(57)【要約】  ｉＰＳ細胞と同等の機能を有する多能性幹細胞を得ることのできる、多能性幹細胞の製造方法を提供する。ポリアミン、または、ＤＮＡメチル化阻害物質を含む培地中で、動物細胞を培養することにより、多能性幹細胞を取得する、多能性幹細胞の製造方法。
2018116511.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアミン、または、ＤＮＡメチル化阻害物質を含む培地中で、動物細胞を培養することにより、多能性幹細胞を取得する、多能性幹細胞の製造方法。
【請求項２】
前記ポリアミンは、スペルミン、スペルミジン、プトレシン、および、それらのアセチル化体、並びに、それらポリアミンの２つ以上の重合体、からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡメチル化阻害物質は、ＤＮＡメチル化酵素をコードする遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、５−アザ−２’−デオキシシチジン、シネフンギン、ゼブラリン、エチオニン、アセチルメチオニン、および、セレノメチオニンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１または２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、胚盤胞期の内部細胞塊から作られる細胞であり、様々な細胞に分化できる多能性幹細胞である。１９９８年にカリフォルニア大学のジェームズ・トムソンらが、ヒトのＥＳ細胞の作製に成功したことをきっかけに、ＥＳ細胞を様々な細胞に分化させ、再生医療に利用することが期待されてきた。しかし、ヒトのＥＳ細胞を作製するにはヒトの受精卵を用いる必要があり、医療への利用は生命倫理上問題がある。そのため、現在ではＥＳ細胞を再生医療に利用することは見送られている。【０００３】
これに対して、山中らは乳腺由来の体細胞から、ＥＳ細胞と同等の機能を有する多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の作製にマウスで成功し、その後、ヒトのｉＰＳ細胞の作製にも成功している（非特許文献１：Cell、３０巻、８６１頁−８７２頁、２００７年）。ヒトのｉＰＳ細胞は、４つの遺伝子（ＳＯＸ２、ＯＣＴ３／４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ−４遺伝子）を、遺伝子組み換えにより同時に体細胞に導入して発現させることにより得られる。ｉＰＳ細胞はＥＳ細胞と同様の性質を有して、様々な細胞や臓器に分化できる上に、ヒト胚を使用しないことから、再生医療への利用が期待されている。しかし、ｉＰＳ細胞は、遺伝子操作により得るため、体細胞あたりのｉＰＳ細胞の変換率は非常に低い。そのため、現在までｉＰＳ細胞の作製方法と選別方法に様々な改良が加えられてきた（特許文献１：特開２００８−２８３９７２号公報、特許文献２：特開２００９−１６５４８０号公報、特許文献３：特開２０１４−００００８３号公報、特許文献４：国際公開第２０１３／１６３２９６号）。しかしながら、依然として体細胞からｉＰＳ細胞への変換率は低く、取得までに時間がかかることがｉＰＳ細胞の問題点の１つである。【０００４】
さらに、細胞は細胞表面に提示したＨＬＡ抗原により、自己と他人を区別している。ｉＰＳ細胞で作製した細胞組織や臓器を再生医療に利用するためには、このＨＬＡ抗原の型を一致させる必要がある。言い換えれば、ｉＰＳ細胞による再生医療では、すべてのＨＬＡ型を有するｉＰＳ細胞群を準備し、それをすべての細胞や臓器に分化したものを前もって準備しておく必要がある。しかし、ＨＬＡ抗原の型は非常に多岐にわたっており、ＨＬＡ抗原の型が一致する確率は千人から１万人に一人にすぎない。ＨＬＡ型を有するｉＰＳ細胞群とそこから分化した細胞群を準備することは不可能ではないが、現実的には極めて困難である。さらに、細胞の自己と他人の区別は、ＨＬＡ抗原以外でも行われているため、ＨＬＡ抗原型の一致したｉＰＳ細胞により、再生医療を行ったとしても、患者は自己免疫反応が生じ、免疫抑制剤を投与し続ける必要がある。このことは、患者にとって大きい負担を強いることになる。【０００５】
上記の２つの問題は、「患者から直接細胞を取り出し、それを再生医療に使う」ことにより解決できる。しかし、ｉＰＳ細胞では、（１）４つの遺伝子を遺伝子操作により導入し選別するため、作製の時間と手間がかかる、（２）ｉＰＳ細胞を得る確率は低く再生医療に十分な細胞を確保するまでに時間がかかる、（３）遺伝子を導入するために得られたｉＰＳ細胞の安全確認に時間がかかる、（４）ひとり当たりに膨大な労力が必要になり高額の医療費が発生するなどの理由により、患者自身の細胞を再生医療に利用することは極めて困難である。【０００６】
一方、遺伝子組換えを用いることなく、短時間、高効率で多能性幹細胞を作製する方法を開発できれば、患者自身の細胞から、多能性幹細胞を作製することが可能になり、再生医療の実現性は非常に高まる。このような細胞の作製法に関する報告は、現在２つしか報告されていない。【０００７】
その１つは、ＳＴＡＰ細胞である（非特許文献２：Nature、５０５巻、６４１頁−６４７頁、２０１４年、特許文献４）。理化学研究所の小保方らのグループは、紅茶の成分を使うことでｉＰＳ細胞と同等の細胞であるＳＴＡＰ細胞を作製できることを発見した。しかし、その後に数多くの検証がなされ、ＳＴＡＰ細胞は、ＥＳ細胞自身を用いた可能性が高く、ＳＴＡＰ細胞の作製方法を提示した論文そのものが、捏造または誤りであることが立証された。【０００８】
もう１つは、２０１６年にＫｉｍらにより報告された研究（非特許文献３：Biochemical  and  Biophysical  Research  Communications、４７２巻、５８９頁−５９１頁、２０１６年）であり、これが最新の研究である。彼らは癌細胞に刺激を与え、生き残った細胞がｉＰＳ細胞に近い細胞であることを発見した。この論文は、「ＳＴＡＰ細胞を作製できた」という見出しで、一部の報道が誤って報道したが、当該論文で得られた細胞は、ｉＰＳ細胞マーカーを発現しておらず、多能性幹細胞ではない。論文の著者自身の結論も「多能性幹細胞は得られなかった」と結論している。【０００９】
すなわち、２０１６年現在においても、化合物で刺激することにより多能性幹細胞を誘導する方法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００８−２８３９７２号公報
【特許文献２】特開２００９−１６５４８０号公報
【特許文献３】特開２０１４−００００８３号公報
【特許文献４】国際公開第２０１３／１６３２９６号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Cell、３０巻、８６１頁−８７２頁、２００７年
【非特許文献２】Nature、５０５巻、６４１頁−６４７頁、２０１４年
【非特許文献３】Biochemical  and  Biophysical  Research  Communications、４７２巻、５８９頁−５９１頁、２０１６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
遺伝子組換えを用いることなく、短時間、高効率でｉＰＳ細胞と同等の機能を有する多能性幹細胞を製造できれば、患者自身の細胞を使って、多能性幹細胞を製造することも可能であり、再生医療の実現性は非常に高まる。しかしながら、上述のとおり、そのような多能性幹細胞の製造方法は、これまで全く見出されていない。【００１３】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、ｉＰＳ細胞と同等の機能を有する多能性幹細胞を得ることのできる、多能性幹細胞の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、以下のとおりである。
［１］  ポリアミン、または、ＤＮＡメチル化阻害物質を含む培地中で、動物細胞を培養することにより、多能性幹細胞を取得する、多能性幹細胞の製造方法。
［２］  前記ポリアミンは、スペルミン、スペルミジン、プトレシン、および、それらのアセチル化体、並びに、それらポリアミンの２つ以上の重合体、からなる群から選択される少なくとも１種である、［１］に記載の製造方法。
［３］  前記ＤＮＡメチル化阻害物質は、ＤＮＡメチル化酵素をコードする遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、５−アザ−２’−デオキシシチジン、シネフンギン、ゼブラリン、エチオニン、アセチルメチオニン、および、セレノメチオニンからなる群から選択される少なくとも１種である、［１］または［２］に記載の製造方法。【００１５】
本発明者は、細胞を初期化する働きのある物質について、数多くの物質を用いて探索し、得られた細胞の性質を調べた。本発明者の鋭意努力の結果、ポリアミンに、細胞の初期化に関する遺伝子群の発現を誘導する働きがあることを発見した。さらに、本発明者は、ポリアミンが結果的にＤＮＡのメチル化を阻害し、それが細胞を初期化していることを発見し、ＤＮＡメチル化阻害物質を用いても同様の細胞を得られることを見出した。また、ポリアミン、または、ＤＮＡメチル化阻害剤による細胞の分化誘導を進めると、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞のマーカータンパク質を有する細胞に変化し、当該細胞が多能性幹細胞になることを発見した。【００１６】
それだけでなく、当該多能性幹細胞は、多能性を保持した状態で培養可能であり、胚様体に分化させる培地で、内胚葉、中胚葉、外胚葉などの様々な体細胞に再分化することも確認でき、本発明を完成するに至った。【００１７】
以下、本明細書において、ポリアミンを用いて得られた多能性幹細胞をＰＩＳ細胞（Polyamine-Induced  Stem  cells）と呼び、ＤＮＡメチル化阻害剤を用いて得られた多能性幹細胞をＤＩＳ細胞（Demethylation-Induced  Stem  Cells）と呼ぶ場合がある。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ｉＰＳ細胞と同等の機能を有する多能性幹細胞を得ることのできる、多能性幹細胞の製造方法を提供することができる。なお、本発明の製造方法は、全く新しい方法であるだけでなく、遺伝子組換えを用いることなく、動物細胞から多能性幹細胞を得た点において、本発明の有用性は極めて高い。【００１９】
さらに、ＰＩＳ細胞およびＤＩＳ細胞では、１〜３日で得られる上に、当該細胞への転換効率も非常に高く、細胞の分離も容易という優れた特徴がある。ｉＰＳ細胞は、時間と手間がかかるだけでなく、ｉＰＳ細胞を得る確率は低いことから、ＰＩＳ細胞およびＤＩＳ細胞はｉＰＳ細胞の作製方法と比較して、進歩性が極めて高い。【００２０】
また、患者から取得した細胞をｉＰＳ細胞に分化して再生医療に利用することは、既に記載の理由により困難であり、そのことが再生医療の実用化における大きな障害となっている。本発明のＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞を作製する方法では、さまざまな細胞を短時間且つ高効率でＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞に変換できる。このため、患者の一部の組織または脂肪組織等を採取すれば、再生医療に十分なＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞の細胞量を短期間で確保することができる。即ち、ＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞を作製する方法を利用すれば、患者自身の細胞を用いて短期間で再生医療を行うことが可能になり、治療後に免疫抑制剤を使用する必要がなく、理想的な再生医療を行うことが可能である。ｉＰＳ細胞と比較した場合、この点において本発明の進歩性および有効性は極めて高い。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、肺由来線維芽細胞ＴＩＧ−１−２０からＰＩＳ細胞への変化の様子を示す。図１のＡは、スペルミンで誘導前のＴＩＧ−１−２０細胞を示す。図１のＢは、４０μＭのスペルミンで６時間誘導後にＴＩＧ−１−２０細胞に起こる変化の様子を示す。図１のＣは、４０μＭのスペルミンで３６時間誘導することにより得られたＰＩＳ細胞を示す。
【図２】図２は、リアルタイムＰＣＲにより測定したｍＲＮＡの発現量を示す。縦軸は、ＴＩＧ−１−２０のｍＲＮＡ量に対するＰＩＳ細胞のｍＲＮＡ量の比率（倍）を示す。
【図３】図３は、Human  ES/iPS  Cell  Characterization  Kitにより活性染色または免疫染色を施したＰＩＳ細胞を示す。左からアルカリホスファターゼの活性染色、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１に対する抗体を用いた蛍光免疫染色。灰色に見える部分が蛍光部位を示す。
【図４】図４は、Cardiomyocyte  Differentiation  KitによりＰＩＳ細胞を心筋細胞に誘導した様子を示す。図４のＡは、ＥＢを形成している様子を示す。図４のＢは、ＥＢから前駆心筋細胞が形成される様子を示す。図４のＣは、微細動のある心筋細胞の様子を示す。
【図５】図５は、マウス前駆白色脂肪細胞株３Ｔ３−Ｌ１をＰＩＳ細胞に分化した様子を示す。図５のＡは、３Ｔ３−Ｌ２４細胞の様子を示す。図５のＢは、形成されたＥＢの様子を示す。
【図６】図６は、マウス前駆白色脂肪細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２株をＤＩＳ細胞に分化した様子を示す。図６のＡは、ＤＩＳ細胞（ＤＩＳ−ＳＩ細胞）の様子を示す。図６のＢは、ＤＩＳ細胞（ＤＩＳ−Ａｚａ細胞）の様子を示す。図６のＣは、ＤＩＳ−Ａｚａ細胞を分化して得られた血球系細胞の初期分化の様子を示す。図６のＤは、得られた神経幹細胞と神経様物資の初期分化の様子を示す。
【図７】図７は、ＰＩＳ細胞をさまざまな胚葉に高効率で分化させた様子を示す。図７のＡは、外胚葉に分化した様子を示す。図７のＢは、中胚葉に分化した様子を示す。図７のＣは、内胚葉に分化した様子を示す。
【図８】図８は、ＰＩＳ細胞を褐色脂肪細胞に分化した様子を示す。図８のＡは、褐色脂肪細胞に分化した細胞がＵＣＰ１を発現している様子を示す。図８のＢは、褐色脂肪細胞に分化した細胞が脂肪を蓄積している様子を示す。
【図９】図９は、マウス脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ２４をＰＩＳ細胞に分化した細胞が、高効率で神経幹細胞および成熟神経細胞に分化した様子を示す。図９のＡは、神経幹細胞に分化した様子を示す。図９のＢとＣは、神経幹細胞が神経細胞に分化した様子を示し、図９のＢは成熟神経細胞のマーカー遺伝子TubulinIIIを発現している様子を示す。図９のＣは成熟神経細胞のマーカー遺伝子ＭＡＰ２を発現している様子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、培地に、ポリアミン、または、ＤＮＡメチル化阻害物質を添加し、動物細胞を（ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞と類似の形態を有するまで）培養することにより、多能性幹細胞を取得する、多能性幹細胞の製造方法である。
【００２３】
なお、動物細胞とは、培養により増殖可能で正常な動物の細胞であればよい。ここで、動物はヒトを含み、好ましくは哺乳動物である。ヒト以外の哺乳動物としては、特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどが挙げられる。哺乳動物以外の動物としては、例えば、ショウジョウバエなどの昆虫類などが挙げられる。
【００２４】
動物細胞としては、例えば、線維芽細胞、表皮細胞、乳腺細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、血管内皮細胞、または、それらの前駆細胞などが挙げられる。他の動物細胞としては、例えば、血球系幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞などの幹細胞が挙げられる。
【００２５】
例えば、ヒトの細胞は、ヒト正常細胞の分譲を行っている保存機関（ＡＴＣＣ、ＪＣＲＢなど）から分譲を受けるか、ヒト正常細胞の販売を行う市販のメーカーから購入するか、または、ヒトから細胞を取り出すことにより取得できる。例えば、ヒトなどの動物の組織から細胞を取り出して用いる場合は、組織検査の装置を用いた組織の一部のサンプリング、手術等による組織の部分的切除、脂肪吸引等の方法により、組織を得た後、トリプシン等の酵素により細胞を分離し、動物細胞用の培地で培養する。
【００２６】
（ポリアミン）
本発明に用いられるポリアミン（polyamine）は、直鎖脂肪族炭化水素に第一級アミノ基あるいは第二級アミノ基が合計で２つ以上結合した化合物を意味する。
【００２７】
ポリアミンとしては、例えば、スペルミン（CAS登録番号71-44-3）、スペルミジン（CAS登録番号124-20-9）、プトレシン（CAS登録番号110-60-1）、および、それらのアセチル化体、並びに、それらポリアミンの２つ以上の重合体が挙げられる。
【００２８】
ポリアミンのアセチル化体（アセチル化ポリアミン）としては、例えば、Ｎ−アセチルプトレシン、Ｎ−アセチルスペルミジン、Ｎ−アセチルスペルミン、ジアセチルプトレシン、ジアセチルスペルミジン、ジアセチルスペルミンが挙げられる。なお、ポリアミンの２つ以上の重合体は、化学合成により得ることができる。
【００２９】
ポリアミンは、炭素鎖３〜４の間隔でアミノ基（−ＮＨ２基または−ＮＨ−基）が存在することで、ヒストンまたは染色体に作用し、細胞を初期化する遺伝子群の発現を誘導する特徴がある。したがって、上記以外のポリアミン（生体内に存在する他のポリアミン、化学合成により得られた他のポリアミンなど）のうち、スペルミン、スペルミジン、プトレシン等と類似の構造を有する化合物も、本発明に用いることができる。なお、ポリアミンの遺伝子発現を誘導する能力は、スペルミン、スペルミジン、プトレシンの順に強く、直鎖分子の長さが長いほど、モル濃度当たりの遺伝子の発現を誘導する効果は大きい。
【００３０】
なお、ポリアミンは水溶性のため、１０〜１００ｍＭ程度の濃度のポリアミン水溶液を作製し、０．２μｍの濾過フィルターにより滅菌処理した後、適切な濃度になるように培地に添加して使用することができる。
【００３１】
（ＤＮＡメチル化阻害物質）
本発明に用いられるＤＮＡメチル化阻害物質としては、例えば、以下の２種類が挙げられる。
【００３２】
ＤＮＡメチル化阻害物質の１種としては、ＤＮＡメチル化酵素をコードする遺伝子（ＤＮＭＴ）の発現を阻害するｓｉＲＮＡが挙げられる。ＤＮＡメチル化酵素とは、細胞を複製する際に親細胞から娘細胞にＤＮＡのメチル化情報を正確に伝える酵素（ＤＮＭＴ１）、娘細胞のＤＮＡをメチル化する酵素（ＤＮＭＴ３）などである。ｓｉＲＮＡとは、特定の遺伝子のｍＲＮＡと相補する短いＲＮＡであり、該特定の遺伝子の発現を阻害することができる。ヒトやマウスでは、ＤＮＭＴ１コード遺伝子またはＤＮＭＴ３コード遺伝子が、ＤＮＭＴをコードする遺伝子に該当し、例えば、それらの発現を阻害するｓｉＲＮＡとして、キアゲン社のｓｉＲＮＡをマニュアルに従って添加することにより、ＤＮＡのメチル化を効率よく阻害することができる。
【００３３】
ＤＮＡメチル化阻害物質の他の１種としては、メチオニン類似物質が挙げられる。メチオニン類似物質は、メチル化反応の反応基質であるアデノシルメチオニンの合成を阻害することにより、メチル化反応を阻害する。
【００３４】
メチオニン類似物質としては、例えば、５−アザ−２’−デオキシシチジン（5-Aza-dc，CAS登録番号2353-33-5）、シネフンギン（CAS登録番号58944-73-3）、ゼブラリン（CAS登録番号360-10-6）、エチオニン（CAS登録番号13073-35-3）、アセチルメチオニン（CAS登録番号567-82-7）、セレノメチオニン（CAS登録番号3211-76-5）が挙げられる。これらのメチオニン類似物質は、水溶性であるため、１０−１００ｍＭ程度の濃度の水溶液を調製し、該水溶液を０．２μｍの濾過フィルターにより滅菌処理した後、適切な濃度になるように培地に添加して使用することができる。
【００３５】
ポリアミンによる多能性幹細胞（ＰＩＳ細胞）、または、ＤＮＡメチル化阻害物質による多能性幹細胞（ＤＩＳ細胞）への誘導は、動物細胞をポリアミンまたはＤＮＡメチル化阻害物質の在下で培養することにより実施できる。細胞培養用のフラスコ、デッィシュあるはプレートに、細胞の増殖で使用される通常の培地を添加し、細胞を播種し、通常の培養温度（３７℃程度）のＣＯ２インキュベーターで培養することにより、細胞をフラスコ底面で増殖している状態にする。ヒト細胞の増殖で使用される通常の培地として、例えば、最少培地（Minimum  Essential  medium：ＭＥＭ）やｉＰＳ細胞用の培地などを利用することができ、２５ｃｍ２の培養フラスコの場合、１０万〜１００万個程度の細胞を播種することが好ましい。
【００３６】
フラスコ底面に細胞が付着して細胞の増殖が開始した後、適切な濃度のポリアミン水溶液、または、ＤＮＡメチル化阻害物質の水溶液を添加し、さらに通常の培養温度（３７℃程度）のＣＯ２インキュベーターで１〜４日間程度培養する。当該操作により、細胞内には無数の小さな球体が生じ、フラスコ底面に付着していた細胞が浮遊し、小さな球体の入った球状の細胞となって、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞と類似の形態に変化する。この細胞が、多能性幹細胞のＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞である。
【００３７】
ポリアミンまたはＤＮＡメチル化阻害物質の添加量が少ない場合、ＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞への変化が起こらず、添加量が多い場合、細胞のアポトーシス（細胞死）が誘導される。そのため、ポリアミンまたはＤＮＡメチル化阻害物質は、ＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞への変化が起こる最低濃度で添加し、可能な限りアポトーシスを起こさないようにする必要がある。ポリアミンまたはＤＮＡメチル化阻害物質の添加濃度と培養時間は、細胞種と細胞数に依存する。そのため、ポリアミンまたはＤＮＡメチル化阻害物質の添加濃度は、光学顕微鏡観察により、ＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞に変化することを確認できる最少濃度を、予備実験により確認することが望ましい。
【００３８】
例えば、１０〜１００万個の正常な線維芽細胞、脂肪細胞の場合、スペルミンを１０μＭ〜１００μＭ程度添加した培地で１〜２日間培養すれば、それらの細胞をＰＩＳ細胞に変化させることができる。さらに、上記の繊維芽細胞等に対しては、ＤＮＭＴをコードする遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡを５〜１０ｎＭ程度添加した培地、５−Ａｚａ−ｄｃを２０〜８０μＭ程度添加した培地、または、エチオニンを１〜１０ｍＭ程度添加した培地で、１〜３日間培養すれば、それらの細胞をＤＩＳ細胞に変化させることができる。
【００３９】
上記ポリアミンまたは上記ｓｉＲＮＡを含有する培地で培養することにより得られたＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞は、上記ポリアミンまたは上記ｓｉＲＮＡを含有する培地で１〜４日間程度培養できる。しかし、アポトーシスにより、次第に生存率が低下するため、光学顕微鏡によりＰＩＳ細胞への変化を確認すると、０〜１日以内に、浮遊したＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞を含む培養液を回収し、通常の速度（８００〜２０００ｒｐｍで３分間程度）で遠心分離を行うことにより、ＰＩＳ細胞を集めることが好ましい。
【００４０】
また、培地には、培養の際に、ＰＩＳ細胞の生存率の低下を防ぐための阻害剤を添加してもよい。生存率の低下を防ぐための阻害剤としては、例えば、Ｒｏｃｋ阻害剤およびアポトーシス阻害剤が使用できる。Ｒｏｃｋ阻害剤としては、例えば、Ｙ−２７６３２、チアゾビビン、ＳＢ４３１５４２、ＰＤ０３２５９０１、アポトーシス阻害剤としては、例えば、ｐ５３阻害剤、Ｂａｘ阻害剤、カスパーゼ阻害剤が挙げられる。
【００４１】
一方、ＤＮＡメチル化阻害物質として、５−アザ−２’−デオキシシチジン、シネフンギン、ゼブラリン、エチオニン、アセチルメチオニン、セレノメチオニンを用いた場合、ＤＮＡのメチル化だけでなく様々なメチル化を阻害し、強い細胞毒性を有する。したがって、細胞の浮遊が起こるとすぐに、浮遊したＤＩＳ細胞を含む培養液を回収し、通常の速度（８００〜２０００ｒｐｍで３分間程度）で遠心分離を行うことによりＤＩＳ細胞を集めることが好ましい。
【００４２】
遠心分離により回収したＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞は、細胞からの分化が非常に高い割合で起こるため、胚様体（ＥＢ）を経由した内胚葉、外胚葉、中胚葉への再分化を直接行うことができる。しかしながら、再生医療に使う場合、「ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞と同等の形質を安定して発現させ、且つＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞のみを選別する」必要がある。この場合は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞様の多能性の形質を獲得し且つ保持するための培地に添加することが好ましい。ＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞の多能性の形質を獲得し且つ保持するための培地として、例えば、ヒトの細胞の場合、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）  ＤＥＦ−ＣＳ  ５００  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ株式会社）、ｍＴｅＳＲ１（ベリタス社）など多くの市販の培地を用いることができる。また、当該培地での培養において、ＰＩＳ細胞の生存率の低下を防ぐためには、Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２、チアゾビビン、ＳＢ４３１５４２、ＰＤ０３２５９０１を添加することも可能である。
【００４３】
これらの培地でＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞の集合体を培養すると、弱く付着（または浮遊）する。ピペッティング（ピペットにより培養液を吸引、排出を繰りかえして懸濁する操作）により当該細胞を浮遊させ、培地と細胞を回収し、遠心分離により細胞を集めた後、新しい培地に移す操作を行う。ＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞に分化していないもとの体細胞は、強固に付着するため、ピペッティングでは剥がれず、ＰＩＳ細胞の集合体またはＤＩＳ細胞の集合体のみを回収できる。
【００４４】
さらに、ＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞の集合体を、Ｔｒｙｐ  ＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ）、０．２５％トリプシン溶液（Ｇｉｂｃｏ）、Ａｃｃｕｔａｓｅ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（フナコシ社）等によって、細胞が分散した状態にし、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）  ＤＥＦ−ＣＳ  ５００  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ株式会社）で培養した場合、個々のＰＩＳ細胞を培養器の底面に弱く付着した状態で増殖させることができる。
【００４５】
Ｒｏｃｋ阻害剤およびアポトーシス阻害剤を添加して培養した場合、細胞にわずかな収縮が見られるが、細胞の浮遊は起こらない。この場合、Ｔｒｙｐ  ＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ、０．２５％トリプシン、Ａｃｃｕｔａｓｅ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎ等により細胞を剥離させ、細胞をＰＢＳ等で洗浄後、ＤＥＦ−ＣＳ  ５００  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｔｅｍ等のｉＰＳ細胞用の培地で１−３日間培養すればよい。こうして得られたＰＩＳ細胞は、ＤＥＦ−ＣＳ  ５００  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＳｙｔｅｍあるいはＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）  ゼラチン溶液（和光純薬（株））等のゼラチン溶液でプレートをコートすることで、付着培養することができる。これにより、細胞の障害が修復され、アポトーシスを起こさず、且つ、高効率でＰＩＳ細胞を得ることができる。
【００４６】
ＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞がｉＰＳ細胞と同等の形質を有することは、ｉＰＳ細胞に特異的なＳＯＸ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃなどの遺伝子マーカーの発現、アルカリホスファターゼ活性の発現、または、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１などの表面抗原マーカーの発現等を調べることにより確認でき、遺伝子の発現上昇の確認にはＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲを、ｉＰＳ細胞に特異的な酵素または表面抗原の確認には、抗体を用いた免疫染色、ウエスタンブロッティングまたはＦＡＣＳを利用すればよい。
【００４７】
ＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞から様々な細胞への分化誘導は、ｉＰＳ細胞で使用される誘導方法と同様の方法により行うことができる。
【００４８】
ＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞は、ｉＰＳ細胞と同様に、Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ（ＥＢ）を経て、内胚葉、中胚葉、外胚葉などに分化し、その後、心筋細胞、脂肪細胞、神経細胞など様々な体細胞に分化できる。細胞の分化において、ｉＰＳ細胞と同様に、均一なＥＢを形成することで、ＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞の分化効率が高まる。
【００４９】
均一なＥＢの形成には、数多くの市販のプレートが存在し、それら利用することも有効な手段である。例えば、胚様体形成プレートＡｇｒｏｗｅｌｌ（ベリタス社）、リピジュア（登録商標）−コートプレート（日油株式会社）、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（ＡＧＣテクノグラス）などを用いることで均一なＥＢを得ることができる。
【００５０】
また、様々な細胞への分化もｉＰＳ細胞の場合と全く同じ培地で行うことができる。様々な細胞への分化誘導を行える市販の試薬が数多く存在し、それら利用することも有効な手段である。例えば、胚体内胚葉（ＥＤ）への分化はＣｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）  Definitive  Endoderm  ChiPSC18（タカラバイオ株式会社）、心筋細胞や肝細胞への分化はPSdif-Cardio  Cardiomyocyte  Differentiation  Kit（フナコシ株式会社）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）  iPS  Cell  to  Hepatocyte  Differentiation  System（タカラバイオ株式会社）、神経細胞への分化には、SETMdiff  Neural  Induced  Medium（ベリタス社）を用いることにより、ＰＩＳ細胞またはＤＩＳ細胞から効率よく細胞を分化することができる。
【実施例】
【００５１】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は本発明の例示であって、本発明を限定することを意図するものではない。【００５２】
実施例１：ポリアミンに細胞を初期化する能力があることの証明【００５３】
この実験は、ポリアミンが、初期化する能力があることを証明するために実施した。【００５４】
ヒト肺由来の線維芽細胞ＴＩＧ−１−２０をＪＣＲＢ細胞バンク（ＪＣＲＢ０５０１株）より入手した。ヒト線維芽細胞ＴＩＧ−１−２０（分裂回数３３回、１０万個）を、６ｍＬの最少培地（ＭＥＭ）を含む２５ｃｍ２の培養フラスコで、１日間培養し、細胞を付着させた。１０ｍＭのプトレシン、２００μＭのスペルミジン、または４０μＭのスペルミンを添加したものと、それらを添加していないもの（コントロール）とを、３７℃で１日間ＣＯ２インキュベーター中で培養した。【００５５】
スペルミンを添加して培養したときの結果を、図１に示した。繊維芽細胞ＴＩＧ−１−２０（図１Ａ）の細胞内に６時間後には細かな粒子上のものが出現し（図１Ｂ）、その後培養を続けると、細胞がフラスコ底部からはがれてＥＳ細胞に近い細胞（図１Ｃ）に変化した。【００５６】
細胞が剥がれてから１２時間後、培地中に懸濁した当該細胞（ＰＩＳ細胞）を遠心分離（８００ｒｐｍ、３分間）により回収し、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）  ＤＥＦ−ＣＳ  ５００  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ株式会社）を用いて培養した。培養は、２４穴のプレートにＤＥＦ−ＣＳ  ＣＯＡＴ−１のＰＢＳ（＋）希釈液を１時間処理した後、ＰＩＳ細胞を６ｍＬの培地添加剤を添加したＤＥＦ−ＣＳ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍに懸濁し、２ｍＬずつ３ウェルに分注して、３７℃で２日間培養した。細胞をピペッティングにより剥がし、遠心分離（８００ｒｐｍ、３分間）によりＰＩＳ細胞を回収した。得られた細胞は、RNeasy  Lipid  Tissue  Mini  KitとQuantiTech  Reverse  Transcription  Kit  （キアゲン社）を用いて、ｍＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成を行い、リアルタイムＰＣＲ用のプライマーとリアルタイムＰＣＲ（キアゲン社）を用いて、ＴＥＲＴ、ＤＭＮＴ１、ＳＯＸ２、ＯＣＴ３／４のｍＲＮＡの発現量を調べた。【００５７】
リアルタイムＰＣＲの結果を図２に示した。ＤＮＭＴ１遺伝子は、ＤＮＡ複製の際に、親細胞ＤＮＡのメチル化情報を娘細胞に伝える役割のメチル化転移酵素をコードする遺伝子である。図２に示すように、ＰＩＳ細胞では、ＤＮＭＴ１の発現が完全に抑制されており、ＤＮＡのメチル化の初期化が起こることがわかった。また、テロメアを伸長するテロメラーゼをコードする遺伝子（ＴＥＲＴ遺伝子）の発現が著しく増加した。つまり、老化により短くなったテロメア伸長（初期化）が起こっていた。さらに、ＥＳ細胞のマーカー遺伝子であり細胞の初期化を誘導するＳＯＸ２とＯＣＴ３／４遺伝子の発現量が増加していた。以上のように、ポリアミンは、細胞の初期化を誘導することが立証された。【００５８】
実施例２：ＰＩＳ細胞がｉＰＳ細胞と同等の形質を有していることの証明【００５９】
この実験は、ＰＩＳ細胞が、ｉＰＳ細胞に特異的なタンパク質を発現していることを証明するために行った。【００６０】
実施例１で用いた方法と全く同じ方法によりＰＩＳ細胞を、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）  ＤＥＦ−ＣＳ  ５００  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ株式会社）を用いて培養し、形質の安定したＰＩＳ細胞を得た。当該培地中で、弱く付着したＰＩＳ細胞をピペティングにより懸濁した後、１，５００ｒｐｍで４分間遠心分離して細胞を集めた。【００６１】
得られたＰＩＳ細胞は、Human  ES/iPS  Cell  Characterization  Kit  （Applied  Stem  Cell社）により、アルカリホスファターゼ活性と３つの表面抗原（ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）の確認を行った。また、ｉＰＳ細胞は、アルカリホスファターゼを発現する特徴がある。さらに、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１は、ｉＰＳ細胞のマーカー遺伝子であり、ｉＰＳ細胞に特異的に発現するタンパク質である。【００６２】
ＰＩＳ細胞を０．２ｍＬ用のサンプルチューブに入れ、懸濁細胞の状態で固定化処理、透過処理、ブロッキングをした後、１次抗体および２次抗体を結合させた。２次抗体で標識した細胞は、マウント液と１：１で混合してスライドグラスを作製し、蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ社、ＥＶＯＳ  ＦＬ  Ａｕｔｏ）により蛍光を確認した。結果を図３に示した。【００６３】
図３は、染色体を蛍光染色した図であり、蛍光物質により、活性染色または免疫染色の図である。蛍光がある場合、図３の写真では灰色に示される。図３から明らかなように、アルカリホスファターゼ活性の強い活性およびＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１抗原の強い発現を確認した。以上のように、ＰＩＳ細胞はｉＰＳ細胞に特異的なタンパク質を発現していることを証明できた。【００６４】
実施例３：ＰＩＳ細胞が様々な細胞に分化する能力を保持していることの確認【００６５】
この実験は、ＰＩＳ細胞が、胚様体を形成し、様々な細胞に再分化できる能力があることを証明するために行った。【００６６】
実施例２において得られたＰＩＳ細胞を用いて、心筋細胞に分化させる実験を行った。PSdif-Cardio  Cardiomyocyte  Differentiation  Kit（フナコシ株式会社）を用い、当該キットが提供するマニュアルに従って、培養を行った。心筋細胞に分化誘導した結果を図４に示した。ＰＩＳ細胞は、ＥＢを形成し（図４Ａ）、前駆心筋細胞（図４Ｂ）に変化し、最終的には微細な振動をする心筋細胞（図４Ｃ）に変化した。以上のように、ＰＩＳ細胞は、胚葉体および体細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞であることを証明できた。【００６７】
実施例４：ヒト線維芽細胞以外の細胞でもＰＩＳ細胞を作製できることの確認【００６８】
この実験は、ヒト線維芽細胞以外の細胞から、ＰＩＳ細胞を作製できることを確認するために行った。【００６９】
マウス前駆脂肪細胞株３Ｔ３−Ｌ１（図５Ａ）をＥＤＣＣより入手した。３Ｔ３−Ｌ１株を６ｍＬのＤＭＥＭ（Dulbecco's  modified  Eagle  Medium）を含む２５ｃｍ２の培養フラスコで１日間培養し、細胞を付着させた。１ｍＭのスペルミンを添加したものを、３７℃で３日間ＣＯ２インキュベーター中で培養した。その結果、実施例１と同様に、ＥＳ細胞様の細胞（ＰＩＳ−Ｌ１細胞）を得ることができ、図５のＢに示すようにＰＩＳ−Ｌ１細胞は、ＥＢを形成した。以上のように、ＰＩＳ細胞の作製方法は、ヒト線維芽細胞だけでなく、マウス脂肪細胞など様々な種の様々な細胞に適用できる方法であることを証明できた。【００７０】
実施例５：ＤＮＡメチル化阻害物質に細胞を初期化する能力があり、ＤＩＳ細胞に変化することの証明【００７１】
この実験は、ＤＮＡメチル化阻害剤に、細胞をＥＳ細胞の状態まで初期化する能力があり、ＤＩＳ細胞を作製できることを証明するために実施した。【００７２】
キアゲン社のＤＮＡメチル化酵素（ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ３Ｂ）をコードする遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡ（カタログ番号SI000189910、SI00982338およびSI00165382）を入手した。また、マウス脂肪細胞由来株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（EC90110523-F0）をＥＣＡＣＣより入手した。２４穴のプレートを用いて、ＤＭＥＭ中で該細胞を１日間培養し、細胞をプレートの各ウェルの底面に付着させた。ｓｉＲＮＡによる遺伝子のサイレンシングは、RNAi  Human/Mouse  Starter  Kit（キアゲン社）を用いて行った。これら３つのｓｉＲＮＡ（５ｎＭ）を含む２００μＬのＤＭＥＭ（血清を含まない）に、６μＬのHyperfect  Transfer  Reagentを加えてｓｉＲＮＡの沈澱物を形成した後、１日間培養した。その後、２００μＬのＬＩＦ（Ｗａｋｏ（株）  カタログ番号129-05601）を添加したＥＳ細胞用無血清培地（ＤＳファーマバイオ社）と交換しさらに３日間培養した。その結果、図６のＡに示すように、マウス脂肪細胞由来株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は、ＤＩＳ細胞（ＤＩＳ−ＳＩ細胞）に変化したが、変化しないマウス脂肪細胞由来株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は細胞底面に付着したままであり、ＤＩＳ−ＳＩ細胞のみを培地から回収できた。【００７３】
５−Ａｚａ−ｄｃについても同様の実験を行った。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２株を５００ｍＬのＤＭＥＭを含む２５ｃｍ２の培養フラスコで１日間培養し、細胞を付着させた４０μＭの５−Ａｚａ−ｄｃを添加したＤＭＥＭで培養した後、６ｍＬのＬＩＦ（Ｗａｋｏ（株）  カタログ番号129-05601）と４０μＭの５−Ａｚａ−ｄｃを添加したＥＳ細胞用無血清培地（ＤＳファーマバイオ社）と交換しさらに３日間培養した。その結果、図６のＢに示すように、前駆脂肪細胞の３Ｔ３−Ｌ１は、ＤＩＳ細胞（ＤＩＳ−Ａｚａ細胞と呼ぶ）に変化したが３Ｔ３−Ｌ１細胞は細胞底面に付着したままであり、ＤＩＳ−Ａｚａ細胞のみを培地から回収できた。【００７４】
さらに、得られたＤＩＳ−Ａｚａ細胞をマウスＥＳ細胞から造血系細胞への分化培地であるES-Cut  Hematopoietic  Differentiation  Kit  with  Cytokine（ベリタス社、カタログ番号ST-03160）を用いて、初期分化を行った。その結果、図６のＣに示すように血球系細胞への初期分化を確認した。また、神経前駆細胞への分化培地（STEMdiff  Neural  Induction  Medium、ベリタス社）を用いて、ＤＩＳ−Ａｚａ細胞を神経細胞に分化させた。図６のＤに示すように、ＤＩＳ−Ａｚａ細胞は、神経幹細胞および神経様細胞に分化した。以上のように、ＤＮＡメチル化阻害物質を用いてもポリアミンと同様に、細胞を多能性幹細胞に初期化する能力があり、様々な細胞に分化するＤＩＳ細胞を作製できることを証明できた。【００７５】
実施例６：高効率でＰＩＳ細胞を作製できることの確認【００７６】
この実験は、（１）体細胞を高効率でＰＩＳ細胞にでき、（２）得られたＰＩＳ細胞を高効率で外胚葉、中胚葉または内胚葉に分化することが可能であり、（３）高効率で様々な細胞に分化できることを証明するために実施した。【００７７】
ヒト肺由来の線維芽細胞ＴＩＧ−１−２０（分裂回数３０−３５回）を、６ｍLの最少培地（ＭＥＭ）を用いて、２５ｃｍ２の培養フラスコ中で1日間培養し、フラスコの底面に付着させた。培養フラスコに、Ｒｏｃｋ阻害剤である２０μＭのＹ−２７６３２および５μＭのチアゾビビンと、アポトーシス阻害剤である６０μＭのｐ５３阻害剤（Ｃｙｃｌｉｃ  ｐｉｆｔｈｒｉｎ―α―ｈｙｄｒｏｂｔｏｍｉｄｅ）および３０μＭのＢａｘ阻害剤（Ｂａｘ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｖ５）とを添加して８時間培養し、この４種類の阻害剤を十分に細胞内に取り込ませた。その後、１００ｍＭのスペルミン溶液を添加して、２４時間培養した。培養した細胞は、阻害剤の影響によりＲｏｃｋの活性化とアポトーシスとが抑制されるためにやや縮んだ状態になるが、それ以外には変化が見られなかった。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で核染色した場合も、アポトーシス時に起こる染色体の断片化は見られなかった。【００７８】
培養フラスコに、Ｔｒｙｐ−ＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ溶液（Ｇｉｂｃｏ）０．８ｍＬを添加して細胞をはがし、ＰＢＳ溶液１０ｍＬに入れた後、遠心分離（８００ｒｐｍ、３分間）により細胞を回収した。上澄みを取り除いた後、ＰＢＳ溶液１０ｍＬを用いて同様の操作を行った。得られた細胞を、ＤＥＦ−ＣＳ  ５００  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ株式会社）を用いて２日間培養し、細胞の修復を行うと同時に、安定したＰＩＳ細胞を得た。その後、このＰＩＳ細胞を、Ｓｔｅｍ  ＸＶｉｖｏ  Ｅｃｔｏｄｅｒｍ  Ｋｉｔ、Ｓｔｅｍ  ＸＶｉｖｏ  Ｍｅｓｏｄｅｒｍ  Ｋｉｔ、Ｓｔｅｍ  ＸＶｉｖｏ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ  Ｋｉｔ  （Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、外胚葉、中胚葉または内胚葉に分化させた。分化した細胞は、これらのキットに含まれている抗ヒトＯｃｔ２ヤギ抗体、抗ヒトＢｒａｃｈｙｕｒｙヤギ抗体および抗ヒトＳＯＸ１７ヤギ抗体を一次抗体として用い、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５５５を結合した抗ヤギＩｇＧウサギ抗体を二次抗体として用いて、蛍光免疫染色を行った。その結果、図７のＡ〜Ｃに示すように、ほとんどの細胞が効率良く（９０％以上）、外胚葉、中胚葉または内胚葉に分化していることを確認した。【００７９】
さらに、ＰＩＳ細胞に対し、ＰＳ−ｄｉｆ  ＢＡ  Ｂｒｏｗｎ  Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ベリタス社）を用いて、中胚葉への誘導および褐色脂肪細胞への分化を行った。得られた細胞は、抗ＵＣＰ１ウサギ抗体（Ｂｉｏｓｉｓ社：ｂｓ１９２Ｒ）を用いて免疫染色した。また、０．１ｍＭのオレイン酸を添加して培養した。その結果、分化した細胞は、褐色を呈するだけでなく、図８のＡに示すようにＵＣＰ１を発現しており、図８のＢに示すように脂肪を蓄積する性質があった。このことから、ＰＩＳ細胞が褐色脂肪細胞に分化していることを確認した。また、生存した細胞の褐色脂肪細胞へ分化効率は９０％以上であり、非常に高効率で分化できることを確認した。【００８０】
実施例７：脂肪細胞からＰＩＳ細胞を作製でき、高効率で分化できることの確認【００８１】
この実験は、体内に多量に存在し、且つ脂肪吸引等で多量に得られる脂肪細胞から、効率よくＰＩＳ細胞を作製および分化させることが可能であることを証明するために実施した。【００８２】
マウス脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ２４（N.Shiomi  et  al.(2011)  JBiSE  4,  684）を、６ｍＬのＤＭＥＭを用いて、２５ｃｍ２の培養フラスコで１日間培養し、フラスコの底面に付着させた。培養フラスコに、Ｒｏｃｋ阻害剤である２０μＭのＹ−２７６３２および５μＭのチアゾビビンと、アポトーシス阻害剤である６０μＭのｐ５３阻害剤（Ｃｙｃｌｉｃ  ｐｉｆｔｈｒｉｎ−α−ｈｙｄｒｏｂｔｏｍｉｄｅ）および３０μＭのＢａｘ阻害剤（Ｂａｘ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｖ５）と、を添加して８時間培養し、この４種類の阻害剤を十分に細胞内に取り込ませた。その後、１００ｍＭのスペルミン溶液を添加して、２日間培養した。Ｔｒｙｐ−ＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ溶液（Ｇｉｂｃｏ）１ｍＬを添加して細胞をはがし、ＰＢＳ溶液１０ｍＬに入れた後、遠心分離（８００ｒｐｍ、３分間）により細胞を回収した。上澄みを取り除いた後、ＰＢＳ溶液１０ｍＬを用いて同様の操作を行った。さらに、得られた細胞は、ＳｔｅｍＭｅｄｉｕｍ（登録商標）マウスＥＳ細胞用無血清培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）を用いて２日間培養し、細胞の修復を行うと同時に、形質の安定したＰＩＳ細胞を得た。【００８３】
ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）  ０．１ｗ・ｖ％ゼラチン溶液（和光純薬工業株式会社）を用いてコーティングされた２４ウェルの培養プレートの各ウェルに、神経分化培地ＮＤｉｆｆ（登録商標）  ２２７（タカラバイオ株式会社：Ｙ４０００２）を２ｍＬ入れ、ＰＩＳ細胞を３日間培養して神経幹細胞に誘導した。さらに、これらの細胞を、Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ（登録商標）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ベリタス社）を用いて神経細胞やグリア細胞に分化させた。得られた神経系の細胞に対し、抗β―チューブリンIIIウサギ抗体とＭＡＰ２ウサギ抗体を一次抗体、Ｃｙ３結合抗ウサギヤギ抗体を二次抗体として、免疫染色を行った。その結果、図９のＡに示すように、ほぼ１００％の細胞が神経幹細胞に分化した。図９のＢとＣに示すように、さらに神経幹細胞から分化した細胞も、ほぼ１００％が成熟神経細胞であることを確認した。【００８４】
今回開示された実施形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の多能性幹細胞の製造方法は、ｉＰＳの作製よりも、はるかに簡便、迅速かつ高効率である。したがって、再生医療の分野の様々な治療に利用可能であり、産業上の利用価値は極めて高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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