(57)【要約】  本発明は、準備段階で培養細胞の活性が低下することを抑制することができ、かつ、培養した細胞組織を流体チップから取り外して観察することを可能とする細胞培養用流体チップを提供する。本発明の細胞培養用流体チップは、基材と、蓋部材とを備え、前記基材及び前記蓋部材は、前記基材と前記蓋部材とを接着することにより前記基材と前記蓋部材との間に第１流路と、第１培養容器を着脱可能に収容するための第１収容部が形成されるように設けられ、第１培養容器は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなり、前記基材及び前記蓋部材は、第１流路に流す培養液の少なくとも一部が第１収容部に供給されるように設けられたことを特徴とする。
2018147032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、蓋部材とを備え、
前記基材及び前記蓋部材は、前記基材と前記蓋部材とを接着することにより前記基材と前記蓋部材との間に第１流路と、第１培養容器を着脱可能に収容するための第１収容部とが形成されるように設けられ、
第１培養容器は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなり、
前記基材及び前記蓋部材は、第１流路に流す培養液の少なくとも一部が第１収容部に供給されるように設けられたことを特徴とする細胞培養用流体チップ。
【請求項２】
前記基材又は前記蓋部材は、第１注入口と第１排出口とを有し、
第１流路は、第１注入口から注入された培養液が第１流路を流れ第１排出口から流出するように設けられた請求項１に記載の流体チップ。
【請求項３】
第１収容部は、第１培養容器を嵌め込むことができるように設けられた受け口を有する請求項１又は２に記載の流体チップ。
【請求項４】
前記基材及び前記蓋部材は、前記基材と前記蓋部材とを接着することにより前記基材と前記蓋部材との間に第２流路が形成されるように設けられ、
前記基材又は前記蓋部材は、第２注入口と、第２排出口とを有し、
第２流路は、第２注入口から注入された培養液又は生理食塩水が第２流路を流れ第２排出口から流出するように設けられ、
前記基材及び前記蓋部材は、第１流路に流す培養液の少なくとも一部と、第２流路に流す培養液又は生理食塩水の少なくとも一部との両方が第１収容部に供給されるように設けられた請求項１〜３のいずれか１つに記載の流体チップ。
【請求項５】
第１収容部に収容された第１培養容器をさらに備え、
前記蓋部材は、前記蓋部材の一部が第１流路の流路壁又は前記収容部の内壁となるように設けられた請求項１〜４のいずれか１つに記載の流体チップ。
【請求項６】
第１培養容器は、ハイドロゲル又は多孔質体からなる透光性の窓部を有し、
前記ハイドロゲルは、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、アルギン酸ナトリウム、コラーゲンゲルのうち少なくとも１つを含み、
前記多孔質体は、多孔質材料シート、メッシュ、エッチングシート、不織布、織布のうち少なくとも１つを含む請求項１〜５のいずれか１つに記載の流体チップ。
【請求項７】
前記基材及び前記蓋部材は、前記基材と前記蓋部材とを接着することにより前記基材と前記蓋部材との間に第２培養容器を着脱可能に収容するための第２収容部が形成されるように設けられ、
第２培養容器は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなり、
前記基材及び前記蓋部材は、第１流路に流す培養液が第１収容部に収容した第１培養容器の内部に浸透し供給されるように設けられ、かつ、第１培養容器の内部を浸透流として流れた後の培養液が第２収容部に収容した第２培養容器の内部に浸透し供給されるように設けられた請求項１又は２に記載の流体チップ。
【請求項８】
第１収容部は、第１培養容器が第１収容部に嵌合するように設けられ、
第２収容部は、第２培養容器が第２収容部に嵌合するように設けられた請求項７に記載の流体チップ。
【請求項９】
第１収容部に収容された第１培養容器をさらに備え、
第１培養容器は、各面に開口を有する多面体形状の第１枠部と、複数の開口のうち少なくとも１つの開口に設けられた第１窓部と、第１枠部及び第１窓部の内部に配置された培養ゲルとを有し、
第１窓部は、透光性のハイドロゲル又は多孔質体からなり、
第１収容部は、培養液が流入する第１流入口と、培養液が流入する第１流出口とを有し、
第１枠部の複数の開口は、第１窓部が設けられていない第１及び第２開口を含み、
第１収容部及び第１培養容器は、第１枠部の第１開口と第１流入口とが隣接するように設けられ、かつ、第１枠部の第２開口と第１流出口とが隣接するように設けられた請求項７又は８に記載の流体チップ。
【請求項１０】
第２収容部に収容された第２培養容器をさらに備え、
第２培養容器は、各面に開口を有する多面体形状の第２枠部と、複数の開口のうち少なくとも１つの開口に設けられた第２窓部と、第２枠部及び第２窓部の内部に配置された培養ゲルとを有し、
第２窓部は、透光性のハイドロゲル又は多孔質体からなり、
第２収容部は、培養液が流入する第２流入口と、培養液が流入する第２流出口とを有し、
第２枠部の複数の開口は、第２窓部が設けられていない第３及び第４開口を含み、
第２収容部及び第２培養容器は、第２枠部の第３開口と第２流入口とが隣接するように設けられ、かつ、第２枠部の第４開口と第２流出口とが隣接するように設けられた請求項７〜９のいずれか１つに記載の流体チップ。
【請求項１１】
前記基材及び前記蓋部材は、前記基材と前記蓋部材とを接着することにより前記基材と前記蓋部材との間に第３培養容器を着脱可能に収容するための第３収容部が形成されるように設けられ、
第３培養容器は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなり、
前記基材及び前記蓋部材は、第１流路に流す培養液が第１収容部に収容した第１培養容器の内部に浸透し供給されるように設けられ、かつ、第１培養容器の内部を浸透流として流れた後の培養液が第２収容部に収容した第２培養容器の内部及び第３収容部に収容した第３培養容器の内部に浸透し供給されるように設けられた請求項７〜１０のいずれか１つに記載の流体チップ。
【請求項１２】
基材を備え、
前記基材は、第１流路と、第１培養容器を着脱可能に収容するための第１収容部とを有し、
第１培養容器は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなり、
前記基材は、第１流路に流す培養液の少なくとも一部が第１収容部に供給されるように設けられたことを特徴とする細胞培養用流体チップ。
【請求項１３】
各面に開口を有する多面体の枠部と、各開口にそれぞれ設けられた窓部とを有し、
前記枠部及び前記窓部は、前記枠部及び前記窓部の内部に培養ゲルを内包できるように設けられ、
前記窓部は、透光性のハイドロゲル又は多孔質体からなり、
少なくとも１つの前記窓部は、前記枠部の外側に突出した凸部を有することを特徴とする培養容器。
【請求項１４】
細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなる第１培養容器内において前記細胞又は細胞組織を準備培養するステップと、
準備培養した細胞又は細胞組織を内包した第１培養容器を細胞培養用流体チップの第１収容部に収容するステップと、
第１収容部に収容した第１培養容器に内包した細胞又は細胞組織に第１流路を介して培養液を供給するステップとを含む培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養用流体チップ、培養容器及び培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養ゲル中で細胞組織を立体培養することにより皮膚の三次元培養組織などを形成する研究が行われている（例えば特許文献１参照）。この研究では、培養ゾルに皮膚線維芽細胞を加えた細胞懸濁ゾルを培養皿に入れ、炭酸ガスインキュベータ内に２時間静置して細胞懸濁ゾルをゲル化している。また、この培養皿に接続されたシリコンチューブで培養皿に培養液を供給しまた他のシリコンチューブで培養液を排出することにより細胞組織を灌流培養している。このように細胞組織を灌流培養することにより、培養ゲル中の細胞組織に酸素や栄養素などを連続的に供給することができ、生体内に近い培養環境で細胞組織を培養することができる。
また、流体チップで細胞培養する研究が行われている（例えば、特許文献２参照）。流体チップを用いて細胞を培養することにより、流路設計が可能となり、精密・定量的な細胞培養環境の制御が可能になる。
また、マイクロ流体デバイスを活用して、生体内における細胞の微小環境や血流などの動的環境を模倣する研究が行われている（例えば、特許文献３）。このようなマイクロ流体デバイスは、生体機能チップ（Organ-on-a-chip又はBody-on-a-chip）と呼ばれ、組織間又は臓器間の相互作用を直接的に評価するデバイスとして、創薬などにおける前臨床試験での活用が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１４−１１３１１８号公報
【特許文献２】特開２００８−５１９５９８号公報
【特許文献３】特表２０１６−５３３１８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
培養皿を用いた灌流培養では、流路設計が難しく流体制御が困難であり、精密・定量的な細胞培養環境の制御ができない。
また、従来の流体チップを用いた細胞培養では、培養の準備として細胞及び培養ゾルの流体チップへの注入、架橋（ゲル化）などを流体チップ内で行う必要があり、細胞培養を始めるまでに時間を要する。このため、細胞培養の準備段階で培養細胞の活性が低下する場合があり、実験結果のばらつきの要因となっている。また、流体チップ内で培養した細胞組織を傷付けずに回収し、保存することが難しい。さらに、細胞組織の観察方向が流体チップの上側又は下側に限定され、培養した細胞組織の三次元構造を把握することが難しい。
また、従来の生体機能チップでは、マイクロチップの流路内において複数種類の細胞を培養し、生体内の動的環境を再現する必要があるため、生体内環境の再現することに多くの労力と時間を必要とする。また、すべての細胞組織が劣化していない状態で複雑な生体内環境を再現することは難しい。また、マイクロチップ内で複数種類の細胞を培養する場合、細胞の種類ごとに培養環境を変えることが難しく、効率的に細胞を培養することが難しい。
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、準備段階で培養細胞の活性が低下することを抑制することができ、かつ、培養した細胞組織を流体チップから取り外して観察することを可能とする細胞培養用流体チップを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、基材と、蓋部材とを備え、前記基材及び前記蓋部材は、前記基材と前記蓋部材とを接着することにより前記基材と前記蓋部材との間に第１流路と、第１培養容器を着脱可能に収容するための第１収容部とが形成されるように設けられ、第１培養容器は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなり、前記基材及び前記蓋部材は、第１流路に流す培養液の少なくとも一部が第１収容部に供給されるように設けられたことを特徴とする細胞培養用流体チップを提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の流体チップに含まれる基材及び蓋部材は、基材と蓋部材とを接着することにより基材と蓋部材との間に第１流路と、第１培養容器を着脱可能に収容するための第１収容部が形成されるように設けられる。このことにより、流体チップの内部に第１流路と第１収容部とを形成することができる。
第１流路に流す培養液の少なくとも一部が第１収容部に供給されるように設けられる。また、第１収容部に収容される第１培養容器は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなる。このため、第１流路に培養液を流すことにより第１収容部に培養液を供給することができ、培養液に含まれる栄養素、タンパク質、化学物質、酸素などを第１培養容器（ハイドロゲル又は多孔質体）及び培養ゲルを介して細胞組織に供給することができ、培養容器内の細胞組織を培養することができる。また、培養液に含まれる刺激因子、成長因子などを細胞組織に供給することができ、刺激因子、成長因子などの細胞組織への影響を調べることができる。また、第１流路に培養液を流すことにより、生体内環境（血流など）を再現することが可能になる。
第１収容部は、第１培養容器を着脱可能に収容できるように設けられるため、第１収容部に第１培養容器を装着したり取り外したりすることができる。このため、予め準備した第１培養容器を任意のタイミングで第１収容部に装着することができ、流体チップ内で培養を始める前に細胞組織が劣化することを抑制することができる。また、実験時間を短縮することができ、実験結果にばらつきが生じることを抑制することができる。また、第１培養容器内の細胞又は細胞組織を最適な培養環境で準備培養した後、第１培養容器を第１収容部に装着することができるため、劣化していない細胞組織を流体チップ内に配置することができる。このことにより、流体チップに複数の種類の細胞組織を配置する場合でも、それぞれの細胞組織が劣化していない状態で流体チップ内に配置することができ、生体内環境を再現性よく再現することができる。また、多種の細胞組織を含む複雑な生体内環境であっても容易に再現することが可能である。さらに、複数の第１培養容器でそれぞれ細胞又は細胞組織を準備培養した後、準備培養した複数の第１培養容器から良好な第１培養容器を選抜して流体チップ内に配置することができる。このことにより、実験に適した細胞又は細胞組織を流体チップ内に配置することができ、生体内環境を再現性よく再現することができる。
第１収容部に収容した第１培養容器は、流体チップ内での細胞培養を終え、蓋部材を基材から取り外した後に第１収容部から取り外すことが可能であり、流体チップから取り外した状態で培養した細胞組織を顕微鏡などで観察することができる。このため、細胞組織を様々な方向から観察することが可能であり、培養した細胞組織の三次元構造を把握することが可能である。また、流体チップ内で培養した細胞組織を容易に傷付けずに回収することができ、保存することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の一実施形態の流体チップの概略上面図である。
【図２】（ａ）は図１の破線Ａ−Ａにおける流体チップの概略断面図であり、（ｂ）は図１の破線Ｂ−Ｂにおける流体チップの概略断面図であり、（ｃ）は図１の一点鎖線Ｃ−Ｃにおける流体チップの概略断面図であり、（ｄ）は図１の一点鎖線Ｄ−Ｄにおける流体チップの概略断面図である。
【図３】本発明の一実施形態の流体チップの概略上面図である。
【図４】（ａ）は図３の破線Ｅ−Ｅにおける流体チップの概略断面図であり、（ｂ）は図３の破線Ｆ−Ｆにおける流体チップの概略断面図であり、（ｃ）は図３の一点鎖線Ｇ−Ｇにおける流体チップの概略断面図であり、（ｄ）は図３の一点鎖線Ｈ−Ｈにおける流体チップの概略断面図である。
【図５】（ａ）（ｂ）はそれぞれ本発明の一実施形態の流体チップの概略上面図である。
【図６】本発明の一実施形態の流体チップの概略上面図である。
【図７】本発明の一実施形態の流体チップの概略断面図である。
【図８】図７の破線で囲んだ範囲Ｈにおける流体チップの概略拡大図である。
【図９】(ａ)（ｂ）はそれぞれ本発明の一実施形態の流体チップの概略上面図である。
【図１０】本発明の一実施形態の流体チップの収容部に収容される培養容器の概略斜視図である。
【図１１】図１０の破線Ｘ−Ｘにおける培養容器の概略断面図である。
【図１２】本発明の一実施形態の培養容器の概略断面図である。
【図１３】本発明の一実施形態の流体チップの収容部に収容される培養容器の概略断面図である。
【図１４】（ａ）は作製した培養容器の写真であり、（ｂ）（ｃ）はそれぞれ作製した培養容器を収容した流体チップの写真である。
【図１５】細胞培養実験で準備培養した細胞を内包する培養容器を複数収容したマルチウェルプレートの写真である。
【図１６】各種培養容器を収容した流体チップの写真である。
【図１７】ドキソルビシンを含む培養液で培養する前と後における各種細胞の写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の細胞培養用流体チップは、基材と、蓋部材とを備え、前記基材及び前記蓋部材は、前記基材と前記蓋部材とを接着することにより前記基材と前記蓋部材との間に第１流路と、第１培養容器を着脱可能に収容するための第１収容部が形成されるように設けられ、第１培養容器は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなり、前記基材及び前記蓋部材は、第１流路に流す培養液の少なくとも一部が第１収容部に供給されるように設けられたことを特徴とする。
【０００９】
本発明の流体チップに含まれる基材又は蓋部材は第１注入口と第１排出口とを有することが好ましく、第１流路は、第１注入口から注入された培養液が第１流路を流れ第１排出口から流出するように設けられることが好ましい。第１注入口に培養液を注入することにより、第１流路に培養液を流すことができる。
第１収容部は、第１培養容器を嵌め込むことができるように設けられた受け口を有することが好ましい。この受け口に培養容器を嵌め込むことにより収容部に培養容器を固定することができる。また、受け口から培養容器を抜き出すことにより収容部から培養容器を取り外すことができる。
【００１０】
前記基材及び前記蓋部材は、基材と蓋部材とを接着することにより基材と蓋部材との間に第２流路が形成されるように設けられることが好ましく、基材又は蓋部材は、第２注入口と、第２排出口とを有することが好ましい。また、第２流路は、第２注入口から注入された培養液又は生理食塩水が第２流路を流れ第２排出口から流出するように設けられることが好ましい。また、基材及び蓋部材は、第１流路に流す培養液の少なくとも一部と、第２流路に流す培養液又は生理食塩水の少なくとも一部との両方が第１収容部に供給されるように設けられることが好ましい。このことにより、第１流路と第２流路とに成分の異なる培養液又は生理食塩水を流すことが可能になり、収容部に培養液成分の濃度勾配を形成することができる。このため、濃度勾配による培養細胞への影響を調べることができる。
本発明の流体チップは、第１収容部に収容された第１培養容器と、基材に接着する蓋部材とをさらに備えることが好ましく、蓋部材の一部が第１流路の流路壁又は前記収容部の内壁となるように設けられることが好ましい。このことにより、培養容器中の細胞組織を培養することができる。また、培養液が漏洩することを防止することができる。また、蓋部材を基材に接着する前に収容部に培養容器を装着することができ、蓋部材を基材から剥ぎ取った後に収容部から培養容器を取り外すことができる。
【００１１】
前記培養容器はハイドロゲル又は多孔質体からなる透光性の窓部を有することが好ましく、前記ハイドロゲルは、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、アルギン酸ナトリウム、コラーゲンゲルのうち少なくとも１つを含み、前記多孔質体は、多孔質材料シート、メッシュ、エッチングシート、不織布、織布のうち少なくとも１つを含むことが好ましい。このことにより、培養液に含まれる栄養素、タンパク質、酸素などを窓部及び培養ゲルを介して細胞組織に供給することができる。また、窓部から培養容器内の細胞組織を顕微鏡などで観察することができる。
前記基材及び前記蓋部材は、基材と蓋部材とを接着することにより基材と蓋部材との間に第２培養容器を着脱可能に収容するための第２収容部が形成されるように設けられることが好ましい。また、第２培養容器は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなることが好ましい。前記基材及び前記蓋部材は、第１流路に流す培養液が第１収容部に収容した第１培養容器の内部に浸透し供給されるように設けられ、かつ、第１培養容器の内部を浸透流として流れた後の培養液が第２収容部に収容した第２培養容器の内部に浸透し供給されるように設けられることが好ましい。このことにより、第１培養容器の内部の細胞組織からの細胞分泌物を培養液と共に第２培養容器の内部の細胞組織に供給することができ、第１培養容器内の細胞組織と第２培養容器内の細胞組織の相互作用を調べることができる。
第１収容部は第１培養容器が第１収容部に嵌合するように設けられることが好ましく、第２収容部は第２培養容器が第２収容部に嵌合するように設けられることが好ましい。このことにより、収容部と培養容器との間に培養液が流れる隙間ができることを抑制することができ、培養容器の内部に効率よく培養液を浸透流として流すことができる。
【００１２】
また、本発明は、基材を備える細胞培養用流体チップであって、前記基材は、第１流路と、培養容器を着脱可能に収容するための収容部とを有し、前記培養容器は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなり、前記基材は、第１流路に流す培養液の少なくとも一部が前記収容部に供給されるように設けられたことを特徴とする細胞培養用流体チップも提供する。
また、本発明は、各面に開口を有する多面体の枠部と、各開口にそれぞれ設けられた窓部とを有し、枠部及び窓部は、枠部及び窓部の内部に培養ゲルを内包できるように設けられ、窓部は、透光性のハイドロゲル又は多孔質体からなり、少なくとも１つの窓部は、枠部の外側に突出した凸部を有することを特徴とする培養容器も提供する。
また、本発明は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなる第１培養容器内において前記細胞又は細胞組織を準備培養するステップと、準備培養した細胞又は細胞組織を内包した第１培養容器を細胞培養用流体チップの第１収容部に収容するステップと、第１収容部に収容した第１培養容器に内包した細胞又は細胞組織に第１流路を介して培養液を供給するステップとを含む培養方法も提供する。
【００１３】
以下、図面を用いて本発明の一実施形態を説明する。図面や以下の記述中で示す構成は、例示であって、本発明の範囲は、図面や以下の記述中で示すものに限定されない。
図１〜１３は本実施形態の細胞培養用流体チップ及び培養容器に関する図面で有り、詳細は上述の図面の説明と同様である。また、図１、２に示した流体チップ３０は、培養容器９が装着されておらず、かつ、蓋部材３が接着されていない流体チップ３０であり、図３、４に示した流体チップ３０は、図１、２に示した流体チップ３０に培養容器９を装着し、基材２に蓋部材３を接着し、流路４ａ、４ｂに培養液１３を流した状態の流体チップ３０である。また、図５（ａ）は培養容器９が装着されていない状態の流体チップ３０の概略上面図であり、図５（ｂ）は培養容器９を装着した状態の流体チップ３０の概略上面図である。また、図６に示した流体チップ３０は、培養容器９が装着されておらず、かつ、蓋部材３が接着されていない流体チップ３０であり、図７に示した流体チップ３０は、図６に示した流体チップ３０に培養容器９ａ、９ｂを装着し、基材２に蓋部材３を接着し、流路４に培養液１３を流した状態の流体チップ３０である。なお、図７は図６の破線Ｇ−Ｇにおける流体チップ３０の断面図である。また、図９（ａ）（ｂ）に示した流体チップ３０は、培養容器９が装着されておらず、かつ、蓋部材３が接着されていない流体チップ３０である。
【００１４】
本実施形態の細胞培養用流体チップ３０は、基材２と、蓋部材３とを備え、基材２及び蓋部材３は、基材２と蓋部材３とを接着することにより基材２と蓋部材３との間に第１流路４と、培養容器９を着脱可能に収容するための収容部８が形成されるように設けられ、
培養容器９は、細胞又は細胞組織１１を包埋する培養ゲル１２を内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル１５又は多孔質体１５からなり、基材２及び蓋部材３は、第１流路４に流す培養液の少なくとも一部が収容部８に供給されるように設けられたことを特徴とする。
また、本実施形態の細胞培養用流体チップ３０は、基材２を備え、基材２は、第１流路４と、培養容器９を着脱可能に収容するための収容部８とを有し、培養容器９は、細胞又は細胞組織１１を包埋する培養ゲル１２を内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル１５又は多孔質体１５からなり、基材２は、第１流路４に流す培養液１３の少なくとも一部が収容部８に供給されるように設けられたことを特徴とする。
以下、本実施形態の細胞培養用流体チップ３０について説明する。
【００１５】
細胞培養用流体チップ３０は、流路４に培養液１３を流すことにより細胞又は細胞組織１１を培養することが可能である流体チップである。また、細胞培養用流体チップ３０は、マイクロ流体チップであってもよく、灌流培養装置であってもよく、培養環境制御装置であってもよく、生体機能チップであってもよい。
流体チップ３０は、基材２を備える。基材２に、流路４、収容部８などを形成することができる。基材２の材料は、シリコーンゴム（例えばＰＤＭＳ）、アクリル樹脂（例えばＰＭＭＡ）、ポリカーボネートなどの高分子材料であってもよく、ガラスであってもよい。基材２の材料は透光性を有することが好ましい。このことにより、培養中の細胞組織１１を容易に観察することができる。
【００１６】
流体チップ３０は、蓋部材３を備えることができる。流路４、収容部８が開放型である場合又は流路４、収容部８が基材２の内部に形成されている場合、蓋部材３は省略することができる。
蓋部材３は、例えばガラス板である。このことにより、蓋部材３側から培養容器９内の細胞組織１１を観察することができ、流体チップ３０中で培養している細胞組織１１を観察することができる。
【００１７】
蓋部材３は、流体チップ３０で細胞培養をする際に基材２に接着される部材である。基材２と蓋部材３は、基材２の粘着性により接着されてもよく、クリップなどを用いて基材２と蓋部材３と圧接することにより基材２と蓋部材３とを接着してもよく、両面テープを用いて基材２と蓋部材３とを接着してもよく、基材２又は蓋部材３の接着面をプラズマエッチング処理することにより基材２と蓋部材３とを接着してもよい。これらの方法により、接着剤や加熱溶融処理などを用いずに基材２と蓋部材３とを接着することができる。また、基材２と蓋部材３の間に形成した流路４が閉塞することを防止することができる。また、基材２と蓋部材３との間にすき間が形成されることを防止することができ、培養液１３が漏洩することを防止することができる。
【００１８】
蓋部材３は、収容部８に培養容器９を収容した後に基材２と接着することができる。また、蓋部材３は、蓋部材３の一部が流路４の流路壁及び収容部８の内壁となるように設けることができる。
また、蓋部材３は、蓋部材３を基材２から剥ぎ取る又は取り外すことができるように設けることができる。このことにより、流体チップ３０での細胞培養後に、流体チップ３０から培養容器９を取り出すことができる。また、流体チップ３０中の細胞組織１１を回転させることも可能である。
【００１９】
基材２及び蓋部材３は、基材２と蓋部材３とを接着することにより基材２と蓋部材３との間に少なくとも１つの流路４が形成されるように設けることができる。また、基材２が、少なくとも１つの流路４を有してもよい。流路４は培養液１３又は生理食塩水が流れる流路である。流路４は例えば基材２に形成された溝であってもよい。又、流路４は蓋部材３に形成された溝であってもよい。溝状の流路４の上部は、基材２と蓋部材３を接着することにより塞ぐことができる。また、流路４は、流体チップ３０の内部流路であってもよい。
基材２及び蓋部材３は、その間に複数の流路４が形成されるように設けることができる。このことにより、それぞれの流路４に成分の異なる培養液１３を流すことができる。また、１つの流路４ａに培養液１３を流し、他の流路４ｂに生理食塩水を流すことができる。例えば、図１〜４に示した流体チップ３０のように、基材２は２つの流路４ａ、４ｂを有してもよい。また、図５に示した流体チップ３０のように、基材２は、３つの流路４ａ、４ｂ、４ｃを有することができる。また、図６〜８に示した流体チップ３０のように、流路４は、培養容器９の内部に培養液１３が浸透流として流れるように設けることができる。また、図９（ａ）（ｂ）に示した流体チップ３０のように、流路４は複数の支流に枝分かれしていてもよい。
流路４は、例えば、基材２又は蓋部材３を機械加工することにより形成されてもよく、基材２又は蓋部材３の型取り成形により形成されてもよく、基材２又は蓋部材３のウェットエッチングにより形成されてもよい。
【００２０】
流路４は、一方の端に注入口１７を有し他方の端に排出口１８を有することができる。このことにより注入口１７に注入した培養液１３が流路４を流れ排出口１８から流出することができる。チューブ２３ａを注入口１７に接続することができ、チューブ２３ｂを排出口１８に接続することができる。また、シリンジポンプから送液される培養液１３をチューブ２３ａを介して注入口１７に注入することができる。また、温度制御装置により温度制御された培養液１３を注入口１７に注入することができる。注入口１７及び／又は排出口１８は基材２に設けてもよく、蓋部材３に設けてもよい。また、注入口１７から培養液と共に薬（例えば、抗生物質など）を注入することができる。このことにより、培養容器９の内部の細胞組織１１に薬を供給することができ、薬の細胞組織１１への影響を調べることができる。また、薬が細胞組織１１に供給されることにより、細胞組織１１から分泌される細胞分泌物の他の細胞組織１１への影響を調べることができる。
例えば、図１〜４に示した流体チップ３０では、注入口１７ａから流入した培養液１３ａが流路４ａを流れ排出口１８ａから排出され、注入口１７ｂから流入した培養液１３ｂが流路４ｂを流れ排出口１８ｂから排出される。
【００２１】
流体チップ３０が複数の流路４を備える場合、複数の流路４は、排出口１８を共有してもよい。例えば、第１流路４を流れる培養液と第２流路４を流れる培養液１３とが合流し、合流した培養液１３が１つの排出口１８から流出するように基材を設けてもよい。
図６に示した流体チップ３０のように、流体チップ３０は流路４の下流側から培養液の一部を上流側に戻して循環させる循環流路５を備えてもよい。この循環流路５に逆流防止弁６を設けるなどして、流路４および循環流路５に培養液を循環させることにより、生体内における血液循環を再現することが可能になる。
【００２２】
基材２及び蓋部材３は、基材２と蓋部材３とを接着することにより基材２と蓋部材３との間に培養容器９を着脱可能に収容するための収容部８が少なくとも１つ形成されるように設けることができる。収容部８を基材２と蓋部材３との間に設けて収容部８の上部が蓋部材３で閉じられた構成にすれば、外部から流路４及び収容部８に加圧しながら培養液１３を供給することができる。また、注入口１７に注入する培養液の圧力を調整することにより、流路４に流す培養液の流速を調整することも可能である。また、例えば、流路４と収容部８との間に変形可能な材料で壁を設け、流路４に培養液１３などを流す圧力を変化させることにより、流路４と収容部８との間の壁を変形させ、収容部８に格納された培養容器９に力学刺激を与えることも可能である。
また、基材２が、少なくとも１つの収容部８を備えてもよい。例えば、基材２に収容部用の溝を形成して蓋部材３で上部を塞ぐことにより収容部８を設けてもよく、基材２に収容部用の溝を形成ことにより上部が開放された状態の収容部８を設けてもよい。
【００２３】
収容部８は、培養容器９を着脱可能に収容するための空間（又はチャンバー）である。収容部８は、基材２に形成された溝であってもよく、蓋部材３に形成された溝であってもよい。このことにより、溝の上側から収容部８に培養容器９を装着したり、収容部８に収容した培養容器９を取り外したりすることができる。この溝状の収容部８の上部は、基材２と蓋部材３を接着することにより塞ぐことができる。
また、基材２と蓋部材３との間において収容部８を設ける位置については、収容部８を流路４の途中に設けて、流路４を流れる培養液の大部分が収容部８を通過するように収容部８を設けることができる。図１〜４に示した例では収容部８の両縁部分が流路４ａ、４ｂに繋がっているが、収容部８を流路４の途中に設けて、流路４を流れる培養液の大部分が収容部８を通過するように収容部８を設けることもできる。
【００２４】
一方、収容部８を流路４から離れた位置に設けて、収容部８と流路４とを繋ぐ連通流路を設けてもよい。この場合、流路４を流れる培養液の多くは収容部８を通過しないが、連通流路を介して一部が収容部８に供給される。
収容部８は基材２又は蓋部材３を機械加工することにより形成されてもよく、基材２又は蓋部材３の型取り成形により形成されてもよく、基材２又は蓋部材３をウェットエッチングすることにより形成されてもよい。
流体チップ３０は、複数の収容部８を備えてもよい。また、基材２及び蓋部材３は、１つの収容部８に複数の培養容器９を収容できるように設けられてもよい。このことにより、複数の培養容器９を流体チップ３０に装着することができ、培養容器９内の細胞組織１１の細胞間相互作用を調べることができる。複数の培養容器９内の細胞組織１１は、同種の細胞組織であってもよく、異種の細胞組織であってもよい。
【００２５】
基材２及び蓋部材３は、流路４に流す培養液１３又は生理食塩水の少なくとも一部が収容部８に供給されるように設けられる。例えば、流路４の途中に収容部８を設けてもよく、流路４を流れる培養液１３又は生理食塩水の一部が収容部８に流入するように流路４及び収容部８を設けてもよい。また、流路４と収容部８とが連通流路により接続されていてもよい。
また、複数の流路４を流れる培養液１３又は生理食塩水の一部がそれぞれ収容部８に流入するように流路４及び収容部８を設けてもよい。このように収容部８を設けることにより、複数の流路４に刺激因子などの成分の異なる培養液１３を流し収容部８にそれぞれの培養液１３の成分を流入させることができ、収容部８に培養液成分の濃度勾配を形成することができる。このように培養液成分の濃度勾配を形成することにより、培養液成分の細胞組織１１への影響を調べることができる。
【００２６】
収容部８は、流路４ａと流路４ｂとを連通する連通路に設けられてもよい。例えば、図３、４に示した流体チップ３０において、流路４ａに成分Ａを含む培養液１３ａを流し、流路４ｂに成分Ａを含まない培養液１３ｂを流すと、収容部８に成分Ａの濃度勾配を形成することができる。このような培養環境で培養した細胞組織１１を観察することにより、培養液成分Ａの細胞組織１１への影響を調べることができる。成分Ａは、例えば、サイトカイン、ホルモンなどの刺激因子とすることができる。このことにより、細胞刺激の培養細胞への影響を調べることができる。
【００２７】
収容部８は、流路４ａ、流路４ｂ、流路４ｃにそれぞれ繋がるように設けられてもよい。例えば、図５に示した流体チップ３０において、流路４ａに成分Ａを含む培養液１３ａを流し、流路４ｂに成分Ｂを含む培養液１３ｂを流し、流路４ｃに成分Ｃを含む培養液１３ｃを流すと、収容部８に成分Ａ、Ｂ、Ｃの濃度勾配を形成することができる。このような培養環境で培養した細胞組織１１を観察することにより、培養液成分Ａ、Ｂ、Ｃの細胞組織１１への影響を調べることができる。
【００２８】
収容部８は、培養容器９を嵌め込んで固定することができるように設けられた受け口２０を有することができる。
培養容器９を受け口２０に嵌め込むことにより、収容部８に培養容器９を固定することができ、培養容器９の位置が変わることを防止することができる。また、受け口２０から培養容器９と抜き取ることにより培養容器９を収容部８から取り外すことができる。
受け口２０は、収容部８の内面に設けられた凹部であってもよい。例えば、受け口２０は、図１〜４に示した流体チップ３０のように培養容器９の底部が丁度嵌まり込む形状でもよいし、培養容器９の底部を挟み込んで固定できる形状であれば溝形状であってもよい。
また、受け口２０は、複数の凸部２２により形成されてもよい。例えば、図５に示した流体チップ３０では、収容部８に収納される培養容器９の周囲に空間が存在して培養液が流通できるようになっているが、複数の凸部２２ａ〜２２ｈを収容部８に設けて、この凸部２２ａ〜２２ｈで培養容器９の４辺近傍において培養容器９を挟み込む構成とすることによって培養容器９を収容部８内の定位置に固定できる。
なお、培養容器９を嵌め込んで固定する受け口（凹部、凸部）は、基材２に設ける代わりに蓋部材３に設けてもよい。
【００２９】
基材２及び蓋部材３は、流路４に流す培養液１３が収容部８ａに収容した培養容器９ａの内部（培養ゲル１２ａ及び細胞組織１１ａ）に浸透し供給されるように設けられ、かつ、培養容器９ａの内部を浸透流として流れた後の培養液１３が収容部８ｂに収容した培養容器９ｂの内部（培養ゲル１２ｂ及び細胞組織１１ｂ）に浸透し供給されるように設けられることができる。このことにより、培養容器９ａの内部の細胞組織１１ａからの細胞分泌物を培養液１３と共に培養容器９ｂの内部の細胞組織１１ｂに供給することができ、細胞組織１１ａと細胞組織１１ｂの相互作用を調べることができる。例えば、細胞組織１１ａを気管支組織とし、細胞組織１１ｂを心臓組織とすることができる。このことにより、気管支組織の細胞分泌物が心臓組織へ与える影響を調べることができる。
【００３０】
例えば、図６〜８に示した流体チップ３０のように、収容部８に培養容器９が嵌合するように、収容部８の形と培養容器９の形とを合わせることができる。そして、この収容部８の側面に設けられた流入口２５から収容部８に培養液が流入し、収容部８の他の側面に設けられた流出口２６から培養液が流出するように収容部８を設けることができる。このように収容部８を設けると、流入口２５の培養液を、培養容器９の窓部１５又は培養ゲル１２に浸み込ませることができる。また、培養ゲル１２に含まれる培養液を他の窓部１５又は培養ゲルから滲出させた培養液を流出口２６から流出させることができる。このように培養容器９の内部の培養ゲル１２に培養液を浸透流として流すことができる。
【００３１】
培養容器９と基材２又は蓋部材３との間に培養液流路が形成されないように、収容部８の内壁と培養容器９とを接触させることができる。このことにより、培養容器９の内部の培養ゲル１２に効率よく培養液を浸透流として流すことができる。
培養容器９が、各面に開口を有する多面体形状の枠部１６と、複数の開口のうち少なくとも１つの開口に設けられた窓部１５と、枠部１６及び窓部１５の内部に配置された培養ゲル１２とを有する場合、培養液の流入口２５に隣接する枠部１５の第１開口及び流出口２６に隣接する枠部１５の第２開口には窓部１５を設けずに、培養ゲルに培養液が直接接触してもよい。このことにより、培養容器９の内部の培養ゲル１２に効率よく培養液を浸透流として流すことができる。
例えば、図８のように、収容部８ａに培養容器９ａを収容することができ、収容部８ｂに培養容器９ｂを収容することができる。このことにより、注入口１７から注入された培養液を、収容部８ａに装着された培養容器９ａの内部の培養ゲル１２に浸透流として流すことができ、その後、収容部８ｂに装着された培養容器９ｂの内部の培養ゲル１２に浸透流として流すことができる。培養容器９の内部に培養液を浸透流として流す方法は、上述の通りである。
また、細胞組織１１ａと細胞組織１１ｂは、異なる細胞組織（例えば、異なる種類の細胞組織、又は異常な細胞組織と正常な細胞組織）とすることができる。例えば、細胞組織１１ａは気管支組織であり、細胞組織１１ｂは心臓組織である。また、例えば、細胞組織１１ａはがん細胞であり、細胞組織１１ｂは正常細胞である。このことにより、がん細胞の細胞分泌物が正常細胞に及ぼす影響を調べることができる。
【００３２】
基材２及び蓋部材３は、流路４に流す培養液１３が収容部８ａに収容した培養容器９ａの内部に浸透し供給されるように設けられ、かつ、培養容器９ａの内部を浸透流として流れた後の培養液１３が収容部８ｂに収容した培養容器９ｂの内部及び収容部８ｃに収容した培養容器９ｃの内部にそれぞれ浸透し供給されるように設けられてもよい。このことにより、培養容器９ａの内部の細胞組織１１ａの細胞分泌物の、培養容器９ｂの内部の細胞組織１１ｂへの影響および培養容器９ｃの内部の細胞組織１１ｃへの影響を同時に調べることができる。培養容器９の内部に培養液を浸透流として流す方法は上述の通りである。
例えば、図９（ａ）（ｂ）に示した流体チップ３０のように、注入口１７から注入された培養液が、収容部８ａに装着された培養容器９ａの内部に浸透流として流れ、その後、収容部８ｂに装着された培養容器９ｂの内部、収容部８ｃに装着された培養容器９ｃの内部、収容部８ｄに装着された培養容器９ｄの内部及び収容部８ｅに装着された培養容器９ｅの内部にそれぞれ浸透流として流れるように流路４及び収容部８を設けることができる。
【００３３】
培養容器９は、細胞又は細胞組織１１を包埋する培養ゲル１２を内包する。また、培養容器９の少なくとも一部がハイドロゲル１５又は多孔質体１５からなる。この培養容器９を収容部８に収容することにより、流路４から収容部８に供給された培養液１３中に培養容器９を浸漬することができる。このため、培養液１３に含まれる栄養素、タンパク質（分子量：数万〜数十万）、酸素などを培養容器９（ハイドロゲル１５又は多孔質体１５）及び培養ゲル１２を介して細胞組織１１に供給することができ、培養容器９内の細胞組織１１を培養することができる。
また、流体チップ３０に組み込む前の培養容器９を、培養皿又はウェルプレート中の培養液１３に浸漬することができ、培養皿又はウェルプレート中の培養液１３に含まれる栄養素、タンパク質、酸素などを培養容器９（ハイドロゲル１５）及び培養ゲル１２を介して細胞組織１１に供給することができる。このため、流体チップ３０に組み込む直前まで、培養容器９を培養液１３中に浸漬することができ、細胞組織１１の細胞活性が劣化することを抑制することができる。
また、流体チップ３０に異なる種類の細胞組織１１を組み込む場合、第１培養容器９ａの内部の培養ゲルにＡ種の細胞組織を包埋して、Ａ種の細胞組織に適した培養条件で第１培養容器９ａ内の細胞組織を培養し、第２培養容器９ｂの内部の培養ゲルにＢ種の細胞組織を包埋して、Ｂ種の細胞組織に適した培養条件で第２培養容器９ｂ内の細胞組織を培養することができる。そして、流体チップを用いた実験の直前に第１培養容器９ａを収容部８ａに装着し及び第２培養容器９ｂを収容部８ｂに装着することができる。このため、劣化していないＡ種の細胞組織及び劣化していないＢ種の細胞組織を用いて実験することが可能になる。ここではＡ種とＢ種を用いて説明したが、より多くの種類の細胞組織を流体チップに組み込んで同様に実験することが可能である。
【００３４】
培養容器９内の培養ゲル１２は、培養ゲル１２に包埋された細胞又は細胞組織１１を培養するためのゲルである。培養ゲル１２に包埋する細胞１１は、一定のパターンで集合した構造を有する細胞組織であってもよく、このような組織構造を有さない細胞であってもよい。また、組織構造を有さない細胞１１を培養することにより、細胞組織１１が成長してもよい。また、培養ゲル１２が細胞組織１１の足場になることができ、細胞組織１１が三次元的に成長することができる。
【００３５】
培養ゲル１２は、例えば、コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、プロテオグリカンなどを含むことができる。また、培養ゲル１２は、ＴＧＦ−β、線維芽細胞増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子などを含むことができる。さらに、培養ゲル１２には、例えば、マトリゲル（登録商標）を用いることができる。
培養ゲル１２は、培養容器９に内包され、流路４から供給される培養液１３に直接接触しないため、培養ゲル１２が培養液１３を吸収し膨潤することにより細胞組織１１の相対位置がずれることを抑制することができる。また、培養液１３の流れにより培養ゲル１２が変形することを抑制することができ、細胞組織１１の相対位置がずれることを抑制することができる。また、細胞組織１１の準備段階（準備培養）では、培養ゲル１２が培養液１３に直接接触しないように窓部１５を設け、培養容器９を収容部８に組み込む前に複数の窓部１５のうち少なくとも１つを除去することができる。このことにより、細胞組織１１の準備培養において培養ゲル１２の膨潤を抑制することができ、流体チップ３０を用いた実験において、窓部１５を除去したところから培養容器９の内部の培養ゲル１２に培養液を接触させ浸透させることができ、培養ゲル１２に培養液を浸透流として流すことができる。なお、比較的短時間の培養であれば培養ゲル１２はあまり膨潤しない。
【００３６】
培養容器９は、培養ゲル１２を内包するように設けられる。また、細胞組織１１を包埋した培養ゲル１２が培養容器９内のスペースを満たす。このことにより、培養容器９中に培養ゲル１２及び細胞組織１１を閉じ込めることができ、培養容器９内で培養ゲル１２が流動すること及び細胞組織１１の相対位置がずれることを抑制することができる。このように細胞組織１１及び培養ゲル１２を培養容器９の内部に配置することにより、細胞組織１１を包埋した培養ゲル１２の取り扱いが容易になる。
また、培養容器９を収容部８に装着することにより、培養ゲル１２及び細胞組織１１を容易に流体チップ３０内に入れることができる。また、収容部８から培養容器９を取り外すことにより、培養ゲル１２及び細胞組織１１を容易に流体チップ３０から取り出すことができる。
【００３７】
培養容器９の形状は、例えば、多面体であってもよい。このことにより、培養容器９を安定して収容部８に収容することができる。培養容器９の形状は、図１０、１１に示した培養容器９のように立方体であってもよく、直方体であってもよく、六角柱であってもよく、円柱であってもよい。培養容器９は、例えば、各辺の長さが１ｍｍ以上５ｃｍ以下となる大きさにすることができる。また、培養容器９の容量は、例えば、１μＬ以上１０ｍＬ以下とすることができる。
【００３８】
培養容器９は、透光性でハイドロゲル又は多孔質体からなる窓部１５を有することができる。また、窓部１５は、透光性であり、かつ、栄養成分透過性を有し、かつ、培養ゲル１２に包埋された細胞又は細胞組織１１を多面観察できるように設けることができる。この窓部１５及び培養ゲル１２を介して、培養液１３に含まれる栄養素、タンパク質、酸素などを細胞組織１１に供給することができる。また、流体チップ３０から培養容器９を取り外した後に、培養容器９の内部の細胞組織７を窓部４から顕微鏡などにより観察することができる。培養容器９の形状が多面体である場合、窓部１５は培養容器９の各面に設けることができる。このことにより、培養容器９内部の細胞組織１１を培養容器９の各面からそれぞれ観察することができる。従って、細胞組織１１の三次元構造を特定することが可能になる。例えば、図１０、１１のように、窓部１５は、培養容器９の各面に設けることができる。なお、窓部１５から細胞組織１１を観察する際、培養容器９を光透過性の高いガラス容器にいれて細胞組織１１を観察することができる。このことにより、培養液などが顕微鏡に付着することを防止することができる。
【００３９】
培養容器９は、細胞組織１１の相対位置がずれることを抑制して回転させることができるため、培養容器９の窓部１５を設けた各面が観察面となるように培養容器９を回転させることができる。特に、培養容器９の上面と下面とが入れ替わるように培養容器９を回転させることや、培養容器９を横倒しにするように回転させることが可能になる。従って、培養容器９の各面から内部の細胞組織１１を観察することが可能になり、細胞組織１１の三次元的な立体形状を容易に明らかにすることができる。なお、細胞組織１１の観察に用いる顕微鏡は、光学顕微鏡であってもよく、レーザー顕微鏡であってもよい。
培養容器９の形状が円柱である場合、窓部１５は円柱の側面に設けることができる。このことにより、レーザー顕微鏡を用いて細胞組織１１の三次元画像を取得することができる。また、窓部１５は、円柱の上面および下面にも設けることができる。このことにより、上面及び下面からも細胞組織１１を観察することができ、三次元画像の解像度を向上させることができる。
【００４０】
窓部１５を構成するハイドロゲルは、タンパク質を通し自立できるだけの硬さがあれば特に限定されない。ハイドロゲルとは、水中の分散質が繋がってネットワークを形成し系全体として固体状になったものである。例えば、窓部１５は、５０ｇ／ｃｍ2以上１００００ｇ／ｃｍ2以下のゲル強度を有することができる。このことにより、培養容器９の内部の培養ゲル１２の重さにより窓部１５が変形することを抑制することができる。また、窓部１５がタンパク質透過性を有することができる。このゲル強度は、ネットワークを形成する分散質の濃度を調整することにより調整することができる。分散質の濃度が低すぎると、ゲル強度が低下する。分散質の濃度が高すぎると、タンパク質透過性が低下する。なお、この分散質の適切な濃度は、分散質の種類により異なる。
【００４１】
例えば、窓部１５を構成するハイドロゲルは、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、アルギン酸ナトリウム又はコラーゲンゲルを含むことができる。このことのより、窓部１５が透光性を有することができる。また、流路４から供給される培養液１３に含まれるタンパク質などの栄養が窓部１５を透過することができ、培養ゲル１２及び細胞組織１１に栄養を供給することができる。また、窓部１５がアガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、アルギン酸ナトリウム又はコラーゲンゲルを含むことにより、培養容器９を回転させた場合でも窓部１５が変形することを抑制することができる。窓部１５がアガロースゲルの場合、アガロースの濃度は、例えば、０．５〜４．０％とすることができる。また、窓部１５がポリアクリルアミドゲルの場合、ポリアクリルアミドの濃度は、例えば、３〜２０％とすることができる。窓部１５がアルギン酸ナトリウムを含む場合、窓部１５は、アルギン酸ナトリウム水溶液にカルシウムイオンを加えてゲル化することにより形成することができる。窓部１５がコラーゲンゲルの場合、高濃度のコラーゲンゲルで窓部１５を形成することができる。このことにより窓部１５が十分な強度を有することができる。
窓部１５を構成する多孔質体は、多数の細かい孔を有する部材である。多孔質体は、例えば、多孔質材料シート、メッシュ、エッチングシート、不織布、織布などである。また、多孔質体はシート形状を有することができる。また、多孔質体は、生体適合性を有することが好ましい。多孔質体は、ポリカーボネートなどの樹脂であってもよく、金などの金属であってもよく、ガラスなどの無機化合物であってもよい。窓部１５が多孔質体からなる場合、窓部１５は、多孔質体のシートを枠部１６に接着することにより形成することができる。
【００４２】
培養容器９は、窓部１５を囲む枠部１６を有することができる。このことにより、培養容器９の強度を大きくすることができ、培養容器９の取り扱いが容易になる。また、窓部１５が傷つくことを抑制することができる。例えば、図１０、１１に示した培養容器９のように、培養容器９を枠部１６と窓部１５から構成することができる。枠部１５の材料は、生体適合性を有する樹脂とすることができる。また、枠部１５の材料は、例えば、ポリカーボネートとすることができる。
図１０、１１に示したような培養容器９は、次のように作製することができる。まず、６面にそれぞれ開口を有する立方体の枠部１６を準備し、窓部用のゾルを枠部１６の開口に流し込みゲル化させハイドロゲルからなる膜状又はシート状の窓部１５を形成する。このようにして、枠部１６の５面にそれぞれ窓部１５を形成した後、ゲル化前の培養ゲルおよび細胞組織１１を枠部１６の立方体中に注入して培養ゲルをゲル化させる。その後、窓部１５用のゾルを残り１つの枠部１６の開口に流し込みゲル化させ膜状又はシート状の窓部１５を形成する。このようにして細胞組織１１と培養ゲル１２を内包した培養容器９を作製することができる。
【００４３】
培養容器９に含まれる少なくとも１つの窓部１５は、枠部１６の外側に突出した凸部２７を有することができる。この凸部２７を引っ張ることにより、枠部１６の開口から窓部１５を除去することができる。このことにより、細胞組織１１の準備段階の培養では、枠部１６の開口に窓部１５を設けておき、培養容器９を収容部８に装着する前に流入口２５に隣接する開口の窓部１５及び、流出口２６に隣接する開口の窓部１５を凸部２７を利用して除去することができる。このことにより、細胞組織１１の準備培養において培養ゲル１２の膨潤を抑制することができ、流体チップ３０を用いた実験において、培養容器９の内部の培養ゲル１２に培養液を浸透流として流すことができる。凸部２７は、例えば、図１２に示した培養容器９のように設けることができる。
【００４４】
培養容器９は、枠部１６を有さず窓部１５を形成するハイドロゲルから構成されてもよい。このことにより、窓部１５から細胞組織を観察する際に死角が生じることを抑制することができる。特に、培養容器９のサイズが十分に小さい場合（例えば、５ｍｍ以下）に培養容器９を枠部１５を有さない構成にすることができる。このような培養容器９は、次のように作製することができる。まず、窓部１５用のゾルを型に流し込みゲル化させて、１つの面に開口を有する中空の立方体ゲルを形成する。その後、ゲル化前の培養ゲルおよび細胞組織１１を立方体ゲル中に注入して培養ゲルをゲル化させる。その後、立方体ゲルの開口に窓部１５用のゾルを流し込みゲル化させ窓部１５を形成する。このようにして細胞組織１１と培養ゲル１２を内包した培養容器９を形成することができる。
【００４５】
本実施形態の流体チップ３０は、例えば、次のように使用することができる。まず、細胞組織１１が包埋された培養ゲル１２を内包した培養容器９を培養液に浸漬し、細胞組織１１を準備培養し、図１０、１１に示したような培養容器９を作製する。この培養容器９を図１、２に示した流体チップ３０の収容部８に装着し、基材２と蓋部材３とを接着することができる。得られた流体チップ３０の注入口１７及び排出口１８にそれぞれチューブ２３を接続させ、培養液１３を流すことにより、図３、４に示したような流体チップ３０を製造することができる。この流体チップ３０を用いて培養容器９中の細胞組織１１を培養することができ、培養液成分の細胞組織１１への影響を調べることができる。また、細胞組織１１の培養中は、流体チップ３０をインキュベータ中に配置することができる。
また、流体チップ３０を用いる細胞組織１１の培養が終わった後、基材２から蓋部材３を剥ぎ取り、培養容器９を収容部８から取り出すことができる。流体チップ３０から取り出した培養容器９を顕微鏡にセットし、培養容器９中の細胞組織１１の観察を行うことができる。また、流体チップ３０から取り出した培養容器９の内部の細胞組織１１を蛍光色素で染色した後に顕微鏡で細胞組織１１を蛍光観察してもよい。また、流体チップ３０から取り出した細胞組織１１を保存することも可能である。
【００４６】
図６〜８に示した流体チップ３０は、例えば、次のように使用することができる。細胞組織１１ａ（例えば気管支組織）が包埋された培養ゲル１２ａを内包した培養容器９ａを培養液に浸漬し、細胞組織１１ａを準備培養し、図１０、１１に示したような培養容器９ａを作製する。また、並行して細胞組織１１ｂ（例えば心臓組織）が包埋された培養ゲル１２ｂを内包した培養容器９ｂを培養液に浸漬し、細胞組織１１ｂを準備培養し、図１０、１１に示したような培養容器９ｂを作製する。この準備培養では、枠部１６の各面の開口には、窓部１５が設けられており、培養ゲル１２と培養液は直接接触していない。
【００４７】
その後、流入口２５に隣接する開口の窓部１５及び流出口２６に隣接する開口の窓部１５を凸部２７などを利用して除去した後、培養容器９ａを図６に示した基材２の収容部８ａに装着し、培養容器９ｂを基材２の収容部８ｂに装着する。その後、基材２と蓋部材３とを接着し、得られた流体チップ３０の注入口１７及び排出口１８にそれぞれチューブ２３を接続させ、培養液１３を流すことにより、図７に示したような流体チップ３０を製造することができる。また、注入口３０から培養液１３と共に薬（例えば抗生物質）を流路４に注入することができる。この流体チップでは、培養液１３が培養容器９ａの内部の培養ゲル１２ａに浸み込み浸透流として流れた後、培養ゲル１２ａを浸み出た培養液１３が流路４を流れ、その後培養液が培養容器９ｂの内部の培養ゲル１２ｂに浸み込み浸透流として流れる。このため、薬の細胞組織１１ａ、１１ｂへの影響、細胞組織１１ａの細胞分泌物の細胞組織１１ｂへの影響などを調べることができる。また、蓋部材３及び窓部１５の上部に顕微鏡を設置することにより、培養液１３を流している際の細胞組織１１ａ、１１ｂの変化を観察することができる。
また、所定の時間培養液を流した後、基材２から蓋部材３を剥ぎ取り、培養容器９ａ、９ｂを収容部８から取り出すことができる。流体チップ３０から取り出した培養容器９ａ、９ｂをそれぞれ顕微鏡にセットし、培養容器９中の細胞組織１１ａ、１１ｂの観察をそれぞれ行うことができる。
【００４８】
細胞培養実験（１）
図１０、１１に示したような気管支組織を内包した培養容器を作製し、培養容器を液体培地中に配置して気管支組織を培養した。まず、一辺３ｍｍのポリカーボネート製の立方体の枠部を準備し、１．５％アガロースゲルで窓部を形成した。その後、立方体内部に培養ゲルであるマトリゲル（登録商標）と気管支組織を注入しゲル化した後、残りの開口に１．５％アガロースゲルで窓部を形成することにより、培養容器を作製した。この培養容器を液体培地中に配置して、気管支組織を１０日間三次元培養した。その後、培養容器中の気管支組織を光学顕微鏡を用いて観察した。図１４（ａ）は、培養した気管支組織を内包した培養容器の写真である。
【００４９】
一方、図１、２に示したような流体チップを作製した。基材の材料はＰＤＭＳとした。また、蓋部材にはガラス板を用いた。培養した気管支組織を内包した培養容器を基材の収容部に装着し、基材を蓋部材に粘着させた。図１４（ｂ）は基材の収容部に培養容器を装着している写真であり、図１４（ｃ）は、基材と蓋部材とを接着した後の流体チップの写真である。その後、注入口及び排出口にチューブを接続し、流路４ａに成長因子を含む培養液を流し、流路４ｂに生理食塩水を流しながら培養容器中の気管支組織を２４時間培養し、細胞誘導の実験を行った。細胞誘導実験が終わった後、蓋部材を基材から剥がし取り、収容部から培養容器を取り出した。この培養容器中の気管支組織を光学顕微鏡を用いて観察し、流体チップでの培養前の気管支組織と比較し、気管支組織の変化を調べた。
このように、本発明の流体チップを用いて、培養液成分の気管支組織への影響を調べることができた。
【００５０】
細胞培養実験（２）
抗がん剤として広く用いられているドキソルビシンにおける効果と副作用として知られている心毒性の評価を本発明の細胞培養用流体チップを用いて行った。
まず、ヒト肝癌由来細胞を内包した培養容器９ａを５つ作製し、ヒト臍帯静脈内皮細胞を内包した培養容器９ｂを３つ作製し、ヒト心筋細胞を内包した培養容器９ｃを３つ作製し、ヒト気管支上皮細胞を内包した培養容器９ｄを３つ作製し、ヒト繊維芽細胞を内包した培養容器９ｅを３つ作製した。これらの培養容器９ａ〜９ｅをマルチウェルプレート３２のウェル３３においてそれぞれ２日間準備培養（三次元培養）した。培養容器の作成方法は培養する細胞の種類を変えた以外は細胞培養実験（１）と同様である。準備培養後のマルチウェルプレート３２の写真を図１５に示す。
【００５１】
その後、各培養容器９ａ〜９ｅを光学顕微鏡にセットし、培養した各種細胞を観察することにより、各細胞が培養ゲル１２内において安定して成長をしているのを確認した。そして、各細胞において形態として状態のよいサンプルのみを抽出し、図３（ｂ）に示したような基材２（材料：ＰＤＭＳ）の収容部８ａにヒト肝癌由来細胞を内包した培養容器９ａを挿入し、収容部８ｂにヒト臍帯静脈内皮細胞を内包した培養容器９ｂを挿入し、収容部８ｃにヒト心筋細胞を内包した培養容器９ｃを挿入し、収容部８ｄにヒト気管支上皮細胞を内包した培養容器９ｄを挿入し、収容部８ｅにヒト繊維芽細胞を内包した培養容器９ｅを挿入した。
【００５２】
その後、基材２に蓋部材３（ガラス板）を接着し、注入口１７、排出口１８にチューブ２３を取り付けることにより、流体チップを作製した。作製した流体チップの写真を図１６に示す。この流体チップでは、流路上流に肝癌細胞を配置し、下流に心毒性を評価するための心筋細胞と共にコントロールとしてその他の正常細胞を配置することで、生体内で生じている組織間の相互作用を模擬した。
【００５３】
作製した流体チップの注入口１７から抗がん剤であるドキソルビシン２０μＭを含む培養液を一定圧力で流体チップ内に供給し、流体チップの流路に２４時間培養液を流し続けることにより各細胞を抗がん剤の存在下で３次元培養した。その後、各培養容器９ａ〜９ｅを流体チップから取り出し光学顕微鏡にセットし、培養した各種細胞を観察することにより、各細胞がどのように形態変化したか確認した。
【００５４】
ヒト肝癌由来細胞、ヒト心筋細胞、ヒト気管支上皮細胞及びヒト繊維芽細胞の抗がん剤処理前及び抗がん剤処理後の写真を図１７に示す。
抗がん剤処理前において浸潤し始めていた肝癌細胞は、ドキソルビシン添加後、２４時間で浸潤部分が消失し、抗がん剤としての効果が確認できた。また、肝癌細胞の下流に存在する気管支上皮細胞ではドキソルビシン添加後においても気管支の分岐は太く成長を続けることが確認できた。また、肝癌細胞の下流に存在する繊維芽細胞ではドキソルビシン添加後においても繊維芽は外に足を伸ばし成長を続けることが確認できた。心筋細胞以外の気管支上皮細胞や繊維芽細胞については、通常の三次元培養同様に成長を続けていることから、流体チップ内に封入すること自体の毒性は問題がないことが確認できた。
一方、肝癌細胞の下流に存在する心筋細胞は、抗がん剤処理により全体サイズが縮小したことが確認できた。これにより、２次元培養で既に確認されているドキソルビシンの存在下で癌細胞から生成する代謝物が心筋細胞に毒性を与えるという結果が三次元培養系においても生じていることが確認できた。
【００５５】
従来であれば、５種類の細胞を流体チップ内に細胞活性を劣化されることなく封入することは熟練の技術が必要であったが、本発明により１分以内に５種の細胞を流体チップ内に封入を達成できる。またすでに培養開始２日目の安定した状態からさらに選別を行うことで、外乱となりやすい細胞活性のバラつきを抑え、複雑な実験系においても安定した結果を出すことができた。
【符号の説明】
【００５６】
２：基材    ３：蓋部材    ４、４ａ、４ｂ、４ｃ：流路    ５：循環流路    ６：逆流防止弁    ８、８ａ、８ｂ、８ｃ、８ｄ、８ｅ：収容部    ９、９ａ、９ｂ、９ｃ、９ｄ、９ｅ：培養容器    １１、１１ａ、１１ｂ：細胞又は細胞組織    １２、１２ａ、１２ｂ：培養ゲル    １３、１３ａ、１３ｂ：培養液    １５、１５ａ、１５ｂ：窓部（ハイドロゲル又は多孔質体）    １６、１６ａ、１６ｂ：枠部    １７、１７ａ、１７ｂ、１７ｃ：注入口    １８、１８ａ、１８ｂ、１８ｃ：排出口    ２０、２０ａ、２０ｂ：受け口    ２２、２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ、２２ｅ、２２ｆ、２２ｇ、２２ｈ：凸部    ２３、２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ：チューブ    ２５、２５ａ、２５ｂ：流入口    ２６、２６ａ、２６ｂ：流出口    ２７、２７ａ、２７ｂ：凸部    ３０：流体チップ    ３２：マルチウェルプレート    ３３：ウェル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月3日(2018.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、蓋部材とを備え、
前記基材及び前記蓋部材は、前記基材と前記蓋部材とを接着することにより前記基材と前記蓋部材との間に第１流路と、第１培養容器を着脱可能に収容するための第１収容部とが形成されるように設けられ、第１培養容器は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなり、
第１収容部は、第１培養容器を嵌め込むことができるように設けられた受け口を有し、
前記基材及び前記蓋部材は、第１流路に流す培養液の少なくとも一部が第１収容部に供給されるように設けられたことを特徴とする細胞培養用流体チップ。
【請求項２】
前記基材又は前記蓋部材は、第１注入口と第１排出口とを有し、
第１流路は、第１注入口から注入された培養液が第１流路を流れ第１排出口から流出するように設けられた請求項１に記載の流体チップ。
【請求項３】
前記基材及び前記蓋部材は、前記基材と前記蓋部材とを接着することにより前記基材と前記蓋部材との間に第２流路が形成されるように設けられ、
前記基材又は前記蓋部材は、第２注入口と、第２排出口とを有し、
第２流路は、第２注入口から注入された培養液又は生理食塩水が第２流路を流れ第２排出口から流出するように設けられ、
前記基材及び前記蓋部材は、第１流路に流す培養液の少なくとも一部と、第２流路に流す培養液又は生理食塩水の少なくとも一部との両方が第１収容部に供給されるように設けられた請求項１又は２に記載の流体チップ。
【請求項４】
第１収容部に収容された第１培養容器をさらに備え、
前記蓋部材は、前記蓋部材の一部が第１流路の流路壁又は前記収容部の内壁となるように設けられた請求項１〜３のいずれか１つに記載の流体チップ。
【請求項５】
第１培養容器は、ハイドロゲル又は多孔質体からなる透光性の窓部を有し、
前記ハイドロゲルは、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、アルギン酸ナトリウム、コラーゲンゲルのうち少なくとも１つを含み、前記多孔質体は、多孔質材料シート、メッシュ、エッチングシート、不織布、織布のうち少なくとも１つを含む請求項１〜４のいずれか１つに記載の流体チップ。
【請求項６】
前記基材及び前記蓋部材は、前記基材と前記蓋部材とを接着することにより前記基材と前記蓋部材との間に第２培養容器を着脱可能に収容するための第２収容部が形成されるように設けられ、
第２培養容器は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなり、
前記基材及び前記蓋部材は、第１流路に流す培養液が第１収容部に収容した第１培養容器の内部に浸透し供給されるように設けられ、かつ、第１培養容器の内部を浸透流として流れた後の培養液が第２収容部に収容した第２培養容器の内部に浸透し供給されるように設けられた請求項１又は２に記載の流体チップ。
【請求項７】
第１収容部は、第１培養容器が第１収容部に嵌合するように設けられ、
第２収容部は、第２培養容器が第２収容部に嵌合するように設けられた請求項６に記載の流体チップ。
【請求項８】
第１収容部に収容された第１培養容器をさらに備え、
第１培養容器は、各面に開口を有する多面体形状の第１枠部と、複数の開口のうち少なくとも１つの開口に設けられた第１窓部と、第１枠部及び第１窓部の内部に配置された培養ゲルとを有し、
第１窓部は、透光性のハイドロゲル又は多孔質体からなり、
第１収容部は、培養液が流入する第１流入口と、培養液が流入する第１流出口とを有し、
第１枠部の複数の開口は、第１窓部が設けられていない第１及び第２開口を含み、
第１収容部及び第１培養容器は、第１枠部の第１開口と第１流入口とが隣接するように設けられ、かつ、第１枠部の第２開口と第１流出口とが隣接するように設けられた請求項６又は７に記載の流体チップ。
【請求項９】
第２収容部に収容された第２培養容器をさらに備え、
第２培養容器は、各面に開口を有する多面体形状の第２枠部と、複数の開口のうち少なくとも１つの開口に設けられた第２窓部と、第２枠部及び第２窓部の内部に配置された培養ゲルとを有し、
第２窓部は、透光性のハイドロゲル又は多孔質体からなり、
第２収容部は、培養液が流入する第２流入口と、培養液が流入する第２流出口とを有し、
第２枠部の複数の開口は、第２窓部が設けられていない第３及び第４開口を含み、
第２収容部及び第２培養容器は、第２枠部の第３開口と第２流入口とが隣接するように設けられ、かつ、第２枠部の第４開口と第２流出口とが隣接するように設けられた請求項６〜８のいずれか１つに記載の流体チップ。
【請求項１０】
前記基材及び前記蓋部材は、前記基材と前記蓋部材とを接着することにより前記基材と前記蓋部材との間に第３培養容器を着脱可能に収容するための第３収容部が形成されるように設けられ、
第３培養容器は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなり、
前記基材及び前記蓋部材は、第１流路に流す培養液が第１収容部に収容した第１培養容器の内部に浸透し供給されるように設けられ、かつ、第１培養容器の内部を浸透流として流れた後の培養液が第２収容部に収容した第２培養容器の内部及び第３収容部に収容した第３培養容器の内部に浸透し供給されるように設けられた請求項６〜９のいずれか１つに記載の流体チップ。
【請求項１１】
基材を備え、
前記基材は、第１流路と、第１培養容器を着脱可能に収容するための第１収容部とを有し、
第１培養容器は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなり、
第１収容部は、第１培養容器を嵌め込むことができるように設けられた受け口を有し、
前記基材は、第１流路に流す培養液の少なくとも一部が第１収容部に供給されるように設けられたことを特徴とする細胞培養用流体チップ。
【請求項１２】
各面に開口を有する多面体の枠部と、各開口にそれぞれ設けられた窓部とを有し、
前記枠部及び前記窓部は、前記枠部及び前記窓部の内部に培養ゲルを内包できるように設けられ、
前記窓部は、透光性のハイドロゲル又は多孔質体からなり、
少なくとも１つの前記窓部は、前記枠部の外側に突出した凸部を有し、
前記凸部は、前記凸部を引っ張ることにより前記枠部の開口から前記窓部を除去することができるように設けられたことを特徴とする培養容器。
【請求項１３】
細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを内包し、かつ、少なくとも一部がハイドロゲル又は多孔質体からなる第１培養容器内において前記細胞又は細胞組織を準備培養するステップと、
準備培養した細胞又は細胞組織を内包した第１培養容器を細胞培養用流体チップの第１収容部に収容するステップと、
第１収容部に収容した第１培養容器に内包した細胞又は細胞組織に第１流路を介して培養液を供給するステップとを含み、
第１収容部は、第１培養容器を嵌め込むことができるように設けられた受け口を有する培養方法。
【国際調査報告】
2018147032.tif 000020
2018147032.tif 000021
2018147032.tif 000022
2018147032.tif 000023