(57)【要約】  薬物の経粘膜吸収促進剤を提供することを課題とし、該課題を、（ａ成分）塩基性アミノ酸、（ｂ成分）２〜５つの塩基性アミノ酸から構成されるペプチド、及び（ｃ成分）トリプトファンからなる群より選択される少なくとも１種を用いることによって解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ成分）塩基性アミノ酸、
（ｂ成分）２〜５つの塩基性アミノ酸から構成されるペプチド、及び
（ｃ成分）トリプトファン
からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、薬物の経粘膜吸収促進剤。
【請求項２】
前記塩基性アミノ酸がＬ−アミノ酸である、請求項１に記載の経粘膜吸収促進剤。
【請求項３】
前記ａ成分を含有する、請求項１又は２に記載の経粘膜吸収促進剤。
【請求項４】
前記塩基性アミノ酸がアルギニン、リシン、及びヒスチジンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤。
【請求項５】
前記塩基性アミノ酸がアルギニンである、請求項１〜４のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤。
【請求項６】
前記ｂ成分が２〜４つの塩基性アミノ酸から構成されるペプチドである、請求項１〜５のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤。
【請求項７】
前記ｃ成分を含有する、請求項１〜６のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤。
【請求項８】
前記粘膜が腸粘膜である、請求項１〜７のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤。
【請求項９】
前記薬物の等電点が７以下である、請求項１〜８のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤。
【請求項１０】
前記薬物がペプチド又はタンパク質である、請求項１〜９のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤及び薬物を含有する、医薬組成物。
【請求項１２】
固形剤である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
経口剤である、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物の経粘膜吸収促進剤、それを含有する医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
21世紀に入り、バイオ市場の急速な発展に伴い、ペプチド・タンパク質・核酸医薬などの高分子を生体に効率よく吸収させるための革新的なDrug Delivery System（DDS）技術の製剤への導入がより一層求められている。特に、患者にとって最も利便性が高い経口製剤開発が望まれているものの、バイオ薬物のような経粘膜吸収性・安定性が極端に低い物質の経口製剤化は最も難しく、99%のバイオ薬物が注射投与に限られているのが現状である。このため、バイオ薬物等の経粘膜吸収性を促進させる手段の開発が強く求められている。【０００３】
従来、例えばある種の界面活性剤を用いて、膜構造の不安定化や細胞間タイトジャンクションの開放を引き起こすことにより、バイオ薬物等の経粘膜吸収性を促進できることが報告されてきた（非特許文献１〜２）。しかしながら、これらの技術は、その原理に起因して、生体に対して悪影響を与える可能性がある。【０００４】
また、近年、TATペプチド、ペネトラチン等の種々の細胞膜透過ペプチド（cell-penetrating peptides (CPPs)）を用いることにより、バイオ薬物の細胞内導入を促進できることが報告されている（非特許文献３）。ただ、これらのペプチドの多くは薬物と架橋して用いることにより、薬物の経粘膜吸収を促進するものである。例えば、前立腺がん治療薬であるロイプロリドのC末端側に、細胞膜透過ペプチドであるアルギニンヘキサペプチドを架橋したものが知られている（非特許文献４）。このため、この技術は汎用性が低く、また架橋により薬物の活性を低下させてしまう可能性もある。【０００５】
本発明者等は、アルギニンオリゴペプチド等の細胞膜透過ペプチドが、薬物と単に混合して用いることによって、薬物の経粘膜吸収性を促進できることを報告している（非特許文献５）。この技術であれば、架橋を必要としないので上述のような問題が生じる可能性は低い。アルギニンオリゴペプチドについては、これまでデカペプチド、オクタペプチド、ヘキサペプチド等の６以上のアルギニンから構成されるペプチドが報告されている。これらの内、オクタペプチド及びデカペプチドは高い経粘膜吸収促進作用を示すものの、アルギニン残基数のより少ないヘキサペプチドの経粘膜吸収性はより低いといわれている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】B. F. Choonara, E. Y. Choonara, P. Kumar, D. Bijukumar, L. C. du Toit, V. Pillay, A review of advanced oral drug delivery technologies facilitating the protection and absorption of protein and peptide molecules, Biotech. Adv. 32 (2014) 1269-1282.
【非特許文献２】S. Gupta, A. Jain, M. Chakraborty, J. K. Sahni, J. Ali, S. Dang, Oral delivery of therapeutic proteins and peptides: a review on recent developments, Drug Deliv. 20 (2013) 237-246.
【非特許文献３】Copolovici DM, Langel K, Eriste E, Langel U 2014. Cell-penetrating peptides: design, synthesis, and applications. ACS Nano. 8(3):1972-1994.
【非特許文献４】Kamei N, Morishita M, Ehara J, Takayama K. 2008. Permeation characteristics of oligoarginine through intestinal epithelium and its usefulness for intestinal peptide drug delivery. J Control Release 131:94-99.
【非特許文献５】Morishita M, Kamei N, Ehara J, Isowa K, Takayama K. A novel approach using functional peptides for efficient intestinal absorption of insulin, J Control Release. 2007 Apr 2;118(2):177-84. Epub 2006 Dec 29.
【非特許文献６】Margherita Di Pisa, Ge!rard Chassaing, and Jean-Marie Swiecicki. Translocation Mechanism(s) of Cell-Penetrating Peptides: Biophysical Studies Using Artificial Membrane Bilayers, Biochemistry 2015, 54, 194-207.
【非特許文献７】医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス, PMDRS, 46(12), 829-836, 2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、薬物の経粘膜吸収促進剤を提供することを課題とする。さらには、薬物との架橋を必要とせず、また生体に対する悪影響がより少ない、経粘膜吸収促進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、アルギニン等の塩基性アミノ酸や、従来報告されていたよりも残基数の少ない（すなわち残基数が５以下の）塩基性アミノ酸オリゴペプチドが、薬物に対して、高い経粘膜吸収促進作用を発揮することを見出した。従来は、塩基性アミノ酸残基数がより少ないとその経粘膜吸収促進作用もより低くなるといわれていたところ（非特許文献５）、本発明のこの知見は驚くべきことであった。さらに、トリプトファンが、薬物に対して高い経粘膜吸収促進作用を発揮することをも見出した。これらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。【０００９】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
項１．  （ａ成分）塩基性アミノ酸、（ｂ成分）２〜５つの塩基性アミノ酸から構成されるペプチド、及び（ｃ成分）トリプトファンからなる群より選択される少なくとも１種を含有する、薬物の経粘膜吸収促進剤．
項２．  前記塩基性アミノ酸がＬ−アミノ酸である、項１に記載の経粘膜吸収促進剤．  項３．  前記ａ成分を含有する、項１又は２に記載の経粘膜吸収促進剤．
項４．  前記塩基性アミノ酸がアルギニン、リシン、及びヒスチジンからなる群より選択される少なくとも１種である、項１〜３のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤．
項５．  前記塩基性アミノ酸がアルギニンである、項１〜４のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤．
項６．  前記ｂ成分が２〜４つの塩基性アミノ酸から構成されるペプチドである、項１〜５のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤．
項７．  前記ｃ成分を含有する、項１〜６のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤．
項８．  前記粘膜が腸粘膜である、項１〜７のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤．
項９．  前記薬物の等電点が７以下である、項１〜８のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤．
項１０．  前記薬物がペプチド又はタンパク質である、項１〜９のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤．
項１１．  項１〜１０のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤及び薬物を含有する、医薬組成物．
項１２．  固形剤である、項１１に記載の医薬組成物．
項１３．  経口投与製剤である、項１１又は１２に記載の医薬組成物．
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、薬物との架橋を必要とせず、また生体に対する悪影響がより少ない、経粘膜吸収促進剤を提供することができる。【００１１】
バイオ薬物等の多くの薬物は、経粘膜吸収性が低いことを理由として注射剤として提供されているが、注射剤は、針を刺すという行為を必要とするものであり、患者にとっての負担感は大きい。また、注射器の使用後の廃棄には経済的負担や環境負荷がかかり、さらに発展途上国等においては注射器の使い回しによる感染症の可能性がある。本発明によれば、薬物の経粘膜吸収性を向上させることにより、薬物を、上記問題がより生じ難い製剤形態（例えば経口剤等）で提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】試験例１の結果を示す。縦軸は血漿中のヒトインスリン濃度を示し、横軸は投与後の経過時間を示し、各データは平均値±SEM（n＝3-5）を示す。「Insulin」は比較例１、「L-R」は実施例１、「L-R2」は実施例２、「L-R4」は実施例３、「L-R8」は比較例２を示す（表１参照）。
【図２】試験例２の結果を示す。縦軸は血漿中のヒトインスリン濃度を示し、横軸は投与後の経過時間を示し、各データは平均値±SEM（n＝4）を示す。「0 mM」は比較例１、「8 mM」は実施例１、「16 mM」は実施例４、「40 mM」は実施例５を示す（表２参照）。
【図３】試験例３の結果を示す。縦軸は血漿中のヒトインスリン濃度を示し、横軸は投与後の経過時間を示し、各データは平均値±SEM（n＝3-4）を示す。「Insulin」は比較例１、「L-R」は実施例１、「L-K」は実施例６、「L-H」は実施例７を示す（表３参照）。
【図４】試験例４の結果を示す。横軸は腸液中のLDH（lactate dehydrogenase）濃度を示し、各データは平均値±SEM（n＝4）を示す。「PBS」は溶液1、「Insulin」は溶液2、「L-R」は溶液3、「Sodium taurodeoxycholate」は溶液4を示す。
【図５】試験例５の結果を示す。横軸は、試験後のTEER（T120）を試験開始時のTEER（T0）で除して、100をかけた値を示し、各データは平均値±SEM（n＝4）を示す。上から順に、試験溶液1、試験溶液2、試験溶液3、試験溶液4、試験溶液5、試験溶液6を用いた場合を示す。
【図６】試験例６の結果を示す。縦軸は血漿中のヒトインスリン濃度を示し、横軸は投与後の経過時間を示し、各データは平均値±SEM（n＝2-4）を示す。「Insulin」は比較例１、「L-R1」は実施例５、「L-R1＋L-W1」は実施例８を示す（表４参照）。
【図７】試験例７の結果を示す。縦軸は血漿中のヒトインスリン濃度を示し、横軸は投与後の経過時間を示し、各データは平均値±SEM（n＝2-6）を示す。「Insulin」は比較例１、「16 mM」は実施例９、「32 mM」は実施例１０を示す（表５参照）。
【図８】試験例８の結果を示す。縦軸は血漿中のヒトインスリン濃度を示し、横軸は投与後の経過時間を示し、各データは平均値±SEM（n＝2-6）を示す。「Insulin」は比較例１、「16 mM」は実施例１１、「32 mM」は実施例１２を示す（表６参照）。
【図９】試験例９の結果を示す。縦軸は腸液中のLDH（lactate dehydrogenase）濃度を示し、各データは平均値±SEM（n＝3）を示す。「PBS」は溶液A、「Insulin」は溶液B、「＋L-R1 (40 mM)」は溶液C、「＋L-W1 (16 mM)」は溶液D、「＋L-W1 (32 mM)」は溶液E、「＋L-R1 (40 mM) ＋L-W1 (50 mM)」は溶液F、「Sodium taurodeoxycholate」は溶液Gを示す。
【図１０】試験例１０の結果を示す。縦軸は、血糖値の、投与前の値を100％とした場合の相対値を示し、横軸は投与後の経過時間を示し、各データは平均値±SEM（n＝4-6）を示す。「L-R1」は L-アルギニンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１４】
本発明は、（ａ成分）塩基性アミノ酸、（ｂ成分）２〜５つの塩基性アミノ酸から構成されるペプチド、及び（ｃ成分）トリプトファンからなる群より選択される少なくとも１種を含有する、薬物の経粘膜吸収促進剤（本明細書において、「本発明の経粘膜吸収促進剤」と示すこともある。）、並びに本発明の経粘膜吸収促進剤及び薬物を含有する、医薬組成物（本明細書において、「本発明の医薬組成物」と示すこともある。）に関する。以下に、これらについて説明する。
【００１５】
塩基性アミノ酸は、側鎖に塩基性官能基を有し、且つ等電点がアルカリ性領域にあるアミノ酸（好ましくはα−アミノ酸）であれば特に制限されない。
【００１６】
塩基性官能基としては、例えばグアニジノ基、アミノ基、イミダゾリル基等が挙げられ、好ましくはグアニジノ基、アミノ基等が挙げられ、より好ましくはグアニジノ基が挙げられる。
【００１７】
塩基性アミノ酸の等電点は、例えば７超、好ましくは７．５以上、より好ましくは９以上、さらに好ましくは１０以上である。等電点の上限は特に限定されないが、例えば１４である。
【００１８】
塩基性アミノ酸の具体例としては、例えば天然アミノ酸であるアルギニン、リシン、ヒスチジン、オルニチン、シトルリン等が挙げられる。これらの中でも、経粘膜吸収促進効果の観点から、好ましくはアルギニン、リシン等が挙げられ、より好ましくはアルギニンが挙げられる。
【００１９】
塩基性アミノ酸の立体配置は、特に制限されず、Ｌ体又はＤ体のいずれでもよい。経粘膜吸収促進効果がより高いという観点、及び／又は用量依存的に経粘膜吸収促進効果がより向上するという観点から、塩基性アミノ酸はＬ−アミノ酸であることが好ましい。
【００２０】
塩基性アミノ酸から構成されるペプチドとは、複数の塩基性アミノ酸同士（好ましくは塩基性アミノ酸の主鎖上のアミノ基及びカルボキシル基）がペプチド結合してなるペプチドであり、この限りにおいて特に制限されない。
【００２１】
該ペプチドを構成する塩基性アミノ酸の数は２〜５つであり、好ましくは２〜４つである。
【００２２】
該ペプチドは、１種の塩基性アミノ酸のみから構成されるものであってもよく、２種以上の塩基性アミノ酸から構成されるものであってもよい。
【００２３】
トリプトファンの立体配置は、特に制限されず、Ｌ体又はＤ体のいずれでもよい。経粘膜吸収促進効果がより高いという観点、及び／又は用量依存的に経粘膜吸収促進効果がより向上するという観点から、トリプトファンはＬ体であることが好ましい。
【００２４】
塩基性アミノ酸、塩基性アミノ酸から構成されるペプチド、及びトリプトファンは、経粘膜吸収促進効果を有する限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。なお、経粘膜吸収促進効果の有無は、公知の方法に従って又は準じて判定することができ、例えば後述の試験例１に記載の方法に従って又は準じて判定することができる。
【００２５】
塩基性アミノ酸、塩基性アミノ酸から構成されるペプチド、及びトリプトファンは、主鎖末端のカルボキシ基が、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。
【００２６】
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
【００２７】
さらに、塩基性アミノ酸、塩基性アミノ酸から構成されるペプチド、及びトリプトファンには、主鎖末端のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、側鎖上の置換基（例えばアミノ基、イミダゾイル基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの等も包含される。
【００２８】
塩基性アミノ酸、塩基性アミノ酸から構成されるペプチド、及びトリプトファンは、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；  酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；  アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；  カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
【００２９】
塩基性アミノ酸、塩基性アミノ酸から構成されるペプチド、及びトリプトファンは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
【００３０】
塩基性アミノ酸（ａ成分）は、１種単独で用いることもできるし、任意の２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００３１】
塩基性アミノ酸から構成されるペプチド（ｂ成分）は、１種単独で用いることもできるし、任意の２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００３２】
トリプトファン（ｃ成分）は、１種単独で用いることもできるし、任意の２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００３３】
本発明の経粘膜吸収促進剤は、有効成分として、ａ成分、ｂ成分、及びｃ成分からなる群より選択される少なくとも１種を含有する限り、特に限定されない。経粘膜吸収促進効果がより高いという観点、及び／又は生体が日常的に接種しており安全性がより高いという観点から、本発明の経粘膜吸収促進剤は、有効成分としてａ成分及びｃ成分からなる群より選択される少なくとも１種を含有することが好ましく、有効成分としてａ成分及びｃ成分からなる群より選択される少なくとも１種のみを含有することがより好ましく、有効成分としてｃ成分のみを含有することがさらに好ましい。
【００３４】
ａ成分、ｂ成分、及びｃ成分は、市販されているものをそのまま用いることができるし、公知の合成方法に従って又は準じて製造することもできる。
【００３５】
限定的な解釈を望むものではないが、ａ成分及びｂ成分を採用する場合の本発明のメカニズムは以下のように考えられる。アルギニンオクタペプチド等の、塩基性アミノ酸を多く含む公知の細胞膜透過性ペプチドは、そのプラスチャージに起因して薬物と複合体を形成して細胞膜を透過することにより、薬物の経粘膜吸収性を向上させると考えられている（非特許文献６及び７）。よって、本発明の有効成分であるａ成分及びｂ成分も、プラスチャージを有するものであり、同様のメカニズムに基づいてその効果を発揮していると考えられる。
【００３６】
したがって、本発明の経粘膜吸収促進剤が対象とする薬物は、特にａ成分及びｂ成分を採用する場合は、生物活性を有し、且つａ成分及び／又はｂ成分と電気的相互作用により複合体を形成できる薬物である限り特に限定されず、例えば等電点（ｐＩ）が中性領域から酸性領域、好ましくはｐＩ：７以下（又は７未満）、より好ましくはｐＩ：７〜０．０１、さらに好ましくはｐＩ：６〜０．１、よりさらに好ましくはｐＩ：６〜１の薬物が挙げられる。
【００３７】
薬物の分子量は特に制限されない。例えば分子量１００〜１００００００、好ましくは３００〜２０００００、より好ましくは８００〜１０００００、さらに好ましくは１５００〜５００００、よりさらに好ましくは２０００〜１００００の薬物が挙げられる。
【００３８】
薬物の具体例としては、例えばペプチド、タンパク質、糖、多糖類、核酸、低分子化合物等が挙げられる。より具体的には、例えばインスリン、ガストリン、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＧＬＰ１、ロイプロリド、カルシトシン、インターフェロンβ、ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ、デキストラン、ナノ粒子等が挙げられる。
【００３９】
本発明の経粘膜吸収促進剤の対象となる粘膜は、特に制限されない。粘膜としては、例えば腸粘膜、胃粘膜、鼻粘膜、口腔粘膜、肺粘膜等が挙げられ、好ましくは腸粘膜が挙げられる。
【００４０】
本発明の医薬組成物は、上述した本発明の経粘膜吸収促進剤と薬物とを含有する限り特に制限されず、必要に応じて他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
【００４１】
本発明の医薬組成物の剤形としては、粘膜からの吸収を目的とし得る剤形である限り特に限定されず、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、シロップ剤、腸溶剤、徐方性カプセル剤、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放剤、徐放性顆粒剤等の経口剤；  点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤、ゼリー剤等の外用剤等が挙げられる。また、本発明の医薬組成物は、固形剤、半固形剤、液剤のいずれでもよいが、好ましくは固形剤、半固形剤であり、より好ましくは固形剤である。
【００４２】
本発明の医薬組成物中の薬物の含有量は、薬物の種類、投与対象、投与経路、剤形、患者の状態、及び医師の判断等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば例えば０．０００１〜９５重量％、好ましくは０．００１〜５０重量％とすることができる。
【００４３】
本発明の医薬組成物中のａ成分及びｂ成分の合計含有量は、薬物の種類、投与対象、投与経路、剤形、患者の状態、及び医師の判断等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば０．０００１〜９５重量％、好ましくは０．００１〜５０重量％とすることができる。
【００４４】
ａ成分及びｂ成分は比較的少なくともその効果を発揮することができる。このような観点から、本発明の医薬組成物は、例えば投与対象の体重１ｋｇに対する１回あたりのａ成分及びｂ成分の合計投与量が、１μｇ〜２００ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜１５０ｍｇ、より好ましくは１００μｇ〜１００ｍｇ、さらに好ましくは５００μｇ〜５０ｍｇとなるように用いられることが好ましい。
【実施例】
【００４５】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００４６】
試験例１：アルギニン又はアルギニンペプチドの経粘膜吸収促進作用の評価
＜試験例1-1：投与液の調製＞
各種量のリコンビナントヒトインスリン（27.5 IU/mg）（和光純薬工業社製）を、ポリプロピレンチューブ中で50μLの0.1N塩酸水溶液に溶解した後、これを、0.001％の濃度でメチルセルロースを含有する1.4 mLのPBS溶液（pH 6.0）で希釈して、さらに50μLの0.1N水酸化ナトリウム水溶液で標準化して、インスリン溶液を得た。一方で、被検物質として、各種量の塩基性アミノ酸（L-アルギニン）（和光純薬工業社製）又は各種量の塩基性アミノ酸オリゴペプチド（2 mer、4 mer、又は8 mer）をポリプロピレンチューブに量り採った後、これを、0.001％の濃度でメチルセルロースを含有するPBS溶液（pH 6.0）に溶解して、被検物質溶液を得た。上記のようにして得たインスリン溶液をそのまま、或いは上記のようにして得たインスリン溶液と被検物質溶液を等量ずつ混合したものを、投与液として以下の投与試験で用いた。【００４７】
＜試験例1-2：投与試験＞
雄のSD（Sprague Dawley）ラット（体重180〜220 g）（SLC社製）を用いて投与試験を行った。板上に固定された麻酔済みラットの腹部を正中切開して、回腸を露出させた。回盲部近位にカニューレを挿入し、液体の損失を防ぐためにしっかりと結紮してから腹腔内の元の場所に戻した。輸液ポンプを用いて、PBS（37℃）をカニューレを通して循環（5.0 mL/min、4分間）させた。カニューレのチューブを除去し、その部分を閉じた。手術による血糖値上昇を元に戻すために、ラットをそのまま30分間放置した。その後、上記試験例1-1で得た投与液0.5 mLを、回腸ループ内へ直接投与した。インスリン投与量、並びに投与液における被検物質の種類及び濃度を表１に示す。実施例１〜３及び比較例２の被検物質の濃度は、アルギニンモノマーに換算した場合の濃度が同一に（8 mM）になるように調整されている。【００４８】
【表１】
2017183559.tif 000002
【００４９】
＜試験例1-3：経粘膜吸収促進作用の評価＞
試験例1-2において、投与前、並びに投与後5、10、15、30、60、120、及び180分経過後に採血した。得られた血液を遠心（13,400 g、1分間）して血漿を得た。血漿中のヒトインスリン（すなわち、投与された後、腸粘膜を経て吸収されたインスリン）の濃度を、ヒトインスリンELISAキット（メルコディア社製）を用いて測定した。測定結果を図１に示す。図１に示されるように、アルギニン又はアルギニンオリゴペプチドをインスリンと共に投与することにより、インスリン吸収が促進された。また、吸収促進作用の強さの順は、アルギニン（実施例１：L-R）＞アルギニンジペプチド（実施例２：L-R2）＞アルギニンテトラペプチド（実施例３：L-R4）＞アルギニンオクタペプチド（比較例２：L-R8）であった。【００５０】
試験例２：アルギニンの用量依存的な経粘膜吸収促進作用の評価
投与液における被検物質の種類及び濃度を表２に示すものとする以外は、試験例１と同様にして試験した。結果を図２に示す。図２に示されるように、アルギニンは用量依存的にインスリン吸収を促進した。【００５１】
【表２】
2017183559.tif 000003
【００５２】
試験例３：塩基性アミノ酸の経粘膜吸収促進作用の評価
投与液における被検物質の種類及び濃度を表３に示すものとする以外は、試験例１と同様にして試験した。結果を図３に示す。図３に示されるように、アルギニン以外の塩基性アミノ酸であっても、インスリン吸収を促進した。また、吸収促進作用の強さの順は、アルギニン（実施例１：L-R）＞リシン（実施例６：L-K）＞ヒスチジン（実施例７：L-H）であった。【００５３】
【表３】
2017183559.tif 000004
【００５４】
試験例４：腸上皮組織のintegrityへの影響の評価１
試験例１の後、回腸を20 mLのPBS（37℃）で処理してから、空気を通じた。0.5 mLの溶液を、回腸ループ内へ直接投与した。投与に供した溶液は以下の4種である：
溶液1：PBS
溶液2：インスリンを含有するPBS（インスリン量：50 IU/体重(kg)）
溶液3：40 mMの濃度でL-アルギニンを含有するPBS
溶液4：5％（w/v）の濃度でタウロデオキシコール酸ナトリウムを含有するPBS。【００５５】
投与から3時間経過後、回腸ループを5.0 mLのPBSで洗浄し、腸液を回収した。腸液中のLDH（lactate dehydrogenase）濃度をLDHキットを用いて測定した。測定結果を図４に示す。図４に示されるように、ポジティブコントロールであるタウロデオキシコール酸ナトリウムを投与した場合、PBSを投与した場合に比べて、腸液中のLDH濃度が極めて高かった。このことは、タウロデオキシコール酸ナトリウムにより、腸上皮のintegrityが崩れたため、本来血中に存在するLDHが腸上皮を通して漏出したことを示す。これに対して、アルギニンを投与した場合の腸液中のLDH濃度はPBSを投与した場合からほぼ変化が無かったことから、アルギニンは、腸上皮組織のintegrityに対して影響が極めて少ない、安全性が高い成分であることが示された。【００５６】
試験例５：上皮組織のタイトジャンクション構造への影響の評価１
アルギニン等の被検物質を作用させた後の培養細胞層の電気抵抗（TEER：transepithelial electrical resistance）に基づいて、被検物質のタイトジャンクション構造への影響を評価した。具体的には次のように行った。【００５７】
ヒト結腸がん由来細胞（Caco-2細胞）を12ウェルトランスウェルプレートに播種（1.0×105cells/cm2）し、DMEM培地中で、21日間（一定のTEER（＞500Ωcm2）（単層中にタイトジャンクションが形成されたことを示す。）に達するまで）培養した。トランスウェルのapical側に500μLのトランスポートバッファー1（10 mMのMESで緩衝化したHBSS）を加え、basal側に1.5 mLのトランスポートバッファー2（10 mMのHEPES（pH7.4）で緩衝化したHBSS）を加えて、30分間のプレインキュベーションを行った。プレインキュベーション後に電圧抵抗計（Millicell ERS-2、ミリポア社製）を用いてTEERを測定し、得られた値を試験開始時のTEER（T0）とした。apical側のトランスポートバッファー1の内の100μLを、100μLの被検物質含有試験溶液に置換し、2時間インキュベーションした。試験溶液に置換後のapical側のチャンバー内における、被検物質の種類及び濃度は以下のとおりである：
試験溶液1：インスリン15μM
試験溶液2：インスリン15μM、L-アルギニン480μM
試験溶液3：インスリン15μM、L-アルギニン960μM
試験溶液4：インスリン15μM、D-アルギニン480μM
試験溶液5：インスリン15μM、D-アルギニン960μM
試験溶液6：インスリン15μM、D-アルギニンオクタペプチド60μM。【００５８】
インキュベーション後、電圧抵抗計（Millicell ERS-2、ミリポア社製）を用いてTEERを測定し、得られた値と試験後のTEER（T120）とした。試験後のTEER（T120）を試験開始時のTEER（T0）で除して、100をかけた値を図５に示す。図５に示されるように、アルギニンを非常に高濃度で作用させても、TEERにほとんど変化は無かった。このことから、アルギニンは、腸上皮組織のタイトジャンクション構造への影響が極めて少ない、安全性が高い成分であることが示された。【００５９】
試験例６：塩基性アミノ酸とトリプトファンの併用による経粘膜吸収促進作用の評価
投与液における被検物質の種類及び濃度を表４に示すものとする以外は、試験例１と同様にして試験した。結果を図６に示す。図６に示されるように、塩基性アミノ酸にトリプトファンを併用することにより、インスリン吸収がより促進された。【００６０】
【表４】
2017183559.tif 000005
【００６１】
試験例７：L-トリプトファン単独の経粘膜吸収促進作用の評価
投与液における被検物質の種類及び濃度を表５に示すものとする以外は、試験例１と同様にして試験した。結果を図７に示す。図７に示されるように、L-トリプトファンにより、インスリン吸収がより促進された。【００６２】
【表５】
2017183559.tif 000006
【００６３】
試験例８：D-トリプトファン単独の経粘膜吸収促進作用の評価
投与液における被検物質の種類及び濃度を表６に示すものとする以外は、試験例１と同様にして試験した。結果を図８に示す。図８に示されるように、D-トリプトファンにより、インスリン吸収がより促進された。【００６４】
【表６】
2017183559.tif 000007
【００６５】
試験例９：腸上皮組織のintegrityへの影響の評価２
投与液として、以下の7種の溶液を用いる以外は、試験例４と同様にして試験した：
溶液A：0.001％の濃度でメチルセルロースを含有するPBS
溶液B：インスリンを含有するPBS（インスリン量：50 IU/体重(kg)）
溶液C：40 mMの濃度でL-アルギニンを含有するPBS
溶液D：16 mMの濃度でL-トリプトファンを含有するPBS
溶液E：32 mMの濃度でL-トリプトファンを含有するPBS
溶液F：40 mMの濃度のL-アルギニン及び50 mMの濃度のL-トリプトファンを含有するPBS
溶液G：5％（w/v）の濃度でタウロデオキシコール酸ナトリウムを含有するPBS。【００６６】
測定結果を図９に示す。図９に示されるように、ポジティブコントロールであるタウロデオキシコール酸ナトリウムを投与した場合、PBSを投与した場合に比べて、腸液中のLDH濃度が極めて高かった。このことは、タウロデオキシコール酸ナトリウムにより、腸上皮のintegrityが崩れたため、本来細胞内に存在するLDHが腸上皮を通して漏出したことを示す。これに対して、トリプトファンを投与した場合の腸液中のLDH濃度はPBSを投与した場合からほぼ変化が無かったことから、トリプトファンは、腸上皮組織のintegrityに対して影響が極めて少ない、安全性が高い成分であることが示された。【００６７】
試験例１０：In vivo経口投与試験
24 時間絶食後のマウスに、インスリン (50 IU/kg)、 L-アルギニン (200 mM)、 あるいはインスリンと L-アルギニン (40 or 200 mM) (100μL) 混合溶液を経口ゾンデ(i..d. 0.9 × length 50 mm) (Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan)を用いて経口投与した。 投与前、並びに投与後15、30、60、120、180、240、300、及び360分後に、尾静脈から採血し(一滴）、経時的に血糖値をOne Touch Ultra View（ Johnson & Johnson K.K., Tokyo, Japan)を用いて測定した。【００６８】
測定結果を図１０に示す。図１０に示されるように、インスリン又はL-アルギニンを単独で経口投与しても血糖値は抑制されないが、インスリンをL-アルギニンと共に経口投与することにより血糖値が抑制された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年11月13日(2017.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ成分）Ｌ−塩基性アミノ酸、
（ｂ成分）２〜４つのＬ−塩基性アミノ酸から構成されるペプチド、及び
（ｃ成分）トリプトファン
からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、等電点が７以下であるタンパク質の経粘膜吸収促進剤。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
前記ａ成分を含有する、請求項１に記載の経粘膜吸収促進剤。
【請求項４】
前記Ｌ−塩基性アミノ酸がＬ−アルギニン、Ｌ−リシン、及びＬ−ヒスチジンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は３に記載の経粘膜吸収促進剤。
【請求項５】
前記Ｌ−塩基性アミノ酸がＬ−アルギニンである、請求項１、３又は４に記載の経粘膜吸収促進剤。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（Ａ）トリプトファン（ｃ成分）を含有する、
（Ｂ）前記ｃ成分及び塩基性アミノ酸を含有する、
（Ｃ）前記ｃ成分、及び２〜５つの塩基性アミノ酸から構成されるペプチドを含有する、或いは
（Ｄ）前記ｃ成分、塩基性アミノ酸、及び２〜５つの塩基性アミノ酸から構成されるペプチドを含有する、
薬物の経粘膜吸収促進剤。
【請求項８】
前記粘膜が腸粘膜である、請求項７に記載の経粘膜吸収促進剤。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
前記薬物がペプチド、タンパク質、糖、多糖類、核酸、及び低分子化合物からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項７又は８に記載の経粘膜吸収促進剤。
【請求項１１】
請求項７、８及び１０のいずれかに記載の経粘膜吸収促進剤及び等電点が７以下である薬物を含有する、医薬組成物。
【請求項１２】
固形剤である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
経口剤である、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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