(57)【要約】  本技術では、微小粒子の特性を光学的に測定する微小粒子測定において、測定の効率化を図る技術を提供する。  これに対し、本技術では、微小粒子を含む複数の容器のうち一の容器から送液された、微小粒子からの光を検出する検出部と、前記検出部で検出した情報に基づき、ある時間区間における検出数に関連する特徴量を特定し、所定の閾値に基づいて前記特徴量が異常であると判定し、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御する情報処理部と、を備える微小粒子測定装置などを提供する。
2018047442.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小粒子を含む複数の容器のうち一の容器から送液された、微小粒子からの光を検出する検出部と、
前記検出部で検出した情報に基づき、ある時間区間における検出数に関連する特徴量を特定し、所定の閾値に基づいて前記特徴量が異常であると判定し、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御する情報処理部と、
を備える微小粒子測定装置。
【請求項２】
前記情報処理部は、異常であると判定した場合、警告を表示するよう制御する、請求項１に記載の微小粒子測定装置。
【請求項３】
前記情報処理部は、所定回数異常であると判定した場合、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御する、請求項１に記載の微小粒子測定装置。
【請求項４】
前記特徴量は、単位時間当たりの検出数であり、
前記情報処理部は、前記単位時間当たりの検出数が前記所定の閾値未満であった場合、異常であると判定する、請求項１に記載の微小粒子測定装置。
【請求項５】
前記所定の閾値は、検出開始から所定時間経過後の単位時間当たりの検出数に基づき特定される値である、請求項４に記載の微小粒子測定装置。
【請求項６】
前記情報処理部は、前記異常が気泡の混入に基づく異常であると判定する、請求項１に記載の微小粒子測定装置。
【請求項７】
前記特徴量は、前記検出部にてトリガー時間が所定の閾時間（Ｔth）を超えて検出された波形パルスの単位時間当たりの割合（Ｒ）であり、
前記情報処理部は、前記割合（Ｒ）が前記所定の閾値を超えた場合、気泡の混入に基づく異常であると判定する、請求項６に記載の微小粒子測定装置。
【請求項８】
前記所定の閾値は、測定対象である微小粒子の大きさに基づき予め定められた値（Ｒth）である、請求項７に記載の微小粒子測定装置。
【請求項９】
前記微小粒子が通流し、検出される検出流路と、
前記検出流路と排液容器とを連結する排液流路と、を更に有し、
前記情報処理部は、前記異常が気泡の混入に基づく異常である場合、前記気泡を前記検出流路及び／又は前記排液流路から前記排液容器に排液するよう制御する、請求項６に記載の微小粒子測定装置。
【請求項１０】
前記情報処理部は、前記異常が気泡の混入に基づく異常である場合、前記検出部で検出された情報のうち、気泡検出時及び気泡検出開始時点から所定の時間遡った時点までに検出された情報を除いて微小粒子の解析を行う、請求項６に記載の微小粒子測定装置。
【請求項１１】
前記情報処理部は、前記一の容器に対して異常に基づき検出を終了したことを表示するよう制御する、請求項１に記載の微小粒子測定装置。
【請求項１２】
前記情報処理部は、前記一の容器に対する検出を終了するよう前記検出部を制御する、請求項１に記載の微小粒子測定装置。
【請求項１３】
前記複数の容器から微小粒子を送液する送液部を更に有し、
前記情報処理部は、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御するため、前記一の容器からの送液を終了するよう前記送液部を制御する、請求項１に記載の微小粒子測定装置。
【請求項１４】
前記複数の容器から微小粒子を送液する送液部を更に有し、
前記情報処理部は、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御した後、前記複数の容器のうちその他の容器からの送液を開始するよう前記送液部を制御する、請求項１に記載の微小粒子測定装置。
【請求項１５】
前記情報処理部は、前記一の容器に対して気泡の混入に基づく異常で検出を終了したことを表示するよう制御する、請求項６に記載の微小粒子測定装置。
【請求項１６】
微小粒子を含む複数の容器のうち一の容器から送液された、微小粒子からの光を検出する検出工程と、
前記検出工程で検出した情報に基づき、ある時間区間における検出数に関連する特徴量を特定し、所定の閾値に基づいて前記特徴量が異常であると判定し、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御する情報処理工程と、
を含む微小粒子測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、微小粒子の特性を光学的に測定する微小粒子測定装置などに関する。より詳しくは、細胞等の微小粒子の特性を光学的に測定する微小粒子測定装置及び微小粒子測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分析手法の発展に伴い、細胞や微生物等の生体微小粒子、マイクロビーズ等の微小粒子などを流路中に通流させ、通流させる工程において、微小粒子等を個々に測定したり、測定した微小粒子等を解析又は分取したりする手法が用いられている。【０００３】
このような手法の代表的な一例として、フローサイトメトリーと呼ばれる分析手法の技術改良が急速に進んでいる。フローサイトメトリーとは、解析の対象となる微小粒子を流体中に整列させた状態で流し込み、該微小粒子にレーザー光等を照射することにより、各微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出することで、微小粒子の解析や分取を行う分析手法である。このフローサイトメトリーに用いられる装置は、フローサイトメーターと呼ばれている。【０００４】
また、近年、フローサイトメーター等の微小粒子測定装置では、全自動化が進められており、例えば、それぞれ異なるサンプルが保持されている複数の容器（試験管、マイクロチューブ、Well等）から自動でサンプリングを行い、測定まで行う装置が開発されている。【０００５】
このような装置に対し、例えば、特許文献１では、分析対象の粒子を含むサンプル液及びシース液が導入される導入部と、前記サンプル液とシース液とで形成された層流が通流する検出部とを備えるフローセルと、前記フローセルの直下に、サンプル液導入方向に対して順方向及び逆方向に移動可能に配置され、サンプル液を吸引する吸引ノズルと、前記フローセルの導入部内に配置されて吸引されたサンプル液を前記フローセル内に排出するサンプル液導入ノズルとが一体で形成されたサンプル液導入部材と、前記サンプル液導入部材の移動量を規制する移動規制機構と、を有する粒子分析装置を提供することにより、他の粒子の混入を抑制し、高精度で粒子を分析できる技術が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−２２２２０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の装置では、複数の容器にサンプル溶液を入れ、連続して測定が行われることが多い。この場合、該装置では、一つの容器からの検出（イベント）数がある数量に到達した時点で、その容器における測定を終了するように設定することがある。しかし、各容器の測定終了の条件を検出数に設定した場合、サンプルがないなどといった挙動を装置が認識できていないと、無駄な測定データを取得したり、測定に時間がかかったりするといった問題があった。また、同一の容器の測定に長時間要すると、それ以降の未測定のサンプルが劣化する等の悪影響も出る。【０００８】
また、容器にサンプルがない場合には、空気が吸い込まれ、流路内で気泡になってしまう。この気泡があるとその後のサンプルの測定データが大きくバラついてしまうため、毎回のサンプル測定終了後に洗浄を長く行うことも考えられるが、その場合、測定が長時間化してしまうといった問題が生じる。【０００９】
そこで、本技術では、微小粒子の特性を光学的に測定する微小粒子測定において、測定の効率化を図る技術を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本技術では、まず、微小粒子を含む複数の容器のうち一の容器から送液された、微小粒子からの光を検出する検出部と、前記検出部で検出した情報に基づき、ある時間区間における検出数に関連する特徴量を特定し、所定の閾値に基づいて前記特徴量が異常であると判定し、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御する情報処理部と、を備える微小粒子測定装置を提供する。
本技術において、前記情報処理部は、異常であると判定した場合、警告を表示するよう制御してもよい。
また、本技術において、前記情報処理部は、所定回数異常であると判定した場合、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御してもよい。
更に、本技術において、前記特徴量は、単位時間当たりの検出数であり、前記情報処理部は、前記単位時間当たりの検出数が前記所定の閾値未満であった場合、異常であると判定してもよい。この場合、前記所定の閾値は、検出開始から所定時間経過後の単位時間当たりの検出数に基づき特定される値であってもよい。
加えて、本技術において、前記情報処理部は、前記異常が気泡の混入に基づく異常であると判定してもよい。この場合、前記特徴量は、前記検出部にてトリガー時間が所定の閾時間（Ｔth）を超えて検出された波形パルスの単位時間当たりの割合（Ｒ）であり、前記情報処理部は、前記割合（Ｒ）が前記所定の閾値を超えた場合、気泡の混入に基づく異常であると判定してもよい。また、この場合、前記所定の閾値は、測定対象である微小粒子の大きさに基づき予め定められた値（Ｒth）であってもよい。
本技術に係る微小粒子測定装置は、前記微小粒子が通流し、検出される検出流路と、前記検出流路と排液容器とを連結する排液流路と、を更に有し、前記情報処理部は、前記異常が気泡の混入に基づく異常である場合、前記気泡を前記検出流路及び／又は前記排液流路から前記排液容器に排液するよう制御してもよい。
また、本技術において、前記情報処理部は、前記異常が気泡の混入に基づく異常である場合、前記検出部で検出された情報のうち、気泡検出時及び気泡検出開始時点から所定の時間遡った時点までに検出された情報を除いて微小粒子の解析を行ってもよい。
更に、本技術において、前記情報処理部は、前記一の容器に対して異常に基づき検出を終了したことを表示するよう制御してもよい。
加えて、本技術において、前記情報処理部は、前記一の容器に対する検出を終了するよう前記検出部を制御してもよい。
本技術に係る微小粒子測定装置は、前記複数の容器から微小粒子を送液する送液部を更に有し、前記情報処理部は、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御するため、前記一の容器からの送液を終了するよう前記送液部を制御してもよい。
また、本技術に係る微小粒子測定装置は、前記複数の容器から微小粒子を送液する送液部を更に有し、前記情報処理部は、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御した後、前記複数の容器のうちその他の容器からの送液を開始するよう前記送液部を制御してもよい。
更に、本技術において、前記情報処理部は、前記一の容器に対して気泡の混入に基づく異常で検出を終了したことを表示するよう制御してもよい。【００１１】
また、本技術では、微小粒子を含む複数の容器のうち一の容器から送液された、微小粒子からの光を検出する検出工程と、前記検出工程で検出した情報に基づき、ある時間区間における検出数に関連する特徴量を特定し、所定の閾値に基づいて前記特徴量が異常であると判定し、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御する情報処理工程と、を含む微小粒子測定方法も提供する。【００１２】
本技術において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソーム等の生体関連微小粒子、或いはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子等の合成粒子などが広く含まれるものとする。【００１３】
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。細胞には、動物細胞(例えば、血球系細胞等)及び植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌等の細菌類、タバコモザイクウイルス等のウイルス類、イースト菌等の菌類などが含まれる。更に、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体等の生体関連高分子も包含される。また、工業用粒子は、例えば、有機若しくは無機高分子材料、金属等であってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレート等が含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料等が含まれる。金属には、金コロイド、アルミ等が含まれる。これらの微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、本技術では、非球形であってもよく、また、その大きさ、質量等も特に限定されない。
【発明の効果】
【００１４】
本技術によれば、微小粒子の特性を光学的に測定する微小粒子測定において、測定の効率化を図ることができる。なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本技術に係る微小粒子測定装置１の第１実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図２】本技術に係る微小粒子測定装置１の第２実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図３】Ａは最初からイベントが検出されない場合（Case 1）のeps-time曲線を示す図であり、ＢはBoost（ブースト）後にイベントが検出されない場合（Case 2）のeps-time曲線を示す図であり、Ｃはサンプルが途中でなくなり、イベントが検出されない場合（Case 3）のeps-time曲線を示す図である。
【図４】３種類のBoostの強さ（Short、Normal、Long）と初期のeps-time曲線の関係を示す図である。
【図５】微小粒子測定装置１での測定データ（eps-time曲線）の一例を示す図面代用グラフである。
【図６】サンプルが途中でなくなり、気泡がイベントとして検出される場合（Case 4）のeps-time曲線を示す図である。
【図７】微小粒子測定装置１のうち、サンプルを負圧で取り入れる構造に関する部分を模式的に示す図である。
【図８】トリガー時間算出の具体例を述べるに当たり、レーザー径、流速、サンプルサイズ、及びトリガーの閾値（Ｉth）の関係を示した図である。
【図９】Ａはイベントチェック及び復帰フローを実施しなかった場合の結果を示す図であり、Ｂはイベントチェック及び復帰フローを実施した場合の結果を示す図である。
【図１０】図５とは異なる微小粒子測定装置１での測定データ（eps-time曲線）の一例を示す図面代用グラフである。
【図１１】Ａは気泡データマスクを実施しなかった場合の結果を示す図であり、Ｂは気泡データマスクを実施した場合の結果を示す図である。
【図１２】本技術に係る微小粒子測定方法を用いた微小粒子測定の流れの一例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．微小粒子測定装置１
（１）検出部１１
（２）情報処理部１２
［情報処理例１］
＜イベントチェックの具体例＞
［情報処理例２］
＜復帰フロー＞
＜気泡データマスク＞
＜イベントチェック（気泡検知）の具体例＞
＜イベントチェック及び復帰フローを実施した場合の結果例＞
＜気泡データマスクの具体例＞
＜気泡データマスクを実施した場合の結果例＞
（３）送液部１３
（４）光照射部１４
（５）分取部１５
（６）記憶部１６
（７）流路Ｐ
（８）表示部１７
（９）ユーザーインターフェース１８
（１０）その他
２．微小粒子測定方法
【００１７】
＜１．微小粒子測定装置１＞
図１は、本技術に係る微小粒子測定装置１の第１実施形態を模式的に示す模式概念図であり、図２は、本技術に係る微小粒子測定装置１の第２実施形態を模式的に示す模式概念図である。本技術に係る微小粒子測定装置１は、微小粒子の特性を光学的に測定する装置であって、検出部１１と、情報処理部１２と、を少なくとも備える。また、必要に応じて、送液部１３、光照射部１４、分取部１５、記憶部１６、流路Ｐ、表示部１７、及びユーザーインターフェース１８などを備えていてもよい。以下、各部について詳細に説明する。
【００１８】
（１）検出部１１
検出部１１では、微小粒子を含む複数の容器のうち一の容器から送液された、微小粒子からの光を検出する。
【００１９】
検出部１１は、微小粒子からの光の検出ができれば、その種類は特に限定されず、公知の光検出器を適宜選択できる。例えば、蛍光測定器、散乱光測定器、透過光測定器、反射光測定器、回折光測定器、紫外分光測定器、赤外分光測定器、ラマン分光測定器、ＦＲＥＴ測定器、ＦＩＳＨ測定器、その他各種スペクトラム測定器、複数の光検出器をアレイ状に並べた、所謂マルチチャンネル光検出器などを１種又は２種以上自由に組み合わせて採用することができる。
【００２０】
本技術では、ＣＣＤやＣＭＯＳ素子等のエリア撮像素子、ＰＭＴ、フォトダイオード等を検出部１１として備えることができるが、これらの中でも特に、ＰＭＴを検出部１１として備えることが好ましい。
【００２１】
また、本技術では、検出部１１を異なる検出波長域を有する複数の受光素子から構成することが好ましい。検出部１１を異なる検出波長域を有する複数の受光素子から構成することで、連続した波長域における光の強度を蛍光スペクトルとして計測することができる。具体的には、例えば、受光素子を一次元に配列したＰＭＴアレイ又はフォトダイオードアレイ、或いはＣＣＤ又はＣＭＯＳ等の２次元受光素子などの独立した検出チャネルが複数並べられたものが挙げられるが、これらの中でも特に、複数のＰＭＴから検出部１１を構成することが好ましい。
【００２２】
微小粒子測定装置１における検出部１１の設置箇所は、微小粒子からの光の検出ができれば特に限定されず、適宜自由に設計できる。例えば、図１及び２に示すように、流路Ｐを挟んで光照射部１４と逆側に配置することが好ましい。また、蛍光は照射光の入射方向とは異なる方向にも放射されるため、本技術では、検出部１１を、流路Ｐを基準に光照射部１４と同じ側や約９０°側面の側に設置することもできる。
【００２３】
（２）情報処理部１２
情報処理部１２では、各種情報処理、各種解析、並びに、検出部１１、送液部１３、光照射部１４、分取部１５、記憶部１６、表示部１７、及びユーザーインターフェース１８等の制御を行われる。情報処理としては、具体的には、検出部１１で検出した情報に基づき、ある時間区間における検出数に関連する特徴量を特定し、所定の閾値に基づいて前記特徴量が異常であると判定し、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御する。なお、本明細書中では、この情報処理の一連の流れを「イベントチェック：Event Check」と称することもある。
【００２４】
前述の通り、従来の装置（特に、測定が全自動化された装置）では、複数の容器にサンプル溶液を入れ、連続して測定が行われることが多く、この場合、一つの容器からの検出数がある数量に到達した時点で、その容器における測定を終了するように設定することがあった。しかし、各容器の測定終了の条件を検出数に設定すると、検出数がある数量に到達しないと、その容器での測定が終了しないことになる。
【００２５】
その容器での測定が終了しない現象が起こるのは、容器内にバッファー溶液のみでサンプルがない場合（具体的には、例えば、サンプルの入れ忘れ等）、サンプル濃度が極めて薄い場合、サンプルが少量である場合、サンプルラインが詰まった場合、サンプルが途中でなくなった場合、サンプル溶液がフローセルに入って来ない場合、サンプルが沈殿している場合などといった、作業ミスや装置に起因するエラー等が原因として考えられる。このような各種挙動を装置が認識できていないと、無駄な測定データを取得したり、測定に時間がかかったりするといったことがあった。また、同一の容器で測定が停滞してしまうと、別の容器のサンプルが経時により劣化し、測定データ全体に悪影響が見られることもあった。これに対し、ある容器の測定において、タイムアウトを設定することも考えられるが、その設定が必ずしも適切でない場合もあり、測定データに逆に悪影響が出ることもある。
【００２６】
また、前述の通り、容器にサンプルがない場合、空気が吸い込まれて流路内で気泡になってしまい、その後のサンプルの測定データが大きくバラついてしまうといった悪影響が出る。そのため、気泡を検知するためにバブルセンサー等の特別なセンサーを搭載することも考えられるが、その構造上、取り付けが困難な場合があり、また、その設計や部品のコストもかかる。また、気泡を除去するために、毎回のサンプル測定終了後に洗浄を長く行うことも考えられるが、その場合、測定時間が長時間化してしまう。
【００２７】
これに対して、本技術では、上述した情報処理（イベントチェック）を行うことにより、測定の効率化を図ることができる。その結果、（ｉ）作業ミスや装置に起因するエラー等があっても、同一の容器に長時間留まることなく測定を終了し、測定時間を無駄にしない、（ｉｉ）全自動の測定において、有益なデータのみの取得を効率的に行うことが出来る、（ｉｉｉ）全自動の測定で信頼性が高く、かつ、迅速な測定が可能になる、（ｉｖ）ハードウェア的な気泡センサーの取り付け、開発が必要なくなる、（ｖ）気泡に起因するデータとその近辺の不良のデータを除外し、良好なデータのみを解析に使用できる、などといった効果が得られる。
【００２８】
イベントチェックの方法としては、検出部１１の種類、測定対象となる微小粒子の種類、測定目的等に応じて、適宜自由な方法を用いることができる。具体的には、例えば、以下の情報処理例１及び２に示す方法等が挙げられる。
【００２９】
［情報処理例１］
情報処理例１では、図３のＡに示すように最初からイベントが検出されない場合（Case 1）、図３のＢに示すようにBoost（ブースト）後にイベントが検出されない場合（Case 2）、図３のＣに示すようにサンプルが途中でなくなり、イベントが検出されない場合（Case 3）を想定した処理例である。図３中、ａは測定開始時点、ｂはイベントが検出されない時点、ｃはイベントが減少する時点、をそれぞれ示している。
【００３０】
Case 1及び2に対しては、例えば、前記特徴量を単位時間当たりの検出数とし、前記単位時間当たりの検出数が前記所定の閾値未満であった場合、異常であると判定する。
【００３１】
より具体的には、例えば、Boost終了からある時間経過後より1秒あたりの検出数：epsを評価し、該検出数が所定の閾値未満ならば、異常であると判定する。なお、Case 1やCase 2が起こる要因としては、例えば、サンプルがない、装置自体の吸引力が弱い、サンプルの濃度が薄い、サンプルが沈殿している、サンプルの粘性が高くサンプルが吸引されないといったことが考えられる。サンプルが沈殿している、サンプルの粘性が高くサンプルが吸引されないといった要因に対しては、測定終了後に、撹拌を実施する、吸引圧力を強くして再度読み込むといった等の処理を実施することが、動作候補の一つとして考えられる。
【００３２】
Case 3に対しては、例えば、Case 1及び2と同様に、前記特徴量を単位時間当たりの検出数とし、前記単位時間当たりの検出数が前記所定の閾値未満であった場合、異常であると判定する。この場合、前記所定の閾値は、検出開始から所定時間経過後の単位時間当たりの検出数に基づき特定される値とすることが考えられる。
【００３３】
より具体的には、例えば、測定開始からある時間経過後のepsを基準数とし、それ以後の単位時間当たりの検出数が該基準数のある割合未満であるならば、異常であると判定する。また、本技術では、Case 3において、Case 1及び2と同様に、前述した絶対数で単位時間当たりの検出数の評価も継続して行い、それによる異常の判定の可能性を継続してもよい。
【００３４】
なお、本技術では、情報処理部１２は、異常であると判定した場合、警告（＝Warning）を表示するように制御することができる。また、情報処理部１２は、所定回数異常であると判定した場合、前記一の容器に対する検出を終了するように制御することもできる。本技術において、前記所定回数は複数回であることが好ましい。
【００３５】
更には、情報処理部１２は、前記一の容器に対して異常に基づき検出を終了したことを表示する（例えば、Errorと表示する）よう制御することもできる。より具体的には、後述する表示部１７を制御することにより行うことができる。また、情報処理部１２は、前記一の容器に対する検出を終了するよう検出部１１を制御することもできる。これらのことは、当然ながら、後述する情報処理例２の場合（Case 4）に対しても適用できる。
【００３６】
次に、Boostについて述べる。Boostは、初期のイベントの出現をできるだけ早くするために実施するものである。ただし、Boostが強いとBoost中の検出は、サンプルの通過位置のバラつきが大きくなり、データとして悪化することが多い。このため、少量サンプルや衝撃に弱いサンプルの場合は、Boostを短くし、多量のサンプルや衝撃に弱くないサンプルの場合は、Boostを強くすることがある。
【００３７】
そのBoostの強さ（例えば、Short、Normal、Longの３種類）により、図４に示すように、初期のeps-time曲線が変化する。そのため、Boostの強さによって、イベントチェックの開始時点を変更する必要がある。例えば、各Boostにおいて、Wait時間を、Shortは12秒、Normal及びLongは7秒と、それぞれ設定し、イベントチェックの開始時点をWait時間経過後とする。
【００３８】
以下、情報処理例１について、測定データの具体例を用いてより詳細に説明する。
【００３９】
＜イベントチェックの具体例＞
図５は、微小粒子測定装置１での測定データ（eps-time曲線）の一例を示す図面代用グラフである。Boostの種類によってWait時間を設定し、Wait時間経過後、イベントチェックを開始し、例えば、5秒間の最大epsを基準数とする。また、絶対的な検出数の判定規格（＝Case 1及び2の場合の所定の閾値）は、５未満とする。更に、イベントの減少の判定規格（＝Case 3の場合の所定の閾値）は、前記基準数の10％を設定する。基準数は容器毎に、サンプルの濃度が異なりイベントの出現も異なるため、毎回取得することとする。
【００４０】
epsの評価は1秒毎に実施し、前述した各判定規格を下回った場合は、異常である判定し、Warning１回とする。サンプルの偏り等による小epsの誤動作を避けるため、このWarningが５回連続で起こった場合にErrorと判定し、その容器での測定を終了して、次の容器の測定に移る。
【００４１】
この具体例で述べた方法により、上記Case1〜3のいずれの場合に対しても対応できる。
【００４２】
［情報処理例２］
情報処理例２では、図６に示すようにサンプルが途中でなくなり、気泡がイベントとして検出される場合（Case 4）を想定した処理例である。図６中、ａは測定開始時点、ｃはイベントが減少する時点、ｄは気泡がイベントとして検出される時点、をそれぞれ示している。
【００４３】
気泡は前方散乱の信号を有し、通常のサンプルと同様にイベントとして検出されてしまう。このことから、散乱の信号で通常のサンプルと気泡との区別をつけることはできない。
【００４４】
ここで、フローサイトメーター等の装置の測定可能サンプルサイズは、最大で数十μｍのものが多いことから、これとレーザーの焦点における径と流路に流れる液体の速度により、サンプル散乱光に検出されるトリガー時間（＝検出された信号にトリガーがかかっている時間、サンプル検出時間）の最大値が論理的に算出できる。
【００４５】
気泡は、小さいものもあれば、大きいものもあり、気泡検知によるトリガー時間はその気泡の大小に左右される。気泡が装置の測定可能サンプルサイズの最大よりも大きい場合には、トリガー時間による区別が可能となる。特に、図７のようなサンプルを負圧で取り入れる構造においては、サンプルがなくなると、空気が吸引され、検出部１１には気泡が常に通過し、イベントにおけるトリガー時間に特徴が現れる。なお、図７中の矢印は、送液方向を示す。
【００４６】
そこで、気泡検知の方法として、例えば、前記特徴量を、前記検出部にてトリガー時間が所定の閾時間（Ｔth）を超えて検出された波形パルスの単位時間当たりの割合（Ｒ）とし、Ｒが前記所定の閾値を超えた場合、前記異常を気泡の混入に基づく異常であると判定する方法が考えられる。Ｔthの設定方法としては、例えば、装置の仕様上、測定対象である微小粒子の大きさに上限がある場合、その上限に相当するトリガー時間に基づいて設定する方法等が挙げられる。
【００４７】
また、この場合、前記所定の閾値は、測定対象である微小粒子の大きさに基づき予め定められた値（Ｒth）とすることができる。Ｒthの設定方法としては、例えば、装置の仕様上、測定対象である微小粒子の大きさに上限がある場合、前述した方法により設定したＴthを超えるイベントの割合等を考慮に入れて設定する方法等が挙げられる。
【００４８】
そして、ＲがＲthを超えた場合、気泡が入っていると判断し、異常であると判定する。その後、本技術では、情報処理部１２は、後述する復帰フローや気泡データマスクの対応の動作に入ってもよい。
【００４９】
なお、本技術では、情報処理部１２は、前記一の容器に対して気泡の混入に基づく異常で検出を終了したことを表示するよう制御することもできる。例えば、情報処理部１２は、前述したCase 1〜3の場合とCase 4の場合とで表示を区別し、ユーザーにその異常が気泡の混入に基づく異常であるか否かを知らせるように表示するよう制御してもよい。
【００５０】
＜復帰フロー＞
空気をサンプルノズルより吸った場合、排液流路に気泡があると送液の乱れに繋がる。乱れのない送液へ復帰するためには、排液流路から気泡を取り除く必要がある。気泡を取り除く具体的な方法としては、例えば、本技術に係る微小粒子測定装置１が、前記微小粒子が通流し、検出される検出流路Ｆ１と、検出流路Ｆ１と排液容器Ｔ３とを連結する排液流路Ｆ２と、を更に有する場合、情報処理部１２が、前記気泡を検出流路Ｆ１及び／又は排液流路Ｆ２から（好ましくは、検出流路Ｆ１及び排液流路Ｆ２から）排液容器Ｔ３に排液するよう制御する方法が挙げられる。これにより、気泡の混入による送液の乱れを排除できる。なお、本明細書中では、この一連の流れを「復帰フロー」と称する。
【００５１】
＜気泡データマスク＞
気泡検出時のデータはもちろん、その直前のデータもサンプルの負荷が軽くなるため、フローポイントが乱れて、測定データは大きなバラつきを持つ。このバラつきを抑える具体的な方法としては、例えば、検出部１１で検出された情報のうち、気泡検出時及び気泡検出開始時点から所定の時間遡った時点までに検出された情報を除いて微小粒子の解析を行う方法が挙げられる。これにより、良好なデータのみを実験データとして解析することが可能となる。なお、本明細書中では、この一連の流れを「気泡データマスク」と称する。
【００５２】
以下、情報処理例２について、測定データの具体例を用いてより詳細に説明する。
【００５３】
＜イベントチェック（気泡検知）の具体例＞
例えば、測定可能サンプルサイズの仕様書上の上限が、40μｍである微小粒子測定装置１では、図８に示す通り、レーザー径は流路方向に9μｍであり、また、流速は5ｍ/ｓであることから、サイズが40μｍであるサンプル検出時のトリガー時間は、信号強度に対するトリガーの閾値（Ｉth）が信号の立ち上がりと立ち下がりを捉えた場合、（40＋9）＊（10＾−6）／5＝9.8（μｓ）となる（ただし、通常の場合、Ｉthは少し高めに設定しているため、トリガー時間は実際上、9.8μｓより短くなる）。
【００５４】
送液速度のバラつき等を考慮に入れて、例えば、トリガー時間の判別の閾値（Ｔth）＝12μｓと設定する。また、サンプルがなく、気泡が吸われた際のトリガー時間が12μｓを超えるサンプルの割合は、本装置においては15％以上であることが判明しているため、Ｔthを超えるイベントの割合の閾値（Ｒth）＝10％と設定する。
【００５５】
以上のことから、システムとして、eps中にＴth（＝12μｓ）を超えるイベントの割合がＲth（＝10％）を超えた場合、気泡が入ったと判断して異常であると判定し、Warning１回とする。このWarningが５回連続で起こった場合にErrorと判定し、その容器での測定を終了する。その後、上述した復帰フローを実施し、次の容器での測定に移る。
【００５６】
＜イベントチェック及び復帰フローを実施した場合の結果例＞
図９のＡはイベントチェック及び復帰フローを実施しなかった場合の結果を示す図であり、図９のＢはイベントチェック及び復帰フローを実施した場合の結果を示す図である。図９のＡでは、気泡検知（イベントチェック）がされないため、気泡（泡）をTotal Events（＝10,000）まで吸ってしまい、気泡を吸った後の次の容器（Well）の測定データは不安定になっている。一方で、図９のＢでは、気泡検知がされ、その容器での測定を終了し、復帰フローが行われる。そのため、気泡を吸った後であっても、次の容器での測定データは安定していることが分かる。
【００５７】
＜気泡データマスクの具体例＞
図１０は、図５とは異なる微小粒子測定装置１での測定データ（eps-time曲線）の一例を示す図面代用グラフである。気泡検知の開始は、Boost時に気泡が発生することがあるため、Boost終了後、例えば、7秒間をWait時間として設定する。サンプルがなくなると空気が入って来て、負荷が軽くなっていくため、検出数が上がり、コアフローのバラつきが大きくなってデータが劣化する（図１０中のｅ時点以降のデータを参照）。このため、気泡データマスクを行う必要がある。具体的には、例えば、図１０に示すように、気泡データの部分と、気泡が入り始めた時間から更に3秒間遡った区間までをマスク対象とする。この場合、取得されたデータにおいては、気泡の割合を最後から検出数により0.1秒ごとに検証していき、最初の気泡データ時点を見つける。次に、そこから更に3秒間遡って、データをマスクする機能を適用し、良好なデータのみを解析に使用する。
【００５８】
この気泡データマスクのアルゴリズムをまとめると、以下の通りとなる。
（ａ）最後の1秒間で、Ｒthを判定する。
（ｂ）Ｒthが判定規格を超えている場合は、そこから判定区間を0.1秒前に戻り、判定する。
（ｃ）Ｒthが判定規格を超えない時間を見つけるまで、（ｂ）を繰り返し行う。
（ｄ）Ｒthが判定規格を超えない時間より、3秒間前に戻り、そこから最後までを気泡データマスク対象区間とする。
【００５９】
＜気泡データマスクを実施した場合の結果例＞
図１１のＡは気泡データマスクを実施しなかった場合の結果を示す図であり、図１１のＢは気泡データマスクを実施した場合の結果を示す図である。図１１のＡでは、気泡やコアのバラつきが大きく、全体的にデータのバラつきが大きい。一方で、図１１のＢでは、Ａと比較してデータのバラつきが小さくなっていることが分かる。
【００６０】
（３）送液部１３
本技術に係る微小粒子測定装置１では、送液部１３を更に備えることができる。送液部１３では、前記複数の容器から微小粒子を送液する。より具体的には、例えば、サンプルを含む容器（試験管、マイクロチューブ、Well等）からノズルを介してサンプルを送液する、又はサンプルを含む容器を格納可能な格納部に圧力をかけることでサンプルを送液する。
【００６１】
本技術に係る微小粒子測定装置１が送液部１３を備える場合、前述した情報処理部１２は、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御するため、前記一の容器からの送液を終了するよう送液部１３を制御することができる。また、情報処理部１３は、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御した後、前記複数の容器のうちその他の容器からの送液を開始するよう送液部１３を制御することもできる。これにより、測定の更なる効率化を図ることができる。
【００６２】
（４）光照射部１４
本技術に係る微小粒子測定装置１では、光照射部１４を更に備えることができる。光照射部１４では、分析対象となる微小粒子に対して光を照射する。
【００６３】
光照射部１４から照射される光の種類は特に限定されないが、粒子から蛍光や散乱光を確実に発生させるためには、光方向、波長、及び光強度が一定の光が好ましい。具体的には、例えば、レーザー、ＬＥＤ等を挙げることができる。レーザーを用いる場合、その種類も特に限定されないが、アルゴンイオン（Ar）レーザー、ヘリウム−ネオン（He-Ne）レーザー、ダイ（dye）レーザー、クリプトン（Cr）レーザー、半導体レーザー、又は半導体レーザーと波長変換光学素子を組み合わせた固体レーザー等を１種又は２種以上自由に組み合わせて用いることができる。
【００６４】
（５）分取部１５
本技術に係る微小粒子測定装置１は、微小粒子の分取を行う分取部１５を更に備えることができる。分取部１５では、検出部１１により検出された値を情報処理部１２で補正して生成されたスペクトルデータに基づいて、微小粒子の分取が行われる。分取部１５では、該スペクトルデータから解析された微小粒子の大きさ、形態、内部構造等の解析結果に基づいて、流路Ｐの下流において、微小粒子の分取を行うことができる。
【００６５】
具体的には、例えば、図２に示すように、所定の振動数で振動する振動素子１５ａ等を用いて、流路Ｐの全体又は一部に振動を加えることで、流路Ｐの吐出口から液滴を発生させる。なお、この場合、用いる振動素子１５ａは特に限定されず、公知のものを適宜自由に選択できる。一例としては、ピエゾ振動素子等を挙げることができる。また、流路Ｐへの送液量、吐出口の径、振動素子の振動数等を調整することにより、液滴の大きさを調整し、微小粒子を一定量ずつ含む液滴を発生させることができる。
【００６６】
次に、情報処理部１２で補正して生成されたスペクトルデータに基づいて解析された微小粒子の大きさ、形態、内部構造等の解析結果に基づいて、プラス又はマイナスの電荷を荷電する（図２中符号１５ｂ参照）。そして、荷電された液滴は、電圧が印加された対向電極１５ｃによって、その進路が所望の方向へ変更され、分取される。
【００６７】
（６）記憶部１６
本技術に係る微小粒子測定装置１では、記憶部１６を更に備えることができる。記憶部１６では、前記特徴量、前記所定の閾値、情報処理部１２での判定結果、検出部１１で検出された値、情報処理部１２にて生成されたスペクトルデータ、各チャンネルの基準スペクトル、解析結果等の、測定に関わるあらゆる事項を記憶することができる。
【００６８】
微小粒子測定装置１において、記憶部１６は必須ではなく、外部の記憶装置を接続してもよい。記憶部１６としては、例えば、ハードディスク等を用いることができる。
【００６９】
（７）流路Ｐ
本技術に係る微小粒子測定装置１では、流路Ｐを更に備えることができる。本技術に係る微小粒子測定装置１では、フローセル（流路Ｐ）中で一列に整列させた微小粒子から得られる光学的情報を検出することにより、微小粒子の解析や分取を行うことができる。
【００７０】
流路Ｐは、微小粒子測定装置１に予め備えていてもよいが、市販の流路Ｐや流路Ｐが設けられた使い捨てのチップ等を微小粒子測定装置１に設置して解析又は分取を行うことも可能である。
【００７１】
流路Ｐの形態も特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、図１に示すような２次元又は３次元のプラスチックやガラス等の基板Ｔ内に形成した流路Ｐに限らず、図２に示すように、従来のフローサイトメーターで用いられているような流路Ｐも、本技術に係る微小粒子測定装置１に対して適用できる。
【００７２】
また、流路Ｐの流路幅、流路深さ、流路断面形状も、層流を形成し得る形態であれば特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、流路幅１ｍｍ以下のマイクロ流路も、微小粒子測定装置１に用いることが可能である。特に、流路幅１０μｍ以上１ｍｍ以下程度のマイクロ流路は、本技術に係る微小粒子測定装置１に好適である。
【００７３】
（８）表示部１７
本技術に係る微小粒子測定装置１では、表示部１７を更に備えることができる。表示部１７では、前記特徴量、前記所定の閾値、情報処理部１２での判定結果、検出部１１で検出された値、情報処理部１２にて生成されたデータ、各チャンネルの基準スペクトル、解析結果等の、測定に関わるあらゆる事項を表示することができる。
【００７４】
具体的には、例えば、図９及び１１で示したデータ等を表示する。本技術では、特に、図９のＢの左上の画像に示すように、前記一の容器に対して異常に基づき検出が終了した場合（例えば、あるWellでの測定がErrorがとなった場合等）、画面上のその容器の対応箇所に所定のマーク（例えば、エクスクラメーションマーク等）を表示してもよい。
【００７５】
また、前記一の容器に対して気泡の混入に基づく異常で検出を終了した場合（＝Case 4に該当して検出を終了した場合）には、画面上のその容器の対応箇所に気泡の混入に基づく異常である旨を示すマークを表示してもよい。本技術では、更に、検出を終了した原因が、Case 1〜4のいずれに該当するかによって表示するマークを適宜変更し、表示してもよい。これにより、ユーザビリティが向上する。
【００７６】
微小粒子測定装置１において、表示部１７は必須ではなく、外部の表示装置を接続してもよい。表示部１７としては、例えば、ディスプレイやプリンタ等を用いることができる。
【００７７】
（９）ユーザーインターフェース１８
本技術に係る微小粒子測定装置１では、ユーザーが操作するための部位であるユーザーインターフェース１８を更に備えることができる。ユーザーは、ユーザーインターフェース１８を通じて、情報処理部１２にアクセスし、本技術に係る微小粒子測定装置１の各部を制御することができる。
【００７８】
微小粒子測定装置１において、ユーザーインターフェース１８は必須ではなく、外部の操作装置を接続してもよい。ユーザーインターフェース１８としては、例えば、マウスやキーボード等を用いることができる。
【００７９】
（１０）その他
なお、本技術では、本技術に係る微小粒子測定装置１の各部で行われる機能を、パーソナルコンピュータや、ＣＰＵ等を含む制御部及び記録媒体（不揮発性メモリ（ＵＳＢメモリ等）、ＨＤＤ、ＣＤ等）等を備えるハードウェア資源にプログラムとして格納し、パーソナルコンピュータや制御部によって機能させることも可能である。
【００８０】
＜２．微小粒子測定方法＞
本技術に係る微小粒子測定方法は、検出工程と、情報処理工程と、を少なくとも行う方法である。検出工程や情報処理工程で行う具体的な方法は、それぞれ、前述した微小粒子測定装置１の、検出部１１や情報処理部１２で行われる方法と同様であるため、ここでは説明を割愛する。
【００８１】
以下、本技術に係る微小粒子測定方法を用いた微小粒子測定の流れの一例について、図１２を参照しながら説明する。なお、図１２に示すフローチャートの各ステップの処理は、例えば、前述した各部によって行われる。
【００８２】
まず、情報処理部１２は、一の容器を選択し、検出部１１での検出を開始する（ステップS1）。そして、情報処理部１２は、ｎ＝０とし、Boostを行った後（ステップS2）、Waitする（ステップS3）。Wait時間は、前述した通り、Boostの種類等により適宜自由に設定できる。
【００８３】
そして、情報処理部１２は、イベントチェックの各判定規格に抵触するか否かを判定する（ステップS4）。各判定規格とは、具体的には、例えば、前述した情報処理例１及び２で示した判定規格等が挙げられる。各判定規格に抵触しない場合は、情報処理部１２は、ｎ＝０として再びステップS4に戻る。
【００８４】
一方で、各判定規格に抵触した場合は、情報処理部１２は、ｎ＞ｔ（例えば、ｎ＞４）であるか否かを判定する（ステップS5）。ｎ＞ｔでない場合は、情報処理部１２は、Warningとして処理し、ｎ＝ｎ＋１として再びステップS4に戻る。一方で、ｎ＞ｔである場合は、情報処理部１２は、Errorと判断して検出部１１での検出を終了する（ステップS6）。その後、情報処理部１２は、ｎ回のWarningのうち、気泡検知があったか否かを判定する（ステップS7）。気泡の検知があった場合は、情報処理部１２は、復帰フローを実施する（ステップS8）。また、図１２中には記載していないが、この際、情報処理部１２は気泡データマスクを行うこともできる。
【００８５】
気泡検知がなかった場合、又は復帰フローを実施した後は、情報処理部１２は、測定対象とした全ての容器での検出は終了したか否かを判定する（ステップS9）。測定対象とした全ての容器での検出が終了していない場合は、情報処理部１２はステップS1に戻り、次の一の容器を選択し、再び検出部１１での検出を開始する。一方で、測定対象とした全ての容器での検出が終了していた場合は、情報処理部１２は、測定を終了する。
【００８６】
なお、本技術では、以下の構成を取ることもできる。
（１）
微小粒子を含む複数の容器のうち一の容器から送液された、微小粒子からの光を検出する検出部と、
前記検出部で検出した情報に基づき、ある時間区間における検出数に関連する特徴量を特定し、所定の閾値に基づいて前記特徴量が異常であると判定し、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御する情報処理部と、
を備える微小粒子測定装置。
（２)
前記情報処理部は、異常であると判定した場合、警告を表示するよう制御する、（１）に記載の微小粒子測定装置。
（３）
前記情報処理部は、所定回数異常であると判定した場合、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御する、（１）又は（２）に記載の微小粒子測定装置。
（４）
前記特徴量は、単位時間当たりの検出数であり、
前記情報処理部は、前記単位時間当たりの検出数が前記所定の閾値未満であった場合、異常であると判定する、（１）から（３）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（５）
前記所定の閾値は、検出開始から所定時間経過後の単位時間当たりの検出数に基づき特定される値である、（４）に記載の微小粒子測定装置。
（６）
前記情報処理部は、前記異常が気泡の混入に基づく異常であると判定する、（１）から（３）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（７）
前記特徴量は、前記検出部にてトリガー時間が所定の閾時間（Ｔth）を超えて検出された波形パルスの単位時間当たりの割合（Ｒ）であり、
前記情報処理部は、前記割合（Ｒ）が前記所定の閾値を超えた場合、気泡の混入に基づく異常であると判定する、（６）に記載の微小粒子測定装置。
（８）
前記所定の閾値は、測定対象である微小粒子の大きさに基づき予め定められた値（Ｒth）である、（７）に記載の微小粒子測定装置。
（９）
前記微小粒子が通流し、検出される検出流路と、
前記検出流路と排液容器とを連結する排液流路と、を更に有し、
前記情報処理部は、前記異常が気泡の混入に基づく異常である場合、前記気泡を前記検出流路及び／又は前記排液流路から前記排液容器に排液するよう制御する、（６）から（８）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（１０）
前記情報処理部は、前記異常が気泡の混入に基づく異常である場合、前記検出部で検出された情報のうち、気泡検出時及び気泡検出開始時点から所定の時間遡った時点までに検出された情報を除いて微小粒子の解析を行う、（６）から（９）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（１１）
前記情報処理部は、前記一の容器に対して異常に基づき検出を終了したことを表示するよう制御する、（１）から（１０）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（１２）
前記情報処理部は、前記一の容器に対する検出を終了するよう前記検出部を制御する、（１）から（１１）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（１３）
前記複数の容器から微小粒子を送液する送液部を更に有し、
前記情報処理部は、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御するため、前記一の容器からの送液を終了するよう前記送液部を制御する、（１）から（１２）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（１４）
前記複数の容器から微小粒子を送液する送液部を更に有し、  前記情報処理部は、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御した後、前記複数の容器のうちその他の容器からの送液を開始するよう前記送液部を制御する、（１）から（１３）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（１５）
前記情報処理部は、前記一の容器に対して気泡の混入に基づく異常で検出を終了したことを表示するよう制御する、（６）から（１４）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（１６）
微小粒子を含む複数の容器のうち一の容器から送液された、微小粒子からの光を検出する検出工程と、
前記検出工程で検出した情報に基づき、ある時間区間における検出数に関連する特徴量を特定し、所定の閾値に基づいて前記特徴量が異常であると判定し、前記一の容器に対する検出を終了するよう制御する情報処理工程と、
を含む微小粒子測定方法。
【符号の説明】
【００８７】
１  微小粒子測定装置
１１  検出部
１２  情報処理部
１３  送液部
１４  光照射部
１５  分取部
１６  記憶部
１７  表示部
１８  ユーザーインターフェース
Ｐ  流路
Ｔ  基板
Ｔ１  シースタンク
Ｔ２  内部排液タンク
Ｔ３  排液容器
Ｐ１、Ｐ２  ポンプ
Ｆ１  検出流路
Ｆ２  排液流路
【図１】
2018047442.tif 000003
【図２】
2018047442.tif 000004
【図３】
2018047442.tif 000005
【図４】
2018047442.tif 000006
【図５】
2018047442.tif 000007
【図６】
2018047442.tif 000008
【図７】
2018047442.tif 000009
【図８】
2018047442.tif 000010
【図９】
2018047442.tif 000011
【図１０】
2018047442.tif 000012
【図１１】
2018047442.tif 000013
【図１２】
2018047442.tif 000014
【国際調査報告】
2018047442.tif 000015
2018047442.tif 000016
2018047442.tif 000017
2018047442.tif 000018