(57)【要約】  生物学的試料から核酸を回収する方法であって、以下の工程：工程ａ）、水溶性の中性ポリマーが酸化セリウムの表面に吸着した担体と核酸を含む溶液を混合し、担体に核酸を吸着させる工程、工程ｂ）、工程ａ）において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、工程ｃ）工程ｂ）において分離した前記核酸が吸着した担体に溶出液を加えて核酸を回収する工程、を含むことを特徴とする核酸の回収方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料から核酸を回収する方法であって、以下の工程：
工程ａ）水溶性の中性ポリマーが酸化セリウムの表面に吸着した担体と核酸を含む溶液を混合し、担体に核酸を吸着させる工程、
工程ｂ）工程ａ）において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程ｃ）工程ｂ）において分離した前記核酸が吸着した担体に溶出液を加えて核酸を回収する工程、
を含むことを特徴とする核酸の回収方法。
【請求項２】
前記水溶性の中性ポリマーが、ｐＨ７の溶液中で−１０ｍＶ以上＋１０ｍＶ以下のゼータ電位を有するポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の核酸の回収方法。
【請求項３】
前記ポリマーが、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリプロピレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド又はヒドロキシプロピルメチルセルロースであることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸の回収方法。
【請求項４】
前記溶出液が緩衝液であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の核酸の回収方法。
【請求項５】
前記生物学的試料が、血液、尿、唾液、粘膜、汗、培養細胞、培養細胞の培養液、組織試料、標本、微生物、微生物の培養液またはウイルスであることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の核酸の回収方法。
【請求項６】
水溶性の中性ポリマーが酸化セリウムの表面に吸着した担体。
【請求項７】
前記水溶性の中性ポリマーが、ｐＨ７の溶液中で−１０ｍＶ以上＋１０ｍＶ以下のゼータ電位を有するポリマーであることを特徴とする請求項６に記載の担体。
【請求項８】
前記水溶性の中性ポリマーが、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリプロピレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド又はヒドロキシプロピルメチルセルロースであることを特徴とする請求項６または７に記載の担体。
【請求項９】
請求項６から８のいずれかに記載の担体と緩衝液を備えることを特徴とする核酸回収用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を回収する方法、水溶性の中性ポリマーが酸化セリウムの表面に吸着した担体、及び核酸回収用のキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を用いた実験技術の発展により新規遺伝子探索やその解析が可能となった。がんなどの疾患を特定するためにヒトのゲノムが解析され、病原体の感染を特定するためにそれらのゲノムが解析されるなど、医療現場においても遺伝子解析を利用したスクリーニング検査や臨床検査などが行われている。【０００３】
また、遺伝子解析の標的としては、ゲノムのような長鎖核酸ばかりではなく、短鎖核酸も注目されている。近年発見されたｍｉＲＮＡは１８塩基長以上２５塩基長以下の１本鎖ＲＮＡであり、６０塩基長以上９０塩基長以下のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡから生合成される。これらは、タンパク質の合成や遺伝子の発現を調節する機能を持っていることから疾患と関連があるとされ、遺伝子解析の標的として注目されている。また、メタゲノミック診断法のように、臨床検体中の病原体由来の数百塩基長の核酸断片を次世代シーケンサーで網羅的に解析する方法もあり、新規な遺伝子解析法として注目されている。現在の遺伝子解析の標的は、遺伝子探索が進むにつれて多様化していると言える。従って、遺伝子解析の標的の多様化に合わせて、核酸の回収方法も、ｍｉＲＮＡのような数十塩基長の核酸からゲノムのような長鎖の核酸まで回収できる方法が求められている。【０００４】
遺伝子解析をする上でまず必要となるのは、生物学的試料から核酸を回収する工程である。核酸を高純度、高収率に回収できれば、その後の検出反応において高感度な遺伝子検出、及び遺伝子解析が可能となる。核酸の回収方法としては、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿及びシリカへの核酸吸着などが代表的なものとして挙げられる。【０００５】
中でも最も汎用的な方法は、特許文献１に記載されている、シリカを含む金属酸化物へ核酸を吸着、溶出させて回収するＢｏｏｍ法である。この方法は、遠心操作により核酸の吸着したシリカから核酸を回収すると同時に核酸の濃縮ができる特徴がある。しかしながら、特許文献２には、Ｂｏｏｍ法を用いた場合、３００塩基長以上１０００塩基長以下の長さを持つ核酸のシリカに対する吸着性は、それより長い長さを有する核酸の吸着性に比べて劣ることが記載されている。これらのことから、１００塩基長以下の長さを有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡやｍｉＲＮＡを回収することは困難であることが予想される。遺伝子解析は医療現場においても利用されていることから、煩雑な操作や有機溶媒を使用せずに、核酸を回収できる方法が好ましい。【０００６】
有機溶媒を使用しない方法として、特許文献３には、酸化鉄などの磁性を有する無機成分を担体として用い、核酸を吸着させて回収する方法が記載されている。しかしながら、この方法では、核酸の回収液に無機成分が溶出してしまい、回収した核酸の純度が低下する課題があったため、無機成分の担体にポリマーや、金属酸化物でコーティングする方法があわせて記載されている。【０００７】
また、有機溶媒を使用しない別の方法としてシリカゲルのイオン交換カラムを用いた方法がある。特許文献４では、イオン交換カラムに用いるシリカゲルの担体に、チタニア、セリア、ジルコニア、ハフニアなどの比重の大きい粒子を含有させて、カラムの密度を高め、核酸の回収量を向上させる方法が記載されている。しかしながら、特許文献４の方法では、プラスミドの回収効率を高めることはできるが、段落［０１３４］に小さい断片の核酸が担体に吸着されないと記載されており、非常に短い核酸であるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡやｍｉＲＮＡを回収することは困難であることが予想される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５２３４８０９号明細書
【特許文献２】特表２０１１−５２２５２９号公報
【特許文献３】特開２００７−６７２８号公報
【特許文献４】特表２００２−５１０７８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のように、様々な核酸の回収方法が検討されているが、上述したように特許文献４に記載の方法では、非常に短い核酸であるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡやｍｉＲＮＡを回収することは困難であることが予想される。また、特許文献３の酸化鉄を担体とする回収方法に関しては、実際に核酸を回収した結果が開示されていないため、どの程度の長さの核酸を、どの程度の効率で回収できるのか不明である。特許文献３の追試実験として、後述する比較例１では、酸化鉄を担体として核酸を回収する実験を行ったが、酸化鉄は核酸に対する吸着性が非常に低く、核酸の回収に適していないことがわかった。また、比較例２では、酸化鉄を金属酸化物で被覆した担体を想定してポリマーが表面に吸着されていない酸化セリウムを担体として核酸を回収する実験を行った。しかしながら、酸化セリウムに吸着した核酸を効率的に溶出することができなかった。【００１０】
本発明者らは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡやｍｉＲＮＡのような非常に短い核酸から、ゲノムのような長い核酸まで効率よく回収するためには、高い吸着率で核酸を吸着する担体と、吸着した核酸を効率よく溶出できる方法を見出す必要があると考えた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、核酸の吸着率の高い担体として酸化セリウムの担体を新規に見出した。さらに表面に水溶性の中性ポリマーを吸着させることで、核酸の吸着率を低下させることなく、核酸の溶出率を改善させることができることを明らかにし、本発明を完成させるにいたった。【００１２】
本発明は以下の通りである。
（１）生物学的試料から核酸を回収する方法であって、以下の工程：
工程ａ）水溶性の中性ポリマーが酸化セリウムの表面に吸着した担体と核酸を含む溶液を混合し、担体に核酸を吸着させる工程、
工程ｂ）工程ａ）において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程ｃ）工程ｂ）において分離した前記核酸が吸着した担体に溶出液を加えて核酸を回収する工程、
を含むことを特徴とする核酸の回収方法。
（２）前記水溶性の中性ポリマーが、ｐＨ７の溶液中で−１０ｍＶ以上＋１０ｍＶ以下のゼータ電位を有するポリマーであることを特徴とする（１）に記載の核酸の回収方法。
（３）前記ポリマーが、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリプロピレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド又はヒドロキシプロピルメチルセルロースであることを特徴とする（１）又は（２）に記載の核酸の回収方法。
（４）前記溶出液が緩衝液であることを特徴とする（１）から（３）のいずれかに記載の核酸の回収方法。
（５）前記生物学的試料が、血液、尿、唾液、粘膜、汗、培養細胞、培養細胞の培養液、組織試料、標本、微生物、微生物の培養液またはウイルスであることを特徴とする（１）から（４）のいずれかに記載の核酸の回収方法。
（６）水溶性の中性ポリマーが酸化セリウムの表面に吸着した担体。
（７）前記水溶性の中性ポリマーが、ｐＨ７の溶液中で−１０ｍＶ以上＋１０ｍＶ以下のゼータ電位を有するポリマーであることを特徴とする（６）に記載の担体。
（８）前記水溶性の中性ポリマーが、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリプロピレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド又はヒドロキシプロピルメチルセルロースであることを特徴とする（６）または（７）に記載の担体。
（９）（６）から（８）のいずれかに記載の担体と緩衝液を備えることを特徴とする核酸回収用のキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、酸化セリウムの表面に水溶性の中性ポリマーが吸着した担体を用いると、簡便な方法で核酸を高収率に回収できること、さらにこれまで効率的に回収することが難しかったｐｒｅ−ｍｉＲＮＡやｍｉＲＮＡなどの非常に短い核酸も高収率で回収することが可能になる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明で用いる生物学的試料は、核酸を含む任意の試料を使用できる。核酸には、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ（キメラ）及び人工核酸などが挙げられる。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、マイクロＤＮＡ、セルフリーＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡなどが挙げられる。また、ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡもしくはｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ、それらの前駆体又は合成ＲＮＡなどが挙げられる。合成ＤＮＡ及び合成ＲＮＡは、所定の塩基配列（天然型配列又は非天然型配列のいずれでもよい）に基づいて、例えば自動核酸合成機を用いて、人工的に作製できる。
【００１５】
また、生物学的試料としては、例えば、培養細胞、培養細胞の培養液、組織試料や標本などの細胞由来試料、細菌、真菌、原生生物やウイルスなどの微生物由来試料、血液、尿、唾液、粘膜、汗、痰、精液などの体液や便などのヒトを含む動物由来試料、核酸の他に、タンパク質、糖や脂質などの生物学的機能を有する化合物を含む溶液などを利用することができ、これらに限定されない。上記生物学的試料は、好ましくは、培養細胞や体液であり、更に好ましくは血液である。血液には、全血、血漿、血清、血球などが含まれる。
【００１６】
これらの生物学的試料が体液等の液体試料である場合には、採取後そのまま本発明を適用してもよいし、採取後に溶液を加えて希釈してもよい。生物学的試料が細胞ペレットや組織片等の固体試料である場合には、採取後に水や緩衝液で希釈してから本発明に用いてもよい。
【００１７】
生物学的試料は、必要に応じて、以下のような処理をしてもよい。これは、核酸が生物学的試料において細胞膜、細胞壁、小胞、リポソーム、ミセル、リボソーム、ヒストン、核膜、ミトコンドリア、ウイルスのキャプシド、エンベロープ、エンドソームまたはエキソソームのような化合物に内包されていたり、これらが相互作用していたりすることが多いためである。より収率よく核酸を回収するために、これらから遊離させることを目的とした処理を行ってもよい。
【００１８】
具体的には、大腸菌が含まれている生物学的試料から核酸の回収効率を高めるために、以下のような処理を行うことができる。例えば、大腸菌が含まれる生物学的試料に対して０．２Ｍの水酸化ナトリウムと１％のＳＤＳの混合液を加えることができ（アルカリ変性法）、また、１０％のサルコシル溶液を加えることもできる（サルコシルによる非変性法）。また、これらの溶液にリゾチームを添加しておいてもよい。また、プロテイナーゼＫにより３７℃で１時間処理を行うこともできる。他の方法として超音波処理を行うこともできる。
【００１９】
生物学的試料に対して、酵母が含まれている生物学的試料から核酸の回収効率を高めるために、以下のような処理を行うことができる。例えば、生化学工業株式会社やナカライテスク株式会社から市販されているザイモリエースで処理した後に１０％のＳＤＳを加えることもできる。
【００２０】
生物学的試料に対して、細胞が含まれている生物学的試料から核酸の回収効率を高めるために、以下のような処理を行うことができる。例えば、１％のＳＤＳを加えることができる。他の方法として、４Ｍ以上の塩化グアニジニウム、グアニジンチオシアン酸塩、及び尿素などを加えることができる。この溶液に対して、サルコシルを０．５％以上になるよう加えてもよい。また、メルカプトエタノールを５０ｍＭ以上の濃度になるよう加えてもよい。
【００２１】
上記の操作において、生物学的試料に含まれる核酸の分解を抑制するために、核酸の分解酵素の阻害剤を添加してもよい。ＤＮＡ分解酵素の阻害剤として、ＥＤＴＡを１ｍＭ以下の濃度で添加することができる。また、ＲＮＡ分解酵素の阻害剤として市販されているＲＮａｓｉｎ  Ｐｌｕｓ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（プロメガ株式会社）、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ株式会社）、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡株式会社）などを使用することができる。
【００２２】
生物学的試料にＤＮＡとＲＮＡが混在している場合には、フェノール・クロロホルム抽出によって分離することもできる。例えば、フェノール・クロロホルム抽出を酸性条件で行えばＲＮＡは水相、ＤＮＡはクロロホルム相に分離され、中性条件で行えばＲＮＡとＤＮＡは水相に分配される。この性質を利用して、取得したい核酸の種類に応じて条件を選択できる。上記のクロロホルムはｐ−ブロモアニソールに置換することもできる。
【００２３】
フェノール・クロロホルム抽出は、市販試薬であるＩＳＯＧＥＮ（登録商標：株式会社ニッポンジーン）、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標：ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＲＮＡｉｓｏ（タカラバイオ株式会社）、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｋｉｔ（東レ株式会社）を利用することもできる。以上の処理は、その一工程のみを行ってもよく、他の操作における工程と組み合わせることもできる。また、それに用いる溶液の濃度は、必要に応じて変えることもできる。
【００２４】
本発明において核酸を含む溶液としては、核酸、人工核酸、色素やリン酸基等の修飾が施された核酸を溶解させた溶液や、生体試料を用いる場合には、体液等の液体試料やその希釈液、細胞ペレットや組織片等の固体試料の希釈液を用いることができる。また、液体試料や固体試料を含む生物学的試料に対し、上記のいずれかの処理を行った後に得られる溶液をそのまま用いてもよいし、必要に応じて希釈してもよい。希釈する溶液は特に限定されないが、水やＴｒｉｓ−塩酸緩衝液などの核酸を含む溶液に汎用される溶液を使用することが好ましい。核酸を含む溶液は、例えば、４Ｍ以上の塩化グアニジニウム、グアニジンチオシアン酸塩や尿素を加えた生物学的試料が好ましい。
【００２５】
本発明において、回収する核酸の長さは特に限定されず数十塩基長の短い核酸からゲノムのように長い核酸まで高収率で回収することができる。特に、従来技術では難しかった１０００塩基長以下の短鎖核酸も高収率で回収することができ、また、１００塩基長以下のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡやｍｉＲＮＡも高収率で回収することができる。
【００２６】
本発明は、水溶性の中性ポリマーが酸化セリウムの表面に吸着した担体を用いることで、高収率な核酸の回収が達成される。本発明の担体は、本発明の担体は、水溶性の中性ポリマーが酸化セリウムの表面に吸着した担体である。以降、本発明の担体と記載する。
【００２７】
本発明の担体を利用した核酸回収では、まず本発明の担体に核酸を吸着させることを特徴としており、本発明の担体は優れた核酸吸着能を有している。本発明の担体の核酸吸着能は、本発明の担体に吸着した核酸の吸着率で評価することができ、以下のとおり算出することができる。はじめに核酸を含む溶液中の核酸量を算出する。次に本発明の担体と核酸を含む溶液とを混合し、本発明の担体に核酸が吸着した後の混合液中の核酸量を算出して、核酸を含む溶液中の核酸量からの差を求める。得られた値を本発明の担体に吸着した核酸量とし、本発明の担体に吸着した核酸量を、核酸を含む溶液中の核酸量で割ることで核酸の吸着率が算出できる。核酸量の定量の方法としては、吸光度測定、蛍光測定、発光測定、電気泳動、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイを使用した解析、シーケンサーを使った解析などが挙げられる。非修飾の核酸であれば、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することで核酸量を定量することができる。また、蛍光色素が修飾された核酸であれば、その蛍光色素に由来する蛍光強度を、濃度既知の溶液における蛍光強度と比較することで核酸量を定量できる。その他、電気泳動により行うことができる。電気泳動による回収率の算出方法は、濃度既知のサンプルと同時に回収操作を行ったサンプルを泳動し、ゲルを染色してバンドの濃度を画像解析により比較することで決定することができる。
【００２８】
一方で、本発明の担体を利用した核酸回収では、本発明の担体に吸着した核酸を溶出液により担体から溶出させることによる核酸回収であるため、本発明の担体は溶出液への優れた核酸溶出能を有している。本発明の担体の核酸溶出能は、本発明の担体から溶出液への核酸の溶出率で評価することができ、以下のとおり求めることができる。核酸が吸着した本発明の担体に対して溶出液を加え、溶出した後の溶液中の核酸量を算出し、核酸の溶出量を算出する。この核酸の溶出量を上記で算出した本発明の担体に吸着した核酸量で割り、溶出率を算出できる。
【００２９】
従って、本発明の核酸の回収方法での核酸回収能は、上記の方法により算出された核酸の吸着率と溶出率の積で算出される核酸の回収率によって評価することができる。
【００３０】
また、核酸の収量を定量することなく、本発明の方法で回収した核酸の収量と、本発明の方法以外の方法で回収した核酸の収量を比較することにより、本発明の核酸の回収方法での核酸回収能を評価することができる。本発明の方法以外の核酸の回収方法としては、たとえば、市販されているキットによる回収方法などが挙げられる。具体的な、核酸の回収量の比較方法としては、はじめに、同量の生物学的試料に対して本発明の担体と本発明の担体以外の担体とを用いて核酸を吸着・溶出して核酸を回収する。溶出液の体積は異なっていても同じでも良いが、同じであることが好ましい。異なっている場合、回収した核酸を希釈又は濃縮して、同体積とする。両サンプルを電気泳動し、ゲルを染色して蛍光スキャナー等で画像を取得し、目的の核酸分画にあたるバンドの濃度を画像解析により比較することで、本発明の方法で回収した核酸の収量と、本発明の方法以外の方法で回収した核酸の収量を比較することができる。
【００３１】
本発明においてポリマーは、基本単位である単量体やモノマーと呼ばれる繰り返し単位が多数繋がった化合物の総称である。本発明の担体に用いるポリマーには、１種類の単量体からなるホモポリマーと２種類以上の単量体からなるコポリマーのいずれもが含まれ、任意の重合度のポリマーも含まれる。また、天然ポリマーと合成ポリマーのいずれ本発明の担体に用いるポリマーに含まれる。
【００３２】
本発明の担体に用いる水溶性の中性ポリマーは、水に対して溶解可能な性質を有し、水に対する溶解度が、少なくとも０．０００１ｗｔ％以上であり、好ましくは、０．００１ｗｔ％以上、より好ましくは０．０１ｗｔ％以上、さらに好ましくは０．１ｗｔ％以上のポリマーである。
【００３３】
本発明で用いる水溶性の中性ポリマーは、好ましくは、ｐＨ７の溶液中でゼータ電位が−１０ｍＶ以上＋１０ｍＶ以下のポリマーである。より好ましくは−８ｍＶ以上＋８ｍＶ以下であり、さらに好ましくは−７ｍＶ以上＋７ｍＶ以下、特に好ましくは−４．０ｍＶ以上＋６．５ｍＶ以下のポリマーである。
【００３４】
ゼータ電位とは、溶液中におけるコロイドの界面の電気的性質を表す値の１つである。荷電したコロイドが溶液に分散していると、コロイドの表面ではコロイドの表面荷電に対する対イオンにより電気二重層が形成されている。このときのコロイド表面の電位を表面電位と呼ぶ。電気二重層は、コロイドの表面電荷の静電相互作用により形成されているため、コロイド側ほどイオンが強く固定されている。電気二重層の中でも静電相互作用により対イオンがコロイド表面に強く固定されている層を固定層、固定層の電位を固定電位と呼ぶ。溶液に対してコロイドを移動させると固定層はコロイドと共に移動する。このとき、コロイドから見て固定層よりも外側に、溶液が持つ粘性のためにコロイドと共に移動する境界面がある。これを、すべり面、または、ずり面と呼ぶ。コロイドから充分に離れた地点の電位をゼロ点としたときの、このすべり面の電位はゼータ電位と定義されている。このように、ゼータ電位はコロイドの表面電荷に依存して変化し、表面電荷はｐＨに依存するプロトンの着脱によって変化するため、本発明ではｐＨ７の溶液中での値を基準とする。また、一般にコロイドのサイズと比べてすべり面までの距離は小さいので、コロイドの表面をすべり面と近似的に表現することもできる。本発明で用いる水溶性の中性ポリマーの場合も同様に、溶液中に分散したコロイドの表面電位をゼータ電位とみなすことができる。
【００３５】
本発明のゼータ電位は、レーザー・ドップラー電気泳動法により測定した値を用いる。ゼータ電位の測定は、ゼータ電位測定装置を使用することで行うことができる。ゼータ電位測定装置は、大塚電子株式会社、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．、Ｒａｎｋｕ  Ｂｒｏｔｈｅｒ  Ｌｔｄ．、ＰｅｎＫｅｍ  Ｉｎｃ．などから市販されている。
【００３６】
ポリマーのゼータ電位を測定する場合には、コロイド分散溶液としてポリマー溶液を調製し、ゼータ電位を測定することができる。ポリマーを例えば、リン酸緩衝液や、塩化ナトリウム溶液、クエン酸緩衝液などの電解質に溶解させてポリマー溶液を調製し、溶液中に分散したポリマーの散乱光や、反射光を検出して測定を行う。コロイドのサイズが大きいほど、低い濃度で散乱光や反射光を検出することが可能となる。
【００３７】
ポリマーのゼータ電位をレーザー・ドップラー法で測定する条件は、ポリマーの濃度を０．１ｗｔ％以上１０ｗｔ％以下となるようにリン酸緩衝液（１０ｍＭ，  ｐＨ７）に溶解し、この溶液を測定用セルに入れて、レーザー・ドップラー電気泳動法を原理とするゼータ電位測定装置に設置して室温で測定する。本発明のゼータ電位は、例えば大塚電子株式会社のゼータ電位測定装置ＥＬＳ−Ｚ等が利用できる。
【００３８】
本発明の担体に用いる水溶性の中性ポリマーとしては、具体的には、以下のものが挙げられる。例えば、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンなどのポリビニル系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）又はポリ（Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミドなどのポリアクリルアミド系ポリマー、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリテトラメチレンエーテルグリコールなどのポリアルキレングリコール系のポリマー、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、（ヒドロキシプロピル）メチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、２−ヒドロキシエチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース等を用いることができる。また、上記のポリマーが含まれる共重合体も用いることができる。
【００３９】
また、フィコール、アガロース、キチン及びデキストランなどのポリサッカライド又はポリサッカライド類縁体並びにアルブミンなどのタンパク質やペプチドも本発明の水溶性の中性ポリマーに含まれる。
【００４０】
水溶性の中性ポリマーの官能基の一部をイオン化させたり、陽性や陰性を示す官能基に置換したり、側鎖にアセチル基など水溶性を発現する官能基を導入してもよい。
【００４１】
水溶性の中性ポリマーの分子量としては、例えば、０．４ｋＤａ以上１０００ｋＤａ以下のポリマーを好ましく用いることができ、より好ましくは２ｋＤａ以上５００ｋＤａ以下、より好ましくは４ｋＤａ以上１５０ｋＤａ以下、さらに好ましくは６ｋＤａ以上１５０ｋＤａ以下、最も好ましくは、６ｋＤａ以上１０ｋＤａ以下である。
【００４２】
本明細書では、ゲルパーミションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定した値を分子量として用いる。ＧＰＣの装置は、例えば、東ソー社のＥｃｏＳＥＣ  ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣ等の装置を使い、東ソ−社のＴＳＫ−ｇｅｌαカラム等を用いて測定することができる。
【００４３】
本発明の担体に用いる酸化セリウムは、ＣｅＯ２の組成式で表される両性酸化物であり、セリアとも呼ばれる。
【００４４】
酸化セリウムは、天然に産出するものを用いてもよいし、工業的に作製したものを用いてもよい。酸化セリウムを作製する方法としては、例えば、酸化セリウムのシュウ酸塩や炭酸塩を熱分解する方法や、酸化セリウムの硝酸塩の水溶液を中和して得られる水酸化酸化セリウムの沈殿物を焼成する方法などが挙げられる。工業的に作製した酸化セリウムは、試薬メーカーや、触媒化学メーカー、一般社団法人触媒学会の参照触媒部会などから入手することができる。
【００４５】
本発明の担体に用いる酸化セリウムは粒状のものがよい。粒径はそろっていても、異なる粒径を混合して利用してもよい。粒径は、水と酸化セリウム粒子の混合物を、６０００Ｇで１分間遠心分離した際に、酸化セリウムの粒子が沈殿する大きさであればよく、例えば、１００μｍ以下の酸化セリウムを好ましく用いることができ、好ましくは５０μｍ以下の酸化セリウムを用いることができ、より好ましくは１０μｍ以下の酸化セリウムを用いることができる。
【００４６】
本発明において、粒径は、レーザー回折・散乱法に基づく粒度分布測定装置を用いて測定した結果得られた球相当径の頻度分布から、５０％径（Ｄ５０、メディアン径）の値として算出することができる。
【００４７】
本発明で用いる溶出液は、本発明の担体に吸着した核酸を溶出させることができれば、特に限定されないが、緩衝液が好ましく、緩衝液にはキレート剤が含まれていてもよい。具体的には、クエン酸とクエン酸ナトリウムを含むクエン酸緩衝液、リン酸とリン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液や、トリスヒドロキシアミノメタンと塩酸を含むＴｒｉｓ−塩酸緩衝液にＥＤＴＡを添加したＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液などが挙げられる。
【００４８】
緩衝液のｐＨはｐＨ４以上ｐＨ９以下が好ましく、より好ましくはｐＨ５以上ｐＨ８以下である。
【００４９】
緩衝液に含まれるキレート剤は、複数の配位座を持つ配位子を持っており、金属イオンへ結合し、錯体を形成する物質を用いることができる。
【００５０】
具体的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ポリリン酸、メタリン酸及び／又は及びそれらの塩などが挙げられる。キレート剤の終濃度は特に限定されないが、５０ｍＭ以上であればよく、好ましくは１００ｍＭ以上、さらに好ましくは５００ｍＭ以上である。
【００５１】
また、上記以外のキレート剤となる化合物として、陰イオン性のポリマーを挙げることができる。カルボン酸を側鎖に持つポリマーは金属イオンを配位するため、これらが緩衝液に含まれていてもよい。このような機能を有するポリマーとして、ポリビニルスルホン酸及び／又はそれらの塩が挙げられる。その終濃度は特に限定されないが、１ｗｔ％以上であればよく、好ましくは１０ｗｔ％以上である。
【００５２】
本発明は、生物学的試料から核酸を回収する方法であって、工程ａ）水溶性の中性ポリマーが酸化セリウムの表面に吸着した担体と核酸を含む溶液を混合し、担体に核酸を吸着させる工程、工程ｂ）工程ａ）において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、工程ｃ）工程ｂ）において前記核酸が吸着した担体に溶出液を加えて核酸を回収する工程を含む。以下、それぞれの工程について詳細に説明する。
【００５３】
本発明の担体は、酸化セリウムの表面に水溶性の中性ポリマーを吸着させることにより作製する。ポリマーは均一の厚さで酸化セリウムの表面に吸着していなくてもよい。
【００５４】
水溶性の中性ポリマーを吸着させる前段階として、予め酸化セリウムを水やエタノールなどの溶液で洗浄し、表面に吸着している不純物を除いておいてもよく、本洗浄操作を省略してもよい。
【００５５】
水溶性の中性ポリマーを酸化セリウム表面に吸着させる方法は、例えば、水溶性の中性ポリマーを溶解させて水溶性の中性ポリマー溶液を調製し、酸化セリウムに接触させる方法が挙げられる。具体的には、水溶性の中性ポリマー溶液に酸化セリウムを浸漬させたり、水溶性の中性ポリマー溶液を酸化セリウムに滴下したり、水溶性のポリマー溶液を酸化セリウムに塗布したり、水溶性のポリマー溶液を霧状にして酸化セリウムに吹き付けたりすることができる。
【００５６】
水溶性の中性ポリマー溶液に、酸化セリウムを浸漬させる方法は特に限定されない。例えば、酸化セリウムに水溶性の中性ポリマー溶液を添加した後、静置しておいてもよいし、撹拌してもよい。撹拌する場合は、ピペッティング、転倒混合、スターラー、ミキサー、ボルテックス、ミル等の分散機や超音波処理装置などで撹拌する方法が挙げられる。
【００５７】
水溶性の中性ポリマー濃度は特に限定されないが、０．０１ｗｔ％以上が好ましく、より好ましくは、０．１ｗｔ％以上である。
【００５８】
静置する場合の浸漬時間は、特に限定されないが、５分以上が好ましい。また、攪拌する際の撹拌時間は、水溶性の中性ポリマーと酸化セリウムが均一に混合されれば、特に限定されないが、ボルテックスの場合１分以上、好ましくは５分以上撹拌することが好ましい。
【００５９】
また、ふるいや、ざる等を用いて水溶性の中性ポリマーを酸化セリウムの表面にディップコートすることもできる。溶液に浸す際の混合時間は、０．１ｗｔ％以上のポリマー濃度であれば５分以上が好ましく、３０分以上であることが好ましい。
【００６０】
水溶性の中性ポリマー溶液を滴下する場合には、スポイト、滴下漏斗、などを用いることができる。ポリマー溶液を滴下する際には、酸化セリウムを振動させたり、回転させたりしてもよく、スピンコーターなどを用いてもよい。
【００６１】
水溶性の中性ポリマー溶液を塗布する場合には、刷毛、ローラー、ワイヤーバーを用いることができる。
【００６２】
水溶性の中性ポリマー溶液を霧状にして吹き付ける場合には、エアースプレーやエアブラシなどを用いることができる。
【００６３】
上記に例示した方法で、酸化セリウムに水溶性の中性ポリマーを吸着させた後は、遠心分離操作を行い、上清となるポリマー溶液を取り除いてもよいし、遠心分離操作を行なわず、そのまま核酸の回収に用いてもよい。また、水溶性の中性ポリマー溶液を溶媒に溶解させている場合、酸化セリウムに水溶性の中性ポリマーを吸着させ、溶媒を取り除いた後、乾燥させてもよいし、乾燥させずに、核酸の回収に用いてもよい。
【００６４】
得られた本発明の担体は、作製して保存しておいたものを使用してもよく、用時調製して使用してもよい。
【００６５】
水溶性の中性ポリマー溶液は、入手した水溶性の中性ポリマーが固体であれば水や有機溶媒に溶解することで調製でき、溶液であれば希釈することで調製できる。ポリマーが溶解しにくい場合や、溶液の粘度が高く混合しにくい場合、加熱処理や超音波処理を行ってもよい。有機溶媒は、例えば、エタノール、アセトニトリル、メタノール、プロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトン、エチレングリコール、グリセロールなど、水と双溶性のあるものを使用することが好ましい。また、水に溶解しにくい場合には、上記の有機溶媒を添加してもよい。
【００６６】
なお、酸化セリウムと水溶性の中性ポリマーを、リンカー分子などによって共有結合させて作製した担体は、本発明の担体に該当しない。具体的なリンカー分子としては、シランカップリング剤などが挙げられる。
【００６７】
工程ａ）は、上記の作製方法によって作製した本発明の担体と、核酸を含む溶液を混合し、本発明の担体に核酸を吸着させる工程である。本発明の担体と核酸を含む溶液の混合方法は特に限定されないが、例えばピペッティングや転倒混合により行ってもよく、ミキサー、ボルテックスなどの装置を使用してもよい。混合時間は、特に限定されないが５分程度であればよく、それ以上の時間混合してもよい。また、本発明の担体をカラムに充填し、核酸を含む溶液を通過させてもよい。
【００６８】
工程ｂ）は、工程ａ）において混合した溶液から、前記核酸が吸着した本発明の担体を分離する工程である。分離の方法としては、工程ａ）で混合した溶液を遠心分離し、核酸が吸着した本発明の担体を沈殿させ、上清を除く方法が挙げられる。核酸が吸着した本発明の担体の比重は水より重いため、遠心操作により容易に沈殿させることができる。遠心分離の条件は、６０００Ｇで１分間処理すればよく、１００００Ｇで１分間処理することがより好ましい。他の分離方法としては、限外ろ過膜を用いる方法が挙げられる。核酸が吸着した担体の粒径より小さな孔径を持つ限外ろ過膜に対し、工程ａ）で混合した溶液を通過させ、核酸が吸着した担体を分離する。このような限外ろ過膜はキット化されており、メルク株式会社のウルトラフリー（商標登録）やＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのナノセップ（商標登録）に代表される遠心ろ過キットを入手して利用することができる。
【００６９】
また、工程ｂ）の操作の後に、必要に応じて以下のような処理をしてもよい。これは、工程ａ）の後に、本発明の担体の表面に目的となる核酸以外の生物学的試料由来物が吸着している可能性があるためである。例えば、より高純度に核酸を単離するため、洗浄や分解の処理を行うことができる。具体的には、非特異的に吸着した化合物を除去するために水で洗浄する、非特異的に吸着したタンパク質を除去するために界面活性剤で洗浄する、イオンや低分子化合物を除去するために界面活性剤を含む溶液で洗浄する、非特異的に吸着した疎水性化合物を除去するために有機溶媒で洗浄する、非特異的に吸着したタンパク質を分解するためにタンパク質分解酵素を添加する、ＤＮＡのみを単離するためにＲＮＡ分解酵素を添加する及びＲＮＡのみを単離するためにＤＮＡ分解酵素を添加する、などの様々な処理をすることができる。
【００７０】
工程ｃ）は、工程ｂ）において分離した前記核酸が吸着した本発明の担体に溶出液を加えて核酸を回収する工程である。
【００７１】
上記溶出液を加えて溶出させた核酸を回収するにあたって、本発明の担体と、核酸を溶出させた溶液を分離したい場合には、工程ｃ）において、核酸が吸着した担体に溶出液を加えて得られた混合物を遠心分離し、本発明の担体を沈殿させ、核酸が溶出している上清を取得する方法が挙げられる。本発明の担体の比重は水より重いため、遠心操作により容易に沈殿させることができる。遠心分離の条件は、６０００Ｇで１分間処理すればよく、１００００Ｇで１分間処理することが好ましい。
【００７２】
他の分離方法としては、限外ろ過膜を用いる方法が挙げられる。本発明の担体の粒径より小さな孔径を持つ限外ろ過膜に対し、工程ｃ）において得られた混合物を通過させ、本発明の担体を分離する。このような限外ろ過膜はキット化されており、メルク株式会社のウルトラフリー（商標登録）やＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのナノセップ（商標登録）に代表される遠心ろ過キットを入手して利用することができる。
【００７３】
回収された核酸は、必要に応じて、化学修飾を行うことができる。化学修飾には、核酸の末端に対する蛍光色素修飾、消光剤修飾、ビオチン修飾、アミノ化、カルボキシル化、マレインイミド化、スクシンイミド化、リン酸化及び脱リン酸化などが挙げられ、他にはインターカレーターによる染色が挙げられる。これらの修飾は化学反応により導入されてもよく、酵素反応により導入されてもよい。上記定量の前にこれらの修飾基を導入し、回収された核酸自身を定量するのではなく、化学修飾を経て導入された修飾基を定量することで、間接的に核酸を定量することができる。本発明により核酸が回収され、特に短鎖核酸であっても高収率に回収されるため、上記定量において高感度に定量することが可能となる。
【００７４】
本発明の核酸回収用キットは、生物学的試料から、核酸を効率的に回収するために利用することができる。
【００７５】
本発明の核酸回収用キットは、その構成成分として、本発明の担体及び緩衝液が含まれる。また、これらの他に説明書等が含まれていてもよい。
【００７６】
本発明の核酸回収用のキットに含まれる、本発明の担体は、乾燥した状態であってもよいし、水溶性の中性ポリマーの溶液中に浸漬された状態であってもよい。
【００７７】
本発明の核酸回収用のキットに含まれる緩衝液には、前記工程ｃ）の溶出液に用いることができる緩衝液が利用できる。
【実施例】
【００７８】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。【００７９】
＜材料と方法＞
ポリエチレングリコールはメルク株式会社より、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）はＡｌｆａ  Ａｅｓａｒ，  Ａ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍａｔｔｈｅｙ  Ｃｏｍｐａｎｙより、酸化セリウム（粒径４．４μｍ）は第一稀元素化学工業株式会社より入手した。実施例中で用いたポリマー水溶液は、それぞれの濃度で水または水とエタノールの混合溶媒に溶解した。また、特に断らない限り、酸化セリウムは、ふるい分けなどせずに購入したまま実験に用いた。【００８０】
また、プラスミドＤＮＡ（２．７ｋｂｐ）のｐＵＣ１９と大腸菌のＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓはタカラバイオ株式会社より、臭化エチジウム、ＬＢ培地のＬＢ  Ｍｉｌｌｅｒ、ＲＰＭＩ培地のＲＰＭＩ  １６４０  （Ｌ−グルタミン含有）、ザイモリエースはナカライテスク株式会社より、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ  Ｐｌｕｓ、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔはキアゲン社より、ＭａｇＭａｘ  ｃｅｌｌ−ＦｒｅｅＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔとＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓはサーモフィッシャー株式会社より、ウシ胎児血清のＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｔｅｒｉｌｅ  ＦｉｌｔｅｒｅｄはＥｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ社より、四酸化三鉄は関東化学株式会社より購入した。ＹＰＤ培地は、１％  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（ベクトン・ディッキンソン株式会社）、２％  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（ベクトン・ディッキンソン株式会社）と２％  Ｄ−グルコース（和光純薬株式会社）を混合して調製した。非常に短い核酸としては、ｍｉＲＮＡのｌｅｔ７ａ配列として知られる２２塩基長の核酸を、ＤＮＡ配列に変換して合成したものとＲＮＡ配列として合成したものをユーロフィンジェノミクス株式会社より購入した。以降ＲＮＡ配列の合成核酸についてはＲＮＡ２２、ＤＮＡ配列の合成核酸についてはＤＮＡ２２と記載する。これらの核酸は、特に精製することなくそのまま用いた。また、実施例で用いた５６６ｂｐのＤＮＡ配列は、ＰＣＲ反応で増幅して取得した。以降、ＤＮＡ５６６と記載する。１０ｋｂｐ以上の長さを有する大腸菌のゲノム断片は、大腸菌ＤＨ５αから取得した。その他の試薬については、和光純薬株式会社、東京化成株式会社、シグマーアルドリッチジャパン合同会社から購入し、特に精製することなくそのまま用いた。【００８１】
ミキサーは東京理化器械株式会社のＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を、蛍光計はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社のＮａｎｏｄｒｏｐ３３００と株式会社堀場製作所のＦＬＵＯＲＯＭＡＸ−３を、ゼータ電位の測定には大塚電子株式会社のＥＬＳ−Ｚを、アガロースゲル電気泳動は株式会社アドバンスのＭｕｐｉｄ−ｅＸＵを、アクリルアミドゲル電気泳動はアズワン株式会社のミニゲルスラブ電気泳動装置を用いた。染色したアガロースゲルは蛍光スキャナーであるＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社のＴｙｐｈｏｏｎ９４１０を、染色したアクリルアミドゲルは蛍光スキャナーであるＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社のＴｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ９５００を用いて解析した。アガロースゲルの画像解析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社のＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標登録）を、アクリルアミドゲルの画像解析はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社のＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ（商標登録）用いた。【００８２】
＜比較例１＞酸化鉄のみを担体として用いた核酸の回収方法
特許文献３の実施例に記載の酸化鉄を担体として用いた核酸の回収方法を検討した。酸化鉄として和光純薬社製のα−酸化鉄を用いた。その他、特許文献３の実施例と同様の条件にするため、核酸溶解液として６Ｍグアニジンチオシアン水溶液、溶出液としてＴＥ緩衝液または水を使用した。【００８３】
最初に１．５ｍｌチューブに、０．５ｍｇの酸化鉄を量り取った。それぞれに２００μｌのエタノールを加え、ボルテックスした後、遠心機で１分間遠心して上清を除いた。この操作を更に２回行って洗浄し、担体として用いた。【００８４】
続いて、洗浄した酸化鉄に対し、１００ｐｍｏｌのＤＮＡ２２が溶解した６Ｍグアニジンチオシアン酸塩水溶液１００μｌを加え、５分間ミキサーで攪拌し、遠心（１００００Ｇ，  １ｍｉｎ）して上清を捨てた。残った担体に対し０．０５％  Ｔｗｅｅｎ水を１００μｌ加え、ボルテックスした。この操作を更に２回行った。その後、５０μｌの水またはＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ８）緩衝液をそれぞれ加えて５分間ミキサーで攪拌した。遠心機で遠心（１００００Ｇ，  １ｍｉｎ）して、上清を核酸溶液として回収した。【００８５】
核酸の担体への核酸の吸着率はＣｙ３の蛍光測定により以下のように算出した。はじめに、酸化セリウムを加える前の１００ｐｍｏｌのＤＮＡ２２が溶解した６Ｍグアニジンチオシアン酸塩水溶液１００μｌの蛍光強度を測定し、次に酸化セリウムを加えて混合した後の蛍光強度を測定した。酸化セリウムを加えた後の蛍光強度を加える前の蛍光強度で割り、加える前の核酸量（１００ｐｍｏｌ）の積をとって溶液中の核酸量を算出した。加える前の核酸量（１００ｐｍｏｌ）から、この値の差をとり、吸着した核酸量を算出した。吸着した核酸量を、酸化セリウムを加える前の核酸量（１００ｐｍｏｌ）で割り、吸着率を算出した。【００８６】
溶出率はＣｙ３の蛍光測定により以下のように算出した。核酸が吸着した酸化セリウムに対して５０μｌのＴＥ緩衝液をそれぞれ加え、溶出した後の溶出液に対して蛍光測定を行った。次に、１００ｐｍｏｌのＤＮＡ２２が溶解した水及びＴＥ緩衝液を調製し、この溶液に対してそれぞれ蛍光測定を行った。溶出液の蛍光強度をこの溶液の蛍光強度で割り、溶出した核酸量を算出した。溶出した核酸量を、吸着した核酸量で割り、溶出率を算出した。回収率は、算出された吸着率と溶出率の積をとって算出した。結果を表１に示した。【００８７】
これらの結果から、酸化鉄を担体として用いた場合、核酸の吸着率が非常に低く、また核酸の溶出はほとんど確認することができなかった。酸化鉄は核酸の回収に適していないことがわかった。また、引用文献３では、無機成分の表面をポリマーで被覆したものを、核酸の回収に利用することができるとの記載があるが、酸化鉄の表面をポリマーで被覆しても、核酸に対する吸着性は変化しないと予想される。つまり、表面をポリマーで被覆した酸化鉄を担体として使用しても、本比較例１の結果と同様に、低い核酸回収率になることが予想される。【００８８】
【表１】
2017159763.tif 000002
【００８９】
＜比較例２＞水溶性の中性ポリマーが表面に吸着していない酸化セリウムを担体として用いた核酸の回収方法。【００９０】
水溶性の中性ポリマーが表面に吸着していない酸化セリウムを担体として用いて、核酸を効率的に回収することができるかを検討した。担体に酸化セリウムを用いた以外は、比較例１と同様の条件、操作を行った。結果を表２に示した。【００９１】
これらの結果から、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着していない酸化セリウムを担体として用いた場合、酸化セリウムの担体に対する核酸の吸着率は非常に高いことがわかったが、核酸の溶出率が低く、効率的に核酸を回収することができないことがわかった。【００９２】
また、特許文献３では、磁性を有する無機成分をさらに金属酸化物で、被覆する方法が記載されているが、酸化セリウムで表面を被覆した金属酸化物を担体として用いた場合、比較例２の結果と同様に、低い回収率となることが予想される。【００９３】
【表２】
2017159763.tif 000003
【００９４】
＜比較例３＞水溶性の中性ポリマー以外の水溶性のポリマーが酸化セリウムの表面に吸着した担体の作製
１．５ｍｌチューブに、０．５ｍｇずつ酸化セリウムを量り取った。これにポリマー溶液として、ポリアクリル酸（ＰＡｃＡ，  ５．１ｋＤａ，  １０ｗｔ％）、ポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳ，  ７．５ｋＤａ，  １０ｗｔ％）、ポリビニルスルホン酸（ＰＶＳＡ，  １０ｗｔ％）、ポリアリルアミン（ＰＡＡ，  １７ｋＤａ，  １０ｗｔ％）、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ，  １５０ｋＤａ，  １ｗｔ％）をそれぞれ５０μｌずつ加えて１０分間ミキサーで攪拌した。遠心機で遠心（１００００Ｇ，  １ｍｉｎ）して上清を除き、それぞれのポリマーが吸着した酸化セリウム得た。【００９５】
＜比較例４＞水溶性の中性ポリマー以外の水溶性の各ポリマーが吸着した酸化セリウムを担体として用いた核酸回収
１．５ｍｌのチューブに比較例３で作製した水溶性の中性ポリマー以外の水溶性のポリマーとして、ポリアクリル酸（ＰＡｃＡ，  ５．１ｋＤａ，  １０ｗｔ％）、ポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳ，  ７．５ｋＤａ，  １ｗｔ％）、ポリビニルスルホン酸（ＰＶＳＡ，  １０ｗｔ％）、ポリアリルアミン（ＰＡＡ，  １７ｋＤａ，  １０ｗｔ％）、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ，  １５０ｋＤａ，  １ｗｔ％）が吸着した酸化セリウムを０．５ｍｇずつ量り取り担体として用いた。溶出液はリン酸緩衝液（０．５Ｍ，  ｐＨ８）を用いた。担体と溶出液以外の条件、操作は比較例１と同様に行い核酸の回収率を算出した。結果を表３に示した。【００９６】
これらの結果から、ポリアクリル酸、ポリビニルスルホン酸、及びポリスチレンスルホン酸が吸着した酸化セリウムを担体に用いた場合には、核酸の吸着率も溶出率も低く、核酸の回収率も低い結果となることがわかった。また、ポリアリルアミン、及びポリ−Ｌ−リシンが吸着した酸化セリウムを担体として用いた場合には、核酸の吸着率は高く保たれたが、溶出率は低く、回収率も低い結果となった。【００９７】
＜実施例１＞酸化セリウムの表面に水溶性の中性ポリマーが吸着した担体の作製
１．５ｍｌチューブに、０．５ｍｇずつ酸化セリウムを量り取った。これに、ポリマー水溶液として、水溶性の中性ポリマーであるポリビニルアルコール（１１％アセチル化，  ＰＶＡ，  １８ｋＤａ，  １０ｗｔ％）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯｚ，  ５ｋＤａ，  １０ｗｔ％）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ，  １０ｋＤａ，  １０ｗｔ％）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ，  ４０ｋＤａ，  １０ｗｔ％）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）（ＨＰＭＣ，  １０ｋＤａ，  １０ｗｔ％）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ，  １０ｋＤａ，  １０ｗｔ％）をそれぞれに５０μｌずつ加えた。また、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ，  ４ｋＤａ，  １０ｗｔ％）とポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ｐＮＩＰＡＡｍ，  ３０ｋＤａ，  １０ｗｔ％）の水溶液はポリマーが溶解するまでエタノールを加えたのち、０．５ｍｇの酸化セリウムへ５０μｌずつ加えた。その他の条件、操作は比較例３と同様に行い、それぞれのポリマーが吸着した酸化セリウムの担体を得た。【００９８】
＜実施例２＞酸化セリウムの表面に水溶性の中性ポリマーが吸着した担体を用いた核酸回収
１．５ｍｌのチューブに実施例１で作製した各水溶性の中性ポリマーとして、ポリビニルアルコール、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、ポリビニルピロリドンが吸着した酸化セリウムを０．５ｍｇずつ量り取り担体として用いた。その他の条件、操作は比較例４と同様に行い、核酸の吸着率、溶出率、回収率を算出した。結果を表３に示した。【００９９】
これらの結果から、比較例４に比べ、酸化セリウムの表面に水溶性の中性ポリマーが吸着した担体を用いた場合、核酸の吸着率は高く保たれたまま、溶出率が向上し、回収率も向上することがわかった。【０１００】
【表３】
2017159763.tif 000004
【０１０１】
＜比較例５＞水溶性の中性ポリマー以外の水溶性のポリマーのゼータ電位の測定
比較例４で用いた水溶性の中性ポリマー以外の水溶性のポリマーであるポリアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸、ポリアリルアミン、ポリーＬ−リシンを終濃度が０．１ｗｔ％以上１０ｗｔ％以下となるようにリン酸緩衝液（１０ｍＭ，  ｐＨ７）に溶解し、大塚電子株式会社のＥＬＳ−Ｚを用いてゼータ電位を測定した。結果を表４に示す。表４は、本測定によって得られたゼータ電位と、それぞれのポリマーが吸着した酸化セリウムを担体として使ったＤＮＡ２２の回収率（比較例４の結果）の相関を取り、ゼータ電位の値の低い順に並べたものである。【０１０２】
これらの結果から、比較例４で用いた水溶性の中性ポリマー以外の水溶性ポリマーのゼータ電位は−１７ｍＶ以下、又は＋１１ｍＶ以上であることがわかった。【０１０３】
＜実施例３＞水溶性の中性ポリマーのゼータ電位測定
終濃度が１ｗｔ％以上１０ｗｔ％以下となるよう、実施例２で用いた水溶性の中性ポリマーであるポリビニルアルコール、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンをリン酸緩衝液（１０ｍＭ，  ｐＨ７）に溶解し、比較例５と同様の方法でゼータ電位を測定した。表４は、本測定によって得られたゼータ電位と、それぞれのポリマーが吸着した酸化セリウムを担体として使ったＤＮＡ２２の回収率（実施例２の結果）の相関を取り、ゼータ電位の値の低い順に並べたものである。【０１０４】
これらの結果から、実施例２で核酸の回収率が向上した水溶性の中性ポリマーのゼータ電位は、ｐＨ７の溶液中で−４ｍＶ以上＋６．５ｍＶ以下であり、−１７ｍＶ以下及び＋１１ｍＶ以上のゼータ電位を持つ水溶性のポリマーと比べて、回収率が向上することがわかった。【０１０５】
【表４】
2017159763.tif 000005
【０１０６】
＜実施例４＞酸化セリウムの表面に水溶性の中性ポリマーが吸着した担体に吸着した核酸の溶出と溶出液の関係
実施例１に従って酸化セリウムの表面にポリエチレングリコールが吸着した担体を作製し、１．５ｍｌチューブに０．５ｍｇずつ量り取った。溶出液として０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ  ５，  ６）、０．５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７，  ８）、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ８）をそれぞれ用いた。その他の条件、操作は比較例１と同様に行い、核酸の吸着率、溶出率、回収率を算出した。結果を表５に示した。【０１０７】
これらの結果から、いずれの緩衝液を溶出液として用いても、核酸を高収率に回収できることが分かった。【０１０８】
【表５】
2017159763.tif 000006
【０１０９】
＜実施例５＞酸化セリウムの表面に水溶性の中性ポリマーが吸着した担体を用いた核酸の回収率と核酸の長さの関係
実施例１に従って酸化セリウムの表面にポリエチレングリコールが吸着した担体を作製し、１．５ｍｌチューブに０．５ｍｇずつ量り取った。核酸を含む溶液として、２５０ｎｇのＤＮＡ５６６、２５０ｎｇのｐＵＣ１９（２．７ｋｂｐ）、２５０ｎｇの大腸菌ゲノム断片（＞１０ｋｂｐ）がそれぞれ溶解した６Ｍグアニジンチオシアン酸塩水溶液を１００μｌ用いた。その他の条件、操作は比較例３と同様に行い、電気泳動により核酸の回収率を算出した。結果を表６に示した。【０１１０】
これらの結果から、水溶性の中性ポリマーである酸化セリウムの表面にポリエチレングリコールが吸着した担体を使うことで、いずれの長さを有する核酸も効率的に回収できることが分かった。【０１１１】
【表６】
2017159763.tif 000007
【０１１２】
＜実施例６＞ウシ胎児血清からの核酸回収
実施例１に従って酸化セリウムの表面にポリエチレングリコールが吸着した担体を作製し、１．５ｍｌチューブに２．５ｍｇずつ量り取った。核酸を含む溶液として１００ｐｍｏｌのＤＮＡ２２が溶解した６Ｍグアニジンチオシアン酸塩水溶液１００μｌと３０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有するウシ胎児血清１００μｌの混合溶液を用いた。その他の条件、操作は比較例４と同様に行い核酸の吸着率、溶出率、回収率を算出した。同様の実験をＲＮＡ２２に対しても行った。結果を表７に示した。なお、回収液中のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試験の検出限界以下（０．２５ｍｇ／ｍｌ以下）であった。【０１１３】
これらの結果から、酸化セリウムの表面にポリエチレングリコールが吸着した担体を用いることで、血清からもＤＮＡ２２、ＲＮＡ２２のいずれも効率よく回収できることが分かった。【０１１４】
【表７】
2017159763.tif 000008
【０１１５】
＜実施例７＞酸化セリウムの表面に吸着させる水溶性の中性ポリマーの分子量の効果
分子量が  ６ｋＤａ、  １０ｋＤａ、５００ｋＤａのポリエチレングリコールと、分子量が１８ｋＤａ、４０ｋＤａ、  １５０ｋＤａ（いずれも１１％アセチル化）のポリビニルアルコールをそれぞれ１０ｗｔ％になるよう調製しポリマー溶液として用いた。担体は、実施例１と同様にして、各分子量の酸化セリウムの表面にポリエチレングリコールが吸着した担体を調製してこれを用いた。その他の条件、操作は比較例４と同様に行い、核酸の吸着率、溶出率、回収率を算出した。結果を表８に示した。【０１１６】
これらの結果から、いずれの分子量を持つポリマーであっても、核酸を回収できることが分かった。【０１１７】
【表８】
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【０１１８】
＜実施例８＞本発明の担体の作製方法における水溶性の中性ポリマーの濃度と撹拌時間の関係
１．５ｍｌチューブに、０．５ｍｇずつ酸化セリウムを量り取った。これに、ポリマー水溶液として、水溶性の中性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ，  １０ｋＤａ）を０．１ｗｔ％、１ｗｔ％、１０ｗｔ％の濃度でそれぞれに５０μｌずつ加えた。各濃度に対してミキサーでそれぞれ１分間、５分間、３０分間攪拌した。遠心機で遠心（１００００Ｇ，  １ｍｉｎ）して上清を除き、酸化セリウムの表面にポリエチレングリコールが吸着した担体得た。また、比較例４と同様に行い、核酸の回収率を算出した。結果を表９に示した。【０１１９】
これらの結果から、いずれの条件で作製された担体も、効率的に核酸を回収できることがわかった。【０１２０】
【表９】
2017159763.tif 000010
【０１２１】
＜実施例９＞本発明の担体の作製方法における水溶性の中性ポリマーの濃度と浸漬時間の関係
１．５ｍｌチューブに、０．５ｍｇずつ酸化セリウムを量り取った。これに、ポリマー水溶液として、水溶性の中性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ，  １０ｋＤａ）を０．１ｗｔ％、１ｗｔ％、１０ｗｔ％の濃度でそれぞれに５０μｌずつ加えて，ピペッティング等の撹拌操作は一切行わず、それぞれ５分間、３０分間静置した。遠心機で遠心（１００００Ｇ，  １ｍｉｎ）して上清を除き、酸化セリウムの表面にポリエチレングリコールが吸着した担体を得た。また、比較例４と同様に行い、核酸の回収率を算出した。結果を表１０に示した。【０１２２】
これらの結果から、いずれの条件で作製された担体も、効率的に核酸を回収できることがわかった。【０１２３】
【表１０】
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【０１２４】
＜実施例１０＞本発明の担体を作製における遠心分離操作の有無と核酸の回収率の関係
１．５ｍｌチューブに、０．５ｍｇずつ酸化セリウムを量り取った。これに、ポリマー水溶液として、水溶性の中性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ，  １０ｋＤａ）を１０ｗｔ％の濃度で５０μｌ加えてミキサーで１０分間攪拌した。この後の操作として、実施例１では、遠心機による遠心分離操作及び上清を除く操作を行ったが、実施例１０ではこれらの操作を行わなかった。このようにして作製した担体用いた以外は、比較例４と同様に行い、核酸の吸着率、溶出率、回収率を算出し、表１１に結果を示した。【０１２５】
これらの結果から、実施例１で作製した担体を用いて核酸の回収を行った実施例２の結果のうち、水溶性の中性ポリマーとして、ポリエチレングリコールを用いた場合の核酸の回収率の結果と比較すると、どちらの方法で本発明の担体を作製しても、効率的に核酸を回収できることがわかった。【０１２６】
【表１１】
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【０１２７】
＜実施例１１＞本発明の担体を使ったヒト血漿からのセルフリーＤＮＡ回収
２本の１．５ｍｌチューブに、ヒト血漿を３００μｌずつ量り取り、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴを４５０μｌずつ加え、ピペッティングにより混合した。得られた２本の試料のうち、１本目は本発明の担体を用いてゲノムを回収し、２本目はコントロールとして市販キットでゲノムを回収した。【０１２８】
まず、上記で用意した１本目の試料に、実施例１と同じ条件で作製したポリエチレングリコールが吸着した酸化セリウム５ｍｇを添加して混合した。１５分間ミキサーで攪拌し、遠心（１００００Ｇ，  １ｍｉｎ）して上清を捨てた。残った担体に対し０．０５％  Ｔｗｅｅｎ水を４００μｌ加え、ボルテックスした。この操作を更に２回行った。その後、５０μｌのリン酸緩衝液（０．５Ｍ，  ｐＨ８）を加えて３０分間ミキサーで攪拌した。遠心機で遠心（１００００Ｇ，  １ｍｉｎ）して、上清を核酸溶液として回収した。【０１２９】
続いて、２本目の試料から、市販キット（ＭａｇＭａｘ  ｃｅｌｌ−ＦｒｅｅＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、サーモフィッシャー株式会社）を用いてプロトコルに従い、セルフリーＤＮＡの回収を行った。このとき、溶出液の体積は５０μｌとした。本発明の担体と市販キットで回収したセルフリーＤＮＡ溶出液を電気泳動（１０％アクリルアミド、１００Ｖ、３５ｍｉｎ）し、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色した。蛍光スキャナーでゲルの蛍光画像を測定し、セルフリーＤＮＡ分画（１６０〜２００ｂｐ）のバンド濃度比を画像解析にて行った。ヒト血漿に含まれているセルフリーＤＮＡの絶対量が不明であるため、回収率の代わりに、本発明の担体と市販キットとの回収量の比を算出した。結果を表１２に示した。【０１３０】
これらの結果から、本発明の担体を用いることで、生物学的試料としてヒト血漿を用いても、市販キットの９．９倍の収量でセルフリーＤＮＡを回収できることがわかった。【０１３１】
【表１２】
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【０１３２】
＜実施例１２＞本発明の担体を使った大腸菌（ＤＨ５α）からのゲノム回収
大腸菌（ＤＨ５α）は、ＬＢの液体培地で培養した。ゲノム回収にあたり、培養液中の大腸菌濃度をＯＤ６００における測定値により算出した。培養液から５×１０７  ｃｅｌｌｓずつ分取して１．５ｍｌチューブ２本に移した。得られた２本の試料のうち、１本目は本発明の担体を用いてゲノムを回収し、２本目はコントロールとして市販キットでゲノムを回収した。大腸菌の細胞数は、ＯＤ６００＝１のとき１０９  ｃｅｌｌｓ／ｍｌとして計算した。【０１３３】
まず、１本目の試料にＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ  Ｐｌｕｓを１００μｌ加えてボルテックスした。この溶液を、実施例１と同じ条件で作製したポリエチレングリコールが吸着した酸化セリウム５ｍｇと混合した。１５分間ミキサーで攪拌し、遠心（１００００Ｇ，  １ｍｉｎ）して上清を捨てた。残った担体に対し０．０５％  Ｔｗｅｅｎ水を４００μｌ加え、ボルテックスした。この操作を更に２回行った。その後、５０μｌのリン酸緩衝液（０．５Ｍ，  ｐＨ８）を加えて３０分間ミキサーで攪拌した。遠心機で遠心（１００００Ｇ，  １ｍｉｎ）して、上清を核酸溶液として回収した。【０１３４】
続いて、２本目の試料から、市販キット（ＤＮｅａｓｙ  ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ，、ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプロトコルに従い、ゲノム回収を行った。このとき、溶出液の体積は５０μｌとした。
本発明の担体と市販キットで回収したゲノム溶出液を電気泳動（１％アガロース、１００Ｖ、６０ｍｉｎ）し、臭化エチジウムで染色した。蛍光スキャナーでゲルの蛍光画像を測定し、ゲノム分画（２５ｋｂｐ付近）のバンド濃度比の画像解析を行った。大腸菌に含まれているゲノムの絶対量が不明であるため、回収率の代わりに、本発明の担体と市販キットとの回収量の比を算出した。結果を表１２に示した。【０１３５】
これらの結果から、本発明の担体を用いることで、生物学的試料として培養液中の大腸菌（ＤＨ５α）を用いても、市販キットの３．８倍の収量でゲノムを回収できることがわかった。【０１３６】
＜実施例１３＞本発明の担体を使った分裂酵母（ＮＢＲＣ１６２８）からのゲノム回収
分裂酵母（ＮＢＲＣ１６２８）は、ＹＰＢ培地に２％アガロースを添加したプレート上で培養し、その後、ＹＰＤの液体培地に移して培養した。ゲノム回収にあたり、培養液中の分裂酵母濃度をＯＤ６００における測定値により測定することで算出した。培養液から５×１０５  ｃｅｌｌｓずつ分取して１．５ｍｌチューブ２本に移した。得られた２本の試料のうち、１本目は本発明の担体を用いてゲノムを回収し、２本目はコントロールとして市販キットでゲノムを回収した。このとき細胞数は、ＯＤ６００＝１のとき１０７  ｃｅｌｌｓ／ｍｌとして計算した。【０１３７】
まず、１本目の試料に、ザイモリエイス溶液（１Ｍソルビトール、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１４ｍＭ  メルカプトエタノール、１００  Ｕ／ｍｌザイモリエイス、ｐＨ７．４）を６００μｌ加え、３０℃で３０分間静置した。その後、遠心（５０００Ｇ，  １０ｍｉｎ）して上清を除き、ペレットを得た。ここにＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ  Ｐｌｕｓを２００μｌ加えてボルテックスした。この溶液を、実施例１と同じ条件で作製したポリエチレングリコールが吸着した酸化セリウム５ｍｇと混合した。１５分間ミキサーで攪拌し、遠心（１００００Ｇ，  １ｍｉｎ）して上清を捨てた。残った担体に対し０．０５％  Ｔｗｅｅｎ水を４００μｌ加え、ボルテックスした。この操作を更に２回行った。その後、５０μｌのリン酸緩衝液（０．５Ｍ，  ｐＨ８）を加えて３０分間ミキサーで攪拌した。遠心機で遠心（１００００Ｇ，  １ｍｉｎ）して、上清を核酸溶液として回収した。【０１３８】
続いて、２本目の試料から、市販キット（ＤＮｅａｓｙ  ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ、  ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプロトコルに従い、ゲノム回収を行った。このとき、溶出液の体積は５０μｌとした。本発明の担体と市販キットで回収したゲノム溶出液を電気泳動（１％アガロース、１００Ｖ、６０ｍｉｎ）し、臭化エチジウムで染色した。蛍光スキャナーでゲルの蛍光画像を測定し、ゲノム分画（２５ｋｂｐ付近）のバンド濃度比の画像解析を行った。分裂酵母に含まれているゲノムの絶対量が不明であるため、回収率の代わりに、本発明の担体と市販キットとの回収量の比を算出した。結果を表１２に示した。【０１３９】
これらの結果から、本発明の担体を用いることで、生物学的試料として分裂酵母（ＮＢＲＣ１６２８）を用いても、市販キットの３．８倍の収量でゲノムを回収できることがわかった。【０１４０】
＜実施例１４＞本発明の担体を使った出芽酵母（ＮＢＲＣ０２１６）からのゲノム回収
分裂酵母（ＮＢＲＣ１６２８）を出芽酵母（ＮＢＲＣ０２１６）にした以外は、その他条件、操作は実施例１３と同様に行った。結果を表１２に示した。【０１４１】
これらの結果から、本発明の担体を用いることで、生物学的試料として出芽酵母（ＮＢＲＣ０２１６）を用いても、市販キットの３．５倍の収量でゲノムを回収できることがわかった。
＜実施例１５＞本発明の担体を使った接着細胞（Ｐａｎｃ１０．０５）からのゲノム回収
接着細胞（Ｐａｎｃ１０．０５）は、ＲＰＭＩ培地に１０％（ｖ／ｖ）となるようウシ胎児血清を添加して、２５ｃｍ２細胞培養用フラスコで培養した。ゲノム回収にあたり、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて細胞を培養フラスコから剥離した。剥離した細胞は１５ｍｌチューブに移し、遠心（１５００ｒｐｍ，  ５ｍｉｎ，  室温）してペレットにし、上清を吸引除去した。その後、２ｍｌの培地を入れて再懸濁した。細胞数をカウントし、この細胞懸濁液から５×１０４  ｃｅｌｌｓずつ分取して１．５ｍｌチューブ２本に移し、遠心（３００Ｇ，  ５ｍｉｎ）してペレットにし、上清を除いた。得られた２本の試料のうち、１本目は本発明の担体を用いてゲノムを回収し、２本目はコントロールとして市販キットでゲノムを回収した。【０１４２】
まず、１本目の試料にＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ  Ｐｌｕｓを１００μｌ加えてボルテックスした。この溶液を、実施例１と同じ条件で作製したポリエチレングリコールが吸着した酸化セリウム５ｍｇと混合した。１５分間ミキサーで攪拌し、遠心（１００００Ｇ，  １ｍｉｎ）して上清を捨てた。残った担体に対し０．０５％  Ｔｗｅｅｎ水を４００μｌ加え、ボルテックスした。この操作を更に２回行った。その後、５０μｌのリン酸緩衝液（０．５Ｍ，  ｐＨ８）を加えて３０分間ミキサーで攪拌した。遠心機で遠心（１００００Ｇ，  １ｍｉｎ）して、上清を核酸溶液として回収した。【０１４３】
続いて、２本目の試料から、市販キット（ＤＮｅａｓｙ  ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ、  ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプロトコルに従い、ゲノム回収を行った。このとき、溶出液の体積は５０μｌとした。本発明の担体と市販キットで回収したゲノム溶出液を電気泳動（１％アガロース、１００Ｖ、６０ｍｉｎ）し、臭化エチジウムで染色した。蛍光スキャナーでゲルの蛍光画像を測定し、ゲノム分画（２５ｋｂｐ付近）のバンド濃度比の画像解析を行った。接着細胞に含まれているゲノムの絶対量が不明であるため、回収率の代わりに、本発明の担体と市販キットとの回収量の比を算出した。結果を表１２に示した。【０１４４】
これらの結果から、本発明の担体を用いることで、生物学的試料として接着細胞（Ｐａｎｃ１０．０５）を用いても、市販キットの８．６倍の収量でゲノムを回収できることがわかった。【０１４５】
＜実施例１６＞本発明の担体を使った浮遊細胞（Ｊｕｒｋａｔ）からのゲノム回収
浮遊細胞（Ｊｕｒｋａｔ）は、ＲＰＭＩ培地に１０％（ｖ／ｖ）となるようウシ胎児血清を添加して、２５ｃｍ２細胞培養用フラスコで培養した。ゲノム回収にあたり、細胞は１５ｍｌチューブに移し、遠心（１５００ｒｐｍ，  ５ｍｉｎ，  室温）してペレットにし、上清を吸引除去した。２ｍｌの培地を入れて再懸濁した。その他の条件、操作は実施例１５と同様に行った。結果を表１２に示した。【０１４６】
これらの結果から、本発明の担体を用いることで、生物学的試料として浮遊細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を用いても、市販キットの５．９倍の収量でゲノムを回収できることがわかった。【０１４７】
＜実施例１７＞尿からの核酸回収
実施例１に従って酸化セリウムの表面にポリエチレングリコールが吸着した担体を作製し、１．５ｍｌチューブに１．５ｍｇ量り取った。核酸を含む溶液として１００ｐｍｏｌのＤＮＡ２２が溶解した人工尿（０．２ｇ／ｌ  ＣａＣｌ２、０．４ｇ／ｌ  ＭｓＳＯ４，  ８ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、２０ｇ／ｌ  尿素、０．３％アンモニア）１ｍｌを調製した。人工尿に１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４）を２００μｌ加えてボルテックスし、混合液を担体に加えた。その他の条件、操作は比較例４と同様に行い核酸の吸着率、溶出率、回収率を算出した。結果を表１３に示した。【０１４８】
これらの結果から、酸化セリウムの表面にポリエチレングリコールが吸着した担体を用いることで、生物学的試料として尿を用いても、ＤＮＡ２２を効率よく回収できることが分かった。【０１４９】
【表１３】
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【０１５０】
＜比較例５＞四酸化三鉄のみを担体として用いた核酸の回収方法
比較例１におけるα−酸化鉄を四酸化三鉄に変更した以外は、比較例１と同様の条件、操作で核酸を回収した。結果を表１３に示した。【０１５１】
これらの結果から、四酸化三鉄を担体として用いた場合、核酸は吸着するものの、核酸の溶出率が低いことがわかった。比較例５と比較例１の結果をあわせると、いずれの種類の酸化鉄を担体として用いた場合でも、核酸を効率的に回収できないことがわかった。【０１５２】
【表１４】
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【産業上の利用可能性】
【０１５３】
本発明により、生物学的試料から、簡便な方法でｐｒｅ−ｍｉＲＮＡやｍｉＲＮＡのような非常に短い核酸から、ゲノムのような長い核酸まで効率よく回収することが可能となる。
【国際調査報告】
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