(57)【要約】  本発明は、シンプルな二本鎖形成により短鎖の核酸を特異度高く検出する、又は定量する手段を提供することを目的とする。  本発明は、配列番号１−１０のいずれか１つの配列を少なくとも１つ有する標的配列に対して相補的な配列において、標的配列における配列番号１−１０のいずれか１つの配列と相補的な部分における少なくとも１個の塩基が脱塩基化されている若しくは置換されている配列を有するポリヌクレオ塩基プローブ、並びに、その設計方法及び利用方法に関する。
2018155427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１−１０のいずれか１つの配列を少なくとも１つ有する標的配列に対して相補的な配列において、前記標的配列における当該配列番号１−１０のいずれか１つの配列と相補的な部分における少なくとも１個の塩基が、脱塩基化されかつ／又は置換され、かつ／あるいは、前記標的配列における配列番号１−１０のいずれか１つの配列における２塩基以下の配列と相補的な配列を末端に少なくとも１つ有するように切断された配列を有するポリヌクレオ塩基プローブ。
【請求項２】
１０〜５０ｍｅｒである、請求項１に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
【請求項３】
１５〜２８ｍｅｒである、請求項２に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
【請求項４】
標識が結合している、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
【請求項５】
前記標的配列における配列番号１−１０のいずれか１つの配列と相補的な部分において、前記脱塩基化され又は置換されている塩基の少なくとも１つが、該標的配列における当該配列番号１−１０のいずれか１つの配列と相補的な部分の内部に位置する、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
【請求項６】
前記標的配列における配列番号１−１０のいずれか１つの配列と相補的な配列において、前記脱塩基化され又は置換されている塩基の少なくとも１つが、３〜５個のグアニン又はシトシンのどちらか一方に対して１個の割合であることを特徴とする、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
【請求項７】
前記標的核酸が、１０〜５０ｍｅｒのＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
【請求項８】
前記標的核酸が、ｍｉＲＮＡである、請求項７に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
【請求項９】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ，ＢＮＡ又はＰＮＡである、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
【請求項１０】
配列番号１−１０のいずれか１つの配列を少なくとも１つ有する標的配列と高い特異度で結合可能なポリヌクレオ塩基プローブ配列の設計方法であって、
Ａ）該標的配列と完全に相補的な１０〜５０ｍｅｒの配列を完全相補的プローブ配列として選択すること、
Ｂ）（ｉ）該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列における配列番号１−１０のいずれか１つの配列と相補的な部分において、少なくとも１個の塩基を脱塩基化させかつ／若しくは置換させることにより、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、及び／又は、
（ｉｉ）該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列における配列番号１−１０のいずれか１つの配列と相補的な部分が２塩基以下となるように該完全相補的プローブ配列の末端を切断することにより、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、を含む方法。
【請求項１１】
被検サンプル中の配列番号１−１０のいずれか１つの配列を少なくとも１つ有する標的核酸を、高い特異度で検出又は定量する方法であって、
前記標的核酸を検出するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも１種類の請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のポリヌクレオ塩基プローブを前記被検サンプルと接触させること、及び
前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を検出又は定量することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異度の高い核酸検出に利用可能なプローブ、その設計方法及び当該プローブを利用した核酸検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、２０塩基程度のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む低分子ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）が様々な機能を有することから注目されている。特に、これらのｎｃＲＮＡレベルが疾患と相関する場合には、マーカーとしての利用が可能である。【０００３】
ハイブリダイゼーションにより標的ＤＮＡ又はＲＮＡとプローブとを結合させる場合、標的ＤＮＡ又はＲＮＡの結合部分の配列（以下、「結合配列」という）に結合力の強いグアニン又はシトシンのどちらか一方が多数連続した配列が存在する場合がある。このような場合、標的以外のＤＮＡ又はＲＮＡであって、この配列と同じ連続配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡにもプローブが結合することで、偽陽性が出やすいという事象があった。従来、このような偽陽性を誘発しやすい配列を有する長鎖の標的ＤＮＡ又はＲＮＡにプローブを結合させる場合には、グアニン又はシトシンのどちらか一方が多数連続した配列を全く含まない部位に対するプローブを設計して利用していた。一般的にハイブリダイゼーションによる特異的配列の検出には１８ｍｅｒ程度のプローブ長が必要と考えられている。しかし、ｍｉＲＮＡのような２０ｍｅｒ程度の短い鎖長で構成される標的配列を検出する場合には、グアニン又はシトシンのどちらか一方が多数連続した配列を全く含まないプローブ設計はできず、偽陽性の発生を回避できない。【０００４】
このため、ｍｉＲＮＡを含むｎｃＲＮＡの検出方法としては、ハイブリダイゼーションによる特異的配列の検出によらない方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用した方法や、オリゴヌクレオチドライゲイションアッセイ（ＯＬＡ）又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（特許文献１）などが用いられてきた。【０００５】
その他、ｍｉＲＮＡの測定の特異度を高める方法として、アフィニティの高いＬＮＡ（特許文献２）を用いる方法が知られている。しかし、この方法はハイブリダイゼーションにおける結合力を高めるが、グアニン又はシトシンのどちらか一方が多数連続した配列がもたらす偽陽性を回避できなかった。【０００６】
特許文献３は、光応答性有機基に結合したプローブを用いて、二本鎖を形成したオリゴヌクレオチドに光を照射し、光の吸収の違いを利用してＳＮＰを検出する方法を開示している。本文献におけるプローブとして、ＳＮＰ部位が変異していない配列及び変異している配列のいずれをも用いることができることが記載されている。その他、特許文献３は、ＳＮＰ用のプローブとして、ＳＮＰ部分が変異型に置換されているプローブを開示している。しかし、これらのプローブの配列はいずれも結合させようとする標的配列そのものにおいてＳＮＰ部分に変異が挿入されていることから、標的配列とは相補的な配列として設計されるものである。【０００７】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ＤＮＡやＲＮＡにおける糖鎖の代わりに、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンがアミド結合で結合した疑似ペプチド骨格を有する、ＤＮＡ／ＲＮＡミメティックである。ＰＮＡはＤＮＡ／ＲＮＡと二本鎖を形成することができることから、新しいプローブとして利用されている（非特許文献１及び非特許文献２）。【０００８】
特許文献４は、一部の塩基が欠落したＰＮＡと核酸とで二本鎖を形成させるステップと、二本鎖を形成したＰＮＡの塩基が欠落した部分（核酸との間でペアを形成していない部分）に対してタグ化塩基を接触させることにより可逆的に結合させるステップと、当該タグ化塩基を検出することにより、標的核酸を検出するステップと、を含む方法を開示している。この方法において、標識はＰＮＡではなくタグ化塩基に付されており、タグ化塩基のＰＮＡへの結合により、標的核酸を検出している。【０００９】
非特許文献３は、一塩基置換、脱塩基又はフェニル置換された１５ｍｅｒのＤＮＡプローブは、完全に相補的なプローブと比較してＴｍ値が低下し、二本鎖の安定性が低下することを開示している。特に、脱塩基又はフェニル置換されたＤＮＡプローブを用いたＤＮＡ・ＤＮＡダブルへリックスの場合、Ｔｍ値が約４０％も減少し、ダブルへリックスの安定性が下がることが報告されている。非特許文献４は、同様に脱塩基又はフェニル置換された１５ｍｅｒのＰＮＡプローブを用いてＰＮＡ・ＤＮＡダブルへリックスを形成させてＴｍ値を測定したところ、脱塩基で４℃、フェニル置換で６．５℃のＴｍ値の低下が見られ、ＤＮＡプローブと同様に安定性が下がることが示されている。非特許文献５は、二重らせん構造の内部を修飾する目的で、１９ｍｅｒのＰＮＡプローブの１塩基を３３０ｎｍの吸光度を有するアントラキノン（ＡＱ）で置換している。ＡＱが比較的高いＴｍ値を維持しながら二本鎖内に収まることが示されている一方、脱塩基は二本鎖形成の安定性を下げることが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０９８０２９号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００６／０６９５８４号
【特許文献３】特開２００１−３４６５７９号
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００９／０３７４７３号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ；２５４：１４９７−１５００（１９９１）
【非特許文献２】Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｅｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ；３６５：５６６−５６８（１９９３）
【非特許文献３】Ｍｉｌｌｉｃａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；１２：７４３５−７４５３（１９８４）
【非特許文献４】Ｈｅｍａｖａｔｈｉ  Ｃｈａｌｌａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ；４０：８３３３−８３３６（１９９９）
【非特許文献５】Ｂｒｕｃｅ  Ａｒｍｉｔａｇｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２６：７１５−７２０（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、グアニン又はシトシンのどちらか一方が連続した配列を有する短鎖の標的核酸の検出において、従来技術が採用していたライゲーションや増幅などの煩雑な操作を必要とすることなく、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションによる二本鎖形成によって偽陽性率低く（特異度高く）検出可能な手段又は定量可能な手段を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、プローブとグアニン又はシトシンのどちらか一方が連続した配列を有する標的核酸とのハイブリダイゼーションによる相補鎖形成における偽陽性率を低下させ、特異度を向上させることを目的とする。特に、本発明は、従来は高い特異度で実施することが困難であった、グアニン又はシトシンのどちらか一方が連続した配列を有する１０〜５０ｍｅｒの標的配列を有する核酸との二本鎖形成において、非標的核酸との非特異的結合を低減させ、それにより高い特異度での検出又は定量を可能とするプローブを提供することを目的とする。一例として、該標的核酸はグアニン又はシトシンが連続した配列を有するｍｉＲＮＡである。【００１３】
一般的に、プローブの塩基を置換したり脱塩基化したりして標的配列と一部において相補的でない配列とすることは、標的核酸への結合力を低下させる。例外的に、標識化のためにＰＮＡプローブの１塩基を３，６−ジアザ（Ｎ３−Ｂｏｃ−アミノエチル）−４，７−ジオキソ−７−（２−アントラキノイル）−へプタン酸等の特定のアントラキノン（ＡＱ）と置換した例において結合力が比較的維持されていることが報告されている。しかし、一般的な核酸検出や核酸解析の分野では、二本鎖形成による核酸検出用プローブにおいて塩基を置換したり脱塩基化したり切断したりして、あえて標的配列と一部において相補的でない配列を採用することは行われてこなかった。また、完全に相補的なプローブの塩基を置換したり脱塩基化したり切断したりすることで、非標的配列との結合を抑制させるという考え方はこれまで存在していなかった。また、ＰＮＡはＤＮＡと比べて二本鎖を安定的に形成する一方、ミスマッチに対する感受性もＤＮＡより高いことが知られていた（Ｍｉｃｈａｅｌら、前掲）。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、このような遺伝子工学の分野における常識的な考え方に拘泥せず、様々なアプローチによりプローブの設計を試みた。その結果、本発明者らは、短鎖のプローブであっても結合力の強い塩基が連続する場合、その一部を切断、脱塩基化又は置換することで、標的核酸への結合力を比較的維持しながら、非標的核酸への結合力を劇的に減少させることができることを見出した。また、本発明者らは、特にこのようなプローブは、結合力の強い塩基（グアニン及びシトシン）が連続する標的核酸の検出において、偽陽性と陽性とを区別可能な程度に、非標的核酸と標的核酸とで異なる結合力を有することを見出した。その結果、結合力の強い塩基（グアニン及びシトシン）が連続する標的核酸の検出において有用なプローブの取得及びその設計を達成するに至った。本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、具体的には以下の発明に関する。【００１５】
（１）  配列番号１−１０のいずれか１つの配列を少なくとも１つ有する標的配列に対して相補的な配列において、前記標的配列における当該配列番号１−１０のいずれか１つの配列と相補的な部分における少なくとも１個の塩基が、脱塩基化されかつ／又は置換され、かつ／あるいは、前記標的配列における配列番号１−１０のいずれか１つの配列における２塩基以下の配列と相補的な配列を末端に少なくとも１つ有するように切断された配列を有するポリヌクレオ塩基プローブ。
（２）  １０〜５０ｍｅｒである、（１）に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
（３）  １５〜２８ｍｅｒである、（２）に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
（４）  標識が結合している、（１）〜（３）のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
（５）  前記標的配列における配列番号１−１０のいずれか１つの配列と相補的な部分において、前記脱塩基化され又は置換されている塩基の少なくとも１つが、該標的配列における当該配列番号１−１０のいずれか１つの配列と相補的な部分の内部に位置する、（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
（６）  前記標的配列における配列番号１−１０のいずれか１つの配列と相補的な配列において、前記脱塩基化され又は置換されている塩基の少なくとも１つが、３〜５個のグアニン又はシトシンのどちらか一方に対して１個の割合であることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
（７）  前記標的核酸が、１０〜５０ｍｅｒのＤＮＡ又はＲＮＡである、（１）〜（６）のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
（８）  前記標的核酸が、ｍｉＲＮＡである、（７）に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
（９）  ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ，ＢＮＡ又はＰＮＡである、（１）〜（８）のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
（１０）  配列番号１−１０のいずれか１つの配列を少なくとも１つ有する標的配列と高い特異度で結合可能なポリヌクレオ塩基プローブ配列の設計方法であって、
Ａ）該標的配列と完全に相補的な１０〜５０ｍｅｒの配列を完全相補的プローブ配列として選択すること、
Ｂ）（ｉ）該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列における配列番号１−１０のいずれか１つの配列と相補的な部分において、少なくとも１個の塩基を脱塩基化させかつ／若しくは置換させることにより、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、及び／又は、
（ｉｉ）該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列における配列番号１−１０のいずれか１つの配列と相補的な部分が２塩基以下となるように該完全相補的プローブ配列の末端を切断することにより、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、を含む方法。
（１１）  前記ポリヌクレオ塩基プローブが、１５〜２８ｍｅｒである、（１０）に記載の方法。
（１２）  前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列の設計において、前記標的配列における配列番号１−１０のいずれか１つの配列と相補的なポリヌクレオ塩基が２塩基以下となるように、脱塩基化、置換又は切断するように設計されることを特徴とする、（１０）又は（１１）に記載の方法。
（１３）  被検サンプル中の配列番号１−１０のいずれか１つの配列を少なくとも１つ有する標的核酸を、高い特異度で検出する方法であって、
前記標的核酸を検出するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも１種類の（１）〜（９）のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブを前記被検サンプルと接触させること、及び
前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を検出することを含む方法。
（１４）  被検サンプル中の配列番号１−１０のいずれか１つの配列を少なくとも１つ有する標的核酸を、高い特異度で定量する方法であって、
前記標的核酸を定量するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも１種類の（１）〜（９）のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブを前記被検サンプルと接触させること、及び
前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を定量することを含む方法。【００１６】
本明細書において「グアニン又はシトシンのどちらか一方が３塩基以上連続した配列」又は「ＧＣ連続配列」とは同意義であり、ＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１）、ＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号２）、ＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、ＣＣＣＣＣＣ（配列番号４）、ＧＧＧＧＧ（配列番号５）、ＣＣＣＣＣ（配列番号６）、ＧＧＧＧ（配列番号７）、ＣＣＣＣ（配列番号８）、ＧＧＧ（配列番号９）、及びＣＣＣ（配列番号１０）を意味する。ただし、「置換／脱塩基プローブＧＣ連続配列」又は「置換／脱塩基後のプローブＧＣ連続配列」の語における、「ＧＣ連続配列」は、置換／脱塩基前の配列がグアニン又はシトシンのどちらか一方が３塩基以上連続した配列であったことを意味する。【００１７】
グアニンとシトシンは相補的であることから、標的核酸がＧＣ連続配列を有する場合、それに相補的なプローブもＧＣ連続配列を有する。本明細書においては、ＧＣ連続配列の用語は、標的核酸に存在する場合とプローブに存在する場合の両方において用いられる。特に、標的核酸／配列に存在するＧＣ連続配列を「標的核酸／配列における配列番号１−１０のいずれか１つの配列」又は「標的ＧＣ連続配列」という。また、プローブに存在する標的ＧＣ連続配列と相補的なＧＣ連続配列、特には、切断前、脱塩基化前又は置換前の標的配列と完全に相補的なプローブに存在する、標的ＧＣ連続配列と相補的なＧＣ連続配列を「プローブＧＣ連続配列」又は「標的配列における配列番号１−１０のいずれか１つの配列と相補的な配列部分」という。このような、切断前、脱塩基化前又は置換前の標的配列と完全に相補的なプローブ配列を「完全相補的プローブ配列」ということがある。一方、プローブＧＣ連続配列におけるグアニン又はシトシンが脱塩基化された、又は置換されたプローブ配列を、「置換／脱塩基プローブ配列」といい、置換／脱塩基プローブ配列における、プローブＧＣ連続配列に相当する配列を「置換／脱塩基プローブＧＣ連続配列」という。例えば、図１Ａのプローブは完全相補的プローブ配列におけるプローブＧＣ連続配列を示し、図１Ｂのプローブは、置換／脱塩基プローブ配列における、置換／脱塩基プローブＧＣ連続配列を示す。【００１８】
本発明において、「ヌクレオ塩基」とは、天然に存在するヌクレオチドの他、ヌクレオチドアナログを含む。天然に存在するヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及び／又はウラシル（Ｕ）の塩基を有するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである。ヌクレオチドアナログとは、上述の天然に存在するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドと同じ塩基を有するが、リボースの化学構造、及び／又はホスホジエステル結合の化学構造が人為的に改変された人工ヌクレオチドやヌクレオチドミメティックを意味する。例えば、グリコール核酸（Ｇｌｙｃｏｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＧＮＡ）、架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ：ＢＮＡ）、２’，４’−架橋化核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＬＮＡ）、ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ：ＰＮＡ）、トレオース核酸（Ｔｈｒｅｏｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＴＮＡ）、及びモルホリノ核酸を挙げることができる。本明細書において、ＧＮＡ，ＢＮＡ，ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、及びモルホリノ核酸は、文脈によってモノマーと解釈してもよいし、ポリマーと解釈してもよい。【００１９】
本発明において、「ポリヌクレオ塩基」とは、上述のヌクレオ塩基が直鎖状に重合した高分子化合物を意味する。ポリヌクレオ塩基は、１種類のヌクレオ塩基のみ（天然に存在するポリヌクレオチドのみ、又はＰＮＡの構成単位のみなど）からなるホモポリマーであってもよい。また、ポリヌクレオ塩基は、２種類以上のヌクレオ塩基（天然に存在するポリヌクレオチドとＰＮＡ、又はＢＮＡとＬＮＡなど）のコポリマーであってもよい。よって、ＤＮＡ及びＲＮＡ等のポリヌクレオチド、並びに、ＧＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、及びモルホリノ核酸のポリマーもポリヌクレオ塩基に含まれる。本明細書において、ポリヌクレオ塩基は、ピロールイミダゾールポリアミド（Ｐｅｔｅｒ  Ｂ．  Ｄｅｒｖａｎ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９９８）３９１−４６８；  Ｐ．  Ｂ．  Ｄｅｒｖａｎ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｗ．  Ｂｕｒｌｉ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３  （１９９９）  ６８８−６９３；  Ｐ．  Ｂ．  Ｄｅｒｖａｎ，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９  （２００１）  ２１５−２２３５．）を含んでいても良い。この場合、本明細書における塩基はピロール及び／又はイミダゾールと置き換えることができる。【００２０】
本明細書において「プローブ」又は「ポリヌクレオ塩基プローブ」とは同意義であり、標的配列とのハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成するために用いられるポリヌクレオ塩基を意味する。本発明のポリヌクレオ塩基プローブは、標的配列と結合する部分として、標的ＧＣ連続配列を少なくとも１つ有する標的配列に対して相補的な完全相補的プローブ配列をベースとし、当該完全相補的プローブ配列におけるプローブＧＣ連続配列中の少なくとも１個の塩基が脱塩基化されている、又は置換されている配列（置換／脱塩基プローブ配列）か、あるいは、プローブＧＣ連続配列中の少なくとも１個の塩基から完全相補的プローブの一方の末端までの全ての塩基が切断されている配列を含む。なお、本明細書において、「切断」とは、プローブの設計段階において、プローブの末端に、プローブＧＣ連続配列を構成するアミノ酸のうち２塩基以下のみを残すように設計することを意味し、実際にプローブの製造過程において「切断」することを必要とするものではない。よって、「前記標的配列における配列番号１−１０のいずれか１つの配列における２塩基以下の配列と相補的な配列を末端に少なくとも１つ有するように切断された配列」とは、完全相補的プローブに含まれる「プローブＧＣ連続配列部分の」一方の末端に位置する２個以下の塩基を除いた残りの塩基と当該残りの塩基に隣接する「完全相補的プローブの」一方の末端までの全ての塩基が欠落している配列、あるいは、プローブＧＣ連続配列部分の末端に由来する２個以下の塩基をプローブの末端に含む配列を意味する。【００２１】
標的配列において標的ＧＣ連続配列が２か所以上存在する場合、プローブにおける切断、置換又は脱塩基を、いずれか１か所のプローブＧＣ連続配列において行ってもよいし、２か所以上のプローブＧＣ連続配列において行ってもよい。好ましくは、本発明のプローブは、全ての箇所のプローブＧＣ連続配列において切断、置換又は脱塩基されている。例えば、標的配列において標的ＧＣ連続配列を２か所以上存在する場合、本発明のプローブは、いずれか１か所のプローブＧＣ連続配列中で切断されて、他のプローブＧＣ連続配列で置換又は脱塩基されていてもよい。あるいは、標的配列において標的ＧＣ連続配列を２か所以上存在する場合、本発明のプローブは、２箇所のプローブＧＣ連続配列において切断されており、他のプローブＧＣ連続配列が存在する場合には、当該プローブＧＣ連続配列で置換又は脱塩基されていてもよい。あるいは、標的配列において標的ＧＣ連続配列を２か所以上存在する場合、全ての箇所のプローブＧＣ連続配列において置換又は脱塩基されていてもよい。すなわち、全ての箇所のプローブＧＣ連続配列において、切断、置換、及び脱塩基のいずれかのみを用いてもよいし、１つのプローブ内に複数存在するプローブＧＣ連続配列の各々について、それぞれ切断、置換、及び脱塩基のいずれかを用いて、結果的に１つのプローブ内で切断、置換、及び脱塩基が組み合わせて用いられてもよい。また、切断、置換、及び脱塩基は、１箇所のプローブＧＣ連続配列内で組み合わせて用いられてもよい。好ましくは、本発明のプローブは、最初に選択された完全相補的プローブ配列における全ての箇所のプローブＧＣ連続配列において切断、置換又は脱塩基された結果、プローブＧＣ連続配列を持たない。【００２２】
また、本発明のプローブ又はポリヌクレオ塩基プローブは、上述の標的配列と結合する部分の他に、標的配列と結合しない部分を有していても良い。このような標的配列と結合しない部分は、標識やリンカーであったり、他の分子と結合していたり、安定性向上を目的としていたりすることができる。例えば、このような標的配列と結合しない部分は、タグ配列やリンカー配列等の標的配列に対して相補的でないポリヌクレオ塩基を含んでいても良いし、低分子化合物やタンパク質が結合していてもよい。一例において、標的配列と結合しない部分は、後述の「修飾」である。【００２３】
本明細書において、「脱塩基化」とは、ヌクレオ塩基における塩基部分が存在しないことを意味する。ＤＮＡやＲＮＡの脱塩基は、糖の１’位に塩基が結合しておらず、水酸基、水素原子、低級アシル基（アセチル基等）や低級アルキル基（メチル基等）が結合していることを含む。ＰＮＡの脱塩基は、グリシン骨格の３級アミンに結合しているメチルカルボニル基の置換基が、塩基の代わりに水酸基、水素原子、低級アシル基（アセチル基等）や低級アルキル基（メチル基等）であることを含む。又は、ＰＮＡの脱塩基は、グリシン骨格の窒素原子が、炭素原子（低級アシル基（アセチル基等）や低級アルキル基（メチル基等）を置換基として有していてもよい）で置換されていることを含む。【００２４】
また、本明細書において、塩基が「置換」されているとは、ヌクレオ塩基における塩基部分が相補的でない塩基と置換されていることを含む。また、プローブ配列中の塩基が「置換」されているとは、ヌクレオ塩基における塩基部分がアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、及びチミン以外の基（例えば、フェニル基、アントラキノン基など）に置換されていることを含む。塩基の置換により導入される基は、好ましくは、当該プローブ配列中の置換されていない他の塩基による、標的配列との二本鎖の形成を阻害しない基である。【００２５】
プローブＧＣ連続配列において、脱塩基化され、若しくは置換される塩基の位置は特に制限されるものではないが、例えば、プローブＧＣ連続配列の内部（Ｇ＊Ｇ、Ｃ＊ＣＣなど。ここで、「＊」は脱塩基化又は置換される塩基を表す。本明細書において、以下同様。）、又は末端（ＧＧ＊、＊ＣＣなど）の塩基であってもよい。好ましくは、プローブＧＣ連続配列の内部のうち、特に中央におけるグアニン又はシトシンが脱塩基化され、若しくは置換される（例えば、Ｃ＊Ｃ、ＧＧ＊ＧＧなど）。例えば、プローブＧＣ連続配列がＧＧＧの場合、Ｇ＊Ｇが好ましく、同様にＣＣＣの場合はＣ＊Ｃが好ましい。また、好ましくは、置換又は脱塩基後のＧＣ連続配列は、Ｇ又はＣが３塩基以上連続した配列を持たない。【００２６】
プローブＧＣ連続配列において、脱塩基化される、又は置換される塩基の数は、標的配列との結合力が維持される限り特に制限されるものではないが、例えば、６〜７個のグアニン又はシトシンに対して２又は３個、３〜５個のグアニン又はシトシンに対して１又は２個、３〜４個のグアニン又はシトシンに対して１個、あるいは、３個のグアニン又はシトシンに対して１個の割合であってよい。【００２７】
置換／脱塩基プローブＧＣ連続配列の例としては、例えば、Ｇ＊ＧＧ＊ＧＧ（配列番号１１）、ＧＧ＊Ｇ＊ＧＧ（配列番号１２），ＧＧ＊ＧＧ＊Ｇ（配列番号１３）、＊Ｇ＊Ｇ＊ＧＧ（配列番号１４）、＊Ｇ＊ＧＧ＊Ｇ（配列番号１５）、＊ＧＧ＊Ｇ＊Ｇ（配列番号１６）、＊ＧＧ＊ＧＧ＊（配列番号１７）、Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ（配列番号１８）、Ｇ＊ＧＧ＊Ｇ＊（配列番号１９）、Ｇ＊Ｇ＊ＧＧ＊（配列番号２０）、ＧＧ＊Ｇ＊Ｇ＊（配列番号２１）、Ｃ＊ＣＣ＊ＣＣ（配列番号２２）、ＣＣ＊Ｃ＊ＣＣ（配列番号２３）、ＣＣ＊ＣＣ＊Ｃ（配列番号２４）、＊Ｃ＊Ｃ＊ＣＣ（配列番号２５）、＊Ｃ＊ＣＣ＊Ｃ（配列番号２６）、＊ＣＣ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号２７）、＊ＣＣ＊ＣＣ＊（配列番号２８）、Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号２９）、Ｃ＊Ｃ＊ＣＣ＊（配列番号３０）、Ｃ＊ＣＣ＊Ｃ＊（配列番号３１）、ＣＣ＊Ｃ＊Ｃ＊（配列番号３２）、＊ＧＧ＊ＧＧ（配列番号３３）、Ｇ＊Ｇ＊ＧＧ（配列番号３４）、Ｇ＊ＧＧ＊Ｇ（配列番号３５）、ＧＧ＊Ｇ＊Ｇ（配列番号３６）、ＧＧ＊ＧＧ＊（配列番号３７）、＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ（配列番号３８）、＊Ｇ＊ＧＧ＊（配列番号３９）、＊ＧＧ＊Ｇ＊（配列番号４０）、Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊（配列番号４１）、＊ＣＣ＊ＣＣ（配列番号４２）、Ｃ＊Ｃ＊ＣＣ（配列番号４３）、Ｃ＊ＣＣ＊Ｃ（配列番号４４）、ＣＣ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４５）、ＣＣ＊ＣＣ＊（配列番号４６）、＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４７）、＊Ｃ＊ＣＣ＊（配列番号４８）、＊ＣＣ＊Ｃ＊（配列番号４９）、Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊（配列番号５０）、ＧＧ＊ＧＧ（配列番号５１）、＊Ｇ＊ＧＧ（配列番号５２）、＊ＧＧ＊Ｇ（配列番号５３）、Ｇ＊Ｇ＊Ｇ（配列番号５４）、Ｇ＊ＧＧ＊（配列番号５５）、ＧＧ＊Ｇ＊（配列番号５６）、ＣＣ＊ＣＣ（配列番号５７）、＊Ｃ＊ＣＣ（配列番号５８）、＊ＣＣ＊Ｃ（配列番号５９）、Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号６０）、Ｃ＊ＣＣ＊（配列番号６１）、ＣＣ＊Ｃ＊（配列番号６２）、Ｇ＊ＧＧ（配列番号６３）、ＧＧ＊Ｇ（配列番号６４）、＊Ｇ＊Ｇ（配列番号６５）、＊ＧＧ＊（配列番号６６）、Ｇ＊Ｇ＊（配列番号６７）、Ｃ＊ＣＣ（配列番号６８）、ＣＣ＊Ｃ（配列番号６９）、＊Ｃ＊Ｃ（配列番号７０）、＊ＣＣ＊（配列番号７１）、Ｃ＊Ｃ＊（配列番号７２）、＊ＧＧ（配列番号７３）、Ｇ＊Ｇ（配列番号７４）、ＧＧ＊（配列番号７５）、＊Ｇ＊（配列番号７６）、＊ＣＣ（配列番号７７）、Ｃ＊Ｃ（配列番号７８）、ＣＣ＊（配列番号７９）、及び＊Ｃ＊（配列番号８０）を挙げることができる。【００２８】
本発明のポリヌクレオ塩基プローブにおける、標的配列と結合する部分の鎖長は、プローブＧＣ連続配列が存在することにより、標的配列以外の配列を有する核酸との結合率（偽陽性率）が高くなる長さであり、具体的には、１０〜５０ｍｅｒである。例えば、本発明のポリヌクレオ塩基プローブにおける、標的配列と結合する部分の鎖長は、１０ｍｅｒ以上、１１ｍｅｒ以上、１２ｍｅｒ以上、１３ｍｅｒ以上、１４ｍｅｒ以上、１５ｍｅｒ以上、１６ｍｅｒ以上、１７ｍｅｒ以上、又は１８ｍｅｒ以上とすることができる。
また、本発明のポリヌクレオ塩基プローブにおける、標的配列と結合する部分の鎖長は、５０ｍｅｒ以下、４５ｍｅｒ以下、４０ｍｅｒ以下、３５ｍｅｒ以下、３０ｍｅｒ以下、２９ｍｅｒ以下、２８ｍｅｒ以下、２７ｍｅｒ以下、２６ｍｅｒ以下、又は２５ｍｅｒ以下とすることができる。
例えば、本発明のポリヌクレオ塩基プローブにおける、標的配列と結合する部分の鎖長は、１０〜４０ｍｅｒ、１３〜３０ｍｅｒ、１５〜２８ｍｅｒ、又は１８〜２５ｍｅｒとすることができる。
なお、上述の「ポリヌクレオ塩基プローブにおける、標的配列と結合する部分の鎖長」は、ポリヌクレオ塩基プローブの鎖長と読み替えてもよい。【００２９】
本明細書におけるヌクレオ塩基プローブは、適宜「修飾」されていてもよい。例えば、修飾としては、検出のための標識や、結合のための官能基などが挙げられる。標識としては、核酸検出の分野で利用可能なものであれば特に制限なく利用することができ、例えば、放射性物質（ＲＩ）、酵素（ビオチンなど）、ハプテン（ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）など）、アフィニティタグ、及び蛍光色素など様々な手法が知られている。【００３０】
蛍光色素としては、赤、橙、黄、緑、青、及び紫の様々なものが知られており、ダンシル、ＴＲＩＴＣ、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、シアニン色素（Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＷＧＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ＦＩＴＣ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴＲＩＴＣ、ＴＸＲＥＤ、ｍＣｈｅｒｒｙ−Ａ、及びｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ等が利用できる。【００３１】
また、本発明のプローブは固相に固定化されていても良い。例えば、アレイ、ビーズ、又はチップに結合していてもよい。【００３２】
「結合のための官能基」は、本明細書におけるヌクレオ塩基プローブを固相又は他の物質と結合するために用いられる基であれば特に限定されるものではなく、例えば、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、アミド基、イミド基、グアニジド基、ウレア基、アルケン、アルキン、スルホン酸、カルボン酸基、又はエステル基等を挙げることができる。【００３３】
本明細書において「標的核酸」とは、本発明のプローブにより存在を検出し、又は定量しようとする目的の核酸であって、ＧＣ連続配列を有する核酸を意味する。例えば、本発明のプローブを疾患や障害の診断目的で利用する場合、標的核酸は生体由来のＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。標的核酸は、ＧＣ連続配列を１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個有していても良い。【００３４】
標的核酸の長さは特に限定されるものではないが、本発明のプローブは特に標的ＧＣ連続配列を避けたプローブを設計できない標的核酸との二本鎖形成に有効であることから、５０ｍｅｒ以下、４５ｍｅｒ以下、４０ｍｅｒ以下、３５ｍｅｒ以下、３０ｍｅｒ以下、２９ｍｅｒ以下、２８ｍｅｒ以下、２７ｍｅｒ以下、２６ｍｅｒ以下、又は２５ｍｅｒ以下の標的核酸が好ましい。例えば、標的核酸の鎖長は、１０ｍｅｒ以上、１１ｍｅｒ以上、１２ｍｅｒ以上、１３ｍｅｒ以上、１４ｍｅｒ以上、１５ｍｅｒ以上、１６ｍｅｒ以上、１７ｍｅｒ以上、又は１８ｍｅｒ以上とすることができる。一例として、標的核酸の鎖長は、１０〜５０ｍｅｒ、１０〜４０ｍｅｒ、１３〜３０ｍｅｒ、１５〜２８ｍｅｒ、又は１８〜２５ｍｅｒである。【００３５】
標的核酸の代表例としては、ＧＣ連続配列を有するｍｉＲＮＡを挙げることができる。このような配列としては、以下の表に記載の配列を挙げることができる。表中において、下線はＧＣ連続配列を示す。配列の横の数値は順に、配列の全長、標的核酸に含まれる標的ＧＣ連続配列の数、標的核酸に含まれる最長の標的ＧＣ連続配列の長さを表す。【００３６】
ＧＣ連続配列を有する標的配列若しくは標的配列と相補的な配列、又はｍｉＲＮＡとしては、例えば、次のものを挙げることができる：ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７６−５ｐ：ＡＧＧＡＧＡＵＣＣＵＧＧＧＵＵ（配列番号８１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７９：ＣＵＣＵＣＣＵＣＣＣＧＧＣＵＵＣ（配列番号８２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１０：ＧＣＡＧＣＡＵＵＣＡＵＧＵＣＣＣ（配列番号８３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６１：ＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧＡＣＣＣＡ（配列番号８４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８１：ＵＣＧＣＣＵＣＣＵＣＣＵＣＵＣＣＣ（配列番号８５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０１：ＧＧＧＡＵＡＵＧＡＡＧＡＡＡＡＡＵ（配列番号８６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５１：ＣＣＵＧＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣＣＡＡ（配列番号８７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９６：ＡＵＧＵＧＧＧＣＵＣＡＧＧＣＵＣＡ（配列番号８８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３０４：ＣＣＧＧＣＡＵＧＵＣＣＡＧＧＧＣＡ（配列番号８９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１７：ＡＣＡＵＵＧＣＣＡＧＧＧＡＧＵＵＵ（配列番号９０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１８：ＣＡＣＵＧＵＧＧＧＵＡＣＡＵＧＣＵ（配列番号９１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１９：ＵＣＣＣＵＧＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＣ（配列番号９２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２８：ＣＣＡＧＵＵＵＵＣＣＣＡＧＧＡＵＵ（配列番号９３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４１９ａ  ：ＵＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＣＵＧＣＡ（配列番号９４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４４１：ＡＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＵＵＧＵＡ（配列番号９５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４４２：ＧＣＣＧＧＡＣＡＡＧＡＧＧＧＡＧＧ（配列番号９６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４４３：ＵＵＧＧＡＧＧＣＧＵＧＧＧＵＵＵＵ（配列番号９７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５５：ＡＧＧＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＵＵＵＵ（配列番号９８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８１：ＧＧＡＧＵＧＧＧＣＵＧＧＵＧＧＵＵ（配列番号９９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８６：ＧＣＵＧＧＧＣＧＡＧＧＣＵＧＧＣＡ（配列番号１００）、
ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９９：ＡＡＧＡＣＵＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＡ（配列番号１０１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５３５：ＧＵＧＧＡＣＣＵＧＧＣＵＧＧＧＡＣ（配列番号１０２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４ｂ：ＵＣＣＣＵＧＵＵＣＧＧＧＣＧＣＣＡ（配列番号１０３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８０：ＵＣＣＣＡＣＣＧＣＵＧＣＣＡＣＣＣ（配列番号１０４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９４：ＧＧＧＡＧＵＣＵＡＣＡＧＣＡＧＧＧ（配列番号１０５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９７：ＣＵＣＣＧＧＧＡＣＧＧＣＵＧＧＧＣ（配列番号１０６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１９５：ＣＧＣＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＵＵ（配列番号１０７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０７−３ｐ：ＵＣＡＧＣＵＧＧＣＣＣＵＣＡＵＵＵＣ（配列番号１０８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０：ＡＵＣＣＣＡＣＣＵＣＵＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号１０９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４ａ：ＧＵＣＣＣＵＧＵＵＣＡＧＧＣＧＣＣＡ（配列番号１１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０８：ＧＣＡＵＧＧＧＵＧＧＵＵＣＡＧＵＧＧ（配列番号１１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２１：ＣＡＧＧＧＡＧＧＵＧＡＡＵＧＵＧＡＵ（配列番号１１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２５：ＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＵＣＣＵＣＵＣＣ（配列番号１１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５ｂ：ＣＣＡＧＧＣＵＣＵＧＣＡＧＵＧＧＧＡ（配列番号１１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３００：ＵＧＧＧＡＧＣＵＧＧＡＣＵＡＣＵＵＣ（配列番号１１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３０８：ＵＣＣＣＵＧＧＡＧＵＵＵＣＵＵＣＵＵ（配列番号１１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２０：ＧＧＧＡＵＵＣＵＧＵＡＧＣＵＵＣＣＵ（配列番号１１７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１９：ＣＡＧＣＡＧＵＧＣＧＣＡＧＧＧＣＵＧ（配列番号１１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５８７−５ｐ：ＡＵＧＧＵＣＡＣＣＵＣＣＧＧＧＡＣＵ（配列番号１１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０３：ＡＧＧＡＧＡＡＧＵＣＧＧＧＡＡＧＧＵ（配列番号１２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２６：ＧＵＧＡＡＧＧＣＣＣＧＧＣＧＧＡＧＡ（配列番号１２１）、ｍｍｕ−ｍｉＲ−６９６：ＧＣＧＵＧＵＧＣＵＵＧＣＵＧＵＧＧＧ（配列番号１２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１４：ＣＵＣＵＧＧＧＡＡＡＵＧＧＧＡＣＡＧ（配列番号１２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０５：ＡＧＧＣＵＧＧＧＣＵＧＧＧＡＣＧＧＡ（配列番号１２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５３０：ＣＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＡＧＣＧ（配列番号１２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７１０：ＧＧＧＵＧＡＧＧＧＣＡＧＧＵＧＧＵＵ（配列番号１２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４１７：ＧＧＵＧＧＧＣＵＵＣＣＣＧＧＡＧＧＧ（配列番号１２７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐ：ＧＵＧＡＧＧＡＣＵＣＧＧＧＡＧＧＵＧＧ（配列番号１２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０：ＵＧＧＡＵＵＵＵＵＧＧＡＵＣＡＧＧＧＡ（配列番号１２９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１７６：ＡＣＵＧＧＣＣＵＧＧＧＡＣＵＡＣＣＧＧ（配列番号１３０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４９：ＡＧＧＧＡＣＣＵＧＡＧＵＧＵＣＵＡＡＧ（配列番号１３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２８９：ＧＣＡＵＵＧＵＧＣＡＧＧＧＣＵＡＵＣＡ（配列番号１３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２９：ＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＡＧＵＵＣＣＡＣ（配列番号１３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８７：ＡＧＡＧＣＵＧＧＣＵＧＡＡＧＧＧＣＡＧ（配列番号１３４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７３６：ＡＧＧＣＡＧＧＵＵＡＵＣＵＧＧＧＣＵＧ（配列番号１３５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５８８−３ｐ：ＡＡＧＵＣＣＣＡＣＵＡＡＵＧＣＣＡＧＣ（配列番号１３６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８５：ＵＧＧＧＣＧＵＡＵＣＵＧＵＡＵＧＣＵＡ（配列番号１３７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０７０：ＣＣＧＧＵＵＣＣＡＧＵＣＣＣＵＧＧＡＧ（配列番号１３８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１３０：ＵＧＡＧＧＧＡＧＵＧＧＡＵＵＧＵＡＵＧ（配列番号１３９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１３１：ＧＧＣＵＧＧＵＣＡＧＡＵＧＧＧＡＧＵＧ（配列番号１４０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３２：ＧＵＧＵＣＵＧＣＵＵＣＣＵＧＵＧＧＧＡ（配列番号１４１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４８：ＡＡＧＵＧＵＧＣＡＧＧＧＣＡＣＵＧＧＵ（配列番号１４２）、ｍｍｕ−ｍｉＲ−６８４：ＡＧＵＵＵＵＣＣＣＵＵＣＡＡＧＵＣＡＡ（配列番号１４３）、ｍｍｕ−ｍｉＲ−６９８：ＣＡＵＵＣＵＣＧＵＵＵＣＣＵＵＣＣＣＵ（配列番号１４４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４１：ＧＡＧＧＧＣＧＧＧＵＧＧＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号１４５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８１：ＡＵＣＧＧＧＣＣＣＵＣＧＧＣＧＣＣＧＧ（配列番号１４６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６５：ＣＵＧＵＧＧＧＣＵＣＡＧＣＵＣＵＧＧＧ（配列番号１４７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２８７：ＵＣＵＣＣＣＵＵＧＡＧＧＧＣＡＣＵＵＵ（配列番号１４８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９０：ＵＧＣＣＣＵＣＣＵＵＵＣＵＵＣＣＣＵＣ（配列番号１４９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０８０：ＵＣＵＡＧＵＧＣＧＧＧＣＧＵＵＣＣＣＧ（配列番号１５０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２９：ＵＧＡＧＧＧＡＧＵＵＧＧＧＵＧＵＡＵＡ（配列番号１５１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１３３：ＵＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＵＵＧＧＧＵＡ（配列番号１５２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２７：ＵＧＡＧＧＧＡＧＵＧＧＧＵＧＧＧＡＧＧ（配列番号１５３）、ｒｎｏ−ｍｉＲ−３４７：ＵＧＵＣＣＣＵＣＵＧＧＧＵＣＧＣＣＣＡ（配列番号１５４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０５：ＵＣＵＧＣＡＧＧＧＵＵＵＧＣＵＵＵＧＡＧ（配列番号１５５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３１：ＧＵＧＵＣＵＧＧＧＣＧＧＡＣＡＧＣＵＧＣ（配列番号１５６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６：ＵＡＡＡＧＡＧＣＣＣＵＧＵＧＧＡＧＡＣＡ（配列番号１５７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７６：ＣＣＵＣＣＵＧＣＣＣＵＣＣＵＵＧＣＵＧＵ（配列番号１５８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１１５：ＡＵＡＵＧＧＧＵＵＵＡＣＵＡＧＵＵＧＧＵ（配列番号１５９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２２ｂ−５ｐ：ＡＧＧＣＡＵＧＧＧＡＧＧＵＣＡＧＧＵＧＡ（配列番号１６０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１７：ＧＣＵＣＧＧＡＣＵＧＡＧＣＡＧＧＵＧＧＧ（配列番号１６１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３０１：ＵＣＣＣＡＣＵＡＣＵＵＣＡＣＵＵＧＵＧＡ（配列番号１６２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２６：ＵＧＵＵＣＣＵＣＵＧＵＣＵＣＣＣＡＧＡＣ（配列番号１６３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２９：ＡＡＡＡＧＣＵＧＧＧＣＵＧＡＧＡＧＧＣＧ（配列番号１６４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８５：ＵＡＡＣＧＧＣＣＧＣＧＧＵＡＣＣＣＵＡＡ（配列番号１６５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０６：ＡＡＡＵＧＧＧＵＧＧＵＣＵＧＡＧＧＣＡＡ（配列番号１６６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７８４：ＵＧＡＧＧＡＧＡＵＧＣＵＧＧＧＡＣＵＧＡ（配列番号１６７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９０−５ｐ：ＣＣＡＵＧＧＡＵＣＵＣＣＡＧＧＵＧＧＧＵ（配列番号１６８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２：ＧＵＣＣＧＣＵＣＧＧＣＧＧＵＧＧＣＣＣＡ（配列番号１６９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９１：ＡＧＡＣＣＡＵＧＧＧＵＵＣＵＣＡＵＵＧＵ（配列番号１７０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０８３：ＣＵＵＡＵＡＵＣＡＧＡＧＧＣＵＧＵＧＧＧ（配列番号１７１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０９：ＡＧＧＧＵＧＵＵＵＣＵＣＵＣＡＵＣＵＣＵ（配列番号１７２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７２２−５ｐ：ＡＧＧＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＵＧＣ（配列番号１７３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７７：ＧＵＡＧＡＧＧＡＧＡＵＧＧＣＧＣＡＧＧＧ（配列番号１７４）、ｍｍｕ−ｍｉＲ−８０５：ＧＡＡＵＵＧＡＵＣＡＧＧＡＣＡＵＡＧＧＧ（配列番号１７５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３：ＵＧＡＧＣＣＣＵＧＵＣＣＵＣＣＣＧＣＡＧ（配列番号１７６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２：ＡＧＡＧＧＵＡＵＡＧＧＧＣＡＵＧＧＧＡＡ（配列番号１７７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６：ＣＣＵＣＵＧＧＧＣＣＣＵＵＣＣＵＣＣＡＧ（配列番号１７８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２４：ＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＡＡＣＣＵＵＡＡ（配列番号１７９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６４８：ＵＧＵＧＧＧＡＣＵＧＣＡＡＡＵＧＧＧＡＧ（配列番号１８０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０１−３ｐ：ＡＵＧＧＧＵＧＡＵＧＧＧＵＧＵＧＧＵＧＵ（配列番号１８１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０８６：ＧＧＡＧＧＵＵＧＧＧＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧ（配列番号１８２）、ｍｍｕ−ｍｉＲ−３４３：ＵＣＵＣＣＣＵＵＣＡＵＧＵＧＣＣＣＡＧＡ（配列番号１８３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０７：ＣＵＧＧＧＵＵＧＧＧＣＵＧＧＧＣＵＧＧＧ（配列番号１８４）、ｇｇａ−ｍｉＲ−７５７：ＧＣＡＧＡＧＣＵＧＣＡＧＡＵＧＧＧＡＵＵＣ（配列番号１８５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１７８：ＵＵＧＣＵＣＡＣＵＧＵＵＣＵＵＣＣＣＵＡＧ（配列番号１８６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１８１：ＣＣＧＵＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧ（配列番号１８７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１８５：ＡＧＡＧＧＡＵＡＣＣＣＵＵＵＧＵＡＵＧＵＵ（配列番号１８８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０３：ＣＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＧＡＵＧＣＡＧＣＵＣ（配列番号１８９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５７：ＡＧＵＧＡＡＵＧＡＵＧＧＧＵＵＣＵＧＡＣＣ（配列番号１９０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８６：ＵＧＣＡＧＧＡＣＣＡＡＧＡＵＧＡＧＣＣＣＵ（配列番号１９１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８８：ＵＧＧＡＣＵＧＣＣＣＵＧＡＵＣＵＧＧＡＧＡ（配列番号１９２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９５：ＵＵＡＧＧＣＣＧＣＡＧＡＵＣＵＧＧＧＵＧＡ（配列番号１９３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ：ＣＵＵＵＵＵＧＣＧＧＵＣＵＧＧＧＣＵＵＧＣ（配列番号１９４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０２：ＵＵＧＧＧＡＣＡＵＡＣＵＵＡＵＧＣＵＡＡＡ（配列番号１９５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０２：ＵＵＧＧＧＡＣＡＵＡＣＵＵＡＵＧＣＵＡＡＡ（配列番号１９６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０２：ＵＵＧＧＧＡＣＡＵＡＣＵＵＡＵＧＣＵＡＡＡ（配列番号１９７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０２：ＵＵＧＧＧＡＣＡＵＡＣＵＵＡＵＧＣＵＡＡＡ（配列番号１９８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０２：ＵＵＧＧＧＡＣＡＵＡＣＵＵＡＵＧＣＵＡＡＡ（配列番号１９９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ＊：ＡＣＵＣＵＵＵＣＣＣＵＧＵＵＧＣＡＣＵＡＣ（配列番号２００）、
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本明細書において「標的配列」とは、プローブが結合する標的核酸に含まれる配列であって、少なくとも１個の標的ＧＣ連続配列を有する配列である。別の表現では、標的配列は、本発明のプローブと二本鎖を形成させることを目的とする配列、すなわち、完全相補的プローブ配列と相補的な配列を意味する。標的配列は、標的核酸の全長配列又は標的核酸の部分配列であってよい。例えば、標的配列は、標的ＧＣ連続配列を１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個有していても良い。標的配列が２か所以上の標的ＧＣ連続配列を有する場合、これらの標的ＧＣ連続配列は互いに離れた位置に存在していても良いし、配列番号８７３や配列番号９６５の例のように隣接して存在していてもよい。標的配列の長さは、１０〜５０ｍｅｒである。例えば、本発明の標的配列の鎖長は、１０ｍｅｒ以上、１１ｍｅｒ以上、１２ｍｅｒ以上、１３ｍｅｒ以上、１４ｍｅｒ以上、１５ｍｅｒ以上、１６ｍｅｒ以上、１７ｍｅｒ以上、又は１８ｍｅｒ以上とすることができる。また、本発明の標的配列の鎖長は、５０ｍｅｒ以下、４５ｍｅｒ以下、４０ｍｅｒ以下、３５ｍｅｒ以下、３０ｍｅｒ以下、２９ｍｅｒ以下、２８ｍｅｒ以下、２７ｍｅｒ以下、２６ｍｅｒ以下、又は２５ｍｅｒ以下とすることができる。本発明の標的配列の鎖長は、１０〜４０ｍｅｒ、１３〜３０ｍｅｒ、１５〜２８ｍｅｒ、又は１８〜２５ｍｅｒとすることができる。【００３８】
本明細書において「非標的核酸」とは、本発明のプローブにより存在を検出することを目的とせず、又は本発明のプローブにより定量することを目的としない核酸であって、標的配列と同様のＧＣ連続配列を有する核酸を意味する。「標的配列と同様のＧＣ連続配列」とは、標的配列が有するＧＣ連続配列と同一の配列、及び標的配列が有するＧＣ連続配列より１〜数塩基長いか又は短いＧＣ連続配列を意味する。【００３９】
また、「非標的配列」とは、非標的核酸が有する配列を意味し、標的配列と同様のＧＣ連続配列を有する配列を意味する。【００４０】
本明細書において、「特異度」とは、プローブと標的核酸とを結合させる場合において、プローブが誤って非標的核酸と結合しない（陰性）割合を意味し、（プローブと結合しなかった非標的核酸の数）／（非標的核酸の総数）で表される。【００４１】
また、本明細書において、「偽陽性」（ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）とは、非標的核酸であるにもかかわらず、プローブが誤って結合することを意味する。また、「偽陽性率」とは、非標的核酸を標的核酸として誤って検出する割合を意味し、１−（特異度）、又は（プローブが誤って結合した非標的核酸の数）／（非標的核酸の総数）で表される。本明細書において、「非特異的結合」とは、プローブが非標的核酸と結合することを意味する。「特異的結合」とは、プローブが非標的核酸と結合することなく、標的核酸と結合することをいう。「プローブが非標的核酸と結合することない」とは、「特異度が高い」又は「高い特異度」及び「偽陽性率が低い」と同義であり、例えば、プローブが完全相補的プローブと比較して非標的配列を偽陽性として検出（又は定量）する割合が低いことを意味してもよく、あるいは、特異度０．８、０．９、０．９５、０．９８、０．９９、０．９９９であってもよい。
【発明の効果】
【００４２】
本発明のプローブは、標的配列と完全相補的な配列を有するプローブと比較して、非特異的配列への結合が少ないことから、核酸検出における偽陽性率の低い検出又は定量を可能とする。特に、本発明のプローブは、プローブそのものの結合活性を変化させることにより、標的配列と非標的配列への結合力の差を増大させることから、ライゲーションや増幅などの複雑なステップを必要とすることなくシンプルな二本鎖形成により短鎖の核酸を特異度高く検出する又は定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、上図のＡが、標的配列をＧＧＧとした場合の、完全相補的プローブ配列（ＣＣＣ）との結合様式を模式化した図を表し、下図のＢが、本発明のプローブ（Ｃ＊Ｃ）との結合様式を模式化した図を表す。
【図２Ａ】図２Ａは、プローブ１（ＴＣＧＣＣＣＴＣＴＣＡＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴ（配列番号９６７）−Ｌｉｎｋｅｒ））と標的／非標的配列との間の結合のＴｍ値を測定した結果を示すグラフである。グラフ左縦軸は規格化済み吸光度Ａ（ｎ、Ｔ）、右縦軸は規格化済み吸光度の一次微分ｄＡ（ｎ、Ｔ）／ｄＴ、横軸は測定温度Ｔ［℃］を表す。実線は規格化済み吸光度Ａ（ｎ、Ｔ）、点線は規格化済み吸光度の一次微分ｄＡ（ｎ、Ｔ）／ｄＴを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂはプローブ２（ＴＣＧＣＣＣＴＣＴＣＡＡＣ＊ＣＡＧＣＴＴＴＴ（配列番号９６８）−Ｌｉｎｋｅｒ）と標的／非標的配列との間の結合のＴｍ値を測定した結果を示すグラフである。実線、点線、グラフ左縦軸、右縦軸、及び横軸は図２Ａと同様である。
【図２Ｃ】図２Ｃはプローブ３（ＴＣＧＣ＊ＣＴＣＴＣＡＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴ（配列番号９６９）−Ｌｉｎｋｅｒ）と標的／非標的配列との間の結合のＴｍ値測定した結果を示すグラフである。実線、点線、グラフ左縦軸、右縦軸、及び横軸は図２Ａと同様である。
【図２Ｄ】図２Ｄはプローブ４（ＴＣＧＣ＊ＣＴＣＴＣＡＡＣ＊ＣＡＧＣＴＴＴＴ（配列番号９７０）−Ｌｉｎｋｅｒ）と標的／非標的配列との間の結合のＴｍ値を測定した結果を示すグラフである。実線、点線、グラフ左縦軸、右縦軸、及び横軸は図２Ａと同様である。
【図３Ａ】図３Ａは、プローブ２３ｍｅｒと標的／非標的配列との間の結合のＴｍ値を測定した結果を示すグラフである。グラフ左縦軸は規格化済み吸光度Ａ（ｎ、Ｔ）、右縦軸は規格化済み吸光度の一次微分ｄＡ（ｎ、Ｔ）／ｄＴ、横軸は測定温度Ｔ［℃］である。グラフの実線は規格化済み吸光度Ａ（ｎ、Ｔ）、点線は規格化済み吸光度の一次微分ｄＡ（ｎ、Ｔ）／ｄＴを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、プローブ１８ｍｅｒと標的／非標的配列との間の結合のＴｍ値を測定した結果を示すグラフである。実線、点線、グラフ左縦軸、右縦軸、及び横軸は図３Ａと同様である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、プローブ１７ｍｅｒと標的／非標的配列との間の結合のＴｍ値を測定した結果を示すグラフである。実線、点線、グラフ左縦軸、右縦軸、及び横軸は図３Ａと同様である。
【図４】図４は、作用電極表面をプローブおよびＨＨＴで修飾した状態を示す図である。
【図５】図５は、作用電極表面をプローブおよびＨＨＴで修飾した状態であり、かつ、マーカーが作用電極表面まで到達する状態を示す図である。
【図６】図６は、作用電極表面をプローブおよびＨＨＴで修飾した状態の時のＣＶ波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。
【図７】図７は、図６の状態に非標的配列のみを試料として加えた結果を示す。作用電極表面をプローブおよびＨＨＴで修飾した状態であり、かつプローブとハイブリダイゼーションする核酸が存在しなかったために、マーカーが作用電極表面まで到達する状態の時のＣＶ波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。
【図８】図８は、作用電極表面をプローブおよびＨＨＴで修飾し、プローブと標的核酸がハイブリダイゼーションした状態で、マーカーが作用電極表面まで到着しづらい状態を示す図である。
【図９】図９は、作用電極表面をプローブおよびＨＨＴで修飾し、プローブと標的核酸がハイブリダイゼーションした状態で、マーカーが作用電極表面まで到着しづらい状態の時のＣＶ波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、プローブ１に対して標的配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のＣＶ波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、プローブ２に対して標的配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のＣＶ波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、プローブ３に対して標的配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のＣＶ波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、プローブ４に対して標的配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のＣＶ波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、プローブ２３ｍｅｒに対して表劇配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のＣＶ波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、プローブ１８ｍｅｒに対して表劇配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のＣＶ波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、プローブ１７ｍｅｒに対して表劇配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のＣＶ波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
１．ポリヌクレオ塩基プローブの設計方法
一態様において、本発明は、配列番号１−１０のいずれか１つの配列（ＧＣ連続配列）を少なくとも１つ有する標的配列を有する標的核酸と高い特異度で結合可能なポリヌクレオ塩基プローブ配列の設計方法であって、
Ａ）該標的配列と完全に相補的な１０〜５０ｍｅｒの配列を完全相補的プローブ配列として選択すること、
Ｂ）（ｉ）該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列におけるＧＣ連続配列と相補的な部分において、少なくとも１個の塩基を脱塩基化させかつ／若しくは置換させることにより、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、及び／又は、
（ｉｉ）該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列におけるＧＣ連続配列と相補的な部分が連続する２塩基以下となるように該完全相補的プローブ配列を切断することにより、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、を含む方法、に関する。
【００４５】
好ましくは、本発明のポリヌクレオ塩基プローブ配列は、プローブ配列中の標的ＧＣ連続配列と相補的なポリヌクレオ塩基配列（プローブＧＣ連続配列）において、グアニン又はシトシンのどちらか一方が連続する塩基数が２塩基以下となるように、脱塩基化、置換又は切断して設計される。
【００４６】
本発明の方法において、標的配列は、標的核酸に含まれ、少なくとも１個のＧＣ連続配列を含む任意の配列を選択することができる。標的配列の長さは、標的核酸の特異的検出が可能な長さであれば特に制限されるものではなく、上述の標的配列の長さとすることができる。完全相補的プローブ配列は、前記標的配列と完全に相補的なポリヌクレオ塩基配列として得ることができる。
【００４７】
脱塩基化させる又は置換させる塩基の位置及び数は、上述の本発明のプローブＧＣ連続配列における置換／脱塩基のいずれを採用することもできる。「脱塩基化」は、塩基部分を水素原子、水酸基、低級アルキル基、低級アシル基等で置換することにより行うことができる。また、ＰＮＡの場合、脱塩基化は、グリシン骨格の窒素原子を、炭素原子（低級アシル基（アセチル基等）や低級アルキル基（メチル基等）を置換基として有していてもよい）と置換することにより行っても良い。また、「置換」は、塩基部分を相補的でない塩基（天然の塩基又は人工塩基など）と置換することにより行うこともできるし、他の塩基による二重らせん構造の形成を阻害しない基、例えば、フェニル基、アントラキノン基などと置換して行ってもよい。好ましくは、置換／脱塩基プローブ配列は、プローブＧＣ連続配列を持たないように設計される。
【００４８】
完全相補的プローブ配列の切断は、プローブＧＣ連続配列内で該完全相補的プローブ配列を切断することにより行う。切断は、切断により得られる断片のうち、ポリヌクレオ塩基プローブとして利用することを意図する断片が、プローブＧＣ連続配列に由来するグアニン又はシトシンをその末端に２塩基以下有することとなるような位置で行う。よって、切断により得られるポリヌクレオ塩基プローブは、一方又は両方の末端に、１若しくは２塩基のグアニンを有するか又は１若しくは２塩基のシトシンを有する。
【００４９】
完全相補的プローブ配列が、２か所以上のプローブＧＣ連続配列を有する場合、以上の置換、脱塩基、及び切断は、単独で又は組み合わせて当該２か所以上のＧＣ連続配列で行うことにより、ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計してもよい。好ましくは、本発明の設計においてプローブ中の全てのプローブＧＣ連続配列において、置換、脱塩基、及び切断が行われる。よって、好ましくは、ポリヌクレオ塩基プローブ配列はプローブＧＣ連続配列を持たないように設計される。
【００５０】
本明細書において、ＧＣ連続配列を少なくとも１つ有する標的配列を「高い特異度で結合、検出、又は定量」する、又は「特異的に検出／結合」するとは、（置換／脱塩基されていない）標的配列と相補的なプローブ（完全相補的プローブ配列を有するプローブ、以下「完全相補的プローブ」という）と比較して、低い割合で非標的配列を偽陽性として検出（又は定量）することを意味する。被検プローブが完全相補的プローブと比較して非標的配列を偽陽性として検出（又は定量）する割合が低いか否かは、例えば、両プローブの非標的配列への結合について二本鎖の５０％が解離して一本鎖になる温度（メルティング・テンパレーチャー：Ｔｍ値）を測定し、被検プローブのＴｍ値が完全相補的プローブのＴｍ値よりも低いか、あるいは、被検プローブのＴｍ値が測定できない（二本鎖を形成しない）場合に、当該被検プローブは、完全相補的プローブと比較して非標的配列を偽陽性として検出（又は定量）する割合が低いと判定することができる。あるいは、特異度０．８、０．９、０．９５、０．９８、０．９９、０．９９９などで、結合、検出、又は定量することを意味してもよい。
【００５１】
２．ポリヌクレオ塩基プローブの製造
本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブは、上述の設計方法により設計されたプローブを、本技術分野において周知の方法を利用して製造することができる。特に、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ等のポリヌクレオ塩基は１塩基ずつ結合させる化学合成に方法が良く知られており、このような方法を採用することができる。例えば、ＰＮＡはＦｍｏｃ固相合成法を用いて、脱塩基する箇所を塩基で伸長する代わりに５−［（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｐｅｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄで伸長することにより、塩基を炭素骨格で置換することができる。また、必要に応じて、合成したポリヌクレオ塩基プローブを固相や標識などの修飾物質に結合することもできる。
【００５２】
３．本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブを用いたＧＣ連続配列を有する標的核酸の検出又は定量方法
別の態様において本発明は、被検サンプル中の配列番号１−１０のいずれか１つの配列を少なくとも１つ有する標的核酸を高い特異度で検出する方法であって、
前記標的核酸を検出するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも１種類の本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブを前記被検サンプルと接触させること、及び
前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を検出することを含む方法に関する。
【００５３】
別の態様において本発明は、被検サンプル中の配列番号１−１０のいずれか１つの配列を少なくとも１つ有する標的核酸を高い特異度で定量する方法であって、
前記標的核酸を定量するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも１種類の本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブを前記被検サンプルと接触させること、及び
前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を定量することを含む方法に関する。
【００５４】
本発明の検出方法及び定量方法において、被検サンプルは、検出又は定量対象となる標的核酸の存在又は量を調べようとする目的の試料を用いて調製することができる。例えば、診断目的の場合、ＤＮＡ又はＲＮＡが検出されうる試料であれば特に制限されるものではなく、リンパ液、血液（血清、血漿）、尿、便、唾液、髄液、涙、バイオプシー、毛、皮膚、爪、浸出液、細胞（例えば、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ））などの体液や組織、エクソソーム、又はセルフリーＤＮＡを用いることができる。これらの試料は適宜ＤＮＡ又はＲＮＡの検出に適したサンプルとして調製される。
【００５５】
少なくとも１種類の本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブと、被検サンプルとの接触は、例えば、バッファー中で本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブと被検サンプルとを混合することにより行うことができる。特に、本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブが固相に結合している場合、静置状態で静的に接触させるほか、マイクロ流路等により動的に接触させることもできる。
【００５６】
ポリヌクレオ塩基プローブと結合した標的核酸の検出又は定量は、核酸検出の分野で広く知られた方法を採用することができる。プローブに標識が結合している場合、当該標識の種類に応じた検出・定量方法を採用することができる。また、プローブに標識が結合していない場合、二本鎖に挿入される挿入剤を用いて電気的に検出又は定量することもできる（特開２００６−０６１０６１号等参照）。
【００５７】
４．本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブの他の利用方法
本発明のプローブは、上述のハイブリダイゼーション後に直接測定する検出及び定量方法の他、ハイブリダイゼーションを利用した後に、増幅やライゲーションを利用して検出や定量する方法において用いることもできる。特に増幅を利用する場合には、プライマーとして用いることができる。また、本発明のプローブは、アンチセンスＤＮＡとして用いることができる。このような、アンチセンスＤＮＡは、遺伝子発現のノックアウト／ノックダウンに用いることができる。また、このようなアンチセンスＤＮＡを治療目的で用いることもでき、例えば、遺伝子治療用とすることもできる。
【００５８】
例えば、本発明に係るプローブは、以下の方法に用いることができる：
被検サンプル中の標的核酸を、配列番号１−１０のいずれか１つの配列を少なくとも１つ有する標的配列に相補的なプローブ（プライマー）を用いた検出又は定量と比較して高い特異度で検出又は定量する方法であって、
前記標的核酸を定量するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも１種類の本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブ（プライマー）を前記被検サンプルと接触させること、
前記標的核酸と相補的な核酸を増幅させること、及び
増幅した前記標的核酸を検出又は定量することを含む方法。
【００５９】
あるいは、本発明に係るプローブは、以下の方法に用いることができる：
被検サンプル中の標的核酸を、配列番号１−１０のいずれか１つの配列を少なくとも１つ有する標的配列に相補的なプローブを用いた検出又は定量と比較して高い特異度で検出又は定量する方法であって、
前記標的核酸を定量するための被検サンプルを調整すること、
（ｉ）少なくとも１種類の本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブと、（ｉｉ）本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブと重複する標的配列を有しない相補的なプローブであって、本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブの前記標的配列と１〜数塩基離れた塩基を前記標的配列の末端とするプローブを前記被検サンプルと接触させること、
前記標的核酸と相補鎖を形成した二種類のプローブをライゲーションにより結合させること、及び
二種類のプローブの結合物を検出又は定量することを含む方法。
【実施例】
【００６０】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本出願は、２０１７年２月２２日に日本国において出願された特願２０１７−０３０５５３号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。また、本願において引用した全ての特許、特許出願及び文献に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。【００６１】
（実施例１）Ｔｍ値決定方法
プローブと標的とが形成する二本鎖のＴｍ値は、温度を変化させながら各セルの２６０ｎｍおよび３２０ｎｍにおける吸光度を測定し、得られた吸光度対温度データから決定した。吸光度変化量の測定装置及び条件は以下の通りとした。吸光度測定は、測定ソフト設定に従って、アニーリングとＴｍ値測定の間行われた。
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
測定装置          吸光光度計  ＵＶ−２６００（島津製作所製）
温度コントローラー  ＴＭＳＰＣ−８（島津製作所製）
８連セル  ２０８−９２０９７−１１（島津製作所製）
測定ソフト  ＵＶＰｒｏｂｅ  ｖｅｒ．２．５２（島津製作所製）
恒温槽  ＣＣＡ−１１１１（ＥＹＥＲＡ製）
測定ソフト設定    吸光度測定前待機時間：４ｍｉｎ．
吸光度測定間隔      ：１℃
スリット幅          ：１．０ｎｍ
積算時間            ：３
温度ブランク      ＳＳＣ（１×）
２０％  ＤＭＳＯ水溶液
測定試料          ＳＳＣ（１×）
２０％  ＤＭＳＯ水溶液
プローブ  ２μＭ
標的      ２μＭ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＳＳＣ：Ｓａｌｉｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ【００６２】
具体的には、測定する各プローブ／標的の組み合わせ核酸試料又は温度ブランクを加えたセルを、９５℃で１０分間アニーリング前待機させた後、９５℃から２０℃まで０．５℃／分で降温させてアニーリングさせた。その後、２０℃で６０分間Ｔｍ値測定前待機させた後、２０℃から９５℃まで０．５℃／分で昇温させてＴｍ値を測定した。温度ブランクを用いてベースラインを測定し、温度ブランクセルのデータを用いて、波長範囲３３０ｎｍ〜２５０ｎｍについてベースライン補正を行った。【００６３】
得られた２波長（２６０ｎｍ、３２０ｎｍ）における吸光度に基づき、試料内核酸の吸光度Ａ２６０（ｎ、Ｔ）から、環境依存性の吸光度変動Ａ３２０（ｎ、Ｔ）を差し引く２波長補正を行い、温度補正済み吸光度Ａｗを計算した。
Ａｗ（ｎ、Ｔ）＝Ａ２６０（ｎ、Ｔ）−Ａ３２０（ｎ、Ｔ）
ｎ：セル番号（ｎ＝１、２、．．．、８）
Ｔ：測定時温度（Ｔ＝２０、２１、．．．、９５）
Ａｗ（ｎ、Ｔ）：セル番号ｎの温度Ｔにおける温度補正済み吸光度
Ａ２６０（ｎ、Ｔ）：セル番号ｎの温度Ｔにおける波長２６０ｎｍの吸光度
Ａ３２０（ｎ、Ｔ）：セル番号ｎの温度Ｔにおける波長３２０ｎｍの吸光度【００６４】
更に、溶媒の温度変化による吸光度変動分を除くため、核酸試料のＡｗ（ｎ、Ｔ）から温度ブランクセルのＡｗ（１、Ｔ）を差し引いて温度補正を行って温度ブランク補正済み吸光度Ａｔを計算した。
Ａｔ（ｎ、Ｔ）＝Ａｗ（ｎ、Ｔ）−Ａｗ（１、Ｔ）
Ａｔ（ｎ、Ｔ）：セル番号ｎの温度ブランク補正済み吸光度【００６５】
得られたＡｔ（ｎ、Ｔ）の最大値が１となるように規格化することで、規格化済み吸光度Ａを計算した。これにより、Ｍａｘ（Ａ（ｎ、Ｔ））＝１となる。
Ａ（ｎ、Ｔ）＝Ａｔ（ｎ、Ｔ）／Ｍａｘ（Ａｔ（ｎ、Ｔ））
Ａ（ｎ、Ｔ）：規格化済み吸光度
Ｍａｘ（Ａｔ（ｎ、Ｔ））：セル番号ｎのＡｔ（ｎ、Ｔ）における最大値【００６６】
上記計算により得られたＡ（ｎ、Ｔ）を元に、塩基対形成量の多寡を示すセル番号ｎの吸光度変化量［％］△ａｂｓ（ｎ）、並びに、Ｔｍ値［℃］を示すセル番号ｎの温度による一次微分の最大値Ｔｍ（ｎ）を以下の式に従い求めた。以下の式において、Ｍｉｎ（Ａｔ（ｎ、Ｔ））は、セル番号ｎのＡｔ（ｎ、Ｔ）における最小値を表す。
△ａｂｓ（ｎ）＝（Ｍａｘ（Ａ（ｎ、Ｔ））−Ｍｉｎ（Ａ（ｎ、Ｔ）））＊１００
Ｔｍ（ｎ）＝Ｍａｘ（ｄＡ（ｎ、Ｔ）／ｄＴ）【００６７】
（実施例２）脱塩基プローブ
本発明の一形態であるＰＮＡを用いたプローブの一部を５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（以下Ａｐｅ）で置換することにより脱塩基を行った。以下において、「Ｌｉｎｋｅｒ」はプローブを金電極に結合させるためのチオール基を含む構造を表す。本実施例における標的ＧＣ連続配列はＧＧＧとし、プローブＧＣ連続配列はＣＣＣとした。Ａｐｅによる置換部位を「＊」で示す。【００６８】
図１Ａは脱塩基非含有の状態を示し、ＰＮＡプローブ（図中下部）のＣＣＣと標的ＲＮＡ（図中上部）のＧＧＧが塩基対を形成している。図１ＢはシトシンのＡｐｅ置換による脱塩基を適用した状態を示し、プローブ（図中下部）のＣ＊Ｃと試料中ＲＮＡ（図中上部）のＧＧＧは一部塩基対を形成できていない様子を示している。【００６９】
脱塩基効果を確認するため、以下の配列を有するプローブ１〜４の４種類のプローブを用いて、標的配列（プローブと相補的な配列）および非標的配列（プローブと相補的でない配列）との塩基対形成について、上述の方法によりＴｍ値を測定した。非標的配列はプローブと相補的ではない配列を有するが、標的配列と同じＧＣ連続配列（ＧＧＧ）を含む。このため、非標的配列はプローブと塩基対を形成しやすく、非標的配列がプローブと塩基対を形成することは偽陽性となることを意味する。
（標的配列及び非標的配列）
標的配列    ＡＡＡＡＧＣＵＧＧＧＵＵＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡ（配列番号９７１）
非標的配列  ＵＧＧＣＡＧＧＧＡＧＧＣＵＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号９７２）
（プローブ）
プローブ１  ＴＣＧＣＣＣＴＣＴＣＡＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴ（配列番号９６７）−Ｌｉｎｋｅｒ
プローブ２  ＴＣＧＣＣＣＴＣＴＣＡＡＣ＊ＣＡＧＣＴＴＴＴ（配列番号９６８）−Ｌｉｎｋｅｒ
プローブ３  ＴＣＧＣ＊ＣＴＣＴＣＡＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴ（配列番号９６９）−Ｌｉｎｋｅｒ
プローブ４  ＴＣＧＣ＊ＣＴＣＴＣＡＡＣ＊ＣＡＧＣＴＴＴＴ（配列番号９７０）−Ｌｉｎｋｅｒ【００７０】
前記プローブと標的／非標的配列の組み合わせ８通りのＴｍ値を、実施例１で示した手法により測定した結果を図２Ａ〜図２Ｄに示す。プローブ１と非標的配列との結合のＴｍ値は５８℃である。△ａｂｓは１０％と高く、プローブ１が本来非相補鎖である非標的配列と塩基対を形成していることが示された。それに対し、脱塩基プローブ２、３、及び４では、非標的配列に対する△ａｂｓにおいて差が顕れており、脱塩基１部位よりも２部位のプローブ４では更に減少傾向がみえる。２箇所以上のＧＣ連続配列を有する標的配列に対して、相補的なプローブにおける両方のＧＣ連続配列に相補的な部分をＡｐｅで置換したプローブ（２部位置換プローブ）を用いることで、非標的配列との非特異的塩基対形成（偽陽性）を効果的に減少できることが示された。プローブ４では、非標的配列との塩基対形成におけるｄＡ（ｎ、Ｔ）／ｄＴの変動はノイズレベルでありＴｍ値は求めることができなかった。よって、プローブ４は、どの温度においても非標的配列とは結合していないと考えられる。一方で、標的配列に対するＴｍ値も脱塩基部位の増加にともない低下する傾向をみせたが、２部位置換プローブでも５８℃あり、△ａｂｓも高い。このことから、標的と問題なく二重鎖を形成していることが確認された。よって、脱塩基プローブを用いて温度を適切にコントロールすることにより、偽陽性率の低い標的配列の検出が可能であることが示された。【００７１】
（実施例３）鎖長違いプローブ
上述の実施例２に示した通り、配列中の塩基を欠失させた脱塩基プローブを用いた実験により、ＧＣ連続配列の脱塩基が効果的に偽陽性率の低い検出を可能とすることが示された。このことから、ＧＣ連続配列が末端付近に存在している配列において、ＧＣ連続配列の途中で切断して配列長を短くしたプローブでも同じく偽陽性率の低い検出が可能か否かを調べた。
具体的には、本発明の一形態であるＰＮＡを用いたプローブにおけるＧＣ連続配列を切断して、以下の配列を有する鎖長の異なるプローブを３種類作製した。標的配列（プローブと相補的な配列）および非標的配列（プローブと相補的でない配列）との塩基対形成について、上述の方法によりＴｍ値を測定した。非標的配列はプローブと相補的ではない配列を有するが、標的配列と同じＧＣ連続配列（ＧＧＧ）を含む。このため、非標的配列はプローブと塩基対を形成しやすく、プローブと塩基対を形成することは偽陽性となることを意味する。本実施例において標的ＧＣ連続配列はＧＧＧとし、相補的なプローブＧＣ連続配列はＣＣＣとした。【００７２】
（標的配列及び非標的配列）
標的配列  ＡＧＣＵＡＣＡＵＵＧＵＣＵＧＣＵＧＧＧＵＵＵＣ（配列番号９７３）
非標的配列  ＵＧＧＣＡＧＧＧＡＧＧＣＵＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号９７４）
（プローブ）
プローブ２３ｍｅｒ  ＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＧＣＴ（配列番号９７５）−Ｌｉｎｋｅｒ
プローブ１８ｍｅｒ  ＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＧＣＴ（配列番号９７６）−Ｌｉｎｋｅｒ
プローブ１７ｍｅｒ  ＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＧＣＴ（配列番号９７７）−Ｌｉｎｋｅｒ【００７３】
前記プローブと標的／非標的配列の組み合わせ６通りのＴｍ値を、実施例１で示した手法により測定した結果を図３Ａ〜図３Ｃに示す。【００７４】
プローブ２３ｍｅｒとプローブ１８ｍｅｒ又はプローブ１７ｍｅｒとの間では、非標的配列に対する△ａｂｓに大きな差がみられる。しかし、プローブ１８ｍｅｒとプローブ１７ｍｅｒとの間では差が見られず、３連続シトシンから１塩基短くなるだけで非標的配列との塩基対をほとんど形成しなくなることが示された。一方で、標的配列に対するＴｍ値は鎖長を短くするにつれ低下する傾向をみせたが、１７ｍｅｒプローブでもＴｍ値は７０℃であり△ａｂｓも高い。このため、標的と二重鎖を形成していることが確認された。よって、プローブ又は標的配列の末端付近にＧＣ連続配列が存在する場合、プローブの鎖長を短くすることで非標的配列との非特異的塩基対形成（偽陽性）を減らす効果があることが示された。プローブ１８ｍｅｒ及びプローブ１７ｍｅｒでは、非標的配列との塩基対形成におけるｄＡ（ｎ、Ｔ）／ｄＴの変動はノイズレベルでありＴｍ値は求めることができなかった。よって、プローブ１８ｍｅｒ及びプローブ１７ｍｅｒは、どの温度においても非標的配列とは結合していないと考えられる。よって、短鎖プローブを用いて温度を適切にコントロールすることにより、偽陽性率の低い標的配列の検出が可能であることが示された。【００７５】
（実施例４）電気化学測定による核酸検出方法の確立
本実施例において「修飾」とは、対応する溶液をピペットにより作用電極上に滴下した後に指定時間だけ指定温度中で静置する工程を指す。また、本実施例において「洗浄」とは、指定温度の指定洗浄液により金電極表面を洗浄する工程を指す。
（１）測定液の調整
リン酸二水素ナトリウム水溶液に対し、ｐＨ７．０となるよう水酸化ナトリウムで調整した後、過塩素酸ナトリウムとヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸カリウムを加えた。測定液の最終濃度は、リン酸二水素ナトリウム  ２．５  ｍＭ、過塩素酸ナトリウム  ５  ｍＭ、及びヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸カリウム  １  ｍＭとした。【００７６】
（２）測定方法
本実施例における電気化学測定は、以下の工程により行った。以下の表において、ＲＴ：室温（約２５℃）、ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸、ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ：超純水を表す。【００７７】
【表１】
2018155427.tif 000003
【００７８】
試料としては、規定濃度の標的核酸または非標的核酸のいずれかを含む溶液を用いた。測定は、作用電極：金電極  直径３００μｍ、対向電極：ＢＡＳ社製  Ｐｔカウンター電極  ５ｃｍ、参照電極：ＢＡＳ社製  ＲＥ−１Ｂ水系参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）、ポテンショスタット（ＢｉｏＤｅｖｉｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製  ｍｉｎｉＳＴＡＴ１００）を用いサイクリックボルタンメトリー（以下、ＣＶ）で行った。測定条件（ｍｉｎｉＳｔａｔ１００設定内容）は、以下の通りとした。【００７９】
【表２】
2018155427.tif 000004
【００８０】
（３）測定１
作用電極表面をプローブおよび６−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｈｅｘａｎｅｔｈｉｏｌ（ＨＨＴ）で修飾した（図４）。この状態では作用電極表面は帯電していない。そのため、測定液中では設定電位に応じてヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸イオン（以下、マーカーと称す）は作用電極表面まで到達することができる（図５）。この状態のときのＣＶによる測定波形（図６）を基本値とする。また、測定１において最大電流値ｉ１を記録した電圧値をＶ１とする。【００８１】
（４）測定２−非標的核酸
非標的核酸を含む試料で電極を修飾した（以下、非相補電極）。非標的核酸はプローブとほとんどハイブリダイゼーションしないため、初期状態（図５）と同様にマーカーが電極表面に到達した。そのため、測定２においても測定１と同様のＣＶ波形（図７）が得られ、測定１において最大電流値ｉ１を記録した電圧値Ｖ１における電流値ｉ２は、測定誤差を除けば理論的には測定１における最大電流値ｉ１と同じ値となった。【００８２】
（５）測定２−標的核酸
次に、標的核酸を含む試料で電極を修飾した（以下、相補電極）。プローブと標的核酸がハイブリダイゼーションしたため、核酸の負電荷によりマーカーが斥力を受けて電極表面に到達しづらくなった（図８）。そのため、得られるＣＶ波形も測定１において最大電流値ｉ１を記録した電圧値Ｖ１における電流値ｉ２が低下した（図９）。【００８３】
（６）ハイブリダイゼーション判定方法の決定
以上の結果から、測定した電極が相補電極であったか非相補電極であったかは、測定１において最大電流値ｉ１を記録した電圧値Ｖ１における電流値により判定することとした。測定１，２で得られた電流値比ｉ２／ｉ１は、理想的には非相補電極であれば１となり、相補電極であれば１よりも小さくなる。実際的には、測定誤差を考慮して
電流値比ｉ２／ｉ１≧０．９のときは非相補電極であり
電流値比ｉ２／ｉ１＜０．９のときは相補電極である
と判定することとした。【００８４】
（実施例５）プローブのＧＣ連続配列の脱塩基による核酸検出への影響評価
上述のＣＶ測定法を用いて、以下の標的配列及び非標的配列に対するプローブ１〜４のハイブリダイゼーションの測定を行った。
標的配列  ＡＡＡＡＧＣＵＧＧＧＵＵＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡ（配列番号９７１）
非標的配列  ＵＧＧＣＡＧＧＧＡＧＧＣＵＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号９７２）
（プローブ）
プローブ１  ＴＣＧＣＣＣＴＣＴＣＡＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴ（配列番号９６７）−Ｌｉｎｋｅｒ
プローブ２  ＴＣＧＣＣＣＴＣＴＣＡＡＣ＊ＣＡＧＣＴＴＴＴ（配列番号９６８）−Ｌｉｎｋｅｒ
プローブ３  ＴＣＧＣ＊ＣＴＣＴＣＡＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴ（配列番号９６９）−Ｌｉｎｋｅｒ
プローブ４  ＴＣＧＣ＊ＣＴＣＴＣＡＡＣ＊ＣＡＧＣＴＴＴＴ（配列番号９７０）−Ｌｉｎｋｅｒ【００８５】
図１０に各プローブに対して標的配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のＣＶ波形を示す。測定１のＣＶ波形を点線、測定２のＣＶ波形を実線で示して、左上に電流値比を記載した。
標的配列−プローブ１〜４：測定１に対する測定２の電流値比がいずれも０．１以下まで低下しているため、標的配列と正しくハイブリダイゼーションした。
非標的配列−プローブ１：電流値比が０．３であり、非標的配列とミスハイブリダイゼーションを起こした。
非標的配列−プローブ２，３：電流値比は０．４、０．７であり、プローブ１の電流値比０．３よりも値が高くなっている為、ＧＣ連続配列を一箇所脱塩基したことによるミスハイブリダイゼーションの低減効果が認められた。
非標的配列−プローブ４：電流値比が０．９であり、ミスハイブリダイゼーションを起こさなかった。ＧＣ連続配列を二箇所とも脱塩基した効果が認められた。【００８６】
（実施例６）プローブのＧＣ連続配列切断による核酸検出への影響評価
上述のＣＶ測定法を用いて、以下の標的配列及び非標的配列に対するプローブ１〜４のハイブリダイゼーションの測定を行った。
標的配列  ＡＧＣＵＡＣＡＵＵＧＵＣＵＧＣＵＧＧＧＵＵＵＣ（配列番号９７３）
非標的配列  ＵＧＧＣＡＧＧＧＡＧＧＣＵＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号９７４）
（プローブ）
プローブ２３ｍｅｒ  ＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＡＴＧＴＡＧＣＴ（配列番号９７５）−Ｌｉｎｋｅｒ
プローブ１８ｍｅｒ  ＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＧＣＴ（配列番号９７６）−Ｌｉｎｋｅｒ
プローブ１７ｍｅｒ  ＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＧＣＴ（配列番号９７７）−Ｌｉｎｋｅｒ【００８７】
図１１に各プローブに対して標的配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のＣＶ波形を示す。測定１のＣＶ波形を点線、測定２のＣＶ波形を実線で示して、左上に電流値比を記載した。
標的配列−プローブ２３ｍｅｒ：電流値比が０．０まで低下しており、標的配列と正しくハイブリダイゼーションした。
標的配列−プローブ１８，１７ｍｅｒ：鎖長が短くなるにつれ電流値比が高くなるが、０．２までで抑えられた。これは、完全長に比べれば標的配列とのハイブリダイゼーションが減少していることを意味するが、それでも相補判定には十分な電流値比低下を保っていた。
非標的配列−プローブ２３ｍｅｒ：電流値比が０．７であり、非標的配列とミスハイブリダイゼーションを起こした。
非標的配列−プローブ１８，１７ｍｅｒ：電流値比が１．０であり、ミスハイブリダイゼーションを完全に抑制した。ＧＣ連続配列を３連続塩基未満となるように切断した効果が認められる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2018155427.tif 000020
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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