(57)【要約】  Ｔｉｅ２活性化効果、血管透過性抑制効果、血管の成熟化効果、血管の正常化効果、血管の安定化効果、リンパ管の安定化効果などを有する組成物等を提供する。  新規なイリドイド化合物（Compound A、Compound B）、オレアノシドＡ、及びケンフェロールからなる群から選択される１以上の成分を組成物に含有させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｉ）で表される化合物、下記（ＩＩ）で表される化合物、下記（ＩＩＩ）で表される化合物（Oleanoside A）、下記（ＩＶ）で表される化合物（Kaempferol）、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を含有する、Ｔｉｅ２活性化用組成物：
【化１】
2017183581.tif 000015
【化２】
2017183581.tif 000016
【化３】
2017183581.tif 000017
【化４】
2017183581.tif 000018
【請求項２】
前記（Ｉ）で表される化合物、前記（ＩＩ）で表される化合物、前記（ＩＩＩ）で表される化合物（Oleanoside A）、前記（ＩＶ）で表される化合物（Kaempferol）、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を含有する、血管透過性抑制用組成物。
【請求項３】
前記（Ｉ）で表される化合物、前記（ＩＩ）で表される化合物、前記（ＩＩＩ）で表される化合物（Oleanoside A）、前記（ＩＶ）で表される化合物（Kaempferol）、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を含有する、血管の成熟化用組成物。
【請求項４】
前記（Ｉ）で表される化合物、前記（ＩＩ）で表される化合物、前記（ＩＩＩ）で表される化合物（Oleanoside A）、前記（ＩＶ）で表される化合物（Kaempferol）、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を含有する、血管の正常化用組成物。
【請求項５】
前記（Ｉ）で表される化合物、前記（ＩＩ）で表される化合物、前記（ＩＩＩ）で表される化合物（Oleanoside A）、前記（ＩＶ）で表される化合物（Kaempferol）、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を含有する、血管の安定化用組成物。
【請求項６】
前記（Ｉ）で表される化合物、前記（ＩＩ）で表される化合物、前記（ＩＩＩ）で表される化合物（Oleanoside A）、前記（ＩＶ）で表される化合物（Kaempferol）、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を含有する、リンパ管の安定化用組成物。
【請求項７】
血管透過性抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、血管の安定化作用、又はリンパ管の安定化作用が、Ｔｉｅ２活性化作用に起因するものである、請求項２〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
食品組成物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
飲料組成物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｔｉｅ２を活性化することにより発揮される機能、血管透過性抑制により発揮される機能、血管の成熟化により発揮される機能、血管の正常化により発揮される機能、血管の安定化により発揮される機能、及びリンパ管安定化により発揮される機能からなる群から選択される１以上の機能の表示を付した、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
機能表示が、「血管透過性亢進を抑制する」、「血管内因子の血管外への漏出を抑制する」、「血管を正常な状態に改善する」、「血管を正常な状態に維持する」、「血管内皮細胞同士の乖離を抑制する」、「血管内皮細胞の細胞死を抑制する」、及び「組織間液の速やかな回収機能を保持する」からなる群から選択される１以上である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｔｉｅ２活性化のための、前記（Ｉ）で表される化合物、前記（ＩＩ）で表される化合物、前記（ＩＩＩ）で表される化合物（Oleanoside A）、前記（ＩＶ）で表される化合物（Kaempferol）、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の使用。
【請求項１３】
前記（Ｉ）で表される化合物、前記（ＩＩ）で表される化合物、前記（ＩＩＩ）で表される化合物（Oleanoside A）、前記（ＩＶ）で表される化合物（Kaempferol）、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上を有効成分として使用する、Ｔｉｅ２を活性化する方法。
【請求項１４】
下記式（Ｉ）
【化５】
2017183581.tif 000019
で表される化合物。
【請求項１５】
下記式（ＩＩ）
【化６】
2017183581.tif 000020
で表される化合物。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載の化合物を含有する組成物。
【請求項１７】
請求項１４及び１５に記載の化合物を含有する組成物。
【請求項１８】
食品組成物である、請求項１６又は１７に記載の組成物。
【請求項１９】
飲料組成物である、請求項１６又は１７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｉｅ２活性化用組成物等に関する。より詳しくは、本発明は、新規イリドイド化合物（Compound A及びCompound B）、オレアノシドＡ（Oleanoside A）、及びケンフェロール（Kaempferol）からなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、Ｔｉｅ２活性化用組成物、血管透過性抑制用組成物、血管の成熟化用組成物、血管の正常化用組成物、血管の安定化用組成物、及びリンパ管安定化用組成物に関する。また、本発明は、新規イリドイド化合物（Compound A及びCompound B）及び当該化合物を含有する組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
オリーブ（Olea europaea）は、モクセイ科オリーブ属に属する植物で、地中海地域をはじめとして広く栽培され、その果実はオリーブ油の抽出や食用として全世界で幅広く利用されている。【０００３】
オリーブの果実には、ヒドロキシチロソール、アクテオシド、オレウロペイン等のポリフェノールが豊富に含まれており（非特許文献１、２）、オリーブ抽出物やそのポリフェノール成分は、動脈硬化抑制作用（非特許文献３）、高血圧抑制作用（特許文献１）、骨重量減少抑制作用（非特許文献４）等を有することが報告されている。【０００４】
近年、血管の老化や機能低下が、しわや肌荒れ等の皮膚性状に影響することが見出され、血管の正常度が皮膚性状を判断する指標として有効であることが知られている。この血管は、血液を通して全身の臓器に酸素や栄養素を送るだけでなく、組織中からの老廃物を運び体外へ排泄する役割を担っており、人体が生命活動を維持するにあたって重要な組織である。一般的に血管の老化や機能の破綻は、動脈硬化に代表されるような人体の健康に大きな影響があるものから、しわやむくみなど外見的な所見にも繋がる。近年、この血管の老化に対して、受容体型チロシンキナーゼＴｉｅ２（Tyrosine kinase with Ig and ECF homology domain 2）の活性化が注目されている。血管の壁細胞からのアンジオポエチン−１によってＴｉｅ２が活性化を受けると血管内皮の細胞間の接着が誘導され、血管内皮細胞の安定化に寄与することが知られている。近年、このＴｉｅ２活性化作用を有する成分や食品が見出されており、サプリメントや飲料等で利用され、美容やむくみ予防、冷え性予防等を目的に用いられている（特許文献２〜４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−３３４０２２号公報
【特許文献２】特開２０１４−０９７９７７号公報
【特許文献３】特開２０１３−２４１３５６号公報
【特許文献４】特開２０１１−１０２２７２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Agric. Food Chem., vol.52， pp479-484， 2004
【非特許文献２】J. Agric. Food Chem., vol.53, pp8963-8969, 2005、
【非特許文献３】Atherosclerosis， vol.188， No.1, pp35-42， 2006
【非特許文献４】Clin. Nutr., vol.25, No.5, 859-868, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、Ｔｉｅ２活性化効果、血管透過性抑制効果、血管の成熟化効果、血管の正常化効果、血管の安定化効果、及びリンパ管の安定化効果等を有する組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を行った結果、オリーブ果実エキスから単離した成分の内、オレアノシドＡ、及びケンフェロールがＴｉｅ２活性化作用、血管透過性抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、血管の安定化作用、及びリンパ管安定化作用等を有することを新たに見出した。さらに、前記オリーブ果実エキスから新規イリドイド化合物（Compound A及びCompound B）を見出すと共に、当該新規化合物もＴｉｅ２活性化作用、血管透過性抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、血管の安定化作用、及びリンパ管安定化作用等を有することを明らかにし、本発明を完成させるに至った。【０００９】
即ち、本発明の態様には、これらに限定されるわけではないが、以下の発明が含まれる。
（１）下記（Ｉ）で表される化合物、下記（ＩＩ）で表される化合物、下記（ＩＩＩ）で表される化合物（Oleanoside A）、下記（ＩＶ）で表される化合物（Kaempferol）、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を含有する、Ｔｉｅ２活性化用組成物：
【化１】
2017183581.tif 000002
【化２】
2017183581.tif 000003
【化３】
2017183581.tif 000004
【化４】
2017183581.tif 000005
（２）前記（Ｉ）で表される化合物、前記（ＩＩ）で表される化合物、前記（ＩＩＩ）で表される化合物（Oleanoside A）、前記（ＩＶ）で表される化合物（Kaempferol）、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を含有する、血管透過性抑制用組成物。
（３）前記（Ｉ）で表される化合物、前記（ＩＩ）で表される化合物、前記（ＩＩＩ）で表される化合物（Oleanoside A）、前記（ＩＶ）で表される化合物（Kaempferol）、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を含有する、血管の成熟化用組成物。
（４）前記（Ｉ）で表される化合物、前記（ＩＩ）で表される化合物、前記（ＩＩＩ）で表される化合物（Oleanoside A）、前記（ＩＶ）で表される化合物（Kaempferol）、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を含有する、血管の正常化用組成物。
（５）前記（Ｉ）で表される化合物、前記（ＩＩ）で表される化合物、前記（ＩＩＩ）で表される化合物（Oleanoside A）、前記（ＩＶ）で表される化合物（Kaempferol）、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を含有する、血管の安定化用組成物。
（６）前記（Ｉ）で表される化合物、前記（ＩＩ）で表される化合物、前記（ＩＩＩ）で表される化合物（Oleanoside A）、前記（ＩＶ）で表される化合物（Kaempferol）、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を含有する、リンパ管の安定化用組成物。
（７）血管透過性抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、血管の安定化作用、又はリンパ管の安定化作用が、Ｔｉｅ２活性化作用に起因するものである、（２）〜（６）のいずれかに記載の組成物。
（８）食品組成物である、（１）〜（７）のいずれかに記載の組成物。
（９）飲料組成物である、（１）〜（７）のいずれかに記載の組成物。
（１０）Ｔｉｅ２を活性化することにより発揮される機能、血管透過性抑制により発揮される機能、血管の成熟化により発揮される機能、血管の正常化により発揮される機能、血管の安定化により発揮される機能、及びリンパ管安定化により発揮される機能からなる群から選択される１以上の機能の表示を付した、（１）〜（９）のいずれかに記載の組成物。
（１１）機能表示が、「血管透過性亢進を抑制する」、「血管内因子の血管外への漏出を抑制する」、「血管を正常な状態に改善する」、「血管を正常な状態に維持する」、「血管内皮細胞同士の乖離を抑制する」、「血管内皮細胞の細胞死を抑制する」、及び「組織間液の速やかな回収機能を保持する」からなる群から選択される１以上である、（１０）に記載の組成物。
（１２）Ｔｉｅ２活性化のための、前記（Ｉ）で表される化合物、前記（ＩＩ）で表される化合物、前記（ＩＩＩ）で表される化合物（Oleanoside A）、前記（ＩＶ）で表される化合物（Kaempferol）、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の使用。
（１３）前記（Ｉ）で表される化合物、前記（ＩＩ）で表される化合物、前記（ＩＩＩ）で表される化合物（Oleanoside A）、前記（ＩＶ）で表される化合物（Kaempferol）、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上を有効成分として使用する、Ｔｉｅ２を活性化する方法。
（１４）下記式（Ｉ）    
【化５】
2017183581.tif 000006
で表される化合物。
（１５）下記式（ＩＩ）      
【化６】
2017183581.tif 000007
で表される化合物。
（１６）（１４）又は（１５）に記載の化合物を含有する組成物。
（１７）（１４）及び（１５）に記載の化合物を含有する組成物。
（１８）食品組成物である、（１６）又は（１７）に記載の組成物。
（１９）飲料組成物である、（１６）又は（１７）に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、新規イリドイド化合物（Compound A及びCompound B）、オレアノシドＡ、ケンフェロール、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する組成物は、Ｔｉｅ２活性化作用、血管透過性抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、血管の安定化作用、及びリンパ管安定化作用を発揮することができる。また、本発明による血管の正常化等により血管内皮細胞同士の連結が強固になることで、血管を介して肌に栄養が行き渡り、肌のハリやキメの改善、しわ防止などの美容効果が得られる。また、血管やリンパ管の内皮細胞の隙間が塞がれることにより血流が改善し、組織中からの水分や老廃物が回収されて、冷え、肩こり、むくみ、クマなどの諸症状の改善効果や予防効果も得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、新規イリドイド化合物（Compound A及びCompound B）、オレアノシドＡ、及びケンフェロールの化学構造を示す。
【図２】図２は、オリーブ果実抽出物の精製フローを示す。
【図３】図３は、新規イリドイド化合物（Compound A）とメガリトラクトノール（Megaritolactonol）の１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲシグナルを示す。
【図４】図４は、新規イリドイド化合物（Compound A）の二次元ＮＭＲ解析結果を示す。具体的には、シフト相関スペクトル解析として、１Ｈ−１Ｈシフト相関二次元ＮＭＲ（1H-1H correlation spectroscopy (COSY)）解析及び１Ｈ−１３Ｃロングレンジシフト相関二次元ＮＭＲ（1H-detected heteronuclear multiple bond connectivity (HMBC)）解析を行った結果を示す。
【図５】図５は、新規イリドイド化合物（Compound B）とオレアノシドＡ（Oleanoside A）の１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲシグナルを示す。
【図６】図６は、新規イリドイド化合物（Compound B）の二次元ＮＭＲ解析結果を示す。具体的には、シフト相関スペクトル解析として、１Ｈ−１３Ｃロングレンジシフト相関二次元ＮＭＲ（1H-detected heteronuclear multiple bond connectivity (HMBC)）解析を行った結果を示す。
【図７】図７は、新規イリドイド化合物（Compound A及びCompound B）、オレアノシドＡ、ケンフェロール、ヒドロキシチロソール、及びチロソールのＴｉｅ２活性化効果を対照群（DMSO）と比較した結果を示す。
【図８】図８は、血管透過性因子である血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）によって引き起こされる血管透過性の亢進に対する、新規イリドイド化合物（Compound A及びCompound B）の抑制効果を評価した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．組成物
１−１．組成物
本発明の一態様は、Compound A、Compound B、オレアノシドＡ、ケンフェロール、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する組成物である。本発明の組成物に含まれる有効成分は、下記式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表される化合物である。
【００１３】
【化７】
2017183581.tif 000008
【００１４】
【化８】
2017183581.tif 000009
【００１５】
【化９】
2017183581.tif 000010
【００１６】
【化１０】
2017183581.tif 000011
【００１７】
前記式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物は新規イリドイド化合物である。前記式（Ｉ）の化合物は、ＩＵＰＡＣ名で２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エチル（Ｅ）−２−（５−エチリデン−２−オキソテトラヒドロピラン−４−イル）アセテート（2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl (E)-2-(5-ethylidene-2-oxotetrahydropyran-4 -yl)acetate）と表され、本明細書においては「Compound A」と記載される場合がある。また、前記式（ＩＩ）の化合物は、ＩＵＰＡＣ名で２−（３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシメチル−５−メトキシカルボニル−２−メチル−２Ｈ−ピラン−４−イル）酢酸（2-(3,4-dihydro-3-hydroxymethyl-5-methoxycarbonyl-2-methyl-2H-pyran-4-yl)acetic acid）と表され、本明細書においては「Compound B」と記載される場合がある。また、前記式（ＩＩＩ）で表される化合物はオレアノシドＡ（Oleanoside A）であり、前記式（ＩＶ）で表される化合物はケンフェロール（Kaempferol）である。
【００１８】
本発明における前記化合物は、薬理学的に許容される任意の塩（無機塩及び有機塩を含む）の形態であってもよい。本明細書において「塩」とは、薬理学的に許容される任意の塩（無機塩及び有機塩を含む）をいい、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩、有機酸塩（酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、ピクリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩等）等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物の塩は、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に調製され得る。
【００１９】
１−２．本発明の組成物に含まれる有効成分の単離・合成 
本発明の組成物に含まれる有効成分（Compound A、Compound B、オレアノシドＡ、ケンフェロール、及び／又はそれらの塩）は、天然物から抽出・単離して製造しても、化学的な合成法により製造してもよく、特に限定されない。本発明の組成物に含まれる有効成分を天然物から製造する場合、原料として用いる天然物は特に限定されないが、例えば、オリーブを用いることが好ましい。オリーブはモクセイ科の植物であり、主原料としてオリーブの果実を用いることができるが、葉、種子、茎等が混在していてもよい。オリーブ果実を原料として用いる場合、生のままで用いてもよいし、凍結乾燥等によって乾燥したものを用いてもよい。また、オリーブ果実から油を搾った後の残滓も、そのまま、あるいは乾燥した状態で用いることができる。オリーブ果実から得られる液相を油層と水層に分離して得られる水層であるオリーブ果汁のみを原料とすることが好ましい。
【００２０】
また、オリーブの品種は特に限定されないが、例えばマンザニロ、ルッカ、ネバディロ・ブランコ、ミッション、ピクアル、アルベキナ、オヒブランカ、コルニカブラ、ゴルダル、モロイオロ、フラントイオ、コラティーナ、レッチーノ等の品種を好適に使用することができる。
【００２１】
ここで、本発明において「オリーブ果汁」とは、オリーブ果実エキスから得られる液相を油層と水層に分離して得られる水層から得られるエキスをいう。オリーブ果実エキスは、例えば、オリーブから水性溶剤を用いて抽出することもできる。水性溶剤としては、水、アルコール類（例えば、エタノール）が挙げられる。オリーブ果実エキスは、オリーブ果汁や水性溶剤抽出物をそのまま用いてもよく、これらをろ過後、吸着カラムにてポリフェノールを濃縮して噴霧乾燥させて得られる抽出物を用いてもよい。  オリーブ果実エキスは、オリーブ果実を分離・精製する工程を経て得ることができる。オリーブ果実の分離工程では、原料であるオリーブ果実を圧搾し、遠心分離によって油分と果汁に分離し、オリーブ果汁を得ることができ、圧搾・遠心分離は当業者に公知の方法を用いて行うことができる。精製工程では、分離工程で得たオリーブ果汁をろ過・濃縮することにより得られるエキスを、本発明におけるオリーブ果実エキスとして用いることができる。また、オリーブ果汁のろ過により得られたろ液を、吸着樹脂を充填したカラムに付加し、糖類やミネラル、有機酸など吸着樹脂に非吸着な成分を除いた後、水性溶剤（例えば、水、エタノール、又はこれらの混合物）を用いて溶出した溶出液をオリーブ果実エキスとして用いてもよい。吸着樹脂の種類やカラムの溶出溶媒は、使用するオリーブの品種、形態等に応じて、当業者は適宜その条件を設定することができる。
【００２２】
天然物由来の原料からの本発明の組成物に含まれる有効成分の抽出は、溶媒を用いて行うことができるがこれに限定されない。本発明の組成物に含まれる有効成分が抽出できる限り、いずれの溶媒を用いてもよく、水、緩衝液等の水溶液、有機溶媒、又はこれらの組み合わせ等を用いることができる。有機溶媒は、一般的に用いられるものであればよく、例えば、アルコール類やケトン類を用いることができる。アルコール類としては、例えば、低級アルコール類（メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール等）、及び液状多価アルコール（１，３−ブチレンアルコール、プロピレングリコール、グリセリン等）が挙げられる。好ましくは、含水低級アルコール類又は低級アルコール類を用いる。ケトン類としては、例えば、アセトン、ブタノン等が挙げられる。溶媒の使用量は、処理する原料の量及び原料中の目的化合物の含量等に応じて、適宜設定することができるが、例えば、原料１ｇに対して、１．０〜１０００ｍＬ、好ましくは２．０〜５００ｍＬ、さらに好ましくは５．０〜１００ｍＬの溶媒を使用してもよい。
【００２３】
本発明の組成物に含まれる有効成分は、原料からの抽出後に必要に応じて、更に精製して純度を高めることができる。精製はいずれの手法で行ってもよく、例えば、クロマトグラフィーにより行うことができる。クロマトグラフィーとして、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、親水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等が例示されるが、これらに限定されない。そして、標品の純度は、高速液体クロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィーと質量分析器を組み合わせたＬＣ−ＭＳにより確認することができるが、これに限定されない。さらに、本発明の組成物に含まれる有効成分の化学構造は、核磁気共鳴（Nuclear Magnetic Resonance：ＮＭＲ）やマススペクトル等により解析することができる。なお、本発明の組成物には、天然において存在する動植物自体で、全く加工されていないものは含まれない。
【００２４】
本発明の組成物に含まれる有効成分を化学的に合成する場合、入手可能な化合物を出発原料として、一般的に知られた有機化学の手法を適宜選択することにより、本発明の化合物を製造することができる。
【００２５】
１−３．Ｔｉｅ２活性化用組成物等
本発明の一態様は、Compound A、Compound B、オレアノシドＡ、ケンフェロール、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有するＴｉｅ２活性化用組成物である。
【００２６】
本発明において「Ｔｉｅ２活性化用組成物」とは、Ｔｉｅ２をリン酸化することで、その活性体（リン酸化Ｔｉｅ２）に変換できる能力を有する組成物をいう。毛細血管の構造の安定化には血管内皮細胞に存在するＴｉｅ２と呼ばれる受容体の活性化が重要な役割を果たしている。このＴｉｅ２は血管内皮細胞のほかリンパ管内皮細胞にも存在が示され、壁細胞から放出されるアンジオポエチン−１によって活性化され、内皮細胞同士の接着や壁細胞との接着を強め、血管構造の安定化に関与している。このＴｉｅ２の活性は、例えば年齢と共に低下するという知見も報告され、それに伴い血管やリンパ管も老化することが明らかとなっている。従って、本発明におけるＴｉｅ２活性化組成物は、Ｔｉｅ２活性化作用により血管やリンパ管の老化を予防し、改善することができる。
【００２７】
また、血管の老化によって血管構造が不安定になると、血管から血漿成分などの栄養成分が漏出し、必要な個所に必要な成分が運ばれなくなる。その結果、肌状態の低下など、様々なトラブルが生じることが考えられる。従って、本発明におけるＴｉｅ２活性化組成物は、Ｔｉｅ２活性化作用により血管内皮細胞を安定化し、血管透過抑制作用を発揮することができる。そして血管の内皮細胞がしっかりと結びつくことにより肌に栄養が行き渡り、肌のハリやキメの改善、しわ防止などの美容効果が得られる。さらに、血管やリンパ管の内皮細胞の隙間が塞がれることにより血流が改善し、組織中からの水分や老廃物が回収されて、冷え、肩こり、むくみ、クマなどの諸症状を改善し、予防する効果が得られる。従って、本発明は、Compound A、Compound B、オレアノシドＡ、ケンフェロール、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有するＴｉｅ２活性化用組成物であって、血管透過性抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、血管の安定化作用、又はリンパ管安定化作用を有する前記組成物であってもよい。
【００２８】
本発明の別の態様として、血管透過性抑制用組成物、血管の成熟化用組成物、血管の正常化用組成物、血管の安定化用組成物、リンパ管安定化用組成物などが挙げられる。これらの組成物は、Compound A、Compound B、オレアノシドＡ、ケンフェロール、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有することが好ましい。
【００２９】
本発明において、「血管透過性抑制」とは、VEGF（血管内皮成長因子）などによって引き起こされる血管透過性の亢進を抑制することをいう。「血管の成熟化」とは、血管内皮細胞と血管壁細胞との接着を誘導して、血管内環境因子が容易には血管外に漏出しないような血管内皮細胞間の接着斑を形成することをいう。「血管の正常化」とは、血管内皮細胞同士の接着を高め、血管壁細胞の血管内皮細胞への裏打ちを促進することにより、血管透過性の破綻した血管や血管の無秩序な増生を招くような異常な血管を、正常な状態にすることをいう。「血管の安定化」とは、既存の血管に対する傷害、血管内皮細胞同士の乖離、及び血管内皮細胞と血管壁細胞の乖離を抑制する作用、及び血管内皮細胞の細胞死を抑制することをいう。「リンパ管安定化」とは、リンパ管内皮細胞が適切に配置して裏打ちされるようリンパ管を安定化し、組織間液の速やかな回収機能を保持することをいう。
【００３０】
１−４．組成物中の有効成分の含有量
本発明の組成物におけるCompound A、Compound B、オレアノシドＡ、ケンフェロール、及びそれらの塩の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、本発明の所望の効果が得られるような量であればよく、特に限定されるものではない。例えば、有効成分としてCompound Aを用いる場合、本発明の組成物におけるCompound Aの含有量は、組成物全体量に対して、０．０１重量％〜９９重量％、好ましくは０．１重量％〜５０重量％、より好ましくは１重量％〜３０重量％、さらにより好ましくは１０重量％〜３０重量％である。有効成分としてCompound Bを用いる場合、本発明の組成物におけるCompound Bの含有量は、組成物全体量に対して、０．０１重量％〜９９重量％、好ましくは０．１重量％〜５０重量％、より好ましくは１重量％〜３０重量％、さらにより好ましくは１０重量％〜３０重量％である。有効成分としてオレアノシドＡを用いる場合、本発明の組成物におけるオレアノシドＡの含有量は、組成物全体量に対して、０．０１重量％〜９９重量％、好ましくは０．１重量％〜５０重量％、より好ましくは１重量％〜３０重量％、さらにより好ましくは１０重量％〜３０重量％である。有効成分としてケンフェロールを用いる場合、本発明の組成物におけるケンフェロールの含有量は、組成物全体量に対して、０．００１重量％〜９９重量％、好ましくは０．０１重量％〜５０重量％、より好ましくは０．１重量％〜３０重量％、さらにより好ましくは１重量％〜３０重量％である。本明細書において用いる「重量％」は、特に断りがない限り、重量／重量（ｗ／ｗ）の重量％を意味する。また、各種有効成分が塩や水和物などの形態にある場合は、これを遊離体（フリー体）に換算した上で上記含有量を算出するものとする。
【００３１】
Compound A、Compound B、オレアノシドＡ、ケンフェロール、及びそれらの塩の含有量は、当業者に公知の方法に従って測定することができる。例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＨＰＬＣなどを用いて、有効成分の種類などに応じた適宜条件を設定して測定することができる。
【００３２】
１−５．他の成分
本発明の組成物は、その形態に応じて、有効成分の他に、任意の添加剤や成分を含有することができる。これらの添加剤及び／又は成分は特に限定されないが、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、酸化防止剤、防腐剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、香料などの添加物を使用できる。例えば、Ｌ−アスコルビン酸、カテキン、デキストリン、シクロデキストリン、炭酸カルシウム、トレハロースなどを使用することができる。また、組成物には公知の成分を含有してもよく、血管の加齢防止や美容に有効であることが公知の成分を含有してもよい。例えば、Ｔｉｅ２活性化作用が報告されているキラヤ、黄杞、銀杏、牡蠣、ウコン、菊、ナツメ、クコ、カミツレ、ブッチャーブルーム、サンザシ、スターフルーツ、ゲットウ、ハス、ルイボス、インディアンデーツ、カリン、シジュウムグァバ、ヒハツ、シベリアニンジン、マンゴージンジャー、高麗ニンジン、アキグミ、オカヒジキ、ハリギリ、リョウブ、ヤブカンゾウ、ハスイモ、ミツバウツギ、クサギ、ムベ、サンショウソウ、コナラ、クヌギ、アキノノゲシ、スイショウガキ、オオバコ、ノビル、ヤマモモ、ニッケイ、ソウカクシ、オウセイ、ギョクチク、カロニン、ハゲキテンの抽出物や血管内皮改善に効果があるプロシアニジンを含有するブドウ種子や松樹皮、ピーナッツ種皮、ライチ種皮などの抽出物やＬ−シトルリン、Ｌ−アルギニンなどのアミノ酸を使用することができる。
【００３３】
１−６．用途
本発明の組成物は、前述の通り様々な生理作用を示し得る。例えば、本発明の組成物を適用することで、血管透過性抑制効果、血管の成熟化効果、血管の正常化効果、血管の安定化効果、リンパ管安定化効果、Ｔｉｅ２活性化効果などが発揮され、これにより肌のハリ・キメの改善、しわ防止などの美容効果、冷え・肩こり・むくみ・クマなど改善・予防効果を得ることもできる。
【００３４】
本発明の組成物は、治療的用途（医療用途）又は非治療用途（非医療用途）のいずれにも適用することができる。かかる組成物としては、医薬品（医薬組成物）、飲食品（食品、飲料、飲食品組成物、食品組成物、飲料組成物を含む）、化粧品（化粧用組成物）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明の組成物は、公知の方法に従って、錠剤（被覆錠剤を含む）、顆粒剤、散剤、粉末剤、又はカプセル剤などの固形剤や、経口液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、又はドリンク剤などの液剤等に製剤化した剤として提供することができる。これらの剤はそのまま、或いは水等と共に服用することができる。また、容易に配合することが出来る形態（例えば、粉末形態や顆粒形態）に調製後、例えば、医薬品や飲食品の原材料として用いることができるが、本形態に限定されるものではない。  本発明の組成物は、化粧品（化粧用組成物）としての剤形も目的に応じて任意に選択することができ、例えば、クリーム、軟膏、乳液、溶液、ゲル、粉剤及び顆粒剤などの剤形やパック、ローション、パウダー及びスティック等の形態とすることができる。その製剤形態も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油２層系及び水−油−粉末３層系など、幅広い形態とすることができる。即ち、基礎化粧料であれば、洗顔料、化粧水、ローション、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック、マスク、マッサージ剤、ファンデーション、口紅、入浴剤、シャンプー、ヘアコンディショナー、ヘアトニック、軟膏、ペースト及びシート状製品（サニタリー用品などの吸収性物品、おしり拭き及びウェットティッシュ等）などの形態に広く利用可能である。そして、本発明の剤形及び形態に限定されるものではない。また、これらの剤型とするにあたって、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、ｐＨ調整剤、色素及び香料などを適宜配合することができる。
【００３６】
本発明の飲料の具体例としては、烏龍茶飲料、紅茶飲料、緑茶飲料、果汁飲料、野菜ジュース、スポーツドリンク、アイソトニック飲料、エンハンスドウォーター、ミネラルウォーター、ニアウォーター、栄養ドリンク剤、美容ドリンク剤、又は各種アルコール飲料などを挙げることができる。
【００３７】
また、本発明の飲料は、必要に応じて殺菌等の工程を経て、容器詰め飲料とされる。例えば、飲料を容器に充填した後に加熱殺菌等を行う方法や、飲料を殺菌してから無菌環境下で容器に充填する方法により、殺菌された容器詰め飲料を製造することができる。
【００３８】
容器詰め飲料に用いる容器の種類は特に制限されず、例えば、ペットボトルなどの樹脂製容器、紙パックなどの紙容器、ガラス瓶などのガラス容器、アルミ缶やスチール缶などの金属製容器、アルミパウチなど、通常、飲料に用いられる容器であればいずれも用いることができる。
【００３９】
本発明の飲食品は特に限定されないが、例えば、健康食品、機能性食品（特定保健用食品、条件付き特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品が含まれる）、特別用途食品、又は健康補助食品などが挙げられる。本発明の飲食品における前記有効成分の含有量は組成物について上記した通りである。
【００４０】
本発明の飲食品は、例えば、公知の飲食品を調製する際に、その原材料に前記有効成分を所定量混合して、公知の飲食品の製造方法に従って調製してもよく、また、既製の公知の飲食品に、前記有効成分を前記所定量となるように添加することで調製してもよい。尚、公知の飲食品が、前記有効成分を元来含有するものであってもよく、前記有効成分が前記所定量となるのであれば、適宜配合して調製することができる。
【００４１】
本発明の組成物は、その形態に応じた適当な方法で適用することができる。適用方法は、本発明に係る有効成分が循環血中に移行できるのであれば特に限定はない。例えば、経口用固形製剤、内服液剤若しくはシロップ剤等の経口用液体製剤、又は注射剤、外用剤、坐剤若しくは経皮吸収剤などの非経口用製剤などの形態とすることができるが、これらに限定されない。なお、本明細書において「適用」とは、摂取、服用、飲用、経皮吸収などの全態様を含むものとして用いられる。  本発明の組成物の適用量は、その形態、投与方法、使用目的及び投与対象である患者又は患獣の年齢、体重、症状によって適時設定され、一定ではない。本発明の組成物の有効ヒト摂取量も一定ではなく、特に限定されない。本発明の組成物の有効ヒト摂取量は、例えば、体重５０ｋｇのヒトで一日あたり０．１ｍｇ〜４００ｍｇ（０．００２ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ）、好ましくは１ｍｇ〜３００ｍｇ（０．０２ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ）、より好ましくは１０ｍｇ〜２００ｍｇ（０．２ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇ）である。尚、本発明の組成物の適用は所望の摂取量範囲内において、１日内において単回又は数回に分けて行ってもよい。適用期間も任意である。尚、本発明の組成物の有効ヒト摂取量とは、ヒトにおいて有効な効果を示す本発明の組成物の摂取量のことであり、当該組成物に含まれる有効成分の種類は特に限定されない。
【００４２】
本発明の組成物の適用対象は、好ましくはヒトであるが、ウシ、ウマ、ヤギ等の家畜動物、イヌ、ネコ、ウサギ等のペット動物、又は、マウス、ラット、モルモット、サル等の実験動物であってもよい。ヒト以外の動物を対象に適用する場合、マウス１個体（約２０ｇ）当たりの１日適用量は、組成物中の有効成分の含有量、適用対象者の状態、体重、性別及び年齢等の条件により異なるが、例えば０．００２ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０２ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇである。  本発明は、別の側面では、血管透過性抑制、血管の成熟化、血管の正常化、血管の安定化、リンパ管安定化、又はＴｉｅ２活性化により発揮される機能の表示を付した、前記本発明の剤を含有する組成物に関する。このような表示又は機能表示は特に限定されないが、例えば、「血管透過性亢進を抑制する」、「血管内因子の血管外への漏出を抑制する」、「血管を正常な状態に改善する」、「血管を正常な状態に維持する」、「血管内皮細胞同士の乖離を抑制する」、「血管内皮細胞の細胞死を抑制する」、又は「組織間液の速やかな回収機能を保持する」など、或いは、これらと同視できる表示又は機能表示が挙げられる。本明細書において、当該表示及び機能表示のような表示は、組成物自体に付されてもよいし、組成物の容器又は包装に付されていてもよい。
【００４３】
２．Ｔｉｅ２を活性化するための使用
本発明の一態様は、Compound A，Compound B、オレアノシドＡ、ケンフェロール、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上のものの、血管透過性抑制、血管の成熟化、血管の正常化、血管の安定化、リンパ管安定化、又はＴｉｅ２活性化のための使用であり、好ましくはＴｉｅ２活性化のための使用である。
【００４４】
また、本発明の使用により、Ｔｉｅ２が活性化されることで、血管透過性抑制効果、血管の成熟化効果、血管の正常化効果、血管の安定化効果、リンパ管安定化効果等を得ることもできる。当該使用は、ヒト又は非ヒト動物における使用であり、治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。ここで、「非治療的」とは、医療行為、即ち、治療による人体への処理行為を含まない概念である。
【００４５】
３．Ｔｉｅ２を活性化する方法
本発明の一態様は、Compound A，Compound B、オレアノシドＡ、ケンフェロール、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上を有効成分として使用する、Ｔｉｅ２活性化方法である。具体的には、本発明の一態様は、Ｔｉｅ２活性化を必要とする対象に、前記有効成分の治療有効量を投与することを含む、Ｔｉｅ２を活性化する方法を提供するものである。尚、Ｔｉｅ２活性化を必要とする対象とは、組成物に関して前記した通りである。
【００４６】
また、本発明の一態様は、Compound A，Compound B、オレアノシドＡ、ケンフェロール、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上を有効成分として使用する、血管透過性抑制、血管の成熟化、血管の正常化、血管の安定化、又はリンパ管安定化のための方法でもある。
【００４７】
また、本明細書において治療有効量とは、Compound A，Compound B、オレアノシドＡ、ケンフェロール、及びそれらの塩からなる群から選択される１以上を上記対象に摂取させた場合に、摂取していない対象と比較して、Ｔｉｅ２活性化が得られる量のことである。具体的な有効量としては、投与形態、投与方法、使用目的及び対象の年齢、体重、症状等によって適時設定され一定ではない。
【００４８】
本発明の方法においては、前記治療有効量となるよう、前記有効成分をそのまま、或いは、前記有効成分を含有する組成物として投与してもよい。
【００４９】
４．新規イリドイド化合物
本発明の一態様は、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される新規イリドイド化合物である。
【００５０】
【化１１】
2017183581.tif 000012
【００５１】
【化１２】
2017183581.tif 000013
【００５２】
なお、前記式（Ｉ）の化合物は、ＩＵＰＡＣ名で２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エチル（Ｅ）−２−（５−エチリデン−２−オキソテトラヒドロピラン−４−イル）アセテート（2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl (E)-2-(5-ethylidene-2-oxotetrahydropyran-4 -yl)acetate）と表され、本明細書においては「Compound A」と記載される場合がある。また、前記式（ＩＩ）の化合物は、ＩＵＰＡＣ名で２−（３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシメチル−５−メトキシカルボニル−２−メチル−２Ｈ−ピラン−４−イル）酢酸（2-(3,4-dihydro-3-hydroxymethyl-5-methoxycarbonyl-2-methyl-2H-pyran-4-yl)acetic acid）と表され、本明細書においては「Compound B」と記載される場合がある。
【００５３】
本発明における化合物は、薬理学的に許容される任意の塩（無機塩及び有機塩を含む）の形態であってもよい。本明細書において「塩」とは、前述の通り、薬理学的に許容される任意の塩（無機塩及び有機塩を含む）であれば特に限定されず、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩、有機酸塩（酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、ピクリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩等）等が挙げられる。本発明の化合物の塩は、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に調製され得る。  
【００５４】
４−１．新規イリドイド化合物の製造方法
本発明の新規イリドイド化合物（Compound A、Compound B）は、天然物から抽出・単離して製造しても、化学的な合成法により製造してもよく、特に限定されない。天然物から製造する場合、原料として用いる天然物は特に限定されないが、特にオリーブを用いることが好ましい。オリーブはモクセイ科の植物であり、主原料としてオリーブの果実を用いることができるが、葉、種子、茎等が混在していてもよい。オリーブ果実を原料として用いる場合、生のままで用いてもよいし、凍結乾燥等によって乾燥したものを用いてもよい。また、オリーブ果実から油を搾った後の残滓も、そのまま、あるいは乾燥した状態で用いることができる。オリーブ果実から得られる液相を油層と水層に分離して得られる水層であるオリーブ果汁のみを原料とすることが好ましい。「オリーブ」及び「オリーブ果汁」は、組成物に関して前述した通りである。
【００５５】
天然物由来の原料（例えば、オリーブ果実エキスなど）からの本発明の新規イリドイド化合物の抽出は、溶媒を用いて行うことができるがこれに限定されない。本発明の組成物に含まれる有効成分が抽出できる限り、いずれの溶媒を用いてもよく、水、緩衝液等の水溶液、有機溶媒、又はこれらの組み合わせ等を用いることができる。有機溶媒は、一般的に用いられるものであればよく、例えば、アルコール類やアセトンを用いることができる。アルコール類としては、例えば、低級アルコール類（メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール等）、及び液状多価アルコール（１，３−ブチレンアルコール、プロピレングリコール、グリセリン等）が挙げられる。好ましくは、含水低級アルコール類又は低級アルコール類を用いる。溶媒の使用量は、処理する原料の量及び原料中の目的化合物の含量等に応じて、適宜設定することができるが、例えば、原料１ｇに対して、１．０〜１０００ｍＬ、好ましくは２．０〜５００ｍＬ、さらに好ましくは５．０〜１００ｍＬの溶媒を使用してもよい。
【００５６】
本発明の新規イリドイド化合物は、原料からの抽出後に必要に応じて、更に精製して純度を高めることができる。精製はいずれの手法で行ってもよく、例えば、クロマトグラフィーにより行うことができる。クロマトグラフィーとして、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、親水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等が例示されるが、これらに限定されない。そして、標品の純度は、高速液体クロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィーと質量分析器を組み合わせたＬＣ−ＭＳにより確認することができるが、これに限定されない。更に、本発明の新規イリドイド化合物の化学構造は、核磁気共鳴（Nuclear Magnetic Resonance：ＮＭＲ）やマススペクトル等により解析することができる。
【００５７】
本発明の新規イリドイド化合物を化学的に合成する場合、入手可能な化合物を出発原料として、一般的に知られた有機化学の手法を適宜選択することにより、所望の化合物を製造することができる。  
【００５８】
４−２．組成物
本発明の一態様は、Compound A及び／又はCompound Bを含有する組成物である。前述した通り、本発明の新規イリドイド化合物であるCompound A及びCompound Bは様々な生理作用を有し、例えば、Ｔｉｅ２活性化作用、血管透過性抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、血管の安定化作用、及びリンパ管安定化作用等を示す。従って、本発明の前記組成物は、ある態様では、Ｔｉｅ２活性化作用、血管透過性抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、血管の安定化作用、又はリンパ管安定化作用を有するものである。また、組成物の態様は、医薬品（医薬組成物）、飲食品（食品、飲料、飲食品組成物、食品組成物、飲料組成物を含む）、化粧品（化粧用組成物）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
本発明の組成物に含まれるCompound A及び／又はCompound Bは、前述の通り、天然物から抽出・単離して製造しても、化学的な合成法により製造してもよく、特に限定されない。本発明の組成物に含まれる有効成分を天然物から製造する場合、原料として用いる天然物は特に限定されないが、例えば、オリーブを用いることが好ましい。また、Compound A及び／又はCompound Bの単離・合成法も、前述の通りである。なお、本発明の組成物には、天然に存在する動植物自体で全く加工やされていないものや、その抽出物そのもので他の成分が配合されていないものは含まれない。
【００６０】
本発明の組成物におけるCompound A及び／又はCompound Bの含有量は特に限定されないが、例えば、本発明の組成物におけるCompound Aの含有量は、組成物全体量に対して、０．０１重量％〜９９重量％、好ましくは０．１重量％〜５０重量％、より好ましくは１重量％〜３０重量％、さらにより好ましくは１０重量％〜３０重量％であり、本発明の組成物におけるCompound Bの含有量は、組成物全体量に対して、０．０１重量％〜９９重量％、好ましくは０．１重量％〜５０重量％、より好ましくは１重量％〜３０重量％、さらにより好ましくは１０重量％〜３０重量％である。なお、組成物中に配合し得る他の成分等は前述した通りである。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。尚、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００６２】
実施例１：Compound A及びCompound Bの構造決定
１−１．オリーブ果実エキスの調製
オリーブ果実を圧搾し、遠心分離し、油分と果汁に分離する。ここで得られたオリーブ果汁をろ過後、吸着系のカラムにて糖類やミネラル、有機酸など吸着樹脂に非吸着な成分を除き、含水アルコール溶出部を濃縮し、噴霧乾燥させたものをオリーブ果実エキスとして用いた。続いてこの果実エキス（500 g）をDia ion HP20を用いたカラムクロマトグラフィー（樹脂量；10L, 溶出溶媒；エタノール：水(0：100→70：30)）を行いオリーブ果実エキスを分画し、各フラクションを以下の通り得た（Fr.1：179 g、Fr.2：120 g、Fr.3：85 g、Fr.4：71 g、Fr.5：26 g）。Fr.1〜Fr.5でTie2活性が認められたフラクションの内、Fr.4（５０％エタノール溶出部、20 g）をToyopearl HW-40Cを用いたカラムクロマトグラフィー（樹脂量；500 mL、溶出溶媒；メタノール：水（10：90→70：30）→アセトン：水（70：30））を行い、Fr.4を19個のフラクション（Fr.4a〜Fr.4s）に分画した。Fr.4a〜Fr.4sでTie2活性が認められたフラクションFr.4kについて下記分析条件1で分取HPLC（Preparative HPLC）を行い、さらに６つの画分（Fr.4ka〜4kf）に分けた。Fr.4ka〜Fr.4kfで最も高いTie2活性が認められたフラクションの内、Fr.4kb及びFr.4kdについて下記分析条件2及び分析条件3で分取HPLC（Preparative HPLC）を用いた精製を行い、Compound A（46.2 mg）、Compound B（19.5 mg）及びOleanoside A（98.1 mg）を単離した。なお、Tie2活性が認められたFr.4rについても、分析条件4で分取HPLC（Preparative HPLC）を行い、Kaempferol（3.7 mg）を単離した。また、図２にはオリーブ果実エキスの精製フローを示す。【００６３】
＜分析条件1＞
検出：220 nm
流速：15 mL/min
カラム：Capcell Pack C18 TYPE AQ φ3.0×25.0 cm (SHISEIDO)
移動相：CH3CN：H2O(32:68)
カラム温度：室温25℃
＜分析条件2＞
検出：220 nm
流速：10 mL/min
カラム：TSK-Gel Amide-80 φ2.15×30.0 cm (TOSOH)
移動相：CH3CN：H2O(0 min, 100:0→15 min, 100:0→20 min, 80:20→ 35 min, 80:20)
カラム温度：室温25℃
＜分析条件3＞
検出：220 nm
流速：10 mL/min
カラム：COSMOSIL Cholester φ2.0×25.0 cm (nacalai tesque)
移動相：CH3CN：H2O(20:80)
カラム温度：室温25℃
＜分析条件4＞
検出：280 nm
流速：15 mL/min
カラム：Capcell Pack C18 TYPE AQφ3.0×25.0 cm (SHISEIDO)
移動相：CH3CN：H2O(27:73)
カラム温度：室温25℃【００６４】
１−２．Compound Aの構造解析
Compound Aは無色油状物質として得られ、high-resolution electrospray-ionization mass spectrometry (HRESI-MS)の結果から分子式C17H20O6であることが明らかとなった。また，そのUVスペクトルパターン(λmax 282)から、本化合物はベンゼン環を分子内に有していることが推測された。次に1H-nuclear magnetic resonance(1H-NMR)において、ABX系シグナルが１組[δH: 6.62 (1H, dd, J=2.0, 8.0 Hz), 6.74 (1H, d, J=2.0 Hz), 6.82 (1H, d, J=8.0 Hz)]が観察されたことと、13C-NMRにおいて観察された８本のピークパターン（δc: 34.6, 66.0, 115.5, 116.4, 121.3, 130.7, 143.5, 143.6）より、ヒドロキシチロソールの存在が示唆された。さらに1H-NMRにおいて、メチル由来シグナルが１つ、メチレン由来シグナルが３つ、メチン由来シグナルが１つ、オレフィンプロトンが１つ確認された。13C-NMRにおいて、ヒドロキシチロソール以外のユニットについて確認したところ、メチル由来シグナルが１つ、メチレン由来シグナルが３つ、メチン由来シグナル２つ、４級炭素由来シグナルが３つ確認された。続いて、これらの結合様式を明らかにする目的で、1H-1H correlation spectroscopy (1H-1H COSY)、1H-detected multiple quantum coherence (HMQC)、1H-detected multiple-bond connectivity (HMBC)を測定し、これらを詳細に解析したところ、本ユニットの構造はイリドイドを特徴とする化合物であることが明らかになった。オリーブ由来のイリドイド類の単離報告例を参考に、２次元ＮＭＲを中心としたスペクトルデータの詳細な解析により、今回構造を明らかにしたイリドイドユニットはメガリトラクトノールの３位の水酸基がカルボキシル基に変換された構造であることを明らかにした。【００６５】
続いて、各ユニットの結合様式を検討するためHMBCを解析したところ、ヒドロキシチロソールユニットの８’位のプロトンからメガリトラクトノールの３位のカルボニルカーボンへの相関が確認されたことから、両ユニットはヒドロキシチロソールの８’位とメガリトラクトノールの３位がエステル結合していることが明らかになった。以上のスペクトルデータから、Compound Aの構造を決定した。Compound A及びメガリトラクトノールの1H-NMR及び13C-NMRシグナルを図３に示す。また、Compound Aの二次元ＮＭＲ解析（1H-1H correlation spectroscopy (COSY)解析及び1H-detected heteronuclear multiple bond connectivity (HMBC)解析）の結果を図４に示す。【００６６】
１−３．Compound Bの構造解析
Compound Bは、無色油状物質として得られた。1H-NMRにおいて、メチル基由来シグナルが１つ、メチレン基由来シグナルが２組、メチン基由来シグナルが３つ、メトキシ基由来シグナルが１つ、オレフィン由来シグナルが１つ確認された。13C-NMRにおいて、メチル基が２つ（δc: 19.4, 51.5）、メチレン基が２つ（δc: 38.2, 62.3）、メチン基が４つ（δc: 29.6, 45.0, 74.1, 156.2）、４級炭素が３つ（δc: 108.5, 169.3, 174.3）、合計１１本のカーボンシグナルが確認できた。以上の1H-NMR及び13C-NMRの結果とUV吸収が確認できなかったことから、本化合物はイリドイド類と推察された。次に、これらの結合様式を確認する目的で2次元NMR（1H-1H COSY, HMQC, HMBC）を解析し、本化合物の構造を明らかにした。以上の解析によって明らかになった構造は、オリーブ果実の成分の一つとして報告されているOleanoside類と類似した構造であり、それらのスペクトルデータを比較したところ６位、７位、８位のシグナルを除いて良好な相関があることが確認できた。以上の結果に加えて、本化合物で８位のメチレンから７位のカルボニルカーボンへのHMBC相関が確認できなかったこと及びMSで得られた分子量の結果に基づいて、Compound Bの構造を決定した。Compound B及びオレアノシドＡの1H-NMR及び13C-NMRシグナルを図５に示す。また、Compound Bの二次元ＮＭＲ解析（1H-1H correlation spectroscopy (COSY)解析及び1H detected heteronuclear multiple bond connectivity (HMBC)解析）の結果を図６に示す。尚、Oleanoside A、Keampferolは論文記載の文献値と比較の上、同定した。【００６７】
実施例２：Tie2活性化作用の評価
Compound A及びCompound Bを、終濃度が10 μg/mLとなるように血清血管内皮細胞増殖用培地（倉敷紡績株式会社製、Humedia-EG2）に溶解し、被験試料を調製した。また、アンジオポエチン-1を500 ng/mLの濃度となるようにHumedia-EG2に溶解させた被験試料を調製し、陽性コントロールとして用いた。【００６８】
次に、コンフルエントまで培養した正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、96 ウェルプレートへ2.0×104細胞／0.1 mL／ウェルとなるように播種し、Humedia-EG2を用いて一晩培養した。一晩培養後のHUVECを、細胞刺激（被験試料添加）の3時間前に0.1 mLの血管内皮細胞基礎培地（倉敷紡績株式会社製、Humedia-EB2）に置換し、再度培養を行った。その後ウェル内に、被験試料を0.1 mL 添加し、20分間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、イムノアッセイキット（R&D Systems 社製、Human Phospho-Tie2（Y992）Immunoassay）を用いてプロトコールに従い、細胞内のリン酸化型Tie2量を測定した。また、陰性コントロールとして被験試料の溶解に用いたジメチルスルホキシド（DMSO）についても、同様にリン酸化型Tie2 を測定した。そして、下記式に従いTie2 活性化率を計算し、リン酸化作用を評価した。【００６９】
Tie2活性化率（%）＝被験試料添加時のリン酸化型Tie2 の測定値／陰性コントロールでのリン酸化型Tie2の測定値）×100【００７０】
結果を表１及び図７に示す。表１及び図７に示されるように、Compound A、Compound B、オレアノシドＡ及びケンフェロールにおいて、Tie2活性化作用が確認された。【００７１】
【表１】
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【００７２】
実施例３：Compound A及びCompound Bの血管透過性抑制作用
実施例１において調製したCompound AもしくはBのDMSO溶液（25 μM）を被験試料に用い、血管透過性因子である血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）によって引き起こされる血管透過性の亢進に対する抑制作用を、マイルスアッセイ法を用いて評価した。本動物実験は、動物愛護管理法他関連法令を遵守し、社内動物実験委員会の審査を経て機関の長が承認した計画に基づき実施した。【００７３】
３−１．試験方法
8週齢のBalb/c雌性マウスを1週間以上の予備飼育を行った後、1匹あたり8つの投与区画を設定（背部正中線を挟んで左右4か所ずつ）し、n=6で評価した。【００７４】
生理食塩水にて調製した1%エバンスブルー色素100 μLを麻酔下で静脈内投与した15分後にVEGF（終濃度300 ng/mL）および各被験試料を等量混合し、その15 μLを背部皮内に投与した。皮内投与の40分後、皮内に漏出した色素を500 μLのホルムアミドを用いて抽出し、620 nmの吸光度により色素量を定量した。なお、VEGFも被験試料も投与しない区画およびVEGFのみ投与する区画も同時に設けた。有意差検定にはDunnettの多重比較検定を用いた。【００７５】
３−２．結果
漏出したエバンスブルーの色素量を図８に示す。被験試料による血管透過性抑制率は、Compound Aが89％、Compound Bが139％であった。以上より、Compound A、Compound Bのいずれについても血管からの透過性を抑制する作用が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は、Ｔｉｅ２活性化効果、血管透過性抑制効果、血管の成熟化効果、血管の正常化効果、血管の安定化効果、及びリンパ管の安定化効果などを有する組成物等を提供するものである。このように、本発明は好ましい生理活性を有する新たな組成物等を提供するものであり、飲食品等に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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