(57)【要約】  トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料の生産方法を提供する。本発明は、トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料の生産方法であって、該乾燥たばこ材料は、内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物またはその一部から生産されるものである、生産方法である。
2018038092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料の生産方法であって、
内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物またはその一部から、該乾燥たばこ材料を生産することを含み、
該トレオニンアルドラーゼは、以下の（ａ）および（ｂ）の少なくとも何れかである、生産方法：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む遺伝子によってコードされるポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼ
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む遺伝子によってコードされるポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼ。
【請求項２】
トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料の生産方法であって、
内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物またはその一部から、該乾燥たばこ材料を生産することを含み、
該トレオニンアルドラーゼは、以下の（ａ）および（ｂ）の少なくとも何れかである、生産方法：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼ、
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼ。
【請求項３】
上記改変されたタバコ植物における内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下は、該トレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の変異対立遺伝子によるものであるか、または該トレオニンアルドラーゼの発現を抑制するために導入された外因性のポリヌクレオチドによるものである、請求項１または２に記載の生産方法。
【請求項４】
上記変異対立遺伝子は、挿入、欠失、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ノンストップ変異、およびスプライス部位変異からなる群より選択される突然変異を含むものである、請求項３に記載の生産方法。
【請求項５】
上記突然変異は、突然変異誘発、ゲノム編集およびノックアウト法からなる群から選択される方法によって導入された人工突然変異を含むものであるか、天然に存在する自然突然変異を含むものである、請求項４に記載の生産方法。
【請求項６】
上記人工突然変異は、突然変異誘発またはゲノム編集によって導入されたものであり、該突然変異誘発またはゲノム編集は、化学物質または放射線への暴露、CRISPR system、Transcription Activator-Like Effector Nucleases、Zinc Finger Nucleases、Oligonucleotide-directed mutagenesis、Ｔ−ＤＮＡ挿入、およびトランスポゾン挿入からなる群より選択される方法によって行われるものである請求項５に記載の生産方法。
【請求項７】
上記改変されたタバコ植物は、上記トレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子として、対立遺伝子同士で同一種類の変異を有するホモ接合体であるか、または対立遺伝子同士で異なる変異を有するヘテロ接合体である、請求項３〜６の何れか一項に記載の生産方法。
【請求項８】
上記外因性のポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子および共抑制因子分子からなる群より選択される分子を含む、請求項３に記載の生産方法。
【請求項９】
上記改変されたタバコ植物は、内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物の自殖によって育成された、または該改変されたタバコ植物同士の交配によって育成された、タバコ品種の植物である、請求項１〜８の何れか一項に記載の生産方法。
【請求項１０】
上記改変されたタバコ植物は、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択される指標に基づき選抜および育成されたタバコ植物である、請求項９に記載の生産方法：
（ａ）上記トレオニンアルドラーゼの発現の低下
（ｂ）上記トレオニンアルドラーゼの活性の低下
（ｃ）加熱処理した葉におけるトレオニン含量の増強
（ｄ）上記トレオニンアルドラーゼの変異対立遺伝子の有無
（ｅ）上記（ｄ）の変異対立遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー
（ｆ）上記トレオニンアルドラーゼの発現を抑制するために導入された外因性のポリヌクレオチドの有無。
【請求項１１】
上記タバコ植物の一部は、葉、根、茎、わき芽、花、種子、植物培養細胞、カルスおよびプロトプラストからなる群より選択される、請求項１〜１０の何れか一項に記載の生産方法。
【請求項１２】
上記乾燥たばこ材料におけるトレオニン含量の増強は、上記改変されたタバコ植物またはその一部の乾燥によって生じたものである、請求項１〜１１の何れか一項に記載の生産方法。
【請求項１３】
上記乾燥が、熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥および日干し乾燥からなる群より選択される乾燥によって行われる、請求項１２に記載の生産方法。
【請求項１４】
上記改変されたタバコ植物は、ニコチアナ タバカムおよびニコチアナ ルスティカからなる群より選択されるタバコ植物である、請求項１〜１３の何れか一項に記載の生産方法。
【請求項１５】
上記乾燥たばこ材料は、葉材料であって、当該乾燥たばこ材料におけるトレオニン含量は、トレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されていない対照のタバコ植物またはその一部から作製した乾燥たばこ材料のトレオニン含量と比べて２０％以上高い、請求項１〜１４の何れか一項に記載の生産方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５の何れか一項に記載の生産方法によって生産される、乾燥たばこ材料。
【請求項１７】
請求項１６に記載の乾燥たばこ材料から調製した、抽出物。
【請求項１８】
請求項１６に記載の乾燥たばこ材料および／または請求項１７に記載の抽出物を使用して製造された、たばこ製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料の生産方法、乾燥たばこ材料およびその抽出物、およびたばこ製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
トレオニンは、植物において、種々の有用な効果をもたらすアミノ酸であり、例えば、タバコ植物では、当該植物をたばこ原料として喫煙に供した場合にそのフレーバー（香喫味）に大きく貢献する成分の１つである。トレオニン含量の増強されたたばこ原料を生産するための品種の開発はタバコ育種における重要な目標となっている。【０００３】
植物のトレオニン含量を増大させるための公知のアプローチの１つはトレオニン生合成の鍵となる酵素（key酵素）であるアスパラギン酸キナーゼ（Asparatate Kinase、ＡＫ）の改変である。ＡＫはアスパラギン酸に由来するトレオニン等の各種アミノ酸の生合成経路における最初の酵素であるが、通常ＡＫの活性は最終生成産物であるトレオニン、リジンおよびＳ−アデノシルメチオニン（S-adenosylmethionine）からのフィードバック阻害によって厳密に制御されている（非特許文献１および非特許文献２）。【０００４】
こうした最終生成産物であるアミノ酸からのフィードバック阻害を受けないよう改変されたＡＫを発現する植物の葉は、高いレベルのトレオニン濃度を示すことが知られている（非特許文献３および特許文献１）。【０００５】
また、アスパラギン酸からリジンまたはメチオニンの生成に至る生合成経路に障害がある場合も、植物のトレオニン含量が高くなることが知られている。例えば、リジン生合成経路における最初の反応を担う酵素であるジヒドロピコリン酸合成酵素（dihydrodipicolinate synthase（ＤＨＤＰＳ））の機能を喪失したシロイヌナズナのＴ−ＤＮＡ挿入変異体は全身で高いレベルのトレオニン濃度を示す（非特許文献４）。また、メチオニン生合成経路におけるKey酵素であるシスタチオニンγ合成酵素（cystathionine gamma-synthase（ＣＧＳ））の発現をアンチセンス抑制したシロイヌナズナのシュートもトレオニン含量が高い（非特許文献５）。【０００６】
しかし、上記の例に限らず、トレオニン含量を高めるよう改変された植物は深刻な生育不全を伴うことが知られている（非特許文献６、非特許文献７および非特許文献８）。【０００７】
このように、トレオニン含量を高めた植物は、収量の大幅な減少に繋がる受け入れがたい形質を伴う。このことがトレオニン含量の高いたばこ原料等を生産するための品種を開発する上での大きな問題となっている。【０００８】
以上の問題を解決するための１つの方法として、特許文献２には、老化誘導プロモータの下でフィードバック阻害を受けないＡＫを発現させる方法が開示されている。この方法によると老化するまではトレオニン含量が高くならないので、植物の生育不全が改善されることが期待できる。【０００９】
また、以上に示した例とは異なり、トレオニン分解を抑制する改変が植物の葉のトレオニン含量の増大に繋がった例はこれまでに知られていない。例えば、シロイヌナズナはトレオニンからグリシンへの異化反応を担う２種類のトレオニンアルドラーゼ（Threonine Aldolases（ＴＨＡ））を有しているが、主に種子および実生で発現するＴＨＡ１の機能喪失は、種子のトレオニン含量を高めるものの、シュートのトレオニン含量に影響しない。一方、全身の維管束組織で発現するＴＨＡ２の機能喪失変異は致死性のアルビノを引き起こす（特許文献３、非特許文献９および非特許文献１０）。さらに、もう１つのトレオニン分解経路のKey酵素であるトレオニンデアミナーゼ（Threonine Deaminase（ＴＤ））の発現抑制は植物の生育を強く阻害する（非特許文献１１）。【００１０】
このようにトレオニン分解を抑制することによりトレオニンレベルの増大を狙ったアプローチは実用的な品種の開発には繋がりにくいことが知られていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開６７３０８３２号明細書（２００４年５月４日公開）
【特許文献２】国際公開公報２０１０／０１８２３４号明細書（２０１０年２月１８日公開）
【特許文献３】国際公開公報２００５／０４７４７２号明細書（２００６年５月２６日公開）
【非特許文献１】Heldt and Piechulla, Plant biochemistry. Fourth Edition, Academic Press, 291-293 (2010).
【非特許文献２】Jander and Joshi, The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologists, 7 (2009).
【非特許文献３】Frankard et al., Theoretical and Applied Genetics, 82, 273-282 (1991).
【非特許文献４】Craciun et al., FEBS letters, 487, 234-238 (2000).
【非特許文献５】Kim et al. Plant Science, 151(1), 9-18 (2000).
【非特許文献６】Shaul and Galili, Plant Physiol 100: 1157-1163 (1992).
【非特許文献７】Karchi et al., The Plant Journal, 3, 721-727 (1993).
【非特許文献８】Sarrobert et al., The Plant Journal, 24, 357-368 (2000).
【非特許文献９】Jander et al., The Plant Journal, 39, 465-475 (2004).
【非特許文献１０】Joshi et al., Plant Cell. 18, 3564-3575 (2006)
【非特許文献１１】Kang et al., The Plant Cell, 18(11), 3303-3320 (2006).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
依然として、トレオニン含量の高いたばこ原料の生産に適し、かつ、生育不全を伴わない品種の探索または開発が求められている。さらに、このような特性を有する品種を遺伝子組み換え体ではない品種の中から選択可能となることも求められている。【００１３】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、タバコ植物の栽培から収穫、乾燥に至る葉たばこ生産上の不利益を伴わずに、トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料を生産するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記の課題を解決するために、本発明は以下の何れかの一態様を包含する。
＜１＞  トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料の生産方法であって、
内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物またはその一部から、該乾燥たばこ材料を生産することを含み、
該トレオニンアルドラーゼは、以下の（ａ）および（ｂ）の少なくとも何れかである、生産方法：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む遺伝子によってコードされるポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼ
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む遺伝子によってコードされるポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼ。
＜２＞  トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料の生産方法であって、
内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物またはその一部から、該乾燥たばこ材料を生産することを含み、
該トレオニンアルドラーゼは、以下の（ａ）および（ｂ）の少なくとも何れかである、生産方法：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼ、
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼ。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料を生産することができ、当該乾燥たばこ材料、当該乾燥たばこ材料から調製した抽出物ならびに当該乾燥たばこ材料およびその抽出物を使用して生産されたたばこ製品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】アスパラギン酸に由来するアミノ酸の代謝経路を示す図である。
【図２】ニコチアナ タバカムの各種組織におけるＮｔＴＨＡ１遺伝子およびＮｔＴＨＡ２遺伝子の発現を示す。
【図３】ＮｔＴＨＡ１遺伝子の野生型対立遺伝子および変異対立遺伝子の塩基配列のアライメントを示す。
【図４】ＮｔＴＨＡ１遺伝子の野生型対立遺伝子および変異対立遺伝子の翻訳産物のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図５】ＮｔＴＨＡ１遺伝子の二重変異体におけるＮｔＴＨＡ１遺伝子の発現を示す。
【図６】圃場で生育させたＮｔＴＨＡ１遺伝子の二重変異体および対照のタバコ植物を示す。
【図７】熱風乾燥における標準的な乾燥スケジュールを示す。
【図８】ＮｔＴＨＡ１遺伝子の二重変異体および対照のタバコ植物から採取した新鮮な葉のトレオニン含量を示す。
【図９】ＮｔＴＨＡ１遺伝子の二重変異体および対照のタバコ植物から採取した葉を熱風乾燥した場合のトレオニン含量を示す。
【図１０】ＮｔＴＨＡ１遺伝子の二重変異体および対照のタバコ植物から採取した葉を各温度条件で熱風乾燥した場合のトレオニン含量を示す。
【図１１】各種遺伝子型の個体におけるＮｔＴＨＡ１遺伝子の発現を示す。
【図１２】各種遺伝子型の個体に由来する乾葉の遊離トレオニン含量を示す。
【図１３】空気乾燥中のタバコ葉を示す。
【図１４】空気乾燥中のタバコ葉の周辺温度、周辺湿度の推移を示す。
【図１５】空気乾燥中の二重変異体および対照のタバコ葉の遊離トレオニン含量の推移を示す。
【図１６】二重変異体および対照の各種乾葉の遊離トレオニン含量を示す。
【図１７】ゲノム編集したタバコ植物におけるＮｔＴＨＡ１遺伝子の発現レベルを示す。
【図１８】ゲノム編集したタバコ植物の乾葉の遊離トレオニン含量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の実施の形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００１８】
〔用語等の定義〕
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言でき、ヌクレオチドの重合体を意図している。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言でき、特に言及のない限り、デオキシリボヌクレオチドの配列またはリボヌクレオチドの配列を意図している。
【００１９】
本明細書において、「ポリペプチド」は、「タンパク質」とも換言できる。
【００２０】
本明細書において、「ホモ接合体（homozygote）」とはトレオニンアルドラーゼをコードするある遺伝子座が一対の同一の対立遺伝子からなるホモ接合型（homozygous）であるタバコ植物を意図する。「ヘテロ接合体（heterozygote）」とはトレオニンアルドラーゼをコードするある遺伝子座が一対の異なる対立遺伝子からなるヘテロ接合型（heterozygous）であるタバコ植物を意図する。
【００２１】
本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」は、ＡおよびＢとＡまたはＢとの双方を含む概念であり、「ＡおよびＢの少なくとも一方」とも換言できる。
【００２２】
本明細書において、「ポリヌクレオチド同士が相補的な関係にある」とは、「ポリヌクレオチドが有する塩基配列同士を比較したときに相補的な関係にある」ことと同義である。
【００２３】
本明細書において、タバコ植物に対して用いる場合、「対照（コントロール）」とは、本発明に係る内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が、正常な状態から変更されていない、例えば低下するよう改変されていない、タバコ植物を意味している。したがって、対照のタバコ植物は、内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下したタバコ植物との比較のための基準を提供することができる。対照は、野生型の同種のタバコ植物とすることができる。または、対照は、後述する組換え発現ベクターの空ベクターを含むタバコ植物であってもよい。
【００２４】
また、本明細書において、トレオニンアルドラーゼのタンパク質に対して用いる場合、「対照」とは、本発明に係るトレオニンアルドラーゼの活性が、正常な状態から変更されていない、例えば低下するよう改変されていない、トレオニンアルドラーゼのタンパク質を意味している。したがって、対照のトレオニンアルドラーゼのタンパク質は、トレオニンアルドラーゼの活性が低下したトレオニンアルドラーゼのタンパク質との比較のための基準を提供することができる。
【００２５】
さらに、本明細書において乾燥たばこ材料に対して用いる場合、「対照」とは、本発明に係る内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が、正常な状態から変更されていない、例えば低下するよう改変されていない、タバコ植物またはその一部を乾燥させた乾燥たばこ材料を意図する。したがって、対照の乾燥たばこ材料は、内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下したタバコ植物またはその一部を乾燥させて作製した乾燥たばこ材料との比較のための基準を提供することができる。
【００２６】
〔１．トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料の生産方法〕
本発明に係る生産方法について説明すれば以下の通りである。
【００２７】
本発明に係る生産方法は、トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料の生産方法であって、内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物またはその一部から、該乾燥たばこ材料を生産することを含み、該トレオニンアルドラーゼは、以下の（ａ）および（ｂ）の少なくとも何れかである、生産方法である。
【００２８】
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む遺伝子によってコードされるポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼ
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む遺伝子によってコードされるポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼ。
【００２９】
また、本発明に係る生産方法は、トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料の生産方法であって、内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物またはその一部から、該乾燥たばこ材料を生産することを含み、該トレオニンアルドラーゼは、以下の（ａ）および（ｂ）の少なくとも何れかである、生産方法である。
【００３０】
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼ、
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼ。
【００３１】
ここで、上記トレオニンアルドラーゼは、以下に詳述する（遺伝子）の項目に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子がコードするタンパク質である。また、トレオニンアルドラーゼについては以下の（トレオニンアルドラーゼとしてのポリペプチド）の項目に詳細を記載する。
【００３２】
本明細書において、「乾燥たばこ材料」とは、採取されたタバコ植物またはその一部を乾燥させたものをいう。
【００３３】
一実施形態において、本発明の生産方法は、内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物またはその一部を乾燥させる乾燥工程を包含している。乾燥工程については、以下の（乾燥工程）の項目で詳細に記載する。
【００３４】
また、本明細書において「トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料」とは、乾燥工程を経て乾燥させたタバコ植物またはその一部のトレオニン含量が、対照と比べて有意に増強されたことを意図している。
【００３５】
例えば、乾燥させたタバコ植物またはその一部のトレオニン含量が、対照と比較して、乾燥重量あたり２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、さらにより好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは６０％以上、特に好ましくは８０％以上、最も好ましくは、１００％増大している。具体的には、乾燥工程を経て乾燥させた植物またはその一部の乾燥重量あたり、好ましくはトレオニン含量が１００μｇ／ｇ（ＤＷ）以上、より好ましくはトレオニン含量が１２０μｇ／ｇ（ＤＷ）以上、さらにより好ましくはトレオニン含量が１４０μｇ／ｇ（ＤＷ）以上、さらにより好ましくはトレオニン含量が１６０μｇ／ｇ（ＤＷ）以上、さらにより好ましくはトレオニン含量が１８０μｇ／ｇ（ＤＷ）以上、さらにより好ましくはトレオニン含量が２００μｇ／ｇ（ＤＷ）以上、特に好ましくはトレオニン含量が２２０μｇ／ｇ（ＤＷ）以上、最も好ましくは、２４０μｇ／ｇ（ＤＷ）以上である。一例では、乾燥たばこ材料は、葉材料であって、当該乾燥たばこ材料におけるトレオニン含量は、トレオニンアルドラーゼが改変されていない対照のタバコ植物またはその一部から作製した乾燥たばこ材料のトレオニン含量と比べて２０％以上増大している。
【００３６】
ここで乾燥たばこ材料のトレオニン含量とは、乾燥たばこ材料に含まれる遊離トレオニンの含量を意図している。
【００３７】
（タバコ植物またはその一部）
まず、本発明の生産方法に用いられるタバコ植物またはその一部について説明する。本明細書において、「タバコ植物またはその一部」とは、タバコ植物の、植物体全体、植物器官（葉、根、茎、わき芽、花、および種子など）、植物組織片（表皮、師部、柔組織、木部および維管束等）ならびに植物細胞（培養細胞、カルス、およびプロトプラスト等)を包含するものを意味する。好ましくは植物体全体、植物器官（葉、根、茎、わき芽、花、および種子など）ならびに植物組織片（表皮、師部、柔組織、木部および維管束等）から選択されるものであり、より好ましくは、植物体全体、および植物器官（葉、根、茎、わき芽、花、および種子など）等から選択されるものであり、さらに好ましくは、植物体全体および葉から選択されるものであり、最も好ましくは、葉である。なお、本発明の生産方法に用いられる葉は、植物体の茎の上部に位置する葉（上葉）であってもよく、茎の真ん中より上に位置する葉（本葉）であってもよい。または、茎に着いたままの葉であってもよい。
【００３８】
本発明の生産方法に用いられるタバコ植物は、トレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物である。ここで、「発現または活性が低下した」とは、「発現が低下した」または「活性が低下した」ことを指し、遺伝的な要因によって、該トレオニンアルドラーゼの「発現」、または、トレオニンアルドラーゼの「活性」が対照の植物（例えば野生型の同種の植物）と比べて低下していることを意味する。また、「発現または活性が低下した」には「発現または活性が欠損した」ことも包含する。
【００３９】
また、トレオニンアルドラーゼの「発現」とはタバコ植物の細胞において該トレオニンアルドラーゼが翻訳され、タンパク質（トレオニンアルドラーゼタンパク質）として存在することを意味している。
【００４０】
ここで、トレオニンアルドラーゼの「発現が低下した」とは、タバコ植物における、該トレオニンアルドラーゼのタンパク質の存在量が、対照のタバコ植物（例えば野生型の同種の植物）と比べて低下した状態を指す。
【００４１】
ある実施形態において、該トレオニンアルドラーゼの発現の低下は、該トレオニンアルドラーゼタンパク質の存在量が、対照のタバコ植物（例えば野生型の同種の植物）におけるものに対して、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下または１％以下であり得る。
【００４２】
また、トレオニンアルドラーゼの「活性が低下した」とは、該トレオニンアルドラーゼタンパク質そのものの活性レベルが、対照のタバコ植物（例えば野生型の同種の植物）におけるものと比較して、有意に低下した状態を意味している。ある実施形態において、該トレオニンアルドラーゼタンパク質の活性の低下は、該トレオニンアルドラーゼタンパク質の活性レベルが、野生型の同種の植物における対照に対して、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下または１％以下であり得る。
【００４３】
（遺伝子（トレオニンアルドラーゼ遺伝子））
本発明の生産方法に係る遺伝子は、トレオニンからグリシンへの異化反応を触媒するトレオニンアルドラーゼをコードするものである。また、該遺伝子の一例は、トレオニンからグリシンへの異化反応を触媒するトレオニンアルドラーゼをコードしており、当該トレオニンアルドラーゼが活性を有していると、アスパラギン酸由来のアミノ酸生合成経路において、トレオニンからグリシンへの異化反応を触媒するものである。以下、本発明の生産方法に係る遺伝子は、「トレオニンアルドラーゼ遺伝子」としても記載する。
【００４４】
本発明の生産方法に係る遺伝子は、以下の何れかに記載のポリヌクレオチドを含むものである。
【００４５】
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、トレオニンからグリシンへの異化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１〜３５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、トレオニンからグリシンへの異化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）上記（ａ）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、トレオニンからグリシンへの異化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号３に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、トレオニンからグリシンへの異化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００４６】
（ｇ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１〜３５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、トレオニンからグリシンへの異化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００４７】
（ｈ）上記（ｅ）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、トレオニンからグリシンへの異化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００４８】
なお、塩基配列の上記配列同一性は、それぞれ、９１％以上であることが好ましく、９２％以上であることがより好ましく、９３％以上であることがさらにより好ましく、９４％以上であることがさらにより好ましく、９５％以上であることがさらにより好ましく、９６％以上であることがさらにより好ましく、９７％以上であることが特に好ましく、９８％以上または９９％以上であることが最も好ましい。また、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸の個数は、それぞれ１〜３２個であることが好ましく、１〜２８個であることがより好ましく、１〜２５個であることがさらにより好ましく、１〜２１個であることが特に好ましく、１〜１７個であることが最も好ましい。
【００４９】
なお、ストリンジェントな条件下とは、例えば、参考文献：Molecular cloning-a Laboratory manual 2nd edition（Sambrookら、1989）に記載の条件等が挙げられる。ストリンジェントな条件下とは、より具体的には例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハートおよび１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。なお、このポリヌクレオチドは、上記（ａ）または（ｅ）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列に対して９１％以上であることが好ましく、９２％以上であることがより好ましく、９３％以上であることがさらにより好ましく、９４％以上であることがさらにより好ましく、９５％以上であることがさらにより好ましく、９６％以上であることがさらにより好ましく、９７％以上であることが特に好ましく、９８％以上または９９％以上であることが最も好ましい。
【００５０】
本発明に係るトレオニンアルドラーゼ遺伝子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。本発明に係るポリヌクレオチドの一例である、配列番号１に示す塩基配列は、配列番号２に示すポリペプチドをコードするコーディング領域（ＣＤＳ）である。本発明に係るポリヌクレオチドの一例である、配列番号３に示す塩基配列は、配列番号４に示すポリペプチドをコードするコーディング領域（ＣＤＳ）である。本発明に係るトレオニンアルドラーゼ遺伝子は、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列等の付加的な配列を含むものであってもよい。
【００５１】
トレオニンアルドラーゼ遺伝子の例としては、タバコ植物であるニコチアナ タバカムのＳゲノムに含まれるＮｔＴＨＡ１ｓ遺伝子（配列番号１）、Ｔゲノムに含まれるＮｔＴＨＡ１ｔ遺伝子（配列番号３）等を挙げることができる。ニコチアナ タバカムは異質４倍体であり、これらの遺伝子は互いに祖先種ゲノムに由来するオルソログ遺伝子である。
【００５２】
一例において、本発明の生産方法に係る遺伝子は、上記の（ａ）〜（ｄ）の何れかに記載のポリヌクレオチド、および（ｅ）〜（ｈ）の何れかに記載のポリヌクレオチドの両方であるか、少なくとも何れか一方を含むものである。
【００５３】
本発明に係るトレオニンアルドラーゼ遺伝子の発現部位および発現する生育段階は特に限定されない。一例として、対照植物において本発明に係るトレオニンアルドラーゼ遺伝子は、植物体の全体において発現しており、少なくとも葉において発現するものであること、および乾燥工程において発現するものであることが好ましい。
【００５４】
（トレオニンアルドラーゼとしてのポリペプチド）
本発明の生産方法に係るポリペプチドは、上記（遺伝子）の欄に記載した遺伝子の翻訳産物であり、少なくともトレオニンからグリシンへの異化反応を触媒する活性を有する植物のトレオニンアルドラーゼである。また、「トレオニンからグリシンへの異化反応を触媒するトレオニンアルドラーゼ」は、一例としては、Ｌ−トレオニンアルドラーゼ（EC 4.1.2.5）である。Ｌ−トレオニンアルドラーゼは、Ｌ-トレオニンからグリシンとアセトアルデヒドとを生成する反応を触媒するものである。
【００５５】
本発明の生産方法に係るトレオニンアルドラーゼとしてのポリペプチドは、より具体的には、以下の（ａ）〜（ｄ）の少なくとも何れかである。なお、このポリペプチドは遺伝子の翻訳産物であって、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」等の意味については上記（遺伝子）の欄の記載をそのまま参照してよい。
【００５６】
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼとしてのポリペプチド
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１〜３５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼとしてのポリペプチド
（ｃ）上記（ａ）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、トレオニンアルドラーゼとしてのポリペプチド
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリチペプチドからなるトレオニンアルドラーゼとしてのポリペプチド
（ｅ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１〜３５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼとしてのポリペプチド
（ｆ）上記（ｄ）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、トレオニンアルドラーゼとしてのポリペプチド。
【００５７】
なお、アミノ酸配列の配列同一性は、それぞれ９１％以上であることが好ましく、９２％以上であることがより好ましく、９３％以上であることがさらにより好ましく、９４％以上であることがさらにより好ましく、９５％以上であることがさらにより好ましく、９６％以上であることがさらにより好ましく、９７％以上であることが特に好ましく、９８％以上または９９％以上であることが最も好ましい。なお、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸の個数は、１〜３２個であることが好ましく、１〜２８個であることがより好ましく、１〜２５個であることがさらにより好ましく、１〜２１個であることがさらにより好ましく、１〜１７個であることが特に好ましい。
【００５８】
一例において、本発明の生産方法に係るポリペプチドは、上記（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のポリペプチドと（ｄ）〜（ｆ）の何れかに記載のポリペプチドとの両方であるか、（ａ）〜（ｆ）の何れかのポリペプチドである。
【００５９】
（本発明の生産方法において用いられるタバコ植物の態様）
本発明の生産方法において用いられるタバコ植物は、内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物である。
【００６０】
なお、「内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下」は、上記のタバコ植物が該トレオニンアルドラーゼをコードする内在性遺伝子として変異対立遺伝子（mutant allele）を有することによって生じているものであるか、または該トレオニンアルドラーゼをコードする内在性の遺伝子の発現を抑制するために上記タバコ植物に導入された外因性のポリヌクレオチドによって生じているものである。
【００６１】
すなわち、一実施形態において、本発明の生産方法に用いられるタバコ植物は、該トレオニンアルドラーゼをコードする内在性の遺伝子として変異対立遺伝子を有するか、または該遺伝子の発現を抑制するために導入された外因性のポリヌクレオチドを有するものである。
【００６２】
ここで、本発明の生産方法において用いられるタバコ植物が有する、上記トレオニンアルドラーゼに係る変異対立遺伝子は、挿入、欠失、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ノンストップ変異およびスプライス部位変異からなる群より選択される突然変異を含むものであり得る。上記突然変異の種類は対照の植物が有する野生型対立遺伝子との比較により明らかにすることができる。また、当該変異対立遺伝子は、突然変異誘発、ゲノム編集およびノックアウト法からなる群より選択されるいずれかの方法によって導入された人工突然変異を含むものであるか、天然に存在する自然突然変異を含むものである。
【００６３】
該突然変異誘発、ゲノム編集またはノックアウト法の方法としては、化学物質または放射線への暴露、CRISPR system、Transcription Activator-Like Effector Nucleases、Zinc Finger Nucleases、Oligonucleotide-directed mutagenesis、Ｔ−ＤＮＡ挿入、およびトランスポゾン挿入などが挙げられる。突然変異誘発またはゲノム編集またはノックアウト法の詳細については、以降の（トレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下したタバコ植物の作出）において詳細に記載する。
【００６４】
また、「自然突然変異」とは、人為的な操作によらず、自然界の放射線および遺伝子複製等の自然要因が原因で生じる突然変異を指す。
【００６５】
なお、上記変異対立遺伝子は、一実施形態において、機能欠失型対立遺伝子(loss of function allele)と同義である。
【００６６】
本発明の生産方法に用いられるタバコ植物は、トレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を含む染色体領域の大規模な欠失を含むものであってもよい。
また、改変されたタバコ植物におけるトレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下は、恒常的に生じるものであっても、断続的に生じるものであってもよく、一過性のものであってもよい。例えば、タバコ植物が所定の温度以上の温度に曝露されたときにのみ、当該トレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下が生じるものであってもよい。そのようなトレオニンアルドラーゼとして加熱条件下で失活する温度感受性変異を含むケースが挙げられる。
【００６７】
さらに、本発明のタバコ植物には、内在性のトレオニンアルドラーゼの発現を抑制するために導入された外因性ポリヌクレオチドを含む植物細胞、該植物細胞を含む植物体、該植物体の形質を有するタバコ品種、およびそれらのクローン等も含まれる。つまり、本発明の植物には、形質転換処理を施した再分化当代である「Ｔ０世代」、Ｔ０世代の植物の自殖種子である「Ｔ１世代」などの後代植物、およびそれらを片親にして交配した雑種植物またはその後代植物、内在性のトレオニンアルドラーゼの発現を抑制するために導入された、外因性ポリヌクレオチドを含むベクター等のコンストラクトを含有する植物またはその後代植物を含む。
【００６８】
本明細書におけるタバコの「品種（ｖａｒｉｅｔｙ）」とは、同じ種の他の植物から区別できる少なくとも１つの特色に関して、個体間での遺伝的変動をほとんど呈さないタバコ植物のある群を指す。該品種は通常の繁殖法によって維持可能である。さらに、本発明の生産方法において使用されるタバコの品種は内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下していることを特色として有する。本明細書においては品種（ｖａｒｉｅｔｙ）」はｃｕｌｔｉｖａｒまたはｌｉｎｅとも換言することができる。
【００６９】
なお、タバコ植物における、トレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下という形質（以下、単に「形質」とも記載する）がトレオニンアルドラーゼの変異対立遺伝子によって付与された形質である場合、本明細書における「タバコ品種」とは、通常はインブレッド品種またはＦ１ハイブリッド品種であり得る。しかし、上記の形質を有する限りにおいては、必ずしも一般的なインブレッド品種またはＦ１ハイブリッド品種のようにその他の形質おいても均質性を示す必要はない。上記タバコ品種は上記形質を有するタバコ植物の自殖によって、または上記形質を有する２つの異なるタバコ植物の交配によって作出することができる。本発明の生産方法に用いられるタバコ植物は、商業的に利用される場合、トレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下を特色として有するタバコ品種の植物であることが特に好ましい。
【００７０】
トレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下したタバコ植物は該特色を有するタバコ植物の自殖によって、または該特色を有する２つの異なるタバコ植物の交配によって、種子として繁殖させることができる。該種子から生育したタバコ植物は通常、上記の特色を具備する。上記タバコ植物は、組織または細胞からカルス誘導等の組織培養法により器官または個体を再生させることによっても繁殖させることもできる。
【００７１】
（トレオニンアルドラーゼ遺伝子の遺伝子型）
タバコ植物における内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下が、該変異対立遺伝子によるものである場合、該タバコ植物は、トレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子座についてみれば、対立遺伝子同士で同一種類の変異を有するホモ接合体であるか、または対立遺伝子同士で異なる変異を有するヘテロ接合体であり得る。
【００７２】
また、遺伝子の変異は、例えば、１つの遺伝子座における１つの領域において生じているものであってもよく、１つの遺伝子座における複数の異なる領域において生じているものであってもよい。また、１つの遺伝子座における複数の領域において変異が生じている場合、異なる種類の変異がそれぞれの変異領域において生じていてもよい。なお、係る変異は、相同染色体における一対のトレオニンアルドラーゼ対立遺伝子の少なくとも一方に生じていればよい（すなわちヘテロ接合型）が、双方に生じていることが好ましい。
【００７３】
なお、タバコ植物がニコチアナ タバカムのような異質４倍体である場合は、２種のオルソログ遺伝子について少なくとも一方の遺伝子座が、一対の対立遺伝子同士で同一種類の変異を有するホモ接合型であるか、一対の対立遺伝子同士で異なる変異を有するヘテロ接合型であることが好ましい。
【００７４】
さらに、これら異質４倍体においてはトレオニンアルドラーゼの２つの遺伝子座における４つの遺伝子のコピーのすべてが変異対立遺伝子であることが特に好ましい。
【００７５】
本発明の製造方法に係るタバコ植物の一例は、配列番号１に記載されるＮｔＴＨＡ１ｓ遺伝子および配列番号３に記載されるＮｔＴＨＡ１ｔ遺伝子の両方がナンセンス変異を有しており、これらの変異ＮｔＴＨＡ１ｓ遺伝子（例えば、配列番号３３または配列番号３４）と変異ＮｔＴＨＡ１ｔ遺伝子（例えば、配列番号３５）との両方の変異ＮｔＴＨＡ１遺伝子がそれぞれホモ接合型であるニコチアナ タバカムの二重変異体が挙げられる。本発明の製造方法に係るタバコ植物の別の一例は、配列番号１に記載されるＮｔＴＨＡ１ｓ遺伝子および配列番号３に記載されるＮｔＴＨＡ１ｔ遺伝子の両方に１塩基挿入を有しており、これらの変異ＮｔＴＨＡ１ｓ遺伝子（例えば、配列番号４９）と変異ＮｔＴＨＡ１ｔ遺伝子（例えば、配列番号５０または配列番号５１）との両方の変異ＮｔＴＨＡ１遺伝子がそれぞれホモ接合型であるニコチアナ タバカムの二重変異体が挙げられる。このようなタバコ植物は一般に交配または選抜などの人為的な操作を経て漸く得ることが可能である。
【００７６】
また、本発明に係る内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物は、フィードバック阻害ヘの感受性の低下したアスパラギン酸キナーゼ（ＡＫ）を発現するものであってもよい。本発明の生産方法では、このようなタバコ植物またはその一部を用いることによってトレオニン含量がさらに増強された乾燥たばこ材料を生産し得る。
【００７７】
一実施形態において、本発明に係るタバコ植物は、内在性のＡＫ遺伝子に変異が導入され、フィードバック感受性の低下したＡＫタンパク質を発現している。あるいは、タバコ植物は、適切な組換え発現ベクターによって植物に導入された変異型ＡＫ遺伝子をコードするポリヌクレオチドによって発現したフィードバック感受性の低下したＡＫタンパク質を有するものであってもよい。よって、本発明に係るタバコ植物の別の一例は、内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されており、且つ、フィードバック感受性の低下したＡＫを発現するように改変されているタバコ植物であり得る。
【００７８】
なお、ＡＫの発現に用いる組換え発現ベクターは、以下の＜組換え発現ベクターおよび形質転換体＞に記載のうちの好適なものを用いることができる。
【００７９】
一実施形態において、タバコ植物において発現されるフィードバック感受性の低下したＡＫタンパク質は、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有している。当該アミノ酸配列は、野生型タバコ植物のＡＫタンパク質における４０５番目のロイシンがフェニルアラニンに置換されている。また、タバコ植物において発現されるフィードバック感受性の低下したＡＫタンパク質は、野生型タバコ植物のＡＫタンパク質の有するアミノ酸配列における複数のアミノ酸において置換等の変異を有していてもよい。
【００８０】
（判定方法または選抜方法を用いて得られたタバコ植物）
一実施形態において、本発明の生産方法に用いるのに好適なタバコ植物であるか否かは、以下の（ａ）または（ｂ）に示される内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下を指標として判定することができる。また、別の実施形態において、本発明の生産方法に用いるのに好適なタバコ植物はトレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下と関連した（ａ）〜（ｅ）のいずれかに示される指標に基づく選抜を経て育成することができる。
【００８１】
（ａ）トレオニンアルドラーゼの発現の低下
（ｂ）トレオニンアルドラーゼの活性の低下
（ｃ）加熱処理した葉におけるトレオニン含量の増強
（ｄ）トレオニンアルドラーゼの変異対立遺伝子の有無
（ｅ）上記（ｄ）の変異対立遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー（連鎖ＤＮＡマーカー）
（ｆ）上記トレオニンアルドラーゼ遺伝子の発現を抑制するために導入された外因性のポリヌクレオチドの有無。
【００８２】
＜本発明の生産方法に用いるのに好適なタバコ植物であることを判定するための方法＞
一実施形態において、本発明の生産方法に、あるタバコ植物またはその一部を原料として適用するに当たり、候補のタバコ植物のトレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下を確認することによって、当該タバコ植物またはその一部が本発明の生産方法に用いるのに好適なタバコ植物であるか否かを判定することができる。
【００８３】
以下に該判定方法について説明する。
【００８４】
該判定方法は、内在性のトレオニンアルドラーゼの発現が低下しているか、該トレオニンアルドラーゼタンパク質そのものの活性が低下しているかを確認することを包含する。一実施形態において、判定は、（ａ）内在性トレオニンアルドラーゼの発現の低下または（ｂ）内在性トレオニンアルドラーゼの活性の低下を指標として行われる。上記判定を行うための具体的手段は特に限定されないが、分子遺伝学的な手法を用いた方法および生化学的な手法を用いた方法等が挙げられる。さらに、該判定方法の一実施形態として、上記（ａ）または（ｂ）の確認に加えて、（ｃ）加熱処理した葉におけるトレオニン含量の増強の有無の確認をさらに含んでいてもよい。
【００８５】
１．トレオニンアルドラーゼの発現が低下していることの確認
トレオニンアルドラーゼの発現の低下は、タバコ植物またはその一部におけるトレオニンアルドラーゼタンパク質の存在量を検査することによって確認することができる。該タンパクの存在量の検査は、例えば、抗体を用いたウェスタン分析またはＥＬＩＳＡ分析等によって実施することができる。必要に応じて基準となる該タンパクの存在量と比較して、該タンパク質の存在量が低減されているか否か検査する。また、基準となるタンパク質の存在量とは、例えば、対照となる同種のタバコ植物（例えば、トレオニンアルドラーゼの発現または活性が、正常な状態から変更されていない、例えば低下するよう改変されていないタバコ植物）におけるトレオニンアルドラーゼタンパク質の存在量を指す。
【００８６】
一般的に、タンパク質の存在量の低下は、遺伝子発現の低下と関連づけることが可能である。遺伝子の変異による発現量の低下は、多くの場合、ｍＲＮＡの品質監視を担うnonsense-mediated mRNA decay （ＮＭＤ）、nonstop decay （ＮＳＤ）、およびno go decay（ＮＧＤ）などの機構による変異ｍＲＮＡの分解に基づく。よって、トレオニンアルドラーゼタンパク質の存在量の低下の確認は、トレオニンアルドラーゼ遺伝子の発現の低下を確認することによって行うことも可能である。タンパク質の量の低下に繋がる遺伝子発現の低下の確認はノーザン分析、ＲＴ−ＰＣＲ分析等による特異的なプローブまたはプライマーを用いた転写産物解析により該遺伝子発現を検査することによって実施できる。
【００８７】
また、上述のトレオニンアルドラーゼの発現の低下の確認については、必要に応じて、特定の生育段階において、且つ部位特異的に実施してもよい。
【００８８】
２．トレオニンアルドラーゼの活性が低下していることの確認
トレオニンアルドラーゼの活性の低下は、例えば、以下の２−１〜２−２の方法によって確認することができる。
【００８９】
２−１．グリシン要求性の酵母を用いた相補試験
あるタバコ植物が有するトレオニンアルドラーゼタンパク質そのものの酵素活性の低下は該植物から単離したトレオニンアルドラーゼ遺伝子のｃＤＮＡを用いた相補性試験により明らかにすることができる。相補試験において、グリシン要求性酵母株であるＹＭ１３(gly1 shm1 shm2）がホストとして好適に利用することができる（Monschauet al. 1997, FEMS microbiology letters 150: 55-60., Joshi et al. 2006. The Plant Cell 18: 3564-3575.）。単離したトレオニンアルドラーゼ遺伝子の翻訳産物が酵素活性を有する場合は機能相補するため、この遺伝子を導入された宿主はグリシンを含まない培地で生育することができる。試験の容易さの観点からは、下記のポリペプチドの活性の測定よりも、酵母を用いた相補試験を行うことが一般的である。
【００９０】
２−２．ポリペプチドの活性測定
対象となるタバコ植物またはその一部から、トレオニンアルドラーゼ遺伝子がコードするポリペプチドを単離する。または対象となる植物におけるトレオニンアルドラーゼ遺伝子のクローンを発現ベクターに導入して、宿主細胞に導入することにより、一過的にポリペプチドを発現させる。これを培養、抽出および精製したものを用いて、トレオニンを基質としたグリシンへの異化反応を触媒する酵素活性の有無を検査し、当該酵素活性が無いか、当該酵素活性が、対照となる同種の植物（例えば、野生型のトレオニンアルドラーゼ遺伝子のホモ接合体）と比較して低下している場合に、トレオニンアルドラーゼの活性が低下しているとみなす。
【００９１】
上述のポリペプチドの発現に用いる組換え発現ベクターおよび宿主細胞としては、（組換え発現ベクターおよび形質転換体）の項目において記載のものおよび当技術分野で公知のものが好適に用いられる。
【００９２】
また、ポリペプチドの合成、抽出および精製方法は、特に限定されず、公知の方法が好適に用いられる。ポリペプチドの合成方法の一例として、アグロバクテリウムを介して、タバコ植物の葉などに一過的発現させる方法、および大腸菌にポリペプチドの発現ベクターを形質転換し、当該大腸菌を培養することによってポリペプチドを発現させる方法等が挙げられる。
【００９３】
また、トレオニンを基質としたグリシン合成を触媒する酵素活性の測定方法として、例えば、上述の方法によって得られたポリペプチドに対し、トレオニンを添加して、インキュベーションした反応液における、アセトアルデヒドを定量する方法が挙げられる（参考文献：Liu et al. 1998. European Journal of Biochemistry, 255, 220-226.）。
【００９４】
また、別の一態様では、上述の方法によって得られたポリペプチドに対し、トレオニン（例えば、Ｌ−Ｔｈｒ）を加えて、インキュベーションした反応液を、精製しＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に供する方法が挙げられる。
【００９５】
上述の物質の量の測定方法としては、質量分析装置を用いた測定、ＨＰＬＣを用いた測定等の方法が挙げられる。なかでも、感度および精度に優れているという点において、質量分析装置を用いた測定方法がましい。測定に用いる質量分析装置としては、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳおよびＧＣ／ＭＳ等が挙げられる。
【００９６】
２−３．トレオニン含量の測定
また、上記の＜２−１＞および＜２−２＞に加え、本発明の生産方法に用いるのに好適なタバコ植物であるか否かの判定は、そのタバコ植物またはその一部を加熱処理し、加熱処理後のタバコ植物またはその一部が含有する遊離トレオニンの量を測定し、測定結果を確認することによって簡単に行うことができる。例えば、加熱処理した後のタバコ植物またはその一部が含有する遊離トレオニンの量が、対照の植物またはその一部を加熱処理した場合と比べて、有意に多いか否かを確認することによって好適なタバコ植物であるか否かが判定できる。
【００９７】
有意に多いとは、好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、７５％以上、１００％以上多いことを意図とする。
【００９８】
上述のトレオニン含量の測定のために行われる上記タバコ植物またはその一部の加熱処理は、例えば、タバコ植物から切り取った葉を所定の温度および湿度の条件下に、一定時間以上暴露することによって行うことができる。一例として、温度３６〜４０および湿度８０〜９０％の条件下に、２４〜４８時間曝露する方法が挙げられる。
【００９９】
＜本発明の生産方法に好適なタバコ植物を育成するための選抜方法＞
一実施形態において、本発明の生産方法に用いられるのに好適なタバコ植物は、上述した（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択される指標に基づいて選抜を行うことを包含する選抜方法を経て育成されたタバコ植物であり得る。
【０１００】
上述の通り、本発明の生産方法に用いるのに好適なタバコ植物であるか否かは、（ａ）トレオニンアルドラーゼの発現の低下または（ｂ）トレオニンアルドラーゼの活性の低下を指標として判定することが可能である。
【０１０１】
ここで、上記（ａ）トレオニンアルドラーゼの発現の低下または（ｂ）トレオニンアルドラーゼの活性の低下は、本発明の生産方法に用いるのに好適なタバコ植物を育成する過程において行われる選抜の指標として用いてもよい。例えば、検定交雑（test cross）から得られた植物における（ａ）トレオニンアルドラーゼの発現の低下または（ｂ）トレオニンアルドラーゼの活性の低下を指標とすることで、選抜を効果的に実施することも可能である。（ａ）トレオニンアルドラーゼの発現の低下または（ｂ）トレオニンアルドラーゼの低下を確認するための具体的な検査の手法は、上記の判定方法において記載した通りである。
【０１０２】
さらなる実施形態において、本発明の生産方法に用いるのに好適なタバコ植物は、（ｄ）トレオニンアルドラーゼの変異対立遺伝子の有無、（ｅ）上記（ｄ）の変異対立遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー、または（ｆ）トレオニンアルドラーゼ遺伝子の発現を抑制するために導入された外因性のポリヌクレオチドの有無を指標とした選抜を経て育成されたものであり得る。つまり、本発明の生産方法に用いられるタバコ植物は、例えば、以下の１〜３の何れかの手法によって実施される選抜を通して育成されたタバコ植物であり得る。
【０１０３】
１．トレオニンアルドラーゼの変異対立遺伝子の有無を指標とした選抜
トレオニンアルドラーゼ遺伝子における、該トレオニンアルドラーゼの発現の低下または活性の低下を生じさせる変異を検出する。該変異の一例は挿入、欠失、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ノンストップ変異、およびスプライス部位変異からなる群より選択される突然変異である。該変異の検出には様々な方法が利用可能であるが、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法またはリアルタイムＰＣＲを利用した方法（Cycling Probe Method, TaqMan（登録商標） SNP Genotyping Assays）などが好適に利用される。トレオニンアルドラーゼの遺伝子座の遺伝子型は、交配または選抜などによる一般的な育種プログラムにおける育種過程を通して、常にモニターすることが可能である。したがって、トレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下したタバコの品種は、トレオニンアルドラーゼの変異対立遺伝子を利用した育種プログラムにおいて、変異対立遺伝子の変異そのものを指標とすることによって、容易に選抜し、育成することが可能である。
【０１０４】
２．トレオニンアルドラーゼの変異対立遺伝子の発現を抑制するために導入された外因性のポリヌクレオチドの有無を指標とした選抜
ある局面においては、トレオニンアルドラーゼの発現の低下は、トレオニンアルドラーゼ遺伝子の発現を抑制するために導入された外因性のポリヌクレオチドによるものが含まれる。そのような場合はトレオニンアルドラーゼ遺伝子の発現を抑制するために導入された外因性のポリヌクレオチドの有無を指標として利用することによって、該形質を有するタバコ植物を選抜および育成することができる。あるいは、該外因性ポリヌクレオチドと共に植物に導入されたコンストラクトの構成要素（プロモータ配列など）も選抜の指標として利用してもよい。
【０１０５】
３．連鎖ＤＮＡマーカーを指標とした選抜
トレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下と関連するトレオニンアルドラーゼの変異対立遺伝子の有無を、当該変異対立遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーを利用して、検査することも可能である。上記の連鎖ＤＮＡマーカーは、一例において、トレオニンアルドラーゼ遺伝子が座乗する位置から約１０ｃＭ以内に位置しており、好ましくは約５ｃＭ以内に位置しており、より好ましくは約２ｃＭ以内に位置しており、さらに好ましくは約１ｃＭ以内に位置している。
【０１０６】
タバコ植物の選抜するにあたり、marker assisted selection （ＭＡＳ）に利用可能な多型性の連鎖ＤＮＡマーカーとしては、ＳＮＰ、ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰおよびｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ等が挙げられる。
【０１０７】
以上のことから、本発明に係る生産方法に用いられるトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下しているタバコ植物は、上記の判定方法を行って、本発明の生産方法に適用できるか否かあらかじめ判定されたものであってもよく、且つ／または上述のタバコ植物の選抜を経て育成されたタバコ品種の植物であってもよい。
【０１０８】
（トレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下したタバコ植物の作出）
本発明に係るトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物は、以下に記載する方法で作出されたタバコ植物を含む。
【０１０９】
ここで、トレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下しているタバコ植物の作出方法としては、トレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の変異対立遺伝子を利用する方法および外因性のポリヌクレオチドを導入することによって遺伝子の発現を抑制する方法が挙げられる。
【０１１０】
なお、上述のように、トレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下は、遺伝的な要因によって生じる遺伝形質であるので、本形質を有するタバコ植物は交配または選抜などによる一般的な育種プログラムの中で作出することが可能である。
【０１１１】
１．変異対立遺伝子を利用する方法
トレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下に繋がるトレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の変異対立遺伝子は、挿入、欠失、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ノンストップ変異、およびスプライス部位変異からなる群より選択される突然変異を含むものである。
【０１１２】
上記突然変異は、通常、トレオニンアルドラーゼタンパク質をコードするアミノ酸配列を変化させる変異を意図するが、トレオニンアルドラーゼ遺伝子の転写活性を抑制させる変異であってもよい。そのような変異としては、例えば、転写調節配列（プロモータ配列またはエンハンサ配列など）における変異が挙げられる。
上記変異対立遺伝子は、変異原処理、ゲノム編集およびノックアウト法から選択されるいずれかの方法によって生じる人工突然変異を含むものであるか、天然に存在する自然突然変異を含むものである。変異原処理の具体例としては、ＥＭＳ（ethyl methane sulfonate：エチルメタンスルホン酸）処理、電磁波、紫外線、Ｘ線、γ線、粒子線、中性子線、α線およびβ線などの各種放射線の照射、または重イオンビーム等の照射等の方法が挙げられる。
【０１１３】
変異原処理によってトレオニンアルドラーゼ遺伝子に変異が導入された植物は、例えば、TILLING（Till et al.，2003）またはAmplicon Sequence解析などの方法によって変異体集団の中から探索することができる。また、トレオニンアルドラーゼ遺伝子に自然突然変異を含むタバコ植物も同様の方法によってタバコの遺伝資源のコレクションの中から探索することができる。そのようなタバコ植物が保持するトレオニンアルドラーゼ遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ等）の塩基配列を解析することによって、導入された変異の内容を明らかにすることができる。さらに、該変異対立遺伝子がトレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下に有用であるか否かの推定に役立つ。
【０１１４】
例えば、ＥＭＳ処理で得られたナンセンス変異遺伝子のポリヌクレオチドとして、本明細書の実施例において得られたタバコ由来の配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１１５】
ゲノム編集の具体例としては、ＴＡＬＥＮ（Transcription Activator-Like Effector Nuclease）法、ＺＦＮ（Zinc Finger Nuclease）法およびＣＲＩＳＰＲ(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) ｓｙｓｔｅｍ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ1など）等のゲノム編集技術が挙げられる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集で得られた１塩基挿入変異遺伝子のポリヌクレオチドとして、本明細書の実施例で得られたタバコ由来の配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１１６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍでは、ゲノム上のＸＧＧのすぐ上流にある塩基配列およびその相補的な配列が、ガイドＲＮＡによって認識され、当該塩基配列内においてCas9によって切断を受ける。ガイドＲＮＡによって認識される当該塩基配列は、例えば、配列番号１もしくは３に記載の塩基配列を有しているポリヌクレオチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド、または配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部のうち、ＸＧＧのすぐ上流にある連続する１０塩基以上、好ましくは１７塩基以上、より好ましくは２０塩基以上である。
【０１１７】
ＴＡＬＥＮでは、二量体を形成する人工ヌクレアーゼの一対のＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、Ｆｏｋ  Ｉ切断ドメインの両端に、５〜７塩基のスペーサを介して存在する塩基配列と結合する。当該ＤＮＡ結合ドメインは、３３〜３４アミノ酸残基を繰り返し単位（モジュール）として、結合する塩基数とモジュールから構成されている。ＤＮＡ結合ドメインによって結合される塩基配列は、配列番号１もしくは３に記載の塩基配列を有しているポリヌクレオチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド、または配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部のうち、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に、５〜７塩基のスペーサを介して存在する、それぞれ連続する６塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは２１塩基以上である。
【０１１８】
ＺＦＮでは、ＴＡＬＥＮと同様に、二量体を形成する人工ヌクレアーゼの一対のＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に、５〜７塩基のスペーサを介して存在する塩基配列と結合する。当該ＤＮＡ結合ドメインは、複数のジンクフィンガーモジュールから構成されている。当該塩基配列は、配列番号１もしくは３に記載の塩基配列を有しているポリヌクレオチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド、または配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部のうち、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に、５〜７塩基のスペーサを介して存在する、それぞれ連続する９塩基以上、好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１８塩基以上である。
【０１１９】
また、ノックアウト法の具体例としては、レトロトランスポゾン等の各種トランスポゾン、もしくはＴ−ＤＮＡなどを用いた遺伝子破壊法が挙げられる。当該手法の具体例は、タバコのレトロトランスポゾンｔｎｔ１もしくは他の植物におけるトランスポゾン、またはアグロバクテリウムのＴ１プラスミドにおけるＴ−ＤＮＡをタバコ植物体に導入する方法である。
【０１２０】
２．外因性のポリヌクレオチドを導入することによって遺伝子の発現を抑制する方法
次に、外因性のポリヌクレオチドを導入することによってトレオニンアルドラーゼ遺伝子の発現を抑制したタバコ植物の作出方法について説明する。
【０１２１】
外因性ポリヌクレオチドは、トレオニンアルドラーゼ遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドであり得る。例えば、当該ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを植物に導入することによって作出する。かかるコンストラクトは、例えば、遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを含む発現カセットを備えたベクター等である。
【０１２２】
外因性のポリヌクレオチドを植物に導入することによって内在性のトレオニンアルドラーゼ遺伝子の発現を抑制する手法としては、例えば、ＲＮＡ干渉法、またはアンチセンスＲＮＡ法、共抑制法、キャリア（抗体またはペプチド等）と核酸との複合体を利用する方法、核酸キャリア（生体内シグナルペプチド等の機能性ペプチド等）を用いた細胞への核酸の導入方法およびデコイ核酸による転写制御因子の阻害等の手法が挙げられる。つまり、上記遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドは、これらの手法において用いられるヌクレオチド分子であってアンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子および共抑制因子分子からなる群より選択される分子であることが好ましい。
【０１２３】
ここで、アンチセンス法とは、目的遺伝子から転写されたｍＲＮＡと相補的なアンチセンスＲＮＡを発現させて、該アンチセンスＲＮＡを目的遺伝子と相補的に結合させ、目的タンパク質の翻訳を妨げ、その結果として該遺伝子の発現を抑制する方法をいう。具体的には、植物で機能するプロモータの下流に、トレオニンアルドラーゼ遺伝子に係るポリヌクレオチド、またはそれらの断片をアンチセンス方向につないで植物細胞または組織に導入すると、上記ｍＲＮＡと相補的なアンチセンスＲＮＡを産生することができる。
【０１２４】
ＲＮＡ干渉法とは、以下の機序で標的ＲＮＡを分解させる現象を利用して目的の遺伝子の発現を抑制する方法をいう。まず、ｄｓＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ、ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ）の鋳型となるＤＮＡを含むベクターを用いることによって細胞内でｄｓＲＮＡを形成させる。次に、当該ｄｓＲＮＡを２本鎖ＲＮＡ特異的なＲＮａｓｅ（Ｄｉｃｅｒ）により切断してｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を生成させる。その後、ｓｉＲＮＡを、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の一部として複合体を形成させ、最終的にＲＩＳＣによって相同性により標的ｍＲＮＡを認識させ、分解させる。
【０１２５】
ＲＮＡ干渉に用いるベクターとしては、ＲＮＡｉを引き起こすｄｓＲＮＡをヘアピン型ｄｓＲＮＡとして発現するベクターが好ましい。ｄｓＲＮＡを発現するＲＮＡｉベクターは、イントロンなどの数塩基以上のスペーサ配列の両端にＩＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ：逆位反復）となるように、ｄｓＲＮＡ形成部分に対応したＤＮＡを配置することによって構築されるヘアピン型のＲＮＡｉベクターを用いることができる。なお、ベクターの構成の詳細については後述する。
【０１２６】
また、ＲＮＡｉベクターは別々のプロモータによってセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡそれぞれが転写され、これらが細胞内でハイブリダイズしてｄｓＲＮＡを産生する、タンデム型であってもよい。あるいは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡがそれぞれ転写されるような複数の発現ベクターを構築して、ＲＮＡｉを引き起こしてもよい。
【０１２７】
共抑制法とは、植物に標的となる内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入した外来遺伝子および標的となる内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。例えば、トレオニンアルドラーゼ遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、当該遺伝子、または、これらと類似した配列を有するＤＮＡを発現できるように作製したベクターを使用して目的の植物を形質転換すればよい。
【０１２８】
これらの遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターによって植物へ導入される。これらの遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを植物へ導入する方法は特に限定されず、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、またはパーティクルガン法等を適宜用いればよい。なお、このポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターは、植物細胞、カルス、植物組織、または植物個体に対して導入すればよい。
【０１２９】
また、トレオニンアルドラーゼ遺伝子の発現の抑制のために導入する外因性ポリヌクレオチドは、内在性のトレオニンアルドラーゼ遺伝子のプロモータ配列またはエンハンサ配列領域の配列を含むものであってもよい。
【０１３０】
＜組換え発現ベクターおよび形質転換体＞
本発明に係るタバコ植物に適用される組換え発現ベクターおよび本発明に係る外因性のポリヌクレオチドが発現可能に導入された形質転換体について以下に説明する。
【０１３１】
組換え発現ベクターを構成するためのベクターの種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なものを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、適宜プロモータ配列を選択し、当該プロモータ配列と本発明に係るトレオニンアルドラーゼ遺伝子に係るポリヌクレオチドとを、例えば、プラスミド、ファージミド、またはコスミド等に組み込んだものを組換え発現ベクターとして用いればよい。
【０１３２】
上記組換え発現ベクターは、好ましくは発現抑制ベクターである。組換え発現ベクターにおいて本発明に係るポリヌクレオチドは、転写に必要な要素（例えば、プロモータなど）が機能的に連結されている。また、必要に応じて、エンハンサ、選択マーカー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナルおよび５’−ＵＴＲ配列などを連結されていてもよい。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【０１３３】
宿主細胞内で作動可能なプロモータ配列としては、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモータ、アグロバクテリウムのノパリン合成遺伝子プロモータおよびトウモロコシ由来のユビキチン遺伝子プロモータ、イネ由来のアクチン遺伝子プロモータなどが挙げられる。宿主細胞内で作動可能なプロモータ配列として、さらには、老化誘導されるシロイヌナズナのＳＡＧ１２遺伝子のプロモータ（Ori et al., The Plant Cell11.6 : 1073-1080 (1999)、 国際特許公開公報第WO 2010/018234 A1号）、熱誘導性のシロイヌナズナのHSP18.2遺伝子のプロモータ（Yoshida, K., et al., Applied microbiology and biotechnology44.3-4 466-472 (1995))が挙げられる。
【０１３４】
また、上記の本発明に係るプロモータとしては、本発明に係る内在性のトレオニンアルドラーゼ遺伝子におけるプロモータ領域の配列を用いてもよい。
【０１３５】
組換え発現ベクターおよび形質転換体の作製は、例えば単離されたトレオニンアルドラーゼ遺伝子のポリヌクレオチドを用いて行われる。トレオニンアルドラーゼ遺伝子に係るポリヌクレオチドを取得する（単離する）方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記トレオニンアルドラーゼ遺伝子の塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。
【０１３６】
また、トレオニンアルドラーゼ遺伝子に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、当該トレオニンアルドラーゼ遺伝子のｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、トレオニンアルドラーゼ遺伝子に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【０１３７】
組換え発現ベクターにおいて、本発明に係るポリヌクレオチドは、必要に応じて、適切なターミネータに結合させてもよい。例えば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネータおよびＣａＭＶ３５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子のターミネータに機能的に結合されていてもよい。ターミネータの種類は、宿主細胞の種類に応じて適宜選択すればよい。
【０１３８】
また、エンハンサは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモータ内の上流側の配列を含むエンハンサ領域およびタバコモザイクウイルスのオメガ配列が挙げられる。
【０１３９】
本発明に係る組換え発現ベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
【０１４０】
レポーター遺伝子としては、遺伝子の発現によって植物細胞が形質転換されたか否かを確認することができるものであればよく、例えば、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）などの蛍光タンパク質、ならびにベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）などが挙げられる。
【０１４１】
なお、レポーター遺伝子を含む発現カセットと目的遺伝子とをそれぞれ別々の組換え発現ベクター上に配置してもよい。別々に配置した場合は、各ベクターを宿主に共導入（コトランスフェクト）すればよい。
【０１４２】
また、組換え発現ベクターにおいて本発明に係るポリヌクレオチドは、必要に応じて、好適なスペーサー配列に結合されていてもよい。また、組換え発現ベクターの一例として、温度感受性のプロモータ下に本発明に係る遺伝子を結合させた構造を有するもの等が挙げられる。
【０１４３】
本発明に係るタバコ植物に適用されるベクターは、遺伝子発現抑制用ベクターであり得る。遺伝子発現抑制用ベクターは、（遺伝子）の項目で記載した遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドを好適なベクターに挿入したものである。
【０１４４】
タバコ植物の形質転換に用いられる組換えベクターのうち、発現抑制ベクターは、植物細胞内における内在性の遺伝子の発現を抑制するためのベクターであり、形質転換植物体を作出するために使用され得るベクターである。係るベクターは、例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドおよび配列番号３に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも何れかの配列に対して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、さらに好ましくは９２％以上、さらにより好ましくは９３％以上、さらにより好ましくは９４％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９６％以上、さらにより好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる群より選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む。このようなベクターとして、ＲＮＡ干渉誘導ベクター、アンチセンスベクターまたは共抑制用ベクターなどが挙げられる。
【０１４５】
ＲＮＡ干渉誘導ベクターは、ＲＮＡ干渉のトリガーとなるｄｓＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ、ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ）の鋳型となるＤＮＡを含むベクターである。ＲＮＡ干渉のトリガーとなる２本鎖ＲＮＡを形成する部分に対応するポリヌクレオチドは、内在性のトレオニンアルドラーゼ遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドであり、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドもしくは配列番号３に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドもしくは配列番号３に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、さらに好ましくは９２％以上、さらにより好ましくは９３％以上、さらにより好ましくは９４％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９６％以上、さらにより好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドにおける、連続する少なくとも２１〜３０塩基（例えば、２１塩基以上、２２塩基以上、２３塩基以上、２４塩基以上、２５塩基以上、２６塩基以上、２７塩基以上、２８塩基以上、２９塩基以上、および３０塩基以上）の塩基配列に示されるポリヌクレオチド（センスＲＮＡ部分）、ならびに当該ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列に示されるポリヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡ部分）である。上述の「連続する少なくとも２１〜３０塩基」の塩基配列は、より詳細には、連続する２１塩基以上、２３塩基以上、２５塩基以上、３０塩基以上、３５塩基以上、４０塩基以上、４５塩基以上、５０塩基以上、６０塩基以上、７０塩基以上、８０塩基以上、９０塩基以上、または１００塩基以上の塩基配列を意味する。
【０１４６】
ＲＮＡ干渉誘導ベクターの例として、老化誘導プロモータまたは温度感受性プロモータ下に上述のＲＮＡ干渉のトリガーの鋳型となるＤＮＡの配列を結合させた構造を有するもの等が挙げられる。
【０１４７】
アンチセンスベクターは、アンチセンス法によって、トレオニンアルドラーゼ遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを含むベクターである。アンチセンスベクターに導入する内在性のトレオニンアルドラーゼ遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチド分子は、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドもしくは配列番号３に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドおよび配列番号３に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも何れかに対して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、さらに好ましくは９２％以上、さらにより好ましくは９３％以上、さらにより好ましくは９４％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９６％以上、さらにより好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列の一部の塩基配列を有するアンチセンスヌクレオチド分子であってもよく、例えば、連続した１５塩基以上から全長未満、２０塩基以上から全長未満、好ましくは１００塩基以上から全長未満、より好ましくは５００塩基以上から全長未満からなる塩基配列を有するアンチセンスヌクレオチド分子であってもよい。
【０１４８】
また、共抑制ベクターは、共抑制法によって、トレオニンアルドラーゼ遺伝子の発現を抑制する共抑制因子分子を含むベクターである。共抑制に用いるヌクレオチド分子は内在性のトレオニンアルドラーゼ遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドであり、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドもしくは配列番号３に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドもしくは配列番号３に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、さらに好ましくは９２％以上、さらにより好ましくは９３％以上、さらにより好ましくは９４％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９６％以上、さらにより好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドにおける、例えば連続した５０塩基であり、好ましくは１００塩基であり、さらに好ましくは５００塩基である。または、共抑制に用いるヌクレオチド分子は、例えば上記塩基配列中の連続した５０塩基以上から全長未満、好ましくは１００塩基以上から全長未満、より好ましくは５００塩基以上から全長未満からなる塩基配列を有するヌクレオチドであってもよい。
【０１４９】
また、形質転換体は、上記の組換え発現ベクターまたはトレオニンアルドラーゼ遺伝子に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、植物細胞、植物組織片および植物器官等であり得る。
【０１５０】
トレオニンアルドラーゼの発現の低下が当該遺伝子の発現を抑制するために導入された外因性のポリヌクレオチドによるものである場合、該タバコ植物は導入されたポリヌクレオチド配列についてホモ接合体であることが望ましいが、ヘミ接合体であってもよい。
【０１５１】
（乾燥（ｃｕｒｉｎｇ）工程）
本発明の一実施形態に係る乾燥たばこ材料の生産方法は、タバコ植物またはその一部の乾燥工程を包含している。
【０１５２】
本明細書におけるタバコ植物またはその一部の乾燥（ｃｕｒｉｎｇ)は、植物中の水分を脱水するのみならず、植物の内容成分の変化を促進することを意図する。
【０１５３】
本明細書におけるトレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料を生産するための乾燥法としては、特に限定されず、一般に実施されるタバコ葉の乾燥（ｃｕｒｉｎｇ）方法、またはその範疇である方法でよい。当該タバコ葉の乾燥（ｃｕｒｉｎｇ）方法としては熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥および日干し乾燥ならびにこれらの乾燥法の組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、乾燥は、熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥および日干し乾燥からなる群より選択される乾燥方法によって行われる。一般的に、タバコ葉の乾燥法は通常はタバコのタイプによって決まっており、例えばバージニアタバコは熱風乾燥され（flue-cured）、バーレータバコは空気乾燥され、オリエントタバコは日干し乾燥される。
【０１５４】
タバコ植物またはその一部の乾燥（ｃｕｒｉｎｇ）を実施するための設備または装置としては、特に限定されず、例えば、乾燥が熱風乾燥によって行われる場合、温度と湿度とを制御できる空間または設備が一般に利用される。また、乾燥が空気乾燥によって行われる場合、採取したタバコ植物またはその一部の乾燥を雨および直射日光等を避けて進行させることができる、小屋などの施設が一般に利用される。
【０１５５】
また、タバコ植物またはその一部の乾燥のための乾燥プログラムは、ステージ、成熟度、器官など、乾燥させるタバコ植物またはその一部の状態に応じて適宜設定を変更することできる。また、タバコ植物の葉を乾燥する場合は、例えば一般に実施される熱風乾燥において用いられる乾燥プログラムを用いてもよい。当該乾燥プログラムとしては、実施例の図７に示されているものが例示される。
【０１５６】
さらに、ある種の加熱処理は採取したタバコ植物またはその一部のトレオニン含量を増強することができる。葉中のタンパク質は熱ストレスを加えられた条件下においてHeat-induced leaf senescenceと呼ばれる機構によって分解が促進される。このような熱ストレスによって生じたタンパク質分解産物は直接的、または間接的にタバコ植物またはその一部のトレオニン含量の増強に貢献する。特にタバコ植物が内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物である場合、上記加熱処理によるトレオニン含量の増強は対照植物を加熱処理した場合と比較して顕著である。また、一般的に実施される方法で乾燥（ｃｕｒｉｎｇ）処理されるタバコ葉は通常は上記熱ストレスに晒される。上記トレオニン含量を増強するための加熱処理の条件（温度、時間など）は、例えば、タンパク質の分解を指標に決定してもよい。タンパク質はＢｒａｄｆｏｒｄ法またはＢＣＡ法（ビシンコニン酸法）などの方法を用いて定量することができる。総タンパク質量の１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上が分解されたことを指標に温度および時間を決定してもよい。また、Heat-induced leaf senescenceはクロロフィルの分解も促進するため、上記加熱処理の条件は葉のクロロフィル分解を指標に決定することもできる。クロロフィルはクロロフィルメーター等を用いて容易に測定することができる。一例として、総クロロフィル量の５％以上、１０％以上、１５％以上または２０％以上が分解されたことを指標に温度および時間を決定する方法が挙げられる。
【０１５７】
上記加熱処理の具体的な条件は、例えば、摂氏３８℃程度の湿潤な雰囲気の中に１２時間以上晒すことである。タンパク質の分解は処理の温度および時間の影響を受けるため、これらは適宜調整する必要がある。上記加熱処理において、当該タバコ植物またはその一部をさらすための温度は、好ましくは２５℃以上６０℃以下の範囲であり、より好ましくは、以下の各範囲から選択される温度である。
【０１５８】
２８℃〜６０℃、３０℃〜６０℃、３２℃〜６０℃、３４℃〜６０℃、３６℃〜６０℃、３８℃〜６０℃、４０℃〜６０℃、４２℃〜６０℃、４４℃〜６０℃、４６℃〜６０℃、４８℃〜６０℃、５０℃〜６０℃、５２℃〜６０℃、５４℃〜６０℃、５６℃〜６０℃、
２８℃〜５８℃、３０℃〜５８℃、３２℃〜５８℃、３４℃〜５８℃、３６℃〜５８℃、３８℃〜５８℃、４０℃〜５８℃、４２℃〜５８℃、４４℃〜５８℃、４６℃〜５８℃、４８℃〜５８℃、５０℃〜５８℃、５２℃〜５８℃、５４℃〜５８℃、
２８℃〜５６℃、３０℃〜５６℃、３２℃〜５６℃、３４℃〜５６℃、３６℃〜５６℃、３８℃〜５６℃、４０℃〜５６℃、４２℃〜５６℃、４４℃〜５６℃、４６℃〜５６℃、４８℃〜５６℃、５０℃〜５６℃、５２℃〜５６℃、
２８℃〜５４℃、３０℃〜５４℃、３２℃〜５４℃、３４℃〜５４℃、３６℃〜５４℃、３８℃〜５４℃、４０℃〜５４℃、４２℃〜５４℃、４４℃〜５４℃、４６℃〜５４℃、４８℃〜５４℃、５０℃〜５４℃、
２８℃〜５２℃、３０℃〜５２℃、３２℃〜５２℃、３４℃〜５２℃、３６℃〜５２℃、３８℃〜５２℃、４０℃〜５２℃、４２℃〜５２℃、４４℃〜５２℃、４６℃〜５２℃、４８℃〜５２℃、
２８℃〜５０℃、３０℃〜５０℃、３２℃〜５０℃、３４℃〜５０℃、３６℃〜５０℃、３８℃〜５０℃、４０℃〜５０℃、４２℃〜５０℃、４４℃〜５０℃、４６℃〜５０℃、
２８℃〜４８℃、３０℃〜４８℃、３２℃〜４８℃、３４℃〜４８℃、３６℃〜４８℃、３８℃〜４８℃、４０℃〜４８℃、４２℃〜４８℃、４４℃〜４８℃、
２８℃〜４６℃、３０℃〜４６℃、３２℃〜４６℃、３４℃〜４６℃、３６℃〜４６℃、３８℃〜４６℃、４０℃〜４６℃、４２℃〜４６℃、２８℃〜４４℃、３０℃〜４４℃、３２℃〜４４℃、３４℃〜４４℃、３６℃〜４４℃、３８℃〜４４℃、４０℃〜４４℃、
２８℃〜４２℃、３０℃〜４２℃、３２℃〜４２℃、３４℃〜４２℃、３６℃〜４２℃、３８℃〜４２℃、
２８℃〜４０℃、３０℃〜４０℃、３２℃〜４０℃、３４℃〜４０℃、３６℃〜４０℃、
２８℃〜３８℃、３０℃〜３８℃、３２℃〜３８℃、３４℃〜３８℃、
２８℃〜３６℃、３０℃〜３６℃、３２℃〜３６℃、
２８℃〜３４℃、３０℃〜３４℃または２８℃〜３２℃。
【０１５９】
また、上記加熱処理において当該植物またはその一部を曝露するための期間は、好ましくは２時間〜９６時間の範囲であり、より好ましくは、以下の範囲から選択される時間である。
【０１６０】
２時間〜９６時間、４時間〜９６時間、８時間〜９６時間、１２時間〜９６時間、１６時間〜９６時間、２４時間〜９６時間、３６時間〜９６時間、４８時間〜９６時間、７２時間〜９６時間、
２時間〜７２時間、４時間〜７２時間、８時間〜７２時間、１２時間〜７２時間、１６時間〜７２時間、２４時間〜７２時間、３６時間〜７２時間、４８時間〜７２時間、
２時間〜４８時間、４時間〜４８時間、８時間〜４８時間、１２時間〜４８時間、１６時間〜４８時間、２４時間〜４８時間、３６時間〜４８時間、
２時間〜３６時間、４時間〜３６時間、８時間〜３６時間、１２時間〜３６時間、１６時間〜３６時間、２４時間〜３６時間、
２時間〜２４時間、４時間〜２４時間、８時間〜２４時間、１２時間〜２４時間、１６時間〜２４時間、
２時間〜１６時間、４時間〜１６時間、８時間〜１６時間、１２時間〜１６時間、
２時間〜１２時間、４時間〜１２時間、８時間〜１２時間、
２時間〜８時間、４時間〜８時間または
２時間〜４時間。
【０１６１】
上記加熱処理における湿度は、特に限定されないが、例えば乾燥装置を用いる場合は、乾燥装置内部の湿度は好ましくは６０〜９５％であり、より好ましくは７０〜９０％である。
【０１６２】
タバコ植物またはその一部のトレオニン含量は上記加熱処理によって増強されるが、通常は、この処理だけでは乾燥（ｃｕｒｉｎｇ）は完了しない。一般には、残っている水分の大半を除去し、内容成分の変化を停止させて、乾燥（ｃｕｒｉｎｇ）を完了させる必要がある。したがって、上記加熱処理は一実施形態として水分除去を主眼に置いた別の乾燥法(ドライイング)と組み合わせて実施されてもよい。あるいは、上記加熱処理は一般的に実施されるタバコ葉の乾燥方法と組み合わせてもよい。たとえば既存の乾燥プログラムの初期過程に挿入されて、実施されてもよい。
【０１６３】
本明細書において記載する乾燥処理のための温度は、乾燥工程中の乾燥環境内（例えば乾燥小屋または乾燥装置内）の平均気温を示す。平均気温は、乾燥小屋または乾燥装置内の１点以上または１箇所以上において測定されるものであり得る。
【０１６４】
また、上記加熱処理において、加熱の温度を時間経過とともに段階的に昇温してもよい。また、一つの加熱処理のためのプログラムにおいて、一定期間の昇温と一定期間の降温とを任意の回数で含んでいてもよい。また、上記加熱は連続して行っても断続的に行ってもよい。すなわち、加熱期間と加熱期間との間に一定の加熱休止期間を設けてもよい。
【０１６５】
上記加熱処理は、燃料等を燃焼させることによって実施されてもよく、太陽光等の熱または電気を利用しで実施されてもよい。また、簡易なビニールハウス等の閉鎖系施設を用いてもよい。また、熱風を用いてもよい。
【０１６６】
上記加熱処理は、タバコ植物またはその一部を、ある温度の環境にある期間曝露する段階、を包含しているものであり得る。
【０１６７】
一例において、本発明に係る生産方法に用いられるタバコ植物またはその一部は、上述の乾燥工程を経ることによって初めてスレオニン含量が増大するものである。
【０１６８】
（生産方法に適用可能なタバコ植物の種類）
本発明に係る生産方法はタバコ（Nicotiana）属の植物であるタバコ植物に適用することができる。タバコ植物としては、タバコ（Nicotiana）属に属する植物であれば特に限定されないが、例えば、ニコチアナ トメントシフォルミス（Nicotiana tomentosiformis）、ニコチアナ シルベストリス（Nicotiana sylvestris）、ニコチアナ ルスティカ（Nicotiana rustica）（マルバタバコ）、ニコチアナ タバカム（Nicotiana tabacum）、ニコチアナ プルムバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）、ニコチアナ アラタ（Nicotiana alata）（ハナタバコ）（Nicotiana alata）、ニコチアナ アカウリス（Nicotiana acaulis）、ニコチアナ アカミナタ（Nicotiana acuminata）、ニコチアナ アカミナタ ヴァリエーション ムルツユロラ（Nicotiana acuminata var. multzjlora）、ニコチアナ アフリカナ（Nicotiana africana）、ニコチアナ アンプレクシカウリス（Nicotiana amplexicaulis）、ニコチアナ アレンツィイ（Nicotiana arentsii）、ニコチアナ アテヌアタ（Nicotiana attenuata）、ニコチアナ ベナビデシイ（Nicotiana benavidesii）、ニコチアナ ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）、ニコチアナ ビゲロビイ（Nicotiana bigelovii）、ニコチアナ ボナリエンシス（Nicotiana bonariensis）、ニコチアナ カビコラ（Nicotiana cavicola）、ニコチアナ クレベランディイ（Nicotiana clevelandii）、ニコチアナ コルディフォリア（Nicotiana cordifolia）、ニコチアナ コリンボサ（Nicotiana corymbosa）、ニコチアナ デブネイ（Nicotiana debneyi）、ニコチアナ エクセルシオール（Nicotiana excelsior）、ニコチアナ フォゲッチアナ（Nicotianaforgetiana）、ニコチアナ フラグランス（Nicotiana fragrans）、ニコチアナ グラウカ（Nicotiana glauca）、ニコチアナ グルチノサ（Nicotiana glutinosa），ニコチアナグッドスピーディイ（Nicotiana goodspeedii）、ニコチアナ ゴセイ（Nicotiana gossei）、ニコチアナ ハイブリッド（Nicotiana hybrid）、ニコチアナ イングルバ（Nicotiana ingulba）、ニコチアナ カワカミイ（Nicotiana kawakamii）、ニコチアナ ナイチアナ（Nicotiana knightiana）、ニコチアナ ラングスドルフィ（Nicotiana langsdorfi）、ニコチアナ リニアリス（Nicotiana linearis）、ニコチアナ ロンギフロラ（Nicotiana longiflora）、ニコチアナ マリチマ（Nicotiana maritima）、ニコチアナ メガロシフォン（Nicotiana megalosiphon）、ニコチアナ ミエルシイ（Nicotiana miersii）、ニコチアナ ノクチフロラ（Nicotiana noctiflora）、ニコチアナ ヌディカウリス（Nicotiana nudicaulis）、ニコチアナ オブツシフォリア（Nicotiana obtusifolia）、ニコチアナ オクシデンタリス（Nicotiana occidentalis）、ニコチアナ オクシデンタリス サブスピーシーズ ヘスペリス（Nicotiana occidentalis subsp. Hesperis）、ニコチアナ オトフォラ（Nicotiana otophora）、ニコチアナ パニクラタ（Nicotiana paniculata）、ニコチアナ パウクツユロラ（Nicotiana pauczjlora）、ニコチアナ ペチュニオイデス（Nicotiana petunioides）、ニコチアナ プランバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）、ニコチアナ クアドリヴァルヴィス（Nicotiana quadrivalvis）、ニコチアナ レイモンディイ（Nicotiana raimondii）、ニコチアナ レパンダ（Nicotiana repanda）、ニコチアナ ロズラタ（Nicotiana rosulata）、ニコチアナ ロズラタ サブスピーシーズ イングルバ（Nicotiana rosulata subsp. Ingulba）、ニコチアナ ロツンディフォリア（Nicotiana rotundifolia）、ニコチアナ セッチェルリイ（Nicotiana setchellii）、ニコチアナ シムランス（Nicotiana simulans）、ニコ��アナ ソラニフォリア（Nicotiana solanifolia）、ニコチアナ スペガウイニイ（Nicotiana spegauinii）、ニコチアナ ストックトニイ（Nicotiana stocktonii）、ニコチアナ スアヴェオレンス（Nicotiana suaveolens）、ニコチアナ チルシフロラ（Nicotiana thyrsiflora）、ニコチアナ トメントサ（Nicotiana tomentosa）、ニコチアナ トリゴノフィラ（Nicotiana trigonophylla）、ニコチアナ アンブラティカ（Nicotiana umbratica）、ニコチアナ アンドゥラタ（Nicotiana undulata）、ニコチアナ ベルンチナ（Nicotiana velutina）、およびニコチアナウィガンディオイデス（Nicotiana wigandioides）などが挙げられる。また品種については、黄色種（バージニア種）、バーレー種、葉巻種、オリエント種、および各地の気候風土に適応し分化した在来種の各品種を含む。一実施形態では、本発明に係る生産方法には、ニコチアナ タバカムおよびニコチアナ ルスティカからなる群より選択されるタバコ属植物が用いられる。
【０１６９】
〔２．乾燥たばこ材料〕
また、本発明は、上記の生産方法により生産された、乾燥たばこ材料も提供する。上記のように、本明細書において、「乾燥たばこ材料」とは、採取されたタバコ植物またはその一部を乾燥させたものを包含するものである。
【０１７０】
本発明の生産方法により生産された乾燥たばこ材料は、任意のたばこ製品の製造用途、たとえば、電子たばこ（e-cigarettes）、非燃焼型加熱式たばこ（heat-not-burn tobacco）、紙巻きたばこ、葉巻およびパイプたばこなどの喫煙製品、ならびに嗅ぎたばこ、噛みたばこなどのスモークレスたばこ製品の製造用途に用いることができる。
【０１７１】
本発明の生産方法により生産された乾燥たばこ材料は、特に限定されるものではないが、スチーム、ロースト、膨化など、含有する成分や物理的性質の変化を伴う更なる加工処理が加えられた上で、上記製品の製造に使用され得る。さらに、別の実施形態として、本発明の生産方法により生産された乾燥たばこ材料は、特に限定されるものではないが、刻みたばこ、顆粒状形態、微粉末形態または液体（抽出物含有物）などの形態に加工された上で上記製品の製造に使用され得る。
【０１７２】
〔３．抽出物〕
本発明に係る乾燥たばこ材料から調製された抽出物は本発明の範疇である。当該抽出物は、乾燥たばこ材料から１つ以上の成分を抽出する抽出工程を含む調製方法によって調製されたものであり得る。
【０１７３】
抽出物の調製は、例えば、本発明の生産方法により生産された乾燥たばこ材料に、水性溶媒などの好適な溶媒を添加して、溶媒可溶化成分と乾燥たばこ材料残渣とに分離することによって行われる。特に限定されるものではないが、抽出物の調整に供せられる乾燥たばこ材料はスチーム、ローストまたは膨化など、含有する成分や物理的性質の変化を伴う更なる加工処理が加えられていてもよい。また、得られた抽出物に対し、目的に応じて、不要な成分の除去、または目的の成分を濃縮するために、カラム精製またはフィルターろ過等を行ってもよい。また、凍結乾燥または減圧蒸留法等による濃縮を行ってもよい。また、必要に応じて抽出物は乾燥させてもよい。係る工程を経て調製された抽出物は、乾燥たばこ材料から不要の成分を除去したものである、または所望の成分のみを含むものであり得る。そのため、種々の製品の生産に用いることができる。一例として、抽出物の調製方法は、上述の生産方法によって得た乾燥たばこ材料に、水等の水性溶媒を添加し、水溶性たばこ抽出物と、乾燥たばこ材料残渣とに分離する工程を含む。たばこ抽出物からたばこ製品を生産する場合、不要成分除去等を行った抽出物と残渣とを、再度混合および乾燥したものを、たばこ製品の製造に用いることができる。
【０１７４】
〔４．たばこ製品〕
本発明は、本発明の生産方法により生産された乾燥たばこ材料および／または当該乾燥たばこ材料から調製した抽出物を原料として用いて製造されたたばこ製品も提供する。たばこ製品は、上述の乾燥たばこ材料、更に加工処理の加えられた乾燥たばこ材料、または抽出物を用いて製造されるものである。上述の乾燥たばこ材料、さらに加工された乾燥たばこ材料または抽出物は、たばこ製品中のたばこ材料の全体として使用されてもよいし、たばこ製品中のたばこ材料の一部として使用されてもよい。あるいは、本発明の方法により生産された乾燥たばこ材料から粉末、液体などの形態にさらに加工された材料はたばこ製品中の他のたばこ材料に添加されて使用されてもよい。本発明により得られる乾燥たばこ材料は、たばこ製品中のたばこ材料の一部として使用される場合、任意の割合で使用することができる。
【０１７５】
たばこ製品には、乾燥たばこ材料の他に、風味料、フィラー、バインダー、ｐＨ調整剤、緩衝剤、着色剤、崩壊補助剤、抗酸化剤、保湿剤および保存料等の他の成分を含み得る。
【０１７６】
以上のように本発明によれば、広範なたばこ製品を製造するための原料として使用され得る、トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料を生産することができる。
【０１７７】
〔５．本発明に係る具体的な態様の例示〕
本発明は以下の＜１＞〜＜１８＞の何れかを包含する。
＜１＞  トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料の生産方法であって、
内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物またはその一部から、該乾燥たばこ材料を生産することを含み、
該トレオニンアルドラーゼは、以下の（ａ）および（ｂ）の少なくとも何れかである、生産方法：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む遺伝子によってコードされるポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼ
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む遺伝子によってコードされるポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼ。
＜２＞  トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料の生産方法であって、
内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物またはその一部から、該乾燥たばこ材料を生産することを含み、
該トレオニンアルドラーゼは、以下の（ａ）および（ｂ）の少なくとも何れかである、生産方法：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼ、
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドからなるトレオニンアルドラーゼ。
＜３＞  上記改変されたタバコ植物における内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性の低下は、該トレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の変異対立遺伝子によるものであるか、または該トレオニンアルドラーゼの発現を抑制するために導入された外因性のポリヌクレオチドによるものである、＜１＞または＜２＞に記載の生産方法。
＜４＞  上記変異対立遺伝子は、挿入、欠失、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ノンストップ変異、およびスプライス部位変異からなる群より選択される突然変異を含むものである、＜３＞に記載の生産方法。
＜５＞  上記突然変異は、突然変異誘発、ゲノム編集およびノックアウト法からなる群から選択される方法によって導入された人工突然変異を含むものであるか、天然に存在する自然突然変異を含むものである、＜４＞に記載の生産方法。
＜６＞  上記人工突然変異は、突然変異誘発またはゲノム編集によって導入されたものであり、該突然変異誘発またはゲノム編集は、化学物質または放射線への暴露、CRISPR system、Transcription Activator-Like Effector Nucleases、Zinc Finger Nucleases、Oligonucleotide-directed mutagenesis、Ｔ−ＤＮＡ挿入、およびトランスポゾン挿入からなる群より選択される方法によって行われるものである＜５＞に記載の生産方法。
＜７＞  上記改変されたタバコ植物は、上記トレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子として、対立遺伝子同士で同一種類の変異を有するホモ接合体であるか、または対立遺伝子同士で異なる変異を有するヘテロ接合体である、＜３＞〜＜６＞の何れか一項に記載の生産方法。
＜８＞  上記外因性のポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子および共抑制因子分子からなる群より選択される分子を含む、＜３＞に記載の生産方法。
＜９＞  上記改変されたタバコ植物は、内在性のトレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されたタバコ植物の自殖によって育成された、または該改変されたタバコ植物同士の交配によって育成された、タバコ品種の植物である、＜１＞〜＜８＞の何れか一項に記載の生産方法。
＜１０＞  上記改変されたタバコ植物は、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択される指標に基づき選抜および育成されたタバコ植物である、＜９＞に記載の生産方法：
（ａ）上記トレオニンアルドラーゼの発現の低下
（ｂ）上記トレオニンアルドラーゼの活性の低下
（ｃ）加熱処理した葉におけるトレオニン含量の増強
（ｄ）上記トレオニンアルドラーゼの変異対立遺伝子の有無
（ｅ）上記（ｄ）の変異対立遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー
（ｆ）上記遺伝子の発現を抑制するために導入された外因性のポリヌクレオチドの有無。＜１１＞  上記タバコ植物の一部は、葉、根、茎、わき芽、花、種子、植物培養細胞、カルスおよびプロトプラストからなる群より選択される、＜１＞〜＜１０＞の何れか一項に記載の生産方法。
＜１２＞  上記乾燥たばこ材料におけるトレオニン含量の増強は、上記改変されたタバコ植物またはその一部の乾燥によって生じたものである、＜１＞〜＜１１＞の何れか一項に記載の生産方法。
＜１３＞  上記乾燥が、熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥および日干し乾燥からなる群より選択される乾燥によって行われる、＜１２＞に記載の生産方法。
＜１４＞  上記改変されたタバコ植物は、ニコチアナ タバカムおよびニコチアナ ルスティカからなる群より選択されるタバコ植物である、＜１＞〜＜１３＞の何れか一項に記載の生産方法。
＜１５＞  上記乾燥たばこ材料は、葉材料であって、当該乾燥たばこ材料におけるトレオニン含量は、トレオニンアルドラーゼの発現または活性が低下するよう改変されていない対照のタバコ植物またはその一部から作製した乾燥たばこ材料のトレオニン含量と比べて２０％以上高い、＜１＞〜＜１４＞の何れか一項に記載の生産方法。
＜１６＞  ＜１＞〜＜１５＞の何れか一項に記載の生産方法によって生産される、乾燥たばこ材料。
＜１７＞  ＜１６＞に記載の乾燥たばこ材料から調製した、抽出物。
＜１８＞  ＜１６＞に記載の乾燥たばこ材料および／または＜１７＞に記載の抽出物を使用して製造された、たばこ製品。
【０１７８】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１７９】
〔実施例１：ニコチアナ タバカムにおけるターゲット遺伝子の選定および単離〕
トレオニンアルドラーゼ（Threonine aldolase（ＴＨＡ））は、生物におけるトレオニンの代謝に関わる酵素であり、Arabidopsis thalianaではＴＨＡ１（Ａｔ１ｇ０８６３０）、ＴＨＡ２（Ａｔ３ｇ０４５２０）という２つの遺伝子によってコードされている（非特許文献１０）ことが知られている。アスパラギン酸に由来するアミノ酸の代謝経路を図１に示す。【０１８０】
ＢＬＡＳＴ検索によってA. thalianaのＴＨＡ遺伝子と相同性を有する３種のタバコ遺伝子を公共核酸データベースから同定した。このうち２種はタバコのＳゲノムに座乗し、１種はＴゲノムに座乗していた。Ｓゲノムの１種とＴゲノムの１種の遺伝子はアミノ酸レベルで９９％という高い配列同一性を示すため、同じ機能を有することが推定された。これらの遺伝子について、ＳゲノムにおけるものをＮｔＴＨＡ１ｓとし、ＴゲノムにおけるものをＮｔＴＨＡ１ｔとした。残り１つの遺伝子は他の２つの遺伝子とアミノ酸レベルで８７％の同一性を示しＮｔＴＨＡ２とした。ＮｔＴＨＡ１ｓ、ＮｔＴＨＡ１ｔおよびＮｔＴＨＡ２のコーディング領域（ＣＤＳ）をそれぞれ配列番号１、３および５に、翻訳産物のアミノ酸配列を配列番号２、４および６に示す。【０１８１】
〔実施例２：タバコにおけるＴＨＡ遺伝子の発現の確認〕
タバコにおけるＴＨＡ遺伝子の発現を確認するために、品種つくば１号の播種後１０日の芽生え、播種後４週の苗の葉身（ラミナ）、播種後５週の苗の根、加熱処理を施したラミナおよび種子からＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲに供試した。葉身の加熱処理は、播種後８週の個体から切り取った葉を温度３７℃および湿度８５％の条件下に、０、８、２４または４８時間暴露して行った。種子のＲＮＡは１０、２５、５０または１００粒から調製した。全ＲＮＡはRNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）を用いて抽出した。ｃＤＮＡ合成はHigh Capacity RNA-to-cDNA Master Mix （Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて行った。手法は抽出Ｋｉｔに添付のマニュアルに従った。【０１８２】
ＮｔＴＨＡ１およびＮｔＴＨＡ２遺伝子のＲＴ−ＰＣＲは表１に示す特異的なプライマーのセットおよびPrimeSTAR（登録商標）Max DNA Polymerase （TAKARA BIO INC.）を用いて実施した。なお、ＮｔＴＨＡ１の検出には２種のオルソログ遺伝子（ＮｔＴＨＡ１_ｓとＮｔＴＨＡ１_t）の両方を同時に増幅するプライマー組を用いた。品種つくば１号のゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ増幅のポジティブコントロールの鋳型として使用した。得られたＰＣＲ産物を電気泳動して確認した。図２は、ニコチアナ タバカムの各種組織におけるＮｔＴＨＡ１およびＮｔＴＨＡ２遺伝子の発現を示す。図２の（ａ）は、ＮｔＴＨＡ１遺伝子の発現を示し、図２の（ｂ）は、ＮｔＴＨＡ２遺伝子の発現を示している。ＮｔＴＨＡ１遺伝子は調査した全てのサンプルにおいて発現していた。特に、ＮｔＴＨＡ１遺伝子は根、芽生え、および加熱処理したラミナにおいて強く発現していた。一方、ＮｔＴＨＡ２遺伝子は根でのみ発現していた。【０１８３】
【表１】
2018038092.tif 000003
〔実施例３：遺伝子変異体の選抜〕
（ＮｔＴＨＡ１_ｓ遺伝子およびＮｔＴＨＡ１_ｔ遺伝子の変異体の選抜）
ＮｔＴＨＡ１_ｓ遺伝子およびＮｔＴＨＡ１_ｔ遺伝子に変異を有する系統はニコチアナタバカム（つくば１号）のＥＭＳ変異体集団（Ｍ２）の中から選抜した。選抜は SingleStrand Conformation Polymorphism（ＳＳＣＰ）解析によって行った。ＳＳＣＰ解析に供試するＰＣＲ断片は、以下の表２に示すＮｔＴＨＡ１遺伝子に特異的なプライマーセットおよびMultiplex PCR Kit（QIGEN）を用いて増幅した。その後、増幅産物の分析はPOP（商標）Conformational Analysis Polymer（Thermo Fisher Scientific Inc.）を充填したキャピラリー電気泳動装置（3130xl PRISM（登録商標）DNA analyzer, Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて実施した。得られたデータをGeneMapper（登録商標）Version4.0（Thermo Fisher Scientific Inc．）で解析し、多型性のＰＣＲ産物が増幅された系統を目的変異体の候補として選抜した。【０１８４】
【表２】
2018038092.tif 000004
選抜した候補系統から増幅したＰＣＲ産物を、TOPO（登録商標）TA Cloning Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いてクローニングした。生じたコロニーをＬＢ／Ｋｍ
液体培地で一晩培養した後、QiaPrep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いてプラスミドを抽出した。その後、得られたプラスミドおよびBigDye（登録商標）Ｔerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いてＰＣＲ産物の塩基配列を解読した。得られたデータをATGC (Ver.7) Sequence Assembly Software（GENETYX CORPORATION）で解析し、ＮｔＴＨＡ１遺伝子に導入された変異を特定した。各手順における全ての手法はＫｉｔに添付のマニュアルに従った。【０１８５】
最終的に、ＮｔＴＨＡ１_ｓ遺伝子にナンセンス突然変異が導入された２種類の変異対立遺伝子（tha1-s1, tha1-s2）を同定した。さらに、ＮｔＴＨＡ１_ｔ遺伝子にナンセンス突然変異が導入された１種の変異対立遺伝子（tha1-t）を同定した。いずれの変異もエキソン１（４５０ｂｐ）の内部に見いだされた。２種類の変異対立遺伝子のうち、ｔｈａ１−ｓ１は、野生型であるＮｔＴＨＡ１ｓの配列番号１に記載の塩基配列における２２３番目の塩基がＣからＴに置換しており（配列番号３３）、野生型であるＮｔＴＨＡ１ｓの配列番号２に記載のアミノ酸配列における７５番目のアミノ酸がストップコドンとなっていた。また、ｔｈａ１−ｓ２は、野生型であるＮｔＴＨＡ１ｓの配列番号１に記載の塩基配列における３７６番目の塩基がＣからＴに置換しており（配列番号３４）、野生型であるＮｔＴＨＡ１ｓの配列番号２に記載のアミノ酸配列における１２６番目のアミノ酸がストップコドンとなっていた。また、tha1-tは、野生型であるＮｔＴＨＡ１ｔの配列番号３に記載の塩基配列における１２１番目の塩基がＣからＴに置換しており（配列番号３５）、野生型であるＮｔＴＨＡ１ｔの配列番号４に記載のアミノ酸配列における４１番目のアミノ酸がストップコドンとなっていた。【０１８６】
図３に、ＮｔＴＨＡ１遺伝子の野生型対立遺伝子および変異対立遺伝子の塩基配列のアライメントを示す。図４に、ＮｔＴＨＡ１遺伝子の野生型対立遺伝子および変異対立遺伝子の翻訳産物のアミノ酸配列のアライメントを示す。【０１８７】
（二重変異体の育成）
ＮｔＴＨＡ１遺伝子の機能欠失の影響を明らかにするために、tha1-s1またはtha1-s2のホモ接合体であり、且つ、tha1-tのホモ接合体である二重変異体植物を育成した。【０１８８】
まず、上述の通り、tha1-s1、tha1-s2またはtha1-tについてホモ接合体であるＭ２植物を選抜した。次に、これらＭ２植物の交配に由来する２種のＦ２分離集団（Ｆ２ population）を作製した。それぞれの集団から、両方のＮｔＴＨＡ１遺伝子座が変異対立遺伝子のホモ接合体である個体を選抜して２つのタイプの二重変異体系統（tha1-s1/tha1-t, tha1-s2/tha1-t）を得た。さらに、前記集団のそれぞれから両方のＮｔＴＨＡ１遺伝子座が野生型のホモ接合体である植物(THA1-s/THA1-t)を対照として選抜した。【０１８９】
なお、２つのＮｔＴＨＡ１遺伝子座の遺伝子型はいずれもＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブを用いたSNP Genotyping Assayによって明らかにした。解析はTaqMan（登録商標）Genotyping Master Mix（Thermo Fisher Scientific Inc.）とStepOnePlus Real-Time PCR System（商標）（Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて実施した。解析に使用したプライマーおよびプローブのセットを表３に示す。【０１９０】
【表３】
2018038092.tif 000005
〔実施例４：遺伝子発現の解析〕
二重変異体におけるＮｔＴＨＡ１遺伝子の発現は以下のように調査した。まず播種後６週の苗からＲＮＡを抽出し、PrimeScript（商標）RT reagent kit with gDNA Eraser（TAKARA BIO INC.）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、以下の表４に示すプライマーおよびプローブセットとTaqMan（登録商標）Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher Scientific Inc.）とを用いて、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを実施した。解析にはStepOnePlus Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いた。ＰＣＲの手順についてはキットおよび装置のマニュアルに従った。【０１９１】
ＮｔＴＨＡ１遺伝子の発現量はelongation factor 1-alpha（ＥＦ−１ alpha）遺伝子（アクセッションＮｏ．ＡＦ１２００９３）を内部標準としたcomparative CT methodで解析した。プライマーおよびプローブセットは、Primer Express（登録商標）3.0（Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いてＮｔＴＨＡ１ｓおよびＮｔＴＨＡ１ｔの塩基配列の間で完全一致する部分で設計した（表４）。二重変異体および対照（control）の植物におけるＮｔＴＨＡ１遺伝子の発現量を図５に示す。図５の（ａ）はtha1-s1/tha1-t二重変異体の発現レベルを示し、図５の（ｂ）はtha1-s2/tha1-t二重変異体の発現レベルを示す。図５の縦軸は、対照植物（THA1-s／THA1-t）におけるNtＴＨＡ1遺伝子の発現量に対する相対的な発現量（Relative expression level）を示している。いずれの二重変異体も、対照植物と比べ、発現が有意に低下していた。【０１９２】
【表４】
2018038092.tif 000006
〔実施例５：植物体の栽培および遊離トレオニン含量の解析〕
（生育状態および形態の観察）
上記のように選抜した二重変異体（tha1-s2/tha1-t）および対照（control）となる植物を、一般的なたばこ耕作法に従い、圃場にて栽培した。図６の（ｂ）は二重変異体であり、図６の（ａ）は対照植物である。【０１９３】
図６に示す通り、二重変異体と対照植物との間に、生育および形態における差は認められなかった。【０１９４】
（植物体中の遊離トレオニン含量の解析）
次に、二重変異体および対照植物のそれぞれから葉を採取し、新鮮な葉および熱風乾燥した葉における遊離トレオニン含量を分析した。熱風乾燥における標準的な乾燥スケジュール(Tabacco Curing schedule)を図７に示す。図７の横軸は、経過時間（Time）(hr)を示し、左側の縦軸は温度（Tempreture）(℃)を示し、右側の縦軸は相対湿度（Relative humidity、RH）（％）を示している。また、図８に、二重変異体および対照植物の新鮮な葉（flesh leaves）の遊離トレオニン含量を示す。図９に、二重変異体および対照植物の熱風乾燥した葉（cured leaves）の遊離トレオニン含量を示す。【０１９５】
なお、図８の（ａ）および図９の（ａ）は、tha1-s1/tha1-t二重変異体および対照植物の遊離トレオニン含量（threonine content）を示す。図８の（ｂ）および図９の（ｂ）は、tha1-s2/tha1-t二重変異体と対照植物の遊離トレオニン含量（threonine content）を示す。図８および９の縦軸は、乾燥タバコ葉の乾燥重量当たりの遊離トレオニン含量（μｇ／ｇＤＷ）を示している。【０１９６】
図８に示すとおり、二重変異体から採取した直後の新鮮な葉のトレオニン含量は対照植物のものと有意な差を示さなかった。一方で、図９に示すとおり、熱風乾燥を施した二重変異体の葉の遊離トレオニン含量は対照と比べて大幅に増大していた。【０１９７】
〔実施例６：熱風乾燥の温度が遊離トレオニン含量に及ぼす影響の解析〕
熱風乾燥の温度が二重変異体（tha1-s2/tha1-t）および対照植物（THA1-s/THA1-t）の葉の遊離トレオニン含量に及ぼす影響を調査した。乾燥開始から０ｈ、８ｈ、１６ｈ、２４ｈ、３０ｈ、３６ｈ、４８ｈ、６０ｈおよび７２ｈ後に乾燥中のタバコ葉３枚をランダムに選び、それらから凡そ１０ｃｍ四方の葉片を採取した。３つの葉片を１つのサンプルとしてまとめて遊離トレオニン含量を測定した。なお、熱風乾燥チャンバーは一定温度（２５℃、３４℃、３８℃または４２℃）を維持し、湿度８５％で運転した。図１０に、ＮｔＴＨＡ１遺伝子の二重変異体および対照のタバコ植物から採取した葉を各温度条件で熱風乾燥した場合のトレオニン含量を示す。乾燥開始から２４時間以降の二重変異体の葉ではどの温度条件でも野生型と比べて遊離トレオニン含量が高かった。【０１９８】
〔実施例７：各種遺伝子型の個体の解析〕
各種遺伝子型の個体におけるＮｔＴＨＡ１遺伝子の発現をさらに詳しく調べるために、ＮｔＴＨＡ１ｓ遺伝子またはＮｔＴＨＡ１ｔ遺伝子を特異的に検出するプライマーおよびプローブを作成した（表５）。表中の‘position’カラムは配列番号１または３における位置を示す。【０１９９】
【表５】
2018038092.tif 000007
ＮｔＴＨＡ１遺伝子座が野生型または変異型のホモ接合体である４つの遺伝子型（tha1-s2/tha1-t、tha1-s2/THA1-t、THA1-s/tha1-t、THA1-s/THA1-t）の植物についてＮｔＴＨＡ１遺伝子の発現を調査した。図１１に、各種遺伝子型の個体におけるＮｔＴＨＡ１遺伝子の発現を示す。図１１に示すように、tha1-s2のホモ接合体ではＮｔＴＨＡ１ｓ遺伝子の発現レベルが低下していた。同様に、tha1-tのホモ接合体ではＮｔＴＨＡ１ｔ遺伝子の発現レベルが低下していた。これら植物から採取した葉を熱風乾燥し、乾葉（乾燥された葉）の遊離トレオニン含量を分析した。図１２に、各種遺伝子型の個体に由来する乾葉の遊離トレオニン含量を示す。二重変異体の乾葉の遊離トレオニン含量は他の遺伝子型のものと比べて有意に高かった。【０２００】
〔実施例７：空気乾燥〕
二重変異体（tha1-s1/tha1-t）と空気乾燥タイプのタバコ品種（TN90）を交配し、ＢＣ１Ｆ２の種子を得た。ＢＣ１Ｆ２植物の幼苗からＤＮＡを抽出しＮｔＴＨＡ１遺伝子の遺伝子型を調査した。二重変異体（tha1-s1/tha1-t）と対照植物（THA1-s/THA1-t）とを選抜し、それぞれ２００個体以上を一般的なたばこ耕作法に従って圃場にて栽培した。【０２０１】
タバコ葉の空気乾燥は一般的な方法に則って実施した。まず、収穫したタバコ葉は１１日間Sun Shade Netで覆われたGreenhouseの中に吊り下げて乾燥を促進させた。タバコ葉はさらに３７日間乾燥小屋の中で乾燥させた。図１３に、空気乾燥中のタバコ葉を示す。図１３（ａ）は吊り下げの開始直後の葉を示し、図１３（ｂ）は吊り下げ開始から１０日目の葉を示す。空気乾燥中のタバコ葉の周辺温度および周辺湿度の推移は図１４に示す。吊り下げの開始から０ｈ、１８ｈ、２４ｈ、４２ｈ、４８ｈ、９０ｈ、９６ｈ、７ｄ、８ｄ、９ｄ、１０ｄおよび１１ｄ後に、タバコ葉３枚をランダムに選び、それらから凡そ１０ｃｍ四方の葉片を採取した。３つの葉片を１サンプルとしてまとめて遊離トレオニン含量を測定した。図１５に、空気乾燥中のタバコ葉の遊離トレオニン含量の推移を示す。図１５に示す通り、二重変異体の遊離トレオニン含量は、空気乾燥の過程を通して対照と比べて高いレベルで推移した。【０２０２】
茎の上部に位置する葉（上葉: Tips）、真ん中より上に位置する葉（本葉: Leaf）、および茎に着いたままの葉も同様の方法で乾燥させた。図１６に、二重変異体および対照の各種乾葉の遊離トレオニン含量を示す。二重変異体の乾葉の遊離トレオニン含量は、異なる着位のいずれの葉においても対照と比べて高かった（図１６）。さらに、茎に着いた状態のまま乾燥させた（stalk cut curing）、二重変異体の乾葉の遊離トレオニン含量も対照と比べて高かった。【０２０３】
〔実施例８：ゲノム編集〕
CRISPR-Cas9 を用いたゲノム編集はLiら（Li et al., Nat Biotechnol. 2013 Aug;31(8):688-912013）の方法を参照して実施した。ターゲット配列（5’-GGAGGCATTGCCACTCTCGGAGG-3’:配列番号４２）はＮｔＴＨＡ１ｓ遺伝子（配列番号１）およびＮｔＴＨＡ１ｔ遺伝子（配列番号３）の共通部分から選択された。この配列は配列番号１または配列番号３の２８３番目から３０５番目の塩基配列であり、３’末端のAGG（下線部）はＰＡＭ配列である。plant codon‐optimized SpCas9 (pcoCas9)とsynthetic-guide RNA (sgRNA)をタバコで発現させるための一体型の植物発現ベクターは、pRI201-AN（タカラバイオ社）のＣａＭＶ ３５Ｓプロモータの下流のNdeI-SalI間にpcoCas9遺伝子を挿入し、KpnI-BamHI間にArabidopsis U6 polymerase III promoterと連結したｓｇＲＮＡ発現カセットを挿入して作成した。【０２０４】
上記ベクターを含むアグロバクテリウム（LBA4404）を播種１０日目のタバコ子葉片 (Nicotiana tabacum, ＳＲ−１)に感染させ、形質転換体を作製した。ＮｔＴＨＡ１ｓ遺伝子およびＮｔＴＨＡ１ｔ遺伝子の両方に１塩基挿入を含む３つのＴ０（Ｍ１）個体を選抜し、自殖した。それぞれの系統からpcoCas9／sgRNAコンストラクトを含まず、ＮｔＴＨＡ１ｓ遺伝子およびＮｔＴＨＡ１ｔ遺伝子の両方が変異型のホモ接合体であるＴ１（Ｍ２）植物を選抜した。上記Ｍ２植物を自殖してＭ３種子を得た。これら系統のＮｔＴＨＡ１遺伝子は、いずれも、２８０番目と２８１番目塩基の間にＴまたはＧの１塩基挿入を有していた（表６）。野生型であるＮｔＴＨＡ１ｓの配列番号１に記載の塩基配列における２８０番目と２８１番目塩基の間に、Ｔの１塩基挿入を有する配列を配列番号４９に示す。また、野生型であるＮｔＴＨＡ１ｔの配列番号３に記載の塩基配列における２８０番目と２８１番目塩基の間に、Ｔの１塩基挿入を有する配列を配列番号５０に、Ｇの１塩基挿入を有する配列を配列番号５１にそれぞれ示す。【０２０５】
【表６】
2018038092.tif 000008
ゲノム編集したタバコ植物におけるＮｔＴＨＡ１遺伝子の発現を調査するために、新しいプライマーおよびプローブセット（セットＡおよびＢ）を変異箇所の上流と下流に一つずつ設計した（表７）。設計にはNCBI Reference Sequence（RefSeq）accession number XM_016599601.1とXM_016606047.1を参照した。いずれのセットを用いても、ＮｔＴＨＡ１＿ｓ遺伝子およびＮｔＴＨＡ１＿ｔ遺伝子の両方を同時に検出可能である。セットＡのプローブは配列番号１または配列番号３の１３〜３６番目の塩基配列と一致する。セットＢのプローブは配列番号１または配列番号３の６９４〜７１１番目の塩基配列と一致する。【０２０６】
【表７】
2018038092.tif 000009
Ｍ３幼苗の葉を採取してＮｔＴＨＡ１遺伝子の発現レベルを調査した（３個体／ｌｉｎｅ）。図１７に、ゲノム編集したタバコ植物におけるＮｔＴＨＡ１遺伝子の発現レベルを示す。図１７に示すとおり、ゲノム編集した個体のＮｔＴＨＡ１遺伝子の発現レベルは野生型ＳＲ−１と比べて大幅に低かった。さらに、これら幼苗を１２ｃｍテラコッタに移植して、温室内で育成した。花芽形成のステージの３個体のそれぞれから３枚の葉を採取して熱風乾燥に供し、遊離トレオニン含量を分析した。熱風乾燥における温度および湿度の設定は３８℃／１００％ＲＨ／１８ｈ、３８℃／８８％ＲＨ／３０ｈ、４５℃／８５％ＲＨ／４８ｈ、５０℃／２０％ＲＨ／７２ｈであった。図１８に、ゲノム編集したタバコ植物の乾葉の遊離トレオニン含量を示す。熱風乾燥した葉の遊離トレオニン含量は、野生型ＳＲ−１と比べてゲノム編集した個体の方が高かった（図１８）。
【産業上の利用可能性】
【０２０７】
本発明は、トレオニン含量の増強された乾燥たばこ材料の生産ならびに当該乾燥たばこ材料および／またはその抽出物を含むたばこ製品の製造に利用することができる。
【図１】
2018038092.tif 000010
【図２】
2018038092.tif 000011
【図３】
2018038092.tif 000012
【図４】
2018038092.tif 000013
【図５】
2018038092.tif 000014
【図６】
2018038092.tif 000015
【図７】
2018038092.tif 000016
【図８】
2018038092.tif 000017
【図９】
2018038092.tif 000018
【図１０】
2018038092.tif 000019
【図１１】
2018038092.tif 000020
【図１２】
2018038092.tif 000021
【図１３】
2018038092.tif 000022
【図１４】
2018038092.tif 000023
【図１５】
2018038092.tif 000024
【図１６】
2018038092.tif 000025
【図１７】
2018038092.tif 000026
【図１８】
2018038092.tif 000027
【配列表】
2018038092000001.app
【国際調査報告】
2018038092.tif 000028
2018038092.tif 000029
2018038092.tif 000030
2018038092.tif 000031