(57)【要約】  Ｃ４ジカルボン酸生産能の向上した変異糸状菌、及び該変異糸状菌を用いたＣ４ジカルボン酸の製造方法の提供。以下：配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド；ならびに、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド、からなる群より選択される少なくとも１種のポリペプチドの発現が強化された、変異糸状菌。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択される少なくとも１種のポリペプチドの発現が強化された、変異糸状菌：
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド；ならびに、
配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下からなる群より選択される少なくとも１種のポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片又はベクターを導入された、請求項１記載の変異糸状菌：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；ならびに、
配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記糸状菌がリゾプス属菌である、請求項１又は２記載の変異糸状菌。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の変異糸状菌を培養することを含む、Ｃ４ジカルボン酸の製造方法。
【請求項５】
前記培養物からＣ４ジカルボン酸を回収することをさらに含む、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
前記Ｃ４ジカルボン酸がフマル酸、リンゴ酸又はコハク酸である、請求項４又は５記載の製造方法。
【請求項７】
宿主糸状菌において、以下からなる群より選択される少なくとも１種のポリペプチドの発現を強化することを含む、変異糸状菌の製造方法：
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド；ならびに、
配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項８】
前記発現の強化が、以下からなる群より選択される少なくとも１種のポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片又はベクターを導入することを含む、請求項７記載の方法：
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；ならびに、
配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記糸状菌がリゾプス属菌である、請求項７又は８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異糸状菌、及びそれを用いたＣ４ジカルボン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ４ジカルボン酸は、酸味料や抗菌剤、ｐＨ調整剤として食品工業において様々な用途に利用されるほか、合成樹脂や生分解性ポリマーの原料としても用いられるなど、工業的な価値が高い物質である。Ｃ４ジカルボン酸は、工業的には石化原料由来の化学合成、又は微生物発酵のいずれかにより製造される。従前は、より低コストなため化学合成法が主流であったが、近年、原料の高騰や、環境負荷などの観点から、循環再生資源を原料とする微生物発酵による製造方法が注目されている。【０００３】
Ｃ４ジカルボン酸の一つであるフマル酸は、リゾプス属菌（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）等の発酵菌を用いて製造できることが知られている。リゾプス属菌は、グルコースを炭素源としてフマル酸を生産し、菌体外に排出する。これまでに、リゾプス属菌のフマル酸高生産化のための手法に関しては、培養法の改良や変異育種による高生産性菌株の作製等が知られている。しかしながら、リゾプス属菌の遺伝学的背景は未だ充分に研究されていないことから、遺伝子組換えによるリゾプス属菌のフマル酸高生産化技術の開発は容易ではなく、報告も少ない。わずかに、サッカロマイセス・セレビシエ由来のピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子をリゾプス・デレマーに導入すること（特許文献１）、及び大腸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子をリゾプス・オリゼに導入すること（非特許文献１）によるフマル酸生産性向上が報告されている。【０００４】
リンゴ酸酵素（ｍａｌｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ、ＭＥ）は、ＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+の還元と共役してリンゴ酸を酸化的に脱炭酸し、ピルビン酸とＣＯ2を生成する反応を触媒する酵素である。ＭＥは、大腸菌の細胞質に存在するほか、Streptococcus属、Candida属、Bradyrhizobium属、Corynebacterium属、ならびに油性酵母、Mucor circinelloides及びMortierella alpine等の脂質生産菌で見出されており、光合成、脂質合成、エネルギー代謝などの様々な代謝経路に関与していることが報告されている。非特許文献２には、リンゴ酸酵素遺伝子sfcAを導入した大腸菌において、コハク酸生産量が増加したことが報告されている。特許文献２には、fum遺伝子をノックアウトし、リンゴ酸酵素遺伝子を過剰発現させた大腸菌において、リンゴ酸生産量が増加したことが報告されている。一方で、リゾプス属等の糸状菌の代謝経路におけるＭＥの役割については未だ不明である。【０００５】
（特許文献１）中国特許出願公開第１０３０１３８４３号明細書
（特許文献２）中国特許第１０１２５５４０５号公報
（非特許文献１）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１２，１４：５１２−５２０
（非特許文献２）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００１，７４：８９−９５
【発明の概要】
【０００６】
一態様において、本発明は、以下：
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド；ならびに、
配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド、
からなる群より選択される少なくとも１種のポリペプチドの発現が強化された、変異糸状菌を提供する。
【０００７】
別の一態様において、本発明は、上記変異糸状菌を培養することを含む、Ｃ４ジカルボン酸の製造方法を提供する。
【０００８】
さらなる一態様において、本発明は、宿主糸状菌において、以下：
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド；ならびに、
配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド、
からなる群より選択される少なくとも１種のポリペプチドの発現を強化することを含む、変異糸状菌の製造方法を提供する。
【０００９】
さらなる一態様において、本発明は、糸状菌において、以下：
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド；ならびに、
配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド、
からなる群より選択される少なくとも１種のポリペプチドの発現を強化することを含む、糸状菌におけるＣ４ジカルボン酸生産能の向上方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
本発明は、Ｃ４ジカルボン酸生産能の向上した変異糸状菌、及び該変異糸状菌を用いたＣ４ジカルボン酸の製造方法に関する。
【００１１】
本発明者は、鋭意検討した結果、所与のアミノ酸配列からなるリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドの発現が強化された糸状菌が、そのＣ４ジカルボン酸生産能を向上させることを見出した。
【００１２】
本発明によれば、Ｃ４ジカルボン酸生産能が向上した変異糸状菌、及びその製造方法が提供される。本発明の変異糸状菌は、Ｃ４ジカルボン酸の生物学的生産のために有用である。本発明の変異糸状菌を用いたＣ４ジカルボン酸の製造方法によれば、効率の良いＣ４ジカルボン酸生産が可能になる。本発明の上記及び他の特徴及び利点は、以下の本明細書の記載からより明らかになるであろう。
【００１３】
（１．定義）
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹ  Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１４】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【００１５】
本明細書における「１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列」とは、１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列をいう。また本明細書における「１個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列」とは、１個以上９０個以下、好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらにより好ましくは１個以上９個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列をいう。本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端へのアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
【００１６】
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
【００１７】
本明細書において、制御領域と遺伝子との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【００１８】
本明細書において、微生物の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該微生物の野生型に存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該微生物に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、微生物に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された微生物と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
【００１９】
本明細書において、微生物の「Ｃ４ジカルボン酸生産能」は、該微生物の培養培地におけるＣ４ジカルボン酸の生産速度として表され、より詳細には、該微生物の培養開始後一定時間経過時までに該微生物により生産されたＣ４ジカルボン酸の培地体積あたりの質量を培養時間で割った値（ｇ／Ｌ／ｈ)で表される。微生物のＣ４ジカルボン酸の生産量は、該微生物の培養物から細胞を除いた培養上清中のＣ４ジカルボン酸の量として算出することができる。培養上清中のＣ４ジカルボン酸の量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により測定することができる。より具体的な測定手順は、後述の参考例１に例示する。
【００２０】
本明細書において、変異体における「Ｃ４ジカルボン酸生産能の向上」とは、該変異体のＣ４ジカルボン酸生産能が、宿主又はコントロールと比較して向上されたことをいう。変異体におけるＣ４ジカルボン酸生産能の向上率は、以下の式で計算される。
向上率（％）
＝（変異体のＣ４ジカルボン酸生産能／宿主又はコントロールのＣ４ジカルボン酸生産能）×１００−１００
ここで、変異体とは、宿主細胞に対して所与の形質が変化するような改変を加えた細胞をいい、宿主とは、該変異体の宿主（親細胞又は親生物体）をいう。コントロールとしては、該変異体と同じ改変を加えた宿主細胞と異なる種の細胞又は生物体、あるいは該改変を加えなかった宿主細胞又は生物体（例えば、空ベクターもしくはコントロール配列を導入した宿主細胞や生物体など）が挙げられる。好ましくは、変異体におけるＣ４ジカルボン酸生産能の向上率は、該変異体によるＣ４ジカルボン酸の生産速度が最大となる時点における、各細胞又は生物体のＣ４ジカルボン酸生産能に基づいて計算される。本明細書において、「Ｃ４ジカルボン酸生産能がＸ％以上向上した変異体」とは、上記式で計算されるＣ４ジカルボン酸生産能の向上率がＸ％以上である変異体をいい、また変異体における「Ｃ４ジカルボン酸生産能のＸ％以上の向上」とは、上記式で計算される該変異体のＣ４ジカルボン酸生産能の向上率がＸ％以上であることを意味する。
【００２１】
本発明により製造されるＣ４ジカルボン酸の例としては、フマル酸、リンゴ酸、及びコハク酸が挙げられ、好ましくはフマル酸及びリンゴ酸、より好ましくはフマル酸が挙げられる。
【００２２】
本明細書において、「リンゴ酸酵素活性」とは、リンゴ酸を脱炭酸してピルビン酸とＣＯ2を生成する活性をいい、好ましくは、下記に示す、ＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+の還元と共役してリンゴ酸を酸化的に脱炭酸し、ピルビン酸とＣＯ2、及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成する反応を触媒する活性である。
L-malate + NAD(P)+ ⇔  pyruvate + CO2 + NAD(P)H
リンゴ酸酵素活性は、公知の方法（例えば、Ｗ．Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１０，４５：１２１−１２８に記載の方法）により測定することができる。
【００２３】
本明細書において、「リンゴ酸酵素」（ｍａｌｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ、ＭＥ）とは、上述したリンゴ酸酵素活性を有する酵素であり、その例としては、ＥＣ１．１．１．３８（ＮＡＤ+のみを利用することが出来るＮＡＤ−ＭＥ）、ＥＣ１．１．１．３９（ＮＡＤ+とＮＡＤＰ+の両方を利用することが出来るＮＡＤ（Ｐ）−ＭＥ）又はＥＣ１．１．１．４０（ＮＡＤＰ+のみを利用することが出来るＮＡＤＰ−ＭＥ）に分類される、ＮＡＤ−リンゴ酸酵素及びＮＡＤＰ−リンゴ酸酵素が挙げられる。
【００２４】
（２．変異糸状菌及びその製造方法）
（２．１．変異糸状菌）
一態様において、本発明は、リンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドの発現が強化された変異糸状菌を提供する。
【００２５】
一実施形態において、本発明の変異糸状菌において発現強化されるリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドの例としては、以下が挙げられる：
（a）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（b）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド；ならびに、
（c）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド。
【００２６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、リゾプス属菌起源のリンゴ酸酵素である。配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＲＯ３Ｇ＿０４５１２として登録されており、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなる遺伝子にコードされる。
【００２７】
本発明の変異糸状菌において発現強化されるリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドとしては、上記に列挙したポリペプチド（a）〜（c）からなる群より選択されるいずれか１種又はいずれか２種以上が挙げられる。
【００２８】
（２．２．変異糸状菌の製造）
本発明の変異糸状菌は、糸状菌を改変し、上記リンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドの発現を強化することによって製造することができる。したがって、さらなる態様において、本発明は、宿主糸状菌において、上記リンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドの発現を強化することを含む、変異糸状菌の製造方法を提供する。
【００２９】
本発明の変異糸状菌の宿主糸状菌としては、細区分真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）に属する全ての糸状形の菌が包含される（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ｂＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより定義されるもの）。
【００３０】
本発明の変異糸状菌の宿主糸状菌の好ましい例としては、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ属、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ属、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属、Ｐａｒａｓｉｔｅｌｌａ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属、Ｐｈｌｅｂｉａ属、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ属、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｔｒａｍｅｔｅｓ属、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属の糸状菌が挙げられる。このうち、Ｃ４ジカルボン酸の生産性の観点からは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｇｒｉｃａｎｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｔｏｎｋｉｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ等のＲｈｉｚｏｐｕｓ属菌が好ましく、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ及びＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅがより好ましく、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒがさらに好ましい。
【００３１】
一実施形態において、本発明の変異糸状菌の宿主糸状菌は、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属菌の変異株であってもよく、該変異株の例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子欠失（Δａｄｈ）株（特願２０１６−０００１８４、その全体が本明細書において参考として援用される）、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子欠失（Δｐｄｃ）株（ＰＣＴ／ＪＰ２０１７／００３６４７、その全体が本明細書において参考として援用される）などが挙げられる。
【００３２】
宿主糸状菌においてリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドの発現を強化する手段としては、宿主細胞に対して該ポリペプチドをコードする遺伝子を外部から発現可能に導入するか、又は宿主ゲノム上の該ポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域を改変することによって、宿主内での該遺伝子の転写量を向上させる方法などが挙げられる。
【００３３】
好ましい実施形態において、本発明によるリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドの発現の強化は、該ポリペプチドをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片又はベクターを、宿主糸状菌に導入することによって行われる。該ＤＮＡ断片又はベクターに含まれるリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が発現することによって、目的のリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドの発現量が増加する。
【００３４】
好ましい実施形態において、発現強化されるべきリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子としては、以下が挙げられる：
（a'）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（b'）配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；ならびに、
（c'）配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【００３５】
本発明による変異糸状菌の製造方法において、上記に挙げたポリヌクレオチド（a'）〜（c'）は、いずれか１種又はいずれか２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００３６】
上記に挙げたポリヌクレオチドは、１本鎖もしくは２本鎖の形態であり得、又はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。該ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ等の人工ＤＮＡであり得る。
【００３７】
当該ポリヌクレオチド（a'）〜（c'）は、遺伝子工学的又は化学的に合成することができる。例えば、配列番号１で示されるポリヌクレオチドは、リゾプス属菌、例えばＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ等から単離することにより調製することができる。あるいは、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を基に、化学合成することができる。配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに対して、紫外線照射や部位特異的変異導入のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入することによって作製することができる。
【００３８】
ヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する手法としては、例えば、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸等の化学的変異原又は紫外線、Ｘ線、ガンマ線、イオンビーム等の物理的変異原による突然変異誘発、部位特異的変異導入法、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂａｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，５８１−６２１，１９９５）に記載の方法、などが挙げられる。部位特異的変異導入の手法としては、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥ）ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７７，６１−６８，１９８９）を利用した方法、ＯＤＡ法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５２，２７１−２７６，１９９５）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２，４８８）等が挙げられる。あるいは、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｕｔａｎ−ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍキット（タカラバイオ社）、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡社）等の市販の部位特異的変異導入用キットを利用することもできる。
【００３９】
好ましくは、宿主糸状菌に導入されるポリヌクレオチドを含有するベクターは、発現ベクターである。また好ましくは、該ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを宿主に導入することができ、かつ宿主内で該ポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターである。好ましくは、該ベクターは、該ポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む。該ベクターは、プラスミド等の染色体外で自立増殖及び複製可能なベクターであってもよく、又は染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
【００４０】
具体的なベクターの例としては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９等のｐＵＣ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＥＴ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア）、ｐＣｏｌｄ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）、ｐＵＢ１１０（Ｍｃｋｅｎｚｉｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｌａｓｍｉｄ  １５（２）：９３−１０３）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ）、ｐＲＳ４０３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＭＷ２１８／２１９（ニッポンジーン）、ｐＲＩ９０９／９１０等のｐＲＩ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＰＴＲ１／２（タカラバイオ）、ｐＢＩ系ベクター（クロンテック）、ＩＮ３系ベクター（インプランタイノベーションズ）、ｐＤＪＢ２（Ｄ．Ｊ．Ｂａｌｌａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３６，３２１−３３１，１９８５）、ｐＡＢ４−１（ｖａｎ  Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ，２０６，７１−７５，１９８７）、ｐＬｅｕ４（Ｍ．Ｉ．Ｇ．Ｒｏｎｃｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８４，３３５−３４３，１９８９）、ｐＰｙｒ２２５（Ｃ．Ｄ．Ｓｋｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６８，３９７−４０６，２００２）、ｐＦＧ１（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ，１８，４４７−４５１，１９９０）などが挙げられる。
【００４１】
宿主糸状菌に導入されるポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片の例としては、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片及び制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。好ましくは、該ＤＮＡ断片は、該ポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む発現カセットであり得る。
【００４２】
当該ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる制御領域は、該ベクター又はＤＮＡ断片が導入された宿主内で、導入されたポリヌクレオチドを発現させるための配列であり、例えば、プロモーターやターミネーター等の発現調節領域、複製開始点などが挙げられる。該制御領域の種類は、ベクター又はＤＮＡ断片を導入する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。必要に応じて、該ベクター又はＤＮＡ断片はさらに、抗生物質耐性遺伝子、アミノ酸合成関連遺伝子等の選択マーカーを有していてもよい。
【００４３】
好ましくは、当該ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる制御領域は、宿主ゲノムに本来備わるポリヌクレオチド（a'）〜（c'）の制御領域と比較して、より高い転写活性を有する制御領域（いわゆる強制御領域）である。リゾプス属菌についての当該強制御領域の例としては、これらに限定されないが、ｌｄｈＡプロモーター（米国特許第６２６８１８９号）、ｐｇｋ１プロモーター（国際公開第２００１／７３０８３号）、ｐｇｋ２プロモーター（国際公開第２００１／７２９６７号）、ｐｄｃＡプロモーター及びａｍｙＡプロモーター（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，１８６：４１−５０）、ｔｅｆ及び１８ＳｒＲＮＡプロモーター（米国特許出願公開第２０１０／１１２６５１号）、ａｄｈ１プロモーター（国際公開第２０１７／０２２５８３号）などが挙げられる（本段落において引用された文献は、その全体が本明細書において参考として援用される）。強制御領域のさらなる例としては、これらに限定されないが、ｒＲＮＡオペロンの制御領域、リボソームタンパク質をコードする遺伝子の制御領域などが挙げられる。
【００４４】
当該ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる目的のポリヌクレオチド及び制御領域は、宿主の核に導入されてもよいが、宿主ゲノムに導入されてもよい。あるいは、当該ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる目的のポリヌクレオチドを、宿主ゲノムに直接導入して、該ゲノム上の高発現プロモーターと作動可能に連結させてもよい。ポリヌクレオチドをゲノムに導入する手段としては、相同組換え法が挙げられる。
【００４５】
宿主糸状菌へのベクター又はＤＮＡ断片の導入には、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いることができる。
【００４６】
ベクター又はＤＮＡ断片を宿主ゲノムに導入する手段の例としては、これに限定されるものではないが、人工ＤＮＡ切断酵素（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＤＮＡ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ又はＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いたゲノム編集が挙げられる。ゲノム編集技術としては、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＺＦＮ（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、又はＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）−Ｃａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１、Ｈｏｍｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ｃｏｍｐａｃｔ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ＴＡＬＥＮなどが挙げられる。これらの技術に基づくゲノム編集のためのキットは市販されており、例えばＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ社、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社などから購入することができる。
【００４７】
目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された変異体は、選択マーカーを利用して選択することができる。例えば、選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合、該抗生物質添加培地で細胞を培養することで、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された変異体を選択することができる。また例えば、選択マーカーがアミノ酸合成関連遺伝子、塩基合成関連遺伝子等の栄養要求性関連遺伝子である場合、該栄養要求性の宿主に遺伝子導入した後、該栄養要求性の有無を指標に、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された変異体を選択することができる。あるいは、ＰＣＲ等によって変異体のＤＮＡ配列を調べることで目的のベクター又はＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
【００４８】
別の好ましい実施形態において、本発明によるリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドの発現の強化は、宿主糸状菌のゲノム上における該ポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域を改変し、該遺伝子の転写量を向上させることによって行われる。本実施形態で転写量向上の標的とする遺伝子としては、上述したポリヌクレオチド（a'）〜（c'）のいずれか１種又はいずれか２種以上が挙げられる。
【００４９】
目的の遺伝子の転写量を向上させるためのゲノム改変の手順としては、例えば、宿主ゲノム上の目的の遺伝子の制御領域に対し、上述した強制御領域を置換するか又は挿入して、該強制御領域を目的の遺伝子と作動可能に連結させることが挙げられる。ゲノム領域の置換又は挿入の手段としては、相同組換え法が挙げられ、さらに上述したゲノム編集技術を組み合わせてもよい。
【００５０】
以上の手順で得られた本発明の変異糸状菌は、その宿主（親糸状菌）と比較して、リンゴ酸酵素活性が向上している。好ましくは、本発明の変異糸状菌のリンゴ酸酵素活性は、宿主に対して１．１倍以上、より好ましくは１．５倍以上、さらに好ましくは２倍以上である。
【００５１】
（２．３．Ｃ４ジカルボン酸生産能の向上）
本発明の変異糸状菌は、その宿主と比較して、Ｃ４ジカルボン酸生産能が向上している。好ましくは、本発明の変異糸状菌のＣ４ジカルボン酸生産能は、宿主に対して１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上向上している。
【００５２】
（３．Ｃ４ジカルボン酸の製造）
本発明の変異糸状菌は、Ｃ４ジカルボン酸生産能が向上している。したがって、さらなる態様において、本発明は、上記本発明の変異糸状菌を培養することを含むＣ４ジカルボン酸の製造方法を提供する。該本発明の製造方法により製造されるＣ４ジカルボン酸としては、フマル酸、リンゴ酸、及びコハク酸が挙げられ、好ましくはフマル酸及びリンゴ酸、より好ましくはフマル酸が挙げられる。
【００５３】
変異糸状菌を培養するための培地及び培養条件は、該変異糸状菌の宿主の種類に応じて適宜選択することができる。一般的には、該変異糸状菌の宿主に対して通常用いられる培地及び培養条件を採用することができる。
【００５４】
例えば、培養温度は、１０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜４５℃であればよい。培養期間は、目的のＣ４ジカルボン酸が充分に産生される期間であれば特に限定されないが、例えば１〜２４０時間、好ましくは１２〜１２０時間、好ましくは２４〜７２時間であり得る。攪拌又は通気下で培養することが好ましい。
【００５５】
糸状菌培養のための培地としては、通常用いられるものを使用すればよい。好ましくは、該培地は液体培地であり、また合成培地、天然培地、及び合成培地に天然成分を添加した半合成培地のいずれであってもよい。市販のＰＤＢ培地（ポテトデキストロース培地；ベクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー製等）、ＰＤＡ培地（ベクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー製等）、ＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地；日本製薬社製（商標名「ダイゴ」）等）、ＮＢ培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ；ベクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー製等）、ＳＢ培地（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ培地；ＯＸＯＩＤ社製等）、ＳＤ培地（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｒｏｐｏｕｔ  Ｂｒｏｔｈ；例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ）なども使用可能である。当該培地には、炭素源、窒素源、無機塩等が含まれるのが一般的であるが、各成分組成は適宜選択可能である。
【００５６】
以下に、糸状菌培養のための好ましい培地組成について詳述する。以下に記載する培地中の各成分の濃度は、初発（培地調製時又は培養開始時）の濃度を表す。
【００５７】
当該培地中の炭素源の例としては、グルコース、マルトース、でんぷん加水分解物、フルクトース、キシロース、スクロース等が挙げられ、このうち、グルコース及びフルクトースが好ましい。これらの糖類は、単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。該培地中の炭素源の濃度は、好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは５％（ｗ／ｖ）以上、さらにより好ましくは７．５％（ｗ／ｖ）以上であって、かつ好ましくは４０％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは３０％（ｗ／ｖ）以下である。あるいは、当該培地中の炭素源の濃度は、好ましくは１〜４０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは５〜３０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは７．５〜３０％（ｗ／ｖ）である。
【００５８】
当該培地中の窒素源の例としては、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム等の含窒素化合物が挙げられる。該培地中の窒素源の濃度は、好ましくは０．００１〜０．５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００１〜０．２％（ｗ／ｖ）である。
【００５９】
当該培地には、硫酸塩、マグネシウム塩、亜鉛塩などを含有することができる。硫酸塩の例としては、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等が挙げられる。マグネシウム塩の例としては、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。亜鉛塩の例としては、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、塩化亜鉛等が挙げられる。該培地中の硫酸塩の濃度は、好ましくは０．００１〜０．５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００１〜０．２％（ｗ／ｖ）である。該培地中のマグネシウム塩の濃度は、好ましくは０．００１〜０．５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１〜０．１％（ｗ／ｖ）である。該培地中の亜鉛塩の濃度は、好ましくは０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００５〜０．０５％（ｗ／ｖ）である。
【００６０】
当該培地のｐＨ（２５℃）は、好ましくは３〜７、より好ましくは３．５〜６である。培地のｐＨは、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア等の塩基、又は硫酸、塩酸等の酸を用いて調整することができる。
【００６１】
当該培地の好ましい例としては、７．５〜３０％炭素源、０．００１〜０．２％硫酸アンモニウム、０．０１〜０．６％リン酸２水素カリウム、０．０１〜０．１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００５〜０．０５％硫酸亜鉛・７水和物、及び３．７５〜２０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する液体培地が挙げられる。
【００６２】
糸状菌を用いてより効率的にＣ４ジカルボン酸を生産するには、以下に示すような工程で生産を行ってもよい。すなわち、糸状菌の胞子懸濁液を調製し（工程Ａ）、それを培養液で培養して胞子を発芽させ菌糸体を調製し（工程Ｂ１）、好適にはさらに当該菌糸体を増殖させ（工程Ｂ２）、次いで調製した菌糸体を培養してＣ４ジカルボン酸を生産させること（工程Ｃ）により、効率よくＣ４ジカルボン酸を製造することができる。ただし、本発明における変異糸状菌の培養工程は、以下の工程に限定されない。
【００６３】
＜工程Ａ：胞子懸濁液の調製＞
変異糸状菌の胞子を、例えば、無機寒天培地（組成例：２％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、１．５％寒天、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））、ＰＤＡ培地、等の培地に接種し、１０〜４０℃、好ましくは２７〜３０℃にて、７〜１０日間静置培養を行なうことにより胞子を形成させ、次いで生理食塩水などに懸濁することで、胞子懸濁液を調製することができる。胞子懸濁液には菌糸体が含まれていても、含まれていなくてもよい。
【００６４】
＜工程Ｂ１：菌糸体の調製＞
工程Ａで得られた胞子懸濁液を、培養液に接種して培養し、胞子を発芽させて菌糸体を得る。培養液に接種する糸状菌の胞子数は、１×１０2〜１×１０8個−胞子／ｍＬ−培養液、好ましくは１×１０2〜５×１０4個−胞子／ｍＬ−培養液、より好ましくは５×１０2〜１×１０4個−胞子／ｍＬ−培養液、さらに好ましくは１×１０3〜１×１０4個−胞子／ｍＬ−培養液である。培養液には、市販の培地、例えば、ＰＤＢ培地、ＬＢ培地、ＮＢ培地、ＳＢ培地、ＳＤ培地等が利用できる。該培養液には、発芽率と菌体生育の観点から、炭素源としてグルコース、キシロースなどの単糖、シュークロース、ラクトース、マルトースなどのオリゴ糖、又はデンプン等の多糖；グリセリン、クエン酸などの生体成分；窒素源として硫酸アンモニウム、尿素、アミノ酸等；その他無機物としてナトリウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、リン酸等の各種塩類、を適宜添加することができる。単糖、オリゴ糖、多糖及びグリセリンの好ましい濃度は０．１〜３０％（ｗ／ｖ）、クエン酸の好ましい濃度は０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム、尿素及びアミノ酸の好ましい濃度は０．０１〜１％（ｗ／ｖ）、無機物の好ましい濃度は０．０００１〜０．５％（ｗ／ｖ）である。当該培養液に胞子懸濁液を接種し、好ましくは８０〜２５０ｒｐｍ、より好ましくは１００〜１７０ｒｐｍで攪拌しながら、２５〜４２．５℃の培養温度制御下で、好ましくは２４〜１２０時間、より好ましくは４８〜７２時間培養する。培養に供する培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、２００ｍＬ容バッフル付フラスコの場合は５０〜１００ｍＬ程度、５００ｍＬ容バッフル付フラスコの場合は１００〜３００ｍＬ程度であればよい。この培養により、接種した胞子は発芽し、菌糸体へと成長する。
【００６５】
＜工程Ｂ２：菌糸体の増殖＞
Ｃ４ジカルボン酸生産能向上の観点から、工程Ｂ１で得られた菌糸体をさらに培養して増殖させる工程（工程Ｂ２）を行うことが好ましい。工程Ｂ２で使用する増殖用の培養液は特に限定されないが、通常使用されるグルコースを含む無機培養液であればよく、例えば、７．５〜３０％グルコース、０．００１〜０．２％硫酸アンモニウム、０．０１〜０．６％リン酸２水素カリウム、０．０１〜０．１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００５〜０．０５％硫酸亜鉛・７水和物、及び３．７５〜２０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液等が挙げられる。当該培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、５００ｍＬ容三角フラスコの場合は５０〜３００ｍＬ、好ましくは１００〜２００ｍＬであればよい。この培養液に、工程Ｂ１で培養した菌体を、湿重量として１〜６ｇ−菌体／１００ｍＬ−培養液、好ましくは３〜４ｇ−菌体／１００ｍＬ−培養液となるよう接種し、１００〜３００ｒｐｍ、好ましくは１７０〜２３０ｒｐｍで攪拌しながら、２５〜４２．５℃の培養温度制御下で、１２〜１２０時間、好ましくは２４〜７２時間培養する。
【００６６】
＜工程Ｃ：Ｃ４ジカルボン酸生産＞
上記の手順（工程Ｂ１又はＢ２）で得られた糸状菌の菌糸体を培養して、当該菌にＣ４ジカルボン酸を生産させる。該培養の条件は、上述した通常の糸状菌の培養条件に従えばよい。培地の量は、２００ｍＬ容三角フラスコの場合は２０〜８０ｍＬ程度、５００ｍＬ容三角フラスコの場合は５０〜２００ｍＬ程度、３０Ｌジャーファーメンターの場合は１０Ｌ〜１５Ｌ程度とすることができるが、培養容器にあわせて適宜調整すればよい。培地に対する工程Ｂ１又はＢ２で得られた菌体の接種量は、好ましくは湿重量として５ｇ〜９０ｇ−菌体／１００ｍＬ−培地、より好ましくは５ｇ〜５０ｇ−菌体／１００ｍＬ−培地であり得る。好適には、培養は、１００〜３００ｒｐｍ、好ましくは１５０〜２３０ｒｐｍで攪拌しながら、２５〜４５℃の温度下で、２時間〜２４０時間、好ましくは１２時間〜１２０時間行われる。ジャーファーメンターを用いる場合は、通気は好ましくは０．０５〜２ｖｖｍ、より好ましくは０．１〜１．５ｖｖｍにて行う。
【００６７】
以上の手順で本発明の変異糸状菌を培養し、Ｃ４ジカルボン酸を生産させる。培養後、培養物からＣ４ジカルボン酸を回収する。必要に応じて、回収したＣ４ジカルボン酸をさらに精製してもよい。培養物からＣ４ジカルボン酸を回収又は精製する方法は、特に限定されず、公知の回収又は精製方法に従って行えばよい。例えば、傾斜法、ろ過、遠心分離などにより培養物から細胞等を除去し、残った培養物を、必要に応じて濃縮した後、晶析法、イオン交換法、溶剤抽出法等の方法、又はこれらの組み合わせにかけることで、該培養物中のＣ４ジカルボン酸を回収又は精製することができる。
【００６８】
培養物から分離された本発明の変異糸状菌は、Ｃ４ジカルボン酸生産に再利用することができる。例えば、培養物から分離した本発明の変異糸状菌に、上述した培地を新たに加え、再び上記条件で培養してＣ４ジカルボン酸を生産させ、次いで生産されたＣ４ジカルボン酸を培地から回収することができる。さらにこの過程を繰り返すことができる。本発明の製造方法において、変異糸状菌の培養及びＣ４ジカルボン酸の回収は、回分式、半回分式及び連続式のいずれの方法で行ってもよい。
【００６９】
（４．例示的実施形態）
本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００７０】
〔１〕以下からなる群より選択される少なくとも１種のポリペプチドの発現が強化された、変異糸状菌：
（a）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（b）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド；ならびに、
（c）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド。
【００７１】
〔２〕好ましくは、以下からなる群より選択される少なくとも１種のポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片又はベクターを導入された、〔１〕記載の変異糸状菌：
（a'）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（b'）配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；ならびに、
（c'）配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【００７２】
〔３〕好ましくは、前記ＤＮＡ断片又はベクターが、前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された制御領域をさらに含有する、〔２〕記載の変異糸状菌。
【００７３】
〔４〕好ましくは、前記ＤＮＡ断片又はベクターが、核内もしくはゲノムに導入されている、〔２〕又は〔３〕記載の変異糸状菌。
【００７４】
〔５〕好ましくは、ゲノム上の前記ポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域が、該遺伝子の転写量を向上させるように改変されており、該遺伝子が、以下からなる群より選択される少なくとも１種である、〔１〕記載の変異糸状菌：
（a'）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（b'）配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；ならびに、
（c'）配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【００７５】
〔６〕好ましくは、前記制御領域に対して強制御領域が置換又は挿入されている、〔５〕記載の変異糸状菌。
【００７６】
〔７〕好ましくは、前記糸状菌がリゾプス属菌である、〔１〕〜〔６〕のいずれか１項記載の変異糸状菌。
【００７７】
〔８〕前記リゾプス属菌が、
好ましくは、リゾプス・デレマー又はリゾプス・オリゼであり、
より好ましくはリゾプス・デレマーである、
〔７〕記載の変異糸状菌。
【００７８】
〔９〕好ましくは、前記リゾプス属菌がΔａｄｈ又はΔｐｄｃ株である、〔７〕又は〔８〕記載の変異糸状菌。
【００７９】
〔１０〕Ｃ４ジカルボン酸生産能が、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上向上している、〔１〕〜〔９〕のいずれか１項記載の変異糸状菌。
【００８０】
〔１１〕前記Ｃ４ジカルボン酸が、
好ましくは、フマル酸、リンゴ酸又はコハク酸であり、
より好ましくはフマル酸又はリンゴ酸であり、
さらに好ましくはフマル酸である、
〔１０〕記載の変異糸状菌。
【００８１】
〔１２〕〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項記載の変異糸状菌を培養することを含む、Ｃ４ジカルボン酸の製造方法。
【００８２】
〔１３〕前記培養物からＣ４ジカルボン酸を回収することをさらに含む、〔１２〕記載の製造方法。
【００８３】
〔１４〕前記Ｃ４ジカルボン酸が、
好ましくは、フマル酸、リンゴ酸又はコハク酸であり、
より好ましくはフマル酸又はリンゴ酸であり、
さらに好ましくはフマル酸である、
〔１２〕又は〔１３〕記載の製造方法。
【００８４】
〔１５〕宿主糸状菌において、以下からなる群より選択される少なくとも１種のポリペプチドの発現を強化することを含む、変異糸状菌の製造方法：
（a）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（b）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド；ならびに、
（c）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド。
【００８５】
〔１６〕糸状菌において、以下からなる群より選択される少なくとも１種のポリペプチドの発現を強化することを含む、糸状菌におけるＣ４ジカルボン酸生産能の向上方法：
（a）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（b）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド；ならびに、
（c）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチド。
【００８６】
〔１７〕好ましくは、前記発現の強化が、以下からなる群より選択される少なくとも１種のポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片又はベクターを導入することを含む、〔１５〕又は〔１６〕記載の方法：
（a'）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（b'）配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；ならびに、
（c'）配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【００８７】
〔１８〕好ましくは、前記ＤＮＡ断片又はベクターが、前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された制御領域をさらに含有する、〔１７〕記載の方法。
【００８８】
〔１９〕好ましくは、前記ＤＮＡ断片又はベクターの導入が、該ＤＮＡ断片又はベクターを核内もしくはゲノムに導入することを含む、〔１７〕又は〔１８〕記載の方法。
【００８９】
〔２０〕好ましくは、ゲノム上の前記ポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域を、該遺伝子の転写量を向上させるように改変することを含み、該遺伝子が、以下からなる群より選択される少なくとも１種である、〔１５〕又は〔１６〕記載の方法：
（a'）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（b'）配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；ならびに、
（c'）配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【００９０】
〔２１〕好ましくは、前記制御領域の改変が、該制御領域に対して強制御領域を置換又は挿入することを含む、〔２０〕記載の方法。
【００９１】
〔２２〕好ましくは、前記糸状菌がリゾプス属菌である、〔１５〕〜〔２１〕のいずれか１項記載の方法。
【００９２】
〔２３〕前記リゾプス属菌が、
好ましくは、リゾプス・デレマー又はリゾプス・オリゼであり、
より好ましくはリゾプス・デレマーである、
〔２２〕記載の方法。
【００９３】
〔２４〕好ましくは、前記リゾプス属菌がΔａｄｈ又はΔｐｄｃ株である、〔２２〕又は〔２３〕記載の方法。
【００９４】
〔２５〕前記ポリペプチドの発現を強化した糸状菌のＣ４ジカルボン酸生産能が、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上向上している、〔１５〕〜〔２４〕のいずれか１項記載の方法。
【００９５】
〔２６〕前記Ｃ４ジカルボン酸が、
好ましくは、フマル酸、リンゴ酸又はコハク酸であり、
より好ましくはフマル酸又はリンゴ酸であり、
さらに好ましくはフマル酸である、
〔２５〕記載の方法。
【実施例】
【００９６】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００９７】
実施例１  変異糸状菌の作製
本実施例で用いたＰＣＲプライマーを表１−１及び表１−２に示す。【００９８】
【表１−１】
2018051837.tif 000002
【００９９】
【表１−２】
2018051837.tif 000003
【０１００】
（１）ゲノム抽出
ＰＤＡ培地にＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ  ＪＣＭ（Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／理研）５５５７株（以降、５５５７株と表記）の胞子を植菌後、３０℃で５日間培養を行った。培養後、菌体を３ｍＬ用メタルコーン（安井器械）とともに３ｍＬ破砕チューブに入れ、直ちに液体窒素中で１０分間以上凍結させた。その後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて１７００ｒｐｍで１０秒間菌体の破砕を行った。破砕後の容器にＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）（ニッポンジーン）を４００μＬ加え転倒混和し、２５０μＬを１．５ｍＬチューブに移した。該菌体溶液から、“Ｇｅｎとるくん（酵母用）”（タカラバイオ）を用いて、プロトコールに従いゲノム抽出を行った。得られたゲノム溶液５０μＬに対し、ＲＮａｓｅＡ（ロシュ）を１μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。反応後、等量のフェノール／クロロホルムを加え、タッピングにより混和した後、４℃、１４５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい１．５ｍＬチューブに移した。再度フェノール／クロロホルム処理を繰り返し、次いでエタノール沈殿を行い、５５５７株の精製ゲノム溶液を得た。【０１０１】
（２）ｃＤＮＡの作製
（i）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出
５５５７株の菌体６ｇ−湿重量を、液体培地４０ｍＬ（０．１ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．６ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、０．２５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０９ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５０ｇ／Ｌ  炭酸カルシウム、１００ｇ／Ｌグルコース）に植菌し、３５℃、１７０ｒｐｍで８時間培養した。培養液中から菌体をろ過、回収し、０．８５％生理食塩水１００ｍＬで２回洗浄を行った。洗浄後、吸引濾過により余分な水分を取り除いた後、０．３ｇを量りとり３ｍＬ用メタルコーン（安井器械）とともに３ｍＬ破砕チューブに入れ、直ちに液体窒素に投入し、凍結させた。得られた凍結菌体を、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて１７００ｒｐｍで１０秒間破砕した。破砕後の菌体にＲＬＴ  ｂｕｆｆｅｒを５００μＬ添加し、転倒混和後、４５０μＬをＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）に供し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出を行った。得られたＲＮＡ溶液４０μＬに１μＬのＤＮａｓｅＩ（ＴａＫａＲａ）及び５μＬの１０×ＤＮａｓｅＩ  ｂｕｆｆｅｒ（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を添加し、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒで５０μＬにフィルアップした後、３７℃で３０分以上反応させて溶液中の残存ＤＮＡを除去した。ＤＮａｓｅＩをさらに１μＬ追加し、３７℃で３０分間反応させた後にフェノール／クロロホルム抽出を行い、次いでエタノール沈殿を行った。沈殿を５０μＬの滅菌水に溶解し、Ｑｕｂｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＲＮＡ溶液の濃度及び純度を測定した。また、該ＲＮＡ溶液を適宜希釈し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）及びＲＮＡ６０００  Ｐｉｃｏ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて抽出したＲＮＡの検定を行った。ＲＮＡの分解度指標である「ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ値）」が６．０以上であることを確認し、得られたＲＮＡ溶液をｔｏｔａｌ  ＲＮＡとして取得した。【０１０２】
（ii）ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡ合成は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIII  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  ｆｏｒ  ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。すなわち、（i）で得られたＲＮＡ溶液１μｇをＤＥＰＣ水で８μＬにフィルアップした後、１０μＬの２×ＲＴ  Ｒｅａｘｔｉｏｎ  Ｍｉｘと、２μＬのＲＴ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを添加し、穏やかに混ぜ、２５℃で１０分間、５０℃で３０分間、８５℃で５分間反応させた。反応後の溶液に１μＬのＲＮａｓｅＨを加え３７℃で２０分間反応させ、これをｃＤＮＡ溶液とした。【０１０３】
（３）リンゴ酸酵素ＲｄＭＥ１遺伝子含有プラスミドベクターの作製
（i）ｐＵＣ１８へのｔｒｐＣ遺伝子領域の導入
上記（１）で得られた５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型に、ｔｒｐＣ遺伝子（配列番号３）を含むＤＮＡ断片を、プライマーｏＪＫ１６２（配列番号１２）及びｏＪＫ１６３（配列番号１３）を用いたＰＣＲにて合成した。次に、プラスミドｐＵＣ１８を鋳型に、プライマーｏＪＫ１６４（配列番号１４）及びｏＪＫ１６５（配列番号１５）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。以上の２断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結しプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣを構築した。【０１０４】
（ii）ＡＤＨ１プロモーター、ターミネーターのクローニング
上記（１）で得られた５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型に、ＡＤＨ１のプロモーター配列（配列番号４）を含むＤＮＡ断片とターミネーター配列（配列番号５）を含むＤＮＡ断片とを、それぞれプライマーｏＪＫ２０２（配列番号１６）及びｏＪＫ２０４（配列番号１７）、ならびにｏＪＫ２０５（配列番号１８）及びｏＪＫ２１６（配列番号１９）を用いたＰＣＲにて増幅した。次に、（i）で得られたプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣを鋳型に、プライマーｏＪＫ２１０（配列番号２０）及びｏＪＫ２１１（配列番号２１）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。以上の３断片を（i）と同様の手順で連結してプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを構築した。得られたプラスミドには、ｔｒｐＣ遺伝子領域の下流にＡＤＨ１プロモーター及びターミネーターが順に配置されている。さらにＡＤＨ１ターミネーターの下流にはＮｏｔ  Ｉ制限酵素認識配列が配置されている。【０１０５】
さらに、ｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈから、ｔｒｐＣ遺伝子領域を除いたプラスミドベクターを作製した。すなわち、上記で構築したｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーｔｒｐＣ−ｌｏｓｔ−Ｆ（配列番号２２）及びｔｒｐＣ−ｌｏｓｔ−Ｒ（配列番号２３）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。本断片を（i）と同様の手順で連結してプラスミドｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを構築した。【０１０６】
（iii）プラスミドベクター作製
リンゴ酸酵素をコードする遺伝子（以下、ＲｄＭＥ１と称する、配列番号１）を、プライマーＮＫ−１４１（配列番号２４）及びＮＫ−１６３（配列番号２５）を用いたＰＣＲにて、（２）で作製したｃＤＮＡライブラリーから増幅した。次に、（ii）で得られたプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーＮＫ−０１１（配列番号２６）及びＮＫ−０１２（配列番号２７）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。上記２断片を（i）と同様の手順で連結してプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−ＲｄＭＥ１−Ｔａｄｈを構築した。得られたプラスミドには、ＡＤＨプロモーターとターミネーターの間にＲｄＭＥ１遺伝子が挿入されている。【０１０７】
（４）ｔｒｐＣ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ用プラスミドの作製
ｐｄｃ１遺伝子ローカスにてｐｄｃ１遺伝子ＯＲＦを除き、ｔｒｐＣ遺伝子領域をｋｎｏｃｋ−ｉｎするためのプラスミドｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８を鋳型にプライマーｐＵＣ１８−Ｐａｅ１−Ｆ３（配列番号２８）及びｐＵＣ１８−Ｈｉｎｄ３−Ｒ３（配列番号２９）にて増幅したｐＵＣ１８ベクター断片と、ＪＣＭ５５５７株のゲノムを鋳型にプライマーＰＤＣ１−ｕｐｓｔｒ−Ｆ（配列番号３０）及びＰＤＣ１−ｕｐｓｔｒ−Ｒ（配列番号３１）にて増幅したｐｄｃ遺伝子のプロモーター部位断片と、ＪＣＭ５５５７株のゲノムを鋳型にプライマーｔｒｐＣｐｒｏ−Ｒ（配列番号３２）及びｔｒｐＣｔｅｒ−Ｆ（配列番号３３）にて増幅したｔｒｐＣ遺伝子領域断片と、ＪＣＭ５５５７株のゲノムを鋳型にプライマーＰＤＣ１−ｄｏｗｎｓｔｒ−Ｆ（配列番号３４）及びＰＤＣ１−ｄｏｗｎｓｔｒ−Ｒ（配列番号３５）にて増幅したｐｄｃ遺伝子のターミネーター部位断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、プラスミドｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎを構築した。【０１０８】
（５）ＲｄＭＥ１遺伝子導入用コンストラクトの作製
（i）ｔｒｐＣ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ用プラスミドとの連結
（４）で作製したプラスミドｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎを鋳型に、プライマーｏＪＫ８９９（配列番号３６）及びｏＪＫ９００（配列番号３７）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。次に、（３）（iii）で得られたプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−ＲｄＭＥ１−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーｏＪＫ９０１（配列番号３８）及びＮＫ−１９５（配列番号３９）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。上記２断片を（i）と同様の手順で連結してプラスミドｐＵＣ１８−Ｐｐｄｃ−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−ＲｄＭＥ１−Ｔｐｄｃを構築した。得られたプラスミドは、ｔｒｐＣ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ用配列を含み、またＡＤＨプロモーターとＰＤＣターミネーターの間に配列番号１で示されるＲｄＭＥ１遺伝子が挿入されている。【０１０９】
（ii）一本鎖ＤＮＡの調製
（i）で作製したプラスミドｐＵＣ１８−Ｐｐｄｃ−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−ＲｄＭＥ１−Ｔｐｄｃを鋳型にプライマーｏＪＫ９０２（配列番号４０）及びｏＪＫ９０３（配列番号４１、５’末端がリン酸化されている）を用いてＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、またプラスミドｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎを鋳型にプライマーＰＤＣ１−ｕｐｓｔｒ−Ｆ２（配列番号４２）及びＰＤＣ１−ｄｏｗｎｓｔｒ−Ｒ−Ｐ（配列番号４３、５’末端がリン酸化されている）を用いてＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、鋳型をＤｐｎ１（ＴＯＹＯＢＯ）処理にて分解した後、生成物をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理、及びエタノール沈殿処理にて精製した。精製物を、さらにＬａｍｂｄａ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて処理した後、上記と同様に精製し、一本鎖ＤＮＡを得た。Ｌａｍｂｄａ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ処理は、３７℃、オーバーナイトで行った。【０１１０】
（６）ｐｄｃ１遺伝子破壊用ＴＡＬＥＮの作製
（i）ＴＡＬＥＮ発現ベクターの作製
Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社に依頼し、Ｃｕｓｔｏｍ  ＸＴＮ  ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社が提供するＴＡＬＥＮの商品名）を作製した。これは、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）をコードする遺伝子（ｐｄｃ遺伝子；配列番号６）を標的とするＴＡＬＥＮのためのキットであり、２つのポリヌクレオチドＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ（配列番号７）及びＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ（配列番号８）を含み、これらはｐｄｃ遺伝子を含む領域（配列番号９）に結合する。ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃは、ｐｄｃ遺伝子のセンス鎖中の５’−ＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＡＡＡＡＴＣＧ−３’（配列番号１０）の配列を標的とするＴＡＬＥＮをコードし、ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃは、アンチセンス鎖中の５’−ＴＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＡＧＡＣＧＧ−３’（配列番号１１）の配列を標的とするＴＡＬＥＮをコードする。【０１１１】
上記ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃをコードするポリヌクレオチドを、上記（３）で作製した発現ベクターｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈに挿入し、ａｄｈプロモーターとａｄｈターミネーターの制御下でＴＡＬＥＮを発現するベクターを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−Ｒ（配列番号４４）及びａｄｈｔｅｒ−Ｆ（配列番号４５）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅した。続いてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−ＴＡＬＥＮ−Ｆ（配列番号４６）及びＴＡＬＥＮ−ａｄｈｔｅｒ−Ｒ（配列番号４７）を用いたＰＣＲにてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ断片を増幅した。上記２断片には、１５塩基ずつオーバーラップする領域が存在する。これら２断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃを含むベクターｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃを得た。【０１１２】
同様に、上記ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃをコードするポリヌクレオチドをｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈに挿入し、ａｄｈプロモーターとａｄｈターミネーターの制御下でＴＡＬＥＮを発現するベクターｐａｄｈ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃを作製した。ｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈ断片の増幅には、プライマーａｄｈｐｒｏ−Ｒ（配列番号４４）及びａｄｈｔｅｒ−Ｆ（配列番号４５）を用いた。ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ断片の増幅には、プライマーａｄｈｐｒｏ−ＴＡＬＥＮ−Ｆ（配列番号４６）及びＴＡＬＥＮ−ａｄｈｔｅｒ−Ｒ（配列番号４７）を用いた。【０１１３】
（ii）エキソヌクレアーゼ発現ベクターの作製
細胞内でＴＡＬＥＮとともにエキソヌクレアーゼを発現させることにより、ＴＡＬＥＮによる標的ＤＮＡの破壊が促進される（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１３，３：１２５３，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０１２５３、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１２，９：９７３−９７５）ため、ＴＡＬＥＮ発現ベクターと共に導入するエキソヌクレアーゼ発現ベクターを作製した。【０１１４】
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＮＲＢＣ５３８４株の精製ゲノム溶液を鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−ｅｘｏ１−Ｆ（配列番号４８）及びｅｘｏ１−ａｄｈｔｅｒ−Ｒ（配列番号４９）を用いてエキソヌクレアーゼ遺伝子断片を、またｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−Ｒ（配列番号４４）及びａｄｈｔｅｒ−Ｆ（配列番号４５）を用いたＰＣＲにてベクター断片をそれぞれ増幅した。増幅した上記２断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、プラスミドｐａｄｈ−ｅｘｏ１を作製した。【０１１５】
（７）宿主への遺伝子導入
（i）トリプトファン栄養要求性株の作製
遺伝子導入の宿主細胞として用いたトリプトファン栄養要求性株は、５５５７株へのイオンビーム照射による変異導入株の中から選抜し取得した。イオンビーム照射は、独立行政法人日本原子力研究開発機構・高崎量子応用研究所のイオン照射施設（ＴＩＡＲＡ）において行った。照射は、ＡＶＦサイクロトロンを用いて12Ｃ5+を加速し、２２０ＭｅＶのエネルギーで１００〜１２５０Ｇｒａｙ照射した。照射した菌体より胞子を回収し、その中から、トリプトファン栄養要求性を示すＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ  ０２Ｔ６株（以降、０２Ｔ６株と表記）を取得した。０２Ｔ６株は、ｔｒｐＣ遺伝子コーディング領域（配列番号３）全長２２９８ｂｐ中の２０９３番目が一塩基欠損している。【０１１６】
（ii）ＤＮＡ−金粒子混合液の作製
上記（６）で作製したｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ、ｐａｄｈ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ、ｐａｄｈ−ｅｘｏ１、及び上記（５）で作製した一本鎖ＤＮＡを混合したＤＮＡ溶液（１μｇ／μＬ）１０μＬを、金粒子溶液（６０ｍｇ／ｍＬ、ＩＮＢＩＯ  ＧＯＬＤ社、粒子径１μｍ）１００μＬに加えた。さらに０．１Ｍスペルミジンを４０μＬ加え、ボルテックスでよく攪拌した。２．５ＭのＣａＣｌ2を１００μＬ加え、ボルテックスで１分間攪拌した後、６０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿に７０％ＥｔＯＨを２００μＬ加え、３０秒間ボルテックスで攪拌した後、６０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿を１００μＬの１００％ＥｔＯＨで再懸濁した。【０１１７】
（iii）遺伝子導入
次に、（i）で作製した０２Ｔ６株の胞子に対し、（ii）で作製したＤＮＡ−金粒子溶液を用い、ＧＤＳ−８０（ネッパジーン）にて遺伝子導入を行った。遺伝子導入後の胞子は、無機寒天培地（２０ｇ／Ｌグルコース、１ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．６ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、０．２５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．０９ｇ／Ｌ硫酸亜鉛・７水和物、１５ｇ／Ｌ寒天）上で、３０℃の条件で１週間程静置培養した。【０１１８】
（iv）遺伝子導入株の選択
培養した菌体から胞子を回収し、ｐＨ３に調製した無機寒天培地（２０ｇ／Ｌグルコース、１ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．６ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、０．２５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．０９ｇ／Ｌ硫酸亜鉛・７水和物、１５ｇ／Ｌ寒天）を用いて菌株を単離した。生育した菌株の菌糸を爪楊枝にて一部かき取り、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に懸濁し、９５℃で１０分間インキュベートした。その後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で適宜希釈し、コロニーＰＣＲ用のゲノムテンプレート溶液とした。コロニーＰＣＲは、上記ゲノムテンプレート溶液、プライマーＮＫ−０６９（配列番号５０）とＮＫ−１１８（配列番号５１）、及びＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。上記プライマーでコロニーＰＣＲを行った場合、ｐｄｃ１遺伝子ローカスにｔｒｐＣ遺伝子断片のｋｎｏｃｋ−ｉｎが起こっていれば、ＤＮＡ断片が増幅する。コロニーＰＣＲによりＤＮＡ増幅断片が得られた菌株を、ｐｄｃ１遺伝子欠失株Δｐｄｃ株として取得した。プラスミドｐＵＣ１８−Ｐｐｄｃ−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−ＲｄＭＥ１−Ｔｐｄｃを用いて遺伝子導入を行った菌株をΔｐｄｃ：：ＭＥ１株とし、プラスミドｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎを用いて遺伝子導入を行った菌株をΔｐｄｃ：：ｔｒｐＣ株とした。残りの菌体を植菌耳で掻き取り、胞子回収溶液（８．５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、０．５ｇ／Ｌポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）中で激しく混和した。混和後の胞子懸濁液を３ＧＰ１００円筒ロート型ガラスろ過器（柴田化学）にてろ過し、これを胞子液とした。胞子液中の胞子数は、ＴＣ２０  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（バイオラッド）を用いて測定した。【０１１９】
実施例２  変異株のリンゴ酸酵素活性測定
（１）菌株の培養
（i）菌糸体の調製
５００ｍＬ用バッフル付三角フラスコ（旭硝子）に、ソルビタンモノラウレート（レオドールＳＰ−Ｌ１０（花王））を最終濃度で０．５％（ｖ／ｖ）添加した２００ｍＬのＳＤ／−Ｔｒｐ培地（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を供し、実施例１で調製したΔｐｄｃ：：ＭＥ１株及びΔｐｄｃ：：ｔｒｐＣ株の胞子液を１×１０3個−胞子／ｍＬ−培地となるようにそれぞれ接種後、２７℃にて３日間、１７０ｒｐｍで攪拌培養した。得られた培養物を予め滅菌処理したメッシュ網目２５０μｍのステンレスふるい（アズワン）を用いてろ過し、菌体をフィルター上に回収した。【０１２０】
（ii）菌糸体の増殖
５００ｍＬ容三角フラスコに供した無機培養液１００ｍＬ（０．１ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．６ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、０．２５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０９ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５０ｇ／Ｌ炭酸カルシウム、１００ｇ／Ｌグルコース）に、（i）で回収した湿菌体５．０〜８．０ｇを接種し、２７℃で約４０時間、２２０ｒｐｍにて攪拌培養した。得られた培養物を、予め滅菌処理したステンレススクリーンフィルターホルダー（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いてろ過し、フィルター上に菌体を回収した。さらにこのフィルターホルダー上で、２００ｍＬの生理食塩水で菌体を洗浄した。洗浄に用いた生理食塩水は吸引ろ過して除去した。【０１２１】
（２）菌体破砕液の調製
上記（１）で得られた湿菌体６．０ｇを、２００ｍＬ容三角フラスコに供した無機培養液４０ｍＬ（０．０１７５ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．０６ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、０．３７５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１３５ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５０ｇ／Ｌ炭酸カルシウム、１００ｇ／Ｌグルコース）に植菌し、３５℃、１７０ｒｐｍで２４時間攪拌培養した。得られた培養物を、予め滅菌処理したステンレススクリーンフィルターホルダー（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いてろ過し、フィルター上に菌体を回収した。さらにこのフィルターホルダー上で、２００ｍＬの生理食塩水で菌体を洗浄し、生理食塩水を吸引ろ過して除去し、菌体を１．０ｇずつ−８０℃にて凍結した。凍結菌体をマルチビーズショッカー及びメタルコーン（安井器械）を用いて破砕した。ここに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）１ｍＬを加えて再度破砕し、１５０００ｒｐｍ・４℃にて５分間遠心分離した後、上清をＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−０．５（３ｋＤａ、ミリポア）を用いて濃縮及び洗浄し。菌体破砕液を得た。【０１２２】
（３）リンゴ酸酵素活性測定
上記（２）で得られた菌体破砕液を５μＬ添加した９６穴アッセイプレート（イワキ）に、１８５μＬの反応液（終濃度５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ2、０．２ｍＭ  ＮＡＤ+）を加え、２００ｍＭ  リンゴ酸を１０μＬ添加することで反応を開始した。３０℃における３４０ｎｍの吸光度変化（ＮＡＤＨの吸光係数＝６２００  Ｍ-1ｃｍ-1）の傾きを基準として活性値（ｍＵ／菌体湿重量ｇ）を算出した。このとき、活性単位（Ｕ）は１分間に消費されたリンゴ酸の量（μｍｏｌ／ｍｉｎ）と定義した。測定結果を表２に示す。参照株であるΔｐｄｃ：：ｔｒｐＣ株と比較して、Δｐｄｃ：：ＭＥ１株ではリンゴ酸酵素活性が約３倍に向上した。【０１２３】
【表２】
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【０１２４】
実施例３  Δｐｄｃ：：ＭＥ１株のＣ４ジカルボン酸生産能
（１）菌株の培養
実施例２（１）と同様の条件で菌糸体を調製し増殖させた。【０１２５】
（２）形質転換株のＣ４ジカルボン酸生産性評価
上記（１）で得られたΔｐｄｃ：：ＭＥ１株及びΔｐｄｃ：：ｔｒｐＣ株の湿菌体６．０ｇを、２００ｍＬ容三角フラスコに供した無機培養液４０ｍＬ（０．０１７５ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．０６ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、０．３７５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１３５ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５０ｇ／Ｌ炭酸カルシウム、１００ｇ／Ｌグルコース）に植菌し、３５℃、１７０ｒｐｍで攪拌培養した。培養８時間後に、菌体を含まない培養上清を回収し、後述する参考例１に記載の手順にてＣ４ジカルボン酸（フマル酸）の定量を行った。求めたＣ４ジカルボン酸の量に基づいて、下記式に従いΔｐｄｃ：：ＭＥ１株におけるＣ４ジカルボン酸生産能向上率を算出した。
向上率（％）
＝（Δｐｄｃ：：ＭＥ１株における生産速度／Δｐｄｃ：：ｔｒｐＣ株における生産速度）×１００−１００
結果を表３に示す。ＲｄＭＥ１遺伝子を導入されていないΔｐｄｃ：：ｔｒｐＣ株と比較して、Δｐｄｃ：：ＭＥ１株では、４０％のフマル酸生産能の向上が観察された。【０１２６】
【表３】
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【０１２７】
参考例１  Ｃ４ジカルボン酸の定量
培養上清中のＣ４ジカルボン酸の定量は、ＨＰＬＣにより行った。ＨＰＬＣ分析に供する培養上清は、予め３７ｍＭ硫酸にて適宜希釈した後、ＤＩＳＭＩＣ−１３ｃｐ（０．２０μｍセルロースアセテート膜、ＡＤＶＡＮＴＥＣ）又はアクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行なった。
ＨＰＬＣの装置は、ＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ（日立ハイテクノロジーズ）を用いた。分析カラムには、ＩＣＳｅｐ  ＩＣＥ−ＩＯＮ−３００  Ｇｕａｒｄ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｅ（４．０ｍｍＩ．Ｄ．×２．０ｃｍ、ＴＲＡＮＳＧＥＮＯＭＩＣ）を接続した有機酸分析用ポリマーカラムＩＣＳｅｐ  ＩＣＥ−ＩＯＮ−３００（７．８ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、ＴＲＡＮＳＧＥＮＯＭＣ）を用い、溶離液は１０ｍＭ硫酸、流速０．５ｍＬ／分、カラム温度５０℃の条件にて溶出を行なった。Ｃ４ジカルボン酸の検出には、ＵＶ検出器（検出波長２１０ｎｍ）を用いた。濃度検量線は、標準試料〔フマル酸（販売元コード０６３−００６５５、和光純薬工業）〕を用いて作成し、濃度検量線に基づいて培養上清中のＣ４ジカルボン酸の定量を行なった。【０１２８】
定量した培地中のＣ４ジカルボン酸量から、該培地の初発Ｃ４ジカルボン酸量を引いた値を、Ｃ４ジカルボン酸生産量とした。培養開始後８時間時点での培地あたりのＣ４ジカルボン酸量を培養時間で割った値を、該細胞のＣ４ジカルボン酸の生産速度として算出した。
【配列表】
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【国際調査報告】
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