(57)【要約】  新規な移植片対宿主病の治療剤又は予防剤、ファイブロサイト浸潤抑制剤並びに涙液及び杯細胞の減少の抑制剤を提供する。  移植片対宿主病の治療又は予防方法は、フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩をそれを必要とする患者に投与することを含む。移植片対宿主病は、骨髄移植後の移植片対宿主病であることが好ましい。また、移植片対宿主病は、眼における移植片対宿主病であることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする、移植片対宿主病の治療又は予防剤。
【請求項２】
前記移植片対宿主病は、骨髄移植後の移植片対宿主病である、請求項１に記載の治療又は予防剤。
【請求項３】
前記移植片対宿主病は、眼における移植片対宿主病である、請求項１又は２に記載の治療又は予防剤。
【請求項４】
前記移植片対宿主病は、ドライアイである、請求項３に記載の治療又は予防剤。
【請求項５】
前記移植片対宿主病は、ファイブロサイト浸潤を伴う移植片対宿主病である、請求項１から４のいずれかに記載の治療又は予防剤。
【請求項６】
フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、請求項１から５のいずれかに記載の治療又は予防剤。
【請求項７】
フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする、ファイブロサイト浸潤抑制剤。
【請求項８】
フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、請求項７に記載のファイブロサイト浸潤抑制剤。
【請求項９】
フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする、杯細胞の減少の抑制剤。
【請求項１０】
フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、請求項９に記載の杯細胞の減少の抑制剤。
【請求項１１】
フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする、涙液減少抑制剤。
【請求項１２】
フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、請求項１１に記載の涙液減少抑制剤。
【請求項１３】
フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を投与することを含む、移植片対宿主病の治療又は予防方法。
【請求項１４】
前記移植片対宿主病は、骨髄移植後の移植片対宿主病である、請求項１３に記載の治療又は予防方法。
【請求項１５】
前記移植片対宿主病は、眼における移植片対宿主病である、請求項１３又は１４に記載の治療又は予防方法。
【請求項１６】
前記移植片対宿主病は、ドライアイである、請求項１５に記載の治療又は予防方法。
【請求項１７】
前記移植片対宿主病は、ファイブロサイト浸潤を伴う移植片対宿主病である、請求項１３から１６のいずれかに記載の治療又は予防方法。
【請求項１８】
フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、請求項１３から１７のいずれかに記載の治療又は予防方法。
【請求項１９】
フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を投与することを含む、ファイブロサイト浸潤抑制方法。
【請求項２０】
フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、請求項１９に記載のファイブロサイト浸潤抑制方法。
【請求項２１】
フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を投与することを含む、杯細胞の減少の抑制方法。
【請求項２２】
フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、請求項２１に記載の杯細胞の減少の抑制方法。
【請求項２３】
フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を投与することを含む、涙液減少抑制方法。
【請求項２４】
フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、請求項２３に記載の涙液減少抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植片対宿主病の治療剤又は予防剤、ファイブロサイト浸潤抑制剤及び涙液減少と杯細胞の減少の抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞の腫瘍化に伴う血液悪性疾患に対して、他者の健康な造血幹細胞を移植して、白血病を根治させる治療法として確立されている医療である造血幹細胞移植が行われる場合がある。他方、近年、ドナーから提供された骨髄細胞、末梢血又は臍帯血の移植片が、免疫応答によってレシピエントの標的臓器を攻撃することによって発症する移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＧＶＨＤ）が問題となっている。【０００３】
この移植片対宿主病の治療剤として、例えば、眼表面の治療としてレバミピドやジクアホソルが知られており、非特許文献１には、レバミピドとジクアホソルとを併用することで、移植片対宿主病の症状の一つであるドライアイを改善することが開示されている。【０００４】
特に、慢性移植片対宿主病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｃＧＶＨＤ）は造血幹細胞移植（骨髄移植）後の重大な合併症であり、一部の患者にとっては致死的であり得る。ｃＧＶＨＤは過去数十年にわたり集中的に研究されてきたが、ｃＧＶＨＤの有効な治療法の開発が遅れている。
ｃＧＶＨＤ患者は、多くの場合、シクロスポリン等の免疫抑制剤やステロイドで治療されているが、望ましい結果は得られ難い。それゆえ、臨床現場では、ｃＧＶＨＤを治療する有効な方法が切望されている。
例えば、非特許文献２には、ドナー免疫細胞及びレシピエント細胞における細胞老化がｃＧＶＨＤの発症プロセスに有害的に関与することが開示されている。【０００５】
一方、慢性炎症及び加齢性疾患の発症に有害な役割を果たす「小胞体ストレス」が知られている（例えば、非特許文献３、４）。
以下、図９及び１０を参照して小胞体ストレスについて概説する。
タンパク質が小胞体において合成される場合、タンパク質は適切にフォールディングされなければならず、小胞体シャペロンはタンパク質のフォールディングを助ける。
しかし、低酸素、カルシウムイオン欠乏、酸化的傷害、ウイルス感染及び炎症性サイトカインは、小胞体のタンパク質の正常なフォールディングを妨げる。【０００６】
図９に示したように、フォールディングされていないタンパク質及びミスフォールドされたタンパク質が小胞体に蓄積されると小胞体ストレスが起こり、結果的に３つの膜貫通タンパク質（イノシトール要求（ＩＲＥ）１α、ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）及び活性化転写因子（ＡＴＦ）６α）が活性化されて、フォールディングされていないタンパク質に対する応答（ＵＰＲ）が開始される。
しかし、ＵＰＲが長期化または失敗すると、炎症及びアポトーシス経路が活性化される（非特許文献５）。
その結果、図９及び１０に示したように、失敗したＵＰＲは、（１）炎症誘発性分子であるチオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）及び活性化Ｂ細胞の転写因子核因子κ軽鎖エンハンサー（ＮＦ−κＢ）、並びに（２）アポトーシスタンパク質Ｃ／ＥＢＰ相同タンパク質（ＣＨＯＰ）の発現を誘導することが知られている（非特許文献６〜８）。【０００７】
しかし、小胞体ストレスとＧＶＨＤ（特に、ｃＧＶＨＤ）との相関はこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｉｏ  Ｙａｍａｎｅ，  Ｙｏｋｏ  Ｏｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，  “Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  Ｒｅｂａｍｉｐｉｄｅ  ａｎｄ  Ｄｉｑｕａｆｏｓｏｌ  ｉｎ  Ｔｗｏ  Ｃａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｒｙ  Ｅｙｅ”  Ｏｐｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．  ９２，  Ｎｏ．  ４Ｓ，  Ａｐｒｉｌ  ２０１５
【非特許文献２】Ｋａｗａｉ  Ｍ，  Ｏｇａｗａ  Ｙ，  Ｓｈｉｍｍｕｒａ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｉｎｇ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｌａｃｒｉｍａｌ  ｇｌａｎｄ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．  ２０１３；３（２４４５）：１−６．
【非特許文献３】Ｂｒｏｗｎ  ＭＫ，  ＮｉｒｉｎｊｉｎｉＮａｉｄｏｏ．  Ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２０１２；３（２６３）：１−１０．
【非特許文献４】Ｇａｒｇ  ＡＤ，  Ｋａｃｚｍａｒｅｋ  Ａ，  Ｋｒｙｓｋｏ  Ｏ，  Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅ  Ｐ，  Ｋｒｙｓｋｏ  ＤＶ，  Ａｇｏｓｔｉｎｉｓ  Ｐ．  ＥＲ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：  ｄｏｅｓ  ｉｔ  ａｉｄ  ｏｒ  ｉｍｐｅｄｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ？  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ２０１２；１８：５８９−５９８．
【非特許文献５】Ｌｅｅ  ＡＳ．  Ｔｈｅ  ＥＲ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ＧＲＰ７８／ＢｉＰ  ａｓ  ａ  ｍｏｎｉｔｏｒ  ｏｆ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００５；３５：３７３−３８１．
【非特許文献６】Ａｎｔｈｏｎｙ  ＴＧ，  Ｗｅｋ  ＲＣ．  ＴＸＮＩＰ  Ｓｗｉｔｃｈｅｓ  Ｔｒａｃｋｓ  ｔｏｗａｒｄ  ａ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＵＰＲ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２０１２；１６：１３５−１３７．
【非特許文献７】Ｌｅｒｎｅｒ  ＡＧ，  Ｕｐｔｏｎ  ＪＰ，  Ｐｒａｖｅｅｎ  ＰＶＫ，  ｅｔ  ａｌ．  ＩＲＥ１ａ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  Ａｃｔｉｖａｔｅ  ｔｈｅ  ＮＬＲＰ３  Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ｕｎｄｅｒ  Ｉｒｒｅｍｅｄｉａｂｌｅ  ＥＲ  Ｓｔｒｅｓｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２０１２；１６：２５０−２６４．
【非特許文献８】Ｏｓｌｏｗｓｋｉ  ＣＭ，  Ｈａｒａ  Ｔ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＢＯＳ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  ＥＲ  Ｓｔｒｅｓｓ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２０１２；１６：２６５−２７３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、新規な移植片対宿主病の治療剤又は予防剤、ファイブロサイト浸潤抑制剤並びに涙液及び杯細胞の減少の抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、移植片対宿主病において、ファイブロサイト浸潤が涙腺に生じること、及びこのファイブロサイト浸潤をフェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩が抑制することを見出した。
更に、本発明者らは、（１）ｃＧＶＨＤに罹患した臓器が小胞体ストレスレベルの上昇を示すこと、（２）小胞体ストレスの緩和がｃＧＶＨＤ（特に、全身性ｃＧＶＨＤ）によって引き起こされる重篤な症状を緩和する強力な治療手段になり得るという新たな仮説を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。【００１１】
＜１＞フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする、移植片対宿主病の治療又は予防剤。
＜２＞前記移植片対宿主病は、骨髄移植後の移植片対宿主病である、＜１＞に記載の治療又は予防剤。
＜３＞前記移植片対宿主病は、眼における移植片対宿主病である、＜１＞又は＜２＞に記載の治療又は予防剤。
＜４＞前記移植片対宿主病は、ドライアイである、＜３＞に記載の治療又は予防剤。
＜５＞前記移植片対宿主病は、ファイブロサイト浸潤を伴う移植片対宿主病である、＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の治療又は予防剤。【００１２】
＜６＞フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の治療又は予防剤。
＜７＞フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする、ファイブロサイト浸潤抑制剤。
＜８＞フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、＜７＞に記載のファイブロサイト浸潤抑制剤。【００１３】
＜９＞フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする、杯細胞の減少の抑制剤。
＜１０＞フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、＜９＞に記載の杯細胞の減少の抑制剤。
＜１１＞フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする、涙液減少抑制剤。
＜１２＞フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、＜１１＞に記載の涙液減少抑制剤。【００１４】
本発明は以下の構成も好ましい。
（１）  フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を投与することを含む、移植片対宿主病の治療又は予防方法。【００１５】
（２）  前記移植片対宿主病は、骨髄移植後の移植片対宿主病である、（１）に記載の治療又は予防方法。【００１６】
（３）  前記移植片対宿主病は、眼における移植片対宿主病である、（１）又は（２）に記載の治療又は予防方法。【００１７】
（４）  前記移植片対宿主病は、ドライアイである、（３）に記載の治療又は予防方法。【００１８】
（５）  前記移植片対宿主病は、ファイブロサイト浸潤を伴う移植片対宿主病である、（１）から（４）のいずれかに記載の治療又は予防方法。【００１９】
（６）  フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、（１）から（５）のいずれかに記載の治療又は予防方法。【００２０】
（７）  フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を投与することを含む、ファイブロサイト浸潤抑制方法。【００２１】
（８）  フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、（７）に記載のファイブロサイト浸潤抑制方法。【００２２】
（９）  フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を投与することを含む、杯細胞の減少の抑制方法。【００２３】
（１０）  フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、（９）に記載の杯細胞の減少の抑制方法。【００２４】
（１１）  フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を投与することを含む、涙液減少抑制方法。【００２５】
（１２）  フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、（１１）に記載の涙液減少抑制方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、新規な移植片対宿主病の治療剤又は予防剤、ファイブロサイト浸潤抑制剤並びに涙液及び杯細胞の減少の抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ｃＧＶＨＤ罹患臓器における小胞体ストレスマーカーの上昇結果を示す図である。図１Ａは、ｃＧＶＨＤ罹患臓器及び対照被験体におけるＧＲＰ７８のｑＰＣＲ分析結果を示す図である。図１Ｂは、小胞体ストレスマーカー及び関連炎症マーカーのイムノブロット分析結果を示す図である。図１Ｃは、各タンパク質バンドに対応する定量分析結果を示す図である。図１Ｄは、ｃＧＶＨＤに罹患した涙腺及びその同系対照の涙腺における上皮細胞の電子顕微鏡写真を示す図である。
【図２】ＰＢＡ処理マウス群及びビヒクル処理マウス群の生存％及び体重変化を示す図である。
【図３−１】ＰＢＡによるｃＧＶＨＤに起因する小胞体ストレスの抑制結果を示す図であり、図３Ａは、イムノブロット分析による、ｃＧＶＨＤ標的臓器における小胞体ストレスマーカー及び関連炎症マーカーのタンパク質レベルの試験結果を示す図である。
【図３−２】ＰＢＡによるｃＧＶＨＤに起因する小胞体ストレスの抑制結果を示す図であり、図３Ｂは、ＰＢＡ処理臓器及びビヒクル処理臓器について、各臓器の標的タンパク質をデンシトメトリーによって定量した結果を示す図である。
【図４−１】ＰＢＡが小胞体ストレスを緩和することによりｃＧＶＨＤ誘発全身性炎症及び線維化の軽減結果を示す図であり、図４Ａは、ＰＢＡ処理臓器のＨＥ（ヘマトキシリン及びエオシン）染色写真と溶媒ビヒクル処理臓器のＨＥ染色写真である。図４Ｂは、ＰＢＡ処理組織及びビヒクル処理組織における一般的な白血球マーカーであるＣＤ４５の免疫染色結果を示す図である。図４Ｃは、ＰＢＡ処理臓器及びビヒクル処理臓器に対するマロリー染色結果を示す図である。
【図４−２】ＰＢＡが小胞体ストレスを緩和することによりｃＧＶＨＤ誘発全身性炎症及び線維化の軽減結果を示す図であり、図４Ｄは、ＰＢＡ処理した涙腺及び小腸並びにビヒクル処理した涙腺及び小腸の電子顕微鏡写真である。図４Ｅは、ＰＢＡ処理臓器及びビヒクル処理臓器におけるＣＤ４５陽性細胞の密度を示す図である。図４Ｆは、ＰＢＡ処理小腸及びＰＢＡ処理眼並びにビヒクル処理した小腸及び眼に対するＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ  ｓｔａｉｎ）染色結果を示す図である。図４Ｇは、ＰＢＡ処理小腸及びＰＢＡ処理眼並びにビヒクル処理した小腸及び眼における杯細胞の密度を示す図である。
【図５】ＰＢＡが小胞体ストレスを緩和することによる炎症及び線維化の各マーカーの低減結果を示す図である。図５Ａは、ＰＢＡ処理マウス及びビヒクル処理マウスから収集した血清中の炎症マーカーであるＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γを測定するために骨髄移植の２８日後にＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。図５Ｂは、線維化マーカーであるＣＴＧＦのイムノブロット分析を行った結果を示す図である。図５Ｃは、各臓器のＣＴＧＦをデンシトメトリーにより定量した結果（ＰＢＡ処理臓器及びビヒクル処理臓器）を示す図である。
【図６】小胞体ストレス緩和剤であるＰＢＡを用いた涙腺線維芽細胞におけるｃＧＶＨＤ誘発小胞体ストレスの緩和結果を示す図である。図６Ａは、マウスの涙腺線維芽細胞における小胞体ストレスマーカー、活性化マーカー及び線維化マーカーのイムノブロット分析の結果を示す図である。図６Ｂは、対応タンパク質バンドの定量分析（ＰＢＡ処理線維芽細胞及びビヒクル処理線維芽細胞）の結果を示す図である。図６Ｃは、ＥＬＩＳＡを用いて、ＰＢＡ処理線維芽細胞及びビヒクル処理線維芽細胞によって産生されたＭＣＰ−１のタンパク質レベルを測定した結果を示す図である。図６Ｄは、ＰＢＡ処理線維芽細胞及びビヒクル処理線維芽細胞におけるＩＬ−６及びＴＧＦ−βのｑＰＣＲ分析結果を示す図である。
【図７】ＰＢＡを用いたマクロファージにおけるｃＧＶＨＤに起因する小胞体ストレスの緩和結果を示す図である。図７Ａは、ＰＢＡ注入涙腺及びビヒクル注入涙腺の免疫蛍光画像を示す図である。図７Ｂは、ＰＢＡ投与マウス由来及びビヒクル投与マウス由来の培養脾臓マクロファージの免疫蛍光結果を示す図である。図７Ｃは、マウス脾臓マクロファージにおける小胞体ストレス各マーカーのイムノブロット分析結果を示す図である。図７Ｄは、各タンパク質バンドの対応する定量分析結果を示す図である。図７Ｅは、脾臓からのＭ１マクロファージ及びＭ２マクロファージの各マーカーのｑＰＣＲ分析結果を示す図である。
【図８】ｃＧＶＨＤと小胞体ストレスとの間の推定される相関を示す図である。
【図９】小胞体ストレスシグナル伝達経路の概要を示す図である。
【図１０】小胞体ストレスシグナル伝達経路の概要を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。なお、説明が重複する箇所については、適宜説明を省略する場合があるが、発明の要旨を限定するものではない。
【００２９】
＜移植片対宿主病の治療剤又は予防剤＞
本発明の移植片対宿主病の治療剤又は予防剤は、フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する。
【００３０】
（フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩）
本発明におけるフェニル酪酸は、以下の式で表される４−フェニル−ｎ−酪酸（以下、単に「ＰＢＡ」ともいう。）であることが好ましい。
【００３１】
【化１】
2017175808.tif 000002
【００３２】
本発明において、「ファイブロサイト浸潤」とは、ある組織中（例えば、涙腺）に、血中からファイブロサイトが浸潤することを意味する。また、「ファイブロサイト浸潤抑制」とは、結果として、組織中にファイブロサイトが浸潤する状態となることを抑制することを意味する。
また、ファイブロサイトは、線維芽細胞（フィブロブラスト）と同一であると当業者に認識されている（Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ＆Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ２０１１  Ｍａｙ；４（３）３１８−３３３（特に３２５頁））。
【００３３】
本発明におけるフェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩は、公知の方法により、準備可能である。例えば、以下のような方法により、フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を準備することができる。
【００３４】
本発明にかかるフェニル酪酸（例えば、４−Ｐｈｅｎｙｌ−ｎ−ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＡＳ登録番号：１８２１−１２−１））は、試薬・工業原料等として入手することもできるし、常法に従って合成することもできる。
【００３５】
本発明にかかるフェニル酪酸の薬理学的に許容される塩とは、カルボキシ基と塩を形成できるものであれば限定されないが、具体的には例えばアルカリ金属、アルカリ土類金属、アミン、塩基性アミノ酸などの塩を挙げることができ、特に、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩がより好ましい。
【００３６】
また本発明のフェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩は、投与後生体内（表面）で容易に加水分解されるエステル・エーテル等の誘導体（いわゆるプロドラッグ）の形態であってもよい。なお本発明のフェニル酪酸として、３−フェニル−ｎ−酪酸（ＣＡＳ登録番号：４５９３−９０−２）、２−フェニル−ｎ−酪酸（ＣＡＳ登録番号：９０−２７−７）、２−フェニルイソ酪酸（ＣＡＳ登録番号：８２６−５５−１）、３−フェニルイソ酪酸（ＣＡＳ登録番号：７７−８３−８）など他の構造異性体も含まれることは言うまでもない。
【００３７】
（移植片対宿主病）
本発明における移植片対宿主病の種類としては、特に限定されず、例えば、その症状が眼、口腔、肝臓、消化管、皮膚、肺等の外分泌腺を備える器官において発現するものが挙げられる。これらのうち、本発明の治療剤又は予防剤は、眼における移植片対宿主病に用いることが好ましい。
【００３８】
眼における移植片対宿主病としては、特に限定されないが、例えば、ドライアイ、乾性結膜炎、角膜損傷等、ドライアイに伴う結膜線維化が挙げられる。これらのうち、特に治療又は予防効果に優れることから、治療又は予防対象である眼における移植片対宿主病の疾患は、ドライアイであることが好ましい。
【００３９】
口腔における移植片対宿主病としては、特に限定されないが、例えば、口腔乾燥症、皮膚硬化による開口障害等が挙げられる。
【００４０】
肝臓における移植片対宿主病としては、特に限定されないが、例えば、急性肝炎等が挙げられる。
【００４１】
消化管における移植片対宿主病としては、特に限定されないが、例えば、下痢、食欲不振、嘔吐、上部消化管狭窄や腸梗塞（閉塞）等が挙げられる。
【００４２】
皮膚における移植片対宿主病としては、特に限定されないが、例えば、皮膚乾燥症、強皮症等が挙げられる。
【００４３】
肺における移植片対宿主病としては、特に限定されないが、例えば、間質性肺炎、閉塞性肺炎等が挙げられる。
【００４４】
移植片対宿主病の原因となる移植される臓器としては、特に限定されず、例えば、骨髄、血液（輸血）等が挙げられる。移植片対宿主病は、特に、骨髄移植後に、骨髄由来の造血幹細胞が、移植片対宿主病の原因であるファイブロサイトに分化して、血中を経由して、外分泌腺の組織に浸潤する可能性が指摘されている。しかしながら、本発明の治療剤又は予防剤は、ファイブロサイト浸潤の抑制効果に優れることから、このような骨髄移植後の移植片対宿主病に対して、特に優れた治療又は予防効果を発揮する。このことから、本発明の治療剤又は予防剤の対象の移植片対宿主病は、骨髄移植後の移植片対宿主病であることが好ましい。
【００４５】
移植片対宿主病は、慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）であってもよく、急性移植片対宿主病（ａｃｕｔｅ  ＧＶＨＤ：ａＧＶＨＤ）であってもよい。なお、通常、慢性移植片対宿主病とは、移植後、一定期間経過後に発症する移植片対宿主病のことを指し、例えば、古典的な分類では移植後、１００日以降に発症する移植片対宿主病を指す。急性移植片対宿主病とは、移植後、一定期間内（慢性移植片対宿主病が発症するまでの期間より短い期間内）に発症する移植片対宿主病を指し、例えば、移植後、古典的には１００日以内に発症する移植片対宿主病を指す。現在の分類では時期による分類はなされておらず急性、慢性に典型的で特徴的所見により両者の区別がなされている。本発明の移植片対宿主病の治療剤又は予防剤は、特に、慢性移植片対宿主病に好適に用いることができる。その理由は、線維化抑制に有効であるためと推測される。
【００４６】
本発明の治療剤又は予防剤は、軽度、中度、又は重度のいずれの移植片対宿主病にも適用可能であるが、特に、重度の移植片対宿主病の治療又は予防に好適に用いることができる。その理由は、重症例のドライアイでは線維化が著明であるからである。なお、重度の移植片対宿主病とは、通常、涙液分泌の細胞源となる涙腺細胞、角結膜ムチンの分泌上皮細胞、マイボーム腺細胞が重度の障害された眼移植片対宿主病のことを指す。
【００４７】
上述のとおり、本発明におけるフェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩は、ファイブロサイト浸潤を特に抑制できる。このことから、本発明における移植片対宿主病は、ファイブロサイト浸潤を伴うものであることが特に好ましい。
【００４８】
（剤形）
本発明の治療剤又は予防剤の剤形は、特に限定されず、移植片対宿主病の症状が発現する器官に応じて、適宜設定することができるが、例えば、軟膏剤、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤等の注射剤、坐剤、腫瘍内直接投与剤等に製剤化し、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供されてよい。特に、本発明の治療剤又は予防剤を、眼における移植片対宿主病の治療剤又は予防剤として用いる場合、点眼剤、結膜下注射剤、軟膏剤として用いることが好ましい。
【００４９】
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜用い、常法により製造することができる。
【００５０】
本発明の治療剤又は予防剤は、上記製剤化を目的として、フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩以外の成分を有してもよいが、有さなくてもよい。より具体的な、本発明の治療剤又は予防剤に含んでもよい成分の例示としては、例えば、メチルセルロース等が挙げられる。
【００５１】
（投与方法）
本発明の治療剤又は予防剤の投与方法は、特に限定されず、症状が発現した器官に応じて適宜選択することができるが、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により、投与が可能である。特に、眼における移植片対宿主病の場合、点眼、結膜下注射による投与が可能である。
本発明の治療剤又は予防剤は、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。その投与量は、年齢、投与経路、投与回数により異なり、当業者であれば適宜選択できる。
投与量としては特に制限はないが、一般的には、経口または経静脈投与の場合、一回につき体重１ｋｇあたりフェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩が０．１μｇ〜１０ｍｇ程度の範囲である。
また点眼剤の場合は、一回につき１〜数滴を一日に１〜数回投与するが、症状により適宜増減することができる。
さらに眼軟膏の場合は、一日に１〜数回、適量を塗布する。
【００５２】
＜スクリーニング方法＞
本発明は、移植片対宿主病の治療剤又は予防剤の候補物質のスクリーニング方法であって、被験物質を、ヒトを除く、移植片対宿主病のモデル動物に投与する工程と、被験物質が投与された前記モデル動物におけるファイブロサイト浸潤の抑制の程度又は小胞体ストレスの抑制の程度を測定する工程と、測定結果に基づいて、移植片対宿主病の治療剤又は予防剤の候補物質として被験物質を選択する工程と、を有するスクリーニング方法、あるいは炎症性サイトカインで刺激されたファイブロブラストの、摘出あるいは培養涙腺組織への浸潤に対する被験物質の抑制効果を評価する工程を有するスクリーニング方法などを包含する。
【００５３】
（投与工程）
本発明における投与工程は、被験物質を、ヒトを除く、移植片対宿主病のモデル動物に投与する工程である。
【００５４】
被験物質は、特に限定されず、天然又は合成の有機又は無機の低分子又は高分子物質等の任意の物質であってよい。
【００５５】
ヒトを除く、移植片対宿主病のモデル動物の種類は、特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ等の哺乳動物等を使用することができる。
【００５６】
移植片対宿主病のモデル動物は、例えば、マウスの移植片対宿主病のモデル動物を作製する場合、雄のＢ１０．Ｄ２（Ｈ―２ｄ）マウスの骨髄を、雌のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ―２ｄ）マウスに移植することにより、作製することができる。
また、移植片対宿主病の上記モデルマウスで観察される過度の炎症及び線維化は、ヒトで観察される炎症及び線維化に非常に類似している。更に、上記モデルマウスにおいて全身性炎症及び線維化が観察されている（Ｙａｇｕｃｈｉ  Ｓ，  Ｏｇａｗａ  Ｙ，  Ｓｈｉｍｍｕｒａ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  Ｔｙｐｅ  １  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  Ｌａｃｒｉｍａｌ  Ｇｌａｎｄ，  Ｌｕｎｇ，  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ａ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１３；８：１−１１．；Ｏｇａｗａ  Ｙ，  Ｍｏｒｉｋａｗａ  Ｓ，  Ｏｋａｎｏ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  ＭＨＣ−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ／ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｈｏｓｔ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．  ｅＬｉｆｅ．  ２０１６；５：ｅ０９３９４．）。
【００５７】
投与方法は、特に限定されず、例えば、目的とする、症状が発現する器官に応じて適宜選択することができるが、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等の方法で投与してもよい。また、目的とする、症状が発現する器官が、眼である場合、結膜下注射、点眼により投与してもよい。
【００５８】
（測定工程）
本発明における測定工程は、被験物質が投与された移植片対宿主病のモデル動物におけるファイブロサイト浸潤の抑制の程度を測定する工程である。
【００５９】
測定方法は、特に限定されず、従来の公知の方法を使用することができ、例えば、被験物質の投与後のヒトを除く移植片対宿主病のモデル動物から、対象となる組織（涙腺等の外分泌腺の組織）を摘出し、ファイブロサイトのマーカー（例えば、ＣＤ４５、コラーゲン・タイプＩ、ＣＸＣＲ４等）又は小胞体ストレスのマーカー（例えば、ＧＲＰ７８、ＣＨＯＰ、ｐ−ＰＥＲＫ、ｐ−ｅＩＦ２α、ｐ−ＩＲＥ１α等）を免疫染色等の方法で検出し、ファイブロサイト浸潤の程度（例えば、検出された面積）又は小胞体ストレスの抑制の程度を測定することで、ファイブロサイト浸潤の抑制又は小胞体ストレスの抑制の程度の程度を測定することができる。この測定結果に基づいて、後述の選択工程において、候補物質を選択することができる。
【００６０】
本発明における測定工程は、ファイブロサイト浸潤の抑制の程度又は小胞体ストレスの抑制の程度以外のものを測定してもよく、測定しなくてもよい。そのような測定してもよい対象としては、例えば、粘膜における杯細胞の数、組織中の炎症の程度、マーカーとなる遺伝子（例えば、繊維化のマーカーとなる遺伝子（例えば、前線維化メディエーター結合組織成長因子（ＣＴＧＦ））、炎症性のマーカーとなる遺伝子（例えば、ＮＦ−κＢ、ＴＸＮＩＰ、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ等）のｍＲＮＡの発現量等が挙げられる。これらの測定結果を、ファイブロサイト浸潤の抑制の程度の測定結果と組み合わせて、後述の選択工程において、被験物質を移植片対宿主病の治療剤又は予防剤の候補物質として選択してもよい。
なお、ＣＴＧＦは線維化のマーカーとなることが知られている（Ｄｚｉａｄｚｉｏ  Ｍ，  Ｕｓｉｎｇｅｒ  Ｗ，  Ｌｅａｓｋ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ．  ＱＪＭ：  Ａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２００５；９８：４８５−４９２．）。
【００６１】
（選択工程）
選択工程は、上記測定結果に基づいて、移植片対宿主病の治療剤又は予防剤の候補物質として被験物質を選択する工程である。
【００６２】
選択方法は、特に限定されず、従来公知の選択方法により候補物質を選択すればよい。例えば、ヒトを除く移植片対宿主病のモデル動物の被験物質の投与前の組織中のファイブロサイト浸潤の程度と比較して、被験物質がファイブロサイト浸潤を抑制したという結果に基づいて、被験物質を候補物質として選択してもよい。また、あらかじめ測定した他の物質（例えば、フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩）を、ヒトを除く移植片対宿主病のモデル動物に投与したときの測定結果と比較して、被験物質を候補物質として選択してもよい（例えば、移植片対宿主病の治療効果を有するフェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を、ヒトを除く移植片対宿主病のモデル動物に投与したときの測定結果と比較して、同様の測定結果である場合、その被験物質を候補物質として選択することができる）。
【００６３】
上記の測定工程において、ファイブロサイト浸潤の抑制の程度以外のもの（粘膜における杯細胞の数、組織中の炎症の程度、マーカーとなる遺伝子のｍＲＮＡの発現量等）を測定した場合、これらの測定結果を、ファイブロサイト浸潤の抑制の程度の測定結果と組み合わせて、被験物質を移植片対宿主病の治療剤又は予防剤の候補物質として選択してもよい。例えば、ファイブロサイト浸潤の抑制効果が示された被験物質について、該被験物質のモデル動物への投与後に更に、粘膜における杯細胞の数、組織中の炎症の程度、もしくはマーカーとなる遺伝子のｍＲＮＡの発現量、又はこれらのうち２つ以上を測定して、それぞれの効果（つまり、粘膜における杯細胞の数の減少の抑制効果、組織中の炎症の抑制効果、マーカーとなる遺伝子のｍＲＮＡの発現量の減少もしくは促進効果、又はこれらのうち２つ以上の効果）があることを確認してから、該被験物質を移植片対宿主病の治療剤又は予防剤の候補物質として選択してもよい。
【００６４】
（その他の工程）
本発明のスクリーニング方法は、上記で述べた工程以外の工程を有してもよく、有さなくてもよい。本発明のスクリーニング方法が、有してもよい工程としては、特に限定されないが、例えば、移植片対宿主病の治療剤又は予防剤の候補物質として選択した被験物質を、ヒトを除く移植片対宿主病のモデル動物に投与して、その治療又は予防効果を確認する工程が挙げられる。
【００６５】
＜ファイブロサイト浸潤抑制剤＞
本発明は、フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、ファイブロサイト浸潤抑制剤を包含する。
【００６６】
本発明のファイブロサイト浸潤抑制剤は、上記の移植片対宿主病の治療剤又は予防剤と同様のもの（同様のフェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩、同様の剤型、同様の投与方法、同様の成分等）を用いることができる。
【００６７】
＜杯細胞の減少の抑制剤＞
本発明は、フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、杯細胞の減少の抑制剤を包含する。杯細胞の種類は、結膜杯細胞であることが好ましい。
【００６８】
本発明の杯細胞の減少の抑制剤は、上記の移植片対宿主病の治療剤又は予防剤と同様のもの（同様のフェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩、同様の剤型、同様の投与方法、同様の成分等）を用いることができる。
【００６９】
＜涙液減少抑制剤＞
本発明は、フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、涙液減少抑制剤を包含する。
【００７０】
本発明において、「涙液減少」とは、例えば、上述した移植片対宿主病（例えば、ドライアイ）による症状としての涙液減少のことを指す。
【００７１】
本発明の涙液減少抑制剤は、上記の移植片対宿主病の治療剤又は予防剤と同様のもの（同様のフェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩、同様の剤型、同様の投与方法、同様の成分等）を用いることができる。
【００７２】
＜移植片対宿主病の治療又は予防方法＞
本発明は、フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩をそれを必要とする患者に投与することを含む、移植片対宿主病の治療又は予防方法を包含する。本発明の方法において、上述の移植片対宿主病の治療又は予防剤と同様のもの（同様のフェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩、同様の剤型、同様の投与方法、同様の成分等）を用いることができる。
【００７３】
＜ファイブロサイト浸潤抑制方法＞
本発明は、フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩をそれを必要とする患者に投与することを含む、ファイブロサイト浸潤抑制方法を包含する。上述の本発明の方法において、ファイブロサイト浸潤抑制剤と同様のもの（同様のフェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩、同様の剤型、同様の投与方法、同様の成分等）を用いることができる。
【００７４】
＜杯細胞の減少の抑制方法＞
本発明は、フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩をそれを必要とする患者に投与することを含む、杯細胞の減少の抑制方法を包含する。上述の本発明の方法において、杯細胞の減少の抑制剤と同様のもの（同様のフェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩、同様の剤型、同様の投与方法、同様の成分等）を用いることができる。
【００７５】
＜涙液減少抑制方法＞
本発明は、フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩をそれを必要とする患者に投与することを含む、涙液減少抑制方法を包含する。上述の本発明の方法において、涙液減少抑制剤と同様のもの（同様のフェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩、同様の剤型、同様の投与方法、同様の成分等）を用いることができる。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明の実施例を記載する。なお、本発明は以下の実施例の記載に限定されるものではない。【００７７】
＜方法＞
（骨髄移植）
８週齢のＢ１０．Ｄ２マウス及びＢＡＬＢ／ｃマウスは三共研究所（東京、日本）から購入した。
骨髄移植をｃＧＶＨＤのマウスモデルに行った（Ｚｈａｎｇ  Ｙ，  ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ＬＬ，  Ｄｅｓａｉ  ＳＲ，  Ｗｕ  Ｃ，  Ｇｉｌｌｉａｍ  ＡＣ．  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａｔｏｕｓ  Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ：  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ，  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２００２；１６８：３０８８−３０９８．）。
ドナーがＢ１０．Ｄ２マウスであり、レシピエントがＢＡＬＢ／ｃマウスであった場合、それは同種異系骨髄移植となり、ｃＧＶＨＤのマウスモデルを発現した。
対照的に、ＢＡＬＢ／ｃマウスからＢＡＬＢ／ｃマウスへの骨髄移植は同系骨髄移植であり、ｃＧＶＨＤは移植レシピエントには起こらなかった。
ｃＧＶＨＤを発現しないレシピエントマウスを対照（コントロール）とした。
レシピエントに骨髄移植の前に７００ｃＧｙを照射し、Ｇａｍｍａｃｅｌ  １３７  Ｃｓ線源（日立メディコ社製）を用いて致死照射を行った。ドナーからの１×１０６個の骨髄細胞及び２×１０６個の脾臓細胞を含有する懸濁液を尾静脈を介して各レシピエントマウスに投与した。
ドナー細胞をＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ社製）に懸濁した。【００７８】
（同種異系骨髄移植レシピエントマウスのＰＢＡによる治療）
上記（骨髄移植）に記載のように骨髄移植を実施し、同種異系骨髄移植レシピエントマウスを２群に分けた。
一方の群はＰＢＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で腹腔内注射により処理し、他方は腹腔内注射により溶媒ビヒクル・リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）処理した。
骨髄移植後１０日目から２７日目まで、同種異系骨髄移植レシピエントにＰＢＡ又は溶媒ビヒクルを１日１回投与した。
骨髄移植後２８日目にサクリファイした。
本願明細書において、ｃＧＶＨＤ罹患臓器（眼窩外涙腺、小腸の近位部、背側皮膚、肝臓、唾液腺、肺、大腸及び眼）を分析した。【００７９】
（組織学的分析及び免疫組織化学）
骨髄移植の３又は４週間後、眼窩外涙腺、小腸の近位部、背側皮膚、肝臓、唾液腺、肺、大腸及び眼を移植レシピエントから採取した。
その後、これらの試料を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。
パラフィンブロックを７μｍ厚の切片に切断し、
（１）ヘマトキシリン及びエオシン、
（２）マロリー３色染色（Ｈｏｐｗｏｏｄ  Ｊ．  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｉｘｔａｔｉｖｅ．  Ｉｎ：  Ｂａｎｃｒｏｆｔ  ＪＤ，  Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ａ，  ｅｄｓ．  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４ｔｈ  ｅｄ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ：  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ−Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  １９９６：２３−４６．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｇ，  Ｇｏｒｄｏｎ  Ｋ．  Ｔｉｓｓｕｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，  ｍｉｃｒｏｔｏｍｙ  ａｎｄ  ｐａｒａｆｆｉｎ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ．  Ｉｎ：  Ｂａｎｃｒｏｆｔ  ＪＤ，  Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ａ，  ｅｄｓ．  Ｔ．  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４ｔｈ  ｅｄ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ：  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ−Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ．  １９９６：４７−６８．）及び
（３）抗体で染色した。【００８０】
免疫組織化学的アッセイのために、まず、パラフィンを除去し、続いて以下の２つの抗原回収法のいずれかを用いて抗原を回収した。
（Ａ）ＣＤ４５抗体（３０−Ｆ１１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で切片を染色するために、それらを抗原回収溶液（Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；  Ｄａｋｏ社製）に浸し、次いで電子レンジオーブンで１０分間沸騰した。
（Ｂ）ＣＤ６８（ＦＡ−１１、Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）及びＣＨＯＰ（Ｆ−１６８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）の多重染色の場合、切片を抗原回収溶液（ＨｉｓｔｏＶＴ  Ｏｎｅ；ナカライテスク社製）を用いて洗浄し、続いて９０℃で４０分間水浴で加熱した。次に、切片を１０％正常ヤギ血清でブロックし、組織切片中の抗原と一次抗体との間の反応を４℃で一晩行った。
次いで、切片を室温（例えば、１〜３０℃）４５分間フルオロフォア標識した二次抗体で処理し、退色防止用マウントメディウム（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ；Ｄａｋｏ社製）でマウントした。【００８１】
蛍光画像をＬＳＭ共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）で撮影した。
ＣＤ４５＋細胞の計数に関しては、各組織切片の５つの領域を２００倍の倍率で無作為に撮影し、続いて個々の画像におけるＣＤ４５＋細胞の数を決定した。
二次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）及びヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８コンジュゲート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を使用した。
アイソタイプコントロールに関して、ラットＩｇＧ２ｂ、κ（ｅＢ１４９／１０Ｈ５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ラットＩｇＧ２ａ（５４４４７、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）をＣＤ４５、ＣＤ６８及びＣＨＯＰのためにそれぞれ使用した。【００８２】
（マウス涙腺由来線維芽細胞の培養）
マウス涙腺に由来する線維芽細胞を、Ｙａｇｕｃｈｉらによって報告された確立された方法を用いて培養した（Ｙａｇｕｃｈｉ  Ｓ，  Ｏｇａｗａ  Ｙ，  Ｓｈｉｍｍｕｒａ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｎｉｎ&#8211;Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌａｃｒｉｍａｌ  Ｇｌａｎｄ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１２；５３：５４１６−５４２５）。
マウス涙腺を採取し、続いて小片に切断した。組織断片を５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ社製）及び５％の抗生物質を含むＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ社製）中３７℃でインキュベートした。
抗生物質は、硫酸ストレプトマイシン（明治製菓ファーマ社製）とベンジルペニシリンカリウム（明治製菓社製）の１：１混合物を用いた。
線維芽細胞は、３〜４日後に細かく切ったものから増殖を開始した。
線維芽細胞を、５％のＦＢＳ及び５％の抗生物質を含むＤＭＥＭ中で培養し、３〜５継代後に実験に使用した。トリプシン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を使用して、線維芽細胞を培養皿から分離した。【００８３】
（脾臓マクロファージの培養）
Ａｌａｔｅｒｙ及びＢｅｓｔａの方法に準じてマウス脾臓マクロファージを培養した（Ａｌａｔｅｒｙ  Ａ，  Ｂａｓｔａ  Ｓ．  Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｌａｒｇｅ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ  ｍｏｕｓｅ  ｓｐｌｅｎｉｃ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００８；３３８：４７−５７）。
５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中に懸濁した脾細胞を培養皿に播種し、３７℃で一晩放置した。次いで、浮遊細胞を除去した。皿に付着した所望の細胞を、組換えマウスＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、５％ＦＢＳ及び５％抗生物質を含むＲＰＭＩ中で７日間培養した。誘導されたマクロファージは、その後、アキュターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を利用して培養皿から分離し、実験に使用した。【００８４】
（培養マクロファージの免疫染色）
誘導したマクロファージを８ウェルチャンバースライド（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｌｉｄｅ；Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に入れ、１０％中性緩衝化ホルマリンで固定した。次いで、０．３％過酸化水素を含有するメタノールで室温で３０分間ブロックし、一次抗体ＣＤ６８（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）及びＣＨＯＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、切片を、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８コンジュゲート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）及び４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて室温で４５分間処理し、退色防止用のマウント媒体（Ｄａｋｏ社製）でマウントした。
蛍光画像をＬＳＭ共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）で撮影した。【００８５】
（電子顕微鏡）
透過電子顕微鏡分析は標準的なプロトコールに従って行った。
マウス涙腺及び小腸から組織を採取し、直ちに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中２．５％グルタルアルデヒドで４℃４時間固定し、０．１Ｍリン酸緩衝液で３回洗浄した。続いて試料を２％オスミウム四酸化物で再び固定し、段階的な一連のエタノール及び１００％プロピレンオキシド中で脱水し、エポキシ樹脂に包埋した。処理した組織から１μｍの切片を作製し、次いでメチレンブルーで染色した。厚い切片を顕微鏡で観察し、超薄切片の調製に適した部分を見いだした。得られた切片をメッシュグリッド上に置き、ウラニルアセテート及びクエン酸鉛で染色し、電子顕微鏡（１２３０  ＥＸＩＩ；ＪＯＥＬ社製）で調べた。全ての電子顕微鏡写真は、バイオスキャンカメラ（ガタンバイオスキャンカメラモデル７９２）を用いて取得した。【００８６】
（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）
ｍｉＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、眼窩外涙腺、小腸近位部分、背側皮膚、肝臓、培養線維芽細胞及び培養マクロファージから全ＲＮＡを抽出し、Ｒｅｖｅｒ  Ｔｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴキット（東洋紡績社製）を用いて対応する相補的ＤＮＡを合成した。
ＴａｑＭａｎリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用による下記遺伝子のｍＲＮＡ発現を分析するために使用されるプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製から購入した。
ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド３−リン酸（ＧＡＰＤＨ）、グルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、マクロファージ化学誘引物質タンパク質−１（ＭＣＰ−１）及び転写増殖因子−β（ＴＧＦ）。
Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲを行い、得られたデータを解析するために２−ΔΔＣＴ法を用い、ｍＲＮＡの発現を測定するための内部標準としてＧＡＰＤＨを用いた。【００８７】
（イムノブロッティング分析）
目的の組織をエッペンドルフチューブに入れ、予め冷却したＲＩＰＡ緩衝液をチューブに添加した。次いで、組織を電気ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。
各サンプルを氷上で１時間放置した後、１５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。その後、上清を氷上で新鮮なチューブに回収し、細胞溶解物として使用した。等量の５×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を各細胞溶解物に添加し、続いて１００℃で５分間タンパク質変性させた。【００８８】
各サンプルからの同量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェルに充填し、次いで溶解した。タンパク質をゲルから１５Ｖで２０分間膜にトランスファーした。
膜を１×ＴＢＳＴ（トリス緩衝食塩水及びＴｗｅｅｎ２０の混合物）中の５％スキムミルク又は５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で室温１時間ブロックした。
次いで、膜を一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。上記一次抗体は、１×ＴＢＳＴ中の５％スキムミルク又は５％ＢＳＡで１０００倍に希釈した。一次抗体とインキュベーション後、膜を１×ＴＢＳＴ（３×１０分）で洗浄し、室温で１時間二次抗体に供し、次いで１×ＴＢＳＴ（３×１０分）及び１×ＴＢＳ（２×１０分）で洗浄した。【００８９】
関心対象のタンパク質は、以下の２つの方法のいずれかを用いて視覚化した。
（１）ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、標的タンパク質の比色検出を行った。
（２）シグナルは、増強化学発光（ＥＣＬ）検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて現像し、その後、標的タンパク質をＬＡＳ４０００ミニ化学発光イメージングシステム（富士フイルム／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で視覚化した。【００９０】
得られたタンパク質バンドの濃度測定分析は、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて行った。この実験で用いた一次抗体は、ＧＲＰ７８（Ａｂｃａｍ社製）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＥＲＫ（Ｔｈｒ９８０；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ＰＥＲＫ（Ｃ３３Ｅ１０；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＩＲＥ１α（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｅｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＩＲＥ１α（１４Ｃ１０；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｅＩＦ２α（１１９Ａ１１；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ｅＩＦ２α（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ＣＨＯＰ（９Ｃ８；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＴＸＮＩＰ（Ｄ５Ｆ３Ｅ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ＮＦ−κＢ（Ａｂｃａｍ社製）、ＨＳＰ４７（ＳＰＡ−４７０；Ｓｔｒｅｓｓ  Ｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＣＴＧＦ（Ａｂｃａｍ社製）及びβ−アクチン（ＡＣ−１５；Ａｂｃａｍ社製）を用いた。【００９１】
二次抗体は、（１）タンパク質バンドを発色させて可視化した場合、ＡＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）又はＡＰ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のいずれかを用い、（２）標的タンパク質をＥＣＬで検出するためには、ＨＲＰ結合抗マウス抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）又はＨＲＰ結合抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。【００９２】
（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））
血液をＰＢＡ処理マウス及びビヒクル処理マウスから採取し、続いて４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
得られた血清中のＭＣＰ−１レベル、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）レベル及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）レベルを、ＥＬＩＳＡセット（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて測定した。
これらのアッセイは、製造者Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社によって提供されたプロトコールに従って行われた。【００９３】
（統計分析）
統計的有意性は、マンホイットニーＵ検定（対応のない２群の差の検討）の使用によって決定した。差は、Ｐ＜０．０５の場合に有意であると考えられる。取得されたデータは、平均値±ＳＤ（標準偏差）として示した。【００９４】
＜結果＞
［ｃＧＶＨＤに罹患した臓器における小胞体ストレスマーカーの上昇］
小胞体ストレスマーカーを測定することにより、ｃＧＶＨＤ罹患臓器において小胞体ストレスが上昇するか否かを調査した。
まず、ｃＧＶＨＤ罹患臓器及び対照被験体におけるＧＲＰ７８のｑＰＣＲ分析を行った。結果を図１Ａに示す。
図１Ａ中、データは、平均値±ＳＤ、対照：ｎ＝５、ｃＧＶＨＤ：ｎ＝４〜５、＊Ｐ＜０．０５として示す。【００９５】
小胞体ストレスマーカー及び関連炎症マーカーのイムノブロット分析を行った。結果を図１Ｂに示す。
図１Ｂ中、レーン１、３、５、７は、同系対照被験体であり、レーン２、４、６、８はｃＧＶＨＤ罹患臓器である。【００９６】
各タンパク質バンドに対応する定量分析を行った。結果を図１Ｃに示す。
図１Ｃ中、データは、平均±ＳＤ、対照：ｎ＝４、ｃＧＶＨＤ：ｎ＝４、＊Ｐ＜０．０５として示す。【００９７】
図１Ａ〜Ｃに示した結果から明らかなように、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）及びイムノブロット分析から、
（１）小胞体ストレスマーカーであるＧＲＰ７８、ＣＨＯＰ、ｐ−ＰＥＲＫ、ｐ−ｅＩＦ２α及びｐ−ＩＲＥ１αが、ｃＧＶＨＤに罹患したマウス臓器において、コントロール（対照）被検体に比べて増加したことが分かり、
（２）それに応じて、２つの炎症マーカーＮＦ−κＢ及びＴＸＮＩＰが、ｃＧＶＨＤ罹患臓器において活性化及び／又は増加したことが分かる。【００９８】
図１Ｄは、ｃＧＶＨＤに罹患した涙腺及びその同系対照の涙腺における上皮細胞の電子顕微鏡写真を示す図である。写真は２０００倍の倍率で撮影し、スケールバーは５μｍを表す。ｃＧＶＨＤに罹患した涙腺上皮写真において、＊は、タンパク質の蓄積のために小胞体が肥大した箇所を示す。
図１Ｄに示した電子顕微鏡写真から明らかなように、ｃＧＶＨＤ罹患涙腺上皮において、ミスフォールドした／フォールディングしていないタンパク質の蓄積が、小胞体を肥大させた（図１Ｄ中＊）。
逆に、コントロール（対照）中の小胞体は無傷のようであった。
これら知見から、ｃＧＶＨＤに罹患した臓器において小胞体ストレスが上昇することが分かった。【００９９】
［小胞体ストレス誘導性炎症経路のＰＢＡによる失活］
次に、ＰＢＡによる小胞体ストレスの低減を介してｃＧＶＨＤの治療を試験した。
上記＜方法＞に示すように、同種異系骨髄移植を受けたマウスをＰＢＡ又は溶媒ビヒクルで処理した。
図２は、ＰＢＡ処理マウス群及びビヒクル処理マウス群の生存％（図２Ａ）及び体重変化（図２Ｂ）を示す図である。
図２Ａ中、値は、平均値±ＳＥ（標準誤差）であり、ｎ＝１４、＊Ｐ＜０．０５として示す。
図２Ｂ中、値は、平均値±ＳＥであり、ｎ＝１０、＊＊＊Ｐ＜０．００１として示す。
図２Ａから明らかなように、ＰＢＡ処理マウス群は、ビヒクル処理マウス群よりも生存率が高かった。
図２Ｂから明らかなように、ビヒクル処理マウス群はＰＢＡ処理マウス群に比べて体重が減少した。
また、ビヒクル処理マウス群の幾匹かは（１）体毛が抜ける及び／又は（２）臥していた。【０１００】
次に、イムノブロット分析を実施して、ｃＧＶＨＤ標的臓器における小胞体ストレスマーカー及び関連炎症マーカーのタンパク質レベルを試験した。結果を図３Ａに示す。
図３Ａ中、レーン１、３、５、７、９、１１、１３はＰＢＡ処理臓器であり、レーン２、４、６、８、１０、１２、１４はビヒクル処理臓器である。【０１０１】
続いて、ＰＢＡ処理臓器及びビヒクル処理臓器について、各臓器の標的タンパク質をデンシトメトリーによって定量した。結果を図３Ｂに示す。
図３Ｂ中、データは平均値±ＳＤ、ＰＢＡ：ｎ＝４、ビヒクル：ｎ＝４、＊Ｐ＜０．０５として示す。【０１０２】
図３Ａ及びＢに示した結果から明らかなように、イムノブロット分析は、ＰＢＡ処理マウスから採取した臓器が、ビヒクル処理マウス由来の臓器と比較して、ＧＲＰ７８、ＣＨＯＰ、ｐ−ＰＥＲＫ、ｐ−ｅＩＦ２α及びｐ−ＩＲＥ１αのタンパク質レベルが低かった。
図３Ａ及びＢに示したように、結果的に、関連する炎症促進分子ＮＦ−κＢ及びＴＸＮＩＰが、ビヒクル処理された臓器と比較して、ＰＢＡ処理された臓器において抑制されたことがわかる。
すなわち、ｃＧＶＨＤに起因するマウスの臓器における小胞体ストレスがＰＢＡによって緩和され得、それに応じて小胞体ストレス関連の炎症促進分子ＮＦ−κＢ及びＴＸＮＩＰが大幅に抑制されることがわかる。
ここで、上皮間葉移行がヒト眼球ｃＧＶＨＤで観察される線維化と相関し、ＴＸＮＩＰが上皮間葉転換と関連していることが知られている（Ｏｇａｗａ  Ｙ，  Ｓｈｉｍｍｕｒａ  Ｓ，  Ｋａｗａｋｉｔａ  Ｔ，  Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｓ，  Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｙ，  Ｔｓｕｂｏｔａ  Ｋ．  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．  ２００９；１７５：２３７２−２３８１．；Ｗｅｉ  Ｊ，  Ｓｈｉ  Ｙ，  Ｈｏｕ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｏｆ  ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｏ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．  ２０１３；２５：２７８８−２７９６．）。
したがって、ＰＢＡは、ＴＸＮＩＰの発現を低下させることによって上皮間葉転換を排除するため、ｃＧＶＨＤ誘発性の全身性線維化を緩和することができると推測される。【０１０３】
［ｃＧＶＨＤ標的器官の組織学的観察］
ＰＢＡが小胞体ストレスを緩和することによりｃＧＶＨＤ誘発性の全身性炎症及び線維化が軽減された。結果を図４Ａ〜Ｇに示す。
図４Ａは、ＰＢＡ処理臓器のＨＥ（ヘマトキシリン及びエオシン）染色写真と溶媒ビヒクル処理臓器のＨＥ染色写真である。
図４Ａ中、画像は倍率２００倍で、スケールバーは２００μｍで撮影した。
重度の炎症部分は＊で示した。ビヒクル処置皮膚の画像では、脂肪組織が失われた箇所に楕円を付した。
ＰＢＡ処理皮膚及びビヒクル処理皮膚の厚さも矢印で示した。ビヒクルによる眼の写真では、マイボーム腺が縮小し収縮した箇所に楕円を付し、結膜上皮は矢印で示した。【０１０４】
図４Ｂは、ＰＢＡ処理組織及びビヒクル処理組織における一般的な白血球マーカーであるＣＤ４５の免疫染色結果を示す図である。
図４Ｂ中、画像は倍率２００倍で、スケールバーは２０μｍで撮影した。
細胞の細胞質ゾル及び核は、それぞれ赤色及び青色に染色された。【０１０５】
図４Ｃは、ＰＢＡ処理臓器及びビヒクル処理臓器に対するマロリー染色結果を示す図である。
図４Ｃ中、写真は２００倍の倍率で撮影し、スケールバーは２００μｍを示す。異常な線維化領域は＊で示した。【０１０６】
図４Ｄは、ＰＢＡ処理した涙腺及び小腸並びにビヒクル処理した涙腺及び小腸の電子顕微鏡写真である。
図４Ｄ中、涙腺のストローマ（左）と小腸の上皮細胞（右）の写真は２０００倍の倍率で撮影し、スケールバーは５μｍである。涙腺の血管の写真（中央）は倍率１５０００倍で、スケールバーは５００ｎｍである。
図４Ｄ中、Ｃａｐは毛細血管を示し、Ｍはミトコンドリアを示す。
ビヒクル処理涙腺の写真では、タンパク質の蓄積により小胞体が肥大した箇所に＊を付し、細胞破片が長方形で示した。
ビヒクル処理小腸の画像では、微絨毛が破壊された箇所に楕円を付し、損傷組織は矢印で示した。【０１０７】
図４Ｅは、ＰＢＡ処理臓器及びビヒクル処理臓器におけるＣＤ４５陽性細胞の密度を示す図である。
図４Ｅ中、データは、平均値±ＳＤであり、ＰＢＡ：ｎ＝３、ビヒクル：ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１として示す。【０１０８】
図４Ｆは、ＰＢＡ処理小腸及びＰＢＡ処理眼並びにビヒクル処理した小腸及び眼に対するＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ  ｓｔａｉｎ）染色結果を示す図である。画像は２００倍の倍率で撮影し、スケールバーは２００μｍである。
杯細胞は、紫色の点として染色された。【０１０９】
図４Ｇは、ＰＢＡ処理小腸及びＰＢＡ処理眼並びにビヒクル処理した小腸及び眼における杯細胞の密度を示す図である。
図４Ｇ中、数値は、平均値±ＳＤであり、ＰＢＡ：ｎ＝３（小腸）、ビヒクル：ｎ＝３（小腸）、ＰＢＡ：ｎ＝５（眼）、ビヒクル：ｎ＝５（眼）＊＊＊Ｐ＜０．００１として示した。【０１１０】
図４Ａ及びＣに示したｃＧＶＨＤ罹患臓器のＨＥ（ヘマトキシリン及びエオシン）染色及びマロリー（３色）染色は、ＰＢＡを用いた小胞体ストレスの低減がｃＧＶＨＤの有効な治療法になり得ることを示している。
図４Ａに示したＨＥ写真から分かるように、炎症細胞の浸潤が、ＰＢＡ処理臓器において、ビヒクル処理臓器と比較して抑制されたことがわかる。
特に、（１）ＰＢＡで処理した小腸及び大腸の腸絨毛は、溶媒ビヒクルで処理した小腸及び大腸とは対照的に損なわれていないことが見て取れ、
（２）ＰＢＡ処理皮膚とは対照的にビヒクル処理皮膚は肥厚し、脂肪組織を失い、コラーゲン束の密度が上昇し、
（３）ビヒクル処理眼のマイボーム腺は、ＰＢＡ処理マイボーム腺と比較して減少し、収縮し、
（４）ＰＢＡ処理結膜上皮とは対照的に、ビヒクル処理結膜上皮の菲薄化及び損傷が観察され、ＰＢＡの全身注射によってシンブルファロンが予防できることが示唆された。【０１１１】
図４Ｃ及びＥに示した免疫染色及びその後のＣＤ４５＋細胞の計数から分かるように、ＰＢＡ処理臓器中の炎症細胞の数は、ビヒクル処理臓器中の炎症細胞の数よりもかなり少なかった。これら知見はまた、ＰＢＡ処理臓器における免疫細胞の移動及び増殖の抑制を示している。
さらに、全身性線維化は、ｃＧＶＨＤにおける最も重大な問題の１つである（Ｏｇａｗａ  Ｙ，  Ｍｏｒｉｋａｗａ  Ｓ，  Ｏｋａｎｏ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  ＭＨＣ−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ／ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｈｏｓｔ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．  ｅＬｉｆｅ．  ２０１６；５：ｅ０９３９４．）。【０１１２】
図４Ｃに示したマロリー染色の結果から、ｃＧＶＨＤ誘発性の全身性の線維化が、ビヒクル処理臓器と比較して、ＰＢＡ処理によって実質的に抑制されることが明らかになった。
図４Ｄに示した涙腺の電子顕微鏡写真の結果から、涙腺を溶媒ビヒクルで処理した場合、（１）フォールディングしていない／ミスフォールドしたタンパク質の蓄積により上皮細胞及び内皮細胞の小胞体が肥大していること、
（２）小胞体には、ストローマに多量の細胞破片が存在すること、
（３）血管内の上皮細胞及び内皮細胞のミトコンドリアが損傷したことがわかる。
これら結果は、ＰＢＡがｃＧＶＨＤに起因する小胞体ストレスから血管を保護し、それによって免疫細胞の組織への移動を抑制することを示唆している。【０１１３】
また、図４Ｄに示した小腸の電子顕微鏡写真分析の結果から、小腸を溶媒ビヒクルで処理した場合、その小絨毛が破壊され、隣接する組織が損傷していることがわかる。
これらの組織学的所見は、ＰＢＡ処理涙腺及びＰＢＡ処理小腸では観察されなかった。【０１１４】
さらに、図４Ｆ及びＧに示したＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ  ｓｔａｉｎ）染色の結果から、（１）ＰＢＡ処理小腸及びＰＢＡ処理結膜上皮の杯細胞が、ビヒクル注入対応物の杯細胞よりも多いこと、（２）腸粘膜及び結膜粘膜の構造は、ＰＢＡの全身注射によって保持されることがわかった。
以上の組織学的観察からわかるように、ＰＢＡは、ｃＧＶＨＤ関連小胞体ストレスによって誘発される全身性炎症及び線維化を緩和することができる。【０１１５】
［炎症性メディエーター及び前線維化メディエーターのＰＢＡによる低減］
ＰＢＡがｃＧＶＨＤに起因する全身性炎症を緩和するか否かをより詳細に調査するために、ＰＢＡ処理マウス及びビヒクル処理マウスから収集した血清中の炎症マーカーＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γのレベルを測定するＥＬＩＳＡを行った。
図５ＡはＰＢＡ処理マウス及びビヒクル処理マウスから収集した血清中の炎症マーカーであるＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γを測定するために骨髄移植の２８日後にＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。
図５Ａ中、データは平均値±ＳＤ、ＰＢＡ：ｎ＝４、ビヒクルｎ＝４、＊Ｐ＜０．０５として示す。
図５Ａに示したように、ＰＢＡ処理マウスの血清は、炎症マーカーであるＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γのタンパク質レベルが、ビヒクル処理マウスと比較して低かった。【０１１６】
さらに、ｃＧＶＨＤ誘発全身性線維化の緩和についてより詳細な調査を行った。
図５Ｂは線維化マーカーである前線維化メディエーター結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）のイムノブロット分析を行った結果を示す図である。
図５Ｂ中、レーン１、３、５、７はＰＢＡ処理臓器を示し、レーン２、４、６、８はビヒクル処理臓器を示す。【０１１７】
図５Ｃは各臓器のＣＴＧＦをデンシトメトリーにより定量した結果（ＰＢＡ処理臓器及びビヒクル処理臓器）を示す図である。
データは平均値±ＳＤ、ＰＢＡ：ｎ＝４、ビヒクルｎ＝４、＊Ｐ＜０．０５として示す。【０１１８】
図５Ｂ及びＣに示したように、イムノブロット分析により、ＣＴＧＦがビヒクル処理臓器で過剰発現したが、ＰＢＡ処理臓器では観察されなかった。これは、ＰＢＡがＣＴＧＦのｃＧＶＨＤ誘導性過剰発現を抑制しているといえる。
以上のデータは、ＰＢＡがｃＧＶＨＤ誘導性小胞体ストレスを抑制し、結果として全身性炎症及び線維化を緩和できることを示しており、ｃＧＶＨＤ誘導性の身体障害を緩和できることを示している。【０１１９】
［小胞体ストレスと機能不全線維芽細胞との相関］
ｃＧＶＨＤに起因する全身性線維化は重大な問題であり、多臓器不全を引き起こす（Ｏｇａｗａ  Ｙ，  Ｍｏｒｉｋａｗａ  Ｓ，  Ｏｋａｎｏ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  ＭＨＣ−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ／ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｈｏｓｔ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．  ｅＬｉｆｅ．  ２０１６；５：ｅ０９３９４．）。
ｃＧＶＨＤ誘発性線維化のメカニズムはまだ解明されていないが、線維化の発生には線維芽細胞が関係している可能性がある（Ｏｇａｗａ  Ｙ，  Ｒａｚｚａｑｕｅ  ＭＳ，  Ｋａｍｅｙａｍａ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４７，  ａ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ，  ｉｎ  Ｌａｃｒｉｍａｌ  Ｇｌａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃＧＶＨＤ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００７；４８：１０７９−１０８６．）。
いくつかの生物学的シグナルは線維芽細胞を刺激し、創傷治癒などのいくつかの生物学的プロセスにおいて不可欠な役割を果たし得る。しかし、線維芽細胞が制御されない様式で活性化されると異常なコラーゲン束を生成し、その異常の原因についてはほとんど知られていないものの、重篤な線維化を誘発する（Ｄａｒｂｙ  ＩＡ，  Ｈｅｗｉｔｓｏｎ  ＴＤ．  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ．  ２００７；２５７：１４３−１７９．；Ｋｅｎｄａｌｌ  Ｒ，  Ｆｅｇｈａｌｉ−Ｂｏｓｔｗｉｃｋ  ＣＡ．  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ：  ｎｏｖｅｌ  ｒｏｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２０１４；５：１−１３．）。【０１２０】
そこで、ｃＧＶＨＤ誘発小胞体ストレスと機能不全線維芽細胞との相関を鋭意調査する観点から、ＰＢＡ処理マウス涙腺及びビヒクル処理マウス涙腺からの線維芽細胞を培養した。
ＰＢＡが小胞体ストレスを緩和することにより涙腺線維芽細胞におけるｃＧＶＨＤ誘発小胞体ストレスが緩和された結果を図６Ａ〜Ｄに示す。
図６Ａは、マウスの涙腺線維芽細胞における小胞体ストレスマーカー、活性化マーカー及び線維化マーカーのイムノブロット分析の結果を示す図である。
図６Ａ中、レーン１はＰＢＡ処理涙腺由来線維芽細胞を示し、レーン２はビヒクル処理涙腺由来線維芽細胞を示す。【０１２１】
図６Ｂは、対応タンパク質バンドの定量分析（ＰＢＡ処理線維芽細胞及びビヒクル処理線維芽細胞）の結果を示す図である。
図６Ｂ中、データは平均値±ＳＤ、ＰＢＡ：ｎ＝４、ビヒクル：ｎ＝４、＊Ｐ＜０．０５として示す。【０１２２】
図６Ｃは、ＥＬＩＳＡを用いて、ＰＢＡ処理線維芽細胞及びビヒクル処理線維芽細胞によって産生されたＭＣＰ−１のタンパク質レベルを測定した結果を示す図である。
図６Ｃ中、データは平均値±ＳＤ、ＰＢＡ：ｎ＝４、ビヒクル：ｎ＝４、＊Ｐ＜０．０５として示す。【０１２３】
図６Ｄは、ＰＢＡ処理線維芽細胞及びビヒクル処理線維芽細胞におけるＩＬ−６及びＴＧＦ−βのｑＰＣＲ分析結果を示す図である。
図６Ｄ中、値は平均値±ＳＤ、ＰＢＡ：ｎ＝４、ビヒクル：ｎ＝４、＊Ｐ＜０．０５として示す。【０１２４】
図６Ａに示した培養線維芽細胞のイムノブロット分析の結果から明らかなように、ＧＲＰ７８、ＣＨＯＰ、リン酸化ＰＥＲＫ、リン酸化ｅＩＦ２α及びリン酸化ＩＲＥ１αが溶媒ビヒクル処理マウスと比較してマウスをＰＢＡで処理することによって大きく抑制されたことがわかる。
したがって、図６Ａ〜Ｄに示した結果から明らかなように、ビヒクル処理線維芽細胞と比較してＰＢＡ処理線維芽細胞では、（１）ＨＳＰ４７、ＣＴＧＦ、線維芽細胞活性化マーカー及び線維化マーカーの各々のタンパク質レベル、（２）ＭＣＰ−１の産生及び（３）ＩＬ−６のｍＲＮＡレベルが低減したことがわかる。
すなわち、上記結果は、（１）ｃＧＶＨＤに起因する小胞体ストレスが有害な方法で線維芽細胞を活性化し、それにより広範囲の線維化を誘発する一方、（２）ＰＢＡは小胞体ストレスを緩和することによって線維芽細胞の機能不全を防ぐことができることを示している。【０１２５】
［小胞体ストレスと、マクロファージのＭ２マクロファージへの分化との相関］
上述のように、マクロファージは免疫応答及び炎症において重要な役割を果たしており、老化マクロファージがｃＧＶＨＤの発症プロセスと有害な関連性があることが知られている。
また、（１）小胞体ストレスがＭ２マクロファージへの分化を促進すること、及び（２）Ｍ２マクロファージが線維化関連疾患に関与することが示唆されている（Ｏｈ  Ｊ，  Ｒｉｅｋ  ＡＥ，  Ｗｅｎｇ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｍ２  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｏａｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１２；２８７：１１６２９−１１６４１．；
Ｘｕｅ  Ｊ，  Ｓｈａｒｍａ  Ｖ，  Ｈｓｉｅｈ  ＭＨ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１５；６：１−１１．；
Ｓｈｉｖｓｈａｎｋａｒ  Ｐ，  Ｈａｌａｄｅ  ＧＶ，  Ｃａｌｈｏｕｎ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｖｅｏｌｉｎ−１  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｍ２  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１４；７６：８４−９３．）。【０１２６】
そこで、ｃＧＶＨＤ誘導小胞体ストレスと、機能不全マクロファージ（Ｍ２マクロファージへの分化）との関係を鋭意調査した。
まず、マウス涙管内のマクロファージが小胞体ストレスマーカーであるＣＨＯＰを発現するか否かを調査するために免疫染色を行った。【０１２７】
ＰＢＡを用いることによりマクロファージにおけるｃＧＶＨＤに起因する小胞体ストレスが緩和された結果を図７Ａ〜Ｅに示す。
図７Ａは、ＰＢＡ注入涙腺及びビヒクル注入涙腺の免疫蛍光画像を示す図である。
図７Ａ中、写真は２００倍の倍率で撮影し、スケールバーは２０μｍを示す。マクロファージ及びＣＨＯＰは、それぞれ赤色及び緑色に染色された。
図７Ａに示した涙腺の蛍光写真から判断されるように、マウスを溶媒ビヒクルで処理すると、ＣＨＯＰを発現するマクロファージが組織に移動したことがわかる。
これは、小胞体ストレスを受けたマクロファージがｃＧＶＨＤの進行に関連していることを示している。
一方、そのようなマクロファージは、ＰＢＡ処理マウスから採取した涙腺では観察されなかった。【０１２８】
次に、ｃＧＶＨＤ罹患マクロファージにおける小胞体ストレスについてのより深く考察するために、ＰＢＡ処理マウス由来及びビヒクル処理マウス由来の脾臓マクロファージを培養した。
図７Ｂは、ＰＢＡ処理マウス由来及びビヒクル処理マウス由来の培養脾臓マクロファージの免疫蛍光結果を示す図である。写真は２００倍の倍率で撮影し、スケールバーは２０μｍを示す。マクロファージ及びＣＨＯＰは、それぞれ赤色及び緑色に染色された。
図７Ｂに示した免疫組織化学の結果から、ビヒクル処理脾臓マクロファージは、ＰＢＡ処理脾臓マクロファージとは対照的に、ＣＨＯＰを発現することが明らかになった。【０１２９】
図７Ｃは、マウス脾臓マクロファージにおける小胞体ストレス各マーカーのイムノブロット分析結果を示す図である。
図７Ｃ中、レーン１はＰＢＡ処理マウス由来の脾臓マクロファージを示し、レーン２はビヒクル処理マウス由来の脾臓マクロファージを示す。【０１３０】
図７Ｄは、各タンパク質バンドの対応する定量分析結果を示す図である。
図７Ｄ中、データは平均値±ＳＤ、ＰＢＡ：ｎ＝４、ビヒクル：ｎ＝４、＊Ｐ＜０．０５として示す。
図７Ｃ及びＤに示したマクロファージの免疫ブロット分析の結果から明らかなように、マクロファージをＰＢＡで処理した場合、小胞体ストレスマーカーであるＧＲＰ７８、ＣＨＯＰ、リン酸化ＰＥＲＫ、リン酸化ｅＩＦ２α及びリン酸化ＩＲＥ１αが溶媒ビヒクルと比較して実質的に抑制されていることがわかる。【０１３１】
さらに、脾臓マクロファージにおける（１）Ｍ１マクロファージマーカーであるＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＭＣＰ−１の遺伝子発現並びに（２）Ｍ２マクロファージマーカーであるＴＧＦ−β及びＩＬ−１０の遺伝子発現を試験するためにｑＰＣＲを行った（Ｓｅｎｅ  Ａ，  Ｋｈａｎ  ＡＡ，  Ｃｏｘ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｐａｉｒｅｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｆｆｌｕｘ  ｉｎ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ａｇｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍａｃｕｌａｒ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．２０１３；１７：５４９−５６１．）。【０１３２】
図７Ｅは、脾臓からのＭ１マクロファージ及びＭ２マクロファージの各マーカーのｑＰＣＲ分析結果を示す図である。
図７Ｅ中、データは平均値±ＳＤ、ＰＢＡ：ｎ＝４〜５、ビヒクル：ｎ＝４〜５、＊Ｐ＜０．０５として示す。
図７Ｅに示した結果から明らかなように、Ｍ２マクロファージマーカーであるＴＧＦ−β及びＩＬ−１０のｍＲＮＡ発現が、ビヒクル処理マクロファージにおいて、ＰＢＡ処理マクロファージと比較して増加したことがわかる。
一方、マクロファージをＰＢＡで処理した場合、溶媒ビヒクルで処理したマクロファージよりも、Ｍ１マクロファージマーカーであるＩＬ−１β及びＩＬ−６の遺伝子発現が高いことがわかる。
以上の結果から、（１）ｃＧＶＨＤ誘発性小胞体ストレスがマクロファージを活性化された表現型に二者択一的に分化させること、及び（２）マクロファージが活性化された表現型に変換することによるｃＧＶＨＤ誘導線維化を、ＰＢＡがマクロファージにおける小胞体ストレスを低減することにより緩和することができると推測される。【０１３３】
＜考察＞
以上のように、（１）小胞体ストレスの上昇と、（２）ｃＧＶＨＤ罹患臓器におけるＮＦ−κＢ及びＴＸＮＩＰなどの炎症誘発性分子の活性及び／又は発現の増加との相関が明らかにされた。
上記のように、ＮＦ−κＢがｃＧＶＨＤ罹患臓器において活性化され、その一部がｃＧＶＨＤに起因する小胞体ストレスから生じることを示唆している。
上述の非特許文献６〜８には、（１）ＴＸＮＩＰがＰＥＲＫ及びＩＲＥ１α経路の下流で生成されること、（２）ＴＸＮＩＰが小胞体ストレスを受けた細胞が恒常性を回復するかアポトーシスを受けるかを決定する交差点において重要な役割を果たすこと、（３）ＴＸＮＩＰがインフラマソーム瘤様受容体ファミリーであるピリンドメイン３（ＮＬＲＰ３）を活性化することによって広範な炎症を誘発することが記載されているが、ＴＸＮＩＰとｃＧＶＨＤとの間の関連性についてはこれまで知られていなかった。
上記のように、小胞体ストレス誘発ＴＸＮＩＰの発現がｃＧＶＨＤによる身体障害と相関し得ることが明らかにされた。【０１３４】
図８はｃＧＶＨＤと小胞体ストレスとの間の推定される相関を示す図である。
図８に示したように、ｃＧＶＨＤに罹患した臓器は酸化的ストレスを受けると考えられる。それに応じて、上皮細胞、線維芽細胞及びマクロファージにおける小胞体ストレスが増大し得る。
その結果、（１）ＮＦ−κＢ及びＴＸＮＩＰなどの炎症関連分子が制御不能な様式で発現及び／又は活性化され、（２）線維芽細胞が機能不全に陥り、その結果、異常なコラーゲン束が生成され、（３）マクロファージは、異常型線維化に関連し得るＭ２表現型に分化され得る。
さらに、小胞体ストレスは炎症によって増加すると考えられているので、小胞体ストレスと炎症との間の悪循環が、ｃＧＶＨＤに罹患した臓器において形成され得る。
したがって、ｃＧＶＨＤに起因する小胞体ストレスの低減はまた、上記悪循環から脱却する可能性がある。
以上まとめると、ＰＢＡは小胞体ストレスを緩和することにより、ｃＧＶＨＤを治療するための有効な薬剤になり得る。
【図１】
2017175808.tif 000003
【図２】
2017175808.tif 000004
【図３−１】
2017175808.tif 000005
【図３−２】
2017175808.tif 000006
【図４−１】
2017175808.tif 000007
【図４−２】
2017175808.tif 000008
【図５】
2017175808.tif 000009
【図６】
2017175808.tif 000010
【図７】
2017175808.tif 000011
【図８】
2017175808.tif 000012
【図９】
2017175808.tif 000013
【図１０】
2017175808.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月1日(2018.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする、移植片対宿主病の治療又は予防剤。
【請求項２】
前記移植片対宿主病は、骨髄移植後の移植片対宿主病である、請求項１に記載の治療又は予防剤。
【請求項３】
前記移植片対宿主病は、眼における移植片対宿主病である、請求項１又は２に記載の治療又は予防剤。
【請求項４】
前記移植片対宿主病は、ドライアイである、請求項３に記載の治療又は予防剤。
【請求項５】
前記移植片対宿主病は、ファイブロサイト浸潤を伴う移植片対宿主病である、請求項１から４のいずれかに記載の治療又は予防剤。
【請求項６】
フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、請求項１から５のいずれかに記載の治療又は予防剤。
【請求項７】
フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする、ファイブロサイト浸潤抑制剤。
【請求項８】
フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、請求項７に記載のファイブロサイト浸潤抑制剤。
【請求項９】
フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする、杯細胞の減少の抑制剤。
【請求項１０】
フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、請求項９に記載の杯細胞の減少の抑制剤。
【請求項１１】
フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする、涙液減少抑制剤。
【請求項１２】
フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、請求項１１に記載の涙液減少抑制剤。
【請求項１３】
フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を投与することを含む、ファイブロサイト浸潤抑制方法。
【請求項１４】
フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、請求項１３に記載のファイブロサイト浸潤抑制方法。
【請求項１５】
フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を投与することを含む、杯細胞の減少の抑制方法。
【請求項１６】
フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、請求項１５に記載の杯細胞の減少の抑制方法。
【請求項１７】
フェニル酪酸またはその薬理学的に許容される塩を投与することを含む、涙液減少抑制方法。
【請求項１８】
フェニル酪酸が４−フェニル−ｎ−酪酸またはその薬理学的に許容される塩である、請求項１７に記載の涙液減少抑制方法。
【国際調査報告】
2017175808.tif 000015
2017175808.tif 000016
2017175808.tif 000017
2017175808.tif 000018