(57)【要約】  本発明の課題は、メチル化されたＤＮＡの増幅及びこれを用いたＤＮＡのメチル化判定並びに癌の判定を簡便に行うことができる方法を提供することにある。  本発明は、「メチル化された分析対象領域の増幅方法、分析対象領域のメチル化判定方法、メチル化判定用試薬、癌の判定方法、癌の判定を行うためのデータを得る方法、癌の判定用試薬および癌の判定を行うためのマーカー」に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程１及び２を含む、二本鎖ＤＮＡ中のメチル化された分析対象領域の増幅方法：
（１）分析対象領域を含む二本鎖ＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程１、
（２）
工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程２。
【請求項２】
前記工程１が、Ｓ１ヌクレアーゼで処理した後に、メチル化感受性制限酵素で処理する、請求項１に記載の増幅方法。
【請求項３】
前記工程１が、メチル化感受性制限酵素で処理した後に、Ｓ１ヌクレアーゼで処理する、請求項１に記載の増幅方法。
【請求項４】
前記工程１の前に、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、請求項１に記載の増幅方法。
【請求項５】
下記工程１〜４を含む、二本鎖ＤＮＡ中の分析対象領域のメチル化判定方法：
（１）分析対象領域を含む二本鎖ＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程１、
（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程２、
（３）工程２で得られた増幅産物の有無を確認する工程３、
（４）工程３の結果に基づいて、分析対象領域がメチル化されているか否かを判定する工程４。
【請求項６】
前記工程１が、Ｓ１ヌクレアーゼで処理した後に、メチル化感受性制限酵素で処理する、請求項５に記載のメチル化判定方法。
【請求項７】
前記工程１が、メチル化感受性制限酵素で処理した後に、Ｓ１ヌクレアーゼで処理する、請求項５に記載のメチル化判定方法。
【請求項８】
前記工程１の前に、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、請求項５に記載のメチル化判定方法。
【請求項９】
Ｓ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含む、ＤＮＡのメチル化判定用試薬。
【請求項１０】
下記工程１〜４を含む、癌の判定方法：
（１）分析対象領域を含む二本鎖ＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程１、
（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程２、
（３）工程２で得られた増幅産物の有無を確認する工程３、
（４）工程３の結果に基づいて、癌を判定する工程４。
【請求項１１】
前記工程１が、Ｓ１ヌクレアーゼで処理した後に、メチル化感受性制限酵素で処理する、請求項１０に記載の癌の判定方法。
【請求項１２】
前記工程１が、メチル化感受性制限酵素で処理した後に、Ｓ１ヌクレアーゼで処理する、請求項１０に記載の癌の判定方法。
【請求項１３】
前記工程１の前に、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、請求項１０に記載の癌の判定方法。
【請求項１４】
分析対象領域が配列番号１、配列番号４又は配列番号１１で表される塩基配列を含む塩基配列である、請求項１０に記載の癌の判定方法。
【請求項１５】
下記工程１〜３を含む、癌の判定を行うためのデータを得る方法：
（１）分析対象領域を含む二本鎖ＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程１、
（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程２、
（３）工程２で得られた増幅産物の有無を確認する工程３。
【請求項１６】
Ｓ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含む、癌の判定用試薬。
【請求項１７】
下記工程１及び２を行うことによって得られる、癌の判定を行うためのマーカー：
（１）分析対象領域を含む二本鎖ＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程１、
（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程２。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチル化されたＤＮＡの増幅方法、ＤＮＡのメチル化判定方法並びに癌の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡのメチル化とは、ＤＮＡメチラーゼによる塩基修飾のことであり、ＣｐＧ配列のシトシン塩基の５位等にメチル基が付加した状態のことである。
ＤＮＡのメチル化は、高等生物において、正常な発生と細胞の分化に極めて重要な役割を担っている。
現在、メチル化されたＤＮＡを増幅する方法としては、例えば、（１）ＤＮＡをバイサルファイト反応に付し、次いで、ＰＣＲ等の核酸増幅反応に付す方法（特許文献１）、（２）ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素及びメチル化非感受性制限酵素で処理し、次いで、ＰＣＲ等の核酸増幅反応に付す方法（特許文献２）が行われている。また、特許文献１および特許文献２では、メチル化されたＤＮＡを増幅する方法により得られた増幅産物をＤＮＡマイクロアレイ等により解析し、その結果に基づいて、ＤＮＡがメチル化されているか否かの判定や解析も行われている。
一方、ＤＮＡのメチル化は、癌化と関連することも知られている。例えば、ＤＮＡのメチル化のパターンの差異が癌や種々の疾患と関連していること（非特許文献１、２）や、ＤＮＡのメチル化率を元に癌を検出する方法等が行われている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／０８９０６３
【特許文献２】ＷＯ２００９／１３１２２３
【特許文献３】特開２００８−２８３９４７
【０００４】
【非特許文献１】Ｙｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １３：３１９−３３，  ２００３
【非特許文献２】Ｋａｎａｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２９：７０３−９，１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１のメチル化されたＤＮＡを増幅する方法は、バイサルファイト反応に付す工程を要する。また、特許文献２のメチル化されたＤＮＡを増幅する方法は、メチル化非感受性制限酵素で処理されたＤＮＡについてアダプターを連結し、その後除去する工程を要する。そのため、何れの方法も煩雑であり、多大な時間を要する。
従って、メチル化されたＤＮＡの増幅、更にはこれを用いたＤＮＡのメチル化判定及び癌の判定を簡便に行うことができる方法の開発が望まれていた。
即ち、本発明は、メチル化されたＤＮＡの増幅及びこれを用いたＤＮＡのメチル化判定並びに癌の判定を簡便に行うことができる方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は上記課題を解決する目的でなされたものであり、以下の構成よりなる。
［１］下記工程１及び２を含む、二本鎖ＤＮＡ中のメチル化された分析対象領域の増幅方法：
（１）分析対象領域を含む二本鎖ＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程１、
（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程２。
［２］前記工程１が、Ｓ１ヌクレアーゼで処理した後に、メチル化感受性制限酵素で処理する、［１］に記載の増幅方法。
［３］前記工程１が、メチル化感受性制限酵素で処理した後に、Ｓ１ヌクレアーゼで処理する、［１］に記載の増幅方法。
［４］前記工程１の前に、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、［１］〜［３］の何れかに記載の増幅方法。
［５］下記工程１〜４を含む、二本鎖ＤＮＡ中の分析対象領域のメチル化判定方法：
（１）分析対象領域を含む二本鎖ＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程１、
（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程２、
（３）工程２で得られた増幅産物の有無を確認する工程３、
（４）工程３の結果に基づいて、分析対象領域がメチル化されているか否かを判定する工程４。
［６］前記工程１が、Ｓ１ヌクレアーゼで処理した後に、メチル化感受性制限酵素で処理する、［５］に記載のメチル化判定方法。
［７］前記工程１が、メチル化感受性制限酵素で処理した後に、Ｓ１ヌクレアーゼで処理する、［５］に記載のメチル化判定方法。
［８］前記工程１の前に、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、［５］〜［７］の何れかに記載のメチル化判定方法。
［９］Ｓ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含む、ＤＮＡのメチル化判定用試薬。
［１０］下記工程１〜４を含む、癌の判定方法：
（１）分析対象領域を含む二本鎖ＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程１、
（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程２、
（３）工程２で得られた増幅産物の有無を確認する工程３、
（４）工程３の結果に基づいて、癌を判定する工程４。
［１１］前記工程１が、Ｓ１ヌクレアーゼで処理した後に、メチル化感受性制限酵素で処理する、［１０］に記載の癌の判定方法。
［１２］前記工程１が、メチル化感受性制限酵素で処理した後に、Ｓ１ヌクレアーゼで処理する、［１０］に記載の癌の判定方法。
［１３］前記工程１の前に、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、［１０］〜［１２］の何れかに記載の癌の判定方法。
［１４］分析対象領域が配列番号１、配列番号４又は配列番号１１で表される塩基配列を含む塩基配列である、［１０］〜［１３］の何れかに記載の癌の判定方法。
［１５］下記工程１〜３を含む、癌の判定を行うためのデータを得る方法：
（１）分析対象領域を含む二本鎖ＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程１、
（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程２、
（３）工程２で得られた増幅産物の有無を確認する工程３。
［１６］Ｓ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含む、癌の判定用試薬。
［１７］下記工程１及び２を行うことによって得られる、癌の判定を行うためのマーカー：
（１）分析対象領域を含む二本鎖ＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程１、
（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程２。
本発明は、更に以下の構成も含む。
［１８］下記工程１〜５を含む、分析対象領域のメチル化解析（判定）方法：
（１）分析対象領域を含むＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼで処理する工程１、
（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で処理する工程２、
（３）工程２で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程３、
（４）工程３で得られた増幅産物の有無を確認する工程４、
（５）工程４の結果に基づいて、分析対象領域がメチル化されているか否かの判定を行う工程５。
［１９］工程３の増幅をＰＣＲで行う、［１８］に記載の解析（判定）方法。
［２０］工程４の増幅産物の確認を電気泳動で行う、［１８］又は［１９］に記載の解析（判定）方法。
［２１］更に、工程１に続いて、工程１で処理されたＤＮＡを精製する精製工程を含む、［１８］〜［２０］の何れかに記載の解析（判定）方法。
［２２］精製工程の精製をカラム精製法により行う、［２１］に記載の解析（判定）方法。
［２３］更に、精製工程を行う前に、認識配列が分析対象領域に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、［２２］に記載の解析（判定）方法。
［２４］Ｓ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含む、ＤＮＡメチル化解析（判定）用試薬。
［２５］下記工程１〜５を含む、癌の判定方法：
（１）分析対象領域を含むＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼで処理する工程１、
（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で処理する工程２、
（３）工程２で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程３、
（４）工程３で得られた増幅産物の有無を確認する工程４、
（５）工程４の結果に基づいて、癌を判定する工程５。
［２６］分析対象領域がプロモーター領域である、［２５］に記載の判定方法。
［２７］工程２のメチル化感受性制限酵素がＨａｐＩＩ、ＨｐａＩＩ又はＳａｃＩＩである、［２５］又は［２６］に記載の判定方法。
［２８］工程３で増幅する核酸が、配列番号１で表される塩基配列を含む連続する塩基配列である、［２５］〜［２７］の何れかに記載の判定方法。
［２９］工程３の増幅をＰＣＲで行う、［２５］〜［２８］の何れかに記載の判定方法。
［３０］ＰＣＲが、配列番号２で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３で表されるリバースプライマーを用いてなされる、［２９］に記載の判定方法。
［３１］工程４の増幅産物の有無の確認を電気泳動で行う、［２５］〜［３０］の何れかに記載の判定方法。
［３２］更に、工程１に続いて、工程１で処理されたＤＮＡを精製する精製工程を含む、［２５］〜［３１］の何れかに記載の判定方法。
［３３］精製工程の精製をカラム精製法により行う、［３２］に記載の判定方法。
［３４］更に、精製工程を行う前に、認識配列が分析対象領域に存在しない制限酵素で処理する断片化工程を含む、［３３］に記載の判定方法。
［３５］下記工程１〜４を含む、癌の判定を行うためのデータを得る方法：
（１）分析対象領域を含むＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼで処理する工程１、
（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で処理する工程２、
（３）工程２で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程３、
（４）工程３で得られた増幅産物の有無を確認する工程４。
［３６］Ｓ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含む、癌の判定用試薬。
［３７］下記工程１〜３を行うことによって得られる、癌の判定を行うためのマーカー：
（１）分析対象領域を含むＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼで処理する工程１、
（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で処理する工程２、
（３）工程２で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程３。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の増幅方法、メチル化判定方法、癌の判定方法及び癌の判定を行うためのデータを得る方法によれば、メチル化されたＤＮＡの増幅、ＤＮＡのメチル化の判定、癌の判定及び癌の判定を行うためのデータの取得を簡便且つ短時間で行うことができる。【０００８】
更に、本発明の増幅方法、メチル化判定方法、癌の判定方法及び癌の判定を行うためのデータを得る方法によれば、ＰＣＲ等の増幅反応時における非特異的な増幅産物を排除することができるので、メチル化されたＤＮＡの増幅、ＤＮＡのメチル化の判定、癌の判定及び癌の判定を行うためのデータの取得を精度よく行うこともできる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の増幅方法のフローチャートを各種パターンに分けて示した図である。
【図２】本発明のメチル化判定方法及び癌の判定方法のフローチャートを各種パターンに分けて示した図である。
【図３】実験例１におけるメチル化状態の確認領域およびＨａｐＩＩ並びにＨｐａＩＩが認識する配列［ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子プロモーター領域内の配列番号１で表される塩基配列からなる領域（２６７塩基対）のうち、四角で囲まれた３つの、ＣｐＧ配列を含む配列（ＣＣＧＧ）］を示した図である。
【図４】実験例１において、各種正常細胞及び各種癌細胞の塩基配列解読結果について、メチル化状態の確認領域である３つの、ＣｐＧ配列を含む配列（ＣＣＧＧ）のシトシンがメチル化シトシンであるか非メチル化シトシンであるかを示した図である。
【図５】実施例１及び比較例１〜３において、正常細胞（ｈｉＰＳ）を用いてＦＯＸＢ２遺伝子のＰＣＲ増幅産物を泳動した結果を示した図である。
【図６】実施例２において、各種正常細胞を用いてＦＯＸＢ２遺伝子のＰＣＲ増幅産物を泳動した結果を示した図である。
【図７】実施例２において、各種癌細胞を用いてＦＯＸＢ２遺伝子のＰＣＲ増幅産物を泳動した結果を示した図である。
【図８】実施例３において、乳癌患者由来の癌細胞を用いてＦＯＸＢ２遺伝子のＰＣＲ増幅産物を泳動した結果を示した図である。
【図９】実施例４において、イヌ由来の癌細胞を用いてＦＯＸＢ２遺伝子のＰＣＲ増幅産物を泳動した結果を示した図である。
【図１０】ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子プロモーター領域内の配列番号１１で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）のうち、ＨｐａＩＩ及びＨａｐＩＩが認識する配列［四角で囲まれた３つの、ＣｐＧ配列を含む配列（ＣＣＧＧ）］を示した図である。
【図１１】実施例５において、肝臓癌患者および肺癌患者由来の血漿を用いてＧＡＰＤＨ遺伝子の特定領域をデジタルＰＣＲ法により増幅した結果を示した図である。
【図１２】実施例５において、肝臓癌患者および肺癌患者由来の血漿を用いてＦＯＸＢ２遺伝子の特定領域をデジタルＰＣＲ法により増幅した結果を示した図である。
【図１３】実施例６において、健常者由来の血漿を用いてＦＯＸＢ２遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の特定領域をデジタルＰＣＲ法により同時に増幅・検出した結果を示した図である。
【図１４】実施例７において、乳癌患者由来の血漿を用いてＦＯＸＢ２遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の特定領域をデジタルＰＣＲ法により同時に増幅・検出した結果を示した図である。
【図１５】実施例７において、大腸癌患者由来の血漿を用いてＦＯＸＢ２遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の特定領域をデジタルＰＣＲ法により同時に増幅・検出した結果を示した図である。
【図１６】実施例７において、膵臓癌患者由来の血漿を用いてＦＯＸＢ２遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の特定領域をデジタルＰＣＲ法により同時に増幅・検出した結果を示した図である。
【図１７】実施例７において、胃癌患者由来の血漿を用いてＦＯＸＢ２遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の特定領域をデジタルＰＣＲ法により同時に増幅・検出した結果を示した図である。
【図１８】実施例７において、抗癌剤投与後の肺癌患者由来の血漿を用いてＦＯＸＢ２遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の特定領域をデジタルＰＣＲ法により同時に増幅・検出した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜本発明の増幅方法＞
本発明の増幅方法は、（１）分析対象領域を含む二本鎖ＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程１、（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程２を含むことを特徴とするものである。
【００１１】
［二本鎖ＤＮＡ及び当該ＤＮＡの抽出］
本発明に係る二本鎖ＤＮＡとしては、ＣｐＧ配列（−ＣＧ−）を含む二本鎖ＤＮＡであれば何れでもよい。
【００１２】
本発明に係る二本鎖ＤＮＡは、当該ＤＮＡを含む試料から抽出すればよく、当該抽出方法は、自体公知のＤＮＡの抽出方法に基づいてなされればよい。当該ＤＮＡの抽出方法としては、具体的には、例えば、試料と界面活性剤（コール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム等）を含む処理液とを混合し、得られた混合液を物理的処理（撹拌、ホモジナイズ、超音波粉砕等）に付し、試料に含まれるＤＮＡを混合液中に遊離させることによりＤＮＡを抽出する方法、フェノール・クロロホルムを用いて試料からＤＮＡを抽出する方法、カラム抽出法等が挙げられる。中でも、フェノール・クロロホルムを用いて試料からＤＮＡを抽出する方法又はカラム抽出法がより好ましい。
【００１３】
フェノール・クロロホルムを用いて試料からＤＮＡを抽出する方法とは、試料中に含まれるタンパク質を変性させるフェノールの性質と、当該作用を促進させるクロロホルムの性質とに基づいて、試料中に存在するタンパク質を除き、ＤＮＡを抽出するというものである。具体的な方法は、自体公知の方法に基づいてなされればよい。
【００１４】
また、上記ＤＮＡ抽出方法は、市販のキット［例えば、Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ（ＱＴＢ（株）製）等］を用いて行ってもよい。
【００１５】
一方、カラム抽出法とは、メンブレン等を内部に備えたカラム等の筒状の容器に試料を添加し、物質の大きさ、吸着力、電荷、疎水性等の違いを利用して、試料中からＤＮＡを抽出するというものである。具体的な方法は、自体公知の方法に基づいてなされればよい。
【００１６】
また、上記ＤＮＡ抽出方法は、市販のキット［例えば、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ  ＳＰ  ｋｉｔ  ＤＮＡ  ｔｉｓｓｕｅ（倉敷紡績（株）製）、ＭａｇＭＡＸＴＭ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）、Ｎｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎ（商標）  Ｐｌａｓｍａ  ＸＳ（マッハライ・ナーゲル（株）製）等］を用いて行ってもよい。
【００１７】
上記試料としては、具体的には、例えば、全血、血清、血漿、尿等の体液、組織、細胞等が挙げられる。このような全血、血清、血漿、尿等の体液、組織、細胞等を試料として用いた場合、本発明の増幅方法により得られた増幅産物をＤＮＡのメチル化の判定や、ＤＮＡのメチル化が関連する疾患の判定又は／及び診断に利用することができる。
【００１８】
尚、上記試料を用いた場合の本発明に係る二本鎖ＤＮＡとしては、例えば、血清、血漿、尿等の体液中に存在する、循環癌（腫瘍）細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ：ＣＴＣ）由来の二本鎖ＤＮＡ、癌（腫瘍）細胞、白血球等の血液細胞、各組織由来の細胞等の死滅に由来する二本鎖ＤＮＡ［ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ  ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）］又はエクソソーム（エキソソーム）由来の二本鎖ＤＮＡや、組織、細胞、全血、尿等の中に存在する細胞由来の二本鎖ＤＮＡが挙げられる。
【００１９】
［分析対象領域］
本発明に係る分析対象領域は、本発明に係る二本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧ配列を含む連続した特定の二本鎖ＤＮＡ部分であり、本発明に係る二本鎖ＤＮＡの一部又は全部であってもよい。
このような分析対象領域のうち、本発明の増幅方法において増幅される分析対象領域は、シトシンがメチル化されたＣｐＧ配列を含む連続した特定の二本鎖ＤＮＡ部分である。
尚、上記「メチル化」とは、ＤＮＡメチラーゼによる塩基修飾のことであり、シトシンの次にグアニンが現れる２塩基配列であるＣｐＧ配列のシトシン塩基の５位等にメチル基が付加した状態を意味する。
【００２０】
本発明に係る分析対象領域の大きさ（塩基対数）は、通常５０〜１０００塩基対であり、５０〜７００塩基対が好ましく、５０〜５００塩基対がより好ましい。
本発明に係る分析対象領域としては、具体的には、例えば、任意に選択した適当な遺伝子のプロモーター領域内の特定領域のＤＮＡが挙げられ、ＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域内の特定領域のＤＮＡがより好ましく、ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域内の特定領域のＤＮＡまたはイヌ由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域内の特定領域のＤＮＡが更に好ましく、ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域内の配列番号１で表される塩基配列からなる領域（２６７塩基対）、ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域内の配列番号１１で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）またはイヌ由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域内の配列番号４で表される塩基配列からなる領域（４３３塩基対）が特に好ましい。
【００２１】
［工程１］
本発明に係る工程１は、分析対象領域を含む二本鎖ＤＮＡを、Ｓ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程である。
【００２２】
本発明に係る工程１におけるＳ１ヌクレアーゼとは、一本鎖特異的ヌクレアーゼの一種であり、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡの一本鎖の領域を分解する酵素である。
本発明に係る工程１におけるＳ１ヌクレアーゼの濃度（ユニット数）は、通常、目的のＤＮＡ１〜２００ｎｇに対して、１〜２００ユニット／μＬであり、５〜１９０ユニット／μＬが好ましく、２０〜１８０ユニット／μＬがより好ましい。
本発明に係る工程１におけるＳ１ヌクレアーゼによる処理は、通常１０〜３７℃で、好ましくは１５〜２５℃で、通常５〜３０分間、好ましくは１０〜２０分間反応を行えばよい。
また、本発明に係る工程１におけるＳ１ヌクレアーゼによる処理は、ｐＨ４〜５の条件の下なされることが好ましく、ここで用いられる緩衝液としては、例えば、酢酸ナトリウム緩衝液等を用いればよい。
【００２３】
本発明に係る工程１におけるメチル化感受性制限酵素とは、認識配列中におけるＣｐＧ配列中のシトシンがメチル化されているか否かにより切断活性が影響される制限酵素のことである。即ち、メチル化感受性制限酵素とは、認識配列がメチル化されたシトシン塩基を含むＣｐＧ配列を有する場合、当該認識配列を切断できないが、認識配列がメチル化されたシトシン塩基を含むＣｐＧ配列を有さない場合、当該認識配列を切断することができる制限酵素のことである。
本発明に係る工程１におけるメチル化感受性制限酵素は、認識する塩基配列が分析対象領域内に存在するものであれば、何れでもよい。即ち、分析対象領域に応じて適宜選択されればよい。
本発明に係る工程１におけるメチル化感受性制限酵素としては、具体的には、例えば、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｆａＩ、Ａｏｒ１３ＨＩ、Ａｏｒ５１ＨＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＢｇｌＩ、ＢｍｇＴ１２０Ｉ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、ＥａｅＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、ＨａｅＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｈａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＰｍａＣＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＶｐａＫ１１ＢＩ等が挙げられる。中でも、ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号１で表される塩基配列からなる領域を分析対象領域として設定した場合、ＨａｐＩＩ、ＨｐａＩＩ又はＳａｃＩＩを用いることが好ましく、ＨｐａＩＩ又はＨａｐＩＩを用いることがより好ましい。また、ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号１１で表される塩基配列からなる領域又はイヌ由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号４で表される塩基配列からなる領域を分析対象領域として設定した場合、ＨａｐＩＩ又はＨｐａＩＩを用いることが好ましい。
本発明に係る工程１におけるメチル化感受性制限酵素の濃度（ユニット数）は、通常、目的のＤＮＡ１〜２００ｎｇに対して、１〜５０ユニット／μＬであり、５〜５０ユニット／μＬが好ましく、１０〜５０ユニット／μＬがより好ましい。
本発明に係る工程１におけるメチル化感受性制限酵素による処理は、通常２０〜５０℃で、好ましくは３５〜４５℃で、通常６０〜１５０分間、好ましくは６０〜１２０分間反応を行えばよい。
また、本発明に係る工程１におけるメチル化感受性制限酵素による処理は、ｐＨ６〜８の条件の下なされることが好ましく、ここで用いられる緩衝液としては、例えば、トリス緩衝液等を用いればよい。
【００２４】
本発明に係る工程１において、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理とメチル化感受性制限酵素による処理は、（ｉ）同時に行っても、（ｉｉ）Ｓ１ヌクレアーゼによる処理の後に、メチル化感受性制限酵素による処理を行っても、又は（ｉｉｉ）メチル化感受性制限酵素による処理の後に、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理を行ってもよいが、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理とメチル化感受性制限酵素による処理とでは好ましいｐＨが異なるため、上記（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）がより好ましく、（ｉｉ）が更に好ましい。
【００２５】
更に、本発明に係る工程１におけるＳ１ヌクレアーゼによる処理又は／及びメチル化感受性制限酵素による処理の後、分析対象領域を含むＤＮＡを精製するのが好ましく、当該精製の詳細は、[精製工程]の項で詳述する。
また、本発明に係る工程１の前に、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理するのが好ましく、当該制限酵素の詳細は、［認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程］の項で詳述する。
【００２６】
このように、本発明に係る工程１におけるＳ１ヌクレアーゼによる処理を行うことにより、人為的操作および内因性の現象（ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のループ領域）により生じた一本鎖ＤＮＡを特異的に切断することができる。その結果、本発明に係る工程２（本発明に係る工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程）において非特異的な増幅産物の生成が抑制される。
また、本発明に係る工程１におけるメチル化感受性制限酵素による処理を行うことにより、メチル化されている二本鎖ＤＮＡの分析対象領域は切断されず、メチル化されていない二本鎖ＤＮＡの分析対象領域が切断されるため、メチル化されている二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を特異的に増幅させることができる。
従って、分析対象領域を含むＤＮＡを本発明に係る工程１で処理することにより、本発明に係る工程２において、メチル化されている二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を特異的且つ高感度に増幅することができる。
【００２７】
［工程２］
本発明に係る工程２は、本発明に係る工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程である。
本発明に係る工程２における増幅産物は、分析対象領域そのものであっても、分析対象領域以外の塩基配列（例えば、プライマー等）を含むものであってもよく、当該増幅産物の大きさ（塩基対数）としては、通常５０〜１１００塩基対であり、５０〜８００塩基対が好ましく、５０〜６００塩基対がより好ましい。
本発明に係る工程２における増幅産物としては、具体的には、例えば、任意に選択した適当な遺伝子のプロモーター領域内の特定領域のＤＮＡが挙げられ、ＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域内の特定領域のＤＮＡがより好ましく、ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域内の特定領域のＤＮＡまたはイヌ由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域内の特定領域のＤＮＡが更に好ましく、ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域内の配列番号１で表される塩基配列からなる領域（２６７塩基対）、ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域内の配列番号１１で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）またはイヌ由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域内の配列番号４で表される塩基配列からなる領域（４３３塩基対）が特に好ましい。
【００２８】
本発明に係る工程２における分析対象領域を増幅する方法は、特に制限されず、自体公知の方法に基づいてなされればよい。このような自体公知の増幅法としては、具体的には、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等が挙げられ、ＰＣＲ法がより好ましい。
【００２９】
上記ＰＣＲ法は、プライマー、核酸合成酵素、核酸合成基質、緩衝液、要すればプローブ等を用いて公知の方法により行えばよい。具体的には、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，Ｖｏｌ．１９，３７４９、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９４，Ｖｏｌ．１６，１１３４−１１３７や「目的別で選べるＰＣＲ実験プロトコール，  ２０１１，  ｐ．ｐ．  ５６−７３，  １２０−１３１」に記載の方法に基づいてなされればよい。
【００３０】
上記ＰＣＲ法としては、血清、血漿、尿等の体液中に存在する、ＣＴＣ由来のＤＮＡの特定領域、ｃｆＤＮＡの特定領域又はエクソソーム（エキソソーム）由来のＤＮＡの特定領域を分析対象領域として設定する場合、デジタルＰＣＲ法が好ましい。
【００３１】
上記デジタルＰＣＲ法とは、ＰＣＲ反応液を多数の小区画にＤＮＡ断片が１分子になるように分割してＰＣＲ反応を実施し、増幅産物が検出された小区画の数に基づいてターゲットＤＮＡを検出、定量するというものである。デジタルＰＣＲ法は、例えば、特表２０１４−５０６４６５号公報に記載の方法やＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  Ｖｏｌ．  ９６，  ｐ．ｐ  ９２３６−９２４１，  Ａｕｇｕｓｔ  １９９９  Ｇｅｎｅｔｉｃｓに記載の方法に基づいてなされればよい。
具体的には、例えば、鋳型となるＤＮＡ含有溶液、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマー対、プローブ、核酸合成基質、核酸合成酵素等を含むデジタルＰＣＲ用反応液を調製し、ドロップレット作製装置[例えば、ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）等]により当該反応液を多数のドロップレット（１サンプルにつき１万〜３万個）に分割する。その後、デジタルＰＣＲ装置［例えば、Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ３Ｄ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）等］により、ＰＣＲ反応を行えばよい。
【００３２】
上記ＰＣＲ法におけるフォワードプライマー及びリバースプライマー（以下、本発明に係るプライマーと略記する場合がある。）からなるプライマー対（以下、本発明に係るプライマー対と略記する場合がある。）は、本発明に係る分析対象領域を増幅するように設計されたものであれば何れでもよい。
本発明に係るプライマー対を構成するプライマーの大きさ（塩基数）としては、通常１０〜５０塩基であり、１０〜３５塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３０塩基が特に好ましい。
本発明に係るプライマー対としては、具体的には、例えば、ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号１で表される塩基配列からなる領域を、分析対象領域として設定した場合、フォワードプライマーとしては、配列番号２で表される塩基配列からなるものが好ましく、リバースプライマーとしては、配列番号３で表される塩基配列からなるものが好ましい。ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号１１で表される塩基配列からなる領域を、分析対象領域として設定した場合、フォワードプライマーとしては、配列番号１２で表される塩基配列からなるものが好ましく、リバースプライマーとしては、配列番号１３で表される塩基配列からなるものが好ましい。また、イヌ由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号４で表される塩基配列からなる領域を、分析対象領域として設定した場合、フォワードプライマーとしては、配列番号５で表される塩基配列からなるものが好ましく、リバースプライマーとしては、配列番号６で表される塩基配列からなるものが好ましい。
以下に、上記プライマー対を構成する各プライマーの塩基配列、名称及びプライマー対により増幅される領域を示す。
【００３３】
【表１】
2018043724.tif 000002
【００３４】
また、本発明に係るプライマー対は、本発明に係るプライマー対をそのまま用いることが好ましいが、フォワードプライマー又はリバースプライマーの何れか一方或いは両方を標識物質で標識したプライマーからなるものであってもよい。
【００３５】
本発明に係るプライマーを標識物質で標識する方法としては、特に制限されず、自体公知の方法に基づいてなされればよい。
本発明に係るプライマーを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、蛍光物質、放射性同位体、酵素及び発光物質など公知の標識物質が挙げられ、蛍光物質が特に好ましい。
例えば、蛍光物質としては、ＴＡＭＲＡＴＭ（シグマアルドリッチ（株）製）、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ６４７（インビトロジェン（株）製）、Ｃｙａｎｉｎｅ  Ｄｙｅ系のＣｙ３、Ｃｙ５（アマシャムバイオサイエンス（株）製）、フルオレセイン等が挙げられる。
放射性同位体としては、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ等が挙げられる。
酵素としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等が挙げられる。
発光物質としては、Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅａｓｔｅｒを含む化学発光試薬等が挙げられる。
【００３６】
本発明に係るプライマーを蛍光物質で標識する方法としては、例えば、フルオレセイン標識したヌクレオチドを自体公知の方法に基づいて、プライマーに取り込ませる方法が挙げられる。また、リンカーアームを有するヌクレオチドを配列のオリゴヌクレオチド中に置換する方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８６年、第１４巻、ｐ.６１１５参照）でもヌクレオチドを蛍光物質で標識することができる。例えば、５位にリンカーアームを有するウリジンを特開昭６０−５００７１７号公報に開示された合成法によりデオキシウリジンから化学合成し、そのデオキシウリジンを含有するオリゴヌクレオチドを合成し、次いでそのオリゴヌクレオチド鎖に蛍光物質を導入する方法がある（特開昭６０−５００７１７号公報）。
【００３７】
本発明に係るプライマーを放射性同位体で標識する方法としては、プライマーを合成する際に、放射性同位体で標識されたヌクレオチドを取り込ませることによって、プライマーを標識する方法や、プライマーを合成した後、放射性同位体で標識する方法等が挙げられる。具体的には、一般的に用いられるランダムプライマー法、ニックトランスレーション、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる５’末端標識法、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いた３’末端標識法等が挙げられる。
【００３８】
本発明に係るプライマーを酵素で標識する方法としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素分子を、標識するプライマーに直接共有結合させる等の直接標識法が挙げられる。
【００３９】
本発明に係るプライマーを発光物質で標識する方法としては、自体公知の方法に基づいて、ヌクレオチドを発光標識する方法が挙げられる。
【００４０】
また、「ビオチン−アビジン反応を利用した検出システム」に従って、上記の標識物質を本発明に係るプライマーに結合させてもよく、その場合には、自体公知の方法に基づいてなされればよい。
【００４１】
上記ＰＣＲ法におけるプローブ（以下、本発明に係るプローブと略記する場合がある。）は、本発明に係るプライマー対で本発明の増幅方法を行った場合に増幅される領域にハイブリダイズするように設計されたものであり、その５’末端がレポーター蛍光色素で標識され、３’末端がクエンチャー蛍光色素で標識されたものであれば何れでもよい。
本発明に係るプローブの大きさ（塩基数）としては、通常１０〜５０塩基であり、１５〜４０塩基が好ましく、２０〜３０塩基がより好ましい。
本発明に係るプローブとしては、具体的には、例えば、ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号１１で表される塩基配列からなる領域を、分析対象領域として設定した場合、配列番号１４で表される塩基配列からなるものが好ましい。
以下に、上記プローブの塩基配列および名称を示す。
【００４２】
【表２】
2018043724.tif 000003
【００４３】
本発明に係るプローブの５’末端をレポーター蛍光色素で、３’末端をクエンチャー蛍光色素で標識する方法としては、上記本発明に係るプライマー対を標識物質で標識する方法と同様である。
【００４４】
本発明に係るプローブをレポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素により標識するために用いられるレポーター蛍光色素としては、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ等が挙げられ、クエンチャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２等が挙げられる。
尚、本発明に係るプローブとして配列番号１４で表される塩基配列からなるものを用いた場合、レポーター蛍光色素としてはＦＡＭが好ましく、クエンチャー蛍光色素としてはＢＨＱ１が好ましい。
【００４５】
また、上記ＰＣＲ法における核酸合成酵素としては、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられ、核酸合成基質としては、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＧＴＴＰ）等が挙げられ、緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液等が挙げられるが、通常この分野で用いられているものであれば何れでもよい。
更に、上記ＰＣＲ用反応液中に、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４等の塩、ポリエチレングリコール、Ｔｒｉｔｏｎ（ユニオンカーバイド（株）製）、Ｎｏｈｉｄｅｔ（シェルケミカルズ（株）製）、ＣＨＡＰＳ（（株）同仁化学製）等の界面活性剤、プロクリン３００（シグマルドリッチ（株）製）等の防腐剤、ＨａｐＩＩ、ＨｐａＩＩ、ＳａｃＩＩ等のメチル化感受性制限酵素等が含まれていてもよい。
【００４６】
このように、本発明に係る工程２を行うことにより、本発明に係る工程１におけるメチル化感受性制限酵素により切断されずに残存するメチル化されている分析対象領域を特異的に増幅させることができる。
【００４７】
［精製工程］
本発明に係る精製工程は、ＤＮＡを精製する工程のことである。
これにより、引き続き行われる処理や工程の前に不純物を取り除くことができるため当該精製工程を行うのが好ましい。
本発明に係る精製工程を行う場合は、本発明に係る工程１の後且つ本発明に係る工程２の前、又は／及び後述する［認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程］の後且つ本発明に係る工程１の前に当該精製工程を行えばよい。
尚、本発明に係る工程１の後且つ本発明に係る工程２の前に当該精製工程を行う場合としては、以下の場合が挙げられる。
（ｉ）本発明に係る工程１においてＳ１ヌクレアーゼによる処理とメチル化感受性制限酵素による処理を同時に行う場合は、これらの処理の後且つ本発明に係る工程２の前に精製工程を行えばよい。
（ｉｉ）本発明に係る工程１においてＳ１ヌクレアーゼによる処理の後にメチル化感受性制限酵素による処理を行う場合は、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理の後、又は／及びメチル化感受性制限酵素処理の後、且つ本発明に係る工程２の前に精製工程を行えばよく、少なくともＳ１ヌクレアーゼによる処理の後（且つメチル化感受性制限酵素による処理の前）に精製工程を行うのが好ましい。
（ｉｉｉ）本発明に係る工程１においてメチル化感受性制限酵素による処理の後にＳ１ヌクレアーゼによる処理を行う場合は、メチル化感受性制限酵素による処理の後、又は／及びＳ１ヌクレアーゼによる処理の後、且つ本発明に係る工程２の前に精製工程を行えばよく、メチル化感受性制限酵素による処理の後及びＳ１ヌクレアーゼによる処理の後且つ本発明に係る工程２の前にそれぞれ精製工程を行うのが好ましい。
本発明に係る工程１におけるＳ１ヌクレアーゼによる処理と本発明に係る工程１におけるメチル化感受性制限酵素による処理および本発明に係る工程２とでは好ましいｐＨが異なる。そのため、上記（ｉｉ）の場合、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理の後に引き続いて当該精製工程を実施することにより、不純物を取り除くとともにｐＨを調整し、本発明に係る工程１におけるメチル化感受性制限酵素の反応を効率的に行うことができる。
また、上記（ｉｉｉ）の場合、メチル化感受性制限酵素による処理及びＳ１ヌクレアーゼによる処理に引き続いて当該精製工程を実施することにより、不純物を取り除くとともにｐＨを調整し、本発明に係る工程２を効率的に行うことができる。
【００４８】
本発明に係る精製工程は、通常この分野でなされる自体公知の精製方法であれば、特に制限されない。具体的には、例えば、アルコール沈殿法、カラム精製法等が挙げられ、ハイスループットに適用できる点から、カラム精製法がより好ましい。
【００４９】
アルコール沈殿法とは、親水性高分子であるＤＮＡの性質を利用して、ＤＮＡ含有溶液にアルコールを添加し、ＤＮＡを沈殿させることでＤＮＡを精製するというものである。アルコール沈殿法により精製を行う場合は、例えば、以下のように行えばよい。
即ち、ＤＮＡ含有溶液  １０〜１００μＬに、アルコール  ５０〜１００μＬ及び緩衝液  ３０〜１００μＬを加え、１００００〜２２０００×ｇで１〜３０分間遠心分離し、フロースルー液を回収することにより、精製されたＤＮＡが得られる。
上記アルコールとしては、イソプロパノール、エタノール、ブタノール等が挙げられ、イソプロパノール又はエタノールがより好ましく、イソプロパノールが更に好ましい。
上記緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられ、トリス緩衝液又はリン酸緩衝液がより好ましく、トリス緩衝液が更に好ましい。尚、上記緩衝液の濃度、ｐＨは通常この分野で用いられる範囲であればよい。
【００５０】
また、上記精製方法は、市販のキットを用いて行ってもよい。
【００５１】
カラム精製法とは、シリカゲル、ポリアクリルアミドゲル、セファクリル等の充填剤を内部に備えたカラム等の筒状の容器［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）、Ｍｏｂｉ  Ｓｐｉｎ  Ｓ−４０００（モレキュラーバイオテクノロジー（株）製）等］にＤＮＡ含有溶液を添加し、ＤＮＡと充填剤との親和性の違いを利用してＤＮＡを精製するというものである。カラム精製法により精製を行う場合は、例えば、以下のように行えばよい。
即ち、ＤＮＡ含有溶液  １０〜１５０μＬに、タンパク質変性剤  ２００〜７００μＬ又は／及び緩衝液  ２００〜７００μＬを加えて混合し、例えば、充填剤を充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜３分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。次いで、緩衝液  ５００〜７００μＬ及びアルコール  ５００〜７００μＬを加え、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜３分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。更に、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜１０分間遠心分離し、新しいチューブに交換し、緩衝液又は滅菌水  ２０〜６０μＬを加え、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜３分間遠心分離し、フロースルー液を回収することにより、精製されたＤＮＡが得られる。
上記タンパク質変性剤としては、グアニジン塩酸塩、ホルムアミド、尿素等が挙げられ、グアニジン塩酸塩がより好ましい。
上記アルコールとしては、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等が挙げられ、エタノール又はイソプロパノールがより好ましく、エタノールが更に好ましい。
上記緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられ、トリス緩衝液又はリン酸緩衝液がより好ましく、トリス緩衝液が更に好ましい。尚、上記緩衝液の濃度、ｐＨは通常この分野で用いられる範囲であればよい。
【００５２】
また、上記精製方法は、市販のキットを用いて行ってもよい。
【００５３】
［認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程］
本発明の増幅方法においては、試料から分析対象領域を含むＤＮＡを抽出した後、認識配列が分析対象領域内に存在しない制限酵素で処理する断片化工程（以下、本発明に係る断片化工程と略記する場合がある。）を行うのが好ましい。特に、血清、血漿、尿等の体液中に存在する、ＣＴＣ由来のＤＮＡの特定領域、ｃｆＤＮＡの特定領域又はエクソソーム（エキソソーム）由来のＤＮＡの特定領域を分析対象領域として設定する場合、当該断片化工程を行うのが好ましい。また、本発明に係る断片化工程を行う場合は、本発明に係る工程１を行う前に当該断片化工程を行えばよい。
本発明に係る断片化工程における制限酵素は、二本鎖ＤＮＡを切断するものであり、その認識配列が分析対象領域内に存在しないものであれば何れでもよく、分析対象領域に応じて、適宜選択されればよい。更に、本発明に係る断片化工程における制限酵素は、必要に応じて複数種用いてもよい。
上記「その認識配列が分析対象領域内に存在しない」とは、「制限酵素の認識配列が分析対象領域を切断することができない」または「制限酵素が分析対象領域中の塩基配列を認識しない」と同一の意味を表すものである。
本発明に係る断片化工程における制限酵素としては、ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号１で表される塩基配列からなる領域またはイヌ由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号４で表される塩基配列からなる領域を分析対象領域と設定した場合、ＢａｍＨＩ又は／及びＨｉｎｄＩＩＩを用いることが好ましい。また、ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号１１で表される塩基配列からなる領域を分析対象領域と設定した場合、ＭｂｏＩを用いることが好ましい。
【００５４】
本発明に係る断片化工程における制限酵素の濃度（ユニット数）は、通常、目的のＤＮＡ１〜２００ｎｇに対して、０．５〜３０ユニット／μＬであり、１〜２５ユニット／μＬが好ましい。また、複数種の制限酵素を用いた処理を行う場合の本発明に係る断片化工程における制限酵素の濃度（ユニット数）についても上記と同様であり、それぞれ通常、０．５〜３０ユニット／μＬであり、１〜２５ユニット／μＬが好ましい。
本発明に係る断片化工程における制限酵素による処理は、通常２０〜５０℃で、好ましくは３５〜４０℃で、通常６０〜１５０分間、好ましくは６０〜１２０分間反応を行えばよい。
【００５５】
また、本発明に係る断片化工程は、ｐＨ６〜８の条件の下なされることが好ましく、ここで用いられる緩衝液としては、例えば、トリス緩衝液等を用いればよい。
尚、上述の通り、本発明に係る断片化工程と本発明に係る工程１におけるメチル化感受性制限酵素による処理における好ましいｐＨは同じである。そのため、本発明に係る工程１におけるメチル感受性制限酵素による処理に加えて、本発明に係る断片化工程における制限酵素による処理と同時にメチル化感受性制限酵素による処理を行ってもよい。
【００５６】
このように、本発明に係る断片化工程を行うことにより、ＤＮＡ中の分析対象領域の外側のＤＮＡを断片化することができるので、引き続き行う工程の反応を効率的に行うことができる。
尚、当該断片化工程の後に、前述した精製工程を行ってもよい。
【００５７】
［本発明の増幅方法の具体例］
本発明の増幅方法の具体例を、（Ａ）血清、血漿、尿等の体液中に存在するＤＮＡの特定領域を分析対象領域として設定する場合、（Ｂ）組織、細胞、全血、尿等の中に存在するＤＮＡの特定領域を分析対象領域として設定する場合に分けて、以下に説明する。
【００５８】
（Ａ）血清、血漿、尿等の体液中に存在するＤＮＡの特定領域（例えば、配列番号１１で表される塩基配列からなる領域）を分析対象領域として設定する場合
（１）ＤＮＡの抽出
例えば、核酸抽出キット［例えば、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）  Ｐｌａｓｍａ  ＸＳ（マッハライ・ナーゲル（株）製）又はＭａｇＭＡＸＴＭ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）］により、試料（例えば、血漿）からＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ）を抽出する。
（２）本発明に係る断片化工程
上記（１）で得たＤＮＡに、本発明に係る断片化工程における緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ５〜１５μＬおよび０．５〜３０ユニット／μＬ  断片化工程における制限酵素（例えば、ＭｂｏＩ）  ０．５〜５μＬを加え、滅菌水で５０〜１００μＬに調製する。尚、１〜５０ユニット／μＬ  メチル化感受性制限酵素（例えば、ＨａｐＩＩ又はＨｐａＩＩ）  ０．５〜５μＬを含むのが好ましい。
その後、２０〜５０℃で６０〜１５０分間反応させて本発明に係る断片化工程で処理された溶液を得る。
更に、必要に応じて、本発明に係る断片化工程で処理された溶液を以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
即ち、上記本発明に係る断片化工程で処理された溶液に、タンパク質変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩）  ５００〜７００μＬ及び緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ｐＨ５〜８  ５００〜７００μＬを加えて混合し、例えば、充填剤を充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜３分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ｐＨ５〜８  ５００〜７００μＬ及びアルコール（例えば、エタノール）  ５００〜７００μＬを加え、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜５分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。この操作をもう一度繰り返し、更に、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜５分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、滅菌水  ２０〜６０μＬを加え、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜３分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
上記で得られた、本発明に係る断片化工程で処理された溶液又はフロースルー液を、本発明に係る工程１に付す。
（３）本発明に係る工程１
（３）−１  Ｓ１ヌクレアーゼによる処理
上記本発明に係る断片化工程で処理された溶液又はフロースルー液  ４０〜６０μＬに、滅菌水  ２０〜５０μＬ、本発明に係る工程１における緩衝液（例えば、酢酸ナトリウム緩衝液）  ５〜１５μＬ及び１〜２００ユニット／μＬ  Ｓ１ヌクレアーゼ  ０．５〜１．５μＬを加え、１０〜３７℃で１０〜２０分間反応させて本発明に係る工程１（Ｓ１ヌクレアーゼによる処理）で処理された溶液を得る。
更に、必要に応じて、本発明に係る工程１（Ｓ１ヌクレアーゼによる処理）で処理された溶液を以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
即ち、上記本発明に係る工程１（Ｓ１ヌクレアーゼによる処理）で処理された溶液に、タンパク質変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩）  ５００〜７００μＬ及び緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ｐＨ５〜８  ５００〜７００μＬを加えて混合し、例えば、充填剤を充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜３分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ｐＨ５〜８  ５００〜７００μＬ及びアルコール（例えば、エタノール）  ５００〜７００μＬを加え、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜５分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。この操作をもう一度繰り返した後、更に、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜５分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、滅菌水  ２０〜６０μＬを加え、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜３分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
上記で得られた、本発明に係る工程１（Ｓ１ヌクレアーゼによる処理）で処理された溶液又はフロースルー液を、本発明に係る工程１（メチル化感受性制限酵素による処理）に付す。
（３）−２  メチル化感受性制限酵素による処理
上記本発明に係る工程１（Ｓ１ヌクレアーゼによる処理）で処理された溶液又はフロースルー液  ４０〜６０μＬに、滅菌水  ２０〜５０μＬ、本発明に係る工程１における緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ５〜１５μＬ及び１〜５０ユニット／μＬ  メチル化感受性制限酵素（例えば、ＨａｐＩＩ又はＨｐａＩＩ）  １〜５μＬを加え、２０〜５０℃で６０〜１５０分間反応させて本発明に係る工程１（メチル化感受性制限酵素による処理）で処理された溶液を得る。
更に、必要に応じて、本発明に係る工程１（メチル化感受性制限酵素による処理）で処理された溶液を以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
即ち、上記本発明に係る工程１（メチル化感受性制限酵素による処理）で処理された溶液に、タンパク質変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩）  ５００〜７００μＬ及び緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ｐＨ５〜８  ５００〜７００μＬを加えて混合し、例えば、充填剤を充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜３分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ｐＨ５〜８  ５００〜７００μＬ及びアルコール（例えば、エタノール）  ５００〜７００μＬを加え、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜５分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。この操作をもう一度繰り返し、更に、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜５分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、滅菌水  ２０〜６０μＬを加え、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜３分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
上記で得られた、本発明に係る工程１（メチル化感受性制限酵素による処理）で処理された溶液又はフロースルー液を、本発明に係る工程２に付す。
（４）本発明の増幅方法に係る工程２
上記本発明に係る工程１で処理された溶液又はフロースルー液  １〜３μＬに、滅菌水  ４〜６μＬ、核酸合成基質、核酸合成酵素等を含むデジタルＰＣＲ用試薬［例えば、ｄｄＰＣＲＴＭＳｕｐｅｒｍｉｘ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）］  ５〜１２μＬ、１〜２０μＭ  フォワードプライマー（例えば、ｈｃｆ−Ｆ−ｆｏｘ）  ０．５〜１．５μＬ、１〜２０μＭ  リバースプライマー（例えば、ｈｃｆ−Ｒ−ｆｏｘ）  ０．５〜１．５μＬ、１〜１０μＭ  プローブ（例えば、ｈｃｆ−Ｐｒｏｂｅ  ｆｏｘ）  ０．５〜１μＬ及び１〜５０ユニット／μＬ  メチル化感受性制限酵素（例えば、ＨａｐＩＩ又はＨｐａＩＩ）  ０．５〜１．５μＬを加え、デジタルＰＣＲ用反応液を調製する。次いで、上記デジタルＰＣＲ用反応液を核酸増幅装置［例えば、サーマルサイクラ―（バイオ・ラッド（株）製）］にセットし、３０〜４０℃で３０〜６０分間インキュベートする。その後、ドロップレット作製装置［例えば、ＱＸ  ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）又はＡｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）］にてドロップレットを作製する。次いで、該ドロップレットをウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）に分注した後、核酸増幅装置［例えば、サーマルサイクラ―（バイオ・ラッド（株）製）］を用いて、９０〜９７℃で５〜１５分間加熱した後、（１）９０〜９５℃で２５〜３０秒間、（２）６０〜６５℃で３０〜９０秒間を１サイクルとして、３０〜５０サイクル加熱することにより、メチル化されている分析対象領域（例えば、配列番号１１で表される塩基配列からなる領域）を増幅させることができる。
【００５９】
（Ｂ）組織、細胞、全血、尿等の中に存在するＤＮＡの特定領域（例えば、配列番号１で表される塩基配列からなる領域）を分析対象領域として設定する場合。
【００６０】
（１）ＤＮＡの抽出
例えば、核酸抽出キット［例えば、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ  ＳＰ  ｋｉｔ  ＤＮＡ  ｔｉｓｓｕｅ（倉敷紡績（株）製）］により、試料（例えば、細胞）からＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を抽出する。
（２）本発明に係る断片化工程
上記（１）で得たＤＮＡに、本発明に係る断片化工程における緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ３〜７μＬ及び０．５〜２５ユニット／μＬ  断片化工程における制限酵素（例えば、ＢａｍＨＩ又は／及びＨｉｎｄＩＩＩ）  ０．５〜１．５μＬを加え、滅菌水で３０〜６０μＬに調製する。その後、２０〜５０℃で４０〜８０分間反応させて、本発明に係る断片化工程で処理された溶液を得る。
更に、必要に応じて、本発明に係る断片化工程で処理された溶液を以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
即ち、上記本発明に係る断片化工程で処理された溶液に、タンパク質変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩）  ２００〜３００μＬ及び緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ｐＨ５〜８  ２００〜３００μＬを加えて混合し、例えば、充填剤を充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜３分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ｐＨ５〜８  ５００〜７００μＬ及びアルコール（例えば、エタノール）  ５００〜７００μＬを加え、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜５分間遠心分離し、新しいチューブに交換し、緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ２０〜４０μＬを加え、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜３分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
上記で得られた、本発明に係る断片化工程で処理された溶液又はフロースルー液を、本発明に係る工程１に付す。
（３）本発明に係る工程１
（３）−１  Ｓ１ヌクレアーゼによる処理
上記本発明に係る断片化工程で処理された溶液又はフロースルー液  ２０〜４０μＬに、滅菌水  １５〜２５μＬ、本発明に係る工程１における緩衝液（例えば、酢酸ナトリウム緩衝液）  ２〜６μＬ及び１〜２００ユニット／μＬ  Ｓ１ヌクレアーゼ  ０．５〜１．５μＬを加え、１０〜３７℃で１０〜２０分間反応させる。その後、反応停止液（例えば、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ）  ０．５〜１．５μＬを加え、２５〜３５μＬの緩衝液（例えば、トリス緩衝液）で溶出し、本発明に係る工程１（Ｓ１ヌクレアーゼによる処理）で処理された溶液を得る。
更に、必要に応じて、本発明に係る工程１で処理された溶液を以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
即ち、上記本発明に係る工程１（Ｓ１ヌクレアーゼによる処理）で処理された溶液  １０〜２０μＬに、タンパク質変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩）  ２００〜３００μＬ及び緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ｐＨ５〜８  ２００〜３００μＬを加えて混合し、例えば、充填剤で充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜３分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ｐＨ５〜８  ５００〜７００μＬ及びアルコール（例えば、エタノール）  ５００〜７００μＬを加え、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜５分間遠心分離し、新しいチューブに交換し、緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ２０〜４０μＬを加え、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜３分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
上記で得られた、本発明に係る工程１（Ｓ１ヌクレアーゼによる処理）で処理された溶液又はフロースルー液を、本発明に係る工程１（メチル化感受性制限酵素による処理）に付す。
（３）−２  メチル化感受性制限酵素による処理
上記本発明に係る工程１（Ｓ１ヌクレアーゼによる処理）で処理された溶液又はフロースルー液  ２０〜３０μＬに、滅菌水  ５〜１５μＬ、本発明に係る工程１における緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ２〜６μＬ及び１〜５０ユニット／μＬ  メチル化感受性制限酵素（例えば、ＨａｐＩＩ、ＨｐａＩＩ又はＳａｃＩＩ）  ０．５〜１．５μＬを加え、２０〜５０℃で６０〜１５０分間反応させて本発明に係る工程１（メチル化感受性制限酵素による処理）で処理された溶液を得る。
更に、必要に応じて、本発明に係る工程１（メチル化感受性制限酵素による処理）で処理された溶液を以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
即ち、上記本発明に係る工程１（メチル化感受性制限酵素による処理）で処理された溶液に、タンパク質変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩）  ２００〜３００μＬ及び緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ｐＨ５〜８  ２００〜３００μＬを加えて混合し、例えば、充填剤で充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜３分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ｐＨ５〜８  ５００〜７００μＬ及びアルコール（例えば、エタノール）  ５００〜７００μＬを加え、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜５分間遠心分離し、新しいチューブに交換し、緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ２０〜４０μＬを加え、１００００〜２２０００×ｇ、室温で１〜３分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
上記で得られた、本発明に係る工程１（メチル化感受性制限酵素による処理）で処理された溶液又はフロースルー液を、本発明に係る工程２に付す。
（４）本発明に係る工程２
上記本発明に係る工程１で処理された溶液又はフロースルー液  ０．５〜１．５μＬに、滅菌水  １５〜２０μＬ、ＰＣＲ反応用緩衝液（例えば、トリス緩衝液）  ２〜３μＬ、核酸合成基質  １．５〜２．５μＬ、１〜１０ユニット／μＬ  核酸合成酵素  ０．１〜０．３μＬ、５〜１５μＭ  フォワードプライマー（例えば、ｈ−Ｆ−ｆｏｘ）  ０．５〜１．５μＬ及び５〜１５μＭ  リバースプライマー（例えば、ｈ−Ｒ−ｆｏｘ）  ０．５〜１．５μＬを加えＰＣＲ用反応液を調製する。次いで、核酸増幅装置［例えば、サーマルサイクラ―（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）］を用いて、９２〜９６℃で１〜３分間加熱した後、（１）９２〜９８℃で２〜１０秒間、（２）６５〜７２℃で１０〜２０秒間を１サイクルとして、３０〜６０サイクル加熱した後、更に、６５〜７２℃で５０〜７０秒加熱することにより、メチル化されている分析対象領域（例えば、配列番号１で表される塩基配列からなる領域）を増幅させることができる。
【００６１】
本発明の増幅方法のフローチャートを各種パターンに分けて図１に示す。本発明の増幅方法としては、パターン１〜５の方法が挙げられるが、パターン１〜３がより好ましく、パターン１又は２が更に好ましく、パターン１が特に好ましい。
【００６２】
＜本発明のメチル化判定方法＞
本発明のメチル化判定方法は、本発明の増幅方法により得られた結果に基づいて、分析対象領域がメチル化されているか否かを判定するものである。
即ち、上述した本発明の増幅方法に引き続いて、増幅産物の確認および分析対象領域がメチル化されているか否かを判定するものであり、（１）Ｓ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程１、（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程２、（３）工程２で得られた増幅産物の有無を確認する工程３、（４）工程３の結果に基づいて、分析対象領域がメチル化されているか否かを判定する工程４を含むことを特徴とするものである。
尚、増幅産物を得るまでの工程３の前までの工程（工程１及び２）は、前述した本発明の増幅方法と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。工程３以降について以下に詳述する。
【００６３】
［工程３］
本発明に係る工程３は、本発明に係る工程２で得られた増幅産物の有無を確認する工程である。即ち、本発明に係る工程２においては、メチル化されている分析対象領域が増幅されるため、本発明に係る工程３は、そのメチル化されている分析対象領域の有無を確認する工程である。
【００６４】
本発明に係る工程３における増幅産物の有無を確認する方法は、通常、この分野でなされている方法であれば、特に制限されず、自体公知の方法に基づいてなされればよい。
具体的には、例えば、（ａ）電気泳動により確認する方法、（ｂ）蛍光リーダーにより確認する方法等が挙げられる。
【００６５】
（ａ）電気泳動により確認する方法
電気泳動により確認する方法とは、本発明に係る工程２で得られた増幅産物を、電気泳動により分離し、確認する方法であり、具体的な方法としては、（ａ−１）標識プライマー法、（ａ−２）インターカレーター法、（ａ−３）標識プローブ法等が挙げられる。
【００６６】
（ａ−１）標識プライマー法
標識プライマー法とは、『本発明に係るプライマーの少なくとも一方を標識物質で標識した標識プライマーを含むプライマー対を用い、本発明に係る工程２を行う。次いで、得られた増幅産物を電気泳動により分離し、該増幅産物中の標識を検出することにより、本発明に係る工程２で得られた増幅産物の有無を確認する』方法である。
尚、本明細書において、「標識を検出する」とは、標識物質の性質に基づいて標識物質を直接又は間接的に測定することを意味する。
標識プライマー法における電気泳動としては、物質の荷電強度に依存して異なる速度で移動又は異なる距離を移動する方法に基づくものであればよく、具体的には、例えば、アガロースゲル電気泳動法、アクリルアミドゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法等が挙げられ、アガロースゲル電気泳動法又はキャピラリー電気泳動法がより好ましい。
尚、上記アガロースゲル電気泳動法は、例えば、「バイオ実験イラステッドＩＩ遺伝子解析の基礎，  ２００６，  ｐ．ｐ．  ５３−５６」に記載の方法に基づいてなされればよい。また、上記キャピラリー電気泳動法は、例えば、ＷＯ２００７／０２７４９５、ＷＯ２０１１／１１８４９６、ＷＯ２００８／０７５５２０等に記載の方法に基づいてなされればよい。
【００６７】
（ａ−２）インターカレーター法
インターカレーター法とは、『本発明に係るプライマー対を用い、本発明に係る工程２を行い、得られた増幅産物を電気泳動により分離する。次いで、該増幅産物をインターカレーターで染色し、該インターカレーター由来の蛍光を検出することにより、本発明に係る工程２で得られた増幅産物の有無を確認する』方法である。
インターカレーター法における電気泳動としては、（ａ−１）標識プライマー法と同じものが挙げられ、好ましいものも同じである。
また、インターカレーター法におけるインターカレーターとしては、通常、この分野で用いられているインターカレーターであれば何れでもよい。具体的には、例えば、（１）〜（５）のインターカレーター並びに下記（６）及び（７）のインターカレーター類似物質が挙げられる。
（１）エチジウム化合物［例えば、エチジウムブロマイド、エチジウムホモダイマー１（ＥｔｈＤ−１）、エチジウムホモダイマー２（ＥｔｈＤ−２）、臭化エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）、ジヒドロエチジウム等］、
（２）アクリジン色素（例えば、アクリジンオレンジ等）、
（３）ヨウ素化合物（ヨウ素化プロピジウム、ヨウ素化ヘキシジウム等）、シアニンダイマー系色素［例えば、ＰＯＰＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＪＯＪＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＬＯＬＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−３（何れもモレキュラープローブ（株）製）等］、
（４）シアニンモノマー系色素［例えば、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５（何れもモレキュラープローブ（株）製）等］、
（５）ＳＹＴＯＸ系色素［例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ（何れもモレキュラープローブ（株）製）等］、ＧｅｌＲｅｄ系色素［例えば、ＧｅｌＲｅｄ核酸ゲル染色液（和光純薬工業（株）製）等］、
（６）ＤＮＡ二重らせんのマイナーグルーブに結合するもの〔例えば、４’,６-ジアミジノ-2-フェニルインドール（ＤＡＰＩ：モレキュラープローブ（株）製）等〕、
（７）アデニン−チミン（Ａ−Ｔ）配列に特異的に結合するもの〔例えば、ペンタハイドレ−ト（ビス−ベンズイミド）（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８：モレキュラープローブ（株）製）、トリヒドロクロライド（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２：モレキュラープローブ（株）製）、ビスベンズイミド色素（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３４５８０：モレキュラープローブ（株）製）等］が挙げられる。中でも、ＳＹＴＯＸ系色素［例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ（何れもモレキュラープローブ（株）製）等］、ＧｅｌＲｅｄ系色素［例えば、ＧｅｌＲｅｄ核酸ゲル染色液（和光純薬工業（株）製）等］がより好ましく、ＧｅｌＲｅｄ系色素［例えば、ＧｅｌＲｅｄ核酸ゲル染色液（和光純薬工業（株）製）等］が特に好ましい。
【００６８】
（ａ−３）標識プローブ法
標識プローブ法とは、『本発明に係るプライマー対を用い、本発明に係る工程２を行い、得られた増幅産物を電気泳動により分離する。次いで、該増幅産物を熱処理に付すことにより、一本鎖にする。次いで、標識物質で標識された、該増幅産物の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブをハイブリダイズさせることで、ハイブリッド体を得て、該ハイブリッド体中の標識を検出することにより、本発明に係る工程２で得られた増幅産物の有無を確認する』方法である。
標識プローブにおける電気泳動としては、（ａ−１）標識プライマー法と同じものが挙げられ、好ましいものも同じである。
【００６９】
（ｂ）蛍光リーダーにより検出する方法
蛍光リーダーにより検出する方法とは、『本発明に係るプライマー対およびプローブを用いた本発明に係る工程２を行い、その後、各ドロップレット由来の蛍光を蛍光リーダーにより検出することにより、本発明に係る工程２で得られた増幅産物の有無を確認する』方法である。
蛍光リーダーにより検出する方法における蛍光リーダーとしては、デジタルＰＣＲ装置に付属のもの［例えば、ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒ（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）等］を用いればよい。
【００７０】
このように本発明に係る工程３を行うことにより、メチル化されている分析対象領域が増幅されているか否かを確認することができる。
【００７１】
［工程４］
本発明のメチル化判定方法に係る工程４は、本発明に係る工程３の結果に基づいて分析対象領域がメチル化されているか否かの判定を行う工程である。
即ち、本発明に係る分析対象領域がメチル化されているか否かの判定は、本発明に係る工程２で増幅された増幅産物の有無の確認の結果に基づいてなされる。分析対象領域がメチル化されている場合、本発明に係る工程２において、当該分析対象領域が増幅されるので、増幅産物が得られる。一方、分析対象領域がメチル化されていない場合、本発明に係る工程２において、当該分析対象領域が増幅されないので、増幅産物が得られない。これは、本発明に係る工程１におけるメチル化感受性制限酵素の性質によるものである。
つまり、分析対象領域がメチル化されている場合、メチル化感受性制限酵素で処理しても、分析対象領域は切断されないので、本発明に係る工程２の増幅反応において分析対象領域が増幅され、本発明に係る工程３において増幅産物が確認される。
一方、分析対象領域がメチル化されていない場合、メチル化感受性制限酵素により分析対象領域が切断されるので、本発明に係る工程２において分析対象領域が増幅されず、本発明に係る工程３において増幅産物が確認されない。
従って、本発明に係る工程３において（ａ）電気泳動により確認する方法を行った場合、（ｉ）増幅産物が確認された場合、当該分析対象領域はメチル化されていると判定することができ、（ｉｉ）増幅産物が確認されなかった場合、当該分析対象領域はメチル化されていないと判定することができる。
一方、本発明に係る工程３において（ｂ）蛍光リーダーにより確認する方法を行った場合、（ｉ）予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが少なくとも１つ確認された場合、当該分析対象領域はメチル化されていると判定することができ、（ｉｉ）予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが確認されなかった場合、当該分析対象領域はメチル化されていないと判定することができる。
尚、上記閾値については、上記蛍光リーダー［例えば、ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒ（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）］の閾値設定機能に従って決定してもよく、分析対象領域を増幅した結果から決定してもよい。
【００７２】
このように本発明のメチル化判定方法に係る工程４を行うことにより、分析対象領域がメチル化されているか否かの判定を行うことができる。
【００７３】
また、本発明のメチル化判定方法は、上記のように増幅産物の有無を確認することで、分析対象領域がメチル化されているか否かを判定することができるため、非常に簡便な方法である。
【００７４】
［本発明のメチル化判定方法の具体例］
本発明のメチル化判定方法の具体例を、（Ａ）血清、血漿、尿等の体液中に存在するＤＮＡの特定領域を分析対象領域として設定する場合、（Ｂ）組織、細胞、全血、尿等の中に存在するＤＮＡの特定領域を分析対象領域として設定する場合に分けて、以下に説明する。
【００７５】
（Ａ）血清、血漿、尿等の体液中に存在するＤＮＡの特定領域（例えば、配列番号１１で表される塩基配列からなる領域）を分析対象領域として設定する場合
（１）ＤＮＡの抽出、（２）本発明に係る断片化工程、（３）本発明に係る工程１および（４）本発明に係る工程２については、［本発明の増幅方法の具体例］で説明した通りである。
（５）本発明に係る工程３
各ドロップレットにおける上記本発明に係る工程２で増幅された増幅産物中の蛍光を、蛍光リーダー［例えば、ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒ（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）等］により検出することにより、上記本発明に係る工程２で増幅された増幅産物の有無を確認することができる。
（６）本発明のメチル化判定方法に係る工程４
上記本発明に係る工程３の増幅産物の有無の確認の結果、予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが少なくとも１つ確認された場合、「その分析対象領域はメチル化されている」と判定することができる。一方、予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが確認されなった場合、「その分析対象領域はメチル化されていない」と判定することができる。
【００７６】
（Ｂ）組織、細胞、全血、尿等の中に存在するＤＮＡの特定領域を分析対象領域（例えば、配列番号１で表される塩基配列からなる領域）として設定する場合
（１）ＤＮＡの抽出、（２）本発明に係る断片化工程、（３）本発明に係る工程１および（４）本発明に係る工程２については、［本発明の増幅方法の具体例］で説明した通りである。
（５）本発明に係る工程３
上記本発明に係る工程２で増幅された増幅産物を、分子量マーカーとともに、０．５〜５％アガロースゲル電気泳動に付す。次いで、インターカレーター［例えば、ＧｅｌＲｅｄ核酸ゲル染色液（和光純薬工業（株）製）等］で染色した後、ＵＶ照射して増幅産物を検出することにより、上記本発明に係る工程２で増幅された増幅産物の有無を確認することができる。
（６）本発明のメチル化判定方法に係る工程４
上記本発明に係る工程３の増幅産物の有無の確認の結果、増幅産物が確認された場合、「その分析対象領域はメチル化されている」と判定することができる。一方、増幅産物が確認されなかった場合、「その分析対象領域はメチル化されていない」と判定することができる。
【００７７】
本発明のメチル化判定方法のフローチャートを各種パターンに分けて図２に示す。本発明のメチル化判定方法としては、パターン１〜５の方法が挙げられるが、パターン１〜３がより好ましく、パターン１又は２が更に好ましく、パターン１が特に好ましい。
【００７８】
尚、本発明のメチル化判定方法を行った後、必要に応じて、バイサルファイトシークエンス解析、マイクロアレイ解析等を行ってもよい。これにより、本発明に係る分析対象領域がメチル化されているか否かだけでなく、どのＣｐＧ配列がメチル化されているのかが分かる。
【００７９】
＜本発明のメチル化判定用試薬＞
本発明のメチル化判定用試薬は、Ｓ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含むことを特徴とするものである。
本発明のメチル化判定用試薬に用いられるメチル化感受性制限酵素の具体例及び好ましい例は、前述の通りである。
さらに、この分野で通常用いられる下記のような試薬類何れか１種以上を加えて、本発明の判定用試薬とすることもできる。
ａ）ＤＮＡ精製用のカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）等］、
ｂ）ＰＣＲ等の増幅反応用試薬（例えば、１種又は複数種のプライマー、プローブ、核酸合成基質、核酸合成酵素等）、
ｃ）断片化用の制限酵素、
ｄ）核酸増幅産物確認用試薬［例えば、アガロースゲル、ローディング緩衝液、染色用試薬（Ｇｅｌ  Ｒｅｄ系染色液、臭化エチジウム等）］、
ｅ）ＤＮＡ抽出用試薬[例えば、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ  ＳＰ  ｋｉｔ  ＤＮＡ  ｔｉｓｓｕｅ（倉敷紡績（株）製）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）  Ｐｌａｓｍａ  ＸＳ（マッハライ・ナーゲル（株）製）又はＭａｇＭＡＸＴＭ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）等]。
また、本発明のメチル化判定用試薬には、本発明のメチル化判定方法を実施するための説明書等を含ませておいてもよい。当該「説明書」とは、本発明のメチル化判定方法における特徴、原理および操作手順などが文章又は図表等により実質的に記載されている本発明のメチル化判定用試薬の取り扱い説明書、添付文章或いはパンフレット（リーフレット）等を意味する。
このように本発明のメチル化判定用試薬により、本発明のメチル化判定方法を簡便、短時間で且つ精度よく行うことができる。
【００８０】
＜本発明の癌の判定方法＞
本発明の癌の判定方法は、本発明の増幅方法により得られた結果に基づいて、癌であるか否かが判定される対象について、癌の判定を下すものである。即ち、上述した本発明の増幅方法に引き続いて、増幅産物の確認をする工程および癌の判定を行う工程を行うものであり、（１）分析対象領域を含むＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程１、（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程２、（３）工程２で得られた増幅産物の有無を確認する工程３、（４）工程３の結果に基づいて、癌を判定する工程４を含むことを特徴とするものである。
尚、増幅産物を得るまでの工程３の前までの工程（工程１〜２）は、前述した本発明の増幅方法と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。また、増幅産物の確認を行う工程３は、前述した本発明のメチル化判定方法と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
【００８１】
［癌］
本発明の癌の判定方法に係る癌とは、制御不能な細胞分裂及び浸潤を通しての隣接組織への直接的な増殖又は転移等に特徴付けられる、疾病又は疾患のことである。本発明の判定方法により判定される癌の具体例としては、細胞癌、腺癌、リンパ腫、白血病、肉腫、中皮腫、神経腫、骨肉腫、胚細胞腫、前立腺癌、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、胃腸癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、メラノーマ、脳癌、精巣癌、腎臓癌、皮膚癌、甲状腺癌、頭頸部癌、肝臓癌、食道癌、胃癌、大腸癌、骨髄癌、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫等が挙げられ、肺癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌又は大腸癌がより好ましい。
【００８２】
［工程４］
本発明の癌の判定方法に係る工程４は、本発明に係る工程３の結果に基づいて、癌の判定を行う工程である。即ち、本発明に係る工程２で増幅された増幅産物の有無の確認の結果に基づいてなされる。
本発明の癌の判定方法に係る工程４における癌の判定とは、本発明に係る工程１〜３の結果により得られたデータを用いてなされる。即ち、本発明に係る工程２で増幅された目的の増幅産物を検出し、当該増幅産物が検出されたとの結果が得られたとき、癌であるか否かが判定される対象について、癌の判定を下すことである。
【００８３】
上記癌であるか否かが判定される対象は、分析対象領域を含むＤＮＡ由来の試料に応じて特定される。
例えば、分析対象領域を含むＤＮＡ由来の試料が組織、細胞等の場合、癌であるか否かが判定される対象は、当該組織、細胞等自体、更には、当該組織、細胞等が由来する動物である。即ち、分析対象領域を含むＤＮＡ由来の試料が組織、細胞等の場合には、当該組織、細胞等自体が癌（化）されているか否かが判定され、更には、当該組織、細胞等が由来する動物が癌に罹患しているか又は当該動物に癌細胞が存在しているか否かが判定される。
一方、分析対象領域を含むＤＮＡ由来の試料が全血、血清、血漿、尿等の体液である場合、癌であるか否かが判定される対象は、以下の通りである。
分析対象領域を含むＤＮＡが上記全血、血清、血漿、尿等の体液中の細胞（白血球等の血液細胞、各組織由来の細胞、ＣＴＣ等）に由来する場合には、当該細胞自体、更には、当該細胞が由来する動物である。即ち、分析対象領域を含むＤＮＡが全血、血清、血漿、尿等の体液中の細胞（白血球等の血液細胞、各組織由来の細胞、ＣＴＣ等）に由来する場合には、当該細胞自体が癌（化）されているか否かが判定され、更には、当該細胞が由来する動物が癌に罹患しているか又は当該動物に癌細胞が存在しているか否かが判定される。
また、分析対象領域を含むＤＮＡが上記血清、血漿、尿等の体液中のｃｆＤＮＡ、エクソソーム（エキソソーム）等に由来する場合には、癌であるか否かが判定される対象は、上記血清、血漿、尿等の体液に由来する動物である。即ち、分析対象領域を含むＤＮＡが上記血清、血漿、尿等の体液中のｃｆＤＮＡ、エクソソーム（エキソソーム）等に由来する場合には、上記血清、血漿、尿等の体液に由来する動物が癌に罹患しているか又は当該動物に癌細胞が存在しているか否かが判定される。
【００８４】
癌であるか否かが判定される対象が癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在している場合、本発明に係る工程２において、当該分析対象領域が増幅されるので、増幅産物が得られる。一方、癌であるか否かが判定される対象が癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していない場合、本発明に係る工程２において、当該分析対象領域が増幅されないので、増幅産物が検出されない。これは、本発明に係る工程１におけるメチル化感受性制限酵素の性質によるものである。
つまり、分析対象領域がメチル化されている場合、メチル化感受性制限酵素で処理しても、分析対象領域は切断されないため、本発明に係る工程２の増幅反応において分析対象領域が増幅され、本発明に係る工程３において増幅産物が確認される。
一方、分析対象領域がメチル化されていない場合、メチル化感受性制限酵素により分析対象領域が切断されるため、本発明に係る工程２において分析対象領域が増幅されず、本発明に係る工程３において増幅産物が確認されない。
従って、本発明に係る工程３において（ａ）電気泳動により確認する方法を行った場合、（ｉ）増幅産物が確認された場合、当該分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象は癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在していると判定することができ、（ｉｉ）増幅産物が確認されなかった場合、当該分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象は、癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していないと判定することができる。
一方、本発明に係る工程３において（ｂ）蛍光リーダーにより確認する方法を行った場合、（ｉ）予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが少なくとも１つ確認された場合、当該分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象は癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在していると判定することができ、（ｉｉ）予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが確認されなかった場合、当該分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象は、癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していないと判定することができる。
尚、上記閾値については、上記蛍光リーダー［例えば、ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒ（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）］の閾値設定機能に従って決定してもよく、分析対象領域を増幅した結果から決定してもよい。
【００８５】
このように本発明の癌の判定方法に係る工程４を行うことにより、癌の判定を行うことができる。
【００８６】
このように本発明の癌の判定方法は、増幅産物の有無を確認するのみでよいため、非常に簡便な方法である。
【００８７】
［本発明の癌の判定方法の具体例］
本発明の癌の判定方法の具体例を、（Ａ）血清、血漿、尿等の体液中に存在するＤＮＡの特定領域を分析対象領域として設定する場合、（Ｂ）組織、細胞、全血、尿等の中に存在するＤＮＡの特定領域を分析対象領域として設定する場合に分けて、以下に説明する。
【００８８】
（Ａ）血清、血漿、尿等の体液中に存在するＤＮＡの特定領域（例えば、配列番号１１で表される塩基配列からなる領域）を分析対象領域として設定する場合
（１）ＤＮＡの抽出、（２）本発明に係る断片化工程、（３）本発明に係る工程１および（４）本発明に係る工程２については、［本発明の増幅方法の具体例］で説明した通りである。また、（５）本発明に係る工程３については、［本発明のメチル化判定方法の具体例］で説明した通りである。
（６）本発明の癌の判定方法に係る工程４
本発明に係る工程３の増幅産物の有無の確認の結果、予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが少なくとも１つ確認された場合、「その分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象は、癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在している」と判定することができる。一方、予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが少なくとも１つ確認されなかった場合、「その分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象は、癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していない」と判定することができる。
（Ｂ）組織、細胞、全血、尿等の中に存在するＤＮＡの特定領域（例えば、配列番号１で表される塩基配列からなる領域）を分析対象領域として設定する場合
（１）ＤＮＡの抽出、（２）本発明に係る断片化工程、（３）本発明に係る工程１および（４）本発明に係る工程２については、［本発明の増幅方法の具体例］で説明した通りである。また、（５）本発明に係る工程３については、［本発明のメチル化判定方法の具体例］で説明した通りである。
（６）本発明の癌の判定方法に係る工程４
本発明に係る工程３の増幅産物の有無の確認の結果、増幅産物が確認された場合、「その分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象は、癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在している」と判定することができる。一方、増幅産物が確認されなかった場合、「その分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象は、癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していない」と判定することができる。
【００８９】
本発明の癌の判定方法のフローチャートを各種パターンに分けて図２に示す。本発明の癌の判定方法としては、パターン１〜５の方法が挙げられるが、パターン１〜３がより好ましく、パターン１又は２が更に好ましく、パターン１が特に好ましい。
【００９０】
＜本発明の癌の判定を行うためのデータを得る方法＞
本発明の癌の判定を行うためのデータを得る方法（以下、本発明のデータを得る方法と略記する場合がある。）は、本発明の増幅方法により得られた結果に基づいて、癌であるか否かが判定される対象について、癌の判定を下すためのデータを取得するものである。即ち、上述した本発明の増幅方法に引き続いて、増幅産物の有無を確認する工程を行うものであり、（１）分析対象領域を含むＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程１、（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程２、（３）工程２で得られた増幅産物の有無を確認する工程３を含むことを特徴とするものである。
尚、増幅産物を得るまでの工程３の前までの工程（工程１及び２）は、前述した本発明の増幅方法と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。また、増幅産物の確認を行う工程３は、前述した本発明のメチル化判定方法と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
【００９１】
＜本発明の癌の判定用試薬＞
本発明の癌の判定用試薬（以下、本発明の癌の判定用試薬と略記する場合がある。）は、Ｓ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含むことを特徴とするものである。
本発明の癌の判定用試薬に用いられるメチル化感受性制限酵素の具体例及び好ましい例は、前述の通りである。
さらに、この分野で通常用いられる下記のような試薬類何れか１種以上を加えて、本発明の判定用試薬とすることもできる。
ａ）ＤＮＡ精製用のカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）等］、
ｂ）ＰＣＲ等の核酸増幅反応用試薬（例えば、１種又は２種以上のプライマー、プローブ、核酸合成基質、核酸合成酵素等）、
ｃ）断片化用の制限酵素、
ｄ）核酸増幅産物確認用試薬［例えば、アガロースゲル、ローディング緩衝液、染色用試薬（Ｇｅｌ  Ｒｅｄ系染色液、臭化エチジウム等）］、
ｅ）ＤＮＡ抽出用試薬[例えば、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ  ＳＰ  ｋｉｔ  ＤＮＡ  ｔｉｓｓｕｅ（倉敷紡績（株）製）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）  Ｐｌａｓｍａ  ＸＳ（マッハライ・ナーゲル（株）製）又はＭａｇＭＡＸＴＭ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）等]。
また、本発明の癌の判定用試薬には、本発明の癌の判定方法を実施するための説明書等を含ませておいてもよい。当該「説明書」とは、本発明の癌の判定方法における特徴、原理および操作手順などが文章又は図表等により実質的に記載されている本発明の癌の判定用試薬の取り扱い説明書、添付文章或いはパンフレット（リーフレット）等を意味する。
このように本発明の癌の判定用試薬により、本発明の癌の判定方法を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
【００９２】
＜本発明の癌の判定を行うためのマーカー＞
本発明の癌の判定を行うためのマーカー（以下、本発明のマーカーと略記する場合がある。）は、本発明の増幅方法を行うことによって得られる増幅産物であって、当該マーカー（増幅産物）の有無によって分析対象領域由来の癌であるか否かが判定される対象について、癌の判定を下すことができるものである。即ち、（１）分析対象領域を含むＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素で処理する工程１、（２）工程１で処理された二本鎖ＤＮＡの分析対象領域を増幅する工程２を行うことによって得られるものである。
尚、増幅産物を得るまでの工程（工程１及び２）は、前述した本発明の増幅方法と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。また、癌および癌であるか否かが判定される対象については、本発明の癌の判定方法と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
【００９３】
＜本発明のマーカーを検出する方法＞
本発明のマーカーを検出する方法は、本発明のマーカーを自体公知の方法により検出するものであり、本発明に係る工程３で説明した方法により検出するのが好ましい。
【００９４】
このように本発明のマーカーを用いることにより、本発明の癌の判定方法を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
【００９５】
以下に、実施例等により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等により何等限定されるものではない。
【実施例】
【００９６】
実験例１  各種正常細胞及び各種癌細胞由来ＤＮＡのメチル化状態の確認
下記各種正常細胞及び各種癌細胞由来のＤＮＡについて、バイサルファイトシークエンス解析によるメチル化状態の確認を行った。【００９７】
（１）条件の設定
下記の通りに試料及びメチル化状態の確認領域を設定した。
・試料
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）：正常細胞
正常線維芽細胞（ＨＤＦ）：正常細胞
グリア芽腫細胞（Ｕ２５１−ＭＧ−Ｐ１）：癌細胞
乳腺癌細胞（ＭＣＦ−７）：癌細胞
前立腺癌細胞（ＬＮＣａｐ  ｃｌｏｎｅ  ＦＧＣ）：癌細胞
骨髄性白血病細胞（ＨＬ６０）：癌細胞
・メチル化状態の確認領域
ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域内の配列番号１で表される塩基配列からなる領域（２６７塩基対）内に存在する、図３で表される四角で囲まれた３つの、ＣｐＧ配列を含む配列（ＣＣＧＧ）【００９８】
（２）ゲノムＤＮＡの抽出
上記各種細胞より、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ  ＳＰ  ｋｉｔ  ＤＮＡ  ｔｉｓｓｕｅ（倉敷紡績（株）製）を使用して、ゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出した。【００９９】
（３）バイサルファイト反応
上記（２）で得たゲノムＤＮＡ  ４００ｎｇそれぞれを、１０μＬの蒸留水に溶解した。その後、Ｅｐｉｓｉｇｈｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｋｉｔ（和光純薬工業（株）製）を使用して、当該溶液それぞれをキット記載の方法に準じてバイサルファイト反応に付した。【０１００】
（４）ＰＣＲ増幅反応
上記（３）で得たバイサルファイト反応産物含有溶液  １μＬそれぞれに、蒸留水  １７．３μＬ、１０×バッファー  ｆｏｒ  Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（東洋紡（株）製）  ２．５μＬ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（東洋紡（株）製）  ２μＬ、２．５ユニット／μＬ  Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ−Ｐｌｕｓ（東洋紡（株）製）  ０．２μＬ、１０μＭ  フォワードプライマー［ＧＧＡＡＴＴＡＧＴＧＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧ（配列番号７）］  １μＬ及び１０μＭ  リバースプライマー［ＣＣＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＡＡＡＣＴＡＡＴＣ（配列番号８）］  １μＬを加えて混合し、これをＰＣＲ用反応液とした。
次いで、上記ＰＣＲ用反応液それぞれを、サーマルサイクラ―（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にセットし、下記反応条件でＰＣＲ増幅反応を行った。
※反応条件
９４℃  ２分間
↓
９４℃  １０秒間→５５℃  １０秒間→７２℃  ２０秒間を１サイクルとして３６サイクル
↓
７２℃  ２分間【０１０１】
（５）ＰＣＲ増幅産物のクローニング
上記（４）で得たＰＣＲ増幅産物それぞれを、１．５％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、ＧｅｌＲｅｄ核酸ゲル染色液（和光純薬工業（株）製）で染色し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（（株）キアゲン製）を使用して、ＰＣＲ増幅産物をそれぞれ回収した。【０１０２】
（６）ＰＣＲ増幅産物に制限酵素認識部位を付加するためのＰＣＲ増幅反応
上記（５）で得たＰＣＲ増幅産物含有溶液  １μＬそれぞれに、蒸留水１７．３μＬ、１０×バッファー  ｆｏｒ  Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（東洋紡（株）製）  ２．５μＬ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（東洋紡（株）製）  ２μＬ、２．５ユニット／μＬ  Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ−Ｐｌｕｓ（東洋紡（株）製）  ０．２μＬ、１０μＭ  フォワードプライマー  １μＬ及び１０μＭ  リバースプライマー  １μＬを加えて混合し、これをＰＣＲ用反応液とした。
尚、上記フォワードプライマーは、上記（４）のフォワードプライマーに制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ）認識部位（配列中の下線部）を付加したものであり、下記塩基配列からなる。上記リバースプライマーは、上記（４）のリバースプライマーに制限酵素（ＢａｍＨＩ）認識部位（配列中の下線部）を付加したものであり、下記塩基配列からなる。
フォワードプライマー：ＴＴＡＣＣＡＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＡＴＴＡＧＴＧＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧ（配列番号９）
リバースプライマー：ＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＡＡＡＣＴＡＡＴＣ（配列番号１０）
次いで、上記ＰＣＲ用反応液それぞれを、サーマルサイクラ―（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にセットし、下記反応条件でＰＣＲ増幅反応を行った。
※反応条件
９４℃  ２分間
↓
９４℃  １０秒間→５５℃  １０秒間→７２℃  ２０秒間を１サイクルとして１２サイクル
↓
７２℃  ２分間
次いで、ＰＣＲ増幅産物含有溶液  ２５μＬそれぞれに、６×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｄｙｅ（（株）ニッポンジーン製）  ５μＬを加えて混合し、１．５％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、ＧｅｌＲｅｄ核酸ゲル染色液（和光純薬工業（株）製）で染色し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｗｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（（株）キアゲン製）を使用して、ＰＣＲ増幅産物それぞれを回収した。【０１０３】
（７）制限酵素処理
上記（６）で得たＰＣＲ増幅産物含有溶液  ４３μＬそれぞれに、１０×Ｂバッファー（（株）ニッポンジーン社製）  ５μＬ、２０ユニット／μＬ  ＨｉｎｄＩＩＩ（（株）ニッポンジーン製）  １μＬ、２０ユニット／μＬ  ＢａｍＨＩ（（株）ニッポンジーン製）  １μＬを混合した後、３７℃で１時間反応させた。同様にｐＵＣ１９（（株）ニッポンジーン製）  ５００ｎｇに蒸留水を加えて４３μＬに調製し、２０ユニット／μＬ  ＨｉｎｄＩＩＩ（（株）ニッポンジーン製）  １μＬ、２０ユニット／μＬ  ＢａｍＨＩ（（株）社ニッポンジーン製）  １μＬを加えた後、３７℃で１時間反応させた。次いで、５．５Ｍ  グアニジン塩酸塩（和光純薬工業（株）製）を２５０μＬそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、１２０００×ｇ、室温で１分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５（（株）ニッポンジーン製）を５００μＬそれぞれ加え、１２０００×ｇ、室温で１分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、１２０００×ｇ、室温で１分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０（（株）ニッポンジーン製）を２５μＬそれぞれ加え、１２０００×ｇ、室温で１分間遠心分離することにより、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ）により処理した各ＰＣＲ増幅産物及びｐＵＣ１９を回収した。【０１０４】
（８）形質転換
上記（７）で得たＰＣＲ増幅産物含有溶液  １μＬぞれぞれに、制限酵素により処理したｐＵＣ１９  １μＬ、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ（株）製）  ２μＬを加えて混合し、１６℃で１時間反応させた。次いで、全量４μＬそれぞれをＥＣＯＳＴＭＣｏｍｐｅｔｅｎｔＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（（株）ニッポンジーン製）に形質転換し、アンピシリン添加ＬＢ寒天培地にスプレッドした。その後、コロニーをアンピシリン添加ＬＢ培地おいて、３７℃で１６時間培養した。その後、プラスミドキットＳＩＩ（倉敷紡績（株）製）を使用して、プラスミドをそれぞれ抽出した。次いで、得られたプラスミドを用いて、タカラバイオ（株）のシークエンス受託サービスにて塩基配列を解読した。
その結果を図４に示す。【０１０５】
図４は、正常細胞（ｈｉＰＳ、ＨＤＦ）、癌細胞（Ｕ２５１−ＭＧ−Ｐ１、ＭＣＦ−７、ＬＮＣａＰ  ｃｌｏｎｅ  ＦＧＣ、ＨＬ６０）の塩基配列解読結果について、メチル化状態の確認領域である３つの、ＣｐＧ配列を含む配列（ＣＣＧＧ）のシトシンがメチル化シトシン又は非メチル化シトシンの何れかであるかを表したものである。また、図４中の丸１〜丸３は、図３中の丸１〜丸３に該当する。
尚、図４中の○は、ＣｐＧ配列のシトシンが非メチル化シトシンであることを、●は、ＣｐＧ配列のシトシンがメチル化シトシンであること表す。
図４の結果から明らかな通り、正常細胞（ｈｉＰＳ、ＨＤＦ）由来のメチル化状態の確認領域である３つの、ＣｐＧ配列を含む配列（ＣＣＧＧ）のシトシンは、非メチル化シトシンであり、癌細胞（Ｕ２５１−ＭＧ−Ｐ１、ＭＣＦ−７、ＬＮＣａＰ  ｃｌｏｎｅ  ＦＧＣ、ＨＬ６０）由来のメチル化状態の確認領域である３つの、ＣｐＧ配列を含む配列（ＣＣＧＧ）のシトシンは、メチル化シトシンであることが分かった。【０１０６】
実施例１及び比較例１〜３
本発明に係る工程１におけるＳ１ヌクレアーゼの効果を検証するために、下記の条件の下、本発明の増幅方法並びにメチル化判定方法及び癌の判定方法を行った。
・実施例１：一本鎖特異的ヌクレアーゼ（Ｓ１ヌクレアーゼ）で処理する工程を行った場合
・比較例１：一本鎖特異的ヌクレアーゼ（マングビーンヌクレアーゼ）で処理する工程を行った場合
・比較例２：一本鎖特異的ヌクレアーゼ（エキソヌクレアーゼＩ）で処理する工程を行った場合
・比較例３：一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理する工程を行わなかった場合【０１０７】
実施例１
（１）条件の設定
下記の通りに試料及び分析対象領域を設定した。
・試料
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）：正常細胞
・分析対象領域
ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号１で表される塩基配列からなる領域（２６７塩基対）【０１０８】
（２）ゲノムＤＮＡの抽出
ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ  ＳＰ  ｋｉｔ  ＤＮＡ  ｔｉｓｓｕｅ（倉敷紡績（株）製）により、その現品説明書に従ってｈｉＰＳ由来のゲノムＤＮＡを抽出した。【０１０９】
（３）制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）による断片化処理及びカラム精製
（２）で得たゲノムＤＮＡ  １５０ｎｇに、１０×Ｂ  バッファー（（株）ニッポンジーン製）５μＬ、２０ユニット／μＬ  ＢａｍＨＩ（（株）ニッポンジーン製）  １μＬ及び２０ユニット／μＬ  ＨｉｎｄＩＩＩ（（株）ニッポンジーン製）  １μＬを加え、滅菌水で全量５０μＬに調製した。その後、３７℃で１時間反応させた。次いで、５．５Ｍ  グアニジン塩酸塩（和光純薬工業（株）製）を２５０μＬ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、２００００×ｇ、室温で３分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５（（株）ニッポンジーン製）  ６００μＬ及び８０％エタノール（和光純薬工業（株）製）  ６００μＬを加え、１２０００×ｇ、室温で１分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、１２０００×ｇ、室温で５分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０（（株）ニッポンジーン製）を３０μＬ加え、１２０００×ｇ、室温で１分間遠心分離することにより、制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）により処理したゲノムＤＮＡを得た。【０１１０】
（４）一本鎖特異的ヌクレアーゼ（Ｓ１ヌクレアーゼ）による処理及びカラム精製
（３）で得たゲノムＤＮＡ含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液  ２５μＬに、１０×Ｓ１ヌクレアーゼバッファー（タカラバイオ（株）製）  ４μＬ及び１８０ユニット／μＬ  Ｓ１ヌクレアーゼ（タカラバイオ（株）製）  １μＬを加え、滅菌水で全量４０μＬに調製した。その後、２３℃で１５分間反応させた後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １μＬを加えた。次いで、５．５Ｍ  グアニジン塩酸塩（和光純薬工業（株）製）  ２００μＬ及び２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．６（和光純薬工業（株）製）を２００μＬ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、２００００×ｇ、室温で３分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５（（株）ニッポンジーン製）６００μＬ、８０％エタノール（和光純薬工業（株）製）  ６００μＬを加え、１２０００×ｇ、室温で１分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、１２０００×ｇ、室温で５分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０（（株）ニッポンジーン製）を３０μＬ加え、１２０００×ｇ、室温で１分間遠心分離することにより、一本鎖特異的ヌクレアーゼ（Ｓ１ヌクレアーゼ）により処理したゲノムＤＮＡを得た。【０１１１】
（５）メチル化感受性制限酵素（ＨａｐＩＩ）による処理及びカラム精製
（４）で得たゲノムＤＮＡ含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液  ２５μＬに、１０×Ｌバッファー（タカラバイオ（株）製）  ４μＬ及び２５ユニット／μＬ  ＨａｐＩＩ（タカラバイオ（株）製）  １μＬを加え、滅菌水で全量４０μＬに調製した。その後、３７℃で２時間反応させた。次いで、５．５Ｍ  グアニジン塩酸塩（和光純薬工業（株）製）  ２００μＬ及び２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．６（和光純薬工業（株）製）を２００μＬ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、２００００×ｇ、室温で３分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５（（株）ニッポンジーン製）６００μＬ及び８０％エタノール（和光純薬工業（株）製）  ６００μＬを加え、１２０００×ｇ、室温で１分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、１２０００×ｇ、室温で５分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０（（株）ニッポンジーン製）を３０μＬ加え、１２０００×ｇ、室温で１分間遠心分離することにより、メチル化感受性制限酵素（ＨａｐＩＩ）により処理したゲノムＤＮＡを得た。
尚、ＨａｐＩＩ及びＨｐａＩＩが認識する配列は、図３で表されるヒト細胞由来ゲノムＤＮＡのＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域内の配列番号１で表される塩基配列からなる領域（２６７塩基対）のうち、四角で囲まれた３つの、ＣｐＧ配列を含む配列（ＣＣＧＧ）である。【０１１２】
（６）ＰＣＲ増幅反応
（５）で得たゲノムＤＮＡ含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液  １μＬに、１０×バッファー  ｆｏｒ  Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（東洋紡（株）製）  ２．５μＬ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（東洋紡（株）製）  ２μＬ、２．５ユニット／μＬ  Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ−Ｐｌｕｓ（東洋紡（株）製）  ０．２μＬ、１０μＭフォワードプライマー（ｈ−Ｆ−Ｆｏｘ）  １μＬ及び１０μＭリバースプライマー（ｈ−Ｒ−Ｆｏｘ）  １μＬを加え、滅菌水で２５μＬに調製し、これをＰＣＲ用反応液とした。
尚、上記プライマーにより得られる増幅産物の大きさ（塩基対数）は、２６７塩基対（配列番号１）である。
また、鋳型として（３）で得たものを用いた以外は、上記と同様にしてＰＣＲ用反応液を調製し、これをコントロールとした。
上記ＰＣＲ用反応液それぞれをサーマルサイクラ―（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にセットし、下記反応条件でＰＣＲ増幅反応を行った。
※反応条件
９４℃  ２分間
↓
９４℃  ４秒間→６８℃  １５秒間を１サイクルとして５０サイクル
↓
６８℃  １分間【０１１３】
（７）電気泳動
（６）で得た増幅産物含有溶液  ２５μＬそれぞれに、６×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｄｙｅ（（株）ニッポンジーン製）５μＬを加えて混合した後、該混合物を２％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、ＧｅｌＲｅｄ核酸ゲル染色液（和光純薬工業（株）製）で染色し、ＵＶ照射装置により増幅産物をそれぞれ確認した。その結果を、図５（レーン１及び２）に示す。【０１１４】
比較例１
実施例１における一本鎖特異的ヌクレアーゼとして、Ｓ１ヌクレアーゼの代わりにマングビーンヌクレアーゼ（タカラバイオ（株）製）を用いた以外は、上記実施例１と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。その結果を図５（レーン３及び４）に示す。【０１１５】
比較例２
実施例２における一本鎖特異的ヌクレアーゼとして、Ｓ１ヌクレアーゼの代わりにエキソヌクレアーゼＩ（タカラバイオ（株）製）を用いた以外は、上記実施例２と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。その結果を図５（レーン５及び６）に示す。【０１１６】
比較例３
実施例１における（４）一本鎖特異的ヌクレアーゼによる処理を行わなかった以外は、実施例１と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。その結果を、図５（レーン７及び８）に示す。【０１１７】
また、図５の各レーンにおける試料、一本鎖特異的ヌクレアーゼ、メチル化感受性制限酵素および増幅産物の有無を下記表３にまとめた。【０１１８】
【表３】
2018043724.tif 000004
【０１１９】
図５の結果より、一本鎖特異的ヌクレアーゼとしてＳ１ヌクレアーゼを用い、ｈｉＰＳをメチル化感受性制限酵素により処理し、本発明に係るプライマー対を用いてＰＣＲ増幅反応を行った場合（レーン２）、目的の増幅産物［配列番号１で表される塩基配列からなる領域（２６７塩基対）］、即ち、分析対象領域は得られないことが分かる。
よって、ｈｉＰＳの分析対象領域は、メチル化感受性制限酵素で切断されており、非メチル化状態であると判定できる。即ち、分析対象領域由来のｈｉＰＳは、正常細胞であると判定できる。
一方、一本鎖特異的ヌクレアーゼとしてマングビーンヌクレアーゼを用いた場合（レーン４）、一本鎖特異的ヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼＩを用いた場合（レーン６）、及び一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理する工程を行わなかった場合（レーン８）、ｈｉＰＳをメチル化感受性制限酵素により処理し、本発明に係るプライマー対を用いてＰＣＲ増幅反応を行うと、目的の増幅産物［配列番号１で表される塩基配列からなる領域（２６７塩基対）］、即ち、分析対象領域と同じ大きさの増幅産物が得られることが分かる。
しかし、比較例１〜３では、実施例１と同じ正常ｈｉＰＳ由来ゲノムＤＮＡを鋳型として用いているにも拘わらず増幅産物が得られていることから、この増幅産物は、人為的或いは内在的に存在する一本鎖ＤＮＡが鋳型となって増幅されてしまった非特異的な増幅産物であると考えられた。
従って、試料（ＤＮＡ）をＳ１ヌクレアーゼで処理することによって、即ち、本発明に係る工程１を行うことによって、偽陽性の原因となり得る非特異的な増幅産物の増幅を抑制し、メチル化された分析対象領域の増幅並びにメチル化の判定及び癌の判定を簡便に精度よく行えることが分かった。【０１２０】
実施例２  各種正常細胞及び各種癌細胞のＦＯＸＢ２遺伝子の解析
実施例１における試料として下記正常細胞及び癌細胞を用いた以外は、実施例１と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。その結果を図６（正常細胞）及び図７（癌細胞）にそれぞれ示す。
・正常細胞
正常線維芽細胞（ＨＤＦ）
正常線維芽細胞（ＣＣＤ−８Ｌｕ）
正常線維芽細胞（ＷＩ−３８）
ＨＩＶ及びＨＢＶ陰性血清（Ｎｏｒｍａｌ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ）
人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）
全胎児細胞（ＨＥ２３）
・癌細胞
神経芽腫細胞（ＩＭＲ−３２）
グリア芽腫細胞（Ｕ２５１−ＭＧ−Ｐ１）
子宮筋腫細胞（ＨｅＬａ）
肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）
結腸腺癌細胞（ＷｉＤｒ）
非小細胞性肺癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ４６０）
膵臓腺癌細胞（ＣＦＰＡＣ−１）
卵巣奇形腫細胞（ＰＡ−１）
乳腺癌細胞（ＭＣＦ−７）
前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ  ｃｌｏｎｅ  ＦＧＣ）
Ｔリンパ性白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ）
骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０）【０１２１】
また、図６の各レーンにおける試料、メチル化感受性制限酵素および増幅産物の有無を下記表４に、図７の各レーンにおける試料、メチル化感受性制限酵素および増幅産物の有無を下記表５にまとめた。【０１２２】
【表４】
2018043724.tif 000005
【０１２３】
【表５】
2018043724.tif 000006
【０１２４】
図６の結果より、各種正常細胞を用いた場合（レーン２、４、６、８、１０及び１２）、何れも目的の増幅産物［配列番号１で表される塩基配列からなる領域（２６７塩基対）］は確認されず、分析対象領域が得られていないことが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されており、非メチル化状態と判定できる。よって、この結果より、分析対象領域由来の各種正常細胞は正常細胞であると判定することができる。
図７の結果より、各種癌細胞を用いた場合（レーン２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４）、何れも目的の増幅産物［配列番号１で表される塩基配列からなる領域（２６７塩基対）］は確認され、分析対象領域が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態と判定できる。よって、この結果より、分析対象領域由来の各種癌細胞は癌細胞であると判定することができる。【０１２５】
以上のことから、本発明によれば、メチル化された分析対象領域の増幅並びにメチル化の判定及び癌の判定を簡便に精度よく行えることが分かった。【０１２６】
実施例３  乳癌患者由来の癌細胞のＦＯＸＢ２遺伝子の解析
実施例１における試料として２人の乳癌患者［乳癌患者１（ステージＩＩＩＡ）及び乳癌患者２（ステージＩＩ）］由来の癌細胞及び当該癌細胞の近傍の正常細胞を用いた以外は、実施例１と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。その結果を図８に示す。【０１２７】
また、図８の各レーンにおける試料、メチル化感受性制限酵素および増幅産物の有無を下記表６にまとめた。【０１２８】
【表６】
2018043724.tif 000007
【０１２９】
図８の結果より、乳癌患者１及び乳癌患者２由来の癌細胞を用いた場合（レーン４及び８）、何れも目的の増幅産物［配列番号１で表される塩基配列からなる領域（２６７塩基対）］が確認され、分析対象領域が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態と判定できる。よって、この結果より、分析対象領域由来の各種癌細胞は癌細胞であると判定することができる。
一方、各種正常細胞を用いた場合（レーン２及び６）、何れも目的の増幅産物［配列番号１で表される塩基配列からなる領域（２６７塩基対）］確認されず、分析対象領域が得られていないことが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されており、非メチル化状態と判定できる。よって、この結果より、分析対象領域由来の癌細胞の近傍の各種正常細胞は、正常細胞であると判定することができる。【０１３０】
以上のことより、実際の臨床検体であってもメチル化された分析対象領域の増幅並びにメチル化の判定及び癌の判定を行えることが分かった。
更に、癌細胞の近傍の正常細胞であっても偽陽性を生じることなくメチル化された分析対象領域の増幅並びにメチル化の判定及びこれに基づく癌の判定を行えることも分かった。【０１３１】
実施例４  イヌ由来の癌細胞のＦＯＸＢ２遺伝子の解析
実施例１における試料として、イヌ由来の癌細胞［ＭＤＣＫ細胞（転移能はない良性癌細胞）、肺癌細胞及び肝臓癌細胞］を用いたこと、分析対象領域をイヌ由来のＦｏｘＢ２遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号４で表される塩基配列からなる領域（４３３塩基対）に設定したこと、及び本発明に係るプライマー対としてｄ−Ｆ−Ｆｏｘ及びｄ−Ｒ−Ｆｏｘを用いたこと以外は、実施例１と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。
尚、本発明に係るプライマー対（ｄ−Ｆ−Ｆｏｘ及びｄ−Ｒ−Ｆｏｘ）により増幅される領域は、配列番号４で表される塩基配列からなる領域（４３３塩基対）である。
その結果を図９に示す。【０１３２】
また、図９の各レーンにおける細胞及びメチル化感受性制限酵素を下記表７にまとめた。【０１３３】
【表７】
2018043724.tif 000008
【０１３４】
図９の結果より、ＭＤＣＫ細胞（転移能はない良性癌細胞）を用いた場合（レーン２）、何れも目的の増幅産物［配列番号４で表される塩基配列からなる領域（４３３塩基対）］は確認されず、分析対象領域が得られていないことが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されており、非メチル化状態と判定できる。よって、この結果より、分析対象領域由来のＭＤＣＫ細胞（転移能はない良性癌細胞）は、正常細胞であると判定することができる。
一方、肺癌細胞及び肝臓癌細胞を用いた場合（レーン４及び６）、何れも目的の増幅産物［配列番号１で表される塩基配列からなる領域（４３３塩基対）］が確認され、分析対象領域が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態と判定できる。よって、この結果より、分析対象領域由来の肝癌細胞及び肝臓癌細胞は、癌細胞であると判定することができる。【０１３５】
以上のことより、本発明によれば、イヌ由来の細胞であっても、メチル化された分析対象領域の増幅並びにメチル化の判定及び癌の判定を行えることが分かった。また、転移能のない良性癌細胞であっても正常細胞であると判定できることも分かった。
更に、イヌ等の動物の癌検診に、本発明のメチル化された分析対象領域の増幅方法並びにメチル化の判定方法及び癌の判定方法を適用できる可能性が示唆された。【０１３６】
実施例５  癌患者由来の血漿を用いたＦｏｘＢ２遺伝子の解析
上述の通り、ｃｆＤＮＡとは、癌（腫瘍）細胞、白血球等の血液細胞、各組織由来の細胞等の死滅に由来するＤＮＡのことであり、血液や尿等の体液中に存在している。また、癌患者におけるｃｆＤＮＡの量は、健常人と比較して多いことが報告されている。
そのため、内視鏡や針を使用して癌（腫瘍）組織を採取する従来の生検（バイオプシー）に代えて、血液や尿等の体液を用いた癌（腫瘍）の検診（リキッドバイオプシー）が注目されている。
そこで、本発明の方法を、リキッドバイオプシーに適用できるか否かの検証を行った。【０１３７】
（１）条件の設定
下記の通りに試料及び分析対象領域を設定した。
・試料
肝臓癌患者由来の血漿
肺癌患者由来の血漿
・分析対象領域
ヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域のうち、配列番号１１で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）【０１３８】
（２）ｃｆＤＮＡの抽出
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）  Ｐｌａｓｍａ  ＸＳ（マッハライ・ナーゲル（株）製）により、その現品説明書に従って、ｃｆＤＮＡをそれぞれ抽出した。【０１３９】
（３）制限酵素（ＭｂｏＩ）による断片化処理、メチル化感受性制限酵素（ＨｐａＩＩ）による処理およびカラム精製
（２）で得たｃｆＤＮＡそれぞれに、１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ（株）製）  １０μＬ、２５ユニット／μＬ  ＭｂｏＩ（ＮＥＢ（株）製）  １μＬ及び５０ユニット／μＬ  ＨｐａＩＩ（ＮＥＢ（株）製）  ３μＬを加え、滅菌水で全量１００μＬにした。その後、３７℃で１時間３０分反応させた。次いで、５．５Ｍ  グアニジン塩酸塩（和光純薬工業（株）製）  ５００μＬおよび２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０（（株）ニッポンジーン製）  ５００μＬをそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、１３０００×ｇ、室温で２分間遠心し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５（（株）ニッポンジーン製）  ６００μＬ及び８０％エタノール（和光純薬工業（株）製）  ６００μＬをそれぞれ加え、１３０００×ｇ、室温で１分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。この操作をもう一度繰り返し、更に、１３０００×ｇ、室温で３分間遠心分離した後、それぞれ新しいチューブに交換し、滅菌水  ５０μＬをそれぞれ添加し、１３０００×ｇ、室温で１分間遠心分離することにより、制限酵素（ＭｂｏＩ）およびメチル化感受性制限酵素（ＨｐａＩＩ）により処理したｃｆＤＮＡをそれぞれ得た。【０１４０】
（４）Ｓ１ヌクレアーゼによる処理およびカラム精製
（３）で得たｃｆＤＮＡ含有滅菌水  ５０μＬそれぞれに、１０×Ｓ１ヌクレアーゼバッファー（タカラバイオ（株）製）  １０μＬ、１８０ユニット／μＬ  Ｓ１ヌクレアーゼ  １μＬを加え、滅菌水で１００μＬに調製した。その後、２３℃で１５分間反応させた。次いで、５．５Ｍ  グアニジン塩酸塩（和光純薬工業（株）製）  ５００μＬおよび２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０（（株）ニッポンジーン製）  ５００μＬをそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、１３０００×ｇ、室温で２分間遠心し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５（（株）ニッポンジーン製）  ６００μＬ及び８０％エタノール（和光純薬工業（株）製）  ６００μＬをそれぞれ加え、１３０００×ｇ、室温で１分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。この操作をもう一度繰り返し、更に、１３０００×ｇ、室温で３分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、滅菌水  ５０μＬをそれぞれ添加し、１３０００×ｇ、室温で１分間遠心分離することにより、Ｓ１ヌクレアーゼにより処理したｃｆＤＮＡをそれぞれ得た。【０１４１】
（５）メチル化感受性制限酵素（ＨｐａＩＩ）による処理及びカラム精製
（４）で得たｃｆＤＮＡ含有滅菌水  ５０μＬそれぞれに、１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ（株）製）  １０μＬ及び５０ユニット／μＬ  ＨｐａＩＩ  ３μＬを加え、滅菌水で全量１００μＬに調製した。その後、３７℃で１時間３０分反応させた。次いで、５．５Ｍ  グアニジン塩酸塩（和光純薬工業（株）製）  ５００μＬおよび２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０（（株）ニッポンジーン製）  ５００μＬをそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、１３０００×ｇ、室温で２分間遠心し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５（（株）ニッポンジーン製）  ６００μＬ及び８０％エタノール（和光純薬工業（株）製）  ６００μＬをそれぞれ加え、１３０００×ｇ、室温で１分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。この操作をもう一度繰り返し、更に、１３０００×ｇ、室温で３分間遠心分離した後、それぞれ新しいチューブに交換し、滅菌水  ５０μＬを添加し、１３０００×ｇ、室温で１分間遠心分離することにより、メチル化感受性制限酵素（ＨｐａＩＩ）により処理したｃｆＤＮＡをそれぞれ得た。
尚、ＨｐａＩＩ及びＨａｐＩＩが認識する配列は、図１０で表されるヒト由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモーター領域内の配列番号１１で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）のうち、四角で囲まれた３つの、ＣｐＧ配列を含む配列（ＣＣＧＧ）である。【０１４２】
（６）デジタルＰＣＲ法による増幅反応
（５）で得たｃｆＤＮＡ含有滅菌水  ３μＬそれぞれに、ｄｄＰＣＲＴＭ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）  １１μＬ、５０ユニット／μＬ  ＨａｐＩＩ（タカラバイオ（株）製）  ０．８μＬ、２０μＭ  フォワードプライマー（ｈｃｆ−Ｆ−ｆｏｘ）  １μＬ、２０μＭ  リバースプライマー（ｈｃｆ−Ｒ−ｆｏｘ）  １μＬおよび１０μＭ  プローブ［ｈｃｆ−Ｐｒｏｂｅ−ｆｏｘ（５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ１で標識）］  １μＬを加え、滅菌水で全量２２μＬに調製し、これをデジタルＰＣＲ用反応液とした。その後、上記反応液それぞれをサーマルサイクラ―（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にセットし、３７℃で４０分間反応させた。次いで、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒにてドロップレットを作成し、このドロップレットを９６ウェルプレートに分注した後、サーマルサイクラ―（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にて、下記反応条件でデジタルＰＣＲ法による増幅反応を行った。
※反応条件
９５℃  １０分間
↓
９４℃  ３０秒間→６２℃  １分間を１サイクルとして４０サイクル
↓
９８℃  １０分間
また、内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨ遺伝子を選択し、ＧＡＰＤＨ遺伝子の特定領域［配列番号１５で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］についても、同じ試料（検体）を用い、解析を行った。ＧＡＰＤＨ遺伝子の解析に用いたフォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブの塩基配列は下記の通りである。
尚、その他の実験条件については、デジタルＰＣＲ用反応液にＨａｐＩＩを添加しなかった以外は、上記と同様である。
フォワードプライマー：ｇａａｇｃｔｔｇｔｃａｔｃａａｔｇｇａａａｔｃｃｃ（配列番号１６）
リバースプライマー：ｇｇｇａｃａｇｇａｃｃａｔａｔｔｇａｇｇｇａｃａｃ（配列番号１７）
プローブ（５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ１で標識）：ｃａａｃｔａｇｇａｔｇｇｔｇｔｇｇｃｔｃｃｃｔｔｇ（配列番号１８）【０１４３】
（７）蛍光リーダーによる増幅産物の確認
（６）で増幅された増幅産物を含有する各ドロップレット由来の蛍光を、ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒ（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にて検出することにより、増幅産物の確認を行った。
尚、ＧＡＰＤＨ遺伝子に関する解析は１試料（検体）を用い、１試料（検体）につき１回行った。また、ＦＯＸＢ２遺伝子に関する解析は１試料（検体）を用い、１試料（検体）につき２回行った。
ＧＡＰＤＨ遺伝子の解析結果を図１１に、ＦＯＸＢ２遺伝子の解析結果を図１２にそれぞれ示す。
陽性又は陰性の判定の基準となる閾値については、ＧＡＰＤＨ遺伝子については、ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅結果を参考とし、蛍光強度８０００に設定した。また、ＦＯＸＢ２遺伝子については、ＦＯＸＢ２遺伝子の増幅結果を参考とし、蛍光強度８０００に設定した。即ち、蛍光強度８０００を超えるドロップレットが少なくとも１つあった場合、陽性（目的の増幅産物が得られた）と判定し、蛍光強度８０００を超えるドロップレットが存在しなかった場合、陰性（目的の増幅産物が得られなかった）と判定した。
また、図１１および図１２における試料、分析対象領域、陽性ドロップレット数、陰性ドロップレット数、総ドロップレット数および閾値を表８および表９にそれぞれにまとめた。【０１４４】
【表８】
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【０１４５】
【表９】
2018043724.tif 000010
【０１４６】
図１１及び表８の結果より、肝臓癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認（２５３個）できることから、目的の増幅産物［ＧＡＰＤＨ遺伝子の特定領域：配列番号１５で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］が増幅されていることが分かる。
また、肺癌患者由来の血漿を用いた場合についても、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認（２２個）確認できることから、目的の増幅産物［ＧＡＰＤＨ遺伝子の特定領域：配列番号１５で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］が増幅されていることが分かる。
以上より、試料（肝臓癌患者由来の血漿および肺癌患者由来の血漿）中にｃｆＤＮＡが存在していることが示された。【０１４７】
図１２及び表９の結果より、肝臓癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認（１回目：５個、２回目：４個）できることから、目的の増幅産物［ＦＯＸＢ２遺伝子の特定領域：配列番号１１で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］が得られていることが分かる。
また、肺癌患者由来の血漿を用いた場合についても、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認（１回目：１個）できることから、目的の増幅産物［ＦＯＸＢ２遺伝子の特定領域：配列番号１１で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態であると判定することができる。また、血漿に由来する対象（肝臓癌患者および肺癌患者）は、癌に罹患している又は当該対象（肝臓癌患者および肺癌患者）中に癌細胞が存在していると判定することができる。【０１４８】
以上のことより、試料として癌患者由来の血漿を用いた場合であっても、メチル化された分析対象領域の増幅並びにこれを用いたメチル化の判定及び癌の判定を行えることが分かった。
従って、本発明のメチル化された分析対象領域の増幅方法並びにメチル化判定方法及び癌の判定方法をリキッドバイオプシーに適用できる可能性が示唆された。【０１４９】
実施例６  健常者由来の血漿を用いたＦＯＸＢ２遺伝子の解析（ＦＯＸＢ２遺伝子とＧＡＰＤＨ遺伝子の同時増幅・検出）
実際の臨床現場を想定した場合、検査の迅速性という観点から、ターゲット遺伝子および内在性コントロールとして選択した遺伝子を同時に増幅・検出することが好ましい。
そこで、本発明の方法を、ターゲット遺伝子および内在性コントロールとして選択した遺伝子の同時増幅・検出に適用できるか否かの検証を行った。
実施例５における試料として健常者由来の血漿を用いたこと、閾値を下記の通りに設定したこと及び下記のデジタルＰＣＲ用反応液を用いたこと以外は、実施例５と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。尚、実験は４試料（検体）を用い、１試料（検体）につきそれぞれ４回ずつ実施した。
その結果を図１３（Ａ、Ｂ）に示す。
・閾値
ＦＯＸＢ２遺伝子については、ＦＯＸＢ２遺伝子の増幅結果を参考とし、蛍光強度８０００に設定した。また、ＧＡＰＤＨ遺伝子については、ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅結果を参考とし、蛍光強度４０００に設定した。
・デジタルＰＣＲ用反応液
メチル化感受性制限酵素により処理したｃｆＤＮＡ  ３μＬに、２０μＭ  フォワードプライマー（ｈｃｆ−Ｆ−ｆｏｘ）  １μＬ、２０μＭ  リバースプライマー（ｈｃｆ−Ｒ−ｆｏｘ）  １μＬ、１０μＭ  プローブ［ｈｃｆ−Ｐｒｏｂｅ−ｆｏｘ（５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ１で標識）］  ０．６μＬ、２０μＭ  フォワードプライマー（配列番号１６で表される塩基配列）  １μＬ、２０μＭ  リバースプライマー（配列番号１７で表される塩基配列）  １μＬ、１０μＭ  プローブ［配列番号１８で表される塩基配列（５’末端をＨＥＸ、３’末端をＢＨＱ１で標識）］  ０．６μＬ、ｄｄＰＣＲＴＭ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）  １１μＬおよび５０ユニット／μＬ  ＨｐａＩＩ（ＮＥＢ（株）製）  ０．６μＬを加え、滅菌水にて全量２２μＬに調製したもの。
また、図１３のＡおよびＢにおける試料、分析対象領域、陽性ドロップレット数、陰性ドロップレット数、総ドロップレット数および閾値を表１０および１１にそれぞれまとめた。【０１５０】
【表１０】
2018043724.tif 000011
【０１５１】
【表１１】
2018043724.tif 000012
【０１５２】
図１３のＡ及び表１０の結果より、健常者由来の血漿を用いた場合、４検体（試料）全てで、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認できないことから、目的の増幅産物［ＦＯＸＢ２遺伝子の特定領域：配列番号１１で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］が増幅されていないことが分かる。
図１３のＢ及び表１１の結果より、健常者由来の血漿を用いた場合、４検体（試料）全てで、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認できたことから、目的の増幅産物［ＧＡＰＤＨ遺伝子の特定領域：配列番号１５で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］が増幅されていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されており、メチル化状態でないと判定することができる。また、血漿に由来する対象（健常者）は、癌に罹患していない又は当該対象（健常者）中に癌細胞が存在していないと判定することができる。【０１５３】
実施例７  各種癌患者由来の血漿を用いたＦＯＸＢ２遺伝子の解析（ＦＯＸＢ２遺伝子とＧＡＰＤＨ遺伝子の同時増幅・検出）
実施例６における試料として下記のものを用いたこと、及び閾値を下記の通り設定したこと以外は、実施例６と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。尚、実験はそれぞれ１試料（検体）を用い、１試料（検体）につきそれぞれ４回行った。その結果を図１４〜１８にそれぞれ示す。
・閾値
ＦＯＸＢ２遺伝子については、ＦＯＸＢ２遺伝子の増幅結果を参考とし、蛍光強度８０００に設定した。また、ＧＡＰＤＨ遺伝子については、ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅結果を参考とし、蛍光強度４０００に設定した。・試料
乳癌患者由来の血漿
大腸癌患者由来の血漿
膵臓癌患者由来の血漿
胃癌患者由来の血漿
抗癌剤投与後の肺癌患者由来の血漿
また、図１４〜１８における試料、分析対象領域、陽性ドロップレット数、陰性ドロップレット数、総ドロップレット数および閾値を表１２〜１６にそれぞれまとめた。【０１５４】
【表１２】
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【０１５５】
【表１３】
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【０１５６】
【表１４】
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【０１５７】
【表１５】
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【０１５８】
【表１６】
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【０１５９】
図１４のＡ及び表１２の結果より、乳癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認（１回目：１個、２回目：１個）できることから、目的の増幅産物［ＦＯＸＢ２遺伝子の特定領域：配列番号１１で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］が得られていることが分かる。
また、図１４のＢ及び表１２の結果より、乳癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認（１回目：９１個、２回目：１２９個、３回目：９３個、４回目：１４７個）できることから、目的の増幅産物［ＧＡＰＤＨ遺伝子の特定領域：配列番号１５で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態であると判定することができる。また、血漿に由来する対象（乳癌患者）は、癌に罹患している又は当該対象（乳癌患者）中に癌細胞が存在していると判定することができる。【０１６０】
図１５のＡ及び表１３の結果より、大腸癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認（１回目：１０個、２回目：９個、３回目：２個、４回目：１０個）できることから、目的の増幅産物［ＦＯＸＢ２遺伝子の特定領域：配列番号１１で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］が得られていることが分かる。
また、図１５のＢ及び表１３の結果より、大腸癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認（１回目：９４個、２回目：１２６個、３回目：９３個、４回目：７４個）できることから、目的の増幅産物［ＧＡＰＤＨ遺伝子の特定領域：配列番号１５で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態であると判定することができる。また、血漿に由来する対象（大腸癌患者）は、癌に罹患している又は当該対象（大腸癌患者）中に癌細胞が存在していると判定することができる。【０１６１】
図１６のＡ及び表１４の結果より、膵臓癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認（２回目：１個、３回目：２個、４回目：１個）できることから、目的の増幅産物［ＦＯＸＢ２遺伝子の特定領域：配列番号１１で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］が得られていることが分かる。
また、図１６のＢ及び表１４の結果より、膵臓癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認（１回目：６５個、２回目：７６個、３回目：８１個、４回目：８６個）できることから、目的の増幅産物［ＧＡＰＤＨ遺伝子の特定領域：配列番号１５で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態であると判定することができる。また、血漿に由来する対象（膵臓癌患者）は、癌に罹患している又は当該対象（膵臓癌患者）中に癌細胞が存在していると判定することができる。【０１６２】
図１７のＡ及び表１５の結果より、胃癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認（１回目：１０個、２回目：９個、３回目：１８個、４回目：１３個）できることから、目的の増幅産物［ＦＯＸＢ２遺伝子の特定領域：配列番号１１で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］が得られていることが分かる。
また、図１７のＢ及び表１５の結果より、胃癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認（１回目：９７個、２回目：１０１個、３回目：１１２個、４回目：１３９個）できることから、目的の増幅産物［ＧＡＰＤＨ遺伝子の特定領域：配列番号１５で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態であると判定することができる。また、血漿に由来する対象（胃癌患者）は、癌に罹患している又は当該対象（胃癌患者）中に癌細胞が存在していると判定することができる。【０１６３】
図１８のＡ及び表１６の結果より、抗癌剤投与後の肺癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認（２回目：１個、３回目：１個）できることから、目的の増幅産物［ＦＯＸＢ２遺伝子の特定領域：配列番号１１で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］が得られていることが分かる。
また、図１８のＢ及び表１６の結果より、抗癌剤投与後の肺癌患者由来の血漿を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認（１回目：８５個、２回目：８２個、３回目：６２個、４回目：９２個）できることから、目的の増幅産物［ＧＡＰＤＨ遺伝子の特定領域：配列番号１５で表される塩基配列からなる領域（１４９塩基対）］が得られていることが分かる。
即ち、分析対象領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、メチル化状態であると判定することができる。また、血漿に由来する対象（抗癌剤投与後の肺癌患者）は、癌に罹患している又は当該対象（抗癌剤投与後の肺癌患者）中に癌細胞が存在していると判定することができる。【０１６４】
実施例６及び７より、本発明の方法によれば、ターゲット遺伝子と内在性コントロールとして選択した遺伝子の同時増幅・検出であっても、メチル化された分析対象領域の増幅並びにメチル化の判定および癌の判定を行えることが分かった。
そのため、実際の臨床現場において、本発明の方法を適用できる可能性が大きく示唆された。
また、実施例８の図１８より、抗癌剤投与後の癌患者由来の血漿を用いた場合であっても、目的の増幅産物が得られていることから、本発明を抗癌剤投与、放射線照射、手術予後等の経過観察に使用できる可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１６５】
本発明の増幅方法、メチル化判定方法、癌の判定方法及び癌の判定を行うためのデータを得る方法によれば、メチル化されたＤＮＡの増幅、ＤＮＡのメチル化の判定癌の判定及び癌の判定を行うためのデータの取得を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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