(57)【要約】本発明は、最終製品中の２Ｍ３ＭＢの含有量を抑えることによってタマネギ様臭の発生が抑制された発酵ビール様発泡性飲料を製造する方法を提供する。本発明は、発酵原料液に酵母を接種して発酵させる発酵工程を有し、酵母を接種する前の発酵原料液又は前記発酵工程中の発酵液中の２，３−エポキシ−３−メチルブタナールの含有量を制御することを特徴とする、発酵ビール様発泡性飲料の製造方法、及び発酵原料液に酵母を接種して発酵させる発酵工程を有し、酵母を接種する前の発酵原料液又は前記発酵工程中の発酵液中の２，３−エポキシ−３−メチルブタナールの含有量を測定することを特徴とする、発酵ビール様発泡性飲料の製造方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵原料液に酵母を接種して発酵させる発酵工程を有し、
酵母を接種する前の発酵原料液又は前記発酵工程中の発酵液中の２，３−エポキシ−３−メチルブタナールの含有量を制御することを特徴とする、発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
【請求項２】
２，３−エポキシ−３−メチルブタナールの含有量の制御を、前記発酵原料液又は前記発酵液への酸素混入量を制御することによって行う、請求項１に記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
【請求項３】
前記発酵原料液又は前記発酵液中の２，３−エポキシ−３−メチルブタナール濃度が１７ｐｐｂ以下となるように制御する、請求項１又は２に記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
【請求項４】
前記発酵原料液又は前記発酵液中のイソα酸の含有量が９０ｐｐｍ以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
【請求項５】
前記発酵原料液又は前記発酵液の液温が５〜１００℃である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
【請求項６】
前記発酵原料液又は前記発酵液中の２，３−エポキシ−３−メチルブタナール濃度を測定する工程を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
【請求項７】
発酵原料液に酵母を接種して発酵させる発酵工程と、
酵母を接種する前の前記発酵原料液又は前記発酵工程中の発酵液中の２，３−エポキシ−３−メチルブタナールの含有量を測定する工程と、
を有することを特徴とする、発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
【請求項８】
２，３−エポキシ−３−メチルブタナール濃度が、１７ｐｐｂ以下である、発酵原料液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビール様発泡性飲料におけるオフフレーバーの１種であるタマネギ様臭の発生が抑制された発酵ビール様発泡性飲料の製造方法に関する。
本願は、２０１６年７月６日に日本に出願された特願２０１６−１３４５３４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
ビールや発泡酒等の発酵ビール様発泡性飲料においては、コゲ臭・日光臭様臭やタマネギ様臭等のオフフレーバーが認められる場合があり、発酵ビール様発泡性飲料の品質向上のためには、これらのオフフレーバーの制御が重要である。原因物質やその生成機序が解明できれば、オフフレーバーを効率よく制御できることが期待できる。しかしながら、オフフレーバーの原因物質は様々であり、その生成機序の解明も困難である。例えば、ビール中のタマネギ様臭の原因物質が２−メルカプト−３−メチル−１−ブタノール（2-mercapto-3-methyl-1-butanol，２Ｍ３ＭＢ）であることは知られているが（例えば、非特許文献１参照。）、どのような作用機序により２Ｍ３ＭＢが生成されるのかは未だ解明されていない。【０００３】
一方で、発酵ビール様発泡性飲料においては、時間の経過、温度の上昇により酸化が加速されて品質が低下することが知られている。このため、各工程における酸素の混入量を抑えることが、より品質の安定した発酵ビール様発泡性飲料を製造する上で重要である。例えば特許文献１には、麦芽を含む原料と仕込用水とを攪拌混合し、加温して糖化させ、麦汁を採取する仕込工程と、酵母を添加して発酵させる発酵工程と、発酵終了液を貯蔵する貯酒工程と、貯酒終了液をろ過し容器に充填するろ過・充填工程を含む麦芽アルコール飲料の製造方法において、前記製造の全工程又はその一部工程における雰囲気中の酸素濃度を低減させることにより、麦芽アルコール飲料の製造工程における酸化を抑制する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−４８６６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Olsen et al., Carlsberg Research Communication, 1988, vol.53, p.1-9．
【非特許文献２】Coghe et al.，JOURNAL OF THE INSTITUTE OF BREWING，2005，vol.111(1)，p.51-60.
【非特許文献３】Iijima et al.，Journal of Applied Microbiology，2010，vol.109, p.1906-1913.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、最終製品中の２Ｍ３ＭＢの含有量を抑えることによってタマネギ様臭の発生が抑制された発酵ビール様発泡性飲料を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、発酵ビール様発泡性飲料の製造工程において２Ｍ３ＭＢの生成機序を調べたところ、２，３−エポキシ−３−メチルブタナール（2,3-epoxy-3-methyl-butanal，ＥＭＢａｌ）が２Ｍ３ＭＢの原因物質であること、ＥＭＢａｌが酸素の存在下で酵母によって代謝されることにより２Ｍ３ＭＢが生成されることを見出し、本発明を完成させた。【０００８】
本発明に係る発酵ビール様発泡性飲料の製造方法及び発酵原料液は、下記［１］〜［８］である。
［１］  発酵原料液に酵母を接種して発酵させる発酵工程を有し、
酵母を接種する前の発酵原料液又は前記発酵工程中の発酵液中の２，３−エポキシ−３−メチルブタナールの含有量を制御することを特徴とする、発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
［２］  ２，３−エポキシ−３−メチルブタナールの含有量の制御を、前記発酵原料液又は前記発酵液への酸素混入量を制御することによって行う、前記［１］の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
［３］  前記発酵原料液又は前記発酵液中の２，３−エポキシ−３−メチルブタナール濃度が１７ｐｐｂ以下となるように制御する、前記［１］又は［２］の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
［４］  前記発酵原料液又は前記発酵液中のイソα酸の含有量が９０ｐｐｍ以下である、前記［１］〜［３］のいずれかの発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
［５］  前記発酵原料液又は前記発酵液の液温が５〜１００℃である、前記［１］〜［４］のいずれかの発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
［６］  前記発酵原料液又は前記発酵液中の２，３−エポキシ−３−メチルブタナール濃度を測定する工程を有する、前記［１］〜［５］のいずれかの発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
［７］  発酵原料液に酵母を接種して発酵させる発酵工程と、
酵母を接種する前の前記発酵原料液又は前記発酵工程中の発酵液中の２，３−エポキシ−３−メチルブタナールの含有量を測定する工程と、
を有することを特徴とする、発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
［８］  ２，３−エポキシ−３−メチルブタナール濃度が、１７ｐｐｂ以下である、発酵原料液。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る発酵ビール様発泡性飲料の製造方法により、製造工程における２Ｍ３ＭＢの生成を抑制することができ、タマネギ様臭が抑制された発酵ビール様発泡性飲料が製造できる。
また、本発明に係る発酵原料液により、タマネギ様臭が抑制された発酵ビール様発泡性飲料を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、参考例３において行った、異性化処理後のホップ抽出液に対する分取ＨＰＬＣのクロマトグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明及び本願明細書において、「発酵ビール様発泡性飲料」とは、発酵工程を経て製造された飲料であって、アルコール含有量や麦芽の使用の有無に関わらず、ビールと同等の又はそれと似た風味・味覚及びテクスチャーを有し、高い止渇感・ドリンカビリティーを有する発泡性飲料を意味する。すなわち、発酵ビール様発泡性飲料は、アルコール飲料であってもよく、アルコール含量が１容量％未満であるいわゆるノンアルコール飲料又はローアルコール飲料であってもよい。また、麦芽を原料とする飲料であってもよく、麦芽を原料としない飲料であってもよい。発酵ビール様発泡性飲料としては、具体的には、ビール、麦芽を原料とする発泡酒、麦芽を使用しない発泡性アルコール飲料、ローアルコール発泡性飲料、ノンアルコールビール等が挙げられる。その他、麦芽を原料とし、発酵工程を経て製造された飲料を、アルコール含有蒸留液と混和して得られたリキュール類であってもよい。アルコール含有蒸留液とは、蒸留操作により得られたアルコールを含有する溶液であり、例えば、原料用アルコールであってもよく、スピリッツ、ウィスキー、ブランデー、ウオッカ、ラム、テキーラ、ジン、焼酎等の蒸留酒等を用いることができる。
【００１２】
本発明に係る発酵ビール様発泡性飲料の製造方法のうち第一の態様に係る方法は、発酵原料液に酵母を接種して発酵させる発酵工程を有し、酵母を接種する前の発酵原料液又は前記発酵工程中の発酵液中のＥＭＢａｌの含有量を制御することを特徴とする。後記実施例に示すように、ＥＭＢａｌはタマネギ様臭の原因物質である２Ｍ３ＭＢの前駆体であり、ＥＭＢａｌが酸素存在下で酵母によって代謝されることにより２Ｍ３ＭＢが生成される。このため、製造工程においてＥＭＢａｌの生成を制御する、特に、発酵液中におけるＥＭＢａｌの含有量を制御することにより、最終製品である発酵ビール様発泡性飲料における２Ｍ３ＭＢの含有量を制御することができる。すなわち、発酵工程終了時までのＥＭＢａｌの含有量を低く抑えることにより、２Ｍ３ＭＢの含有量が十分に低く、タマネギ様臭が抑えられた発酵ビール様発泡性飲料が製造できる。本発明においては、飲料中の２Ｍ３ＭＢの含有量を充分に抑えることができるため、酵母接種前の発酵原料液や発酵工程中における発酵液のＥＭＢａｌ濃度を、１７ｐｐｂ以下に制御することが好ましく、１０ｐｐｂ以下に制御することがより好ましく、５ｐｐｂ以下に制御することがさらに好ましい。
【００１３】
【化１】
2018008175.tif 000002
【００１４】
本発明に係る発酵ビール様発泡性飲料の製造方法は、酵母を接種する前の発酵原料液又は前記発酵工程中の発酵液中のＥＭＢａｌの含有量を制御する以外は、一般的な発酵ビール様発泡性飲料と同様にして製造できる。そこで、まずは一般的な発酵ビール様発泡性飲料の製造方法を説明する。一般的な発酵ビール様発泡性飲料は、仕込（発酵原料液調製）、発酵、貯酒、濾過の工程で製造することができる。
【００１５】
まず、仕込工程（発酵原料液調製工程）として、穀物原料及び糖質原料からなる群より選択される１種以上から発酵原料液を調製する。具体的には、まず、穀物原料と糖質原料の少なくともいずれかと原料水とを含む混合物を調製して加温し、穀物原料等の澱粉質を糖化させる。糖液の原料としては、穀物原料のみを用いてもよく、糖質原料のみを用いてもよく、両者を混合して用いてもよい。穀物原料としては、例えば、大麦や小麦、これらの麦芽等の麦類、米、トウモロコシ、大豆等の豆類、イモ類等が挙げられる。穀物原料は、穀物シロップ、穀物エキス等として用いることもできるが、粉砕処理して得られる穀物粉砕物として用いることが好ましい。穀物類の粉砕処理は、常法により行うことができる。穀物粉砕物としては、麦芽粉砕物、コーンスターチ、コーングリッツ等のように、粉砕処理の前後において通常なされる処理を施したものであってもよい。本発明においては、用いられる穀物粉砕物は、麦芽粉砕物であることが好ましい。麦芽粉砕物を用いることにより、ビールらしさがよりはっきりとした発酵ビール様発泡性飲料を製造することができる。麦芽粉砕物は、大麦、例えば二条大麦を、常法により発芽させ、これを乾燥後、所定の粒度に粉砕したものであればよい。また、本発明において用いられる穀物原料としては、１種類の穀物原料であってもよく、複数種類の穀物原料を混合したものであってもよい。例えば、主原料として麦芽粉砕物を、副原料として米やトウモロコシの粉砕物を用いてもよい。糖質原料としては、例えば、液糖等の糖類が挙げられる。
【００１６】
当該混合物には、穀物原料等と水以外の副原料を加えてもよい。当該副原料としては、例えば、ホップ、食物繊維、酵母エキス、果汁、苦味料、着色料、香草、香料等が挙げられる。また、必要に応じて、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ等の糖化酵素やプロテアーゼ等の酵素剤を添加することができる。
【００１７】
糖化処理は、穀物原料等由来の酵素や、別途添加した酵素を利用して行う。糖化処理時の温度や時間は、用いた穀物原料等の種類、発酵原料全体に占める穀物原料の割合、添加した酵素の種類や混合物の量、目的とする発酵ビール様発泡性飲料の品質等を考慮して、適宜調整される。例えば、糖化処理は、穀物原料等を含む混合物を３５〜７０℃で２０〜９０分間保持する等、常法により行うことができる。
【００１８】
糖化処理後に得られた糖液を煮沸することにより、煮汁（糖液の煮沸物）を調製することができる。糖液は、煮沸処理前に濾過し、得られた濾液を煮沸処理することが好ましい。また、この糖液の濾液に替わりに、麦芽エキスに温水を加えたものを用い、これを煮沸してもよい。煮沸方法及びその条件は、適宜決定することができる。
【００１９】
煮沸処理前又は煮沸処理中に、香草等を適宜添加することにより、所望の香味を有する発酵ビール様発泡性飲料を製造することができる。特にホップは、煮沸処理前又は煮沸処理中に添加することが好ましい。ホップの存在下で煮沸処理することにより、ホップの風味・香気成分を効率よく煮出することができる。ホップの添加量、添加態様（例えば数回に分けて添加するなど）及び煮沸条件は、適宜決定することができる。
【００２０】
仕込工程後、発酵工程前に、調製された煮汁から、沈殿により生じたタンパク質等の粕を除去することが好ましい。粕の除去は、いずれの固液分離処理で行ってもよいが、一般的には、ワールプールと呼ばれる槽を用いて沈殿物を除去する。この際の煮汁の温度は、１５℃以上であればよく、一般的には５０〜８０℃程度で行われる。粕を除去した後の煮汁（濾液）は、プレートクーラー等により適切な発酵温度まで冷却する。この粕を除去した後の煮汁が、発酵原料液となる。
【００２１】
次いで、発酵工程として、冷却した発酵原料液に酵母を接種して、発酵を行う。冷却した発酵原料液は、そのまま発酵工程に供してもよく、所望のエキス濃度に調整した後に発酵工程に供してもよい。発酵に用いる酵母は特に限定されるものではなく、通常、酒類の製造に用いられる酵母の中から適宜選択して用いることができる。上面発酵酵母であってもよく、下面発酵酵母であってもよいが、大型醸造設備への適用が容易であることから、下面発酵酵母であることが好ましい。
【００２２】
さらに、貯酒工程として、得られた発酵液を、貯酒タンク中で熟成させ、０℃程度の低温条件下で貯蔵し安定化させた後、濾過工程として、熟成後の発酵液を濾過することにより、酵母及び当該温度域で不溶なタンパク質等を除去して、目的の発酵ビール様発泡性飲料を得ることができる。当該濾過処理は、酵母を濾過除去可能な手法であればよく、例えば、珪藻土濾過、平均孔径が４〜５μｍ程度のフィルターによるフィルター濾過等が挙げられる。
【００２３】
後記実施例に示すように、ＥＭＢａｌは、異性化処理したホップに酸素を接触させることにより生成されており、ＥＭＢａｌの前駆体は異性化処理したホップに由来する成分である。このため、例えば、異性化処理によってＥＭＢａｌの前駆体となる成分の含有量が比較的少ない品種のホップを選択して原料としたり、ＥＭＢａｌの前駆体の含有量が比較的少ない異性化処理済ホップを原料とすることにより、発酵工程における発酵液中のＥＭＢａｌの含有量を低く抑えることができる。ホップを原料とする場合には、仕込工程における異性化処理の条件、すなわち糖化処理後に得られた糖液の煮沸条件を適宜調節することによっても、発酵液中のＥＭＢａｌの含有量を低く抑えることができる。また、発酵原料液の苦味価が高い場合や、イソα酸濃度が高い場合には、発酵工程における発酵液中のＥＭＢａｌの含有量が高くなる傾向にある。このため、例えば、酵母接種前の発酵原料液のイソα酸の濃度を、９０ｐｐｍ以下、好ましくは５０ｐｐｍ以下に調整することにより、発酵液中のＥＭＢａｌの含有量を低く抑えることができる。
【００２４】
その他、ＥＭＢａｌの前駆体からのＥＭＢａｌの生成反応は、５〜１００℃の広い範囲内で可能であり、その生成効率は温度の影響も受ける。発酵原料液や発酵液の液温が高いほど、ＥＭＢａｌは生成されやすい。このため、仕込工程においてホップ添加後の液温の条件を制御したり、発酵工程において発酵温度を制御することにより、発酵液中のＥＭＢａｌの含有量を低く抑えることができる。
【００２５】
また、仕込工程では、発酵原料液に意図的に酸素を混入することはないが、発酵工程の初期には、酵母を増殖させるために、発酵液に酸素を供給する。この酸素供給量が酵母の増殖に必要な量よりも多い場合には、発酵液中の余剰の酸素により、発酵原料液から持ち込まれたＥＭＢａｌの前駆体が酸化されてＥＭＢａｌが生成されてしまう。このため、発酵工程における発酵液の溶存酸素量を調節することによっても、発酵液中のＥＭＢａｌの含有量を低く抑えることができる。発酵液の溶存酸素量は、発酵液に対する酸素を含むガスの供給条件を調節することにより調整できる。
【００２６】
酵母を接種する前の発酵原料液中のＥＭＢａｌ含有量が多い場合には、発酵工程開始前において、発酵原料液に意図せぬ酸素の混入が行われた可能性が高い。製造設備に微小な亀裂や空隙が存在している場合には、そこから酸素が混入する場合がある。このため、発酵原料液中のＥＭＢａｌ含有量が多い場合には、製造設備の点検を行うことが好ましい。なお、２Ｍ３ＭＢは酸化により生成されるが、製造工程において液中の溶存酸素量をモニタリングしても、製造された発酵ビール様発泡性飲料にタマネギ様臭が発生するかどうかの指標とすることはできない。酸素は反応性が高く、溶液中の酸素は速やかに消費されてしまうため、意図せぬ酸素の混入の場合、溶液中の実際の酸素濃度と、当該溶液がどれだけ酸素が暴露したかということが関連しないためである。これに対して、ＥＭＢａｌは２Ｍ３ＭＢの直接の基質であり、よってＥＭＢａｌの含有量は、タマネギ様臭の指標、ひいては酸化劣化の指標として有用である。
【００２７】
ＥＭＢａｌの含有量の制御に当たり、発酵原料液又は発酵液中のＥＭＢａｌの濃度を測定してもよい。得られた測定値を指標として、ホップからのＥＭＢａｌの前駆体の持ち込み量を制御したり、発酵工程における酸素供給条件を調節することができる。ＥＭＢａｌの濃度の測定は、仕込工程や発酵工程に組込んで常に実施してもよく、定期的に（例えば、１〜３カ月ごとに）実施してもよく、製造条件や使用する原料のロット等が切り替わるたびに実施してもよい。
【００２８】
発酵原料液及び発酵液中のＥＭＢａｌの濃度を測定する方法としては、特に限定されるものではない。例えば、逆相カラムや陰イオン交換カラム等の固相抽出カラムを用いたクロマトグラフィーにより発酵原料液又は発酵液からその他の物質を吸着除去し、得られた粗精製物を、ジクロロメタン等の極性の低い有機溶媒で抽出し、脱水させた後、ガスクロマトグラフ−質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により測定することができる。
【００２９】
また、本発明に係る発酵ビール様発泡性飲料の製造方法のうち第二の態様に係る方法は、発酵原料液に酵母を接種して発酵させる発酵工程と、酵母を接種する前の前記発酵原料液又は前記発酵工程中の発酵液中のＥＭＢａｌの含有量を測定する工程とを有することを特徴とする。当該方法において、発酵工程を含む発酵ビール様発泡性飲料の製造、及びＥＭＢａｌ濃度の測定は、第一の態様に係る方法と同様に行うことができる。
【００３０】
当該方法により、従来は発酵完了後にしかわからなかったタマネギ様臭の発生を、発酵工程が終了する前に予測することができる。例えば、発酵原料液中のＥＭＢａｌの含有量が多い場合には、当該発酵原料液から製造される発酵ビール様発泡性飲料は、タマネギ様臭が生じる可能性が高いと予測される。逆に発酵原料液中のＥＭＢａｌの含有量が少ない場合には、当該発酵原料液からタマネギ様臭がほとんどしない発酵ビール様発泡性飲料が製造されると予測される。
【実施例】
【００３１】
次に実施例及び参考例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等に限定されるものではない。【００３２】
＜ＥＭＢａｌの含有量の測定＞
以降の実験において、ＥＭＢａｌの含有量は次のようにして測定した。
まず、内部標準物質としてＥＭＢａｌの安定同位体（D6-2,3-epoxy-3-methylbutanal）を１００ｐｐｂとなるように添加した試料２０ｇを、メタノール及び水でコンディショニングした固相抽出カラム（陰イオン交換カラム「ＩｎｅｒｔＳｅｐ  ＭＡ−１」（ジーエルサイエンス株式会社製））へと負荷した。当該固相抽出カラムの素通り液を採取し、ジクロロメタン３ｍＬを加えて抽出し、溶媒層を回収した。この溶媒抽出操作を３回繰り返し、回収した溶媒層を全て混合したものに無水硫酸ナトリウムを５ｇ加え、３０分間以上脱水した。その後、窒素パージにて約５００μＬまで濃縮した後、下記の条件でＧＣ／ＭＳにて測定した。【００３３】
（ＧＣ／ＭＳ条件）
ガスクロマトグラフ：「Ａｇｉｌｅｎｔ  ６８９０ ガスクロマトグラフ 」（Agilent Technologies社製）
検出器：「ＭＳＤ５９７５」（Agilent Technologies社製）
カラム：「ＤＢ−ＷＡＸ ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｏｌｕｍｎ」（長さ：６０ｍ、内径：０．２５ｍｍ、膜厚：０．２５μｍ、Agilent Technologies社製）
注入口温度：２５０℃ 
注入モード：パルス化スプリットレスインジェクションモード（pulsed splitless injection mode）
注入量：１μＬ
キャリアガス：ヘリウム（１ｍＬ／ｍｉｎ）
カラム温度設定：４０℃（５分間保持）−（５℃／ｍｉｎ）−１６０℃（５分間）
イオン化条件：７０ｅＶ
測定モード：シングルイオン−モニタリングモード(single ion-monitoring(SIM) mode) 
定量：それぞれの香気成分のピークエリア面積と内部標準品のピークエリア面積との比較にて実施。【００３４】
［参考例１］
下面発酵酵母を、ＥＭＢａｌの化学合成品を添加した合成培地で培養し、２Ｍ３ＭＢの生成を確認した。
酵母の培養には、アミノ酸を含有していない完全合成培地であるＹＮＢ（Yeast Nitrogen Base）培地（ベクトン・ディッキンソン社製、表１参照。）に、最終濃度２質量％のグルコースと表２に記載のアミノ酸を配合したアミノ酸添加ＹＮＢ培地を用いた。なお、添加するアミノ酸の組成は、Cogheらによる麦芽１００％ビールに含まれているとの報告（非特許文献２）に準じて決定した。【００３５】
【表１】
2018008175.tif 000003
【００３６】
【表２】
2018008175.tif 000004
【００３７】
前記アミノ酸添加ＹＮＢ培地に、２０ｐｐｂとなるようにＥＭＢａｌの化学合成品を添加し、さらに酵母を２０×１０６個／ｍＬとなるように添加し、１５℃で３日間発酵させた。発酵終了後の発酵液を遠心分離処理（７０００ｒｐｍ×１５分間）して酵母を除去したものについて２Ｍ３ＭＢ濃度を測定した。対照として、ＥＭＢａｌの化学合成品を添加しなかった以外は同様にして発酵させ、発酵液の２Ｍ３ＭＢ濃度を測定した。発酵液の２Ｍ３ＭＢ濃度は、Iijimaらの方法（非特許文献３）に準じて行った。【００３８】
この結果、ＥＭＢａｌを添加しなかった培地で培養した場合には、発酵後の発酵液からは２Ｍ３ＭＢは検出されなかったのに対して、２０ｐｐｂのＥＭＢａｌを添加した培地で培養した発酵液の２Ｍ３ＭＢ濃度は１．２６ｐｐｂであった。これらの結果から、２Ｍ３ＭＢの前駆体はＥＭＢａｌであること、発酵工程において、ＥＭＢａｌを酵母が代謝することによって２Ｍ３ＭＢが合成されること、がわかった。【００３９】
［参考例２］
異性化処理前のホップと異性化処理後のホップについてＥＭＢａｌの含有量を測定し、ＥＭＢａｌが異性化処理済のホップに由来する成分であることを調べた。ホップはナゲット品種を用いた。【００４０】
具体的には、ホップとエージングホップ（ホップペレットを３７℃、１週間空気にさらして酸化させたホップ）について、異性化処理前と後でＥＭＢａｌの含有量を測定した。ＥＭＢａｌは溶液状態でないと測定できないため、異性化処理前のホップとしては、室温で水にホップを縣濁した後、ホップを除去したものをサンプルとした。また、異性化処理後のホップには、さらに、ホットエア処理（９０℃、５分間、２Ｌ／分で空気をバブリングした処理）を行って、酸素の巻き込みを行ったものについてもＥＭＢａｌの含有量を測定した。さらに、前記アミノ酸添加ＹＮＢ培地に、各ホップをイソα酸濃度が１０ｐｐｍとなる量で添加し、さらに酵母を２０×１０６個／ｍＬとなるように添加し、１５℃で３日間発酵させた。発酵終了後の発酵液を遠心分離処理（７０００ｒｐｍ×１５分間）して酵母を除去したものについて２Ｍ３ＭＢ濃度を測定した。【００４１】
各ホップのＥＭＢａｌ濃度及び２Ｍ３ＭＢ濃度の測定結果を表３に示す。表中、「ホップ」はエージング処理もホットエア処理もしていないホップ、「エージングホップ」はエージング処理したホップ、「ホップ＋ホットエア」はエージング未処理のホップに異性化処理後にホットエア処理を行ったホップ、「エージングホップ＋ホットエア」はエージング処理済のホップに異性化処理後にホットエア処理を行ったホップの結果をそれぞれ示す。【００４２】
【表３】
2018008175.tif 000005
【００４３】
この結果、ＥＭＢａｌは、異性化処理前のホップでは検出されず、異性化処理後のホップからは検出され、ホットエア処理によりＥＭＢａｌ濃度は増大した。また、使用したホップに含まれているＥＭＢａｌ量が多いほど、発酵において２Ｍ３ＭＢが多く生成された。これらの結果から、ＥＭＢａｌは、異性化処理後のホップに酸素を接触させることによって生成されること、このＥＭＢａｌが酵母に代謝されて２Ｍ３ＭＢが生成されることが確認された。また、ホップとエージングホップでは異性化処理後のＥＭＢａｌ濃度に差がなかったことから、異性化処理前のホップにエージング処理（酸化処理）を行っても、ＥＭＢａｌは生成されないことも確認された。【００４４】
［実施例１］
麦芽６０ｇ、副原料２０ｇ、及び３２０ｍＬの水を混合し、得られた混合物を５０℃、３０分間保持してタンパク質分解処理を行った後、当該混合物を６５℃、７０分間保持することにより、麦芽由来成分を糖化させた。得られた麦汁を濾過し、得られた濾過液にホップ（アメリカナゲット種）を添加して９０分間煮沸した。煮沸処理後、濃度調整湯を添加し、ホップ粕などを分離し、５℃に冷却することにより、麦汁（３００ｍＬ）を得た。使用する麦芽のロット、添加するホップ量、副原料の種類等を適宜変更し、１３種の麦汁（サンプル１〜１３）を製造した。これらの麦汁中のＥＭＢａｌ濃度を測定した。測定結果を表４に示す。【００４５】
次いで、これらの麦汁２００ｍＬに対して、２０×１０６個／ｍＬとなるように酵母を添加し、１５℃で６日間発酵させた。発酵終了後の発酵液（発酵ビール様発泡性飲料）を遠心分離処理（７０００ｒｐｍ×１５分間）して酵母を除去したものについて２Ｍ３ＭＢ濃度を測定した。また、得られた発酵液について、５名のパネルにて、タマネギ様臭を０〜３の４段階（０：感じない、１：やや感じる、２：感じる、３：強く感じる）の評点で官能評価を行った。各発酵液の２Ｍ３ＭＢ濃度の測定値及び全パネルの評価点の平均値を表４に示す。【００４６】
【表４】
2018008175.tif 000006
【００４７】
この結果、麦汁中のＥＭＢａｌ濃度が高いほど、得られた発酵液中の２Ｍ３ＭＢ濃度が高くなり、また、２Ｍ３ＭＢ濃度が高いほど、タマネギ様臭がより強く感じられる傾向が観察された。【００４８】
［実施例２］
発酵中の発酵液のＥＭＢａｌ濃度に対する、発酵液への酸素供給量の影響を調べた。
具体的には、実施例１と同様にして、麦汁（３００ｍＬ）を得た。得られた麦汁の苦味価（ＢＵ）を測定した。苦味価の測定は、ＥＢＣ（European Brewery Convention）のＡｎａｌｙｔｉｃａ−ＥＢＣ標準法に準じて行った。【００４９】
次いで、得られた麦汁２００ｍＬに対して、２０×１０６個／ｍＬとなるように酵母を添加し、１０℃で６日間発酵させた。なお、発酵液へ空気のバブリングを実施し、発酵開始から２４０分間又は３７０分間、発酵液に酸素を接触させた。また、バブリング終了後の発酵液を一部分取し、ＥＭＢａｌ濃度を測定した。発酵終了後の発酵液（発酵ビール様発泡性飲料）を遠心分離処理（７０００ｒｐｍ×１５分間）して酵母を除去したものについて、実施例１と同様にして２Ｍ３ＭＢ濃度を測定した。【００５０】
麦汁中の苦味価（ＢＵ）、発酵温度（℃）（表中、「液温」）、酸素接触時間（空気バブリング時間）（分）、発酵液の溶存酸素量（ＤＯ）（ｐｐｍ）、バブリング終了後発酵途中の発酵液のＥＭＢａｌ濃度（表中、「発酵中ＥＭＢａｌ」）（ｐｐｂ）、及び発酵後の発酵液の２Ｍ３ＭＢ濃度（ｐｐｂ）の測定結果を表５に示す。この結果、発酵中に発酵液に供給された酸素によってもＥＭＢａｌが生成されること、このため、発酵液への酸素供給量が多いほど、得られる発酵液の２Ｍ３ＭＢ濃度が高くなることがわかった。【００５１】
【表５】
2018008175.tif 000007
【００５２】
［実施例３］
麦汁中のＥＭＢａｌ濃度に対する、温度の影響を調べた。
具体的には、まず、実施例１と同様にして、麦汁（３００ｍＬ）を得、苦味価を測定した。次いで、得られた麦汁に対して、液温を０、２０、５０、７０、又は９０℃にし、５分間、酸素の巻き込み処理（２Ｌ／分で空気をバブリングする処理）を行った後、ＥＭＢａｌ濃度を測定した。麦汁の液温を室温より上げる場合は、麦汁をホットプレートにて加熱し、室温より下げる場合は、恒温水槽を用いた。酸素の巻き込み処理後の麦汁２００ｍＬに対して、２０×１０６個／ｍＬとなるように酵母を添加し、１５℃で６日間発酵させた。発酵終了後の発酵液について、実施例１と同様にして２Ｍ３ＭＢ濃度を測定した。【００５３】
麦汁中の苦味価（ＢＵ）、酸素の巻き込み処理時の液温（℃）（表中、「液温」）、酸素接触時間（空気バブリング時間）（分）、発酵液の溶存酸素量（ＤＯ）（ｐｐｍ）、酸素の巻き込み処理後の麦汁のＥＭＢａｌ濃度（表中、「麦汁中ＥＭＢａｌ」）（ｐｐｂ）、及び発酵後の発酵液の２Ｍ３ＭＢ濃度（ｐｐｂ）の測定結果を表６に示す。この結果、麦汁に酸素が供給されている場合には、液温が高いほどより多くのＥＭＢａｌが生成されることがわかった。【００５４】
【表６】
2018008175.tif 000008
【００５５】
［実施例４］
麦汁中のＥＭＢａｌ濃度に対する、高温時の酸素接触量の影響を調べた。
具体的には、まず、実施例１と同様にして、麦汁（３００ｍＬ）を得、苦味価を測定した。次いで、得られた麦汁に対して、液温を９０℃にし、０、１、５、又は２０分間、実施例３と同様にして酸素の巻き込み処理を行った後、ＥＭＢａｌ濃度を測定した。酸素の巻き込み処理後の麦汁２００ｍＬに対して、２０×１０６個／ｍＬとなるように酵母を添加し、１５℃で６日間発酵させた。発酵終了後の発酵液について、実施例１と同様にして２Ｍ３ＭＢ濃度を測定した。【００５６】
麦汁中の苦味価（ＢＵ）、酸素の巻き込み処理時の液温（℃）（表中、「液温」）、酸素接触時間（空気バブリング時間）（分）、発酵液の溶存酸素量（ＤＯ）（ｐｐｍ）、酸素の巻き込み処理後の麦汁のＥＭＢａｌ濃度（表中、「麦汁中ＥＭＢａｌ」）（ｐｐｂ）、及び発酵後の発酵液の２Ｍ３ＭＢ濃度（ｐｐｂ）の測定結果を表７に示す。この結果、高温ではＥＭＢａｌの合成が低温より速やかに生じること、酸素の供給量が多いほどより多くのＥＭＢａｌが生成されることがわかった。【００５７】
【表７】
2018008175.tif 000009
【００５８】
［実施例５］
麦汁中のＥＭＢａｌ濃度に対する、イソα酸量の影響を調べた。
具体的には、まず、ホップの添加量をイソα酸量が０．１〜２ｇとなるように調節した以外は実施例１と同様にして、麦汁（３００ｍＬ）を得、苦味価を測定した。
次いで、得られた麦汁２００ｍＬに対して、液温を９０℃にし、５２０分間、実施例３と同様にして酸素の巻き込み処理を行った後、ＥＭＢａｌ濃度を測定した。酸素の巻き込み処理後の麦汁２００ｍＬに対して、２０×１０６個／ｍＬとなるように酵母を添加し、１５℃で６日間発酵させた。発酵終了後の発酵液について、実施例１と同様にして２Ｍ３ＭＢ濃度を測定した。
また、対照として、麦汁２００ｍＬに対して、酸素の巻き込み処理を行わずにそのまま実施例１と同様にして発酵させた後、発酵後の発酵液中の２Ｍ３ＭＢ濃度を測定した。【００５９】
麦汁中の苦味価（ＢＵ）、酸素の巻き込み処理時の液温（℃）（表中、「液温」）、酸素接触時間（空気バブリング時間）（分）、発酵液の溶存酸素量（ＤＯ）（ｐｐｍ）、酸素の巻き込み処理後の麦汁のＥＭＢａｌ濃度（表中、「麦汁中ＥＭＢａｌ」）（ｐｐｂ）、及び発酵後の発酵液の２Ｍ３ＭＢ濃度（ｐｐｂ）の測定結果を表８に示す。なお、酸素の巻き込み処理を行わなかったサンプルでは、発酵前の麦汁のＥＭＢａｌ濃度を表中に示す。この結果、麦汁の苦味価が高いほど、酸素の巻き込み処理後の麦汁のＥＭＢａｌ濃度が高くなることがわかった。また、酸素の巻き込み処理を行わなかった麦汁でも、苦味価が高い麦汁ほどＥＭＢａｌ濃度が高かった。【００６０】
【表８】
2018008175.tif 000010
【００６１】
［参考例３］
ＥＭＢａｌが異性化処理後のホップのいずれの成分に由来するかを調べるため、異性化処理後のホップに対して分取ＨＰＬＣを行った。ホップはナゲット品種を用いた。【００６２】
具体的には、まず、ホップをミルにより細かく粉砕し、湯で抽出した抽出液を、凍結乾燥した。得られた固形分を７０％メタノール溶液に再度溶解させたものに対して、下記の条件にて分取ＨＰＬＣを行った。【００６３】
（分取ＨＰＬＣ条件）
カラム：Ｃ１８カラム「ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  Ｐｒｅｐ  Ｃｏｌｕｍｎ」（長さ：２５０ｍｍ、内径：１０ｍｍ、Waters社製）
移動相Ａ：１％  ギ酸水
移動相Ｂ：１％  ギ酸含有メタノール溶液
流速：１５ｍＬ／分
グラジエント条件： 移動相Ｂ濃度６８％（０分）→移動相Ｂ濃度７２％（１分）→移動相Ｂ濃度７２％（１８分）→移動相Ｂ濃度１００％（１８．０１分）→移動相Ｂ濃度１００％（２３分）→移動相Ｂ濃度６８％（２３．０１分）→移動相Ｂ濃度６８％（３０分）
検出波長：２７５ｎｍ【００６４】
分取ＨＰＬＣにより、イソコフムロンよりも速く溶出される画分（第１画分、Ｓ−フラクション）、イソコフムロンが溶出される画分（第２画分）、ｎ−イソフムロンが溶出される画分（第３画分）、イソアドフムロンが溶出される画分（第４画分）、イソα酸よりも後に溶出される画分（第５画分）の５つの画分を分取した。分取ＨＰＬＣのクロマトグラフを図１に示す。図１のＦｒ．１〜Ｆｒ．５が、それぞれ第１画分〜第５画分として分取した部分である。得られた分取液を再度凍結乾燥し、ｐＨ５の酢酸バッファーへと再度溶解させた後、９０℃、５分間のエアレーションを行った。エアレーション後の各溶液についてＥＭＢａｌ濃度を測定した。各画分のＥＭＢａｌ濃度（ｐｐｂ）の測定結果を、主に含まれている成分と苦味価（Ｂ．Ｕ．）と共に表９に示す。【００６５】
【表９】
2018008175.tif 000011
【００６６】
ホップ由来の苦味成分は、主に、劣化画分（Ｓ−フラクション成分、第１画分、図１のクロマトグラム中の保持時間２．６分〜１０分の画分）と、イソα酸（第２画分と第３画分と第４画分の合計、保持時間１０分〜１６分の画分）と、イソ化前のα酸及びβ酸（第５画分、保持時間２１分〜２６．５分の画分）とに分類できる。表９の結果から、異性化ホップに由来するＥＭＢａｌは、Ｓ−フラクションに由来するものが全体の２１．９％、イソα酸に由来するものが全体の６５．５％、イソ化前のα酸等に由来するものが全体の１２．６％であった。これらの結果から、ＥＭＢａｌは主にイソα酸に由来すること、このため、イソα酸含有量の多いホップやホップエキスを用いた場合には、イソα酸と共に持ち込まれるＥＭＢａｌ量が多くなってしまうことが判明した。
【図１】
2018008175.tif 000012
【国際調査報告】
2018008175.tif 000013
2018008175.tif 000014
2018008175.tif 000015
2018008175.tif 000016