(57)【要約】  本発明は、カルシウムインジケーターを有する遺伝子改変トリパノソーマ・クルージおよび抗トリパノソーマ薬のスクリーニングのためのその応用を提供する。具体的には、本発明によれば、哺乳動物由来カルモジュリン、ミオシン軽鎖キナーゼ由来ペプチド（Ｍ１３ペプチド）およびマーカータンパク質との融合タンパク質を含む細胞内カルシウムインジケーターを体内に有する遺伝子改変トリパノソーマ・クルージおよびこれを用いた抗トリパノソーマ薬のスクリーニング方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来カルモジュリン、ミオシン軽鎖キナーゼ由来ペプチド（Ｍ１３ペプチド）およびマーカータンパク質との融合タンパク質を含む細胞内カルシウムインジケーターを体内に有する遺伝子改変トリパノソーマ・クルージ。
【請求項２】
マーカータンパク質が蛍光タンパク質又は発光タンパク質である、請求項１記載のトリパノソーマ・クルージ。
【請求項３】
細胞内カルシウムインジケーターがＧＥＣＯ、好ましくはＧ−ＧＥＣＯ、Ｂ−ＧＥＣＯ、Ｒ−ＧＥＣＯ、ＧＥＸ−ＧＥＣＯまたはＧＥＭ−ＧＥＣＯである、請求項２に記載のトリパノソーマ・クルージ。
【請求項４】
蛍光タンパク質が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分を有し、カルシウムイオン濃度をドナー由来およびアクセプター由来の蛍光強度の比により検出できる、請求項２に記載のトリパノソーマ・クルージ。
【請求項５】
amastigote（アマスティゴートまたは無鞭毛体）のステージにある請求項１から４のいずれか１項に記載のトリパノソーマ・クルージを細胞内に含む哺乳動物細胞。
【請求項６】
哺乳動物由来カルモジュリン、ミオシン軽鎖キナーゼ由来ペプチド（Ｍ１３ペプチド）および前記トリパノソーマ・クルージ内のマーカータンパク質と異なるマーカータンパク質との第二の融合タンパク質を含む第二の細胞内カルシウムインジケーターを細胞内にさらに有する、請求項５記載の細胞。
【請求項７】
第二の細胞内カルシウムインジケーターがＧＥＣＯ、好ましくはＧ−ＧＥＣＯ、Ｂ−ＧＥＣＯ、Ｒ−ＧＥＣＯ、ＧＥＸ−ＧＥＣＯまたはＧＥＭ−ＧＥＣＯである、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
第二の細胞内カルシウムインジケーターにおけるマーカータンパク質が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分を有し、カルシウムイオン濃度をドナー由来およびアクセプター由来の蛍光強度の比により検出できる、請求項６に記載の細胞。
【請求項９】
下記の工程を含む、抗トリパノソーマ薬のスクリーニング方法：
（ａ） 請求項１〜４のいずれか一項に記載のトリパノソーマ・クルージ内のカルシウムイオン濃度を前記マーカーの示す強度を検出して測定する工程、
（ｂ） 被験物質を前記トリパノソーマ・クルージに接触させる工程、
（ｃ） （ａ）で測定したカルシウムイオン濃度と比較して、接触によって前記トリパノソーマ・クルージ内のカルシウムイオン濃度を規定比率以下に減少させた物質を選別する工程。
【請求項１０】
下記の工程を含む、トリパノソーマ・クルージのamastigoteに作用する抗トリパノソーマ薬のスクリーニング方法：
（ａ−０） 請求項１〜４のいずれか一項に記載のトリパノソーマ・クルージを感染させた哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）を提供する工程、
（ａ−１） 前記トリパノソーマ・クルージのamastigoteのカルシウムイオン濃度を前記マーカーの示す強度を検出して測定する工程、
（ｂ−１） 被験物質を前記哺乳動物細胞に接触させる工程、
（ｃ−１） （ａ−１）で測定したカルシウムイオン濃度と比較して、接触によって前記哺乳動物細胞内のトリパノソーマ・クルージのamastigote内のカルシウムイオン濃度を規定値以下に減少させる物質を選別する工程。
【請求項１１】
哺乳動物細胞が、哺乳動物由来カルモジュリン、ミオシン軽鎖キナーゼ由来ペプチド（Ｍ１３ペプチド）およびトリパノソーマ・クルージ内のマーカータンパク質と異なるマーカータンパク質との融合タンパク質を含む第二の細胞内カルシウムインジケーターを細胞内に有する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
トリパノソーマ・クルージ内の細胞内カルシウムインジケーターがＧＥＣＯ、好ましくはＧ−ＧＥＣＯ、Ｂ−ＧＥＣＯ、Ｒ−ＧＥＣＯ、ＧＥＸ−ＧＥＣＯまたはＧＥＭ−ＧＥＣＯである、請求項９から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
トリパノソーマ・クルージ内の細胞内カルシウムインジケーターにおけるマーカータンパク質が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分を有し、カルシウムイオン濃度をドナー由来およびアクセプター由来の蛍光強度の比により検出できる、請求項９から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
第二の細胞内カルシウムインジケーターがＧＥＣＯ、好ましくはＧ−ＧＥＣＯ、Ｂ−ＧＥＣＯ、Ｒ−ＧＥＣＯ、ＧＥＸ−ＧＥＣＯまたはＧＥＭ−ＧＥＣＯである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
第二の細胞内カルシウムインジケーターにおける蛍光タンパク質が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分を有し、カルシウムイオン濃度をドナー由来およびアクセプター由来の蛍光強度の比により検出できる、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
トリパノソーマ・クルージに包含されたカルシウムインジケーターがカルシウムの存在下において赤色、橙色、黄色、緑色、および青色のいずれかの蛍光色を呈し、哺乳動物由来の細胞に包含されたカルシウムインジケーターがカルシウムの存在下において前記蛍光色とは異なる蛍光色を呈する、請求項９から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
工程ｃ−１において、原虫株に包含されたカルシウムインジケーターの蛍光強度を哺乳動物細胞におけるカルシウムインジケーターの蛍光強度に対するよりも選択的に減じる作用を有する物質を選別する、請求項１１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
マーカータンパク質が、赤色蛍光タンパク質に由来する、橙色蛍光タンパク質に由来する、黄色蛍光タンパク質に由来する、または緑色蛍光タンパク質に由来する、または、青色蛍光タンパク質に由来する、請求項１に記載の原虫株、請求項４に記載の原虫株、請求項６〜８のいずれか一項に記載の細胞、または請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本発明は、米国仮出願（US 62/375,622、出願日：2016/8/16）の優先権の利益を享受する出願であり、その全体は引用することによって本願に取り込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、カルシウムインジケーターを有する遺伝子改変トリパノソーマ・クルージおよび抗トリパノソーマ薬のスクリーニングのためのその応用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
トリパノソーマ・クルージは、ラテンアメリカにおいて見られるシャーガス病の原因となる寄生性原生生物である。これまでにシャーガス病治療薬としてベンズニダゾール（benznidazole）およびニフルティモックス（nifurtimox）の２つが開発されているが、これらはしばしば重篤な副作用をもたらす。また、これらのシャーガス病治療薬は、急性期に対してしか有効性を示さず、その効果は限定的である。【０００４】
トリパノソーマ・クルージは、その生活環においてT. cruziのIP3Rホモログ（TcIP3R）のmRNA発現が大きく変動することが見出されている（非特許文献１）。また、TcIP3Rの発現量を半分以下に低下させるとT. cruziが成長できないことが示されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hashimoto, M. et al., Mol. Microbiol., 87, 1133-1150, 2013
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、カルシウムインジケーターを有する遺伝子改変トリパノソーマ・クルージおよび抗トリパノソーマ薬のスクリーニングのためのその応用を提供する。
【０００７】
本発明者らは、細胞内カルシウムインジケーターを発現するトリパノソーマ・クルージを作製し、細胞に感染させたところ、トリパノソーマ・クルージは、生活環依存的にその細胞内カルシウムイオン濃度を変化させること、および細胞内カルシウムイオン濃度から細胞内の生活環を推定することができることを見出した。
本発明者らはまた、アマスティゴートが特に高い細胞内カルシウムイオン濃度を示すこと、および細胞内カルシウムイオン濃度を低下させることによってアマスティゴートが効果的に死滅することも見出した。
本発明はこれら知見に基づくものである。
【０００８】
本発明によれば、例えば以下の発明が提供される。
（１）哺乳動物由来カルモジュリン、ミオシン軽鎖キナーゼ由来ペプチド（Ｍ１３ペプチド）およびマーカータンパク質との融合タンパク質を含む細胞内カルシウムインジケーターを体内に有する遺伝子改変トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）｛例えば、前記カルモジュリン、マーカータンパク質およびＭ１３ペプチドは、リンカーを介してまたは介さずにこの順番で融合していてもよい｝。
（２）マーカータンパク質が蛍光タンパク質又は発光タンパク質である、上記（１）記載のトリパノソーマ・クルージ。
（３）細胞内カルシウムインジケーターがＧＥＣＯ、好ましくはＧ−ＧＥＣＯ、Ｂ−ＧＥＣＯ、Ｒ−ＧＥＣＯ、ＧＥＸ−ＧＥＣＯまたはＧＥＭ−ＧＥＣＯである、上記（２）に記載のトリパノソーマ・クルージ。
（４）蛍光タンパク質が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分を有し、カルシウム濃度をドナー由来およびアクセプター由来の蛍光強度の比により検出できる（例えば、カメレオンタンパク質である）、上記（２）に記載のトリパノソーマ・クルージ。
（５）amastigote（アマスティゴートまたは無鞭毛体）のステージにある上記（１）から（４）のいずれかに記載のトリパノソーマ・クルージを細胞内に含む哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）。
（６）哺乳動物由来カルモジュリン、ミオシン軽鎖キナーゼ由来ペプチド（Ｍ１３ペプチド）および前記トリパノソーマ・クルージ内のマーカータンパク質と異なるマーカータンパク質との第二の融合タンパク質を含む第二の細胞内カルシウムインジケーターを細胞内にさらに有する（特に限定されないが例えば、これにより、トリパノソーマ・クルージ内のカルシウム濃度と哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）内のカルシウム濃度とをそれぞれ測定できる）、上記（５）記載の細胞。
（７）第二の細胞内カルシウムインジケーターがＧＥＣＯ、好ましくはＧ−ＧＥＣＯ、Ｂ−ＧＥＣＯ、Ｒ−ＧＥＣＯ、ＧＥＸ−ＧＥＣＯまたはＧＥＭ−ＧＥＣＯである、上記（６）に記載の細胞。
（８）第二の細胞内カルシウムインジケーターにおけるマーカータンパク質が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分を有し、カルシウム濃度をドナー由来およびアクセプター由来の蛍光強度の比により検出できる（例えば、カメレオンタンパク質である）、上記（６）に記載の細胞。
（９）下記の工程を含む、抗トリパノソーマ薬のスクリーニング方法：
（ａ） 上記（１）〜（４）のいずれかに記載のトリパノソーマ・クルージ内のカルシウムイオン濃度を前記マーカーの示す強度を検出して測定する工程、
（ｂ） 被験物質を前記トリパノソーマ・クルージに接触させる工程、
（ｃ） （ａ）で測定したカルシウムイオン濃度と比較して、接触によって前記トリパノソーマ・クルージ内のカルシウムイオン濃度を規定比率以下に減少させた物質を選別する工程｛ここで、規定比率は、２分の１、３分の１、４分の１または５分の１以下の数値である｝。
（１０）下記の工程を含む、トリパノソーマ・クルージのamastigoteに作用する抗トリパノソーマ薬のスクリーニング方法：
（ａ−０）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のトリパノソーマ・クルージを感染させた哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）を提供する工程、
（ａ−１） 前記トリパノソーマ・クルージのamastigoteのカルシウムイオン濃度を前記マーカーの示す強度を検出して測定する工程、
（ｂ−１） 被験物質を前記哺乳動物細胞に接触させる工程、
（ｃ−１） （ａ−１）で測定したカルシウムイオン濃度と比較して、接触によって前記哺乳動物細胞内のトリパノソーマ・クルージのamastigote内のカルシウムイオン濃度を規定値以下に減少させる物質を選別する工程｛ここで規定値は、３００ｎＭ以下、２９０ｎＭ以下、２８０ｎＭ以下、２７０ｎＭ以下、２６０ｎＭ以下、２５０ｎＭ以下、２４０ｎＭ以下、２３０ｎＭ以下、２２０ｎＭ以下、２１０ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、または１５０ｎＭ以下の濃度であり、好ましくは、１００ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲である｝。
（１１）哺乳動物細胞が、哺乳動物由来カルモジュリン、ミオシン軽鎖キナーゼ由来ペプチド（Ｍ１３ペプチド）およびトリパノソーマ・クルージ内のマーカータンパク質と異なるマーカータンパク質との融合タンパク質を含む第二の細胞内カルシウムインジケーターを細胞内に有する、上記（１０）記載の方法。
（１２）トリパノソーマ・クルージ内の細胞内カルシウムインジケーターがＧＥＣＯ、好ましくはＧ−ＧＥＣＯ、Ｂ−ＧＥＣＯ、Ｒ−ＧＥＣＯ、ＧＥＸ−ＧＥＣＯまたはＧＥＭ−ＧＥＣＯである、上記（９）から（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）トリパノソーマ・クルージ内の細胞内カルシウムインジケーターにおけるマーカータンパク質が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分を有し、カルシウム濃度をドナー由来およびアクセプター由来の蛍光強度の比により検出できる（例えば、カメレオンタンパク質である）、上記（９）から（１１）のいずれかに記載の方法。
（１４）第二の細胞内カルシウムインジケーターがＧＥＣＯ、好ましくはＧ−ＧＥＣＯ、Ｂ−ＧＥＣＯ、Ｒ−ＧＥＣＯ、ＧＥＸ−ＧＥＣＯまたはＧＥＭ−ＧＥＣＯである、上記（１１）に記載の方法。
（１５）第二の細胞内カルシウムインジケーターにおける蛍光タンパク質が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分を有し、カルシウム濃度をドナー由来およびアクセプター由来の蛍光強度の比により検出できる（例えば、カメレオンタンパク質である）、上記（１１）記載の方法。
（１６）トリパノソーマ・クルージに包含されたカルシウムインジケーターがカルシウムの存在下において赤色、橙色、黄色、緑色、および青色のいずれかの蛍光色を呈し、哺乳動物由来の細胞に包含されたカルシウムインジケーターがカルシウムの存在下において前記蛍光色とは異なる蛍光色を呈する、上記（９）から（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）工程ｃ−１において、原虫株に包含されたカルシウムインジケーターの蛍光強度を哺乳動物細胞におけるカルシウムインジケーターの蛍光強度に対するよりも選択的に（例えば、大きな比率で）減じる作用を有する物質を選別する、上記（１１）から（１５）のいずれかに記載の方法。
（１８）マーカータンパク質が、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍｃｈｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ２、ＤｓＲｅｄ、Ａｚａｌｅａ  Ｂ５、赤色蛍光変異導入ｃｐ（円順列変異）ＧＦＰなど）に由来する、橙色蛍光タンパク質（例えば、ＯＦＰ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅなど）に由来する、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｙｐｅｔ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＶｅｎｕｓ、Ｔｏｐａｚなど）に由来する、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ｍＡＧ、ｍＫＧ、ＫｉｋＧ、２２Ｇ、ｍＷａｓａｂｉ、ｃｐ（円順列変異）ＧＦＰなどに由来する、または、青色蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｃｙａｎ、ｍＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、青色蛍光変異導入ｃｐ（円順列変異）ＧＦＰなど）に由来する、上記（１）に記載の原虫株、上記（４）に記載の原虫株、上記（６）〜（８）のいずれかに記載の細胞、または上記（９）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
【０００９】
本発明では、例えば、以下の発明が提供される。
（１Ａ）哺乳動物由来カルモジュリン、ミオシン軽鎖キナーゼ由来ペプチド（Ｍ１３ペプチド）およびマーカータンパク質との融合タンパク質を含む細胞内カルシウムインジケーターを体内に有する遺伝子改変トリパノソーマ・クルージ。
（２Ａ）マーカータンパク質が蛍光タンパク質又は発光タンパク質である、上記（１Ａ）記載のトリパノソーマ・クルージ。
（３Ａ）細胞内カルシウムインジケーターがＧＥＣＯ、好ましくはＧ−ＧＥＣＯ、Ｂ−ＧＥＣＯ、Ｒ−ＧＥＣＯ、ＧＥＸ−ＧＥＣＯまたはＧＥＭ−ＧＥＣＯである、上記（２Ａ）に記載のトリパノソーマ・クルージ。
（４Ａ）蛍光タンパク質が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分を有し、カルシウムイオン濃度をドナー由来およびアクセプター由来の蛍光強度の比により検出できる、上記（２Ａ）に記載のトリパノソーマ・クルージ。
（５Ａ）amastigote（アマスティゴートまたは無鞭毛体）のステージにある上記（１Ａ）から（４Ａ）のいずれかに記載のトリパノソーマ・クルージを細胞内に含む哺乳動物細胞。
（６Ａ）哺乳動物由来カルモジュリン、ミオシン軽鎖キナーゼ由来ペプチド（Ｍ１３ペプチド）および前記トリパノソーマ・クルージ内のマーカータンパク質と異なるマーカータンパク質との第二の融合タンパク質を含む第二の細胞内カルシウムインジケーターを細胞内にさらに有する、上記（５Ａ）記載の細胞。
（７Ａ）第二の細胞内カルシウムインジケーターがＧＥＣＯ、好ましくはＧ−ＧＥＣＯ、Ｂ−ＧＥＣＯ、Ｒ−ＧＥＣＯ、ＧＥＸ−ＧＥＣＯまたはＧＥＭ−ＧＥＣＯである、上記（６Ａ）に記載の細胞。
（８）第二の細胞内カルシウムインジケーターにおけるマーカータンパク質が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分を有し、カルシウムイオン濃度をドナー由来およびアクセプター由来の蛍光強度の比により検出できる、上記（６Ａ）に記載の細胞。
（９Ａ）下記の工程を含む、抗トリパノソーマ薬のスクリーニング方法：
（ａ）上記（１Ａ）〜（４Ａ）のいずれかに記載のトリパノソーマ・クルージ内のカルシウムイオン濃度を前記マーカーの示す強度を検出して測定する工程、
（ｂ） 被験物質を前記トリパノソーマ・クルージに接触させる工程、
（ｃ） （ａ）で測定したカルシウムイオン濃度と比較して、接触によって前記トリパノソーマ・クルージ内のカルシウムイオン濃度を規定比率以下に減少させた物質を選別する工程。
（１０Ａ）下記の工程を含む、トリパノソーマ・クルージのamastigoteに作用する抗トリパノソーマ薬のスクリーニング方法：
（ａ−０）上記（１Ａ）〜（４Ａ）のいずれかに記載のトリパノソーマ・クルージを感染させた哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）を提供する工程、
（ａ−１） 前記トリパノソーマ・クルージのamastigoteのカルシウムイオン濃度を前記マーカーの示す強度を検出して測定する工程、
（ｂ−１） 被験物質を前記哺乳動物細胞に接触させる工程、
（ｃ−１） （ａ−１）で測定したカルシウムイオン濃度と比較して、接触によって前記哺乳動物細胞内のトリパノソーマ・クルージのamastigote内のカルシウムイオン濃度を規定値以下に減少させる物質を選別する工程。
（１１Ａ）哺乳動物細胞が、哺乳動物由来カルモジュリン、ミオシン軽鎖キナーゼ由来ペプチド（Ｍ１３ペプチド）およびトリパノソーマ・クルージ内のマーカータンパク質と異なるマーカータンパク質との融合タンパク質を含む第二の細胞内カルシウムインジケーターを細胞内に有する、上記（１０Ａ）記載の方法。
（１２Ａ）トリパノソーマ・クルージ内の細胞内カルシウムインジケーターがＧＥＣＯ、好ましくはＧ−ＧＥＣＯ、Ｂ−ＧＥＣＯ、Ｒ−ＧＥＣＯ、ＧＥＸ−ＧＥＣＯまたはＧＥＭ−ＧＥＣＯである、上記（９Ａ）から（１１Ａ）のいずれかに記載の方法。
（１３Ａ）トリパノソーマ・クルージ内の細胞内カルシウムインジケーターにおけるマーカータンパク質が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分を有し、カルシウムイオン濃度をドナー由来およびアクセプター由来の蛍光強度の比により検出できる、上記（９Ａ）から（１１Ａ）のいずれかに記載の方法。
（１４Ａ）第二の細胞内カルシウムインジケーターがＧＥＣＯ、好ましくはＧ−ＧＥＣＯ、Ｂ−ＧＥＣＯ、Ｒ−ＧＥＣＯ、ＧＥＸ−ＧＥＣＯまたはＧＥＭ−ＧＥＣＯである、上記（１１Ａ）に記載の方法。
（１５Ａ）第二の細胞内カルシウムインジケーターにおける蛍光タンパク質が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分を有し、カルシウムイオン濃度をドナー由来およびアクセプター由来の蛍光強度の比により検出できる、上記（１１Ａ）記載の方法。
（１６Ａ）トリパノソーマ・クルージに包含されたカルシウムインジケーターがカルシウムの存在下において赤色、橙色、黄色、緑色、および青色のいずれかの蛍光色を呈し、哺乳動物由来の細胞に包含されたカルシウムインジケーターがカルシウムの存在下において前記蛍光色とは異なる蛍光色を呈する、上記（９Ａ）から（１５Ａ）のいずれかに記載の方法。
（１７Ａ）工程ｃ−１において、原虫株に包含されたカルシウムインジケーターの蛍光強度を哺乳動物細胞におけるカルシウムインジケーターの蛍光強度に対するよりも選択的に減じる作用を有する物質を選別する、上記（１１Ａ）から（１５Ａ）のいずれかに記載の方法。
（１８Ａ）マーカータンパク質が、赤色蛍光タンパク質に由来する、橙色蛍光タンパク質に由来する、黄色蛍光タンパク質に由来する、または緑色蛍光タンパク質に由来する、または、青色蛍光タンパク質に由来する、上記（１Ａ）に記載の原虫株、上記（４Ａ）に記載の原虫株、上記（６Ａ）〜（８Ａ）のいずれかに記載の細胞、または上記（９Ａ）〜（１４Ａ）のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、トリパノソーマ・クルージのエピマスティゴートの体内のカルシウムイオン濃度を示す。図１Ａでは、また、100μMのBAPTA-AMで3分間処理したエピマスティゴートの体内のカルシウムイオン濃度を示す。図1Ａでは、各群で２０個体のエピマスティゴートを観察し、発現するR-GECO1の蛍光強度から細胞内カルシウムイオン濃度を推定し、図示した。図中の記号「＊＊＊」は、2つの群間のステューデントのｔ検定において、p<0.001であったことを意味する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、R-GECO1を発現するトリパノソーマ・クルージのクローン株の各ステージにおけるR-GECO1の蛍光強度を示す。図1Ｂの上パネルは、通常の培地中のエピマスティゴート、トリポマスティゴートおよびアマスティゴートにおけるR-GECO1の蛍光シグナルが示されており、図1Ｂの下パネルは、培地にカルシウムイオンとイオノマイシンとが添加された場合の蛍光シグナルが示されている。図中のバーは、５μｍを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、エピマスティゴート（Ｅ）、トリポマスティゴート（Ｔ）、およびアマスティゴート（Ａ）における細胞内カルシウムイオン濃度[Ca2+]iを示す。各群２０個体の蛍光強度を測定した。統計解析は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）およびテューキーの検定（Tukey’s test）を用いて行い、ｐ値を図示した。
【図２Ａ】図２Ａは、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓアルビノ細胞に、R-GECO1発現トリポマスティゴートを感染させて、感染84時間後の細胞の蛍光像である。アマスティゴートの運動は、４０×ドライタイプの対物レンズを備えたリアルタイム共焦点顕微鏡（Nikon AIR）を用いて記録した。連続イメージは、１５分間隔で取得された。図２Ａでは、１細胞のアマスティゴート（矢尻で示される）が、１回分裂し２細胞となり、２回分裂して４細胞となり、３回分裂して８細胞となったようすが示されている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、左パネルにおいて、R-GECO1発現トリポマスティゴート（矢印）およびトリポマスティゴート（矢尻）を重度に感染させた細胞の明視野画像を示す。この蛍光イメージが図２Ｂの右パネルである。この代表的な顕微鏡画像は、倒立顕微鏡（IX72; Olympus, Tokyo, Japan）を用いて取得した。この視野のビデオにより、この宿主細胞中でトリポマスティゴートは激しく動くことが明らかとなった。図２Ｂ中のバーは、１０μｍを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、トリパノソーマ・クルージの各ステージにおける、TcIP3RのmRNAの発現量と細胞内カルシウムイオン濃度との関係を示す。各ステージでそれぞれ２０個体のトリパノソーマ・クルージの蛍光強度を観察し、細胞内カルシウムイオン濃度を求めた。また、TcIP3RのmRNAの発現量は、定量的リアルタイムRT-PCRにより、相対的な転写産物量として決定した。データは、３回の独立した実験における平均±SDで示される。図３Ａ中の記号「Ｔ」はトリポマスティゴート、「Ａ」はアマスティゴート、「Ｅ」はエピマスティゴートを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、R-GECO1を発現する野生型エピマスティゴートとＳＫＯ株のエピマスティゴートの細胞内カルシウムイオン濃度を示す。図３Ｂでは、各２０個体の蛍光強度を測定した。統計解析は、ステューデントのｔ検定を用いて行い、記号「＊＊＊」はp<0.001を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、10mM塩化カルシウムまたは10mM BAPTAで2時間処理したR-GECO1を発現する野生型エピマスティゴートの細胞内カルシウムイオン濃度を示す。図３Ｃでは、各20個体の蛍光強度を測定した。
【発明の具体的説明】
【００１１】
「トリパノソーマ・クルージ」（Trypanosoma cruzi）とは、トリパノソーマ属に属する原虫の一種であり、人獣共通感染症であるシャーガス病（Chargas’ disease）の原因として知られている。トリパノソーマ・クルージは、その生活環において、主に、アマスティゴート（無鞭毛型）、トリポマスティゴート（錐鞭毛型）、およびエピマスティゴート（上鞭毛型）の形態および代謝型を取り、異なる環境に適応することができる。
トリパノソーマ・クルージの生活環は、昆虫相（insect phase）と哺乳動物相（mammalian phase）とに大別され、哺乳動物相は以下の通りに概略される：
トリポマスティゴートが動物に感染すると、体内で細胞内に侵入する；
細胞内では、トリポマスティゴートは、アマスティゴートになる；
アマスティゴートは、細胞内で分裂により増殖する；
増殖した細胞内のアマスティゴートは、再びトリポマスティゴートになり、細胞を壊して他の細胞に感染したり、血流に入って体内に拡散する。
【００１２】
本明細書では、「動物」は、哺乳動物、特にヒトを含む意味で用いられる。
【００１３】
本明細書では、「カルシウムインジケーター」とは、水溶液中のカルシウムイオン濃度を検出できるタンパク質を意味する。カルシウムインジケーターは、カルシウムイオンの濃度依存的にその蛍光強度を変化させ、蛍光強度からカルシウムイオン濃度を推定することに用い得る。本明細書では、「細胞内カルシウムインジケーター」とは、細胞内のカルシウムイオン濃度の推定に適したカルシウムインジケーターを意味する。細胞内カルシウムインジケーターとしては、細胞内カルシウムイオン濃度依存的にシグナル（例えば、青、緑及び赤の蛍光や発光などの光）を発する各種インジケーターが知られており、特にタンパク質でコードされるものが周知である。カルシウムインジケーターは、当業者であればカルシウム結合ペプチドと蛍光タンパク質とをリンカーを介して連結させることにより適宜設計することができる。
【００１４】
本明細書では、「蛍光共鳴エネルギー移動」（ＦＲＥＴ）とは、第一の蛍光タンパク質の蛍光の波長と第二の蛍光タンパク質の励起光の波長のスペクトルが重なり合う場合に、前記２つの蛍光タンパク質が近接すると、第一の蛍光タンパク質を励起したときに、第一の蛍光タンパク質が吸収したエネルギーが、第二の蛍光タンパク質の励起のためのエネルギーとして用いられ、第二の蛍光タンパク質の蛍光が発するという現象である。このとき第一の蛍光タンパク質をドナータンパク質（供与体）といい、第二の蛍光タンパク質をアクセプタータンパク質（受容体）という。ドナータンパク質とアクセプタータンパク質との距離が１０ｎｍ以下程度になったときにＦＲＥＴ効率が顕著に向上すると考えられている。
ＦＲＥＴは、タンパク質間相互作用の変化の解析手法として当業者に周知である。具体的には、ＦＲＥＴでは、タンパク質Ａにドナータンパク質を連結し、タンパク質Ｂにアクセプタータンパク質を連結して、タンパク質ＡとＢとの相互作用を検出することができる。ＦＲＥＴは、分子内のドメイン間の相対的位置関係の変化の解析手法としても用いられている。例えば、ドメインＡにドナータンパク質を連結し、ドメインＢにアクセプタータンパク質を連結して、タンパク質のコンフォメーションが変化すると、ドナータンパク質とアクセプタータンパク質との距離が変動し、ＦＲＥＴ効率に変化を生じさせることができることが知られている。
【００１５】
本明細書では、「生物発光共鳴エネルギー移動」（ＢＲＥＴ）とは、ＦＲＥＴにおいて供与体として第１の蛍光タンパク質の代わりに生物発光タンパク質を用いて、ドナータンパク質とアクセプタータンパク質とが近接すると、ドナータンパク質が生物発光しようとするときにそのエネルギーがアクセプタータンパク質の励起のためのエネルギーとして用いられ、ドナーの代わりにアクセプタータンパク質の蛍光が発するという現象である。生物発光タンパク質としては、ルシフェラーゼが挙げられる。
【００１６】
本明細書では、「蛍光タンパク質」とは、特定の波長を有する光で励起することにより、蛍光を発するタンパク質を意味する。通常は、蛍光は励起光よりも長い波長を有する。励起光と蛍光を区別するためにダイクロイックミラーが用いられる。ダイクロイックミラーは、特定波長の光を反射するが、それ以外の波長の光を透過する性質を有する。
【００１７】
本明細書では、「発現」または「発現する」とは、タンパク質をコードする遺伝子からタンパク質が産生されることを意味する。
【００１８】
本明細書では、「ベクター」とは、遺伝子組換えに用いられる核酸分子を言う。本明細書では、大腸菌に遺伝子導入することが念頭に置かれるため、ベクターは、大腸菌で自己複製可能な複製起点を有し、形質転換した大腸菌を選択するための耐性遺伝子を有し、外来遺伝子を導入するための挿入部位（例えば、マルチクローニングサイト）を有する。
本明細書では、「タンパク質発現ベクター」とは、細胞内でタンパク質を発現させることに用いるベクターを意味する。タンパク質発現ベクターは、通常、細胞においてタンパク質を発現させるためのプロモーターおよびポリＡ付加配列を有する。タンパク質発現ベクターとしては、プラスミドがよく用いられている。
【００１９】
本明細書では、「遺伝子改変」とは、遺伝子工学を用いて人為的に遺伝情報を変化させたことを意味する。遺伝子改変動物には、そのゲノムを改変した動物およびそのゲノムを改変せずに目的ベクターを体内に有する動物を含む意味で用いられる。
【００２０】
本明細書では、「融合タンパク質」とは、タンパク質の全部または一部と他のタンパク質の全部または一部とが連結したタンパク質を意味する。融合タンパク質が由来するタンパク質は、２種類以上であり得、例えば、３種類のタンパク質の全部または一部が１つのポリペプチドとして連結した融合タンパク質を含む意味で用いられる。
【００２１】
本明細書では、「カルシウムイオン濃度」とは、カルシウムイオンであるCa2+の濃度（すなわち、[Ca2+]）を意味する。本明細書では、細胞内カルシウムイオン濃度を[Ca2+]iと表記することがある。
【００２２】
本発明者らは、細胞内カルシウムインジケーターを発現するトリパノソーマ・クルージを作製し、細胞に感染させたところ、トリパノソーマ・クルージは、生活環依存的にその細胞内カルシウムイオン濃度を変化させること、および細胞内カルシウムイオン濃度から細胞内の生活環を推定することができることを見出した。
本発明者らはまた、アマスティゴートが特に高い細胞内カルシウムイオン濃度を示すこと、および細胞内カルシウムイオン濃度を低下させることによってアマスティゴートが効果的に死滅することも見出した。
【００２３】
本発明によれば、細胞内カルシウムインジケーターを体内に有する、トリパノソーマ・クルージが提供される。トリパノソーマ・クルージは、生活環によって細胞内カルシウムイオン濃度を大きく変動させるから、細胞内カルシウムインジケーターを体内に持たせることによってトリパノソーマ・クルージがどの生活環であるかを、容易に判別することができる。
【００２４】
細胞内カルシウムインジケーターとしては、特に限定されないが例えば、多く開発されているカルシウムインジケーターの内、トリパノソーマ・クルージの体内のカルシウムイオンの変動域をダイナミックレンジに含むインジケーターを用いることができる。
例えば、１００ｎＭ〜６００ｎＭをダイナミックレンジに含むインジケーターであれば、トリパノソーマ・クルージの体内のカルシウムイオンの変動を良好に検出することができる。例えば、５０ｎＭ〜６００ｎＭの範囲にダイナミックレンジを含むインジケーターは、トリパノソーマ・クルージが、アマスティゴートか、エピマスティゴートか、トリポマスティゴートのいずれかであるかを判別することに適している。
また例えば、アマスティゴートの体内カルシウムイオン濃度にのみ応答して特定のシグナルを発するインジケーターを用いてもよく、このようなインジケーターは、アマスティゴートの検出に適している。例えば、３５０ｎＭ以上、３６０ｎＭ以上、３７０ｎＭ以上、３８０ｎＭ以上、３９０ｎＭ以上、４００ｎＭ以上、４１０ｎＭ以上、４２０ｎＭ以上、４３０ｎＭ以上、４４０ｎＭ以上、４５０ｎＭ以上、４６０ｎＭ以上、４７０ｎＭ以上、４８０ｎＭ以上、４９０ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、５１０ｎＭ以上、５２０ｎＭ以上、５３０ｎＭ以上、５４０ｎＭ以上、５５０ｎＭ以上のカルシウムイオン濃度に応答して特定のシグナルを発するインジケーターがアマスティゴートの検出に適している。
【００２５】
細胞内カルシウムインジケーターは、哺乳動物由来カルモジュリン、ミオシン軽鎖キナーゼ由来ペプチド（Ｍ１３ペプチド）およびマーカータンパク質との融合タンパク質（以下、「本発明の融合タンパク質」ということがある）を含み得る。上記融合タンパク質において、哺乳動物由来カルモジュリンは、カルシウムイオン濃度依存的にＭ１３ペプチドに結合し、これを介してマーカータンパク質の構造を変換し、マーカータンパク質の機能をオン・オフすることができる。マーカータンパク質としては、イメージングが容易な蛍光タンパク質または発光タンパク質を用いることができる。このような融合タンパク質としては、例えば、ＧＣａＭＰ、およびＧＥＣＯが挙げられる。
【００２６】
本発明で用いられ得るＧＣａＭＰとしては、特に限定されないが例えば、ＧＣａＭＰ１．６、ＧＣａＭＰ２、ＧＣａＭＰ３（例えば、配列番号１）、並びに、ＧＣａＭＰ６ｆ、６ｍおよび６ｓが挙げられる。
【００２７】
マーカータンパク質では、例えば、カルモジュリン、マーカータンパク質およびＭ１３ペプチドは、リンカーを介してまたは介さずにこの順番で融合していてもよい。例えば、ＧＣａＭＰでは、Ｎ末端側から、Ｍ１３ペプチド、ＥＧＦＰ（１４９〜２３８）、リンカー（ＧＧＴＧＧＳ）、ＥＧＦＰ（１〜１４４）、リンカー（ＴＲ）、及びカルモジュリン（２〜１４８）が連結された。カルモジュリンが構造変化を示さない低カルシウムイオン濃度環境下では、カルモジュリンとＭ１３ペプチドとは解離しており、ＥＧＦＰが蛍光を発し得るが、カルモジュリンがカルシウムと結合すると、Ｍ１３ペプチドと相互作用をするようになり、ＥＧＦＰの構造が歪められて蛍光を発し得ない状態となる。このように、Ｍ１３ペプチドとＥＧＦＰとカルモジュリンとがこの順番で、あるいは、カルモジュリンとＥＧＦＰとＭ１３ペプチドとがこの順番で連結した融合タンパク質は、細胞内カルシウムイオン濃度依存的に特定の蛍光を発し得る。このような原理で、ＥＧＦＰ部分を他の蛍光タンパク質に置き換えれば、様々な細胞内カルシウムインジケーターを作製することができるであろう。また、ＧＦＰは、中央に存在する１本のαヘリックス部分に発光団が存在し、これを１１本のアンチパラレルβシートが取り囲む構造をし、αヘリックスを安定化させ、安定的な蛍光を発生させている。従って、αヘリックスを取り巻くβシート部分の構造を、同様にＭ１３ペプチドとカルモジュリンを用いて変換させることにより、ＧＦＰの発光と消光を制御できる。
このように当業者であれば、カルモジュリンと蛍光タンパク質とＭ１３ペプチドとを組み合わせてカルシウムイオン濃度依存的に特定の蛍光を発する融合タンパク質を作製することができるであろう。
【００２８】
ある態様では、マーカータンパク質は、例えば、
赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍｃｈｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ２、ＤｓＲｅｄ、Ａｚａｌｅａ  Ｂ５、赤色蛍光変異導入ｃｐ（円順列変異）ＧＦＰなど）に由来する；
橙色蛍光タンパク質（例えば、ＯＦＰ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅなど）に由来する、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｙｐｅｔ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＶｅｎｕｓ、Ｔｏｐａｚなど）に由来する；
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ｍＡＧ、ｍＫＧ、ＫｉｋＧ、２２Ｇ、ｍＷａｓａｂｉ、ｃｐ（円順列変異）ＧＦＰなどに由来する；または、
青色蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｃｙａｎ、ｍＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、青色蛍光変異導入ｃｐ（円順列変異）ＧＦＰなど）に由来するものとすることができる。
【００２９】
本発明で用いられ得るＧＥＣＯとしては、特に限定されないが例えば、Ｇ−ＧＥＣＯ（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）、Ｂ−ＧＥＣＯ（例えば、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）、ＧＥＸ−ＧＥＣＯ（例えば、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）、ＧＥＭ−ＧＥＣＯ（例えば、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）、および、Ｒ−ＧＥＣＯ（例えば、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）が挙げられる。
【００３０】
本発明ではまた、上記融合タンパク質として、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分を有し、カルシウムイオン濃度をドナー由来およびアクセプター由来の蛍光強度の比により検出できる、タンパク質を用いることができる。本発明ではさらに、融合タンパク質として、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を生じるドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分を有し、カルシウムイオン濃度をドナー由来およびアクセプター由来の蛍光強度の比により検出できる、タンパク質を用いることができる。
このようなタンパク質としては、特に限定されないがカメレオンを用いることができる。カメレオンは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分として、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をそれぞれ有し、これがカルモジュリンとＭ１３ペプチドとで連結された融合タンパク質である。カルモジュリンがカルシウムに反応すると、Ｍ１３ペプチドと結合し、これによってＣＦＰとＹＦＰの距離が縮まり、ＦＲＥＴを生じるようになる。すなわち、低カルシウムイオン濃度環境下では、この融合タンパク質は、ＣＦＰによる蛍光を発するが、高カルシウムイオン濃度環境下（つまり、カルモジュリンがカルシウムに結合する環境下）では、この融合タンパク質は、ＹＦＰの蛍光を発する。
このように、ＦＲＥＴを生じるドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分を有し、カルシウムイオン濃度をドナー由来およびアクセプター由来の蛍光強度の比により検出できる、タンパク質を当業者であれば作製することができ、これを本発明において用いることができる。同様にして、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を生じるドナー発光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分を有し、カルシウムイオン濃度をドナー由来およびアクセプター由来の蛍光強度の比により検出できる、タンパク質も当業者であれば作製することができ、これを本発明において用いることができる。
ＦＲＥＴおよびＢＲＥＴにおいては、ドナータンパク質の発光波長が、アクセプター蛍光タンパク質の励起波長と重なるようにドナータンパク質とアクセプター蛍光タンパク質を選択することで、効率良くＦＲＥＴまたはＢＲＥＴを誘発することができる。
【００３１】
トリパノソーマ・クルージへの融合タンパク質の導入は、遺伝子発現ベクターを用いて常法により行うことができる。遺伝子発現ベクターは、遺伝子発現を可能とするプロモーターに作動可能に融合タンパク質を連結することによって、融合タンパク質を発現するベクターとして得ることができる。融合タンパク質の導入は、トリパノソーマ・クルージのゲノム中に融合タンパク質をコードする遺伝子を導入することによって行ってもよいであろう。以下、本発明の融合タンパク質を含む細胞内カルシウムインジケーターを体内に有する遺伝子改変トリパノソーマ・クルージを、「本発明の遺伝子改変トリパノソーマ・クルージ」と呼ぶことがある。
【００３２】
トリパノソーマ・クルージは、トリポマスティゴートの形態で細胞内に侵入し、細胞内ではアマスティゴートに変化する。従って、本発明では、本発明の融合タンパク質を体内に有するトリパノソーマ・クルージ（アマスティゴートのステージにある）を細胞内に含む、哺乳動物細胞（以下、「本発明の哺乳動物細胞」ということがある）が提供される。このような哺乳動物細胞は、抗トリパノソーマ薬のスクリーニングや開発に有用であると考えられる。哺乳動物細胞は、例えばヒト細胞であり得る。
【００３３】
本発明の哺乳動物細胞は、トリパノソーマ・クルージが有する第１の本発明の融合タンパク質とは異なる第２の本発明の融合タンパク質を有していてもよい。本発明のある態様では、第２の本発明の融合タンパク質は、第１の融合タンパク質とは異なる波長の蛍光を発し、これにより視覚的にトリパノソーマ・クルージのカルシウムイオン濃度と哺乳細胞のカルシウムイオン濃度とを区別できるようにしてもよい。このようにすることで、トリパノソーマ・クルージ内のカルシウムイオン濃度を推定できると共に、哺乳動物細胞内のカルシウムイオン濃度を推定することが容易になる。
【００３４】
本発明によれば、細胞内のトリパノソーマ・クルージは、そのカルシウムイオン濃度を低下させると死滅することが明らかとなった。従って、本発明によれば、下記の工程を含む、抗トリパノソーマ薬のスクリーニング方法：
（ａ） 本発明の遺伝子改変トリパノソーマ・クルージ内のカルシウムイオン濃度を前記マーカータンパク質の示す強度を検出して測定する工程、
（ｂ） 被験物質を前記トリパノソーマ・クルージに接触させる工程、および
（ｃ） （ａ）で測定したカルシウムイオン濃度と比較して、接触によって前記トリパノソーマ・クルージ内のカルシウムイオン濃度を規定比率以下に減少させた物質を選別する工程
が提供される。
【００３５】
上記（ａ）において、カルシウムイオン濃度は、本発明の融合タンパク質に含まれるマーカータンパク質が示す強度（例えば、蛍光タンパク質の場合は蛍光強度）を検出することにより、測定することができる。マーカータンパク質が示す強度と、カルシウムイオン濃度との関係は、事前に検量線を作製して決定し、得られている検量線に基づいてマーカータンパク質が示す強度からカルシウムイオン濃度を推定してもよい。
【００３６】
上記（ｂ）において、被験物質は、抗トリパノソーマ薬（例えば、抗トリパノソーマ・クルージ薬）の候補である。被験物質は、トリパノソーマ・クルージの細胞膜に対して透過性であっても、非透過性であってもよい。
【００３７】
上記（ｃ）において、（ａ）で測定したカルシウムイオン濃度と比較して、接触によって前記トリパノソーマ・クルージ内のカルシウムイオン濃度を規定比率以下に減少させた物質が、抗トリパノソーマ・クルージ薬としてスクリーニングされる。ここで、規定比率は、例えば、２分の１、３分の１、４分の１または５分の１以下の数値であり得る。
【００３８】
本発明によればまた、記の工程を含む、トリパノソーマ・クルージのamastigoteに作用する抗トリパノソーマ薬のスクリーニング方法：
（ａ−０） 本発明の哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）を提供する工程、
（ａ−１） 前記トリパノソーマ・クルージのamastigoteのカルシウムイオン濃度を前記マーカータンパク質の示す強度を検出して測定する工程、
（ｂ−１） 被験物質を前記哺乳動物細胞に接触させる工程、
（ｃ−１） （ａ−１）で測定したカルシウムイオン濃度と比較して、接触によって前記哺乳動物細胞内のトリパノソーマ・クルージのamastigote内のカルシウムイオン濃度を規定値以下に減少させる物質を選別する工程
が提供される。
【００３９】
上記（ａ−０）において、本発明の哺乳動物細胞は、上記の通り、作製することができる。本発明のある態様では、上記哺乳動物細胞は、上述の通り、第２の本発明の融合タンパク質を細胞内に有していてもよい。
【００４０】
上記（ａ−１）において、カルシウムイオン濃度は、本発明の融合タンパク質に含まれるマーカータンパク質が示す強度（例えば、蛍光タンパク質の場合は蛍光強度）を検出することにより、測定することができる。マーカータンパク質が示す強度と、カルシウムイオン濃度との関係は、事前に検量線を作製して決定し、得られている検量線に基づいてマーカータンパク質が示す強度からカルシウムイオン濃度を推定してもよい。
【００４１】
上記（ｂ−１）において、被験物質は、抗トリパノソーマ薬（例えば、抗トリパノソーマ・クルージ薬）の候補である。被験物質は、トリパノソーマ・クルージの細胞膜に対して透過性であっても、非透過性であってもよい。
【００４２】
上記（ｃ−１）において、（ａ−１）で測定したカルシウムイオン濃度と比較して、接触によって前記トリパノソーマ・クルージ内のカルシウムイオン濃度を規定値以下に減少させた物質が、抗トリパノソーマ薬（例えば、抗トリパノソーマ・クルージ薬）としてスクリーニングされる。ここで、規定値は、３００ｎＭ以下、２９０ｎＭ以下、２８０ｎＭ以下、２７０ｎＭ以下、２６０ｎＭ以下、２５０ｎＭ以下、２４０ｎＭ以下、２３０ｎＭ以下、２２０ｎＭ以下、２１０ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、または１５０ｎＭ以下の濃度であり、好ましくは、１００ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲である。
【００４３】
上記（ａ−０）において、上記哺乳動物細胞は、第２の本発明の融合タンパク質を細胞内に有する場合には、哺乳動物細胞のカルシウムイオン濃度よりも、トリパノソーマ・クルージ内のカルシウムイオン濃度を選択的に低下させる物質を、上記（ｃ−１）において選択することができる。このようにすることで、哺乳動物細胞に対する副作用が低減された抗トリパノソーマ薬（例えば、抗トリパノソーマ・クルージ薬）をスクリーニングできる期待が高まる。
【００４４】
以下、実施例により本発明を説明するが、下記実施例は本発明を限定するために用いられることが意図されているものではなく、本発明を理解するために例示されたものである。そして、本発明は、特許請求の範囲に記載された事項に基づいて規定されるものである。
【実施例】
【００４５】
実施例１：トリパノソーマの生活環と細胞内カルシウムイオン濃度との関係
本実施例では、カルシウムインジケーターであるR-GECO1を強制発現させたT. Cruziを作製し、T. Cruziの生活環と細胞内カルシウムイオン濃度との関係を調べた。【００４６】
（１）R-GECO1遺伝子の発現ベクターの作製
R-GECO1遺伝子は、pCMV-R-GECO1プラスミドベクター（Addgene, plasmid 45494）を鋳型としてＰＣＲにより増幅して得た。この際には、プライマーとして、
フォワードプライマー：5’-CACCATGGTCGACCTTCACGTCGTA-3’  配列番号７
リバースプライマー  ：5’-CTACTTCGCTGTCATCATTTGTAC-3’   配列番号８
をそれぞれ用いた。ここで、フォワードプライマーの下線で示されるCACC配列は、後述するベクターにクローニングするために必要となる配列である。【００４７】
PCR増副産物をpENTR/D-TOPO (Life Technologies, Rockville, MD)ベクターにクローニングした。得られたプラスミドをネオマイシン耐性遺伝子を含むpTREXベクターに変換し、Gateway Vector Conversion System (pTREX(neoR)-GW; Life Technologies)で改変してpTREX (neoR)-GW/R-GECO1を得た。このベクターは、リボソームプロモーターでタンパク質発現を駆動するT. cruzi pTREXベクターにクローニングされ（Vazquez, M. P. & Levin, M. J., Gene, 239, 217-225, 1999参照）、タンパク質の恒常的発現を可能とする。【００４８】
次に、ピューロマイシン耐性遺伝子を、pBApo-CMV Pur DNAプラスミドベクター(Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA)を鋳型として、以下プライマー：
フォワードプライマー：5’-ATGACCGAGTACAAGCCCAC-3’  配列番号９
リバースプライマー  ：5’-TCAGGCACCGGGCTTGC-3’     配列番号１０
を用いたPCRにより増幅した。pTREX (neoR)-GW/R-GECO1のネオマイシン耐性遺伝子を得られたピューロマイシン耐性遺伝子と置き換えるため、pTREX (neoR)-GW/R-GECO1を鋳型とし、以下プライマー：
フォワードプライマー：5’-GGGGATCGATCCGGAACAA-3’   配列番号１１
リバースプライマー  ：5’-ATTGGCTGCAGGGTCGCT-3’    配列番号１２
を用いたPCRを行った。得られた増副産物とピューロマイシン耐性遺伝子の増副産物とをライゲーションして、pTREX (purR)-GW/R-GECO1を得た。【００４９】
（２）トリパノソーマ・クルージの培養
T. CruziのTulahuen株のエピマスティゴートは、Iizumi, K. et al., Biochim. Biophys. Acta. 1758, 738-46, 2006に記載の通りに培養した。マンマリアンステージは、HeLa細胞または3T3-Swissアルビノ細胞(Health Science Research Resources Bank, Tokyo, Japan)で維持し、トリポマスティゴートは、感染した3T3-Swissアルビノ細胞のサブカルチャーを遠心分離して回収した（Nakajima-Shimada, J., Antimicrob Agents Chemother. 40, 2455-2458, 1996）。メタサイクロジェネシス（metacyclogenesis）は、Hashimoto, M. et al., Trypanosoma cruzi, Mol Microbiol. 87, 1133-1350, 2013に記載された通りに行った。
T. CruziのTcIP3Rのシングルノックアウト(SKO)株は、Hashimoto, M. et al., Trypanosoma cruzi, Mol Microbiol. 87, 1133-1350, 2013に記載されたものである。【００５０】
（３）R-GECO1のT. Cruziでの発現
１×１０７個体のエピマスティゴートをAmaxa Basic（商標） Parasite Nucleofector Kit 2 solution (Lonza, Germany)で懸濁した。個体（野生型またはTcIP3RのSKO）をpTREX (neoR)/R-GECO1またはpTREX (purR)/R-GECO1とそれぞれ混合し、エレクトロポレーションした。安定形質転換体（野生型）は、0.5 mg/mLのG418を含むLIT培地で３０日間細胞を培養して選択した。安定形質転換体（TcIP3RのSKO）は、0.25 mg/mLのG418と3 μg/mLのピューロマイシンを含むLIT培地で３０日間細胞を培養して選択した。R-GECO1を安定発現するアマスティゴートおよびトリポマスティゴートは、R-GECO1を安定発現するエピマスティゴートから上述の通り転換して得た。【００５１】
（４）蛍光顕微鏡下での細胞内カルシウムイオン濃度[Ca2+]iの検出
T. cruziのカルシウムイオン濃度のイメージングでは、蛍光顕微鏡(Axio Imager M2; Carl Zeiss Co. Ltd., Oberkochen, Germany)またはレーザー共焦点顕微鏡(Nikon A1R, Nikon Co. Ltd., Tokyo, Japan)を用いた。通常の培養培地中で蛍光イメージを取得した後に、各個体においてR-GECO1の最大蛍光シグナル（Fmax）を決定するために個体をカルシウム溶液（10 mM Ca2+および0.26 mMイオノマイシン）で処理した。これにより、細胞質Ca2+濃度が上昇し、R-GECO1をCa2+で飽和させることができる。蛍光強度をCa2+濃度に変換するために、以下式を用いた：
[Ca2+]in = Kdn × (F - FMIN)/(FMAX - F)
｛ここで、KdはR-GECO1の解離定数（482nM）であり、nはR-GECO1のヒル係数（2.0）であり、Fは各個体の蛍光強度であり、FMAXは各個体におけるR-GECO1の最大蛍光強度であり、FMINはZhaoらにより得られた変換比を用いて計算されたR-GECO1の最小強度（=FMAX/16）である。｝。
BAPTAは、細胞膜非透過性であり、細胞外Ca2+濃度を低下させるCa2+キレート剤であり、Ｏ，Ｏ’−ビス（2−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸塩、テトラアセトキシメチルエステル(BAPTA-AM)は、細胞膜透過性であり、細胞内Ca2+濃度[Ca2+]iを低下させるCa2+キレート剤であり、これらは、Dojindo Molecular Technologies, Inc. (Kumamoto, Japan)から購入した。また、IP3R阻害剤である２−アミノエトキシジフェニルボラート（2-APB）は、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)から購入した。
統計解析は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）またはスチューデントのt検定（Student’s t-test）を用いたSigma Plot ver. 12 software (Systat Software, Inc., San Jose, CA)により行った。【００５２】
実験と結果
まず、T. Cruziの生活環において細胞内カルシウムイオン濃度[Ca2+]i変化を検出できるかどうかを確認した。上述のように調製したR-GECO1を発現するT. Cruziを100μMのBAPTA-AMの存在下及び非存在下で観察した。T. Cruziの培地をPBSに置き換え、最終濃度100μMのBAPTA-AMを添加し、3分後にR-GECO1の蛍光強度から[Ca2+]iを算出した。結果は、図１Ａに示される通りであった。【００５３】
図１Ａに示されるように、R-GECO1の蛍光強度変化から、BAPTA-AMの添加による[Ca2+]iの濃度変化を確認することができた。このことは、BAPTA-AMがT. Cruziの細胞内カルシウムイオン濃度を低下させることができる。処理後のT. Cruziは死滅していることも確認された。
次に、個体毎のばらつきを排除するためT. cruziをクローニングして、以降の実験を行った。【００５４】
T. cruziはエピマスティゴート、トリポマスティゴート、およびアマスティゴートの形態を取る。それぞれの形態において[Ca2+]iがどのように変動するかを確認した。結果は図１Ｂに示される通りであった。【００５５】
図１Ｂに示されるように、いずれの形態においても、T. cruziの細胞質においてR-GECO1の蛍光シグナルを観察することができたが、蛍光強度が形態によって大きく異なっていた。そこで、エピマスティゴート（Ｅ）、トリポマスティゴート（Ｔ）、およびアマスティゴート（Ａ）について、R-GECO1の蛍光シグナル強度から[Ca2+]iを算出した。
すると図１Ｃに示されるとように、[Ca2+]iは、アマスティゴート（579 ± 204 nM）とエピマスティゴート（327 ± 44 nM）において高く、トリポマスティゴート（85 ± 39 nM）では低かった。この結果は、[Ca2+]iがT. cruziの生活環の進行によって顕著に変動することを意味する。
その後、10mMカルシウムと260μMイオノマイシンを添加したところ、T. cruziの細胞質におけるR-GECO1の蛍光シグナルは同等になった（図１Ｂ）。
なお、カルシウム振動はいずれの形態においても観察されなかった。【００５６】
実施例２：宿主細胞に寄生したトリパノソーマの[Ca2+]iの変化
本実施例では、宿主細胞に感染したT. cruziの[Ca2+]i変化を調べた。
3T3-Swiss細胞にR-GECO1発現トリポマスティゴートを感染させ、ある一つのT. cruzi（アマスティゴート）の成長を蛍光顕微鏡下で観察した。結果は図２Ａに示される通りであった。【００５７】
図２Ａに示されるように、T. cruziが３回分裂して８つになるところを観察することができた。また、図２Ａに示されるように、[Ca2+]iは分裂を通して変化しなかった。【００５８】
アマスティゴートは細胞内で数回分裂するとトリポマスティゴートに転換し、細胞を溶解させる。宿主細胞に寄生したトリポマスティゴートにおける[Ca2+]iが減少するのかを確認した。結果は、図２Ｂに示される通りであった。【００５９】
図２Ｂに示されるように、宿主細胞においてもトリポマスティゴート（右パネルの矢尻）中でR-GECO1の蛍光シグナルを観察することができた。ここから[Ca2+]iを算出したところ、アマスティゴート（右パネルの矢印）の[Ca2+]iと比較して顕著に低かった。
これらの結果から、アマスティゴートは、宿主細胞の細胞質などの低カルシウムイオン濃度環境においても[Ca2+]iを維持することができることが分かった。また、トリポマスティゴートにおける[Ca2+]iは、アマスティゴートの[Ca2+]iよりも顕著に低かった。【００６０】
実施例３：TcIP3Rと[Ca2+]iとの関係
Hashimoto, M. et al., Mol. Microbiol., 87, 1133-1150, 2013においてT. cruziの生活環においてT. cruziのIP3Rホモログ（TcIP3R）のmRNA発現が大きく変動することが見出されている。そこで、本実施例では、TcIP3RのmRNA発現と[Ca2+]iとの関係を調べた。【００６１】
図３Ａに示されるように、各形態（Ｔ、ＥまたはＡ）におけるとTcIP3RのmRNA発現量と[Ca2+]iとには正の線型的な相関（R2=0.66）があることが明らかとなった。この結果は、TcIP3RがT. cruziの[Ca2+]iの制御に関与していることを示唆する結果であった。【００６２】
そこで、Hashimoto, M. et al., Mol. Microbiol., 87, 1133-1150, 2013により作製された、ゲノム上に３つ存在するTcIP3Rの単一ノックアウト（ＳＫＯ）株を用意した。このＳＫＯ株においては、サザンブロット解析により単一のTcIP3Rの発現が特異的に破壊されていることと、ＳＫＯにおいてはTcIP3Rの発現が約35%低下していることが明らかとなっている。また、ＳＫＯは、エピマスティゴートの成長の抑制などのいくつかの表現型を示す。
ネオマイシン耐性遺伝子を有するＳＫＯにpTREX(purR)をトランスフェクションし、ピューロマイシンとG418とでR-GECO1発現ＳＫＯを選択した。また、野生型Tulahuen株にpTREX(purR)をトランスフェクションし、ピューロマイシンで選択した、R-GECO1発現野生株も用意した。R-GECO1の蛍光シグナル強度をランダムにピックアップした複数の個体において測定した。その結果は、図３Ｂに示される通りであった。【００６３】
図３Ｂに示されるように、ＳＫＯ株の蛍光強度は、野生株の蛍光強度よりも有意に低かった。また、ＳＫＯにおけるTcIP3Rの発現は、野生株の約65%であり、ＳＫＯ株における蛍光シグナル強度は、野生株の約50%であった。【００６４】
次に、[Ca2+]iの維持にカルシウムイオンの流入や排出が影響するのかを確認した。具体的には、細胞外培地に過剰量の塩化カルシウムまたは細胞膜非透過性カルシウムキレート剤であるBAPTAを添加した。２時間後、上記処理を行ったT. cruziの[Ca2+]iを非処理のT. cruziの[Ca2+]iと比較した。結果は、図３Ｃに示される通りであった。【００６５】
図３Ｃに示されるように、[Ca2+]iは、過剰量の塩化カルシウムまたはBAPTAの添加によって影響を受けなかった。BAPTAの添加によって培地中のカルシウムイオンがキレートされると、[Ca2+]iはPMCAの機能によって低下し得ると考えていたが、[Ca2+]iはBAPTA処理によっても低下しなかった。この結果は、T. cruziが構成的なカルシウムイオンの流入や排出をしていないことを示唆する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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