(57)【要約】  Ｉ型制限修飾系酵素を構成する制限酵素、修飾酵素、及び認識酵素からなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素の活性が欠失又は抑制されている、改変された偏性嫌気性酢酸生成微生物が提供される。少なくとも前記制限酵素の活性が欠失又は抑制されていることが好ましい。前記偏性嫌気性酢酸生成微生物はClostridium属細菌又はMoorella属細菌であることが好ましく、Clostridium ljungdahliiであることが特に好ましい。
2018070141.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉ型制限修飾系酵素を構成する制限酵素、修飾酵素、及び認識酵素からなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素の活性が欠失又は抑制されている、改変された偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項２】
少なくとも前記制限酵素の活性が欠失又は抑制されている、請求項１に記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項３】
前記制限酵素、前記修飾酵素、及び前記認識酵素からなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子の一部又は全部が欠失している、請求項１に記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項４】
少なくとも前記制限酵素をコードする遺伝子の一部又は全部が欠失している、請求項３に記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項５】
前記制限酵素、前記修飾酵素、又は前記認識酵素の活性が欠失している、請求項１〜４のいずれかに記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項６】
一酸化炭素又は二酸化炭素を唯一の炭素源として増殖可能である、請求項１〜５のいずれかに記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項７】
一酸化炭素脱水素酵素を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項８】
メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項９】
細菌である、請求項１〜８のいずれかに記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項１０】
Clostridium属細菌又はMoorella属細菌である、請求項９に記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項１１】
Clostridium ljungdahliiである、請求項１０に記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項１２】
前記制限酵素が、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１〜１１のいずれかに記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項１３】
Clostridium ljungdahliiであり、
少なくとも前記制限酵素の活性が欠失又は抑制されており、
少なくとも前記制限酵素をコードする遺伝子の一部又は全部が欠失している、請求項１に記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の偏性嫌気性酢酸生成微生物に目的タンパク質をコードする外来遺伝子が導入され、当該目的タンパク質を発現可能である、組換え微生物。
【請求項１５】
前記外来遺伝子がゲノムに組み込まれている、請求項１４に記載の組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は偏性嫌気性酢酸生成微生物、並びに、組換え微生物に関する。本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物は、外来遺伝子による形質転換効率が高いものである。
【背景技術】
【０００２】
偏性嫌気性酢酸生成微生物は、古くからブタノール、アセトンなどの発酵生産に用いられている。特に、Clostridium属細菌は、リグノセルロース系バイオマスや合成ガスを利用した、バイオエタノール生産や酢酸、乳酸などの有機酸の生産などに利用されている。Clostridium属細菌は医療分野への用途も期待されている。【０００３】
Clostridium属細菌等の偏性嫌気性酢酸生成微生物を宿主とした組換え微生物は、有用物質の生産能力の向上等を図るうえで有用である。しかし、一般にClostridium属細菌の形質転換効率は極めて低いため、所望の組換え微生物を得るのが難しく、当該技術分野における開発を妨げる主要因となっている。【０００４】
一般に、微生物は、ウイルスやファージなどの外来ＤＮＡから自己を守るために制限修飾系を発達させている。制限修飾系は、ＤＮＡを切断する制限酵素とＤＮＡをメチル化する修飾酵素から構成される。修飾酵素の活性により、メチル化修飾を受けたＤＮＡは制限酵素による切断から守られ、微生物自身のゲノムＤＮＡが切断されることはない。微生物は、このメチル化修飾により自身のＤＮＡとウイルスなどの外来ＤＮＡとを見分け、制限酵素で外来ＤＮＡを切断することにより、自己を守っている。【０００５】
制限修飾系は、サブユニットの構造、切断部位、コファクター（補因子）の特徴などによって、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＶＩ型の４種類に大きく分類されている。Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型制限修飾系の制限酵素は、メチル化されていないＤＮＡを識別し、切断する（例えば、非特許文献１）。しかしながら、ＤＮＡが制限酵素と対になるメチル化酵素によって認識・修飾されたときには、制限酵素はＤＮＡを切断することができない。一方、ＩＶ型制限修飾系は制限酵素のみからなり、外来性ＤＮＡのメチル化様式を有するＤＮＡを識別して切断する、メチル化依存的な制限酵素である。このように、制限修飾系は微生物細胞を外来ＤＮＡから守る強固なシステムである。したがって、外来ＤＮＡを微生物に導入して形質転換するには、宿主の制限修飾系を克服することが重要となる。【０００６】
細菌において、制限修飾系、特にＩＩ型制限修飾酵素（メチルトランスフェラーゼ）を利用した形質転換効率の向上についてはこれまで検討されており、例えば特許文献１において記載されている。しかし、その実施には複数のステップが必要で、また宿主の全メチルトランスフェラーゼを必要とするなどの煩雑な操作を伴い、課題も多い。
また、Ｉ型制限修飾系の改変、特にＩ型制限酵素の欠失により形質転換効率が向上したという報告は見当たらない。【０００７】
ところで、Clostridium属細菌の中でも、特にClostridium ljungdahliiに対する期待が大きい。Clostridium ljungdahliiは、ゲノム情報が公開されている点、培養が容易である点、さらに合成ガス（Synthesis gas, Syngas）を資化できる点などの利点を有する。【０００８】
合成ガスは、廃棄物、天然ガス、及び石炭から高温・高圧下で金属触媒の作用によって効率よく得られる、一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素を主成分とする混合ガスである。一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素を含む合成ガスは、廃棄物由来の合成ガスや工場排ガス、天然ガス、または石炭由来の合成ガスとして、ほぼ永久的に生産されており、かつ利用可能である。このことから、合成ガス資化能を有する微生物を利用した、恒久的な物質生産法の確立が期待されている。組換え微生物を用いることで、目的物質の生産性向上が期待されるが、組換え体である合成ガス資化性微生物の利用に関する報告は極めて少ない。これは、上述の通り、Clostridium属細菌における形質転換効率が低く、所望の組換え体を取得しにくいことが主要因と考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２０１５−５１５２６８号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Wil A. M. Loenen et al.，Nucleic Acids Research，2014，vol.42(1)，p.22−44
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記現状に鑑み、本発明は、形質転換効率が向上したClostridium属細菌等の偏性嫌気性酢酸生成微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記した課題を解決するための本発明の１つの様相は、Ｉ型制限修飾系酵素を構成する制限酵素、修飾酵素、及び認識酵素からなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素の活性が欠失又は抑制されている、改変された偏性嫌気性酢酸生成微生物である。【００１３】
本様相は改変された偏性嫌気性酢酸生成微生物に係るものである。本様相の偏性嫌気性酢酸生成微生物では、Ｉ型制限修飾系酵素を構成する制限酵素、修飾酵素、及び認識酵素からなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素の活性が欠失又は抑制されている。そのため、Ｉ型制限修飾系の機能が失われているか、低下している。本様相の偏性嫌気性酢酸生成微生物は外来ＤＮＡに対する分解性（切断性）が寛容であるので、宿主として用いた場合の形質転換効率が高い。本様相の偏性嫌気性酢酸生成微生物を用いることにより、偏性嫌気性酢酸生成微生物の組換え体を高効率で得ることができる。【００１４】
好ましくは、少なくとも前記制限酵素の活性が欠失又は抑制されている。【００１５】
好ましくは、前記制限酵素、前記修飾酵素、及び前記認識酵素からなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子の一部又は全部が欠失している。【００１６】
好ましくは、少なくとも前記制限酵素をコードする遺伝子の一部又は全部が欠失している。【００１７】
好ましくは、前記制限酵素、前記修飾酵素、又は前記認識酵素の活性が欠失している。【００１８】
好ましくは、前記偏性嫌気性酢酸生成微生物が一酸化炭素又は二酸化炭素を唯一の炭素源として増殖可能である。【００１９】
好ましくは、前記偏性嫌気性酢酸生成微生物が一酸化炭素脱水素酵素を有する。【００２０】
好ましくは、前記偏性嫌気性酢酸生成微生物がメチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する。【００２１】
好ましくは、前記偏性嫌気性酢酸生成微生物が細菌である。【００２２】
好ましくは、前記偏性嫌気性酢酸生成微生物がClostridium属細菌又はMoorella属細菌である。【００２３】
好ましくは、前記偏性嫌気性酢酸生成微生物がClostridium ljungdahliiである。【００２４】
好ましくは、前記制限酵素が、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。【００２５】
好ましくは、前記偏性嫌気性酢酸生成微生物がClostridium ljungdahliiであり、少なくとも前記制限酵素の活性が欠失又は抑制されており、少なくとも前記制限酵素をコードする遺伝子の一部又は全部が欠失している。【００２６】
本発明の他の様相は、上記の偏性嫌気性酢酸生成微生物に目的タンパク質をコードする外来遺伝子が導入され、当該目的タンパク質を発現可能である、組換え微生物である。【００２７】
本様相は組換え微生物に係るものである。本様相の組換え微生物は、宿主である上記偏性嫌気性酢酸生成微生物に目的タンパク質をコードする外来遺伝子が導入され、当該目的タンパク質を発現可能である。本様相の組換え微生物は、その作製が容易である。【００２８】
好ましくは、前記外来遺伝子がゲノムに組み込まれている。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物によれば、偏性嫌気性酢酸生成微生物の組換え体を高効率で得ることができる。【００３０】
本発明の組換え微生物は、その作成が容易である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】pCL2-TypeIKOベクターの構成を表す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明において「遺伝子」という用語は、全て「核酸」あるいは「ＤＮＡ」という用語に置き換えることができる。
【００３３】
本発明の改変された偏性嫌気性酢酸生成微生物は、Ｉ型制限修飾系酵素を構成する制限酵素、修飾酵素、及び認識酵素からなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素の活性が欠失又は抑制されているものである。ここで偏性嫌気性とは、酸素存在下では実質的に生育できない性質を指し、絶対嫌気性と同義である。酢酸生成微生物（acetogen）とは、嫌気呼吸によって酢酸（acetate）を生成する微生物を指す。
【００３４】
一般に、Ｉ型制限修飾系酵素は、認識、修飾、制限（切断）の３つの酵素サブユニットから成るコンプレックスとして機能する。認識酵素（Ｉ型認識酵素）は、種特異的あるいは各酵素特異的なＤＮＡ配列を認識する。修飾酵素（Ｉ型修飾酵素）はメチルトランスフェラーゼ活性によるメチル化を行う。制限酵素（Ｉ型制限酵素）は、エンドヌクレアーゼ活性によるＤＮＡの切断を行う。
そして、これら３つの酵素のうち少なくとも１つの活性が失われると、そのＩ型制限修飾系は機能しないことが知られている（上記非特許文献１）。本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物では、Ｉ型制限修飾系酵素を構成する制限酵素、修飾酵素、及び認識酵素からなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素の活性が欠失又は抑制されている。換言すれば、Ｉ型制限修飾系の機能が失われているか、低下している。
【００３５】
酵素活性の欠失とは、当該酵素の活性が無いことを意味する。酵素活性の抑制とは、改変される前の微生物（野生型）における酵素活性と比較して、その活性が５０％以下に低下していることを指し、好ましくは２５％以下、より好ましくは１０％以下である。Ｉ型制限修飾系酵素の活性測定は、例えば、Piero R. Bianco et al., Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, No. 10, 3377-3390 に記載の方法（DNA cleavage assay）によって行うことができる。
【００３６】
酵素の活性を欠失又は抑制させる手法としては、例えば、発現する酵素の分子数を減少（ゼロを含む）させる手法と、発現する酵素自体の活性を減少（ゼロを含む）させる手法の２つが大きく挙げられる。
【００３７】
発現する酵素の分子数を減少させる手法としては、Ｉ型制限修飾系酵素の遺伝子の発現量を転写レベル又は翻訳レベルで減少させることが挙げられる。具体的には、Ｉ型制限修飾系酵素の遺伝子のプロモーター配列やシャインダルガルノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変し、遺伝子の発現量を減少させることが挙げられる。
【００３８】
発現する酵素自体の活性を減少させる手法としては、ゲノム上のＩ型制限修飾系酵素の遺伝子の一部又は全部を欠失させることが挙げられる。例えば、制限酵素、修飾酵素、又は認識酵素をコードする遺伝子の一部又は全部が欠失した態様が挙げられる。このうち、少なくとも制限酵素をコードする遺伝子の一部又は全部が欠失した態様が好ましい。
【００３９】
発現する酵素自体の活性を減少させる他の手法としては、ゲノム上のＩ型制限修飾系酵素の遺伝子に変異を導入することが挙げられる。例えば、目的微生物に変異誘発剤等による処理を行い、標的であるＩ型制限修飾系酵素の遺伝子に変異を導入することが挙げられる。例えば、放射線照射や、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の変異剤によって目的微生物を処理し、Ｉ型制限修飾系酵素の活性が欠失又は抑制された変異微生物（改変微生物）を選抜することができる。
【００４０】
宿主微生物が本来有している酵素遺伝子を、酵素活性が低い別の遺伝子に置換してもよい。例えば、ゲノム上にある既存のＩ型制限修飾系酵素の遺伝子を、当該遺伝子にフレームシフトを生じさせた変異遺伝子、当該遺伝子に点変異を生じさせた変異遺伝子、当該遺伝子の部分断片遺伝子、等に置換することにより、Ｉ型制限修飾系酵素自体の活性を減少させることができる。
【００４１】
遺伝子の置換は、ゲノム編集（CRISPR-Cas9システム）という手法により行うこともできる。ゲノム編集は、エンドヌクレアーゼであるCas9もしくは触媒活性をもたない変異型Cas9がsgRNA（single guide RNA）と複合体を形成し、sgRNAと標的ＤＮＡが相補的に結合する領域の近傍にPAM（proto-spacer adjacent motif）と呼ばれる特定の短い塩基配列があるという条件下であれば、いかなるＤＮＡ配列も部位特異的に標的とすることが可能である。合成ガス資化性微生物におけるゲノム編集の利用は、例えば「Huang H et al.，ACS Synth Biol. 2016 Jun 15.」に記載されている。
【００４２】
遺伝子の置換は、相同組換えによっても行うことができる。相同組換えに求められる塩基配列の配列同一性は、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。なお、相同組換え法による遺伝子操作法は既に多くの細菌等で確立されており、直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、プラスミドを用いる方法等がある（米国特許第６３０３３８３号明細書、特開平０５−００７４９１号公報等）。Clostridium属細菌におけるプラスミドによる相同組換えの手法は、例えば「Heap JT et al.，J. Microbiol. Methods，2007，vol.70(3)，p.452−64」に記載されている。
【００４３】
Cas9をコードする遺伝子やsgRNAをコードする遺伝子と共に、Ｉ型制限修飾酵素の一部又は全部を欠失させるための相同ＤＮＡ配列を導入してもよい。
【００４４】
改変前の微生物に外来遺伝子等のＤＮＡ配列（ＤＮＡ断片）を導入することにより、Ｉ型制限修飾系酵素の遺伝子の一部又は全部を欠失させることができる。例えば、Ｉ型制限修飾系酵素の遺伝子の構造遺伝子内部にＤＮＡ配列を挿入することにより、Ｉ型制限修飾系酵素の遺伝子の一部又は全部を欠失させることができる。この際に導入されるＤＮＡ配列としては特に限定はなく、その微生物が元々有しているＤＮＡ配列でもよいし、その微生物が元々有していない異種ＤＮＡ配列であってもよい。導入するＤＮＡ配列としては、抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【００４５】
この際に微生物にＤＮＡ断片を導入する方法としては特に限定はなく、微生物の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、微生物に導入可能であり、かつ組換え後に自己複製できないベクターを用いることができる。例えば、微生物が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、微生物において染色体（ゲノム）中への組み込みが可能であるものを用いることができる。例えば、ベクターを用いて上記ＤＮＡ断片を導入した後、ベクターが消失する構成が好ましい。
【００４６】
偏性嫌気性酢酸生成微生物のＩ型制限修飾系酵素の例としては、以下のものが挙げられる。
【００４７】
Ｉ型制限酵素（例えば、EC:3.1.21.3）の例：
ADK13415（Clostridium ljungdahlii−hsdR）；AKN29959（Clostridium carboxidivorans−hsdR）；AFA47678（Acetobacterium woodii−hsdR1）；ADO36134（Eubacterium limosum−hsdR）等（いずれもNCBI-ProteinIDで表示）。
なお、Ｉ型制限酵素は、Ｉ型制限酵素Ｒサブユニット（type I restriction enzyme, R subunit）、Ｉ型制限酵素エンドヌクレアーゼサブユニット、とも呼ばれる。
【００４８】
Ｉ型認識酵素（例えば、EC:3.1.21.3）の例：
ADK13414（Clostridium ljungdahlii−hsdS）；AKN31535（Clostridium carboxidivorans−hsdS）；AFA47246（Acetobacterium woodii−hsdS1）；ADO36135（Eubacterium limosum−hsdS）等（いずれもNCBI-ProteinIDで表示）。
なおＩ型認識酵素は、Ｉ型制限酵素Ｓサブユニット（type I restriction enzyme, specificity subunit）とも呼ばれる。
【００４９】
Ｉ型修飾酵素（例えば、EC:2.1.1.72）の例：
ADK13413（Clostridium ljungdahlii−hsdM）；AKN33779（Clostridium carboxidivorans−hsdM）；AFA47243（Acetobacterium woodii−hsdM1）；ADO36136（Eubacterium limosum−hsdM）等（いずれもNCBI-ProteinIDで表示）。
なおＩ型修飾酵素は、Ｉ型修飾酵素Ｍサブユニット（type I restriction enzyme M protein）とも呼ばれる。
【００５０】
本発明においては、酵素活性が欠失又は抑制されている酵素は、制限酵素、修飾酵素、認識酵素のいずれか１個でもよいし、２個以上でもよい。このうち、少なくとも制限酵素の活性が欠失又は抑制されていることが好ましい。また、偏性嫌気性酢酸生成微生物が複数のＩ型制限修飾系酵素を有する場合には、少なくとも１つのＩ型制限修飾系酵素の活性が欠失又は抑制されておればよい。さらに、複数の制限酵素、修飾酵素、又は認識酵素を有する場合は、これらの少なくとも１つの活性が欠失又は抑制されておればよい。例えば、複数の制限酵素を有する場合は、１つの制限酵素の活性が欠失又は抑制されていてもよく、２以上、例えば全ての制限酵素の活性が欠失又は抑制されていてもよい。
【００５１】
具体例として、Clostridium ljungdahlii由来の上記したＩ型制限酵素ADK13414（hsdS）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００５２】
本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物は、一酸化炭素又は二酸化炭素を唯一の炭素源として増殖可能であることが好ましい。
また本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物は、一酸化炭素脱水素酵素を有するものであることが好ましい。詳細には、主に一酸化炭素代謝、すなわち一酸化炭素脱水素酵素の働きにより、一酸化炭素と水から二酸化炭素とプロトンを発生する機能によって生育する微生物が好ましい。
また本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物は、メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有することが好ましい。メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する経路は、例えば、還元型アセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）とメタノール経路（Methanol pathway）に含まれている。
本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物は、アセチルＣｏＡ経路を保有し、かつ一酸化炭素耐性と合成ガス資化性を保有する微生物が好ましい。
【００５３】
本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物は、細菌、例えばClostridium属細菌又はMoorella属細菌であることが好ましく、Clostridium ljungdahliiであることが特に好ましい。
本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物として採用可能な微生物の具体例としては、Clostridium ljungdahlii、Clostridium carboxidivorans、Moorella thermoacetica（Clostridium thermoaceticumと同じ）（Pierce EG. Et al.，Environ. Microbiol.，2008，vol.10，p.2550−2573)、Acetobacterium woodii（Dilling S. et al.，Appl. Environ. Microbiol.，2007，vol.73(11)，p.3630−3636）等のClostridium属細菌、Moorella属細菌、又はAcetobacterium属細菌が挙げられる。これらの４種の嫌気性微生物は、合成ガス資化性微生物の代表例として知られている。特に、Clostridium属細菌は、宿主−ベクター系や培養方法が確立しており、本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物として好適である。
その他の例としては、Carboxydocella sporoducens sp. Nov.（Slepova TV. et al.，Inter. J. Sys. Evol. Microbiol.，2006，vol.56，p.797−800）、Rhodopseudomonas gelatinosa（Uffen RL, J. Bacteriol.，1983，vol.155(3)，p.956−965）、Eubacterium limosum（Roh H. et al.，J. Bacteriol.，2011，vol.193(1)，p.307−308）、Butyribacterium methylotrophicum（Lynd, LH. Et al.，J. Bacteriol.，1983，vol.153(3)，p.1415−1423）等が挙げられる。
【００５４】
なお、上記で具体的に列挙した細菌の増殖及びＣＯＤＨ活性は全て酸素感受性であるが、酸素非感受性のＣＯＤＨも知られている。例えば、Bradyrhizobium japonicum（Lorite MJ. Et al.，Appl. Environ. Microbiol.，2000，vol.66(5)，p.1871−1876）を始めその他のバクテリア種には、酸素非感受性のＣＯＤＨが存在する（King GM et al.，Appl. Environ. Microbiol.，2003，vol.69(12)，p.7257−7265）。好気性水素酸化細菌であるラルソトニア（Ralsotonia）属菌にも、酸素非感受性のＣＯＤＨが存在する（NCBI Gene ID：4249199，8019399)。
このように、ＣＯＤＨを有する細菌は広く存在しており、その中から本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物を適宜選択することができる。例えば、ＣＯ、ＣＯ／Ｈ2（ＣＯとＨ2を主成分とするガス）、若しくはＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2（ＣＯとＣＯ2とＨ2を主成分とするガス）を唯一の炭素源かつエネルギー源とした選択培地を用い、嫌気的条件で、本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物として利用できるＣＯＤＨを有する細菌を分離することができる。
【００５５】
本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物は、偏性嫌気性微生物の培養方法として公知の方法で培養することができる。例えば糖類、酢酸、エタノール、メタノール、グリセリン等の炭素源を用いて、嫌気条件下で培養することができる。
【００５６】
本発明は、上記の偏性嫌気性酢酸生成微生物に目的タンパク質をコードする外来遺伝子が導入され、当該目的タンパク質を発現可能である組換え微生物を包含する。前記外来遺伝子は、ゲノム上に組み込まれていることが好ましい。
【００５７】
本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物に遺伝子（ＤＮＡ）を導入する方法としては、偏性嫌気性酢酸生成微生物の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、当該微生物に導入可能でかつ組み込まれた遺伝子を発現可能なベクターを用いることができる。
例えば、当該微生物が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記外来遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記外来遺伝子、および転写終結配列からなる一連の構成を当該微生物内で構築することが好ましい。
【００５８】
偏性嫌気性酢酸生成微生物がClostridium属細菌（Moorella属細菌のような近縁種を含む）の場合について説明すると、Clostridium属細菌と大腸菌とのシャトルベクターpIMP1（Mermelstein LD et al., Bio/technology 1992, 10, 190-195）を用いることができる。本シャトルベクターは、pUC9 (ATCC 37252)とBacillus subtilisから分離されたpIM13 (Projan SJ et al., J. Bacteriol. 1987, 169 (11), 5131-5139)との融合ベクターであり、Clostridium属細菌内でも安定的に保持される。
【００５９】
また、ベクターを用いて複数種の目的遺伝子（ＤＮＡ）を本発明の偏性嫌気性酢酸生成微生物に導入する場合、各遺伝子を１つのベクターに組み込んでもよいし、別々のベクターに組み込んでもよい。さらに１つのベクターに複数の遺伝子を組み込む場合には、各遺伝子を共通のプロモーターの下で発現させてもよいし、別々のプロモーターの下で発現させてもよい。複数種の酵素を融合タンパク質の形で発現させるべく、複数種の遺伝子を連結させた融合遺伝子を導入してもよい。
【００６０】
本発明の組換え微生物は、偏性嫌気性微生物の培養方法として公知の方法で培養することができる。例えば糖類、酢酸、エタノール、メタノール、グリセリン等の炭素源を用いて、嫌気条件下で培養することができる。
【００６１】
合成ガスを用いて培養することもできる。例えば、ガス成分を炭素源、エネルギー源とする場合は、生育に必要な無機塩類及び、合成ガスからなる栄養条件で培養する。好ましくは０．２〜０．３ＭＰａ（絶対圧）程度の加圧状態で培養することによりガス成分の資化性は高まる。さらには、初期増殖及び到達細胞密度を良好にするためには、ビタミン、酵母エキス、コーンスティープリカー、バクトトリプトン等の有機物を少量加えてよい。
【００６２】
本発明の組換え微生物を培養することにより、導入した外来遺伝子がコードする目的タンパク質を発現させることができる。必要に応じて、培養物から目的タンパク質を単離することができる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００６４】
（１）Ｉ型制限酵素欠失用CRISPR-Cas9およびsgRNA発現ベクターの構築
Ｉ型制限酵素欠失用CRISPR-Cas9およびsgRNA発現遺伝子クラスターである配列番号２の人工合成遺伝子（６７０１ｂｐ）を構築した。該遺伝子クラスターは、Streptococcus pyogenes由来Csn1（エンドヌクレアーゼ、GenBank: AAZ51387.1）、sgRNA発現カセットの各遺伝子とClostridium ljungdahliiのhsdR（Ｉ型制限酵素、GenBank: ADK13415.1）の上流配列（LHA、1008bp）、下流配列（RHA、999bp）、thlプロモーター（Pthl）、araEプロモーター（ParaE）、fdxターミネーター（fdx terminator）を含み、さらに、両末端にそれぞれNotIとXhoIの認識配列を含む。
Clostridium/E. coliシャトルベクターpCL2のBamHI/SalIサイトに配列番号３の人工合成ＤＮＡ（４３ｂｐ）をクローニングし、pCL2-MSとした。さらに、pCL2-MSのNotI/XhoIサイトに、配列番号２の人工合成遺伝子をNotI/XhoIで制限酵素処理した遺伝子断片をクローニングし、pCL2-TypeIKO（図１）とした。これらのクローニングの際には大腸菌JM109を用いた。pCL2-TypeIKOもpCL2と同様にシャトルベクターとして機能する。pCL2-TypeIKOの全塩基配列を配列番号４に示す。【００６５】
（２）Ｉ型制限酵素活性が欠失した改変型Clostridium ljungdahliiの作製
上記（１）で作製したpCL2-TypeIKOを、エレクトロポレーションにてClostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）に導入し、組換え体（改変型Clostridium ljungdahlii）を取得した。コントロールとして、pCL2-MSを同様にしてClostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）に導入し、組換え体を取得した。エレクトロポレーションは、Appl. Environ. Microbiol. 2013, 79(4):1102-9で推奨されている方法によって行った。取得した組換え体のゲノムＤＮＡを抽出してシークエンシングを行い、ゲノム上からＩ型制限酵素遺伝子が欠失していることを確認した。【００６６】
（３）改変型Clostridium ljungdahliiによる形質転換効率向上の確認 
Clostridium/E. coliシャトルベクターpCL2を、エレクトロポレーションにて、上記（２）で取得したＩ型制限酵素欠失組換え体（改変型Clostridium ljungdahlii）および野生型Clostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）に導入し、形質転換効率の比較を行った。その結果、宿主として野生型Clostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）を用いた場合においては、形質転換効率が１．０×１０2ｃｆｕ／μｇであったのに対し、Ｉ型制限酵素欠失組換え体（改変型Clostridium ljungdahlii）を用いた場合では、１．０×１０5ｃｆｕ／μｇの値が得られ、有意に形質転換効率が向上した。
以上のことから、Ｉ型制限酵素活性が欠失した改変型Clostridium ljungdahliiを用いることで、形質転換効率が向上し、Clostridium ljungdahliiへの形質転換を容易に実施できることが示された。【００６７】
（４）改変型Clostridium ljungdahliiによる遺伝子欠失効率向上の確認
Appl. Environ. Microbiol. 2013, 79(4):1102-9を参照し、C. ljungdahliiのpta遺伝子(CLJU_c12770)の上流配列と下流配列、及びクラリスロマイシン耐性遺伝子ermC(GenBank: AB982225.1)を含むpUC-Δpta-ermC（配列番号５）を作製した。前記pUC-Δpta-ermCを、エレクトロポレーションにて、上記（２）で取得したＩ型制限酵素欠失組換え体（改変型Clostridium ljungdahlii）および野生型Clostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）に導入し、遺伝子欠失効率の比較を行った。その結果、宿主として野生型Clostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）を用いた場合において取得した遺伝子欠失体は、１クローンのみであったのに対し、Ｉ型制限酵素欠失組換え体（改変型Clostridium ljungdahlii）を用いた場合では、１３クローン取得できたことから、有意に遺伝子欠失効率が向上した。
以上のことから、Ｉ型制限酵素活性が欠失した改変型Clostridium ljungdahliiを用いることで、遺伝子欠失効率が向上し、Clostridium ljungdahliiのゲノム遺伝子改変を容易に実施できることが示された。【００６８】
（５）改変型Clostridium ljungdahliiの増殖効率の確認
上記（２）で取得したＩ型制限酵素欠失組換え体（改変型Clostridium ljungdahlii）、及び野生型Clostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）を、それぞれ３７℃、嫌気条件下で培養した。具体的には、ATCC1754培地（ただしpH=5.5、フルクトース非含有）２５ｍＬに植菌し、ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2＝３３／３３／３４％（体積比）の混合ガスを１００ｍＬ容の密閉可能なヘッドスペースバイアル容器に仕込み、０．２５ＭＰａ（絶対圧）のガス圧で充填し、アルミキャップで密封した後、振とう培養した。その結果、Ｉ型制限酵素欠失組換え体（改変型Clostridium ljungdahlii）において、野生型Clostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）と同等の増殖が確認された。
以上のことから、Ｉ型制限酵素欠失変異は、増殖に影響しないことが示された。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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