(57)【要約】  液体媒体の置換を課題とする。試料液体及び第二の液体媒体を含む少なくとも二以上の液体により複数の層流部分からなる層流を形成する工程であって、試料液体が分散状態の目的粒子を含む第一の液体媒体であり、層流が少なくとも試料液体により構成される第一の層流部分と第二の液体媒体により構成される第二の層流部分とを含む工程と；層流に外力を作用させることにより、目的粒子を第一の層流部分から第二の層流部分に移動させる工程であって、目的粒子は外力の作用により第二の層流部分の方向に移動することを可能にする少なくとも一の物理的特性を有する工程と；第二の層流部分から目的粒子を含む層流画分を回収する工程であって、層流画分の回収が、層流の流れ方向に垂直な層流画分回収面から行われ、層流画分回収面と第一の層流部分の断面とが離間している方法、及び該方法を実施するための流路デバイス。
2017221898.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の液体媒体から第二の液体媒体中に目的粒子を移動させることにより、液体媒体を置換する方法であって、
（ｉ）試料液体及び第二の液体媒体を含む、少なくとも二以上の液体をそれぞれ同一方向に送液することにより、複数の層流部分からなる層流を形成する工程であって、
前記試料液体が、分散状態の目的粒子を含む第一の液体媒体であり、
前記層流は少なくとも、前記試料液体により構成される第一の層流部分と、前記第二の液体媒体により構成される第二の層流部分とを含む、工程と、
（ｉｉ）前記層流に外力を作用させることにより、前記目的粒子を前記第一の層流部分から前記第二の層流部分に移動させる工程であって、前記目的粒子は、外力の作用により前記第二の層流部分の方向に移動することを可能にする少なくとも一の物理的特性を有する工程と、
（ｉｉｉ）前記第二の層流部分から、前記目的粒子を含む層流画分を回収する工程であって、前記層流画分の回収が、前記層流の流れ方向に垂直な層流画分回収面から行われ、かつ、前記層流画分回収面と前記第一の層流部分の断面とが離間していることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第一及び第二の層流部分が互いに隣接接触していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一の層流部分及び前記第二の層流部分の間に、少なくとも第三の液体媒体により構成される第三の層流部分が介在していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記外力が、電場、磁場、水力学的濾過、または決定論的側方移動（ＤＬＤ）による外力のいずれか一種以上であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記外力が少なくとも、決定論的側方移動（ＤＬＤ）による外力を含み、前記目的粒子の物理的特性が粒径であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記目的粒子が、生体粒子、ビーズ、ビーズと生体粒子との複合体粒子、のいずれかを少なくとも含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記目的粒子が生体粒子とビーズとの複合体粒子であって、前記第二の液体媒体が前記複合体粒子を解離させて、前記生体粒子を遊離させることができることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生体粒子が、生体分子、細胞外小胞、細胞のいずれかであることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記生体粒子が、生体分子、細胞のいずれかであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体粒子が、細胞であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第一の液体媒体から第二の液体媒体中に目的粒子を移動させることのできる流路デバイスであって、
該流路デバイスが、
（ｉ）前記流路デバイスの前方に、試料液体を導入するための第一の導入口及び第二の液体媒体を導入するための第二の導入口を少なくとも含む複数の導入口と、
（ｉｉ）層流を形成できる流路と、
（ｉｉｉ）前記流路デバイスの後方に、少なくとも第一の排出口及び第二の排出口を含む二以上の排出口と、
（ｉｖ）外力を付与する機構と、
を備え、
前記試料液体が、分散状態の目的粒子を含む第一の液体媒体であり、
前記流路は少なくとも、前記試料液体により構成される第一の層流部分、及び第二の液体媒体により構成される第二の層流部分を含む層流を形成することができ、
前記第二の排出口が、前記外力の作用により前記第二の層流部分に移動してきた前記目的粒子を含む層流画分を、前記層流の流れ方向に垂直な層流画分回収面から回収するための、目的粒子回収用排出口であり、
前記第一の排出口が、前記第二の排出口からみて前記第一の層流部分の側にあり、
前記第一の層流部分の側にある前記第二の排出口の隔壁が、前記層流画分回収面と前記第一の層流部分の断面とが離間するような位置に備えられていることを特徴とする、流路デバイス。
【請求項１２】
前記第一及び第二の層流部分が互いに隣接接触して形成されるように、前記第一及び第二の導入口が隣接して形成されていることを特徴とする、請求項１１に記載の流路デバイス。
【請求項１３】
前記流路デバイスの前方に、第三の液体媒体を導入するための第三の導入口がさらに備えられ、
前記流路が、さらに第三の液体媒体による第三の層流部分をも含む層流を形成することができ、
前記第三の導入口が、前記第三の層流部分が前記第一の層流部分及び前記第二の層流部分の間に介在するように、前記第一の導入口と前記第二の導入口の間に備えられていることを特徴とする、請求項１１に記載の流路デバイス。
【請求項１４】
前記外力を付与する機構が、決定論的側方移動（ＤＬＤ）を利用するための複数の柱状構造による所定の配置パターン構造であることを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の流路デバイス。
【請求項１５】
請求項１１に記載の流路デバイスを複数含む流路デバイス系であって、
前記複数の流路デバイスは直列接続されており、
前記直列接続は、一の流路デバイスの前記第二の排出口と、直列接続の相手方となる他の一の流路デバイスの前記第一の導入口とを接続して形成され、
前記各流路デバイスの外力を付与する機構または外力の強さが互いに異なることを特徴とする、流路デバイス系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体媒体の置換方法、特に目的粒子として、生体粒子、ビーズ、若しくは該生体粒子とビーズとの複合体粒子のいずれかを少なくとも含む液性混合試料の液体媒体を置換する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液性混合試料（例えば血液や培養液、反応溶液）から目的粒子を分離し、液体媒体を置換することは、基礎研究、診断及び治療を行うために必要とされる手法である。【０００３】
一般的に例えば、液性混合試料中に含まれる蛋白質等の液体媒体置換を行う場合、抗体標識磁性粒子を用いて蛋白質等を捕捉し複合体粒子を形成した後、磁力で当該複合体粒子を捕捉し、続いて上清の除去、洗浄を繰り返す事で、目的の液体媒体へと置換する手法が取られている。【０００４】
また遠心分離法等を用いて固有密度（比重）を有する細胞（例えば、白血球と赤血球）を分離する方法や、フローサイトメトリー法といった方法も当該目的に使用できることが知られている。【０００５】
もっとも、目的粒子を含む液性混合試料において、その液体媒体を精度良く置換する方法としては、遠心分離等による液体固体分離を行った後、液体部分を除き、新たな液体媒体を加える操作を繰り返し行う事で置換する方法が従来一般的である。【０００６】
しかしながら、このような従来の方法では、その過程において目的粒子にロスが生じる事が課題となっている。また、精度良く液体媒体の置換を行う事を狙いとする場合には、洗浄を繰り返す必要があるが、とりわけ混合試料中に含まれる目的粒子が希少なものである場合に、その回収率が低減してしまう恐れがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】D.W.Inglis, et al, Critical particle size for fractionation by deterministic lateral displacement, Lab on a Chip, 6, 655-658 (2006).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の課題は、液性試料中の目的粒子の損失を最小限に留めつつ、精度よく、所望の液体媒体に置換する方法及び該方法のためのデバイスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
［本発明の第一の態様］
本発明の第一の態様は、
第一の液体媒体から第二の液体媒体中に目的粒子を移動させることにより、液体媒体を置換する方法であって、
（ｉ）試料液体及び第二の液体媒体を含む、少なくとも二以上の液体をそれぞれ同一方向に送液することにより、複数の層流部分からなる層流を形成する工程であって、
前記試料液体が、分散状態の目的粒子を含む第一の液体媒体であり、
前記層流は少なくとも、前記試料液体により構成される第一の層流部分と、前記第二の液体媒体により構成される第二の層流部分とを含む、工程と、
（ｉｉ）前記層流に外力を作用させることにより、前記目的粒子を前記第一の層流部分から前記第二の層流部分に移動させる工程であって、前記目的粒子は、外力の作用により前記第二の層流部分の方向に移動することを可能にする少なくとも一の物理的特性を有する工程と、
（ｉｉｉ）前記第二の層流部分から、前記目的粒子を含む層流画分を回収する工程であって、前記層流画分の回収が、前記層流の流れ方向に垂直な層流画分回収面から行われ、かつ、前記層流画分回収面と前記第一の層流部分の断面とが離間していることを特徴とする方法、である。【００１０】
［本発明の第二の態様］
本発明の第二の態様は、
第一の液体媒体から第二の液体媒体中に目的粒子を移動させることのできる流路デバイスであって、
該流路デバイスが、
（ｉ）前記流路デバイスの前方に、試料液体を導入するための第一の導入口及び第二の液体媒体を導入するための第二の導入口を少なくとも含む複数の導入口と、
（ｉｉ）層流を形成できる流路と、
（ｉｉｉ）前記流路デバイスの後方に、少なくとも第一の排出口及び第二の排出口を含む二以上の排出口と、
（ｉｖ）外力を付与する機構と、
を備え、
前記試料液体が、分散状態の目的粒子を含む第一の液体媒体であり、
前記流路は少なくとも、前記試料液体により構成される第一の層流部分、及び第二の液体媒体により構成される第二の層流部分を含む層流を形成することができ、
前記第二の排出口が、前記外力の作用により前記第二の層流部分に移動してきた前記目的粒子を含む層流画分を、前記層流の流れ方向に垂直な層流画分回収面から回収するための、目的粒子回収用排出口であり、
前記第一の排出口が、前記第二の排出口からみて前記第一の層流部分の側にあり、
前記第一の層流部分の側にある前記第二の排出口の隔壁が、前記層流画分回収面と前記第一の層流部分の断面とが離間するような位置に備えられていることを特徴とする、流路デバイス、である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来技術に比較し目的粒子の損失をより低減させつつ、精度よく液体媒体の置換をすることができる。【００１２】
また、本発明では連続してその液体媒体の置換をすることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施形態に係る液体媒体の置換方法の一例を説明する模式図である。
【図２】本発明の実施形態に係る３以上の層流部分を用いた液体媒体の置換方法の一例を説明する模式図である。
【図３】本発明の実施形態に係る流路デバイスの基本構造の一例を説明する模式図である。
【図４】本発明の実施形態に係る流路デバイスの一例を説明する模式図である。
【図５】本発明の実施形態に係る３以上の層流部分を構成する流路デバイスの基本構造の一例を説明する模式図である。
【図６】本発明の実施形態に係る流路デバイスの鉛直方向断面図の一例を示す模式図である。
【図７】本発明の実施形態に係る送液部および回収部を備えた流路装置の一例を説明する模式図である。
【図８】本発明の実施形態に係る粒子を移動させる外力の基本原理の一例を説明する模式図である。
【図９】本発明の実施形態に係る決定論的側方移動（ＤＬＤ）構造部分を備えた流路デバイスの一例を説明する模式図である。
【図１０】本発明の実施形態に係る決定論的側方移動（ＤＬＤ）構造部分を備えた流路デバイスの鉛直方向断面図の一例を示す模式図である。
【図１１】本発明の実施例を説明する流路デバイスの一例を示す模式図である。
【図１２】本発明の実施例で用いた流路デバイスの一例の概観図である。
【図１３】本発明の実施例で用いた流路デバイスの一例の構造詳細図である。
【図１４】本発明の実施例で用いた流路デバイス中の層流形成の様子の一例を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［１．本発明の第一の態様の液体媒体の置換方法］
以下、本発明の液体媒体の置換方法について、図を参照しながら説明する。
【００１５】
本発明は、目的粒子１（細胞等を含む生体粒子や、ビーズ、ビーズと生体粒子との複合体粒子）を含む液性の混合試料（試料液体）から、その目的粒子の損失を最小限に留めつつ、混合試料の液体媒体（第一の液体媒体）を所望の第二の液体媒体に置換する方法である。
【００１６】
試料液体とは、分散状態の目的粒子を含む液体媒体（第一の液体媒体）であり、目的粒子を含む液性の混合試料そのものでもよいし、あるいは適宜任意の緩衝液で希釈した液体でもよい。例えば試料液体として、血球細胞を含む血液、リンパ液、唾液、尿、涙等の体液を挙げることができる。
【００１７】
なお、ここでいう第一の液体媒体は、試料液体から目的粒子を除いた残りの部分全部を指すものであり、純粋な液体媒体そのもののみならず、目的粒子以外の含有成分が含まれる場合には、それらも第一の液体媒体を構成するものとして扱う。
【００１８】
液体媒体（培養溶液等）中に懸濁された目的粒子としては、例えば、生体粒子、ビーズ、ビーズと生体粒子との複合体粒子が含まれる。また、より具体的な生体粒子の例としては、生体分子（例えば、核酸、蛋白質、糖、脂質、等）、細胞外小胞（例えば、エクソソーム、アポトーシス小体、等）、細胞が含まれる。このように、目的粒子としては、単一の物質であっても、その他の物質との複合体であっても良い。また、試料液体中に含まれる目的粒子の種類や数は限定されない。複合体粒子を形成するビーズとしては、ビーズに、生体粒子の特徴的構造を認識する対象捕捉分子を結合させたものが例示できる。このような対象捕捉分子としては、抗体、ペプチドアプタマー、レクチン、細胞間接着分子、糖鎖、細胞認識性の高分子が好ましく、このような対象捕捉分子を担持するビーズとしては、ポリスチレンビーズやラテックスビーズ、磁性ビーズ等が好ましい。なお、これらの一例に限定されず、本目的を達成できる手段であれば何ら限定はされず適宜手段を選択し、利用する事ができる。
【００１９】
第二の液体媒体は、目的粒子を受け取るのに好適な任意の液体媒体を用いることができる。もっとも、目的粒子に細胞が含まれ、細胞生存性への影響を回避したい目的であれば、等張液を一種または複数組合せて使用することができ、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）等を使用すれば良い。また、目的粒子に核酸、蛋白質などが含まれる場合、これら物質の変性を回避する目的から、好適な緩衝液を選択することが好ましい。また、第二の液体媒体が、ｐＨ等の調節により、複合体粒子を解離させて目的粒子を遊離させるものであってもよい。なお、目的粒子を液体媒体中で溶解、若しくは任意の反応をさせる場合には、必要に応じて適宜好適な液体媒体を選択すれば良く、前述の限りではない。
【００２０】
本発明の液体媒体の置換方法は、同一方向に並行して流れる、試料液体により構成される第一の層流部分と前記第二の液体媒体により構成される第二の層流部分とを少なくとも含む層流を利用し、目的粒子を、外力の作用により第一の層流部分から第二の層流部分の方向に移動させることで、目的粒子を含む液体媒体を第一の液体媒体から第二の液体媒体に置換するものである。
【００２１】
ここで、層流とは、管内に粘性流体を流す場合において、流体の各部分が管軸に平行に整然と運動し、隣り合った流体部分が混じり合うことのない滑らかな流れのことをいう。これに対して層流でない流れを乱流といい、乱流においては隣り合った流体部分が混じり合う。このような互いに混じり合わないという層流の性質を利用することで、精度よく、液体媒体の置換が可能となる。本発明の方法で用いる層流は、少なくとも試料液体から構成される第一の層流部分と、所望の液体媒体である第二の液体媒体から構成される第二の層流部分を少なくとも含む。ここで、層流部分とは、所定の液体媒体から構成され、所定の流速で一体として流れる層流を意図している。このため、液体媒体が異なる（たとえば、目的粒子以外の含有成分が互いに異なるリン酸緩衝液）場合や、流速が異なる場合（液体媒体の送液装置が異なる場合は、流速が異なるものと看做す）における互いに並行して流れる層流は別個の層流部分として扱う。また、液体媒体が同一であり、同一の送液装置で液体媒体を送液する場合であっても、該送液装置につながる液体媒体導入口が２つに分かれているため、空間的に分離した２つの層流が形成される場合は、それらは別々の層流部分とする（図１３〜図１４の導入口３２Ｂ参照）。もっとも、層流状態をできるだけ乱さないという観点からは、異なる層流部分の単位断面積当たりの流速はできる限り同一に設定することが好ましい。
【００２２】
また、本発明の方法においては、目的粒子は、外力の作用により第二の層流部分の方向に移動することを可能にする少なくとも一の物理的特性を有する。好ましい外力として、電場、磁場、水力学的濾過または決定論的側方移動（ＤＬＤ）による外力のいずれか一種以上を挙げることができ、それぞれに対応する目的粒子の物理的特性は、それぞれ電荷、磁性、粒径である。例えば、目的粒子が磁性を有しているものであれば、層流平面上、流れ方向に対し直角方向へ磁場を与える事で、試料液体から構成される第一の層流部分から目的の液体媒体（第二の液体媒体）から構成される第二の層流部分へ、徐々に移動をさせることができる。流体力学的手法としては、例えば、ＤＬＤを原理とした構造を流路デバイス中に設ける事で、目的粒子の大きさに従い、同様に目的の液体媒体（第二の液体媒体）から構成される第二の層流部分へと移動させることができる。
【００２３】
このような目的粒子の物理的特性は、たとえば生体粒子の物理的性質そのものを利用してもよいが、ビーズと生体粒子との複合体粒子を形成させた際の、ビーズの物理的性質に由来するものであってもよい。たとえばビーズと目的の生体粒子との複合体粒子とすることで、少なくとも粒径のサイズを調節することができる。
【００２４】
本発明の液体媒体の置換方法は、より具体的には、（ｉ）試料液体により構成される第一の層流部分と第二の液体媒体により構成される第二の層流部分とを少なくとも含む層流を形成する工程、（ｉｉ）外力を作用させることにより、目的粒子を試料液体から第二の液体媒体へ移動させる工程、及び（ｉｉｉ）移動してきた目的粒子の層流画分を回収する工程、を含む。
【００２５】
図１には、試料液体により構成される第一の層流部分１１と、所望の液体媒体である第二の液体媒体により構成される第二の層流部分１２とからなる層流とが互いに隣接している一例が図示されており、外力Ｆの作用により目的粒子１が、第一の層流部分１１から第二の層流部分１２に移動する様子が示されている、なお、図１中、１４は層流の流れ方向に垂直な平面である層流画分回収面を示し、この面を通過する第二の層流部分１２の層流画分を回収することで、目的粒子を回収する。
【００２６】
ここで、本発明の方法においては、層流画分回収面と前記第一の層流部分の断面とが離間している。より好ましくは、層流画分回収面は第二の層流部分の断面の内部にある。層流画分回収の際に可能な限り、試料液体の混入を避けるためである。ここで、第一の層流部分の断面とは、第一の層流部分の層流流れ方向に垂直な断面のことをいう。また、離間の程度については、層流画分回収面における層流状態の乱れや層流界面における拡散による液体媒体の移動の影響等を考慮して決定することができる。図１に示される一例においては、少なくとも層流画分回収面は、第二の層流部分の層流流れ方向に垂直な断面の内部にある。
【００２７】
他方、目的粒子の十分な回収率を得る観点からは、できるだけ漏れなく目的粒子を回収できるのに十分な大きさの層流画分回収面を確保することが好ましい。好ましくは９０％以上、より好ましく９５％以上、もっとも好ましくは９９％以上の目的粒子を回収できるのに十分な面積の層流画分回収面を設定することが好ましい。このためには、層流の流速や流路長、外力による目的粒子の移動速度等を調節することにより、層流画分回収面における目的粒子の分布ができるだけ狭くなるように設計することが有利である。特に、流路長を十分長くすることが有利である。
【００２８】
層流の構成としては、図１のように層流部分が２つの場合に限られず、必要に応じて３つ以上としても良い。
【００２９】
例えば試料液体から構成される第一の層流部分と、所望の液体媒体（第二の液体媒体）から構成される第二の層流部分との間に、任意のその他の液体媒体（第三の液体媒体）から構成される第三の層流部分を設ける構造とすることで、層流界面での拡散による液体媒体成分の移動の影響をより一層低減でき、成分の共雑を低減できることや、第三の層流部分を粒子が通過する過程で目的粒子以外の共雑物の洗浄が可能である。このため、より高精度に液体媒体の置換を実施する場合には、第一の層流部分と、第二の層流部分との間に介在する第三の層流部分を設けた構成がより好ましい。
【００３０】
このような構成の一例として図２の構成を一例として挙げることができる。すなわち、図２には、試料液体により構成される第一の層流部分１１と、置き換えたい液体媒体である第二の液体媒体により構成される第二の層流部分１２とに加えて、第一の層流部分と第二の層流部分の間に、第三の液体媒体による第三の層流部分１３をさらに含む層流を用いた一例を図示している。図１１、１３及び１４もこの構成の一例に含まれる。
【００３１】
なお、図２では、層流画分回収面１４が図１と同様、第二の層流部分の断面の内部にある一例が図示されている。しかし、この図２のような構成例では、層流画分１４が第一の層流部分の断面と離間するためには、必ずしも、第二の層流部分の層流流れ方向に垂直な断面の内部にある必要はなく、第三の層流部分１３の層流の流れ方向に垂直な断面の一部を含んでもよい。特に第三の液体媒体が第二の液体媒体と同一の液体媒体である場合には、なおさら、第三の層流部分１３の層流の流れ方向に垂直な断面の一部を含んでもよい。もっとも前述した精度よく液体媒体の置換をする観点からは、層流画分回収面は少なくとも第二の層流部分の層流流れ方向に垂直な断面と同一とするか、より好ましくは前記断面の内部にあることが好ましい。
【００３２】
さらに本発明の方法で用いる層流の構成としては、図１や図２に示される例のみならず、追加の層流部分を他の任意の位置、たとえば第二の層流部分に隣接し、かつ第一の層流部分とは反対側の位置に第三の液体媒体により構成される第三の層流部分を含めることができる。このような一例において、有利な用い方もできる。たとえば、目的粒子とする生体粒子について、該生体粒子とビーズとの複合体粒子を用い、第二の液体媒体としてｐＨ等の調節により複合体粒子が解離して、目的の生体粒子が遊離するような液体媒体を用い、外力の作用がビーズの性質（たとえばビーズの有する磁性等）による場合を考える。この場合、第二の層流部分で遊離したビーズは、更に外力の作用により第三の層流部分に移動するが、目的の生体粒子自体には、もはや外力による作用は及ばず、第二の層流部分に留まるため、第二の層流部分から、目的の生体粒子のみを直接、回収することも可能である。また、この場合、層流画分回収面は、第一の層流部分の断面と離間しているのみならず、ビーズの混入を回避するのに必要な限度において第三の層流部分の断面とも離間していることが好ましい。さらにこの場合の層流画分回収面は、第二の層流部分の断面の内部にあることが好ましい。
【００３３】
［２．本発明の第二の態様の流路デバイス］
前記１．で説明した本発明の第一の態様の液体媒体を置換する方法に好適に用いられる流路デバイスは、
（ｉ）流路デバイスの前方に、試料液体を導入するための第一の導入口及び第二の液体媒体を導入するための第二の導入口を少なくとも含む複数の導入口と、
（ｉｉ）層流を形成できる流路と、
（ｉｉｉ）流路デバイスの後方に、少なくとも第一の排出口及び第二の排出口を含む二以上の排出口と、
（ｉｖ）外力を付与する機構と、
を備え、
流路は少なくとも、試料液体により構成される第一の層流部分、及び第二の液体媒体により構成される第二の層流部分を含む層流を形成することができ、
第二の排出口が、外力の作用により第二の層流部分に移動してきた目的粒子を含む層流画分を、層流の流れ方向に垂直な層流画分回収面から回収するための、目的粒子回収用排出口であり、
第一の排出口が、第二の排出口からみて第一の層流部分の側にあり、
第一の層流部分の側にある第二の排出口の隔壁が、層流画分回収面と第一の層流部分の断面とが離間するような位置に備えられている。
【００３４】
ここで、第一の排出口と第二の排出口とが互いに隣接している場合には、第一の層流部分の側にある第二の排出口の隔壁は、第一の排出口と第二の排出口との間を隔てる隔壁である。しかし、第一の排出口と第二の排出口との間に追加の排出口（例えば第三の排出口）が介在し、かつ前記追加の排出口と第二の排出口とが隣接している場合には、第一の層流部分の側にある第二の排出口の隔壁は、前記追加の排出口と第二の排出口との間を隔てる隔壁である。
【００３５】
用いることのできる流路は、層流を生じさせることができる機構を備えていれば、特に限定されない。もっとも、用いる流路幅あるいは流速等により、層流とならず乱流（混合流）を生じさせてしまう場合は、層流を形成する条件下で用いるべきである。
【００３６】
なお、層流となるか乱流となるかは、レイノルズ数と呼ばれる慣性力を粘性力で割った値に相当する無次元数が指標となることが知られている。たとえば、円管内の流れの場合、層流と乱流の境界となる臨界レイノルズ数は、およそ２０００〜４０００程度が目安といわれている。流体の粘性係数が大きい場合、あるいは流速が小さい場合、粘性力が支配的となり層流を生じさせる方向に傾く。また、集積回路のマイクロ加工技術を利用した微細構造を有するマイクロ（流路）デバイスでは一般に、レイノルズ数が小さく層流になるとされている。
【００３７】
また、層流画分回収面から回収するとは、層流画分回収面を通過する層流部分を回収することを意味する。
【００３８】
以下、本発明の流路デバイスについて、図を参照しながら説明する。
【００３９】
図３は試料液体から構成される第一の層流部分と所望の液体媒体である第二の液体媒体から構成される第二の層流部分からなる層流を形成できる、本発明の流路デバイスの基本構造３０の一例を上面から観察した模式図である。
【００４０】
まず、図３の流路デバイスの入口構造としては、試料液体導入口３１及び液体媒体（第二の液体媒体）導入口３２Ａとを備えている。また、図３の流路デバイスの流体の出口構造としては、主に試料液体を排出する第一の排出口４１及び、目的の液体媒体（第二の液体媒体）を排出する第二の排出口４２Ａとを備えている。なお、導入口や排出口の数については、図１のようにそれぞれ２つに必ずしも限定されるものではなく、目的に応じてより多くの導入口及び排出口を設けても良い。
【００４１】
また、図３にも示されているとおり、流路デバイスの試料液体導入口３１及び液体媒体導入口３２Ａと、第一の排出口４１及び第二の排出口４２Ａとの間には、目的粒子を移動させる外力を与える機構Ｆを有している。この機構により、層流平面上、試料液体中に含まれる目的粒子を流れ方向に対して直交する方向に移動させることができる。
【００４２】
外力を与える機構Ｆとしては、流路に沿って一定して同じ設計の機構が連続していても良く、目的に応じて、適宜手法を組み合わせ、また、流路に沿って徐々に設計を変化させた機構を設定することも可能である。該外力はすでに前記したように、電場、磁場、水力学的濾過、または決定論的側方移動（ＤＬＤ）による外力のいずれか一種以上が好ましいが、目的粒子を移動させることができれば、特にこれらに限定されない。
【００４３】
なお、図３には、層流流れに垂直な平面上にある層流画分回収面１４も図示されている。隔壁４３は、この層流画分回収面１４が第一の層流部分の断面１５と離間するように設けられる。目的とする液体媒体以外の液体媒体の混入を避けるためである。図３に示す一例の場合、層流画分回収面１４は第二の層流部分の断面の内部にある。
【００４４】
もっとも、層流画分回収面１４は、目的粒子をできるだけ漏れなく回収するとの観点からは、十分な面積の層流画分回収面を設定することが好ましい。このためには、層流の流速や流路長、外力による目的粒子の移動速度等を調節することにより、層流画分回収面における目的粒子の分布ができるだけ狭くなるように設計することが有利である。特に、流路長を十分長くすることが有利である。
【００４５】
図４は、図３の流路デバイスの２つの導入口及び２つの排出口がそれぞれ独立となるように隔壁構造を設けた流路デバイスの一例を図示したものである。試料液体導入口３１から流路デバイス４０内への入口部分の構造については、試料液体を、所望の液体媒体（第二の液体媒体）との層流として流す必要がある為、図示のようなそれぞれ独立の隔壁構造を設けることが好ましい。試料液体導入口３１から送液した試料液体は、液体媒体導入口３２Ａから送液した第二の液体媒体（典型的には緩衝液）と層流（流れ方向に平行して層を成す流れ）を保持しながら、流れて行き、目的粒子は前述の外力を与える機構に従い、流れ方向に対して斜め方向へ移動する事で、試料液体の層流部分から目的の液体媒体である第二の液体媒体の層流部分へと移動する。一方、目的粒子以外については試料液体の層流部分（第一の層流部分）の流れに従い大局的に直進して流れる。
【００４６】
このように、液体媒体の置換をより有効に行う目的から、流路デバイス平面上における層流流れに垂直な方向における試料液体導入口３１の位置は、同方向における第二の排出口４２Ａの側にではなく、同方向における第一の排出口４１の側に寄せて設置することが好ましい。
【００４７】
同様に、流路デバイス平面上における層流流れに垂直な方向における液体媒体（第二の液体媒体）導入口３２Ａの位置は、同方向における第一の排出口４１の側ではなく、同方向における第二の排出口４２Ａの側に寄せて設置をすることが好ましい。
【００４８】
また、第一の排出口４１及び第二の排出口４２Ａの構造は、排出される液量を調整するために、目的に応じて設計を適宜変更することが可能である。例えば、排出口付近の隔壁４３を図面上部から下部に向かって１：１の間隔となるように設けた場合（第一の層流部分と第二の層流部分の流速が同一の場合、ｘ２：ｙ２＝１：１、図４）、それぞれの排出口から得られる液量は概ね１：１となる。これに対して、同様に隔壁４３を９：１の間隔となるように設けた場合、第二の排出口４２Ａから得られる液量を概ね１０倍に濃縮する事が可能である（第一の層流部分と第二の層流部分の流速が同一の場合、ｘ２：ｙ２＝９：１、図４）。このように、用途に応じて目的粒子の液体媒体の置換だけでなく、液量の濃縮にも用いることが可能である。
【００４９】
同様に、導入口も適宜変更する事で（たとえば図４の隔壁４４の位置の調節等）、使用する液量の比率（第一の層流部分と第二の層流部分の流速が同一の場合、ｘ１：ｙ１）変更も可能であることから、使用液量を削減したい場合などに効果的である。
【００５０】
また、目的に応じて３つ以上の層流部分を構成する場合については、図５のように試料液体の層流部分（第一の層流部分）と目的の液体媒体（第二の液体媒体）の層流部分（第二の層流部分）との間に、別の液体媒体（第三の液体媒体）の層流部分（第三の層流部分）を設ける構造とすることができる。
【００５１】
この場合、第三の液体媒体の導入口として液体媒体（第三の液体媒体）導入口３２Ｂ及びこの第三の液体媒体を排出する第三の排出口４２Ｂを適宜設定することができる。液体媒体導入口３２Ｂは試料液体導入口３１及び液体媒体（第二の液体媒体）導入口３２Ａの間に存在している事が本手法の目的から適している。これに対して、第三の排出口４２Ｂについては、第一の排出口４１を利用してまとめることで代替できるため、設置は必ずしも必須ではない。もっとも本発明の目的から、目的とする液体媒体（第二の液体媒体）へのその他の液体媒体の混入を最小限に抑えるため、第二の排出口４２Ａを上記のように、他の液体媒体と共用しないことが好ましい。
【００５２】
同様に、目的に応じて、層流部分の個数を４、５、…、ｎ個以上の構成とする場合については、これら液体媒体それぞれの層の導入口及び、この別の液体媒体を排出する排出口を適宜設定する事ができる。また、同様にそれらの液体媒体（第二の液体媒体以外の追加の液体媒体）導入口は試料液体導入口３１及び液体媒体（第二の液体媒体）導入口３２Ａの間に存在していることが好ましいが、必ずしもそうする必要はない。他方、追加の液体媒体用の排出口については、第二の液体媒体の排出口である第二の排出口以外の排出口（たとえば第一の排出口）を利用することで代替も可能であるから、追加の排出口の設置は必ずしも必須ではない。
【００５３】
なお、図５では、図３や図４と同様、層流画分回収面１４が第二の層流部分の断面の内部となるように排出口側隔壁４３が設けられた一例を図示しているが、これはあくまで好ましい態様の一例にすぎない。図５の例では第二の層流部分と、試料液体から構成される第一層流との間には第三の層流部分が介在しているため、層流画分回収面１４が第一の層流部分の断面と離間している限りは、排出口側隔壁４３が第三の層流部分の方にずれて設けられていてもよい。もっとも、より精密に液体媒体を置換する観点からは、層流画分回収面ができるだけ多く第一の層流部分の断面と離間していることが好ましく、第二の層流部分の断面の内部とすることが好ましい。
【００５４】
図６は、本発明の実施形態に係る流路デバイスの一例の鉛直方向断面の模式図である。
【００５５】
流路デバイス４０は、それぞれの導入口、排出口構造部等の形状を備えた流路構造部５０と、平面構造部５１との接合によって作成することができ、その空間に流路空間５３を有している。また、それぞれ試料液体導入口３１、液体媒体（第二の液体媒体）導入口３２Ａ、第一の排出口４１、第二の排出口４２Ａ部分には、適宜チューブを接合させ、またシリンジ等との接合部を設けることにより、適宜変更を加えて使用することもできる。
【００５６】
流路空間５３の高さは目的粒子が通過可能な高さに設定されていれば何ら限定は無い。
【００５７】
流路構造部５０の部材、及び流路構造の作製方法は公知のいずれかの方法を適宜選択して作製することができる。部材の材料としては、例えば、ガラス、シリコーン、ジメチルポリシロキサン、プラスチック等を用いることができる。
【００５８】
また、平面構造部５１については、平坦かつ流路構造部５０と接合可能な材料であれば特に限定されないが、強度を有している、ガラス、プラスチック等を使用することが好ましい。
【００５９】
なお、本流路デバイス４０はそれぞれ流路構造及び導入口、排出口構造部等の形状を備え、流路空間が形成されていればよく、例えば図示の平面構造部５１側の部材にそれぞれ流路構造及び導入口、排出口構造部等の形状を備えている構造とすることもできる。
【００６０】
図７は、本発明の実施形態に係る送液部および回収部を備えた流路装置の一例を説明する模式図である。
【００６１】
流路装置８０は、流路デバイス４０に複数の送液部及び回収部を備えた装置である。図７には、試料液体導入口３１に試料液体送液部８１、液体媒体導入口３２Ａに液体媒体送液部８２Ａ、第一の排出口４１に第一の回収部９１、第二の排出口４２Ａに第二の回収部９２Ａを設けた例を図示している。
【００６２】
試料液体送液部８１と液体媒体送液部８２Ａは、それぞれ送液系を備えた機構を有することができ、一定の速度でそれぞれ独立した送液が可能である。これらは一定の速度で送液可能な機構であれば特に限定はされないが、例えば、シリンジポンプ等による送液が好適である。また、必要に応じて試料液体送液部８１には粒子の沈殿、及び凝集を防ぐための攪拌機構を備えていても良い。
【００６３】
第一の回収部９１、第二の回収部９２Ａに関しては排出液を回収できる機構であれば特に限定されないが、開始直前、直後で排出液の分画ができる機構等を備えていても良い。
【００６４】
前記同様、目的に応じて４、５、…、ｎ層以上の構成とする場合については、各液体媒体の導入口及び排出口を適宜設定し、それぞれに対応する送液部、及び回収部を適宜設けることができる。
【００６５】
更に本発明の流路デバイスを複数、直列接続した流路デバイス系とすることもできる。直接接続はたとえば、一の流路デバイスの第二の排出口と、直列接続の相手方となる他の一の流路デバイスの第一の導入口とを接続して形成することができる。また、用いる複数の流路デバイスに適用される外力の機構または外力の強さを互いに異ならせることができる。これにより、目的粒子のより精密な移動を可能とすることができる。
【００６６】
たとえば、目的粒子として生体粒子の分離を行う場合、生体粒子とビーズとの複合体粒子を用い、かつ第二の液体媒体としてｐＨ等の調節により複合体粒子が解離して目的の生体粒子が遊離するような液体媒体を用い、外力の作用がビーズの性質（たとえばビーズの有する磁性や大きさ等）による場合を考える。この場合、第二の層流部分で遊離した生体粒子とビーズをさらに、直接接続された他の一の流路デバイスに導入することにより、この他の一の流路デバイスにおける外力の作用によりビーズのみを移動させ、目的の生体粒子のみを直接、回収することも可能である。この場合、前記他の一の流路デバイスにおいては、複合体を形成していない生体粒子の回収は、第一の層流部分から行われることになる。また、この場合の前記他の一の流路デバイスにおける層流画分回収面は第二の層流部分の断面から離間していることが好ましく、第一の層流部分の断面の内部にあることがより好ましい。
【００６７】
［３．本発明の実施例で用いる粒子を移動させるための外力］
次に、本発明の実施例で具体的に用いていた目的粒子を移動させる外力である、決定論的側方移動（ＤＬＤ）の原理について以下、説明する。
【００６８】
［３−１．決定論的側方移動（ＤＬＤ）］
決定論的側方移動（ＤＬＤ）とは、わずかにずれた柱状構造（ピラー）に粒子の分散液を流した際、大きい粒子はピラー周囲に生じる流れの変化より斜めに流れるのに対し、小さい粒子は層流に乗って大域的には直線的に進む性質を利用して、寸法によるソーティングを実現する方法である（非特許文献１、図８を参照）。
【００６９】
規則的な障害物（マイクロピラー）をずらしながら配置した流路を用い、小さい粒子は流れに乗って直進する一方、大きな粒子は障害物周囲に生じる流れの変化に従い、障害物のずれに沿って斜めに進む。このため、目的粒子について、本手法を応用させる事で層間移動の外力を与えることができる。
【００７０】
［３−２．ＤＬＤ原理における斜め方向に移動する粒子直径の閾値］
非特許文献１に記載のＤＬＤ原理に基づいて、斜め方向に移動する粒子直径の閾値（Ｄｃ）を設定することが出来る。より具体的には、閾値Ｄｃの設定は、以下の式１から求めることが出来る。
【００７１】
Ｄｃ＝２ηＧε            （式１）
ここで、
Ｄｃ：斜め方向に移動する粒子直径の閾値
η：変数
Ｇ：ピラー間ギャップ 
ε：ピラーのずれ角度（tanθ）
そして、上記式１を解くと、下記の近似式２が得られる。
【００７２】
Ｄｃ＝１．４Ｇε0.48        （式２）
経験則から、０．０６＜ε＜０．１程度の場合に分離が良好であることから、
ε＝tanθ＝１／１５＝０．０６７
を用いて、以下の関係式３を導くことが出来る。
【００７３】
Ｇ≒２．６２０５７Ｄｃ  （式３）
そして、上記の式３から、斜め方向に移動する粒子直径の閾値Ｄｃに基づいて、ピラー間ギャップＧを算出し、特定のピラー間ギャップのピラー（障害物構造）が設置された構造部分を有する流路デバイスを作製することが出来る。
【００７４】
このようにして、目的の閾値Ｄｃを有するＤＬＤマイクロ流路を有する流路デバイスを作製することが出来る。
【００７５】
例として、図９のように目的粒子を移動させる外力として前記ＤＬＤを基本構造としたＤＬＤ構造部分１０１を設けた流路デバイス１００として使用することが可能である。また、断面を図１０に示す。
【００７６】
なお、粒子直径の閾値以外で液体媒体の置換をより有効に行うための因子として重要なのは流路長である。側方への移動距離は流路長に比例するため、流路長が長いほど、好ましい。
【００７７】
以上、本発明の実施形態を詳述してきたが、実際には、上記の実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の変更があっても本発明に含まれる。
【実施例】
【００７８】
本実施例では、懸濁液中に含まれる３０μｍビーズ、もしくはビーズと生体粒子との複合体粒子の分離及び液体媒体の置換を目的とした。【００７９】
（作製例１）流路デバイスの作製
決定論的側方移動（ＤＬＤ）法の原理に基づき、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）を使用して、粒径３０μｍを分離の閾値Ｄｃとして設定した決定論的側方移動（ＤＬＤ）構造を有する流路デバイスを作製した。【００８０】
具体的には、下記式：
Ｇ≒２．６２０５７Ｄｃ  
にＤｃ＝３０μｍを代入して得られたＧ＝７８．６μｍから、直径１５μｍのピラーが、間隔７８．６μｍで配列され、
また、好適な分離条件：
ε＝tanθ＝１／１５
から、このピラーを１５段で一列ずれるように配置した基本構造を有するものである。【００８１】
また、流路空間の高さは５０μｍとした。【００８２】
より具体的には、上記基本構造を有するように、マスクを使用してレジスト型を作製した後に、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）をモールディングして、ピラーが等間隔で配置されるＰＤＭＳ製流路を作製して、マイクロピラー構造を有するＤＬＤマイクロ流路の流路構造部５０とした。【００８３】
そして、この流路構造部５０の両端の一方には、ポート穴をあけ、試料液体（第一の液体媒体＋目的粒子）導入口３１と液体媒体（第二の液体媒体）導入口３２Ａを、他方には第一の排出口４１と第二の排出口４２Ａを設けた。ここで、排出口近傍でたとえ、ごくわずかな乱流が発生した場合でも、回収層流画分に第一の層流部分から直接、試料液体が混入することのないよう考慮して、層流の流れ方向に垂直な第二の排出口４２Ａの層流画分回収面と、試料液体から構成される第一の層流部分の断面とが離間するような位置に、第一の排出口４１と第二の排出口４２Ａの間の隔壁４３を設けた。【００８４】
次いで、この流路構造部５０を、平面構造部５１としてのガラス基板に接合させ、流路構造部とガラス基板との間の空間に流路空間５２が形成されるようにした。【００８５】
そして、試料液体導入口３１と緩衝液液体媒体導入口３２Ａ、および、第一の排出口４１と第二の排出口４２Ａにチューブを取付けて送液装置を備えた流路デバイスを作製した。【００８６】
この流路デバイスを以下の実施例１〜３で使用した。    
なお、この流路デバイスの第一の層流部分と第二の層流部分の流路幅の比（ｘ１：ｙ１、図４）は、およそ１：１であった。【００８７】
（実施例１）
試料液体として、目的粒子である３０μｍのビーズサンプルを懸濁させた第一の液体媒体［５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）］、第二の液体媒体として、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を準備し、作製例１で作製した流路デバイスを用いて、該ビーズサンプルを第一の液体媒体から第二の液体媒体に移動させることで、液体媒体の置換を行うことを試みた。【００８８】
まず、前記試料液体及び第二の液体媒体を送液する前に、０．０５％ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を事前に試料液体導入口３１及び液体媒体導入口３２Ａより通水し、流路中から気泡を除去した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）をそれぞれ通水し、流路デバイス内を第二の液体媒体であるリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で満たした。【００８９】
次に、試料液体を試料液体導入口３１に、第二の液体媒体を液体媒体導入口３２Ａからそれぞれシリンジポンプにて１０μＬ／ｍｉｎの一定速度で送液し、試料液体により構成された第一の層流部分及び第二の液体媒体により構成された第二の層流部分からなる層流の形成を確認した。【００９０】
第一の排出口４１から得られた排出液、及び、第二の排出口４２Ａから得られた排出液をそれぞれ顕微鏡下で観察したところ、第一の排出口４１から得られた排出液に３０μｍビーズは含まれておらず、また、第二の排出口４２Ａから得られた排出液（回収層流画分）中に３０μｍビーズが含まれている事を顕微鏡下での観察にて確認した。【００９１】
さらにそれぞれの排出液上清について、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによりタンパク質の定量を行った所、第一の排出口４１から得られた排出液の上清からは約５％の蛋白質の含有が検出されたが、第二の排出口４２Ａから得られた排出液中の上清からはほぼ検出されなかった。【００９２】
以上のように、第一の液体媒体中に分散された３０μｍビーズサンプルについて、作製例１の流路デバイスを用いて第二の液体媒体中へ移動させることで、液体媒体の置換ができた事が確認された。【００９３】
（比較例１）
５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中に懸濁された３０μｍビーズサンプルをチューブに取り、１０００×ｇ（重力加速度）で遠心分離した後、ＰＢＳを添加し、液体媒体の置換を行った。その結果、３０μｍビーズの量にロスが生じ、かつＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイを行ったところ、その上清から微量の蛋白質が検出された。【００９４】
（実施例２）
５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（第一の液体媒体）中に１０ｎｇ/ｍＬ濃度で懸濁された癌胎児性抗原（ＣＥＡ、型式「ＨＩＳＣＬ  ＣＥＡキャリブレータ」、カイノス社）に対して、抗ＣＥＡモノクローナル抗体を標識した３０μｍビーズサンプルを反応させて、複合体粒子を形成させた。【００９５】
これにより得られた試料液体について、実施例１と同様、作製例１で作製した流路デバイスを用いて、別途用意したＰＢＳ（第二の液体媒体）中へ、前記複合体を移動させることで、液体媒体の置換を行うことを試みた。【００９６】
まず、試料液体及びＰＢＳを送液する前に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ緩衝液を事前に試料液体導入口３１及び液体媒体導入口３２Ａより通水し、流路中から気泡を除去し、デバイス内を満たした。【００９７】
次に、試料液体を試料液体導入口３１に、ＰＢＳを液体媒体導入口３２Ａからそれぞれシリンジポンプにて１０μＬ／ｍｉｎの一定速度で送液し、試料液体により構成された第一の層流部分及び第二の液体媒体により構成された第二の層流部分からなる層流の形成を確認した。【００９８】
第一の排出口４１から得られた排出液、及び、第二の排出口４２Ａから得られた排出液をそれぞれ顕微鏡下で観察したところ、第一の排出口４１から得られた排出液に３０μｍビーズは含まれておらず、また、第二の排出口４２Ａから得られた排出液中に３０μｍビーズが含まれている事を顕微鏡下での観察にて確認した。【００９９】
さらにそれぞれの排出液上清について、ＢＣＡアッセイによりタンパク質の定量を行った所、第一の排出口４１から得られた排出液の上清からは約５％の蛋白質の含有が検出されたが、第二の排出口４２Ａから得られた排出液中の上清からはほぼ検出されなかった。【０１００】
以上のように、３０μｍビーズ複合体について、作製例１の流路デバイスを用いて第二の液体媒体中へ移動させることで、第一の液体媒体をＰＢＳに置換できた事が確認された。【０１０１】
なお、本実施例で用いた抗原のサイズは、ビーズのサイズと比べてかなり小さいため、本実施例にように複合体粒子を形成させても、複合体粒子のサイズはビーズ自体のサイズと大きく異なることはない。【０１０２】
（比較例２）
上記同様の目的で、５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中に１０ｎｇ/ｍＬ濃度で懸濁されたＣＥＡ抗原（型式「ＨＩＳＣＬ  ＣＥＡキャリブレータ」、カイノス社）に対して、抗ＣＥＡモノクローナル抗体を標識した３０μｍビーズサンプルを反応させ、複合体を形成させた。【０１０３】
これにより得られた試料液体をチューブに取り、１０００×ｇで遠心分離した後、ＰＢＳを添加し、液体媒体の置換を行った。その結果、３０μｍビーズの量にロスが生じ、かつＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイを行ったところ、その上清から微量の蛋白質が検出された。【０１０４】
（実施例３）
本実施例は全血中に混入させたヒト乳がん由来細胞（ＭＣＦ−７）を分離し、別途用意したＰＢＳ（第二の液体媒体）中に移動させることで、全血（第一の液体媒体）をＰＢＳに置換する目的で行った。【０１０５】
まず、事前にプローブとして有核細胞染色試薬(Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：タカラバイオ）にて染色を行ったヒト乳がん由来細胞（ＭＣＦ−７：ＤＳファーマバイオメディカル）を、ＰＢＳにて希釈した正常全血内に加えて試料サンプルとした。【０１０６】
この試料サンプルに対し、対象捕捉分子としてヒト上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に対するモノクローナル抗体（抗ＥｐＣＡＭ抗体）を担持した粒径３０μｍの抗ＥｐＣＡＭ抗体標識ビーズ［ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）, Ｈｕｍａｎ, ｐｌｕｒｉＢｅａｄｓ、ｓ−ｂｅａｄｓ：ｐｌｕｒｉｓｅｌｅｃｔ］を添加し、室温にて攪拌しながらインキュベートして複合体を形成させ試料液体を得た。【０１０７】
この試料液体について、作製例１で作製した流路デバイスを用いて、別途用意したＰＢＳ（第二の液体媒体）中へ、前記複合体を移動させることで、液体媒体の置換を行うことを試みた。【０１０８】
まず、デバイスを、予め1％ＢＳＡ含有ＰＢＳで満たしておき、試料液体を試料液体導入口３１に、ＰＢＳを液体媒体導入口３２Ａからそれぞれシリンジポンプにて１０μＬ／ｍｉｎの一定速度で送液し、試料液体により構成された第一の層流部分及びＰＢＳにより構成された第二の層流部分からなる層流の形成を確認した。【０１０９】
第一の排出口４１から得られた排出液、及び、第二の排出口４２Ａから得られた排出液をそれぞれ蛍光顕微鏡下で観察したところ、第一の排出口４１から得られた排出液に３０μｍビーズ及び該ビーズと細胞との複合体は含まれておらず、その他、血球細胞及び血液成分が観察された。また、第二の排出口４２Ａから得られた排出液中に３０μｍビーズ及び該ビーズと細胞との複合体が含まれている事を蛍光顕微鏡下での観察にて確認した。【０１１０】
以上のように、３０μｍビーズ複合体について、作製例１の流路デバイスを用いてＰＢＳ中へ移動させることで、第一の液体媒体をＰＢＳに置換できた事が確認された。【０１１１】
なお、本実施例で用いたＭＣＦ−７細胞のサイズは３０μｍ未満であり、分離の閾値として３０μｍを採用した場合、３０μｍビーズとの複合体粒子を形成した細胞のみ側方移動し、ビーズ未結合の細胞があった場合、係る未結合の細胞は側方移動せずに第一の排出口４１から出てしまう事になる。このため、ビーズを過剰に用いる等、試料液体中の細胞をできるだけ残らずビーズとの複合体粒子とすることが、損失を最小限として回収率を上げる観点で好ましい。【０１１２】
（比較例３）
上記同様の目的で、実施例３で調製した試料液体をチューブに取り、１０００×ｇで遠心分離した後、ＰＢＳを添加し、液体媒体の置換を行った。実施例３に比較し、３０μｍビーズ及びその細胞複合体の量にロスが生じてしまい、また、赤血球等の混入が起こり、目的とする複合体粒子を精度良くＰＢＳ液体媒体へ置換する事ができなかった。【０１１３】
（作製例２）
次に、作製例１にて作製した流路デバイスと同様のマイクロピラー構造を備えるものの、導入口が３つからなる図１１〜図１４に示すデバイスを設計し、同様の作製方法に従いデバイスを作製した。【０１１４】
以下、本流路デバイスを実施例４〜６にて使用した。【０１１５】
なお、図１４にも図示されているように、この流路デバイスでは、試料液体から構成される第一の層流部分は専ら第一の排出口４１から排出され、目的粒子を含有する層流画分を回収する第二の排出口４２Ａと第一の排出口４１との間には、第三の排出口４２Ｂが介在しているため、層流画分回収面と第一の層流部分の断面とが明白に大きく離間している。【０１１６】
層流形成の確認として、まず、０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳを事前に試料液体導入口３１及び２つの液体媒体導入口３２Ａ及び３２Ｂより通水し、流路中から気泡を除去した後、ＰＢＳをそれぞれ通水し、流路デバイス内をＰＢＳで満たした。【０１１７】
次に、試料液体導入口３１から５％ＢＳＡ含有ＰＢＳを、シリンジポンプにて１０μＬ／ｍｉｎの一定速度で送液し、液体媒体導入口３２ＡからＰＢＳをシリンジポンプにて１０μＬ／ｍｉｎの一定速度で送液し、液体媒体導入口３２Ｂから超純水をシリンジポンプにて１０倍量となる１００μＬ／ｍｉｎの一定速度で送液した。【０１１８】
試料液体により構成された第一の層流部分、該第一の層流部分の両側にそれぞれ位置する超純水により構成された第三及び第四の層流部分、及びＰＢＳから構成された第二の層流部分からなる、図１４に示すような層流を形成できた。【０１１９】
なお、液体媒体導入口３２Ｂからの送液速度を、液体媒体導入口３２Ａからの送液速度の１０倍に設定したのは、送液量を流路体積に比例した量とすることによって、層流全体の流速が一様となるように考慮したものである。【０１２０】
以下、この送液量比率にて実験を実施した。【０１２１】
（実施例４）
実施例１と同様、試料液体として、目的粒子である３０μｍのビーズサンプルを懸濁させた第一の液体媒体（５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）、第二の液体媒体として、ＰＢＳを準備した。【０１２２】
そして、作製例２により作製した流路デバイスを用いて、該ビーズサンプルを第一の液体媒体から第二の液体媒体に移動させることで、液体媒体の置換を行うことを試みた。【０１２３】
まず、サンプル及びＰＢＳを送液する前に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳバッファーを事前に試料液体導入口３１及び２つの液体媒体導入口３２Ａ及び３２Ｂより通水し、流路中から気泡を除去した後、ＰＢＳをそれぞれ通水し、流路デバイス内をＰＢＳで満たした。【０１２４】
次に、試料液体を試料液体導入口３１にシリンジポンプにて１０μＬ／ｍｉｎの一定速度で送液し、ＰＢＳを液体媒体導入口３２Ａにシリンジポンプにて１０μＬ／ｍｉｎの一定速度で送液し、及び３２ＢからＰＢＳをシリンジポンプにて１００μＬ／ｍｉｎの一定速度で送液し、層流の形成を確認した。【０１２５】
その後、第一の排出口４１から得られた排出液、及び、第二の排出口４２Ａから得られた排出液をそれぞれ顕微鏡下で観察したところ、第一の排出口４１から得られた排出液に３０μｍビーズは含まれておらず、また、第二の排出口４２Ａから得られた排出液中に３０μｍビーズが含まれている事を顕微鏡下での観察にて確認した。【０１２６】
また、第三の排出口４２Ｂから得られた排出液に３０μｍビーズは含まれていなかった。【０１２７】
さらにそれぞれの排出液上清について、ＢＣＡアッセイによりタンパク質の定量を行った所、第一の排出口４１から得られた排出液の上清からは約１％の蛋白質の含有が検出されたが、第二の排出口４２Ａから得られた排出液中の上清からはほぼ検出されなかった。【０１２８】
また、実施例１での結果に比較し、より低値を示した。【０１２９】
以上のように、第一の液体媒体中に分散された３０μｍビーズサンプルについて、作製例２の流路デバイスを用いてＰＢＳ中へ移動させることで、より精度よく液体媒体の置換ができた事が確認された。【０１３０】
（実施例５）
実施例２と同様、５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（第一の液体媒体）中に１０ｎｇ/ｍＬ濃度で懸濁された癌胎児性抗原（ＣＥＡ、型式「ＨＩＳＣＬ  ＣＥＡキャリブレータ」、カイノス社）に対して、抗ＣＥＡモノクローナル抗体を標識した３０μｍビーズサンプルを反応させて、複合体粒子を形成させた。【０１３１】
これにより得られた試料液体について、実施例４と同様、作製例２で作製した流路デバイスを用いて、別途用意したＰＢＳ（第二の液体媒体）中へ、前記複合体粒子を移動させることで、液体媒体の置換を行うことを試みた。【０１３２】
まず、試料液体及びＰＢＳを送液する前に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳを事前に試料液体導入口３１及び２つの液体媒体導入口３２Ａ及び３２Ｂより通水し、流路中から気泡を除去し、デバイス内を満たした。【０１３３】
次に、試料液体を試料液体導入口３１に、ＰＢＳを液体媒体導入口３２Ａからそれぞれシリンジポンプにて１０μＬ／ｍｉｎの一定速度で送液し、液体媒体導入口３２ＢからＰＢＳをシリンジポンプにて１００μＬ／ｍｉｎの一定速度で送液し、層流の形成を確認した。【０１３４】
第一の排出口４１から得られた排出液、及び、第二の排出口４２Ａから得られた排出液をそれぞれ顕微鏡下で観察したところ、第一の排出口４１から得られた排出液に３０μｍビーズは含まれておらず、また、第二の排出口４２Ａから得られた排出液中に３０μｍビーズが含まれている事を目視にて確認した。また、第三の排出口４２Ｂから得られた排出液に３０μｍビーズは含まれていなかった。【０１３５】
さらにそれぞれの排出液上清について、ＢＣＡアッセイによりタンパク質の定量を行った所、第一の排出口４１から得られた排出液の上清からは約１％の蛋白質の含有が検出されたが、第二の排出口４２Ａから得られた排出液中の上清からはほぼ検出されなかった。また、実施例２での結果に比較し、より低値を示した。【０１３６】
以上のように、３０μｍビーズ複合体粒子について、作製例２の流路デバイスを用いてＰＢＳ中へ移動させることで、第一の液体媒体をＰＢＳへより精度良く置換できた事が確認された。【０１３７】
（実施例６）
実施例３と同様に、全血中に混入させたヒト乳がん由来細胞（ＭＣＦ−７）を分離し、別途用意したＰＢＳ（第二の液体媒体）中に移動させることで、全血（第一の液体媒体）をＰＢＳに置換する目的で行った。【０１３８】
まず、事前にプローブとして有核細胞染色試薬(Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：タカラバイオ）にて染色を行ったヒト乳がん由来細胞（ＭＣＦ−７：ＤＳファーマバイオメディカル）を、ＰＢＳにて希釈した正常全血内に加えて試料サンプルとした。【０１３９】
この試料サンプルに対し、対象捕捉分子としてヒトＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体（抗ＥｐＣＡＭ抗体）を担持した粒径３０μｍの抗ＥｐＣＡＭ抗体標識ビーズ［ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）, Ｈｕｍａｎ, ｐｌｕｒｉＢｅａｄｓ、ｓ−ｂｅａｄｓ：ｐｌｕｒｉｓｅｌｅｃｔ］を添加し、室温にて攪拌しながらインキュベートして複合体粒子を形成させ試料液体を得た。【０１４０】
この試料液体について、作製例２で作製された流路デバイスを用いて、別途用意したＰＢＳ（第二の液体媒体）中へ、前記複合体粒子を移動させることで、液体媒体の置換を行うことを試みた。【０１４１】
まず、流路デバイスを、予め1％ＢＳＡ含有ＰＢＳで満たしておき、試料液体を試料液体導入口３１に、ＰＢＳを液体媒体導入口３２Ａからそれぞれシリンジポンプにて１０μＬ／ｍｉｎの一定速度で送液し、また、液体媒体導入口３２Ｂから、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳをシリンジポンプにて１００μＬ／ｍｉｎの一定速度で送液した。【０１４２】
第一の排出口４１から得られた排出液、及び、第二の排出口４２Ａから得られた排出液をそれぞれ蛍光顕微鏡下で観察したところ、第一の排出口４１から得られた排出液に３０μｍビーズは含まれておらず、その他、血球細胞及び血液成分が観察された。【０１４３】
また、第二の排出口４２Ａから得られた排出液中に３０μｍのビーズ及び該ビーズと細胞との複合体粒子が含まれている事を蛍光顕微鏡下での観察にて確認した。実施例３での結果に比較し、より精度良く、血液成分（赤血球や白血球等）の混入が低減された様子を確認した。【０１４４】
また、第三の排出口４２Ｂから得られた排出液に３０μｍのビーズ及び該ビーズと細胞との複合体粒子は含まれていなかった。【０１４５】
以上のように、全血中に混入させた３０μｍビーズ複合体粒子について、作製例２の流路デバイスを用いてＰＢＳ中へ移動させることで、第一の液体媒体をＰＢＳへより精度良く置換できた事が確認された。【０１４６】
（実施例７）
更に実施例６と同様にして、全血中に混入させたヒト乳がん由来細胞（ＭＣＦ−７）を分離し、別途用意した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（第二の液体媒体）中に移動させることで、全血（第一の液体媒体）を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（第二の液体媒体）に置換する目的で行った。【０１４７】
すなわち、実施例６で調製した試料液体について、作製例２で作製された流路デバイスを用いて、別途用意した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（第二の液体媒体）中へ、複合体粒子を移動させることで、液体媒体の置換を行うことを試みた。【０１４８】
まず、流路デバイスを、予め１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで満たしておき、試料液体を試料液体導入口３１に、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を液体媒体導入口３２Ａからそれぞれシリンジポンプにて１０μＬ／ｍｉｎの一定速度で送液し、また、液体媒体導入口３２Ｂから、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳをシリンジポンプにて１００μＬ／ｍｉｎの一定速度で送液し、層流の形成を確認した。【０１４９】
第一の排出口４１から得られた排出液、及び、第二の排出口４２Ａから得られた排出液をそれぞれ顕微鏡下で観察したところ、第一の排出口４１から得られた排出液に３０μｍビーズは含まれておらず、その他、血球細胞及び血液成分が観察された。【０１５０】
また、第二の排出口４２Ａから得られた排出液中に３０μｍのビーズ及び該ビーズと細胞との複合体が含まれている事を顕微鏡下での観察にて確認した。【０１５１】
また、第三の排出口４２Ｂから得られた排出液に３０μｍのビーズ及び該ビーズと細胞との複合体粒子は含まれていなかった。【０１５２】
以上の様に１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中に置換したビーズおよびその細胞との複合体粒子は再度、液体媒体を置換することなく、また、希釈をすることなく、そのまま培養に供する事ができた。
【産業上の利用可能性】
【０１５３】
本発明の液体媒体の置換方法、およびデバイスは、研究用途、診断用途、医薬品の製造等における核酸、蛋白質、細胞等の分離、および精製に利用することが可能である。
【符号の説明】
【０１５４】
１  …目的粒子
１１…第一の層流部分（分散した目的粒子を含む第一の液体媒体）
１２…第二の層流部分（目的粒子を受け取る第二の液体媒体）
Ｆ  …外力
１３…第三の層流部分（第三の液体媒体）
１４…層流画分回収面
１５…第一の層流部分の（層流流れに垂直な）断面
３０…流路デバイスの基本構造の一例
３１…試料液体導入口（分散した目的粒子を含む第一の液体媒体）
３２Ａ…液体媒体導入口（目的粒子を受け取る第二の液体媒体）
４１…第一の排出口
４２Ａ…第二の排出口（目的粒子含有層流画分回収用排出口）
４０…流路デバイスの他の構造の一例
４３…排出口側隔壁
４４…導入口側隔壁
３２Ｂ…液体媒体導入口（第三の液体媒体）
４２Ｂ…第三の排出口
５０…流路構造部
５１…平面構造部
５３…流路空間
８１…試料液体送液部
８２Ａ…液体媒体送液部（第二の液体媒体送液部）
９１…第一の回収部
９２Ａ…第二の回収部（目的粒子含有層流画分回収部）
１００…実施例で使用の流路デバイス
１０１…決定論的側方移動（ＤＬＤ）構造部分
ｘ１…第一の層流部分の幅
ｙ１…第二の層流部分の幅
ｘ２…第一の排出口による排出幅
ｙ２…第二の排出口による排出幅
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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