(57)【要約】  本発明は、以下の（１）および（２）を含む、抗がん剤を提供する。（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、（２）免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）および（２）を含む、抗がん剤：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質。
【請求項２】
抗がん剤が配合剤である、請求項１に記載の抗がん剤。
【請求項３】
抗がん剤がHVJ-Eを含む医薬組成物および免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む医薬組成物を含むキットである、請求項１に記載の抗がん剤。
【請求項４】
免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質が、下記から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗がん剤、
(a) 免疫チェックポイントタンパク質をコードする塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸、
(b) 免疫チェックポイントタンパク質に対する中和抗体。
【請求項５】
がんが、メラノーマ、メルケル細胞がん、肺がん、中皮腫、頭頚部がん、食道がん、胃がん、肝がん、膵臓がん、大腸がん、前立腺がん、腎がん、膀胱がん、尿路上皮がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、脳腫瘍、甲状腺がん、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、滑膜肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、リンパ腫、および白血病からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗がん剤。
【請求項６】
がんが、メラノーマ、中皮腫または前立腺がんである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗がん剤。
【請求項７】
免疫チェックポイントタンパク質が、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7.1、B7.2、B7-H3、B7-H4、B7-H5（VISTA）、KIR、CD137、LAG-3、TIM-3、TIGIT、OX40およびBTLAからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗がん剤。
【請求項８】
免疫チェックポイントタンパク質が、PD-1である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗がん剤。
【請求項９】
以下の（１）および（２）の有効量を対象に投与することを含む、がんの予防または治療方法：
（１）HVJ-E、
（２）免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)および免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む、抗がん剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫チェックポイントタンパク質は、免疫システムの異常賦活化による自己免疫疾患の発症などを防止する因子でありPD-1(Programmed cell death protein 1、別名CD279)、PD-L1（Programmed cell death ligand 1、別名B7-H1/CD274）、PD-L2（Programmed cell death ligand 2、別名：B7-DC/CD273）およびCTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4、別名CD152)などが主要な分子である事が知られている(非特許文献１）。
これらの免疫チェックポイントタンパク質は、通常免疫系の細胞に発現しており、PD-1は活性化Tリンパ細胞、Bリンパ細胞および骨髄系細胞などの細胞に発現している。PD-1のリガンドであるPD-L1は、γ-インターフェロンの刺激を受けたTリンパ細胞を初めとする体内の種々の細胞に恒常的に発現しており、同様にPD-1のリガンドであるPD-L2は炎症など免疫反応の誘導時に抗原提示細胞（マクロファージ、樹状細胞など）に発現誘導される。一方、CTLA-4は活性化Tリンパ細胞やNK細胞に発現誘導され、CTLA-4のリガンドであるB7.1とB7.2は、いずれもマクロファージ、樹状細胞など抗原提示細胞に特化した細胞に発現している。【０００３】
がん細胞は、体内の自己細胞に由来するため、従来は免疫システムによる排除を受けにくいものと考えられていたが、近年、免疫チェックポイントタンパク質により免疫システムが抑制されることが、がん細胞が体内で免疫システムからの攻撃を回避するメカニズムである事が示唆されていた(非特許文献２）。特に、がん細胞が発現するPD-L1が、PD-1との結合を介して腫瘍免疫に重要な細胞傷害性Tリンパ細胞の機能を抑制することが明らかとなり、がん細胞が積極的に免疫システムの攻撃を回避している事が明らかとなった(非特許文献３）。また、CTLA-4やPD-1による免疫抑制を解除する事で抗腫瘍効果が認められる事が明らかとなった(非特許文献４）。そのため、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体などの抗体医薬が、免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質として臨床開発され、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、腎癌、ホジキンリンパ腫に対する治療薬として承認されている(非特許文献５）。また、抗PD-L1抗体についても膀胱がん、膵臓がん、乳がん、大腸がん、リンパ腫などの患者を対象とした臨床開発が進められている(非特許文献６）。【０００４】
以上の通り、免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質による治療が、一部のがんにおいて治療効果を認めたことで、免疫システムを抑制する免疫チェックポイントタンパク質の機能を解除するという新たながん治療の方向性が示された。一方、免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質による治療効果が認められない症例や、がん種も報告されており、免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質による治療効果を如何にして向上するかが課題となっている(非特許文献７）。【０００５】
ところで、HVJ-Eは、げっ歯類に特異性を持つパラミクソウイルスであるHVJ(hemagglutinating virus of Japan)を完全に不活性化した粒子状の物質である(非特許文献８）。これまでに発明者は、HVJ-Eが、抗腫瘍免疫とがん細胞選択的アポトーシスの誘導を含む複数の抗腫瘍活性を有することを報告してきたが(非特許文献９〜１３）、免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を同時に作用させた場合に、HVJ-Eが有する複合的な抗腫瘍効果がどのように変化をするのかについては明らかにされていない状況である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Korman AJ, et al. Checkpoint blockade in cancer immunotherapy. Adv Immunol. 2006;90:297-339.
【非特許文献２】Dong H, et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat Med. 2002 Aug;8(8):793-800.
【非特許文献３】Kleffel S, et al. Melanoma Cell-Intrinsic PD-1 Receptor Functions Promote Tumor Growth. Cell. 2015 Sep 10;162(6):1242-56.
【非特許文献４】Littman DR. Releasing the Brakes on Cancer Immunotherapy. Cell. 2015 Sep 10;162(6):1186-90.
【非特許文献５】Sharma P, Allison JP. The future of immune checkpoint therapy. Science. 2015 Apr 3;348(6230):56-61.
【非特許文献６】Wolchok JD. PD-1 Blockers. Cell. 2015 Aug 27;162(5):937
【非特許文献７】Tumeh PC, et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):568-71.
【非特許文献８】Kaneda Y, et al. Hemagglutinating virus of Japan (HVJ) envelope vector as a versatile gene delivery system. Mol. Ther. 2002 Aug;6(2):219-26.
【非特許文献９】Kurooka M, Kaneda Y. Inactivated Sendai virus particles eradicate tumors by inducing immune responses through blocking regulatory T cells. Cancer Research, 67, 227-236, 2007.
【非特許文献１０】Kawaguchi Y, et al. Efficient eradication of hormone-resistant human prostate cancers by inactivated Sendai virus particle. Int. J. Cancer 2009. 124: 2478-87.
【非特許文献１１】Matsushima-Miyagi T., et al. TRAIL and Noxa are selectively up-regulated in prostate cancer cells downstream of the RIG-I/MAVS signaling pathway by non-replicating Sendai virus particles. Clinical Cancer Research, 18, 6271-83, 2012.
【非特許文献１２】Suzuki H, et al. Sendai virus F glycoprotein induces IL-6 production in dendritic cells in a fusion-independent manner. FEBS Letter, 2008. 582: 1325-29.
【非特許文献１３】Nomura M, et al. Accumulation of cytosolic calcium induces necroptotic cell death in human neuroblastoma. Cancer Res. 74, 1056-1066, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質である抗PD-1抗体をHVJ-Eと組み合わせて、がん細胞を増殖抑制する効果が顕著に増強するのか否かを確認し、その結果を基にHVJ-Eと免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を組み合わせることによって得られる、がん細胞に対する増殖抑制効果が高い新規抗がん剤、および新たながん治療法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決すべく、悪性黒色腫移植マウスにHVJ-Eと免疫チェックポイントタンパク質PD-1の阻害物質である抗PD-1抗体を組み合わせて投与し、抗腫瘍効果について腫瘍サイズの変化を指標として評価した。その結果、HVJ-Eと抗PD-1抗体を同時に投与した場合には2種類の分子が協調的に作用してがん細胞の増殖を抑制できることが確認された。さらに、HVJ-Eを単独で投与した場合や、抗PD-1抗体を単独で投与した場合には、抗腫瘍効果が徐々に減弱する現象が認められたのに対して、HVJ-Eと抗PD-1抗体を組み合わせて投与した場合には、抗腫瘍効果が増強される現象が認められた。
また、悪性胸膜中皮腫移植マウスにHVJ-Eと抗PD-1抗体を組み合わせて投与し、抗腫瘍効果について腫瘍サイズの変化を指標として評価した。その結果、HVJ-Eと抗PD-1抗体を同時に投与した場合には2種類の分子が協調的に作用してがん細胞の増殖を抑制できることが確認された。さらに、悪性胸膜中皮腫移植マウスに対して抗PD-1抗体を単独で投与した場合には、生存率の向上は認められないこと、HVJ-Eとアイソタイプ対照抗体を同時に投与した場合には、生存率が経日的に低下し、評価最終日の生存率が0%となるのに対して、HVJ-Eと抗PD-1抗体を同時に投与した場合には評価最終日においても40%のマウスが生存していた。
さらに、SV40のLargeT遺伝子を発現するトランスジェニックマウスで自然発症した前立腺がん細胞であるTRAMP-C1細胞を移植したマウスにHVJ-Eと抗PD-1抗体を組み合わせて投与し、抗腫瘍効果について腫瘍サイズの変化を指標として評価した。その結果、悪性黒色腫移植マウスの場合と同様に、HVJ-Eと抗PD-1抗体を同時に投与した場合には2種類の分子が協調的に作用してがん細胞の増殖を抑制できることが確認された。さらに、悪性黒色腫移植マウスの場合と同様に、抗PD-1抗体を単独で投与した場合には、抗腫瘍効果が徐々に減弱し、陰性対照と同様の腫瘍サイズとなってしまう現象が認められたのに対して、HVJ-Eと抗PD-1抗体を組み合わせて投与した場合には、それぞれの単剤投与よりも抗腫瘍効果が増強される現象が認められた。
以上の結果から、HVJ-Eと抗PD-1抗体を組み合わせて投与した場合には、それぞれを単独で投与した場合と比較して、がん増殖の抑制効果と生存率の改善効果が当業者の予測を超えて高まることが明らかとなった。以上の発見から、本発明が完成されるに至った。即ち、本発明は、
［１］以下の（１）および（２）を含む、抗がん剤：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質；
［２］抗がん剤が配合剤である、［１］に記載の抗がん剤；
［３］抗がん剤がHVJ-Eを含む医薬組成物および免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む医薬組成物を含むキットである、［１］に記載の抗がん剤；
［４］免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質が、下記から選択される、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の抗がん剤、
(a) 免疫チェックポイントタンパク質をコードする塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸、
(b) 免疫チェックポイントタンパク質に対する中和抗体；
［５］がんが、メラノーマ、メルケル細胞がん、肺がん、中皮腫、頭頚部がん、食道がん、胃がん、肝がん、膵臓がん、大腸がん、前立腺がん、腎がん、膀胱がん、尿路上皮がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、脳腫瘍、甲状腺がん、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、滑膜肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、リンパ腫、および白血病からなる群から選択される、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の抗がん剤；
［６］がんが、メラノーマ、中皮腫または前立腺がんである、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の抗がん剤；
［７］免疫チェックポイントタンパク質が、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7.1、B7.2、B7-H3、B7-H4、B7-H5（VISTA）、KIR、CD137、LAG-3、TIM-3、TIGIT、OX40およびBTLAからなる群から選択される、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の抗がん剤；
［８］免疫チェックポイントタンパク質が、PD-1である、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の抗がん剤；
［９］以下の（１）および（２）の有効量を対象に投与することを含む、がんの予防または治療方法；
（１）HVJ-E、
（２）免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質；
を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、有効成分としてHVJ-Eと免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を組み合わせることによって、単独投与よりも顕著に優れた抗腫瘍効果が期待できる新たな抗がん剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】悪性黒色種移植マウスにPBS、アイソタイプ対照抗体（腹腔内投与）、抗PD-1抗体（腹腔内投与）、HVJ-E（皮下投与）、HVJ-E（皮下投与）+アイソタイプ対照抗体（腹腔内投与）またはHVJ-E（皮下投与）+抗PD-1抗体（腹腔内投与）を投与し、投与開始後12日観察した場合における、腫瘍体積を示す図である。
【図２】悪性黒色種移植マウスにPBS、抗PD-1抗体（腹腔内投与）、HVJ-E（腫瘍内投与）またはHVJ-E（腫瘍内投与）+抗PD-1抗体（腹腔内投与）を投与し、投与開始後30日観察した場合における、腫瘍体積を示す図である。
【図３】悪性胸膜中皮腫移植マウスにPBS、抗PD-1抗体（腹腔内投与）またはHVJ-E（腫瘍内投与）+抗PD-1抗体（腹腔内投与）を投与した場合における、腫瘍体積を示す図である。
【図４】悪性胸膜中皮腫移植マウスに投与したPBS、抗PD-1抗体、HVJ-E+アイソタイプ対照抗体（IgG2b）またはHVJ-E+抗PD-1抗体の投与スケジュールを示す図である。
【図５】悪性胸膜中皮腫移植マウスにPBS、抗PD-1抗体、HVJ-E+アイソタイプ対照抗体（IgG2b）またはHVJ-E+抗PD-1抗体を投与した場合における、マウスの生存率を示す図である。
【図６】前立腺がん移植マウスにPBS、抗PD-1抗体（腫瘍内投与）、HVJ-E（皮内投与）、HVJ-E（皮内投与）+アイソタイプ対照抗体（腫瘍内投与）またはHVJ-E（皮内投与）+抗PD-1抗体（腫瘍内投与）を投与し、投与開始後30日観察した場合における、腫瘍体積を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、以下の（１）および（２）:
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質
を含む、抗がん剤を提供する。
【００１２】
本発明において、「センダイウイルスエンベロープ (hemagglutinating virus of Japan envelope、以下、本発明のHVJ-E)」とは、センダイウイルス（hemagglutinating virus of Japan、以下、HVJ）由来のHVJの粒子構造を維持したウイルスエンベロープをいう。HVJとは、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス属に属し、細胞融合作用をもつウイルスをいう。HVJ粒子は、その表面にヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを有するエンベロープをもち、直径150〜300 nmの多形性を示す。また、HVJは、約15,500塩基長のマイナス鎖RNAをゲノムとして有し、RNAポリメラーゼを持ち、熱に不安定で、ほとんどあらゆる種類の赤血球を凝集し、また溶血性を示す。本発明のHVJ-Eの調製のために用いられるHVJとしては、例えばVR-105、VR-907等が挙げられ、American Type Culture Collection（ATCC）から購入することができる。また、HVJは、野生型ウイルスであっても、組換え型ウイルスであっても良い。
【００１３】
本発明のHVJ-Eは、HVJを不活性化することによって調製することができる。本発明のHVJ-Eを調製するためのHVJの不活性化方法としては、例えばUV処理やアルキル化処理が挙げられる。不活性化処理により、ゲノムRNAがウイルスエンベロープ内で変性または断片化されてその活性を喪失し、ウイルスとしての複製能が失われる。本発明のHVJ-Eの調製方法は、具体的には、特開2001-286282号公報（WO01/57204号公報）、特開2002-065278号公報、WO03/014338号公報等に記載されており、特に特開2001-286282号公報の実施例８などに記載の方法に従って調製することができる。このようにして得られる本発明のHVJ-Eは複製能が消失しているが、細胞融合能を維持しているため、遺伝子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プラスミド等を封入することによって、遺伝子導入用ベクターとしても利用することができる。本発明のHVJ-Eはまた、遺伝子やタンパク質を封入したリポソームと予め紫外線照射によりRNAを不活性化したHVJとを融合することで得られる融合粒子（センダイウイルス−リポソーム）であってもよい。
【００１４】
本発明において、「免疫チェックポイントタンパク質」とは、体内の免疫システムを制御するタンパク質として公知となっている因子であり、癌治療においてその活性阻害が有用であることが示唆されている。免疫チェックポイントタンパク質としては、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7.1、B7.2、B7-H3、B7-H4、B7-H5（VISTA）、KIR、CD137、LAG-3、TIM-3、TIGIT、OX40およびBTLAが挙げられ、その中でもPD-1が好ましく挙げられる。ここで、PD-1は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、PD-L1は、配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、PD-L2は、配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、CTLA-4は、配列番号：８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、B7.1は、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、B7.2は、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、B7-H3は、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、B7-H4は、配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、B7-H5（VISTA）は、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質列、KIRは、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、CD137は、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、LAG-3は、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、TIM-3は、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、TIGITは、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、OX40は、配列番号：３０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質およびBTLAは、配列番号：３２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００１５】
本発明において、「免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質」とは、免疫チェックポイントタンパク質の発現または活性を抑制する物質であれば特に制限されない。
【００１６】
本発明において「免疫チェックポイントタンパク質の発現を抑制する物質」とは、免疫チェックポイントタンパク質の遺伝子の転写レベル、転写後調節のレベル、タンパク質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル等のいかなる段階で作用するものであってもよい。従って、免疫チェックポイントタンパク質の発現を抑制する物質としては、例えば、該遺伝子の転写を阻害する物質、初期転写産物からmRNAへのプロセッシングを阻害する物質、mRNAの細胞質への輸送を阻害する物質、mRNAの分解を促進する物質、mRNAからタンパク質への翻訳を阻害する物質、免疫チェックポイントタンパク質の翻訳後修飾を阻害する物質などが含まれる。いずれの段階で作用するものであっても好ましく用いることができるが、免疫チェックポイントタンパク質の産生を直接的に阻害するという意味では、mRNAからタンパク質への翻訳を阻害する物質が好ましい。
【００１７】
免疫チェックポイントタンパク質のmRNAからタンパク質への翻訳を特異的に阻害する物質として、好ましくは、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸が挙げられる。
【００１８】
免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列としては、
(a) 免疫チェックポイントタンパク質をコードする塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列、または
(b) 免疫チェックポイントタンパク質をコードする塩基配列の相補鎖配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、免疫チェックポイントタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする塩基配列と、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列
が挙げられる。
ここで、「免疫チェックポイントタンパク質をコードする塩基配列」とは、PD-1をコードする塩基配列として配列番号：１で表される塩基配列、PD-L1をコードする塩基配列として配列番号：３で表される塩基配列、PD-L2をコードする塩基配列として配列番号：５で表される塩基配列、CTLA-4をコードする塩基配列として配列番号：７で表される塩基配列、B7.1をコードする塩基配列として配列番号：９で表される塩基配列、B7.2をコードする塩基配列として配列番号：１１で表される塩基配列、B7-H3をコードする塩基配列として配列番号：１３で表される塩基配列、B7-H4をコードする塩基配列として配列番号：１５で表される塩基配列、B7-H5（VISTA）をコードする塩基配列として配列番号：１７で表される塩基配列、KIRをコードする塩基配列として配列番号：１９で表される塩基配列、CD137をコードする塩基配列として配列番号：２１で表される塩基配列、LAG-3をコードする塩基配列として配列番号：２３で表される塩基配列、TIM-3をコードする塩基配列として配列番号：２５で表される塩基配列、TIGITをコードする塩基配列として配列番号：２７で表される塩基配列、OX40をコードする塩基配列として配列番号：２９で表される塩基配列およびBTLAをコードする塩基配列として配列番号：３１で表される塩基配列が挙げられる。
また、「実質的に相補的」とは、塩基配列間で約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の相補性を有することをいう。また、「活性」とは、T細胞のがん細胞に対する抗腫瘍活性を抑制する作用などをいう。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的（例えば、生理学的または薬理学的）に同じであることを示す。したがって、これらの活性の程度（例えば、約0.1〜約10培、好ましくは約0.5〜約2倍）やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。免疫チェックポイントタンパク質の活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC／0.1％ SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。
【００１９】
より好ましくは、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列としては、(a) 免疫チェックポイントタンパク質をコードする塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列が挙げられる。
【００２０】
「免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列の一部」とは、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに特異的に結合することができ、且つ該mRNAからのタンパク質の翻訳を阻害し得るものであれば、その長さや位置に特に制限はないが、配列特異性の面から、標的配列に相補的もしくは実質的に相補的な部分を少なくとも10塩基以上、好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約20塩基以上含むものである。
【００２１】
具体的には、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸として、以下の(i)〜(iii)のいずれかのものが好ましく例示される。
(i) 免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに対するアンチセンス核酸
(ii) 免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに対するsiRNA
(iii) 免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに対するsiRNAを生成し得る核酸
【００２２】
(i) 免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに対するアンチセンス核酸
本発明における、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに対するアンチセンス核酸（本発明のアンチセンス核酸）とは、該mRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸であって、標的mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、タンパク質合成を抑制する機能を有するものである。
アンチセンス核酸は、2-デオキシ-D-リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、D-リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN-グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖DNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、DNA:RNAハイブリッドであってもよい。
【００２３】
上記の通り、アンチセンス核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性RNase Hに認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こすことができる。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、免疫チェックポイントタンパク質の遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。
【００２４】
本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果として免疫チェックポイントタンパク質のタンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、これらタンパク質をコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約10塩基程度、長いものでmRNAもしくは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約10〜約40塩基、特に約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、それに限定されない。具体的には、免疫チェックポイントタンパク質の遺伝子の5'端ヘアピンループ、5'端６−ベースペア・リピート、5'端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3'端非翻訳領域、3'端パリンドローム領域または3'端ヘアピンループなどが、アンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されない。
【００２５】
さらに、本発明のアンチセンス核酸は、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。
【００２６】
アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、天然型のDNAもしくはRNAでもよいが、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2'位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2'-O-Me）、CH2CH2OCH3（2'-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。
【００２７】
RNAの糖部のコンフォーメーションはC2'-endo（S型）とC3'-endo（N型）の２つが支配的であり、一本鎖RNAではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとN型に固定される。したがって、標的RNAに対して強い結合能を付与するために、2'酸素と4’炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したRNA誘導体であるBNA(LNA)（Imanishi, T. et al., Chem. Commun., 1653-9, 2002; Jepsen, J.S. et al., Oligonucleotides, 14, 130-46, 2004）やENA（Morita, K. et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22, 1619-21, 2003）もまた、好ましく用いられ得る。
【００２８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、免疫チェックポイントタンパク質のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも自体公知の手法により、化学的に合成することができる。
【００２９】
(ii) 免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに対するsiRNA
本明細書においては、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに相補的なオリゴRNAとその相補鎖とからなる二本鎖RNA、いわゆるsiRNAもまた、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAに相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉（RNAi）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として汎用されている。siRNAは標的となるmRNAの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：RNAi Designer; Invitrogen）を用いて適宜設計することができる。
【００３０】
siRNAを構成するリボヌクレオシド分子もまた、安定性、比活性などを向上させるために、上記のアンチセンス核酸の場合と同様の修飾を受けていてもよい。但し、siRNAの場合、天然型RNA中のすべてのリボヌクレオシド分子を修飾型で置換すると、RNAi活性が失われる場合があるので、RISC複合体が機能できる最小限の修飾ヌクレオシドの導入が必要である。
【００３１】
siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるショートヘアピンRNA（shRNA）を合成し、これをダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
【００３２】
(iii) 免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに対するsiRNAを生成し得る核酸
本明細書においては、生体内で上記の免疫チェックポイントタンパク質のmRNAに対するsiRNAを生成し得るようにデザインされた核酸もまた、免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。そのような核酸としては、上記したshRNAやそれを発現するように構築された発現ベクターなどが挙げられる。shRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば15から25塩基程度）のスペーサー配列を間に挿入して連結した塩基配列を含むオリゴRNAをデザインし、これをDNA/RNA自動合成機で合成することにより調製することができる。shRNAの発現カセットを含む発現ベクターは、上記shRNAをコードする二本鎖DNAを常法により作製した後、適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。shRNAの発現ベクターとしては、U6やH1などのPol III系プロモーターを有するものが用いられ得る。この場合、該発現ベクターを導入された動物細胞内で転写されたshRNAは、自身でループを形成した後に、内在の酵素ダイサー（dicer）などによってプロセシングされることにより成熟siRNAが形成される。
【００３３】
免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の他の好ましい例としては、該mRNAをコード領域の内部で特異的に切断し得るリボザイムが挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないというさらなる利点を有する。免疫チェックポイントタンパク質のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
【００３４】
免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸は、細胞導入用物質と組み合されていてもよい。例えば、前記核酸は、HVJ-E、リポソーム、ミクロスフェアに封入された形態で供与されてよい。また、前記核酸は、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性物質が付加された形態で供与されてもよい。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の3'端または5'端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3'端または5'端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
【００３５】
これらの核酸の免疫チェックポイントタンパク質のタンパク質発現阻害活性は、免疫チェックポイントタンパク質の遺伝子を導入した形質転換体、生体内や生体外の免疫チェックポイントタンパク質の遺伝子発現系、または生体内や生体外の免疫チェックポイントタンパク質のタンパク質翻訳系を用いて調べることができる。
【００３６】
本発明における免疫チェックポイントタンパク質の発現を抑制する物質は、上記のような免疫チェックポイントタンパク質のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に限定されず、免疫チェックポイントタンパク質のタンパク質の産生を直接的または間接的に阻害する限り、低分子化合物などの他の物質であってもよい。
【００３７】
本発明において「免疫チェックポイントタンパク質の活性を抑制する物質」とは、T細胞のがん細胞に対する抗腫瘍活性を制御する作用を抑制する限り、いかなるものであってもよく、例えば、PD-1とPD-L1との結合を阻害する物質等が挙げられる。
【００３８】
具体的には、免疫チェックポイントタンパク質の活性を抑制する物質として、例えば、免疫チェックポイントタンパク質に対する中和抗体が挙げられる。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
免疫チェックポイントタンパク質に対する中和抗体としては、抗 CTLA-4抗体としてはイピリムマブ（Ipilimumab、Bristol-Myers Squibb）とトレメリムマブ（Tremelimumab、Astrazeneca）を、抗 PD-1抗体としてはニボルマブ（Nivolumab、Bristol-Myers Squibb）とペンブロリズマブ（Pembrolizumab、Merck/MSD）を、抗 PD-L1 抗体としてはデュルルマブ（Durvalumab、Astrazeneca）とアテゾリズマブ（Atezolizumab、Roche）とアベルマブ（Avelumab、Pfizer/ EMD Serono/ Merck KGaA）とピディリツマブ（Pidilizumab、CureTech）を、抗KIR抗体としてはリリルマブ（lirilumab、Bristol-Myers Squibb）を、抗CD137抗体としてはウレルマブ（urelumab、Bristol-Myers Squibb）を、抗LAG-3抗体としては（BMS-986016、Bristol-Myers Squibb）を、それぞれ公知の例として挙げることができる。
以下に、本発明の抗体を調製するために使用される抗原の調製法、および該抗体の製造法について説明する。
【００３９】
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、上記した免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチド、あるいはそれと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなど、何れのものも使用することができる（以下、これらを単に本発明の抗原と称することもある）。
免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドは、例えば、（a）哺乳動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（b）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（c）免疫チェックポイントタンパク質の抗原タンパク質をコードするDNAを含有する形質転換体を培養、あるいは（d）免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を鋳型として無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成することによって製造される。
（a）哺乳動物の組織または細胞から免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドを調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、粗分画物（例、膜画分、可溶性画分）をそのまま抗原として用いることもできる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。得られた免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドをそのまま免疫原とすることもできるし、ペプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれを免疫原とすることもできる。
（b）化学的に本発明の抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述の（a）の方法を用いて天然材料より精製した免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドと同一の構造を有するもの、具体的には、免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドのアミノ酸配列において少なくとも3個以上、好ましくは6個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチドなどが用いられる。
（c）DNAを含有する形質転換体を用いて本発明の抗原を製造する場合、該DNAは、公知のクローニング方法〔例えば、Molecular Cloning 2nd ed.（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法など〕に従って作製することができる。該クローニング方法とは、（1）免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドをコードする遺伝子配列に基づきデザインしたDNAプローブを用い、ヒトcDNAライブラリーからハイブリダイゼーション法により該抗原をコードするDNAを単離するか、（2）免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドをコードする遺伝子配列に基づきデザインしたDNAプライマーを用い、哺乳動物由来のcDNAを鋳型としてPCR法により該抗原をコードするDNAを調製し、該DNAを宿主に適合する発現ベクターに挿入する方法などが挙げられる。該発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより、所望の抗原を得ることができる。
（d）無細胞転写／翻訳系を利用する場合、上記（c）と同様の方法により調製した抗原をコードするDNAを挿入した発現ベクター（例えば、該DNAがT7、SP6プロモーター等の制御下におかれた発現ベクターなど）を鋳型とし、該プロモーターに適合するRNAポリメラーゼおよび基質（NTPs）を含む転写反応液を用いてmRNAを合成した後、該mRNAを鋳型として公知の無細胞翻訳系（例：大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽出液）を用いて翻訳反応を行わせる方法などが挙げられる。塩濃度等を適当に調整することにより、転写反応と翻訳反応を同一反応液中で一括して行うこともできる。
【００４０】
抗原としては完全な免疫チェックポイントタンパク質やその部分アミノ酸配列を有するペプチドを用いることができる。部分アミノ酸配列としては、例えば3個以上の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは4個以上、より好ましくは5個以上、いっそう好ましくは6個以上の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。あるいは、該アミノ酸配列としては、例えば20個以下の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは18個以下、より好ましくは15個以下、いっそう好ましくは12個以下の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。これらのアミノ酸残基の一部（例：1ないし数個）は置換可能な基（例：Cys、水酸基等）によって置換されていてもよい。抗原として用いられるペプチドは、このような部分アミノ酸配列を1ないし数個含むアミノ酸配列を有する。
【００４１】
あるいは、免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドを発現する哺乳動物細胞自体を、本発明の抗原として直接用いることもできる。哺乳動物細胞としては、上記（a）項で述べたような天然の細胞、上記（c）項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形質転換に用いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスター、ニワトリなどから採取した細胞であれば何れのものでも良く、HEK293、COS7、CHO-K1、NIH3T3、Balb3T3、FM3A、L929、SP2/0、P3U1、B16、またはP388などが好ましく用いられる。免疫チェックポイントタンパク質またはその部分ペプチドを発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した温血動物細胞は、組織培養に用いられる培地（例、RPMI1640）または緩衝液（例、Hanks’ Balanced Salt Solution）に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
【００４２】
本発明の抗原は、免疫原性を有していれば不溶化したものを直接免疫することもできるが、分子内に１ないし数個の抗原決定基しか有しない低分子量（例えば、分子量約3,000以下）の抗原（即ち、免疫チェックポイントタンパク質の部分ペプチド）を用いる場合には、これらの抗原は通常免疫原性の低いハプテン分子なので、適当な担体（キャリアー）に結合または吸着させた複合体として免疫することができる。担体としては天然もしくは合成の高分子を用いることができる。天然高分子としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のサイログロブリン、例えばニワトリのオボアルブミン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）などが用いられる。合成高分子としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または共重合物などの各種ラテックスなどが挙げられる。
【００４３】
該キャリアーとハプテンとの混合比は、担体に結合あるいは吸着させた抗原に対する抗体が効率よく産生されれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常用されている上記の天然もしくは合成の高分子キャリアーを、重量比でハプテン1に対し0.1〜100の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。
【００４４】
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン-2,4-ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同士を架橋するN,N’-o-フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-スクシンイミジル（SPDP）など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
【００４５】
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入、皮下注射、皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独で、あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常1〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ニワトリが挙げられる。抗Ig抗体産生の問題を回避するためには投与対象と同一種の哺乳動物を用いることが好ましいが、モノクローナル抗体作製には一般にマウスおよびラットが好ましく用いられる。
【００４６】
ヒトに対する人為的免疫感作は倫理的に困難であることから、本発明の抗体がヒトを投与対象とする場合には、(i)後述する方法に従って作製されるヒト抗体産生動物（例：マウス）を免疫してヒト抗体を得る、(ii)後述する方法に従ってキメラ抗体、ヒト化抗体もしくは完全ヒト抗体を作製する、あるいは(iii)体外免疫法とウイルスによる細胞不死化、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマ作製技術、ファージディスプレイ法等とを組み合わせてヒト抗体を得ることが好ましい。尚、体外免疫法は、通常の免疫では抗体産生が抑制される抗原に対する抗体を取得できる可能性があることの他、ng〜μgオーダーの抗原量で抗体を得ることが可能であること、免疫が数日間で終了することなどから、不安定で大量調製の困難な抗原に対する抗体を得る方法として、非ヒト動物由来の抗体を調製する場合にも好ましく用いられ得る。
【００４７】
体外免疫法に用いられる動物細胞としては、ヒトおよび上記した温血動物（好ましくはマウス、ラット）の末梢血、脾臓、リンパ節などから単離されるリンパ球、好ましくはＢリンパ球等が挙げられる。例えば、マウスやラット細胞の場合、4〜12週齢程度の動物から脾臓を摘出・脾細胞を分離し、適当な培地（例：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、ハムF12培地等））で洗浄した後、抗原を含む胎仔ウシ血清（FCS；5〜20%程度）添加培地に浮遊させて4〜10日間程度CO2インキュベーターなどを用いて培養する。抗原濃度としては、例えば0.05〜5μgが挙げられるがこれに限定されない。同一系統の動物（1〜2週齢程度が好ましい）の胸腺細胞培養上清を常法に従って調製し、培地に添加することが好ましい。
【００４８】
ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養上清を得ることは困難なので、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等数種のサイトカインおよび必要に応じてアジュバント物質（例：ムラミルジペプチド等）を抗原とともに培地に添加して免疫感作を行うことが好ましい。
【００４９】
モノクローナル抗体の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物（例：マウス、ラット）もしくは動物細胞（例：ヒト、マウス、ラット）から抗体価の上昇が認められた個体もしくは細胞集団を選択し、最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取もしくは体外免疫後4〜10日間培養した後に細胞を回収して抗体産生細胞を単離し、これと骨髄腫細胞とを融合させることにより抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の抗体価の測定は、例えば標識化抗原と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。
【００５０】
骨髄腫細胞は多量の抗体を分泌するハイブリドーマを産生し得るものであれば特に制限はないが、自身は抗体を産生もしくは分泌しないものが好ましく、また、細胞融合効率が高いものがより好ましい。また、ハイブリドーマの選択を容易にするために、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）感受性の株を用いることが好ましい。例えばマウス骨髄腫細胞としてはNS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等が、ラット骨髄腫細胞としてはR210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3等が、ヒト骨髄腫細胞としてはSKO-007、GM 1500-6TG-2、LICR-LON-HMy2、UC729-6等が挙げられる。
【００５１】
融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法［ネイチャー（Nature）、256巻、495頁(1975年)］に従って実施することができる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（PEG）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGなどが用いられる。PEGの分子量は特に制限はないが、低毒性で且つ粘性が比較的低いPEG1000〜PEG6000が好ましい。PEG濃度としては例えば10〜80%程度、好ましくは30〜50%程度が例示される。PEGの希釈用溶液としては無血清培地（例：RPMI1640）、5〜20%程度の血清を含む完全培地、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、トリス緩衝液等の各種緩衝液を用いることができる。所望によりDMSO（例：10〜20％程度）を添加することもできる。融合液のpHとしては、例えば4〜10程度、好ましくは6〜8程度が挙げられる。
抗体産生細胞（脾細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常1:1〜20:1程度であり、通常20〜40℃、好ましくは30〜37℃で通常1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００５２】
抗体産生細胞株はまた、リンパ球をトランスフォームし得るウイルスに抗体産生細胞を感染させて該細胞を不死化することによっても得ることができる。そのようなウイルスとしては、例えばエプスタイン−バー（EB）ウイルス等が挙げられる。大多数の人は伝染性単核球症の無症状感染としてこのウイルスに感染した経験があるので免疫を有しているが、通常のEBウイルスを用いた場合にはウイルス粒子も産生されるので、適切な精製を行うべきである。ウイルス混入の可能性のないEBシステムとして、Ｂリンパ球を不死化する能力を保持するがウイルス粒子の複製能力を欠損した組換えEBウイルス（例えば、潜伏感染状態から溶解感染状態への移行のスイッチ遺伝子における欠損など）を用いることもまた好ましい。
【００５３】
マーモセット由来のB95-8細胞はEBウイルスを分泌しているので、その培養上清を用いれば容易にＢリンパ球をトランスフォームすることができる。この細胞を例えば血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）添加培地（例：RPMI1640）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により培養上清を分離し、これに抗体産生Ｂリンパ球を適当な濃度（例：約107細胞/mL）で浮遊させて、通常20〜40℃、好ましくは30〜37℃で通常0.5〜2時間程度インキュベートすることにより抗体産生Ｂ細胞株を得ることができる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ球として提供される場合、大部分の人はEBウイルス感染細胞に対して傷害性を示すＴリンパ球を有しているので、トランスフォーメーション頻度を高めるためには、例えばヒツジ赤血球等とＥロゼットを形成させることによってＴリンパ球を予め除去しておくことが好ましい。また、可溶性抗原を結合したヒツジ赤血球を抗体産生Ｂリンパ球と混合し、パーコール等の密度勾配を用いてロゼットを分離することにより標的抗原に特異的なリンパ球を選別することができる。さらに、大過剰の抗原を添加することにより抗原特異的なＢリンパ球はキャップされて表面にIgGを提示しなくなるので、抗IgG抗体を結合したヒツジ赤血球と混合すると抗原非特異的なＢリンパ球のみがロゼットを形成する。従って、この混合物からパーコール等の密度勾配を用いてロゼット非形成層を採取することにより、抗原特異的Ｂリンパ球を選別することができる。
【００５４】
トランスフォーメーションによって無限増殖能を獲得したヒト抗体分泌細胞は、抗体分泌能を安定に持続させるためにマウスもしくはヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させることができる。骨髄腫細胞としては上記と同様のものが用いられ得る。
【００５５】
ハイブリドーマのスクリーニング、育種は通常HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、5〜20% FCSを含む動物細胞用培地（例：RPMI1640）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で行われる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンの濃度としては、例えばそれぞれ約0.1mM、約0.4μMおよび約0.016mM等が挙げられる。ヒト−マウスハイブリドーマの選択にはウワバイン耐性を用いることができる。ヒト細胞株はマウス細胞株に比べてウワバインに対する感受性が高いので、10-7〜10-3M程度で培地に添加することにより未融合のヒト細胞を排除することができる。
【００５６】
ハイブリドーマの選択にはフィーダー細胞やある種の細胞培養上清を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては、ハイブリドーマの出現を助けて自身は死滅するように生存期間が限られた異系の細胞種、ハイブリドーマの出現に有用な増殖因子を大量に産生し得る細胞を放射線照射等して増殖力を低減させたもの等が用いられる。例えば、マウスのフィーダー細胞としては、脾細胞、マクロファージ、血液、胸腺細胞等が、ヒトのフィーダー細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げられる。細胞培養上清としては、例えば上記の各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞の培養上清が挙げられる。
また、ハイブリドーマは、抗原を蛍光標識して融合細胞と反応させた後、蛍光活性化セルソータ（FACS）を用いて抗原と結合する細胞を分離することによっても選択することができる。この場合、標的抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマを直接選択することができるので、クローニングの労力を大いに軽減することが可能である。
【００５７】
標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローニングには種々の方法が使用できる。
アミノプテリンは多くの細胞機能を阻害するので、できるだけ早く培地から除去することが好ましい。マウスやラットの場合、ほとんどの骨髄腫細胞は10〜14日以内に死滅するので、融合2週間後からはアミノプテリンを除去することができる。但し、ヒトハイブリドーマについては通常融合後4〜6週間程度はアミノプテリン添加培地で維持される。ヒポキサンチン、チミジンはアミノプテリン除去後1週間以上後に除去するのが望ましい。即ち、マウス細胞の場合、例えば融合7〜10日後にヒポキサンチンおよびチミジン（HT）添加完全培地（例：10% FCS添加RPMI1640）の添加または交換を行う。融合後8〜14日程度で目視可能なクローンが出現する。クローンの直径が1mm程度になれば培養上清中の抗体量の測定が可能となる。
【００５８】
抗体量の測定は、例えば標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチド（抗原決定基として用いた部分アミノ酸配列を含む）を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質（例：125I, 131I, 3H, 14C）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン）などで標識した抗免疫グロブリン（IgG）抗体（もとの抗体産生細胞が由来する動物と同一種の動物由来のIgGに対する抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法、抗IgG抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、上記と同様の標識剤で標識した標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチドを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法などによって行うことができる。
【００５９】
クローニング方法としては限界希釈法が通常用いられるが、軟寒天を用いたクローニングやFACSを用いたクローニングも可能である。限界希釈法によるクローニングは、例えば以下の手順で行うことができるがこれに限定されない。
上記のようにして抗体量を測定して陽性ウェルを選択する。適当なフィーダー細胞を選択して96ウェルプレートに添加しておく。抗体陽性ウェルから細胞を吸い出し、完全培地（例：10% FCSおよびP/S添加RMPI1640）中に30細胞/mLの密度となるように浮遊させ、フィーダー細胞を添加したウェルプレートに0.1mL（3細胞/ウェル）加え、残りの細胞懸濁液を10細胞/mLに希釈して別のウェルに同様にまき（1細胞/ウェル）、さらに残りの細胞懸濁液を3細胞/mLに希釈して別のウェルにまく（0.3細胞/ウェル）。目視可能なクローンが出現するまで2〜3週間程度培養し、抗体量を測定・陽性ウェルを選択し、再度クローニングする。ヒト細胞の場合はクローニングが比較的困難なので、10細胞/ウェルのプレートも調製しておく。通常2回のサブクローニングでモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができるが、その安定性を確認するためにさらに数ヶ月間定期的に再クローニングを行うことが望ましい。
【００６０】
ハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養することができる。
インビトロでの培養法としては、上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、細胞密度を例えば105〜106細胞/mL程度に保ちながら、また、FCS濃度を徐々に減らしながら、ウェルプレートから徐々にスケールアップしていく方法が挙げられる。
インビボでの培養法としては、例えば、腹腔内にミネラルオイルを注入して形質細胞腫（MOPC）を誘導したマウス（ハイブリドーマの親株と組織適合性のマウス）に、5〜10日後に106〜107細胞程度のハイブリドーマを腹腔内注射し、2〜5週間後に麻酔下に腹水を採取する方法が挙げられる。
【００６１】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法［例：塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例：DEAE、QEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など］に従って行うことができる。
【００６２】
以上のようにして、ハイブリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、モノクローナル抗体を製造することができる。
【００６３】
免疫チェックポイントタンパク質の活性を阻害するためには、免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体は免疫チェックポイントタンパク質の機能を中和するものでなければならないので、得られたモノクローナル抗体の中和活性について調べる必要がある。中和活性は、例えば、抗体の存在下および非存在下におけるPD-1とPD-L1の結合等の程度を比較することにより測定することができる。
【００６４】
好ましい一実施態様において、本発明の抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、本発明の抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。
【００６５】
（３）ポリクローナル抗体の作製
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質もしくはペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
【００６６】
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアータンパク質とハプテンとの混合比は、キャリアータンパク質に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜約20、好ましくは約1〜約5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
【００６７】
また、ハプテンとキャリアータンパク質のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約1〜約6週毎に1回ずつ、計約2〜約10回程度行われる。
【００６８】
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
【００６９】
以上の通りにして得られるHVJ-Eと免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質は、抗がん剤として提供することができる。
本明細書の後述する実施例においては、HVJ-Eと抗PD-1抗体の併用投与は、HVJ-E単独投与、抗PD-1抗体単独投与よりも担癌マウスの腫瘍増殖を抑制する効果と生存率を改善する効果を示した。以上のことから、HVJ-Eと免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質の併用投与は、がんの発症、進行を治療できることが示唆される。従って、本発明は、HVJ-Eと免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む、抗がん剤（本発明の抗がん剤）を提供することができる。
【００７０】
本発明の抗がん剤の投与対象は、ヒトまたは他の温血動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリなど）があげられ、好ましくはヒトである。
【００７１】
本発明の抗がん剤の適用対象となるがんは、例えば、特に制限はないが、メラノーマ（悪性黒色腫）、メルケル細胞がん、肺がん、中皮腫、頭頚部がん、食道がん、胃がん、肝がん、膵臓がん、大腸がん、前立腺がん、腎がん、膀胱がん、尿路上皮がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、脳腫瘍、甲状腺がん、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、滑膜肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、リンパ腫、白血病等があげられるが、その中でも、メラノーマ、中皮腫または前立腺がんがより適切である。また、中皮腫は悪性胸膜中皮腫がより適切である。
【００７２】
本発明の抗がん剤は、HVJ-Eおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む配合剤（本発明の配合剤）であっても、HVJ-E含む医薬組成物および免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む医薬組成物を含むキット（本発明のキット）であってもよい。
【００７３】
本発明の抗がん剤が配合剤の場合、本発明のHVJ-Eおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは他の温血動物に対して経口的または非経口的（例、腫瘍内投与、血管内投与、皮下投与、皮内投与など）に投与することができ、非経口投与が好ましく、腫瘍内投与がより好ましい。
【００７４】
非経口投与のための医薬組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は腫瘍内注射剤、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明のHVJ-Eおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO−50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記HVJ-Eおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
【００７５】
経口投与のための医薬組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００７６】
本発明の配合剤は、成人のがん患者に投与する場合、例えば、腫瘍部位、またはその周辺部、皮内、あるいは皮下に、直接注射により投与することができる。その投与量は、腫瘍の大きさ、患者の年齢、体重、状態等を考慮して、医者または医療従事者が適宜決定することができる。腫瘍体積が1000mm3以下（例えば、200mm3程度など）の場合、１腫瘍部位あたり１回当たりのHVJ-Eの投与量を3HAU〜75万HAU、好ましくは30HAU〜30万HAU、さらに好ましくは300HAU〜20万HAU、(例えば9,000HAU〜10万HAU)とすることができる。あるいはまた、体重1kgあたり、10万HAU以下であることが好ましい。また、免疫チェックポイントタンパク質がPD-1の場合、PD-1の阻害物質の投与量は、腫瘍体積が1000mm3以下（例えば、200mm3程度など）の場合、体重kgあたりの１回あたりの抗PD-1抗体の投与量を0.1mg〜10mg、好ましくは0.3mg〜5mg、更に好ましくは1mg〜3mg（例えば2mg〜3mg）とすることができる。あるいは、腫瘍体積が1000mm3以下（例えば、200mm3程度など）の場合、１腫瘍部位あたりの１回あたりのPD-1をコードする塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の投与量を10mg〜2000mg、好ましくは20mg〜1000mg、更に好ましくは50mg〜300mgとすることができる。また、PD-1をコードする塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の投与量は、体重1kgあたり、1mg〜20mgであることが好ましい。更に体表面積1m2あたり、10mg〜500mgであることが好ましい。
【００７７】
本発明の抗がん剤がキットの場合、本発明の配合剤と同様に、HVJ-Eおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質をそれぞれ、適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは他の温血動物に対して経口的または非経口的に投与することができる。非経口投与のための医薬組成物、経口投与のための医薬組成物は、本発明の配合剤と同様の手法で調製することができる。
【００７８】
本発明のキットに含まれるHVJ-Eを含む医薬組成物および免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む医薬組成物は、同一の投与経路で投与されても、異なる投与経路で投与されてもよい。
同一の経路で投与する場合、HVJ-Eを含む医薬組成物および免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む医薬組成物は、本発明の配合剤と同様の投与量および投与経路であってよい。
また、異なる経路で投与する場合、HVJ-Eを含む医薬組成物は腫瘍部位、またはその周辺部、皮内、あるいは皮下に投与することが好ましく、抗PD-1抗体は静脈内、皮下、皮内、腹腔内等への投与が好ましく、PD-1をコードする塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸は腫瘍部位、またはその周辺部、皮内、静脈内、皮下あるいは筋肉内等への投与が好ましい。また、その投与量は同一の経路で投与する場合と同様であってよい。
また、HVJ-Eを含む医薬組成物および免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を含む医薬組成物は、同時に投与されても、互いに異なる時点で投与されてもよい。また、両者が互いに異なる時点で投与される場合は、どちらを先に投与してもよい。
HVJ-E自体の抗がん効果と免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質の抗がん効果とが相まって、それぞれ単独に用いた場合では実現できない抗がん活性を達成することが可能であるため、HVJ-Eや免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を、それぞれ単独で投与する場合と比較して、HVJ-E及び免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質それぞれの投与量を減らすことが可能であり、安全性の観点から有利である。また、投与回数も腫瘍の大きさ、患者の年齢、体重、状態等を考慮して、医者または医療従事者が適宜決定することができる。
【００７９】
なお、前記した各医薬組成物は、本発明のHVJ-Eおよび免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【実施例】
【００８０】
細胞株とマウス
B16-F10マウスメラノーマ細胞株を10%FBS (BioWest, Nuaille, France)および0.1 mg/mlペニシリン‐ストレプトマイシン混合溶液 (Nacalai Tesque Inc.)を含有するDMEM培地 (Nacalai Tesque Inc.)中で維持培養した。Clea Japanより購入した6週齢の雌C57BL/6Nマウスを室温調節下、無菌室で維持し、大阪大学(Suita, Japan)の動物実験規定の承認プロトコールおよびガイドラインに従って、取り扱った。AB22マウス中皮腫細胞株を5％FBS (HyClone, South Logan Utah, USA)を含むDMEM培地 (Nacalai Tesque Inc.)中で維持培養した。Clea Japanより購入した8週齢の雌BALB/cマウスを室温調節下、無菌室で維持し、大阪大学(Suita, Japan)の動物実験規定の承認プロトコールおよびガイドラインに従って、取り扱った。TRAMP-C1マウス前立腺がん細胞株を10%FBS (BioWest, Nuaille, France)および0.1 mg/mlペニシリン‐ストレプトマイシン混合溶液 (Nacalai Tesque Inc.)を含有するDMEM培地 (Nacalai Tesque Inc.)中で維持培養した。Clea Japanより購入した7週齢の雌C57BL/6Nマウスを室温調節下、無菌室で維持し、大阪大学(Suita, Japan)の動物実験規定の承認プロトコールおよびガイドラインに従って、取り扱った。【００８１】
ウイルス
HVJ (VR-105 parainfluenza  Sendai/52 Z strain)をATCC (Manassas, VA)から購入し、Cancer Res. 67, 227-236, 2007に記載の方法に従い調製した。簡潔に述べると、HVJの種溶液を10日齢の孵化鶏卵に注射し、3日間、37℃で培養器中で培養した。3日後に、HVJを注射した鶏卵から尿膜腔液を採取した。回収したウイルス(生HVJ)をUV照射(198 mJ/cm2)によって不活性化し、HVJ-Eを調製した。【００８２】
抗PD-1抗体
抗PD-1抗体（LEAFTMPurified anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody、Catalog#: 114108, Clone: RMP1-14）およびアイソタイプが同じIgG2aである対照抗体（LEAFTM Purified Rat IgG2a, κIsotype Ctrl Antibody、Catalog#: 400516, Clone: RTK2758）を BioLegend (San Diego, CA, USA)より購入した。【００８３】
実施例１  腫瘍接種試験（１）
50μlのPBS中に懸濁したB16-F10マウスメラノーマ細胞106個をC57BL/6Nマウスの背部に皮内注射し、６群（n=４/群）に分けた。腫瘍の直径が3-5mmになった6日後（Day0）、前記６群のうち３群には、総量50μlのPBS中に溶解したHVJ-E (粒子数1.0 × 1010(1000HAU))を2日ごとに計6回マウスの皮下へ注射し、残りの３群には50μlのPBSのみ2日ごとに計6回マウスの皮下へ注射した。さらに、上記のHVJ-Eを投与したマウスの腹腔内へ100μlのPBSのみ（HVJ-E投与群）、100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体(100 μg)（antiPD-1 ab+HVJ-E投与群）または100μlのPBS中に溶解したアイソタイプ対照抗体(100 μg)（isotype IgG2b+HVJ-E投与群）をDay0に単回注射した。同様に、上記のPBSを投与したマウスの腹腔内へ100μlのPBSのみ（PBS投与群）、100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体 (100 μg)（antiPD-1 ab投与群）または100μlのPBS中に溶解したアイソタイプ対照抗体(100 μg)（isotype IgG2b投与群）をDay0に単回注射した。腫瘍サイズを12日目まで観察した。腫瘍体積は、ノギスを用いて盲検下で計測し、以下の式を用いて計算した:
腫瘍体積(mm3) =長さ×(幅)2/2
結果を図１に示す。HVJ-E投与群およびantiPD-1 ab投与群は、それぞれ陰性対照群であるPBS投与群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果を示した。antiPD-1 ab+HVJ-E投与群では、HVJ-E投与群およびantiPD-1 ab投与群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果の増強を示した。一方、isotype IgG2b+HVJ-E投与群では、HVJ-E投与群およびisotype IgG2b投与群に対して抗腫瘍効果の増強は認められなかった。【００８４】
実施例２  腫瘍接種試験（２）
50μlのPBS中に懸濁したB16-F10マウスメラノーマ細胞106個をC57BL/6Nマウスの背部に皮内注射し、４群に分けた。腫瘍の直径が3-5mmになった6日後（Day0）、前記４群のうち２群には、総量50μlのPBS中に溶解したHVJ-E (粒子数1.0 × 1010(1000HAU))を2日ごとに計3回マウスの腫瘍内へ注射し、Day18以降は用法用量を変更し、HVJ-E (粒子数5.0 × 1010(5000HAU))を2日ごとに計6回マウスに腫瘍内注射した。残りの２群には50μlのPBSのみ2日ごとに計3回マウスの腫瘍内へ注射し、Day18以降は50μlのPBSのみを2日ごとに計6回マウスに腫瘍内注射した。さらに、上記のHVJ-Eを投与したマウスの腹腔内へ100μlのPBSのみ（HVJ-E投与群）または100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体 (100 μg)（antiPD-1 ab+HVJ-E投与群）をDay0、Day14およびDay18に計３回注射した。同様に、上記のPBSを投与したマウスの腹腔内へ100μlのPBSのみ（PBS投与群）または100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体 (100 μg)（antiPD-1 ab投与群）をDay0、Day14およびDay18に計３回注射した。実施例１と同じ計算式に従い、腫瘍サイズを30日目まで観察した。
結果を図２に示す。HVJ-E投与群は、投与開始後14日目の時点では、陰性対照群であるPBS投与群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果を示したが、投与開始後30日目の時点では、18日目以降の投与ではHVJ-Eの用量を5倍にしたにも係わらず抗腫瘍効果を示さなかった。同様に、antiPD-1 ab投与群においても、投与開始後14日目の時点では、陰性対照群であるPBS投与群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果を示したが、投与開始後30日目の時点では、抗腫瘍効果を示さなかった。一方、antiPD-1 ab+HVJ-E投与群では、投与開始後14日目と30日目のいずれの評価時点でも、HVJ-E投与群およびantiPD-1 ab投与群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果の増強を示した。【００８５】
実施例３  腫瘍接種試験（３）
50μlのPBS中に懸濁したAB22マウス中皮腫細胞106個をBALB/cマウスの皮内へ注射し、３群に分けた。4, 7，8，10，12，14，17，18，20，22, 24日後に、前記３群のうち１群に総量50μlのPBS中に溶解したHVJ-E (粒子数1.0 × 1010(1000HAU))を計１１回腫瘍内投与し、残りの２群には50μlのPBSのみ腫瘍内へ注射した。さらに、上記のHVJ-Eを投与したマウスの腹腔内へ100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体 (100 μg)（antiPD-1 ab+HVJ-E投与群）を4日目と18日目に計２回注射した。同様に、上記のPBSを投与したマウスの腹腔内へ100μlのPBSのみ（PBS投与群）または100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体 (100 μg)（antiPD-1 ab投与群）を4日目と18日目に計２回注射した。実施例１と同じ計算式に従い、腫瘍サイズを27日目まで観察した。
結果を図３に示す。antiPD-1 ab投与群は、試験開始後27日目の時点で、陰性対照群であるPBS投与群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果を示さなかった。一方、antiPD-1 ab+HVJ-E投与群では、試験開始後27日目の時点で、antiPD-1 ab投与群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果の増強を示した。【００８６】
実施例４  腫瘍接種試験（４）
50μlのPBS中に懸濁したAB22マウス中皮腫細胞106個をBALB/cマウスの胸腔内へ注射し、４群に分けた。4日後から、前記４群のうち２群に総量50μlのPBS中に溶解したHVJ-E (粒子数1.0 × 1010(1000HAU) を2週間で計4回の投与（初回は胸腔内投与、その後3回は皮下投与）を行った。該投与を1サイクルとして、3サイクル繰り返し、6週間で計12回の投与を実施した。7週目以降は各サイクルで行われる4回の投与を全て皮下投与に変更し、2週間で計4回の投与を行った。該投与を1サイクルとして、3サイクル繰り返し、6週間で計9回の投与を実施した（3サイクル目については初回の皮下投与のみを実施）。また、残りの２群には50μlのPBSのみ投与した。最終的に、73日目までのHVJ-E またはPBSの投与回数は、胸腔内投与は計3回、皮下投与は計18回となった。さらに、上記のHVJ-Eを投与したマウスの腹腔内へ総量100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体 (100 μg)（antiPD-1 ab+HVJ-E投与群）またはアイソタイプ対照抗体(100 μg)（isotype IgG2b+HVJ-E投与群）を4日目以降の上記の各HVJ-E投与サイクルの初回投与時に注射した。同様に、上記のPBSを投与したマウスの腹腔内へ100μlのPBSのみ（PBS投与群）または100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体(100 μg)（antiPD-1 ab投与群）を4日目以降の上記の各HVJ-E投与サイクルの初回投与時に注射した。最終的に、PBS、抗PD-1抗体またはアイソタイプ対照抗体の投与回数は、計6回となった。生存率を73日目まで観察した。
結果を図５に示す。antiPD-1 ab投与群は、陰性対照群であるPBS投与群に対して生存率を指標とした抗腫瘍効果を示さず25日目に生存率が0%（全例死亡）となった。陰性対照群であるPBS投与群に対してisotype IgG2b+HVJ-E投与群は生存率を指標とした抗腫瘍効果の増強（生存期間の延長）を示したが、試験開始後73日目に生存率が0%（全例死亡）となった。一方、試験開始後73日目におけるantiPD-1 ab+HVJ-E投与群の生存率は40%であり、antiPD-1 ab投与群やisotype IgG2b+HVJ-E投与群よりも高い生存率を示した。【００８７】
実施例５  腫瘍接種試験（５）
50μlのPBS中に懸濁したTRAMP-C1マウス前立腺がん細胞106個を50μlのマトリゲル（Corning  Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration, Phenol Red Free、Catalog#:354262）と混合して計100μlの溶液とした後、 C57BL/6Nマウスの背部に皮内注射し、5群（n=４/群）に分けた。腫瘍の直径が5mm以上になった日をDay0とし、前記５群のうち３群には、総量50μlのPBS中に溶解したHVJ-E (粒子数1.0 × 1010(1000HAU))を2日ごとに計6回（Day0、Day2、Day4、Day6、Day8、Day10）マウスの皮内へ注射し、その後6回（Day20、Day22、Day24、Day26、Day28、Day30）マウスの皮内へ追加注射した。残りの２群には50μlのPBSのみを、上記のHVJ-Eの投与日と同一の日に計12回（Day0、Day2、Day4、Day6、Day8、Day10、Day20、Day22、Day24、Day26、Day28、Day30）マウスの皮内へ注射した。さらに、上記のHVJ-Eを投与したマウスの腫瘍内へ100μlのPBSのみ（HVJ-E群）、100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体(100 μg)（PD-1 ab+HVJ-E群）または100μlのPBS中に溶解したアイソタイプ対照抗体(100 μg)（Ctrl IgG+HVJ-E群）を、Day0とDay20 の計2回注射した。同様に、上記のPBSのみを投与したマウスの腫瘍内へ100μlのPBSのみ（PBS群）、または100μlのPBS中に溶解した抗PD-1抗体 (100 μg)（PD-1 ab群）を、Day0とDay20 の計2回注射した。腫瘍サイズを30日目まで観察した。腫瘍体積は、ノギスを用いて盲検下で計測し、以下の式を用いて計算した:
腫瘍体積(mm3) =長さ×(幅)2/2
結果を図６に示す。HVJ-E群は、陰性対照群であるPBS群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果を示した。一方PD-1 ab群は、投与開始から20日の時点で陰性対照群であるPBS群とほぼ同様の腫瘍サイズとなった。PD-1 ab+HVJ-E群では、HVJ-E群およびPD-1 ab群に対して腫瘍サイズを指標とした抗腫瘍効果の増強を示した。一方、Ctrl IgG+HVJ-E群は、HVJ-E群よりも抗腫瘍効果が低かった。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)および免疫チェックポイントタンパク質の阻害物質を有効成分とする抗がん剤は、それぞれ単独で使用した場合よりも著しい抗腫瘍効果を発揮し、新規ながん治療剤として有用である。本出願は、日本で出願された特願２０１６−２１４１９８（出願日：平成２８年１１月１日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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