(57)【要約】【課題】バイオセンサの検出特異性を高める。【解決手段】検出対象物質と結合することができる識別物質と、前記識別物質の電荷を帯電する電極とを備え、前記検出対象物質が前記識別物質に結合することにより生じる前記電極の電荷密度の変化を検出するバイオセンサにおいて、前記電極の表面がポリカテコールアミンによりコーティングされており、ポリカテコールアミンによりコーティングされた前記電極表面の全部又は一部には、さらに、検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成されたポリマー層が形成されており、前記ポリマー層は前記識別物質を含み、前記ポリマー層は超薄膜層であることを特徴とする、バイオセンサを提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象物質と結合することができる識別物質と、前記識別物質の電荷を帯電する電極とを備え、前記検出対象物質が前記識別物質に結合することにより生じる前記電極の電荷密度の変化を検出するバイオセンサにおいて、
前記電極の表面がポリカテコールアミンによりコーティングされており、
ポリカテコールアミンによりコーティングされた前記電極表面の全部又は一部には、さらに、検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成されたポリマー層が形成されており、
前記ポリマー層は前記識別物質を含み、
前記ポリマー層は超薄膜層であることを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオセンサであって、
前記ポリカテコールアミンが、Ｌ−ドーパ、ドーパミン、アドレナリン、または、ノルアドレナリンの重合物であることを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項３】
請求項１に記載のバイオセンサであって、
前記超薄膜層は、厚さが１μｍ以下の薄膜層であることを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項４】
請求項３に記載のバイオセンサであって、
前記超薄膜層は、厚さが１００ｎｍ以下の薄膜層であることを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項５】
請求項１に記載のバイオセンサであって、
前記検出対象物質はカテコールアミンであり、
前記バイオセンサは、Ｌ−ドーパを実質的に検出しないことを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項６】
請求項５に記載のバイオセンサであって、
前記検出対象物質はドーパミン、アドレナリン、または、ノルアドレナリンであることを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項７】
請求項５または６に記載のバイオセンサであって、
前記識別物質は、フェニルボロン酸であることを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のバイオセンサであって、
前記電極が、金電極、銀電極、銅電極、白金電極、インジウム−スズ酸化物（ＩＴＯ）電極、パラジウム電極、鋼電極、ニッケルチタン合金電極、酸化チタン電極、二酸化ケイ素電極、水晶電極、酸化アルミニウム電極、ガリウムヒ素電極、ガラス電極、または、酸化タンタル電極であることを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のバイオセンサであって、
前記電極が、電界効果トランジスタのゲート電極に電気的に接続されている
ことを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項１０】
請求項９に記載のバイオセンサであって、
前記電極は、前記電界効果トランジスタから離れて配置されており、
前記電極は、配線を介して、前記電界効果トランジスタの前記ゲート電極と電気的に接続されていることを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項１１】
請求項９に記載のバイオセンサであって、
前記電極が、前記電界効果トランジスタのゲート絶縁膜上に直接に載置されることにより、前記ゲート絶縁膜に電気的に接続されていることを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のバイオセンサであって、
前記電極が、信号増幅器に電気的に接続されていることを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項１３】
請求項１２に記載のバイオセンサであって、
前記信号増幅器が、オペアンプであることを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のバイオセンサであって、
前記ポリマー層は、
（ａ）：１または複数種のモノマー、前記検出対象物質、および、前記識別物質、を含むモノマー溶液を前記電極の表面の全部又は一部において重合させることにより、前記電極の表面の全部または一部に超薄膜層であるポリマー層を形成させるステップ、および、
（ｂ）：前記ステップ（ａ）の後、前記ポリマー層から前記検出対象物質を除去することにより、前記ポリマー層に前記検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型を形成させるステップ、
を含む方法によって形成されることを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項１５】
請求項１４に記載のバイオセンサであって、
前記モノマー溶液の重合が、リビングラジカル重合、または、電解重合であることを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項１６】
請求項１５に記載のバイオセンサであって、
前記リビングラジカル重合は、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加−開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）、または、ニトロキシドを介した重合（ＮＭＰ）であることを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項１７】
請求項１６に記載のバイオセンサであって、
前記リビングラジカル重合は、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）であり、
前記ステップ（ａ）に先立って、重合開始分子が電極の表面の全部又は一部にあらかじめ結合されることを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項１８】
請求項１４に記載のバイオセンサであって、
前記ステップ（ａ）が、１または複数種のモノマー、前記検出対象物質、および、前記識別物質、を含むモノマー溶液を、スピンコートを用いて電極の表面の全部又は一部に適用し、適用されたモノマー溶液を重合させることにより、前記電極の表面の全部または一部に超薄膜層のポリマー層を形成させるステップ、であることを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項１９】
請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のバイオセンサであって、
前記モノマー溶液が、アクリルアミド誘導体、メタクリルアミド誘導体、アクリレート誘導体、メタクリレート誘導体、アクリロニトリル、２−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、Ｎ−ビニル−２−ピロリドンおよび酢酸ビニルからなる群から選択される少なくとも１種類のモノマーを含むことを特徴とする、
バイオセンサ。
【請求項２０】
バイオセンサにおいて使用される電極であって、
前記バイオセンサは、検出対象物質が識別物質に結合することにより生じる前記電極の電荷密度の変化を検出するバイオセンサであり、
前記電極は、前記検出対象物質と結合することができる前記識別物質の電荷を帯電する電極であり、
前記電極の表面はポリカテコールアミンによりコーティングされており、
ポリカテコールアミンによりコーティングされた前記電極の表面の全部又は一部には、さらに検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成されたポリマー層が形成されており、
前記ポリマー層には前記識別物質を含み、
前記ポリマー層は超薄膜層である
ことを特徴とする、
電極。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れた検出特異性および検出感度を有するバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々なバイオセンサが研究・開発され、医療、創薬、臨床検査等の分野で利用されている。バイオセンサは、生物の持つ優れた分子識別力を利用して外界の情報（例えば、化学的要素）を何らかの物理的な信号として認識するもので、様々な原理や測定対象がある。より詳細には、バイオセンサは、化学物質を測定対象とする化学センサの一種であり、測定対象物質のみを認識する分子識別素子と、認識したという情報を電気的な信号等の物理的な信号に変換する信号変換素子とで構成される。一般には、分子識別素子には、酵素、抗体、ＤＮＡ、細胞、微生物等の生体分子や生体分子を捉える化合物を用いるため、これらのセンサはバイオセンサと呼ばれる。【０００３】
また、信号変換素子としては、電極、サーミスタ、水晶振動子、表面プラズモン共鳴、半導体素子等の通常の電子機器や化学センサが使用されるが、最近では電界効果トランジスタ（ＦＥＴ：Ｆｉｅｌｄ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）を用いたバイオセンサの研究が盛んになってきている。ＦＥＴを用いたバイオセンサでは、分子識別素子が測定対象となる化学物質を認識すると、熱、質量、電荷等の物理的変化や対象物質の分解、物質の生成等の化学的変化が起こり、この変化を電荷変化もしくはキャパシタンス変化として信号変換素子であるＦＥＴで電気信号に変換して対象物質を測定する。ＦＥＴを用いたバイオセンサは、（１）イオンや分子固有の電荷を電気的に検出できる、（２）測定までの手間や時間がかからない、（３）リアルタイム測定が可能である、（４）非標識、非侵襲での電気的計測が可能である、（５）半導体の微細加工技術により小型化、集積化が可能である、等の特徴を有する。【０００４】
これまでに、非侵襲的に採取した微量の体液試料を使用可能であり、且つ、微量の試料を用いた場合や試料中の測定対象物質の濃度が低い場合であっても対象物質を高精度に測定可能な、高感度のバイオセンサが提案されている（例えば特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１４／１７８２３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献１に記載のバイオセンサは、体液中に含まれる微量の測定対象物質を測定可能とした点において画期的な発明であった。しかし、体液中には測定対象物質以外の様々な物質が含まれているため、このようなバイオセンサを実用化するにあたっては、測定対象物質に対する検出感度を高めるのみならず、測定対象物質以外の誤検出を防ぐ（すなわち、検出特異性を高める）必要があった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、バイオセンサの検出特異性を高めるため鋭意研究を重ねた結果、バイオセンサのゲート電極（被験試料と接する電極）をカテコールアミンの重合物（ポリカテコールアミン）でコーティングすることにより、被験試料中の物質の当該ゲート電極への非特異的な吸着を防ぎ、検出ノイズをほぼ完全に除去し得ることを見出した。【０００８】
さらに本発明者らは、ポリカテコールアミンでコーティングされたバイオセンサのゲート電極上に分子鋳型ポリマー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ：ＭＩＰ）の層を積層することにより、被験試料中の検出対象物質のみがゲート電極と相互作用するように設計可能であることを見出した。なお、本明細書において、分子鋳型ポリマーとは、所定の作成方法によって、当該ポリマー表面やポリマー中において、検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する“分子鋳型”が形成されたものをいい、当該分子鋳型には、当該検出対象物質のみが組み込まれることができる。【０００９】
さらに、本発明者らは、分子鋳型ポリマーをゲート電極に適用したバイオセンサの実用化に向けてさらに研究を重ねた。すると、本発明者らは、簡易的な方法により作製した分子鋳型ポリマーをゲート電極に適用したバイオセンサは、確かに従来技術と比較して検出対象物質に対する特異性は向上するものの、分子鋳型ポリマー層の厚みにより、検出対象物質に対する検出感度と検出の安定性がやや低下するという新たな技術的課題に遭遇した。【００１０】
ここで、本発明者らは、主に高分子化学の分野において用いられるポリマーの制御技術を本技術分野に応用することにより、ゲート電極に適用される分子鋳型ポリマー層の膜厚を制御することに成功し、これにより、分子鋳型ポリマー層を超薄膜層とすることを可能とした。超薄膜の分子鋳型ポリマー層を有するゲート電極は、検出対象物質に対する検出特異性のみならず、極めて高い検出感度も兼ね備える。【００１１】
すなわち本発明は、一実施形態において、検出対象物質と結合することができる識別物質と、前記識別物質の電荷を帯電する電極とを備え、前記検出対象物質が前記識別物質に結合することにより生じる前記電極の電荷密度の変化を検出するバイオセンサにおいて、前記電極の表面がポリカテコールアミンによりコーティングされており、ポリカテコールアミンによりコーティングされた前記電極表面の全部又は一部には、さらに、検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成されたポリマー層が形成されており、前記ポリマー層は前記識別物質を含み、前記ポリマー層は超薄膜層であることを特徴とする、バイオセンサに関する。【００１２】
また、本発明の一実施形態においては、前記ポリカテコールアミンが、Ｌ−ドーパ、ドーパミン、アドレナリン、または、ノルアドレナリンの重合物であることを特徴とする。【００１３】
また、本発明の一実施形態においては、前記超薄膜層は、厚さが１μｍ以下の薄膜層であることを特徴とする。【００１４】
また、本発明の一実施形態においては、前記超薄膜層は、厚さが１００ｎｍ以下の薄膜層であることを特徴とする。【００１５】
また、本発明の一実施形態においては、前記検出対象物質がカテコールアミンであり、前記バイオセンサは、Ｌ−ドーパを実質的に検出しないことを特徴とする。【００１６】
また、本発明の一実施形態においては、前記検出対象物質がドーパミン、アドレナリン、または、ノルアドレナリンであることを特徴とする。【００１７】
また、本発明の一実施形態においては、前記識別物質がフェニルボロン酸であることを特徴とする。【００１８】
また、本発明の一実施形態においては、前記電極が、金電極、銀電極、銅電極、白金電極、インジウム−スズ酸化物（ＩＴＯ）電極、パラジウム電極、鋼電極、ニッケルチタン合金電極、酸化チタン電極、二酸化ケイ素電極、水晶電極、酸化アルミニウム電極、ガリウムヒ素電極、ガラス電極、または、酸化タンタル電極であることを特徴とする。【００１９】
また、本発明の一実施形態においては、前記電極が、電界効果トランジスタのゲート電極に電気的に接続されていることを特徴とする。【００２０】
また、本発明の一実施形態においては、前記電極は、前記電界効果トランジスタから離れて配置されており、前記電極は、配線を介して、前記電界効果トランジスタの前記ゲート電極と電気的に接続されていることを特徴とする。【００２１】
また、本発明の一実施形態においては、前記電極が、前記電界効果トランジスタのゲート絶縁膜上に直接に載置されることにより、前記ゲート絶縁膜に電気的に接続されていることを特徴とする。【００２２】
また、本発明の一実施形態においては、前記電極が、信号増幅器に電気的に接続されていることを特徴とする。【００２３】
また、本発明の一実施形態においては、前記信号増幅器が、オペアンプであることを特徴とする。【００２４】
また、本発明の一実施形態においては、前記ポリマー層は、
（ａ）：１または複数種のモノマー、前記検出対象物質、および、前記識別物質、を含むモノマー溶液を前記電極の表面の全部又は一部において重合させることにより、前記電極の表面の全部または一部に超薄膜層であるポリマー層を形成させるステップ、および、
（ｂ）：前記ステップ（ａ）の後、前記ポリマー層から前記検出対象物質を除去することにより、前記ポリマー層に前記検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型を形成させるステップ、
を含む方法によって形成されることを特徴とする。【００２５】
また、本発明の一実施形態においては、前記モノマー溶液の重合が、リビングラジカル重合、または、電解重合であることを特徴とする。【００２６】
また、本発明の一実施形態においては、前記リビングラジカル重合が、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加−開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）、または、ニトロキシドを介した重合（ＮＭＰ）であることを特徴とする。【００２７】
また、本発明の一実施形態においては、前記リビングラジカル重合は、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）であり、前記ステップ（ａ）に先立って、重合開始分子が電極の表面の全部又は一部にあらかじめ結合されることを特徴とする。【００２８】
また、本発明の一実施形態においては、前記ステップ（ａ）が、１または複数種のモノマー、前記検出対象物質、および、前記識別物質、を含むモノマー溶液を、スピンコートを用いて電極の表面の全部又は一部に適用し、適用されたモノマー溶液を重合させることにより、前記電極の表面の全部または一部に超薄膜層のポリマー層を形成させるステップ、であることを特徴とする。【００２９】
また、本発明の一実施形態においては、前記モノマー溶液が、アクリルアミド誘導体、メタクリルアミド誘導体、アクリレート誘導体、メタクリレート誘導体、アクリロニトリル、２−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、Ｎ−ビニル−２−ピロリドンおよび酢酸ビニルからなる群から選択される少なくとも１種類のモノマーを含むことを特徴とする。【００３０】
また、本発明の他の実施形態は、バイオセンサにおいて使用される電極であって、前記バイオセンサは、検出対象物質が識別物質に結合することにより生じる前記電極の電荷密度の変化を検出するバイオセンサであり、前記電極は、前記検出対象物質と結合することができる前記識別物質の電荷を帯電する電極であり、前記電極の表面はポリカテコールアミンによりコーティングされており、ポリカテコールアミンによりコーティングされた前記電極の表面の全部又は一部には、さらに検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成されたポリマー層が形成されており、前記ポリマー層には前記識別物質を含み、前記ポリマー層は超薄膜層であることを特徴とする、電極に関する。【００３１】
なお、上記に述べた本発明の一又は複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、実施例１で用いたイオン感応性バイオセンサの概略的な構成を示す模式図を示す。
【図２】図２は、実施例１で用いたイオン感応性バイオセンサの電極に検出非対象物質（ドーパミン）を加えたときのＦＥＴのゲート表面電位変化を示すグラフを示す。
【図３】図３は、実施例１で用いたイオン感応性バイオセンサの電極に検出非対象物質（アルブミン）を加えたときのＦＥＴのゲート表面電位変化を示すグラフを示す。
【図４】図４は、本発明の一実施形態に係るバイオセンサの概略的な構成を示す模式図を示す。
【図５】図５は、ポリドーパミン薄膜層によるカテコールアミン類分子の金電極への吸着を抑制した効果を示す、ＦＥＴのゲート表面電位変化を示すグラフを示す。
【図６】図６は、カテコールアミン類分子の金電極への吸着を示す、ＦＥＴのゲート表面電位変化を示すグラフを示す。
【図７】図７は、ポリドーパミン薄膜層、および、ドーパミンに対する分子鋳型ポリマー層を金電極上に形成した拡張型ＦＥＴに各物質を添加ときのＦＥＴのゲート表面電位変化を示すグラフを示す。
【図８】図８は、ポリドーパミン薄膜層、および、ドーパミンに対する分子鋳型ポリマー層を金電極上に形成した拡張型ＦＥＴに各物質を様々な濃度で添加したときのＦＥＴのゲート表面電位変化量を示す棒グラフを示す。
【図９】図９は、ポリドーパミン薄膜層、および、ドーパミンに対する分子鋳型ポリマー層を金電極上に形成した拡張型ＦＥＴに各物質を添加ときのＦＥＴのゲート表面電位変化を示すグラフを示す。
【図１０】図１０は、ポリドーパミン薄膜層、および、ドーパミンに対する分子鋳型ポリマー層を金電極上に形成した拡張型ＦＥＴに各物質を様々な濃度で添加したときのＦＥＴのゲート表面電位変化量を示す棒グラフを示す。
【図１１】図１１は、ポリドーパミン薄膜層、および、ドーパミンに対する分子鋳型ポリマー層を金電極上に形成した拡張型ＦＥＴにドーパミンを添加ときのＦＥＴのゲート表面電位変化を示すグラフを示す。
【図１２】図１２は、ポリＬ−ドーパ薄膜層、および、グルコースに対する分子鋳型ポリマー層を金電極上に形成した拡張型ＦＥＴにグルコースを添加ときのＦＥＴのゲート表面電位変化を示すグラフを示す。
【図１３】図１３は、図１２に示す実験結果を、ゲート表面電位の変化とグルコース濃度の２軸でプロットした図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明のバイオセンサは、検出対象物質と、当該検出対象物質に特異的あるいは選択的に結合することができる識別物質との結合により生じる電気的な変化を、電極の電荷密度の変化として検出するという基本的な原理に基づく（詳細は後述する）。本発明における「検出対象物質」は、当該物質に対応する分子鋳型ポリマーを製造可能なものであれば限定されず、当業者が技術常識に基づいて様々な物質を検出対象とすることができる。
【００３４】
本発明のバイオセンサを用いれば、様々な被験試料中の微量な物質の検出に利用可能であり、例えば、本発明のバイオセンサを用いて、生体由来の物質、環境中の物質、または、食品中の物質を検出することができる。特に、本発明は、被験試料中の検出対象物質の濃度が極めて薄くても検出可能であるため、例えば体液（血液、リンパ液、組織液、体腔液、消化液、汗、涙、鼻汁、唾液、尿、精液、膣液、羊水、乳汁など）中の物質の検出に好適に利用することができる。体液中の物質の例示としては、例えば、体液成分（例えば、アルカリフォスファターゼ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、乳酸脱水素酵素、ロイシンアミノペプチダーゼ、γ−ＧＴＰ、クレアチンキナーゼ、コリンエステラーゼ、ビリルビン、胆汁酸、アルブミン、尿素窒素、クレアチニン、尿酸、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、中性脂肪、グルコース、アミラーゼ、リパーゼ、ナトリウム、カリウム、クロール、カルシウム、無機リン、マグネシウム、亜鉛、鉄、フェリチン、Ｃ反応性蛋白、β２−マイクログロブリン、ヘモグロビンＡ１Ｃ、グリコアルブミン、アンモニア、各種ホルモン、各種神経伝達物質（例えば、カテコールアミン、セロトニン、メラトニン、ヒスタミン等のモノアミン類；アスパラギン酸、グルタミン酸、γ―アミノ酪酸、グリシン、タウリン等のアミノ酸；アセチルコリン；神経ペプチド類）等の一般的な血液生化学検査の検査項目となる成分）、疾患関連バイオマーカー（例えば、腫瘍マーカー、自己免疫疾患マーカー、中枢神経疾患マーカー、心疾患バイオマーカー、等）病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、等）およびその関連因子、事前に投与された薬剤の薬剤分子、が挙げられる。
【００３５】
本発明における「検出対象物質と結合することができる識別物質」は、検出対象物質に応じて当業者が適宜選択することができ、当該識別物質は、検出対象物質に特異的に結合することができる物質であってよく、検出対象物質に選択的に結合することができる物質であってもよい。
【００３６】
本発明における「検出対象物質と結合することができる識別物質」の例示としては、例えば、特異的または選択的な相互作用が生じることが知られている物質のペア（例えば、グルコースとフェニルボロン酸、乳酸とフェニルボロン酸、ヒスタミンとカルボキシル基モノマー、尿酸とカルボキシル基モノマー、クレアチニンとカルボキシル基モノマー、シアル酸とフェニルボロン酸＆アミノ基モノマー、ドーパミンとフェニルボロン酸＆アミノ基モノマー、ビオチンとストレプトアビジン）のいずれか片方、特定の分子と特異的に結合するアプタマー（例えば、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー）、受容体−リガンド（またはアゴニスト）の組み合わせのいずれか片方、検出対象物質に特異的に結合する抗体（例えば、検出対象物質に特異的に結合するモノクローナル抗体）またはその抗原結合断片、検出対象物質に特異的に結合する核酸（例えば、目的とする核酸に相補的な配列を有する核酸）を挙げることができる。
【００３７】
本発明において、ポリマー層に検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型を形成させる方法は限定されず、分子鋳型ポリマーの形成方法として当業者に知られた様々な方法を用いることができる。具体的には、検出対象物質を含むモノマー溶液を重合させ、ポリマーとした後、当該ポリマーから検出対象物質を除去することによって、分子鋳型ポリマーを作製することができる。
【００３８】
本発明において、分子鋳型ポリマーを作製するためのモノマー溶液は、１種類または２種類以上のモノマーを含む。モノマー溶液に含まれるモノマーの例としては、例えば、アクリルアミド誘導体（アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、アクリロイルモルホリン等）、メタクリルアミド誘導体（メタクリルアミド、ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、メタクリロイルモルホリン等）、アクリレート誘導体（ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ジメチルアミノエチルアクリレート、ジメチルアミノプロピルアクリレート等）、メタクリレート誘導体（ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプロピルメタクリレート等）、アクリロニトリル、２−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、または、酢酸ビニルからなる群から選択される１または複数のモノマーが挙げられる。
【００３９】
本発明において、検出対象物質を含むポリマーから検出対象物質を除去する方法は限定されず、検出対象物質の種類、用いたモノマーの種類に応じて当業者が適宜選択することができる。検出対象物質−識別物質−除去方法の組み合わせの限定されない例示としては、以下を挙げることができる。
・グルコース−フェニルボロン酸−塩酸／メタノール
・乳酸−フェニルボロン酸−塩酸／メタノール
・ヒスタミン−カルボキシル基モノマー−酢酸／メタノール／アセトニトリル
・尿酸−カルボキシル基モノマー−酢酸／メタノール／アセトニトリル
・クレアチニン−カルボキシル基モノマー−酢酸／メタノール／アセトニトリル
・シアル酸−フェニルボロン酸＆アミノ基モノマー−塩酸／メタノール
・ドーパミン−フェニルボロン酸＆アミノ基モノマー−塩酸／メタノール
【００４０】
本発明のバイオセンサにおいては、電極表面に適用される分子鋳型ポリマー層が超薄膜層であることを特徴とする。ポリマー層の厚みを制御する方法は限定されず、高分子化学分野において公知の様々な方法を用い得る。例えば、ポリマー層の厚みを制御する方法として、化学的な方法を用いてポリマー層の厚みを制御する方法や、物理的な方法を用いて薄いポリマー層を作製する方法を用いることができる。
【００４１】
本発明に用いることができる、ポリマー層の厚みの化学的な制御方法としては、例えばリビングラジカル重合や電解重合を用いることができる。特に、リビングラジカル重合では、重合時間でポリマー層の厚みを制御することができるため、ナノオーダーの厚さの均一なポリマー層の作製に好適に用いることができる。
【００４２】
リビングラジカル重合法としては、ニトロキドを介した重合（Ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ＮＭＰ）；例えば特開昭６０−８９４５２号公報）、原子移動ラジカル重合（Ａｔｏｍ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ＡＴＲＰ）；例えば特表平１０−５０９４７５号公報）、可逆的付加‐開裂連鎖移動重合（Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ａｄｄｉｔｉｏｎ／  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ＲＡＦＴ）；例えば国際公開第９８／０１４７８号パンフレット）が知られている。本発明においては、検出対象物質の性質や必要な検出手順に応じて、これらのいずれかの重合方法のうち適切なものを選択して用いることができる。
【００４３】
また、重合速度の改善、操作の簡便性などを目的として還元剤を添加し、ＡＴＲＰ系中に生成した２価銅を連続的に活性な１価銅に還元するＡｃｔｉｖａｔｏｒ  ＲｅＧｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＡＲＧＥＴ）ＡＴＲＰ法が報告されている（例えば、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ，Ｉｎｔ  Ｅｄ，４５（２７），４４８２（２００６））。この方法では、厳密な真空状態を必要とせずにポリマー層の厚さを制御できるため、本発明においても好適に用いることができる。
【００４４】
重合は、無溶媒で行うこともできるし、各種の溶媒中で行うこともできる。好ましい溶媒としては、アニソール、トルエン、エチルベンゼン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等を挙げることができる。
【００４５】
重合溶媒の使用量は特に限定されないが、モノマー１００質量部に対して０〜２０００質量部の範囲内が好ましく、１０〜１０００質量部の範囲内がより好ましい。これら各範囲の上限値は、重合速度低下の抑制、重合制御の点で意義がある。
【００４６】
重合開始分子は、一般的にリビングラジカル重合の重合開始分子として知られている基を有する化合物が好適に使用できる。例えば、ハロゲン化アルキル有機物、有機過酸化物、アゾ系化合物、無機過酸化物、レドックス型重合開始剤等を用いることができる。
【００４７】
重合には触媒を使用することが好ましい。触媒の種類は、一般的に知られている各種のものの中から、重合法に応じて適宜選択することができる。例えば、重合法としてＡＴＲＰを用いる場合は、Ｃｕ（０）、Ｃｕ+、Ｃｕ2+、Ｆｅ+、Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、Ｒｕ2+、Ｒｕ3+等の金属を含む金属触媒を使用できる。分子量や分子量分布の高度な制御を達成する為には、特にＣｕ+を含む１価の銅化合物あるいは０価の銅が好ましい。その具体例としては、Ｃｕ（０）、ＣｕＣｌ、ＣｕＢｒ、Ｃｕ2Ｏ等が挙げられる。
【００４８】
また、上述した金属触媒には、通常は有機配位子が使用される。金属への配位原子としては、例えば、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子等が挙げられる。中でも、窒素原子、リン原子が好ましい。有機配位子の具体例としては、２，２’−ビピリジンおよびその誘導体、１，１０−フェナントロリンおよびその誘導体、テトラメチルエチレンジアミン、ペンタメチルジエチレントリアミン、トリス（ジメチルアミノエチル）アミン（Ｍｅ６ＴＲＥＮ）、トリフェニルホスフィン、トリブチルホスフィン等が挙げられる。
【００４９】
本発明に用いることができる、ポリマー層の厚みの物理的な制御方法の例としては、スピンコートを用いた方法が挙げられる。具体的には、対象とする面にモノマー溶液を適用し、スピンコート装置を用いて高速回転させることにより不要なモノマー溶液を除去し、その後重合させることによって、ナノオーダーの厚さのポリマー層を作製することができる。また、この方法によるポリマー層の厚さは、スピンコート装置の回転速度によって調節することができる。
【００５０】
検出感度を高める観点から、本発明のバイオセンサにおいて用いる分子鋳型ポリマー層の厚さは１μｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ以下であることがより好ましい。本発明のバイオセンサにおいて用いる分子鋳型ポリマー層の厚さの好ましい上限および下限は検出対象物質によって異なるが、例えば、上限を１μｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍまたは５０ｎｍ、下限を１ｎｍ、３ｎｍ、５ｎｍ、８ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍまたは３０ｎｍとしてもよい。例えば、ポリマー層の厚さは１ｎｍ〜１μｍであってよく、好ましくは３ｎｍ〜５００ｎｍであってよく、さらに好ましくは５ｎｍ〜１００ｎｍであってよく、最も好ましくは５ｎｍ〜５０ｎｍであってよい。なお、当然のことながら、本発明のバイオセンサにおいて用いる分子鋳型ポリマー層の厚さは、その全ての領域において厳密に均一な厚さである必要はなく、平均して上記範囲内の厚さであればよい。
【００５１】
本発明において、分子鋳型ポリマー層の厚さの測定方法は特に限定されず、当技術分野において公知の任意の方法を用いて測定することができる。例えば、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）や市販のエリプソメータを用いて分子鋳型ポリマー層の厚さを測定することができる。
【００５２】
本発明のバイオセンサは、被験試料と接触する電極の表面の全部または一部がポリカテコールアミンによりコーティングされていることにより、被験試料中の夾雑物（例えば、アルブミン等のタンパク質）が電極に非特異的に吸着することに起因する測定ノイズが大幅に低減されていることを特徴とする。ここで、「カテコールアミン」とは、チロシンから誘導された、カテコールとアミンを有する化合物の総称であり、例えばＬ−ドーパ、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン等が知られている。また、「ポリカテコールアミン」とは、カテコールアミンの重合物を意味し、例えば、Ｌ−ドーパ、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリンの重合物が挙げられる。
【００５３】
なお、電極の表面へポリカテコールアミンをコーティングする方法は特に限定されず、当業者が適宜選択することができる。例えば、カテコールアミンは酸化することで重合するため、電極の表面へカテコールアミン溶液を適用し、静置することで、自己酸化（空気酸化）による重合を誘導することができる。他の酸化方法としては、例えば、電気化学的酸化（サイクリックボルタメトリ等）、ＵＶオゾン酸化、過マンガン酸カリウム等の酸化剤の添加、等が挙げられる。
【００５４】
[バイオセンサの構成]
本発明の一実施形態に係るバイオセンサの一例を示し、その構成について説明する。図４は、本発明の一実施形態であるバイオセンサ２００の概略的な構成を示す模式図である。なお、以下の説明では、検出対象物質をドーパミンとし、検出素子としていわゆる拡張ゲート（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｇａｔｅ）型のＦＥＴを使用した場合を例に挙げて説明するが、本発明に係るバイオセンサは、このような例に限定されるものではない。例えば、ゲート電極が絶縁膜上に直接に載置される通常のＦＥＴを用いてもよい。
【００５５】
また、本発明に係るバイオセンサは、検出素子としてＦＥＴを用いるものに限定されない。本発明の本質的な特徴は、ポリカテコールアミンによるコーティングを行った電極部分において被験試料中の検出対象物質の存在を電気的な信号として検出することにあり、例えば当該電極を信号増幅器（例えば、真空管、トランジスタ、オペアンプ、マグアンプ、等）に接続することによっても、バイオセンサとして使用することができる。
【００５６】
図４に示すように、本発明の一実施形態に係るバイオセンサ２００は、検出素子としてＦＥＴデバイス２０１を用いて検出対象物質（ドーパミン）を検出するためのバイオセンサであって、分子識別部材（図４において、拡張ゲート電極２０６、ポリカテコールアミン薄膜層２０７、および、分子鋳型ポリマー層２０８とまとめて「分子識別部材」と呼ぶこととする）と、ＦＥＴデバイス２０１とを主に備える。拡張ゲート電極２０６は基板２０５上にスパッタされており、ポリカテコールアミン薄膜層２０７は拡張ゲート電極２０６上にコーティングされており、分子鋳型ポリマー層２０８はポリカテコールアミン薄膜層２０７のさらに上に設けられている。また、拡張ゲート電極２０６は、酸化物ゲート絶縁体２０２上のゲート電極２０３と配線２０４を介して電気的に接続されている。分子識別部材は、酸化物ゲート絶縁体２０２を介してＦＥＴデバイス２０１に接続され、ＦＥＴにおけるゲート電極としての役割も有している。ここで、分子鋳型ポリマー層２０８は、フェニルボロン酸を含んでおり、その表面および内部において、ドーパミンの分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成されている。
【００５７】
また、基板２０５上には、分子識別部材を囲うようにガラスリングが固定されており、ガラスリング内には緩衝液２１０が満たされている。
【００５８】
なお、図４に示すように、必要に応じて参照電極２０９を設けてもよい。参照電極２０９は、緩衝液２１０中に設けられ、ＦＥＴデバイス２０１のソース電極及びドレイン電極とともに閉回路を形成する。参照電極２０９はＦＥＴにおける電圧測定の基準電位となる電極であり、アースされることもある。実用上は、ＦＥＴにおける電圧測定の際に必要となるが、他の公知の方法により代替可能であれば参照電極２０９を設けなくてもよい。
【００５９】
ＦＥＴデバイス２０１の半導体基板は、例えば、ｐ型半導体であり、その一部（例えば２箇所）が局所的にドーピングされて形成されたｎ型半導体部分にソース電極及びドレイン電極が設けられる。すなわち、グルコースセンサ１００で使用されるＦＥＴは、所謂ｎチャネル型ＭＯＳＦＥＴ（Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｆｉｅｌｄ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）である。なお、本発明に係るバイオセンサで使用するＦＥＴは、上記のｎチャネル型ＭＯＳＦＥＴ（ｎ−ＭＯＳ）に限られず、ｐチャネル型ＭＯＳＦＥＴ（ｐ−ＭＯＳ）、ｎチャネル接合型ＦＥＴ、ｐチャネル接合型ＦＥＴであってもよい。
【００６０】
また、半導体基板の素材としては、特に制限されるものではないが、Ｓｉ、ＧａＡｓ、透明酸化物半導体（例えば、ＩＴＯ、ＩＧＺＯ、ＩＺＯ）、有機半導体、炭素半導体（例えば、カーボンナノチューブ、グラフェン半導体、ダイヤモンド半導体等）等、公知の半導体を適宜選択して用いることができる。なお、半導体基板の素材として炭素半導体を用いると、Ｓｉを使用した場合よりもバイオセンサ２００の測定感度をより高くし得る（被験試料中の検出対象物質濃度が低くても高精度に測定し得る）。
【００６１】
次に、図４に示した本発明の一実施形態に係るバイオセンサ２００の測定原理について説明する。緩衝液２１０に被験試料が添加されると、被験試料中のドーパミン分子のみが、分子鋳型ポリマー層２０８の表面および内部に形成された分子鋳型に組み込まれる。分子鋳型ポリマー層２０８には、ドーパミンに特異的に反応するフェニルボロン酸が含まれているため、分子鋳型ポリマー層２０８に入り込んだグルコースは、当該フェニルボロン酸に反応する。分子鋳型ポリマー層２０８中のフェニルボロン酸と、グルコースとの反応によって、分子識別部材における電荷密度とキャパシタンスの少なくともいずれか一方が変化し、これをＦＥＴが電位の変化として検出することで、検出対象物質の存在あるいは濃度を測定することができる。
【００６２】
なお、拡張ゲート電極２０６の一部でも分子鋳型ポリマー２０８で覆われていない箇所が存在すると、試験試料中の物質（例えば、アルブミン等のタンパク質）が非特異的に拡張ゲート電極２０６に吸着するため、測定ノイズが発生し得る。しかし、本発明においては、拡張ゲート電極２０６がポリカテコールアミン薄膜層２０７によってコーティングされているため、仮に拡張ゲート電極２０６の一部に分子鋳型ポリマー２０８で覆われていない箇所が存在したとしても、非特異的な吸着による測定ノイズが発生しない。
【００６３】
また、バイオセンサ２００においては、検出素子として、上述したように拡張ゲート型のＦＥＴを使用している。拡張ゲート型のＦＥＴを用いたバイオセンサ２００では、分子識別部材がＦＥＴ本体（ソース電極およびドレイン電極が設けられた半導体基板を含むＦＥＴデバイス２０１）から分離しており、分子識別部材をＦＥＴデバイス２０１から着脱自在に接続することができる。
【００６４】
すなわち、分子識別部材とＦＥＴデバイスとを別々に準備して、組み合わせることが可能である。本願明細書に開示されているとおり、分子識別部材は様々な検出対象物質を特異的に検出するように改変可能であるため、例えば、様々な検出対象物質に対応した分子識別部材を、検出装置本体（ＦＥＴデバイス）に着脱可能なチップとして構成することにより、１台の検出装置で多様な因子の検出が可能となる。
【００６５】
本明細書において用いられる用語は、特に定義されたものを除き、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【００６６】
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
【００６７】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【００６８】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００６９】
実施例１：ポリカテコールアミンの電極へのコーティングによるノイズ除去効果
各種ポリカテコールアミン（Ｌドーパ、ドーパミン、アドレナリン、または、ノルアドレナリンの重合物）の電極へのコーティングによるノイズ除去効果を示すため、まずは、ポリドーパミン薄膜層を金電極に積層したイオン感応性バイオセンサを作成した。【００７０】
（１）ポリカテコールアミン薄膜層を金電極に積層したイオン感応性バイオセンサの作製
本実施例において用いたイオン感応性センサは、以下のように作製した（構成の概念図を図１に示した）。【００７１】
本実施例において用いたイオン感応性センサにおいては、検出素子としてＭＯＳＦＥＴ（ＮＸＰ社製、２Ｎ７００２）を用いた。対象物の電荷を検出するための電極（イオン感応性電極）としては、ガラス基板にスパッタした６ｍｍ直径金電極を用い、金電極上に、後述する方法にて、ポリカテコールアミン薄膜層を作製した。前記金電極は、前記ＭОＳＦＥＴに直接接触しているゲート電極から、配線を介して電気的に接続させることにより、拡張型のゲート電極（拡張ゲート電極）とした。【００７２】
次に、本実施例では溶液中での測定を行うため、上述のようにして得られたイオン感応性電極（ポリカテコールアミン薄膜層によるコーティングを行った金電極）上に、外径１２ｍｍ、内径１０ｍｍ、高さ１０ｍｍのガラスリングを、エポキシ樹脂を用いて固定した。【００７３】
（２）金電極上へのポリカテコールアミン薄膜層の作製
Ｌ−ドーパ粉末（Ｄ０６００，東京化成工業）、ドーパミン粉末（Ａ０３０５，東京化成工業）、ノルアドレナリン粉末（Ａ０９０６，東京化成工業）、または、アドレナリン粉末（Ａ０１７３，東京化成工業）を、それぞれトリス緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ１０）に溶解させ、２５ｍＭのカテコールアミン溶液（Ｌ−ドーパ溶液、ドーパミン溶液、ノルアドレナリン溶液、または、ノルアドレナリン溶液）を作製した。次に、前出のガラスリングを固定した金電極にいずれかのカテコールアミン溶液を５００μｌ入れ、紫外線オゾン表面処理/改質装置（ミズカプラニング社製、ＰＬ―１６）にて５分間ＵＶを照射し、２４時間室温にて放置することによって、金電極上にポリカテコールアミン薄膜層を形成させた。【００７４】
比較例として、ガラスリングを固定した金電極に単純なトリス緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ１０）を適用した以外は、上記と同様の手順を行った金電極（すなわち、ポリカテコールアミンによるコーティングのない金電極）を有するイオン感応性バイオセンサを用意した。【００７５】
（３）ポリカテコールアミン薄膜層によるノイズ除去効果
本実施例に係るイオン感応性センサが、比較例のイオン感応性センサと比較して、非特異的な吸着によるノイズが大幅に低減されていることを示すための比較実験を行った。【００７６】
（３−１）夾雑物の例としてドーパミンを用いた比較実験
本実施例に係るイオン感応性センサのガラスリングに５００μｌのリン酸ナトリウム緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を入れ、ゲート電位安定後に終濃度が１００ｎＭおよび１０μＭになるようドーパミンを添加した。また、比較例に係るイオン感応性センサを用いて同様の試験を行った。【００７７】
なお、本実施例においてＰＢＳに添加した「ドーパミン」は、検出対象（水素イオン）以外の夾雑物（すなわち、電極への非特異的な吸着を引き起こす物質）の例として用いている。【００７８】
比較実験の結果を図２に示す。図２の縦軸は、ポリカテコールアミンの表面電位の変化（ｍＶ）を示し、横軸は、計測時間（秒）を示している。【００７９】
図２に示すように、本実施例に係るイオン感応性センサは、ドーパミン（すなわち、検出非対象物質）の添加に対してゲート表面電位がほとんど反応しなかった。一方、ポリカテコールアミンによるコーティングのない金電極を有するイオン感応性センサ（比較例）は、ドーパミンの添加に反応して負方向への電位シフトが確認された。【００８０】
（３−２）夾雑物の例としてアルブミンを用いた比較実験
本実施例に係るイオン感応性センサのガラスリングに５００μｌのリン酸ナトリウム緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を入れ、ゲート電位安定後に終濃度が１ｇ／Ｌおよび５ｇ／Ｌになるようアルブミンを添加した。また、比較例に係るイオン感応性センサを用いて同様の試験を行った。【００８１】
なお、本実験においてＰＢＳに添加した「アルブミン」は、検出対象（水素イオン）以外の夾雑物（すなわち、電極への非特異的な吸着を引き起こす物質）の例として用いている。【００８２】
比較実験の結果を図３に示す。図３の縦軸は、ポリカテコールアミンの表面電位の変化（ｍＶ）を示し、横軸は、計測時間（秒）を示している。【００８３】
図３に示すように、本発明のイオン感応性センサは、アルブミン（すなわち、検出非対象物質）の添加に対してゲート表面電位がほとんど反応しなかった。一方、ポリカテコールアミンによるコーティングのない金電極を有するイオン感応性センサ（比較例）は、アルブミンの添加に反応して負方向への電位シフトが確認された。【００８４】
以上の結果から、各種ポリカテコールアミン（Ｌドーパ、ドーパミン、アドレナリン、または、ノルアドレナリンの重合物）の電極へのコーティングによって、バイオセンサの電極へ検出非対象物質が吸着することによるノイズをほぼ完全に排除できることが示された。【００８５】
実施例２：検出対象物質を特異的に検出するバイオセンサの作製
実施例１で示した、ポリカテコールアミンをコーティングした電極を利用して、本発明の一実施形態である、検出対象物質を特異的に検出するバイオセンサを作製した。本実施例においては、検出対象物質として、「ドーパミン」を用いた例を示す。【００８６】
（１）カテコールアミンセンサの設計
本実施例において用いた、本発明の一実施形態であるカテコールアミンセンサは、以下に説明するように作成した（構成の概念図を図４に示した）。【００８７】
本実施例において用いたバイオセンサにおいては、検出素子としてＭＯＳＦＥＴ（ＮＸＰ社製、２Ｎ７００２）を用いた。対象物の電荷を検出するための電極としては、ガラス基板にスパッタした６ｍｍ直径金電極を用い、金電極上に、後述する方法にて、ポリドーパミン薄膜層、およびカテコールアミンの分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成された、超薄膜のポリマー層を作製した。前記金電極（対象物の電荷を検出するための電極）は、前記ＭОＳＦＥＴに直接接触している金属電極（ゲート電極）から、配線を介して電気的に接続させることにより、拡張型のゲート電極（拡張ゲート電極）とした。【００８８】
前記ポリマー層は、その成分に、カテコールアミンに特異的に結合する物質（フェニルボロン酸）を含み、ポリマー層に形成された分子鋳型にカテコールアミンが嵌ると、当該カテコールアミンはポリマー層中のフェニルボロン酸と結合する。本発明の一実施形態であるカテコールアミンセンサは、当該結合により生じる電極の電荷密度の変化を検出することにより、対象物中のカテコールアミンの存在を判定する。【００８９】
本実施例においては、便宜上、前記対象物の電荷を検出するための電極と前記ポリマー層とを含めて「分子識別部材」と呼ぶことがある。【００９０】
次に、本実施例では溶液中での測定を行うため、上述のようにして得られた分子識別部
材上に、外径１２ｍｍ、内径１０ｍｍ、高さ１０ｍｍのガラスリングを、エポキシ樹脂を用いて固定した。【００９１】
（２）検出非対象物質の金電極への吸着を阻害するポリドーパミン薄膜層の形成
ドーパミン粉末（Ａ０３０５：東京化成工業社製）をリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，  ＰＢＳ，ｐＨ７．４）に溶解させ、５ｍｇ／ｍｌのドーパミン溶液を作製し、１０分間窒素バブリングにより脱気した。次に、前出のガラスリングを固定した金電極に５００μｌのドーパミン溶液を入れ、紫外線オゾン表面処理/改質装置（ミズカプラニング社製、ＰＬ―１６）にて１分間ＵＶを照射することによって金電極上にポリドーパミン薄膜層を形成させた。【００９２】
比較例として、ドーパミン溶液の代わりにＰＢＳバッファのみで上記と同様の手法にて作製した金電極（すなわち、ポリドーパミンによるコーティングのない金電極）を用意した。【００９３】
（３）：ポリドーパミン薄膜層の効果の検証
（２）で作製したポリドーパミン薄膜層を備えた金電極と、ポリドーパミン薄膜層を備えていない金電極（比較例）を用いて実験を行った。【００９４】
まずは、上記金電極部分にＰＢＳ緩衝液５００μｌ加え、ＦＥＴリアルタイム計測装置にてゲート電圧０Ｖ、ソース−ドレイン電流９０μＡを一定として、カテコールアミンとしてアドレナリン（Ａ０１７３、東京化成工業）とドーパミン（Ａ０３０５、東京化成工業）を終濃度１０ｎＭから１００μＭまで逐次的に添加した。【００９５】
ポリドーパミン薄膜層を有する金電極における表面電位の変化を図５に示し、ポリドーパミン薄膜層を有しない金電極における表面電位の変化を図６に示す。図５および図６の縦軸は、分子識別部材の表面電位の変化（ｍＶ）を示し、横軸は、計測時間（秒）を示している。【００９６】
図５に示すように、ポリドーパミン薄膜層を有する金電極は、各カテコールアミン（ドーパミンまたはアドレナリン）に対して応答しなかった。一方、図６に示すように、ポリドーパミン薄膜層を有しない金電極は、各カテコールアミン（ドーパミンまたはアドレナリン）に対して反応し、濃度依存的にゲート表面電位が変化した。【００９７】
すなわち、ポリドーパミン薄膜層を有する金電極を拡張型ゲート電極として用いることにより、金電極への検出非対象物質の非特異的な吸着を防止することができ、測定の際のノイズを低減させることができることが示された。【００９８】
（４）検出対象物質を選択的に検出するバイオセンサの作製
（４−１）ＡＴＲＰ法による、ドーパミンを選択的に捕捉する分子鋳型ポリマー（ＭＩＰ）層の形成（製造例１）
次に、以下に示す方法により、（２）で作製した金電極上に、ドーパミンの分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成された、超薄膜の分子鋳型ポリマー層を形成させた。【００９９】
１ｍＭの２−ブロモイソブチレート（東京化成工業社製）／エタノール溶液に、ポリドーパミン薄膜層を形成した金電極を一晩浸漬させることで、ポリドーパミン薄膜層上に重合開始分子を結合させた。【０１００】
次に、３−アクリルアミドフェニルボロン酸０．０２ｇと、Ｎ−３−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド０．０５ｇと、エチレングリコールジメタクリレート０．２３ｇと、ドーパミン０．０２ｇを超純水で全量０．６ｇに調整した後、０．４ｇのジメチルホルムアミドを加え、完全に溶解した後、１０ｍＭ臭化銅（ＩＩ）および１００ｍＭトリス（２−ピリジルメチル）アミン／ジメチルホルムアミド溶液を１００μｌ加え、次に２００ｍＭアスコルビン酸５０μｌを加えた。【０１０１】
ガラスリングで覆われた、重合開始分子が結合された金電極に、上記の溶液（モノマー溶液）を５００μｌ滴下し、真空下、４０℃にて１８時間重合反応させることで、金電極上にハイドロゲルを作製した。重合反応終了後、ゲート電極を０．１Ｍ塩酸／メタノール溶液に２日間浸漬させ、モノマー成分およびドーパミンを除去することで、金ゲート電極上に、カテコールアミンの分子構造と相補的な分子鋳型を有する超薄膜のポリマー層を形成させた。
作製されたポリマー層の厚さを、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて測定したところ、およそ５０ｎｍであった。【０１０２】
また、（２）で作製したポリカテコールアミンによるコーティングのない金電極についても、上記と同様の方法で超薄膜の分子鋳型ポリマー（ＭＩＰ）層を形成させた。【０１０３】
（４−２）ＡＴＲＰ法による、ドーパミンを選択的に捕捉する分子鋳型ポリマー（ＭＩＰ）層の形成（製造例２）
下記に示すように（４−１）とはエチレングリコールジメタクリレート（架橋剤）の条件を変えて、（２）で作成した金電極上に分子鋳型ポリマー（ＭＩＰ）層を形成させた。製造例２では、製造例１よりもポリマー溶液におけるエチレングリコールジメタクリレート（架橋剤）の割合が高いため、より強固なポリマーが形成される。【０１０４】
１ｍＭの２−ブロモイソブチレート（東京化成工業社製）／エタノール溶液に、ポリドーパミン薄膜層を形成した金電極を一晩浸漬させることで、ポリドーパミン薄膜層上に重合開始分子を結合させた。【０１０５】
次に、３−アクリルアミドフェニルボロン酸０．０２ｇと、Ｎ−３−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド０．０５ｇと、エチレングリコールジメタクリレート０．４３ｇと、ドーパミン０．０２ｇを超純水で全量０．６ｇに調整した後、０．４ｇのジメチルホルムアミドを加え、完全に溶解した後、１０ｍＭ臭化銅（ＩＩ）および１００ｍＭトリス（２−ピリジルメチル）アミン／ジメチルホルムアミド溶液を１００μｌ加え、次に２００ｍＭアスコルビン酸５０μｌを加えた。【０１０６】
ガラスリングで覆われた重合開始分子が結合された金電極に、上記の溶液（モノマー溶液）を５００μｌ滴下し、真空下、４０℃にて６時間重合反応させることで、金電極上にハイドロゲルを作製した。重合反応終了後、ゲート電極を０．１Ｍ塩酸／メタノール溶液に２日間浸漬させ、モノマー成分およびドーパミンを除去することで、金ゲート電極上に、カテコールアミンの分子構造と相補的な分子鋳型を有する超薄膜のポリマー層を形成させた。
作製されたポリマー層の厚さを、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて測定したところ、およそ５０ｎｍであった。【０１０７】
また、（２）で作製したポリカテコールアミンによるコーティングのない金電極についても、上記と同様の方法で超薄膜の分子鋳型ポリマー（ＭＩＰ）層を形成させた。【０１０８】
（４−３）ＡＴＲＰ法による、ドーパミンを選択的に捕捉する分子鋳型ポリマー（ＭＩＰ）層の形成（製造例３）
本製造例では、下記に示すように、ポリドーパミン薄膜層を形成するステップにおいて、ＡＴＲＰ法の重合開始分子を含むポリドーパミン薄膜層を形成させることによって、分子鋳型ポリマー層を形成させるステップにおいて重合開始分子を結合させるステップを省略した例を示す。【０１０９】
ドーパミン粉末０．２ｇ、２−ブロモイソブチリルブロミド（東京化成社製）０．４９ｇ、トリエチルアミン０．２１ｇを１０ｍｌジメチルホルムアミドに溶解させ、窒素雰囲気下にて４時間撹拌した。その後、１１１ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン溶液と混合し、その溶液を前出のガラスリングを固定した金基板に５００μｌ入れ、室温にて２４時間静置させることによって、金基板上に、ブチル基（重合開始分子）を導入したポリドーパミン薄膜層を形成させた。【０１１０】
次に、Ｎ−３−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド０．４ｇと、４−ビニルフェニルボロン酸０．６ｇと、エチレングリコールジメタクリレート０．６ｇと、ドーパミン０．４ｇをジメチルホルムアミド４ｍｌと超純水２ｍｌで溶解させた後、１０ｍＭ臭化銅（ＩＩ）および１００ｍＭトリス（２−ピリジルメチル）アミン／ジメチルホルムアミド溶液を６００μｌ加え、次に１００ｍＭアスコルビン酸６００μｌを加え、重合溶液とした。【０１１１】
ガラスリングで覆われた、重合開始分子を含むポリドーパミン薄膜層によりコーティングされた金電極に、上記の溶液（モノマー溶液）を５００μｌ滴下し、窒素雰囲気下、室温にて１８時間ＡＴＲＰ重合反応させることで金電極上にハイドロゲルを作製した。重合反応終了後、ゲート電極を０．１Ｍ塩酸／メタノール溶液に２日間浸漬させ、モノマー成分およびドーパミンを除去することで、金ゲート電極上に、ドーパミンの分子構造と相補的な分子鋳型を有する超薄膜のポリマー層を形成させた。
作製されたポリマー層の厚さを、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて測定したところ、およそ２０ｎｍであった。【０１１２】
比較例として、上記重合溶液よりドーパミンのみを省いた組成にて、同様の手法にて、分子鋳型のないハイドロゲルを金電極上に作製した。また、他の比較例として、金電極にブロモ基を導入したポリドーパミン薄膜層によるコーティングのみを行った電極（すなわち、分子鋳型ポリマー層のない電極）を用意した。【０１１３】
（４−４）ＡＴＲＰ法による、グルコースを選択的に捕捉する分子鋳型ポリマー（ＭＩＰ）層の形成（製造例４）
本製造例では、グルコースの分子構造と相補的な分子構造を有する超薄膜の分子鋳型ポリマー層を作製した例を示す。【０１１４】
Ｌ−ドーパ粉末０．２ｇ、２−ブロモイソブチリルブロミド（東京化成社製）０．４９ｇ、トリエチルアミン０．２１ｇを１０ｍｌジメチルホルムアミドに溶解させ、窒素雰囲気下にて４時間撹拌した。その後、１１１ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン溶液と混合し、その溶液を前出のガラスリングを固定した金基板に５００μｌ入れ、室温にて２４時間静置させることによって金基板上にブチル基を導入したポリＬ−ドーパ薄膜層を形成させた。【０１１５】
次に、Ｎ−３−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド７０ｍＭと、４−ビニルフェニルボロン酸７０ｍＭと、ヒドロキシエチルメタクリレート２８０ｍＭと、Ｎ‘，Ｎ’―メチレンビスアクリルアミド７０ｍＭと、グルコース３５ｍＭをジメチルホルムアミド３０ｍｌと超純水３０ｍｌで溶解させた後、１．４ｍＭ臭化銅（ＩＩ）および１４ｍＭトリス（２−ピリジルメチル）アミン／ジメチルホルムアミドを加え、次に１４ｍＭアスコルビン酸を加え、重合溶液とした。【０１１６】
ガラスリングで覆われた、重合開始分子を含むポリＬ−ドーパ薄膜層によりコーティングされた金電極に、上記の溶液（モノマー溶液）を５００μｌ滴下し、窒素雰囲気下、室温にて１８時間ＡＴＲＰ重合反応させることで、金電極上にハイドロゲルを作製した。重合反応終了後、ゲート電極を０．１Ｍ塩酸／メタノール溶液に２日間浸漬させ、モノマー成分およびグルコースを除去することで、金ゲート電極上に、グルコースの分子構造と相補的な分子構造を有する超薄膜のポリマー層を形成させた。
作製されたポリマー層の厚さを、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて測定したところ、およそ２０ｎｍであった。【０１１７】
（５）本発明のセンサ（製造例１）によるカテコールアミンの高感度検出
上記の（１）〜（４）の方法によって作製した、本発明の一実施形態であるバイオセンサを用いて、被験試料としてドーパミン、アドレナリンを添加した場合と、Ｌ-ドーパ（ドーパミン、アドレナリン、ノルアドレナリンの前駆体）を添加した場合の金電極のゲート表面電位の変化を測定した。【０１１８】
図７に示すように、製造例１の方法で作製したポリドーパミン薄膜層および分子鋳型ポリマー層を含むセンサでは、ドーパミン、アドレナリンを添加した際のゲート表面電位の変化が１０ｎＭより負方向へ見られた。一方で、Ｌ−ドーパを添加してもゲート表面電位変化量はほとんど変化しなかった。すなわち、製造例１の方法で作製したバイオセンサは、ドーパミンおよびアドレナリンと、それらの前駆体であるＬ−ドーパとを区別して検出することが可能であることが示された。【０１１９】
１０ｎＭから１μＭまでの濃度において各物質を添加した際のゲート表面電位変化量を図８に示す。図８に示すとおり、製造例１の方法で作製したバイオセンサは、唾液や尿中に含まれるような極めて低濃度のカテコールアミン濃度範囲において、活性型のカテコールアミン（ドーパミン、アドレナリン）とその前駆体（Ｌ−ドーパ）とを区別して検出し得ることが示された。なお、通常、唾液中には数百ｎＭ程度、尿中には数ｍＭ程度、涙液中には数μＭ程度、血液中には数ｎＭ程度の濃度でカテコールアミンが含まれることが報告されている。【０１２０】
すなわち、本発明のバイオセンサは、様々な体液に含まれる微量の生体分子に対して高い選択性および十分な検出感度を有する、実用性に優れた装置であることが示された。【０１２１】
（６）本発明のセンサ（製造例２）によるカテコールアミンの高感度検出
（５）と同様の実験を、製造例２の方法で作製したバイオセンサを用いて行った。その結果を図９および図１０に示す。【０１２２】
図９および図１０に示すように、製造例２の方法で作製したポリドーパミン薄膜層および分子鋳型ポリマー層を含むセンサでは、ドーパミンを添加した際に、顕著なゲート表面電位の変化見られた。一方で、アドレナリンおよびＬ−ドーパを添加してもゲート表面電位変化量はほとんど変化しなかった。すなわち、製造例２の方法で作製したバイオセンサは、ドーパミンと、それ以外のカテコールアミンとを区別して検出することが可能であることが示された。【０１２３】
すなわち、本発明のバイオセンサは、分子鋳型ポリマー層の強固さを調整することにより、検出対象物質に対する検出特異性をさらに高めることができることが示された。【０１２４】
（７）本発明のセンサ（製造例３）によるドーパミンの高感度検出
上記の製造例３の方法によって作製した、本発明の一実施形態であるバイオセンサおよび比較例を用いて、被験試料としてドーパミンを添加した場合の金電極のゲート表面電位の変化を測定した。【０１２５】
図１１に示すように、製造例３の方法で作製したポリドーパミン薄膜層および分子鋳型ポリマー層を含むセンサにおいては、ドーパミンを添加した際に顕著なゲート表面電位の変化が見られた。一方、ブロモ基を導入したポリドーパミン薄膜層のみを有する電極においては、ゲート表面電位の変化が全く見られなかった。また、分子鋳型のないセンサにおいてはドーパミンを添加した際のゲート表面電位の変化幅が、本発明のセンサと比較して極めて小さいことが明らかとなった。【０１２６】
すなわち、本発明のセンサを用いると、極めて微量のカテコールアミン（例えば、唾液や尿中に含まれるような濃度範囲のカテコールアミン）を選択的に検出できることが示された。【０１２７】
（８）本発明のセンサ（製造例４）によるグルコースの検出
上記の製造例４の方法によって作製した、本発明の一実施形態であるバイオセンサを用いて、被験試料としてドーパミンを添加した場合の金電極のゲート表面電位の変化を測定した。【０１２８】
製造例４の方法で作製したポリＬ−ドーパ薄膜層および分子鋳型ポリマー層を含むセンサにおいて、グルコースをそれぞれ４００μＭ、１ｍＭ、４ｍＭ、１０ｍＭ添加した結果を図１２に示す。図１２に示すとおり、それぞれの添加濃度において、顕著なゲート表面電位の変化が見られた。また、図１３に示すように、各濃度のグルコースを添加した際のゲート表面電位のシフト量をプロットしたところ、相関係数０．９４３にてグルコース濃度依存的にゲート表面電位は変化した。【０１２９】
すなわち、本発明のセンサを用いると、極めて微量のグルコース（例えば、血液や尿中に含まれるような濃度範囲のグルコース）を定量的に検出できることが示された。【０１３０】
すなわち、本発明のセンサを用いると、様々な種類の微量分子を定量的に検出し得ることが示された。
【符号の説明】
【０１３１】
１００：ゲート電極拡張型イオン感応性センサ
１０１：電気信号検出器（ＭＯＳＦＥＴ）
１０２：配線
１０３：基板
１０４：イオン感応性電極（金電極）
１０５：ポリカテコールアミン薄膜層
１０６：参照電極
１０７：緩衝液
１０８：ゲート電極
２００：ゲート電極拡張型バイオセンサ
２０１：FETデバイス
２０２：酸化物ゲート絶縁体
２０３：ゲート電極
２０４：配線
２０５：基板
２０６：拡張ゲート電極（金電極）
２０７：ポリカテコールアミン薄膜層
２０８：分子鋳型ポリマー層
２０９：参照電極
２１０：緩衝液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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