(57)【要約】  細胞分泌型アミロスフェロイド様構造体及びそれを用いた医薬及びワクチン並びにそれらの製法の提供。  一態様において、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）又はアミロイドβタンパク質（Ａβ）配列を含むその一部を発現する細胞を培養液中で培養し、該培養液中に細胞分泌型アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）様構造体を得る工程を含む製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分泌型アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）様構造体の製造方法であって、
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）又はアミロイドβタンパク質（Ａβ）配列を含むその一部を発現する細胞を培養液中で培養し、該培養液中に細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を得る工程を含む、製造方法。
【請求項２】
さらに、前記培養液中から細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を回収することを含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記細胞が、ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部の発現系が導入された細胞である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ＡＰＰは、野生型、又は、１若しくは複数のアミノ酸変異を有する前記野生型の変異体である、請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記ＡＰＰは、Ａβアミノ酸配列のＧＸＸＸＧモチーフにおけるグリシンにアミノ酸変異を有する変異体のＡＰＰである、請求項１から４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に得られる構造体であって、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対して抗原性を示す、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を有効成分とする医薬組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を含むワクチン。
【請求項９】
請求項６に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体、及び、抗ＡＳＰＤ抗体を含むキット。
【請求項１０】
請求項６に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の能動ワクチンとしての使用。
【請求項１１】
ワクチン製造における請求項６に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の使用。
【請求項１２】
請求項６に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の、ＡＳＰＤ測定における標準物質としての使用。
【請求項１３】
ＡＳＰＤが起因となる疾病の予防、改善、及び／又は治療の方法であって、請求項６に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体、請求項７に記載の医薬組成物、又は、請求項８に記載のワクチンを対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
ＡＳＰＤが起因となる疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である
、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＳＰＤ、ＡＳＰＤに起因する疾病、又は、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型
認知症に対する免疫を対象に獲得させる方法であって、請求項６に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体、請求項７に記載の医薬組成物、又は、請求項８に記載のワクチンを対象に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
請求項６に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体と、薬学的に許容される腑形剤とを組み合わせることを含む、医薬組成物又はワクチンの製造方法。
【請求項１７】
請求項６に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体と、抗ＡＳＰＤ抗体とを組み合わせることを含む、キットの製造方法。
【請求項１８】
ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を有する、非ヒト動物。
【請求項１９】
ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に形成される構造体であって、ＡＳＰＤ特異的抗体に対して抗原性を示す構造体の形成効率を指標とすることを含む、ＡＳＰＤの形成に影響を与える物質のスクリーニング方法。
【請求項２０】
ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に分泌される、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、Ａβ４３及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つを指標とする、ＡβのＣ末端切断に影響を与える物質のスクリーニング方法。
【請求項２１】
Ａβの２５〜３７番目のアミノ酸配列におけるＧＸＸＸＧモチーフのグリシンに１又は複数の置換変異を有する変異型Ａβを含む液体を撹拌することで形成される合成ＡＳＰＤ様構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）様構造体、その製造方法及びその使用、医薬組成物、その製造方法及びその使用、並びに、スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロスフェロイド（amylospheroids（ＡＳＰＤ））は、アミロイドβタンパク質（Ａβ）が約３０個集まった直径約１０ｎｍの球状のＡβ集合体であって、アルツハイマー病が発症する不可逆的段階において重要な役割を果たすと考えられる構造体である。【０００３】
ＡＳＰＤは、強い神経毒性を示すin vitroで合成されたＡβ集合体（すなわち、合成ＡＳＰＤ）として単離された（非特許文献１）。この合成ＡＳＰＤに対する特異的な抗体が作製され（特許文献１及び２）、この抗体を用い、アルツハイマー病のヒト患者の脳から、実際に、生体内で形成されたＡＳＰＤ（すなわち、ネイティブＡＳＰＤ）が単離された（非特許文献１）。【０００４】
ネイティブＡＳＰＤ及び合成ＡＳＰＤは、同様に、成熟神経細胞に対して選択的に細胞死を誘発する。この神経細胞死におけるＡＳＰＤのターゲットが、神経の生存と機能に極めて重要な役割を果たしているシナプスタンパク質「Ｎａ+，Ｋ+−ＡＴＰａｓｅポンプのα３サブユニット（以下、ＮＡＫα３）」であることが発見され、ＡＳＰＤの結合によりＮＡＫα３の機能が低下し、神経細胞が過剰に興奮することで神経細胞が死に至ることが明らかにされた（特許文献３、非特許文献２）。【０００５】
アルツハイマー病における臨床症状と最も相関するのが神経細胞の脱落である。神経細胞脱落が認められるアルツハイマー病患者の大脳皮質におけるネイティブＡＳＰＤ量は、アルツハイマー病の重症度に相関して増加し、そして、神経細胞脱落があまり認められないアルツハイマー病患者の小脳におけるネイティブＡＳＰＤ量は微量しか存在しないことが明らかとなった（非特許文献３）。したがってアミロスフェロイドは、アルツハイマー病が発症する不可逆的段階において重要な役割を果たすと考えられる。さらに、ネイティブＡＳＰＤは、レビー小体型認知症患者の脳からも検出されており（非特許文献３）、レビー小体型認知症においてもＡＳＰＤはその発症において重要な役割を果たすと考えられる。【０００６】
ネイティブＡＳＰＤと等価であると考えられる合成ＡＳＰＤは、Ａβを含む液体をゆっくり撹拌することにより製造されうる（非特許文献１、特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０１６６４４
【特許文献２】ＷＯ２００９／０５７６６４
【特許文献３】ＷＯ２０１３／０９９８０６
【特許文献４】ＷＯ２０１３／０９４６１４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hoshi et al., Spherical aggregates of β-amyloid (amylospheroid) show high neurotoxicity and activate tau protein kinase I/glycogen synthase kinase-3β, PNAS May 27, 2003 vol. 100 no. 11 6370-6375
【非特許文献２】Ohinishi et al., Na, K-ATPase α3 is a death target of Alzheimer patient amyloid-β assembly, PNAS August 11, 2015 vol. 112 no. 32 E4465-E4474
【非特許文献３】Noguchi et al., Isolation and characterization of patient-derived, toxic, high mass amyloid beta-protein (Abeta) assembly from Alzheimer disease brains, J Biol Chem. 2009 Nov 20;284(47):32895-905
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のとおり、アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）はアルツハイマー病やレビー小体型認知症において重要な役割を果たす。現時点では、ネイティブＡＳＰＤを患者脳から精製して治療薬などの開発に使うことは非常に困難である。よって、患者脳に存在するネイティブＡＳＰＤと等価若しくは部分的に等価なＡＳＰＤ様構造体が製造し易くなれば、アルツハイマー病やレビー小体型認知症の研究、並びに、これらの疾病に対する予防方法及び予防薬、及び、治療方法及び予防・治療薬の開発に大きく寄与するものと考えられる。【００１０】
アミロイドβタンパク質（Ａβ）を含む液体をゆっくり撹拌することで、ネイティブＡＳＰＤとほぼ等価である合成ＡＳＰＤをin vitroで製造できる（非特許文献１及び特許文献４）。そして、合成ＡＳＰＤは、アジュバントなしでウサギに免疫を誘導できること、老齢サルで一定のワクチン効果があり安全であることが見出された。一方で、合成ＡＳＰＤは、製造ロットごとにＡＳＰＤ量がある程度上下すること、製造されたＡＳＰＤの長期保管が難しいこと、製造量のスケールアップが困難であること等の問題も見出された。【００１１】
そこで、本開示は、一態様において、ＡＳＰＤ様構造体及びその製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示は、一態様において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の製造方法であって、ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する細胞を培養液中で培養し、該培養液中に細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を得る工程を含む製造方法に関する。【００１３】
本開示は、その他の態様において、ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に得られる構造体であって、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対して抗原性を示す、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体に関する。【００１４】
本開示は、その他の態様において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を有効成分とする医薬組成物する。
本開示は、その他の態様において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を含むワクチンに関する。
本開示は、その他の態様において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の能動ワクチンとしての使用に関する。
本開示は、その他の態様において、ワクチン製造における細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の使用に関する。
本開示は、その他の態様において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の、ＡＳＰＤ測定における標準物質としての使用に関する。【００１５】
本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤが起因となる疾病の予防、改善、及び／又は治療の方法であって、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体、前記医薬組成物、又は、前記ワクチンを対象に投与することを含む方法に関する。
本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤ、ＡＳＰＤに起因する疾病、又は、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症に対する免疫を対象に獲得させる方法であって、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体、前記医薬組成物、又は、前記ワクチンを対象に投与することを含む方法に関する。
本開示は、その他の態様において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体と、薬学的に許容される腑形剤とを組み合わせることを含む、医薬組成物又はワクチンの製造方法に関する。【００１６】
本開示は、その他の態様において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体、及び、抗ＡＳＰＤ抗体を含むキットに関する。
本開示は、その他の態様において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体と、抗ＡＳＰＤ抗体とを組み合わせることを含む、キットの製造方法に関する。
本開示は、その他の態様において、ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を有する非ヒト動物に関する。【００１７】
本開示は、その他の態様において、ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に形成される、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対して抗原性を示す構造体の形成効率を指標とすることを含む、ＡＳＰＤの形成に影響を与える物質のスクリーニング方法に関する。
本開示は、ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に分泌される、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、Ａβ４３及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つを指標とする、ＡβのＣ末端切断に影響を与える物質のスクリーニング方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、発現させたＡＰＰのバリアント及びそれらの変異体の変異箇所を説明する概略図である。
【図２】図２は、試験例１〜１４のＡＰＰの発現系で過剰発現させた細胞の培養液中のＡＳＰＤ濃度の測定結果を示すグラフである。
【図３】図３は、試験例１〜１４のＡＰＰの発現系で過剰発現させた細胞の培養液中のＡβ１−４０濃度の測定結果を示すグラフである。
【図４】図４は、試験例１〜１４のＡＰＰの発現系で過剰発現させた細胞の培養液中のＡβ１−４２濃度の測定結果を示すグラフである。
【図５】図５は、ｈＡＰＰ６９５ｓｗ−Ｇ３３Ｘを過剰発現させた細胞の培養液中のＡＳＰＤ濃度の測定結果を示すグラフである。
【図６】図６は、ｈＡＰＰ６９５ｓｗ−Ｇ３３Ｘを過剰発現させた細胞の培養液中のＡβ１−４０濃度の測定結果を示すグラフである。
【図７】図７は、ｈＡＰＰ６９５ｓｗ−Ｇ３３Ｘを過剰発現させた細胞の培養液中のＡβ１−４２濃度の測定結果を示すグラフである。
【図８】図８は、合成ＡＳＰＤの免疫原性を評価した結果の一例を示すグラフである。
【図９】図９は、合成ＡＳＰＤ（野生型）及び合成ＡＳＰＤ（Ｇ３３Ｌ型）の神経細胞毒性を確認した結果の一例を示すグラフである。
【図１０】図１０は、試験例１５〜３６のＡＰＰの発現系で過剰発現させた細胞の培養液中のＡＳＰＤ濃度の測定結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、試験例１５〜３６のＡＰＰの発現系で過剰発現させた細胞の培養液中のＡβ１−４０濃度の測定結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、試験例１５〜３６のＡＰＰの発現系で過剰発現させた細胞の培養液中のＡβ１−４２濃度の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、一又は複数の実施形態において、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を発現する細胞を培養した培養液中にＡＳＰＤ様構造体の存在が確認されたことに基づく。
本開示は、一又は複数の実施形態において、簡便でスケールアップ可能な、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の提供に関する。
本開示における細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、一又は複数の実施形態において、保存安定性に優れる。
本開示における細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、一又は複数の実施形態において、Ａβモノマーの含有率を極めて低く製造することもできるため、限外ろ過によるＡβモノマーの除去が簡単となり、ワクチン等の製造効率の向上が可能となる。
また、本開示における細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、一又は複数の実施形態において、Ａβモノマーの含有率を低減できるから、生体に投与した場合の安全性を、例えば、ネイティブＡＳＰＤや合成ＡＳＰＤよりも、向上しうる。
【００２０】
［アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）様構造体］
本開示において、ＡＳＰＤ様構造体とは、ＡＳＰＤに特異的な抗体が抗原抗体反応する構造体、言い換えれば、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対して抗原性を示す構造体をいう。
なお、本開示において、単にアミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）という場合には、ネイティブＡＳＰＤ及び合成ＡＳＰＤを含みうる。
【００２１】
ＡＳＰＤに特異的な抗体としては、一又は複数の実施形態において、ＷＯ２００６／０１６６４４及びＷＯ２００９／０５７６６４に開示されるポリクローナル抗ＡＳＰＤ抗体及びモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体が挙げられ、さらなる一又は複数の実施形態において、ウサギポリクローナル抗ＡＳＰＤ抗体（ｒｐＡＳＤ１、ｒｐＡＳＤ２及びｒｐＡＳＤ３）、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体（ＭＡＳＤ１、ＭＡＳＤ２及びＭＡＳＤ３）、ハムスターモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体（ｈａＡＳＤ１、ｈａＡＳＤ２、ｈａＡＳＤ３、ｈａＡＳＤ４及びｈａＡＳＤ５）、並びに、ヒト化モノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体（ｈｕＡＳＤ２）等が挙げられる。
【００２２】
［細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体］
本開示において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、本開示にかかる製造方法によって製造されるＡＳＰＤ様構造体をいう。一又は複数の実施形態において、ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部の発現系が導入された細胞の培養液中に見出されたＡＳＰＤ様構造体をいう。本開示に係る細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する細胞の培養液中に得られるものであるから、細胞分泌型であるといえる。
【００２３】
したがって、本開示は一態様において、ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に得られる構造体であって、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対して抗原性を示す、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体に関する。
【００２４】
本開示に係る細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤと等価なものであってもよく、その他の一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤと部分的に等価なものであってもよい。部分的に等価とは、少なくとも、ＡＳＰＤに特異的な抗体が抗原抗体反応する構造体、言い換えれば、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対して抗原性を示す構造体であることをいう。
【００２５】
本開示に係る細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、一又は複数の実施形態において、Ａβ集合体である。本開示において、単にＡβというときは、Ａβ４０（Ａβ１−４０）、Ａβ４１（Ａβ１−４１）、Ａβ４２（Ａβ１−４２）、Ａβ４３（Ａβ１−４３）、又はこれらの全部若しくは一部を指し得る。
【００２６】
本開示に係る細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤと同様の分子量であってもよく、その他の一又は複数の実施形態において、１００ｋＤａ以上、又は、１００〜７００ｋＤａである。
【００２７】
本開示に係る細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、ＡＳＰＤ様構造体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの細胞毒性、すなわち、機能的に成熟した神経細胞に選択的に細胞死を誘発する特性が、ＡＳＰＤと同等であってもよく、或いは、ＡＳＰＤよりも弱毒性であってもよく、或いは、細胞毒性を有していなくてもよく、或いは、ＡＳＰＤと比べて毒性が高くてもよい。
【００２８】
本開示に係る細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤと同様な形状であってもよく、異なる形状であってもよい。本開示に係る細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、さらなる一又は複数の実施形態において、電子顕微鏡観察において直径１０〜１５ｎｍの球状であってもよく、該形状とは異なる形状であってもよい。
【００２９】
［細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の製造方法］
本開示に係る細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、一又は複数の実施形態において、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）又はアミロイドβタンパク質（Ａβ）配列を含むその一部を発現する細胞を培養液中で培養することで、その培養液中に得ることができる。
したがって、本開示は一態様において、ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する細胞を培養液中で培養し、該培養液中に細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を得る工程を含む、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の製造方法に関する。以下、前記製造方法を単に「本開示に係る製造方法」ともいう。
【００３０】
本開示に係る製造方法において、培養される細胞内で発現するＡＰＰは、一又は複数の実施形態において、ヒトＡＰＰであってもよく、ヒト以外の動物のＡＰＰであってもよい。ヒトＡＰＰは、ｈＡＰＰ７７０、ｈＡＰＰ７５１、及びｈＡＰＰ６９５のいずれのスプライシングバリアントであってもよい。ＡＰＰ及びＡβの配列は公知のデータベースからえることができる。例えば、ｈＡＰＰ７７０のＮＣＢＩのアクセッション番号は、ＮＰ＿０００４７５（VERSION NP_000475.1 GI:4502167）である。スプライシングバリアントの配列は例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０５０６７（Modified: November 1, 1991 -v3）を参照できる。
【００３１】
また、本開示に係る製造方法の一又は複数の実施形態において、培養する細胞内で発現させるＡＰＰは、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の形成量を向上させる点から、前記細胞に導入されたＡＰＰの発現系から発現させることが好ましく、かつ／あるいは、前記細胞における過剰発現であることが好ましい。本開示に係る製造方法の一又は複数の実施形態において、培養する細胞内で発現させるＡＰＰは、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の形成量を向上させる点から、ＡＰＰのシグナル配列を有することが好ましい。
【００３２】
本開示に係る製造方法の一又は複数の実施形態において、培養する細胞内で発現させるＡＰＰは、野生型であってもよく、あるいは、変異型のＡＰＰであってもよい。変異型ＡＰＰとしては、家族性アルツハイマー病に連鎖する変異が挙げられ、例えば、Ｓｗｅｄｉｓｈ変異、Ｉｔａｌｉａｎ変異、Ｌｅｕｖｅｎ変異、Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ変異、Ｌｏｎｄｏｎ変異、Ｉｒａｎｉａｎ変異、Ａｕｓｔｒｉａｎ変異、Ｇｅｒｍａｎ変異、Ｆｒｅｎｃｈ変異、Ｆｌｏｒｉｄａ変異、Ｉｂｅｒｉａｎ変異、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ変異、Ｂｅｌｇｉａｎ変異、Ｆｌｅｍｉｓｈ変異、Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ変異、Ｂｒｉｔｉｓｈ変異、Ｔｏｔｔｏｒｉ変異、Ｉｔａｌｉａｎ変異、Ａｒｃｔｉｃ変異、Ｏｓａｋａ変異、Ｉｏｗａ変異、Ｄｕｔｃｈ変異などが挙げられる。これらのなかでも、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の形成量を向上させる点からはＳｗｅｄｉｓｈ変異を含むことが好ましい。
【００３３】
さらに、本開示に係る製造方法の一又は複数の実施形態において、培養する細胞内で発現させるＡＰＰは、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の形成効率を向上させる点から、Ａβの２５〜３７番目のアミノ酸配列におけるＧＸＸＸＧモチーフのグリシンに１又は複数の置換変異を有することが好ましい。すなわち、Ａβの２５番目、２９番目、３３番目、及び３７番目に相当するグリシンからなる群から選択される１又は複数のグリシンの置換変異を有することが好ましく、少なくとも３３番目のグリシンの置換変異を有することが好ましい。置換変異としては、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の形成効率を向上する点、及び、培養液中のＡβ量を低減する点から、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、メチオニン、チロシン、又はシステインへの置換変異が好ましい。本開示において、１又は複数とは、１、２、３若しくは４、又は、１、２若しくは３、又は、１若しくは２である。
その他の一又は複数の実施形態において、培養する細胞内で発現させるＡＰＰは、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の形成効率を向上させる点から、Ａβの３３番目及び３７番目のグリシンの置換変異を有することが好ましい。本実施形態において、置換変異としては、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の形成効率を向上する点、及び、培養液中のＡβ量を低減する点から、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、メチオニン、チロシン、又はシステインへの置換変異が好ましく、３３番目及び３７番目の少なくとも一方が、イソロイシンへの置換変異であることがより好ましい。
【００３４】
本開示に係る製造方法の一又は複数の実施形態において、培養する細胞内で発現されるＡＰＰは、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の形成効率を向上させる点から、Ｓｗｅｄｉｓｈ変異並びにＡβの２５番目、２９番目、３３番目、及び３７番目に相当するグリシンからなる群から選択される１又は複数のグリシンの置換変異を有するものが挙げられる。その他の一又は複数の実施形態において、本開示におけるＡＰＰは、ｈＡＰＰ７７０又はｈＡＰＰ６９５においてＳｗｅｄｉｓｈ変異並びにＡβの２５番目、２９番目、３３番目、及び３７番目に相当するグリシンからなる群から選択される１又は複数のグリシンの置換変異を有するものが挙げられる。さらにその他の一又は複数の実施形態において、本開示におけるＡＰＰは、ｈＡＰＰ７７０又はｈＡＰＰ６９５においてＳｗｅｄｉｓｈ変異並びにＡβの３３番目に相当するグリシンの置換変異を有するものが挙げられる。さらにその他の一又は複数の実施形態において、本開示におけるＡＰＰは、ｈＡＰＰ７７０又はｈＡＰＰ６９５においてＳｗｅｄｉｓｈ変異並びにＡβの３３番目及び３７番目に相当するグリシンの置換変異（好ましくは少なくとも一方がイソロイシンへの置換変異）を有するものが挙げられる。本開示に係る製造方法の一又は複数の実施形態において、培養する細胞内で発現させるＡＰＰは、ＡＳＰＤ様構造体の形成を著しく妨げない範囲でその他の変異を有してもよい。その他の変異としては、修飾アミノ酸、非天然アミノ酸、Ｄ−アミノ酸等への変異を含みうる。修飾アミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、アミノ基修飾、カルボキシル基修飾、チオール基修飾、水酸基修飾、糖化修飾、PEG化修飾等が挙げられる。
【００３５】
本開示に係る製造方法の一又は複数の実施形態において、培養する細胞内で発現させるＡＰＰは、ＡＰＰの一部であってアミロイドβタンパク質（Ａβ）配列を含む部分ペプチドであってもよい（該部分ペプチドを、以下では単に「ＡＰＰの一部」ともいう）。ＡＳＰＤは、ＡＰＰから切り出されるＡβの集合体の一形態だからである。
本開示に係る製造方法の一又は複数の実施形態において、培養する細胞内で発現させるＡＰＰの一部は、Ｎ末端が切断された形態であってもよく、さらなる一又は複数の実施形態において、Ｎ末端がβシクレターゼの切断部位で切断された形態であってもよい。
本開示に係る製造方法の一又は複数の実施形態において、培養する細胞内で発現させるＡＰＰの一部は、Ａβの１〜４３番目、１〜４２番目又は１〜４０番目を含む部分であることが挙げられ、さらなる一又は複数の実施形態において、Ａβの１〜４３番目、１〜４２番目又は１〜４０番目を含む部分、及び、ＡＰＰのシグナル配列を有することが挙げられる。
【００３６】
培養する細胞内におけるＡＰＰ又はその一部の発現は、ＡＰＰ又はその一部を発現可能な発現系を導入した細胞で行うことができる。ＡＰＰ又はその一部の発現は、一過性発現系によるものでもよく、安定発現細胞株によるものであってもよい。ＡＰＰ又はその一部の発現は、ＡＳＰＤ様構造体の形成を妨げない範囲で、高発現又は過剰発現であることがＡＳＰＤ様構造体の形成量向上の点から好ましい。ＡＰＰ又はその一部の発現系は、制御可能なものであってもよい。
【００３７】
ＡＰＰ又はその一部を発現可能な発現系は、一又は複数の実施形態において、ＡＰＰ又はその一部をコードする配列に、導入する宿主細胞に応じた発現調節配列が作動的に連結されている核酸を有する発現カセットが挙げられる。発現調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター等が挙げられ、その他には、開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及び停止コドンなどが挙げられる。
【００３８】
ＡＰＰ又はその一部の発現系は、一又は複数の実施形態において、発現させたい細胞（宿主）に応じた発現ベクターを適宜選択して導入することができる。該発現ベクターは、一又は複数の実施形態において、上述の発現カセットを有するベクターが挙げられる。発現ベクターとしては、一又は複数の実施形態において、プラスミド、コスミド、ＹＡＣＳ、ウイルス（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、エピソームＥＢＶなど）ベクター及びファージベクターが挙げられる。
【００３９】
本開示に係る製造方法において培養する細胞は、ＡＰＰ又はその一部を発現する細胞である。本開示に係る製造方法において培養する細胞は、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の形成量向上の点から、ＡＰＰ又はその一部を発現可能な発現系が導入された細胞であることが好ましく、ＡＰＰ又はその一部を高発現若しくは過剰発現する又はすることが可能な細胞であることがより好ましい。本開示に係る製造方法のその他の実施形態において、ＡＰＰ又はその一部を発現する細胞は、遺伝子導入若しくはゲノム編集によりゲノムＡＰＰ遺伝子が過剰発現するようになった細胞であってもよい。
【００４０】
また、本開示に係る製造方法において培養される細胞は、一又は複数の実施形態において、Ａβを産生可能な細胞が好ましく、γシクレターゼとβシクレターゼの双方が発現している細胞であることがより好ましい。
【００４１】
ＡＰＰ又はその一部の発現系が導入される宿主細胞は、一又は複数の実施形態において、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、微生物等、及びそれらの細胞株が挙げられる。動物細胞としては、哺乳類細胞、ヒト細胞、ヒト以外の哺乳類細胞が挙げられる。
ＡＰＰ又はその一部の発現系が導入される宿主細胞は、一又は複数の実施形態において、取扱性の点から、細胞株が好ましい。限定されない具体的な細胞株としては、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞などが挙げられる。
【００４２】
本開示に係る製造方法におけるＡＰＰ又はその一部を発現する細胞の培養条件は、該細胞の種類、該細胞に導入されている発現系の種類、及び、その発現系の導入形態（一過性導入か安定導入か）などに応じて、当業者であれば、発現系に組み込まれたＡＰＰ又はその一部が発現（好ましくは過剰発現）するように、培地、温度、ＣＯ2濃度などを適宜設定できる。
【００４３】
一又は複数の実施形態において、一過性のＡＰＰ発現系を用いる場合の培養としては、増殖培地で培養・形質導入し、その後、無血清培地に交換して２４時間〜４８時間培養することが挙げられる。そして、前記培養の後に培地中に細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体が得られる。
【００４４】
細胞が動物細胞である場合、培地としては、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ'ｓ培地、およびこれらの混合培地などが挙げられる。これらの培地には、血清又は血清代替物が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、脂質、アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。
【００４５】
本開示に係る製造方法は、一又は複数の実施形態において、さらに、前記培養液中から細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を回収することを含む。
培養液中の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の回収は、一又は複数の実施形態において、孔径０．２２μｍフィルターのろ液を５０ｋＤａ又は１００ｋＤａの限外ろ過をした保持液を回収する工程により行うことができる。但し、ＡＳＰＤの回収方法はこの方法に限定されなくてもよい。
【００４６】
本開示に係る製造方法であれば、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の製造が容易になるため、一又は複数の実施形態において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体そのものを抗原とした能動ワクチン療法の開発や、能動ワクチンとして機能する医薬組成物の開発、神経細胞死阻止薬の開発が容易になる。
【００４７】
［ワクチン］
ＡＳＰＤを構成するＡβそのものを生体内に導入して免疫を付与する試みの結果、Ａβの配列の一部（１６〜３３番目の残基）がＴ細胞を活性化し炎症性反応を引き起こすことが報告された（Monsonego, A. et al. J. Clin. Invest. 112:415-422 (2003), Monsonego, A. et al. PNAS 103:5048-5053 (2006)）。したがって、Ａβそのものをワクチンとして用いることは難しい。
一方、ＡＳＰＤは、Ｔ細胞を活性化するＡβの配列（１６〜３３番目の残基）が球状構造の内部に折り畳まれてほぼ隠され（Ohnishi et al. PNAS 112:E4465-E4474 (2015)）、Ａβワクチンで問題となる炎症性Ｔ細胞応答を惹起しないというデータが得られている。
そして、合成ＡＳＰＤについては、アジュバントなしでウサギに免疫がつくこと、その免疫量は通常のペプチド抗原の１／５〜１／１０と少量で充分であることが見出された。さらに、ＡＳＰＤを用いて老齢カニクイザルの皮下投与で免疫すると、脳の糖代謝（神経活動）が高まることも見出された。
これらの知見から、ＡＳＰＤは、安全性が高い能動ワクチンとして使用できるといえる。そして、本開示にかかる細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体も、能動ワクチンとして使用でき、また、ワクチンの製造に使用できる。
したがって、本開示は、一態様において、ＡＳＰＤを有効成分とする医薬組成物に関し、或いは、ＡＳＰＤを含むワクチンに関する。
【００４８】
合成ＡＳＰＤを用いて、例えばワクチン等のような医薬組成物を製造しようとする場合、以下の問題点が見出された。すなわち、合成ＡＳＰＤの従来の製造法では、製造ロットごとにＡＳＰＤ量がある程度上下し、また、製造されたＡＳＰＤの長期保管が難しく、そして、製造量のスケールアップが困難であり、さらに、合成ＡＳＰＤを製造した後に残存するＡβの除去が必要であり、製造効率が下がる等の問題が見出された。
本開示に係る細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を用いたワクチン等の医薬組成物であれば、一又は複数の実施形態において、これらの問題の１つ若しくは一部又はそれ以上を解消しうる。
【００４９】
よって、本開示は、一態様において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を有効成分とする医薬組成物に関する。本開示に係る医薬組成物の一又は複数の実施形態として、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を含むワクチンが挙げられる。本開示に係る医薬組成物及びワクチンは、薬学的に許容される腑形剤及び／又はアジュバントを含んでもよい。
【００５０】
本開示に係る医薬組成物及びワクチンは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに起因する疾病の予防、改善、及び／又は治療のために使用されうる。本開示に係る医薬組成物及びワクチンは、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療のために使用されうる。
本開示に係る医薬組成物及びワクチンは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに起因する疾病を罹患するおそれのある対象、罹患したおそれのある対象、又は、罹患した対象に投与されうる。本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症を罹患するおそれのある対象、罹患したおそれのある対象、又は、罹患した対象に投与されうる。該対象としては、哺乳類、ヒト、ヒト以外の哺乳類が挙げられる。
【００５１】
本開示に係る医薬組成物及びワクチンをＡＳＰＤ、ＡＳＰＤに起因する疾病、又は、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症に対する免疫を対象に獲得させる一又は複数の実施形態について説明する。本開示に係る医薬組成物及びワクチンの投与法は、一又は複数の実施形態において、筋内、腹腔内、皮内若しくは皮下への注射、又は、口道、消化管、気道、尿生殖路への経粘膜投与が含まれうる。本開示に係る医薬組成物及びワクチンにおける細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の投与量としては、投与対象に著しい副作用を及ぼすことなく免疫防御応答を誘発する量が挙げられる。本開示に係る医薬組成物及びワクチンの投与量は、一又は複数の実施形態において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を０．０１μｇ〜１０ｍｇ、０．１〜１０００μｇ、１〜１００μｇ、５〜５０μｇ、又は５〜２５μｇの範囲で含むことになると量と見込まれる。初期投与に続いて、十分な間を置いて１回又は数回のブースター投与をしてもよい。
【００５２】
したがって、本開示は一態様において、ＡＳＰＤに起因する疾病（例えば、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症）の予防、改善、及び／又は治療の方法であって、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体又は本開示に係る医薬組成物若しくはワクチンを対象に投与することを含む方法に関する。
本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤ、ＡＳＰＤに起因する疾病、又は、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症に対する免疫を対象に獲得させる方法であって、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体又は本開示に係る医薬組成物若しくはワクチンを対象に投与することを含む方法に関する。
【００５３】
また、本開示は、一態様において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体と、腑形剤及び／又はアジュバントとを組合せることを含む、医薬組成物又はワクチンの製造方法に関する。
本開示は、その他の態様において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を有効成分とする医薬組成物、又は、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を有するワクチンの製造方法であって、本開示に係る製造方法により細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を製造する工程を含む製造方法に関する。
【００５４】
本開示は、その他の態様において、本開示に係る製造方法に用いるキットであって、ＡＰＰ又はその一部の発現系が導入された細胞株を含むキットに関する。本開示にかかるキットによれば、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の製造が容易になる。本開示にかかるキットには、さらに、培養容器、培地、及び説明書の少なくとも１つが含まれてもよい。本開示に係る製造方法に用いるキットは、一又は複数の実施形態において、ＡＰＰ又はその一部の発現系が導入された細胞株に替えて、ＡＰＰ又はその一部の発現系を有するベクターであってもよい。
【００５５】
［モデル動物］
本開示は、その他の態様において、ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を有する非ヒト動物に関する。前記細胞は、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を分泌するから、前記非ヒト動物は、ＡＳＰＤに起因する疾病、例えば、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症のモデル動物となり得る。前記細胞としては、該モデル動物とする観点から、脳の細胞が好ましく、或いは、神経細胞が好ましい。前記発現系の導入方法は、特に制限されないが、遺伝子導入技術を用いる方法、ゲノム編集技術を用いる方法などが挙げられる。非ヒト動物としては、ヒト以外の哺乳類、ヒト以外の霊長類が挙げられる。本態様の一又は複数の実施形態は、ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現するように遺伝子改変された細胞を有する遺伝子改変動物である。
本態様のモデル動物において、遺伝子改変された細胞内で発現されるＡＰＰは、例えば、本開示で開示されるような、ＡＰＰの変異体又はＡβの変異体であってもよい。すなわち、前記細胞で発現されるＡＰＰは、上述と同様に、Ａβの２５番目、２９番目、３３番目、及び３７番目に相当するグリシンからなる群から選択される１又は複数のグリシンの置換変異を有することが好ましく、少なくとも３３番目のグリシンの置換変異を有することが好ましい。置換変異としては、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、メチオニン、チロシン、又はシステインへの置換変異が好ましい。
その他の一又は複数の実施形態において、前記細胞で発現されるＡＰＰは、Ａβの３３番目及び３７番目のグリシンの置換変異を有することが好ましい。本実施形態において、置換変異としては、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、メチオニン、チロシン、又はシステインへの置換変異が好ましく、３３番目及び３７番目の少なくとも一方が、イソロイシンへの置換変異であることがより好ましい。
【００５６】
［標準物質］
細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤ測定におけるＡＳＰＤの標準物質として使用できる。その他の一又は複数の実施形態において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、ＡＳＰＤを測定するキットに使用できる。すなわち、本開示は、一態様において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体と抗ＡＳＰＤ抗体を含むキットに関する。抗ＡＳＰＤ抗体としては、上述のＡＳＰＤに特異的な抗体が挙げられる。また、本開示は、一態様において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体と、抗ＡＳＰＤ抗体とを組み合わせることを含む、キットの製造方法に関する。これらのキットは、例えば、ＡＳＰＤの測定に使用できる。
【００５７】
［スクリーニング方法１］
本開示は、一態様において、ＡＳＰＤの形成に影響を与える物質のスクリーニング方法であって、ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に形成される、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対して抗原性を示す構造体（すなわち、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体）の形成効率を指標とすることを含むスクリーニング方法に関する。
前記指標は、一又は複数の実施形態において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の形成量であってもよく、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、Ａβ４３又はこれらの合計量に対する相対量であってもよい。この形態のスクリーニング方法は、テスト物質を培養液に添加した場合と添加しない場合とにおける細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の形成効率を比較して、ＡＳＰＤの形成に影響を与える物質であるか否かを判断すること含んでもよい。例えば、テスト物質を培養液に添加した場合に該形成効率が低下すれば、該物質がＡＳＰＤの形成を阻害する影響があると判断できる。また、例えば、テスト物質を培養液に添加した場合に該形成効率が亢進すれば、該物質がＡＳＰＤの形成を促進する影響があると判断できる。
本態様のスクリーニング方法において、培養する細胞内で発現されるＡＰＰは、例えば、本開示で開示されるような、ＡＰＰの変異体又はＡβの変異体であってもよい。
【００５８】
［スクリーニング方法２］
本開示は、一態様において、ＡβのＣ末端切断に影響を与える物質のスクリーニング方法であって、ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に形成される、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、Ａβ４３及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのＡβを指標とすることを含むスクリーニング方法に関する。
前記指標は、一又は複数の実施形態において、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、Ａβ４３及びこれらの組合せの分泌量若しくは培養液中の濃度であってもよく、或いは、例えば、Ａβ４０に対するＡβ４２の割合（Ａβ４２／Ａβ４０）といった相対量であってもよい。この形態のスクリーニング方法は、テスト物質を培養液に添加した場合と添加しない場合とにおける前記指標を比較して、ＡβのＣ末端切断に影響を与える物質であるか否か、或いは、γセクレターゼに対する影響を与える物質であるか否かを判断すること含んでもよい。例えば、テスト物質を培養液に添加した場合に「Ａβ４２／Ａβ４０」が低下すれば、該物質がＡβ４２の産生を抑制する影響があると判断できる。
本態様のスクリーニング方法において、培養する細胞内で発現されるＡＰＰは、例えば、本開示で開示されるような、ＡＰＰの変異体又はＡβの変異体であってもよい。
【００５９】
［変異型合成ＡＳＰＤ］
本開示は、さらにその他の態様において、変異型合成ＡＳＰＤに関する。本開示において、変異型合成ＡＳＰＤは、変異型のＡβを用いて、合成ＡＳＰＤの製造方法と同様の製法で合成される合成ＡＳＰＤ様構造体をいう。すなわち、本開示において、変異型合成ＡＳＰＤは、Ａβの２５〜３７番目のアミノ酸配列におけるＧＸＸＸＧモチーフのグリシンに１又は複数の置換変異を有する変異型Ａβを含む液体を撹拌することで形成される合成ＡＳＰＤ様構造体をいう。前記液体には、変異型合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、例えば、フタル酸エステルなどの可塑剤が含まれていてもよい。一又は複数の実施形態において、変異型合成ＡＳＰＤは、前記変異型Ａβを、前記可塑剤を含む有機溶媒に溶解すること、前記変異型Ａβの溶液を水性溶液で希釈すること、及び、前記希釈後の溶液を撹拌することを含む製造方法で合成できる。
前記変異型Ａβとしては、Ａβの２５番目、２９番目、３３番目、及び３７番目に相当するグリシンからなる群から選択される１又は複数のグリシンの置換変異を有することが好ましく、少なくとも３３番目のグリシンの置換変異を有することが好ましい。置換変異としては、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、メチオニン、チロシン、システインへの置換変異が好ましい。
前記変異型Ａβとしては、その他の一又は複数の実施形態において、Ａβの３３番目及び３７番目のグリシンの置換変異を有することが好ましい。本実施形態において、置換変異としては、合成ＡＳＰＤの形成効率向上の観点から、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、メチオニン、チロシン、又はシステインへの置換変異が好ましく、３３番目及び３７番目の少なくとも一方が、イソロイシンへの置換変異であることがより好ましい。
本開示に係る変異型ＡＳＰＤは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤ特異的抗体に対して抗原性を示す。また、本開示に係る変異型ＡＳＰＤは、その他の一又は複数の実施形態において、成熟神経細胞に対して細胞毒性を示す。
【００６０】
本開示は、一又は複数の実施形態において、以下に関しうる；
［１］  細胞分泌型アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）様構造体の製造方法であって、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）又はアミロイドβタンパク質（Ａβ）配列を含むその一部を発現する細胞を培養液中で培養し、該培養液中に細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を得る工程を含む、製造方法。
［２］  さらに、前記培養液中から細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を回収することを含む、［１］記載の製造方法。
［３］  前記細胞が、ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部の発現系が導入された細胞である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］  前記ＡＰＰは、野生型、又は、１若しくは複数のアミノ酸変異を有する前記野生型の変異体である、［１］から［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］  前記ＡＰＰは、Ａβアミノ酸配列のＧＸＸＸＧモチーフにおけるグリシンにアミノ酸変異を有する野生型又は変異体のＡＰＰである、［１］から［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］  ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に得られる構造体であって、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対して抗原性を示す、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体。
［７］  ［６］に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を有効成分とする医薬組成物。
［８］  ［６］に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を含むワクチン。
［９］  ［６］に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体、及び、抗ＡＳＰＤ抗体を含むキット。
［１０］  ［６］に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の能動ワクチンとしての使用。
［１１］  ワクチン製造における［６］に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の使用。
［１２］  ［６］に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の、ＡＳＰＤ測定における標準物質としての使用。
［１３］  ＡＳＰＤが起因となる疾病の予防、改善、及び／又は治療の方法であって、［６］に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体、［７］に記載の医薬組成物、又は、［８］に記載のワクチンを対象に投与することを含む、方法。
［１４］  ＡＳＰＤが起因となる疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［１３］に記載の方法。
［１５］  ＡＳＰＤ、ＡＳＰＤに起因する疾病、又は、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症に対する免疫を対象に獲得させる方法であって、［６］に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体、［７］に記載の医薬組成物、又は、［８］に記載のワクチンを対象に投与することを含む、方法。
［１６］  ［６］に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体と、薬学的に許容される腑形剤とを組み合わせることを含む、医薬組成物又はワクチンの製造方法。
［１７］  ［６］に記載の細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体と、抗ＡＳＰＤ抗体とを組み合わせることを含む、キットの製造方法。
［１８］  ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を有する、非ヒト動物。
［１９］  ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に形成される構造体であって、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対して抗原性を示す構造体の形成効率を指標とすることを含む、ＡＳＰＤの形成に影響を与える物質のスクリーニング方法。
［２０］  ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部を発現する発現系が導入された細胞を培養した培養液中に分泌される、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、Ａβ４３及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つを指標とする、ＡβのＣ末端切断に影響を与える物質のスクリーニング方法。
［２１］  Ａβの２５〜３７番目のアミノ酸配列におけるＧＸＸＸＧモチーフのグリシンに１又は複数の置換変異を有する変異型Ａβを含む液体を撹拌することで形成される合成ＡＳＰＤ様構造体。
【００６１】
以下に、実施例を用いて本発明の一又は複数の実施形態をさらに説明する。
【実施例】
【００６２】
１．ｈＡＰＰを発現する培養細胞のコンストラクション
（１−１）ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）
発現させるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）として、下記表１及び図１に示す試験例１〜１４のＡＰＰを用いた。図１の配列（配列番号１）は、ヒトのＡβを含むｈＡＰＰの部分アミノ酸配列である。
試験例１〜７のＡＰＰは、ｈＡＰＰ７７０野生型、ｈＡＰＰ７７０Swedish変異型、及びＧＸＸＸＧモチーフの１又は２個のグリシンが変異したｈＡＰＰ７７０Swedish型である。
試験例８〜１４のＡＰＰは、ｈＡＰＰ６９５野生型、ｈＡＰＰ６９５Swedish変異型、及びＧＸＸＸＧモチーフの１又は２個のグリシンが変異したｈＡＰＰ６９５Swedish型である。【００６３】
【表１】
2017179646.tif 000002
【００６４】
（１−２）ｈＡＰＰを過剰発現する培養細胞
上記試験例１〜１４のｈＡＰＰを過剰発現するＣＨＯ細胞を以下のように作製した。
ＣＨＯ／Ｋ１細胞を増殖培地にて２．５ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度で１２ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ2で維持した。２４時間後、遺伝子導入試薬（ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ）を用いて発現ベクターをＣＨＯ／Ｋ１細胞に導入した。導入方法は、１ウェルあたりＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ２５μＬ及びプラスミドＤＮＡ  ０．５μｇを混合し、さらに１．５μＬのＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを加え、室温で１０分間反応させた。その間に０．５ｍＬ増殖培地を交換しておき反応終了後、反応液を２５μＬ添加した。２４時間後、新しい１ｍＬ増殖培地に交換してさらに培養した。
増殖培地：１０％ＦＢＳ含有Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地に、１００ユニット／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、及び、１００μｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを加えたもの【００６５】
２．ＡＳＰＤの形成と回収
（２−１）ｈＡＰＰを過剰発現する培養細胞の培養と上清の回収
遺伝子導入から４８時間後、細胞を１ｘＰＢＳ（−）にて２回洗浄したのち１ｍＬ無血清培地に交換した。無血清培地に交換２４時間後、０．２２μｍフィルターでろ過した培養上清を回収し、直ちに液体窒素で凍結させて−８０℃にて保存した。
無血清培地：ＤＭＥＭ／Ｆ−１２に１ｘＩＴＳ−Ｘを加えたもの【００６６】
（２−２）分析
ＡＰＰ過剰発現細胞を培養した培養液を回収し、培養液中のＡＳＰＤ，Ａβ１−４０、及びＡβ１−４２の含有量を下記条件のＥＬＩＳＡ法で確認した。その結果を図２〜４に示す。
［ＡＳＰＤ  ＥＬＩＳＡ］
回収した培養上清について、抗ＡＳＰＤ抗体２種類（ｒｐＡＳＤ１、ＭＡＳＤ３）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡで定量した。
詳細には、測定前日に白色９６ウェルプレートに抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体（ｒｐＡＳＤ１）を５００ｎｇ／ウェルとなるように分注し、４℃で一晩固相化した。翌日、ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３％ＢＳＡにて３０分間ブロッキングを行い、再度３回洗浄した。各ウェルに１００μＬの標準液またはサンプルを分注し、１時間室温でインキュベーション後、３回洗浄し、１００ｎｇ／ウェルとなるように抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体（ＭＡＳＤ３）を添加し、さらに１時間室温でインキュベーションした。再度３回洗浄を行い、１／１０，０００希釈した二次抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ）を１００μＬ／ウェルで分注し、１時間室温でインキュベーションした。３回洗浄した後、１００μＬの発光基質を添加して１分遮光で反応させ、ルミノメーターで発光を検出した。
［Ａβ  ＥＬＩＳＡ］
回収した培養上清について、市販で入手可能なＡβ  ｍｏｎｏｍｅｒ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを用いて測定した。使用したＫｉｔは、以下の通り。測定は、Ｋｉｔ添付の説明書通り行った。
Ａβ１−４０：ヒトβアミロイド（１−４０）ＥＬＩＳＡキットワコー（Ｗａｋｏ＃２９２−６２３０１）
Ａβ１−４２：ヒトβアミロイド（１−４２）ＥＬＩＳＡキットワコー高感度品（Ｗａｋｏ＃２９６−６４４０１）【００６７】
図２〜４に示すとおり、試験例１〜１４のＡＰＰを過剰発現させたいずれの場合も培養液中にＡＳＰＤの形成が認められた。
ｈＡＰＰ７７０とｈＡＰＰ６９５を比較した場合、変異による大きな差は見られなかったが、若干ｈＡＰＰ６９５の方が、培養上清中のＡＳＰＤ濃度が高い傾向があった。また、変異の場所と数については、２カ所でも１カ所でもＧ７０４又はＧ６２９のＧ／Ｌ変異がＡＳＰＤ形成には重要であると考えられた。さらに、野生型（ｗｔ）に比べ、Ｓｗｅｄｉｓｈ（ｓｗ）変異ではアミロイドがより多く分泌されるが、さらにＧＸＸＸＧモチーフに変異を入れることによって、ほとんどのアミロイドがＡＳＰＤの構成要素として使用されることが示唆された。【００６８】
３．ｈＡＰＰ６９５ｓｗ−Ｇ３３Ｘの過剰発現
ｈＡＰＰ６９５Swedish変異型の６２９位（Ａβの３３位）のグリシンを１９種のアミノ酸に変異させたＡＰＰを過剰発現する細胞を上記（１−２）と同様に作製し、上記２．と同様に培養してその培養液中に培養液中のＡＳＰＤ，Ａβ１−４０、及びＡβ１−４２の含有量を確認した。その結果を表２及び図５〜７に示す。【００６９】
【表２】
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【００７０】
表２及び図５〜７に示すとおり、ｈＡＰＰ６９５Swedish変異型の６２９位（Ａβの３３位）のグリシンを所定のアミノ酸、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、バリン、チロシン、システインへの置換をすることにより、培養液中のＡβ量を著しく低減するとともに、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の形成量を向上できることが確認された。一方、プロリン（又はスレオニン）への置換をすることにより、Ａβ１−４０、Ａβ１−４２及びＡＳＰＤ様構造体のいずれについても培養液中濃度の低下が確認された。この結果から、これらのアミノ酸による６２９位（Ａβの３３位）の変異によっては、ＡＰＰからのＡβの切り出しが阻害され、且つＡＳＰＤ様構造体の形成が抑制されることが示唆された。以上のことから、アミロイドβ産生およびＡＳＰＤ形成の双方に対する阻害剤スクリーニングへの変異体の利用も可能と考えられた。【００７１】
３．他の宿主細胞を用いた細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の製造
ＣＨＯの他に、ＨＥＫ２９３及びＮｅｕｒｏ２ａの細胞株においても、ＡＰＰ又はＡβ配列を含むその一部の発現系が導入された細胞とすることで、細胞内でＡＳＰＤ様構造体が形成されることが認められた。【００７２】
４．細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体の安定性確認：−８０℃の保存安定性
試験例１４のhAPP695-sw-G33Iを発現させて得られた細胞分泌型ＡＳＰＤ構造体を０ヶ月、３ヶ月及び６ヶ月間−８０℃保存したサンプルを、２種類のＡＳＰＤ特異的抗体（中和抗体）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡで測定して検量線を作成した。
その結果、その検量線の一次回帰直線の傾きは、３つのサンプルでほぼ一定の値を示した。したがって、サンドイッチELISAに使用している中和抗体２種類に対する反応性が安定しており、保存による劣化はないと考えられた。
一方、従来の方法で製造された合成ＡＳＰＤは、−８０℃の保存後では一次回帰直線における傾きのバラツキが大きく、ＡＳＰＤ濃度に対しるシグナルの大きさもバラツキが大きく、保存安定性が低いと考えられる。【００７３】
５．合成ＡＳＰＤの免疫原性
ニュージーランドホワイト（各条件３羽）に、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、アジュバントなしで、合成ＡＳＰＤによる１００μｇ免疫を６回行い、その後、全採血を行い、血清中の合成ＡＳＰＤに対する反応性をドットブロットで評価を行った。その結果の一例を図８に示す。全てのウサギでアジュバントなしでも充分な反応性が得られることがわかった。【００７４】
６．合成ＡＳＰＤ及び変異型合成ＡＳＰＤ（Ｇ３３Ｌ）の神経細胞毒性
野生型Ａβ１−４２を用いて製造した合成ＡＳＰＤの神経細胞毒性と、Ｇ３３Ｌ変異型Ａβ１−４２を用いて製造した変異型合成ＡＳＰＤ（Ｇ３３Ｌ）の神経細胞毒性とを比較した。
具体的には、一定濃度の合成ＡＳＰＤ（０．５８μＭ）及び変異型合成ＡＳＰＤ（０．５３μＭ）をそれぞれ成熟ラット海馬由来初代培養神経細胞に投与し一晩置いた後、蛍光試薬（Thermo Fisher社製CyQUANT）を添加し、共焦点イメージサイトメーターＣＱ１を用いて細胞生存率を確認した。その結果を図９の右に示す。同図に示す通り、変異型合成ＡＳＰＤ（Ｇ３３Ｌ型）は、合成ＡＳＰＤ（野生型）と同様に、成熟神経細胞に対して同程度の細胞毒性を示した。【００７５】
７．変異型合成ＡＳＰＤとｒｐＡＳＤ１抗体との解離定数
合成ＡＳＰＤまたは変異型合成ＡＳＰＤ（Ｇ３３Ｌ）をリガンドとしてセンサーチップ上に固相化し、アナライトとして抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体（ｒｐＡＳＤ１）を流して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により解離定数（ＫD）を求めた。その結果、抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体（ｒｐＡＳＤ１）に対する反応性は、合成ＡＳＰＤと変異型合成ＡＳＰＤ（Ｇ３３Ｌ）とで同等であった。【００７６】
８．ｈＡＰＰ６９５ｓｗの１及び２アミノ酸変異体の過剰発現
発現させるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）として、下記表３及び図１に示す試験例１５〜３６のＡＰＰを用いた。上記１及び２の記載と同様にして、ＡＰＰ過剰発現細胞を培養した培養液を回収し、培養液中のＡＳＰＤ，Ａβ１−４０、及びＡβ１−４２の含有量を下記条件のＥＬＩＳＡ法で確認した。その結果を図１０〜１２に示す。【００７７】
【表３】
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【００７８】
図１０〜１２に示すとおり、試験例１５〜３６のＡＰＰを過剰発現させたいずれの場合も培養液中にＡＳＰＤの形成が認められた。
ロイシンへの１アミノ酸又は２アミノ酸置換変異と、イソロイシンのそれらとで、上清中のＡＳＰＤ，Ａβ１−４０、及びＡβ１−４２の含有量に大きな差は見られなかった。しかし、Ａβの３３番目及び３７番目のグリシンが二つともイソロイシンに変異したＡＰＰ（試験例３０）のＡＳＰＤ形成量は、Ａβの３３番目及び３７番目のグリシンが二つともロイシンに変異したＡＰＰ（試験例２３）と比べて、著しく増加していた。
また、２か所をロイシンとイソロイシンに変異させたＡＰＰ（試験例３１−３６）では、Ａβの３３番目及び３７番目のグリシンをロイシンとイソロイシンに変異させたＡＰＰ（試験例３５−３６）のＡＳＰＤの形成量が、Ａβの３３番目及び３７番目のグリシンが二つともイソロイシンに変異したＡＰＰ（試験例３０）と同程度に増加した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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