(57)【要約】  本発明は、不純物、特にＬ−システイニル−Ｌ−グリシンの含有量が低減した還元型グルタチオンの結晶及びその製造方法を提供することを目的とする。本発明は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対して、Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシンのピーク面積が０．０２以下である、還元型グルタチオンの結晶に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対して、Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシンのピーク面積が０．０２以下である、還元型グルタチオンの結晶。
【請求項２】
ＨＰＬＣ分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対して、酸化型グルタチオンのピーク面積が０．７以下である、請求項１に記載の還元型グルタチオンの結晶。
【請求項３】
ＨＰＬＣ分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対して、他のピークの総面積が１．０以下である、請求項１または２に記載の還元型グルタチオンの結晶。
【請求項４】
ＨＰＬＣ分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対して、酸化型グルタチオンのピーク以外の他のピーク面積が各々０．０８以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の還元型グルタチオンの結晶。
【請求項５】
ＨＰＬＣ分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対してＬ−システイニル−Ｌ−グリシンのピーク面積が０．０２以下である還元型グルタチオンの結晶の製造方法であって、還元型グルタチオン含有水溶液を高架橋度陽イオン交換樹脂に通過させた後、該水溶液を回収し、該水溶液中に還元型グルタチオンの結晶を析出させ、該水溶液から還元型グルタチオンの結晶を採取することを特徴とする製造方法。
【請求項６】
高架橋度陽イオン交換樹脂が、１２％以上の架橋度を有する陽イオン交換樹脂である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
高架橋度陽イオン交換樹脂が、スルホン基を陽イオン交換基とする陽イオン交換樹脂である、請求項５または６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不純物、特にＬ−システイニル−Ｌ−グリシンの含有量が低減した還元型グルタチオンの結晶及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオン（γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシン）は生物に広く存在する還元性化合物であり、肝臓において解毒作用を有することが知られている。このため、グルタチオンは医薬品、健康食品及び化粧品等の製品、原料または中間体として広く用いられている。【０００３】
グルタチオンの製造方法としては、酵母などの微生物を用いた発酵法、及び酵素法（非特許文献１）などが知られているが、副生物として類似構造を持つ類縁不純物を生成するという問題がある。【０００４】
グルタチオンの精製法としては、亜酸化銅と銅塩を形成させる方法や強酸性イオン交換樹脂に吸着させて酸または塩基で溶出させる方法（特許文献１〜３）、弱塩基性陰イオン交換樹脂を通過させる方法（特許文献４）が知られているが、グルタチオンは加熱、酸化、ｐＨ変動等により、容易に反応または分解して多数の不純物を生成させる。【０００５】
これらの不純物の中でも、特に、Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシンは、様々な疾患の原因となるフリーラジカルを発生させることが知られている（非特許文献２、３）。また、厚生労働省による医薬品原薬の不純物に関するガイドラインでは、原薬の最大一日投与量によっては、グルタチオンに含まれるそれぞれの不純物を、最小で０．０５％以下に低減することが求められている。【０００６】
このように、医薬品や食品原料としてのグルタチオンには、安全性の面から、不純物の低減が強く望まれている。グルタチオンの精製法として、特許文献５には、システインやγ−グルタミルシステインといった特定の不純物を除去する方法が開示されている。しかし、これまでに、Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシンを除去する方法についての報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】日本国特公昭４４−２３９号公報
【特許文献２】日本国特公昭４５−４７５５号公報
【特許文献３】日本国特公昭４６−２８３８号公報
【特許文献４】日本国特公昭４５−２７７９７号公報
【特許文献５】日本国特開昭６１−２８２３９７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Appl. Microbiol. Biotechnol., 66, 233 (2004)
【非特許文献２】J Investig Med., Vol 47,No.3, 151-160 (1999)
【非特許文献３】BioFactors., 17, 187-198 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のとおり、従来の方法では、Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシンを低減させることは困難であった。したがって、本発明は、不純物、特にＬ−システイニル−Ｌ−グリシンの含有量が低減した還元型グルタチオンの結晶及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の（１）〜（７）に関する。
（１）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対してＬ−システイニル−Ｌ−グリシンのピーク面積が０．０２以下である、還元型グルタチオンの結晶。
（２）ＨＰＬＣ分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対して、酸化型グルタチオンのピーク面積が０．７以下である、（１）に記載の還元型グルタチオンの結晶。
（３）ＨＰＬＣ分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対して、他のピークの総面積が１．０以下である、（１）または（２）に記載の還元型グルタチオンの結晶。
（４）ＨＰＬＣ分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対して、酸化型グルタチオンのピーク以外の他のピーク面積が各々０．０８以下である、（１）〜（３）のいずれか１に記載の還元型グルタチオンの結晶。
（５）ＨＰＬＣ分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対してＬ−システイニル−Ｌ−グリシンのピーク面積が０．０２以下である還元型グルタチオンの結晶の製造方法であって、還元型グルタチオン含有水溶液を高架橋度陽イオン交換樹脂に通過させた後、該水溶液を回収し、該水溶液中に還元型グルタチオンの結晶を析出させ、該水溶液から還元型グルタチオンの結晶を採取することを特徴とする製造方法。
（６）高架橋度陽イオン交換樹脂が、１２％以上の架橋度を有する陽イオン交換樹脂である、（５）に記載の製造方法。
（７）陽イオン交換樹脂が、スルホン基を陽イオン交換基とする陽イオン交換樹脂である、（５）または（６）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、不純物、特にＬ−システイニル−Ｌ−グリシンの含有量が低減した還元型グルタチオンの結晶及びその製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、還元型グルタチオン含有水溶液中のＬ−システイニル−Ｌ−グリシンの増加プロファイルを表わす。縦軸は、該水溶液のＨＰＬＣ分析における、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対するＬ−システイニル−Ｌ−グリシンのピーク面積を、横軸は時間（ｈ）を表わす。図１において、白丸は４０℃、黒ひし形は２５℃の結果を表わす。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．本発明の結晶
本発明の還元型グルタチオンの結晶（以下、本発明の結晶ともいう）は、ＨＰＬＣ分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対してＬ−システイニル−Ｌ−グリシンのピーク面積が０．０２以下、好ましくは０．０１５以下、より好ましくは０．０１以下、最も好ましくは０．００６以下である。
【００１４】
本発明の結晶は、ＨＰＬＣ分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対して、酸化型グルタチオンのピーク面積が、好ましくは０．７以下、より好ましくは０．６以下、さらに好ましくは０．５以下である。
【００１５】
本発明の結晶は、ＨＰＬＣ分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対して、他のピークの総面積が、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、さらに好ましくは０．８以下、最も好ましくは０．７以下である。
【００１６】
本発明の結晶は、ＨＰＬＣ分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対して、酸化型グルタチオンのピーク以外の他のピーク面積が、各々好ましくは０．０８以下、より好ましくは０．０６以下、さらに好ましくは０．０４以下、最も好ましくは０．０２以下である。
【００１７】
ＨＰＬＣ分析とは、分析対象である化合物を溶媒に溶解してＨＰＬＣによる分析に供することを意味する。ＨＰＬＣ分析としては、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、及びＬ−システイニル−Ｌ−グリシンを同時に検出することができる分析方法であれば、分析条件等は特に限定されず、好ましくは２１０ｎｍの吸光度を検出・測定するＨＰＬＣ分析方法を挙げることができ、より好ましくは、以下のＨＰＬＣ分析例に記載のＨＰＬＣ分析方法を挙げることができる。
【００１８】
［ＨＰＬＣ分析例］
ＨＰＬＣ分析中における不純物の増加を防止するために、サンプル溶解からＨＰＬＣで分析するまでの時間は１０分以内とする。また、ＨＰＬＣのサンプルラックは１０℃以下に冷却する。当該条件における定量限界と検出限界は、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対して０．００１である。
使用機器：システムコントローラ（ＣＢＭ−２０Ａ）、検出器（ＳＰＤ−２０Ａ）、ポンプ（ＬＣ−２０ＡＤ）、オートサンプラー（ＳＩＬ−２０ＡＣＨＴ）、カラムオーブン（ＣＴＯ−２０ＡＣ）、デガッサ（ＤＧＵ−２０Ａ）（いずれも島津製作所社製）
検出器：紫外吸光光度計（測定波長２１０ｎｍ）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  粒径３μｍ  ３．０×１５０ｍｍ（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）
移動相：０．２０Ｗ/Ｖ％の１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム、０．６６Ｗ/Ｖ％のリン酸二水素カリウムを含む、３Ｗ/Ｖ％メタノール溶液（リン酸でｐＨ３．０に調整）
リン酸二水素カリウム  ６．８ｇ、１−へプタスルホン酸ナトリウム  ２．０２ｇをＰＦＷ１０００ｍＬに溶解し、リン酸を加えてｐＨ３．０に調整し、この液９７０ｍＬにメタノール３０ｍＬを加えることにより、移動相を調製する。
カラム温度：３５℃
流速：０．４〜０．７ｍＬ／ｍｉｎ（還元型グルタチオンの保持時間が約５分になるように調整する）
試料注入量：３０μＬ
試料調製方法：サンプル約０．０５ｇを秤量し、移動相１００ｍＬに溶解したものを試料とする。
【００１９】
ピーク面積とは、ＨＰＬＣ分析を行ったとき、ベースラインとピークラインで囲まれた部分の面積のことをいい、ＨＰＬＣ分析によって検出された化合物ごとに求めることができる。
【００２０】
本発明の結晶としては、ＨＰＬＣ分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対して、Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシンのピーク面積が０．０２以下であることに加え、さらに酸化型グルタチオンのピーク面積が好ましくは０．７以下、より好ましくは０．６以下、さらに好ましくは０．５以下である、還元型グルタチオンの結晶が挙げられる。
【００２１】
また、本発明の結晶としては、ＨＰＬＣ分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対して、Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシンのピーク面積が０．０２以下であることに加え、さらに他のピークの総面積が、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、さらに好ましくは０．８以下、最も好ましくは０．７以下である、還元型グルタチオンの結晶が挙げられる。
【００２２】
また、本発明の結晶としては、ＨＰＬＣ分析において、還元型グルタチオンのピーク面積１００に対して、Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシンのピーク面積が０．０２以下であることに加え、さらに酸化型グルタチオンのピーク以外の他のピーク面積が、各々好ましくは０．０８以下、より好ましくは０．０６以下、さらに好ましくは０．０４以下、最も好ましくは０．０２以下である、還元型グルタチオンの結晶が挙げられる。
【００２３】
本発明の結晶としては、具体的には、例えば、ＨＰＬＣ分析における各化合物の保持時間とピーク面積が、表３（実施例３及び４）に示す数値で表される還元型グルタチオンの結晶を挙げることができる。
【００２４】
２．本発明の結晶の製造方法
本発明の結晶の製造方法は、還元型グルタチオン含有水溶液を高架橋度陽イオン交換樹脂に通過させた後、該水溶液を回収し、該水溶液中に還元型グルタチオンの結晶を析出させ、該水溶液から還元型グルタチオンの結晶を採取することを特徴とする、還元型グルタチオンの結晶の製造方法である。
【００２５】
本発明の製造方法に用いる還元型グルタチオン含有水溶液は、発酵法、酵素法、天然物からの抽出法、化学合成法等のいずれの製造方法によって製造されたものであってもよいが、例えば、グルタチオンを生産する能力を有する微生物を培養して得られる還元型グルタチオンを含有する培養物（国際公開第２００８／１２６７８４号）、及び酵素法で得られる還元型グルタチオン含有水溶液［Appl. Microbiol. Biotechnol., 66, 233 (2004)、日本国特開昭６０−１０５４９９号公報等］等から不溶物を除去する等して得られる溶液を挙げることができる。
【００２６】
また、還元型グルタチオン含有水溶液は、酸化型グルタチオン・６水和物を還元して得られる還元型グルタチオンを含有する水溶液であってもよい。酸化型グルタチオン・６水和物は、国際公開第２０１１／１３２７２４号に記載の方法に従って取得することができる。
【００２７】
酸化型グルタチオン・６水和物を水溶液に溶解し、国際公開第２０１２／１３７８２４号、国際公開第２０１０／１４０６２５号、または、国際公開第２０１４／１３３１２９号に記載の方法に従って酸化型グルタチオン含有水溶液を電解還元することにより、還元型グルタチオン含有水溶液を取得することができる。酸化型グルタチオンは、酸化型グルタチオン・６水和物の結晶として取得することで、不純物をより効率的に除去することができる（国際公開第２０１１／１３２７２４号）。
【００２８】
本明細書において不純物とは、還元型グルタチオンの結晶に含まれる、還元型グルタチオン以外の全ての化合物のことをいう。
【００２９】
還元型グルタチオン含有水溶液を高架橋度陽イオン交換樹脂に通過させる方法としては、例えば、還元型グルタチオン含有水溶液を、高架橋度イオン交換樹脂を充填したカラムに通過させる方法を挙げることができる。
【００３０】
高架橋度陽イオン交換樹脂に通過させるときに障害となる固形物が還元型グルタチオン含有水溶液に含まれる場合には、予め遠心分離、濾過またはセラミックフィルタ等を用いて当該固形物を除去することができる。
【００３１】
また、高架橋度陽イオン交換樹脂に通過させるときに障害となる水溶性の不純物が還元型グルタチオン含有水溶液に含まれる場合には、還元型グルタチオン含有水溶液を、イオン交換樹脂等を充填したカラムに通過させる等により、当該不純物を除去することができる。
【００３２】
また、高架橋度陽イオン交換樹脂に通過させるときに障害となる疎水性の不純物が還元型グルタチオン含有水溶液に含まれる場合には、還元型グルタチオン含有水溶液を合成吸着樹脂や活性炭等を充填したカラムに通過させる等により、当該不純物を除去することができる。
【００３３】
還元型グルタチオン含有水溶液の還元型グルタチオンの濃度としては、通常２５ｇ／Ｌ以上、好ましくは５０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１００ｇ／Ｌ以上を挙げることができる。
【００３４】
上記濃度の還元型グルタチオン含有水溶液は、該水溶液を加熱濃縮法または減圧濃縮法などの一般的な濃縮方法により濃縮することで取得できる。
【００３５】
還元型グルタチオン含有水溶液のｐＨは、通常ｐＨ２．０〜１０．０、好ましくはｐＨ２．０〜７．０であり、必要に応じて該水溶液のｐＨを塩酸、硫酸、酢酸、リンゴ酸等の無機または有機の酸、水酸化ナトリウム等のアルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて上記の範囲に調整することができる。
【００３６】
水に対するグルタチオンの飽和溶解度は、１０℃で８３ｇ／Ｌ、２５℃で１３０ｇ／Ｌであるが、ｐＨを上げると上昇することが知られている（国際公開第２０１１／１３７８２４）。したがって、グルタチオン含有水溶液に塩基を添加してｐＨを上昇させることで、グルタチオン濃度をさらに高めることができる。
【００３７】
本発明の製造方法に用いられる高架橋度陽イオン交換樹脂の架橋度としては、例えば、通常１２％以上、好ましくは１４％以上、より好ましくは１５％以上、最も好ましくは１６％以上を挙げることができる。架橋度とは、イオン交換樹脂において、架橋剤が該樹脂を構成する全原料中に占める重量比率のことをいう。
【００３８】
高架橋度陽イオン交換樹脂の架橋剤としては、例えば、ジビニルベンゼンを挙げることができる。高架橋度陽イオン交換樹脂の陽イオン交換基としては、例えば、スルホン基を挙げることができる。
【００３９】
高架橋度陽イオン交換樹脂のイオン型としては、Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシンを吸着する能力があれば特に限定されないが、例えば、水素イオン型を挙げることができる。高架橋度陽イオン交換樹脂の粒子径としては、例えば、通常３００〜９００μｍ、好ましくは４００〜８００μｍ、最も好ましくは５００〜７００μｍを挙げることができる。
【００４０】
本発明の製造方法で用いられる高架橋度陽イオン交換樹脂としては、具体的には、例えば、ＵＢＫ１２、ＵＢＫＮ１Ｕ、ＵＢＫ１６、ＳＫ１１０、ＳＫ１１２、ＰＫ２２０、ＰＫ２２８（いずれも三菱化学社製）、Ｃ１００×１６ＭＢＨ、Ｃ１００×１２、Ｃ１００×１０（いずれもＰｕｒｏｉｔｅ社製）、アンバーライト（商標）  ２００ＣＴ、アンバーライト（商標） ２５２（いずれもロームアンドハース社製）からなる群より選ばれる高架橋度陽イオン交換樹脂を、好ましくは、ＵＢＫ１２、ＵＢＫＮ１Ｕ、ＵＢＫ１６（いずれも三菱化学社製）を挙げることができる。
【００４１】
本発明の製造方法において、高架橋度陽イオン交換樹脂の量は、当業者であれば、高架橋度陽イオン交換樹脂に通過させる還元型グルタチオン含有水溶液のｐＨや量に応じて容易に設定することができ、例えば、該水溶液の通常０．１〜５倍量を挙げることができる。
【００４２】
還元型グルタチオン含有水溶液を高架橋度陽イオン交換樹脂に通過させるときの温度としては、通常５〜４０℃、好ましくは１０〜３５℃、最も好ましくは１５〜３０℃を挙げることができる。
【００４３】
還元型グルタチオン含有水溶液を高架橋度陽イオン交換樹脂に通過させるときの速度としては、Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシンの除去能力が低下しない限り特に制限はなく、液空間速度（ＳＶ）で、通常０．１〜１０．０、好ましくは０．２〜９．０、より好ましくは０．３〜８．０、最も好ましくは０．５〜５．０を挙げることができる。液空間速度（ＳＶ）とは、通液量（Ｌ／ｈ）を樹脂充填量（Ｌ）で割った値のことをいう。
【００４４】
高架橋度陽イオン交換樹脂に通過させて得られる還元型グルタチオンを含有する水溶液をイオン交換樹脂に通過させて脱塩し、脱塩された還元型グルタチオンを含有する水溶液をそのまま還元型グルタチオンの結晶の析出に用いることができる。
【００４５】
脱塩に用いるイオン交換樹脂としては、例えば、ＷＡ−３０、ＷＡ−２１に代表される弱塩基性イオン交換樹脂［いずれもダイヤイオン（商標）、三菱化学社製］を挙げることができる。
【００４６】
還元型グルタチオンの結晶を析出させる方法としては、還元型グルタチオンを結晶として析出させることができる方法であればいずれの方法でもよく、例えば、日本国特許第５２４３９６３号明細書に記載された、還元型グルタチオン含有水溶液に還元型グルタチオンの種晶及び溶媒を添加する方法を挙げることができる。
【００４７】
また、還元型グルタチオン含有水溶液にグルタチオンのα晶の結晶を選択的に起晶させ（日本国特許第５２４３９６３号明細書）、該グルタチオンのα晶の結晶を含む水溶液に、グルタチオンの濃度を飽和溶解度以上に高めた水溶液を連続または分割しながら添加して還元型グルタチオンの結晶を析出させる方法を用いてもよい。
【００４８】
還元型グルタチオンの結晶を採取する方法としては、特に限定はなく、濾取、加圧濾過、吸引濾過、遠心分離等を挙げることができる。さらに結晶への母液の付着を低減し、結晶の品質を向上させるために、結晶を採取した後、適宜、該結晶を洗浄することができる。
【００４９】
洗浄に用いる溶液は、特に制限はなく、水、メタノール、エタノール、アセトン、ｎ−プロパノール、イソプロピルアルコール及びそれらから選ばれる１種類の溶液または複数種類を任意の割合で混合した溶液を用いることができる。
【００５０】
上記した方法により本発明の還元型グルタチオンの結晶を取得することができ、得られた結晶が湿晶である場合は、乾燥することにより取り扱いやすい結晶を取得することができる。乾燥条件としては、還元型グルタチオンの結晶の形態を保持できる方法ならばいずれでもよく、例えば、減圧乾燥、真空乾燥、流動層乾燥、通風乾燥等が挙げられる。
【００５１】
乾燥温度としては、付着水分や溶液を除去でき、還元型グルタチオンの結晶が分解しない範囲ならばいずれでもよいが、通常７０℃以下、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５０℃以下を挙げることができる。
【実施例】
【００５２】
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［参考例］
還元型グルタチオンのα晶の結晶（興人社製）を水に溶解してから１００ｇ／Ｌに調整して密閉し、撹拌しながら２５℃と４０℃の恒温槽に設置した。これらの還元型グルタチオン水溶液を経時で採取し、ＨＰＬＣ分析した。図１に示す結果より、還元型グルタチオンは経時で温度依存的に分解し、Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシンを生成することが分かった。【００５３】
［比較例］
日本国特許第５２４３９６３号明細書の実施例１に記載された方法に従い、還元型グルタチオンを１８３ｇ／Ｌの濃度で含む水溶液を調製した。当該水溶液を、そのまま加熱減圧下で５３９ｇ／Ｌまで濃縮し、得られた濃縮溶液を２５℃に保ちつつ、還元型グルタチオンのα晶の結晶（興人社製）を該濃縮液に種晶として添加した。種晶添加後、２５℃で１０時間撹拌することで、還元型グルタチオンのα晶の結晶が起晶した水溶液が得られた。【００５４】
得られた水溶液を１０℃まで冷却した後、０．３倍等量のエタノールを該水溶液に添加することにより還元型グルタチオンのα晶の結晶を晶析させた。得られたスラリーを遠心分離して水溶液層を除去した後に６０ｖ／ｖ％エタノールを用いて結晶を洗浄してから、４０℃で減圧乾燥させ、還元型グルタチオンのα晶の結晶を取得した。【００５５】
［実施例１］
日本国特許第５２４３９６３号明細書に記載の方法で取得した還元型グルタチオンの結晶を水に溶解した後、６０℃で１時間加熱することでＬ−システイニル−Ｌ−グリシンの含有量を増加させた後、還元型グルタチオンを１００ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌの濃度で含む各水溶液を調製した。【００５６】
これらの水溶液それぞれ６７０ｍＬ、１３４０ｍＬ、２６８０ｍＬを、水素イオン型に再生した１００ｍＬのＵＢＫ１６（三菱化学社製）を充填した直径２ｃｍのガラスカラムに、室温下、液空間速度ＳＶ１．０（１００ｍＬ／ｈ）の流速で通過させた。還元型グルタチオン水溶液を通過させた後は、糖度（Ｂｒｉｘ）が１％以下になるまでＵＢＫ１６の水洗を行い、還元型グルタチオン画分を回収した。還元型グルタチオンの収率、Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシンの除去率及び液量増加率の結果を表１に示す。【００５７】
【表１】
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【００５８】
表１に示すように、高架橋度陽イオン交換樹脂を用いることにより、還元型グルタチオン含有水溶液の還元型グルタチオン濃度がいずれの濃度であっても、還元型グルタチオン含有水溶液を通過させた後の液量の増加を抑え、かつ還元型グルタチオンの収率を大きく落とすことなく、Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシンを選択的に吸着、除去できることが分かった。【００５９】
［実施例２］
日本国特許第５２４３９６３号明細書に記載の方法で取得した還元型グルタチオンの結晶を水に溶解し、６０℃で１時間加熱してＬ−システイニル−Ｌ−グリシンの含有量を増加させた後、還元型グルタチオンを１００ｇ／Ｌの濃度で含む水溶液を調製した。【００６０】
水素イオン型に再生したＵＢＫＮ１Ｕ（架橋度１４％）、ＵＢＫ１２（架橋度１２％）、ＵＢＫ０８（架橋度８％）、ＵＢＫ０６（架橋度６％）（いずれも三菱化学社製）各１００ｍＬを充填した直径２ｃｍのガラスカラムを用意し、ＵＢＫＮ１Ｕには６４３ｍＬ、ＵＢＫ１２には６１６ｍＬ、ＵＢＫ０８には５３６ｍＬ、ＵＢＫ０６には４８２ｍＬの該水溶液を、室温下、ＳＶ１．０（１００ｍＬ／ｈ）の流速で通過させた。通過させる還元型グルタチオン含有水溶液の量は、それぞれの樹脂が持つ総交換容量に応じて調整した。【００６１】
還元型グルタチオン含有水溶液を通過させた後は、糖度（Ｂｒｉｘ）が１％を切るまで各樹脂の水洗を行い、還元型グルタチオン画分を回収した。還元型グルタチオンの収率、Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシンの除去率及び液量増加率の結果を表２に示す。【００６２】
【表２】
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【００６３】
表２に示すように、１２％以上の架橋度を有する高架橋度陽イオン交換樹脂を用いることにより、還元型グルタチオン含有水溶液を通過させた後の液量増加を抑え、かつ還元型グルタチオンの収率を大きく落とすことなく、Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシンを選択的に吸着、除去できることがわかった。【００６４】
［実施例３］
本発明の結晶の製造−１
国際公開第２０１１／１３２７２４号に記載された方法で取得した酸化型グルタチオンを、国際公開第２０１２／１３７８２４号に記載された方法で還元し、還元型グルタチオンを１６４ｇ／Ｌの濃度で含む水溶液を得た。得られた還元型グルタチオン含有水溶液を２５℃に保ちつつ、水素イオン型に再生したＵＢＫ１６（三菱化学社製）を充填したカラムに液空間速度ＳＶ２．５で通過させて還元型グルタチオンを含む画分を得た。【００６５】
この画分を加熱減圧下で５３０ｇ／Ｌまで濃縮し、得られた濃縮溶液を２５℃に保ちつつ、これに還元型グルタチオンのα晶の結晶（興人社製）を種晶として添加した。種晶添加後、２５℃で１７時間撹拌することで、還元型グルタチオンのα晶の結晶が起晶した水溶液を得た。得られた水溶液を１０℃まで冷却した後、０．３倍等量のエタノールを該水溶液に添加することにより還元型グルタチオンのα晶の結晶を晶析させた。【００６６】
得られたスラリーを遠心分離することにより水溶液層を除去した後に３０ｖ／ｖ％エタノールで結晶を洗浄し、４０℃の空気を通風させることで乾燥させ、本発明の結晶である還元型グルタチオンのα晶の結晶を取得した。【００６７】
［実施例４］
本発明の結晶の製造−２
国際公開第２０１１／１３２７２４号に記載された方法で取得した酸化型グルタチオンを、国際公開第２０１２／１３７８２４号に記載された方法で還元し、還元型グルタチオンを１７３ｇ／Ｌの濃度で含む水溶液を得た。【００６８】
得られた還元型グルタチオン含有水溶液を２５℃に保ちつつ、水素イオン型に再生したＵＢＫ１６（三菱化学社製）を充填したカラムに液空間速度ＳＶ２．５で通過させて還元型グルタチオンを含む画分を得た。この画分を加熱減圧下で４２６ｇ／Ｌまで濃縮し、得られた濃縮溶液を２５℃に保ちつつ、これに還元型グルタチオンのα晶の結晶（興人社製）を種晶として添加した。種晶添加後、２５℃で１９時間撹拌することで、還元型グルタチオンのα晶の結晶が起晶した水溶液を得た。【００６９】
得られた水溶液を１０℃まで冷却した後、０．３倍等量のエタノールを該水溶液に添加することにより還元型グルタチオンのα晶の結晶を晶析させた。得られたスラリーを遠心分離することにより水溶液層を除去した後に３０ｖ／ｖ％エタノールで結晶を洗浄し、４０℃の空気を通風させることで乾燥させ、本発明の結晶である還元型グルタチオンのα晶の結晶を取得した。【００７０】
市販の還元型グルタチオンの結晶（市販品Ａ及びＢ）、比較例で得られた還元型グルタチオンの結晶、並びに、実施例３及び４で得られた本発明の結晶をＨＰＬＣで分析し、該結晶に含有される不純物を測定した。ＨＰＬＣ分析の結果を表３に示す。表３において、還元型グルタチオンのピーク面積を１００としたときの各ピークの面積を示す。【００７１】
また、表３において、「Ｎ．Ｄ」は検出限界以下、「グルタチオン」は還元型グルタチオン、「γＧＣ−Ａｌａ」はγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−Ｌ−アラニン、「ＣｙｓＧｌｙ」はＬ−システイニル−Ｌ−グリシン、「ＧＳＳＧ」は酸化型グルタチオンをそれぞれ示す。【００７２】
【表３】
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【００７３】
表３に示すように、本発明の結晶は、市販品Ａ及びＢ、並びに比較例で得られた還元型グルタチオンの結晶と比較して、Ｌ−システイニル−Ｌ−グリシンの含有量が顕著に低く、さらに酸化型グルタチオン及びγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−Ｌ−アラニンなどの他の不純物の含有量も大幅に低いことが分かった。【００７４】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１６年３月１７日付けで出願された日本特許出願（特願２０１６−５３８４４号）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明により、不純物、特にＬ−システイニル−Ｌ−グリシンの含有量が低減した還元型グルタチオンの結晶、及びその製造方法が提供される。
【図１】
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【国際調査報告】
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