(57)【要約】遺伝子変異の検出方法であって、第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドに、一本鎖環状DNAおよびプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によって標的ポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、を含み、前記一本鎖環状DNAは、前記標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な配列と、該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、好ましくは検出試薬結合配列に相補的な配列と、を含み、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な配列を有する領域と、該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列を有する領域と、を含む方法。
2018020831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した第２の領域を含むキャプチャーポリヌクレオチドに、一本鎖環状DNAおよびオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってキャプチャーポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、
を含む遺伝子変異の検出方法であって、
前記一本鎖環状DNAは、
前記キャプチャーポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な配列と、
該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、を含み、
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、
前記キャプチャーポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な配列を有する領域と、
該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列を有する領域と、を含み、
前記キャプチャーポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーは変異を含み、変異特異的にキャプチャーポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAとがハイブリダイズし、三者複合体を形成したときに核酸増幅反応が起こり、検出試薬によって検出される、方法。
【請求項２】
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドに、一本鎖環状DNAおよびプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によって標的ポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、
を含み、
前記一本鎖環状DNAは、
前記標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な配列と、
該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、を含み、
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、
前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な配列を有する領域と、該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列を有する領域と、
を含む方法。
【請求項３】
前記一本鎖環状DNAはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項１または２に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項４】
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドに、第１の一本鎖環状DNAおよび第１のプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によって標的ポリヌクレオチドと第１のプライマーと第１の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のプライマーと第２の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程および
増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、
を含み、
前記第１の一本鎖環状DNAは、
前記標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な配列と、
該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、第２の一本鎖環状DNA結合配列に相補的な配列と、
を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、
前記標的ポリヌクレオチド第２の領域に相補的な配列を有する領域と、
該配列の３’側に隣接した、第１の一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列を有する領域と、
を含み
前記第２の一本鎖環状DNAは、
第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列に相補的な配列と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２のプライマー結合配列と、を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、
第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、方法。
【請求項５】
前記第２の一本鎖環状DNAはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項４に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に存在する変異塩基とハイブリダイズする塩基を、前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を有する領域の最も３’側の位置に有する、請求項２に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項７】
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に存在する変異塩基とハイブリダイズする塩基を、前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を有する領域の最も３’側の位置に有する、請求項４に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項８】
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、その３’側の変異を含む第２の領域を含むmiRNAに、一本鎖環状DNAおよびキャプチャーポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってキャプチャーポリヌクレオチドとmiRNAと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、を含み、前記一本鎖環状DNAは、
miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域と、
を含み、
前記キャプチャーポリヌクレオチドは、
一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と
miRNAの第１の領域に相補的なmiRNA結合配列を含む、方法。
【請求項９】
前記一本鎖環状DNAはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項８に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項１０】
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含むmiRNAに、第１の一本鎖環状DNAおよびキャプチャーポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってmiRNAとキャプチャーポリヌクレオチドと第１の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のプライマーと第２の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程および
増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、
を含み、
前記第１の一本鎖環状DNAは、
miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域と、
第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含み、
前記キャプチャーポリヌクレオチドは、
一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と
miRNAの第１の領域に相補的な配列を含み
前記第２の一本鎖環状DNAは、
第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２のプライマー結合配列と、を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、
第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、方法。
【請求項１１】
前記第２の一本鎖環状DNAはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項１０に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項１２】
前記検出用試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列であり、前記検出用試薬がグアニン四重鎖結合試薬である、請求項３，５，９または１１に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項１３】
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列がＣ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3配列を含む、請求項１２に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項１４】
グアニン四重鎖結合試薬が下記一般式（I）で表される化合物を含む、請求項１２または１３に記載の遺伝子変異の検出方法。
【化１】
2018020831.tif 000021
Ｒ1は水素、またはＯ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい炭化水素基を示し、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して炭素数１〜５の炭化水素基を示し、
nは０〜５の整数を示し、
ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す。
【請求項１５】
遺伝子変異が一塩基多型である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子変異の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism: SNP）や塩基挿入、塩基欠失などの遺伝子変異を含むポリヌクレオチドを簡便に効率よく検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、疾患に関連するSNPなどの遺伝子変異が数多く見出されており、遺伝子変異を解析して疾患のかかりやすさを予測する遺伝子検査や、治療方法を遺伝子変異の種類によって変えたりするオーダーメイド医療が注目を集めている。例えば、SNPの解析方法としては、SNP特異的プライマーやSNP特異的プローブを使用し、増幅やハイブリダイゼーションの有無によってSNPのタイプを調べる方法や、制限酵素による切断の有無によってSNPのタイプを調べる方法や、配列を直接シークエンシングする方法などが知られている。しかしながら、これらの方法はクリニックでの簡易検査やセルフメディケーションに用いるには装置の価格や使用コストが高く、操作も煩雑である。【０００３】
特許文献１ではローリングサークル増幅法によってRNAを検出する方法が開示されているが、アナライトのRNAをプライマーに使用しているため、検出対象にできる配列が３'末端に制約される。また、増幅効率や検出効率の面でも十分ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2012-080871号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Anal. Chem., 2016, 88 (14), pp 7137-7144
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、標的ポリヌクレオチド上の特定の位置に存在するSNPなどの遺伝子変異や塩基挿入、塩基欠失を簡便な手法で効率よく検出するための方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、PCT/JP2016/059262（WO 2016/152936）で既に出願済の一本鎖環状DNA、プライマーおよびグアニン四重鎖結合試薬を用いたポリヌクレオチドの検出方法（非特許文献１）において、SNPなどの遺伝子変異を含む標的ポリヌクレオチドを用い、該遺伝子多型を含む領域にプライマーを設計することにより、増幅の有無によって遺伝子変異のタイプや有無を効率的に判別できることを見出し、本発明を完成させた。【０００８】
本発明によれば、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した第２の領域を含むキャプチャーポリヌクレオチドに、一本鎖環状DNAおよびオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってキャプチャーポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸、好ましくは増幅された核酸中に含まれる検出試薬結合配列を検出試薬によって検出する工程、
を含む遺伝子変異の検出方法であって、
前記一本鎖環状DNAは、
前記キャプチャーポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０〜３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、
好ましくは検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含み、
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、
前記キャプチャーポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を有する領域と、
該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列を有する領域と、を含み、
前記キャプチャーポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーは変異を含み、変異特異的にキャプチャーポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAとがハイブリダイズし、三者複合体を形成したときに核酸増幅反応が起こり、検出試薬によって検出される、方法が提供される。【０００９】
前記キャプチャーポリヌクレオチドの位置に、変異を含む標的ポリヌクレオチドを配置する方法である、本発明の第一の態様によれば、
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドに、一本鎖環状DNAおよびプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によって標的ポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸、好ましくは増幅された核酸中に含まれる検出試薬結合配列を検出試薬によって検出する工程、
を含み、
前記一本鎖環状DNAは、
前記標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０〜３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、
好ましくは検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含み、
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、
（ii）前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を有する領域と、
該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列を有する領域と、を含む
方法、が提供される。【００１０】
前記キャプチャーポリヌクレオチドの位置に、変異を含む標的ポリヌクレオチドを配置する方法である、本発明の第二の態様によれば、
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドに、第１の一本鎖環状DNAおよび第１のプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によって標的ポリヌクレオチドと第１のプライマーと第１の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のプライマーと第２の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程および
増幅された核酸、好ましくは増幅された核酸中に含まれる検出試薬結合配列を検出試薬によって検出する工程、
を含み、
前記第１の一本鎖環状DNAは、
前記標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０〜３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、
第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、
（ii）前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を有する領域と、
該配列の３’側に隣接した、第１の一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列を有する領域と、
を含み
前記第２の一本鎖環状DNAは、
（iii）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列と、
好ましくは検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、
（iv）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、方法
が提供される。【００１１】
なお、前記オリゴヌクレオチドプライマー（第二の態様においては第１のオリゴヌクレオチドプライマー）は、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に存在する変異塩基とハイブリダイズする塩基を、前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を有する領域の最も3’側の位置に有することが好ましい。【００１２】
前記オリゴヌクレオチドの位置に、変異を含む標的miRNA（マイクロRNA）を配置する方法である、本発明の第三の態様によれば、
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、その３’側の変異を含む第２の領域を含むmiRNAに、一本鎖環状DNAおよびキャプチャーポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってキャプチャーポリヌクレオチドとmiRNAと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および増幅された核酸、好ましくは検出試薬結合配列を検出試薬によって検出する工程、を含み、前記一本鎖環状DNAは、
miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域と、好ましくは検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含み、
前記キャプチャーポリヌクレオチドは、
一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と
miRNAの第１の領域に相補的なmiRNA結合配列を含む、方法が提供される。【００１３】
前記オリゴヌクレオチドの位置に、変異を含む標的miRNA（マイクロRNA）を配置する方法である、本発明の第四の態様によれば、
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含むmiRNAに、第１の一本鎖環状DNAおよびキャプチャーポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってmiRNAとキャプチャーポリヌクレオチドと第１の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のプライマーと第２の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程および
増幅された核酸、好ましくは増幅された核酸中に含まれる検出試薬結合配列を検出試薬によって検出する工程、
を含み、
前記第１の一本鎖環状DNAは、
miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域と、
第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含み、
前記キャプチャーポリヌクレオチドは、
一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と
miRNAの第１の領域に相補的な配列を含み
前記第２の一本鎖環状DNAは、
（iii）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列と、
好ましくは検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、
（iv）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、方法
が提供される。【００１４】
また、前記検出用試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列であり、前記検出用試薬がグアニン四重鎖結合試薬であることが好ましく、グアニン四重鎖結合試薬は後述のThT誘導体であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の一態様によれば、標的ポリヌクレオチド配列が存在すると、一本鎖環状DNAとプライマーがハイブリダイズして、そこから、幾つものグアニン四重鎖含有配列などの検出試薬結合配列が直列に繋がったDNA鎖が生成し、これをThT（誘導体）などの検出試薬で染色することにより、標的ポリヌクレオチド配列を特異的に検出できる。昇温・降温などの温度サイクルを必要するPCR法ではなく、一定温度で反応が進行するRCA法を用いるため、簡易検出法への応用が可能である。そして、標的ポリヌクレオチド配列における変異塩基とプライマーの塩基が一致しない場合は増幅がほとんど起こらないので、変異のタイプや有無の判別が可能であり、遺伝子診断等の用途に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の第一の態様にかかるポリヌクレオチド増幅方法の模式図。星印はSNP部位を示す。
【図２】本発明の第二の態様にかかるポリヌクレオチド増幅方法の模式図。星印はSNP部位を示す。
【図３】実施例１（サンプルｂ２〜ｂ７）の標的ポリヌクレオチド、第１の一本鎖環状DNA、および各種第１のプライマーの複合体形成と、その伸長産物と第２の一本鎖環状DNA、および第２のプライマーの複合体形成を示す図。
【図４】実施例１における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。
【図５】実施例２（サンプルａ２、ａ４、ｂ２、ｂ４、ｂ５、ｂ６）の標的ポリヌクレオチド、一本鎖環状DNA、および各種プライマーの複合体形成と、その伸長産物と第２の一本鎖環状DNA、および第２のプライマーの複合体形成を示す図。
【図６】実施例２における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。
【図７】実施例２における二重鎖DNAと一本鎖DNAをターゲットにした場合の蛍光スペクトルの違いを示す図。
【図８】実施例３（サンプルｂ２、ｂ３、ｂ４、ｂ５、ｃ２、ｃ３、ｃ４、ｃ５）の標的ポリヌクレオチド、一本鎖環状DNA、および各種プライマーの複合体形成と、その伸長産物と第２の一本鎖環状DNA、および第２のプライマーの複合体形成を示す図。
【図９】実施例３における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。
【図１０】実施例４（サンプルｂ１、ｂ２、ｂ３、ｂ４、ｂ５）の標的ポリヌクレオチド、一本鎖環状DNA、および各種プライマーの複合体の構造を示す図。
【図１１】実施例４における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。
【図１２】実施例５（左はG636のSNPでプライマーP2、右はG681のSNPでプライマーP4）の標的ポリヌクレオチド、一本鎖環状DNA、および各種プライマーの複合体形成と、その伸長産物と第２の一本鎖環状DNA、および第２のプライマーの複合体形成を示す図。
【図１３】実施例５における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。
【図１４】本発明の第三の態様にかかるポリヌクレオチド増幅方法の模式図。星印はSNP部位を示す。
【図１５】本発明の第四の態様にかかるポリヌクレオチド増幅方法の模式図。星印はSNP部位を示す。
【図１６】実施例６（miR-21-CA）の標的ポリヌクレオチド（miRNA）、一本鎖環状DNA、キャプチャーポリヌクレオチドおよびプライマーの複合体の構造を示す図。
【図１７】実施例６における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。
【図１８】実施例７（miR-13（u））の標的ポリヌクレオチド（miRNA）、一本鎖環状DNA、キャプチャーポリヌクレオチドおよびプライマーの複合体の構造を示す図。
【図１９】実施例７における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。
【図２０】実施例８の標的ポリヌクレオチド（長鎖DNA）、一本鎖環状DNA、キャプチャーポリヌクレオチドおよびプライマーの複合体の構造を示す図。
【図２１】実施例８(PCR増幅産物を用いた時)における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。
【図２２】実施例８(抽出物を用いた時)における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明によれば、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した第２の領域を含むキャプチャーポリヌクレオチドに、一本鎖環状DNAおよびオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってキャプチャーポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸、好ましくは増幅された核酸中に含まれる検出試薬結合配列を検出試薬によって検出する工程、
を含む遺伝子変異の検出方法であって、
前記一本鎖環状DNAは、
前記キャプチャーポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０〜３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、
好ましくは検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含み、
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、
前記キャプチャーポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を有する領域と、
該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列を有する領域と、を含み、
前記キャプチャーポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーは変異を含み、変異特異的にキャプチャーポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAとがハイブリダイズし、三者複合体を形成したときに核酸増幅反応が起こり、検出試薬によって検出される、方法が提供される。
ここで、遺伝子変異としては、一塩基多型（SNP）、塩基欠失、塩基挿入などが挙げられる。
【００１８】
＜キャプチャーポリヌクレオチドを変異を含む標的ポリヌクレオチドとする場合〜第一の態様＞
本発明の第一の態様にかかる遺伝子変異の検出方法は、
第１の領域と、その３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドを用い、
（i）標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０〜３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、
検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含む一本鎖環状DNAと、
（ii）標的ポリヌクレオチドの、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列と、
を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）検出試薬と、
を用いる。
【００１９】
＜標的ポリヌクレオチド＞
標的ポリヌクレオチドは、SNPなどの遺伝子変異を含む配列であれば特に限定されず、DNAでもRNAでもよい。DNAは一本鎖DNAでもよいし、センス鎖とアンチセンス鎖（相補鎖）からなる二本鎖DNAでもよい。
標的ポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムDNAやRNAにおいて、標的の遺伝子変異を含む領域を第２の領域と設定し、その５’側に隣接する領域を第１の領域と設定し、これらを含む配列を標的ポリヌクレオチドとして設定できる。そして、第１の領域と第２の領域の配列に基づいて、下記の一本鎖環状DNAとプライマーを設計することができる。
【００２０】
標的ポリヌクレオチドは生物種由来の試料から調製または単離されたものでもよい。そのような標的ポリヌクレオチドを含む試料には、ウイルス、原核生物または真核生物の個体そのもの、あるいはその一部が使用できる。例えば、脊椎動物（ヒトを含む）では、糞便、尿、または汗のような排泄物、血液、精液、唾液、胃液、または胆汁のような体液等が挙げられる。また、外科的に生体から取り出した組織、または体毛のように生体から脱落した組織であってもよい。さらに、食品等の加工物から調製したポリヌクレオチド含有調製物であってもよい。また、前記試料をさらに分画して、その一部を取り出したものから調製したRNA含有調製物であってもよい。試料は、標的となるポリヌクレオチドを含有していれば、ポリヌクレオチドが精製されていても、精製されていなくても用いることができる。
【００２１】
標的ポリヌクレオチドは一本鎖環状DNAおよびプライマーがハイブリダイズできるものであれば、長さも特に限定されない。ステムループ構造のループ部分に一本鎖環状DNAがハイブリダイズしやすいので、ステムループ構造を取るポリヌクレオチドが好ましい。
【００２２】
＜一本鎖環状DNA＞
一本鎖環状DNAは、標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０〜３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、好ましくは７〜８塩基のプライマー結合配列と、
グアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列と、を含む。
なお、標的ポリヌクレオチドが二本鎖DNAの場合、図８のｃ２、ｃ３、ｃ５に示すように、一本鎖環状DNAは、標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０〜３０塩基の配列の３’側に隣接して、該配列の３’末端側と相補的な配列をさらに含むことが好ましい。これにより、二本鎖DNAの相補鎖がハイブリダイズでき、より複合体が安定化される。
【００２３】
図１を参照し、例を挙げて説明する。なお、一本鎖環状DNAでは、時計回りに５’→３’である。一本鎖環状DNA１０は標的ポリヌクレオチド１１の第1の領域１１１に相補的な配列１０１と、その５’側に連結したプライマー結合配列１０２と、グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列１０３を含む。配列１０１の長さは、通常、１０〜３０塩基であり、好ましくは１５〜２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。配列１０２の長さは好ましくは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。
【００２４】
グアニン四重鎖形成配列としては、Nat Rev Drug Discov. 2011 Apr; 10(4): 261-275.に記載されたような配列が挙げられ、Ｇ3Ｎ1-10Ｇ3Ｎ1-10Ｇ3Ｎ1-10Ｇ3で表されるが、具体的には、配列番号２７〜３２に記載の配列などが例示される。グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列としては、Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3が例示される。すなわち、連続する３つのＣが、１〜１０個（好ましくは１〜５個）の任意の塩基（Ｎ＝Ａ，Ｔ，ＧまたはＣ）からなる配列をスペーサーとして、４回繰り返される配列である。
22mer DNA（２２ＡＧ：5'-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3' （配列番号２７）および
２２Ｋｉｔ：5'-AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG-3'（配列番号２８））、
26mer DNA（２６Ｔｅｌ：5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTT-3'（配列番号２９））、
27mer DNA（２７Ｍｙｃ：5'-TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGA AGG-3'（配列番号３０））、
20mer DNA（２０Ｓｒｃ：5'-GGGCGGCGGGCTGGGCGGGG-3'（配列番号３１））、
18mer RNA（１８Ｒａｓ：5'-GGGAGGGGCGGGUCUGGG-3'（配列番号３２））。
【００２５】
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列はその前後、すなわち、プライマー結合配列１０２との間および標的ポリヌクレオチドの第1の領域に相補的な配列１０１との間に任意の配列を含んでもよい。一本鎖環状DNA１０全体の長さは、好ましくは３５〜１００塩基である。
【００２６】
なお、図１では、検出試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列である場合について説明したが、例えば、検出試薬結合配列をアプタマー配列もしくは分子ビーコン（FRETを生じさせる蛍光基（ドナー）と消光基（アクセプター）を有するヘアピン状のオリゴヌクレオチド）結合配列とし、検出試薬として、アプタマー結合性発色分子もしくは分子ビーコンを用いて検出することも可能である。また、検出試薬結合配列にハイブリダイズする標識プローブを用いて検出することも可能である。
また、本発明の第一の態様においては、配列非特異的にDNAに結合して蛍光を発するCyber Gold（商品名）などの核酸染色試薬を検出試薬として用いて増幅された核酸を検出することも可能であるため、一本鎖環状DNAにおける検出試薬結合配列に相補的な配列の存在は必須ではない。
【００２７】
一本鎖環状DNA１０は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。一本鎖ＤＮＡの環状化は、任意の手段によって行うことができるが、例えば、CircLigase（登録商標）、CircLigase II（登録商標）、ssDNA Ligase（Epicentre社）、ThermoPhage ligase（登録商標） single-stranded DNA（Prokzyme社）を用いて行うことができる。
【００２８】
＜オリゴヌクレオチドプライマー＞
プライマー１２は、標的ポリヌクレオチド１１の、第１の領域１１１の３’側に隣接したSNPなどの遺伝子変異（図１の星印）を含む第２の領域１１２に相補的な８〜１５塩基の標的ポリヌクレオチド結合配列１２１と、その３’側に連結された、一本鎖環状DNA１０のプライマー結合領域１０２に相補的な好ましくは７〜８塩基の環状DNA結合配列１２２と、を含む。なお、プライマーは担体に固定化するなどして固相化されてもよい。これにより固相での検出も可能となる。固相化法としては、ビオチンなどでプライマーを標識し、アビジン等との相互作用により固相化する方法などが挙げられる。
【００２９】
オリゴヌクレオチドプライマーにおいては、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に存在する変異塩基とハイブリダイズする塩基を、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な配列１２１の最も３’側の位置に有することが好ましい。
例えば、標的ポリヌクレオチドの多型がA/Gの一塩基多型で、Aを検出しようとするときは、Aに対応するTが標的ポリヌクレオチド結合配列の３’末端の位置になるように、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することが特に好ましい。
【００３０】
＜増幅方法＞
標的ポリヌクレオチド１１に一本鎖環状DNA１０およびプライマー１２をハイブリダイズさせて三者の複合体を形成させた後、ローリングサークル増幅（RCA）法によって標的ポリヌクレオチドに基づく核酸増幅反応を行う。
【００３１】
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば、一本鎖環状DNAと標的ポリヌクレオチドとプライマーの組み合わせを検討し、適宜設定できる。
【００３２】
RCA法はLizardi et al., Nature Genet. 19: 225-232 (1998);米国特許第５，８５４，０３３号及び同第６，１４３，４９５号；ＰＣＴ出願ＷＯ９７／１９１９３などに記載されている。RCA法は、例えば、phi29 polymerase、Klenow DNA Polymerase (5'-3', 3'-5' exo minus) 、Sequenase（登録商標）Version 2.0 T7 DNA Polymerase (USB社)、Bsu DNA Polymerase, Large Fragment (NEB社)などの中温性の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素や、Bst DNA Polymerase (Large Fragment) 、Bsm DNA Polymerase, Large Fragment (Fermentas社)、BcaBEST DNA polymerase (TakaraBio社)、Vent DNA polymerase (NEB社)、Deep Vent DNA polymerase (NEB社)、DisplaceAce (登録商標) DNA Polymerase (Epicentre社)等の耐熱性の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いることで行うことができる。
【００３３】
RCAによるＤＮＡの伸長反応は、サーマルサイクラーを用いる必要はなく、例えば、２５℃〜６５℃の範囲の一定の温度において実施される。反応温度は、酵素の至適温度とプライマー鎖長に基づく変性温度（プライマーが鋳型ＤＮＡに結合（アニール）／解離する温度帯）に基づいて通常の手順により適宜設定される。さらに、一定の比較的低温においても実施される。例えば、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素としてphi29ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、好ましくは２５℃〜４２℃、より好ましくは約３０〜３７℃で反応する。RCAによって、標的ポリヌクレオチド１１依存的に、プライマー１２から一本鎖環状DNA１０に沿ってグアニン四重鎖形成配列（配列１０３に対応）を含む核酸（増幅産物１３）が増幅される。増幅産物１３はグアニン四重鎖を含む配列１０４を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬１０５によって検出される。
【００３４】
標的ポリヌクレオチドにおけるSNPなどの遺伝子変異のタイプがプライマーに設定した塩基のタイプと一致するとき、すなわち、標的ポリヌクレオチドの変異塩基がプライマーに含まれる変異部位の塩基の相補塩基に該当するときは、増幅反応が起こり、検出試薬で検出されるが、標的ポリヌクレオチドの変異のタイプがプライマーに設定した塩基のタイプと異なるときは増幅反応がほとんど起こらず、検出試薬で検出されない。したがって、本発明の検出方法により、標的ポリヌクレオチドのSNPなどの遺伝子変異のタイプや遺伝子変異の有無が同定できる。
【００３５】
なお、上記第一及び第二の態様においては、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に変異が含まれるように設計し、変異に対応する塩基を有するプライマーとのハイブリダイゼーションに基づく複合体の安定性に基づいてプライマーからの伸長反応を解析するが、標的ポリヌクレオチドの第１の領域に変異が含まれるように設計し、変異に対応する塩基を有する一本鎖環状DNAとのハイブリダイゼーションに基づく複合体の安定性に基づいてプライマーからの伸長反応を解析する態様も本発明の方法に含まれる。
【００３６】
＜キャプチャーポリヌクレオチドを変異を含む標的ポリヌクレオチドとする場合〜第二の態様＞
本発明の第二の態様にかかる遺伝子変異検出方法は、
第１の領域と、その３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドを用い、
（i）標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０〜３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、第１のプライマー結合配列と、
第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含む第１の一本鎖環状DNAと、
（ii）標的ポリヌクレオチドの、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第１の一本鎖環状DNAの第１のプライマー結合領域に相補的な配列と、
を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列と、
グアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含む、第２の一本鎖環状DNAと、
（iv））第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的な配列と、
を含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（v）グアニン四重鎖結合試薬などの検出試薬、とを用いる。
【００３７】
＜標的ポリヌクレオチド＞
標的ポリヌクレオチドについては、第一の態様で説明したとおりである。
【００３８】
＜第１の一本鎖環状DNA＞
第１の一本鎖環状DNAは、標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０〜３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、好ましくは７〜８塩基のプライマー結合配列と、
第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含む。
なお、標的ポリヌクレオチドが二本鎖DNAの場合、図８のｃ２、ｃ３、ｃ５に示すように、第１の一本鎖環状DNAは、標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０〜３０塩基の配列の３’側に隣接して、該配列の３’末端側と相補的な配列をさらに含むことが好ましい。これにより、二本鎖DNAの相補鎖がハイブリダイズでき、より複合体が安定化される。
【００３９】
図２を参照して説明する。
第１の一本鎖環状DNA２０は標的ポリヌクレオチド２１の第1の領域２１１に相補的な配列２０１と、
その５’側に連結したプライマー結合配列２０２と、第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３を含む。
配列２０１の長さは、通常、１０〜３０塩基であり、好ましくは１５〜２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。配列２０２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。第１の一本鎖環状DNA２０全体の長さは、好ましくは３５〜１００塩基である。第１の一本鎖環状DNA２０は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
【００４０】
＜第１のオリゴヌクレオチドプライマー＞
第１のオリゴヌクレオチドプライマー２２は、標的ポリヌクレオチド２１の、第１の領域２１１の３’側に隣接した遺伝子変異を含む第２の領域２１２に相補的な８〜１５塩基の配列２２１と、その３’側に連結された、第１の一本鎖環状DNA２０のプライマー結合領域２０２に相補的な好ましくは７〜８塩基の配列２２２と、を含む。
なお、第１のオリゴヌクレオチドプライマーにおいては、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に存在する変異塩基とハイブリダイズする塩基を、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な配列２２１の最も３’側の位置に有することが好ましい。
例えば、標的ポリヌクレオチドの遺伝子変異がA/Gの一塩基多型で、Aを検出しようとするときは、Aに対応するTが標的ポリヌクレオチド結合配列２２１の最も３’側の位置になるように、第１オリゴヌクレオチドプライマーを設計することが好ましい。
【００４１】
＜第２の一本鎖環状DNA＞
第２の一本鎖環状DNA２４は、第１の一本鎖環状DNA２０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３と同一の配列２４１と、
該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列２４２と、
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列２４３と、
を含む。
配列２４１の長さは、通常、１０〜３０塩基であり、好ましくは１５〜２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。配列２４２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列２４３については、第一の態様で説明したのと同様である。第２一本鎖環状DNA２４全体の長さは、好ましくは３５〜１００塩基である。第２の一本鎖環状DNA２４は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
【００４２】
なお、図２では、検出試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列である場合について説明したが、検出試薬結合配列をアプタマー配列もしくは分子ビーコン（FRETを生じさせる蛍光基（ドナー）と消光基（アクセプター）を有するヘアピン状のオリゴヌクレオチド）結合配列とし、検出試薬として、アプタマー結合性発色分子もしくは分子ビーコンを用いて検出することも可能である（ChemBioChem 2007, 8, 1795-1803；J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 7430-7433）。
また、本発明の第二の態様においては、配列非特異的にDNAに結合して蛍光を発するCyber Gold（商品名）などの核酸染色試薬を検出試薬として用いて増幅された核酸を検出することも可能であるため、第2の一本鎖環状DNAにおける検出試薬結合配列に相補的な配列の存在は必須ではない。
【００４３】
＜第２のオリゴヌクレオチドプライマー＞
第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５は、第１の一本鎖環状DNA２０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３の５’側に隣接した領域２０４と同一の配列２５１（好ましくは８〜１５塩基の配列）と、該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列２４２に相補的な配列２５２（好ましくは７〜８塩基の配列）と、を含む。
【００４４】
＜増幅方法＞
図２に示されるように、まず、標的ポリヌクレオチド２１に第１の一本鎖環状DNA２０およびプライマー２２をハイブリダイズさせて三者の複合体を形成させた後、ローリングサークル増幅（RCA）法によって標的ポリヌクレオチドに基づく核酸増幅反応を行う。反応条件等は第一の態様と同様である。
RCAによって、標的ポリヌクレオチド２１依存的に、プライマー２２から第１の一本鎖環状DNA２０に沿って第１増幅産物２３が増幅される。
【００４５】
増幅産物２３は、第１の一本鎖環状DNA２０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３に相補的な配列２３１を含むため、この配列２０３と同一の配列２４１を含む第２の一本鎖環状DNA２４は、第１の増幅産物２３の配列２３１に、配列２４１を介してハイブリダイズする。
このようにしてできた、第１の増幅産物２３と、第２の一本鎖環状DNAの複合体に、第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５がハイブリダイズして三者の複合体ができる。
【００４６】
すなわち、第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５は、第１の一本鎖環状DNA２０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３の５’側に隣接した領域２０４と同一の配列２５１を有するので、第１の増幅産物２３の、第１の一本鎖環状DNA２０の領域２０４に相補的な領域２３２に、配列２５１を介してハイブリダイズする。
また、第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５は、配列２５１の３’側に、第２の一本鎖環状DNA２４の第２のプライマー結合配列２４２に相補的な配列２５２を有するので、第２の一本鎖環状DNA２４にも配列２５２を介してハイブリダイズする。
【００４７】
この第１の増幅産物２３と、第２の一本鎖環状DNA２４と、第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５との三者複合体から、RCAにより、第２の増幅産物２６（伸長鎖）が増幅される。第２の増幅産物２６はグアニン四重鎖を含む配列２６１を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬２６２によって検出される。第二の態様では、第１の増幅産物２３に含まれる領域２３１のそれぞれに第２の一本鎖環状DNA２４がハイブリダイズしてRCA反応が起こるので、検出感度の著しい向上が達せられる。
【００４８】
そして、標的ポリヌクレオチドのSNPなどの遺伝子変異のタイプがプライマーに設定した塩基のタイプと一致するときは、増幅反応が起こり、検出試薬で検出されるが、標的ポリヌクレオチドの遺伝子変異のタイプがプライマーに設定した塩基のタイプと異なるときは増幅反応がほとんど起こらず、検出試薬で検出されない。
したがって、本発明の検出方法により、標的ポリヌクレオチドのSNPなどの遺伝子変異のタイプまたは遺伝子変異の有無が同定できる。
【００４９】
＜オリゴヌクレオチドプライマーを変異を含む標的ポリヌクレオチドとする場合〜第三の態様＞
本発明の第三の態様にかかる遺伝子変異の検出方法は、
第１の領域と、その３’側の変異を含む第２の領域を含むmiRNAを標的ポリヌクレオチドとして用い、
（i）miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域とグアニン四重鎖などの検出試薬結合配列に相補的な配列を含む一本鎖環状DNAと、
（ii）一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な鋳型結合配列と
miRNAの第１の領域に相補的なmiRNA結合配列を含むキャプチャーポリヌクレオチドと、
（iii）検出試薬と、
を用いて反応を行う。
【００５０】
＜標的ポリヌクレオチド＞
標的ポリヌクレオチドは、SNPなどの遺伝子変異を含むmiRNAである。miRNAは３’側に変異を有するもの、すなわち、第１の領域と、その３’側の変異を含む第２の領域を含むものを使用する。変異はmiRNAの３’末端または３’末端から１〜３塩基以内の位置に存在することが好ましい。miRNAの長さは好ましくは１５〜３０塩基であり、より好ましくは１５〜２５塩基であり、さらに好ましくは１５〜２３塩基である。
【００５１】
＜一本鎖環状DNA＞
一本鎖環状DNAは、miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域とグアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列を含む。
【００５２】
図１４を参照し、例を挙げて説明する。なお、一本鎖環状DNAでは、時計回りに５’→３’である。一本鎖環状DNA３０は標的miRNA３２の第２の領域３２２に相補的な配列（miRNA結合領域）３０１と、その３’側に連結した第２の領域３０２と、グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列３０３を含む。
配列３０１の長さは、好ましくは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。第２の領域３０２の長さは通常、１０〜３０塩基であり、好ましくは１５〜２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。
一本鎖環状DNA３０の、miRNA３２の第２の領域３２２に相補的なmiRNA結合領域３０１は、miRNAの変異（検出対象変異：図１４の星印）と相補的な塩基を含んでおり、miRNAの変異が検出対象と異なる場合はハイブリダイズしない。したがって、ハイブリダイズの有無により目的変異の有無の検出が可能である。
【００５３】
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列３０３はその前後、すなわち、第２の領域３０２との間およびmiRNA結合領域３０１との間に任意の配列を含んでもよい。一本鎖環状DNA３０全体の長さは、好ましくは３５〜１００塩基である。なお、グアニン四重鎖形成配列は他の検出試薬結合配列に置換され得る。また、本発明の第三の態様においては、配列非特異的にDNAに結合して蛍光を発するCyber Gold（商品名）などの核酸染色試薬を検出試薬として用いて増幅された核酸を検出することも可能であるため、一本鎖環状DNAにおける検出試薬結合配列に相補的な配列の存在は必須ではない。
【００５４】
＜キャプチャーポリヌクレオチド＞
キャプチャーポリヌクレオチドは、一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な鋳型結合配列とmiRNAの第１の領域に相補的なmiRNA結合配列を含む。
図１４において、キャプチャーポリヌクレオチド３１は、一本鎖環状DNA３０の第２の領域３０２に相補的な配列３１１と、miRNA３２の第１の領域３２１に相補的なmiRNA結合配列３１２を含み、配列３１１の長さは通常、１０〜３０塩基であり、好ましくは１５〜２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％であり、配列３１２の長さは通常、８〜１５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。なお、非特異的増幅を起こさないために、キャプチャーポリヌクレオチドの３’末端はリン酸機などで修飾されていることが好ましい。
【００５５】
＜増幅方法＞
標的ポリヌクレオチド（miRNA）３２に一本鎖環状DNA３０およびキャプチャーポリヌクレオチド３１をハイブリダイズさせて三者の複合体を形成させた後、ローリングサークル増幅（RCA）法によって標的ポリヌクレオチドに基づく核酸増幅反応を行う。
【００５６】
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば、一本鎖環状DNAと標的ポリヌクレオチドとプライマーの組み合わせを検討し、適宜設定できる。
【００５７】
RCAによって、標的ポリヌクレオチド（miRNA）３２から一本鎖環状DNA３０に沿って増幅産物３３が増幅される。増幅産物３３はグアニン四重鎖を含む配列３３１を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬３４によって検出される。
【００５８】
標的ポリヌクレオチドにおけるmiRNAの変異のタイプが一本鎖環状DNAのmiRNA結合領域に設定した塩基のタイプと一致するとき、すなわち、標的ポリヌクレオチドの変異塩基が一本鎖環状DNAに含まれる変異部位の塩基の相補塩基に該当するときは、増幅反応が起こり、検出試薬で検出されるが、標的ポリヌクレオチドの変異のタイプが一本鎖環状DNAに設定した塩基のタイプと異なるときは増幅反応がほとんど起こらず、検出試薬で検出されない。したがって、本発明の検出方法により、標的ポリヌクレオチドのSNPなどの遺伝子変異のタイプや遺伝子変異の有無が同定できる。
【００５９】
＜オリゴヌクレオチドプライマーを変異を含む標的ポリヌクレオチドとする場合〜第四の態様＞
本発明の第四の態様にかかる遺伝子変異の検出方法は、
第１の領域と、その３’側の変異を含む第２の領域を含むmiRNAを標的ポリヌクレオチドとして用い、
（i）miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域と、第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、を含む第１の一本鎖環状DNA、
（ii）一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な鋳型結合配列と、miRNAの第１の領域に相補的なmiRNA結合配列を含むキャプチャーポリヌクレオチド、
（iii）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列と、検出試薬結合配列に相補的な配列と、を含む第２の一本鎖環状DNA、
（iv）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的な配列とを含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、とを用いる。
【００６０】
＜標的ポリヌクレオチド＞
標的ポリヌクレオチドとキャプチャーポリヌクレオチドについては、第三の態様で説明したとおりである。
【００６１】
＜第１の一本鎖環状DNA＞
一本鎖環状DNAは、miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域と第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列を含む。
miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域はmiRNAの変異部分に相補的な配列を含んでおり、ハイブリダイズの有無により変異の有無の検出が可能である。
【００６２】
図１５を参照し、例を挙げて説明する。なお、一本鎖環状DNAでは、時計回りに５’→３’である。一本鎖環状DNA４０は標的miRNA４２の第２の領域４２２に相補的な配列（miRNA結合領域）４０１と、その３’側に連結した第２の領域４０２と、第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列４０３を含む。
【００６３】
配列４０１の長さは、好ましくは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。配列４０２の長さは通常、１０〜３０塩基であり、好ましくは１５〜２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。第１の一本鎖環状DNA４０全体の長さは、好ましくは３５〜１００塩基である。第１の一本鎖環状DNA４０は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
【００６４】
＜第２の一本鎖環状DNA＞
第２の一本鎖環状DNA４４は、第１の一本鎖環状DNA４０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列４０３と同一の配列４４１と、該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列４４２と、グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列４４３と、を含む。
配列４４１の長さは、通常、１０〜３０塩基であり、好ましくは１５〜２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。配列４４２の長さは好ましくは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列４４３については、第一の態様で説明したのと同様である。第２一本鎖環状DNA４４全体の長さは、好ましくは３５〜１００塩基である。第２の一本鎖環状DNA４４は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
【００６５】
なお、図１５では、検出試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列である場合について説明したが、検出試薬結合配列をアプタマー配列もしくは分子ビーコン（FRETを生じさせる蛍光基（ドナー）と消光基（アクセプター）を有するヘアピン状のオリゴヌクレオチド）結合配列とし、検出試薬として、アプタマー結合性発色分子もしくは分子ビーコンを用いて検出することも可能である（ChemBioChem 2007, 8, 1795-1803；J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 7430-7433）。また、上述したとおり、本発明の第四の態様においては、配列非特異的にDNAに結合して蛍光を発するCyber Gold（商品名）などの核酸染色試薬を検出試薬として用いて増幅された核酸を検出することも可能であるため、第2の一本鎖環状DNAにおける検出試薬結合配列に相補的な配列の存在は必須ではない。
【００６６】
＜第２のオリゴヌクレオチドプライマー＞
第２のオリゴヌクレオチドプライマー４５は、第１の一本鎖環状DNA４０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列４０３の５’側に隣接した領域４０４と同一の配列４５１（好ましくは８〜１５塩基の配列）と、該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列４４２に相補的な配列４５２（好ましくは７〜８塩基の配列）と、を含む。
【００６７】
＜増幅方法＞
図１５に示されるように、まず、標的ポリヌクレオチド（miRNA）４２に、キャプチャーオリゴヌクレオチド４１および第１の一本鎖環状DNA４０をハイブリダイズさせて三者の複合体を形成させた後、ローリングサークル増幅（RCA）法によって標的ポリヌクレオチドに基づく核酸増幅反応を行う。反応条件等は第一の態様と同様である。
RCAによって、標的ポリヌクレオチド（miRNA）４２依存的に、第１の一本鎖環状DNA４０に沿って第１増幅産物４３が増幅される。
【００６８】
増幅産物４３は、第１の一本鎖環状DNA４０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列４０３に相補的な配列４３１を含むため、この配列４０３と同一の配列４４１を含む第２の一本鎖環状DNA４４は、第１の増幅産物４３の配列４３１に、配列４４１を介してハイブリダイズする。
【００６９】
このようにしてできた、第１の増幅産物４３と、第２の一本鎖環状DNAの複合体に、第２のオリゴヌクレオチドプライマー４５がハイブリダイズして三者の複合体ができる。
【００７０】
すなわち、第２のオリゴヌクレオチドプライマー４５は、第１の一本鎖環状DNA４０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列４０３の５’側に隣接した領域４０４と同一の配列４５１を有するので、第１の増幅産物４３の、第１の一本鎖環状DNA４０の領域４０４に相補的な領域４３２に、配列４５１を介してハイブリダイズする。
また、第２のオリゴヌクレオチドプライマー４５は、配列４５１の３’側に、第２の一本鎖環状DNA４４の第２のプライマー結合配列４４２に相補的な配列４５２を有するので、第２の一本鎖環状DNA４４にも配列４５２を介してハイブリダイズする。
【００７１】
この第１の増幅産物４３と、第２の一本鎖環状DNA４４と、第２のオリゴヌクレオチドプライマー４５との三者複合体から、RCAにより、第２の増幅産物４６（伸長鎖）が増幅される。第２の増幅産物４６はグアニン四重鎖を含む配列４６１を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬４６２によって検出される。第四の態様では、第１の増幅産物４３に含まれる領域４３１のそれぞれに第２の一本鎖環状DNA４４がハイブリダイズしてRCA反応が起こるので、検出感度の著しい向上が達せられる。
【００７２】
そして、標的ポリヌクレオチドのSNPなどの遺伝子変異のタイプがプライマーに設定した塩基のタイプと一致するときは、増幅反応が起こり、検出試薬で検出されるが、標的ポリヌクレオチドの遺伝子変異のタイプがプライマーに設定した塩基のタイプと異なるときは増幅反応がほとんど起こらず、検出試薬で検出されない。
したがって、本発明の検出方法により、標的ポリヌクレオチドのSNPなどの遺伝子変異のタイプまたは遺伝子変異の有無が同定できる。
【００７３】
＜検出試薬＞
本発明の方法においては、配列非特異的にDNAに結合して蛍光を発するCyber Gold（商品名）などの核酸染色試薬を検出試薬として用いることもできるが、特異的かつ好感度に検出するためには、特定の核酸配列（検出試薬結合配列）に結合して発光又は発色する分子が好ましい。
上記の通り、検出試薬結合配列と検出試薬の組み合わせは任意に決定でき、アプタマー配列とアプタマー結合性発色分子の組み合わせ、分子ビーコン結合配列と分子ビーコンの組み合わせ、特異的配列とそれにハイブリダイズする標識プローブの組み合わせなどを用いてることもできるが、好ましくはグアニン四重鎖とグアニン四重鎖結合試薬の組み合わせである。グアニン四重鎖結合試薬としては、以下のような試薬が挙げられる。
［１］チオフラビンT（ThT）またはその誘導体
【化１】
2018020831.tif 000003
［２］H-aggregate 『 Yan, J. W.; Ye, W. J.; Chen, S. B.; Wu, W. B.; Hou, J. Q.; Ou, T. M.; Tan, J. H.; Li, D.; Gu, L. Q.; Huang, Z. S. Anal. Chem. 2012, 84, 6288-6292.』
【化２】
2018020831.tif 000004
［３］TMPyP4 『Yaku, H.; Fujimoto, T.; Murashima, T.; Miyoshi, D.; Sugimoto, N. Chem. Commun. 2012, 48, 6203-6216.』
【化３】
2018020831.tif 000005
［４］ PPIX 『Li, T.; Wang, E.; Dong, S. Anal. Chem. 2010, 82, 7576-7580.』
【化４】
2018020831.tif 000006
［５］BPBC『Jin, B.; Zhang, X.; Zheng, W.; Liu, X.; Qi, C.; Wang, F.; Shangguan,D. Anal. Chem. 2014, 86, 943-952.』
［６］APD『Nikan, M.; Di Antonio, M.; Abecassis, K.; McLuckie, K.; Balasubramanian, S. Angew. Chem., Int. Ed. 2013, 52, 1428-1431.』
【化５】
2018020831.tif 000007
［７］チアゾールオレンジ（TO）
『Nakayama S.;Kelsey I.; Wang J.; Roelofs K.; Stefane B.; Luo Y.;Lee V  .T.;Sintim H.O. J.Am.Chem.Soc. 2011,133,4856-4864.』
【００７４】
好ましくは、以下の一般式（I）で示されるＴｈＴ誘導体が使用できる（Anal. Chem. 2014, 86, 12078-12084）。特開2016-079132。
【化６】
2018020831.tif 000008
ここで、Ｒ1は水素、またはＯ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい炭素数１〜１０（好ましくは１〜５）の炭化水素基を示す。炭化水素基は直鎖でも分岐鎖でもよいし、飽和でも不飽和でもよく、アルキル基などの脂肪族炭化水素基でもよいし、アリール基やアリールアルキル基などの芳香族炭化水素基でもよい。「Ｏ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでいてもよい」とは、炭化水素基が、アミノ基（−ＮＲ2）（Ｒは独立して水素または炭素数１〜５のアルキル基）、ニトロ基（−ＮＯ2）、シアノ基（−ＣＮ）、イソシアネート基（−ＮＣＯ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アルデヒド基（−ＣＨＯ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、メルカプト基（−ＳＨ）、スルホン酸基（−ＳＯ3Ｈ）等の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等を含む官能基を含んでいてもよいことを意味するほか、エーテル基（−Ｏ−）、イミノ基（−ＮＨ−）、チオエーテル基（−Ｓ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、チオエステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−）等の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等を含む連結基が炭化水素基の炭素骨格の内部又は末端に含まれていてもよいことを意味する。
【００７５】
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して炭素数１〜５の（脂肪族）炭化水素基を示し、より好ましくは炭素数１〜３の炭化水素基を示し、メチル基が特に好ましい。炭素数１〜５の炭化水素基は直鎖でも分岐鎖でもよいし、飽和でも不飽和でもよい。
【００７６】
ｎは０〜５の整数を示し、より好ましくは０〜３の整数を示し、特に好ましくは１である。
ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示し、より好ましくはＯである。
【００７７】
具体的には以下のような化合物が例示される。
【化７】
2018020831.tif 000009
【化８】
2018020831.tif 000010
【００７８】
検出は、例えば、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と、RCA産物を含む試料を接触させ、グアニン四重鎖構造に結合した化合物を、化合物が発する蛍光に基づいて検出することにより、被検ＤＮＡ中のグアニン四重鎖構造を検出することができる。検出操作自体は、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を用いる点を除けば、公知の方法と同様であり、化合物を緩衝液中に溶解した溶液を、被検ＤＮＡを含む試料と接触させ、インキュベーション後、洗浄し、洗浄後に被検ＤＮＡと結合している蛍光色素の蛍光を検出することにより行うことができる。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例の態様には限定されない。【００８０】
【表１】
2018020831.tif 000011
DNAプライマー(2)は、DNAプライマー(1)の7塩基目のG(7G)をTに変えた配列
DNAプライマー(3)は、DNAプライマー(1)の8塩基目のG(8G)をTに変えた配列
DNAプライマー(4)は、DNAプライマー(1)の9塩基目のC(9C)をAに変えた配列
DNAプライマー(5)は、DNAプライマー(1)の10塩基目のC(10C)をAに変えた配列
DNAプライマー(6)は、DNAプライマー(1)の11塩基目のA(11A)をTに変えた配列
DNAテンプレート(1)〜(9)は、環状化してある。
ターゲットRNA(2)は、ターゲットRNA(1)の30塩基目のU(30U)をAに変えた配列
ターゲットDNA(2)は、ターゲットDNA(1)の30塩基目のT(30T)をAに変えた配列
Complementary DNAは、ターゲットDNA(1)と相補的な配列【００８１】
[1] DNAテンプレートの環化
(1) 5μMの1本鎖DNA(Cid Pre T：67mer, Cid Mai T：62mer)を20μL(最終濃度0.5μM)、10×添付Bufferを20μL、50mM MnCl2を10μL(最終濃度2.5mM)、5M Beatine 40μL(最終濃度1M)、100U/μLのCircLigase  (Epicentre Technologies, WI, USA)を10μL(最終濃度5U/μL)、水100μLを混合した(計200μL)。
(2) 60℃で24時間インキュベートさせた。
(3) PAGE精製を行った。【００８２】
[2] 反応溶液の調製
[実施例1]プライマーの1塩基ミスマッチ
a1〜a7の調製（表２）
100nMのDNAテンプレート(1) 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのDNAプライマー(1)〜(6)のいずれか(表２参照) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase（New England Biolabs） 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水4μLを混合した(計20μL)。【００８３】
b1〜b7の調製（表２）
100nMのDNAテンプレート(1) 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのDNAプライマー(1)〜(6)のいずれか(表２参照) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー 2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMターゲットRNA(1) 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【００８４】
c1〜c7の調製（表２）
100nMのDNAテンプレート(1) 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのDNAプライマー(1)〜(6)のいずれか(表２参照) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー 2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nM noターゲットRNA 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【００８５】
[実施例2]ターゲットのDNA/RNAの違いと1塩基ミスマッチ
a1〜a6の調製（表３）
100nMのDNAテンプレート(1) 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDNAプライマー(1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7)2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水または10nMのRNA 2μL (表３参照)、水2μLを混合した(計20μL)。【００８６】
b1〜b6およびa2, b1, b2, b4-b6の調製（表３、４）
100nMのDNAテンプレート(1) 10μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 10μL(最終濃度40nM)、120nMのDNAプライマー(1) 10μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7) 10μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー 10μL、10×添付BSA溶液 10μL、10mMのdNTPs 10μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 10μL(最終濃度0.1U/μL)、水または10nMのDNA 10μL (表３、４参照)、水10μLを混合した(計100μL)。
なお、b5とb6の二重鎖DNAは事前にDenatureとAnnealingを行って二重鎖を形成した物を使用している。【００８７】
[実施例3]ターゲットが二重鎖DNAにおける環状テンプレートの最適化
a1〜a5の調製（表５）
100nMのDNAテンプレート(1)、(3)、(4)または(5)のいずれか(表５参照) 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDNAプライマー(1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水4μLを混合した(計20μL)。【００８８】
b1〜b5の調製（表５）
100nMのDNAテンプレート(1)、(3)、(4)または(5)のいずれか(表５参照) 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDNAプライマー(1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMターゲットDNA(1)(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)【００８９】
c1〜c5の調製（表５）
100nMのDNAテンプレート(1)、(3)、(4)または(5)のいずれか(表５参照) 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDNAプライマー(1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nM二重鎖DNA(ターゲットDNA(1)とComplementary DNA) 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)【００９０】
d1〜d5の調製（表５）
100nMのDNAテンプレート(1)、(3)、(4)または(5)のいずれか(表５参照) 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDNAプライマー(1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nM Complementary DNA (最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【００９１】
[実施例4]3者複合体のプライマーの最適化
a1〜a5の調製（表７）
400nMのDNAテンプレート(6)〜(9)のいずれか(表７参照) 2μL(最終濃度40nM)、480nMのDNAプライマー(1)、(8)〜(11)のいずれか(表７参照) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水8μLを混合した(計20μL)。【００９２】
b1〜b5の調製（表７）
400nMのDNAテンプレート(6)〜(9)のいずれか(表７参照) 2μL(最終濃度40nM)、480nMのDNAプライマー(1)、(8)〜(10)のいずれか(表７参照) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、800nMターゲットRNA(1) 2μL(最終濃度80nM)、水6μLを混合した(計20μL)。【００９３】
c1〜c5の調製（表７）
400nMのDNAテンプレート(6)〜(9)のいずれか(表７参照) 2μL(最終濃度40nM)、480nMのDNAプライマー(1)、(8)〜(10)のいずれか(表７参照) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、800nM no target RNA 2μL(最終濃度80nM)、水6μLを混合した(計20μL)。【００９４】
[3] 反応
上記で調製した溶液を37℃で2時間インキュベートさせた。【００９５】
[4]  検出
視覚的検出
各反応溶液 8μLに5×PBS153NMバッファー（50 mM HPO42-, 730 mM Cl-, 765 mM Na+, 13.5 mM K+, 12.5 mM Mg2+pH 7.4）を2μL加えた。
・混合溶液10μLと蛍光色素(1×PBS153NMバッファーに溶けた30μM ThT誘導体（THT-HE  特開2016-079132）溶液、最終濃度(5μM))を2μL混合させて25℃で30分インキュベートさせた。
・調製した溶液に410nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。【００９６】
蛍光分光光度計による測定
・4.の反応液50μLに5×PBS153NMバッファーを20μL、水30μLを加えた。
・混合溶液100μLと蛍光色素(1×PBS153NMバッファーに溶けた30μM ThT誘導体溶液、最終濃度(5μM))を20μL混合させて25℃で30分インキュベートさせた。
・蛍光分光光度計で励起波長412nm, 測定波長430nm-650nmの条件で溶液の蛍光強度を測定した。【００９７】
結果
[実施例1]プライマーの1塩基ミスマッチ
表２の各反応組成にて、DNAプライマー(1)とターゲットRNA(1)がハイブリダイゼーションする箇所を1塩基ずつミスマッチとなるように（図３）して、反応進行の変化を検証した。
結果は、図４に示すように、DNAプライマー(1)、ターゲットRNA(1)、テンプレートDNA(1)の三者複合体の根元に近づくにつれ顕著に反応の進行が妨げられることが分かった。【００９８】
【表２】
2018020831.tif 000012
【００９９】
[実施例2]ターゲットのDNA/RNAの違いと1塩基ミスマッチ
表３の各反応組成にて、ターゲットRNA(1)に三者複合体の根元部分の箇所にミスマッチ(30U→A)に変異させたターゲットを用いて反応の進行を検証した（図５）。また、ターゲットがDNAの場合でも本法で検出できるか検証した。
結果は、ターゲットRNAにミスマッチがある場合(図６ a4)、顕著に反応の進行が阻害されていることが分かった。
また、ターゲットがDNAになった場合でも図６のb3を見ると検出可能であることが分かった。ターゲットRNAで行ったように1塩基ミスマッチがあるターゲットDNA(図６ b4)では、RNA同様に顕著に反応の進行が阻害されることが分かった。一般に体内でDNAは2重鎖で存在することが多い。そのため、ターゲットDNAと相補的な配列を持つComplementary DNAとの二重鎖をターゲットとした場合でも検出可能か検証した(図６ b5)。結果は、1本鎖のDNAと比べて蛍光強度は弱いが、ターゲットではないDNA(図６ b3)または、ターゲットDNA(2)の1塩基ミスマッチ(図６ b4)に比べて明らかに発光しており、十分検出可能な範囲であることが示唆される。一方で、ターゲットDNA(2)の1塩基ミスマッチとComplementary DNAとの二重鎖をターゲットとした場合(図６ b6)では、反応の進行が阻害されていることが分かった。【０１００】
【表３】
2018020831.tif 000013
【０１０１】
表４の各反応組成にて、二重鎖DNAを標的にした際の蛍光と1本鎖DNAを標的とした場合と比較し、同じ性質のものであるか蛍光分光光度計を用いて検討した(図７)。
結果は、蛍光スペクトルのピークトップはほぼ同じ波長であり、また、反応が進行することで蛍光強度が増大されているので、同様の性質を持つことが示唆される。【０１０２】
【表４】
2018020831.tif 000014
【０１０３】
[実施例3]ターゲットが二重鎖DNAにおける環状テンプレートの最適化
二重鎖DNAをターゲットとする場合二重鎖を解離して三者複合体を形成する必要がある。ターゲットDNAとDNAテンプレートの結合を促進するためにDNAテンプレートにターゲットDNAと相補的な配列(表5：Complementary DNA)とハイブリダイゼーションする配列をDNAテンプレート(1)に3塩基ずつ増やしていった(図８)。
これを用いて表５の各反応組成にて反応を行ったところ、図９に示すように、ssDNA(ターゲットDNA(1))では、挿入数が多くなるにつれて反応の進行が妨げられていることが分かった。これは、Complementary DNAが存在しない場合、DNAテンプレート内でステムを組みやすくなりテンプレートとターゲットの結合が阻害されるためと考えられる。
一方で、dsDNAにおいては、挿入数が多くなるごとに反応の進行が促進されていることが分かった。このことから、ターゲットがdsDNAにおいてテンプレート内にComplementary DNAと相補的な配列を適切な数を入れることで反応が促進される。【０１０４】
【表５】
2018020831.tif 000015
【０１０５】
[実施例4]三者複合体のプライマーの最適化
これまでに、DNAプライマーが17mer(DNAプライマー(8))のときは、反応が進行しないことが分かっていた。二重鎖DNAの安定はDNAの長さとその配列に依存する。そこで反応が進行するDNAプライマー(1)(18mer)と反応が進行しないDNAプライマー(8)の中間の安定さを配列を変化させることでDNAプライマーの最適化を行った。
今回は、DNAプライマー(1)をベースに3′末端2残基を変化させた。二重鎖の安定性は、Nearestneighbor thermodynamicsによるとDNAプライマー(1)>(11)>(10)>(9)>(8)の順に安定である(表6)。
表７の各反応組成にて反応を行ったところ（図１０）、結果は図１１に示すように、DNAプライマー(9)では、反応が進行しなかったが(10),(11)では反応が進行した。反応が進行するか否かの境界はDNAプライマー(9)と(10)の間であることが分かった。よって、プライマーとテンプレート二重鎖のΔG037は-3.8未満が好ましいと考えられた。【０１０６】
【表６】
2018020831.tif 000016
【０１０７】
【表７】
2018020831.tif 000017
【０１０８】
[実施例5] 長鎖DNAの1塩基多型検出
長鎖DNA中の1塩基多型(SNPs)を検出するために以下の実験を行った。図１２に反応スキームを示す。SNPを含む標的配列として、シトクロムP450をコードするCYP2C19遺伝子の636位のSNPまたは681位のSNPを含む部位を含む1kbp(変異箇所前後500bp)の配列をヒト培養細胞(HepG2)ゲノムサンプルからPCR増幅したものを用いた。
以下の試薬を調製し、図13 (A)及び(C)では、シトクロムP450をコードするCYP2C19遺伝子の636塩基(G636)の変異(GがAに変異)を、図13(B)及び(D)では、CYP2C19遺伝子の681塩基(G681)の変異(GがAに変異)を検出するために、上記の標的配列を加えて37℃で2時間インキュベートさせて伸長反応を行った。各反応溶液 8μLに5×PBS153NMバッファー（50 mM HPO42-, 730 mM Cl-, 765 mM Na+, 13.5 mM K+, 12.5 mM Mg2+pH 7.4）を2μL加えた。混合溶液10μLと蛍光色素(1×PBS153NMバッファーに溶けた30μM ThT誘導体（THT-HE  特開2016-079132）溶液、最終濃度(5μM))を2μL混合させて25℃で30分インキュベートさせた。調製した溶液に410nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。【０１０９】
図13 (A) a1〜a5の調製
100nMのDNAテンプレート T2 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer P2 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１１０】
図13 (A) b1〜b5の調製
100nMのDNAテンプレートT2 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer P3 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１１１】
図13 (B) a1〜a5の調製
100nMのDNAテンプレートT3 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer P4 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１１２】
図13 (B) b1〜b5の調製
100nMのDNAテンプレートT3 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer P5 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１１３】
図13 (C) a1〜a5の調製
100nMのDNAテンプレートT2 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer P2 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40merまたはHepG2遺伝子から増幅した2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１１４】
図13 (C) b1〜b5の調製
100nMのDNAテンプレートT2 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer P3 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40merまたはHepG2遺伝子から増幅した2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１１５】
図13 (D) a1〜a5の調製
100nMのDNAテンプレートT3 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer P4 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40merまたはHepG2遺伝子から増幅した2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１１６】
図13 (D) b1〜b5の調製
100nMのDNAテンプレートT3 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer P5 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40merまたはHepG2遺伝子から増幅した2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１１７】
【表８】
2018020831.tif 000018
【０１１８】
[3]長鎖DNAの1塩基多型検出
最適化条件の検討では、40merの1本鎖及び2本鎖のDNAをターゲットした。CYP2C19遺伝子の636塩基の1本鎖及び2本鎖の野生型(図13 (A) a2, a3)及び変異(図13 (A) b4, b5)を見分けることができた。また、CYP2C19遺伝子の681塩基の野生型(図13 (B) a2, a3)及び変異(図13 (B) b4, b5)を見分けることができた。
ヒト培養細胞(HepG2)ゲノムサンプルは、1kbp(変異箇所前後500bp)をPCRで増幅したものを用いた。結果は、G636では野生型(図13(C) a4)、G681でも野生型(図13(D) a4)を確認した。このことから、ターゲットが、1kbpの長鎖2重鎖DNAであった場合でも変異を確認することができる。【０１１９】
[実施例６] 異なる鎖長の変異miRNAの検出
miRNAの３’末端への2塩基の付加を検出するために以下の実験を行った。図１６に反応スキームを示す。表９のmiR-21CAはmiR-21の３’末端にCAの2塩基が付加されている。
この変異を検出するために、以下の試薬を調製し、37℃で2時間インキュベートさせて伸長反応を行った。各反応溶液 8μLに5×PBS153NMバッファー（50 mM HPO42-, 730 mM Cl-, 765 mM Na+, 13.5 mM K+, 12.5 mM Mg2+pH 7.4）を2μL加えた。混合溶液10μLと蛍光色素(1×PBS153NMバッファーに溶けた30μM ThT誘導体（THT-HE  特開2016-079132）溶液、最終濃度(5μM))を2μL混合させて25℃で30分インキュベートさせた。調製した溶液に410nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。【０１２０】
図17 a1〜a2の調製
100nMのDNAテンプレートT4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのCapture Probe(1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP6 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水4μLを混合した(計20μL)。【０１２１】
図17 b1〜b2の調製
100nMのDNAテンプレートT4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのCapture Probe(1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP6 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMのmiR-21 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１２２】
図17 c1〜c2の調製
100nMのDNAテンプレートT4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのCapture Probe (1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP6 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMのmiR-21CA 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１２３】
図17 d1〜d2の調製
100nMのDNAテンプレートT4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのCapture Probe(1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP6 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMのmiR-221 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１２４】
[実施例７] 一塩基置換変異miRNAの検出
miRNAの一塩基置換を検出するために以下の実験を行った。図１８に反応スキームを示す。表９のmiR-13aとmiR-13bは互いにc/uの一塩基置換を有する。
この変異を検出するために、以下の試薬を調製し、37℃で2時間インキュベートさせて伸長反応を行った。各反応溶液 8μLに5×PBS153NMバッファー（50 mM HPO42-, 730 mM Cl-, 765 mM Na+, 13.5 mM K+, 12.5 mM Mg2+pH 7.4）を2μL加えた。混合溶液10μLと蛍光色素(1×PBS153NMバッファーに溶けた30μM ThT誘導体（THT-HE  特開2016-079132）溶液、最終濃度(5μM))を2μL混合させて25℃で30分インキュベートさせた。調製した溶液に410nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。【０１２５】
図19 a1〜a2の調製
100nMのDNAテンプレートT5 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのCapture Probe(2) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP6 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水4μLを混合した(計20μL)。【０１２６】
図19 b1〜b2の調製
100nMのDNAテンプレートT5 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのCapture Probe(2) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP6 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMのmiR-13a 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１２７】
図19 c1〜c2の調製
100nMのDNAテンプレートT5 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのCapture Probe(2) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP6 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMのmiR-13b 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１２８】
図19 d1〜d2の調製
100nMのDNAテンプレートT5 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのCapture Probe(2) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP6 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMのmiR-221 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１２９】
【表９】
2018020831.tif 000019
【０１３０】
＜結果＞
[1]異なる鎖長の変異miRNAの検出（実施例６）
本方法はmiRNAの鎖長の異なる変異を検出法である。テンプレートの設計では、ターゲットRNAとテンプレートのハイブリダイズ部分の熱力学を考慮して作製する。これまでの研究でハイブリダイズ部分の-ΔG°が4.2kcal/molを超過した場合、反応が進行することが分かっている。これを考慮し、変異体であるmiR-21CAの場合は-ΔG°が5.7kcal/molで変異がないmiR-21では-ΔG°が2.7kcal/molと設計した(図16)。
実際の実験結果は、ターゲットがmiR-21CAだった場合、反応は進行してし(図17 c2)、miR-21では、反応の進行は見られなかった(図17 b2)。
また、capture probeなしの場合(図17 a1, b1, c1, d1)や違うターゲットの場合(図17 d2)でも反応の進行は確認できなかった。【０１３１】
[2]1塩基変異miRNAの検出（実施例７）
本方法は、miRNAの1塩基違いを検出する方法である。テンプレートの設計では、テンプレートとターゲットであるmiR-13bが相補的になるようにして、また、熱力学安定性を考慮して設計した(図18)。
実験結果は、miR-13aの場合は(図19 b2)、テンプレートとミスマッチとなり反応は進行しなかった。一方で、miR-13bでは(図19 c2)、完全に相補的になるため反応が進行した。
また、capture probeなしの場合(図19 a1, b1, c1, d1)や違うターゲットの場合(図19 d2)でも反応の進行は確認できなかった。【０１３２】
[実施例８] 長鎖DNAの1塩基多型検出
長鎖DNA中の1塩基多型検出のために、図２０に示すような反応を行い、長鎖DNAに含まれる多型Ｇ６３６とＧ６８１の検出を行った。【０１３３】
1．溶液の調製
[1]長鎖DNAの1塩基多型検出 (PCR増幅サンプルを用いた時)【０１３４】
図21 (A) a1〜a9の調製
100nMのDNAテンプレート t4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート t2 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer p2 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー p1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１３５】
図21 (A) b1〜b9の調製
100nMのDNAテンプレート t4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート t2 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer p3 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー p1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１３６】
図21 (B) a1〜a9の調製
100nMのDNAテンプレート t5 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート t2 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer p4 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー p1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１３７】
図21 (B) b1〜b9の調製
100nMのDNAテンプレート t5 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート t2 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer p5 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー p1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１３８】
[2] 長鎖DNAの1塩基多型検出(抽出物を用いた時)【０１３９】
(1)細胞抽出液(全DNA)の作製
口腔粘膜を綿棒でこすり取り、ISOHAIR EASY(ニッポンジーン製)150μLに懸濁させた。添付書のプロトコルに従い処理した。その後、スピンカラム(遠心式限外ろ過フィルターユニット)を用いて20mM Tris-HCl pH7.4に置換した。【０１４０】
(2) 検出サンプルの調製
図22 (A) a1〜a3の調製
100nMのDNAテンプレート t4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート t2 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer p2 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー p1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１４１】
図22 (A) b1〜b3の調製
100nMのDNAテンプレート p4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート t2 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer p3 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー p1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。【０１４２】
【表１０】
2018020831.tif 000020
2本鎖DNAはそれぞれ相補鎖をアニーリングした物を使用した
G636及びG681を含んだ1kbp長鎖DNAはヒト口腔粘膜の遺伝子をPCRにより増幅したサンプルを使用した【０１４３】
用いた試薬
ThT(チオフラビンT)誘導体 
5×PBS153NM
50 mM HPO42-, 730 mM Cl-, 765 mM Na+, 13.5 mM K+, 12.5 mM Mg2+pH 7.4
1×PBS153NM
10 mM HPO42-, 146 mM Cl-, 153 mM Na+, 2.7 mM K+, 2.5 mM Mg2+pH 7.4
ISOHAIR EASY (ニッポンジーン製)【０１４４】
2．ポリメラーゼ反応
・1．で調製した溶液を37℃で2時間インキュベートさせた。【０１４５】
3．視覚的検出
・2.の反応溶液 8μLに5×PBS153NMバッファーを2μL加えた。
・混合溶液10μLと蛍光色素(1×PBS153NMバッファーに溶けた30μM ThT誘導体溶液、最終濃度(5μM))を2μL混合させて25℃で30分インキュベートさせた。
・調製した溶液に410nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。【０１４６】
結果
[1]長鎖DNAの1塩基多型検出(PCR増幅サンプルを用いた時)
本方法は、ゲノム中の1塩基多型(SNPs)を検出する方法である。図21 (A)では、シトクロムP450をコードするCYP2C19遺伝子の636塩基(G681, Genotype#3)の変異(GがAに変異)を検出し、図21(B)ではCYP2C19遺伝子の681塩基(G636, Genotype#2)の変異(GがAに変異)を検出する。Primerはそれぞれの野生型、変異型に対応したものを使用している。(図20)
ヒト口腔粘膜細胞ゲノムサンプルは、1kbp(変異箇所前後500bp)をPCRで増幅したものを用いた。対象者は6名である。結果は、G636ではEにヘテロ(野生型と変異型の混合)を確認し、G681ではFにヘテロを確認した。
このことから、ターゲットが、1kbpの長鎖2重鎖DNAであった場合でも変異を確認することができる。【０１４７】
[2] 長鎖DNAの1塩基多型検出(抽出物を用いた時)
本方法は、細胞抽出液(全ゲノム中)から1塩基多型(SNPs)を検出する方法である。図22では、シトクロムP450をコードするCYP2C19遺伝子の636塩基(G681, Genotype#3)の変異(GがAに変異)を検出する。Primerはそれぞれの野生型、変異型に対応したものを使用している。(図20)
結果は、全ゲノムを用いた場合でも1塩基を見分けることができた(図22)。
【符号の説明】
【０１４８】
１０・・・一本鎖環状DNA、１１・・・標的ポリヌクレオチド、１２・・・オリゴヌクレオチドプライマー、１３・・・増幅産物（伸長産物）、１０１・・・第１の領域に相補的な配列、１０２・・・プライマー結合配列、１０３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、１０４・・・グアニン四重鎖を含む配列、１０５・・・グアニン四重鎖検出試薬、１１１・・・第１の領域、１１２・・・第２の領域、１２１・・・第２の領域に相補的な配列、１２２・・・プライマー結合領域に相補的な配列【０１４９】
２０・・・一本鎖環状DNA、２１・・・標的ポリヌクレオチド、２２・・・第１のオリゴヌクレオチドプライマー、２３・・・第１の増幅産物（伸長産物）、２４・・・第２の一本鎖環状DNA、２５・・・第２のオリゴヌクレオチドプライマー、２６・・・第２の増幅産物（伸長産物）、２０１・・・第１の領域に相補的な配列、２０２・・・第１のプライマー結合配列、２０３・・・第２の一本鎖環状DNA結合配列に相補的な配列、２０４・・・２０３の５’側に隣接した領域、２１１・・・第１の領域、２１２・・・第２の領域、２２１・・・第２の領域に相補的な配列、２２２・・・第１のプライマー結合領域に相補的な配列、２３１・・・２０３の相補領域、２３２・・・領域２０４に相補的な領域、２４１・・・第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列２０３と同一の配列、２４２・・・第２のプライマー結合配列、２４３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、２５１・・・領域２０４と同一の配列、２５２・・・第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列２４２に相補的な配列、２６１・・・グアニン四重鎖を含む配列、２６２・・・グアニン四重鎖検出試薬【０１５０】
３０・・・一本鎖環状DNA、３１・・・キャプチャーポリヌクレオチド、３２・・・miRNA、３３・・・増幅産物（伸長産物）、３４・・・グアニン四重鎖検出試薬、３０１・・・miRNAの第２の領域に相補的な配列、３０２・・・一本鎖環状DNAの第２の領域、３０３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、３１１・・・一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列、３１２・・・miRNAの第１の領域に相補的な配列、３２１・・・miRNAの第１の領域、３２２・・・miRNAの変異を含む第２の領域、３３１・・・グアニン四重鎖形成配列【０１５１】
４０・・・一本鎖環状DNA、４１・・・キャプチャーポリヌクレオチド、４２・・・miRNA、４３・・・第１の増幅産物（伸長産物）、４４・・・第２の一本鎖環状DNA、４５・・・第２のオリゴヌクレオチドプライマー、４６・・・第２の増幅産物（伸長産物）、４７・・・グアニン四重鎖検出試薬、４０１・・・miRNAの第２の領域に相補的な配列、４０２・・・一本鎖環状DNAの第２の領域、４０３・・・第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列、４０４・・・４０３の５’側に隣接した領域、４１１・・・一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列、４１２・・・miRNAの第１の領域に相補的な配列、４２１・・・miRNAの第１の領域、４２２・・・miRNAの変異を含む第２の領域、４３１・・・４０３の相補領域、４３２・・・領域４０４に相補的な領域、４３３・・・配列４０３に相補的な配列、４４１・・・第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列４０３と同一の配列、４４２・・・第２のプライマー結合配列、４４３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、４５１・・・領域４０４と同一の配列、４５２・・・第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列４４２に相補的な配列、４６１・・・グアニン四重鎖形成配列
【図１】
2018020831.tif 000022
【図２】
2018020831.tif 000023
【図３】
2018020831.tif 000024
【図３−１】
2018020831.tif 000025
【図４】
2018020831.tif 000026
【図５】
2018020831.tif 000027
【図５−１】
2018020831.tif 000028
【図６】
2018020831.tif 000029
【図７】
2018020831.tif 000030
【図８】
2018020831.tif 000031
【図８−１】
2018020831.tif 000032
【図８−２】
2018020831.tif 000033
【図９】
2018020831.tif 000034
【図１０】
2018020831.tif 000035
【図１１】
2018020831.tif 000036
【図１２】
2018020831.tif 000037
【図１３】
2018020831.tif 000038
【図１４】
2018020831.tif 000039
【図１５】
2018020831.tif 000040
【図１６】
2018020831.tif 000041
【図１７】
2018020831.tif 000042
【図１８】
2018020831.tif 000043
【図１９】
2018020831.tif 000044
【図２０】
2018020831.tif 000045
【図２１】
2018020831.tif 000046
【図２２】
2018020831.tif 000047
【配列表】
2018020831000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月30日(2017.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドに、一本鎖環状ＤＮＡおよびプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によって標的ポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状ＤＮＡの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、
を含み、
前記一本鎖環状ＤＮＡは、
前記標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な配列と、
該配列の５’側に隣接した、７〜８塩基のプライマー結合配列と、を含み、
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、
前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を有する領域と、
該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状ＤＮＡのプライマー結合配列に相補的な７〜８塩基の配列を有する領域と、
を含み、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に存在する変異塩基とハイブリダイズする塩基を、前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を有する領域の最も３’側の位置に有する、方法。
【請求項３】
前記一本鎖環状ＤＮＡはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項２に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項４】
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドに、第１の一本鎖環状ＤＮＡおよび第１のプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によって標的ポリヌクレオチドと第１のプライマーと第１の一本鎖環状ＤＮＡの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状ＤＮＡと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のプライマーと第２の一本鎖環状ＤＮＡの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程および
増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、
を含み、
前記第１の一本鎖環状ＤＮＡは、
前記標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な配列と、
該配列の５’側に隣接した、７〜８塩基の第１のプライマー結合配列と、第２の一本鎖環状ＤＮＡ結合配列に相補的な配列と、
を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、
前記標的ポリヌクレオチド第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を有する領域と、
該配列の３’側に隣接した、第１の一本鎖環状ＤＮＡの第１のプライマー結合配列に相補的な７〜８塩基の配列を有する領域と、
を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に存在する変異塩基とハイブリダイズする塩基を、前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を有する領域の最も３’側の位置に有し、
前記第２の一本鎖環状ＤＮＡは、
第１の一本鎖環状ＤＮＡの第２の一本鎖環状ＤＮＡ結合配列に相補的な配列と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、７〜８塩基の第２のプライマー結合配列と、を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、
第１の一本鎖環状ＤＮＡの第２の一本鎖環状ＤＮＡ結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の８〜１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状ＤＮＡの第２のプライマー結合配列に相補的な７〜８塩基の配列とを含む、方法。
【請求項５】
前記第２の一本鎖環状ＤＮＡはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項４に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、その３’側の変異を含む第２の領域を含むｍｉＲＮＡに、一本鎖環状ＤＮＡおよびキャプチャーポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってキャプチャーポリヌクレオチドとｍｉＲＮＡと一本鎖環状ＤＮＡの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、を含み、前記一本鎖環状ＤＮＡは、
ｍｉＲＮＡの第２の領域に相補的な７〜８塩基のｍｉＲＮＡ結合領域であってｍｉＲＮＡの変異塩基と相補的な塩基を含むｍｉＲＮＡ結合領域とその３’側の第２の領域と、
を含み、
前記キャプチャーポリヌクレオチドは、
一本鎖環状ＤＮＡの第２の領域に相補的な配列と
ｍｉＲＮＡの第１の領域に相補的な８〜１５塩基のｍｉＲＮＡ結合配列を含む、方法。
【請求項９】
前記一本鎖環状ＤＮＡはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項８に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項１０】
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含むｍｉＲＮＡに、第１の一本鎖環状ＤＮＡおよびキャプチャーポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってｍｉＲＮＡとキャプチャーポリヌクレオチドと第１の一本鎖環状ＤＮＡの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状ＤＮＡと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のプライマーと第２の一本鎖環状ＤＮＡの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程および
増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、
を含み、
前記第１の一本鎖環状ＤＮＡは、
ｍｉＲＮＡの第２の領域に相補的な７〜８塩基のｍｉＲＮＡ結合領域であってｍｉＲＮＡの変異塩基と相補的な塩基を含むｍｉＲＮＡ結合領域とその３’側の第２の領域と、
第２の一本鎖環状ＤＮＡ結合配列の相補配列と、
を含み、
前記キャプチャーポリヌクレオチドは、
一本鎖環状ＤＮＡの第２の領域に相補的な配列と
ｍｉＲＮＡの第１の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を含み
前記第２の一本鎖環状ＤＮＡは、
第１の一本鎖環状ＤＮＡの第２の一本鎖環状ＤＮＡ結合配列の相補配列と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、７〜８塩基の第２のプライマー結合配列と、を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、
第１の一本鎖環状ＤＮＡの第２の一本鎖環状ＤＮＡ結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の８〜１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状ＤＮＡの第２のプライマー結合配列に相補的な７〜８塩基の配列とを含む、方法。
【請求項１１】
前記第２の一本鎖環状ＤＮＡはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項１０に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項１２】
前記検出用試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列であり、前記検出用試薬がグアニン四重鎖結合試薬である、請求項３，５，９または１１に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項１３】
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列がＣ３Ｎ１−１０Ｃ３Ｎ１−１０Ｃ３Ｎ１−１０Ｃ３配列を含む、請求項１２に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項１４】
グアニン四重鎖結合試薬が下記一般式（Ｉ）で表される化合物を含む、請求項１２または１３に記載の遺伝子変異の検出方法。
【化１】
2018020831.tif 000048
Ｒ１は水素、またはＯ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい炭化水素基を示し、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立して炭素数１〜５の炭化水素基を示し、
ｎは０〜５の整数を示し、
ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す。
【請求項１５】
遺伝子変異が一塩基多型である、請求項２〜５、８〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子変異の検出方法。
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月29日(2019.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドに、一本鎖環状DNAおよびプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリング
サークル増幅によって標的ポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAの複合体形成
に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、
を含み、
前記一本鎖環状DNAは、
前記標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な配列と、
該配列の５’側に隣接した、７〜８塩基のプライマー結合配列と、を含み、
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、
前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を有する領域と、該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な７〜８塩基
の配列を有する領域と、
を含み、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に存在する変異塩基とハイブリダイズする塩基を、前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を有する領域の最も３’側の位置に有する、方法。
【請求項２】
前記一本鎖環状DNAはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項１に記載の
遺伝子変異の検出方法。
【請求項３】
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドに、第１の一本鎖環状DNAおよび第１のプライマーをハイブリダイズさせる工程
、ローリングサークル増幅によって標的ポリヌクレオチドと第１のプライマーと第１の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、当該核酸増幅反応によって
生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリ
ダイズさせて当該伸長鎖と第２のプライマーと第２の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づ
く核酸増幅反応を行う工程および
増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、
を含み、
前記第１の一本鎖環状DNAは、
前記標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な配列と、
該配列の５’側に隣接した、７〜８塩基の第１のプライマー結合配列と、第２の一本鎖環状DNA結合配列に相補的な配列と、
を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、
前記標的ポリヌクレオチド第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を有する領域と、
該配列の３’側に隣接した、第１の一本鎖環状DNAの第１のプライマー結合配列に相補的
な７〜８塩基の配列を有する領域と、
を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に存在する変異塩基とハイブリダイズする塩基を、前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を有する領域の最も３’側の位置に有し、
前記第２の一本鎖環状DNAは、
第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列に相補的な配列と同一の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７〜８塩基の第２のプライマー結合配列と、を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、
第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の８〜１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的
な７〜８塩基の配列とを含む、方法。
【請求項４】
前記第２の一本鎖環状DNAはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項３に
記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項５】
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、その３’側の変異を含む第２の領域を含むmiRNAに、一本鎖環状DNAおよびキャプチャーポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってキャプチャーポリヌクレオチドとmiRNAと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、を含み、前記一本鎖環状DNAは、
miRNAの第２の領域に相補的な７〜８塩基のmiRNA結合領域であってmiRNAの変異塩基と相
補的な塩基を含むmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域と、
を含み、
前記キャプチャーポリヌクレオチドは、
一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と
miRNAの第１の領域に相補的な８〜１５塩基のmiRNA結合配列を含む、方法。
【請求項６】
前記一本鎖環状DNAはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項５に記載の
遺伝子変異の検出方法。
【請求項７】
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含むmiRNAに、第
１の一本鎖環状DNAおよびキャプチャーポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程、
ローリングサークル増幅によってmiRNAとキャプチャーポリヌクレオチドと第１の一本鎖
環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、当該核酸増幅反応によって生じ
た伸長鎖に第２の一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイ
ズさせて当該伸長鎖と第２のプライマーと第２の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核
酸増幅反応を行う工程および
増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、
を含み、
前記第１の一本鎖環状DNAは、
miRNAの第２の領域に相補的な７〜８塩基のmiRNA結合領域であってmiRNAの変異塩基と相
補的な塩基を含むmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域と、
第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含み、
前記キャプチャーポリヌクレオチドは、
一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と
miRNAの第１の領域に相補的な８〜１５塩基の配列を含み
前記第２の一本鎖環状DNAは、
第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７〜８塩基の第２のプライマー結合配列と、を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、
第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の８〜１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的
な７〜８塩基の配列とを含む、方法。
【請求項８】
前記第２の一本鎖環状DNAはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項７に
記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項９】
前記検出試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列であり、前記検出試薬がグアニン四重鎖結合試薬である、請求項２，４，６または８に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項１０】
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列がＣ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3配列を含む、請求項９に記載の遺伝子変異の検出方法。
【請求項１１】
グアニン四重鎖結合試薬が下記一般式（I）で表される化合物を含む、請求項９または１
０に記載の遺伝子変異の検出方法。
【化１】
2018020831.tif 000049
Ｒ1は水素、またはＯ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい炭化水素基を
示し、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して炭素数１〜５の炭化水素基を示し、
nは０〜５の整数を示し、
ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す。
【請求項１２】
遺伝子変異が一塩基多型である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子変異の検出方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
(2) 検出サンプルの調製
図22 a1〜a3の調製
100nMのDNAテンプレート t4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート t2 2μL(最
終濃度40nM)、120nMのPrimer p2 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー p1 2μL(
最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
図22 b1〜b3の調製
100nMのDNAテンプレート p4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート t2 2μL(最
終濃度40nM)、120nMのPrimer p3 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーt1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA
2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μL
を混合した(計20μL)。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
結果
[1]長鎖DNAの1塩基多型検出(PCR増幅サンプルを用いた時)
本方法は、ゲノム中の1塩基多型(SNPs)を検出する方法である。図21 (A)では、シトク
ロムP450をコードするCYP2C19遺伝子の636塩基(G636, Genotype#3)の変異(GがAに変異)を検出し、図21(B)ではCYP2C19遺伝子の681塩基(G681, Genotype#2)の変異(GがAに変異)を
検出する。Primerはそれぞれの野生型、変異型に対応したものを使用している。(図20)
ヒト口腔粘膜細胞ゲノムサンプルは、1kbp(変異箇所前後500bp)をPCRで増幅したものを用いた。対象者は6名である。結果は、G636ではEにヘテロ(野生型と変異型の混合)を確認し、G681ではFにヘテロを確認した。
このことから、ターゲットが、1kbpの長鎖2重鎖DNAであった場合でも変異を確認することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
[2] 長鎖DNAの1塩基多型検出(抽出物を用いた時)
本方法は、細胞抽出液(全ゲノム中)から1塩基多型(SNPs)を検出する方法である。図22
では、シトクロムP450をコードするCYP2C19遺伝子の636塩基(G636, Genotype#3)の変異(GがAに変異)を検出する。Primerはそれぞれの野生型、変異型に対応したものを使用している。(図20)
【国際調査報告】
2018020831.tif 000050
2018020831.tif 000051
2018020831.tif 000052
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