(57)【要約】内因性GPC3ポリペプチドの発現を欠損し、かつ生理的に妥当なレベルでヒトGPC3ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物、当該非ヒト動物の作製方法、及び当該非ヒト動物を用いた被験物質の評価方法。さらに、当該非ヒト動物をモデルとして利用した、被験物質における、安全性、疾患の治療効果、薬物動態、体内分布などの評価方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性ＧＰＣ３ポリペプチドの発現を欠損し、ヒトＧＰＣ３ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項２】
生理的に妥当なレベルで前記ヒトＧＰＣ３ポリペプチドを発現する、請求項１の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項３】
トータルＲＮＡ中のヒトＧＰＣ３のｍＲＮＡのコピー数が、野生型非ヒト動物におけるトータルＲＮＡ中の該非ヒト動物ＧＰＣ３のｍＲＮＡのコピー数と同等である、請求項１または請求項２に記載の遺伝子改変非ヒト動物
【請求項４】
トータルＲＮＡ中の前記ヒトＧＰＣ３のｍＲＮＡのコピー数が、野生型サルにおけるトータルＲＮＡ中のサルＧＰＣ３のｍＲＮＡのコピー数、およびヒトにおけるトータルＲＮＡ中のヒトＧＰＣ３のｍＲＮＡのコピー数のいずれか、または両方、と同等である、請求項１から３のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項５】
ヒトＧＰＣ３ポリペプチドまたはその断片に対して免疫寛容を示す、請求項１から４のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項６】
前記非ヒト動物が非ヒト哺乳動物、好ましくはげっ歯類である、請求項１から５のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項７】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項１から６のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物から単離された組織または細胞。
【請求項９】
前記非ヒト動物が、ヒトＧＰＣ３ポリペプチドを発現するがん組織またはがん細胞を含む、請求項１から７のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１０】
がんの治療薬のスクリーニングに使用するための、請求項９に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１１】
５'側にエクソン・イントロン構造を含む塩基配列が付加され、かつ、３'側に非ヒト動物のＧＰＣ３遺伝子の３'非翻訳領域が付加されたヒトＧＰＣ３遺伝子をコードするＤＮＡを含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＤＮＡ構築物を保持するノックインベクター。
【請求項１３】
以下の工程；
（１）ヒトＧＰＣ３ポリペプチドに結合する抗原結合分子を、請求項１から７、９、および１０のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物に投与する工程
（２）前記被験物質を投与した遺伝子改変非ヒト動物における、がん細胞増殖抑制効果、安全性、薬物動態および生体内分布特性からなる群から選択される少なくとも１つの評価指標を測定する工程、および
（４）工程（３）で測定した評価指標が、対照の評価指標と比較して優れた抗原結合分子を選抜する工程、
を含む、がんの治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記抗原結合分子が抗体である、請求項１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載のスクリーニング方法により選抜された抗体のアミノ酸配列情報を取得し、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞に導入することを含む、抗体の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトGPC3ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物、及びヒトGPC3ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物を用いた化合物の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗体医薬など、分子標的に対する特異性の高い治療薬の開発が数多くなされており、その前臨床評価をより適切に行うためにヒト化マウスなどのヒト化非ヒト動物の要望が高まっている。ヒト化マウスを作成する手法としては、マウス遺伝子をヒト遺伝子に置換するジーンターゲッティング法がある。これまでに、ヒトのゲノム遺伝子をマウスホモログ遺伝子と置き換える方法が報告されているが、置き換えられたヒト遺伝子の発現量がマウスホモログ遺伝子の発現量と比べ低く、発現を制御する事が困難である（非特許文献1）。全長のヒト遺伝子のコード配列を標的のマウス遺伝子に挿入する場合には、転写されたmRNAにおいては、マウス遺伝子の終止コドンの遥かに上流に、挿入したヒト遺伝子の終止コドン（premature termination codon, PTC）が存在し、かつ、この終止コドンの下流にマウス遺伝子に由来するエクソン・エクソン結合部が存在するという構造となる。この構造が、ナンセンス変異依存mRNA分解機構（NMD機構）により認識されてmRNAが分解を受けるため、目的の遺伝子発現量が得られないことが多い。その対策として、例えば、任意の外来遺伝子をコードするDNAの3'側にhp7と呼ばれる配列を挿入する事により、NMD機構による当該外来遺伝子のmRNAの分解を回避し、マウスにおいて当該外来遺伝子を安定して発現される方法が報告されている（特許文献1）。Hp7の他に、NMDを回避する手段としては、任意の外来遺伝子のcDNA配列の直下にポリA付加シグナルを付加してマウスに挿入することが行われている。これにより、転写されるmRNAにおいて、PTCの下流に標的遺伝子由来のエクソン−エクソン結合部が生じない構造となるため、NMDは生じない。その他に、mRNAの安定性に関与するものとして3'非翻訳領域（3' untranslated region,3'UTR）やスプライシング機構が挙げられる。3'UTRに存在するポリA付加シグナルがmRNAの安定性に寄与する事（非特許文献2）やadenine/uridine-rich elements（非特許文献3）やGU-rich elements（非特許文献4）の存在がタンパクの翻訳調整に寄与している事が報告されている。また、イントロンが存在しない遺伝子、つまり、スプライスアウトを経験しないmRNAの発現量は低下することが報告されている（非特許文献5）。一方で、エクソン・イントロン構造を有していても、遺伝子の長さが数十キロベースと短い場合、そのゲノム領域と挿入したいゲノム領域を置換する事は可能である。しかし、遺伝子の長さが数百キロベースを超えている場合、その領域での置換は困難である（非特許文献5）。このように、非ヒト動物内因性の遺伝子発現を抑え、かつ生理的に妥当なレベルで外来遺伝子を発現させることができる非ヒト動物の作成として汎用性のある方法は存在していない。【０００３】
このような状況において、非ヒト動物の内因性GPC3ポリペプチドの発現を欠損し、かつ生理的に妥当なレベルでヒトGPC3ポリペプチドを発現させることができる非ヒト動物は未だ存在せず、またその作製方法もまた不明であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2011、Feb 8;108(6):2390-2395.
【非特許文献２】Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2008、40(11):2384-2396.
【非特許文献３】J. Cell. Biol. 2008. Apr 21;181(2):189-194.
【非特許文献４】RNA. Biol. 2008.Oct-Dec;5(4):201-207
【非特許文献５】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:836-840.
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO 2014042251 A1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記のような情況に鑑みてなされたものであり、ヒトGPC3ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物、当該遺伝子改変非ヒト動物の作製方法、及び当該遺伝子改変非ヒト動物を用いた種々の疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、非ヒト動物の内因性GPC3ポリペプチドの発現を欠損し、かつ生理的に妥当なレベルでヒトGPC3ポリペプチドを発現させることができる非ヒト動物を作製する方法について、鋭意研究を行った。その結果、驚くべきことに、エクソン・イントロン構造配列及び非ヒト動物の野生型GPC3遺伝子の3'非翻訳領域を用いることにより、生理的に妥当なレベルでヒトGPC3遺伝子を発現する非ヒト動物を作製することができた。【０００８】
また、本発明者らは、非ヒト動物の内因性GPC3ポリペプチドの発現を欠損し、かつ生理的に妥当なレベルでヒトGPC3ポリペプチドを発現させることができる非ヒト動物が、ヒトGPC3に対して免疫寛容を示すことを見出した。すなわち、当該非ヒト動物をモデルとして利用すれば、被験物質における、安全性、疾患の治療効果、薬物動態、体内分布などを正確かつ簡便に評価することが可能である。さらに、このような評価系を利用することにより、所望の活性を有する抗体などの開発を効率的に行うことが可能である。【０００９】
より具体的には、例えば、以下の発明が提供される。
［１］内因性ＧＰＣ３ポリペプチドの発現を欠損し、ヒトＧＰＣ３ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物。
［２］生理的に妥当なレベルで前記ヒトＧＰＣ３ポリペプチドを発現する、［１］の遺伝子改変非ヒト動物。
［３］トータルＲＮＡ中のヒトＧＰＣ３のｍＲＮＡのコピー数が、野生型非ヒト動物におけるトータルＲＮＡ中の該非ヒト動物ＧＰＣ３のｍＲＮＡのコピー数と同等である、［１］または［２］に記載の遺伝子改変非ヒト動物
［４］トータルＲＮＡ中の前記ヒトＧＰＣ３のｍＲＮＡのコピー数が、野生型サルにおけるトータルＲＮＡ中のサルＧＰＣ３のｍＲＮＡのコピー数、およびヒトにおけるトータルＲＮＡ中のヒトＧＰＣ３のｍＲＮＡのコピー数のいずれか、または両方、と同等である、［１］から［３］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［５］ヒトＧＰＣ３ポリペプチドまたはその断片に対して免疫寛容を示す、［１］から［４］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［６］前記非ヒト動物が非ヒト哺乳動物、好ましくはげっ歯類である、［１］から［５］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［７］前記非ヒト動物がマウスである、［１］から［６］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［８］［１］から［７］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物から単離された組織または細胞。
［９］前記非ヒト動物が、ヒトＧＰＣ３ポリペプチドを発現するがん組織またはがん細胞を含む、［１］から［７］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［１０］がんの治療薬のスクリーニングに使用するための、［９］に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［１１］５'側にエクソン・イントロン構造を含む塩基配列が付加され、かつ、３'側に非ヒト動物のＧＰＣ３遺伝子の３'非翻訳領域が付加されたヒトＧＰＣ３遺伝子をコードするＤＮＡを含む、ＤＮＡ構築物。
［１２］［１１］に記載のＤＮＡ構築物を保持するノックインベクター。
［１３］以下の工程； （１）ヒトＧＰＣ３ポリペプチドに結合する抗原結合分子を、［１］から［７］、［９］、［１０］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物に投与する工程 （２）前記被験物質を投与した遺伝子改変非ヒト動物における、がん細胞増殖抑制効果、安全性、薬物動態および生体内分布特性からなる群から選択される少なくとも１つの評価指標を測定する工程、および （４）工程（３）で測定した評価指標が、対照の評価指標と比較して優れた抗原結合分子を選抜する工程、 を含む、がんの治療薬のスクリーニング方法。
［１４］前記抗原結合分子が抗体である、［１３］に記載のスクリーニング方法。
［１５］［１３］または［１４］に記載のスクリーニング方法により選抜された抗体のアミノ酸配列情報を取得し、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞に導入することを含む、抗体の生産方法。【００１０】
［１６］前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞である、［１５］に記載の方法。
また、例えば、以下の発明が提供される。
［１７］非ヒト動物の内因性ＧＰＣ３遺伝子の同一読み取り枠に挿入された、５'側にエクソン・イントロン構造を含む塩基配列が付加され、かつ、３'側に該非ヒト動物のＧＰＣ３遺伝子の３'非翻訳領域が付加されたヒトＧＰＣ３遺伝子をコードするＤＮＡを、含む、遺伝子改変非ヒト動物。
［１８］前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、［１７］に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［１９］前記エクソン・イントロン構造を含む塩基配列が、ベータグロビンの第２エクソン配列、同イントロン配列および同第３エクソン配列を含む配列である、［１７］または［１８］に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［２０］前記ベータグロビンが前記非ヒト動物のベータグロビンである、［１７］から［１９］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［２１］前記非ヒト動物のＧＰＣ３遺伝子の３'非翻訳領域が、ポリＡ付加シグナル配列を含む領域である、［１７］から［２０］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［２２］ヒトＧＰＣ３ポリペプチドまたはその断片に対して免疫寛容を示す、［１７］から［２１］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［２３］前記非ヒト動物が非ヒト哺乳動物、好ましくはげっ歯類である、［１７］から［２２］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［２４］前記非ヒト動物がマウスである、［１７］から［２３］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［２５］［１７］から［２４］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物から単離された組織または細胞。
［２６］前記非ヒト動物が、ヒトＧＰＣ３ポリペプチドを発現するがん組織またはがん細胞を含む、［１７］から［２４］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［２７］がんの治療薬をスクリーニングするための、［２６］に記載の遺伝子改変非ヒト動物。【００１１】
また、例えば、以下の発明が提供される。
［２８］５'側にエクソン・イントロン構造を含む塩基配列が付加され、かつ、３'側に非ヒト動物のＧＰＣ３遺伝子の３'非翻訳領域が付加されたヒトＧＰＣ３遺伝子をコードするＤＮＡを含む、ＤＮＡ構築物。
［２９］前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、［２８］に記載のＤＮＡ構築物。
［３０］前記エクソン・イントロン構造を含む塩基配列が、ベータグロビンの第２エクソン配列、同イントロン配列および同第３エクソン配列を含む配列である、［２８］または［２９］に記載のＤＮＡ構築物。
［３１］前記ベータグロビンがマウスベータグロビンである、［２８］から［３０］のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物。
［３２］前記非ヒト動物のＧＰＣ３遺伝子の３'非翻訳領域が、ポリＡ付加シグナル配列を含む領域である、［２８］から［３１］のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物。
［３３］組換え酵素基質配列、薬剤選択マーカー、および／またはその他の配列をさらに含む、［２８］から［３２］のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物。
［３４］［２８］から［３３］のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物を保持するノックインベクター。
［３５］前記ＤＮＡ構築物の５'側に非ヒト動物のＧＰＣ３遺伝子の標的領域の５'側上流領域と相同な塩基配列、前記ＤＮＡ構築物の３'側に非ヒト動物のＧＰＣ３遺伝子の標的領域の３'側下流領域と相同な塩基配列を含むことを特徴とする、［３４］に記載のノックインベクター。
［３６］［３５］に記載のノックインベクターが導入された、非ヒト動物細胞。
［３７］前記細胞が、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、生殖系列幹細胞、または受精卵である、［３６］に記載の非ヒト動物細胞。【００１２】
また、例えば、以下の発明が提供される。
［３８］以下の工程； （１）ヒトＧＰＣ３ポリペプチドを発現するがん組織またはがん細胞を含む、［１］から［７］、［９］、［１０］、［１７］から［２４］、［２６］、［２７］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物に、被験物質を投与する工程、 （２）該被験物質を投与した遺伝子改変非ヒト動物におけるがん細胞増殖抑制効果を測定する工程、および （３）（２）で測定したがん細胞増殖抑制効果が、対照と比較して有意に大きかった被験物質を選択する工程 を含む、被験物質におけるがんの治療効果を評価する方法。
［３９］以下の工程； （１）［１］から［７］、［９］、［１０］、［１７］から［２４］、［２６］、［２７］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物に被験物質を投与する工程、 （２）該被験物質を投与した遺伝子改変非ヒト動物におけるサイトカインの放出を測定する工程、および （３）工程（２）で測定したサイトカインレベルを、対照のサイトカインレベルと比較し、サイトカインレベルの変化によって生じる安全性リスクが示される工程 を含む、被験物質の安全性を評価する方法。
［４０］前記非ヒト動物が、ヒトＧＰＣ３ポリペプチドを発現するがん組織またはがん細胞を含む、［３９］に記載の方法。
［４１］以下の工程； （１）［１］から［７］、［９］、［１０］、［１７］から［２４］、［２６］、［２７］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物に被験物質を投与する工程、および （２）該被験物質を投与した遺伝子改変非ヒト動物における、該被験物質の血中濃度の経時的な変化を測定する工程、 を含む、被験物質の薬物動態特性を評価する方法。
［４２］前記非ヒト動物が、ヒトＧＰＣ３ポリペプチドを発現するがん組織またはがん細胞を含む、［４１］に記載の方法。
［４３］以下の工程； （１）［１］から［７］、［９］、［１０］、［１７］から［２４］、［２６］、［２７］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物に被験物質を投与する工程、 （２）該被験物質を投与した遺伝子改変非ヒト動物における、被験物質の体内分布を測定する工程、および （３）被験物質の局在によって被験物質の生体内分布特性が示される工程 を含む、被験物質の生体内分布特性を評価する方法。
［４４］前記非ヒト動物が、ヒトＧＰＣ３ポリペプチドを発現するがん組織またはがん細胞を含む、［４３］に記載の方法。
［４５］前記被験物質が、ヒトＧＰＣ３ポリペプチドに結合する抗原結合分子である、［３８］から［４４］のいずれか１つに記載の方法。
［４６］前記抗原結合分子が抗体である、［４５］に記載の方法。【００１３】
また、例えば、以下の発明が提供される。
［４７］内因性のCD3ε、CD3δ及びCD3γからなる群より選ばれる少なくとも1種以上のCD3遺伝子がゲノム上で機能的に欠損し、ヒトCD3ε、CD3δ及びCD3γからなる群より選ばれる少なくとも1種以上のヒトCD3遺伝子を機能的に発現する、［１］から［１０］、［１７］から［２４］、［２６］及び［２７］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［４８］ヒトCD3ε、CD3δ及びCD3γからなるヒトCD3遺伝子を機能的に発現する、［４７］に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［４９］ヒトCD3ε、CD3δ及びCD3γからなる群より選ばれる少なくとも1種以上のヒトCD3遺伝子の全長塩基配列がゲノム上に挿入されている、［４７］または［４８］に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［５０］前記非ヒト動物が有するT細胞は、その細胞膜上で非ヒト動物由来のT細胞受容体とヒトCD3分子が複合体を形成することを特徴とする、［４７］から［４９］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［５１］ヒト免疫チェックポイント遺伝子、ヒト癌特異的抗原遺伝子、及び／又はヒト免疫共刺激分子の遺伝子をさらに発現する、［４７］から［５０］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［５２］前記非ヒト動物が非ヒトほ乳動物である、［４７］から［５１］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［５３］前記非ヒトほ乳動物がマウスである、［５２］に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［５４］悪性腫瘍性疾患又は自己免疫疾患の治療薬をスクリーニングするための、［４７］から［５３］のいずれか１つに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［５５］前記非ヒト動物に癌細胞が移植されていることを特徴とする、悪性腫瘍性疾患の治療薬をスクリーニングするための、［５４］に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［５６］前記癌細胞が肺癌、胃癌、肝癌、食道癌又は卵巣癌由来の細胞である、［５５］に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
［５７］以下の工程（１）〜（２）：
（１）  ［４７］から［５６］のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物、その臓器、組織または細胞と被験物質を接触させる工程、及び
（２）  該遺伝子改変非ヒト動物個体、その臓器、組織または細胞に対する被験物質の薬効及び／又は毒性を指標として、候補被験物質を選択する工程、
を含む、悪性腫瘍性疾患又は自己免疫疾患の治療薬のスクリーニング方法。
［５８］以下の工程（１）〜（３）：
（１）ヒトCD3結合ドメイン及び癌特異的抗原結合ドメインを含む抗原結合分子のライブラリーのうち１つを被験物質として、［４７］から［５７］のいずれかに記載の第1の遺伝子改変非ヒト動物に投与する工程、
（２）該癌特異的抗原を発現する細胞に対する該被験物質の細胞増殖抑制効果及び／又は薬物動態学的特性を測定する工程、及び
（３）該被験物質の細胞増殖抑制効果及び／又は薬物動態学的特性を、該第１の非ヒト動物とは異なる第2の遺伝子改変非ヒト動物に投与された対照抗体の細胞増殖抑制効果及び／又は薬物動態学的特性と比較する工程、
を含む、悪性腫瘍性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
［５９］以下の工程（１）〜（３）：
（１）内因性GPC3ポリペプチドの発現を欠損し、ヒトGPC3ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物を作製する工程、
（２）内因性のCD3ε、CD3δ及びCD3γからなる群より選ばれる少なくとも1種以上のCD3遺伝子がゲノム上で機能的に欠損し、ヒトCD3ε、CD3δ及びCD3γからなる群より選ばれる少なくとも1種以上のヒトCD3遺伝子を機能的に発現する遺伝子改変非ヒト動物を作製する工程、
（３）該ヒトGPC3ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物と該ヒトCD3遺伝子を機能的に発現する遺伝子改変非ヒト動物を交配する工程、
を含む、ヒトGPC3ポリペプチドを発現し、かつヒトCD3遺伝子を機能的に発現する非ヒト動物の作製方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】マウスグリピカン−３（mGPC3）遺伝子のゲノムDNAの構造（１）と、挿入されるノックインベクターver.1（２）、ver.2（３）、ver.3（４）との関係を模式的に示す図である。ノックインベクターver.1（２）は、ヒトグリピカン−３（hGPC3）cDNA、hp7配列、ポリA付加シグナル（pA）、および組換え酵素Creの基質配列であるloPに挟まれたネオマイシン耐性遺伝子（neo）を有する。Creを作用させる事で、loxP間同士の部位特異的な組換えが起こり、loxPに挟まれたネオマイシン耐性遺伝子が除去される。ノックインベクターver.2（３）はmGpc3遺伝子の標的領域の5'側上流領域約800塩基、マウスのベータグロビンの第2エクソン、イントロン、第3エクソン、hGPC3 cDNA、マウスベータグロビンの第3エクソン中のpolyA付加シグナル、loxP配列、neo遺伝子、mGpc3遺伝子の標的領域の3'側下流領域約800塩基を有する。ノックインベクターver.3（４）は、ノックインベクターver.2（３）のマウスベータグロビンの第3エクソン中のpolyA付加シグナルをmGpc3遺伝子の3'非翻訳領域に変えたものである。図1におけるaはマウスベータグロビンの第2エクソン、bはマウスベータグロビンの第2イントロン、cはマウスベータグロビンの第3エクソンおよびdはpolyA付加シグナルを含むマウスベータグロビンの第3エクソンを示している。
【図２】mGpc3遺伝子のゲノムDNA（ａ）にノックインベクターver.1（ｂ）が相同組換えを起こして、挿入される過程（ｃ）を示したものである。その後、組換え酵素CreによりloxPに挟まれたネオマイシン耐性遺伝子（neo）を除去する事でhGPC3ノックインアレル（ｄ）を完成させる過程を示す。ノックインベクターver.2も同様の過程でneoが除去される。
【図３】hGPC3ノックインベクターver.1およびhGPC3ノックインベクターver.2の相同組換えES細胞のスクリーニングを行ったPCRの代表例［hGPC3ノックインベクターver.1（ａ）、hGPC3ノックインベクターver.2（ｂ）］、およびhGPC3ノックインベクターver.3遺伝子を含むファウンダーマウスの検出を行ったPCRの代表例（ｃ）を示す。
【図４】hGPC3ノックインマウスver.1およびhGPC3ノックインマウスver.2のneo遺伝子カセットの除去の検出を行ったPCRの代表例［hGPC3ノックインマウスver.1（ａ）、hGPC3ノックインマウスver.2（ｂ）］を示す。
【図５】hGPC3ノックインマウスver.1、hGPC3ノックインマウスver.2およびhGPC3ノックインマウスver.3のホモ接合体およびヘミ接合体を検出したPCRの代表例［hGPC3ノックインマウスver.1（ａ）、hGPC3ノックインマウスver.2（ｂ）、hGPC3ノックインマウスver.3（ｃ）］を示す。hGPC3KI/hGPC3KI、hGPC3KI/-、hGPC3KI/+および+/+は、それぞれホモ型ノックインマウス、ヘミ型ノックインマウス、ヘテロ型ノックインマウスおよび野生型を示す。
【図６】抗ヒトGPC3抗体を用いた時の、hGPC3ノックインマウスver.1および野生型マウスの肺におけるウェスタンブロットの結果を示す図である。ライセート濃度は、各レーンにアプライされた肺ライセートの総タンパク重量である。
【図７】抗ヒトGPC3抗体を用いた時のhGPC3ノックインマウスver.2、hGPC3ノックインマウスver.3および野生型マウスの肺におけるウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図８】hGPC3ノックインマウスver.2、ver.3、野生型マウスおよびカニクイザルの肺におけるGPC3 mRNAの発現量を示したグラフである。（ａ）Universal Probe#46を使用した時の、hGPC3ノックインマウスver.2、ver.3およびカニクイザルの結果を示した図である。（ｂ）Universal Probe#28を使用した時の、野生型マウス、ver.2およびver.3の結果を示した図である。
【図９】hGPC3ノックインマウスver.3およびヒトの肺におけるGPC3 mRNAの発現量を示したグラフである。
【図１０】ヒトGPC3タンパクの投与をday0,14,21,28,35,42,49に実施した時の野生型マウスおよびhGPC3ノックインマウスver.3の血漿中における抗ヒトGPC3抗体の濃度を示す図である。
【図１１】hGPC3ノックインマウスver.3における、hGPC3_mCD3抗体のLLC1/hGPC3移植モデルでの抗腫瘍効果を示す図である。
【図１２】hGPC3_mCD3抗体の投与後2時間後、1日後および7日後の、hGPC3ノックインマウスver.1およびhGPC3ノックインマウスver.3の血漿中におけるhGPC3_mCD3抗体濃度の推移を示す図である。
【図１３】hGPC3_mCD3抗体の投与後、野生型マウス、hGPC3ノックインマウスver.1およびhGPC3ノックインマウスver.3の血漿中におけるIFN-gamma、IL-10、IL-17およびIL-2の濃度の経時的推移を示す図である。
【図１４】hGPC3_mCD3抗体の投与後、野生型マウス、hGPC3ノックインマウスver.1およびhGPC3ノックインマウスver.3の血漿中におけるIL-4、IL-6およびTNFの濃度の経時的推移を示す図である。
【図１５Ａ】マウスＣｄ３ε、Ｃｄ３δおよびＣｄ３γ遺伝子を含むゲノムＤＮＡの構造（１）と、当該遺伝子領域の全域を含むバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）クローンを改変することにより構築したマウスＣｄ３遺伝子改変ベクター（２）、上述のベクターによってｌｏｘＰ配列およびＲｏｘ配列を標的位置に挿入したゲノムＤＮＡの構造（３）、さらに組換え酵素ＣｒｅおよびＤｒｅの作用によるＣｄ３ε、Ｃｄ３δおよびＣｄ３γ遺伝子の欠損アレルの構造（４）を示すものである。
【図１５Ｂ】ヒトＣＤ３ε、ＣＤ３δおよびＣＤ３γ遺伝子を含むＢＡＣクローン（a）、およびそのＢＡＣクローンを改変するための５’改変カセット（ｂ）および３’改変カセット（ｃ）、および、それらを用いた改変により構築したヒトＣＤ３遺伝子領域導入ベクター（ｄ）の構造を示す。
【図１６】マウスＣｄ３遺伝子改変ＥＳ細胞の樹立のための解析したＰＣＲの代表例を示す。
【図１７Ａ】マウスＣｄ３遺伝子改変ＥＳ細胞に、Ｃｒｅ発現ベクターおよびＤｒｅ発現ベクターとともに、ヒトＣＤ３遺伝子領域導入ベクターを導入し、得られたＥＳ細胞クローンの遺伝子型を解析したＰＣＲの代表例を示す。図１７ＡはマウスＣｄ３遺伝子領域の欠損を検出するＰＣＲ結果の代表例を示す。
【図１７Ｂ】ヒトＣＤ３遺伝子領域の導入を検出するＰＣＲ結果の代表例を示す。
【図１８】樹立した各ラインのヒトＣＤ３遺伝子置換マウス、Ｃｄ３遺伝子欠損マウス、野生型およびヒトＣＤ３ε遺伝子導入マウスから採取した胸腺の代表的なマクロ写真である。各遺伝子型とも１２−１３週齢の雄より摘出した胸腺である。
【図１９】樹立した各ラインのヒトＣＤ３遺伝子置換マウス、Ｃｄ３遺伝子欠損マウス、野生型およびヒトＣＤ３ε遺伝子導入マウスから採取した脾臓および胸腺の組織重量を測定した結果を示している。体重あたりの組織重量比を算出し、個体毎に得られた値を黒点にてプロット、平均値をカラムにて表す。
【図２０】樹立した各ラインのヒトＣＤ３遺伝子置換マウス、Ｃｄ３遺伝子欠損マウス、野生型マウスおよびヒトＣＤ３ε遺伝子導入（ｈＣＤ３ε  Ｔｇ）マウスにおける各ヒトＣＤ３分子および各マウスＣｄ３の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲによって検討した結果を示す。樹立したヒトＣＤ３遺伝子置換マウスのラインのうちライン番号１Ｃ３および８Ｉ１２においてｈＣＤ３ε、ｈＣＤ３δおよびｈＣＤ３γに特異的なシグナルが検出された。ライン番号３Ｂ１および２Ａ４には検出されなかった。
【図２１】樹立した各ラインのヒトＣＤ３遺伝子置換マウス（１Ｃ３、８Ｉ１２および４ＨＨ３）の胸腺（Ａ）および脾臓（Ｂ）について実施したＣＤ３の組織免疫染色の代表例を示す。いずれの組織においても、野生型マウスと同様にＴ細胞ゾーンにのみ染色が認められた。また、Ｃｄ３遺伝子欠損マウスでは染色が認められておらず、ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスにおける染色は導入したヒトＣＤ３遺伝子の発現によるものであることが示された。
【図２２】樹立した各ラインのヒトＣＤ３置換マウスの脾臓における成熟Ｔ細胞の存在比率をＦＡＣＳにて解析した代表的な結果を示す。
【図２３】ヒトＣＤ３遺伝子置換マウス（１Ｃ３）、Ｃｄ３遺伝子欠損マウスと野生型マウスの脾臓細胞のマイトジェン刺激における細胞増殖活性を示す。樹立したヒトＣＤ３遺伝子置換マウス（１Ｃ３）は野生型の９０%の細胞増殖活性があることが示された。
【図２４】ヒトＣＤ３遺伝子置換マウス（１Ｃ３）、Ｃｄ３遺伝子欠損マウスと野生型マウスの脾臓細胞のマイトジェン刺激におけるサイトカイン産生を示す。樹立したヒトＣＤ３遺伝子置換マウス（１Ｃ３）は、Ｃｄ３遺伝子欠損マウスにおいて機能欠失したサイトカイン産生能を回復できていることが示された。
【図２５Ａ】図２５Ａ〜Ｄは、ヒトＣＤ３遺伝子置換マウス（１Ｃ３）、Ｃｄ３遺伝子欠損マウスと野生型マウスの脾臓細胞の抗ＣＤ３抗体刺激における細胞増殖活性（図１１Ａ、Ｂ）、およびサイトカイン産生（図１１Ｃ、Ｄ）を示す。樹立したヒトＣＤ３遺伝子置換マウス（１Ｃ３）は、抗ヒトＣＤ３抗体の刺激に特異的に反応し、細胞増殖活性、およびサイトカイン産生が示された。
【図２５Ｂ】図２５Ａ欄の説明を参照。
【図２５Ｃ】図２５Ａ欄の説明を参照。
【図２５Ｄ】図２５Ａ欄の説明を参照。
【図２６】樹立した各ラインのヒトＣＤ３置換マウスへのニワトリ卵白アルブミン（Ｏｖｏａｌｂｕｍｉｎ，ＯＶＡ）を免疫した際のＯＶＡ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＥの血清中濃度を測定した結果を示す。個体毎のＯＶＡ特異的な血清中ＩｇＧ１およびＩｇＥ濃度を棒グラフで示す。棒グラフの下の数字は個体番号を示す。
【図２７】Hepa1-6/HER2細胞を移植したhCD3トランスジェニックマウスモデルにおける、HER2_CD3抗体を投与した際の腫瘍体積の変化を示す。矢印は抗体投与を示す（*: P<0.05 (t-test)）。
【図２８】Hepa1-6/hGPC3細胞を移植したhCD3トランスジェニックマウスモデルにおける、抗マウスCTLA-4抗体、抗マウスPD-1抗体、抗マウスPD-L1抗体を投与した際の腫瘍体積の変化を示す。矢印は抗体投与を示す。
【図２９】Colon38細胞株を移植したマウスモデルにおける、MDX10//TR01H113、もしくはControlとしてのバッファーを投与した際の腫瘍体積の変化を示す（図中、それぞれ「MDX10//TRO01H1333」および「ベヒクル」）。各点は一群 n=5 の腫瘍体積の平均値を示す。最終計測点で平均値を比較したところ、MDX10//TR01H113投与群とバッファー投与群の2群間には有意な差が認められた（p=0.0021、Studentのt検定）。
【図３０】Hepa1-6/hGPC3細胞を移植したヒトGPC3ノックイン・ヒトCD3遺伝子置換マウスモデルにおける、hGPC3_hCD3抗体を投与した際の腫瘍体積の変化を示す。矢印は抗体投与を示す。*: P<0.05 (Steel検定、JMPソフトウェア、SAS institute inc.)
【図３１】Hepa1-6/hGPC3細胞を移植したヒトGPC3ノックイン・ヒトCD3遺伝子置換マウスモデルにおける、hGPC3_hCD3抗体投与前日、投与後6h, 24 h、二回目投与後 6hの血漿中サイトカイン濃度の推移を示す。破線は検出限界を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．定義
その他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当技術分野の当業者らによって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものに類似するまたはそれと等価であるいかなる方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができるが、ここでは、特定の方法および材料が記載される。本明細書において言及される刊行物はすべて、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる。
【００１６】
本明細書においては、「1の」又は「複数の」といった数量を意味する限定を記載して用語の説明をしていない限り、本明細書に記載されている用語は、特に数量が限定されたものとしては解釈されず、「1又は複数の」という意味を有する用語であるものと理解される。
【００１７】
「保存的置換」とは、アミノ酸のそれらの側鎖および化学的性質で関連性のあるアミノ酸ファミリー内で起こるものである。例えば、アミノ酸は、共通の側鎖特性によって群に分けることができる：
(1) 疎水性：ノルロイシン、メチオニン (Met)、アラニン (Ala)、バリン (Val)、ロイシン (Leu)、イソロイシン (Ile)；
(2) 中性の親水性：システイン (Cys)、セリン (Ser)、トレオニン (Thr)、アスパラギン (Asn)、グルタミン (Gln)；
(3) 酸性：アスパラギン酸 (Asp)、グルタミン酸 (Glu)；
(4) 塩基性：ヒスチジン (His)、リジン (Lys)、アルギニン (Arg)；
(5) 鎖配向に影響する残基：グリシン (Gly)、プロリン (Pro)；
(6) 芳香族性：トリプトファン (Trp)、チロシン (Tyr)、フェニルアラニン (Phe)。
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを、別のクラスのものに交換することをいう。非限定の一態様において、本発明は、本明細書中に記載したアミノ酸配列に保存的アミノ酸置換を含むヒトGPC3ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物を含む。
【００１８】
「標的遺伝子」とは、外来性の遺伝子を挿入する対象となる非ヒト動物の内因性の遺伝子を含む。「標的領域」とは、外来性の遺伝子を挿入する対象となる非ヒト動物の内因性の遺伝子の特定の領域を含む。非限定の一態様において、標的領域とは、挿入された外来性の遺伝子の5'側及び3'側に接する内因性の遺伝子を含む領域をいう。別の一態様において、標的領域とは、外来性の伝子の挿入により発現が欠損する内因性の遺伝子の領域をいう。
【００１９】
「内因性」とは、生物、組織または細胞内等に自然に由来する物質を含む。例えば、内因性の核酸又はペプチドは、細胞中にあり、組換え操作技術を用いて細胞に導入されたものではない核酸またはペプチドをいう。
【００２０】
「外来性」とは、当該生物、組織または細胞以外の、他の生物、組織または細胞等に由来する物質を含む。例えば、「外来遺伝子」は、本発明の非ヒト動物に導入する遺伝子を含む。本発明における外来遺伝子は、由来する生物種を限定することなく使用することができるが、好ましくはヒト遺伝子である。また、外来遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（GFP）、β-ガラクトシダーゼなどのレポータ遺伝子、薬剤（ネオマイシン等）耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子を使用することも可能である。外来遺伝子としては、2以上の遺伝子の組み合わせを使用することも可能である。また、外来遺伝子には、該遺伝子の発現を調節するエンハンサーなどが付加されていてもよい。外来遺伝子の形態は特に限定されず、例えば、cDNAであっても、ゲノムDNAであってもよい。
【００２１】
「単離された」とは、そのもともとの環境の成分から分離されていることをいう。
【００２２】
「機能的に連結された」とは、各遺伝子が目的とする機能を発揮することが可能な状態で連結している状態を含む。例えば、タンパク質をコードする核酸配列は、制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結して、適切な転写調節を保持することができるが、そのように機能する限り、プロモーターは配列に連続している必要はない。ここで、「機能的に連結」の語は、「作動可能に連結」の語と交換可能に使用されてもよい。
【００２３】
「ベクター」としては、バクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、または人工染色体由来の、遺伝子操作されたプラスミドまたはウイルスが例示されるが、これらに限定されない。
【００２４】
「非ヒト動物」とは、ヒト以外の動物であれば特に制限されず、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、サルが挙げられる。非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物であり、げっ歯類に分類される動物であり、更に好ましくはマウスである。好ましいマウスの例としては、C57/BL/6、 ICR、 BALB/cが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
「野生型」とは、自然界においてみられる通常の構造及び／又は活性を有していることを含む。野生型の核酸又はペプチドには、対立遺伝子変異等の複数の異なる形態及び多型が含まれる。また、「野生型」非ヒト動物は、場合によって、GPC3遺伝子に関して野生型である動物、すなわち、GPC3に関して遺伝的に操作されていない動物を含む。
【００２６】
本明細書において、用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
【００２７】
「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および、抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００２８】
本明細書において、「がん(cancer)」、「癌(carcinoma)」「腫瘍(tumor)」「新生物(neoplasm)」等の用語は互いに区別されず、相互に交換可能であり、一般的に表現される「がんcancer」を意味するものとする。
【００２９】
２．グリピカン3（GPC3）
グリピカン3（Glypican 3; GPC3）は、細胞表面上に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンのファミリーの1つであり、発生における細胞分裂や、がん細胞の増殖に関与している可能性があることが示唆されているが、その機能はまだよく解明されていない。非限定の一態様において、GPC3のポリペプチド配列の例としては、配列番号：１（ヒト、NCBI RefSeq: NP_004475.1）、配列番号：２（サル、NCBI RefSeq: XP_005594665.1）、配列番号：３（マウス、NCBI RefSeq: NP_057906.2）、DNA配列としては配列番号：４（ヒト、NCBI RefSeq: NM_004484.3）、配列番号：５（サル、NCBI RefSeq: XM_005594608.2）、配列番号：６（マウス、NCBI RefSeq: NM_016697.3）が挙げられる。非限定の一態様において、グリピカン3（GPC3）またはGPC3ポリペプチドは、全長GPC3ポリペプチドおよびその断片を含み、アミノ酸変異を含んでいてもよい。
【００３０】
非限定の一態様において、「GPC3遺伝子」は、GPC3ポリペプチドをコードする遺伝子であれば特に限定されず、ゲノムDNAであってもcDNAであってもよい。また、GPC3遺伝子は、その多型又は変異体を含む。
【００３１】
３．ヒトGPC3ポリペプチドを発現する非ヒト動物
非限定の一態様において、本発明は、ヒトGPC3遺伝子をコードするDNAを含み、ヒトGPC3ポリペプチドを発現する非ヒト動物を提供する。別の一態様において、本発明の非ヒト動物は、ヒトGPC3遺伝子をコードするDNAを、非ヒト動物のゲノム上に存在する内因性GPC3遺伝子の同一読み取り枠に挿入したことを特徴とする非ヒト動物を含む。なお、上記ヒトGPC3遺伝子をコードするDNAは、ゲノムDNAであってもcDNAであってもよい。好ましくはcDNA、より具体的にはアミノ酸配列コード領域(CDS)を含むcDNAを挙げることができる。アミノ酸配列コード領域には、シグナル配列も含まれる。
【００３２】
非限定の一態様において、「同一読み取り枠」とはmRNAがタンパク質に翻訳される際に読み取られる3塩基毎の塩基配列の単位を意味する。「同一読み取り枠に挿入」とは、非ヒト動物の内因性GPC3遺伝子の開始コドンATGとヒトGPC3遺伝子の開始コドンATGとが一致するように、ヒトGPC3遺伝子を挿入することを含む。また、ヒトGPC3遺伝子の開始コドンATGの５'側にエクソン・イントロン構造配列が付加され、非ヒト動物の内因性GPC3遺伝子の開始コドンATGと、該エクソン・イントロン構造の５'側末端とが一致するように、ヒトGPC3遺伝子を挿入する場合も、「同一読み取り枠に挿入」することに含まれる。
【００３３】
これにより、非ヒト動物における内因性GPC3遺伝子のプロモーターと挿入したヒトGPC3遺伝子とが作動可能に連結し、当該プロモーターの活性化に応答してヒトGPC3遺伝子が発現するようになる。このような構成を採用した場合には、外来性のヒトGPC3が内因性のGPC3発現制御システムの下で発現するため、内因性のGPC3と同じようなタイミングや場所（組織）でヒトGPC3が発現するように制御できる。GPC3は、発生への関与も予想されている遺伝子である。したがって、上記構成を採用することによって、非ヒト動物の生存や発生における遺伝子改変の影響を小さくする作用が期待できる。
【００３４】
別の一態様において、ヒトGPC3遺伝子の挿入の際には、破壊した内因性GPC3遺伝子が元来の読み枠にて再び翻訳される可能性をなくす観点から、内因性GPC3遺伝子のATG以降の配列について、3の倍数ではない塩基数の配列を欠損させることが好ましい。また、本発明においてヒトGPC3遺伝子は、内因性GPC3遺伝子の本来の翻訳開始点が存在するエクソンのみに挿入されている（すなわち、内因性GPC3遺伝子の標的エクソンのみと相同組換えが生じている）ことが好ましい。
【００３５】
非限定の一態様において、本発明の非ヒト動物が保有するヒトGPC3遺伝子は、配列番号：４と、少なくとも50%、60%、70%、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、さらに好ましくは90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上相同である、ヒトGPC3遺伝子を含む。別の一態様において、当該ヒトGPC3遺伝子は、その多型又は変異体を含む。別の一態様において、当該ヒトGPC3遺伝子は、アミノ酸の挿入、欠失又は保存的アミノ酸置換がなされたヒトGPC3ポリペプチドをコードする遺伝子でもよい。
【００３６】
非限定の一態様において、本発明の非ヒト動物が発現するヒトGPC3ポリペプチドは、配列番号：１と、少なくとも50%、60%、70%、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、さらに好ましくは90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上相同である、ヒトGPC3ポリペプチドを含む。別の一態様において、当該ヒトGPC3遺伝子は、その多型又は変異体を含む。別の一態様において、当該ヒトGPC3ポリペプチドは、アミノ酸の挿入、欠失又は保存的アミノ酸置換がなされていてもよい。本発明において、塩基配列やアミノ酸配列の相同性は、公知のアルゴリズムで決定することができる。複数の配列間の相同性を求めるアルゴリズムが公知である。配列情報の相同性(homology)は、塩基配列間の比較において同義コドンを考慮したり、あるいはアミノ酸配列間の比較において異なるアミノ酸残基の共通性を考慮して決定する場合と、これらの要素を考慮せず純粋に配列情報の比較に基づいて決定する場合がある。後者の比較結果は、好ましくは同一性(identity)で表すことができる。
【００３７】
非限定の一態様において、本発明の非ヒト動物は、当該非ヒト動物の内因性GPC3ポリペプチドの発現を欠損し、かつ生理的に妥当なレベルでヒトGPC3ポリペプチドを発現することができる。本発明の非ヒト動物に挿入されたヒトGPC3遺伝子（mRNAを含む）または当該遺伝子から発現するヒトGPC3ポリペプチドは、当業者に周知の様々な方法、例えば、PCR、サザンブロット、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphis）法、ウェスタンブロット、IHC、ELISA、等により検出することができる。
【００３８】
非限定の一態様において、例えば、「内因性GPC3ポリペプチドの発現を欠損」するとは、非ヒト動物における内因性のGPC3ポリペプチドが発現しない限り、特にその態様は限定されない。具体的には、例えば、相同組み換え技術やクリスパー・キャス（CRISPR/Cas9）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ (Zinc Finger Nucleases)、あるいはテイレン (TALEN) 等のゲノム編集技術によるノックアウト技術を用いて、非ヒト動物のゲノム上で、内因性のGPC3遺伝子を欠損（無効化）させてもよいし、siRNA等を用いて内因性のGPC3遺伝子の発現を完全に抑制させる手法を用いてもよい。また、内因性のGPC3ポリペプチドが発現しない限り、例えば、ノックイン技術を用いて、非ヒト動物ゲノム上のGPC3遺伝子の位置に外来遺伝子を挿入してもよい。
【００３９】
非限定の一態様において、「生理的に妥当なレベルでヒトGPC3ポリペプチドを発現」するとは、例えば、非ヒト動物におけるヒトGPC3ポリペプチド又はヒトGPC3 mRNAの発現量が、次の(i)-(iii)からなる発現量から選択されるいずれかの発現量と同等であることを含む：
(i) 野生型マウスにおけるマウスGPC3ポリペプチド又はマウスGPC3 mRNAの発現量、
(ii) 野生型サルにおけるサルGPC3ポリペプチド又はサルGPC3 mRNAの発現量、及び、
(iii) ヒトにおけるヒトGPC3ポリペプチド又はヒトGPC3 mRNAの発現量。
また、例えば、非ヒト動物の1つ又は複数の臓器におけるヒトGPC3ポリペプチド又はヒトGPC3 mRNAの発現量が、次の(i)-(iii)からなる発現量から選択されるいずれかの発現量と同等であることを含む：
(i) 野生型マウスの当該臓器におけるマウスGPC3ポリペプチド又はマウスGPC3 mRNAの発現量、
(ii) 野生型サルの当該臓器におけるサルGPC3ポリペプチド又はサルGPC3 mRNAの発現量、及び
(iii)ヒトの当該臓器におけるヒトGPC3ポリペプチド又はヒトGPC3 mRNAの発現量。
好ましくは、本発明の非ヒト動物の1つ又は複数の臓器におけるヒトGPC3ポリペプチド又はヒトGPC3 mRNAの発現量は、ヒトの当該臓器におけるヒトGPC3ポリペプチド又はヒトGPC3 mRNAの発現量と同等である。ここで、臓器には、肺及び気管が含まれるが、これらに限定されない。本発明において、通常、一方の発現量を100とした場合に、他方の発現量が50-150%、たとえば70-130%、より具体的には80-120%である場合に、発現量を同等と見なすことができる。またポリペプチドやmRNAの発現量の比較は、共通の組織や細胞の間で比較することが望ましい。
【００４０】
非限定の一態様において、GPC3ポリペプチドの発現量は、総タンパク重量あたりのGPC3ポリペプチド重量として表すことができ、また、GPC3 mRNAの発現量は、トータルRNA中の該GPC3 mRNAのコピー数として表すことができる。RNAのコピー数を定量的に評価する方法は公知である。具体的には、たとえばリアルタイムPCR法により、RNA量が既知の標準試料をサンプルとして増幅反応を行い、一定のシグナル強度に達するまでに要した反応サイクル数に基づいて検量線（スタンダードカーブ）を描くことができる。一方、定量すべきRNA試料についても同様の増幅反応を行って、同じシグナル強度に達する反応サイクル数を測定すれば、得られた結果を予め作成した検量線に当てはめることでRNA量を決定することができる。一方、トータルRNAの量は、電気泳動法や吸光度の測定により決定する方法が公知である。なお本発明において、トータルRNAとは、トータルmRNAであっても良い。
【００４１】
また、別の一態様においては、ヒトGPC3ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物にヒトGPC3に結合する抗体を投与し、当該抗体の血中半減期等の薬物動態学的特性が、ヒトに当該抗体を投与した場合と類似していることをもって、「生理的に妥当なレベルでヒトGPC3ポリペプチドを発現」していると判断してもよい。
【００４２】
非限定の一態様において、ヒトGPC3ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトGPC3ポリペプチドに対して免疫寛容を示す。すなわち、生体は、生体（自己）にとって異物である抗原に対しては獲得免疫応答システムを作動させるため、非ヒト動物にヒトGPC3ポリペプチドを投与し又はヒトGPC3ポリペプチドを発現した細胞を移植すると、当該ヒトGPC3ポリペプチド又はヒトGPC3ポリペプチドを発現した細胞を異物として認識し、排除してしまう。しかしながら、本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトGPC3ポリペプチドを発現するため、ヒトGPC3ポリペプチドを自己の生体成分とみなし、これに対しては免疫応答を示さなくなる。本発明の遺伝子改変非ヒト動物が、ヒトGPC3に対して免疫寛容を示すかどうかは、当業者に公知の様々な方法、例えば、当該非ヒト動物にヒトGPC3ポリペプチド又はその断片を投与し、当該非ヒト動物の体内における抗ヒトGPC3抗体価を測定することによって確認することができる。別の一態様において、本発明における、ヒトGPC3ポリペプチドを発現する非ヒト動物は、正常な免疫系を有する。
【００４３】
非限定の一態様において、非ヒト動物がヒトGPC3ポリペプチドに対して免疫寛容を示すことは、非ヒト動物に、ヒトGPC3ポリペプチドまたはその断片を投与した後に、当該ヒト動物の血漿中の抗ヒトGPC3抗体の抗体価を測定することにより確認できる。このとき、ヒトGPC3ポリペプチドまたはその断片と共にアジュバンドを投与してもよい。抗体価の測定は、例えば、ヒトGPC3ポリペプチドまたはその断片を投与した日から数えて0日目、14日目、21日目、28日目、35日目、42日目、および／または49日目に行うことができる。例えば、ヒトGPC3ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物の血漿中の、抗ヒトGPC3抗体の抗体価が、野生型非ヒト動物の抗ヒトGPC3抗体の抗体価より有意に低い場合には、当該遺伝子改変非ヒト動物が、ヒトGPC3ポリペプチドに対して免疫寛容を示すと評価することができる。
【００４４】
本発明において、遺伝子改変非ヒト動物が、ヒトGPC3ポリペプチドに対して免疫寛容であることは、当該動物において、ヒトGPC3に対する抗原結合分子の種々の特性を評価するときに有利な特徴である。たとえば本発明の遺伝子改変非ヒト動物にヒトGPC3を発現するがん細胞を移植したモデル動物において、抗原結合分子の特性を評価する場合を想定する。このときに、もしも宿主動物がヒトGPC3に免疫応答してヒトGPC3に対する抗体を産生すると、産生された抗体が抗原結合分子の作用の評価を妨げかねない。たとえば、免疫不全動物移植モデルを利用すれば、宿主の免疫応答の問題は無いかもしれない。しかし、免疫システムを欠損した免疫不全動物における評価系では、抗原結合分子の例えば免疫系に関与する作用を評価することはできない。一方、本発明の遺伝子改変非ヒト動物であれば、免疫システムを備えているので、このような制限はない。
【００４５】
４．DNA、ノックインベクター
非限定の一態様において、本発明は、ヒトGPC3ポリペプチドを発現する非ヒト動物を作製するためのDNA構築物、前記DNA構築物を保持するノックインベクターおよび前記ノックインベクターが導入された形質転換細胞又はその子孫細胞を提供する。
【００４６】
非限定の一態様において、本発明のDNA構築物は、5'側にエクソン・イントロン構造配列が付加され、かつ、3'側に非ヒト動物のGPC3遺伝子の3'非翻訳領域が付加されたヒトGPC3遺伝子をコードするDNAを含む、DNA構築物を含む。別の一態様において、本発明のDNA構築物は、さらに、組換え酵素基質配列（例えば、Creの基質配列であるloxP配列）、薬剤選択マーカー（例えば、neo遺伝子）及び／又はその他の配列を含んでも良い。
【００４７】
非限定の一態様において、本発明のDNA構築物は、5'側にエクソン・イントロン構造配列が付加され、かつ、3'側に非ヒト動物のベータグロビンの3'非翻訳領域が付加されたヒトGPC3遺伝子をコードするDNAを含む、DNA構築物を含む。別の一態様において、本発明のDNA構築物は、さらに、組換え酵素基質配列（例えば、Creの基質配列であるloxP配列）、薬剤選択マーカー（例えば、neo遺伝子）及び／又はその他の配列を含んでも良い。
【００４８】
非限定の一態様において、「エクソン・イントロン構造配列」とは、スプライシング反応により除去されないエクソンと、同反応により除去されるイントロンの両方を含む配列を意味する。エクソン・イントロン構造配列としては、エクソンおよびイントロンの両方を含み、スプライシングによりイントロンが除去される配列であれば何でもよい。本発明のエクソン・イントロン構造配列としては、ベータグロビンの第２エクソン配列、同イントロン配列および同第３エクソン配列を含む配列、が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４９】
非限定の一態様において、本発明のDNA構築物は、5'側にベータグロビンの第2エクソン、同イントロンおよび同第3エクソンが付加され、かつ、3'側に非ヒト動物のGPC3遺伝子の3'非翻訳領域が付加されたヒトGPC3遺伝子をコードするDNAを含む、DNA構築物を含む。また、別の一態様において、本発明のDNA構築物は、5'側にベータグロビンの第2エクソン、同イントロンおよび同第3エクソンが付加され、かつ、3'側に非ヒト動物のGPC3遺伝子の3'非翻訳領域、薬剤選択マーカーおよび組換え酵素基質配列が付加されたヒトGPC3遺伝子をコードするDNAを含む、DNA構築物を含む。前記ベータグロビンは、特に限定されないが、好ましくは、当該遺伝子改変非ヒト動物由来のベータグロビンである。例えば、遺伝子改変非ヒト動物がマウスである場合、マウスベータグロビンであることが好ましいが、他のベータグロビン（例えばラビットのベータグロビン等）でもよい。3'側に付加する非ヒト動物のGPC3の3'非翻訳領域の長さは、好ましくは約800bp、あるいはそれ以上である。他方、本発明のノックインベクターにおいて、ヒトGPC3遺伝子をコードするDNAは、通常、ｃＤＮＡであることができる。ヒトGPC3のｃＤＮＡは、好ましくはそのコーディング配列からなることができる。たとえば、配列番号：１０に示す塩基配列は、ヒトGPC3のｃＤＮＡ中、開始コドン(atg)から終止コドン(tga)を含み、ヒトGPC3の全長アミノ酸配列（シグナル配列を含む５８０アミノ酸）をコードしている。
【００５０】
非限定一態様において、本発明のDNA構築物は、5'側にベータグロビンの第2エクソン、同イントロンおよび同第3エクソンが付加され、かつ、3'側にベータグロビンの3'非翻訳領域が付加されたヒトGPC3遺伝子をコードするDNAを含む、DNA構築物を含む。また、別の一態様において、本発明のDNA構築物は、5'側にベータグロビンの第2エクソン、同イントロンおよび同第3エクソンが付加され、かつ、3'側に非ヒト動物のベータグロビンの3'非翻訳領域、薬剤選択マーカーおよび組換え酵素基質配列が付加されたヒトGPC3遺伝子をコードするDNAを含む、DNA構築物を含む。前記ベータグロビンは、特に限定されないが、好ましくは、当該遺伝子改変非ヒト動物由来のベータグロビンである。例えば、遺伝子改変非ヒト動物がマウスである場合、マウスベータグロビンであることが好ましいが、他のベータグロビン（例えばラビットのベータグロビン等）でもよい。
以上のようなDNA構築物の構造の例として、次のような塩基配列を含むDNA構築物を示すことができる；
5’-hGPC3）のコーディング配列（配列番号：１０）−hp7配列（配列番号：１１）―polyA付加シグナル（配列番号：１２）-3’；
あるいは
5'-マウスのベータグロビンの第2エクソン（配列番号：１４）−イントロン（配列番号：１５）、第3エクソン（配列番号：１６）―hGPC3遺伝子のコーディング配列（配列番号：１０）−マウスベータグロビンの第3エクソン中のpolyA付加シグナル-3’。
更に上記の構造において、その5’側上流にはマウスGPC3遺伝子の5’側上流配列を配置することもできる。マウスGPC3遺伝子の5’側上流配列には、たとえば翻訳開始点の上流８００bpを用いることができる。一方、上記構造の3’側下流にも同様に、マウスGPC3遺伝子の3’側下流配列を配置することもできる。マウスGPC3遺伝子の3’側下流配列には、たとえば終止コドンの下流領域の８００bpを用いることができる。
【００５１】
本発明における配列特異的に作用する組換酵素としては、例えば、Cre、Dre、Flpなどを使用することができる。ゲノム領域に挿入する基質配列に合わせて、特異的な組換酵素を使用する。すなわち、Creに対してはloxP配列、Dreに対してはRox配列、Flpに対してはFrt配列を使用する。ここで、「loxP配列」はATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATの塩基配列（配列番号：７）、「Rox配列」はTAACTTTAAATAATTGGCATTATTTAAAGTTAの塩基配列（配列番号：８）、「Frt配列」はGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCの塩基配列（配列番号：９）を利用することができるが、これに限定されるものではない。
【００５２】
本発明における薬剤選択マーカーとしては、例えば、ポジティブ選択用として例えばネオマイシン耐性遺伝子(neo)、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子などを使用することができ、ネガティブ選択用として例えばヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(HSV-tk)、ジフテリア毒素A遺伝子などを使用することができる。 
【００５３】
非限定の一態様において、本発明の「DNA構築物を保持するノックインベクター」とは、前記非ヒト動物を作製するためのDNA構築物を、相同組換えによって、宿主中の標的遺伝子領域に挿入する能力を有するベクターであり、前記非ヒト動物を作製するためのDNA構築物の5'側に5'アーム（標的領域の5'上流の塩基配列と相同な塩基配列）が配置され、3'側に3'アーム（標的領域の3'下流の塩基配列と相同な塩基配列）が配置されている。本発明においてノックインベクターは、前記非ヒト動物を作製するためのDNA構築物が、宿主中の標的遺伝子の同一読み取り枠に挿入されるように構築される。一態様において、ノックインベクターにおいて、任意の外来遺伝子は、その翻訳開始点が、標的遺伝子の翻訳開始点と一致するように、当該翻訳開始点が含まれるエクソン内に挿入されていることが好ましい。この場合、ノックインベクターにおいて、任意の外来遺伝子の翻訳開始点の5'側には、標的遺伝子の翻訳開始点よりも上流の塩基配列が配置されていることが好ましい。別の一態様において、ノックインベクターの任意の外来遺伝子の5'側にエクソン・イントロン構造配列が付加されている場合には、当該エクソン・イントロン構造の5'側末端が、標的遺伝子の翻訳開始点と一致するように、当該翻訳開始点が含まれるエクソン内に挿入されていることが好ましい。この場合、ノックインベクターにおいて、前記エクソン・イントロン構造の5'側末端の5'側上流には、標的遺伝子の翻訳開始点よりも上流の塩基配列が配置されていることが好ましい。
【００５４】
また、本発明のノックインベクターは、宿主細胞内において複製する能力を有することが好ましい。このようなベクターは、例えば、前記非ヒト動物を作製するためのDNAを公知のベクターに挿入することにより構築することができる。ノックインベクターは遺伝子工学に利用されるベクターであれば特に限定されず、公知のベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（BAC）ベクター、酵母人工染色体（YAC）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターその他のウイルスベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
非限定の一態様において、本発明の「ノックインベクターが導入された形質転換細胞」は、前記非ヒト動物を作製するためのDNAを保持するノックインベクターが導入された細胞である。別の一態様において、本発明の形質転換細胞は、5'側にエクソン・イントロン構造配列が付加され、かつ、3'側に非ヒト動物のGPC3遺伝子の3'非翻訳領域が付加されたヒトGPC3遺伝子をコードするDNAが、非ヒト動物のゲノム上に存在する内因性GPC3遺伝子の同一読み取り枠に挿入されている細胞である。
【００５６】
さらに別の一態様において、本発明の形質転換細胞は、5'側にエクソン・イントロン構造配列が付加され、かつ、3'側に非ヒト動物のベータグロビンの3'非翻訳領域が付加されたヒトGPC3遺伝子をコードするDNAが、非ヒト動物のゲノム上に存在する内因性GPC3遺伝子の同一読み取り枠に挿入されている細胞である。ノックインベクターが導入される宿主細胞は、前記非ヒト動物の細胞または前記非ヒト動物の細胞に分化可能な細胞（細胞の集団を含む）である。このような宿主細胞としては、目的に応じて種々の細胞を用いることができ、例えば、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）などの多能性幹細胞、精子幹細胞などの生殖細胞へ分化する能力を有する生殖系列幹細胞、受精卵が挙げられる。前記宿主細胞への前記ノックインベクターの導入は、エレクトロポレーション法などの公知の方法で行うことができる。あるいは本発明は、本発明のノックインベクターで形質転換された細胞、当該細胞から発生した遺伝子改変非ヒト動物、そして更に当該遺伝子改変非ヒト動物にがん細胞を移植または発がんを誘導したモデル動物を提供する。また本発明は、これらの遺伝子改変非ヒト動物やモデル動物によって、抗原結合物質や、がんの治療作用を評価するための被験物質の、細胞増殖抑制作用、安全性、あるいは薬物動態等の特性を評価する方法に関する。
【００５７】
５．ヒトGPC3ポリペプチドを発現する非ヒト動物の作製方法
非限定の一態様において、ヒトGPC3ポリペプチドを発現する非ヒト動物の作製方法は、ヒトGPC3遺伝子をコードするDNAを保持するノックインベクターを宿主細胞に導入することを含む。ヒトGPC3遺伝子をコードするDNAを保持するノックインベクターの導入の方法は、特に限定されないが、ノックインベクターの受精卵前核への顕微注入、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞、精子幹細胞等の生殖系列幹細胞への電気穿孔（エレクトロポーション）法、リポフェクション法、ウイルス感染および形質転換等による導入など、公知の手法を適宜用いることが可能である。
【００５８】
非限定の一態様において、上記ノックインベクターは、ゲノム上の標的領域に特異的な標的配列に結合して切断するZinc Finger Nuclease(ZFN)、Transcription Activator-like Effector Nuclease(TALEN)などの人工ヌクレアーゼやClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat(CRISPR)/Cas9などとともに宿主細胞へ注入する。
【００５９】
非限定の一態様においては、ノックインベクターが導入された多能性幹細胞をマイクロインジェクション法などの公知の方法で初期胚に注入し、これを仮親に移植して発生させることにより、キメラ動物を得ることができる。また、このキメラ動物を繁殖させることにより、その後代から、ノックインアレルがホモ接合体化された個体を得ることができる。
別の一態様において、生殖系列幹細胞を用いる場合には、公知の方法にてノックインベクターを導入して標的組換えを行なった細胞を、動物の生殖巣に移植して生殖細胞に分化させ、その動物を交配することにより、あるいは、動物より採取した生殖細胞を利用して、ノックイン動物を作出することが可能である（Kanatsu-Shinohara,M. et al.(2008) Biol.Reprod. 79, 1121-1128）。
【００６０】
別の一態様において、受精卵を用いる場合には、人工ヌクレアーゼ等とともにノックインベクターが注入された受精卵を、仮親に移植して発生させることにより、ノックイン動物を作製することが可能である。ZFNおよびTALENを用いた方法に関しては、それぞれ文献（Cui, X. et al.(2011) Nat.Biotechnol. 29, 64-67）および文献（Li, T. et al.（2011） Nucleic Acids Res. 39, 6315-6325）に記載されている。CRISPR／Cas9を用いた方法に関しては、文献（Yang, H. et al.(2013) Cell.in press.）に記載されている。
さらに、別の一態様において、動物の精巣あるいは卵巣にノックインベクターを注入して、エレクトロポレーション等の手法により生殖細胞を、直接、遺伝子組換えし、その後、交配を行うことなどによりノックインアレルを有する個体を得ることも可能である（Niu, Y. et al.(2008) J.Genet.Genomics. 35,701-714）。
【００６１】
本発明において、遺伝子改変非ヒト動物は、ノックインアレルをホモで有するホモ接合体(homozygous)であることも、1コピーのノックインアレルを有するヘミ接合体(hemizygous)であることもできる。繁殖において、改変した形質を安定に保存するためには、ホモ接合体であることが好ましい。なお、GPC3はX染色体上に位置するため、メス(XX)の場合はホモ接合体となりえるが、オス(XY)の場合はヘミとなる。一方メスのヘミ接合体は、ノックインアレルの存在によってヒトGPC3を発現するが、内因性のGPC3アレルを欠損した状態にあるので、その発現も抑制される。
【００６２】
あるいは本発明は、以下の工程を含むヒトGPC3ポリペプチドを発現する非ヒト動物の製造方法に関する：
（Ａ）非ヒト動物の幹細胞に本発明のノックインベクターを導入して非ヒト動物の幹細胞ゲノムの内因性ＧＰＣ３アレルにヒトＧＰＣ３をコードする遺伝子を組み込む工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の非ヒト動物幹細胞を同じ非ヒト動物の初期胚に移植する工程；
（Ｃ）工程（Ｂ）の初期胚を仮親の非ヒト動物の子宮に移植して発生させ、体細胞にノックインベクターが導入されたゲノムを有する非ヒト動物のキメラ動物を得る工程；および
（Ｄ）工程（Ｃ）のキメラ動物を繁殖させて、その後代から、ノックインアレルがホモ接合体化された個体を得る工程。
【００６３】
あるいは本発明は、以下の工程を含むヒトGPC3ポリペプチドを発現する非ヒト動物の製造方法に関する：
（Ａ）非ヒト動物の受精卵に本発明のノックインベクターを導入して非ヒト動物の受精卵ゲノムの内因性ＧＰＣ３アレルにヒトＧＰＣ３をコードする遺伝子を組み込む工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の非ヒト動物受精卵を仮親の非ヒト動物の子宮に移植して発生させ、体細胞にノックインベクターが導入されたゲノムを有する非ヒト動物を得る工程；および
（Ｃ）工程（Ｂ）の非ヒト動物を繁殖させて、その後代から、ノックインアレルがホモ接合体化された個体を得る工程。
本発明の製造方法において、ノックインベクターは、通常、ヒトＧＰＣ３のｃＤＮＡを発現可能に保持し、かつヒトＧＰＣ３のｃＤＮＡとその発現制御領域を含む発現カセットを非ヒト動物のゲノム上の内因性ＧＰＣ３アレルに組み込むための組み換え領域に挟まれている。
【００６４】
６．ヒトGPC3ポリペプチドを発現する非ヒト動物を用いた被験物質の評価方法
非限定の一態様において、本発明の非ヒト動物は、被験物質における、安全性、疾患の治療効果、薬物動態、体内分布など種々の評価に利用することが可能である。従って、本発明は、このような本発明の非ヒト動物を利用した被験物質の評価方法をも提供する。別の一態様において、本発明は、被験物質における、安全性、疾患の治療効果、薬物動態、体内分布など種々の評価および/またはスクリーニングに用いるための非ヒト動物を含む。さらに別の一態様において、本発明は、被験物質における、安全性、疾患の治療効果、薬物動態、体内分布など種々の評価および/またはスクリーニングに用いるための、本発明の非ヒト動物の使用をも含む。
【００６５】
本発明の評価方法に用いる「被験物質」としては、特に限定されるものではなく、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出物などが挙げられる。好ましくはヒトGPC3に対する抗体であり、例えば、WO2003/ 000883, WO2004/022739, WO2006/006693, WO2007/047291, WO2006/046751, WO2009/041062, 及びWO2016/047722等に記載される公知の抗体が挙げられる。被験物質の非ヒト動物への投与は、例えば、尾静脈投与、皮下投与、腹腔内投与、経口投与、経鼻投与、経皮投与、経肺投与などで行うことができるが、これらに限定されない。
【００６６】
被験物質の評価の態様としては、以下が挙げられる。例えば、本発明の非ヒト動物に、被験物質を投与し、血漿中のサイトカイン（例えば、IFN-gamma、IL-10、IL-17、IL-2、IL-4、IL-6およびTNFが含まれるが、これらに限定されない。）の濃度を測定することにより、被験物質の生体に対する安全性を評価することができる。より具体的には、サイトカインレベルを、対照における同じサイトカインのレベルと比較して、両者に違いが見られた場合に、被験化合物の安全性のリスクが示される。ここで「安全性のリスク」とは、サイトカインレベルの変化によって、生体において何らかの不利益をもたらす生体反応が予測されることをいう。先に例示したIFN-gamma、IL-10、IL-17、IL-2、IL-4、IL-6あるいはTNF等に代表されるサイトカインの、生体内における役割はよく知られていて、疾患の治療における各サイトカインレベルの変化と、生体反応の関連についても多くの情報が蓄積されている。したがって当業者であれば、サイトカインレベルの変化によって示唆される安全性のリスクを予測することができる。このとき、当該非ヒト動物の1つまたは複数の臓器におけるヒトGPC3遺伝子の発現レベルが、マウス、サル又はヒトと同等である場合、当該非ヒト動物を用いた安全性試験結果を、マウス、サル又はヒトに外挿し、マウス、サル又はヒトにおける影響を予測することも可能となる。別の一態様において、当該非ヒト動物は、ヒトGPC3を発現するがん細胞を含んでいてもよい。
【００６７】
また、ヒトGPC3ポリペプチドを発現するがん細胞を含む本発明の非ヒト動物に、被験物質を投与し、がん細胞の増殖が抑制されたか否かを測定することにより、当該被験物質の治療効果を評価することができる。ここで、治療効果は、抗腫瘍効果又は細胞傷害活性と言い換えても良い。非ヒト動物に含まれるがん細胞の増殖が抑制されたか否かは、がん細胞のサイズ及びその変化を計測することにより評価することが可能である。
【００６８】
ヒトGPC3ポリペプチドを発現するがん細胞を含む本発明の非ヒト動物は、ヒトGPC3ポリペプチドを発現するがん細胞を移植した非ヒト動物を含む。前述のとおり、非限定の一態様において、ヒトGPC3ポリペプチドを発現する非ヒト動物は、ヒトGPC3ポリペプチドに対して免疫寛容を示す。したがって、本発明のヒトGPC3ポリペプチドを発現する非ヒト動物に、ヒトGPC3ポリペプチドを発現するがん細胞を移植しても、当該非ヒト動物が当該がん細胞に免疫応答を示すことはない。そのため、本発明の非ヒト動物をモデルとして使用することにより、被験物質の治療効果をより正確に評価することが可能となる。
【００６９】
別の一態様において、ヒトGPC3ポリペプチドを発現するがん細胞を含む本発明の非ヒト動物は、がんを発症した本発明の非ヒト動物である。当該がんは、自然発症したものでも、人為的に発症を誘導させたものでもよい。がんの発症を誘導する非ヒト動物モデル及びその作製方法は公知である。具体的には、例えば、非ヒト動物にインスリン抵抗性を惹起し、高脂肪食負荷を行うことによって、肝炎、肝線維化、肝硬変へと進行する病態を発症し、かつ当該病態進行に付随する肝がんを発症する動物モデルおよびその作製方法（WO2011013247 A1）が知られている。また、CDAHFD（Choline-deficient, L-amino acid-defined high fat diet containing 0.1% methionine）を給餌することによって、肝炎、肝線維化、肝硬変へと進行する病態を発症する動物モデルおよびその作製方法（International Journal of Experimental Pathology, 2013 Apr;94(2):93-103.）が知られており、当該動物モデルへのCDAHFDの給餌をさらに継続することで、肝がんを発症させることも可能である。
【００７０】
したがって本発明は、被験化合物によるがんの治療効果を評価するためのモデル動物を提供する。本発明に基づくがんの治療効果を評価するためのモデル動物は、本発明の遺伝子改変非ヒト動物を利用して製造することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、被験化合物によるがんの治療効果を評価するためのモデル動物の製造方法に関する：
（Ａ）非ヒト動物の幹細胞に本発明のノックインベクターを導入して非ヒト動物の幹細胞ゲノムの内因性ＧＰＣ３アレルにヒトＧＰＣ３をコードする遺伝子を組み込む工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の非ヒト動物幹細胞を同じ非ヒト動物の初期胚に移植する工程；
（Ｃ）工程（Ｂ）の初期胚を仮親の非ヒト動物の子宮に移植して発生させ、体細胞にノックインベクターが導入されたゲノムを有する非ヒト動物のキメラ動物を得る工程； 
（Ｄ）工程（Ｃ）のキメラ動物を繁殖させて、その後代から、ノックインアレルがホモ接合体化された個体を得る工程；および
（Ｅ）工程（Ｄ）のホモ接合個体にがん細胞を移植しまたはがんの発症を誘導して、がんの治療効果を評価するためのモデル動物とする工程。
【００７１】
また、本発明は、被験化合物によるがんの治療効果を評価するための、別のモデル動物も提供する。本発明に基づくがんの治療効果を評価するためのモデル動物は、本発明の遺伝子改変非ヒト動物を利用して製造することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、被験化合物によるがんの治療効果を評価するためのモデル動物の製造方法に関する：
（Ａ）非ヒト動物の受精卵に本発明のノックインベクターを導入して非ヒト動物の受精卵ゲノムの内因性ＧＰＣ３アレルにヒトＧＰＣ３をコードする遺伝子を組み込む工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の非ヒト動物受精卵を仮親の非ヒト動物の子宮に移植して発生させ、体細胞にノックインベクターが導入されたゲノムを有する非ヒト動物を得る工程；および
（Ｃ）工程（Ｂ）の非ヒト動物を繁殖させて、その後代から、ノックインアレルがホモ接合体化された個体を得る工程；および
（Ｄ）工程（Ｃ）のホモ接合個体にがん細胞を移植しまたはがんの発症を誘導して、がんの治療効果を評価するためのモデル動物とする工程。
【００７２】
非限定の一態様において、本発明の非ヒト動物に移植されるがん細胞としては、例えば、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、食道がん、腎臓がん、子宮がん、肝がん、肺がん、膵臓がん、胃がん、膀胱がん又は大腸がん細胞等が好適に挙げられる。なお、本明細書に記載の「がん」は、卵巣がん、胃がん等の上皮性の悪性腫瘍のみならず、慢性リンパ性白血病やホジキンリンパ腫等の造血器がんを含む非上皮性の悪性腫瘍も意味するものとする。また本発明における移植がん細胞は、ＧＰＣ３を標的とする薬剤の作用を評価するために、ＧＰＣ３を発現しているがん細胞であることが望ましい。
【００７３】
本発明において遺伝子改変非ヒト動物に移植するがん細胞は、任意の動物に由来するがん細胞であることができる。中でも、宿主となる非ヒト動物と共通の種に由来するがん細胞は、移植がん細胞として好ましい（同種移植）。更に、実験動物用のマウスやラットのような、系統が管理された種を遺伝子改変非ヒト動物として利用することによって、種のみならず、同じ系統に由来するがん細胞を移植することもできる（同系移植）。このように、できるだけ遺伝的な共通性が高いがん細胞を移植がん細胞とすることにより、細胞自身に対する宿主の免疫応答等の被験化合物に起因しない作用が抑制され、被験化合物のがんに対する治療効果をより特異的に評価することができる。本発明において、がん細胞は、たとえば皮下などに移植することができる。あるいは特定の組織内に移植することによって、被験化合物の組織への移行性を評価することもできる。
【００７４】
また、被験物質を投与した本発明の非ヒト動物において、被験物質の血中濃度を測定することにより、被験物質の有効血中濃度または薬物動態学的特性を評価することもできる。ここで「薬物動態学的特性」とは、動物の体内における被験物質の血中半減期や消失速度等の特性を意味する。例えば、非限定の一態様においては、有効血中濃度が低い、血中半減期が長い、または消失速度が遅い物質ほど、薬物動態学的特性は優れていると判断される。被験物質の血中濃度の測定の手法については特に限定されるものではない。被験物質がタンパク質（抗体を含む）である場合には、例えば、ELISA法が挙げられ、被験物質が低分子化合物である場合には、例えば、液体クロマトグラフ−質量分析（LC-MS）法が挙げられる。血中濃度から薬物動態学的特性を評価する方法論については、文献（Igawa et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:1203-1207）を参照のこと。上記本発明の被験物質の評価方法を利用することにより、所望の活性を有するヒトGPC3標的治療剤を効率的に選抜することが可能である。従って、本発明は、このような抗体の選抜方法をも提供する。
【００７５】
また、被験物質を投与した本発明の非ヒト動物において、被験物質の体内分布を観察することにより、当該被験物質の目的部位への到達度や生体内分布特性を評価することもできる。例えば、ヒトGPC3を発現するがん細胞を移植した本発明の非ヒト動物に、被験物質としてイメージング剤を結合したヒトGPC3標的治療薬を投与し、当該イメージング剤を検出することで、被験物質の体内分布を観察することができる。イメージングに使用される放射性核種には、SPECTイメージング用のI-131、I-123、In-111およびTc-99m、ならびにPETイメージング用のF-18、I-124、Cu-64、Y-86などがあるが、これらに限られない。非限定の一態様において、イメージング剤検出の結果、当該被験物質のがん細胞への集積度が高い場合には、当該被験物質はがん細胞への特異性が高いと評価される。
【００７６】
非限定の一態様として、本発明は、さらに、以下の工程（１）〜（２）：
（１）本発明の非ヒト動物、その臓器、組織または細胞と被験物質を接触させる工程、及び
（２）該非ヒト動物個体、その臓器、組織または細胞に対する被験物質の薬効及び毒性のいずれか、または両方を指標として、候補被験物質を選択する工程、を含む、悪性腫瘍性疾患又は自己免疫疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供する。別の一態様において、当該非ヒト動物は、ヒトGPC3を発現するがん細胞を移植されていてもよい。
【００７７】
非限定の一態様において、本発明の非ヒト動物個体、その臓器、組織または細胞に対する被験物質の治療効果（薬効）及び／又は安全性（毒性）を測定し、薬効が認められたまたは高い被験物質を選択したり、毒性が低いまたは無い被験物質を選択したりすることができる。また、比較対照として薬効を有する物質を使用して同様に測定を実施し、対照に比べて薬効が高い、または毒性が低い被験物質を選択することもできる。薬効としては、特に制限されるものではないが、例えば細胞増殖抑制作用、細胞傷害作用、または腫瘍増殖抑制作用などが挙げられる。
【００７８】
例えば、本発明は、以下の工程（１）〜（３）：
（１）ヒトGPC3結合ドメインを含む抗原結合分子を被験物質として、ヒトGPC3を発現するがん細胞を移植された本発明の非ヒト動物の第１の個体に投与する工程、
（２）該がん細胞に対する該被験物質の細胞増殖抑制効果及び薬物動態学的特性のいずれか、または両方を測定する工程、及び
（３）該被験物質の細胞増殖抑制効果及薬物動態学的特性のいずれか、または両方を、前記第１の個体とは異なる、ヒトGPC3を発現するがん細胞を移植された本発明の非ヒト動物の第２の個体に投与された対照抗体の細胞増殖抑制効果及薬物動態学的特性のいずれか、または両方と比較する工程、を含む、悪性腫瘍性疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング工程は、更に付加的に、（４）前記工程（３）の結果、細胞増殖抑制効果及び薬物動態特性のいずれか、または両方が優れた被験物質を選択する工程、を含むことができる。本発明において、対照抗体の細胞増殖抑制効果及び薬物動態特性は、必ずしも両方を同時に満足するものでなくても良い。むしろ、いずれかにおいて、一定の評価を得ているものを利用して候補をスクリーニングする過程を繰り返すことによって、結果的に、両者の特性においてより優れた作用を持つ被験物質を効率的にしぼりこむことができる。
【００７９】
上記本発明の被験物質の評価方法を利用することにより、所望の活性を有するヒトGPC3に対する抗体を効率的に生産することが選抜である。従って、本発明は、このような抗体の選抜方法をも提供する。
【００８０】
ヒトGPC3を発現するがん細胞株を移植し、次いで被験物質としてのヒトGPC3に対する抗体を投与した非ヒト動物において、がん細胞株の増殖が抑制されたか否かを測定し、がん細胞の増殖を抑制する抗体を選抜することにより、ヒトGPC3を発現するがん細胞の増殖を効率的に阻害する抗体を取得することができる。また、ヒトGPC3に対する抗体を投与した非ヒト動物において、該抗体の血中濃度を測定し、所望の血中濃度を有する抗体を選抜することにより、所望の体内動態を有する、ヒトGPC3に対する抗体を取得することができる。こうして活性の評価および選抜を行った抗体がマウスモノクローナル抗体などである場合には、当該抗体をキメラ化またはヒト型化して、ヒトに投与した場合に抗原性が少なく、ひいては副作用の少ない抗体を取得することができる。そして、このようにして得られた抗体はGPC3を発現するがんの治療に有用な治療薬に用いることができる。
【００８１】
非限定の一態様において、上記方法により評価、スクリーニング又は選抜された治療薬の対象となるがんは、標的となるGPC3が高発現しているがんであればどのようながんも該当する。そのようながんの一例として、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、子宮体がん、頭頸部がん、肝臓がん、肺がん、悪性カルチノイド（Malignant carcinoid）、悪性神経膠腫（Malignant glioma）、悪性リンパ腫（Malignant lymphoma）、悪性黒色種（Malignant melanoma）、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎臓がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿路上皮がん等から選択されるがんが例示される。
【００８２】
７．CD3
Ｔ細胞受容体（Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）複合体は、主にＴ細胞上に発現する抗原受容体分子である。抗原と結合するＴＣＲα鎖およびβ鎖（あるいはδ鎖およびγ鎖）と、主に細胞内へのシグナル伝達機能を有する複数のＣＤ３分子（ＣＤ３イプシロン（ε）、ＣＤ３デルタ（δ）、ＣＤ３ガンマ（γ））およびＣＤ２４７から構成される。
【００８３】
ここで遺伝子名の記述方法に関し、一般的に、生物種によってはＣＤ３εをＣＤ３Ｅ、ＣＤ３δをＣＤ３Ｄ、ＣＤ３γをＣＤ３Ｇなどと表記することもあるが、本明細書においては、生物種に依存することなく、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γという遺伝子表記を用いる。すなわち本発明においてＣＤ３εにはＣＤ３ＥおよびＣＤ３ｅが含まれ、ＣＤ３δにはＣＤ３ＤおよびＣＤ３ｄが含まれ、ＣＤ３γにはＣＤ３ＧおよびＣＤ３ｇが含まれる。例えば、本明細書で「ヒトＣＤ３ε」と記載するときはヒト遺伝子のＣＤ３イプシロンを意味し、「マウスＣd３ε」と記載するときはマウス遺伝子のＣd３イプシロンを意味する。また、本明細書で「ヒトＣＤ３δ」と記載するときはヒト遺伝子のＣＤ３デルタを意味し、「マウスＣd３δ」と記載するときはマウス遺伝子のＣd３デルタを意味する。さらに、本明細書で「ヒトＣＤ３γ」と記載するときはヒト遺伝子のＣＤ３ガンマを意味し、「マウスＣd３γ」と記載するときはマウス遺伝子のＣd３ガンマを意味する。
【００８４】
本発明において、ヒトCD3ε、CD3δおよびCD3γからなる群より選択される1種以上のCD3としては特に制限はないが、例えばヒトCD3εであってよい。また、ヒトCD3ε、CD3δおよびCD3γからなる群より選択される2種以上のCD3であってもよく、例えばヒトCD3εおよびCD3δ、あるいはヒトCD3εおよびCD3γ、あるいはヒトCD3δおよびCD3γであってもよい。また、ヒトCD3ε、CD3δ、およびCD3γからなるCD3、すなわち３種すべてであってもよい。
【００８５】
８．ヒトCD3遺伝子を機能的に発現する非ヒト動物
本発明はまた、内因性のCD3ε、CD3δ及びCD3γからなる群より選ばれる少なくとも1種以上のCD3遺伝子がゲノム上で機能的に欠損し、ヒトCD3ε、CD3δ及びCD3γからなる群より選ばれる少なくとも1種以上のヒトCD3遺伝子を機能的に発現する遺伝子改変非ヒト動物に関する。
【００８６】
本発明における「内因性の遺伝子がゲノム上で機能的に欠損する」とは、非ヒト動物ゲノム上における内因性の標的遺伝子（例えば、CD3ε、CD3δ又はCD3γ）がその機能を発現しない限り、特にその態様は限定されず、非ヒト動物ゲノム上における内因性の標的遺伝子（例えば、CD3ε、CD3δ又はCD3γ）または蛋白質が発現しないものであってよい。例えば、相同組み換え技術やクリスパー・キャス（CRISPR/Cas9）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ (Zinc Finger Nucleases)、あるいはテイレン (TALEN) 等のゲノム編集技術によるノックアウト技術を用いて、非ヒト動物のゲノム上で、標的とした遺伝子を欠損（無効化）させてもよいし、siRNA等を用いて標的とした遺伝子の発現を完全に抑制させる手法を用いてもよい。また、内因性の標的遺伝子が発現しない限り、例えば、ノックイン技術を用いて、非ヒト動物ゲノム上の標的遺伝子の位置に外来遺伝子を挿入してもよい。
【００８７】
本発明における非限定の一態様において、内因性のCD3ε、CD3δ及びCD3γからなる群より選ばれる少なくとも1種以上のCD3遺伝子がゲノム上で機能的に欠損する動物は、ヒトCD3遺伝子などの外来CD3を発現させない場合、成熟T細胞の分化および生成が阻害される。ここで成熟T細胞とは、例えばCD4またはCD8のどちらか一方（両方ではなく）が陽性のT細胞（それぞれCD4単一陽性細胞、CD8単一陽性細胞という）である。より具体的には、ヒトCD3遺伝子などの外来CD3を発現しない場合、内因性のCD3ε、CD3δ及びCD3γからなる群より選ばれる少なくとも1種以上のCD3遺伝子がゲノム上で機能的に欠損する動物の脾臓におけるCD4単一陽性細胞およびCD8単一陽性細胞の合計は、野生型のレベル、または通常正常とされるレベルに比べ、例えば70％以下、好ましくは60％以下、より好ましくは50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下、3％以下、または1％以下である。成熟T細胞の計数を行う発達ステージは、野生型において成熟T細胞が生成するステージである限りいずれでもよいが、一般にアダルト（繁殖可能）となる齢であることが好ましく、例えばマウスであれば8〜12週齢、例えば12週齢であってよい。
【００８８】
また本発明における非限定の一態様において、内因性のCD3ε、CD3δ及びCD3γからなる群より選ばれる少なくとも1種以上のCD3遺伝子がゲノム上で機能的に欠損する動物は、ヒトCD3遺伝子などの外来CD3を発現しない場合、抗体産生が阻害される。ここで抗体の型は特に限定されず、例えばIgG（例えばIgG1）の産生が阻害されることであってもよく、および/または、IgEの産生が阻害されることであってもよい。抗体産生が阻害されているかどうかは、外来抗原を接種して、抗体が産生されるか否か、あるいは抗体産生量を測定することにより決定することができる。外来抗原としては特に制限はなく、例えばニワトリ卵白アルブミン（OVA）などの所望の抗原を用いて抗体産生を確認することができる。ヒトCD3遺伝子などの外来CD3を発現しない場合、内因性のCD3ε、CD3δ及びCD3γからなる群より選ばれる少なくとも1種以上のCD3遺伝子がゲノム上で機能的に欠損する動物における抗体価は、野生型のレベルまたは通常正常とされるレベルに比べ、例えば70％以下、好ましくは60％以下、より好ましくは60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下、3％以下、または1％以下である。抗体産生を測定する発達ステージは、野生型において抗体が生成するステージである限りいずれでもよいが、一般にアダルトとなる齢であることが好ましく、例えばマウスであれば8〜12週齢、例えば12週齢であってよい。
【００８９】
本発明において、機能を欠損させる内因性CD3遺伝子は、CD3ε、CD3δおよびCD3γからなる群より選択される1種以上のいずれでもよいが、例えば内因性CD3ε遺伝子を少なくとも機能的に欠損しているものであってよい。また、2種以上を機能的に欠損するものも好ましく、例えば内因性CD3εおよびCD3δ、あるいは内因性CD3εおよびCD3γ、あるいは内因性CD3δおよびCD3γを少なくとも機能的に欠損している。また、内因性CD3ε、CD3δおよびCD3γをすべて機能的に欠損しているものであってもよい。
【００９０】
本発明における「ヒトCD3遺伝子を機能的に発現する」とは、非ヒト動物のT細胞上にヒトCD3分子が発現しているが、該非ヒト動物において、Ｔ細胞を含めた免疫担当細胞が正常な機能を維持している状態を意味する。ここで、免疫担当細胞が正常な機能を維持しているかどうかは、例えば、該非ヒト動物のT細胞の分化過程、Ｔ細胞の成熟過程、胸腺重量、胸腺細胞数、脾臓における機能的T細胞のCD4及びCD8陽性細胞の比率等を指標に判断することができる。
本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、好ましくは成熟T細胞を分化・生成する能力を有する。すなわち本発明においてヒトCD3遺伝子を機能的に発現するとは、当該動物において成熟T細胞が生成されることであってもよい。例えば、本発明の遺伝子改変非ヒト動物がマウスの場合、Ｔ細胞の分化および成熟過程が影響を受けず、胸腺重量や胸腺細胞数が正常なマウスと同等であることが望ましい。ここで、正常なマウスにおける胸腺細胞数と同等であるとは、遺伝子改変非ヒト動物の胸腺細胞数が少なくとも１×１０４個以上、好ましくは１×１０５個以上、５×１０５個以上、１×１０６個以上、５×１０６個以上、１×１０７個以上、特に好ましくは５×１０７個以上であり、遺伝子改変非ヒト動物の胸腺細胞数が５〜６×１０７個の範囲であることが最も好ましい。
また、機能的Ｔ細胞の表面マーカーであるＣｄ４あるいはＣｄ８の陽性細胞の比率も、正常なマウスと同等であることが望ましい。ここで、正常なマウスにおける成熟Ｔ細胞のＣｄ４およびＣｄ８陽性細胞の比率と同等であるとは、脾臓において評価した場合に、成熟Ｔ細胞全体の細胞数におけるＣｄ４陽性細胞の比率が、好ましくは、１０〜４０％、１２〜３８％、１４〜３６％、１６〜３４％、１８〜３２％、特に好ましくは２０〜３０％の比率である。また、成熟Ｔ細胞全体の細胞数におけるＣｄ８陽性細胞の比率が、好ましくは、５〜３０％、７〜２８％、９〜２６％、１１〜２４％、１３〜２２％、特に好ましくは１５〜２０％の比率である。
非ヒト動物の胸腺重量および胸腺細胞数および末梢でのＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞の存在比率の評価方法としては、例えば、後述する実施例に記載の解析方法等、周知の解析方法を当業者が適宜用いることによって評価することができる。
ヒトCD3置換マウスのＴ細胞を含めた免疫担当細胞は、マイトジェン刺激後の細胞増殖能が、野生型マウスと比較して同等であることが望ましい。同等であるとは、マイトジェン刺激後のチミジン取り込み、ブロモデオキシウリジンの取り込み、ＭＴＳアッセイ、CFSE [5-(and 6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester]アッセイ等による評価値が、好ましくは野生型の65%〜135%、70%〜130%、75%〜125%、80%〜120%であり、特に好ましくは85〜115%である。
【００９１】
また本発明における非限定の一態様において、本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトCD3遺伝子を発現しない対照（当該動物と同じ組み合わせで内因性のCD3遺伝子を欠損する動物）と比較して、成熟T細胞の生成能が上昇している。より具体的には、脾臓におけるCD4単一陽性細胞およびCD8単一陽性細胞の合計が、当該対照に比べ、例えば1.3倍以上、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは1.6倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、50倍以上、または100倍以上である。成熟T細胞の計数を行う発達ステージは、本発明の動物において成熟T細胞が生成するステージである限りいずれでもよいが、一般にアダルトとなる齢であることが好ましく、例えばマウスであれば8〜12週齢、例えば12週齢であってよい。
【００９２】
また、本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、例えば外来抗原に対する抗体を産生する能力を有する。抗体の型は特に限定されず、例えばIgG（例えばIgG1）であってもよく、あるいはIgEであってもよい。外来抗原は特に限定されず、ニワトリ卵白アルブミン（OVA）などの所望の抗原を用いて抗体産生を確認することができる。
【００９３】
また本発明における非限定の一態様において、本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトCD3遺伝子を発現しない対照（当該動物と同じ組み合わせで内因性のCD3遺伝子を欠損する動物）と比較して、高い抗体産生能を有する。ここで抗体の型は特に限定されず、例えばIgG（例えばIgG1）であってもよく、IgEであってもよい。抗体産生能が上昇しているかどうかは、外来抗原を接種して抗体が産生されるか否か、あるいは抗体産生量を測定することにより決定することができる。外来抗原としては特に制限はなく、例えばニワトリ卵白アルブミン（OVA）などの所望の抗原を用いて抗体産生を確認することができる。本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、当該対照動物に比べ、抗体価が例えば1.3倍以上、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは1.6倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、50倍以上、または100倍以上である。抗体産生を誘導させる発達ステージは、本発明の動物において抗体が生成するステージである限りいずれでもよいが、一般にアダルトとなる齢であることが好ましく、例えばマウスであれば8〜12週齢、例えば12週齢であってよい。抗原の感作や抗体の測定時期は適宜設計してよいが、例えば感作は４週間間隔にて２回行い、100μgの抗原を、１回目は完全フロイント・アジュバンドを用いて背部皮下に感作し、その４週間後に不完全フロイント・アジュバンドを用いて同様に背部皮下に感作し、２回目の感作の１週間後に採血して抗体価を測定することができる。
【００９４】
また本発明における非限定の一態様において、Ｔ細胞を含めた免疫担当細胞が正常な機能を維持している状態とは、遺伝改変非ヒト動物の獲得免疫に関する機能（液性免疫、細胞性免疫）が正常な機能を維持している状態を含む。
【００９５】
本発明における非限定の一態様において、本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトCD3ε、CD3δ及びCD3γからなる群より選ばれる少なくとも1種以上のヒトCD3遺伝子の全長塩基配列がゲノム上に挿入されている、遺伝子改変非ヒト動物である。ゲノム上に挿入される全長塩基配列に関し、ヒトCD3ε、CD3δおよびCD3γからなる群より選択される1種以上のCD3としては特に制限はないが、例えばヒトCD3εの全長塩基配列であってよい。また、ヒトCD3ε、CD3δおよびCD3γからなる群より選択される2種以上のCD3であってもよく、例えばヒトCD3εの全長塩基配列およびCD3δの全長塩基配列、あるいはヒトCD3εの全長塩基配列およびCD3γの全長塩基配列、あるいはヒトCD3δの全長塩基配列およびCD3γの全長塩基配列であってもよい。また、ヒトCD3εの全長塩基配列、CD3δの全長塩基配列、およびCD3γの全長塩基配列からなるCD3、すなわち３種すべてであってもよい。  本発明における非限定の一態様において、CD3遺伝子の「全長塩基配列」とは、細胞外領域、膜貫通領域、及び細胞質領域を含む、CD3分子（CD3ε、CD3δ、CD3γ）をコードする塩基配列であり、さらに発現調節領域（プロモーター）を含む塩基配列であってもよい。
【００９６】
本発明の非限定の一態様として、上述した遺伝子改変非ヒト動物が有するT細胞の細胞上で、非ヒト動物由来のT細胞受容体とヒトCD3分子が複合体を形成することを特徴とする、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。
ここで、ＣＤ３εは、ＣＤ３δあるいはＣＤ３γとの二量体を形成し、さらにそれらの二量体がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖、ＴＣＲβ鎖とともに複合体を形成することにより、機能的なＴＣＲ複合体を形成する。特定の理論に拘束されることは意図しないが、本発明の遺伝子改変非ヒト動物においては、該非ヒト動物のＴ細胞の細胞上で、非ヒト動物由来のＴＣＲα鎖、β鎖とともに、ヒト由来のＣＤ３ε、ＣＤ３δ及び/又はＣＤ３γが複合体を形成することができる。
【００９７】
本発明における非限定の一態様において、上述した本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、ヒト癌特異的抗原遺伝子、ヒト免疫チェックポイント遺伝子、及び／又はヒト免疫共刺激分子の遺伝子をさらに発現する、遺伝子改変非ヒト動物であってもよい。ヒト癌特異的抗原とは、癌細胞と健常細胞を区別することを可能とする、癌細胞が発現する抗原を意味し、例えば、細胞の悪性化に伴って発現する抗原、細胞が、がん化した際に細胞表面やタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖が含まれる。「免疫チェックポイント」とは、免疫担当細胞上に発現し、リガンドと結合することによって、当該免疫担当細胞に対し免疫応答を阻害するシグナルを伝達する分子をいう。免疫チェックポイントおよびそのリガンドには、例えば、PD-1、CTLA-4、TIM3、LAG3、PD-L1、PD-L2, BTNL2, B7-H3, B7-H4, CD48, CD80,2B4, BTLA, CD160, CD60, CD86, またはVISTA等の分子が含まれるが、これらに限定されない。「免疫共刺激分子」とは、免疫担当細胞上に発現し、リガンドと結合することによって、当該免疫担当細胞に対し免疫応答を活性化するシグナルを伝達する分子をいう。免疫共刺激分子として、例えば、CD28、ICOS、CD137、CD137L、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、RANK、RANKL、CD30、CD153、GITR、GITRL等の分子が含まれるが、これに限定されることはない。ヒト癌特異的抗原遺伝子、ヒト免疫チェックポイント遺伝子、及び／又はヒト免疫共刺激分子をさらに発現する上記遺伝子改変動物は、これに限定されることはないが、ヒトCD3遺伝子を発現する遺伝子改変動物とヒト癌特異的抗原遺伝子、ヒト免疫チェックポイント遺伝子及び／又はヒト免疫共刺激分子を発現する遺伝子改変動物を交雑する等、当業者公知の方法を適宜用いることによって作製することができる。
【００９８】
非限定の一態様において、本発明のヒトCD3遺伝子を機能的に発現する非ヒト動物として、WO2017/010423またはWO2016/085889に開示される遺伝子改変非ヒト動物が例示される。ヒトCD3遺伝子を機能的に発現する非ヒト動物の作成方法もまた、WO2017/010423またはWO2016/085889に開示される方法が例示される。
【００９９】
９．ヒトGPC3ポリペプチドを発現し、かつヒトCD3遺伝子を機能的に発現する非ヒト動物
本発明はまた、ヒトGPC3ポリペプチドを発現し、かつヒトCD3遺伝子を機能的に発現する非ヒト動物に関する。
【０１００】
非限定の一態様において、本発明の、ヒトGPC3ポリペプチドを発現し、かつヒトCD3遺伝子を機能的に発現する非ヒト動物は、
（i）内因性GPC3ポリペプチドの発現を欠損し、ヒトGPC3ポリペプチドを発現し、かつ、
（ii）内因性のCD3ε、CD3δ及びCD3γからなる群より選ばれる少なくとも1種以上のCD3遺伝子がゲノム上で機能的に欠損し、ヒトCD3ε、CD3δ及びCD3γからなる群より選ばれる少なくとも1種以上のヒトCD3遺伝子を機能的に発現する、
遺伝子改変非ヒト動物である。
【０１０１】
非限定の一態様において、本発明の、ヒトGPC3ポリペプチドを発現し、かつヒトCD3遺伝子を機能的に発現する非ヒト動物は、本明細書において開示されるヒトGPC3ポリペプチドを発現する非ヒト動物と、本明細書において開示されるヒトCD3遺伝子を機能的に発現する非ヒト動物を交配することによって得ることができる。このとき、目的の非ヒト動物が得られているかどうかは、ヒトGPC3ポリペプチドを発現する非ヒト動物と、ヒトCD3遺伝子を機能的に発現する非ヒト動物を交配し、得られた次世代の個体の遺伝子型を解析し、ヒトGPC3ノックインアレル、非ヒトCD3遺伝子領域欠損アレル、かつヒトCD3遺伝子領域を有するアレルが伝達していることを確認することによって、判断することができる。
【０１０２】
１０．ヒトGPC3ポリペプチドを発現し、かつヒトCD3遺伝子を機能的に発現する非ヒト動物を用いた被験物質の評価方法
本発明の非限定の一態様として、以下の工程（１）〜（２）：
（１）非限定の一態様において、本発明の、ヒトGPC3ポリペプチドを発現し、かつヒトCD3遺伝子を機能的に発現する非ヒト動物は、被験物質における、安全性、疾患の治療効果、薬物動態、体内分布など種々の評価に利用することが可能である。従って、本発明は、このような非ヒト動物を利用した被験物質の評価方法をも提供する。別の一態様において、本発明は、被験物質における、安全性、疾患の治療効果、薬物動態、体内分布など種々の評価および/またはスクリーニングに用いるための非ヒト動物を含む。さらに別の一態様において、本発明は、被験物質における、安全性、疾患の治療効果、薬物動態、体内分布など種々の評価および/またはスクリーニングに用いるための、ヒトGPC3ポリペプチドを発現し、かつヒトCD3遺伝子を機能的に発現する非ヒト動物の使用をも含む。
【０１０３】
上記評価方法に用いる被験物質としては、特に限定されるものではないが、好ましくはヒトGPC3に結合するペプチド、たんぱく質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生成物、細胞、細胞抽出物、抗体もしくは抗体断片、または、ヒトCD3に結合するペプチド、たんぱく質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生成物、細胞、細胞抽出物、抗体もしくは抗体断片である。好ましくは、ヒトGPC3に結合する抗体、またはヒトCD3に結合する抗体であり、さらに好ましくは、ヒトGPC3及びヒトCD3に結合する多重特異性抗体である。ヒトGPC3及びヒトCD3に結合する多重特異性抗体の例として、WO2016/047722に記載される公知の抗体が挙げられる。
【０１０４】
また、本明細書において、「ヒトGPC3ポリペプチドを発現する非ヒト動物を用いた被験物質の評価方法」として開示される種々の評価方法を、ヒトGPC3ポリペプチドを発現し、かつヒトCD3遺伝子を機能的に発現する非ヒト動物を用いて実施することも、当然に可能である。
【０１０５】
１１．抗原結合分子
本明細書における「抗原結合分子」とは、抗原結合ドメインを含む分子であれば特に限定されず、さらに、５アミノ酸程度以上の長さを有するペプチドやタンパク質が含まれていてもよい。生物由来のペプチドやタンパク質に限定されず、例えば、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、あるいは合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれであってもよい。
【０１０６】
非限定の一態様において、抗原結合分子の好ましい例として、抗体のFc領域に含まれるFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子を挙げることができる。生体内に投与されたタンパク質の血中半減期を延ばす方法として、目的タンパク質に抗体のFcRn結合ドメインを付加し、FcRnを介したリサイクリング機能を利用する方法が良く知られている。別の一態様において、抗原分子の好ましい例として、抗体を挙げることができる。
【０１０７】
１２．抗体
本明細書において、抗体とは、天然のものであるかまたは部分的もしくは完全合成により製造された免疫グロブリン、又はその断片をいう。抗体はそれが天然に存在する血漿や血清等の天然資源や抗体を産生するハイブリドーマ細胞の培養上清から単離され得るし、または遺伝子組換え等の手法を用いることによって部分的にもしくは完全に合成され得る。抗体の例としては免疫グロブリンのアイソタイプおよびそれらのアイソタイプのサブクラスが好適に挙げられる。ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgMの9種類のクラス（アイソタイプ）が知られている。本発明において抗体には、これらのアイソタイプのうちIgG1、IgG2、IgG3、IgG4が含まれ得る。
【０１０８】
非限定の一態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号；および、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、親抗体のものからクラスまたはサブクラスが変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片も含む。
【０１０９】
非限定の一態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体およびその作製方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)において総説されており、当該技術分野において知られる種々の手法によって製造され得る。
【０１１０】
非限定の一態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において知られる種々の手法によって製造され得る。ヒト抗体は、例えば、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) および Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008) に、概説されている。
【０１１１】
本発明の抗体は、所望の1つまたは複数の活性を伴う抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離してもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリの生成や、所望の結合特性を備える抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングするための、様々な方法が当該技術分野において知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) において総説されている。
【０１１２】
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に結合特異性を有する、モノクローナル抗体である。  多重特異性抗体を作製するための手法は、これらに限定されるものではないが、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの組み換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、WO93/08829、およびTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 参照）、およびknob-in-hole技術（例えば、米国特許第5,731,168号参照）を含む。多重特異性抗体は、Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果 (electrostatic steering effects) を操作すること (WO2009/089004A1)；2つ以上の抗体または断片を架橋すること（米国特許第4,676,980号およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)参照）；ロイシンジッパーを用いて2つの特異性を有する抗体を作成すること（Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 参照）；「ダイアボディ」技術を用いて二重特異性抗体断片を作製すること（Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 参照）；および、単鎖Fv (scFv) 二量体を用いること（Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 参照）；および、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) に記載されるように三重特異性抗体を調製すること、によって作製してもよい。
【０１１３】
「オクトパス抗体」を含む、3つ以上の機能的抗原結合部位を伴う改変抗体も、本明細書では抗体に含まれる（例えば、米国特許出願公開第2006/0025576号A1参照）。
【０１１４】
本明細書で抗体または断片は、特定の抗原と、当該抗原とは別の異なる抗原とに結合する1つの抗原結合部位を含む、「デュアルアクティングFab」または「DAF」も含む（例えば、米国特許出願公開第2008/0069820号参照）
【０１１５】
特定の態様において、抗体または抗体断片は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含み、また、当該配列の翻訳後修飾を含む。翻訳後修飾は、重鎖又は軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。
【実施例】
【０１１６】
次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１１７】
［実施例１］ヒトGPC3ノックインマウスの作出
（１）ノックインインベクターの構築
hGPC3ノックイン（hGPC3KI）ベクターver.1は、マウスグリピカン-3遺伝子（mGpc3）のゲノム領域がクローニングされている人工染色体（BAC）クローン上の、Gpc3遺伝子の標的領域にヒトグリピカン-3遺伝子（hGPC3）のコーディング配列（配列番号：１０）、hp7配列（配列番号：１１）、polyA付加シグナル（配列番号：１２）、loxP配列（配列番号：７）、ネオマイシン耐性（neo）遺伝子（配列番号：１３）をRed/ETシステム（GeneBridge）を利用して相同組換えにより導入した。導入の際、mGpc3の翻訳開始点の直下に、hGPC3の翻訳開始点を合わせる形で挿入した。ベクターの構成を図１（２）に示す。
hGPC3KIベクターver.2は、プラスミドベクターに、mGpc3遺伝子の標的領域の5'側上流領域約800bp、マウスのベータグロビンの第2エクソン（配列番号：１４）、イントロン（配列番号：１５）、第3エクソン（配列番号：１６）、hGPC3遺伝子のコーディング配列、マウスベータグロビンの第3エクソン中のpolyA付加シグナル、loxP配列、neo遺伝子、マウスGpc3遺伝子の標的領域の3'側下流領域約800bpを挿入した。ベクターの構成を図１（３）に示す。
hGPC3KIベクターver.3は、プラスミドベクターに、mGpc3遺伝子の標的領域の5'側上流領域約800bp、マウスのベータグロビンの第2エクソン、イントロン、第3エクソン、hGPC3遺伝子のコーディング配列、mGpc3遺伝子の3'非翻訳領域（配列番号：１７）、mGpc3遺伝子の標的領域の3'側下流領域約800bpを挿入した。ベクターの構成を図１（４）に示す。【０１１８】
（２）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）の設計
mGpc3遺伝子の翻訳開始点付近で遺伝子二本鎖切断（Double strand Break、DSB）が起こるようにZFNの設計を行った。ZFNとは任意の配列に結合が可能なタンパクと遺伝子を二本鎖切断する事が可能なヌクレアーゼが連結した融合タンパクである。ZFNは任意の配列に結合する事で、繰り返しその箇所のDSBを引き起こす。相同組換えはDSBが起こる事で生じる為、標的領域にDSBが繰り返し起こる事で、外来遺伝子の標的領域への挿入効率を上げる事が可能となる。【０１１９】
（３）hGPC3KIベクターver.1およびhGPC3KIベクターver.2のES細胞への導入
hGPC3KIベクターver.1をC57BL(B6)のES（Embryonic stem）細胞へエレクトロポレーションにより導入し、G418による選択培養後に得られた薬剤耐性クローンより相同組換え体をPCRにてスクリーニングした。
hGPC3KIベクターver.2のES細胞への導入は、標的配列を切断するZFNプラスミドベクターもしくはZFN mRNAと共にエレクトロポレーションにより行い、G418による選択培養後に得られた薬剤耐性クローンより相同組換え体をPCRにてスクリーニングした。
スクリーニングには、上記の薬剤耐性クローンより抽出したゲノムをPCRのテンプレートとして用いた。
hGPC3KIベクターver.1をスクリーニングする為のPCR反応液組成は、サンプル1 micro-l、2xGC緩衝液I 12.5 micro-l、dNTP（2.5mM）4 micro-l、プライマー（各50 micro-M）各0.1 micro-l、LA Taq（TAKARA）0.25 micro-l、および蒸留水7.05 micro-l（全25 micro-l）とした。また、PCR条件は、94℃にて5分間の前加熱、94℃にて30秒間、58℃にて30秒間、72℃にて5分30秒間の増幅サイクル35サイクル、並びに72℃にて7分間の複加熱とした。プライマーとしては、フォワードプライマー［5'-AGATGGCTGCCTGTGACATTTCTGGAAGTGT-3'（配列番号：１８）］およびリバースプライマー［5'-CTGAATTAGTTCCCTTCTTCGGCTGGATAA-3'（配列番号：１９）］を使用した。当該プライマーを用いた場合、hGPC3KIベクターver.1がマウス内因性GPC3遺伝子の同一読み取り枠に挿入されていれば、約5．5kbのサイズにバンドが増幅されることが予想された。
hGPC3KIベクターver.2をスクリーニングする為のPCR反応液組成は、hGPC3KIベクターver.1をスクリーニングする為のPCR反応液組成と同様とした。PCR条件は、94℃にて5分間の前加熱、94℃にて30秒間、58℃にて30秒間、72℃にて3分間の増幅サイクル35サイクル、並びに72℃にて7分間の複加熱とした。プライマーとしては、フォワードプライマー［5'-ATGAGACCCAGCAAGCTACACGGGCT-3'（配列番号：２０）］およびリバースプライマー［5'-ACTTGAGCTCCATACTTGCAGACT-3'（配列番号：２１）］を使用した。当該プライマーを用いた場合、hGPC3KIベクターver.2がマウス内因性GPC3遺伝子の同一読み取り枠に挿入されていれば、約2kbのサイズにバンドが増幅されることが予想された。
上記のPCR反応により、hGPC3KIベクターver.1の相同組換えを起こしたES細胞のサンプルでは、約5．5kbのサイズにバンドが増幅された［図３（ａ）］。また、hGPC3KIベクターver.2の相同組換えを起こしたES細胞のサンプルでは、約2kbのサイズにバンドが増幅された［図３（ｂ）］。【０１２０】
（４）hGPC3KIマウスver.1およびhGPC3KIマウスver.2の作出
hGPC3KIベクターver.1およびhGPC3KIベクターver.2の相同組換えESクローンをトリプシン処理により浮遊させ、ES細胞培地で洗浄した。48時間間隔で5IUのウマ絨毛ゴナドトロピン（eCG）およびヒト絨毛ゴナドトロピン（hCG）を腹腔内投与することにより、過剰排卵処理を施したBALB／cの雌マウスを同系統の雄マウスと交配した。雌マウスのプラグが確認された日を0.5日とし、妊娠3.5日に子宮を灌流し、回収した胚盤胞を宿主胚として10〜15個のES細胞を注入した。注入後の胚は、偽妊娠2．5日齢のICR系の受容雌の子宮内に移植し、産仔を得た。ES細胞の胚盤胞への注入によりキメラマウスを得た。雄キメラマウスは性成熟後にB6雌マウスと交配し、ノックインアレルの次世代マウスへの伝達を、PCR法により確認した。PCRは実施例１（３）に記載した方法にて実施した。その結果、hGPC3KIマウスver.1では約5.5kb、hGPC3KIマウスver.2では約2kbのシグナルが検出された個体が得られ、これら個体にはノックインアレルが伝達していることが確認された。【０１２１】
（５）hGPC3KIマウスver.3の作出
hGPC3KIベクターver.3を用いたノックインマウスの作出は、受精卵へKIベクターver.3およびZFNを導入する事で行った。B6マウスから採取した前核期受精卵にKIベクターver.3及びZFN mRNAをマイクロインジェクション法によって注入した。KIベクターver.3およびZFNを注入した受精卵のうち、2細胞期胚にまで発生したものを、ICR（レシピエントマウス）の卵管内に移植した。得られたマウスにhGPC3KIベクターver.3遺伝子を含むファウンダーマウスをPCR法により判別した。PCR反応組成は実施例１（３）と同様の組成で実施し、プライマー及びPCR条件は実施例１（３）に記載のhGPC3KIベクターver.2のスクリーニングと同様の方法で実施した。その結果、約2kbのシグナルが検出されたファウンダーマウスを得た［図３（ｃ）］。得られたファウンダーマウスは性成熟後にB6雄マウスと交配し、ノックインアレルの次世代マウスへの伝達を確認した。【０１２２】
（６）neo遺伝子の除去
ノックインアレルの伝達が確認されたhGPC3KIマウスver.1およびhGPC3KIマウスver.2の個体の繁殖により得た受精卵の前核に環状の組換酵素Cre発現ベクターを顕微注入することによって、neo遺伝子カセットを除去した。すなわち、一過性にCreを発現させることによって、ノックインアレルに配置した2ヶ所のloxP間の組換えが誘導され、neo遺伝子カセットが除去される（図２参照）。Cre発現ベクターの顕微注入後の受精卵は、偽妊娠0.5日のICR系受容雌の卵管内に移植し、19日後に産仔を得た。neo遺伝子カセットの除去の確認は、離乳後の産仔より得たゲノムDNAを用いてPCR法によって実施した。PCR反応組成は実施例１（３）と同様の組成で実施した。また、PCR条件は、94℃にて5分間の前加熱、94℃にて30秒間、58℃にて30秒間、72℃にて2分間の増幅サイクル35サイクル、並びに72℃にて7分間の複加熱とした。プライマーとしては、フォワードプライマー［5'-TGATGATGAAGATGAGTGCATTGGA-3'（配列番号：２２）］およびリバースプライマー［5'-TGGCCAGAACTACGGGTCCAGCT-3'（配列番号：２３）］を使用した。
hGPC3KIマウスver.1に関して、ノックインアレルに由来する増幅産物として約2.5kbのシグナルが検出されるのに対して、neoカセットが除去された個体のサンプルでは約1kbのシグナルが検出された［図４（ａ）］。一方、hGPC3KIマウスver.2においては、ノックインアレルに由来する増幅産物として約3kbのシグナルが検出されるのに対して、neoカセットが除去された個体のサンプルでは約1.6kbのシグナルが検出された［図４（ｂ）］。【０１２３】
（７）hGPC3KIマウスver.1、hGPC3KIマウスver.2およびhGPC3KIマウスver.3の樹立
neo遺伝子カセットの除去が確認されたhGPC3KIマウスver.1およびhGPC3KIマウスver.2の繁殖により、ノックインアレルをホモ接合体化およびヘミ接合体化した個体を得た。同様に、hGPC3KIマウスver.3もノックインアレルの次世代への伝達が確認されたマウス同士の交配により、ノックインアレルをホモ接合体化およびヘミ接合体化した個体を得た。ホモ接合体およびヘミ接合体の確認はPCR法にて実施した。PCR反応組成は実施例１（３）と同様の組成で実施した。
hGPC3KIマウスver.1のPCR条件は、94℃にて5分間の前加熱、94℃にて30秒間、58℃にて30秒間、72℃にて15秒間の増幅サイクル35サイクル、並びに72℃にて7分間の複加熱とした。hGPC3KIマウスver.2のPCR条件は、94℃にて5分間の前加熱、94℃にて30秒間、58℃にて30秒間、72℃にて2分間の増幅サイクル35サイクル、並びに72℃にて7分間の複加熱とした。hGPC3KIマウスver．3のPCR条件は、94℃にて5分間の前加熱、94℃にて30秒間、58℃にて30秒間、72℃にて20秒間の増幅サイクル35サイクル、並びに72℃にて7分間の複加熱とした。
プライマーとしては、hGPC3KIマウスver.1およびhGPC3KIマウスver.3ではフォワードプライマー1［5'-AGGGCCCTGAGCCAGTGGTCAGT-3'（配列番号：２４）］、フォワードプライマー2［5'-TAGCGGCTCCTCTCTTGCTCTGT-3'（配列番号：２５）］およびリバースプライマー［5'-GCCCGGGGCATGTGGACAGAGTCCCATACT-3'（配列番号：２６）］を使用した。hGPC3KIマウスver.2は、実施例１（３）でhGPC3KIベクターver.2のスクリーニングに使用したプライマーを用いた。
hGPC3KIマウスver.1のホモ接合体もしくはヘミ接合体ではノックインアレルに由来する約1.3kbのシグナルは検出されるが、野生型アレル由来の約0.5kbのシグナルは検出されないことを指標として、ホモ接合体およびヘミ接合体を確認した［図５（ａ）］。一方、hGPC3KIマウスver.2はヘミ接合体を約2kbで検出するプライマーで確認した［図５（ｂ）］。hGPC3KIマウスver.3のホモ接合体およびヘミ接合体ではノックインアレルに由来する1kbのシグナルは検出されるが、野生型アレル由来の0.5kbのシグナルは検出されないことを指標として、ホモ接合体およびヘミ接合体を確認した［図５（ｃ）］。【０１２４】
［実施例２］hGPC3KIマウスの発現解析
（1）蛋白の発現確認
hGPC3KIマウス及び野生型マウスの肺ライセ―トを用いてウェスタンブロット法により、各GPC3蛋白の発現を確認した。hGPC3KIマウス及び野生型マウスの肺ライセートは片肺より調製した。各肺ライセ―トにサンプル緩衝液（nacalai、カタログ番号）を添加後、95℃、5分間の加熱し1レーンあたり総タンパク量が50〜450 micro-gとなるように希釈してSDS-PAGEのサンプルとした。SDS-PAGEにより分画した後、メンブレンにトランスファーした。抗ヒトGPC3抗体を一次抗体、HRP標識抗ヒトIgG抗体を二次抗体として用いて検出を行った。ライセ―トの内部標準をTubulin alphaとし、抗Tubulin alpha抗体を一次抗体、HRP標識抗ラットIgG抗体を二次抗体として用い、検出した。
hGPC3KIマウスver.1において、肺ライセ―ト50 micro-gではhGPC3蛋白のシグナルはほぼ検出されなかったが、ライセ―トの濃度を増やす事で、ライセ―トの濃度依存的に検出されるシグナルの強度が増加していった（図６）。一方、hGPC3KIマウスver.2およびver.3の肺ライセ―トでは、30 micro-gでhGPC3蛋白のシグナルを検出した（図７）。GPC3は通常、プロセシングを受ける為、数種類の分子量の蛋白が存在する。その内、一次抗体として使用した抗ヒトGPC3抗体を用いた際は、GPC3蛋白は約20kDaと約60kDa付近に検出される。野生型マウスでは、60kDa付近でPositive controlと同等のサイズに弱いシグナルが検出されたが、20kDa付近ではシグナルが検出されなかった事より、60kDa付近で検出されたシグナルは非特異的シグナルである可能性が高い。hGPC3KIver.2とver.3を比較すると、60kDa、20kDaのシグナル共に、hGPC3Kiver.2の方がver.3に比べて発現量が高い事を示した。一方で、hGPC3KIver.1の発現量は、hGPC3KIver.2およびver.3に比べて著しく低かった。【０１２５】
（２）ｍＲＮＡの発現確認
hGPC3KIマウス、野生型マウス、カニクイザル及びヒトの肺totalRNAを用いてリアルタイムPCR法により、各グリピカン-3 mRNAの発現量を解析した。hGPC3KIマウス及び野生型マウスは片肺よりtotalRNAを調製した。カニクイザルは肺の細気管支の一部分totalRNAを調製した。また、hGPC3KIマウスver.3とヒトとを比較する際は、ver.3の肺を副肺葉、肺前葉、肺中葉、肺後葉および左肺に分けてtotalRNAを調製した。得られた各トータルRNAの量は、260nmにおける吸光度を測定することによって決定した。ヒトの肺totalRNAはClontech社より購入したものを使用した。
hGPC3KIマウスとサル［図８（ａ）］、および、野生型マウスとhGPC3KIマウス［図８（ｂ）］を比較する際に使用したcDNAは、各2.5 micro-gのトータルRNAを鋳型として、SuperScriptIIIFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen）により、逆転写反応で合成した。hGPC3KIマウス ver.3とヒト［図９］を比較する際に使用したcDNAは、各0.5 micro-gのトータルRNAを鋳型として、SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit（Invitrogen）により、逆転写反応で合成した。合成したcDNAを鋳型としてリアルタイムPCRによって、各グリピカン−3を検出した。
検出に用いたプライマーに関して、hGPC3KIマウス、サルおよびヒトを比較する場合は、蛋白コーディング領域にて設定した。フォワードプライマー［5'-GAAACCTTATCCAGCCGAAGA-3'（配列番号：２７）］およびリバースプライマー［5'-GCAAAGGGTGTCGTTTTCC-3'（配列番号：２８）］の組み合わせで実施した。hGPC3KIマウスと野生型マウスを比較する場合はmGpc3遺伝子の5'非翻訳領域にて設定した。フォワードプライマー［5'-CAGGTAGCTGCGAGGAAACT-3'（配列番号：２９）］およびリバースプライマー［5'-CCGACAGAGCAAGAGAGGAG-3'（配列番号：３０）］の組み合わせで実施した。解析は絶対定量法にて行った。hGPC3KIマウスとサル、および、野生型マウスとhGPC3KIマウスの比較の際は、hGPC3 cDNAが挿入されているプラスミドを2.2×1016〜2.2×1023の範囲で調整したものを用い、hGPC3KIマウス ver.3とヒトの比較の際は、hGPC3 cDNAが挿入されているプラスミドを1.0×10〜1.0×108の範囲で調整したものを用いて検量線を作成し、各肺組織におけるグリピカン-3 mRNAのコピー数を算定した。
リアルタイムPCR反応液の組成は、サンプル1 micro-l、FastStart Universal Probe Master（Roche）5 micro-l、Universal Probe（Roche）0.2 micro-l、プライマー（各10 micro-M）各0.2 micro-lおよび蒸留水3.4 micro-l（全10 micro-l）とした。Universal Probeに関して、hGPC3KIマウス、サルおよびヒトを比較する場合は、Universal Probe＃46（Roche）、hGPC3KIマウスと野生型マウスを比較する場合はUniversal Probe＃28（Roche）を使用した。
PCR条件は、50℃にて2分間、95℃にて10分間の前加熱をした後、95℃にて15秒間、60℃にて1分間の増幅サイクル50サイクルとした。
hGPC3KIマウスver.2、ver.3およびカニクイザルの肺におけるGPC3 mRNAの発現量を比較した所、ver.2の発現量が最も高く、ver.3とカニクイザルの発現量はほぼ同等であった［図８（ａ）］。hGPC3KIマウスver.3の発現量は野生型マウスともほぼ同等である事が示された［図８（ｂ）］。さらに、hGPC3KIマウスver.3の発現量がカニクイザルの発現量とほぼ同等であった事から、ver.3とヒトの肺における発現量も比較した所、ヒトとほぼ同等の発現量を示した（図９）。【０１２６】
（３）発現量の比較
蛋白の発現量の結果から、hGPC3KIマウスver.2およびver.3は、ver.1に比べて高い発現量を示した。hGPC3KIマウスver.2およびver.3は、エクソン・イントロン構造を挿入した為、スプライスアウト（スプライシングによってイントロンが除かれること）を起こす設計になっている。その為、それがmRNAの安定性に寄与し、結果として、hGPC3蛋白の安定した合成に繋がったと考えられる。また、hGPC3KIマウスver.2のmRNA量の発現量と比較して、hGPC3KIマウスver.3の発現量はヒトとサルの発現量に近い事が示された。一方で、ver.2の発現量は野生型の発現量よりも高い発現を示した。これはトランスジーンに使用する3'非翻訳領域（3'UTR）の選択により、トランスジーンの発現量をコントロール出来る事を示し、且つ、mGpc3遺伝子の3'UTRを利用する事で、トランスジーンの発現量をヒトもしくはサルの発現量に調節できることが示された。mRNAの発現量は上述のように、様々な要因によってコントロールされており、一概に決まった方法で遺伝子改変マウスを作製しても、目的のレベルの発現量を呈するマウスを作製する事はとても困難である。しかし、我々はこれらの困難を克服し、目的のレベルの発現量を呈するhGPC3KIマウスver.3を樹立する事ができた。
ヒトの発現量に最も近い発現量示すことから、hGPC3KIマウスver.3を中心に以降の機能解析に使用した。【０１２７】
［実施例３］ヒトGPC3ポリペプチドに対する免疫寛容
（１）抗原の免疫
hGPC3KIマウスver.3および野生型マウスにアジュバント（ゲルブアジュバント10:Gerbu GmbH製）と混合した可溶型ヒトGPC3タンパクを0.1 mg/0.1 mlで皮下に投与した。投与は初回投与をday0として、day14, 21, 28, 35, 42, 49, 56に実施した。なお、可溶型ヒトGPC3タンパクは、当業者公知の方法に従って作製された。【０１２８】
（２）抗体価の測定
初回投与をday0として各投与の前にヘパリン処理にて採血し、血漿を得た。血漿中の抗ヒトGPC3抗体の濃度測定は可溶化ヒトGPC3（shGPC3）を固相化した酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）で測定した。4 micro-g/mL  shGPC3溶液（pH9.6）を96well plateに固相化した。各wellを0.05％tween20含有PBS溶液で洗浄した後、サンプルを添加した。2次抗体としてGoat HRP−Anti Mouse IgG（Sigma-Aldrich）を用い、発色試薬としてテトラメチルベンゼン（TMB）基質溶液（SurModics）を用い、1N 硫酸で反応を停止した。UV plateリ−ダ−を用い、吸収波長450 nmにおける吸光度を測定した。結果、野生型マウスに比べて、hGPC3KIマウスver.3において、抗ヒトGPC3抗体価の上昇抑制が観察され、ヒトGPC3に対する免疫寛容が確認された（図１０）。野生型マウスにとってhGPC3は免疫原となる為、自己の免疫機能により移植したヒトGPC3を発現したがん細胞を排除してしまう可能性がある。一方で、ヒトGPC3に対する免疫寛容が成立しているhGPC3KIマウスver.3において、ヒトGPC3は内因性の免疫のターゲットとはならない。その為、マウス内でヒトGPC3を発現したがん細胞を移植した担がんモデルを使用した検体の評価を行う場合、より正確な薬効の評価を行う事ができる。【０１２９】
［実施例４］hGPC3KIマウスver.3を用いた抗ヒトGPC3抗マウスCD3二重特異性抗体の抗腫瘍試験
（１）細胞株
LLC1細胞（ATCCから入手可能。ATCC number: CRL-1642）にヒトGPC3を強制発現させた、LLC1細胞（LLC1/hGPC3）を用いた。LLC1/hGPC3細胞は10%FBS（BIONET社製）、0.5 mg/mLG418（ナカライテスク社製）を含むDulbecco`s Modifid Eagle's Medium培地（SIGMA社製）にて維持継代した。
（２）LLC1/hGPC3移植モデルの作製
LLC1/hGPC3細胞をDulbecco`s Modifid Eagle's Medium培地（SIGMA社製）で1×107個/mLになるように調製した。hGPC3KIマウスver.3の腹部皮下へこの細胞懸濁液100 micro-L（1×106個/マウス）を移植した。腫瘍体積は以下の式にて算出し、腫瘍体積が150〜200mm3程度となった時点でモデル成立とした。
腫瘍体積＝長径×短径×短径／２
（３）投与薬剤の調製
抗ヒトGPC3（hGPC3）抗体と抗マウスCD3（mCD3）抗体を組み合わせた、hGPC3/mCD3二重特異性抗体（hGPC3_mCD3）を作製した。hGPC3側として、配列番号：３１で表される重鎖及び配列番号：３２で表される軽鎖を用いた。また、mCD3側として、配列番号：３３で表される重鎖及び配列番号：３４で表される軽鎖を用いた。hGPC3_mCD3抗体はPBS(-)を用いて、0.5 mg/mL（5 mg/kg投与群）および0.1 mg/mL（1 mg/kg投与群）になるように調製した。
（４）薬剤投与
上記（２）で作製したLLC1/hGPC3移植モデルに対し、腫瘍体積を似て群分けし、上記（３）で調製した抗体試料を10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。陰性対照として、PBS(-)（Vehicle）を同様に10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。
（５）抗腫瘍効果の評価 
hGPC3_mCD3抗体のLLC1/hGPC3移植モデルにおける抗腫瘍効果については移植後19日目の腫瘍体積で評価した。その結果、hGPC3_mCD3抗体の投与により、腫瘍の増殖抑制が有意に認められた（図１１）。
（６）血漿中抗体濃度測定
上記抗体の投与後2時間後、1日後、7日後のhGPC3KIマウスver.3およびver.1より、30 micro-L程度血液をヘパリン処理にて採取した。採取した血液は遠心分離にて血漿を分離した。血漿中のhGPC3_mCD3抗体濃度の測定は可溶化ヒトGPC3（shGPC3）を固相化した酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）で測定した。1 micro-g/mL shGPC3溶液（pH9.6）を96well plateに固相化した。各 wellを0.05% tween20含有TBS溶液で洗浄した後、サンプルを添加した。
２次抗体としてAnti-Human Kappa Light chain Goat IgG Biotin （免疫生物研究所）を添加後、Streptavidin-AP conjugate （Roche Diagnostics）を反応させた。発色試薬としてBlue Phos Microwell phosphatase Substrate System （Kirkegaard&Perry Laboratories）を用い、UV plateリ−ダ−で吸収波長650 nmにおける吸光度を測定した。結果、hGPC3KIマウスにおいて、hGPC3_mCD3抗体は抗原依存的な消失を示し、hGPC3の発現が高いver.3ではver.1に比べて血漿中からの早い消失が確認された（図１２）。【０１３０】
［実施例５］hGPC3_mCD3抗体投与におけるサイトカイン放出
実施例４と同様に、hGPC3_mCD3抗体を調製し、hGPC3KIマウスver.1、hGPC3KIマウスver.3および野生型マウスへ投与を行った。投与前日、投与後2h、6h、24h、48h後に30 micro-l程度血液をヘパリン処理にて採取し血漿を得た。得られた血漿を用い、IFN-gamma、IL-10、IL-17A、IL-2、IL-4、IL-6およびTNFの濃度をBDTMcytometric bead array（CBA）mouse Th1/Th2/Th17 cytokine kit （BD Bioscience社製）にて測定した。その結果、hGPC3抗原に依存したサイトカインの放出がhGPC3KIマウスver.3およびver.1で確認され、ver.1よりもver.3で高い放出量を示した。一方で、hGPC3_mCD3抗体はマウスGPC3には結合しないため、hGPC3が発現していない野生型マウスではサイトカイン放出はほとんど認められなかった（図１３、１４）。サイトカインの上昇は、組織に発現したhGPC3にhGPC3_mCD3抗体が結合し、Ｔ細胞が活性化する事で起こる。hGPC3KIマウスver.3におけるサイトカインの上昇は、ノックインしたhGPC3遺伝子が膜上に発現するなど、本来のGPC3の発現の特徴を反映している事を示す。また、抗ヒトGPC3抗ヒトCD3二重特異性抗体をサルに投与した際も、サイトカインの上昇が確認された事から、hGPC3KIマウスver.3はヒト、サルと同様に薬理作用を示すマウスであると考えられ、それらの薬理作用の評価に有用であり、ヒト由来の疾患関連分子に特異的に作用する薬剤の開発に利用できることが示唆された。【０１３１】
[実施例６]ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスの作出
（１）マウスＣｄ３遺伝子領域改変ベクターの構築（図15Ａ）
マウスＣｄ３ε、Ｃｄ３δおよびＣｄ３γ遺伝子が配置するゲノム領域がクローニングされている大腸菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを用いた。このＢＡＣ上のマウスＣｄ３εをコードする遺伝子領域の５’上流、約３．５ｋｂの位置にｌｏｘＰ配列を挿入するとともに、さらに上流のゲノム領域を約３．１ｋｂ残して除去した。その際、ｌｏｘＰ配列をネオマイシン耐性（ｎｅｏ）遺伝子カセットとともに導入し、Ｒｅｄ／ＥＴシステム（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）を利用して相同組換にて挿入した。その際、カナマイシン添加培地にて生育できた大腸菌クローンの中から、さらにｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法により増幅が正しくなされたクローンを選抜した。次いで、ＢＡＣ上のＣｄ３γ遺伝子の３’下流にｌｏｘＰ配列およびＲｏｘ配列を配置した。すなわち、ｌｏｘＰ配列およびＲｏｘ配列を、ハイグロマイシン耐性（Ｈｙｇ）遺伝子カセットとともに導入し、Ｒｅｄ/ＥＴシステムにより相同組換にて挿入した。その際、ハイグロマイシン添加培地にて生育できた大腸菌クローンの中から、ＰＣＲ法により、ｌｏｘＰ配列およびＲｏｘ配列が期待通り、挿入できたクローンをＰＣＲ法にて選抜した。次いで、Ｈｙｇ遺伝子カセットより３’下流のゲノム領域を約３．４ｋｂ残して除去した。【０１３２】
（２）マウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）へのマウスＣｄ３遺伝子領域改変ベクターの導入（図15Ａ）
マウスＥＳ細胞（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来）に上記のマウスＣｄ３遺伝子領域改変ベクターをエレクトロポレーションにより導入し、Ｇ４１８による選択培養後に得られた薬剤耐性クローンより、相同組み換え体をＰＣＲ法によってスクリーニングした。エレクトロポレーションに用いたマウスＣｄ３遺伝子領域改変ベクターは、６０μｇをＮｏｔＩで直鎖状化、またはＮｏｔＩ未処理による環状のベクターを、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿させＰＢＳに溶解して用いた。
スクリーニングで用いたＥＳ細胞は９６穴プレートで培養し、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ溶液で２回洗浄後、以下の組成の細胞溶解緩衝液（１０×ＬＡ緩衝液II（ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  Ｔａｑ用）５μｌ；２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ５μｌ；５％  ＮＰ−４０  ５μｌ；プロティナーゼＫ（ＴＡＫＡＲＡ，２０ｍｇ／ｍｌ）２μｌ；蒸留水３３μｌ）を加えて５５℃２時間処理し、続いて９５℃にて１５分処理することで、プロティナーゼＫを失活させてＰＣＲサンプルとした。
ＰＣＲ反応混合物は、サンプル１μｌ、１０×ＬＡ緩衝液II  ２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２．５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）４μｌ、プライマー（各５０μＭ）各０．１μｌ、ＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）０．２５μｌ、および蒸留水１４．５５μｌ（全２５μｌ）とした。また、ＰＣＲ条件は、９４℃にて２分間の前加熱、９８℃にて１０秒間、６８℃にて４分３０秒間の増幅サイクル３５サイクル、並びに６８℃にて５分間の複加熱とした。
使用したプライマーは以下の通りである。プライマーは、Ｈｙｇ遺伝子カセット内にＨｙｇＦ１４７４をフォワードプライマーとして配置し、ｇ４９８９ＲをマウスＣｄ３遺伝子改変ベクター上の３’側相同アームよりも３’下流側のマウスゲノム領域にリバースプライマーとして配置した（図16を参照）。相同組み換えを起こしたＥＳ細胞のサンプルでは、約４ｋｂのバンドが増幅される。ＨｙｇＦ１４７４（前方）５’−ＴＡＴＣＡＧＡＧＣＴＴＧＧＴＴＧＡＣＧＧ−３’（配列番号：35）；ｇ４９８９Ｒ（後方）５’−ＡＣＴＣＧＴＴＧＴＧＧＣＴＴＡＧＡＡＧＣＡＧＴＡＡＣＡＡＴＡＣＣ−３’（配列番号：36）。さらに、上記のプライマーセットにより、増幅シグナルの得られたクローンを用いて、別プライマーセットにより確認した。すなわち、マウスＣｄ３遺伝子改変ベクター上の５’側相同アームよりも５’上流側のマウスゲノム領域に、ｅ２７２４８Ｆをフォワードプライマーとして配置し、Ｎｅｏ遺伝子カセット内にＮｅｏ０６３５Ｒをリバースプライマーとして配置した。相同組み換えを起こしたＥＳ細胞のサンプルでは、約４ｋｂのバンドが増幅される。ｅ２７２４８Ｆ（前方）５’−ＡＣＴＧＴＡＡＴＣＣＴＡＧＴＡＣＴＴＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧ−３’（配列番号：37）；Ｎｅｏ０６３５Ｒ（後方）５’−ＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＣＡＡＴＧＧＣＣＧＡＴＣＣ−３’（配列番号：38）。【０１３３】
（３）ヒトＣＤ３遺伝子領域導入ベクターの構築（図15Ｂ）
ヒトＣＤ３ε、ＣＤ３δおよびＣＤ３γ遺伝子が配置するゲノム領域がクローニングされているＢＡＣクローンを用いた。このＢＡＣ上のヒトＣＤ３εをコードする遺伝子領域の５’上流にｌｏｘＰ配列を挿入した。その際、ｌｏｘＰ配列をＨｙｇ遺伝子カセットとともに導入し、Ｒｅｄ／ＥＴシステム（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）を利用して相同組換にて挿入した。その際、ハイグロマイシン添加培地にて生育できた大腸菌クローンの中から、さらにＰＣＲ法により増幅が正しくなされたクローンを選抜した。次いで、ＢＡＣ上のヒトＣＤ３γ遺伝子の３’下流に、Ｆｒｔ配列で両端を挟まれたピューロマイシン耐性（Ｐｕｒｏ）遺伝子および、そのさらに下流にＲｏｘ配列を配置すべく、Ｎｅｏ遺伝子カセットとともに導入し、Ｒｅｄ/ＥＴシステムにより相同組換にて挿入した。その際、カナマイシン添加培地にて生育できた大腸菌クローンの中から、ＰＣＲ法により、Ｆｒｔ配列、Ｐｕｒｏ遺伝子、Ｒｏｘ配列およびＮｅｏ遺伝子が期待通り、挿入できたクローンをＰＣＲ法にて選抜した。【０１３４】
（４）Ｃｄ３遺伝領域改変したマウスＥＳ細胞へのヒトＣＤ３遺伝子領域導入ベクターおよび組換え酵素発現ベクターの導入
上述の工程においてマウスＣｄ３遺伝子領域の標的位置に正しくｌｏｘＰ配列およびＲｏｘ配列を挿入できたＥＳ細胞クローン（１Ｄ４、５Ｈ１、６Ｉ５および３Ａ５）に対して、ヒトＣＤ３遺伝子領域導入ベクター、組換え酵素Ｃｒｅ発現ベクターおよび組換え酵素Ｄｒｅ発現ベクターをエレクトロポレーションにより導入し、ピューロマイシンによる選択培養の後、生育したＥＳ細胞クローンを遺伝子型解析した。
まず、ＣｒｅおよびＤｒｅの作用により、マウスＣｄ３遺伝子領域に配置したｌｏｘＰ配列およびＲｏｘ配列間にて組換えが起こり、Ｃｄ３εからＣｄ３γまでのゲノム領域を欠損したクローンを選別するためのＰＣＲスクリーニングを実施した。スクリーニングで用いたＥＳ細胞は９６穴プレートで培養し、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ溶液で２回洗浄後、以下の組成の細胞溶解緩衝液（１０×ＬＡ緩衝液II（ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  Ｔａｑ用）５μｌ；２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ５μｌ；５％  ＮＰ−４０  ５μｌ；プロティナーゼＫ（ＴＡＫＡＲＡ，２０ｍｇ／ｍｌ）２μｌ；蒸留水３３μｌ）を加えて５５℃２時間処理し、続いて９５℃にて１５分処理することで、プロティナーゼＫを失活させてＰＣＲサンプルとした。
ＰＣＲ反応混合物は、サンプル１μｌ、１０×ＬＡ緩衝液II  ２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２．５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）４μｌ、プライマー（各５０μＭ）各０．１μｌ、ＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）０．２５μｌ、および蒸留水１４．５５μｌ（全２５μｌ）とした。また、ＰＣＲ条件は、９４℃にて２分間の前加熱、９８℃にて１０秒間、６８℃にて４分３０秒間の増幅サイクル３５サイクル、並びに６８℃にて５分間の複加熱とした。使用したプライマーは以下の通りである。プライマーは、マウスＣｄ３ε遺伝子の５’側上流側のゲノム領域にｅ３０２３０Ｆをフォワードプライマーとして配置し、マウスＣｄ３γ遺伝子の３’下流側のゲノム領域にｇ１４３９Ｒをリバースプライマーとして配置した（図17A参照）。Ｃｄ３遺伝子領域を欠損したＥＳ細胞のサンプルでは、約０．７ｋｂのバンドが増幅される。ｅ３０２３０Ｆ（前方）５’−ＴＡＧＣＡＧＣＣＴＴＣＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＧＧＡＣＴＣ−３’（配列番号：39）；ｇ１４３９Ｒ（後方）５’−ＴＴＧＡＴＧＴＧＣＣＡＣＣＴＣＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＧＧ−３’（配列番号：40）。
マウスＣｄ３遺伝子領域を欠損しているＥＳ細胞クローンのうち、ヒトＣＤ３遺伝子領域の導入されているクローンを選抜するためのＰＣＲスクリーニングを実施した。スクリーニングにはマウスＣｄ３遺伝子領域の欠損を検出した際に用いたＰＣＲサンプルを用いた。ＰＣＲ反応混合物は、サンプル１μｌ、１０×ＬＡ緩衝液II  ２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２．５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）４μｌ、プライマー（各５０μＭ）各０．１μｌ、ＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）０．２５μｌ、および蒸留水１４．５５μｌ（全２５μｌ）とした。また、ＰＣＲ条件は、９４℃にて２分間の前加熱、９４℃にて３０秒間、５８℃にて１分間、７２℃にて５分間の増幅サイクル３５サイクル、並びに７２℃にて５分間の複加熱とした。使用したプライマーは以下の通りである。プライマーは、ヒトＣＤ３ε遺伝子の５’側上流側のゲノム領域にｈＣＤ３ｅ＿５ａｒｍ＿Ｆ２をフォワードプライマーとして配置し、ヒトＣＤ３ε遺伝子の第２エクソン内にｈＣＤ３ｅ＿ｅｘ２＿Ｒ２をリバースプライマーとして配置した（図17B参照）。ヒトＣＤ３遺伝子領域が導入されたＥＳ細胞のサンプルでは、約５．５ｋｂのバンドが増幅される。ｈＣＤ３ｅ＿５ａｒｍ＿Ｆ２（前方）５’−ＡＡＣＴＧＡＣＡＡＴＧＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＡ−３’（配列番号：41）；ｈＣＤ３ｅ＿ｅｘ２＿Ｒ２（後方）５’−ＡＴＧＧＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＣＴＡＡＧＡＴ−３’（配列番号：42）。【０１３５】
（５）マウスＣｄ３遺伝子欠損かつヒトＣＤ３遺伝子導入マウスの作出
相同組換えＥＳクローンをトリプシン処理により浮遊させ、ＥＳ細胞培地で洗浄した。４８時間間隔で５ＩＵのウマ絨毛ゴナドトロピン（ｅＣＧ）およびヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を腹腔内投与することにより、過剰排卵処理を施したＢＡＬＢ／ｃの雌マウスを同系統の雄マウスと交配した。雌マウスのプラグが確認された日を０．５日とし、妊娠３．５日に子宮を灌流し、回収した胚盤胞期胚をホスト胚として１０〜１５個のＥＳ細胞を注入した。注入後の胚は、偽妊娠２．５日齢のＩＣＲ系の受容雌の子宮内に移植し、１７日後に産仔を得た。ＥＳ細胞の胚盤胞への注入により得られた産仔の毛色での判別により、組換えＥＳ細胞（黒色）とホスト胚盤胞由来の細胞（アルビノ）の混在したキメラマウスが得られた。雄キメラマウスは性成熟後にＣ５７ＢＬ／６Ｎ雌マウスと交配し、ノックインアレルの次世代マウスへの伝達を、次世代マウスの組織より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により確認した。ＰＣＲは、上述のＥＳ細胞のスクリーニングの際に利用した方法にて実施した。その結果、ヒトＣＤ３遺伝子領域特異的な５．５ｋｂのシグナル、およびマウスＣｄ３遺伝子領域欠損に特異的な０．７ｋｂのシグナルが検出された個体が得られ、これら個体にはヒトＣＤ３遺伝子領域アレルとともにマウスＣｄ３遺伝子領域欠損アレルが伝達されたことが確認された。さらに、上述の遺伝子型のマウスの繁殖により、マウスＣｄ３遺伝子領域についてホモ欠損型であり、かつヒトＣＤ３遺伝子領域を有するマウス個体、すなわちヒトＣＤ３遺伝子領域置換マウスを得た。なお、ヒトＣＤ３εのみを導入したトランスジェニックマウス（以下、ｈＣＤ３εＴｇマウス）をＷａｎｇらの報告（Wang et.al.(1994)PNAS.91:9402-9406）に従って作製し、以降の実験にて比較検討した。【０１３６】
（６）ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスの胸腺および脾臓重量
マウス（１２−１４週齢、雄）より脾臓および胸腺を採取し、組織重量を測定した。図４に示す通り、ヒトＣＤ３置換マウスの胸腺には肉眼的な異常は認められなかった。解析には体重当たりの組織重量を算出した。各群４匹の雄マウスについて、体重、および組織重量（脾臓、胸腺）を測定しグラフに示した。体重あたりの組織重量比を算出し、個体ごとに得られた値を黒点にてプロット、平均値をカラムにて示す（図19）。脾臓重量に関しては、Ｃｄ３遺伝子欠損マウスにて他の遺伝子型のマウスと比較して増加の傾向が認められたが、顕著な差は認められなかった。一方、胸腺重量に関しては、Ｃｄ３遺伝子欠損マウスでは野生型と比較して３分の１程度までの低下が認められた。このＣｄ３遺伝子欠損マウスにヒトＣＤ３遺伝子を導入したヒトＣＤ３遺伝子置換マウスでは、胸腺重量の回復が認められ、特にライン番号１Ｃ３の個体においては野生型マウスと同等の胸腺重量にまで回復が認められた。ｈＣＤ３εＴｇマウスでは、Ｗａｎｇらの報告の通り、胸腺の委縮が認められた（Wang et.al.(1994)PNAS.91:9402-9406）。【０１３７】
（７）ヒトＣＤ３遺伝子置換マウス各ラインにおけるヒトＣＤ３およびマウスＣｄ３の発現確認
−血球ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法での確認−
血球ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりヒトＣＤ３ε、ヒトＣＤ３δ、ヒトＣＤ３γ、マウスＣｄ３ε、マウスＣｄ３δおよびマウスＣｄ３γの発現を解析した。背中足静脈あるいは腹部大静脈より採取した血液より、Ｃａｔｒｉｍｏｘ−１４  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ）を用いてトータルＲＮＡを調製した。各１μｇのトータルＲＮＡを鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ    ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（２０）プライマーを用いて逆転写反応を行なうことによってｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうことによって、ヒトＣＤ３ε、ヒトＣＤ３δ、ヒトＣＤ３γ、マウスＣｄ３ε、マウスＣｄ３δおよびマウスＣｄ３γを検出した。いずれの遺伝子発現の検出にも蛋白コーディング領域に対するプライマーを設定した。ヒトＣＤ３εの検出は、フォワードプライマーＥ０３３３Ｆ（５’−ＡＡＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＴＡＴＴＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＣ−３’（配列番号：43））およびリバースプライマーＥ０９１２Ｒ（５’−ＴＧＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧＴＴＣＴＣＣＡＧＡＧＧ−３’（配列番号：44））の組合せを使用して実施した。ヒトＣＤ３δの検出は、フォワードプライマーＤ００９２Ｆ（５’−ＴＡＧＴＴＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＣＴＴＴＡＴＣＴＡＣＴＧＧ−３’（配列番号：45））およびリバースプライマーＤ０６８５Ｒ（５’−ＡＴＧＧＣＴＧＣＴＴＣＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧ−３’（配列番号：46））の組合せを使用して実施した。ヒトＣＤ３γの検出は、フォワードプライマーＧ００４８Ｆ（５’−ＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧ−３’（配列番号：47））およびリバースプライマーＧ０６６６Ｒ（５’−ＴＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＡＣＴＣ−３’（配列番号：48））の組合せを使用して実施した。一方、マウスＣｄ３εの検出は、フォワードプライマーｅ００６５Ｆ（５’−ＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＡＡＣＡＣ−３’（配列番号：49））およびリバースプライマーｅ０６９９Ｒ（５’−ＴＧＣＴＣＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＴＣＣＡＣＡＧ−３’（配列番号：50））の組合せを使用して実施した。マウスＣｄ３δの検出は、フォワードプライマーｄ０５５Ｆ（５’−ＴＣＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＴＧＣＣＴＣＴＡＴＴＴＧＴＴＧＣ−３’（配列番号：51））およびリバースプライマーｄ６５１Ｒ（５’−ＴＴＧＣＴＡＴＧＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＡＡＡＣＣＴＣＣＡＴＣ−３’（配列番号：52））の組合せを使用して実施した。マウスＣｄ３γの検出は、フォワードプライマーｇ０８０Ｆ（５’−ＡＡＴＡＣＴＴＣＴＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＡＡＧＡＧ−３’（配列番号：53））およびリバースプライマーｇ３１６Ｒ（５’−ＴＡＧＴＴＧＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＣＴＴＡＴＴＡＴＧＣ−３’（配列番号：54））の組合せを使用して実施した。
ＰＣＲ反応液の組成は、サンプル１μｌ、１０×Ｅｘ緩衝液  ２．５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）２μｌ、プライマー（各５０μＭ）各０．１μｌ、Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）０．２５μｌ、および蒸留水１９．０５μｌ（全２５μｌ）とした。また、ＰＣＲ条件は、ヒトＣＤ３δ、ヒトＣＤ３γ、マウスＣｄ３δおよびマウスＣｄ３γに関しては、９４℃にて２分間の前加熱、９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、７２℃にて２分間の増幅サイクル３５サイクル、並びに７２℃にて５分間の複加熱とした。ヒトＣＤ３εおよびマウスＣｄ３εに関しては、９４℃にて２分間の前加熱、９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、７２℃にて２分間の増幅サイクル４０サイクル、並びに７２℃にて５分間の複加熱とした。ヒトＣＤ３ε、ヒトＣＤ３δおよびヒトＣＤ３γの増幅産物は、それぞれ５８０ｂｐ、５９４ｂｐおよび６２０ｂｐ、マウスＣｄ３ε、マウスＣｄ３δおよびマウスＣｄ３γの増幅産物は６３５ｂｐ、５９７ｂｐおよび２３７ｂｐに検出されるようＰＣＲプライマーを設計した。
Ｃｄ３遺伝子欠損マウスではマウスの各Ｃｄ３分子由来のＰＣＲシグナルは検出されなかった。このＣｄ３遺伝子欠損マウスに対して、ヒトＣＤ３遺伝子領域が導入されたヒトＣＤ３遺伝子置換マウスのライン（ライン番号：１Ｃ３，３Ｂ１，８Ｉ１２および２Ａ４）のうち、ライン１Ｃ３および８Ｉ１２に由来するサンプルではヒトＣＤ３ε、ヒトＣＤ３δおよびヒトＣＤ３γのみが検出され、マウスＣｄ３ε、マウスＣｄ３δおよびマウスＣｄ３γはいずれも検出されなかった（図20）。野生型マウス由来のサンプルからはヒトＣＤ３ε、ヒトＣＤ３δおよびヒトＣＤ３γは検出されず、マウスＣｄ３ε、マウスＣｄ３δおよびマウスＣｄ３γが検出された（図20）。この結果より、デザイン通りにマウスＣｄ３ε、Ｃｄ３δおよびＣｄ３γの代わりにヒトＣＤ３ε、ＣＤ３δおよびＣＤ３γが発現するマウスが得られたことが確認された。なお、図６中のライン４ＨＨ３は、マウスＣｄ３アレルが野生型で、ヒトＣＤ３遺伝子が導入されている個体にて解析しており、ヒトの各ＣＤ３分子とマウスの各Ｃｄ３分子の両方が検出されているが、その後、Ｃｄ３欠損マウスとの繁殖により、マウスＣｄ３アレルの欠損したヒトＣＤ３遺伝子の発現ラインとして樹立した。【０１３８】
−組織免疫染色法による解析−
抗ＣＤ３抗体を一次抗体として用い、その組織分布を検討した。Ｃｄ３欠損マウスではいずれの組織においてもＣＤ３の染色は認められなかったが、Ｃｄ３欠損マウスにヒトＣＤ３遺伝子を導入したヒトＣＤ３置換マウスでは、野生型マウスと同等のＣＤ３特異的な染色が認められた。すなわち、胸腺（図21Ａ）および脾臓（図21Ｂ）のＴ細胞ゾーンにおいて特異的な染色が認められた。いずれの組織においても、野生型マウスと同様にＴ細胞ゾーンにのみ染色が認められた。また、Ｃｄ３遺伝子欠損マウスでは染色が認められておらず、ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスにおける染色は導入したヒトＣＤ３遺伝子の発現によるものであることが示された。さらに、主要臓器のおけるＣＤ３の検出は野生型と同様であり、異所性の染色は認められなかった（表１）。
【表１】
2018038046.tif 000002
【０１３９】
（８）ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスにおける成熟Ｔ細胞の存在比率の評価
脾臓細胞を用いたＦＡＣＳ解析を実施した。マウス（１２−１４週齢、雄）より脾臓を採取し、７０μｍメッシュを用いて細胞を単離した。溶血剤（ＳＩＧＭＡ社製）を添加して赤血球を溶解した。Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液にてブロッキング後、２×１０６個の細胞に対して、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣｄ３抗体、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３抗体、ＡＰＣ標識抗マウスＣｄ４抗体、ＰＥ標識抗マウスＣｄ８抗体を用い、各陽性細胞数をフローサイトメーターにて解析した。Ｃｄ３遺伝子欠損マウスにおいては、ほぼ完全に欠損していた成熟Ｔ細胞、すなわちＣｄ４およびＣｄ８単一陽性細胞が、ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスにおいては野生型と同等の比率にて存在していることが示された。【０１４０】
成熟Ｔ細胞の存在比率
【表２】
2018038046.tif 000003
脾臓細胞あたりの、各マーカー陽性細胞の発現比率（単位％）を表に示した。ヒトCD3s置換マウス#4HH3を除く各実験群は4個体の平均を示し、ライン#4HH3については2個体の発現比率を示した。（括弧内は標準偏差を示す）
ND, not detected.【０１４１】
[実施例７]ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスにおける脾臓細胞の細胞増殖能の評価
マウス（１２週齢、雄）より脾臓を採取し、７０μmメッシュを用いて細胞を単離した。溶血剤（ＳＩＧＭＡ社製）を添加して赤血球を溶解した。単離した脾臓細胞にＴ細胞マイトジェンのＰＨＡ  （ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ, ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、５日間培養した後、細胞増殖アッセイ用試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ，  Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＭＴＳアッセイを実施した。各遺伝子型の細胞増殖活性について、マイトジェン非添加における活性を１とした場合の相対比率にて表した（図23）。
その結果、Ｃｄ３遺伝子欠損マウスの脾臓細胞では、マイトジェン刺激に対する細胞増殖活性は、マイトジェン非添加より低下の傾向が認められ、野生型マウスの約60％であった。一方、ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスと野生型マウスの脾臓細胞では、マイトジェン刺激により細胞増殖活性は増加し、その活性はヒトＣＤ３遺伝子置換マウスでは野生型マウスと比較し約９０％であることが示された。【０１４２】
[実施例８]ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスの脾臓細胞におけるサイトカイン産生の評価
マウスより脾臓を採取し、７０μｍメッシュを用いて細胞を単離し、溶血剤を添加して赤血球を溶解し、脾臓細胞を調製した。Ｔ細胞マイトジェンのＰＨＡ (phytohaemagglutinin)を終濃度１μg/mL添加した培養液にて３日間培養した後、培養液中に産生されたサイトカインを測定した（図24）。
その結果、Ｃｄ３遺伝子欠損マウスの脾臓細胞では、マイトジェン刺激によるサイトカイン産生は認められないのに対し、ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスでは、サイトカイン産生が認められ、その機能は回復していることが示された。【０１４３】
[実施例９]ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスの脾臓細胞におけるヒトＣＤ３抗体に対する反応性の評価
マウスより脾臓を採取し、７０μｍメッシュを用いて細胞を単離し、溶血剤を添加して赤血球を溶解し、脾臓細胞を調製した。抗ヒトＣＤ３抗体にて固層化を施したプレートに細胞を播種し、培養３日後の細胞増殖活性を評価するためＭＴＳアッセイを実施した（図25Ａ、Ｂ）。また、培養液中に産生されたサイトカインを測定した（図25Ｃ、Ｄ）。
その結果、ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスは抗ヒトＣＤ３抗体の刺激に特異的に反応し、細胞増殖活性（図25Ｂ）、およびサイトカイン産生（図25Ｄ）が示された。そのレベルは、野生型マウスの抗マウスＣＤ３抗体の刺激に対する反応性と同程度であった。この結果により、ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスは、正常な機能を有するヒトＣＤ３を発現していることが示された。【０１４４】
[実施例１０]ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスの免疫機能評価
（１）外来抗原感作に対する特異的抗体産生能の検討
外来抗原に対して特異的な抗体を産生するためには、樹状細胞等、抗原提示細胞の表面に主要組織適合性抗原（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）とともに提示された抗原ペプチドに結合できる機能的なヘルパーＴ細胞が存在し、抗体産生細胞に適切な抗体を産生させるための指令を出す機能を保有していなければならない。上述のヒトＣＤ３遺伝子置換マウスが、正常な機能を持つヘルパーＴ細胞を持ち、外来抗原の感作に対して特異的抗体を産生することができるかどうかを検討した。感作抗原としては、ニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）をフロイント・アジュバンドとともに感作した。ＯＶＡの感作は４週間間隔にて２回行った。すなわち、１匹当たり１００μｇのＯＶＡを、１回目は完全フロイント・アジュバンドを用いて背部皮下に感作し、その４週間後に不完全フロイント・アジュバンドを用いて同様に背部皮下に感作した。ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスとしては、由来する改変ＥＳ細胞クローンの異なる２ライン（ライン番号１Ｃ３および８Ｉ１２）を設定し、ヒトＣＤ３ε過剰発現マウスと比較した。さらに、対照として、野生型マウスおよびＣｄ３遺伝子欠損マウスを設定して同様の抗原感作を行った。
２回目の感作の１週間後に、イソフルラン吸入麻酔下にて開腹し、腹部大静脈より全採血および放血することによって安楽死処置を施した。採取した血液より血清を分離し、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１およびＯＶＡ特異的ＩｇＥの濃度を測定した（図26）。
その結果、マウスＣｄ３欠損マウスの血清中からはＯＶＡ特異的抗体は、ＩｇＧ１タイプもＩｇＥタイプのいずれも検出されなかったのに対し、ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスは２ラインともＯＶＡ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＥが検出され、そのレベルは野生型マウスと同等であった。この結果により、ヒトＣＤ３遺伝子置換マウスは、外来抗原の感作に対して正常な抗体産生能を有していることが示された。【０１４５】
[実施例１１]ヒトHER2発現マウス肝細胞ガン株移植モデルにおける抗ヒトHER2抗ヒトCD3二重特異性抗体の抗腫瘍効果
（１）細胞株
ヒトHER2を強制発現させたHepa1-6細胞（Hepa1-6/HER2）を用いた。Hepa1-6/HER2細胞は10%FBS（BOVOGEN社製）、0.5 mg/mL Zeocin (ナカライテスク社製)を含むDulbecco's Modifid Eagle's Medium培地（SIGMA社製）にて維持継代した。
（２）Hepa1-6/HER2移植モデルの作製
Hepa1-6/HER2細胞をDulbecco's Modifid Eagle's Medium培地（SIGMA社製）とマトリゲルにて1×１０8個／ｍLになるように調製した。mCd3 KO homo, hCD3 Tg型マウス#1C3（19週齢）の腹部皮下へこの細胞懸濁液100μL（1×１０7個／マウス）を移植した。腫瘍体積は以下の式にて算出し、腫瘍体積が160〜234 mm3になった時点でモデル成立とした。
腫瘍体積＝長径×短径×短径/2
（３）投与薬剤の調製
Her2とCD3に対する二重特異性抗体（HER2_CD3抗体）はＰＢＳ（−）を用いて、0.5 mg/mL（5 mg/kg投与群）になるように調製した。HER2_CD3抗体（HER2結合H鎖可変領域：配列番号：55および56、HER2結合L鎖可変領域：配列番号：57および58、CD3結合H鎖可変領域：配列番号：59および60、CD3結合L鎖可変領域：配列番号：61および62）は、当業者公知の方法に従って作製された。
（４）薬剤投与
（２）で作製したHepa1-6/HER2移植モデルに対し、腫瘍体積にて群分けし、上記（３）で調製した抗体試料を10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。陰性対照として、ＰＢＳ（−）（Vehicle）を同様に10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。
（５）抗腫瘍効果の評価
HER2_CD3抗体のHepa1-6/HER2移植モデルにおける抗腫瘍効果については移植後28日目の腫瘍体積（図27）で評価した。統計解析にはJMP（SAS Institute Inc.）を用い、統計解析は最終測定日の腫瘍体積を用いて、Wilcoxon検定にて確認した。（有意水準は両側5%）その結果、HER2_CD3抗体の投与により、腫瘍の増殖抑制が有意に認められた。【０１４６】
[実施例１２]ヒトGlypican3（GPC3）発現マウス肝細胞ガン株移植モデルにおける免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果
（１）細胞株
ヒトGPC3を強制発現させたHepa1-6細胞（Hepa1-6/hGPC3）を用いた。Hepa1-6/hGPC3細胞は10%FBS（BOVOGEN社製）、0.6 mg/mL G418 (ナカライテスク社製)を含むDulbecco's Modifid Eagle's Medium培地（SIGMA社製）にて維持継代した。
（２）Hepa1-6/hGPC3移植モデルの作製
Hepa1-6/hGPC3細胞をDulbecco's Modifid Eagle's Medium培地（SIGMA社製）とマトリゲルにて5×１０7個／ｍLになるように調製した。mCd3 KO homo, hCD3 Tg型マウス#1C3（20週齢）の腹部皮下へこの細胞懸濁液200μL（1×１０7個／マウス）を移植した。腫瘍体積は以下の式にて算出し、腫瘍体積が160〜300 mm3になった時点でモデル成立とした。
腫瘍体積＝長径×短径×短径/2
（３）投与薬剤の調製
免疫チェックポイント阻害剤である、抗マウスCTLA-4抗体（clone:UC10-4F10-11, BioXcell社製）、抗マウスPD-1抗体（clone:RMP1-14, BioXcell社製）、抗マウスPD-L1抗体（clone:10F.9G2, BioXcell社製）はＰＢＳ（−）を用いて、1 mg/mL（0.2 mg/head投与）になるように調製した。
（４）薬剤投与
（２）で作製したHepa1-6/hGPC3移植モデルに対し、腫瘍体積にて群分けし、上記（３）で調製した抗マウスCTLA-4抗体、抗マウスPD-1抗体、抗マウスPD-L1抗体を0.2 mL/mouseにて尾静脈より投与した。陰性対照として、ＰＢＳ（−）（Vehicle）を同様に尾静脈より投与した。投与は腫瘍移植後7日(群分け当日)、12日（群分け5日後）の二回実施した。
（５）抗腫瘍効果の評価
Hepa1-6/hGPC3移植モデルにおける抗腫瘍効果については腫瘍体積の推移（図28）で評価した。その結果、免疫チェックポイント阻害剤の投与により、腫瘍の増殖抑制が認められた。【０１４７】
[実施例１３]抗ヒトCTLA4/抗ヒトCD3二重特異性抗体による、in vivo薬効評価
13-1.  ヒトCTLA4およびヒトCD3に特異的に結合する二重特異性抗体の発現と精製
抗ヒトCTLA4側として重鎖可変領域MDX10D1H（配列番号：63）および軽鎖可変領域MDX10D1L（配列番号：64）を用いた。この時定常領域はFcγ受容体への結合を低減し、2つの重鎖がヘテロ会合化するように改変を加えた重鎖定常領域mF18mN4（配列番号：65）、軽鎖定常領域mk1（配列番号：66）を使用している。これら遺伝子を動物発現プラスミドに挿入した。【０１４８】
また抗ヒトCD3側としては、重鎖可変領域TR01H113（配列番号：67）、軽鎖可変領域L0011（配列番号：68）、この時定常領域はFcγ受容体への結合を低減し、2つの重鎖がヘテロ会合化するように改変を加えた重鎖定常領域mF18mP4（配列番号：69）、軽鎖定常領域mk1（配列番号：66）を使用している。これら遺伝子を動物発現プラスミドに挿入した。【０１４９】
抗ヒトCTLA4抗体および抗ヒトCD3抗体は以下の方法を用いて抗体を発現させた。FreeStyle 293 Expression Medium培地（Invitrogen）に1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で懸濁し、播種したヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrogen）に対して、リポフェクション法により調製されたプラスミドを導入した。CO2インキュベーター（37℃、8%CO2、90 rpm）で4日間培養した培養上清から、Hi TrapTM Protein G HPカラム（GE Healthcare）を用いて当業者公知の方法で抗体を精製した。分光光度計を用いて、精製した抗体溶液の280 nmでの吸光度を測定した。得られた測定値からPACE法により算出した吸光係数を用いて、精製した抗体の濃度を算出した（Protein Science (1995) 4, 2411-2423）。【０１５０】
精製したそれぞれのホモ体は表３の組み合わせで、定常領域の電荷の違いを利用した当業者公知の方法（WO2015/046467）で混合し、目的の二重特異性抗体）を作製した。
【表３】
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【０１５１】
13-2.  同系腫瘍株移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果の評価
13-2-1.  細胞株
Colon38細胞は（公財）がん研究会から譲渡されたものを使用した。Colon38細胞は10%FBS（SIGMA社製）を含む、RPMI1640 （SIGMA社製）にて維持継代した。【０１５２】
13-2-2.  同系腫瘍株移植マウスモデルの作製
ヒトCD3遺伝子置換マウスをヒトCTLA4遺伝子置換マウス (Blood 2005 106:3127-3133)と交雑することにより、ヒトCD3遺伝子置換かつヒトCTLA4遺伝子置換マウスを樹立し、抗腫瘍効果評価用モデルマウスとして使用した。
マウスへ自家移植する腫瘍細胞株としてColon38を用いた。マウスの皮下に細胞を移植し、移植腫瘍の体積が100mm3程度以上になったものをモデル成立とした。
移植腫瘍の体積は以下の式にて算出した。
腫瘍体積＝長径×短径×短径/2【０１５３】
13-2-3.  投与薬剤の調製
Colon38細胞移植モデルへの投与薬剤としては、13-1.で作製した抗ヒトCTLA4/抗ヒトCD3バイスペシフィックモノクローナル抗体（MDX10//TR01H113）を用いた。媒体としてヒスチジンバッファー（150mM NaCl/20mM His-HCl buffer, pH 6.0、以下単にバッファーと表記）を用い1000μg/mLになるように調製した。【０１５４】
13-2-4.  薬剤投与
Colon38細胞移植モデルでのMDX10//TR01H113抗体の評価においては、移植後12日目にMDX10//TR01H113を200μg/mouseもしくはControl群（ベヒクル投与群）としてバッファーを0.2 mL/mouse、尾静脈より投与した。【０１５５】
薬剤処置に関する詳細は表４に示した。
【表４】
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【０１５６】
13-2-5.  抗腫瘍効果の評価
抗腫瘍効果については、８-2-2に記した計算式にて算出した腫瘍体積で評価した。統計解析にはJMPTM 11.2.1（SAS Institute Inc.）を用いた。
その結果、抗マウスCTLA4/CD3バイスペシフィックモノクローナル抗体を投与すると、Control群と比較して、腫瘍の増殖抑制が有意に認められた（図29）。【０１５７】
[実施例１４]ヒトGPC3ノックイン・ヒトCD3遺伝子置換マウスの作出
ヒトGPC3ノックインマウスとヒトCD3遺伝子置換マウスを交配し、得られた次世代の個体の遺伝子型解析により、ヒトGPC3ノックインアレル、マウスＣｄ３遺伝子領域欠損アレル、かつヒトＣＤ３遺伝子領域を有するアレルが伝達しているマウス系統を樹立した。【０１５８】
[実施例１５］ヒトGPC3ノックイン・ヒトCD3遺伝子置換マウスを用いた抗ヒトGPC3抗マウスCD3二重特異性抗体の抗腫瘍試験
（１）細胞株
Hepa1-6細胞（ATCCから入手可能。ATCC number: CRL-1830）にヒトGPC3を強制発現させた、Hepa1-6細胞（Hepa1-6/hGPC3）を用いた。Hepa1-6/hGPC3細胞は10%FBS（BIONET社製）、0.6 mg/mLG418（ナカライテスク社製）を含むDulbecco`s Modifid Eagle’s Medium培地（SIGMA社製）にて維持継代した。
（２）Hepa1-6/hGPC3移植モデルの作製
Hepa1-6/hGPC3細胞をDulbecco`s Modifid Eagle’s Medium培地（SIGMA社製）で2×108個/mLになるように調製し、等容量のＭａｔｒｉｇｅｌを添加した（1×108個/mL）。ヒトGPC3ノックイン・ヒトCD3遺伝子置換マウスの腹部皮下へこの細胞懸濁液100 μL（1×107個/マウス）を移植した。腫瘍体積は以下の式にて算出し、腫瘍体積が160〜360mm3程度となった時点でモデル成立とした。
腫瘍体積＝長径×短径×短径／２
（３）投与薬剤の調製
ヒトGPC3およびヒトCD3に対する二重特異性抗体（hGPC3_hCD3抗体）はPBS(-)を用いて、0.5 mg/mL（5 mg/kg投与群）、0.1 mg/mL（1 mg/kg投与群、）0.02 mg/mL（0.2 mg/kg投与群）になるように調製した。hGPC3_hCD3抗体は、抗ヒトCD3側として重鎖可変領域TR01H113（配列番号：67）および重鎖定常領域E2702sKsc（配列番号：70）、抗ヒトGPC3側として重鎖可変領域GCH065（配列番号：71）および重鎖定常領域E2704sEpsc（配列番号：72）、共通軽鎖として、軽鎖可変領域L0011（配列番号：73）および軽鎖定常領域k0（配列番号：74）を用いて、当業者公知の方法に従って作製された。
（４）薬剤投与
上記（２）で作製したHepa1-6/hGPC3移植モデルに対し、腫瘍体積を似て群分けし、上記（３）で調製した抗体試料を10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。陰性対照として、PBS(-)（Vehicle）を同様に10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。
（５）抗腫瘍効果の評価
hGPC3_hCD3抗体のHepa1-6/hGPC3移植モデルにおける抗腫瘍効果については移植後29日目の腫瘍体積で評価した。その結果、hGPC3_hCD3抗体の投与により、用量依存的な腫瘍の増殖抑制が認められた（図30）。
（６）hGPC3_hCD3抗体投与におけるサイトカイン放出
投与前日、初回投与後6h、24h、二回目投与前日及び6h後に30μl程度血液をヘパリン処理にて採取し血漿を得た。得られた血漿を用い、IFNγ、IL-10、IL-17、IL-2、IL-4、IL-6およびTNFの濃度をBDTMcytometric bead array（CBA）mouse Th1/Th2/Th17 cytokine kit 2（BD Bioscience社製）にて測定した。その結果、hGPC3抗原に依存したサイトカインの放出がヒトGPC3ノックイン・ヒトCD3遺伝子置換マウスで確認された。しかし、二回目投与後のサイトカインの放出はほとんど認められなかった。（図31）サイトカインの上昇は、組織に発現したhGPC3にhGPC3_hCD3抗体が結合し、Ｔ細胞が活性化する事で起こる。ヒトGPC3ノックイン・ヒトCD3遺伝子置換マウスにおけるサイトカインの上昇は、hGPC3KIマウスと同様、ノックインしたhGPC3遺伝子が膜上に発現するなど、本来のGPC3の発現の特徴を反映している事を示す。また、抗ヒトGPC3抗ヒトCD3二重特異性抗体をサルに投与した際も、サイトカインの上昇が確認された事から、ヒトGPC3ノックイン・ヒトCD3遺伝子置換マウスもヒト、サルと同様に薬理作用を示すマウスであると考えられ、更に、ヒト、サルと交差するCD3アームをもつ抗体を評価することができるため、それらの薬理作用の評価に有用であり、ヒト由来の疾患関連分子に特異的に作用する薬剤の開発に利用できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１５９】
本発明は、非ヒト動物の内因性GPC3ポリペプチドの発現を欠損し、かつ生理的に妥当なレベルでヒトGPC3ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物、当該非ヒト動物の作製方法、及び当該非ヒト動物を用いた被験物質の評価方法を提供するものである。したがって、本発明は、特に、ヒトGPC3ポリペプチドを発現するがんを含む疾患の治療薬の開発に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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