(57)【要約】  作製したライブラリーをプールし、ハイブリダイゼーションによるターゲットエンリッチメントシステムを組み合わせ、さらに次世代シーケンシングにより遺伝子検査を行うことにより、迅速、高精度、かつ低価格の遺伝子検査方法を提供することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料ごとに異なるインデックス配列を検体に付加したライブラリーを作製し、
作製したライブラリーをプールし、
プールしたＤＮＡ試料をプローブセットにハイブリダイゼーションさせ、
キャプチャーしたＤＮＡライブラリープールをＰＣＲ増幅し、
次世代シーケンス法を行うことにより遺伝子変異を検出する遺伝子変異検査方法。
【請求項２】
検出する遺伝子の変異が
家族性腫瘍であることを特徴とする請求項１記載の遺伝子検査方法。
【請求項３】
前記家族性腫瘍が、遺伝性乳がん卵巣がん症候群、又はリンチ症候群であることを特徴とする請求項２記載の遺伝子検査方法。
【請求項４】
検査する遺伝子の変異が
体細胞変異であることを特徴とする請求項１記載の遺伝子検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生殖系列細胞、体細胞に生じた変異を検出する遺伝子検査技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の変異が原因となって生じる疾患には種々のものが知られている。中でも、がんは特定の遺伝子の変異が発がんに関与することが知られている。がんは体細胞の変異が集積して発症するが、乳がん及び卵巣がんに関連するＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２のように、生殖系列に変異を保因しており、遺伝的に乳がん、卵巣がんを発症しやすい遺伝要因を有している者がいる。【０００３】
ＢＲＣＡ１あるいはＢＲＣＡ２遺伝子変異を生まれつき持つ遺伝性乳がん卵巣がん症候群（Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）では、乳がんに罹患する生涯リスクは５６〜８５％と言われている。乳がんも両側性乳がんの割合が４０〜６５％、さらに、卵巣がんに罹患する生涯リスクは、ＢＲＣＡ１に変異を有する者では５０％以上、ＢＲＣＡ２に変異を有する者では２０％以上であると言われている。また、男性の場合も、ＢＲＣＡ１あるいはＢＲＣＡ２に変異を有すると男性乳がんや前立腺がんに罹患する割合が高くなることが知られている。【０００４】
ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２に対する遺伝子検査によって、病因となりうる生殖系列変異保因者を早期に発見することは、予防的介入を可能にし、がんの発症率、死亡率を顕著に減少させることができる（非特許文献１〜４）。また、ＢＲＣＡ１／２の変異に関する情報は、同じ変異を有している可能性のある他の家族にとっても重要な情報となる。そのため、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２に対する遺伝子検査は、乳がん、あるいは卵巣がんを罹患した女性、また、乳がん・卵巣がんの家族歴のある女性において、標準的な検査となってきている。さらに、最近では一般集団に対するＢＲＣＡ１／２変異の遺伝子検査も提唱されている。生殖系列変異保因者を早期発見することは、予防的介入を可能にすることから潜在的利益につながると考えられている。【０００５】
従来から、ＢＲＣＡ１／２遺伝子の変異を検出する遺伝子検査方法が開示されており、これらの方法により検査を行うことが可能である（特許文献１、２）。しかしながら、現在提供されている遺伝子検査は、非常に高額であることから、一般集団に遺伝子検査が普及するには至っていない。【０００６】
また、遺伝子検査は遺伝性のがんだけではなく、体細胞突然変異により発症したがんにおいても重要となってきている。分子標的薬の開発により、特定の医薬品に対する有効性を予め検討するためには、遺伝子変異を同定する必要があるからである。遺伝子変異を同定することにより、患者にとって最も有効な医薬を選択することができるだけではなく、治療効果を期待することができない患者に対して、副作用の危険性のある治療を行うことを避けることができる。【０００７】
特定の変異を検出する遺伝子検査は、一般的にサンガーシーケンス法（ジデオキシ法）によって行われている。例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＥＭＱＮ）の報告によれば、ＢＲＣＡ１／２の遺伝子検査の場合には、７５％がサンガーシーケンス法で行っている（非特許文献５）。サンガーシーケンス法は正確であり、遺伝子検査の標準的な方法であるものの、多くの時間と労力が必要とされる。特にＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２は、それぞれ長さが８１．１、８４．７ｋｂにわたり、２４、２７のエクソンが存在する大きな遺伝子である。そのため、遺伝子検査には、多くの時間と労力を必要とする。さらに、サンガーシーケンス法は、多量の試料ＤＮＡを必要とするという問題もある。【０００８】
次世代シーケンス法（ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ、以下、次世代シーケンス法をＮＧＳと略記することがある。）と呼ばれる高速高精度のシーケンサーの開発により、従来のサンガーシーケンス法に比べて、膨大な塩基配列情報を非常に短時間、かつ低コストで得ることができるようになった（非特許文献６）。さらに、ゲノム配列のうちの特定の領域のシーケンスを効率的に解析するエクソン解析により、多数の臨床サンプルＤＮＡ配列を決定することができるようになった。【０００９】
ＢＲＣＡ１／２の遺伝子変異の同定にも、特定の領域を選択的に濃縮するターゲットエンリッチメントシステムとＮＧＳを組み合わせて検査が行われるようになってきた（非特許文献７〜１４）。ＥＭＱＮの報告によれば、１９％の研究機関でＢＲＣＡの遺伝子検査にＮＧＳの技術を用いていることが報告されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００２−５０２２２７号公報
【特許文献２】特表平１０−５０５７４２号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Hartmann, L.C. et al., 1999, N. Engl. J. Med., Vol.340, pp.77-84.
【非特許文献２】Meijers-Heijboer, H. et al., 2001, N. Engl. J. Med., Vol.345,pp.159-164.
【非特許文献３】Rebbeck, T.R. et al., 2004, J. Clin. Oncol., Vol.22, pp.1055-1062.
【非特許文献４】Domcheck, S.M. et al., 2010, JAMA., Vol.304, pp.967-975.
【非特許文献５】Wallace, A.J., 2016, Eur. J. Hum. Genet. Suppl 1, S10-8.
【非特許文献６】Goodwin, S. et al., 2016, Nat. Rev. Genet., Vol.17. pp.333-351.
【非特許文献７】Walsh, T. et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol.107,pp.12629-12633.
【非特許文献８】Bosdet, I.E. et al., 2013, J. Mol. Diagn., Vol.15, pp.769-809.
【非特許文献９】Chong, H.K. et al., 2014, PLoS One, Vol.9, e97408.
【非特許文献１０】Castera, L. et al., 2014, Eur. J. Hum. Genet., Vol.22, pp.1305-1313.
【非特許文献１１】Judkins, T. et al., 2015, BMC Cancer, Vol.15, 215., doi:10.1186/s12885-015-1224-y
【非特許文献１２】Strom, C.M. et al., 2015, PLoS One, Vol.10, e0136419.
【非特許文献１３】Lincoln, S.E. et al., 2015, J. Mol. Diagn., Vol.17, pp.533-544.
【非特許文献１４】Kang, H. et al., 2016, PeerJ., Vol.4, e2162.
【非特許文献１５】Smith, T.M. et al., 1996, Genome Res., Vol.6, pp.1029-1049.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＮＧＳは、従来のサンガーシーケンス法と遜色ない結果が得られることが報告されている。しかしながら、家族性腫瘍が疑われる集団だけではなく一般集団にも適用できるような安価で高精度な技術は報告されていない。【００１３】
本発明は、ターゲットエンリッチメントシステムとＮＧＳを組み合わせ、ＢＲＣＡ１やＢＲＣＡ２をはじめとする家族性腫瘍の原因遺伝子の変異や、体細胞遺伝子変異の検出を行うための新しい検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、以下の遺伝子変異検査方法に関する。
（１）試料ごとに異なるインデックス配列を検体に付加したライブラリーを作製し、作製したライブラリーをプールし、プールしたＤＮＡ試料をプローブセットにハイブリダイゼーションさせ、キャプチャーしたＤＮＡライブラリープールをＰＣＲ増幅し、次世代シーケンス法を行うことにより遺伝子変異を検出する遺伝子変異検査方法。
（２）検出する遺伝子の変異が家族性腫瘍であることを特徴とする（１）記載の遺伝子検査方法。
（３）前記家族性腫瘍が、遺伝性乳がん卵巣がん症候群、又はリンチ症候群であることを特徴とする（２）記載の遺伝子検査方法。
（４）検査する遺伝子の変異が体細胞変異であることを特徴とする（１）記載の遺伝子検査方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法は、迅速であり、高精度であるとともに、低価格かつ少量のＤＮＡ試料で実施することができることから、家族性腫瘍が疑われる集団だけではなく、一般集団にも適用することができる。また、本発明の方法において、体細胞変異を検出することにより、分子標的薬による治療に際して高い効果が期待できる医薬を選択して患者に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】遺伝子検査の工程を示す図。
【図２】ＢＲＣＡ１／２のプローブの位置を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は多数臨床検体を用いてターゲットシーケンスを行うことにより、低価格でありながら、迅速、高精度の遺伝子検査を行う方法を提供する。
【００１８】
表１に家族性腫瘍とその原因遺伝子のリストを示す。遺伝性疾患の可能性のある患者の検査を行い、原因遺伝子を調べることができる。また、遺伝性疾患を発症した家族の遺伝子を検査することにより、早期に疾患に罹患する可能性のある者を検出することができる。さらに、遺伝性疾患を発症した家族がいる者だけではなく、一般集団を検査することができれば、早期発見につながることから非常に有益である。特に、変異の保有率の高いＢＲＣＡ１やＢＲＣＡ２は、一般集団を対象として遺伝子検査を行うことができれば、将来腫瘍を発症する可能性のある人を早期に検出し、予防的介入を行うことができる。例えば、乳がん、卵巣がんに将来罹患する可能性が高いことが分かった場合には、早期にがんを発見するために、検診の頻度を高くするなどの対策を立てることができる。
【表１】
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【００１９】
検査の対象となる表１に示す家族性疾患と遺伝子は今後研究により増加する可能性がある。また、体細胞遺伝子変異は、分子標的薬の増加とともに、治療に先立って遺伝子変異の検査を行う必要性が高まることから適用範囲が広がるものと考えられる。
【００２０】
以下、母集団における遺伝子変異の頻度の高いＢＲＣＡ１／２の変異の検出を例に詳細に説明するが、これに限らずあらゆる遺伝子変異の検出に用いることができる。
【００２１】
［実施例１］遺伝子検査方法の概要
本検査方法は大きく分けてＤＮＡライブラリー調整工程、ハイブリダイゼーション工程、シーケンス工程の３工程からなっている（図１）。以下、種々のキットを利用して各工程を実施しているが、同様の反応を行うことのできる方法やキットを用いて実施してもよい。各キットは、遺伝子検査の目的に合うように、キットに添付されているプロトコルを修正して用いており、キットの方法をそのまま用いているわけではない。
【００２２】
ＢＲＣＡ１／２などの生殖系列の変異を検出する場合には、血液サンプルからＤＮＡサンプル調整する。ここでは、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ（ロシュ社製）を用いて血液からＤＮＡを抽出して用いた。なお、体細胞変異を検出する場合には腫瘍組織などの疾患部位からＤＮＡサンプル調整すればよい。
【００２３】
（Ｉ）ＤＮＡライブラリー調整工程
（１）まず、抽出したＤＮＡを定量する。ＤＮＡ濃度は、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＢＲ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャー社製）を用い、ＦｉｌｔｅｒＭａｘ  Ｆ５マルチモードプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）によって測定した。ＤＮＡサンプルは終濃度が２０ｎｇ／μｌになるようにヌクレアーゼフリー水で希釈する。
（２）ＰＣＲプレート上で、２０ｎｇＤＮＡに、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＱＸＴ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー社製）を用いてトランスポゼースによりＤＮＡを断片化した後、アダプターを付加する。
（３）アダプターが付加されたＤＮＡをＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ビーズ（ベックマン  コールター社製）を用いて精製する。
（４）Ｐ７、Ｐ５  ｄｕａｌ  ｉｎｄｅｘ  ｐｒｉｍｅｒを用いて、以下のＰＣＲ反応により、インデックスタグを付加する。ステップ１：６８℃２分、ステップ２：９８℃２分、ステップ３：９８℃３０秒、ステップ４：５７℃３０秒、ステップ５：７２℃１分、ステップ６：７２℃５分、ステップ７：４℃で維持。ステップ３〜５を７回繰り返す。
（５）工程（３）と同様にしてＤＮＡを精製する。
（６）ＤＮＡ濃度を上記（１）と同様に、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＢＲ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて測定し、それぞれ等量のＤＮＡサンプルを最終的に１μｇになるように新しいチューブにプールする。ここでは、９６検体までの異なる対象について１度にライブラリー調整を行い、試料をプールして以下の工程を行っている。プールする試料は９６検体までである必要はなく、３８４検体等、反応を行うのに都合のよい検体数とすることができる。
【００２４】
本実施例で示すＤＮＡライブラリー調整工程は、個人識別のためのインデックスタグ付加の工程をＰＣＲによるＤＮＡライブラリー増幅工程と同時に行えるように工夫している。その結果、以下のハイブリダイゼーション工程において、多数サンプルを同時に行うことができる。ＤＮＡライブラリー調整工程は、工程（１）、（２）、（６）が各１時間、工程（３）〜（５）が各１．５時間を要する。
【００２５】
（ＩＩ）ハイブリダイゼーション工程
（１）ＳｅｑＣａｐ  ＥＺ  ｃｈｏｉｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ  ダイアグノスティクス社製）を用いて、上記ＤＮＡライブラリー調整工程においてプールされたＤＮＡサンプルとプローブをハイブリダイズする。
このとき、プールされたＤＮＡライブラリーには、インデックス、及びアダプターが付加されている。そのため、インデックス付加アダプター配列同士が反応してしまい、非特異的なキャプチャーにより、標的領域の抽出効率が低下する可能性がある。そこで、ヒトゲノム中に存在する反復配列に起因する非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するためのＣＯＴヒトＤＮＡに加え、インデックス付加アダプター配列の反応を抑制するために、インデックス配列に対応したブロックオリゴを合成し過剰量添加している。
（２）ポストキャプチャー・プール法により得られたＤＮＡをＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  ストレプトアビジン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて精製する。
（３）精製後のＤＮＡをＴＳ-ＰＣＲ  オリゴ１、２を用い、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ（カパ  バイオシステムズ社製）によってＰＣＲ増幅した。オリゴＤＮＡの配列、ＰＣＲサイクルは以下のとおりである。
【００２６】
オリゴ１：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡ（配列番号１）
オリゴ２：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧ（配列番号２）
ステップ１：９８℃３０秒、ステップ２：９８℃１０秒、ステップ３：６０℃３０秒、ステップ４：７２℃３０秒、ステップ５：７２℃５分、ステップ６：４℃で維持。ステップ２〜４を１２〜１８回繰り返す。
ＰＣＲ増幅したＤＮＡは、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ビーズにより精製する。
【００２７】
ハイブリダイゼーション工程は、工程（１）に２１時間、工程（２）に３時間、工程（３）に１．５時間を要する。ＤＮＡライブラリー調整工程からハイブリダイゼーション工程（１）のプローブとのハイブリダイゼーションまでを１日目に行えばよく、ハイブリダイゼーション工程（２）、（３）は２日目に行えばよい。
【００２８】
（ＩＩＩ）シーケンス工程
（１）ＰＣＲ増幅したＤＮＡライブラリーを希釈し、アルカリにより一本鎖にする。
（２）ＭｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｖ３（イルミナ社製）によってシーケンシングを行う。
工程（１）は０．５時間、工程（２）は５５時間を要する。したがって、すべての工程は５日程度で終了する。
【００２９】
この遺伝子検査方法は、例えば、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＱＸＴ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔで行うことができるライブラリー作製方法とＳｅｑＣａｐ  ＥＺ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍで行うことができるハイブリダイゼーションによるターゲットエンリッチメントシステムを組み合わせることによって２０ｎｇという少量のＤＮＡを用いて９６サンプルという多数の試料をプールしてハイブリダイゼーションを行うことにより、費用と労力をかけずに遺伝子検査を行うことができる。
【００３０】
［実施例２］乳がん患者から得られた試料を用いた結果
千葉大学において病理学的に診断が確定し、インフォームドコンセントが得られた患者１１名から、血液試料を得てＢＲＣＡ１／２遺伝子の検査に用いた。
【００３１】
プローブとしては、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｅｓ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎに基づいて、ＢＲＣＡ１／２の転写産物を包含する合計２３０ｋｂの領域とこれら遺伝子に隣接する５ｋｂの領域を選択した。また、ＢＲＣＡ１のイントロン領域の約４１．５％はＡｌｕ配列からなることが報告されていることから（非特許文献１５）、意味のない変異の検出を避けるために、これらの反復配列の領域を除いてプローブデザインを行った（図２）。
【００３２】
実施例１に記載の方法で、乳がん患者１１名から得た試料を用いて遺伝子解析を行い、標準的な臨床検査（サンガーシーケンス法）によってすでに得られている遺伝子変異との比較を行った。
【００３３】
すでに得られていた検査結果によれば、１１名の患者のうち８名で、９つの明らかな遺伝子変異が認められていた。ＢＲＣＡ１における２つのナンセンス変異（ｃ．Ｔ１８８Ａ［ｐ．Ｌ６３Ｘ］、ｃ．Ｃ３６０７Ｔ［ｐ．Ｒ１２０３Ｘ］）、ＢＲＣＡ１におけるフレームシフト（ｃ．６６ｄｕｐＡ［ｐ．Ｅ２３ｆｓ］）、ＢＲＣＡ２におけるフレームシフト（ｃ．６５９７＿６５９８ｄｅｌ［ｐ．Ｔ２１９９ｆｓ］）は病因として報告されていた。また、ＢＲＣＡ１のスプライス部位の変異（ｃ．４４８５−２Ａ＞Ｇ）が、病因の可能性があると報告されていた。さらに、ＢＲＣＡ１に２つ（ｃ．Ｃ６２６Ｔ［ｐ．Ｐ２０９Ｌ］、ｃ．Ａ２７２６Ｔ［ｐ．Ｎ９０９Ｉ］）、ＢＲＣＡ２に２つ（ｃ．Ａ３３９５Ｇ［ｐ．Ｋ１１３２Ｒ］、ｃ．Ｔ３４２０Ａ［ｐ．Ｓ１１４０Ｒ］）の合計４つのミスセンス変異体が重要性不明の変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ  ｕｎｃｅｒｔａｉｎ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ、ＶＵＳ）として報告されていた（表２）。実施例１に記載の方法を用いて得られた結果は、完全に標準的な遺伝子検査方法により得られた結果と一致していた。この結果は、本発明の検査方法が正確な検査を行うことができることを裏付ける結果である。
【表２】
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【００３４】
［実施例３］一般集団でのＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２遺伝子検査
健康診断のために受診した３７３名の日本人の一般集団について、実施例２と同様の方法によりＢＲＣＡ１／２の遺伝子検査を行った。
【表３】
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【００３５】
３７３名から得られたＢＲＣＡ１、及びＢＲＣＡ２の遺伝子配列において、７６の変異がエクソン中に検出された。２７の変異は同義置換であり、１６の変異は、機能的な重要性及び東アジア集団で１％以上の変異が認められていることから無害な変異であると考えられる。
【００３６】
病因となり得る変異として、ＢＲＣＡ２にナンセンス変異（ｃ．Ａ６９２２Ｔ［ｐ．Ｋ２０３８Ｘ］）、及びフレームシフトによる欠失変異（ｃ．３５７１ｄｅｌＡ［ｐ．Ｋ１１９１ｆｓ］）を検出した（表３）。これらの病因となり得る変異ついてはサンガーシーケンス法によっても確認を行った結果、本発明の方法と同一の結果が得られた。
【００３７】
さらに、重要性が不明の変異体としてフレームシフトを伴わない欠失変異をＢＲＣＡ２で検出した（ｃ．９１０６＿９１０８ｄｅｌ［ｐ．３０３６＿３０３６ｄｅｌ］）。
【００３８】
以上の結果から、ＢＲＣＡ１、あるいはＢＲＣＡ２の生殖系列に有害な遺伝子変異を有する割合は０．５４％と推定された（９５％信頼区間は０．０６５〜１．９％）。有害な遺伝子変異が一般集団にも検出されたことは、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の遺伝子変異のスクリーニング検査を行うことの重要性を示している。ＢＲＣＡ１、あるいはＢＲＣＡ２の変異を検出することにより、乳がん、卵巣がんの早期発見、予防につなげることができる。
【００３９】
上記実施例２及び３の結果は、ハイブリダイゼーションをベースとしている本発明の方法が、サンガーシーケンス法と並ぶ高い精度を備えていることを示している。ＰＣＲをベースとしている遺伝子検査方法では、父方、母方から由来するアリールを同等に増幅できない場合もあるため、精度が低くなる傾向がある。しかし、本発明のようにハイブリダイゼーションをベースとする方法では、そのような心配をする必要がない。
【００４０】
本発明の方法により、一般集団のスクリーニングにも遺伝子検査を行うことができるようになれば、家族歴のない集団から遺伝子変異を有する者を検出できる。さらに、現在のところＶＵＳとして判定され、意味のある変異かどうか不明の変異についても継続的にモニタリングを行い、情報を蓄積することによって評価することが可能となり、重要な遺伝子情報の蓄積を行うことができるようになる。
【００４１】
［実施例４］乳がん患者への適用
次に、本法の有用性を検証するために、乳がん患者２８８名の試料を解析した結果を示す。中国の重慶医科大学付属第一医院において病理学的に診断が確定し、インフォームドコンセントが得られた乳がん患者のがん組織からＤＮＡを抽出し、表１に示す乳がん発症リスクとなりうる家族性腫瘍原因遺伝子を対象とした多遺伝子パネル検査を実施した。表１に示す５４遺伝子のタンパク質コーディング領域およびエクソン・ジャンクション５０ｂｐをハイブリダイゼーション・キャプチャするためのプローブを設計した。乳がん患者において検出された変異を分類し、病因になりうると判断された一塩基置換を表４に、挿入・欠失変異を表５に示す。２８８例中、４２例（１４．６％）の乳癌患者において病因となる変異を同定することができた。ＢＲＣＡ１／２変異を有する患者が最も多いものの、２３例（８．０％）を説明するに過ぎず、多遺伝子パネル検査でより多くの遺伝子を同時解析する有用性が分かる。表４、及び表５において、Ｅｘｏｍｅ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＥｘＡＣ）が解析を行った東アジア人における遺伝子変異の頻度情報を併せて示しているが、これらの変異は病因変異であることから一般的な東アジア人ではほとんど保有していない。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
【表５】
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【００４４】
多数の遺伝子について検査を行う多遺伝子パネル検査は、新たな変異の発見といった情報の蓄積だけではなく、分子標的薬が存在する遺伝子に変異が生じている場合には分子標的薬で治療を行うなど、実臨床での応用が期待される。効果が期待できる患者に適切な治療を行うことは、医療経済の観点からも今後益々重要になると考えられるが、本実施例で示した方法であれば、高精度、迅速な検査方法であり、かつ安価に検査を行うことができることから、非常に有用な検査方法となる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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