(57)【要約】  本発明は、担体分子と、担体分子に結合している蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂを含み、蛍光色素ａと蛍光色素ｂは励起波長が異なり、蛍光色素ａと蛍光色素ｂの間に蛍ＦＲＥＴが生じない蛍光プローブに関する。本発明は、また、標的細胞を前記の蛍光プローブで標識する工程と、蛍光プローブで標識された標的細胞に励起光を照射して、蛍光プローブからの蛍光を観察する工程を含む蛍光検出方法に関する。本発明は、また、細胞を前記の蛍光プローブによって蛍光標識する工程と、蛍光標識細胞をフローサイトメーター又は蛍光顕微鏡によって選別する工程と、選別した蛍光標識細胞を生体内に移植する工程と、生体内の蛍光標識細胞をインビボ蛍光イメージング装置で観察する工程を含む蛍光プローブの使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体分子と、前記担体分子に結合している蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂを含む蛍光プローブにおいて、蛍光色素ａの励起波長と蛍光色素ｂの励起波長は異なり、蛍光色素ａと蛍光色素ｂの間に蛍光共鳴エネルギー移動が生じないことを特徴とする蛍光プローブ。
【請求項２】
前記蛍光プローブは、細胞標識用蛍光プローブであり、蛍光色素ａは、インビトロ蛍光イメージング用蛍光色素であり、蛍光色素ｂは、インビボ蛍光イメージング用蛍光色素である請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
細胞表面に特異的に結合することで細胞を標識する請求項１又は２に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
細胞内部に取り込まれることで細胞を標識する請求項１又は２に記載の蛍光プローブ。
【請求項５】
蛍光色素ａは、励起波長が３５０〜６５０ｎｍの範囲である請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項６】
蛍光色素ｂは、励起波長が６００〜８５０ｎｍの範囲である請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項７】
蛍光色素ａがポルフィリンである請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項８】
蛍光色素ｂがインドシアニングリーンである請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項９】
前記担体分子は、ポリシロキサンである請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項１０】
フローサイトメーターによる蛍光標識細胞の選別に用いる請求項２〜９のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項１１】
標的細胞を検出する蛍光検出方法であって、
標的細胞を蛍光プローブで標識する工程と、
蛍光プローブで標識された標的細胞に励起光を照射して、蛍光プローブからの蛍光を観察する工程を含み、
前記蛍光プローブは、担体分子と、前記担体分子に結合している蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂを含み、蛍光色素ａの励起波長と蛍光色素ｂの励起波長は異なり、且つ蛍光色素ａと蛍光色素ｂの間に蛍光共鳴エネルギー移動が生じないことを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項１２】
蛍光色素ａは、インビトロ蛍光イメージング用蛍光色素であり、蛍光色素ｂは、インビボ蛍光イメージング用蛍光色素である請求項１１に記載の蛍光検出方法。
【請求項１３】
蛍光プローブで標識された標的細胞に蛍光色素ａを励起する励起光を照射し、インビトロ蛍光イメージングによって蛍光プローブからの蛍光を観察する請求項１１又は１２に記載の蛍光検出方法。
【請求項１４】
蛍光プローブで標識された標的細胞を生体（ただし、人体を除く）内に移植し、該生体に蛍光色素ｂを励起する励起光を照射し、インビボ蛍光イメージングによって蛍光プローブからの蛍光を観察する請求項１１又は１２に記載の蛍光検出方法。
【請求項１５】
前記蛍光プローブは、細胞表面に特異的に結合することで細胞を標識する請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
【請求項１６】
前記蛍光プローブは、細胞内部に取り込まれることで細胞を標識する請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
【請求項１７】
蛍光色素ａは、励起波長が３５０〜６５０ｎｍの範囲である請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
【請求項１８】
蛍光色素ｂは、励起波長が６００〜８５０ｎｍの範囲である請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
【請求項１９】
蛍光色素ａがポルフィリンである請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
【請求項２０】
蛍光色素ｂがインドシアニングリーンである請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
【請求項２１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の蛍光プローブの使用方法であって、
細胞を蛍光プローブによって蛍光標識する工程と、
蛍光プローブによって蛍光標識された蛍光標識細胞をフローサイトメーター又は蛍光顕微鏡によって確認して選別する工程と、
選別した蛍光標識細胞を生体（ただし、人体を除く）内に移植する工程と、
生体内の蛍光標識細胞をインビボ蛍光イメージング装置で観察する工程を含み、
前記フローサイトメーター又は蛍光顕微鏡による蛍光標識細胞の選別は、蛍光色素ａ由来の蛍光を検出することで行い、前記生体内の蛍光標識細胞のインビボ蛍光イメージング装置による観察は、蛍光色素ｂ由来の蛍光を検出することで行うことを特徴とする蛍光プローブの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二種類の蛍光色素を含む蛍光プローブ、蛍光検出方法及び蛍光プローブの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌や発生学の研究領域において、マウス等の動物を用いた生体内の蛍光イメージング解析が広く行われている。マウスに移植したｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞、癌細胞及び肝硬変細胞等の疾患関連細胞等の細胞が移植後、どの位置で分化、生育、転移するかと言った情報の解析は、蛍光イメージング解析がメジャーな手法である。特にマウス等の動物の生存を維持したまま、移植細胞の経過を観察するには、現状、蛍光イメージング解析を用いる手法しかなく、特に重要な解析手法として位置づけられている。【０００３】
生体内の移植細胞の蛍光イメージグ解析は、通常、移植する前に予めインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で細胞を蛍光プローブで標識し、該細胞をマウス等の生体内に移植し、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）蛍光イメージング装置で観察することで行われる。例えば、特許文献１には、アニオン性ポルフィリンとカチオン性オルガノアルコキシシラン及び非カチオン性シランを結合させたポルフィリン含有複合体を生体観察のための近赤外蛍光プローブとして用いることが記載されている。【０００４】
一方、所定量の細胞を蛍光プローブで標識した場合、通常、全ての細胞が蛍光プローブで標識されることはない。そのため、蛍光プローブと結合していない細胞もマウス等の生体内に移植されてしまうことがある。生体観察用の近赤外蛍光プローブの場合、現状、蛍光顕微鏡やフローサイトメーター等のインビトロ蛍光イメージング装置で蛍光を検出することができず、インビトロで近赤外蛍光プローブと結合している蛍光標識細胞を確認することは困難である。それは、インビトロ蛍光イメージング装置とインビボ蛍光イメージング装置で求められる波長特性が異なるためである。インビトロ蛍光イメージング装置では励起波長３５０〜６５０ｎｍ、蛍光波長４００〜８００ｎｍの波長領域で解析を行うことが一般的であり、インビボ蛍光イメージング装置では励起波長６００〜８５０ｎｍ、蛍光波長６５０〜９２０ｎｍの波長領域で解析を行うことが一般的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−１３６５５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したとおり、インビトロ蛍光イメージング解析とインビボ蛍光イメージング解析に適した蛍光色素の波長特性は大きく異なるため、現在のところ、インビトロ及びインビボの両方の蛍光イメージング解析に使用できる蛍光プローブは存在しない。【０００７】
本発明は、前記従来の問題を解決するため、インビトロ及びインビボの両方の蛍光イメージング解析に使用できる蛍光プローブ、蛍光検出方法及び蛍光プローブの使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、担体分子と、前記担体分子に結合している蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂを含む蛍光プローブにおいて、蛍光色素ａの励起波長と蛍光色素ｂの励起波長は異なり、蛍光色素ａと蛍光色素ｂの間に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じないことを特徴とする蛍光プローブに関する。【０００９】
前記蛍光プローブは、細胞標識用蛍光プローブであり、蛍光色素ａは、インビトロ蛍光イメージング用蛍光色素であり、蛍光色素ｂは、インビボ蛍光イメージング用蛍光色素であることが好ましい。前記蛍光プローブは、細胞表面に特異的に結合することで細胞を標識してもよく、細胞内部に取り込まれることで細胞を標識してもよい。【００１０】
蛍光色素ａは、励起波長が３５０〜６５０ｎｍの範囲であることが好ましく、蛍光色素ｂは、励起波長が６００〜８５０ｎｍの範囲であることが好ましい。蛍光色素ａがポルフィリンであることが好ましい。蛍光色素ｂがインドシアニングリーンであることが好ましい。【００１１】
前記担体分子は、ポリシロキサンであることが好ましい。【００１２】
前記蛍光プローブは、フローサイトメーターによる蛍光標識細胞の選別に用いてもよい。【００１３】
本発明は、また、標的細胞を観察する蛍光検出方法であって、標的細胞を蛍光プローブで標識する工程と、蛍光プローブで標識された標的細胞に励起光を照射して、蛍光プローブからの蛍光を観察する工程を含み、前記蛍光プローブは、担体分子と、前記担体分子に結合している蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂを含み、蛍光色素ａの励起波長と蛍光色素ｂの励起波長は異なり、且つ蛍光色素ａと蛍光色素ｂの間に蛍光共鳴エネルギー移動が生じないことを特徴とする蛍光検出方法に関する。【００１４】
蛍光プローブで標識された標的細胞に蛍光色素ａを励起する励起光を照射し、インビトロ蛍光イメージングによって蛍光プローブからの蛍光を観察してもよい。また、蛍光プローブで標識された標的細胞を生体（ただし、人体を除く）内に移植し、該生体に蛍光色素ｂを励起する励起光を照射し、インビボ蛍光イメージングによって蛍光プローブからの蛍光を観察してもよい。【００１５】
本発明は、また、前記の蛍光プローブの使用方法であって、細胞を蛍光プローブによって蛍光標識する工程と、蛍光プローブによって蛍光標識された蛍光標識細胞をフローサイトメーター又は蛍光顕微鏡によって確認して選別する工程と、選別した蛍光標識細胞を生体（ただし、人体を除く）内に移植する工程と、生体内の蛍光標識細胞をインビボ蛍光イメージング装置で観察する工程を含み、前記フローサイトメーターによる蛍光標識細胞の選別は、蛍光色素ａ由来の蛍光を検出することで行い、前記生体内の蛍光標識細胞のインビボ蛍光イメージング装置による観察は、蛍光色素ｂ由来の蛍光を検出することで行うことを特徴とする蛍光プローブの使用方法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、励起波長が異なり、且つ蛍光共鳴エネルギー移動が生じない蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂを有する蛍光プローブを用いることにより、インビトロ及びインビボの両方の蛍光イメージング解析を行うことができる。特に、既存の蛍光顕微鏡、フローサイトメーター等のインビトロ蛍光イメージング装置にて、細胞のインビトロ蛍光イメージング解析を行うことができ、既存のインビボ蛍光イメージング装置にて、生体内のインビボ蛍光イメージング解析を行うことができる。また、フローサイトメーターにより蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞を選別し、選別した蛍光標識細胞をマウス等の生体内に移植し、生存しているマウス等の生体内における蛍光標識細胞の局在を経時的に観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、テトラキス（４−カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）、及び、ＴＣＰＰと（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）の加水分解・縮合により生成したハイブリットナノ粒子（ＰＰＳ ＨＮＰｓ）のフーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴ−ＩＲ）にて測定したＦＴ−ＩＲスペクトルを示す。
【図２】図２は、ＰＰＳ ＨＮＰｓの29Ｓｉ固体核磁気共鳴（固体ＮＭＲ）スペクトルを示す。
【図３】図３は、ＰＰＳ ＨＮＰｓのＴＧ及びＤＴＡ曲線を示す。
【図４】図４Ａは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ生成反応後の上澄み液の吸収スペクトルを示し、図４Ｂは、葉酸の濃度検量線を示す。
【図５】図５は、ＰＰＳ ＨＮＰｓ、及び、ＰＰＳ ＨＮＰｓにさらにインドシアニングリーン（ＩＣＧ）及び葉酸（ＦＡ）を結合させた複合体（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）の吸収スペクトルを示す。
【図６】図６Ａは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの短波長側の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示し、図６Ｂは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの長波長側の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示す。
【図７】図７Ａは、マウスのマクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、ＤＡＰＩで染色したＲＡＷ２６４．７細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＤＡＰＩ）、ＰＰＳ ＨＮＰｓにさらにインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を結合させた複合体（ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）で標識したＲＡＷ２６４．７細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）、及び、これら三つの画像を重ね合せた像（Ｍｅｒｇｅ）を示す。図７Ｂは、ヒトの子宮頸癌由来のＨｅＬａ Ｓ３細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、ＤＡＰＩで染色したＨｅＬａ Ｓ３細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＤＡＰＩ）、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識したＨｅＬａ Ｓ３細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）、及び、これら三つの画像を重ね合せた像（Ｍｅｒｇｅ）を示す。図７Ｃは、ヒトの大腸がん由来のＨＣＴ１１６細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、ＤＡＰＩで染色したＨＣＴ１１６細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＤＡＰＩ）、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識したＨＣＴ１１６細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）、及び、これら三つの画像を重ね合せた像（Ｍｅｒｇｅ）を示す。
【図８】図８は、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＲＡＷ２６４．７細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す。
【図９】図９は、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨｅＬａ Ｓ３細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す。
【図１０】図１０は、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨＣＴ１１６細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す。
【図１１】図１１は、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＲＡＷ２６４．７細胞を移植したマウス体内における蛍光標識細胞の経時的局在を蛍光インビボイメージング装置で観察した結果を示す。
【図１２】図１２は、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨｅＬａＳ３細胞を移植したマウス体内における蛍光標識細胞の経時的局在を蛍光インビボイメージング装置で観察した結果を示す。
【図１３】図１３は、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＲＡＷ２６４．７細胞を移植したマウスの２４時間後の各臓器をインビボ蛍光イメージング装置で観察した蛍光画像を示す。
【図１４】図１４は、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＲＡＷ２６４．７細胞を移植したマウスの２４時間後の各臓器をインビボ蛍光イメージング装置で解析した結果を示す。
【図１５】図１５は、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨｅＬａ Ｓ３細胞を移植したマウスの２４時間後の各臓器をインビボ蛍光イメージング装置で観察した蛍光画像を示す。
【図１６】図１６は、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨｅＬａ Ｓ３細胞を移植したマウスの２４時間後の各臓器を蛍光インビボイメージング装置で解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の発明者らは、インビトロ及びインビボの両方の蛍光イメージング解析に用いることができる蛍光プローブについて鋭意検討した結果、担体分子と、前記担体分子に結合している蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂを含む蛍光プローブにおいて、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂとして、励起波長が互いに異なり、且つ、互いに蛍光共鳴エネルギー移動が生じない蛍光色素を用いることで、インビトロ及びインビボの両方の蛍光イメージング解析に用いることができる蛍光プローブが得られることを見出し、本発明に至った。従来、二種類の蛍光色素を含む蛍光プローブが存在しているものの、これらの蛍光プローブは、二種類の蛍光色素間で蛍光共鳴エネルギー移動が生じるものであって、インビトロ及びインビボの両方の蛍光イメージング解析に用いることはできない。
【００１９】
（蛍光プローブ）
本発明の蛍光プローブは、担体分子と、前記担体分子に結合している蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂを含み、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂは、励起波長が異なり、且つ、蛍光色素ａと蛍光色素ｂの間に蛍光共鳴エネルギー移動が生じない。蛍光色素ａと蛍光色素ｂは、担体分子と共有結合することが好ましい。
【００２０】
蛍光色素ａは、インビトロ蛍光イメージング用蛍光色素（可視光線蛍光イメージング用蛍光色素とも称される。）であることが好ましく、励起波長が３５０〜６５０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が４００〜８００ｎｍの範囲であることがより好ましく、励起波長が３８０〜５８０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が４５０〜６８０ｎｍの範囲であることがさらに好ましい。励起波長と蛍光波長が上述した範囲であると、汎用の蛍光顕微鏡やフローサイトメーター等のインビトロ蛍光イメージング装置にて蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞を観察することができる。
【００２１】
蛍光色素ａとしては、例えば、ポルフィリン、フルオレセイン、ローダミン等のインビトロ蛍光イメージング用蛍光色素を用いることができる。ポルフィリンは、特に限定されないが、インビトロ蛍光イメージング用蛍光色素として好適である観点から、カルボキシル基を有するポルフィリンを用いることができる。なお、“ポルフィリン”は、４つのピロール環がα位置で4つのメチン基と交互に結合した環状化合物とその誘導体の総称の意味で用いている。カルボキシル基を有するポルフィリンは、一般的に、励起波長が４００〜６５０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が６００〜７４０ｎｍの範囲である。
【００２２】
カルボキシル基を有するポルフィリンとしては、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される化合物を用いることができる。
【００２３】
【化１】
2017187717.tif 000002
【００２４】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ1b、Ｒ2b、Ｒ3b、及びＲ4bは、同一又は異なっていてもよく、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）、スルホ基（ＳＯ3Ｈ）又は水素原子（Ｈ）を示す（ただし、全てが水素原子又は全てがスルホ基である場合は除く。）。好ましくは、前記一般式（Ｉ）中、Ｒ1b、Ｒ2b、Ｒ3b、及びＲ4bが全てカルボキシル基、又はＲ1bはカルボキシル基でＲ2b、Ｒ3b、及びＲ4bは水素原子である。カルボキシル基を有するポルフィリンは、より好ましくは、前記一般式（Ｉ）で表され、Ｒ1b、Ｒ2b、Ｒ3b、及びＲ4bが、全てカルボキシル基である化合物である。Ｒ1b、Ｒ2b、Ｒ3b、及びＲ4bが全てカルボキシル基である化合物は、テトラキス（４−カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）と呼ばれる。
【００２５】
【化２】
2017187717.tif 000003
【００２６】
また、例えばビリルビン、ヘミン、プロトポルフィリン等も、カルボキシル基を有するポルフィリンとして用いることができる。
【００２７】
本発明に用いるカルボキシル基を有するポルフィリンは、公知の化合物であるか、又は公知の方法により容易に製造できる。例えば東京化成工業株式会社等から市販のものを入手することができる。
【００２８】
蛍光色素ｂは、蛍光色素ａと励起波長が異なり、且つ、蛍光色素ａとの間に蛍光共鳴エネルギー移動が生じない蛍光色素を用いる。蛍光色素ｂは、インビボ蛍光イメージング用蛍光色素である（近赤外線蛍光イメージング用蛍光色素とも称される。）ことが好ましく、励起波長が６００〜８５０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が６５０〜９２０ｎｍの範囲であることがより好ましく、励起波長が６３０〜７９０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が６８０〜９１０ｎｍの範囲であることがさらに好ましい。励起波長と蛍光波長が上述した範囲であると、汎用のインビボ蛍光イメージング装置にてマウス等の生体内の蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞を観察することができる。
【００２９】
蛍光色素ｂとしては、例えば、インドシアニン化合物、クマリン、ローダミン、キサンテン、ヘマトポルフィリン、及びフルオレスカミン等のインビボ蛍光イメージング用蛍光色素を用いることができる。インドシアニン化合物としては、生体内の安全性の観点から、インドシアニングリーンやその誘導体を用いることが好ましい。インドシアニングリーンは、一般的に、励起波長が７４０〜７９０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が８１０〜８６０ｎｍの範囲である。インドシアニングリーンの誘導体は、インドシアニングリーンの主要な骨格及び機能を維持しつつその一部を他の官能基等で置換した化合物をいい、励起波長が７５０〜７９０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が７９０〜９００ｎｍの範囲である。蛍光色素ｂとして、励起波長が７４０〜７９０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が７９０〜９００ｎｍの範囲のインドシアニングリーンやその誘導体を用いることで、マウス等の生体におけるエサ等からの自家蛍光に影響されることなく、汎用のインビボ蛍光イメージング装置にてマウス等の生体内の蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞を観察することができる。また、マウス等の生体内の臓器に局在する蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞を観察することができる。
【００３０】
前記担体分子は、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂと結合し、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの異なる励起波長を維持することができるものであればよい。例えば、ポリシラン、ポリゲルマン、ポリスタナン、ポリシロキサン、ポリシルセスキオキサン、ポリシラザン、ポリボラジレン、ポリホスファゼン等の無機ポリマーやポリピロール、ポリエチレングリコール、多糖等の有機ポリマー等のポリマーを用いることができる。蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂとして、蛍光色素ａの蛍光が蛍光色素ｂを励起しないように、適宜選択して用いることができる。蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂのいずれか一方は、担体分子であるポリマーの主鎖構造中に組み込まれていることが好ましく、他方は同担体の表面に存在する官能基と結合することが好ましい。このような構造であると、ＦＲＥＴが生じにくい。蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの間にＦＲＥＴを生じさせない観点から、前記担体分子は、ポリシロキサン（以下において、シロキサン結合を有するポリマーとも記す。）であることが好ましい。ポリシロキサンは、例えば、後述するように、シラン化合物が加水分解、重縮合することで形成される。
【００３１】
本発明の蛍光プローブは、細胞標識用蛍光プローブとして用いることが好ましい。細胞標識用蛍光プローブとして用いる場合、細胞表面に特異的に結合することで細胞を標識してもよい。この場合、本発明の蛍光プローブは、細胞の表面を特異的に認識する物質と結合する細胞表面結合物質を有することが好ましい。蛍光プローブが細胞表面結合物質を介して細胞表面に特異的に結合して細胞を標識することで、細胞標識用蛍光プローブとして用いることができる。細胞の表面を特異的に認識する物質とは、特定の細胞の表面に存在するタンパク質、脂質、糖鎖、及び／又は核酸等である。例えば、癌細胞の表面には、癌細胞に特異的な葉酸受容体、トランスフェリン受容体、抗原等が存在する。蛍光プローブに葉酸、トランスフェリン、抗体等を結合することにより、癌細胞を特異的に標識することができる。また、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞の表面には細胞表面マーカー（膜タンパク質）等が存在する。蛍光プローブに細胞表面マーカーと特異的に結合する分子等を結合することにより、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞を特異的に標識することができる。
【００３２】
本発明の蛍光プローブは、また、細胞の内部に取り込まれることで細胞を標識してもよい。このような細胞としては、例えば、マクロファージ、樹状細胞、免疫細胞、癌細胞、ｉＰＳ細胞等が挙げられる。細胞内部に蛍光プローブを取り込んだマクロファージ、樹状細胞、免疫細胞、癌細胞、ｉＰＳ細胞等を用い、免疫細胞療法において、マクロファージや樹状細胞の体内での動態を確認することができる。
【００３３】
本発明の蛍光プローブは、担体分子と蛍光色素ａを結合、好ましくは共有結合させて担体分子と蛍光色素ａの複合体を形成し、その後、担体分子と蛍光色素ａの複合体からなるナノ粒子表面に蛍光色素ｂを結合、好ましくは共有結合させて、担体分子、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの複合体を形成することで作製することができる。担体分子と蛍光色素ａの複合体からなるナノ粒子に蛍光色素ｂを結合させる際に、同時に、細胞表面結合物質を担体分子と蛍光色素ａの複合体からなるナノ粒子に結合させてもよい。或いは、本発明の蛍光プローブは、担体分子と蛍光色素ｂを結合、好ましくは共有結合させて担体分子と蛍光色素ｂの複合体を形成し、その後、担体分子と蛍光色素ｂの複合体からなるナノ粒子に蛍光色素ａを結合、好ましくは共有結合させて、担体分子、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの複合体を形成することで作製してもよい。担体分子と蛍光色素ｂの複合体からなるナノ粒子に蛍光色素ａを結合させる際に、同時に、細胞表面結合物質を担体分子と蛍光色素ｂの複合体からなるナノ粒子に結合させてもよい。なお、担体分子と蛍光色素ａの複合体、担体分子と蛍光色素ｂの複合体、担体分子、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの複合体において、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの励起波長及び蛍光波長は、担体分子と結合する前後でほとんど変化しないことが好ましい。
【００３４】
蛍光色素ａと蛍光色素ｂとして、励起波長が異なりかつ一方の蛍光色素の蛍光が他方の蛍光色素を励起しない蛍光色素を選ぶこと、担体分子、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの複合体中の蛍光色素ａと蛍光色素ｂの配置等を調整すること等により、蛍光色素ａと蛍光色素ｂの間でＦＲＥＴが生じないようにする。担体分子、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの複合体において、担体分子がポリシロキサンである場合、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂのいずれかはシロキサンネットワーク（ポリマーの主鎖）中に組み込まれ、他方は、シロキサンネットワーク中に組み込まれず、ポリシロキサンと一方の蛍光色素の複合体からなるナノ粒子表面の官能基（シロキサンネットワークを形成していない官能基）と結合することが好ましい。このような構造であると、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの間でＦＲＥＴが生じにくい。
【００３５】
担体分子がポリシロキサンであり、蛍光色素ａがポルフィリンであり、蛍光色素ｂがインドシアニングリーンである場合、例えば下記のように蛍光プローブを作製することができる。
【００３６】
まず、アミノ基を有するシランとカルボキシル基を有するポルフィリンを反応させてポルフィリンを分子内に含むシラン（以下において、「ポルフィリン‐シラン」とも記す。）を得る。具体的には、溶媒にアミノ基を有するシランとカルボキシル基を有するポルフィリンを溶解させ、縮合剤を加えアミド化反応を起こす。溶媒としては、例えば、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等を用いることができる。縮合剤としては、例えば、カルボジイミド等を使用することができる。カルボジイミドとしては、特に限定されないが、例えば、Ｎ，Ｎ´−ジプロピルカルボジイミド等が挙げられる。副生成物を減らすために、スクシンイミド等を加えてもよい。スクシンイミドとしては、特に限定されないが、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド等が挙げられる。反応温度は、特に限定されないが、合成コストの観点から、例えば、２０〜１５０℃であることが好ましく、２０〜８０℃であることがより好ましい。反応時間は、特に限定されないが、例えば、１〜７２時間であることが好ましく、１〜２４時間であることがより好ましい。反応後、遠心分離して生成物を沈殿として回収することで、ポルフィリン‐シランを得ることができる。
【００３７】
上記反応において、アミノ基を含むシランとカルボキシル基を有するポルフィリンのモル比（アミノ基を含むシラン：カルボキシル基を有するポルフィリン）は、４：１〜１：１であることが好ましく、より好ましくは４：１〜２：１であり、さらに好ましくは４：１である。
【００３８】
次に、上記で得られたポルフィリン‐シランと一種以上の官能基を有するシラン（以下において、「官能基シラン」とも記す。）との加水分解・縮合反応により、シロキサンとポルフィリンの複合体を得る。具体的には、溶媒にポルフィリン‐シランと官能基シランを溶解させ、さらにアルカリ溶液を加えて反応させる。溶媒としては、例えば、ＤＭＦ等を用いることができる。アルカリ溶液としては、例えば、ｐＨが８以上のアンモニア水、水酸化ナトリウムの水溶液等を用いることができる。反応温度は、特に限定されないが、合成コストの観点から、例えば、２０〜２００℃であることが好ましく、６０〜８０℃であることがより好ましい。反応時間は、特に限定されないが、例えば、１〜７２時間であることが好ましく、３〜２４時間であることがより好ましい。反応後、遠心分離することにより生成物を沈殿として回収することで、ポリシロキサンにポルフィリンが共有結合したポリシロキサンとポルフィリンの複合体を得ることができる。
【００３９】
上記反応において、ポルフィリン‐シランと官能基シランのモル比（ポルフィリン‐シラン：官能基シラン）は、１：２〜１：１００であることが好ましく、より好ましくは１：２１〜１：５０であり、さらに好ましくは１：３０〜１：４０である。
【００４０】
アミノ基を有するシランとしては、アミノ基を有するものであればよく、特に限定されない。例えば、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物を好適に用いることができる。
Ｘi−Ｓｉ（Ｒ2a）j（ＯＲ1a）(4-i-j)    （ＩＩ）
【００４１】
一般式（ＩＩ）において、ＸはＨ2ＮＣmＨ2m−、Ｈ2ＮＣnＨ2n−ＨＮＣmＨ2m−、又はＰｈ−ＮＨＣmＨ2m−〔ここでＰｈはフェニル基を示す。〕で示される基を示し、中でもＨ2ＮＣmＨ2m−、又はＨ2ＮＣnＨ2n−ＨＮＣmＨ2m−で示される基が好適である。ｍ及びｎは、同一又は異なって、１〜６の整数を示す。ｍは１、２、３又は４が好ましく、１、２、又は３がより好ましい。ｎは１、２、３又は４が好ましく、１、２、又は３がより好ましい。また、上記のＨ2ＮＣmＨ2m−、Ｈ2ＮＣnＨ2n−ＨＮＣmＨ2m−、Ｐｈ−ＮＨＣmＨ2m−は、それぞれ、Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）m−、Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）n−ＨＮ（ＣＨ2）m−、Ｐｈ−ＮＨ（ＣＨ2）ｍ−であることが好ましい。
【００４２】
また、Ｒ1a及びＲ2aは、同一又は異なって、炭素数１〜６のアルキル基を示す。当該アルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状であってよく、直鎖状が好ましい。また、炭素数１、２、３又は４のアルキル基が好ましい。炭素数１〜６のアルキル基としては、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、１−エチルプロピル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、１，２，２−トリメチルプロピル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、イソヘキシル、３−メチルペンチル基等が例示される。中でも、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルが好ましい。
【００４３】
また、ｉは１又は２、ｊは０又は１、〔但し（４−ｉ−ｊ）≧２〕を示す。すなわち、（ｉ、ｊ）は（１、０）、（１、１）、又は（２、０）を示す。
【００４４】
一般式（ＩＩ）で表される化合物としては、例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリエトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、トリメトキシ［３−（フェニルアミノ）プロピル］シラン等が挙げられる。中でも、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）及び／又は３−アミノプロピルトリメトキシシランが好ましい。
【００４５】
上述したアミノ基を有するシランは、例えば、東京化成工業株式会社製の市販品を用いることができる。また、アミノ基を有するシランは１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４６】
官能基シランは、一種以上の官能基を有するものであれば特に限定されず、一種の官能基を有する単官能基シランであってもよく、二種以上の官能基を有する多官能基シランであってもよい。官能基を有するシランとして、例えば一般式（ＩＩＩ）：
Ｙｐ−Ｓｉ（Ｒ2c）ｑ（ＯＲ1c）(4-p-q)      （ＩＩＩ）
で表される化合物を好適に用いることができる。
【００４７】
上記一般式（ＩＩＩ）において、ＹはＣＨ2＝ＣＨ−で示される基、ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2−で示される基、アルケンを有する基、チオールを有する基、ジスルフィドを有する基、アミンを有する基、エステルを有する基、アミドを有する基、カルボン酸を有する基、ウレアを有する基、チオウレアを有する基、ＯＣＮＣＨ2ＣＨ2−で示される基、ＣｌＣαＨ2α−で示される基、ＨＳＣβＨ2β−で示される基、ＣＦ3ＣγＦ2γ−ＣδＨ2δ−で示される基、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯＣεＨ2ε−で示される基、ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯＣζＨ2ζ−で示される基、ＨＮ−ＣＯＮＨ−ＣηＨ2η−で示される基、下記化学式（ａ）で示される基、下記化学式（ｂ）で示される基、炭素数１〜１８のアルキル基、又はフェニル基を示す。
【００４８】
【化３】
2017187717.tif 000004
【００４９】
【化４】
2017187717.tif 000005
【００５０】
上記において、α、β、δ、ε、ζ、η、θ及びιは、それぞれ独立して１〜６の整数数を示し、好ましくは１、２、３又は４の整数を示し、γは０〜８の整数を示し、好ましくは０、１、２、３、４、５、６又は７の整数を示す。また、炭素数１〜１８のアルキル基は、炭素数１〜１２が好ましく、炭素数１、２、３、４、５、６、７又は８がより好ましい。また、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、直鎖状であることが好ましい。また、上記のＣｌＣαＨ2α−、ＨＳＣβＨ2β−、ＣＦ3ＣγＦ2γ−ＣδＨ2δ−、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯＣεＨ2ε−、ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯＣζＨ2ζ−、ＨＮ−ＣＯＮＨ−ＣηＨ2η−は、それぞれ、Ｃｌ（ＣＨ2）α−、ＨＳ（ＣＨ2）β−、ＣＦ3（ＣＦ2）γ−（ＣＨ2）δ−、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯ（ＣＨ2）ε−、ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯ（ＣＨ2）ζ−、ＨＮ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）η−であることが好ましい。
【００５１】
また、Ｒ1cは、炭素数１〜６のアルキル基、又は−（ＣＨ2）τ−ＯＣＨ3を示し、Ｒ2cは、炭素数１〜６のアルキル基、又はフェニル基を示す。Ｒ1c及びＲ2cは同一であっても異なってもよい。Ｒ1c及びＲ2cのいずれにおいても、炭素数１〜６のアルキル基は、直鎖状又は分岐状であってよく、直鎖状が好ましい。また、炭素数１、２、３又は４のアルキル基が好ましい。炭素数１〜６のアルキル基としては、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、１−エチルプロピル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、１，２，２−トリメチルプロピル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、イソヘキシル、３−メチルペンチル基等が例示される。中でも、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルが好ましい。また、τは１〜４の整数（好ましくは１、２又は３）を示す。
【００５２】
また、ｐは１、２又は３、ｑは０、１又は２、但し、（４−ｐ−ｑ）≧１を示す。すなわち、（ｐ、ｑ）は（１、０）、（１、１）、（１、２）、（２、０）、（２、１）又は（３、０）を示す。
【００５３】
また、官能基シランとしては、例えば下記の一般式（ＩＶ）で表される化合物も好適に用いることができる。
Ｚ−ＳｉＣｌ3    （ＩＶ）
【００５４】
上記一般式（ＩＶ）において、ＺはＣＨ2＝ＣＨ−で示される基、ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2−で示される基、アルケンを有する基、チオールを有する基、ジスルフィドを有する基、アミンを有する基、エステルを有する基、アミドを有する基、カルボン酸を有する基、ウレアを有する基、チオウレアを有する基、ＣｌＣκＨ2κ−で示される基、ＣＦ3ＣλＦ2λ−ＣξＨ2ξ−で示される基、炭素数１〜１８のアルキル基、フェニル基、又はシクロヘキシル基を示す。κ及びξは、それぞれ独立して１〜６の整数を示し、好ましくは１、２、３又は４の整数を示し、λは０〜８の整数を示し、好ましくは０、１、２、３、４、５、６又は７の整数を示す。また、炭素数１〜１８のアルキル基は、炭素数１〜１２が好ましく、炭素数１、２、３、４、５、６、７又は８がより好ましい。また、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、直鎖状であることが好ましい。また、上記のＣｌＣκＨ2κ−、ＣＦ3ＣλＦ2λ−ＣξＨ2ξ−は、それぞれ、Ｃｌ（ＣＨ2）κ−、ＣＦ3（ＣＦ2）λ−（ＣＨ2）ξ−であることが好ましい。
【００５５】
また、多官能基性シランとして、Ｎ-［２-（Ｎ-ビニルベンジルアミノ）エチル］-３−アミノプロピルトリメトキシシラン塩酸塩を用いてもよい。
【００５６】
一般式（ＩＩＩ）で表される化合物としては、具体的には、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシラン、テトラブトキシシラン、テトライソプロポキシシラン、アリルトリエトキシシラン、アリルトリメトキシシラン、ジエトキシメチルビニルシラン、ジメトキシメチルビニルシラン、トリエトキシビニルシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリス(２-メトキシエトキシ)シラン、(クロロメチル)トリエトキシシラン、３-クロロプロピルジメトキシメチルシラン、３-クロロプロピルトリエトキシシラン、２-(３,４-エポキシシクロヘキシル)エチルトリメトキシシラン、３-メルカプトプロピル(ジメトキシ)メチルシラン、(３-メルカプトプロピル)トリエトキシシラン、(３-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン、イソシアン酸３-(トリエトキシシリル)プロピル、メタクリル酸３-(トリメトキシシリル)プロピル、トリエトキシ-１Ｈ,１Ｈ,２Ｈ,２Ｈ-トリデカフルオロ-n-オクチルシラン、アクリル酸３-(トリメトキシシリル)プロピル、３-トリメトキシシリルプロピルクロリド、１-[３-(トリメトキシシリル)プロピル]尿素、トリメトキシ(３,３,３-トリフルオロプロピル)シラン、３-ウレイドプロピルトリエトキシシラン、ジエトキシ(３-グリシジルオキシプロピル)メチルシラン、３-グリシジルオキシプロピル(ジメトキシ)メチルシラン、３-グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン、2-シアノエチルトリエトキシシラン、ジアセトキシジメチルシラン、ジエトキシジメチルシラン、ジメトキシジメチルシラン、ジメトキシジフェニルシラン、ジメトキシメチルフェニルシラン、ドデシルトリエトキシシラン、ヘキシルトリメトキシシラン、オクタデシルトリエトキシシラン、オクタデシルトリメトキシシラン、n-オクチルトリエトキシシラン、ペンチルトリエトキシシラン、トリアセトキシメチルシラン、トリエトキシエチルシラン、トリメトキシ(メチル)シラン、トリメトキシフェニルシラン、トリメトキシ(プロピル)シラン等が挙げられる。中でも、３-メルカプトプロピル(ジメトキシ)メチルシラン、(３-メルカプトプロピル)トリエトキシシラン、(３-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン等が好ましい。
【００５７】
また、一般式（ＩＶ）で表される化合物としては、具体的には、アリルトリクロロシラン、トリクロロビニルシラン、３-クロロプロピルトリクロロシラン、トリクロロ(１Ｈ,１Ｈ,２Ｈ,２Ｈ-ヘプタデカフルオロデシル）シラン、トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−トリデカフルオロ−ｎ−オクチル）シラン、ブチルトリクロロシラン、シクロヘキシルトリクロロシラン、デシルトリクロロシラン、ドデシルトリクロロシラン、エチルトリクロロシラン、ｎ−オクチルトリクロロシラン、フェニルトリクロロシラン、トリクロロ−２−シアノエチルシラン、トリクロロヘキシルシラン、トリクロロ（メチル）シラン、トリクロロオクタデシルシラン、トリクロロ（プロピル)シラン、トリクロロテトラデシルシラン等が挙げられる。
【００５８】
上記官能基シランは、例えば東京化成工業株式会社製の市販品を用いることができる。また、官能基シランは１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００５９】
次に、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子と、インドシアニングリーンを反応させてポリシロキサン、ポルフィリン及びインドシアニングリーンの複合体を形成する。具体的には、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子の水溶液にインドシアニングリーンの水溶液を加えて、４〜５０℃の温度で、１〜２４時間撹拌することで反応させる。ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子表面の官能基とインドシアニングリーンが共有結合してポリシロキサン、ポルフィリン及びインドシアニングリーンの複合体を形成する。インドシアニングリーンとして、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子表面の官能基と結合する官能基で修飾されたインドシアニングリーンを用いる。例えば、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子を形成した官能基シランが3-メルカプトプロピル(ジメトキシ)メチルシラン、(３-メルカプトプロピル)トリエトキシシラン及び(３-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン等のチオール基を有する場合、マレイミド基が結合しているインドシアニングリーンを用いることができる。なお、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子とインドシアニングリーンを反応させて、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子にインドシアニングリーンを結合させると同時に、細胞表面結合物質、例えば、葉酸をポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子に結合させてもよい。葉酸としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の片末端にマレイミド基が、もう一方の片末端に葉酸が結合したものを用いることができる。
【００６０】
上記反応において、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子のインドシアニングリーンと共有結合する官能基と、インドシアニングリーンを修飾し、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子と共有結合する官能基のモル比（ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子のインドシアニングリーンと共有結合する官能基：インドシアニングリーンを修飾した官能基）は、１：１〜３：１であることが好ましく、１：１〜２：１であることがより好ましく、１：１であることがさらに好ましい。
【００６１】
ポルフィリンとしてＴＣＰＰを用いた場合、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体において、ＴＣＰＰのカルボキシル基はアミド結合を形成して存在することが好ましく、ＴＣＰＰはアミド結合によりシロキサンネットワーク（ポリシロキサンの主鎖）中に組み込まれていることがより好ましい。そして、インドシアニングリーンは、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子表面の官能基（ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子を形成する官能基シランの官能基）と結合することが好ましい。このような構造になることで、ポルフィリンとインドシアニンの間にＦＲＥＴが生じない。本発明において、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体等の複合体や蛍光プローブの構造は、後述するように、フーリエ変換赤外分光法で解析することができる。
【００６２】
前記蛍光プローブは、特に限定されないが、インビトロ及びインビボの両方の蛍光イメージングに好適である観点から、蛍光色素ａを１質量％以上含み、蛍光色素ｂを０．１質量％以上含むことが好ましく、より好ましくは蛍光色素ａを５〜９０質量％含み、蛍光色素ｂを１〜１０質量％含む。また、蛍光色素ａがポルフィリンであり、蛍光色素ｂがインドシアニングリーンであり、担体分子がポリシロキサンである場合、蛍光プローブにおいて、ポルフィリンの４つのピロールの環状構造部分（ポルフィン）の含有量が１質量％以上であることが好ましく、インドシアニングリーンの含有量が０．１質量％以上であることが好ましい。より好ましくは、ポルフィリンの４つのピロールの環状構造部分（ポルフィン）の含有量が５〜９０質量％であり、インドシアニングリーンの含有量が１〜１０質量％である。本発明において、後述するように、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体等の複合体や蛍光プローブの熱重量・示差熱分析により、ポルフィリン等の蛍光色素やシリカポリマーなどの担体分子の含有量を測定することができる。
【００６３】
前記蛍光プローブは、特に限定されないが、細胞を標識しやすい観点から、平均粒子径が３〜２５０ｎｍであることが好ましく、１０〜８０ｎｍであることがより好ましい。本発明において、平均粒子径は、動的光散乱法で測定する。
【００６４】
（蛍光検出方法）
本発明の蛍光検出方法は、標的細胞を観察するのに用いる。具体的には、標的細胞を蛍光プローブで標識する工程と、蛍光プローブで標識された標的細胞に励起光を照射して、蛍光プローブからの蛍光を観察する工程を含む。蛍光プローブとしては、上述した本発明の蛍光プローブを用いる。
【００６５】
標的細胞の標識は、蛍光プローブを細胞表面に結合させること、あるいは、蛍光プローブを細胞内に取り込ませることで行うことができる。蛍光プローブを細胞表面に結合させる場合、蛍光プローブは細胞表面結合物質を有する。例えば、蛍光プローブが葉酸を有する場合、ヒトの子宮頸癌由来のＨｅＬａ Ｓ３細胞やヒトの大腸がん由来のＨＣＴ１１６細胞等の癌細胞の表面に結合してこれらの癌細胞を標識することができる。具体的には、細胞を蛍光プローブ入りの細胞培養培地で培養することで、細胞を蛍光プローブで標識することができる。標的細胞としては、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞、癌細胞及び肝硬変細胞等の疾患関連細胞等が挙げられる。
【００６６】
蛍光プローブで標識された標的細胞に蛍光色素ａを励起する励起光を照射し、蛍光顕微鏡やフローサイトメーター等のインビトロ蛍光イメージング装置を用いたインビトロ蛍光イメージングによって蛍光プローブからの蛍光を観察することができる。例えば、波長範囲が３５０〜６５０ｎｍの励起光で蛍光色素ａを励起し、４００〜８００ｎｍ波長範囲の蛍光を観察する。好ましくは、波長範囲が３８０〜５８０ｎｍの励起光で蛍光色素ａを励起し、４５０〜６８０ｎｍ波長範囲の蛍光を観察する。
【００６７】
また、蛍光プローブで標識された標的細胞を生体（ただし、人体を除く）内に移植し、該生体内の蛍光プローブで標識された標的細胞に蛍光色素ｂを励起する励起光を照射し、インビボ蛍光イメージング装置を用いたインビボ蛍光イメージングによって蛍光プローブからの蛍光を観察することができる。例えば、波長範囲が６００〜８５０ｎｍの励起光で蛍光色素ｂを励起し、６５０〜９２０ｎｍ波長範囲の蛍光を観察する。好ましくは、波長範囲が６３０〜７９０ｎｍの励起光で蛍光色素ｂを励起し、６８０〜９１０ｎｍ波長範囲の蛍光を観察する。本発明において、生体は、蛍光観察を行うことができる動物であれば特に限定は無い。好ましくは哺乳動物である。特に好ましくは、マウス、ラット等のげっ歯類の哺乳動物である。なお、マウス等の生体内への蛍光プローブで標識された標的細胞の移植は、後述するとおりに行うことができる。
【００６８】
本発明の蛍光プローブを用いることで、インビトロ及びインビボのいずれにおいても、蛍光プローブで標識された標的細胞を観察することができる。
【００６９】
（蛍光プローブの使用方法）
本発明の蛍光プローブの使用方法は、細胞を蛍光プローブによって蛍光標識する工程と、蛍光プローブによって標識された蛍光標識細胞をフローサイトメーター又は蛍光顕微鏡によって確認して選別する工程と、選別した蛍光標識細胞を生体（ただし、人体を除く）内に移植する工程と、生体内の蛍光標識細胞をインビボ蛍光イメージング装置で観察する工程を含む。
【００７０】
まず、細胞を蛍光プローブによって蛍光標識する。細胞の標識は、蛍光プローブを細胞表面に結合させること、あるいは、蛍光プローブを細胞内に取り込ませることで行うことができる。蛍光プローブを細胞表面に結合させる場合、蛍光プローブは細胞表面結合物質を有する。例えば、蛍光プローブが葉酸を有する場合、ヒトの子宮頸癌由来のＨｅＬａ Ｓ３細胞やヒトの大腸がん由来のＨＣＴ１１６細胞等の癌細胞の表面に結合してこれらの癌細胞を標識することができる。具体的には、細胞を蛍光プローブ入りの細胞培養培地で培養することで、細胞を蛍光プローブで標識することができる。細胞としては、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞、癌細胞及び肝硬変細胞等の疾患関連細胞等が挙げられる。
【００７１】
次に、蛍光プローブによって標識された蛍光標識細胞をフローサイトメーターによって選別する。フローサイトメーター又は蛍光顕微鏡による蛍光標識細胞の確認・選別は、蛍光色素ａ由来の蛍光を検出することで行う。具体的には、蛍光プローブによって蛍光標識操作を行った後の細胞をフローサイトメーターに供給し、蛍光色素ａの励起する波長の励起光で蛍光色素ａを励起し、励起された蛍光色素ａからの蛍光を検出することで、蛍光プローブによって蛍光標識された蛍光標識細胞を選別することができる。フローサイトメーターによる観察は、例えば、励起波長３５０〜６４０ｎｍ、蛍光波長６３０〜７８０ｎｍの条件下で行うことができる。或いは、蛍光プローブによって蛍光標識操作を行った後の細胞を蛍光顕微鏡に供給し、蛍光色素ａの励起する波長の励起光で蛍光色素ａを励起し、励起された蛍光色素ａからの蛍光を検出することで、蛍光プローブによって蛍光標識された蛍光標識細胞を選別することができる。蛍光顕微鏡による観察は、例えば、励起波長３５０〜６４０ｎｍ、蛍光波長６３０〜７８０ｎｍの条件下で行うことができる。従来は、蛍光プローブによって蛍光標識操作を行った後の細胞をそのままマウス等の生体内に移植していたが、本発明の蛍光プローブを用いることで、蛍光プローブによって蛍光標識された蛍光標識細胞のみをフローサイトメーターによって選別してマウス等の生体内に移植することができる。
【００７２】
次に、選別した蛍光標識細胞を生体（ただし、人体を除く）内に移植する。選別した蛍光標識細胞の生体内への移植は、例えば、皮下、静脈、腹腔等からの投与によって行うことができる。例えば、マウスの場合、蛍光標識細胞をリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、シリンジを用いて蛍光標識細胞の懸濁液をマウスの尾静脈に注射することで、蛍光標識細胞をマウス体内に移植する。
【００７３】
次に、生体内の蛍光標識細胞をインビボ蛍光イメージング装置で観察する。インビボ蛍光イメージング装置としては、特に限定されず、例えば、倉敷紡績社の蛍光インビボイメージング装置「ＫＵＲＡＶＩＣ  ＫＶ−７００」、パーキンエルマー社のＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ＭａｅｓｔｒｏTM等を用いることができる。生体内の蛍光標識細胞のインビボ蛍光イメージング装置による観察は、蛍光色素ｂ由来の蛍光を検出することで行う。具体的には、蛍光色素ｂを励起する波長の励起光で蛍光色素ｂを励起し、励起された蛍光色素ｂからの蛍光を検出する。生体内の蛍光標識細胞のインビボ蛍光イメージング装置による観察は、例えば、励起波長６５０〜７６０ｎｍ、蛍光波長７６０〜８５０ｎｍの条件下で行うことができる。生体内の蛍光標識細胞のインビボ蛍光イメージング装置による観察を経時的に行うことで、マウス等の生体内に移植したｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞、癌細胞及び肝硬変細胞等の疾患関連細胞等の細胞が移植後、どの位置で分化、生育、転移するかと言った情報を取得することができる。
【００７４】
従来は、細胞を蛍光プローブで標識を行った後、細胞が実際に蛍光プローブで標識されたか否かを確認せず、マウス等の生体内に移植していたが、本発明の蛍光プローブを用いることで、フローサイトメーターによって蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞のみを選択し、マウス等の生体内に移植し、移植後の蛍光標識細胞の生体内における経過をインビボ蛍光イメージング装置で観察することができる。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。【００７６】
（試薬）
テトラキス（４−カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）、（３−メルカプトプロピル)トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、マレイミド基が結合したインドシアニングリーン（分子量８５３、以下において、単に「ＩＣＧ-Ｍａｌ」とも記す。）、葉酸とマレイミド基が両末端に結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（分子量３４００、以下において、単に「ＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌ」とも記す。）は、いずれも、東京化成工業株式会社から入手した。ＭＰＴＭＳ、ＩＣＧ-Ｍａｌ及びＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌの構造式を下記に示した。【００７７】
【化５】
2017187717.tif 000006
【００７８】
【化６】
2017187717.tif 000007
【００７９】
【化７】
2017187717.tif 000008
【００８０】
（実施例１）
（蛍光プローブの作製）
＜担体分子と蛍光色素ａの複合体の作製＞
（１）ＴＣＰＰをＤＭＦに溶解させたＴＣＰＰのＤＭＦ溶液（３．８ｍＭ、３２ｍＬ）にＡＰＴＥＳ（４６２μｍｏｌ）を加え、続いてＮ，Ｎ´−ジプロピルカルボジイミド（４８０μｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（４８０μｍｏｌ）を加え、５０℃で２４時間撹拌した。
（２）上記で得られたポルフィリン‐シランのＤＭＦ溶液２００μＬ（ポルフィリン‐シラン０．７５μｍｏｌ）を、ＭＰＴＭＳ５μＬ（０．０２７ｍｍｏｌ）と混合した。得られた混合液に、ＤＭＦを５００μＬとアンモニア水（濃度：２８質量％、ｐＨ１１）を３００μＬ加えて、８０℃で２４時間反応を行った。
（３）２４時間後、生成物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分）で沈殿物として回収し、生成物を水とエタノールで数回洗浄し、最終的に１ｍＬの水に分散させた。
（４）得られた物質は、ポリシロキサンを担体分子とし、ポルフィリンを蛍光色素ａとするポリシロキサンにポルフィリンが共有結合したポリシロキサンとポルフィリンの複合体であり、動的光散乱法（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ製「ＤｅｌｓａＭａｘ  ＰＲＯ」）により測定したところ、平均粒子径が約４０ｎｍの蛍光ハイブリッドナノ粒子（以下において、単に「ＰＰＳ ＨＮＰｓ」とも記す。）であった。【００８１】
＜担体分子と蛍光色素ａの複合体に蛍光色素ｂを結合させる工程＞
（１）上記で得られたＰＰＳ ＨＮＰｓの水分散液１ｍＬに、ＩＣＧ-Ｍａｌの水溶液を６３μＬ(濃度：２ｍｇ/ｍＬ、ＩＣＧ-Ｍａｌ：１．４８×１０-4ｍｍｏｌ)添加し、３０℃で３時間撹拌して反応させた。
（２）反応後、生成物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分）で沈殿物として回収し、水で数回洗浄し、最終的に１ｍＬの水に分散させた。
（３）得られた物質は、ポリシロキサンを担体とし、ポルフィリンを蛍光色素ａとし、インドシアニングリーンを蛍光色素ｂとするポリシロキサンにポルフィリン及びインドシアニングリーンが共有結合した複合体（蛍光プローブ）であり、動的光散乱法（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製「ＤｅｌｓａＭａｘ ＰＲＯ」）により測定したところ、平均粒子径が約５０ｎｍの蛍光ハイブリッドナノ粒子（以下において、単に「ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ」とも記す。）であった。【００８２】
（実施例２）
（蛍光プローブの作製）
＜担体分子と蛍光色素ａの複合体の作製＞
実施例１と同様にして、ＰＰＳ ＨＮＰｓを得た。【００８３】
＜担体分子に蛍光色素ｂ及び細胞表面結合物質を結合させる工程＞
（１）上記で得られたＰＰＳ ＨＮＰｓの水分散液１ｍＬに、ＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌの水溶液を２５１μＬ（濃度：２ｍｇ／ｍＬ、ＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌ：１．４８×１０-4ｍｍｏｌ）と、ＩＣＧ-Ｍａｌの水溶液（濃度：２ｍｇ／ｍＬ、ＩＣＧ-Ｍａｌ：１．４８×１０-4ｍｍｏｌ）を６３μＬ添加し、３０℃で３時間撹拌した。
（２）反応後、生成物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分）で沈殿物として回収し、水で数回洗浄し、最終的に１ｍＬの水に分散させた。
（３）得られた物質は、ポリシロキサンを担体分子とし、ポルフィリンを蛍光色素ａとし、インドシアニングリーンを蛍光色素ｂとし、葉酸を細胞表面結合物質とするポリシロキサンにポルフィリン、インドシアニングリーン及び葉酸が共有結合した複合体（蛍光プローブ）であり、動的光散乱法（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製「ＤｅｌｓａＭａｘ  ＰＲＯ」）により測定したところ、平均粒子径が約６５ｎｍの蛍光ハイブリッドナノ粒子（以下において、単に「ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ」とも記す。）であった。【００８４】
（フーリエ変換赤外分光法による確認）
実施例１及び実施例２で得られたＰＰＳ ＨＮＰｓと、原料として用いたＴＣＰＰをフーリエ変換赤外分光光度計（Ｎｉｃｏｌｅｔ社製「ＮＥＸＵＳ４７０」）で解析し、ＰＰＳ ＨＮＰｓ及びＴＣＰＰのＦＴ−ＩＲスペクトルを図１に示した。図１のＦＴ−ＩＲスペクトルから、どちらとも３４３０〜３２５０ｃｍ-1にピロール環に由来するピークを示すことが分かった。ＰＰＳ ＨＮＰｓにおいて、ＴＣＰＰの１８００〜１６４０ｃｍ-1のカルボン酸（カルボキシル基）のピークが消失し、１７４０〜１６２０ｃｍ-1のアミド由来のピークが現れたことから、ＴＣＰＰのカルボキシル基がアミド結合を形成してシロキサンと共有結合した（ポルフィリン‐シランとＭＰＴＭＳの加水分解・縮合により形成された）ポリシロキサンとポルフィリンの複合体が確実に合成されていることが確認された。また、ＰＰＳ ＨＮＰｓの１２６０〜１０１０ｃｍ-1（νＳｉ−Ｏ−Ｓｉ）、８７０〜７４０ｃｍ-1（νＳｉ−Ｏ−Ｓｉ）、５４０〜４１０ｃｍ-1（σＳｉ−Ｏ−Ｓｉ）にシロキサン結合に由来するピークが現れていた。すなわち、ＰＰＳ ＨＮＰｓでは、ポルフィリン‐シラン及びＭＰＴＭＳ（官能基シラン）にてシロキサンネットワークが形成され、ポルフィリンはアミド結合によりシロキサンネットワーク中に組み込まれていることが確認された。【００８５】
実施例１及び実施例２で得られたＰＰＳ ＨＮＰｓを29Ｓｉ固体ＮＭＲで構造解析し、ＰＰＳ ＨＮＰｓの29Ｓｉ固体ＮＭＲスペクトルを図２に示した。図２から、−５８及び−６９ｐｐｍにピークが現れることが確認された。−５８ｐｐｍのピークは、下記の化学式で表されるＴ2構造を示し、−６９ｐｐｍのピークは、下記の化学式で表されるＴ3構造を示していると推測される。この結果より、ＰＰＳ ＨＮＰｓには、一部Ｔ2構造のＳｉが存在するものの、ほとんどのＭＰＴＭＳとポルフィリン‐シランが加水分解、重縮合を受けていることが確認された。ポリシロキサンにポルフィリンが共有結合して複合体を形成していることになる。【００８６】
【化８】
2017187717.tif 000009
【００８７】
（熱重量・示差熱分析）
熱分析計（リガク製、ＴＧ８１２０）を用いてＰＰＳ ＨＮＰｓに対して熱重量・示差熱分析（ＴＧ-ＤＴＡ）を行った。図３にＰＰＳ ＨＮＰｓのＴＧ（熱重量）及びＤＴＡ（示唆熱）曲線を示した。解析の結果、１００℃における重量減少は吸着水によるもの、３００℃における重量減少はアミノプロピル部分及びメルカプトプロピル部分の燃焼によるもの、３００〜４００℃における重量減少はポルフィリンの４つのピロールの環状構造部分（ポルフィン）の分解によるものであり、残りの部分がポリシロキサン部分と推測される。具体的には、ＰＰＳ ＨＮＰｓ中には７重量％の吸着水、２９重量％のアミノプロピル部分及びメルカプトプロピル部分、１７重量％のポルフィリンの４つのピロールの環状構造部分（ポルフィン）、４７重量％のポリシロキサン部分が含まれていると推測される。【００８８】
（ＰＰＳ ＨＮＰｓに結合したＦＡ-ＰＥＧ及びＩＣＧの定量）
ＰＰＳ ＨＮＰｓに結合したＦＡ-ＰＥＧ及びＩＣＧの量を求めるために、実施例２において、反応終了後の上澄み液（１ｍＬ）の吸収スペクトルを分光光度計（日本分光社製「Ｖ−５７０」）にて測定し、未反応のＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌ、ＩＣＧ-Ｍａｌ量を計算した。図４Ａに、上澄み液の吸収スペクトルを示した。ＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌは葉酸の水溶液中の吸光係数が不明であったため、葉酸のピーク波長３７７ｎｍにおける検量線を作成し、そこから濃度を算出した。図４Ｂに葉酸の検量線を示した。図４Ａにおいて３７７ｎｍの吸光度は０．０３２であり、これより求められる上澄み中の葉酸の濃度は１２ｎｍｏｌ／ｍＬである。使用したＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌ量は１４８ｎｍｏｌであるため、９２％のＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌが反応したことが確認された。次にＩＣＧ-Ｍａｌについては、ＩＣＧの水溶液中の８００ｎｍにおけるモル吸光係数ε８００＝１４７０００Ｌ/ｍｏｌ・ｃｍを用いてランベルト・ベールの式Ａ800＝ε800ｃＬから上澄み中の濃度を計算した結果、０．０９４ｎｍｏｌ/ｍＬであった。使用したＩＣＧ−Ｍａｌ量は１４８ｎｍｏｌであるため、９９．９％のＩＣＧ-Ｍａｌが反応したと見積もることができる。以上の計算結果より９２％のＦＡ-ＰＥＧ、ほぼ１００％のＩＣＧがＰＰＳ ＨＮＰｓに結合していると判断した。同様に、実施例１において、ＰＰＳ ＨＮＰｓに結合したＩＣＧの量を求めたところ、ほぼ１００％のＩＣＧがＰＰＳ ＨＮＰｓに結合していることが確認された。【００８９】
（分光法による吸収スペクトルの確認）
実施例１及び実施例２で得られたＰＰＳ ＨＮＰｓの水溶液及び実施例２で得られたＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの水溶液の吸収スペクトルを分光光度計（日本分光社製「Ｖ−５７０」）にて測定し、その結果を下記図５に示した。図５のＰＰＳ ＨＮＰｓ及びＦＡ−ＰＥＧ／ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの吸収スペクトルから、ＰＰＳ ＨＮＰｓにＩＣＧが結合することにより、波長７００〜９００ｎｍあたりにＩＣＧに由来するピークが現れることが確認された。また、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ及びＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓにおいて、ポルフィリンに由来する３８０〜６５０ｎｍあたりのピークにはほとんど変化がないことが確認された。【００９０】
（蛍光プローブの波長特性確認）
実施例２で得られたＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの水溶液を用い、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの励起波長スペクトル及び蛍光波長スペクトルを、日本分光社製の分光蛍光光度計ＦＰ−６６００にて解析した。その結果を図６に示した。図６Ａはインビトロ蛍光イメージングに用いる短波長側の波長特性を示し、図６Ｂはインビボ蛍光イメージングに用いる長波長側の波長特性を示している。図６Ａ及び図６Ｂのから、最大励起波長４２５ｎｍ、最大蛍光波長６５５ｎｍの短波長側と、最大励起波長６５０ｎｍ、最大蛍光波長９０５ｎｍの長波長側のどちらにおいてもストークスシフトが大きいことが分かった。ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ及びＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓは、いずれも、担体分子（ポリシロキサン）に結合した異なる励起波長の２つの蛍光色素（ポルフィリンとＩＣＧ）を有し、且つ２つの蛍光色素の間で蛍光共鳴エネルギー移動が生じない蛍光プローブであることが確認された。該蛍光プローブは、インビトロ及びインビボのどちらのイメージングにも用いることができる。さらに、ストークスシフトが大きいため、インビボイメージングにおいては生体の自家蛍光に妨げられることなく、非常に高い有用性が見込める。【００９１】
（蛍光顕微鏡による解析）
（１）細胞
マウスと同種の細胞であるマウスのマクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細胞、マウスと異種の細胞であるヒトの子宮頸癌由来のＨｅＬａ Ｓ３細胞とヒトの大腸がん由来のＨＣＴ１１６細胞を用いた。実施例において、細胞及び細胞培養用培地は、シグマーアルドリッチ社から入手した。細胞培養ディッシュは、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製のものを用いた。
（２）細胞の蛍光プローブ標識
（ａ）細胞を細胞培養ディッシュ（直径３５ｍｍ）中の細胞培養用培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に播種（０．３ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）し、一晩培養した。
（ｂ）培養した細胞を蛍光プローブ（３０μｇ／ｍＬ）入りの細胞培養用培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に交換し、２４時間培養を行った。このとき、ＲＡＷ２６４．７細胞は、蛍光プローブＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ入りの細胞培養用培地に交換し、ＨｅＬａ Ｓ３細胞とＨＣＴ１１６細胞は、蛍光プローブＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ入りの細胞培養用培地に交換した。
（ｃ）上清を捨て、培養細胞を２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、和光純薬「Ｄ−ＰＢＳ（−）（０４５−２９７９５）」）で洗浄した。
（ｄ）上清を捨て、培養細胞に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を２ｍＬ添加し、３０分間室温（２０±５℃）で静置した。
（ｅ）上清を捨て、培養細胞に１×ＰＢＳを１ｍＬ加えた。この工程を３回繰り返した。
（３）蛍光顕微鏡による観察
ライフテクノロジーズ社の蛍光顕微鏡ＥＶＯＳ（登録商標）ＦＬ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて蛍光プローブで標識した蛍光標識細胞を観察した。ポルフィリンの波長特性に合わせ、励起波長は４２２ｎｍ、蛍光波長は６５５ｎｍで観察を行った。その結果を図７に示した。【００９２】
図７Ａには、ＲＡＷ２６４．７細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、蛍光色素ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を使用した細胞核の蛍光イメージ（ＤＡＰＩ）、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ（蛍光プローブ）による蛍光イメージング、これら三つの画像を重ねあわせた像（Ｍｅｒｇｅ）が示されている。図７Ａの明視野像から、細胞が存在していることが分かった。またＤＡＰＩの画像から、ＤＡＰＩによって染色された細胞核が確認された。ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの画像から、蛍光プローブによって細胞が標識されていることが分かった。Ｍｅｒｇｅの画像から、ＲＡＷ２６４．７細胞において、蛍光プローブによる蛍光は、細胞質にて多く観察され、核は蛍光していないことがわかった。この結果からＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ（蛍光プローブ）が細胞内に取り込まれて、細胞質で留まっていることが確認された。ＲＡＷ２６４．７細胞は、マクロファージ細胞であり、貪食能により蛍光プローブを細胞内に取込み、細胞質に蛍光プローブが集まったと考えられる。【００９３】
図７Ｂには、ＨｅＬａ Ｓ３細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、蛍光色素ＤＡＰＩを使用した細胞核の蛍光イメージ（ＤＡＰＩ）、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ蛍光プローブによる蛍光イメージング、これら三つの画像を重ねあわせた像（Ｍｅｒｇｅ）が示されている。図７Ｂの明視野像から、細胞が存在していることが分かった。またＤＡＰＩの画像から、ＤＡＰＩによって染色された細胞核が確認された。ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ蛍光プローブの画像から、蛍光プローブによって細胞が標識されていることが分かった。Ｍｅｒｇｅの画像から、ＨｅＬａ Ｓ３細胞の蛍光プローブの蛍光は、細胞核も含めて細胞全体が蛍光していることがわかった。この結果から蛍光プローブが細胞表面に結合しており、細胞全体が光って観測されていることが明らかになった。がん細胞は細胞表面に葉酸を結合させる受容体を持っており、蛍光プローブ（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）が葉酸を介してがん細胞であるＨｅＬａ Ｓ３細胞の表面に結合したと考えられる。【００９４】
図７Ｃには、ＨＣＴ１１６細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、蛍光色素ＤＡＰＩを使用した細胞核の蛍光イメージ（ＤＡＰＩ）、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ蛍光プローブによる蛍光イメージング、これら三つの画像を重ねあわせた像（Ｍｅｒｇｅ）が示されている。図７Ｃの明視野像から、細胞が存在していることが分かった。またＤＡＰＩの画像から、ＤＡＰＩによって染色された細胞核が確認された。ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ蛍光プローブの画像から、蛍光プローブによって細胞が標識されていることが分かった。Ｍｅｒｇｅの画像から、ＨＣＴ１１６細胞の蛍光プローブの蛍光は、細胞核も含めて細胞全体が蛍光していることがわかった。この結果から蛍光プローブが細胞表面に結合しており、細胞全体が光って観測されていることが明らかになった。がん細胞は細胞表面に葉酸を結合させる受容体を持っており、蛍光プローブ（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）が葉酸を介してがん細胞であるＨＣＴ１１６細胞の表面に結合したと考えられる。【００９５】
（フローサイトメーターによる解析）
（１）細胞
マウスと同種の細胞であるマウスのマクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細胞及びマウスと異種の細胞であるヒトの子宮頸癌由来のＨｅＬａ Ｓ３細胞とヒトの大腸がん由来のＨＣＴ１１６細胞を用いた。
（２）細胞の蛍光プローブ標識
（ａ）細胞を細胞培養ディッシュ（直径３５ｍｍ）中の細胞培養培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に下記表１に示す播種量で播種し、一晩培養した。
（ｂ）培養した細胞を下記表１に示す蛍光プローブ（５０μｇ／ｍＬ）入りの細胞培養培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に交換し、さらに４８時間培養を行った。
（ｃ）細胞培養ディッシュから細胞を回収した。このとき、ＨｅＬａ Ｓ３細胞及びＨＣＴ１１６細胞の回収には０．２５％のトリプシン/ＥＤＴＡ溶液を使用した。
（ｄ）回収液を１０００回転にて５分間遠心分離した後、上清を捨て、細胞を４００μＬの細胞培養培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に懸濁した。
（ｅ）懸濁液を１０００回転、５分間遠心分離した後、上清を捨て、細胞に４％ＰＦＡを１ｍＬ添加し、３０分間室温（２０±５℃）で静置した。
（ｆ）再懸濁液を１０００回転、５分間遠心分離した後、上清を捨て、細胞に１ｘＰＢＳを１ｍＬ加えた。この工程を３回繰り返した。【００９６】
【表１】
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【００９７】
（３）フローサイトメーターによる観察
ＢＤ社のフローサイトメーターＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＸ−２０を用いて蛍光プルーブで標識を行った細胞を観察した。励起波長は４０５ｎｍ、蛍光波長は６７０ｎｍで観察を行った。その結果を図８（ＲＡＷ２６４．７細胞）、図９（ＨｅＬａ Ｓ３細胞）及び図１０（ＨＣＴ１１６細胞）に示した。【００９８】
図８、図９及び図１０から分かるように、全ての細胞サンプルで蛍光標識されている細胞と蛍光標識されていない細胞とを分離して観察することができた。光強度としては、１００〜１００００倍ほどの差があった。細胞に対して蛍光プローブによる標識を行った後、蛍光標識された細胞と蛍光標識されていない細胞を明確に判別し、分離することができた。フローサイトメーターを用いることで、蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞のみを選別し、マウス等の生体内へ移植することができ、蛍光インビボイメージング装置により、マウス等の生体内での蛍光標識細胞の局在をより正確に確認することができる。【００９９】
（マウスへの蛍光標識細胞の移植）
（１）細胞
ＲＡＷ２６４．７細胞及びＨｅＬａ Ｓ３細胞を用いた。
（２）細胞の蛍光プローブによる標識
（ａ）細胞を細胞培養ディッシュ（直径６０ｍｍ）中の細胞培養用培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に播種（１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）し、一晩培養した。
（ｂ）培養した細胞を蛍光プローブ（３０μｇ／ｍＬ）入りの細胞培養用培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に交換し、２４時間培養を行った。このとき、ＲＡＷ２６４．７細胞は、蛍光プローブＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ入りの細胞培養用培地に交換し、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞は、蛍光プローブＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ入りの細胞培養用培地に交換した。
（ｃ）細胞培養ディッシュから細胞を回収した。このとき、ＨｅＬａ Ｓ３細胞の回収にはトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を使用した。
（ｄ）回収液を１０００回転にて５分間遠心分離した後、上清を捨て、細胞を１０００μＬの無血清培地（ＤＭＥＭ培地）に懸濁した。
（ｅ）懸濁液を１０００回転にて５分間遠心分離した後、上清を捨て、１０００μＬの血清培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）を加え、細胞を懸濁した。
（ｆ）１ｘ１０6細胞を１００μＬの１ｘＰＢＳに懸濁し、シリンジを用いてマウス（ＫＳＮ／Ｓｌｃ、雄、６週零、日本エスエルシー株式会社）の尾静脈に注射した。細胞数については、血球計算盤を用いて測定した。【０１００】
（３）マウス体内の蛍光プローブで標識されて蛍光標識細胞の観察
倉敷紡績社の蛍光インビボイメージング装置「ＫＵＲＡＶＩＣ  ＫＶ−７００」を用いてマウス体内の蛍光標識細胞を観察した。観察は注射直前を０時間として、２４時間まで間隔をあけて撮影を行った。ＩＣＧの波長特性に合わせ、励起波長は７４７ｎｍ、蛍光波長は８５０ｎｍで観察を行った。その結果を図１１（ＲＡＷ２６４．７細胞）及び図１２（ＨｅＬａ Ｓ３細胞）に示した。【０１０１】
図１１から、蛍光プローブ（ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）で標識されたＲＡＷ２６４．７細胞のマウス体内における２４時間までの動きが確認できた。すなわち、ＲＡＷ２６４．７細胞がマウス体内でどのような動きをしたか確認できた。特に、インビボ観察に適した蛍光波長の選択によって、自家蛍光を捉えることなく、明確にＩＣＧの蛍光のみを捉えることができた。２４時間後の状態としては、ＲＡＷ２６４．７細胞が脾臓や肝臓が多いものの、内臓全体に分布していることが分かった。【０１０２】
図１２から、蛍光プローブ（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）で標識されたＨｅＬａ Ｓ３細胞のマウス体内における２４時間までの動きが確認できた。すなわち、ＨｅＬａ Ｓ３細胞がマウス体内でどのような動きをしたか確認できた。特に、インビボ観察に適した蛍光波長の選択によって、自家蛍光を捉えることなく、明確にＩＣＧの蛍光のみを捉えることができた。２４時間後の状態としては、細胞が肝臓に特に集積していることが分かった。【０１０３】
（４）マウス体内の蛍光プローブで標識された細胞の集積の確認
２４時間経過後のマウスを解剖し、臓器を取り出し、蛍光インビボイメージング装置「ＫＵＲＡＶＩＣ  ＫＶ−７００」により、２４時間後の蛍光プローブで標識された細胞のマウス体内での集積の状態を観察した。その結果を図１３（ＲＡＷ２６４．７細胞）、図１４（ＲＡＷ２６４．７細胞）、図１５（ＨｅＬａ Ｓ３細胞）及び図１６（ＨｅＬａ Ｓ３細胞）を示した。【０１０４】
図１３及び図１４から分かるように、２４時間後に、蛍光プローブ（ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）で標識されたＲＡＷ２６４．７細胞は脾臓や肝臓に多く集積されているものの、内臓全体に分布していた。また、図１５及び図１６から分かるように、２４時間後に、蛍光プローブ（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）で標識されたＨｅＬａ細胞は、肝臓に特に多く集積した。【０１０５】
以上から分かるように、蛍光プローブとしてＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ及びＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ等の担体分子に結合した異なる励起波長の２つの蛍光色素を有し、且つ２つの蛍光色素の間で蛍光色素ａと蛍光色素ｂの間に蛍光共鳴エネルギー移動が生じない蛍光プローブを用いることにより、蛍光プローブで標識された細胞を蛍光顕微鏡やフローサイトメーター等の蛍光インビトロイメージング装置で確認できるとともに、蛍光プローブで標識された細胞を移植した生体内における蛍光標識細胞の時間に伴う局在等を蛍光インビボイメージング装置で確認できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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