(57)【要約】  アルミニウム耐性酵母、例えば、Schizoblastosporion starkeyihenriciiの酵母、より具体的には配列番号１又は２で示された塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を、２８ｓｒＲＡＮ遺伝子のＤ１／Ｄ２領域に有する酵母と、ガリウムなどの周期表１３族に属する金属やジスプロシウムなどのランタノイドの金属イオンを、好ましくは液中で接触させた後、酵母を回収することで前記金属イオンを回収する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
希少金属の金属イオンとアルミニウム耐性酵母を接触させる工程を含む希少金属の回収方法。
【請求項２】
前記アルミニウム耐性酵母は、Schizoblastosporion属（シゾブラストスポリオン属）に属する酵母及び／又はSaccharomyces属（サッカロミセス属）に属する酵母である請求項１に記載の希少金属の回収方法。
【請求項３】
１細胞あたり１.５pg以上のジスプロシウム回収能を有する酵母を用いる請求項１又は２に記載の希少金属の回収方法。
【請求項４】
希少金属の金属イオンとSchizoblastosporion starkeyihenricii（シゾブラストスポリオン  スターキーヘンリシ）に属する酵母を接触させる工程を含む希少金属の回収方法。
【請求項５】
Schizoblastosporion starkeyihenriciiに属する酵母はアルミニウム耐性である請求項４に記載の希少金属の回収方法。
【請求項６】
希少金属の金属イオンと配列番号１又は配列番号２に記載の塩基配列と９５％以上好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列を２８ｓｒＲＮＡ遺伝子のＤ１／Ｄ２領域に有する酵母を接触させる工程を含む希少金属の回収方法。
【請求項７】
希少金属の金属イオンと受託番号ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２５、受託番号ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２６、受託番号ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ−０２５２１で寄託された酵母の少なくとも１種以上の酵母を接触させる工程を含む希少金属の回収方法。
【請求項８】
前記希少金属の金属イオンは、周期表１３族又はランタノイドに属する金属の金属イオンである請求項１〜７の何れか１項に記載の希少金属の回収方法。
【請求項９】
希少金属の金属イオンとの接触によって希少金属を回収できる酵母のスクリーニング方法であって、  ３価のアルミニウムイオンの存在下で被験酵母を生育する工程と、  当該工程後に良好な生育を示す酵母株を取得する工程と、  さらに希少金属の金属イオンと前記取得された酵母株を接触させる工程を含む方法。
【請求項１０】
さらに１細胞あたりジスプロシウムとして１.５pg以上の回収能を示す酵母株を選択する工程を有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１１】
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２５又は受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２６又は受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２５で寄託された酵母。
【請求項１２】
１細胞あたり１.５ｐｇ以上のジスプロシウム回収能を有するアルミニウム耐性のSchizoblastosporion属（シゾブラストスポリオン属）に属する酵母又はSaccharomyces属（サッカロミセス属）に属する酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は希少金属の回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  金属性廃棄物に含まれるガリウム、ジスプロシウム、ネオジウムなどの希少金属を回収する方法として、細菌類等を用いたバイオソープション法が知られている。例えば、特許文献１には鉄還元細菌を用いる方法が、特許文献２にはトリコクラジウム属に属する微生物を用いる方法が、特許文献３にはスコプラリオプシス属に属する微生物を用いる方法、特許文献４にはペシロマイセス属に属する微生物を用いる方法が、特許文献５にはペニシリウム属に属する微生物を用いる方法が提案されている。しかしながら、これらの細菌などでは培養の煩雑さや細菌による感染対策などその取り扱いが容易でなかった。【０００３】  酵母はその取り扱いが容易であり菌体の回収も細菌に比べて容易である。これまで、酵母を使って貴金属などを回収する方法が特許文献６に示されているが、ここではジスプロシウムなどの希少金属を回収することは示されていない。また、本願発明者らは、カドニウム耐性酵母を使って希少金属を回収することを試みているが、これまでのところ、希少金属の回収率が悪く、さらに回収率を高めた方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−１９６４号公報
【特許文献２】特開２０１２−２４４９１４号公報
【特許文献３】特開２０１３−２２６１００号公報
【特許文献４】特開２０１３−２２６１０１号公報
【特許文献５】特開２０１３−２２６１０２号公報
【特許文献６】国際公開公報ＷＯ２０１５／０９９１８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本願に係る発明は、上記の背景技術に鑑みてなされたものであって、酵母を利用して希少金属を回収する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明に係る回収方法は、アルミニウム耐性酵母、例えば、Schizoblastosporion starkeyihenriciiに属する酵母やSaccharomyces属（サッカロミセス属）に属する酵母と希少金属を接触する工程を含む方法である。
【発明の効果】
【０００７】  取り扱いが容易である酵母によって、ジスプロジウムのような希少金属の回収が図れる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１はジスプロシウム存在下における酵母の生育を示すグラフである。（Ａ）はFC-ATL02株を、（Ｂ）はFC-ATL05株を、（Ｃ）はBY4741株を示す。
【図２】図２は接触時のｐＨがジスプロシウムの回収に与える影響を示すグラフである。（Ａ）はFC-ATL02株を、（Ｂ）はFC-ATL05株を示す。
【図３】図３は攪拌がジスプロシウムの回収に与える影響を示すグラフである。（Ａ）はFC-ATL02株を、（Ｂ）はFC-ATL05株を示す。
【図４】図４はジスプロシウムの局在性を示すグラフである。（Ａ）はFC-ATL02株を、（Ｂ）はFC-ATL05株を示す。
【図５】図５は酵母のプロトプラストによるジスプロシウムの回収を示すグラフである。（Ａ）はFC-ATL02株を、（Ｂ）はFC-ATL05株を示す。
【図６】図６は各種の金属イオン存在下における酵母の生育を示すグラフである。（Ａ）はアルミニウムイオン、（Ｂ）はガリウムイオン、（Ｃ）はパラジウムイオン、（Ｄ）はインジウム、（Ｅ）はネオジウムイオンについてである。
【図７】図７はジスプロシウムとアルミニウムの共存下におけるジスプロシウム及びアルミニウムの回収を示すグラフである。（Ａ）は細胞壁分解酵素未処理菌体によるジスプロシウムとアルミニウム（Ｄｙ：Ａｌ＝１：１）の回収率を、（Ｂ）は細胞壁分解酵素処理菌体（プロトプラスト）によるジスプロシウムとアルミニウム（Ｄｙ：Ａｌ＝１：１）の回収率を、（Ｃ）はジスプロシウムとアルミニウムを１：１、１：１０の存在比で回収（未処理菌体）させた場合のジスプロシウムの回収量を、（Ｄ）はジスプロシウムとアルミニウムを１：１、１：１０の存在比で回収（未処理菌体）させた場合のアルミニウムの回収量を示す。
【図８】図８はジスプロシウムとガリウムの共存下におけるジスプロシウム、及びガリウムの回収を示すグラフである。（Ａ）は細胞壁分解酵素未処理菌体によるジスプロシウムとガリウム（Ｄｙ：Ｇａ＝１：１）の回収率を、（Ｂ）は細胞壁分解酵素処理菌体（プロトプラスト）によるジスプロシウムとガリウム（Ｄｙ：Ｇａ＝１：１）の回収率を、（Ｃ）はジスプロシウムとガリウムを１：１、１：１０の存在比で回収（未処理菌体）させた場合のジスプロシウムの回収量を、（Ｄ）はジスプロシウムとガリウムを１：１、１：１０の存在比で回収（未処理菌体）させた場合のガリウムの回収量を示す。
【図９】図９はジスプロシウムとパラジウムの共存下におけるジスプロシウム及びパラジウムの回収を示すグラフである。（Ａ）は細胞壁分解酵素未処理菌体によるジスプロシウムとパラジウム（Ｄｙ：Ｐｄ＝１：１）の回収率を、（Ｂ）は細胞壁分解酵素処理菌体（プロトプラスト）によるジスプロシウムとパラジウム（Ｄｙ：Ｐｄ＝１：１）の回収率を、（Ｃ）はジスプロシウムとパラジウムを１：１、１：１０の存在比で回収（未処理菌体）させた場合のジスプロシウムの回収量を、（Ｄ）はジスプロシウムとパラジウムを１：１、１：１０の存在比で回収（未処理菌体）させた場合のパラジウムの回収量を示す。
【図１０】図１０はジスプロシウムとインジウムの共存下におけるジスプロシウム及びインジウムの回収を示すグラフである。（Ａ）は細胞壁分解酵素未処理菌体によるジスプロシウムとインジウム（Ｄｙ：Ｉｎ＝１：１）の回収率を、（Ｂ）は細胞壁分解酵素処理菌体（プロトプラスト）によるジスプロシウムとインジウム（Ｄｙ：Ｉｎ＝１：１）の回収率を、（Ｃ）はジスプロシウムとインジウムを１：１、１：１０の存在比で回収（未処理菌体）させた場合のジスプロシウムの回収量を、（Ｄ）はジスプロシウムとインジウムを１：１、１：１０の存在比で回収（未処理菌体）させた場合のインジウムの回収量を示す。
【図１１】図１１はジスプロシウムとネオジウムの共存下におけるジスプロシウム及びネオジウムの回収を示すグラフである。（Ａ）は細胞壁分解酵素未処理菌体によるジスプロシウムとネオジウム（Ｄｙ：Ｎｄ＝１：１）の回収率を、（Ｂ）は細胞壁分解酵素処理菌体（プロトプラスト）によるジスプロシウムとネオジウム（Ｄｙ：Ｎｄ＝１：１）の回収率を、（Ｃ）はジスプロシウムとネオジウムを１：１、１：１０の存在比で回収（未処理菌体）させた場合のジスプロシウムの回収量を、（Ｄ）はジスプロシウムとネオジウムを１：１、１：１０の存在比で回収（未処理菌体）させた場合のネオジウムの回収量を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】  本願発明に係る希少金属の回収方法は、アルミニウム耐性酵母と希少金属の金属イオンを接触する工程を含む方法である。回収の対象となる希少金属は、例えば、ガリウム（Ｇａ）であり、インジウム（Ｉｎ）であり、タリウム（ＴＩ）などの周期表１３族に属する金属であり得る。また、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジウム（Ｎｄ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、Ｈｏ（ホルミウム）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテシウム（Ｌｕ）のランタノイドに属する金属である。これらの金属は、アルミニウムと同様に３価の金属イオンが安定な形であり、取り扱いが容易なアルミニウムイオンと同様の挙動を示すと考えられる。
【００１０】  本回収方法において用いられる酵母はアルミニウム耐性酵母である。当該酵母は、３価のアルミニウムイオンを含む培地中で培養した後、生育が認められた株を取得することで得られる。培地は、酵母が増殖できる培地であれば特に限られず、例えばＧＹＰ液体培地やＧＹＰ寒天培地であり得る。アルミニウムイオンの濃度は適宜当業者によって定められるが０.１〜１０ｍＭ程度である。耐性の有無は、アルミニウムイオンに耐性を示さない酵母の標準株と比較される。比較は、同じ濃度のアルミニウムイオンを含む培地で培養した場合に生育を示すか示さないで判断できる。その後、耐性があると判断された酵母株は希少金属の金属イオンと接触させて、金属イオンの回収量の多かった菌株を取得する。このとき使用される金属イオンは、回収目的の希少金属と同じ金属のイオン、例えばジスプロシウムを回収する目的ではジスプロシウムイオンと接触させることが好ましいが、回収目的の金属と異なる希少金属のイオンでも差し支えない。取得する菌株は、好ましくはジスプロシウムとして１細胞当たり１.５pg以上、好ましくは２.０pg以上の回収能を示す菌株である。
【００１１】  また、本回収方法において用いられる酵母はSchizoblastosporion属（シゾブラストスポリオン属）の酵母、特にSchizoblastosporion starkeyihenricii（シゾブラストスポリオン  スターキーヘンリシ）に属する酵母、好ましくはSchizoblastosporion starkeyihenriciiの２８ｓｒＲＮＡ遺伝子のＤ１／Ｄ２領域の塩基配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、望ましくは９９％以上の相同性を有する酵母であり得る。さらには、２８ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤ１／Ｄ２領域に、配列番号１又は２に記載の塩基配列と９５％好ましくは９８％、望ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列を有する酵母でもあり得る。相同性は一般的な方法により調べられ、例えばＢＬＡＳＴによる方法が用いられる。より具体的な酵母として、ＮＰＭＤ独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ） 日本国 〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室において、受託番号ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２５や受託番号ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２６として寄託された酵母（いずれも寄託日が２０１６年８月８日である）が例示される。
【００１２】  さらに、本回収方法において用いられる酵母はSaccharomyces属（サッカロミセス）属の酵母、特にSaccharomyces cerevisiae（サッカロミセス  セレビシエ）に属する酵母であり得る。より具体的な酵母として、ＮＰＭＤ独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ） 日本国 〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室において、受託番号ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ−０２５２１として寄託された酵母（寄託日が２０１７年７月２８日である）が例示される。
【００１３】  回収に際して、上記酵母を、上記の希少金属の金属イオンと接触させる。金属イオンはこれらの希少金属が取り得るイオン価の金属イオンであればよいが、好ましくは３価である。接触させる環境は、希少金属が金属イオンとして存在する環境であればよく、好ましくは金属イオンを含む液中である。当該液は金属や土砂その他の沈殿物や懸濁物を含む液であってもよい。また、当該液は、ＧＹＰ培地のような酵母が増殖するために必要な栄養素を含む液でもあり、増殖又は生育に必要な栄養素を含まない液でもあり得る。用いる酵母は同じ株の酵母のみを用いても、複数の異なる株の酵母を混ぜて用いることとしてもよい。
【００１４】  両者を接触させる液のｐＨや温度も当業者が選択される事項である。ｐＨは好ましくは３以上、望ましくは５以上であり、また、好ましくは８以下、望ましくは７.５以下である。ｐＨが８を越えたり、５未満となれば金属の回収量が低下する傾向にある。温度も特に限定されないが、酵母の生育指摘温度である３０℃〜４０℃が好ましい。
【００１５】  液中の金属イオン濃度も当業者が適宜定めることができる。酵母の菌体濃度（菌体密度）によっても異なるが、その下限は概ね０.００１ｍＭであり、好ましくは０.０１ｍＭであり、さらに好ましくは０.１ｍＭであり得る。また、金属イオンの濃度が高くなると回収量が低下する傾向にあり、その上限は１０Ｍであり、好ましくは１Ｍであり、望ましくは０.１Ｍであり得る。
【００１６】  酵母と接触させる際の菌体数も当業者が適宜定めることができる。液中で接触させる場合には、酵母の菌体濃度（菌体密度）は、接触時の液１ｍｌ中、好ましくは１０3cells以上であり、望ましくは１０5〜１０8cellsである。接触させる酵母は生菌又は死菌のいずれでもよいが、好ましくは生菌である。また、酵母は細胞膜が除かれたプロトプラストとして用いられるのが望ましい。回収速度が早く短時間、例えば１時間、さらには３０分程度の接触時間で金属イオンが回収される。プロトプラストの作製方法も公知であって、例えば、酵母と細胞壁分解酵素と接触させる方法が挙げられる。
【００１７】  金属イオンとの接触時間も当業者により適宜定めることができる。接触時間は例えば５分以上であり、１時間であり、６時間であり、１２時間であり、２４時間以上でもあり得る。また、接触は静置で行ってもよいが、攪拌しながら接触させることが好ましい。
【００１８】  希少金属イオンとの接触に際しては、回収目的である金属イオン以外の金属イオンが存在していてもよく、希少金属の金属イオンが併存していても差し支えない。
【００１９】  金属イオンと接触した後の酵母は接触環境から分離回収される。酵母に回収された金属イオンは、例えば回収された酵母の菌体を焼却することで、金属酸化物又は還元体である金属として回収される。また、菌体を硝酸分解することで、金属イオンの高濃度溶液として回収することもできる。
【実施例１】
【００２０】  〔ジスプロシウム高回収能を持つ酵母のスクリーニング〕  （アルミニウム耐性酵母の獲得）  ２箇所の畑（タマネギ畑、ホウレンソウ畑）、湿原、源泉周辺及び山頂付近の計５箇所の土壌からアルミニウム耐性酵母のスクリーニングを行った。各地の土壌1.0ｇを5mlの滅菌水で懸濁した懸濁液0.5mlを終濃度5mM AlCl3、pH3.0、2.0％NaClになるように調製したGYP液体培地に植菌した後、30℃で48時間培養した。その培養液を下記に示す各濃度のAlCl3を含むGYP寒天培地に植菌して、生育できる菌株をスクリーニングした。得られた菌株から検鏡によって酵母を選別した後、GYP液体培地（AlCl3を含まない）で前培養した後、各濃度のAlCl3を含むGYP寒天培地で培養を繰り返して、安定的に各濃度に対してアルミニウム耐性を有する酵母を単離した。【００２１】  各実施例において酵母の培養にはGYP培地（D-Glucose：2.0％、Tryptone：1.0％、Yeast extract：0.5％）を基本培地として用いた。細菌による汚染を防ぐために、培地には抗菌物質としてアンピシリンナトリウム（50mg/ml）を添加した。GYP液体培地に2.0％の寒天粉末を添加した培地をGYP寒天培地とした。アルミニウム耐性酵母のスクリーニングには、終濃度がそれぞれ0.1mM、1 mM、5mM、10mMとなるようにAlCl3を加えたGYP寒天培地を用いた。【００２２】  対照として、酵母標準株の１つであるS. cerevisiae BY4741株を用いてアルミニウム耐性試験を行った。GYP液体培地5mlで30℃、24時間前培養液したBY4741株をOD660=1.0相当の酵母培養液1mlを、AlCl3(終濃度0.1mM、1mM、5mM、10mM)を加えたGYP液体培地に植菌し、30℃で24時間培養後の生菌数をコロニーカウント法により測定して行った。その結果、5mMのAlCl3で生育が完全に抑えられた。【００２３】  対照試験の結果から5mMのAlCl3を加えたGYP寒天培地で生育した酵母を選択することとし、その結果、タマネギ畑から12株、ホウレンソウ畑から8株、湿原から2株、源泉付近から11株、山頂付近から11株の酵母が選択された。【００２４】  （ジスプロシウムの回収実験）  単離した各酵母菌株（全４４株）をそれぞれGYP液体培地5mlに植菌して、30℃で24時間前培養した後、前培養液（OD660=1.0相当の酵母培養液）1mlをGYP培地5mlに植菌して、30℃で24時間本培養した。本培養後、1.5ml容チューブに菌体濃度がOD660=1.0相当の酵母培養液1mlを遠心分離（6000rpm、10分間）にて回収し、滅菌水での洗浄（6000rpm、10分間）を２度行った。その後、回収菌体と100mg/lジスプロシウム溶液（0.609mMの(CH3COO)3Dy、10mM Acetate Buffer(pH4.0)）を混合し、30℃で24時間攪拌接触させた。接触後、菌体を遠心分離にて回収して、滅菌水で２度洗浄した後、濃硝酸を1ml加えて90℃で1時間反応させて有機物の硝酸分解を行った。硝酸分解後、反応物を蒸留水で希釈し、ICP発光分光器を用いてジスプロシウム含量の測定を行った。【００２５】  酵母の標準株の１つであるS. cerevisiae BY4741株についても同様に回収実験を行い、BY4741株との比較を行った。その結果を表１に示す。タマネギ畑から単離されたアルミニウム耐性酵母の中に一菌体あたりの回収量がBY4741株よりも多い株が２株確認され、その２株（FC-ATL02株、FC-ATL05株）を選択した。なお、表中に示す＋＋は、スクリーニングされた酵母の回収量がBY4741株よりも多かったことを、＋はスクリーニングされた酵母の回収量がBY4741株のそれよりも小さく、その１／２以上であっ���ことを、−はスクリーニングされた酵母の回収量がBY4741株の１／２未満であったことを示す。【００２６】
【表１】
2018038218.tif 000002
【００２７】  （酵母の同定）  選択された酵母２株について同定を行った。GYP培地で48時間培養した酵母培養液の菌体（OD660=5.0相当の酵母培養液1ml分）を回収して1mlのSTE溶液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0）に懸濁させた。懸濁液をφ0.5mmガラスビーズ0.5gの入ったエッペンチューブに移して、0.2mlの10％SDSを添加後、マルチビーズショッカー（安井理化機械社製）を用いて菌体破砕を行った。【００２８】  菌体破砕液を65℃で1時間保温後、遠心分離（10,000×g、10分間）して、上清0.5mlを回収した。上清に0.25mlのPEG溶液（30％Polyethylene glycol 6000、1.6M NaCl）を加えて一晩放置後、 遠心分離（8,000×g、20分間）した。得られた沈殿を0.5mlのTE溶液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA）に溶解した。そこに7.5M酢酸カリウム0.25mlを加えて混合して、氷上で5分間静置後、遠心分離（10,000×g, 30分）して上清を回収した。その上清と等量のフェノール/クロロホルムを加えて混和し、遠心分離（10,000×g, 10分）して上清0.3 mlを回収した（この操作は２度繰り返した）。【００２９】  回収した上清0.6mlと等量のイソプロパノールを添加して、-20℃、15分間塩析後、遠心分離（10,000×g, 20分）によってDNAを含む沈殿を回収した。沈殿は70%エタノール1mlで2度洗浄後、自然乾燥してデオキシリボヌクレアーゼ入りTE溶液（5μl RNase A、1ml EDTA、 10ml Tris-HCl、pH8.0）50μlに溶解した。【００３０】  次に、LSU(28S)rRNA遺伝子のD1/D2領域の塩基配列を解析した。上記で調整した酵母のDNA試料をD1/D2-fw（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'：配列番号３）及びD1/D2-rv（5'-GGTCCGTGTTTCAAGAAGACGG-3'：配列番号４）をプライマーとして用いてPCRを行った。PCR反応溶液（1μl DNA試料、1 μl D1/D2-fw、1μl D1/D2-rv、0.25μl Ex-Tag、0.5μl Ex-Tag buffer、4μl dNTP Mix、37.75μl 滅菌フィルターろ過水）50μlをサーマルサイクラ―を用いてPCRを行った。変性反応94℃、3分、アニーリング反応55℃、3分、伸長反応72℃、4分の条件を33回繰り返し行った。PCR産物を0.8％アガロースゲル電気泳動で分画した後、エチジウムブロマイドで染色して抽出DNAの増加を確認した。PCR産物のDNA塩基配列の決定は、ユーロフィンジェノミクス株式会社（東京）により行われた。【００３１】  その結果、２株の塩基配列はいずれもSchizoblastosporion starkeyihenriciiと99.5％の相同性（ＢＬＡＳＴ）を示した。ATL02株のD1/D2領域の塩基配列は配列番号１に、ATL05株のそれは配列番号２に示した。選択された２株はSchizoblastosporion sp. FC-ATLO2株および同FC‐ATLO5株として、ＮＰＭＤ独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ） 日本国〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室に、平成２８年８月８日付けで、FC-ATL02株は受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２３２５で、FC-ATL05株は受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２３２６で寄託された。【００３２】  （ジスプロシウム感受性実験）  上記で選択された酵母２株をそれぞれGYP液体培地で30℃、24時間前培養を行った。(CH3COO)3Dyの終濃度が0mM、0.01mM、0.1mM、1.0mM、10mMになるように調製したGYP培地5mlに、OD660＝1.0となるように調製した酵母の前培養液50μlを植菌した。24時間ごとに各濃度での吸光度（660nm）を測定して、BY4741株と単離した酵母のジスプロシウムの感受性を測定した。その結果を図１に示した。BY4741株はジスプロシウムの濃度が上昇するにしたがって生育度が減少したが、単離した２菌株ともジスプロシ��ムの濃度がBY4741株の生育に影響を及ぼす値まで上昇させても生育度に明確な差を示さなかった。
【実施例２】
【００３３】  〔ジスプロシウムの回収実験〕  （１）ジスプロシウム回収時の最適pHの検討  GYP液体培地150ml、30℃で24時間培養した菌体を回収し、滅菌水での洗浄を２度行った後、菌体濃度がOD660＝10.0相当の酵母培養液50mlになるように調製した。各pH（3.0，4.0，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5）に調製した200mg/lのジスプロシウム溶液（1.218 mM(CH3COO)3Dy、10mM Acetate Buffer）50mlを混合し、撹拌条件30℃で接触させた。接触後、反応液1ml分の菌体を回収してジスプロシウム含有量を測定した。その結果を図２に示す。pH5.0−7.5で回収活性が高かった。【００３４】  （２）静置・攪拌による回収量の検討  GYP液体培地150ml、30℃で24時間培養した菌体を回収し、滅菌水での洗浄を２度行った後、菌体濃度がOD600＝10.0相当の酵母培養液50mlになるように調製した。菌体溶液と200mg/lのジスプロシウム溶液と混合し、静置条件と攪拌条件（150rpm）で30℃、24時間接触させた。接触後、接触液1ml分の菌体を回収し、ジスプロシウム含有量を測定した。その結果を図３に示した。ジスプロシウムと接触させる液を静置する場合と撹拌する場合とでは、攪拌して接触させる方がジスプロシウム回収に適していることが示された。【００３５】  （３）菌体内ジスプロシウムの局在性  （Ａ）回収後の細胞表層・表層内側のジスプロシウム含有量測定    GYP液体培地150ml、30℃で培養した後、菌体濃度がOD660＝10.0の酵母培養液50ml相当となるように集菌した。その後、滅菌水で２度洗浄を行った。集菌した菌体と200mg/lのジスプロシウム溶液(pH6.0)50mlを混合し、30℃、攪拌条件（150rpm）で接触させた。接触後その1ml分の菌体を回収した後、菌体を滅菌水で２度洗浄を行った。【００３６】    次いで、回収した菌体と細胞壁分解酵素（終濃度Zymolyase（登録商標） 2unit：0.1mg/ml，リン酸バッファー(pH7.5)：0.8M，ソルビトール）を混合し、37℃で2時間反応させた。反応後、 菌体（プロトプラスト）画分と遠心分離上清画分（細胞壁画分）に分けて回収し、各々ジスプロシウム含有量を測定した。【００３７】  （Ｂ）プロトプラストを用いたジスプロシウムの回収    ジスプロシウム溶液との反応前に（Ａ）で集菌した酵母菌体を細胞壁分解酵素溶液（終濃度Zymolyase 2 unit：0.1mg/ml，リン酸バッファー(pH7.5)：0.8M，ソルビトール）で処理し（37℃で2時間反応）、プロトプラスト化した。調製したプロトプラストと200mg/lのジスプロシウム溶液(pH6.0)50ml（0.8 Mソルビトール添加）を混合し、30℃で攪拌接触させた。その後回収されたジスプロシウム量を測定した。【００３８】    これらの結果を図４及び図５に示した。細胞壁分解成分を含む細胞壁画分よりも、プロトプラスト画分の方にジスプロシウム含有量が多く、プロトプラストの状態では３０分程度のより早い時間で溶液中のジスプロシウムの大半を回収することが示された。
【実施例３】
【００３９】  〔他の金属イオンとの競合実験〕    以下の実験にはSchizoblastosporion sp. FC-ATL02株を用いて実験を行った。また、金属塩にはAlCl3、GaCl3、PdCl2、InCl3・4H2O、NdCl3を用いた。【００４０】  （１）他の金属イオンによる感受性試験    GYP液体培地で30℃、24時間前培養を行ったのち、下記の金属塩を各々0mM、5mM、10mMを含むGYP培地5mlに、OD660＝1.0に調製した酵母の前培養液50μlを植菌した。24時間ごとに各濃度での吸光度（660nm）を測定して、酵母の各金属に対する感受性を測定した。その結果を図６に示した。ネオジウムについては全ての濃度で生育度に大きな差は見られなかった。その他の金属は濃度が上がるにつれて生育度が減少し、特にアルミニウム、ガリウム、パラジウム、インジウムに関しては10mMでは72時間培養しても生育度が少なかった。【００４１】  （２）他の金属イオン単独の回収実験  菌体濃度がOD660＝10.0の酵母培養液50ml相当分の菌体を回収し、1.218mMになるように金属溶液を加えた液中で、30℃、4時間接触させた。その結果、回収率はパラジウムが92.6％、ガリウムが67.3％、インジウムが74.8％、ネオジウムが67.9％、アルミニウムが37.6％であった。【００４２】  （３）競合回収実験  菌体濃度がOD660＝10.0の酵母培養液50ml相当分の菌体を回収し、200mg/lのジスプロシウム(1.218mM)と同濃度の他の金属イオンを加えた混合液中で30℃、24時間接触させた。接触後、菌体を回収し、各金属含量を各々ICP-OES（ICP発光分析器）を用いて測定した。また、プロトプラストを用いて同様の実験を行った。さらに、他の金属イオンをジスプロシウムの１０倍濃度として同様の実験も行った。それらの結果を図７〜１１に示した。【００４３】  アルミニウムが併存する環境では、同濃度の実験においては、未処理の菌体ではアルミニウムの方が先に全量回収された（図７（Ａ））。プロトプラストでは未処理の菌体と比べて両金属の回収速度が速かった（図７（Ｂ））。また、アルミニウム濃度をジスプロシウム濃度の10倍にした実験では, 同濃度のときと比べてジスプロシウムの回収量が激減したが（図７（Ｃ））、同時にアルミニウムの回収量も減少することが示された（図７（Ｄ））。【００４４】  ガリウムが併存する環境では、同濃度の条件においては、未処理の菌体ではガリウムが先に全量回収された（図８（Ａ））。プロトプラストでは両金属とも反応開始30分で全量回収された（図８（Ｂ））。ガリウムをジスプロシウムの10倍濃度にした条件ではアルミニウムの時と同様にジスプロシウム、ガリウムの回収量がともに減少した（図８（Ｃ）（Ｄ））。【００４５】  パラジウムが併存する環境では、同濃度の条件においては、未処理の菌体ではパラジウムが先に全量回収された（図９（Ａ））。一方、プロトプラストではジスプロシウムはアルミニウムやガリウムの時とは違い、パラジウムが全量回収された後も回収量が増加しなかった（図９（Ｂ））。パラジウムをジスプロシウムの10倍濃度にした条件では、ジスプロシウムの回収量はパラジウム濃度に関係なく変化を示さなかったが（図９（Ｃ））、パラジウムは濃度に比例して回収量が増加した（図９（Ｄ））。【００４６】  インジウムが併存する環境では、同濃度の条件では未処理の菌体、プロトプラストの菌体に関わらず、全ての採取時間で同じ回収率を示した（図１０（Ａ）（Ｂ））。インジウムをジスプロシウムの10倍濃度にした条件では、ジスプロシウムの回収量は90％近く減少したのに対し（図１０（Ｃ））、インジウムの回収量は2倍程度の増加に留まった（図１０（Ｄ））。【００４７】  ネオジウムが共存する環境では、同濃度の条件では未処理の菌体、プロトプラストの菌体に関わらず、全ての採取時間で同じ回収率を示した（図１１（Ａ）（Ｂ））。ネオジウムをジスプロシウムの10倍濃度にした条件では、ジスプロシウムの回収量は3分の1に減少し（図１１（Ｃ））、ネオジウムの回収量は約3倍増加した（図１１（Ｄ））。【００４８】  これらの実験から、３価の金属イオンや２価の金属イオンが共存する環境下でも、各希少金属の金属イオンの回収はそれぞれ異なった態様を示すものの、３価の金属イオンの形態を取るジスプロシウムやネオジウムなどの希少金属を回収できるといえる。
【実施例４】
【００４９】  （アルミニウム耐性酵母の選別）  大阪府立大学大学院生命環境科学研究科で所有する数種のサッカロミセス属の酵母（Saccharomyces cerevisiae）について、実施例１と同様にしてアルミニウム耐性酵母のスクリーニングを行った。酵母の培養懸濁液0.5mlを終濃度5mM AlCl3、pH3.0、2.0％NaClになるように調製したGYP液体培地に植菌した後、30℃で48時間培養した。その培養液を下記に示す各濃度のAlCl3を含むGYP寒天培地に植菌して、生育できる菌株をスクリーニングした。得られた菌株から検鏡によって酵母を選別した後、GYP液体培地（AlCl3を含まない）で前培養した後、各濃度のAlCl3を含むGYP寒天培地で培養を繰り返して、安定的に各濃度に対してアルミニウム耐性を有する酵母１株（FC-IDY03株）を単離した。【００５０】  単離した酵母株をGYP液体培地5mlに植菌して、30℃で24時間前培養した後、前培養液（OD660=1.0相当の酵母培養液）1mlをGYP培地5mlに植菌して、30℃で24時間本培養した。本培養後、1.5ml容チューブに菌体濃度（OD660=1.0/ml）分を遠心分離（6000rpm、10分間）にて回収し、滅菌水での洗浄（6000rpm、10分間）を２度行った。その後、回収菌体を精製水に懸濁した菌体懸濁液を、酢酸ジスプロシウム水溶液、酢酸ネオジウム水溶液、塩化ガリウム水溶液、塩化インジウム水溶液にそれぞれ添加し、それぞれ菌体濃度がOD660=0.5の酵母培養液1ml、各金属イオンの終濃度が1mmol/lとなるように添加して、30℃で１晩攪拌した。その後菌体を実施例１におけるジスプロシウムの回収実験と同様に硝酸分解して、ICP発光分光器を用いて各金属の回収量を求めた。また、比較として、S. cerevisiae BY4741株についても同様にして各金属の回収量を求めた。その結果を表２に示す。【００５１】
【表２】
2018038218.tif 000003
【００５２】  この結果、アルミニウム耐性を示した酵母S. cerevisiae FC-IDY03株は、ジスプロシウムやインジウムに対して、S. cerevisiaeの標準株の１つであるBY4741株よりも良好な回収能を示した。この酵母株（FC-IDY03株）は、ＮＰＭＤ独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ） 日本国〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室に、平成２９年７月２８日付けで受託番号ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ Ｐ−０２５２１で寄託された。【００５３】  このようにアルミニウム耐性を示すサッカロミセス属の酵母を使ってもジスプロシウムやインジウムなどの希少金属を回収できる可能性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】  本発明の方法は、ジスプロシウムやネオジウムなどの希少金属の回収方法として利用できる。
【図１】
2018038218.tif 000004
【図２】
2018038218.tif 000005
【図３】
2018038218.tif 000006
【図４】
2018038218.tif 000007
【図５】
2018038218.tif 000008
【図６】
2018038218.tif 000009
【図７】
2018038218.tif 000010
【図８】
2018038218.tif 000011
【図９】
2018038218.tif 000012
【図１０】
2018038218.tif 000013
【図１１】
2018038218.tif 000014
【配列表】
2018038218000001.app
【国際調査報告】
2018038218.tif 000015
2018038218.tif 000016
2018038218.tif 000017
2018038218.tif 000018