(57)【要約】  反応液中で生じた被験物質とその結合パートナーとの間の免疫凝集反応について、該反応の第１の期間における該反応液の散乱光強度、および、該反応の第２の期間における該反応液の散乱光強度に基づいて、該第１の期間における散乱光強度の変化速度と該第２の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動に関する指標値を決定する工程、および、該指標値と、予め設定された閾値とを比較することにより、該被験物質の濃度が適正な範囲内のものであるか否かを判定する工程を含む、反応液中の被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定する方法、ならびに、当該方法を実行するための処理部を有する試料分析装置。
2018110006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応液中の被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定する方法であって、
反応液中で生じた被験物質とその結合パートナーとの間の免疫凝集反応について、該反応の第１の期間における該反応液の散乱光強度、および、該反応の第２の期間における該反応液の散乱光強度に基づいて、該第１の期間における散乱光強度の変化速度と該第２の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動に関する指標値を決定する工程、および、
該指標値と、予め設定された閾値とを比較することにより、該被験物質の濃度が適正な範囲内のものであるか否かを判定する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
該指標値が、該第１の期間における散乱光強度の変化速度と該第２の期間における散乱光強度の変化速度との比である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の散乱光強度として、散乱光強度の測定値と透過光強度の測定値との比が用いられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該反応液が、該被験物質を含む湿性生体試料に由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該湿性生体試料が、血液、唾液、尿、汗、リンパ液、および喀痰からなる群から選択されるものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該被験物質が、蛋白質、ペプチド、脂質、核酸、多糖類、糖類、および抗体からなる群から選択されるものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該反応液が、該被験物質を含む検体試料と、該結合パートナーを担持した不溶性担体粒子を含む懸濁液とを混合することにより調製されたものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該不溶性担体粒子が、ラテックス、金属コロイド、シリカ、カーボン、および磁性体粒子からなる群から選択される１以上を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該適正な範囲の濃度が、プロゾーン現象を生じる濃度およびその付近の濃度のいずれでもない濃度である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
被験物質の濃度を測定し、該測定された濃度が所定の閾値濃度よりも低い場合に、該被験物質の濃度は適正な範囲内のものではないと判定する工程を更に含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
試料分析装置であって、当該試料分析装置は、
散乱光強度を測定するための散乱光強度測定部と、
反応液中で生じた被験物質とその結合パートナーとの間の免疫凝集反応について、該反応の第１の期間における該反応液の散乱光強度、および、該反応の第２の期間における該反応液の散乱光強度に基づいて、該第１の期間における散乱光強度の変化速度と該第２の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動に関する指標値を決定するための指標値決定部と、
該指標値と、予め設定された閾値とを比較することにより、該被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定するための第１判定部と
を有する、前記試料分析装置。
【請求項１２】
該指標値が、該第１の期間における散乱光強度の変化速度と該第２の期間における散乱光強度の変化速度との比である、請求項１１に記載の試料分析装置。
【請求項１３】
透過光強度を測定するための透過光強度測定部を更に有し、
前記の散乱光強度として、散乱光強度の測定値と透過光強度の測定値との比を用いる、請求項１１または１２に記載の試料分析装置。
【請求項１４】
該被験物質を含む湿性生体試料を分析するためのものである、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の試料分析装置。
【請求項１５】
該湿性生体試料が、血液、唾液、尿、汗、リンパ液、および喀痰からなる群から選択されるものである、請求項１４に記載の試料分析装置。
【請求項１６】
該第１判定部が、該被験物質の濃度が、プロゾーン現象を生じる濃度およびその付近の濃度のいずれでもない濃度であるか否かを判定するものである、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の試料分析装置。
【請求項１７】
被験物質の濃度を測定するための濃度測定部を更に有する、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の試料分析装置。
【請求項１８】
測定された該被験物質の濃度が所定の閾値濃度よりも低い場合に、該被験物質の濃度は適正な範囲内のものではないと判定するための第２判定部を更に有する、請求項１７に記載の試料分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概しては免疫凝集反応を用いた濃度測定法の技術分野に関し、より詳細には、被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定する方法、およびそのための処理部を有する試料分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫凝集反応を用いた濃度測定法において、該当測定試薬を用いた自動分析装置における光学的測定方法として吸光度測定および散乱光測定が用いられている（特許文献１）。
これらの光学的測定においては、反応開始から特定時間後の濁度の変化速度と検体濃度との関係を示す検量線を用いて、測定された濁度の変化速度に基づいて被験物質の定量が行われている。これらの検量線では被験物質の濃度が高くなるに従い傾きが小さくなり、さらに高い濃度域では傾きが逆勾配の領域（プロゾーン領域）が生じる。
プロゾーン領域では検量線から２つの解が生じる為定量が行えない。そのため、試験対象がプロゾーン領域での高濃度物質を含んでいるかどうかを判定し、プロゾーン領域で被験物質を測定しているか否かを判定することが自動分析装置を用いた測定では重要である。【０００３】
従来、プロゾーン領域の判定のために、反応初期吸光度の値、吸光度が安定するまでの時間、反応初期吸光度の変化速度等が用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ  ２０１４／１９２９６３  Ａ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したような従来技術によるプロゾーン領域の判定は、反応が平衡になるまで測定時間を十分長く取ることにより、そのときの一定時間での初期吸光度やその時間までの吸光度変化量などを利用するものである。しかしながら、より短時間にて測定を完了するために、反応の初期段階にてプロゾーン判定できる方法が望ましい。【０００６】
また、試薬ばらつきなどによる測定結果のばらつきの影響を受けにくいロバストな判定方法が望まれる。【０００７】
本発明は当該技術分野における上述の問題に鑑みて為されたものであり、短時間で、測定ばらつきの影響を受けにくい、被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定する方法、および、そのための処理部を有する試料分析装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上述の課題に対し鋭意検討を行ったところ、免疫凝集反応の第１の期間の濁度変化速度と第２の期間の濁度変化速度との比を吸光度（透過光）測定により求め、この比を所定の閾値と比較することにより、反応が平衡に達していない短時間にても、被験物質濃度の適正性の判定を行い得ることを見出した。しかしながら、吸光度測定により求めた上記の比を用いた場合、プロゾーン領域に近い被験物質濃度では当該比の測定値と閾値との差が小さく、試薬ばらつきを含む測定結果のばらつきの影響を受けやすいという問題があった。【０００９】
そこで本発明者は更に改良を検討したところ、吸光度測定により求めた上記の比の代わりに、反応の第１の期間の散乱光強度変化速度と第２の期間の散乱光強度変化速度との間の変動に関する指標値を用いる方法論に想到した。散乱光強度の測定により求めた指標値は、透過光を用いる場合と比べて、被験物質の濃度の増加に伴う当該指標値の増加の程度を大きくすることができ、かつ、プロゾーン領域付近の高濃度範囲において当該指標値が一定値以上となることを発見した。そのため、被験物質濃度がプロゾーン領域近傍の検体でも、プロゾーン判定のための閾値と測定される当該指標値との間の差を大きくすることができ、これにより測定ばらつきの影響を受けにくくすることができることが分かった。本発明者はこれらの発見に基づき更なる検討を行い、本発明を完成するに至った。【００１０】
本発明は即ち、以下を提供する。
［１］反応液中の被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定する方法であって、
反応液中で生じた被験物質とその結合パートナーとの間の免疫凝集反応について、該反応の第１の期間における該反応液の散乱光強度、および、該反応の第２の期間における該反応液の散乱光強度に基づいて、該第１の期間における散乱光強度の変化速度と該第２の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動に関する指標値を決定する工程、および、
該指標値と、予め設定された閾値とを比較することにより、該被験物質の濃度が適正な範囲内のものであるか否かを判定する工程
を含む、前記方法。
［２］該指標値が、該第１の期間における散乱光強度の変化速度と該第２の期間における散乱光強度の変化速度との比である、上記［１］に記載の方法。
［３］前記の散乱光強度として、散乱光強度の測定値と透過光強度の測定値との比が用いられる、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］該反応液が、該被験物質を含む湿性生体試料に由来する、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］該湿性生体試料が、血液、唾液、尿、汗、リンパ液、および喀痰からなる群から選択されるものである、上記［４］に記載の方法。
［６］該被験物質が、蛋白質、ペプチド、脂質、核酸、多糖類、糖類、および抗体からなる群から選択されるものである、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］該反応液が、該被験物質を含む検体試料と、該結合パートナーを担持した不溶性担体粒子を含む懸濁液とを混合することにより調製されたものである、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］該不溶性担体粒子が、ラテックス、金属コロイド、シリカ、カーボン、および磁性体粒子からなる群から選択される１以上を含む、上記［７］に記載の方法。
［９］該適正な範囲の濃度が、プロゾーン現象を生じる濃度およびその付近の濃度のいずれでもない濃度である、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］被験物質の濃度を測定し、該測定された濃度が所定の閾値濃度よりも低い場合に、該被験物質の濃度は適正な範囲内のものではないと判定する工程を更に含む、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］試料分析装置であって、当該試料分析装置は、
散乱光強度を測定するための散乱光強度測定部と、
反応液中で生じた被験物質とその結合パートナーとの間の免疫凝集反応について、該反応の第１の期間における該反応液の散乱光強度、および、該反応の第２の期間における該反応液の散乱光強度に基づいて、該第１の期間における散乱光強度の変化速度と該第２の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動に関する指標値を決定するための指標値決定部と、
該指標値と、予め設定された閾値とを比較することにより、該被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定するための第１判定部と
を有する、前記試料分析装置。
［１２］該指標値が、該第１の期間における散乱光強度の変化速度と該第２の期間における散乱光強度の変化速度との比である、上記［１１］に記載の試料分析装置。
［１３］透過光強度を測定するための透過光強度測定部を更に有し、
前記の散乱光強度として、散乱光強度の測定値と透過光強度の測定値との比を用いる、上記［１１］または［１２］に記載の試料分析装置。
［１４］該被験物質を含む湿性生体試料を分析するためのものである、上記［１１］〜［１３］のいずれかに記載の試料分析装置。
［１５］該湿性生体試料が、血液、唾液、尿、汗、リンパ液、および喀痰からなる群から選択されるものである、上記［１４］に記載の試料分析装置。
［１６］該第１判定部が、該被験物質の濃度が、プロゾーン現象を生じる濃度およびその付近の濃度のいずれでもない濃度であるか否かを判定するものである、上記［１１］〜［１５］のいずれかに記載の試料分析装置。
［１７］被験物質の濃度を測定するための濃度測定部を更に有する、上記［１１］〜［１６］のいずれかに記載の試料分析装置。
［１８］測定された該被験物質の濃度が所定の閾値濃度よりも低い場合に、該被験物質の濃度は適正な範囲内のものではないと判定するための第２判定部を更に有する、上記［１７］に記載の試料分析装置。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、短時間で、測定ばらつきの影響を受けにくい、被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定する方法、および、そのための処理部を有する試料分析装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、一実施形態による本発明の試料分析装置の構成の概略のブロック図を示す図である。
【図２】図２は、本発明の試料分析装置が有し得る光学システムの構成例を概略で示すブロック図である。
【図３】図３は、他の実施形態による本発明の試料分析装置の構成の概略のブロック図を示す図である。
【図４】図４は、既知濃度のＣＲＰを含む血清を測定したときの測定表示値の変化を示すグラフである。
【図５】図５は、散乱光および吸光度をそれぞれ用いた時のたわみ値について、血清ＣＲＰ濃度に対する変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の判定方法およびそのための処理部を有する本発明の試料分析装置についてその例示的な態様を示して詳細に説明する。
【００１４】
（判定方法）
本発明は、反応液中の被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定する方法を提供する。
本発明の判定方法は、
反応液中で生じた被験物質とその結合パートナーとの間の免疫凝集反応について、該反応の第１の期間における該反応液の散乱光強度、および、該反応の第２の期間における該反応液の散乱光強度に基づいて、該第１の期間における散乱光強度の変化速度と該第２の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動に関する指標値を決定する工程、および、
該指標値と、予め設定された閾値とを比較することにより、該被験物質の濃度が適正な範囲内のものであるか否かを判定する工程
を含む。
【００１５】
本明細書において「免疫凝集反応」とは、抗原と抗体の反応により凝集が生じる反応をいう。本発明においては特に、被験物質とその結合パートナーとの間の抗原−抗体反応に応答して、反応液中に存在する粒子の凝集が生じる反応をいう。該凝集は、反応液の濁度の増加をもたらすものであり得る。免疫凝集反応により生じる粒子の凝集を定量することにより、被験物質の濃度が測定される。一般に、免疫凝集反応を用いた濃度測定法において、「プロゾーン現象」または、「フック効果」と呼ばれる、抗原−抗体反応において抗原量または抗体量が過剰である場合に、測定されるシグナル値が減少し、その結果として本来得られるべきものよりも低い被験物質濃度を与える、または該シグナル値のみからは被験物質濃度を一つに特定できなくさせる現象が生じることが知られている。一つの実施形態において、本発明の判定方法は、免疫凝集反応を用いた被験物質の濃度測定においてプロゾーン現象が生じているか否かを判定する方法である。また、一般に、試薬量のばらつきなどに起因して測定結果にばらつきが生じ得るので、プロゾーン現象が生じる濃度領域（本明細書において、プロゾーン領域ともいう。）に近い濃度領域についても、濃度測定のために適正ではない可能性がある。よって、好ましい実施形態において、本発明の判定方法は、被験物質の濃度がプロゾーン領域内またはその付近の領域内の濃度（換言すれば、プロゾーン現象の発生の可能性が疑われる濃度）ではないことを判定する方法である。
【００１６】
また、本発明の判定方法は、被験物質の濃度を測定し、該測定された濃度が所定の閾値濃度よりも低い場合に、該被験物質の濃度は適正な範囲内のものではないと判定する工程を更に含んでもよい。当該工程は、本発明による「指標値」の決定工程の前に行われることが好ましい。これは、一般に、低濃度領域では測定再現性が良くなく、また反応開始後初期の濁度変化が小さいために該指標値の数値が安定しないためである。
【００１７】
本発明の判定方法は、免疫凝集反応を用いた被験物質の濃度測定と共に行うことができる。本発明の判定方法を用いることで、該測定が適正な濃度範囲内の被験物質に対して行われたか否かを判定することができる。濃度測定値の取得方法は特に限定されない。例えば、透過光（吸光度）、散乱光、または透過光および散乱光を測定し、得られたシグナル値と検量線に基づいて濃度を決定することができる。
【００１８】
本明細書において「反応液」は、被験物質と、その結合パートナーと、粒子とが該液中に共存することにより免疫凝集反応が進行するものであれば特に限定されない。該反応液は、例えば、被験物質を含む試料と、（ｉ）結合パートナーおよび粒子を含む溶液、または、（ｉｉ）結合パートナーを含む溶液および粒子を含む溶液とを混合することにより調製することができる。
【００１９】
本発明による分析の対象とする試料は特に限定されないが、通常、湿性生体試料である。湿性生体試料としては、例えば、血液（全血、血清、血漿）、唾液、尿、汗、リンパ液、喀痰等の体液が挙げられる。また、「被験物質を含む試料」には、上記のような試料そのもののみならず、分析目的のための各種調製（例えば、緩衝液等との混合や希釈等）が為された試料も包含される。希釈のために、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０の緩衝液、具体的には、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液等を用いることができる。
【００２０】
本明細書において「被験物質」は、免疫凝集反応を用いて濃度を測定可能なものである限り特に限定されない。被験物質は、例えば、蛋白質、ペプチド、脂質、核酸、多糖類および糖類等の抗原、または抗体であってよい。抗原としては、各種の抗原、受容体、ホルモンおよびホルモン様物質、薬物、酵素等が挙げられ、具体的には、例えば、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、インスリン、ヒトフィブリノーゲン、マイクロアルブミン、ＩＶ型コラーゲン、マイコプラズマ抗原、ＨＢｓ抗原、ヘモグロビンＡ１ｃ等が挙げられる。抗体としては、各種疾患と関連する自己抗体、各種の毒素や病原菌等に対する抗体等が挙げられ、具体的には、例えば、リウマトイド因子、抗核抗体、抗ＣＣＰ抗体、抗ＤＮＡ抗体、抗ＥＮＡ抗体、抗内因子抗体、抗リン脂質抗体等の自己抗体や、抗梅毒抗原抗体、抗梅毒トレポネーマ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ＨＢｃ抗体、抗ＨＢｅ抗体、抗インスリン抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗リン脂質抗体等が挙げられる。
【００２１】
被験物質との結合パートナーは、被験物質との抗原−抗体反応を生じることができ、かつ該反応により粒子の凝集を誘発できるものである限り特に限定されない。また、粒子の凝集の誘発のために、追加の成分（例えば、１次抗体である結合パートナーに特異的に結合できる２次抗体）が必要または望ましいものであってもよい。結合パートナーは、例えば、蛋白質、ペプチド、脂質、核酸、多糖類および糖類等の抗原または抗体であってよい。
【００２２】
結合パートナーは、反応液の調製の時点で粒子に担持されていてもよいし、あるいは該時点では粒子に担持されていなくてもよい（後者の例としては、ヘモグロビンＡ１ｃの測定などが挙げられる。）。粒子に担持される結合パートナーの量または結合パートナーと粒子との量比は、用いる具体的物質等によっても異なり、特に限定されない。
【００２３】
粒子は、被験物質とその結合パートナーとの抗原−抗体反応により凝集を誘発されることができるものである限り、特に限定されない。該粒子は、好ましくは、不溶性担体粒子である。不溶性担体粒子としては、公知の担体粒子を用いることができる。担体の材質としては、例えば、ポリスチレン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレート等の合成高分子粉末、金属コロイド（金、チタン、ニッケル等）、シリカ、カーボン、磁性体粒子等が挙げられる。水または水系媒体中に各種高分子微粒子を安定に懸濁させたラテックスは当該技術分野において頻用されており、本発明においても好ましい担体粒子として挙げられる。
【００２４】
不溶性担体粒子の粒径は特に限定されず、本発明において用いる測定方法や粒子の材質等によっても異なるが、通常は０．０１〜１．０μｍ、好ましくは０．１〜０．７μｍ程度である。また、溶液中の担体粒子濃度は、免疫凝集反応のために通常用いられる濃度とすればよく、通常は１〜２０重量％であることが好ましい。
【００２５】
上述の通り、結合パートナーは反応液の調製の時点で粒子（好ましくは不溶性担体粒子）に担持されていてもよい。結合パートナーを不溶性担体粒子に担持させる方法は特に限定されず、物理吸着法および共有結合による化学結合法等の従来公知の方法を用いることができる。また、担持後には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等を用いたブロッキング処理等の公知の処理を適宜行ってもよい。
【００２６】
結合パートナーおよび／または粒子を含む溶液は、水または水系媒体をベースとするものであってよい。該溶液は更に、安定化剤や凝集促進剤等の追加成分を含んでいてもよい。あるいは、これらの追加成分は、被験物質を含む試料溶液中に添加されていてもよいし、または、免疫凝集反応が起こる反応液中に別途添加してもよい。安定化剤としては、例えば、上述したような緩衝液、ポリエチレングリコールや多糖類等の合成または天然高分子、界面活性剤等が挙げられる。凝集促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、プルラン、リン脂質ポリマー等の合成または天然高分子が挙げられる。また、混合前のいずれかの溶液、または反応液中に、必要に応じて、界面活性剤、合成または天然高分子、有機または無機試薬等を適宜添加してもよい。
【００２７】
上述したような、被験物質を含む試料溶液と結合パートナーおよび／または粒子を含む１以上の溶液と（任意に、追加成分を含む更なる溶液と）を混合することにより、該混合液（反応液）中で免疫凝集反応を開始させることができる。
【００２８】
免疫凝集反応の開始後、該反応の第１の期間における該反応液の散乱光強度、および、該反応の第２の期間における該反応液の散乱光強度に基づいて、第１の期間における散乱光強度の変化速度と第２の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動に関する指標値を決定する。
第１の期間および第２の期間の選択は、決定される指標値の信頼性を著しく損なわない限り、任意の期間であってよい。第１の期間と第２の期間とは、一部分が重複していてもよい。一般に、反応開始直後（例えば、反応開始から５秒まで）は反応液がまだ十分に撹拌されていないため安定した信号が得られない可能性があるので、この期間は第１の期間または第２の期間として用いないことが好ましい。また、短時間での判定を可能とするという目的からは、具体的な反応系によっても異なるが、第１の期間および第２の期間は反応開始から例えば５分以内、好ましくは３分以内、より好ましくは２分以内、更に好ましくは１分以内の期間である。
一つの実施形態において、第１の期間および第２の期間の一方は、反応開始後に濁度が急速に変化する期間（反応の前期）であり、他方は、濁度が急速に変化する期間を過ぎて濁度の変化が緩やかになった後の期間（反応の後期）である。より詳細には、例えば、反応の前期は反応が平衡になるときの濁度の２０％の濁度になる時点を含むものであってよく、反応の後期は、反応が平衡になるときの７０％の濁度になる時点を含むものであってよい。実際には、これらの期間は、測定時間を任意に定め、測定期間から前期および後期を適宜定義することにより決定してもよい。対象とする反応系によっても異なるが、具体的には例えば、１測定の場合、反応開始から１１〜３０秒を反応の前期、反応開始から４１〜６０秒を反応の後期とすることができる。
【００２９】
上記指標値を決定するために用いられる散乱光強度は、第１の期間の２以上の時点において測定された該反応液の散乱光強度、および、第２の期間の２以上の時点において測定された該反応液の散乱光強度であってよい。この場合、第１の期間および第２の期間の時間的長さ（即ち、当該２以上の時点間の最大の時間差）は特に限定されないが、各期間における散乱光強度の変化速度の信頼性を高めるという観点からは、それぞれ、通常１０〜２５秒、好ましくは１５〜２０秒である。
【００３０】
第１の期間または第２の期間における散乱光強度の変化速度は、当該期間内における散乱光強度の変化速度の程度を示すものであれば特に限定されず、各期間内の特定の時点における変化速度であってもよいし、あるいは、各期間内の全体的な変化速度を示すものであってもよい。具体的には、当該変化速度は、例えば、（ａ）当該期間内において等間隔（例えば１秒毎）に散乱光強度を測定することにより各時点における単位時間あたりの散乱光強度の変化量を求め、それを当該期間にわたって平均すること、または、（ｂ）当該期間内の任意の２時点において散乱光強度を測定し、２時点間の時間長さで測定値の間の変化量を除算すること等により決定することができる。あるいは、複数の時点における散乱光強度の測定値から散乱光強度の時間変化に関するグラフを作成し、該グラフにおける曲線の接線の傾きから変化速度を決定してもよい。
【００３１】
本発明において「散乱光強度」は、測定対象とする反応液からの散乱光の強度を定量的に示したものである限り、特に限定されない。好ましい実施形態において、所与の時点ｔの散乱光強度としては、下記式に示す通り、時点ｔにおける散乱光強度の測定値と透過光強度の測定値との比を用いることができる：
散乱光強度（ｔ）＝Ｓ（ｔ）／Ｔ（ｔ）；
（式中、Ｓ（ｔ）は時点ｔにおいて測定された散乱光強度を示し、Ｔ（ｔ）は時点ｔにおいて測定された透過光強度を示す。）
散乱光の信号は測定位置に入射する光量により変動するため、このように定義される散乱光強度を用いることにより、溶液中の測定位置における見かけの散乱光を減衰した透過光で補正することができる。
【００３２】
散乱光強度（および、場合により透過光強度）の測定に用いる光源は特に限定されず、ランプ、半導体レーザー、ＬＥＤ（発光ダイオード）等を用いることができる。単波長を照射できるという観点から半導体レーザーが好ましい。照射光波長についても特に限定されないが、５３０〜７８０ｎｍ（例えば、６５０ｎｍ）の波長領域の照射光を用いることが好ましい。また、例えば、全血試料からＣＲＰの測定を行う場合、ヘモグロビンの吸収波長を避けるべく、６００〜７８０ｎｍの照射光が好ましく用いられる。
【００３３】
散乱光強度の測定に用いる散乱角度についても特に限定されないが、散乱光測定における透過光の影響を低減すると共に十分な強度の散乱光を受光する目的から、好ましくは３〜８５度、より好ましくは３５〜５５度である。
【００３４】
指標値の算出方法は、第１の期間における散乱光強度の変化速度と第２の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動の度合いを示すものである限り特に限定されない。指標値の具体例としては、該２つの変化速度の間の比（例えば、実施例に記載されるように、反応の前期における散乱光強度の変化速度に対する反応の後期における散乱光強度の変化速度の比）、または、該２つの変化速度の間の差等を挙げることができる。
【００３５】
上記のようにして指標値が決定されたら、該指標値を、予め設定された閾値と比較することにより、被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定する。
閾値は、複数の既知濃度の被験物質含有試料を用いて作成した検量線、および、これらの試料のそれぞれについて得られた上記指標値を用いて設定することができる。即ち、例えば、複数の既知濃度の被験物質含有試料を用いて作成した検量線から、プロゾーン現象が発生する濃度またはその手前の濃度を閾値濃度Ｃ０として設定でき、更に、該閾値濃度Ｃ０における指標値Ａ０を、本発明の判定方法における測定方法と同一の条件下で求め、得られた指標値Ａ０を上記閾値として設定することができる。検体試料について決定された指標値が、このようにして設定された閾値Ａ０よりもよりも大きいのか、それとも小さいのかに応じて、検体試料中の被験物質濃度がプロゾーン領域またはその付近の濃度領域にあるのか否かを判定することができる。
【００３６】
（試料分析装置）
本発明はまた、試料分析装置を提供する。本発明の試料分析装置は、上述の本発明の判定方法を実行するための処理部を有する装置である。従って、本発明の判定方法に関して上述した全ての実施形態、および好ましい態様等は本発明の試料分析装置についても同様に適用され得る。従って、当該装置による分析の対象とする試料および被験物質についても、上述の記載が適用され得る。
本発明の試料分析装置は、
散乱光強度を測定するための散乱光強度測定部と、
反応液中で生じた被験物質とその結合パートナーとの間の免疫凝集反応について、該反応の第１の期間における該反応液の散乱光強度、および、該反応の第２の期間における該反応液の散乱光強度に基づいて、該第１の期間における散乱光強度の変化速度と該第２の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動に関する指標値を決定するための指標値決定部と、
該指標値と、予め設定された閾値とを比較することにより、該被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定するための第１判定部と
を有する。
【００３７】
一実施形態による本発明の試料分析装置の概略のブロック図を図１に示す。
本例の試料分析装置１０は、散乱光強度測定部１１、透過光強度測定部１２、指標値決定部１３、および第１判定部１４を有して構成されている。本発明の判定方法に関して上述した通り、本発明による判定のために用いる散乱光強度として、散乱光強度の測定値を透過光強度の測定値にて補正したものを用いることができ、本例では、この目的のために、本発明の装置において必須の構成要素である散乱光強度測定部１１、指標値決定部１３、および第１判定部１４に加えて、透過光強度測定部１２を有している。但し、本発明の実施において、透過光強度による散乱光強度の補正は必ずしも必要ではなく、よって透過光強度測定部１２は必須の構成要素ではない。
散乱光強度測定部１１および透過光強度測定部１２は、図２に例示的な概略のブロック図を示すように、一つの光学システムとして構成してもよい。図２に示す光学システムは、光源３１、測定セル３２、散乱光受光部３３、透過光受光部３４、および制御部３５を有して構成されている。光源３１は、ランプ、半導体レーザー、ＬＥＤ（発光ダイオード）等であってよく、単波長を照射できるという観点から半導体レーザーが好ましい。測定セル３２には検体溶液が設置され、そこに光源３１から光が照射される。その散乱光および透過光がそれぞれ散乱光受光部３３および透過光受光部３４により受光される。これらの受光部は、フォトダイオード等の受光素子により構成されたものであってよい。散乱光受光部３３および透過光受光部３４からのアナログ信号が制御部３５に伝送され、制御部３５はそれをデジタル信号に変換する。制御部３５はまた、光源３１、散乱光受光部３３、および透過光受光部３４を駆動するために、これらに電力を供給する。散乱光強度および透過光強度を計測するための上記の構成は、従来公知の光学測定装置と同様の構成を用いることができる。また、光の波長や散乱角度等の各種パラメータは、本発明の判定方法に関して上述した通りである。
【００３８】
指標値決定部１３および第１判定部１４は、一つの制御装置として構成することができる。該制御装置は、好ましい実施形態において、コンピュータを用いて実装される。
【００３９】
指標値決定部１３は、散乱光強度測定部１１の例えば制御部３５から、各計測時間におえる散乱光強度、ならびにこれらの散乱光強度に対応する反応開始からの経過時間のデータを受け取る。指標値決定部１３は、受け取ったこれらのデータに基づいて、本発明の判定方法に関して上述したような指標値を決定する。
【００４０】
第１判定部１４は、指標値決定部１３により決定された指標値と、例えばユーザーにより予め第１判定部１４に設定された閾値とを比較することにより、検体試料中の被験物質濃度の適正性を判定する。適正性の判定方法は、本発明の判定方法に関して上述した通りである。
【００４１】
他の実施形態による本発明の試料分析装置の概略のブロック図を図３に示す。
本例の試料分析装置２０は、散乱光強度測定部２１、透過光強度測定部２２、指標値決定部２３、および第１判定部２４に加えて、濃度測定部２５および第２判定部２６を有して構成されている。散乱光強度測定部２１、透過光強度測定部２２、指標値決定部２３、および第１判定部２４は、図１に示す試料分析装置１０に関して説明した、それぞれ、散乱光強度測定部１１、透過光強度測定部１２、指標値決定部１３、および第１判定部１４と同様の構成であってよい。
濃度測定部２５は、検体試料中の被験物質の濃度を測定するための機能部である。濃度測定のための方法は特に限定されず、例えば、透過光強度の測定値および／または散乱光強度の測定値と、予め作成された検量線を用いて自体公知の方法により濃度を測定することができる。よって、図３では、濃度測定部２５と、透過光強度測定部２２および散乱光強度測定部２１とを破線で繋いでいる。
第２判定部２６は、濃度測定部２５により測定された被験物質の濃度が所定の閾値濃度よりも低い場合に、該被験物質の濃度は適正な範囲内のものではないと判定するための機能部である。本発明の判定方法に関して上述した通り、第２判定部による判定は第１判定部による判定よりも前に行うことが好ましい。試料分析装置２０は、第２判定部により被験物質濃度は適正な範囲内ではないと判定した時には、それをユーザーに報告し、第１判定部による判定のための更なる処理（即ち、追加的な透過光および／または散乱光強度測定、指標値決定部および第１判定部による処理）を行わないように構成されていることが好ましい。
【００４２】
以下により具体的な実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【００４３】
例えば以下の手順により、血液試料からのＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）濃度を測定することができる。
ＣＲＰ測定手順
１．緩衝液を吸引し、測定セル内に吐出する。
２．次に溶血試薬を吸引し、測定セル内に吐出する。
３．検体を吸引し、測定セル内に吐出する。
４．ラテックス試薬を吸引し、測定セル内に吐出する。
５．測定セル内の溶液をよく撹拌する。
６．免疫反応が生じて、ＣＲＰ測定を行う。吸光度の変化を１秒ごとに１分間測定する。そのときのデータは信号処理部を経て演算部に取り込まれる。
７．前記測定が終わると、ＣＲＰセルは希釈液で洗浄され、全ての測定が終わる。
８．測定によって得られたデータに基づいて、２０秒から６０秒までの吸光度の時間変化量を求め、予め既知濃度の血清より求めておいた検量線からＣＲＰ濃度を得る。
（横軸を吸光度の時間変化、縦軸を濃度として予め検量線を作っておく。）
【００４４】
上述の手順にて、既知の濃度でＣＲＰを含む１０個の試料を用い、ＣＲＰに対する抗体を担持したラテックスとの免疫凝集反応を開始させた。その後、吸光度測定とあわせて散乱光強度を測定した。散乱光強度の測定には、波長６５０ｎｍ、散乱角４５度の散乱光と透過光の信号を用いた。各反応液について濁度（吸光度）に基づくたわみ値および散乱光量に基づくたわみ値を決定した。たわみ値は、本発明による指標値の一例であり、具体的には以下の通りに算出した。
たわみ値＝Ｓｐ（４０−５９）／Ｓｐ（１０−２９）
Ｓｐ（１０−２９）は試薬反応開始後１０秒から２９秒までの平均単位時間変化量
Ｓｐ（４０−５９）は試薬反応開始後４０秒から５９秒までの平均単位時間変化量
濁度と散乱光は以下の関係で求めたものを用いた。
濁度＝−ｌｏｇ（Ｔｔ／Ｔ０）
Ｔ０：検出系ブランク時の透過光量
Ｔｔ：反応時間ｔにおける透過光量
散乱光＝Ｓｔ／Ｔｔ
Ｓｔ：反応時間ｔにおける散乱光量
【００４５】
図４は、濃度既知の血清タンパクと吸光度で測定したときの測定値の関係をプロットしたものである。血清濃度３２ｍｇ／ｄｌをピークとして、この濃度より高い血清は見かけの測定値が小さく観察されている。同じ血清濃度にて吸光度と散乱光のたわみ値を測定したときの関係を図５に示す。吸光度から求めたたわみ値は８から３２ｍｇ／ｄＬにかけて変化量が大きく、その後緩やかに１００ｍｇ／ｄＬまで増加する。
散乱光から計算したたたわみ値は、血清濃度８から１６ｍｇ／ｄｌにかけて急激に増加し、その後３２ｍｇ／ｄＬまで大きく増加する。その後、血清濃度によらず一定値を示すようになる。
プロゾーンを高精度に判定するためには、通常測定濃度では小さい値を示し、プロゾーンに近づくとその数値が大きく変化する性質をもつ指標がよい。測定ばらつきの影響を考慮すると、指標の変化幅が小さいほうが変化幅が大きい指標より低濃度で判定するようになる。図５中の１６ｍｇ／ｄＬから３２ｍｇ／ｄＬまでの数値変化量を吸光度の場合をΔＲＬ、散乱光の場合をΔＲＳとすると、散乱光の数値の方が吸光度の数値より１．８倍同じ濃度変化量に対する変化量が大きい。この数値が大きいほど、測定ばらつきの影響が小さくなり、より高精度のプロゾーン判定が可能になる。プロゾーン判定の閾値を吸光度と散乱光とでＤＴとＤＳとすると、散乱光でのＤＳのほうがより吸光度のＤＴより閾値に対する変化量の余裕が大きく、より測定ばらつき影響が改善されていることがわかる。
【００４６】
本出願は、日本で出願された特願２０１６−２４３７９６（出願日：２０１６年１２月１５日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含される。
【符号の説明】
【００４７】
１０，２０  試料分析装置
１１，２１  散乱光強度測定部
１２，２２  透過光強度測定部
１３，２３  指標値決定部
１４，２４  第１判定部
２５  濃度判定部
２６  第２判定部
３１  光源
３２  測定セル
３３  散乱光受光部
３４  透過光受光部
３５  制御部
【図１】
2018110006.tif 000003
【図２】
2018110006.tif 000004
【図３】
2018110006.tif 000005
【図４】
2018110006.tif 000006
【図５】
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【国際調査報告】
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2018110006.tif 000009
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