(57)【要約】  本発明は、野生型のグルタチオン合成酵素を改変して、活性がより安定に保持される、とりわけ熱安定性の高い改変型グルタチオン合成酵素および／または該酵素を生産する形質転換体を提供する。  本発明のポリペプチドは、（ａ）γ−グルタミルジペプチドにグリシンを結合する反応を行い、且つ、（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素と比較して、熱安定性および／または保存安定性が高いポリペプチドである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）；
（ａ）γ−グルタミルジペプチドにグリシンを結合する反応を行い、かつ、
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素と比較して、熱安定性および／または保存安定性が高い、
の性質を示すポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ｃ）、（ｄ）；
（ｃ）還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および／または酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を生成し、かつ、
（ｄ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素と比較して、熱安定性および／または保存安定性が高い、
の性質を示すポリペプチド。
【請求項３】
γ−グルタミルシステインおよび酸化型γ−グルタミルシステインを基質としてＧＳＨおよびＧＳＳＧを生成する、γ−グルタミルシステインを基質としてＧＳＨを生成する、または、酸化型γ−グルタミルシステインを基質としてＧＳＳＧを生成する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
以下の（Ａ）から（Ｃ）のいずれかに示すポリペプチド：
（Ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
１３、１７、２０、２３、３９、７０、７８、１０１、１１３、１２５、１２６、１３６、１３８、１４９、１５２、１５４、１５５、１９７、２００、２１５、２２６、２２７、２３０、２３９、２４１、２４６、２４９、２５４、２６０、２６２、２６３、２７０、２７８、２９９、３０５、３０７および３１０番目から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド、
（Ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
１３、１７、２０、２３、３９、７０、７８、１０１、１１３、１２５、１２６、１３６、１３８、１４９、１５２、１５４、１５５、１９７、２００、２１５、２２６、２２７、２３０、２３９、２４１、２４６、２４９、２５４、２６０、２６２、２６３、２７０、２７８、２９９、３０５、３０７および３１０番目から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸部位以外のアミノ酸の１個もしくは複数個が置換、付加、挿入もしくは欠失されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド、
（Ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
１３、１７、２０、２３、３９、７０、７８、１０１、１１３、１２５、１２６、１３６、１３８、１４９、１５２、１５４、１５５、１９７、２００、２１５、２２６、２２７、２３０、２３９、２４１、２４６、２４９、２５４、２６０、２６２、２６３、２７０、２７８、２９９、３０５、３０７および３１０番目から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
以下の（Ｄ）から（Ｆ）のいずれかに示すポリペプチド：
（Ｄ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
１３番目がセリン、１７番目がグルタミン酸、２０番目がスレオニン、２３番目がロイシン、３９番目がスレオニン、７０番目がセリン、７８番目がロイシン、１０１番目がアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、１１３番目がヒスチジン、１２５番目がバリン、１２６番目がアスパラギン、１３６番目がスレオニン、１３８番目がアラニン、１４９番目がグルタミン、１５２番目がグルタミン、１５４番目がアスパラギン、１５５番目がロイシン、１９７番目がグルタミン、２００番目がセリン、２１５番目がアスパラギン酸、２２６番目がアルギニン、２２７番目がセリン、２３０番目がプロリン、２３９番目がセリン、２４１番目がヒスチジン、２４６番目がアルギニン、２４９番目がグルタミン酸、２５４番目がアスパラギン酸、２６０番目がアラニン、システイン、グリシン、グルタミン、スレオニン、２６２番目がシステイン、２６３番目がアルギニン、２７０番目がイソロイシン、２７８番目がグリシン、アラニン、２９９番目がアラニン、３０５番目がグリシン、３０７番目がバリンおよび３１０番目がスレオニンに置換、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド、
（Ｅ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
１３番目がセリン、１７番目がグルタミン酸、２０番目がスレオニン、２３番目がロイシン、３９番目がスレオニン、７０番目がセリン、７８番目がロイシン、１０１番目がアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、１１３番目がヒスチジン、１２５番目がバリン、１２６番目がアスパラギン、１３６番目がスレオニン、１３８番目がアラニン、１４９番目がグルタミン、１５２番目がグルタミン、１５４番目がアスパラギン、１５５番目がロイシン、１９７番目がグルタミン、２００番目がセリン、２１５番目がアスパラギン酸、２２６番目がアルギニン、２２７番目がセリン、２３０番目がプロリン、２３９番目がセリン、２４１番目がヒスチジン、２４６番目がアルギニン、２４９番目がグルタミン酸、２５４番目がアスパラギン酸、２６０番目がアラニン、システイン、グリシン、グルタミン、スレオニン、２６２番目がシステイン、２６３番目がアルギニン、２７０番目がイソロイシン、２７８番目がグリシン、アラニン、２９９番目がアラニン、３０５番目がグリシン、３０７番目がバリンおよび３１０番目がスレオニンに置換、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸部位以外のアミノ酸の１個もしくは複数個が置換、付加、挿入もしくは欠失されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド、
（Ｆ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
１３番目がセリン、１７番目がグルタミン酸、２０番目がスレオニン、２３番目がロイシン、３９番目がスレオニン、７０番目がセリン、７８番目がロイシン、１０１番目がアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、１１３番目がヒスチジン、１２５番目がバリン、１２６番目がアスパラギン、１３６番目がスレオニン、１３８番目がアラニン、１４９番目がグルタミン、１５２番目がグルタミン、１５４番目がアスパラギン、１５５番目がロイシン、１９７番目がグルタミン、２００番目がセリン、２１５番目がアスパラギン酸、２２６番目がアルギニン、２２７番目がセリン、２３０番目がプロリン、２３９番目がセリン、２４１番目がヒスチジン、２４６番目がアルギニン、２４９番目がグルタミン酸、２５４番目がアスパラギン酸、２６０番目がアラニン、システイン、グリシン、グルタミン、スレオニン、２６２番目がシステイン、２６３番目がアルギニン、２７０番目がイソロイシン、２７８番目がグリシン、アラニン、２９９番目がアラニン、３０５番目がグリシン、３０７番目がバリンおよび３１０番目がスレオニンに置換、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上である請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
以下の（Ｇ）から（Ｉ）のいずれかに示すポリペプチド：
（Ｇ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
（１）１３番目がセリン、
（２）１７番目がグルタミン酸、１１３番目がヒスチジン、２３０番目がプロリン、
（３）２０番目がスレオニン、２１５番目がアスパラギン酸、
（４）２０番目がスレオニン、２４１番目がヒスチジン、
（５）２３番目がロイシン、１２６番目がアスパラギン、
（６）３９番目がスレオニン、２６０番目がアラニン、
（７）７０番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（８）７８番目がロイシン、２７８番目がアラニン、
（９）１０１番目がアスパラギン、
（１０）１０１番目がグルタミン、
（１１）１０１番目がセリン、
（１２）１０１番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（１３）１０１番目がスレオニン、
（１４）１２５番目がバリン、２４９番目がグルタミン酸、
（１５）１２５番目がバリン、１５２番目がグルタミン、
（１６）１３６番目がスレオニン、
（１７）１３８番目がアラニン、１４９番目がグルタミン、２４１番目がヒスチジン、２６３番目がグルタミン、
（１８）１５４番目がアスパラギン、２４６番目がアルギニン、
（１９）１５５番目がロイシン、２３９番目がセリン、
（２０）１９７番目がグルタミン、
（２１）２００番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（２２）２２６番目がアルギニン、２６０番目がアラニン、
（２３）２２７番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（２４）２５４番目がアスパラギン酸、２６０番目がアラニン、
（２５）２６０番目がアラニン、
（２６）２６０番目がアラニン、２７８番目がグリシン、３０７番目がバリン、
（２７）２６０番目がアラニン、２９９番目がアラニン、
（２８）２６０番目がアラニン、３０５番目がグリシン、
（２９）２６０番目がアラニン、３１０番目がスレオニン、
（３０）２６０番目がシステイン、
（３１）２６０番目がグリシン、
（３２）２６０番目がグルタミン、
（３３）２６０番目がスレオニン、
（３４）２６２番目がシステイン、
（３５）２７０番目がイソロイシン、
から選択されるアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド、
（Ｈ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
（１）１３番目がセリン、
（２）１７番目がグルタミン酸、１１３番目がヒスチジン、２３０番目がプロリン、
（３）２０番目がスレオニン、２１５番目がアスパラギン酸、
（４）２０番目がスレオニン、２４１番目がヒスチジン、
（５）２３番目がロイシン、１２６番目がアスパラギン、
（６）３９番目がスレオニン、２６０番目がアラニン、
（７）７０番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（８）７８番目がロイシン、２７８番目がアラニン、
（９）１０１番目がアスパラギン、
（１０）１０１番目がグルタミン、
（１１）１０１番目がセリン、
（１２）１０１番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（１３）１０１番目がスレオニン、
（１４）１２５番目がバリン、２４９番目がグルタミン酸、
（１５）１２５番目がバリン、１５２番目がグルタミン、
（１６）１３６番目がスレオニン、
（１７）１３８番目がアラニン、１４９番目がグルタミン、２４１番目がヒスチジン、２６３番目がグルタミン、
（１８）１５４番目がアスパラギン、２４６番目がアルギニン、
（１９）１５５番目がロイシン、２３９番目がセリン、
（２０）１９７番目がグルタミン、
（２１）２００番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（２２）２２６番目がアルギニン、２６０番目がアラニン、
（２３）２２７番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（２４）２５４番目がアスパラギン酸、２６０番目がアラニン、
（２５）２６０番目がアラニン、
（２６）２６０番目がアラニン、２７８番目がグリシン、３０７番目がバリン、
（２７）２６０番目がアラニン、２９９番目がアラニン、
（２８）２６０番目がアラニン、３０５番目がグリシン、
（２９）２６０番目がアラニン、３１０番目がスレオニン、
（３０）２６０番目がシステイン、
（３１）２６０番目がグリシン、
（３２）２６０番目がグルタミン、
（３３）２６０番目がスレオニン、
（３４）２６２番目がシステイン、
（３５）２７０番目がイソロイシン、
から選択されるアミノ酸が置換されているポリペプチドにおいて、前記アミノ酸部位以外のアミノ酸の１個もしくは複数個が置換、付加、挿入もしくは欠失されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド、
（Ｉ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
（１）１３番目がセリン、
（２）１７番目がグルタミン酸、１１３番目がヒスチジン、２３０番目がプロリン、
（３）２０番目がスレオニン、２１５番目がアスパラギン酸、
（４）２０番目がスレオニン、２４１番目がヒスチジン、
（５）２３番目がロイシン、１２６番目がアスパラギン、
（６）３９番目がスレオニン、２６０番目がアラニン、
（７）７０番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（８）７８番目がロイシン、２７８番目がアラニン、
（９）１０１番目がアスパラギン、
（１０）１０１番目がグルタミン、
（１１）１０１番目がセリン、
（１２）１０１番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（１３）１０１番目がスレオニン、
（１４）１２５番目がバリン、２４９番目がグルタミン酸、
（１５）１２５番目がバリン、１５２番目がグルタミン、
（１６）１３６番目がスレオニン、
（１７）１３８番目がアラニン、１４９番目がグルタミン、２４１番目がヒスチジン、２６３番目がグルタミン、
（１８）１５４番目がアスパラギン、２４６番目がアルギニン、
（１９）１５５番目がロイシン、２３９番目がセリン、
（２０）１９７番目がグルタミン、
（２１）２００番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（２２）２２６番目がアルギニン、２６０番目がアラニン、
（２３）２２７番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（２４）２５４番目がアスパラギン酸、２６０番目がアラニン、
（２５）２６０番目がアラニン、
（２６）２６０番目がアラニン、２７８番目がグリシン、３０７番目がバリン、
（２７）２６０番目がアラニン、２９９番目がアラニン、
（２８）２６０番目がアラニン、３０５番目がグリシン、
（２９）２６０番目がアラニン、３１０番目がスレオニン、
（３０）２６０番目がシステイン、
（３１）２６０番目がグリシン、
（３２）２６０番目がグルタミン、
（３３）２６０番目がスレオニン、
（３４）２６２番目がシステイン、
（３５）２７０番目がイソロイシン、
から選択されるアミノ酸が置換されているポリペプチドにおいて、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド、または、請求項７に記載のポリヌクレオチドを発現させた形質転換体および／またはその処理物を、γ−グルタミルジペプチドに作用させることを特徴とするγ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸を示す）の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド、または、請求項７に記載のポリヌクレオチドを発現させた形質転換体および／またはその処理物を、酸化型γ−グルタミルシステインに作用させることを特徴とするＧＳＳＧの製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド、または、請求項７に記載のポリヌクレオチドを発現させた形質転換体および／またはその処理物を、γ−グルタミルシステインに作用させることを特徴とするＧＳＨの製造方法。
【請求項１１】
ＡＴＰ再生系の共存下で反応を行うことを特徴とする、請求項８に記載のγ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸を示す）の製造方法。
【請求項１２】
ＡＴＰ再生系としてポリリン酸キナーゼを用いることを特徴とする、請求項１１に記載のγ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸を示す）の製造方法。
【請求項１３】
ＡＴＰ再生系の共存下で反応を行うことを特徴とする、請求項９に記載のＧＳＳＧの製造方法。
【請求項１４】
ＡＴＰ再生系としてポリリン酸キナーゼを用いることを特徴とする、請求項１３に記載のＧＳＳＧの製造方法。
【請求項１５】
ＡＴＰ再生系の共存下で反応を行うことを特徴とする、請求項１０に記載のＧＳＨの製造方法。
【請求項１６】
ＡＴＰ再生系としてポリリン酸キナーゼを用いることを特徴とする、請求項１５に記載のＧＳＨの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変型グルタチオン合成酵素、およびそれをコードする遺伝子、ならびにそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンは、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、グリシンの３つのアミノ酸から成るペプチドで、人体だけでなく、他の動物や植物、微生物など多くの生体内に存在する。グルタチオンはまた、活性酸素の消去作用、解毒作用、アミノ酸代謝などの機能を有し、生体にとって重要な化合物である。【０００３】
グルタチオンは、生体内において、Ｌ−システイン残基のチオール基が還元されたＳＨの形態である還元型のグルタチオン（以下、「ＧＳＨ」と称することもある。）、またはＬ−システイン残基のチオール基が酸化され、グルタチオン２分子間でジスルフィド結合を形成した形態である酸化型のグルタチオン（以下、「ＧＳＳＧ」と称することもある。）のいずれかの形態で存在する。【０００４】
グルタチオンの製造方法としては、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、グリシンおよび界面活性剤や有機溶媒の存在下、γ−グルタミルシステイン合成酵素やグルタチオン合成酵素を組換え生産させたエシェリヒア・コリやサッカロマイセス・セレビシエの菌体を酵素源として用いる酵素法等が知られている（特許文献１および２）。また、最近において、出願人は、Ｌ−グルタミン酸とＬ−シスチンとから酸化型γ−グルタミルシステインを製造し、続いて、酸化型γ−グルタミルシステインとグリシンとから酸化型グルタチオンを製造する工程を含む、酸化型グルタチオンの製造方法を公開している（特許文献３）。【０００５】
グルタチオン合成に関わる酵素として、Ｌ−グルタミン酸とＬ−システインとを結合して、γ−グルタミルシステインを生成するγ−グルタミルシステイン合成酵素（以下、「ＧＳＨＩ」と称することもある。）と、γ−グルタミルシステインとグリシンとを結合して還元型グルタチオンを生成するグルタチオン合成酵素（以下、「ＧＳＨＩＩ」と称することもある。）とが知られている。また、ＧＳＨＩおよびＧＳＨＩＩは、それぞれ、Ｌ−シスチン、酸化型γ−グルタミルシステインも基質として利用できることが知られており、この場合、各酵素反応の生成物として、それぞれ、酸化型γ−グルタミルシステイン、酸化型グルタチオンが合成される（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６０−２７３９６号公報（１９８５年２月１２日公開）
【特許文献２】特開昭６０−２７３９７号公報（１９８５年２月１２日公開）
【特許文献３】国際公開第２０１６／００２８８４号公報（２０１６年１月７日公開）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Appl. Microbial. Biotechnol., 66, 233 (2004)
【非特許文献２】Appl. Environ. Microbial., 44, 1444 (1982)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、グルタチオン合成酵素を使用したグルタチオン生産を工業的スケールで行う場合、グルタチオン合成酵素の保存安定性や反応温度での熱安定性が必要となる。また、グルタチオン合成酵素を発現している組換え菌体を使用した反応を行う場合、該酵素の安定性が高ければ、組換え菌を加熱して、宿主に由来する該酵素以外の酵素を失活または活性低下させることで、宿主由来酵素によるバックグラウンドの反応を抑制することができる。【０００９】
そこで、本発明の課題は、野生型グルタチオン合成酵素と比較して、その活性がより安定に保持される、とりわけ、熱安定性の高い改変型グルタチオン合成酵素、および／または該酵素を生産する形質転換体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、野生型グルタチオン合成酵素遺伝子に変異を導入して作製した変異型グルタチオン合成酵素遺伝子ライブラリー（以下、「変異酵素遺伝子ライブラリー」と称する。）の中から、熱安定性が野生型グルタチオン合成酵素よりも向上した改変型グルタチオン合成酵素を見出すことに成功し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明の一態様は以下の構成を包含する。【００１２】
［１］以下の（ａ）、（ｂ）；
（ａ）γ−グルタミルジペプチドにグリシンを結合する反応を行い、かつ、
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素と比較して、熱安定性および／または保存安定性が高い、
の性質を示すポリペプチド。【００１３】
［２］以下の（ｃ）、（ｄ）；
（ｃ）還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および／または酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を生成し、かつ、
（ｄ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素と比較して、熱安定性および／または保存安定性が高い、
の性質を示すポリペプチド。【００１４】
［３］γ−グルタミルシステインおよび酸化型γ−グルタミルシステインを基質としてＧＳＨおよびＧＳＳＧを生成する、γ−グルタミルシステインを基質としてＧＳＨを生成する、または、酸化型γ−グルタミルシステインを基質としてＧＳＳＧを生成する、［１］に記載のポリペプチド。【００１５】
［４］以下の（Ａ）から（Ｃ）のいずれかに示すポリペプチド：
（Ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
１３、１７、２０、２３、３９、７０、７８、１０１、１１３、１２５、１２６、１３６、１３８、１４９、１５２、１５４、１５５、１９７、２００、２１５、２２６、２２７、２３０、２３９、２４１、２４６、２４９、２５４、２６０、２６２、２６３、２７０、２７８、２９９、３０５、３０７および３１０番目から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなる、［１］から［３］のいずれかに記載のポリペプチド、
（Ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
１３、１７、２０、２３、３９、７０、７８、１０１、１１３、１２５、１２６、１３６、１３８、１４９、１５２、１５４、１５５、１９７、２００、２１５、２２６、２２７、２３０、２３９、２４１、２４６、２４９、２５４、２６０、２６２、２６３、２７０、２７８、２９９、３０５、３０７および３１０番目から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸部位以外のアミノ酸の１個もしくは複数個が置換、付加、挿入もしくは欠失されている、［１］から［３］のいずれかに記載のポリペプチド、
（Ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
１３、１７、２０、２３、３９、７０、７８、１０１、１１３、１２５、１２６、１３６、１３８、１４９、１５２、１５４、１５５、１９７、２００、２１５、２２６、２２７、２３０、２３９、２４１、２４６、２４９、２５４、２６０、２６２、２６３、２７０、２７８、２９９、３０５、３０７および３１０番目から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上である、［１］から［３］のいずれかに記載のポリペプチド。【００１６】
［５］以下の（Ｄ）から（Ｆ）のいずれかに示すポリペプチド：
（Ｄ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
１３番目がセリン、１７番目がグルタミン酸、２０番目がスレオニン、２３番目がロイシン、３９番目がスレオニン、７０番目がセリン、７８番目がロイシン、１０１番目がアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、１１３番目がヒスチジン、１２５番目がバリン、１２６番目がアスパラギン、１３６番目がスレオニン、１３８番目がアラニン、１４９番目がグルタミン、１５２番目がグルタミン、１５４番目がアスパラギン、１５５番目がロイシン、１９７番目がグルタミン、２００番目がセリン、２１５番目がアスパラギン酸、２２６番目がアルギニン、２２７番目がセリン、２３０番目がプロリン、２３９番目がセリン、２４１番目がヒスチジン、２４６番目がアルギニン、２４９番目がグルタミン酸、２５４番目がアスパラギン酸、２６０番目がアラニン、システイン、グリシン、グルタミン、スレオニン、２６２番目がシステイン、２６３番目がアルギニン、２７０番目がイソロイシン、２７８番目がグリシン、アラニン、２９９番目がアラニン、３０５番目がグリシン、３０７番目がバリンおよび３１０番目がスレオニンに置換、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなる、［１］から［３］のいずれかに記載のポリペプチド、
（Ｅ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
１３番目がセリン、１７番目がグルタミン酸、２０番目がスレオニン、２３番目がロイシン、３９番目がスレオニン、７０番目がセリン、７８番目がロイシン、１０１番目がアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、１１３番目がヒスチジン、１２５番目がバリン、１２６番目がアスパラギン、１３６番目がスレオニン、１３８番目がアラニン、１４９番目がグルタミン、１５２番目がグルタミン、１５４番目がアスパラギン、１５５番目がロイシン、１９７番目がグルタミン、２００番目がセリン、２１５番目がアスパラギン酸、２２６番目がアルギニン、２２７番目がセリン、２３０番目がプロリン、２３９番目がセリン、２４１番目がヒスチジン、２４６番目がアルギニン、２４９番目がグルタミン酸、２５４番目がアスパラギン酸、２６０番目がアラニン、システイン、グリシン、グルタミン、スレオニン、２６２番目がシステイン、２６３番目がアルギニン、２７０番目がイソロイシン、２７８番目がグリシン、アラニン、２９９番目がアラニン、３０５番目がグリシン、３０７番目がバリンおよび３１０番目がスレオニンに置換、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸部位以外のアミノ酸の１個もしくは複数個が置換、付加、挿入もしくは欠失されている、［１］から［３］のいずれかに記載のポリペプチド、
（Ｆ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
１３番目がセリン、１７番目がグルタミン酸、２０番目がスレオニン、２３番目がロイシン、３９番目がスレオニン、７０番目がセリン、７８番目がロイシン、１０１番目がアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、１１３番目がヒスチジン、１２５番目がバリン、１２６番目がアスパラギン、１３６番目がスレオニン、１３８番目がアラニン、１４９番目がグルタミン、１５２番目がグルタミン、１５４番目がアスパラギン、１５５番目がロイシン、１９７番目がグルタミン、２００番目がセリン、２１５番目がアスパラギン酸、２２６番目がアルギニン、２２７番目がセリン、２３０番目がプロリン、２３９番目がセリン、２４１番目がヒスチジン、２４６番目がアルギニン、２４９番目がグルタミン酸、２５４番目がアスパラギン酸、２６０番目がアラニン、システイン、グリシン、グルタミン、スレオニン、２６２番目がシステイン、２６３番目がアルギニン、２７０番目がイソロイシン、２７８番目がグリシン、アラニン、２９９番目がアラニン、３０５番目がグリシン、３０７番目がバリンおよび３１０番目がスレオニンに置換、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上である［１］から［３］のいずれかに記載のポリペプチド。【００１７】
［６］以下の（Ｇ）から（Ｉ）のいずれかに示すポリペプチド：
（Ｇ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
（１）１３番目がセリン、
（２）１７番目がグルタミン酸、１１３番目がヒスチジン、２３０番目がプロリン、
（３）２０番目がスレオニン、２１５番目がアスパラギン酸、
（４）２０番目がスレオニン、２４１番目がヒスチジン、
（５）２３番目がロイシン、１２６番目がアスパラギン、
（６）３９番目がスレオニン、２６０番目がアラニン、
（７）７０番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（８）７８番目がロイシン、２７８番目がアラニン、
（９）１０１番目がアスパラギン、
（１０）１０１番目がグルタミン、
（１１）１０１番目がセリン、
（１２）１０１番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（１３）１０１番目がスレオニン、
（１４）１２５番目がバリン、２４９番目がグルタミン酸、
（１５）１２５番目がバリン、１５２番目がグルタミン、
（１６）１３６番目がスレオニン、
（１７）１３８番目がアラニン、１４９番目がグルタミン、２４１番目がヒスチジン、２６３番目がグルタミン、
（１８）１５４番目がアスパラギン、２４６番目がアルギニン、
（１９）１５５番目がロイシン、２３９番目がセリン、
（２０）１９７番目がグルタミン、
（２１）２００番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（２２）２２６番目がアルギニン、２６０番目がアラニン、
（２３）２２７番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（２４）２５４番目がアスパラギン酸、２６０番目がアラニン、
（２５）２６０番目がアラニン、
（２６）２６０番目がアラニン、２７８番目がグリシン、３０７番目がバリン、
（２７）２６０番目がアラニン、２９９番目がアラニン、
（２８）２６０番目がアラニン、３０５番目がグリシン、
（２９）２６０番目がアラニン、３１０番目がスレオニン、
（３０）２６０番目がシステイン、
（３１）２６０番目がグリシン、
（３２）２６０番目がグルタミン、
（３３）２６０番目がスレオニン、
（３４）２６２番目がシステイン、
（３５）２７０番目がイソロイシン、
から選択されるアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなる、［１］から［３］のいずれかに記載のポリペプチド、
（Ｈ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
（１）１３番目がセリン、
（２）１７番目がグルタミン酸、１１３番目がヒスチジン、２３０番目がプロリン、
（３）２０番目がスレオニン、２１５番目がアスパラギン酸、
（４）２０番目がスレオニン、２４１番目がヒスチジン、
（５）２３番目がロイシン、１２６番目がアスパラギン、
（６）３９番目がスレオニン、２６０番目がアラニン、
（７）７０番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（８）７８番目がロイシン、２７８番目がアラニン、
（９）１０１番目がアスパラギン、
（１０）１０１番目がグルタミン、
（１１）１０１番目がセリン、
（１２）１０１番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（１３）１０１番目がスレオニン、
（１４）１２５番目がバリン、２４９番目がグルタミン酸、
（１５）１２５番目がバリン、１５２番目がグルタミン、
（１６）１３６番目がスレオニン、
（１７）１３８番目がアラニン、１４９番目がグルタミン、２４１番目がヒスチジン、２６３番目がグルタミン、
（１８）１５４番目がアスパラギン、２４６番目がアルギニン、
（１９）１５５番目がロイシン、２３９番目がセリン、
（２０）１９７番目がグルタミン、
（２１）２００番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（２２）２２６番目がアルギニン、２６０番目がアラニン、
（２３）２２７番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（２４）２５４番目がアスパラギン酸、２６０番目がアラニン、
（２５）２６０番目がアラニン、
（２６）２６０番目がアラニン、２７８番目がグリシン、３０７番目がバリン、
（２７）２６０番目がアラニン、２９９番目がアラニン、
（２８）２６０番目がアラニン、３０５番目がグリシン、
（２９）２６０番目がアラニン、３１０番目がスレオニン、
（３０）２６０番目がシステイン、
（３１）２６０番目がグリシン、
（３２）２６０番目がグルタミン、
（３３）２６０番目がスレオニン、
（３４）２６２番目がシステイン、
（３５）２７０番目がイソロイシン、
から選択されるアミノ酸が置換されているポリペプチドにおいて、前記アミノ酸部位以外のアミノ酸の１個もしくは複数個が置換、付加、挿入もしくは欠失されている、［１］から［３］のいずれかに記載のポリペプチド、
（Ｉ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；
（１）１３番目がセリン、
（２）１７番目がグルタミン酸、１１３番目がヒスチジン、２３０番目がプロリン、
（３）２０番目がスレオニン、２１５番目がアスパラギン酸、
（４）２０番目がスレオニン、２４１番目がヒスチジン、
（５）２３番目がロイシン、１２６番目がアスパラギン、
（６）３９番目がスレオニン、２６０番目がアラニン、
（７）７０番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（８）７８番目がロイシン、２７８番目がアラニン、
（９）１０１番目がアスパラギン、
（１０）１０１番目がグルタミン、
（１１）１０１番目がセリン、
（１２）１０１番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（１３）１０１番目がスレオニン、
（１４）１２５番目がバリン、２４９番目がグルタミン酸、
（１５）１２５番目がバリン、１５２番目がグルタミン、
（１６）１３６番目がスレオニン、
（１７）１３８番目がアラニン、１４９番目がグルタミン、２４１番目がヒスチジン、２６３番目がグルタミン、
（１８）１５４番目がアスパラギン、２４６番目がアルギニン、
（１９）１５５番目がロイシン、２３９番目がセリン、
（２０）１９７番目がグルタミン、
（２１）２００番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（２２）２２６番目がアルギニン、２６０番目がアラニン、
（２３）２２７番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（２４）２５４番目がアスパラギン酸、２６０番目がアラニン、
（２５）２６０番目がアラニン、
（２６）２６０番目がアラニン、２７８番目がグリシン、３０７番目がバリン、
（２７）２６０番目がアラニン、２９９番目がアラニン、
（２８）２６０番目がアラニン、３０５番目がグリシン、
（２９）２６０番目がアラニン、３１０番目がスレオニン、
（３０）２６０番目がシステイン、
（３１）２６０番目がグリシン、
（３２）２６０番目がグルタミン、
（３３）２６０番目がスレオニン、
（３４）２６２番目がシステイン、
（３５）２７０番目がイソロイシン、
から選択されるアミノ酸が置換されているポリペプチドにおいて、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上である、［１］から［３］のいずれかに記載のポリペプチド。【００１８】
［７］［１］から［６］のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【００１９】
［８］［１］から［６］のいずれかに記載のポリペプチド、または、［７］に記載のポリヌクレオチドを発現させた形質転換体および／またはその処理物を、γ−グルタミルジペプチドに作用させることを特徴とするγ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸を示す）の製造方法。【００２０】
［９］［１］から［６］のいずれかに記載のポリペプチド、または、［７］に記載のポリヌクレオチドを発現させた形質転換体および／またはその処理物を、酸化型γ−グルタミルシステインに作用させることを特徴とするＧＳＳＧの製造方法。【００２１】
［１０］［１］から［６］のいずれかに記載のポリペプチド、または、［７］に記載のポリヌクレオチドを発現させた形質転換体および／またはその処理物を、γ−グルタミルシステインに作用させることを特徴とするＧＳＨの製造方法。【００２２】
［１１］ＡＴＰ再生系の共存下で反応を行うことを特徴とする、［８］に記載のγ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸を示す）の製造方法。【００２３】
［１２］ＡＴＰ再生系としてポリリン酸キナーゼを用いることを特徴とする、［１１］に記載のγ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸を示す）の製造方法。【００２４】
［１３］ＡＴＰ再生系の共存下で反応を行うことを特徴とする、［９］に記載のＧＳＳＧの製造方法。【００２５】
［１４］ＡＴＰ再生系としてポリリン酸キナーゼを用いることを特徴とする、［１３］に記載のＧＳＳＧの製造方法。【００２６】
［１５］ＡＴＰ再生系の共存下で反応を行うことを特徴とする、［１０］に記載のＧＳＨの製造方法。【００２７】
［１６］ＡＴＰ再生系としてポリリン酸キナーゼを用いることを特徴とする、［１５］に記載のＧＳＨの製造方法。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の一態様により、熱安定性が野生型グルタチオン合成酵素よりも向上した改変型グルタチオン合成酵素およびそれをコードする遺伝子、該酵素を発現させた形質転換体、および／またはその処理物を触媒として使用するペプチドおよびグルタチオンの製造方法を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（１．ポリペプチド）
本発明の一実施形態におけるポリペプチドは、以下の（ａ）〜（ｂ）または（ｃ）〜（ｄ）の性質を示すことを特徴とする；
（ａ）γ-グルタミルジペプチドにグリシンを結合する反応を行い、かつ、
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素と比較して、熱安定性および／または保存安定性が高い。
【００３０】
（ｃ）ＧＳＨおよび／またはＧＳＳＧを生成し、かつ、
（ｄ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素と比較して、熱安定性および／または保存安定性が高い。
【００３１】
本明細書において、「γ−グルタミルジペプチド」とは、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基に別のアミノ酸が結合した化合物をいう。グルタミン酸のγ位に結合するアミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリンなどの中性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンなどの芳香族アミノ酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ‐ロイシン、ヒドロキシプロリン、α‐アミノ酪酸、およびβ‐アミノ酪酸が挙げられる。
【００３２】
本発明の一実施形態におけるポリペプチドは、γ−グルタミルジペプチドにグリシンを結合する反応を行い、かつ、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素と比較して、熱安定性および／または保存安定性が高い性質を示すポリペプチドであり、γ−グルタミルシステインおよび酸化型γ−グルタミルシステインを基質とした場合にはＧＳＨおよびＧＳＳＧを生成し、γ−グルタミルシステインを基質とした場合にはＧＳＨを生成し、酸化型γ−グルタミルシステインを基質とした場合にはＧＳＳＧを生成する。本発明の一実施形態におけるポリペプチドは、ＧＳＨおよびＧＳＳＧを生成し、かつ、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素と比較して、熱安定性および／または保存安定性が高い性質を示すポリペプチドであり、γ−グルタミルシステインおよび酸化型γ−グルタミルシステインを基質とした場合にはＧＳＨおよびＧＳＳＧを生成し、γ−グルタミルシステインを基質とした場合にはＧＳＨを生成し、酸化型γ−グルタミルシステインを基質とした場合にはＧＳＳＧを生成する。本発明の一実施形態におけるポリペプチドは、ＧＳＨを生成し、かつ、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素と比較して、熱安定性および／または保存安定性が高い性質を示すポリペプチドであり、γ−グルタミルシステインを基質とした場合には、ＧＳＨを生成する。本発明の一実施形態におけるポリペプチドは、ＧＳＳＧを生成し、かつ、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素と比較して、熱安定性および／または保存安定性が高い性質を示すポリペプチドであり、酸化型γ−グルタミルシステインを基質とした場合には、ＧＳＳＧを生成する。
【００３３】
［変異の記載方法］
なお、本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限り、ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように表される。また、参照を容易にするため、一般的に用いられている下記の命名法を適用する。該命名法は、“もとのアミノ酸；位置；置換したアミノ酸”と記述する方法であり、例えば、位置１３におけるロイシンのセリンへの置換は「Ｌ１３Ｓ」と表される。多重変異については、記号“／”により分けることで表記する。例えば、「Ｓ２０Ｔ／Ｅ２１５Ｄ」とは、位置２０のセリンをスレオニンへ、かつ、位置２１５グルタミン酸をアスパラギン酸へ置換することを示す。
【００３４】
［アミノ酸の略号］
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン。
【００３５】
［配列同一性］
ポリペプチドやポリヌクレオチドの「配列同一性」とは、対比される２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを最適に整列させ、アミノ酸または核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
【００３６】
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（ウィスコンシン大学）、ｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙ Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（スイスバイオインフォマティックス研究所）、ＢＬＡＳＴ（米国生物工学情報センター）、ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社）。
【００３７】
本発明の一実施形態において、変異を導入する前の野生型グルタチオン合成酵素（本明細書において、「野生型酵素」と称することもある。）は、配列表の配列番号１で表される３１４個のアミノ酸残基からなり、かつ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ（例えば、γ-グルタミルアラニン）で表されるγ−グルタミルジペプチドとグリシンとからγ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（例えば、γ-グルタミルアラニルグリシン）を生成する能力、γ−グルタミルシステインとグリシンとからＧＳＨを生成する能力、または酸化型γ−グルタミルシステインとグリシンとからからＧＳＳＧを生成する能力を有するポリペプチドである。
【００３８】
ポリペプチドの由来は限定されるものではないが、好ましくはヒドロゲノフィルス科（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌａｌｅｓ）、より好ましくはチオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物、さらに好ましくはチオバチルス・デニトリフィキャンス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ２５２５９株由来のグルタチオン合成酵素である。
【００３９】
本発明の一実施形態において、野生型グルタチオン合成酵素は、配列表の配列番号１のアミノ酸をコードするものであれば、特に限定されないが、例えば、配列表の配列番号２に示されるポリヌクレオチドによりコードされる。このポリヌクレオチドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））等に記載される通常の遺伝子工学的手法に準じてヒドロゲノフィルス科、好ましくはチオバチルス属、より好ましくはチオバチルス・デニトリフィキャンス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ２５２５９株から取得することができる。さらに配列表の配列番号３に示されるように、配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを化学合成によって取得することもできるし、宿主に合わせてコドン最適化したものを化学合成によって取得することもできる。
【００４０】
即ち、チオバチルス・デニトリフィキャンス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ２５２５９株のゲノムＤＮＡからを鋳型にＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または配列番号２で示されるポリヌクレオチドを増幅して野生型酵素遺伝子を調製することもできるし、例えば配列番号３のポリヌクレオチドのように、配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを化学合成しても良い。
【００４１】
本発明の一実施形態におけるポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列に改変を加えて得られるものであってもよい。
【００４２】
配列番号１に示すアミノ酸配列に加える改変としては、置換、付加、挿入もしくは欠失が挙げられ、１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。上記の「複数個のアミノ酸」とは、例えば、６３個、好ましくは４７個、より好ましくは３１個、さらに好ましくは２５個、１６個、９個、７個、５個、４個、３個または２個のアミノ酸を意味する。
【００４３】
また、改変を加えた後のアミノ酸配列と、配列番号１に示すアミノ酸配列との配列の同一性は８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上である。
【００４４】
本発明の一実施形態におけるポリペプチドは、上記（ａ）〜（ｂ）もしくは（ｃ）〜（ｄ）の性質を示すか、またはγ−グルタミルシステインおよび酸化型γ−グルタミルシステインを基質としてＧＳＨおよびＧＳＳＧを生成する、γ−グルタミルシステインを基質としてＧＳＨを生成する、または、酸化型γ−グルタミルシステインを基質としてＧＳＳＧを生成するとの性質を示すことに加えて、以下で例示するような、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたポリペプチド、またはそのようなアミノ酸配列と特定の配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【００４５】
本発明の一実施形態におけるポリペプチドは、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失、付加される場所は特に制限されないが、好ましくは配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１３、１７、２０、２３、３９、７０、７８、１０１、１１３、１２５、１２６、１３６、１３８、１４９、１５２、１５４、１５５、１９７、２００、２１５、２２６、２２７、２３０、２３９、２４１、２４６、２４９、２５４、２６０、２６２、２６３、２７０、２７８、２９９、３０５、３０７および３１０番目から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。本発明の別の一実施形態におけるポリペプチドは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち上記で示した位置から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸部位以外のアミノ酸の１個もしくは複数個、例えば、６３個、好ましくは４７個、より好ましくは３１個、さらに好ましくは２５個、１６個、９個、７個、５個、４個、３個または２個が置換、付加、挿入もしくは欠失されているポリペプチドであり得る。本発明の他の一実施形態におけるポリペプチドは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち上記で示した位置から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上であるポリペプチドであり得る。
【００４６】
より好ましくは、本発明の一実施形態におけるポリペプチドは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；１３番目がセリン、１７番目がグルタミン酸、２０番目がスレオニン、２３番目がロイシン、３９番目がスレオニン、７０番目がセリン、７８番目がロイシン、１０１番目がアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、１１３番目がヒスチジン、１２５番目がバリン、１２６番目がアスパラギン、１３６番目がスレオニン、１３８番目がアラニン、１４９番目がグルタミン、１５２番目がグルタミン、１５４番目がアスパラギン、１５５番目がロイシン、１９７番目がグルタミン、２００番目がセリン、２１５番目がアスパラギン酸、２２６番目がアルギニン、２２７番目がセリン、２３０番目がプロリン、２３９番目がセリン、２４１番目がヒスチジン、２４６番目がアルギニン、２４９番目がグルタミン酸、２５４番目がアスパラギン酸、２６０番目がアラニン、システイン、グリシン、グルタミン、スレオニン、２６２番目がシステイン、２６３番目がアルギニン、２７０番目がイソロイシン、２７８番目がグリシン、アラニン、２９９番目がアラニン、３０５番目がグリシン、３０７番目がバリンおよび３１０番目がスレオニンに置換、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているポリペプチドである。本発明の別の一実施形態におけるポリペプチドは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち上記で示した位置から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸部位以外のアミノ酸の１個もしくは複数個、例えば、６３個、好ましくは４７個、より好ましくは３１個、さらに好ましくは２５個、１６個、９個、７個、５個、４個、３個または２個が置換、付加、挿入もしくは欠失されているポリペプチドであり得る。本発明の他の一実施形態におけるポリペプチドは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち上記で示した位置から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上であるポリペプチドであり得る。
【００４７】
さらに好ましくは、本発明の一実施形態におけるポリペプチドは、下記の（１）〜（３５）；配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち下記の（１）〜（３５）；
（１）１３番目がセリン、
（２）１７番目がグルタミン酸、１１３番目がヒスチジン、２３０番目がプロリン、
（３）２０番目がスレオニン、２１５番目がアスパラギン酸、
（４）２０番目がスレオニン、２４１番目がヒスチジン、
（５）２３番目がロイシン、１２６番目がアスパラギン、
（６）３９番目がスレオニン、２６０番目がアラニン、
（７）７０番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（８）７８番目がロイシン、２７８番目がアラニン、
（９）１０１番目がアスパラギン、
（１０）１０１番目がグルタミン、
（１１）１０１番目がセリン、
（１２）１０１番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（１３）１０１番目がスレオニン、
（１４）１２５番目がバリン、２４９番目がグルタミン酸、
（１５）１２５番目がバリン、１５２番目がグルタミン、
（１６）１３６番目がスレオニン、
（１７）１３８番目がアラニン、１４９番目がグルタミン、２４１番目がヒスチジン、２６３番目がグルタミン、
（１８）１５４番目がアスパラギン、２４６番目がアルギニン、
（１９）１５５番目がロイシン、２３９番目がセリン、
（２０）１９７番目がグルタミン、
（２１）２００番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（２２）２２６番目がアルギニン、２６０番目がアラニン、
（２３）２２７番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（２４）２５４番目がアスパラギン酸、２６０番目がアラニン、
（２５）２６０番目がアラニン、
（２６）２６０番目がアラニン、２７８番目がグリシン、３０７番目がバリン、
（２７）２６０番目がアラニン、２９９番目がアラニン、
（２８）２６０番目がアラニン、３０５番目がグリシン、
（２９）２６０番目がアラニン、３１０番目がスレオニン、
（３０）２６０番目がシステイン、
（３１）２６０番目がグリシン、
（３２）２６０番目がグルタミン、
（３３）２６０番目がスレオニン、
（３４）２６２番目がシステイン、
（３５）２７０番目がイソロイシン、
のいずれかで示されるアミノ酸が置換されているポリペプチドである。本発明の別の一実施形態におけるポリペプチドは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち上記で示した位置から選択されるアミノ酸が置換されているポリペプチドにおいて、前記アミノ酸部位以外のアミノ酸の１個もしくは複数個、例えば、６３個、好ましくは４７個、より好ましくは３１個、さらに好ましくは２５個、１６個、９個、７個、５個、４個、３個または２個が置換、付加、挿入もしくは欠失されているポリペプチドであり得る。本発明の他の一実施形態におけるポリペプチドは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち上記で示した位置から選択されるアミノ酸が置換されているポリペプチドにおいて、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上であるポリペプチドであり得る。
【００４８】
本発明の一実施形態において、酵素の熱安定性は、例えば、以下の方法で評価できる。
【００４９】
［酵素の熱安定性の評価方法］
酵素を含む無細胞抽出液を任意の温度（例えば４０〜９０℃）で任意の時間（例えば０．１分〜４８時間）インキュベートする。熱処理を行っていない無細胞抽出液と熱処理済みのサンプルを０．０１〜１．０ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６〜９）で希釈し、その希釈液を用いて下記の［グルタチオン合成酵素活性の評価方法（１）］またはグルタチオン合成酵素活性の評価方法（２）］のいずれかで酵素の活性を測定することで、熱処理後の残存活性を下記式により算出できる。この残存活性を熱安定性の指標とする。
残存活性（％）＝［熱処理サンプルの酵素活性］÷［非熱処理サンプルの酵素活性］×１００。
【００５０】
［グルタチオン合成酵素活性の評価方法（１）］
２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に基質（例えばγ−グルタミルシステイン、酸化型γ−グルタミルシステイン）１〜５０ｍＭ、ＡＴＰ二ナトリウム塩３０ｍＭ、グリシン３０ｍＭ、硫酸マグネシウム七水和物１０ｍＭおよび本発明の一実施形態におけるポリペプチドを含む反応液を３０℃で反応させ、得られた反応液をＨＰＬＣ分析して生成物（例えば、ＧＳＨ、ＧＳＳＧ、γ−グルタミル−システイニルグルタチオン）を定量することにより、グルタチオン合成酵素活性を評価することができる。グルタチオン合成酵素活性１Ｕは１分間に１μｍｏｌのグリシンを基質に結合する反応を触媒する酵素量とした。
【００５１】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ−３（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、野村化学社製）；
溶離液：リン酸２水素カリウム  １２．２ｇ、１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム  ７．２ｇを蒸留水１．８Ｌで溶解した後、該溶液をｐＨ３．０に調整し、メタノール１００ｍｌを追加して溶解した液；
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；
カラム温度：４０℃；
測定波長：２１０ｎｍ。
【００５２】
［グルタチオン合成酵素活性の評価方法（２）］
グルタチオン合成酵素活性の測定は、より安価に入手できる化合物（例えばγ−グルタミルアラニン）をγ−グルタミルシステインまたは酸化型γ−グルタミルシステインの代替基質として用いることでも実施できる。より詳しくは、上記方法におけるγ−グルタミルシステインおよび／または酸化型γ−グルタミルシステインの代わりに代替基質を用いる。代替基質を用いた活性測定法は以下である。２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に基質１〜５０ｍＭ、ＡＴＰ二ナトリウム塩２０ｍＭ、グリシン２０ｍＭ、硫酸マグネシウム七水和物１０ｍＭおよび本発明のポリペプチドを含む反応液を３０℃で反応させ、得られた反応液のＨＰＬＣ分析によって生成物を定量することにより、当該酵素の活性を評価することができる。酵素活性１Ｕは１分間に１μｍｏｌの生成物生産を触媒する酵素量とした。
【００５３】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、住化分析センター製）；
溶離液：蒸留水：イソプロピルアルコール＝９５：５の溶液に２ｍＭの硫酸銅を溶解した液；
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；
カラム温度：４０℃；
測定波長：２５４ｎｍ。
【００５４】
本明細書において、「熱安定性が向上している」とは、上記の評価を行なった場合の残存活性が、配列表の配列番号１に記載のグルタチオン合成酵素と比較して、１％以上高いことであり、好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上高いことである。
【００５５】
具体的には、６０℃または７０℃でインキュベートした後のγ−グルタミルシステイン、酸化型γ−グルタミルシステインまたはγ−グルタミルアラニンに対する残存活性を後述の参考例３または４に記載する方法で測定した場合に、少なくともどちらか一つの方法において、残存活性が野生型酵素と比較して１％以上高いことであり、好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、もっとも好ましくは２０％以上高いことをいう。
【００５６】
酵素は熱により変性するため、一般的に、熱安定性の高い酵素は、緩慢な温度条件下における酵素活性の安定性が高い。熱安定性は、水素結合、疎水性結合、イオン相互作用、金属結合、および／またはジスルフィド結合を含む安定力の関数である。そのような安定効果は、酵素の長期間の安定性に寄与する（Pure & Appl. Chem., 63, 10, 1527-1540 (1991)）。すなわち、酵素において、熱安定性が高ければ、保存安定性も高くなる傾向にある（換言すれば、熱安定性と保存安定性とは、相関関係にある）。したがい、本発明の一実施形態におけるグルタチオン合成酵素は、熱安定性に優れると共に、保存安定性にも優れる。
【００５７】
本明細書において、「保存安定性が高い」とは、例えば、該酵素、該酵素を含む溶液、あるいは該酵素を生産する組換え体について、４〜４０℃で長期間（例えば、１時間〜２年間）静置後に前記の活性測定を行った際、静置前の活性に対する静置後の活性の割合が、野生型酵素と比較して１％以上高いことであり、好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上高いことである。
【００５８】
本発明の一実施形態におけるグルタチオン合成酵素は、下記の方法により探索することができる。
【００５９】
具体的には、エラープローンＰＣＲ法（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １，  １１−１５（１９８９））、あるいは同様の原理に基づいたキットを用いて、配列表の配列番号３に示す塩基配列（化学合成した野生型酵素遺伝子）に１つ以上の塩基配列の置換、挿入、欠失、付加が導入されたＤＮＡ断片を得ることができる。例えば、野生型酵素遺伝子をテンプレートにして、プライマー１：５’−ＧＧＧＴＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＴＣＧ−３’（配列表の配列番号４）、およびプライマー２：５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＴＣＣＧＧＡＣＧＣＧ−３’（配列表の配列番号５）とＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いることにより、野生型酵素をコードする遺伝子の全長にランダムに変異が導入され、かつ開始コドンにＮｄｅＩ認識部位が付加され、終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ認識部位が付加された複数種類の二本鎖ＤＮＡ（変異型酵素遺伝子）を得ることができる。この増幅断片をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、このプラスミドを用いてエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株（以下、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１）を形質転換する。形質転換した大腸菌を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地に塗布し、シングルコロニーの大腸菌を得る。また、野生型遺伝子の変わりに前記方法で得られた変異型酵素遺伝子を用いて、同様の操作でさらに変異を導入した変異酵素遺伝子ライブラリーを作製することもできる。
【００６０】
上記ライブラリーから、本発明の一実施形態における改変型グルタチオン合成酵素を選抜することができる。選抜方法としては特に限定されないが、好ましくは以下で示す方法である。なお、改変型酵素（または、改変型グルタチオン合成酵素）とは、目的の性質を付与するための変異を導入した変異型酵素のことであって、本明細書においては、変異酵素遺伝子ライブラリーから、野生型酵素と比較して熱安定性および／または保存安定性が高いものとして選抜したグルタチオン合成酵素を意味する。
【００６１】
［熱安定性が向上した酵素のプレート評価による選抜法］
変異酵素遺伝子ライブラリーの各組換え菌および野生型酵素を生産する組換え菌（例えば、参考例３に示すＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２））を適当な培地（例えば２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム  ０．５％、ｐＨ７．０））に接種し、３７℃で２４時間振盪培養する。得られた各培養液を遠心分離して上清を除き、適当な緩衝液（例えば０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５））で懸濁する。この懸濁液を破砕処理後、遠心分離により沈殿を除くことで無細胞抽出液を得る。各酵素を含む無細胞抽出液を適当な温度（好ましくは４０〜８０℃）で加熱しインキュベートする。０．１分〜４８時間程度インキュベートした後、９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に分注し、ＡＴＰ二ナトリウム塩（好ましくは３０ｍＭ）、硫酸マグネシウム七水和物（好ましくは１０ｍＭ）、酸化型γ−グルタミルシステインを含む溶液（好ましくは１５ｍＭ）、グリシン（好ましくは３０ｍＭ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ５〜９）を加えて、１０〜５０℃で３分〜４８時間インキュベートする。反応液中で生成したグルタチオンを定量する方法として、例えば以下の方法が挙げられる。反応液を新たな９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に分注し、グルタチオン還元酵素（好ましくは３０Ｕ／Ｌ以上、シグマアルドリッチ社製）、ＮＡＤＰＨ（好ましくは１．２ｍＭ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ５〜９）を添加して１０〜５０℃で０．１〜６０分インキュベートする。ここで、グルタチオン合成酵素によって生成した酸化型グルタチオンが還元型グルタチオンに変換される。ここに５，５‘−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（以下、ＤＴＮＢと記載）（好ましくは０．２ｍｇ／ｍＬ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ５〜９）を添加し、経時的に目視および４０５ｎｍの吸光を検出する。このとき、反応液中に還元型グルタチオンが存在すれば、４０５ｎｍにおける吸光を検出できる。熱処理しない無細胞抽出液を用いてグルタチオン合成反応を行った対照の吸光に対する、熱処理した無細胞抽出液を用いてグルタチオン合成反応を行ったサンプルの吸光の比率を活性残存率とし、該活性残存率が野生型グルタチオン合成酵素よりも高いものを熱安定性の向上した酵素として選抜した。選抜した酵素の培養液からプラスミドを抽出し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて改変型グルタチオン合成酵素遺伝子の塩基配列を決定し、変異部位を特定することができる。
【００６２】
得られた複数の改変型グルタチオン合成酵素の変異を部位特異的変異導入によって、一方のいくつか、あるいは双方を組み合わせることで、熱安定性を強化した改変型グルタチオン合成酵素を作製できる。このような改変型グルタチオン合成酵素もまた本発明の一実施形態におけるポリペプチドに含まれる。
【００６３】
（２．ポリヌクレオチド）
本発明の一実施形態において、上記本発明の一実施形態におけるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００６４】
本発明の一実施形態におけるポリヌクレオチドは、上記本発明の一実施形態におけるポリペプチドをコードするものであれば特に限定されない。本発明の一実施形態におけるポリヌクレオチドは、例えば、配列表の配列番号２および３に示した野生型酵素をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはこれに改変を加えて得られるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６５】
野生型酵素遺伝子の改変方法としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９））等に記載の公知の方法を用いることができる。すなわち、野生型酵素遺伝子の塩基の１個、または複数個（例えば、４０個、好ましくは２０個、より好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個の塩基）を置換、付加、挿入もしくは欠失することにより、野生型酵素のアミノ酸配列を改変したポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、エラープローンＰＣＲ法（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １，  １１−１５（１９８９））などのＰＣＲを用いた変異導入法や、あるいは市販のキットＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などの利用が挙げられる。
【００６６】
ポリヌクレオチドを部位特異的変異導入法により作製する場合、部位特異的変異導入法としては、例えば、Ｏｌｆｅｒｔ Ｌａｎｄｔら（Ｇｅｎｅ， ９６， １２５−１２８（１９９０））、Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ３，１， Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｖｌａｓｕｋら（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｉｎｏｕｙｅ，Ｍ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｈｏｓ．Ｎ．Ｈｕｎｔら（Ｇｅｎｅ，７７，５１（１９８９））の方法やＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）の市販キットの利用等があげられる。なお、２箇所に変異を導入する場合には上記方法に準じた方法を２回繰り返すことにより、目的とする本発明の一実施形態におけるポリヌクレオチドを得ることができる。なお、複数の他のポジションが他のアミノ酸で置換されている場合も当該方法により、目的とする本発明の一実施形態におけるポリヌクレオチドを得ることができる。
【００６７】
本発明の一実施形態におけるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、γ−グルタミルシステイン、酸化型γ−グルタミルシステインまたはγ−グルタミルアラニンのそれぞれとグリシンとから、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンまたはγ−グルタミルアラニルグリシンを生成する活性を有し、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素と比較して熱安定性が高いポリペプチドをコードし、かつ、配列表の配列番号２および３に示した塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが好ましい。
【００６８】
ここで、「配列表の配列番号２に示したポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして、ストリンジェントな条件下で、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味する。
【００６９】
ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．３倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。より好ましくは６５℃で０．１３倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、さらに好ましくは６５℃で０．０９倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、とりわけ好ましくは６５℃で０．０７倍、０．０６倍、０．０４倍、０．０３倍、０．０２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるポリヌクレオチドである。
【００７０】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００７１】
上記の条件にてハイブリダイズが可能なポリヌクレオチドとしては、配列番号２に示されるポリヌクレオチドと、配列同一性が好ましくは７８％以上、より好ましくは８４％以上、さらに好ましくは８７％以上、とりわけ好ましくは８９％、９０％、９３％、９５％、９７％以上のＤＮＡをあげることができ、コードされるポリペプチドが、本発明の一実施形態におけるポリペプチドの性質を有する限り、上記本発明の一実施形態におけるポリヌクレオチドに包含される。
【００７２】
「配列表の配列番号３に示したポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」に関しても前記と同様に、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．６倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。より好ましくは６５℃で０．２５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、さらに好ましくは６５℃で０．１５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、とりわけ好ましくは６５℃で０．１２倍、０．１０倍、０．０７倍、０．０５倍、０．０４倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるポリヌクレオチドである。
【００７３】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００７４】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、配列番号２に示されるポリヌクレオチドと、配列同一性が好ましくは７８％以上、より好ましくは８４％以上、さらに好ましくは８７％以上、とりわけ好ましくは８９％、９０％、９３％、９５％、９７％以上のＤＮＡをあげることができ、コードされるポリペプチドが、本発明の一実施形態におけるポリペプチドの性質を有する限り、上記一実施形態におけるポリヌクレオチドに包含される。
【００７５】
（３．形質転換体）
本発明の一実施形態において、上記本発明の一実施形態におけるポリペプチド、または、上記本発明の一実施形態におけるポリヌクレオチドを発現させた形質転換体を提供する。
【００７６】
本発明の一実施形態におけるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、ポリペプチド発現ベクターを作製できる。
【００７７】
本明細書において、「発現ベクター」とは、プロモーター等の配列を含み、形質転換後の細胞内で遺伝子が発現するように構築したベクターを意味する。上記で用いる発現ベクターとしては、適当な宿主生物内で上記本発明の一実施形態におけるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現できるものであれば、特に限定されない。
【００７８】
本明細書において、「ベクター」とは、遺伝子を組み込み、組換えＤＮＡを増幅・維持・導入させる核酸分子を意味する。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
【００７９】
本発明の一実施形態におけるベクターは、本発明の一実施形態におけるポリヌクレオチドと作動可能に連結された制御因子を含み得る。本明細書において、「制御因子」は、機能的プロモーターおよび任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列を意味する。また、本明細書において、「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメント（上記制御因子を含む）と遺伝子とが、宿主細胞内で作動し得る状態で連結されることを意味する。制御因子のタイプおよび種類が、本発明の一実施形態におけるベクターが導入される宿主生物に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００８０】
本発明の一実施形態において、例えば、宿主生物が大腸菌の場合には、本発明の一実施形態におけるベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明の一実施形態におけるポリヌクレオチドと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。そのようなベクターとしては、例えば、ｐＵＣＮ１８（参考例１参照）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（国際公開第９４／０３６１３号公報）などが挙げられる。
【００８１】
各宿主生物における利用可能なベクター、プロモーターなどについては、微生物学基礎講座（８、安藤忠彦、共立出版、（１９８７））などに詳細に記述されている。
【００８２】
本発明の一実施形態におけるベクターは、ＡＴＰ再生能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。ＡＴＰ再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、ポリリン酸キナーゼ（以下、「ＰＰＫ」と称することもある。）、アデニレートキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホクレアチンキナーゼが挙げられる。
【００８３】
本発明の一実施形態におけるベクターにより宿主細胞を形質転換することにより、本発明の一実施形態における形質転換体を得ることができる。本発明の一実施形態における形質転換体としては、本発明の一実施形態におけるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体中に導入して得られる形質転換体も含まれる。
【００８４】
本発明の一実施形態におけるベクターの導入により形質転換される宿主細胞としては、本発明の一実施形態における各ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリペプチド発現ベクターにより形質転換され、導入したポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現することができる細胞であれば、特に制限されない。宿主細胞として利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ)属、バチルス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)属、シュードモナス(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)属、セラチア(Ｓｅｒｒａｔｉａ)属、ブレビバクテリウム(Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ)属、コリネバクテリイウム(Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ)属、ストレプトコッカス(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ)属、およびラクトバチルス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ)属などの宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス(Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ)属およびストレプトマイセス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)属などの宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、クライベロマイセス(Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ)属、シゾサッカロマイセス(Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、チゴサッカロマイセス(Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、ヤロウイア(Ｙａｒｒｏｗｉａ)属、トリコスポロン(Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ)属、ロドスポリジウム(Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ)属、ピキア(Ｐｉｃｈｉａ)属、およびキャンディダ(Ｃａｎｄｉｄａ)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ(Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ)属、アスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)属、セファロスポリウム(Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ)属、およびトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に、蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ，  ３１５， ５９２−５９４ （１９８５））や、菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入および発現効率の観点から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。
【００８５】
本発明の一実施形態におけるベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる。例えば、ポリペプチド発現ベクターとして前記の発現ベクターｐＵＣＮ１８に改変型グルタチオン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを導入した本発明の一実施形態におけるプラスミド（実施例１〜２、７〜８、１２〜１８に示すｐＮＫＰｍ０１〜３５）を用い、かつ宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）などを用いて、そのプロトコールに従って操作することにより、当該ベクターを宿主細胞に導入した形質転換体（例えば、実施例１８に示すＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２ｍ３５））が得られる。
【００８６】
また、本発明の一実施形態におけるポリペプチドおよび前記のＡＴＰ再生能を有するポリペプチドの両ポリペプチドを、同一菌体内で発現させた形質転換体を作製することもできる。すなわち、本発明の一実施形態におけるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびＡＴＰ再生能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる。また、これら２種類のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらを同一の宿主細胞に導入することによっても得ることができる。
【００８７】
このようにして得られる形質転換体としては、例えば、本発明の一実施形態における改変型グルタチオン合成酵素をコードするヌクレオチドを前記の発現ベクターｐＵＣＮ１８に導入した組換えベクター（例えば、実施例２に示したｐＴＤＧＳＨ２ｍ１５）とＡＴＰ再生能を有するポリペプチドであるポリリン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターとを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入した形質転換体などが挙げられるがこれに限定されない。
【００８８】
（４．製造方法）
本発明の一実施形態において、上記本発明の一実施形態におけるポリペプチド、または、上記本発明の一実施形態におけるポリヌクレオチドを発現させた形質転換体および／またはその処理物を、γ−グルタミルジペプチドに作用させることを特徴とするγ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸を示す）の製造方法を提供する。
【００８９】
本発明の一実施形態におけるポリペプチド、または、本発明の一実施形態におけるポリヌクレオチドを発現させた形質転換体および／またはその処理物を、γ−グルタミルジペプチド、より好ましくはγ−グルタミルシステイン、酸化型γ−グルタミルシステインまたはγ−グルタミルアラニンに作用させることにより、各々さらに１分子のアミノ酸が付加した、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸を表す）、より好ましくは還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンまたはγ−グルタミルアラニルグリシンを製造することができる。
【００９０】
本発明の一実施形態におけるポリペプチド、または、本発明の一実施形態におけるポリヌクレオチドを発現させた形質転換体および／またはその処理物の基質となるペプチドは特に制限されるものではないが、γ−グルタミルシステインおよび酸化型γ−グルタミルシステインにグリシンを付加する反応である場合、その産物が有用なグルタチオンとなるため、非常に有益な反応となる。
【００９１】
本発明の一実施形態におけるポリペプチド、または、本発明の一実施形態におけるポリペプチドを発現させた形質転換体および／またはその処理物を用いて、上記ペプチドを基質としてペプチド伸長反応を行う場合、以下のように実施され得る。但し、以下の方法に限定されるわけではない。
【００９２】
具体的には、適当な溶媒（例えば５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）など）、基質としてのペプチド（例えば、γ−グルタミルシステイン、酸化型γ−グルタミルシステイン、γ−グルタミルアラニン）を加え、硫酸マグネシウムやＡＴＰ等の補酵素、ならびに本発明の一実施形態における形質転換体の培養物および／またはその処理物などを添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。このとき、本発明の一実施形態におけるポリペプチドを発現された形質転換体とは別に、前記のＡＴＰ再生能を有するポリペプチドを発現された形質転換体およびその培養物、および／またはその処理物などを添加しても良い。
【００９３】
本明細書において、「形質転換体の処理物」とは、例えば、無細胞抽出液、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、菌体破砕物、またはそれらの混合物もしくは固定化物等であり、本発明の一実施形態におけるポリペプチドの酵素触媒活性が残存しているものを意味する。本発明の一実施形態におけるポリペプチド自体、本発明の一実施形態におけるポリヌクレオチドを発現させた形質転換体の固定化物等もまた、上記「形質転換体の処理物」の範囲に包含される。
【００９４】
本発明の一実施形態におけるポリペプチド、または、本発明の一実施形態におけるポリヌクレオチドを発現させた形質転換体および／またはその処理物と基質との反応は、５〜８０℃、好ましくは１０〜７０℃、より好ましくは２０〜７０℃の温度で行われる。反応中の反応液のｐＨは、３〜１０、好ましくは４〜１０、より好ましくは５〜９に維持する。反応はバッチ式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合は、反応基質は、０．０１〜１００％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜７０％、より好ましくは０．５〜５０％の仕込み濃度で添加されうる。また、反応の途中で新たに基質を追加で添加しても良い。
【００９５】
また、本発明の一実施形態におけるポリペプチド、または、本発明の一実施形態におけるポリヌクレオチドを発現させた形質転換体および／またはその処理物と基質との反応には、水系溶媒を用いてもよいし、水系の溶媒と有機系の溶媒とを混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、２−プロパノール、酢酸エチル、トルエン、メタノール、エタノール、ｎ−ブタノール、ヘキサン、アセトニトリル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、アセトン、ジメトキシプロパン、ｔ−メチルブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルアセトアミド、ジグリム、エチレングリコール、ジメトキシエタン、四塩化炭素、塩化メチレン、エチルセロソルブ、酢酸セロソルブ、１，３−ジメチル−2−イミダゾリジノン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等が挙げられる。
【００９６】
また、本発明の一実施形態におけるポリペプチド、または、本発明の一実施形態におけるポリヌクレオチドを発現させた形質転換体および／またはその処理物と基質との反応を行う際に、本発明の一実施形態におけるポリペプチドおよびＡＴＰ再生能を有するポリペプチドの両方を生産する形質転換体を用いるか、あるいはＡＴＰ再生能を有するポリペプチドを生産する形質転換体を別途添加して用いれば、補酵素ＡＴＰの使用量を大幅に減らすことが可能となる。ＡＴＰ再生能を有するポリペプチドについて、次に詳述する。
【００９７】
本発明の一実施形態におけるポリペプチドの生産能を有する形質転換体を用いて、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ、還元型グルタチオンおよび／または酸化型グルタチオン合成反応を行う場合、補酵素としてＡＴＰが必要となる。上記のように、反応系にＡＴＰを必要な量だけ添加することによっても実施しうる。しかし、脱リン酸化された該補酵素（ＡＤＰやＡＭＰ）をＡＴＰに変換する能力（以下、「ＡＴＰ再生能」と称する。）を有する酵素をその基質と共に用いる、すなわち、ＡＴＰ再生系を本発明の一実施形態におけるポリペプチドと組み合わせて上記反応を行うことにより、高価なＡＴＰの使用量を大幅に削減することができる。ＡＴＰ再生能力を有する酵素としては、ポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホクレアチンキナーゼ等を用いることができ、これらを単独で用いることもできるし、これらのうち複数を組み合わせても良い。好適には、ポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼが用いられる。
【００９８】
ＡＴＰ再生系を用いる上記の反応は、ＡＴＰ再生系をγ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ、還元型グルタチオンまたは酸化型グルタチオン合成反応系内に添加することによっても行われ得る。しかし、本発明の一実施形態におけるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびＡＴＰ再生能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両方により形質転換された形質転換体を触媒として用いた場合は、ＡＴＰ再生能を有する酵素を別に調製して反応系内に添加しなくても、効率的に反応を行うことができる。このような形質転換体は、上述した方法により得られる。
【００９９】
合成反応後の反応液からの生成物の採取方法は特に限定されないが、反応液から直接精製するか、または反応液から菌体等を分離後、メタノール等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、合成吸着剤のカラムクロマトグラフィー等により精製することにより、容易に生成物が得られる。
【実施例】
【０１００】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、以下の文献に記載されている：
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９））。【０１０１】
（参考例１）組換えベクターｐＴＤＧＳＨ２の構築
Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｉｆｉｔｒｉｃａｎｓＡＴＣＣ２５２５９由来グルタチオン合成酵素（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１１３１２９２１）をコードする遺伝子を大腸菌宿主に対応するようコドン最適化した遺伝子配列（配列番号２）の５’端にＮｄｅＩサイト、３’端にＥｃｏＲＩサイトを付加した配列をユーロフィンジェノミクス社にて化学合成した。この遺伝子をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＴＤＧＳＨ２を構築した。【０１０２】
（参考例２）ポリペプチドを発現する組換え生物の作製
参考例１で構築した組換えベクターｐＴＤＧＳＨ２を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２）を得た。また、ｐＵＣＮ１８を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）を得た。【０１０３】
（参考例３）組換え生物におけるＤＮＡの発現
参考例２で得た２種類の組換え生物（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２））を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム  ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。上記の培養で得られたそれぞれ培養液について、遠心分離により菌体を集め、１ｍｌの２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液のグルタチオン合成酵素活性を測定した。グルタチオン合成酵素活性は、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に、酸化型γ−グルタミルシステイン  １５ｍＭ、グリシン  ３０ｍＭ、ＡＴＰ  ３０ｍＭ、硫酸マグネシウム  １０ｍＭ、および無細胞抽出液を添加して３０℃で１０分間反応を行い、生成した酸化型グルタチオンをＨＰＬＣ分析により定量した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌの酸化型グルタチオンを生成する酵素活性を２Ｕと定義した。それぞれの組換え生物のグルタチオン合成酵素活性を以下に示す。【０１０４】
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）については、グルタチオン合成酵素活性は０．１ｍＵ／ｍｇ以下であった。一方、ＴＤＧＳＨ２を発現させたＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２）のグルタチオン合成活性は７００ｍＵ／ｍｇであった。以上のように、参考例２で得られた組換え生物はグルタチオン合成活性を有し、ＴＤＧＳＨ２の生産を確認できた。【０１０５】
（参考例４）代替基質を用いた酵素活性測定
参考例２で得た２種類の組換え生物（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２））を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム  ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。上記の培養で得られたそれぞれ培養液について、遠心分離により菌体を集め、１ｍｌの２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液のγ−グルタミルアラニルグリシン合成酵素活性を測定した。γ−グルタミルアラニルグリシン合成酵素活性は、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に、γ−グルタミルアラニン  ２０ｍＭ、グリシン  ２０ｍＭ、ＡＴＰ  ２０ｍＭ、硫酸マグネシウム  １０ｍＭ、および２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で２０倍希釈した無細胞抽出液を添加して３０℃で１０分間反応を行い、生成したγ−グルタミルアラニルグリシンをＨＰＬＣ分析により定量した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのγ−グルタミルアラニルグリシンを生成する酵素活性を１Ｕと定義した。それぞれの組換え生物のγ−グルタミルアラニルグリシン合成酵素活性を以下に示す。【０１０６】
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）については、γ−グルタミルアラニルグリシン合成酵素活性は０．１Ｕ／ｍｇ以下であった。一方、ＴＤＧＳＨ２を発現させたＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２）のγ−グルタミルアラニルグリシン合成活性は６Ｕ／ｍｇであった。以上のように、野生型のグルタチオン合成酵素がγ−グルタミルアラニルグリシン合成活性も持つことを確認できた。【０１０７】
（参考例５）野生型酵素の熱安定性
参考例３と同様の方法で野生型酵素の無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液を６０℃で１０分間または３０分間、７０℃で１０分間または１５分間インキュベートした。インキュベート後、各無細胞抽出液を希釈した。加熱をしない無細胞抽出液も同様に希釈した。これら無細胞抽出液のグルタチオン合成活性を参考例３と同様の方法で測定した。下記式より加熱後の残存活性を算出し、この値を熱安定性の指標とした。結果を表１に示す。
残存活性（％）＝［加熱後の酵素活性］÷［加熱前の酵素活性］×１００【０１０８】
【表１】
2018084165.tif 000002
野生型酵素はこれらの条件で加熱すると、失活し、活性が検出できなかった。【０１０９】
（実施例１）変異酵素遺伝子ライブラリーの作製１
参考例１で作製したＴ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ由来グルタチオン合成酵素遺伝子を含むプラスミドｐＴＤＧＳＨ２をテンプレートに、プライマー１：５’−ＧＧＧＴＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＴＣＧ−３’（配列表の配列番号４）およびプライマー２：５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＴＣＣＧＧＡＣＧＣＧ−３’（配列表の配列番号５）を用いてエラープローンＰＣＲ法（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １，  １１−１５（１９８９））を用いて、ＲＫＰ遺伝子全長にランダムな変異を導入したＤＮＡ増幅断片を得た。この増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化したのち、同酵素で処理した高発現ベクターｐＵＣＮ１８に組み込み、複数の変異酵素発現プラスミドを作製した。このプラスミドを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地に塗布した。生育したコロニーは変異導入されたグルタチオン合成酵素遺伝子を有する組換え大腸菌であり、この組換え菌群を変異酵素遺伝子ライブラリー１とした。【０１１０】
（実施例２）改変型グルタチオン合成酵素の選抜１
変異酵素遺伝子ライブラリー１より、熱安定性が野生型グルタチオン合成酵素と比較して向上した改変型グルタチオン合成酵素を選抜した。実施例１で作製した変異酵素遺伝子ライブラリー１の各組換え菌および参考例２で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２）（対照）をそれぞれ参考例３と同様の方法で培養した。得られた各培養液を遠心分離して上清を除き、例えば０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５））で懸濁した。この懸濁液を破砕処理後、遠心分離により沈殿を除くことで無細胞抽出液を得た。各酵素を含む無細胞抽出液を６０℃で加熱した。３０分間加熱後、９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に分注し、ＡＴＰ二ナトリウム塩  ３０ｍＭ、硫酸マグネシウム七水和物１０ｍＭ、酸化型γ−グルタミルシステイン１５ｍＭ、グリシン３０ｍＭを含む０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を加えて、３０℃で３時間インキュベートした。反応液を新たな９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に分注し、グルタチオン還元酵素（３０ユニット／Ｌ、シグマアルドリッチ社製）、ＮＡＤＰＨ１．２ｍＭ）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して室温で２分間インキュベートした。ここで、グルタチオン合成酵素によって生成した酸化型グルタチオンが還元型グルタチオンに変換される。ここにＤＴＮＢ０．２ｍｇ／ｍＬを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、経時的に４０５ｎｍの吸光を検出した。無細胞抽出液を熱処理せずにグルタチオン合成反応を行った対照の吸光に対する、無細胞抽出液を熱処理後にグルタチオン合成反応を行ったサンプルの吸光の比率を活性残存率とし、該活性残存率が野生型グルタチオン合成酵素の活性残存率よりも高いものを熱安定性の向上した酵素として選抜した。選抜した酵素の培養液からプラスミドを抽出し、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて改変型グルタチオン合成酵素遺伝子の塩基配列を決定し、変異部位を特定した。得られた熱安定性の向上した改変型グルタチオン合成酵素における変異部位を表２に示す。【０１１１】
【表２】
2018084165.tif 000003
表２に示す１７種類の熱安定性が向上した酵素を取得した。【０１１２】
（実施例３）改変型グルタチオン合成酵素の評価１
実施例２で取得した改変型グルタチオン合成酵素の各組換え菌および参考例２で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２）（対照）をそれぞれ参考例３および４と同様の方法で培養した。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液と等量の０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これらの無細胞抽出液について参考例３および４と同様の方法でグルタチオン合成活性およびγ−グルタミルアラニルグリシン合成活性の両方があることを確認した。改変型グルタチオン合成酵素の、野生型酵素のグルタチオン合成活性を１００とした場合の相対活性を表３に示す。【０１１３】
【表３】
2018084165.tif 000004
（実施例４）改変型グルタチオン合成酵素の評価２
実施例２で取得した改変型グルタチオン合成酵素の各組換え菌および参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２）（対照）をそれぞれ参考例３および４と同様の方法で培養した。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液と等量の０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液を６０℃で１０分間加熱した。加熱した無細胞抽出液および非加熱の無細胞抽出液を希釈して参考例４に示した方法でγ−グルタミルアラニルグリシン合成活性を測定した。下記式より加熱後の残存活性を算出し、この値を熱安定性の指標とした。
残存活性（％）＝［加熱後の酵素活性］÷［加熱前の酵素活性］×１００
６０℃、１０分間の加熱で評価した野生型酵素および改変型グルタチオン合成酵素の相対活性を表４に示す。【０１１４】
【表４】
2018084165.tif 000005
表４に示した改変型グルタチオン合成酵素は野生型酵素よりも熱安定性が向上していた。【０１１５】
（実施例５）改変型グルタチオン合成酵素の評価３
実施例２で取得した改変型グルタチオン合成酵素の各組換え菌および参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２）（対照）をそれぞれ参考例３および４と同様の方法で培養した。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液と等量の０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液を６０℃で３０分間加熱した。加熱した無細胞抽出液および非加熱の無細胞抽出液を希釈して参考例４に示した方法でγ−グルタミルアラニルグリシン合成活性を測定した。下記式より加熱後の残存活性を算出し、この値を熱安定性の指標とした。
残存活性（％）＝［加熱後の酵素活性］÷［加熱前の酵素活性］×１００
６０℃、３０分間の加熱で評価した野生型酵素および改変型グルタチオン合成酵素の相対活性を表５に示す。【０１１６】
【表５】
2018084165.tif 000006
表５に示した改変型グルタチオン合成酵素は野生型酵素よりも熱安定性が向上していた。【０１１７】
（実施例６）改変型グルタチオン合成酵素の評価４
実施例２で取得した改変型グルタチオン合成酵素の各組換え菌および参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２）（対照）をそれぞれ参考例３および４と同様の方法で培養した。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液と等量の０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液を７０℃で１５分間加熱した。加熱した無細胞抽出液および非加熱の無細胞抽出液を希釈して参考例４に示した方法でγ−グルタミルアラニルグリシン合成活性を測定した。下記式より加熱後の残存活性を算出し、この値を熱安定性の指標とした。
残存活性（％）＝［加熱後の酵素活性］÷［加熱前の酵素活性］×１００
７０℃、１５分間の加熱で評価した野生型酵素および改変型グルタチオン合成酵素の相対活性を表６に示す。【０１１８】
【表６】
2018084165.tif 000007
表６に示した改変型グルタチオン合成酵素は野生型酵素よりも熱安定性が向上していた。【０１１９】
（実施例７）変異酵素遺伝子ライブラリーの作製２
実施例２で取得したプラスミドｐＴＤＧＳＨ２ｍ１５（表２参照）をテンプレートに、プライマー１：５’−ＧＧＧＴＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＴＣＧ−３’（配列表の配列番号４）およびプライマー２：５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＴＣＣＧＧＡＣＧＣＧ−３’（配列表の配列番号５）を用いてエラープローンＰＣＲ法（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １，  １１−１５（１９８９））を用いて、グルタチオン合成酵素遺伝子全長にランダムな変異を導入したＤＮＡ増幅断片を得た。この増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化したのち、同酵素で処理した高発現ベクターｐＵＣＮ１８に組み込み、複数の変異酵素発現プラスミドを作製した。このプラスミドを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地に塗布した。生育したコロニーは変異導入されたグルタチオン合成酵素遺伝子を有する組換え大腸菌であり、この組換え菌群を変異酵素遺伝子ライブラリー２とした。【０１２０】
（実施例８）改変型グルタチオン合成酵素の選抜２
変異酵素遺伝子ライブラリー２より、熱安定性が野生型グルタチオン合成酵素と比較して向上した改変型グルタチオン合成酵素を選抜した。実施例７で作製した変異酵素遺伝子ライブラリー２の各組換え菌および参考例２で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２）（対照）、実施例２で取得したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２ｍ１５）をそれぞれ参考例３と同様の方法で培養した。得られた各培養液を遠心分離して上清を除き、例えば０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５））で懸濁した。この懸濁液を破砕処理後、遠心分離により沈殿を除くことで無細胞抽出液を得た。各酵素を含む無細胞抽出液を６０℃で加熱した。４０分間加熱後、９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に分注し、ＡＴＰ二ナトリウム塩  ３０ｍＭ、硫酸マグネシウム七水和物１０ｍＭ、酸化型γ−グルタミルシステイン１５ｍＭ、グリシン３０ｍＭを含む０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を加えて、３０℃で３時間インキュベートした。反応液を新たな９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に分注し、グルタチオン還元酵素（３０ユニット／Ｌ、シグマアルドリッチ社製）、ＮＡＤＰＨ１．２ｍＭ）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して室温で２分間インキュベートした。ここで、グルタチオン合成酵素によって生成した酸化型グルタチオンが還元型グルタチオンに変換される。ここにＤＴＮＢ０．２ｍｇ／ｍＬを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、経時的に４０５ｎｍの吸光を検出した。無細胞抽出液を熱処理しないでグルタチオン合成反応を行った対照の吸光に対する、無細胞抽出液を熱処理後にグルタチオン合成反応を行ったサンプルの吸光の比率を活性残存率とし、この活性残存率が野生型グルタチオン合成酵素およびＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２ｍ１５）によって生産される改変型酵素の活性残存率よりも高いものを熱安定性の向上した酵素として選抜した。選抜した酵素の培養液からプラスミドを抽出し、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて改変型グルタチオン合成酵素遺伝子の塩基配列を決定し、変異部位を特定した。得られた熱安定性の向上した改変型グルタチオン合成酵素における変異部位を表７に示す。【０１２１】
【表７】
2018084165.tif 000008
表７に示す１１種類の熱安定性が向上した酵素を取得した。【０１２２】
（実施例９）改変型グルタチオン合成酵素の評価５
実施例８で取得した改変型グルタチオン合成酵素の各組換え菌および参考例２で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２）（対照）をそれぞれ参考例３および４と同様の方法で培養した。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液と等量の０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これらの無細胞抽出液について参考例３および４と同様の方法でグルタチオン合成活性およびγ−グルタミルアラニルグリシン合成活性の両方があることを確認した。改変型グルタチオン合成酵素の、野生型酵素のグルタチオン合成活性を１００とした場合の相対活性を表８に示す。【０１２３】
【表８】
2018084165.tif 000009
（実施例１０）改変型グルタチオン合成酵素の評価６
実施例８で取得した改変型グルタチオン合成酵素の各組換え菌および参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２）（対照）をそれぞれ参考例３および４と同様の方法で培養した。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液と等量の０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液を６０℃で１０分間加熱した。加熱した無細胞抽出液および非加熱の無細胞抽出液を希釈して参考例４に示した方法でγ−グルタミルアラニルグリシン合成活性を測定した。下記式より加熱後の残存活性を算出し、この値を熱安定性の指標とした。
残存活性（％）＝［加熱後の酵素活性］÷［加熱前の酵素活性］×１００
６０℃、１０分間の加熱で評価した野生型酵素および改変型グルタチオン合成酵素の相対活性を表９に示す。【０１２４】
【表９】
2018084165.tif 000010
表９に示した改変型グルタチオン合成酵素は野生型酵素よりも熱安定性が向上していた。【０１２５】
（実施例１１）改変型グルタチオン合成酵素の評価７
実施例８で取得した改変型グルタチオン合成酵素の各組換え菌および参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２）（対照）、実施例２で取得したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２ｍ１５）をそれぞれ参考例３および４と同様の方法で培養した。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液と等量の０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液を７０℃で１０分間加熱した。加熱した無細胞抽出液および非加熱の無細胞抽出液を希釈して参考例４に示した方法でγ−グルタミルアラニルグリシン合成活性を測定した。下記式より加熱後の残存活性を算出し、この値を熱安定性の指標とした。
残存活性（％）＝［加熱後の酵素活性］÷［加熱前の酵素活性］×１００
７０℃、１０分間の加熱で評価した野生型酵素および改変型グルタチオン合成酵素の残存活性を表１０に示す。【０１２６】
【表１０】
2018084165.tif 000011
表１０に示した改変型グルタチオン合成酵素は野生型酵素よりも熱安定性が向上した。またＶ２６０Ａ変異に他の変異を加えることで更に熱安定性が向上することも示された。【０１２７】
（実施例１２）２６０位を置換した改変型グルタチオン合成酵素の作製１
参考例３で作製したプラスミドｐＴＤＧＳＨ２を鋳型として、プライマー３：５’−ＡＣＧＡＴＴＧＣＣＣＣＴＴＧＧＴＧＴＣＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＴＴ−３’（配列表の配列番号６）、プライマー４：５’−ＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧＧＧＣＡＡＴＣＧＴ−３’（配列表の配列番号７）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＶ２６０Ｃのアミノ酸置換を有するプラスミド全長を増幅した。このＰＣＲ反応液１００μＬをＤｐｎＩで消化したものを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＨＢ１０１）コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型グルタチオン合成酵素Ｖ２６０Ｃを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２ｍ２９）を得た。【０１２８】
（実施例１３）２６０位を置換した改変型グルタチオン合成酵素の作製２
参考例３で作製したプラスミドｐＴＤＧＳＨ２を鋳型として、プライマー５：５’−ＡＣＧＡＴＴＧＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＴＣＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＴＴ−３’（配列表の配列番号８）、プライマー６：５’−ＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＣＡＡＴＣＧＴ−３’（配列表の配列番号９）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＶ２６０Ｇのアミノ酸置換を有するプラスミド全長を増幅した。このＰＣＲ反応液１００μＬをＤｐｎＩで消化したものを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＨＢ１０１）コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型グルタチオン合成酵素Ｖ２６０Ｇを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２ｍ３０）を得た。【０１２９】
（実施例１４）２６０位を置換した改変型グルタチオン合成酵素の作製３
参考例３で作製したプラスミドｐＴＤＧＳＨ２を鋳型として、プライマー７：５’−ＡＣＧＡＴＴＧＣＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＴＴ−３’（配列表の配列番号１０）、プライマー８：５’−ＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＣＡＡＴＣＧＴ−３’（配列表の配列番号１１）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＶ２６０Ｑのアミノ酸置換を有するプラスミド全長を増幅した。このＰＣＲ反応液１００μＬをＤｐｎＩで消化したものを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＨＢ１０１）コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型グルタチオン合成酵素Ｖ２６０Ｑを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２ｍ３１）を得た。【０１３０】
（実施例１５）２６０位を置換した改変型グルタチオン合成酵素の作製４
参考例３で作製したプラスミドｐＴＤＧＳＨ２を鋳型として、プライマー９：５’−ＡＣＧＡＴＴＧＣＣＣＣＴＴＧＧＡＣＡＣＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＴＴ−３’（配列表の配列番号１２）、プライマー１０：５’−ＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＴＣＣＡＡＧＧＧＧＣＡＡＴＣＧＴ−３’（配列表の配列番号１３）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＶ２６０Ｔのアミノ酸置換を有するプラスミド全長を増幅した。このＰＣＲ反応液１００μＬをＤｐｎＩで消化したものを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＨＢ１０１）コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型グルタチオン合成酵素Ｖ２６０Ｔを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２ｍ３２）を得た。【０１３１】
（実施例１６）１０１位を置換した改変型グルタチオン合成酵素の作製１
参考例３で作製したプラスミドｐＴＤＧＳＨ２を鋳型として、プライマー１１：５’−ＧＣＧＡＣＧＣＡＣＣＴＧＴＴＡＡＡＣＧＴＡＧＣＣＧＡＡＡＣＣＡＡＣ−３’（配列表の配列番号１４）、プライマー１２：５’−ＧＴＴＧＧＴＴＴＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＧＧＴＧＣＧＴＣＧＣ−３’（配列表の配列番号１５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＧ１０１Ｎのアミノ酸置換を有するプラスミド全長を増幅した。このＰＣＲ反応液１００μＬをＤｐｎＩで消化したものを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＨＢ１０１）コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型グルタチオン合成酵素Ｇ１０１Ｎを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２ｍ３３）を得た。【０１３２】
（実施例１７）１０１位を置換した改変型グルタチオン合成酵素の作製２
参考例３で作製したプラスミドｐＴＤＧＳＨ２を鋳型として、プライマー１３：５’−ＧＣＧＡＣＧＣＡＣＣＴＧＴＴＡＣＡＧＧＴＡＧＣＣＧＡＡＡＣＣＡＡＣ−３’（配列表の配列番号１６）、プライマー１４：５’−ＧＴＴＧＧＴＴＴＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＴＡＡＣＡＧＧＴＧＣＧＴＣＧＣ−３’（配列表の配列番号１７）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＧ１０１Ｑのアミノ酸置換を有するプラスミド全長を増幅した。このＰＣＲ反応液１００μＬをＤｐｎＩで消化したものを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＨＢ１０１）コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型グルタチオン合成酵素Ｇ１０１Ｑを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２ｍ３４）を得た。【０１３３】
（実施例１８）１０１位を置換した改変型グルタチオン合成酵素の作製３
参考例３で作製したプラスミドｐＴＤＧＳＨ２を鋳型として、プライマー１５：５’−ＧＣＧＡＣＧＣＡＣＣＴＧＴＴＡＡＣＣＧＴＡＧＣＣＧＡＡＡＣＣＡＡＣ−３’（配列表の配列番号１８）、プライマー１６：５’−ＧＴＴＧＧＴＴＴＣＧＧＣＴＡＣＧＧＴＴＡＡＣＡＧＧＴＧＣＧＴＣＧＣ−３’（配列表の配列番号１９）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＧ１０１Ｔのアミノ酸置換を有するプラスミド全長を増幅した。このＰＣＲ反応液１００μＬをＤｐｎＩで消化したものを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＨＢ１０１）コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型グルタチオン合成酵素Ｇ１０１Ｔを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２ｍ３５）を得た。【０１３４】
（実施例１９）改変型グルタチオン合成酵素の評価８
実施例１２〜１８で取得した改変型グルタチオン合成酵素の各組換え菌および参考例２で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２）（対照）をそれぞれ参考例３および４と同様の方法で培養した。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液と等量の０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これらの無細胞抽出液について参考例３および４と同様の方法でグルタチオン合成活性およびγ−グルタミルアラニルグリシン合成活性の両方があることを確認した。改変型グルタチオン合成酵素の、野生型酵素のグルタチオン合成活性を１００とした場合の相対活性を表１１に示す。【０１３５】
【表１１】
2018084165.tif 000012
（実施例２０）改変型グルタチオン合成酵素の評価９
実施例１２〜１８で取得した改変型グルタチオン合成酵素の各組換え菌および参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２）（対照）をそれぞれ参考例３および４と同様の方法で培養した。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液と等量の０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液を６０℃で１０分間加熱した。加熱した無細胞抽出液および非加熱の無細胞抽出液を希釈して参考例４に示した方法でγ−グルタミルアラニルグリシン合成活性を測定した。下記式より加熱後の残存活性を算出し、この値を熱安定性の指標とした。
残存活性（％）＝［加熱後の酵素活性］÷［加熱前の酵素活性］×１００
６０℃、１０分間の加熱で評価した野生型酵素および改変型グルタチオン合成酵素の残存活性を表１２に示す。【０１３６】
【表１２】
2018084165.tif 000013
表１２に示した改変型グルタチオン合成酵素は野生型酵素よりも熱安定性が向上していた。【０１３７】
（参考例６）改変型グルタチオン合成酵素の調製
実施例２で取得したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＤＧＳＨ２ｍ１５）を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％）、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。酵素活性を測定すると（参考例４）に記載の方法で４Ｕ／ｍｌであった。また、国際公開第２０１６／００２８８４号公報に記載の方法で宿主細胞として用いたＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１に由来するアデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）活性を測定すると９０Ｕ／ｍｌであった。続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした。【０１３８】
（実施例２１）改変型グルタチオン合成酵素によるグルタチオンの製造１
国際公開第２０１６／００２８８４号公報の＜実施例１＞に記載の方法で酸化型γ−グルタミルシステインを合成した。この反応で２２時間後の反応液に、グリシン０．１９ｇ（２．５３ｍｍｏｌ）、参考例６で調製した改変型グルタチオン合成酵素（Ｖ２６０Ａ）２ｇ、国際公開第２０１６／００２８８４号公報の実験４と同様の方法で調製したＰＡＰ酵素液２ｇを添加し、反応を開始した。この際、１５質量％水酸化ナトリウム水溶液０．７ｇでｐＨを７．５に調整した。１時間反応後に反応液を分析したところ、酸化型グルタチオンの生成が確認できた。収率は対初発Ｌ−シスチンで２．５時間反応後に６ｍｏｌ％であり、１４時間反応後に４３ｍｏｌ％であった。【０１３９】
（参考例７）ポリリン酸キナーゼ用発現ベクターの構築
国際公開第２００６／０８０３１３号公報に記載の情報に基づき、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来ポリリン酸キナーゼ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０２３１０９５２９）のＮ末端側８２アミノ酸を切断し、８３番目のアスパラギンを開始コドンであるメチオニンに置換したポリペプチドをコードする遺伝子を大腸菌宿主に対応するようコドン最適化した遺伝子配列（配列番号２０）の５’端にＮｄｅＩサイト、３’端にＥｃｏＲＩサイトを付加した配列をユーロフィンジェノミクス社にて化学合成した。この遺伝子をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＰＰＫを構築した。【０１４０】
（参考例８）ポリリン酸キナーゼを発現する組換え生物の作製
参考例７で構築した組換えベクターｐＰＰＫを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＰＰＫ）を得た。また、ｐＵＣＮ１８を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）を得た。【０１４１】
（参考例９）組換え生物におけるポリリン酸キナーゼ遺伝子の発現
参考例８で得た２種類の組換え生物（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＰＰＫ））を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム  ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。上記の培養で得られたそれぞれ培養液について、遠心分離により菌体を集め、１ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液のポリリン酸キナーゼ活性を測定した。ポリリン酸キナーゼ活性は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に、メタリン酸ナトリウム（和光純薬社製）  ５ｍＭ、ＡＤＰ二ナトリウム塩（オリエンタル酵母社製）  １０ｍＭ、硫酸マグネシウム（和光純薬社製）  ７０ｍＭ、および無細胞抽出液を添加して３０℃で５分間反応を行い、生成したＡＴＰをＨＰＬＣ分析により定量した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＡＴＰを生成する酵素活性を１Ｕと定義した。それぞれの組換え生物の無細胞抽出液のＡＴＰ生成活性を以下に示す。Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）については、ＡＴＰ生成活性は０．１ｍＵ／ｍｇ以下であった。一方、ポリリン酸キナーゼを発現させたＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＰＰＫ）のＡＴＰ生成活性は１６０Ｕ／ｍｇであった。以上のように、参考例８で得られた組換え生物はＡＴＰ生成活性を有し、ポリリン酸キナーゼの生産を確認できた。【０１４２】
（参考例１０）ポリリン酸キナーゼの調製
参考例８で取得したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＰＰＫ）を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％）、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。酵素活性を測定すると（参考例９）に記載の方法で１１０Ｕ／ｍＬであった。続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした。【０１４３】
（実施例２２）改変型グルタチオン合成酵素によるグルタチオンの製造２
国際公開第２０１６／００２８８４号公報の＜実施例１＞に記載の方法で酸化型γ−グルタミルシステインを合成した。この反応で２２時間後の反応液に、グリシン０．１９ｇ（２．５３ｍｍｏｌ）、参考例６で調製した改変型グルタチオン合成酵素（Ｖ２６０Ａ）２ｇ、参考例９で調製したポリリン酸キナーゼ酵素液２ｇを添加し、反応を開始した。この際、１５質量％水酸化ナトリウム水溶液１．１ｇでｐＨを７．５に調整した。１時間反応後に反応液を分析したところ、酸化型グルタチオンの生成が確認できた。収率は対初発Ｌ−シスチンで２時間反応後に３３ｍｏｌ％であり、８時間反応後に６４ｍｏｌ％であった。
【配列表】
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【国際調査報告】
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