(57)【要約】  異科接木可能であるナス科等の特定の科の植物を媒体として用いて、これとは異科の植物において形質調節物質を機能させる際の、より効率的な条件を提供すること。  送達物質として形質調節物質産生用植物ウイルスを選択し、これを、異科接木可能であるナス科等の特定の科の植物を介して異科植物へと送達すること。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナス科、アブラナ科、シソ科、又はハマウツボ科に属する植物の部分構造体を含む、形質調節物質産生用植物ウイルスの異科植物への形質調節用の送達媒体。
【請求項２】
異目植物への送達媒体である、請求項１に記載の送達媒体。
【請求項３】
前記部分構造体がナス科に属する植物の部分構造体である、請求項１又は２に記載の送達媒体。
【請求項４】
前記部分構造体がタバコ属に属する植物の部分構造体である、請求項１〜３のいずれかに記載の送達媒体。
【請求項５】
前記形質調節物質がRNA及びタンパク質からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１〜４のいずれかに記載の送達媒体。
【請求項６】
形質調節物質産生用植物ウイルスを含有する、請求項１〜５のいずれかに記載の送達媒体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の送達媒体と異科植物とが直接又は他の植物を介して接木されてなる、部分構造体。
【請求項８】
請求項７に記載の部分構造体を含む、植物体。
【請求項９】
請求項８に記載の植物体に、該植物体が含む請求項１〜６のいずれかに記載の送達媒体を介して、形質調節物質産生用植物ウイルスを送達することを含む、植物体の形質調節方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の植物体に、該植物体が含む請求項１〜６のいずれかに記載の送達媒体を介して、形質調節物質産生用植物ウイルスを送達することを含む、形質調節された植物体の製造方法。
【請求項１１】
請求項６に記載の送達媒体を異科植物に直接又は他の植物を介して接木することを含む、請求項９に記載の形質調節方法。
【請求項１２】
請求項６に記載の送達媒体を異科植物に直接又は他の植物を介して接木することを含む、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の植物体又は請求項８に記載の植物体の子孫植物体から得られる、形質調節された植物体の種子。
【請求項１４】
請求項８に記載の植物体又は請求項８に記載の植物体の子孫植物体から得られる、形質調節された植物体の種子集団。
【請求項１５】
請求項８に記載の植物体又は請求項８に記載の植物体の子孫植物体から種子を得ることを含む、形質調節された植物体の種子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物形質調節方法、及び該方法にとって有用な媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
接木とは2つ以上の植物を外科的に1つに融合する技術である。接木は、一般に裸子植物、被子植物を対象に施され、園芸、農学的に広く利用されている。一般的には、接木は、根部を構成する台木と地上部をなす穂木とを備えており、それぞれの優れた能力を共に発揮させる植物体を作製する技術である。接木の目的及び手法は多岐にわたる。例えば、果樹全般の枝変りや新品種は、接木によってクローン繁殖されることが多い。また、ナス科やウリ科をはじめとする蔬菜類では、有用な根系システムを接木により利用することで病害耐性獲得や果実等の品質・生産性の向上が果たされている。【０００３】
接木は、あらゆる組み合わせで適用できる方法ではなく、一般的に、系統関係が近いほど接木が成立しやすいとされている。接木は、少なくとも2つの植物体が接木面を介してこれら植物体が生きている状態をもって接木成立とする。概して、同種間、同属間、同科間の順に接木が成立しにくくなり、例外的に特定の異科植物間の接木が報告されている（非特許文献１、２）ものの、一般的に異科植物間では接木は成立しないとされている。【０００４】
そのような中で、本発明者らは、ナス科等の特定の科の植物が多様な異科植物と接木可能であることを報告している（特許文献１）。この技術によれば、ナス科等の特定の科の植物を媒体として用いることにより、これとは異科の植物へと微量の有用物質を送達することはある程度可能であるとされている。しかしながら、異科植物間の接木では、通常の近縁な植物種間における親和性の高い接木と比べて、物質輸送の効率が低いとされている。通常の近縁な植物種間の接木では、接木部位に発達する柔組織が分化して、接木される互いの植物の両者の組織の間を元どおりの組織に再構成し、栄養を運ぶ篩管や水を運ぶ道管がつながる。一方で、特許文献１で報告された異科接木法では、接木部位における柔組織の分化までは共通した現象として起こるが、それ以降の再組織化が近縁な植物種間で果たされる程度には確立されず、物質輸送の経路として重要な篩管や道管の発達は部分的に認められるものの、その形成方向はランダムであり、近縁な植物種間の接木と比較すると物質輸送が十分に果たされていなかった。そのため、形質調節に十分な量の物質を送達するための技術が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第2016/060189号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Simon, S.V. Jahrb. wiss. Bot., 1930. 72, 137-160.
【非特許文献２】Nickell L.G., Science, 1948. 108. 389.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、ナス科等の特定の科の植物と異科植物との接木について研究していく中で、異科植物へ形質調節物質を送達して機能させる場合、条件（例えば形質調節物質の種類や送達方法等）によってその効率に大きな差があることを見出した。【０００８】
そこで、本発明では、異科接木可能であるナス科等の特定の科の植物を媒体として用いて、これとは異科の植物において形質調節物質を機能させる際の、より効率的な条件を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題に鑑みて様々な選択肢を鋭意研究した結果、驚くべきことに送達物質として形質調節物質産生用植物ウイルスを、異科接木可能であるナス科等の特定の科の植物を介して異科植物へと送達することによって、異科植物において形質調節物質をより効率的に機能させ得ることを見出した。【００１０】
特許文献１では、接木部位において道管要素、篩管要素がランダムな方向に形成されており、また、その柔組織内では篩管要素及び道管要素がその配向が乱れていたため、通常の近縁な植物種間における接木と比べて物質輸送効率が低いことが示唆されていた。【００１１】
さらに、特許文献１で物質送達が示されているのは、単純に受動的に輸送され得る物質に関するものに限られていた。細胞間のシンプラスティックな物質輸送を担う原形質連絡については、形成されていることは示されているが、機能性については記載されていない。一般に、ウイルスは細胞間移行時に原形質連絡の構成要素と相互作用したり、構造を変化させたりして移行を可能にする、能動的な移行を必要とするものであり、ウイルスが移行時に利用する構造が、異科接木面に新たにできた原形質連絡で機能的に形成されているとは思われていなかった。【００１２】
それゆえ、本発明で、形質調節に十分な量のウイルスの移行が検出できたことで、このような能動的な移行を可能にする機能的な構造が形成されていることは、非常に驚くべきことであった。【００１３】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
項１．  ナス科、アブラナ科、シソ科、又はハマウツボ科に属する植物の部分構造体を含む、形質調節物質産生用植物ウイルスの異科植物への形質調節用の送達媒体．
項２．  異目植物への送達媒体である、項１に記載の送達媒体．
項３．  前記部分構造体がナス科に属する植物の部分構造体である、項１又は２に記載の送達媒体．
項４．  前記部分構造体がタバコ属に属する植物の部分構造体である、項１〜３のいずれかに記載の送達媒体．
項５．  前記形質調節物質がRNA及びタンパク質からなる群より選択される少なくとも1種である、項１〜４のいずれかに記載の送達媒体．
項６．  形質調節物質産生用植物ウイルスを含有する、項１〜５のいずれかに記載の送達媒体．
項７．  項１〜６のいずれかに記載の送達媒体と異科植物とが直接又は他の植物を介して接木されてなる、部分構造体．
項８．  項７に記載の部分構造体を含む、植物体．
項９．  項８に記載の植物体に、該植物体が含む項１〜６のいずれかに記載の送達媒体を介して、形質調節物質産生用植物ウイルスを送達することを含む、植物体の形質調節方法．
項１０．  項８に記載の植物体に、該植物体が含む項１〜６のいずれかに記載の送達媒体を介して、形質調節物質産生用植物ウイルスを送達することを含む、形質調節された植物体の製造方法．
項１１．  項６に記載の送達媒体を異科植物に直接又は他の植物を介して接木することを含む、項９に記載の形質調節方法．
項１２．  項６に記載の送達媒体を異科植物に直接又は他の植物を介して接木することを含む、項１０に記載の製造方法．
項１３．  項８に記載の植物体又は項８に記載の植物体の子孫植物体から得られる種子。
項１４．  項８に記載の植物体又は項８に記載の植物体の子孫植物体から得られる、形質調節された植物体の種子集団。
項１５．  項８に記載の植物体又は項８に記載の植物体の子孫植物体から種子を得ることを含む、形質調節された植物体の種子の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、異科接木可能であるナス科等の特定の科の植物を媒体として用いて、これとは異科の植物へと形質調節物質産生用植物ウイルスを送達することによって、異科植物において形質調節物質をより効率的に機能させることが可能となる。これにより、形質調節物質（例えばタンパク質、RNA等）の種類に応じて、当代、さらには次世代に亘って、植物の成長、形態、開花、結実等の各種の特性の制御、又は植物体を宿主とする細菌やウイルスなどの微生物や昆虫などの動物の誘因や防除が可能となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例1-4で得られた電気泳動ゲルの染色画像を示す。画像の上方において、At (-)はネガティブコントロール（ウイルス非感染シロイヌナズナ）のサンプルを示し、Nb (+)/At (-)は実施例1-3で得られたサンプルを示し、Nb (+)はポジティブコントロール（ウイルス感染させたベンサミアナタバコ）のサンプルを示す。画像の左側において、CMV-Z1はCMV検出用プライマーセットによりPCRした場合を示し、AtACTはシロイヌナズナアクチン遺伝子特異的プライマーセットによりPCRした場合を示し、NbACTはベンサミアナタバコアクチン遺伝子特異的プライマーセットによりPCRした場合を示す。
【図２】実施例2-4で得られた電気泳動ゲルの染色画像を示す。画像の上方において、At (-)はネガティブコントロール（ウイルス非感染シロイヌナズナ）のサンプルを示し、Nb (+)/At (-)は実施例2-3で得られたサンプルを示し、Nb (+)はポジティブコントロール（ウイルス感染させたベンサミアナタバコ）のサンプルを示す。画像の左側において、ALSVはALSV検出用プライマーセットによりPCRした場合を示し、AtACTはシロイヌナズナアクチン遺伝子特異的プライマーセットによりPCRした場合を示し、NbACTはベンサミアナタバコアクチン遺伝子特異的プライマーセットによりPCRした場合を示す。
【図３】実施例4-3で得られた植物体の写真を示す。画像の左側において白化が起こっていないシロイヌナズナの枝を示し、画像の右側において白化が起こったシロイヌナズナの枝を示す。
【図４】実施例4-4で得られた電気泳動ゲルの染色画像を示す。画像の上方において、At (-)はネガティブコントロール（ウイルス非感染シロイヌナズナ）のサンプルを示し、Nb (+)/At (-)は実施例4-3で得られたサンプルを示し、そのうちBreach (-)は白化が起こっていない枝のサンプルを示し、(+)は白化が起こった枝のサンプルを示す。画像の左側において、PDSはPDS遺伝子特異的プライマーセットによりPCRした場合を示し、AtACTはシロイヌナズナアクチン遺伝子特異的プライマーセットによりPCRした場合を示す。
【図５】実施例5-3で得られた植物体断面の蛍光写真を示す。画像の左側において、実施例5-3で得られたサンプルの茎の横断面を示し、画像の右側においてネガティブコントロール（ウイルス非感染ベンサミアナタバコを接木したシロイヌナズナ）のサンプルの茎の横断面を示す。矢印はEGFP蛍光を示し、アスタリスクで挟まれた帯状の部分は木部組織の自家蛍光を示す。白化が起こっていないシロイヌナズナの枝を示し、画像の右側において白化が起こったシロイヌナズナの枝を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１７】
1．送達媒体
本発明は、その一態様において、ナス科、アブラナ科、シソ科、又はハマウツボ科に属する植物（本明細書において、「異科接木可能な植物」と示すこともある。）の部分構造体を含む、形質調節物質産生用植物ウイルスの異科植物への形質調節用の送達媒体（本明細書において、「本発明の送達媒体」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００１８】
異科接木可能な植物は、ナス科、アブラナ科、シソ科、及びハマウツボ科の中でも、異科植物との接木をより効率的に成立させることができ、延いては形質調節物質産生用植物ウイルスをより効率的に送達できるという観点からはナス科植物が好ましい。
【００１９】
ナス科植物としては、特に限定されず、例えば、タバコ属、アントケルキス属（Anthocercis）、アントツロケ属（Anthotroche）、クレニディウム属（Crenidium）、キファンテラ属（Cyphanthera）、ドゥボイシア属（Duboisia）、グラムモソレン属（Grammosolen）、シモナンツス属（Symonanthus）、ペチュニア属、ベンタミエラ属（Benthamiella）、ボウケティア属（Bouchetia）、バンマツリ属（Brunfelsia）、コムベラ属（Combera）、ファビアナ属（Fabiana）、フンジケリア属（Hunzikeria）、レプトグロッシス属（Leptoglossis）、アマモドキ属（Nierembergia）、パンタカンタ属（Pantacantha）、カリブラコア属（Calibrachoa）、プロウマニア属（Plowmania）、トウガラシ属、リキアンテス属（Lycianthes）、ナス属、ヤルトマタ属（Jaltomata）、チョウセンアサガオ属、キダチチョウセンアサガオ属、ホオズキ属、イガホオズキ属、ハダカホオズキ属、ハシリドコロ属、ヒヨス属、ベラドンナ属、マンドラゴラ属、クコ属、カリブラコア属等に属する植物が挙げられる。これらの中でも、異科植物との接木をより効率的に成立させることができ、延いては形質調節物質産生用植物ウイルスをより効率的に送達できるという観点からは、タバコ属、アントケルキス属（Anthocercis）、アントツロケ属（Anthotroche）、クレニディウム属（Crenidium）、キファンテラ属（Cyphanthera）、ドゥボイシア属（Duboisia）、グラムモソレン属（Grammosolen）、シモナンツス属（Symonanthus）、ペチュニア属、ベンタミエラ属（Benthamiella）、ボウケティア属（Bouchetia）、バンマツリ属（Brunfelsia）、コムベラ属（Combera）、ファビアナ属（Fabiana）、フンジケリア属（Hunzikeria）、レプトグロッシス属（Leptoglossis）、アマモドキ属（Nierembergia）、パンタカンタ属（Pantacantha）、カリブラコア属（Calibrachoa）、プロウマニア属（Plowmania）、トウガラシ属、リキアンテス属（Lycianthes）、ナス属、ヤルトマタ属（Jaltomata）等が好ましく、タバコ属、ペチュニア属、トウガラシ属、ナス属等がより好ましく、タバコ属がさらに好ましい。
【００２０】
タバコ属に属する植物としては、特に限定されず、例えば、Nicotiana benthamiana、Nicotiana tabacum、Nicotiana umbratica、Nicotiana rustica、Nicotiana acuminata、Nicotiana alata、Nicotiana attenuata、Nicotiana clevelandii、Nicotiana excelsior、Nicotiana forgetiana、Nicotiana glauca、Nicotiana glutinosa、Nicotiana langsdorffii、Nicotiana longiflora、Nicotiana obtusifolia、Nicotiana paniculata、Nicotiana plumbagifolia、Nicotiana quadrivalvis、Nicotiana repanda、Nicotiana suaveolens、Nicotiana sylvestris、Nicotiana tomentosa等が挙げられる。これらの中でも、異科植物との接木をより効率的に成立させることができ、延いては形質調節物質産生用植物ウイルスをより効率的に送達できるという観点からは、Nicotiana benthamiana、Nicotiana tabacum、Nicotiana umbratica、Nicotiana rustica等が好ましく、Nicotiana benthamianaがより好ましい。
【００２１】
ペチュニア属（ツクバネアサガオ属）に属する植物としては、特に限定されず、例えば、Petunia × atkinsiana（ペチュニア）、Petunia alpicola、Petunia axillaris、Petunia bajeensis、Petunia bonjardinensis、Petunia exserta、Petunia guarapuavensis、Petunia inflata、Petunia integrifolia、Petunia interior、Petunia ledifolia、Petunia littoralis、Petunia mantiqueirensis、Petunia occidentalis、Petunia patagonica、Petunia reitzii、Petunia riograndensis、Petunia saxicola、Petunia scheideana、Petunia villadiana等が挙げられる。これらの中でも、異科植物との接木をより効率的に成立させることができ、延いては形質調節物質産生用植物ウイルスをより効率的に送達できるという観点からは、Petunia × atkinsianaが好ましい。
【００２２】
トウガラシ属に属する植物としては、特に限定されず、例えば、Capsicum annuum L.（例えば、'Grossum'（ピーマン）、'Abbreviatum'、'Acuminoum'、'Cerasiforme'、'Conoides'、'Fasciculatum'、'Longum'、'Nigrym'、'Parvo-acuminatum'等）、Capsicum baccatum、Capsicum cardenasii、Capsicum chinense Jacq. Heser & Smith、Capsicum frutescens L. 、Capsicum pubescens Ruiz & Pav.等が挙げられる。これらの中でも、異科植物との接木をより効率的に成立させることができ、延いては形質調節物質産生用植物ウイルスをより効率的に送達できるという観点からは、Capsicum annuum L.が好ましく、Capsicum annuum L. 'Grossum'（ピーマン）がより好ましい。
【００２３】
ナス属に属する植物としては、特に限定されず、例えばSolanum lycopersicum L（トマト）、Solanum melongena L（ナス）、Solanum tuberosum L、Solanum acaule Bitt、Solanum aethiopicum L、Solanum betaceum Cav、Solanum jasminoides Paxt、Solanum mammosum L、Solanum muricatum Aiton、Solanum nigrum L、Solanum pseudocapsicum L、Solanum ptychanthum Dunal等が挙げられる。これらの中でも、異科植物との接木をより効率的に成立させることができ、延いては形質調節物質産生用植物ウイルスをより効率的に送達できるという観点からは、Solanum lycopersicum L（トマト）、Solanum melongena L（ナス）等が好ましい。
【００２４】
アブラナ科植物としては、特に限定されず、例えば、シロイヌナズナ属、アブラナ属、ナズナ属、タネツケバナ属、タイリンミヤコナズナ属、アマナズナ属、セイヨウワサビ属、ヤマガラシ属、オランダガラシ属、イヌガラシ属、マメグンバイナズナ属、カラクサナズナ属、クジラグサ属、ミヤマナズナ属、イワナズナ属、ニワナズナ属、キハナハタザオ属、エダウチナズナ属、キバナスズシロ属、ダイコン属、ダイコンモドキ属、シロガラシ属、ミヤガラシ属、オオアラセイトウ属、タイセイ属、ワサビ属、グンバイナズナ属、ヤマハタザオ属、ムラサキナズナ属、イヌナズナ属、ハクセンナズナ属、タカネグンバイ属、マガリバナ属、トモシリソウ属、ヒメアラセイトウ属、アラセイトウ属、ハナダイコン属、ツノミナズナ属、ゴウダソウ属等に属する植物が挙げられる。これらの中でも、異科植物との接木をより効率的に成立させることができ、延いては形質調節物質産生用植物ウイルスをより効率的に送達できるという観点からは、シロイヌナズナ属、アマナズナ属、アブラナ属、エダウチナズナ属、キバナスズシロ属、ダイコン属、ダイコンモドキ属、シロガラシ属、ミヤガラシ属、オオアラセイトウ属、ナズナ属、タネツケバナ属、セイヨウワサビ属 、ヤマガラシ属、オランダガラシ属、イヌガラシ属等が好ましく、シロイヌナズナ属、アブラナ属、ナズナ属、タネツケバナ属等がより好ましく、シロイヌナズナ属、アブラナ属等がさらに好ましく、シロイヌナズナ属がよりさらに好ましい。
【００２５】
シロイヌナズナ属に属する植物としては、特に限定されず、例えば、Arabidopsis thaliana（シロイヌナズナ）、Arabidopsis arenicola、Arabidopsis arenosa、Arabidopsis cebennensis、Arabidopsis croatica、Arabidopsis halleri、Arabidopsis lyrata、Arabidopsis neglecta、Arabidopsis pedemontana、Arabidopsis suecica等が挙げられる。これらの中でも、異科植物との接木をより効率的に成立させることができ、延いては形質調節物質産生用植物ウイルスをより効率的に送達できるという観点からは、Arabidopsis thaliana（シロイヌナズナ）が好ましい。
【００２６】
アブラナ属に属する植物としては、特に限定されず、例えば、Brassica Oleracea（例えば、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ等）、Brassica Napus（例えば、セイヨウアブラナ等）、Brassica Barrelieri、Brassica carinata 、Brassica elongata、Brassica fruticulosa、Brassica juncea、Brassica narinosa、Brassica nigra、Brassica nipposinica、Brassica rapa、Brassica rupestris、Brassica Tournefortii等が挙げられる。これらの中でも、異科植物との接木をより効率的に成立させることができ、延いては形質調節物質産生用植物ウイルスをより効率的に送達できるという観点からは、Brassica Oleracea、Brassica Napus等が好ましく、Brassica Oleraceaがより好ましく、ブロッコリーがさらに好ましい。
【００２７】
ナズナ属に属する植物としては、特に限定されず、例えば、Capsella rubella（ルベラナズナ）、Capsella abscissa、Capsella andreana、Capsella australis、Capsella austriaca、Capsella bursa-pastoris、Capsella divaricata、Capsella draboides、Capsella gracilis、Capsella grandiflora、Capsella humistrata、Capsella hybrida、Capsella hyrcana、Capsella integrifolia、Capsella lycia、Capsella mexicana、Capsella orientalis、Capsella pillosula、Capsella pubens、Capsella puberula、Capsella schaffneri、Capsella stellata、Capsella tasmanica、Capsella thomsoni、Capsella thracica、Capsella viguieri、Capsella villosula等が挙げられる。これらの中でも、異科植物との接木をより効率的に成立させることができ、延いては形質調節物質産生用植物ウイルスをより効率的に送達できるという観点からは、Capsella rubella（ルベラナズナ）が好ましい。
【００２８】
タネツケバナ属に属する植物としては、特に限定されず、例えば、Cardamine hirsuta（ミチタネツケバナ）、Cardamine anemonoides、Cardamine appendiculata、Cardamine arakiana、Cardamine dentipetala、Cardamine dentipetala var. longifructa、Cardamine fallax、Cardamine impatiens、Cardamine kiusiana、Cardamine leucantha、Cardamine lyrata、Cardamine niigatensis、Cardamine nipponica、Cardamine pratensis、Cardamine regeliana、Cardamine schinziana、Cardamine scutata、Cardamine tanakae、Cardamine torrentis、Cardamine valida等が挙げられる。これらの中でも、異科植物との接木をより効率的に成立させることができ、延いては形質調節物質産生用植物ウイルスをより効率的に送達できるという観点からは、Cardamine hirsuta（ミチタネツケバナ）が好ましい。
【００２９】
シソ科植物としては、特に限定されず、例えば、シソ属、ラベンダー属、ムラサキシキブ属、ハマゴウ属、チーク属、ハマクサギ属、キランソウ属、クサギ属、カリガネソウ属、ルリハッカ属、ニガクサ属、シモバシラ属、ナギナタコウジュ属、ヤマジソ属、カワミドリ属、イヌハッカ属、オレガノ属、ハッカ（メンサ）属、ムシャリンドウ属、カキドオシ属、ヤナギハッカ属、ウツボグサ属、シロネ属、ラショウモンカズラ属、セイヨウヤマハッカ属、ヤグルマハッカ属、アキギリ属、キダチハッカ属、ローズマリー属、イブキジャコウソウ属 、トウバナ属、ヤマハッカ属、イガニガクサ属、メボウキ属、タツナミソウ属、イヌゴマ属、スズコウジュ属、オドリコソウ属、チシマオドリコソウ属、ジャコウソウ属、ミズトラノオ属、テンニンソウ属、メハジキ属、マネキグサ属、ヤンバルツルハッカ属、ニガハッカ属等に属する植物が挙げられる。これらの中でも、異科植物との接木をより効率的に成立させることができ、延いては形質調節物質産生用植物ウイルスをより効率的に送達できるという観点からは、シソ属、ラベンダー属、シモバシラ属、ナギナタコウジュ属、ヤマジソ属、カワミドリ属、イヌハッカ属、オレガノ属、ハッカ属、ムシャリンドウ属、カキドオシ属、ヤナギハッカ属、ウツボグサ属、シロネ属、ラショウモンカズラ属、セイヨウヤマハッカ属、ヤグルマハッカ属、アキギリ属、キダチハッカ属、ローズマリー属、イブキジャコウソウ属、トウバナ属、ヤマハッカ属、イガニガクサ属、メボウキ属等が好ましく、シソ属、ラベンダー属等がより好ましく、シソ属がさらに好ましい。
【００３０】
シソ属に属する植物としては、特に限定されず、例えば、Perilla frutescens（例えば、シソ、エゴマ等）が挙げられる。中でも、異科植物との接木をより効率的に成立させることができ、延いては形質調節物質産生用植物ウイルスをより効率的に送達できるという観点からは、Perilla frutescensが好ましく、シソがより好ましい。
【００３１】
ラベンダー属に属する植物としては、特に限定されず、例えば、Lavandula angustifolia（ラベンダー）、Lavandula latifolia、Lavandula stoechas、Lavandula multifida、Lavandula × intermedia等が挙げられる。これらの中でも、異科植物との接木をより効率的に成立させることができ、延いては形質調節物質産生用植物ウイルスをより効率的に送達できるという観点からは、Lavandula angustifolia（ラベンダー）が好ましい。
【００３２】
ハマウツボ科植物としては、特に限定されず、例えば、コシオガマ属、Castilleja属、Orthocarpus属、Agalinis属、Aureolaria属、Esterhazya属、Seymeria属、Lamourouxia属、Cordylanthus属、Triphysaria属、ナンバンギセル属、オニク属、ホンオニク属、ハマウツボ属、キヨスミウツボ属、コゴメグサ属、ヤマウツボ属、ママコナ属、クチナシグサ属、セイヨウヒキヨモギ属、シオガマギク属、ヒキヨモギ属、ストライガ属等に属する植物が挙げられる。これらの中でも、異科植物との接木をより効率的に成立させることができ、延いては形質調節物質産生用植物ウイルスをより効率的に送達できるという観点からは、コシオガマ属、シオガマギク属、Castilleja属、Orthocarpus属、Agalinis属、Aureolaria属、Esterhazya属、Seymeria属、Lamourouxia属、Cordylanthus属、Triphysaria属等が好ましく、コシオガマ属がより好ましい。
【００３３】
コシオガマ属に属する植物としては、特に限定されず、例えば、Phtheirospermum japonicum（コシオガマ）、Phtheirospermum glandulosum、Phtheirospermum muliense、Phtheirospermum parishii、Phtheirospermum tenuisectum等が挙げられる。これらの中でも、異科植物との接木をより効率的に成立させることができ、延いては形質調節物質産生用植物ウイルスをより効率的に送達できるという観点からは、Phtheirospermum japonicum（コシオガマ）が好ましい。
【００３４】
上記した異科接木可能な植物の「部分構造体」とは、異科接木可能な植物の全体における任意の一部分からなる構造体であって、接木可能な構造体である限り、特に制限されない。例えば地下部全体又はその一部からなる構造体、地下部全体又はその一部と地上部全体又はその一部とからなる構造体、地上部全体又はその一部からなる構造体等が挙げられる。なお、本明細書において、地下部としては、地下に埋没して存在し得る構造である限り特に制限されず、例えば根、地下茎等が挙げられる。また、本明細書において、地上部としては、地上に露出して存在し得る構造である限り特に制限されず、例えば茎、幹、枝、葉柄、葉、芽、花等が挙げられる。
【００３５】
本発明の送達媒体は、異科接木可能な植物の部分構造体を含む限りにおいて特に制限されず、異科接木可能な植物の部分構造体（1又は複数）のみからなるものであってもよいし、異科接木可能な植物の構造全体であってもよい。2種以上の部分構造体を含む場合、各部分構造体は、通常、接木された状態である。
【００３６】
本発明の送達媒体は、異科植物と接木可能な構造体である限り、特に制限されない。例えば地下部全体又はその一部からなる構造体、地下部全体又はその一部と地上部全体又はその一部とからなる構造体、地上部全体又はその一部からなる構造体等が挙げられる。
【００３７】
本発明の送達媒体の形態は、異科接木可能な形態である限り特に制限されない。より効率的に異科接木が可能であるという観点から、本発明の送達媒体は、その一部において、接木に適した面を有することが好ましい。接木に適した面としては、公知の各種の形態、例えば平坦状、V字状等の凹状、突起状の凸状等、必要に応じて良好な接触が得られるような切断面が挙げられる。
【００３８】
本発明の送達媒体は、後述の「3．形質調節方法」で説明されるように、異科植物に接木することにより（或いは、異科植物に接木した状態で）用いられ得るものであり、該送達媒体を介して形質調節物質産生用植物ウイルスを異科植物へ送達して、形質を調節するために用いられ得る。
【００３９】
この用途の観点から、本発明の送達媒体は、細胞分裂など細胞活動が活発な組織、例えば、前形成層などを含む柔組織を含むことが好ましい。柔組織が良好な接木を媒介することができると考えられるからである。柔組織は、柔細胞からなる植物の組織をいう。柔組織としては、例えば茎・根の皮層・髄，葉の柵状組織・海綿状組織、維管束の木部柔組織・篩部柔組織、果実の果肉、塊茎・塊根その他の貯蔵組織などが挙げられる。
【００４０】
なお、本発明において、接木は、公知の方法に従って又は準じて行うことができる。本発明において、接木は、典型的には、植物の任意の部位（例えば茎上の任意の部位）を切断して2以上の接木用部分構造体（例えば台木、中間台木、穂木等）を得る工程（工程1）、及び接木用部分構造体の切断面同士を接触させて栽培する工程（工程2）を含む方法によって行うことができる。
【００４１】
工程1において、接木用部分構造体の切断面は、切断面同士の接触面積がより広くなる形態に加工されることが好ましい。例えば、一方の切断面中央部に1〜2 cm程度の切れ込みを入れ、他方の切断面をV字型に切削することが挙げられる。これらの加工は、例えば片刃のカミソリを用いて行うことができる。
【００４２】
工程2において、切断面同士の接触の態様は特に制限されない。接触は、接木用部分構造体にダメージを与えぬように静かに行うことが望ましい。
【００４３】
工程2において、接触後は、接触部位ができる限り動かないように、接触部位を固定することが好ましい。固定は、例えば接触部位をパラフィルム等のシート状のもので巻くことにより行うことができる。
【００４４】
工程2における栽培の初期（例えば接触から3〜14日間）においては、地上部側の接木用部分構造体（例えば、穂木、中間台木等）全体を保湿状態に保つことが望ましい。保湿は、例えば水を霧吹きしたプラスチックバックで地上部側の接木用部分構造体全体を覆うことによって行うことができる。
【００４５】
工程2における栽培の初期において保湿処理した場合、栽培の後期（例えば接触から〜30日間）においては保湿処理が無い状態で栽培することが好ましい。
【００４６】
3つの接木用部分構造体を接木する場合、先に2つの接木用部分構造体を上記工程1及び2により接木し、得られた植物体から得られた接木用部分構造体と3つ目の接木用部分構造体を接木することが望ましい。4つ以上の接木用部分構造体を接木する場合も、これに準じた方法で接木することが望ましい。
【００４７】
本発明の送達媒体と接木される「異科植物」は、本発明の送達媒体とは異科に属する植物である限り特に制限されない。特許文献１に示されるように、本発明の送達媒体は、シダ植物、裸子植物、被子植物のモクレン類、単子葉類、真正双子葉類（バラ類I、バラ類II、キク類I、キク類II及びそれらの外群）を含む広い範囲の植物との接木を成立させることができる。異科植物の具体例としては、アオイ科、アブラナ科、キク科、ヤナギ科、キンポウゲ科、クスノキ科、センリョウ科、ドクダミ科、サトイモ科、シソ科、スミレ科、セリ科、ツゲ科、ツツジ科、タデ科、ヒユ科、ヒルガオ科、バラ科、ビャクダン科、フウチョウソウ科、フウロソウ科、ブドウ科、ブナ科、スイカズラ科、マツムシソウ科、マメ科、ミカン科、ムクロジ科、ヤマモガシ科、ユキノシタ科、キョウチクトウ科、リンドウ科、オシダ科、ヒノキ科、ウリ科、ナス科、ゴマ科、オオバコ科、ハマウツボ科、アゼナ科、フウチョウボク科、カリケラ科、クサトベラ科、ミツガシワ科、スティリディウム科、ヒメハギ科、スリアナ科、ムンティンギア科、キティヌス科、フタバガキ科、サルコラエナ科、ハンニチバナ科、ベニノキ科、スファエロセパルム科、テトラメレス科、ベゴニア科、ダティスカ科、メギ科、ツヅラフジ科、ヒブリス科、スチルベ科、ゴマノハグサ科、サギゴケ科、ハエドクソウ科、キリ科、コショウ科、ディディメラ科、キンモウワラビ科、ツルキジノオシダ科、タマシダ科、ナナバケシダ科、ツルシダ科、ウラボシ科、シノブ科、キンモウワラビ科、ツルキジノオシダ科、タマシダ科、ナナバケシダ科、ツルシダ科、ウラボシ科、シノブ科等に属する植物が挙げられる。
【００４８】
本発明の送達媒体がナス科タバコ属植物の部分構造体を含む場合、これと接木される異科植物としては、好ましくは食用とされる植物である58科620種に及ぶ双子葉類、20科213種に及ぶ単子葉類、シダ類16種が挙げられる。
【００４９】
前記食用とされる植物のうち、双子葉類では、ダイズ、アズキ、エンドウ、ササゲなど68種のマメ科植物、キュウリ、メロン、スイカ、カボチャなど57種のウリ科植物、タバコ、ナス、トマト、ピーマンなどの63種のナス科植物、シュンギク、フキ、ゴボウ、レタスなどの57種のキク科植物、ニンジン、パセリ、ミツバ、セロリなど24種のセリ科植物、スイバ、タデ、ダイオウルバーブ、ソバなど23種のタデ科植物、ホウレンソウ、オカヒジキ、フダンソウ、ビートなど44種のヒユ科植物が挙げられる。
【００５０】
また、前記食用とされる植物のうち、単子葉類では、50種のユリ科植物、22種のサトイモ科植物、26種のヤマノイモ科植物、40種のイネ科植物が挙げられる。さらに、ミカン科、ヤシ科などの木本植物と、31科149種の香辛料類が含まれる。
【００５１】
本発明の送達媒体がナス科ペチュニア属、トウガラシ属、ナス属等の植物の部分構造体を含む場合、これと接木される異科植物としては、好ましくはアブラナ科、フウチョウソウ科、フウチョウボク科、キク科、カリケラ科、クサトベラ科、ミツガシワ科、スティリディウム科、キョウチクトウ科、リンドウ科、マメ科、ヒメハギ科、スリアナ科等が挙げられ、より好ましくはアブラナ科、キク科、キョウチクトウ科、マメ科等に属する植物が挙げられる。
【００５２】
本発明の送達媒体がシロイヌナズナ属植物などのアブラナ科植物の部分構造体を含む場合、これと接木される異科植物としては、好ましくはキク科、カリケラ科、クサトベラ科、ミツガシワ科、スティリディウム科、アオイ科、ムンティンギア科、キティヌス科、フタバガキ科、サルコラエナ科、ハンニチバナ科、ベニノキ科、スファエロセパルム科、ウリ科、テトラメレス科、ベゴニア科、ダティスカ科、キンポウゲ科、メギ科、ツヅラフジ科、アゼナ科、ヒブリス科、スチルベ科、オオバコ科、ゴマノハグサ科、シソ科、サギゴケ科、ハエドクソウ科、キリ科、ナス科、ヒルガオ科、マメ科、ヒメハギ科、スリアナ科、キョウチクトウ科、リンドウ科、ハマウツボ科等が挙げられ、より好ましくはキク科、アオイ科、ウリ科、キンポウゲ科、アゼナ科、オオバコ科、シソ科、ナス科、ヒルガオ科、マメ科、キョウチクトウ科、ハマウツボ科に属する植物が挙げられる。
【００５３】
本発明の送達媒体がシソ属植物などのシソ科植物の部分構造体を含む場合、これと接木される異科植物としては、好ましくは、アブラナ科、フウチョウソウ科、フウチョウボク科、マメ科、ヒメハギ科、スリアナ科、キク科、カリケラ科、クサトベラ科、ミツガシワ科、スティリディウム科、ウリ科、テトラメレス科、ベゴニア科、ダティスカ科、ナス科、ヒルガオ科、ドクダミ科、コショウ科、キョウチクトウ科、リンドウ科、ツゲ科、ディディメラ科、ハマウツボ科、サギゴケ科、ハエドクソウ科、キリ科等が挙げられ、より好ましくはアブラナ科、マメ科、キク科、ウリ科、ナス科、ドクダミ科、キョウチクトウ科、ツゲ科、ハマウツボ科等に属する植物が挙げられる。
【００５４】
本発明の送達媒体がコシオガマ属植物などのハマウツボ科植物の部分構造体を含む場合、これと接木される異科植物としては、好ましくは、キョウチクトウ科、リンドウ科、キク科、カリケラ科、クサトベラ科、ミツガシワ科、スティリディウム科、マメ科、ヒメハギ科、スリアナ科、ツゲ科、ディディメラ科、ドクダミ科、コショウ科、オシダ科、キンモウワラビ科、ツルキジノオシダ科、タマシダ科、ナナバケシダ科、ツルシダ科、ウラボシ科、シノブ科、ウリ科、テトラメレス科、ベゴニア科、ダティスカ科、ナス科、ヒルガオ科、アブラナ科、フウチョウソウ科、フウチョウボク科等が挙げられ、より好ましくはキョウチクトウ科、キク科、マメ科、ツゲ科、ドクダミ科、オシダ科、ウリ科、ナス科、アブラナ科等に属する植物が挙げられる。
【００５５】
本発明の送達媒体を介して異科植物へと送達される形質調節物質産生用植物ウイルスとは、形質調節物質を植物体内で産生可能な植物ウイルスである限り特に制限されない。
【００５６】
形質調節物質は、植物ウイルスから産生可能なものである限り特に制限されない。形質調節物質としては、例えばRNA、タンパク質等が挙げられる。RNAにはsiRNA等のnon-coding RNAも含まれる。siRNAの標的遺伝子、RNAの由来遺伝子、及びタンパク質の由来遺伝子としては、例えば、PEBP遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばFT遺伝子、TFL1遺伝子など）、MADS遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばSOC1遺伝子、AP1遺伝子、AP3遺伝子、AG遺伝子、FLC遺伝子など）、LFY遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばLFY遺伝子、FLO遺伝子など）、bZIP遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばFD遺伝子、ABI5遺伝子など）、bHLH遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばPIF3遺伝子、SPCH遺伝子など）、AP2遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばAP2遺伝子、PLT遺伝子など）、ARF遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばETT遺伝子、MP遺伝子など）、BZR遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばBZR1遺伝子、BES1遺伝子など）、CCT遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばCO遺伝子、TOC1遺伝子など）、Dof遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばCDF1遺伝子、OBP1遺伝子など）、YABBY遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばFIL遺伝子、CRC遺伝子など）、C2H2-zinc finger遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばJAG遺伝子、KNU遺伝子、SUP遺伝子など）、G2-like遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばKAN1遺伝子、LUX遺伝子、APL遺伝子など）、GRAS遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばRGA1遺伝子、LAS遺伝子など）、GRF遺伝子ファミリーに属する遺伝子、Homeobox遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えば、BELサブファミリーに属するBEL1遺伝子など、HD-zipサブファミリーに属するLMI1遺伝子、HAT1遺伝子、PHB遺伝子、ATML1遺伝子など、KNOXサブファミリーに属するSTM遺伝子、BP遺伝子、KNAT3遺伝子など、WOXサブファミリーに属するWUS遺伝子、WOX9遺伝子など）、HSF遺伝子ファミリーに属する遺伝子、MYB遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばGL1遺伝子、RAX1遺伝子など）、MYB-related遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばCCA1遺伝子、CPC遺伝子など）、NAC遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばCUC1遺伝子、VND6遺伝子など）、PHD遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばMS1遺伝子など）、SBP遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばSPL3遺伝子、SPL9遺伝子など）、TCP遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばTb1遺伝子、CYC遺伝子、CIN遺伝子など）、Trihelix遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばPTL遺伝子など）、VOZ遺伝子、WRKY遺伝子ファミリーに属する遺伝子、TAW1遺伝子、BTB/POZ遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばBOP1遺伝子など）、ペプチドホルモン（例えばCLE、RGF/CLEL/GLV、PSK、PSY、CEP、IDA、SCRL、LURE、EPF、RALF，ESF1など）をコードする遺伝子、LRR-RK遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばCLV1遺伝子、ER遺伝子など）、F-box遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えばUFO遺伝子、FKF遺伝子など）、植物ホルモン（例えばオーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、エチレン、アブシジン酸、ブラシノステロイド、ジャスモン酸、サリチル酸、ストリゴラクトンなど）の生合成遺伝子（例えばYUC遺伝子、IPT遺伝子、GAox遺伝子、ACS遺伝子、NCED遺伝子、DWF4遺伝子、DAD1遺伝子、ICS遺伝子、CCD遺伝子など）、受容体をコードする遺伝子（例えばTIR1遺伝子、AHK2遺伝子、GID1遺伝子、ETR1遺伝子、PYR遺伝子、BRI1遺伝子、COI1遺伝子、NPR3遺伝子、D14遺伝子など）、シグナル伝達に関与する遺伝子（例えばAux/IAA遺伝子、ARR遺伝子、DELLA遺伝子、CTR1遺伝子、PP2A遺伝子、BSK1遺伝子、JAZ遺伝子、NPR1遺伝子、SMAX1遺伝子など）、光受容体をコードする遺伝子（例えばPHY遺伝子、CRY遺伝子、PHOT遺伝子など）、マイクロRNAをコードする遺伝子（例えばMIR156遺伝子、MIR165遺伝子など）、一次代謝産物または二次代謝産物の生合成に関わる酵素をコードする遺伝子（例えばFAD2遺伝子、GAD遺伝子など）等が挙げられる。
【００５７】
なお、本明細書において、「産生」とは、例えば形質調節物質がsiRNAである場合は、形質調節物質産生用植物ウイルスのゲノムが植物内で切断されてsiRNAが生じることや、形質調節物質産生用植物ウイルスのゲノムからRNAが転写され、該RNAから形成されたdsRNA（二本鎖RNA）が切断されてsiRNAが生じること等が挙げられ、形質調節物質がタンパク質である場合は、形質調節物質産生用植物ウイルスのゲノムからmRNAが転写され、該mRNAが翻訳されてタンパク質が生じることが挙げられる。
【００５８】
なお、本明細書において、「形質」には、ある植物において次世代に遺伝する形質のみならず、ある植物の当代限りにおいて現れる形質も包含される。
【００５９】
植物ウイルスは、本発明の送達媒体やそれと接木される植物において感染可能であり、且つ本発明の送達媒体を介して送達された異科植物において形質調節物質を発現し得る植物ウイルスである限り特に制限されない。植物ウイルスとしては、例えばキュウリモザイクウイルス、アフリカキャッサバモザイクウイルス、リンゴ小球形潜在ウイルス、オオムギ斑葉モザイクウイルス、Bean pod mottle virus、Beet curly top virus、Brome mosaic virus、Cabbage leaf curl virus、Cotton leaf crumple virus、シンビジュームモザイクウイルス、ブドウAウイルス、Pea early browning virus、Poplar mosaic virus、ジャガイモXウイルス、Rice tungro bacilliform virus、サテライトタバコモザイクウイルス、Tobacco curly shoot virus、タバコモザイクウイルス、タバコ茎えそウイルス、トマトモザイクウイルス、foxtail mosaic virus、pepino mosaic virus、narcissus mosaic virus、bean yellow dwarf virus、tobacco yellow dwarf virus、wheat dwarf virus、maize streak virus、barley stripe mosaic virus、cowpea mosaic virus、beet yellows virus、beet western yellows virus、white clover mosaic virus等が挙げられる。植物ウイルスと植物との好適な組合せについては、各種文献で報告されており、例えば文献a（Trends in Plant Science, December 2011, Vol.16, No.12, pp656-665.）や文献b（ウイルス、第60巻、第2号、pp.155-162、2010.）等において報告されている。植物ウイルスは、これらの公知の情報に基づいて適宜選択することができる。
【００６０】
形質調節物質産生用植物ウイルスのゲノムには、上記植物ウイルスのゲノム領域の他に、形質調節物質を発現するための領域が含まれる。該領域としては、形質調節物質がsiRNAである場合であれば、例えば該siRNAの標的遺伝子のプロモーター配列、該siRNAの標的遺伝子のコード配列、該siRNAを発現させるために必要な配列（例えば植物内で機能するプロモーター配列、切断されて該siRNAを生じるRNAをコードする配列等）等が挙げられる。該領域の別の例としては、形質調節物質がタンパク質である場合であれば、例えば該タンパク質を発現させるために必要な配列（例えば植物内で機能するプロモーター配列、該タンパク質をコードする配列等）等が挙げられる。該領域の別の例としては、形質調節物質をウイルスの遺伝子との融合遺伝子として発現させるための配列が挙げられる。形質調節物質がsiRNAである場合であれば、例えば該siRNAの標的遺伝子のプロモーター配列、該siRNAの標的遺伝子のコード配列、切断されて該siRNAを生じるRNAをコードする配列等をウイルスの遺伝子の転写産物と融合した形で発現させることができる。形質調節物質がタンパク質である場合であれば、該タンパク質とウイルスのタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできるが、該タンパク質とウイルスのタンパク質とのリンカー配列中にペプチダーゼ認識配列（例えば2Aペプチド配列など）等を付与することにより、該タンパク質をウイルスのタンパク質から切り離した状態で発現させることもできる。また、ウイルスゲノム上のサブゲノミックプロモーターにより、単独のタンパク質として発現させることもできる。
【００６１】
本発明の送達媒体は、該送達媒体を介して形質調節物質産生用植物ウイルスを異科植物へ送達して形質を調節するために用いられる限りにおいて形質調節物質産生用植物ウイルスを含有するものでなくてもよいが、後述の「3．形質調節方法」で説明されるようにより簡便にウイルス送達ができるという観点からは、好ましくは形質調節物質産生用植物ウイルスを含有する。含有されるウイルスの量としては特に制限されないが、具体的には、本発明の送達媒体1つ当たり、例えば0.05fg〜100mgであり、好ましくは50fg〜100mgであり、より好ましくは、50pg〜100mgであり、さらに好ましくは50pg〜10mgである。
【００６２】
本発明の送達媒体は、公知の方法に従って又は準じて製造することができる。
【００６３】
本発明の送達媒体の製造方法の1つ目の例（製造例1）として、本発明の送達媒体が異科接木可能な植物の部分構造体1種のみからなるものである場合であれば、例えば該異科接木可能な植物を定法に従って栽培し、その一部を切り取る方法が挙げられる。
【００６４】
本発明の送達媒体の製造方法の2つ目の例（製造例2）として、本発明の送達媒体が、異科接木可能な植物の部分構造体2種からなるものである場合であれば、例えば2種の異科接木可能な植物を接木してなる植物体を作製した後、2種それぞれの部分構造体を含む部位を切り取る方法が挙げられる。
【００６５】
本発明の送達媒体の製造方法の3つ目の例（製造例3）として、本発明の送達媒体が、形質調節物質産生用植物ウイルスを含有する場合であれば、異科接木可能な植物又はその部分構造体を含む植物に形質調節物質産生用植物ウイルスを感染させた後、異科接木可能な植物の部分構造体を含む部位を切り取る方法が挙げられる。
【００６６】
なお、本発明において、形質調節物質産生用植物ウイルスの感染は、公知の方法に従って又は準じて行うことができる。
【００６７】
形質調節物質産生用植物ウイルスの感染方法の1つ目の例（感染例1）としては、プロモーター（例えばT7プロモーター、T3プロモーター、35Sプロモーター等）、及びその下流に形質調節物質産生用植物ウイルスのゲノム（植物ウイルスのゲノム領域、及び形質調節物質を発現するための領域を含む）を含むプラスミドを準備する工程（工程a1）、工程a1で得られたプラスミドから、試験管内転写により、形質調節物質産生用植物ウイルスのゲノムRNAを得る工程（工程b1）、及び工程b1で得られたゲノムRNAを植物に接種（例えば、摩擦接種法、パーティクルガン接種法等）する工程（工程c1）を含む方法によって行うことができる。或いは、工程a1で得られたプラスミドが35Sプロモーター等の植物細胞内で転写活性化能を持つプロモーターを含むTiプラスミドである場合であれば、上記工程b1及びc1に代えて、例えば工程a1で得られたプラスミドをアグロバクテリアに導入して培養する工程（工程b2）、及び工程b2で得られた培養液を植物に接種（例えば、インフィルトレーション法、爪楊枝接種法、吸引注入法等）する工程（工程c2）を含む方法によって行うことができる。或いは、上記工程b1及びc1に代えて、例えば工程a1で得られたプラスミドを植物に接種（例えば磨砕接種法、パーティクルガン接種法等）する工程（工程c3）を含む方法によって行うことができる。或いは、上記工程c2に代えて、安定的形質転換体を作出（例えばリーフディスク法や花序浸潤法、減圧濾過法等）する工程（工程c4）を含む方法によって行うことができる。これらの方法により植物内に導入されたゲノムRNAやプラスミド、T-DNAから、形質調節物質産生用植物ウイルスが産生される。
【００６８】
形質調節物質産生用植物ウイルスの感染方法の2つ目の例（感染例2）としては、（例えば上記感染例1によって得られた）形質調節物質産生用植物ウイルスを含む植物から、該ウイルスを採取する工程（工程d1）、及び工程d1で採取された該ウイルスを植物に接種する工程（工程e1）を含む方法が挙げられる。工程d1における採取は、例えば形質調節物質産生用植物ウイルスを含む植物の一部（例えば、葉等）を磨砕することにより得られるウイルス液を回収することにより行うことができる。工程e1における接種は、例えば炭化ケイ素等の研磨剤を用いて植物の接種対象部位（例えば、葉等）に傷をつけ、そこにウイルスを接触させることにより行うことができる。
【００６９】
2．植物体
本発明は、その一態様において、本発明の送達媒体と異科植物とが直接又は他の植物を介して接木されてなる、部分構造体（本明細書において、「本発明の部分構造体」と示すこともある。）、及び本発明の部分構造体を含む、植物体（本明細書において、「本発明の植物体」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００７０】
本発明の部分構造体における異科植物としては、上記「1．送達媒体」で説明した「本発明の送達媒体と接木される異科植物」と同様のものを採用することができる。
【００７１】
本発明の部分構造体には、本発明の送達媒体と異科植物とが直接接木されてなる部分構造体、及び本発明の送達媒体と異科植物とが他の植物を介して接木されてなる部分構造体が包含される。後者の場合、他の植物としては、特に制限されず、本発明の送達媒体が含む異科接木可能な植物の部分構造体と同科の植物であってもよい。本発明の部分構造体の具体例としては、植物の一方の側（例えば、任意の根、茎、枝、葉等の先端側）から、本発明の送達媒体、異科植物の順に接木されてなる部分構造体や、植物の一方の側（例えば、任意の根、茎、枝、葉等の先端側）から、本発明の送達媒体、他の植物、異科植物の順に接木されてなる部分構造体が挙げられる。
【００７２】
本発明の植物体には、本発明の部分構造体のみからなる植物体、及び本発明の部分構造体と他の（1又は複数の）植物とが接木されてなる植物体が包含される。後者の場合、他の植物としては、特に制限されない。本発明の植物体の具体例としては、植物の一方の側（例えば、任意の根、茎、枝、葉等の先端側）から、本発明の送達媒体、異科植物の順に接木されてなる植物体、植物の一方の側（例えば、任意の根、茎、枝、葉等の先端側）から、本発明の部分構造体、（1又は複数の）他の植物の順に接木されてなる植物体、植物の一方の側（例えば、任意の根、茎、枝、葉等の先端側）から、（1又は複数の）他の植物、本発明の部分構造体、（1又は複数の）他の植物の順に接木されてなる植物体等が挙げられる。
【００７３】
3．形質調節方法
本発明は、その一態様において、本発明の植物体に、該植物体が含む本発明の送達媒体を介して、形質調節物質産生用植物ウイルスを送達することを含む、植物体の形質調節方法（本明細書において、「本発明の形質調節方法」と示すこともある。）に関する。また、本発明は、これと同様の工程を含む、形質調節された植物体の製造方法にも関する。以下、これらについて説明する。
【００７４】
本発明の形質調節方法によって、本発明の送達媒体を介してこれとは異科植物に形質調節物質産生用植物ウイルスを送達することができ、該異科植物において形質調節物質を発現させることができる。
【００７５】
形質調節物質産生用植物ウイルスの送達の方法は、本発明の送達媒体を介する限りにおいて特に制限されない。該方法には、本発明の植物体中の本発明の送達媒体部位に形質調節物質産生用植物ウイルスを感染させる方法以外にも、本発明の植物体が本発明の送達媒体を介して直接又は間接的に2つの植物（少なくとも1方は異科植物）が接木されてなる構造を有している場合であれば、本発明の送達媒体以外の部位に形質調節物質産生用植物ウイルスを感染させる方法等が包含される。後者の例であっても、本発明の送達媒体を介した一方の側に形質調節物質産生用植物ウイルスが感染すれば、該ウイルスは、本発明の送達媒体を介して（通って）もう一方の側（異科植物側）に送達されることになる。
【００７６】
上記のように本発明の植物体にウイルスを感染させる方法以外にも、本発明の送達媒体が形質調節物質産生用植物ウイルスを含有する場合であれば、本発明の送達媒体を異科植物に直接又は他の植物を介して接木することにより、それによって得られる本発明の植物体に、本発明の送達媒体を介して、形質調節物質産生用植物ウイルスを送達することができる。この方法であれば、より簡便にウイルス送達が可能である。該方法においては、接木されれば、本発明の送達媒体中のウイルスが異科植物へと送達されることとなり、該異科植物において形質調節物質を発現させることができる。
【００７７】
4．形質調節された植物体の種子
本発明は、その一態様において、本発明の植物体又は本発明の植物体の子孫植物体から得られる、形質調節された植物体の種子（本明細書において、「本発明の種子」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００７８】
本発明の種子は、本発明の形質調節方法により形質調節された本発明の植物体、又は該植物体の子孫植物体から得られる種子であり、この限りにおいて特に制限されない。ここで、子孫植物体とは、ある植物体（F0）の種子が発芽して得られる植物体（F1）のみならず、それ以降の子孫世代（F2以降）も包含する。
【００７９】
5．形質調節された植物体の種子集団
本発明は、その一態様において、本発明の植物体又は本発明の植物体の子孫植物体から得られる、形質調節された植物体の種子集団（本明細書において、「本発明の種子集団」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００８０】
本発明の種子集団は、本発明の形質調節方法により形質調節された本発明の植物体、又は該植物体の子孫植物体から得られる種子集団であり、この限りにおいて特に制限されない。子孫植物体については、上記「4．形質調節された植物体の種子」における定義と同じである。
【００８１】
本発明の種子集団は、本発明の形質調節方法により形質調節された本発明の植物体、又は該植物体の子孫植物体から得られているが故に、効率的に形質調節されている。すなわち、本発明の種子集団においては、個体再生を必要とする従来の形質調節法よりもゲノムDNAの損傷が少ない。
【実施例】
【００８２】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００８３】
実施例1：ウイルス送達試験1
ウイルス感染させたベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）と、これとは異科に属するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）とを接木し、一定期間経過後にシロイヌナズナの組織中に植物ウイルスが検出されるか否かを調べた。検出されれば、ベンサミアナタバコを介して、異科植物にウイルスが移行したことを示す。具体的には、以下のように行った。【００８４】
＜実施例1-1．ウイルス感染させたベンサミアナタバコの調製＞
培養土にベンサミアナタバコの種子を播種し、連続恒明条件下の植物栽培棚で1〜2ヶ月栽培した。別途用意された、既にCMV（キュウリモザイクウイルス）に感染した植物の葉を、酸化酵素阻害剤として10mM DIECA（ジエチルジチオカルバミド酸）を含む0.1 Mリン酸緩衝液中で液状になるまで磨砕し、ウイルス液を作製した。栽培後のベンサミアナタバコの任意の葉にカーボランダム（炭化ケイ素）を振りかけ、そこへウイルス液を6μL滴下した後、葉表面全体をこすった。水道水で接種葉表面を洗い流し、連続恒明条件下の植物栽培棚で、さらに1週間栽培した。得られた植物体を以下の接木処理に供した。【００８５】
＜実施例1-2．シロイヌナズナの調製＞
培養土にシロイヌナズナの種子を播種し、連続恒明条件下の植物栽培棚で、数週間〜数ヶ月間栽培した。得られた植物体を以下の接木処理に供した。【００８６】
＜実施例1-3．接木処理及びサンプリング＞
ウイルス感染させたベンサミアナタバコを穂木として、シロイヌナズナを台木として、接木処理を行った。具体的には以下の次のように行った。接木処置（割り接ぎ）は、茎に施した。台木は、茎を真横に切断し、切断面中央部に1〜2 cm程度の切れ込みを入れて用意した。穂木は、茎を切断して上部を切り離し、さらに切り口の部位を台木とフィットするようＶ字型に切削して用意した。一連の切削は片刃のカミソリを用いて行った。台木の茎あるいは葉柄に入れた切れ込みに、穂木の茎をダメージを与えぬよう静かに差し込み、穂木がその位置から動かぬようにパラフィルムで固定した。支持棒を台木及び穂木に添え、水を霧吹きしたプラスチックバックを穂木全体が覆われるように被せ、最後にプラスチックバックのジップを台木の茎が位置する側まで閉じた。その状態で27℃、弱光、連続恒明条件下のインキュベーター内で7日間育成し、7日目にプラスチックバックに切れ込みを入れ、下のジップも空け、さらに1日置いた。翌日、中の水が揮発したことを確認して、プラスチックバックを取り外した。その後、24℃、連続恒明条件下の栽培棚で育成を続け、接木後8〜20日でCMV非感染個体の接木部位から離れた新しい組織をサンプリングした。また、接木処理の手技的な問題から接木が成立しなかった場合についても、同様にサンプリングを行った。【００８７】
＜実施例1-4．ウイルスの検出＞
ウイルスの検出は、ウイルスの核酸塩基配列に特異的なプライマーを用いたRT-PCR法により行った。具体的には次のように行った。上記実施例1-3で得られたサンプルに加え、ポジティブコントロールとしてウイルス感染させたベンサミアナタバコのサンプル、ネガティブコントロールとしてウイルス非感染シロイヌナズナを用いた。それぞれのサンプルからTRIzol（登録商標）試薬（Life Technologies社製）を用いてトータルRNAを抽出し、該RNAからSuperScriptIII (Life Technologies)を用いてcDNAを合成し、これを鋳型としてPCR反応を30〜32サイクル行った。PCR反応は、プライマーセットとして、CMV検出用プライマーセット（CPTALL-3: GACTGACCATTTTAGCCG（配列番号1）とCPTALL-5: YASYTTTDRGGTTCAATTCC（配列番号2））、シロイヌナズナアクチン遺伝子特異的プライマーセット（内部標準）（AtACT2_F: TTCAGATGCCCAGAAGTCTTGTTCC（配列番号3）とAtACT2_R:CTGGACCTGCCTCATCATACTC（配列番号4）、及びベンサミアナタバコアクチン遺伝子特異的プライマーセット（内部標準）（NbACT_F: CCTGAGGTCCTTTTCCAACCATC（配列番号5）とNbACT_R: GCCTTTGCAATCCACATCTGTTGG（配列番号6））を用いた。PCR産物をアガロースゲルを用いて電気泳動し、ゲルをエチジウムブロマイド染色してバンドパターンを確認した。【００８８】
＜実施例1-5．結果＞
実施例1-4で得られた電気泳動ゲルの染色画像を図１に示す。図１に示されるように、ウイルス感染させたベンサミアナタバコと接木したシロイヌナズナ（Nb (+)/At (-)）では、ポジティブコントロール（Nb (+)）と同様にCMV特異的なバンドが検出された。一方、ネガティブコントロール（At (-)）ではCMV特異的なバンドは検出されなかった。以上より、ベンサミアナタバコ（穂木）を介して、これとは異科の植物（台木）にウイルスを送達できることが示された。【００８９】
実施例2：ウイルス送達試験2
ウイルス発現ベクターとアグロバクテリアを用いてウイルス感染させたベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）から異科植物にウイルスが移行するかを調べた。具体的には、以下のように行った。【００９０】
＜実施例2-1．ウイルス感染させたベンサミアナタバコの調製＞
培養土にベンサミアナタバコの種子を播種し、連続恒明条件下の植物栽培棚で1〜2ヶ月栽培した。感染に用いるベクターはALSV（リンゴ小球形潜在ウイルス）のゲノム配列を人工合成することにより作成した。pGWB2ベクターのカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーターとノパリンシンターゼターミネーターとの間にALSVのRNA1またはRNA2の配列を導入し、それぞれpALSV1またはpALSV2とした。この際、CaMV35Sプロモーターの転写開始点とALSVのRNA1またはRNA2の5’末端が一致するようにした。ALSVの感染は、アグロバクテリア（GV3101（pMP90）株）を用いて行った。pALSV1またはpALSV2をエレクトロポレーションによりアグロバクテリアに導入した。必要な抗生物質を加えたLB培地で選抜を行った後、必要な抗生物質を含む2mlのLB培地で28℃、一晩前培養した。前培養液0.5 mlを、必要な抗生物質を含む10 ml LB培地に移し、OD600 = 0.5-0.6となるまで28℃、5〜6時間培養した。遠心分離により集菌し、10 mlのアグロバクテリア誘導バッファ（組成：10 mM MES (pH5.5), 100μM アセトシリンゴン）に再懸濁した。懸濁液は室温50 rpmで3時間振盪させた。その後、遠心分離により集菌し、インフィルトレーションバッファ（組成：5 mM MES (pH5.5)）に再懸濁した。pALSV1とpALSV2をそれぞれ導入したアグロバクテリアを、等濃度になるように混合した。混合した感染液はシリンジを用いてベンサミアナタバコの葉に注入した。連続明条件下の植物栽培棚でさらに1週間栽培した。得られた植物体を以下の接木処理に供した。【００９１】
＜実施例2-2．シロイヌナズナの調製＞
培養土にシロイヌナズナの種子を播種し、連続明条件下の植物栽培棚で、数週間〜数ヶ月間栽培した。得られた植物体を以下の接木処理に供した。【００９２】
＜実施例2-3．接木処理及びサンプリング＞
ウイルス感染させたベンサミアナタバコを穂木として、シロイヌナズナを台木として、接木処理を行った。具体的には以下の次のように行った。接木処置（割り接ぎ）は、茎に施した。台木は、茎を真横に切断し、切断面中央部に1〜2 cm程度の切れ込みを入れて用意した。穂木は、茎を切断して上部を切り離し、さらに切り口の部位を台木とフィットするようＶ字型に切削して用意した。一連の切削は片刃のカミソリを用いて行った。台木の茎あるいは葉柄に入れた切れ込みに、穂木の茎をダメージを与えぬよう静かに差し込み、穂木がその位置から動かぬようにパラフィルムで固定した。支持棒を台木及び穂木に添え、水を霧吹きしたプラスチックバックを穂木全体が覆われるように被せ、最後にプラスチックバックのジップを台木の茎が位置する側まで閉じた。その状態で27℃、弱光、連続恒明条件下のインキュベーター内で7日間育成し、7日目にプラスチックバックに切れ込みを入れ、下のジップも空け、さらに1日置いた。翌日、中の水が揮発したことを確認して、プラスチックバックを取り外した。その後、24℃、連続恒明条件下の栽培棚で育成を続け、接木後8〜20日でALSV非感染個体の接木部位から離れた新しい組織をサンプリングした。【００９３】
＜実施例2-4．ウイルスの検出＞
ウイルスの検出は、ウイルスの核酸塩基配列に特異的なプライマーを用いたRT-PCR法により行った。具体的には次のように行った。上記実施例2-3で得られたサンプルに加え、ネガティブコントロールとしてウイルス非感染ベンサミアナタバコを接木したシロイヌナズナを用いた。それぞれのサンプルからTRIzol（登録商標）試薬（Life Technologies社製）を用いてトータルRNAを抽出し、該RNAからSuperScriptIII (Life Technologies)を用いてcDNAを合成し、これを鋳型としてPCR反応をALSV検出については32サイクル、内部標準については28サイクル行った。PCR反応は、プライマーセットとして、ALSV検出用プライマーセット（ALSV_F: GAGTGGTCATGCTACCATTCGAG（配列番号7）とALSV_R: CAGGTGAACTTTCCCCAAAAGCTTG（配列番号8））、及びシロイヌナズナアクチン遺伝子特異的プライマーセット（内部標準）（AtACT2_F: TTCAGATGCCCAGAAGTCTTGTTCC（配列番号3）とAtACT2_R:CTGGACCTGCCTCATCATACTC（配列番号4））を用いた。PCR産物をアガロースゲルを用いて電気泳動し、ゲルをエチジウムブロマイド染色してバンドパターンを確認した。【００９４】
＜実施例2-5．結果＞
実施例2-4で得られた電気泳動ゲルの染色画像を図２に示す。図２に示されるように、ウイルス感染させたベンサミアナタバコと接木したシロイヌナズナ（Nb (+)/At (-)）では、ALSV特異的なバンドが検出された。一方、ネガティブコントロール（Nb (-)/At (-)）ではバンドは検出されなかった。以上より、ウイルス発現ベクターにより感染させたウイルスについても、ベンサミアナタバコ（穂木）を介してこれとは異科の植物（台木）に送達できることが示された。【００９５】
実施例3：ウイルス送達試験3
ウイルス感染させたベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）と、これとは異科に属するナタネ（Brassica napus）とを接木し、一定期間経過後にナタネの組織中に植物ウイルスが検出されるか否かを調べた。検出されれば、ベンサミアナタバコを介して、異科植物にウイルスが移行したことを示す。具体的には、以下のように行った。【００９６】
＜実施例3-1．ウイルス感染させたベンサミアナタバコの調製＞
培養土にベンサミアナタバコの種子を播種し、連続恒明条件下の植物栽培棚で1〜2ヶ月栽培した。TRV（タバコ茎えそウイルス）の感染は、アグロバクテリウム（GV3101（pMP90）株）を用いて行った。TRVの感染にはpTRV1とpTRV2-MCSベクターを用いた。アグロバクテリウムの準備は実験例2-1と同様に行い、pTRV1とpTRV2-MCSをそれぞれ導入したアグロバクテリウムを等濃度になるように混合した。シリンジを用いてベンサミアナタバコの葉に注入した。連続明条件下の植物栽培棚で1週間栽培した。得られた植物体を以下の接木処理に供した。【００９７】
＜実施例3-2．ナタネの調製＞
培養土にナタネの種子を播種し、22℃連続明条件下の植物栽培棚で、数週間栽培した。花茎の伸長を促すため、4℃で6週間以上春化処理を行った。その後再び22℃連続明条件下の植物栽培棚で数週間栽培を行った。得られた植物体を以下の接木処理に供した。【００９８】
＜実施例3-3．接木処理及びサンプリング＞
ウイルス感染させたベンサミアナタバコを穂木として、ナタネを台木として、接木処理を実施例1-3と同様に行った。接木処置後、27℃、弱光、連続恒明条件下のインキュベーター内で7日間育成し、7日目にプラスチックバックに切れ込みを入れ、下のジップも空け、さらに1日置いた。翌日、中の水が揮発したことを確認して、プラスチックバックを取り外した。その後、ウイルスの感染を促すため7日間4℃処理を行った。再び22℃、連続恒明条件下の栽培棚で育成を続け、接木後14〜20日でTRV非感染個体の接木部位から離れた新しい組織をサンプリングした。【００９９】
＜実施例3-4．ウイルスの検出＞
ウイルスの検出は、ウイルスの核酸塩基配列に特異的なプライマーを用いたRT-PCR法により行った。具体的には次のように行った。上記実施例3-3で得られたサンプルに加え、ポジティブコントロールとしてウイルス感染させたベンサミアナタバコのサンプル、ネガティブコントロールとしてウイルス非感染ナタネを用いた。それぞれのサンプルからTRIzol（登録商標）試薬（Life Technologies社製）を用いてトータルRNAを抽出し、該RNAからSuperScriptIII (Life Technologies)を用いてcDNAを合成し、これを鋳型としてPCR反応をTRV検出については32サイクル、内部標準については28サイクル行った。PCR反応は、プライマーセットとして、TRV検出用プライマーセット1（TRV2_F: CTGGGAGATGATACGCTGTTTGAG（配列番号9）とTRV2_R: GAACCTAAAACTTCAGACACGGATCTAC（配列番号10））、ナタネアクチン遺伝子特異的プライマーセット（内部標準）（BnaACT2_F:CTGTCCCAATCTACGAGGGTTTC（配列番号11）とBnaACT2_R:GCTCTGCTGTCGTGGTGAAC（配列番号12））、及びベンサミアナタバコアクチン遺伝子特異的プライマーセット（内部標準）（NbACT_F: CCTGAGGTCCTTTTCCAACCATC（配列番号5）とNbACT_R: GCCTTTGCAATCCACATCTGTTGG（配列番号6））を用いた。PCR産物をアガロースゲルを用いて電気泳動し、ゲルをエチジウムブロマイド染色してバンドパターンを確認した。【０１００】
＜実施例3-5．結果＞
ウイルス感染させたベンサミアナタバコと接木したナタネ（Nb (+)/Bn(-)）では、ポジティブコントロール（Nb (+)）と同様にTRV特異的なバンドが検出される。一方、ネガティブコントロール（Bn (-)）ではTRV特異的なバンドは検出されない。以上より、ベンサミアナタバコ（穂木）を介して、これとは異科の植物（台木）にウイルスを送達できることが示される。【０１０１】
実施例4：ウイルスによるsiRNA送達試験
シロイヌナズナの内生遺伝子の部分配列を含むウイルスを感染させたベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）と、これとは異科に属するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）とを接木し、一定期間経過後にシロイヌナズナの表現型を観察するとともに、標的内生遺伝子の発現量を調べた。標的内生遺伝子の発現量低下に伴う表現型の変化が見られれば、ベンサミアナタバコを介して、異科植物の形質調節が行われたことを示す。具体的には、以下のように行った。【０１０２】
＜実施例4-1．ウイルス感染させたベンサミアナタバコの調製＞
培養土にベンサミアナタバコの種子を播種し、連続恒明条件下の植物栽培棚で1〜2ヶ月栽培した。シロイヌナズナのPDS遺伝子の部分配列（CATGGTTCCAAGATGGCATTCTTGGATGGTAATCCTCCGGAAAGGCTTTGTATGCCAGTAGTGGATCATATTCGATCACTAGGTGGGGAAGTGCAACTTAATTCTAGGATAAAGAAAATTGAGCTCAATGACGATGGCACGGTTAAGAGTTTCTTACTCACTAATGGAAGCACTGTCGAAGGAGACGCTTATGTGTTTGCC（配列番号13））をALSVのRNA2のMP遺伝子とVP25遺伝子の間に組込んだベクターを作成した。PDS遺伝子配列はウイルスの翻訳フレームと一致するように挿入し、両側にシステインプロテアーゼC-PROの認識アミノ酸配列グルタミン-グリシンのコドンを導入した。アグロバクテリアの準備は実験例2-1と同様に行い、ALSVのRNA1とPDS遺伝子を含むRNA2を発現させるベクターをそれぞれ導入したアグロバクテリアを等濃度になるように混合した。シリンジを用いてベンサミアナタバコの葉に注入した。連続明条件下の植物栽培棚で1週間栽培した。得られた植物体を以下の接木処理に供した。【０１０３】
＜実施例4-2．シロイヌナズナの調製＞
培養土にシロイヌナズナの種子を播種し、連続明条件下の植物栽培棚で、数週間〜数ヶ月間栽培した。得られた植物体を以下の接木処理に供した。【０１０４】
＜実施例4-3．接木処理、表現型観察及びサンプリング＞
ウイルス感染させたベンサミアナタバコを穂木として、シロイヌナズナを台木として、実施例1-3と同様に接木処理を行った。接木処理後、27℃、弱光、連続恒明条件下のインキュベーター内で7日間育成し、7日目にプラスチックバックに切れ込みを入れ、下のジップも空け、さらに1日置いた。翌日、中の水が揮発したことを確認して、プラスチックバックを取り外した。その後、24℃、連続恒明条件下の栽培棚で育成を続け、接木後2~3週間で表現型の観察を行った。また、白化の表現型が見られた組織をサンプリングした。【０１０５】
＜実施例4-4．PDS遺伝子の発現解析＞
PDS遺伝子の発現解析は、PDS遺伝子の核酸塩基配列に特異的なプライマーを用いたRT-PCR法により行った。上記実施例4-3で得られたサンプルに加え、ネガティブコントロールとしてウイルス非感染シロイヌナズナ、白化の表現型が見られないシロイヌナズナ組織サンプルを用いた。それぞれのサンプルからTRIzol（登録商標）試薬（Life Technologies社製）を用いてトータルRNAを抽出し、該RNAからSuperScriptIII (Life Technologies)を用いてcDNAを合成し、これを鋳型としてPCR反応を30〜32サイクル行った。PCR反応は、プライマーセットとして、PDS遺伝子特異的プライマーセット1（AtPDS_F: GATAGCTTTGAACCGGTTTCTTCAGG（配列番号14）とAtPDS_R: GAAGTACGGTATTTCTTTCCAGGGATC（配列番号15））、及びシロイヌナズナアクチン遺伝子特異的プライマーセット（内部標準）（AtACT2_F: TTCAGATGCCCAGAAGTCTTGTTCC（配列番号3）とAtACT2_R:CTGGACCTGCCTCATCATACTC（配列番号4））を用いた。PCR産物をアガロースゲルを用いて電気泳動し、ゲルをエチジウムブロマイド染色してバンドパターンを確認した。【０１０６】
＜実施例4-5．結果＞
実施例4-3で得られた植物体の写真を図３に示す。また、実施例4-4で得られた電気泳動ゲルの染色画像を図４に示す。図３に示されるように、ウイルス感染させたベンサミアナタバコと接木したシロイヌナズナでは、花茎の白化が見られた。この白化した花茎では、接木処理を行っていないシロイヌナズナや、白化が起こらなかった組織よりもPDS遺伝子の発現量が低下していた（図４）。以上より、ベンサミアナタバコ（穂木）を介して、これとは異科の植物（台木）にsiRNAを含むウイルスを送達し、形質調節が可能であることが示された。【０１０７】
実施例5：ウイルスによる外来タンパク質送達試験
外来遺伝子であるEGFP遺伝子配列を含むウイルスを感染させたベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）と、これとは異科に属するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）とを接木し、一定期間経過後にシロイヌナズナにおいてEGFP蛍光を観察した。蛍光シグナルが見られれば、ベンサミアナタバコを介して、異科植物に外来タンパク質の移行が行われたことを示す。具体的には、以下のように行った。【０１０８】
＜実施例5-1．ウイルス感染させたベンサミアナタバコの調製＞
培養土にベンサミアナタバコの種子を播種し、連続恒明条件下の植物栽培棚で1〜2ヶ月栽培した。EGFP遺伝子配列をALSVのRNA2のMP遺伝子とVP25遺伝子の間に組込んだベクターを作成した。EGFP遺伝子配列はウイルスの翻訳フレームと一致するように挿入し、両側にシステインプロテアーゼC-PROの認識アミノ酸配列グルタミン-グリシンのコドンを導入した。アグロバクテリアの準備は実験例2-1と同様に行い、ALSVのRNA1とEGFP遺伝子を含むRNA2を発現させるベクターをそれぞれ導入したアグロバクテリアを等濃度になるように混合した。シリンジを用いてベンサミアナタバコの葉に注入した。連続明条件下の植物栽培棚で1週間栽培した。得られた植物体を以下の接木処理に供した。【０１０９】
＜実施例5-2．シロイヌナズナの調製＞
培養土にシロイヌナズナの種子を播種し、連続明条件下の植物栽培棚で、数週間〜数ヶ月間栽培した。得られた植物体を以下の接木処理に供した。【０１１０】
＜実施例5-3．接木処理、表現型観察及びサンプリング＞
ウイルス感染させたベンサミアナタバコを穂木として、シロイヌナズナを台木として、実施例1-3と同様に接木処理を行った。接木処理後、27℃、弱光、連続恒明条件下のインキュベーター内で7日間育成し、7日目にプラスチックバックに切れ込みを入れ、下のジップも空け、さらに1日置いた。翌日、中の水が揮発したことを確認して、プラスチックバックを取り外した。その後、24℃、連続恒明条件下の栽培棚で育成を続け、接木後2~3週間で接木を行ったシロイヌナズナの茎を切断し、蛍光の観察を行った。【０１１１】
＜実施例5-4．結果＞
実施例5-3で得られた植物体断面の蛍光写真を図５に示す。図５に示されるように、ウイルス感染させたベンサミアナタバコと接木したシロイヌナズナでは、茎の篩部組織にEGFP蛍光が見られた。以上より、ベンサミアナタバコ（穂木）を介して、これとは異科の植物（台木）に外来タンパク質を含むウイルスを送達し、外来タンパク質を発現させることが可能であることが示された。【０１１２】
実施例6：ウイルスによる外来タンパク質送達試験
外来遺伝子であるβ-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子配列を含むウイルスを感染させたベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）と、これとは異科に属するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）とを接木し、一定期間経過後にシロイヌナズナにおいてGUS染色を行った。染色が見られれば、ベンサミアナタバコを介して、異科植物に外来タンパク質の移行が行われたことを示す。具体的には、以下のように行った。【０１１３】
＜実施例6-1．ウイルス感染させたベンサミアナタバコの調製＞
培養土にベンサミアナタバコの種子を播種し、連続恒明条件下の植物栽培棚で1〜2ヶ月栽培した。GUS遺伝子配列をALSVのRNA2のMP遺伝子とVP25遺伝子の間に組込んだベクターを作成した。GUS遺伝子配列はウイルスの翻訳フレームと一致するように挿入し、両側にシステインプロテアーゼC-PROの認識アミノ酸配列グルタミン-グリシンのコドンを導入した。アグロバクテリアの準備は実験例2-1と同様に行い、ALSVのRNA1とGUS遺伝子を含むRNA2を発現させるベクターをそれぞれ導入したアグロバクテリアを等濃度になるように混合した。シリンジを用いてベンサミアナタバコの葉に注入した。連続明条件下の植物栽培棚で1週間栽培した。得られた植物体を以下の接木処理に供した。【０１１４】
＜実施例6-2．シロイヌナズナの調製＞
培養土にシロイヌナズナの種子を播種し、連続明条件下の植物栽培棚で、数週間〜数ヶ月間栽培した。得られた植物体を以下の接木処理に供した。【０１１５】
＜実施例6-3．接木処理、表現型観察及びサンプリング＞
ウイルス感染させたベンサミアナタバコを穂木として、シロイヌナズナを台木として、実施例1-3と同様に接木処理を行った。接木処理後、27℃、弱光、連続恒明条件下のインキュベーター内で7日間育成し、7日目にプラスチックバックに切れ込みを入れ、下のジップも空け、さらに1日置いた。翌日、中の水が揮発したことを確認して、プラスチックバックを取り外した。その後、24℃、連続恒明条件下の栽培棚で育成を続け、接木後2~3週間で接木を行ったシロイヌナズナ組織のGUS染色を行った。ネガティブコントロールとして、ウイルス感染させていないベンサミアナタバコを接木したシロイヌナズナ組織も同様に染色を行った。【０１１６】
＜実施例6-4. GUS染色＞
植物組織を氷冷した90％アセトンを用いて15分間浸透処理した後、GUS染色液（組成：0.5 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta delta-glucuronic acid (X-Gluc)、50mMリン酸緩衝液, pH7.2、5 mMフェロシアン化カリウム、5 mMフェリシアン化カリウム、0.2％ TritonX-100）に浸漬し、10-15分間の減圧を３回程度繰返し、組織にGUS染色液を浸透させた。試料は37℃、暗所において24時間染色した。染色後、70％エタノールにより反応を停止させた。【０１１７】
＜実施例6-5．結果＞
ウイルス感染させたベンサミアナタバコと接木したシロイヌナズナでは、GUS染色が見られる。ネガティブコントロールであるウイルス感染させていないベンサミアナタバコを接木したシロイヌナズナ組織では染色が見られない。以上より、ベンサミアナタバコ（穂木）を介して、これとは異科の植物（台木）に外来タンパク質を含むウイルスを送達し、外来タンパク質を発現させることが可能であることが示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月15日(2018.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナス科、アブラナ科、シソ科、又はハマウツボ科に属する植物の部分構造体を含む、形質調節物質産生用植物ウイルスの異科植物への形質調節用の送達媒体。
【請求項２】
形質調節物質産生用植物ウイルスを含有する、請求項１に記載の送達媒体。
【請求項３】
異目植物への送達媒体である、請求項２に記載の送達媒体。
【請求項４】
前記部分構造体がナス科に属する植物の部分構造体である、請求項２又は３に記載の送達媒体。
【請求項５】
前記部分構造体がタバコ属に属する植物の部分構造体である、請求項２〜４のいずれかに記載の送達媒体。
【請求項６】
前記形質調節物質がＲＮＡ及びタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２〜５のいずれかに記載の送達媒体。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれかに記載の送達媒体と異科植物とが直接又は他の植物を介して接木されてなる、部分構造体。
【請求項８】
請求項７に記載の部分構造体を含む、植物体。
【請求項９】
ナス科、アブラナ科、シソ科、又はハマウツボ科に属する植物の部分構造体を含む、形質調節物質産生用植物ウイルスの異科植物への形質調節用の送達媒体と異科植物とが直接又は他の植物を介して接木されてなる部分構造体を含む、植物体に、該植物体が含む前記送達媒体を介して、形質調節物質産生用植物ウイルスを送達することを含む、植物体の形質調節方法。
【請求項１０】
ナス科、アブラナ科、シソ科、又はハマウツボ科に属する植物の部分構造体を含む、形質調節物質産生用植物ウイルスの異科植物への形質調節用の送達媒体と異科植物とが直接又は他の植物を介して接木されてなる部分構造体を含む、植物体に、該植物体が含む前記送達媒体を介して、形質調節物質産生用植物ウイルスを送達することを含む、形質調節された植物体の製造方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の送達媒体を異科植物に直接又は他の植物を介して接木することを含む、請求項９に記載の形質調節方法。
【請求項１２】
請求項２に記載の送達媒体を異科植物に直接又は他の植物を介して接木することを含む、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の植物体又は請求項８に記載の植物体の子孫植物体から得られる、形質調節された植物体の種子。
【請求項１４】
請求項８に記載の植物体又は請求項８に記載の植物体の子孫植物体から得られる、形質調節された植物体の種子集団。
【請求項１５】
請求項８に記載の植物体又は請求項８に記載の植物体の子孫植物体から種子を得ることを含む、形質調節された植物体の種子の製造方法。
【国際調査報告】
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