(57)【要約】  本発明は、配列番号２、４、６若しくは８で表されるアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＭＲＡＰ２タンパク質、又は連続する７以上のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物等に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４、６若しくは８で表されるアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＭＲＡＰ２タンパク質、又は連続する７個以上のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
【請求項２】
前記ＭＲＡＰ２タンパク質の部分ポリペプチドであって、配列番号１０〜２４のうち偶数の配列番号のいずれかで表されるアミノ酸配列の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記癌がＭＲＡＰ２を細胞表面に発現する癌である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記癌が白血病、悪性リンパ腫、肺癌、脳腫瘍、大腸癌、メラノーマ、神経芽腫、膵癌、胃癌、肝癌、卵巣癌、食道癌、腎癌、肥満細胞腫及び肛門周囲腺癌からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は多重特異性抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＭＲＡＰ２タンパク質のＮ末端部分ポリペプチドであって、配列番号１０、１４、１８若しくは２２で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチドと免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント。
【請求項８】
ＭＲＡＰ２タンパク質のＣ末端部分ポリペプチドであって、配列番号１２、１６、２０若しくは２４で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチドと免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント。
【請求項９】
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は多重特異性抗体である、請求項７又は８に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物と、抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含んでなる、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品。
【請求項１１】
配列番号２、４、６若しくは８で表されるアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＭＲＡＰ２タンパク質、又は連続する７個以上のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを被験者に投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＲＡＰ２に対する抗体又はそのフラグメントの癌の治療及び／又は予防剤等としての新規な医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌細胞上の抗原タンパク質を標的にした、癌を治療するための各種抗体医薬が世の中に台頭してきた。それらの抗体医薬は癌特異的治療薬として一定の薬効が得られ注目されているが、標的となる抗原タンパク質の多くは複数の正常細胞にも発現するものであり、抗体投与の結果、癌細胞だけでなく、抗原が発現する正常細胞も障害されてしまい、その結果生じる副作用が問題になっている。従って、癌細胞表面に特異的に発現する癌抗原を同定し、それを標的とした抗体を医薬品として使用することができれば、より副作用の少ない抗体医薬による治療が可能になると期待される。【０００３】
Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＭＲＡＰ２）は１型又は２型の膜貫通タンパク質であり、メラノコルチンレセプター（ＭＣＲ）の活性制御に関わっており、生体内のエネルギー代謝において機能している（非特許文献１）。また、ＭＲＡＰ２欠損マウスでは過食がないにも関わらず肥満になることが報告されており、ヒトにおいても重度の肥満患者の中には、ＭＲＡＰ２遺伝子に変異を有する患者がいることが報告されている（非特許文献２）。しかし、ＭＲＡＰ２タンパク質が癌細胞に対する免疫誘導活性を有し、それによって該タンパク質が癌の治療や予防に有用であるという報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Jackson DS. et al. Front. Neurosci, 9:213 (2015)
【非特許文献２】Asai M. et al. Science, 341:275-278 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、癌細胞の表面に特異的に発現する癌抗原タンパク質を同定し、それを標的とした抗体の、癌の治療及び／又は予防剤としての用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、イヌの精巣組織由来ｃＤＮＡライブラリーと白血病患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得し、取得したイヌ遺伝子及びそのヒト、ネコ、マウス相同性遺伝子を基にして、配列番号２、４、６又は８で表されるアミノ酸配列を有するＭＲＡＰ２及びそれらＭＲＡＰ２に対する抗体を作製した。そしてＭＲＡＰ２が白血病、悪性リンパ腫、肺癌、脳腫瘍、大腸癌、メラノーマ、神経芽腫、膵癌、胃癌、肝癌、卵巣癌、食道癌、腎癌、肥満細胞腫又は肛門周囲腺癌に特異的に発現していること、そしてＭＲＡＰ２タンパク質の一部がそれら癌細胞の細胞表面に特異的に発現していることを見出した。そして、それらＭＲＡＰ２の各癌細胞の細胞表面に発現する部分に対する抗体が、ＭＲＡＰ２を発現する癌細胞を障害することを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００７】
従って、本発明は、以下の（１）〜（１１）を含む。
（１）配列番号２、４、６若しくは８で表されるアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＭＲＡＰ２タンパク質、又は連続する７個以上のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
（２）前記ＭＲＡＰ２タンパク質の部分ポリペプチドであって、配列番号１０〜２４のうち偶数の配列番号のいずれかで表されるアミノ酸配列の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む、（１）に記載の医薬組成物。
（３）前記癌がＭＲＡＰ２を細胞表面に発現する癌である、（１）又は（２）に記載の医薬組成物。
（４）前記癌が白血病、悪性リンパ腫、肺癌、脳腫瘍、大腸癌、メラノーマ、神経芽腫、膵癌、胃癌、肝癌、卵巣癌、食道癌、腎癌、肥満細胞腫及び肛門周囲腺癌からなる群から選択される、（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、（１）〜（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は多重特異性抗体である、（１）〜（５）のいずれかに記載の医薬組成物。
（７）ＭＲＡＰ２タンパク質のＮ末端部分ポリペプチドであって、配列番号１０、１４、１８若しくは２２で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチドと免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント。
（８）ＭＲＡＰ２タンパク質のＣ末端部分ポリペプチドであって、配列番号１２、１６、２０若しくは２４で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、からなるポリペプチドと免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント。
（９）前記抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は多重特異性抗体である、（７）又は（８）に記載の抗体又はそのフラグメント。
（１０）（１）〜（６）のいずれかに記載の医薬組成物と、抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含んでなる、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品。
（１１）配列番号２、４、６若しくは８で表されるアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＭＲＡＰ２タンパク質、又は連続する７個以上のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを被験者に投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法。【０００８】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１６−０６４０３３号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明で用いられるＭＲＡＰ２に対する抗体は、癌細胞を障害する。従って、ＭＲＡＰ２に対する抗体は癌の治療や予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】同定したイヌＭＲＡＰ２遺伝子の、イヌの腫瘍組織での発現パターンを示す図である。
【図２】同定したＭＲＡＰ２遺伝子の、ヒトの各組織及び癌細胞株での発現パターンを示す図である。Ａ：ヒトＭＲＡＰ２遺伝子の、ヒトの各組織での発現パターンを示す。Ｂ：ヒトＭＲＡＰ２遺伝子の、ヒトの各癌細胞株での発現パターンを示す。
【図３】同定したマウスＭＲＡＰ２遺伝子の、マウスの各癌細胞株での発現パターンを示す図である。
【図４】ＭＲＡＰ２に対するポリクローナル抗体（抗Ｎ末側ＭＲＡＰ２ポリクローナル抗体及び抗Ｃ末側ＭＲＡＰ２ポリクローナル抗体）による、ＭＲＡＰ２遺伝子を発現する白血病細胞株（Ｋ５６２）及び悪性リンパ腫細胞株（Ｎａｍａｌｗａ）に対する細胞障害活性を示す図である。コントロール−１；コントロールポリクローナル抗体を添加したときのＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性、抗Ｎ末側−１；抗Ｎ末側ＭＲＡＰ２ポリクローナル抗体を添加したときのＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性、抗Ｃ末側−１；抗Ｃ末側ＭＲＡＰ２ポリクローナル抗体を添加したときのＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性を示す。コントロール−２；コントロールポリクローナル抗体を添加したときのＮａｍａｌｗａ細胞に対する細胞傷害活性、抗Ｎ末側−２；抗Ｎ末側ＭＲＡＰ２ポリクローナル抗体を添加したときのＮａｍａｌｗａ細胞に対する細胞傷害活性、抗Ｃ末側−２；抗Ｃ末側ＭＲＡＰ２ポリクローナル抗体を添加したときのＮａｍａｌｗａ細胞に対する細胞傷害活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ＭＲＡＰ２タンパク質若しくはその断片に対する抗体又はそのフラグメント、好ましくは抗原結合性フラグメントの、癌の治療及び／又は予防用途に関する。
【００１２】
本発明は、配列番号２、４、６若しくは８で表されるアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上、例えば９９．５％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＭＲＡＰ２タンパク質、又は連続する７個以上（７個〜各配列の全長、好ましくは７個〜１５０個、より好ましくは７個〜５０個）のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物に関する。
【００１３】
本発明はまた、ＭＲＡＰ２タンパク質の部分ポリペプチドであって、配列番号１０〜２４のうち偶数の配列番号のいずれかで表されるアミノ酸配列の連続する７個以上（７個〜各配列の全長、好ましくは７個〜４０個、より好ましくは７個〜２０個、例えば、７〜１２個又は８〜１１個）のアミノ酸からなるポリペプチド、又は該アミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物に関する。
【００１４】
本発明で用いられる配列番号２、４、６若しくは８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその断片に対する抗体又はそのフラグメントの抗腫瘍活性は、担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で調べることによって、あるいは、後述するように、該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞障害活性を示すか否かを生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で調べることによって評価することができる。同様に、本発明で用いられる配列番号１０〜２４のうち偶数の配列番号のポリペプチド又はその断片に対する抗体又はそのフラグメントの抗腫瘍活性は、担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で調べることによって、あるいは、後述するように、該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞障害活性を示すか否かを生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で調べることによって評価することができる。
【００１５】
なお、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３に示されている。
【００１６】
本発明が開示する配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列は、イヌ精巣組織由来ｃＤＮＡライブラリーと白血病患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチドとして、また配列番号２で表されるアミノ酸配列は、そのヒト相同因子（ホモログ）として、配列番号６で表されるアミノ酸配列は、そのネコ相同因子として、配列番号８で表されるアミノ酸配列は、そのマウス相同因子として単離された、ＭＲＡＰ２のアミノ酸配列である（後述の実施例１参照）。
【００１７】
本発明では、ＭＲＡＰ２タンパク質の内、癌細胞の細胞表面に発現する部分に結合する抗体が好ましく用いられる。具体的には、ＭＲＡＰ２タンパク質のＮ末端部分である、配列番号１０（ヒト）、１４（イヌ）、１８（ネコ）若しくは２２（マウス）で表されるアミノ酸配列、又はＭＲＡＰ２タンパク質のＣ末端部分である、配列番号１２（ヒト）、１６（イヌ）、２０（ネコ）若しくは２４（マウス）で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はその断片（好ましくは、それらアミノ酸配列の連続する７個以上のアミノ酸からなる）、あるいはこれらポリペプチドと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体が挙げられ、本発明の抗体には、これらポリペプチドに結合する、かつ、抗腫瘍活性を示すすべての抗体が含まれる。
【００１８】
本発明で用いられる上記ＭＲＡＰ２に対する抗体は、抗腫瘍活性を発揮しうる限りいかなる種類の抗体であってもよく、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は単鎖抗体（ｓｃＦＶ）などであってよい。本発明で用いる抗体はまた、抗体フラグメント、例えばＦａｂやＦ（ａｂ’）２などの抗原結合性フラグメントを含む。これらの抗体及びそのフラグメントは、また当業者に公知の方法により調製することが可能である。本発明においては、ＭＲＡＰ２タンパク質又はその断片と特異的に結合することが可能な抗体が望ましいし、モノクローナル抗体であることが好ましいが、均質な抗体を安定に生産できるかぎり、ポリクローナル抗体であってもよい。また、被験者がヒトである場合には、拒絶反応を回避若しくは抑制するためにヒト抗体又はヒト化抗体であることが望ましい。
【００１９】
ここで、「ＭＲＡＰ２タンパク質又はその断片と特異的に結合する」とは、ＭＲＡＰ２タンパク質又はその断片に特異的に結合し、それ以外のタンパク質と実質的に結合しないことを意味する。
【００２０】
本発明で用いることができる抗体の抗腫瘍活性は、生体内で担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を調べることによって、あるいは、後述するように、生体外で該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞障害活性を示すか否かを調べることによって評価することができる。
【００２１】
さらにまた、本発明における癌の治療及び／又は予防の対象である被験者は、ヒト、ペット動物、家畜類、競技用動物、実験動物などの哺乳動物であり、好ましい被験者は、ヒトである。
【００２２】
以下に、本発明に関する抗原の作製、抗体の作製、ならびに医薬組成物について説明する。
【００２３】
＜抗体作製用抗原の作製＞
本発明で用いられるＭＲＡＰ２に対する抗体を取得するための感作抗原として使用されるタンパク質又はその断片は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、ラット、ニワトリなど、その由来となる動物種は制限されない。しかし細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、一般的には、哺乳動物由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。例えば、ＭＲＡＰ２がヒトＭＲＡＰ２の場合、ヒトＭＲＡＰ２タンパク質やその部分ポリペプチド、ヒトＭＲＡＰ２を発現する細胞などを用いることができる。
【００２４】
ヒトＭＲＡＰ２及びそのホモログの塩基配列及びアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）のＷｅｂサイトにアクセスし、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：５８７３−５８７７，１９９３； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２， １９９７）を利用することによって入手することができる。
【００２５】
本発明では、ヒトＭＲＡＰ２の配列番号１の塩基配列又は配列番号２のアミノ酸配列を基準とした場合、これらのＯＲＦ又は成熟部分の塩基配列又はアミノ酸配列と７０％〜１００％、好ましくは８０％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％、さらに好ましくは９５％〜１００％、例えば９７％〜１００％、９８％〜１００％、９９％〜１００％又は９９．５％〜１００％の配列同一性を有する配列からなる核酸又はタンパク質がターゲットになる。ここで、「％配列同一性」は、２つの配列を、ギャップを導入してか又はギャップを導入しないで、最大の類似度となるようにアラインメント（整列）したとき、アミノ酸（又は塩基）の総数に対する同一アミノ酸（又は塩基）のパーセンテージ（％）を意味する。
【００２６】
ＭＲＡＰ２タンパク質の断片は、抗体が認識する最小単位であるエピトープ（抗原決定基）のアミノ酸長から、該タンパク質の全長未満の長さを有する。エピトープは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド断片を指し、その最小単位は、約７〜１２アミノ酸、例えば８〜１１アミノ酸からなり、ＭＲＡＰ２タンパク質のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００２７】
上記した、ヒトＭＲＡＰ２タンパク質やその部分ペプチドを含むポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる（日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、化学修飾とペプチド合成、東京化学同人（日本）、１９８１年）。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第３版， Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９５）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓなど）を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。
【００２８】
上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡは、ヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼなど）及びＭｇ２＋含有ＰＣＲバッファーを用いて、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で１分間（伸長）からなる反応行程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。ＰＣＲの手法、条件等については、例えばＡｕｓｕｂｅｌら， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第３版， Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９５）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（特に第１５章）に記載されている。
【００２９】
また、本明細書中の配列表の配列番号１〜８で表される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてヒトなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、配列番号２、４、６若しくは８のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。そのような細胞や組織の例は、脳、白血病、悪性リンパ腫、肺癌、脳腫瘍、大腸癌、メラノーマ、神経芽腫、膵癌、胃癌、肝癌、卵巣癌、食道癌、腎癌、肥満細胞腫又は肛門周囲腺癌などの癌又は腫瘍に由来する細胞又は組織であるがこれに限定されない。上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９）、Ａｕｓｂｅｌら（上記）等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、ヒトＭＲＡＰ２タンパク質やその部分ペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００３０】
上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ等の哺乳動物細胞、ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３、マウス胎仔皮膚細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、出芽酵母、分裂酵母等の酵母細胞、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、好ましくは、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、マルチクローニングサイト、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子、レポーター遺伝子等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。
【００３２】
宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、好ましくは、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＳｅｃＴａｇ（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ（例えば（Ｈｉｓ）６〜（Ｈｉｓ）１０）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。
【００３３】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、ウイルス感染、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、等の周知の方法を用いることができる。
【００３４】
宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。単離精製技術としては、例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
＜抗体の構造＞
抗体は通常少なくとも２本の重鎖及び２本の軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。ＩｇＭは別として、他のクラスの抗体は、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０ｋＤａのヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結されているが、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は変動する。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた鎖内ジスルフィド結合も有する。それぞれの重鎖は一方の端に可変ドメイン（ＶＨ領域）を有し、それにいくつかの定常領域が続く。それぞれ軽鎖は可変ドメイン（ＶＬ領域）を有し、その反対の端に１つの定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の最初の定常領域と整列しており、かつ軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。抗体の可変ドメインは特定の領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる特定の可変性を示して抗体に結合特異性を付与する。可変領域の相対的に保存されている部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれている。完全な重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ３つのＣＤＲにより連結された４つのＦＲを含む。３つのＣＤＲは重鎖ではそのＮ末から順にＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、同様に軽鎖ではＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と呼ばれている。抗体の抗原への結合特異性には、ＣＤＲＨ３が最も重要である。また、各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって近接した状態で一緒に保持され、他方の鎖からのＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は抗体が抗原に結合することに直接寄与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）への関与、Ｆｃγ受容体への結合を介した食作用、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介した半減期／クリアランス速度、補体カスケードのＣ１ｑ構成要素を介した補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ活性）を示す。
【００３６】
＜抗体の作製＞
本発明における抗ＭＲＡＰ２抗体とは、上記のようなＭＲＡＰ２タンパク質の全長又はその断片と免疫学的反応性を有する抗体を意味する。
【００３７】
ここで、「免疫学的反応性」とは、生体内で又は生体外で抗体とＭＲＡＰ２抗原とが結合する特性を意味し、このような結合を介して腫瘍又は腫瘍細胞を障害（例えば、死滅、抑制又は退縮）する機能、が発揮される。すなわち、本発明で使用される抗体は、ＭＲＡＰ２タンパク質と結合して腫瘍、好ましくはＭＲＡＰ２タンパク質を細胞表面に発現している（有している）癌、例えば白血病、悪性リンパ腫、肺癌、脳腫瘍、大腸癌、メラノーマ、神経芽腫、膵癌、胃癌、肝癌、卵巣癌、食道癌、腎癌、肥満細胞腫若しくは肛門周囲腺癌などを障害することができるならば、その種類を問わない。
【００３８】
抗体の例は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体などを含む。抗体はまた、例えば、抗体フラグメント（例えばＦａｂやＦ（ａｂ’）２などの抗原結合性フラグメント）を含む。また、抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラスであってよく、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＹ、又は任意のサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２などである。
【００３９】
抗体はさらに、グリコシル化の他に、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、又はペグ（ＰＥＧ）化などによって修飾されていてもよい。
【００４０】
以下に、種々の抗体の作製例を示す。
【００４１】
本発明で使用可能なポリクローナル抗体は、例えば、次のようにして得ることができる。
【００４２】
天然のＭＲＡＰ２タンパク質、あるいはＧＳＴなどとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させた組換えＭＲＡＰ２タンパク質、又はその部分ペプチドをマウス、ヒト抗体産生マウス、ウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＭＲＡＰ２タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。後述の実施例では、ＭＲＡＰ２タンパク質のアミノ酸配列中、癌細胞の細胞表面に発現する領域に対するマウスポリクローナル抗体が作製され、抗腫瘍効果が確認されている。
【００４３】
本発明で使用可能な抗体の別の例がモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、例えば、次のようにして得ることができる。例えば、ＭＲＡＰ２を細胞表面に発現する細胞（白血病細胞株Ｋ５６２や悪性リンパ腫細胞株Ｎａｍａｌｗａなど）をマウスに投与して免疫し、同マウスより脾臓を抽出し、細胞を分離の上、該細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、癌細胞増殖抑制作用を持つ抗体を産生するクローンを選択する。癌細胞増殖抑制作用を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを単離し、当該ハイブリドーマを培養し、培養上清から一般的なアフィニティ精製法により抗体を精製することで、調製することが可能である。
【００４４】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば以下のようにしても作製することができる。まず、公知の方法にしたがって、感作抗原を動物に免疫する。一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
【００４５】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付すが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００４６】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９７９）１２３， １５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９７８）８１， １−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ． Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９７６）６， ５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ． Ｄ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （１９７６）８， ４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９７８）２７６， ２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅＳｔ． Ｇｒｏｔｈ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ （１９８０）３５， １−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ， Ｉ．Ｓ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． （１９７８）１４８， ３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９７９）２７７， １３１−１３３）等が好適に使用される。
【００４７】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． （１９８１）７３， ３−４６）等に準じて行うことができる。
【００４８】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００４９】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００５０】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とするハイブリドーマを形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
【００５１】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。
【００５２】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウイルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６（登録番号ＴＩＢ１９６）と融合させ、所望の活性（例えば、細胞増殖抑制活性）を有するヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
【００５３】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００５４】
すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。
【００５５】
ここで、ヒト抗体産生マウスとしては、例えばＫＭマウス（キリンファーマ／Ｍｅｄａｒｅｘ）及びＸｅｎｏマウス（Ａｍｇｅｎ）が知られている（例えば、国際公開第ＷＯ０２／４３４７８号、同第ＷＯ０２／０９２８１２号など）。このようなマウスをＭＲＡＰ２タンパク質又はその断片で免疫するときには、完全ヒトポリクローナル抗体を血液から得ることができる。また、免疫後のマウスから脾臓細胞を取出し、ミエローマ細胞との融合法により完全ヒトモノクローナル抗体を作製することができる。
【００５６】
抗原の調製は、例えば、動物細胞を用いた方法（特表２００７−５３００６８）やバキュロウイルスを用いた方法（例えば、国際公開第ＷＯ９８／４６７７７号など）などに準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
【００５７】
さらにまた、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ， Ａ．Ｋ． Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ， Ｊａｍｅｓ， Ｗ． Ｌａｒｒｉｃｋ， ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ， １９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
【００５８】
モノクローナル抗体には、ヒトモノクローナル抗体、非ヒト動物モノクローナル抗体（例えばマウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体など）などが含まれる。モノクローナル抗体は、ＭＲＡＰ２タンパク質又はその断片を免疫した非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ヒト抗体産生マウスなど）からの脾細胞とミエローマ細胞との融合によって得られたハイブリドーマを培養することによって作製されうる。
【００５９】
キメラ抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。
【００６０】
ポリクローナル抗体には、ヒト抗体産生動物（例えば、マウス）にＭＲＡＰ２タンパク質又はその断片を免疫して得られる抗体が含まれる。
【００６１】
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体のＣＤＲを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。
【００６２】
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ； ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開第ＥＰ２３９４００号、国際公開第ＷＯ９６／０２５７６号参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９３， ５３： ８５１−８５６）。また、様々なヒト抗体由来のフレームワーク領域に置換してもよい（国際公開第ＷＯ９９／５１７４３号参照）。
【００６３】
キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、ＦＲ）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。
【００６４】
アミノ酸の置換は、例えば１５未満、１０未満、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下のアミノ酸、好ましくは１〜５アミノ酸、より好ましくは１又は２アミノ酸、の置換であり、置換抗体は、未置換抗体と機能的に同等であるべきである。置換は、保存的アミノ酸置換が望ましく、これは、電荷、側鎖、極性、芳香族性などの性質の類似するアミノ酸間の置換である。性質の類似したアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（トレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）などに分類しうる。
【００６５】
本発明の抗体は抗体修飾物であってもよい。抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。本発明の抗体修飾物においては、結合される物質は限定されない。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
【００６６】
ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が本発明の抗体と同様の生物学的あるいは生化学的活性、具体的には腫瘍を障害する機能、を有すること、ヒトへの適用時に拒絶反応を本質的に起こさないことなどを指す。このような活性としては、例えば、細胞増殖抑制活性、あるいは結合活性を例示することができる。
【００６７】
あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｇｅｎｅ １５２， ２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ， ＭＪ．， ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｍ． （１９８３） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １００， ４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２， ９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ， Ｗ． ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ， ＨＪ．， （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４， ３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ， ＴＡ．， （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８２， ４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ （１９８８） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ８５， ２７６３−２７６６）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。
【００６８】
上記抗ＭＲＡＰ２抗体が認識するＭＲＡＰ２タンパク質のエピトープを認識する抗体は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。例えば、抗ＭＲＡＰ２抗体が認識するＭＲＡＰ２タンパク質のエピトープを通常の方法（例えば、エピトープマッピングなど）により決定し、該エピトープに含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製された抗体のエピトープを決定し、抗ＭＲＡＰ２抗体とエピトープが同じ抗体を選択する方法などにより得ることができる。ここで、「エピトープ」は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド断片を指し、その最小単位は、約７〜１２アミノ酸、好ましくは８〜１１アミノ酸からなる。
【００６９】
本発明の抗体の親和定数Ｋａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）は、好ましくは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、あるいは、少なくとも１０１３Ｍ−１である。 
【００７０】
本発明の抗体は、抗腫瘍剤とコンジュゲートすることができる。抗体と抗腫瘍剤との結合は、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、チオール基などと反応性の基（例えば、コハク酸イミジル基、ホルミル基、２−ピリジルジチオ基、マレイイミジル基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシ基など）をもつスペーサーを介して行うことができる。
【００７１】
抗腫瘍剤の例は、文献等で公知の下記の抗腫瘍剤、すなわち、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、チオテパ、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、ブラタシン、ブラタシノン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、ズオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏＲＮＡｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタ��ン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；アンドロゲン類、例えばカルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、エルフォルニチン （ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）、テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎｅ）Ａ、アングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）、ウレタン、ビンデシン、ダカーバジン、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ミトブロニトール、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ドキセタキセル、クロランブシル、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、テニポシド、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）、イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、イリノテカン、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、並びにそれらの薬学的に許容可能な塩又は誘導体を包含する。
【００７２】
あるいは、本発明の抗体には、文献等で公知の、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３ＳＭ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、１７５Ｌｕ、１７６Ｌｕなどの放射性同位体を結合することも可能である。放射性同位体は、腫瘍の治療や診断のために有効なものが望ましい。
【００７３】
本発明の抗体は、好ましくは、ＭＲＡＰ２と免疫学的反応性を有する抗体、あるいは、ＭＲＡＰ２を特異的に認識する抗体である。該抗体は、それを投与する対象動物において拒絶反応がほとんど又はまったく回避されるような構造をもつ抗体であるべきである。そのような抗体としては、例えば対象動物がヒトである場合、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体（例えばヒト−マウスキメラ抗体）、単鎖抗体、二重特異性抗体などが挙げられる。これらの抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域がヒト抗体由来のものであるか、あるいは、重鎖及び軽鎖の可変領域が非ヒト動物抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）とヒト抗体由来のフレームワーク領域からなるものであるか、あるいは、重鎖及び軽鎖の可変領域が非ヒト動物抗体由来のものであり、かつ、重鎖及び軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のものである組換え型抗体である。好ましい抗体は、前２つの抗体である。
【００７４】
これらの組換え型抗体は、次のようにして作製することができる。ハイブリドーマなどの抗体産生細胞からヒトＭＲＡＰ２に対するモノクローナル抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体など）をコードするＤＮＡをクローニングし、これを鋳型にして該抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法等により作製し、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈＥｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１））に基づいて軽鎖及び重鎖の各可変領域の配列又は各ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列を決定する。
【００７５】
さらに、これらの各可変領域をコードするＤＮＡ又は各ＣＤＲをコードするＤＮＡを、遺伝子組換え技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））又はＤＮＡ合成機を用いて作製する。ここで、上記ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、ヒト抗体産生動物（例えば、マウス）にヒトＭＲＡＰ２を免疫したのち、該免疫動物から切除した脾細胞とミエローマ細胞とを融合させることによって作製することができる。これとは別に、必要に応じて、遺伝子組換え技術又はＤＮＡ合成機を用いてヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域及び定常領域をコードするＤＮＡを作製する。
【００７６】
ヒト化抗体の場合には、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ中のＣＤＲコーディング配列を、それらに対応する、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲコーディング配列と置換したＤＮＡを作製し、それによって得られたＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって、ヒト化抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。
【００７７】
キメラ抗体の場合には、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって、キメラ抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。
【００７８】
単鎖抗体の場合には、この抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーを介して直線状に連結された抗体であり、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、リンカーをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを結合することによって単鎖抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、ＣＤＲのみヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものである。また、リンカーは、１２〜１９アミノ酸からなり、例えば１５アミノ酸の（Ｇ４Ｓ）３（Ｇ． −Ｂ． Ｋｉｍら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２００７， ２０（９）： ４２５−４３２）が挙げられる。
【００７９】
二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）の場合には、この抗体は２つの異なるエピトープと特異的に結合可能な抗体であり、例えば重鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡをこの順序で結合する（ただし、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡと重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡとは上記のようなリンカーをコードするＤＮＡを介して結合される。）ことによって二重特異性抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、ＣＤＲのみヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものである。
【００８０】
上記のようにして作製された組換えＤＮＡを、１つ又は複数の適当なベクターに組み込み、これを宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、（共）発現させることによって組換え型抗体を作製することができる（Ｐ．Ｊ． Ｄｅｌｖｅｓ．， ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．， １９９７ ＷＩＬＥＹ、Ｐ． Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ． Ｄｅａｎ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．， ２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ； Ｊ．Ｗ． Ｇｏｄｉｎｇ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ．， １９９３ ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ）。
【００８１】
上記抗体は、好ましくは、細胞障害活性を有しており、これによって抗腫瘍効果を発揮することができる。
【００８２】
また、ヒトＭＲＡＰ２に対する別のヒト抗体又は非ヒト動物抗体（例えばマウス抗体）を産生しうるハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収し、ヒトＭＲＡＰ２との免疫学的結合性及び細胞障害活性を指標として目的の抗体であるか否かを判定する。それによって目的のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを識別したのち、上記のとおり、該ハイブリドーマから目的の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを作製し配列決定し、該ＤＮＡを別の抗体の作製のために利用する。
【００８３】
さらに本発明の上記抗体は、ＭＲＡＰ２を特異的に認識するという特異性を有する限り、抗体の特にフレームワーク領域の配列及び／又は定常領域の配列において、１若しくは数個（好ましくは、１若しくは２個）のアミノ酸の置換、欠失又は付加があってもよい。ここで数個とは、２〜５個、好ましくは２個又は３個を意味する。
【００８４】
本発明はさらに、本発明の上記抗体をコードするＤＮＡ、あるいは、上記抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡ、あるいは、上記抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡも提供する。
【００８５】
これらの配列のＤＮＡによってコードされる相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の特異性を決定する領域であるため、抗体のそれ以外の領域（すなわち、定常領域及びフレームワーク領域）をコードする配列は他の抗体由来の配列であってもよい。ここで他の抗体とはヒト以外の生物由来の抗体も含むが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。すなわち、上記のＤＮＡでは、重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域及び各定常領域をコードする領域がヒト抗体由来の対応アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。
【００８６】
本発明のＤＮＡは、例えば上記の方法又は以下の方法で得ることができる。まず、本発明の抗体に関わるハイブリドーマから、市販のＲＮＡ抽出キットを用いて全ＲＮＡを調製し、ランダムプライマー等を用いて逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。次いで既知のマウス抗体重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の各可変領域において、それぞれ保存されている配列のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃＤＮＡを増幅させる。定常領域をコードする配列については、既知の配列をＰＣＲ法で増幅することによって得ることができる。ＤＮＡの塩基配列は、配列決定用プラスミド又はファージに組み込むなどして、常法により決定することができる。
【００８７】
本発明で用いられる抗ＭＲＡＰ２抗体によるＭＲＡＰ２発現癌細胞に対する抗腫瘍効果は、以下の機序：ＭＲＡＰ２発現細胞のエフェクター細胞抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）、又はＭＲＡＰ２発現細胞の補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ活性）により起こると考えられる。
【００８８】
従って、本発明で用いられる抗ＭＲＡＰ２抗体の活性は、以下の実施例に具体的に示されるように、生体外でＭＲＡＰ２を発現する癌細胞に対して上記ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を測定することで評価することができる。
【００８９】
本発明で用いられる抗ＭＲＡＰ２抗体は、癌細胞上のＭＲＡＰ２タンパク質と結合し、上記活性によって、抗腫瘍作用を示すことから、癌の治療あるいは予防に有用であると考えられる。すなわち本発明は、抗ＭＲＡＰ２抗体を有効成分とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。抗ＭＲＡＰ２抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト化抗体にすることが好ましい。
【００９０】
なお、抗ＭＲＡＰ２抗体と癌細胞表面上のＭＲＡＰ２タンパク質との結合親和性が高い程、抗ＭＲＡＰ２抗体による、より強い抗腫瘍活性が得られる。従って、ＭＲＡＰ２タンパク質と高い結合親和性を有する抗ＭＲＡＰ２抗体を獲得できれば、より強い抗腫瘍効果が期待でき、癌の治療及び／又は予防を目的とした医薬組成物として適応することが可能になる。高い結合親和性として、前述したように、結合定数（親和定数）Ｋａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）が、好ましくは、１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、あるいは、少なくとも１０１３Ｍ−１であることが望ましい。
【００９１】
＜抗原発現細胞への結合＞
抗体がＭＲＡＰ２に結合する能力は、実施例で述べられるような例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫蛍光及びフローサイトメトリー分析などを用いた結合アッセイを利用して特定することができる。
【００９２】
＜免疫組織化学染色＞
ＭＲＡＰ２を認識する抗体は、当業者に周知の方法での免疫組織化学により、外科手術の間に患者から得た組織、患者の骨髄組織、リンパ節、末梢血細胞又は骨髄細胞や、自然に又はトランスフェクション後にＭＲＡＰ２を発現する細胞系を接種した異種移植組織を担持する動物から得た組織から、パラホルムアルデヒド又はアセトン固定した凍結切片又はパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋した組織切片を使用して、ＭＲＡＰ２との反応性に関して試験することができる。
【００９３】
免疫組織化学染色のため、ＭＲＡＰ２に対して免疫学的反応性のある抗体を、様々な方法で染色させることができる。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウス抗体やヤギ抗ウサギ抗体を反応させることにより、可視化することができる。
【００９４】
＜医薬組成物＞
本発明は本発明の抗体、すなわち上述したＭＲＡＰ２に対する抗体又はそのフラグメント（好ましくは抗原結合性フラグメント）を含む医薬組成物（又は医薬）を提供する。本発明の医薬組成物（又は医薬）は通常は上述したＭＲＡＰ２に対する抗体又はそのフラグメント（好ましくは抗原結合性フラグメント）を有効量で含む。
【００９５】
本発明の癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物の標的は、ＭＲＡＰ２遺伝子を（通常は細胞表面に）発現する癌（細胞）であれば特に限定されない。
【００９６】
本明細書で使用される「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。
【００９７】
本発明において対象となる癌は、配列番号２、４、６若しくは８のアミノ酸配列又は７以上の連続アミノ酸からなるその部分配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子を発現している癌であり、好ましくはそのようなポリペプチドを細胞表面に発現している癌である。本発明において対象となる癌は、好ましくは白血病、悪性リンパ腫、肺癌、脳腫瘍、大腸癌、メラノーマ、神経芽腫、膵癌、胃癌、肝癌、卵巣癌、食道癌、腎癌、肥満細胞腫若しくは肛門周囲腺癌であり、これらの特定の癌には、例えば、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、無白血病性白血病、白血球血症性白血病（ｌｅｕｋｏｃｙｔｈｅｍｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好塩基球性白血病、芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄球性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、未分化細胞性白血病、有毛状細胞性白血病、血球芽細胞性白血病（ｈｅｍｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、血球芽細胞性白血病（ｈｅｍｏｃｙｔｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、組織球白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ向性白血病、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫（ＢＬ）、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血病（ＳＬＬ／ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、辺縁帯（ｍａｒｇｉｎａｌ  ｚｏｎｅ）リンパ腫（ＭＺＬ）、毛状細胞白血病（ＨＣＬ）、リンパ形質細胞性白血病（ＬＰＬ）、粘膜結合類リンパ組織（ＭＡＬＴ）の結節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、縦隔大細胞リンパ腫、血管内大細胞リンパ腫、原発性滲出リンパ腫、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、前駆Ｔ細胞及びＮＫ細胞リンパ腫（前駆Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫、ＮＫ芽細胞性リンパ腫）、成熟Ｔ及びＮＫ細胞の腫瘍（抹消Ｔ細胞リンパ腫及び白血病（ＰＴＬ）を含む）、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫及び大型顆粒性リンパ球性白血病、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病／前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大型顆粒性リンパ球性白血病、攻撃性ＮＫ細胞白血病、結節外Ｔ−／ＮＫ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾臓性Ｔ細胞リンパ腫、無構造性大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、アンギオセトリック（ａｎｇｉｏｃｅｔｒｉｃ）及び血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫／セザリー症候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ））、ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、肺腺癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起膠腫、非神経膠腫、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、原発性脳リ���パ腫、胚細胞腫瘍、表在型大腸癌、腫瘤型大腸癌、潰瘍浸潤型大腸癌、びまん浸潤型大腸癌、基底細胞癌、有棘細胞癌、黒色腫、表在性拡大型黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端性黒子性黒色腫、神経芽細胞腫、神経節芽腫、神経節腫、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、カルチノイド、膵島細胞腫瘍、腫瘤型胃癌、潰瘍限局型胃癌、潰瘍浸潤型胃癌、びまん浸潤型胃癌、肝細胞癌及び肝芽腫、上皮性卵巣癌、境界型腫瘍、胚細胞腫瘍、間質性腫瘍、漿液性腺癌、明細胞腺癌、類内膜腺癌、移行上皮癌、粘液性腺癌、混在型卵巣癌、扁平上皮癌、食道腺癌、腎細胞癌、腎腺癌、副腎腫、腎線維肉腫、移行上皮癌（腎盂及び／又は尿管（uterer））、肥満細胞腫、肛門周囲腺腫、肛門周囲腺癌が包含されるが、これらに限定されない。
【００９８】
また、対象となる動物は、哺乳動物であり、例えば霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物、実験動物などを含む哺乳動物であり、特にヒト、イヌ及びネコが好ましい。
【００９９】
本発明で用いられる抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体若しくは媒体又は添加剤、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【０１００】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って調製することができる。
【０１０１】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−６０と併用してもよい。
【０１０２】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【０１０３】
投与は、経口又は非経口であり、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身又は局部的に投与することができる。また注射、注入、徐放製剤の埋め込み等による腫瘍への局所投与によって本発明の抗体を腫瘍に直接投与してもよい。
【０１０４】
また、患者の年齢、体重、性別、症状などにより適宜投与方法を選択することができる。抗体又は抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重、年齢、性別、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０１０５】
本発明の抗体若しくはそのフラグメント、又はそれを含む上記の医薬組成物を被験者に投与することによって上述の癌、とりわけＭＲＡＰ２を細胞表面に発現している癌、好ましくは、白血病、悪性リンパ腫、肺癌、脳腫瘍、大腸癌、メラノーマ、神経芽腫、膵癌、胃癌、肝癌、卵巣癌、食道癌、腎癌、肥満細胞腫若しくは肛門周囲腺癌を治療及び／又は予防することができる。
【０１０６】
さらに、本発明の医薬組成物（又は医薬）を、上で例示したような抗腫瘍剤又は抗腫瘍剤を含む医薬組成物（又は医薬）と組み合わせて、被験者に併用投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法も本発明に包含される。対象となる癌は上記と同じである。本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤は、同時に、又は、別々に被験者に投与されうる。別々に投与する場合には、いずれの医薬組成物が先であっても又は後であってもよく、それらの投与間隔、投与量、投与経路及び投与回数は、専門医によって適宜選択されうる。同時に投与する場合、例えば、本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤を、薬理学上許容される担体（又は媒体）中で混合し製剤化して得られる医薬剤型の医薬組成物も包含されるものとする。また、抗腫瘍剤を含有する上記医薬組成物及び剤型のいずれに対しても、本発明の抗体を含有する医薬組成物及び剤型についての処方、製剤化、投与経路、用量、癌等の説明を適用しうる。
【０１０７】
したがって、本発明は、本発明の医薬組成物と、上で例示したような抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含む、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品及びそれを投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法も提供する。また、本発明は、本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤とを、薬理学上許容される担体及び／又は添加剤とともに含む、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物も提供する。
【実施例】
【０１０８】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの具体例によって制限されないものとする。【０１０９】
実施例１  ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの同定
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
健常な犬の精巣組織から酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム法（Ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０ ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ ＲＮＡを精製した。【０１１０】
この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリーの作製にはｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ， ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ， ＺＡＰ−ｃＤＮＡ ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｇ Ｋｉｔ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリーのサイズは１×１０６ｐｆｕ／ｍｌであった。【０１１１】
（２）血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
上記で作製したイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに約２５００クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’）にファージを感染させ、４２℃、３〜４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ Ｅｘｔｒａ： ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｎｅｃｅ）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２〜３時間反応させた。【０１１２】
上記患犬血清としては、白血病の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は−８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓファージを宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｒｅ ＭＲＦ’）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次いで０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３ ｐＨ８．３のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をＮＨＳ−カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌及びファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。【０１１３】
かかる処理血清とタンパク質をブロットした上記メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ Ｄｏｇ ＩｇＧ−ｈ＋Ｌ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ： ＢＥＴＨＹＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温で１時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Ｒｏｃｈｅ）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌＳＯ４、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％ゼラチン ｐＨ７．５）５００μｌに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する約１００００個のファージクローンをスクリーニングして、１個の陽性クローンを単離した。【０１１４】
（３）単離抗原遺伝子の相同性検索
上記方法により単離した１個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ'）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液１００μｌ、さらにＥｘＡｓｓｉｓｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）１μｌを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５〜３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心を行い、上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液１０μｌを混合した後、３７℃で１５分間反応させ、５０μlをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃で一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地で３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。【０１１５】
精製したプラスミドは、配列番号２５に記載のＴ３プライマーと配列番号２６に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号３に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を用いて、配列同一性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を行い既知遺伝子との配列同一性検索を行った結果、得られた遺伝子はＭＲＡＰ２遺伝子であることが判明した。イヌＭＲＡＰ２のヒト相同因子であるヒトＭＲＡＰ２では、配列同一性が塩基配列９１％、アミノ酸配列９４％であり、ネコＭＲＡＰ２は、配列同一性が塩基配列９５％、アミノ酸配列９６％であり、マウス相同因子であるマウスＭＲＡＰ２では、配列同一性が塩基配列８４％、アミノ酸配列８８％であった。ヒトＭＲＡＰ２の塩基配列を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２に、ネコＭＲＡＰ２の塩基配列を配列番号５、アミノ酸配列を配列番号６に、マウスＭＲＡＰ２の塩基配列を配列番号７、アミノ酸配列を配列番号８に示す。【０１１６】
（４）各組織での遺伝子発現解析
上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ、ヒト及びマウスの各種正常組織、各種腫瘍組織及び各種癌細胞株における発現をＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ）法により調べた。逆転写反応は以下の通り行った。すなわち、各組織５０〜１００ｍｇ及び各細胞株５〜１０×１０６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により本キット添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ヒト正常組織（脳、精巣、結腸、胎盤）のｃＤＮＡは、ジーンプールｃＤＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ（クロンテック）及びＬａｒｇｅ−Ｉｎｓｅｒｔ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ（クロンテック）を用いた。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（イヌプライマーは配列番号２７及び２８、ヒトプライマーは配列番号２９及び３０、マウスプライマーは配列番号３１及び３２に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したｃＤＮＡサンプル０．２５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返してＰＣＲを行った。その結果、図１に示すように、イヌＭＲＡＰ２遺伝子は、イヌ腫瘍組織では肥満細胞腫、肛門周囲腺癌で強い発現が見られた（図１）。ヒトＭＲＡＰ２遺伝子発現においては、健常なヒト組織ではほとんどの組織で発現が見られなかった（図２Ａ）。一方ヒト癌細胞では白血病、悪性リンパ腫、肺癌、脳腫瘍、大腸癌、膵癌、胃癌、肝癌、卵巣癌、食道癌、腎癌の細胞株でヒトＭＲＡＰ２遺伝子の強い発現が見られた（図２Ｂ）。さらに、マウスＭＲＡＰ２遺伝子は、白血病、メラノーマ、神経芽腫の細胞株で発現が検出された（図３）。【０１１７】
実施例２  ヒトＭＲＡＰ２タンパクの作製
（１）ヒトＭＲＡＰ２をコードする全長ｃＤＮＡ、及びヒトＭＲＡＰ２の細胞外領域（以下、ｈＮ末側ＭＲＡＰ２、ｈＣ末側ＭＲＡＰ２）をコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒトＭＲＡＰ２をコードする全長ｃＤＮＡは実施例１で取得した配列番号１の遺伝子を基に、以下の方法にてクローニングした。ＰＣＲは、実施例１で作製した各種組織・細胞由来ｃＤＮＡのうちＲＴ−ＰＣＲ法による発現が確認できたｃＤＮＡを１μｌ、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号３３及び３４に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ）を用いて、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号２のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。上記のＰＣＲ反応により得られた増幅産物はｐｃＤＮＡ３．１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に挿入した（以下、ヒトＭＲＡＰ２／ｐｃＤＮＡ３．１）。また、ＤＮＡシーケンサーを用いたシークエンシングによって、その増幅産物がヒトＭＲＡＰ２をコードするｃＤＮＡ配列であることを確認した。配列番号１で表される配列はヒトＭＲＡＰ２遺伝子の塩基配列を、配列番号２で表される配列はヒトＭＲＡＰ２タンパク質のアミノ酸配列を示す。【０１１８】
また、配列番号１を基に、ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号３５及び３６に記載）を各０．４μＭ， ０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ）を用いて、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、７２℃で３０秒のサイクルを３０回繰り返すことによりＰＣＲを行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号１のうち、ＭＲＡＰ２タンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列（Ｎ末側）（配列番号１０）をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて約１３０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。上記のＰＣＲ反応により得られた増幅産物はマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃタンパク質をコードするｃＤＮＡが挿入されたｐＳｅｃＴａｇＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結し、ヒトＮ末側ＭＲＡＰ２細胞外領域／マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ融合タンパク質（以下、ｈＮ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃ）をコードする発現ベクターとした（以下、ｐＳｅｃＢ−ｈＮ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃ）。また、ＤＮＡシーケンサーを用いたシークエンシングによって、その増幅産物が、ｈＮ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃをコードするｃＤＮＡ配列であることを確認した。配列番号３７で表される配列はｈＮ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃをコードする塩基配列を、配列番号３８で表される配列はｈＮ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃのアミノ酸配列を示す。【０１１９】
また、配列番号１を基に、ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号３９及び４０に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ）を用いて、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、７２℃で３０秒のサイクルを３０回繰り返すことによりＰＣＲを行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号１のうち、ＭＲＡＰ２タンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列（Ｃ末側）（配列番号１２）をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて約４００ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。上記のＰＣＲ反応により得られた増幅産物はマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃタンパク質をコードするｃＤＮＡが挿入されたｐＳｅｃＴａｇＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結し、ヒトＣ末側ＭＲＡＰ２細胞外領域／マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ融合タンパク質（以下、ｈＣ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃ）をコードする発現ベクターとした（以下、ｐＳｅｃＢ−ｈＣ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃ）。また、ＤＮＡシーケンサーを用いたシークエンシングによって、その増幅産物が、ｈＣ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃをコードするｃＤＮＡ配列であることを確認した。配列番号４１で表される配列はｈＣ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃをコードする塩基配列を、配列番号４２で表される配列はｈＣ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃのアミノ酸配列を示す。【０１２０】
（２）ｈＮ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃの作製
ＭＲＡＰ２に対する抗体を作製するための免疫抗原としてｈＮ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃを作製した。【０１２１】
発現ベクターｐＳｅｃＢ−ｈＮ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃをヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３細胞へリポフェクション法により導入し、導入７日後の培養上清よりｈＮ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃの精製を実施した。培養上清をＨｉ Ｔｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）にアプライし、結合バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム (ｐＨ ７．０)）にて洗浄後、溶出バッファー（０．１Ｍ グリシン−ＨＣｌ (ｐＨ ２．７)）で溶出した。溶出液は中和バッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ ９．０)）を加えたチューブに溶出することにより直ちに中和した。次に、上記方法によって得られた溶出液のバッファーを、限外ろ過ＮＡＮＯＳＥＰ １０Ｋ ＯＭＥＧＡ（ＰＡＬＬ）を用いて、生理用リン酸緩衝液（日水製薬）置換した後、ＨＴタフリンアクロディスク０．２２μｍ（ＰＡＬＬ）にて無菌ろ過を行い、これを以下の実験に用いた。【０１２２】
（３）ｈＣ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃの作製
ＭＲＡＰ２に対する抗体を作製するための免疫抗原としてｈＣ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃを作製した。【０１２３】
発現ベクターｐＳｅｃＢ−ｈＣ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃをヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３細胞へリポフェクション法により導入し、導入７日後の培養上清よりｈＣ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃの精製を実施した。培養上清をＨｉ Ｔｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）にアプライし、結合バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム (ｐＨ ７．０)）にて洗浄後、溶出バッファー（０．１Ｍ グリシン−ＨＣｌ (ｐＨ ２．７)）で溶出した。溶出液は中和バッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ ９．０)）を加えたチューブに溶出することにより直ちに中和した。次に、上記方法によって得られた溶出液のバッファーを、限外ろ過ＮＡＮＯＳＥＰ １０Ｋ ＯＭＥＧＡ（ＰＡＬＬ）を用いて、生理用リン酸緩衝液（日水製薬）置換した後、ＨＴタフリンアクロディスク０．２２μｍ（ＰＡＬＬ）にて無菌ろ過を行い、これを以下の実験に用いた。 【０１２４】
実施例３  ＭＲＡＰ２の細胞外領域に結合するポリクローナル抗体の作製
（１）Ｎ末側ＭＲＡＰ２に対するポリクローナル抗体の作製
ＭＲＡＰ２のＮ末側細胞外領域に結合する抗体を得るために、上記で作製したｈＮ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃ  ０．１ｍｇを抗原として、等容量の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）溶液と混合し、これを２週間毎に４回、マウスの皮下に投与を行った。その後血液を採取し、ポリクローナル抗体を含む抗血清を得た。さらにこの抗血清をプロテインＧ担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて精製し、ｈＮ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃに対するポリクローナル抗体を得た。また、抗原を投与していないマウスの血清を上記と同様にしてプロテインＧ担体を用いて精製したものをコントロール抗体とした。【０１２５】
（２）Ｃ末側ＭＲＡＰ２に対するポリクローナル抗体の作製
ＭＲＡＰ２のＣ末側細胞外領域に結合する抗体を得るために、上記で作製したｈＣ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃ  ０．１ｍｇを抗原として、等容量の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）溶液と混合し、これを２週間毎に４回、マウスの皮下に投与を行った。その後血液を採取し、ポリクローナル抗体を含む抗血清を得た。さらにこの抗血清をプロテインＧ担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて精製し、ｈＣ末側ＭＲＡＰ２−ｍＩｇＧ２ａＦｃに対するポリクローナル抗体を得た。また、抗原を投与していないマウスの血清を上記と同様にしてプロテインＧ担体を用いて精製したものをコントロール抗体とした。【０１２６】
（３）全長ヒトＭＲＡＰ２定常発現細胞の樹立
上記で作製したヒトＭＲＡＰ２／ｐｃＤＮＡ３．１をＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）へリポフェクション法により導入し、５００ μｇ/ｍｌのＧ４１８（ナカライ）による選抜により、全長ヒトＭＲＡＰ２を定常的に発現するＣＨＯ細胞株を樹立した（ＣＨＯ−ヒトＭＲＡＰ２）。また、ＭＲＡＰ２をコードするｃＤＮＡが挿入されていない発現ベクター（以下、ｅｍｐ/ｐｃＤＮＡ３．１）を上記と同様に導入して選抜した細胞をコントロール細胞とした（以下、ＣＨＯ−ｅｍｐ）。【０１２７】
（４）細胞表面上での抗原タンパクの発現解析
（３）で樹立した全長ヒトＭＲＡＰ２定常発現細胞表面上に発現するＭＲＡＰ２特異的に、（１）で作製したポリクローナル抗体が反応するかどうかを調べた。ＣＨＯ−ヒトＭＲＡＰ２細胞及びＣＨＯ−ｅｍｐ細胞それぞれ１０６個細胞を１．５ｍｌのミクロ遠心チューブにて遠心分離した。これに上記（１）で調製したＮ末側ＭＲＡＰ２に対するポリクローナル抗体２μｇ（５μｌ）を添加し、さらに９５μｌの０．１％牛胎児血清を含むＰＢＳで懸濁後、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（サンタクルズ）及び９５μｌの０．１％ 牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、ＭＲＡＰ２に対するポリクローナル抗体の代わりに上記（１）で調製したコントロール抗体を用いて行い、コントロールとした。その結果、抗Ｎ末側ＭＲＡＰ２ポリクローナル抗体を添加されたＣＨＯ−ヒトＭＲＡＰ２細胞は、コントロールに比べて、２１５％の蛍光強度の増強を示した。一方、同様の操作をＣＨＯ−ｅｍｐ細胞に対して実施した。その結果、抗Ｎ末側ＭＲＡＰ２ポリクローナル抗体を添加されたＣＨＯ−ｅｍｐ細胞は、コントロールに比べて、０％の蛍光強度の増強を示した。このことから、抗Ｎ末側ＭＲＡＰ２ポリクローナル抗体は、細胞膜表面上に発現するＭＲＡＰ２タンパク質特異的に結合することが明らかとなった。なお、上記蛍光強度の増強率は、各細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ値）の増加率にて表され、以下の計算式により算出した。【０１２８】
平均蛍光強度の増加率（蛍光強度の増強率）（％）＝（（抗ヒトＭＲＡＰ２抗体を反応させた細胞のＭＦＩ値）−（コントロールＭＦＩ値））÷（コントロールＭＦＩ値）×１００。【０１２９】
次に、（３）で樹立した全長ヒトＭＲＡＰ２定常発現細胞表面上に発現するＭＲＡＰ２特異的に、（２）で作製したポリクローナル抗体が反応するかどうかを調べた。ＣＨＯ−ヒトＭＲＡＰ２細胞及びＣＨＯ−ｅｍｐ細胞それぞれ１０６個細胞を１．５ｍｌのミクロ遠心チューブにて遠心分離した。これに上記（２）で調製したＣ末側ＭＲＡＰ２に対するポリクローナル抗体２μｇ（５μｌ）を添加し、さらに９５μｌの０．１％牛胎児血清を含むＰＢＳで懸濁後、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（サンタクルズ）及び９５μｌの０．１％ 牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、ＭＲＡＰ２に対するポリクローナル抗体の代わりに上記（２）で調製したコントロール抗体を用いて行い、コントロールとした。その結果、抗Ｃ末側ＭＲＡＰ２ポリクローナル抗体を添加されたＣＨＯ−ヒトＭＲＡＰ２細胞は、コントロールに比べて、２２３％の蛍光強度の増強を示した。一方、同様の操作をＣＨＯ−ｅｍｐ細胞に対して実施した。その結果、抗Ｃ末側ＭＲＡＰ２ポリクローナル抗体を添加されたＣＨＯ−ｅｍｐ細胞は、コントロールに比べて、０％の蛍光強度の増強を示した。このことから、抗Ｃ末側ＭＲＡＰ２ポリクローナル抗体は、細胞膜表面上に発現するＭＲＡＰ２タンパク特異的に結合することが明らかとなった。なお、上記蛍光強度の増強率は、各細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ値）の増加率にて表され、以下の計算式により算出した。【０１３０】
平均蛍光強度の増加率（蛍光強度の増強率）（％）＝（（抗ヒトＭＲＡＰ２抗体を反応させた細胞のＭＦＩ値）−（コントロールＭＦＩ値））÷（コントロールＭＦＩ値）×１００。【０１３１】
次に、ＭＲＡＰ２遺伝子の発現が多く確認された白血病細胞株２種（Ｋ５６２、ＴＨＰ−１）、悪性リンパ腫細胞株（Ｎａｍａｌｗａ）について、その細胞表面上にＭＲＡＰ２タンパク質が発現しているかどうかを調べた。上記で遺伝子発現が認められた各ヒト細胞株それぞれ１０６個細胞を１．５ｍｌのミクロ遠心チューブにて遠心分離した。これに上記（２）で調製したＣ末側ＭＲＡＰ２に対するポリクローナル抗体２μｇ（５μｌ）を添加し、さらに９５μｌの０．１％牛胎児血清を含むＰＢＳで懸濁後、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（サンタクルズ）及び９５μｌの０．１％ 牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、Ｃ末側ＭＲＡＰ２に対するポリクローナル抗体の代わりに上記（２）で調製したコントロール抗体を用いて行い、コントロールとした。その結果、抗Ｃ末側ＭＲＡＰ２ポリクローナル抗体を添加された細胞は、コントロールに比べて、いずれも蛍光強度が３０％以上強かった。具体的には、Ｋ５６２が１９７％、ＴＨＰ−１が１２３％、Ｎａｍａｌｗａが１０４％の蛍光強度の増強を示した。このことから、上記ヒト癌細胞株の細胞膜表面上にＭＲＡＰ２タンパクが発現していることが確認された。なお、上記蛍光強度の増強率は、各細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ値）の増加率にて表され、以下の計算式により算出した。【０１３２】
平均蛍光強度の増加率（蛍光強度の増強率）（％）＝（（抗ヒトＭＲＡＰ２抗体を反応させた細胞のＭＦＩ値）−（コントロールＭＦＩ値））÷（コントロールＭＦＩ値）×１００。【０１３３】
実施例４  ＭＲＡＰ２に対するポリクローナル抗体の癌細胞に対する抗腫瘍効果（ＡＤＣＣ活性）
次にＭＲＡＰ２に対するポリクローナル抗体が、ＭＲＡＰ２を発現する腫瘍細胞を障害することができるかどうかを検討した。実施例３で調製したヒトＮ末側ＭＲＡＰ２又はヒトＣ末側ＭＲＡＰ２に対するポリクローナル抗体を用いて評価を行った。ＭＲＡＰ２の発現が確認されているヒト白血病細胞株Ｋ５６２、ヒト悪性リンパ腫細胞株Ｎａｍａｌｗａを１０６個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個ずつ添加した。これに、上記ヒトＭＲＡＰ２に対する各ポリクローナル抗体を１μｇ添加し、さらにマウスの末梢血から分離したリンパ球をそれぞれ２×１０５個ずつ添加して、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム（Ｃｒ）５１の量を測定し、ヒトＮ末側ＭＲＡＰ２及びヒトＣ末側ＭＲＡＰ２に対するポリクローナル抗体による癌細胞に対するＡＤＣＣ活性を算出した。その結果、Ｋ５６２細胞に対して、それぞれ１５．７％、１６．３％、Ｎａｍａｌｗａ細胞に対して、それぞれ１４．８％、１４．０％のＡＤＣＣ活性が確認された（図４参照）。一方、それぞれの細胞株に対して、抗原で免疫されていないマウスの末梢血から調製したコントロール抗体（実施例３）を用いて同様の操作を行った場合、及び抗体を添加しなかった場合には、活性はほとんど認められなかった（図４参照）。従って、ＭＲＡＰ２に対する抗体を用いたＡＤＣＣ活性により、ＭＲＡＰ２を発現する腫瘍細胞を障害することができることが明らかになった。【０１３４】
なお、図４中の細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）は、上記のように、本発明で用いられるＭＲＡＰ２に対する抗体、マウスリンパ球及びクロミウム５１を取り込ませた１０３個の細胞株を混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下の計算式＊により算出した白血病細胞株に対する細胞障害活性を示した結果である。【０１３５】
＊式：細胞障害活性（％）＝ＭＲＡＰ２に対する抗体及びマウスリンパ球を加えた際のＫ５６２からのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量×１００。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明の抗体は、癌の治療及び／又は予防のため有用である。【０１３７】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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