(57)【要約】  バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・サブティリスの培養物の少なくとも一方を含み、前記バチルス・サブティリスが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法を用いた飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）による質量分析において、３０４５．５±０．５８の範囲、６９４２．５±０．５８の範囲、および９１４０．５±０．５８の範囲（ｍ／ｚ）からなる群から選択された少なくとも１つの質量電荷比（ｍ／ｚ）にピークを有する、抗菌剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・サブティリスの培養物の少なくとも一方を含み、
前記バチルス・サブティリスが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法を用いた飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）による質量分析において、３０４５．５±０．５８の範囲、６９４２．５±０．５８の範囲、および９１４０．５±０．５８の範囲（ｍ／ｚ）からなる群から選択された少なくとも１つの質量電荷比（ｍ／ｚ）にピークを有する微生物である、抗菌剤。
【請求項２】
前記バチルス・サブティリスおよび前記バチルス・サブティリスの培養物の少なくとも一方が、前記バチルス・サブティリスおよび前記バチルス・サブティリスの培養物の少なくとも一方における抗菌活性を示す抗菌物質であり、
前記抗菌物質の分子量が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、１５ＫＤａ以下であり、且つ
前記抗菌物質のフラグメンテーションイオンの質量が、エレクトロスプレーイオン化質量分析法による質量分析において、１４６０±１の範囲および１４７４±１の範囲である、
請求項１記載の抗菌剤。
【請求項３】
前記抗菌剤が、真菌に対する抗菌剤である、請求項１または２記載の抗菌剤。
【請求項４】
前記真菌が、ピリキュラリア属（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｓｐ．）、リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐ．）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、およびピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐ．）からなる群から選択された少なくとも１つの真菌である、請求項３記載の抗菌剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の抗菌剤を含む、農薬。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか一項に記載の抗菌剤と植物とを接触させる接触工程を含む、微生物による植物病害の防除方法。
【請求項７】
前記植物が、イネである、請求項６記載の防除方法。
【請求項８】
前記イネが、前記イネの苗または種子である、請求項７記載の防除方法。
【請求項９】
バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、
前記バチルス・サブティリスが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法を用いた飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）による質量分析において、３０４５．５±０．５８の範囲、６９４２．５±０．５８の範囲、および９１４０．５±０．５８の範囲（ｍ／ｚ）からなる群から選択された少なくとも１つの質量電荷比（ｍ／ｚ）にピークを有する、新規バチルス・サブティリス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１６年３月４日に出願された、日本国特許出願第２０１６−０４２６５９号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。【０００２】
本発明は、抗菌剤、農薬、微生物による植物病害の防除方法、および新規バチルス・サブティリスに関する。
【背景技術】
【０００３】
農作物の栽培において、微生物による農作物への病害が問題となっている。前記病害への対処方法として、例えば、他の微生物を散布し、前記微生物が産生する抗菌物質により、前記病害を防除する方法が試みられている。しかしながら、例えば、特許文献１に記載のように、イネに感染する真菌等に対して抗菌活性を示す抗菌物質は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】日本国特開２００３−１９９５５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、例えば、イネに感染する真菌等に対して抗菌活性を示す、新たな抗菌剤、農薬、微生物による植物病害の防除方法、および新規バチルス・サブティリスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、鋭意研究を行った結果、以下の発明を完成するに至った。【０００７】
本発明の抗菌剤は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・サブティリスの培養物の少なくとも一方を含み、前記バチルス・サブティリスが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法を用いた飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）による質量分析において、３０４５．５±０．５８の範囲、６９４２．５±０．５８の範囲、および９１４０．５±０．５８の範囲（ｍ／ｚ）からなる群から選択された少なくとも１つの質量電荷比（ｍ／ｚ）にピークを有する、微生物である。【０００８】
本発明の農薬は、前記本発明の抗菌剤を含む。【０００９】
本発明の微生物による植物病害の防除方法（以下、「防除方法」ともいう。）は、前記本発明の抗菌剤と植物とを接触させる接触工程を含む。【００１０】
本発明の新規バチルス・サブティリス（以下、「新規微生物」ともいう。）は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、
前記バチルス・サブティリスは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法を用いた飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）による質量分析において３０４５．５±０．５８の範囲、６９４２．５±０．５８の範囲、および９１４０．５±０．５８の範囲（ｍ／ｚ）からなる群から選択された少なくとも１つの質量電荷比（ｍ／ｚ）にピークを有する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、例えば、イネに感染する真菌等に対して抗菌活性を示す、新たな抗菌剤、農薬、微生物による植物病害の防除方法、および新規バチルス・サブティリスを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例１における培養後の寒天培地の写真である。
【図２】図２は、実施例１における質量分析の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例２における各画分の電気泳動の結果を示す写真である。
【図４】図４は、実施例２における各画分の抗菌活性を示す写真である。
【図５】図５は、実施例２における各領域の抗菌活性を示す写真である。
【図６】図６は、実施例２におけるＨＰＬＣの分析結果を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例２におけるエレクトロスプレーイオン化を含む液体クロマトグラフ質量分析法の分析結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の抗菌剤は、例えば、前記バチルス・サブティリスおよび前記バチルス・サブティリスの培養物の少なくとも一方が、前記バチルス・サブティリスおよび前記バチルス・サブティリスの培養物の少なくとも一方における抗菌活性を示す抗菌物質であり、
前記抗菌物質の分子量が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、１５ＫＤａ以下であり、且つ
前記抗菌物質のフラグメンテーションイオンの質量が、エレクトロスプレーイオン化質量分析法による質量分析において、１４６０±１の範囲および１４７４±１の範囲である。
【００１４】
本発明の抗菌剤は、例えば、前記抗菌剤が、真菌に対する抗菌剤である。前記真菌が、例えば、ピリキュラリア属（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｓｐ．）、リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐ．）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、およびピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐ．）からなる群から選択された少なくとも１つの真菌である。
【００１５】
本発明の防除方法は、例えば、前記植物が、イネである。前記イネが、例えば、前記イネの苗または種子（以下、「種もみ」ともいう。）である。
【００１６】
＜抗菌剤＞
本発明の抗菌剤は、前述のように、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・サブティリスの培養物の少なくとも一方を含み、前記バチルス・サブティリスが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法を用いた飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）による質量分析において、３０４５．５±０．５８の範囲、６９４２．５±０．５８の範囲、および９１４０．５±０．５８の範囲（ｍ／ｚ）からなる群から選択された少なくとも１つの質量電荷比（ｍ／ｚ）にピークを有することを特徴とする。本発明の抗菌剤は、前記バチルス・サブティリスおよび前記バチルス・サブティリスの培養物の少なくとも一方を含み、前記バチルス・サブティリスが、前述のピークを有することが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。
【００１７】
本発明者らは鋭意研究の結果、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる質量分析において、前述のピークを有する新規バチルス・サブティリス（新規微生物）が、真菌、細菌等の微生物に対し、抗菌活性を示す抗菌物質を産生することを見出した。また、前記抗菌物質のフラグメンテーションイオンが、例えば、エレクトロスプレーイオン化を含む液体クロマトグラフ質量分析法による質量分析において、公知のバチルス・サブティリスが産生する、イツリン、サーファクチン、フェンジャイシン等の抗菌物質と異なる質量電荷比にピークを有することから、前記抗菌物質は、新規な抗菌物質であることが推定された。このため、本発明によれば、例えば、イネの苗や種もみに感染する真菌、細菌等の微生物に対して抗菌活性を示す新規な抗菌物質、それを含む新規微生物、前記新規微生物の培養物等を含む新たな抗菌剤が提供できる。
【００１８】
本発明において、抗菌活性は、静菌活性でもよいし、殺菌活性でもよい。後述するように、前記抗菌剤を真菌に使用する場合、前記抗菌活性は、例えば、前記真菌の菌糸の伸長阻害または抑制、前記真菌の分生子形成阻害または抑制、および前記真菌の菌糸体の形成阻害または抑制等のいずれでもよい。前記抗菌剤を細菌に使用する場合、前記抗菌活性は、例えば、前記細菌の増殖の阻害または抑制、および滅菌のいずれでもよい。
【００１９】
本発明において、前記バチルス・サブティリスは、前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる質量分析において、３０４５．５±０．５８の範囲、６９４２．５±０．５８の範囲、および９１４０．５±０．５８の範囲からなる群から選択された少なくとも１つ、好ましくは、３０４６、６９４３、および９１４１、または３０４５、６９４２、および９１４０（ｍ／ｚ）からなる群から選択された少なくとも１つの質量電荷比（ｍ／ｚ）にピークを有する。前記バチルス・サブティリスは、例えば、上記ピークのうち、いずれか１つのピークを有してもよいし、複数のピークを有してもよいが、全てのピークを有することが好ましい。前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに供するバチルス・サブティリスの培養方法および条件は、特に制限されず、例えば、後述する実施例の培養方法および条件があげられる。
【００２０】
前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる質量分析に使用する質量分析計および質量分析条件は、例えば、それぞれ、ＡＸＩＭＡ（登録商標）Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計（島津製作所社製）および下記質量分析条件があげられる。
【００２１】
（質量分析条件）
加速電圧：２０ｋＶ（リニアモード）
イオン源部のレーザー：波長３３７ｎｍの窒素レーザー
パルス反復値：３ｎｓｅｃ
レーザー照射レート：５０Ｈｚ以下
チャンバー内の真空度：１．０Ｅ−３Ｐａ以下
【００２２】
前記新規微生物の培養物は、特に制限されず、例えば、前記新規微生物の菌体、前記新規微生物の培養上清、前記新規微生物の菌体抽出物等があげられる。また、本発明の抗菌剤は、さらに、前記新規微生物以外の微生物の培養物を含んでいてもよい。前記新規微生物以外の微生物の培養物としては、特に制限されず、例えば、他の微生物の菌体、前記他の微生物の培養上清、前記他の微生物の菌体抽出物等があげられる。
【００２３】
前記培養物は、例えば、前記菌体の処理物、前記培養上清の処理物、前記菌体抽出物の処理物等でもよい。前記処理物は、特に制限されず、例えば、前記培養物の濃縮物、乾燥物、凍結乾燥物、溶媒処理物、界面活性剤処理物、酵素処理物、タンパク質分画物、超音波処理物、磨砕処理物、前記抗菌物質の精製物等があげられる。また、前記培養物は、例えば、前記菌体、前記培養上清、前記菌体抽出物、前記菌体の処理物、前記培養上清の処理物、前記菌体抽出物の処理物等の混合物でもよい。前記混合物は、特に制限されず、任意の組み合わせおよび比率で混合した混合物とすることができる。前記組み合わせは、特に制限されず、例えば、前記菌体および前記培養上清の混合物等があげられる。
【００２４】
本発明の抗菌剤は、例えば、前記バチルス・サブティリスおよび前記バチルス・サブティリスの培養物の少なくとも一方が、抗菌活性を示す抗菌物質を含むことが好ましい。前記抗菌物質の分子量が、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、１５ＫＤａ以下であり、且つ前記抗菌物質のフラグメンテーションイオンの質量が、エレクトロスプレーイオン化分析法による質量分析において、１４６０±１の範囲および１４７４±１の範囲、または１４６０および１４７４である。前記抗菌物質は抗菌活性を示すため、例えば、本発明の抗菌剤は、例えば、前記バチルス・サブティリスおよび前記バチルス・サブティリスの培養物の少なくとも一方が、前記バチルス・サブティリスおよび前記バチルス・サブティリスの培養物の少なくとも一方における前記抗菌活性を示す抗菌物質であってもよい。
【００２５】
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用する電気泳動装置および条件は、例えば、それぞれ、ミニプロティアンＴｅｔｒａセルシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）および下記電気泳動条件があげられる。
【００２６】
（電気泳動条件）
（１）分離ゲル：２０％アクリルアミド
（２）濃縮ゲル：４．５％アクリルアミド
（３）ゲルサイズ：ミニゲル（サイズ（Ｗ×Ｌ）：８．３ｃｍ×７．３ｃｍ）
（４）ゲルの厚み：１ｍｍ
（５）電気泳動緩衝液：２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、２００  ｍｍｏｌ／Ｌ  グリシン、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム
【００２７】
また、前記エレクトロスプレーイオン化質量分析に使用する分析機器、質量分析計および質量分析条件は、例えば、それぞれ、１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＨＰＬＣシステム（Agilent Technologies社製、Agilent G6530B Accurate-Mass Q TOF（Agilent Technologies社製）および下記エレクトロスプレーイオン化を含む液体クロマトグラフ質量分析法の条件があげられる。
【００２８】
（エレクトロスプレーイオン化を含む液体クロマトグラフ質量分析法の条件）
（１）カラム：Ｍｏｎｏｂｉｓ  ＯＤＳカラム（京都モノテック社製）
（２）移動相：  溶媒  Ａ：０．２％酢酸水溶液
Ｂ：０．２％酢酸−メタノール
グラジエント条件：時間（溶媒比（Ａ：Ｂ））
０分：（Ａ：Ｂ＝９８：２）
１３分：（Ａ：Ｂ＝２：９８）
となるよう、０分から１３分にかけて直線的に溶
媒Ａの割合を減少、溶媒Ｂの割合を増加させ、６
分間、溶媒ＡおよびＢの割合を維持。
（３）流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
（４）モード：ＭＳ  Ｑ−ＴＯＦ、Ｄｕａｌ  ＡＪＳ  ＥＳＩイオン化、ポジティブイオンモード
【００２９】
本発明の抗菌剤は、さらに、例えば、添加剤等の他の成分を含んでいてもよい。前記添加剤としては、特に制限されず、例えば、安定化剤等があげられる。前記抗菌剤の製造方法は、特に制限されず、例えば、後述する抗菌剤の剤型に応じて、適宜決定でき、例えば、通常用いられる製剤化技術等を採用できる。
【００３０】
本発明の抗菌剤は、例えば、種々の真菌、細菌等の微生物に使用できる。前記真菌は、例えば、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｇｒｉｓｅａ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ等のピリキュラリア属（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｓｐ．）、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ等のリゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐ．）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ等のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ等のフサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐ．）等があげられる。前記細菌は、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌａｄｉｏｌｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ等のバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｖｅｎａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｌａｎｔａｒｉｉ等のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）等があげられる。
【００３１】
前記新規微生物の採取源としては、特に限定されず、例えば、肥料、土壌、海水、川水、湖水、沼水、排水等があげられ、好ましくは、前記肥料である。また、前記土壌としては、例えば、陸地、海底、川底、湖底および沼底の土、砂および泥土等があげられる。
【００３２】
前記新規微生物の単離方法としては、特に制限されず、例えば、従来公知の採取法、培養法等を用いることができる。前記新規微生物の単離方法は、例えば、後述する実施例の単離方法が参照できる。前記採取源が肥料の場合、前記新規微生物は、例えば、採取した肥料を緩衝液等により懸濁後、この懸濁液を遠心分離し、得られた上清を寒天培地等で培養し、得られたコロニーから単離できる。前記採取源が湖水の場合、前記新規微生物は、例えば、採取した湖水をフィルター等によりろ過し、このろ液を寒天培地等で培養し、得られたコロニーから単離できる。また、前記採取源が泥土の場合、前記新規微生物は、例えば、採取した泥土を緩衝液等により懸濁後、この懸濁液を遠心分離し、得られた上清を寒天培地等で培養し、得られたコロニーから前記新規微生物を単離できる。前記単離した新規微生物は、さらに、例えば、液体培地中で培養してもよい。
【００３３】
前記新規微生物の培養において、培地は、特に制限されず、例えば、後述するＥ５液体培地およびその固体培地、コーンミール液体培地およびその固体培地（Ｆｌｕｋａ社製、カタログ番号：42347-500G-F）、ＬＢ液体培地およびその固体培地、Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ液体培地およびその固体培地等が使用できる。
【００３４】
前記新規微生物の培養温度は、特に制限されず、例えば、２５〜５５℃、２５〜３５℃、４５〜５５℃である。
【００３５】
前記培養において、培養時のｐＨは、特に限定されず、例えば、ｐＨ４．５〜７．５の範囲、ｐＨ６．５〜７．５の範囲、ｐＨ４.５〜５.５の範囲である。
【００３６】
前記培養は、例えば、好気的条件下で行ってもよく、嫌気的条件下で行ってもよい。前記好気的条件または嫌気的条件は、特に制限されず、従来公知の方法を用いて設定できる。また、前記培養時の光条件は、特に制限されず、例えば、暗黒条件でもよく、照明条件でもよい。
【００３７】
前記培養時間は、特に制限されず、例えば、前記新規微生物の増殖が定常期に達するまでであってもよい。前記新規微生物の増殖が、約７２時間以内に定常期に達する培養条件下の場合、前記培養時間は、例えば、７２時間であってもよい。
【００３８】
前記新規微生物の培養において、例えば、前記新規微生物のみを培養してもよく、さらに、他の微生物を同時に混合培養してもよい。前記他の微生物としては、特に制限されない。
【００３９】
＜農薬＞
本発明の農薬は、前述のように、前記本発明の抗菌剤を含むことを特徴とする。本発明の農薬は、前記本発明の抗菌剤を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の農薬によれば、例えば、微生物による植物病害を防除できる。本発明の農薬は、例えば、前記本発明の抗菌剤の説明を援用できる。
【００４０】
本発明の農薬の剤形は、特に制限されず、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、等の固形剤、液剤、乳剤等があげられる。本発明の農薬は、例えば、公知の農薬を含んでもよい。前記公知の農薬は、例えば、生物学的農薬、化学的農薬でもよい。前記生物学的農薬は、例えば、抗菌活性、殺虫活性、殺菌活性、除草活性、植物成長調節活性、昆虫忌避活性等の活性を有する微生物（例えば、細菌、真菌）を含む農薬である。また、前記化学的農薬は、例えば、抗菌物質、殺虫物質、殺菌物質、除草物質、植物成長調節物質、昆虫忌避物質等があげられる。
【００４１】
前記農薬の使用対象は、特に制限されず、例えば、植物、前記植物を栽培する土壌、水等の培地があげられる。前記植物は、例えば、イネ等のイネ科植物等があげられる。前記農薬を前記植物に使用する場合、前記植物において前記農薬を接触させる位置は、特に制限されず、前記植物個体全体でもよいし、前記植物個体の部分でもよい。前記植物個体の部分は、例えば、器官、組織、細胞または栄養繁殖体等があげられ、いずれでもよい。前記器官は、例えば、花弁、花冠、花、葉、種子、果実、茎、根等があげられる。具体例として、前記使用対象は、例えば、イネの種子（種もみ）、苗等があげられる。前記農薬を使用する際の植物の成長状態は、特に制限されず、例えば、種子でもよいし、苗でもよいし、成長体でもよい。
【００４２】
前記農薬の使用量および使用回数は、特に制限されず、例えば、前記使用対象に応じて適宜設定できる。
【００４３】
本発明の農薬は、例えば、一般的な使用方法により、使用できる。前記使用方法は、例えば、前記農薬を手で直接散布する方法、背負い式散粒機、パイプ散粒機、空中散粒機、動力散粒機、育苗箱用散粒機、多口ホース散粒機、田植え機等に付設した散粒機等の散粒機を用いて散粒する方法等があげられる。また、本発明の農薬が液剤の場合、前記農薬は、例えば、背負い式散布機、動力散布機、スプリンクラー、トラクター等に搭載される型の散布機、多口ホース散布機等の散布機を用いて散布できる。
【００４４】
本発明の農薬の使用場所は、特に制限されず、例えば、水田、乾田、育苗箱、畑地、果樹園、桑畑、温室、露地等の農耕地等に使用できる。
【００４５】
本発明の農薬をイネに使用する場合について、例をあげて説明する。本発明の農薬をイネに使用する場合、本発明の農薬は、例えば、播種時、育苗期、田植時等に使用できる。本発明の農薬は、例えば、未希釈の状態で使用してもよいし、希釈した状態で使用してもよく、例えば、前記水田に使用する場合、例えば、前述の散粒機、散布機、スプリンクラー等を用いて散粒、散布等できる。また、本発明の農薬を前記イネの種もみの消毒に使用する場合、前記農薬は、例えば、前記イネの種もみのコート剤として使用できる。前記本発明の農薬は、例えば、さらに、前記イネの種もみの浸種の際、浸漬する水に溶解して使用してもよいし、前記イネの種もみを種子消毒する際、温湯に溶解して使用してもよいし、前記イネの種もみの催芽の際、水に噴霧してもよい。
【００４６】
前記水田に使用する場合、本発明の農薬の使用量および使用回数は、特に制限されず、前記水田の大きさおよび前記使用方法に応じて適宜決定できる。
【００４７】
＜微生物による植物病害の防除方法＞
本発明の微生物による植物病害の防除方法は、前述のように、前記本発明の抗菌剤と植物とを接触させる接触工程を含む。本発明の防除方法は、前記本発明の抗菌剤を使用することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の防除方法によれば、例えば、前記種苗や成長体等の植物を前記真菌、前記細菌等の微生物による植物病害から防除できる。本発明の防除方法は、例えば、前記本発明の抗菌剤、農薬等の説明を援用できる。
【００４８】
本発明において、前記微生物による植物病害の防除は、例えば、前記微生物の感染による病害の発生および進行に対する阻害能または抑制能を意味し、具体的に、例えば、病害の未発生、発生した病害の進行の停止、および、発生した病害の進行の抑制（阻害ともいう）等のいずれでもよい。
【００４９】
前記接触工程は、前記本発明の抗菌剤と植物とを接触させる工程である。前記接触工程は、例えば、前記本発明の抗菌剤として、前記本発明の農薬と前記植物とを接触させてもよい。前記本発明の抗菌剤と前記植物との接触方法等は、例えば、前記本発明の農薬の説明を援用できる。
【００５０】
＜新規バチルス・サブティリス＞
本発明の新規バチルス・サブティリスは、前述のように、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、前記バチルス・サブティリスが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法を用いた飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）による質量分析において、３０４５．５±０．５８の範囲、６９４２．５±０．５８の範囲、および９１４０．５±０．５８の範囲（ｍ／ｚ）からなる群から選択された少なくとも１つの質量電荷比（ｍ／ｚ）にピークを有することを特徴とする。本発明の新規微生物は、前記バチルス・サブティリスであり、前記バチルス・サブティリスが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる質量分析において、前述のピークを有することを特徴とし、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の新規微生物によれば、例えば、前記本発明の抗菌剤および農薬を製造できる。本発明の新規微生物は、例えば、前記本発明の抗菌剤、農薬、および防除方法の説明を援用できる。
【実施例】
【００５１】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらの作業手順書に基づいて使用した。【００５２】
［実施例１］
本発明の新規微生物を分離し、前記新規微生物が抗菌活性を示す抗菌物質を産生していることを確認した。【００５３】
（１）新規微生物の分離
山形県内で取得した有機肥料を単離源にし、前記新規微生物を単離した。単離用培地は、Ｅ５培地を用いた。前記Ｅ５培地の原料培地は、下記表１の組成で混合後、暗冷所で保管した。つぎに、前記原料培地を２．４ｇ秤量し、これを１．２Ｌの蒸留水に添加し、５分間煮沸した。前記煮沸後、得られた溶液をろ過して不純物を取り除いた後、溶液分を容器へ回収した。さらに、回収した溶液について、１２１℃、２０分間の条件でオートクレーブ滅菌後、冷却することにより、前記Ｅ５培地を調製した。【００５４】
【表１】
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【００５５】
１ＬのＥ５培地に、最終濃度１．５％ｗ／ｖとなるように寒天を添加した。得られた混合液を溶解し、１２１℃、２０分間の条件でオートクレーブ滅菌した後、適温の状態（液体の状態）でシャーレへ注ぎ、冷却して固化することにより、Ｅ５寒天プレート培地（Ｅ５寒天培地）を調製した。【００５６】
適量の前記Ｅ５培地をフラスコに導入後、前記フラスコに前記単離源を２５０ｍｇ投入し、３０〜４８℃、回転数１２０ｒｐｍの条件下、２４〜１４４時間培養した。得られた培養液の一部を前記Ｅ５寒天培地へ塗抹し、コロニー形成が確認できるまで培養した。形成された各コロニーについて、滅菌した爪楊枝で釣菌し、コロニーの形状や色、匂い等で判別し、それらをさらに前記Ｅ５寒天培地へ再塗抹した。同様の処理を複数回繰り返すことで、集積培養し、特徴の異なる７２株の微生物を取得した。これらをＹＡＥ株と命名した。前記新規微生物（ＹＡＥ５１株）は、上記分離方法によって５１番目に取得されたバチルス・サブティリスである。【００５７】
（２）抗菌活性の確認
１ＬのＥ５培地に、１．２５ｇのＢａｃｔｏ（商標）  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Becton Dickinson社製、カタログ番号：212750）を添加後、さらに、最終濃度１．５％ｗ／ｖとなるように寒天を添加した。得られた混合液を溶解し、１２１℃、２０分間の条件でオートクレーブ滅菌した後、適温の状態（液体の状態）でシャーレへ注ぎ、冷却して固化することにより、Ｅ５イースト寒天プレート培地（Ｅ５イースト寒天培地）を調製した。【００５８】
前記Ｅ５イースト寒天培地の中心部に、別途、前記Ｅ５イースト寒天培地で培養した真菌株を、０．５ｃｍ×０．５ｃｍサイズの寒天ブロックとして播種した。前記真菌株は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ  ＭＡＦＦ２３５９４９（イネバカ苗病菌、農業生物資源ジーンバンクから入手）、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｇｒｉｓｅａ  ＭＡＦＦ１０１５１８（イネイモチ病菌、農業生物資源ジーンバンクから入手）またはＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ  ＭＡＦＦ３０５２２９（イネ紋枯病菌、農業生物資源ジーンバンクから入手）を使用した。【００５９】
前記播種後、さらに、前記新規微生物を前記真菌株の周辺に、滅菌した爪楊枝で播種した。そして、３０℃の条件下で、所定日数（イネバカ苗病菌：５日間、イネイモチ病菌：３日間、イネ紋枯病菌：３日間）、前記Ｅ５イースト寒天培地を培養した。前記培養後、新規微生物が、各真菌株との間に形成した阻止円の径（Ｒ）について、下記抗菌活性の評価基準により評価した。なお、阻止円の径は、長径と短径との平均値とした。また、前記Ｅ５イースト寒天培地に代えて、コーンミールアガー寒天培地（Ｆｌｕｋａ社製、カタログ番号：42347-500G-F）を用い、前記真菌株として、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ  ＮＢＲＣ３０５４６（イネ立枯病、独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手）を用い、所定日数（イネ立枯病：３日間）培養した以外は、同様にして評価した。【００６０】
（抗菌活性の評価基準）
＋＋＋：５≦Ｒ    （ｍｍ）
＋＋  ：１＜Ｒ＜５（ｍｍ）
＋    ：０＜Ｒ≦１（ｍｍ）
−    ：０＝Ｒ    （ｍｍ）【００６１】
これらの結果を図１に示す。図１は、前記培養後の寒天培地の写真である。図１において、（Ａ）は、イネバカ苗病菌の結果を示し、（Ｂ）は、イネイモチ病菌の結果を示し、（Ｃ）は、イネ紋枯病菌の結果を示し、（Ｄ）は、イネ立枯病の結果を示し、図中の実線が、前記新規微生物が増殖している領域であり、破線が、各真菌株が増殖している領域であり、前記実線と前記破線との間の領域が、前記阻止円を示す。図１に示すように、前記新規微生物は、いずれの真菌株に対しても、抗菌活性を示した。【００６２】
つぎに、前記阻止円の径（Ｒ）と、抗菌活性の評価とを下記表２に示す。下記表２に示すように、前記新規微生物は、いずれの真菌株に対しても抗菌活性を示し、特に、イネイモチ病菌およびイネ紋枯病菌に対し、高い抗菌活性を示した。【００６３】
【表２】
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【００６４】
（３）新規微生物の同定
冷蔵保存した５ｍｇのマトリックス４−ＣＨＣＡ（島津ＧＬＣ社製、カタログ番号：529-CHCA）粉末の入ったバイアルに、１００％アセトニトリル、１００％エタノール、および１０％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏを、それぞれ、６７μＬ添加後、十分に懸濁し、前記マトリックスの終濃度が、２５ｍｇ／ｍｌのマトリックス試薬を調製した。【００６５】
滅菌した爪楊枝を用い、前記Ｅ５イースト寒天培地における前記新規微生物の増殖期コロニーを釣菌し、サンプルプレート（島津ＧＬＣ社製）のウェルに塗布した。つぎに、前記ウェルに、１μＬの前記マトリックス試薬を添加後、室温（２５℃前後）の条件下で、３０分間〜１時間乾燥させ、前記マトリックス試薬を完全に乾燥させた。【００６６】
前記新規微生物の同定は、質量分析計（ＡＸＩＭＡ（登録商標）Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計、島津製作所社製）を用い、下記質量分析条件で測定した。前記質量分析計の制御および質量データの収集は、付属のソフトウェア（ＬＡＵＮＣＨＰＡＤ、島津製作所社製）を用いた。なお、下記質量分析条件で計測可能な質量の範囲は、１Ｄａ〜５００ｋＤａである。【００６７】
（質量分析条件）
加速電圧：２０ｋＶ（リニアモード）
イオン源部のレーザー：波長３３７ｎｍの窒素レーザー
パルス反復値：３ｎｓｅｃ
レーザー照射レート：５０Ｈｚ以下
チャンバー内の真空度：１．０Ｅ−３Ｐａ以下【００６８】
得られた質量データおよび、ビオメリュー社が登録した６種類の標準細菌株由来タンパク質の質量データに基づき、ソフトウェア（ＳＡＲＡＭＩＳ（商標）Ｐｒｅｍｉｕｍ、ビオメリュー社製）を用いて、前記新規微生物株の同定を行なった。前記同定は、下記参考文献に基づいて、実施した。同様の同定を、さらに、３回実施した。参考文献：Lohmann C et.al.，“Comparison between the Biflex III-Biotyper and the Axima-SARAMIS Systems for Yeast Identification by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry”, J Clin Microbiol., 2013, vol.51, No. 4, pages.1231-1236【００６９】
これらの結果を図２に示す。図２は、質量分析の結果を示すグラフである。図２は、前記新規微生物および前記標準細菌株の結果を示し、図中の数字は、ピークの数値（ｍ／ｚ）を示し、矢印は、前記新規微生物には存在し、前記標準細菌株には存在しないピークを示す。図２において、横軸は、質量電荷比（ｍ／ｚ）を示し、縦軸は、相対強度（％）を示す。図２に示すように、前記新規微生物の質量データにおいて、多数のピークが、前記標準細菌株のタンパク質の質量データのピークと一致した。また、前記新規微生物の質量データでは、３０４６、６９４３、および９１４１（ｍ／ｚ）のピークが存在するのに対し、前記標準細菌株のタンパク質の質量データでは、これらのピークは存在しなかった。また、さらなる３回の同定結果と平均した結果、前記新規微生物は、３０４５．５±０．５８の範囲、６９４２．５±０．５８の範囲、および９１４０．５±０．５８の範囲（ｍ／ｚ）にピークを有することがわかった。【００７０】
つぎに、前記新規微生物の質量データと前記６種類の標準細菌株の質量データのピークの一致率を、下記表３に示す。下記表３に示すように、前記新規微生物は、バチルス・サブティリスに属する細菌株とピークの一致率が極めて高かった。これらの結果から、前記新規微生物は、バチルス・サブティリスに属する新規微生物であることが分かった。なお、前記新規微生物の質量データにおいて、３０４５．５±０．５８の範囲、６９４２．５±０．５８の範囲、および９１４０．５±０．５８の範囲（ｍ／ｚ）のピークが、これらの細菌株の質量データのピークと相違し、これらのピークにより、本発明の新規微生物が特定できることが分かった。【００７１】
【表３】
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【００７２】
［実施例２］
本発明の新規微生物から、前記抗菌活性を示す抗菌物質を精製および分析した。【００７３】
（１）ゲル濾過カラムを用いた精製
２００ｍＬのＬＢ培地を１Ｌの羽根つき三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分間の条件で、オートクレーブ滅菌した。前記ＬＢ培地の組成は、１％Ｂａｃｔｏ（商標）Ｔｒｙｐｔｏｎ（Becton Dickinson社製、カタログ番号：211705）、０．５％Ｂａｃｔｏ（商標）Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ（和光純薬工業社製：カタログ番号：191-01665）とした。前記新規微生物を前記ＬＢ培地に播種し、振盪回転数１２０ｒｐｍ、３０℃の条件下で、４８時間培養した。【００７４】
前記培養後、８０００×ｇの条件下で２０分間遠心した。つぎに、上清を回収することで、菌体を除去後、前記上清に終濃度が、３０％となるように、硫酸アンモニウム（和光純薬工業社製：カタログ番号：013-03433）を添加した。つぎに、４℃の条件下で、１時間静置し、さらに、１００００×ｇの条件下で２０分間遠心し、析出した物質（沈殿）を回収した。【００７５】
回収した沈殿を、２ｍＬの２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶解し、粗精製試料を調製した。前記粗精製試料を、セルロースチューブ１８／３２（エーディア社製、カタログ番号：UC18-32-100）内に導入し、１Ｌの透析液中で脱塩（以下、「透析」ともいう。）し、粗精製抗菌物質溶液を得た。前記透析液は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液とした。前記透析処理は、４℃の条件下で、一晩継続して行なった。また、前記透析処理中、１回、前記透析液を交換した。【００７６】
つぎに、前記粗精製抗菌物質溶液を、下記ゲルろ過の精製条件でゲル濾過に供し、第９１２、２１、２４、２７および３０番目の画分を取得した。なお、前記ゲル濾過において２５０ｍＬのカラム平衡用緩衝液を導入後、１ｍＬの前記粗精製抗菌物質溶液を導入し、さらに、１８０ｍＬの移動相を導入した。そして、前記移動相の導入中に、各画分を回収した。【００７７】
（ゲルろ過の精製条件）
（１）使用機器：低圧順相クロマトグラム（ＡＫＴＡ  ｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）
（２）カラム：  HiPrep 16/60 Sephacryl S-200HR（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、カタログ番号：17116601）
（３）カラム平衡用緩衝液および移動相：  ２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ    ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）
（４）流速      ０．５ｍＬ／ｍｉｎ
（５）分取量：  ５ｍＬ／画分【００７８】
つぎに、各画分について、アミコンウルトラ−０．５（メルクミリポア社製、カタログ番号：UFC501096）を用い、限外ろ過により、２０倍の濃度（１／２０の体積）まで濃縮し、各画分の試料を調製した。前記粗精製抗菌物質溶液および前記各画分の試料を、それぞれ、等量の×２  ＳＤＳサンプルバッファーと混合し、１００℃の条件下で、３分間煮沸した。前記煮沸後、前記粗精製抗菌物質溶液および前記各画分の試料について、電気泳動装置（ミニプロティアンＴｅｔｒａセルシステム、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用い、下記電気泳動条件で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。なお、電流値は、３０ｍＡとし、４０分間電気泳動した。【００７９】
（電気泳動条件）
（１）分離ゲル：２０％アクリルアミド
（２）濃縮ゲル：４．５％アクリルアミド
（３）ゲルサイズ：ミニゲル（サイズ（Ｗ×Ｌ）：８．３ｃｍ×７．３ｃｍ）
（４）ゲルの厚み：１ｍｍ
（５）電気泳動緩衝液：２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ（和光純薬社製、カタログ番号：207-06275）、２００  ｍｍｏｌ／Ｌ  グリシン（和光純薬社製、カタログ番号：G8898-1KG）、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ナカライテスク社製、カタログ番号：31607-65）【００８０】
前記電気泳動後、前記アクリルアミドゲルは、固定液で処理後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）（和光純薬社製、カタログ番号：031-17922）の染色液で３０分間染色した。前記固定液の組成は、５０％エタノール、１０％酢酸とした。前記染色後、脱色液でＣＢＢ色素を除去することにより脱色した。前記脱色液の組成は、２５％メタノール、７．５％酢酸とした。前記脱色処理は３時間行い、数回、前記脱色液を交換した。【００８１】
この結果を図３に示す。図３は、各画分の電気泳動の結果を示す写真である。図３において、写真の左は、分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー、前記粗精製抗菌物質溶液、前記第９、１２、２１、２４、２７および３０番目の画分を示す。図３に示すように、前記粗精製抗菌物質溶液に含まれる前記抗菌物質は、前記第１２番目の画分に精製されており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、分子量が１５ＫＤａ以下の抗菌物質であった。【００８２】
つぎに、各画分の抗菌活性を、Ｗｅｌｌ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ法により検討した。まず、Ｄｉｆｃｏ（商標）Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ（Becton Dickinson社製、カタログ番号：21340）を用い、添付の作業手順書に基づき、培地を調製した。具体的には、Ｄｉｆｃｏ（商標）Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒを３９ｇ秤量し、１Ｌの蒸留水が入った容器へ導入し、溶解した。前記容器および培地を、１２１℃、２０分間の条件でオートクレーブ滅菌した後、適温の状態（液体の状態）でプラスチック製のペトリ皿へ注ぎ、冷却して固化することにより、Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒプレート培地を調製した。【００８３】
つぎに、前記真菌株として、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ  ＭＡＦＦ３０５２２９（イネ紋枯病菌）を用い、前記新規微生物に代えて、１００μＬの前記第９、１２、２１、２４、２７および３０番目の画分を、前記真菌株の周辺に形成した直径約０．８ｍｍの６つの穴に、それぞれ導入した以外は、前記実施例１（２）と同様にして、培養した。【００８４】
この結果を図４に示す。図４は、各画分の抗菌活性を示す写真である。図４に示すように、前記第１２の画分の阻止円が極めて大きく、前記第１２の画分に抗菌物質が含まれていることが分かった。以上のことから、前記抗菌物質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、分子量が１５ＫＤａ以下の抗菌物質であることがわかった。【００８５】
前記第１２の画分について、２０％アクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。前記第１２の画分は、複数レーンで電気泳動した。そして、前記電気泳動後、１つのレーンについて、ＣＢＢ染色した。そして、前記ＣＢＢ染色をしたレーンを基準として、前記ＣＢＢ染色していないレーンについて、バンドが観察される領域（第２の領域）、前記領域より分子量が大きい領域（第１の領域）、および前記領域より分子量が小さい領域（第３の領域）の３つの領域に分割した。前記分割後の３つの領域について、超純水で洗浄した。【００８６】
つぎに、前記真菌株として、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ  ＭＡＦＦ３０５２２９（イネ紋枯病菌）を用いた。前記Ｅ５イースト寒天プレート培地上に、前記新規微生物に代えて前記洗浄後の３つの領域を載せて、さらに、その上へ１０ｍＬの滅菌済みＥ５イースト寒天溶液を重層してゲルを固定した。つぎに、ゲル周辺部にＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ  ＭＡＦＦ３０５２２９が生育する、約５ｍｍ×５ｍｍ四方角の寒天ブロックを播種した。前記播種後、３０℃の条件下で、３日間培養した。抗真菌反応は、前記イネ紋枯病菌の生育阻止円の大きさで評価した。【００８７】
この結果を図５に示す。図５は、各領域の抗菌活性を示す写真である。図５に示すように、前記第２の領域では、菌糸の形成が観察されなかった。これに対し、前記第１および第３の領域では、菌糸の形成が観察された。これらの結果から、前記抗菌物質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、分子量が１５ＫＤａ以下の抗菌物質であることが確認された。【００８８】
（２）ＨＰＬＣによる分析
前記粗精製抗菌物質溶液を、有機溶媒（１−ブタノール）で抽出処理した後、抽出液を乾固した。これを、エタノールに溶解することで粗精製サンプルを調製し、ＨＰＬＣによる分析に供した。分析機器（ＬａＣｈｒｏｍ  ＨＰＬＣシステム、日立ハイテクサイエンス社製）を用い、下記逆相ＨＰＬＣの分析条件で、逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ）に供し、分析した。また、コントロール１は、前記粗精製サンプルに代えて、メタノールを用いた以外は同様にして、また、コントロール２は、１．０ｍｇ／ｍＬ  Ａ型イツリンおよび１．０ｍｇ／ｍＬ  サーファクチンを含むメタノール溶液を用いた以外は、同様にして、分析した。【００８９】
（逆相ＨＰＬＣの分析条件）
（１）カラム：  Ｍｏｎｏｂｉｓ  ＯＤＳカラム（京都モノテック社製、耐高圧型、メソポア径１１ｎｍ、内径２．０ｍｍ×５０ｍｍ）
（２）移動相：  溶媒  Ａ：０．１％ギ酸（関東化学社製、カタログ番号：16233-00）−アセトニトリル（関東化学製、カタログ番号：01031-96）と２−プロパノール（関東化学社製、カタログ番号：32435-80）との混合液（混合比、ギ酸−アセトニトリル：２−プロパノール＝３：７）
Ｂ：０．１％ギ酸水溶液
グラジエント条件：時間（溶媒比（Ａ：Ｂ））
０分：（Ａ：Ｂ＝４０：６０）
３０分：（Ａ：Ｂ＝１００：０）
となるよう、０分から３０分にかけて直線的に溶
媒Ｂの割合を減少、溶媒Ａの割合を増加させた。
流速  ０．１５ｍＬ／ｍｉｎ
（３）測定波長：２０５ｎｍ
（４）カラム温度：４０℃【００９０】
この結果を図６に示す。図６は、ＨＰＬＣの分析結果を示すグラフである。図６において、横軸は、保持時間を示し、縦軸は、濃度分布を示す。図６に示すように、図中の矢印で示す位置に、前記粗精製サンプルは、前記コントロール１および２には存在しないピークを有していた。これらの結果から、前記粗精製サンプルは、公知の抗菌物質とは異なる抗菌物質を含むことが分かった。【００９１】
（３）エレクトロスプレーイオン化を含む液体クロマトグラフ質量分析法による分析
分析機器（１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＨＰＬＣシステム、Agilent Technologies社製）および質量分析計（Agilent G6530B Accurate-Mass Q TOF、Agilent Technologies社製）を用い、前記粗精製サンプルについて、下記エレクトロスプレーイオン化を含む液体クロマトグラフ質量分析法の条件で測定した。前記質量分析計の制御および質量データの収集は、付属のソフトウェア（MassHunter Workstation Software Qualitative Analysis Version B.06.00、Agilent Technologies社製）を用いた。また、コントロールは、１．０ｍｇ／ｍＬ  Ａ型イツリンおよび１．０ｍｇ／ｍＬ  サーファクチンを含むメタノール溶液を用いた以外は、同様にして、分析した。【００９２】
（エレクトロスプレーイオン化を含む液体クロマトグラフ質量分析法の条件）
（１）カラム：Ｍｏｎｏｂｉｓ  ＯＤＳカラム
（２）移動相：  溶媒  Ａ：０．２％酢酸（関東化学社製、カタログ番号：0
1021-00）水溶液
Ｂ：０．２％酢酸−メタノール（関東化学社製、カ
タログ番号：25185-76）
グラジエント条件：時間（溶媒比（Ａ：Ｂ））
０分：（Ａ：Ｂ＝９８：２）
１３分：（Ａ：Ｂ＝２：９８）
となるよう、０分から１３分にかけて直線的に溶
媒Ａの割合を減少、溶媒Ｂの割合を増加させ、６
分間、溶媒ＡおよびＢの割合を維持。
（３）流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
（４）モード：ＭＳ  Ｑ−ＴＯＦ、Ｄｕａｌ  ＡＪＳ  ＥＳＩイオン化、ポジティブイオンモード【００９３】
この結果を図７に示す。図７は、エレクトロスプレーイオン化を含む液体クロマトグラフ質量分析法の分析結果を示すグラフである。図７において、（Ａ）は、前記粗精製サンプルの結果を示し、（Ｂ）は、前記コントロールの結果を示し、横軸は、質量電荷比（ｍ／ｚ）を示し、縦軸は、相対強度（％）を示す。図７に示すように、前記粗精製サンプルでは、公知の抗菌物質であるＡ型イツリン、フェンジャイシンおよびサーファクチンのピークとは異なり、７３１および７３８（ｍ／ｚ）の質量電荷比にピークがあり、新規な抗菌物質のフラグメンテーションイオンであることが分かった。また、前記質量電荷比から、前記新規な抗菌物質のフラグメンテーションイオンの質量（分子量）は、それぞれ、１４６０および１４７４であることがわかった。これらの結果から、前記新規微生物が、エレクトロスプレーイオン化を含む液体クロマトグラフ質量分析法による質量分析において、前記新規な抗菌物質のフラグメンテーションイオンのピークとして質量が、１４６０および１４７４である新規な抗菌物質を産生していることが分かった。【００９４】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
以上のように、本発明によれば、例えば、イネに感染する真菌、細菌等の微生物に対して抗菌活性を示す、新規な抗菌物質、それを含む新規微生物、前記新規微生物の培養物等を含む新たな抗菌剤が提供できる。したがって、本発明は、農業分野、医療分野、環境分野等において極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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