(57)【要約】【課題】ＲＮＡ医薬等に適用するのにより実用的なヌクレオシド及びその利用を提供する。【解決手段】以下の式（１）又は（２）で表される、ヌクレオシド誘導体又はその塩。【化２０】2018110678.tif 000024（式（１）中、Ｒ1は、水素原子、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された基を表し、式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。式（１）及び式（２）中、Ｒ2及びＲ4は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）nＲ5Ｒ6（nは０又は１を示し、Ｒ5及びＲ6は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ5及びＲ6が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ3は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ7（Ｒ7は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。）、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
2018110678.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）又は（２）で表される、ヌクレオシド誘導体又はその塩。
【化１８】
2018110678.tif 000022
（式（１）中、Ｒ1は、水素原子、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された基を表し、式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。式（１）及び式（２）中、Ｒ2及びＲ4は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）nＲ5Ｒ6（nは０又は１を示し、Ｒ5及びＲ6は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ5及びＲ6が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ3は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ7（Ｒ7は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。ただし、Ｒ7が、水素原子のとき、連結基は、炭素数２以上のあアルキレン基である。）、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
【請求項２】
前記式（１）及び式（２）中、Ｒ7は水素原子を表すか又はＲ3は前記連結基を有するグアニジノ基を表す、請求項１に記載のヌクレオシド誘導体又はその塩。
【請求項３】
前記式（１）及び式（２）中、Ｒ3の前記連結基は、炭素数２以上６以下のアルキレン基を表す、請求項１又は２に記載のヌクレオシド誘導体又はその塩。
【請求項４】
前記式（１）及び式（２）中、Ｒ3の前記連結基は、炭素数２以上６以下のアルキレン基を表し、Ｒ7は水素原子を表す、請求項１〜３のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体又はその塩。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体を含む、オリゴヌクレオチドに対する細胞膜透過性付与剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体を含む、オリゴヌクレオチドに対するリボヌクレアーゼ耐性付与剤。
【請求項７】
以下の式（３）及び式（４）からなる群から選択される部分構造を少なくとも１個備える、オリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
【化１９】
2018110678.tif 000023
（式（３）中、Ｒ1は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された水酸基を表し、式（４）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。式（３）及び式（４）中、Ｒ3は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ7（Ｒ7は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。ただし、Ｒ7が、水素原子のとき、連結基は、炭素数２以上のアルキレン基である。）、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
【請求項８】
前記部分構造を少なくとも２個備える、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
【請求項９】
前記部分構造を少なくとも３個備えており、前記オリゴヌクレオチドを５’末端側、中央部及び３’末端側に備える、請求項７又は８に記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
【請求項１０】
）前記部分構造を少なくとも６個備える、請求項７〜９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチドである、請求項７〜１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、ヌクレオシド誘導体及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんをはじめ、遺伝子変異や遺伝子発現異常が原因又は関連している疾患は多数知られている。遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ医薬は、こうした疾患に有用であり、優れた医薬品ポテンシャルを有しているといえる。【０００３】
一方、ｓｉＲＮＡ等は、細胞膜透過が困難であったり、ヌクレアーゼによる分解を受けやすいという問題がある。また、標的選択性は高いものの、標的組織までの選択的輸送が困難であるという問題がある。こうした点を改善するべく、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）などの送達用のキャリアが検討されている。また、ＲＮＡのリボースに対してアミノメチル基を導入するなどの改変する試みも行われている（非特許文献１〜４）。
【発明の概要】
【０００４】
しかしながら、こうした試みにもかかわらず、ＲＮＡ医薬の有効性の一層の向上が求められている。送達用キャリアにも不十分な点があるほか、こうしたＲＮＡの改変によっても、十分な細胞膜透過性、リボヌクレアーゼ耐性及び標的組織送達性を充足することはできていない。こうしたことから、現状においても、ｓｉＲＮＡ等においてその本来の優れた医薬品ポテンシャルを発揮できていない。
【０００５】
本明細書は、ＲＮＡ医薬等に適用するのにより実用的なヌクレオシド及びその利用を提供することを、目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、リボヌクレオチドの糖部であるリボースに着目した。リボースの第４’位にアミノ基などの塩基性を有する置換基を備えること、又は２’位の水酸基をハロゲン原子で置換することで、リボヌクレアーゼ耐性ほか細胞膜透過性を向上させうるという知見を得た。本明細書によれば、かかる知見に基づき以下の手段が提供される。【０００７】
（１）以下の式（１）又は（２）で表される、ヌクレオシド誘導体又はその塩。
【化１】
2018110678.tif 000003
（式（１）中、Ｒ1は、水素原子、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された基を表し、式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。式（１）及び式（２）中、Ｒ2及びＲ4は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）nＲ5Ｒ6（nは０又は１を示し、Ｒ5及びＲ6は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ5及びＲ6が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ3は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ7（Ｒ7は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。）、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
（２）前記式（１）及び式（２）中、Ｒ7は水素原子を表すか又はＲ3は前記連結基を有するグアニジノ基を表す、（１）に記載のヌクレオシド誘導体又はその塩。
（３）前記式（１）及び式（２）中、Ｒ3の前記連結基は、炭素数２以上６以下のアルキレン基を表す、（１）又は（２）に記載のヌクレオシド誘導体又はその塩。
（４）前記式（１）及び式（２）中、Ｒ3の前記連結基は、炭素数２以上６以下のアルキレン基を表し、Ｒ7は水素原子を表す、（１）〜（３）のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体又はその塩。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体を含む、オリゴヌクレオチドに対する細胞膜透過性付与剤。
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体を含む、オリゴヌクレオチドに対するリボヌクレアーゼ耐性付与剤。
（７）以下の式（３）及び式（４）からなる群から選択される部分構造を少なくとも１個備える、オリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
【化２】
2018110678.tif 000004
（式（３）中、Ｒ1は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された水酸基を表し、式（４）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。式（３）及び式（４）中、Ｒ3は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ7（Ｒ7は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。）、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
（８）前記部分構造を少なくとも２個備える、（７）に記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
（９）前記部分構造を少なくとも３個備えており、前記オリゴヌクレオチドを５’末端側、中央部及び３’末端側に備える、（７）又は（８）に記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
（１０）前記部分構造を少なくとも６個備える、（７）〜（９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
（１１）前記オリゴヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチドである、（７）〜（１０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド誘導体又はその塩。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】オリゴヌクレオチド合成のためのモノマーの構造を示す図である。
【図２】リンカーの構造を示す図である。
【図３】オリゴヌクレオチドの融解温度の評価結果を示す図である。
【図４】オリゴヌクレオチドの融解温度の評価結果を示す図である。
【図５】リボヌクレアーゼ耐性の評価結果を示す図である。
【図６】リボヌクレアーゼ耐性の他の評価結果を示す図である。
【図７】アミノアルキル基修飾による細胞膜透過性の評価結果を示す図である。
【図８】アミノアルキル基修飾による細胞膜透過性の他の評価結果を示す図である。
【図９】パッセンジャー鎖のウリジンユニットを２’−フルオロアミノエチルウリジン又は２’−Ｏ−メチルアミノエチルウリジンで置換したｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ活性の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書の開示は、ＲＮＡ医薬に好適な実用性のあるヌクレオシド誘導体又はその塩及びその利用に関する。本明細書に開示されるヌクレオシド誘導体又はその塩（以下、単に、本ヌクレオシド誘導体ともいう。）によれば、リボヌクレアーゼ耐性を有するとともに、細胞膜透過性に優れている。このため、従来のＲＮＡ医薬に用いられてきた送達用のＬＮＰなどのキャリアを用いない投与に好適なオリゴヌクレオチドを提供できる。
【００１０】
また、本ヌクレオシド誘導体は、ＲＮＡを用いた検出プローブなど試薬としても有用である。すなわち、種々のＲＮＡ試薬に好適なオリゴヌクレオチドを提供できる。
【００１１】
本明細書に開示されるヌクレオシド誘導体は、従来困難であったリボースの第４’位に種々のアミノアルキル系置換基を導入し、その性質について精査したところ、予想を超える有用な特徴を見出したことに基づいている。従来、リボヌクレアーゼ耐性に関しては、リボースの２’位や３’位の置換体によることが一般的であった。本明細書に開示されるヌクレオシド誘導体によれば、予想を超えるリボヌクレアーゼ耐性と細胞膜透過性という、ＲＮＡ医薬等に有用な特性を兼ね備えることができる。
【００１２】
以下、本開示の代表的かつ非限定的な具体例について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本開示の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに発明は、さらに改善されたヌクレオシド誘導体及びその利用を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。
【００１３】
また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本開示を実施する際に必須のものではなく、特に本開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
【００１４】
本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。以下、本明細書の開示の各種実施形態について詳細に説明する。
【００１５】
（本ヌクレオシド誘導体）
本ヌクレオシド誘導体は、以下の式（１）又は（２）で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩とすることができる。本ヌクレオシド誘導体は、当業者の周知の方法で、オリゴヌクレオチドの部分構造に含めることができる。
【００１６】
【化３】
2018110678.tif 000005
【００１７】
本ヌクレオシド誘導体は、リボース及びデオキシリボースの第４’位に塩基性を有する置換基を備えることで、本ヌクレオシド誘導体に由来する部分構造を備えるオリゴヌクレオチドにおいて、オリゴヌクレオチドが有するリン酸基などに起因する負電荷の少なくとも一部を中和することができるという電荷調節能を備えることができる。
【００１８】
また、当該部分構造を備えるオリゴヌクレオチドの細胞膜透過性を向上させることができる。
【００１９】
さらに、本ヌクレオシド誘導体に由来する部分構造を備えるオリゴヌクレオチドにおいて、リボヌクレアーゼ耐性を向上することができる。
【００２０】
本明細書中、式等で表される化合物における置換基における「低級」の意は、該置換基を構成する炭素数が、最大１０個までであることを意味している。例えば、通常は炭素数１〜６個、又は炭素数１〜５個が例示され、さらには炭素数１〜４個、又は炭素数１〜３個であることが好ましい例として挙げられる。
【００２１】
以下、本明細書に開示される本ヌクレオシド誘導体又はその塩及びこれらの利用について説明する。
【００２２】
（ヌクレオシド誘導体及びその塩）
本ヌクレオシド誘導体又はその塩の一つの態様は、以下の式（１）で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩である。
【００２３】
【化４】
2018110678.tif 000006
【００２４】
また、本ヌクレオシド誘導体又はその塩の他の一つの態様は、以下の式（２）で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩である。
【００２５】
【化５】
2018110678.tif 000007
【００２６】
[Ｒ1について]
式（１）中、Ｒ1は、水素原子、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された水酸基を表す。Ｒ1が水素原子のとき、本ヌクレオシド誘導体は、デオキシリボヌクレオシド誘導体である。Ｒ1が、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された水酸基であるとき、本ヌクレオシド誘導体は、リボヌクレオシド誘導体である。
【００２７】
[Ｘについて]
式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。ハロゲン原子としては、特に限定するものではないが、塩素原子、ヨウ素原子、フッ素原子及び臭素原子等が挙げられる。Ｒ1がハロゲン原子のとき、本ヌクレオシド誘導体は、デオキシリボヌクレオシド誘導体である。なお、ハロゲン原子は、式（２）からも明らかなように、リボースの２’位の炭素原子に対する結合方向は特に限定するものではないが、天然のリボースの水酸基に相当するようにハロゲン原子が結合することが好適である。
【００２８】
（アルキル基）
本明細書中、アルキル基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和炭化水素基が挙げられる。通常は、低級アルキル基が好ましく、例えば炭素数１〜６個の低級アルキル基、又は炭素数１〜５個の低級アルキル基がより好ましい例として挙げられ、さらに炭素数１〜４個又は炭素数１〜３個の低級アルキル基が特に好ましい例として挙げられる。直鎖状の炭素数１から４までのアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、又ｎ−ブチル基等が好適な例として挙げられ、このうち、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基が好ましく、また例えばメチル基、エチル基が好ましく、また例えばメチル基が好ましい。また分枝状の炭素数１から４までのアルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基等が挙げられ、このうち、イソプロピル基が特に好ましい例として挙げられる。又、環状の炭素数１から４までのアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロプロピルメチル基等が挙げられる。
【００２９】
（アルケニル基）
本明細書中、アルケニル基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和炭化水素基が挙げられる。通常は、低級アルケニル基が好ましく、低級アルケニル基としては、例えばエテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基などが挙げられる。
【００３０】
（水酸基の保護基又は保護された水酸基）
本明細書において、水酸基の保護基としては、当業者に周知であって、例えばＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００７年版）を参考にすることができる。水酸基の保護基としては、代表的な例を挙げると、例えば、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、低級アルコキシメチル基、適宜の置換基があってもよいオキシカルボニル基、適宜の置換基があってもよいテトラヒドロピラニル基、適宜の置換基があってもよいテトラチオピラニル基、合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基（但し前述の置換アリールにおける置換基としては、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン原子、又はシアノ基を意味する。）、又はシリル基、等が例示される。
【００３１】
なお、本明細書中、アルコキシ基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和アルキルエーテル基が挙げられる。低級アルコキシ基が好ましく、低級アルコキシ基としては、例えば炭素数１〜６個の低級アルコシキ基、又は炭素数１〜５個の低級アルコシキ基が挙げられ、さらには炭素数１〜４個、又は炭素数１〜３個のアルコキシ基が好ましく、炭素数１〜４個のアルコキシ基が特に好ましい。炭素数１〜４個のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、又はｎ−ブトキシ基等が好ましい例として挙げられる。また、イソプロポキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、又はｔ−ブトキシ基等も好ましい例として挙げられる。また、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基も好ましく、シクロプロピルメトキシ基も好ましい例として挙げられる。
【００３２】
本明細書中、アルキルチオ基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和アルキルチオ基が挙げられる。低級アルキルチオ基が好ましく、低級アルキルチオ基としては、例えば炭素数１〜６個の低級アルキルチオ基、又は炭素数１〜５個の低級アルキルチオ基が好ましく、さらには炭素数１〜４個の低級アルキルチオ基、又は炭素数１〜３個までのアルキルチオ基が特に好ましい例として挙げられる。炭素数１〜４個の飽和アルキルチオ基としては、例えば、メチルチオ基、エチオルチオ基、ｎ−プロピルチオ基、ｎ−ブチルチオ基等が好ましい例として例示される。またイソプロピルチオ基、イソブチルチオ基、ｓ−ブチルチオ基、又はｔ−ブチルチオ基等も好ましい例として例示される。またシクロプロピルチオ基、又はシクロブチルチオ基が好ましい例として挙げられ、さらにシクロプロピルメチルチオ基がさらに好ましい例として例示される。
る。）
【００３３】
これらのうち、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、シリル基が特に好ましい例として挙げられる。また、合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基（但しその置換アリールにおける置換基は、前述の通り）も好ましい例として挙げられる。
【００３４】
上記の脂肪族アシル基としては、例えば、アルキルカルボニル基、カルボキシアルキルカルボニル基、ハロゲノ低級アルキルカルボニル基、又は低級アルコキシ低級アルキルカルボニルが挙げられる。
【００３５】
なお、前記アルキルカルボニル基におけるアルキルは前述の説明の通りである。すなわち、アルキルカルボニル基としては、例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３−メチルノナノイル基、８−メチルノナノイル基、３−エチルオクタノイル基、３，７−ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１−メチルペンタデカノイル基、１４−メチルペンタデカノイル基、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５−メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１−メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基、又はヘナイコサイル基が挙げられる。このうち、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基が好ましい例として挙げられ、さらにはアセチル基が特に好ましい例として挙げられる。また前記カルボキシ化アルキルカルボニル基におけるアルキルは前述の説明の通りである。カルボキシ化の置換位置などについても適宜選択できる。すなわち、カルボキシ化アルキルカルボニル基としては、例えばスクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基が挙げられる。
【００３６】
前記ハロゲノ低級アルキルカルボニル基における、ハロゲン、低級、及びアルキルについては前述の説明の通りである。ハロゲンの置換位置などについても適宜選択できる。すなわち、ハロゲノ低級アルキルカルボニル基としては、例えばクロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基が挙げられる。
【００３７】
前記低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基における、アルコキシ及びアルキル、さらに低級については前述の説明の通りである。低級アルコキシが置換する位置などについても適宜選択できる。すなわち、低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基として、例えばメトキシアセチル基が挙げられる。
【００３８】
上記の芳香族アシル基としては、例えば、アリールカルボニル基、ハロゲノアリールカルボニル基、低級アルキル化アリールカルボニル基、低級アルコキシ化アリールカルボニル基、カルボキシ化アリールカルボニル基、ニトロ化アリールカルボニル基、又はアリール化アリールカルボニル基が挙げられる。
【００３９】
前記アリールカルボニル基としては、例えばベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基が挙げられ、さらに好ましくはベンゾイル基が挙げられる。前記ハロゲノアリールカルボニル基としては、例えば、２−ブロモベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基が挙げられる。前記低級アルキル化アリールカルボニル基としては、２，４，６−トリメチルベンゾイル基、４−トルオイル基、３−トルオイル基、２−トルオイル基が挙げられる。前記低級アルコキシ化アリールカルボニル基としては、例えば４−アニソイル基、３−アニソイル基、２−アニソイル基が挙げられる。
【００４０】
前記カルボキシル化アリールカルボニル基としては、例えば２−カルボキシベンゾイル基、３−カルボキシベンゾイル基、４−カルボキシベンゾイル基が挙げられる。前記ニトロ化アリールカルボニル基としては、例えば、４−ニトロベンゾイル基、３−ニトロベンゾイル基、２−ニトロベンゾイル基が挙げられる。前記アリール化アリールカルボニル基としては、例えば、４−フェニルベンゾイル基が挙げられる。
【００４１】
低級アルコキシメチル基としては、例えばメトキシメチル基、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ−ブトキシメチル基が挙げられる。特に好ましくはメトキシメチル基が挙げられる。
【００４２】
適宜の置換基があってもよいオキシカルボニル基としては、低級アルコキシカルボニル基、ハロゲン又はシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基、又はアルケニルオキシカルボニル基が挙げられる。
【００４３】
前記低級アルコキシカルボニル基としては、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニルイソブトキシカルボニル基が挙げられる。前記ハロゲン又はシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基としては、２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル基が挙げられる。
【００４４】
前記アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基が挙げられる。上記の、適宜の置換基があってもよいテトラヒドロピラニル基としては、例えばテトラヒドロピラン−２−イル基、又は、３−ブロモテトラヒドロピラン−２−イル基が好ましい例として挙げられ、特に好ましくはテトラヒドロピラン−２−イル基が挙げられる。
【００４５】
適宜の置換基があってもよいテトラチオピラニル基としては、例えばテトラヒドロチオピラン−２−イル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラン−４−イル基が挙げられ、さらに好ましくはテトラヒドロチオピラン−２−イル基が挙げられる。合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基、においては、前述の置換アリールにおける置換基としては、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、又はシアノ基を意味する。
【００４６】
合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基としては、例えばベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基が挙げられ、好ましくはベンジル基、トリフェニルメチル基が挙げられる。その他に、例えば９−アンスリルメチル４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基が挙げられ、好ましくは、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基が挙げられる。その他の種類として、例えば４−メトキシベンジル基、４−メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基が挙げられ、好ましくは４−メトキシベンジル基、４−メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基が挙げられる。さらには、例えば４−クロロベンジル基、４−ブロモベンジル基が挙げられる。またその他に、例えば４−シアノベンジル基も好ましい例として挙げられる。
【００４７】
本明細書中、シリル基としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、ジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリルフェニルジイソプロピルシリル基が挙げられる。このなかでさらに好ましくは、トリメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基が挙げられ、特に好ましくは、トリメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ジフェニルメチルシリル基が挙げられる。
【００４８】
本明細書における水酸基の保護基としては、化学的方法（例えば、加水素分解、加水分解、電気分解、又は光分解など）、又は生物学的方法（例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など）、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。水酸基の保護基としては、特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基が好ましい例として挙げられる。なお、保護された水酸基は、かかる保護基で水素原子が置換された水酸基ということができる。
【００４９】
[Ｒ2及びＲ4について]
式（１）及び式（２）中、Ｒ2及びＲ4は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6を表す。水酸基の保護基は既に説明したとおりである。
【００５０】
（保護されたリン酸基）
保護されたリン酸基における保護基は当業者公知であり、上述の参考文献や説明を参考にすることができる。
【００５１】
リン酸基の保護基としては、例えば、低級アルキル基、シアノ基で置換された低級アルキル基、シリル基で置換されたエチル基、ハロゲンで置換された低級アルキル基、低級アルケニル基、シアノ基で置換された低級アルケニル基、シクロアルキル基、シアノ基で置換された低級アルケニル基、アラルキル基、ニトロ基でアリール環が置換されたアラルキル基、ハロゲンでアリール環が置換されたアラルキル基、低級アルキル基で置換されたアリール基、ハロゲンで置換されたアリール基、又はニトロ基で置換されたアリール基が挙げられる。
【００５２】
前記の低級アルキル基としては、前述したとおりである。前記のシアノ基で置換された低級アルキル基としては、例えば２−シアノエチル基、２−シアノ−１、１−ジメチルエチル基が挙げられ、特に好ましくは、２−シアノエチル基が挙げられる。前記のシリル基で置換されたエチル基としては、例えば２−メチルジフェニルシリルエチル基、２−トリメチルシリルエチル基、２−トリフェニルシリルエチル基が挙げられる。
【００５３】
前記のハロゲンで置換された低級アルキル基としては、例えば２，２，２−トリクロロエチル基、２，２，２−トリブロモエチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基が挙げられ、特に好ましくは、２，２，２−トリクロロエチル基が挙げられる。前記の低級アルケニル基としては、例えばエテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基などが挙げられる。
【００５４】
前記のシアノ基で置換された低級アルケニル基としては、例えば２−シアノエチル基、２−シアノプロピル基、２−シアノブテニル基が挙げられる。前記のアラルキル基としては、例えばベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、インデニルメチル基、フェナンスレニルメチル基、アントラセニルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、１−フェネチル基、２−フェネチル基、１−ナフチルエチル基、２−ナフチルエチル基、１−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、３−フェニルプロピル基、１−ナフチルプロピル、２−ナフチルプロピル、３−ナフチルプロピル、１−フェニルブチル基、２−フェニルブチル基、３−フェニルブチル基、４−フェニルブチル基が挙げられ、さらに好ましくは、ベンジル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、１−フェネチル基、２−フェネチル基が挙げられ、特に好ましくは、ベンジル基が挙げられる。
【００５５】
前記のニトロ基でアリール環が置換されたアラルキル基としては、２−（４−ニトロフェニル）エチル基、０−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、２，４−ジニトロベンジル基、４−クロロ−２−ニトロベンジル基などが挙げられる。
【００５６】
本明細書においてリン酸の保護基としては、化学的方法（例えば、加水素分解、加水分解、電気分解、又は光分解など）、又は生物学的方法（例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など）、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。リン酸の保護基としては、特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基が好ましい例として挙げられる。
【００５７】
（−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6）
本発明のヌクレオシド類縁体のＲ2及びＲ4は、−Ｐ(＝Ｏ)n(Ｒ5)Ｒ6となる場合がある。ｎは０又は１を示し、Ｒ5及びＲ6は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ5及びＲ6が共に水素原子となることはない。保護された水酸基及び低級アルコキシ基については、既に説明したとおりである。
【００５８】
（保護されたメルカプト基）
保護されたメルカプト基は、当業者において周知である。保護されたメルカプト基としては、例えば上記水酸基の保護基として挙げたものの他、例えばアルキルチオ基、アリールチオ基、脂肪族アシル基、芳香族アシル基が挙げられる。好ましくは、脂肪族アシル基、芳香族アシル基が挙げられ、特に好ましくは、芳香族アシル基が挙げられる。アルキルチオ基としては、低級アルキルチオ気が好ましく、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｔ−ブチルチオ基が好ましい例として挙げられる。アリールチオ基としては、例えばベンジルチオが挙げられる。また芳香族アシル基としてはベンゾイル基が挙げられる。
【００５９】
前記のシアノ低級アルコキシ基としては、例えば、シアノ基が置換した直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである炭素数１〜５個のアルコキシ基（なお、シアノ基中の炭素の数を含めずに数えた場合）が好ましい例として挙げられ、具体的には例えば、シアノメトキシ、２−シアノエトキシ、３−シアノプロポキシ、４−シアノブトキシ、３−シアノ―２−メチルプロポキシ、又は１−シアノメチル−１，１−ジメチルメトキシ等が挙げられ、特に好ましくは、２−シアノエトキシ基が挙げられる。
【００６０】
Ｒ5及びＲ6として、置換されたアミノ基が選択できる。そのアミノ基の置換基は、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、シアノ低級アルコキシ基、又は低級アルキル基のいずれかを示す。なお前記Ｒ5及びＲ6が共に、置換されたアミノ基である場合では、該置換されたアミノ基として互いに異なった置換されたアミノ基であってもよい。前記の低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、シアノ低級アルコキシ基、及び低級アルキル基は、前述に説明された通りである。
【００６１】
−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6としては、より具体的には、ホスホロアミダイド基、H−ホスホネート基、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられ、ホスホロアミダイド基が特に好ましい例として挙げられる。
【００６２】
−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6において、ｎが０であり、Ｒ5及びＲ6の少なくとも一方が置換されたアミノ基であり、他方は何であってもよい場合には、ホスホロアミダイド基となる。ホスホロアミダイド基としては、Ｒ5及びＲ6の一方が置換されたアミノ基であり、他方が低級アルコキシ基、又はシアノ低級アルコキシ基であるホスホロアミダイド基が、縮合反応の反応効率が良好であり、特に好ましい。その置換されたアミノ基としては、例えば、ジエチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基等が好ましい例として挙げられ、特に好ましくはジイソプロピルアミノ基が例示される。また、Ｒ5及びＲ6の他方の置換基における低級アルコキシ基としては、メトキシキ基が好ましい例として挙げられる。また、シアノ低級アルコキシ基としては、２−シアノエチル基が好ましい例として挙げられる。ホスホロアミダイド基としては、具体的には、−Ｐ（ＯＣ2Ｈ4ＣＮ）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ3）2）、又は−Ｐ（ＯＣＨ3）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ3）2）が好ましい例として挙げられる。
【００６３】
−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6において、ｎが１であり、Ｒ5及びＲ6の少なくとも一方が水素原子であり、他方は水素原子以外であれば何であってもよい場合には、H−ホスホネート基となる。その、水素以外の置換基としては、例えば、ヒドロキシル基、メチル基、メトキシ基、チオール基等が挙げられ、特に好ましくはヒドロキシル基が例示される。
【００６４】
また、−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6において、ｎが１であり、Ｒ5及びＲ6が共に低級アルコキシ基である場合には、ホスホニル基となる。なお、Ｒ5及びＲ6における低級アルコキシ基は互いに同一でも相違していてもよい。その低級アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基等が好ましい例として挙げられる。ホスホニル基としては、具体的には、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＣＨ3）2が挙げられる。
【００６５】
本ヌクレオシド誘導体におけるＲ2としては、例えば、−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6であることが特に好ましい。−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6としては、ホスホロアミダイド基、Ｈ−ホスホネート基、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられる。Ｒ2としては、その他にリン酸基、又は保護されたリン酸基であることも好ましい。さらにＲ2としては、水素原子、又は水酸基の保護基であることも好ましい。
【００６６】
Ｒ2の具体的な他の例示としては、水素原子、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、−Ｐ（ＯＣ2Ｈ4ＣＮ）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ3）2）、−Ｐ（ＯＣＨ3）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ3）2）、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられる。
【００６７】
本ヌクレオシド誘導体におけるＲ4としては、例えば、水素原子又は水酸基の保護基が好ましい。また例えば、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6であることも好ましい。Ｒ4としての具体的な例示を挙げると、水素原子、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、又はトリメチルシリル基が好ましい例として挙げられる。
【００６８】
[Ｒ3について]
式（１）及び式（２）中、Ｒ3は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ7、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表すことができる。すなわち、ＮＨＲ7、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基は、それぞれが連結基を介して４’位の炭素原子に結合している。
【００６９】
連結基としては、例えば、炭素数１個以上の２価炭化水素基を表すことができる。すなわち、２価の炭化水素基としては、炭素数１〜８個以下のアルキレン基、炭素数２〜８個以下のアルケニレン基などが挙げられる。
【００７０】
連結基としてのアルキレン基としては、直鎖状、分枝状であってもよいが、好ましくは直鎖状である。例えば、低級アルキル基が好ましく、例えば炭素数１〜６個の低級アルキル基、また例えば、炭素数２〜６個の低級アルキル基が好ましく、また例えば、炭素数２〜４個又は炭素数２〜３個の低級アルキル基が好ましい。直鎖状の炭素数１から４までのアルキル基としては、メチレン基、エチレン基、プロパンー１、３−ジイル基、ｎ−ブタン−１，１−ジイル基、ｎ−ペンチル−１−５，−ジイル基、ｎ−ヘキシル−１，６−ジイル基等が挙げられる。また、例えば、ブタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。また例えば、エチレン基、プロパンー１、３−ジイル基、ｎ−ブタン−１，１−ジイル基が特に好ましい例として挙げられる。
【００７１】
連結基としてのアルケニレン基としては、直鎖状、分枝状であり、好ましくは直鎖状である。例えば、低級アルケニレン基が好ましく、低級アルケニレン基としては、例えば、エテン−１，２−ジイル基、プロペンー１，３−ジイル基、ブテン−１，４−ジイル基等が挙げられる。
【００７２】
式（１）で表されるヌクレオシド誘導体においては、例えばエチレン基などの炭素数２以上のアルキレン基などの２価炭化水素基であることがオリゴヌクレオチド誘導体のヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性の観点から好適である。また、式（２）で表されるヌクレオシド誘導体においては、例えばエチレン基などの炭素数１以上のアルキレン基などの２価炭化水素基であってもヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性の観点から好適である。
【００７３】
Ｒ7としては、水素原子、アルキル基又はアルケニル基又はアミノ基の保護基が挙げられる。アルキル基は、既に説明したアルキル基のほか、低級アルキル基が好ましく挙げられる。アルケニル基としては、既に説明したアルケニル基のほか、低級アルケニル基が好ましく挙げられる。Ｒ7が水素原子などこれらの基であるとき、連結基は、炭素数２以上、また例えば３以上、また例えば４以上で、例えば６以下、また例えば５以下、また例えば４以下のアルキレン基であることが好適である。より好適には、連結基は、炭素数２以上の連結基であり、炭素数２以上のアルキレン基である。
【００７４】
また、Ｒ7が水素原子のとき、Ｒ3は、連結基を有するＮＨ2（アミノ基）、すなわち、連結基がアルキレン基やアルケニレン基のときには、アミノアルキル基やアミノアルケニル基などとなる。式（１）及び式（２）中、Ｒ3がアミノアルキル基などであることにより、本ヌクレオシド誘導体及び本ヌクレオシド誘導体に由来するモノマーユニットを備えるオリゴヌクレオチド誘導体は、周囲のｐＨ環境において電荷が変化するという特徴を伴う電荷付与性を発揮することができる。例えば、酸性下ではカチオニックであり、生理的条件下の中性ではプラス電荷が減少して電荷ゼロとなりうる。すなわち、かかる電荷調節能によれば、ｐＨ環境を変化させることで、必要時にヌクレオシド誘導体の電荷をダイナミックに変化させたり、所望の電荷を付与したりすることができる。したがって、このような本ヌクレオシド誘導体によれば、オリゴヌクレオチドの電荷を従来とは異なる態様であるいは従来よりも一層高い自由度で調整できるようになる。以上のことから、Ｒ3がかかるアミノアルキル基などである本ヌクレオシド誘導体は、オリゴヌクレオチド等に対する電荷（正電荷）付与剤又は電荷調節剤として有用である。
【００７５】
Ｒ3としては、それぞれ連結基を有する、アジド基、アミジノ基、すなわち、ＣＨ3（ＮＨ）Ｃ（ＮＨ）−（アミジンのアミノ基から水素原子1個を除いたもの）、グアニジノ基、すなわち、ＮＨ2（ＮＨ）Ｃ（ＮＨ）−（グアニジンのアミノ基から水素原子1個を除いたもの）が挙げられる。なかでも、グアニジノ基が挙げられる。Ｒ3が、これらの基を有するとき、連結基は、炭素数１以上、また例えば２以上などのアルキレン基又はアルケニレン基などとすることができる。なお、Ｒ3が、連結基を有するアミジノ基、グアニジノ基のときには、既述のアミノアルキル基などのときとは異なり、常にカチオニックとなる。かかる本ヌクレオシド誘導体は、Ｒ3がアミノアルキル基などである本ヌクレオシド誘導体と組み合わせて用いるのに有用である。
【００７６】
アミノ基に対する保護基は、当業者に周知されており、前述の参考文献を参照することができる。具体的には、上記にて水酸基の保護基として挙げたものの他、例えばベンジル基、メチルベンジル基、クロロベンジル基、ジクロロベンジル基、フルオロベンジル基、トリフルオロメチルベンジル基、ニトロベンジル基、メトキシフェニル基、メトキシメチル（ＭＯＭ）基、Ｎ−メチルアミノベンジル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンジル基、フェナシル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、フタルイミド基、アリルオキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、１−メチル−１−（４−ビフェニル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）基、又は２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭ）基などが挙げられる。さらに好ましくは、ベンジル基、メトキシフェニル基、アセチル基、トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）基、ピバロイル基、ベンゾイル基、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、１−メチル−１−（４−ビフェニル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）基、又は２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭ）基が挙げられ、特に好ましくは、ベンジル基、メトキシフェニル基、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシメチル基が挙げられる。
【００７７】
本発明においてアミノ基の保護基としては、化学的方法（例えば、加水素分解、加水分解、電気分解、又は光分解など）、又は生物学的方法（例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など）、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基がアミノ基の保護基として好ましい。
【００７８】
[Ｂ：塩基について]
本ヌクレオシド誘導体におけるＢ：塩基としては、公知の天然塩基ほか、人工塩基が挙げられる。例えば、Ｂとしては、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基が選択できる。
【００７９】
すなわち、Ｂとしては、プリン−９−イル基、又は２−オキソ−ピリミジン−１−イル基が挙げられるほか、２，６−ジクロロプリン−９−イル、又は２−オキソ−ピリミジン−１−イルが挙げられる。さらに、２−オキソ−４−メトキシ−ピリミジン−１−イル、４−（１H−１，２，４−トリアゾール‐１−イル）−ピリミジン−１−イル、又は２，６−ジメトキシプリン−９−イルが挙げられる。
【００８０】
さらに、アミノ基が保護された２−オキソ−４−アミノ−ピリミジン−１−イル、アミノ基が保護された２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル、アミノ基が保護された２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル、アミノ基及び／又は水酸基が保護された２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル、アミノ基が保護された２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル、アミノ基が保護された６−アミノプリン−９−イル、又はアミノ基が保護された４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−ピリミジン−１−イル基が挙げられる。なお、水酸基及びアミノ基の各保護基については、既に説明したとおりである。
【００８１】
さらに、６−アミノプリン−９−イル（アデニン）、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル（グアニジン）、２−オキソ−４−アミノ−ピリミジン−１−イル（シトシン）、２−オキソ−４−ヒドロキシ−ピリミジン−1−イル（ウラシル）、又は２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチルピリミジン−１−イル（チミン）が挙げられる。
【００８２】
さらにまた、４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−ピリミジン−１−イル（メチルシトシン）、２，６−ジアミノプリン−９−イル、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル、６−メルカプトプリン−９−イル、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−ピリミジン−１−イル、又は２−オキソ−４−メルカプト−ピリミジン−１−イルが挙げられる。
【００８３】
また、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル、又は２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イルが挙げられる。
【００８４】
置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基それぞれにおける置換基は、水酸基、保護された水酸基、低級アルコキシ基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルキルチオ基、アミノ基、保護されたアミノ基、低級アルキル基で置換されたアミノ基、低級アルキル基、低級アルコキシメチル基、又はハロゲン原子のいずれか一つ、又はそれらの複数の組み合わせのいずれかである。これらの置換基は、既に説明したとおりである。
【００８５】
本ヌクレオシド誘導体におけるＢとしては、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基における置換基が既述の各置換基が好ましいが、これに加えてさらに、トリアゾール基、低級アルコキシメチル基が加わることも好ましい。
【００８６】
置換プリン−９−イル基の好ましい例としては、例えば、６−アミノプリン−９−イル、２，６−ジアミノプリン−９−イル、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル、２，６−ジメトキシプリン−９−イル、２，６−ジクロロプリン−９−イル、又は６−メルカプトプリン−９−イル等が挙げられる。上述の置換基中にアミノ基や水酸基があれば、それらのアミノ基及び／又は水酸基が保護化された置換基が好ましい例として挙げられる。
【００８７】
置換２−オキソ−ピリミジン−１−イルとしては、例えば２−オキソ−４−アミノ−ピリミジン−１−イル、１Ｈ−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−ピリミジン−１−イル、４−１Ｈ−１，４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−ピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−メトキシ−ピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−メルカプト−ピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−ヒドロキシ−ピリミジン−1−イル、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチルピリミジン−１−イル、又は４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−ピリミジン−１−イル等が挙げられる。
また、２−オキソ−４−メトキシ−ピリミジン−１−イル、又は４−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール‐１−イル）−ピリミジン−１−イルが好ましい例として挙げられる。
【００８８】
こうしたＢのうち、置換基中にアミノ基や水酸基があれば、それらのアミノ基又は水酸基が保護化された置換基が好ましい例として挙げられる。
【００８９】
本ヌクレオシド誘導体は、塩であってもよい。塩の形態は特に限定されないが、一般的には酸付加塩が例示され、分子内対イオンの形態をとっていてもよい。又は置換基の種類によっては塩基付加塩が形成される場合もある。塩としては、薬学的に許容される塩が好ましい。薬学的に許容しうる塩を形成する酸及び塩基の種類は当業者には周知であり、例えばＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１−１９（１９７７）に記載しているものなどを参考にすることができる。例えば、酸付加塩としては、鉱酸塩、有機酸塩が挙げられる。また、一個以上の置換基が酸性部分を含有する場合、塩基付加塩も好ましい例として挙げられる。
【００９０】
鉱酸塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素酸塩、リン酸塩、リン酸水素酸塩などが挙げられる。通常は、塩酸塩、リン酸塩、が好ましい例として挙げられる。有機酸塩としては、例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、又はｐ−トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。通常は、酢酸塩等が好ましい例として挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ金属の塩、アルカリ土類金属の塩、有機アミン塩、アミノ酸の付加塩が挙げられる。
【００９１】
前記のアルカリ金属の塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。また、アルカリ土類金属の塩としては、例えば、マグネシウム塩、カルシウム塩などが挙げられる。有機アミン塩としては、例えば、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、プロカイン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩等が例示される。また、アミノ酸の付加塩としては、例えば、アルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩、セリン塩、グリシン塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられる。
【００９２】
本ヌクレオシド誘導体又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあり、これらの物質も本明細書の開示の範囲に含まれる。本ヌクレオシド誘導体又はその塩は、後述の合成例や公知の方法に準じて、当業者は容易に製造することができる。
【００９３】
本ヌクレオシド誘導体は、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部としてオリゴヌクレオチドに導入することで、一本鎖としてのオリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させうることができるほか、哺乳動物細胞等の細胞膜透過性を向上させることができる。すなわち、本ヌクレオシド誘導体は、それ自体は、ヌクレアーゼ耐性向上剤及び／又は細胞膜透過性付与剤として有用である。また、本ヌクレオシド誘導体は、４’に塩基性の置換基を備えることができる。これにより、オリゴヌクレオチド等におけるリン酸基などに由来する負電荷を調整することができるという電荷調節剤又は正電荷付与剤として機能することができる。
【００９４】
（オリゴヌクレオチド誘導体及びその塩）
本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド誘導体（以下、本オリゴヌクレオチド誘導体ともいう。）は、式（３）及び式（４）で表される部分構造を少なくとも１個含有することができる。式（３）及び式（４）で表される部分構造は、それぞれ、式（１）及び式（２）で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩に基づいて取得されうる。
【００９５】
【化６】
2018110678.tif 000008
【００９６】
式（３）及び式（４）で表される部分構造におけるＲ1、Ｘ，Ｒ3及びＢについては、式（１）及び式（２）におけるのとそれぞれ同義である。
【００９７】
式（３）及び式（４）で表される部分構造は、本オリゴヌクレオチド誘導体中において２個以上含んでいてもよい。その場合、これらの部分構造は、互いに同一であっても異なっていてもよい。また、本オリゴヌクレオチド誘導体に含まれる部分構造の全体は、式（３）で表される部分構造のみから構成されていてもよいし、式（４）で表される部分構造のみから構成されていてもよい。また、式（３）で表される部分構造１又は２以上有し、かつ式（４）で表される部分構造を１又は２以上有していてもよい。
【００９８】
また、式（３）及び式（４）で表される部分構造の配置としては、互いに隣り合ってもよいし、離れて存在してもよい。例えば、本オリゴヌクレオチド誘導体は、前記部分構造を少なくとも３個備えることができる。この場合、各部分構造を、本オリゴヌクレオチド誘導体の５’末端側、中央部及び３’末端側に略均等に備えることができる。部分構造を本オリゴヌクレオチド誘導体のこれら各部に略均等に備える、とは、これらの各部において、同数個を必ずしも部分構造を備えることを限定するものではなく、これら各部に少なくとも１個をそれぞれ備えることを少なくとも充足すれば足りる。例えば、各部に１〜３個程度の部分構造を備える場合には、略均等ということができる。部分構造は、本オリゴヌクレオチド誘導体において、少なくとも６個備えることができる。
【００９９】
式（３）で表される部分構造は、糖鎖部分がリボース又はデオキシリボースに由来していることから、本オリゴヌクレオチド誘導体は、オリゴリボヌクレオチドであってもよいし、オリゴデオキシリボヌクレオチドであってもよい。また、本オリゴヌクレオチド誘導体は、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとのキメラであってもよい。
【０１００】
本オリゴヌクレオチド誘導体は、それ自体一本鎖であるが、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、及びオリゴデオキシリボ／リボヌクレオチド（キメラ鎖）とのハイブリッド、すなわち、二本鎖の形態を採ることもできる。
【０１０１】
本オリゴヌクレオチド誘導体は、式（３）及び式（４）で表される部分構造以外の部分構造としては、その他の天然のヌクレオチド、又は公知のヌクレオシド誘導体及び／又はヌクレオチド誘導体などに該当する部分構造を備えることができる。本明細書において規定する部分構造及びその他の部分構造は、互いに、例えば、リン酸ジエステル結合、リン酸モノエステル結合、チオリン酸エステル結合等によって結合されうる。
【０１０２】
本オリゴヌクレオチド誘導体は、部分構造及びその他のヌクレオシド誘導体の個数を単位として、少なくとも２個以上、さらには８個以上であることが好ましく、特に好ましくは１５個以上であることが挙げられる。上限としては特に限定されないが、例えば１００個以下であり、また例えば、８０個以下であり、また例えば、６０個以下であり、また例えば、５０個以下であり、また例えば、４０個以下であり、また例えば、３０個以下であり、また例えば、２０個以下であってもよい。
【０１０３】
本オリゴヌクレオチド誘導体は、式（３）及び式（４）で表される部分構造ほか、その他の部分構造において、一個以上の不斉中心を有する場合があり、立体異性体が存在する場合も同様であって、立体異性体の任意の混合物、又はラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また互変異性体として存在しうる場合もある。
【０１０４】
本オリゴヌクレオチド誘導体は、塩であってもよい。塩の形態は特に限定されないが、薬学的に許容される塩が好ましい例として挙げられる。塩については、既述の本ヌクレオシド誘導体における塩の態様を適用することができる。本オリゴヌクレオチド誘導体又はその塩としては、水和物や溶媒和物であってもよく、これらも本発明の範囲に含まれる。
【０１０５】
（本ヌクレオシド誘導体及び本オリゴヌクレオチド誘導体の製造）
本ヌクレオシド誘導体及び本オリゴヌクレオチド誘導体は、当業者であれば、後段の具体的な合成例のほか、本願出願時において公知のヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドについての合成技術に基づいて、容易に合成されうる。
【０１０６】
本ヌクレオシド誘導体及び本オリゴヌクレオチド誘導体は、例えば下記の方法により製造できるが、本発明のヌクレオシド類縁体又はオリゴヌクレオチド類縁体の製造方法は下記の方法に限定されるものではない。
【０１０７】
それぞれの反応において、反応時間は特に限定されないが、後述の分析手段により反応の進行状態を容易に追跡できるため、目的物の収量が最大となる時点で終了すればよい。また、それぞれの反応は必要により、例えば、窒素気流下又はアルゴン気流下などの不活性ガス雰囲気下で行うことができる。それぞれの反応において、保護基による保護及びその後の脱保護が必要な場合は、後述の方法を利用することにより適宜反応を行うことができる。
【０１０８】
なお、本明細書においては、Ｂｎはベンジル基を示し、Ａｃはアセチル基を示し、Ｂｚはベンゾイル基を示し、ＰＭＢはｐ−メトキシベンジル基を示し、Ｔｒはトリフェニルメチル基を示し、ＴＨＡは、トリフルオロアセチル基を示し、ＴｓＯは、トシルオキシ基を示し、ＭＭＴｒは４−メトキシトリフェニルメチル基を示し、ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基を示し、ＴＭＳはトリメチルシリル基を示し、ＴＢＤＭＳはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基を示し、ＴＢＤＰＳはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基を示し、ＭＯＭはメトキシメチル基を示し、ＢＯＭはベンジルオキシメチル基を示し、ＳＥＭは２−（トリメチルシリル）エトキシメチル基を示す。
【０１０９】
例えば、本ヌクレオシド誘導体の一例は、以下のスキームに従い合成することができる。なお、以下のスキームは、グルコースを出発物質として、チミンリボヌクレオシド誘導体を合成し、本オリゴヌクレオチド誘導体の合成のためのホスホロアミダイト剤を合成するまでのスキームの一例である。
【０１１０】
【化７】
2018110678.tif 000009
【０１１１】
【化８】
2018110678.tif 000010
【０１１２】
常法に従い、グルコース１から、上記化合物２を取得した。化合物２から、Bioorganic & Medical Chemistry 11(2003)211-2226, Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672, The Journal of Organic Chemistry 2013, 78, 9956-9962, HELVATICA CHIMICA ACTA Vol. 83 (2000) 128-151等のほか、Bioorganic & Medical Chemistry 11(2003)211-2226, Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672の記載に基づいて化合物３ないし化合物２０を得ることができる。
【０１１３】
式（３）及び（４）で表される部分構造を備える本オリゴヌクレオチド誘導体は、式（１）又は（２）で表される各種の本ヌクレオシド誘導体を、アミダイト剤等として利用することで容易に製造できる。すなわち、こうしたヌクレオシド誘導体を用いることで、公知のＤＮＡシンセサイザーを用いて合成することができ、得られるオリゴヌクレオチド誘導体は、カラムを用いて精製し、生成物の純度を逆相ＨＰＬＣやＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析することにより、精製された本オリゴヌクレオチド誘導体を得ることができる。なお、本オリゴヌクレオチド誘導体を酸付加塩とする方法は、当業者に周知である。
【０１１４】
本オリゴヌクレオチド誘導体によれば、リボース４'位に連結基を介して所定のＮ含有基を備えることで、ＲＮＡ干渉能等の生体におけるＲＮＡ機能を維持しつつ、ＲＮＡの実質電荷量を調節でき、脂溶性（ファンデルワールス分子間力）を増強し、ｄｓＲＮＡ溶融温度をさげることを実現できる。これにより、リボヌクレアーゼ耐性を向上させることができるほか、細胞膜透過性を向上させることができる。さらに、リン酸基等によるマイナス電荷を中和し、全体としての電荷を調節することもできる。
【０１１５】
本オリゴヌクレオチド誘導体においては、本部分構造を少なくとも２個備えることができる。本部分構造を複数個備えることで、細胞膜透過性、リボヌクレアーゼ耐性等を確実に向上させ、また調整することができる。また、本オリゴヌクレオチド誘導体は、本部分構造を少なくとも３個備えることもできる。
【０１１６】
本オリゴヌクレオチド誘導体においては、１個又は２個以上の本部分構造の備える部位は特に限定するものではないが、例えば、５’末端側及び３’末端側のいずれか及び双方に備えることができる。５’末端側及び３’末端側とは、それぞれ、本オリゴヌクレオチドのポリマー鎖の各末端から適数個の範囲の領域をいい、それぞれ、ポリマー鎖の全構成単位の、例えば３０％を超えない構成単位からなる領域をいう。上記末端からの範囲の割合は、ポリマー鎖の全長によっても異なるが、例えば２５％以下、また例えば２０％以下、また例えば１０％以下、また例えば５％以下などとすることができる。より具体的には、５’末端側及び３’末端側とは、例えば各末端から１個〜３０個、また例えば例えば１個〜２５個、また例えば１個〜２０個、また例えば１個〜１５個、また例えば１個〜１０個、また例えば１個〜８個、また例えば１個〜６個、また例えば１個〜５個、また例えば１個〜４個、また例えば１〜３個、また例えば例えば１〜２個のヌクレオシド誘導体由来の構成単位の領域とすることができる。本オリゴヌクレオチド誘導体は、こうした末端領域のいずれかに１個又は２個以上の本部分構造を備えることができる。好ましくは、２個以上備えることができる。また、本オリゴヌクレオチド誘導体は、５’末端及び３’末端（すなわち、各末端から１個目の構成単位）のいずれか又は双方に本部分構造を備えることもできる。
【０１１７】
本オリゴヌクレオチド誘導体においては、１個又は２個以上の本部分構造を、５’末端側及び３’末端側以外の部分である中央部に備えることもできる。本オリゴヌクレオチド誘導体が、中央部に本部分構造を備えることで、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性の向上や調整が一層容易になる。また、オリゴヌクレオチド全体の電荷の調整もより容易になる。
【０１１８】
本オリゴヌクレオチド誘導体は、５’末端側及び３’末端側のいずれか又は双方と中央部に本部分構造を備えることもできる。好ましくは５’末端側、３’末端側及び中央部の各部に１個又は２個以上の本部分構造を備えることができる。このように、全体として、おおよそ均等にあるいは分散して本部分構造を備えることで、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性さらには電荷調節性を向上させることができる。本オリゴヌクレオチド誘導体の中央部には、本部分構造を２個以上備えることが、特性向上の観点から有用である。
【０１１９】
本オリゴヌクレオチド誘導体における本部分構造としては、式（３）で表されるリボヌクレオシド誘導体由来する部分構造、式（４）で表されるデオキシリボヌクレオチド誘導体に由来する部分構造を用いることができる。なお、式（３）で表されるリボヌクレオシド誘導体及び式（４）の部分構造は、Ｂの塩基として、ＲＮＡにおける塩基であるウラシル（Ｕ）他を備えることで、リボヌクレオシド誘導体の代替物として用いることができる。
【０１２０】
また、本部分構造は、式（３）及び（４）におけるＲ3が、炭素数１又は２以上のアルキレン基を連結基として、ＮＨＲ7を有することが、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性さらには電荷調節性の観点から好適である。この場合、Ｒ7は、水素原子であってもよいし、炭素数１〜６程度のアルキル基を有するアシル基であってもよい。当該アルキレン基は、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基などとすることができる。また、例えばエチレン基、プロピレン基、ブチレン基などとすることができる。また例えば例えばエチレン基、プロピレン基などとすることができる。エチレン基、プロピレン基を連結基とすることで、メチレン基を用いた場合に比較して高いリボヌクレアーゼ耐性と細胞膜透過性さらには電荷調節性とを得ることができる。
【０１２１】
また、本部分構造は、連結基を備えるアミジノ基、アジド基及びグアニジノ基であってもよい。かかる官能基を備えることでも、高いリボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性を得ることができる。この場合、連結基は、炭素数１以上のアルキレン基であってもよい。
【０１２２】
また、本部分構造は、式（３）及び式（４）のＲ3の連結基が炭素数１〜６程度のアルキル基、さらに、例えば、炭素数の下限が２以上、また例えば３以上であることが好適である。かかる構造は、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性に有効である。
【０１２３】
本オリゴヌクレオチド誘導体は、少なくとも本部分構造を少なくとも６個備えることが好適である。６個以上備えることで、リボヌクレアーゼ耐性や細胞膜透過性、さらには電荷調節性に有利である。
【０１２４】
本オリゴヌクレオチド誘導体は、例えば、ｓｉＲＮＡとして利用できる。すなわち、二重鎖を形成したオリゴヌクレオチド誘導体は、生体内成分（ＲＩＳＣタンパク質）と複合体を形成して、配列特異的にｍＲＮＡを切断することにより、ｍＲＮＡ上の情報がリボソームにより特定のタンパク質へ翻訳されることをできなくする。また、ｍｉＲＮＡを構成する構成物として、あるいはまたアプタマーＲＮＡの構成物としても取り込まれて、リボヌクレアーゼ耐性や細胞膜透過性向上の特徴を生かしつつ、利用できると考えられる。さらに、他の化合物と連結してコンジュゲートを構成することもできる。さらにまた、本オリゴヌクレオチド誘導体は、リボザイムの構成物としても利用できる。また、本オリゴヌクレオチド誘導体は、ＲＮＡチップやその他の試薬としても有用である。
【０１２５】
このことから本オリゴヌクレオチド誘導体は、天然ヌクレオチドにはない特徴を生かして、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤をはじめとする遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する種々のＲＮＡ医薬品の構成物として、天然ヌクレオチドに優る有用性が期待される。すなわち、本オリゴヌクレオチド誘導体は、こうしたＲＮＡ医薬のほか、その原料又は中間体試薬として有用である。また、本ヌクレオシド誘導体は、こうしたＲＮＡ医薬の原料又は中間体として有用である。
【０１２６】
本オリゴヌクレオチド誘導体の電荷調節性、リボヌクレアーゼ耐性、細胞膜透過性、電荷調節能ならびに本オリゴヌクレオチド誘導体を含む種々のＲＮＡの生物活性については、当業者であれば、適宜、後述する実施例や本願出願時における当業者の周知の手法を参照することで容易に評価することができる。
【実施例】
【０１２７】
以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１２８】
（１）2′OH-4′アミノメチルアミダイトユニット及び樹脂体
以下のスキームに従い、2′OH-4′アミノメチルアミダイトユニット及び樹脂体を合成した。【０１２９】
【化９】
2018110678.tif 000011
【０１３０】
3,5-di-O-benzyl-4-C-[(trifluoromethanesulfonyl)oxy]methyl-1,2-O-(1-methylethylidene)-α-D-ribofuranose 1
グルコースを出発原料とし、既存の手法(Bioorganic & Medical Chemistry 11(2003)211-2226, Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672)を用いて目的物 1を合成した。【０１３１】
3,5-di-O-benzyl-4-C-azidomethyl-1,2-O-(1-methylethylidene)-α-D-ribofuranose 2
3,5-di-O-benzyl-4-C-[(trifluoromethanesulfonyl)oxy]methyl-1,2-O-(1-methylethylidene)-α-D-ribofuranose (3.77 g, 7.09 mmol) のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液 (80 mL) に、アルゴン雰囲気下でアジ化ナトリウム（ＮａＮ3）(3.87 g, 59.6 mmol) を加え、６０℃で一晩撹拌した。反応混合物の酢酸エチル溶液を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、4:1、v/v] により精製し、目的物2 (2.16 g, 5.08 mmol, 72%) を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.35 (s, 3H, CH3)，1.65 (s, 3H, CH3)，3.31 (d, J= 13.3 Hz, 1H)，3.44 (d, J= 10.6 Hz, 1H)，3.57 (d, J= 10.1 Hz, 1H)，4.03 (d, J= 13.3 Hz, 1H)，4.19 (d, J= 5.0 Hz, 1H)，4.47 (d, J= 11.9 Hz, 1H)，4.54 (d, J= 12.4 Hz, 2H)，4.62 (t, J= 3.7 Hz, 1H)，4.74 (d, J= 12.4 Hz, 1H)，5.77 (d, J= 4.1 Hz, 1H)，7.28-7.33 (m, 10H, Bn)【０１３２】
3,5-di-O-benzyl-4-C-azidomethyl-1,2-di-O-acetyl-α-D-ribofuranose 3
3,5-di-O-benzyl-4-C-azidomethyl-1,2-O-(1-methylethylidene)-α-D-ribofuranose (1.46 g, 3.44 mmol) に５０％酢酸 (29.6 mL) を加えて溶かし、１００℃で１時間撹拌した。反応混合物をエタノールで共沸して乾燥させ、ピリジン (7.41 mL, 91.8 mmol) と無水酢酸（Ａｃ2Ｏ）(4.93 mL, 52.2 mmol) を加え、アルゴン雰囲気下、室温で一晩撹拌した。反応混合物を、氷浴中で冷却し、冷水に注いだ後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、4:1、v/v] で精製し、目的物3 (1.46 g, 3.11 mmol, 90%) を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.90 (s, 3H, CH3)，2.13 (s, 3H, CH3)，3.46 (ABq, J= 19.2 Hz and 15.6 Hz, 2H)，3.60 (dd,J= 11.9 Hz and 1.8 Hz, 2H)，4.35 (d, J= 5.0 Hz, 1H)，4.48 -4.52 (m, 4H)，4.60 (d, J= 11.5 Hz, 1H)，5.34 (d, J= 5.0 Hz, 1H)，6.16 (s, 1H)，7.28-7.36 (m, 10H, Bn)【０１３３】
3′,5′-di-O-benzyl-4′-C-azidomethyl-2′-O-acetyluridine 4
3,5-di-O-benzyl-4-C-azidomethyl-1,2-di-O-acetyl-α-D-ribofuranose (2.04 g, 4.35 mmol) のアセトニトリル溶液 (20 mL) に、アルゴン雰囲気下でウラシル (0.975 g, 8.70 mmol) とN,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド（ＢＳＡ）(8.51 mL, 34.8 mmol) を加え、９５℃で３０分加熱還流した。これを０℃に冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル (TMSOTf) (1.57 mL, 8.70 mmol) を慎重に滴下した。再度９５℃で１５分加熱還流した後、氷浴中で冷却し、飽和重曹水を加えた。反応混合物をクロロホルムで抽出し、有機層を飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:1、v/v] で精製し、目的物４ (1.95 g, 3.75 mmol, 86%) を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ：2.12 (s, 3H, CH3)，3.36 (d, J= 13.3 Hz, 1H)，3.48 (d, J= 10.1 Hz, 1H)，3.66 (d, J= 13.3 Hz, 1H)，3.77 (d, J= 10.1 Hz, 1H)，4.38 (d, J= 5.5 Hz, 1H)，4.42-4.48 (m, 3H)，4.63 (d, J= 11.5 Hz,1H)，5.32 (dd, J= 7.8 Hz and 2.5 Hz, 1H)，5.40 (t, J= 5.0 Hz, 1H)，6.18 (d, J= 5.0 Hz, 1H)，7.27-7.41 (m, 10H, Bn)，7.64 (d, J= 8.3 Hz, 1H)，8.25 (s, 1H)【０１３４】
3′,5′-di-O-benzyl-4′-C-azidomethyluridine 5
3′,5′-di-O-benzyl-4′-C-azidomethyl-2′-O-acetyluridine (1.95 g, 3.75 mmol) にアンモニア水 (16 mL) とメタノール (16 mL) を加え、室温で１．５時間撹拌した。反応混合物にエタノールを加え、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:2、v/v] で精製し、目的物５ (1.73 g, 3.61 mmol, 96%)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ：3.25 (d, J= 8.3 Hz, 1H)，3.42 (d, J= 12.8 Hz, 1H)，3.55 (d, J= 10.1 Hz, 1H)，3.71 (m, 2H)，4.24 (d, J= 6.0 Hz, 1H)，4.31-4.36 (m, 1H)，4.50 (2, 2H)，4.62 (d, J= 11.5 Hz, 1H)，4.73 (d, J= 11.4 Hz, 1H)，5.40 (dd, J= 7.8 Hz and 2.3 Hz, 1H)，5.89 (d, J= 4.6 Hz, 1H)，7.32-7.40 (m, 10H, Bn)，7.58 (d, J= 8.4 Hz, 1H)，8.50 (s, 1H)【０１３５】
4′-C-azidomethyluridine 6
3′,5′-di-O-benzyl-4′-C-azidomethyluridine (3.16g, 6.59mmol) のジクロロメタン溶液(80 mL) を、アルゴン雰囲気下、−７８℃まで冷却し、１Ｍ三塩化ホウ素ジクロロメタン溶液 (44.8 mL, 44.8 mmol) を加えて３時間撹拌した。その後−３０℃に昇温して３時間撹拌した。反応混合物にジクロロメタン−メタノール (1:1、v/v、80 mL) を加え、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、4:1、v/v] で精製し、目的物６ (1.31 g, 4.38 mmol, 66%) を得た。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：3.15 (d,J= 5.0 Hz, 1H)，3.58-3.55 (m, 3H)，4.02 (t, J= 5.0 Hz, 1H)，4.22 (dd, J= 6.4 Hz and 5.5 Hz, 1H)，5.30 (t, J= 5.5 Hz, 1H)，5.38 (d, J= 5.0 Hz, 1H)，5.45 (d, J= 6.9 Hz, 1H)，5.68 (dd, J= 8.2 Hz and 1.8 Hz, 1H)，5.88 (d, J= 7.8 Hz, 1H)，7.82 (d, J= 8.2 Hz, 1H)，11.4 (s, 1H)；13C-NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ52.1，62.9，71.3，73.0，86.1，87.0，102.3，140.8，151.0，163.0【０１３６】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-azidomethyluridine 7
4′-C-azidomethyluridine (0.541 g, 1.81 mmol) のピリジン溶液 (5.4 mL) に、アルゴン雰囲気下で４，４’-ジメトキシトリチルクロリド (DMTrCl) (0.797 g, 2.35 mmol) を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、12:1、v/v] で精製し、目的物７(0.464 g, 0.772 mmol, 43%) を得た。無色非晶質。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ：3.29 (d, J= 3.6 Hz, 1H, 3′-OH)，3.33 (d, J= 10.1 Hz, 1H, 4′(C)-CH2)，3.39 (d, J= 10.5 Hz, 1H, 4′(C)-CH2)，3.58 (d, J= 12.8 Hz, 1H, 5′-H)，3.67 (d, J= 13.3 Hz, 1H, 5′-H)，3.77 (s, 6H, 2×OMe)，4.38 (q, J= 5.5 Hz, 1H, 3′-H)，4.42 (q, J= 5.5 Hz, 1H, 2′-H)，4.79 (d, J= 5.0 Hz, 1H, 2′-OH)，5.41 (dd, J= 8.3 Hz and 1.9 Hz, 1H, 5-H)，5.94 (d, J= 5.5 Hz, 1H, 1′-H)，6.84 (d, J= 9.2 Hz, 5H, DMTr)，7.23-7.37 (m, 8H, DMTr)，7.59 (d, J= 8.2 Hz, 1H, 6-H)，9.65 (s, 1H, 3-NH)【０１３７】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminomethyluridine 8
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-azidomethyluridine (0.450 g, 0.749 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (15 mL) に、トリフェニルホスフィン(PPh3) (0.491 g, 1.87 mmol) と水 (0.540 mL, 30.0 mmol) を加え、４５℃で２４時間撹拌した。反応混合物中のテトラヒドロフランを減圧留去した後、ジクロロメタン溶液 (4.0 mL) とした。トリフルオロ酢酸エチル(CF3COOEt) (0.237 mL, 1.99 mmol) とトリエチルアミン (Et3N) (0.138 mL, 0.995 mmol) を加え、室温で２４時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、15:1、v/v] で精製し、目的物８ (0.445 g, 0.663 mmol, 89%) を得た。無色非晶質。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.26 (t, J= 7.4 Hz, 2H, 4′(C)-CH2)，3.27 (d, J= 10.6 Hz,
1H, 5′-H)，3.32 (d, J= 10.7 Hz, 1H, 5′-H)，3.76 (s, 6H, 2×OMe)，4.12 (q, J= 7.3 Hz, 1H, 3′-OH)，4.35 (t, J= 5.5 Hz, 1H, 3′-H)，4.51 (q, J= 5.2 Hz, 1H, 2′-H)，5.07 (d, J= 4.1 Hz, 1H, 2′-OH)，5.44 (dd, J= 7.8 Hz and 1.8 Hz, 1H, 1′-H)，6.83 (d, J= 8.7 Hz, 4H, DMTr)，7.11 (t, J= 6.2 Hz, 1H, -NHCOCF3)，7.22-7.34 (m, 9H, DMTr)，7.57 (d, J= 8.2 Hz, 1H, 6-H)，9.74 (s, 1H, 3-NH)【０１３８】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminomethyl-2′-O-[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]-uridine 9a
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminomethyl-3′-O-[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]-uridine 9b
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminomethyluridine (0.445 g, 0.663 mmol) のジメチルホルムアミド溶液 (4.4 mL) に、アルゴン雰囲気下でトリエチルアミン (Et3N) (0.276 mL, 1.99 mmol) とｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド (TBDMSCl) (0.200 g, 1.33 mmol) を加えて室温で一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:1、v/v] で精製し、目的物9a (0.221 g, 0.281 mmol, 42%) 及び目的物９ｂ (0.142 g, 0.181 mmol, 27%) を得た。【０１３９】
化合物９ａ
1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ：0.0520 (s, 3H, Si-SH3)，0.108 (s, 3H, Si-CH3)，0.911 (s, 9H, tert -butyl)，3.10 (s, 1H, 3′-OH)，3.33 (s, 2H, 5′-OH)，3.56 (m, 1H, 4′(C)-CH2)，3.63 (m, 1H, 4′(C)-CH2)，3.80 (s, 6H, 2×OMe)，4.23 (d, J= 5.5 Hz, 1H, 3′-H)，4.60 (t, J= 6.2 Hz, 1H, 2′-H)，5.42 (d, J= 8.2 Hz, 1H, 5-H)，6.04 (d, J= 6.9 Hz, 1H, 1′-H)，6.84 (d,J= 8.9 Hz, 5H, DMTr)，7.20-7.22 (m, 4H, DMTr)，7.29-7.32 (m, 4H, DMTr)，7.65 (d,J= 8.2 Hz, 1H, 6-H)，8.57 (s, 1H, 3-NH)【０１４０】
化合物９ｂ
1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ：-0.0305 (s, 3H, Si-CH3)，0.0749 (s, 3H, Si-CH3)，0.866 (s, 9H, tert -butyl)，3.07 (d, J= 4.1 Hz, 1H, 2′-OH)，3.22 (d, J= 10.3 Hz, 1H, 5′-H)，3.37 (d, J= 10.3 Hz, 1H, 5′-H)，3.59 (q, J= 4.7 Hz, 1H, 4′(C)-CH2)，3.64 (q, J= 7.0 Hz, 1H, 4′(C)-CH2)，3.79(s, 6H, 2×OMe)，4.26 (m, 1H, 2′-H)，4.49 (d, J= 6.2 Hz, 1H, 3′-H)，5.44 (d, J= 7.6 Hz, 1H, 5-H)，5.76 (d, J= 3.5 Hz, 1H, 1′-H)，6.83 (dd, J= 8.9 Hz and 2.7 Hz, 4H, DMTr)，7.11 (s, 1H, -NHCOCF3)，7.23-7.34 (m, 9H, DMTr)，7.57 (d, J= 8.3 Hz, 1H, 6-H)，8.55 (s, 1H, 3-NH)【０１４１】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroaminomethyl-2′-O-[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]-3′-[2-cyanoethyl-N,N-bis(1-methylethyl)-phosphoramidite]-uridine 10
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminomethyl-2′-O-[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]-uridine (0.221 g, 0.281 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (2.2 mL) に、アルゴン雰囲気下でジイソプロピルエチルアミン (DIPEA) (0.245 mL, 0.141 mmol) とクロロ(ジイソプロピルアミノ)亜ホスフィン酸２−シアノエチル (CEP-Cl) (0.125 mL, 0.562 mmol) を加えて室温で１時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、2:3、v/v] で精製し、目的物10 (0.215 g, 0.218 mmol, 78%) を得た。
31P-NMR (400 MHz, CDCl3) δ：151.67，152.10【０１４２】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminomethyl-3′-O-[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]-uridine 担持ＣＰＧ 担体１１
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminomethyl-3′-O-[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]-uridine (0.142 g, 0.181 mmol) のピリジン溶液 (2.0mL) に、アルゴン雰囲気下でN,N-ジメチル-4-アミノピリジン (DMAP) (44.2 mg, 0.362 mmol) と無水コハク酸 (72.5 mg, 0.724 mmol) を加えて室温で２４時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣にジメチルホルムアミド (1.9 mL) を加えて溶かし、定孔ガラス (controlled pore glass:CPG) (0.359 g) と1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (EDC) (36.6 mg, 0.191 mmol) を加えて３日間振盪した。ＣＰＧをフィルターで濾別し、ピリジンで洗浄後、アルゴン雰囲気下でＤＭＡＰ (0.183 g)、ピリジン (13.5 mL)と無水酢酸 (1.5 mL) を加えて２４時間静置した。ＣＰＧを濾別し、ピリジン、エタノール及びアセトニトリルで洗浄後乾燥させ、目的物１１ (活性：35.6 μmol /g) を得た。【０１４３】
（２）2′OH-4′アミノエチル樹脂体
以下のスキームに従い、2′OH-4′アミノエチルアミダイトユニット及び樹脂体を合成した。【０１４４】
【化１０】
2018110678.tif 000012
【０１４５】
5-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4-C-[[(4-methylphenyl)sulfonyl]oxy]ethyl-3-O-benzyl-1,2-di-O-acetyl-α-D-ribofuranose 12
グルコースを出発原料とし、既存の手法を用いて目的物 12を合成した。【０１４６】
5-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4-C-azidoethyl-3-O-benzyl-1,2-di-O-acetyl-α-D-ribofuranose 13
5-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4-C-[[(4-methylphenyl)sulfonyl]oxy]ethyl-3-O-benzyl-1,2-di-O-acetyl-α-D-ribofuranose (3.48 g, 4.57 mmol) のジメチルホルムアミド (DMF) 溶液 (35 mL) に、アルゴン雰囲気下でアジ化ナトリウム (NaN3) (1.04 g, 16.0 mmol) を加えて５０℃で一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、7:1、v/v] により精製し、目的物１３ (2.37 g, 3.75 mmol, 82%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.07 (s, 9H), 1.81 (s, 3H), 1.97-2.05 (m, 1H), 2.10 (s, 3H), 2.14-2.21 (m, 1H), 3.25-3.31 (m, 1H), 3.39-3.46 (m, 1H), 3.60 (s, 2H), 4.32 (d, J=5.04 Hz, 1H), 4.52 (d, J=11.5 Hz, 1H), 4.59 (d, J=11.4 Hz, 1H), 5.35 (d, J=5.04 Hz, 1H), 6.14 (s, 1H), 7.27-7.46 (m, 10H), 7.62-7.65 (m, 5H)
13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ：19.46, 20.96, 21.11, 27.04, 31.56, 46.78, 67.99, 73.65, 74.58, 79.32, 87.08, 97.82, 127.64, 127.94, 128.02, 128.07, 128.61, 130.03, 130.13, 132.71, 133.08, 135.65, 135.75, 137.49, 169.28, 169.78【０１４７】
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyl-2′-O-acetyluridine 14
5-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4-C-azidoethyl-3-O-benzyl-1,2-di-O-acetyl-α-D-ribofuranose (11.1 g, 17.6 mmol) のアセトニトリル溶液 (100 mL) に、アルゴン雰囲気下でウラシル (3.95 g, 35.2 mmol) とN,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド (BSA) (34.4 mL, 141 mmol) を加え、９５℃で１時間加熱還流した。これを０℃に冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル (TMSOTf) (6.36 mL, 35.2 mmol) を慎重に滴下した。再度５０℃で３時間撹拌した後、氷浴中で冷却し、飽和重曹水を加えた。反応混合物をクロロホルムで抽出し、有機層を飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、2:1、v/v] で精製し、目的物１４ (10.2 g, 14.9 mmol, 85%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.10 (s, 9H), 1.65-1.73 (m, 1H), 2.05-2.14 (m, 4H), 3.23-3.30 (m, 1H), 3.35-3.41 (m, 1H), 3.56 (d, J=11.5 Hz, 1H), 3.86 (d, J=11.5 Hz, 1H), 4.39-4.42 (m, 2H), 4.61 (d, J=11.0 Hz, 1H), 5.32-5.39 (m, 2H), 6.13 (d, J=5.04 Hz, 1H), 7.33-7.49 (m, 10H), 7.57-7.64 (m, 6H), 8.02 (s, 1H)
13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ：19.46, 20.89, 27.18, 31.09, 46.53, 66.54, 74.59, 74.92, 86.85, 87.42, 103.07, 128.03, 128.21, 128.25, 128.39, 128.74, 130.38, 130.48, 131.91, 132.60, 135.47, 135.77, 137.10, 139.87, 150.18, 162.78, 170.09【０１４８】
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyluridine 15
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyl-2′-O-acetyluridine (10.2 g, 14.9 mmol) にアンモニア水 (83 mL) とメタノール (83 mL) を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物にエタノールを加え、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:1、v/v] で精製し、目的物１５ (9.39  g, 14.6  mmol, 98%) を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ：1.09 (s, 9H), 1.67-1.73 (m, 1H), 2.15-2.21 (m, 1H), 3.20-3.26 (m, 1H), 3.33-3.38 (m, 1H), 3.47-3.55 (m, 2H), 3.80 (d, J=10.9Hz, 1H), 4.19 (d, J=6.30 Hz, 1H), 4.30 (q, J=5.75Hz, 1H), 4.59 (d, J=11.5 Hz, 1H), 4.72 (d, J=11.5 Hz, 1H), 5.39 (d, J=8.60Hz, 1H), 5.90 (d, J=5.70 Hz, 1H), 7.32-7.42 (m. 9H), 7.45-7.48 (m, 2H), 7.57-7.62 (m, 5H), 9.20 (s, 1H)
13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ：19.44, 27.19, 31.19, 46.55, 66.86, 74.70, 74.99, 78.77, 87.23, 89.37, 102.84, 128.21, 128.25, 128.35, 128.61, 128.89, 130.39, 130.49, 131.99, 132.57, 135.49, 135.74, 136.89, 139.98, 150.83, 163.00【０１４９】
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyluridine 16
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyluridine (2.42 g, 3.77 mmol) のジクロロメタン溶液 (95 mL) を、アルゴン雰囲気下、-78℃まで冷却し、１Ｍ三塩化ホウ素ジクロロメタン溶液 (25.6 mL, 25.6 mmol) を加えて３時間撹拌した。その後−３０℃に昇温して３時間撹拌した。反応混合物にジクロロメタン−メタノール (1:1、v/v、50 mL) を加え、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:1、v/v] で精製し、目的物１６ (1.91 g, 3.47 mmol, 92%) を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ：1.08 (s, 9H), 1.85-1.91 (m,1H), 2.10-2.16 (m, 1H), 3.32-3.38 (m, 2H), 3.45 (d, J=4.0 Hz, 1H), 3.66 (d, J=10.9 Hz, 1H), 3.78 (d, J=11.5 Hz, 1H), 4.33 (t, J=5.70 Hz, 1H), 4.43-4.44 (m, 1H), 5.11 (d, J=5.15 Hz, 1H), 5.38 (d, J=8.05 Hz, 1H), 5.95 (d, J=5.15 Hz, 1H), 7.40-7.48 (m, 6H), 7.61-7.64 (m, 4H), 7.74 (d, J=8.60 Hz, 1H), 10.2 (s, 1H)
13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ：19.42, 27.15, 31.12, 46.86, 67.25, 72.31, 75.93, 88.67, 89.52, 102.61, 128.22, 128.24, 130.36, 130.47, 131.95, 132.55, 135.53, 135.75, 140.26, 151.79, 163.59【０１５０】
4′-C-azidoethyluridine 17
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyluridine (0.746 g, 1.35 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (8.0 mL) に、アルゴン雰囲気下で１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリドテトラヒドロフラン溶液 (TBAF) (2.0 mL, 2.0 mmol) を加え、室温で２４時間撹拌した。その後、溶媒を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、5:1、v/v] で精製し、目的物１７ (0.409 g, 1.31 mmol, 97%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：0.958-1.02 (m, 1H), 1.10-1.18 (m,1H), 2.54-2.64 (m, 4H), 3.15 (t, J=5.04 Hz, 1H), 3.41 (q, J=7.32 Hz, 1H), 4.40-4.43 (m, 2H), 4.50 (d, J=6.40 Hz, 1H), 4.85 (d, J=8.24 Hz, 1H), 5.01 (d, J=7.36 Hz, 1H), 7.02 (d, J=8.24 Hz, 1H), 10.5 (s, 1H)【０１５１】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-azidoethyluridine 18
4′-C-azidoethyluridine (1.19 g, 3.79 mmol) のピリジン溶液 (12 mL) に、アルゴン雰囲気下で4,4'-ジメトキシトリチルクロリド (DMTrCl) (1.93 g, 5.69 mmol) を加え、室温で７時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:4、v/v] で精製し、目的物１８ (1.19 g, 1.94 mmol, 51%) を得た。【０１５２】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminoethyluridine 19
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-azidoethyluridine (1.19 g, 1.94 mmol)のテトラヒドロフラン溶液 (40 mL) に、トリフェニルホスフィン(PPh3) (1.30 g, 4.95 mmol) と水 (1.43 mL, 79.32 mmol) を加え、４５℃で７時間撹拌した。反応混合物中のテトラヒドロフランを減圧留去した後、ジクロロメタン溶液 (11 mL) とした。トリフルオロ酢酸エチル(CF3COOEt) (0.691 mL, 5.79 mmol) とトリエチルアミン (Et3N) (0.401 mL, 2.90 mmol) を加え、室温で２４時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:2、v/v] で精製し、目的物１９ (1.05 g, 1.53 mmol, 79%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：2.00-2.05 (m, 1H), 2.11-2.17 (m, 1H), 3.25-3.35 (m, 4H), 3.78 (s, 6H), 3.96 (s, 1H), 4.35 (s, 1H), 4.52 (s, 1H), 5.17 (s, 1H), 5.41 (d, J=7.80 Hz, 1H), 5.96 (d, J=5.96 Hz, 1H), 6.86 (d, J=8.72 Hz, 5H), 7.28-7.41 (m, 8H), 7.46 (m, 1H), 7.65 (d, J=8.24 Hz, 1H), 10.2 (s, 1H)【０１５３】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminoethyl-2′-O-[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]-uridine 20
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminoethyluridine (1.04 g, 1.53 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (10 mL) に、アルゴン雰囲気下でピリジン (0.753 mL, 9.33 mmol)、硝酸銀 (AgNO3) (0.442 g, 2.60 mmol) とｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド (TBDMSCl) (0.461 g, 3.06 mmol) を加えて室温で３時間撹拌した。反応混合物をクロロホルムで希釈後、セライトで濾過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、3:2、v/v] で精製し、目的物２０ (1.13 g, 1.41 mmol, 92%) を得た。
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ：0.0554 (s, 3H), 0.113 (s, 3H), 0.912 (s, 9H), 2.00 (t, J=6.18 Hz, 2H), 3.16 (d, J=1.38 Hz, 1H), 3.25-3.34 (m, 4H), 3.80 (s, 6H), 4.20 (d, J=4.14 Hz, 1H), 4.62 (t, J=5.52 Hz, 1H), 5.35 (dd, J=8.22 Hz and 2.04 Hz, 1H), 6.02 (d, J=6.84 Hz, 1H), 6.85 (d, J=8.22 Hz, 4H), 7.19-7.24 (m, 5H), 7.30-7.33 (m, 4H), 7.67 (d, J=8.28 Hz, 1H), 8.06 (s, 1H)【０１５４】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminoethyl-2′-O-[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]-uridine担持CPG 担体 21
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminoethyluridine (0.209 g, 0.262 mmol) のピリジン溶液 (3.0 mL) に、アルゴン雰囲気下でN,N-ジメチル-4-アミノピリジン (DMAP) (64.0 mg, 0.524 mmol) と無水コハク酸 (0.105 g, 1.05 mmol) を加えて室温で２４時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、15:1、v/v] で精製した。精製物にジメチルホルムアミド (2.77 mL) を加えて溶かし、定孔ガラス (controlled pore glass:CPG) (0.444 g) と1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (EDC) (51.8 mg, 0.270 mmol) を加えて４日間振盪した。ＣＰＧをフィルターで濾別し、ピリジンで洗浄後、アルゴン雰囲気下でＤＭＡＰ (0.183 g)、ピリジン (13.5 mL)と無水酢酸 (1.5 mL) を加えて３２時間静置した。ＣＰＧを濾別し、ピリジン、エタノール及びアセトニトリルで洗浄後乾燥させ、目的物２１ (活性：30.7 μmol /g) を得た。【０１５５】
（３）2′OMe-4′アミノエチルアミダイトユニット
以下のスキームに従い、2′OMe-4′アミノエチルアミダイトユニットを合成した。【０１５６】
【化１１】
2018110678.tif 000013
【０１５７】
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyl-2′-O-methyluridine 22
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyluridine (6.06 g, 9.46 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (60 mL) に、アルゴン雰囲気下、氷浴下６０％水素化ナトリウム(NaH) (1.14 g, 28.4 mmol) を加え、０℃で１０分間撹拌した。これにヨードメタン (CH3I) (2.94 mL, 47.3 mmol) を慎重に滴下し、遮光条件下、０℃で８時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、2:1、v/v] で精製し、目的物２２ (4.18 g, 6.37 mmol, 67%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.09 (s, 9H), 1.71-1.77 (m, 1H), 2.29-2.35 (m, 1H), 3.25-3.31 (m, 1H), 3.34-3.39 (m, 1H), 3.52 (s, 3H), 3.68 (d, J=11.5 Hz, 1H), 3.75 (dd, J=5.70 Hz and 2.30 Hz, 1H), 3.98 (d, J=11.5Hz, 1H), 4.35 (d, J=6.30 Hz, 1H), 4.51 (d, J=11.5 Hz, 1H), 4.71 (d, J=11.5 Hz, 1H), 5.09 (dd, J=8.00 Hz and 1.70 Hz, 1H), 6.08 (d, J=2.30 Hz, 1H), 7.34-7.40 (m, 9H), 7.44-7.47 (m, 2H), 7.51 (d, J=7.45 Hz, 2H), 7.61 (d, J=6.85 Hz, 2H), 7.79 (d, J=8.05 Hz, 1H), 8.96 (s, 1H)
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ：19.57, 27.25, 31.05, 46.61, 59.45, 65.45, 73.16, 75.78, 83.96, 87.30, 88.33, 102.58, 128.00, 128.15, 128.26, 128.33, 128.73, 130.33, 130.42, 131.97, 132.89, 135.36, 135.58, 137.33, 139.98, 149.99, 163.08【０１５８】
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-2′-O-methyluridine 23
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyl-2′-O-methyluridine (1.06 g, 1.62 mmol) のジクロロメタン溶液 (42 mL) を、アルゴン雰囲気下、−７８℃まで冷却し、１Ｍ三塩化ホウ素ジクロロメタン溶液 (11 mL, 11 mmol) を加えて３時間撹拌した。その後−２０℃に昇温して５時間撹拌した。反応混合物にジクロロメタン−メタノール (1:1、v/v、24 mL) を加え、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチルメタノール、1:1、v/v] で精製し、目的物２３ (0.713 g, 1.26 mmol, 78%) を得た。
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ：1.11 (s, 9H), 1.73-1.78 (m, 1H), 2.05-2.10 (m, 1H), 2.89 (d, J=5.52 Hz, 1H), 3.28-3.33 (m, 1H), 3.36-3.40 (m, 1H), 3.53 (s, 3H), 3.71 (d, J=11.7 Hz, 1H), 3.89-3.93 (m, 2H), 4.49 (t, J=6.18 Hz, 1H), 5.33 (d, J=6.18 Hz, 1H), 6.08 (s, J=4.14 Hz, 1H), 7.40-7.43 (m, 4H), 7.46-7.48 (m, 2H), 7.61 (d, J=7.56 Hz, 2H), 7.65 (d, J=7.56 Hz, 2H), 7.78 (d, J=8.22 Hz, 1H), 9.11 (s, 1H)
13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ：19. 52, 27.20, 30.91, 46.63, 59.39, 66.80, 70.11, 84.41, 86.66, 87.77, 102.95, 128.23, 128.28, 130.43, 130.51, 131.84, 132.68, 135.39, 135.68, 139.93, 150.31, 163.09【０１５９】
4′-C-azidoethyl-2′-O-methyluridine 24
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-2′-O-methyluridine (0.693 g, 1.23 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (7.0 mL) に、アルゴン雰囲気下で１Ｍ テトラブチルアンモニウムフルオリドテトラヒドロフラン溶液 (TBAF) (1.85 mL, 1.85 mmol) を加え、室温で２１時間撹拌した。その後、溶媒を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、8:1、v/v] で精製し、目的物２４ (0.390 g, 1.19 mmol, 97%) を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ：0.901-0.961 (m, 1H), 1.08-1.14 (m, 1H), 2.45 (s, 3H), 2.50-2.63 (m, 4H), 3.14 (t, J=6.30 Hz, 1H), 3.33 (t, J=5.75 Hz, 1H), 4.44-4.48 (m, 2H), 4.83 (d, J=8.05 Hz, 1H), 5.07 (d, J=6.90 Hz, 1H), 7.05 (d, 8.05 Hz, 1H), 10.5 (s, 1H)
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ：30.99, 46.38, 57.45, 64.27, 69.70, 82.28, 84.98, 87.21, 102.34, 140. 62, 150.75, 163.02【０１６０】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-azidoethyl-2′-O-methyluridine 25
4′-C-azidoethyl-2′-O-methyluridine (0.365 g, 1.12 mmol) のピリジン溶液 (4.0 mL) に、アルゴン雰囲気下で4,4'-ジメトキシトリチルクロリド (DMTrCl) (0.569 g, 1.68 mmol) を加え、室温で２０時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:1、v/v] で精製し、目的物２５ (0.365 g, 1.12 mmol, 96%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.74-1.81 (m, 1H), 2.08-2.11 (m, 1H), 2.87 (d, J=6.44 Hz, 1H), 3.18-3.23 (m, 1H), 3.26-3.30 (m, 1H), 3.35 (s, 2H), 3.58 (s, 3H), 3.80 (s, 6H), 3.93 (dd, J=5.96 Hz and 3.64 Hz, 1H), 4.10-4.15 (m, 1H), 4.61 (t, J=6.40 Hz, 1H), 5.22 (d, J=8.24 Hz, 1H), 6.03 (d, J=3.64 Hz, 1H), 6.85 (d, J=9.16 Hz, 4H), 7.24-7.25 (m, 2H), 7.26-7.35 (m, 7H), 7.81 (d, J=8.24 Hz, 1H), 8.50 (s, 1H)【０１６１】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminoethyl-2′-O-methyluridine 26
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-azidoethyl-2′-O-methyluridine (0.679 g, 1.08 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (25 mL) に、トリフェニルホスフィン(PPh3) (0.708 g, 2.70 mmol) と水 (0.798 mL) を加え、４５℃で２３時間撹拌した。反応混合物中のテトラヒドロフランを減圧留去した後、ジクロロメタン溶液 (6.8 mL) とした。トリフルオロ酢酸エチル(CF3COOEt) (0.387 mL, 3.24 mmol) とトリエチルアミン (Et3N) (0.558 mL, 1.626 mmol) を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、2:3、v/v] で精製し、目的物２６ (1.12 g, 1.39 mmol, 92%) を得た。
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ：1.94-1.97 (m, 1H), 2.03-2.08 (m, 1H), 3.05 (d, J=4.60 Hz, 1H), 3.31-3.41 (m, 4H), 3.54 (s, 3H), 3.80 (s, 6H), 4.03 (t, J=5.04 Hz, 1H), 4.47 (t, J=5.04 Hz, 1H), 5.29 (d, J=8.24 Hz, 1H), 6.03 (d, J=5.04 Hz, 1H), 6.85 (d, J=8.76 Hz, 4H), 7.23-7.25 (m, 2H), 7.28-7.34 (m, 7H), 8.18 (s, 1H)【０１６２】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminoethyl-2′-O-methyl-3′-[2-cyanoethyl-N,N-bis(1-methylethyl)-phosphoramidite]-uridine 27
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminoethyl-2′-O-methyluridine (1.00 g, 1.43 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (10 mL) に、アルゴン雰囲気下でジイソプロピルエチルアミン (DIPEA) (1.25 mL, 7.15 mmol) とクロロ(ジイソプロピルアミノ)亜ホスフィン酸2-シアノエチル (CEP-Cl) (0.638 mL, 2.86 mmol) を加えて室温で１．５時間撹拌した。反応混合物をクロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:1、v/v] で精製し、目的物２７ (0.884 g, 0.983 mmol, 69%) を得た。【０１６３】
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ：150.94, 151.53【０１６４】
（４）2′OH-4′アミノプロピルアミダイトユニット及び樹脂体
以下のスキームに従い、2′OH-4′アミノプロピルアミダイトユニット及び樹脂体を合成した。【０１６５】
【化１２】
2018110678.tif 000014
【０１６６】
5-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4-C-azidopropyl-3-O-benzyl-1,2-O-(1-methylethylidene)-α-D-ribofuranose 29
5-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4-C-[[(4-methylphenyl)sulfonyl]oxy]propyl-3-O-benzyl-1,2-O-(1-methylethylidene)-α-D-ribofuranose (8.82 g, 12.1 mmol) のジメチルホルムアミド (DMF) 溶液 (90 mL) に、アルゴン雰囲気下でアジ化ナトリウム (NaN3) (6.59 g, 101 mmol) を加え、６０℃で一晩撹拌した。反応混合物の酢酸エチル溶液を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、15:1、v/v] により精製し、目的物２９ (5.98 g, 9.94 mmol, 82%) を得た。無色油状であった。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：0.98 (s, 9H, TBDPS), 1.36 (s, 3H, CH3), 1.35-1.41 (m, 1H, 4-(C)-CH), 1.55-1.57 (m, 1H, 4-(C)-CH), 1.62 (s, 3H, CH3), 1.73-1.78 (m, 1H, 4-(C-CH2)-CH), 2.09-2.13 (m, 1H, 4-(C-CH2)-CH), 3.18-3.23 (m, 2H, 4-(C-CH2-CH2)-CH2), 3.41 (d, J =11.0 Hz, 1H, 5-H), 3.65 (d, J =11.0 Hz, 1H, 5-H), 4.30 (d, J =5.48 Hz, 1H, 3-H), 4.59 (d, J  =12.4 Hz, 1H, Bn), 4.67 (dd, J =5.52 Hz and 3.64 Hz, 1H, 2-H), 4.82 (d, J =12.4 Hz, 1H, Bn), 5.79 (d, J =3.68 Hz, 1H, 1-H), 7.30-7.46 (m, 10H, TBDPS), 7.59-7.64 (m, 5H, Bn)
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ :  19.33, 23.28, 26.32, 26.92, 29.03, 52.19, 66.46, 72.55, 78.12, 79.45, 87.53, 104.30, 113.32, 127.86, 127.88, 128.58, 129.85, 129.93, 132.99, 133.29, 135.68, 135.77, 138.05
HRMS (ESI) m/z Calcd for C34H43N3O5SiNa (M+Na)+ ; 624.28697 found 624.28993【０１６７】
5-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4-C-azidopropyl-3-O-benzyl-1,2-di-O-acetyl-α-D-ribofuranose 30
5-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4-C-azidopropyl-3-O-benzyl-1,2-O-(1-methylethylidene)-α-D-ribofuranose (0.40 g, 0.665 mmol) に50% 酢酸 (5.70 mL) を加えて溶かし、120℃で1時間加熱還流した。反応混合物をエタノールで共沸して乾燥させ、ピリジン (1.43 mL, 17.7 mmol) と無水酢酸 (Ac2O) (0.95 mL, 10.2 mmol) を加え、アルゴン雰囲気下、室温で一晩撹拌した。反応混合物を，氷浴中で冷却し，冷水に注いだ後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、5:1、v/v] で精製し、目的物３０ (0.314 g, 0.486 mmol, 74%) を得た。無色油状であった。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.06 (s, 9H, TBDPS), 1.10-1.14 (m, 1H, 4-(C)-CH), 1.54-1.58 (m, 1H, 4-(C)-CH), 1.74-1.77 (m, 1H, 4-(C-CH2)-CH), 1.82 (s, 3H, CH3), 1.84-1.90 (m, 1H, 4-(C-CH2)-CH), 2.10 (s, 3H, CH3), 3.19-3.23 (m, 2H, 4-(C-CH2-CH2)-CH2), 3.59 (dd, J =10.6 Hz and 13.3 Hz, 2H, 5-H2), 4.38 (d, J =5.52 Hz, 1H, 3-H), 4.54 (d, J =11.4 Hz, 1H, Bn), 4.60 (d, J =11.4 Hz, 1H, Bn), 5.36 (d, J =5.48 Hz, 1H, 2-H), 6.13 (s, 1H, 1-H), 7.27-7.64 (m, 15H, Bn and TBDPS)
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ : 19.48, 20.95, 22.91, 27.05, 29.50, 52.12, 67.42, 73.63, 74.93, 79.26, 88.12, 97.87, 127.63, 127.74, 127.91, 127.97, 130.08, 132.88, 133.20, 135.66, 135.76, 169.45, 169.90
HRMS (ESI) m/z Calcd for C35H43N3O7SiNa (M+Na)+ ; 668.27680 found 668.27474【０１６８】
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoepropyl-3′-O-benzyl-2′-O-acetyluridine 31
5-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4-C-azidopropyl-3-O-benzyl-1,2-di-O-acetyl-α-D-ribofuranose (2.76 g, 4.27 mmol) のアセトニトリル溶液 (28 mL) に、アルゴン雰囲気下でウラシル (0.957 g, 8.54 mmol) とN,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド (BSA) (11.1 mL, 34.2 mmol) を加え、９５℃で１時間加熱還流した。これを０℃に冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル (TMSOTf) (1.55 mL, 8.54 mmol) を慎重に滴下した。再度９５℃で１５分加熱還流した後、氷浴中で冷却し、飽和重曹水を加えた。反応混合物をクロロホルムで抽出し、有機層を飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、2:1、v/v] で精製し、目的物３１ (2.27 g, 3.26 mmol, 76%) を得た。【０１６９】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.09 (s, 9H, TBDPS), 1.45-1.51 (m, 2H, 4′-(C)-CH2), 1.64-1.69 (m, 1H, 4′-(C-CH2)-CH), 1.82-1.89 (m, 1H, 4′-(C-CH2)-CH), 2.11 (s, 3H, CH3), 3.18-3.24 (m, 2H, 4′-(C-CH2-CH2)-CH2), 3.56 (d, J  =11.4 Hz, 1H, 5′-H), 3.84 (d, J  =10.9 Hz, 1H, 5′-H), 4.39-4.44 (m, 2H, 3′-H and Bn), 4.61 (d, J =11.0 Hz, 1H, Bn), 5.32-5.48 (m, 2H, 2′-H and 6-H), 6.18 (d, J =5.04 Hz, 1H, 1′-H), 7.28-7.57 (m, 15H, Bn and TBDPS), 7.67 (d, J =8.24Hz, 1H, 5-H), 8.66 (s, 1H, 3-NH)
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ : 19.46, 20.90, 23.01, 23.12, 26.96, 27.17, 29.18, 51.88, 66.51, 74.63, 75.09, 77.76, 86.30, 88.18, 103.03, 128.01, 128.07, 128.20, 128.25, 128.68, 130.34, 130.46, 131.96, 132.68, 135.45, 135.68, 135.77, 137.30, 139.83, 150.28, 162.84, 170.17
HRMS (ESI) m/z Calcd for C37H43N5O7SiNa (M+Na)+ ; 720.28294 found 720.28484【０１７０】
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidopropyl-3′-O-benzyluridine 32
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoepropyl-3′-O-benzyl-2′-O-acetyluridine (1.57 g, 2.24 mmol) にアンモニア水 (16 mL) とメタノール (16 mL) を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物にエタノールを加え、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、2:1、v/v] で精製し、目的物３２ (1.44 g, 2.19 mmol, 98%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.09 (s, 9H, TBDPS), 1.37-1.41 (m, 1H, 4′-(C)-CH), 1.51-1.55 (m, 1H, 4′-(C)-CH), 1.61-1.68 (m, 1H, 4′-(C-CH2)-CH), 1.85-1.89 (m, 1H, 4′-(C-CH2)-CH), 3.13-3.19 (m, 2H, 4′-(C-CH2-CH2)-CH2), 3.55 (d, J =11.0 Hz, 1H, 5′-H), 3.60 (d, J =7.80 Hz, 1H, 2′-OH), 3.78 (d, J =11.0 Hz, 1H, 5′-H), 4.19 (d, J =5.96 Hz, 1H, 3′-H), 4.29 (dd, J =5.96 Hz and 12.36 Hz, 1H, 2′-H), 4.59 (d, J =11.4 Hz, 1H, Bn), 4.74 (d, J =11.5 Hz, 1H, Bn), 5.39 (d, J =8.24 Hz, 1H, 6-H), 5.94 (d, J =5.52 Hz, 1H, 1′-H), 7.34-7.60 (m, 15H, Bn and TBDPS), 7.69 (d, J =7.80 Hz, 1H, 5-H), 9.37 (s, 1H, 3-NH)
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ : 19.42, 22.99, 27.16, 29.36, 51.92, 66.76, 74.66, 75.15, 78.84, 87.92, 88.94, 102.80, 128.17, 128.21, 128.31, 128.45, 128.78, 130.32, 130.42, 132.05, 132.64, 135.45, 135.73, 137.12, 139.95, 151.00, 163.16
HRMS (ESI) m/z Calcd for C35H41N5O6SiNa (M+Na)+ ; 678.27238 found 678.27027【０１７１】
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidopropyluridine 33
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidopropyl-3′-O-benzyluridine (1.80 g, 2.74 mmol) のジクロロメタン溶液 (72 mL) を、アルゴン雰囲気下、−７８℃まで冷却し、１Ｍ三塩化ホウ素ジクロロメタン溶液 (16.4 mL, 16.4 mmol) を加えて３時間撹拌した。その後−３０℃に昇温して３時間撹拌した。反応混合物にジクロロメタン−メタノール (1:1、v/v、40 mL) を加え、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、2:3、v/v] で精製し、目的物３３ (1.31 g, 2.32 mmol, 85%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.08 (s, 9H, TBDPS), 1.52-1.71 (m, 3H, 4′-(C)-CH2-CH), 1.87-1.98 (m, 1H, 4′-(C-CH2)-CH), 3.20-3.27 (m, 2H, 4′-(C-CH2-CH2)-CH2), 3.39 (s, 1H, 3′-OH), 3.66 (d, J =11.0 Hz, 1H, 5′-H), 3.77 (d, J =11.5 Hz, 1H, 5′-H), 4.32-4.36 (m, 1H, 3′-H), 4.38-4.42 (m, 1H, 2′-H), 5.15 (s, 1H, 2′-OH), 5.39 (d, J =7.8 Hz, 1H, 6-H), 5.94 (d, J =5.48 Hz, 1H, 1′-H), 7.39-7.66 (m, 10H, TBDPS), 7.77 (d, J =8.24 Hz, 1H, 5-H), 10.24 (s, 1H, 3-NH)
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ : 19.42, 23.33, 27.14, 29.14, 51.88, 67.01, 72.23, 76.21, 89.57, 102.51, 128.22, 130.33, 130.43, 132.03, 132.65, 135.51, 135.74, 140.32, 151.81, 163.70
HRMS (ESI) m/z Calcd for C28H35N5O6SiNa (M+Na)+ ; 588.22543 found 588.22729【０１７２】
4′-C-azidopropyluridine 34
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidopropyluridine (2.07 g, 3.66 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (21.0 mL) に、アルゴン雰囲気下で１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリドテトラヒドロフラン溶液 (TBAF) (5.49 mL, 5.49 mmol) を加え、室温で一晩撹拌した。その後、溶媒を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、5:1、v/v] で精製し、目的物３４ (1.16 g, 3.55 mmol, 97%) を得た。無色非晶質であった。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：1.52-1.68 (m, 4H, 4′-(C)-CH2-CH2), 3.26-3.35 (m, 2H, 4′-(C-CH2-CH2)-CH2), 3.42-3.49 (m, 2H, 5′-H2), 3.94-3.96 (m, 1H, 3′-H), 4.21-4.22 (m, 1H, 2′-H),  5.07 (d, J =4.60 Hz, 1H, 3′-OH), 5.15 (s, 1H, 5′-OH), 5.24 (d, J =6.44 Hz, 1H, 2′-OH), 5.65 (d, J =8.24 Hz, 1H, 6-H), 5.80 (d, J =7.80 Hz, 1H, 1′-H), 7.83 (d, J =8.24 Hz, 1H, 5-H), 11.28 (s, 1H, 3-NH)
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ : 22.87, 29.32, 51.41, 64.60, 71.85, 73.29, 86.05, 87.48, 102.18, 140.90, 151.07, 163.10
HRMS (ESI) m/z Calcd for C12H17N5O6Na (M+Na)+ ; 350.10765 found 350.10522【０１７３】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-azidopropyluridine 35
4′-C-azidopropyluridine (0.30 g, 0.917 mmol) のピリジン溶液 (3.0 mL) に、アルゴン雰囲気下で4,4'-ジメトキシトリチルクロリド (DMTrCl) (0.497 g, 1.47 mmol) を加え、室温で５．５時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:1、v/v] で精製し、目的物３５ (0.331 g, 0.526 mmol, 57%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.46-1.56 (m, 2H, 4′-(C)-CH2), 1.70-1.78 (m, 1H, 4′-(C-CH2)-CH), 1.87-1.94 (m, 1H, 4′-(C-CH2)-CH), 3.21-3.24 (m, 2H, 4′-(C-CH2-CH2)-CH2), 3.27 (s, 2H, 5′-H2), 3.41 (d, J =4.12 Hz, 1H, 3′-H), 3.78 (s, 6H, DMTr), 4.42 (d, J =4.12 Hz, 1H, 2′-H), 4.45 (s, 1H, 3′-OH), 5.15(s, 1 H, 2′-OH), 5.39 (d, J =7.80 Hz, 1H, 6-H), 5.91 (d, J =5.04 Hz, 1H, 1′-H), 6.85-7.31 (m, 13H, DMTr), 7.74 (d, J =8.28 Hz, 1H, 5-H), 10.12 (s, 1H, 3-NH)
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ : 23.24, 29.60, 51.83, 55.36, 65.89, 72.52, 76.16, 87.40, 89.01, 89.85, 102.42, 113.43, 127.32, 128.19, 130.24, 135.01, 135.15, 140.51, 144.19, 151.74, 158.80, 163.72
HRMS (ESI) m/z Calcd for C33H35N5O8Na (M+Na)+ ; 652.23833 found 652.23622【０１７４】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminopropyluridine 36
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-azidopropyluridine (1.22 g, 1.94 mmol)のテトラヒドロフラン溶液 (35 mL) に、トリフェニルホスフィン(PPh3) (1.27 g, 4.85 mmol) と水 (1.40 mL, 77.6 mmol) を加え、４５℃で８時間撹拌した。反応混合物中のテトラヒドロフランを減圧留去した後、ジクロロメタン溶液 (12 mL) とした。トリフルオロ酢酸エチル(CF3COOEt) (0.69 mL, 5.82 mmol) とトリエチルアミン (Et3N) (0.40 mL, 2.91 mmol) を加え、室温で２４時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:1、v/v] で精製し、目的物３６ (1.09 g, 1.55 mmol, 80%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.34-1.55 (m, 4H, 4′-(C)-CH2-CH2), 1.68-1.84 (m, 2H, 4′-(C-CH2-CH2)-CH2), 3.23-3.31 (m, 4H, 5′-H2 and 2′-OH and 3′-OH), 3.77 (s, 6H, DMTr), 4.20-4.26 (m, 1H, -NHCOCF3), 4.40 (d, J =5.48 Hz, 1H, 3′-H), 4.53 (t, J =5.96 Hz, 1H, 2′-H), 5.38 (d, J =7.80 Hz, 1H, 6-H), 5.98 (d, J =5.96 Hz, 1H, 1′-H), 6.84-7.38 (m, 13H, DMTr), 7.69 (d, J =7.80 Hz, 1H, 5-H), 10.35 (s, 1H, 3-NH)
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ : 11.06, 23.08, 23.81, 29.01, 30.43, 38.79, 55.31, 68.26, 72.78, 75,49, 87.44, 88.51, 88.67, 113.42, 127.30, 128.17, 128.90, 130.21, 131.02, 134.93, 135.08, 144.14, 151.83, 158.78, 163.86
HRMS (ESI) m/z Calcd for C35H36F3N3O9Na (M+Na)+ ; 722.23013 found 722.23205【０１７５】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminopropyl-2′-O-[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]-uridine 37
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminopropyluridine (1.36 g, 1.94 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (14 mL) に、アルゴン雰囲気下でピリジン (0.955 mL, 11.8 mmol)、硝酸銀 (AgNO3) (0.560 g, 3.30 mmol) とｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド (TBDMSCl) (0.526 g, 3.49 mmol) を加えて室温で４時間撹拌した。反応混合物をクロロホルムで希釈後、セライトで濾過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、3:2、v/v] で精製し、目的物３７ (1.34 g, 1.64 mmol, 85%) を得た。無色非晶質であった。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：0.0547 (s, 3H, TBDMS), 0.119 (s, 3H, TBDMS), 0.915 (s, 9H, TBDMS), 1.47-1.57 (m, 4H, 4′-(C)-CH2-CH2), 1.69-1.74 (m, 2H, 4′-(C-CH2-CH2)-CH2), 3.05 (s, 1H, 3′-OH), 3.22-3.25 (m, 2H, 5′-H2), 3.31-3.34 (m, 1H, -NHCOCF3), 3.81 (s, 6H, DMTr),  4.26 (d, J =5.52 Hz, 1H, 3′-H), 4.62 (dd, J =5.52 Hz and 6.84 Hz, 1H, 2′-H), 5.33 (d, J =8.28 Hz, 1H, 6-H), 6.04 (d, J =7.32 Hz, 1H, 1′-H), 6.84-7.32 (m, 13H, DMTr), 7.71 (d, J =8.24 Hz, 1H, 5-H), 8.11 (s, 1H, 3-NH)
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ : 18.01, 22.93, 25.61, 30.26, 40.27, 55.40, 67.43, 73.12, 75.88, 86.89, 87.96, 102.96, 113.53, 127.54, 128.16, 128.28, 130.19, 130.30, 134.63, 134.80, 140.36, 144.08, 150.49, 157.55, 158.98, 162.82
HRMS (ESI) m/z Calcd for C41H50F3N3O9SiNa (M+Na)+ ; 836.31661 found 836.31586 【０１７６】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroaminopropyl-2′-O-[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]-3′-[2-cyanoethyl-N,N-bis(1-methylethyl)-phosphoramidite]-uridine 38
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminopropyl-2′-O-[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]-uridine (1.13 g, 1.39 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (11 mL) に、アルゴン雰囲気下でジイソプロピルエチルアミン (DIPEA) (1.21 mL, 6.95 mmol) とクロロ(ジイソプロピルアミノ)亜ホスフィン酸-2-シアノエチル (CEP-Cl) (0.620 mL, 2.78 mmol) を加えて室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:2、v/v] で精製し、目的物３８ (1.25 g, 1.23 mmol, 88%) を得た。
31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ：149.4626, 151.1583
HRMS (ESI) m/z Calcd for C50H67F3N5O10PSiNa (M+Na)+ ; 1036.42446 found 1036.42397【０１７７】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminopropyl-2′-O-[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]-uridine 担持CPG 担体 39
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminopropyl-2′-O-[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]-uridine (0.163 g, 0.20 mmol) のピリジン溶液 (1.7 mL) に、アルゴン雰囲気下でN,N-ジメチル-4-アミノピリジン (DMAP) (48.9 mg, 0.40 mmol) と無水コハク酸 (80.1 mg, 0.80 mmol) を加えて室温で２３時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣にジメチルホルムアミド (1.98 mL) を加えて溶かし、定孔ガラス (controlled pore glass:CPG) (0.326 g) と1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (EDC) (38.0 mg, 0.198 mmol) を加えて５日間振盪した。ＣＰＧをフィルターで濾別し、ピリジンで洗浄後、アルゴン雰囲気下でＤＭＡＰ (0.183 g)、ピリジン (13.5 mL)と無水酢酸 (1.5 mL) を加えて１６時間静置した。ＣＰＧを濾別し、ピリジン、エタノール及びアセトニトリルで洗浄後乾燥させ、目的物３９ (活性：40.8 μmol /g) を得た。【０１７８】
（５）2′OMe-4′アミノプロピルアミダイトユニット及び樹脂体
以下のスキームに従い、2′OＭe-4′アミノプロピルアミダイトユニット及び樹脂体を合成した。【０１７９】
【化１３】
2018110678.tif 000015
【０１８０】
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidopropyl-3′-O-benzyl-2′-O-methyluridine 40
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidopropyl-3′-O-benzyluridine (5.33 g, 8.10 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (53 mL) に、アルゴン雰囲気下、氷浴下60%水素化ナトリウム(NaH) (0.972 g, 24.3 mmol) を加え、０℃で１０分間撹拌した。これにヨードメタン (CH3I) (3.02 mL, 48.6 mmol) を慎重に滴下し、遮光条件下、０℃で８時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、3:1、v/v] で精製し、目的物４０ (4.00 g, 5.98 mmol, 74%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.08 (s, 9H, TBDPS), 1.39-1.46 (m, 1H, 4′-(C)-CH), 1.52-1.60 (m, 1H, 4′-(C)-CH), 1.65-1.70 (m, 1H, 4′-(C-CH2)-CH), 1.97-2.05 (m, 1H, 4′-(C-CH2)-CH), 3.19-3.26 (m, 2H, 4′-(C-CH2-CH2)-CH2), 3.51 (s, 3H, 2′-OCH3), 3.68 (d, J =11.5 Hz, 1H, 5′-H), 3.74 (m, 1H, 2′-H), 3.95 (d, J =11.5 Hz, 1H, 5′-H), 4.35 (d, J =4.60 Hz, 1H, 3′-H), 4.52 (d, J =11.5 Hz, 1H, Bn), 4.73 (d, J =11.9Hz, 1H, Bn), 5.12 (d, J =8.24 Hz, 1H, 6-H), 6.09 (s, 1H, 1′-H), 7.35-7.63 (m, 15H, Bn and TBDPS), 7.78 (d, J =8.24 Hz, 1H, 5-H), 9.04 (s, 1H, 3-NH)
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ : 19.56, 22.84, 27.26, 29.00, 51.85, 59.44, 65.37, 73.25, 75.93,  84.19, 87.95, 88.06, 102.59, 128.02, 128.09, 128.14, 128.25, 128.69, 130.29, 130.39, 132.07, 132.99, 135.36, 135.60, 137.49, 140.03, 150.09, 163.16【０１８１】
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidopropyl-2′-O-methyluridine 41
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidopropyl-3′-O-benzyl-2′-O-methyluridine (4.00 g, 5.98 mmol) のジクロロメタン溶液 (60 mL) を、アルゴン雰囲気下、−７８℃まで冷却し、１Ｍ三塩化ホウ素ジクロロメタン溶液 (35.9 mL, 35.9 mmol) を加えて３時間撹拌した。その後−３０℃に昇温して５時間撹拌した。反応混合物にジクロロメタン−メタノール (1:1、v/v、100 mL) を加え、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:1、v/v] で精製し、目的物４１ (2.99 g, 5.16 mmol, 86%) を得た。
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ：1.11 (s, 9H, TBDPS), 1.49-1.56 (m, 2H, 4′-(C)-CH2), 1.58-1.64 (m, 1H, 4′-(C-CH2)-CH), 1.76-1.80 (m, 1H, 4′-(C-CH2)-CH), 2.74 (d, J =5.52 Hz, 1H, 3′-OH), 3.21-3.25 (m, 2H, 4′-(C-CH2-CH2)-CH2), 3.52 (s, 3H, 2′-OCH3), 3.70 (d, J =11.0 Hz, 1H, 5′-H), 3.88 (d, J =11.0 Hz, 1H, 5′-H), 3.93 (m, 1H, 2′-H), 4.49 (t, J =5.46 Hz, 1H, 3′-H),  5.31 (d, J =8.28 Hz, 1H, 6-H), 6.06 (d, J =4.80 Hz, 1H, 1′-H), 7.41-7.66 (m, 10H, TBDPS), 7.08 (d, J =7.56 Hz, 1H, 5-H), 8.04 (s, 1H, 3-NH)
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ : 19.52, 23.10, 27.21, 28.98, 51.86, 59.37, 66.76, 70.09, 84.61, 86.50, 88.46, 102.90, 128.22, 128.27, 130.39, 130.48, 131.96, 132.81, 135.41, 135.70, 140.01, 150.37, 163.12【０１８２】
4′-C-azidopropyl-2′-O-methyluridine 42
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidopropyl-2′-O-methyluridine (2.99 g, 5.16 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (30.0 mL) に、アルゴン雰囲気下で１Ｍ テトラブチルアンモニウムフルオリドテトラヒドロフラン溶液 (TBAF) (7.74 mL, 7.74 mmol) を加え、室温で一晩撹拌した。その後、溶媒を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、10:1、v/v] で精製し、目的物４２ (1.68 g, 4.94 mmol, 96%) を得た。
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ：1.55-1.67 (m, 4H, 4′-(C)-CH2-CH2), 3.27-3.29 (m, 2H, 4′-(C-CH2-CH2)-CH2), 3.32 (s, 3H, 2′-OCH3), 3.42-3.45 (m, 2H, 5′-H2), 3.98 (dd, J =7.56 Hz and 4.80 Hz, 1H, 2′-H), 4.16 (t, J =5.46 Hz, 1H, 3′-H), 5.13 (d, J =6.18 Hz, 1H, 3′-OH), 5.20 (d, J =5.46 Hz, 1H, 5′-OH), 5.67 (d, J =8.28 Hz, 1H, 6-H), 5.90 (d, J =6.84 Hz, 1H, 1′-H), 7.89 (d, J =8.22 Hz, 1H, 5-H), 11.34 (s, 1H, 3-NH)
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ : 22.77, 29.13, 51.33, 57.32, 64.24, 69.61, 82.45, 84.68, 88.00, 102.27, 140.67, 150.74, 162.95【０１８３】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-azidopropyl-2′-O-methyluridine 43
4′-C-azidopropyl-2′-O-methyluridine (1.68 g, 4.94 mmol) のピリジン溶液 (17 mL) に、アルゴン雰囲気下で4,4'-ジメトキシトリチルクロリド (DMTrCl) (2.51 g, 7.41 mmol) を加え、室温で５時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、2:1、v/v] で精製し、目的物４３ (3.12 g, 4.85 mmol, 98%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.38-1.44 (m, 1H, 4′-(C)-CH), 1.54-1.64 (m, 2H, 4′-(C)-CH-CH), 1.78-1.84 (m, 1H, 4′-(C-CH2)-CH), 2.77 (d, J =6.44 Hz, 1H, 3′-OH), 3.17-3.22 (m, 2H, 4′-(C-CH2-CH2)-CH2), 3.34 (s, 2H, 5′-H2), 3.57 (s, 3H, 2′-OCH3), 3.80 (s, 6H, DMTr), 3.92 (dd, J =4.12 Hz and 5.96 Hz, 1H, 2′-H), 4.60 (t, J =5.96 Hz, 1H, 3′-H), 5.22 (d, J =8.24 Hz, 1H, 6-H), 6.02 (d, J =4.12 Hz, 1H, 1′-H), 6.84-7.36 (m, 13H, DMTr), 7.82 (d, J =8.24 Hz, 1H, 5-H), 8.09 (s, 1H, 3-NH)
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ : 14.33, 23.00, 29.32, 51.82, 55.40, 59.50, 60.52, 65.42, 70.55, 84.72, 86.84, 87.63, 87.98, 102.67, 113.48, 127.43, 128.19, 128.33, 130.29, 130.34, 134.96, 135.18, 140.33, 144.26, 150.28, 158.94, 158.99, 163.10【０１８４】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminopropyl-2′-O-methyluridine 44
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-azidopropyl-2′-O-methyluridine (3.12 g, 4.85 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (62.4 mL) に、トリフェニルホスフィン(PPh3) (3.18 g, 12.1 mmol) と水 (3.50 mL, 194 mmol) を加え、４５℃で２０時間撹拌した。反応混合物中のテトラヒドロフランを減圧留去した後、ジクロロメタン溶液 (30 mL) とした。トリフルオロ酢酸エチル(CF3COOEt) (1.74 mL, 14.5 mmol) とトリエチルアミン (Et3N) (1.00 mL, 7.28 mmol) を加え、室温で２４時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:1、v/v] で精製し、目的物４４を定量的に得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.40-1.45 (m, 1H, 4′-(C)-CH), 1.51-1.54 (m, 1H, 4′-(C)-CH),  1.63-1.67 (m, 1H, 4′-(C-CH2)-CH), 1.72-1.78 (m, 1H, 4′-(C-CH2)-CH), 2.88 (d, J =4.56 Hz, 1H, 3′-OH), 3.25-3.28 (m, 2H, 4′-(C-CH2-CH2)-CH2), 3.30 (d, J =10.5 Hz, 1H, 5′-H), 3.35 (d, J =10.1 Hz, 1H, 5′-H), 3.54 (s, 3H, 2′-OCH3), 3.80 (s, 6H, DMTr), 4.03 (t, J =5.04 Hz, 1H, 2′-H), 4.54 (t, J =5.04 Hz, 1H, 3′-H), 5.26 (d, J =8.24 Hz, 1H, 6-H), 6.03 (d, J =5.04 Hz, 1H, 1′-H), 6.66 (m, 1H, -NHCOCF3), 6.84-7.55 (m, 13H, DMTr), 7.74 (d, J =8.24 Hz, 1H, 5-H), 8.17 (s, 1H, 3-NH)
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ : 14.32, 22.78, 29.38, 40.20, 55.38, 59.30, 60.52, 65.89, 70.75, 84.28, 86.43, 87.71, 87.97, 102.79, 113.48, 127.45, 128.21, 128.28, 130.26, 130.32, 132.07, 133.11, 134.81, 135.03, 140.24, 144.14, 150.39, 158.94, 158.99, 163.03【０１８５】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroaminopropyl-2′-O-methyl-3′-[2-cyanoethyl-N,N-bis(1-methylethyl)-phosphoramidite]-uridine 45
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminopropyl-2′-O-methyluridine (1.55 g, 2.17 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (15 mL) に、アルゴン雰囲気下でジイソプロピルエチルアミン (DIPEA) (1.90 mL, 10.9 mmol) とクロロ(ジイソプロピルアミノ)亜ホスフィン酸-2-シアノエチル (CEP-Cl) (0.97 mL, 4.34 mmol) を加えて室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:1、v/v] で精製し、目的物４５ (1.57 g, 1.71 mmol, 79%) を得た。
31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ：150.57, 151.44【０１８６】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminopropyl-2′-O-methyluridine 担持CPG 担体 46
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminopropyl-2′-O-methyluridine (0.142 g, 0.20 mmol) のピリジン溶液 (1.4 mL) に、アルゴン雰囲気下でN,N-ジメチル-4-アミノピリジン (DMAP) (48.9 mg, 0.40 mmol) と無水コハク酸 (80.1 mg, 0.80 mmol) を加えて室温で２４時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣にジメチルホルムアミド (2.0 mL) を加えて溶かし、定孔ガラス (controlled pore glass:CPG) (0.373 g) と1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (EDC) (38.3 mg, 0.20 mmol) を加えて４日間振盪した。ＣＰＧをフィルターで濾別し、ピリジンで洗浄後、アルゴン雰囲気下でＤＭＡＰ (0.183 g)、ピリジン (13.5 mL)と無水酢酸 (1.5 mL) を加えて１６時間静置した。ＣＰＧを濾別し、ピリジン、エタノール及びアセトニトリルで洗浄後乾燥させ、目的物４６ (活性：35.8 μmol /g) を得た。【０１８７】
（６）2′OMe-4′グアニジノメチルアミダイトユニット及び樹脂体
以下のスキームに従い、2′OH-4′グアニジノメチルアミダイトユニット及び樹脂体を合成した。【０１８８】
【化１４】
2018110678.tif 000016
【０１８９】
5′-O-(4,4′-dimethoxytrityl)- 4′-C-aminomethyl-2′-O-methyluridine 47
グルコースを出発原料とし、既存の手法を用いて目的物４７を合成した。【０１９０】
5′-O-(4,4′-dimethoxytrityl)-4′-C-[N,N′-bis-[(2-cyanoethoxy)carbonyl]guanidinyl]-2′-O-methyluridine 48
5′-O-(4,4′-dimethoxytrityl)- 4′-C-aminomethyl-2′-O-methyluridine (0.40 g, 0.679 mmol) のジクロロメタン溶液 (4.0 mL) に、アルゴン雰囲気下で活性化した3Å モレキュラーシーブスを加えて１５分間攪拌。これにN,N'-Bis-[(2-cyanoethoxy)carbonyl]-S-methyl-isothiourea (0.463 g, 2.4 mmol) のピリジン溶液 (0.263 mL, 3.26 mmol) を加え、４０℃で２時間加熱還流した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [酢酸エチル] で精製し、目的物４８(0.35 g, 0.423 mmol, 62%)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ：1.88 (1H, s), 2.72 (2H, t, J=6.84 Hz), 2.80 (2H, t, J=6.44 Hz), 3.36 (1H, s, J=10.5 Hz), 3.41 (1H, d, J=11.0 Hz), 3.54 (3H, s), 3.69 (1H, dd, J=5.96 Hz), 3.83 (6H, s), 3.87 (1H, dd, J=7.8 Hz), 3.99 (1H, m), 4.3 (2H, t, J=6.44 Hz), 4.42-4.44 (2H, m), 4.56 (1H, t, J= 5.92 Hz), 5.35 (1H, d, J=6.88 Hz), 6.10 (1H, d, J=4.12 Hz), 6.85 (4H, d, J=8.28 Hz), 7.26-7.37 (7H, m), 7,64 (1H, d, J=8.24 Hz), 8.65 (1H, t, J=5.96 Hz), 9.48 (1H, s), 11.63 (1H, s)【０１９１】
5′-O-(4,4′-dimethoxytrityl)-4′C-[N,N′-bis[(2-cyanoethoxy)carbonyl]guanidinyl]methyl-2′-O-methyl-3′-[2-cyanoethyl-N,N-bis(1-methylethyl)-phosphoramidite]-uridine 49
5′-O-(4,4′-dimethoxytrityl)-4′-C-[N,N′-bis-[(2-cyanoethoxy)carbonyl]guanidinyl]-2′-O-methyluridine (0.35 g, 0.423 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (3.5 mL) に、アルゴン雰囲気下でジイソプロピルエチルアミン (DIPEA) (0.37 mL, 2.12 mmol) とクロロ(ジイソプロピルアミノ)亜ホスフィン酸-2-シアノエチル (CEP-Cl) (0.19 mL, 0.846 mmol) を加えて室温で１．５時間撹拌した。反応混合物をクロロホルムで抽出し、有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:2、v/v] で精製し、目的物４９(0.339 g, 0.330 mmol, 78%) を得た。
31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ：151.8312, 152.1004【０１９２】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminopropyl-2′-O-[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]-uridine 担持ＣＰＧ担体 50
5′-O-(4,4′-dimethoxytrityl)-4′-C-[N,N′-bis-[(2-cyanoethoxy)carbonyl]guanidinyl]-2′-O-methyluridine (0.114 g, 0.139 mmol) のピリジン溶液 (1.0 mL) に、アルゴン雰囲気下でN,N-ジメチル-4-アミノピリジン (DMAP) (34.0 mg, 0.278 mmol) と無水コハク酸 (56.0 mg, 0.556 mmol) を加えて室温で２５時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣にジメチルホルムアミド (1.28 mL) を加えて溶かし、定孔ガラス (controlled pore glass:CPG) (0.192 g) と1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (EDC) (24.5 mg, 0.128 mmol) を加えて４日間振盪した。ＣＰＧをフィルターで濾別し、ピリジンで洗浄後、アルゴン雰囲気下でＤＭＡＰ (0.183 g)、ピリジン (13.5 mL)と無水酢酸 (1.5 mL) を加えて６５時間静置した。ＣＰＧを濾別し、ピリジン、エタノール及びアセトニトリルで洗浄後乾燥させ、目的物５０ (活性：41.4 μmol /g) を得た。【０１９３】
（７）2′OMe-4′アミノエチルシトシンアミダイトユニット
以下のスキームに従い、2′OＭｅ-4′アミノエチルシトシンアミダイトユニットを合成した。【０１９４】
【化１５】
2018110678.tif 000017
【０１９５】
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyl-2′-O-methyl -4-N-acetylcytosine 51
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyl-2′-O-methyluridine (623.6 mg, 0.95 mmol) のアセトニトリル溶液 (10 mL) に、アルゴン雰囲気下で、トリエチルアミン (Et3N) (0.55 mL, 4.0 mmol) 、N,N-ジメチル-4-アミノピリジン(DMAP) (367 mg, 3.0 mmol) と2,4,6トリイソプロピルベンジルスルホン酸クロリド(TPSCl) (606 mg, 3.0 mmol) を加えて１時間撹拌した。反応混合物にアンモニア水 (16 mL) を加え、１．５時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をピリジン溶液 (10 mL) とし、無水酢酸 (0.19 mL, 2.0 mmol) を加えて１．５時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、20:1、v/v] で精製し、目的物５１ (333.4 mg, 0.48 mmol, 50%) を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ：1.11 (s, 9H), 1.75-1.78 (m, 1H), 2.20 (s, 3H), 2.42-2.45 (m, 1H), 3.32-3.38 (m, 2H), 3.68-3.73 (m, 2H), 4.04 (d, J =11.48 Hz, 1H), 4.34 (d, J=5.48 Hz, 1H), 4.46 (d, J=11.44 Hz, 1H), 4.63 (d, J=11.44 Hz, 1H), 6.12 (s, 1H), 6.90 (d, J=2.93 Hz), 7.31-7.48 (m, 12H), 7.55-7.66 (m, 4H), 8.33 (d, J=8.20 Hz, 1H), 8.74 (s, 1H)【０１９６】
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-2′-O-methyl -4-N-acetylcytosine 52
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyl-2′-O-methyl -4-N-acetylcytosine (333.4 mg, 0.48 mmol) のジクロロメタン溶液 (10 mL) を、アルゴン雰囲気下、−７８℃まで冷却し、１Ｍ三塩化ホウ素ジクロロメタン溶液 (3.5 mL, 3.5 mmol) を加えて３時間撹拌した。その後−３０℃に昇温して３時間撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、20:1、v/v] で精製し、目的物５２ (225.8 mg, 0.37 mmol, 78%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.12 (s, 9H), 1.71-1.75 (m, 1H), 2.13-2.21 (m, 4H), 2.85 (d, J=8.24 Hz, 1H), 3.28-3.41 (m, 2H), 3.64 (s, 3H), 3.71 (d, J=11.48 Hz, 1H), 3.82 (dd, J =3.68 Hz, 2.72 Hz, 1H), 3.97 (d, J=11.44 Hz, 1H), 4.52 (t, J =6.40 Hz, 1H), 6.12 (d, J =4.10 Hz, 1H), 7.41-7.51 (m, 6H), 7.63-7.66 (m, 4H), 8.5 (d, J=7.32 Hz, 1H), 8.47 (s, 1H)【０１９７】
4′-C-azidoethyl-2′-O-methyl -4-N-acetylcytosine 53
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-2′-O-methyl -4-N-acetylcytosine (225.8 mg, 0.37 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (5.0 mL) に、アルゴン雰囲気下で１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリドテトラヒドロフラン溶液 (TBAF) (0.56 mL, 0.56 mmol) を加え、室温で１４時間撹拌した。その後、溶媒を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、10:1、v/v] で精製し、目的物５３ (95.6 mg, 0.26 mmol, 70%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.87-1.91 (m, 1H), 2.10-2.17 (m, 1H), 2.25 (s, 3H), 2.94 (d, J=5.04 Hz, 1H), 3.43-3.47 (m, 1H), 3.54 (s, 3H), 3.65-3.83 (m, 3H), 4.42 (t, J =5.04 Hz, 1H), 4.50 (t, J =5.04 Hz, 1H), 5.63 (d, J =5.04 Hz, 1H), 7.44 (d, J=7.32 Hz, 1H), 8.02 (d, J=7.80 Hz, 1H), 8.90 (s, 1H)【０１９８】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]- 4′-C-azidoethyl-2′-O-methyl -4-N-acetylcytosine 54
4′-C-azidoethyl-2′-O-methyl -4-N-acetylcytosine (570.5 mg, 1.55 mmol) のピリジン溶液 (30 mL) に、アルゴン雰囲気下で4,4'-ジメトキシトリチルクロリド (DMTrCl) (847 mg, 2.5 mmol) を加え、室温で１８．５時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、20:1、v/v] で精製し、目的物５４ (948.9 mg, 1.41 mmol, 91%) を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ：1.73-1.78 (m, 1H), 2.12-2.18 (m, 1H), 2.22 (s, 3H), 2.89 (d, J=6.45 Hz, 1H), 3.16-3.22 (m, 1H), 3.28-3.31 (m. 1H), 3.35 (d, J=10.9 Hz, 1H), 3.41 (d, J=10.9 Hz, 1H), 3.66 (s, 3H), 3.81 (s, 6H), 4.62 (s, 1H), 6.07 (d, J =1.70 Hz, 1H), 6.86 (d, J=8.00 Hz, 4H), 6.96 (d, J=8.70 Hz, 1H), 7.27-7.36 (m, 9H), 8.31 (d, J=7.45 Hz, 1H), 9.43 (s, 1H)【０１９９】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminoethyl-2′-O-methyl -4-N-acetylcytosine 55
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]- 4′-C-azidoethyl-2′-O-methyl -4-N-acetylcytosine (948.9 mg, 1.41 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (15 mL) に、トリフェニルホスフィン(PPh3) (918 mg, 3.5 mmol) と水 (1.0 mL, 56 mmol) を加え、４５℃で２２時間撹拌した。反応混合物中のテトラヒドロフランを減圧留去した後、ジクロロメタン溶液 (10 mL) とした。トリフルオロ酢酸エチル(CF3COOEt) (0.5 mL, 4.2 mmol) とトリエチルアミン (Et3N) (0.30 mL, 2.1 mmol) を加え、室温で４２時間撹拌した。反応混合物をクロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、20:1、v/v] で精製し、目的物５５ (252.6 mg, 0.34 mmol, 25%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.89-1.96 (m, 1H), 2.07-2.14 (m, 1H), 2.21 (s, 3H), 3.12 (d, J=12.0 Hz, 1H), 3.25-3.29 (m, 1H), 3.31-3.41 (m. 4H), 3.62 (s, 3H), 3.81 (s, 6H), 3.90 (dd, J =2.76 Hz, 3.20 Hz, 1H), 4.54 (t, J =5.96 Hz, 1H), 6.12 (d, J =5.04 Hz, 1H), 6.85 (d, J=8.72, 4H), 6.99 (d, J=8.72, 1H), 7.27-7.36 (m, 7H), 8.20 (d, J=8.72, 1H), 8.84 (s, 1H)【０２００】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminoethyl-2′-O-methyl-3′-[2-cyanoethyl-N,N-bis(1-methylethyl)-phosphoramidite]- 4-N-acetylcytosine 56
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminoethyl-2′-O-methyl -4-N-acetylcytosine (252.6 mg, 0.34 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (2.5 mL) に、アルゴン雰囲気下でジイソプロピルエチルアミン (DIPEA) (0.31 mL, 1.8 mmol) とクロロ(ジイソプロピルアミノ)亜ホスフィン酸2-シアノエチル (CEP-Cl) (0.16 mL, 0.72 mmol) を加えて室温で１．５時間撹拌した。反応混合物をクロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:5、v/v] で精製し、目的物５６を定量的に得た。
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ：151.02, 151.61
【実施例２】
【０２０１】
（2′F-4′アミノエチルウリジンアミダイトユニットの合成）
以下に示すスキームにて2′F-4′アミノエチルウリジンアミダイトユニットを合成した。【０２０２】
【化１６】
2018110678.tif 000018
【０２０３】
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyl-2′-O-methanesulfonyluridine 57
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyluridine (0.524 g 0.817 mmol) のピリジン溶液 (4.30 mL) に、アルゴン雰囲気下、氷浴下でメタンスルホニルクロリド (MsCl) (0.13 mL, 1.63 mmol) を慎重に滴下し、６時間撹拌した。反応物をクロロホルムで抽出し、有機層を飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:1、v/v] で精製し、目的物５７(0.585 g, 0.813 mmol, quant.) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.10 (s, 9H), 1.67-1.75 (m, 1H), 2.07-2.14 (m, 1H), 3.14 (s, 3H), 3.26-3.37 (m, 2H), 3.59 (d, J=11.5 Hz, 1H), 3.91 (d, J=11.4 Hz, 1H), 4.36 (d, J=5.96 Hz, 1H), 4.48 (d, J=11.0 Hz, 1H), 4.84 (d, J=11.5 Hz, 1H), 5.29-5.33 (m, 2H), 6.13 (d, J=4.12 Hz, 1H), 7.34-7.40 (m, 9H), 7.42-7.49 (m, 2H), 7.55-7.57 (m, 2H), 7.60 (m, 2H), 7.69 (d, J=8.24 Hz, 1H), 8.30 (s, 1H)【０２０４】
4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyl-2,2′-anhydrouridine 58
5′-O-[(1,1-dimethylethyl)diphenylsilyl]-4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyl-2′-O-methanesulfonyluridine (0.585 g, 0.813 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (6.0 mL) に、アルゴン雰囲気下で１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリドテトラヒドロフラン溶液 (TBAF) (1.22 mL, 1.22 mmol) を加え、室温で２時間撹拌した。その後、溶媒を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、15:1、v/v] で精製し、目的物５８ (0.268 g, 0.696 mmol, 86%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.05-1.20 (m, 2H), 2.30-2.42 (m, 1H), 2.43-2.46 (m, 1H), 2.58 (t, J=7.80 Hz, 2H), 3.51 (s, 1H), 3.81 (d, J=11.5 Hz, 1H), 3.98 (d, J=11.9 Hz, 1H), 4.39 (t, J=5.04 Hz, 1H), 4.73 (d, J=5.96 Hz, 1H), 5.04 (d, J=7.36 Hz, 1H), 5.52 (d, J=5.96 Hz, 1H), 6.50-6.54 (m, 1H), 6.57-6.58 (m, 4H), 6.99 (d, J=7.36 Hz, 1H)【０２０５】
4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyl-2′-deoxy-2′-fluorouridine 62
4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyl-2,2′-anhydrouridine (2.50 g, 6.50 mmol) のジメチルホルムアミド溶液 (45 mL) に、アルゴン雰囲気下、氷浴下でジヒドロピラン (DHP) (15.3 mL, 169 mmol) とパラトルエンスルホン酸一水和物 (p-TsOH・H2O) (1.36 g, 7.15 mmol) を加えて４時間撹拌した。反応物をトリエチルアミンで中和し、溶媒を減圧下濃縮し、残渣を酢酸エチルで抽出し、飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、15:1、v/v] で精製し、ジアステレオマー混合物 (5′-O-tetrahydropyranyl-4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyl -2,2′-anhydrouridine) ５９ (2.74 g, 5.84 mmol, 90%) を得た。【０２０６】
続いて、ジアステレオマー混合物５９ (2.74 g, 5.84 mmol) のメタノール溶液 (38 mL) に、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液 (10 mL) を加えて室温で３時間撹拌した。反応物を１Ｍ 酢酸で中和し、溶媒をエタノールで共沸した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、30:1、v/v] で精製し、ジアステレオマー混合物(5′-O-tetrahydropyranyl-4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyl-arabinouridine) ６０ (2.82 g, 5.78 mmol, quant.) を得た。【０２０７】
続いて、ジアステレオマー混合物６０ (3.39 g, 6.95 mmol) のジクロロメタン溶液 (181 mL) に、アルゴン雰囲気下でピリジン (8.64 mL) 、N,N-ジメチル-4-アミノピリジン (DMAP) (3.82 g, 31.3 mmol) を加えて０℃まで冷却した。反応混合物にトリフルオロメタンスルホン酸無水物 (Tf2O) (3.42 mL, 20.9 mmol) を慎重に滴下し、０℃で１時間撹拌した。反応物をクロロホルムで抽出し、有機層を飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をアセトニトリルで共沸した後、テトラヒドロフラン溶液 (167 mL) とした。アルゴン雰囲気下、氷浴下でテトラブチルアンモニウムフルオリド (TBAF) (10.9 g, 3.06 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (34.7 mL) を慎重に滴下し、０℃で１時間撹拌した。反応混合物に更に同量のテトラブチルアンモニウムフルオリドテトラヒドロフラン溶液 (TBAF) (34.7 mL, 3.06 mmol) を慎重に滴下し、０℃で４時間撹拌した。反応物を減圧下濃縮し、残渣をクロロホルムで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:2、v/v] で精製し、目的物 (5′-O-tetrahydropyranyl-4′-C- azidoethyl-3′-O-benzyl-2′-fluorouridine) ６１のジアステレオマー混合物 (2.34 g, 4.78 mmol, 69%) を得た。【０２０８】
続いて、ジアステレオマー混合物 (2.34 g, 4.78 mmol) のメタノール溶液 (48.0 mL) に、アルゴン雰囲気下でパラトルエンスルホン酸一水和物 (p-TsOH・H2O) (1.39 g, 7.47 mmol) を加え、室温で６時間撹拌した。反応混合物を減圧留去した後、ピリジンで３度共沸し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、5:2、v/v] で精製し、目的物６２ (1.36 g, 3.33 mmol, 70%) を得た。
1H NMR (400MHz,DMSO-d6) δ：1.78-1.86 (m, 1H), 1.99-2.06 (m, 1H), 3.42-3.48 (m, 3H), 3.60-3.64 (m, 1H), 4.36 (dd, J=19.3Hz and 5.04Hz, 1H), 4.62 (d, J=11.9Hz, 1H), 4.70 (d, J=11.4Hz, 1H), 5.36 (m, 0.5H), 5.42 (t, J=5.52Hz, 1H), 5.50 (m, 0.5H), 5.65 (dd, J=7.80Hz and 1.84Hz, 1H), 6.04 (dd, J=17.9Hz and 2.32Hz, 1H), 7.31-7.35 (m, 1H), 7.36-7.37 (m, 4H), 7.91 (d, J=8.28Hz, 1H), 11.4 (s, 1H)
13C NMR (101MHz, DMSO-d6) δ：30.38, 46.00, 63.09, 72.30, 76.61, 76.75, 86.68, 87.45, 87.79, 91.67, 93.55, 101.77, 127.47, 127.71, 128.33, 137.89, 140.90, 150.35, 163.15
19F NMR (376MHz, DMSO-d6) δ：-120.08, -119.88【０２０９】
4′-C-azidoethyl-2′-deoxy-2′-fluorouridine 63
4′-C-azidoethyl-3′-O-benzyl-2′-deoxy-2′-fluorouridine (0.672 g, 1.66 mmol) のジクロロメタン溶液 (27 mL) を、アルゴン雰囲気下、−７８℃まで冷却し、１Ｍ三塩化ホウ素ジクロロメタン溶液 (13.3 mL, 13.3 mmol) を加えて３時間撹拌した。その後−３０℃に昇温して５時間撹拌した。反応混合物にジクロロメタン−メタノール (1:1、v/v、25 mL) を加え、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [クロロホルム-メタノール、8:1、v/v] で精製し、目的物６３ (339 mg, 1.08 mmol, 65%) を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：1.74-1.79 (m, 1H), 1.81-2.01 (m, 1H), 3.38-3.45 (m, 3H), 3.55 (dd, J=11.9 Hz and 5.04 Hz, 1H), 4.26-4.32 (m, 1H), 5.10 (t, J=5.04 Hz, 0.5H), 5.23 (t, J=5.04 Hz, 1H), 5.35 (t, J=5.04 Hz, 1H), 5.66 (d, J=7.80 Hz, 1H), 5.79 (d, J=5.52 Hz, 1H), 6.05 (dd, J=15.1 Hz and 4.12 Hz, 1H), 7.90 (d, J=8.24 Hz, 1H), 11.4 (s, 1H)
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ：30.44, 46.15, 63.40, 69.37, 69.53, 79.20, 85.81,86.13, 87.10, 92.26, 94.13, 102.09, 140.61, 150.53, 163.09
19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ-123.84, -123.97【０２１０】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-azidoethyl-2′-deoxy-2′-fluorouridine 64
4′-C-azidoethyl-2′-deoxy-2′-fluorouridine (343 mg, 1.09 mmol) のピリジン溶液 (4.0 mL) に、アルゴン雰囲気下で4,4'-ジメトキシトリチルクロリド (DMTrCl) (554 mg, 1.64 mmol) を加え、室温で６時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:1、v/v] で精製し、目的物６４ (615 mg, 0.996 mmol, 91%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.85-1.93 (m, 1H), 2.02-2.09 (m, 1H), 2.78 (s, 1H), 3.21-3.27 (m, 1H), 3.31-3.40 (m, 3H), 3.80 (s, 6H), 4.60-4.64 (m, 1H), 5.10 (t, J=1.84 Hz, 0.5H), 5.25 (t, J=1.60 Hz, 0.5H), 5.36 (d, J=8.24 Hz, 1H), 6.14 (dd, J=15.6 Hz and 3.20 Hz, 1H), 6.85 (d, J=8.72 Hz, 4H), 7.24 (s, 3H), 7.27-7.36 (m, 6H), 7.65 (d, J=7.80 Hz, 1H), 8.99 (s, 1H)
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ：31.16, 46.51, 55.41, 65.70, 71.48, 71.63, 86.97, 87.19, 87.52, 87.76, 92.90, 94.80, 102.96, 113.52, 127.47, 128.23, 128.26, 130.24, 130.28, 134.82, 135.00, 140.50, 144.08, 150.18, 158.96, 163.02
19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ：-122.41, -122.67【０２１１】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminoethyl-2′-deoxy-2′-fluorouridine 65
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-azidoethyl-2′-deoxy-2′-fluorouridine (616 mg, 0.997 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (25 mL) に、トリフェニルホスフィン(PPh3) (654 mg, 2.49 mmol) と水 (0.719 mL) を加え、４５℃で１５時間撹拌した。反応混合物中のテトラヒドロフランを減圧留去した後、ジクロロメタン溶液 (6.0 mL) とした。トリフルオロ酢酸エチル(CF3COOEt) (0.35 mL, 2.93 mmol) とトリエチルアミン (Et3N) (0.203 mL, 1.47 mmol) を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、2:3、v/v] で精製し、目的物６５ (610 mg, 0.887 mmol, 91%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：1.90-2.11 (m, 2H), 3.31-3.42 (m, 4H), 3.80 (s, 6H), 4.60 (dd, J=13.8 Hz amd 5.04 Hz, 1H), 5.14 (t, J=4.56 Hz, 0.5H), 5.28 (s, 0.5H), 5.41 (d, J=7.80 Hz, 1H), 6.15 (dd, J=15.1 Hz and 3.64 Hz, 1H), 6.86 (d, J=7.80 Hz, 4H), 7.28-7.37 (m, 10H), 7.63 (d, J=8.28 Hz, 1H), 9.55 (s, 1H)
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ：30.94, 35.33, 55.38, 65.76, 71.47, 71.62, 87.15, 87.36, 87.83, 92.63, 94.52, 103.11, 113.53, 117.35, 127.47, 128.18, 128.26, 130.23, 134.71, 134.90, 140.58, 143.99, 150.54, 157.12, 157.48, 158.92, 163.34
19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ：-124.43, -124.56【０２１２】
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacet  ylaminoethyl-2′-deoxy-2′-fluoro-3′-[2-cyanoethyl-N,N-bis(1-methy  lethyl)-phosphoramidite]-uridine 66
5′-O-[bis(4-methoxyphenyl)phenylmethyl]-4′-C-trifluoroacetylaminoethyl-2′-deoxy-2′-fluorouridine (562 mg, 0.817 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (6 mL) に、アルゴン雰囲気下でジイソプロピルエチルアミン (DIPEA) (0.713 mL, 409 mmol) とクロロ(ジイソプロピルアミノ)亜ホスフィン酸2-シアノエチル (CEP-Cl) (0.365 mL, 1.63 mmol) を加えて室温で１時間撹拌した。反応混合物をクロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー [ヘキサン-酢酸エチル、1:1、v/v] で精製し、目的物６６ (696 mg, 0.784 mmol, 96%) を得た。
31P NMR (162MHz, CDCl3) δ：151.16, 151.69, 152.64, 152.72
【実施例３】
【０２１３】
（アミノアルキルRNA含有ＲＮＡオリゴマー合成）
実施例１及び２で合成したヌクレオシドを用いて、オリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドの合成は、ホスホロアミダイト法を用いた核酸自動合成機によって行った。0.1 -0.15 Mヌクレオシドアミダイトのアセトニトリル溶液及び、ヌクレオチド担持ＣＰＧ担体を用いて合成した。合成終了後、ＣＰＧ樹脂をサンプリングチューブに移し、アセトニトリル-ジエチルアミン (9:1, v/v, 1.0 mL) を加えて５分間撹拌した。上澄みを除去し、アンモニア水−メチルアミン (1:1, v/v, 1.0 mL) を加え、６５℃で１０分静置した。反応混合物を0.1 M トリエチルアミン-酢酸緩衝液 (TEAA) で10 mLにメスアップし、平衡化したSep-Pac tC18逆相カラムに通して吸着させた。カラムを滅菌水で洗浄後、アセトニトリル−水 (1:1, v/v, 3 mL) で溶出し、減圧乾固して粗製物を得た。粗製物はloading solution (1×TBE in 90 % ホルムアミド) (200 μL) に溶解させ、20% PAGE (500 V, 20 mA) により精製した。0.1 M トリエチルアミン-酢酸緩衝液、1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 水溶液 (20 mL) を加え、一晩振盪した。振盪後、ろ液を平衡化したSep-Pac tC18逆相カラムに通し、カラムに吸着させた。カラムを滅菌水で洗浄して塩を取り除き、アセトニトリル−水 (1:1、v/v、3 mL) で溶出し、減圧下乾固した。【０２１４】
オリゴヌクレオチドは滅菌水 (1 mL) に溶かし、希釈液の260 nmにおける吸光度から収量を求めた。また、60 pmol相当のオリゴヌクレオチドを減圧乾固させ、3 μLの滅菌水及び3 μLのマトリックス溶液とよく混和し、プレート上で乾固した後、MALDI-TOF/MSで質量を測定した。【０２１５】
合成した配列（オリゴリボヌクレオチドについて配列番号１、オリゴデオキシリボヌクレオチドについて配列番号２）及び収率・質量測定の結果を、以下の表に示す。なお、uAEは2'-OMe-4'-AEUを、uAMは2'-OMe-4'-AMUを、uGMは2'-OMe-4'-GMUを、uAPは2'-OMe-4'-APUを、uFAEは2'-F-4'-AEUを示す。これらの構造を図１に示す。また、Fは蛍光標識用に導入したFluoresceinを、小文字のa, u, c, gはそれぞれU, A, Gの2'-OMe修飾体を指す。さらに、3'末端にはアルキン-セリノールリンカー を導入し、今後クリック反応によりＤＤＳ分子を結合させるための足場とした。リンカーを図２に示す。【０２１６】
【表１】
2018110678.tif 000019
【０２１７】
【表２】
2018110678.tif 000020
【実施例４】
【０２１８】
（融解温度(Tm)の測定）
10 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0, 100 mM NaCl) 中でアニーリングした３μMの以下に示すRNA二重鎖を、５℃から７０℃まで＋０．５℃/min で昇温し、吸光度変化から融解温度 (Tm) を算出した。結果を、図３及び４に示す。【０２１９】
図３に示すように、アミノエチル修飾による、RNA二本鎖形成能の低下が確認された。相補鎖が、2'位が-OH, -OMeに関わらず一修飾辺り約２℃融解温度が低下した。
【実施例５】
【０２２０】
（ウシ血清中でのリボヌクレアーゼ耐性試験）
実施例３で合成した蛍光標識オリゴヌクレオチド300 pmolをOPTI-MEM滅菌水３７．５μLに溶かし、リボヌクレアーゼ源としてのウシ血清１．２μLを加え, ３７℃でインキュベートした。０, ０．５, １, ３, ６, １２, ２４時間後に反応液１．２μLとloading solution (9 M urea含有)５μLを混ぜて反応を停止させた。この反応溶液を20% PAGE, 500 V, 20 mAにて分離した、ルミノ・イメージアナライザー LAS4000を用いて分析した。結果を図５及び図６に示す。【０２２１】
図５に示すように、まずアミノエチル修飾位置によるリボヌクレアーゼ耐性を比較した。未修飾のＯＮ１や修飾位置が3'末端にまとまっているＯＮ３では０−１時間でほぼ分解が完了したのに対し、均等にアミノエチル修飾を導入したＯＮ２, ４、全てに２'−ＯＭｅ修飾を導入したＯＮ５では分解速度の低下が見られた。２'−ＯＭｅ修飾では６ｈでほぼ分解が完了したのに対し、ＯＮ２, ４では２４時間経過後も全長ＲＮＡの存在が確認された。特に、均等に６ヶ所修飾を導入したＯＮ４では６時間たっても分解物がほぼ見られないことから、アミノアルキル修飾が高いリボヌクレアーゼ耐性を示すことが確認された。【０２２２】
続いて、図６に示すように、アミノアルキル側鎖の鎖長の違いによるリボヌクレアーゼ耐性能を比較した。その結果、導入したアルキル鎖がアミノメチル基（ＯＮ８）、アミノエチル基（ＯＮ２）、アミノプロピル基（ＯＮ１０）と鎖長が長くなるに従いオリゴヌクレオチドの分解速度が低下すること、即ち、リボヌクレアーゼ耐性が向上することが確認された。
【実施例６】
【０２２３】
（細胞膜透過性試験）
HeLa細胞を20000 cell/mLになるように調製し、48 well plateの各wellに 400 μLずつ入れ２４時間培養した。蛍光修飾オリゴヌクレオチド(40 pmol) をOPTI-MEM(400 μL) に溶解させ、各ウェルの培地を吸引したのちに全量をウェルに加えた。１時間インキュベート後、血清入り培養培地 (10%BS入りD-MEM(WAKO)) を200 μL/well加えた。２４時間後、各ウェルの培地を除去し、PBSで２回ウェルを洗浄した。その後、倒立型蛍光顕微鏡 (IX70, OLYMPUS社製) を用い、細胞観察を行った。結果を図７及び図８に示す。【０２２４】
図７に示すように、アミノエチル修飾による細胞膜透過性の顕著な向上が見られた。特にＯＮ２では１１量体中３ヶ所のみに修飾をもつが、極めて高い細胞内取り込みが確認された。また、修飾位置に着目すると、３'末端に修飾を導入したＯＮ３では膜透過能がみられないことから、アミノエチル修飾を配列に対して均等に分布させることが必要であると示唆された。【０２２５】
図８に示すように、続いて導入したアミノアルキル側鎖の鎖長の違いによるオリゴヌクレオチドの細胞膜透過能を比較した。その結果、アミノメチル基を導入したオリゴヌクレオチド（ＯＮ８）と比較して、アミノエチル基（ＯＮ２）及びアミノプロピル基（ＯＮ１０）を導入したオリゴヌクレオチドで細胞膜透過能が向上する事が確認された。これは、エチル基、プロピル基による脂溶性の増加、もしくはファンデルワールス分子間力の増加によると想定される。
【実施例７】
【０２２６】
（RNA干渉能の検証）
以下に示すｓｉＲＮＡ二重鎖のパッセンジャー鎖におけるウリジンを、実施例１及び実施例２で合成した２’−フルオロアミノエチルウリジン及び２’−Ｏ−メチルアミノエチルウリジン並びにこれらの誘導体を用いて、実施例３に準じて２’−フルオロアミノエチル修飾ｓｉＲＮＡと２’−Ｏ−メチルアミノエチル修飾ｓｉＲＮＡをそれぞれ合成した。【０２２７】
【化１７】
2018110678.tif 000021
【０２２８】
アミノエチル修飾ｓｉＲＮＡのRNA干渉能の評価にはDual luciferase reporter assayを用いた。HeLa細胞（Firefly luciferase、Renilla luciferase安定発現株）を8.0×103 cells/mLになるように調製し、96 well plateの各wellに 100 μLずつ入れ24時間培養した。合成したsiRNAのそれぞれの鎖をTE buffer 10 μlに溶解し、95℃で3分加熱後、1時間以上静置し室温に戻した。このsiRNA各量、培地 （OPTI‐MEM）各量、 lipofectamin RNAiMAX（transfection試薬）1.5 μLを総量50 μLになるように混合し、培地を吸った96 well plateの各wellに 10 μLずつ入れ、CO2インキュベーター37℃で20分後培地を50 μl加えてCO2インキュベーター37℃で24時間培養した。24 時間後、培地を吸い、冷凍保存した。なお、ｓｉＲＮＡは、１ｎＭ及び１０ｎＭの２濃度で評価した。また、ポジティブコントロールとして、天然ｓｉＲＮＡを同様にして処理した。【０２２９】
ルシフェラーゼ発光の測定は、解凍後Dual glo substrate（Firefly luciferaseの基質）24 μLを加え5分間静置後、サンプル23 μLを発光測定用の96 well plateに移し、Firefly luciferaseを測定した。その後、Stop and glo substrate（Renilla luciferaseの基質）23 μLを加え10分静置後、Renilla luciferaseを測定した。Renilla luciferaseの発光測定値をFirefly luciferaseの値で割り、% of controlを用いて比較した。なお、luciferase測定には、Luminescenser JNR IIを使用した。結果を図９に示す。【０２３０】
図９に示すように、２’−フルオロアミノエチル修飾ｓｉＲＮＡと２’−Ｏ−メチルアミノエチル修飾ｓｉＲＮＡのいずれも、遺伝子発現抑制能を示した。特に、２’−フルオロアミノエチル修飾ｓｉＲＮＡは、ポジティブコントロールである天然ｓｉＲＮＡと同程度の遺伝子発現抑制能を示した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０２３１】
【非特許文献１】HELVATICA CHIMICA ACTA Vol. 83 (2000) 128-151
【非特許文献２】The Journal of Organic Chemistry 2012, 77, 3233-3245
【非特許文献３】Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672
【非特許文献４】The Journal of Organic Chemistry 2013, 78, 9956-9962
【配列表フリーテキスト】
【０２３２】
配列番号１〜４：合成ヌクレオチド
【図１】
2018110678.tif 000025
【図２】
2018110678.tif 000026
【図３】
2018110678.tif 000027
【図４】
2018110678.tif 000028
【図５】
2018110678.tif 000029
【図６】
2018110678.tif 000030
【図７】
2018110678.tif 000031
【図８】
2018110678.tif 000032
【図９】
2018110678.tif 000033
【配列表】
2018110678000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月30日(2018.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（２）で表される、ヌクレオシド誘導体又はその塩。
【化１８】
2018110678.tif 000034
（式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表し、Ｒ２及びＲ４は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）ｎＲ５Ｒ６（ｎは０又は１を示し、Ｒ５及びＲ６は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ５及びＲ６が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ３は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ７（Ｒ７は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。ただし、Ｒ７が水素原子又はアミノ基の保護基のとき、連結基は、炭素数２〜３のアルキレン基である。）を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
【請求項２】
前記式（２）中、Ｒ７は水素原子を表す、請求項１に記載のヌクレオシド誘導体又はその塩。
【請求項３】
前記式（２）中、前記ハロゲン原子は、フッ素原子を表す、請求項２に記載のヌクレオシド誘導体又はその塩。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体又はその塩を含む、オリゴリボヌクレオチドに対する細胞膜透過性付与剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体又はその塩を含む、オリゴリボヌクレオチドに対するリボヌクレアーゼ耐性付与剤。
【請求項６】
以下の式（４）からなる群から選択される部分構造を少なくとも１個備える、オリゴリボヌクレオチド誘導体又はその塩を含むＲＮＡ干渉剤。
【化１９】
2018110678.tif 000035
（式（４）中、Ｘは、ハロゲン原子を表し、Ｒ３は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ７（Ｒ７は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。ただし、Ｒ７が、水素原子のとき、連結基は、炭素数２〜３のアルキレン基である。）を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
【請求項７】
前記式（４）中、Ｒ７は水素原子を表し、前記ハロゲン原子は、フッ素原子を表す、請求項７に記載のオリゴリボヌクレオチド誘導体又はその塩を含む、請求項７に記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項８】
前記部分構造を少なくとも３個備えており、前記部分構造を５’末端側、中央部及び３’末端側に備える、請求項６に記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項９】
前記部分構造を少なくとも３個備えており、前記部分構造を５’末端側、中央部及び３’末端側に備える、請求項７に記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項１０】
前記部分構造を少なくとも６個備える、請求項６〜９のいずれかに記載のオリゴリボヌクレオチド誘導体又はその塩を含む、ＲＮＡ干渉剤。
【請求項１１】
以下の式（１）で表される、ヌクレオシド誘導体又はその塩。
【化２０】
2018110678.tif 000036
（式（１）中、Ｒ１は、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基を表し、Ｒ２及びＲ４は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）ｎＲ５Ｒ６（ｎは０又は１を示し、Ｒ５及びＲ６は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ５及びＲ６が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ３は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ７（Ｒ７は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。ただし、Ｒ７が、水素原子又はアミノ基の保護基のとき、連結基は、炭素数２〜３のアルキレン基である。）を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
【請求項１２】
前記式（１）中、Ｒ７は、水素原子を表す、請求項１１に記載のヌクレオシド誘導体又はその塩。
【請求項１３】
前記式（１）中、Ｒ１は水素原子がアルキル基で置換された水酸基を表す、請求項１２に記載のヌクレオシド誘導体又はその塩。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体又はその塩を含む、オリゴリボヌクレオチドに対する細胞膜透過性付与剤。
【請求項１５】
請求項１１〜１３のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体又はその塩を含む、オリゴリボヌクレオチドに対するリボヌクレアーゼ耐性付与剤。
【請求項１６】
以下の式（３）で表される部分構造を備えるオリゴリボヌクレオチド誘導体又はその塩を含むＲＮＡ干渉剤。
【化２１】
2018110678.tif 000037
（式（３）中、Ｒ１は、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基を表し、Ｒ３は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ７（Ｒ７は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。ただし、Ｒ７が、水素原子のとき、連結基は、炭素数２〜３のアルキレン基である。）を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
【請求項１７】
前記式（３）中、Ｒ１は、水素原子がアルキル基で置換された水酸基を表し、Ｒ７は水素原子を表す、請求項１６に記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項１８】
前記部分構造を少なくとも３個備えており、前記部分構造を５’末端側、中央部及び３’末端側に備える、請求項１６に記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項１９】
前記部分構造を少なくとも３個備えており、前記部分構造を５’末端側、中央部及び３’末端側に備える、請求項１７に記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項２０】
前記部分構造を少なくとも６個備える、請求項１６〜１９のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項２１】
以下の式（２）で表される、ヌクレオシド誘導体又はその塩を含有する、オリゴリボヌクレオチドに対する細胞膜透過性又はリボヌクレオチド耐性の付与剤。
【化１８】
2018110678.tif 000038
（式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表し、Ｒ２及びＲ４は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）ｎＲ５Ｒ６（ｎは０又は１を示し、Ｒ５及びＲ６は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ５及びＲ６が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ３は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ７（Ｒ７は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。ただし、Ｒ７が水素原子のとき、連結基は、炭素数２〜３のアルキレン基である。）を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
【請求項２２】
以下の式（１）で表される、ヌクレオシド誘導体又はその塩を含有する、オリゴリボヌクレオチドに対する細胞透過性又はリボヌクレアーゼ耐性の付与剤。
【化２０】
2018110678.tif 000039
（式（１）中、Ｒ１は、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基を表し、Ｒ２及びＲ４は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）ｎＲ５Ｒ６（ｎは０又は１を示し、Ｒ５及びＲ６は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ５及びＲ６が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ３は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ７（Ｒ７は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。ただし、Ｒ７が、水素原子のとき、連結基は、炭素数２〜３のアルキレン基である。）を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
【国際調査報告】
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