(57)【要約】新たな、血液脳関門の制御技術を提供すること。Claudin 5タンパク質の細胞外ドメイン内の領域がエピトープである、抗体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Claudin 5タンパク質の細胞外ドメイン内の領域がエピトープである、抗体。
【請求項２】
前記エピトープが、Claudin 5タンパク質の、第1細胞外ループC末端側内の領域、第2細胞外ループ内の領域、並びに第1細胞外ループ及び第2細胞外ループから形成される立体構造からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記エピトープが、Claudin 5タンパク質の第2細胞外ループ内の領域である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
前記エピトープが、配列番号73で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質においてN末端から151番目のアミノ酸、又は他のClaudin 5タンパク質において該アミノ酸に対応するアミノ酸を含む領域である、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号99で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質点変異体S151Tに対する結合性が、配列番号73で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、請求項３又は４に記載の抗体。
【請求項６】
前記エピトープが、Claudin 5タンパク質の第1細胞外ループ及び第2細胞外ループから形成される立体構造である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項７】
Claudin 5タンパク質以外のClaudinファミリータンパク質に対する結合性が、Claudin 5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。
【請求項８】
下記のいずれかの抗体A〜Iからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体：
（A）
配列番号1で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号2で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号3で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号7で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体A；
（B）
配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号10で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号11で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号13で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号14で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号15で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体B；
（C）
配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体C；
（D）
配列番号25で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体D；
（E）
配列番号33で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号35で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号37で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号39で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体E；
（F）
配列番号41で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号42で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号43で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号45で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号46で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号47で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体F；
（G）
配列番号49で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号50で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号51で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号53で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号54で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号55で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体G；
（H）
配列番号57で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号58で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号59で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号61で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号62で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号63で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体H；並びに
（I）
配列番号65で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号66で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号67で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号69で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号70で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号71で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体I。
【請求項９】
モノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の抗体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含有する、細胞。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の抗体と薬物との複合体。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかに記載の抗体、及び請求項１２に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、医薬。
【請求項１４】
血液脳関門制御用である、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれかに記載の抗体、及び請求項１２に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Claudin 5抗体、及びその抗体を含有する医薬に関する。より詳細には、Claudin 5の細胞外領域を認識する抗体、血液脳関門制御用医薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液脳関門は、血液と脳の間での物質交換を制限する機構であり、異物侵入から脳を保護する重要な役割を果たしている。一方で、血液脳関門は静脈内投与された薬物の脳への移行を妨げるため、脳疾患治療薬開発の大きな妨げとなっている。この血液脳関門の機能は、脳毛細血管内皮細胞間に形成される高度な密着結合により生み出されており、物質透過を許容する他の臓器の血管内皮細胞間の間隙とは大きく異なる。これまで、この物質輸送を制限する密着結合を制御し、細胞間隙を介して薬物を輸送する方法論として、マンニトール高張液を頸動脈より投与する方法が考案されてきた。しかし、本手法では、細胞の脱水による物理的な細胞形態、密着結合の破壊を介するため副作用も大きい。そこで、密着結合のみを特異的に制御する新たな技術の開発が望まれている。【０００３】
上皮細胞や血管内皮細胞の間に存在する密着結合の形成には、Claudinファミリー分子が重要な役割を担っている。Claudinファミリーは、27種の4回膜貫通タンパク質のメンバーからなり、細胞外に2つのループ（N末端側から第1、第2細胞外ループ）を持ち、これらの細胞間での相互作用が密着結合形成に寄与する。各組織において発現するClaudinファミリー分子の種類（構成比率）や量は異なっており、この違いが組織特異的な密着結合、バリア機能を生み出している。特に、脳血管内皮細胞間の密着結合においては、Claudin 5が高発現し血液脳関門の機能を生み出している。実際、Claudin 5欠損マウスでは、血液脳関門の機能が失われ分子量1000以下の物質透過が許容される。また、Claudin 5 siRNAをマウスに静脈内投与する実験では、脳血管内皮細胞のClaudin 5の発現低下による分子量1000以下の物質の脳内移行が誘導され、かつ重篤な副作用がないことも報告されている（非特許文献1）。これらの知見から、Claudin 5の機能制御が、細胞間隙を介する新たな脳内薬物送達戦略になると期待されている。【０００４】
これまでにClaudin 5によるバリア機能の阻害を目的とし、いくつかのClaudin 5相互作用分子が作製されてきた。例えば、Claudinファミリー分子の細胞接着を調節するペプチド類及び抗体に関する報告があるが、該報告においてはClaudin 5抗体による血液脳関門制御に関する実証データは示されていない（特許文献1）。別の例として、Claudin 1の第1細胞外ループの部分配列由来ペプチド（約20アミノ酸）を用いて、Claudin 1及びClaudin 5の相互作用の阻害を介して、マウス脳毛細血管内皮細胞のバリアを制御できることが報告されている（非特許文献2）。また、Claudin 3とClaudin 4に結合し、高いバリア制御活性を持つ分子として知られるClostridium perfringens enterotoxinのC末端に変異を導入し、Claudin 5結合分子を創製した例も報告されている（非特許文献3）。しかし、これらの分子は、Claudin 5への結合特異性が低く、他Claudin分子にも結合する問題があるため、これらを用いた血液脳関門制御技術の開発は、バリア制御活性の増強、副作用低減の観点から非常に難しいと考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表2003-524384号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Matthew Campbell, Anna-Sophia Kiang, Paul F. Kenna, Christian Kerskens, Christoph Blau, Laurence O'Dwyer, Amanda Tivnan, Julie Anne Kelly, Brenda Brankin, Gwyneth-Jane Farrar, Peter Humphries. RNAi-mediated reversible opening of the blood-brain barrier. The journal of gene medicine 10 (2008) 930-947.
【非特許文献２】Christian Staat, Caroline Coisne, Sebastian Dabrowski, Svetlana M. Stamatovic, Anuska V. Andjelkovic, Hartwig Wolburg, Britta Engelhardt, Ingolf E. Blasig. Mode of action of claudin peptidomimetics in the transient opening of cellular tight junction barriers. Biomaterials 54 (2015) 9-20.
【非特許文献３】Jonas Protze, Miriam Eichner, Anna Piontek, Stefan Dinter, JanRossa, Kinga Grazyna Blecharz, Peter Vajkoczy, Joerg Piontek, Gerd Krause. Directed structural modification of Clostridium perfringens enterotoxin to enhance binding to claudin-5. Cellular and Molecular Life Sciences 72 (2015) 1417-1432
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新たな、Claudin 5特異性の高い、Claudin 5の細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体を提供することを課題とする。さらには、同抗体を用いたClaudin 5発現細胞の検出技術及び血液脳関門制御技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
Claudin 5に対し特異性の高い結合分子を作製し、その有用な活性、好ましくは血液脳関門のバリアを制御する活性を実証した例は存在しない。その一因としてClaudin 5が膜タンパク質であり、溶解度や凝集性の観点から精製が困難であり、ファージディスプレイ法に用いるスクリーニングマテリアルや免疫原として十分な質・量のものが得られないといったことが挙げられる。本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、Claudin 5タンパク質の細胞外ドメイン内の領域がエピトープである抗体（本明細書において、「本発明の抗体」、「Claudin 5細胞外ドメイン抗体」などと示すこともある。）を作り出すことに成功した。かつ、驚くべきことに、本発明の抗体が、脳内血管内皮細胞間の連結を開く作用、すなわち血液脳関門制御活性を有することを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。【０００９】
即ち、本発明は、一実施形態として、下記の態様を包含する：
項１．  Claudin 5タンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープ領域を認識する、抗体．
項２．  前記エピトープ領域が、Claudin 5タンパク質の、第1細胞外ループC末端側内の領域、第2細胞外ループ内の領域、並びに第1細胞外ループ及び第2細胞外ループから形成される立体構造からなる群より選択される少なくとも1種である、項１に記載の抗体．  項３．  前記エピトープ領域が、Claudin 5タンパク質の第2細胞外ループ内の領域である、項１又は２に記載の抗体．
項４．  前記エピトープ領域が、配列番号73で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質においてN末端から151番目のアミノ酸、又は他種のClaudin 5タンパク質において該アミノ酸に対応するアミノ酸を含む領域である、項３に記載の抗体．
項５．  配列番号99で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質点変異体S151Tに対する結合性が、配列番号73で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、項３又は４に記載の抗体．
項６．  前記エピトープ領域が、Claudin 5タンパク質の第1細胞外ループ及び第2細胞外ループから形成される立体構造である、項１又は２に記載の抗体．
項７．  Claudin 5タンパク質以外のClaudinファミリータンパク質に対する結合性が、Claudin 5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、項１〜６のいずれかに記載の抗体．
項８．  下記のいずれかの抗体A〜Iからなる群より選択される、項１〜７のいずれかに記載の抗体：
（A）
配列番号1で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号2で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号3で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号7で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体A；
（B）
配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号10で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号11で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号13で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号14で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号15で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体B；
（C）
配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体C；
（D）
配列番号25で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体D；
（E）
配列番号33で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号35で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号37で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号39で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体E；
（F）
配列番号41で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号42で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号43で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号45で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号46で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号47で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体F；
（G）
配列番号49で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号50で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号51で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号53で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号54で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号55で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体G；
（H）
配列番号57で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号58で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号59で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号61で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号62で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号63で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体H；並びに
（I）
配列番号65で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号66で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号67で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号69で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号70で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号71で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体I．
項９．  モノクローナル抗体である、項１〜８のいずれかに記載の抗体．
項１０．  項１〜９のいずれかに記載の抗体をコードする、ポリヌクレオチド．
項１１．  項１０に記載のポリヌクレオチドを含有する、細胞．
項１２．  項１〜９のいずれかに記載の抗体と薬物との複合体．
項１３．  項１〜９のいずれかに記載の抗体、及び項１２に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、医薬．
項１４Ａ．  血液脳関門制御用である、項１３に記載の医薬．
項１４Ｂ．  脳血管内皮細胞層バリア機能制御用である、項１３に記載の医薬．
項１４Ｃ．  血液脳関門の薬物透過促進用である、項１３に記載の医薬．
項１４Ａ１．  血液脳関門制御における使用のための、項１〜９のいずれかに記載の抗体、及び項１２に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種．
項１４Ｂ１．  脳血管内皮細胞層バリア機能制御における使用のための、項１〜９のいずれかに記載の抗体、及び項１２に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種．
項１４Ｃ１．  血液脳関門の薬物透過促進における使用のための、項１〜９のいずれかに記載の抗体、及び項１２に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種．
項１４Ａ２．  血液脳関門制御用医薬の製造のための、項１〜９のいずれかに記載の抗体、及び項１２に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種の使用．
項１４Ｂ２．  脳血管内皮細胞層バリア機能制御用医薬の製造のための、項１〜９のいずれかに記載の抗体、及び項１２に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種の使用．
項１４Ｃ２．  血液脳関門の薬物透過促進用医薬の製造のための、項１〜９のいずれかに記載の抗体、及び項１２に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種の使用．
項１４Ａ３．  項１〜９のいずれかに記載の抗体、及び項１２に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を患者に投与することを含む、血液脳関門制御方法．
項１４Ｂ３．  項１〜９のいずれかに記載の抗体、及び項１２に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を患者に投与することを含む、脳血管内皮細胞層バリア機能制御方法．
項１４Ｃ３．  項１〜９のいずれかに記載の抗体、及び項１２に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を患者に投与することを含む、血液脳関門の薬物透過促進方法．
項１５．  項１〜９のいずれかに記載の抗体、及び項１２に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、試薬．
【発明の効果】
【００１０】
本発明により取得されたClaudin 5の細胞外領域を認識するモノクローナル抗体は、既存のClaudin 5の細胞外領域に結合する分子と異なり、高いClaudin特異性を有している。そのため、Claudin 5を発現している細胞ポピュレーションの小さい細胞を、細胞の固定・透過処理なしで検出・単離することも可能である。また、本発明により取得された抗体は学術的な利用も可能である。脳内血管内皮細胞を含む血管内皮細胞はヘテロな集団であることが知られているが、本発明で得られた抗体を用いれば、これらの細胞をClaudin 5の発現量の違いによりグループ分けして解析することが可能になるなど、血液脳関門の仕組みや病的破綻の理解の一端を紐解くための有用な試薬に成り得る。【００１１】
本発明で開発された抗体は、十分な脳内血管内皮細胞が作り出す密着結合によるバリアを制御する活性を有していたことより、例えば薬物と併用投与することにより、又は薬物と抗体との複合体を投与することによって、薬物の血液脳関門の通過を促進することができ、ひいては中枢神経疾患などの疾患に対するその薬物の予防又は治療効果をより高めることが可能となる。【００１２】
本発明によれば、新規な抗体としてClaudin 5細胞外ドメインに対する抗体を提供することができ、ひいてはClaudin 5、血液脳関門等に関する研究に資することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒトcDNA由来のClaudin 5コード配列と、コドン変換後のClaudin 5コード配列との対比を示す。上段がヒトcDNA由来のClaudin 5コード配列を示し、下段がコドン改変後のClaudin 5コード配列を示す。アスタリスクは改変前後で一致する塩基を示す。
【図２】ヒト・マウス−キメラClaudin 5タンパク質の配列を示す。マウスClaudin 5タンパク質の配列を基に、細胞外ループ（ECL）およびその近傍の膜貫通領域（TM、下線）の配列がヒトClaudin 5由来の配列に変更されている。マウス配列からヒト配列に変更したアミノ酸残基を囲み線赤字で示す。また、細胞内C末領域のうち、キメラClaudin 5タンパク質から削除された部分を網掛けで示している。
【図３】細胞外ドメインリバーシブルClaudin 5タンパク質の配列を示す。下線赤字が第1細胞外ループを示し、二重下線青字が第2細胞外ループを示し、囲み線が膜貫通領域を示す。
【図４】実施例1で得られた抗体の特異性解析（実施例3）の結果を示すFACSヒストグラムである。ヒストグラムの最上方に、使用した細胞株名（HT-1080又はL）と、レトロウイルスを用いて該細胞に発現させているClaudinタンパク質名を示す（hはヒトの略称を示し、mはマウスの略称を示し、CLDNはClaudinの略称を示す、mockはClaudin タンパク質を発現しないレトロウイルス感染細胞を示す）。ヒストグラムの最左側に、1次抗体として使用した抗体を示す。各ヒストグラム中、横軸が蛍光シグナル、縦軸が細胞数を示す。抗体を作用させない場合（Vehicle）に比べて、右側（蛍光シグナルが強い側）にシフトしているピークを囲み線で示す。
【図５】実施例1で得られた抗体の特異性解析（実施例4）の結果を示すFACSヒストグラムである。ヒストグラムの最上方に、レトロウイルスを用いて細胞に発現させているClaudinタンパク質名を示す。ヒストグラムの最左側に、1次抗体として使用した抗体を示す。各ヒストグラム中、横軸が蛍光シグナル、縦軸が細胞数を示す。抗体を作用させない場合（Vehicle）に比べて、右側（蛍光シグナルが強い側）にシフトしているピークを囲み線で示す。
【図６】各生物種のClaudin 5タンパク質のアミノ酸配列比較を示す。生物種間で異なるアミノ酸を下線赤字で示す。配列上方の数字は、N末端から数えたアミノ酸番号を示す。
【図７】実施例1で得られた抗体のエピトープ解析（実施例5）の結果を示すFACSヒストグラムである。ヒストグラムの最上方に、レトロウイルスを用いてHT-1080細胞に発現させているClaudinタンパク質名を示す。ヒストグラムの最左側に、1次抗体として使用した抗体を示す。各ヒストグラム中、横軸が蛍光シグナル、縦軸が細胞数を示す。抗体を作用させない場合（Vehicle）に比べて、右側（蛍光シグナルが強い側）にシフトしているピークを囲み線で示す。図の最上方に、各Claudinタンパク質の配列構造を示す。該構造図中、ヒトClaudin 1の配列は赤太線で示す。
【図８】ヒトClaudinタンパク質、及びキメラタンパク質のアミノ酸配列比較を示す。ヒトClaudin 1の配列を下線赤字で示す。配列上方の数字は、N末端から数えたアミノ酸番号を示す。
【図９】実施例1で得られた抗体のエピトープ解析（実施例6）の結果を示すFACSヒストグラムである。ヒストグラムの最上方に、レトロウイルスを用いて細胞に発現させているClaudinタンパク質名を示す。ヒストグラムの最左側に、1次抗体として使用した抗体を示す。各ヒストグラム中、横軸が蛍光シグナル、縦軸が細胞数を示す。抗体を作用させない場合（Vehicle）に比べて、右側（蛍光シグナルが強い側）にシフトしているピークを囲み線で示す。図の最上方に、各Claudinタンパク質の配列構造を示す。点変異体の該構造図中、点変異部位を●で示す。
【図１０】実施例1で得られた抗体のエピトープ解析（実施例7）の結果を示すウェスタンブロッティング写真である。写真の最上方に用いた1次抗体を示し、その下に用いた細胞を示す。写真左側に、バンドが表すタンパク質名を示す。
【図１１】実施例1で得られた抗体のバリア機能制御活性評価（実施例8）の結果を示すグラフである。各グラフ中、縦軸は経皮電気抵抗値を示し、横軸は抗体溶液添加からの経過時間を示し、グラフ内に表示される濃度は各抗体の培地中の濃度を示す。各プロットは平均値（n=4-6）であり、バーは標準偏差を示す。
【図１２】実施例1で得られた抗体のバリア機能制御活性評価（実施例9）の結果を示すグラフである。縦軸は経内皮電気抵抗値を示し、横軸は被検溶液添加からの経過時間を示し、グラフ内に表示される濃度は各被検物の培地中の濃度を示し、Vehicleは抗体の希釈に用いた液を添加した場合を示す。各プロットは平均値（n=3）であり、バーは標準偏差を示す。
【図１３】実施例1で得られた抗体のバリア機能制御活性評価（実施例10）の結果を示すグラフである。横軸中、濃度は各被検物の培地中の濃度を示し、Vehicleは抗体の希釈に用いた液を添加した場合を示す。各プロットは平均値（n=3）であり、バーは標準偏差を示す。アスタリスクはコントロールIgGと比べた場合のP値が0.05未満であることを示す。
【図１４】実施例1で得られた抗体のバリア機能制御活性評価（実施例11）の結果を示すグラフである。縦軸は脳脊髄液中の蛍光色素濃度を示し、横軸は蛍光色素投与からの経過時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
1．定義
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１５】
アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS，Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264−2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high−scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873−7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
【００１６】
本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
【００１７】
本明細書中において、「CDR」とは、Complementarity Determining Regionの略であり、相補性決定領域とも称される。CDRとは、イムノグロブリンの可変領域に存在する領域であり、抗体が有する抗原への特異的な結合に深く関与する領域である。そして、「軽鎖CDR」とはイムノグロブリンの軽鎖の可変領域に存在するCDRであり、「重鎖CDR」とはイムノグロブリンの重鎖の可変領域に存在するCDRのことを意味する。
【００１８】
本明細書中において、「可変領域」とは、上述したCDR1〜CDR3（以下、単に「CDRs1-3」という）を含む領域のことを意味する。これらのCDRs1-3の配置順序は特に限定はされないが、好ましくは、N末端側からC末端側の方向に、CDR1、CDR2、及びCDR3の順か、若しくはこの逆の順に、連続又は後述するフレームワーク領域（FR）と称される他のアミノ酸配列を介して、配置された領域を意味する。そして「重鎖可変領域」とは、上述の重鎖CDRs1-3が配置された領域であり、「軽鎖可変領域」とは、上述の軽鎖CDRs1-3が配置された領域である。
【００１９】
各可変領域の上記CDR1-3以外の領域は、上述するようにフレームワーク領域（FR）と称される。特に可変領域のN末端と上記CDR1との間の領域をFR1、CDR1とCDR2との間の領域をFR2、CDR2とCDR3との間の領域をFR3、CDR3と可変領域のC末端との間をFR4とそれぞれ定義される。
【００２０】
FRは、上述した抗原認識配列として特に重要なCDRs1-3を繋ぐリンカー配列としての機能も兼ね備えており、可変領域全体の立体構造形成に寄与する領域である。
【００２１】
2．抗体
本発明は、一実施形態として、Claudin 5タンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープ領域を認識する、抗体（本明細書において、「本発明の抗体」、「Claudin 5細胞外ドメイン抗体」などと示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００２２】
Claudin 5タンパク質は、Claudin 5（CLDN5、Cldn5などと称されることもある）遺伝子の発現産物であり、生物内で発現しているClaudin 5タンパク質である。Claudin 5タンパク質の由来生物種としては、特に制限されず、動物、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類が挙げられる。
【００２３】
種々の生物種由来Claudin 5タンパク質のアミノ酸配列は公知である。具体的には、例えば、ヒトClaudin 5タンパク質としては配列番号73に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質などが挙げられ、マウスClaudin 5タンパク質としては配列番号90に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質などが挙げられ、ラットClaudin 5タンパク質としては配列番号91に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質などが挙げられ、サルClaudin 5タンパク質としては配列番号92に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質などが挙げられる。
【００２４】
Claudin 5タンパク質は、その本来の活性、Claudin 5タンパク質同士でその細胞外ループを介して相互作用して密着結合を形成可能な限りにおいて、置換、欠失、付加、挿入などのアミノ酸変異を有していてもよい。変異としては、活性がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。
【００２５】
Claudin 5タンパク質の好ましい具体例としては、下記（a）に記載するタンパク質及び下記（b）に記載するタンパク質：
（a）配列番号73及び90〜92のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（b）配列番号73及び90〜92のいずれかに示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ密着結合形成能を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
【００２６】
上記（b）において、同一性は、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは98％以上である。
【００２７】
上記（b）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（b’）配列番号73及び90〜92のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つイノシトール リン酸結合加水分解活性を有するタンパク質
が挙げられる。
【００２８】
上記（b’）において、複数個とは、例えば2〜20個であり、好ましくは2〜10個であり、より好ましくは2〜5個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。
【００２９】
Claudin 5タンパク質の細胞外ドメインは、Claudin 5タンパク質が細胞膜（好ましくは内皮細胞膜、好ましくは血管内皮細胞膜、より好ましくは脳毛細血管内皮細胞膜）に4回膜貫通して配置された状態において、細胞外に露出する領域であり、その限りにおいて特に制限されない。また、Claudin 5タンパク質の細胞外ドメインは、N末端側に存在する第1細胞外ループと、C末端側に存在する第2細胞外ループからなる。各Claudin 5タンパク質の細胞外ドメイン、さらには第1細胞外ループ及び第2細胞外ループは、既に公知であるか、或いは各種膜貫通領域予測ツール（例えば、SOSUI：http://harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/など）などを用いて容易に決定することができる。
【００３０】
細胞外ドメインの具体例としては、例えば配列番号73で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質においては、N末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜80番目のアミノ酸（アラニン）までの領域（第1細胞外ループ）、及びN末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域（第2細胞外ループ）が挙げられる。他種のClaudin 5タンパク質における細胞外ドメインの具体例としても、これに対応する領域が挙げられる。ここで、本明細書において、「対応する領域」とは、例えばヒトClaudin 5タンパク質のアミノ酸配列と、他種のClaudin 5アミノ酸配列とを、配列分析用ツール（FASTA、BLASTなど）で比較した場合に、対応する領域である。
【００３１】
本発明の抗体は、Claudin 5タンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープ領域（本明細書において、単に「エピトープ」と表記する場合もある。）を認識する。換言すれば、本発明の抗体は、Claudin 5タンパク質の細胞外ドメイン内の領域に対して結合する、又は該領域に対する結合性を有する。
【００３２】
本発明の抗体のエピトープは、特に制限されず、直鎖状エピトープであっても、立体エピトープであってもよい。エピトープが直鎖状エピトープの場合、エピトープである「Claudin 5タンパク質の細胞外ドメイン内の領域」は、連続するアミノ酸配列である。また、エピトープが立体エピトープの場合、エピトープである「Claudin 5タンパク質の細胞外ドメイン内の領域」は、連続するアミノ酸配列であってもよいし、複数の、互いに連続していないアミノ酸配列であってもよい。
【００３３】
エピトープを構成するアミノ酸残基の数は、特に制限されないが、例えば40以下、35以下、6〜30、6〜25、6〜20、6〜15、又は6〜10である。
【００３４】
本発明の抗体のエピトープの好ましい具体例としては、第1細胞外ループのC末端側内の領域、第2細胞外ループ内の領域、第1細胞外ループ及び第2細胞外ループから形成される立体構造などが挙げられる。
【００３５】
エピトープの好ましい具体例である第1細胞外ループのC末端側内の領域としては、例えば第1細胞外ループを構成するアミノ酸配列を3分割した場合のC末端側2/3のアミノ酸配列からなる領域、第1細胞外ループを構成するアミノ酸配列を2分割した場合のC末端側半分のアミノ酸配列からなる領域が挙げられる。より具体的には、例えば配列番号73で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質において、N末端から46番目のアミノ酸〜80番目のアミノ酸までの領域が好ましく、N末端から55番目のアミノ酸〜80番目のアミノ酸までの領域がより好ましい。
【００３６】
エピトープの好ましい具体例である第2細胞外ループ内の領域としては、例えば配列番号73で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質においては、N末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域が挙げられ、好ましくはN末端から151番目のアミノ酸（セリン）を含む領域が挙げられる。他種のClaudin 5タンパク質における具体例としても、これに対応する領域が挙げられる。
【００３７】
本発明の抗体のエピトープが第2細胞外ループ内の領域である場合、好ましい一実施形態として、ヒトClaudin 5タンパク質に対する抗体であれば、配列番号99で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質点変異体S151T（実施例6）に対する結合性が、配列番号73で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質に対する結合性の1/5以下、1/20以下、1/100以下、1/500以下、1/2000以下、又は1/10000以下である抗体が挙げられ、他種のClaudin 5タンパク質に対する抗体であれば、上記点変異体に対応する点変異体に対する結合性が、野生型Claudin 5タンパク質に対する結合性の1/5以下、1/20以下、1/100以下、1/500以下、1/2000以下、又は1/10000以下である抗体が挙げられる。
【００３８】
本発明の抗体のエピトープが第2細胞外ループ内の領域である場合、好ましい一実施形態として、ヒトClaudin 5タンパク質に対する抗体であれば、配列番号97及び／又は98で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質点変異体（D68E、T75A：実施例6）に対する結合性を有する抗体が挙げられ、他種のClaudin 5タンパク質に対する抗体であれば、上記点変異体に対応する点変異体に対する結合性を有する抗体が挙げられる。
【００３９】
なお、被検抗体の、対象Claudinタンパク質に対する結合性は、実施例1-4と同様にして、対象Claudinタンパク質を発現する細胞を被検抗体（又はその抗体希釈に用いた溶液）を用いて蛍光染色し、蛍光染色細胞をFACS解析することにより調べることができる。細胞の蛍光シグナルの総和を、被検抗体の対象Claudinタンパク質の結合性とみなすことができる。被検抗体を用いた場合の蛍光シグナルの総和が、その抗体希釈液を用いた場合（Vehicle）の蛍光シグナルの総和の1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、5000倍、又は10000倍以上である場合に、被検抗体は対象タンパク質に対して「結合性を有する」と判定することができる。結合性については、以下においても同様である。
【００４０】
本発明の抗体が、第2細胞外ループ内の領域をエピトープとする、ヒトClaudin 5タンパク質に対する抗体である場合、好ましい一実施形態として、配列番号96で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質変異体（5-5-1：実施例5）に対する結合性が、配列番号73で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質に対する結合性の1/5以下、1/20以下、1/100以下、1/500以下、1/2000以下、1/10000以下である抗体が挙げられる。
【００４１】
本発明の抗体が、第2細胞外ループ内の領域をエピトープとする、ヒトClaudin 5タンパク質に対する抗体である場合、好ましい一実施形態として、配列番号93〜95で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質変異体（1-1-5、1-5-5、及び／又は5-1-5：実施例5）に対する結合性を有する抗体が挙げられる。
【００４２】
エピトープの好ましい具体例である第1細胞外ループ及び第2細胞外ループから形成される立体構造としては、例えば配列番号73で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質においては、N末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜80番目のアミノ酸（アラニン）までの領域、及びN末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域から形成される立体構造が挙げられ、好ましくはN末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜67番目のアミノ酸（チロシン）までの領域、及びN末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域から形成される立体構造が挙げられ、より好ましくはN末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜55番目のアミノ酸（バリン）までの領域、及びN末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域から形成される立体構造が挙げられ、さらに好ましくはN末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜48番目のアミノ酸（リシン）までの領域、及びN末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域から形成される立体構造が挙げられる。他種のClaudin 5タンパク質における具体例としても、これに対応する領域が挙げられる。
【００４３】
本発明の抗体のエピトープが第1細胞外ループ及び第2細胞外ループから形成される立体構造である場合、好ましい一実施形態として、ヒトClaudin 5タンパク質に対する抗体であれば、配列番号97〜99で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質点変異体（D68E、T75A、及び／又はS151T：実施例6）に対する結合性を有する抗体が挙げられ、他種のClaudin 5タンパク質に対する抗体であれば、上記点変異体に対応する点変異体に対する結合性を有する抗体が挙げられる。
【００４４】
本発明の抗体が、第1細胞外ループ及び第2細胞外ループから形成される立体構造をエピトープとする、ヒトClaudin 5タンパク質に対する抗体である場合、好ましい一実施形態として、配列番号93、94、及び／又は96で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質変異体（1-1-5、1-5-5、及び／又は5-5-1：実施例5）に対する結合性が、配列番号73で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質に対する結合性の1/5以下、1/20以下、1/100以下、1/500以下、1/2000以下、1/10000以下である抗体が挙げられる。
【００４５】
本発明の抗体が、第1細胞外ループ及び第2細胞外ループから形成される立体構造をエピトープとする、ヒトClaudin 5タンパク質に対する抗体である場合、好ましい一実施形態として、配列番号95で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質変異体（5-1-5：実施例5）に対する結合性を有する抗体が挙げられる。
【００４６】
本発明の抗体は、Claudin 5タンパク質に対する特異性がより高いことが好ましい。これにより、血液脳関門以外の密着結合を開くことによる副作用を、より低減することが可能である。この観点から、本発明の抗体として、好ましくは、Claudin 5タンパク質以外のClaudinファミリータンパク質に対する結合性が、Claudin 5タンパク質に対する結合性の1/5以下である抗体が挙げられる。
【００４７】
この結合性判定のための比較対象である「Claudin 5タンパク質以外のClaudinファミリータンパク質」としては、例えばヒトの場合であれば、Claudin 1、Claudin 2、Claudin 3、Claudin 4、Claudin 6、Claudin 7、Claudin 9などが挙げられ、マウスの場合であれば、Claudin 1、Claudin 2、Claudin 3、Claudin 4などが挙げられる。上記結合性を判定するに当たって、比較対象であるClaudinファミリータンパク質は、1種のみであってもよいし、2種以上を任意に組み合わせたものであってもよいし、全種であってもよい。
【００４８】
本発明の抗体の解離定数（Kd）は、特に制限されない。Kdは、例えば1×10−7（M）以下、好ましくは3×10−8（M）以下、より好ましくは1×10−8（M）以下である。
【００４９】
本発明の抗体として、Claudin 5タンパク質に対する結合性、血液脳関門制御活性などの観点から、好ましくは下記抗体A〜Iが挙げられる。
【００５０】
（抗体A）
配列番号1で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号2で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号3で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号7で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体A。
【００５１】
抗体Aにおいて、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列としては、好ましくは配列番号4で示されるアミノ酸配列が挙げられ、軽鎖可変領域全体N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列の配列としては、好ましくは配列番号8で示されるアミノ酸配列が挙げられる。抗体Aとして、より具体的には、実施例における抗体2B12が挙げられる。
【００５２】
（抗体B）
配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号10で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号11で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号13で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号14で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号15で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体B。
【００５３】
抗体Bにおいて、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列としては、好ましくは配列番号12で示されるアミノ酸配列が挙げられ、軽鎖可変領域全体N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列の配列としては、好ましくは配列番号16で示されるアミノ酸配列が挙げられる。抗体Bとして、より具体的には、実施例における抗体2B1が挙げられる。
【００５４】
（抗体C）
配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体C。
【００５５】
抗体Cにおいて、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列としては、好ましくは配列番号20で示されるアミノ酸配列が挙げられ、軽鎖可変領域全体N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列の配列としては、好ましくは配列番号24で示されるアミノ酸配列が挙げられる。抗体Cとして、より具体的には、実施例における抗体4F1が挙げられる。
【００５６】
（抗体D）
配列番号25で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体D。
【００５７】
抗体Dにおいて、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列としては、好ましくは配列番号28で示されるアミノ酸配列が挙げられ、軽鎖可変領域全体N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列の配列としては、好ましくは配列番号32で示されるアミノ酸配列が挙げられる。抗体Dとして、より具体的には、実施例における抗体4D2が挙げられる。
【００５８】
（抗体E）
配列番号33で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号35で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号37で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号39で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体E。
【００５９】
抗体Eにおいて、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列としては、好ましくは配列番号36で示されるアミノ酸配列が挙げられ、軽鎖可変領域全体N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列の配列としては、好ましくは配列番号40で示されるアミノ酸配列が挙げられる。抗体Eとして、より具体的には、実施例における抗体1B3が挙げられる。
【００６０】
（抗体F）
配列番号41で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号42で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号43で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号45で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号46で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号47で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体F。
【００６１】
抗体Fにおいて、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列としては、好ましくは配列番号44で示されるアミノ酸配列が挙げられ、軽鎖可変領域全体N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列の配列としては、好ましくは配列番号48で示されるアミノ酸配列が挙げられる。抗体Fとして、より具体的には、実施例における抗体1D1が挙げられる。
【００６２】
（抗体G）
配列番号49で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号50で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号51で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号53で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号54で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号55で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体G。
【００６３】
抗体Gにおいて、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列としては、好ましくは配列番号52で示されるアミノ酸配列が挙げられ、軽鎖可変領域全体N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列の配列としては、好ましくは配列番号56で示されるアミノ酸配列が挙げられる。抗体Gとして、より具体的には、実施例における抗体3A5が挙げられる。
【００６４】
（抗体H）
配列番号57で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号58で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号59で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号61で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号62で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号63で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体H。
【００６５】
抗体Hにおいて、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列としては、好ましくは配列番号60で示されるアミノ酸配列が挙げられ、軽鎖可変領域全体N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列の配列としては、好ましくは配列番号64で示されるアミノ酸配列が挙げられる。抗体Hとして、より具体的には、実施例における抗体2D1が挙げられる。
【００６６】
（抗体I）
配列番号65で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号66で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号67で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号69で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号70で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号71で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体I。
【００６７】
抗体Iにおいて、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列としては、好ましくは配列番号68で示されるアミノ酸配列が挙げられ、軽鎖可変領域全体N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列の配列としては、好ましくは配列番号72で示されるアミノ酸配列が挙げられる。抗体Iとして、より具体的には、実施例における抗体4A1が挙げられる。
【００６８】
抗体A〜Iの重鎖可変領域全体の配列、及び軽鎖可変領域全体の配列の上記好ましい例（配列番号4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72）において、そのアミノ酸配列は、変異していてもよい。例えば、上記好ましい例（配列番号4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72）に対して、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上、よりさらに好ましくは99％以上の同一性を有する配列も、抗体A〜Iの重鎖可変領域全体の配列、及び軽鎖可変領域全体の配列として採用することができる。変異部位は、任意であってもよいが、CDR以外の部位であることが好ましい。
【００６９】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよいが、Kd値、特異性などの観点から、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００７０】
本発明の抗体の分子量は、特に制限されないが、下限は、例えば20,000、好ましくは50,000、好ましくは100,000、より好ましくは120,000であり、上限は、例えば1,000,000、好ましくは500,000、より好ましくは200,000である。
【００７１】
本発明の抗体の構造は、特に制限されない。本発明の抗体は、定常領域を含むものであってもよいし、定常領域を含まないものであってもよい。定常領域を含む場合、重鎖の定常領域（CH1、CH2、及びCH3）並びに軽鎖の定常領域（CL）の全てを含んでいてもよいし、これらの内の任意の1種又は2種以上の組み合わせを含んでいてもよい。
【００７２】
本発明の抗体の構造の具体例としては、イムノグロブリン、Fab、F(ab’)2、ミニボディ（minibody）、scFv‐Fc、Fv、scFv、ディアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）などが挙げられる。これらの中でも、本発明の効果の観点から、好ましくはイムノグロブリンが挙げられる。
【００７３】
イムノグロブリンは、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を有する1本の重鎖と軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を有する1本の軽鎖から成る構造が2つ組み合わされた構造を有する。
【００７４】
Fabとは、重鎖可変領域及び重鎖定常領域中のCH1を含む重鎖の断片と、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域（CL）を含む軽鎖とを含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが上述する非共有結合性の分子間相互作用によって会合するか、またはジスルフィド結合によって結合してなる構造を有する。Fabにおいて、CH1とCLとは、それぞれに存在するシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合していてもよい。
【００７５】
F(ab’)2とは、2対の上記Fabを有し、CH1同士がこれらに含まれるシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合してなる構造である。
【００７６】
ミニボディとは、下記scFVを構成する重鎖可変領域にCH3が結合した断片2つが、CH3同士で非共有結合性の分子間相互作用によって会合した構造である。
【００７７】
scFv‐Fcとは、下記scFv、CH2、およびCH3を含む抗体断片2つが、上記ミニボディと同様にCH3同士で非共有結合性の分子間相互作用によって会合し、それぞれのCH3に含まれるシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合した構造である。
【００７８】
Fvとは、抗体の最小構造単位ともいわれ、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが非共有結合性の分子間相互作用によって会合した構造である。Fvにおいて、重鎖可変領域および軽鎖可変領域内に存在するシステイン残基のチオール基同士がジスルフィド結合していても良い。
【００７９】
scFvとは、重鎖可変領域のC末端と軽鎖可変領域のN末端がリンカーで繋がれた構造、又は重鎖可変領域のN末端と軽鎖可変領域のC末端とがリンカーで繋がれた構造であり、単鎖抗体とも呼ばれる。
【００８０】
ディアボディ、トリアボディ、およびテトラボディとは、それぞれ上記scFvが2量体、3量体および4量体を形成し、Fvなどと同様に可変領域同士の非共有結合性の分子間相互作用等により、構造的に安定な状態で会合した構造である。
【００８１】
本発明の抗体がイムノグロブリンである場合、そのクラスは特に制限されない。該クラスとしては、例えばIgA、IgD、IgE、IgG、IgMなど、さらにはこれらのサブクラスが挙げられる。好ましいクラスとしては、例えばIgG、IgMなどが挙げられ、好ましくはIgGが挙げられ、より好ましくはIgG2が挙げられ、さらに好ましくはIgG2aが挙げられる。
【００８２】
本発明の抗体の由来は特に制限されない。本発明の抗体は、例えばヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、ウサギ由来抗体、サル由来抗体、チンパンジー由来抗体などであり得る。また、本発明の抗体は、キメラ抗体（例えばヒト以外の生物（マウスなど）由来抗体の定常領域のアミノ酸配列をヒト由来抗体の定常領域のアミノ酸配列に置き換えられてなる抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体などであってもよい。
【００８３】
本発明の抗体は、例えば、以下のClaudin 5タンパク質の細胞外ドメインを含み、且つ該ドメインが露出しているプロテオリポソームを免疫抗原として用い、それ以外は定法に従った又は準じた方法によって製造することができる（製造方法1）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、プロテオリポソームを、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、プロテオリポソームをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
【００８４】
なお、通常、単に野生型Claudin 5タンパク質を含むプロテオリポソームを免疫抗原としても、本発明の抗体は得ることができない。
【００８５】
本発明の抗体を得るには、免疫抗原として、例えば細胞外ドメインのアミノ酸配列が目的生物種（例えばヒト）のClaudin 5タンパク質の細胞外ドメイン配列であり、且つ細胞内ドメインのアミノ酸配列が、免疫対象動物のClaudin 5タンパク質の細胞内ドメイン配列であるClaudin 5タンパク質を含み、且つ細胞外ドメインが露出しているプロテオリポソーム（免疫抗原1）を用いることが好ましい。免疫抗原1としては、例えば配列番号75で示されるアミノ酸配列からなるヒト・マウス−キメラClaudin 5タンパク質を含むプロテオリポソームが挙げられる。
【００８６】
或いは、本発明の抗体を得るための免疫抗原としては、Claudin 5タンパク質の細胞外ドメインが膜の両側に露出している（好ましくはそれ以外のドメインが露出していない）プロテオリポソーム（免疫抗原2）を用いることが好ましい。免疫抗原1としては、例えば配列番号77で示されるアミノ酸配列からなる細胞外ドメインリバーシブルClaudin 5タンパク質を含むプロテオリポソームが挙げられる。
【００８７】
免疫抗原としては、上記免疫抗原1及び2をそれぞれ単独で用いてもよいし、これらを組み合わせて用いてもよい。
【００８８】
免疫抗原であるプロテオリポソームは、例えばClaudin 5タンパク質変異体（上記ヒト・マウス−キメラClaudin 5タンパク質や、細胞外ドメインリバーシブルClaudin 5タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを用いて、公知の無細胞タンパク質合成系により、調製することができる。なお、上記変異体のコード配列として、Claudin 5タンパク質をコードするゲノム配列をそのまま利用すると、通常は、タンパク質発現がほとんど起こらない。これは、Claudin 5タンパク質をコードするゲノム配列はGC含量が非常に高く、このためmRNAが高次構造を取り翻訳阻害しているためと考えられる。そこで、上記変異体のコード配列に、Claudin 5タンパク質をコードするゲノム配列を利用する際は、GC含量が50％付近（例えば45〜55％）になるようにコドン変換した上で利用することが望ましい。
【００８９】
プロテオリポソームを構成する脂質としては、リポソームを構成可能な公知の脂質を各種使用することができる。脂質の中でも、ホスファチジルコリン（好ましくは卵黄由来ホスファチジルコリン）とモノホスホリル脂質Aとの組み合わせを採用することが好ましい。該組み合わせの場合の両者の重量比（ホスファチジルコリン：モノホスホリル脂質A）は、例えば5〜200：1、好ましくは10〜100：1、より好ましくは20〜70：1、さらに好ましくは30〜50：1、よりさらに好ましくは35〜45：1である。
【００９０】
プロテオリポソームを免疫する対象動物は、抗体を製造可能な動物である限り特に制限されない。該対象動物としては、好ましくは自己免疫疾患動物（マウスの場合であれば、例えばBXSBマウスなど）が挙げられる。
【００９１】
本発明の抗体の少なくともCDRのアミノ酸配列が既に分かっている場合、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにより形質転換させた宿主を培養し、本発明の抗体を含む画分を回収する工程を含む方法（製造方法2）によっても製造することができる。
【００９２】
本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、本発明の抗体を発現可能な状態で含む限りにおいて特に制限されず、本発明の抗体のコード配列以外に、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、本発明の抗体コード配列に隣接して配置される分泌シグナルペプチドコード配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、リプレッサー配列、インスレーター配列、複製基点、薬剤耐性遺伝子コード配列などが挙げられる。また、
本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、直鎖状のポリヌクレオチドであってもよいし、環状のポリヌクレオチド（ベクターなど）であってもよい。
【００９３】
本発明のポリヌクレオチドの具体例としては、（I）本発明の抗体の重鎖、重鎖可変領域、及び重鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、（II）本発明の抗体の軽鎖、軽鎖可変領域、及び軽鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであっても、（III）本発明の抗体の重鎖、重鎖可変領域、及び重鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含む核酸、並びに本発明の抗体の軽鎖、軽鎖可変領域、及び軽鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。
【００９４】
宿主は、特に制限されず、例えば昆虫細胞、真核細胞、哺乳類細胞等が挙げられる。中でも、抗体をより効率的に発現させる観点から、哺乳類細胞であるHEK細胞、CHO細胞、NS0細胞、SP2/O細胞など好ましい。
【００９５】
形質転換、培養、及び回収の方法は、特に制限されず、抗体製造における公知の方法を採用することができる。
【００９６】
回収後は、必要に応じて本発明の抗体を精製してもよい。精製は、抗体製造における公知の方法、例えばクロマトグラフィー、透析などにより行うことができる。
【００９７】
3．複合体
本発明は、一実施形態として、本発明の抗体と薬物との複合体（本明細書において、「本発明の複合体」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００９８】
薬物は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。薬物としては、例えば、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子、及びこれらの類縁体、グリコサミノグリカン及びその誘導体、オリゴ糖、多糖及びこれらの誘導体、タンパク質及びペプチドなどの生理活性的物質；抗神経剤、抗ウイルス剤、抗癌剤、抗生物質、酵素剤、抗酸化剤、抗炎症剤、ステロイド剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、血管拡張剤、平滑筋細胞の増殖及び／又は遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、免疫抑制剤、脂質取込み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、血管内皮細胞の増殖又は抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫賦活剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ；：Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ）阻害剤、終末糖化産物（ＡＧＥｓ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）阻害剤、及びラジカルスカベンジャー等の薬理的活性物質などが挙げられる。本発明の複合体は、本発明の抗体を部分構造として含んでおり、これにより血液脳関門をより効率的に透過できることから、薬物の中でも、抗神経剤（例えば、中枢神経系の治療及び／又は診断に用いることができる薬物）が好ましい。
【００９９】
抗神経剤の具体例としては、コンスタン、セパゾン、セルシン、セレナール、ソラナックス、デパス、バランス、メイラックス、リーゼ、リボトリール、レキソタン、ワイバックス、セディール、グランダキシン、エリスパン等の抗不安剤；アナフラニール、トフラニール、トリプタノール、アモキサン、アンプリット、プロチアデン、テシプール、テトラミド、ルジオミール、デジレル、レスリン、アビリット、ドグマチール、ミラドール、リタリン、デプロメール、パキシル、ルボックス、トレドミン等の抗うつ剤；アモバン、ハルシオン、エバミール、マイスリー、リスミー、レンドルミン、ロラメット、サイレース、ドラール、ベンザリン、ユーロジン、ロヒプノール、インスミン、ソメリン、ダルメート、フェノバール、イソミタール等の抗不眠剤；ウインタミン、コントミン、ニューレプチル、ヒルナミン、ＰＺＣ、メレリル、インプロメン、セレネース、オーラップ、クレミン、クロフェクトン、デフェクトン、ホーリット、ロドピン、アタラックス等の精神安定剤；リーマス、テグレトール等の躁鬱剤；エトトイン、フェニトイン、アセチルフェネトライド、プリミドン、スルチアム、エトスクシミド、クロナゼパム、カルバマゼピン、バルプロ酸ナトリウム、ゾニサミド等の抗てんかん剤；レボドパ剤、メシル酸ペルゴリド、塩酸アマンダジン、塩酸トリヘキシフェニジル、塩酸ピロヘプチン、塩酸マザチコ−ル、塩酸メチキセン、ビペリデン、プロフェナミン、ドロキシドパ等のパーキンソン病治療剤などが挙げられる。
【０１００】
本発明の複合体は、本発明の抗体と薬物とが、直接又はリンカーなどを介して間接的に結合することによって形成される。結合態様は特に制限されず、例えば共有結合、配位結合、イオン結合などが挙げられる。本発明の抗体と薬物との結合は、その結合態様に応じて、公知の方法に従って又は準じて実施することができる。
【０１０１】
共有結合は、例えば、本発明の抗体と薬物の各々が有する官能基又は必要に応じて導入された官能基を反応させることによって行われ得る。当該官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基とカルボキシル基、カルボキシル基とヒドロキシル基、マレイミド基とチオール基、チオール基とチオール基、ヒドラジド基とケトン基、ヒドラジド基とアルデヒド基、アミノ基とアルデヒド基、チオール基とカルボキシル基、アミノ基とスクアリン酸誘導体、ジエニルアルデヒド基とアミノ基、ハロエステルとチオール基、アジドとアルキン等が挙げられる。
【０１０２】
4．医薬
本発明は、一実施形態として、本発明の抗体、及び本発明の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、医薬（本明細書において、「本発明の医薬」と示すこともある。）に関する。
【０１０３】
本発明の抗体は、脳血管内皮細胞間の連結を開き、血液脳関門の物質透過を促進することができる。このため、本発明の抗体、本発明の複合体は、医薬、特に血液脳関門制御（抑制）用、脳血管内皮細胞層バリア機能制御（抑制）用、血液脳関門の薬物透過促進用などの用途に用いられる医薬の有効成分として、好適に利用することができる。
【０１０４】
本発明の医薬は、本発明の抗体を含むが本発明の複合体を含まない場合であれば、薬物と併用することにより、その薬物の血液脳関門の透過促進を図ることができる。また、本発明の医薬は、本発明の複合体を含む場合であれば、そのまま、或いは薬物と併用することにより、該複合体中の薬物又は併用された薬物の血液脳関門の透過促進を図ることができる。
【０１０５】
本発明の医薬中の有効成分の含有量は、対象とする疾患の種類、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、患者の年齢、及び患者の体重等を考慮して適宜設定することができる。例えば、本発明の医薬中の有効成分の含量は、本発明の医薬全体を100重量部として0.0001重量部〜100重量部程度をすることができる。
【０１０６】
本発明の医薬の投与形態は、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与、及び非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与）のいずれかの投与経路でヒトを含む哺乳類に投与することができる。好ましい投与形態は非経口投与であり、より好ましくは静脈注射である。経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、有効成分を、薬学的に許容される坦体等と混合等することにより、常法に従って製造することができる。
【０１０７】
非経口投与のための剤型は、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等が挙げられる。例えば、注射用製剤は、抗体又は細胞を注射用蒸留水に溶解して調製し、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、及び安定化剤等を添加することができる。医薬は、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
【０１０８】
本発明の医薬は、疾患の治療又は予防に有効な他の薬剤を更に含有していてもよい。本発明の医薬は、必要に応じて殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、及びアミノ酸等の成分を配合することもできる。
【０１０９】
本発明の医薬の製剤化に用いる担体には、当該技術分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤等を用いることができる。
【０１１０】
本発明の医薬の投与量は、例えば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態および毒物学的特徴等の薬理学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与されるか、など様々な因子を元に、臨床医師により決定することができる。本発明の医薬の投与量は、例えば、一日当たりで、1μg/kg（体重）〜10g/kg（体重）程度とすることができる。本発明の医薬の投与スケジュールも、その投与量と同様の要因を勘案して決定することができる。例えば、上記の1日当たりの投与量で、1日〜1月に1回投与することできる。
【０１１１】
5．試薬
本発明は、一実施形態として、本発明の抗体、及び本発明の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、試薬（本明細書において、「本発明の試薬」と示すこともある。）、より詳細には、Claudin 5を検出などするための試薬に関する。ここで、「試薬」には、Claudin 5を検出などすることにより検査、検出、診断など行うための「検査薬」も包含される。
【０１１２】
本発明の試薬は、本発明の抗体、及び本発明の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する組成物の形態であってもよい。該組成物には、必要に応じて他の成分が含まれていてもよい。他の成分としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
【０１１３】
本発明の試薬は、本発明の抗体、及び本発明の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含むキットの形態であってもよい。該キットには、Claudin 5の検出、分離などの実施に用いられ得る器具、試薬などが含まれていてもよい。このような器具、試薬としては、例えば試験管、マイクロタイタープレート、アガロース粒子、ラテックス粒子、精製用カラム、標識抗体、標準試料（陽性対照、陰性対照）などが挙げられる。
【実施例】
【０１１４】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【０１１５】
参考例1．抗原の作製
抗体の作製に用いる免疫抗原（プロテオリポソーム）を、以下の通り調製した。【０１１６】
＜参考例1-1．鋳型プラスミドの作製＞
pEU-E01ベクター（CellFree Sciences社製）に、野生型ヒトClaudin 5タンパク質（配列番号73）のコード配列（配列番号74）からなるDNA断片、ヒト・マウス−キメラClaudin 5タンパク質（配列番号75）のコード配列（配列番号76）からなるDNA断片、又は細胞外ドメインリバーシブルClaudin 5タンパク質（配列番号77）のコード配列（配列番号78）からなるDNA断片をコードするDNA断片を、Gateway法又はGibson Assembly法を用いて挿入して、鋳型プラスミドを得た。【０１１７】
なお、予備実験においては、野生型ヒトClaudin 5タンパク質のコードDNA断片の塩基配列として、ヒトcDNA由来の塩基配列を採用した場合、タンパク質の合成が確認できなかった。この原因として、ヒトcDNA由来のClaudin 5コード配列はGC含量が平均68%と高く、部分的に80%まで高い部分もあるので、mRNAが高次構造を取り翻訳阻害している可能性が考えられた。そこで、ヒトcDNA由来の塩基配列において、アミノ酸配列が変化しないようにコドン変換を行い、GC含量を50%付近に調整した配列を、野生型ヒトClaudin 5タンパク質のコード配列（配列番号74）とした。ヒトcDNA由来のClaudin 5タンパク質コード配列と、コドン変換後のClaudin 5タンパク質コード配列（配列番号74）との対比を、図１に示す。【０１１８】
ヒト・マウス−キメラClaudin 5タンパク質は、細胞外領域及びその近傍の膜貫通領域がヒト由来の配列であり、細胞内領域及びその近傍の膜貫通領域がマウス由来の配列であり、且つC末端側が削除されたアミノ酸配列からなる。該タンパク質の配列を図２に示す。該タンパク質のコード配列も、ヒトcDNA由来のClaudin 5タンパク質コード配列と同様に、コドン変換されている。【０１１９】
細胞外ドメインリバーシブルClaudin 5タンパク質は、脂質膜を介して両側に細胞外ドメインが配置されるように改変したClaudin 5タンパク質である。該タンパク質の配列、及び脂質膜に配置された状態の模式図を図３に示す。該タンパク質のコード配列も、ヒトcDNA由来のClaudin 5タンパク質コード配列と同様に、コドン変換されている。【０１２０】
＜参考例1-2．リポソームの調製＞
無細胞系に添加するリポソームは、卵黄由来ホスファチジルコリン（EggPC、和光純薬工業社製）にMPLA （Avanti社製）を添加した混合脂質を用いて調製した。具体的には以下のようにして調製した。【０１２１】
クロロホルムに溶解したホスファチジルコリン50 mgとMPLA 1.25 mgをナス型フラスコに分注し、混合した。エバポレーターを用いて、フラスコを回転させながらクロロホルムを蒸発させて、脂質薄膜を得た。脂質薄膜からクロロホルムを完全に除くため、フラスコを真空デシケーター内、陰圧下で、6時間以上静置した。タンパク質合成キット（WEPRO7240 expression kit、CellFree Science社製）の付属バッファー（SUB-AMIX SGCバッファー）を、脂質濃度が25 mg/mLになるようにフラスコに添加し、超音波破砕（Branson、SONIFIER model 450D-Advanced）してリポソームを得た。【０１２２】
＜参考例1-3．無細胞タンパク質合成系によるプロテオリポソームの調製＞
タンパク質合成キット（WEPRO7240 expression kit、CellFree Science社製）を用いて、プロテオリポソームを調製した。具体的には以下の様に行った。【０１２３】
転写反応は、参考例1-1で得られた鋳型プラスミドを用いて、キットの手順書に従って実施した。【０１２４】
翻訳反応は、透析重層法で行った。具体的な手順は次の通りである。6穴平底プレート（TPP）に、キットに付属のSUB-AMIX SGCバッファーを3.5 mL注入した。プレートに透析カップ（Pierce, Slide-A-LyzerTM MINI Dialysis Device, 10 kDa MWCO）を挿入し、カップ内にSUB-AMIX SGCバッファーを2 mL注入した。さらに、上記転写反応により得られたmRNA 125 μL、キットに付属のコムギ胚芽抽出液 125 μL、クレアチンキナーゼ 2 μL、及び参考例1-2で得られたリポソーム200 μLを混合した翻訳反応液を、カップ内のSUB-AMIX SGC バッファーの下層に静かに注入し、重層した。15℃で24時間静置し、翻訳反応を行った。【０１２５】
翻訳反応後、透析カップ内液を混和し、15 mLまたは50 mLの遠心チューブに回収した。チューブを遠心（15,000rpm、10分間、4℃）することにより、プロテオリポソームを沈殿させた。上清を除去し、フィルター滅菌したPBS又はHBSバッファーでペレットを再懸濁した。遠心とバッファーによる再懸濁を3回繰り返し、プロテオリポソームを洗浄した。最終的に、プロテオリポソームを任意の量のバッファーに懸濁し、プロテオリポソーム懸濁液を得た。プロテオリポソーム懸濁液中の各タンパク質の濃度は、SDS-PAGE及びCBB染色により検出されたバンドを基に、BSA濃度標準のバンドとの比較により、算出した。【０１２６】
実施例1．抗体の作製
参考例1で得られた免疫抗原（ヒト・マウス−キメラClaudin 5タンパク質、又は細胞外ドメインリバーシブルClaudin 5タンパク質のプロテオリポソーム）を用いて、モノクローナル抗体を作製した。具体的には以下の様に行った。【０１２７】
＜実施例1-1．免疫＞
参考例1で得られたプロテオリポソームを、タンパク質濃度が40 μg/mLトなるように希釈した。得られた希釈液500 μLを、BXSBマウス（雄性、6週齢）（清水実験材料社製）に腹腔内投与した。その後、2週間おきに、投与を計2〜3回行った。【０１２８】
＜実施例1-2．細胞融合＞
（1）動物、細胞：免疫したBXSB系マウス及びその脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞（P3U1細胞）を使用する。【０１２９】
（2）試薬：PEG1500、及び10X BM condimed H1はRoche Diagnostics社より購入した。50X HAT supplementはInvitrogen社より購入した。その他試薬は、試薬特級品を用いた。その他試薬は、試薬特級品を用いた。【０１３０】
（3）溶血剤：2.06 gのTrisを100 mLの超純水に溶解させ、1N-HClでpHを7.65に調整したものと、8.3 gのNH4Clを900 mLの超純水に溶解させたものとを混ぜ合わせた（計1000 mL、pH=7.2）。この溶液をオートクレーブにかけ滅菌し、4℃で保存した。【０１３１】
（4）実験操作
（4-1）脾臓懸濁液の調製：最終免疫から3日後に、イソフルラン麻酔下で開腹して脾臓を取り出し、冷RPMI培地（血清は含まない）が入ったディッシュに移した。脾臓を細切りにした後、セルストレーナー（100 μm、Becton Dickinson社製）を用いて、冷RPMI培地中に脾臓細胞を懸濁させた。脾臓細胞懸濁液にRPMI培地を加え、冷却遠心機を用いて遠心（300 g、5分間）により洗浄した。次に、細胞ペレットに溶血剤を5 mL加えて、5分間氷上でインキュベートした。30 mLのRPMI培地を加えて、遠心により洗浄した。最後に、セルストレイナー（70 μm）を用いて、脾臓細胞懸濁液から完全に組織片を取り除いた。【０１３２】
（4-2）P3U1細胞の調製：50 mLの10%FBS添加RPMI培地中で、継代培養してきたP3U1細胞をファルコンチューブに移した。遠心分離（300 g、5分間）による洗浄（洗浄液はRPMI培地）を3回繰り返して、P3U1細胞のペレットを得た。【０１３３】
（4-3）細胞融合：（4-1）で調製した脾臓懸濁液で、（4-2）で調製したP3U1細胞ペレットを砕きよく懸濁させた（細胞の比率は脾臓細胞：P3U1＝10:1）。遠心分離（300 g、5分間）を行い、細胞ペレットを得た。ファルコンチューブの底を手のひらに叩きつけるようにタッピングを行い、このペレットをほぐした。その後、細胞に、37℃に保温していたPEG1500 2 mLを、ファルコンチューブを回しつつ、チップの先で軽くかき混ぜるように、1分間かけてゆっくり添加した。その後、30秒間十分にタッピングを行い、30秒間静置した。次に、遠沈管に、5 mLのRPMI培地を、PEG1500を加えた要領で2分間かけて添加し、3分間静置した。その後、30 mLのRPMI培地を加え、遠心分離（300 g, 5分間）した。上清を捨て、細胞を1XHAT/20%FBS/10% BM condimed H1添加RPMI培地で懸濁し、得られた懸濁液（全量は50 mL）を、予め0.5 mLの1XHAT/20%FBS/10% BM condimed H1添加RPMI培地を加えていた24ウェルプレート4枚の各ウェルに0.5 mLずつ播いた。セレクション状況を経時的に観察しつつ、インキュベーター内で、最低7日間は培養を続けた。【０１３４】
＜実施例1-3．スクリーニング用細胞の作製＞
pCX4purベクター（大阪バイオサイエンス研究所製）に、野生型ヒトClaudin 5タンパク質のコード配列からなるDNA断片を挿入して、レトロウイルス作製用ベクターを得た。パッケージング細胞（Phoenix A細胞）を12ウェルプレート（Becton Dickinson社製）の各ウェルに0.5×105個ずつ播種し、24時間培養した。その後、X-treme GENE HP DNA（Roche Diagnosis社製）3 μLを用いて、pCL amphoベクター0.5 μg及びレトロウイルス作製用ベクター0.5 μgをphoenix A細胞へトランスフェクションした。24時間後に培地交換を行い、更に24時間培養した。レトロウイルスを含む培養上清を回収し、これを0.45 μmのフィルターで濾過することで夾雑物を除き、そこへ8 μg/mLとなるようにポリブレン（SigmaAldrich社製）を加えた。得られた溶液を用いて、ヒト繊維肉腫由来細胞（HT-1080細胞）を24時間培養した。その後、細胞を、10 cmディッシュ（コーニング社製）中、5 μg/mLのピューロマイシンを含む10%FBS添加DMEMを用いて2日培養し、未感染細胞を除去した。【０１３５】
＜実施例1-4．FACSを用いたスクリーニング及びクローニング＞
10 cmディッシュに、実施例1-3で得られたスクリーニング用細胞又はmock細胞（Claudinを発現しないレトロウイルス感染させたHT-1080細胞）を播種し、翌日、細胞を回収した。得られた細胞1.0×105個に対して、実施例1-2で得られたスクリーニング対象の培養上清100 μLを1次抗体として添加し、4℃で1時間反応させた。細胞を0.2% BSA-TBSを用いて3回洗浄した後、2次抗体溶液（FITC conjugated goat anti-mouse IgG + IgM in 1% BSA-PBS（1:400））100 μLと混合し、4℃で1時間反応させた。細胞を0.2% BSA-TBSを用いて洗浄した後、FACS解析（FACS caliber、BD Bioscience社製）を行った。横軸を蛍光シグナル、縦軸を細胞数としたヒストグラムにおいて、mock細胞に比べて、ピークが右側（蛍光シグナルが強い側）にシフトした場合に、処理に用いた培養上清のウェルにポジティブクローン（抗Claudin 5抗体産生細胞）が存在すると判定した。【０１３６】
クローニングは、脾臓懸濁液を事前に96ウェルプレートの各ウェルに100 μLずつ播き支持層を形成させたプレートを用いて行った。ポジティブクローンが存在するウェルの細胞を、一回目のクローニングのときは100倍に、二回目以降のクローニングのときは1000倍、6000倍、36000倍の三段階に、10%FBS添加RPMI培地で希釈し、支持層を形成させておいた96ウェルプレートの各ウェルに100μLずつ播き、インキュベーターで培養した。クローニング終了の判定は、FACSにより選別したポジティブクローンが、シングルクローンであることを倒立位相差顕微鏡で確認し行った。【０１３７】
その結果、免疫抗原としてヒト・マウス−キメラClaudin 5タンパク質のプロテオリポソームを用いた場合には3つのハイブリドーマ（4F1、4A1、及び1B3）が得られ、免疫抗原として細胞外ドメインリバーシブルClaudin 5タンパク質のプロテオリポソームを用いた場合には5つのハイブリドーマ（1D1、2B1、3A5、2D1、及び2B12）が得られ、2種のプロテオリポソームを混合して免疫抗原として用いた場合には1つのハイブリドーマ（4D2）が得られた。【０１３８】
＜実施例1-5．クローニングされたハイブリドーマの大量培養＞
クローニングされたハイブリドーマを、予めddY系マウス脾細胞の支持層を形成させた24ウェルプレートに移し、インキュベーター内で培養した。細胞が増殖し始めた後、培養液全量を、9 mLの10%FBS添加RPMI培地を入れた組織培養用25 cm3フラスコに移し、培養を継続した。更なる増殖を確認した後、培養液全量を、40 mLの10%FBS添加RPMI培地を入れた組織培養用75 cm3フラスコに移し、培養を継続した。【０１３９】
＜実施例1-6．抗体の調製＞
（1）動物：Balb/c nu/nu系マウスを使用した。【０１４０】
（2）使用細胞：クローニングされたハイブリドーマ細胞。【０１４１】
（3）使用試薬：プリスタン（2,6,10,14-tetramethyl pentadecan）は和光純薬工業社より、Protein G sepharose 4 fast flowはGE Healthcare社より購入した。【０１４２】
（4）腹水の回収：Balb/c nu/nuマウスの腹腔に、プリスタンを0.5 mL投与し、その1週間後に、ハイブリドーマ細胞（1×107cells）を腹腔内投与した。ハイブリドーマを投与したマウスは投与後7-10日から急激に腹水が溜まるので、腹部の腫れが最大となったころを見計らい、麻酔下で腹水を採取した。腹水は15 mLのファルコンチューブに採取し、遠心分離（3000 rpm,10分間）により不要物を除去した。腹水は-80℃で保存し、用事解凍して用いた。【０１４３】
（5）プロテインGによる精製
（5-1）試薬の調製：
・Starting buffer： 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0  20 mMリン酸水素二ナトリウム溶液（5.36 g/L）と20 mMリン酸二水素ナトリウム（2.76 g/L）を61：39の割合で混合する。
・Elution buffer：100 mM glycine HCl, pH 2.7  グリシン7.507 gを950 mLのミリQ水に溶かし、HClでpHを2.7に調整後、全量を1000 mLにメスアップする。
・Neutralize buffer：1.0 M tris HCl, pH 9.0  2.0 Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（242 g/L）50 mLに対し塩酸を加えpHを9.0に調整し、全量が100mLになるように、ミリQ水でメスアップした。
・Elution (non-specifically bound protein) buffer： 3 M NaCl  塩化ナトリウム17.5 gを100 mLのミリQ水に溶かす。【０１４４】
（5-2）精製：
腹水に対しその三倍量のStarting bufferを加え、20分間静置した後、遠心分離（3000 rpm, 30分間）、及び0.8μmのメンブランスフィルターを通すことにより、不溶物を除去した。得られたサンプルを、Starting Bufferで十分に平衡化されたプロテインGカラム（0.7×5 cm）にロードした。サンプル液が完全に流出した後、30 mLのStarting bufferでカラムを洗浄した。Elution buffer 10 mLをカラムに通し、抗体を溶出させた。溶出液は、フラクションコレクターを用いて50滴ずつ分取した。この際、フラクションコレクターの各フラクションには、予め50μLのNeutralize bufferを加えておいた。得られた抗体画分を、4℃の条件下、PBS中で透析（Slide A Lyzer 20 kMWCO）した。以下、精製されたモノクローナル抗体の名称は、上記ハイブリドーマと同じとする（例えば、ハイブリドーマ2B12から得られた抗体は、「抗体2B12」又は単に「2B12」と表記する。）。【０１４５】
実施例2．抗体のクラス、アミノ酸配列、及びKd値の決定
＜実施例2-1．抗体のクラスの決定＞
（1）使用細胞：実施例1でクローニングしたハイブリドーマ。【０１４６】
（2）使用試薬：Mouse monoclonal antibody isotyping test kit はAbD SEROTEC社より購入した。その他試薬は、試薬特級品を使用した。 【０１４７】
（3）実験方法：ハイブリドーマ培養上清を、1%BSA（w/v）-PBSにより10倍程度希釈し、希釈液の内150μLをdevelopment tubeに加えた。30秒間静置した後、development tubeを軽くvortexし、該tube内のcoloured micro particleを完全に懸濁させた。その後、development tubeにisotyping stripを添加し、5〜10分間静置した。バンドの位置を確認することにより、抗体のクラスを決定した。各抗体のクラスを表Ｘに示す。【０１４８】
【表Ｘ】
2018105560.tif 000002
【０１４９】
＜実施例2-2．抗体のアミノ酸配列の決定＞
実施例1でクローニングしたハイブリドーマのゲノム情報より、抗体のアミノ酸配列を決定した。各抗体における、重鎖可変領域内の各領域（CDR1~3及びFR1~4）のアミノ酸配列を表Ｙに、軽鎖可変領域内の各領域（CDR1~3及びFR1~4）のアミノ酸配列を表Ｚに示す。表Ｙ及び表Ｚ中、アミノ酸は一文字表記で示し、各配列は最上段左側がN末端側であり、括弧内の数字はその配列の配列番号を示し、「全体」は重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の全体の配列（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）を示す。【０１５０】
【表Ｙ】
2018105560.tif 000003
【０１５１】
【表Ｚ】
2018105560.tif 000004
【０１５２】
＜実施例2-3．抗体のKd値の決定＞
実施例1-3で得られたヒトClaudin 5タンパク質発現細胞と、各抗体（1次抗体として）を用いて、実施例1-4と同様にしてFACS解析を行った。得られたデータから、FACS解析で得られたMFIをY軸とした飽和結合曲線を描き、50％飽和結合濃度を求めることによってKd値を算出した。各抗体のKd値を表Ｐに示す。【０１５３】
【表Ｐ】
2018105560.tif 000005
【０１５４】
実施例3．抗体の特異性解析1
実施例1-3と同様にして、pCX4purベクターに、野生型ヒトClaudin 1タンパク質（配列番号79）のコード配列、野生型ヒトClaudin 2タンパク質（配列番号80）のコード配列、野生型ヒトClaudin 3タンパク質（配列番号81）のコード配列、野生型ヒトClaudin 4タンパク質（配列番号82）のコード配列、野生型ヒトClaudin 6タンパク質（配列番号83）のコード配列、野生型ヒトClaudin 7タンパク質（配列番号84）のコード配列、野生型ヒトClaudin 9タンパク質（配列番号85）のコード配列、野生型マウスClaudin 1タンパク質（配列番号86）のコード配列、野生型マウスClaudin 2タンパク質（配列番号87）のコード配列、野生型マウスClaudin 3タンパク質（配列番号88）のコード配列、野生型マウスClaudin 4タンパク質（配列番号89）のコード配列、又は野生型マウスClaudin 5タンパク質（配列番号90）のコード配列からなるDNA断片を挿入してレトロウイルス作製用ベクターを得て、これらと実施例1-3で作製したレトロウイルス作製用ベクターとを用いて、各種Claudinタンパク質発現細胞を作製した。該細胞と、各抗体（抗体濃度10μg/mL、1次抗体として）を用いて、実施例1-4と同様にしてFACS解析を行った。横軸を蛍光シグナル、縦軸を細胞数としたヒストグラムを図４に示す。【０１５５】
図４に示されるように、抗体2B12及び2B1は、Claudin 5以外のヒトClaudin及びマウスClaudinには結合しなかった。抗体4F1は、Claudin 5以外のヒトClaudin及びほぼ全てのマウスClaudinに結合しなかった。このことから、これらの抗体は、ヒトClaudin 5に対する特異性が高いことが示唆された。【０１５６】
実施例4．抗体の特異性解析2
実施例1-3と同様にして、pCX4purベクターに、野生型ラットClaudin 5タンパク質（配列番号91）のコード配列、又は野生型サルClaudin 5タンパク質（配列番号92）のコード配列からなるDNA断片を挿入してレトロウイルス作製用ベクターを得て、これらと実施例1-3及び3で作製したレトロウイルス作製用ベクターとを用いて、各種Claudinタンパク質発現細胞を作製した。該細胞と、各抗体（抗体濃度10 μg/mL、1次抗体として）を用いて、実施例1-4と同様にしてFACS解析を行った。横軸を蛍光シグナル、縦軸を細胞数としたヒストグラムを図５に示す。なお、図６に、各生物種のClaudin 5タンパク質のアミノ酸配列比較図を示す。【０１５７】
図５に示されるように、抗体2B12及び2B1は、マウスClaudin 5及びラットClaudin 5には結合しなかった。一方、抗体4F1は、ヒト、サル、マウス、ラットClaudin 5に結合した。【０１５８】
実施例5．抗体のエピトープ解析1
実施例1-3と同様にして、pCX4purベクターに、野生型ヒトClaudin 5タンパク質と野生型ヒトClaudin 5タンパク質とのキメラタンパク質（1-1-5：ヒトClaudin 5タンパク質において第1細胞外ループがヒトClaudin 1タンパク質の配列に置換されてなるタンパク質（配列番号93）、1-5-5：ヒトClaudin 5タンパク質において第1細胞外ループのN末端側約半分がヒトClaudin 1タンパク質の配列に置換されてなるタンパク質（配列番号94）、5-1-5：ヒトClaudin 5タンパク質において第1細胞外ループのC末端側約半分がヒトClaudin 1タンパク質の配列に置換されてなるタンパク質（配列番号95）、5-5-1：ヒトClaudin 5タンパク質において第2細胞外ループがヒトClaudin 1タンパク質の配列に置換されてなるタンパク質（配列番号96））のコード配列からなるDNA断片を挿入してレトロウイルス作製用ベクターを得て、これらと実施例1-3で作製したレトロウイルス作製用ベクターとを用いて、各種Claudinタンパク質発現細胞を作製した。該細胞と、各抗体（抗体濃度10 μg/mL、1次抗体として）を用いて、実施例1-4と同様にしてFACS解析を行った。横軸を蛍光シグナル、縦軸を細胞数としたヒストグラムを図７に示す。図８に、各キメラタンパク質のアミノ酸配列比較図を示す。【０１５９】
図７より、抗体2B12及び2B1は第2細胞外ループを認識し、抗体4F1は第1細胞外ループ及び第2細胞外ループの両方を認識することが示唆された。【０１６０】
実施例6．抗体のエピトープ解析2
実施例1-3と同様にして、pCX4purベクターに、野生型ヒトClaudin 5タンパク質の点変異体（D68E：ヒトClaudin 5タンパク質においてN末端から68番目のアミノ酸（アスパラギン酸）がグルタミン酸（マウスClaudin 5タンパク質における対応位置のアミノ酸）に変異してなるタンパク質（配列番号97）、T75A：ヒトClaudin 5タンパク質においてN末端から75番目のアミノ酸（トレオニン）がアラニン（マウスClaudin 5タンパク質における対応位置のアミノ酸）に変異してなるタンパク質（配列番号98）、S151T：ヒトClaudin 5タンパク質においてN末端から151番目のアミノ酸（セリン）がトレオニン（マウスClaudin 5タンパク質における対応位置のアミノ酸）に変異してなるタンパク質（配列番号99））のコード配列からなるDNA断片を挿入してレトロウイルス作製用ベクターを得て、これらと実施例1-3及び3で作製したレトロウイルス作製用ベクターとを用いて、各種Claudinタンパク質発現細胞を作製した。該細胞と、各抗体（抗体濃度10μg/mL、1次抗体として）を用いて、実施例1-4と同様にしてFACS解析を行った。横軸を蛍光シグナル、縦軸を細胞数としたヒストグラムを図９に示す。【０１６１】
図９より、抗体2B12及び2B1は第2細胞外ループ内のヒト特異的アミノ酸を認識することが示唆された。【０１６２】
実施例7．抗体のエピトープ解析3
実施例1-3で得られたヒトClaudin 5タンパク質発現細胞又はmock細胞からライセートを調製し、該ライセートを還元条件下のSDS-PAGEにより分離した。1次抗体として実施例1で得られた各抗体（抗体濃度10μg/mL）を用いて、定法に従ってウェスタンブロッティングを行った。1次抗体としては、ポジティブコントロールとしてClaudin 5のC末端を認識する市販のモノクローナル抗体（4C3C2）、及びローディングコントロールとしてβアクチン抗体も用いた。結果を図１０に示す。【０１６３】
図１０より、抗体2B12及び2B1は直鎖状のペプチドを認識し、抗体4F1はClaudin 5の立体構造を認識することが示唆された。【０１６４】
実施例8．抗体のバリア機能制御活性の評価1
底面がポリエチレンテレフタレート製の透過膜（孔径0.4μm、1.6×106pores/cm2）である単層培養用インサート（BD Falcon社製、カタログ番号：353095）を24ウェルプレートの各ウェルにセットし、該膜上でヒト皮膚微小血管内皮細胞（Lonza社製、カタログ番号：CC-2543）を培養し、該膜上に内皮細胞の単層状シートを形成させた。培地に、実施例1で得られた各抗体、又はコントロールIgG若しくはIgMの溶液を10μL添加した。添加後、経皮電気抵抗値の経時変化を、経皮電気抵抗測定装置（cellZscope、nanoAnalytics社製）を用いて測定した。結果を図１１に示す。【０１６５】
図１１より、抗体2B12、2B1、及び4F1は、内皮細胞間の連結を開く作用、すなわち内皮細胞層バリア機能制御活性を有することが示唆された。【０１６６】
実施例9．抗体のバリア機能制御活性の評価2
血液脳関門を模倣した培養物（サル型BBBキット、ファーマコセル社製）を用いて、バリア機能制御活性を評価した。該培養物は、底面がポリエチレンテレフタレート製の透過膜（孔径3.0 μm、1.6×106pores/cm2）であるインサートが培養ウェルにセットされた構造を有しており、インサート底面の上側にサル脳毛細血管内皮細胞の単層状シートが形成されており、該底面の下側にラットペリサイトの細胞シートが形成されており、且つ培養ウェルの底面上にラットアストロサイトの細胞シートが形成されている。【０１６７】
該培養物のインサート側（血管側）の培地に、実施例1で得られた各抗体、C-CPE mt5（ウェルシュ菌エンテロトキシンのC末断片の変異体：ポジティブコントロール）、コントロールIgGの溶液、又は抗体の希釈に用いた液を30μL添加した。添加後、経内皮電気抵抗値の経時変化を、ミリセルERS抵抗値測定システム（Milipore社製）を用いて測定した。結果を図１２に示す。【０１６８】
図１２より、抗体2B12及び2B1は、脳血管内皮細胞間の連結を開く作用、すなわち脳血管内皮細胞層バリア機能制御活性（＝血液脳関門制御活性）を有することが示唆された。【０１６９】
実施例10．抗体のバリア機能制御活性の評価3
実施例9で用いた培養物を用いた。該培養物のインサート側（血管側）の培地に、実施例1で得られた各抗体、C-CPE mt5（ウェルシュ菌エンテロトキシンのC末断片の変異体：ポジティブコントロール）、コントロールIgGの溶液、又は抗体の希釈に用いた液を30μL添加した。添加9時間後、あらかじめ900 μLの培地を入れておいた24ウェルプレート（Greiner社製）（洗浄用プレート）にインサートを移し、インサート側の培地の交換を1度行った。その後、インサート側の培地を吸引し、10 μg/mLのフルオロセインナトリウム（和光純薬社製）を含む培地200 μLを添加し、あらかじめHIENAI plate warmer（コスモバイオ社製）上で 900 μLの培地を入れておいた24ウェルプレート（Greiner社製）（測定用プレート）にインサートを移した。測定用プレートに移してから30分経過したインサートは順次洗浄用プレートに移した。その後、測定用プレート上（脳側）の培地中の蛍光強度をTriSTAR LB 941（Berthold Technologies）により測定した。見かけ上の透過係数（Papp）は、次式により算出した；Papp (cm/s) = （脳側の培地量×脳側に透過したフルオロセインナトリウムの濃度）/（インサートの透過膜の表面積×フルオロセインナトリウムの血管側への添加濃度×実験時間）。結果を図１３に示す。【０１７０】
図１３より、抗体2B12は、脳血管内皮細胞間の連結を開き、物質透過を促進する作用、すなわち脳血管内皮細胞層バリア機能制御活性（＝血液脳関門制御活性）を有することが示唆された。【０１７１】
実施例11．抗体のバリア機能制御活性の評価4
カニクイザルを用いて、抗体の血液脳関門制御活性を評価した。具体的には以下の様にして行った。
＜カニクイザルへの抗体と蛍光色素の投与＞
浜松ファーマリサーチ（静岡）に外部委託して実施した。実験開始1日目、8日目、15日目、22日目にカニクイザル（3年齢、オス）（イブバイオサイエンス、和歌山）の静脈に実施例1で得られた各抗体（1日目：mouse IgG（8 mg/kg）、8日目：2B12（1 mg/kg）、15日目：2B12（3 mg/kg）、22日目：2B12（8 mg/kg））を投与した。投与翌日にケタミン麻酔下で、蛍光色素フルオレセインナトリウム（20 mg/kg）を静脈投与した。フルオレセインナトリウム投与直前、投与10、30、60、120分後に、脳脊髄液と静脈血を採取した。
＜脳脊髄液中の蛍光色素の測定＞
採取した脳脊髄液中の蛍光分子量を蛍光プレートリーダー（TriSTAR LB 941）により測定した。結果を図１４に示す。
＜静脈血（血漿）中の毒性マーカーの測定＞
採取した血漿中の肝毒性マーカー（AST、ALT）、および肝・腎毒性マーカー（BUN）濃度を測定キット（テストワコー（和光純薬））を用いて測定した。結果を表Ｑに示す。
【表Ｑ】
2018105560.tif 000006
＜結果＞
Claudin-5抗体を8mg/kgで投与30分後に、脳脊髄液における蛍光色素の増加が見られた。同量のコントロール抗体投与条件では、この増加が見られなかった。また、蛍光色素が増加した条件において、血液中の肝・腎毒性マーカーの大きな変化は見られなかった。本結果から、Claudin-5抗体は、顕著な毒性なしに、低分子化合物のサル血液脳関門通過を促進することが示された。
【図１】
2018105560.tif 000007
【図２】
2018105560.tif 000008
【図３】
2018105560.tif 000009
【図４】
2018105560.tif 000010
【図５】
2018105560.tif 000011
【図６】
2018105560.tif 000012
【図７】
2018105560.tif 000013
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月25日(2018.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｌａｕｄｉｎ  ５タンパク質の細胞外ドメイン内の領域がエピトープである、抗体。
【請求項２】
前記エピトープが、Ｃｌａｕｄｉｎ  ５タンパク質の、第１細胞外ループＣ末端側内の領域、第２細胞外ループ内の領域、並びに第１細胞外ループ及び第２細胞外ループから形成される立体構造からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記エピトープが、Ｃｌａｕｄｉｎ  ５タンパク質の第２細胞外ループ内の領域である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
前記エピトープが、配列番号７３で示されるアミノ酸配列からなるヒトＣｌａｕｄｉｎ  ５タンパク質においてＮ末端から１５１番目のアミノ酸、又は他のＣｌａｕｄｉｎ  ５タンパク質において該アミノ酸に対応するアミノ酸を含む領域である、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号９９で示されるアミノ酸配列からなるヒトＣｌａｕｄｉｎ  ５タンパク質点変異体Ｓ１５１Ｔに対する結合性が、配列番号７３で示されるアミノ酸配列からなるヒトＣｌａｕｄｉｎ  ５タンパク質に対する結合性の１／５以下である、請求項３又は４に記載の抗体。
【請求項６】
前記エピトープが、Ｃｌａｕｄｉｎ  ５タンパク質の第１細胞外ループ及び第２細胞外ループから形成される立体構造である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項７】
Ｃｌａｕｄｉｎ  ５タンパク質以外のＣｌａｕｄｉｎファミリータンパク質に対する結合性が、Ｃｌａｕｄｉｎ  ５タンパク質に対する結合性の１／５以下である、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。
【請求項８】
下記のいずれかの抗体Ａ〜Ｉからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体：
（Ａ）
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体Ａ；
（Ｂ）
配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体Ｂ；
（Ｃ）
配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体Ｃ；
（Ｄ）
配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体Ｄ；
（Ｅ）
配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３５で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号３７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体Ｅ；
（Ｆ）
配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４３で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号４５で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体Ｆ；
（Ｇ）
配列番号４９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号５３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５４で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５５で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体Ｇ；
（Ｈ）
配列番号５７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５８で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号６１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体Ｈ；並びに
（Ｉ）
配列番号６５で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号６９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体Ｉ。
【請求項９】
抗体Ａ〜Ｂからなる群より選択される、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体である、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含有する、細胞。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体と薬物との複合体。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体、及び請求項１３に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、医薬。
【請求項１５】
血液脳関門制御用である、請求項１４に記載の医薬。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体、及び請求項１３に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、試薬。
【国際調査報告】
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2018105560.tif 000023
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