(57)【要約】本発明は、無細胞翻訳系を用いて、従来の手法（ＡＲＳを使用せずに、翻訳系外で保護基を有しないアミノアシルｔＲＮＡを調製した後に翻訳系内に添加する手法）と比較して優れた翻訳効率を達成することが可能な、多様な構造を持つアミノ酸を含むペプチドの合成方法を提供することを課題とする。本発明において、ｔＲＮＡに結合しているアミノ酸を適切な保護基で保護することにより、無細胞翻訳系においてｔＲＮＡに結合しているアミノ酸の保護基を脱保護する工程と、鋳型核酸からペプチドを翻訳する工程を並行して行い、アミノ酸を含むペプチドを効率的に合成できることが見出された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
保護基を有するアミノ酸が結合したｔＲＮＡを含む無細胞翻訳系中で、該アミノ酸の保護基を脱保護する工程、及び翻訳工程を含む、少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチドの合成方法であって、該脱保護する工程、および該翻訳工程が並行して行われる、方法。
【請求項２】
前記アミノ酸の保護基が、酵素、還元剤、及び光反応からなる群より選択される一以上によって脱保護される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が、加水分解酵素である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が、ペニシリンアミドヒドロラーゼ、エステラーゼ、又はアミノペプチダーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記保護基が、下記一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＸＩＩ）で表される基である、請求項４に記載の方法：
2018143145.tif 000130
（式中、
Ｘ１は、ペニシリンアミドヒドロラーゼが認識する部分構造であり、
Ｙは、ＮＨもしくは酸素原子であり、
Ｘ２は、エステラーゼが認識する部分構造であり、
Ｘ３は、アミノペプチダーゼが認識する部分構造であり、
Ｌは、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである）。
【請求項６】
前記式（Ｉ）中のＸ１が以下一般式（ＩＶ）で表される基、もしくは２−チエニルメチルであるか、または、前記式（ＩＩＩ）中のＸ２が置換されてもよいアルキル、アラルキル、またはシクロアルキルである、請求項５に記載の方法：
2018143145.tif 000131
（式中のＲ１、およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル、フルオロ、クロロ、ブロモ、アミノ、ニトロ、またはメトキシである）。
【請求項７】
前記式（ＸＩＩ）が、下記一般式（ＸＩＩＩ）で表される基である、請求項５に記載の方法：
2018143145.tif 000132
【請求項８】
前記還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記保護基が、下記一般式（Ｖ）で表される基であるか、又は主鎖のアミノ基と一緒になって形成されたアジド基である、請求項８に記載の方法：
2018143145.tif 000133
（式中のＬは、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである）。
【請求項１０】
前記保護基が、４−アジドベンジルオキシカルボニル基（Ａｃｂｚ）、又はアジドメチルオキシカルボニル基（Ａｚｏｃ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アミノ酸が、アミノ酸類縁体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アミノ酸類縁体が、環状アミノ酸を含むＮアルキルアミノ酸、脂肪族アミノ酸、芳香族アミノ酸、βアミノ酸、Ｄアミノ酸、及びαジアルキルアミノ酸からなる群より選ばれる１種以上の翻訳可能なアミノ酸類縁体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アミノ酸類縁体が、下記一般式（ＶＩ）または（ＶＩＩ）で表される、請求項１２に記載の方法：
2018143145.tif 000134
（式中、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはシクロアルキルであり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはＲ３とＲ４もしくはＲ３とＲ５は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成してもよく、
Ｒ６、およびＲ７は、それぞれ独立して水素原子またはメチルである）。
【請求項１４】
前記保護基が、翻訳後修飾のために用いられる反応条件とオルソゴナルな反応条件によって脱保護される保護基である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記保護基が、iSP(Initiation Suppression)法で用いられる保護基とオルソゴナルな保護基である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
下記一般式（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）で表される、アミノ酸類縁体の主鎖のアミノ基上に、保護基Ｐ１を有する化合物：
2018143145.tif 000135
（式中、Ｒ３〜Ｒ７はそれぞれ請求項１３に定義したとおりであり、Ｐ１は請求項５〜７のいずれか一項に記載の保護基である）。
【請求項１７】
下記一般式（Ｘ）または（ＸＩ）で表される、請求項１６に記載の化合物とｐＣｐＡ、又はｐｄＣｐＡとが結合してなる化合物：
2018143145.tif 000136
（式中、Ｒ３〜Ｒ７はそれぞれ請求項１３に定義したとおりであり、Ｒ８は水素原子またはヒドロキシルであり、Ｐ１は請求項５〜７のいずれか一項に記載の保護基である）。
【請求項１８】
請求項１６に記載の化合物とｔＲＮＡが結合してなるアミノアシルｔＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞翻訳系を用いたペプチドの合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
中分子化合物（分子量：５００〜２０００）は、タフターゲットにアクセスできる点で低分子には困難なこと、細胞内に移行できる点（細胞内標的創薬可、経口化可）で抗体にも困難なことを実現できる可能性があることから注目を集めている。中分子化合物の代表的な分子種としてペプチドがある。天然物であるシクロスポリンＡはその代表例であり、細胞内標的であるサイクロフィリンを阻害する経口投与可能なペプチドである。【０００３】
シクロスポリンＡの特徴として、非天然型アミノ酸を構成成分に含む環状ペプチドであることが挙げられる。これに端を発し、近年、非天然型アミノ酸をペプチドに導入することでペプチドのdrug-likenessを高め、さらにそれを創薬へ応用する研究が複数報告されている(非特許文献５，６，７)。このような非天然型アミノ酸の導入は、水素結合供与性水素の減少、プロテアーゼ耐性の獲得、コンフォーメーションの固定化につながり、膜透過性や代謝安定性に寄与することも知られるようになった(非特許文献５、８、特許文献３)。
このことから、非天然型アミノ酸を複数含む多様なペプチドのライブラリーから医薬品の候補物質を選択する創薬方法が考えられている。なかでも無細胞翻訳系を利用した非天然型アミノ酸を含有するペプチドのｍＲＮＡディスプレイライブラリーなどは、その多様性、スクリーニングの簡便性の点から期待が集まっている(非特許文献９，１０、特許文献２)。【０００４】
地球上の生物は一般的に、ＤＮＡ（＝情報貯蔵物質）の情報が、ＲＮＡ（＝情報伝達物質）を介して、タンパク質（＝機能物質）の構造ならびにその構造によって生じる機能を規定している。ポリペプチドやタンパク質は２０種類のアミノ酸からなる。４種類のヌクレオチドからなるＤＮＡからＲＮＡに情報が転写され、その情報がアミノ酸に翻訳され、アミノ酸がポリペプチドやタンパク質を構成する。【０００５】
翻訳の際、３文字のヌクレオチドの並びを１種類のアミノ酸に対応させるアダプターとしての役割を果たすのがｔＲＮＡである。また、ｔＲＮＡとアミノ酸との結合に関与するのが、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（aminoacyl-tRNA syathetase；ARS）である。ＡＲＳはアミノ酸とｔＲＮＡとを特異的に結合させる酵素である。生物種毎に、一部の例外を除き、天然に存在する２０種類のアミノ酸それぞれに対応する２０種類のＡＲＳが存在する。ＡＲＳは、ｔＲＮＡを、２０種類のタンパク性アミノ酸のうち当該ｔＲＮＡのコドンに割りつけられた特定のアミノ酸で正確にアシル化する。【０００６】
ｍＲＮＡの翻訳による非天然型アミノ酸を含有するペプチドの合成に必要な非天然型アミノアシルｔＲＮＡは、上述したＡＲＳを使用して調製できることが報告されている（非特許文献１）。しかし天然型ＡＲＳは基質特異性が高く、ＡＲＳがアシル化することができるアミノ酸の構造は、天然型アミノ酸のそれに類似したものに限定される。したがって、ＡＲＳを使用して非天然型アミノアシルｔＲＮＡを調製することは、汎用性の高い方法とはいえない。また近年では、その基質特異性を変化させた改変型ＡＲＳを作成することにより、一部の非天然型アミノ酸に対するアミノアシル化効率の向上が達成されている（特許文献１）。しかしながらこの手法を用いた場合、改変型ＡＲＳもアミノ酸毎に用意する必要があることから、多大な時間と労力を要する。
このように、ＡＲＳを使用して多様な構造を持つ非天然型アミノ酸をアミノアシル化することは簡単ではない。このような背景から、ＡＲＳを用いない、多様な構造を持つ非天然型アミノアシルｔＲＮＡの調製法（ｎｏｎ−ＡＲＳ法と定義する）が知られている。代表的なものとして以下の方法が挙げられる。【０００７】
まず、Hechtらが開発したｐｄＣｐＡ法（非特許文献２）では、化学合成した非天然型アミノ酸でアシル化されたｐｄＣｐＡ（5’-phospho-2’-deooxyribocytidylriboadenosine）と転写で得た３’末端のＣＡが欠如したｔＲＮＡをT4 RNA ligaseにより連結することができる。この方法では、原理上化学合成さえ可能であれば、構造の制限なく、任意の非天然型アミノ酸でアミノアシル化されたｔＲＮＡを調製することが可能である。またForsterらは、ｐｄＣｐＡの代わりにｐＣｐＡ（5’-phospho-ribocytidylriboadenosine）を用いたｐＣｐＡ法について報告している（非特許文献３）。【０００８】
別の方法として、Sugaらは、あらかじめエステル化により活性化した非天然型アミノ酸を人工ＲＮＡ触媒（フレキシザイム）を用いてｔＲＮＡにアミノアシル化させる方法を報告している（特許文献２）。こちらも任意の非天然型アミノ酸でアミノアシル化されたｔＲＮＡを調製できると考えられる。
なおこれらｎｏｎ−ＡＲＳ法においては、翻訳系の外で調製された非天然型アミノアシルｔＲＮＡを翻訳反応液に添加することにより、ペプチドを合成する。【０００９】
上記のいずれかの手法を用いることにより、多様な構造を持つ非天然型アミノアシルｔＲＮＡを調製することが可能である。全ての非天然型アミノ酸を翻訳によりペプチドに導入することが可能とは限らないが、多様なαアミノ酸、Ｎアルキルアミノ酸、またβアミノ酸やＤ−アミノ酸などを翻訳によりペプチドに導入することが検討、報告されている（非特許文献４）。【００１０】
またKawakamiらは、翻訳後修飾を活用することにより、従来では翻訳により導入することが不可能であった正もしくは負に帯電した置換基を側鎖に持つＮアルキルアミノ酸を含むペプチドを合成することに成功している（非特許文献１４）。これは直接的に翻訳効率を改善した例ではないが、多様な構造を持つ非天然型アミノ酸を含むペプチドを合成するための有効な手法のひとつであると考えられる。【００１１】
非天然型アミノアシルｔＲＮＡを使用してペプチドを合成する際に、ペプチドの翻訳効率を改善した手法として、リボソームの改変（非特許文献１５）や、ＥＦ−Ｔｕの改変（非特許文献１６）などが報告されている。これら改変体を用いる手法は、意図した構造を持つ非天然型アミノ酸に対する基質特異性を変化させるため、その構造毎に非天然型アミノアシルｔＲＮＡを用意する必要があり、多大な労力を要する。多様な構造を持つ非天然型アミノ酸に対して翻訳効率の改善効果を有する汎用性の高い手法は、本発明者らの知る限り報告されていない。【００１２】
また、無細胞翻訳系中に大量のｔＲＮＡを添加すると、ペプチド収量が低下する一因となることが知られている（非特許文献１７)。そのため、無細胞翻訳系中に天然には存在しない成分を添加すると、ペプチドの翻訳合成が妨げられ、収量に影響を及ぼす可能性があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】WO2007/103307
【特許文献２】WO2007/066627
【特許文献３】WO2013/100132
【００１４】
【非特許文献１】M. C. T. Hartman et al., PLoS one, 2007, 10, e972.
【非特許文献２】S.M. Hecht et al., J. Biol. Chem. 253 (1978) 4517-4520.
【非特許文献３】J. Wang et al., ACS. Chem. Biol. 2015, 10, 2187-2192.
【非特許文献４】R. Maini et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2016, 34, 44-52.
【非特許文献５】R. S. Lokey et al., Nat. Chem. Biol. 2011, 7(11), 810-817.
【非特許文献６】J. W. Szostak et al., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 6131-6136.
【非特許文献７】T．Kawakami et al., Chemistry & Biology, 2008，Vol. 15, 32-42.
【非特許文献８】H. Kessler et al., J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12125-12133.
【非特許文献９】S. W. Millward et al., J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 14142-14143.
【非特許文献１０】Y. Yamagishi et al., Chem. Biol., 18, 1562-1570, 2011.
【非特許文献１１】T. Fujino et al., J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 1830-1837.
【非特許文献１２】T. Fujino et al., J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 1962-1969.
【非特許文献１３】T. Kawakami et al., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16861-16863.
【非特許文献１４】T．Kawakami et al., Chem. Sci., 2014，5, 887-893.
【非特許文献１５】R. Maini et al., Biochemistry. 2015, 54, 3694-3706.
【非特許文献１６】Y. Doi et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 14458-14462.
【非特許文献１７】A. O. Subtelny et al., Angew Chem Int Ed 2011 50 3164.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本願発明者らはこれまでに、目的の活性を有する中分子環状ペプチドの取得の可能性を高めるため、直鎖部を有するなど構造の多様性に着目してペプチドディスプレイライブラリーを構築してきた。その検討のなかで、多様な標的に対して結合するペプチドの取得の可能性をより大きく高めるためには、側鎖の性質が異なるアミノ酸を多種類導入することも重要であると考えるに至った。その考えのもと、翻訳合成による導入報告例の無い多様な構造を持つ天然アミノ酸およびアミノ酸類縁体を合成し、ｐＣｐＡ法により調製したアミノアシルｔＲＮＡを使用して当該天然アミノ酸およびアミノ酸類縁体の翻訳導入を試みた。しかし、全く翻訳されないものや、翻訳が不十分なものが散見された。本願発明者らは、天然アミノ酸やアミノ酸類縁体の構造は多岐に渡るため、それらの全てに対応する改変体（例えばリボソームだがこれに限らない）を調製することは現実的でないとの判断に至った。【００１６】
本発明はこのような情況に鑑みて為されたものであり、多様な構造を持つ天然アミノ酸およびアミノ酸類縁体に対して従来の手法、すなわちＡＲＳによらない手法により無保護のアミノアシルｔＲＮＡを翻訳系外で調製した後に、当該アミノアシルｔＲＮＡを翻訳系内に添加する手法、と比較して優れた翻訳効率を達成する、無細胞翻訳系を用いたペプチドの合成方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決するために検討した結果、従来の手法と比較して多様な構造を持つ天然アミノ酸およびアミノ酸類縁体を含むペプチドの翻訳効率を改善できることを見出した。具体的には、保護基を持つ天然アミノ酸やアミノ酸類縁体が結合しているアミノアシルｔＲＮＡを無細胞翻訳系内に添加し、当該系内で脱保護とペプチド翻訳を並行して行う手法の確立に成功した。【００１８】
この手法を着想するにあたり、本発明者らは、アミノアシルｔＲＮＡの加水分解に着目し、これを最小限に止めることにより翻訳効率を改善できるとの仮説を持った。アミノアシルｔＲＮＡは、翻訳系内においては、ＥＦ−ｔｕと複合体を形成することにより、加水分解に対する安定性を増すことが知られている。しかしながら、ＥＦ−ｔｕは天然型のアミノアシルｔＲＮＡを本来の基質とするため、多様な構造を持つ非天然型アミノアシルｔＲＮＡがＥＦ−ｔｕと複合体を形成する能力は、天然型とのそれと比較して弱いと考えられる。すなわち、構造により程度の差はあれ、非天然型アミノアシルｔＲＮＡはこの安定化効果を得難いであろうと考えられる。まず本発明者らは、この推測のもと、ＥＦ−ｔｕの濃度を上げることで、非天然型アミノアシルｔＲＮＡの加水分解に対する安定性を増加させることを考え、検討を行った。しかしながら、翻訳効率の改善は不十分であった。また上述したように、従来の手法では、無細胞翻訳系外で無保護のアミノアシルｔＲＮＡを調製しそれを系内に添加するために、調製中においても少なからず加水分解が進行してしまうことも見出した。すなわち、翻訳系外におけるアミノアシルｔＲＮＡ単独での加水分解、及びアミノ酸類縁体ゆえの翻訳系内における加水分解、これら２つがアミノ酸類縁体の翻訳効率を低下させている一因であると推定した。一方で、窒素原子が保護されたアミノ酸類縁体が結合しているアミノアシルｔＲＮＡは、無保護のアミノアシルｔＲＮＡと比較して加水分解に対する安定性が向上することを見出していた。【００１９】
以上の知見から、本発明者らは、窒素原子が保護されたアミノ酸類縁体が結合しているアミノアシルｔＲＮＡを翻訳系内に添加し、系内で脱保護する手法を開発できれば、上述した２つの加水分解の影響を最小限に止めることが可能と考えた。その考えのもとに本発明者らは種々検討を行い、適切な保護基を見出し、多様な構造を持つ天然アミノ酸およびアミノ酸類縁体を従来法と比較して効率よく翻訳することが可能である、本発明を完成するに至った。【００２０】
本発明はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下〔１〕から〔１８〕に記載の発明を提供する。
〔１〕保護基を有するアミノ酸が結合したｔＲＮＡを含む無細胞翻訳系中で、該アミノ酸の保護基を脱保護する工程、及び翻訳工程を含む、少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチドの合成方法であって、該脱保護する工程、および該翻訳工程が並行して行われる、方法。
〔２〕前記アミノ酸の保護基が、酵素、還元剤、及び光反応からなる群より選択される一以上によって脱保護される、〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記酵素が、加水分解酵素である、〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記酵素が、ペニシリンアミドヒドロラーゼ、エステラーゼ、又はアミノペプチダーゼである、〔３〕に記載の方法。
〔５〕前記保護基が、下記一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＸＩＩ）で表される基である、〔４〕に記載の方法：
2018143145.tif 000002
（式中、
Ｘ１は、ペニシリンアミドヒドロラーゼが認識する部分構造であり、
Ｙは、ＮＨもしくは酸素原子であり、
Ｘ２は、エステラーゼが認識する部分構造であり、
Ｘ３は、アミノペプチダーゼが認識する部分構造であり、
Ｌは、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである）。
〔６〕前記式（Ｉ）中のＸ１が以下一般式（ＩＶ）で表される基、もしくは２−チエニルメチルであるか、または、前記式（ＩＩＩ）中のＸ２が置換されてもよいアルキル、アラルキル、またはシクロアルキルである、〔５〕に記載の方法：
2018143145.tif 000003
（式中のＲ１、およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル、フルオロ、クロロ、ブロモ、アミノ、ニトロ、またはメトキシである）。
〔７〕前記式（ＸＩＩ）が、下記一般式（ＸＩＩＩ）で表される基である、〔５〕に記載の方法：
2018143145.tif 000004
〔８〕前記還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、〔２〕に記載の方法。
〔９〕前記保護基が、下記一般式（Ｖ）で表される基であるか、又は主鎖のアミノ基と一緒になって形成されたアジド基である、〔８〕に記載の方法：
2018143145.tif 000005
（式中のＬは、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである）。
〔１０〕前記保護基が、４−アジドベンジルオキシカルボニル基（Ａｃｂｚ）、又はアジドメチルオキシカルボニル基（Ａｚｏｃ）である、〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記アミノ酸が、アミノ酸類縁体である、〔１〕〜〔１０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２〕前記アミノ酸類縁体が、環状アミノ酸を含むＮアルキルアミノ酸、脂肪族アミノ酸、芳香族アミノ酸、βアミノ酸、Ｄアミノ酸、及びαジアルキルアミノ酸からなる群より選ばれる１種以上の翻訳可能なアミノ酸類縁体である、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕前記アミノ酸類縁体が、下記一般式（ＶＩ）または（ＶＩＩ）で表される、〔１２〕に記載の方法：
2018143145.tif 000006
（式中、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはシクロアルキルであり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはＲ３とＲ４もしくはＲ３とＲ５は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成してもよく、
Ｒ６、およびＲ７は、それぞれ独立して水素原子またはメチルである）。
〔１４〕前記保護基が、翻訳後修飾のために用いられる反応条件とオルソゴナルな反応条件によって脱保護される保護基である、〔１〕〜〔１３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１５〕前記保護基が、iSP(Initiation Suppression)法で用いられる保護基とオルソゴナルな保護基である、〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕下記一般式（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）で表される、アミノ酸類縁体の主鎖のアミノ基上に、保護基Ｐ１を有する化合物：
2018143145.tif 000007
（式中、Ｒ３〜Ｒ７はそれぞれ〔１３〕に定義したとおりであり、Ｐ１は〔５〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の保護基である）。
〔１７〕下記一般式（Ｘ）または（ＸＩ）で表される、〔１６〕に記載の化合物とｐＣｐＡ、又はｐｄＣｐＡとが結合してなる化合物：
2018143145.tif 000008
（式中、Ｒ３〜Ｒ７はそれぞれ〔１３〕に定義したとおりであり、Ｒ８は水素原子またはヒドロキシルであり、Ｐ１は〔５〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の保護基である）。
〔１８〕〔１６〕に記載の化合物とｔＲＮＡが結合してなるアミノアシルｔＲＮＡ。【００２１】
本発明においては、さらに、以下の〔２−１〕から〔２−１３〕に記載の発明も提供される。
〔２−１〕保護基を有する、無細胞翻訳系の１種以上の構成成分を、該無細胞翻訳系中で脱保護する工程、及び翻訳工程を含む、ペプチドの合成方法であって、該脱保護する工程および該翻訳工程が並行して行われる、方法。
〔２−２〕保護基を有する、無細胞翻訳系の１種以上の構成成分を、該無細胞翻訳系中で酵素、還元剤、または光反応によって脱保護する工程、及び翻訳工程を含む、ペプチドの合成方法であって、該脱保護する工程および該翻訳工程が並行して行われる、方法。
〔２−３〕保護基を有するアミノ酸が結合したｔＲＮＡを含む無細胞翻訳系中で、該アミノ酸の保護基を酵素、還元剤、または光反応によって脱保護する工程、及び翻訳工程を含む、ペプチドの合成方法。
〔２−４〕無細胞翻訳系中で、前記アミノ酸の保護基を脱保護した後に翻訳工程を開始する、〔２−３〕に記載の方法。
〔２−５〕１種以上のアミノ酸残基を含み、かつ環状部を有するペプチドと当該ペプチドをコードする核酸との複合体、又は当該複合体を含むライブラリーの製造方法であって、〔２−１〕〜〔２−４〕に記載の方法によりペプチドを合成する工程、及び合成されたペプチドを環化する工程を含む、方法。
〔２−６〕アミド結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、エーテル結合、エステル結合、チオエステル結合、又は炭素-炭素結合によって前記ペプチドが環化される、〔２−５〕に記載の方法。
〔２−７〕ペプチドの合成方法における酵素、還元剤、または光反応によって脱保護される保護基の使用であって、該方法は、保護基を有する、無細胞翻訳系の１種以上の構成成分を、該無細胞翻訳系中で脱保護する工程、及び翻訳工程を含み、該脱保護する工程および該翻訳工程が並行して行われる、前記使用。
〔２−８〕ペプチドの合成方法における酵素、還元剤、または光反応によって脱保護される保護基の使用であって、該方法は、保護基を有するアミノ酸が結合したｔＲＮＡを含む無細胞翻訳系中で、該アミノ酸の保護基を脱保護する工程、及び翻訳工程を含み、該脱保護する工程および該翻訳工程が並行して行われる、前記使用。
〔２−９〕保護基を有する、無細胞翻訳系の１種以上の構成成分を、該無細胞翻訳系中で脱保護する工程、及び翻訳工程を含む、合成されるペプチドの収率を上げる方法であって、該脱保護する工程および該翻訳工程が並行して行われる、方法。
〔２−１０〕保護基を有するアミノ酸が結合したｔＲＮＡを含む無細胞翻訳系中で、該アミノ酸の保護基を脱保護する工程、及び翻訳工程を含む、合成されるペプチドの収率を上げる方法であって、該脱保護する工程および該翻訳工程が並行して行われる、方法。
〔２−１１〕ペプチドの合成方法において使用するための、酵素、還元剤、または光反応によって脱保護される保護基であって、該方法は、保護基を有する、無細胞翻訳系の１種以上の構成成分を、該無細胞翻訳系中で脱保護する工程、及び翻訳工程を含み、該脱保護する工程および該翻訳工程が並行して行われる、前記保護基。
〔２−１２〕ペプチドの合成方法において使用するための、酵素、還元剤、または光反応によって脱保護される保護基であって、該方法は、保護基を有するアミノ酸が結合したｔＲＮＡを含む無細胞翻訳系中で、該アミノ酸の保護基を脱保護する工程、及び翻訳工程を含み、該脱保護する工程および該翻訳工程が並行して行われる、前記保護基。
〔２−１３〕前記アミノ酸が、アミノ酸類縁体である、〔２−３〕〜〔２−６〕、〔２−１０〕のいずれか一項に記載の方法、〔２−８〕に記載の使用、または〔２−１２〕に記載の保護基。
【発明の効果】
【００２２】
本発明では、無細胞翻訳系中で翻訳工程と並行し、アミノアシルｔＲＮＡを構成するアミノ酸の保護基を脱保護する。本発明により、無細胞翻訳系外で脱保護を行う従来のｐＣｐＡ法と比較して、翻訳効率が向上したペプチドの合成方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１−１】AAtR-1, AAtR-4, AAtR-7を用いて行った翻訳合成ペプチドの主生成物の分子量をMALDI TOF MSにより確認した実験結果を示す図である。
【図１−２】AAtR-2, AAtR-5, AAtR-8を用いて行った翻訳合成ペプチドの主生成物の分子量をMALDI TOF MSにより確認した実験結果を示す図である。
【図１−３】AAtR-3, AAtR-6, AAtR-9を用いて行った翻訳合成ペプチドの主生成物の分子量をMALDI TOF MSにより確認した実験結果を示す図である。
【図１−４】AAtR-10, AAtR-16を用いて行った翻訳合成ペプチドの主生成物の分子量をMALDI TOF MSにより確認した実験結果を示す図である。
【図１−５】AAtR-11, AAtR-17を用いて行った翻訳合成ペプチドの主生成物の分子量をMALDI TOF MSにより確認した実験結果を示す図である。
【図１−６】AAtR-12, AAtR-18を用いて行った翻訳合成ペプチドの主生成物の分子量をMALDI TOF MSにより確認した実験結果を示す図である。
【図１−７】AAtR-13, AAtR-19を用いて行った翻訳合成ペプチドの主生成物の分子量をMALDI TOF MSにより確認した実験結果を示す図である。
【図１−８】AAtR-14, AAtR-20を用いて行った翻訳合成ペプチドの主生成物の分子量をMALDI TOF MSにより確認した実験結果を示す図である。
【図１−９】AAtR-15, AAtR-21を用いて行った翻訳合成ペプチドの主生成物の分子量をMALDI TOF MSにより確認した実験結果を示す図である。
【図２−１】AAtR-1〜AAtR-9を用いた翻訳合成ペプチドの翻訳量を電気泳動により確認した実験結果を示す図である（Pep-4はAAtR-1、Pep-5はAAtR-2、Pep-6はAAtR-3を用いて合成されたペプチドの翻訳量を基準(100)として、相対値が記載されている）。
【図２−２】AAtR-10〜AAtR-13、AAtR-16〜AAtR-19を用いた翻訳合成ペプチドの翻訳量を電気泳動により確認した実験結果を示す図である（Pep-14はAAtR-11、Pep-15はAAtR-12、Pep-16はAAtR-13、Pep-13はAAtR-10を用いて合成されたペプチドの翻訳量を基準(100)として、相対値が記載されている）。
【図２−３】AAtR-14, AAtR-20を用いた翻訳合成ペプチドの翻訳量を電気泳動により確認した実験結果を示す図である（Pep-17はAAtR-14を用いて合成されたペプチドの翻訳量を基準(100)として、相対値が記載されている）。
【図２−４】AAtR-15, AAtR-21を用いた翻訳合成ペプチドの翻訳量を電気泳動により確認した実験結果を示す図である（Pep-18はAAtR-15を用いて合成されたペプチドの翻訳量を基準(100)として、相対値が記載されている）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
＜置換基等の定義＞
本明細書において、「アルキル」とは脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される１価の基であり、骨格中にヘテロ原子または不飽和の炭素−炭素結合を含有せず、水素および炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する。炭素鎖の長さｎは１〜２０個の範囲であり、好ましくはＣ２−Ｃ１０アルキルである。アルキルとしては、たとえば、「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソプロピル、ｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、１−メチルプロピル基、１，１−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１，１，２，２−テトラメチルプロピル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、イソペンチル、ネオペンチル等が挙げられる。
【００２５】
本明細書において「アルケニル」とは、少なくとも１個の二重結合（２個の隣接ＳＰ２炭素原子）を有する１価の基である。二重結合および置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。アルケニルとしては、直鎖状または分枝鎖状のものが挙げられ、内部オレフィンを含む直鎖などを含む。好ましくはＣ２−Ｃ１０アルケニル、さらに好ましくはＣ２−Ｃ６アルケニルが挙げられる。
このようなアルケニルとして、具体的には、たとえば、ビニル、アリル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル（シス、トランスを含む）、３−ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。
【００２６】
本明細書において「アルキニル」は、少なくとも１個の三重結合（２個の隣接ＳＰ炭素原子）を有する、１価の基である。直鎖状または分枝鎖状のアルキニルが挙げられ、内部アルキレンを含む。好ましくはＣ２−Ｃ１０アルキニル、さらに好ましくはＣ２−Ｃ６アルキニルが挙げられる。
アルキニルとしては具体的には、たとえば、エチニル、１−プロピニル、プロパルギル、３−ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、３−フェニル−２−プロピニル、３−（２'−フルオロフェニル）−２−プロピニル、２−ヒドロキシ−２−プロピニル、３−（３−フルオロフェニル）−２−プロピニル、３−メチル−（５−フェニル）−４−ペンチニルなどが挙げられる。
【００２７】
本明細書において「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に飽和した環状の１価の脂肪族炭化水素基を意味し、単環、ビシクロ環、スピロ環を含む。好ましくはＣ３−Ｃ１０シクロアルキルが挙げられる。シクロアルキルとしては具体的には、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチルなどが挙げられる。
【００２８】
本明細書において「アリール」とは、１価の芳香族炭化水素環を意味し、好ましくはＣ６−Ｃ１０アリールが挙げられる。アリールとしては具体的には、たとえば、フェニル、ナフチル（たとえば、１−ナフチル、２−ナフチル）などが挙げられる。
【００２９】
本明細書において「ヘテロアリール」とは、環を構成する原子中に好ましくは１〜５個のヘテロ原子を含有する芳香族性の環の１価の基を意味し、部分的に飽和されていてもよい。環は単環、または２個の縮合環（たとえば、ベンゼンまたは単環へテロアリールと縮合した２環式ヘテロアリール）であってもよい。環を構成する原子の数は好ましくは５〜１０である（５員−１０員ヘテロアリール）。
ヘテロアリールとしては具体的には、たとえば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられる。
【００３０】
本明細書において「アリールアルキル（アラルキル）」とは、アリールとアルキルを共に含む基であり、例えば、前記アルキルの少なくとも一つの水素原子がアリールで置換された基を意味し、好ましくは、「Ｃ５〜Ｃ１０アリールＣ１−Ｃ６アルキル」が挙げられる。たとえば、ベンジルなどが挙げられる。
【００３１】
本明細書において「アリーレン」は、前記アリールからさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される２価の基を意味する。アリーレンは、単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は特に限定されないが、好ましくは６〜１０である（Ｃ６〜１０アリーレン）。アリーレンとして具体的には、たとえば、フェニレン、ナフチレンなどが挙げられる。
【００３２】
本明細書において「ヘテロアリーレン」は、前記ヘテロアリールからさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される２価の基を意味する。ヘテロアリーレンは、単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は特に限定されないが、好ましくは５〜１０である（５員〜１０員ヘテロアリーレン）。ヘテロアリーレンとして具体的には、ピロールジイル、イミダゾールジイル、ピラゾールジイル、ピリジンジイル、ピリダジンジイル、ピリミジンジイル、ピラジンジイル、トリアゾールジイル、トリアジンジイル、イソオキサゾールジイル、オキサゾールジイル、オキサジアゾールジイル、イソチアゾールジイル、チアゾールジイル、チアジアゾールジイル、フランジイルおよびチオフェンジイルなどが挙げられる。
【００３３】
本発明において、ペプチドを構成する「アミノ酸」は、「天然アミノ酸」でも「アミノ酸類縁体」でもよい。「アミノ酸」、「天然アミノ酸」、「アミノ酸類縁体」はそれぞれ、「アミノ酸残基」、「天然アミノ酸残基」、「アミノ酸類縁体残基」ということがある。
【００３４】
「天然アミノ酸」とは、α−アミノカルボン酸（α−アミノ酸）であり、タンパク質に含まれる２０種類のアミノ酸を指す。具体的にはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏを指す。
【００３５】
「アミノ酸類縁体」は、特に限定されないが、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、Ｎ置換アミノ酸、α，α−二置換アミノ酸、ヒドロキシカルボン酸、非天然型アミノ酸（側鎖が天然と異なるアミノ酸；例えば、非天然型のα−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸）を含む。α−アミノ酸の場合、Ｄ型アミノ酸でもよく、α，α−ジアルキルアミノ酸でもよい。β−アミノ酸やγ−アミノ酸の場合も、α−アミノ酸と同様に、任意の立体配置が許容される。アミノ酸類縁体の側鎖（主鎖メチレン）は特に制限されないが、水素原子の他にも例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルを有し得る。それぞれには１つ以上の置換基を有していてもよく、それら置換基は例えば、ハロゲン原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、Ｐ原子を含む任意の官能基の中から選択することができる。例えば、本明細書において「ハロゲンを置換基に有していてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル」とは、１つ以上のハロゲン原子で置換された「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」を意味し、具体的には、例えば、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、フルオロメチル、ペンタプルオロエチル、テトラフルオロエチル、トリフルオロエチル、ジフルオロエチル、フルオロエチル、トリクロロメチル、ジクロロメチル、クロロメチル、ペンタクロロエチル、テトラクロロエチル、トリクロロエチル、ジクロロエチル、クロロエチル等が挙げられる。また、例えば「置換基を有していてもよいＣ５〜Ｃ１０アリールＣ１−Ｃ６アルキル」とは、「Ｃ５〜Ｃ１０アリールＣ１−Ｃ６アルキル」のアリールおよび／またはアルキルの少なくとも一つの水素原子が、置換基により置換された基を意味する。さらに、これら「置換基を２つ以上有している場合」は、例えば、Ｓ原子を含む官能基を有し、さらにその官能基がアミノやハロゲンなどの官能基を有していることも含む。
【００３６】
アミノ酸類縁体の主鎖アミノ基は、非置換（ＮＨ２基）でもよく、置換（即ち、ＮＨＲ基：Ｒは置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルを示し、またプロリンのようにＮ原子に結合した炭素鎖とα位の炭素原子とが環を形成していてもよい。該置換基は、側鎖の置換基と同様であり、例えば、ハロゲン、オキシ、ヒドロキシなどが挙げられる。）されていてもよい。さらに、これらの置換基の定義の中における「アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキル」は、前記の当該官能基の定義を準用する。例えば、本明細書において「アルコキシ」とは、水酸基の水素原子が前記アルキルで置換された基を意味し、例えば好ましい例として「Ｃ１−Ｃ６アルコキシ」が挙げられる。
【００３７】
ハロゲン由来の置換基としては、フルオロ（−Ｆ）、クロロ（−Ｃｌ）、ブロモ（−Ｂｒ）、ヨウド（−Ｉ）などが挙げられる。
【００３８】
Ｏ原子由来の置換基としては、ヒドロキシル（−ＯＨ）、オキシ（−ＯＲ）、カルボニル（−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）、カルボキシル（−ＣＯ２Ｈ）、オキシカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）、カルボニルオキシ（−Ｏ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）、チオカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＳＲ）、カルボニルチオ基（−Ｓ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）、アミノカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＮＨＲ）、カルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）、オキシカルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）、スルホニルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ）、アミノスルホニル（−ＳＯ２−ＮＨＲ）、スルファモイルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−ＮＨＲ）、チオカルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）−ＳＨ）、カルボキシルカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＯ２Ｈ）が挙げられる。
【００３９】
オキシ（−ＯＲ）の例としては、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシなどが挙げられる。
【００４０】
カルボニル（−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、ホルミル（−Ｃ＝Ｏ−Ｈ）、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アラルキルカルボニルなどが挙げられる。
【００４１】
オキシカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）の例としては、アルキルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アラルキルオキシカルボニルなどが挙げられる。
（−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）
【００４２】
カルボニルオキシ（−Ｏ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルオキシ、シクロアルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールカルボニルオキシ、アラルキルカルボニルオキシなどが挙げられる。
【００４３】
チオカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＳＲ）の例としては、アルキルチオカルボニル、シクロアルキルチオカルボニル、アルケニルチオカルボニル、アルキニルチオカルボニル、アリールチオカルボニル、ヘテロアリールチオカルボニル、アラルキルチオカルボニルなどが挙げられる。
【００４４】
カルボニルチオ（−Ｓ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルチオ、シクロアルキルカルボニルチオ、アルケニルカルボニルチオ、アルキニルカルボニルチオ、アリールカルボニルチオ、ヘテロアリールカルボニルチオ、アラルキルカルボニルチオなどが挙げられる。
【００４５】
アミノカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノカルボニル、シクロアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキニルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニルなどが挙げられる。これらに加えて、−Ｃ＝Ｏ−ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
【００４６】
カルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルアミノ、シクロアルキルカルボニルアミノ、アルケニルカルボニルアミノ、アルキニルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
【００４７】
オキシカルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）の例としては、アルコキシカルボニルアミノ、シクロアルコキシカルボニルアミノ、アルケニルオキシカルボニルアミノ、アルキニルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
【００４８】
スルホニルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ）の例としては、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキルスルホニルアミノ、アルケニルスルホニルアミノ、アルキニルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アラルキルスルホニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
【００４９】
アミノスルホニル（−ＳＯ２−ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノスルホニル、シクロアルキルアミノスルホニル、アルケニルアミノスルホニル、アルキニルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニルなどが挙げられる。これらに加えて、−ＳＯ２−ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
【００５０】
スルファモイルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−ＮＨＲ）の例としては、アルキルスルファモイルアミノ、シクロアルキルスルファモイルアミノ、アルケニルスルファモイルアミノ、アルキニルスルファモイルアミノ、アリールスルファモイルアミノ、ヘテロアリールスルファモイルアミノ、アラルキルスルファモイルアミノなどが挙げられる。さらに、−ＮＨ−ＳＯ２−ＮＨＲ中のＮ原子と結合した２つのＨ原子はアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より独立して選択される置換基で置換されていてもよく、またこれらの２つの置換基は環を形成しても良い。
【００５１】
Ｓ原子由来の置換基として、チオール（−ＳＨ）、チオ（−Ｓ−Ｒ）、スルフィニル（−Ｓ＝Ｏ−Ｒ）、スルホニル（−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ）、スルホ（−ＳＯ３Ｈ）が挙げられる。
【００５２】
チオ（−Ｓ−Ｒ）の例としては、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオなどの中から選択される。
【００５３】
スルフィニル（−Ｓ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、アルキルスルフィニル、シクロアルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、アリールスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニル、アラルキルスルフィニルなどが挙げられる。
【００５４】
スルホニル（−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ）の例としては、アルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アラルキルスルホニルなどが挙げられる。
【００５５】
Ｎ原子由来の置換基として、アジド（−Ｎ３、「アジド基」ともいう）、シアノ（−ＣＮ）、１級アミノ（−ＮＨ２）、２級アミノ（−ＮＨ−Ｒ）、３級アミノ（−ＮＲ（Ｒ'））、アミジノ（−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２）、置換アミジノ（−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲ'Ｒ''）、グアニジノ（−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２）、置換グアニジノ（−ＮＲ−Ｃ（＝ＮＲ'''）−ＮＲ'Ｒ''）、アミノカルボニルアミノ（−ＮＲ−ＣＯ−ＮＲ'Ｒ''）が挙げられる。
【００５６】
２級アミノ（−ＮＨ−Ｒ）の例としては、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アラルキルアミノなどが挙げられる。
【００５７】
３級アミノ（−ＮＲ（Ｒ'））の例としては、例えばアルキル（アラルキル）アミノなど、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択される、任意の２つの置換基を有するアミノ基が挙げられ、これらの任意の２つの置換基は環を形成しても良い。
【００５８】
置換アミジノ（−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲ'Ｒ''）の例としては、Ｎ原子上の３つの置換基Ｒ、Ｒ'、およびＲ''が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、例えばアルキル（アラルキル）（アリール）アミジノなどが挙げられる。
【００５９】
置換グアニジノ（−ＮＲ−Ｃ（＝ＮＲ'''）−ＮＲ'Ｒ''）の例としては、Ｒ，Ｒ'、Ｒ''、およびＲ'''が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらが環を形成した基などが挙げられる。
【００６０】
アミノカルボニルアミノ（−ＮＲ−ＣＯ−ＮＲ'Ｒ''）の例としては、Ｒ、Ｒ'、およびＲ''が、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらは環を形成した基などが挙げられる。
【００６１】
Ｂ原子由来の置換基として、ボリル（−ＢＲ（Ｒ'））やジオキシボリル（−Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ'））などが挙げられる。これらの２つの置換基ＲおよびＲ'は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択されるか、あるいはこれらは環を形成してもよい。
【００６２】
ペプチドを構成する「アミノ酸」を構成する少なくとも１つの原子は、原子番号（陽子数）が同じで，質量数（陽子と中性子の数の和）が異なる原子（同位体）であってもよい。当該ペプチドを構成する「アミノ酸」に含まれる同位体の例としては、水素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子、フッ素原子、塩素原子などがあり、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ等が含まれる。
【００６３】
特定の理論に拘束されることは無いが、本発明によるペプチドの翻訳効率の改善効果が大きいアミノ酸の特徴としては、アミノアシルｔＲＮＡ単独での加水分解が速く、且つＥＦ−ｔｕとの親和性が低いアミノ酸を挙げることができる。
一方で、特定の理論に拘束されることは無いが、本発明において翻訳効率の改善効果が大きくないと予測されるアミノ酸の特徴としては、アミノアシルｔＲＮＡ単独での加水分解が遅いアミノ酸（特に翻訳時間を考慮したときに無視できるほど遅い）、及び／又はＥＦ−ｔｕとの親和性が十分に高いアミノ酸を挙げることができる。そのようなアミノ酸であっても、本発明の効果を損なわない範囲で使用することはできる。
【００６４】
本発明において、本発明のペプチド合成に利用できるアミノ酸類縁体を以下に例示するが、それらに限定されない。これらのアミノ酸類縁体の多くは側鎖が保護あるいは無保護、アミン部位が保護あるいは無保護の状態で購入することができる。購入できないものは、既知の方法によって合成することができる。
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【００６５】
アミノ酸類縁体として、以下のＮ−Ｍｅアミノ酸を用いることができる。
Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルフェニルアラニン、Ｎ−メチルチロシン、Ｎ−メチル−３−クロロフェニルアラニン、Ｎ−メチル−４―クロロフェニルアラニン、Ｎ−メチル−４−メトキシフェニルアラニン、Ｎ−メチル−４−チアゾールアラニン、Ｎ−メチルヒスチジン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアスパラギン酸。
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【００６６】
アミノ酸類縁体として、以下のＮ−アルキルアミノ酸も用いることができる。
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【００６７】
アミノ酸類縁体として、以下のＤ型アミノ酸も用いることができる。
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【００６８】
アミノ酸類縁体として、以下のα，α−ジアルキルアミノ酸も用いることができる。
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【００６９】
アミノ酸類縁体として、以下のアミノ酸も用いることができる。
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【００７０】
非限定の一態様として、本発明におけるペプチド合成に用いられるアミノ酸類縁体としては、環状アミノ酸を含むＮアルキルアミノ酸、脂肪族アミノ酸、芳香族アミノ酸、βアミノ酸、Ｄアミノ酸、及びαジアルキルアミノ酸からなる群より選ばれる１種以上の翻訳可能なアミノ酸類縁体を選択することができる。
上記態様において用いられるアミノ酸類縁体が翻訳可能か否かは、これに限定されることはないが、無細胞翻訳系にて翻訳合成されたペプチドを質量分析するためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳや、ラジオアイソトープでラベルしたアミノ酸を用いたペプチドの電気泳動による検出等、当業者公知の手法により評価することができる。
【００７１】
非限定の一態様として、本発明のペプチド合成に用いることができる、保護基を有するアミノ酸の導入位置としては、翻訳されるペプチドのＮ末端以外の位置に導入されることが好ましい。
【００７２】
非限定の一態様として、本発明におけるペプチド合成に用いられるアミノ酸としては、下記一般式（ＶＩ）または（ＶＩＩ）で示される、翻訳可能なアミノ酸を挙げることができる。
2018143145.tif 000018
式中のＲ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはシクロアルキルであり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはＲ３とＲ４もしくはＲ３とＲ５は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成してもよい。Ｒ６、およびＲ７は、それぞれ独立して水素原子またはメチルである。
これらに限定されることはないが、Ｒ４、Ｒ５のいずれか一方は水素原子であるかもしくはＲ３と一緒になって環を形成してもよく、その際にＲ４、Ｒ５のもう一方は置換されていてもよいＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルケニル、Ｃ１−６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはＣ３−７シクロアルキルである。
【００７３】
非限定の一態様として、本発明におけるペプチド合成に用いられるアミノ酸類縁体としては、アゼチジン−２−カルボン酸（Aze(2)）、ｎ−ブチルグリシン（nBuG）、３−ピリジルアラニン（Ala(3-Pyr)）、２−アミノ−２−メチルプロパン酸（α-アミノイソ酪酸；AIB）、３−アミノプロパン酸（β−アラニン；β−Ａｌａ）、Ｄ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）、及びホモフェニルアラニン（Ｈｐｈ）からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸類縁体を選択することができる。
【００７４】
非限定の一態様として、本発明は、保護基を有するアミノ酸が結合したｔＲＮＡを含む無細胞翻訳系中で、該アミノ酸の保護基を脱保護する工程、及び翻訳工程を含む、少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチドの合成方法であって、該脱保護する工程、および該翻訳工程が並行して行われる、ペプチドの合成方法を提供する。
【００７５】
上記態様における「保護基を有するアミノ酸」とは、アミノ酸の主鎖及び／又は側鎖に保護基を有するアミノ酸を意味する。そのような特徴を有するアミノ酸である限り限定されることは無いが、好ましくはアミノ酸の主鎖のアミノ基上に保護基を有するアミノ酸である。
【００７６】
上記態様における「並行して行われる」とは、保護基を有するアミノ酸を結合したｔＲＮＡを含む無細胞翻訳系中で、該アミノ酸の保護基を脱保護する工程とペプチドの翻訳工程をともに行うことを意味する。保護基を脱保護する工程とペプチドの翻訳工程がともに無細胞翻訳系中で行われていれば、上記脱保護工程及び上記翻訳工程は、時間的に一部重複して行われてもよいし、あるいは時間的に一致して同時に行われてもよい。あるいは、脱保護工程と翻訳工程を時間的に互いに独立して行ってもよい。
上記脱保護工程及び上記翻訳工程は、脱保護工程を先に開始してもよいし、翻訳工程を先に開始してもよい。あるいは、両工程を同時に開始することもできる。また、並行して行う時間に特に制限はなく、例えば、30秒、1分、5分、10分、20分、30分、60分、120分、180分以上であってもよい。
本発明の非限定の一態様として、ｔＲＮＡに結合したアミノ酸が無細胞翻訳系中に添加される時点においては、該アミノ酸はまだ保護基を有していることが好ましい。あるいは、ｔＲＮＡに結合したアミノ酸が無細胞翻訳系中に添加される前に、該アミノ酸の保護基は脱保護されていないことが好ましい。
【００７７】
非限定の一態様として、上記ペプチド合成方法における該アミノ酸の保護基を脱保護する工程は、翻訳条件下において脱保護反応が進行する限り、どのような脱保護法を用いてもよい。さらに、脱保護のために行う操作や脱保護反応のために加える試薬、または脱保護反応により系内に排出される保護基の残骸が翻訳系にダメージを与えない限り、どのような脱保護法を用いてもよい。ただし、そのような翻訳系にダメージを与える脱保護法であっても、本発明の効果を損なわない範囲で使用することはできる。
非限定の一態様として、本発明のペプチド合成方法は、ペプチドを翻訳後修飾する工程を含んでもよい。限定の一態様として、本発明のペプチド合成方法は、翻訳後修飾によりペプチドを環化する工程を含んでもよい。本発明のペプチド合成方法よって得られる環化前のペプチドは、環化反応に供されるアミノ酸が保護基で保護されたものであってもよい。本発明においては、例えば、翻訳後修飾の過程で脱保護を行うこともできる。その場合、上記翻訳条件下における脱保護条件は、該翻訳後修飾のために用いる脱保護反応条件とオルソゴナルな脱保護条件であることが好ましい。本発明においては、翻訳条件下における脱保護条件は、翻訳後修飾のために用いる脱保護反応条件とオルソゴナルな脱保護条件である限り、どのような脱保護法を用いてもよい。ここで、翻訳後修飾とは、翻訳後にリボゾームの作用以外で自動的に生じるあるいは翻訳条件下において脱保護反応を進行させるための試薬とは異なる試薬を添加させて生じさせる化学反応を指し、例えば環化反応や脱保護反応を挙げることができる。
【００７８】
本発明における無細胞翻訳系中でアミノ酸の保護基を脱保護する工程は、該無細胞翻訳系に最初から含まれる構成成分（例えば、DTT(dithiothreitol)等）の影響により、該系内で自発的に起きる脱保護反応を除くものとして解釈することが出来る。
【００７９】
非限定の一態様として、上記ペプチド合成方法において、上記アミノ酸の保護基の脱保護が、酵素による脱保護、還元剤による脱保護、及び光反応による脱保護からなる群より選ばれる一以上の脱保護である、ペプチドを合成する方法を提供する。
【００８０】
これに限定されることはないが、上記酵素による脱保護に用いられる酵素は、好ましくは加水分解酵素であり、より好ましくは、ペニシリンアミドヒドロラーゼ、エステラーゼ、又はアミノペプチダーゼである。
本発明におけるペニシリンアミドヒドロラーゼは、EC番号（Enzyme Commission numbers）3.5.1.11に分類される加水分解酵素を表す。EC番号3.5.1.11に分類される加水分解酵素は、ペニシリンと水を天然の基質とし、生成物としてカルボン酸とぺニシラン酸を与える化学反応を触媒する酵素である。また、通常のペプチド結合を加水分解せず、例えばフェニルアセチルアミド結合に対して特異的に加水分解作用を有することもあわせて古くから知られている。例えば、大腸菌由来のペニシリンアミドヒドロラーゼを用いることも出来る。これらのペニシリンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列および塩基配列は、当業者に公知である（www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=EC+3.5.1.11）。
なおこれらのペニシリンアミドヒドロラーゼは、その機能を保持する限り、遺伝子操作によりアミノ酸が改変された改変体であってもよく、化学修飾の有無も問わない。EC番号は、酵素を反応形式に従って系統的に分類するための４組の数字より成る番号で、国際生化学分子生物学連合の酵素委員会によって定義づけられている酵素の番号である。
【００８１】
本発明におけるエステラーゼは、エステラーゼ活性を有する酵素である限り、特に限定されることはなく、当業者がエステラーゼ活性を有する酵素を適宜選択することができる。そのような酵素として、例えばEC番号（Enzyme Commission numbers）3.1.1.XXに分類される酵素を挙げることができる。EC番号3.1.1.XXに分類される酵素は、カルボン酸エステルをカルボン酸とアルコールに加水分解する酵素である。これらに限定されることはないが、例えば好ましくはEC番号3.1.1.1に分類されるカルボキシルエステラーゼや、EC番号3.1.1.3に分類されるトリアシルグリセロールリパーゼ（単にリパーゼともいう）が挙げられる。例えば、大腸菌由来やブタ肝臓由来のエステラーゼを用いることも出来る。これらエステラーゼのアミノ酸配列および塩基配列は、当業者に公知である（www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=EC+3.1.1）。
なおこれらのエステラーゼは、その機能を保持する限り、遺伝子操作によりアミノ酸が改変された改変体であってもよく、化学修飾の有無も問わない。
【００８２】
本発明におけるアミノペプチダーゼは、アミノペプチダーゼ活性を有する酵素である限り、特に限定されることはなく、当業者がアミノペプチダーゼ活性を有する酵素を適宜選択することができる。そのような酵素として、例えばEC番号（Enzyme Commission numbers）3.4.11.XXに分類される酵素を挙げることができる。EC番号3.4.11.XXに分類される酵素は、ペプチドのアミノ酸鎖をN 末端から段階的に加水分解し，アミノ酸を生じる反応を触媒する酵素である。これらに限定されることはないが、例えば好ましくはEC番号3.4.11.1に分類されるロイシンアミノペプチダーゼや、EC番号3.4.11.18に分類されるメチオニンアミノペプチダーゼが挙げられる。例えば、細菌由来やブタ腎臓由来のアミノペプチダーゼを用いることも出来る。これらアミノペプチダーゼのアミノ酸配列および塩基配列は、当業者に公知である（www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=EC+3.4.11）。
なおこれらのアミノペプチダーゼは、その機能を保持する限り、遺伝子操作によりアミノ酸が改変された改変体であってもよく、化学修飾の有無も問わない。
【００８３】
非限定の一態様として、上記酵素によって脱保護される保護基は、ペニシリンアミドヒドロラーゼが認識する部分構造Ｘ１を有する下記一般式（Ｉ）、若しくは一般式（ＩＩ）で表される基であることが好ましい。
2018143145.tif 000019
（式中のＹは、ＮＨもしくは酸素原子であり、Ｌは、単結合（ここではメチレン基を表す）、アリーレン、またはヘテロアリーレンである。）
式中のＸ１は、酵素であるペニシリンアミドヒドロラーゼによって認識される構造であり、式（Ｉ）中のＹ−Ｃ＝Ｏで表記されるエステルまたはアミド結合、あるいは式（ＩＩ）中の＊−Ｃ＝Ｏで表記されるアミド結合がペニシリンアミドヒドロラーゼの基質として加水分解され得る限り、特にその構造（Ｘ１）が限定されることはない。加水分解された後の残りの保護基は自動的にアミノ酸から脱保護される。そのような構造は、当業者が公知技術より適宜選択することができる（Journal of Molecular Biology, Volume 284, Issue 2, 27 November 1998, Pages 463-475, Annals New York Academy of Sciences, Volume 799, Enzyme Engineering XIII Pages 659-669）。
【００８４】
非限定の一態様として、上記酵素によって脱保護される保護基は、エステラーゼが認識する部分構造Ｘ２を有する下記一般式（ＩＩＩ）で表される基であることが好ましい。
2018143145.tif 000020
（式中のＬは、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである。）
式中のＸ２は、酵素であるエステラーゼによって認識される構造であり、式中、Ｘ２とＬとの間にあるエステル結合がエステラーゼの基質として加水分解され得る限り、特にその構造（Ｘ２）が限定されることはない。加水分解された後の残りの保護基は自動的にアミノ酸から脱保護される。エステラーゼはその種類により多様な基質特異性を持つことが知られており、当業者は公知技術より適切な構造を適宜選択することができる。
【００８５】
非限定の一態様として、上記酵素によって脱保護される保護基は、アミノペプチダーゼが認識する部分構造Ｘ３を有する下記一般式（ＸＩＩ）で表される基であることが好ましい。
2018143145.tif 000021
（式中のＬは、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである。）
式中のＸ３は、酵素であるアミノペプチダーゼによって認識される構造であり、式中のアミド結合がアミノペプチダーゼの基質として加水分解され得る限り、特にその構造（Ｘ３）が限定されることはない。加水分解された後の残りの保護基は自動的にアミノ酸から脱保護される。そのような構造は、当業者が公知技術より適宜選択することができる。
【００８６】
非限定の一態様において、上記式（Ｉ）中の部分構造Ｘ１は、以下一般式（ＩＶ）もしくは２−チエニルメチルであることが好ましい。
2018143145.tif 000022
（式中のＲ１、およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル、フルオロ、クロロ、ブロモ、アミノ、ニトロ、またはメトキシである。）
また、Ｒ１、およびＲ２の組み合わせとして、好ましくは、Ｒ１＝ＦかつＲ２＝Ｈ、Ｒ１＝ＣｌかつＲ２＝Ｈ、Ｒ１＝ＢｒかつＲ２＝Ｈが挙げられる。また、Ｒ１は、−ＣＨＲ２−に対してオルト位、メタ位、パラ位のどの位置に存在していてもよく、パラ位に存在することが好ましい。
【００８７】
非限定の一態様において、上記式（ＩＩＩ）中の部分構造Ｘ２は、置換されてもよいアルキル、アラルキル、またはシクロアルキルであることが好ましく、メチル、エチル、ベンジル、若しくはｎ−プロピルであることが特に好ましい。
【００８８】
非限定の一態様において、上記式（ＸＩＩ）は、下記一般式（ＸＩＩＩ）であることが好ましい。
2018143145.tif 000023
【００８９】
非限定の一態様において、上記酵素のうち、ペニシリンアミドヒドロラーゼにより脱保護される保護基は、好ましくは、４−（２−（４−フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジルオキシカルボニル（Ｆ−Ｐｎａｚ）基である。エステラーゼにより脱保護される保護基は、好ましくは、４−（プロピオニルオキシ）ベンジルオキシカルボニル（Ｅｔｅｚ）基である。アミノペプチダーゼにより脱保護される保護基は、好ましくは、（Ｓ）−（（４−（２−アミノ−４−メチルペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル（Ｌｅｕｚ）基である。
【００９０】
非限定の一態様において、混合する酵素の濃度と該酵素により脱保護される保護基を有するアミノ酸を結合したｔＲＮＡの濃度の比率としては、１：１０００、１：９００、１：８００、１：７００、１：６００、１：５００、１：４００、１：３００、１：２００、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：１が好ましい。
【００９１】
これに限定されることはないが、上記還元剤による脱保護に用いられる還元剤は、好ましくは、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。さらに好ましくは、上記還元剤によって脱保護される保護基として、下記一般式（Ｖ）で表される保護基、又は主鎖のアミノ基と一緒になって形成されたアジド基（主鎖のアミノ基をマスクするアジド基）を用いることができる。
2018143145.tif 000024
（式中のＬは、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである。）
【００９２】
非限定の一態様において、上記還元剤（好ましくは、ＴＣＥＰ）により脱保護される保護基は、好ましくは、４−アジドベンジルオキシカルボニル基（Ａｃｂｚ）、又はアジドメチルオキシカルボニル（Ａｚｏｃ）である。
【００９３】
非限定の一態様において、混合する還元剤の濃度と該還元剤により脱保護される保護基を有するアミノ酸を結合したｔＲＮＡの濃度の比率としては、５０００：１、４０００：１、３０００：１、２０００：１、１０００：１、９００：１、８００：１、７００：１、６００：１、５００：１、４００：１、３００：１、２００：１、１００：１が好ましい。
【００９４】
これに限定されることはないが、上記光反応による脱保護は、公知の方法を適宜参照することにより、当業者が実施することができる（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,Volume 24, Issue 23, Nat. Commun. 7:12501 doi: 10.1038/ncomms12501 (2016).）。
【００９５】
非限定の一態様において、本発明は、保護基を有するアミノ酸を結合したｔＲＮＡを含む無細胞翻訳系中で、該アミノ酸の保護基を酵素、又は還元剤によって脱保護する工程、及び翻訳工程を含む、ペプチドの合成方法を提供する。
上記態様において、アミノ酸の保護基を脱保護する工程とペプチドの翻訳工程は、時間的に一部重複して行うか、時間的に一致して同時に行うことができる。あるいは本発明においては、脱保護工程と翻訳工程を時間的に互いに独立して行ってもよい。独立して行う場合、これに限定されることはないが、無細胞翻訳系中で、該アミノ酸の保護基を脱保護した後に翻訳工程を開始することがより好ましい。
【００９６】
本発明におけるペプチド合成反応の完了後、翻訳後修飾の過程でさらにペプチドの環化反応等を行う場合は、該翻訳後修飾のために用いる反応条件とオルソゴナルな反応条件によって脱保護される保護基を、本発明におけるペプチドの合成反応に用いることが好ましい。
すなわち、非限定の一態様として、本発明は、アミノ酸の有する保護基が、翻訳後修飾のために用いられる反応条件とオルソゴナルな反応条件によって脱保護される保護基である、ペプチドの合成方法を提供する。さらに、上述したアミノ酸の有する保護基は、iSP(Initiation Suppression)法で用いられる保護基とオルソゴナルな保護基であることが好ましい。
【００９７】
非限定の一態様として、本発明は、アミノ酸の有する保護基が、iSP(Initiation Suppression)法で用いられる保護基とオルソゴナルな保護基である、ペプチドの合成方法を提供する。
例えば、翻訳後修飾の過程で、還元条件下でペプチドの環化反応を行う場合、該還元条件とはオルソゴナルな反応条件である酵素による脱保護条件を、本発明のペプチド合成に用いることができる。
上記態様における、「オルソゴナル」な保護基とは、他の脱保護反応の条件に実質的に影響されない保護基をいう。例えば、他の脱保護反応が還元条件下で行なわれる場合、オルソゴナルな保護基としては、還元反応以外の条件（例えば、酵素反応、光反応等）で脱保護反応が進行し得る保護基を選択することが好ましい。また、他の脱保護反応が酵素反応（エステラーゼ）で行なわれる場合、オルソゴナルな保護基として他の酵素反応（例えば、ペニシリンアミドヒドロラーゼ）で脱保護反応が進行し得る保護基を選択することもできる。
【００９８】
非限定の一態様として、翻訳されるペプチドのＮ末端にメチオニン以外の他の所望のアミノ酸を導入する場合は、例えば以下のような方法を用いることができる（ＷＯ２０１３／１００１３２）。
iSP(Initiation Suppression)法
本来は、一般的に翻訳開始アミノ酸（Ｎ末端アミノ酸）としてメチオニンが翻訳されるが、他の所望のアミノ酸をアミノアシル化した翻訳開始ｔＲＮＡを用いて翻訳させることによって、当該所望のアミノ酸を翻訳開始アミノ酸（Ｎ末端アミノ酸）として翻訳させることもできる。Ｎ末端におけるアミノ酸類縁体の許容度は、ペプチド鎖の伸長時におけるそれよりも高く、Ｎ末端では天然アミノ酸と大きく構造の異なるアミノ酸類縁体を利用できることが知られている（非特許文献：J Am Chem Soc. 2009 Apr 15;131(14):5040-1.Translation initiation with initiator tRNA charged with exotic peptides.Goto Y, Suga H.）。
これに限定されることはないが、Ｎ末端のアミノ酸として、Ｃｙｓ、又は側鎖にＳＨ基を有するアミノ酸類縁体を用いる場合、該アミノ酸の主鎖のアミノ基及び／又は側鎖のＳＨ基は保護基を有していることが好ましい。保護基は、本発明のペプチド合成における脱保護条件とはオルソゴナルな条件で反応が進行する保護基を選択することがさらに好ましい。
【００９９】
翻訳開始アミノ酸としてメチオニン以外の所望のアミノ酸を導入するその他の方法として、initiation read through（イニシエーション リード スルー：開始コドンの読み飛ばし）を挙げることが出来る。一般的には、タンパクやペプチドはＡＵＣコドンとしてコードされる翻訳開始アミノ酸であるメチオニンから翻訳される。これに対しinitiation read throughでは、無細胞翻訳系において翻訳開始メチオニルｔＲＮＡが含まれないようにすることにより、あるいは、翻訳開始アミノ酸を翻訳効率の低いアミノ酸類縁体に置き換えることにより、２番目以降のコドンにコードされるアミノ酸をＮ末端アミノ酸とする翻訳産物を合成することができる。
【０１００】
さらに別法として、酵素、例えば、peptide deformylase（ペプチド デフォルミラーゼ）とMethionine aminopeptidase（メチオニン アミノペプチダーゼ）を作用させることによってペプチドのＮ末端のメチオニンを削り取る方法が知られている（非特許文献：Meinnel, T., et al. Biochimie (1993) 75, 1061-1075, Methionine as translation start signal: A review of the enzymes of the pathway in Escherichia coli.）。翻訳開始メチオニンから始まるペプチドのライブラリーを用意し、これにMethionine aminopeptidaseを作用させることによってＮ末端のメチオニンを除去し、Ｎ末端のアミノ酸がランダムなライブラリーを調製することも出来る。
【０１０１】
非限定の一態様として、本発明におけるペプチド合成反応の完了後、翻訳後修飾の過程で、さらにペプチドの環化を行うこともできる。その場合、合成されたペプチドのＮ末端側のアミノ酸残基（以下、天然のアミノ酸残基やアミノ酸類縁体残基に加え、Ｎ末端カルボン酸類縁体を含む）の反応点と、Ｃ末端側のアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基の側鎖の反応点とを結合させ、ペプチドを環化することができる（ＷＯ２０１３／１００１３２）。そのような方法としては、例えば、側鎖にアミノ基と反応補助基を有する、Ｎ末端側のアミノ酸残基と、Ｎ末端側のアミノ酸残基よりもＣ末端側に位置する、活性エステル基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基をアミド結合させて環状化合物を得る方法、アミノ基を有するＮ末端のアミノ酸残基の当該アミノ基と、活性エステル基を側鎖に有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基の当該活性エステル基をアミド結合させて環状化合物を得る方法、Ｎ末端のアミノ酸残基の反応点と、側鎖に１つの反応点を有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基の反応点とを炭素−炭素結合させる方法などが挙げられる。また、上記の例に限定されず、例えば、活性エステル基を有するＮ末端側のアミノ酸残基の当該活性エステル基と側鎖にアミノ基（反応補助基を有してもよい）を有するＣ末端側のアミノ酸残基における当該アミノ基との間でアミド結合させるなど、上記と逆の官能基を配置してもよい。
【０１０２】
本発明におけるＮ末端カルボン酸類縁体は、アミノ基とカルボキシル基とを同時に持ち、両者の間の原子数が３つ以上の化合物、アミノ基を持たない様々なカルボン酸誘導体や、２残基〜４残基から形成されるペプチド、主鎖アミノ基がカルボン酸とのアミド結合などで化学修飾されたアミノ酸でもよい。また、環化に使用できるホウ酸やホウ酸エステル部位を有していてもよい。また、二重結合部位や三重結合部位を有するカルボン酸でもよく、ケトンやハライドを有するカルボン酸でもよい。なお、これらの化合物において規定された官能基以外の部分は、置換されてもよいアルキル基、アラルキル基、アリール基、シクロアルキル基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基などの中から幅広く選択（自由に置換）される。
【０１０３】
転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）は、分子量２５０００から３００００で、３’末端のＣＣＡ配列を含む鎖長７３〜９３塩基からなるＲＮＡであり、コドンの識別に関与するＲＮＡである。ｔＲＮＡはその３’末端においてアミノ酸のカルボキシ末端とエステル結合を形成し、アミノアシルｔＲＮＡを形成する。アミノアシルｔＲＮＡはポリペプチド伸長因子（ＥＦ−Ｔｕ）、ＧＴＰと三重複合体を形成し、ribosomeに運ばれる。ribosomeにおけるｍＲＮＡの塩基配列情報からアミノ酸配列への翻訳の過程において、アミノアシルｔＲＮＡの配列中のアンチコドンとｍＲＮＡのコドンとが塩基対を形成し、これによってコドンを識別する。細胞内で生合成されるｔＲＮＡには共有結合的に修飾された塩基が含まれており、当該塩基がｔＲＮＡのコンフォメーションやアンチコドンの塩基対形成に影響し、ｔＲＮＡのコドン識別を助けていることがある。一般的な試験管内転写にて合成したｔＲＮＡは所謂核酸塩基であるアデニン、ウラシル、グアニン、シトシンから成るが、細胞内から調製したものや化学的に合成したものにはこれらのメチル化体、含硫誘導体、脱アミノ誘導体、イソペンテニル基やトレオニンを含むアデノシン誘導体などの修飾塩基を含むものもある。また、ｐｄＣｐＡ法などを利用した場合にデオキシ塩基を含む場合もある。
【０１０４】
非限定の一態様として、本発明のペプチド合成において用いられるアミノアシルｔＲＮＡは、以下のような方法を用いて作製することができる。
所望のｔＲＮＡ配列をコードし、上流にＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６プロモーターを配置した鋳型ＤＮＡを用意し、T7 RNA polymeraseやT3, SP6 RNA polymeraseなどのプロモーターに適応したＲＮＡポリメラーゼを利用して、転写によってｔＲＮＡを合成することが出来る。あるいは、細胞からｔＲＮＡを抽出精製し、ｔＲＮＡの配列と相補的な配列を有するプローブを用いて目的の生成ｔＲＮＡを抽出することも出来る。この際、目的のｔＲＮＡの発現ベクターで形質転換した細胞をソースとして用いることも出来る。化学合成によって目的の配列のｔＲＮＡを合成することも出来る。アミノアシルｔＲＮＡは、例えば、このようにして得られた３’末端のＣＣＡ配列からＣＡを除いたｔＲＮＡと別途調製したアミノアシル化したｐｄＣｐＡまたはｐＣｐＡとをＲＮＡリガーゼで結合させることで得ることが出来る（ｐｄＣｐＡ法、ｐＣｐＡ法）。
【０１０５】
例えば、式（ＶＩ）又は（ＶＩＩ）で表されるアミノ酸のためのアミノアシルｔＲＮＡは、式（ＶＩ）又は（ＶＩＩ）で表されるアミノ酸と結合したｐｄＣｐＡまたはｐＣｐＡを使用して製造することができる。当該アミノアシルｔＲＮＡは、本発明のペプチド、ペプチドとｍＲＮＡの結合体、ペプチドとｍＲＮＡの結合体のライブラリーの製造において有用である。したがって本発明は、式（ＶＩ）又は（ＶＩＩ）で表されるアミノ酸と結合したｐｄＣｐＡまたはｐＣｐＡに関する。このような式（ＶＩ）又は（ＶＩＩ）で表されるアミノ酸と結合したｐｄＣｐＡまたはｐＣｐＡとして具体的には、下記式（Ｘ）または（ＸＩ）で表される化合物が挙げられる。
2018143145.tif 000025
（式中、Ｒ３〜Ｒ７、およびＰ１は後述の式（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）中のＲ３〜Ｒ７およびＰ１と同意義であり、Ｒ８は水素原子またはヒドロキシルである。）
また本発明は、式（ＶＩ）又は（ＶＩＩ）で表されるアミノ酸でアミノアシル化されたｔＲＮＡに関する。
あるいは、全長ｔＲＮＡを用意し、種々のアミノ酸類縁体の活性エステルをｔＲＮＡに担持させるリボザイムであるフレキシザイムによるアミノアシル化も可能である。
【０１０６】
また本発明において翻訳合成は、例えば、大腸菌の翻訳に必要な蛋白因子類（メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ、 EF-G、RF1、RF2、RF3、RRF、IF1、IF2、IF3、EF-Tu、EF-Ts、ARS（AlaRS、ArgRS、AsnRS、AspRS、CysRS、GlnRS、GluRS、GlyRS、HisRS、IleRS、LeuRS、LysRS、MetRS、PheRS、ProRS、SerRS、ThrRS、TrpRS、TyrRS、ValRSから必要なものを選ぶ））、リボソーム、アミノ酸、クレアチンキナーゼ、ミオキナーゼ、無機ピロフォスファターゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、E. coli 由来tRNA、クレアチンリン酸、グルタミン酸カリウム、HEPES-KOH pH7.6、酢酸マグネシウム、スペルミジン、ジチオスレイトール、GTP、ATP、CTP、UTPなどを混合したPUREsystem等の公知の無細胞翻訳系にmRNAを加えることによって行うことが出来る。また、T7 RNA polymeraseを加えておけば、T7プロモーターを含む鋳型DNAからの転写、翻訳を共役して行なうこともできる。このとき所望のアシル化tRNA群やARSが許容するアミノ酸類縁体群（例えばF-Tyr）を系に添加することによってアミノ酸類縁体群を含むペプチドを翻訳合成することが出来る（Kawakami T, et al. Ribosomal synthesis of polypeptoids and peptoid-peptide hybrids. J Am Chem Soc. 2008, 130, 16861-3., Kawakami T, et al. Diverse backbone-cyclized peptides via codon reprogramming. Nat Chem Biol. 2009, 5, 888-90.）。あるいは、リボソームやEF-Tuなどの変異体を利用することによってアミノ酸類縁体の翻訳導入の効率を高めることも出来る(Dedkova LM, et al. Construction of modified ribosomes for incorporation of D-amino acids into proteins. Biochemistry. 2006, 45, 15541-51., Doi Y,et al. Elongation factor Tu mutants expand amino acid tolerance of protein biosynthesis system. J Am Chem Soc. 2007, 129, 14458-62., Park HS,et al. Expanding the genetic code of Escherichia coli with phosphoserine. Science. 2011, 333, 1151-4.)。
【０１０７】
無細胞翻訳系は、ｍＲＮＡを蛋白質に翻訳することが出来るものである限り、様々なものを含み得る。例えば、細胞より抽出したリボソームの他、翻訳に関与する蛋白因子群、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＡＴＰなどのエネルギー源、その再生系を組み合わせたものなどが挙げられる。また本発明の無細胞翻訳系は、これら以外にも、開始因子、伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素などを含むことができる。これらの因子は、種々の細胞の抽出液から精製することによって得ることができる。因子を精製するための細胞は、例えば原核細胞、または真核細胞を挙げることができる。原核細胞としては、大腸菌細胞、高度好熱菌細胞、または枯草菌細胞を挙げることができる。真核細胞としては、酵母細胞、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞を材料にしたものが知られている。
一方、PURE systemは大腸菌の翻訳に必要な蛋白因子類、エネルギー再生系酵素、リボソームのそれぞれを抽出、精製し、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰなどと混合した再構成無細胞翻訳系である。不純物の含有量が少ないだけでなく、再構成系であるため排除したい蛋白因子、アミノ酸を含まない系を容易に作製することができる。（(i)Nat Biotechnol. 2001;19:751-5. Cell-free translation reconstituted with purified components. Shimizu Y, Inoue A, Tomari Y, Suzuki T, Yokogawa T, Nishikawa K, Ueda T.(ii)Methods Mol Biol. 2010;607:11-21.PURE technology.Shimizu Y, Ueda T.）。
【０１０８】
非限定の一態様として、本発明は、下記の一般式（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）で表される化合物を提供する。これらの化合物は、アミノ酸の主鎖のアミノ基上に、保護基Ｐ１を有する。
2018143145.tif 000026
（式中のＲ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはシクロアルキルであり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはＲ３とＲ４もしくはＲ３とＲ５は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成してもよい。Ｒ６、Ｒ７は、それぞれ独立して水素原子またはメチルであり、Ｐ１は、酵素、還元剤、及び／又は光反応によって脱保護される保護基である。）
これに限定されることはないが、式中のＰ１は、ペニシリンアミドヒドロラーゼ、エステラーゼ、又はアミノペプチダーゼが認識する保護基であることが好ましい。
【０１０９】
このようなＰ１として、具体的には例えば、ペニシリンアミドヒドロラーゼが認識する部分構造Ｘ１を有する下記一般式（Ｉ）、若しくは一般式（ＩＩ）で表される保護基、エステラーゼが認識する部分構造Ｘ２を有する下記一般式（ＩＩＩ）、又はアミノペプチダーゼが認識する部分構造Ｘ３を有する下記一般式（ＸＩＩ）で表される保護基が挙げられる。
2018143145.tif 000027
（式中のＹは、ＮＨもしくは酸素原子であり、Ｌは、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである。）
【０１１０】
より具体的には、式中のＰ１は、前記式（Ｉ）中の部分構造Ｘ１が以下一般式（ＩＶ）もしくは２−チエニルメチルであるか、または、前記式（ＩＩＩ）中の部分構造Ｘ２が、置換されてもよいアルキル、アラルキル、またはシクロアルキルであることが好ましく、メチル、エチル、ベンジル、若しくはｎ−プロピルであることが特に好ましい。
2018143145.tif 000028
（Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル、フルオロ、クロロ、ブロモ、アミノ、ニトロ、またはメトキシである。）
【０１１１】
また、前記式（ＸＩＩ）は、より具体的には、下記一般式（ＸＩＩＩ）であることが好ましい。
2018143145.tif 000029
【０１１２】
このような基としてよりさらに具体的には、４−（２−（４−フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジルオキシカルボニル（Ｆ−Ｐｎａｚ）基：
2018143145.tif 000030
４−（プロピオニルオキシ）ベンジルオキシカルボニル（Ｅｔｅｚ）基：
2018143145.tif 000031
（Ｓ）−（（４−（２−アミノ−４−メチルペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル（Ｌｅｕｚ）基：
2018143145.tif 000032
が挙げられる。
【０１１３】
式中のＰ１は、下記一般式（Ｖ）で表される保護基であるか、又は主鎖のアミノ基と一緒になって形成されたアジド基（主鎖のアミノ基をマスクするアジド基）であることもできる。
2018143145.tif 000033
（式中のＬは、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである。）
これらの保護基は、還元剤（好ましくは、ＴＣＥＰ）により脱保護することができる。これらの保護基として、より具体的には、例えば、４−アジドベンジルオキシカルボニル基（Ａｃｂｚ）、又はアジドメチルオキシカルボニル基（Ａｚｏｃ）が挙げられる。
【０１１４】
非限定の一態様として、本発明は、以下の一般式（Ｘ）または（ＸＩ）で表される化合物を提供する。これらの化合物は、一般式（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）で表される化合物とｐＣｐＡ、又はｐｄＣｐＡとが結合してなる化合物である。
2018143145.tif 000034
（式中、Ｒ３〜Ｒ７、およびＰ１は前記式（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）中のＲ３〜Ｒ７およびＰ１と同意義であり、Ｒ８は水素原子またはヒドロキシルである。）
【０１１５】
さらに本発明は、前記式（Ｘ）または（ＸＩ）に記載の化合物とｔＲＮＡとが結合してなるアミノアシルｔＲＮＡに関する。
さらに本発明は、前記式（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）に記載の化合物とｔＲＮＡとが結合してなるアミノアシルｔＲＮＡに関する。
【０１１６】
上述したアミノアシルｔＲＮＡは、本発明におけるアミノ酸を含むペプチドの効率的な翻訳において有用である。上述したアミノアシルｔＲＮＡは、当業者に周知の方法によって取得することができる。
【０１１７】
非限定の一態様として、本発明は、保護基を有する、無細胞翻訳系の１種以上の構成成分を、該無細胞翻訳系中で脱保護する工程、及び翻訳工程を含む、ペプチドの合成方法であって、該脱保護する工程および該翻訳工程が並行して行われる方法を提供する。これに限定されることはないが、上記態様における脱保護には、酵素、又は還元剤を利用することが好ましい。本態様において用いられる酵素や還元剤の種類、保護基の種類、アミノ酸の種類等は、上述した記載を適宜参考にすることができる。
上記態様における「無細胞翻訳系の構成成分」は、アミノ酸を含むペプチドの翻訳合成をする際に使用する無細胞翻訳系中に含まれる構成成分であれば限定されることはない。
【０１１８】
非限定の一態様として、本発明は、１種以上のアミノ酸残基を含み、かつ環状部を有するペプチドと当該ペプチドをコードする核酸との複合体、又は当該複合体を含むライブラリーの製造方法であって、本発明におけるペプチドの合成工程、及び合成されたペプチドを環化する工程を含む、前記複合体又は前記ライブラリーの製造方法を提供する。これに限定されることはないが、合成されたペプチドは、アミド結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、エーテル結合、エステル結合、チオエステル結合又は炭素-炭素結合によって環化することが好ましい。
【０１１９】
mRNA display
本発明における「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）あるいは、人工塩基を有するヌクレオチド誘導体を含むことができる。また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むこともできる。本発明の核酸は、目的とする遺伝情報が保持される限り、これらの核酸のいずれか、あるいは混成とすることもできる。すなわち、ＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリッドヌクレオチドやＤＮＡとＲＮＡのような異なる核酸が１本鎖に連結されたキメラ核酸も本発明における核酸に含まれる。
本発明においては、これら核酸を鋳型として含むdisplayライブラリーなどの核酸ライブラリーを、好適に用いることができる。
【０１２０】
displayライブラリーは、表現型であるペプチドとその遺伝子型であるペプチドをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡとが対応付けられているライブラリーである。所望の固定した標的にライブラリーを接触させ、標的に結合しない分子を洗い流すことで、標的に結合するペプチドの濃縮が可能である(パニング法)。このような過程を経て選択されたペプチドに対応付けられている遺伝子情報を解析することで、標的に結合したタンパク質の配列を明らかにすることが出来る。例えば、アミノアシルｔＲＮＡのアナログである抗生物質ピューロマイシンがribosomeにおけるｍＲＮＡ翻訳伸長中の蛋白質に非特異的に連結されることを利用する方法が、mRNA display(Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94:12297-302. RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. Roberts RW, Szostak JW.)ないしはin vitro virus(FEBS Lett. 1997;414:405-8. In vitro virus: bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. Nemoto N, Miyamoto-Sato E, Husimi Y, Yanagawa H.)として報告されている。
【０１２１】
Ｔ７プロモーターなどのプロモーターを含むＤＮＡライブラリーからの転写により得られるｍＲＮＡのライブラリーの３'末端にピューロマイシンなどのスペーサーを結合しておくと、無細胞翻訳系において当該ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳させる時に、ピューロマイシンがribosomeによってアミノ酸と間違って認識され、タンパク質に取り込まれる。これにより、ｍＲＮＡとこれにコードされる蛋白質が連結され、ｍＲＮＡとその産物が対応付けられたライブラリーを取得することができる。この過程は大腸菌などの形質転換を含まないため、高い効率が実現され、大規模なdisplayライブラリー(１０１２−１０１４種類）を構築することが出来る。パニングで濃縮、選択された蛋白質に結合している遺伝子情報を含むタグであるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅し、塩基配列を解析することで、所望の標的物質に結合した蛋白質の配列を明らかにすることが出来る。ライブラリーの鋳型となるDNAライブラリーは、アミノ酸残基を固定しない箇所については塩基を混ぜて合成することによって得ることができる。A, T, G, Cの 4塩基の混合(N)の３の倍数個の繰り返し、もしくはコドンの一文字目二文字目はN、三文字目はW, M, K, Sなどの 2塩基の混合として合成することができる。さらに、導入するアミノ酸の種類を16以下に抑えるのであれば、三文字目を1種類の塩基にする方法もある。
【０１２２】
無細胞翻訳系を利用したdisplayライブラリーは、mRNA displayの他に、
ペプチドとピューロマイシンの複合体にペプチドをコードするｃＤＮＡが結合しているcDNA display(Nucleic Acids Res. 2009;37(16):e108.cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions.Yamaguchi J, Naimuddin M, Biyani M, Sasaki T, Machida M, Kubo T, Funatsu T, Husimi Y, Nemoto N.)、
ｍＲＮＡ翻訳中におけるribosomeと翻訳産物の複合体が比較的安定であることを利用したribosome display(Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91:9022-6. An in vitro polysome display system for identifying ligands from very large peptide libraries. Mattheakis LC, Bhatt RR, Dower WJ.)、
bacteriophage endonuclease P2AがDNAと共有結合を形成することを利用したcovalent display(Nucleic Acids Res. 2005;33:e10.Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system.Reiersen H, Lobersli I, Loset GA, Hvattum E, Simonsen B, Stacy JE, McGregor D, Fitzgerald K, Welschof M, Brekke OH, Marvik OJ.)、
微生物のプラスミドの複製開始蛋白RepAが複製開始点oriに結合することを利用したCIS display(Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:2806-10. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Odegrip R, Coomber D, Eldridge B, Hederer R, Kuhlman PA, Ullman C, FitzGerald K, McGregor D.)
が知られている。また、DNAライブラリーを構成するDNAの1分子毎に転写翻訳系をwater-in-oilエマルジョンやリポソームに封入し、翻訳反応を行う、in vitro compartmentalization(Nat Biotechnol. 1998;16:652-6. Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Tawfik DS, Griffiths AD.)も知られている。適宜、公知の方法を用いて上記方法を使用することができる。
【０１２３】
本発明では、上述の無細胞翻訳系を用いてこれら核酸ライブラリーを翻訳することができる。無細胞翻訳系を使用する場合、目的の核酸の下流にスペーサーをコードする配列を含むことが好ましい。スペーサー配列としては、グリシンやセリンを含む配列が挙げられるがこれに限定されない。またピューロマイシン、その誘導体などリボソームによる翻訳時にペプチドに取り込まれる化合物と核酸ライブラリーの間には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ヘキサエチレングリコール（ｓｐｃ１８）のポリマー（例えば５つのポリマー）などで形成されるリンカーを含むことが好ましい。
【０１２４】
所望の活性を有する環状ペプチドのスクリーニング・製造方法
所望の活性を有するペプチド-核酸複合体を製造する方法としては、例えば以下の工程を含む製造方法を挙げることができる：
(i)上述した本発明におけるペプチドの合成方法を使用して、天然アミノ酸及び／又はアミノ酸類縁体の総数が9〜13残基である非環状ペプチドを翻訳合成して、当該非環状ペプチドとそれをコードする核酸配列がリンカーを介して結合している複合体からなる非環状ペプチド-核酸複合体を形成する工程
(ii)工程(i)で翻訳合成された複合体の非環状ペプチドをアミド結合又は炭素-炭素結合によって環化し、環状部の天然アミノ酸及び／又はアミノ酸類縁体の残基数の合計が５〜１２となる環状ペプチドを形成する工程
(iii)工程(ii)で得られた環状部を有するペプチド-核酸複合体ライブラリーと標的物質とを接触させ、当該標的物質に対して結合活性を有する複合体を選択する工程。
【０１２５】
さらに、上記の工程で選択された複合体から、所望の活性を有するペプチドを製造することができる。
例えば以下の工程を含む製造方法を挙げることができる：
(iv)前記工程(iii)で選択された複合体の核酸配列に基づきペプチドの配列情報を得る工程、および、
(v)前記工程(iv)で得られた配列情報に基づきペプチドを化学合成する工程。
上記の製造工程において、前記非環状ペプチドはα-ヒドロキシカルボン酸、及び、保護されていてもよい側鎖にアミノ基を有する天然アミノ酸及び／又はアミノ酸類縁体を含んでいてもよい。さらに、工程(ii）の環状ペプチドを形成する工程の前又は後で、α-ヒドロキシカルボン酸と側鎖にアミノ基を有する天然アミノ酸及び／又はアミノ酸類縁体を化学反応させて分枝部位を形成させる工程を含んでいてもよい。当該工程により、環状部の様々な位置に直鎖部を有する環状ペプチドを製造することが可能である。
【０１２６】
ここで、上述の工程(i)に記載の天然アミノ酸及び／又はアミノ酸類縁体の総数、及び、工程(ii)に記載の環状部の天然アミノ酸及び／又はアミノ酸類縁体の残基数の合計には、翻訳後修飾によって除かれる天然アミノ酸及び／又はアミノ酸類縁体は含まれない。
【０１２７】
なお、本製造方法では、工程(ii)や工程(v)において、上述の環状ペプチドを最適化するための化学修飾を行ってもよい。また、本発明において、標的物質は生体内分子が好ましい。本発明における「生体内分子」とは、生体内の分子であれば特に限定されないが、疾患治療のターゲットとなる分子が好ましく、特に、従来の分子量500未満の低分子化合物が結合し得る穴(キャビティ)を有していない分子や、抗体等の高分子化合物がアクセスすることのできない細胞内蛋白、核酸、膜蛋白の細胞内領域又は膜蛋白の膜貫通ドメイン等が好ましい。
具体的には例えば、STAT、AP1、CREB、SREBPなどの転写因子、ムスカリン性アセチルコリン受容体, カンナビノイド受容体、ＧＬＰ−１受容体、PTH受容体などのGタンパク質共役型受容体(GPCR)、TNF、TNFR、IL-6、IL-6R等のサイトカインやそのレセプター、P2X受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体などのイオンチャネル型受容体、イオンチャネル、トランスポーター、miR-21、miR206などのmicroRNAなどが挙げられる。
また、環状部は、例えば、上述の環化反応を利用して形成することが可能であり、当該環化反応によって、アミド結合や炭素-炭素結合を形成させることが可能である。
【０１２８】
また、環状ペプチド-核酸複合体の合成工程において、無細胞翻訳系など公知の技術を用いることができる。具体的には、上述した方法を用いて作製することができる。
【０１２９】
非限定の一態様として、本発明は、ペプチドの合成方法における酵素、還元剤、または光反応によって脱保護される保護基の使用であって、該方法は、保護基を有する、無細胞翻訳系の1種以上の構成成分を、該無細胞翻訳系中で脱保護する工程、及び翻訳工程を並行して行うことを特徴とする、該保護基の使用を提供する。
非限定の一態様として、本発明は、ペプチドの合成方法における酵素、還元剤、または光反応によって脱保護される保護基の使用であって、該方法は、保護基を有するアミノ酸を結合したtRNAを含む無細胞翻訳系中で、該アミノ酸の保護基を脱保護する工程、及び翻訳工程を並行して行うことを特徴とする、該保護基の使用を提供する。
【０１３０】
非限定の一態様として、本発明は、ペプチドの合成方法において使用するための、酵素、還元剤、または光反応によって脱保護される保護基であって、該方法は、保護基を有する、無細胞翻訳系の１種以上の構成成分を、該無細胞翻訳系中で脱保護する工程、及び翻訳工程を含み、該脱保護する工程および該翻訳工程が並行して行われる、前記保護基を提供する。
非限定の一態様として、本発明は、ペプチドの合成方法において使用するための、酵素、還元剤、または光反応によって脱保護される保護基であって、該方法は、保護基を有するアミノ酸が結合したｔＲＮＡを含む無細胞翻訳系中で、該アミノ酸の保護基を脱保護する工程、及び翻訳工程を含み、該脱保護する工程および該翻訳工程が並行して行われる、前記保護基を提供する。
【０１３１】
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１３２】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。
なお、実施例中では以下の略号を使用した。
ＤＣＭ          ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ      Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ          ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ        ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ          ジチオスレイロール
ＦＡ            ギ酸
ＴＦＡ          トリフルオロ酢酸
ＴＦＥ          トリフルオロエタノール
ＴＨＦ          テトラヒドロフラン
ＴＣＥＰ        トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン
ＮＭＰ          Ｎ−メチル‐２‐ピロリドン
ＤＢＵ          １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン
ＨＯＡｔ        １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＩＣ          Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド
ＰＧＡ          ペニシリンＧアシラーゼ
Ａｃｂｚ        ４−アジドベンジルオキシカルボニル基：
2018143145.tif 000035
Ｆ−Ｐｎａｚ    ４−（２−（４−フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジルオキシカルボニル基：
2018143145.tif 000036
Ｐｅｎ          ４−ペンテノイル基
ＣＨ２ＣＮ      シアノメチル基
ＤＭＡＰ        ４，４−ジメチルアミノピリジン：
Ｅｔｅｚ        ４−（プロピオニルオキシ）ベンジルオキシカルボニル基：
2018143145.tif 000037
Ｌｅｕｚ        （Ｓ）−（（４−（２−アミノ−４−メチルペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル基：
2018143145.tif 000038
【０１３３】
また、ＬＣＭＳの分析条件は、下記のとおりである。
【表１】
2018143145.tif 000039
【０１３４】
実施例１．無細胞翻訳系に用いるｐＣｐＡ-アミノ酸の合成
以下のスキームに従い、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ０５、ｔｓ０７、ｔｓ０９、ｔｓ１４、ｔｓ１９、ｔｓ２０、ｔｓ２３、ｔｓ２６、ｔｓ２９、ＴＳ０３、ＴＳ０６、ＴＳ０９、ＴＳ１２、ＴＳ１５、ＴＳ１８、ＴＳ２１、ＴＳ２４、ＴＳ２９、ＴＳ３４、ＴＳ３７）を合成した。
2018143145.tif 000040
【０１３５】
（Ｓ）−１−（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アゼチジン−２−カルボン酸（化合物ｔｓ０１、Ａｃｂｚ−Ａｚｅ（２）−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000041
【０１３６】
窒素雰囲気下、（Ｓ）−アゼチジンー２−カルボン酸（Ｈ−Ａｚｅ（２）−ＯＨ））（５０．６ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルグリシン（Ｈ−ｎＢｕＧ−ＯＨ））（６５．６ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（８３．０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）及び文献記載（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２００８，  １９，  ７１４．）の方法で合成した炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（５６６ｍｇ、１．８０ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（５．０ｍＬ）を添加した。室温で５分撹拌後トリエチルアミン（４１８μＬ、３．００ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。反応混合物を室温で１５時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−１−（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アゼチジン−２−カルボン酸（化合物ｔｓ０１、Ａｃｂｚ−Ａｚｅ（２）−ＯＨ）（８０．０ｍｇ、５８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２７５  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．６０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１３７】
Ｎ−（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｎ−ブチルグリシン（化合物ｔｓ０２、Ａｃｂｚ−ｎＢｕＧ−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000042
【０１３８】
窒素雰囲気下、（Ｓ）−アゼチジンー２−カルボン酸（Ｈ−Ａｚｅ（２）−ＯＨ））（５０．６ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルグリシン（Ｈ−ｎＢｕＧ−ＯＨ））（６５．６ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（８３．０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）及び文献記載（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２００８，  １９，  ７１４．）の方法で合成した炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（５６６ｍｇ、１．８０ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（５．０ｍＬ）を添加した。室温で５分撹拌後トリエチルアミン（４１８μＬ、３．００ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。反応混合物を室温で１５時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｎ−ブチルグリシン（化合物ｔｓ０２、Ａｃｂｚ−ｎＢｕＧ−ＯＨ）（７０．０ｍｇ、４６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３０５  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．７７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１３９】
（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ｔｓ０３、Ａｃｂｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000043
【０１４０】
窒素雰囲気下、（Ｓ）−アゼチジンー２−カルボン酸（Ｈ−Ａｚｅ（２）−ＯＨ））（５０．６ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルグリシン（Ｈ−ｎＢｕＧ−ＯＨ））（６５．６ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（８３．０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）及び文献記載（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２００８，  １９，  ７１４．）の方法で合成した炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（５６６ｍｇ、１．８０ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（５．０ｍＬ）を添加した。室温で５分撹拌後トリエチルアミン（４１８μＬ、３．００ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。反応混合物を室温で１５時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ｔｓ０３、Ａｃｂｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（１０５．０ｍｇ、６２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３４０  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．４３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１４１】
（Ｓ）−アゼチジン−１,２−ジカルボン酸 ２−（シアノメチル）１−（４−アジドベンジル）（化合物ｔｓ０４、Ａｃｂｚ−Ａｚｅ（２）−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000044
【０１４２】
窒素雰囲気下、（Ｓ）−１−（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アゼチジン−２−カルボン酸（化合物ｔｓ０１、Ａｃｂｚ−Ａｚｅ（２）−ＯＨ）（７０．０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０８９ｍＬ、０．５０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５０７μｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．０２６ｍＬ、０．３８ｍｍｏｌ）を０度において加え室温で２時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物（Ｓ）−アゼチジン−１,２−ジカルボン酸 ２−（シアノメチル）１−（４−アジドベンジル）（化合物ｔｓ０４、Ａｃｂｚ−Ａｚｅ（２）−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（２．００ｍｌ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３１６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１４３】
（２Ｓ）−アゼチジン−１，２−ジカルボン酸  １−（４−アジドベンジル）  ２−（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル)−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル）（化合物ｔｓ０５、Ａｃｂｚ−Ａｚｅ（２）−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000045
【０１４４】
緩衝液Ａ（４０ｍｌ）に、リン酸二水素 （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（８５．０ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）を溶解させ、（Ｓ）−アゼチジン−１,２−ジカルボン酸 ２−（シアノメチル）１−（４−アジドベンジル）（化合物ｔｓ０４、Ａｃｂｚ−Ａｚｅ（２）−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（２．００ｍｌ）を投与し、室温で９０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応液を０度で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｔｓ０５、Ａｃｂｚ−Ａｚｅ（２）−ｐＣｐＡ）（６．０ｍｇ、８．５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ９１１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１４５】
なお、緩衝液Ａは以下のように調整した。
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物（６，４０ｇ、２０ｍｍｏｌ）とイミダゾール（６．８１ｇ、１００ｍｍｏｌ）の水溶液に酢酸を添加し、ｐＨ８、２０ｍＭ  Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム、１００ｍＭイミダゾールの緩衝液Ａ（１Ｌ）を得た。【０１４６】
シアノメチル  Ｎ−（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｎ−ブチルグリシナート（化合物ｔｓ０６、Ａｃｂｚ−ｎＢｕＧ−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000046
【０１４７】
窒素雰囲気下、Ｎ−（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｎ−ブチルグリシン（化合物ｔｓ０２、Ａｃｂｚ−ｎＢｕＧ−ＯＨ）（７０．０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０８０ｍＬ、０．４６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２２９μｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．０２３ｍＬ、０．３４ｍｍｏｌ）を０度において加え室温で２時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル  Ｎ−（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｎ−ブチルグリシナート（化合物ｔｓ０６、Ａｃｂｚ−ｎＢｕＧ−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（２．００ｍｌ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３４６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１４８】
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル  −Ｎ−（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｎ−ブチルグリシナート（化合物ｔｓ０７、Ａｃｂｚ−ｎＢｕＧ−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000047
【０１４９】
緩衝液Ａ（４０ｍｌ）に、リン酸二水素 （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（８５．０ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）を溶解させ、（シアノメチル  Ｎ−（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｎ−ブチルグリシナート（化合物ｔｓ０６、Ａｃｂｚ−ｎＢｕＧ−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（２．００ｍｌ）を投与し、室温で９０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応液を０度で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｔｓ０７、Ａｃｂｚ−ｎＢｕＧ）−ｐＣｐＡ）（１６．０ｍｇ、２１．８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ９４１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１５０】
（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｔｓ０８、Ａｃｂｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000048
【０１５１】
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ｔｓ０３、Ａｃｂｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（８０．０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０８２ｍＬ、０．４７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２３４μｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．０２４ｍＬ、０．３５ｍｍｏｌ）を０度において加え室温で２時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｔｓ０８、Ａｃｂｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（２．００ｍｌ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３８１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１５２】
（２Ｒ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸  （２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ｔｓ０９、Ａｃｂｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000049
【０１５３】
緩衝液Ａ（４０ｍｌ）に、リン酸二水素 （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（８５．０ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）を溶解させ、（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｔｓ０８、Ａｃｂｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（２．００ｍｌ）を投与し、室温で９０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応液を０度で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｔｓ０９、Ａｃｂｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ））−ｐＣｐＡ）（１０．０ｍｇ、１３．１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ９７６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１５４】
２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アセトアミド（化合物ｔｓ１０）の合成
2018143145.tif 000050
【０１５５】
窒素雰囲気下、２−（４−フルオロフェニル）酢酸（３００ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）、４−アミノフェニルメタノール（２６４ｍｇ、２．１４ｍｍｏｌ）、ＤＭＴ−ＭＭ（６４６ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）の混合物に対してＴＨＦ（９．７ｍｌ）を加えたのち、４０度において２時間撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アセトアミド（化合物ｔｓ１０）（４００．０ｍｇ、７９．０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２６０  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１５６】
炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）の合成
2018143145.tif 000051
【０１５７】
窒素雰囲気下、２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アセトアミド（化合物ｔｓ１０）（３００ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．００ｍｌ）に溶解し、ピリジン（０．１８７ｍｌ、２．３１ｍｍｏｌ）を加えたのち、反応液を０度に冷却した。その反応液に対して４−ニトロフェニルクロロホルメート（２３３ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１．１３ｍｌ）を０度においてゆっくり滴下したのち、室温において２時間撹拌した。反応液を濃縮し得られた残渣をヘキサン−酢酸エチル３：１で洗浄し、炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（３３０．０ｍｇ、６７．２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４２５  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１５８】
Ｎ−ブチル−Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）グリシン（化合物ｔｓ１２、Ｆ−Ｐｎａｚ−ｎＢｕＧ−ＯＨ））の合成
2018143145.tif 000052
【０１５９】
窒素雰囲気下、ｎ−ブチルグリシン（Ｈ−ｎＢｕＧ−ＯＨ））（４６．４ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（１５０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（０．３５ｍＬ）を添加した。室温で５分撹拌した後トリエチルアミン（１１３μＬ、０．８１ｍｍｏｌ）を０度にて添加した。反応混合物を室温で１５時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製しＮ−ブチル−Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）グリシン（化合物ｔｓ１２）、Ｆ−Ｐｎａｚ−ｎＢｕＧ−ＯＨ）（１１０．０ｍｇ、７５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４１５  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．７２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１６０】
シアノメチル Ｎ−ブチル−Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ)カルボニル)グリシナート（化合物ｔｓ１３、Ｆ−Ｐｎａｚ−ｎＢｕＧ−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000053
【０１６１】
窒素雰囲気下、Ｎ−ブチル−Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）グリシン（化合物ｔｓ１２、Ｆ−Ｐｎａｚ−ｎＢｕＧ−ＯＨ）（３０．０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１８．８７ｕＬ、０．１１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１８０μｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（４．８３ｕＬ、０．３４ｍｍｏｌ）を０度において加え室温で２時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル Ｎ−ブチル−Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ)カルボニル)グリシナート（化合物ｔｓ１３、Ｆ−Ｐｎａｚ−ｎＢｕＧ−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（２．００ｍｌ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４５６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１６２】
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル Ｎ−ブチル−Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）グリシナート（化合物ｔｓ１４、Ｆ−Ｐｎａｚ−ｎＢｕＧ−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000054
【０１６３】
緩衝液Ａ（４０ｍｌ）に、リン酸二水素 （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（１０４．０ｍｇ、０．１４４ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル Ｎ−ブチル−Ｎ−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ)カルボニル)グリシナート（化合物ｔｓ１３、Ｆ−Ｐｎａｚ−ｎＢｕＧ−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（２．００ｍｌ）を投与し、室温で６０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応液を０度で４５分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｔｓ１４、Ｆ−Ｐｎａｚ−ｎＢｕＧ−ｐＣｐＡ）（２５．０ｍｇ、３３．０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０５１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１６４】
（Ｓ）−１−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アゼチジン−２−カルボン酸（化合物ｔｓ１５、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｚｅ（２）−ＯＨ））の合成
2018143145.tif 000055
【０１６５】
窒素雰囲気下、（Ｓ）−アゼチジンー２−カルボン酸（Ｈ−Ａｚｅ（２）−ＯＨ））（２０．０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（１０１ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（０．３５ｍＬ）を添加した。室温で５分撹拌した後トリエチルアミン（６３．４μＬ、０．４６ｍｍｏｌ）を０度にて添加した。反応混合物を室温で３０分撹拌した後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し（Ｓ）−１−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アゼチジン−２−カルボン酸（化合物ｔｓ１５、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｚｅ（２）−ＯＨ））（６６．０ｍｇ、８６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３８５  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．６０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１６６】
（Ｓ）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ｔｓ１６、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ））の合成
2018143145.tif 000056
【０１６７】
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（３０．０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（９２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（０．１８ｍＬ）を添加した。室温で５分撹拌した後トリエチルアミン（５７．９μＬ、０．４２ｍｍｏｌ）を０度にて添加した。反応混合物を３５度において３０分撹拌した後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し（Ｓ）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ｔｓ１６、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ））（３３．０ｍｇ、４１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４５２  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１６８】
（Ｓ）−アゼチジン−１，２−ジカルボン酸 １−（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）  ２−（シアノメチル)（化合物ｔｓ１７、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｚｅ（２）−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000057
【０１６９】
窒素雰囲気下、（Ｓ）−１−（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アゼチジン−２−カルボン酸（化合物ｔｓ１５、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｚｅ（２）−ＯＨ）（３０．０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（２０．３４ｕＬ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１９４μｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（６．２４ｕＬ、０．０９ｍｍｏｌ）を０度において加え室温で３時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物（Ｓ）−アゼチジン−１，２−ジカルボン酸 １−（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）  ２−（シアノメチル)（化合物ｔｓ１７、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｚｅ（２）−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（２．００ｍｌ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４２６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１７０】
（Ｓ）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｔｓ１８、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000058
【０１７１】
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ｔｓ１６、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ））（３０．０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１７．４１ｕＬ、０．１０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１６６μｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（６．２４ｕＬ、０．０９ｍｍｏｌ）を０度において加え室温で３時間攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し（Ｓ）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｔｓ１８、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１４．０ｍｇ、４３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４９１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１７２】
（２Ｓ）−アゼチジン−１，２−ジカルボン酸  １−（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）  ２−（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル）（化合物ｔｓ１９、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｚｅ（２）−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000059
【０１７３】
緩衝液Ａ（４０ｍｌ）に、リン酸二水素  （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（１１３．０ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）を溶解させ、（Ｓ）−アゼチジン−１，２−ジカルボン酸 １−（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）  ２−（シアノメチル)（化合物ｔｓ１７、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｚｅ（２）−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（２．００ｍｌ）を投与し、室温で６０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応液を０度で４５分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｔｓ１９、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｚｅ（２）−ｐＣｐＡ）（６．０ｍｇ、７．５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０２１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１７４】
（２Ｓ）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸  （２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｔｓ２０、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000060
【０１７５】
緩衝液Ａ（１５ｍｌ）に、リン酸二水素  （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（４１．０ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）を溶解させ、（Ｓ）−２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｔｓ１８、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（０．７５ｍｌ）を投与し、室温で６０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（０．７５ｍＬ）を加えた。反応液を０度で４５分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｔｓ２０、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ））−ｐＣｐＡ）（６．０ｍｇ、１９．４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０８６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１７６】
（Ｓ）−１−（ペンタ−４−エノイル）アゼチジン−２−カルボン酸（化合物ｔｓ２１、Ｐｅｎ−Ａｚｅ（２）−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000061
【０１７７】
（Ｓ）−アゼチジンー２−カルボン酸（Ｈ−Ａｚｅ（２）−ＯＨ））（４．００ｇ、３９．５６ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン （１１１ ｍｌ）／水（１１１ｍｌ）に溶解させた後に、ペンタ−４−エン酸 ２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２３．４  ｇ、１１８．６７  ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（６．６５ｇ、７９．１６ｍｍｏｌ）を加え、反応液を２５度で１６時間撹拌した。反応が完結した後、反応液に水を加えて酢酸エチルで洗浄し、水層の液性がｐＨ３になるまで１Ｍ塩酸水溶液を加えた。得られた混合物を酢酸エチルで抽出操作を行い有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、（Ｓ）−１−（ペンタ−４−エノイル）アゼチジン−２−カルボン酸（化合物ｔｓ２１、Ｐｅｎ−Ａｚｅ（２）−ＯＨ）（６．３０ｇ、８７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １８４（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．０３分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ２）【０１７８】
（Ｓ）−１−（ペンタ−４−エノイル）アゼチジン−２−カルボン酸シアノメチル（化合物ｔｓ２２、Ｐｅｎ−Ａｚｅ（２）−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000062
【０１７９】
窒素雰囲気下、（Ｓ）−１−（ペンタ−４−エノイル）アゼチジン−２−カルボン酸（化合物ｔｓ２１、Ｐｅｎ−Ａｚｅ（２）−ＯＨ）（０．７１ｇ、３．８８ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１．００ｇ、７．７５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１６ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（１．８６ｇ、１５．５１ｍｍｏｌ）を加えて２５度で１６時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し（Ｓ）−１−（ペンタ−４−エノイル）アゼチジン−２−カルボン酸シアノメチル（化合物ｔｓ２２、Ｐｅｎ−Ａｚｅ（２）−ＯＣＨ２ＣＮ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２２３（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．１３分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ２）【０１８０】
（２Ｓ）−１−（ペンタ−４−エノイル）アゼチジン−２−カルボン酸 （２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｔｓ２３、Ｐｅｎ−Ａｚｅ（２）−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000063
【０１８１】
緩衝液Ａ（２００ｍｌ）に、リン酸二水素 （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（８００ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）を溶解させ、（Ｓ）−１−（ペンタ−４−エノイル）アゼチジン−２−カルボン酸シアノメチル（化合物ｔｓ２２、Ｐｅｎ−Ａｚｅ（２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．０５ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（６．００ｍｌ）を投与し、２５度で６０分撹拌した。室温でトリフルオロ酢酸（４．６０ｍＬ）を加えたのち凍結乾燥を行った。得られた残渣を水（５０．０ｍｌ）に溶解させ酢酸エチル（１００ｍｌ）で洗浄した後、水層を凍結乾燥した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｔｓ２３、Ｐｅｎ−Ａｚｅ（２）−ｐＣｐＡ）（２０．０ｍｇ、２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ８１８（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６３分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１）【０１８２】
Ｎ−ブチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシン（化合物ｔｓ２４、Ｐｅｎ−ｎＢｕＧ−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000064
【０１８３】
ｎ−ブチルグリシン塩酸塩（Ｈ−ｎＢｕＧ−ＯＨ・ＨＣｌ））（１７．００ｇ、７．６２ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン （１５０ｍｌ）／水（１５０ｍｌ）に溶解させ、炭酸ナトリウムでｐＨ７に調整した後、ペンタ−４−エン酸 ２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２０．０  ｇ、１０１．４  ｍｍｏｌ）と、炭酸ナトリウム（７．００ｇ、８３．３３ｍｍｏｌ）を加え、反応液を室温で１６時間撹拌した。反応が完結した後、反応液をジエチルエーテルで洗浄し、水層の液性がｐＨ２になるまで１Ｍ塩酸水溶液を加えた。得られた混合物をＤＣＭで４回抽出操作を行い有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／エーテル）にて精製し、Ｎ−ブチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシン（化合物ｔｓ２４、Ｐｅｎ−ｎＢｕＧ−ＯＨ）（７．００ｇ、６２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２１４（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．２４分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ３）【０１８４】
シアノメチル  Ｎ−ブチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシナート（化合物ｔｓ２５、Ｐｅｎ−ｎＢｕＧ−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000065
【０１８５】
窒素雰囲気下、Ｎ−ブチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシン（化合物ｔｓ２４、Ｐｅｎ−ｎＢｕＧ−ＯＨ）（３．８０ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（４．６ｇ、３５．６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（８０ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（（８．５４ｇ、７１．２ｍｍｏｌ）を加えて室温で１６時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製しシアノメチル  Ｎ−ブチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシナート（化合物ｔｓ２５、Ｐｅｎ−ｎＢｕＧ−ＯＣＨ２ＣＮ）（２．８ｇ、６４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２５３（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．４０分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ３）【０１８６】
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル  Ｎ−ブチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシナート（化合物ｔｓ２６、Ｐｅｎ−ｎＢｕＧ−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000066
【０１８７】
緩衝液Ａ（１００ｍｌ））に、リン酸二水素 （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル  Ｎ−ブチル−Ｎ−（ペンタ−４−エノイル）グリシナート（化合物ｔｓ２５、Ｐｅｎ−ｎＢｕＧ−ＯＣＨ２ＣＮ）（５５８ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（４ｍｌ）を投与し、室温で２時間撹拌した。室温でトリフルオロ酢酸（２．３０ｍＬ）を加えたのち凍結乾燥を行った。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｔｓ２６、Ｐｅｎ−ｎＢｕＧ−ｐＣｐＡ）（６５ｍｇ、１４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ８４８（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．２５分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ３）【０１８８】
（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ｔｓ２７、Ｐｅｎ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000067
【０１８９】
ＤＣＭ（２０ｍｌ）に２−クロロトリチルレジン（１．６０ｍｍｏｌ／ｇ、３．２１ｇ）を加え１０分間振とうしレジンを膨潤させた。ＤＣＭを除いたのち、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（２．００ｇ、５．１５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１．３３ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（３３ｍｌ）を加え室温で３０分間振とうした後、ＭｅＯＨ（２．７８ｍｌ）を加えさらに１時間振とうした。ＤＣＭ溶液を除去した後ＤＣＭ（１５ｍｌ）でレジンを２回洗浄し、化合物ｔｓ２７＋＋＋を得た。得られた化合物ｔｓ２７＋＋＋に対して、２％ＤＢＵ−ＤＭＦ溶液（２０ｍｌ）を加え室温で１５分振とうした後に溶液を除去し、ＤＭＦ（２０ｍｌ）で５回レジンを洗浄し、化合物ｔｓ２７＋＋（２．３５ｇ、５．１４ｍｍｏｌ）を得た。得られた化合物ｔｓ２７＋＋に対して、４−ペンテン酸（２．０６ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（２．１０ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）及びＤＩＣ（３．２４ｇ、２５．７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２０ｍｌ）を加え室温で終夜振とうした。溶液を除去しＤＭＦ（２０ｍｌ）で４回、ＤＣＭ（２０ｍｌ）で４回レジンを洗浄し、化合物２７＋（２．７６ｇ、５．１２ｍｍｏｌ）を得た。得られた化合物２７＋に対してＤＣＭ（３０ｍｌ）を加え１５分間振とうしレジンを膨潤させた。ＤＣＭを除いたのちＴＦＥ（５０ｍｌ）／ＤＣＭ（５０ｍｌ）を加え室温で２時間半振とうし、化合物ｔｓ２７のレジン上から切り出した。切り出し液ＴＦＥ−ＤＣＭ（１００ｍｌ）を除去し、さらにＴＦＥ（３０ｍｌ）／ＤＣＭ（３０ｍｌ）でレジンを２回洗浄した。この洗浄液（計６０ｍｌ）と先ほどの切り出し液（１００ｍｌ）を合わせエバポレーターで留去し得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ｔｓ２７、Ｐｅｎ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（５６４ｍｇ、４４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２４７（Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．３３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１９０】
（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｔｓ２８、Ｐｅｎ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000068
【０１９１】
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（化合物ｔｓ２７、Ｐｅｎ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＨ）（１００ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１０６ｕＬ、０．６０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．００ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（２８．１ｕＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を室温で加え室温で３０分攪拌した後Ｎ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（３５ｕＬ、０．２０ｍｍｏｌ）及び２−ブロモアセトニトリル（８．４３ｕＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を再び加えた。室温で１０分撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えＭＴＢＥで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後エバポレーターで溶媒を留去し、粗生成物（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｔｓ２８、Ｐｅｎ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（０．５７ｍｌ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２８８  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１９２】
（２Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸 （２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｔｓ２９、Ｐｅｎ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000069
【０１９３】
緩衝液Ａ（１７ｍｌ）に、リン酸二水素 （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（５９．２ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）を溶解させ、（Ｓ）−２−（ペンタ−４−エンアミド）−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｔｓ２８、Ｐｅｎ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（０．５７ｍｌ）を投与し、室温で６０分撹拌した。反応液に酢酸（１７ｍＬ）を加え１時間撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｔｓ２９、Ｐｅｎ−Ａｌａ（３−Ｐｙｒ）−ｐＣｐＡ）（１４．８ｍｇ、２０．５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ８９６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３９、０．４１分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ２）【０１９４】
Ｎ−（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−アラニン（化合物ＴＳ０１、Ａｃｂｚ−Ａｌａ−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000070
【０１９５】
窒素雰囲気下、Ｌ−アラニン（Ｈ−Ａｌａ−ＯＨ）（４４．５ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）及び文献記載（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００８，１９，７１４．）の方法で合成した炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（１５７ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（１．０ｍＬ）を添加した。０℃で５分撹拌後トリエチルアミン（１７４μＬ、１．２５ｍｍｏｌ）を０℃にて添加した。反応混合物を室温で７２時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製しＮ−(（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−アラニン（化合物ＴＳ０１、Ａｃｂｚ−Ａｌａ−ＯＨ）（１１３．６ｍｇ、８６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２６３  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．６１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１９６】
シアノメチル（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−アラニナート（化合物ＴＳ０２、Ａｃｂｚ−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000071
【０１９７】
窒素雰囲気下、Ｎ−(（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−アラニン（化合物ＴＳ０１、Ａｃｂｚ−Ａｌａ−ＯＨ）（１７４．０ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．１７２ｍＬ、０．９９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１３１５μｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．０６７ｍＬ、０．９９ｍｍｏｌ）を０℃において加え室温で１８時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−アラニナート（化合物ＴＳ０２、Ａｃｂｚ−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（２．００ｍｌ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３０２  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．７１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１９８】
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル  （（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−アラニナート（化合物ＴＳ０３、Ａｃｂｚ−Ａｌａ−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000072
【０１９９】
緩衝液Ａ（４０ｍｌ）に、リン酸二水素 （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（６０．２ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−アラニナート（化合物ＴＳ０２、Ａｃｂｚ−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（１．２５ｍｌ）を投与し、室温で９０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（１．２５ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＴＳ０３、Ａｃｂｚ−Ａｌａ−ｐＣｐＡ）（３６．３ｍｇ、４８．５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ８９９  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２００】
（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−アラニン（化合物ＴＳ０４、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000073
【０２０１】
窒素雰囲気下、Ｌ−アラニン（Ｈ−Ａｌａ−ＯＨ）（３０．０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（１４３ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１．１２ｍＬ）を添加した。室温で５分撹拌した後、トリエチルアミン（９４．０μＬ、０．６７ｍｍｏｌ）を０℃にて添加した。反応混合物を室温において４０時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−アラニン（化合物ＴＳ０４、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ−ＯＨ）（７８．６ｍｇ、６２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３７３  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．６２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２０２】
シアノメチル（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−アラニナート（化合物ＴＳ０５、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000074
【０２０３】
窒素雰囲気下、（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−アラニン（化合物ＴＳ０４、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ−ＯＨ）（３１．１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（２９．０μＬ、０．１７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４１５μｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（５７．９μＬ、０．８３ｍｍｏｌ）を０℃において加え室温で２時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−アラニナート（化合物ＴＳ０５、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（０．７５ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４１２  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．７１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２０４】
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル  （（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−アラニナート（化合物ＴＳ０６、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000075
【０２０５】
緩衝液Ａ（２２．５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（３０．０ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｌ−アラニナート（化合物ＴＳ０５、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（０．７５ｍＬ）を投与し、室温で１２０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（０．７５ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＴＳ０６、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ａｌａ−ｐＣｐＡ）（７．９ｍｇ、１８．７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １００７  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．４７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２０６】
２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−２−メチルプロパン酸（化合物ＴＳ０７、Ａｃｂｚ−ＡＩＢ−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000076
【０２０７】
窒素雰囲気下、２−アミノ−２−メチルプロパン酸（Ｈ−ＡＩＢ−ＯＨ）（３２．８ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）及び文献記載（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００８，１９，７１４．）の方法で合成した炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（１００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１．５９ｍＬ）を添加した。０℃で５分撹拌後、トリエチルアミン（１２７μＬ、０．７３ｍｍｏｌ）を０℃にて添加した。反応混合物を室温で１５時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−２−メチルプロパン酸（化合物ＴＳ０７、Ａｃｂｚ−ＡＩＢ−ＯＨ）（８．０ｍｇ、９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２７７  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．６４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２０８】
２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−２−メチルプロパン酸シアノメチル（化合物ＴＳ０８、Ａｃｂｚ−ＡＩＢ−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000077
【０２０９】
窒素雰囲気下、２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−２−メチルプロパン酸（化合物ＴＳ０７、Ａｃｂｚ−ＡＩＢ−ＯＨ）（７．０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（８．８０μＬ、０．０６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１２６μＬ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（２．５４μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）を０℃において加え室温で３時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−２−メチルプロパン酸シアノメチル（化合物ＴＳ０８、Ａｃｂｚ−ＡＩＢ−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（０．７５ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３１６  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２１０】
２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−２−メチルプロパン酸 （２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ＴＳ０９、Ａｃｂｚ−ＡＩＢ−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000078
【０２１１】
緩衝液Ａ（１５ｍＬ）に、リン酸二水素 （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（３１．９ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）を溶解させ、２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−２−メチルプロパン酸シアノメチル（化合物ＴＳ０８、Ａｃｂｚ−ＡＩＢ−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（０．７５ｍＬ）を投与し、室温で１２０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（０．７５ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＴＳ０９、Ａｃｂｚ−ＡＩＢ−ｐＣｐＡ）（１．８ｍｇ、８．９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １００７  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．４７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２１２】
２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−２−メチルプロパン酸（化合物ＴＳ１０、Ｆ−Ｐｎａｚ−ＡＩＢ−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000079
【０２１３】
窒素雰囲気下、２−アミノ−２−メチルプロパン酸（Ｈ−ＡＩＢ−ＯＨ）（１２．９ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（１０６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１．００ｍＬ）を添加した。室温で５分撹拌した後、トリエチルアミン（４０．１μＬ、０．２９ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。反応混合物を５０℃において１５時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−２−メチルプロパン酸（化合物ＴＳ１０、Ｆ−Ｐｎａｚ−ＡＩＢ−ＯＨ）（２１．０ｍｇ、４３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３８７  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．６３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２１４】
２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−２−メチルプロパン酸シアノメチル（化合物ＴＳ１１、Ｆ−Ｐｎａｚ−ＡＩＢ−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000080
【０２１５】
窒素雰囲気下、２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−２−メチルプロパン酸（化合物ＴＳ１０、Ｆ−Ｐｎａｚ−ＡＩＢ−ＯＨ）（２０．０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１４．３９μＬ、０．０８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５７μＬ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（５．１８μＬ、０．０８ｍｍｏｌ）を０℃において加え、室温で２４時間撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−２−メチルプロパン酸シアノメチル（化合物ＴＳ１１、Ｆ−Ｐｎａｚ−ＡＩＢ−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（１．５０ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４２６  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．７１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２１６】
２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−２−メチルプロパン酸 （２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ＴＳ１２、Ｆ−Ｐｎａｚ−ＡＩＢ−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000081
【０２１７】
緩衝液Ａ（３０．０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（７４．４ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）を溶解させ、２−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−２−メチルプロパン酸シアノメチル（化合物ＴＳ１１、Ｆ−Ｐｎａｚ−ＡＩＢ−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（１．５０ｍＬ）を投与し、室温で１２０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（１．５０ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＴＳ１２、Ｆ−Ｐｎａｚ−ＡＩＢ−ｐＣｐＡ）（７．３ｍｇ、１３．９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０２１  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．４６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２１８】
２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ＴＳ１３、Ａｃｂｚ−β―Ａｌａ−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000082
【０２１９】
窒素雰囲気下、３−アミノプロパン酸（２８．４ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）及び文献記載（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００８，１９，７１４．）の方法で合成した炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（１００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１．５９ｍＬ）を添加した。０℃で５分撹拌後、トリエチルアミン（１２７μＬ、０．７３ｍｍｏｌ）を０℃にて添加した。反応混合物を室温で１５時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ＴＳ１３、Ａｃｂｚ−β−Ａｌａ−ＯＨ）（６０．０ｍｇ、７１．４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２６３  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．５８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２２０】
３−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸シアノメチル（化合物ＴＳ１４、Ａｃｂｚ−β−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000083
【０２２１】
窒素雰囲気下、２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ＴＳ１３、Ａｃｂｚ−β−Ａｌａ−ＯＨ）（６０．０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（７９．０μＬ、０．４５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．１４ｍＬ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（２３．０μＬ、０．３４ｍｍｏｌ）を０℃において加え、室温で３時間撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物３−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸シアノメチル（化合物ＴＳ１４、Ａｃｂｚ−β−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（２．５０ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３０２  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．６９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２２２】
３−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸 （２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ＴＳ１５、Ａｃｂｚ−β−Ａｌａ−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000084
【０２２３】
緩衝液Ａ（５０ｍＬ）に、リン酸二水素 （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（３１．９ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）を溶解させ、３−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸シアノメチル（化合物ＴＳ１４、Ａｃｂｚ−β−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（２．５０ｍＬ）を投与し、室温で３０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２．５０ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＴＳ１５、Ａｃｂｚ−β−Ａｌａ−ｐＣｐＡ）（３０．０ｍｇ、３３．７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ８９７  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．４２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２２４】
３−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ＴＳ１６、Ｆ−Ｐｎａｚ−β−Ａｌａ−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000085
【０２２５】
窒素雰囲気下、３−アミノプロパン酸（２２．３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（１１１ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１．００ｍＬ）を添加した。室温で５分撹拌した後、トリエチルアミン（８０．１μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。反応混合物を室温において１５時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、３−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ＴＳ１６、Ｆ−Ｐｎａｚ−β−Ａｌａ−ＯＨ）（５７．０ｍｇ、６０．９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３７３  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．５８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２２６】
３−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸シアノメチル（化合物ＴＳ１７、Ｆ−Ｐｎａｚ−β−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000086
【０２２７】
窒素雰囲気下、３−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ＴＳ１６、Ｆ−Ｐｎａｚ−β−Ａｌａ−ＯＨ）（２０．０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１４．９３μＬ、０．０９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１０７μＬ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（５．３７μＬ、０．０８ｍｍｏｌ）を０℃において加え、室温で９０分撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物３−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸シアノメチル（化合物ＴＳ１７、Ｆ−Ｐｎａｚ−β−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（１．５０ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４１２  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．６７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２２８】
３−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸 （２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ＴＳ１８、Ｆ−Ｐｎａｚ−β−Ａｌａ−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000087
【０２２９】
緩衝液Ａ（３０ｍＬ）に、リン酸二水素 （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（４８．９ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）を溶解させ、３−（（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸シアノメチル（化合物ＴＳ１７、Ｆ−Ｐｎａｚ−β−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（１．５０ｍＬ）を投与し、室温で３０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（１．５０ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＴＳ１８、Ｆ−Ｐｎａｚ−β−Ａｌａ−ｐＣｐＡ）（８．６ｍｇ、１７．６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １００７  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．４４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２３０】
Ｎ−（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｄ−アラニン（化合物ＴＳ１９、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000088
【０２３１】
窒素雰囲気下、Ｄ−アラニン（Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ）（４４．５ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）及び文献記載（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００８，１９，７１４．）の方法で合成した炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（１５７ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（１．０ｍＬ）を添加した。０℃で５分撹拌後、トリエチルアミン（１７４μＬ、１．２５ｍｍｏｌ）を０℃にて添加した。反応混合物を室温で７２時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ−(（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｄ−アラニン（化合物ＴＳ１９、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ）（１１９．１ｍｇ、９０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２６３  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．６１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２３２】
シアノメチル（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｄ−アラニナート（化合物ＴＳ２０、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000089
【０２３３】
窒素雰囲気下、Ｎ−(（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｄ−アラニン（化合物ＴＳ１９、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ）（７９．０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０７９ｍＬ、０．４５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（６００μｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．０３０ｍＬ、０．４５ｍｍｏｌ）を０℃において加え、室温で１８時間撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｄ−アラニナート（化合物ＴＳ２０、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（２．００ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３０２  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．７１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２３４】
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル  （（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｄ−アラニナート（化合物ＴＳ２１、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ａｌａ−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000090
【０２３５】
緩衝液Ａ（７２ｍＬ）に、リン酸二水素 （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（１０８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｄ−アラニナート（化合物ＴＳ２０、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（２．２５ｍＬ）を投与し、室温で９０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２．２５ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＴＳ２１、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ａｌａ−ｐＣｐＡ）（５６．３ｍｇ、４１．７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ８９９  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２３６】
（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｄ−アラニン（化合物ＴＳ２２、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000091
【０２３７】
窒素雰囲気下、Ｄ−アラニン（Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ）（１００ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）、炭酸−（４−ニトロフェニル）−４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（４７６ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（３．７４ｍＬ）を添加した。室温で５分撹拌した後、トリエチルアミン（３１３μＬ、２．２５ｍｍｏｌ）を０℃にて添加した。反応混合物を室温において２０時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｄ−アラニン（化合物ＴＳ２２、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ）（３６６ｍｇ、８７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３７３  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．６２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２３８】
シアノメチル（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｄ−アラニナート（化合物ＴＳ２３、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000092
【０２３９】
窒素雰囲気下、（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｄ−アラニン（化合物ＴＳ２２、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ）（３６６ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（３４１μＬ、１．９５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４．８８ｍＬ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（６６１μＬ、９．７７ｍｍｏｌ）を０℃において加え、室温で２時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、シアノメチル（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｄ−アラニナート（化合物ＴＳ２３、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）（３９０ｍｇ、９７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４１２  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．７１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２４０】
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル  （（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｄ−アラニナート（化合物ＴＳ２４、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｄ−Ａｌａ−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000093
【０２４１】
緩衝液Ａ（４５ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（８０．０ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル（（（４−（２−（４−フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−Ｄ−アラニナート（化合物ＴＳ２３、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＣＨ２ＣＮ）（６８．７ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．５０ｍＬ）を投与し、室温で１２０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（１．５０ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＴＳ２４、Ｆ−Ｐｎａｚ−Ｄ−Ａｌａ−ｐＣｐＡ）（１９．７ｍｇ、２３．５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １００７  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．４７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２４２】
プロピオン酸 ４−（ヒドロキシメチル）フェニル（化合物ＴＳ２５）の合成
2018143145.tif 000094
【０２４３】
窒素雰囲気下、4−（ヒドロキシメチル）フェノール（１２４ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１２．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の混合物に対してＤＣＭ（５．００ｍＬ）を加えて撹拌したのち、トリエチルアミン（３０７μＬ、２．２０ｍｍｏｌ）、続けてプロピオン酸無水物（１２８μＬ、１．００ｍｍｏｌ）を室温にて加え、そのまま１５分撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、プロピオン酸 ４−（ヒドロキシメチル）フェニル（化合物ＴＳ２５）（９７．０ｍｇ、５４．０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １７９  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．５１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２４４】
プロピオン酸 ４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル（化合物ＴＳ２６）の合成
2018143145.tif 000095
【０２４５】
窒素雰囲気下、プロピオン酸 ４−（ヒドロキシメチル）フェニル（化合物ＴＳ２５）（９７．０ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）、４−ニトロフェニルクロロホルメート（１０８ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）の混合物をＤＣＭ（１．００ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。そこへピリジン（０．０５２ｍＬ、０．６５ｍｍｏｌ）を加えたのち、室温において１時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、プロピオン酸 ４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル（化合物ＴＳ２６）（８２．０ｍｇ、４４．１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３４６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２４６】
（Ｓ）−４−フェニル−２−（（（（４−（プロピオニルオキシ）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ブタン酸（化合物ＴＳ２７、Ｅｔｅｚ−Ｈｐｈ−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000096
【０２４７】
窒素雰囲気下、ホモフェニルアラニン（Ｈ−Ｈｐｈ−ＯＨ）（４２．６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、プロピオン酸 ４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル（化合物ＴＳ２６）（８２．０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１．１９ｍＬ）を添加した。室温で５分撹拌した後、トリエチルアミン（７６．０μＬ、０．５５ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。反応混合物を室温において４時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−４−フェニル−２−（（（（４−（プロピオニルオキシ）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ブタン酸（化合物ＴＳ２７、Ｅｔｅｚ−Ｈｐｈ−ＯＨ）（４６．０ｍｇ、５０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３８４  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．７５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２４８】
（Ｓ）−４−フェニル−２−（（（（４−（プロピオニルオキシ）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ブタン酸シアノメチル（化合物ＴＳ２８、Ｅｔｅｚ−Ｈｐｈ−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000097
【０２４９】
窒素雰囲気下、（Ｓ）−４−フェニル−２−（（（（４−（プロピオニルオキシ）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ブタン酸（化合物ＴＳ２７、Ｅｔｅｚ−Ｈｐｈ−ＯＨ）（４６．０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（３３．０μＬ、０．１９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２００μＬ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（１１．０μＬ、０．１７ｍｍｏｌ）を室温にて加え、終夜撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物（Ｓ）−４−フェニル−２−（（（（４−（プロピオニルオキシ）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ブタン酸シアノメチル（化合物ＴＳ２８、Ｅｔｅｚ−Ｈｐｈ−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（３．００ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４２３  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２５０】
（２Ｓ）−４−フェニル−２−（（（（４−（プロピオニルオキシ）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ブタン酸 （２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ＴＳ２９、Ｅｔｅｚ−Ｈｐｈ−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000098
【０２５１】
緩衝液Ａ（６０．０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（７２．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を溶解させ、（Ｓ）−４−フェニル−２−（（（（４−（プロピオニルオキシ）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ブタン酸シアノメチル（化合物ＴＳ２８、Ｅｔｅｚ−Ｈｐｈ−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（３．００ｍＬ）を投与し、室温で６０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（３．００ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＴＳ２９、Ｅｔｅｚ−Ｈｐｈ−ｐＣｐＡ）（１６．４ｍｇ、１６．１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０１８  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２５２】
（Ｓ）−（１−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ＴＳ３０）の合成
2018143145.tif 000099
【０２５３】
窒素雰囲気下、（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン（２３１ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）、４−アミノフェニルメタノール（１２３ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）の混合物に対してＤＣＭ（２．００ｍＬ）を加え撹拌したのち、室温において２−エトキシキノリン−１（２Ｈ）−カルボン酸エチル（２７２ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）を加え、さらに１時間撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、（Ｓ）−（１−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ＴＳ３０）（２８５．０ｍｇ、８５．０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３３５  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．６６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２５４】
（Ｓ）−（４−メチル−１−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソペンタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ＴＳ３１）の合成
2018143145.tif 000100
【０２５５】
窒素雰囲気下、（Ｓ）−（１−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ＴＳ３０）（１６８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、４−ニトロフェニルクロロホルメート（１０１ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の混合物をＤＣＭ（２．００ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却したのち、ピリジン（０．０４９ｍＬ、０．６０ｍｍｏｌ）を加え、室温において１時間撹拌した。反応液にＤＣＭ（３．５ｍＬ）を加えたのち、水（２ｍＬ）で有機層を２回洗浄し、濃縮し粗生成物（Ｓ）−（４−メチル−１−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソペンタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ＴＳ３１）（２５０．０ｍｇ、１００％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ５０２  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２５６】
（Ｓ）−２−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−メチルペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−４−フェニルブタン酸（化合物ＴＳ３２、Ｂｏｃ−Ｌｅｕｚ−Ｈｐｈ−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000101
【０２５７】
窒素雰囲気下、ホモフェニルアラニン（Ｈ−Ｈｐｈ−ＯＨ）（２２．４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、（Ｓ）−（４−メチル−１−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソペンタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物ＴＳ３１）（６２．７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（０．５０ｍＬ）を添加した。室温で５分撹拌した後、トリエチルアミン（４０．０μＬ、０．２９ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。反応混合物を室温において３時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−メチルペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−４−フェニルブタン酸（化合物ＴＳ３２、Ｂｏｃ−Ｌｅｕｚ−Ｈｐｈ−ＯＨ）（３７．０ｍｇ、５５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ５４０  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２５８】
（Ｓ）−２−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−メチルペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−４−フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ＴＳ３３、Ｂｏｃ−Ｌｅｕｚ−Ｈｐｈ−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000102
【０２５９】
窒素雰囲気下、（（Ｓ）−２−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−メチルペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−４−フェニルブタン酸（化合物ＴＳ３２、Ｂｏｃ−Ｌｅｕｚ−Ｈｐｈ−ＯＨ）（１４．０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（７．０μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５０μＬ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（２．５μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）を室温にて加え、３５℃にて１時間撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物（Ｓ）−２−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−メチルペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−４−フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ＴＳ３３、Ｂｏｃ−Ｌｅｕｚ−Ｈｐｈ−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（０．７５ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０７４  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．４６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２６０】
（２Ｓ）−２−（（（（４−（（Ｒ）−２−アミノ−４−メチルペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−４−フェニルブタン酸 （２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ＴＳ３４、Ｌｅｕｚ−Ｈｐｈ−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000103
【０２６１】
緩衝液Ａ（１５．０ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（２７．１ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を溶解させ、（Ｓ）−２−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−メチルペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−４−フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ＴＳ３３、Ｂｏｃ−Ｌｅｕｚ−Ｈｐｈ−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（０．７５ｍＬ）を投与し、室温で６０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（３．００ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で６０分撹拌した。さらにトリフルオロ酢酸（４．５０ｍＬ）を加え、室温にて４５分撹拌したのち、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＴＳ３４、Ｌｅｕｚ−Ｈｐｈ−ｐＣｐＡ）（２．０ｍｇ、７．４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０７４  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．４６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２６２】
（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−４−フェニルブタン酸（化合物ＴＳ３５、Ａｃｂｚ−Ｈｐｈ−ＯＨ）の合成
2018143145.tif 000104
【０２６３】
窒素雰囲気下、ホモフェニルアラニン（Ｈ−Ｈｐｈ−ＯＨ）（５４．０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）及び文献記載（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００８，１９，７１４．）の方法で合成した炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（９９．０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（２．０ｍＬ）を添加した。室温で５分撹拌後、トリエチルアミン（９６６．０μＬ、０．６９ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。反応混合物を室温で１５時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−４−フェニルブタン酸（化合物ＴＳ３５、Ａｃｂｚ−Ｈｐｈ−ＯＨ）（３３．０ｍｇ、３１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３５３  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２６４】
（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−４−フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ＴＳ３６、Ａｃｂｚ−Ｈｐｈ−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2018143145.tif 000105
【０２６５】
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−４−フェニルブタン酸（化合物ＴＳ３５、Ａｃｂｚ−Ｈｐｈ−ＯＨ）（３５．０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０３５ｍＬ、０．２０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．０１３ｍＬ、０．２０ｍｍｏｌ）を室温において加え、室温で４時間撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−４−フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ＴＳ３６、Ａｃｂｚ−Ｈｐｈ−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（３．００ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３９２  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２６６】
（２Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−４−フェニルブタン酸 （２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ＴＳ３７、Ａｃｂｚ−Ｈｐｈ−ｐＣｐＡ）の合成
2018143145.tif 000106
【０２６７】
緩衝液Ａ（６０ｍＬ）に、リン酸二水素 （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（７２．０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を溶解させ、（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−４−フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ＴＳ３６、Ａｃｂｚ−Ｈｐｈ−ＯＣＨ２ＣＮ）のアセトニトリル溶液（３．００ｍＬ）を投与し、室温で１２０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（３．００ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で３０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＴＳ３７、Ａｃｂｚ−Ｈｐｈ−ｐＣｐＡ）（２７．０ｍｇ、２７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ９８７  （Ｍ＋Ｈ）−
保持時間：０．６２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２６８】
実施例２．アミノアシルｔＲＮＡの合成
定法により以下のtRNAGluUAG（-CA）を調製した。
配列番号ＴＲ−１（配列番号：１）
tRNAGluUAG(-CA)  RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC【０２６９】
定法により以下のtRNAGluACG（-CA）を調製した。
配列番号ＴＲ−２（配列番号：９）
tRNAGluACG(-CA)  RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUACGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC【０２７０】
アミノアシルｐＣｐＡを用いたアミノアシルｔＲＮＡ合成：その１
５０μＭ  転写tRNAGluUAG(-CA)（配列番号ＴＲ−１）(２０μｌ)に、10X ligation buffer （500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2）(４μｌ)、１０ｍＭ  ＡＴＰ  （４μｌ）、Nuclease free water  （５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、２．５ｍＭのアミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ０５、ｔｓ０７、ｔｓ０９、ｔｓ１４、ｔｓ１９、ｔｓ２０、ｔｓ２３、ｔｓ２６、およびｔｓ２９）のＤＭＳＯ溶液  （４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、０．３Ｍ 酢酸ナトリウムと、６２．５ｍＭヨウ素（水：ＴＨＦ＝１：１溶液）を加え、室温で１０分間静置し、ペンテノイル基の脱保護を行った後、フェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によりアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ−１、２、３、４，５，６，７，８，９）を回収した。（なお保護基がペンテノイル基でない、ｔｓ０５、ｔｓ０７、ｔｓ０９、ｔｓ１４、ｔｓ１９、ｔｓ２０、についてはこの操作を行っていない。）回収したアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ−１、２、３，４，５，６，７，８，９）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。【０２７１】
化合物ＡＡｔＲ−１
Aze(2)-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000107
【０２７２】
化合物ＡＡｔＲ−２
nBuG-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000108
【０２７３】
化合物ＡＡｔＲ−３
Ala(3-Pyr)-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000109
【０２７４】
化合物ＡＡｔＲ−４
Acbz-Aze(2)-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000110
【０２７５】
化合物ＡＡｔＲ−５
Acbz-nBuG-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000111
【０２７６】
化合物ＡＡｔＲ−６
Acbz-Ala(3-Pyr)-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000112
【０２７７】
化合物ＡＡｔＲ−７
F-Pnaz-Aze(2)-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000113
【０２７８】
化合物ＡＡｔＲ−８
F-Pnaz-nBuG-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000114
【０２７９】
化合物ＡＡｔＲ−９
F-Pnaz-Ala(3-Pyr)-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000115
【０２８０】
アミノアシルｐＣｐＡを用いたアミノアシルｔＲＮＡ合成：その２
５０μＭ  転写tRNAGluUAG(-CA)（配列番号ＴＲ−１）(２０μｌ)に、10X ligation buffer （500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2）(４μｌ)、１０ｍＭ  ＡＴＰ  （４μｌ）、Nuclease free water  （５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、２．５ｍＭのアミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ０３、ＴＳ０６、ＴＳ０９、ＴＳ１２、ＴＳ１５、ＴＳ１８、ＴＳ２１、ＴＳ２４、ＴＳ２９、およびＴＳ３７）のＤＭＳＯ溶液  （４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、０．３Ｍ 酢酸ナトリウムと、０．５Ｍ ＴＣＥＰ水溶液（ｐＨ７に調整、４μＬ）を加え、室温で１０分間静置し、Ａｃｂｚ基の脱保護を行った後、フェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によりアミノアシル化ｔＲＮＡを回収した。（なお保護基がＡｃｂｚ基でない、ＴＳ０６、ＴＳ１２、ＴＳ１８、ＴＳ２４、ＴＳ２９についてはこの脱保護操作を行っていない。）回収したアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ−１０〜ＡＡｔＲ−１４，ＡＡｔＲ−１６〜ＡＡｔＲ−２０）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。【０２８１】
化合物ＡＡｔＲ−１０
Ala-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000116
【０２８２】
化合物ＡＡｔＲ−１１
AIB-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000117
【０２８３】
化合物ＡＡｔＲ−１２
β-Ala-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000118
【０２８４】
化合物ＡＡｔＲ−１３
D-Ala-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000119
【０２８５】
化合物ＡＡｔＲ−１４
Hph-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000120
【０２８６】
化合物ＡＡｔＲ−１６
F-Pnaz-Ala-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000121
【０２８７】
化合物ＡＡｔＲ−１７
F-Pnaz-AIB-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000122
【０２８８】
化合物ＡＡｔＲ−１８
F-Pnaz-β-Ala-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000123
【０２８９】
化合物ＡＡｔＲ−１９
F-Pnaz-D-Ala-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000124
【０２９０】
化合物ＡＡｔＲ−２０
Etez-Hph-tRNAGluUAG（配列番号：２）
2018143145.tif 000125
【０２９１】
アミノアシルｐＣｐＡを用いたアミノアシルｔＲＮＡ合成：その３
５０μＭ  転写tRNAGluACG(-CA)（配列番号ＴＲ−２）(２０μｌ)に、10X ligation buffer （500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2）(４μｌ)、１０ｍＭ  ＡＴＰ  （４μｌ）、Nuclease free water  （５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、２．５ｍＭのアミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ３４、およびＴＳ３７）のＤＭＳＯ溶液  （４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、０．３Ｍ 酢酸ナトリウムと、０．５Ｍ ＴＣＥＰ水溶液（ｐＨ７に調整、４μＬ）を加え、室温で１０分間静置し、Ａｃｂｚ基の脱保護を行った後、フェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によりアミノアシル化ｔＲＮＡを回収した。（なお保護基がＡｃｂｚ基でないＴＳ３４についてはこの脱保護操作を行っていない。）回収したアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ−１５，ＡＡｔＲ−２１）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。【０２９２】
化合物ＡＡｔＲ−１５
Hph-tRNAGluACG（配列番号：１０）
2018143145.tif 000126
【０２９３】
化合物ＡＡｔＲ−２１
Leuz-Hph-tRNAGluACG（配列番号：１０）
2018143145.tif 000127
次に、本手法を用いることにより、翻訳の伸長反応におけるアミノ酸の翻訳効率と生成物の純度がどのように影響されるかを確認するための実験を実施した。具体的には、同じアミノ酸を含む同じペプチド化合物の翻訳合成を実施し、生成物の純度については質量分析を用いて比較・確認を行い、翻訳効率については放射性同位体によるラベル体を用いて比較・確認を行った。【０２９４】
実施例３．ペプチドの翻訳合成
翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ  ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ  ＧＴＰ，１ｍＭ  ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．６，１００ｍＭ  酢酸カリウム，６ｍＭ  酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ  ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍＭ  10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ  ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ  無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ  ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ  メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ  ＥＦ−Ｇ、０．２４μＭ  ＲＦ２、０．１７μＭ  ＲＦ３、０．５μＭ  ＲＲＦ，２．７μＭ  ＩＦ１，０．４μＭ  ＩＦ２，１．５μＭ  ＩＦ３，４０μＭ  ＥＦ−Ｔｕ，４４μＭ  ＥＦ−Ｔｓ，１．２μＭ  リボソーム，０．７３μＭ  ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ  ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ  ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ  ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ  ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ  ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ  ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ  ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ  ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ  ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ  ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ  ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ  ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ  ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ  ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ  ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ  ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ  ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ  ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ  ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にＨｉｓタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ  鋳型ｍＲＮＡと、Ａｌａ，Ｐｈｅ，Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ，Ａｒｇ，Ｓｅｒ，Ｖａｌの各アミノ酸をそれぞれ２５０μＭずつ加え、さらに１０μＭのアミノアシルｔＲＮＡＧｌｕを翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。【０２９５】
＜質量分析による検出：その１＞
無細胞翻訳系にて翻訳合成されたペプチドを質量分析するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に１μＭ  鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ−１）と各アミノ酸としてＡｌａ，Ｐｈｅ，Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ，Ａｒｇ，Ｓｅｒ，Ｖａｌ（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、調製した９種類の１０μＭアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−１、ＡＡｔＲ−２、ＡＡｔＲ−３、ＡＡｔＲ−４、ＡＡｔＲ−５、ＡＡｔＲ−６、ＡＡｔＲ−７、ＡＡｔＲ−８、ＡＡｔＲ−９）をそれぞれ添加し、３７℃で６０分間保温した。Ａｃｂｚ保護基のついたアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−４、ＡＡｔＲ−５、ＡＡｔＲ−６）を用いた翻訳系については脱保護試薬としてＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン；還元剤、最終濃度１０ｍＭ）を、Ｆ−Ｐｎａｚ保護基のついたアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−７、ＡＡｔＲ−８、ＡＡｔＲ−９）については脱保護試薬としてＰＧＡ（ペニシリンＧアシラーゼ（＝ペニシリンアミドヒドロラーゼ）、最終濃度１ｕＭ、ＳＩＧＭＡ社）を加えた。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析した。翻訳産物はマトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルを測定して同定した。
その結果、Ａｃｂｚ保護されたアミノアシルｔＲＮＡをＴＣＥＰを用い翻訳系内で脱保護を行った翻訳産物（ＡＡｔＲ−４、ＡＡｔＲ−５、ＡＡｔＲ−６）、Ｆ−Ｐｎａｚ保護されたアミノアシルｔＲＮＡをＰＧＡを用い翻訳系内で脱保護を行った翻訳産物（ＡＡｔＲ−７、ＡＡｔＲ−８、ＡＡｔＲ−９）のいずれにおいても表２に示した目的物が主生成物として翻訳出来ていることが確認された（図１−１、図１−２、図１−３）。【０２９６】
＜質量分析による検出：その２＞
無細胞翻訳系にて翻訳合成されたペプチドを質量分析するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に１μＭ  鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ−１）と各アミノ酸としてＡｌａ，Ｐｈｅ，Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ，Ａｒｇ，Ｓｅｒ，Ｖａｌ（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、調製した８種類の１０μＭアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−１０〜ＡＡｔＲ−１３、ＡＡｔＲ−１６〜ＡＡｔＲ−１９）をそれぞれ添加し、３７℃で６０分間保温した。Ｆ−Ｐｎａｚ保護基のついたアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−１６〜ＡＡｔＲ−１９）については脱保護試薬としてＰＧＡ（最終濃度１μＭ、ＳＩＧＭＡ社）を加えた。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析した。翻訳産物はマトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルを測定して同定した。
その結果、Ｆ−Ｐｎａｚ保護されたアミノアシルｔＲＮＡをＰＧＡを用い翻訳系内で脱保護を行った翻訳産物も従来法同様に表２に示した目的物が主生成物として翻訳出来ていることが確認された（図１−４、図１−５、図１−６、図１−７）。【０２９７】
＜質量分析による検出：その３＞
無細胞翻訳系にて翻訳合成されたペプチドを質量分析するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に１μＭ  鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ−１）と各アミノ酸としてＡｌａ，Ｐｈｅ，Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ，Ａｒｇ，Ｓｅｒ，Ｖａｌ（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、調製した２種類の１０μＭアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−１４、ＡＡｔＲ−２０）をそれぞれ添加し、３７℃で６０分間保温した。Ｅｔｅｚ保護基のついたアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−２０）については脱保護試薬としてＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ―２  ＣＢ（リパーゼ、最終濃度１ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を加えた。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析した。翻訳産物はマトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルを測定して同定した。
その結果、Ｅｔｅｚ保護されたアミノアシルｔＲＮＡをリパーゼを用い翻訳系内で脱保護を行った翻訳産物も従来法同様に表２に示した目的物が主生成物として翻訳出来ていることが確認された（図１−８）。【０２９８】
＜質量分析による検出：その４＞
無細胞翻訳系にて翻訳合成されたペプチドを質量分析するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に１μＭ  鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ−１）と各アミノ酸としてＡｌａ，Ｐｈｅ，Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ，Ｌｅｕ，Ｓｅｒ，Ｖａｌ（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、調製した２種類の１０μＭアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−１５、ＡＡｔＲ−２１）をそれぞれ添加し、３７℃で６０分間保温した。Ｌｅｕｚ保護基のついたアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−２１）については脱保護試薬としてＡｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（ロイシンアミノペプチダーゼ、最終濃度１ｍｇ／ｍｌ、ＳＩＧＭＡ社）を加えた。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析した。翻訳産物はマトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルを測定して同定した。
その結果、Ｌｅｕｚ保護されたアミノアシルｔＲＮＡをロイシンアミノペプチダーゼを用い翻訳系内で脱保護を行った翻訳産物も従来法同様に表２に示した目的物が主生成物として翻訳出来ていることが確認された（図１−９）。【０２９９】
鋳型ＤＮＡ（配列番号Ｄ−１）から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro 転写反応により鋳型用ｍＲＮＡ（配列番号Ｒ−１）を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。【０３００】
鋳型ＤＮＡ  配列番号Ｄ−１（配列番号：３）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGTCTAAAGCCGTTTGCTCGTGTTGGTTAAGCTTCG【０３０１】
鋳型ｍＲＮＡ  配列番号Ｒ−１（配列番号：４）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAGUCUAAAGCCGUUUGCUCGUGUUGGUUAAGCUUCG【０３０２】
ペプチド配列
fMetSer[Xaa]LysProPheAlaArgValGly（配列番号：５）
fMetSerLeuLysProPheAla[Xaa]ValGly（配列番号：１１）【０３０３】
【表２】
2018143145.tif 000128
【０３０４】
＜電気泳動による検出：その１＞
Ｎ末端にシステインまたはシステイン類縁体が翻訳導入されたペプチドを検出するために、ラジオアイソトープでラベルしたアスパラギン酸を用いてペプチドの翻訳実験を行った。具体的には、上述の無細胞翻訳系に１μＭ  鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ−１Ｄ）と各アミノ酸としてＡｌａ，Ｐｈｅ，Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ，Ａｒｇ，Ｓｅｒ，Ｖａｌ（各々最終濃度２５０μＭ）、１４Ｃ-アスパラギン酸(最終濃度３７μＭ、Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、MC139)を加えた溶液を調製し、調製した９種類の１０μＭアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−１、ＡＡｔＲ−２、ＡＡｔＲ−３、ＡＡｔＲ−４、ＡＡｔＲ−５、ＡＡｔＲ−６、ＡＡｔＲ−７、ＡＡｔＲ−８、ＡＡｔＲ−９）をそれぞれ添加し、３７℃で１時間静置した。Ａｃｂｚ保護基のついたアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−４、ＡＡｔＲ−５、ＡＡｔＲ−６）を用いた翻訳系については脱保護試薬としてＴＣＥＰ（最終濃度１０ｍＭ）を、Ｆ−Ｐｎａｚ保護基のついたアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−７、ＡＡｔＲ−８、ＡＡｔＲ−９）については脱保護試薬としてＰＧＡ（最終濃度１ｕＭ、ＳＩＧＭＡ社）を加えた。
得られた翻訳反応溶液に対して等量の2Xサンプルバッファー(ＴＥＦＣＯ社、catNo.06-323)を加え、95℃で3分間加熱後、電気泳動（16% Peptide-PAGE mini、ＴＥＦＣＯ社、TB-162）を実施した。泳動後のゲルは、Clear Dry Quick Dry Starter KIT(ＴＥＦＣＯ社、03-278)を用いて乾燥させ、イメージングプレート(GEヘルスケア社、28-9564-75)に２４時間露光させ、バイオアナライザーシステム(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア社)で検出し、ImageQuantTL(GEヘルスケア社)で解析した。
その結果、Ａｃｂｚ保護されたアミノアシルｔＲＮＡをＴＣＥＰを用い翻訳系内で脱保護を行った翻訳産物（ＡＡｔＲ−４、ＡＡｔＲ−５、ＡＡｔＲ−６）、Ｆ−Ｐｎａｚ保護されたアミノアシルｔＲＮＡをＰＧＡを用い翻訳系内で脱保護を行った翻訳産物（ＡＡｔＲ−７、ＡＡｔＲ−８、ＡＡｔＲ−９）いずれにおいても、翻訳系外で調製したアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−１、ＡＡｔＲ−２、ＡＡｔＲ−３）を用いた場合と比較して、表３に示した目的物が高い翻訳効率で合成されていることが確認された（図２−１）。【０３０５】
＜電気泳動による検出：その２＞
Ｎ末端にシステインまたはシステイン類縁体が翻訳導入されたペプチドを検出するために、ラジオアイソトープでラベルしたアスパラギン酸を用いてペプチドの翻訳実験を行った。具体的には、上述の無細胞翻訳系に１μＭ  鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ−１Ｄ）と各アミノ酸としてＡｌａ，Ｐｈｅ，Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ，Ａｒｇ，Ｓｅｒ，Ｖａｌ（各々最終濃度２５０μＭ）、１４Ｃ-アスパラギン酸(最終濃度３７μＭ、Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、ＭＣ１３９)を加えた溶液を調製し、調製した８種類の１０μＭアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−１０〜ＡＡｔＲ−１３、ＡＡｔＲ−１６〜ＡＡｔＲ−１９）をそれぞれ添加し、３７℃で１時間静置した。Ｆ−Ｐｎａｚ保護基のついたアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−１６〜ＡＡｔＲ−１９）については脱保護試薬としてＰＧＡ（最終濃度１μＭ、ＳＩＧＭＡ社）を加えた。
得られた翻訳反応溶液に対して等量の2Xサンプルバッファー(ＴＥＦＣＯ社、catNo.06-323)を加え、95℃で3分間加熱後、電気泳動（16% Peptide-PAGE mini、ＴＥＦＣＯ社、TB-162）を実施した。泳動後のゲルは、Clear Dry Quick Dry Starter KIT(ＴＥＦＣＯ社、03-278)を用いて乾燥させ、イメージングプレート(GEヘルスケア社、28-9564-75)に２４時間露光させ、バイオアナライザーシステム(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア社)で検出し、ImageQuantTL(GEヘルスケア社)で解析した。
その結果、Ｆ−Ｐｎａｚ保護されたアミノアシルｔＲＮＡをＰＧＡを用い翻訳系内で脱保護を行った翻訳産物（ＡＡｔＲ−１６〜ＡＡｔＲ−１９）においては、翻訳系外で調製したアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−１０〜ＡＡｔＲ−１３）を用いた場合と比較して、表３に示した目的物が高い翻訳効率で合成されていることが確認された（図２−２）。【０３０６】
＜電気泳動による検出：その３＞
Ｎ末端にシステインまたはシステイン類縁体が翻訳導入されたペプチドを検出するために、ラジオアイソトープでラベルしたアスパラギン酸を用いてペプチドの翻訳実験を行った。具体的には、上述の無細胞翻訳系に１μＭ  鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ−１Ｄ）と各アミノ酸としてＡｌａ，Ｐｈｅ，Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ，Ａｒｇ，Ｓｅｒ，Ｖａｌ（各々最終濃度２５０μＭ）、１４Ｃ-アスパラギン酸(最終濃度３７μＭ、Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、ＭＣ１３９)を加えた溶液を調製し、調製した２種類の１０μＭアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−１４、ＡＡｔＲ−２０）をそれぞれ添加し、３７℃で１時間静置した。Ｅｔｅｚ保護基のついたアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−２０）については脱保護試薬としてＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ―２  ＣＢ（リパーゼ；最終濃度１ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を加えた。
得られた翻訳反応溶液に対して等量の2Xサンプルバッファー(ＴＥＦＣＯ社、catNo.06-323)を加え、95℃で3分間加熱後、電気泳動（16% Peptide-PAGE mini、ＴＥＦＣＯ社、TB-162）を実施した。泳動後のゲルは、Clear Dry Quick Dry Starter KIT(ＴＥＦＣＯ社、03-278)を用いて乾燥させ、イメージングプレート(GEヘルスケア社、28-9564-75)に２４時間露光させ、バイオアナライザーシステム(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア社)で検出し、ImageQuantTL(GEヘルスケア社)で解析した。
その結果、Ｅｔｅｚ保護されたアミノアシルｔＲＮＡをリパーゼを用い翻訳系内で脱保護を行った翻訳産物（ＡＡｔＲ−２０）においては、翻訳系外で調製したアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−１４）を用いた場合と比較して、表３に示した目的物が高い翻訳効率で合成されていることが確認された（図２−３）。【０３０７】
＜電気泳動による検出：その４＞
Ｎ末端にシステインまたはシステイン類縁体が翻訳導入されたペプチドを検出するために、ラジオアイソトープでラベルしたアスパラギン酸を用いてペプチドの翻訳実験を行った。具体的には、上述の無細胞翻訳系に１μＭ  鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ−１Ｄ）と各アミノ酸としてＡｌａ，Ｐｈｅ，Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ，Ｌｅｕ，Ｓｅｒ，Ｖａｌ（各々最終濃度２５０μＭ）、１４Ｃ-アスパラギン酸(最終濃度３７μＭ、Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、ＭＣ１３９)を加えた溶液を調製し、調製した２種類の１０μＭアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−１５、ＡＡｔＲ−２１）をそれぞれ添加し、３７℃で１時間静置した。Ｌｅｕｚ保護基のついたアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−２１）については脱保護試薬としてＡｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ、ＳＩＧＭＡ社）を加えた。
得られた翻訳反応溶液に対して等量の2Xサンプルバッファー(ＴＥＦＣＯ社、catNo.06-323)を加え、95℃で3分間加熱後、電気泳動（16% Peptide-PAGE mini、ＴＥＦＣＯ社、TB-162）を実施した。泳動後のゲルは、Clear Dry Quick Dry Starter KIT(ＴＥＦＣＯ社、03-278)を用いて乾燥させ、イメージングプレート(GEヘルスケア社、28-9564-75)に２４時間露光させ、バイオアナライザーシステム(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア社)で検出し、ImageQuantTL(GEヘルスケア社)で解析した。
その結果、Ｌｅｕｚ保護されたアミノアシルｔＲＮＡをロイシンアミノペプチダーゼを用い翻訳系内で脱保護を行った翻訳産物（ＡＡｔＲ−２１）においては、翻訳系外で調製したアミノアシルｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ−１５）を用いた場合と比較して、表３に示した目的物が高い翻訳効率で合成されていることが確認された（図２−４）。【０３０８】
鋳型ＤＮＡ（配列番号Ｄ−１Ｄ）から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro 転写反応により鋳型用ｍＲＮＡ（配列番号Ｒ−１Ｄ）を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。【０３０９】
鋳型ＤＮＡ  配列番号Ｄ−１Ｄ（配列番号：６）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGTCTAAAGCCGTTTGCTCGTGTTGGTGACGACGACTAAGCTTCG【０３１０】
鋳型ｍＲＮＡ  配列番号Ｒ−１Ｄ（配列番号：７）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAGUCUAAAGCCGUUUGCUCGUGUUGGUGACGACGACUAAGCUUCG【０３１１】
ペプチド配列
fMetSer[Xaa]LysProPheAlaArgValGlyAspAspAsp（配列番号：８）
fMetSerLeuLysProPheAla[Xaa]ValGlyAspAspAsp（配列番号：１２）【０３１２】
【表３】
2018143145.tif 000129
【産業上の利用可能性】
【０３１３】
本発明により、１または複数のアミノ酸を含むペプチドを効率的に合成する手法が提供された。本発明の方法は、無細胞翻訳系において、ｔＲＮＡに結合しているアミノ酸の保護基を脱保護する工程と、鋳型核酸からペプチドを翻訳する工程を含み、これらの工程を並行して行う。本発明は、医薬品の候補物質として期待されるアミノ酸を含む環状ペプチドなどの中分子化合物の合成やスクリーニングにおいて有用である。
【図１−１】
2018143145.tif 000137
【図１−２】
2018143145.tif 000138
【図１−３】
2018143145.tif 000139
【図１−４】
2018143145.tif 000140
【図１−５】
2018143145.tif 000141
【図１−６】
2018143145.tif 000142
【図１−７】
2018143145.tif 000143
【図１−８】
2018143145.tif 000144
【図１−９】
2018143145.tif 000145
【図２−１】
2018143145.tif 000146
【図２−２】
2018143145.tif 000147
【図２−３】
2018143145.tif 000148
【図２−４】
2018143145.tif 000149
【配列表】
2018143145000001.app
【国際調査報告】
2018143145.tif 000150
2018143145.tif 000151
2018143145.tif 000152
2018143145.tif 000153