(57)【要約】  液体を収容するための空洞である流路と、流路内を通過した光を、流路内を再度通過するように鏡面反射させるための反射部と、を有する測定チップの流路内に、被測定物質を含む検体を導入し、検体中の被測定物質の量を示す測定値を取得する。次いで、検体が流路内に存在する状態で、赤血球が吸収する波長の光を含む第１の光が流路内の検体を透過し、反射部で反射し、かつ流路内の検体を再度透過することで得られる第２の光を検出する。次いで、第２の光の検出結果に基づいて、検体のヘマトクリット値を決定する。次いで、ヘマトクリット値に基づいて測定値を補正する。
2018034143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液を含む検体中の被測定物質の量を測定するための測定方法であって、
液体を収容するための空洞である流路と、前記流路内を通過した光を、前記流路内を再度通過するように鏡面反射させるための反射部と、を有する測定チップの前記流路内に、前記被測定物質を含む前記検体を導入し、前記検体中の前記被測定物質の量を示す測定値を取得する工程と、
前記検体が前記流路内に存在する状態で、赤血球が吸収する波長の光を含む第１の光が前記流路内の前記検体を透過し、前記反射部で反射し、かつ前記流路内の前記検体を再度透過することで得られる第２の光を検出する工程と、
前記第２の光の検出結果に基づいて、前記検体のヘマトクリット値を決定する工程と、
前記ヘマトクリット値に基づいて前記測定値を補正する工程と、
を含む、測定方法。
【請求項２】
前記ヘマトクリット値を決定する工程は、前記第２の光となる光の前記流路内の光路長、前記流路の高さ、および前記第１の光の波長の少なくとも１つに基づいて前記ヘマトクリット値を補正する工程を含む、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記流路内が空洞である第１の状態で、前記第１の光が前記流路内を通過し、前記反射部で反射し、かつ前記流路内を再度通過することで得られる第３の光と、前記第１の光が前記流路の、前記反射部に対向する面で反射することで得られる第４の光とをアレイセンサーにより検出する工程と、
前記第１の光に対して透明な第１の液で、前記流路内が満たされている第２の状態で、前記第１の光が前記流路内の前記第１の液を透過し、前記反射部で反射し、かつ前記流路内の前記第１の液を再度透過することで得られる第５の光をアレイセンサーにより検出する工程と、
前記第３の光、前記第４の光および前記第５の光の検出結果に基づいて、前記第２の光となる光の前記流路内の光路長または前記流路の高さを決定する工程と、
をさらに含む、請求項２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記第１の光の少なくとも一部の波長の光を吸収する色素を含む第２の液で、前記流路内が満たされている状態で、前記第１の光が前記流路内の前記第２の液を透過し、前記反射部で反射し、かつ前記流路内の前記第２の液を再度透過することで得られる第６の光を検出する工程と、
前記第６の光の検出結果に基づいて、前記第２の光となる光の前記流路内の光路長または前記流路の高さを決定する工程と、
をさらに含む、請求項２に記載の測定方法。
【請求項５】
前記ヘマトクリット値を決定する工程では、血液が溶血した状態の前記検体を透過した前記第２の光の検出結果に基づいて、前記ヘマトクリット値を決定する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項６】
前記第１の光に対して透明な参照液が前記流路内に存在する状態で、前記第１の光が前記流路内の前記参照液を透過し、前記反射部で反射し、かつ前記流路内の前記参照液を透過することで得られる第７の光を検出する工程をさらに含み、
前記ヘマトクリット値を決定する工程では、前記第２の光の検出結果に基づいて決定される前記ヘマトクリット値を、前記第７の光の検出結果に基づいて補正する、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項７】
前記第２の光を検出する工程では、前記第１の光の光軸と前記第２の光の光軸とを含む平面が前記流路の長手方向に沿うように、前記第１の光を前記反射部に照射する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項８】
前記測定チップは、プリズムと、前記プリズム上に配置されている金属膜と、前記金属膜上に配置されている前記流路と、前記流路を挟んで前記プリズムと対向するように配置されている前記反射部と、を有し、
前記測定値を取得する工程では、前記金属膜上に、前記検体中に含まれていた前記被測定物質が固定化され、かつ前記検体が存在しない状態で、前記プリズムを介して前記金属膜に、表面プラズモン共鳴が生じる入射角で第８の光を照射したときに生じる、前記被測定物質の量を示すシグナルを検出して、前記測定値を取得し、
前記第２の光を検出する工程では、前記検体が前記流路内に存在する状態で、前記プリズム側から前記反射部に前記第１の光を照射する、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項９】
前記反射部は、金属膜である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項１０】
前記測定チップは、プリズムと、前記プリズム上に配置されている金属膜である前記反射部と、前記反射部上に配置されている前記流路と、を有し、
前記測定値を取得する工程では、前記反射部上に、前記検体中に含まれていた前記被測定物質が固定化され、かつ前記検体が存在しない状態で、前記プリズムを介して前記反射部に、表面プラズモン共鳴が生じる入射角で第８の光を照射したときに生じる、前記被測定物質の量を示すシグナルを検出して、前記測定値を取得し、
前記第２の光を検出する工程では、前記検体が前記流路内に存在する状態で、前記流路側から前記反射部に前記第１の光を照射する、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項１１】
血液を含む検体中の被測定物質の量を測定するための測定装置であって、
液体を収容するための空洞である流路と、前記流路内を通過した光を、前記流路内を再度通過するように鏡面反射させるための反射部と、を有する測定チップを保持するためのチップホルダーと、
前記チップホルダーに保持された前記測定チップの前記流路内に、前記検体中の前記被測定物質が存在する状態で、前記検体中の前記被測定物質の量を示す測定値を取得するための測定値取得部と、
赤血球が吸収する波長の光を含む第１の光を出射するための光出射部と、
前記検体が前記流路内に存在する状態で、前記光出射部が前記反射部に向けて前記第１の光を出射したときに、前記第１の光が前記流路内の前記検体を透過し、前記反射部で反射し、かつ前記流路内の前記検体を再度透過することで得られる第２の光を検出するための光検出部と、
前記光検出部による前記第２の光の検出結果に基づいて前記検体のヘマトクリット値を決定するとともに、前記ヘマトクリット値に基づいて前記測定値を補正する処理部と、
を有する、測定装置。
【請求項１２】
前記処理部は、前記第２の光となる光の前記流路内の光路長、前記流路の高さ、および前記第１の光の波長の少なくとも１つに基づいて前記ヘマトクリット値を補正する、請求項１１に記載の測定装置。
【請求項１３】
前記光検出部は、前記第２の光を受光するためのアレイセンサーを有し、
前記光検出部は、
前記流路内が空洞である状態で、前記光出射部が前記反射部に向けて前記第１の光を出射したときに、前記第１の光が前記流路内を通過し、前記反射部で反射し、かつ前記流路内を再度通過することで得られる第３の光と、前記第１の光が、前記流路の、前記反射部に対向する面で反射することで得られる第４の光とを検出し、かつ
前記第１の光に対して透明な第１の液で前記流路内が満たされている状態で、前記光出射部が前記反射部に向けて前記第１の光を出射したときに、前記第１の光が前記流路内の前記第１の液を透過し、前記反射部で反射し、かつ前記流路内の前記第１の液を再度透過することで得られる第５の光を検出し、
前記処理部は、前記アレイセンサーによる前記第３の光、前記第４の光および前記第５の光の検出結果に基づいて、前記第２の光となる光の前記流路内の光路長または前記流路の高さを決定する、
請求項１２に記載の測定装置。
【請求項１４】
前記光検出部は、前記第１の光の少なくとも一部の波長の光を吸収する色素を含む第２の液で、前記流路内が満たされている状態で、前記光出射部が前記反射部に向けて前記第１の光を出射したときに、前記第１の光が前記流路内の前記第２の液を透過し、前記反射部で反射し、かつ前記流路内の前記第２の液を再度透過することで得られる第６の光を検出し、
前記処理部は、前記光検出部による前記第６の光の検出結果に基づいて、前記第２の光となる光の前記流路内の光路長または前記流路の高さを決定する、
請求項１２に記載の測定装置。
【請求項１５】
前記処理部は、前記流路の高さに関する情報をあらかじめ記憶している、請求項１２に記載の測定装置。
【請求項１６】
前記処理部は、血液が溶血した状態の前記検体を透過した前記第２の光の検出結果に基づいて、前記ヘマトクリット値を決定する、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項１７】
前記光検出部は、前記第１の光に対して透明な参照液が前記流路内に存在する状態で、前記光出射部が前記反射部に向けて前記第１の光を出射したときに、前記第１の光が前記流路内の前記参照液を透過し、前記反射部で反射し、かつ前記流路内の前記参照液を再度透過することで得られる第７の光を検出し、
前記処理部は、前記第７の光の検出結果に基づいて、前記ヘマトクリット値を補正する、
請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項１８】
前記光出射部および前記光検出部は、前記第１の光の光軸と前記第２の光の光軸とを含む平面が前記流路の長手方向に沿うように配置されている、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項１９】
前記測定チップは、プリズムと、前記プリズム上に配置されている金属膜と、前記金属膜上に配置されている前記流路と、前記流路を挟んで前記プリズムと対向するように配置されている前記反射部とを有し、
前記測定値取得部は、
第８の光を出射するための第２の光出射部と、
前記金属膜上に、前記検体に含まれていた前記被測定物質が固定化され、かつ前記検体が存在しない状態で、前記第２の光出射部が前記プリズムを介して前記金属膜に向けて、表面プラズモン共鳴が生じる入射角で前記第８の光を出射したときに生じる、前記被測定物質の量を示すシグナルを検出するためのシグナル検出部と、
を有し、
前記光出射部は、前記プリズム側から前記反射部に向けて前記第１の光を出射し、
前記処理部は、前記シグナル検出部の検出結果に基づいて前記測定値を取得する、
請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項２０】
前記反射部は、金属膜である、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項２１】
前記測定チップは、プリズムと、前記プリズム上に配置されている金属膜である前記反射部と、前記反射部上に配置されている前記流路と、を有し、
前記測定値取得部は、
第８の光を出射するための第２の光出射部と、
前記金属膜上に、前記検体に含まれていた前記被測定物質が固定化され、かつ前記検体が存在しない状態で、前記第２の光出射部が前記プリズムを介して前記金属膜に向けて、表面プラズモン共鳴が生じる入射角で前記第８の光を出射したときに生じる、前記被測定物質の量を示すシグナルを検出するためのシグナル検出部と、
を有し、
前記光出射部は、前記流路側から前記反射部に向けて前記第１の光を出射し、
前記処理部は、前記シグナル検出部の検出結果に基づいて前記測定値を取得する、
請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項２２】
前記シグナル検出部は、前記シグナルを集光するための光学レンズと、前記シグナルを受光するための受光素子とを有し、
前記光学レンズは、前記第１の光を前記反射部に導くとともに、前記第２の光を前記受光素子に導く光学レンズとしても機能し、
前記受光素子は、前記第２の光を受光するための受光素子としても機能する、
請求項２１に記載の測定装置。
【請求項２３】
血液を含む検体中の被測定物質の量を測定するための測定システムであって、
液体を収容するための空洞である流路と、前記流路内を通過した光を、前記流路内を再度通過するように鏡面反射させるための反射部と、を有する測定チップと、
前記流路内に、前記検体中の前記被測定物質が存在する状態で、前記検体中の前記被測定物質の量を示す測定値を取得するための測定値取得部と、
赤血球が吸収する波長の光を含む第１の光を出射するための光出射部と、
前記検体が前記流路内に存在する状態で、前記光出射部が前記反射部に向けて前記第１の光を出射したときに、前記第１の光が前記流路内の前記検体を透過し、前記反射部で反射し、かつ前記流路内の前記検体を再度透過することで得られる第２の光を検出するための光検出部と、
前記光検出部による前記第２の光の検出結果に基づいて前記検体のヘマトクリット値を決定するとともに、前記ヘマトクリット値に基づいて前記測定値を補正する処理部と、
を有する、測定システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液を含む検体中の被測定物質を測定する測定方法、測定装置および測定システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査において、タンパク質やＤＮＡなどの、検体中の微量の被測定物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。たとえば、血液中の抗原（被測定物質）を測定する場合、検体としては、患者から採取された全血、またはその全血から血球成分が分離された血漿または血清が使用され得る。また、患者の状態を把握するためには、血漿または血清に対する被測定物質の量（濃度）を測定する必要がある。しかしながら、全血に対する血漿または血清の割合は患者ごとに異なるため、検体として全血を使用して被測定物質の量を示す測定値を取得した場合には、全血に対する血漿または血清の割合に応じて当該測定値を補正する必要がある。このとき、測定値の補正には、ヘマトクリット値が用いられ得る。従来、ヘマトクリット値および上記測定値に基づいて、被測定物質の量を決定する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。【０００３】
特許文献１に記載の測定方法では、検体中の血液と、色素との呈色反応を利用している。まず、ヘモグロビンに対して特異的な吸収波長を有する第１の光と、色素に対して特異的な吸収波長を有する第２の光とによって検体の吸光度をそれぞれ測定する。ヘマトクリット値は、第１の光に対する検体の吸光度と、第２の光に対する検体の吸光度とに基づいて決定される。血漿または血清中の被測定物質の量を示す測定値は、決定されたヘマトクリット値と、第２の光に対する検体の吸光度とに基づいて決定される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−２３６４８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載の測定方法では、検体を試験紙に吸収させた状態で吸光度の測定が行われる。試験紙ごとに微細構造が異なるため、試験紙による光（第１の光および第２の光）の散乱にばらつきが生じてしまい、吸光度を高精度に測定できないことがある。また、第１の光および第２の光が色素によって吸収されてしまい、吸光度を高精度に測定できないこともある。このため、特許文献１に記載の測定方法には、ヘマトクリット値を高精度に決定できないという問題がある。【０００６】
ヘマトクリット値をより高精度に決定する観点から、試験紙の厚みを大きくすることで検体中の光路長を長くして、検体による光の吸収量を高めるという方法が考えられる。しかしながら、この方法では、試験紙による散乱および色素による吸収の寄与が大きくなってしまうため、ヘマトクリット値の測定精度を高めることは難しい。【０００７】
本発明の目的は、ヘマトクリット値を高精度に決定し、血液を含む検体中の被測定物質の量を高精度に測定できる測定方法、測定装置および測定システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る測定方法は、血液を含む検体中の量を測定するための測定方法であって、液体を収容するための空洞である流路と、前記流路内を通過した光を、前記流路内を再度通過するように鏡面反射させるための反射部と、を有する測定チップの前記流路内に、前記被測定物質を含む前記検体を導入し、前記検体中の前記被測定物質の量を示す測定値を取得する工程と、前記検体が前記流路内に存在する状態で、赤血球が吸収する波長の光を含む第１の光が前記流路内の前記検体を透過し、前記反射部で反射し、かつ前記流路内の前記検体を再度透過することで得られる第２の光を検出する工程と、前記第２の光の検出結果に基づいて、前記検体のヘマトクリット値を決定する工程と、前記ヘマトクリット値に基づいて前記測定値を補正する工程と、を含む。【０００９】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る測定装置は、血液を含む検体中の被測定物質の量を測定するための測定装置であって、液体を収容するための空洞である流路と、前記流路内を通過した光を、前記流路内を再度通過するように鏡面反射させるための反射部と、を有する測定チップを保持するためのチップホルダーと、前記チップホルダーに保持された前記測定チップの前記流路内に、前記検体中の前記被測定物質が存在する状態で、前記検体中の前記被測定物質の量を示す測定値を取得するための測定値取得部と、赤血球が吸収する波長の光を含む第１の光を出射するための光出射部と、前記検体が前記流路内に存在する状態で、前記光出射部が前記反射部に向けて前記第１の光を出射したときに、前記第１の光が前記流路内の前記検体を透過し、前記反射部で反射し、かつ前記流路内の前記検体を再度透過することで得られる第２の光を検出するための光検出部と、前記光検出部による前記第２の光の検出結果に基づいて前記検体のヘマトクリット値を決定するとともに、前記ヘマトクリット値に基づいて前記測定値を補正する処理部と、を有する。【００１０】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る測定システムは、血液を含む検体中の被測定物質の量を測定するための測定システムであって、液体を収容するための空洞である流路と、前記流路内を通過した光を、前記流路内を再度通過するように鏡面反射させるための反射部と、を有する測定チップと、前記流路内に、前記検体中の前記被測定物質が存在する状態で、前記検体中の前記被測定物質の量を示す測定値を取得するための測定値取得部と、赤血球が吸収する波長の光を含む第１の光を出射するための光出射部と、前記検体が前記流路内に存在する状態で、前記光出射部が前記反射部に向けて前記第１の光を出射したときに、前記第１の光が前記流路内の前記検体を透過し、前記反射部で反射し、かつ前記流路内の前記検体を再度透過することで得られる第２の光を検出するための光検出部と、前記光検出部による前記第２の光の検出結果に基づいて前記検体のヘマトクリット値を決定するとともに、前記ヘマトクリット値に基づいて前記測定値を補正する処理部と、を有する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ヘマトクリット値を高精度に決定でき、血液を含む検体中の被測定物質の量を高精度に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施の形態１〜３に係る測定システムの構成の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、実施の形態１に係る測定システムにおけるヘマトクリット値取得部の構成を示す断面模式図である。
【図３】図３は、実施の形態１に係る測定システムの動作手順の一例を示すフローチャートである。
【図４】図４は、図３に示される光学ブランク値の測定工程内の工程を示すフローチャートである。
【図５】図５は、実施の形態２に係る測定システムの動作手順の一例を示すフローチャートである。
【図６】図６Ａ、Ｂは、実施の形態２に係る測定システムにおける流路の高さの測定について説明するための図であり、実施の形態２に係る測定システムにおけるヘマトクリット値取得部の構成を示す断面模式図である。
【図７】図７は、実施の形態３に係る測定システムの動作手順の一例を示すフローチャートである。
【図８】図８は、変形例１に係る測定システムにおけるヘマトクリット値取得部の構成を示す断面模式図である。
【図９】図９は、変形例２に係る測定システムにおける測定値取得部およびヘマトクリット値取得部の構成を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。ここでは、本発明に係る測定装置および測定システムの代表例として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）を利用した測定装置（ＳＰＦＳ装置）および測定システムについて説明する。
【００１４】
［実施の形態１］
（測定システム）
図１は、実施の形態１に係る測定システム１の構成の一例を示す模式図である。本実施の形態に係る測定システム１は、測定チップ１０およびＳＰＦＳ装置１００を有する。測定システム１は、血液を含む検体中の被測定物質の量を測定するためのシステムである。
【００１５】
図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光出射部（特許請求の範囲では、「第２の光出射部」と称している）１１０、シグナル検出部１２０、送液部１３０、搬送部１４０、光出射部１５０、光検出部１６０および制御処理部（処理部）１７０を有する。実施の形態１では、励起光出射部１１０およびシグナル検出部１２０は、ともに検体中の被測定物質の量を示す測定値を取得するための測定値取得部を構成する。光出射部１５０および光検出部１６０は、検体のヘマトクリット値を取得するためのヘマトクリット値取得部を構成する。
【００１６】
図２は、実施の形態１に係る測定システム１におけるヘマトクリット値取得部の構成を示す断面模式図である。図２は、図１の紙面に対する垂直な面に対して法線方向から見たときの図である。図１において、光出射部１５０および光検出部１６０は、便宜上、紙面に沿って配列されているが、光出射部１５０および光検出部１６０は、図２に示されるように、図１の紙面に垂直な方向に沿って配列されている。図２においては、測定チップ１０内の光路を示すために、測定チップ１０の断面へのハッチングを省略している。なお、図１において、光δ’の光軸が点線で示されているのは、光δ１の光軸および光δ’の光軸が図１の紙面に垂直な平面内に含まれることを示している。
【００１７】
ＳＰＦＳ装置１００は、搬送部１４０のチップホルダー（ホルダー）１４２に測定チップ１０を装着した状態で使用される。そこで、先に測定チップ１０について説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００について説明する。
【００１８】
（測定チップ）
測定チップ１０は、プリズム２０、金属膜３０および流路蓋４０を有する。本実施の形態では、測定チップ１０の流路蓋４０は、後述の液体チップ５０と一体化されている。
【００１９】
プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光出射部１１０からの励起光α（特許請求の範囲では、「第８の光」と称している）をプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射されて反射光となる。出射面２３は、反射光をプリズム２０の外部に出射させる。
【００２０】
プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。
【００２１】
入射面２１は、励起光出射部１１０からの励起光αが入射面２１で反射して励起光出射部１１０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。
【００２２】
ここで「共鳴角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面２３から出射される励起光αの反射光の光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、測定チップ１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）γの光量が最大となるときの、入射角を意味する。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。
【００２３】
なお、測定チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率や、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の厚み、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０上に捕捉された被測定物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
【００２４】
プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０を構成する樹脂の例には、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、およびシクロオレフィン系ポリマーが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４〜１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
【００２５】
詳細については後述するが、本実施の形態では、金属膜３０は、プリズム２０側の面において、表面プラズモン共鳴を生じる場所を提供するとともに、流路４１側の面において、流路４１内を通過した光を反射させる「反射部」として機能する。
【００２６】
金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を生じさせることができる。局在場光は、金属膜３０の表面から励起光αの波長程度離れた距離まで及ぶ。金属膜３０は、成膜面２２上の全面に形成されていてもよいし、成膜面２２上の一部に形成されていてもよい。本実施の形態では、金属膜３０は、成膜面２２の全面に形成されている。
【００２７】
金属膜３０は、光出射部１５０から出射された、流路４１内を通過した光を、流路４１内を再度通過するように鏡面反射させる。本実施の形態では、金属膜３０は、流路蓋４０で測定チップ１０内に入射した第１の光δ１を流路蓋４０に向けて鏡面反射させる。金属膜３０の反射率は、例えば、４０〜９８％である。また、金属膜３０の材料として、銀やアルミニウムなどを用いて金属膜３０を形成した場合には、反射率が高い金属膜３０が得られる。この場合、金属膜３０の反射率は、例えば、８５〜９８％である。
【００２８】
金属膜３０には、被測定物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。金属膜３０上において、捕捉体が固定化されている領域を、特に「反応場」という。捕捉体は、金属膜３０の全面に固定化されていてもよいし、表面の一部に固定化されていてもよい。第１の光δ１が捕捉体により散乱されるのを抑制する観点からは、金属膜３０の、反射部として機能する領域（第１の光δ１が鏡面反射する領域）においては、捕捉体は固定化されていないことが好ましい。また、捕捉体は、被測定物質に特異的に結合する。このため、被測定物質は、捕捉体を介して金属膜３０上に固定化され得る。
【００２９】
捕捉体の種類は、被測定物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被測定物質に特異的に結合可能な抗体（１次抗体）またはその断片、被測定物質に特異的に結合可能な酵素などである。
【００３０】
金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせ得るとともに、その表面で光を鏡面反射できる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミニウム、およびこれらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、ＳＰＲを効率的に発生させる観点から、２０〜６０ｎｍの範囲内が好ましい。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。
【００３１】
流路蓋４０は、金属膜３０上に配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合、流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されていてもよい。本実施の形態では、流路蓋４０は、金属膜３０の上に配置されている。金属膜３０上に流路蓋４０を配置することで液体を収容するための空洞である流路４１が形成される。本実施の形態では、流路４１は、底面と、天面と、当該底面および当該天面を接続する一対の側面とを有する。本明細書中、流路４１のプリズム２０側の面を「流路４１の底面」といい、流路４１の、流路４１の底面と対向する面を「流路４１の天面」という。また、流路４１の天面と流路４１の底面との間隔を流路４１の高さｈとする。
【００３２】
図２に示されるように、流路蓋４０は、枠体４２、液体注入部被膜フィルム４３および液体貯蔵部被膜フィルム４４を有する。枠体４２には、２つの貫通孔が形成されている。枠体４２の裏面には、凹部（流路溝）が形成されている。金属膜３０（およびプリズム２０）上に流路蓋４０（枠体４２）が配置され、当該凹部の開口部が金属膜３０により閉塞されることで、流路４１が形成される。さらに、一方の貫通孔の開口部が液体注入部被膜フィルム４３により閉塞されることで、液体注入部４５が形成され、他方の貫通孔の開口部が液体貯蔵部被膜フィルム４４により閉塞されることで、液体貯蔵部４６が形成される。液体貯蔵部被膜フィルム４４には、通気孔４７が設けられている。
【００３３】
局在場光が及ぶ領域を十分に確保する観点からは、流路４１の高さｈ（流路溝の深さ）は、ある程度大きいことが好ましい。流路４１内に混入する不純物の量を低減する観点からは、流路４１の高さｈ（流路溝の深さ）は、小さいことが好ましい。このような観点から、流路４１の高さｈは、０．０５〜０．１５ｍｍの範囲内であることが好ましい。流路４１の両端は、流路４１内と外部とを連通させるように、流路蓋４０に形成された液体注入部４５および液体貯留部４６とそれぞれ接続されている（図２参照）。
【００３４】
枠体４２は、金属膜３０上から放出される光（蛍光βおよびプラズモン散乱光γ）と、金属膜３０に向けて出射される第１の光δ１（および第１の光δ１と同じ波長の光δ’（後述））とに対して透明な材料からなることが好ましい。枠体４２の材料の例には、ガラスおよび樹脂が含まれる。当該樹脂の例には、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）が含まれる。また、上記の光に対して透明であれば、枠体４２の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。枠体４２は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。
【００３５】
液体注入部被覆フィルム４３は、ピペットチップ１３４を挿入可能であり、かつピペットチップ１３４を挿入した際には、ピペットチップ１３４の外周に隙間なく密着することが可能なフィルムである。たとえば、液体注入部被覆フィルム４３は、弾性フィルムおよび粘着フィルムの２層フィルムである。液体注入部被覆フィルム４３には、ピペットチップ１３４を挿入するための微細な貫通孔を設けられていてもよい。本実施の形態では、液体注入部被覆フィルム４３に外径が１.２ｍｍのピペットチップ挿入用貫通孔４８が設けられている。
【００３６】
前述のとおり、液体貯留部被覆フィルム４４は、通気孔４７を有する。液体貯留部被覆フィルム４４の構成は、特に制限されない。たとえば、液体貯留部被覆フィルム４４は、前述の液体注入部被覆フィルム４３と同様の２層フィルムであってもよい。
【００３７】
前述のとおり、本実施の形態では、測定チップ１０および液体チップ５０は、一体化されている（図１参照）。より具体的には、枠体４２および液体チップ５０が一体化されている。液体チップ５０は、液体を収容する容器である。また、液体チップ５０は、分注された検体を収容したり、液体を所期の濃度に希釈したりするために用いられてもよい。液体チップ５０は、液体を収容するためのウェルを有する。ウェルの開口部は、液体を収容した状態でフィルムなどにより閉塞されていてもよい。ウェルの開口部を閉塞するフィルムは、液体チップ５０の使用前にユーザーにより取り除かれてもよい。また、ピペットチップ１３４がフィルムを貫くことができる場合は、ウェルの開口部がフィルムで閉塞された状態で液体チップ５０が使用されてもよい。
【００３８】
液体チップ５０に収容される液体の例には、血液を含む検体や、蛍光物質で標識された捕捉体を含む標識液、洗浄液（緩衝液）、第１の光δ１に対して透明な液体（後述の参照液、第１の液）、溶血剤、色素を含む液体（後述の第２の液）およびこれらの希釈液が含まれる。
【００３９】
測定チップ１０および液体チップ５０は、通常、測定のたびに交換される。また、測定チップ１０は、好ましくは各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。
【００４０】
（ＳＰＦＳ装置）
次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光出射部１１０、シグナル検出部１２０、送液部１３０、搬送部１４０、光出射部１５０、光検出部１６０および制御処理部（処理部）１７０を有する。
【００４１】
励起光出射部１１０は、励起光α（特許請求の範囲では、「第８の光」と称している）を出射する。蛍光βの検出時には、励起光出射部１１０は、金属膜３０で表面プラズモン共鳴が発生するように、金属膜３０に対するＰ波を入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接もしくは間接に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０に表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。励起光出射部１１０は、光源ユニット１１１、角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。
【００４２】
第１の光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の光を、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。第１の光源ユニット１１１は、例えば、光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。
【００４３】
光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオードや水銀灯などのレーザー光源が含まれる。光源から出射される励起光αの波長は、例えば、４００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲内である。光源から出射される励起光αがビームでない場合は、励起光αは、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される励起光αが単色光でない場合は、励起光αは、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される励起光αが直線偏光でない場合は、励起光αは、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
【００４４】
ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。
【００４５】
コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。
【００４６】
バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源から出射された励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。
【００４７】
直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを直線偏光の光にする。
【００４８】
半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように光の偏光方向を調整する。
【００４９】
スリットおよびズーム手段は、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、光源から出射された励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
【００５０】
ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。
【００５１】
温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源から出射された励起光αの波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源から出射された励起光αの波長およびエネルギーを一定に制御する。
【００５２】
角度調整機構１１２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））に対する励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０の所定の位置に向けて所定の入射角で光を照射するために、光源から出射された励起光αの光軸とチップホルダー１４２とを相対的に回転させる。たとえば、角度調整機構１１２は、金属膜３０上において励起光αの光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を中心として光源ユニット１１１を回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。特に、回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの光源から出射された励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
【００５３】
前述のとおり、光源から金属膜３０に対して出射された励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光γの光量が最大となる角度が増強角である。光源から出射された励起光αの入射角を増強角またはその近傍の角度に設定することで、高強度の蛍光βおよびプラズモン散乱光γを検出することが可能となる。プリズム２０の材料および形状、金属膜３０の厚み、流路４１内の液体の屈折率などにより、光源から出射された励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路４１内の捕捉体の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。
【００５４】
第１の光源制御部１１３は、第１の光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、第１の光源ユニット１１１からの励起光αの出射を制御する。第１の光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００５５】
シグナル検出部１２０は、金属膜３０上に、検体中の被測定物質が存在する状態で、励起光出射部１１０がプリズム２０を介して金属膜３０に、表面プラズモン共鳴が生じる入射角で励起光αを照射したときに、測定チップ１０で生じるシグナル（例えば、蛍光β、反射光またはプラズモン散乱光γ）を検出する。被測定物質は、流路４１内で固定化されていてもよいし、固定化されていなくてもよい。本実施の形態では、シグナル検出部１２０は、金属膜３０上に、検体中に含まれていた被測定物質が固定化され、かつ流路４１内に検体が存在しない状態で、上記シグナルを検出する。シグナル検出部１２０は、検出したシグナル量（例えば、蛍光βの光量、反射光δ’の光量、またはプラズモン散乱光γの光量）を示す信号を制御処理部１７０に出力する。シグナル検出部１２０は、受光光学系ユニット１２１、位置切替え機構１２２および第１のセンサー制御部１２７を含む。
【００５６】
受光光学系ユニット１２１は、測定チップ１０の金属膜３０の法線上に配置される。受光光学系ユニット１２１は、第１のレンズ１２３、光学フィルター１２４、第２のレンズ１２５および第１の受光センサー１２６を含む。
【００５７】
位置切替え機構１２２は、光学フィルター１２４の位置を、受光光学系ユニット１２１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、第１の受光センサー１２６が蛍光βを検出するときには、光学フィルター１２４を受光光学系ユニット１２１の光路上に配置し、第１の受光センサー１２６がプラズモン散乱光γを検出するときには、光学フィルター１２４を受光光学系ユニット１２１の光路外に配置する。
【００５８】
第１のレンズ１２３は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光（シグナル）を集光する。第２のレンズ１２５は、例えば、結像レンズであり、第１のレンズ１２３で集光された光を第１の受光センサー１２６の受光面に結像させる。両レンズの間において、光は、略平行の光束となっている。
【００５９】
光学フィルター１２４は、第１のレンズ１２３および第２のレンズ１２５の間に配置されている。光学フィルター１２４は、蛍光検出時においては、光学フィルター１２４に入射する光のうち、蛍光成分のみを透過させ、励起光成分（プラズモン散乱光γ）を除去する。これにより、蛍光成分のみを第１の受光センサー１２６に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光βを検出することができる。光学フィルター１２４の種類の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１２４の例には、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルターと、所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターとが含まれる。
【００６０】
第１の受光センサー１２６は、蛍光βおよびプラズモン散乱光γを検出する。第１の受光センサー１２６は、微量の被測定物質からの微弱な蛍光βを検出することが可能な、高い感度を有する。第１の受光センサー１２６は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、シリコンフォトダイオード（ＳｉＰＤ）などである。
【００６１】
第１のセンサー制御部１２７は、第１の受光センサー１２６の出力値の検出や、当該出力値による第１の受光センサー１２６の感度の管理、適切な出力値を得るための第１の受光センサー１２６の感度の変更などを制御する。第１のセンサー制御部１２７は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００６２】
送液部１３０は、チップホルダー１４２に保持された測定チップ１０の流路４１内に、液体チップ５０内の液体を供給する。また、送液部１３０は、測定チップ１０の流路４１内から液体を除去する。さらに、送液部１３０は、液体チップ５０内の液体を分注し、かつ希釈する。送液部１３０は、ピペット１３１およびピペット制御部１３５を含む。
【００６３】
ピペット１３１は、シリンジポンプ１３２と、シリンジポンプ１３２に接続されたノズルユニット１３３と、ノズルユニット１３３の先端に装着されたピペットチップ１３４とを有する。シリンジポンプ１３２内のプランジャーの往復運動によって、ピペットチップ１３４における液体の吸引および排出が定量的に行われる。
【００６４】
ピペット制御部１３５は、シリンジポンプ１３２の駆動装置、およびノズルユニット１３３の移動装置を含む。シリンジポンプ１３２の駆動装置は、シリンジポンプ１３２のプランジャーを往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ノズルユニット１３３の移動装置は、例えば、ノズルユニット１３３を、垂直方向に自在に動かす。ノズルユニット１３３の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
【００６５】
ピペット制御部１３５は、シリンジポンプ１３２を駆動して、液体チップ５０から各種液体をピペットチップ１３４内に吸引させる。そして、ピペット制御部１３５は、ノズルユニット１３３を移動させて、測定チップ１０の流路４１内にピペットチップ１３４を挿入させるとともに、シリンジポンプ１３２を駆動して、ピペットチップ１３４内の液体を流路４１内に注入させる。また、液体の導入後、ピペット制御部１３５は、シリンジポンプ１３２を駆動して、流路４１内の液体をピペットチップ１３４内に吸引させる。このように流路４１内の液体を順次交換することによって、反応場において捕捉体と被測定物質を反応させたり（１次反応）、被測定物質と蛍光物質で標識された捕捉体とを反応させたりする（２次反応）。また、送液部１３０は、上記のように液体チップ５０内の液体を吸引したり、吐出したりすることで、検体を分注したり、希釈したりする。
【００６６】
搬送部１４０は、測定チップ１０を設置位置、検体中の被測定物質の量を示す測定値を取得するための第１の測定位置、ヘマトクリット値を取得するための第２の測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「設置位置」とは、測定チップ１０をＳＰＦＳ装置１００に設置するための位置である。また、「第１の測定位置」とは、励起光出射部１１０が測定チップ１０に向けて励起光αを出射したときに、測定チップ１０から放出されるシグナルをシグナル検出部１２０が検出する位置である。また、「第２の測定位置」とは、光出射部１５０が金属膜３０に向けて第１の光δ１を出射したときに、測定チップ１０内で反射した光δ’を光検出部１６０が検出する位置である。さらに、「送液位置」とは、送液部１３０が測定チップ１０の流路４１内に液体を供給するか、または測定チップ１０の流路４１内の液体を除去する位置である。
【００６７】
搬送部１４０は、搬送ステージ１４１およびチップホルダー１４２を含む。
【００６８】
搬送ステージ１４１は、チップホルダー１４２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１４１も、励起光αや、励起光αの反射光、蛍光β、プラズモン散乱光γ、第１の光δ１、第１の光δ１の反射光δ’などの光の光路を妨げない形状である。搬送ステージ１４１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。
【００６９】
チップホルダー１４２は、搬送ステージ１４１に固定されており、測定チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１４２の形状は、測定チップ１０を保持することができ、かつ励起光αや励起光αの反射光、蛍光β、プラズモン散乱光γ、第１の光δ１、第１の光δ１の反射光δ’などの光の光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１４２には、上記の光が通過するための開口が設けられている。
【００７０】
光出射部１５０は、赤血球が吸収する波長の光を含む第１の光δ１を出射する。本実施の形態では、光出射部１５０は、流路４１側から金属膜３０に向けて第１の光δ１を出射する。第１の光δ１は、赤血球に含まれるヘモグロビンが吸収する波長の光を含むことが好ましい。光出射部１５０は、第２の光源ユニット１５１および第２の光源制御部１５２を含む。
【００７１】
第２の光源ユニット１５１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の第１の光δ１を、金属膜３０に向けて出射する。第２の光源ユニット１５１は、例えば、光源、コリメーター、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。コリメーター、ＡＰＣ機構および温度調整機構については、第１の光源ユニット１１１のコリメーター、ＡＰＣ機構および温度調整機構と同様であるため、その説明を省略する。光源の温度変化による第１の光δ１の波長のばらつきを抑制する観点から、第２の光源ユニット１５１は、温度調整機構を有することが好ましい。
【００７２】
金属膜３０の外縁部よりも内側に第１の光δ１を照射して、第１の光δ１が金属膜３０以外の領域に照射されることによるエネルギー効率の低下を抑制する観点から、光源は、レーザー光源であることが好ましい。レーザー光源は、ＬＥＤのような指向性が低い光源と比較して、より小さい照射スポットで金属膜３０に第１の光δ１を照射することができる。光源は、例えば、レーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオードや水銀灯などのレーザー光源が含まれる。光出射部１５０からの第１の光δ１の中心波長は、例えば、５００〜６５０ｎｍである。光源から出射される第１の光δ１がビームでない場合は、第１の光δ１は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。
【００７３】
第２の光源制御部１５２は、第２の光源ユニット１５１に含まれる各種機器を制御して、第２の光源ユニット１５１からの第１の光δ１の出射を制御する。第２の光源制御部１５２は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００７４】
光検出部１６０は、第１の光δ１が測定チップ１０内で反射することで得られる光δ’を検出する。たとえば、流路４１内に検体が存在する状態では、光検出部１６０は、光出射部１５０が金属膜３０に向けて第１の光δ１を出射したときに、第１の光δ１が流路４１内の検体を透過し、金属膜３０で反射し、かつ流路４１内の検体を再度透過することで得られる第２の光δ２を検出する。光検出部１６０は、検出した光δ’の光量を示す信号を出力する。光検出部１６０は、第２の受光センサー１６１および第２のセンサー制御部１６２を含む。
【００７５】
第２の受光センサー１６１は、測定チップ１０内で反射した第１の光δ１である光δ’を検出する。第２の受光センサー１６１は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、シリコンフォトダイオード（ＳｉＰＤ）などである。
【００７６】
第２のセンサー制御部１６２は、第２の受光センサー１６１の出力値の検出や、当該出力値による第２の受光センサー１６１の感度の管理、適切な出力値を得るための第２の受光センサー１６１の感度の変更などを制御する。第２のセンサー制御部１６２は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００７７】
前述のとおり、図２は、実施の形態１に係る測定システム１におけるヘマトクリット値取得部の構成を示す断面模式図である。図２は、第１の光δ１の光軸と、第１の光δ１の測定チップ１０での反射光δ’の光軸とを含む平面（図１の紙面に対して垂直な面）に対して垂直な方向から見たときの図である。図２に示されるように、光出射部１５０（第２の光源ユニット１５１）および光検出部１６０（第２の受光センサー１６１）は、第１の光δ１の光軸と、第１の光δ１の反射光δ’の光軸とを含む平面が流路４１の長手方向に沿うように配置されていることが好ましい。これにより、流路４１の長手方向において、第１の光δ１の照射スポットの位置がずれたとしても、第１の光δ１が流路４１以外の領域に照射されることを抑制することができる。また、第１の光δ１が金属膜３０に対して垂直に入射した場合と比較して、第１の光δ１が金属膜３０に対して斜めから入射した場合には、金属膜３０上における第１の光δ１の照射スポットの形状は、一方向に伸びた形状となる。金属膜３０に対する第１の光δ１の入射角に応じて照射スポットが伸びる方向は、流路４１の長手方向に沿っていることが好ましい。これにより、照射スポットが伸びる方向が流路４１の短手方向に沿う場合と比較して、照射スポットの位置がずれたとしても、第１の光δ１が流路４１（金属膜３０）以外の領域に照射されるのを抑制することができる。なお、照射スポットの位置ずれの原因には、搬送ステージ１４１におけるチップホルダー１４２の位置決め誤差や、チップホルダー１４２に対する測定チップ１０の設置誤差などが含まれる。
【００７８】
制御処理部１７０は、角度調整機構１１２、第１の光源制御部１１３、位置切替え機構１２２、第１のセンサー制御部１２７、ピペット制御部１３５、搬送ステージ１４１、第２の光源制御部１５２および第２のセンサー制御部１６２を制御する。制御処理部１７０は、シグナル検出部１２０（第１の受光センサー１２６）および光検出部１６０（第２の受光センサー１６１）の検出結果を処理する処理部としても機能する。本実施の形態では、制御処理部１７０は、シグナル検出部１２０による蛍光βの検出結果に基づいて、検体中の被測定物質の量を示す測定値を決定する。また、制御処理部１７０は、光検出部１６０による第２の光δ２の検出結果に基づいて検体のヘマトクリット値を決定する。これとともに、制御処理部１７０は、ヘマトクリット値に基づいて上記測定値を補正する。これにより、制御処理部１７０は、血漿または血清中の被測定物質の量（濃度）を決定する。また、制御処理部１７０には、上記の検出結果を処理する際に使用される所定の情報（例えば、種々の変換係数、検量線に関するデータ）などがあらかじめ記録されていてもよい。本実施の形態では、制御処理部１７０には、ヘマトクリット関連値（後述）をヘマトクリット値に変換するための係数があらかじめ記録されている。制御処理部１７０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００７９】
（ＳＰＦＳ装置における光路）
図１に示されるように、励起光αは、入射面２１からプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、金属膜３０に全反射角度（ＳＰＲが生じる角度）で入射する。このように、金属膜３０に対して励起光αをＳＰＲが生じる角度で照射することで、金属膜３０上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜３０上に存在する被測定物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光βが放出される。ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光物質から放出された蛍光βの光量（強度）を検出する。なお、特に図示していないが、金属膜３０での励起光αの反射光は、出射面２３でプリズム２０外に出射する。
【００８０】
また、図２に示されるように、本実施の形態では、第１の光δ１は、流路蓋４０の枠体４２を介して流路４１（測定チップ１０）内に入射する。第１の光δ１は、測定チップ１０内で反射して光δ’となる。光δ’は、流路蓋４０の枠体４２を介して流路４１（測定チップ１０）外に出射される。ＳＰＦＳ装置１００は、測定チップ１０から出射された光δ’の光量（強度）を検出する。
【００８１】
本明細書において、測定チップ１０内での第１の光δ１の反射光δ’には、流路４１内に存在する液体の種類または測定チップ１０内の反射位置に応じて異なる符号が付されている。流路４１内に検体が存在する場合、第１の光δ１は、流路４１内の検体を透過し、金属膜３０で反射し、かつ流路４１内の検体を再度透過して第２の光δ２となる。第１の光δ１に対して透明な参照液で、流路４１内が満たされている場合、第１の光δ１は、流路４１内の参照液を透過し、金属膜３０で反射し、かつ流路４１内の参照液を再度透過して第７の光δ７となる。
【００８２】
（測定システムの動作手順）
次に、実施の形態１に係る測定システム１の動作手順（実施の形態１に係る測定方法）について説明する。図３は、測定システム１の動作手順の一例を示すフローチャートである。図４は、図３に示される光学ブランク値の測定工程（工程Ｓ１１３）内の工程を示すフローチャートである。本実施の形態では、検体中の被測定物質の量を示す測定値として、蛍光βの光量である蛍光値が測定される。
【００８３】
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００の設置位置に配置されたチップホルダー１４２に、測定チップ１０を設置する。測定チップ１０の金属膜３０上に保存試薬が存在する場合は、捕捉体が適切に被測定物質を捕捉できるように、金属膜３０上を洗浄して保存試薬を除去する。
【００８４】
次いで、検体を分注し、希釈する（工程Ｓ１１１）。具体的には、制御処理部１７０は、ピペット制御部１３５を制御して、液体チップ５０内の検体を、測定値（蛍光値）測定用の第１の検体と、ヘマトクリット値測定用の第２の検体とに分ける。第１の検体および第２の検体は、それぞれ液体チップ５０の空のウェルに収容される。本工程Ｓ１１１では、測定精度および測定感度の観点から、第１の検体をさらに希釈する。第１の検体を希釈しないと、検体中の不純物が捕捉体に吸着（非特異吸着）する量が増加して、ノイズが増加してしまい、結果として、測定精度を悪化させてしまうおそれがある。また、捕捉体の量と比較して被測定物質の量が多すぎる場合、捕捉体で捕捉できる被測定物質の量が飽和してしまい、高濃度な検体の濃度を特定することができなくなってしまう。希釈液としては、例えば、生理食塩水が使用され得る。第１の検体は、例えば、２〜５０倍に希釈される。
【００８５】
次いで、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する（工程Ｓ１１２）。具体的には、制御処理部１７０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を設置位置から送液位置に移動させる。制御処理部１７０は、ピペット制御部１３５を制御して、液体チップ５０内の励起光αに対して透明な参照液（後述）を流路４１内に提供する。制御処理部１７０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を送液位置から第１の測定位置に移動させる。制御処理部１７０は、位置切替え機構１２２を制御して、光学フィルター１２４を受光光学系ユニット１２１の光路外に移動させる。制御処理部１７０は、第１の光源制御部１１３、角度調整部１１２および第１のセンサー制御部１２７を制御して、第１の光源ユニット１１１から励起光αを、金属膜３０の所定の位置に、金属膜３０に対する励起光αの入射角度を走査しながら照射するとともに、第１の受光センサー１２６でプラズモン散乱光γを検出する。これにより、制御処理部１７０は、励起光αの入射角と、プラズモン散乱光γの光量との関係を含むデータを得る。得られたデータは、制御処理部１７０に記憶される。そして、制御処理部１７０は、データを解析して、プラズモン散乱光γの光量が最大となる入射角である増強角を決定する。最後に、制御処理部１７０は、角度調整部１１２を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を決定した増強角に設定する。
【００８６】
なお、増強角は、プリズム２０の素材および形状、金属膜３０の厚み、流路４１内の液体の屈折率などにより決まるが、流路４１内の捕捉体の種類および量、プリズム２０の形状誤差などの各種要因によりわずかに変動する。このため、測定を行うたびに増強角を決定することが好ましい。増強角は、０．１°程度のオーダーで決定される。
【００８７】
次いで、光学ブランク値を測定する（工程Ｓ１１３）。本実施の形態において、光学ブランク値は、蛍光値（測定値）の決定に使用される第１のブランク値と、ヘマトクリット値の決定に使用される第２のブランク値とを含む。ここで、「第１のブランク値」とは、参照液が流路４１内に存在する状態で、測定チップ１０の上方に放出される背景光の光量を意味する。また、「第２のブランク値」とは、参照液が流路４１内に存在する状態で、光出射部１５０が金属膜３０に向けて第１の光δ１を出射したときに、第１の光δ１が流路４１内の参照液を透過し、金属膜３０で反射し、かつ流路４１内の参照液を再度透過することで得られる第７の光δ７の光量を意味する。
【００８８】
本実施の形態では、参照液は、励起光αおよび第１の光δ１に対して透明である。なお、参照液の屈折率は、検体の屈折率と同じか同程度であることが好ましい。これにより、流路４１内に参照液が存在する場合と、流路４１内に検体が存在する場合とにおいて、枠体４２の流路溝（凹部）の底面（流路４１の天面）における第１の光δ１の反射率を同じか同程度にすることができるとともに、金属膜３０の表面における光δの反射率を同じか同程度にすることができる。
【００８９】
図４に示されるように、工程Ｓ１１３では、まず、第１のブランク値を測定する（工程Ｓ１１３１）。制御処理部１７０は、位置切替え機構１２２を制御して、光学フィルター１２４を受光光学系ユニット１２１の光路上に移動させる。次いで、制御処理部１７０は、第１の光源制御部１１３を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に向けて第１の光源ユニット１１１から励起光αを出射させる。これと同時に、制御処理部１７０は、第１の光センサー制御部１２７を制御して、第１の受光センサー１２６で蛍光βとほぼ同じ波長の光の光量を検出する。これにより、第１の受光センサー１２６は、蛍光値の測定（工程Ｓ１１６）においてノイズとなる光の光量（第１のブランク値）を測定することができる。第１のブランク値は、制御処理部１７０に送信され、記録される。
【００９０】
次いで、第２のブランク値を測定する（工程Ｓ１１３２）。制御処理部１７０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を第１の測定位置から第２の測定位置に移動させる。次いで、制御処理部１７０は、第２の光源制御部１５２を制御して、第２の光源ユニット１５１から金属膜３０に第１の光δ１を照射させる。これと同時に、制御処理部１７０は、第２の光センサー制御部１６２を制御して、第２の受光センサー１６１で、金属膜３０で反射した第７の光δ７を検出する。これにより、第２の受光センサー１６１は、ヘマトクリット値の測定においてノイズとなる光の光量（第２のブランク値）を測定することができる。第２のブランク値は、制御処理部１７０に送信され、記録される。なお、第２のブランク値は、下記式（１）で表される参照液の吸光度ＯＤ１として記録されてもよい。
【数１】
2018034143.tif 000003
［上記式（１）において、ＯＤ１は参照液の吸光度であり、Ｉ０は第１の光δ１の光量であり、Ｉ１は第７の光δ７の光量である。］
【００９１】
次いで、検体中の被測定物質と金属膜３０上の捕捉体とを反応させる（１次反応；工程Ｓ１１４）。具体的には、制御処理部１７０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を第２の測定位置から送液位置に移動させる。この後、制御処理部１７０は、ピペット制御部１３５を制御して、流路４１内の参照液を排出し、工程Ｓ１１１において希釈された第１の検体を流路４１内に提供する。これにより、検体中に被測定物質が存在する場合には、被測定物質の少なくとも一部は金属膜３０上の捕捉体により捕捉される。なお、第１の検体は、溶血していない。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄して、捕捉体に捕捉されなかった物質を除去する。なお、被測定物質の例には、トロポニン、ミオグロビンおよびクレアチンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）が含まれる。
【００９２】
次いで、反射膜３０上の捕捉体に捕捉された被測定物質を蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ１１５）。具体的には、制御処理部１７０は、ピペット制御部１３５を制御して、液体チップ５０内の蛍光標識液を流路４１内に提供する。これにより、被測定物質を蛍光物質で標識することができる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された抗体（２次抗体）を含む緩衝液である。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄し、遊離の蛍光物質などを除去する。
【００９３】
次いで、反応場の被測定物質を標識している蛍光物質から放出される蛍光βを検出して、蛍光値を測定する（工程Ｓ１１６）。具体的には、制御処理部１７０は、ピペット制御部１３５を制御して、液体チップ５０内の測定用の緩衝液を流路４１内に提供する。制御処理部１７０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を送液位置から第１の測定位置に移動させる。この後、制御処理部１７０は、第１の光源制御部１１３を制御して、検体中に含まれていた被測定物質が固定化され、かつ検体が存在しない状態で、励起光出射部１１０の第１の光源ユニット１１１から励起光αを、プリズム２０を介して捕捉体が固定化されている領域に対応する金属膜３０の裏面に、表面プラズモン共鳴が生じる入射角で照射する。これとともに、制御処理部１７０は、第１のセンサー制御部１２７を制御して、測定チップ１０内で生じる蛍光β（シグナル）を第１の受光センサー１２６で検出する。これにより、第１の受光センサー１２６は、蛍光βの光量である蛍光値（測定値）を取得する。蛍光値は、制御処理部１７０に送信され、記録される。なお、本明細書中、「検体が存在しない状態」とは、流路４１内から検体を除去する操作が行われた状態をいう。すなわち、流路４１内に検体が実質的に存在していなければよく、流路４１内に除去しきれなかった検体がわずかに残存していてもよい。
【００９４】
次いで、工程Ｓ１１１において分注された第２の検体中の血液を溶血するとともに、希釈する（工程Ｓ１１７）。制御処理部１７０は、ピペット制御部１３５を制御して、液体チップ５０内に収容されている第２の検体中に、他の液体チップ５０内に収容されている溶血剤を提供する。これにより、第２の検体中の血液を溶血するとともに、希釈することができる。このとき、第２の検体は、例えば、１〜２０倍に希釈される。このとき、第２の検体の希釈倍率が１倍の場合、第２の検体は希釈されていないことを示している。希釈倍率が大きいほど、検体の吸収光量は少なくなる。このため、希釈倍率が大きすぎると、十分な測定分解能が得られなくなる。
【００９５】
次いで、ヘマトクリット関連値を取得する（工程Ｓ１１８）。具体的には、制御処理部１７０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を第１の測定位置から送液位置に移動させる。制御処理部１７０は、ピペット制御部１３５を制御して、液体チップ５０中の血液が溶血した状態の検体を流路４１内に提供する。次いで、制御処理部１７０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を送液位置から第２の測定位置に移動させる。次いで、検体が流路４１内に存在する状態で、制御処理部１７０は、光出射部１５０の第２の光源制御部１５２を制御して、第２の光源ユニット１５１から金属膜３０に第１の光δ１を照射させる。これと同時に、制御処理部１７０は、第２のセンサー制御部１６２を制御して、第２の受光センサー１６１で、流路４１内の検体を透過し、金属膜３０で反射し、かつ流路４１内の検体を再度透過した第２の光δ２を検出する。これにより、第２の受光センサー１６１は、第２の光δ２の光量を測定する。測定値は、制御処理部１７０に送信され、記録される。なお、第２の光δ２の光量は、下記式（２）で表される検体の吸光度ＯＤ２として記録されてもよい。
【数２】
2018034143.tif 000004
［上記式（２）において、ＯＤ２は検体の吸光度であり、Ｉ０は第１の光δ１の光量であり、Ｉ２は第２の光δ２の光量である。］
【００９６】
検体の吸光度ＯＤ２は、検体による光の吸収に起因するシグナル成分と、それ以外の要因に起因するノイズ成分（第２のブランク値）とを含む。したがって、制御処理部１７０は、工程Ｓ１１８で得られた検体の吸光度ＯＤ２から、工程Ｓ１１３２で得られたノイズ成分（第２のブランク値）を引くことで、シグナル成分を算出することができる。制御処理部１７０は、本工程Ｓ１１８で得られた測定値（第２の光δ２の光量または検体の吸光度ＯＤ２）と、工程Ｓ１１３２で得られた測定値（第７の光δ７の光量または参照液の吸光度ＯＤ１）とに基づいて、下記式（３）で表されるヘマトクリット関連値Ｈｃｔ’を算出する。
【数３】
2018034143.tif 000005
［上記式（３）において、Ｈｃｔ’はヘマトクリット関連値であり、Ｉ１は第７の光δ７の光量であり、Ｉ２は第２の光δ２の光量である。］
【００９７】
なお、検体（ヘモグロビン）の吸光度は、第１の光δ１の波長に応じて変化する。第１の光δ１の波長を安定させて、高精度に吸光度を測定する観点から、光出射部１５０の光源の温度を一定に保たれるように調整することが好ましい。
【００９８】
次いで、ヘマトクリット値を決定する（工程Ｓ１１９）。制御処理部１７０は、光検出部１６０による第２の光δ２の検出結果に基づいて検体のヘマトクリット値を決定する。本実施の形態では、制御処理部１７０は、制御処理部１７０にあらかじめ記録されている補正係数を、工程Ｓ１１８で得られたヘマトクリット関連値に掛けることにより、ヘマトクリット値Ｈｃｔを算出する。
【００９９】
なお、前述のとおり、吸光度は、光出射部１５０から出射される第１の光δ１の波長に応じて変化する。このため、より正確なヘマトクリット値を得る観点からは、第１の光δ１の波長に基づいて、ヘマトクリット値を補正することが好ましい。たとえば、第１の光δ１の波長の基準値を５２０ｎｍとしてヘマトクリット値を算出した場合を考える。この場合、光検出部１６０が検出した第２の光δ２の波長が５３０ｎｍであったときは、測定値と基準値とのずれ量（１０ｎｍ）に相当する赤血球の吸収率（吸光量）のずれ量を考慮して、第１の光δ１の波長が５２０ｎｍのときの値となるようにヘマトクリット値Ｈｃｔを補正すればよい。
【０１００】
最後に、ヘマトクリット値に基づいて測定値を補正する（工程Ｓ１２０）。蛍光値は、被測定物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光成分（シグナル成分）と、蛍光物質以外の要因に起因するノイズ成分（第１のブランク値）とを含む。したがって、制御処理部１７０は、工程Ｓ１１６で得られた蛍光値から、工程Ｓ１１３１で得られた第１のブランク値を引くことで、検体中の被測定物質の量を示す測定値（シグナル成分）を算出することができる。さらに、制御処理部１７０は、算出された測定値に以下の式（４）で表される変換係数ｃを掛けることで、算出された測定値を血漿中の被測定物質の量に変換する。
【数４】
2018034143.tif 000006
［上記式（４）において、Ｈｃｔはヘマトクリット値（０〜１００％）であり、ｄｆは希釈液の希釈倍率である。］
【０１０１】
以上の手順により、血漿中の被測定物質の量を決定することができる。
【０１０２】
なお、ヘマトクリット値を高精度に測定する観点から、第２のブランク値の測定（工程Ｓ１１３２）は、蛍光値の測定（工程Ｓ１１６）の後に行われてもよい。これにより、第２のブランク値の測定（工程Ｓ１１３２）と、ヘマトクリット関連値の取得（工程Ｓ１１８）との時間間隔を短くして、光出射部１５０の光源のパワーの変動や、光出射部１５０の温度変化に起因する第１の光δ１の波長の変動などの影響を小さくすることができる。さらに、１次反応および２次反応に起因して、金属膜３０の表面における第１の光δ１の散乱状態が変化することも考えられるが、１次反応および２次反応の後に第２のブランク値の測定（工程Ｓ１１３２）と、ヘマトクリット関連値の取得（工程Ｓ１１８）とを行うことで、上記の散乱状態の変化の影響が及ばない。このような観点から、蛍光値の測定（工程Ｓ１１６）の後に第２のブランク値の測定（工程Ｓ１１３２）を行うことは好ましい。
【０１０３】
また、入射角を増強角に設定する工程（工程Ｓ１１２）、光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ１１３）および１次反応を行う工程（工程Ｓ１１４）をこの順番に行う態様について説明した。しかし、本発明に係る測定方法および測定装置では、これらの順番に限定されない。たとえば、１次反応を行った後に入射角を増強角に設定してもよいし、光学ブランク値を測定した後に１次反応を行ってもよい。
【０１０４】
また、１次反応を行う工程（工程Ｓ１１４）の後に、２次反応を行う工程（工程Ｓ１１５）を行った（２工程方式）。しかしながら、被測定物質を蛍光物質で標識するタイミングは、特に限定されない。たとえば、測定チップ１０の流路４１内に試料液を導入する前に、試料液に標識液を添加して被測定物質を予め蛍光物質で標識しておいてもよい。また、測定チップ１０の流路内に試料液と標識液を同時に注入してもよい。前者の場合は、測定チップ１０の流路４１内に試料液を注入することで、蛍光物質で標識されている被測定物質が捕捉体により捕捉される。後者の場合は、被測定物質が蛍光物質で標識されるとともに、被測定物質が捕捉体により捕捉される。いずれの場合も、測定チップ１０の流路４１内に試料液を導入することで、１次反応および２次反応の両方を完了することができる（１工程方式）。
【０１０５】
（効果）
本実施の形態では、液体を収容するための流路４１が空洞となっている。このため、本実施の形態に係る測定方法では、検体を試験紙に吸収させた状態で光学測定を行う従来の測定方法のように、試験紙による光の散乱が生じない。また、本実施の形態に係る測定方法では、色素による呈色反応を利用している従来の測定方法のように、色素による光の吸収も生じない。これらの結果として、本実施の形態に係る測定方法では、検体のヘマトクリット値を高精度に測定することができ、血漿中の被測定物質の量を高精度に決定することができる。
【０１０６】
また、本実施の形態に係る測定方法では、金属膜３０によって第２の光δ２となる光を流路４１内において往復させる。これにより、金属膜３０による反射を利用しない場合と比較して、第２の光δ２となる光の流路４１内の光路長を長くすることができる。この結果として、検体による光の吸収量を多くして、ヘマトクリット値を高精度に測定できる。これにより、血漿中の被測定物質の量を高精度に決定することができる。また、従来の測定方法では、試験紙による散乱によって、検体中の光の光路長がばらついてしまうのに対して、本実施の形態に係る測定方法では、流路４１は、形状が一定の空洞となっているため、検体中の光の光路長が安定する。このような観点からも、ヘマトクリット値を高精度に測定でき、血漿中の被測定物質の量を高精度に決定することができる。
【０１０７】
また、本実施の形態に係る測定方法では、ＳＰＦＳを利用して検体に含まれる被測定物質の量を示す測定値（蛍光値）を取得している。ＳＰＲが生じるように励起光αが金属膜３０に照射されたとき、局在場光は、金属膜３０の表面から励起光αの波長程度離れた領域にしか及ばない。すなわち、蛍光値を測定する観点からは、当該領域を超えて流路４１の高さを大きくする必要性は小さい。一方、流路４１の高さを大きくすることにより、流路４１内に混入し得る不純物の量が増えてしまい、蛍光値の測定精度が低下してしまう可能性もある。このような観点からは、流路４１の高さは、小さいことが好ましい。しかしながら、流路４１の高さが小さいと、流路４１内の光の光路長も短くなってしまうため、検体による吸光量が小さくなり、ヘマトクリット値を高精度に測定できないとも考えられる。したがって、検体による吸光量を十分に確保しつつ、ヘマトクリット値を高精度に測定する観点からは、流路４１の高さは、大きいことが好ましい。この点に関して、本実施の形態に係る測定方法では、流路４１の高さは小さいものの、金属膜３０を設けることによって検体中の光の光路長を長くしている。したがって、流路４１内に混入し得る不純物の量を抑制しつつ、検体による吸光量も確保することができる。結果として、蛍光値およびヘマトクリット値をともに高精度に測定することができる。
【０１０８】
また、本実施の形態に係る測定方法では、工程Ｓ１１３２において第２のブランク値を測定し、ノイズ成分の影響を除去することができる（工程Ｓ１１８）。このため、ヘマトクリット値をより高精度に測定することができる。
【０１０９】
さらに、上記実施の形態では、１次反応（工程Ｓ１１４）の前に第２のブランク値の測定（工程Ｓ１１３２）を行った。このため、仮に、１次反応の後の流路４１内の洗浄が十分でなく、流路４１内に血液が残存してしまったとしても、第２のブランク値の測定に、血液の残存による影響が及ばないため、ヘマトクリット値を高精度に測定することができる。このような観点から、１次反応（工程Ｓ１１４）の前に第２のブランク値の測定（工程Ｓ１１３２）を行うことは好ましい。
【０１１０】
さらに、本実施の形態では、血液が溶血した状態の検体を透過した第２の光δ２の検出結果に基づいて、ヘマトクリット値を決定した。血液を溶血させることにより、赤血球による光の散乱の影響を小さくすることができる。この結果として、ヘマトクリット値をより高精度に測定でき、血漿中の被測定物質の量をより高精度に決定することができる。一方で、蛍光値の測定に使用される第１の検体は、血液を溶血させていない。これにより、溶血によって赤血球中のプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）が赤血球外に流れ出し、被測定物質を分解してしまうことを防止し、蛍光値をより高精度に測定することができる。
【０１１１】
［実施の形態２］
実施の形態２では、流路の高さに基づいてヘマトクリット値を補正する。実施の形態２に係る測定システムおよび測定装置の構成は、光検出部を除いて実施の形態１に係る測定システムおよび測定装置と同じ構成であるため、同じ構成要素については、同じ符号を付してその説明を省略する。
【０１１２】
（測定システムおよびＳＰＦＳ装置）
図１は、実施の形態２に係る測定システム２の構成を示す模式図である。図１に示されるように、測定システム２は、測定チップ１０およびＳＰＦＳ装置２００を有する。ＳＰＦＳ装置２００は、励起光出射部１１０、シグナル検出部１２０、送液部１３０、搬送部１４０、光出射部１５０、光検出部２６０および制御処理部（処理部）２７０を有する。実施の形態２では、光出射部１５０および光検出部２６０は、検体のヘマトクリット値を取得するためのヘマトクリット値取得部を構成する。
【０１１３】
光検出部２６０は、測定チップ１０内での第１の光δ１の反射光である光δ’を検出する。光検出部２６０は、検出した光δ’の光量を示す信号を出力する。光検出部２６０は、第２の受光センサー２６１および第２のセンサー制御部１６２を含む。
【０１１４】
第２の受光センサー２６１は、測定チップ１０内での第１の光δ１の反射光である光δ’を受光するためのアレイセンサーである。第２の受光センサー２６１の種類の例には、１次元撮像素子（ラインセンサー）または２次元撮像素子（イメージセンサー）である。第２の受光センサー２６１の例には、電荷結合素子（ＣＣＤ）および相補型金属酸化膜半導体素子（ＣＭＯＳ）が含まれる。
【０１１５】
制御処理部２７０は、流路４１の高さを測定するための制御が加わる点を除いて、実施の形態１に係る制御処理部１７０と同様であるため、その説明を省略する。
【０１１６】
（測定システムの動作手順）
次に、実施の形態２に係る測定システム２の動作手順（実施の形態２に係る測定方法）について説明する。図５は、測定システム２の動作手順の一例を示すフローチャートである。
【０１１７】
実施の形態１に係る測定方法と同様にして、測定の準備（工程Ｓ１１０）から検体の分注および希釈（工程Ｓ１１１）までの工程を行う。
【０１１８】
次いで、流路４１の高さを測定する（工程Ｓ２００）。具体的には、制御処理部２７０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を設置位置から第２の測定位置に移動させる。この後、制御処理部２７０は、第２の光源制御部１５２を制御して、第２の光源ユニット１５１から金属膜３０に向けて第１の光δ１を出射させる。これと同時に、制御処理部２７０は、第２のセンサー制御部１６２を制御して、流路４１内が空洞である第１の状態で、第１の光δ１が流路４１内を通過し、金属膜３０で反射し、かつ流路４１内を再度通過することで得られる第３の光δ３と、第１の光δ１が流路４１の、金属膜３０に対向する面（流路４１の天面）で反射することで得られる第４の光δ４と、第１の光δ１が枠体４２の天面で反射することで得られる第９の光δ９とを第２の受光センサー（アレイセンサー）２６１により、それぞれ区別して検出する。第３の光δ３の検出結果と、第４の光δ４の検出結果とは、制御処理部２７０に送信され、記録される。
【０１１９】
次いで、制御処理部２７０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を第２の測定位置から送液位置に移動させる。制御処理部２７０は、ピペット制御部１３５を制御して、液体チップ５０内に収容されている第１の光δ１に対して透明な第１の液を提供する。第１の液の屈折率は、空気の屈折率（１．０）より大きく、かつ流路蓋４０（枠体４２）の屈折率（１．５）に近いほど好ましい。制御処理部２７０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を送液位置から第２の測定位置に再度移動させる。次いで、制御処理部２７０は、第２の光源ユニット１５１から金属膜３０に第１の光δ１を照射させる。これと同時に、制御処理部２７０は、第２のセンサー制御部１６２を制御して、第１の液で、流路４１内が満たされている第２の状態で、第１の光δ１が流路４１内の第１の液を透過し、金属膜３０で反射し、かつ流路４１内の第１の液を再度透過することで得られる第５の光δ５と、第１の光δ１が枠体４２の天面で反射することで得られる第９の光δ９とを第２の受光センサー（アレイセンサー）２６１により検出する。第５の光δ５の検出結果は、制御処理部２７０に送信され、記録される。
【０１２０】
図６Ａ、Ｂは、流路４１の高さの測定について説明するための図であり、実施の形態２に係る測定システム２におけるヘマトクリット値取得部の構成を示す模式図である。図６Ａ、Ｂにおいては、測定チップ１０内の光路を示すために、測定チップ１０の断面へのハッチングを省略している。なお、図６Ａは、流路４１内が空洞である状態（第１の状態）を示しており、図６Ｂは、第１の液で流路４１内が満たされている状態（第２の状態）を示している。
【０１２１】
まず、第１の状態における第３の光δ３、第４の光δ４および第９の光δ９の検出について説明する。図６Ａに示されるように、第２の光源ユニット１５１から出射された第１の光δ１は、金属膜３０の表面（流路４１の底面）だけではなく、枠体４２の天面と、枠体４２の凹部の底面（流路４１の天面）とでも反射する。異なる位置で反射した光δ’（第３の光δ３、第４の光δ４および第９の光δ９）は、第２の受光センサー２６１の異なる位置に到達する。第９の光δ９、第４の光δ４および第３の光δ３は、この順で光出射部１５０から離れた位置の、第２の受光センサー２６１（アレイセンサー）の受光面に到達する。このように、第２の受光センサー２６１は、測定チップ１０内における反射位置が異なる光の光量をそれぞれ区別して測定することができる。
【０１２２】
次いで、第２の状態における第５の光δ５および第９の光δ９の検出について説明する。図６Ｂに示されるように、第２の光源ユニット１５１から出射された第１の光δ１は、金属膜３０の表面（流路４１の底面）だけでなく、枠体４２の天面でも反射する。第１の状態の場合と比較して、第２の状態においては、枠体４２の凹部の底面（流路４１の天面）で、光が反射しない。これは、枠体４２の屈折率と同程度の屈折率を有する第１の液が流路４１内に満たされているためである。
【０１２３】
そして、第１の状態における第３の光δ３、第４の光δ４および第９の光δ９の検出結果と、第２の状態における第５の光δ５および第９の光δ９の検出結果とに基づいて、流路４１の高さを決定する。たとえば、第１の状態における検出結果と、第２の状態における検出結果とに基づいて下記の表１に示されるデータが得られたとする。表１では、反射位置Ｎｏ．、各反射位置での反射率と、第１の状態における結果および第２の状態で得られる結果（反射率）の差分とを示している。
【０１２４】
【表１】
2018034143.tif 000007
【０１２５】
第１の状態および第２の状態において、反射位置１での反射率は、互いに同じであり、４％であった。また、反射位置３での反射率も、第１の状態および第２の状態において、互いに同じであり、６０％であった。一方で、第１の状態における反射位置２での反射率と、第２の状態における反射位置２での反射率とは、互いに異なっていた。
【０１２６】
流路４１の底面以外の位置における反射率と比較して、流路４１の底面での反射率は大きい。すなわち、反射率が大きい反射位置３は、流路４１の底面であると決定され得る。このように、流路４１の底面の位置は、高精度に検出され得る。
【０１２７】
これに対して、流路４１の天面での反射率と枠体４２の天面での反射率とは、互いに同程度であり、かつ小さい。このため、流路４１の天面の位置および枠体４２の天面の位置は、高精度に検出され難い。そこで、制御処理部２７０は、第１の状態における検出結果と、第２の状態における検出結果との差分を取ることにより、反射位置２で反射した第４の光δ４のピークのみを抽出し、反射位置２を決定することができる。前述のとおり、第１の状態および第２の状態において屈折率が変化する反射位置２は、流路４１の天面と決定され得る。
【０１２８】
反射位置２が決定されると、残りの反射位置１も決定され得る。第１の状態および第２の状態において、屈折率が変化しない反射位置１は、枠体４２の天面であると決定され得る。
【０１２９】
したがって、制御処理部２７０は、流路４１の底面の位置と、流路４１の天面の位置とに基づいて、流路４１の高さを決定することができる。
【０１３０】
次いで、実施の形態１に係る測定方法と同様にして、入射角の増強角への設定（工程Ｓ１１２）からヘマトクリット関連値の取得（工程Ｓ１１８）までの工程を行う。
【０１３１】
次いで、ヘマトクリット値を決定する（工程Ｓ２１９）。制御処理部２７０は、光検出部１６０による第２の光δ２の検出結果に基づいて検体のヘマトクリット値を決定する。本実施の形態では、制御処理部２７０は、制御処理部２７０にあらかじめ記録されている補正係数を、工程Ｓ１１８で得られたヘマトクリット関連値に掛けることにより、ヘマトクリット値を算出する。さらに、本実施の形態では、工程Ｓ２００で測定された流路４１の高さに基づいて、ヘマトクリット値を補正する。たとえば、流路４１の高さの基準値を１００μｍとしてヘマトクリット値を算出した場合を考える。この場合、流路４１の高さの測定値が１１０μｍであったときは、測定値と基準値とのずれ量（１０μｍ）、つまり流路４１の高さのずれ量に相当する検体の吸収率（吸光量）の変化量を考慮して、流路４１の高さが１００μｍのときの値となるようにヘマトクリット値を補正すればよい。
【０１３２】
最後に、実施の形態１での測定値の補正（工程Ｓ１２０）と同様にして、ヘマトクリット値に基づいて測定値を補正する。実施の形態２では、制御処理部２７０は、ヘマトクリット値として、工程Ｓ２１９で得られた補正後のヘマトクリット値を使用する。
【０１３３】
以上の手順により、血漿中の被測定物質の量（濃度）を決定することができる。
【０１３４】
（効果）
実施の形態２では、実施の形態１の効果に加えて、より高精度にヘマトクリット値を測定し、より高精度に血漿中の被測定物質の量を決定することができる。実施の形態２では、流路４１の高さに基づいてヘマトクリット値を補正することで、測定チップ１０の製造時における寸法誤差の影響を取り除くことができる。これにより、測定チップ１０に要求される寸法精度を低減することができる。
【０１３５】
［実施の形態３］
実施の形態３でも、流路の高さに基づいてヘマトクリット値を補正する。実施の形態３に係る測定システムおよび測定装置は、測定装置の動作手順（測定方法）を除いて、実施の形態１に係る測定システムおよび測定装置と同じであるため、同じ構成要素については、同じ符号を付してその説明を省略する。
【０１３６】
（測定システムおよびＳＰＦＳ装置）
図１は、実施の形態３に係る測定システム３の構成を示す模式図である。図１に示されるように、測定システム３は、測定チップ１０およびＳＰＦＳ装置３００を有する。ＳＰＦＳ装置３００は、励起光出射部１１０、シグナル検出部１２０、送液部１３０、搬送部１４０、光出射部１５０、光検出部１６０および制御処理部（処理部）３７０を有する。
【０１３７】
制御処理部３７０は、流路４１の高さを測定するための制御が加わる点を除いて、実施の形態１に係る制御処理部１７０と同様であるため、その説明を省略する。なお、制御処理部３７０には、後述の第６の光δ６の検出結果に基づいて、流路４１の高さを決定するための検量線に関するデータが記録されている。
【０１３８】
（ＳＰＦＳ装置の動作手順）
実施の形態３に係る測定システム３の動作手順（実施の形態３に係る測定方法）について説明する。図７は、測定システム３の動作手順の一例を示すフローチャートである。
【０１３９】
実施の形態１に係る測定方法と同様にして、測定の準備（工程Ｓ１１０）からヘマトクリット関連値の取得（工程Ｓ１１８）までの工程を行う。
【０１４０】
次いで、流路４１の高さを測定する（工程Ｓ３００）。具体的には、制御処理部３７０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を第２の測定位置から送液位置に移動させる。この後、制御処理部３７０は、ピペット制御部１３５を制御して、流路４１内の液体を排出し、液体チップ５０内に収容されている、第１の光δ１の少なくとも一部の波長の光を吸収する色素を含む第２の液を提供する。制御処理部３７０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を送液位置から第２の測定位置に再度移動させる。次いで、制御処理部３７０は、第２の光源ユニット１５１から金属膜３０に第１の光δ１を照射させる。これと同時に、制御処理部３７０は、第２のセンサー制御部１６２を制御して、第２の液で流路４１内が満たされている状態で、第１の光δ１が流路４１内の第２の液を透過し、金属膜３０で反射し、かつ流路４１内の第２の液を再度透過して第６の光δ６を第２の受光センサー１６１により検出する。第６の光δ６の検出結果は、制御処理部３７０に送信され、記録される。
【０１４１】
制御処理部３７０は、光検出部１６０による第６の光δ６の検出結果に基づいて、流路４１の高さを決定する。第２の液中の第６の光δ６の光路長は、流路４１の高さに応じて変化する。第２の液中での第６の光δ６の色素による吸収量は、第２の液中での第６の光δ６の光路長に応じて変化する。したがって、第６の光δ６の光量に基づいて、流路４１の高さを決定することができる。たとえば、制御処理部３７０は、あらかじめ作成しておいた検量線と、第６の光δ６の検出結果（光量）とに基づいて、流路４１の高さを決定する。
【０１４２】
次いで、ヘマトクリット値を決定する（工程Ｓ３１９）。制御処理部３７０は、光検出部１６０の検出結果に基づいて検体のヘマトクリット値を決定する。本実施の形態では、制御処理部３７０は、制御処理部３７０にあらかじめ記録されている補正係数を、工程Ｓ１１８で得られたヘマトクリット関連値に掛けることにより、ヘマトクリット値を算出する。さらに、実施の形態３では、工程Ｓ３００で測定された流路４１の高さに基づいて、ヘマトクリット値を補正する。たとえば、流路４１の高さの基準値を１００μｍとしてヘマトクリット値を算出した場合を考える。この場合、流路４１の高さの測定値が１１０μｍであったときは、測定値と基準値とのずれ量（１０μｍ）、つまり流路４１高さのずれ量に相当する検体の吸収率（吸光量）の変化量を考慮して、流路４１の高さが１００μｍのときの値となるようにヘマトクリット値を補正すればよい。
【０１４３】
最後に、実施の形態１での測定値の補正（工程Ｓ１２０）と同様にして、ヘマトクリット値に基づいて測定値を補正する。実施の形態３では、制御処理部３７０は、ヘマトクリット値として、工程Ｓ３１９で得られた補正後のヘマトクリット値を使用する。
【０１４４】
以上の手順により、血漿中の被測定物質の量を決定することができる。
【０１４５】
（効果）
実施の形態３では、実施の形態２と同様の効果を得られる。
【０１４６】
［変形例］
（変形例１）
上記実施の形態１〜３では、金属膜である金属膜３０において、第１の光δ１を鏡面反射させるとともに、表面プラズモン共鳴を生じさせる態様について説明したが、本発明はこの態様に限定されない。図８は、変形例１に係る測定システムにおけるヘマトクリット値取得部の構成を示す模式図である。図８においては、測定チップ１０’内の光路を示すために、測定チップ１０’の断面へのハッチングを省略している。図８に示されるように、第１の光δ１を鏡面反射させるための反射部３０’と、表面プラズモンを生じさせる金属膜３０とが別体として形成されていてもよい。なお、変形例１に係る測定チップ１０’のプリズム２０は、励起光αおよび第１の光δ１（および第１の光δ１と同じ波長の光δ’）に対して透明な誘電体からなる。
【０１４７】
変形例１に係る測定チップ１０’では、反射部３０’は、流路４１を挟んでプリズム２０と対向するように配置されており、金属膜３０は、プリズム２０上に配置されている。変形例１では、反射部３０’は、枠体４２の凹部の底面（流路４１の天面）に配置されている。
【０１４８】
反射部３０’の材料は、その表面で光を鏡面反射できる金属であれば特に限定されない。反射部３０’の材料の例には、金、銀、銅、アルミニウム、およびこれらの合金が含まれる。変形例１では、反射部３０’は、金薄膜である。反射部３０’の厚みは、特に限定されないが、２０ｎｍ〜１０μｍの範囲内が好ましい。反射部３０’の形成方法は、特に限定されない。反射部３０’の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。
【０１４９】
変形例１では、光出射部１５０は、プリズム２０側から反射部３０’に向けて第１の光δ１を出射する。光検出部１６０は、光出射部１５０が反射部３０’に向けて第１の光δ１をプリズム２０側から出射したときに、第１の光δ１が流路４１内を通過し、反射部３０’で反射し、かつ流路４１内を再度通過した光を検出する。
【０１５０】
（変形例２）
上記実施の形態１〜３では、測定値取得部とヘマトクリット値測定部とが別体である態様について説明したが、本発明はこの態様に限定されない。図９は、変形例２に係る測定システムにおける測定値取得部およびヘマトクリット値取得部の構成を示す模式図である。図９に示されるように、測定値取得部およびヘマトクリット値取得部は、一体として構成されていてもよい。変形例２に係るＳＰＦＳ装置は、必要に応じて、他の光学素子を有していてもよい。変形例２に係るＳＰＦＳ装置は、第２の光源ユニット１５１からの第１の光δ１を反射するためのミラー１５３を有する。
【０１５１】
変形例２に係るＳＰＦＳ装置では、シグナル検出部１２０のシグナルを集光するための光学レンズ（第１レンズ１２３および第２レンズ１２５）は、第１の光δ１を金属膜３０に導くとともに、測定チップ１０内での第１の光δ１の反射光δ’（例えば、第２の光δ２）を受光素子に導く光学レンズとしても機能する。また、シグナルを検出するための受光素子（第１の受光センサー１２６）は、第１の光δ１の測定チップ１０内での反射光δ’（例えば、第２の光δ２）を受光するための第２の受光センサー１６１としても機能する。このように、測定値取得部およびヘマトクリット値測定部が一体として構成されていることは、測定装置のコストの低減と、測定装置の小型化との観点から好ましい。また、第１の測定位置と、第２の測定位置との間の移動が不要となるため、測定時間を短くすることもできる。なお、変形例２では、光学フィルター１２４は、光δ’に対して透明であってもよいし、光δ’に対して透明でなくてもよい。光学フィルター１２４が光δ’に対して透明でない場合、光δ’を検出する際に、光学フィルター１２４は光路外に退避される。
【０１５２】
また、上記実施の形態２、３に係る測定装置２００、３００の構成は、上記の態様に限定されない。上記実施の形態２、３に係る測定装置２００、３００では、流路４１の高さを測定するための光（第３の光δ３、第４の光δ４、第６の光δ６および第９の光δ９）を受光する受光センサーとしては、第２の光δ２を受光する第２の受光センサー１６１、２６１と同じ受光センサーを使用する場合について説明したが、本発明はこの態様に限定されない。流路４１の高さを測定するための上記光を受光する受光センサーと、第２の光δ２を受光するための第２の受光センサーとは、異なっていてもよい。測定装置の大型化を避ける観点からは、流路４１の高さを測定するための上記光を受光するための受光センサーと、第２の光δ２を受光するための受光センサーとは、同じであることが好ましい。
【０１５３】
また、上記実施の形態２、３では、流路４１の高さを測定するとき、およびヘマトクリット値を測定するときにおいて、同一の光源ユニット（第２の光源ユニット１５１）を使用したが、使用される光源ユニットは、異なっていてもよい。
【０１５４】
また、流路４１の高さを測定する場合に、測定装置２００、３００のヘマトクリット値測定部を使用しなくてもよい。たとえば、レーザー変位計のような他の光学装置が準備されてもよい。
【０１５５】
また、上記実施の形態２、３では、流路４１の高さを測定する態様について説明したが、本発明はこの態様に限定されない。流路４１の高さに関する情報は、測定チップの製造時にあらかじめ測定されていてもよい。流路４１の高さに関する情報は、制御処理部２７０、３７０にあらかじめ記録されていてもよいし、バーコードなどの識別子として測定チップに付されていてもよい。これにより、被測定物質の量を測定するときに、流路４１の高さを測定しなくてもよいため、被測定物質の測定時間（診断時間）を短くすることができる。
【０１５６】
また、上記実施の形態２、３では、流路４１の高さに基づいてヘマトクリット値を補正する態様について説明したが、流路４１の高さの代わりに第２の光δ２となる光の流路４１内の光路長に基づいてヘマトクリット値を補正してもよい。
【０１５７】
さらに、上記実施の形態１〜３では、ＳＰＳＦ法を利用し、測定値として蛍光物質からの蛍光βの蛍光値を測定する態様について説明したが、本発明はこの態様に限定されない。たとえば、ＳＰＲ法を利用し、測定値として励起光αの反射光の光量を測定してもよい。または、本発明は、ＥＬＩＳＡ法やＲＩｆＳ法、ＱＣＭ法などを利用して測定値を取得してもよい。
【０１５８】
本出願は、２０１６年８月１８日出願の特願２０１６−１６０７５３に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１５９】
本発明に係る被測定物質の測定方法、測定装置および測定システムは、被測定物質を高い信頼性で検出することができるため、例えば疾患の検査などに有用である。
【符号の説明】
【０１６０】
１、２、３  測定システム
１０、１０’  測定チップ
２０  プリズム
２１  入射面
２２  成膜面
２３  出射面
３０  金属膜
３０’  反射部
４０  流路蓋
４１  流路
４２  枠体
４３  液体注入部被膜フィルム
４４  液体貯蔵部被膜フィルム
４５  液体注入部
４６  液体貯蔵部
４７  通気孔
４８  ピペットチップ用貫通孔
５０  液体チップ
１００、２００、３００  ＳＰＦＳ装置
１１０  励起光出射部（第２の光出射部）
１１１  第１の光源ユニット
１１２  角度調整機構
１１３  第１の光源制御部
１２０  シグナル検出部
１２１  受光光学系ユニット
１２２  位置切替え機構
１２３  第１のレンズ
１２４  光学フィルター
１２５  第２のレンズ
１２６  第１の受光センサー
１２７  第１のセンサー制御部
１３０  送液部
１３１  ピペット
１３２  シリンジポンプ
１３３  ノズルユニット
１３４  ピペットチップ
１３５  ピペット制御部
１４０  搬送部
１４１  搬送ステージ
１４２  チップホルダー
１５０  光出射部
１５１  第２の光源ユニット
１５２  第２の光源制御部
１５３  ミラー
１６０、２６０  光検出部
１６１、２６１  第２の受光センサー
１６２  第２のセンサー制御部
１７０、２７０、３７０  制御処理部
α  励起光（第８の光）
β  蛍光
γ  プラズモン散乱光
δ１  第１の光
δ’  測定チップ内での第１の光の反射光
δ２  第２の光
δ３  第３の光
δ４  第４の光
δ５  第５の光
δ７  第７の光
δ９  第９の光
【図１】
2018034143.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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2018034143.tif 000018
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