(57)【要約】  血液を含む検体を、第１の検体と第２の検体とに分ける。第２の検体中の血液を溶血させる。収容部内に、被測定物質を含む第１の検体を導入し、血液が溶血していない状態の第１の検体中の前記被測定物質の量を示す測定値を取得する。血液が溶血した状態の第２の検体が測定チップの収容部内に存在する状態で、赤血球が吸収する波長の光を含む第１の光が、収容部内の前記第２の検体を透過することで得られる第２の光を検出する。第２の光の検出結果に基づいて、検体のヘマトクリット値を決定する。ヘマトクリット値に基づいて測定値を補正する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体を収容するための収容部を有する測定チップを用いて、血液を含む検体中の被測定物質の量を測定するための測定方法であって、
前記検体を第１の検体と第２の検体とに分ける工程と、
前記第２の検体中の血液を溶血させる工程と、
前記収容部内に、前記被測定物質を含む前記第１の検体を導入し、血液が溶血していない状態の前記第１の検体中の前記被測定物質の量を示す測定値を取得する工程と、
血液が溶血した状態の前記第２の検体が前記測定チップの前記収容部内に存在する状態で、赤血球が吸収する波長の光を含む第１の光が、前記収容部内の前記第２の検体を透過することで得られる第２の光を検出する工程と、
前記第２の光の検出結果に基づいて、前記検体のヘマトクリット値を決定する工程と、
前記ヘマトクリット値に基づいて前記測定値を補正する工程と、
を含む、測定方法。
【請求項２】
前記第１の光に対して透明な参照液が前記収容部内に存在する状態で、前記第１の光が前記収容部内の前記参照液を透過することで得られる第３の光を検出する工程をさらに含み、
前記ヘマトクリット値を決定する工程では、前記第２の光の検出結果に基づいて決定される前記ヘマトクリット値を、前記第３の光の検出結果に基づいて補正する、
請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記収容部は、液体が流れる流路である、請求項１または請求項２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記第２の光を検出する工程は、前記測定値を取得する工程の後に行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項５】
前記第２の検体中の血液を溶血させる工程は、前記測定値を取得する工程の後に行われる、請求項４に記載の測定方法。
【請求項６】
前記測定値を取得する工程は、前記第１の検体を前記収容部内に提供する工程を含み、
前記検体を前記第１の検体と前記第２の検体とに分ける工程は、前記第１の検体を前記収容部内に提供する工程前の１０分以内に行われる、
請求項５に記載の測定方法。
【請求項７】
前記測定チップは、プリズムと、前記プリズム上に配置されている金属膜と、前記金属膜上に配置されている前記収容部と、を有し、
前記測定値を取得する工程では、前記金属膜上に、前記第１の検体中に含まれていた前記被測定物質が固定化され、かつ前記第１の検体および第２の検体が存在しない状態で、前記プリズムを介して前記金属膜に、表面プラズモン共鳴が生じる入射角で第４の光を照射したときに生じる、前記被測定物質の量を示すシグナルを検出して、前記測定値を取得する、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項８】
前記シグナルは、前記被測定物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光である、請求項７に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液を含む検体中の被測定物質を測定する測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査において、タンパク質やＤＮＡなどの、検体中の微量の被測定物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。たとえば、血液中の抗原（被測定物質）を測定する場合、検体としては、患者から採取された全血、またはその全血から血球成分が分離された血漿または血清が使用され得る。また、患者の状態を把握するためには、血漿または血清に対する被測定物質の量（濃度）を測定する必要がある。しかしながら、全血に対する血漿または血清の割合は患者ごとに異なるため、検体として全血を使用して被測定物質の量を示す測定値を取得した場合には、全血に対する血漿または血清の割合に応じて当該測定値を補正する必要がある。このとき、測定値の補正には、ヘマトクリット値が用いられ得る。そこで、ヘマトクリット値および上記測定値に基づいて、被測定物質の量を決定する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。【０００３】
特許文献１に記載の測定方法では、まず、酸化剤および界面活性剤により検体中の血液を溶血させるとともに、検体を希釈する。次いで、血液が溶血した状態の検体中の被測定物質の量を示す測定値を取得する。次いで、血液が溶血した状態の検体中のヘモグロビンの量を測定して、検体のヘマトクリット値を取得する。最後にヘマトクリット値に基づいて、上記測定値を補正する。以上の手順により、特許文献１に記載の測定方法では、血漿または血清中の被測定物質の量を測定する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−０３６９５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載の測定方法では、ヘマトクリット値を取得する工程、および測定値を取得する工程のいずれにおいても、血液が溶血した状態の検体が使用される。本発明者らは、血液が溶血した状態の検体について被測定物質の測定を行った場合、測定項目によっては、正確に測定できないことがあることを実験により確認した。これは、血液が溶血することによって、赤血球中のプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）が赤血球外に流れ出し、被測定物質を分解してしまうためと考えられる。このように、特許文献１に記載の測定方法では、検体中の被測定物質の量を高精度に測定できないことがある。【０００６】
本発明の目的は、検体中の被測定物質の量を示す測定値と、ヘマトクリット値とを高精度に測定し、血液を含む検体中の被測定物質の量を高精度に測定できる測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る測定方法は、液体を収容するための収容部を有する測定チップを用いて、血液を含む検体中の被測定物質の量を測定するための測定方法であって、前記検体を第１の検体と第２の検体とに分ける工程と、前記第２の検体中の血液を溶血させる工程と、前記収容部内に、前記被測定物質を含む前記第１の検体を導入し、血液が溶血していない状態の前記第１の検体中の前記被測定物質の量を示す測定値を取得する工程と、血液が溶血した状態の前記第２の検体が前記測定チップの前記収容部内に存在する状態で、赤血球が吸収する波長の光を含む第１の光が、前記収容部内の前記第２の検体を透過することで得られる第２の光を検出する工程と、前記第２の光の検出結果に基づいて、前記検体のヘマトクリット値を決定する工程と、前記ヘマトクリット値に基づいて前記測定値を補正する工程と、を含む。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、血液を含む検体中の被測定物質の量を高精度に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の一実施の形態に係る測定方法に含まれる工程の一例を示すフローチャートである。
【図２】図２は、図１に示される光学ブランク値の測定工程内の工程を示すフローチャートである。
【図３】図３は、測定チップおよびＳＰＦＳ装置の構成の一例を示す図である。
【図４】図４Ａは、吸光度法によって血漿中の被測定物質の量を決定したときの精度を示すグラフであり、図４Ｂは、電気抵抗法によって血漿中の被測定物質の量を決定したときの精度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の一実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。ここでは、本発明に係る測定方法の代表例として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）を利用した測定方法について説明する。
【００１１】
図１は、本発明の一実施の形態に係る測定方法に含まれる工程の一例を示すフローチャートである。図２は、図１に示される光学ブランク値の測定工程（工程Ｓ１１３）内の工程を示すフローチャートである。図３は、本実施の形態に係る測定方法を実施するために使用されうる測定チップ１０および測定装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成の一例を示す図である。測定チップ１０およびＳＰＦＳ装置１００については、別途詳細に後述する。
【００１２】
本実施の形態に係る測定方法は、液体を収容するための収容部（本実施の形態では、流路４１）を有する測定チップ１０を用いて、血液を含む検体中の被測定物質の量を測定する測定方法である。本実施の形態では、被測定物質の量を示す測定値として、被測定物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光β（シグナル）の光量である蛍光値が測定される。
【００１３】
本実施の形態に係る測定方法は、測定の準備をする工程（工程Ｓ１１０）と、検体を分注および希釈する工程（工程Ｓ１１１）と、入射角を増強角に設定する工程（工程Ｓ１１２）と、光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ１１３）と、１次反応を行う工程（工程Ｓ１１４）と、２次反応を行う工程（工程Ｓ１１５）と、蛍光値を測定する工程（工程Ｓ１１６）と、溶血を行う工程（工程Ｓ１１７）と、ヘマトクリット関連値を取得する工程（工程Ｓ１１８）と、ヘマトクリット値を決定する工程（工程Ｓ１１９）と、測定値を補正する工程（工程Ｓ１２０）と、を含む。
【００１４】
１）測定の準備
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００の設置位置に配置されたチップホルダー１４２に、測定チップ１０を設置する。ここで「設置位置」とは、測定チップ１０をＳＰＦＳ装置１００に設置するための位置である。
【００１５】
（測定チップ）
ここで、ＳＰＦＳ装置１００で使用される測定チップ１０について説明する。図３は、測定チップ１０およびＳＰＦＳ装置１００の構成の一例を説明するための図である。測定チップ１０は、プリズム２０、金属膜３０および流路蓋４０を有する。本実施の形態では、測定チップ１０の流路蓋４０は、液体を収容するための液体チップ５０と一体化されている。
【００１６】
プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、後述の励起光出射部１１０からの励起光α（特許請求の範囲では、「第４の光」と称している）をプリズム２０の内部に入射させる。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接もしくは間接に励起させる光である。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射されて反射光となる。出射面２３は、反射光をプリズム２０の外部に出射させる。
【００１７】
プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。
【００１８】
入射面２１は、励起光出射部１１０からの励起光αが入射面２１で反射してＳＰＦＳ装置１００の光源に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。
【００１９】
ここで「共鳴角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面２３から出射される励起光αの反射光の光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、測定チップ１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光γ」という）の光量が最大となるときの、入射角を意味する。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。
【００２０】
なお、測定チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率や、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の厚み、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０上に捕捉された被測定物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
【００２１】
プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０を構成する樹脂の例には、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、およびシクロオレフィン系ポリマーが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４〜１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
【００２２】
金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を生じさせることができる。局在場光は、金属膜３０の表面から励起光αの波長程度離れた距離まで及ぶ。金属膜３０は、成膜面２２上の全面に形成されていてもよいし、成膜面２２上の一部に形成されていてもよい。本実施の形態では、金属膜３０は、成膜面２２の全面に形成されている。
【００２３】
また、本実施の形態では、金属膜３０は、流路４１内を通過した光を、流路４１内を再度通過するように鏡面反射させる反射部としても機能する。本実施の形態では、金属膜３０は、流路蓋４０で測定チップ１０内に入射した、赤血球が吸収する波長の光を含む第１の光δ１を流路蓋４０に向けて鏡面反射させる。
【００２４】
金属膜３０には、被測定物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。金属膜３０上において、捕捉体が固定化されている領域を、特に「反応場」という。捕捉体は、金属膜３０の全面に固定化されていてもよいし、表面の一部に固定化されていてもよい。流路４１内を透過した光が捕捉体により散乱されるのを抑制する観点からは、金属膜３０の、反射部として機能する領域（光が鏡面反射する領域）においては、捕捉体は固定化されていないことが好ましい。また、捕捉体は、被測定物質に特異的に結合する。このため、被測定物質は、捕捉体を介して金属膜３０上に固定化され得る。
【００２５】
捕捉体の種類は、被測定物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被測定物質に特異的に結合可能な抗体（１次抗体）またはその断片、被測定物質に特異的に結合可能な酵素などである。
【００２６】
金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミニウム、およびこれらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、ＳＰＲを効率的に発生させる観点から、２０〜６０ｎｍの範囲内が好ましい。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。
【００２７】
流路蓋４０は、金属膜３０上に配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合、流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されていてもよい。本実施の形態では、流路蓋４０は、金属膜３０の上に配置されている。金属膜３０上に流路蓋４０を配置することで液体を収容するための収容部が金属膜３０上に形成される。本実施の形態では、当該収容部は、液体が流れる流路４１である。流路４１は、底面と、天面と、当該底面および当該天面を接続する一対の側面とを有する。本明細書中、流路４１のプリズム２０側の面を「流路の底面」といい、流路４１の、流路４１の底面と対向する面を「流路の天面」という。また、流路４１の底面と流路４１の天面との間隔を流路４１の高さとする。流路４１の高さは、精密に管理され得るため、収容部が流路４１であることは、検体による光の吸収に関係する流路４１の光路長を精密に管理する観点から好ましい。
【００２８】
流路蓋４０の裏面には、凹部（流路溝）が形成されている。金属膜３０（およびプリズム２０）上に流路蓋４０が配置され、当該凹部の開口部が金属膜３０により閉塞されることで、流路４１が形成される。局在場光が及ぶ領域を十分に確保する観点からは、流路４１の高さ（流路溝の深さ）は、ある程度大きいことが好ましい。流路４１内に混入する不純物の量を低減する観点からは、流路４１の高さ（流路溝の深さ）は、小さいことが好ましい。このような観点から、流路４１の高さは、０．０５〜０．１５ｍｍの範囲内であることが好ましい。流路４１の両端は、流路４１内と外部とを連通させるように、流路蓋４０に形成された不図示の注入口および排出口とそれぞれ接続されている。
【００２９】
流路蓋４０は、金属膜３０上から放出される光（蛍光βおよびプラズモン散乱光γ）と、金属膜３０に向けて照射される、赤血球が吸収する波長の光を含む第１の光δ１（および第１の光δ１と同じ波長の光）とに対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋４０の材料が第１の光δ１に対して透明であることは、ノイズとなる光の散乱を抑制し、ヘマトクリット値を高精度に測定する観点から好ましい。流路蓋４０の材料の例には、ガラスおよび樹脂が含まれる。当該樹脂の例には、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）が含まれる。また、上記の光に対して透明であれば、流路蓋４０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。
【００３０】
測定チップ１０は、通常、測定のたびに交換される。また、測定チップ１０は、好ましくは各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。
【００３１】
なお、測定チップ１０の金属膜３０上に保存試薬が存在する場合は、捕捉体が適切に被測定物質を捕捉できるように、金属膜３０上を洗浄して保存試薬を除去する。
【００３２】
２）検体の分注および希釈
次いで、検体を分注し、希釈する（工程Ｓ１１１）。具体的には、測定値（蛍光値）測定用の第１の検体と、ヘマトクリット値測定用の第２の検体とに、検体を分ける。本工程Ｓ１１１では、測定精度および測定感度の観点から、第１の検体をさらに希釈する。第１の検体を希釈しないと、検体中の不純物が捕捉体に吸着（非特異吸着）する量が増加して、ノイズが増加してしまい、結果として、測定精度を悪化させてしまうおそれがある。また、捕捉体の量と比較して被測定物質の量が多すぎる場合、捕捉体で捕捉できる被測定物質の量が飽和してしまい、高濃度な検体の濃度を特定することができなくなってしまう。希釈液としては、例えば、生理食塩水が使用され得る。第１の検体は、例えば、１〜５００倍に希釈される。
【００３３】
検体の分注は、検体中の血球成分が沈降してしまう前に行われることが好ましい。検体が血球成分と上澄み成分とに分離する前に、検体を第１の検体と第２の検体とに分けることにより、第１の検体に含まれる血球量と、第２の検体に含まれる血球量とを同程度にすることができる。このような観点から、検体の分注は、血液が格納されている容器、例えば採血管内で検体を十分に混和した後に行われることが好ましい。また、ＳＰＦＳ装置１００内における検体の分注は、１次反応（工程Ｓ１１４）の前に行われることが好ましく、例えば、１次反応を行う工程前の１０分以内に行われることが好ましい。
【００３４】
３）入射角を増強角に設定
次いで、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する（工程Ｓ１１２）。具体的には、まず、励起光αに対して透明な参照液を流路４１内に提供する。次いで、流路４１内に参照液が存在する状態で、プリズム２０を介して、捕捉体が固定化されている領域に対応する金属膜３０の裏面に、金属膜３０に対する励起光αの入射角度を走査しながら励起光αを照射するとともに、測定チップ１０で生じるプラズモン散乱光γを検出する。これにより、励起光αの入射角と、プラズモン散乱光γの光量との関係を含むデータが得られる。得られたデータを解析することにより、プラズモン散乱光γの光量が最大となる入射角である増強角が決定され得る。最後に、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を決定した増強角に設定する。
【００３５】
なお、増強角は、プリズム２０の素材および形状、金属膜３０の厚み、流路４１内の液体の屈折率などにより決まるが、流路４１内の捕捉体の種類および量、プリズム２０の形状誤差などの各種要因によりわずかに変動する。このため、測定を行うたびに増強角を決定することが好ましい。増強角は、０．１°程度のオーダーで決定される。
【００３６】
４）光学ブランク値の測定
次いで、光学ブランク値を測定する（工程Ｓ１１３）。本実施の形態において、光学ブランク値は、蛍光値（測定値）の決定に使用される第１のブランク値と、ヘマトクリット値の決定に使用される第２のブランク値とを含む。ここで、「第１のブランク値」とは、第１の光δ１に対して透明な参照液が流路４１内に存在する状態で、測定チップ１０の上方に放出される蛍光βと同じ波長の光の光量を意味する。また、「第２のブランク値」とは、参照液が流路４１内に存在する状態で、金属膜３０に第１の光δ１を照射したときに、第１の光δ１が流路４１内の参照液を透過することで得られる第３の光δ３の光量を意味する。
【００３７】
本実施の形態では、参照液は、励起光αおよび第１の光δ１に対して透明である。なお、参照液の屈折率は、検体の屈折率と同じか同程度であることが好ましい。これにより、流路４１内に参照液が存在する場合と、流路４１内に検体が存在する場合とにおいて、流路蓋４０の流路溝（凹部）の底面（流路の天面）における第１の光δ１の反射率を同じか同程度にすることができるとともに、金属膜３０（反射部）の表面における光の反射率を同じか同程度にすることができる。
【００３８】
図２に示されるように、工程Ｓ１１３では、まず、第１のブランク値を測定する（工程Ｓ１１３１）。金属膜３０（成膜面２２）に励起光αを照射するのと同時に、蛍光βとほぼ同じ波長の光の光量を検出する。これにより、蛍光値の測定（工程Ｓ１１６）においてノイズとなる光の光量（第１のブランク値）を測定することができる。
【００３９】
次いで、第２のブランク値を測定する（工程Ｓ１１３２）。上記参照液が流路４１内に存在する状態で、流路蓋４０を介して、捕捉体が固定化されている領域に対応する金属膜３０の表面に第１の光δ１を照射するのと同時に、金属膜３０で反射した第３の光δ３を検出する。これにより、ヘマトクリット値の測定においてノイズとなる光の光量（第２のブランク値）を測定することができる。第２のブランク値は、下記式（１）で表される参照液の吸光度ＯＤ１であってもよい。
【数１】
2018034208.tif 000003
［上記式（１）において、ＯＤ１は参照液の吸光度であり、Ｉ０は第１の光δ１の光量であり、Ｉ１は第３の光δ３の光量である。］
【００４０】
５）１次反応
次いで、検体中の被測定物質と金属膜３０上の捕捉体とを反応させる（１次反応；工程Ｓ１１４）。具体的には、流路４１内の参照液を排出し、工程Ｓ１１１において希釈された第１の検体を流路４１内に提供する。これにより、検体中に被測定物質が存在する場合には、被測定物質の少なくとも一部は金属膜３０上の捕捉体により捕捉させることができる。なお、第１の検体は、溶血されていない。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄して、捕捉体に捕捉されなかった物質を除去する。なお、被測定物質の例には、トロポニン、ミオグロビンおよびクレアチンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）が含まれる。
【００４１】
６）２次反応
次いで、金属膜３０上の捕捉体に捕捉された被測定物質を蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ１１５）。具体的には、蛍光標識液を流路４１内に提供する。これにより、被測定物質を蛍光物質で標識することができる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された抗体（２次抗体）を含む緩衝液である。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄し、遊離の蛍光物質などを除去する。
【００４２】
７）蛍光値の測定
次いで、反応場の被測定物質を標識している蛍光物質から放出される蛍光を検出して、蛍光値を測定する（工程Ｓ１１６）。まず、測定用の緩衝液を流路４１内に提供する。第１の検体中に含まれていた被測定物質が固定化され、かつ第１の検体および第２の検体が存在しない状態で、プリズム２０を介して捕捉体が固定化されている領域に対応する金属膜３０の裏面に、表面プラズモン共鳴が生じる入射角で励起光α照射する。これとともに、測定チップ１０内で生じる蛍光β（シグナル）を検出する。これにより、血液が溶血していない状態の第１の検体中の被測定物質の量を示す、蛍光βの光量である蛍光値（測定値）を取得することができる。なお、本明細書中、「検体が存在しない状態」とは、流路４１内から検体を除去する操作が行われた状態をいう。すなわち、流路４１内に検体が実質的に存在していなければよく、流路４１内に除去しきれなかった検体がわずかに残存していてもよい。
【００４３】
８）溶血および希釈
次いで、工程Ｓ１１１において分注した第２の検体中の血液を溶血させるとともに、希釈する（工程Ｓ１１７）。具体的には、第２の検体中に溶血剤を提供する。これにより、第２の検体中の血液を溶血させるとともに、希釈することができる。このとき、第２の検体は、例えば、１〜２０倍に希釈される。このとき、第２の検体の希釈倍率が１倍の場合、第２の検体は希釈されていないことを示している。希釈倍率が大きいほど、検体の吸収光量は少なくなる。このため、希釈倍率が大きすぎると、十分な測定分解能が得られなくなる。
【００４４】
また、溶血剤の種類は、血液を溶血できれば特に限定されず、公知の溶血剤から適宜選択されうる。溶血剤は、例えば、界面活性剤である。界面活性剤の種類の例には、アニオン性の界面活性剤、カチオン性の界面活性剤およびノニオン性の界面活性剤が含まれる。中でも、界面活性剤は、アニオン性の界面活性剤であることが好ましい。
【００４５】
９）ヘマトクリット関連値の取得
次いで、ヘマトクリット関連値を取得する（工程Ｓ１１８）。具体的には、血液が溶血した状態の検体を流路４１内に提供する。次いで、血液が溶血した状態の第２の検体が流路４１内に存在する状態で、金属膜３０に第１の光δ１を照射させるのと同時に、流路４１内の第２の検体を透過し、金属膜３０で反射し、かつ流路４１内の第２の検体を再度透過することで得られる第２の光δ２を検出する。これにより、第２の光δ２の光量を測定することができる。なお、第２の光δ２の光量は、下記式（２）で表される第２の検体の吸光度ＯＤ２であってもよい。
【数２】
2018034208.tif 000004
［上記式（２）において、ＯＤ２は第２の検体の吸光度であり、Ｉ０は第１の光δ１の光量であり、Ｉ２は第２の光δ２の光量である。］
【００４６】
次いで、第２の光δ２の検出結果に基づいて決定されるヘマトクリット値を、第３の光δ３の検出結果に基づいて補正する。第２の検体の吸光度ＯＤ２は、第２の検体による光の吸収に起因するシグナル成分と、それ以外の要因に起因するノイズ成分（第２のブランク値）とを含む。したがって、工程Ｓ１１８で得られた検体の吸光度ＯＤ２から、工程Ｓ１１３２で得られたノイズ成分（第２のブランク値）を引くことで、シグナル成分を算出することができる。本工程Ｓ１１８で得られた測定値（第２の光δ２の光量または検体の吸光度ＯＤ２）と、工程Ｓ１１３２で得られた測定値（第３の光δ３の光量または参照液の吸光度ＯＤ１）とに基づいて、下記式（３）で表されるヘマトクリット関連値Ｈｃｔ’が算出され得る。
【数３】
2018034208.tif 000005
［上記式（３）において、Ｈｃｔ’はヘマトクリット関連値であり、Ｉ１は第３の光δ３の光量であり、Ｉ２は第２の光δ２の光量である。］
【００４７】
なお、検体（ヘモグロビン）の吸光度は、第１の光δ１の波長に応じて変化する。第１の光δ１の波長を安定させて、高精度に吸光度を測定する観点から、第１の光δ１の光源の温度を一定に保たれるように調整することが好ましい。
【００４８】
１０）ヘマトクリット値の決定
次いで、第２の光δ２の検出結果に基づいて、ヘマトクリット値を決定する（工程Ｓ１１９）。本実施の形態では、所定の補正係数を、工程Ｓ１１８で得られたヘマトクリット関連値に掛けることにより、ヘマトクリット値Ｈｃｔを算出する。
【００４９】
なお、前述のとおり、吸光度は、第１の光δ１の波長に応じて、変化する。このため、より正確なヘマトクリット値を得る観点からは、第１の光δ１の波長に基づいて、ヘマトクリット値を補正することが好ましい。たとえば、第１の光δ１の波長の基準値を５２０ｎｍとしてヘマトクリット値を算出した場合を考える。この場合、検出した第２の光δ２の波長が５３０ｎｍであったときは、測定値と基準値とのずれ量（１０ｎｍ）に相当する赤血球の吸収率（吸光量）のずれ量を考慮して、第１の光δ１の波長が５２０ｎｍのときの値となるようにヘマトクリット値Ｈｃｔを補正すればよい。
【００５０】
また、ヘマトクリット値は、流路４１の高さまたは第２の光δ２となる光の流路４１内の光路長に基づいて補正されてもよい。たとえば、流路４１の高さの基準値を１００μｍとしてヘマトクリット値を算出した場合を考える。この場合、流路４１の高さの測定値が１１０μｍであったときは、測定値と基準値とのずれ量（１０μｍ）、つまり流路４１の高さのずれ量に相当する赤血球の吸収率（吸光量）の変化量を考慮して、流路４１の高さが１００μｍのときの値となるようにヘマトクリット値を補正すればよい。
【００５１】
１１）測定値の補正
最後に、ヘマトクリット値に基づいて測定値（蛍光値）を補正する（工程Ｓ１２０）。蛍光値は、被測定物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光成分（シグナル成分）と、蛍光物質以外の要因に起因するノイズ成分（第１のブランク値）とを含む。したがって、工程Ｓ１１６で得られた蛍光値から、工程Ｓ１１３１で得られた第１のブランク値を引くことで、被測定物質の量を示す測定値（シグナル成分）を算出することができる。さらに、算出された測定値に以下の式（４）で表される変換係数ｃを掛けることで、算出された測定値を血漿中の被測定物質の量に変換することができる。
【数４】
2018034208.tif 000006
［上記式（４）において、Ｈｃｔはヘマトクリット値（０〜１００％）であり、ｄｆは希釈液の希釈倍率である。］
【００５２】
以上の手順により、血漿中の被測定物質の量（濃度）を決定することができる。
【００５３】
なお、本実施の形態では、第２の光δ２を検出する工程（ヘマトクリット関連値の取得；工程Ｓ１１８）が、測定値を取得する工程（蛍光値の測定；工程Ｓ１１６）の後に行われる態様について説明した。第２の光δ２の検出と、蛍光βの検出とを同一の測定チップ１０（流路４１）内で行う場合、第２の光δ２を検出する工程が測定値を取得する工程の後に行われることは、測定値を高精度に取得する観点から好ましい。第２の光δ２を検出する工程が測定値を取得する工程の後に行われることにより、溶血剤が添加された第２の検体中の被測定物質と、金属３０膜上の捕捉体とが反応してしまうことを抑制することができるためである。
【００５４】
また、本実施の形態では、第２の検体中の血液を溶血させる工程（工程Ｓ１１７）が、測定値を取得する工程（蛍光値の測定；工程Ｓ１１６）の後に行われる態様について説明した。溶血剤を扱うピペットと、検体を扱うピペットとが同一である場合、第２の検体中の血液を溶血させる工程（工程Ｓ１１７）が、測定値を取得する工程（蛍光値の測定；工程Ｓ１１６）の後に行われることは、測定値を高精度に取得する観点から好ましい。第２の検体中の血液を溶血させる工程が測定値を取得する工程の後に行われることにより、ピペット内に溶血剤が残存し、残存した溶血剤が第１の検体に混入してしまうことを防止できるためである。
【００５５】
また、本実施の形態では、検体を分注する工程（工程Ｓ１１１）が、１次反応の工程（工程Ｓ１１４）の前に行われる態様について説明した。検体を分注する工程が、第１の検体を流路４１内に提供する工程（１次反応の工程）前の１０分以内に行われることは、血漿または血清中の被測定物質の量を高精度に決定する観点から好ましい。検体を分注する工程が１次反応の工程前の１０分以内に行われることにより、血球成分が沈降する前に検体を分注することができ、第１の検体のヘマトクリット値と、第２の検体のヘマトクリット値とを、同じか同程度とすることができるためである。これにより、第２の検体を用いて取得されたヘマトクリット値に基づいて、第１の検体を用いて取得された測定値を正確に補正することができる。
【００５６】
また、ヘマトクリット値を高精度に測定する観点から、第２のブランク値の測定は、蛍光値の測定（工程Ｓ１１６）の後に行われてもよい。これにより、第２のブランク値の測定（工程Ｓ１１３２）と、ヘマトクリット関連値の取得（工程Ｓ１１８）との時間間隔を短くして、光源のパワーの変動や、光源の温度変化に起因する第１の光δ１の波長の変動などの影響を小さくすることができる。さらに、１次反応および２次反応に起因して、金属膜３０の表面における第１の光δ１の散乱状態が変化することも考えられるが、１次反応および２次反応の後に第２のブランク値の測定（工程Ｓ１１３２）と、ヘマトクリット関連値の取得（工程Ｓ１１８）とを行うことで、上記の散乱状態の変化の影響が及ばない。このような観点から、蛍光値の測定（工程Ｓ１１６）の後に第２のブランク値の測定（工程Ｓ１１３２）を行うことは好ましい。
【００５７】
また、上記実施の形態では、入射角を増強角に設定する工程（工程Ｓ１１２）、光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ１１３）および１次反応を行う工程（工程Ｓ１１４）をこの順番に行う態様について説明した。しかし、本発明に係る測定方法では、この順番に限定されない。たとえば、１次反応を行った後に入射角を増強角に設定してもよいし、光学ブランク値を測定した後に１次反応を行ってもよい。
【００５８】
また、上記の説明では、１次反応を行う工程（工程Ｓ１１４）の後に、２次反応を行う工程（工程Ｓ１１５）を行った（２工程方式）。しかしながら、被測定物質を蛍光物質で標識するタイミングは、特に限定されない。たとえば、測定チップ１０の流路４１内に試料液を導入する前に、試料液に標識液を添加して被測定物質を予め蛍光物質で標識しておいてもよい。また、測定チップ１０の流路４１内に試料液と標識液を同時に注入してもよい。前者の場合は、測定チップ１０の流路４１内に試料液を注入することで、蛍光物質で標識されている被測定物質が捕捉体により捕捉される。後者の場合は、被測定物質が蛍光物質で標識されるとともに、被測定物質が捕捉体により捕捉される。いずれの場合も、測定チップ１０の流路４１内に試料液を導入することで、１次反応および２次反応の両方を完了することができる（１工程方式）。
【００５９】
（ＳＰＦＳ装置）
次いで、本実施の形態に係る測定方法に従って動作し、検体中の被測定物質を測定し得るＳＰＦＳ装置の一例について説明する。図３は、ＳＰＦＳ装置１００の構成の一例を示す構成図である。ＳＰＦＳ装置１００は、励起光出射部１１０、シグナル検出部１２０、送液部１３０、搬送部１４０、光出射部１５０、光検出部１６０および制御処理部（処理部）１７０を有する。励起光出射部１１０およびシグナル検出部１２０は、ともに検体中の被測定物質の量を示す測定値を取得するための測定値取得部を構成する。光出射部１５０および光検出部１６０は、検体のヘマトクリット値を取得するためのヘマトクリット値取得部を構成する。
【００６０】
図３において、光出射部１５０および光検出部１６０は、便宜上、紙面に沿って配列されているが、光出射部１５０および光検出部１６０は、図３の紙面に垂直な方向に沿って配列されている。なお、図３において、光δ’の光軸が点線で示されているのは、第１の光δ１の光軸および光δ’の光軸が図３の紙面に垂直な平面内に含まれることを示している。
【００６１】
ＳＰＦＳ装置１００は、搬送部１４０のチップホルダー（ホルダー）１４２に前述の測定チップ１０を装着した状態で使用される。前述のとおり、測定チップ１０は、プリズム２０、金属膜３０および流路蓋４０を有する。測定チップ１０の流路蓋４０は、液体チップ５０と一体化されている。プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。プリズム２０および流路蓋４０の間には、流路４１が形成されている。
【００６２】
励起光出射部１１０は、励起光α（第４の光）を出射する。蛍光βの検出時には、励起光出射部１１０は、金属膜３０で表面プラズモン共鳴が発生するように、金属膜３０に対するＰ波を入射面２１に向けて出射する。励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０に表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。励起光出射部１１０は、第１の光源ユニット１１１、角度調整機構１１２および第１の光源制御部１１３を含む。
【００６３】
第１の光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の光を、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。第１の光源ユニット１１１は、例えば、光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。
【００６４】
光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオードや水銀灯などのレーザー光源が含まれる。光源から出射される励起光αの波長は、例えば、４００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲内である。光源から出射される励起光αがビームでない場合は、励起光αは、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される励起光αが単色光でない場合は、励起光αは、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される励起光αが直線偏光でない場合は、励起光αは、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
【００６５】
ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。
【００６６】
コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。
【００６７】
バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源から出射された励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。
【００６８】
直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを直線偏光の光にする。
【００６９】
半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように光の偏光方向を調整する。
【００７０】
スリットおよびズーム手段は、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、光源から出射された励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
【００７１】
ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。
【００７２】
温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源から出射された励起光αの波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源から出射された励起光αの波長およびエネルギーを一定に制御する。
【００７３】
角度調整機構１１２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））に対する励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０の所定の位置に向けて所定の入射角で光を照射するために、光源から出射された励起光αの光軸とチップホルダー１４２とを相対的に回転させる。たとえば、角度調整機構１１２は、金属膜３０上において励起光αの光軸と直交する軸（図３の紙面に対して垂直な軸）を中心として第１の光源ユニット１１１を回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。特に、回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの光源から出射された励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
【００７４】
前述のとおり、光源から金属膜３０に対して出射された励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光γの光量が最大となる角度が増強角である。光源から出射された励起光αの入射角を増強角またはその近傍の角度に設定することで、高強度の蛍光βおよびプラズモン散乱光γを検出することが可能となる。プリズム２０の材料および形状、金属膜３０の厚み、流路４１内の液体の屈折率などにより、光源から出射された励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路４１内の捕捉体の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。
【００７５】
第１の光源制御部１１３は、第１の光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、第１の光源ユニット１１１からの励起光αの出射を制御する。第１の光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００７６】
シグナル検出部１２０は、金属膜３０上に、検体中の被測定物質が存在する状態で、励起光出射部１１０がプリズム２０を介して金属膜３０に、表面プラズモン共鳴が生じる入射角で励起光αを照射したときに、測定チップ１０で生じるシグナル（例えば、蛍光β、反射光またはプラズモン散乱光γ）を検出する。被測定物質は、流路４１内で固定化されていてもよいし、固定化されていなくてもよい。本実施の形態では、シグナル検出部１２０は、金属膜３０上に、検体中に含まれていた被測定物質が固定化され、かつ流路４１内に検体が存在しない状態で、上記シグナルを検出する。シグナル検出部１２０は、検出したシグナル量（例えば、蛍光βの光量、反射光の光量、またはプラズモン散乱光γの光量）を示す信号を制御処理部１７０に出力する。シグナル検出部１２０は、受光光学系ユニット１２１、位置切替え機構１２２および第１のセンサー制御部１２７を含む。
【００７７】
受光光学系ユニット１２１は、測定チップ１０の金属膜３０の法線上に配置される。受光光学系ユニット１２１は、第１のレンズ１２３、光学フィルター１２４、第２のレンズ１２５および第１の受光センサー１２６を含む。
【００７８】
位置切替え機構１２２は、光学フィルター１２４の位置を、受光光学系ユニット１２１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、第１の受光センサー１２６が蛍光βを検出するときには、光学フィルター１２４を受光光学系ユニット１２１の光路上に配置し、第１の受光センサー１２６がプラズモン散乱光γを検出するときには、光学フィルター１２４を受光光学系ユニット１２１の光路外に配置する。
【００７９】
第１のレンズ１２３は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光（シグナル）を集光する。第２のレンズ１２５は、例えば、結像レンズであり、第１のレンズ１２３で集光された光を第１の受光センサー１２６の受光面に結像させる。両レンズの間において、光は、略平行の光束となっている。
【００８０】
光学フィルター１２４は、第１のレンズ１２３および第２のレンズ１２５の間に配置されている。光学フィルター１２４は、蛍光検出時においては、光学フィルター１２４に入射する光のうち、蛍光成分のみを透過させ、励起光成分（プラズモン散乱光γ）を除去する。これにより、蛍光成分のみを第１の受光センサー１２６に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光βを検出することができる。光学フィルター１２４の種類の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１２４の例には、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルターと、所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターとが含まれる。
【００８１】
第１の受光センサー１２６は、蛍光βおよびプラズモン散乱光γを検出する。第１の受光センサー１２６は、微量の被測定物質からの微弱な蛍光βを検出することが可能な、高い感度を有する。第１の受光センサー１２６は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、シリコンフォトダイオード（ＳｉＰＤ）などである。
【００８２】
第１のセンサー制御部１２７は、第１の受光センサー１２６の出力値の検出や、当該出力値による第１の受光センサー１２６の感度の管理、適切な出力値を得るための第１の受光センサー１２６の感度の変更などを制御する。第１のセンサー制御部１２７は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００８３】
送液部１３０は、チップホルダー１４２に保持された測定チップ１０の流路４１内に、液体チップ５０内の液体を供給する。また、送液部１３０は、測定チップ１０の流路４１内から液体を除去する。さらに、送液部１３０は、液体チップ５０内の液体を分注し、かつ希釈する。送液部１３０は、ピペット１３１およびピペット制御部１３５を含む。
【００８４】
ピペット１３１は、シリンジポンプ１３２と、シリンジポンプ１３２に接続されたノズルユニット１３３と、ノズルユニット１３３の先端に装着されたピペットチップ１３４とを有する。シリンジポンプ１３２内のプランジャーの往復運動によって、ピペットチップ１３４における液体の吸引および排出が定量的に行われる。
【００８５】
ピペット制御部１３５は、シリンジポンプ１３２の駆動装置、およびノズルユニット１３３の移動装置を含む。シリンジポンプ１３２の駆動装置は、シリンジポンプ１３２のプランジャーを往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ノズルユニット１３３の移動装置は、例えば、ノズルユニット１３３を、垂直方向に自在に動かす。ノズルユニット１３３の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
【００８６】
ピペット制御部１３５は、シリンジポンプ１３２を駆動して、液体チップ５０から各種液体をピペットチップ１３４内に吸引させる。そして、ピペット制御部１３５は、ノズルユニット１３３を移動させて、測定チップ１０の流路４１内にピペットチップ１３４を挿入させるとともに、シリンジポンプ１３２を駆動して、ピペットチップ１３４内の液体を流路４１内に注入させる。また、液体の導入後、ピペット制御部１３５は、シリンジポンプ１３２を駆動して、流路４１内の液体をピペットチップ１３４内に吸引させる。このように流路４１内の液体を順次交換することによって、反応場において捕捉体と被検出物質を反応させたり（１次反応）、被測定物質と蛍光物質で標識された捕捉体とを反応させたりする（２次反応）。また、送液部１３０は、上記のように液体チップ５０内の液体を吸引したり、吐出したりすることで、検体を分注したり、希釈したりする。
【００８７】
搬送部１４０は、測定チップ１０を搬送し、固定する。搬送部１４０は、搬送ステージ１４１およびチップホルダー１４２を含む。
【００８８】
搬送ステージ１４１は、チップホルダー１４２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１４１も、励起光αや、励起光αの反射光、蛍光β、プラズモン散乱光γ、第１の光δ１、第１の光δ１の反射光δ’（第２の光δ２および第３の光δ３）などの光の光路を妨げない形状である。搬送ステージ１４１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。
【００８９】
チップホルダー１４２は、搬送ステージ１４１に固定されており、測定チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１４２の形状は、測定チップ１０を保持することができ、かつ励起光αや励起光αの反射光、蛍光β、プラズモン散乱光γ、第１の光δ１、第１の光δ１の反射光δ’などの光の光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１４２には、上記の光が通過するための開口が設けられている。
【００９０】
光出射部１５０は、赤血球が吸収する波長の光を含む第１の光δ１を出射する。本実施の形態では、光出射部１５０は、流路４１側から金属膜３０に向けて第１の光δ１を出射する。第１の光δ１は、赤血球に含まれるヘモグロビンが吸収する波長の光を含むことが好ましい。光出射部１５０は、第２の光源ユニット１５１および第２の光源制御部１５２を含む。
【００９１】
第２の光源ユニット１５１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の第１の光δ１を、金属膜３０に向けて出射する。第２の光源ユニット１５１は、例えば、光源、コリメーター、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。コリメーター、ＡＰＣ機構および温度調整機構については、第１の光源ユニット１１１のコリメーター、ＡＰＣ機構および温度調整機構と同様であるため、その説明を省略する。光源の温度変化による第１の光δ１の波長のばらつきを抑制する観点から、第２の光源ユニット１５１は、温度調整機構を有することが好ましい。
【００９２】
金属膜３０の外縁部よりも内側に第１の光δ１を照射して、第１の光δ１が金属膜３０以外の領域に照射されることによるエネルギー効率の低下を抑制するする観点から、光源は、レーザー光源であることが好ましい。レーザー光源は、ＬＥＤのような指向性が低い光源と比較して、より小さい照射スポットで金属膜３０に第１の光δ１を照射することができる。光源は、例えば、レーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオードや水銀灯などのレーザー光源が含まれる。光出射部１５０からの第１の光δ１の中心波長は、例えば、５００〜６５０ｎｍである。光源から出射される第１の光δ１がビームでない場合は、第１の光δ１は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。
【００９３】
第２の光源制御部１５２は、第２の光源ユニット１５１に含まれる各種機器を制御して、第２の光源ユニット１５１からの第１の光δ１の出射を制御する。第２の光源制御部１５２は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００９４】
光検出部１６０は、第１の光δ１が測定チップ１０内で反射することで得られる光δ’を検出する。たとえば、流路４１内に検体が存在する状態では、光検出部１６０は、光出射部１５０が金属膜３０に向けて第１の光δ１を出射したときに、第１の光δ１が流路４１内の検体を透過し、金属膜３０で反射し、かつ流路４１内の検体を再度透過することで得られる第２の光δ２を検出する。光検出部１６０は、検出した光δ’の光量を示す信号を出力する。光検出部１６０は、第２の受光センサー１６１および第２のセンサー制御部１６２を含む。
【００９５】
第２の受光センサー１６１は、測定チップ１０内で反射した第１の光δ１である光δ’を検出する。第２の受光センサー１６１は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、シリコンフォトダイオード（ＳｉＰＤ）などである。
【００９６】
第２のセンサー制御部１６２は、第２の受光センサー１６１の出力値の検出や、当該出力値による第２の受光センサー１６１の感度の管理、適切な出力値を得るための第２の受光センサー１６１の感度の変更などを制御する。第２のセンサー制御部１６２は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００９７】
光出射部１５０（第２の光源ユニット１５１）および光検出部１６０（第２の受光センサー１６１）は、第１の光δ１の光軸と、第１の光δ１の反射光δ’の光軸とを含む平面が流路４１の長手方向に沿うように配置されていることが好ましい。これにより、流路４１の長手方向において、第１の光δ１の照射スポットの位置がずれたとしても、第１の光δ１が流路４１以外の領域に照射されることを抑制することができる。また、第１の光δ１が金属膜３０に対して垂直に入射した場合と比較して、第１の光δ１が金属膜３０に対して斜めから入射した場合には、金属膜３０上における第１の光δ１の照射スポットの形状は、一方向に伸びた形状となる。金属膜３０に対する第１の光δ１の入射角に応じて照射スポットが伸びる方向は、流路４１の長手方向に沿っていることが好ましい。これにより、照射スポットが伸びる方向が流路４１の短手方向に沿う場合と比較して、照射スポットの位置がずれたとしても、第１の光δ１が流路４１（金属膜３０）以外の領域に照射されるのを抑制することができる。なお、照射スポットの位置ずれの原因には、搬送ステージ１４１におけるチップホルダー１４２の位置決め誤差や、チップホルダー１４２に対する測定チップ１０の設置誤差などが含まれる。
【００９８】
制御処理部１７０は、角度調整機構１１２、第１の光源制御部１１３、位置切替え機構１２２、第１のセンサー制御部１２７、ピペット制御部１３５、搬送ステージ１４１、第２の光源制御部１５２および第２のセンサー制御部１６２を制御する。制御処理部１７０は、シグナル検出部１２０（第１の受光センサー１２６）および光検出部１６０（第２の受光センサー１６１）の検出結果を処理する処理部としても機能する。本実施の形態では、制御処理部１７０は、シグナル検出部１２０による蛍光βの検出結果に基づいて、検体中の被測定物質の量を示す測定値を決定する。また、制御処理部１７０は、光検出部１６０による第２の光δ２の検出結果に基づいて検体のヘマトクリット値を決定する。これとともに、制御処理部１７０は、ヘマトクリット値に基づいて上記測定値を補正する。これにより、制御処理部１７０は、血漿または血清中の被測定物質の量（濃度）を決定する。また、制御処理部１７０には、上記の検出結果を処理する際に使用される所定の情報（例えば、種々の変換係数、検量線に関するデータ）などがあらかじめ記録されていてもよい。本実施の形態では、制御処理部１７０には、ヘマトクリット関連値をヘマトクリット値に変換するための係数があらかじめ記録されている。制御処理部１７０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００９９】
（ＳＰＦＳ装置における光路）
図３に示されるように、励起光αは、入射面２１からプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、金属膜３０に全反射角度（ＳＰＲが生じる角度）で入射する。このように、金属膜３０に対して励起光αをＳＰＲが生じる角度で照射することで、金属膜３０上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜３０上に存在する被測定物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光βが放出される。ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光物質から放出された蛍光βの光量（強度）を検出する。なお、特に図示していないが、金属膜３０での励起光αの反射光は、出射面２３でプリズム２０外に出射する。
【０１００】
また、図３に示されるように、本実施の形態では、第１の光δ１は、流路蓋４０を介して流路４１（測定チップ１０）内に入射する。第１の光δ１は、測定チップ１０内で反射する。測定チップ１０内で反射した光は、流路蓋４０を介して流路４１（測定チップ１０）外に出射する。ＳＰＦＳ装置１００は、測定チップ１０から出射した光を検出する。
【０１０１】
（効果）
本実施の形態では、血液が溶血していない状態の第１の検体により、被測定物質の量を示す測定値（蛍光値）を取得し、血液が溶血した状態の第２の検体の検体により、ヘマトクリット関連値を取得し、ヘマトクリット値を決定する。第１の検体中の血液が溶血していないことにより、赤血球中のプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）が赤血球外に流れ出し、被測定物質を分解してしまうのを抑制することができる。この結果として、測定値を高精度に取得することができる。また、第２の検体中の血液が溶血していることにより、赤血球による光の散乱の影響を小さくすることができる。この結果として、ヘマトクリット関連値を高精度に取得し、ヘマトクリット値を高精度に決定することができる。したがって、本実施の形態に係る測定方法では、検体中の被測定物質の量を示す測定値と、ヘマトクリット値とを高精度に測定し、血液を含む検体中の被測定物質の量を高精度に測定できる。
【０１０２】
なお、本実施の形態に係る測定方法では、金属膜３０によって第２の光δ２となる光を流路４１内において往復させる。これにより、金属膜３０による反射を利用しない場合と比較して、第２の光δ２となる光の流路４１内の光路長を長くすることができる。この結果として、検体による光の吸収量を多くして、ヘマトクリット値を高精度に測定できる。これにより、被測定物質の量を高精度に決定することができる。
【０１０３】
また、本実施の形態に係る測定方法では、工程Ｓ１１３２において第２のブランク値を測定し、ノイズ成分の影響を除去することができる（工程Ｓ１１８）。このため、ヘマトクリット値をより高精度に測定することができる。
【０１０４】
また、本実施の形態では、１次反応（工程Ｓ１１４）の前に第２のブランク値の測定（工程Ｓ１１３２）を行った。このため、仮に、１次反応の後の流路４１内の洗浄が十分でなく、流路４１内に血液が残存してしまったとしても、第２のブランク値の測定に、血液の残存による影響が及ばない。このため、ヘマトクリット値を高精度に測定することができる。このような観点から、１次反応（工程Ｓ１１４）の前に第２のブランク値の測定（工程Ｓ１１３２）を行うことは好ましい。
【０１０５】
さらに、本実施の形態では、ＳＰＦＳ法を利用し、測定値として蛍光物質からの蛍光βの蛍光値を測定する態様について説明したが、本発明はこの態様に限定されない。たとえば、ＳＰＲ法を利用し、測定値として励起光αの反射光の光量を測定してもよい。また、本発明は、ＥＬＩＳＡ法やＲＩｆＳ法、ＱＣＭ法などを利用して測定値を取得してもよい。
【０１０６】
［参考実験］
参考実験では、吸光度法、ミクロヘマトクリット法または電気抵抗法を利用して、ヘマトクリット値をそれぞれ測定し、あらかじめ取得しておいた被測定物質の量を示す測定値を当該ヘマトクリット値Ｈｃｔで補正し、それらの測定結果を比較した。
【０１０７】
１．測定値の取得
検体としては、ヘパリンが添加された、心筋トロポニン（ｃＴｎ）Ｉを含む２４種類の全血を使用した。測定値の取得において、当該検体中の血液は溶血していない。吸光度法によるヘマトクリット値を測定する機能を有する高感度自動免疫測定装置（上記実施の形態に係るＳＰＦＳ装置）を用いて、検体中のｃＴｎＩの濃度を測定した。
【０１０８】
２．ミクロヘマトクリット法
血液が溶血していない状態の上記検体をガラス製のキャピラリーに入れ、公知のヘマトクリット遠心分離機（センテック３２２０；株式会社久保田製作所製、「センテック」は同社の登録商標）を用いて、１２０００ｒｐｍで５分間、遠心した。ヘマトクリット遠心分離機に付属の計測器を用いて、遠心後の検体のヘマトクリット値を測定した。次いで、測定したヘマトクリット値に基づいて、検体中のｃＴｎＩの濃度を、血漿中のｃＴｎＩの濃度に補正した。
【０１０９】
３．吸光度法
まず、界面活性剤により血液を溶血させた。次いで、高感度自動免疫測定装置を用いて、血液が溶血した状態の上記検体のヘマトクリット値を吸光度法により測定した。次いで、測定したヘマトクリット値に基づいて、検体中のｃＴｎＩの濃度を、血漿中のｃＴｎＩの濃度に補正した。
【０１１０】
４．電気抵抗法
公知のヘマトクリット分析装置（ｉ−ＳＴＡＴ；アボット  ポイント  オブ  ケア  インコーポレイテッド社製、「ｉ−ＳＴＡＴ」は同社の登録商標）を用いて、血液が溶血していない状態の上記検体のヘマトクリット値を電気抵抗法により測定した。次いで、測定したヘマトクリット値に基づいて、検体中のｃＴｎＩの濃度を、血漿中のｃＴｎＩの濃度に補正した。
【０１１１】
検体Ｎｏ．、検体中のｃＴｎＩ濃度ＷＢ−ｃＴｎＩ、ミクロヘマトクリット法により得られたヘマトクリット値Ｈｃｔおよび血漿中のｃＴｎＩ濃度（補正値Ａ（基準値））と、吸光度法により得られたヘマトクリット値Ｈｃｔ、血漿中のｃＴｎＩ濃度（補正値Ｂ）および基準値に対する補正値Ｂのずれ量ＢｉａｓＢと、電気抵抗法により得られたヘマトクリット値Ｈｃｔ、血漿中のｃＴｎＩ濃度（補正値Ｃ）および基準値に対する補正値Ｃのずれ量ＢｉａｓＣとを表１に示す。表１において、ＢｉａｓＢは、下記式（５）により算出された値であり、ＢｉａｓＣは、下記式（６）により算出された値である。
【数５】
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【数６】
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【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
図４Ａは、吸光度法によって決定された血漿中の被測定物質の量の精度を示すグラフであり、図４Ｂは、電気抵抗法によって決定された血漿中の被測定物質の量の精度を示すグラフである。図４Ａにおいて、横軸は、平均ｃＴｎＩ濃度を示し、縦軸は、補正値Ａ（基準値）に対する補正値Ｂのずれ量であるＢｉａｓＢを示している。図４Ｂにおいて、横軸は、平均ｃＴｎＩ濃度を示し、縦軸は、補正値Ａ（基準値）に対する補正値Ｃのずれ量であるＢｉａｓＣを示している。
【０１１４】
図４Ａおよび表１に示されるように、ＢｉａｓＢは、本実施例で使用したいずれの検体においても５％以内であった。一方、図４Ｂおよび表１に示されるように、ＢｉａｓＣは、本実施例で使用した検体の少なくとも一部において５％超であり、ヘマトクリット値が５０％以上の高いヘマトクリット値を有する検体において、ＢｉａｓＣが大きくなる傾向が確認された。このように、溶血していない血液を含む検体を使用する電気抵抗法と比較して、溶血した血液を含む検体を使用する吸光度法の方が、血漿中の被測定物質の量をより高精度に決定できることがわかる。また、ミクロヘマトクリット法と比較して、吸光度法では、遠心分離装置のような装置を別途準備する必要がなく、被測定物質を測定するための装置内で簡易に高精度な測定が可能である。以上のとおり、本発明によれば、ヘマトクリット値を測定するための装置を別途準備する必要がなく、ヘマトクリット値および被測定物質の量を高精度に決定できることがわかる。
【０１１５】
本出願は、２０１６年８月１８日出願の特願２０１６−１６０７５６に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明に係る被測定物質の測定方法は、被測定物質を高い信頼性で検出することができるため、例えば疾患の検査などに有用である。
【符号の説明】
【０１１７】
１０  測定チップ
２０  プリズム
２１  入射面
２２  成膜面
２３  出射面
３０  反射部
３０  金属膜
４０  流路蓋
４１  流路
５０  液体チップ
１００  ＳＰＦＳ装置
１１０  励起光出射部
１１１  第１の光源ユニット
１１２  角度調整機構
１１３  第１の光源制御部
１２０  シグナル検出部
１２１  受光光学系ユニット
１２２  位置切替え機構
１２３  第１のレンズ
１２４  光学フィルター
１２５  第２のレンズ
１２６  第１の受光センサー
１２７  第１のセンサー制御部
１３０  送液部
１３１  ピペット
１３２  シリンジポンプ
１３３  ノズルユニット
１３４  ピペットチップ
１３５  ピペット制御部
１４０  搬送部
１４１  搬送ステージ
１４２  チップホルダー
１５０  光出射部
１５１  第２の光源ユニット
１５２  第２の光源制御部
１６０  光検出部
１６１  第２の受光センサー
１６２  第２のセンサー制御部
１７０  制御処理部
α  励起光（第４の光）
β  蛍光
γ  プラズモン散乱光
δ１  第１の光
δ’  測定チップ内での第１の光の反射光
δ２  第２の光
δ３  第３の光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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