(57)【要約】  捕捉対象の細胞を含む液体からフィルターを用いて前記細胞を捕捉する工程を有し、前記捕捉は、前記細胞が前記フィルター内を移動する状態で行われる、細胞分離方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
捕捉対象の細胞を含む液体からフィルターを用いて前記細胞を捕捉する工程を有し、前記捕捉は、前記細胞が前記フィルター内を移動する状態で行われる、細胞分離方法。
【請求項２】
前記フィルター内における前記細胞の移動速度をＶ１とし、前記フィルター外における前記細胞の移動速度をＶ２とした場合、０＜（Ｖ１／Ｖ２）＜１の関係式が成立する、請求項１に記載の細胞分離方法。
【請求項３】
前記液体が、前記捕捉対象の細胞以外の他の成分をさらに含み、前記フィルター内における前記細胞の速度をＶ１とし、前記フィルター内における前記他の成分の移動速度をＶ３とした場合、Ｖ１＜Ｖ３の関係式が成立する、請求項１又は請求項２に記載の細胞分離方法。
【請求項４】
前記フィルターによる前記細胞の単位時間あたりの捕捉量の変化量をΔＴとしたとき、ΔＴが０以下となる期間を前記捕捉工程の少なくとも一部に有する、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項５】
前記フィルターによる前記細胞の単位時間あたりの新たな捕捉量をＲ１とし、前記フィルターからの前記細胞の単位時間あたりの放出量をＲ２としたとき、Ｒ１≦Ｒ２の関係式が成立する期間を前記捕捉工程の少なくとも一部に有する、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項６】
捕捉された前記細胞を培養する工程をさらに有する、請求項１〜請求項５に記載の細胞分離方法。
【請求項７】
前記細胞が血中循環がん細胞（ＣＴＣ）であり、前記液体が血液である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項８】
前記フィルターが多孔質体である、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項９】
前記フィルターがガラス粒子の焼結体である、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項１０】
前記フィルターを通過した液体が前記フィルターを再度通過するように前記液体を循環させる、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項１１】
生体から採取した体液から細胞を除去するための、請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項１２】
血液から特定の成分を回収又は除去するための、請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項１３】
捕捉対象の細胞を含む液体が流動する流路と、前記流路内に設けられて前記細胞を捕捉するフィルターを有し、前記細胞が前記フィルター内を移動する状態で前記捕捉が行われる、細胞分離装置。
【請求項１４】
前記細胞の前記フィルター内における移動速度を制御する制御機構をさらに有する、請求項１３に記載の細胞分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離方法及び細胞分離装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液等の体液に含まれる特定の細胞を分離し、これを医療行為、検査、研究等に利用する技術の検討が種々行われている。例えば、特許文献１には液体試料から細胞を分離及び回収するためのフィルターを備える細胞分離構造体を用いて目的とする細胞をフィルター上部に捕捉し、その他の成分はフィルターを通過させる方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１４−２３３２６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に記載の発明は、液体試料からの細胞の回収率の改善を主な課題とするものである。一方で、回収した細胞を培養して検査等に用いるためには、細胞に与えるダメージを少なくし、良好な状態で分離するという観点からの細胞分離技術の改善も重要な課題である。例えば、がんの転移・再発を引き起こす要因と考えられている血中循環がん細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ、ＣＴＣ）を血液から分離し、その性質を明らかにすることができれば、原発巣の特定、再発可能性の予測、抗がん剤等の薬剤に対する感受性の検査などへの利用が期待できるが、血液中に存在するＣＴＣの数は赤血球等の血球細胞１０９個に対して１〜１００個と非常に少ない。従って、回収した細胞を有効に利用するためには、回収後の細胞が培養可能な状態であることが重要になると考えられる。
本発明は上記課題に鑑み、細胞に与えるダメージを抑制できる細胞分離方法及び細胞分離装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するための具体的手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞捕捉対象の細胞を含む液体からフィルターを用いて前記細胞を捕捉する工程を有し、前記捕捉は、前記細胞が前記フィルター内を移動する状態で行われる、細胞分離方法。
＜２＞前記フィルター内における前記細胞の移動速度をＶ１とし、前記フィルター外における前記細胞の移動速度をＶ２とした場合、０＜Ｖ１／Ｖ２＜１の関係式が成立する、＜１＞に記載の細胞分離方法。
＜３＞前記液体が、前記捕捉対象の細胞以外の他の成分をさらに含み、前記フィルター内における前記細胞の速度をＶ１とし、前記フィルター内における前記他の成分の移動速度をＶ３とした場合、Ｖ１＜Ｖ３の関係式が成立する、＜１＞又は＜２＞に記載の細胞分離方法。
＜４＞前記フィルターによる前記細胞の単位時間あたりの捕捉量の変化量をΔＴとしたとき、ΔＴが０以下となる期間を前記捕捉工程の少なくとも一部に有する、＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
＜５＞前記フィルターによる前記細胞の単位時間あたりの新たな捕捉量をＲ１とし、前記フィルターからの前記細胞の単位時間あたりの放出量をＲ２としたとき、Ｒ１≦Ｒ２の関係式が成立する期間を前記捕捉工程の少なくとも一部に有する、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
＜６＞捕捉された前記細胞を培養する工程をさらに有する、＜１＞〜＜５＞に記載の細胞分離方法。
＜７＞前記細胞が血中循環がん細胞（ＣＴＣ）であり、前記液体が血液である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
＜８＞前記フィルターが多孔質体である、＜１＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
＜９＞前記フィルターがガラス粒子の焼結体である、＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
＜１０＞前記フィルターを通過した液体が前記フィルターを再度通過するように前記液体を循環させる、＜１＞〜＜９＞のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
＜１１＞生体から採取した体液から細胞を除去するための、＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
＜１２＞血液から特定の成分を回収又は除去するための、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
＜１３＞捕捉対象の細胞を含む液体が流動する流路と、前記流路内に設けられて前記細胞を捕捉するフィルターを有し、前記細胞が前記フィルター内を移動する状態で前記捕捉が行われる、細胞分離装置。
＜１４＞前記細胞の前記フィルター内における移動速度を制御する制御機構をさらに有する、＜１３＞に記載の細胞分離装置。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、細胞に与えるダメージを抑制できる細胞分離方法及び細胞分離装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】がん細胞（ＧＦＰ−ＬＬＣ細胞）を含む血液をフィルター１とフィルター２を用いて循環させたときの、赤血球数とがん細胞（ＧＦＰ−ＬＬＣ細胞）数の変化を示すグラフである。
【図２】がん細胞（ＧＦＰ−ＬＬＣ細胞）を含む血液をフィルター１を用いて循環させたときのフィルターによるＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の捕捉量とその変化量を示すグラフである。
【図３】フィルター１とフィルター２で捕捉したがん細胞（ＧＦＰ−ＬＬＣ細胞）の捕捉直後と２日間培養後の蛍光顕微鏡写真である。
【図４】フィルター１とフィルター２の表面のＳＥＭ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）画像である。
【図５】フィルター１とフィルター２で捕捉したがん細胞（ＧＦＰ−ＬＬＣ細胞）の捕捉直後、２４時間培養後、７２時間培養後の生存数を示すグラフである。
【図６】フィルター１とフィルター２を用いて循環させた後の血液の可逆的酸素分子（Ｏ２）結合能の評価結果を示すグラフである。
【図７】常温及び常圧下でウシ血液をフィルター１とフィルター２を用いてろ過したときの赤血球数の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。以下の実施形態において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合を除き、必須ではない。数値及びその範囲についても同様であり、本発明を制限するものではない。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲には、「〜」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
【０００９】
＜細胞分離方法＞
本発明の細胞分離方法は、捕捉対象の細胞を含む液体からフィルターを用いて前記細胞を捕捉する工程（捕捉工程）を有し、前記捕捉は、前記細胞が前記フィルター内を移動する状態で行われる。
【００１０】
本発明者らの検討により、本発明の細胞分離方法によれば、細胞に与えるダメージが抑えられた状態で細胞を分離できることがわかった。その要因は必ずしも明らかではないが、捕捉された細胞がフィルター上又はフィルター内で停止した状態ではなく移動する状態であることで、捕捉された細胞同士の接触や堆積が生じにくくなっていることが考えられる。
【００１１】
本発明の細胞分離方法に用いられる「液体」は、細胞を含むものであれば特に制限されず、血液、リンパ液等の生体由来の体液であっても、これを必要に応じて希釈又は濃縮したものであっても、細胞を混合した生体に由来しない液体であってもよい。
【００１２】
本発明の細胞分離方法において、細胞を含む液体は、重力で流動する（自然落下）状態であっても、加圧又は減圧が施された状態であってもよい。また、フィルターを通過した液体がフィルターを再度通過するように液体を循環させてもよい。
【００１３】
本発明の細胞分離方法に用いられる「細胞」は、捕捉対象となりうるものであればどのような細胞であってもよい。液体に捕捉対象の細胞以外の他の成分も含まれている場合は、捕捉効率の観点からは、他の成分よりも捕捉対象の細胞のサイズが大きいことが好ましい。例えば、細胞を含む液体が血液であって、赤血球ではない細胞が捕捉対象である場合は、捕捉対象の細胞はがん細胞（ＣＴＣ）、幹細胞、白血球等の、赤血球（約６μｍ）よりもサイズの大きい（例えば、１０μｍ以上）細胞であることが好ましい。
【００１４】
本発明の細胞分離方法において、細胞の捕捉が「細胞がフィルター内を移動する状態で行われる」とは、フィルター内における捕捉対象の細胞が停止せずに移動している（移動速度がゼロではない）が、その移動速度がフィルター外における移動速度よりも遅いことを利用して捕捉が行われることを意味する。すなわち、フィルター内における細胞の移動速度をＶ１とし、フィルター外における細胞の移動速度をＶ２とした場合、０＜（Ｖ１／Ｖ２）＜１の関係式が成立する状態を意味する。Ｖ１／Ｖ２の値は上記関係式を満たすのであれば特に制限されないが、０＜（Ｖ１／Ｖ２）＜０．５であることが好ましく、０＜（Ｖ１／Ｖ２）＜０．１であることがより好ましい。
【００１５】
液体が捕捉対象の細胞と、捕捉対象の細胞以外の他の成分とを含む場合は、捕捉対象の細胞と他の成分のフィルター内における移動速度に差が生じていることが好ましい。すなわち、捕捉対象の細胞のフィルター内における速度をＶ１とし、他の成分のフィルター内における速度をＶ３とした場合、Ｖ１＜Ｖ３の関係式が成立することが好ましい。
【００１６】
捕捉対象の細胞のフィルター内における速度Ｖ１と、他の成分のフィルター内における速度Ｖ３とがＶ１＜Ｖ３の関係式を満たすことで、捕捉対象の細胞を選択的に捕捉することができる。このため、例えば、液体から捕捉対象の細胞のみを捕捉し、他の成分は捕捉せずに液体中に残したい場合に有利であると考えられる。
【００１７】
本発明の細胞分離方法は、フィルターによる細胞の単位時間あたりの捕捉量の変化量をΔＴとしたとき、ΔＴが０以下となる期間を捕捉工程の少なくとも一部に有することが好ましい。「ΔＴ」は、たとえば、捕捉工程の開始からｔ分後におけるフィルター内の捕捉量からｔ−ｘ分後におけるフィルター内の捕捉量を差し引いた値をｘで割ることで、１分あたり平均値としてのΔＴを計算することができる。
【００１８】
ΔＴが０以下となる期間においては、フィルターによって新たに捕捉される細胞の量とフィルターから放出される細胞の量とが等しいか、前者よりも後者の方が多い状態になっていると考えることができる。従って、細胞がフィルター内を移動する状態で捕捉が行われていると考えることができる。
【００１９】
本発明の細胞分離方法は、フィルターによる細胞の単位時間あたりの新たな捕捉量をＲ１とし、フィルターからの細胞の単位時間あたりの放出量をＲ２としたとき、Ｒ１≦Ｒ２の関係式が成立する期間を捕捉工程の少なくとも一部に有することが好ましい。
【００２０】
Ｒ１とＲ２の関係がＲ１≦Ｒ２となる期間においては、フィルター内に新たに捕捉される細胞の量に比べてフィルターから放出される細胞の量とが等しいか、それよりも多くなっている。従って、細胞がフィルター内を移動する状態で捕捉が行われていると考えることができる。
【００２１】
本発明の細胞分離方法では、本発明の目的が達成される範囲内において、捕捉対象の細胞のすべてが上記の条件を満たさなくてもよく、他の成分のすべてが上記の条件を満たさなくてもよい。
【００２２】
本発明の細胞分離方法において、細胞がフィルター内を移動する状態であるか否かを確認する方法は、特に制限されない。例えば、フィルター内を通過している細胞が、一定期間の経過後にフィルター外に放出されるか否かを確認する方法が挙げられる。具体的には、フィルターを通過した後の液体中の細胞の割合（数、濃度等）を一定期間ごとに測定し、その変化を調べることで確認する方法が挙げられる。液体中の細胞の割合を調べる方法は特に制限されず、顕微鏡等を用いた目視により行っても、画像の撮影及び解析により行っても、吸光度等の測定によって行ってもよい。
【００２３】
本発明の細胞分離方法において、細胞の捕捉を細胞がフィルター内を移動する状態で行うようにする手法は、特に制限されない。例えば、細胞を含む液体の流速、フィルターの構成（孔径、空隙率、流動方向の厚み）等を調節する手法が挙げられる。
【００２４】
本発明の細胞分離方法に用いられる「フィルター」は、液体から捕捉対象の細胞を捕捉可能であれば、その構造は特に制限されない。例えば、織布（ナイロンメッシュ、ポリスチレンメッシュ等）、不織布等のシート状物、多孔質体、多孔板等が挙げられる。
【００２５】
フィルターは、必要に応じて細胞の捕捉を促進するための処理が施されてもよい。例えば、親水性を増す官能基（水酸基等）や、疎水性を増す官能基（アルキル基、トリアルキルシリル基等）、捕捉対象の細胞に特異的に結合する抗体等の物質をフィルターに付着させてもよい。
【００２６】
本発明者らの検討により、細胞の回収効率と細胞に与えるダメージ低減とを両立する観点からは、多孔質体がフィルターとして好適であることがわかった。その理由は明らかではないが、捕捉対象の細胞が他の成分とサイズの違いが小さい場合、シート状物の場合は捕捉対象の細胞のみを捕捉し、他の成分は捕捉しないようにするためには孔径の厳密な調節が求められるのに対し、多孔質体の場合はシート状物ほどの厳密な孔径の調整を要しないことが考えられる。また、主に表面近傍で細胞を捕捉するシート状物に対し、多孔質体では三次元的に形成された細孔内に細胞が入り込むため、細胞同士の接触や堆積が生じにくいことが考えられる。
【００２７】
フィルターとして使用可能な多孔質体の構成（材質、形状等）は特に制限されず、細胞分離方法の条件、捕捉対象等に応じて選択できる。細胞の捕捉に適した細孔を有し、耐久性に優れ、かつ簡便な手法で製造できるという観点からは、ガラス粒子の焼結体であることが好ましい。ガラス粒子の粒子径、粒度分布、焼結条件（温度、圧力等）などを変更することで、所望の細孔が内部に形成された焼結体を得ることができる。ガラス粒子は球状（ガラスビーズ）であっても、破砕ガラス等の不規則な形状であってもよい。細孔の内壁が細胞に与えるダメージを低減する観点からは、表面の平滑なガラスビーズであることが好ましい。ガラスビーズを用いたフィルターの作製方法としては、例えば、特開２０１５−４７２８５号公報の記載を参照することができる。
【００２８】
フィルターがガラス粒子の焼結体である場合、ガラス粒子の体積平均平均粒子径（Ｄ５０％）は１０μｍ〜３００μｍの範囲内であってよく、２０μｍ〜２００μｍの範囲内であることが好ましく、５０μｍ〜１２０μｍの範囲内であることがより好ましい。
【００２９】
フィルターがガラス粒子の焼結体である場合、フィルターの空隙率は１０体積％〜６０体積％の範囲内であってよく、２０体積％〜６０体積％の範囲内であることが好ましく、２５体積％〜４５体積％の範囲内であることがより好ましい。
【００３０】
フィルターがガラス粒子の焼結体である場合、フィルターの厚み（液体の流動方向の長さ）は０．１ｍｍ〜１００ｍｍの範囲内であってよく、０．５ｍｍ〜５０ｍｍの範囲内であることが好ましく、１ｍｍ〜１０ｍｍの範囲内であることがより好ましい。
【００３１】
フィルターがガラス粒子の焼結体である場合、フィルターの面積（液体と接触する面の面積）は１ｍｍ２〜２０００ｍｍ２の範囲内であってよく、１０ｍｍ２〜１０００ｍｍ２の範囲内であることが好ましく、１０ｍｍ２〜５００ｍｍ２の範囲内であることがより好ましい。
【００３２】
本発明の細胞分離方法は、捕捉工程において捕捉された細胞を培養する工程（培養工程）をさらに有してもよい。培養はフィルター内で行っても、フィルターから取り出して行ってもよい。培養の方法は特に制限されず、公知の方法で行うことができる。本発明の方法において捕捉対象が培養可能な細胞（ＣＴＣ等）である場合、血球細胞等の他の成分が捕捉対象の細胞とともにフィルターに捕捉されていても、培養工程を経ることで捕捉対象の細胞のみが生存し、検査等に利用しやすくなる。
【００３３】
本発明の細胞分離方法は、生体から採取した体液から細胞を除去するためのものであってもよい。この場合、細胞を除去した後の体液を生体に戻してもよい。例えば、がん患者から採取した血液から本発明の細胞分離方法によってＣＴＣを除去し、ＣＴＣが除去された後の血液をがん患者に戻すことで、がんの転移又は再発を防止するためのものであってもよい。
【００３４】
本発明の細胞分離方法は、捕捉対象の細胞をフィルターの上部に堆積させないように実施されるため、大量の液体から細胞を捕捉する場合であってもフィルターの目詰まりが起こりにくい。このため、生体の全身の血液からＣＴＣを除去する用途にも好適に使用できる。この場合、本発明の細胞分離方法は、一般的な人工透析装置を改変したものを用いて実施してもよい。さらには、本発明の細胞分離方法は、献血等により採取した血液から特定の成分を回収又は除去する用途にも好適に使用できる。
【００３５】
＜細胞分離装置＞
本発明の細胞分離装置は、捕捉対象の細胞を含む液体が流動する流路と、前記流路内に設けられて前記細胞を捕捉するフィルターを有し、前記細胞が前記フィルター内を移動する状態で前記捕捉が行われる。
【００３６】
本発明の細胞分離装置における各用語の定義及びその説明については、本発明の細胞分離装置における対応する用語の定義及びその説明を参照することができる。
【００３７】
本発明の細胞分離装置が有する流路は、細胞を含む液体が流動しうるもの（チューブ等）であれば特に制限されない。必要に応じ、ポンプ等の液体を加圧又は減圧するための手段を備えていてもよい。また、液体がフィルターを一回のみ通過するように構成されていても、液体が循環してフィルターを複数回通過するように構成されていてもよい。流路内に設けられるフィルターは、１つでも複数であってもよい。
【００３８】
本発明の細胞分離装置は、細胞のフィルター内における移動速度がフィルター外における移動速度よりも低い状態で細胞の捕捉が行われるのであれば、そのための手段は特に制限されない。例えば、細胞のフィルター内における移動速度がフィルター外における移動速度よりも低い状態で細胞の捕捉が行われるように液体の流速を制御する機構、細胞のフィルター内における移動速度がフィルター外における移動速度よりも低い状態で細胞の捕捉が行われているか否かをモニターする機構などの、細胞のフィルター内における移動速度を制御する制御機構をさらに有していてもよい。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４０】
＜実施例１＞
各種フィルターを用いて、細胞を含む液体から細胞を捕捉する試験を行った。
試験では、細胞としてはＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、緑色蛍光タンパク質）を導入したがん細胞（ＧＦＰ−ＬＬＣ  （Ｌｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞）を使用し、液体としてはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）を使用した。液体中の細胞数は３．５×１０４個／ｍＬとした。この液体（８ｍＬ）を大気圧で自然落下により、下記のフィルター１〜５（下記）のそれぞれを用いてろ過し、ろ過後の液体中の細胞数を調べた。結果を表１に示す。【００４１】
【表１】
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【００４２】
フィルター１：ガラスビーズの焼結体（下記方法で作製）
フィルター２：破砕ガラスの焼結体（ＳＨＩＢＡＴＡ社製、商品名「加工用ガラスフィルターＰ−４０」、品目コード「Ｄ１３０００−４０４」、直径２３ｍｍの円盤状、厚み：１．２ｍｍ、空隙率：４５体積％）
フィルター３：ナイロンメッシュフィルター（株式会社くればぁ製、商品名「ナイロンメッシュ」、厚み：０．１ｍｍ、孔径：１０μｍ）
フィルター４：ポリスチレンメッシュフィルター（株式会社くればぁ製、商品名「ポリスチレンメッシュ」、厚み：０．１ｍｍ、孔径：１０μｍ）
フィルター５：不織布フィルター（タピルス株式会社、商品名「Ｐ０１０ＳＷ−００Ｘ」、厚み：０．１ｍｍ、孔径：６０μｍ）【００４３】
フィルター１は、ソーダ石灰ガラス製ビーズ（株式会社ユニオン、商品名「ＵＢ−４７Ｌ」、粒子径６３μｍ〜１０６μｍ）１ｇをアルミナ製の円筒状の型（直径：約２４ｍｍ）に充填し、ステンレス棒で圧力をかけながら大気雰囲気下において７００℃で１時間の焼成を行って作製した。得られたフィルター１は厚みが１．２ｍｍの円盤状であり、空隙率は３０体積％であった。【００４４】
表１に示すように、ガラス粒子の焼結体であるフィルター１とフィルター２は、織布又は不織布からなるフィルター３〜５に比べてＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の捕捉効率に優れていた。【００４５】
＜実施例２−１＞
実施例１で使用したフィルター１とフィルター２を用いて、がん細胞を含む血液からのがん細胞の捕捉の経時的変化を調べる試験を行った。
試験では、ウシ血液（赤血球の数は約５〜６×１０９個／ｍＬ）にＧＦＰを導入したがん細胞（ＧＦＰ−ＬＬＣ細胞）を、０．５〜１×１０６個／ｍＬとなるように混合したものを入れたビンに、フィルターが設けられたチューブ（血液の流回路）を接続した装置内を、ポンプを用いて循環させた（循環量は全体で５０〜１４０ｍｌ、設定流速：１０ｍＬ／分で６０分の後、２７ｍＬ／分で２００分）。試験の途中でサンプルを複数回採取し、その中のＧＦＰ−ＬＬＣ細胞（ＧＦＰ−ＬＬＣ）と赤血球の数（個／ｍＬ）を、湿式粒度分布計を用いて測定した（粒度分布計測定時に、血液サンプルを５０〜１５０倍に希釈した）。フィルターを通過した血液の延べ量（全循環量）（横軸）と、赤血球の数（左縦軸）およびＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の数（右縦軸）の関係を図１に示す。【００４６】
図１に示すように、フィルター１とフィルター２のいずれの場合も採取したサンプル中の赤血球の数は循環量が増えても殆ど変化しておらず、フィルターに捕捉されていないことが示唆された。一方、採取したサンプル中のＧＦＰ−ＬＬＣ細胞は試験開始から循環量が増えるにつれて減少する傾向を示しており、フィルターに捕捉されていることが示唆された。【００４７】
さらに、採取したサンプル中のＧＦＰ−ＬＬＣ細胞は試験開始から一定の間は減少する傾向を示すが、その後に上昇に転じる（フィルター１）か、減少せずに一定の水準を維持する（フィルター２）現象がみられた。これらの現象は、フィルターによって捕捉されたＧＦＰ−ＬＬＣ細胞がフィルター内にとどまらず、フィルター内を上流から下流に移動して放出される（すなわち、ＧＦＰ−ＬＬＣ細胞のフィルター内における移動速度がフィルター外における移動速度よりも遅い）挙動を示すことを示唆している。【００４８】
＜実施例２−２＞
実施例２−１と同様にして、がん細胞を含む血液からのがん細胞の捕捉の経時的変化を調べる試験をフィルター１を用いて行い、下記（１）〜（３）に示す方法でフィルターによるＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の捕捉数（×１０５個）とその変化量ΔＴ（ｔｎ−１からｔｎまでの１分当たり平均値、×１０５個／分）を計算した。結果を表２及び図２に示す。【００４９】
（１）ビン内の血液中のＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の濃度Ｘ（×１０５個／ｍｌ）を画像解析粒度分布計で測定した。
（２）ビン及びチューブ内に含まれるＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の数（×１０５個）を下記式により計算した。
ＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の数＝ビン内の血液量（ｍｌ）×Ｘ（×１０５個／ｍｌ）×全血液量（ｍｌ）／ビン内の血液量（ｍｌ）
（３）循環開始時の血液全体に含まれるＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の数から、表１に示す循環開始からの経過時間ｔにおけるビン及びチューブ内のＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の数を差し引くことで、当該時間におけるフィルター内のＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の数（フィルターによるＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の捕捉数、×１０５個）を計算した。【００５０】
【表２】
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【００５１】
表２及び図２に示すように、フィルターによるＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の捕捉数（棒グラフ）は循環開始から４０分後に最大となり、その後はほぼ一定の傾向を示した。また、フィルターによるＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の捕捉数の１分当たりの変化量ΔＴ（折れ線グラフ）は循環開始から５分経過後には減少傾向を示し、循環開始から４０分後以降は０付近でほぼ一定の値を示した。ΔＴがほぼ０になっている期間では、フィルターによるＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の新たな捕捉量Ｒ１とフィルターからのＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の放出量Ｒ２との間にＲ１≦Ｒ２の関係式が成立していると考えることができる。【００５２】
循環開始から４０分後にΔＴがほぼ０になっていることから、ＧＦＰ−ＬＬＣ細胞は厚み１．２ｍｍのフィルター内を約４０分で移動し、放出されると考えることができる。従って、フィルター内でのＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の移動速度をＶ１とすると、Ｖ１＝１．２ｍｍ／４０ｍｉｎ＝０．０３ｍｍ／ｍｉｎと計算される。【００５３】
フィルター外でのＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の移動速度をＶ２とすると、血液の流速（５ｍｌ／ｍｍ）と流路の半径（１０ｍｍ）とからＶ２＝（５ｍｌ／ｍｉｎ×１０００）／１０×１０×３．１４）＝１５．９ｍｍ／ｍｉｎと計算される。【００５４】
以上より、上記の試験ではＶ１／Ｖ２の値は０．００２と計算され、０＜（Ｖ１／Ｖ２）＜１の関係式が成立していると考えることができる。【００５５】
＜実施例３＞
実施例１で使用したフィルター１とフィルター２を用いて、ＧＦＰ−ＬＬＣ細胞を含む血液から捕捉したＧＦＰ−ＬＬＣ細胞を培養した場合の状態を調べる試験を行った。
試験では、実施例２に記載した方法でＧＦＰ−ＬＬＣ細胞を含む血液を循環させ、全循環量が１２００ｍｌになった時点でフィルター１とフィルター２をチューブから取り外し、フィルター内に捕捉されたＧＦＰ−ＬＬＣ細胞をＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ）をフィルターに添加した中で培養し、捕捉直後と培養から２日後の状態を、蛍光顕微鏡を用いて調べた。結果を図３に示す。【００５６】
図３に示すように、フィルター１とフィルター２のいずれも培養後のＧＦＰ−ＬＬＣ細胞は生存していることが示唆された。また、フィルター１に捕捉されたＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の方がフィルター２に捕捉されたＧＦＰ−ＬＬＣ細胞よりも培養後の状態がより良好である傾向がみられた。この理由としては、図４のフィルター１とフィルター２のＳＥＭ画像に示すように、球状のガラスビーズの焼結体であるフィルター１の方が破砕ガラスの焼結体であるフィルター２よりも細孔の内壁が平滑であり、細孔を通過するＧＦＰ−ＬＬＣ細胞に与えるダメージがより小さいことが考えられる。【００５７】
上記培養試験において、各フィルターにおける培養直後（ｉｎｉｔｉａｌ）、４８時間後（４８ｈ）及び７２時間後（７２ｈ）におけるＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の生存数（個）を図５に示す。ＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の生存数の測定は、粒度分布計および血球計算盤によって行った。コントロールとして、フィルターを通過させないＧＦＰ−ＬＬＣ細胞（再培養の開始時に細胞数を揃えた）を使用した。【００５８】
図５に示すように、フィルター１（左図）とフィルター２（右図）のいずれも培養によるＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の増加が確認されたが、フィルター１（ＧＢＦ）の方がフィルター２（ＣＦ）に比べて増加の度合いが大きかった。【００５９】
＜実施例４＞
実施例１で使用したフィルター１及びフィルター２と同じ材質で、厚みが０．４ｍｍのフィルターをそれぞれ３枚ずつ重ねて厚さ１．２ｍｍの積層体とし、これを用いて実施例３と同様にしてＧＦＰ−ＬＬＣ細胞を含む血液から捕捉した。次いで積層体を分解し、実施例３と同様にしてＧＦＰ−ＬＬＣ細胞を３日間培養した。【００６０】
ＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の捕捉直後のフィルターを蛍光顕微鏡で観察したところ、フィルター１とフィルター２のいずれにおいても血液がフィルターに流入する側に配置されたフィルター、血液がフィルターから流出する側に配置されたフィルター、これらの間に配置されたフィルターのいずれにおいてもＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の存在が確認され、フィルター内に捕捉されたＧＦＰ−ＬＬＣ細胞が流入側から流出側まで移動していることがわかった。【００６１】
ＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の培養から３日後のフィルターを蛍光顕微鏡で観察したところ、フィルター１とフィルター２のいずれにおいても血液がフィルターに流入する側に配置されたフィルター、血液がフィルターから流出する側に配置されたフィルター、これらの間に配置されたフィルターのいずれにおいてもＧＦＰ−ＬＬＣ細胞の増加が確認されたが、フィルター１においてその傾向がより顕著であった。【００６２】
＜実施例４＞
実施例１で使用したフィルター１とフィルター２を用いて、ＧＦＰ−ＬＬＣ細胞を含む血液を循環させた後、赤血球の酸素分子（Ｏ２）に対する結合能を調べる試験を行った。
試験では、実施例２に記載した方法でＧＦＰ−ＬＬＣ細胞を含む血液を循環させ、全循環量が６０００ｍｌになった時点で血液をチューブから取り出し、酸素ガス（Ｏ２）及び二酸化炭素ガス（ＣＯ２）を吹き込んだときの吸収波長を調べた。結果を図６に示す。【００６３】
図６に示すように、フィルター１とフィルター２のいずれを用いた場合も、循環後にＯ２を吹き込むと、約９００ｎｍの吸収が増大して鮮血色を呈し、ＣＯ２を吹き込むと約７５５ｎｍの吸収が増大して濃褐色を示すことがわかった。しかもこの現象は可逆的であったことから、フィルターを通過した後も、赤血球のＯ２結合能が維持されていることが確認された。この結果は、本発明の細胞分離方法は、細胞を分離した後の血液を再び生体内に戻す用途にも適用可能であることを示唆している。【００６４】
＜実施例５＞
実施例１で使用したフィルター１とフィルター２を用いて、ウシ血液（５ｍｌ、希釈なし）を常温常圧下でろ過し、ろ過前後の赤血球数の変化を測定した。血液５ｍｌの自然落下によるろ過の所要時間は約２分であった。図７に示すように、フィルター１の方で、フィルター２よりも赤血球の減少が抑制された。この結果は、捕捉対象の細胞を含む液体が血液であって赤血球が他の成分に該当する場合、フィルター１の方がフィルター２よりも、捕捉対象の細胞を選択的に捕捉する用途に適していることを示唆している。【００６５】
以上の結果より、本発明の細胞分離方法及び細胞分離装置は、捕捉された細胞に与えるダメージを抑制できることがわかった。【００６６】
日本国特許出願第２０１６−１６５８８９号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
【図１】
2018038060.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月18日(2018.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
捕捉対象の細胞を含む液体からフィルターを用いて前記細胞を捕捉する工程を有し、前記捕捉は、前記細胞が前記フィルター内を移動する状態で行われ、前記フィルターを通過した液体が前記フィルターを再度通過するように前記液体を循環させる、細胞分離方法。
【請求項２】
前記フィルター内における前記細胞の移動速度をＶ１とし、前記フィルター外における前記細胞の移動速度をＶ２とした場合、０＜（Ｖ１／Ｖ２）＜１の関係式が成立する、請求項１に記載の細胞分離方法。
【請求項３】
前記液体が、前記捕捉対象の細胞以外の他の成分をさらに含み、前記フィルター内における前記細胞の速度をＶ１とし、前記フィルター内における前記他の成分の移動速度をＶ３とした場合、Ｖ１＜Ｖ３の関係式が成立する、請求項１又は請求項２に記載の細胞分離方法。
【請求項４】
前記フィルターによる前記細胞の単位時間あたりの捕捉量の変化量をΔＴとしたとき、ΔＴが０以下となる期間を前記捕捉工程の少なくとも一部に有する、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項５】
前記フィルターによる前記細胞の単位時間あたりの新たな捕捉量をＲ１とし、前記フィルターからの前記細胞の単位時間あたりの放出量をＲ２としたとき、Ｒ１≦Ｒ２の関係式が成立する期間を前記捕捉工程の少なくとも一部に有する、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項６】
捕捉された前記細胞を培養する工程をさらに有する、請求項１〜請求項５に記載の細胞分離方法。
【請求項７】
前記細胞が血中循環がん細胞（ＣＴＣ）であり、前記液体が血液である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項８】
前記フィルターが多孔質体である、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項９】
前記フィルターがガラス粒子の焼結体である、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
生体から採取した体液から細胞を除去するための、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項１２】
血液から特定の成分を回収又は除去するための、請求項１〜請求項９及び請求項１１のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項１３】
捕捉対象の細胞を含む液体が流動する流路と、前記流路内に設けられて前記細胞を捕捉するフィルターを有し、前記細胞が前記フィルター内を移動する状態で前記捕捉が行われ、前記フィルターを通過した液体が前記フィルターを再度通過するように前記液体を循環させる、細胞分離装置。
【請求項１４】
前記細胞の前記フィルター内における移動速度を制御する制御機構をさらに有する、請求項１３に記載の細胞分離装置。
【手続補正書】
【提出日】平成30年6月20日(2018.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
捕捉対象の細胞を含む液体からフィルターを用いて前記細胞を捕捉する捕捉工程を有し、前記捕捉は、前記細胞が前記フィルター内を移動する状態で行われ、前記フィルターを通過した液体が前記フィルターを再度通過するように前記液体を循環させ、かつ下記（１）又は（２）の少なくともいずれかを満たすように行われる、細胞分離方法。
（１）前記フィルターによる前記細胞の単位時間あたりの捕捉量の変化量をΔＴとしたとき、ΔＴが０以下となる期間を前記捕捉工程の少なくとも一部に有する。
（２）前記フィルターによる前記細胞の単位時間あたりの新たな捕捉量をＲ１とし、前記フィルターからの前記細胞の単位時間あたりの放出量をＲ２としたとき、Ｒ１≦Ｒ２の関係式が成立する期間を前記捕捉工程の少なくとも一部に有する。
【請求項２】
前記フィルター内における前記細胞の移動速度をＶ１とし、前記フィルター外における前記細胞の移動速度をＶ２とした場合、０＜（Ｖ１／Ｖ２）＜１の関係式が成立する、請求項１に記載の細胞分離方法。
【請求項３】
前記液体が、前記捕捉対象の細胞以外の他の成分をさらに含み、前記フィルター内における前記細胞の速度をＶ１とし、前記フィルター内における前記他の成分の移動速度をＶ３とした場合、Ｖ１＜Ｖ３の関係式が成立する、請求項１又は請求項２に記載の細胞分離方法。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
捕捉された前記細胞を培養する工程をさらに有する、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項７】
前記細胞が血中循環がん細胞（ＣＴＣ）であり、前記液体が血液である、請求項１、２、３、６のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項８】
前記フィルターが多孔質体である、請求項１、２、３、６、７のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項９】
前記フィルターがガラス粒子の焼結体である、請求項１、２、３、６、７、８のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
生体から採取した体液から細胞を除去するための、請求項１、２、３、６、７、８、９のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項１２】
血液から特定の成分を回収又は除去するための、請求項１、２、３、６、７、８、９、１１のいずれか１項に記載の細胞分離方法。
【請求項１３】
捕捉対象の細胞を含む液体が流動する流路と、前記流路内に設けられて前記細胞を捕捉するフィルターを有し、前記細胞が前記フィルター内を移動する状態で前記捕捉が行われ、前記フィルターを通過した液体が前記フィルターを再度通過するように前記液体を循環させ、かつ下記（１）又は（２）の少なくともいずれかを満たすように前記捕捉が行われる、細胞分離装置。
（１）前記フィルターによる前記細胞の単位時間あたりの捕捉量の変化量をΔＴとしたとき、ΔＴが０以下となる期間を前記捕捉工程の少なくとも一部に有する。
（２）前記フィルターによる前記細胞の単位時間あたりの新たな捕捉量をＲ１とし、前記フィルターからの前記細胞の単位時間あたりの放出量をＲ２としたとき、Ｒ１≦Ｒ２の関係式が成立する期間を前記捕捉工程の少なくとも一部に有する。
【請求項１４】
前記細胞の前記フィルター内における移動速度を制御する制御機構をさらに有する、請求項１３に記載の細胞分離装置。
【国際調査報告】
2018038060.tif 000012
2018038060.tif 000013
2018038060.tif 000014
2018038060.tif 000015