(57)【要約】  配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域等を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域等を含む重鎖可変領域とを保持する抗ＨＭＧＢ１抗体、又は、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域等と、配列番号：９に記載のアミノ酸配列等を含む重鎖可変領域とを保持する抗ＨＭＧＢ１抗体、及びそれを有効成分とする、アルツハイマー病を治療又は予防するための組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＭＧＢ１に対する抗体であって、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の特徴を有するモノクローナル抗体
（ａ）  配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）  配列番号：３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体を有効成分とする、アルツハイマー病を治療又は予防するための組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体を産生する、又は請求項３に記載のＤＮＡ若しくは請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
請求項１に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＭＧＢ１に対する抗体、及びそれを含有するアルツハイマー病を治療又は予防するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（アルツハイマー型認知症、ＡＤ）は、初老期〜老年期に生じる進行性の神経変性疾患である。その主な症状は、記憶障害、認識障害、高次脳機能障害（失語、失行、失認、構成失行）、人格の変化等である。そして、このような症状故、患者本人の生活の質の低下のみならず、家族等の周囲の生活にも多大な影響を与えている。さらに、その患者数は人口の高齢化に伴い増加の一途を辿っており、アルツハイマー病は世界的に現代社会の抱える深刻な問題となっている。【０００３】
そのため、アルツハイマー病については精力的に研究が進められており、例えば、アルツハイマー病は、老人班の沈着、神経原線維変化（神経原線維のもつれ、対らせん状繊維（ＰＨＦ））の沈着によっても神経病理学的に特徴づけられることが明らかになっている。そして、これら構造体の沈着が、前述の諸症状に関与する神経機能障害や神経細胞死（神経細胞の脱落）を引き起こすと考えられている。【０００４】
また、老人班は、アミロイドβ（Ａβ）と称される４０アミノ酸程度のポリペプチドが凝集し、神経細胞の外部に高密度に沈着して生じる構造体であることが明らかになっている。さらに、神経原線維変化についても、微小管結合タンパク質であるタウ（ｔａｕ）がリン酸化されることにより、細胞骨格を形成する微小管から解離し、ｔａｕ同士が重合することによって生じる構造体であることが明らかになっている。【０００５】
このように、アルツハイマーの病因及び発症機構については、Ａβの凝集（アミロイド病変）が生じ、該凝集によってｔａｕのリン酸化及び重合（ｔａｕ病変）が促進され、ひいては神経細胞死等に至るという機構（アミロイドカスケード仮説）が有力視されているものの、アルツハイマー病の発症機構等については未だ解明されておらず。そのため、当該疾患の治療方法の開発において、有用な標的分子が見出されていないのが現状である。【０００６】
ところで、ＤＮＡの構造維持や転写調節に関わる非ヒストンクロマチン関連性タンパク質の一つとして、ＨＭＧＢ１（Ｈｉｇｈ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｂｏｘ  １）タンパク質が知られている。また近年、このＨＭＧＢ１に関しては、このような核内の機能のみならず、細胞の壊死により細胞外に遊離し、又は血管炎症性シグナル応答で細胞外に能動的に分泌される等により、所謂ＤＡＭＰｓ（損傷関連分子パターン）として機能することも注目されている。さらに、ＨＭＧＢ１は、ミクログリアによる貪食作用を抑制することも報告されている。そして、この貪食作用によってＡβの凝集が除去されることから、ＨＭＧＢ１はアルツハイマー病等の病変に関連することが示唆されている（特許文献１及び２）。【０００７】
しかしながら、上述の通り、アルツハイマー病については、その発症機構も含めて未だ解明されておらず、根治薬の提供に至っていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−１０７２６０号公報
【特許文献２】国際公開第２００８／０９９９１３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、アルツハイマー病の治療又は予防を可能とする物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＨＭＧＢ１タンパク質に対して高い親和性を示すマウスモノクローナル抗体を得ることに成功した。また、当該抗体をアルツハイマー病モデルマウスに投与することによって、当該マウスにおける認識障害、スパイン形態の異常、ＤＮＡ損傷を回復できること等を見出した。さらに前記抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域、並びに各々の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３の配列も決定し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、ＨＭＧＢ１に対する抗体、及びそれを含有するアルツハイマー病を治療又は予防するための組成物に関し、より具体的には以下を提供する。
＜１＞  ＨＭＧＢ１に対する抗体であって、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の特徴を有するモノクローナル抗体
（ａ）  配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）  配列番号：３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
＜２＞  ＜１＞に記載の抗体を有効成分とする、アルツハイマー病を治療又は予防するための組成物。
＜３＞  ＜１＞に記載の抗体をコードするＤＮＡ。
＜４＞  ＜３＞に記載のＤＮＡを含むベクター。
＜５＞  ＜１＞に記載の抗体を産生する、又は＜３＞に記載のＤＮＡ若しくは＜４＞に記載のベクターを含む、宿主細胞。
＜６＞  ＜１＞に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＨＭＧＢ１タンパク質に対して高い親和性を示す抗体を提供することが可能となる。また、本発明によれば、前記抗体を用いたアルツハイマー病の治療又は予防に有効な薬剤及び方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ＧＳＴ融合ＨＭＧＢ１タンパク質を用いたＥＬＩＳＡにより、ＨＭＧＢ１との親和性において、抗ＨＭＧＢ１抗体７クローンを比較した結果を示す、グラフである。図中、縦軸は、波長４５０〜６３０ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示す。
【図１Ｂ】表面プラズモン共鳴（ＳＥＲ）解析により、ＨＭＧＢ１との親和性において、抗ＨＭＧＢ１抗体７クローンを比較した結果を示す、グラフである。図中、縦軸は、結合レスポンス（レゾナンスユニット、ＲＵ）を示す。
【図２】抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（２Ｃ８Ｃ）を産生するハイブリドーマからの抗体遺伝子の単離、及び同遺伝子の配列を同定する工程を示す、概略図である。なお、図中のプライマーのＤＮＡ配列は、配列番号：１３〜１５に各々示す。
【図３】抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（２Ｃ８Ｃ）の軽鎖（マウスＩｇｋ／シグナル配列、可変領域及び定常領域の一部）の配列を示す、図である。なお、図中のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列番号：１及び２に示す。
【図４】抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（２Ｃ８Ｃ）の重鎖（マウスＩｇＧ２ａ／シグナル配列、可変領域及び定常領域の一部）の配列を示す、図である。なお、図中のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列番号：７及び８に示す。また、以下の図において、特にウサギ由来のポリクローナル抗体と断らない限り、抗ＨＭＧＢ１抗体又はａｎｔｉ−ＨＭＧＢは、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（２Ｃ８Ｃ）を示す。
【図５Ａ】抗ＨＭＧＢ１抗体皮下注射によるたＡＤモデルマウスの治療プロトコールを示す、概略図である。当該プロトコールに供するマウスは、非注射群と注射群（ＰＢＳ注射群、コントロールＩｇＧ注射群、抗ＨＭＧＢ１抗体注射群）とに分けた。注射群は更に、１〜６月齢間注射したグループと、３〜６月齢間注射したグループとに分けた。注射は、１週間に１回行い、１回の注射あたり量は１ｍｇ／ｋｇとした。Ｙ−迷路試験は、初期段階の記憶障害を検出するための唯一の方法であり、過去の報告（Ｏａｋｌｅｙ，Ｈ．ら、．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６，１０１２９−１０１４０（２００６））に基づき前記試験を行い、マウス６月齢のＹ−迷路における交替率を判定した。
【図５Ｂ】抗ＨＭＧＢ１抗体等を注射したマウスグループ（注射期間：１〜６月齢及び３〜６月齢）のＹ−迷路試験における交替率を示す、グラフである。この図に示す通り、抗ＨＭＧＢ１抗体等を注射したＡＤモデルマウス（５ｘＦＡＤマウス）において、交替率は標準レベル（Ｂ６／ＳＪＬ）まで低減した。一方、ＡＤモデルマウスにおいて、ＰＢＳ又はＩｇＧを注射したことによる効果は認められなかった。
【図５Ｃ】ＡＤモデルマウス等における樹状突起スパインを二光子顕微鏡によって解析するためのプロトコールを示す、概略図である。
【図５Ｄ】独立した５ｘＦＡＤマウスグループ等の樹状突起スパインを、二光子顕微鏡により解析した結果を示す、写真である。図中、「ＷＴ  ＩｇＧ」は野生型マウス（Ｂ６／ＳＪＬ）にＩｇＧを注射した結果を示し、「５×ＦＡＤ  ＩｇＧ」はＡＤモデルマウスにＩｇＧを注射した結果を示し、「５×ＦＡＤ  ａｎｔｉ−ＨＭＧＢ１」はＡＤモデルマウスに抗ＨＭＧＢ１抗体を注射した結果を示す（図中の標記については、図５Ｅ及び図５Ｆにおいても同様である）。
【図５Ｅ】独立したＡＤモデルマウスグループ等の樹状突起スパインを、二光子顕微鏡により解析した結果を示す、グラフである。図５Ｃに示すプロトコールに基づき、抗ＨＭＧＢ１抗体を１〜６月齢間注射したことによって、図５Ｄ及びＥに示す通り、５ｘＦＡＤマウスの６月齢におけるスパイン密度は回復した。
【図５Ｆ】前記二光子顕微鏡解析に用いたマウスを、もう８週生育した８月齢（３２週）において、Ｙ−迷路にて試験した結果を示す、グラフである。この図に示す通り、５×ＦＡＤマウスにおける記憶障害は、依然改善していた。
【図５Ｇ】マウス（１月齢（１Ｍ）、３月齢（３Ｍ）及び６月齢（６Ｍ））の大脳皮質（ＣＴＸ）のＤＮＡ損傷マーカー  γＨ２ＡＸをウェスタンブロットにて検出した結果を示す、写真である。図中「Ｔｇ］は５ｘＦＡＤマウスを解析した結果を示し、「Ｂ６／ＳＪＬ］はその野生型マウスを解析した結果を示す。
【図５Ｈ】マウス（１月齢（１Ｍ）、３月齢（３Ｍ）及び６月齢（６Ｍ））大脳皮質（ＣＴＸ）のＤＮＡ損傷マーカー  γＨ２ＡＸをウェスタンブロットにて検出した結果を示す、グラフである。図中、各グループ（１Ｍ、３Ｍ，６Ｍ）において、右側の棒「Ｔｇ］は５ｘＦＡＤマウスを解析した結果を示し、左側の棒「Ｃｏｎｔ」はその野生型マウスを解析した結果を示す。縦軸は、ウェスタンブロットにて検出したγＨ２ＡＸの量をＧＡＰＤＨ量を基準として表す相対値を示す。図５Ｇ及びＨに示す通り、５ｘＦＡＤマウスにおいて特に、加齢におけるＤＮＡ損傷の蓄積が認められた。
【図５Ｉ】１〜６月齢間又は３〜６月齢間抗ＨＭＧＢ１抗体を皮下注射した５×ＦＡＤマウス６月齢等の、大脳皮質におけるＤＮＡ損傷（γＨ２ＡＸ）を、ウェスタンブロットにて検出した結果を示す、写真である。図中「１］は、野生型マウス（Ｂ６／ＳＪＬ）にコントロールＩｇＧを注射した結果を示し、「２］は、５×ＦＡＤマウス（Ｔｇ）にコントロールＩｇＧを注射した結果を示し、「３］は、１〜６月齢の間、５×ＦＡＤマウスに抗ＨＭＧＢ１抗体を注射した結果を示し、「４］は、３〜６月齢の間、５×ＦＡＤマウスに抗ＨＭＧＢ１抗体を注射した結果を示す（図中の表記については、図５Ｊにおいても同様である）。
【図５Ｊ】１〜６月齢間又は３〜６月齢間抗ＨＭＧＢ１抗体を皮下注射した５×ＦＡＤマウス６月齢等の、大脳皮質におけるＤＮＡ損傷（γＨ２ＡＸ）を、ウェスタンブロットにて検出した結果を示す、グラフである。なお、図中の縦軸は、ウェスタンブロットにて検出したγＨ２ＡＸの量をＧＡＰＤＨ量を基準として表す相対値を示す。図５Ｉ及びＪに示す通り、抗ＨＭＧＢ１抗体を皮下注射することによって、５×ＦＡＤマウスにおけるＤＮＡ損傷は、完全に回復した。
【図６Ａ】ビオチン標識ＩｇＧを皮下注射して３日目のマウス等における、血漿中の該ＩｇＧの濃度を示す、グラフである。図中、「非処置」は前記ＩｇＧを注射しなかったマウス（陰性対照）の結果を示す。白丸は、検出できる最小値であったことを示す。またＰ値は、ウィルコクソン順位和検定及びフィシャーの正確確立検定による（図中の表記については、図６Ｂにおいても同様である）。
【図６Ｂ】ビオチン標識ＩｇＧを皮下注射して３日目のマウス等における、大脳皮質中の該ＩｇＧの濃度を示す、グラフである。ＰＢＳを全身かん流して調製した脳組織において、注射した前記ＩｇＧの存在がいくらか（０．００８％）検出された。
【図６Ｃ】ビオチン標識ＩｇＧを皮下注射したマウスにおいて、前記ＩｇＧを検出するため、脳組織においてアビジンＨＲＰによる免疫組織化学解析及びＤＡＢ発色を行った結果を示す、写真である。マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６ｊの雄（２月齢）を用い、当該マウスに、ビオチン標識マウスＩｇＧ（１ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射した。該注射後１日目又は３日目（ｎ＝３）の脳組織を、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定し、パラフィン包埋し、５μｍの切片を調製し、アビジンＨＲＰによる免疫組織化学解析及びＤＡＢ発色により、前記ＩｇＧの検出を試みた。その結果、図６Ｃに示すとおり、明瞭なシグナルは検出されなかった。
【図７Ａ】アミロイドβ（Ａβ）のポリマー化、Ａβのオリゴマー化、Ａβ及びＨＭＧＢ１からなるヘテロマー形成、並びにＨＭＧＢ１のオリゴマー化における、ＨＭＧＢ１及び抗ＨＭＧＢ１抗体のビトロにおける影響を、抗Ａβ抗体を用いたウェスタンブロットにて解析した結果を示す、写真である。なお、サンプルは、３７℃、４８時間インキュベートすることにより調製した。ゲルは、０．０３６％ＳＤＳのものを用いた。また図中、「抗体（−）」は、抗ＨＭＧＢ１抗体添加に対するコントロールとして、ノーマルマウスＩｇＧを添加した結果を示す。
【図７Ｂ】Ａβのポリマー化、Ａβのオリゴマー化、Ａβ及びＨＭＧＢ１からなるヘテロマー形成、並びにＨＭＧＢ１のオリゴマー化における、ＨＭＧＢ１及び抗ＨＭＧＢ１抗体のビトロにおける影響を、抗Ａβ抗体（６Ｅ１０）を用いたウェスタンブロットにて解析した結果を示す、積み上げ棒グラフである。この図においては、図７Ａに示したＡβの全ウェスタンブロットシグナル（ＩｇＧシグナルは除外した）における、Ａβ種４タイプ間の比率を、定量的に解析した結果を示す。また、３回の実験の平均値を示す。図７Ａ及び図７Ｂに示す通り、ＨＭＧＢ１の存在下若しくは非存在下、又はＨＭＧＢ１抗体の存在下若しくは非存在下にて、Ａβ１−４２を４８時間インキュベートした結果、ＨＭＧＢ１は、Ａβの原線維／凝集体を著しく減少させ、Ａβ種の他のタイプ（モノマー、オリゴマー及びＡＤＤＬｓ／前原線維等）を増加させた。さらに、抗ＨＭＧＢ１抗体の添加は、ＨＭＧＢ１によるＡβの原線維／凝集体の減少を抑制し、ＨＭＧＢ１によるＡβのオリゴマー及びＡＤＤＬｓ／前原線維の増加を阻害した。
【図７Ｃ】Ａβオリゴマー化におけるＨＭＧＢ１及び抗ＨＭＧＢ１抗体の影響を、抗Ａβ抗体（６Ｅ１０）を用いたウェスタンブロットにて更に解析した結果を示す、写真である。この図に示す通り、ＨＭＧＢ１の用量依存的に、Ａβのモノマー、オリゴマー及びＡＤＤＬｓ／前原線維は増加した。また、Ａβのオリゴマー化におけるＨＭＧＢ１の影響を、抗ＨＭＧＢ１抗体は阻害した。しかし、コントロールＩｇＧ添加において、その阻害効果は認められなかった。
【図７Ｄ】ビトロでのＨＭＧＢ１のポリマー化を、抗ＨＭＧＢ１抗体（ウサギ由来のポリクローナル抗体）を用いたウェスタンブロットにて解析した結果を示す、写真である。サンプルは、図７Ｃに示したものと同じものを用いた。図７Ｄにおいて、それらの分子量から判定した結果が示す通り、Ａβは、ＨＭＧＢ１のポリマー化を阻害し、他のタイプ（ＡβとＨＭＧＢ１とからなるヘテロマー）を生じさせた。
【図７Ｅ】Ａβの非存在下における、ビトロでのＨＭＧＢ１のポリマー化を、抗ＨＭＧＢ１抗体（ウサギ由来のポリクローナル抗体）を用いたウェスタンブロットにて解析した結果を示す、写真である。この図に示す通り、Ａβの非存在下、ＨＭＧＢ１の凝集は、用量依存的に促進された。抗ＨＭＧＢ１抗体は、ＨＭＧＢ１のポリマー化を阻害し、ＨＭＧＢ１のモノマー及びダイマーの割合を増加させた。この効果は、コントロールＩｇＧにおいては認められなかった。
【図７Ｆ】インビトロ凝集サンプルを電子顕微鏡により観察した結果を示す、写真である。この図に示す通り、ＨＭＧＢ１は、Ａβの原線維形成を阻害し（黒矢印にて示す）、Ａβオリゴマー又はＡＤＤＬｓ/前原線維に関連するかもしれない非晶構造を増加させた。一方、抗ＨＭＧＢ１抗体の添加は、原線維形成を回復させた（黒矢印にて示す）。免疫電子顕微鏡による解析結果から、ＨＭＧＢ１がＡβ原線維の周辺に局在し（白矢印にて示す）、それの拡張を阻害していることが考えられる。
【図８Ａ】５×ＦＡＤマウスのミクログリアにおける、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体のインビボ効果について解析した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。この図において、５×ＦＡＤマウス（６月齢）における、大脳皮質（ＲＳＤ）の低倍率観察結果及び代表的なＡβプラークの高倍率観察結果を示す。それらの結果、抗ＨＭＧＢ１抗体を用いて治療した後（１〜６月齢及び３〜６月齢に治療したグループ）、ミクログリアの大多数は、Ａβプラークを形成し、ミクログリアは、細胞質にＡβを取り込んでいた。
【図８Ｂ】図８Ａに示した蛍光顕微鏡写真の 一視野におけるミクログリアの数（ｎ＝１０、大脳皮質）を、定量的に解析した結果を示す、グラフである。この図に示す通り、一視野におけるミクログリアの数は、抗ＨＭＧＢ１抗体による治療後、マウスにおいて増加が認められた。
【図８Ｃ】図８Ａに示した蛍光顕微鏡写真の一視野において、プラークを形成するミクログリアの数（ｎ＝３０、大脳皮質）を、定量的に解析した結果を示す、グラフである。この図に示す通り、プラークを形成するミクログリアの数は、抗ＨＭＧＢ１抗体による治療後、マウスにおいて増加が認められた。
【図８Ｄ】初代培養ラットミクログリアによる蛍光（ＴＡＭＲＡ−）Ａβの貪食を検出するためのプロトコールの概略を示す図である。この図に示す通り、ＴＡＭＲＡ−Ａβ、ヒトＨＭＧＢ１及び抗ＨＭＧＢ１抗体を混合し、プレインキュベートした後、初代培養のミクログリアに添加した。
【図８Ｅ】初代培養ラットミクログリアによる蛍光Ａβの貪食を検出した結果を示す、写真である。
【図８Ｆ】初代培養ラットミクログリアによる蛍光Ａβの貪食を、定量的に解析した結果を示す、グラフである。図８Ｅ及び図８Ｆに示す通り、抗ＨＭＧＢ１抗体の添加によって、ＴＡＭＲＡ−Ａβの貪食は増強された（図８Ｅの真ん中の写真  参照）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜ＨＭＧＢ１タンパク質に対する抗体＞
後述の実施例において示す通り、本発明者らは、ＨＭＧＢ１タンパク質に対して高い親和性を示すマウスモノクローナル抗体（以下、「２Ｃ８Ｃ抗体」とも称する）を得ることに成功した。また、当該抗体をアルツハイマー病モデルマウスに投与することによって、当該マウスにおける認識障害、スパイン形態の異常、ＤＮＡ損傷を回復させること等を見出した。さらに前記抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域、並びに各々の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３の配列も決定した。
【００１５】
本発明は、かかる事項に基づき、ＨＭＧＢ１に対する抗体であって、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の特徴を有するモノクローナル抗体を提供する。
（ａ）  配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）  配列番号：３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
【００１６】
なお、配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列は、２Ｃ８Ｃ抗体の軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を示し、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列は、２Ｃ８Ｃ抗体の重鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を示す。また、配列番号：３に記載のアミノ酸配列は、２Ｃ８Ｃ抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示し、配列番号：９に記載のアミノ酸配列は、２Ｃ８Ｃ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
【００１７】
本発明において、「ＨＭＧＢ１（Ｈｉｇｈ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｂｏｘ  １）」は、ＨＭＧ１、ＨＭＧ３、ＳＢＰ−１、ＨＭＧ−１とも称されるタンパク質である。ヒト由来のものであれば典型的には、ＮＣＢＩレファレンスシークエンス：ＮＰ＿００２１１９．１で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＮＣＢＩレファレンスシークエンス：ＮＭ＿００２１２８．５で特定されるヌクレオチド配列がコードするタンパク質）である。しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し、それにコードされるタンパク質のアミノ酸配列もそれに伴い改変される。したがって、本発明に係る「ＨＭＧＢ１」は、前記典型的なアミノ酸配列からなるタンパク質に特定されることなく、このような天然の変異体も含まれる。また、ＨＭＧＢ１の配列は極めて高度に保存されていることが知られており、例えば、ヒト由来のＨＭＧＢ１とラットにおけるそれとは、Ｃ末の正／負帯電領域において２アミノ酸が異なる他は、完全に一致している。
【００１８】
本発明における「抗体」は、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスを含む。「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれ、また、抗体の機能的断片の形態も含む意である。「ポリクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。また、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、及び／又は回収された（即ち、単離された）抗体である。
【００１９】
本発明の抗体は、上述のＨＭＧＢ１タンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状等は特に限定されない。具体的には、非ヒト動物由来の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びこれら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体又はヒト化抗体が望ましい。
【００２０】
本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８−２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。
【００２１】
キメラ抗体の定常領域には、通常、ヒト由来の抗体のものが使用される。例えば重鎖においては、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃμ、Ｃδ、Ｃα１、Ｃα２、及びＣεを定常領域として利用することができる。また軽鎖においてはＣκやＣλを定常領域として使用できる。これらの定常領域のアミノ酸配列、並びにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体自体の安定性、又は抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト由来の抗体定常領域中の１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、付加及び／又は挿入をすることができる。
【００２２】
本発明において「ヒト化抗体」とは、非ヒト（マウス等）由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト由来の抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、オーバーラップエクステンションＰＣＲ等、公知である（例えば、欧州特許出願公開第２３９４００号明細書、欧州特許出願公開第１２５０２３号明細書、国際公開第９０／０７８６１号、国際公開第９６／０２５７６号）。抗体の可変領域は、通常、４つのＦＲにはさまれた３つのＣＤＲで構成されている。ＣＤＲは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。ＣＤＲのアミノ酸配列は多様性に富む一方、ＦＲを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため、一般に、ＣＤＲの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるといわれている。また、ＣＤＲの機能の維持の観点から、非ヒト由来ＣＤＲのヒトＦＲへの移植においては、その非ヒト動物由来のＦＲと相同性の高いヒトＦＲが選択される。すなわち、ＣＤＲ内のアミノ酸は、抗原を認識するばかりでなく、ＣＤＲの近傍にあるＦＲのアミノ酸と配位し、ＣＤＲのループ構造の維持にも関与しているため、移植すべきＣＤＲに隣接しているＦＲのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトＦＲを利用することが好ましい。
【００２３】
非ヒト動物由来のＦＲと相同性の高い公知のヒトＦＲの検索を、例えば、インターネットで利用可能な抗体に特化した検索システム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／）を利用して行うことができる。このようにして得られたヒトＦＲの配列と一致するように、非ヒト由来の抗体のＣＤＲ以外の配列に変異を導入することができる。あるいは、検索によって得られたヒトＦＲのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）が入手可能な場合は、その配列中に非ヒト由来ＣＤＲを導入してもよい。変異の導入等は核酸合成、部位特異的変異誘発などの当該分野で公知の技術を用いて行うことができる。
【００２４】
このようにして作製されたヒト化抗体の抗原への親和性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、ＣＤＲを介して連結されたときに該ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト由来の抗体のＦＲが好適に選択できる。また必要に応じ、Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１−８５６等に記載の方法に沿って、ヒト化抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するようにＦＲのアミノ酸残基を置換することもでき、さらに当該アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への親和性を測定して評価することによって、所望の性質を有する変異ＦＲ配列を選択することができる。
【００２５】
本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、ＨＭＧＢ１タンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。
【００２６】
ここで「Ｆａｂ」とは、１つの軽鎖及び重鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意味する。抗体のパパイン消化によって、また、組換え方法によって得ることができる。「Ｆａｂ’」は、抗体のヒンジ領域の１つ又はそれより多いシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのわずかの残基の付加によって、Ｆａｂとは異なる。「Ｆ（ａｂ’）２」とは、両方の軽鎖と両方の重鎖の部分からなる免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意味する。
【００２７】
「可変領域断片（Ｆｖ）」は、完全な抗原認識及び結合部位を有する最少の抗体断片である。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである。「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」は、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。「ｓｃ（Ｆｖ）２」は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にしたものである。「ダイアボディー」とは、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、この断片は、同一ポリペプチド鎖の中に軽鎖可変領域に結合した重鎖可変領域を含み、各領域は別の鎖の相補的領域とペアを形成している。「多特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。例えば、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現により調製することができる。
【００２８】
本発明の抗体には、望ましい活性（抗原に対する親和性及び／又は他の生物学的特性）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。このようなアミノ酸配列変異体は、例えば、２Ｃ８Ｃ抗体の抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（ＦＲ及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８）、ＭＡｂｓ．Ｍａｒ−Ａｐｒ；６（２）：４３７−４５（２０１４））。また、現在では、統合計算化学システム等（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔ、カナダＣＣＧ社製）を利用することにより、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をモデリングすることもできる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｓｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｋａｇａｋｕ／ｃｓ／ｃｃｇ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ／ｐｒｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ  参照）。さらに、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２０１０  Ａｕｇ；２３（８）：６４３−５１に記載の通り、抗原へのアフィニティーにおいて、重鎖可変領域のＣＤＲ１及び軽鎖可変領域のＣＤＲ３は関与していない例が知られている、また同様に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４４：１０７５−１０８４（２００７））には、大抵の抗体においては、軽鎖可変領域のＣＤＲ２は抗原へのアフィニティーに関与していないということが報告されている。このように、抗体の抗原へのアフィニティーにおいては、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域各々のＣＤＲ１〜３の全てを要せずとも、同等の活性を発揮し得る。実際に、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００３  Ｊｕｌ  １８；３０７（１）：１９８−２０５、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００４  Ｊｕｌ  ９；３４０（３）：５２５−４２、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００３  Ａｕｇ  ２９；３３１（５）：１１０９−２０においては、元の抗体の少なくとも１のＣＤＲを保持することによって、抗原へのアフィニティーが維持された例が報告されている。したがって、本発明の抗体は、２Ｃ８Ｃ抗体の少なくとも１のＣＤＲを含む抗体でもあり得る。
【００２９】
また、本発明の抗体に関し、改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。
【００３０】
また、改変後のアミノ酸配列が、２Ｃ８Ｃ抗体の抗体鎖に対して、アミノ酸配列レベルで８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる抗体鎖を有する抗体も、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、本発明の抗体に含まれる。かかる相同性としては、少なくとも８０％であればよいが、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。また、配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＰによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。なお、本明細書において「相同性」は「同一性」を含む。
【００３１】
また、「同等の活性を有する」とは、抗原への親和性等が、対象抗体（代表的には、２Ｃ８Ｃ抗体）と同等（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）であることを意味する。さらに、抗原への親和性は、例えば、後述の実施例に示す通り、公知の免疫学的手法（例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴法））を用いて、当業者であれば適宜評価することができる。
【００３２】
また、本発明の抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変化させる等の抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。これにより、例えば、抗体のＡＤＣＣ活性（抗体依存性細胞障害活性）を向上させることができる。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ−結合又はＯ−結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入又は欠失等の公知の方法で行うことができる（特開２００８−１１３６６３号公報、米国特許第５０４７３３５号、米国特許第５５１０２６１号、米国特許第５２７８２９９号、国際公開第９９／５４３４２号）。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
【００３３】
本発明の抗体は、後述の実施例の通り、ハイブリドーマ法によって作製することができ、また組換えＤＮＡ法によって作製することができる。ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（ＨＭＧＢ１タンパク質、その部分ペプチド、それらにＦｃタンパク質等が融合してあるタンパク質、またはこれらを発現する細胞等）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等である。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、ＨＭＧＢ１タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。ＨＭＧＢ１タンパク質に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【００３４】
組換えＤＮＡ法は、上記本発明の抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば、ＨＥＫ細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７−７７５（１９９０））。本発明の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（国際公開第９４／１１５２３号公報  参照）。本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【００３５】
本発明は、上記本発明の抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ＤＮＡを保持する宿主細胞、及び該宿主細胞を培養し、抗体を回収することを含む抗体の生産方法をも提供することができる。
【００３６】
＜ＨＭＧＢ１に対する抗体を含む組成物等＞
本発明の抗体は、後述の実施例において示す通り、ＨＭＧＢ１タンパク質に対して高い親和性を示し、アルツハイマー病モデルマウスにおける認識障害等を回復させることから、アルツハイマー病の治療又は予防に利用することができる。したがって、本発明は、本発明の抗体を有効成分とする医薬組成物、並びに本発明の抗体の治療上又は予防上の有効量を、ヒトを含む哺乳類に投与する工程を含んでなる、アルツハイマー病の治療又は予防の方法をも提供するものである。
【００３７】
本発明において「アルツハイマー病」とは、アルツハイマー型認知症、ＡＤとも称される神経変性疾患であり、遺伝子の変異に起因する「家族性アルツハイマー病」及び「遺伝性アルツハイマー病」や、生活習慣やストレスといった環境因子による「孤発性アルツハイマー病」も含まれる。さらに、「アルツハイマー病」には、記憶障害、認識障害、高次脳機能障害（失語、失行、失認、構成失行）、人格の変化といった症状の発現、画像診断によって判断される脳の萎縮の出現等の臨床症候が確認される段階のみならず、その前段階とされる軽度認知障害（ＭＣＩ）、さらにその前の、認知機能は正常であるがアミロイドβ（Ａβ）の凝集（アミロイド病変）が脳内に生じている前臨床期アルツハイマー病（プレクリニカルＡＤ）も含まれる。また、アルツハイマー病の治療には、アミロイド病変も含めたアルツハイマー病の病変の回復、改善のみならず、その進行の抑制も含まれる。
【００３８】
本発明の抗体を有効成分とする医薬組成物は、本発明の抗体と任意の成分、例えば生理食塩水、葡萄糖水溶液又はリン酸塩緩衝液等を含有する組成物の形態で使用することができる。本発明の医薬組成物は、必要に応じて液体又は凍結乾燥した形態で製形化しても良く、任意に薬学的に許容される担体若しくは媒体、例えば、安定化剤、防腐剤、等張化剤等を含有させることもできる。
【００３９】
薬学的に許容される担体としては、凍結乾燥した製剤の場合、マンニトール、ラクトース、サッカロース、ヒトアルブミン等を例として挙げることができ、液状製剤の場合には、生理食塩水、注射用水、リン酸塩緩衝液、水酸化アルミニウム等を例として挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
医薬組成物の投与方法は、投与対象の年齢、体重、性別、健康状態等により異なるが、非経口投与（例えば、皮下投与、静脈投与、動脈投与、局所投与）、経口投与のいずれかの投与経路で投与することができる。好ましい投与方法は、非経口投与であり、より好ましくは皮下投与である。医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重、性別、健康状態、症状の進行の程度及び投与する医薬組成物の成分により変動しうるが、通常、成人には体重１ｋｇ当たり１日０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇである。本発明の医薬組成物は、アルツハイマー病の治療に用いられる公知の医薬品と併用してもよい。
【００４１】
以上、本発明の抗体の好適な実施形態（用途）について説明したが、本発明の抗体は上記実施形態に限定されるものではない。本発明の抗体はＨＭＧＢ１タンパク質に対する高い親和性を有することから、例えば、ＨＭＧＢ１タンパク質を検出するための試薬及び診断薬、ＨＭＧＢ１タンパク質を標的とするミサイル療法に用いられるための薬剤、ＨＭＧＢ１タンパク質に関連する疾患を治療又は予防するための医薬組成物にも好適に用いられる。
【００４２】
ＨＭＧＢ１タンパク質を検出するための試薬及び診断薬に用いられる場合には、その検出のために、本発明の抗体は直接又は間接的に標識物質が結合しているものであってもよい。かかる標識物質としては、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質が挙げられる。
【００４３】
ＨＭＧＢ１タンパク質を標的とするミサイル療法に用いられるための薬剤に用いられる場合には、本発明の抗体は直接又は間接的に送達を要する物質が結合しているものであってもよい。かかる物質としては、例えば、光感受性物質、毒性ペプチド、化学療法剤、放射性化学物質等の細胞傷害性物質が挙げられる。
【００４４】
また、本発明において、ＨＭＧＢ１タンパク質に関連する疾患としては、ＨＭＧＢ１タンパク質の発現が、その発症、症状の進行、悪化等に関与する疾患であればよく、例えば、アルツハイマー病の他、全身性アミロイドーシス、敗血症が挙げられる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例は、以下に示す材料及び方法にて行った。【００４６】
マウス
５×ＦＡＤトランスジェニックマウス（５×ＦＡＤマウス）は、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）の変異［スウェーデンタイプ（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ）、フロリダタイプ（Ｉ７１６Ｖ）及びロンドンタイプ（Ｖ７１７Ｉ）］を有するヒトＡＰＰ（７７０）と、ＦＡＤ変異（Ｍ１４６Ｌ及びＬ２８５Ｖ）を有するヒトＰＳ１とが、過剰発現しているマウスであり、ジャクソンラボラトリー（ＣＡ、ＵＳＡ）から購入したものを用いた。なお、前記トランスジェニックマウスにおいて、導入遺伝子であるＡＰＰ及びＰＳ１は共に、マウスＴｈｙ１プロモーター制御下にて発現する（Ｏａｋｌｅｙ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００６年、２６巻、１０１２９〜１０１４０ページ  参照）。また、前記トランスジェニックマウスの遺伝的背景は、Ｃ５７／Ｂ６の雌マウスとＳＪＬ／Ｊの雌マウスとを交配させて作製されるＣ５７／Ｂ６ＸＳＪＬである。【００４７】
ウェスタンブロット解析
マウスの大脳皮質組織又は初代培養皮質ニューロンは、溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、Ｓｉｇｍａ製、ＭＯ、ＵＳＡ）、２％ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ製、ＭＯ，ＵＳＡ）、１ｍＭ  ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ製、ＭＯ，ＵＳＡ）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製、カタログ番号：５３９１３４、１：２００にて希釈））を添加した後、プラスチックホモジェナイザー（製品名：バイオマッシャーＩＩ、株式会社ニッピ製、東京、日本）を用いて、均質化した。得られたタンパク質溶解液は、４℃にて３０分間回転させながらインキュベーションした後、１００℃にて１５分間ボイルした。次いで、遠心処理（１６，０００ｘｇ、１０分間、４℃）に供し、得られた上清に、等容積のサンプルバッファー（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８、Ｓｉｇｍａ製、ＭＯ、ＵＳＡ）、４％ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ製、ＭＯ、ＵＳＡ）、２０％グリセロール（Ｗａｋｏ製、大阪、日本）、１２％メルカプトエタノール（Ｗａｋｏ製、大阪、日本）及び０．０５％ＢＰＢ（Ｎａｃａｌａｉ製、京都、日本）を添加し、希釈した。【００４８】
そして、このようにして調製したサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して分画した。セミドライ法にて、イモビロン（登録商標）−Ｐ  ポリフッ化ビニリデンのメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製、ＭＡ、ＵＳＡ）に転写し、２％ＢＳＡ（Ｎａｃａｌａｉ製、京都、日本）又は５％ミルク含有ＴＢＳＴ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）によるブロッキング処理に供した。【００４９】
また、以下に示す一次抗体及び二次抗体を、０．２％ＢＳＡ又は免疫反応促進用試薬（製品名：Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）ｓｏｌｕｔｉｏｎ、大阪、日本）を含むＴＢＳＴに希釈して用いた。
＜一次抗体＞
マウス抗アクチン抗体、１：１０００にて希釈（カタログ番号：ｓｃ−８３３４，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製，ＴＸ，ＵＳＡ）、
ウサギ抗ＧＦＰ抗体、１：１０００にて希釈（カタログ番号：ｓｃ−４７７７８，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製，ＴＸ，ＵＳＡ）、
マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体、１：３０００にて希釈（カタログ番号：ＭＡＢ３７４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製，ＭＡ，ＵＳＡ）、
マウス抗アミロイドβ抗体、１：５０００にて希釈（ｃｌｏｎｅ  ８２Ｅ１，ＩＢＬ，群馬，日本）、
マウス抗リン酸化Ｈ２ＡＸ（γＨ２ＡＸ）抗体、１：３０００にて希釈（カタログ番号：ＪＢＷ３０１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製，ＭＡ，ＵＳＡ）、
＜二次抗体＞
ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体、１：３０００にて希釈（カタログ番号：ＮＡ９３４，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、
ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体、１：３０００にて希釈（カタログ番号：ＮＡ９３１，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）。【００５０】
一次抗体及び二次抗体と共に４℃にて一晩インキュベートし、次いで室温にて１時間インキュベートすることを繰り返した。ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  ウェスタンブロット検出試薬（カタログ番号：ＲＰＮ２２３２、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）及びルミノイメージアナライザ（製品名：ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ５００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて、タンパク質を検出した。【００５１】
免疫組織化学解析
先ず、マウスの脳を４％パラホルムアルデヒドにて固定し、パラフィンに包埋した。矢状断面又は冠状断面の切片（厚さ５μｍ）を、ミクロトーム（大和光気工業株式会社製、埼玉、日本）を用いて調製した。【００５２】
免疫組織化学解析は、以下の一次抗体を用いて行なった。
マウス抗アミロイドβ抗体、１：５０００にて希釈（ｃｌｏｎｅ  ８２Ｅ１，カタログ番号：１０３２３，ＩＢＬ製、群馬、日本）、
ウサギ抗ＨＭＧＢ１抗体、１：２０００にて希釈（カタログ番号：ａｂ１８２５６，Ａｂｃａｍ製，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、
ウサギ抗Ｉｂａ１抗体、１：２０００にて希釈（カタログ番号：０１９−１９７４１，Ｗａｋｏ製，大阪、日本）。【００５３】
各抗体と反応させた組織は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８標識二次抗体又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５６８標識二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて可視化した。次いで、アミロイドβを、免疫組織化学用染色試薬キット（製品名：Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット、カタログ番号：ＰＫ−６１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、ＵＳＡ）及び免疫染色用ペルオキシダーゼ基質キット（製品名：ＤＡＢペルオキシダーゼ基質キット、カタログ番号：ＳＫ−４１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、ＵＳＡ）を用いて可視化した。核は、ＤＡＰＩ（ＰＢＳにて０．２μｇ／ｍｌに希釈して使用、カタログ番号：Ｄ５２３、ＤＯＪＩＮＤＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、熊本、日本）にて染色した。【００５４】
全ての画像は、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０、東京、日本）、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ製、東京、日本）又は共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１２００ＩＸ８３、東京、日本）を用いて取得した。【００５５】
抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの作製
ウィスターラットのｍＲＮＡから、ＨＭＧＢ１タンパク質（全長）をコードするｃＤＮＡを調製し、ｐＧＥＸ−３Ｘベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）にサブクローニングし、常法に沿って、ＨＭＧＢ１タンパク質を発現させ、精製した。【００５６】
なお、ウィスターラット由来のＨＭＧＢ１タンパク質の配列と、マウス由来のそれとは一致している。一方、ラット由来のＨＭＧＢ１タンパク質とヒト由来のそれとは、Ｃ末の正／負帯電領域において２アミノ酸が異なる他は、一致している。【００５７】
前記ＨＭＧＢ１タンパク質１００μｇをアジュバントであるタイターマックス（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製，ＬＡ，ＵＳＡ）とよく混ぜた。そして、それを、６週齢のＣ３Ｈ／Ｈｅ及びＭＲＬの雌マウスの足裏に一日おきに、Ｃ３Ｈ／Ｈｅにおいては合計４回、ＭＲＬにおいては合計５回免疫した。最終免疫から２日後、免疫マウスよりリンパ球を調製し、マウスミエローマ細胞とＰＥＧ法により細胞融合させた。ＦＣＳ、アミノプテリン、ストレプトマイシン及びペニシリンを含む選択培地で９６ウェルマイクロプレートを用い、３７℃５％ＣＯ２条件下で約２週間培養した。【００５８】
そして、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を選抜すべく、以下に示すＥＬＩＳＡ法を行った。先ず、前記２週間後の培養液を一部採取し、２５０ｎｇ／ウェルのＨＭＧＢ１タンパク質又はネガティヴコントロールタンパク質（ＧＳＴ）を固相したマイクロプレートに５００μＬ／ウェルで添加した。次いで、室温で１時間反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄し、２次抗体（ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ、株式会社医学生物学研究所製、コード番号３３０）を能書に沿って希釈し、５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。反応後ＰＢＳで３回洗浄した後、ＴＭＢ試薬（ＭＯＳＳ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ，ＵＳＡ）を５０μＬ／ウェルで添加し、１５分酵素発色反応に供した。次いで、１．５規定リン酸にて酵素反応を停止させた後、４５０ｎｍ（リファランス６３０ｎｍ）のプレートリーダーで吸光度を測定し、ＨＭＧＢ１固相プレートに特異的に反応するクローンを選別し、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を樹立した。【００５９】
なお、上記の通り調製したハイブリドーマ  約１０００クローンから、かかるＥＬＩＳＡ法による３回のスクリーニングを経て、表１に示す通り、１０クローンを選抜した。【００６０】
【表１】
2018030405.tif 000002
【００６１】
抗体の精製
選抜したハイブリドーマクローンは、血清非含有培地（製品名：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製，ＭＡ，ＵＳＡ）にて培養し、この選抜クローンの拡大培養後の培地から、遠心処理にて細胞残屑を除外した。【００６２】
半精製した培地中のモノクローナル抗体は、抗体精製用アフィニティー担体（製品名：ｒプロテインＡセファロース  ファスト  フロー  レジン、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ製、Ｅｎｇｌａｎｄ）に、循環ポンプを用い、一晩かけて結合させた。【００６３】
そして、１０倍容積のＰＢＳにてカラムを洗浄した後、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ４．０）にて担体に結合していたモノクローナル抗体を溶出した。１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）にて中和した後、推奨プロトコールに沿って、ＰＢＳによる透析に供した。【００６４】
抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の皮下注射
１〜６月齢又は３〜６月齢の５×ＦＡＤマウス又はＢ６／ＳＪＬマウスの首の背中側に、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を、１ｍｇ／ｋｇの濃度にて、１週間に１回注射した。また同様に、対照群として、コントロールＩｇＧ（ハイブリドーマ細胞株よりプロテインＡにて精製されたマウスＩｇＧ２ａ抗体、ＭＢＬ社製）を注射したマウスも調製した。【００６５】
２光子顕微鏡による、スパインの病理解析
シナプシン１プロモーターを有するアデノ随伴ウィルス１（ＡＡＶ１）−ＥＧＦＰ（力価：１×１０１０ベクターゲノム／ｍＬ、１μＬ）を、２．５％イソフルランにて麻酔したマウス（２２週齢）の膨大後部皮質（ブレグマより前後方向に−２．０ｍｍ及び中外側に０．６ｍｍ、深さ１ｍｍ）に注入した。【００６６】
その２週間後、高速マイクロドリルを用いて、マウス膨大後部皮質において、頭蓋骨の薄削円形部を調製した。そして、顕微鏡テーブル上に搭載したカスタムマシーンのステージに、ヘッドプレートを取り付けることによって、マウスの頭を固定した。【００６７】
２光子イメージングは、正立顕微鏡（ＢＸ６１ＷＩ、Ｏｌｙｍｐｕｓ製、日本）、水浸対物レンズ（ＸＬＰｌａｎＮ２５ｘＷ；開口数，１．０５）及びパルスレーザー（ＭａｉＴａｉ  ＨＰ  ＤｅｅｐＳｅｅ、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ製、ＵＳＡ）を備えた、走査型レーザー顕微鏡システム  ＦＶ１０００ＭＰＥ２（Ｏｌｙｍｐｕｓ製）を用いて行なった。【００６８】
ＥＧＦＰは８９０ｎｍの波長の光にて励起し、５００〜５５０ｎｍの範囲にてスキャンした。三次元イメージングのためにスキャンした領域は、１００×１００μｍ（１μｍ  Ｚ軸ステップ、１０２４×１０２４ピクセル）である。【００６９】
大脳皮質第１層（レイヤー１）の高倍率イメージング（１０１．２８μｍ×１０１．２８μｍ；１０２４×１０２４ピクセル；１μｍ  Ｚｓｔｅｐ）は、５×デジタルズーミングにて、膨大後部皮質の薄削頭蓋骨観察窓を通して観察した。【００７０】
ビオチン標識抗体の血漿及び脳への移行
ビオチン標識マウスＩｇＧ（製品番号；ＳＡＢ３７００９０１，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製，ＭＯ，ＵＳＡ）を、上述の抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体と同様にして、皮下に注射した。血漿及び脳組織のサンプリングは、１日目及び３日目に行った。血漿及び脳組織への移行を検出するため、サンドイッチＥＬＩＳＡシステムを構築した。【００７１】
Ｙ−迷路試験
当該試験において、探索行動を、３つの同一のアームからなり、アーム間の角度が等しくなるよう配置されている、Ｙ字型の迷路（Ｏ’ＨＡＲＡ＆Ｃｏ．，Ｌｔｄ製，東京，日本）上にて行なわせた。６月齢のマウスを、１つのアームの端に置き、８分の活動期間中、迷路上を自由に行動させた。自発的な交替行動の割合（交替率として示す）は、前に入ったアームとは異なる新たなアームに進入した回数を、アームから他のアームに移動した全ての回数で割ることによって、算出した。【００７２】
異なるＡβ種の作製
Ａβオリゴマー、前原線維／ＡＤＤＬｓ及び凝集体／原線維は、Ｋｌｅｉｎ，Ｗ．Ｌ．、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．４１，３４５−３５２（２００２）に記載の方法に沿って調製した。【００７３】
簡潔に説明すると、凍結乾燥したアミロイドβ１−４２（Ａβ１−４２）タンパク質（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製，大阪，日本）を、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ製，ＭＯ，ＵＳＡ）に１ｍＭになるよう溶かし、保存溶液として調製した。Ａβ１−４２保存溶液を、細胞培養用に１００μＭに希釈し、またＰＢＳを用いたインビトロ解析のため、３０μＭに希釈した。オリゴマー及びＡＤＤＬｓを形成させるため、更に５℃で２４時間インキュベートし、凝集体／原線維を形成させるため、更に３７℃で２４時間インキュベートした。【００７４】
Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
Ｓｃｈaｇｇｅｒ，Ｈ．Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１，１６−２２（２００６）に記載の方法に沿って、Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、Ａβ形成を試験した。【００７５】
簡潔に説明すると、０．１％ＳＤＳ、０．１ｇ／ｍｌ  グリセロール及び１Ｍ  Ｔｒｉｓからなる電気泳動用ゲルを、ＨＣｌによって、ｐＨ８．４５になるよう調整した。また、１６％、１０％及び４％のゲルを、下から順に重層して用いた。そして、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．９）のアノードバッファーと、１Ｍ  Ｔｒｉｓ及び１Ｍ  Ｔｒｉｃｉｎｅのカソードバッファーとを用いたＴｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、Ａβサンプルを分画した。【００７６】
透過型電子顕微鏡
インビトロ凝集体形成アッセイにおける各サンプルを、２％グルタルアルデヒドにて固定し、フォルムバールでコートした３００−メッシュ銅グリッド上に１分間置いた。次いで、水で洗浄した後、１％酢酸ウラニルにて１分間ネガティブ染色を行なった。そして、サンプルは、８０ｋＶにて作動させた透過型電子顕微鏡（ＨＩＴＡＣＨＩ製，Ｈ−７１００，東京，日本）にて観察した。【００７７】
免疫電子顕微鏡法
インビトロ凝集体形成アッセイにおける各サンプルを、ニッケルグリッド上に置き、室温、１％ＰＦＡ含有０．１Ｍリン酸バッファーにて固定した。０，１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）にて洗浄した後、抗体の非特異的結合を除外するため、５％ヤギ血清含有０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにて１０分間インキュベートした。【００７８】
５％ヤギ血清含有０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）にて、一次抗体と共に、室温にて２時間インキュベートした。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）にて洗浄した後、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）にて、二次抗体と共に、室温にて１時間インキュベートした。【００７９】
なお、一次抗体として、
マウス抗Ａβ抗体（１：５０にて希釈，ｃｌｏｎｅ  ６Ｅ１０，商品コード：ＳＩＧ−３９３００，Ｃｏｖａｎｃｅ製，ＮＪ，ＵＳＡ）又は
ウサギ抗ＨＭＧＢ１抗体（１：５０にて希釈，ａｂ１８２５６，Ａｂｃａｍ製，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）］
を用いた
また、二次抗体として、
１０ｎｍ金標識抗マウス（１：１００にて希釈，ＥＭ  ＧＡＦ  １０，ＢＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製，Ｃａｒｄｉｆｆ，ＵＫ）又は
５ｎｍ金標識抗ウサギ（１：１００にて希釈，ＥＭ  ＧＡＲ  ５，ＢＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製，Ｃａｒｄｉｆｆ，ＵＫ）を用いた
サンプルは、１％酢酸ウラニルにて１分間ネガティブ染色をし、透過型電子顕微鏡の観察に供した。【００８０】
ミクログリアによるＡβの貪食
初代培養皮質ニューロンは、Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｋ．ら、Ｇｌｉａ  ２４，２７２−２８９（１９９８）．に記載の方法にて、ウィスターラットより調製した。そして、８ウェルチャンバーグラススライド（製品名：Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ，Ｎａｌｇｅｎｅ製，ＩＬ，ＵＳＡ）に、コーテチィングを施すことなく、２×１０４細胞／ウェルになるよう、播種した。【００８１】
プレインキュベートしたＴＡＭＲＡ−Ａβ（１０ｎＭ，製品番号：ＡＫ１３Ａ，Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．製，東京，日本）、ＴＡＭＲＡ−Ａβ／ＨＭＧＢ１（各１０ｎＭ）又はＴＡＭＲＡ−Ａβ／ＨＭＧＢ１／抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（各１０ｎＭ）を、初代培養細胞に添加した。そして、その４５分後に、細胞を１％ＰＦＡにて２０分間固定した。【００８２】
画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１２００−ＩＸ８３（Ｏｌｙｍｐｕｓ製，東京，日本）にて取得した。ＴＡＭＲＡ−Ａβを取り込んだミクログリアの割合を、２０×対物レンズ画像における１０視野において算出し、また各グループにおけるＴＡＭＲＡ−Ａβを取り込んだミクログリアの数を、計測した。【００８３】
統計解析
生物学的解析において、データは正規分布に従うかを考慮し、平均値プラスマイナス標準誤差にて表した。スチューデントｔ検定は、２グループ間の比較に用いた。複数グループ間の比較は、テューキーのＨＳＤ検定又はダネット検定を用いた。有意水準は、１％又は５％に設定した。【００８４】
倫理
本研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針における勧告を、厳密に遵守して行なった。また、本研究は、東京医科歯科大学の遺伝子組み換え実験、ヒト倫理及び動物実験に関する承認を受けたものである（承認番号は、各々２０１０−２１５Ｃ１４、２０１４−５−４及び  ０１６０３２８Ｃである）。【００８５】
（抗ＨＭＧＢ１抗体の調製、及びその配列の決定）
アルツハイマー病（ＡＤ）における、ＨＭＧＢ１を標的とする抗体療法の有効性を評価すべく、先ず、上述の通り、複数のＨＭＧＢ１に対する抗体を作製して選抜した１０クローンについて、結合アッセイの結果に基づき、クローン２Ｃ８Ｃを選抜した（図１Ａ及び１Ｂ  参照。図１Ａ及び１Ｂにおいては１０クローンの内の７クローンの結果について開示してある）。なお、クローン２Ｃ８Ｃは、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスに由来する。【００８６】
そして、図２に示す方法に準じて、ハイブリドーマ（２Ｃ８Ｃ）から、重鎖及び軽鎖に関し、可変領域及び定常領域をコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅して取得し、シークエンシング解析に供した。その結果、図３及び４に示す通り、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（２Ｃ８Ｃ抗体）の重鎖及び軽鎖の可変領域及びＣＤＲのアミノ酸配列を同定することができた。なお、ＣＤＲはｋａｂａｔルールに基づいて予測した。また、同定された各配列は以下の配列番号によって特定される。
２Ｃ８Ｃ抗体の軽鎖（シグナルペプチド、可変領域及び定常領域）をコードするヌクレオチド配列…配列番号：１
２Ｃ８Ｃ抗体の軽鎖（シグナルペプチド、可変領域及び定常領域）のアミノ酸配列…配列番号：２
２Ｃ８Ｃ抗体の軽鎖（可変領域）のアミノ酸配列…配列番号：３
２Ｃ８Ｃ抗体の軽鎖（可変領域のＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列…配列番号：４〜６
２Ｃ８Ｃ抗体の重鎖（シグナルペプチド、可変領域及び定常領域）をコードするヌクレオチド配列…配列番号：７
２Ｃ８Ｃ抗体の重鎖（シグナルペプチド、可変領域及び定常領域）のアミノ酸配列…配列番号：８
２Ｃ８Ｃ抗体の重鎖（可変領域）のアミノ酸配列…配列番号：９
２Ｃ８Ｃ抗体の重鎖（可変領域のＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列…配列番号：１０〜１２。【００８７】
（アルツハイマー病における、ＨＭＧＢ１を標的とする抗体療法の有効性）
次に、このようにして得られた抗ＨＭＧＢ１抗体を、図５Ａに示す２種のプロトコールにて、ＡＤマウスモデル（５×ＦＡＤマウス）の皮下に注射することにより、当該マウスモデルにおけるアルツハイマー病（ＡＤ）の症候及び表現型が改善されるかを評価した。【００８８】
なお、同様の方法にて、ビオチン標識ＩｇＧが送達されることをＥＬＩＳＡにて解析した結果、皮下注射によって、血漿及び脳組織においてＩｇＧの濃度が向上したことにより、確認しているが（図６Ａ及び６Ｂ  参照）、免疫組織化学解析においては確認できていない（図６Ｃ  参照）。【００８９】
Ｙ−迷路試験は、Ｏａｋｌｅｙ，Ｈ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６，１０１２９−１０１４０（２００６）．において報告されているように、５×ＦＡＤの６月齢における発症を感度良く検出した。そして、図５Ｂに示す通り、抗ＨＭＧＢ１抗体を皮下注射したことにより、２つのプロトコールのいずれにおいても、５×ＦＡＤマウスの認識障害を野生型マウスのレベルまでに完全に回復させた。【００９０】
さらに、Ｙ−迷路試験の結果と一致し、該試験とは異なる同抗体の皮下注射群において、スパイン形態における抗体による効果も２光子励起顕微鏡により明らかになった（図５Ｃ〜５Ｅ  参照）。さらにまた、新たな実験群においても、Ｙ−迷路試験における認識障害の回復が確認された（図５Ｆ  参照）。【００９１】
また、図５Ｉ及び５Ｊに示す通り、抗ＨＭＧＢ１抗体は大脳皮質におけるＤＮＡ損傷を減少させることも明らかになった。なお、正常マウスにおいても経年とともにＤＮＡ損傷は増加する。また、ＡＤマウスの全ての齢において、その増加の程度は大きい（図５Ｇ及びＨ  参照）。しかしながら、１〜６月齢又は３〜６月齢において抗ＨＭＧＢ１抗体を注入した結果、５×ＦＡＤマウスの大脳皮質におけるＤＮＡ損傷は、正常マウスの６月齢のそれ位まで、はっきりと減少した(図５Ｉ及び５Ｊ  参照)。【００９２】
以上の通り、抗ＨＭＧＢ１抗体投与によってＡＤモデルマウスにおける病理及び認識機能が改善されること、ひいては、ＨＭＧＢ１を標的とする抗体療法がアルツハイマー病において有効であることが明らかになった。【００９３】
（ＨＭＧＢ１及びＡβ間における双方的な多量体化抑制）
次に、前述の抗ＨＭＧＢ１抗体のアルツハイマー病に対する効果は、ＨＭＧＢ１毒性に対する直接的な効果であるのか、又はアミロイドβ（Ａβ）の多量体形成過程への間接的な効果であるのかを調べた。【００９４】
ＡβとＨＭＧＢ１とは相互作用することが既に報告されている（Ｔａｋａｔａ，Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３０１，６９９−７０３（２００３）及びＴａｋａｔａ，Ｋ．ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ  ２０１２，６８５７３９（２０１２）参照）。しかし、Ａβの多量体形成過程、Ａβモノマー／オリゴマー／ポリマーの比率といったことへのＨＭＧＢ１の影響は、いまだ不確かである。そこで、この点について解析した。【００９５】
先ず、Ａβ１−４２ペプチドの凝集過程におけるＨＭＧＢ１への影響を評価するための条件を調べた。その結果、図には示さないが、３７℃にて４８時間インキュベーションすることが、Ｈｏｒｔｓｃｈａｎｓｋｙ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４，１７５３−１７５９  （２００５）．及びＧｕａｎ，Ｙ．ら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ６，１５０３−１５０８（２０１５）にて報告されているように、ウェスタンブロット及び電子顕微鏡にて凝集を検出する条件として適切であることを見出した。【００９６】
次に、その条件にてＨＭＧＢ１がＡβ凝集過程にどのような影響を与えているのかを調べた。すなわち、モノマー、オリゴマー（２〜４量体）、ＡＤＤＬｓ／前原線維、及び原線維（Ｈａａｓｓ，Ｃ．＆Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８，１０１−１１２（２００７）及びＬａｍｂｅｒｔ，Ｍ  Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，６４４８−６４５３（１９９８）参照）といった様々なＡβ種を評価した。【００９７】
その結果、図７Ａに示す通り、ウェスタンブロット解析において、ＨＭＧＢ１はＡβ多量体化を明確に抑制し、全てのＡβ種において、オリゴマー及びＡＤＤＬｓの比率を増加させることが明らかになった。また、抗ＨＭＧＢ１抗体を試料に添加することによって、ＨＭＧＢ１によるＡβオリゴマー／ＡＤＤＬｓの増加は抑制されたが、Ａβ凝集体は増加することが明らかになった。なお、ＩｇＧコントロールではこのような効果は認められなかった。また、図７Ｂに示す通り、定量的な解析結果は、前記知見を裏づけるものであった。【００９８】
次に、原線維／凝集体以外のＡβ種に着目し、実験を繰り返した結果、図７Ｃに示す通り、抗ＨＭＧＢ１抗体は、ＨＭＧＢ１によるＡβモノマー及びオリゴマー／ＡＤＤＬｓの増加を抑制することも明らかになった。【００９９】
一方、図７Ｄに示す通り、インビトロにおけるＨＭＧＢ１の多量体化は、Ａβ添加によって阻害されることが明らかになった。さらに、Ａβ及びＨＭＧＢ１を混合することによって、それらのヘテロ多量体に対応する３つのバンドが検出された。分子量に基づけば、それらへテロ多量体は、Ｈ１Ａ１（ＨＭＧＢ１：Ａβ＝１：１）ヘテロダイマー、Ｈ１Ａ２（ＨＭＧＢ１：Ａβ＝１：２）ヘテロダイマー、Ｈ２Ａ２（ＨＭＧＢ１：Ａβ＝２：２）ヘテロダイマーであることが予期される(図７のＤ  参照)。また、市販の抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体は、これらＡβ−ＨＭＧＢ１へテロ複合体を認識した。さらに、前記抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（２Ｃ８Ｃ抗体）は、これらへテロ複合体の形成に影響を与えることも、ウェスタンブロットによって明らかになった。すなわち、当該抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を添加することによって、ＨＭＧＢ１モノマー（Ｈ１）が増加し、Ｈ２Ａ２が減少することが見出された。また、図７Ｅに示す通り、前記抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体は、ＨＭＧＢ１のみからなる多量体形成を抑制し、ＨＭＧＢ１モノマーを増加させることも認められた。なお、非常に分子量が大きく、原線維を想起させる物質は、ＨＭＧＢ１のみとのインキュベーションでは認められなかった。【０１００】
次に、Ａβ多量体形成におけるＨＭＧＢ１による影響を、電子顕微鏡により解析した。その結果、図７Ｆに示す通り、ＨＭＧＢ１はＡβ原線維の形成を阻害し、一方、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体は、Ａβ原線維の形成を回復させることが明らかになった。【０１０１】
以上の結果をまとめると、ＡβとＨＭＧＢ１とは互いの分子の多量体形成を互いに阻害しあっていることが示唆される。そして、その相互干渉の結果として、ＨＭＧＢ１はＡβの原線維形成を阻害し、Ａβのオリゴマー及び前原線維を増加させる（図７Ａ  参照）。一方、抗ＨＭＧＢ１抗体は、Ａβ及びＨＭＧＢ１双方の多量体形成を阻害し、Ａβ多量体形成においては、ＨＭＧＢ１存在下、Ａβオリゴマーと前原線維を減少させた（図７Ａ〜７Ｃ  参照）。なお、図には示さないが、ウェスタンブロット解析においては、ＨＭＧＢ１の原線維は認められなかった。【０１０２】
（抗ＨＭＧＢ１抗体による、ミクログリアの貪食作用への影響）
Ａβ及びＨＭＧＢ１複合体はミクログリアに貪食され易いということが、報告されている（Ｔａｋａｔａ，Ｋ．ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ  ２０１２，６８５７３９（２０１２）参照）。そこで、ミクログリアによるＡβ貪食における抗ＨＭＧＢ１抗体の影響について分析した。【０１０３】
その結果、図８Ａ〜８Ｃに示す通り、ミクログリア特異的マーカーｌｂａ１に対する免疫組織化学的解析により、抗ＨＭＧＢ１抗体（２Ｃ８Ｃ抗体）の注入によって、ミクログリアの数は増加することが認められた。特に、Ａβ凝集体の周りにおいて、ミクログリアはＡβを細胞質に取り込んでおり、抗ＨＭＧＢ１抗体によって、Ａβ／ＨＭＧＢ１複合体の貪食作用は増強されることが明らかになった。【０１０４】
また、図８Ｄ〜Ｆに示す通り、ミクログリア初代培養において、Ａβ／ＨＭＧＢ１／抗ＨＭＧＢ１抗体複合体によるミクログリア貪食作用は、Ａβによるそれ又はＡβ−ＨＭＧＢ１複合体によるそれよりも高いものであった。【０１０５】
これらの結果から、抗ＨＭＧＢ１抗体によるＡβ沈着の減少は、Ａβ多量体形成におけるＨＭＧＢ１の直接的な影響故ではなく、ミクログリアによるＡβ／ＨＭＧＢ１／抗ＨＭＧＢ１抗体複合体におけるＡβ貪食が増強された結果に基づくと考えられる。おそらくは、Ｂａｒｄ，Ｆ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６，９１６−９１９（２０００）に記載のＡβ抗体の場合同様に、Ｆｃ受容体を介した貪食作用により生じているものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
以上説明したように、本発明の抗体は、ＨＭＧＢ１タンパク質に対して高い親和性を有し、アルツハイマー病の各種病変を回復等させることができるため、特に当該疾患の治療又は予防において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０７】
配列番号：１
＜２２３＞  ２Ｃ８Ｃ  軽鎖のシグナル配列、可変領域及び定常領域
配列番号：３
＜２２３＞  ２Ｃ８Ｃ  軽鎖可変領域
配列番号：４
＜２２３＞  ２Ｃ８Ｃ  軽鎖ＣＤＲ１
配列番号：５
＜２２３＞  ２Ｃ８Ｃ  軽鎖ＣＤＲ２
配列番号：６
＜２２３＞  ２Ｃ８Ｃ  軽鎖ＣＤＲ３
配列番号：７
＜２２３＞  ２Ｃ８Ｃ  重鎖のシグナル配列、可変領域及び定常領域
配列番号：９
＜２２３＞  ２Ｃ８Ｃ  重鎖可変領域
配列番号：１０
＜２２３＞  ２Ｃ８Ｃ  重鎖ＣＤＲ１
配列番号：１１
＜２２３＞  ２Ｃ８Ｃ  重鎖ＣＤＲ２
配列番号：１２
＜２２３＞  ２Ｃ８Ｃ  重鎖ＣＤＲ３
配列番号：１３
＜２２３＞  ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ５’プライマー
配列番号：１４
＜２２３＞  ｍＩｇＧ２ａ  ３’プライマー
配列番号：１５
＜２２３＞  ｍＩｇｋ  ３’プライマー
【図１Ａ】
2018030405.tif 000003
【図１Ｂ】
2018030405.tif 000004
【図２】
2018030405.tif 000005
【図３】
2018030405.tif 000006
【図４】
2018030405.tif 000007
【図５Ａ】
2018030405.tif 000008
【図５Ｂ】
2018030405.tif 000009
【図５Ｃ】
2018030405.tif 000010
【図５Ｄ】
2018030405.tif 000011
【図５Ｅ】
2018030405.tif 000012
【図５Ｆ】
2018030405.tif 000013
【図５Ｇ】
2018030405.tif 000014
【図５Ｈ】
2018030405.tif 000015
【図５Ｉ】
2018030405.tif 000016
【図５Ｊ】
2018030405.tif 000017
【図６Ａ】
2018030405.tif 000018
【図６Ｂ】
2018030405.tif 000019
【図６Ｃ】
2018030405.tif 000020
【図７Ａ】
2018030405.tif 000021
【図７Ｂ】
2018030405.tif 000022
【図７Ｃ】
2018030405.tif 000023
【図７Ｄ】
2018030405.tif 000024
【図７Ｅ】
2018030405.tif 000025
【図７Ｆ】
2018030405.tif 000026
【図８Ａ】
2018030405.tif 000027
【図８Ｂ】
2018030405.tif 000028
【図８Ｃ】
2018030405.tif 000029
【図８Ｄ】
2018030405.tif 000030
【図８Ｅ】
2018030405.tif 000031
【図８Ｆ】
2018030405.tif 000032
【配列表】
2018030405000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月11日(2017.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＭＧＢ１に対する抗体であって、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の特徴を有するモノクローナル抗体
（ａ）  配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列を各々相補性決定領域１〜３として含む軽鎖可変領域と、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列を各々相補性決定領域１〜３として含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）  配列番号：３に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号：３に記載のアミノ酸配列のフレームワーク領域において１〜１０のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：９に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号：９に記載のアミノ酸配列のフレームワーク領域において１〜１０のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体を有効成分とする、アルツハイマー病を治療又は予防するための組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体を産生する、又は請求項３に記載のＤＮＡ若しくは請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
請求項１に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ。
【国際調査報告】
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