(57)【要約】  共焦点ピンホールと励起光の集光点とが光学的に非共役な位置関係となる最適点を自動設定して、操作者にかかる負担を軽減することを目的として、本発明に係る顕微鏡（１）は、光源（２）からの励起光を走査するスキャナ（７）と、走査される励起光を試料（Ａ）に集光する一方、各走査位置で試料において発生した蛍光を集光する対物光学系（８）と、集光された蛍光を検出する検出器（１２）と、検出器と対物光学系との間に配置され対物光学系により集光された蛍光を部分的に遮断する遮光部材（１１）と、遮光部材と試料における励起光の集光点との位置関係を、光学的に共役な位置関係と、光学的に非共役な位置関係とに時間的に切り替える切替部（３）と、集光点と光学的に共役な位置における蛍光分布を取得する蛍光分布取得部（１８）と、取得された蛍光分布に基づいて、切替部における非共役な位置関係を設定する設定部（１７）とを備える。
2017221356.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの励起光を走査するスキャナと、
該スキャナにより走査される前記励起光を試料に集光する一方、各走査位置で前記試料において発生した信号光を集光する対物光学系と、
該対物光学系により集光された前記信号光を検出する検出器と、
該検出器と前記対物光学系との間に配置され該対物光学系により集光された前記信号光を部分的に遮断する遮光部材と、
該遮光部材と前記試料における前記励起光の集光点との位置関係を、光学的に共役な位置関係と、光学的に非共役な位置関係とに時間的に切り替える切替部と、
前記集光点と光学的に共役な位置における蛍光分布を取得する蛍光分布取得部と、
該蛍光分布取得部により取得された前記蛍光分布に基づいて、前記切替部における前記非共役な位置関係を設定する設定部とを備える顕微鏡。
【請求項２】
前記設定部が、前記蛍光分布取得部により取得された前記蛍光分布を焦点蛍光と焦点外蛍光とに分離し、前記焦点蛍光が所定の閾値以下になりかつ前記集光点と光学的に共役な位置に最も近い位置関係を、前記切替部における非共役な位置関係として設定する請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記設定部が、前記蛍光分布取得部により取得された前記蛍光分布を所定の分布モデルに当てはめて、焦点蛍光と焦点外蛍光とを分離する請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記蛍光分布取得部が、前記試料における前記励起光の前記集光点と前記遮光部材との位置関係を変化させたときに、前記検出器により検出される前記信号光である蛍光の強度に基づいて前記蛍光分布を取得する請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記蛍光分布取得部が、前記遮光部材と前記試料における前記励起光の前記集光点との位置関係が共役な位置関係にあるとき、および異なる２点の非共役な位置関係にあるときに取得された蛍光の強度に基づいて前記蛍光分布を取得する請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記蛍光分布取得部が、前記対物光学系と前記励起光の波長とにより決定される前記集光点における前記励起光のスポット径の理論的な大きさに基づいて、前記蛍光の強度を取得する前記遮光部材と前記試料における前記励起光の前記集光点との位置関係を設定する請求項４または請求項５に記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記蛍光分布取得部が、前記試料における前記励起光の前記集光点と光学的に共役な位置に配置された２次元センサである請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項８】
前記蛍光分布取得部が、複数点において前記蛍光分布を取得し、
前記設定部が、複数の前記蛍光分布の平均に基づいて前記切替部における前記非共役な位置関係を設定する請求項１から請求項７のいずれかに記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
焦点外蛍光の共焦点ピンホール内への漏れ込みにより、試料の深部の観察が困難になるのを防止するために、共焦点ピンホールと励起光の集光点との位置関係を光学的に共役な位置と非共役な位置とに切り替えてそれぞれ蛍光を検出し、取得された蛍光信号の差分を演算する顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２０１５／１６３２６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の顕微鏡では、共焦点ピンホールと励起光の集光点とが光学的に非共役な位置関係となる最適点の設定については、操作者が手動で試料を撮影しながら共焦点ピンホールの位置を調整する必要があり煩雑であった。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、共焦点ピンホールと励起光の集光点とが光学的に非共役な位置関係となる最適点を自動設定して、操作者にかかる負担を軽減することができる顕微鏡を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様は、光源からの励起光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査される前記励起光を試料に集光する一方、各走査位置で前記試料において発生した信号光を集光する対物光学系と、該対物光学系により集光された前記信号光を検出する検出器と、該検出器と前記対物光学系との間に配置され該対物光学系により集光された前記信号光を部分的に遮断する遮光部材と、該遮光部材と前記試料における前記励起光の集光点との位置関係を、光学的に共役な位置関係と、光学的に非共役な位置関係とに時間的に切り替える切替部と、前記集光点と光学的に共役な位置における蛍光分布を取得する蛍光分布取得部と、該蛍光分布取得部により取得された前記蛍光分布に基づいて、前記切替部における前記非共役な位置関係を設定する設定部とを備える顕微鏡である。【０００６】
本態様によれば、光源からの励起光がスキャナにより走査され、対物光学系によって試料に集光されることにより、試料における励起光の集光点において蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。発生した蛍光および試料からの励起光の反射光は対物光学系によって集光された後に検出器により検出され、検出された蛍光の強度と走査位置とを対応づけることにより蛍光画像が生成される。【０００７】
この場合において、蛍光分布取得部により、集光点と光学的に共役な位置における蛍光分布が取得され、取得された蛍光分布に基づいて設定部により、切替部における非共役な位置関係が設定される。そして、切替部の作動により、検出器の前段に設けられた遮光部材と試料における励起光の集光点との位置関係が共役な位置関係に切り替えられると、焦点蛍光および焦点外蛍光とが検出器により検出される。【０００８】
また、切替部の作動により、設定部により設定された非共役な位置関係に切り替えられると、焦点蛍光は遮光部材を通過できずに焦点外蛍光のみが検出器により検出される。そして、検出されたこれら蛍光信号の差分が演算されることにより、焦点外蛍光が除去された焦点蛍光を得ることができ、鮮明な蛍光画像を取得することができる。
すなわち、本態様によれば、集光点と光学的に共役な位置における蛍光分布に基づいて、最適な非共役な位置関係を求められるので、操作者が煩雑な設定作業を行うことなく、焦点外蛍光が精度よく除去された焦点蛍光を得ることができる。したがって、操作者にかかる負担を軽減することができる。【０００９】
上記態様においては、前記設定部が、前記蛍光分布取得部により取得された前記蛍光分布を焦点蛍光と焦点外蛍光とに分離し、前記焦点蛍光が所定の閾値以下になりかつ前記集光点と光学的に共役な位置に最も近い位置関係を、前記切替部における非共役な位置関係として設定してもよい。【００１０】
共役な位置関係からずれればずれるほど、非共役の度合いが強くなって、取得される焦点蛍光はゼロに近づくが、取得される焦点外蛍光は、遮光部材と試料における集光点とが光学的に共役な位置関係である場合に検出器により検出される焦点外蛍光とは相違するものとなる。このようにすることで、遮光部材と試料における集光点とが光学的に共役な位置関係である場合に検出器により検出される焦点外蛍光に等しくかつ焦点蛍光が含まれていない蛍光を検出することができ、差分によって精度よく焦点外蛍光を除去した焦点蛍光を得ることができる。【００１１】
また、上記態様においては、前記設定部が、前記蛍光分布取得部により取得された前記蛍光分布を所定の分布モデルに当てはめて、焦点蛍光と焦点外蛍光とを分離してもよい。
このようにすることで、蛍光分布を所定の分布モデルに当てはめるだけで、焦点蛍光と焦点外蛍光とを簡易に分離することができ、適正な非共役な位置関係を設定することができる。【００１２】
また、上記態様においては、前記蛍光分布取得部が、前記試料における前記励起光の前記集光点と前記遮光部材との位置関係を変化させたときに、前記検出器により検出される前記信号光である蛍光の強度に基づいて前記蛍光分布を取得してもよい。
このようにすることで、顕微鏡の基本構成によって蛍光分布を取得することができる。【００１３】
また、上記態様においては、前記蛍光分布取得部が、前記遮光部材と前記試料における前記励起光の前記集光点との位置関係が共役な位置関係にあるとき、および異なる２点の非共役な位置関係にあるときに取得された蛍光の強度に基づいて前記蛍光分布を取得してもよい。
このようにすることで、最低限、共役な位置関係、非共役な度合いの高い位置関係および、共役な位置関係に近く非共役な度合いの低い位置関係の３点において、蛍光強度を取得することにより、設定部によって焦点蛍光と焦点外蛍光とを精度よく分離可能な非共役な位置関係を簡易に設定することができる。【００１４】
また、上記態様においては、前記蛍光分布取得部が、前記対物光学系と前記励起光の波長とにより決定される前記集光点における前記励起光のスポット径の理論的な大きさに基づいて、前記蛍光の強度を取得する前記遮光部材と前記試料における前記励起光の前記集光点との位置関係を設定してもよい。
このようにすることで、非共役の度合いについてはスポット径の理論的な大きさによって決定することができ、これにより、設定部によって焦点蛍光と焦点外蛍光とを精度よく分離可能な非共役な位置関係を簡易に設定することができる。【００１５】
また、上記態様においては、前記蛍光分布取得部が、前記試料における前記励起光の前記集光点と光学的に共役な位置に配置された２次元センサであってもよい。
このようにすることで、蛍光分布を一度に取得でき、設定部によって焦点蛍光と焦点外蛍光とを精度よく分離可能な非共役な位置関係を高速に設定することができる。【００１６】
また、上記態様においては、前記蛍光分布取得部が、複数点において前記蛍光分布を取得し、前記設定部が、複数の前記蛍光分布の平均に基づいて前記切替部における前記非共役な位置関係を設定してもよい。
このようにすることで、蛍光画像を取得することなく、簡易に、設定部によって焦点蛍光と焦点外蛍光とを精度よく分離可能な非共役な位置関係を設定することができ、試料への励起光の照射時間を低減して試料のダメージを軽減することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、共焦点ピンホールと励起光の集光点とが光学的に非共役な位置関係となる最適点を自動設定して、操作者にかかる負担を軽減することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡を示すブロック図である。
【図２Ａ】図１の顕微鏡のピンホールにおける蛍光光束とピンホールとのシフト量を説明する部分的な縦断面図である。
【図２Ｂ】図２のシフト量と焦点蛍光および焦点外蛍光との関係を示すグラフである。
【図３】図１の顕微鏡により取得される蛍光強度とシフト量との関係および設定モードにおいて検出されるシフト量の一例を示すグラフである。
【図４Ａ】図１の顕微鏡の撮影モードにおいて、設定部により設定された２種類の励起光の内の一方の励起光の照射パターンの一例を示す図である。
【図４Ｂ】図１の顕微鏡の撮影モードにおいて、設定部により設定された２種類の励起光の内の他方の励起光の照射パターンの一例を示す図である。
【図５】図１の顕微鏡の第１の変形例を示すブロック図である。
【図６Ａ】図１の顕微鏡の第２の変形例を示すブロック図である。
【図６Ｂ】図６Ａの顕微鏡のピンホールを有するディスクを示す平面図である。
【図７】図１の顕微鏡の第３の変形例を示すブロック図である。
【図８】図１の顕微鏡の第４の変形例を示すブロック図である。
【図９】図１の顕微鏡の第５の変形例を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の一実施形態に係る顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、レーザ光源２からの励起光を交互に射出される２種類の励起光に切り替える切替部３と、該切替部３により切り替えられた２種類の励起光を試料Ａに照射して、試料Ａにおいて発生した蛍光を検出する顕微鏡本体４と、該顕微鏡本体４において検出された蛍光を用いて演算により画像を生成する演算部５と、該演算部５により生成された画像を表示するモニタ６とを備えている。
【００２０】
顕微鏡本体４は、切替部３からの励起光を２次元的に走査するスキャナ７と、該スキャナ７により走査された励起光を試料Ａに集光し、試料Ａからの蛍光（信号光）を集光する対物レンズ（対物光学系）８と、該対物レンズ８により集光され、スキャナ７を経由して戻る蛍光を励起光の光路から分岐するダイクロイックミラー９と、該ダイクロイックミラー９によって分岐された蛍光を集光する結像レンズ１０と、対物レンズ８の焦点位置と光学的に共役な位置に配置されたピンホール（遮光部材）１１と、該ピンホール１１を通過した蛍光を検出する光検出器（検出器）１２とを備えている。
【００２１】
なお、遮光部材としてピンホール１１を例示したが、これに代えて、対物レンズ８の焦点位置と光学的に共役な位置に配置されたときに焦点蛍光を通過させ、非共役な位置に配置されたときに焦点蛍光を遮断する任意の遮光部材を採用してもよい。その他、遮光部材としてはマイクロミラーデバイスや空間光変調器が挙げられる。
【００２２】
スキャナ７は、例えば、非平行な軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラーを近接配置してなる近接ガルバノミラーである。
光検出器１２は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）である。
【００２３】
レーザ光源２は、励起光を連続的に射出する光源である。
切替部３は、図１に示されるように、揺動角度を変化させる可動ミラー（偏向素子）１３と、該可動ミラー１３を駆動する駆動制御部１４とを備えている。
【００２４】
駆動制御部１４には、設定部１６が接続されるとともに、設定部１６には入力部１７および分布取得部（蛍光分布取得部）１８が接続されている。入力部１７は、設定モードと撮影モードの２つの動作モードを選択する入力を行うキーボード、マウスあるいはＧＵＩにより構成されている。設定部１６は、入力部１７からの入力に基づいて、駆動制御部１４を２つの動作モードのいずれかによって動作させるように設定するようになっている。
【００２５】
設定部１６は、入力部１７から設定モードが選択された場合には、予め設定されているシフト量だけ、可動ミラー１３を駆動してレーザ光束をシフトさせるように駆動制御部１４を動作させる一方、撮影モードが選択された場合には、所定の周波数を発振する周波数発振器として駆動制御部１４を機能させるようになっている。
ここで、予め設定されているシフト量ｘは、図２Ａおよび図３に示されるように、集光点とピンホール１１とが光学的に共役な位置関係となるシフト量ゼロの第１シフト量ｘ１、集光点とピンホール１１とが部分的に光学的に非共役な位置関係となる第２シフト量ｘ２および集光点とピンホール１１とが十分に光学的に非共役な位置関係となる第３シフト量ｘ３である。
【００２６】
さらに具体的には、設定モードにおいては、設定部１６は、予め設定された３つのシフト量を達成可能な角度に可動ミラー１３を設定するように駆動制御部１４に指令するとともに、可動ミラー１３の各角度において光検出器１２により検出された蛍光の強度を分布取得部１８に記憶させるようになっている。
分布取得部１８は、可動ミラー１３の３つの各角度を達成可能なシフト量ｘと、各角度において取得された蛍光強度とを対応づけた蛍光分布を生成するようになっている。
【００２７】
すなわち、対物レンズ８による励起光の集光点とピンホール１１の位置関係が光学的に共役な位置に配置されている場合には、光検出器１２により検出される蛍光においては、図２Ｂに示されるように、焦点から発生する焦点蛍光が大きく支配的である一方、焦点以外の位置において発生した焦点外蛍光も含まれている。そして、集光点とピンホール１１の位置関係が光学的に共役な位置からずれていくと、焦点蛍光は減少するが、焦点外蛍光はあまり変化しない。
【００２８】
設定部１６は、分布取得部１８により取得された蛍光分布から、焦点蛍光をほとんど含まず焦点外蛍光が支配的である蛍光を検出可能な集光点とピンホール１１との位置関係を達成可能な可動ミラー１３の角度、すなわち、図２Ｂにおける符号ｘＰのシフト量の達成可能な角度を算出するようになっている。
符号ｘＰのシフト量を達成可能な角度の算出方法は、分布取得部１８により生成された３点からなる蛍光分布を、例えば、ガウス関数等の分布モデルにフィッティングして最適位置を探す方法を挙げることができる。
【００２９】
すなわち、ガウス関数へのフィッティングを行うと、次式により表すことができる。
Ｌ＝Ｐｅｘｐ（−ｘ２／２ｗ２）＋Ｑ
ここで、Ｐは焦点内蛍光強度、Ｑは焦点外蛍光の強度である。ｘは励起光束のシフト量、ｗ２は分散である。
【００３０】
これにより、第１項の焦点蛍光と第２項の焦点外蛍光とを分離することができ、第１項の大きさが、例えば、閾値＝０．０１Ｐ以下となる最小のシフト量ｘ＝ｘＰを切替部３による最適な非共役な位置関係として設定することができる。なお、０．０１は焦点蛍光が１％まで減少したことを意味しているが、この値は、任意に設定することができる。
【００３１】
そして、設定部１６は、算出した最適な非共役な位置関係を達成可能なシフト量ｘ＝ｘＰに対応する可動ミラー１３の角度および共役な位置関係を達成可能なシフト量ｘ＝０に対応する可動ミラー１３の角度を、撮影モードにおける可動ミラー１３の角度として駆動制御部１４に設定するようになっている。
【００３２】
撮影モードにおいては、駆動制御部１４は、所定の周波数を発振し、発振された周波数に同期して、可動ミラー１３の角度を、設定部１６により設定された２つの角度に交互に切り替えるようになっている。図中符号１５はミラーである。なお、偏向素子として可動ミラー１３を例示したが、音響光学偏向器や電気光学偏向器などのデバイスを使用することもできる。
【００３３】
これにより、撮影モードにおいては、顕微鏡本体４に対して、入射角度の異なる２種類の励起光が交互に入射させられるようになっている。すなわち、顕微鏡本体４に入射してくる２種類の励起光は、図４Ａおよび図４Ｂに示されるように、反転したタイミングを有する矩形波状に形成されている。なお、ここでは２種類の励起光として反転したタイミングを有する矩形波状の光を例示したが、これに代えて、正弦波状等の任意の繰り返し形状を有し、位相の異なる励起光を採用してもよい。
【００３４】
図４Ａに示される一方の励起光は、スキャナ７および対物レンズ８を介してピンホール１１と光学的に共役な位置に焦点を結び、図４Ｂに示される他方の励起光は、スキャナ７および対物レンズ８を介してピンホール１１と光学的に非共役な位置に焦点を結ぶようになっている。入射角度の切替周波数は、各画素位置において２種類の励起光を少なくとも１回明滅させることができる周波数に設定されている。
【００３５】
２種類の励起光は交互に試料Ａに照射されるので、発生する蛍光も、交互に異なる時刻に光検出器１２により検出されるようになっている。
演算部５は、同一の画素位置において、光検出器１２により検出された、２種類の励起光により発生した蛍光の強度の差分を算出するようになっている。演算部５は、例えば、ロックインアンプ（図示略）を備えている。
【００３６】
ロックインアンプは、励起光を明滅させるための駆動制御部１４により発生された周波数に同期して光検出器１２から出力された２種類の蛍光信号の差分をハードウェア的に算出するようになっている。
そして、演算部５は、画素毎に算出された差分とスキャナ７による走査位置とを対応づけて記憶することにより、画像を生成するようになっている。
【００３７】
このように構成された本実施形態に係る顕微鏡１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１を用いて試料Ａの蛍光観察を行うには、顕微鏡本体４のステージ（図示略）に試料Ａを配置して、対物レンズ８の焦点位置を試料Ａに一致するように調節した状態で、レーザ光源２から連続した励起光を発生させる。
【００３８】
そして、入力部１７において設定モードが選択されたときには、設定部１６が、駆動制御部１４に対して、集光点とピンホール１１とが共役となるシフト量ｘ１および非共役の度合いの異なる２つのシフト量ｘ２，ｘ３に対応する３つの角度に可動ミラー１３の角度を設定し、それぞれの角度において光検出器１２により検出された蛍光強度とシフト量ｘとが、分布取得部１８により対応づけられて、蛍光分布が生成される。
【００３９】
生成された蛍光分布は設定部１６に送られる。設定部１６においては、送られてきた蛍光分布が、ガウス分布に当てはめられて、共役な位置関係となるシフト量ｘ＝０および最適な非共役な位置関係となるシフト量ｘ＝ｘＰに対応する可動ミラー１３の角度が算出される。
設定部１６は、入力部１７において撮影モードが選択されると、算出された可動ミラー１３の角度を駆動制御部１４により切り替えられる可動ミラー１３の角度として設定する。
【００４０】
撮影モードにおいては、駆動制御部１４は、該駆動制御部１４により発振された所定の周波数に従って、設定部１６により設定された２つの角度に可動ミラー１３の角度を交互に変化させることにより、顕微鏡本体４に、入射角度の異なる２種類の励起光を交互に入射させる。
【００４１】
その結果、一方の励起光に含まれる焦点蛍光は、ピンホール１１と共役な試料Ａ内の位置に集光させられるので、その焦点位置近傍において発生した蛍光が、対物レンズ８によって集光され、スキャナ７を経由して戻る途中でダイクロイックミラー９によって分離され、結像レンズ１０によって集光されてピンホール１１を通過し、光検出器１２により検出される。
【００４２】
この場合において、試料Ａに励起光が照射されると、励起光は対物レンズ８の焦点位置に至る経路の途中においても試料Ａを通過することにより蛍光物質を励起するので、蛍光は対物レンズ８の焦点位置のみならず該焦点位置に至る経路の途中においても発生する。特に、試料Ａが散乱物質からなる場合には、励起光の散乱により蛍光が焦点位置以外の部位において蛍光が発生し易い。
【００４３】
また、特に、高精細な観察を行うために試料Ａに入射される励起光のＮＡを増大させると、焦点位置に至るまでに励起光が通過する領域が増えるため、焦点位置以外の部位で発生する蛍光が増大する。また、同様に深部観察時にも励起光が通過する領域が増加するため焦点外蛍光が増加する。さらに深部観察には散乱の影響を補償するために励起光を強める必要があり焦点外蛍光の影響が特に顕著である。
【００４４】
試料Ａにおいて発生した蛍光の内、対物レンズ８の焦点位置から発生した蛍光は、光学的に共役な位置に配置されているピンホール１１を容易に通過するので光検出器１２により信号光として検出されるが、焦点位置以外の部位から発生した蛍光はサンプルにより散乱され、その一部がピンホール１１を通過して光検出器１２によりノイズとして検出されてしまう。したがって、一方の励起光の照射により検出される蛍光には、対物レンズ８の焦点位置において発生した、信号として取得すべき焦点蛍光と、他の部位において発生した、信号として取得すべきでない焦点外蛍光とが含まれている。
【００４５】
また、他方の励起光は、試料Ａ内のピンホール１１とは非共役な位置に集光させられて、対物レンズ８の焦点位置および焦点位置に至るまでの経路の途中において蛍光物質を励起することにより蛍光を発生させる。
この場合において、非共役な焦点位置において発生した蛍光はピンホール１１を通過することができずに遮断される一方、焦点位置以外の部位から発生した蛍光の一部はサンプルにより散乱され、先のステップ同様に同じピンホール１１を通過して光検出器１２により検出される。
【００４６】
そして、本実施形態に係る顕微鏡１によれば、非共役な位置が最適に設定されているので、光検出器１２により検出される蛍光内の焦点蛍光は９９％削減されており、かつ、焦点外蛍光は、共役な位置関係において光検出器１２により検出された焦点外蛍光とほぼ同等である。
したがって、演算部５において、これらの２種類の励起光の照射により検出された蛍光の差分が演算されることにより、対物レンズ８の焦点位置以外の部位において発生した、信号として取得すべきでない焦点外蛍光が除去された焦点蛍光を精度よく取得することができる。
【００４７】
２種類の励起光が照射されることにより蛍光が発生する範囲は厳密には一致していないが、多くの部分において一致しているため、また同じピンホール１１を用いて検出を行っていることにより、そのまま減算しても大部分の焦点外蛍光を除去することができる。特に、励起光のＮＡを大きくして高精細な観察を行う場合には、蛍光発生範囲の重複率が増大するので、さらに効果的に焦点外蛍光を除去することができる。
【００４８】
このように本実施形態に係る顕微鏡１によれば、対物レンズ８の焦点位置において発生した蛍光を高いＳ／Ｎ比で検出することができ、ノイズの少ない鮮明な画像を取得することができるという利点がある。特に、励起光のＮＡが大きな高精細の観察時、および、試料Ａが強い散乱物質であって焦点外蛍光が発生し易い場合に効果が高い。そして、最適な非共役位置が自動的に設定されるので、操作者が手動で試料Ａを撮影しながらピンホール１１と蛍光光束との位置関係を調整する煩わしい作業が必要なく、操作者にかかる負担を軽減することができるという利点がある。
【００４９】
また、本実施形態においては、画素毎に極めて短い時間差で取得した２種類の蛍光の差分を演算しているので、高速に移動する試料Ａであってもブレの少ない蛍光画像を取得することができるという利点がある。
【００５０】
なお、本実施形態においては、遮光部材としてピンホール１１を例示したが、これに代えて、対物レンズ８の焦点位置と光学的に共役な位置に配置されたときに焦点蛍光を通過させ、非共役な位置に配置されたときに焦点蛍光を遮断する任意の遮光部材を採用してもよい。他の遮光部材としてはマイクロミラーデバイスや空間光変調器が挙げられる。
【００５１】
また、本実施形態においては、光検出器１２が検出する試料Ａからの信号光として、蛍光のみを用いたものを例示したが、これに加えて、試料Ａからの励起光の反射光を用いてもよい。試料Ａからの励起光の反り光をイメージングすることにより、屈折率分布をイメージングすることができる。
【００５２】
切替部３を構成する偏向素子として可動ミラー１３を例示したが、図５に示されるように、音響光学偏向器（音響光学素子、光束移動部）１９や電気光学偏向器（電気光学素子、光束移動部）２０などのデバイスを使用することもできる。これらのデバイス１９，２０も、駆動制御部１４によって発振された所定の周波数に従って入力する電圧を切り替えることにより、可動ミラー１３と同様に入力電圧に同期して蛍光光束の結像レンズ１０への入射角度を変化させることができる。
【００５３】
設定部１６は、設定モード時に、駆動制御部１４によって発生する電圧を切り替えて分布取得部１８により蛍光分布を取得させ、取得された蛍光分布に基づいて、撮影モード時にデバイス１９，２０に入力する電圧を設定する。これらのデバイス１９，２０によれば、可動ミラー１３のような可動部分を含まないため、コンパクトかつ長寿命に構成することができる。
【００５４】
また、本実施形態においては、固定された遮光部材１１に対して入射する蛍光光束の入射位置を時間的に切り替えることとしたが、これに代えて、蛍光光束を固定しておき、遮光部材２１を蛍光光束の光軸Ｓに交差する方向に移動させることにしてもよい。
すなわち、遮光部材２１として、図６Ｂに示されるように、周方向に間隔をあけて配列された複数のピンホール２２を有する円板状のディスクを採用し、図６Ａに示されるように、モータ（切替部）２３によってディスク２１を中心軸回りに回転させることにしてもよい。
【００５５】
このようにすることで、結像レンズ１０による蛍光の集光位置をディスク２１に一致させておき、モータ２３によってディスク２１を回転させることにより、蛍光の光軸Ｓにピンホール２２が一致する状態と一致しない状態とを交互に繰り返すことができる。すなわち、蛍光の光軸Ｓにいずれかのピンホール２２が一致した状態で、試料Ａにおける励起光の集光点とピンホール２２とが光学的に共役な位置関係となり、蛍光の光軸Ｓに対していずれのピンホール２２も一致していない状態で、試料Ａにおける励起光の集光点とピンホール２２とが光学的に非共役な位置関係となる。
【００５６】
本実施形態においては、蛍光の光軸Ｓにピンホール２２が一致した位置、部分的に一致している位置および完全に一致していない位置の３箇所で取得した蛍光強度に基づいて蛍光分布を生成し、生成された蛍光分布に基づいて非共役な位置として設定される最適なディスク２１の位置を設定することにより、焦点外蛍光を精度よく除去することができる。
【００５７】
これにより、光学的に共役な位置関係と光学的に非共役な位置関係とを時間的に交互に形成し、焦点蛍光を精度よく検出するための２種類の蛍光を同一の光検出器１２によって、順次検出することができる。また、ディスク２１を高速に回転させることにより、２つの位置関係をより高速に切り替えることができるという利点がある。
【００５８】
また、本実施形態においては、蛍光光束をピンホール２２に対して光軸Ｓに交差する方向に移動させる場合について例示したが、これに代えて、ピンホール２２を蛍光光束に対して移動させることにしてもよい。
また、図７に示されるように、レーザ光源２から試料Ａに入射される励起光の入射角度を異ならせることにより、非共役な位置関係を達成してもよい。その場合に、レーザ光源２とダイクロイックミラー９との間に配置された可動ミラー３０によって励起光の入射角度を変化させる場合に、試料Ａにおける集光点の位置がずれないように、スキャナ７を連動して動作させる必要がある。この場合、駆動制御部１４が可動ミラー３０を駆動させると、可動ミラー３０が揺動してレーザ光束をシフトさせるようになっている。符号３１は、レーザ光源２から可動ミラー３０への励起光の光路を形成するためのミラーである。
【００５９】
また、当てはめを行う分布モデルとしては、ガウス関数に限定されるものではなく、ローレンツ関数あるいはフォークト関数を用いてもよい。また、共役な位置関係となるシフト量ｘ１＝０、非共役な位置関係となるシフト量ｘ２，ｘ３の３点について蛍光強度を検出することとしたが、これに代えて、４点以上のシフト量において蛍光強度を検出して蛍光分布を生成することにしてもよい。これにより、分布モデルへの当てはめの精度を向上することができる。
【００６０】
また、試料Ａにおける１箇所において蛍光分布を取得してもよいし、２箇所以上において取得された蛍光強度を平均して蛍光分布を生成してもよい。
また、ｘ＝ｘ２，ｘ３について予め設定しておくこととしたが、その目安として、励起光のスポット径の理論的な大きさを表す単位であるエアリ（ＡＩＲＹ）を用いてもよい。
【００６１】
すなわち、対物レンズ８のＮＡおよび波長λによって定まる焦点サイズ（励起光のスポット径）およびピンホールサイズを１エアリとしたときに、シフト量ｘ２＝０．５エアリ、シフト量ｘ３＝５エアリのように設定しておくことにすればよい。このようにすることで、３点の蛍光分布によって精度よく、非共役な位置関係を最適化したシフト量を算出することができる。
【００６２】
また、本実施形態においては、設定モードにおけるシフト量の設定の際にも、顕微鏡本体４に備えられた光検出器１２を用いて検出された蛍光強度を用いることとした。これにより、顕微鏡本体４の基本構成に、新たなデバイスを追加することなく、蛍光分布を生成することができる。
【００６３】
これに代えて、図８に示されるように、試料Ａからの蛍光の一部を分岐するハーフミラー２４と、分岐された蛍光を、ピンホール１１と光学的に共役な位置において撮像するカメラ（蛍光分布取得部）２５のような２次元センサとを備えていてもよい。図中、符号２６は集光レンズである。
このようにすることで、カメラ２５によって２次元的な蛍光分布を一度に取得でき、設定モードにおける蛍光分布取得時に、蛍光光束あるいはピンホール１１のシフトが不要となるので短時間で処理することができるという利点がある。
【００６４】
また、本実施形態においては、蛍光光束とピンホール１１とを蛍光光束の光軸Ｓに交差する方向に相対的に移動させる場合について説明したが、これに代えて、図９に示されるように、蛍光光束とピンホール１１とを蛍光光束の光軸Ｓに沿う方向に相対的に移動させることにしてもよい。
【００６５】
すなわち、図９に示す例では、音響光学偏向器１９あるいは電気光学偏向器２０に代えて、音響光学レンズ２７を採用している。音響光学レンズ２７は、入力される電圧に応じて、屈折力を変化させるレンズであり、周波数発振器２８による周波数に同期して屈折力を切り替えることにより、結像レンズ１０による蛍光の結像位置をピンホール１１に一致する位置とピンホール１１から光軸方向にずれた位置とで切り替えることができる。
この場合においても、最適な非共役な位置関係が存在し、最適な位置関係に設定することで、焦点外蛍光を精度よく除去することができる。
【符号の説明】
【００６６】
１  顕微鏡
２  レーザ光源（光源）
３  切替部
７  スキャナ
８  対物レンズ（対物光学系）
１１  ピンホール（遮光部材）
１２  光検出器（検出器）
１６  設定部
１８  分布取得部（蛍光分布取得部）
２３  モータ（切替部）
２５  カメラ（２次元センサ、蛍光分布取得部）
Ａ  試料
【図１】
2017221356.tif 000003
【図２Ａ】
2017221356.tif 000004
【図２Ｂ】
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【図３】
2017221356.tif 000006
【図４Ａ】
2017221356.tif 000007
【図４Ｂ】
2017221356.tif 000008
【図５】
2017221356.tif 000009
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2017221356.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月20日(2018.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの励起光を走査するスキャナと、
該スキャナにより走査される前記励起光を試料に集光する一方、各走査位置で前記試料において発生した信号光を集光する対物光学系と、
該対物光学系により集光された前記信号光を検出する検出器と、
該検出器と前記対物光学系との間に配置され該対物光学系により集光された前記信号光を部分的に遮断する遮光部材と、
該遮光部材と前記試料における前記励起光の集光点との位置関係を、光学的に共役な位置関係と、光学的に非共役な位置関係とに時間的に切り替える切替部と、
前記集光点と光学的に共役な位置における蛍光分布を取得する蛍光分布取得部と、
該蛍光分布取得部により取得された前記蛍光分布に基づいて、前記切替部における前記非共役な位置関係を設定する設定部とを備え、
該設定部が、前記蛍光分布取得部により取得された前記蛍光分布を所定の分布モデルに当てはめて、焦点蛍光と焦点外蛍光とを分離する顕微鏡。
【請求項２】
前記設定部が、前記焦点蛍光が所定の閾値以下になりかつ前記集光点と光学的に共役な位置に最も近い位置関係を、前記切替部における非共役な位置関係として設定する請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記蛍光分布取得部が、前記試料における前記励起光の前記集光点と前記遮光部材との位置関係を変化させたときに、前記検出器により検出される前記信号光である蛍光の強度に基づいて前記蛍光分布を取得する請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記蛍光分布取得部が、前記遮光部材と前記試料における前記励起光の前記集光点との位置関係が共役な位置関係にあるとき、および異なる２点の非共役な位置関係にあるときに取得された蛍光の強度に基づいて前記蛍光分布を取得する請求項３に記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記蛍光分布取得部が、前記対物光学系と前記励起光の波長とにより決定される前記集光点における前記励起光のスポット径の理論的な大きさに基づいて、前記蛍光の強度を取得する前記遮光部材と前記試料における前記励起光の前記集光点との位置関係を設定する請求項３または請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記蛍光分布取得部が、前記試料における前記励起光の前記集光点と光学的に共役な位置に配置された２次元センサである請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記蛍光分布取得部が、複数点において前記蛍光分布を取得し、
前記設定部が、複数の前記蛍光分布の平均に基づいて前記切替部における前記非共役な位置関係を設定する請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明の一態様は、光源からの励起光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査される前記励起光を試料に集光する一方、各走査位置で前記試料において発生した信号光を集光する対物光学系と、該対物光学系により集光された前記信号光を検出する検出器と、該検出器と前記対物光学系との間に配置され該対物光学系により集光された前記信号光を部分的に遮断する遮光部材と、該遮光部材と前記試料における前記励起光の集光点との位置関係を、光学的に共役な位置関係と、光学的に非共役な位置関係とに時間的に切り替える切替部と、前記集光点と光学的に共役な位置における蛍光分布を取得する蛍光分布取得部と、該蛍光分布取得部により取得された前記蛍光分布に基づいて、前記切替部における前記非共役な位置関係を設定する設定部とを備え、該設定部が、前記蛍光分布取得部により取得された前記蛍光分布を所定の分布モデルに当てはめて、焦点蛍光と焦点外蛍光とを分離する顕微鏡である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
また、蛍光分布を所定の分布モデルに当てはめるだけで、焦点蛍光と焦点外蛍光とを簡易に分離することができ、適正な非共役な位置関係を設定することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
上記態様においては、前記設定部が、前記焦点蛍光が所定の閾値以下になりかつ前記集光点と光学的に共役な位置に最も近い位置関係を、前記切替部における非共役な位置関係として設定してもよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
共役な位置関係からずれればずれるほど、非共役の度合いが強くなって、取得される焦点蛍光はゼロに近づくが、取得される焦点外蛍光は、遮光部材と試料における集光点とが光学的に共役な位置関係である場合に検出器により検出される焦点外蛍光とは相違するものとなる。このようにすることで、遮光部材と試料における集光点とが光学的に共役な位置関係である場合に検出器により検出される焦点外蛍光に等しくかつ焦点蛍光が含まれていない蛍光を検出することができ、差分によって精度よく焦点外蛍光を除去した焦点蛍光を得ることができる。
【国際調査報告】
2017221356.tif 000015
2017221356.tif 000016