示した。【０１４２】
図３に示すように、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体は、インタクトなＨＣＴ１１６細胞と強く反応したことから、本発明の抗ＭＣＴ５抗体は、ネイティブな構造のＭＣＴ５を認識することが確認された。【０１４３】
実施例２
（１）内在化の解析
上記実施例１．で示されるように、抗ＭＣＴ５モノクローナル抗体であるＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体が細胞表面上に結合した後、ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎにより細胞内に取り込まれるかを解析した。
ヒト乳癌細胞であるＳＫ−ＢＲ３、ＭＤＡ−ＭＢ２３１及びヒト大腸癌細胞であるＨＣＴ１１６細胞をＧｌａｓｓ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｄｉｓｈ上に、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう播種した。１日間培養を行った後、氷上に１５分間静置して細胞を冷却した。培地を除去後、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を１０ｍｇ／ｍＬとなるよう培地で調製した一次抗体を添加し、氷上で３０分間反応させた。培地を用いて２回洗浄後、二次抗体として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識で氷上３０分反応させた。培地で２回洗浄した後、３７℃、５％ＣＯ２下で０、１５、３０、６０、１２０分間培養を行なった後、氷上で冷却した培地で洗浄した。さらに、細胞内のＬｙｓｏｓｏｍｅを染色するために、ＰＢＳに２００ｎＭとなるよう調製したＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  ＤＮＤ−９９（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加し、室温で１分間反応させた後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後に蛍光顕微鏡を用いて解析を行った。結果を図４に示す。【０１４４】
一方、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体であるｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（標品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）を用い、ＨＥＲ２強陽性であるＳＫ−ＢＲ３細胞を用いて上記と同様の解析を行った。その結果も図３に示す。この際、二次抗体として抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識を同様の濃度で用いた。【０１４５】
図４は、ＳＫ−ＢＲ３、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＨＣＴ１１６いずれの細胞の場合においても、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体が細胞内に取り込まれることが示された。
図４左のパネルに示したｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂは、抗体（緑の蛍光）が内在化されることが明らかにされている抗体である。Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの場合は、細胞表面上の抗体は３０分までは細胞表面に留まり、その後細胞内に取り込まれた後速やかにＬｙｓｏｓｏｍｅ（赤の蛍光）に取り込まれるため、黄色の蛍光を示す。一方、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体の場合、培養開始１５分後には細胞内への取り込みが観察され、１２０分の間で継時的に進行する事が示されたが、Ｌｙｓｏｓｏｍｅへの局在化は明確に検出されなかった。【０１４６】
（２）内在化機構の解析
Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎは細胞のエンドサイトーシスによって行われる。エンドサイトーシスは、取り込む物質の種類や大きさ、関与する細胞分子の違いによって異なるが大きく分けて、クラスリン依存性エンドサイトーシス、カベオラ依存性エンドサイトーシス、ファゴサイトーシス、ピノサイトーシスに分類されている。
受容体のような膜タンパク質の多くはクラスリン依存性エンドサイトーシスによって取り込まれ、その解析にはエンドサイトーシス阻害剤が利用される。【０１４７】
クラスリン依存性エンドサイトーシスの阻害剤であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を用い、上記実施例（１）で観察されたＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが阻害されるかを解析した。【０１４８】
上記（１）記載の方法と同様にＧｌａｓｓ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｄｉｓｈ上で培養したＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞に０．５ｍｇ／ｍＬとなるようＣｏｎＡを混合した培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で６０分間培養を行った。培地で２回洗浄後、上記の方法と同様に一次抗体、二次抗体を用いて細胞を染色し、０、３０、６０、１２０分後に蛍光顕微鏡を用いて解析を行った。【０１４９】
図５は、ＣｏｎＡで前処理することにより、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体のｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが観察した期間中において阻害されることを示している。左のパネルの０ｍｇ／ｍＬはＣｏｎＡを含まない場合の継時的な変化を示しており、右のパネルはＣｏｎＡを含んだ場合の結果を示している。ＣｏｎＡで前処理することにより、本来細胞の内部に抗体が輸送される培養時間においても、抗体が細胞表面上に留まっていることが示された。このことから、細胞膜上のＭＣＴ５に結合したＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体は、クラスリン依存性エンドサイトーシスによって取り込まれることが確認された。【０１５０】
また、ＣｏｎＡを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で６０分間処理したＨＣＴ１１６細胞との反応性を解析した。１０ｍｇ／ｍｌに調製したＩＭＩ４Ｃ４ａ、１０７、２１７、２２１、２２３、３０３、３０６及び３０１抗体と細胞とを反応させ、二次抗体として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識を用いて検出を行った。実験結果を図６に示した。３０１抗体を除く全ての抗体がＨＣＴ１１６細胞の表面に結合することが示された。
上記、実施例１（３）に記載されるように、使用した抗体は全てＩＣＤ４に結合する抗体であることから、３０１抗体はＩＣＤ４には結合するが、細胞には結合しない抗体であると考えられた。【０１５１】
Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎする抗体として解析の進んでいるｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂは、細胞外に結合した抗体はｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎするものの、速やかに細胞外へ戻されるｔｕｒｎ  ｏｖｅｒが起きると報告されている。このため、図３右パネルに示されるように０〜３０分間の培養ではｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが明確に検出できなかったと考えられる。一方、ＩＭＩ４Ｃ４ａの場合は、１５分間の培養でも明確にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが検出出来たため、取り込まれる効率が極めて良いと判断される。すなわち、低濃度の抗体−薬剤コンジュゲートでもがん細胞を殺傷出来ると考えられる。【０１５２】
実施例３
（１）抗体のビオチン化
ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体をＥＺ−ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用い、キット付属のマニュアルに従ってビオチン化した。ＰＢＳ（−）に１ｍｇ／ｍＬとなるよう調製したＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体を準備し、ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ粉末をＤＭＳＯに溶解させ、抗体溶液に添加した。３０分間室温で反応後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を１／１００量添加し、未反応のＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ試薬を不活化した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３０ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて未反応の試薬を除去するとともにＰＢＳ（−）に溶媒を置換した。【０１５３】
（２）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＺＡＰを用いた影響
抗体が細胞内に取り込まれることを利用して、がん細胞の増殖を抑制できるか解析した。培地中に５０ｎＭのビオチン化ＩＭＩ４Ｃ４ａ、３０３、３０６及び１０７抗体を添加し、１５，３０，５０ｎＭのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＺＡＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製，Ｓａｐｏｒｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ複合体）を混合し、氷上で１時間反応させた後、前日に２，５００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう播種しておいたＭＣＦ７−ＭＣＴ５細胞へ添加した。Ｓａｐｏｒｉｎはリボソーム不活性化活性を有しており、細胞内に取り込まれた場合にのみ細胞増殖を抑制する。溶液を添加後、３７℃、５％ＣＯ２下で３日間培養を行い、細胞の増殖をＷＳＴ−８（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて測定した。図７にその結果を示す。【０１５４】
図７に示されるように、一定量のビオチン化抗体に対しＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＺＡＰを増加させて添加した場合、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体の場合に顕著に増殖が阻害されていることが示された。また、実施例２．（２）に記載のように、３０１抗体は抗原であるＩＣＤ４には結合するが、細胞には結合しない抗体である。そのため、図７では、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＺＡＰ濃度を上昇させた場合でも、細胞の増殖はほとんど抑制されなかった。
以上のことから、ＩＭＩ４Ｃ４ａ抗体は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅとして細胞を殺傷することに利用できる事が示された。【０１５５】
産業上の利用可能性
本発明により、ＭＣＴ５の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体が提供される。本発明の抗体は、ＭＣＴ５を発現する癌細胞と特異的に結合し、細胞内へ抗体に結合させた分子を輸送することで癌治療に利用することができる。【０１５６】
配列表フリーテキスト
配列番号７〜９、１２〜１４、２１〜３０：合成配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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