(57)【要約】  副作用を減じたアンチセンス核酸（ＡＳＯ）を提供すること。  ＡＳＯにおいて、天然の核酸間結合であるホスホジエステル結合と、リン酸基の酸素原子の一つを硫黄原子に置換したホスホロチオエート化結合を交互に持つ構造をアンチセンス活性部位に用いることにより、上記課題は解決される。
2018051762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（ＸＸ）で表されるＰＳＰＯユニットを含む、アンチセンス核酸
【化１】
2018051762.tif 000084
［式中、
Ａは、独立に、化学修飾されていてもよいヌクレオシドから選択され、
ｎは、２以上の整数を表す］。
【請求項２】
以下の式（ＸＸ’）で表される構造を有する、請求項１に記載のアンチセンス核酸
【化２】
2018051762.tif 000085
［式中、
Ａは、独立に、化学修飾されていてもよいヌクレオシドから選択され、
ｎは、２以上の整数を表し、
Ｙは、上記ＰＳＰＯユニットの５’側に位置し、かつアンチセンス核酸の５’末端に位置する構成単位を含む、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含む５’ウィング領域；式（ＸＸ’−ａ）もしくは式（ＸＸ’−ｂ）
【化３】
2018051762.tif 000086
で表される部分；またはＹ−ＰＳＰＯユニット−ＮＬ−（ここで、ＮＬはヌクレオチドリンカーを表す）であり、そして、
Ｚは、上記ＰＳＰＯユニットの３’側に位置し、かつアンチセンス核酸の３’末端に位置する構成単位を含む、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含む３’ウィング領域；化学修飾されていてもよいヌクレオシド；式（ＸＸ’−ｃ）もしくは式（ＸＸ’−ｄ）
【化４】
2018051762.tif 000087
で表される部分；または−ＮＬ−ＰＳＰＯユニット−Ｚ（ここで、ＮＬはヌクレオチドリンカーを表す）である］。
【請求項３】
少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいヌクレオチドを構成単位として含み、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有する１つまたは複数のモチーフを含むアンチセンス核酸であって、
上記モチーフが以下の式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される、請求項１に記載のアンチセンス核酸。
【化５】
2018051762.tif 000088
［式中、
Ａ１〜Ａｉは、それぞれ互いに独立に、化学修飾されていてもよいヌクレオシドから選択され、
Ｒは、独立に、式（Ｉ）が核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
ここで、部分構造（Ｉ−ａ）
【化６】
2018051762.tif 000089
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（Ｉ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜１００の整数であり、そして
当該部分構造（Ｉ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］、
または、
【化７】
2018051762.tif 000090
［式中、
Ａ１〜ＡｉおよびＲは、式（Ｉ）に関して定義されるとおりであり、
ここで、部分構造（ＩＩ−ａ）
【化８】
2018051762.tif 000091
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（ＩＩ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜１００の整数であり、そして  当該部分構造（ＩＩ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］。
【請求項４】
Ａ１〜Ａｉのうちの連続した少なくとも４つが、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオシドである、請求項３に記載のアンチセンス核酸。
【請求項５】
（ａ）上記モチーフの５’側に位置し、かつアンチセンス核酸の５’末端に位置する構成単位を含む、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含む５’ウィング領域、および／または、
（ｂ）上記モチーフの３’側に位置し、かつアンチセンス核酸の３’末端に位置する構成単位を含む、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含む３’ウィング領域、
および任意選択的に、
（ｃ）上記５’ウィング領域と上記モチーフの間、上記モチーフと上記３’ウィング領域の間および／または上記モチーフ間に介在し、１〜２０塩基の長さを有する少なくとも１つのヌクレオチドリンカー、
をさらに含み、
上記５’ウィング領域および３’ウィング領域は、それぞれ互いに独立に、１〜１０塩基の長さを有する、
請求項４に記載のアンチセンス核酸。
【請求項６】
上記デオキシリボヌクレオシドが化学修飾されていない、請求項４または５のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸。
【請求項７】
上記５’ウィング領域および上記３’ウィング領域を含み、
上記５’ウィング領域が、式（ＩＩＩ）
【化９】
2018051762.tif 000092
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｃは、１〜９の整数を表す］
で表され、
上記３’ウィング領域が、式（ＩＶ）
【化１０】
2018051762.tif 000093
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｄは、１〜９の整数を表す］
で表されるか；
あるいは、
上記５’ウィング領域が、式（ＩＩＩ’）または式（ＩＩＩ’’）：
【化１１】
2018051762.tif 000094
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｃ’は、０〜４の整数を表す］、
または
【化１２】
2018051762.tif 000095
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｃ’は、０〜４の整数を表す］
で表され、
上記３’ウィング領域が、式（ＩＶ’）または式（ＩＶ’’）：
【化１３】
2018051762.tif 000096
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｄ’は、０〜４の整数を表す］
または
【化１４】
2018051762.tif 000097
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｄ’は、０〜４の整数を表す］
で表される、
請求項５または６に記載のアンチセンス核酸。
【請求項８】
Ｘが独立して、核酸類似体である、請求項７に記載のアンチセンス核酸。
【請求項９】
核酸類似体が、架橋化核酸である、請求項８に記載のアンチセンス核酸。
【請求項１０】
架橋化核酸が、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、アミドＢＮＡ及びｃＭＯＥ−ＢＮＡからなる群から選択される、請求項９に記載のアンチセンス核酸。
【請求項１１】
長さが８〜１００塩基である、請求項１〜１０のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸。
【請求項１２】
式（Ｖ）
【化１５】
2018051762.tif 000098
［式中、
Ａ１〜Ａｉは、独立して、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオシドであり、
Ｒは、独立に、式（Ｖ）のＡ１からＡｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｅは１〜９の整数、ｇは１〜９の整数を表し、
ここで、部分構造（Ｖ−ａ）
【化１６】
2018051762.tif 000099
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（Ｖ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜９６の整数であり、そして
当該部分構造（Ｖ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］
で表される構造、または、
式（ＶＩ）
【化１７】
2018051762.tif 000100
［式中、
Ａ１〜Ａｉは、独立して、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオシドであり、
Ｒは、独立に、式（ＶＩ）のＡ１からＡｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｅは１〜９の整数、ｇは１〜９の整数を表し、
ここで、部分構造（ＶＩ−ａ）
【化１８】
2018051762.tif 000101
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（ＶＩ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜９６の整数であり、そして
当該部分構造（ＶＩ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］
で表される構造、または、
式（Ｖ’）
【化１９】
2018051762.tif 000102
［式中、
Ａ１〜Ａｉは、独立して、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオシドであり、
Ｒは、独立に、式（Ｖ’）のＡ１からＡｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｅ’は０〜４の整数を示し、そしてｇ’は０〜４の整数を表し、
ここで、部分構造（Ｖ’−ａ）
【化２０】
2018051762.tif 000103
は常に存在し、そして
ｉ＝６〜９６の整数である］
で表される構造、または、
式（ＶＩ’）
【化２１】
2018051762.tif 000104
［式中、
Ａ１〜Ａｉは、独立して、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオシドであり、
Ｒは、独立に、式（ＶＩ’）のＡ１からＡｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｅ’は０〜４の整数を示し、そしてｇ’は０〜４の整数を表し、
ここで、部分構造（ＶＩ’−ａ）
【化２２】
2018051762.tif 000105
は常に存在し、そして
ｉ＝６〜９６の整数である］
で表される構造を有する、請求項３〜１１のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸。
【請求項１３】
上記モチーフが、式（ＶＩＩ）
【化２３】
2018051762.tif 000106
［式中、Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
Ｑは、Ｓ−またはＯ−であり、そして
ｆは、１〜１０の整数である］
で表される１つまたは複数の構造により、１か所または複数か所で中断されている、請求項３〜１２のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸。
【請求項１４】
Ａ１〜Ａｉが、それぞれ互いに独立に、化学修飾ヌクレオシドから選択される、請求項３に記載のアンチセンス核酸。
【請求項１５】
上記化学修飾ヌクレオシドが核酸類似体である、請求項１４に記載のアンチセンス核酸。
【請求項１６】
式（ＶＩＩＩ）
【化２４】
2018051762.tif 000107
［式中、
ＸおよびＸ１〜Ｘｉは、独立して核酸類似体であり、
Ｒは、独立に、式（ＶＩＩＩ）のＸ１からＸｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
ｅは１〜９の整数、ｇは１〜９の整数を表し、
ここで、部分構造（ＶＩＩＩ−ａ）
【化２５】
2018051762.tif 000108
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（ＶＩＩＩ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜９６の整数であり、そして
当該部分構造（ＶＩＩＩ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］
で表される構造、または、
式（ＩＸ）
【化２６】
2018051762.tif 000109
［式中、
ＸおよびＸ１〜Ｘｉは、独立して核酸類似体であり、
Ｒは、独立に、式（ＩＸ）のＸ１からＸｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
ｅは１〜９の整数、ｇは１〜９の整数を表し、
ここで、部分構造（ＩＸ−ａ）
【化２７】
2018051762.tif 000110
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（ＩＸ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜９６の整数であり、そして
当該部分構造（ＩＸ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］
で表される構造、または、
式（ＶＩＩＩ’）
【化２８】
2018051762.tif 000111
［式中、
ＸおよびＸ１〜Ｘｉは、独立して核酸類似体であり、
Ｒは、独立に、式（ＶＩＩＩ’）のＸ１からＸｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
ｅ’は０〜４の整数を示し、そしてｇ’は０〜４の整数を表し、
ここで、部分構造（ＶＩＩＩ’−ａ）
【化２９】
2018051762.tif 000112
は常に存在し、そして
ｉ＝６〜９６の整数である］
で表される構造、または、
式（ＩＸ’）
【化３０】
2018051762.tif 000113
［式中、
ＸおよびＸ１〜Ｘｉは、独立して核酸類似体であり、
Ｒは、独立に、式（ＩＸ’）のＸ１からＸｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
ｅ’は０〜４の整数を示し、そしてｇ’は０〜４の整数を表し、
ここで、部分構造（ＩＸ’−ａ）
【化３１】
2018051762.tif 000114
は常に存在し、そして
ｉ＝６〜９６の整数である］
で表される構造を有する、請求項３、１４および１５のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸。
【請求項１７】
（ｉ）請求項１〜１６のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸、および
（ｉｉ）化学修飾されていてもよいヌクレオチドを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）アンチセンス核酸に対して相補的なポリヌクレオチドを含む相補鎖、
を含む二本鎖核酸複合体。
【請求項１８】
（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドが、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドおよび／または化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドを構成単位として少なくとも含む、請求項１７に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項１９】
（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドが、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドのみを構成単位として含む、請求項１８に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項２０】
（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドが、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオチドのみを構成単位として含む、請求項１９に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項２１】
（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドが、化学修飾されていないリボヌクレオチドのみを構成単位として含む、請求項１８に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項２２】
（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドが、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドおよび化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドのみを構成単位として含む、請求項１８に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項２３】
上記ポリヌクレオチドが、上記デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドを交互に含む、請求項２２に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項２４】
上記デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが化学修飾されていない、請求項２２または２３に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項２５】
（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドが少なくとも１つのバルジを含む、請求項１７〜２４のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項２６】
（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉ）アンチセンス核酸に対して少なくとも１つのミスマッチを含む、請求項１７〜２５のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項２７】
上記（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドの長さが、８〜１００塩基である、請求項１７〜２６のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項２８】
上記（ｉ）アンチセンス核酸が、上記（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドと同じ長さを有する、請求項１７〜２７のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項２９】
上記（ｉ）アンチセンス核酸の長さが、上記（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドの長さと異なる、請求項１７〜２７のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項３０】
少なくとも１つのリガンドを含む、請求項１７〜２９のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項３１】
少なくとも１つのリガンドが、上記（ｉｉ）相補鎖のポリヌクレオチドの１つまたは複数の構成単位に結合している、請求項３０に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項３２】
上記少なくとも１つのリガンドが、タンパク質リガンド、ペプチドリガンド、アプタマーリガンド、糖鎖リガンド、脂質リガンド、低分子リガンドおよび生体分子／生体活性分子リガンドからなる群から選択される、請求項３０または３１に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項３３】
上記少なくとも１つのリガンドが、環状ペプチド、Ｎ−アセチルガラクトサミン、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール）もしくはその類縁体、ステアリン酸、ドコサン酸、アニスアミド、葉酸もしくはその類縁体、アナンダミドまたはスペルミンである、請求項３２に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項３４】
哺乳動物において標的遺伝子の発現を減少させるための、請求項１〜１６のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸。
【請求項３５】
標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、請求項３４に記載のアンチセンス核酸。
【請求項３６】
哺乳動物において、標的遺伝子の発現が亢進している細胞の増殖を抑制するための、請求項１〜１６のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸。
【請求項３７】
上記標的遺伝子ががん遺伝子であり、上記細胞が癌細胞である、請求項３６に記載のアンチセンス核酸。
【請求項３８】
哺乳動物において標的遺伝子の発現を減少させるための、請求項１７〜３３のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項３９】
上記（ｉ）アンチセンス核酸が、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、請求項３８に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項４０】
哺乳動物において、標的遺伝子の発現が亢進している細胞の増殖を抑制するための、請求項１７〜３３のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項４１】
上記標的遺伝子ががん遺伝子であり、上記細胞が癌細胞である、請求項４０に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項４２】
請求項１〜１６のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸または請求項１７〜３３のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体と、任意に薬理学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項４３】
癌を治療および／または予防するための、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
請求項１〜１６のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸または請求項１７〜３３のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体を細胞と接触させる工程を含む、細胞内の転写産物レベルを低減する方法であって、
アンチセンス核酸が該転写産物のいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、方法。
【請求項４５】
上記転写産物が、タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
上記転写産物が、タンパク質をコードしない転写産物である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
哺乳動物において標的遺伝子の発現を低減させるための、請求項１〜１６のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸または請求項１７〜３３のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体の使用。
【請求項４８】
哺乳動物において標的遺伝子の発現を低減させるための薬剤を製造するための、請求項１〜１６のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸または請求項１７〜３３のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体の使用。
【請求項４９】
請求項１〜１６のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸または請求項１７〜３３のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において標的遺伝子の発現レベルを低減する方法であって、
アンチセンス核酸が、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、方法。
【請求項５０】
上記投与が経腸管的投与である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
上記投与が非経腸管的投与である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
上記核酸複合体の投与量が、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項４９〜５１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５３】
上記哺乳動物がヒトある、請求項４９〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンチセンス効果によって標的遺伝子の発現を阻害又は制御する活性を有するアンチセンス核酸の副作用を減じる構造に関し、より詳しくは、核酸間のホスホロチオエート結合を至適に用いることで、アンチセンス効果の維持と副作用低減の両立を可能としたアンチセンス核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、オリゴヌクレオチドは、核酸医薬と称される医薬品としての開発が進められており、特に標的遺伝子の選択性の高さの観点から、アンチセンス法を利用した核酸医薬の開発が精力的に進められている。アンチセンス法は、標的遺伝子のｍＲＮＡ（センス鎖）の部分配列に相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンス核酸（ＡＳＯ））を細胞内に導入することにより、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を選択的に阻害又は制御する方法である。【０００３】
ＡＳＯとして臨床試験が実施されているパイプラインの大半を占めているのが、ＰＳ型ＡＳＯである。ＰＳ型ＡＳＯは、天然の核酸間結合であるホスホジエステル結合（図１．Ａ）のリン酸基の酸素原子の一つを硫黄原子に置換しホスホロチオエート化（ＰＳ化）したものである（図１．Ｂ）。ＰＳ化は、ヌクレアーゼ耐性（非特許文献１）、細胞内への取り込み（非特許文献２）等の点で向上が見られるが、肝毒性等の様々な副作用の原因となっていることが知られている（非特許文献３）。【０００４】
ＰＳ型ＡＳＯの代表例の一つとして、第二世代の核酸構造と呼ばれるＧａｐｍｅｒ構造を持つ抗コレステロール血症治療薬としてＩｏｎｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社により開発されたｍｉｐｏｍｅｒｓｅｎが挙げられる。２０１３年に世界初の全身投与型核酸医薬品としてホモ接合性家族性高コレステロール血症を対象に米国において承認されたが、ＰＳ型ＡＳＯの持つ肝毒性等の様々な副作用が認められた（非特許文献４）。また、欧州においては副作用を理由に承認に至っていない（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １６，  ｐｐ．３２０９−３２２１，  （１９９８）
【非特許文献２】Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖ．，  ３，  ｐｐ．５３−６６，  （２００９），ｄｏｉ：１０．１０８９／ａｒｄ．１９９３．３．５３．
【非特許文献３】Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９９６  Ｏｃｔ；１４（１０）：３７６−８７．
【非特許文献４】Ｕ．  Ｓ．  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｎｅｗｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ＮｅｗｓＥｖｅｎｔｓ／Ｎｅｗｓｒｏｏｍ／ＰｒｅｓｓＡｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔｓ／ｕｃｍ３３７１９５．ｈｔｍ？ｓｏｕｒｃｅ＝ｇｏｖｄｅｌｉｖｅｒｙ．
【非特許文献５】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ，  ＥＭＡ／７９２７３６／２０１２，  ＥＭＥＡ／Ｈ／Ｃ／００２４２９，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｕｅｎａｖｉｓｔａｉｎｖ．ｃｏｍ／ｄｂｉｍａｇｅｓ／Ｉｓｉｓ％２０Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．ｐｄｆ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、副作用を減じたアンチセンス核酸（ＡＳＯ）を提供することである。【０００７】
本発明のさらなる目的は、ＡＳＯの副作用の原因とされるＰＳ化修飾を至適に用いることで、ＡＳＯのアンチセンス効果を維持したまま副作用を低減したＡＳＯを提供することである。【０００８】
本発明のさらに別の目的は、上記ＡＳＯと、それに対して少なくとも一部が相補的なポリヌクレオチドとを含む二本鎖核酸複合体を提供することである。【０００９】
本発明の他の目的は、以下の記載から明らかとなろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、ＡＳＯにおいて、天然の核酸間結合であるホスホジエステル結合と、リン酸基の酸素原子の一つを硫黄原子に置換したホスホロチオエート化（ＰＳ化）結合を交互に持つ構造（図１．Ｃ）をアンチセンス活性部位に用いることにより、アンチセンス効果を維持したまま副作用を低減する効果を見出した。【００１１】
また、本発明者等は、上記構造を有するＡＳＯとそれに対して少なくとも一部が相補的なポリヌクレオチドとを含む二本鎖核酸も同様に、上記ＡＳＯに基づくアンチセンス効果を維持する一方で、その副作用は低減されることを見出した。【００１２】
従って、本発明は以下に関する：
１．以下の式（ＸＸ）で表されるＰＳＰＯユニットを含む、アンチセンス核酸【００１３】
【化１】
2018051762.tif 000003
【００１４】
［式中、
Ａは、独立に、化学修飾されていてもよいヌクレオシドから選択され、
ｎは、２以上の整数を表す］。
２．以下の式（ＸＸ’）で表される構造を有する、上記１に記載のアンチセンス核酸【００１５】
【化２】
2018051762.tif 000004
【００１６】
［式中、
Ａは、独立に、化学修飾されていてもよいヌクレオシドから選択され、
ｎは、２以上の整数を表し、
Ｙは、上記ＰＳＰＯユニットの５’側に位置し、かつアンチセンス核酸の５’末端に位置する構成単位を含む、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含む５’ウィング領域；式（ＸＸ’−ａ）もしくは式（ＸＸ’−ｂ）【００１７】
【化３】
2018051762.tif 000005
【００１８】
で表される部分；またはＹ−ＰＳＰＯユニット−ＮＬ−（ここで、ＮＬはヌクレオチドリンカーを表す）であり、そして、
Ｚは、上記ＰＳＰＯユニットの３’側に位置し、かつアンチセンス核酸の３’末端に位置する構成単位を含む、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含む３’ウィング領域；化学修飾されていてもよいヌクレオシド；式（ＸＸ’−ｃ）もしくは式（ＸＸ’−ｄ）【００１９】
【化４】
2018051762.tif 000006
【００２０】
で表される部分；または−ＮＬ−ＰＳＰＯユニット−Ｚ（ここで、ＮＬはヌクレオチドリンカーを表す）である］。
３．少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいヌクレオチドを構成単位として含み、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有する１つまたは複数のモチーフを含むアンチセンス核酸であって、
上記モチーフが以下の式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される、上記１に記載のアンチセンス核酸。【００２１】
【化５】
2018051762.tif 000007
【００２２】
［式中、
Ａ１〜Ａｉは、それぞれ互いに独立に、化学修飾されていてもよいヌクレオシドから選択され、
Ｒは、独立に、式（Ｉ）が核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
ここで、部分構造（Ｉ−ａ）【００２３】
【化６】
2018051762.tif 000008
【００２４】
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（Ｉ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜１００の整数であり、そして
当該部分構造（Ｉ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］、
または、【００２５】
【化７】
2018051762.tif 000009
【００２６】
［式中、
Ａ１〜ＡｉおよびＲは、式（Ｉ）に関して定義されるとおりであり、
ここで、部分構造（ＩＩ−ａ）【００２７】
【化８】
2018051762.tif 000010
【００２８】
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（ＩＩ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜１００の整数であり、そして  当該部分構造（ＩＩ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］。
４．Ａ１〜Ａｉのうちの連続した少なくとも４つが、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオシドである、上記３に記載のアンチセンス核酸。
５．（ａ）上記モチーフの５’側に位置し、かつアンチセンス核酸の５’末端に位置する構成単位を含む、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含む５’ウィング領域、および／または、
（ｂ）上記モチーフの３’側に位置し、かつアンチセンス核酸の３’末端に位置する構成単位を含む、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含む３’ウィング領域、
および任意選択的に、
（ｃ）上記５’ウィング領域と上記モチーフの間、上記モチーフと上記３’ウィング領域の間および／または上記モチーフ間に介在し、１〜２０塩基の長さを有する少なくとも１つのヌクレオチドリンカー、
をさらに含み、
上記５’ウィング領域および３’ウィング領域は、それぞれ互いに独立に、１〜１０塩基の長さを有する、
上記４に記載のアンチセンス核酸。
６．上記デオキシリボヌクレオシドが化学修飾されていない、上記４または５のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸。
７．上記５’ウィング領域および上記３’ウィング領域を含み、
上記５’ウィング領域が、式（ＩＩＩ）【００２９】
【化９】
2018051762.tif 000011
【００３０】
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｃは、１〜９の整数を表す］
で表され、
上記３’ウィング領域が、式（ＩＶ）【００３１】
【化１０】
2018051762.tif 000012
【００３２】
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｄは、１〜９の整数を表す］
で表されるか；
あるいは、
上記５’ウィング領域が、式（ＩＩＩ’）または式（ＩＩＩ’’）：【００３３】
【化１１】
2018051762.tif 000013
【００３４】
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｃ’は、０〜４の整数を表す］、
または【００３５】
【化１２】
2018051762.tif 000014
【００３６】
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｃ’は、０〜４の整数を表す］
で表され、
上記３’ウィング領域が、式（ＩＶ’）または式（ＩＶ’’）：【００３７】
【化１３】
2018051762.tif 000015
【００３８】
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｄ’は、０〜４の整数を表す］
または【００３９】
【化１４】
2018051762.tif 000016
【００４０】
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｄ’は、０〜４の整数を表す］
で表される、
上記５または６に記載のアンチセンス核酸。
８．Ｘが独立して、核酸類似体である、上記７に記載のアンチセンス核酸。
９．核酸類似体が、架橋化核酸である、上記８に記載のアンチセンス核酸。
１０．架橋化核酸が、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、アミドＢＮＡ及びｃＭＯＥ−ＢＮＡからなる群から選択される、上記９に記載のアンチセンス核酸。
１１．長さが８〜１００塩基である、上記１〜１０のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸。
１２．式（Ｖ）【００４１】
【化１５】
2018051762.tif 000017
【００４２】
［式中、
Ａ１〜Ａｉは、独立して、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオシドであり、
Ｒは、独立に、式（Ｖ）のＡ１からＡｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｅは１〜９の整数、ｇは１〜９の整数を表し、
ここで、部分構造（Ｖ−ａ）【００４３】
【化１６】
2018051762.tif 000018
【００４４】
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（Ｖ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜９６の整数であり、そして
当該部分構造（Ｖ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］
で表される構造、または、
式（ＶＩ）【００４５】
【化１７】
2018051762.tif 000019
【００４６】
［式中、
Ａ１〜Ａｉは、独立して、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオシドであり、
Ｒは、独立に、式（ＶＩ）のＡ１からＡｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｅは１〜９の整数、ｇは１〜９の整数を表し、
ここで、部分構造（ＶＩ−ａ）【００４７】
【化１８】
2018051762.tif 000020
【００４８】
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（ＶＩ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜９６の整数であり、そして
当該部分構造（ＶＩ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］
で表される構造、または、
式（Ｖ’）【００４９】
【化１９】
2018051762.tif 000021
【００５０】
［式中、
Ａ１〜Ａｉは、独立して、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオシドであり、
Ｒは、独立に、式（Ｖ’）のＡ１からＡｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｅ’は０〜４の整数を示し、そしてｇ’は０〜４の整数を表し、
ここで、部分構造（Ｖ’−ａ）【００５１】
【化２０】
2018051762.tif 000022
【００５２】
は常に存在し、そして
ｉ＝６〜９６の整数である］
で表される構造、または、
式（ＶＩ’）【００５３】
【化２１】
2018051762.tif 000023
【００５４】
［式中、
Ａ１〜Ａｉは、独立して、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオシドであり、
Ｒは、独立に、式（ＶＩ’）のＡ１からＡｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｅ’は０〜４の整数を示し、そしてｇ’は０〜４の整数を表し、
ここで、部分構造（ＶＩ’−ａ）【００５５】
【化２２】
2018051762.tif 000024
【００５６】
は常に存在し、そして
ｉ＝６〜９６の整数である］
で表される構造を有する、上記３〜１１のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸。
１３．上記モチーフが、式（ＶＩＩ）【００５７】
【化２３】
2018051762.tif 000025
【００５８】
［式中、Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
Ｑは、Ｓ−またはＯ−であり、そして
ｆは、１〜１０の整数である］
で表される１つまたは複数の構造により、１か所または複数か所で中断されている、上記３〜１２のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸。
１４．Ａ１〜Ａｉが、それぞれ互いに独立に、化学修飾ヌクレオシドから選択される、上記３に記載のアンチセンス核酸。
１５．上記化学修飾ヌクレオシドが核酸類似体である、上記１４に記載のアンチセンス核酸。
１６．式（ＶＩＩＩ）【００５９】
【化２４】
2018051762.tif 000026
【００６０】
［式中、
ＸおよびＸ１〜Ｘｉは、独立して核酸類似体であり、
Ｒは、独立に、式（ＶＩＩＩ）のＸ１からＸｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
ｅは１〜９の整数、ｇは１〜９の整数を表し、
ここで、部分構造（ＶＩＩＩ−ａ）【００６１】
【化２５】
2018051762.tif 000027
【００６２】
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（ＶＩＩＩ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜９６の整数であり、そして
当該部分構造（ＶＩＩＩ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］
で表される構造、または、
式（ＩＸ）【００６３】
【化２６】
2018051762.tif 000028
【００６４】
［式中、
ＸおよびＸ１〜Ｘｉは、独立して核酸類似体であり、
Ｒは、独立に、式（ＩＸ）のＸ１からＸｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
ｅは１〜９の整数、ｇは１〜９の整数を表し、
ここで、部分構造（ＩＸ−ａ）【００６５】
【化２７】
2018051762.tif 000029
【００６６】
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（ＩＸ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜９６の整数であり、そして
当該部分構造（ＩＸ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］
で表される構造、または、
式（ＶＩＩＩ’）【００６７】
【化２８】
2018051762.tif 000030
【００６８】
［式中、
ＸおよびＸ１〜Ｘｉは、独立して核酸類似体であり、
Ｒは、独立に、式（ＶＩＩＩ’）のＸ１からＸｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
ｅ’は０〜４の整数を示し、そしてｇ’は０〜４の整数を表し、
ここで、部分構造（ＶＩＩＩ’−ａ）【００６９】
【化２９】
2018051762.tif 000031
【００７０】
は常に存在し、そして
ｉ＝６〜９６の整数である］
で表される構造、または、
式（ＩＸ’）【００７１】
【化３０】
2018051762.tif 000032
【００７２】
［式中、
ＸおよびＸ１〜Ｘｉは、独立して核酸類似体であり、
Ｒは、独立に、式（ＩＸ’）のＸ１からＸｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
ｅ’は０〜４の整数を示し、そしてｇ’は０〜４の整数を表し、
ここで、部分構造（ＩＸ’−ａ）【００７３】
【化３１】
2018051762.tif 000033
【００７４】
は常に存在し、そして
ｉ＝６〜９６の整数である］
で表される構造を有する、上記３、１４および１５のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸。
１７．（ｉ）上記１〜１６のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸、および
（ｉｉ）化学修飾されていてもよいヌクレオチドを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）アンチセンス核酸に対して相補的なポリヌクレオチドを含む相補鎖、
を含む二本鎖核酸複合体。
１８．（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドが、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドおよび／または化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドを構成単位として少なくとも含む、上記１７に記載の二本鎖核酸複合体。
１９．（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドが、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドのみを構成単位として含む、上記１８に記載の二本鎖核酸複合体。
２０．（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドが、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオチドのみを構成単位として含む、上記１９に記載の二本鎖核酸複合体。
２１．（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドが、化学修飾されていないリボヌクレオチドのみを構成単位として含む、上記１８に記載の二本鎖核酸複合体。
２２．（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドが、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドおよび化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドのみを構成単位として含む、上記１８に記載の二本鎖核酸複合体。
２３．上記ポリヌクレオチドが、上記デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドを交互に含む、上記２２に記載の二本鎖核酸複合体。
２４．上記デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが化学修飾されていない、上記２２または２３に記載の二本鎖核酸複合体。
２５．（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドが少なくとも１つのバルジを含む、上記１７〜２４のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体。
２６．（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉ）アンチセンス核酸に対して少なくとも１つのミスマッチを含む、上記１７〜２５のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体。
２７．上記（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドの長さが、８〜１００塩基である、上記１７〜２６のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体。
２８．上記（ｉ）アンチセンス核酸が、上記（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドと同じ長さを有する、上記１７〜２７のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体。
２９．上記（ｉ）アンチセンス核酸の長さが、上記（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドの長さと異なる、上記１７〜２７のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体。
３０．少なくとも１つのリガンドを含む、上記１７〜２９のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体。
３１．少なくとも１つのリガンドが、上記（ｉｉ）相補鎖のポリヌクレオチドの１つまたは複数の構成単位に結合している、上記３０に記載の二本鎖核酸複合体。
３２．上記少なくとも１つのリガンドが、タンパク質リガンド、ペプチドリガンド、アプタマーリガンド、糖鎖リガンド、脂質リガンド、低分子リガンドおよび生体分子／生体活性分子リガンドからなる群から選択される、上記３０または３１に記載の二本鎖核酸複合体。
３３．上記少なくとも１つのリガンドが、環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列含有ペプチド、Ｎ−アセチルガラクトサミン、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール）、ステアリン酸、ドコサン酸、アニスアミド、葉酸、アナンダミドまたはスペルミンである、上記３２に記載の二本鎖核酸複合体。
３４．哺乳動物において標的遺伝子の発現を減少させるための、上記１〜１６のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸。
３５．標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、上記３４に記載のアンチセンス核酸。
３６．哺乳動物において、標的遺伝子の発現が亢進している細胞の増殖を抑制するための、上記１〜１６のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸。
３７．上記標的遺伝子ががん遺伝子であり、上記細胞が癌細胞である、上記３６に記載のアンチセンス核酸。
３８．哺乳動物において標的遺伝子の発現を減少させるための、上記１７〜３３のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体。
３９．上記（ｉ）アンチセンス核酸が、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、上記３８に記載の二本鎖核酸複合体。
４０．哺乳動物において、標的遺伝子の発現が亢進している細胞の増殖を抑制するための、上記１７〜３３のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体。
４１．上記標的遺伝子ががん遺伝子であり、上記細胞が癌細胞である、上記４０に記載の二本鎖核酸複合体。
４２．上記１〜１６のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸または上記１７〜３３のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体と、任意に薬理学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
４３．癌を治療および／または予防するための、上記４２に記載の医薬組成物。
４４．上記１〜１６のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸または上記１７〜３３のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体を細胞と接触させる工程を含む、細胞内の転写産物レベルを低減する方法であって、
アンチセンス核酸が該転写産物のいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、方法。
４５．上記転写産物が、タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物である、上記４４に記載の方法。
４６．上記転写産物が、タンパク質をコードしない転写産物である、上記４４に記載の方法。
４７．哺乳動物において標的遺伝子の発現を低減させるための、上記１〜１６のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸または上記１７〜３３のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体の使用。
４８．哺乳動物において標的遺伝子の発現を低減させるための薬剤を製造するための、上記１〜１６のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸または上記１７〜３３のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体の使用。
４９．上記１〜１６のいずれか１つに記載のアンチセンス核酸または上記１７〜３３のいずれか１つに記載の二本鎖核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において標的遺伝子の発現レベルを低減する方法であって、
アンチセンス核酸が、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、方法。
５０．上記投与が経腸管的投与である、上記４９に記載の方法。
５１．上記投与が非経腸管的投与である、上記４９に記載の方法。
５２．上記核酸複合体の投与量が、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日である、上記４９〜５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．上記哺乳動物がヒトある、上記４９〜５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．上記少なくとも１つのリガンドが、環状ペプチド、Ｎ−アセチルガラクトサミン、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール）もしくはその類縁体、ステアリン酸、ドコサン酸、アニスアミド、葉酸もしくはその類縁体、アナンダミドまたはスペルミンである、上記３２に記載の二本鎖核酸複合体。
【発明の効果】
【００７５】
ＡＳＯにおいて、天然の核酸間結合であるホスホジエステル結合と、リン酸基の酸素原子の一つを硫黄原子に置換したホスホロチオエート化（ＰＳ化）結合を交互に持つ構造（図１．Ｃ）をアンチセンス活性部位に用いることにより、アンチセンス効果を維持したまま副作用を低減する効果を得ることが可能である。【００７６】
また、上記ＡＳＯを用いることにより、副作用の低減と、標的細胞、好ましくは標的癌細胞の増殖の特異的かつ効率的な抑制を両立することが可能である。【００７７】
さらに、上記ＡＳＯとそれに対して少なくとも一部が相補的なポリヌクレオチドとを含む二本鎖核酸を用いることにより、上記ＡＳＯに基づくアンチセンス効果を維持したまま副作用を低減する効果を得ることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ＤＮＡ分子のバックボーン構造において、Ａ．天然型のホスホジエステル結合のＰＯ型結合、Ｂ．ホスホロチオエート結合のＰＳ型結合、およびＣ．ＰＳ型及びＰＯ型が構造に配置されたＰＳ−ＰＯ型結合を示す。
【図２】１．第一世代と言われるアンチセンス核酸において、ＰＳ−ＰＯ構造を採用した態様を示す。黒い実線部分がＰＳ−ＰＯ構造である（ここでは、デオキシリボヌクレオチドから構成される構造を示す）。２．第二世代と言われるギャップマー構造を持つアンチセンス核酸において、ＰＳ−ＰＯ構造を採用した態様を示す。ギャップ領域である中央部（黒い実線部分）はアンチセンス活性に関して主要な役割を果たすＲＮａｓｅＨの基質であり、ＰＳ−ＰＯ構造を有する。一方、ウィング領域である両末端部（白枠で表示）には、ヌクレアーゼ耐性と標的となるｍＲＮＡに対する親和性を高めるために、化学修飾ヌクレオチド、例えばＬＮＡやＲＮＡ誘導体が用いられる。３．ウィング領域が５’末端のみにある例。４．ウィング領域が３’末端のみにある例。５及び６．アンチセンス活性部分がＲＮａｓｅＨ非依存的に機能する場合の構造例である。ここで、５は、ウィング領域と同様の構造によりギャップ領域が複数箇所で中断されている態様、６は、アンチセンス核酸全体が化学修飾ヌクレオチド、例えばＬＮＡやＲＮＡ誘導体から構成される態様を示す。
【図３】アンチセンス核酸に相補的な核酸鎖が付加した二本鎖核酸の構造の例を示す。１〜６におけるアンチセンス核酸はそれぞれ、図２の１〜６の構造に相当するものである。
【図４】Ａ５４９細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図５】Ａ４３１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図６】ＡｓＰＣ−１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図７】ＨＰＡＣ細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図８】ＨｅｐＧ２細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図９】ＭＣＦ−７細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１０】ＯＶＣＡＲ−３細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１１】ＭＣＡＳ細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１２】Ｃａｋｉ−１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１３】ＤＵ１４５細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１４】ＰＣ−３細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１５】Ｔ２４細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１６】ＨＣＴ１１６細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１７】ＨＧＣ−２７細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１８】ＭＫＮ４５細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１９】ＰＡＮＣ−１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図２０】ＯＶＣＡＲ−３細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸によるｍＲＮＡ発現抑制活性試験の結果を示す。
【図２１】Ａ４３１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸によるｍＲＮＡ発現抑制活性試験の結果を示す。
【図２２】膵癌同所移植マウスモデルを用いた場合のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）値の測定結果を示す。
【図２３】膵癌同所移植マウスモデルを用いた場合のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値の測定結果を示す。
【図２４】膵癌同所移植マウスモデルを用いた場合の肝重量比の算出結果を示す。
【図２５】膵癌同所移植マウスモデルを用いた場合の膵臓重量比の比較による抗腫瘍効果の評価結果を示す。
【図２６】ＰＡＮＣ−１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験の結果を示す。
【図２７】ＡＳＰＣ−１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験の結果を示す。
【図２８】Ａ５４９細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験の結果を示す。
【図２９】ＰＡＮＣ−１細胞株を用いた場合の、ｃＲＧＤを相補鎖中央部に結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験の結果を示す。
【図３０】Ｋ５６２細胞株を用いた場合の、ｃＲＧＤを相補鎖中央部に結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験の結果を示す。
【図３１】葉酸を相補鎖中央部に結合させたヒトＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験の結果を示す。
【図３２】ヒトＳＴＡＴ３遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験の結果を示す。
【図３３】ＰＳ−ＰＯ型２本鎖核酸のＰＢＭＣ（ヒト末梢血単核細胞）におけるインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）発現誘導作用の検証試験の結果を示す。
【図３４】リガンドがリンカーを介してヌクレオチドの２’位から懸垂しているポリヌクレオチドの例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
上述のように、本発明のアンチセンス核酸は、それを構成するポリヌクレオチドのバックボーンの少なくとも一部に、天然の核酸間結合であるホスホジエステル結合（ＰＯ型結合）と、リン酸基の酸素原子の一つを硫黄原子に置換したホスホロチオエート化（ＰＳ化）結合（ＰＳ型結合）を交互に持つ構造（ＰＳ−ＰＯ構造）を用いた核酸である。このような構造を採用することにより、本発明のアンチセンス核酸は、アンチセンス効果を維持したまま副作用を低減することができる。このＰＳ−ＰＯ構造によって、全ＰＳ型構造に比べて、アンチセンス活性部位の核酸分子、例えばＤＮＡ分子のＳ原子置換による脂質性が半減し、加えてＰＳ型とＰＯ型の結合が交互に規則的に連続する配列効果により、天然に近似したバックボーン構造効果が増大する効果を狙ったものである。このようにＡＳＯの骨格を大きく変動することによって天然の核酸と同程度の安全性（副作用の低減）を確保することができた。
【００８０】
このＰＳ−ＰＯ構造は、ＲＮＡバックボーンの例としては、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０１５，  Ｖｏｌ．４３（９），  ４５６９−４５７８、  Ｃｅｌｌ，  ２０１２，  Ｖｏｌ．１５０，  ８８３−８９４、  ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５２８７４などに記載のものが知られているが、これらの文献における核酸の作用メカニズムはＲＮＡ干渉によるものであり、本発明のようなアンチセンス効果に基づくアンチセンス核酸ではない。また、ＤＮＡのバックボーンにＰＳ−ＰＯ構造を持ち、その副作用を減じる効果を報告された例は無い。
【００８１】
ここで、「アンチセンス核酸」（本明細書では、「ＡＳＯ」とも呼ぶ）とは、ポリヌクレオチドから構成される核酸であって、アンチセンス効果を有するものをいう。アンチセンス核酸は、典型的には、一本鎖構造を有する。
【００８２】
本明細書において、「アンチセンス効果」とは、標的転写産物（ＲＮＡセンス鎖）と、例えば、その部分配列に相補的なＤＮＡ鎖、又は通常アンチセンス効果が生じるように設計された鎖等とがハイブリダイズすることによって生じる、標的遺伝子の発現又は標的転写産物レベルの抑制を意味する。ある場合においては、ハイブリダイゼーション産物により前記転写産物を被覆することによって生じ得る翻訳の阻害又はエクソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果、及び／又は、ハイブリダイズした部分が認識されることにより生じ得る前記転写産物の分解によって生じる、前記抑制も包含し得る。
【００８３】
上記のように、本発明のアンチセンス核酸はポリヌクレオチドを含む。本発明の１つの実施態様において、上記アンチセンス核酸はポリヌクレオチドであり、すなわち、ポリヌクレオチドのみからなる。
【００８４】
本発明の１つの実施態様において、本発明は、アンチセンス核酸であって、それを構成するポリヌクレオチドのバックボーンの少なくとも一部にＰＳ−ＰＯ構造を持つアンチセンス核酸に関する。上記アンチセンス核酸は一本鎖であることができる。
【００８５】
本発明の１つの実施態様において、本発明は、以下の式（ＸＸ）で表されるＰＳＰＯユニットを含む、アンチセンス核酸に関する
【００８６】
【化３２】
2018051762.tif 000034
【００８７】
［式中、
Ａは、独立に、化学修飾されていてもよいヌクレオシドから選択され、
ｎは、２以上の整数、好ましくは２〜５０、例えば５〜２０の整数を表す］。
【００８８】
また、本発明のさらなる実施態様において、本発明は、以下の式（ＸＸ’）で表される構造を有する、アンチセンス核酸に関する
【００８９】
【化３３】
2018051762.tif 000035
【００９０】
［式中、
Ａは、独立に、化学修飾されていてもよいヌクレオシドから選択され、
ｎは、２以上の整数、好ましくは２〜５０、例えば５〜２０の整数を表し、
Ｙは、上記ＰＳＰＯユニットの５’側に位置し、かつアンチセンス核酸の５’末端に位置する構成単位を含む、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含む５’ウィング領域；式（ＸＸ’−ａ）もしくは式（ＸＸ’−ｂ）
【００９１】
【化３４】
2018051762.tif 000036
【００９２】
で表される部分；またはＹ−ＰＳＰＯユニット−ＮＬ−（ここで、ＮＬはヌクレオチドリンカーを表す）であり、そして、
Ｚは、上記ＰＳＰＯユニットの３’側に位置し、かつアンチセンス核酸の３’末端に位置する構成単位を含む、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含む３’ウィング領域；化学修飾されていてもよいヌクレオシド；式（ＸＸ’−ｃ）もしくは式（ＸＸ’−ｄ）
【００９３】
【化３５】
2018051762.tif 000037
【００９４】
で表される部分；または−ＮＬ−ＰＳＰＯユニット−Ｚ（ここで、ＮＬはヌクレオチドリンカーを表す）である］。
【００９５】
本発明の１つの実施態様において、本発明は、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有する１つまたは複数のモチーフを含む、アンチセンス核酸に関する。当該モチーフは、少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいヌクレオチドを構成単位として含むことができる。
【００９６】
上記モチーフは、以下の式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される：
【００９７】
【化３６】
2018051762.tif 000038
【００９８】
［式中、
Ａ１〜Ａｉは、それぞれ互いに独立に、化学修飾されていてもよいヌクレオシドから選択され、
Ｒは、独立に、式（Ｉ）が核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
ここで、部分構造（Ｉ−ａ）
【００９９】
【化３７】
2018051762.tif 000039
【０１００】
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（Ｉ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜１００の整数であり、そして
当該部分構造（Ｉ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］、
または、
【０１０１】
【化３８】
2018051762.tif 000040
【０１０２】
［式中、
Ａ１〜ＡｉおよびＲは、式（Ｉ）に関して定義されるとおりであり、
ここで、部分構造（ＩＩ−ａ）
【０１０３】
【化３９】
2018051762.tif 000041
【０１０４】
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（ＩＩ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜１００の整数であり、そして  当該部分構造（ＩＩ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］。
【０１０５】
式（Ｉ）または（ＩＩ）に示されるように、上記モチーフは、交互にホスホジエステル結合（以下、「ＰＯ結合」ともいう）とホスホロチオエート化結合（以下、「ＰＳ結合」ともいう）を介して結合された化学修飾されていてもよいヌクレオシドから構成される。
【０１０６】
上記モチーフは、ＰＳ結合とＰＯ結合の繰り返しを少なくとも２つ有する。下記のように、部分構造（Ｉ−ａ）が存在せず、ｉ＝５の場合の式（Ｉ）（あるいは、部分構造（ＩＩ−ａ）が存在せず、ｉ＝５の場合の式（ＩＩ））が、上記繰り返しが２つの場合に相当する：
【０１０７】
【化４０】
2018051762.tif 000042
【０１０８】
また、上記モチーフは、ｉの数に応じて種々の数のＰＳ結合とＰＯ結合の繰り返しを有する構造を取り得る。
【０１０９】
例えば、ｉ＝７の場合には、上記モチーフは下記の式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される。
【０１１０】
【化４１】
2018051762.tif 000043
【０１１１】
ｉ＝７の場合の上記モチーフは、ＰＳ結合とＰＯ結合の繰り返しを３つ有する。そして、それぞれ、以下の部分：
【０１１２】
【化４２】
2018051762.tif 000044
【０１１３】
が、部分構造
【０１１４】
【化４３】
2018051762.tif 000045
【０１１５】
に相当する。
【０１１６】
なお、上記２つの式からも明らかなように、上記モチーフにおいて、最初の結合（Ａ１とＡ２との間の結合）はＰＳ結合であっても、またはＰＯ結合であってもよい。
【０１１７】
また、例えば、ｉ＝８の場合には、上記モチーフは下記の式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される：
【０１１８】
【化４４】
2018051762.tif 000046
【０１１９】
この場合、上記モチーフはＰＳ結合とＰＯ結合の繰り返しを３つ有するが、それに加えてさらにもう１つのＰＯ結合（式（Ｉ））またはＰＳ結合（式（ＩＩ））を有する。このように、上記モチーフは、必ずしも最初の結合としてＰＯ結合から始まってＰＳ結合で終わるか、あるいはＰＳ結合で始まってＰＯ結合で終わる必要はない。すなわち、上記モチーフは、ＰＳ結合とＰＯ結合が交互に繰り返される構造であれば、上記のような、ＰＳ結合で始まってＰＳ結合で終わる（またはＰＯ結合で始まってＰＯ結合で終わる）構造であることもできる。
【０１２０】
上記式（Ｉ）または（ＩＩ）において、Ｒは、ｉの数に応じて、上記のようにＰＳ結合とＰＯ結合が交互に存在するように、Ｓ−またはＯ−から独立に選択される。
【０１２１】
本発明の１つの好ましい実施態様において、上記式（Ｉ）または（ＩＩ）におけるｉは、５〜５０、より好ましくは８〜３０、さらに好ましくは１０〜２５の整数、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５である。
【０１２２】
本発明のアンチセンス核酸は、１つまたは複数の上記のモチーフを含む。本発明の１つの実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、上記モチーフを１〜１０個、好ましくは１、２、３、４または５個含む。本発明の１つの好ましい実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、上記モチーフを１個含む。
【０１２３】
また、本発明の他の実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、上記モチーフのみからなる。
【０１２４】
上記のように、上記モチーフは、少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいヌクレオチドを構成単位として含むことができる。
【０１２５】
また、本発明の１つの実施態様において、アンチセンス核酸は、リボヌクレオチドを含まないか、あるいは、リボヌクレオチドも化学修飾されたリボヌクレオチドも含まない。
【０１２６】
本発明の１つの実施態様において、上記の少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいヌクレオチドには、リボヌクレオチドが含まれない。
本発明の１つの好ましい実施態様において、上記の少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。
【０１２７】
「少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチド」は、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個の連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチド、例えば、４〜２０塩基の連続したデオキシリボヌクレオチド（化学修飾されていてもよい）を含む領域であることができ、好ましくは５〜１６塩基の連続したデオキシリボヌクレオチド（化学修飾されていてもよい）を含む領域であり、より好ましくは６〜１４塩基、例えば７〜１３塩基の連続したデオキシリボヌクレオチド（化学修飾されていてもよい）を含む領域である。この領域には、ＲＮＡ鎖にハイブリダイズした際に、ＲＮＡ鎖を切断するＲＮａｓｅＨによって認識されるヌクレオチド、例えば天然型デオキシリボヌクレオチドや核酸間結合のみが化学修飾されたデオキシリボヌクレオチドを用いることもでき、そのような場合に当該領域は、ＲＮａｓｅＨの基質となる。このような領域は、「ギャップ領域」とも呼ばれる。
【０１２８】
本発明の１つの実施態様において、上記デオキシリボヌクレオチドは化学修飾されておらず、好ましくは、核酸間結合以外の部分は化学修飾されていない。さらに、本発明の１つの実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、ＲＮａｓｅＨの基質となる領域を含み、従って、アンチセンス核酸全体としてもＲＮａｓｅＨの基質となることができる。この場合、上記アンチセンス核酸は、ＲＮａｓｅＨ依存的にアンチセンス効果を奏する。
【０１２９】
また、本発明の他の実施態様において、上記デオキシリボヌクレオチドにおいて、各ヌクレオチドは互いに独立に化学修飾されている。デオキシリボヌクレオチドに関して利用可能な修飾はこの分野において知られている。
【０１３０】
本発明の１つの実施態様において、本発明のアンチセンス核酸では、上記モチーフにおいて、Ａ１〜Ａｉのうちの連続した少なくとも４つが、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオシドである。この態様において、Ａ１〜Ａｉのうちの連続した少なくとも４つ、例えば少なくとも５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個が化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオシドであることができ、例えば、Ａ１〜Ａｉのうちの連続した４〜２０個、好ましくは５〜１６個、より好ましくは６〜１４個、例えば７〜１３個が、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオシドであることができる。本発明のさらなる１つの実施態様において、上記モチーフでは、Ａ１〜Ａｉの全てが化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオシドである。これらの態様において、好ましくは、上記デオキシリボヌクレオシドは化学修飾されていない。
【０１３１】
本発明の１つの実施態様において、核酸間結合を介して結合されたＡ１〜Ａｉのうちの連続した少なくとも４つがＲＮａｓｅＨの基質となる。この場合、アンチセンス核酸全体としてもＲＮａｓｅＨの基質となることができる。
【０１３２】
本明細書において、「核酸」とは、天然型核酸、非天然型核酸及び／又は核酸類似体をいうが、「核酸」はモノマーヌクレオチドを意味する場合もあり、複数のモノマーから構成されるオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドを意味する場合もある。「核酸鎖」という文言は、ここではオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドを称するためにも用いられる。核酸鎖は、その全部又は一部を、自動合成機の使用といった化学合成法によって調製してもよく、ポリメラーゼ、ライゲース又は制限酵素反応に限定されるわけではないが、酵素処理により調製してもよい。本発明の１つの実施態様において、本発明のアンチセンス核酸におけるポリヌクレオチド（および相補鎖におけるポリヌクレオチド）は、化学合成または酵素的反応によって人工的に調製されたものである。
【０１３３】
本明細書において、「天然型核酸」とは、ヌクレオチドを基本単位とし、リン酸が各ヌクレオチド間で糖の３’と５’位炭素の間にジエステル結合の橋をつくって結ばれ重合した自然界に存在するポリヌクレオチドをいう。通常は、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルのいずれかの塩基を有するリボヌクレオチドが連結したＲＮＡ及び／又はアデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの塩基を有するデオキシリボヌクレオチドが連結したＤＮＡが該当する。なお、本明細書では、上記の各ヌクレオチド間の結合を「核酸間結合」ともいう。
【０１３４】
本明細書において、「非天然型核酸」とは、非天然型ヌクレオチドを含む又はそれからなる核酸をいう。ここで「非天然型ヌクレオチド」とは、人工的に構築された又は人工的に化学修飾された自然界に存在しないヌクレオチドであって、前記天然に存在するヌクレオチドに類似の性質及び／又は構造を有するヌクレオチド、又は天然に存在するヌクレオシド若しくは塩基に類似の性質及び／又は構造を有するヌクレオシド若しくは塩基を含むヌクレオチドをいう。例えば、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオチドが挙げられる。さらに、置換五単糖（２’−Ｏ−メチルリボース、２’−デオキシ−２’−フルオロリボース、３’−Ｏ−メチルリボース、１’，２’−デオキシリボース）、アラビノース、置換アラビノース糖；置換六単糖及びアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオチドが含まれる。また、非天然型ヌクレオチドは、人工的に構築された塩基類似体又は人工的に化学修飾された塩基（修飾塩基）を包含するヌクレオチドも含む。「塩基類似体」には、例えば、２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基等が挙げられる。「修飾塩基」には、例えば、修飾化ピリミジン（例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル）、修飾化プリン（例えば、６−メチルアデニン、６−チオグアノシン）及び他の複素環塩基等が挙げられる。また、メチルホスホネート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ／ＲＮＡ（すなわち、チオリン酸結合を有するＤＮＡ／ＲＮＡ）、ホスホルアミデート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル型ＤＮＡ／ＲＮＡ等の化学修飾核酸や核酸類似体も含むこともできる。本明細書では、これらをまとめて「化学修飾ヌクレオチド」とも呼ぶ。
【０１３５】
本明細書において「核酸類似体」とは、天然型核酸に類似の構造及び／又は性質を有する人工的に構築された化合物をいう。例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ／ＬＮＡ：Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ／Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、モルフォリノ核酸、塩基性ポリアミノ酸（Ｐｏｌｙ  Ｌ−Ｌｙｓ、Ｐｏｌｙ  Ｌ−Ａｒｇ）等が挙げられる。なお、これらの核酸類似体は、上記のような化学修飾をさらに受けていてもよい。
【０１３６】
本発明の１つの実施態様において、本発明のアンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体は、上記のような各種核酸を適宜組み合わせて含むかまたは組み合わせてなる核酸（ポリヌクレオチド）を、アンチセンス核酸および／または相補的な核酸鎖に有することができる。
【０１３７】
本明細書において、「ヌクレオチド」とはヌクレオシドの糖部分がリン酸とエステルをつくっている化合物を意味し、ここで「ヌクレオシド」とは、プリン塩基またはピリミジン塩基のような窒素を含む有機塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物を意味する。
【０１３８】
また、「デオキシリボヌクレオチド」は、糖部分がＤ−２−デオキシリボースからなるヌクレオチドであり、「リボヌクレオチド」は、糖部分がＤ−リボースからなるヌクレオチドである。そして「デオキシリボヌクレオシド」は、糖部分がＤ−２−デオキシリボースからなるヌクレオシドであり、「リボヌクレオシド」は、糖部分がＤ−リボースからなるヌクレオシドである。
【０１３９】
「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドを基本単位とし、リン酸が各ヌクレオチド間で糖の３’と５’位炭素の間にジエステル結合の橋をつくって結ばれた、複数のヌクレオチドが重合した鎖状の物質を意味する。これは、いわゆるオリゴヌクレオチドも包含する。なお、本明細書では、このようなポリヌクレオチドにその構成単位として含まれるヌクレオチド（重合した状態にある）についても同様に「ヌクレオチド」と呼ぶことがある。
【０１４０】
ここで、上記「デオキシリボヌクレオチド」は、天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを意味する。当該デオキシリボヌクレオチドは、その塩基、糖若しくはリン酸塩結合が化学修飾されていてもよい。同様に、「リボヌクレオチド」は、天然に存在するリボヌクレオチドを意味する。当該リボヌクレオチドは、その塩基、糖若しくはリン酸塩結合が化学修飾されていてもよい。化学修飾としては例えば上述したようなものが考えられる。
【０１４１】
本発明の１つの実施態様において、化学修飾ヌクレオチドは、塩基部位が修飾されていてもよい。塩基部位の修飾としては、例えば、シトシンの５−メチル化、５−フルオロ化、５−ブロモ化、５−ヨード化、Ｎ４−メチル化、チミジンの５−デメチル化、５−フルオロ化、５−ブロモ化、５−ヨード化、アデニンのＮ６−メチル化、８−ブロモ化、グアニンのＮ２−メチル化、８−ブロモ化が挙げられる。さらにまた、ある実施態様における化学修飾ヌクレオチドにおいては、リン酸ジエステル結合部位が修飾されていてもよい。リン酸ジエステル結合部位の修飾としては、例えば、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル−メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化が挙げられるが、体内動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化（チオリン酸結合）が好ましい。また、このような塩基部位の化学修飾やリン酸ジエステル結合部位の化学修飾は同一のヌクレオチドに対して、複数種組み合わせて施されていてもよい。
【０１４２】
当業者であれば、ヌクレオチドの種類（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド）に応じて、適宜、それぞれにおいて可能な化学修飾を選択して施すことが可能である。
【０１４３】
上記のような化学修飾は同一のヌクレオチドに対して、複数種組み合わせて施されていてもよい。
【０１４４】
本発明の１つの実施態様において、化学修飾ヌクレオチドは糖部位が修飾されていてもよく、例えば上記化学修飾は、２’−Ｏ−メチル化、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化、２’−Ｏ−アミノプロピル（ＡＰ）化、２’−フルオロ化からなる群から選択される。
【０１４５】
また、本発明においては、ヌクレオシドも同様に化学修飾を受けていてもよい。具体的には、各ヌクレオシドは、その塩基または糖部分が、上述のような化学修飾を施されていてもよく、化学修飾は、同一のヌクレオシドに対して複数種組み合わせて施されていてもよい。上記のような「核酸類似体」も、化学修飾ヌクレオシドの一例である。核酸類似体は、上記のような化学修飾をさらに受けていてもよい。なお、本明細書では、ポリヌクレオチドにその構造単位として組み込まれたヌクレオシドも、ポリヌクレオチドの末端を構成するヌクレオシド（５’末端に−ＯＨ基を有するヌクレオシドまたは３’末端に−ＯＨ基を有するヌクレオシド）も、同様に「ヌクレオシド」と呼ぶことがある。
【０１４６】
通常、上記のような化学修飾は、塩基対形成には影響を及ぼさず、従って、ヌクレオチド間の相補性やポリヌクレオチド間の相補性には影響を及ぼさないと考えられる。すなわち、通常、相補的な２つのヌクレオチドは、化学修飾された後も塩基対を形成する能力を維持することができ、従って依然として相補的であることができる。
【０１４７】
しかしながら、ある場合において、化学修飾の数や位置によっては、ここで開示するアンチセンス核酸や二本鎖核酸が奏するアンチセンス効果等に影響を与えることになるかもしれない。これらの態様は、標的遺伝子の配列等によっても異なるため、一概には言えないが、当業者であれば、アンチセンス法に関する文献の記載等を参酌しながら、決定することができる。また、化学修飾後のアンチセンス核酸が有するアンチセンス効果を測定し、得られた測定値が、化学修飾前のアンチセンス核酸のそれよりも有意に低下していなければ（例えば、化学修飾後のアンチセンス核酸の測定値が化学修飾前のアンチセンス核酸の測定値の３０％以上であれば）、当該化学修飾は評価することができる。アンチセンス効果の測定は、例えば、細胞等に被検核酸化合物を導入し、該被検核酸化合物が奏するアンチセンス効果によって抑制された該細胞等における標的遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量、ｃＤＮＡ量、タンパク質量等）を、ノザンブロッティング、定量的ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング等の公知の手法を適宜利用することによって行うことができる。あるいは、例えば、細胞に被検核酸化合物を導入し、該被検核酸化合物が奏する標的遺伝子発現抑制に起因する細胞増殖抑制を、ＷＳＴ（または類似の色素ＭＴＴ、ＸＴＴ、ＭＴＳ等）をホルマザン色素へ還元する酵素活性を測定する比色定量法、ＢｒｄＵ取込量の測定、フローサイトメトリー等の公知の手法を用いて測定することにより行うことができる。
【０１４８】
上述のように、本発明のアンチセンス核酸のポリヌクレオチドは、任意選択で核酸類似体を含むことができる。本発明において使用される核酸類似体の例としては、例えばＲＮＡ誘導体が挙げられる。ＲＮＡ誘導体の例としては、架橋型核酸塩基（「架橋化核酸」とも呼ぶ）、糖部化学修飾体等を挙げることができ、例えばＢＮＡ／ＬＮＡ、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、２’−Ｏ−ＭＯＥ、４’−Ｏ−アミノアルキル等が挙げられる。
【０１４９】
本発明の１つの実施態様において、上記核酸類似体は、ＢＮＡ／ＬＮＡ、好ましくは下記の式（１）で表されるＢＮＡである。
【０１５０】
【化４５】
2018051762.tif 000047
【０１５１】
［式（１）中、Ｂａｓｅは、置換基を有していてもよい芳香族複素環基若しくは芳香族炭化水素環基、例えば、天然型ヌクレオシドの塩基部位（プリン塩基、ピリミジン塩基）又は非天然型（化学修飾）ヌクレオシドの塩基部位を示す。なお、塩基部位の化学修飾の例は、前述の通りである。Ｒ１、Ｒ２は、同一又は異なっていてもよく、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、又は、−Ｐ（Ｒ３）Ｒ４（ここで、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なっていてもよく、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、炭素数１〜６のシアノアルコキシ基又は炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す）を示す］。
【０１５２】
なお、前記化学式において示されている化合物はヌクレオシドであるが、本明細書において、「ＬＮＡ」や「ＢＮＡ」には、当該ヌクレオシドにリン酸基が結合した形態（ヌクレオチド）も含まれる。すなわち、本明細書において「ＬＮＡ」や「ＢＮＡ」という語句を用いた場合には、ポリヌクレオチド中に、ヌクレオチドとして組み込まれているＬＮＡ／ＢＮＡも意味する。またこれは、「核酸類似体」という語句を使用する場合にもあてはまる。
【０１５３】
また、ＢＮＡとしては、例えば、ＬＮＡ（ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（登録商標）、２’，４’−ＢＮＡ）とも称される、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ）の他に、β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、ＥＮＡとも称されるエチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ）、β−Ｄ−チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ３）−２’）ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＮＣとも称されるオキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ、３’アミノ−２’，４’−ＢＮＡ、５’−メチルＢＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡとも称される（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、ｃＭＯＥ−ＢＮＡとも称される（４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、ＡｍＮＡとも称されるアミドＢＮＡ（４’−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ（Ｒ＝Ｈ、Ｍｅ）、当業者に知られた他のＢＮＡが挙げられる。
【０１５４】
本発明の１つの実施態様では、核酸類似体（例えばＬＮＡ／ＢＮＡ）はさらに、上述の化学修飾（または化学修飾の組み合わせ）を受けていてもよい。本発明の１つの実施態様では、核酸類似体（例えばＬＮＡ／ＢＮＡ）は、ホスホロチオエート化が施されたヌクレオチドとして、上記ポリヌクレオチドに組み込まれている。
【０１５５】
当業者であれば、ヌクレオチドの種類（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド）や核酸類似体の種類に応じて、適宜、それぞれにおいて可能な化学修飾を選択して施すことが可能である。
【０１５６】
本発明の１つの実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含むウィング領域を含むことができる。ウィング領域は、主に、アンチセンス核酸のヌクレアーゼ耐性と、標的となるｍＲＮＡに対する当該核酸の親和性とを高めるために、化学修飾ヌクレオチドを配置した領域である。「１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含むウィング領域」は、上記ＰＳＰＯユニットの、または上記モチーフの、好ましくは前記少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドを含む領域（以下「ＤＮＡギャップ領域」とも称する）の、５’末側及び／又は３’末側に配置されるものであり、好ましくはアンチセンス核酸の５’末端および／または３’末端に配置されるものである。従って、本発明の１つの好ましい実施態様において、上記ウィング領域は、アンチセンス核酸の５’末端に位置する構成単位および／またはアンチセンス核酸の３’末端に位置する構成単位を含む。
【０１５７】
本発明の１つの実施態様において、上記ＰＳＰＯユニットの、または上記モチーフの、例えば該ＤＮＡギャップ領域の５’末端に配置された化学修飾ヌクレオチド、例えば核酸類似体を含む領域（以下「５’ウィング領域」とも称する）、ならびに、上記ＰＳＰＯユニットの、または上記モチーフの、例えば該ＤＮＡギャップ領域の３’末端に配置された化学修飾ヌクレオチド、例えば核酸類似体を含む領域（以下「３’ウィング領域」とも称する）は、それぞれ独立したものであり、化学修飾ヌクレオチドを少なくとも１種含んでいればよく、さらに、かかる化学修飾ヌクレオチド以外に天然型のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）も含まれていてもよい。また、５’ウィング領域及び３’ウィング領域の鎖長は独立的に、通常１〜１０塩基であることができ、好ましくは１〜７塩基、又は２〜５塩基、例えば２〜４塩基である。
【０１５８】
さらに、５’ウィング領域及び３’ウィング領域における化学修飾ヌクレオチド及び天然型のヌクレオチドの種類や数や位置については、ある実施形態におけるアンチセンス核酸が奏するアンチセンス効果等に影響を与える場合もあるため、好ましい態様は、配列等によっても変わり得る。一概には言えないが、当業者であれば、例えば、Ｔａｃｈａｓらの米国特許第８２９９０３９号明細書の記載のようなアンチセンス法に関する文献の記載を参酌しながら、好ましい態様を決定することができる。また、前記「少なくとも４つ以上の連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチド」を含む領域同様に、化学修飾後、例えば核酸類似体導入後の核酸（または当該核酸を含む二本鎖核酸）が有するアンチセンス効果を測定し、得られた測定値が、これらの前の核酸（または当該核酸を含む二本鎖核酸）のそれよりも有意に低下していなければ、当該化学修飾、例えば核酸類似体は好ましい態様であると評価することができる。
【０１５９】
なお、ＰＳ−ＰＯ構造は、従来技術のＰＳ型アンチセンス鎖構造に比べて酵素耐性が弱くなる傾向がある。従って、ＰＳ−ＰＯ構造を有するアンチセンス核酸には、至適な酵素耐性を持たせる必要がある。本発明では、本発明において用いられるようなＰＳ−ＰＯ構造を有するアンチセンス核酸において、中央に少なくとも４塩基以上の鎖長のＤＮＡ（好ましくは化学修飾されていないＤＮＡ）が配置され、さらにＲＮＡ（すなわち、標的転写産物）と強い結合能力を持つ修飾ヌクレオチド、好ましくは核酸類似体、例えばＬＮＡ（又は他のＢＮＡ）が両端に配置されることによって、当該アンチセンス鎖が、至適な酵素耐性を有し、その結果、ＰＳ型構造を有するアンチセンス核酸と同等の標的転写産物の発現抑制効果、標的細胞増殖の抑制効果を有することが見出された。
【０１６０】
よって、本発明の１つの実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、上記５’ウィング領域および３’ウィング領域を含む。そして、上記５’ウィング領域および３’ウィング領域はそれぞれ独立に、核酸類似体を含んでいることが望ましい。本発明の１つの実施態様において、上記５’ウィング領域および３’ウィング領域はそれぞれ、核酸類似体からなる。この場合、核酸類似体はさらに化学修飾されていてもよく、さらに化学修飾されていなくてもよい。上記５’ウィング領域および３’ウィング領域はそれぞれ、ＢＮＡ／ＬＮＡを含んでいてもよく、この場合、ＬＮＡ／ＢＮＡはさらに化学修飾されていてもよい。本発明の１つの実施態様において、ＬＮＡ／ＢＮＡはホスホロチオエート化されている。
【０１６１】
また、本発明の１つの実施態様において、アンチセンス核酸は、リボヌクレオチドを含まないか、あるいは、リボヌクレオチドも化学修飾されたリボヌクレオチドも含まない。
【０１６２】
本発明の１つの実施態様において、上記ウィング領域における核酸間結合は、ＰＳ型構造（すなわちＰＳ結合が連続した構造）を有してもよく、ＰＯ型構造（すなわちＰＯ結合が連続した構造）を有していてもよく、またはＰＳ−ＰＯ構造を有していてもよい。上記ウィング領域の長さが短い場合、例えば４塩基以下の場合には、好ましくは、上記ウィング領域における核酸間結合は、ＰＳ型構造を有していてもよい。
【０１６３】
また、本発明の１つの実施態様において、上記５’ウィング領域は、式（ＩＩＩ）
【０１６４】
【化４６】
2018051762.tif 000048
【０１６５】
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｃは、１〜９の整数を表す］
で表される。
【０１６６】
また、本発明の１つの態様において、上記３’ウィング領域は、式（ＩＶ）
【０１６７】
【化４７】
2018051762.tif 000049
【０１６８】
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｄは、１〜９の整数を表す］
で表される。
【０１６９】
ここで、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）において、好ましくは、Ｘは核酸類似体であり、より好ましくは架橋化核酸である。本発明の１つの好ましい実施態様において、上記架橋化核酸は、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、アミドＢＮＡ及びｃＭＯＥ−ＢＮＡからなる群から選択される。好ましくは、ＸはＬＮＡである。また、ｃおよびｄは、好ましくは、それぞれ互いに独立に、１〜６の整数、すなわち、１、２、３、４、５または６を示し、最も好ましくは、ｃおよびｄはいずれも１である。
【０１７０】
さらに、本発明の１つの実施態様において、上記５’ウィング領域は、式（ＩＩＩ’）または式（ＩＩＩ’’）で表される：
【０１７１】
【化４８】
2018051762.tif 000050
【０１７２】
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｃ’は、０〜４の整数を表す］、
または
【０１７３】
【化４９】
2018051762.tif 000051
【０１７４】
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｃ’は、０〜４の整数を表す］。
【０１７５】
また、本発明の１つの態様において、上記３’ウィング領域は、式（ＩＶ’）または式（ＩＶ’’）で表される：
【０１７６】
【化５０】
2018051762.tif 000052
【０１７７】
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｄ’は、０〜４の整数を表す］、
または
【０１７８】
【化５１】
2018051762.tif 000053
【０１７９】
［式中、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｄ’は、０〜４の整数を表す］。
【０１８０】
ここで、式（ＩＩＩ’）、（ＩＩＩ’’）、（ＩＶ’）または（ＩＶ’’）において、好ましくは、Ｘは核酸類似体であり、より好ましくは架橋化核酸である。本発明の１つの好ましい実施態様において、上記架橋化核酸は、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、アミドＢＮＡ及びｃＭＯＥ−ＢＮＡからなる群から選択される。好ましくは、ＸはＬＮＡである。また、ｃ’およびｄ’は、好ましくは、それぞれ互いに独立に、０〜３の整数、すなわち、０、１、２または３を示し、最も好ましくは、ｃ’およびｄ’はいずれも０である。
【０１８１】
本発明の１つの実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、上記５’ウィング領域と上記モチーフの間、上記モチーフと上記３’ウィング領域の間および／または上記モチーフ間に介在するヌクレオチドリンカーを含むことができる。
【０１８２】
ここで、「ヌクレオチドリンカー」とは、上記５’ウィング領域と上記モチーフの間、上記モチーフと上記３’ウィング領域の間または上記モチーフ間（上記モチーフを複数有する場合）をつなぐリンカーであり、ヌクレオチド（または化学修飾ヌクレオチド）から構成される。また、「ヌクレオチドリンカー」は、上記５’ウィング領域と上記ＰＳＰＯユニットの間、上記ＰＳＰＯユニットと上記３’ウィング領域の間、または複数の上記ＰＳＰＯユニットの間をつなぐリンカーであることもできる。上記ヌクレオチドリンカーは、好ましくは、１〜２０、より好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜５、特に１〜３塩基の長さを有する。
【０１８３】
本発明の１つの実施態様において、上記ヌクレオチドリンカーは、以下の式（Ｘ）または式（ＸＩ）で表される構造を有するか、式（Ｘ）または式（ＸＩ）の単位からなるホモポリマーであるか、式（Ｘ）および式（ＸＩ）の単位からなるランダム、交互、ブロックもしくはグラジエントコポリマーであるか、またはそれらの組み合わせである：
【０１８４】
【化５２】
2018051762.tif 000054
【０１８５】
［式中、Ａは、独立して、化学修飾されていてもよいヌクレオシド、例えば化学修飾されていないデオキシリボヌクレオシドもしくはリボヌクレオシドから選択される］。この態様において、上記ホモポリマー、コポリマーまたはそれらの組み合わせは、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、例えば１、２、３、４または５個の上記単位から構成されることができる。
【０１８６】
また、本発明のさらなる実施態様において、上記ヌクレオチドリンカーは、以下の式（ＸＩＩ）で表される：
【０１８７】
【化５３】
2018051762.tif 000055
【０１８８】
［式中、
Ａは、独立して、化学修飾されていてもよいヌクレオシド、例えば化学修飾されていないデオキシリボヌクレオシドもしくはリボヌクレオシドから選択され、
ａおよびｂは互いに独立して、０〜２０の整数、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５、特に１〜３の整数であり、
ただし、ａ＝０の場合には、ｂは１〜２０の整数、好ましくは１〜１０、例えば１〜５または１〜３の整数であり、ｂ＝０の場合には、ａは１〜２０の整数、好ましくは１〜１０、例えば１〜５または１〜３の整数であり、
ａおよびｂの両方が１以上である場合、−ＡＰ（＝Ｏ）Ｏ−−単位および−ＡＰ（＝Ｏ）Ｓ−−単位の配置は、ランダム、交互、ブロック、グラジエントまたはこれらの組み合わせである］。
【０１８９】
例えば、上記ヌクレオチドリンカーは、ＰＳ型結合および／またはＰＯ型結合に関して、以下のような配置を有することができる（式（Ｘ）で表される単位をｐｏ、式（ＸＩ）で表される単位をｐｓで示す）：
【０１９０】
【化５４】
2018051762.tif 000056
【０１９１】
本発明の１つの実施態様において、上記ヌクレオチドリンカーは、ＰＳ−ＰＯ構造を２回繰り返した構造（−ｐｓ−ｐｏ−ｐｓ−ｐｏ−または−ｐｏ−ｐｓ−ｐｏ−ｐｓ−）からなる構造ではなく、好ましくは当該構造を含まない。
【０１９２】
本発明の１つの実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、上記のヌクレオチドリンカーを含まない。
【０１９３】
本発明のアンチセンス核酸は、上記のモチーフ（Ｍ）、５’ウィング領域（５Ｗ）、３’ウィング領域（３Ｗ）およびヌクレオチドリンカー（ＮＬ）から選択される１つまたは複数を任意の組み合わせで有することができる（ただし、少なくとも１つのモチーフを含む）。本発明のアンチセンス核酸は、例えば以下のような構成を取ることができる：
【０１９４】
【化５５】
2018051762.tif 000057
【０１９５】
本発明のさらなる１つの実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、上記モチーフ、上記５’ウィング領域および３’ウィング領域からなる。
【０１９６】
本発明の１つの好ましい実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、以下の式（Ｖ）または（ＶＩ）で表される：
式（Ｖ）
【０１９７】
【化５６】
2018051762.tif 000058
【０１９８】
［式中、
Ａ１〜Ａｉは、独立して、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオシドであり、
Ｒは、独立に、式（Ｖ）のＡ１からＡｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｅは１〜９の整数、好ましくは１〜６の整数、例えば、１、２、３、４、５または６を示し、そしてｇは１〜９の整数、好ましくは１〜６の整数、例えば、１、２、３、４、５または６を表し、
ここで、部分構造（Ｖ−ａ）
【０１９９】
【化５７】
2018051762.tif 000059
【０２００】
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（Ｖ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜９６の整数、好ましくは８〜３０、より好ましくは９〜２５、さらに好ましくは１０〜２０の整数、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９であり、そして
当該部分構造（Ｖ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］、
または、
式（ＶＩ）
【０２０１】
【化５８】
2018051762.tif 000060
【０２０２】
［式中、
Ａ１〜Ａｉは、独立して、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオシドであり、
Ｒは、独立に、式（ＶＩ）のＡ１からＡｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｅは１〜９の整数、好ましくは１〜６の整数、例えば、１、２、３、４、５または６を示し、そしてｇは１〜９の整数、好ましくは１〜６の整数、例えば、１、２、３、４、５または６を表し、
ここで、部分構造（ＶＩ−ａ）
【０２０３】
【化５９】
2018051762.tif 000061
【０２０４】
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（ＶＩ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜９６、好ましくは８〜３０、より好ましくは９〜２５、さらに好ましくは１０〜２０の整数、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９の整数であり、そして
当該部分構造（ＶＩ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］。
【０２０５】
ここで、式（Ｖ）または（ＶＩ）において、好ましくは、Ｘは核酸類似体であり、より好ましくは架橋化核酸であり、さらに好ましくは、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、アミドＢＮＡ及びｃＭＯＥ−ＢＮＡからなる群から選択される。好ましくは、ＸはＬＮＡである。また、ｅおよびｇは、好ましくは、それぞれ互いに独立に、１〜６の整数、すなわち、１、２、３、４、５または６を示し、最も好ましくは、ｅおよびｇはいずれも１である。
【０２０６】
本発明の別の好ましい実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、以下の式（Ｖ’）または（ＶＩ’）で表される：
式（Ｖ’）
【０２０７】
【化６０】
2018051762.tif 000062
【０２０８】
［式中、
Ａ１〜Ａｉは、独立して、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオシドであり、
Ｒは、独立に、式（Ｖ’）のＡ１からＡｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｅ’は０〜４の整数、好ましくは０〜３の整数、すなわち、０、１、２または３を示し、そしてｇ’は０〜４の整数、好ましくは０〜３の整数、すなわち、０、１、２または３を表し、
ここで、部分構造（Ｖ’−ａ）
【０２０９】
【化６１】
2018051762.tif 000063
【０２１０】
は常に存在し、そして
ｉ＝６〜９６の整数、好ましくは６〜９６の範囲内の偶数であり、より好ましくは８〜３０の範囲内の偶数、さらに好ましくは８〜２６の範囲内の偶数、より一層好ましくは１０〜２０の範囲内の偶数、例えば、１０、１２、１４、１６、１８または２０である］、または、
式（ＶＩ’）
【０２１１】
【化６２】
2018051762.tif 000064
【０２１２】
［式中、
Ａ１〜Ａｉは、独立して、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオシドであり、
Ｒは、独立に、式（ＶＩ’）のＡ１からＡｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
ｅ’は０〜４の整数、好ましくは０〜３の整数、すなわち、０、１、２または３を示し、そしてｇ’は０〜４の整数、好ましくは０〜３の整数、すなわち、０、１、２または３を表し、
ここで、部分構造（ＶＩ’−ａ）
【０２１３】
【化６３】
2018051762.tif 000065
【０２１４】
は常に存在し、そして
ｉ＝６〜９６の整数、好ましくは６〜９６の範囲内の偶数であり、より好ましくは８〜３０の範囲内の偶数、さらに好ましくは８〜２６の範囲内の偶数、より一層好ましくは１０〜２０の範囲内の偶数、例えば、１０、１２、１４、１６、１８または２０である］。
【０２１５】
ここで、式（Ｖ’）または（ＶＩ’）において、好ましくは、Ｘは核酸類似体であり、より好ましくは架橋化核酸であり、さらに好ましくは、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、アミドＢＮＡ及びｃＭＯＥ−ＢＮＡからなる群から選択される。好ましくは、ＸはＬＮＡである。また、ｅ’およびｇ’は、好ましくは、それぞれ互いに独立に、０、１、２または３を示し、最も好ましくは、ｅおよびｇはいずれも０である。
【０２１６】
本発明の別の実施態様において、本発明のアンチセンス核酸では、上記モチーフが、式（ＶＩＩ）
【０２１７】
【化６４】
2018051762.tif 000066
【０２１８】
［式中、Ｘは、独立して化学修飾ヌクレオシドであり、
Ｑは、Ｓ−またはＯ−であり、そして
ｆは、１〜１０の整数である］
で表される１つまたは複数の構造により、１か所または複数か所で中断されている。例えば、上記式（ＶＩＩ）で中断されたモチーフは以下のような構造を有する：
【０２１９】
【化６５】
2018051762.tif 000067
【０２２０】
［式中、Ａ１〜Ａｉ、Ｘ、Ｑおよびｆは、上記で定義されたとおりであり、好ましくは、Ａ１〜Ａｉは、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオチドである］。
【０２２１】
このように、上記モチーフは、適切な核酸間結合を有するポリヌクレオチド鎖が形成される様式で、上記式（ＶＩＩ）により中断されていてもよい。
【０２２２】
従って、本発明の１つの態様において、本発明は、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有する１つまたは複数のモチーフを含むアンチセンス核酸であって、当該モチーフが上記の式（Ｉ）または（ＩＩ）で表され、かつ、上記モチーフが、上記式（ＶＩＩ）で表される１つまたは複数の構造により、１か所または複数か所で中断されているアンチセンス核酸に関する。この態様は、図２の５で示される態様に相当する。
【０２２３】
ここで、上記式（ＶＩＩ）において、Ｘは好ましくは、独立して核酸類似体であり、より好ましくは架橋化核酸であり、さらに好ましくは、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、アミドＢＮＡ及びｃＭＯＥ−ＢＮＡからなる群から選択される。最も好ましくは、ＸはＬＮＡである。また、ｆは、好ましくは、それぞれ互いに独立に、１〜６の整数、例えば、１、２、３、４、５または６を示し、最も好ましくは、ｆは１である。
【０２２４】
上記式（ＶＩＩ）は、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の一部と類似する構造（または当該一部と同一の構造）であって、化学修飾ヌクレオシド、好ましくは核酸類似体と核酸間結合からなる。上記モチーフが、上記式（ＶＩＩ）で表される１つまたは複数の構造により、１か所または複数か所で中断されると、例えば、中断構造が大きい場合および／または中断構造の数が多い場合、上記アンチセンス核酸に、少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいヌクレオチド、特にＲＮａｓｅＨに認識されるような少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチド（核酸間結合のみが化学修飾されていてもよい）を含むギャップ領域が存在しなくなる場合が生じる（図２の５参照）。このような場合、上記アンチセンス核酸は、ＲＮａｓｅＨの基質を含まず、従って、ＲＮａｓｅＨ非依存的にアンチセンス効果を奏する（例えばハイブリダイゼーション産物により標的転写産物を被覆することによって生じ得る翻訳の阻害又はエクソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果による）。
【０２２５】
従って、本発明の本発明の１つの実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、ＲＮａｓｅＨの基質となる領域を含まず、従って、アンチセンス核酸全体としてもＲＮａｓｅＨの基質とならない。
【０２２６】
本発明のさらなる実施態様において、本発明のアンチセンス核酸では、上記モチーフにおいて、Ａ１〜Ａｉが、それぞれ互いに独立に、化学修飾ヌクレオシドから選択される。本発明の１つの実施態様において、上記化学修飾ヌクレオシドは核酸類似体であり、より好ましくは架橋化核酸である。上記架橋化核酸は、好ましくは、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、アミドＢＮＡ及びｃＭＯＥ−ＢＮＡからなる群から選択される。
【０２２７】
本発明の１つの実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、以下の式（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）で表される：
【０２２８】
【化６６】
2018051762.tif 000068
【０２２９】
［式中、
ＸおよびＸ１〜Ｘｉは、独立して核酸類似体であり、
Ｒは、独立に、式（ＶＩＩＩ）のＸ１からＸｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
ｅは１〜９の整数、好ましくは１〜６の整数、例えば、１、２、３、４、５または６を示し、そしてｇは１〜９、好ましくは１〜６の整数、例えば、１、２、３、４、５または６の整数を表し、
ここで、部分構造（ＶＩＩＩ−ａ）
【０２３０】
【化６７】
2018051762.tif 000069
【０２３１】
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（ＶＩＩＩ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜９６の整数、好ましくは８〜３０、より好ましくは９〜２５、さらに好ましくは１０〜２０の整数、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９であり、そして
当該部分構造（ＶＩＩＩ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］、
または、
式（ＩＸ）
【０２３２】
【化６８】
2018051762.tif 000070
【０２３３】
［式中、
ＸおよびＸ１〜Ｘｉは、独立して核酸類似体であり、
Ｒは、独立に、式（ＩＸ）のＸ１からＸｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
ｅは１〜９の整数、好ましくは１〜６の整数、例えば、１、２、３、４、５または６を示し、そしてｇは１〜９の整数、好ましくは１〜６の整数、例えば、１、２、３、４、５または６を表し、
ここで、部分構造（ＩＸ−ａ）
【０２３４】
【化６９】
2018051762.tif 000071
【０２３５】
は、存在していても、存在していなくてもよく、
当該部分構造（ＩＸ−ａ）が存在する場合には、ｉ＝６〜９６の整数、好ましくは８〜３０、より好ましくは９〜２５、さらに好ましくは１０〜２０の整数、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９であり、そして
当該部分構造（ＩＸ−ａ）が存在しない場合には、ｉ＝５である］。
【０２３６】
本発明の１つの好ましい実施態様において、上記式（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）において、ＸおよびＸ１〜Ｘｉは、独立して、架橋化核酸であり、好ましくはＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、アミドＢＮＡ及びｃＭＯＥ−ＢＮＡからなる群から選択される架橋化核酸である。
【０２３７】
本発明の別の実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、以下の式（ＶＩＩＩ’）または（ＩＸ’）で表される：
（ＶＩＩＩ’）
【０２３８】
【化７０】
2018051762.tif 000072
【０２３９】
［式中、
ＸおよびＸ１〜Ｘｉは、独立して核酸類似体であり、
Ｒは、独立に、式（ＶＩＩＩ’）のＸ１からＸｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
ｅ’は０〜４の整数、好ましくは０〜３の整数、すなわち、０、１、２または３を示し、そしてｇ’は０〜４の整数、好ましくは０〜３の整数、すなわち、０、１、２または３を表し、
ここで、部分構造（ＶＩＩＩ’−ａ）
【０２４０】
【化７１】
2018051762.tif 000073
【０２４１】
は常に存在し、そして
ｉ＝６〜９６の整数、好ましくは６〜９６の範囲内の偶数であり、より好ましくは８〜３０の範囲内の偶数、さらに好ましくは８〜２６の範囲内の偶数、より一層好ましくは１０〜２０の範囲内の偶数、例えば、１０、１２、１４、１６、１８または２０である］、  または、
式（ＩＸ’）
【０２４２】
【化７２】
2018051762.tif 000074
【０２４３】
［式中、
ＸおよびＸ１〜Ｘｉは、独立して核酸類似体であり、
Ｒは、独立に、式（ＩＸ’）のＸ１からＸｉまでの間の領域が、核酸間結合としてホスホジエステル結合とホスホロチオエート化結合を交互に有するように、Ｓ−またはＯ−から選択され、
ｅ’は０〜４の整数、好ましくは０〜３の整数、すなわち、０、１、２または３を示し、そしてｇ’は０〜４の整数、好ましくは０〜３の整数、すなわち、０、１、２または３を表し、
ここで、部分構造（ＩＸ’−ａ）
【０２４４】
【化７３】
2018051762.tif 000075
【０２４５】
は常に存在し、そして
ｉ＝６〜９６の整数、好ましくは６〜９６の範囲内の偶数であり、より好ましくは８〜３０の範囲内の偶数、さらに好ましくは８〜２６の範囲内の偶数、より一層好ましくは１０〜２０の範囲内の偶数、例えば、１０、１２、１４、１６、１８または２０である］。
【０２４６】
本発明の１つの好ましい実施態様において、上記式（ＶＩＩＩ’）または（ＩＸ’）において、ＸおよびＸ１〜Ｘｉは、独立して、架橋化核酸であり、好ましくはＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、アミドＢＮＡ及びｃＭＯＥ−ＢＮＡからなる群から選択される架橋化核酸である。
【０２４７】
上記アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドの長さは特に制限はないが、好ましくは少なくとも８塩基であり、少なくとも１０塩基であり、少なくとも１２塩基であり、少なくとも１３塩基であり、少なくとも１４塩基であり、又は少なくとも１５塩基である。前記長さは、好ましくは１００塩基以下、３５塩基以下、２５塩基以下、２０塩基以下、１９塩基以下、１８塩基以下または１７塩基以下であることができる。前記長さの範囲は、好ましくは１０〜３５塩基であり、より好ましくは１２〜２５塩基であり、さらに好ましくは１３〜２０塩基である。通常、前記標的に対する核酸鎖によるアンチセンス効果の強さや、費用、合成収率等の他の要素に応じて、前記長さは選択される。なお、本発明におけるポリヌクレオチド（アンチセンス核酸、相補鎖）は、脱塩基ヌクレオシド等を含み得るが、そのような場合であっても、本明細書では、１ヌクレオチドに相当する長さを１塩基の長さとして表す。
【０２４８】
また、本発明の１つの実施態様において、上記アンチセンス核酸は、合成、精製および／または単離されたアンチセンス核酸である。当該アンチセンス核酸は、標的遺伝子の発現や転写産物（タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物またはタンパク質をコードしない転写産物）のレベルをアンチセンス効果によって抑制する活性を有する。
【０２４９】
本発明のアンチセンス核酸は、標的転写産物（典型的には遺伝子の転写産物）の選択に応じて、標的細胞、好ましくは標的癌細胞の増殖を抑制することができる。典型的には、標的遺伝子の発現亢進を伴う細胞を標的細胞とし、本発明のアンチセンス核酸により、その増殖を抑制することができる。例えば、本発明のアンチセンス核酸により、標的癌細胞においてがん遺伝子（例えば、アポトーシス抑制機能を有するＢＣＬ２遺伝子、またはＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子もしくはＳＴＡＴ３遺伝子）を標的遺伝子としてその発現を抑制することにより、当該癌細胞の増殖を抑制することができる。
【０２５０】
アンチセンス効果によって発現が抑制される「標的遺伝子」又は「標的転写産物」としては、特に制限はなく、例えば、各種疾患において発現が亢進している遺伝子が挙げられる。本発明の１つの実施態様において、上記標的遺伝子は、がん遺伝子である。また「標的遺伝子の転写産物」とは、標的遺伝子をコードするゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡのことであり、塩基の修飾を受けていないｍＲＮＡや、スプライシングを受けていないｍＲＮＡ前駆体等も含まれる。通常、「転写産物」は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって合成される、いかなるＲＮＡでもよい。
【０２５１】
「合成、精製および／または単離されたアンチセンス核酸」という文言は、ここではポリヌクレオチド鎖を含むアンチセンス核酸であって、ポリヌクレオチドの各構成単位はそれぞれ天然に生じる物質であっても、天然には生じない物質でもあってもよいが、ポリヌクレオチド自体（すなわちポリヌクレオチド全体）としては、天然では生じないものおよび／または天然では実質的に生じないもの（典型的には人工的に構築されたもの）を意味する。
【０２５２】
「相補的」という文言は、ヌクレオチドの塩基が他のヌクレオチドの塩基と、水素結合を介して、いわゆるワトソン−クリック型塩基対（天然型塩基対）や非ワトソン−クリック型塩基対（フーグスティーン型塩基対等）を形成できる関係のことを意味する。例えば、ＤＮＡにおいては、アデニン（Ａ）がチミジン（Ｔ）に対して相補的であり、ＲＮＡにおいては、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）に対して相補的である。
【０２５３】
例えば、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドのある位置のヌクレオチドが、標的遺伝子の転写産物のある位置のヌクレオチドと水素結合を介して塩基対を形成できる場合、上記ポリヌクレオチドと上記転写産物は、当該水素結合の位置において相補的であると考えられる。
【０２５４】
あるポリヌクレオチドが他のポリヌクレオチドとハイブリダイズもしくはアニーリング（本明細書では、これらの語を互換的に使用する）するためには、両ポリヌクレオチドは、塩基配列の全ての位置において相補的である必要はない。そして、本発明に関しても、アンチセンス核酸が機能を発揮するためには、塩基配列の全ての位置において相補的である必要はなく、一部の位置におけるミスマッチが許容される。
【０２５５】
例えば、標的転写産物の塩基配列と、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドの塩基配列とは、完全に相補的である必要はなく、すなわち、両者は全ての位置で相補的である必要はない。
【０２５６】
本発明では、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドは、その少なくとも一部が、標的転写産物に対して相補的である。本発明の１つの実施態様において、標的転写産物の塩基配列とアンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドの塩基配列は、その少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上、または１００％）が相補的であればよい。例えば、７０％のヌクレオチドが相補的な場合、両者は７０％の「相補性」を有する。本発明の好ましい１つの実施態様において、両者は完全に相補的であり、すなわち、１００％の相補性を有する。
【０２５７】
なお、２つのポリヌクレオチドの相補性（例えば、標的転写産物とアンチセンス核酸のポリヌクレオチドとの相補性）は、両者が異なる長さを有する場合には、二本鎖形成領域（ミスマッチを含む場合にはそれらを含めた二本鎖形成領域全体）における相補性として算出することができる。
【０２５８】
配列の相補性は、ＢＬＡＳＴプログラム等を利用することにより決定することができる。そして、当業者であれば、例えば、標的遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸を容易に設計することができる。
【０２５９】
本発明の別の態様において、本発明は、
（ｉ）上記アンチセンス核酸、および
（ｉｉ）化学修飾されていてもよいヌクレオチドを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）アンチセンス核酸に対して相補的なポリヌクレオチドを含む相補鎖、
を含む二本鎖核酸複合体、
に関する。
【０２６０】
本発明の１つの実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、構成単位としての、化学修飾されていてもよいヌクレオチドからなる。また、本発明のさらなる実施態様において、上記相補鎖は、上記ポリヌクレオチドからなる。
【０２６１】
上記のように、ＰＳ−ＰＯ構造は従来技術のＰＳ型アンチセンス鎖構造に比べて酵素耐性が弱くなる傾向があるため、ＰＳ−ＰＯ構造を有するアンチセンス核酸には、至適な酵素耐性を持たせる必要がある。本発明では、本発明において用いられるようなＰＳ−ＰＯ構造を有するアンチセンス核酸を、それに相補的な鎖との二本鎖核酸構造とすることにより、当該二本鎖核酸が、至適な酵素耐性を有し、その結果、ＰＳ型構造を有するアンチセンス核酸と同等またはそれ以上の標的転写産物の発現抑制効果、標的細胞増殖の抑制効果を有することも見出された。
【０２６２】
上記相補鎖は、上記のようにアンチセンス核酸に対して少なくとも一部が相補的である核酸である。上記の相補的な核酸は、合成、精製および／または単離された核酸である。ここで、「合成、精製および／または単離された核酸」という文言は、ポリヌクレオチド鎖を含み、上記アンチセンス核酸に対して少なくとも一部が相補的な核酸であって、ポリヌクレオチドの各構成単位はそれぞれ天然に生じる物質であっても、天然には生じない物質でもあってもよいが、ポリヌクレオチド自体（すなわちポリヌクレオチド全体）としては、天然では生じないものおよび／または天然では実質的に生じないもの（典型的には人工的に構築されたもの）を意味する。
【０２６３】
上記相補鎖におけるポリヌクレオチドは、「化学修飾されていてもよいヌクレオチド」を構成単位として少なくとも含む。この文言は、上記ポリヌクレオチドが、化学修飾されているかもしくはされていないヌクレオチドを有することを意味する。ここで、必須の構成単位である上記ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドであっても、リボヌクレオチドであっても、これらの組み合わせであってもよい。また、当該ヌクレオチドはそれぞれ独立に、化学修飾されていても、化学修飾されていなくてもよい。化学修飾としては、アンチセンス核酸に関して述べたような化学修飾を使用することができる。化学修飾されているヌクレオチドは、例えば、核酸間結合を介して結合された核酸類似体（本明細書では、簡便のために、このようなヌクレオチドの形態にある核酸類似体も、ヌクレオシドの形態にある核酸類似体も、同様に「核酸類似体」と呼ぶことがある）であってもよく、当該核酸類似体はさらに別の上記のような化学修飾をされていてもよい。このように、アンチセンス核酸に対して親和性を持つものであれば、ヌクレオチド以外にも、ペプチド鎖をもつＰＮＡやモルフォリノ核酸、あるいは塩基性ポリアミノ酸（Ｐｏｌｙ  Ｌ−Ｌｙｓ、Ｐｏｌｙ  Ｌ−Ａｒｇ）等の核酸類似体を相補鎖の構成単位に使用することができる。なお、本明細書では、このような核酸類似体を構成単位として含む構造も、ポリヌクレオチド（または核酸もしくは核酸鎖）と呼ぶ。
【０２６４】
ここで、上記相補鎖を構成するポリヌクレオチドは、核酸間結合として、連続したＰＳ型構造を有してもよく、連続したＰＯ型構造を有していてもよく、またはＰＳ−ＰＯ構造を有していてもよく、あるいはこれらの組み合わせを有していてもよい。
【０２６５】
本発明の１つの実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドおよび／または化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドを構成単位として少なくとも含む。
【０２６６】
本発明のさらなる１つの実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドのみを構成単位として含む。本発明の別の実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオチドのみを構成単位として含む。
【０２６７】
本発明の別の実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドのみを構成単位として含む。本発明の１つの実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されていないリボヌクレオチドのみを構成単位として含む
本発明のさらなる１つの実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドおよび化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドのみを構成単位として含む。好ましくは、上記デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは化学修飾されていない。
【０２６８】
この態様において、上記ポリヌクレオチドにおける、デオキシリボヌクレオチドの数とリボヌクレオチドの数の比は特に限定はされない。本発明の１つの実施態様において、当該ポリヌクレオチドは、その総ヌクレオチド数に対して、１〜９０％、好ましくは５〜７０％、より好ましくは１０〜５０％、例えば３０〜５０％の数のリボヌクレオチドを含むことができる。例えば、上記ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの総ヌクレオチド数に対して、例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％の数のリボヌクレオチドを含むことができる。これらの場合、残りの部分が、デオキシリボヌクレオチドである。また、本発明のさらなる実施態様では、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、１〜１２個のリボヌクレオチド、例えば、２〜１０個、３〜９個または５〜８個のリボヌクレオチドを含むことができる。本発明のさらなる１つの実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のリボヌクレオチドを含む。これらは、デオキシリボヌクレオチドにも当てはまる。相補鎖のポリヌクレオチドにおけるリボヌクレオチドの位置およびデオキシリボヌクレオチドの位置は、特に制限はされない。
【０２６９】
相補鎖のポリヌクレオチドが、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドおよび化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドのみを構成単位として含み、かつ上記ポリヌクレオチドがリボヌクレオチドを複数個含む場合には、各リボヌクレオチドは互いに離れて存在していてもよく、または連続して存在していても、両者が組み合わされて存在していてもよい。これらは、デオキシリボヌクレオチドにも当てはまる。
【０２７０】
本発明の１つの態様において、相補鎖のポリヌクレオチドは、化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドと化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドとを複数個ずつ含み、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドは交互にまたはほぼ交互に存在する。この場合に、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドは、１個ずつ、２個ずつ、３個ずつ、４個ずつ、５個ずつまたは６個ずつ、交互に（またはほぼ交互に）存在していてもよい。好ましくは、上記デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは化学修飾されていない。
【０２７１】
本発明のさらなる実施態様において、相補鎖のポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの５’末端領域および／または３’末端領域における全ての構成単位が化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドであり、それら以外の領域における全ての構成単位が化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドである。好ましくは、上記デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは化学修飾されていない。ここで、「５’末端領域」は、上記ポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位（５’末端から数えて１番目の構成単位）と５’末端から数えて２〜ｎ番目の構成単位とを含む領域である。ここでｎは、３〜２０の整数であることができ、好ましくは３〜１０の整数、例えば４、５、６、７、８または９であることができる。「３’末端領域」は、上記ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位（３’末端から数えて１番目の構成単位）と３’末端から数えて２〜ｍ番目の構成単位とを含む領域である。ここでｍは、３〜２０の整数であることができ、好ましくは３〜１０の整数、例えば４、５、６、７、８または９であることができる。
【０２７２】
本発明の１つの好ましい実施態様において、相補鎖のポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの５’末端領域および３’末端領域における全ての構成単位がデオキシリボヌクレオチドであり、そして、５’末端および３’末端領域以外の領域における全ての構成単位がリボヌクレオチドであり、ここで、上記５’末端領域は、５’末端に位置する構成単位と５’末端から数えて２〜ｎ番目（ｎ＝３〜６）の構成単位からなる領域であり、上記３’末端領域は、３’末端に位置する構成単位と３’末端から数えて２〜ｍ番目（ｍ＝３〜６）の構成単位とからなる領域である。例えば、実施例１に記載の配列番号１２で表される相補鎖が、この態様に該当するものであり、５’末端に位置する構成単位と５’末端から数えて２〜５番目の構成単位とからなる領域における全ての構成単位、ならびに３’末端に位置する構成単位と３’末端から数えて２〜５番目の構成単位とからなる領域における全ての構成単位がデオキシリボヌクレオチドであり、それ以外の領域（５’末端から数えて６〜１１番目の構成単位からなる領域）における全ての構成単位がリボヌクレオチドである。好ましくは、上記デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは化学修飾されていない。
【０２７３】
本発明の他の実施態様において、相補鎖のポリヌクレオチドは、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオチドと、糖が化学修飾されたヌクレオチドのみからなるか、あるいは、相補鎖のポリヌクレオチドは、化学修飾されていないリボヌクレオチドと、糖が化学修飾されたヌクレオチドのみからなる。好ましくは、上記化学修飾は、２’−Ｏ−メチル化、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化、２’−Ｏ−アミノプロピル（ＡＰ）化、２’−フルオロ化からなる群から選択される。
【０２７４】
本発明のさらなる実施態様において、相補鎖のポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの５’末端領域および／または３’末端領域における全ての構成単位が化学修飾クレオチド、好ましくは糖が化学修飾されたヌクレオチド（化学修飾は、例えば、２’−Ｏ−メチル化、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化、２’−Ｏ−アミノプロピル（ＡＰ）化、２’−フルオロ化からなる群から選択される）、より好ましくは２’−Ｏ−メチル型デオキシリボヌクレオチド／リボヌクレオチドであり、そして、５’末端および３’末端領域以外の領域における全ての構成単位が化学修飾されていないデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドである。ここで、５’末端領域および／または３’末端領域は上記の意味を有する。本発明の１つの好ましい実施態様において、相補鎖のポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの５’末端領域および３’末端領域における全ての構成単位が糖が化学修飾されたヌクレオチド（化学修飾は、例えば、２’−Ｏ−メチル化、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化、２’−Ｏ−アミノプロピル（ＡＰ）化、２’−フルオロ化からなる群から選択される）、より好ましくは２’−Ｏ−メチル型デオキシリボヌクレオチド／リボヌクレオチドであり、そして、５’末端および３’末端領域以外の領域における全ての構成単位がデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドであり、ここで、５’末端領域は、５’末端に位置する構成単位と５’末端から数えて２〜ｎ番目（ｎ＝３〜６）の構成単位とからなる領域であり、３’末端領域は、３’末端に位置する構成単位と３’末端から数えて２〜ｍ番目（ｍ＝３〜６）の構成単位とからなる領域である。例えば、実施例１に記載の配列番号７で表される相補鎖が、この態様に該当するものであり、５’末端に位置する構成単位と５’末端から数えて２および３番目の構成単位とからなる領域における全ての構成単位、ならびに３’末端に位置する構成単位と３’末端から数えて２および３番目の構成単位とからなる領域における全ての構成単位が２’−Ｏ−メチル型デオキシリボヌクレオチド／リボヌクレオチドであり、それ以外の領域（５’末端から数えて４〜１３番目の構成単位からなる領域）における全ての構成単位が化学修飾されていないリボヌクレオチドである。なお、化学修飾ヌクレオチドで構成される５’末端領域および／または３’末端領域は、核酸間結合として、連続したＰＳ型構造を有してもよく、連続したＰＯ型構造を有していてもよく、またはＰＳ−ＰＯ構造を有していてもよい。例えば、５’末端領域は核酸間結合として連続したＰＳ型構造を有し、３’末端領域は核酸間結合として連続したＰＯ型構造を有することもできる（例えば、配列番号７）。
【０２７５】
本発明のさらなる実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドとその５’側に位置する５’ウィング領域および３’側に位置する３’ウィング領域とからなる。この態様において、上記デオキシリボヌクレオチドはその一部または全部が化学修飾されていてもよく、好ましくは、上記デオキシリボヌクレオチドはその一部または全部が、より好ましくは全部が、核酸間結合としてホスホロチオエート化結合を有する。好ましくは、上記デオキシリボヌクレオチドは、核酸間結合以外は化学修飾されていない。好ましくは、上記５’ウィング領域および３’ウィング領域は、核酸間結合としてホスホロチオエート化結合を有するＬＮＡ／ＢＮＡからなる。
【０２７６】
上述のように、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、上記アンチセンス核酸と少なくとも一部が相補的なポリヌクレオチドである。相補鎖におけるポリヌクレオチドの塩基配列と上記アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドの塩基配列とは、両者が少なくとも部分的に二本鎖を形成することが可能であれば、完全に相補的である必要はなく、例えば、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の相補性を有していればよい。
【０２７７】
本発明の１つの好ましい実施態様において、両ポリヌクレオチドは１００％の相補性を有する。ここで、相補性は上記のように二本鎖形成領域（二本鎖形成領域全体）における相補性として算出する。この態様では、例えば、相補鎖のポリヌクレオチドの長さが、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドの長さより長い場合には、アンチセンス核酸のポリヌクレオチド全体が相補鎖のポリヌクレオチドの一部分と完全に相補的であり、その完全に相補的な部分が二本鎖形成領域となる。また、相補鎖のポリヌクレオチドの長さが、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドより短い場合には、相補鎖のポリヌクレオチド全体がアンチセンス核酸のポリヌクレオチドの一部分と完全に相補的であり、その完全に相補的な部分が二本鎖形成領域となる。そして、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドと相補鎖のポリヌクレオチドが同じ長さを有する場合には、両ポリヌクレオチドは全体にわたって完全に相補的である。
【０２７８】
本発明では、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドと相補鎖におけるポリヌクレオチドが、上述の相補性に基づいて「アニーリング」し、二本鎖を形成することができる。当業者であれば、２本の核酸鎖がアニーリングできる条件（温度、塩濃度等）を容易に決定することができる。
【０２７９】
相補鎖におけるポリヌクレオチドは、上述のように、化学修飾されていてもよいヌクレオチドを含む。ＲＮＡ分解酵素等の核酸分解酵素に対する耐性が高いという観点から、相補鎖におけるポリヌクレオチドにおいて、ヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチド）は、アンチセンス核酸に関して述べたような化学修飾を受けていてもよい。例えば、相補鎖のポリヌクレオチドが特定の細胞の核内に送達されるまで、ＲＮａｓｅＡ等のＲＮＡ分解酵素による分解を抑制しつつも、特定の細胞内においてはＲＮａｓｅＨにより該ポリヌクレオチドが分解されることにより、アンチセンス効果を発揮し易いという観点から、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、核酸類似体を含んでいてもよい。
【０２８０】
化学修飾、例えば核酸類似体の数や位置は、ある実施形態における核酸複合体が奏するアンチセンス効果等に影響を与える場合もあるため、相補鎖のポリヌクレオチドにおける核酸類似体の数及び化学修飾の位置には好ましい態様が存在する。この好ましい態様は、化学修飾対象となる核酸の種類、配列等によっても異なるため、一概には言えないが、前述のアンチセンス核酸におけるポリヌクレオチド同様に、化学修飾後、例えば核酸類似体導入後の核酸複合体が有するアンチセンス効果を測定することにより特定することができる。
【０２８１】
本発明の１つの実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、アンチセンス核酸の５’ウィング領域及び／又は３’ウィング領域に対して相補的な領域に、化学修飾ヌクレオチド、例えば核酸類似体を有する。
【０２８２】
相補鎖におけるポリヌクレオチドの長さは特に制限されないが、少なくとも８塩基であり、少なくとも１０塩基であり、少なくとも１２塩基であり、少なくとも１３塩基であり、少なくとも１４塩基であり、少なくとも１５塩基、または少なくとも１６塩基である。前記長さは、好ましくは１００塩基以下、３５塩基以下、２５塩基以下、２０塩基以下、１９塩基以下、１８塩基以下または１７塩基以下であることができる。前記長さの範囲は、好ましくは１０〜３５塩基であり、より好ましくは１２〜２５塩基であり、さらに好ましくは１３〜２０塩基である。通常、酵素耐性に関する効果や、費用、合成収率等の他の要素に応じて、長さは選択される。
【０２８３】
本発明の１つの実施形態において、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドの長さと相補鎖におけるポリヌクレオチドの長さは同一であってもよく、異なっていてもよい。
【０２８４】
本発明の１つの実施形態において、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドの長さは、相補鎖におけるポリヌクレオチドの長さよりも大きい。
【０２８５】
本発明の他の実施形態において、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドの長さは、相補鎖におけるポリヌクレオチドの長さよりも小さい。
【０２８６】
さらに、本発明の１つの実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含む。
【０２８７】
「ミスマッチ」とは、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドと相補鎖におけるポリヌクレオチドとの間のアニーリングによって形成された二本鎖形成領域（以下、単に「二本鎖形成領域」とも呼ぶ）内のある位置において、両ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド間でワトソン−クリック型塩基対が形成されないことをいう。
【０２８８】
ただし、ここでいうミスマッチは、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドと相補鎖のポリヌクレオチドが二本鎖形成領域内で同一の数のヌクレオチドおよび／または核酸類似体（以下、まとめて「ヌクレオチド等」とも呼ぶ）を有し、上記位置を除く全ての位置において塩基対を形成しているにもかかわらずに、当該位置でのみ塩基対が形成されないことを意味する。従って、これは、オーバーハングや、二本鎖形成領域内の両ポリヌクレオチドの長さの相違に起因して生じるバルジのような構造は含まない。なおこれは、ミスマッチとオーバーハングやバルジとを区別することを意図するものであり、本発明の核酸複合体において、ミスマッチとバルジ（および／またはオーバーハング）が同時に存在することを妨げるものではない。
【０２８９】
従って、「相補鎖におけるポリヌクレオチドは、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含む」とは、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドと相補鎖のポリヌクレオチドが二本鎖形成領域内において同一の長さを有し、かつ、後者が、両ポリヌクレオチド間でワトソン−クリック型塩基対を形成しないようなヌクレオチド等を当該二本鎖形成領域内において少なくとも１つ含むことを意味する。ミスマッチの例としては、Ａ対Ｇ、Ｃ対Ａ、Ｕ対Ｃ、Ａ対Ａ、Ｇ対Ｇ、Ｃ対Ｃ等や、リボヌクレオチドを用いたＵ対Ｇ、Ｕ対Ｃ、Ｕ対Ｔ等が挙げられるが、同様に、例えば、非塩基残基対ヌクレオチド等、非環状残基対ヌクレオチド等も含まれる。広い意味において、ここで用いられるミスマッチには、特定の位置における二本鎖の熱力学的安定性がその位置におけるワトソン−クリック型塩基対の熱力学的安定性よりも低くなるように、その位置またはその近傍での熱力学的安定性を減少させる、その位置での任意の変換も含まれる。
【０２９０】
本発明の１つの実施態様において、上記核酸複合体は、相補鎖におけるポリヌクレオチドが、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含む。ミスマッチの数は、二本鎖核酸の形成が妨げられない範囲内であれば特に制限はされず、ミスマッチを複数個含む場合には、各ミスマッチは互いに離れて存在していてもよく、または連続して存在していても、両者が組み合わされて存在していてもよい。本発明の１つの実施態様では、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドに対して１つのミスマッチを含む。
【０２９１】
ミスマッチの位置は、ミスマッチ構造を形成できる位置であれば特に制限はされない。
【０２９２】
例えば、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドおよび相補鎖のポリヌクレオチドがそれぞれ１０〜３５塩基の長さを有する場合には、例えば、二本鎖形成領域の５’末端（アンチセンス核酸のポリヌクレオチドの上記領域内の５’末端）から数えて、２〜１５番目の位置に、例えば６〜１１番目（例えば６、７、８、９、１０または１１番目）の位置にミスマッチを導入することができる。
【０２９３】
本発明の核酸複合体が少なくとも１つのミスマッチを有する場合、ミスマッチの部分、すなわち、二本鎖が形成されていない部分において、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅの攻撃を適度に受けるため、細胞内または生体内において、標的ｍＲＮＡに送達される頃までの間に、当該相補鎖のみが適度に切断されて（相補鎖のポリヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはこれらの組み合わせのいずれの場合であっても）、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドのみとなり、当該アンチセンス核酸のポリヌクレオチドが標的ｍＲＮＡと良好に二本鎖を形成するのを促進することも考えられる。
【０２９４】
上記のようなミスマッチを有する場合、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドと相補鎖におけるポリヌクレオチドは完全に相補的ではなくなるが、上記のように、本発明ではこのように両者が完全に相補的でなくてもよい。本発明の１つの好ましい態様では、相補鎖のポリヌクレオチドがミスマッチを含む場合、両ポリヌクレオチドは、ミスマッチ部分を除く二本鎖形成領域において、１００％の相補性を有する。
【０２９５】
本発明の別の実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、ミスマッチを含まない。
【０２９６】
また、例えば相補鎖におけるポリヌクレオチドを適度に切断するという観点から、上記のようなミスマッチを形成させる代わりに、または、ミスマッチ形成に加えて、相補鎖におけるポリヌクレオチドに上述のように、少なくとも１つのリボヌクレオチドを含ませることも可能である。リボヌクレオチドは概して、デオキシリボヌクレオチドや化学修飾ヌクレオチド（例えば核酸類似体）よりも核酸分解酵素に対する耐性が弱いため、相補鎖においてリボヌクレオチド導入部位を起点としたポリヌクレオチドの切断が適度に促進され得ると考えられる。
【０２９７】
従って、本発明の１つの実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、構成単位として１つまたは複数のリボヌクレオチドを含む。本発明のさらなる実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含み、かつ、構成単位としてリボヌクレオチドを含む。本発明のさらに１つの実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含み、かつ、リボヌクレオチドを構成単位として含み、かつ、当該リボヌクレオチドの少なくとも１つが当該ミスマッチを形成する。例えば、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドに対して、Ｇ対Ｕのミスマッチ（アンチセンス核酸がＧで、相補鎖がＵ）を１つ含むことができる。
【０２９８】
相補鎖がリボヌクレオチドを含む場合、当該リボヌクレオチドの位置は、特に制限はされない。上記ポリヌクレオチドが１０〜３５塩基の長さを有する場合には、５’末端から数えて、１〜３５番目、例えば２〜３０番目、３〜２５番目、４〜２０番目、５〜１５番目、６〜１１番目（例えば、６、７、８、９、１０または１１番目）の位置にリボヌクレオチドを含むことができる。
【０２９９】
また、本発明の１つの実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは少なくとも１つのバルジを含む。
【０３００】
ここで、「バルジ」とは、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドと相補鎖のポリヌクレオチドとの間のアニーリングによって形成された二本鎖領域（以下、単に「二本鎖領域」とも呼ぶ）内で、後者に対応する１個の塩基または連続する２個以上の塩基が前者に不足していることにより生じる、塩基対を形成せずに二本鎖核酸から外部に飛び出した後者ポリヌクレオチド内のヌクレオチド（および／または化学修飾ヌクレオチド）から形成されるふくらみ構造を意味する。
【０３０１】
バルジの数は、二本鎖の形成が可能な範囲内であれば特に制限はされない。本発明の１つの実施態様では、相補鎖におけるポリヌクレオチドは１〜４つのバルジ、例えば、１〜３つのバルジを含むことができる。本発明のさらなる１つの実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、１つのバルジを含む。
【０３０２】
バルジの位置は、バルジ構造を形成できる位置であれば特に制限はされない。例えば、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドおよび相補鎖のポリヌクレオチドがそれぞれ１０〜３５塩基の長さを有する場合には、例えば、二本鎖形成領域の５’末端（アンチセンス核酸のポリヌクレオチドの上記領域の５’末端）から数えて、２〜１５番目の位置に、例えば６〜１２番目（例えば６、７、８、９、１０、１１または１２番目）の位置になるように、相補鎖のポリヌクレオチドの対応の位置にバルジを導入することができる。
【０３０３】
バルジを構成するヌクレオチド等の数（アンチセンス核酸のポリヌクレオチドと塩基対を形成していないヌクレオチドの数）は、バルジ構造を形成できる数であれば特に制限はされない。本発明の１つの実施態様において、上記バルジは、１つのバルジあたり１〜７つ、例えば、１〜５つまたは２〜４つのヌクレオチド等で構成されることができる。
【０３０４】
複数のバルジを有する場合、各バルジは、同一の数のヌクレオチド等で構成されていても、あるいは、各バルジはそれぞれ独立に異なる数のヌクレオチド等で構成されていてもよい。
【０３０５】
本発明の１つの実施態様において、上記バルジは、ヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドから構成される。
【０３０６】
本発明のさらなる１つの実施態様において、上記バルジを構成するヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチド（いずれも修飾されていても、修飾されていなくてもよい）が使用される。好ましくは、上記デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは化学修飾されていない。
【０３０７】
当業者であれば、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドの種類や塩基配列に応じて、バルジが形成されるように、相補鎖におけるポリヌクレオチドの構成単位を適宜選択することが可能である。
【０３０８】
本発明の１つの好ましい実施態様において、上記バルジを構成するヌクレオチドは、その一部または全部がリボヌクレオチド、好ましくはウラシル（Ｕ）である。より好ましくは、上記バルジを構成するヌクレオチドは、その一部または全部が、化学修飾されていないリボヌクレオチド、好ましくは化学修飾されていないウラシル（Ｕ）である。
【０３０９】
相補鎖におけるポリヌクレオチドがバルジを含む本発明の核酸複合体は、バルジ構造の部分（すなわち、二本鎖が形成されていない部分）において、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅの攻撃を適度に受けるため、細胞内または生体内において、標的ｍＲＮＡに送達される頃までの間に、当該相補鎖のみが適度に切断されて（相補鎖のポリヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはこれらの組み合わせのいずれの場合であっても）、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドのみとなり、当該アンチセンス核酸のポリヌクレオチドが標的ｍＲＮＡと良好に二本鎖を形成するのを促進すると考えられる。
【０３１０】
なお、相補鎖におけるポリヌクレオチドは少なくとも１つのバルジを含む場合、上記の相補性は、バルジ構造部分を二本鎖形成領域から除いた後に算出する。すなわち、上記相補性の算出の際、バルジ構造部分は二本鎖形成領域に含めない。また、上記のように、アンチセンス核酸と相補鎖は、本発明の１つの好ましい実施態様において、両ポリヌクレオチドは１００％の相補性を有する。この態様では、例えば、相補鎖のポリヌクレオチド（バルジ形成部分を除く）の長さが、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドの長さより長い場合には、アンチセンス核酸のポリヌクレオチド全体が相補鎖のポリヌクレオチドの一部分と完全に相補的であり（バルジ形成部分を除く）、その完全に相補的な部分が二本鎖形成領域となる。また、相補鎖のポリヌクレオチド（バルジ形成部分を除く）の長さが、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドより短い場合には、相補鎖のポリヌクレオチド全体（バルジ形成部分を除く）がアンチセンス核酸のポリヌクレオチドの一部分と完全に相補的であり、その完全に相補的な部分が二本鎖形成領域となる。そして、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドと相補鎖のポリヌクレオチド（バルジ形成部分を除く）が同じ長さを有する場合には、バルジ構造部分を除いて両ポリヌクレオチドは全体にわたって完全に相補的である。
【０３１１】
以上のように、上記アンチセンス核酸とその相補鎖を含む二本鎖核酸を用いた場合、当該二本鎖核酸が、至適な酵素耐性を有し、その結果、ＰＳ型構造を有するアンチセンス核酸と同等またはそれ以上の標的転写産物の発現抑制効果、標的細胞増殖の抑制効果を有することが見出された。そして、上記二本鎖核酸複合体では、種々のポリヌクレオチドを相補鎖として使用することができる。
【０３１２】
さらに、本発明では、ある特定のポリヌクレオチドを相補鎖として用いた場合、例えば、相補鎖のポリヌクレオチドがアンチセンス核酸に対して少なくとも１つのミスマッチを含む場合、および相補鎖のポリヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドを交互に含む場合に、他のポリヌクレオチドを相補鎖として使用した場合に比べて、当該核酸複合体の副作用がさらに低減すること、具体的には肝毒性（特にＡＳＴ値）がさらに低減することも見出された。
【０３１３】
また、本発明の１つの実施態様において、上記核酸複合体はオーバーハングを有することができる。
【０３１４】
ここで、「オーバーハング」とは、一方の鎖が二本鎖を形成する相補性の他鎖の末端を超えて伸びる１本鎖領域から生じる、末端塩基対非形成型ヌクレオチド（または化学修飾ヌクレオチド）のことをいう。各オーバーハングは、少なくとも１つのヌクレオチド（または化学修飾ヌクレオチド）を含む。好ましくは、各オーバーハングは、２ヌクレオチドオーバーハングである。オーバーハングを構成するヌクレオチドは任意に選択することができる。オーバーハングのヌクレオチドは、標的転写産物と塩基対を形成してもしなくてもよい。上記２ヌクレオチドオーバーハングの例としては、ＵＵ、ＴＴ、ＡＡ、ＧＧ、ＣＣ、ＡＣ、ＣＡ、ＡＧ、ＧＡ、ＧＣおよびＣＧが挙げられるが、これらに限定はされない。
【０３１５】
オーバーハングの位置としては、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドの５’末端、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドの３’末端、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドの５’末端および３’末端、相補鎖におけるポリヌクレオチドの５’末端、相補鎖におけるポリヌクレオチドの３’末端、相補鎖におけるポリヌクレオチドの５’末端および３’末端、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドの５’末端および相補鎖のポリヌクレオチドの５’末端、またはアンチセンス核酸のポリヌクレオチドの３’末端および相補鎖のポリヌクレオチドの３’末端が可能である。
【０３１６】
本発明の他の実施態様において、上記核酸複合体はオーバーハングを含まない。
【０３１７】
また、本発明の１つの実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと任意に核酸類似体とを構成単位として少なくとも含む。上記デオキシリボヌクレオチドは化学修飾されていても、化学修飾されていなくてもよい。本発明の１つの実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドと任意に核酸類似体のみを構成単位として含む。本発明の別の実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されたデオキシリボヌクレオチドと任意に核酸類似体のみを構成単位として含む。
【０３１８】
さらに、本発明の１つの実施態様において、相補的な核酸鎖におけるポリヌクレオチドは、核酸類似体を含む。本発明の他の実施態様において、相補的な核酸鎖におけるポリヌクレオチドは、核酸類似体を含まない。また、本発明の別の実施態様において、相補的な核酸鎖におけるポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドを含まない。本発明のさらに別の実施態様において、相補的な核酸鎖におけるポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドを含まない。
【０３１９】
なお、上述のように、本発明の１つの実施態様において、相補鎖は、デオキシリボヌクレオチドのみからなる。この態様でも、上記二本鎖核酸複合体は標的転写産物のレベルを良好に抑制できるが、これは以下の機構によるものと考えられる：アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドと相補的な核酸鎖におけるポリヌクレオチドにより形成されたＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖が標的転写産物に送達されるまでの間にＤＮａｓｅに認識され、当該ＤＮａｓｅによって相補的な核酸鎖におけるポリヌクレオチドが分解される。その後、残ったアンチセンス活性部分におけるポリヌクレオチドが標的転写産物とＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を形成し、ＲＮａｓｅＨによってこの部分が認識され、分解される。
【０３２０】
本発明の１つの実施態様において、上記アンチセンス核酸または上記二本鎖核酸複合体は、細胞または哺乳動物において標的遺伝子の発現を減少させるためのアンチセンス核酸または核酸複合体である。また、本発明のさらなる実施態様において、上記アンチセンス核酸または核酸複合体は、標的細胞（好ましくは癌細胞）内の標的遺伝子（好ましくはがん遺伝子）の発現を抑制することにより、当該標的細胞の増殖を抑制するためのアンチセンス核酸または核酸複合体である。典型的には、上記標的遺伝子の発現亢進を伴う細胞を標的細胞とすることができる。また、本発明のさらなる実施態様において、上記アンチセンス核酸または核酸複合体は、標的組織および／または標的部位において、標的遺伝子の発現を抑制するためのアンチセンス核酸または核酸複合体である。
【０３２１】
本発明のさらなる１つの実施態様において、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドは、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である。本発明の１つの実施態様において、上記標的遺伝子はヒトｂｃｌ−２、ヒトＢＣＲ−ＡＢＬまたはヒトＳＴＡＴ３である。
【０３２２】
本発明の１つの実施態様において、上記アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドは、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号２、１７、１９または２２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｂ）上記（ａ）のポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
（ｃ）上記（ａ）のポリヌクレオチドのうちの少数のヌクレオチドが置換し、欠失し、付加し及び／又は挿入されたポリヌクレオチド、
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドを部分配列として含むポリヌクレオチド。
【０３２３】
上記（ｂ）のポリヌクレオチドは、上記（ａ）のポリヌクレオチドの塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、例えば９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．５％以上の配列同一性を有する。好ましくは、上記（ｂ）のポリヌクレオチドは、標的転写産物の発現抑制活性を有し、および／または副作用が低減されている。
【０３２４】
上記（ｃ）のポリヌクレオチドは、上記（ａ）のポリヌクレオチドのうちの少数の、好ましくは、１個〜数個、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドが置換し、欠失し、付加し及び／又は挿入されたポリヌクレオチドであることができる。好ましくは、上記（ｃ）のポリヌクレオチドは、標的転写産物の発現抑制活性を有し、および／または副作用が低減されている。
【０３２５】
上記（ｄ）のポリヌクレオチドは、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドを部分配列として含むポリヌクレオチドであり、好ましくは標的転写産物の発現抑制活性を有し、および／または副作用が低減されている。本発明の１つの実施態様において、上記（ｄ）のポリヌクレオチドの長さは８〜１００塩基である。好ましくは、前記長さは、少なくとも１０塩基であり、少なくとも１２塩基であり、又は少なくとも１３塩基である。前記長さは、好ましくは１００塩基以下、３５塩基以下、２５塩基以下または２０塩基以下であることができる。
【０３２６】
本明細書において、塩基配列に関する「配列同一性」とは、比較すべき２つ塩基配列の塩基ができるだけ多く一致するように両塩基配列を整列させ、一致した塩基数を全塩基数で除したものを百分率（％）で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ等の周知のプログラムを用いて行なうことができる（Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：２２６４−２２６８，  １９９３；  Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２，  １９９７）。ギャップが挿入される場合、上記全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数となる。このようにして数えた全塩基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、同一性（％）は、長い方の配列の全塩基数で、一致した塩基数を除して算出される。
【０３２７】
通常、上述の化学修飾（例えば核酸類似体）の存在は、上記の配列同一性に影響を及ぼさない。
【０３２８】
本発明の１つの実施態様において、上記（ｉｉ）相補鎖におけるポリヌクレオチドは、以下の（ａ’）〜（ｄ’）から選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ’）配列番号７〜１６、１８、２０、２１および２３のいずれか１つで示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｂ’）上記（ａ’）のポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
（ｃ’）上記（ａ’）のポリヌクレオチドのうちの少数のヌクレオチドが置換し、欠失し、付加し及び／又は挿入されたポリヌクレオチド、
（ｄ’）上記（ａ’）〜（ｃ’）のいずれか１つのポリヌクレオチドを部分配列として含むポリヌクレオチド。
【０３２９】
上記（ｂ’）のポリヌクレオチドは、上記（ａ’）のポリヌクレオチドの塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、例えば９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．５％以上の配列同一性を有する。好ましくは、上記（ｂ’）のポリヌクレオチドは、アンチセンス核酸と少なくとも一部が相補的であり、より好ましくはアンチセンス核酸と１００％の相補性を有する。
【０３３０】
上記（ｃ’）のポリヌクレオチドは、上記（ａ’）のポリヌクレオチドのうちの少数の、好ましくは、１個〜数個、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドが置換し、欠失し、付加し及び／又は挿入されたポリヌクレオチドであることができる。好ましくは、上記（ｃ’）のポリヌクレオチドは、アンチセンス核酸と少なくとも一部が相補的であり、より好ましくはアンチセンス核酸と１００％の相補性を有する。
【０３３１】
上記（ｄ’）のポリヌクレオチドは、上記（ａ’）〜（ｃ’）のいずれかのポリヌクレオチドを部分配列として含むポリヌクレオチドであり、好ましくはアンチセンス核酸と少なくとも一部が相補的であり、より好ましくはアンチセンス核酸と１００％の相補性を有する。本発明の１つの実施態様において、上記（ｄ’）のポリヌクレオチドの長さは８〜１００塩基である。好ましくは、前記長さは、少なくとも１０塩基であり、少なくとも１２塩基であり、少なくとも１３塩基であり、少なくとも１４塩基であり、少なくとも１５塩基、または少なくとも１６塩基である。前記長さは、好ましくは１００塩基以下、４５塩基以下、３５塩基以下、３０塩基以下、２５塩基以下、２４塩基以下、２３塩基以下、２２塩基以下、２１塩基以下または２０塩基以下であることができる。
【０３３２】
本発明の１つの実施態様において、上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体は、標的部位への送達を目的としたリガンドを、例えば１〜１０個、好ましくは１〜６個、例えば１、２、３、４または５個含むことができる。上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体が複数のリガンドを含む場合、それらのリガンドは同じであってもよく、あるいは各々互いに異なっていてもよい。
【０３３３】
上記二本鎖核酸複合体がリガンドを有する場合、例えば、上記相補鎖にリガンド分子が結合していても良い。
【０３３４】
本発明において、「リガンド」とは、レセプターと結合する能力を有する物質を意味しており、典型的にはレセプターに特異的に結合可能な物質を利用することができる。レセプターはリガンドを結合可能な物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞膜上に存在する種々のレセプターが挙げられる。すなわち、ここで用いる場合、「リガンド」と「レセプター」の用語は、互いに結合可能な相手、好ましくは互いに特異的に結合可能な相手の意味で用いており、それらの結合により何らかの生体反応が惹起されるものに限定されない。例えば、標的細胞の細胞膜表面に存在するレセプターに特異的に結合可能な物質をリガンドとして使用することができる。
【０３３５】
上記リガンドは、例えば、タンパク質、ペプチド、アプタマー、糖鎖、脂質、低分子、生体分子／生体活性分子であることができるが、これらに限定はされない。
【０３３６】
「タンパク質」は、α−Ｌ−アミノ酸（グリシンを含む）がペプチド結合により直鎖状に連結したものを意味する。本明細書においては、タンパク質は、アミノ酸のみからなる単純タンパク質も、アミノ酸以外の構成成分を含む複合タンパク質も含む概念であり、１００残基以上のアミノ酸から構成されるものを指す。リガンドとして使用されるタンパク質（以下、「タンパク質リガンド」とも呼ぶ）の例としては、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ１〜１２（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １−１２）、外膜特異的リポタンパク質分子シャペロンＬｏｌＡ、外膜特異的リポタンパク質受容体ＬｏｌＢ、リポキシゲナーゼおよびシクロオキゲナーゼが挙げられる。
【０３３７】
またリガンドとして使用できるタンパク質としては、抗体も挙げることができる（以下、「抗体リガンド」とも呼ぶ）。例えば、適切なレセプターを選択し、それを抗原として認識する抗体をリガンドとして使用することにより、本発明のアンチセンス核酸を、当該レセプターが存在する標的細胞や標的組織（典型的には、当該レセプターが表面に存在する標的細胞や標的組織）に特異的に送達することができる。
【０３３８】
また、リガンドとしてはペプチドを使用することもできる。「ペプチド」とは、２分子以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した物質であり、本明細書においては、１００残基未満のアミノ酸が連結した物質を指す。本発明においては、好ましくは、６０残基以下のアミノ酸、例えば５０残基以下、４０残基以下、３０残基以下、２０残基以下、または１０残基以下のアミノ酸、例えば９残基以下、８残基以下、７残基以下、６残基以下、５残基以下のアミノ酸が連結したペプチドがリガンドとして使用される。リガンドとして使用されるペプチド（以下、「ペプチドリガンド」とも呼ぶ）は、特に限定されないが、その例としては、環状ＲＧＤ配列含有ペプチドのような環状ペプチド、インスリン、グルカゴン様ペプチド−１、バソプレシン、オキシトシンが挙げられる。
【０３３９】
ここで、「環状ＲＧＤ配列含有ペプチド」（以後、「ｃＲＧＤ」、「ｃＲＧＤペプチド」とも呼ぶ）は、少なくとも１つのアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を有し、環状構造を形成するペプチドである。上記の「環状ペプチド」は、好ましくは、環状ＲＧＤ配列含有ペプチドと同一のまたは類似のリガンド特性、特に標的特異性を有するペプチドである。なお、環状ペプチドの配列長は特に制限されないが、環構造を形成する観点から、アミノ酸数が通常３以上、例えば、４〜１５または５〜１０であることが好ましい。
【０３４０】
ＲＧＤ配列は、細胞表面上の細胞接着分子であるインテグリン分子（特にαＶβ３やαＶβ５等）に結合してこれを活性化することや、細胞側のエンドサイトーシスを誘導することが知られており、ＲＧＤぺプチドの腫瘍標的リガンドとしての使用も知られている。
【０３４１】
本発明では、斯かるＲＧＤ配列を有し、環状構造を形成するペプチドであれば、任意のｃＲＧＤペプチドを使用することが可能である。
【０３４２】
ｃＲＧＤペプチドの配列長は特に制限されないが、環構造を形成する観点から、アミノ酸数が通常３以上、例えば、４〜１５または５〜１０であることが好ましい。
【０３４３】
また、ＲＧＤ配列以外の部分を構成するアミノ酸の種類およびこれらの配列は任意である。従って、ｃＲＧＤペプチドは、生体を構成する２０種類のアミノ酸の他に、その他の種類の天然アミノ酸や合成アミノ酸を含んでいてもよい。ただし、本発明のアンチセンス核酸の投与対象に望ましくない影響を及ぼさず、当該複合体の活性を実質的に損なわず、さらにＲＧＤ配列の機能を妨げないアミノ酸およびそれらの配列が好ましい。
【０３４４】
上述のように、ｃＲＧＤペプチドは、少なくとも１つのＲＧＤ配列を有する。本発明の１つの実施態様において、上記ｃＲＧＤペプチドは、１つのＲＧＤ配列を有する。
【０３４５】
ｃＲＧＤペプチドの具体例としては、以下のアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられるがこれに限定はされない：
ｃＲＧＤｆＫ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）（配列番号２４）。
【０３４６】
上記ｃＲＧＤペプチドは、周知の自動合成装置によって合成することが可能であり、または市販されているもの（例えば、Ｓｅｌｌｅｃｋ社製「Ｃｙｃｌｏ（−ＲＧＤｆＫ）」）を使用することも可能である。
【０３４７】
さらに、リガンドとしてはアプタマーを使用することもできる（以下、「アプタマーリガンド」とも呼ぶ）。アプタマーとは、特定の分子と、典型的にはハイブリダイズ以外の手段で、特異的に結合する核酸分子であり、通常、核酸の配列をランダムに変化させて、標的の分子と特異的に結合するものを当業者に公知の方法（例えばＳＥＬＥＸ法や一段階セレクション法）を用いて選択することによって得ることができる。従って、標的分子に特異的に結合するアプタマーをリガンドとして使用することにより、本発明のアンチセンス核酸を、当該標的分子が存在する標的細胞や標的組織（典型的には、当該標的分子が表面に存在する標的細胞や標的組織）に特異的に送達することができる。
【０３４８】
リガンドとしては糖鎖を使用することもできる。ここで「糖鎖」とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸などの単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子を指す。リガンドとして使用される糖鎖（以下、「糖鎖リガンド」とも呼ぶ）は、特に限定されないが、その例としては、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ヒアルロン酸、デキストリンおよびセルロースが挙げられる。
【０３４９】
リガンドとしては脂質を使用することもできる。本明細書で使用する場合に、「脂質」には、単純脂質、複合脂質および誘導脂質が含まれる。リガンドとして使用される脂質（以下、「脂質リガンド」とも呼ぶ）は、特に限定されないが、例えば、複合脂質であるリン脂質や糖脂質、誘導脂質である脂肪酸やステロイドが挙げられる。リン脂質の例としてはスフィンゴリン脂質、糖脂質の例としてはスフィンゴ糖脂質、脂肪酸の例としては、直鎖状または分岐状のＣ４〜Ｃ３０飽和または不飽和脂肪酸、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノレン酸、ドコサン酸が挙げられ、ステロイドの例としてはコレステロールが挙げられる。また、脂溶性ビタミンであるビタミンＥ（トコフェロール）もリガンドとして使用できる脂質の一例として挙げることができる。トコフェロールは、例えば、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロールおよびδ−トコフェロールからなる群から選択される。また、本発明では、トコフェロールの類縁体を使用することもできる。
【０３５０】
ここで、「類縁体（ａｎａｌｏｇ）」とは、ある化合物と同一または類似の基本骨格を有し、類似した構造および性質を有する化合物、特に同一または類似のリガンド特性を有する化合物を指す。類縁体には、例えば、生合成中間体、代謝産物、置換基を有する化合物などが含まれる。ある化合物が別の化合物の類縁体であるかどうかは、当業者であれば判定することが可能である。
本明細書において、「トコフェロール類縁体」には、トコフェロールの不飽和アナログ（例えば、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、δ−トコトリエノール等のトコトリエノール）、トコフェロールもしくは上記不飽和アナログの薬学的に許容可能なエステル（例えば、酢酸エステル、コハク酸エステル、プロピオン酸エステル）、およびそれらの薬学的に許容可能な塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩）が含まれる。上記の塩は、特に、コハク酸のような二カルボン酸とのエステルの場合に形成させることが可能である。上記のトコフェロール類縁体は、トコフェロールと同一のまたは類似のリガンド特性、特に標的特異性を有することができる。
【０３５１】
リガンドとしては低分子・低分子化合物を使用することもできる。リガンドとして使用され得る低分子・低分子化合物（以下、「低分子リガンド」とも呼ぶ）は、特に限定されないが、その例としては、アニスアミド、チロフィバン、および２−ピロリジン−１−イル−Ｎ−［４−［４−（２−ピロリジン−１−イル−アセチルアミノ）−ベンジル］−フェニル］−アセトアミドが挙げられる。
【０３５２】
リガンドとしては生体分子／生体活性分子を使用することもできる。リガンドとして使用され得る生体分子／生体活性分子（以下、「生体分子／生体活性分子リガンド」とも呼ぶ）は、生体に関連する分子、または生体に影響を与え得る活性を有する分子であれば特に限定されないが、その例としては、葉酸、アナンダミド、スペルミンが挙げられる。
【０３５３】
例えば、「葉酸」は、すべての細胞がＤＮＡ合成に必要とするビタミンである。多くの癌細胞において葉酸受容体が過剰発現していることが報告されており、従って、葉酸は癌標的リガンドとして広く使用されている。また、葉酸と葉酸受容体の複合体がエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれることや、多くの癌細胞において、葉酸の取り込みが多いことも報告されている。
【０３５４】
本発明では、このような葉酸も上記リガンドとして使用することができ、葉酸は例えば、市販のもの（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製「葉酸」）を容易に入手することが可能である。また、本発明では、葉酸の類縁体を使用することもできる。
【０３５５】
ここで、本明細書において、「葉酸類縁体」は、ベンゾイル部分を介してアミノ酸部分（好ましくはグルタミン酸部分）と結合した縮合ピリミジン複素環を有する化合物、すなわち、アミノ酸部分、ベンゾイル部分および縮合ピリミジン複素環をベースとした化合物を指す（葉酸自体は除く）。上記「縮合ピリミジン複素環」としては、例えば、プテリジン又は二環式ピロロピリミジンなど５若しくは６員環の複素環をさらに融合させたピリミジンを挙げることができる。葉酸またはその類縁体の例としては、葉酸（プテロイル−グルタミン酸）骨格をベースとし、任意選択的に置換された葉酸、ホリニン酸、プテロポリグルタミン酸、ならびに葉酸レセプター結合プテリジン、例えば、テトラヒドロプテリン、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、デアザおよびジデアザアナログが挙げられる。上記の葉酸類縁体は、葉酸と同一のまたは類似のリガンド特性、特に標的特異性を有することができる。
【０３５６】
また、当業者は、他の生体分子／生体活性分子リガンドについても、それぞれのレセプターの情報、例えば、各種組織や細胞における発現レベルや発現特異性等を考慮に入れながら、本発明のアンチセンス核酸の所望の標的に応じて、適切な生体分子／生体活性分子リガンドを適宜選択することが可能である。
【０３５７】
本発明の１つの好ましい態様において、上記リガンドは、タンパク質リガンド、ペプチドリガンド、アプタマーリガンド、糖鎖リガンド、脂質リガンド、低分子リガンドおよび生体分子／生体活性分子リガンドからなる群から選択され、より好ましくはペプチドリガンド、糖鎖リガンド、脂質リガンド、低分子リガンドおよび生体分子／生体活性分子リガンドからなる群から選択される。
【０３５８】
本発明のさらなる好ましい態様において、上記リガンドは、環状ペプチド、例えば環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列含有ペプチド、葉酸もしくはその類縁体、ビタミンＥ（トコフェロール）もしくはその類縁体、ステアリン酸、ドコサン酸、アナンダミド、スペルミン、コレステロール、アニスアミドまたはＮ−アセチルガラクトサミンから選択される。
【０３５９】
本発明の別の実施態様において、上記リガンドは、ペプチドリガンド、生体分子／生体活性分子リガンドまたは脂質リガンドから選択され、例えば、環状ＲＧＤ配列含有ペプチド、葉酸またはビタミンＥ（トコフェロール）から選択される。
【０３６０】
好ましくは、上記のようなリガンドを有する本発明のアンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体は、上記リガンドが特異的に結合可能なレセプターを有する細胞や組織（例えばそれらの表面に有する）を標的細胞または標的組織とすることができる。標的細胞や標的組織の種類は特に限定されず、目的などに応じて適宜の細胞や組織を標的とすることができる。例えば、標的細胞は組織や臓器を形成する細胞であってもよい。あるいは、標的細胞は、白血病細胞のように単独で存在する細胞であってもよく、固形がん細胞のように組織に腫瘍を形成している細胞やリンパ組織や他の組織に浸潤している細胞などであってもよい（以下、これらの細胞をまとめて単に「癌細胞」とも呼ぶ）。
【０３６１】
本発明の１つの実施態様において、上記リガンドは、直接結合していても、リンカーを介して間接的に結合していてもよい。例えば、上記リガンドは、上記ポリヌクレオチドの５’末端または３’末端に、および／またはそれ以外の部位、例えばポリヌクレオチド全体の個数に対してｍ％の個数を有する、下記に定義する中央領域内における１つまたは複数の構成単位に、直接またはリンカーを介して結合させることができる（ここで、ｍは、１〜７０の整数、例えば２〜６０の整数、５〜５０の整数、１０〜４０の整数であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６５であることができる）。ここで、「中央領域」とは、上記ポリヌクレオチドが奇数個の構成単位からなる場合には、上記ポリヌクレオチドの中央に位置する１個の構成単位と、当該中央構成単位から５’方向および３’方向にそれぞれ同じ数の構成単位とを含む領域であって、上記ポリヌクレオチドの中央と当該領域の中央とが同一である領域を意味し、上記ポリヌクレオチドが偶数個の構成単位からなる場合には、上記ポリヌクレオチドの中央に位置する２個の構成単位と、当該中央構成単位から５’方向および３’方向にそれぞれ同じ数の構成単位とを含む領域であって、上記ポリヌクレオチドの中央と当該領域の中央とが同一である領域を意味する。
【０３６２】
本発明の１つの実施態様において、上記リガンドは、上記ポリヌクレオチドの５’末端に結合している。本発明の他の実施態様において、上記ポリヌクレオチドが１０〜３５塩基の長さを有する場合には、上記リガンドは、上記ポリヌクレオチドの５’末端から数えて、１〜３５番目、例えば２〜３０番目、３〜２５番目、４〜２０番目、５〜１５番目、６〜１１番目（例えば、６、７、８、９、１０または１１番目）の構成単位に、例えばその２’位または４’位を介して結合している。
【０３６３】
上記のようなリガンドを、任意選択的にリンカーを介して、ポリヌクレオチドに結合させる方法は当業者によく知られている。当業者は、使用するリガンドやリンカーの種類に応じて適宜適切な公知の方法を選択することにより、上記結合を達成することが可能であるが、例えば、リガンドとしてｃＲＧＤｆＫ、リンカーとしてＡｚｉｄｏ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒを使用して、リガンドをヌクレオチドの２’位から懸垂させる場合の方法を以下に簡単に説明する：
【０３６４】
（ａ）リガンドとリンカーとの結合
ｃＲＧＤｆＫとＡｚｉｄｏ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒを、ＮＨＳエステルとｃＲＧＤｆＫのリジンのアミノ基との縮合反応により結合させて、ｃＲＧＤｆＫにアミド結合によりアジド−ＰＥＧ４が連結しているアジド化ｃＲＧＤｆＫを作成する。
【０３６５】
（ｂ）アルキン修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの調製
（リンカーを介して）リガンドを結合させたい位置の構成単位をアルキン修飾ヌクレオチドとしたポリヌクレオチドを調製する。このようなポリヌクレオチドの調製方法は、当業者には公知であり、例えば、標準的なオリゴ合成においてアルキンホスホロアミダイトを用いることにより合成することができる。アルキン修飾ヌクレオチドの調製のためには、例えば、２’−Ｏ−プロパルギルアデノシン、２’−Ｏ−プロパルギルシチジン、２’−Ｏ−プロパルギルグアノシン、２’−Ｏ−プロパルギルウリジンまたは２’−Ｏ−プロパルギル脱塩基リボースを使用することができる。
【０３６６】
（ｃ）クリック反応
アジドとアルキンによる付加感化反応（クリック反応）を用いて、アジド化ｃＲＧＤｆＫとアルキン修飾ヌクレオチドとを結合させる。
【０３６７】
これにより、所望の位置のヌクレオチド（または化学修飾ヌクレオチドまたは核酸類似体）の２’の部位に、トリアゾールを介してＰＥＧ４が結合し、そこにアミド結合によって結合したｃＲＧＤｆＫを有するポリヌクレオチド、すなわち、リガンドがリンカーを介してヌクレオチドの２’位から懸垂しているポリヌクレオチドが得られる。そのようなポリヌクレオチドの例を図３４に示す。
【０３６８】
上記のように、リンカーを介してリガンドが相補鎖のポリヌクレオチドに結合している場合、当該ポリヌクレオチドにおける結合を担う構成単位は、リンカーとの結合のために化学修飾されていてもよい。例えば、上記構成単位（デオシキリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたは核酸類似体）のリンカー結合部位をアミノ化、チオール化、アルキン化またはジベンゾシクロオクチン化することにより、それぞれ、リンカーにおけるアミン反応性基、チオール反応性基、アルキン反応性基またはジベンゾシクロオクチン反応性基との反応を介して、上記構成単位とリンカーとの間に共有結合を形成させることができる。このような化学修飾がなされたヌクレオチドを、ここでは「リンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチド」とも呼び、このような修飾は、上で説明した化学修飾の一態様を構成するものである。なお、「リンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチド」は、上記で例示したような反応の結果としてリンカーの一端と共有結合を形成するため、反応前と反応後では異なる構造を取り得るが、リンカーと共有結合を形成している形態のヌクレオチドも、ここでは「リンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチド」として呼ぶことができる。同様に、上記リガンドをポリヌクレオチドに直接結合させる場合にも、例えば、リンカーを介したリガンドの結合に関して上述したような化学修飾や反応性基を適宜、リガンドを結合させるポリヌクレオチドの構成単位（ヌクレオチドまたは核酸類似体）および／またはリガンドに導入し、公知の反応、例えば上述したような反応を使用することにより、当該構成単位とリガンドとの間で共有結合を形成させることが可能である。この場合、上記のような化学修飾がされたヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド）を「リガンドとの結合のために化学修飾されたヌクレオチド」とも呼ぶ。
【０３６９】
本発明の１つの実施態様において、上記相補鎖におけるポリヌクレオチドは、リンカーを介してリガンドが結合している構成単位として、リンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド）、好ましくはリンカーとの結合のために化学修飾されたリボヌクレオチドを少なくとも１つ含む。このリンカーとの結合のために化学修飾されたリボヌクレオチドに、リガンドを結合させることができる。
【０３７０】
本発明の他の実施態様において、上記相補鎖におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオチドおよびリンカーとの結合のために化学修飾されたリボヌクレオチドのみを構成単位として含む。本発明のさらなる実施態様において、上記相補鎖におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオチド、化学修飾されていないリボヌクレオチドおよびリンカーとの結合のために化学修飾されたリボヌクレオチドのみを構成単位として含む。これらの実施態様では、このリンカーとの結合のために化学修飾されたリボヌクレオチドに、リガンドを結合させることができる。
【０３７１】
本発明の１つの実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含み、かつ、構成単位としてリンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチド（好ましくはリボヌクレオチド）を含む。本発明のさらに１つの実施態様において、相補鎖におけるポリヌクレオチドは、アンチセンス核酸におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含み、かつ、リンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチド（好ましくはリボヌクレオチド）を構成単位として含み、かつ、当該ヌクレオチドの少なくとも１つが当該ミスマッチを形成し、すなわち、この実施態様では、リガンドが結合している構成単位が上記ミスマッチを形成する。例えば、上記ミスマッチは、Ｇ対Ｕのミスマッチ（アンチセンス核酸がＧで、相補鎖がＵ）であることができる。
【０３７２】
また、上記相補鎖が複数のリガンドを含む場合、これらのリガンドは同一の構成単位に結合していてもよく（例えば、同一の構成単位の同一の位置（例えば２’位）に結合していてもよい）、または互いに異なる構成単位に結合していてもよい。前者の場合、例えば、適当な分岐リンカーを用いることにより、複数のリガンドを多量体（例えば２〜１０量体、好ましくは２〜６量体、例えば２、３、４、５または６量体）として同一の構成単位に結合させてもよい。本願では、本発明の核酸複合体において、複数のリガンドを多量体として同一の構成単位に結合させた場合でも、良好な活性が達成されることも見出された。
【０３７３】
分岐リンカーとしては種々のものが公知であり、当業者であれば使用するリガンドに応じて適宜適切な分岐リンカーを選択することが可能である。
【０３７４】
本発明においては、例えば、分岐リンカーとして、ポリヌクレオチドと２つのｃＲＧＤｆＫとを以下に示すように連結するリンカーを使用することができる。この場合、２つのｃＲＧＤｆＫを２量体の形態で、同一の構成単位ヌクレオチドに結合させることができる。
【０３７５】
【化７４】
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また、例えば、４分岐型の分岐リンカーを使用して４つのｃＲＧＤｆＫとポリヌクレオチドとを連結することにより、以下に示すように、４つのｃＲＧＤｆＫを４量体の形態で、同一の構成単位ヌクレオチドに結合させることができる。
【０３７６】
【化７５】
2018051762.tif 000077
【０３７７】
１つの実施態様において、上記アンチセンス核酸は、ポリヌクレオチドのみからなる。本発明の別の実施態様において、上記アンチセンス核酸は、ポリヌクレオチドおよびリガンドのみからなる。本発明のさらなる実施態様において、上記アンチセンス核酸は、ポリヌクレオチド、リガンドおよびリンカーのみからなる。
本発明の他の実施態様において、上記二本鎖核酸複合体は、上記アンチセンス核酸および上記相補鎖のみからなる。本発明のさらなる実施態様において、上記二本鎖核酸複合体は、アンチセンス核酸、相補鎖およびリガンドのみからなる。本発明のさらに他の実施態様において、上記二本鎖核酸複合体は、アンチセンス核酸、相補鎖、リガンドおよびリンカーのみからなる。
【０３７８】
以上、いくつかの実施態様において、アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体の好適な典型例について説明したが、いくつかの実施態様におけるアンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体は上記典型例に限定されるものではない。また、いくつかの実施形態において、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドおよび／または相補的な核酸鎖のポリヌクレオチドは、当業者であれば公知の方法を適宜選択することにより調製することができる。例えば、標的転写産物の塩基配列（典型的には標的遺伝子の塩基配列）の情報に基づいて、核酸の塩基配列を設計し、市販の核酸自動合成機（アプライドバイオシステムズ社製、べックマン社製等）を用いて合成し、次いで、得られるポリヌクレオチドを逆相カラム等を用いて精製することにより、核酸を調製することができる。そして、このようにして調製した核酸を適当な緩衝液中にて混合し、約９０〜９８℃にて数分間（例えば、５分間）かけて変性させた後、必要に応じて約３０〜７０℃にて約１〜８時間かけてアニーリングさせることにより、いくつかの実施形態におけるアンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体を調製することができる。なお、二本鎖核酸複合体において、上記相補鎖のポリヌクレオチドにリガンドが結合している場合には、当該二本鎖核酸複合体は、例えば、予めリガンドを結合させたポリヌクレオチドを用いて、前記の通りアンチセンス核酸のポリヌクレオチドとアニーリングすることにより、調製することができる。
【０３７９】
上述のように、アンチセンス核酸（ＡＳＯ）としてＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドを細胞に導入した場合、標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）と当該ＡＳＯとが結合して、部分的に二本鎖が形成され、この二本鎖が蓋の役割をして、リボソームによる翻訳を生じさせず、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現が阻害されることが知られている。
【０３８０】
また、ＡＳＯとしてＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドを細胞に導入した場合、部分的にＤＮＡ−ＲＮＡのヘテロオリゴヌクレオチドが形成され、ＲＮａｓｅＨによってこの部分が認識され、標的遺伝子のｍＲＮＡが分解されるため、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現が阻害されることも知られている。ＡＳＯが蓋の役割をする場合に比べ、このＲＮａｓｅＨ依存的経路の場合の方が、多くの場合において遺伝子発現の抑制効果が高いことも明らかになっている。
【０３８１】
ＡＳＯとしてＤＮＡを用いた場合のアンチセンス効果に関連して、特表２０１５−５０２１３４号公報では、ＬＮＡ／ＤＮＡギャップマーとそれに対するＲＮＡからなる相補鎖とをアニーリングさせた二本鎖アンチセンス核酸が開示されている。ここでは、当該二本鎖核酸のアンチセンス効果について記載されている。当該文献におけるような二本鎖核酸は、ＨＤＯ（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）と呼ばれるものである。
【０３８２】
ＡＳＯとしてｍＲＮＡ前駆体の特定領域に相補的でかつＲＮａｓｅＨの基質とならない修飾ＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドを細胞に導入すると、部分的にＤＮＡ−ＲＮＡのヘテロオリゴヌクレオチドが形成され標的遺伝子のエクソンを読み飛ばすこと（エクソンスキッピング法）が知られている。
【０３８３】
＜標的遺伝子の発現又は標的転写産物を抑制するための組成物＞
本発明のアンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体は、特異性高く効率良く標的細胞内に取り込まれて、当該細胞内の標的遺伝子の発現又は標的転写産物レベルを抑制し、当該細胞の増殖を極めて効果的に抑制することができる。従って、上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体を有効成分として含有する、例えば、標的遺伝子の発現および／または標的細胞（例えば癌細胞）の増殖をアンチセンス効果によって抑制するための組成物を、本発明は提供することができる。本発明のアンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体は、優れた特異性と効率で標的組織や標的部位に送達することができ、高い特異性および効率で標的細胞の増殖を抑制できるため、低濃度の投与により高い薬効を得ることができる。そして、発明のアンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体は特に、副作用が少ないという利点も有する。従って、代謝性疾患、腫瘍、感染症といった標的遺伝子の発現亢進に伴う疾患を治療、予防するための医薬組成物も提供することができる。
【０３８４】
従って、本発明の１つの実施態様において、本発明は、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的遺伝子の発現を減少させるための、上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体に関する。
【０３８５】
また、本発明のさらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的遺伝子の発現が亢進している細胞の増殖を抑制するための、上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体に関する。上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体は、癌細胞の増殖を抑制するためのアンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体であることができ、または、癌治療用および／または予防用アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体であることができる。
【０３８６】
さらに、本発明の１つの実施態様において、本発明は、上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体と、任意に薬理学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物に関する。
【０３８７】
また、本発明の別の実施態様において、本発明は、上記医薬組成物を製造するための、上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体の使用に関する。
【０３８８】
本発明の１つの実施態様において、本発明は、上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、遺伝子の発現亢進を伴う疾患を治療または予防する方法に関する。
さらに別の実施態様において、本発明は、上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において癌を治療する方法に関する。
【０３８９】
上記医薬組成物は、癌細胞の増殖を抑制するための医薬組成物であることができ、または、上記医薬組成物は、癌治療用および／または予防用医薬組成物であることができる。
【０３９０】
上記癌細胞の癌および上記癌は、例えば、脳腫瘍；頭、首、肺、子宮又は食道の扁平上皮癌；メラノーマ；肺又は子宮の腺癌；腎癌；悪性混合腫瘍；肝細胞癌；基底細胞癌；勅細胞腫様歯肉腫；口腔内腫瘤；肛門周囲腺癌；肛門嚢腫瘤；肛門嚢アポクリン腺癌；セルトリ細胞腫；膣前庭癌；皮脂腺癌；皮脂腺上皮腫；脂腺腺腫；汗腺癌；鼻腔内腺癌；鼻腺癌；甲状腺癌；大腸癌；気管支腺癌；腺癌；腺管癌；乳腺癌；複合型乳腺癌；乳腺悪性混合腫瘍；乳管内乳頭状腺癌；線維肉腫；血管周皮腫；肉腫；骨肉腫；軟骨肉腫；軟部組織肉腫；組織球肉腫；粘液肉腫；未分化肉腫；肺癌；肥満細胞腫；皮膚平滑筋腫；腹腔内平滑筋腫；平滑筋腫；慢性型リンパ球性白血病；リンパ腫；消化管型リンパ腫；消化器型リンパ腫；小〜中細胞型リンパ腫；副腎髄質腫瘍；顆粒膜細胞腫；褐色細胞腫；頭頸部癌；乳癌；肺癌；結腸癌；卵巣癌；前立腺癌；神経膠腫；神経膠芽腫；星状細胞腫；多形神経膠芽腫；炎症性乳癌；ウィルムス腫瘍；ユーイング肉腫；横紋筋肉腫；上衣腫；髄芽腫；腎癌；肝癌；黒色腫；膵臓癌；骨巨細胞腫；甲状腺癌；リンパ芽球性Ｔ細胞白血病；慢性骨髄性白血病；慢性リンパ球性白血病；ヘアリー細胞白血病；急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；ＡＭＬ；慢性好中球性白血病；急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病；形質細胞腫；免疫芽球性大細胞型白血病；マントル細胞白血病；多発性骨髄腫；巨核芽球性白血病；急性巨核球性白血病；前骨髄球性白血病；赤白血病；ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫；リンパ芽球性Ｔ細胞リンパ腫；バーキットリンパ腫；濾胞性リンパ腫；神経芽細胞腫；膀胱癌；尿路上皮癌；外陰癌；子宮頸癌；子宮内膜癌；中皮腫；食道癌；唾液腺癌；肝細胞癌；胃癌；上咽頭癌；頬癌；口腔癌ＧＩＳＴ（消化管間葉性腫瘍）；上皮様細胞癌；肺胞基底上皮腺癌および精巣癌からなる群から選択される。
【０３９１】
本発明のさらなる実施態様において、本発明は、上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体を細胞と接触させる工程を含む、細胞内の転写産物レベルを低減する方法に関する。
【０３９２】
本発明の別の実施態様において、本発明は、上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体を細胞、好ましくは癌細胞と接触させる工程を含む、当該細胞の増殖を抑制する方法に関する。
【０３９３】
本発明の別の実施態様において、本発明は、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的遺伝子の発現を低減させるための、上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体の使用に関する。
【０３９４】
本発明の別の実施態様において、本発明は、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的細胞、好ましくは癌細胞の増殖を抑制するための、上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体の使用に関する。
【０３９５】
本発明はさらに、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的遺伝子の発現を低減させるための薬剤を製造するための、上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体の使用に関する。本発明はまた、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的細胞、好ましくは癌細胞の増殖を抑制するための薬剤を製造するための、上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体の使用に関する。
【０３９６】
さらなる実施態様において、本発明は、上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的遺伝子の発現レベルを低減する方法に関する。本発明の別の実施態様において、本発明は、上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的細胞、好ましくは癌細胞の増殖を抑制する方法に関する。
【０３９７】
これらの態様では、好ましくは、アンチセンス核酸のポリヌクレオチドは、上記転写産物のいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である。
【０３９８】
別の実施態様において、本発明は、アンチセンス核酸のデリバリー手段として様々なドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を用いて利用することができる。ＤＤＳ複合体としては、界面活性剤ペプチド（Ｍｅｄ．  Ｍｏｌ．  Ｍｏｒｐｈｏｌ．，  ４６，  ｐｐ．８６，  ２０１３）、多糖シゾフィラン（Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ，  １５１，  ｐｐ．１５５，  ２０１１）、シクロデキストリン（Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．，  １２，  ｐｐ．３１２９，  ２０１５）、カチオニックリポソーム（Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ．，  １００，  ｐｐ．１６５，  ２００４）、核酸ミセル粒子（Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．，  １１，  ｐｐ．９０４，  ２０１４）、アテロコラーゲン（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０２，  ｐｐ．１２１７９，  ２００５）などが挙げられる。
【０３９９】
１つの実施態様において、上記転写産物は、タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物である。好ましくは、上記タンパク質はヒトＢＣＬ２、ヒトＢＣＲ−ＡＢＬまたはヒトＳＴＡＴ３である。他の実施態様において、上記転写産物は、タンパク質をコードしない転写産物である。
【０４００】
また、本発明の１つの実施態様において、上記標的遺伝子は、ヒトｂｃｌ−２、ヒトＢＣＲ−ＡＢＬまたはヒトＳＴＡＴ３である。
【０４０１】
１つの好ましい実施態様において、上記哺乳動物はヒトである。
【０４０２】
アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体を含む上記組成物や薬剤は、公知の製剤学的方法により所望の投与形態や剤形に製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的に使用することができる。
【０４０３】
これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容可能な担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、ｐＨ調節剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
【０４０４】
上記アンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体、または組成物または薬剤の好ましい投与形態としては特に制限はなく、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的、より具体的には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与が挙げられる。
【０４０５】
各実施形態においてアンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体や組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができ、すなわち、ヒトおよび／またはヒト以外の動物を対象とすることができる。ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。
【０４０６】
いくつかの実施形態におけるアンチセンス核酸（または二本鎖核酸複合体）または組成物を投与又は摂取する場合、その投与量又は摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）等に応じて、適宜選択されるが、ある実施形態にかかるアンチセンス核酸または組成物の有効摂取量は、ヌクレオチド換算で０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日であることが好ましい。
【０４０７】
後述の実施例で示されるように、がん遺伝子であるｂｃｌ−２（あるいはＢＣＲ−ＡＢＬまたはＳＴＡＴ３）を標的とする本発明の二本鎖核酸複合体は、非常に高い効率で標的細胞の増殖を抑制することができる。また、本発明の二本鎖アンチセンス核酸は、優れた特異性と効率で、標的組織や標的部位に送達することが可能である。さらに、本発明の二本鎖核酸複合体は、その副作用が極めて少ない。従って、本発明は、対象に対して、本発明のアンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体を添加または投与し、標的遺伝子の発現又は標的転写産物をアンチセンス効果によって抑制する方法を提供することができる。また、本発明は、本発明のアンチセンス核酸または二本鎖核酸複合体を対象に投与することによって、必要に応じて組織・部位特異的に、標的遺伝子の発現亢進等を伴う細胞の増殖を抑制し、それによってこのような発現亢進等を伴う各種疾患を治療、予防するための方法をも提供することができる。
【実施例】
【０４０８】
以下、例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、実施形態は以下の例に限定されるものではない。【０４０９】
例１
［２本鎖核酸の合成］
ヒトＢＣＬ２遺伝子の配列に基づいて、該遺伝子を標的とするＰＳ−ＰＯ型アンチセンス核酸を基本骨格とする２本鎖核酸を設計した。ＢＣＬ２遺伝子に対する２本鎖核酸の具体例としては、アンチセンス鎖ヌクレオチドの配列（１６ｍｅｒ）を配列番号１〜６に、相補鎖ヌクレオチド配列を配列番号７〜１６に示す（表１）。各々の遺伝子配列においてアンチセンス鎖とそれぞれの相補鎖をアニーリングさせることで２本鎖核酸を形成する。配列番号１〜６と７〜１２で各々形成される２本鎖核酸をＢＮＳＰ−１〜３６とする（表２参照）。また、配列番号１と１４から形成される２本鎖核酸をＢＮＳＰ−３７、配列番号２と１３から形成される２本鎖核酸をＢＮＳＰ−３８、配列番号２と１４から形成される２本鎖核酸をＢＮＳＰ−３９、配列番号２と１５から形成される２本鎖核酸をＢＮＳＰ−４０、配列番号２と１６から形成される２本鎖核酸をＢＮＳＰ−４１、配列番号１７と１０から形成される２本鎖核酸をＢＮＳＰ−４２とする。尚、配列番号１３〜１６の５’末端には、【０４１０】
【化７６】
2018051762.tif 000078
【０４１１】
で表示している５’−Ｏｃｔｙｌ−ｔｏｃｈｏｐｈｅｒｏｌ（Ｌｉｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を結合させた。これらの２本鎖核酸のうち、配列番号１７については日本テクノサービス株式会社製の核酸合成機（型番：Ｍ−８−ＭＸ＿Ａ８Ｓ）を用いて合成し、それ以外は株式会社ジーンデザイン社に合成を委託し合成した。配列表記として下線で示すヌクレオチドはＲＮＡ、【０４１２】
【化７７】
2018051762.tif 000079
【０４１３】
はＬＮＡ、それ以外はＤＮＡを表す。また、ヌクレオチドの結合様式としてｐｓはチオリン酸結合、ｐｏはホスホジエステル結合を示し、Ｎ（ｍ）は２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを表す。【０４１４】
【表１】
2018051762.tif 000080
【０４１５】
【表２】
2018051762.tif 000081
【０４１６】
例２
［細胞培養］
後述の実験に用いるヒト癌由来細胞株は、以下の方法で維持した細胞株を用いた。【０４１７】
ヒト上皮様細胞癌由来細胞株（Ａ４３１細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ０００４）、ヒト肝癌由来細胞株（ＨｅｐＧ２細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ−ＲＣＢ１８８６）及びヒト膵臓癌由来細胞株（ＨＰＡＣ細胞株：ＡＴＣＣ細胞バンクより購入、細胞番号：ＣＲＬ−２１１９）は、１０質量％のウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＤＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社製）を用い、ヒト膵臓癌由来細胞株（ＡｓＰＣ−１細胞株：ＡＴＣＣ細胞バンクより購入、細胞番号：ＣＲＬ−１６８２）、ヒト胃癌由来細胞株（ＭＫＮ４５細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ０２５４）、ヒト膵臓癌由来細胞株（ＰＡＮＣ−１細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ−ＲＣＢ２０９５）、ヒト前立腺癌由来細胞株（ＤＵ１４５細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ−ＲＣＢ２１４３）、ヒト前立腺癌由来細胞株（ＰＣ−３細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ−ＲＣＢ２１４５）、及びヒト卵巣癌由来細胞株（ＯＶＣＡＲ−３細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ−ＲＣＢ２１３５）は、１０質量％のウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＲＰＭＩ１６４０：ＧＩＢＣＯ社製）を用い、ヒト肺胞基底上皮腺癌由来細胞株（Ａ５４９細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ００７６）、ヒト腎癌由来細胞株（Ｃａｋｉ−１細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ０８０１）、ヒト胃癌由来細胞株（ＨＧＣ−２７細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ−ＲＣＢ０５００）、及びヒト膀胱癌由来細胞株（Ｔ２４細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ−ＲＣＢ２５３６）は、１０質量％のウシ胎児血清、ＭＥＭ用非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社）を用い、ヒト卵巣癌由来細胞株（ＭＣＡＳ細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ０２４０）は、２０質量％のウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社）を用い、ヒト乳腺癌由来細胞株（ＭＣＦ−７細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ０１３４）は、１０質量％のウシ胎児血清、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌ  インスリン、ＭＥＭ用非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社）を用い、ヒト大腸癌由来細胞株（ＨＣＴ１１６細胞株：ＡＴＣＣ細胞バンクより購入、細胞番号：ＣＣＬ−２４７）は、１０質量％のウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ：ＧＩＢＣＯ社）を用い、３７℃、５質量％ＣＯ２条件下にて維持した。【０４１８】
例３
［細胞増殖アッセイ］
後述の実験で行った細胞増殖アッセイは、特に断りのない限り、以下の方法で行った。【０４１９】
９６穴マイクロプレートを用い、加湿条件下（３７℃、５％  ＣＯ２）、１００μｌ／ウェルの培地で細胞を培養した。細胞増殖アッセイには細胞増殖試薬  ＷＳＴ−１（ロッシュ社製）を１ウェルに対し１０μｌ添加し、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）を用いて吸光度を測定した。【０４２０】
例４
［定量ＲＴ−ＰＣＲ］
後述の実験で行った定量ＲＴ−ＰＣＲは、特に断りのない限り、以下の方法で行った。Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、培養細胞からトータルＲＮＡを抽出した。上記トータルＲＮＡを用いた定量ＲＴ−ＰＣＲはＱｕａｎｔ−Ｆａｓｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用し、推奨される条件で行った。プライマーはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製  ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ  Ｐｒｏｂｅを使用した。内因性コントロールプライマーには同社製β−Ａｃｔｉｎを用いた。上記定量ＲＴ−ＰＣＲの増幅は、ＲＯＴＯＲ−Ｇｅｎｅ  Ｑ  （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。ｍＲＮＡ発現量はＤｅｌｔａ  Ｄｅｌｔａ  ＣＴ法により算出した。【０４２１】
例５
［ヒトＢＣＬ２遺伝子遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験］
上記のヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおける細胞増殖抑制活性を調べるために、以下の実験を行った。まず、表２に示した２本鎖核酸ＢＮＰＳ−１〜３６（計３６本）を用意した。次いで、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、上述の実施例２に示した計１６細胞株に３ｎＭの２本鎖核酸をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞株を、トランスフェクトから７２時間培養し、上述の実施例３に記載の細胞増殖アッセイ法により２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性を測定した。【０４２２】
また、上記の２本鎖核酸に代えて、非標的遺伝子に対する２本鎖核酸を用いて、同様の細胞増殖アッセイを行った。【０４２３】
その結果をＡ５４９細胞株は図４、Ａ４３１細胞株は図５、ＡｓＰＣ−１細胞株は図６、ＨＰＡＣ細胞株は図７、ＨｅｐＧ２細胞株は図８、ＭＣＦ−７細胞株は図９、ＯＶＣＡＲ−３細胞株は図１０、ＭＣＡＳ細胞株は図１１、Ｃａｋｉ−１細胞株は図１２、ＤＵ１４５細胞株は図１３、ＰＣ−３細胞株は図１４、Ｔ２４細胞株は図１５、ＨＣＴ１１６細胞株は図１６、ＨＧＣ−２７細胞株は図１７、ＭＫＮ４５細胞株は図１８、ＰＡＮＣ−１細胞株は図１９に示す。図４〜１８から分かるように、ＰＳ結合を６個減らしたアンチセンス鎖に様々な構造の相補鎖をアニーリングしたＢＮＳＰ−７〜１２の２本鎖核酸は、アンチセンス鎖が全てＰＳ結合を基本骨格とするＢＮＳＰ−１〜６とヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とすることで各種癌細胞株に対して同等の増殖抑制活性を示した。また、図１９から分かるように、ＰＳ結合とＰＯ結合が完全に交互である構造を持つアンチセンス鎖が、全てＰＳ結合を基本骨格とするＢＮＳＰ−１、４と、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とすることでＰＡＮＣ−１細胞株に対して同等の増殖抑制活性を示した。【０４２４】
例６
［ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験］
上記のヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおけるｍＲＮＡ発現抑制活性を調べるために、以下の実験を行った。アンチセンス配列番号１〜６と相補鎖配列番号１０をアニーリングさせた２本鎖核酸ＢＮＳＰ−４、ＢＮＳＰ−１０、ＢＮＳＰ−１６、ＢＮＳＰ−２２、ＢＮＳＰ−２８、ＢＮＳＰ−３４を用意した。次いで、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、ＯＶＣＡＲ−３細胞株及びＡ４３１細胞株に１０ｎＭの上記２本鎖核酸をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞株を、トランスフェクトから２４時間培養し、上述の実施例４に記載の定量ＲＴ−ＰＣＲ法により２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性を定量した。【０４２５】
また、上記の２本鎖核酸に代えて、非標的遺伝子に対する２本鎖核酸を用いて、同様のｍＲＮＡ発現抑制活性を定量した。【０４２６】
その結果をＯＶＣＡＲ−３細胞株は図２０、Ａ４３１細胞株は図２１に示す。図２０より分かる通り、ＢＮＳＰ−１０はヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とすることで各種癌細胞株に対してアンチセンス鎖が全てＰＳ結合を基本骨格とするＢＮＳＰ−４と同等のｍＲＮＡ発現抑制活性を示した。また、図２０、２１よりわかる通り、その他のＢＮＳＰ−１６、ＢＮＳＰ−２２、ＢＮＳＰ−２８、ＢＮＳＰ−３４よりもＢＮＳＰ−１０は強いｍＲＮＡ発現抑制活性を示した。【０４２７】
例７
［ＰＳ−ＰＯ型２本鎖核酸の膵癌同所移植マウスモデルにおける肝毒性発現検証及び薬効評価］
上記のＰＳ−ＰＯ型２本鎖核酸とアンチセンス鎖が全てＰＳ結合を基本骨格とする２本鎖核酸を比較して後述する２項目において差が出るかどうか評価するため、以下の実験を行った。
１．肝毒性の発現検証
２．膵癌部位の増殖抑制効果【０４２８】
飼育環境下で数日間馴化したＢＡＬＢ／ｃＡ  Ｊｃｌ−ｎｕ／ｎｕマウス（６週令：雄、日本クレア株式会社より購入）に三種混合麻酔薬（ドミトール０．３ｍｇ／ｋｇ＋ドルミカム４ｍｇ／ｋｇ＋ベトルファール５ｍｇ／ｋｇ）をマウス体重１０ｇあたり８０μｌ、腹腔内投与して全身麻酔を施した後、１匹あたり１×１０６個のヒト癌細胞株を膵臓に注入し、膵臓同所移植モデルマウスを作製した（ＳｈａｍとしてＰＢＳを注入するマウスも作製）。尚、移植翌日から毎日（午後）体重を測定し、人道的エンドポイントから急激な体重減少（数日間で２０％以上）、自力歩行不能かつ摂食・摂水不能な重篤状態に陥ったマウスには安楽死処置を施すこととした。癌細胞移植４日後（ｄａｙ４）、体重を指標に群分けを行い（６群×６匹）、Ｓａｌｉｎｅ及びＢＮＳＰ−３７〜４１を３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈より投与した。また、Ｓｈａｍ群にはＳａｌｉｎｅを投与した。投与期間及び回数は１日１回（ｄａｙ４，６，８，１２，１５，１８，２０，２２，２５）の合計９回実施した。体重測定等で経過を観察し、癌細胞移植から２６日後、麻酔状態下にて腹部静脈より静脈血を採取した後、肝臓及び膵臓を摘出した。肝毒性の血液生化学的検査は株式会社ＬＳＩメディエンスに委託し、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の定量を行った。また、肝肥大を評価するため、摘出した肝臓重量を測定し、マウス体重で補正することで肝重量比を算出した。その結果をＡＳＴ値は図２２、ＡＬＴ値は図２３、肝重量比は図２４に示す。さらに、膵臓重量比を比較することでＢＮＳＰ−３７〜４１の抗腫瘍効果を評価した。その結果を図２５に示す。図２２〜２４から分かる通り、アンチセンス鎖が全てＰＳ結合を基本骨格とする２本鎖核酸（ＢＮＳＰ−３７）では、ＡＳＴ、ＡＬＴ、肝重量比全てにおいてＳａｌｉｎｅ投与群より明らかな肝毒性の発現が見られたが、アンチセンス鎖のＰＳ結合を６個減らしたＢＮＳＰ−３８〜４１はＳａｌｉｎｅ投与群と同程度であり、ＢＮＳＰ−３７と比較して統計学的有意に肝毒性マーカー及び肝肥大を抑制していることが明らかとなった。さらに、図２５から分かる通り、抗腫瘍効果ではＢＮＳＰ−３９がＢＮＳＰ−３７と同程度の統計学的に有意な癌増殖抑制作用を示し、薬効を維持したまま肝毒性を著しく減じることが可能になる構造が見出された。【０４２９】
例８
［２本鎖核酸の合成］
ヒトＢＣＬ２、ＢＣＲ−ＡＢＬ及びＳＴＡＴ３遺伝子の配列に基づいて、該遺伝子を標的とするＤＮＡ−ＤＮＡを基本骨格とし、糖部位にリガンド結合部位を有する塩基を含む２本鎖核酸を設計した。各標的遺伝子に対する２本鎖核酸の具体例としては、ＢＣＬ２遺伝子に対する相補鎖ヌクレオチド配列（１６ｍｅｒ）を配列番号１８に示す。また、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子に対するアンチセンス鎖ヌクレオチドの配列（２０ｍｅｒ）を配列番号１９に、相補鎖ヌクレオチド配列を配列番号２０及び２１に示す。さらに、ＳＴＡＴ３遺伝子に対するアンチセンス鎖ヌクレオチドの配列（２０ｍｅｒ）を配列番号２２に、相補鎖ヌクレオチド配列を配列番号２３に示す。各々の遺伝子配列においてアンチセンス鎖とそれぞれの相補鎖をアニーリングさせることで２本鎖核酸を形成する。ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とした配列番号２と１８から形成される２本鎖核酸をＢＮＳＰ−４３、ヒトＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子を標的とした配列番号１９と２０から形成される２本鎖核酸をＢＮＳＰ−４４、配列番号１９と２１から形成される２本鎖核酸をＢＮＳＰ−４５、ヒトＳＴＡＴ３遺伝子を標的とした配列番号２２と２３から形成される２本鎖核酸をＢＮＳＰ−４６とする。核酸は社内でＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（ＮＴＳＨ−８：日本テクノサービス株式会社製）を用い、常法に従い合成した。また、アンチセンス鎖とそれぞれの相補鎖のアニーリングによる２本鎖核酸の形成も社内で行った。
配列表記として下線で示すヌクレオチドはＲＮＡ、【０４３０】
【化７８】
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はＬＮＡ、それ以外はＤＮＡを表す。また、ヌクレオチドの結合様式としてｐｓはチオリン酸結合、ｐｏはホスホジエステル結合を示し、Ｎ１は２’−Ｏ−Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ  Ｃｙｔｉｄｉｎｅ、Ｎ２は２’−Ｏ−Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ  Ｕｒｉｄｉｎｅを表す。【０４３１】
【表３】
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【０４３２】
例９
［糖部２’部位へのＲＧＤ付加］
上記相補鎖のうち、Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ基を有するＢＮＳＰ−４３相補鎖（配列番号１８）へのｃＲＧＤ付加は以下の通り行った。
（１）ｃＲＧＤｆＫ  （Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ＲＧＤ：Ｃｙｃｌｏ（−ＲＧＤｆＫ）  Ｓｅｌｌｅｃｋ社製Ｓ７８３４）のペプチドのＮ末端に縮合反応によりＡｚｉｄｏ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒを結合させアジド化ペプチドを作製した。
（２）３０％ＤＭＳＯ溶液中、ＢＮＳＰ−４３相補鎖（配列番号１８）とアジド化ペプチドを原料として、Ｃｕ（ＩＩ）錯体の存在下、クリック反応を行った。３０％ＤＭＳＯ溶液中、ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｎ３  ５等量、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ５等量を加え４０℃で１６時間反応させた。
（３）クリック反応による過剰なＣｕはオリゴＤＮＡのリン酸ジエステル、塩基部あるいはトリアゾールに付着している可能性があり、陽イオン交換樹脂（Ａｇ（登録商標）ＭＰ−５０（バイオラッド社製）によりＮａ＋に置換した。。
（４）アンチセンス鎖（配列番号２）とｃＲＧＤの付加したＢＮＳＰ−４３相補鎖（配列番号１８）をアニーリングさせた２本鎖核酸をＢＮＳＰ−４３−ｃＲＧＤとする。
（５）さらに、多量体のｃＲＧＤを付加した２本鎖核酸の場合には、２本鎖核酸名に「ＤｉｃＲＧＤ」（二量体）や「ＴＥｃＲＧＤ」（四量体）を付して呼ぶ（例えば、「ＢＮＳＰ−４３−ＤＥｃＲＧＤ」、「ＢＮＳＰ−４３−ＴＥｃＲＧＤ」）。【０４３３】
例１０
［葉酸の付加］
葉酸は、ＰＥＧ３−Ｆｏｌａｔｅ（ｂａｓｅ  ｃｌｉｃｋ社製：ＢＣＦＡ−１１１−１）をクリック反応によりＰｒｏｐａｒｇｙｌ基を有するＢＮＳＰ−４５相補鎖（配列番号２１）に付加した。アンチセンス鎖（配列番号１９）とＰＥＧ３−Ｆｏｌａｔｅを付加したＢＮＳＰ−４５相補鎖（配列番号２１）をアニーリングさせた２本鎖核酸をＢＮＳＰ−４５−ＰＥＧ−３−Ｆｏｌａｔｅとする。さらに、アンチセンス鎖（配列番号１９）と社内で合成したＰＥＧ１１−Ｆｏｌａｔｅ及びＰＥＧ２３−Ｆｏｌａｔｅを付加したＢＮＳＰ−４５相補鎖（配列番号２１）をアニーリングさせた２本鎖核酸をＢＮＳＰ−４５−ＰＥＧ−１１−Ｆｏｌａｔｅ及びＢＮＳＰ−４５−ＰＥＧ−２３−Ｆｏｌａｔｅとする。【０４３４】
例１１
［細胞培養］
後述の実験に用いるヒト癌由来細胞株は、以下の方法で維持した細胞株を用いた。
ヒト肺胞基底上皮腺癌由来細胞株（Ａ５４９細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ００７６）は、１０質量％のウシ胎児血清、ＭＥＭ用非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社）、ヒト膵臓癌由来細胞株（ＰＡＮＣ−１細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ−ＲＣＢ２０９５）、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株（Ｋ５６２細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ００１９）、ヒト膵臓癌由来細胞株（ＡｓＰＣ−１細胞株：ＡＴＣＣ細胞バンクより購入、細胞番号：ＣＲＬ−１６８２）は、１０質量％のウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＲＰＭＩ１６４０：ＧＩＢＣＯ社製）を用い、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：クラボウ社より購入、製品番号：ＨＣ−０００１）は、５質量％のウシ胎児血清、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩを添加した成長培地（ＬＧＭ−３  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ：ロンザ社製）を用いた。【０４３５】
例１２
［ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験］
上記のヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおけるｍＲＮＡ発現抑制活性を調べるために、以下の実験を行った。２本鎖核酸ＢＮＳＰ−１、ＢＮＳＰ−４、ＢＮＳＰ−７、ＢＮＳＰ−１０及びＰＳ結合とＰＯ結合が完全に交互である構造を持つアンチセンス鎖（配列番号１７）と相補鎖（配列番号１０）をアニーリングさせたＢＮＳＰ−４２を用意した。次いで、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、ＰＡＮＣ−１細胞株、ＡｓＰＣ−１細胞株及びＡ５４９細胞株に１０ｎＭとなるよう上記２本鎖核酸をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞株を、トランスフェクトから２４時間培養し、上述の実施例４に記載の定量ＲＴ−ＰＣＲ法により２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性を定量した。【０４３６】
また、上記の２本鎖核酸に代えて、非標的遺伝子に対する２本鎖核酸を用いて、同様のｍＲＮＡ発現抑制活性を定量した。【０４３７】
その結果をＰＡＮＣ−１細胞株は図２６、ＡＳＰＣ−１細胞株は図２７、Ａ５４９細胞株は図２８に示す。図２６から分かる通り、ＰＳ結合とＰＯ結合が完全に交互である構造を持つアンチセンス鎖が、全てＰＳ結合を基本骨格とするＢＮＳＰ−１、４とヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とすることでＰＡＮＣ−１細胞株に対して同等のｍＲＮＡ発現抑制活性を示した。図２７、２８より分かる通り、ＢＮＳＰ−７及びＢＮＳＰ−１０はヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とすることでｍＲＮＡ発現抑制活性を示した。【０４３８】
例１３
［ｃＲＧＤを相補鎖中央部に結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験］
上記のヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とするｃＲＧＤを結合させた２本鎖核酸のインビトロにおけるｍＲＮＡ発現抑制活性を調べるために、以下の実験を行った。相補鎖中央部に１量体、２量体、４量体のｃＲＧＤを結合させた２本鎖核酸ＢＮＳＰ−４３−ｃＲＧＤ、ＢＮＳＰ−４３−ＤｉｃＲＧＤ、ＢＮＳＰ−４３−ＴＥｃＲＧＤ、並びにＢＮＳＰ−１０を用意し、ＰＡＮＣ−１細胞株には３μＭ、Ｋ５６２細胞株には３００ｎＭとなるよう添加した。２本鎖核酸添加後、２４時間培養し、上述の実施例４に記載の定量ＲＴ−ＰＣＲ法により２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性を定量した。【０４３９】
また、上記の２本鎖核酸に代えて、非標的遺伝子に対する２本鎖核酸を用いて、同様のｍＲＮＡ発現抑制活性を定量した。【０４４０】
その結果をＰＡＮＣ−１細胞株は図２９、Ｋ５６２細胞株は図３０に示す。図２９から分かる通り、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸に１量体のｃＲＧＤを結合させることでリガンドの結合していないＢＮＳＰ−１０よりもＰＡＮＣ−１細胞株に対してｍＲＮＡ発現抑制活性が増強していることが明らかとなった。また、図３０より分かる通り、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸に結合させたｃＲＧＤの数依存的にＫ５６２細胞株に対してｍＲＮＡ発現抑制活性が増強していることが明らかとなった。【０４４１】
例１４
［葉酸を相補鎖中央部に結合させたヒトＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験］
上記のヒトＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子を標的とする葉酸を結合させた２本鎖核酸のインビトロにおけるｍＲＮＡ発現抑制活性を調べるために、以下の実験を行った。相補鎖中央部に異なる長さのＰＥＧを介して葉酸を結合させた２本鎖核酸ＢＮＳＰ−４５−ＰＥＧ３−Ｆｏｌａｔｅ、ＢＮＳＰ−４５−ＰＥＧ１１−Ｆｏｌａｔｅ、ＢＮＳＰ−４５−ＰＥＧ２３−Ｆｏｌａｔｅ、並びに及びＢＮＳＰ−４４を用意し、Ｋ５６２細胞株に３００ｎＭとなるよう添加した。２本鎖核酸添加後、２４時間培養し、上述の実施例４に記載の定量ＲＴ−ＰＣＲ法により２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性を定量した。【０４４２】
また、上記の２本鎖核酸に代えて、非標的遺伝子に対する２本鎖核酸を用いて、同様のｍＲＮＡ発現抑制活性を定量した。
その結果を図３１に示す。図３１から分かる通り、ヒトＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子を標的とする２本鎖核酸に葉酸を結合させることでリガンドの結合していないＢＮＳＰ−４４よりもＫ５６２細胞株に対してｍＲＮＡ発現抑制活性が増強していることが明らかとなった。また、ＰＥＧ３、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ２３の比較では、ＰＥＧの長さは短い方がｍＲＮＡ発現抑制活性が増強することが明らかとなった。【０４４３】
このように本願では、ポリヌクレオチドとリガンドとの結合に、ポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）をベースとするリンカー、すなわちポリアルキレングリコールリンカー（例えばＰＥＧリンカー）を使用することができる。当該リンカーのポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）の長さは、１〜１００の整数、例えば１〜５０の整数、２〜３０の整数または１〜１２の整数、例えば１、２、３、４、５、６、７または８であることができるが、上記の比較では、ポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）の長さは短い方が有利あることが見出された。よって、本発明の１つの実施態様において、上記長さは、好ましくは１〜３０、より好ましくは１〜２０、特に好ましくは２〜１５である。【０４４４】
例１５
［ヒトＳＴＡＴ３遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験］
上記のヒトＳＴＡＴ３遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおけるｍＲＮＡ発現抑制活性を調べるために、以下の実験を行った。２本鎖核酸ＢＮＳＰ−４６を用意し、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、ＡｓＰＣ−１細胞株に０．３、１、３ｎＭとなるようトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞株を、トランスフェクトから２４時間培養し、上述の実施例４に記載の定量ＲＴ−ＰＣＲ法により２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性を定量した。【０４４５】
また、上記の２本鎖核酸に代えて、非標的遺伝子に対する２本鎖核酸を用いて、同様のｍＲＮＡ発現抑制活性を定量した。
その結果を図３２に示す。図３２から分かる通り、ヒトＳＴＡＴ３遺伝子を標的とすることでＡｓＰＣ−１細胞株に対して用量依存的なｍＲＮＡ発現抑制活性を示した。【０４４６】
例１６
［ＰＳ−ＰＯ型２本鎖核酸のＰＢＭＣ（ヒト末梢血単核細胞）におけるインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）発現誘導作用の検証］
上記のＰＳ−ＰＯ型２本鎖核酸と、アンチセンス鎖が全てＰＳ結合を基本骨格とする１本鎖核酸及びアンチセンス鎖が全てＰＳ結合を基本骨格とする２本鎖核酸を比較してＩＦＮ−α発現誘導作用において差が出るかどうか評価するため、以下の実験を行った。【０４４７】
１本鎖核酸（配列番号１）、２本鎖核酸ＢＮＳＰ−１、ＢＮＳＰ−４、ＢＮＳＰ−７、ＢＮＳＰ−１０を用意した。次いで、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、ＰＢＭＣ細胞に３０、１００、３００ｎＭとなるよう上記２本鎖核酸をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞株を、トランスフェクトから２４時間培養し、常法によりＩＦＮ−αの発現量をＥＬＩＳＡ法により定量した。【０４４８】
また、上記の２本鎖核酸に代えて、ＩＦＮ−α発現ポジティブコントロールとしてＣｐＧＰｏ（インビトロジェン社：ＯＤＮ２２１６）を用いて、同様のＩＦＮ−α発現量を定量した。【０４４９】
その結果を図３３に示す。図３３から分かる通り、１本鎖核酸と比較して、２本鎖核酸にすることでＩＦＮ−α誘導能は約２分の１に低下し、さらにアンチセンス鎖をＰＳ−ＰＯ型にした２本鎖核酸ではＩＦＮ−αが全く誘導されないことが明らかとなった。このような結果も、本願の二本鎖核酸複合体が副作用の低減効果を有することを支持するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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