(57)【要約】  オレフィン化合物を高い生産性にて製造することを可能とする方法、及び該方法に用いられる酵素を提供することを目的とし、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）の様々な部位に、アミノ酸置換を伴う変異を導入し、ＭＶＤの変異体を多数調製した。そして、それら変異体について、イソプレン等のオレフィン化合物の生成に関する触媒活性を評価した結果、１５３位のセリン及び２０９位のスレオニンが各々他のアミノ酸に置換されることによって、前記触媒活性が向上することを見出した。また、更に１５２位のグリシンを他のアミノ酸に置換することによって、前記変異体の触媒活性は更に向上することを明らかにした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリン及び２０９位又は該部位に対応するスレオニンが、各々他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの存在下、下記式（１）で表される化合物とＡＴＰとを反応させる工程を含む、オレフィン化合物の製造方法
【化１】
2018143163.tif 000011
［式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１５のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基又はハロゲン原子を示す（前記アルキル基及びアルケニル基は、各々独立に、ヒドロキシ基及び／又はカルボキシ基によって任意に置換されていてもよい）］。
【請求項２】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリン及び２０９位又は該部位に対応するスレオニンが、各々他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞を、培養し、該宿主細胞及び／又はその培養物において生成されたオレフィン化合物を採取する工程を含む、オレフィン化合物の製造方法。
【請求項３】
前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリンが変異してなる他のアミノ酸が、アスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アスパラギン酸である、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼが、更に配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５２位又は該部位に対応するグリシンが他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼである、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５２位又は該部位に対応するグリシンが変異してなる他のアミノ酸が、ロイシンである、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記オレフィン化合物がイソプレンである請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
オレフィン化合物を生成する触媒活性が高められたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの製造方法であって、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリン及び２０９位又は該部位に対応するスレオニンを、各々他のアミノ酸に変異させる工程を含む、製造方法。
【請求項９】
前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリンが変異してなる他のアミノ酸が、アスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アスパラギン酸である、請求項８又は９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５２位又は該部位に対応するグリシンを他のアミノ酸に変異させる工程を更に含む、請求項８〜１０のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５２位又は該部位に対応するグリシンが変異してなる他のアミノ酸が、ロイシンである、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記オレフィン化合物がイソプレンである請求項８〜１２のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１４】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリン及び２０９位又は該部位に対応するスレオニンが、各々他のアミノ酸に変異している、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
【請求項１５】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリンが変異してなる他のアミノ酸が、アスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項１４に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
【請求項１６】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アスパラギン酸である、請求項１４又は１５に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
【請求項１７】
更に、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５２位又は該部位に対応するグリシンが他のアミノ酸に変異している、請求項１４〜１６のうちのいずれか一項に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
【請求項１８】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５２位又は該部位に対応するグリシンが変異してなる他のアミノ酸が、ロイシンである、請求項１７に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
【請求項１９】
請求項１４〜１８のうちのいずれか一項に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項２０】
請求項１９に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項２１】
請求項１９に記載のＤＮＡ又は請求項２０に記載のベクターが導入された宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞に発現したタンパク質を採取する工程を含む、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の製造方法。
【請求項２３】
請求項１４〜１８のうちのいずれか一項に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、該ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターを含む、下記式（１）で表される化合物とＡＴＰとを反応させ、オレフィン化合物の生成を促進するための剤
【化２】
2018143163.tif 000012
［式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１５のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基又はハロゲン原子を示す（前記アルキル基及びアルケニル基は、各々独立に、ヒドロキシ基及び／又はカルボキシ基によって任意に置換されていてもよい）］。
【請求項２４】
前記オレフィン化合物がイソプレンである請求項２３に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を用いたオレフィン化合物の製造方法に関する。また本発明は、前記変異体、及びその製造方法に関し、さらに、前記変異体をコードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡが挿入されているベクターにも関する。また本発明は、前記ＤＮＡ又は前記ベクターが導入された宿主細胞を用いたオレフィン化合物の製造方法に関し、さらにまた、前記変異体、前記ＤＮＡ又は前記ベクターを含む、オレフィン化合物の生成を促進するための剤にも関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプレン等のオレフィン化合物は、合成ゴム等の様々な合成ポリマーの原料として極めて有用であり、これら化合物は、石油の分留といった化学的方法によって得ることができる。【０００３】
しかしながら、このような化学的方法においても、その収率は低く、製造コストがかかり、また時間を要する。さらに、昨今の環境問題を考慮するに、化学的方法に代わって、限られた資源を無駄にすることなく環境に優しい持続可能なオレフィン化合物の製造方法の開発が求められている。【０００４】
かかる状況を鑑み、微生物等の代謝経路を利用又は改変して、オレフィン化合物を製造することが試みられている。例えば、メバロン酸経路に関与するジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ等に変異を導入し、当該変異酵素を利用したイソプレン等の製造方法が開示されている（特許文献１〜３）。【０００５】
また、本発明者らによっても、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼに１又は複数のアミノ酸変異を導入し、当該酵素（ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体）の基質特異性を、元来の５−ジホスホメバロン酸から３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテート等に対するものに変更することで、イソプレン等を製造することが試みられている。【０００６】
より具体的には、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの様々な部位に、アミノ酸置換を伴う変異を導入し、約２００のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの変異体を調製した。そして、それら変異体について、イソプレンの生成に関する触媒活性を、本発明者らは評価した。【０００７】
その結果、７４位のアルギニンがヒスチジンに置換され、かつ２０９位のスレオニンがアルギニンに置換されたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒ）は、約２００もの変異体の中で群を抜いてイソプレンの生成に関する極めて高い触媒活性を示すことを、本発明者らは明らかにしている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０９２５６７号
【特許文献２】国際公開第２０１５／００４２１１号
【特許文献３】国際公開第２０１５／０２１０４５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】折下涼子ら、「有用酵素の基質特異性改変とバイオイソプレン生産への応用」、日本農芸化学会大会講演要旨集、ｖｏｌ．２０１６、ｐ．２Ｊ００３（２０１６年３月５日発行）、及びそれに付随するポスター（２０１６年３月２８日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであり、オレフィン化合物を高い生産性にて製造することを可能とする酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、イソプレンの生成において高い触媒活性を示すジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの変異体を、上述のＲ７４ＨＴ２０９Ｒの他更に得るべく、鋭意研究を重ねた。その結果、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの１５３位のセリン及び２０９位のスレオニンが各々他のアミノ酸に置換されたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（Ｓ１５３ＸＴ２０９Ｘ）は、イソプレンを生成する高い触媒活性を有していることを明らかにした。特に、約２００もの変異体においてイソプレンの生成に関する極めて高い触媒活性を有する変異体として、先に唯一得られたＲ７４ＨＴ２０９Ｒと比してなお、Ｓ１５３ＸＴ２０９Ｘは、更に約４倍以上も高い触媒活性を有していることを明らかにした。【００１２】
なお、本願明細書の記載において、上記のような「Ｘ」は、各部位において置換される他のアミノ酸を意味する（例えば、「Ｓ１５３Ｘ」の「Ｘ」はセリン以外のアミノ酸を意味し、Ｔ２０９Ｘの「Ｘ」はスレオニン以外のアミノ酸を意味する）。【００１３】
さらに、本発明者らは、前述のＳ１５３ＸＴ２０９Ｘにおいて、更に１５２位のグリシンも他のアミノ酸に置換した。その結果、前記触媒活性が更に１．３倍も向上することを見出した。さらにまた、この三重変異体（Ｇ１５２ＸＳ１５３ＸＴ２０９Ｘ）において、更に７４位のアルギニンを他のアミノ酸に置換することによって、前記触媒活性が更に最大で３倍を超えて向上することを明らかにした。【００１４】
また、これらジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの変異体は、イソプレンのみならず、イソブテンの生成においても高い触媒活性を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下を提供するものである。【００１５】
＜１＞  配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリン及び２０９位又は該部位に対応するスレオニンが、各々他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの存在下、下記式（１）で表される化合物とＡＴＰとを反応させる工程を含む、オレフィン化合物の製造方法【００１６】
【化１】
2018143163.tif 000002
【００１７】
［式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１５のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基又はハロゲン原子を示す（前記アルキル基及びアルケニル基は、各々独立に、ヒドロキシ基及び／又はカルボキシ基によって任意に置換されていてもよい）］。
＜２＞  配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリン及び２０９位又は該部位に対応するスレオニンが、各々他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞を、培養し、該宿主細胞及び／又はその培養物において生成されたオレフィン化合物を採取する工程を含む、オレフィン化合物の製造方法。
＜３＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリンが変異してなる他のアミノ酸が、アスパラギン酸又はグルタミン酸である、＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アスパラギン酸である、＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一に記載の製造方法。
＜５＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼが、更に配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５２位又は該部位に対応するグリシンが他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼである、＜１＞〜＜４＞のうちのいずれか一に記載の製造方法。
＜６＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５２位又は該部位に対応するグリシンが変異してなる他のアミノ酸が、ロイシンである、＜５＞に記載の製造方法。
＜７＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼが、更に配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンが他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼである、＜５＞又は＜６＞に記載の製造方法。
＜８＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンが変異してなる他のアミノ酸が、チロシン、ヒスチジン、グルタミン又はアスパラギンである、＜７＞に記載の製造方法。＜９＞  前記オレフィン化合物がイソプレンである請求項＜１＞〜＜８＞のうちのいずれか一に記載の製造方法。
＜１０＞  前記オレフィン化合物がイソブテンである請求項＜１＞〜＜８＞のうちのいずれか一に記載の製造方法。
＜１１＞  オレフィン化合物を生成する触媒活性が高められたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの製造方法であって、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリン及び２０９位又は該部位に対応するスレオニンを、各々他のアミノ酸に変異させる工程を含む、製造方法。
＜１２＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリンが変異してなる他のアミノ酸が、アスパラギン酸又はグルタミン酸である、＜１１＞に記載の製造方法。
＜１３＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アスパラギン酸である、＜１１＞又は＜１２＞に記載の製造方法。
＜１４＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５２位又は該部位に対応するグリシンを他のアミノ酸に変異させる工程を更に含む、＜１１＞〜＜１３＞のうちのいずれか一に記載の製造方法。
＜１５＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５２位又は該部位に対応するグリシンが変異してなる他のアミノ酸が、ロイシンである、＜１４＞に記載の製造方法。
＜１６＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンを他のアミノ酸に変異させる工程を更に含む、＜１４＞又は＜１５＞に記載の製造方法。
＜１７＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンが変異してなる他のアミノ酸が、チロシン、ヒスチジン、グルタミン又はアスパラギンである、＜１６＞に記載の製造方法。＜１８＞  前記オレフィン化合物がイソプレンである＜１１＞〜＜１７＞のうちのいずれか一に記載の製造方法。
＜１９＞  前記オレフィン化合物がイソブテンである＜１１＞〜＜１７＞のうちのいずれか一に記載の製造方法。
＜２０＞  配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリン及び２０９位又は該部位に対応するスレオニンが、各々他のアミノ酸に変異している、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
＜２１＞  配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリンが変異してなる他のアミノ酸が、アスパラギン酸又はグルタミン酸である、＜２０＞に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
＜２２＞  配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アスパラギン酸である、＜２０＞又は＜２１＞に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
＜２３＞  更に、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５２位又は該部位に対応するグリシンが他のアミノ酸に変異している、＜２０＞〜＜２２＞のうちのいずれか一に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
＜２４＞  配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５２位又は該部位に対応するグリシンが変異してなる他のアミノ酸が、ロイシンである、＜２３＞に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
＜２５＞  更に、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンが他のアミノ酸に変異している、＜２３＞又は＜２４＞に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
＜２６＞  配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンが変異してなる他のアミノ酸が、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、セリン及びアラニン（好ましくはチロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、及びセリン；さらに好ましくはチロシン、ヒスチジン、グルタミン及びアスパラギン）からなる群から選ばれる、又は
チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、グルタミン酸、ロイシン、セリン及びバリン（好ましくはチロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、グルタミン酸及びロイシン；さらに好ましくは、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン及びリシン）からなる群から選ばれる、＜２５＞に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
＜２７＞  ＜２０＞〜＜２６＞のうちのいずれか一に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ。
＜２８＞  ＜２７＞に記載のＤＮＡを含むベクター。
＜２９＞  ＜２７＞に記載のＤＮＡ又は＜２８＞に記載のベクターが導入された宿主細胞。
＜３０＞  ＜２９＞に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞に発現したタンパク質を採取する工程を含む、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の製造方法。
＜３１＞  ＜２０＞〜＜２６＞のうちのいずれか一に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、該ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターを含む、下記式（１）で表される化合物とＡＴＰとを反応させ、オレフィン化合物の生成を促進するための剤【００１８】
【化２】
2018143163.tif 000003
【００１９】
［式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１５のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基又はハロゲン原子を示す（前記アルキル基及びアルケニル基は、各々独立に、ヒドロキシ基及び／又はカルボキシ基によって任意に置換されていてもよい）］。
＜３２＞  前記オレフィン化合物がイソプレンである＜３１＞に記載の剤。
＜３３＞  前記オレフィン化合物がイソブテンである＜３１＞に記載の剤。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、オレフィン化合物を高い生産性にて製造することを可能とする酵素、並びに当該酵素を用いたオレフィン化合物の製造方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの１５３位のセリン及び２０９位のスレオニンを各々他のアミノ酸に置換した変異体（Ｓ１５３ＸＴ２０９Ｘ）等について、３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートを基質とするイソプレンの生成に関する酵素活性を解析した結果を示すグラフである。なお、縦軸は、各アミノ酸変異体によって生成されたイソプレン量を、７４位のアルギニン及び２０９位のスレオニンを各々ヒスチジン及びアルギニンに置換したジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの変異体（Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒ）におけるそれを基準（１）として算出した相対値を示す。また、図中「Ｓ１５３Ｅ」等は、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの各変異体を示し、数字は当該酵素においてアミノ酸置換を伴う変異が導入された部位（１５３位等）を表し、数字の左側のアルファベットは置換される前のアミノ酸（Ｓ／セリン等）を表し、数字の右側のアルファベットは置換された後のアミノ酸（Ｅ／グルタミン酸等）を表す。
【図２】ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの１５２位のグリシン、１５３位のセリン及び２０９位のスレオニンを各々ロイシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸に置換した３重アミノ酸変異体（図中「ＬＥＤ」と表記する）と、更に７４位のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した４重アミノ酸変異体（図中「Ｒ７４Ｘ＿ＬＥＤ」と表記する）とについて、３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートを基質とするイソプレンの生成に関する酵素活性を解析した結果を示すグラフである。なお、縦軸は、各アミノ酸変異体によって生成されたイソプレン量を、前記３重アミノ酸変異体におけるそれを基準（１）として算出した相対値を示す。また、対照としてＲ７４ＨＴ２０９Ｒによって生成されたイソプレン量の相対値も示す。
【図３】前記３重アミノ酸変異体（図中「ＬＥＤ」と表記する）と、前記４重アミノ酸変異体（図中「Ｒ７４Ｘ＿ＬＥＤ」と表記する）とについて、β−ヒドロキシイソ吉草酸を基質とするイソブテンの生成に関する酵素活性を解析した結果を示すグラフである。なお、縦軸は、各アミノ酸変異体によって生成されたイソブテン量を、前記３重アミノ酸変異体におけるそれを基準（１）として算出した相対値を示す。また、対照としてＲ７４ＨＴ２０９Ｒによって生成されたイソブテン量の相対値も示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
＜オレフィン化合物の製造方法  １＞
後述の実施例において示すように、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの１５３位のセリン及び２０９位のスレオニンを各々他のアミノ酸に置換することによって、オレフィン化合物を生成する下記反応を促進する触媒活性（「オレフィン化合物を生成する触媒活性」とも称する）が向上することを見出した。
【００２３】
【化３】
2018143163.tif 000004
【００２４】
したがって、本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリン（以下、単に「１５３位のセリン」とも称する）及び２０９位又は該部位に対応するスレオニン（以下、単に「２０９位のスレオニン」とも称する）が、各々他のアミノ酸に変異している、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（以下、「ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体」とも称する）の存在下、前記式（１）で表される化合物とＡＴＰ（アデノシン三リン酸）とを反応させる工程を含む、オレフィン化合物の製造方法を提供する。
【００２５】
本発明において「オレフィン化合物」は、炭素間二重結合を少なくとも１つ有する炭化水素化合物を意味し、またヒドロキシ基及び／又はカルボキシ基等の置換基、ハロゲン原子等の原子が導入されているものであってもよい。このような化合物としては、例えば、イソブテン、エテン、プロペン、２−メチル−１−ブテン、イソプレノール、３−ヒドロキシ−３−メチル−４−ペンテン酸等のモノオレフィン化合物、イソプレン、ブタジエン（１，３−ブタジエン）、ピペリレン、２，３−ジメチルブタジエン、１，３−ヘキサジエン、２−メチル−１，３−ペンタジエン、クロロプレン、３−メチル−２，４−ペンタジエン酸といった共役ジエン化合物等のジオレフィン化合物が挙げられる。
【００２６】
本発明においてオレフィン化合物を製造するための原料となる下記式（１）で表される化合物において、Ｒ１及びＲ２については特に制限はなく、各々独立に、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１５のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基又はハロゲン原子を示す（前記アルキル基及びアルケニル基は、各々独立に、ヒドロキシ基及び／又はカルボキシ基によって任意に置換されていてもよい）。
【００２７】
【化４】
2018143163.tif 000005
【００２８】
また、本発明において、共役ジエン化合物を製造する場合には、以下の反応式に示すように、上記式（１）で表される化合物のより具体的な態様として、下記式（４）で表される化合物が好適に用いられる。
【００２９】
【化５】
2018143163.tif 000006
【００３０】
前記式（４）で表される化合物において、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５については特に制限はなく、各々独立に、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、ハロゲン原子、炭素数２〜１５のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択される置換基を示す。
【００３１】
また本発明において、炭素数１〜１０のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、（シクロヘキシル）メチル基、（１−メチルシクロヘキシル）メチル基、（１−メチルシクロペンチル）メチル基、（１−エチルシクロヘキシル）メチル基が挙げられる。また、炭素数２〜１５のアルケニル基としては、例えば、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、３−ブテニル基、５−ヘキセニル基、７−オクテニル基が挙げられ、炭素数６〜２０のアリール基としては、例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、アセナフチル基、フェナントリル基、アントリル基が挙げられる。また、ハロゲン原子は、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子を示す。
【００３２】
このような前記式（１）で表される化合物は、後述の実施例において示すように、市販の製品として購入することができる。また、当業者であれば、公知の合成方法（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８８年、２０巻、１５号、１７６３〜１７６６ページに記載の方法）を適宜参酌しながら、合成することもできる。
【００３３】
後述のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の存在下、前記式（１）で表される化合物とＡＴＰとの反応の条件については、当該反応が促進され、オレフィン化合物が生成される条件であればよく、当業者であれば、反応液の組成、反応液のｐＨ、反応温度、反応時間等を適宜調整し、設定することができる。
【００３４】
例えば、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体と、その基質である前記式（１）で表される化合物及びＡＴＰとが添加される反応液においては、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの補因子であるマグネシウムイオンが、通常１〜５０ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭ含まれていればよく、その他の組成、ｐＨについては前述のとおり、前記反応を妨げない限り、特に制限はないが、好ましくはｐＨ７〜８の緩衝液であり、より好ましくはｐＨ７〜８のトリス塩酸緩衝液である。
【００３５】
また、反応温度としても、前記反応を妨げない限り、特に制限はないが、通常２０〜４０℃であり、好ましくは２５〜３７℃である。さらに、反応時間としては、オレフィン化合物が生成し得る時間であればよく、特に制限はないが、通常３０分〜７日であり、好ましくは１２時間〜２日である。
【００３６】
また、このような条件にて生成されるオレフィン化合物は、大概気化し易いため、揮発性ガスの公知の回収、精製方法により採取することができる。かかる採取方法としては、ガスストリッピング、分留、吸着、脱着、パーベーパレーション、固相に吸着させたイソプレンの熱若しくは真空による固相からの脱着、溶媒による抽出、又はクロマトグラフィー（例えば、ガスクロマトグラフィー）等が挙げられる。また、生成されるオレフィン化合物が液体である場合にも、公知の回収、精製方法（蒸留、クロマトグラフィー等）を適宜利用し、採取することができる。さらに、これらの方法は単独にて行ってもよく、また適宜組み合わせて多段階的に実施し得る。
【００３７】
＜オレフィン化合物の製造方法  ２＞
また、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリン及び２０９位又は該部位に対応するスレオニンが各々他のアミノ酸に変異している、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを発現するように形質転換された宿主細胞を、培養することにより、オレフィン化合物を生産性高く製造することができる。したがって、本発明においては、後述のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体をコードするＤＮＡ又はベクターが導入された宿主細胞を培養し、該宿主細胞及び／又はその培養物において生成されたオレフィン化合物を採取する工程を含む、オレフィン化合物の製造方法も提供される。
【００３８】
宿主細胞の培養条件については、後述のとおりであるが、培地には、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの基質である前記（１）式にて表される化合物、補因子であるマグネシウムイオンが添加されていることが好ましく、これら化合物全てが添加されていることがより好ましい。また、培養温度は、用いる宿主細胞の種類に合わせて適宜設計変更し得るが、通常２０〜４０℃であり、好ましくは２５〜３７℃である。
【００３９】
また、本発明において、「培養物」とは、宿主細胞を培地で培養することによって得られる、増殖した宿主細胞、該宿主細胞の分泌産物及び該宿主細胞の代謝産物等を含有する培地のことであり、それらの希釈物、濃縮物を含む。
【００４０】
このような宿主細胞及び／又は培養物からのオレフィン化合物の採取についても、特に制限はなく、上述の公知の回収、精製方法を用いて行うことができる。また、採取の時期としては、用いる宿主細胞の種類に合わせて適宜調整され、オレフィン化合物が生成し得る時間であればよいが、通常３０分〜７日であり、好ましくは１２時間〜２日である。
【００４１】
＜ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体＞
次に、上述の本発明のオレフィン化合物の製造方法において用いられる、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体について説明する。本発明において「ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ」とは、ＭＶＤ（Ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）とも称され、またＥＣ番号：４．１．１．３３として登録されている酵素であり、５−ジホスホメバロン酸及びＡＴＰからイソペンテニル二リン酸、ＡＤＰ、リン酸及び二酸化炭素を生成する、下記反応を触媒とするカルボキシリアーゼの一種である。
【００４２】
【化６】
2018143163.tif 000007
【００４３】
本発明において、後述の変異が導入されるジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとしては、特に制限はなく、様々な生物由来のものを用いることができる。このような酵素としては、例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＭＶＤ（配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、出芽酵母（ＹＪＭ７株）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ａ６ＺＳＢ７にて特定されるタンパク質）、出芽酵母（ＲＭ１１−１ａ株）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｂ３ＬＰＫ０にて特定されるタンパク質）、カンジダ酵母（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｂ９Ｗ６Ｇ７にて特定されるタンパク質）、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｃ４ＱＸ６３にて特定されるタンパク質）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｏ１３９３６３にて特定されるタンパク質）、アシュビア（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ７５１Ｄ８にて特定されるタンパク質）、デバリオマイセス  ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６ＢＹ０７にて特定されるタンパク質）、キイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ５４ＹＱ９にて特定されるタンパク質）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ２ＵＧＦ４にて特定されるタンパク質）、エンセファリトゾーン・クニクリ（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ  ｃｕｎｉｃｕｌｉ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ８ＳＲＲ７にて特定されるタンパク質）、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｂ７Ｓ４２２にて特定されるタンパク質）、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ａ９ＺＮ０３にて特定されるタンパク質）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ  ｘ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓａｎｄｅｒａｅ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｂ３Ｆ８Ｈ５にて特定されるタンパク質）、ムラサキ（Ａｒｎｅｂｉａ  ｅｕｃｈｒｏｍａ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ０９ＲＬ４にて特定されるタンパク質）、ジャポニカ米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６ＥＴＳ８にて特定されるタンパク質）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ８ＬＢ３７にて特定されるタンパク質）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ａ８ＷＢＸ７にて特定されるタンパク質）、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ａ５Ａ７Ａ２にて特定されるタンパク質）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ５Ｕ４０３にて特定されるタンパク質）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ９９ＪＦ５又はＱ３ＵＹＣ１にて特定されるタンパク質）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６２９６７にて特定されるタンパク質）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ０Ｐ５７０にて特定されるタンパク質）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ５３６０２にて特定されるタンパク質）が挙げられる。これらの中では、出芽酵母由来のＭＶＤが好ましく、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質がより好ましい。また、自然界においてヌクレオチド配列が変異することにより、タンパク質のアミノ酸配列の変化が生じ得ることは理解されたい。
【００４４】
さらに、本発明の「ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ」は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位のセリン及び２０９位のスレオニン以外に、人工的に変異が導入されているものであってもよい。すなわち、本発明の「ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ」には、「ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列（配列番号：２に記載のアミノ酸配列等）の１５３位及び２０９位以外において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質」も含まれる。ここで「複数」とは、特に制限はないが、通常２〜８０個、好ましくは２〜４０個、より好ましくは２〜２０個、さらに好ましくは２〜１０個（例えば、２〜８個、２〜４個、２個）である。
【００４５】
また、本発明の「ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ」において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリン及び２０９位又は該部位に対応するスレオニン以外の、他の部位におけるアミノ酸変異としては、オレフィン化合物を生成する触媒活性を有する限り特に制限はないが、後述の実施例に示すとおり、当該活性がより高くなる傾向にあるという観点から、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５２位又は該部位に対応するグリシン（以下、単に「１５２位のグリシン」とも称する）が他のアミノ酸に変異していることが好ましく、更に配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニン（以下、単に「７４位のアルギニン」とも称する）も他のアミノ酸に変異していることがより好ましい。
【００４６】
本発明において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリンが変異してなる「他のアミノ酸」とは、セリン以外のアミノ酸であれば良く、特に制限はないが、後述の実施例に示すとおり、オレフィン化合物の生成において高い触媒活性を発揮し易いという観点から、好ましくはアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、より好ましくはグルタミン酸である。
【００４７】
また、本発明において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる「他のアミノ酸」とは、スレオニン以外のアミノ酸であれば良く、特に制限はないが、後述の実施例に示すとおり、オレフィン化合物の生成において高い触媒活性を発揮し易いという観点から、好ましくはアスパラギン酸である。
【００４８】
さらに、本発明において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５２位又は該部位に対応するグリシンが変異してなる「他のアミノ酸」とは、グリシン以外のアミノ酸であれば良く、特に制限はないが、後述の実施例に示すとおり、オレフィン化合物の生成において高い触媒活性を発揮し易いという観点から、好ましくはロイシンである。
【００４９】
さらに、本発明において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンが変異してなる「他のアミノ酸」とは、アルギニン以外のアミノ酸であれば良く、特に制限はないが、後述の実施例に示すとおり、オレフィン化合物の生成において高い触媒活性を発揮し易いという観点から、好ましくは、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、セリン、アラニン、リシン、グルタミン酸、バリン及びロイシンからなる群から選択され、より好ましくは、チロシン、ヒスチジン、グルタミン及びアスパラギンからなる群から選択される。また、例えば、イソプレンの生成において高い触媒活性を発揮し易いという観点から、好ましくは、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、セリン及びアラニン（より好ましくは、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン及びセリン；さらに好ましくは、チロシン、ヒスチジン、グルタミン及びアスパラギン）からなる群から選択される。また、例えば、イソブテンの生成において高い触媒活性を発揮し易いという観点から、好ましくは、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、グルタミン酸、ロイシン、セリン及びバリン（より好ましくは、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、グルタミン酸及びロイシン；さらに好ましくは、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン及びリシン）からなる群から選択される。
【００５０】
なお、本発明において、「対応する部位」とは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ等）やＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を利用し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列と、他品種に由来するＭＶＤ等のアミノ酸配列とを整列させた際に、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における１５３位、２０９位、１５２位又は７４位と同列になる部位のことである。
【００５１】
また「野生型のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ」は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位のセリン及び２０９位のスレオニンにおける変異、更には前述の人工的な変異が導入される前のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼであり、例えば、前記出芽酵母等の様々な生物由来のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ及びその天然の変異体が挙げられる。
【００５２】
また、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体が、オレフィン化合物を生成する触媒活性を有するか否かは、例えば、後述の実施例に示すとおり、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）にて、直接オレフィン化合物の量を測定することにより判定することができ、さらに野生型のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおける量と比較することで、野生型のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼよりもオレフィン化合物を生成する触媒活性が高いか否かも判定することができる。
【００５３】
本発明において、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体は、オレフィン化合物を生成する触媒活性において、野生型のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼに対し、１０倍以上（例えば、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上）であることが好ましく、５０倍以上（例えば、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上）であることがより好ましく、１００倍以上（例えば、２００倍以上、３００倍以上、４００倍以上）であることがさらに好ましく、５００倍以上（例えば、６００倍以上、７００倍以上、８００倍以上、９００倍以上）であることがより好ましく、１０００倍以上（例えば、１１００倍以上、１２００倍以上、１３００倍以上、１４００倍以上）であることがより好ましく、１５００倍以上（例えば、１６００倍以上、１７００倍以上、１８００倍以上、１９００倍以上）であることが特に好ましい。
【００５４】
また、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体は、他の化合物が直接又は間接的に付加されていてもよい。かかる付加としては特に制限はなく、遺伝子レベルでの付加であってもよく、化学的な付加であってもよい。また付加される部位についても特に制限はなく、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体のアミノ末端（以下「Ｎ末端」とも称する）及びカルボキシル末端（以下「Ｃ末端」とも称する）のいずれかであってもよく、その両方であってもよい。遺伝子レベルでの付加は、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体をコードするＤＮＡに、他のタンパク質をコードするＤＮＡを読み枠を合わせて付加させたものを用いることにより達成される。このようにして付加される「他のタンパク質」としては特に制限はなく、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の精製を容易にする目的の場合には、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−）タグ（ｔａｇ）タンパク質、ＦＬＡＧ−タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等の精製用タグタンパク質が好適に用いられ、またジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の検出を容易にする目的の場合には、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化学発光タンパク質等の検出用タグタンパク質が好適に用いられる。化学的な付加は、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよい。「共有結合」としては特に制限はなく、例えば、アミノ基とカルボキシル基とのアミド結合、アミノ基とアルキルハライド基とのアルキルアミン結合、チオールどうし間のジスルフィド結合、チオール基とマレイミド基又はアルキルハライド基とのチオエーテル結合が挙げられる。「非共有結合」としては、例えば、ビオチン−アビジン間結合が挙げられる。また、このようにして化学的に付加される「他の化合物」としては、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の検出を容易にする目的の場合には、例えば、Ｃｙ３、ローダミン等の蛍光色素が好適に用いられる。
【００５５】
また、本発明のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体は、他の成分と混合して用いてもよい。他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、プロテアーゼ阻害剤、保存剤が挙げられる。
【００５６】
＜ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの変異体をコードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡを有するベクター＞
次に、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体をコードするＤＮＡ等について説明する。かかるＤＮＡを導入することによって、宿主細胞の形質を転換し、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を当該細胞において製造させること、ひいてはオレフィン化合物を製造させることが可能となる。
【００５７】
本発明のＤＮＡは、天然のＤＮＡに人為的に変異が導入されたＤＮＡであってもよく、人工的に設計されたヌクレオチド配列からなるＤＮＡであってもよい。さらに、その形態について特に制限はなく、ｃＤＮＡの他、ゲノムＤＮＡ、及び化学合成ＤＮＡが含まれる。これらＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、出芽酵母等からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作製し、これを展開して、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（例えば、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、出芽酵母から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。
【００５８】
そして、このように調製したＤＮＡに、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位のセリン及び２０９位のスレオニン等を各々他のアミノ酸に置換することは、当業者であれば、公知の部異特異的変異導入法を利用することで行うことができる。部異特異的変異導入法としては、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９８５年、８２巻、２号、４８８〜４９２ページ）、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｂｙ−ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．、Ｇｅｎｅ、１９８９年、７７巻、５１〜５９ページ）が挙げられる。
【００５９】
また、当業者であれば、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの１５３位のセリン及び２０９位のスレオニンを各々他のアミノ酸に置換してあるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を人工的に設計し、該配列情報に基づき、自動核酸合成機を用いて、本発明のＤＮＡを化学的に合成することもできる。
【００６０】
無論、これらの方法によれば、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、１５３位のセリン及び２０９位のスレオニン以外の他の部位の（例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５２位の、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位の）アミノ酸も、人工的に他のアミノ酸に置換することができる。
【００６１】
さらに、本発明のＤＮＡは、コードするジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の発現効率を後述の宿主細胞においてより向上させるという観点から、当該宿主細胞の種類に合わせて、コドンを最適化したジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体をコードするＤＮＡの態様もとり得る。
【００６２】
また、本発明においては、前述のＤＮＡを宿主細胞内において複製することができるよう、当該ＤＮＡが挿入されているベクターも提供される。
【００６３】
本発明において「ベクター」は、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
【００６４】
このようなベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージＤＮＡが挙げられる。また、プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）が挙げられる。ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、宿主細胞が昆虫由来であれば、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを、植物由来であればＴ−ＤＮＡ等、動物由来であればレトロウイルス、アデノウイルスベクター等の動物ウイルスベクターも、本発明のベクターとして用いることもできる。また、本発明のベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。例えば、本発明のＤＮＡをベクターに挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。
【００６５】
また、本発明のベクターは、前記ＤＮＡがコードするジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を宿主細胞内にて発現可能な状態で含んでなる発現ベクターの形態であってもよい。本発明にかかる「発現ベクター」は、これを宿主細胞に導入してジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を発現させるために、前記ＤＮＡの他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や形質転換された宿主細胞を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが望ましい。発現を制御するＤＮＡ配列としては、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）及びターミネーター等がこれに含まれる。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主細胞と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。また、前記発現を制御するＤＮＡ配列以外に発現を誘導するＤＮＡ配列を含んでいても良い。かかる発現を誘導するＤＮＡ配列としては、宿主細胞が細菌である場合には、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、下流に配置された遺伝子の発現を誘導することのできるラクトースオペロンが挙げられる。本発明における遺伝子マーカーは、形質転換された宿主細胞の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
【００６６】
また、本発明のＤＮＡ又はベクターは、他の成分と混合して用いてもよい。他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、ＤＮａｓｅ阻害剤、保存剤が挙げられる。
【００６７】
＜オレフィン化合物の生成を促進するための剤＞
上述のとおり、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体、該変異体をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターを用いることにより、下記式（１）で表される化合物とＡＴＰとを反応させ、オレフィン化合物の生成を促進することが可能となる。したがって、本発明は、少なくとも配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリン及び２０９位又は該部位に対応するスレオニンが各々他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、該ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターを含む、下記式（１）で表される化合物とＡＴＰとを反応させ、オレフィン化合物の生成を促進するための剤も提供する。
【００６８】
【化７】
2018143163.tif 000008
【００６９】
［式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１５のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基又はハロゲン原子を示す（前記アルキル基及びアルケニル基は、各々独立に、ヒドロキシ基及び／又はカルボキシ基によって任意に置換されていてもよい）］。
【００７０】
このような剤としては、上述のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体等を含むものであれば良いが、他の成分と混合していても用いてもよい。かかる他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、プロテアーゼ阻害剤、ＤＮａｓｅ阻害剤、保存剤が挙げられる。
【００７１】
また、本発明は、このような剤を含むキットをも提供することができる。本発明のキットにおいて、上記剤は、本発明のＤＮＡ等が導入され、形質転換された、後述の宿主細胞の態様にて含まれていてもよい。さらに、このような剤の他、前記式（１）で表される化合物、本発明のＤＮＡ等を導入するための宿主細胞、該宿主細胞を培養するための培地、及びそれらの使用説明書等が、本発明のキットに含まれていてもよい。また、このような使用説明書は、本発明の剤等を上述のオレフィン化合物の製造方法に利用するための説明書である。説明書は、例えば、本発明の製造方法の実験手法や実験条件、及び本発明の剤等に関する情報（例えば、ベクターのヌクレオチド配列等が示されているベクターマップ等の情報、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の配列情報、宿主細胞の由来、性質、当該宿主細胞の培養条件等の情報）を含むことができる。
【００７２】
＜ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体をコードするＤＮＡ等が導入された宿主細胞＞
次に、本発明のＤＮＡ又はベクターが導入された宿主細胞について説明する。前述のＤＮＡ又はベクターの導入によって形質転換された宿主細胞を用いれば、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を製造することが可能となり、ひいてはオレフィン化合物を製造させることも可能となる。
【００７３】
本発明のＤＮＡ又はベクターが導入される宿主細胞は特に限定されず、例えば、微生物（大腸菌、出芽酵母、分裂酵母、枯草菌、放線菌、糸状菌等）、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞が挙げられるが、比較的安価な培地にて、短時間にて高い増殖性を示し、ひいては生産性高いオレフィン化合物の製造に寄与し得るという観点から、微生物を宿主細胞として利用することが好ましく、大腸菌を利用することがより好ましい。
【００７４】
また、本発明のＤＮＡ又はベクターの導入も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。例えば、大腸菌等の微生物への導入方法としては、ヒートショック法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法が挙げられ、植物細胞への導入方法としては、アグロバクテリウムを用いる方法やパーティクルガン法が挙げられ、昆虫細胞への導入方法としては、バキュロウィルスを用いる方法やエレクトロポレーション法が挙げられ、動物細胞への導入方法としては、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法が挙げられる。
【００７５】
このようにして宿主細胞内に導入されたＤＮＡ等は、宿主細胞内において、そのゲノムＤＮＡにランダムに挿入されることによって保持されてもよく、相同組み換えによって保持されてもよく、またベクターであれば、そのゲノムＤＮＡ外の独立体として複製され保持し得る。
【００７６】
＜ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の製造方法＞
後述の実施例に示すとおり、本発明のＤＮＡ等が導入された宿主細胞を培養することにより、該宿主細胞内にてジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を製造することができる。したがって、本発明は、前述の宿主細胞を培養し、該宿主細胞に発現したタンパク質を採取する工程を含む、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の製造方法をも提供することができる。
【００７７】
本発明において、「宿主細胞を培養する」条件は、前記宿主細胞がジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を製造できる条件であればよく、当業者であれば、宿主細胞の種類、用いる培地等に合わせて、温度、空気の添加の有無、酸素の濃度、二酸化炭素の濃度、培地のｐＨ、培養温度、培養時間、湿度等を適宜調整し、設定することができる。
【００７８】
かかる培地としては、宿主細胞が資化し得るものが含有されていればよく、炭素源、窒素源、硫黄源、無機塩類、金属、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、カゼイン加水分解物、血清等が含有物として挙げられる。また、かかる培地には、例えば、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体をコードするＤＮＡの発現を誘導するためのＩＰＴＧや、本発明にかかるベクターがコードし得る薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質（例えば、アンピシリン）や、本発明にかかるベクターがコードし得る栄養要求性を相補する遺伝子に対応する栄養物（例えば、アルギニン、ヒスチジン）を添加してもよい。
【００７９】
そして、このようにして培養した宿主細胞から、「該細胞に発現したタンパク質を採取する」方法としては、例えば、宿主細胞を濾過、遠心分離等により培地から回収し、回収した宿主細胞を、細胞溶解、磨砕処理又は加圧破砕等によって処理し、さらに、限外濾過処理、塩析、硫安沈殿等の溶媒沈殿、クロマトグラフィー（例えば、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー）等によって、宿主細胞において発現したタンパク質を精製、濃縮する方法が挙げられる。また、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体に、前述の精製タグタンパク質が付加されている場合には、該タグタンパク質が吸着する基質を用いて精製し、採取することもできる。さらに、これらの精製、濃縮方法は単独にて行ってもよく、また適宜組み合わせて多段階的に実施し得る。
【００８０】
また、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体は、上記生物学的合成に限定されることなく、本発明のＤＮＡ等及び無細胞タンパク質合成系を用いても製造することができる。かかる無細胞タンパク質合成系としては特に制限はないが、例えば、コムギ胚芽由来、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来の合成系が挙げられる。さらに、当業者であれば、市販のペプチド合成機等を用い、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を化学的に合成することもできる。
【００８１】
また、本発明は、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、少なくとも配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１５３位又は該部位に対応するセリン及び２０９位又は該部位に対応するスレオニンを各々他のアミノ酸に変異させる工程を含む、オレフィン化合物を生成する触媒活性が高められたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの製造方法をも提供することができる。
【００８２】
「オレフィン化合物を生成する触媒活性が高められたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ」とは、１５３位のセリン及び２０９位のスレオニン等に変異が導入されることにより、その導入前と比較してオレフィン化合物を生成する触媒活性が高いジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを意味し、その比較対象は通常、上記出芽酵母等の様々な生物由来のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ及びその天然の変異体である。
【００８３】
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおける「他のアミノ酸の変異」導入は、コードするＤＮＡの改変によって行うことができる。「ＤＮＡの改変」は、上記のとおり、当業者においては公知の方法、例えば、部位特異的変異誘発法、改変された配列情報に基づくＤＮＡの化学的合成法を用いて、適宜実施することが可能である。また、「他のアミノ酸の変異」導入は、上記のとおり、ペプチドの化学的合成法を用いても行うことができる。
【００８４】
また、このような変異導入によって、オレフィン化合物を生成する触媒活性が高められたかどうかは、上記のとおり、ＧＣ−ＭＳ分析等により評価することができる。
【実施例】
【００８５】
＜ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の作製及び評価＞
本発明者らは、オレフィン化合物を高い生産性にて製造することを可能とすべく、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（以下「ＭＶＤ」とも称する）のアミノ酸に変異を導入し、当該酵素（ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体）の基質特異性を、元来の５−ジホスホメバロン酸から３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテート等に対するものに変更することで、下記式に示すような反応を経て、イソプレン等を製造することを着想した。【００８６】
【化８】
2018143163.tif 000009
【００８７】
そこで、本発明者らは、以下に示す方法等にて、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの様々な部位に、アミノ酸置換を伴う変異を導入し、多数のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの変異体を調製した。そして、それら変異体について、３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートを基質とするイソプレンの生成に関する触媒活性とを評価した。【００８８】
なお、本発明者らは従前にも、約２００のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸変異体を調製し、３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートを基質とするイソプレンの生成に関する触媒活性の評価を行っている。そして、その結果、７４位のアルギニンがヒスチジンに置換され、かつ２０９位のスレオニンがアルギニンに置換されたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒ）は、約２００もの変異体の中で群を抜いてイソプレンの生成に関する極めて高い触媒活性を示すこと（野生型のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼに比べ７０倍近い触媒活性を示すこと等）を見出している（非特許文献１  参照）。【００８９】
＜プラスミドベクターの調製＞
先ず、出芽酵母由来のＭＶＤ（ｓｃＭＶＤ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）を大腸菌にて効率良く発現させるために、それをコードする野生型ヌクレオチド配列（配列番号：１に記載のヌクレオチド配列）を、大腸菌におけるコドンの使用頻度を考慮して改変した。次いで、かかる改変ヌクレオチド配列（配列番号：３に記載のヌクレオチド配列）からなるＤＮＡを常法に沿って化学合成した。そして、このようにして調製したＤＮＡを、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のマルチクローニングサイト（ＮｄｅＩ認識サイトとＢａｍＨＩ認識サイトとの間）に挿入することにより、当該野生型のｓｃＭＶＤを、ポリヒスチジンタグをそのＮ末端に融合させた形態にて、大腸菌において発現可能なプラスミドベクター（ｓｃＭＶＤベクター）を調製した。【００９０】
次に、各部位におけるアミノ酸置換を伴う変異をｓｃＭＶＤに導入すべく、各変異が導入されたアミノ酸配列をコードするプライマーを設計し、合成した。そして、前記ｓｃＭＶＤベクターを鋳型として、このようなプライマーと部位特異的突然変異誘発キット（製品名：ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）とを用い、そのキット添付のプロトコルに従って、各変異が導入されたｓｃＭＶＤを、ポリヒスチジンタグをそのＮ末端に融合させた形態にて、大腸菌において発現可能なプラスミドベクターを調製した。【００９１】
＜酵素溶液の調製＞
前記のとおり調製したプラスミドベクターを各々、大腸菌（ＢＬ２１）に、ヒートショック法により導入し、野生型のｓｃＭＶＤ又は各ｓｃＭＶＤ変異体を発現する形質転換体を調製した。次いで、これら形質転換体を各々、０．４ｍＭのＩＰＴＧとアンピシリンとを添加したＬＢ培地にて一晩培養した。当該培養後の形質転換体を遠心分離により集菌し、ＤＮａｓｅＩを添加したタンパク質抽出試薬（製品名：Ｂ−ＰＥＲ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を加え、溶菌した。このようにして得られた各溶菌液に遠心分離を施し、得られた各上清をポリヒスチジン精製用カラム（製品名：ＴＡＬＯＮ（登録商標）カラム、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に添加した。次いで、各カラムに溶出液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭ  イミダゾール）を添加し、各ポリヒスチジンタグが融合しているｓｃＭＶＤを溶出させた。そして、各溶出液を緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）にて透析した後、限外ろ過スピンカラム（製品名：アミコンウルトラ、ミリポア社製）によって濃縮し、酵素溶液を調製した。また、このようにして調製した溶液中の酵素（ポリヒスチジンタグが融合している、ｓｃＭＶＤ又はその変異体）の濃度を、タンパク質定量キット（製品名：ＢＣＡアッセイキット、ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付のプロトコールに沿って測定した。【００９２】
＜酵素活性の測定  １＞
３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートを基質とするイソプレンの合成における、各酵素活性を測定した。先ず、緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ）に、０．５ｍＭ  ３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートと、５ｍＭ  ＡＴＰとを添加した。次いで、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）用の１０ｍｌバイアルに、この反応液２．５ｍｌと、０．５ｍｇの前記酵素とを添加し、その直後にバイアルのキャップを閉め、酵素反応を開始した。当該酵素反応は３７℃にて行い、反応を開始してから７２時間後にバイアルのヘッドスペース中に生成されたイソプレン量を、サンプル平衡化のために５０℃にて３０分間加熱した後、ＧＣ−ＭＳ（製品名：ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０  Ｕｌｔｒａ、島津製作所社製）によって測定した。そして、得られた各変異体における測定値を、前記Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒにおけるそれを基準（１）として、相対値を算出した。得られた結果の一部を図１に示す。【００９３】
図１に示すとおり、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの１５３位のセリン及び２０９位のスレオニンが各々他のアミノ酸に置換されたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（S１５３ＸＴ２０９Ｘ）は、イソプレンを生成する極めて高い触媒活性を有していることを明らかになった。【００９４】
すなわち、約２００もの変異体の中からイソプレンの生成に関する極めて高い触媒活性を有する変異体として、従前唯一得られていたＲ７４ＨＴ２０９Ｒと比してなお、更に約４倍以上も高い触媒活性を有する変異体を、新たに得ることができた。【００９５】
なお、図１に示すとおり、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの１５３位のセリンのみを他のアミノ酸に置換しても、Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒのような高い触媒活性を有する変異体を得ることはできなかった。【００９６】
さらに、前述のＳ１５３ＸＴ２０９Ｘにおいて、更に１５２位のグリシンも他のアミノ酸に置換した３重アミノ酸変異体を調製し、イソプレンの生成に関する触媒活性を評価した。その結果、図１に示すとおり、当該更なるアミノ酸置換に伴い、Ｓ１５３ＸＴ２０９Ｘと比して約１．３倍、イソプレンの生成に関する触媒活性が向上することも明らかになった。【００９７】
さらにまた、前述の３重アミノ酸変異体（１５２位のグリシン、１５３位のセリン及び２０９位のスレオニンが、各々ロイシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸に置換されたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ；Ｇ１５２ＬＳ１５３ＥＴ２０９Ｄ）において、更に７４位のアルギニンも他のアミノ酸に置換した４重アミノ酸変異体を調製し、イソプレンの生成に関する触媒活性を評価した。得られた結果を図２に示す。【００９８】
なお、図２においては、各変異体におけるＧＣ−ＭＳの測定値を、Ｇ１５２ＬＳ１５３ＥＴ２０９Ｄにおけるそれを基準（１）として、相対値を算出した結果を示す。また、Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒの測定値も併せて示す。【００９９】
図２に示すとおり、７４位における更なるアミノ酸置換に伴い、前記３重アミノ酸変異体と比して、イソプレンの生成に関する触媒活性は更に向上し得ることが明らかになった。特に、７４位のアルギニンをアスパラギン、グルタミン、ヒスチジン又はチロシンにすることにより、前記３重アミノ酸変異体と比して、触媒活性は少なくとも１．５倍、最大で３倍超、向上した。【０１００】
なお、図表には示さないが、７４位のアルギニンを、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン及びチロシン以外のアミノ酸に置換した４重変異体の活性も同様に評価した。その結果、いずれも、Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒよりも高い触媒活性を示すことが確認された。【０１０１】
＜酵素活性の測定  ２＞
次に、上述の変異体がイソプレン以外のオレフィン化合物の生成でも利用できることを確認した。すなわち、β−ヒドロキシイソ吉草酸を基質とするイソブテンの合成（下記式に示す反応）における、各酵素活性を以下のようにして評価した。【０１０２】
【化９】
2018143163.tif 000010
【０１０３】
先ず、緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ）に、０．５ｍＭ  β−ヒドロキシイソ吉草酸（東京化成工業株式会社製、製品コード：Ｈ０７０１、β−Ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｖａｌｅｒｉｃ  Ａｃｉｄ）と、５ｍＭ  ＡＴＰとを添加した。そして、ＧＣ−ＭＳ用の１０ｍｌバイアルに、この反応液２．５ｍｌと、１０ｍｇの前記酵素とを添加し、その直後にバイアルのキャップを閉め、酵素反応を開始した。当該酵素反応は３７℃にて行い、反応を開始してから数日後（約２日後）にバイアルのヘッドスペース中に生成されたイソブテン量を、サンプル平衡化のために５０℃にて３０分間加熱した後、ＧＣ−ＭＳ（製品名：ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０  Ｕｌｔｒａ、島津製作所社製）によって測定した。得られた結果を図３に示す。【０１０４】
なお、図３においては、各変異体におけるＧＣ−ＭＳの測定値を、Ｇ１５２ＬＳ１５３ＥＴ２０９Ｄにおけるそれを基準（１）として、相対値を算出した結果を示す。また、Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒの測定値も併せて示す。【０１０５】
図３に示すとおり、前記３重アミノ酸変異体は、イソプレン生成の際同様に、Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒと比して高いイソブテンの生成に関する触媒活性も有していることが確認された。また、その高い触媒活性は、７４位における更なるアミノ酸置換に伴い、前記３重アミノ酸変異体と比して更に向上し得ることも確認された。特に、７４位のアルギニンをアスパラギン、グルタミン、ヒスチジン又はチロシンにすることにより、前記３重アミノ酸変異体と比して、イソブテン生成における触媒活性は少なくとも２倍、最大で約７倍、向上した。【０１０６】
なお、図表には示さないが、７４位のアルギニンを、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン及びチロシン以外のアミノ酸に置換した４重変異体の活性も同様に評価した。その結果、いずれも、Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒよりも高い触媒活性を示すことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
以上説明したように、本発明によれば、オレフィン化合物を高い生産性にて製造することを可能とする酵素、並びに当該酵素を用いたオレフィン化合物の製造方法を提供することが可能となる。また、本発明によれば、化学合成によらず、生合成によってオレフィン化合物を製造できるため、環境への負荷が少ない。したがって、本発明は、合成ゴム等の様々な合成ポリマーの原料の製造において極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０８】
配列番号：３
＜２２３＞  大腸菌における発現のためにコドンが最適化された配列
【図１】
2018143163.tif 000013
【図２】
2018143163.tif 000014
【図３】
2018143163.tif 000015
【配列表】
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【国際調査報告】
2018143163.tif 000016
2018143163.tif 000017
2018143163.tif 000018
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