(57)【要約】［要約］［課題］精度の高い細胞測定方法を提供する。［解決手段］標的細胞を色素で染色する工程と、前記標的細胞の画像を取得する画像取得工程と、前記画像を多段階二値化処理することにより、前記標的細胞と夾雑細胞とを判別する判別工程と、前記判別工程の結果に基づいて前記画像から前記夾雑細胞によるノイズを排除する工程と、前記夾雑細胞を排除した画像の細胞量の指標を積算することにより、前記標的細胞量を評価する工程とを有する細胞測定方法。【選択図】図１
2018084002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞を色素で染色する工程と、
前記標的細胞の画像を取得する画像取得工程と、
前記画像を多段階二値化処理することにより、前記標的細胞と夾雑細胞とを判別する判別工程と、
前記判別工程の結果に基づいて前記画像から前記夾雑細胞によるノイズを排除する工程と、
前記夾雑細胞を排除した画像の細胞量の指標を積算することにより、前記標的細胞量を評価する工程と
を有する細胞測定方法。
【請求項２】
前記判別工程は、所定の基準差以上に異なる２つの閾値による２回の二値化処理において島状部分が略円形であることにより、当該２つの閾値の間では閾値の大小によらず当該島状部分が略円形であると推定できるときは、当該島状部分が略球形の細胞であると判断する工程を含む、
請求項１に記載の細胞測定方法。
【請求項３】
前記判別工程は、所定の基準差以上に異なる２つの閾値による２回の二値化処理において島状部分の輪郭に円弧が占める割合が所定の値以上であることにより、当該２つの閾値の間では閾値の大小によらず当該島状部分の輪郭に円弧が占める割合が前記所定の値以上であると推定できるときは、当該島状部分が略球形の細胞の集合であると判断する工程を含む、
請求項１または２に記載の細胞測定方法。
【請求項４】
前記判別工程は、閾値を順次増加または減少させながら二値化処理を行う、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞測定方法。
【請求項５】
前記標的細胞が癌細胞であり、前記夾雑細胞が線維芽細胞である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞測定方法。
【請求項６】
前記標的細胞がコラーゲンゲルに包埋して培養された細胞である、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞測定方法。
【請求項７】
前記画像が標的細胞を撮像した透過像の明度画像である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞測定方法。
【請求項８】
前記画像が標的細胞を撮像した透過像に基づく吸光度画像である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞測定方法。
【請求項９】
前記細胞量の指標が吸光度であり、前記標的細胞量の評価が標的細胞の推定体積値を算出することにより行われる、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞測定方法。
【請求項１０】
前記画像取得工程は、
前記色素による吸光度が異なる第１の光および第２の光に対する透過像に基づく第１画像および第２画像を取得する工程と、
前記第１画像および前記第２画像のそれぞれを複数の分割領域に分割し、該分割領域毎に前記第１画像と前記第２画像を比較してノイズを排除した第１ノイズ除去画像を取得する工程とからなる、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞測定方法。
【請求項１１】
前記第１画像および前記第２画像は、前記第１の光および前記第２の光を同時に照射して、１台のカラーカメラで撮像された透過像に基づいて取得される、
請求項１０に記載の細胞測定方法。
【請求項１２】
前記第１画像および前記第２画像は、前記第１の光と前記第２の光を順次照射して、１台のカメラで都度撮像することにより得られた透過像に基づいて取得される、
請求項１０に記載の細胞測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞量の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮性悪性腫瘍や肉腫等に対する抗癌剤の感受性試験では、抗癌剤と接触させた癌細胞と接触させなかった癌細胞とを同じ条件で培養して、培養後の癌細胞の増殖度を比較することで癌細胞の抗癌剤に対する感受性を評価する。癌細胞の増殖が少ないほど抗癌効果が高い抗癌剤と期待される。【０００３】
癌細胞の培養法として、特許文献１〜５には癌細胞をコラーゲンゲルに包埋して培養する方法が記載されている。このコラーゲンゲル包埋培養法は、寒天等の表面で癌細胞を培養する表面培養法に比べて、癌細胞の増殖が良好に行われることが知られている。【０００４】
培養した癌細胞の定量方法として、特許文献１には、増殖した癌細胞をＴＶカメラ等で撮像し、得られた画像情報を電子的に画像解析して、癌細胞コロニーの推定体積値を算出する方法が記載されている。また、特許文献３には、コラーゲンゲル内で培養した癌細胞を色素で染色して撮像し、画像濃度に基づいて癌細胞を定量する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平３−２８５６９６号公報
【特許文献２】国際公開第９５／１８２１６号
【特許文献３】特開平１０−１１５６１２号公報
【特許文献４】特許第３３６３４４５号公報
【特許文献５】特開２００８−１１７９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１や特許文献３に記載された癌細胞の定量方法には、さらなる定量精度の向上という課題があった。抗癌剤の感受性試験は、従来、癌患者から摘出された外科手術材料を出発材料として行われている。一方、手術適応外となり外科手術材料が得られない進行再発症例や、近年増えてきた術前化学療法を対象として、穿刺針等を用いて細胞を採取する生検材料を出発材料とする抗癌剤感受性試験への要望が高まっている。しかし、生検材料では、手術材料と比べて採取できる組織片が小さく、抗癌剤感受性試験においては、従来の１０分の１以下の細胞量を精度よく定量することが求められる。特許文献１や特許文献３では、このような少量の癌細胞を精度良く定量することが難しかった。【０００７】
また、定量精度を損なう原因の一つに、癌細胞と線維芽細胞の混同があった。線維芽細胞は癌細胞とともに色素で染色されるからである。特許文献１には、画像解析により、癌細胞と線維芽細胞をその形状と画像の濃淡によって区別することが記載されている。特許文献３には、線維芽細胞が癌細胞に比べて格段に染色され難いことを利用して、画像濃度によって両者を区別することが記載されている。しかし、これらの方法を用いても、両者が密集して混在している場合には精度よく判別できないことがあった。【０００８】
本発明は上記を考慮してなされたものであり、より定量精度の高い細胞測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の細胞測定方法は、標的細胞を色素で染色する工程と、前記標的細胞の画像を取得する画像取得工程と、前記画像を多段階二値化処理することにより、前記標的細胞と夾雑細胞とを判別する判別工程と、前記判別工程の結果に基づいて前記画像から前記夾雑細胞によるノイズを排除する工程と、前記夾雑細胞を排除した画像の細胞量の指標を積算することにより、前記標的細胞量を評価する工程とを有する。【００１０】
ここで、標的細胞とは測定しようとする細胞をいう。また、多段階二値化処理とは、閾値を変化させながら複数回の二値化処理を行うことをいう。また、ノイズとは染色された標的細胞に由来しない、不要な画像情報をいう。また、細胞量の指標とは、画像の濃淡や、画像の濃淡から算出される吸光度など、細胞の多寡に対応して増減する指標を意味する。この方法により、誤差の原因となる夾雑細胞によるノイズの影響を排除して、細胞量を精度よく測定することができる。【００１１】
好ましくは、前記判別工程は、所定の基準差以上に異なる２つの閾値による２回の二値化処理において島状部分が略円形であることにより、当該２つの閾値の間では閾値の大小によらず当該島状部分が略円形であると推定できるときは、当該島状部分が略球形の細胞であると判断する工程を含む。【００１２】
さらに好ましくは、前記判別工程は、所定の基準差以上に異なる２つの閾値による２回の二値化処理において島状部分の輪郭に円弧が占める割合が所定の値以上であることにより、当該２つの閾値の間では閾値の大小によらず当該島状部分の輪郭に円弧が占める割合が前記所定の値以上であると推定できるときは、当該島状部分が略球形の細胞の集合であると判断する工程を含む。【００１３】
好ましくは、前記判別工程は、閾値を順次増加または減少させながら二値化処理を行う。【００１４】
好ましくは、前記標的細胞が癌細胞であり、前記夾雑細胞が線維芽細胞である。【００１５】
好ましくは、前記標的細胞が三次元培養された細胞であり、より好ましくは、前記細胞がコラーゲンゲルに包埋して培養された細胞である。【００１６】
前記画像は標的細胞を撮像した透過像の明度画像であってもよい。この場合、前記閾値は明度値である。あるいは、好ましくは、前記画像が標的細胞を撮像した透過像に基づく吸光度画像であってもよい。ここで、吸光度画像とは、明度画像の各画素の明度値を吸光度に換算して量子化した画像をいう。この場合、前記閾値は量子化された吸光度である。【００１７】
好ましくは、前記細胞量の指標が吸光度であり、前記標的細胞量の評価が標的細胞の推定体積値を算出することにより行われる。【００１８】
好ましくは、前記画像取得工程は、前記色素による吸光度が異なる第１の光および第２の光に対する透過像に基づく第１画像および第２画像を取得する工程と、前記第１画像および前記第２画像のそれぞれを複数の分割領域に分割し、該分割領域毎に前記第１画像と前記第２画像を比較してノイズを排除した第１ノイズ除去画像を取得する工程とからなる。ここで、画像の分割領域とは、画像上の１以上の画素からなる領域をいう。【００１９】
好ましくは、前記第１画像および前記第２画像は、前記第１の光および前記第２の光を同時に照射して、１台のカラーカメラで撮像された透過像に基づいて取得される。【００２０】
あるいは、好ましくは、前記第１画像および前記第２画像は、前記第１の光と前記第２の光を順次照射して、１台のカメラで都度撮像することにより得られた透過像に基づいて取得される。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の細胞測定方法によれば、標的細胞が夾雑細胞やゴミ等のノイズ成分に対して相対的に少量であっても、細胞量を精度よく評価することができる。特に、標的細胞と夾雑細胞が密集して混在している場合にも、両者を精度よく判別することができ、標的細胞量を精度よく評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の第１の実施形態で用いる細胞測定装置の構成例を示す図である。
【図２】本発明の第１の実施形態の癌細胞定量方法のフロー図である。
【図３】画像の明度を説明するための図である。
【図４】本発明の第１の実施形態の癌細胞定量方法で得られる元画像を説明するための図である。
【図５】ニュートラルレッドの吸光スペクトルである。
【図６】実験例で癌細胞を定量した試料の元画像である。
【図７】実験例で癌細胞を定量した試料の元画像である。
【図８】画像上の島状部分が略円形であるか否かの判断方法を説明する図である。
【図９】重なり合う細胞の多段階二値化処理を説明するための図である。
【図１０】球形細胞の集合である島状部分の多段階二値化処理を説明する図である。
【図１１】球形細胞の集合である島状部分の多段階二値化処理を説明する図である。
【図１２】実施例の原画像（Ａ）と吸光度画像の二値化画像（Ｂ）である。
【図１３】実施例における異なる閾値に対する二値化処理の結果を示す図である。
【図１４】実施例において島状部分の輪郭に占める円弧を示す図である。
【図１５】多段階二値化処置における基準区間長さあるいは基準差を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
まず、多段階二値化処理によって標的細胞と夾雑細胞を判別する方法を、図８〜１１に基づいて説明する。ここでは、染色された細胞の明度画像（濃淡画像）において、球形の癌細胞を標的細胞、紡錘形の線維芽細胞を夾雑細胞として説明する。
【００２４】
画像上で他と分離された島状部分（以下単に「島」ということがある）の形状が「丸い」、すなわち略円形であるかどうかは、いくつかの方法によって判断できる。例えば、図８を参照して、島の、縦横比が１に近いか否か（図８Ｐ）、アスペクト比が１に近いか否か（図８Ｑ）、面積が外接矩形の面積のπ／４に近いか否か（図８Ｒ）、周囲長の二乗と面積の比が４πに近いか否か（図８Ｓ）によって判断できる。島が丸いか否かは、これらのうち複数の方法を併用して判断するのが好ましい。丸くない島を丸いと誤認する確率を下げるためである。例えば、図８のＰおよびＱの方法では丸い島と星形の島の判別が難しいし、図８のＲおよびＳの方法では丸い島と紡錘形の島の判別が難しい。
【００２５】
次に、図９を参照して、細胞が重なっている場合を考える。１段目（Ｃ）は単独の癌細胞からなる島、２段目（ＦＦ）は紡錘形の線維芽細胞同士が交差した島、３段目（ＣＦ）は癌細胞と線維芽細胞が重なった島を示している。列Ｇ０はこれらの島の明度画像を示している（以下、列Ｇ０の画像を「画像Ｇ０」という。他も同様）。
【００２６】
閾値を明度の高い（色の薄い）レベル（二値レベル１）に設定して、画像Ｇ０を二値化する（列Ｇ１）。この画像Ｇ１に対して、上記方法により二値化処理後の島が丸いか否かを判断すると、島Ｃは丸いと判断され、島ＦＦは丸くないと判断されて、癌細胞と線維芽細胞は正しく判別される。しかし、島ＣＦは丸くないと判断され、線維芽細胞と重なった癌細胞を見落とすことになる。
【００２７】
閾値をより明度の低い（より色の濃い）レベル（二値レベル２）に設定して、画像Ｇ０を二値化する（列Ｇ２）。この画像Ｇ２に対して、島が丸いか否かを判断する。島Ｃは丸いと判断され結論は変わらない。島ＣＦは丸いと判断されて、癌細胞が正しく判別される。しかし今度は、島ＦＦも丸いと判断されて、線維芽細胞の交差部分を癌細胞と誤認する。
【００２８】
閾値をさらに明度の低い（さらに色の濃い）レベル（二値レベル３）に設定して、画像Ｇ０を二値化する（列Ｇ３）。この画像Ｇ３に対して、島が丸いか否かを判断する。島Ｃおよび島ＦＦは消滅する。島ＣＦは丸いと判断されて、癌細胞が正しく判別される。
【００２９】
このように、一つの二値化画像のみに基づいて島が丸いか否かを判断すると、癌細胞と線維芽細胞を誤認する虞がある。しかし、閾値を段階的に変化させながら順次二値化処理を行い（Ｇ１〜Ｇ３）、連続する２回以上の二値化処理において島が丸いときにその島が癌細胞であると判断することにより、島Ｃ、島ＦＦ、島ＣＦのいずれに対しても癌細胞と線維芽細胞を正しく判別できる。
【００３０】
図１０を参照して、癌細胞がある程度密集している場合でも、上記方法によって癌細胞と線維芽細胞を判別することができる。
【００３１】
さらに、多段階二値化処理において、二値化処理後の各島が丸いか否かの判断に加えて、各島の輪郭に占める円弧の割合によってその島が癌細胞の集合であるか否かを判断することが好ましい。図１１を参照して、癌細胞が図１０よりさらに密集している場合は、閾値を変化させていっても癌細胞は分離せず、島は丸いと判断されないことがある。ここで、図１１の画像Ｇ１と画像Ｇ２において、島の輪郭のうち外側に点線を示した部分は円弧からなる。このように、連続する２回以上の二値化処理において島の輪郭に円弧が占める割合が所定の値以上であるときは、その島が癌細胞の集合であると判断することができる。
【００３２】
輪郭の抽出と、輪郭に占める円弧の割合を求めるには、公知の方法を用いることができる。例えば、坂上勝彦・高木幹雄、「反復演算による重なり合った粒子像の分離」、情報処理学会誌、１９８３年９月、第２４巻、第５号、ｐｐ．５６１−５６７に記載された方法を用いることができる。輪郭の内、円で近似可能な部分を円弧と判定し、島全体の輪郭長に対する円弧と判定した部分の輪郭長の割合を算出する。
【００３３】
その島が癌細胞の集合であるか否かの判断基準となる上記所定の値（以下「基準割合」という）は、低く設定しすぎると、癌細胞の集合でないものを癌細胞の集合であると誤認する確率が増えるので、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上とする。一方、基準割合を高く設定しすぎると、癌細胞の集合をそうでないと誤認する確率が増えるので、好ましくは８０％以下、より好ましくは７０％以下とする。
【００３４】
本発明の細胞測定方法の第１の実施形態として、抗癌剤感受性試験における癌細胞の定量方法を以下に説明する。
【００３５】
生体から採取された組織に対しては、培養に先立って、細切、細胞分散酵素処理による細胞間質の消化などの分散処理が行われる。場合によっては、この後に、予備培養で血球などの不要な細胞を除去して、生細胞を回収する分離処理が行われる。
【００３６】
培養試料の作製は、種々公知の方法を用いることができる。なかでも、三次元培養法を用いるのが好ましい。より好ましくはコラーゲンゲル包埋培養法を用いるのがよい。この方法では、培養に使用する癌細胞の量が少なくても良好な培養およびその後の癌細胞の定量が行える。
【００３７】
コラーゲンゲル包埋培養法による手順は次のとおりである。分離・分散処理された細胞をコラーゲン溶液に混合する。このとき、コラーゲン溶液に、コラーゲン以外にも培養に必要な各種成分を添加しておくことができる。例えば、コラーゲン溶液に、目的とする細胞の生理的条件と同一または近似した緩衝液を添加することができる。この癌細胞を含むコラーゲン溶液を、培養容器内の支持面上に滴下して滴塊状のコラーゲンゲルを形成させ、培養容器内に液体培地を添加する。同様にいくつかの試料を調製する。一部の試料では、培養容器に抗癌剤を添加し、所定時間経過後に抗癌剤を洗浄除去して、再度培養を行う。
【００３８】
培養終了後、培養容器に色素を添加して、標的細胞である癌細胞を染色する。染色方法としては、通常の癌細胞培養における染色方法が適用できる。具体的には、ギムザ液染色法、クリスタルバイオレット染色法、ニュートラルレッド（ＮＲ）染色法、フルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）染色法あるいはその他の蛍光試薬を用いた染色法が挙げられる。染色法としては、癌細胞を選択的に染色でき、癌細胞以外の成分を出来るだけ染色しない方法が好ましい。生細胞を選択的に染色する生細胞染色法を用いれば、抗癌剤の感受性等を測定するのに適している。ＮＲ染色法は、癌細胞のうち生細胞だけを選択的に染色できる方法として好ましい。
【００３９】
染色完了後、ホルマリンにより色素を細胞内に固定して、乾燥させる。コラーゲンゲル乾燥物は、滴塊状コラーゲンゲルから水分が抜けて、平坦な面状になる。
【００４０】
次に、標的細胞を含む試料の撮像と画像処理の方法を、図１〜５に基づいて説明する。図２に処理のフローチャートを示す。
【００４１】
図１において、本実施形態の測定装置１０は、試料２０を載せる試料ステージ１１と、試料を下方から照射する照明１２と、試料の透過像を撮像するカラーカメラ１６と、画像処理装置１７を有する。照明１２は１個のＬＥＤパッケージ１３を有し、照明電源１４に接続されている。照明と試料ステージの間には光拡散板１５が挿入されている。各ＬＥＤパッケージには、第１の光を出射するＬＥＤチップ（図示せず）と、第２の光を出射するＬＥＤチップ（図示せず）が組み込まれている。
【００４２】
第１の光および第２の光は試料を染色した色素に対する吸光度が異なる。本実施形態では、第１の光と第２の光を同時に試料に向けて照射し、１台のカラーカメラで撮像して１枚の元画像を取得する。この元画像を色分解することにより、第１の光に対する透過像である第１画像と、第２の光に対する透過像である第２画像が取得される。
【００４３】
第１の光および第２の光は、前記色素に対する吸光度の違いが大きいほど好ましい。十分な測定精度を得るには、第１の光および第２の光が試料を透過する際の減衰量の比が１．５倍以上あることが好ましく、２倍以上あることがさらに好ましい。そのためには、両者の吸光度の差は、好ましくはｌｏｇ１．５≒０．１８以上であり、より好ましくｌｏｇ２≒０．３０以上である。吸光度は測定条件によって変化するので、実際の測定条件の下でこのような差が得られるように、第１の光および第２の光の波長を選択するのが好ましい。
【００４４】
例として、図５にニュートラルレッド（ＮＲ）のｐＨ＝７．１における吸光スペクトルを示す（小畠りから、中和滴定と酸塩基指示薬の可視吸収スペクトル、慶応義塾大学日吉紀要自然科学、２０１１年９月、Ｎｏ．５０、ｐｐ．７７−１０２を基に作成）。ＮＲはこのｐＨでは約３８０ｎｍ〜６００ｎｍの範囲に吸収帯があり、４６２ｎｍと５１８ｎｍに吸収ピークを有する。この場合、第１の光には波長分布がこの吸収帯と重なる緑色の光を、第２の光には波長分布がこの吸収帯と重ならない赤色の光を選択することができる。
【００４５】
照明の光源としては、ＬＥＤを用いるのが好ましい。ＬＥＤは波長分布が狭く、第１画像と第２画像の違いが明瞭に出やすいからである。なお、照明の物理的な形態は特に限定されない。例えば、ＬＥＤパッケージの数は特に限定されない。また、例えば、本実施形態のように第１の光を出射するＬＥＤチップと第２の光を出射するＬＥＤチップが一つのＬＥＤパッケージに組み込まれていてもよいし、第１の光を出射するＬＥＤパッケージと第２の光を出射するＬＥＤパッケージを交互に並べてもよい。
【００４６】
画像は多数の画素データの集合として構成される。各画素には、カメラの撮像素子に捉えられた光の強度に対応した明度を表す情報が含まれている。明度は、例えば、撮像の取込階調が８ビットであれば０〜２５５の２５６通りの数値で表される。光が試料を通過する際に吸収があると、透過像上でその部分は暗く、すなわち明度が小さく写る。
【００４７】
第１の光に対する透過像である第１画像は、ＮＲによる吸収が大きいので、培養試料中にＮＲに染色された癌細胞が存在すれば、その部分の透過光強度は小さくなる。そして、癌細胞の厚さが大きいほど、透過光強度は小さく、画像の明度は小さくなる。他方、第２の光に対する透過像である第２画像は、癌細胞の存在量をあまり反映しない。
【００４８】
ここで、第１画像および第２画像のそれぞれを同じ方法で複数の分割領域に分割する。同じ方法で分割するとは、第１画像と第２画像の対応する分割領域同士が同じ大きさであって、試料の同じ場所を写したものであるように分割することをいう。本実施形態では、一つの画素を一つの分割領域とする。第１画像および第２画像は一つの元画像から得られるので、各画素は両画像を同じ方法で分割した領域である。
【００４９】
まず、癌細胞を含まない試料の画像情報から得られるブランク画像明度Ｗと、暗黒状態の画像情報から得られる暗画像明度Ｂとを上下限として、画素毎に前記上下限値に対する明度の相対値を求めて、第１画像および第２画像を補正する。ブランク画像は、癌細胞を添加しないことを除いて癌細胞の培養試料と同じ工程を経て処理されたブランク試料を撮像して得られた、最も明るい状態の画像である。ただし、コラーゲンゲル基質などは存在するので、完全な白画像ではない。暗画像は、撮影レンズのシャッターを閉じるなどして光が入らないようにした最も暗い状態での画像である。図３に示すように、第１画像の明度Ｔ１と第２画像の明度Ｔ２は、ブランク画像の明度Ｗと暗画像の明度Ｂとの間にある。
【００５０】
次に、第１画像と第２画像を比較して、ノイズの影響を排除する。
【００５１】
第１画像と第２画像の各画素を比較して、明度の差または比が所定の閾値より小さい場合は、その画素の領域は癌細胞ではないと判断して、当該画素を除外する。より詳しくは、当該画素のデータを、後に癌細胞量を評価する際の基になるデータから除外する。具体的には、例えば、第１画像を修正して、当該画素の明度を上記ブランク画像の明度で上書きすればよい。これにより、当該画素の明度は癌細胞量の評価に影響を及ぼさず、実質的に除外される。
【００５２】
上記閾値として、明度の差を基準とする場合は、例えば、閾値を明度の階調数の８分の１とすることができる。つまり、明度が８ビット・２５６階調で表されるときは、第１画像と第２画像の明度の差が３２より小さい場合に当該画素を除外すればよい。あるいは、明度の比を基準とする場合は、第１画像と第２画像の明度の比が所定の閾値より小さい場合に当該画素を除外すればよい。より好ましくは、これらの閾値は予備実験により求めておく。
【００５３】
不透明なゴミは、波長によらず光を透過しないので、第１画像でも第２画像でも同様に暗く写る。また、コラーゲンゲル乾燥物に含まれる気泡は、光の屈折によって画像上で暗く写るので、やはり光源の波長によらず、第１画像でも第２画像でも同様に暗く写る。したがって、第１画像と第２画像で明度に差がない領域を除外することによって、これらのノイズを排除することができる。
【００５４】
なお、気泡は、コラーゲンゲル包埋培養法において細胞量が少ない場合に特に問題となる。細胞量が少ないと、コラーゲンゲル乾燥物に気泡が残ることがある。その原因は明らかでないが、細胞量が多い場合は、ゲル内の気体がゲル滴塊中の細胞と基質の界面を通って外部に抜けるのに対して、細胞量が少なくなると、ゲル内の気体が抜けきらずに残存するものと考えられる。
【００５５】
図４に、ＮＲで染色した試料の透過像（元画像）を示す。第１の光は主波長が５２８ｎｍの緑色の光、第２の光は主波長が６２５ｎｍの赤色の光であった。ただし、図４はカラー画像である元画像を白黒画像に変換したもので、解像度も変換している。中央部の円形の範囲が試料（コラーゲンゲル乾燥物）である。試料中に多数散在する細かな暗点が癌細胞またはそのコロニーで、元画像では赤く、第１画像には暗く現れ、第２画像には現れない。ただし、点線で囲んだ暗点はゴミで、元画像では灰色で、第１画像および第２画像に暗く現れる。上方の中実の楕円と下方の中空の楕円が気泡によるノイズで、元画像では灰色で、第１画像および第２画像に暗く現れる。
【００５６】
ノイズの他の原因に、線維芽細胞の混入がある。線維芽細胞は、癌細胞とともにＮＲ等の色素で染色されるが、癌細胞に比べて格段に染色され難く、画像の明度が癌細胞に比べて明らかに高くなる。そこで、第１画像において、ある画素の明度が所定の閾値を超える場合は、その画素の領域が線維芽細胞であると判断して、当該画素を除外する。具体的には、例えば、第１画像を修正して、当該画素の明度を上記ブランク画像の明度で上書きすればよい。閾値は、予備実験により求めておくことができる。これにより、試料中の線維芽細胞が癌細胞や他の線維芽細胞と分離して存在する部分については、線維芽細胞によるノイズを排除できる。
【００５７】
以上の処理を試料の全範囲にわたって分割領域毎に繰り返すことで、癌細胞による光吸収に起因しないノイズの影響を排除することができる。このように、第１画像と第２画像の比較によって除去できるノイズを「第１ノイズ」という。これにより、第１ノイズ除去画像が得られる。
【００５８】
次に、第１ノイズ除去画像に対して多段階二値化処理を行う。
【００５９】
多段階二値化処理では、閾値を変化させながら複数回の二値化処理を行い、島が丸いか、および島の輪郭に円弧が占める割合が所定の値（基準割合）より大きいかを判断する。以下において、島が丸い場合と、島の輪郭に円弧が占める割合が基準割合より大きい場合とを合わせて、「島が円形等である」という。
【００６０】
多段階二値化処理において閾値を変化させる間隔（以下「閾値間隔」という）と、何回の二値化処理で島が円形等であればその島が癌細胞であると判断するかの回数（以下「基準回数」という）は相互に関連する。例えば、閾値を段階的に増加させながら二値化処理を行う場合、閾値間隔が小さければ基準回数は大きくする必要があり、閾値間隔が大きければ基準回数は小さくてもよい。二値化処理の閾値間隔と基準回数は、以下のように定めることができる。
【００６１】
図１５において、横軸は明度を示し、横軸上の各点はその明度を閾値とする二値化処理後の判定結果を示す。閾値を段階的に増加させながら二値化処理を行ったと仮定し、１回目の二値化処理（閾値はＴｈ１）では島は円形等でなく、２〜４回目の二値化処理（同Ｔｈ２、Ｔｈ３、Ｔｈ４）では島は円形等であったとする。このとき、明度直線上でＴｈ２とＴｈ４の間を区間Ｉ２４とすると、区間Ｉ２４の下限値Ｔｈ２と上限値Ｔｈ４を閾値とする二値化処理において島が円形等であったので、区間Ｉ２４に含まれる明度を閾値として二値化すれば、その閾値の大小によらず、当該島は円形等であると推定できる。
【００６２】
そこで、閾値をある所定の長さの区間内で変化させても二値化処理後の島が円形等である場合に、その島が癌細胞であると判断することにする。その所定長さを「基準区間長さ」といい、あるいは、区間の上限値と下限値との差という意味から「基準差」と呼ぶ。基準区間長さと基準差は等しい。すると、基準差以上に異なる２つの閾値による二値化処理においていずれも島が円形等であれば、当該２つの閾値の間では閾値の大小によらず当該島は円形等であると推定でき、当該島が癌細胞からなると判断できる。
【００６３】
図１５において、閾値Ｔｈ２とＴｈ４の差が基準差ＩＲより大きいときは、
基準差ＩＲ以上に異なる２つの閾値Ｔｈ２、Ｔｈ４による２回の二値化処理において島が円形等であることにより、２つの閾値Ｔｈ２、Ｔｈ４の間では閾値の大小によらず当該島が二値化処理後に円形等であると推定できる。したがって、閾値をＴｈ２−Ｔｈ４間に含まれる基準区間長さＩＲの区間内で変化させても当該島が二値化処理後に円形等であると推定できるので、当該島が癌細胞であると判断できる。
【００６４】
二値化処理の閾値間隔と基準回数は、この基準区間長さに基づいて定めることができる。例えば、閾値間隔ΔＴｈ＝ＩＲで基準回数が２回、閾値間隔ΔＴｈ＝ＩＲ／２で基準回数が３回などと設定することができる。
【００６５】
基準区間長さは、明度を２５６階調で表す場合、好ましくは７０以下、より好ましくは４０以下とする。基準区間長さが大きすぎると、癌細胞を見落とす確率が高くなるからである。一方、基準区間長さは、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上とする。基準区間長さが小さすぎると、癌細胞でない細胞を癌細胞と誤認する確率が高くなるからである。例えば、図９の２段目（ＦＦ）に示した線維芽細胞の重なり部分を癌細胞と誤認する確率が高くなる。明度の階調数が２５６でない場合は、これと同じ比率で、階調数に応じて基準区間長さの好ましい値を定めることができる。また、さらに好ましくは、基準区間長さは予備実験により決定する。さらに、明度画像に対して多段階二値化処理を行う場合、明度が高い領域では明度の基準区間長さを大きく、明度が低い領域では明度の基準区間長さを小さく設定することが好ましい。
【００６６】
多段階二値化処理により、試料の全範囲にわたって前述の形状判断を島毎に繰り返す。そして、各島の画像を、その島が円形等であると判断された二値化処理のうち最小または最大の閾値によるものの形状および当該閾値で置き換える。これにより、線維芽細胞によるノイズを排除した第２ノイズ除去画像が得られる。
【００６７】
次に、第２ノイズ除去画像から、癌細胞を定量する。
【００６８】
癌細胞量は、各画素毎の細胞量の指標を積算することによって評価できる。好ましくは、癌細胞量は推定体積値によって評価される。コラーゲンゲル包埋培養法によれば、癌細胞のコロニーは３次元的に発達するので、その厚さを考慮することで、より的確な評価ができるからである。推定体積値は、各画素の明度から吸光度を求め、吸光度を試料範囲全体にわたって積算することで求められる。各領域において、吸光度は細胞厚さとリニアに相関しているからである。
【００６９】
ランベルト・ベールの法則により、試料への入射光強度をＩ０、透過光強度をＩとすると、
Ｉ／Ｉ０＝ｅｘｐ（−αＬ）
の関係がある。ここで、αは染色された癌細胞の吸光係数、Ｌは癌細胞中を光が通過する距離、すなわち癌細胞の厚さである。各画素の癌細胞による吸光度Ａは、
Ａ＝−ｌｏｇ（Ｉ／Ｉ０）
＝（αＬ）／２．３０３
で表されるので、吸光度Ａは癌細胞厚さＬに比例する。吸光度Ａは当該画素の細胞量の指標であり、これを試料の全範囲にわたって積算することにより細胞の体積を求めることができる。なお、ｌｏｇは常用対数である。
【００７０】
一方、吸光度Ａは、第２ノイズ除去画像から、
Ａ＝ｌｏｇ（Ｓ／Ｔ）
で求められる。ここで、Ｓは画像の階調数、Ｔは画素の明度である。
【００７１】
以上より、癌細胞量の推定体積値Ｖは、
Ｖ＝ΣＬ＝ＣΣＡ＝ＣΣ｛ｌｏｇ（Ｓ／Ｔ）｝    （式１）
で求められる。ここで、Ｃは定数である。このように、各画素の明度から吸光度を求め、吸光度を試料範囲全体にわたって積算することによって、細胞の推定体積値を求めることができる。
【００７２】
なお、ある画素について、何らかの理由によって、明度Ｔが０であるとき（元画像の明度が暗画像の明度Ｂに等しかったとき）は、式１の右辺対数の真数の分母が０になり、計算ができない。これに対しては、試料画像が暗くなりすぎないように光源の明るさ等を調節するとともに、適当な例外処理を行うのが好ましい。
【００７３】
なお、簡易的には、各画素の明度を積算して、その積算値から吸光度を求めてもよい。推定体積値Ｖｐは、
Ｖｐ＝ＣｐＡｐ＝Ｃｐｌｏｇ（ｎＳ／ΣＴ）
で表される。ここで、Ｃｐは定数、Ａｐは吸光度、ｎは画素数（分割領域の数）である。この式は試料範囲全体を一つの領域として吸光度を求めているが、細胞量が多ければ、例えば手術材料を出発材料とするような場合には、十分な精度が得られる。この式を用いる場合でも、上記画像処理によって、ゴミ等に起因するノイズの影響はすでに排除されている。
【００７４】
抗癌剤の感受性試験では、抗癌剤を加えなかったコントロール試料と抗癌剤を加えた試料とで、培養後の癌細胞量を比較することにより、抗癌剤の感受性を評価する。
【００７５】
本実施形態の癌細胞定量方法の効果を改めて述べる。
【００７６】
ゴミや気泡によるノイズは、従来の技術では排除することが難しかった。本実施形態の方法によれば、第１の光および第２の光を用いることにより、ゴミの混入や気泡の残存の影響を排除して、癌細胞を精度良く定量することができる。不透明なゴミは、第１画像のみでは癌細胞と誤認識され、さらに画像に暗く写るため厚い癌細胞と誤認識されるので、定量精度を大きく損なう。気泡は、第１画像のみではやはり癌細胞と誤認識され、癌細胞のコロニーに比べて大きなものが多いので、定量精度を大きく損なう。
【００７７】
さらに、多段階二値化処理により、試料中に癌細胞と線維芽細胞が密集して混在した部分があっても、線維芽細胞の影響を排除して、癌細胞を精度良く定量することができる。
【００７８】
さらに、上記式１により、試料画像の分割領域毎に吸光度を求めて、それを積算すれば、癌細胞の推定体積値をより正確に算出することができる。
【００７９】
次に、本発明の細胞測定方法の第２の実施形態を説明する。
【００８０】
本実施形態は、第１の実施形態と同じく、抗癌剤感受性試験における癌細胞の定量方法に関する。本実施形態の方法は、第１画像および第２画像の取得方法が第１の実施形態と異なる。その他の工程は第１の実施形態と同様である。
【００８１】
本実施形態では、第１の光を発する第１光源と第２の光を発する第２光源を順次点灯させ、各光源点灯時に１台のカメラで都度撮像を行う。これにより、第１光源点灯時の撮像によって第１画像が、第２光源点灯時の撮像によって第２画像が得られる。なお、本実施形態においても、光源の物理的な形態は特に限定されない。例えば、第１光源であるＬＥＤチップと第２光源であるＬＥＤチップが一つのＬＥＤパッケージに組み込まれていてもよいし、第１光源と第２光源として別個のＬＥＤパッケージを用い、それらを交互に並べてもよい。
【００８２】
本実施形態では、モノクロカメラを使用することができる。その場合は、モノクロカメラの方がカラーカメラよりも高解像度のものが入手可能であるので、より精細な画像を得ることができる。
【００８３】
次に、本発明の細胞測定方法の第３の実施形態を説明する。
【００８４】
本実施形態は、第１の実施形態と同じく、抗癌剤感受性試験における癌細胞の定量方法に関する。本実施形態の方法は、第１画像および第２画像として吸光度画像を用い、この吸光度画像に対してゴミ等のノイズ除去および多段階二値化による線維芽細胞のノイズ除去を行う点で第１の実施形態と異なる。
【００８５】
まず、元画像を色分解して得られた各画像について、画素毎に明度から吸光度を求め、２５６階調などに量子化して、吸光度画像である第１画像および第２画像を得る。第１画像と第２画像の各画素を比較して、吸光度の差または比が所定の閾値より小さい場合は、その画素の領域は癌細胞ではないと判断して除外する。この閾値として、吸光度の差を基準とする場合は、例えば、閾値を吸光度の階調数の８分の１とすることができる。あるいは、吸光度の比を基準とする場合は、第１画像と第２画像の吸光度の比が所定の閾値より小さい場合に当該画素を除外すればよい。より好ましくは、これらの閾値は予備実験により求めておく。この処理を試料の全範囲にわたって画素毎に繰り返すことで、第１ノイズ除去画像が得られる。第１ノイズ除去画像も吸光度画像である。
【００８６】
次に、第１ノイズ除去画像に対して多段階二値化処理を行う。本実施形態では、吸光度画像を対象に二値化を行うので、二値化の閾値も量子化された吸光度である。第１実施形態と同様の理由から、吸光度を８ビット（０〜２５５段階）で量子化した場合、吸光度の基準区間長さは、好ましくは５０以下、より好ましくは４０以下とし、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上とする。なお、吸光度の量子化ビット数が８ビットでない場合は、これと同じ比率で、量子化ビット数に応じて閾値の好ましい間隔を定めればよい。
【００８７】
多段階二値化処理を、試料の全範囲にわたって島毎に繰り返ことにより、線維芽細胞によるノイズを排除した第２ノイズ除去画像が得られる。第２ノイズ除去画像も吸光度画像である。
【００８８】
次に、第２ノイズ除去画像から、癌細胞を定量する。第２ノイズ除去画像の各画素の値を積算することにより、癌細胞の推定体積値を算出することができる。
【００８９】
本実施形態は、試料中に癌細胞が密集した部分がある場合に、特にメリットがある。画像の明度は癌細胞の厚さに比例しない。癌細胞の重なりがある程度を超えると、第１の光に対する透過像より第２の光に対する透過像の方が明度の下がり方が大きくなり、両画像の明度の差はむしろ減少していく。そのため、ゴミ等のノイズを除去する工程で癌細胞、それも高度に密集した癌細胞を除外してしまう虞がある。これに対して、吸光度は癌細胞の厚さに比例するので、吸光度画像を用いればこのような問題がない。
【実施例】
【００９０】
上記実施形態の多段階二値化処理の実施例を説明する。【００９１】
生体から採取した胃癌組織に対して細胞分離・分散処理して得た初代培養癌細胞を、コラーゲンゲル包埋法で培養した。細胞を包埋するコラーゲンゲル溶液として、セルマトリックスＴｙｐｅＣＤ（倉敷紡績株式会社）８容量に、１０倍のハムＦ１２培養液（重曹不含）１容量、再構成用緩衝溶液（２６０ｍＭ重曹および２００ｍＭ−ＨＥＰＥＳを含む５０ｍＭ−ＮａＯＨ溶液）１容量を加え、氷中に保存した。コラーゲン溶液に細胞を、最終密度が２×１０４セル／ｍＬになるように加え、良く混合してコラーゲン混合液を調製した。このコラーゲン混合液を、マイクロ・ピペットを用いて、２４ウェルプレートの１ウェルに１０μＬずつ、適当な間隔をあけて３個所に滴下した。その後、ＣＯ２インキュベータ中で３７℃で１時間加温し、細胞を含むコラーゲン基質を作製した。得られたコラーゲンゲル基質に、１０％ＦＢＳ含有ＤＦ培地を１ｍＬ加えて、１６０時間培養を行った。その後、ウェルにＮＲ染色剤を注入し、ホルマリン固定・乾燥を行って、コラーゲンゲル乾燥物を得た。【００９２】
得られたコラーゲンゲル乾燥物を試料ステージに載せ、下方から照明で照らし、カラーカメラで透過像を撮像した。照明は、ＬＥＤパッケージ（ＣＲＥＥ  Ｉｎｃ．、ＭＣ−Ｅ  Ｃｏｌｏｒ）を１個使用した。ＬＥＤパッケージにはＲＧＢ３色のＬＥＤチップが搭載されており、この内ＲおよびＧのチップのみを点灯させて使用した。第１の光は主波長５２８ｎｍの緑色の光、第２の光は主波長６２５ｎｍの赤色の光であった。カラーカメラ（ソニー株式会社、ＸＣＬ５００５ＣＲ）は、画素数２４４８×２０５０、ＲＧＢ各８ビット階調で、光学倍率１．３倍のレンズを用いた。このとき画像の解像度は約２．７μｍであった。【００９３】
撮像された元画像をＲＧＢの３色に色分解して、Ｇ画像を第１画像、Ｒ画像を第２画像とした。第１画像と第２画像を画素毎に比較して、明度の差が３６以上の場合に、第１ノイズと判定し、画像から除去した。残りの画素に対して、Ｇ画像の画素値から吸光度を算出し、得られた吸光度を８ビットで量子化した値を画素値とする吸光度画像を作成した。この画像に対して多段階二値化処理を適用し、基準区間長さ（＝基準差）を３０として、画像中の各島が丸いまたは島の輪郭に円弧が占める割合が６０％（基準割合）以上である場合に、その島が癌細胞からなると判断した。【００９４】
多段階二値化処理は、具体的には、閾値を３０，５０，６０，４０，６０，７０，５０，７０，８０，・・・のように変化させて行い、３０以上の差がある２つの閾値による２回の二値化処理において島状部分が略円形である場合に、その島が癌細胞からなると判断した。ただし、閾値をこのように変則的に変化させたのは、本実施例の効果の解析を容易にするためであって、本来は不要である。閾値を順次増加または減少させながら二値化処理を行うことが、処理の無駄が少ないので好ましい。本実施例では、基準区間長さを３０としたので、例えば、閾値を１０ずつ段階的に増加または減少させながら二値化処理を行い、３回連続で島が円形等である場合にその島が癌細胞からなると判断しても、当然に同じ結果が得られる。【００９５】
図１２Ａに元画像、図１２Ｂに、この元画像から第１ノイズを除去し、吸光度画像を閾値３で二値化した画像を示す。図１２の左下に、癌細胞と線維芽細胞が密集して混在する部分が存在する。【００９６】
図１３は図１２左下の四角で囲った部分を異なる閾値で二値化処理したときの画像を示している。図中の「Ｔｈ」は閾値の値である。閾値が３から１３０までのいずれの二値化画像においてもこの島は丸くない。しかし、閾値が９０、１００、１１０、１２０、１３０での二値化画像において、島の輪郭に占める円弧の割合はいずれも６０％以上であった。閾値が９０および１２０のときに輪郭に円弧が占める割合が基準割合以上であったため、この島は癌細胞の集合と判断した。参考のため、図１４に、閾値が９０および１２０のときの島の輪郭に占める円弧を示す。【００９７】
ここで、第１ノイズ除去画像を得るまでの実験例を説明する。【００９８】
癌細胞としてヒト大腸癌由来細胞株であるＨＣＴ−１１６を用い、コラーゲンゲル包埋法で培養した。細胞を包埋するコラーゲンゲル溶液として、セルマトリックスＴｙｐｅＣＤ（倉敷紡績株式会社）８容量に、１０倍のハムＦ１２培養液（重曹不含）１容量、再構成用緩衝溶液（２６０ｍＭ重曹および２００ｍＭ−ＨＥＰＥＳを含む５０ｍＭ−ＮａＯＨ溶液）１容量を加え、氷中に保存した。コラーゲン溶液にＨＣＴ−１１６株を、最終密度が４×１０４セル／ｍＬになるように加え、良く混合してコラーゲン混合液を調製した。このコラーゲン混合液を、マイクロ・ピペットを用いて、２４ウェルプレートの１ウェルに１０μＬずつ、適当な間隔をあけて３個所に滴下した。その後、ＣＯ２インキュベータ中で３７℃で１時間加温し、癌細胞を含むコラーゲン基質を作製した。得られたコラーゲンゲル基質に、１０％ＦＢＳ含有ＤＦ培地を１ｍＬ加えて、１６時間培養を行った。その後、ウェルにＮＲ染色剤を注入し、ホルマリン固定・乾燥を行って、コラーゲンゲル乾燥物を得た。【００９９】
得られたコラーゲンゲル乾燥物を試料ステージに載せ、下方から照明で照らし、カラーカメラで透過像を撮像した。照明は、ＬＥＤパッケージ（ＣＲＥＥ  Ｉｎｃ．、ＭＣ−Ｅ  Ｃｏｌｏｒ）を１個使用した。ＬＥＤパッケージにはＲＧＢ３色のＬＥＤチップが搭載されており、この内ＲおよびＧのチップのみを点灯させて使用した。第１の光は主波長５２８ｎｍの緑色の光、第２の光は主波長６２５ｎｍの赤色の光であった。カラーカメラ（ソニー株式会社、ＸＣＬ５００５ＣＲ）は、画素数２４４８×２０５０、ＲＧＢ各８ビット階調で、光学倍率１．３倍のレンズを用いた。このとき画像の解像度は約２．７μｍであった。【０１００】
撮像された元画像を白黒画像に変換したものが図６（気泡のない試料）および図７（気泡の多い試料）である。図６および図７に示す試料には、ほぼ同程度の量の癌細胞が含まれる。なお、前述の図４も本実験例と同じ方法で得られた画像である。元画像をＲＧＢの３色に色分解して、Ｇ画像を第１画像、Ｒ画像を第２画像とした。第１画像と第２画像を画素毎に比較して、明度の差が３５以内の場合に、癌細胞ではないと判断した。前述の式１によって、画素毎に吸光度を算出し、試料の全範囲にわたって積算して、癌細胞の推定体積値を求めた。このとき、式１の定数Ｃの値は２．０×１０−４を用いた。【０１０１】
比較実験例として、第２画像を利用せず、第１画像の明度から吸光度を算出し、試料の全範囲にわたって積算して、癌細胞の推定体積値を同様に求めた。【０１０２】
実験例の方法で得られた推定体積値は、図６が０．４２、図７が０．４４であった。比較実験例の方法では、図６が０．４７、図７が１．５４であった。気泡のない図６では、実験例と比較実験例で同程度の推定体積値が得られた。他方、気泡の多い図７では、比較実験例による推定体積値は、実験例のそれの約３倍であった。これは、気泡によるノイズの影響であり、実験例では気泡によるノイズが排除できた。【０１０３】
本発明の細胞測定方法は、上記の実施形態や実施例に限定されるものではなく、その技術的思想の範囲内で様々な変形が可能である。【０１０４】
例えば、上記の実施形態では、明度の相対化（ブランク補正）、第１画像と第２画像の比較によるゴミ・気泡等のノイズ排除、線維芽細胞のノイズ排除の順に実施されるが、これらはそれぞれ順番を入れ替えて実施してもよい。【０１０５】
また、例えば、白色照明を用いて、カメラの前方に設けたカラーフィルタを順次切り替えて撮影し、第１画像および第２画像を取得してもよい。【０１０６】
また、例えば、照明に連続スペクトルを有する白色光源を用い、カラーカメラで撮像して色分解をすることで、第１画像と第２画像を取得してもよい。ただし、カラーカメラの撮像素子は一般に感度スペクトルが広く一部が重複しているため、波長の異なる２つの光源を用いる方が、第１画像と第２画像の違いが明瞭に得られる。
【符号の説明】
【０１０７】
１０  測定装置、１１  試料ステージ、１２  照明、１３  ＬＥＤパッケージ、１４  照明電源、１５  光拡散板、１６  カラーカメラ、１７  画像処理装置、２０  試料、Ａ  吸光度、Ｂ  暗画像明度、ＩＲ  基準区間長さ、あるいは基準差、Ｓ  階調数、Ｔ  明度、Ｔｈ  閾値、Ｖ  推定体積値、Ｗ  ブランク画像明度
【図１】
2018084002.tif 000003
【図２】
2018084002.tif 000004
【図３】
2018084002.tif 000005
【図４】
2018084002.tif 000006
【図５】
2018084002.tif 000007
【図６】
2018084002.tif 000008
【図７】
2018084002.tif 000009
【図８】
2018084002.tif 000010
【図９】
2018084002.tif 000011
【図１０】
2018084002.tif 000012
【図１１】
2018084002.tif 000013
【図１２】
2018084002.tif 000014
【図１３】
2018084002.tif 000015
【図１４】
2018084002.tif 000016
【図１５】
2018084002.tif 000017
【国際調査報告】
2018084002.tif 000018
2018084002.tif 000019
2018084002.tif 000020
2018084002.tif 000021