(57)【要約】巨核球細胞群の不均質性を識別し、細胞群を選別する。以下の工程を含む、巨核球細胞群における細胞の不均質性を識別する方法：（１）マイクロRNAによって特異的に認識される核酸配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを巨核球細胞群に導入する工程、および（２）当該マーカー遺伝子の翻訳量を指標として、特性の異なる細胞群を識別する工程。
2018052126.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、巨核球細胞群における細胞の不均質性を識別する方法：（１）マイクロRNAによって特異的に認識される核酸配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを巨核球細胞群に導入する工程、および（２）当該マーカー遺伝子の翻訳量を指標として、特性の異なる細胞群を識別する工程。
【請求項２】
以下の工程を含む、巨核球細胞群から血小板産生能の高い細胞群を選別する方法：（１）let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAによって特異的に認識される核酸配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを巨核球細胞群に導入する工程、および（２）当該マーカー遺伝子の翻訳量を指標として、血小板産生能の高い細胞群を選別する工程。
【請求項３】
前記mRNAを細胞群に導入する工程が、巨核球細胞の増殖期に実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記mRNAが、前記let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAによって特異的に認識される核酸配列と、前記マーカー遺伝子が、5'から3'の方向に連結されている、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記選別する工程が、前記let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAの活性が低い細胞群で当該マーカー遺伝子の翻訳量が多い細胞群を選別する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAによって特異的に認識される核酸配列を持たず、前記マーカー遺伝子とは異なるマーカー遺伝子を含むコントロールmRNAを細胞群に導入する工程をさらに含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記選別する工程が、フローサイトメトリーを用いて行われる請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記選別する工程が、イメージアナライザーを用いて行われる請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAが、let-7a-5pである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法により血小板産生能の高い細胞群を選別する工程と、
選別した細胞群を培養する工程と、
前記培養する工程により得られた培養物から血小板を回収する工程と
を含む、血小板の製造方法。
【請求項１２】
let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAによって特異的に認識される核酸配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを含んでなる、巨核球細胞選別キット。
【請求項１３】
前記mRNAが、前記let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAによって特異的に認識される核酸配列と、前記マーカー遺伝子が、5'から3'の方向に連結されている核酸である、請求項１２に記載の巨核球細胞選別キット。
【請求項１４】
前記let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAが、let-7a-5pである、請求項１２または１３に記載の巨核球細胞選別キット。
【請求項１５】
巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて、不死化巨核球細胞を得る工程と、
前記癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子の強制発現を抑制して、巨核球細胞を培養する工程と
を含み、前記不死化巨核球細胞を得る工程において、NR6A1遺伝子を強制発現させる工程を含む、血小板の産生方法。
【請求項１６】
巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて、不死化巨核球細胞を得る工程と、
前記癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子の強制発現を抑制して、巨核球細胞を培養する工程と
を含み、前記不死化巨核球細胞を得る工程における前記細胞中の、Lin28A遺伝子をコードするDNAのプロモーターのCpGアイランド領域におけるメチル化量を減少させる工程を含む、血小板の産生方法。
【請求項１７】
前記メチル化量を減少させる工程が、前記不死化巨核球細胞を得る工程における細胞を振盪培養する工程を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
多能性幹細胞を分化誘導して、巨核球細胞より未分化な細胞を得る工程と、
前記巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて、不死化巨核球細胞を得る工程と、
前記癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子の強制発現を抑制して、巨核球細胞を培養する工程と
を含み、前記巨核球細胞より未分化な細胞を得る工程が、前記多能性幹細胞をMatrigel（登録商標）、ラミニン421もしくはその断片、またはラミニン121若しくはその断片、あるいはそれらの組み合わせから選択される基質を用いて培養する工程を含む、血小板の産生方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、巨核球細胞群における細胞の不均質性を識別する方法、及びmiRNAの発現を指標として巨核球細胞から血小板産生能が高い細胞を選別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板製剤は、手術時や傷害時の大量出血、或いは、抗がん剤治療後の血小板減少に伴う出血傾向を呈する患者に対して、その症状の治療および予防を目的として投与される。
現在、血小板製剤の製造は、献血に依存しているが、感染症に関してより安全であり、血小板の安定供給が求められている。そのニーズに応えるべく、今日では、in vitroで培養した巨核球細胞から血小板を生産する方法が開発されている。本出願人らは、多能性幹細胞をソースとして不死化した、不死化巨核球前駆細胞株（immortalized megakaryocyte progenitor cell lines：imMKCL）の樹立方法を確立してきた（例えば、特許文献１、２、非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第2012/157586号
【特許文献２】国際公開第2014/123242号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nakamura et al, Cell Stem Cell. 2014 Apr 3;14(4):535-48.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
不死化巨核球前駆細胞株は冷凍による保存が可能であり、人工的な多核化の促進が可能であるなど、多くの利点があり、この不死化巨核球前駆細胞株から、需要に応じて血小板を安定的に、大量に製造することが可能である。血小板のより効率的な製造を模索する中で、本発明者らは、樹立後の不死化巨核球前駆細胞株はその特性が不均一であること（heterogenuity）を初めて見出した。これは、従来の細胞表面マーカーによる識別においては、得ることができなかった知見である。例えば、巨核球細胞群には、血小板産生能の高い細胞群とそうでない細胞群が混在していることを見出した。また、このようなヘテロな細胞集団をそのまま用いて血小板産生を行うと、収量が不安定になるおそれがあることも見出した。巨核球細胞株について、増殖能を選別する古典的な選別方法である、limiting dilutionの方法が知られている。しかし、このような増殖能のみの選別では、成熟過程における血小板産生能の高い細胞群を選別することができない。  【０００６】
一般的な細胞を選別する方法としては、細胞を定量的に分類する方法としては、例えば、マイクロアレイや次世代シーケンシングなどを用いた多変量の測定に基づく細胞のプロファイリングが知られている。また、近年、miRNAの発現を指標として生細胞を生きたまま、高精度で判別する方法が確立されている（国際公開第2015/105172号）。  【０００７】
巨核球細胞のheterogeneityを識別し、細胞群を選別する、特には、血小板産生能の高い細胞群を選別する方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、マイクロRNAの発現を指標として、巨核球細胞群を選別することができることを見出し、本発明を完成するに至った。  【０００９】
すなわち、本発明は次に記載の事項を提供するものである。
［１］  以下の工程を含む、巨核球細胞群における細胞の不均質性を識別する方法：（１）マイクロRNAによって特異的に認識される核酸配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを巨核球細胞群に導入する工程、および（２）当該マーカー遺伝子の翻訳量を指標として、特性の異なる細胞群を識別する工程。
［２］  以下の工程を含む、巨核球細胞群から血小板産生能の高い細胞群を選別する方法：
（１）let-7ファミリーから選択されるマイクロRNA によって特異的に認識される核酸配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを巨核球細胞群に導入する工程、および（２）当該マーカー遺伝子の翻訳量を指標として、血小板産生能の高い細胞群を選別する工程。
［３］  前記mRNAを細胞群に導入する工程が、巨核球細胞の増殖期に実施される、［２］に記載の方法。
［４］  前記mRNAが、前記let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAによって特異的に認識される核酸配列と、前記マーカー遺伝子が、5'から3'の方向に連結されている、［２］または［３］に記載の方法。
［５］  前記選別する工程が、前記let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAの活性が低い細胞群で当該マーカー遺伝子の翻訳量が多い細胞群を選別する、［２］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］  前記let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAによって特異的に認識される核酸配列を持たず、前記マーカー遺伝子とは異なるマーカー遺伝子を含むコントロールmRNAを細胞群に導入する工程をさらに含む、［２］〜［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］  前記選別する工程が、フローサイトメトリーを用いて行われる［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］  前記選別する工程が、イメージアナライザーを用いて行われる［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。
［９］  前記マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子である、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］  前記let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAが、let-7a-5pである、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］  ［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法により血小板産生能の高い細胞群を選別する工程と、
選別した細胞群を培養する工程と、
前記培養する工程により得られた培養物から血小板を回収する工程とを含む、血小板の製造方法。
［１２］  let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAによって特異的に認識される核酸配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを含んでなる、巨核球細胞選別キット。
［１３］  前記mRNAが、前記let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAによって特異的に認識される核酸配列と、前記マーカー遺伝子が、5'から3'の方向に連結されている核酸である、［１２］に記載の巨核球細胞選別キット。
［１４］  前記let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAが、let-7a-5pである、［１２］または［１３］に記載の巨核球細胞選別キット。
［１５］  巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて、不死化巨核球細胞を得る工程と、
前記癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子の強制発現を抑制して、巨核球細胞を培養する工程と
を含み、前記不死化巨核球細胞を得る工程において、NR6A1遺伝子及び／またはLin28A遺伝子を強制発現させる工程を含む、血小板の産生方法。
［１６］  巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて、不死化巨核球細胞を得る工程と、
前記癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子の強制発現を抑制して、巨核球細胞を培養する工程と
を含み、前記不死化巨核球細胞を得る工程における前記細胞中の、Lin28A遺伝子をコードするDNAのプロモーターのCpGアイランド領域におけるメチル化量を減少させる工程を含む、血小板の産生方法。
［１７］  前記メチル化量を減少させる工程が、前記不死化巨核球細胞を得る工程における細胞を振盪培養する工程を含む、［１６］に記載の方法。
［１８］  多能性幹細胞を分化誘導して、巨核球細胞より未分化な細胞を得る工程と、
前記巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて、不死化巨核球細胞を得る工程と、
前記癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子の強制発現を抑制して、巨核球細胞を培養する工程と
を含み、前記巨核球細胞より未分化な細胞を得る工程が、前記多能性幹細胞をMatrigel（登録商標）、ラミニン421もしくはその断片、またはラミニン121若しくはその断片、あるいはそれらの組み合わせから選択される基質を用いて培養する工程を含む、血小板の産生方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、マイクロRNAの活性を指標として利用することで、巨核球細胞群における細胞の不均質性を識別することができる。特には、巨核球細胞群から、高い分解能で血小板産生能が高い細胞群を選別することができる。本発明による方法は、細胞が生存した状態で適用することができるため、選別後の細胞を医療用途において利用することができる点で特に有利である。また、本発明の方法は、細胞群にmRNAを導入することにより実施することができ、このmRNAは約１日程度の半減期で分解されて、細胞内から速やかに除去されるため、細胞内におけるウイルス感染やDNAの残存により、ゲノムに損傷を与えるといった問題を生ずることがない。また、サイトメーターを利用した簡便な検出の方法においても有利である。本発明の方法によれば、巨核球細胞群の増殖期において、選別が可能であるため、血小板産生能が高い細胞群のみを選別して成熟させることで、効率的な血小板の産生が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、let-7a-5p活性に応答して蛍光蛋白質の発現量が抑制されるmiRNA応答性mRNAの構成、及びmiRNA活性によらず蛍光蛋白質を発現するコントロールmRNAの構成、並びにこれを用いた細胞分離のスキームを示す図である。
【図２】図２は、SeV2 imMKCLを用いて、巨核球増殖条件（DOX ON）におけるlet-7a-5p活性が異なる細胞群があること、巨核球からの血小板産生条件（DOX OFF）におけるlet-7a-5p活性が低い細胞群は、血小板産生が多いことを示す。
【図３】図３は、let-7a-5p活性に基づき、巨核球増殖条件（DOX ON）におけるlet-7a-5p活性の低い細胞集団(L)と高い細胞群（H）に分離した後、血小板産生条件（DOX OFF）とし、経時的にlet-7a-5p活性を測定した結果、let-7a-5p活性の低い細胞集団(L)の活性は低いままであり、高い細胞群（H）の活性は高いままであり、day４に至るまで活性の高さの傾向が変化しないことを示す。
【図４】図４は、let-7a-5p 阻害剤によりlet-7a-5p活性が低下すること（左図）、let-7a-5p 阻害剤によりlet-7a-5p活性が低下した細胞群(H + Inhibitor)は、巨核球増殖条件（DOX ON）におけるlet-7a-5p活性の低い細胞集団(L)と同等に血小板産生が高いことを示す（右図）。
【図５】図５は、巨核球増殖条件（DOX ON）におけるlet-7a-5p活性の低い細胞集団(L)と高い細胞群（H）における3遺伝子（C-MYC, BMI1, BCLXLの発現量を定量PCRで確認した結果、発現量に有意差がないことを示す。
【図６】図６は、let-7a-5pの標的を見つける目的で、let-7a-5p活性の高い細胞集団と低い細胞集団に対してRNAシークエンスを行い、遺伝子発現量比較を行い、活性の低い細胞集団で2倍以上発現している遺伝子は691個存在すること、さらに、miRSystem、miRDB、miRSearchの３つのmiRNA標的予測データベースを用いて、691個の遺伝子の中からlet-7a-5pの標的となりうるものを選び出したところ、18個の遺伝子がピックアップされることを示す。
【図７】図７は、18個の遺伝子の発現量をプロットし、この中でLIN28A、NR6A1の二つの遺伝子がlet-7a-5p活性の低い細胞集団で多く発現していることを示す。
【図８】図８は、LIN28Aはinhibitorを導入しても発現量は変化せず、NR6A1はlet-7a-5p活性の高い集団で発現量が下がり、inhibitorによりその効果がレスキューされることでlet-7a-5pの標的となっていることを示す。また、Lin28Ｂもlet-7a-5pの標的となっていることを示す。
【図９】図９は、LIN28B、NR6A1に加えて、IGF2BP1もlet-7a-5pの標的となっていることを示す。
【図１０】図１０は、NR6A1の血小板産生に対する影響を調べた実験結果を示す図であり、図１０（ａ）は、Let-7a-5p活性の高い群のimMKCLに、何も発現しないウイルスを感染させた場合（Mock）と、NR6A1を発現するウイルスを感染させた場合（NR6A1 O/E）の血小板産生数を、前者を１００％として示したものである。図１０（ｂ）は、SeV2 imMKCLに、Negative Control、NR6A1 siRNAの＃１と＃３をそれぞれ導入した場合の、血小板産生数を、Negative Controlを１００％として示したものである。図１０（ｃ）は、臍帯血由来巨核球細胞に、Negative Control、NR6A1 siRNAの＃１と＃３をそれぞれ導入した場合の、血小板産生数を、Negative Controlを１００％として示したものである。
【図１１】図１１は、Lin28A,Bの血小板産生に対する影響を調べた実験結果を示す図であり、図１１（ａ）は、let-7a-5p活性の低い細胞集団(Group L)に、Lin28A siRNAを加えることにより、let-7a-5p活性が上昇したことを示す図である。図１１（ｂ）は、Let-7a-5p応答性tagBFP mRNA スイッチを用い、let-7a-5p活性の低い細胞集団にvehicleとスイッチを共導入したサンプル（Let7-Low vehicle）、let-7a-5p活性の低い細胞集団にLin28A siRNAとスイッチを共導入したサンプル（Let7-Low Lin28A siRNA）、let-7a-5p活性の低い細胞集団にLin28B siRNAとスイッチを共導入したサンプル（Let7-Low Lin28B siRNA）、let-7a-5p活性の高い細胞集団にvehicleとスイッチを共導入した導入したサンプル（Let7-High vehicle）のそれぞれにおける、tagBFPの平均蛍光強度（MFI）を示すグラフであり、let-7a-5p活性はLin28A siRNAにより上昇したが、Lin28A siRNAによっては上昇しなかったことを示す。図１１（ｃ）は、GroupL,Hそれぞれ7〜8サンプルに対して前記Lin28A遺伝子をコードするDNAの、プロモーターのCpGアイランドに含まれる16個のCpG配列それぞれでメチル化しているかどうかを示した図であり、白丸が非メチル化、黒丸がメチル化したCpGを表す。図１１（ｄ）は、let-7a-5p活性の低い細胞集団(Group L)と、高い細胞集団(Group H)における、CpGのメチル化％である。
【図１２】図１２（ａ）は、従来、静置培養（static）としていたのを、DOX ON、DOX OFFの各状態における培養条件を、静置培養（static）または振盪培養（flask）に変更した実験スキームを示す図であり、図１２（ｂ）は、LIN28A及びNR6A1のそれぞれについて、静置培養（Static）した細胞から抽出されたmRNA量を１とした場合の相対量を示すグラフであり、図１２（ｃ）は、これらの各条件で得られた血小板産生数を、DOX on （Static）-DOX off（Static）として培養した場合を１００％とした相対数で表したグラフであり、図１２（ｄ）は、DOX onで一週間、静置培養（static）または振盪培養（flask）した細胞中のDNAにおけるLIN28Aプロモーター領域CpGアイランドのメチル化を、先に記載したのと同じ方法で解析した結果を示す。
【図１３】図１３は、分化誘導前のiPS細胞の培養条件が血小板産生に与える影響を調べた実験結果を示す図である。図１３（ａ）は、MKiPS細胞から、分化誘導させた各段階の細胞における定量PCRにて測定したLIN28A mRNA量を示すグラフであり、図１３（ｂ）は、MKiPS細胞から、分化誘導後、１４日、３５日の細胞について、Let-7a-5p活性を測定した結果を示し、図１３（ｃ）は、Laminin511で培養したMKiPS11細胞株から抽出したLIN28AmRNA発現量を１とした場合の、LIN28AmRNAの相対発現量を表すグラフであり、図１３（ｄ）は、Laminin511で培養したMKiPS11細胞株から分化誘導した巨核球細胞が産生した血小板数を１００％とした場合の、血小板産生数の相対量を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明を、実施態様を示して詳細に説明する。しかしながら、本発明は以下の実施態様に限定されるものではない。  
【００１３】
［巨核球細胞群における細胞の不均質性を識別する方法］
本発明は、一実施形態によれば、以下の工程を含む、巨核球細胞群における細胞の不均質性を識別する方法に関する。
（１）マイクロRNAによって特異的に認識される核酸配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを巨核球細胞群に導入する工程、および（２）当該マーカー遺伝子の翻訳量を指標として、特性の異なる細胞群を識別する工程。  
【００１４】
本実施形態においては、マイクロRNAによって特異的に認識される核酸配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAにより、巨核球細胞群における細胞の不均質性を識別することができる。従来、巨核球細胞は、以下に詳述する細胞表面マーカーにより「巨核球細胞」として識別される以外に、その増殖、成熟の過程において変化しうる特性を識別し、区別し、分別することができなかった。本実施形態は、mRNAにより、細胞の不均質性を識別する方法に関する。以下に具体的な例として、血小板産生能の高い細胞群を選別する方法について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。  
【００１５】
［血小板産生能の高い細胞群を選別する方法］
本発明は、一実施形態によれば、以下の工程を含む、巨核球細胞群から血小板産生能の高い細胞群を選別する方法に関する。
（１）let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAによって特異的に認識される核酸配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを細胞群に導入する工程、および（２）当該マーカー遺伝子の翻訳量を指標として、血小板産生能の高い細胞群を選別する工程。  
【００１６】
本発明の選別方法において、mRNAを導入する対象となる巨核球細胞群とは、以下に定義される巨核球細胞から主として構成される細胞群をいう。「巨核球細胞」とは、生体内においては骨髄中に存在する最大の細胞であり、血小板を放出することを特徴とする。また、細胞表面マーカーCD41a、CD42a、及びCD42b陽性で特徴づけられ、他に、CD9、CD61、CD62p、CD42c、CD42d、CD49f、CD51、CD110、CD123、CD131、及びCD203cからなる群より選択されるマーカーをさらに発現していることもある。「巨核球細胞」は、多核化（多倍体化）すると、通常の細胞の16〜32倍のゲノムを有するが、本明細書において、単に「巨核球細胞」という場合、上記の特徴を備えている限り、多核化した巨核球細胞と多核化前の巨核球細胞の双方を含む。「多核化前の巨核球細胞」は、「未熟な巨核球細胞」、又は「増殖期の巨核球細胞」とも同義である。  
【００１７】
巨核球細胞は、公知の様々な方法で得ることができる。巨核球細胞の製造方法の非限定的な例として、国際公開第2011/034073号に記載された方法が挙げられる。同方法では、「巨核球細胞より未分化な細胞」において、癌遺伝子とポリコーム遺伝子を強制発現させることにより、無限に増殖する不死化巨核球細胞株を得ることができる。また、国際公開第2012/157586号に記載された方法に従って、「巨核球細胞より未分化な細胞」において、アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させることによっても、不死化巨核球細胞株を得ることができる。これらの不死化巨核球細胞株は、遺伝子の強制発現を解除することにより、多核化が進み、血小板を放出するようになる。  
【００１８】
巨核球細胞を得るために、上記の文献に記載された方法を組み合わせてもよい。その場合、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子の強制発現は、同時に行ってもよく、順次行ってもよい。例えば、癌遺伝子とポリコーム遺伝子を強制発現させ、当該強制発現を抑制し、次にアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させ、当該強制発現を抑制して、多核化巨核球細胞を得てもよい。また、癌遺伝子とポリコーム遺伝子とアポトーシス抑制遺伝子を同時に強制発現させ、当該強制発現を同時に抑制して、多核化巨核球細胞を得ることもできる。まず、癌遺伝子とポリコーム遺伝子を強制発現させ、続いてアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させ、当該強制発現を同時に抑制して、多核化巨核球細胞を得ることもできる。本明細書において、遺伝子を強制発現させる工程を増殖期あるいは増殖可能な状態、強制発現を抑制する工程を成熟期ということもある。  
【００１９】
本発明において、「巨核球細胞より未分化な細胞」とは、巨核球への分化能を有する細胞であって、造血幹細胞系から巨核球細胞に至る様々な分化段階の細胞を意味する。巨核球より未分化な細胞の非限定的な例としては、造血幹細胞、造血前駆細胞、CD34陽性細胞、巨核球・赤芽球系前駆細胞（MEP）が挙げられる。これらの細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血から単離して得ることもできるし、さらにより未分化な細胞であるES細胞、iPS細胞等の多能性幹細胞から分化誘導して得ることもできる。  
【００２０】
本発明において、「癌遺伝子」とは、生体内において細胞の癌化を誘導する遺伝子のことをいい、例えば、MYCファミリー遺伝子（例えば、c-MYC、N-MYC、L-MYC）、SRCファミリー遺伝子、RASファミリー遺伝子、RAFファミリー遺伝子、c-Kit、PDGFR、Ablなどのプロテインキナーゼファミリー遺伝子が挙げられる。  
【００２１】
「ポリコーム遺伝子」とは、CDKN2a（INK4a/ARF）遺伝子を負に制御し、細胞老化を回避するために機能する遺伝子として知られている（小倉ら, 再生医療 vol.6, No.4, pp26-32；Jseus et al., Jseus et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology vol.7, pp667-677, 2006；Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.100, pp211-216, 2003）。ポリコーム遺伝子の非限定的な例として、BMI1、Mel18、Ring1a/b、Phc1/2/3、Cbx2/4/6/7/8、Ezh2、Eed、Suz12、HADC、Dnmt1/3a/3bが挙げられる。  
【００２２】
「アポトーシス抑制遺伝子」とは、細胞のアポトーシスを抑制する機能を有する遺伝子をいい、例えば、BCL2遺伝子、BCL−xL遺伝子、Survivin遺伝子、MCL1遺伝子などが挙げられる。  
【００２３】
遺伝子の強制発現及び強制発現の解除は、国際公開第2011/034073号、国際公開第2012/157586号、国際公開第2014/123242、またはNakamura S et al, Cell Stem Cell. 14, 535-548, 2014に記載された方法、その他の公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。例えば、遺伝子の強制発現及びその解除のためにTet-on（登録商標）又はTet-off（登録商標）システムのような薬剤応答性の遺伝子発現誘導システムを用いる場合、強制発現する工程においては、対応する薬剤、例えば、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンを培地に含有させ、これらを培地から除くことによって強制発現を抑制してもよい。  
【００２４】
遺伝子の強制発現及び強制発現の抑制（解除）を実施する際の巨核球細胞の培養条件は、通常の条件とすることができる。例えば、温度は約35℃〜約42℃、約36℃〜約40℃、又は約37℃〜約39℃とすることができ、5〜15%CO2及び／又は20％O2としてもよい。  
【００２５】
巨核球細胞を培養する際の培地は特に限定されず、巨核球細胞から血小板が産生されるのに好適な公知の培地やそれに準ずる培地を適宜使用することができる。例えば、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばIMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地が挙げられる。  
【００２６】
培地には、血清又は血漿が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、モノチオグリセロール（MTG）、脂質、アミノ酸（例えばL-グルタミン）、アスコルビン酸、ヘパリン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質も含有し得る。サイトカインとは、血球系分化を促進するタンパク質であり、例えば、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、トロンボポエチン（TPO）、各種TPO様作用物質、Stem Cell Factor（SCF）、ITS（インスリン−トランスフェリン−セレナイト）サプリメント、ADAM阻害剤、などが例示される。本発明において好ましい培地は、血清、インスリン、トランスフェリン、セリン、チオールグリセロール、アスコルビン酸、TPOを含むIMDM培地である。さらにSCFを含んでいてもよく、さらにヘパリンを含んでいてもよい。それぞれの濃度も特に限定されないが、例えば、TPOは、約10ng/mL〜約200ng/mL、又は約50ng/mL〜約100ng/mLとすることができ、SCFは、約10ng/mL〜約200ng/mL、又は約50ng/mLとすることができ、ヘパリンは、約10U/mL〜約100U/mL、又は約25U/mLとすることができる。ホルボールエステル（例えば、ホルボール-12-ミリスタート-13-アセタート；PMA）を加えてもよい。  
【００２７】
本発明に係る製造方法では、巨核球細胞の培養工程を、血清フリー及び／又はフィーダー細胞フリーの条件で行ってもよい。好ましくは、TPOを含有する培地で本発明の方法にしたがって製造された巨核球を培養することで行う方法である。血小板産生工程においては、血清フリー且つフィーダー細胞フリーで行うことができれば、得られた血小板を臨床的に用いる場合に免疫原性の問題が生じにくい。また、フィーダー細胞を用いないで血小板を産生させることができれば、フィーダー細胞を接着させる必要がないので、フラスコなどで浮遊培養することができるので、製造コストを抑制できるとともに、大量生産に適している。なお、フィーダー細胞を用いない場合は、conditioned mediumを使用してもよい。conditioned mediumは、特に限定されず、当業者が公知の方法等に従って作製することができるが、例えば、フィーダー細胞を適宜培養し、培養物からフィーダー細胞をフィルターで除去することによって得ることができる。  
【００２８】
具体的には、上記の遺伝子を巨核球細胞より未分化な細胞において強制発現させる工程は、当業者の常法にしたがって行うことができ、例えば、これらの遺伝子を発現するベクター、またはこれらの遺伝子をコードするタンパク質またはRNAの形態で巨核球細胞より未分化な細胞へ導入することによって成し得る。さらには、これらの遺伝子の発現を誘導する低分子化合物等を巨核球細胞より未分化な細胞と接触させることによって行うことができる。  
【００２９】
これらの遺伝子を発現するベクターとは、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びセンダイウィルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例、pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo）などが用いられ得る。単回導入により実施し得るという点において、好ましくは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。発現ベクターにおいて使用されるプロモーターの例としては、EF-αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点などを含有していてもよい。有用な選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。  
【００３０】
本発明の発現ベクターにおいて、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンによりその遺伝子の発現を制御するため、プロモーター領域にはテトラサイクリン反応性エレメントを有している薬剤応答性ベクターであってもよい。この他にも、Cre-loxPシステムを使用して、遺伝子をベクターから切り出すため、loxP配列にて遺伝子またはプロモーター領域もしくはその両方をはさむようにloxP配列を設置された発現ベクターを用いてもよい。  
【００３１】
巨核球細胞の製造においては、アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて培養している細胞を、(a)アクトミオシン複合体機能阻害剤で処理する工程、(b)ROCK阻害剤で処理する工程、(c)HDAC阻害剤で処理する工程、の少なくとも１つを含む。これらの処理により、より安定な増殖と多核化を進めることができる。  
【００３２】
アクトミオシン複合体機能阻害剤、ROCK阻害剤、HDAC阻害剤等で細胞を処理する場合の至適濃度などは、当業者であれば、予備的な実験によって予め決定することができる。また、処理する期間や方法なども、当業者において適宜選択することができる。例えば、ミオシン重鎖II ATPase阻害剤であるブレビスタチン処理の場合、2〜15μg/ml、あるいは、5〜10μg/ml程度を培養液中に添加し、培養期間としては、例えば、5〜10日間程度、特に、6〜7日間程度が好ましい。また、ROCK阻害剤であるY27632は、5〜15μM、あるいは、8〜12μM、好ましくは10μM程度で使用し、HDAC阻害剤であるバルプロ酸は、0.1〜1mM、あるいは、0.2〜0.7mM、好ましくは0.5mM程度で使用することができる。Y27632、バルプロ酸の処理時間としては、10〜21日間、好ましくは14日間程度である。  
【００３３】
ROCK（Rho-associated coiled−coil forming kinase／Rho結合キナーゼ）阻害剤としては、例えば、〔（R）−（＋）−トランス−N−（4−ピリジル）−4−（1−アミノエチル）-シクロヘキサンカルボキサミド・2HCl・H2O〕（Y27632）などを挙げることができる場合によっては、Rhoキナーゼ活性を阻害するような抗体、あるいは、核酸（例えば、shRNAなど）も、ROCK阻害剤として使用することができる。  
【００３４】
HDAC阻害剤は、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）活性を阻害する作用をもつ。これまでに、HDAC阻害剤は多数知られており、例えば、バルプロ酸、トリコスタチンA、SAHA（スベロイルアニリドヒドロキサム酸）、APHA（アロイルピロリルヒドロキシアミド）などを挙げることができ、特に、バルプロ酸、トリコスタチンAなどを好適に使用することができる。使用薬物が塩の形態を有する場合には、塩の形態で使用してもよい。  
【００３５】
アクトミオシン複合体機能阻害剤、ROCK阻害剤、HDAC阻害剤等で細胞を処理する場合の至適濃度などは、当業者であれば、予備的な実験によって予め決定することができる。また、処理する期間や方法なども、当業者において適宜選択することができる。例えば、ミオシン重鎖II ATPase阻害剤であるブレビスタチン処理の場合、2〜15μg/ml、あるいは、5〜10μg/ml程度を培養液中に添加し、培養期間としては、例えば、5〜10日間程度、特に、6〜7日間程度が好ましい。また、ROCK阻害剤であるY27632は、5〜15μM、あるいは、8〜12μM、好ましくは10μM程度で使用し、HDAC阻害剤であるバルプロ酸は、0.1〜1mM、あるいは、0.2〜0.7mM、好ましくは0.5mM程度で使用することができる。Y27632、バルプロ酸の処理時間としては、10〜21日間、好ましくは14日間程度である。  
【００３６】
強制発現させる工程の後、当該工程で得られた巨核球または巨核球前駆細胞に対して、強制発現を抑制して培養する工程をさらに含む。強制発現を抑制あるいは停止する方法として、例えば、薬剤応答性ベクターを用いて強制発現をしている場合には、対応する薬剤と当該細胞と接触させないことによって達成させてもよい。具体的には、ドキシサイクリンやテトラサイクリンにより遺伝子の強制発現を行う場合には、これらを除去した培地において細胞を培養することにより、強制発現を抑制することができる。この他にも、上記のLoxPを含むベクターを用いた場合は、Creリコンビナーゼを当該細胞に導入することによって達成させてもよい。さらに、一過性発現ベクター、およびRNAまたはタンパク質導入を用いた場合は、当該ベクター等との接触を止めることによって達成させてもよい。本工程において用いられる培地は、上記と同一の培地を用いて行うことができる。  
【００３７】
強制発現を抑制または停止して培養する際の培養条件は、上記のとおりである。また培養期間については、巨核球の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能であるが、例えば、2日間〜10日間、好ましくは3日間〜7日間程度である。少なくとも3日以上であることが望ましい。また、培養期間中は、適宜、継代を行うことが望ましい。  
【００３８】
遺伝子の強制発現を抑制する工程においても、培地にROCK阻害剤及び／又はアクトミオシン複合体機能阻害剤を加える。ROCK阻害剤及びアクトミオシン複合体機能阻害剤としては、上述した多核化巨核球の製造方法で使用したものと同じものを使用することができる。ROCK阻害剤としては、例えばY27632が挙げられる。アクトミオシン複合体機能阻害剤としては、ミオシン重鎖II ATPase阻害剤である、ブレビスタチンが挙げられる。ROCK阻害剤を単独で加えてもよく、ROCK阻害剤とアクトミオシン複合体機能阻害剤を単独で加えてもよいし、これらを組み合わせて加えてもよい。  
【００３９】
ROCK阻害剤及び／又はアクトミオシン複合体機能阻害剤は、0.1μM〜30μMで加えることが好ましく、例えば0.5μM〜25μM、5μM〜20μM等としてもよい。ROCK阻害剤及び／又はアクトミオシン複合体機能阻害剤を加えてからの培養期間は1日〜15日とすることができ、3日、5日、7日等としてもよい。ROCK阻害剤及び／又はアクトミオシン複合体機能阻害剤を加えることにより、CD42b陽性血小板の割合をさらに増加させることが可能である。  
【００４０】
なお、上述の巨核球細胞の製造方法の非限定的な例を開示するUS 2012-0238023 A1（国際公開第2011/034073号）、US 2014-0127815 A1（国際公開第2012/157586号）、US 2016-0002599 A1（国際公開第2014/123242号）は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。  
【００４１】
ｍRNAを導入する巨核球細胞群は、好ましくは、増殖可能な状態にある巨核球細胞群である。増殖可能な状態にある巨核球細胞群は、先に記載した巨核球細胞の製造方法において、巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つを強制発現した状態をいう。したがって、例えば、ドキシサイクリンやテトラサイクリンを含む増殖用の培地で培養している状態の巨核球細胞群であってもよく、他の方法で遺伝子を強制発現した状態にある巨核球細胞群であってもよい。増殖用の培地で培養されている期間であれば、ｍRNAをの導入時期は、特に限定されることはなく、増殖のための培養開始直後であってもよく、適切な倍加速度による増殖が確認できる培養開始後、３日〜４日であってもよい。なお、mRNAの導入後も、通常の方法に従って、必要な期間にわたって、増殖のための培養を５ヶ月以上継続することが可能である。  
【００４２】
本発明の方法において、選別される「血小板産生能が高い細胞群」とは、let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAの発現を指標として、他の細胞群と分類されるある一群の細胞をいう。  
【００４３】
本発明において、「血小板産生能が高い細胞群を選別する」とは、本発明者らによりヘテロな細胞集団であることが見いだされた巨核球細胞群の中から、相対的に血小板産生能が高い細胞群について、他の細胞群と区別可能な、すなわち検出可能な信号情報を提示することをいい、特には、視覚的に認識可能な情報を提示することをいうものとする。なお「視覚的に認識可能な構報」とは、細胞が直接的に視認しうる信号を発することに限定されるものではなく、細胞が発した信号を、数値、図表又は画像等によって視覚的に認識可能な情報に変換された情報であり、当業者が視覚的に認識可能な情報をいう。本明細書において、選別するという文言には、当該選別の後に、血小板産生能が高い細胞群を認識し、血小板産生能が高い細胞群を識別し、血小板産生能が高い細胞群を同定し、血小板産生能が高い細胞群を分類し、血小板産生能が高い細胞群を単離し、所望しない細胞群を除去し、所望の綱胞群の生死を判定し、血小板産生能が高い細胞群の特定の生物学的な信号を検出あるいは定量し、血小板産生能が高い細胞群の特定の物理的あるいは化学的な信号に基づいて分画することを含んでも良い。  
【００４４】
本発明の方法においては、指標となるマイクロRNAは、let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAである。let-7ファミリーに属するマイクロRNAとしては、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7a-3p、hsa-let-7b-3p、hsa-let-7d-3p、hsa-let-7e-3p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-let-7f-2-3p、hsa-let-7g-3p、hsa-let-7i-3p、hsa-let-7a-2-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7c-3p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-98-3p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-99b-3p、has-miR-100-5p、hsa-miR-100-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-125b-1-3p、hsa-miR-125b-2-3p、hsa-miR-202-5p、hsa-miR-202-3pが挙げられるが、これらには限定されない。指標となるマイクロRNAとしては、中でも、let-7a-5p、let-7g-5p、let-7i-5pが好ましいが、これらには限定されない。なお、以下の本明細書の説明において、let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAを、let-7 miRNAと指称する場合がある。したがって、巨核球細胞群に導入されるメッセンジャーRNA（mRNA）は、let-7 miRNAによって特異的に認識される配列（let-7 miRNAの標的配列とも指称する）と機能的に連結したマーカー遺伝子を含む。かかるmRNAを、let-7 miRNA応答性mRNA、あるいはmiRNA switchとも指称する。また、具体的なmiRNAの名称に基づいてlet-7a-5p応答性mRNAとも指称する。以下、let-7 miRNAが、let-7a-5pである場合について詳細に説明するが、本発明は、当該マイクロRNAに関するものには限定されない。他のlet-7 miRNAに関しても、下記のlet-7a-5p標的配列と同様に標的配列及びmRNAの配列を決定し、実施することができる。let-7a-5p標的配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAは、let-7a-5pが存在する場合に、その活性に応じてマーカー遺伝子の翻訳が制御される。好ましくは、let-7a-5pが存在する場合に、その活性に応じてマーカー遺伝子の翻訳が抑制されることで、当該マーカー遺伝子より翻訳された蛋白質（以下、マーカー蛋白質と指称する）の量が定量的に減少するmRNAである。  
【００４５】
let-7a-5pの標的配列は、let-7a-5pに特異的に結合可能な配列をいう。miRNA標的配列は、例えば、指標となるmiRNAに完全に相補的な配列であることが好ましい。
【表１】
2018052126.tif 000003
【００４６】
あるいは、当該let-7a-5p標的配列は、let-7a-5pにおいて認識され得る限り、完全に相補的な配列との不一致（ミスマッチ）を有していても良い。当該舶RNAに完全に相補的な配列からの不一致は、血小板産生能が高い細胞において、通常に let-7a-5pが認識し得る不一致であれば良く、生体内における細胞内の本来の機能では、40〜50％程度の不一致があっても良いとされている。このような不一致は、特に限定されない級1 塩基、 2塩基‘3塩基、4塩基、5 塩基、6塩基、7塩基、8塩基、9塩基、若しくは10塩基又は全認識配列の1 ％、5%、 10%. 20%. 30%、若しくは40％の不一致が例示される。また、特には、細胞が備えているlet-7a-5p 上のlet-7a-5p標的配列のように、特に、シード領域以外の部分に、すなわちlet-7a-5pの3'側16塩基程度に対応する、標的配列内の5'側の領域に、多数の不一致を含んでもよく、シード領域の部分は、不一致を含まないか、1 塩基、2塩基若しくは3塩基の不一致を含んでもよい。  
【００４７】
マーカー遺伝子は、細胞内で翻訳されて、マーカーとして機能し、細胞群の選別を可能にする任意の蛋白質をコードする遺伝子である。細胞内で翻訳されてマーカーとして機能しうる蛋白質としては、一例としては、蛍光、発光、呈色、若しくは蛍光、発光又は呈色を補助することなどにより、視覚化し、定量化することができる蛋白質であってよい。蛍光蛋白質としては、Sirius、EBFPなどの青色蛍光蛋白質；mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFPなどのシアン蛍光蛋白質；TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green（例えば、hmAGl)、ZsGreen、 EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、などの緑色蛍光蛋白質；TagYFP、 EYFP、 Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、Turbo YFP、ZsYellow、mBananaなどの黄色蛍光蛋白質；Kusabira Orange （例えば、hmKO2)、mOrangeなどの燈色蛍光蛋白質；TurboRFP、DsRed-Express、 DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、などの赤色蛍光蛋白質；Tur boFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed（例えば、hd KeimaRed)、mRasberry、mPlumなどの近赤外蛍光蛋白質が挙げられるが、これらには限定されない。  
【００４８】
発光蛋白質としては、イクオリンを例示することができるが、これに限定されない。また、蛍光、発光又は呈色を補助する蛋白質として、ルシフェラーゼ、ホスフアターゼ、ペルオキシダーゼ、βラクタマーゼなどの蛍光、発光又は呈色前駆物質を分解する酵素を例示することができるが、これらには限定されない。ここで本発明において、蛍光、発光又は呈色を補助する蛋白質をマーカー遺伝子として使用する場合、血小板産生能が高い細胞の選別において、対応する前駆物質と細胞を接触させること、又は細胞内に対応する前駆物質を導入することによって行われ得る。  
【００４９】
また、細胞内でマーカーとして機能しうる蛋白質の別の例としては、細胞の機能に直接影響を与える蛋白質類が挙げられる。細胞増殖蛋白質、細胞死滅蛋白質、アポトーシス制御蛋白質、細胞シグナル因子、薬剤耐性遺伝子、転写制御因子、翻訳制御因子、分化制御因子、リプログラミング誘導因子、RNA結合タンパク質因子、クロマチン制御因子、膜タンパク質を例示することができるが、これらには限定されない。例えば、細胞増殖蛋白質は、それを発現した細胞のみを増殖させ、増殖した細胞を特定することでマーカーとして機能する。細胞死滅蛋白質は、それを発現した細胞の細胞死を引き起こすことで、特定のmiRNAを含有もしくは含有しない細胞自体を死滅させ、細胞の生死を示すマーカーとして機能する。細胞シグナル因子は、それを発現した細胞が、特定の生物学的信号を発し、この信号を特定することでマーカーとして機能する。細胞死滅蛋白質として、例えば、BaxまたはBimが例示される。  
【００５０】
本発明において、マーカー遺伝子は、局在化シグナルをコードする遺伝子を備えていてもよい。局在化シグナルとしては、核局在化シグナル、細胞膜局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル、タンパク質分泌シグナル等を挙げることができ、具体的には、古典的核移行配列（NLS) 、M9 配列、ミトコンドリア標的配列（MTS）、小胞体移行配列を挙げることができるが、これらには限定されない。このような局在化シグナルは、後述するイメージングサイトメトリー等で、本発明の方法における選別工程を、画像上で行うときに特に有利である。  
【００５１】
本発明において、マーカー遺伝子として、翻訳制御因子を用いる場合、当該翻訳制御因子によって翻訳が制御される第二のマーカー遺伝子を有するmRNAを同時に細胞へ導入する。このような蛋白質によって翻訳が制御される第二のマーカー遺伝子を有するmRNAとして、当該翻訳を制御しうる蛋白質が結合できるRNA配列と機能的に連結された第ニのマーカー遺伝子配列を有するmRNAが例示される。  
【００５２】
本発明においてmiRNAの標的配列とマーカー遺伝子が機能的に連結するとは、マー力一遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ただし、開始コドンを含む。）の5' UTR内、3' UTR内、及び／または当該オープンリーディングフレーム内に、少なくとも１つのlet-7a-5p標的配列を備えることを意味する。 mRNAは、好ましくは、5'末端から、5' から3'、の向きに、Cap構造（7 メチルグアノシン5'リン酸）、マーカー遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム並びに、ポリAテイルを備え、5'UTR内、3'UTR内、及び／またはオープンリーディングフレーム内に少なくとも１つのlet-7a-5p標的配列を備える。mRNAにおけるlet-7a-5p標的配列の位置は、5'UTRであっても、3'UTRであってもよく、オープンリーディングフレーム内（開始コドンの3'側）であってもよく、これらのすべてにlet-7a-5p標的配列を備えていてもよい。したがって、let-7a-5p標的配列の数は、1 つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つあるいはそれ以上であっても良い。  
【００５３】
好ましくは、let-7a-5p標的配列は、5'UTRに1つ存在する。効率的な翻訳抑制を達成することができるためである。このとき、Cap構造とlet-7a-5p標的配列との間の塩基数及び塩基の種類は、開始コドンとなるAUGを含まず、かつステム構造や立体構造を構成しにくい限り、任意であってよい。例えば、Cap 構造とlet-7a-5p標的配列と間の塩基数は、0〜50塩基、好ましくは、10〜30塩基となるように設計することができるが、これらには限定されない。 また、let-7a-5p標的配列と開始コドンと間の塩基数及び塩基の種類は、ステム構造や立体構造を構成しにくいものである限り、任意であってよく、let-7a-5p標的配列と開始コドンとの間の塩基数は、0〜50 塩基、好ましくは、10〜30塩基となるように設計することができるが、これらには限定されない。なお、let-7a-5p標的配列が3’UTRに4つ存在する場合であっても、翻訳抑制を達成することは可能であることが確認されている。  
【００５４】
let-7a-5p応答性mRNAは、通常のウリジン、シチジンに替えて、シュードウリジン、5−メチルシチジンなどの修飾塩基を含んでいることが好ましい。細胞毒性を低減させるためである。修飾塩基の位置は、ウリジン、シチジンいずれの場合も、独立に、全てあるいは一部とすることができ、一部である場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができる。  
【００５５】
let-7a-5p応答性mRNAは、上記に従って配列が決定されれば、遺伝子工学的に既知の任意の方法により当業者が合成することができる。特には、プロモーター配列を含むテンプレートDNAを鋳型として用いたin vitro転写合成法により、得ることができる。  
【００５６】
本発明にむいて、let-7a-5p応答性mRNAを巨核球細胞群に導入する工程（以下、導入工程と指称する）は、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて、let-7a-5p応答性mRNAを直接、細胞群に含まれる細胞に導入することができる。あるいは、設計したlet-7a-5p応答性mRNAの核酸配列をコードするベクターを巨核球細胞群に導入することにより、let-7a-5p応答性mRNAを巨核球細胞群に導入することもできる。  
【００５７】
let-7a-5p応答性let-7a-5pとコントロールとなるmRNA （以下、コントロールmRNAとも指称する）とを用いる場合には、これらのmRNAを巨核球細胞群に共導入することが好ましい。共導入した2以上のmRNAから発現するマーカー蛋白質の活性比は、細胞集団内において一定であるためである。この時の導入量は、導入するmRNA、導入方法および導入試薬の種類等により異なり、所望の翻訳量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。ここで、コントロールmRNAとは、let-7a-5p標的部位を有さず、let-7a-5p応答性mRNAがコードするのマーカー遺伝子とは異なるマーカー遺伝子をコードするmRNAをいう。コントロールmRNAの導入量もまた、所望の翻訳量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。コントロールmRNAは、let-7a-5pの存在に関わらず、マーカー遺伝子を発現するmRNAである。  
【００５８】
let-7a-5p応答性mRNAが細胞に導入されると、細胞内では、細胞に所定のlet-7a-5pがRISCとして存在する場合、let-7a-5p応答性mRNAがコードするマーカー遺伝子の翻訳量が抑制される。そして、翻訳量の制御は、let-7a-5p活性に応じて定量的になされる。すなわち、let-7a-5pの存在量が多い細胞ではマーカー遺伝子の翻訳量が相対的に少なく、let-7a-5pの存在量が少ない細胞ではマーカー遺伝子の翻訳量が相対的に多くなる。一方、細胞に所定のlet-7a-5pが存在しない場合、もしくは所定のlet-7a-5pがRISCとして存在しない場合、let-7a-5p応答性mRNAがコードするマーカー遺伝子の翻訳量が抑制されることはない。したがって、let-7a-5pの存在量が異なる複数の細胞と間で、マーカー遺伝子の翻訳量が異なる。なお、本明細書において、let-7a-5pがRISC として存在する場合を、「let-7a-5p活性が存在する場合」とも指称し、活性化状態にあるlet-7a-5pの存在量が相対的に多い場合を「let-7a-5p活性が高い場合」とも指称する。一方、コントロールmRNAは、let-7a-5p活性に関係なくマーカー蛋白質を発現する。導入されても、let-7a-5p標的配列が存在しないため、let-7a-5p発現量に応じて翻訳制御されることがないためである。  
【００５９】
次いで、マーカー遺伝子の翻訳量を指標として、細胞を選別する工程（以下、選別工程とも指称する）を実施する。選別工程では、上記のようなマーカー遺伝子の翻訳量から、細胞を選別する。本発明者らは、let-7a-5p活性が相対的に高い巨核球細胞群が、血小板産生能が相対的に低く、let-7a-5p活性が相対的に低い巨核球細胞群が、血小板産生能が相対的に高いことを見出している（図１、図２）。マーカー蛋白質として蛍光蛋白質を用いた場合、図１のヒストグラムを参照すると、Controlで示される線よりも右下に位置する細胞群は、let-7a-5pに応答して翻訳抑制された巨核球細胞群を表す。この中で、白色矢印が示す蛍光強度が相対的に高い細胞群は、let-7a-5p活性が相対的に低い巨核球細胞群を示している。黒色矢印が示す蛍光強度が相対的に低い細胞群は、let-7a-5p活性が相対的に高い巨核球細胞群を示している。このようなlet-7a-5p活性と、マーカー遺伝子の翻訳制御量により、巨核球細胞群を選別することができる。蛍光強度の高低は相対的なものであり、選別する対象となる巨核球細胞群の特性や、マーカー蛋白質の特性によっても異なりうるため、当業者が適宜閾値を決定し、分別することができる。その際、例えば、実施例にて後述する、let-7a-5pの阻害剤を用いた活性のレスキューに関する事前実験を行い、あるいは、血小板産生量についての事前実験を行い、閾値を決定することもできる。  
【００６０】
好ましい態様において、マーカー遺伝子は薬剤耐性遺伝子であってもよい。「薬剤耐性遺伝子」は、対応する薬剤に対して抵抗性を有する蛋白質を発現する遺伝子であれば何でもよい。例えば、抗生物質耐性遺伝子を含むが、これらに限定されない。抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられる。本発明において、好ましくは、ピューロマイシン耐性遺伝子またはブラストサイジン耐性遺伝子が抗生物質耐性遺伝子として用いられる。マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合、let-7a-5p活性が高い巨核球細胞群においては、薬剤耐性遺伝子の発現が選択的に抑制される。このため、let-7a-5p活性が高い巨核球細胞群は、対応する薬剤に対する抵抗性が低下して死滅する。したがって、これらの死細胞を選択的に除去することができる。
【００６１】
あるいは、マーカー遺伝子として翻訳制御因子を用いた場合、同時に細胞へ導入した第二のマーカー遺伝子の翻訳量から細胞を選別することができる。上述したマーカー遺伝子により翻訳が抑制される第二のマーカー遺伝子を有するmRNAを利用することで、第二のマーカー遺伝子の翻訳量は、指標となるlet-7a-5pの発現量と比例する。すなわち、血小板産生能が高い細胞群が、指標となるlet-7a-5pの発現量が少ない細胞である場合、第二のマーカー遺伝子の翻訳量が少ない細胞を選別し、指標となるlet-7a-5pの発現量が多い細胞である場合、第二のマーカー遺伝子の翻訳量が多い細胞を選別することができる。マーカー遺伝子として細胞死滅蛋白質を用いた場合、指標となるlet-7a-5pの発現量が多い細胞は、特異的に細胞死を誘導され、取り除くことができる。
【００６２】
具体的には、選別工程は、所定の検出装置を用いて、マーカー蛋白質からの信号を検出することにより実施することができる。検出装置としては、フローサイトメーター、イメージングサイトメーター、蛍光顕微鏡、発光顕微鏡、CCD力メラ等が挙げられるが、これらには限定されない。このような検出装置は、マー力一蛋白質及び選別の態様により、当業者が適したものを用いることができる。例えばマーカー蛋白質が、蛍光蛋白質又は発光蛋白質の場合には、フローサイトメーター、イメージングサイトメーター、蛍光顕微鏡、CCDカメラといった検出装遺を用いてマー力一蛋白質の定量が可能であり、マーカー蛋白質が、蛍光、発光又は呈色を補助する蛋白質の場合には、発光顕微鏡、CCDカメラ、ルミノメーターといった検出装置を用いたマーカー蛋白質の定量方法が可能であり、マーカー蛋白質が、膜局在蛋白質の場合には、抗体などの細胞表面蛋白質特異的な検出試薬と、上記の検出装置を用いたマーカー蛋白質の定量方法が可能である他、磁気細胞分離装置（MACS)といった、マーカー蛋白質の定量過程を経ない細胞の単離方法が可能である。  
【００６３】
増殖期にある巨核球細胞群に対してmRNAを導入した場合には、血小板産生能の高い細胞群を選別した後、必要に応じて、選別後の巨核球細胞群について増殖のための培養を継続することができる。それに続き、通常の巨核球細胞の製造方法にしたがって、遺伝子の強制発現を抑制（解除）し、巨核球細胞を成熟させ、血小板の産生に用いることができる。
あるいは、増殖期以外の巨核球細胞群に対してmRNAを導入した場合にも、通常の巨核球細胞の製造方法にしたがって、選別後の巨核球細胞の製造を継続し、血小板の産生に用いることができる。  
【００６４】
本実施形態によれば、miRNAの発現を指標として、巨核球細胞群から、血小板産生能が相対的に高い細胞群を選別することができる。この選別は、巨核球細胞の増殖期に実施することができる。したがって、選別された血小板産生能が相対的に高い細胞群のみを、増殖期において容易に選別し、その細胞集団のみを増やすことができることから、その後に血小板産生能の高い細胞集団のみを成熟させることから最終段階での血小板の産生効率が高くなる。
【００６５】
［血小板の製造方法］
本発明は、別の実施形態によれば、血小板の製造方法であって、
（ｉ）先の実施形態に記載の方法により血小板産生能の高い巨核球細胞群を選別する工程と、
（ｉｉ）選別した細胞群を培養する工程と、
（ｉｉｉ）前記培養する工程により得られた培養物から血小板を回収する工程とを含む。  
【００６６】
「血小板」は、血液中の細胞成分の一つであり、CD41a陽性及びCD42b陽性で特徴づけられる。血小板は、血栓形成と止血において重要な役割を果たすとともに、損傷後の組織再生や炎症の病態生理にも関与する。出血等により血小板が活性化されると、その膜上にIntegrin αIIBβ3（glycoprotein IIb/IIIa; CD41aとCD61の複合体）などの細胞接着因子の受容体が発現する。その結果、血小板同士が凝集し、血小板から放出される各種の血液凝固因子によってフィブリンが凝固することにより、血栓が形成され、止血が進む。  
【００６７】
血小板の機能は、公知の方法により測定し評価することができる。例えば、活性化した血小板膜上のIntegrin αIIBβ3に特異的に結合するPAC-1に対する抗体を用いて、活性化した血小板量を測定することができる。また、同様に血小板の活性化マーカーであるCD62P（P-selectin）を抗体で検出し、活性化した血小板量を測定してもよい。例えば、フローサイトメトリーを用い、活性化非依存性の血小板マーカーCD61又はCD41に対する抗体でゲーティングを行い、その後、抗PAC-1抗体や抗CD62P抗体の結合を検出することにより行うことができる。これらの工程は、アデノシン二リン酸（ADP）存在下で行ってもよい。  
【００６８】
また、血小板の機能の評価は、ADP存在下でフィブリノーゲンと結合するか否かを見て行うこともできる。血小板がフィブリノーゲンと結合することにより、血栓形成の初期に必要なインテグリンの活性化が生じる。  
【００６９】
さらに、血小板の機能の評価は、国際公開第2011/034073号の図６に示されるように、in vivoでの血栓形成能を可視化して観察する方法で行うこともできる。  
【００７０】
本実施形態に係る血小板の製造方法は、国際公開第2011/034073号、国際公開第2012/157586号、及び国際公開第2014/123242号に開示された本出願人らによる先行技術による方法に対して、その過程で、先に記載した実施形態にしたがってlet-7a-5p応答性mRNAを用いて巨核球細胞を選別し、選別した巨核球細胞において血小板を産生させることを特徴とする。したがって、所定の時期に選別を行うことを除いては、これらの方法と同様にして実施することができる。  
【００７１】
例えば、好ましい実施態様において、巨核球細胞が増殖可能な状態にある所定の遺伝子を強制発現させる工程において選別方法を実施する場合には、選別後に必要な程度まで強制発現させる工程を継続することができる。その後、巨核球細胞を成熟させる、遺伝子の強制発現を抑制する工程を実施することができる。  
【００７２】
本発明で得られた血小板は、製剤として患者に投与することができる。投与に当たっては、本発明の方法で得られる血小板は、例えば、ヒト血漿、輸液剤、クエン酸含有生理食塩液、ブドウ糖加アセテートリンゲル液を主剤とした液、PAS（platelet additive solution）（Gulliksson, H. et al., Transfusion, 32：435-440, (1992））等にて保存、製剤化してもよい。保存期間は、3日から7日程度で、好ましくは4日間である。保存条件として、室温（20-24度）で振盪撹拌して保存することが望ましい。  
【００７３】
［巨核球細胞選別キット］
本発明は、さらに別の実施形態によれば、巨核球細胞選別キットであって、前記let-7ファミリーから選択されるマイクロRNAによって特異的に認識される核酸配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを含んでなる。好ましい実施形態において、let-7ファミリーから選択されるマイクロRNA（let-7miRNA）はlet-7a-5pであり、mRNAは、先の実施形態において、let-7a-5p応答性mRNAあるいはmiRNA switchとして説明したｍRNAであってよい。このほかに、細胞選別キットは、let-7miRNA標的配列を持たず、let-7miRNA応答性mRNAとは異なるマーカー遺伝子を含むコントロールmRNAや、これらの巨核球細胞への導入に必要な試薬類、let-7miRNA阻害剤、let-7miRNAなどを含んでいてもよい。  
【００７４】
［血小板の製造方法］
本発明は、また別の実施形態によれば、血小板の製造方法であって、
（ａ）巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて、不死化巨核球細胞を得る工程と、
（ｂ）前記強制発現を抑制して、巨核球細胞を培養する工程と
を含み、前記不死化巨核球細胞を得る工程において、NR6A1遺伝子を強制発現させる工程を含む。  
【００７５】
不死化巨核球細胞を得る工程（ａ）及び巨核球細胞を培養する工程（ｂ）については、先に記載したとおりである。本実施形態においては、不死化巨核球細胞を得る工程において、NR6A1遺伝子を強制発現させる工程を含む。  
【００７６】
NR6A1遺伝子の強制発現は、不死化巨核球細胞を得る工程における、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子の強制発現と同様の方法で、これらの遺伝子を組み込んだウイルスベクターを作製することにより実施することができる。具体的には、NR6A1遺伝子の強制発現及び強制発現の解除は、国際公開第2011/034073号、国際公開第2012/157586号、国際公開第2014/123242、またはNakamura S et al, Cell Stem Cell. 14, 535-548, 2014に記載された方法、その他の公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。NR6A1遺伝子の鋳型配列を配列番号４９に示す。NR6A1遺伝子の強制発現は、不死化巨核球細胞を得る工程（ａ）において実施することができ、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子の強制発現の解除と概ね同時に、R6A1遺伝子の強制発現の解除も行うことができる。  
【００７７】
血小板の製造方法の別の態様においては、
巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて、不死化巨核球細胞を得る工程と、
前記癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子の強制発現を抑制して、巨核球細胞を培養する工程と
を含み、前記不死化巨核球細胞を得る工程における前記細胞中の、Lin28A遺伝子をコードするDNAのプロモーターのCpGアイランド領域におけるメチル化量を減少させる工程を含む。  
【００７８】
細胞中のLin28A遺伝子をコードするDNAの、プロモーターのCpGアイランド領域におけるメチル化量の検出は、MeCP2 suppresses LIN28A expression via binding to its methylated-CpG islands in pancreatic cancer cells（Oncotarget. 2016 Mar 22; 7(12): 14476-14485）に基づき、例えば、QIAGEN社のDNA抽出キット、ザイモリサーチ社のEZ DNA Methylation-Gold Kitを用いて、あるいは同様の市販のキットを用い、これらのキットの指示にしたがって、実施することができる。ここでいう「細胞」中とは、不死化巨核球細胞を得る工程（ａ）における細胞であってもよく、巨核球細胞を培養する工程（ｂ）における細胞であってもよいが、不死化巨核球細胞を得る工程（ａ）における細胞中の状態に基づいて判断することが好ましい。メチル化量を減少させる工程は、細胞を振盪培養することにより実施することができる。メチル化量を減少させる工程は、不死化巨核球細胞を得る工程（ａ）または巨核球細胞を培養する工程（ｂ）あるいはこれらの両方の工程において、実施することができるが、メチル化量の判断基準時を、不死化巨核球細胞を得る工程（ａ）とすることが好ましいため、不死化巨核球細胞を得る工程（ａ）において振盪培養を行うことが好ましい。振盪培養の条件は、培養規模にもよるが、例えば、５０ｒｐｍ以上であり、１００ｒｐｍ以上とすることが好ましい。また、このような条件とする場合、振盪培養の期間は、３日〜１０日間程度とすることが好ましい。メチル化量を減少させて、メチル化量が、例えば、２０％以下、好ましくは１３％以下程度であると、let-7a-5pの活性を抑制することができ、巨核球の成熟を阻害する要因を除去し得るためより好ましい。  
【００７９】
血小板の製造方法のまた別の態様においては、
多能性幹細胞を分化誘導して、巨核球細胞より未分化な細胞を得る工程と、
前記巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて、不死化巨核球細胞を得る工程と、
前記癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子の強制発現を抑制して、巨核球細胞を培養する工程と
を含み、前記巨核球細胞より未分化な細胞を得る工程が、前記多能性幹細胞をMatrigel（登録商標）を含む基質を用いて培養する工程を含む。  
【００８０】
本実施形態においては、多能性幹細胞を分化誘導して、巨核球細胞より未分化な細胞を得る工程を含む。多能性幹細胞は、特には限定されず、ES細胞やiPS細胞が含まれるが、好ましくは、iPS細胞である。iPS細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO2007/069666）であってよい。このようなであってもよい。また、特には、国際公開WO2016/167329に開示された方法により製造されたiPS細胞であって、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子がノックインされたiPS細胞であってもよく、特には限定されない。  
【００８１】
本実施形態においては、巨核球細胞より未分化な細胞を得る工程において、多能性幹細胞をMatrigel（登録商標）、ラミニン421もしくはその断片、またはラミニン121若しくはその断片、あるいはそれらの組み合わせから選択される基質を用いて培養する。Matrigel（登録商標）、ラミニンはいずれも、基底膜を構成する細胞外細胞マトリックスの1つである。Matrigel（登録商標）は、ラミニンを主成分とし、IV型コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン／ニドゲン、成長因子を含む。ラミニンには多数のアイソフォームが存在しており、各アイソフォームは、５種類のα鎖（α１、α２、α３、α４、α５）、３種類のβ鎖（β１、β２、β３）及び３種類のγ鎖（γ１、γ２、γ３）がそれぞれ１本ずつサブユニット鎖としてＣ末端側で会合してコイルドコイル構造を作り、ジスルフィド結合によって安定化したヘテロ３量体分子を形成している。本実施形態において使用するラミニン４２１は、α４鎖、β２鎖及びγ１鎖から構成され、ラミニン１２１は、α１鎖、β２鎖及びγ１鎖から構成される。これらの断片としては、例えばＥ８断片が好ましい。ラミニンは天然型であってもよく、その生物学的活性を維持する限り、１またはそれ以上のアミノ酸残基が修飾された修飾型であってもよい。ラミニンは既知の任意の製造方法により得ることができ、市販品を用いることもできる。ラミニンの製造方法は特に限定されず、例えば、ラミニン高発現細胞から精製する方法、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられるが、これらには限定されない。ラミニン断片の製造方法も特に限定されず、例えば、全長ラミニンをエラスターゼ等のタンパク質分解酵素で消化し、目的の断片を分取し、精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられるが、これらには限定されない。製造量、品質の均一性、製造コスト等の観点から、ラミニンおよびラミニン断片の両者とも、組換えタンパク質として製造することが好ましい。
【００８２】
iPS細胞などの多能性幹細胞から、分化誘導により、巨核球細胞より未分化な細胞を調製する技術は確立されており、基質以外の培養条件は、公知の技術に基づいて実施することができる。例えば、国際公開WO2011/034073において詳述した、多能性幹細胞から巨核球細胞より未分化な細胞を誘導する条件と同様であってよい。具体的には、「巨核球細胞より未分化な細胞」として、ｉＰＳ細胞から調製されるネット様構造物（ｉＰＳ−ｓａｃとも称する）から得られる細胞（特に、ネット様構造物から分離した直後の細胞）を誘導する培養条件であってよい。ｉＰＳ細胞から調製される「ネット様構造物」とは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞由来の立体的な嚢状（内部に空間を伴うもの）構造体で、内皮細胞集団などで形成され、内部に造血前駆細胞を含むもののことである。ネット様構造物の詳細については、例えば、ＴＡＫＡＹＡＭＡら，ＢＬＯＯＤ  ２００８，１１１：５２９８−５３０６、を参照のこと。ネット様構造物をヒトｉＰＳ細胞から調製するために適した細胞の培養条件は、用いるｉＰＳ細胞によって異なるが、例えば、培地としては、最終濃度１５％のＦＢＳを添加したＩＭＤＭを用い、その他無血清の場合においても適宜増殖因子およびサプリメント等を加えたものを使用することができる。さらに、ネット様構造物を効率的に形成させるために、ＶＥＧＦを０〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、２０ｎｇ／ｍｌ程度加えるのがよい。培養の環境としては、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の種類によって異なるが、例えば、５％  ＣＯ２、３６〜３８℃、好ましくは３７℃の条件を用いることができる。
【実施例】
【００８３】
以下、本発明を、実施例を用いてより詳細に説明する。しかしながら、下記の実施例は、本発明を限定するものではない。  【００８４】
IVT (in vitro transcription) に用いる鋳型DNAの作製
5'UTRの鋳型(miRNA標的配列なし)と3'UTRの鋳型は、対応するプライマーとKOD-Plus-Neo（KOD-401,TOYOBO）を用いて、94°C 2 min後、98°C、10 sec、68°C、1 min を25サイクルという条件でPCR増幅を行い、作製した。tagBFP及びhmAG1をコードする遺伝子は、鋳型プラスミド(それぞれpTAP-tagBFP、pFucci-S/G2/M Green-Hyg (Expression vector)) から対応するプライマーとKOD-Plus-Neo（KOD-401,TOYOBO）を用いて、94°C、2 min後、98°C、10 sec、68°C、1 min を25サイクルという条件でPCR増幅を行い、作製した。  【００８５】
IVTの鋳型となるFull DNA Templateは上記で作製したPCR産物と、それぞれ対応するプライマー（miRNA応答配列を持つものは、5'UTRの代わりにオリゴDNAを使用）を用いて、94°C 2 min後、98°C 10 sec、68°C 1 min を25サイクルという条件でPCR増幅を行い、作製した。全てのPCR産物は、MiniElute PCR purification Kit (QIAGEN)により精製した。但し、PCR反応でプラスミドを用いたものに関しては、精製前に制限酵素Dpn Iによる処理を施した。使用したプライマー及びオリゴヌクレオチド配列を表２に示す。  【００８６】
【表２】
2018052126.tif 000004
【００８７】
microRNA switchの作製と精製
全てのmRNAは、MegaScript kit (Ambion)により作製した。この時、免疫反応を抑えるため、修飾塩基pseudouridine-5'-triphosphateと5-methylcytidine-5'-triphosphate (TriLink Bio Technologies)をUTPとCTPの代わりにそれぞれ加えた。またGTPは、Anti Reverse Cap Analog (TriLink Bio Technologies)で5倍希釈した。反応混合液を37°Cで6時間インキュベートして、TURBO DNase (Amibion)を加えた後、37°Cでさらに30分インキュベートした。得られたmRNAは、FavorPrep Blood／Cultured Cells total RNA extraction column (Favorgen Biotech)で精製し、Antarctic phosphatase (New England Biolabs)を用いて37C°で30分インキュベートした。その後、RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (QIAGEN)により、さらに精製した。作製したmRNAの配列を表３に示す。  【００８８】
【表３Ａ】
2018052126.tif 000005
【表３Ｂ】
2018052126.tif 000006
【表３Ｃ】
2018052126.tif 000007
【００８９】
細胞培養、血小板の産生
Nakamura et al, Cell Stem Cell. 2014 Apr 3;14(4):535-48.及び国際公開第2014/123242号に記載の方法により樹立した、iPS細胞（TKDN SeV2：センダイウィルスを用いて樹立されたヒト胎児皮膚繊維芽細胞由来iPS細胞、585A1、585B1、606A1、648B1および692D2：Okita K, et al, Stem Cells 31, 458-66, 2012に記載のエピソーマルベクターを用いて樹立されたヒト末梢血単核球由来iPS細胞）由来の造血幹細胞に、c-MYC、BMI1およびBCL-XLを同時に導入して製造した不死化巨核球前駆細胞株Cl-7（以下、imMKCLともいう）を出発物質とし、Nakamura et alの12頁、Cell Cultureに記載の方法に基づいて細胞培養を行った。ただし、血小板産生条件では、C3H10T1/2細胞は用いず、フィーダーフリー条件下で6well培養プレートにヒトstem cell factor (SCF) 50ng/ml, ヒトthrombopoietin (TPO) 50 ng/mlに加えてROCK (Rho associated protein kinase)阻害剤 Y27632（国際公開第2012/157586号） 10μM、Aryl hydrocarbon receptor antagonist, StemRegenin 1 (SR1) 0.75nM、ADAM 17阻害剤、KP457 15μM（Hirata et al., Stem Cell Translational Medicine, in press）を添加した培地2ml/wellに、細胞を1*105/mlとなるよう播種した。DOX OFF （血小板産生のための培地）に変化させたday6-8後に血小板数測定をFACS Verseを用いて行った。DOX ON培地は、Takayama et al, Blood. 2008 Jun 1;111(11):5298-306に記載の、ESC differentiation mediumに、SCF、TPOを先に記載の濃度で、ドキシサイクリン（Doxycycline）を0.5μg/ml加えたものとした。DOX OFF培地は、SCF, TPO, Y27632, KP457を先に記載の濃度で加えたものとした。  【００９０】
miRNA switchの導入及び解析
巨核球細胞株が増殖を示すドキシサイクリンDOX ON (ドキシサイクリン存在下) の条件で、6well培養プレートにヒトstem cell factor (SCF) 50ng/ml, ヒトthrombopoietin (TPO) 50 ng/ml存在した状態で、miRNA switchのimMKCLへの導入はリポフェクション法で行った。Stemfect (Stemgent社)1μl+Buffer 5.25μl、および100ng/μlのコントロールmRNAとlet-7a-5p応答性ｍRNAを0.75μlずつ+Buffer 4.75μlを混ぜて15分間室温静置し、96wellプレートに入れて1-4*106/mlに懸濁した細胞液を50μl混ぜ合わせて30分間室温静置したのち、培地を150μl加えて一晩培養した。翌朝、細胞増殖するDOX ONの条件のまま、FACS AriaIIを用いて解析した。  【００９１】
DOX ON条件のままで、let-7a-5p活性の高い群（activity High）と低い群(activity Low)をFACS AriaII(解析と同じ機種)を用いて細胞分離を実施した（フローサトメータによるソート）。分離後は再度、ドキシサイクリンを添加した培地（DOX ON）に懸濁した。一度分離した細胞は、２週間までなら分離効果が確実に残っていることは確認した（図３）。このため、実験には分離後３日から２週間までのものを使用した。それをDOX OFF(巨核球を成熟化させ、血小板が産生するための培地)に変えて６日後には、低い群(activity Low)で、有意に血小板産生数が上昇していた（図２）。  【００９２】
let-7a-5p活性で分離した後にDOX OFFとし、継時的にlet-7a-5p活性を調べたが、活性の高さの傾向は保たれたままであった（図３）。  【００９３】
let-7a-5p inhibitor及びNegetive ControlはApplied Biosystems社から購入した。予備実験での検討に基づいて、imMKCLへの導入方法はリポフェクション法で行い、Stemfect (Stemgent社)1μl+Buffer 5.25μl、および10μMのmiRNA inhibitorやネガティブコントロールを0.4μl+Buffer 5.85μlを混ぜて15分間室温静置、96wellプレートに入れて1-4*106/mlに懸濁した細胞液を50μl混ぜ合わせて30分間室温静置したのち、培地を150μl加えて一晩培養した。翌朝細胞を洗浄し、一部はFACS AriaIIで解析し、残りはDOXを除いた培地に懸濁して細胞を成熟させた。Highの細胞集団へのinhibitorにより、血小板産生数が上昇し、Low細胞集団と近似した。つまり、let-7a-5p活性が高いと血小板産生放出が抑制されていることを示した（図４）。  【００９４】
図１、２について記載した方法でlet-7a-5p活性の高い集団と低い集団を分離したのち、RNA抽出、cDNA合成を行い、定量PCRを行った。RNA抽出はmiRNeasy Mini Kit (QIAGEN社)を用い、製造者の指示に従って行った。cDNA合成は500ngのトータルRNAを用い、ReverTra Ace（登録商標） qPCR RT Master Mix (東洋紡社)を使って製造者の指示に従って行った。定量PCRに使用したプライマーは既報（Nakamura et al, Cell Stem Cell. 2014 Apr 3;14(4):535-48.）の通りである。詳細な配列は、下表５に記載する。試薬はSYBR PreMix ExTaq II (タカラバイオ社)を使用し、以下の表４に示す混合溶液を作製した。装置はStepOneplus (Applied Biosystems社)を用いた。PCRサイクルは95℃1分→（95℃10秒→55℃10秒→72℃30秒）*40サイクルで行った。内因性コントロールにはGAPDHを用い、データ解析はΔΔCT法を用いた。let-7a-5p活性に不均一性が出る原因が、imMKCLに強制発現している3遺伝子（C-MYC, BMI1, BCLXL）の影響である可能性があるため、これら3遺伝子の発現量を定量PCRで確認したが、統計学的に有意差は出なかった（図５）。  【００９５】
【表４】
2018052126.tif 000008
【００９６】
let-7a-5pが機能的に巨核球成熟・血小板産生を阻害していることが判明したため、let-7a-5pの標的を見つける目的で、let-7a-5p活性の高い細胞集団と低い細胞集団に対してRNAシークエンスを行い、遺伝子発現量比較を行った。図５で用いたRNAサンプルの一部をRNAシークエンスに用いた。cDNA合成およびライブラリ作製は過去の論文通り (T Nakamura et al, Nucleic Acids Res. 2015 May 19;43(9):e60.)に行った。シークエンスはMiSeq Reagent Kit v3（イルミナ社）を用いた。活性の低い細胞集団で2倍以上発現している遺伝子は691個存在した。さらに、miRSystem、miRDB、miRSearchの３つのmiRNA標的予測データベースを用いて、691個の遺伝子の中からlet-7a-5pの標的となりうるものを選び出し、18個の遺伝子をピックアップした（図６）。これらの遺伝子のうち、Lin 28AおよびNR6A1が、let-7a-5p活性の低い細胞集団（血小板産生能力が高い細胞集団）において発現が高いことがわかった（図７）。  【００９７】
図１、２及び５について記載した方法で、Lin 28A, Lin 28B, NR6A1の定量PCR（図８）、およびE2F2, TTLL4, TBKBP1, XKR8, CCNF, IGF2BP1の定量PCR（図９）を行った。各遺伝子のプライマーはRoche社Universal Probe Library Assay Design Centerで設計を行い、あらかじめ希釈系列を用いてプライマーが適正であることを確認した。配列は下表５に示す。その結果、let-7a-5p活性の高い集団にinhibitorを加えることにより発現量がレスキューされたNR6A1及びLin28Ｂが、let-7a-5pの標的となっていることが示唆された（図８）。同様に、IGF2BP1もlet-7a-5pの標的となっていることが示唆された（図９）。  【００９８】
【表５】
2018052126.tif 000009
【００９９】
試薬の変更
先に記載したmiRNA switchの導入及び解析に関する実験を、リポフェクション試薬をScreenfect（Wako社）に変更して行った。具体的にはScreenfect 1μl + Buffer 7μl、および100ng/μlのコントロールmRNAとlet-7a-5p応答性mRNAを0.5ulずつ+Buffer 7μlを混ぜて15分間静置し、96wellプレートに入れて2*106/mlに懸濁した細胞液を50μl混ぜ合わせて30分間室温静置したのち、培地を150μl加えて一晩培養した。また、先に記載した定量PCRのうち、NR6A1のプライマーは以下のより非特異的増幅の少ないものに変更した。変更に当たって何度か変更前後のプライマーを用いて実験を行って、結果にほとんど差がないことを証明した。
Forward Primer; CCCAGTCATACAGTCTGAT（配列番号４５）
Reverse Primer; AAGCAGGGCAAATAGTTCT（配列番号４６）  【０１００】
NR6A1の強制発現
先に図７を参照して示した実験結果から、NR6A1はLet-7a-5pの下流標的遺伝子であることが想定され、Let-7a-5p活性の高い群の細胞にNR6A1を過剰発現させることで抑制されている血小板産生がレスキューされることが考えられた。それを実証するために、NR6A1を過剰発現させるためのウイルスを作製した。先に記載した定量PCRの実験で用いたcDNA（配列番号４９）を鋳型とし以下のプライマーを用いてPCR（94℃1分→（98℃ 5秒→57℃ 10秒→72℃ 1分）×3サイクル→（98℃ 5秒→68℃10秒→72℃1分）×40サイクル）を行ってインサートを作製した。これをクローンテック社のIn-Fusion HD cloning Kitを用いて、決められた手順通りに研究室内で用いているレンチウイルスベクター（tet依存性、GFP発現）に組み込むことでtet依存性NR6A1発現ベクターを作製した。このプラスミドをもとにウイルスを作製した。
Forward Primer; CGGTACCCGGGGATCCGCCACCATGGAGCGGGACGAACCG（配列番号４７）
Reverse Primer; GCTGACTAGAGGATCCTCATTCCTTGCCCACACTGGT（配列番号４８）【０１０１】
Let-7a-5p活性の高い群のimMKCLになにも発現しないウイルスとNR6A1を発現するウイルスをMOI=1となるように感染させ、十分に細胞数が増殖したのちにフローサイトメーターでGFP陽性細胞を分離した。そのimMKCLをDOX offとしたところ、day7で計測した血小板産生数は、NR6A1感染群で有意に多くみられた（図１０（ａ））。これにより、Let-7a-5pが機能的に血小板産生を障害した原因遺伝子の少なくとも一つはNR6A1であることが示唆された。また、NR6A1の強制発現により、血小板産生数を増加させることができることがわかった。  【０１０２】
NR6A1が巨核球成熟・血小板産生に重要な遺伝子であることを証明するために、siRNAによるノックダウンを行った。siRNAはすべてDharmacon社から購入し、imMKCLへの導入は予備検討の結果、先に図４を参照して記載したlet-7a-5p inhibitor及びNegative Controlを用いる実験と同様に実施できることが判明した。さらに予備検討でAHR（Aryl Hydrocarbon Receptor）のノックダウンが血小板産生を促進することも証明し、この実験系が正常に働くことを示した。NR6A1のsiRNAは配列4種類分購入し、予備検討により＃１と＃３で十分なノックダウン効率が得られることを証明した。imMKCLに対してNR6A1 siRNA＃１、＃３およびネガティブコントロールsiRNAを導入したところ、NR6A1ノックダウンにより有意に血小板産生能が低下した（図１０（ｂ））。  【０１０３】
imMKCLだけでなく、臍帯血由来巨核球においてもlet-7a-5pやNR6A1が重要な遺伝子であるかどうか実験を行った。DSファーマバイオメディカル社から購入した臍帯血CD34陽性細胞を先の細胞培養、血小板の産生の実験に記載のESC differentiation mediumにSCF 2.5ng/ml, TPO 100ng/ml, FLT3L 2.5ng/ml, IL6 50ng/mlを加えた培地を用いて7日間培養した。7日後に得られた細胞のうち、CD41陽性細胞をミルテニーバイオテク社のMACSビーズを用いて分離し、let-7a-5pおよびネガティブコントロール、NR6A1 siRNAおよびネガティブコントロールをリポフェクション法により導入した。導入方法は予備検討の結果、Stemfect (Stemgent社)1μl+Buffer 5.25μl、および10μMのlet-7a-5pおよびネガティブコントロール、NR6A1 siRNAおよびネガティブコントロール1 μl+Buffer 5.25μlを混ぜて15分間室温静置、96 wellプレートに入れて1-4*106/mlに懸濁した細胞液を50μl混ぜ合わせて30分間室温静置したのち、imMKCLのDOX off培地と同じ培地に移し替えて7日間培養し、血小板産生数を測定した。その結果、Let-7a-5p mimicやNR6A1 siRNAは有意に血小板産生能を低下させた（図１０（ｃ））。これにより、imMKCL細胞株だけでなく、より一般的な巨核球細胞においてLet-7a-5pは成熟を阻害する因子であり、NR6A1は促進する重要な因子であることが明らかとなった。  【０１０４】
LIN28A
先に記載したlet-7a-5pの標的となりうるものとしてピックアップした１８の遺伝子のうち、LIN28AはLet-7a-5pの成熟を阻害する遺伝子であることは多数報告されている。imMKCLにおいても、Let-7a-5p活性の高い群と低い群とでは大きくLIN28AmRNA発現量に差がみられることから（図８）、LIN28Aがより上流でLet-7a-5p活性を調節している可能性を考えて実験を行った。Let-7a-5p活性の低い群のimMKCL（DOX ON）に、配列番号１６で示すLet-7a-5p応答性tagBFP mRNAと、配列番号１８で示すControl hmAG1 mRNAを共導入、またはこれらとLIN28A siRNAの共導入をinhibitor導入の実験と同様にリポフェクション法で行った。その結果、LIN28AノックダウンによりLet-7a-5p活性の上昇が認められた（図１１（ａ））。LIN28Bのノックダウンではそのような結果は見られなかった（図１１（ｂ））。グラフ中、"vehicle"は、siRNA negative controlのトランスフェクションを表す。imMKCLにおいてLIN28AがLet-7a-5p活性の調節因子であることが明らかとなった。  【０１０５】
LIN28Aの発現を調節する因子を調べるために、LIN28Aプロモーター領域におけるCpGアイランドのDNAメチル化について調べた。先に細胞培養、血小板の産生について述べた条件で細胞を培養し、巨核球細胞株が増殖を示すドキシサイクリンDOX ON (ドキシサイクリン存在下) の状態において、Let-7a-5p活性の高い細胞群と低い細胞群それぞれから、QIAGEN社のDNA抽出キットを用いて決められて手順通りにDNAを抽出した。次にザイモリサーチ社のEZ DNA Methylation-Gold Kitを用いて決められた手順通りにバイサルファイト処理を行い、次にバイサルファイトPCRを行った。CpGアイランドの検索やバイサルファイトPCRのプライマーは過去の文献に基づいて行った（Oncotarget. 2016 Mar 22; 7(12): 14476-14485）。PCRの酵素には、東洋紡社のKOD Multi&Epiを用いて、このようにして得られたPCR産物をタカラ社のMighty-TAを使用し、95℃ 5分→（95℃ 30秒→53℃ 30秒→72℃ 30秒）×40サイクル→72℃ 10分でPCRを行った。このPCR産物をタカラバイオ社Mighty TAクローニングキットを用いてクローニングを行い、定められたプライマーを用いて行ったコロニーPCRで適切な位置にバンドの出るものを各サンプル当たり10個ずつプラスミド増幅させてマクロジェン社にシークエンスを依頼した。シークエンス結果はweb上無料ソフトQUMAを用いて解析を行った。その結果、Let-7a-5p活性の高い細胞群ではかなりメチル化が行われており、活性の低い細胞群の10倍近くメチル化されていることが判明した（図１１（ｃ）、（ｄ））。図１１（ｄ）中、CpG %は、全てのCpG の個数に対する、メチル化したCpGの個数を示す。LIN28Aプロモーター領域CpGアイランドのメチLIN28A及びNR6A1ル化がLIN28A発現量に大きく作用している可能性が示唆された。  【０１０６】
LIN28Aプロモーター領域CpGアイランドのメチル化によりLIN28A発現量が抑制され、結果としてlet-7a-5pの活性を高め、NR6A1発現を抑制することで血小板産生を低下させることが判明したため、そのメチル化を解除することができればLIN28A発現を高めることで血小板産生が上がると考えられた。メチル化を解除する方法として、巨核球細胞株を振盪培養する方法について検討した。すなわち、DOX onの状態の細胞株を一部は通常通り静置培養、一つは125mlフラスコに25mlの培養液及び細胞を入れて100rpmで振盪培養を一週間行った。その後、DOX offとする際にもそれぞれの条件の細胞を静置培養と振盪培養を行い、血小板産生能を確認した（図１２（ａ））。DOX onで一週間培養した際の細胞からRNAを抽出し、LIN28A及びNR6A1発現量をRT-PCRにて測定した。図１２（ｂ）は、LIN28A及びNR6A1のそれぞれについて、静置培養（Static）した細胞から抽出されたmRNA量を１とした場合の相対量を示すグラフである。図１２（ｂ）にあるように、振盪培養を行った時のほうが両遺伝子とも発現量は上がっていた。図１２（ｃ）は、これらの各条件で得られた血小板産生数を、DOX on （Static）-DOX off（Static）として培養した場合を１００％とした相対数で表したグラフである。図１２（ｃ）から、DOX onで振盪培養した細胞群が多くの血小板を産生したことがわかる。さらに、DOX onで一週間静置あるいは振盪培養した細胞中のDNAにおけるLIN28Aプロモーター領域CpGアイランドのメチル化を先に記載したのと同じ方法で解析した。解析結果を図１２（ｄ）に示す。図１２（ｄ）から、振盪培養したほうがメチル化率は５０％以上低下しており、メチル化を解除する方法の一つとして振盪培養という方法があることが示唆された。  【０１０７】
基質の検討
さらに、iPS細胞の段階での培養方法が、巨核球細胞株作成後の血小板産生能に影響を与えるのかどうかを調べるために、MKiPSの技術を使用した。具体的には、引用することにより本明細書の一部をなすものとする国際公開WO2016/167329の開示に基づき、imMKCLに対して山中4因子（OCT4, SOX2, KLF4, CMYC）を導入してMKiPS細胞を作製し、それを再度巨核球に分化させてDOX onとすることでimMKCLを作製し、DOX onとして培養を続けた。図１３（ａ）は、MKiPS細胞から、分化誘導させた各段階の細胞における定量PCRにて測定したLIN28AｍRNA量を示すグラフであり、縦軸は、先の、細胞培養、血小板の産生の項目で詳述したSeV2 imMKCLにおけるLIN28A発現量を１としたときの相対量を表す。図１３（ｂ）は、MKiPS細胞から、分化誘導後、１４日、３５日の細胞について、配列番号１６で示すLet-7a-5p応答性tagBFP mRNAと、配列番号１８で示すControl hmAG1 mRNAを共導入して、Let-7a-5p活性を測定した結果を示す。継代が進むにつれてLIN28A発現量は減少し(図１３（ａ）、Let-7a-5p活性は上昇することを確認した（図１３（ｂ））。【０１０８】
次に、MKiPS細胞を培養する基質によってその後の血小板産生に差が出るか検証した。具体的には、MKiPS11,12の二つの細胞株に対して、Laminin511（商品名：iMatrix-511）とMatrigel（登録商標）上で培養した。具体的には、6wellプレート上に予めLamininないしはMatrigelをコーティングし、そこにLaminin511上には5*104個/well、Matrigel上にはコロニーを崩さないように１：４〜６となるように、MKiPS11,12の二つの細胞株を播種して一週間培養した。培養液交換は概ね二日に一回行った。その後、EB法で分化しday14で回収した細胞を一部はRNA抽出に用い、残りをDOX onで一週間培養し、その後DOX offとしてさらに一週間後に血小板産生数を測定した。Day14の段階で抽出したRNAを用いてRT-PCRを行った。図１３（ｃ）は、Laminin511で培養したMKiPS11細胞株から抽出したLIN28AmRNA発現量を１とした場合の、LIN28AmRNAの相対発現量を表すグラフである。LIN28A発現量は二株ともにMatrigel群のほうが多くなっていた (図１３（ｃ）)。さらに、これらについて、図２の実験と同様の条件で巨核球細胞を培養し、血小板を産生した。図１３（ｄ）は、Laminin511で培養したMKiPS11細胞株から分化誘導した巨核球細胞が産生した血小板数を１００％とした場合の、血小板産生数の相対量を表すグラフである。血小板産生数もMatrigel群で多くなっていた(図１３（ｄ）)。図示はしないが、Matrigelに代えて、ラミニン121、ラミニン421を用いた場合にも、Matrigelと同様の効果が実証された。このことから、iPS細胞の段階で、その培養方法が巨核球細胞株作成後の血小板産生に影響を与えることが示唆された。
【図１】
2018052126.tif 000010
【図２】
2018052126.tif 000011
【図３】
2018052126.tif 000012
【図４】
2018052126.tif 000013
【図５】
2018052126.tif 000014
【図６】
2018052126.tif 000015
【図７】
2018052126.tif 000016
【図８】
2018052126.tif 000017
【図９】
2018052126.tif 000018
【図１０】
2018052126.tif 000019
【図１１】
2018052126.tif 000020
【図１２】
2018052126.tif 000021
【図１３】
2018052126.tif 000022
【配列表】
2018052126000001.app
【国際調査報告】
2018052126.tif 000023
2018052126.tif 000024
2018052126.tif 000025
2018052126.tif 000026
2018052126.tif 000027
2018052126.tif 000028
2018052126.tif 000029
2018052126.tif 000030
2018052126.tif 000031
2018052126.tif 000032
2018052126.tif 000033