(57)【要約】  細胞に多能性誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置３０と、因子導入装置３０で作製された誘導因子導入細胞を培養するための初期化浮遊培養器と、を備える細胞処理装置。
2018155607.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に多能性誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置と、
前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞を浮遊培養するための浮遊培養器と、
を備える、細胞処理装置。
【請求項２】
前記浮遊培養器内で前記誘導因子導入細胞が初期化される、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項３】
前記浮遊培養器内で前記誘導因子導入細胞が初期化され、拡大培養される、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項４】
前記浮遊培養器が、
前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に培地が入れられる容器と、
前記容器内の培地を攪拌させるための駆動装置と、
を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項５】
前記容器内に攪拌部材が設けられている、請求項４に記載の細胞処理装置。
【請求項６】
前記駆動装置が、磁力を介して、前記攪拌部材を回転させる、請求項５に記載の細胞処理装置。
【請求項７】
前記浮遊培養器が、
前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、
前記容器内の溝に沿って前記培地が流れるよう、前記容器内に前記培地を供給するポンプと、
を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項８】
前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、前記浮遊培養器の半透膜内に送られる、請求項４から７のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項９】
前記浮遊培養器が、
培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器と、
前記半透膜内に前記培地の液流が生じるよう、前記半透膜内に前記培地を供給するポンプと、
を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項１０】
前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、前記容器内の前記半透膜の外に送られる、請求項９に記載の細胞処理装置。
【請求項１１】
前記浮遊培養器が、
前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器と、
前記容器内の培地を攪拌させるための駆動装置と、
を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項１２】
前記容器内に攪拌部材が設けられている、請求項１１に記載の細胞処理装置。
【請求項１３】
前記駆動装置が、磁力を介して、前記攪拌部材を回転させる、請求項１２に記載の細胞処理装置。
【請求項１４】
前記浮遊培養器が、
前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、
前記容器内の溝に沿って前記培地が流れるよう、前記容器内に前記培地を供給するポンプと、
を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項１５】
前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、前記浮遊培養器の容器内に送られる、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項１６】
前記培地が液体培地である、請求項４から１５のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項１７】
前記培地がゲル培地である、請求項４から１５のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項１８】
細胞と培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に培地が入れられる容器と、
前記容器内に設けられた攪拌部材と、
を備える、浮遊培養器。
【請求項１９】
前記容器内の培地を攪拌させるための駆動装置をさらに備える、請求項１８に記載の浮遊培養器。
【請求項２０】
前記駆動装置が、磁力を介して、前記攪拌部材を回転させる、請求項１９に記載の浮遊培養器。
【請求項２１】
細胞と培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、
を備える、浮遊培養器。
【請求項２２】
前記容器内の溝に沿って前記培地が流れるよう、前記容器内に前記培地を供給するポンプをさらに備える、請求項２１に記載の浮遊培養器。
【請求項２３】
細胞と培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器を備える、浮遊培養器。
【請求項２４】
前記容器内の溝に沿って前記培地が流れるよう、前記容器内に前記培地を供給するポンプをさらに備える、請求項２３に記載の浮遊培養器。
【請求項２５】
培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に細胞と培地が入れられる容器と、
を備える、浮遊培養器。
【請求項２６】
前記半透膜内に前記培地の液流が生じるよう、前記半透膜内に前記培地を供給するポンプをさらに備える、請求項２５に記載の浮遊培養器。
【請求項２７】
前記培地が液体培地である、請求項１８から２６のいずれか１項に記載の浮遊培養器。
【請求項２８】
前記培地がゲル培地である、請求項１８から２６のいずれか１項に記載の浮遊培養器。
【請求項２９】
細胞に多能性誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製することと、
前記誘導因子導入細胞を浮遊培養して前記誘導因子導入細胞を初期化することと、
を含む、幹細胞の誘導方法。
【請求項３０】
前記浮遊培養が、攪拌培養である、請求項２９に記載の幹細胞の誘導方法。
【請求項３１】
前記誘導因子導入細胞を浮遊培養する際に液体培地が用いられる、請求項２９又は３０に記載の幹細胞の誘導方法。
【請求項３２】
前記誘導因子導入細胞を浮遊培養する際にゲル培地が用いられる、請求項２９又は３０に記載の幹細胞の誘導方法。
【請求項３３】
細胞に誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製することと、
前記誘導因子導入細胞を浮遊培養して目的とする体細胞を誘導することと、
を含む、細胞の誘導方法。
【請求項３４】
浮遊培養が、攪拌培養である、請求項３３に記載の細胞の誘導方法。
【請求項３５】
前記誘導因子導入細胞を浮遊培養する際に液体培地が用いられる、請求項３３又は３４に記載の細胞の誘導方法。
【請求項３６】
前記誘導因子導入細胞を浮遊培養する際にゲル培地が用いられる、請求項３３又は３４に記載の細胞の誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞技術に関し、細胞処理装置、浮遊培養器、及び幹細胞の誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、ヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞である。ＥＳ細胞は、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を有する。現在、ヒトＥＳ細胞は、パーキンソン病、若年性糖尿病、及び白血病等、多くの疾患に対する細胞移植療法に利用可能である。しかし、ＥＳ細胞の移植には障害もある。特に、ＥＳ細胞の移植は、不成功な臓器移植に続いて起こる拒絶反応と同様の免疫拒絶反応を惹起しうる。また、ヒト胚を破壊して樹立されるＥＳ細胞の利用に対しては、倫理的見地から批判や反対意見が多い。【０００３】
このような背景の状況の下、京都大学の山中伸弥教授は、４種の遺伝子：ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、及びＳＯＸ２を体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を樹立することに成功した。これにより、山中教授は、２０１２年のノーベル生理学・医学賞を受賞した（例えば、特許文献１、２参照。）。ｉＰＳ細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞である。したがって、ｉＰＳ細胞は、細胞移植療法への利用が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４１８３７４２号公報
【特許文献２】特開２０１４−１１４９９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ｉＰＳ細胞に限らず、様々な細胞を効率よく培養可能な装置や方法が望まれている。本発明は、細胞処理装置、浮遊培養器、及び幹細胞の誘導方法を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様によれば、細胞に多能性誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置と、因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞を浮遊培養するための浮遊培養器と、を備える、細胞処理装置が提供される。【０００７】
上記の細胞処理装置において、浮遊培養器内で誘導因子導入細胞が初期化されてもよい。【０００８】
上記の細胞処理装置において、浮遊培養器内で誘導因子導入細胞が初期化され、拡大培養されてもよい。【０００９】
上記の細胞処理装置において、浮遊培養器が、誘導因子導入細胞と培地が入れられる半透膜と、半透膜が入れられ、半透膜の周囲に培地が入れられる容器と、容器内の培地を攪拌させるための駆動装置と、を備えていてもよい。半透膜は、例えば、チューブ状である。【００１０】
上記の細胞処理装置において、容器内に攪拌部材が設けられていてもよい。【００１１】
上記の細胞処理装置において、駆動装置が、磁力を介して、攪拌部材を回転させてもよい。【００１２】
上記の細胞処理装置において、浮遊培養器が、誘導因子導入細胞と培地が入れられる半透膜と、半透膜が入れられ、半透膜の周囲に培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、容器内の溝に沿って培地が流れるよう、容器内に培地を供給するポンプと、を備えていてもよい。【００１３】
上記の細胞処理装置において、因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、浮遊培養器の半透膜内に送られてもよい。【００１４】
上記の細胞処理装置において、浮遊培養器が、培地が入れられる半透膜と、半透膜が入れられ、半透膜の周囲に誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器と、半透膜内に培地の液流が生じるよう、半透膜内に培地を供給するポンプと、を備えていてもよい。【００１５】
上記の細胞処理装置において、因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、容器内の半透膜の外に送られてもよい。【００１６】
上記の細胞処理装置において、浮遊培養器が、誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器と、容器内の培地を攪拌させるための駆動装置と、を備えていてもよい。【００１７】
上記の細胞処理装置において、容器内に攪拌部材が設けられていてもよい。【００１８】
上記の細胞処理装置において、駆動装置が、磁力を介して、攪拌部材を回転させてもよい。【００１９】
上記の細胞処理装置において、浮遊培養器が、誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、容器内の溝に沿って培地が流れるよう、容器内に培地を供給するポンプと、を備えていてもよい。【００２０】
上記の細胞処理装置において、因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、浮遊培養器の容器内に送られてもよい。【００２１】
上記の細胞処理装置において、培地が液体培地であってもよい。【００２２】
上記の細胞処理装置において、培地がゲル培地であってもよい。【００２３】
また、本発明の態様によれば、細胞と培地が入れられる半透膜と、半透膜が入れられ、半透膜の周囲に培地が入れられる容器と、容器内に設けられた攪拌部材と、を備える、浮遊培養器が提供される。【００２４】
上記の浮遊培養器において、容器内の培地を攪拌させるための駆動装置をさらに備えていてもよい。【００２５】
上記の浮遊培養器において、駆動装置が、磁力を介して、攪拌部材を回転させてもよい。【００２６】
また、本発明の態様によれば、細胞と培地が入れられる半透膜と、半透膜が入れられ、半透膜の周囲に培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、を備える浮遊培養器が提供される。【００２７】
上記の浮遊培養器において、容器内の溝に沿って培地が流れるよう、容器内に培地を供給するポンプをさらに備えていてもよい。【００２８】
また、本発明の態様によれば、細胞と培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器を備える浮遊培養器が提供される。【００２９】
上記の浮遊培養器において、容器内の溝に沿って培地が流れるよう、容器内に培地を供給するポンプをさらに備えていてもよい。【００３０】
また、本発明の態様によれば、培地が入れられる半透膜と、半透膜が入れられ、半透膜の周囲に細胞と培地が入れられる容器と、を備える、浮遊培養器が提供される。【００３１】
上記の浮遊培養器において、半透膜内に培地の液流が生じるよう、半透膜内に培地を供給するポンプをさらに備えていてもよい。【００３２】
上記の浮遊培養器において、培地が液体培地であってもよい。【００３３】
上記の浮遊培養器において、培地がゲル培地であってもよい。【００３４】
また、本発明の態様によれば、細胞に多能性誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製することと、誘導因子導入細胞を浮遊培養して誘導因子導入細胞を初期化することと、を含む、幹細胞の誘導方法が提供される。【００３５】
上記の幹細胞の誘導方法において、浮遊培養が、攪拌培養であってもよい。【００３６】
上記の幹細胞の誘導方法において、誘導因子導入細胞を浮遊培養する際に液体培地が用いられてもよい。【００３７】
上記の幹細胞の誘導方法において、誘導因子導入細胞を浮遊培養する際にゲル培地が用いられてもよい。【００３８】
また、本発明の態様によれば、細胞に誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製することと、誘導因子導入細胞を浮遊培養して目的とする体細胞を誘導することと、を含む、細胞の誘導方法が提供される。【００３９】
上記の細胞の誘導方法において、浮遊培養が、攪拌培養であってもよい。【００４０】
上記の細胞の誘導方法において、誘導因子導入細胞を浮遊培養する際に液体培地が用いられてもよい。【００４１】
上記の細胞の誘導方法において、誘導因子導入細胞を浮遊培養する際にゲル培地が用いられてもよい。
【発明の効果】
【００４２】
本発明によれば、細胞処理装置、浮遊培養器、及び幹細胞の誘導方法を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】実施形態に係る細胞処理装置の模式図である。
【図２】実施形態に係る細胞処理装置の導入細胞送液路の一例の模式的断面図である。
【図３】実施形態に係る細胞処理装置の導入細胞送液路の一例の模式的断面図である。
【図４】実施形態に係る浮遊培養器の模式的斜視図である。
【図５】実施形態に係る浮遊培養器の模式的断面図である。
【図６】実施形態に係る浮遊培養器の模式的断面図である。
【図７】実施形態に係る浮遊培養器の模式的斜視図である。
【図８】実施形態に係る浮遊培養器の模式的断面図である。
【図９】実施形態に係る浮遊培養器の模式的斜視図である。
【図１０】実施形態に係る浮遊培養器の模式的断面図である。
【図１１】実施形態に係る浮遊培養器の模式的斜視図及び模式的断面図である。
【図１２】実施形態に係る浮遊培養器の模式的斜視図及び模式的断面図である。
【図１３】実施形態に係る溶液置換器の模式図である。
【図１４】実施形態に係る細胞処理装置の模式図である。
【図１５】実施例１に係る誘導された細胞塊の顕微鏡写真である。
【図１６】実施例１に係るＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）で得られたドットプロットである。
【図１７】実施例１に係る誘導された細胞の顕微鏡写真である。
【図１８】実施例２に係る誘導された細胞塊の顕微鏡写真である。
【図１９】実施例２に係るＦＡＣＳで得られたドットプロットである。
【図２０】実施例２に係る誘導された細胞の顕微鏡写真である。
【図２１】実施例３に係る誘導された細胞塊の顕微鏡写真である。
【図２２】実施例３に係る細胞塊の数を示すグラフである。
【図２３】実施例３に係る透析チューブを用いて誘導培養された細胞の顕微鏡写真である。
【図２４】実施例３に係る透析チューブを用いずに誘導培養された細胞の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下に本発明の実施形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。ただし、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
【００４５】
実施形態に係る細胞処理装置は、図１に示すように、細胞に多能性誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置３０と、因子導入装置３０で作製された誘導因子導入細胞を培養するための初期化浮遊培養器と、初期化浮遊培養器で樹立された幹細胞からなる複数の細胞塊を拡大培養するための拡大浮遊培養器と、を備える。なお、初期化浮遊培養器と、拡大浮遊培養器と、を別個に設けず、同じ浮遊培養器の中で誘導因子導入細胞を培養し、幹細胞を誘導してもよい。
【００４６】
細胞処理装置は、例えば、血液から細胞を分離する分離装置１０と、分離装置１０で分離された細胞を含む溶液が通過する導入前細胞送液路２０と、を備えていてもよい。導入前細胞送液路２０は、因子導入装置３０に接続される。細胞処理装置は、導入前細胞送液路２０又は因子導入装置３０内に多能性誘導因子を送る誘導因子送液機構２１を備えていてもよい。
【００４７】
初期化浮遊培養器と、拡大浮遊培養器と、は、誘導因子導入細胞を培養して幹細胞からなる複数の細胞魂を作製する細胞塊作製装置４０の少なくとも一部を構成している。細胞処理装置は、複数の細胞塊のそれぞれを順次パッケージするパッケージ装置１００を備えていてもよい。
【００４８】
分離装置１０は、例えばヒトの血液が入ったバイアルを受け取る。分離装置１０は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、及び生物学的製剤基準血液保存液Ａ液（ＡＣＤ−Ａ液、テルモ株式会社）等の抗凝固剤を保存する抗凝固剤タンクを備えている。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、抗凝固剤タンクから、ヒトの血液に、抗凝固剤を添加する。
【００４９】
また、分離装置１０は、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ（登録商標、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）等の単核細胞分離用試薬を保存する分離用試薬タンクを備えている。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、分離用試薬タンクから、例えば１５ｍＬチューブ２本に、単核細胞分離用試薬を５ｍＬずつ分注する。なお、チューブの代わりに、樹脂バッグを用いてもよい。
【００５０】
さらに、分離装置１０は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液を保存する緩衝液タンクを備えている。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、緩衝液タンクから、例えばヒトの血液５ｍＬに、緩衝液５ｍＬを加えて希釈する。またさらに、分離装置１０は、ポンプ等を用いて、希釈されヒトの血液を、チューブ中の単核細胞分離用試薬上に、５ｍＬずつ加える。
【００５１】
分離装置１０は、温度設定可能な遠心機をさらに備える。遠心機は、例えば１８℃に設定される。分離装置１０は、移動装置等を用いて、単核細胞分離用試薬及びヒトの血液等が入れられたチューブを、遠心機のホルダーに入れる。遠心機は、チューブ中の溶液を、例えば４００×ｇで３０分間遠心する。チューブの代わりに、樹脂バッグを遠心させてもよい。
【００５２】
遠心後、分離装置１０は、チューブ中の溶液の単核球細胞で白く濁った中間層をポンプ等で回収する。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、回収した単核球細胞の懸濁液を、導入前細胞送液路２０に送り出す。あるいは、さらに、分離装置１０は、回収した単核球細胞溶液２ｍＬに対し、例えばＰＢＳ１２ｍＬを加えて、チューブを遠心機のホルダーに入れる。遠心機は、チューブ中の溶液を、例えば２００×ｇで１０分間遠心する。
【００５３】
遠心後、分離装置１０は、ポンプ等を用いて、チューブ中の溶液の上清を吸引して除去し、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０（登録商標、ロンザジャパン株式会社）等の単核球細胞培地３ｍＬをチューブ中の単核球細胞溶液に加えて懸濁する。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、単核球細胞懸濁液を、導入前細胞送液路２０に送り出す。なお、分離装置１０は、透析膜を使用して、血液から単核球細胞を分離してもよい。また、皮膚等から予め分離された繊維芽細胞等の体細胞を使用する場合は、分離装置１０は無くともよい。
【００５４】
分離装置１０は、遠心分離以外の方法で、誘導に適した細胞を分離してもよい。例えば、分離すべき細胞がＴ細胞であればＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８のいずれかが陽性である細胞をパニングにより分離すればよい。分離すべき細胞が血管内皮前駆細胞であればＣＤ３４が陽性である細胞をパニングにより分離すればよい。分離すべき細胞がＢ細胞であれば、ＣＤ１０，ＣＤ１９，ＣＤ２０のいずれかが陽性である細胞をパニングにより分離すればよい。また、パニングに限らず、磁気細胞分離方法（ＭＡＣＳ）やフローサイトメトリー等により分離してもよい。また、誘導に適した細胞は、血液由来の細胞に限定されない。
【００５５】
誘導因子送液機構２１は、誘導因子導入試薬溶液等を保存する誘導因子導入試薬タンクを備える。遺伝子導入試薬溶液等の誘導因子導入試薬溶液は、例えば、Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標、ロンザジャパン株式会社）溶液等のエレクトロポレーション溶液、サプリメント溶液、及びプラスミドセットを含む。プラスミドセットは、例えば、ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３−Ｆを０．８３μｇ、ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫを０．８３μｇ、ｐＣＥ−ｈＵＬを０．８３μｇ、及びｐＣＸＷＢ−ＥＢＮＡ１を０．５μｇ含む。誘導因子送液機構２１は、マイクロポンプ等を用いて、誘導因子導入試薬溶液中に単核球細胞懸濁液が懸濁されるように、誘導因子導入試薬溶液を、導入前細胞送液路２０に送り出す。
【００５６】
導入前細胞送液路２０の内壁には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ（ｐｏｌｙ  ２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）をコーティングして、細胞非接着性にしてもよい。あるいは、導入前細胞送液路２０の材料に、細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、導入前細胞送液路２０の材料に、温度伝導率が良く、二酸化炭素透過性の材料を用いることにより、導入前細胞送液路２０内の条件が、周囲の温度及び二酸化炭素濃度と同等になる。さらに、導入前細胞送液路２０には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。
【００５７】
導入前細胞送液路２０に接続された因子導入装置３０は、例えばエレクトロポレーターであり、誘導因子導入試薬溶液と単核球細胞懸濁液の混合液を受け取り、単核球細胞に対してプラスミドのエレクトロポレーションを実施する。因子導入装置３０は、エレクトロポレーションを実施後、プラスミドをエレクトロポレーションされた単核球細胞を含む溶液に、単核球細胞培地を加える。因子導入装置３０は、ポンプ等を用いて、プラスミドをエレクトロポレーションされた単核球細胞（以下、「誘導因子導入細胞」という。）を含む溶液を、導入細胞送液路３１に送り出す。
【００５８】
なお、因子導入装置３０は、エレクトロポレーターに限定されない。因子導入装置３０は、細胞に初期化因子をコードしているＲＮＡをリポフェクション法により導入してもよい。リポフェクション法とは、陰性荷電物質である核酸と、陽性荷電脂質と、の複合体を、電気的な相互作用により形成し、複合体をエンドサイトーシスや膜融合により細胞内に取り込ませる方法である。リポフェクション法は、細胞へのダメージが少なく、導入効率に優れており、操作が簡便であり、時間がかからない等の利点を有する。また、リポフェクション法においては、細胞のゲノムに初期化因子が挿入される可能性がないため、得られた幹細胞を全ゲノムシークエンスして、外来遺伝子の挿入の有無を確認する必要がない。多能性誘導因子としての初期化因子ＲＮＡは、例えば、ＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ、及びｃ−ＭＹＣのｍＲＮＡを含む。なお、ここでは遺伝子記号はヒトで記載しているが、大文字・小文字表記によって、種を制限することを意図するものではない。例えば、全て大文字表記していても、マウス又はラットの遺伝子を含むことを排除するものではない。ただし、実施例においては、実際に使用した生物種に則って、遺伝子記号を表記している。
【００５９】
初期化因子ＲＮＡのリポフェクションには、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）或いはリポフェクション試薬が用いられる。ＲＮＡのリポフェクション試薬としては、ｓｉＲＮＡのリポフェクション試薬及びｍＲＮＡのリポフェクション試薬が使用可能である。より具体的には、ＲＮＡのリポフェクション試薬としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）３０００、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｆｅｃｔ）、ＮｅｘｔＦｅｃｔ（登録商標）ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏｏＳｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ−１００２）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４  ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ−１００３）、及びＲｅｐｒｏＲＮＡ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等が使用可能である。
【００６０】
因子導入装置３０が、リポフェクション法により細胞に初期化因子を導入する場合は、初期化因子ＲＮＡ及び試薬等が、誘導因子送液機構２１により導入前細胞送液路２０に送り出される。
【００６１】
導入細胞送液路３１の内壁には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡをコーティングして、非接着性にしてもよい。あるいは、導入細胞送液路３１の材料に、細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、導入細胞送液路３１の材料に、温度伝導率が良く、二酸化炭素透過性の材料を用いることにより、導入細胞送液路３１内の条件が、周囲の管理された温度及び二酸化炭素濃度と同等になる。さらに、導入細胞送液路３１には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。また、エレクトロポレーションの後は、多くの細胞が死に、死んだ細胞の細胞塊ができることがある。そのため、導入細胞送液路３１に、死細胞塊を除去するフィルターを設けてもよい。あるいは、図２に示すように、導入細胞送液路３１内部に、内径を断続的に変化させる一又は複数の襞を設けてもよい。またあるいは、図３に示すように、導入細胞送液路３１の内径を断続的に変化させてもよい。
【００６２】
図１に示すように、導入細胞送液路３１に接続された細胞塊作製装置４０は、因子導入装置３０で作製された誘導因子導入細胞を培養する初期化培養装置５０と、初期化培養装置５０で樹立された幹細胞からなる細胞塊（細胞コロニー）を複数の細胞塊に分割する第１の分割機構６０と、第１の分割機構６０で分割された複数の細胞塊を拡大培養する拡大培養装置７０と、拡大培養装置７０で拡大培養された幹細胞からなる細胞塊を複数の細胞塊に分割する第２の分割機構８０と、複数の細胞魂をパッケージ装置１００に順次送る細胞魂搬送機構９０と、を備える。
【００６３】
初期化培養装置５０は、例えば、図４から図６に示す初期化浮遊培養器を備える。初期化浮遊培養器は、誘導因子導入細胞と培地が入れられる透析チューブ７５と、透析チューブ７５が入れられ、透析チューブ７５の周囲に培地が入れられる容器７６と、容器７６内の培地を攪拌させるための駆動装置７４と、を備える。
【００６４】
図１に示す因子導入装置３０で作製された誘導因子導入細胞は、図４から図６に示す初期化浮遊培養器の透析チューブ７５内に送られる。
【００６５】
透析チューブ７５は、半透膜からなり、例えば、ＲＯＣＫ阻害剤を透過させる。透析チューブ７５の分画分子量は、０．１ＫＤａ以上、１０ＫＤａ以上、あるいは５０ＫＤａ以上である。透析チューブ７５は、例えば、セルロースエステル、エチルセルロース、セルロースエステル類、再生セルロース、ポリスルホン、ポリアクリルニトリル、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリエステル系ポリマーアロイ、ポリカーボネート、ポリアミド、セルロースアセテート、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、銅アンモニウムレーヨン、鹸化セルロース、ヘモファン膜、フォスファチジルコリン膜、及びビタミンＥコーティング膜等からなる。
【００６６】
容器７６としては、例えば円柱形であるが、これに限定されない。容器７６の側壁は、例えば、ポリプロピレンやガラス等の透明材料からなる。容器７６は、二酸化炭素透過性であってもよい。二酸化炭素透過性の容器７６としては、Ｇ−Ｒｅｘ（登録商標、Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ）が使用可能である。
【００６７】
誘導因子導入細胞は、透析チューブ７５内に入れられる。透析チューブ７５には、透析チューブ７５内に細胞を含む培地を送液するための送液路が接続されていてもよい。また、透析チューブ７５には、透析チューブ７５内の細胞を含む培地を容器外部に送液するための送液路が接続されていてもよい。
【００６８】
容器７６内及び透析チューブ７５内に入れられる培地は、例えば、血液細胞培地又は幹細胞用培地である。例えば、初期化培養の当初は、血液細胞培地を用い、その後は、幹細胞用培地を用いてもよい。幹細胞用培地としては、例えば、Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ(ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ)等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地を使用可能である。
【００６９】
ただし、幹細胞用培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばＰｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２、ＲｅｐｒｏＸＦ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、ＴｅＳＲＥ８、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ＥＳ／ｉＰＳ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ  （登録商標）ＸＦ／ＦＦ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  ｉＰＳ  ａｎｄ  ＥＳ  Ｃｅｌｌｓ、Ｐｌｕｒｉｔｏｎ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）、Ｓｔｅｍｆｉｔ  ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ  ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、ＥＳＣ−Ｓｕｒｅ（登録商標）ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｆｅｅｄｅｒ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｈＥＳＣ／ｉＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、及びＬ７（登録商標）ｈＰＳＣ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＬＯＮＺＡ）等を利用してもよい。
【００７０】
培地は、ゲル培地ではない液体培地であってもよいし、ゲル培地であってもよい。
【００７１】
培地がゲル培地である場合、ゲル培地は、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
【００７２】
あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。
【００７３】
容器７６の内、例えば底面には、攪拌部材２７１が設けられている。攪拌部材２７１の形状は任意であり、棒状であってもよいし、攪拌翼が設けられた板状であってもよい。攪拌部材２７１は、磁力を受ける金属を備えていてもよい。駆動装置７４は、例えば磁力を介して、容器７６内の攪拌部材２７１を回転させる。これにより、容器７６内の培地が攪拌され、透析チューブ７５内の細胞が浮遊培養される。この際、容器７６内の透析チューブ７５の外の培地が主に撹拌される。透析チューブ７５内の培地の流速は、容器７６内の透析チューブ７５の外側の培地の流速より遅くなるか、あるいは透析チューブ７５内の培地は、ほとんど流動しない。
【００７４】
攪拌されている培地中では、ｉＰＳ細胞同士がランダムに衝突し、結合して、様々な大きさの細胞塊（コロニー）が形成される場合がある。そのためコロニー間の均質性が保てない場合がある。さらに、大きすぎるコロニーにおいては、コロニーの中まで栄養や成長因子がとどかず、内部から分化、細胞死してしまう場合がある。その一方で、小さすぎるコロニーは、継代培養には適さない場合がある。これに対し、透析チューブ７５内では、培地の流速が遅いか、培地が流動しないため、細胞同士が衝突する頻度が低い。そのため、コロニーにおいてクローナリティを維持することが可能である。したがって、例えば、幹細胞がｉＰＳ細胞である場合、１つの体細胞由来のｉＰＳ細胞のクローナリティを担保することが可能である。また、幹細胞同士が衝突する頻度が低いため、幹細胞のコロニーの大きさを均質に保つことが可能である。
【００７５】
透析チューブ７５内に入れられる培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでいなくてもよい。容器７６内の透析チューブ７５の周囲に入れられる培地には、例えば、ＲＯＣＫ阻害剤を終濃度が１０００μｍｏｌ／Ｌ以上０．１μｍｏｌ／Ｌ以下、１００μｍｏｌ／Ｌ以上１μｍｏｌ／Ｌ以下、あるいは５μｍｏｌ／Ｌ以上２０μｍｏｌ／Ｌ以下となるよう、毎日添加する。ＲＯＣＫ阻害剤を透析チューブ７５の周囲の培地に添加することにより、ＲＯＣＫ阻害剤が透析チューブ７５内に浸透し、細胞によるコロニー形成が促進される。
【００７６】
培地は、例えば、ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）やＴＧＦ−β等の成長因子を含んでいてもよいし、含んでいなくともよい。
【００７７】
透析チューブ７５内で細胞を浮遊培養する間、容器７６内の透析チューブ７５の周囲の培地は交換される。なお、培地を交換するとは、培地を一部置換することや、補充することも含む。この場合、透析チューブ７５内に培地を補給しなくともよい。あるいは、透析チューブ７５内で細胞を浮遊培養する間、透析チューブ７５内に培地が補給される。この場合、容器７６内の透析チューブ７５の周囲に培地を補給しなくともよい。
【００７８】
初期化浮遊培養器は、透析チューブ７５の周囲に培地の水素イオン指数（ｐＨ）を測定するｐＨセンサーを備えていてもよい。
【００７９】
実施形態に係る細胞処理装置は、培地補給装置としての補給培地送液ポンプを用いて、初期化浮遊培養器の容器７６内の透析チューブ７５の周囲の培地を、交換、あるいは補給する。補給培地送液ポンプとしては、点滴に用いられるポンプ等が使用可能である。補給培地送液ポンプと、初期化浮遊培養器の容器７６と、は、送液チューブで接続される。補給培地送液ポンプは、送液チューブを介して、初期化浮遊培養器の容器７６内に培地を送液する。初期化浮遊培養器の容器７６には、廃液チューブが接続されている。初期化浮遊培養器の容器７６内の培地は、廃液チューブを介して排出される。初期化浮遊培養器の容器７６内の培地は、例えば、補給培地送液ポンプによって補給される新鮮な培地による圧力によって排出されてもよいし、重力を利用して排出してもよいし、排出ポンプによって排出してもよい。
【００８０】
補給培地送液ポンプから初期化浮遊培養器に送液される培地の温度は、例えば、初期化浮遊培養器中の培地の温度が急激に変化しないように設定される。例えば、初期化浮遊培養器中の培地の温度が３７℃である場合は、初期化浮遊培養器に送液される培地の温度も３７℃に設定される。ただし、初期化浮遊培養器に送液される前の培地は、冷蔵保存部で、例えば４℃等の低温で冷蔵保存されていてもよい。
【００８１】
例えば、補給培地送液ポンプによって初期化浮遊培養器の容器７６内に送液される培地の量と、初期化浮遊培養器の容器７６から排出される培地の量と、が同じになるよう、補給培地送液ポンプは制御される。補給培地送液ポンプは、初期化浮遊培養器の容器７６内に、常時、培地を送液してもよいし、適宜間隔をおいて、培地を送液してもよい。
【００８２】
培地を常時送液する場合、送液される培地の流量は、一定であっても、一定でなくてもよい。例えば、培地及び培地中の細胞塊を撮影装置で監視し、培地及び培地中の細胞塊の状態に応じて、送液される培地の流量を増加させたり、減少させたりしてもよい。
【００８３】
また、培地を常時送液せずに、培地及び培地中の細胞塊の状態に応じて、培地の送液の開始及び終了をしてもよい。この場合も、培地及び培地中の細胞塊の状態に応じて、送液される培地の流量を増加させたり、減少させたりしてもよい。
【００８４】
なお、初期化浮遊培養器に送液される培地の流量が大きすぎると、初期化浮遊培養器内の細胞が培地の圧力によりダメージを受ける場合がある。そのため、初期化浮遊培養器に送液される培地の流量は、細胞がダメージを受けないように設定される。
【００８５】
培地を交換せずに細胞の培養を続けると、細胞が排出する乳酸等の老廃物の蓄積や、ｐＨの変化が、細胞培養に悪影響を及ぼしうる。また、培地中に含まれるｂＦＧＦやリコンビナントタンパク質等の様々なタンパク質が分解され、細胞の培養に必要な成分が培地から損なわれうる。
【００８６】
これに対し、補給培地送液ポンプで新鮮な培地を初期化浮遊培養器中に送液し、古い培地を初期化浮遊培養器から排出することにより、初期化浮遊培養器中から老廃物を除去し、培地中のｐＨを適切な範囲内に保ち、細胞の培養に必要な成分を補給することが可能になる。これにより、培地の状態を一定に近い状態に保つことが可能である。
【００８７】
なお、補給培地送液ポンプと、初期化浮遊培養器の容器７６と、を、送液チューブで接続してもよいし、補給培地送液ポンプと、初期化浮遊培養器の容器７６内の透析チューブ７５内と、を送液チューブで接続してもよい。透析チューブ７５内に新鮮な培地を送液することにより、透析チューブ７５内の培地に含まれる老廃物が、透析チューブ７５外に排出される。また、透析チューブ７５内の培地のｐＨを適切な範囲内に保ち、透析チューブ７５内の培地に細胞の培養に必要な成分を補給することが可能である。
【００８８】
初期化浮遊培養器の構造は、図４から図６に示した構造に限定されない。例えば、図７及び図８に示す初期化浮遊培養器は、誘導因子導入細胞と培地が入れられる透析チューブ７５と、透析チューブ７５が入れられ、透析チューブ７５の周囲に培地が入れられる容器７６であって、内側面にらせん状の溝２７２が設けられている容器７６と、容器７６内の溝２７２に沿って培地が流れるよう、容器７６内に培地を供給するポンプと、を備えている。
【００８９】
初期化浮遊培養器の容器７６の上部には、容器７６内外に連通する第１の連通孔２７３が設けられており、容器７６の下部には、容器７６内外に連通する第２の連通孔２７４が設けられている。例えば、第１の連通孔２７３から容器７６内に培地が導入され、導入された培地が、溝２７２に沿って回転流を生じさせながら容器７６の下部に導かれ、第２の連通孔２７４から、容器７６外に排出される。第２の連通孔２７４から排出された培地は、循環経路を経て、再び第１の連通孔２７３から容器７６内に導入されてもよい。
【００９０】
あるいは、第２の連通孔２７４から容器７６内に培地が導入され、導入された培地が、溝２７２に沿って回転流を生じさせながら容器７６の上部に導かれ、第１の連通孔２７３から、容器７６外に排出されてもよい。第１の連通孔２７３から排出された培地は、循環経路を経て、再び第２の連通孔２７４から容器７６内に導入されてもよい。
【００９１】
なお、らせん状の溝２７２は、容器７６の内壁に直接設けられていてもよいし、容器７６の内壁に、らせん状の溝が設けられた部材を配置してもよい。
【００９２】
また、例えば、図９及び図１０に示す初期化浮遊培養器は、誘導因子導入細胞と培地が入れられる透析チューブ７５と、透析チューブ７５が入れられ、透析チューブ７５の周囲に培地が入れられる容器７６と、透析チューブ７５内に液流が生じるよう、透析チューブ７５内に培地を供給するポンプと、を備える。
【００９３】
初期化浮遊培養器の透析チューブ７５の上部には、透析チューブ７５内外に連通する第１の連通孔２７５が設けられており、透析チューブ７５の下部には、透析チューブ７５内外に連通する第２の連通孔２７６が設けられている。例えば、第１の連通孔２７５から透析チューブ７５内に培地が導入され、導入された培地が、透析チューブ７５の下部に導かれ、第２の連通孔２７６から、透析チューブ７５外に排出される。第２の連通孔２７６から排出された培地は、循環経路を経て、再び第１の連通孔２７５から透析チューブ７５内に導入されてもよい。
【００９４】
あるいは、第２の連通孔２７６から透析チューブ７５内に培地が導入され、導入された培地が、透析チューブ７５の上部に導かれ、第１の連通孔２７５から、透析チューブ７５外に排出されてもよい。第１の連通孔２７５から排出された培地は、循環経路を経て、再び第２の連通孔２７６から透析チューブ７５内に導入されてもよい。
【００９５】
また、図４から図１０においては、透析チューブを備える初期化浮遊培養器を説明したが、図１１及び図１２に示すように、初期化浮遊培養器は、透析チューブを備えていなくともよい。この場合、細胞は、容器７６内で攪拌浮遊培養される。
【００９６】
細胞処理装置は、図１に示す初期化培養装置５０における培養を撮影する写真カメラやビデオカメラ等の初期化培養撮影装置をさらに備えていてもよい。ここで、初期化培養装置５０で使用される培地に無色の培地を用いると、有色の培地を用いた場合に生じうる乱反射や自家蛍光を抑制することが可能となる。ただし、培地のｐＨを確認するために、フェノールレッド等のｐＨ指示薬を含んでいてもよい。また、誘導された細胞と、誘導されなかった細胞とでは、細胞の形状及び大きさ等が異なるため、細胞処理装置は、初期化培養装置５０における細胞を撮影することにより、誘導された細胞の割合を算出する誘導状態監視装置を、さらに備えていてもよい。あるいは、誘導状態監視装置は、抗体免疫染色法又はＲＮＡ抽出法により、誘導された細胞の割合を特定してもよい。さらに、細胞処理装置は、磁気細胞分離方法やフローサイトメトリー等により、誘導されていない細胞を取り除く、未誘導細胞除去装置を備えていてもよい。
【００９７】
初期化培養装置５０には、第１細胞塊送液路５１が接続されている。初期化培養装置５０は、細胞塊の含有液を、ポンプ等を用いて、第１細胞塊送液路５１に送り出す。なお、第１細胞塊送液路５１は、所定の大きさ未満の誘導された細胞のみを通す内径を有し、所定の大きさ以上の誘導されていない細胞を除去する分岐流路に接続されていてもよい。
【００９８】
細胞塊を含む溶液を第１細胞塊送液路５１に送り出すポンプは、例えば、細胞塊の大きさの値が、所定の閾値以上になった場合に、駆動されてもよい。あるいは、細胞塊を含む溶液を第１細胞塊送液路５１に送り出すポンプは、例えば、細胞塊の密度の値が、所定の閾値以上になった場合に、駆動されてもよい。
【００９９】
第１細胞塊送液路５１の内壁には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡをコーティングして、細胞非接着性にしてもよい。あるいは、第１細胞塊送液路５１の材料に、細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、第１細胞塊送液路５１の材料に、温度伝導率が良く、二酸化炭素透過性の材料を用いることにより、第１細胞塊送液路５１内の条件が、周囲の管理された温度及び二酸化炭素濃度と同等になる。さらに、第１細胞塊送液路５１には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。
【０１００】
第１細胞塊送液路５１は、第１の分割機構６０に接続されている。第１の分割機構６０は、例えば、メッシュを備える。溶液に含まれる細胞塊は、水圧によってメッシュを通過する際、メッシュの各孔の大きさの複数の細胞塊に分割される。例えば、メッシュの各孔の大きさが均一であれば、分割後の複数の細胞塊の大きさも、ほぼ均一となる。あるいは、第１の分割機構６０は、ノズルを備えていてもよい。例えば、略円錐状のノズルの内部を階段状に微細加工することにより、溶液に含まれる細胞塊がノズルを通過する際に、複数の細胞塊に分割される。
【０１０１】
第１の分割機構６０には、拡大培養装置７０が接続されている。第１の分割機構６０で分割された細胞塊を含む溶液は、拡大培養装置７０に送られる。
【０１０２】
拡大培養装置７０は、図４から図１０に示したような初期化浮遊培養器と同様の構造を備える拡大浮遊培養器を用いてもよい。拡大培養装置７０においても、図４から図１０に示す浮遊培養器の透析チューブ７５に、複数の細胞塊が入れられる。また、拡大培養装置７０においても、補給培地送液ポンプを用いて、容器７６内の透析チューブ７５の周囲の培地を、交換、あるいは補給する。あるいは、補給培地送液ポンプと、浮遊培養器の容器７６内の透析チューブ７５内と、を送液チューブで接続して、透析チューブ７５内の培地に細胞の培養に必要な成分を補給してもよい。
【０１０３】
あるいは、拡大培養装置７０は、図１１及び図１２に示したような初期化浮遊培養器と同様の構造を備える拡大浮遊培養器を用いてもよい。この場合、容器７６内に複数の細胞塊が入れられる。
【０１０４】
細胞処理装置は、図１に示す拡大培養装置７０における培養を撮影する拡大培養撮影装置をさらに備えていてもよい。ここで、拡大培養装置７０で使用される培地に無色の培地を用いると、有色の培地を用いた場合に生じうる乱反射や自家蛍光を抑制することが可能となる。ただし、培地のｐＨを確認するために、フェノールレッド等のｐＨ指示薬を含んでいてもよい。また、誘導された細胞と、誘導されなかった細胞とでは、細胞の形状及び大きさ等が異なるため、細胞処理装置は、拡大培養装置７０における細胞を撮影することにより、誘導された細胞の割合を算出する誘導状態監視装置を、さらに備えていてもよい。あるいは、誘導状態監視装置は、抗体免疫染色法又はＲＮＡ抽出法により、誘導された細胞の割合を特定してもよい。さらに、細胞処理装置は、磁気細胞分離方法やフローサイトメトリー等により、誘導されていない細胞を取り除く、未誘導細胞除去装置を備えていてもよい。
【０１０５】
拡大培養装置７０は、細胞塊を含む溶液を、拡大培養送液路７１を介して、第１の分割機構６０に送る。第１の分割機構６０で分割された細胞塊は、再び拡大培養装置７０内で培養される。必要な細胞の量が得られるまで、第１の分割機構６０における細胞塊の分割と、拡大培養装置７０内での細胞塊の培養が繰り返される。
【０１０６】
拡大培養装置７０中の細胞塊を含む溶液を、拡大培養送液路７１を介して、第１の分割機構６０に送り出すポンプは、例えば、細胞塊の大きさの値が、所定の閾値以上になった場合に、駆動されてもよい。あるいは、細胞塊を含む溶液を第１細胞塊送液路５１に送り出すポンプは、例えば、細胞塊の密度の値が、所定の閾値以上になった場合に、駆動されてもよい。
【０１０７】
拡大培養装置７０には、第２細胞塊送液路７２が接続されている。拡大培養装置７０は、拡大培養された細胞塊の含有液を、ポンプ等を用いて、第２細胞塊送液路７２に送り出す。第２細胞塊送液路７２は、所定の大きさ未満の誘導された細胞のみを通す内径を有し、所定の大きさ以上の誘導されていない細胞を除去する分岐流路に接続されていてもよい。
【０１０８】
第２細胞塊送液路７２の内壁には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡをコーティングして、細胞非接着性にしてもよい。あるいは、第２細胞塊送液路７２の材料に、細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、第２細胞塊送液路７２の材料に、温度伝導率が良く、二酸化炭素透過性の材料を用いることにより、第２細胞塊送液路７２内の条件が、周囲の管理された温度及び二酸化炭素濃度と同等になる。さらに、第２細胞塊送液路７２には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。
【０１０９】
第２細胞塊送液路７２は、第２の分割機構８０に接続されている。第２の分割機構８０は、例えば、メッシュを備える。溶液に含まれる細胞塊は、水圧によってメッシュを通過する際、メッシュの各孔の大きさの複数の細胞塊に分割される。例えば、メッシュの各孔の大きさが均一であれば、分割後の複数の細胞塊の大きさも、ほぼ均一となる。あるいは、第２の分割機構８０は、ノズルを備えていてもよい。例えば、略円錐状のノズルの内部を階段状に微細加工することにより、溶液に含まれる細胞塊がノズルを通過する際に、複数の細胞塊に分割される。
【０１１０】
第２の分割機構８０に、複数の細胞魂をパッケージ装置１００に順次送る細胞魂搬送機構９０が接続されている。細胞魂搬送機構９０と、パッケージ装置１００と、の間には、パッケージ前細胞流路９１が接続されている。細胞魂搬送機構９０は、ポンプ等を用いて、第２の分割機構８０で分割された細胞塊のそれぞれを、パッケージ前細胞流路９１を介して、パッケージ装置１００に順次送る。
【０１１１】
パッケージ前細胞流路９１には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡをコーティングしてもよい。あるいは、パッケージ前細胞流路９１の材料に、細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、パッケージ前細胞流路９１の材料に、温度伝導率が良く、二酸化炭素透過性の材料を用いることにより、パッケージ前細胞流路９１内の条件が、周囲の管理された温度及び二酸化炭素濃度と同等になる。パッケージ前細胞流路９１には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。
【０１１２】
パッケージ前細胞流路９１には、凍結保存液送液機構１１０が接続されている。凍結保存液送液機構１１０は、細胞凍結保存液をパッケージ前細胞流路９１に送り込む。これにより、パッケージ前細胞流路９１内で、細胞塊が細胞凍結保存液で懸濁される。
【０１１３】
パッケージ装置１００は、パッケージ前細胞流路９１を介して送られてきた複数の細胞塊のそれぞれを順次凍結する。例えば、パッケージ装置１００は、細胞塊を受け取るたびに細胞塊をクライオチューブ等の凍結保存容器に入れ、細胞塊溶液を例えば−８０℃以下で瞬間的に凍結する。体積あたりの表面積が小さい凍結保存容器を用いると、凍結に時間がかかる傾向にあるため、体積あたりの表面積が大きい凍結保存容器を用いることが好ましい。体積あたりの表面積が大きい凍結保存容器を用いることにより、解凍後の細胞の生存率を高くすることが可能となる。凍結保存容器の形状としては、キャピラリー状及び球状が挙げられるが、これらに限定されない。また、必要とされる解凍後の細胞の生存率によっては、必ずしも瞬間凍結をしなくともよい。
【０１１４】
凍結には、例えば、ガラス化（Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を用いる。この場合、細胞凍結保存液としては、ＤＡＰ２１３（コスモバイオ株式会社）及びＦｒｅｅｚｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル株式会社）が使用可能である。凍結は、ガラス化法以外の通常の方法で行ってもよい。この場合、細胞凍結保存液としては、ＣｒｙｏＤｅｆｅｎｄ−Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（Ｒ＆Ｄシステム社）や、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標、日本全薬工業株式会社）等が使用可能である。凍結は、液体窒素によって行ってもよいし、ペルチェ素子によっておこなってもよい。ペルチェ素子を用いると、温度変化を制御したり、温度のムラを抑制したりすることが可能となる。凍結細胞が臨床用途である場合は、凍結保存容器は完全閉鎖系であることが好ましい。ただし、パッケージ装置１００は、幹細胞を凍結することなく、保存容器内にパッケージしてもよい。
【０１１５】
あるいは、パッケージ装置１００においては、図１３に示すような溶液置換器１０１を用いて、細胞塊の溶液を培地から凍結保存液に置換してもよい。溶液置換器１０１の内部には、底面上に、細胞塊が透過しない細孔が設けられたフィルター１０２が設けられている。また、溶液置換器１０１には、内部のフィルター１０２上に細胞塊を含む培地を送液する第１の送液流路１０３が接続された細胞塊導入孔、内部のフィルター１０２上に細胞塊を含まない凍結液を送液する第２の送液流路１０４が接続された置換溶液導入孔、内部のフィルター１０２上から細胞塊を含む凍結液を排出する第１の排出流路１０５が接続された細胞塊流出孔が設けられている。さらに、溶液置換器１０１には、フィルター１０２を透過した溶液を排出する第２の排出流路１０６が接続された廃液流出孔が設けられている。第１の送液流路１０３、第２の送液流路１０４、第１の排出流路１０５、及び第２の排出流路１０６のそれぞれには、チューブ等が使用可能である。
【０１１６】
まず、図１３（ａ）及び図１３（ｂ）に示すように、第２の排出流路１０６における溶液の流動を停止させた状態で、第１の送液流路１０３から溶液置換器１０１内部に、細胞塊を含む培地を入れる。次に、図１３（ｃ）に示すように、第２の排出流路１０６における溶液の流動を許容する状態にし、培地を溶液置換器１０１から排出する。この際、図１３（ｄ）に示すように、細胞塊は、フィルター１０２上に残る。さらに、図１３（ｅ）及び図１３（ｆ）に示すように、第２の排出流路１０６における溶液の流動を停止させた状態で、第２の送液流路１０４から溶液置換器１０１内部に、凍結保存液を入れ、凍結保存液中に細胞塊を分散させる。その後、図１３（ｇ）に示すように、第１の排出流路１０５から、細胞塊を含む凍結保存液を排出する。細胞塊を含む凍結保存液は、第１の排出流路１０５を経由して、凍結保存容器等に送られる。
【０１１７】
図１に示す細胞処理装置は、分離装置１０、導入前細胞送液路２０、誘導因子送液機構２１、因子導入装置３０、細胞塊作製装置４０、及びパッケージ装置１００等の動作記録、並びに撮影装置が撮影した画像を、有線又は無線により、外部のサーバーに送信してもよい。また、外部のサーバーにおいて、ニューラルネットワークにより、例えば、誘導因子導入条件、培養条件、及び凍結条件等の条件と、幹細胞の不完全な初期化、幹細胞の分化及び増殖の失敗、及び染色体異常等の結果と、の関連を分析し、結果を導く条件を抽出したり、結果を予測したりしてもよい。さらに、外部サーバーは、標準作業手順（ＳＯＰ）に基づいて、細胞処理装置の分離装置１０、誘導因子送液機構２１、因子導入装置３０、細胞塊作製装置４０、及びパッケージ装置１００等を制御し、ＳＯＰに基づいて各装置が稼働しているか否かを監視し、各装置の稼働記録を自動的に生成してもよい。
【０１１８】
以上説明した細胞処理装置によれば、自動で、ｉＰＳ細胞等の幹細胞の誘導を行うことが可能である。
【０１１９】
なお、実施形態に係る細胞処理装置は、図１に示す構成に限定されない。例えば、図１４に示す細胞処理装置においては、血液保存部２０１から単核球分離部２０３に、血液送液路２０２を経由して血液が送液される。血液保存部２０１及び単核球分離部２０３としては、例えばチューブが使用可能である。血液送液路２０２は、例えば、樹脂チューブやシリコンチューブ等である。後述する他の送液路も同様である。血液保存部２０１には、バーコード等の識別子を付けて、血液の情報を管理してもよい。送液には、ポンプ２０４が使用される。
【０１２０】
ポンプ２０４としては、容積式ポンプが使用可能である。容積式ポンプの例としては、ピストンポンプ、プランジャーポンプ、及びダイヤフラムポンプを含む往復ポンプ、あるいは、ギアポンプ、ベーンポンプ、及びネジポンプを含む回転ポンプが挙げられる。ダイヤフラムポンプの例としては、チュービングポンプ及び圧電（ピエゾ）ポンプが挙げられる。チュービングポンプの例としては、ペリスタポンプ（登録商標、アトー株式会社）、並びにＲＰ−Ｑ１及びＲＰ−ＴＸ（高砂電気工業株式会社）が挙げられる。圧電ポンプの例としては、ＳＤＭＰ３０４、ＳＤＰ３０６、ＳＤＭ３２０、及びＡＰＰ−２０ＫＧ（高砂電気工業株式会社）が挙げられる。また、様々な種類のポンプを組み合わせたマイクロ流体チップモジュール（高砂電気工業株式会社）を用いてもよい。
【０１２１】
ペリスタポンプ（登録商標）、チュービングポンプ、及びダイヤフラムポンプ等の密閉型ポンプを用いると、血液送液路２０２内部の血液にポンプが直接接触することなく、送液することが可能である。後述する他のポンプにおいても同様である。あるいは、ポンプ２０４、並びに後述するポンプ２０７、ポンプ２１６、ポンプ２２２、ポンプ２２５、ポンプ２３４、ポンプ２４２、及びポンプ２５２としては、シリンジポンプを使用してもよい。密閉型ポンプ以外のポンプであっても、加熱滅菌処理等により再利用が可能である。
【０１２２】
単核球分離部２０３には、分離剤保存部２０５から、送液路２０６及びポンプ２０７を介して、赤血球凝固剤が送られる。分離剤保存部２０５としては、例えばチューブが使用可能である。分離剤保存部２０５には、バーコード等の識別子を付けて、分離剤の情報を管理してもよい。赤血球凝固剤としては、例えば、ＨｅｔａＳｅｐ（登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）や赤血球凝固剤（ニプロ）等が使用可能である。単核球分離部２０３内において、赤血球凝固剤によって赤血球が沈降し、単核球細胞が分離される。単核球分離部２０３内の単核球細胞を含む上澄みは、単核球送液路２０８及びポンプ２０９を介して、単核球精製フィルター２１０に送られる。単核球精製フィルター２１０において、単核球細胞以外の成分が除去され、単核球細胞を含む溶液が得られる。単核球精製フィルター２１０としては、Ｐｕｒｅｃｅｌｌ（登録商標、ＰＡＬＬ）、セルソーバＥ（旭化成株式会社）、セパセルＰＬ（旭化成株式会社）、アダカラム（登録商標、ＪＩＭＲＯ）、及び分離バック（二プロ株式会社）等が使用可能である。
【０１２３】
図１４においては、単核球分離部２０３、分離剤保存部２０５、単核球精製フィルター２１０、及びポンプ２０４、２０７、２０９等が、分離装置を構成している。
【０１２４】
単核球細胞を含む溶液は、導入前細胞送液路２１１及びポンプ２１２を介して、因子導入部２１３に送られる。因子導入部２１３としては、例えばチューブが使用可能である。因子導入部２１３には、多能性誘導因子を含む因子保存部２１４から、因子送液路２１５及びポンプ２１６を介して、多能性誘導因子が送られる。因子保存部２１４としては、例えばチューブが使用可能である。因子保存部２１４には、バーコード等の識別子を付けて、多能性誘導因子の情報を管理してもよい。因子保存部２１４及びポンプ２１６等が、誘導因子送液機構を構成している。因子導入装置としての因子導入部２１３において、多能性誘導因子が、例えばＲＮＡリポフェクション法によって細胞に導入され、誘導因子導入細胞が作製される。ただし、誘導因子のトランスフェクションの方法は、ＲＮＡリポフェクション法に限定されない。例えば、多能性誘導因子を含むセンダイウイルスベクターを用いてもよい。あるいは、多能性誘導因子がタンパク質であってもよい。
【０１２５】
誘導因子導入細胞は、導入細胞送液路２１７及びポンプ２１８を介して、細胞塊作製装置の一部としての初期化浮遊培養器２１９に送られる。導入細胞送液路２１７は、例えば、温度透過性かつ二酸化炭素透過性である。初期化浮遊培養器２１９は、例えば、図４から図１０に示したような構造を備える。この場合、誘導因子導入細胞は、透析チューブ内に入れられる。あるいは、初期化浮遊培養器２１９は、例えば、図１１及び図１２に示したような構造を備える。この場合、誘導因子導入細胞は、容器内に入れられる。
【０１２６】
図１４に示す初期化浮遊培養器２１９には、細胞に多能性誘導因子が導入されてから最初の数日間、血液細胞培地を含む血液細胞培地保存部２２０から、培地送液路２２１及びポンプ２２２を介して、血液細胞培地が補給される。培地送液路２２１は、例えば、温度透過性かつ二酸化炭素透過性である。血液細胞培地保存部２２０には、バーコード等の識別子を付けて、血液細胞培地の情報を管理してもよい。血液細胞培地保存部２２０、培地送液路２２１、及びポンプ２２２は、培地補給装置を構成している。ポンプ２２２は、血液細胞培地を連続的に補給してもよいし、血液細胞培地を所定のタイミングで補給してもよい。
【０１２７】
その後、初期化浮遊培養器２１９には、幹細胞培地を含む幹細胞培地保存部２２３から、培地送液路２２４及びポンプ２２５を介して、幹細胞培地が補給される。幹細胞培地保存部２２３には、バーコード等の識別子を付けて、幹細胞培地の情報を管理してもよい。培地送液路２２４は、例えば、温度透過性かつ二酸化炭素透過性である。幹細胞培地保存部２２３、培地送液路２２４、及びポンプ２２５は、培地補給装置を構成している。ポンプ２２５は、幹細胞培地を連続的に補給してもよいし、幹細胞培地を所定のタイミングで補給してもよい。
【０１２８】
血液細胞培地保存部２２０及び幹細胞培地保存部２２３は、例えば、冷蔵保存部２６０で４℃等の低温で冷蔵保存されていてもよい。血液細胞培地保存部２２０及び幹細胞培地保存部２２３から送られる培地は、例えば、冷蔵保存部２６０の外の加熱器で３７℃に昇温されてから培養器に送れてもよい。あるいは、低温保存されていた培地は、送液路を進む間に３７℃に昇温するよう、送液路の周囲の温度を設定してもよい。初期化浮遊培養器２１９内の古くなった培地は、廃液送液路２２６及びポンプ２２７を介して、廃液保管部２２８に送られる。廃液保管部２２８には、バーコード等の識別子を付けて、廃液の情報を管理してもよい。
【０１２９】
初期化浮遊培養器２１９で培養された細胞塊は、導入細胞送液路２２９、ポンプ２３０、及び細胞塊分割器２３１を介して、細胞塊作製装置の一部としての第１の拡大浮遊培養器２３２へ送られる。細胞塊分割器２３１を通過することにより、細胞塊は、より小さな細胞塊に分割される。第１の拡大浮遊培養器２３２は、例えば、図４から図１０に示したような構造を備える。この場合、細胞塊は、透析チューブ内に入れられる。あるいは、第１の拡大浮遊培養器２３２は、例えば、図１１及び図１２に示したような構造を備える。この場合、細胞塊は、容器内に入れられる。
【０１３０】
図１４に示す第１の拡大浮遊培養器２３２には、幹細胞培地を含む幹細胞培地保存部２２３から、培地送液路２３３及びポンプ２３４を介して、幹細胞培地が補給される。導入細胞送液路２２９及び培地送液路２３３は、例えば、温度透過性かつ二酸化炭素透過性である。幹細胞培地保存部２２３、培地送液路２３３、及びポンプ２３４は、培地補給装置を構成している。ポンプ２３４は、幹細胞培地を連続的に補給してもよいし、幹細胞培地を所定のタイミングで補給してもよい。
【０１３１】
第１の拡大浮遊培養器２３２内の古くなった培地は、廃液送液路２３５及びポンプ２３６を介して、廃液保管部２２８に送られる。
【０１３２】
第１の拡大浮遊培養器２３２で培養された細胞塊は、導入細胞送液路２３７、ポンプ２３８、細胞塊分割器２３９を経て、細胞塊作製装置の一部としての第２の拡大浮遊培養器２４０へ送られる。細胞塊分割器２３９を通過することにより、細胞塊は、より小さな細胞塊に分割される。図１４に示す第２の拡大浮遊培養器２４０、例えば、図４から図１０に示したような構造を備える。この場合、細胞塊は、透析チューブ内に入れられる。あるいは、第２の拡大浮遊培養器２４０、例えば、図１１及び図１２に示したような構造を備える。この場合、細胞塊は、容器内に入れられる。
【０１３３】
図１４に示す第２の拡大浮遊培養器２４０には、幹細胞培地を含む幹細胞培地保存部２２３から、培地送液路２４１及びポンプ２４２を介して、幹細胞培地が補給される。導入細胞送液路２３７及び培地送液路２４１は、例えば、温度透過性かつ二酸化炭素透過性である。幹細胞培地保存部２２３、培地送液路２４１、及びポンプ２４２は、培地補給装置を構成している。ポンプ２４２は、幹細胞培地を連続的に補給してもよいし、幹細胞培地を所定のタイミングで補給してもよい。
【０１３４】
第２の拡大浮遊培養器２４０内の古くなった培地は、廃液送液路２４３及びポンプ２４４を介して、廃液保管部２２８に送られる。
【０１３５】
第２の拡大浮遊培養器２４０で培養された細胞塊は、導入細胞送液路２４５及びポンプ２４６を経て、溶液置換器２４７へ送られる。溶液置換器２４７は、例えば図１３に示す構成を備えていてもよい。図１４に示す溶液置換器２４７内において、細胞塊はフィルターで保持され、培地は、廃液送液路２４８及びポンプ２４９を介して、廃液保管部２２８に送られる。
【０１３６】
ポンプ２４９の駆動停止により廃液送液路２４８内の溶液の流動を停止した後、あるいは弁等で廃液送液路２４８を閉じた後、溶液置換器２４７には、凍結保存液を含む凍結保存液保存部２５０から、送液路２５１及びポンプ２５２を介して、凍結保存液が入れられる。これにより、凍結保存液中に細胞塊が分散する。
【０１３７】
細胞塊を分散させた凍結保存液は、パッケージ装置の一部としての送液路２５３及びポンプ２５４を介して、凍結保存容器２５５内に送られる。凍結保存容器２５５は、低温保管庫２５６に入れられている。低温保管庫２５６には、液体窒素保管庫２５７から送液路２５８を介して、例えば−８０℃の液体窒素が送られる。これにより、凍結保存容器２５５内の細胞塊が凍結させられる。ただし、細胞塊の凍結は、液体窒素に依らなくともよい。例えば、低温保管庫２５６が、圧縮式冷凍庫、吸収式冷凍庫、あるいはペルチェ式冷凍庫等の冷凍庫であってもよい。
【０１３８】
上述した送液路には、適宜、逆流防止弁を設けてもよい。上述した送液路、単核球分離部２０３、単核球精製フィルター２１０、因子導入部２１３、初期化浮遊培養器２１９、第１の拡大浮遊培養器２３２、第２の拡大浮遊培養器２４０、及び溶液置換器２４７等は、例えば部材２５９に配置されている。部材２５９の材料は、例えば樹脂であるが、これに限定されない。部材２５９は、例えば、滅菌処理可能な耐熱性材料からなる。部材２５９の形状は、板状であってもよいし、カセット状であってもよい。また、部材２５９は、可撓性のバックであってもよい。培地が流れる送液路は、例えば、二酸化炭素透過性材料からなる。また、上述した送液路、単核球分離部２０３、単核球精製フィルター２１０、因子導入部２１３、初期化浮遊培養器２１９、第１の拡大浮遊培養器２３２、第２の拡大浮遊培養器２４０、及び溶液置換器２４７等は、複数のケースに分割されて格納されてもよい。
【０１３９】
例えば、部材２５９及び部材２５９に設けられた流路等は使い捨て可能であり、細胞塊の凍結が完了した後は、廃棄して、新しいものと交換してもよい。あるいは、部材２５９及び部材２５９に設けられた流路等を再利用する場合は、部材２５９にバーコード等の識別子を付け、使用回数等を管理してもよい。
【０１４０】
以上説明した実施形態に係る細胞処理装置によれば、自動的にｉＰＳ細胞等の幹細胞を誘導することが可能である。
【０１４１】
上記のように、本発明を実施形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施形態、実施形態及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、因子導入装置３０は、エレクトロポレーションやＲＮＡリポフェクションではなく、レトロウイルス、レンチウイルス、及びセンダイウイルス等のウイルスベクターや、プラスミドを用いるトランスフェクション、あるいはタンパク質トランスフェクションにより、細胞を誘導してもよい。また、導入前細胞送液路２０、導入細胞送液路３１、細胞塊送液路５１、拡大培養送液路７１、細胞塊送液路７２、及びパッケージ前細胞流路９１はマイクロフルイディクス技術により基板上に設けられていてもよい。この様に、本発明はここでは記載していない様々な実施形態等を包含するということを理解すべきである。
【実施例】
【０１４２】
（実施例１）
ゲル培地ではない液体培地である、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に懸濁した５×１０６個の繊維芽細胞（ＨＤＦ１４１９、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）を、ウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを３７℃のＣＯ２インキュベーター中に静置して、繊維芽細胞を接着培養した。２４時間後、パントロピックレトロウイルス発現システム（Ｐｌａｔ−ＧＰ、Ｐａｎｔｒｏｐｉｃ、Ｐｌａｔ−ＧＰ）を用いて、繊維芽細胞に初期化因子ＯＳＫＭ（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ）を導入した。その後７日間、２４時間ごとに培地を交換した。【０１４３】
０．２５％のトリプシンを利用して細胞をウェルからはがし、細胞数を測定した。さらに、ｂＦＧＦを含有していないｈＥＳ培地（Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル）に脱アシル化ジェランガムが０．０２質量％になるよう添加して、ゲル培地を用意した。用意したゲル培地に、濃度が１×１０５個／ｍＬになるよう細胞を懸濁し、培養器の容器に入れた。その後、マグネットとスターラーを利用して、ＣＯ２インキュベーター中で細胞の攪拌浮遊培養を２２日間行った。その間、４８時間ごとに、１０ｍＬの培地を培養器に添加した。【０１４４】
培養後、図１５の写真に示すように、細胞塊の形成が確認された。後述するゲル培地ではない液体培地を使った場合（図１８）と比較して、細胞塊の大きさは均一であった。回収した細胞の一部を、未分化であることを示す細胞表面マーカーであるＴＲＡ−１−６０に対する抗体を用いて、ＦＡＣＳで解析したところ、図１６に示すように、細胞がＴＲＡ−１−６０陽性であることが確認された。回収した残りの細胞は、フィーダー細胞上に播種し、５日間培養した。その後、パラホルムアルデヒドで細胞コロニーを固定し、ＯＣＴ３／４に対する抗体で細胞を免疫染色したところ、図１７に示すように、細胞がＯＣＴ３／４陽性であることが確認された。したがって、繊維芽細胞からｉＰＳ細胞が誘導されたことが示された。【０１４５】
（実施例２）
実施例１と同様に、繊維芽細胞に初期化因子ＯＳＫＭ（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ）を導入した。その後７日間、２４時間ごとに培地を交換した。【０１４６】
０．２５％のトリプシンを利用して細胞をウェルからはがし、細胞数を測定した。さらに、ｂＦＧＦを含有しているｈＥＳ培地（Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル）を用意した。当該培地は、ポリマーを添加しておらず、ゲル培地ではない液体培地であった。用意した液体培地に、濃度が１×１０５個／ｍＬになるよう細胞を懸濁し、培養器の容器に入れた。その後、マグネットとスターラーを利用して、ＣＯ２インキュベーター中で細胞の攪拌浮遊培養を８日間行った。その間、４８時間ごとに、１０ｍＬの培地を培養器に添加した。【０１４７】
培養後、図１８の写真に示すように、細胞塊の形成が確認された。回収した細胞の一部を、未分化であることを示す細胞表面マーカーであるＴＲＡ−１−６０に対する抗体を用いて、ＦＡＣＳで解析したところ、図１９に示すように、細胞がＴＲＡ−１−６０陽性であることが確認された。回収した残りの細胞は、フィーダー細胞上に播種し、５日間培養した。その後、パラホルムアルデヒドで細胞コロニーを固定し、ＯＣＴ３／４に対する抗体で細胞を免疫染色したところ、図２０に示すように、細胞がＯＣＴ３／４陽性であることが確認された。したがって、繊維芽細胞を初期化し、ｉＰＳ細胞が誘導されたことが示された。【０１４８】
（実施例３）
実施例１と同様に、繊維芽細胞に初期化因子ＯＳＫＭ（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ）を導入した。その後７日間、２４時間ごとに培地を交換した。【０１４９】
０．２５％のトリプシンを利用して細胞をウェルからはがし、細胞数を測定した。さらに、ｂＦＧＦを含有していないｈＥＳ培地（Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル）に脱アシル化ジェランガムが０．０２質量％になるよう添加して、ゲル培地を用意した。用意したゲル培地に、濃度が１×１０５個／ｍＬになるよう細胞を懸濁し、透析チューブを有しない培養器又は図５に示すような培養器の透析チューブに入れた。【０１５０】
いずれの培養器も、ＣＯ２インキュベーター中に配置した。その後、透析チューブを有しない培養器においては、ゲル培地を撹拌することなく、細胞を２０日間浮遊培養した。一方、透析チューブを有する培養器においては、マグネットとスターラーを利用して、透析チューブの外側の容器内のゲル培地を撹拌し、細胞の浮遊培養を２０日間行った。その間、４８時間ごとに、１０ｍＬの培地を培養器に添加した。【０１５１】
培養後、図２１の写真に示すように、細胞塊の形成が確認された。回収した細胞の数を計測したところ、図２２に示すように、細胞を透析チューブに入れて撹拌培養した場合の方が、透析チューブに入れなかった場合より、細胞数が多かった。このことは、透析チューブの外側の撹拌されている培地から、栄養成分等が透析チューブ内の細胞に効率的に補給されていたことを示している。回収した細胞は、フィーダー細胞上に播種し、５日間培養した。その後、パラホルムアルデヒドで細胞コロニーを固定し、ＯＣＴ３／４に対する抗体で細胞を免疫染色したところ、図２３（透析チューブを用いて培養）及び図２４（透析チューブを用いずに培養）に示すように、細胞がＯＣＴ３／４陽性であることが確認された。したがって、繊維芽細胞からｉＰＳ細胞が誘導されたことが示された。
【符号の説明】
【０１５２】
１０・・・分離装置、２０・・・導入前細胞送液路、２１・・・誘導因子送液機構、３０・・・因子導入装置、３１・・・導入細胞送液路、４０・・・細胞塊作製装置、５０・・・初期化培養装置、５１・・・細胞塊送液路、６０・・・分割機構、７０・・・拡大培養装置、７１・・・拡大培養送液路、７２・・・細胞塊送液路、７４・・・駆動装置、７５・・・透析チューブ、７６・・・容器、８０・・・分割機構、９０・・・細胞魂搬送機構、９１・・・パッケージ前細胞流路、１００・・・パッケージ装置、１０１・・・溶液置換器、１０２・・・フィルター、１０３・・・送液流路、１０４・・・送液流路、１０５・・・排出流路、１０６・・・排出流路、１１０・・・凍結保存液送液機構、２０１・・・血液保存部、２０２・・・血液送液路、２０３・・・単核球分離部、２０４・・・ポンプ、２０５・・・分離剤保存部、２０６・・・送液路、２０７・・・ポンプ、２０８・・・単核球送液路、２０９・・・ポンプ、２１０・・・単核球精製フィルター、２１１・・・導入前細胞送液路、２１２・・・ポンプ、２１３・・・因子導入部、２１４・・・因子保存部、２１５・・・因子送液路、２１６・・・ポンプ、２１７・・・導入細胞送液路、２１８・・・ポンプ、２１９・・・初期化浮遊培養器、２２０・・・血液細胞培地保存部、２２１・・・培地送液路、２２２・・・ポンプ、２２３・・・幹細胞培地保存部、２２４・・・培地送液路、２２５・・・ポンプ、２２６・・・廃液送液路、２２７・・・ポンプ、２２８・・・廃液保管部、２２９・・・導入細胞送液路、２３０・・・ポンプ、２３１・・・細胞塊分割器、２３２・・・拡大浮遊培養器、２３３・・・培地送液路、２３４・・・ポンプ、２３５・・・廃液送液路、２３６・・・ポンプ、２３７・・・導入細胞送液路、２３８・・・ポンプ、２３９・・・細胞塊分割器、２４０・・・拡大浮遊培養器、２４１・・・培地送液路、２４２・・・ポンプ、２４３・・・廃液送液路、２４４・・・ポンプ、２４５・・・導入細胞送液路、２４６・・・ポンプ、２４７・・・溶液置換器、２４８・・・廃液送液路、２４９・・・ポンプ、２５０・・・凍結保存液保存部、２５１・・・送液路、２５２・・・ポンプ、２５３・・・送液路、２５４・・・ポンプ、２５５・・・凍結保存容器、２５６・・・低温保管庫、２５７・・・液体窒素保管庫、２５８・・・送液路、２５９・・・部材、２６０・・・冷蔵保存部、２７１・・・攪拌部材、２７２・・・溝、２７３・・・連通孔、２７４・・・連通孔、２７５・・・連通孔、２７６・・・連通孔
【図１】
2018155607.tif 000003
【図２】
2018155607.tif 000004
【図３】
2018155607.tif 000005
【図４】
2018155607.tif 000006
【図５】
2018155607.tif 000007
【図６】
2018155607.tif 000008
【図７】
2018155607.tif 000009
【図８】
2018155607.tif 000010
【図９】
2018155607.tif 000011
【図１０】
2018155607.tif 000012
【図１１】
2018155607.tif 000013
【図１２】
2018155607.tif 000014
【図１３】
2018155607.tif 000015
【図１４】
2018155607.tif 000016
【図１５】
2018155607.tif 000017
【図１６】
2018155607.tif 000018
【図１７】
2018155607.tif 000019
【図１８】
2018155607.tif 000020
【図１９】
2018155607.tif 000021
【図２０】
2018155607.tif 000022
【図２１】
2018155607.tif 000023
【図２２】
2018155607.tif 000024
【図２３】
2018155607.tif 000025
【図２４】
2018155607.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月2日(2019.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置と、
前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞を浮遊培養して前記誘導因子導入細胞から誘導多能性幹細胞を誘導するための浮遊培養器と、
を備える、細胞処理装置。
【請求項２】
前記浮遊培養器内で前記誘導因子導入細胞が初期化される、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項３】
前記浮遊培養器内で前記誘導された細胞が拡大培養される、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項４】
前記浮遊培養器が、
前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に培地が入れられる容器と、
前記容器内の培地を攪拌させるための駆動装置と、
を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項５】
前記容器内に攪拌部材が設けられている、請求項４に記載の細胞処理装置。
【請求項６】
前記駆動装置が、磁力を介して、前記攪拌部材を回転させる、請求項５に記載の細胞処理装置。
【請求項７】
前記浮遊培養器が、
前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、
前記容器内の溝に沿って前記培地が流れるよう、前記容器内に前記培地を供給するポンプと、
を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項８】
前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、前記浮遊培養器の半透膜内に送られる、請求項４から７のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項９】
前記浮遊培養器が、
培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器と、
前記半透膜内に前記培地の液流が生じるよう、前記半透膜内に前記培地を供給するポンプと、
を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項１０】
前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、前記容器内の前記半透膜の外に送られる、請求項９に記載の細胞処理装置。
【請求項１１】
前記浮遊培養器が、
前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器と、
前記容器内の培地を攪拌させるための駆動装置と、
を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項１２】
前記容器内に攪拌部材が設けられている、請求項１１に記載の細胞処理装置。
【請求項１３】
前記駆動装置が、磁力を介して、前記攪拌部材を回転させる、請求項１２に記載の細胞処理装置。
【請求項１４】
前記浮遊培養器が、
前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、
前記容器内の溝に沿って前記培地が流れるよう、前記容器内に前記培地を供給するポンプと、
を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項１５】
前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、前記浮遊培養器の容器内に送られる、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項１６】
前記培地が液体培地である、請求項４から１５のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項１７】
前記培地がゲル培地である、請求項４から１５のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項１８】
誘導因子を導入された誘導因子導入細胞と培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜内に前記誘導因子導入細胞を含む培地を送液するための送液路と
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に培地が入れられる容器と、
前記容器内に設けられた攪拌部材と、
を備え、
前記半透膜内で、前記誘導因子導入細胞を浮遊培養して前記誘導因子導入細胞から誘導多能性幹細胞を誘導するための浮遊培養器。
【請求項１９】
前記容器内の培地を攪拌させるための駆動装置をさらに備える、請求項１８に記載の浮遊培養器。
【請求項２０】
前記駆動装置が、磁力を介して、前記攪拌部材を回転させる、請求項１９に記載の浮遊培養器。
【請求項２１】
誘導因子を導入された誘導因子導入細胞と培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜内に前記誘導因子導入細胞を含む培地を送液するための送液路と
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、
を備え、
前記半透膜内で、前記誘導因子導入細胞を浮遊培養して前記誘導因子導入細胞から誘導多能性幹細胞を誘導するための浮遊培養器。
【請求項２２】
前記容器内の溝に沿って前記培地が流れるよう、前記容器内に前記培地を供給するポンプをさらに備える、請求項２１に記載の浮遊培養器。
【請求項２３】
（削除）
【請求項２４】
（削除）
【請求項２５】
培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に誘導因子を導入された誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器と、
を備え、
前記容器内で、前記誘導因子導入細胞を浮遊培養して前記誘導因子導入細胞から誘導多能性幹細胞を誘導するための浮遊培養器。
【請求項２６】
前記半透膜内に前記培地の液流が生じるよう、前記半透膜内に前記培地を供給するポンプをさらに備える、請求項２５に記載の浮遊培養器。
【請求項２７】
前記培地が液体培地である、請求項１８から２２、２５、及び２６のいずれか１項に記載の浮遊培養器。
【請求項２８】
前記培地がゲル培地である、請求項１８から２２、２５、及び２６のいずれか１項に記載の浮遊培養器。
【請求項２９】
細胞に誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製することと、
前記誘導因子導入細胞を浮遊培養して前記誘導因子導入細胞から誘導多能性幹細胞を誘導することと、
を含む、幹細胞の誘導方法。
【請求項３０】
前記浮遊培養が、攪拌培養である、請求項２９に記載の幹細胞の誘導方法。
【請求項３１】
前記誘導因子導入細胞を浮遊培養する際に液体培地が用いられる、請求項２９又は３０に記載の幹細胞の誘導方法。
【請求項３２】
前記誘導因子導入細胞を浮遊培養する際にゲル培地が用いられる、請求項２９又は３０に記載の幹細胞の誘導方法。
【請求項３３】
（削除）
【請求項３４】
（削除）
【請求項３５】
（削除）
【請求項３６】
（削除）
【請求項３７】
前記浮遊培養器が半透膜を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項３８】
前記因子導入装置で作製された前記誘導因子導入細胞が、前記浮遊培養器に送られる、請求項３７に記載の細胞処理装置。
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月20日(2019.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置と、
前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞を浮遊培養して前記誘導因子導入細胞から誘導多能性幹細胞を誘導するための浮遊培養器と、
を備える、細胞処理装置。
【請求項２】
前記浮遊培養器内で前記誘導因子導入細胞が初期化される、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項３】
前記浮遊培養器内で前記誘導された細胞が拡大培養される、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項４】
前記浮遊培養器が、
前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に培地が入れられる容器と、
前記容器内の培地を攪拌させるための駆動装置と、
を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項５】
前記容器内に攪拌部材が設けられている、請求項４に記載の細胞処理装置。
【請求項６】
前記駆動装置が、磁力を介して、前記攪拌部材を回転させる、請求項５に記載の細胞処理装置。
【請求項７】
前記浮遊培養器が、
前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、
前記容器内の溝に沿って前記培地が流れるよう、前記容器内に前記培地を供給するポンプと、
を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項８】
前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、前記浮遊培養器の半透膜内に送られる、請求項４から７のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項９】
前記浮遊培養器が、
培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器と、
前記半透膜内に前記培地の液流が生じるよう、前記半透膜内に前記培地を供給するポンプと、
を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項１０】
前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、前記容器内の前記半透膜の外に送られる、請求項９に記載の細胞処理装置。
【請求項１１】
前記浮遊培養器が、
前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器と、
前記容器内の培地を攪拌させるための駆動装置と、
を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項１２】
前記容器内に攪拌部材が設けられている、請求項１１に記載の細胞処理装置。
【請求項１３】
前記駆動装置が、磁力を介して、前記攪拌部材を回転させる、請求項１２に記載の細胞処理装置。
【請求項１４】
前記浮遊培養器が、
前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、
前記容器内の溝に沿って前記培地が流れるよう、前記容器内に前記培地を供給するポンプと、
を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項１５】
前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、前記浮遊培養器の容器内に送られる、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項１６】
前記培地が液体培地である、請求項４から１５のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項１７】
前記培地がゲル培地である、請求項４から１５のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項１８】
誘導因子を導入された誘導因子導入細胞と培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜内に前記誘導因子導入細胞を含む培地を送液するための送液路と
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に培地が入れられる容器と、
前記容器内に設けられた攪拌部材と、
を備え、
前記半透膜内で、前記誘導因子導入細胞を浮遊培養して前記誘導因子導入細胞から誘導多能性幹細胞を誘導するための浮遊培養器。
【請求項１９】
前記容器内の培地を攪拌させるための駆動装置をさらに備える、請求項１８に記載の浮遊培養器。
【請求項２０】
前記駆動装置が、磁力を介して、前記攪拌部材を回転させる、請求項１９に記載の浮遊培養器。
【請求項２１】
誘導因子を導入された誘導因子導入細胞と培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜内に前記誘導因子導入細胞を含む培地を送液するための送液路と
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、
を備え、
前記半透膜内で、前記誘導因子導入細胞を浮遊培養して前記誘導因子導入細胞から誘導多能性幹細胞を誘導するための浮遊培養器。
【請求項２２】
前記容器内の溝に沿って前記培地が流れるよう、前記容器内に前記培地を供給するポンプをさらに備える、請求項２１に記載の浮遊培養器。
【請求項２３】
培地が入れられる半透膜と、
前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に誘導因子を導入された誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器と、
を備え、
前記容器内で、前記誘導因子導入細胞を浮遊培養して前記誘導因子導入細胞から誘導多能性幹細胞を誘導するための浮遊培養器。
【請求項２４】
前記半透膜内に前記培地の液流が生じるよう、前記半透膜内に前記培地を供給するポンプをさらに備える、請求項２３に記載の浮遊培養器。
【請求項２５】
前記培地が液体培地である、請求項１８から２４のいずれか１項に記載の浮遊培養器。
【請求項２６】
前記培地がゲル培地である、請求項１８から２４のいずれか１項に記載の浮遊培養器。
【請求項２７】
細胞に誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製することと、
前記誘導因子導入細胞を浮遊培養して前記誘導因子導入細胞から誘導多能性幹細胞を誘導することと、
を含む、幹細胞の誘導方法。
【請求項２８】
前記浮遊培養が、攪拌培養である、請求項２７に記載の幹細胞の誘導方法。
【請求項２９】
前記誘導因子導入細胞を浮遊培養する際に液体培地が用いられる、請求項２７又は２８に記載の幹細胞の誘導方法。
【請求項３０】
前記誘導因子導入細胞を浮遊培養する際にゲル培地が用いられる、請求項２７又は２８に記載の幹細胞の誘導方法。
【請求項３１】
前記浮遊培養器が半透膜を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項３２】
前記因子導入装置で作製された前記誘導因子導入細胞が、前記浮遊培養器に送られる、請求項３１に記載の細胞処理装置。
【国際調査報告】
2018155607.tif 000027
2018155607.tif 000028
2018155607.tif 000029
2018155607.tif 000030
2018155607.tif 000031
2018155607.tif 000032