(57)【要約】  本発明は、ヒトインスリン精製用分離剤であって、ヒトインスリン及び特定のインスリンを含む溶液から、前記分離剤を用いて特定の液体クロマトグラフィーの分離条件によりヒトインスリンを単離する際に、高回収率でヒトインスリンを回収できるヒトインスリン精製用分離剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインスリン精製用分離剤であって、
下記式（１）で表されるヒトインスリン及び下記式（２）で表されるｄｅｓＢ３０インスリンを含む溶液から、前記分離剤を用いて下記液体クロマトグラフィーの分離条件により下記式（１）で表されるヒトインスリンを単離する際に、９９．５％純度で回収したときの下記式（１）で表されるヒトインスリンの回収率が、７０％以上である、
ヒトインスリン精製用分離剤。
（液体クロマトグラフィーの分離条件）
カラムサイズ：１５０ｍｍ×４．６ｍｍ  内径
溶離液：水／ｐＨ調整剤／水溶性有機溶媒／塩
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃
測定波長：ＵＶ２８０ｎｍ
サンプル：下記式（１）で表されるヒトインスリン９６質量％及び下記式（２）で表されるｄｅｓＢ３０インスリン４質量％を含むインスリン混合物を１００ｍｇ／ｍＬに調製した溶液
サンプル注入量：１００μＬ
【化１】
2018147393.tif 000010
【請求項２】
前記分離剤の体積平均粒子径が、１〜５０μｍである、請求項１に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
【請求項３】
多孔性粒子と、前記多孔性粒子に結合したイオン交換基とを有する、請求項１又は２に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
【請求項４】
前記イオン交換基が、強酸性官能基を含む、請求項３に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
【請求項５】
前記強酸性官能基の導入量が、前記分離剤の湿潤状態での単位質量当たり０．０４５〜０．２５ｍｅｑ／ｇである、請求項４に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
【請求項６】
前記イオン交換基が、イオン性官能基を含む水溶性高分子である、請求項３〜５のいずれか１項に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
【請求項７】
ヒトインスリン精製用分離剤であって、
多孔性粒子と、前記多孔性粒子に結合したイオン交換基とを有し、
前記イオン交換基が、強酸性官能基を含み、
前記強酸性官能基の導入量が、前記分離剤の湿潤状態での単位質量当たり０．０４５〜０．２５ｍｅｑ／ｇである、
ヒトインスリン精製用分離剤。
【請求項８】
ヒトインスリン精製用分離剤であって、
下記式（１）で表されるヒトインスリン及び下記式（３）で表されるＡ２１デスアミドインスリンを含む溶液から、前記分離剤を用いて下記液体クロマトグラフィーの分離条件により下記式（１）で表されるヒトインスリンを単離する際に、９９．９％純度で回収したときの下記式（１）で表されるヒトインスリンの回収率が、９７％以上である、
ヒトインスリン精製用分離剤。
（液体クロマトグラフィーの分離条件）
カラムサイズ：１５０ｍｍ×４．６ｍｍ  内径
溶離液：水／ｐＨ調整剤／水溶性有機溶媒
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃
測定波長：ＵＶ２８０ｎｍ
サンプル：下記式（１）で表されるヒトインスリン９６質量％及び下記式（３）で表されるＡ２１デスアミドインスリン４質量％を含むインスリン混合物を１００ｍｇ／ｍＬに調製した溶液
サンプル注入量：４００μＬ
【化２】
2018147393.tif 000011
【請求項９】
前記分離剤の体積平均粒子径が、１〜５０μｍである、請求項８に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
【請求項１０】
多孔性粒子と、前記多孔性粒子に結合した疎水性官能基と、前記多孔性粒子に結合したイオン交換基とを有する、請求項８又は９に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
【請求項１１】
前記疎水性官能基が、飽和アルキル基、不飽和アルキル基及びアリール基からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１０に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
【請求項１２】
前記疎水性官能基の導入量が、前記分離剤乾燥質量当たり０．０１〜０．２５ｇ／ｇである、請求項１０又は１１に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
【請求項１３】
前記イオン交換基が、アニオン交換基である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
【請求項１４】
前記イオン交換基の導入量が、前記分離剤乾燥質量当たり０．０１〜２．０ｍｅｑ／ｇである、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
【請求項１５】
ヒトインスリン精製用分離剤であって、
多孔性粒子と、前記多孔性粒子に結合した疎水性官能基と、前記多孔性粒子に結合したイオン交換基とを有し、
前記イオン交換基が、アニオン交換基であり、
前記イオン交換基の導入量が、前記分離剤乾燥質量当たり０．０１〜２．０ｍｅｑ／ｇである、
ヒトインスリン精製用分離剤。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のヒトインスリン精製用分離剤を用いた、ヒトインスリンの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトインスリン精製用分離剤及びヒトインスリンの精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトインスリンの工業的製造においては、しばしば特定の遺伝子を組み込んだ大腸菌や酵母にインスリン前駆体となるペプチド（プロインスリン、ミニプロインスリン）を合成させる遺伝子工学的手法が用いられる。この手法においては、インスリン前駆体中の特定部位をトリプシン等の酵素を用いた反応により切断して所望のインスリン分子を得るが、酵素反応の際にインスリンのアミノ酸配列内で不要な切断も並行して起こり、所望のインスリンから一つ以上のアミノ酸分子が脱落したインスリン様分子が不純物として副生する。不純物となるインスリン様分子としては、例えば、ｄｅｓＢ２３−３０インスリン、ｄｅｓＢ３０インスリン等が挙げられる。【０００３】
また、その他のインスリン製造プロセス中に副生するインスリン様不純物としては、所望のインスリン配列中のアミノ酸分子が一部変化したものがあり、その例としては、Ａ２１デスアミドインスリン等が挙げられる。【０００４】
従来、インスリン製造プロセス中の精製（不純物除去）工程において、副生不純物の一つであるｄｅｓＢ３０インスリンは、インスリンからアミノ酸１分子（Ｂ３０位のトレオニン）のみが脱離した構造であるために、インスリンから直接分離除去することは困難であり、その工業的手法は確立されていなかった。【０００５】
インスリン精製の一般な手法としては、例えば、逆相クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーによる分離が用いられるが、液体クロマトグラフィーによって効率的にインスリンからｄｅｓＢ３０インスリンを分離する方法は見出されていない。
また、液体クロマトグラフィーによって効率的にインスリンからＡ２１デスアミドインスリンを分離する方法も見出されていない。【０００６】
非特許文献１には、逆相液体クロマトグラフィーによるインスリン／ｄｅｓＢ３０インスリンの分離方法が示されている。
特許文献１には、高圧条件におけるイオン交換液体クロマトグラフィーでの組換インスリン／ｄｅｓＢ３０インスリンの分離方法が示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】日本国特開平１０−１８２７００号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＡｋｚｏＮｏｂｅｌ社  Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）ホームページ  Ｎｅｗｓ  Ｍａｙ  ２０１６  「Using EternityXT stationary phase for analysis and purification under reversed-phase chromatography」［２０１７年２月７日検索］、インターネット（https://www.kromasil.com/notes/?archive）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、従来知られている方法では、工業的スケールでｄｅｓＢ３０インスリンを分離した高純度のヒトインスリン（レギュラーインスリンとも称される。）を提供するには不十分であった。【００１０】
例えば、非特許文献１に記載の方法は、分析スケールであることや、クロマトグラフィー移動相に過塩素酸塩等の特殊な試薬を添加する必要があることから、工業スケールでのインスリン精製工程には適さない。【００１１】
特許文献１に記載の方法は、ｄｅｓＢ３０インスリンと分離すべき目的物が組換インスリン（インスリン誘導体）であり、これは通常のヒトインスリンとアミノ酸配列が異なることから、より容易にｄｅｓＢ３０インスリンとの分離が可能であると言える。よって、本方法では、よりアミノ酸配列が近く構造が似ているヒトインスリン／ｄｅｓＢ３０インスリンの分離は達成できないと推察される。【００１２】
本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものである。
本発明の第１実施形態の目的は、インスリン製造プロセス中の精製工程において、ヒトインスリンとｄｅｓＢ３０インスリンを効果的に分離可能な分離剤、及び当該分離剤を用いたヒトインスリンの精製方法を提供することにある。【００１３】
また、本発明の第２実施形態の目的は、インスリン製造プロセス中の精製工程において、ヒトインスリンとＡ２１デスアミドインスリンを効果的に分離可能な分離剤、及び当該分離剤を用いたヒトインスリンの精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本願発明者らが鋭意研究を行なった結果、特定の条件を用いたイオン交換クロマトグラフィーによってヒトインスリン（レギュラーインスリン）とｄｅｓＢ３０インスリンを効率的に分離可能であることを見出し、本発明の第１実施形態に至った。【００１５】
また、本願発明者らが鋭意研究を行なった結果、特定の条件を用いた逆相クロマトグラフィーによってヒトインスリン（レギュラーインスリン）とＡ２１デスアミドインスリンを効率的に分離可能であることを見出し、本発明の第２実施形態に至った。【００１６】
即ち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
［１］ヒトインスリン精製用分離剤であって、下記式（１）で表されるヒトインスリン及び下記式（２）で表されるｄｅｓＢ３０インスリンを含む溶液から、前記分離剤を用いて下記液体クロマトグラフィーの分離条件により下記式（１）で表されるヒトインスリンを単離する際に、９９．５％純度で回収したときの下記式（１）で表されるヒトインスリンの回収率が、７０％以上である、ヒトインスリン精製用分離剤。
（液体クロマトグラフィーの分離条件）
カラムサイズ：１５０ｍｍ×４．６ｍｍ  内径
溶離液：水／ｐＨ調整剤／水溶性有機溶媒／塩
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃
測定波長：ＵＶ２８０ｎｍ
サンプル：下記式（１）で表されるヒトインスリン９６質量％及び下記式（２）で表されるｄｅｓＢ３０インスリン４質量％を含むインスリン混合物を１００ｍｇ／ｍＬに調製した溶液
サンプル注入量：１００μＬ【００１７】
【化１】
2018147393.tif 000002
【００１８】
［２］前記分離剤の体積平均粒子径が、１〜５０μｍである、［１］に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
［３］多孔性粒子と、前記多孔性粒子に結合したイオン交換基とを有する、［１］又は［２］に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
［４］前記イオン交換基が、強酸性官能基を含む、［３］に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
［５］前記強酸性官能基の導入量が、前記分離剤の湿潤状態での単位質量当たり０．０４５〜０．２５ｍｅｑ／ｇである、［４］に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
［６］前記イオン交換基が、イオン性官能基を含む水溶性高分子である、［３］〜［５］のいずれか１つに記載のヒトインスリン精製用分離剤。
［７］ヒトインスリン精製用分離剤であって、多孔性粒子と、前記多孔性粒子に結合したイオン交換基とを有し、前記イオン交換基が、強酸性官能基を含み、前記強酸性官能基の導入量が、前記分離剤の湿潤状態での単位質量当たり０．０４５〜０．２５ｍｅｑ／ｇである、ヒトインスリン精製用分離剤。
［８］ヒトインスリン精製用分離剤であって、下記式（１）で表されるヒトインスリン及び下記式（３）で表されるＡ２１デスアミドインスリンを含む溶液から、前記分離剤を用いて下記液体クロマトグラフィーの分離条件により下記式（１）で表されるヒトインスリンを単離する際に、９９．９％純度で回収したときの下記式（１）で表されるヒトインスリンの回収率が、９７％以上である、ヒトインスリン精製用分離剤。
（液体クロマトグラフィーの分離条件）
カラムサイズ：１５０ｍｍ×４．６ｍｍ  内径
溶離液：水／ｐＨ調整剤／水溶性有機溶媒
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃
測定波長：ＵＶ２８０ｎｍ
サンプル：下記式（１）で表されるヒトインスリン９６質量％及び下記式（３）で表されるＡ２１デスアミドインスリン４質量％を含むインスリン混合物を１００ｍｇ／ｍＬに調製した溶液
サンプル注入量：４００μＬ【００１９】
【化２】
2018147393.tif 000003
【００２０】
［９］前記分離剤の体積平均粒子径が、１〜５０μｍである、［８］に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
［１０］多孔性粒子と、前記多孔性粒子に結合した疎水性官能基と、前記多孔性粒子に結合したイオン交換基とを有する、［８］又は［９］に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
［１１］前記疎水性官能基が、飽和アルキル基、不飽和アルキル基及びアリール基からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１０］に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
［１２］前記疎水性官能基の導入量が、前記分離剤乾燥質量当たり０．０１〜０．２５ｇ／ｇである、［１０］又は［１１］に記載のヒトインスリン精製用分離剤。
［１３］前記イオン交換基が、アニオン交換基である、［１０］〜［１２］のいずれか１つに記載のヒトインスリン精製用分離剤。
［１４］前記イオン交換基の導入量が、前記分離剤乾燥質量当たり０．０１〜２．０ｍｅｑ／ｇである、［１０］〜［１３］のいずれか１つに記載のヒトインスリン精製用分離剤。
［１５］ヒトインスリン精製用分離剤であって、多孔性粒子と、前記多孔性粒子に結合した疎水性官能基と、前記多孔性粒子に結合したイオン交換基とを有し、前記イオン交換基が、アニオン交換基であり、前記イオン交換基の導入量が、前記分離剤乾燥質量当たり０．０１〜２．０ｍｅｑ／ｇである、ヒトインスリン精製用分離剤。
［１６］［１］〜［１５］のいずれか１つに記載のヒトインスリン精製用分離剤を用いた、ヒトインスリンの精製方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の第１実施形態のヒトインスリン精製用分離剤を用いることで、分離が困難なｄｅｓＢ３０インスリンを分離除去することが可能となり、当該分離剤は工業的に有用である。
さらに、本発明の第１実施形態によるヒトインスリンの精製方法を用いることで、従来のインスリン製造における精製工程の負荷が低減され、製造制約やコストの削減が期待できる。【００２２】
また、本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤を用いることで、分離が困難なＡ２１デスアミドインスリンを分離除去することが可能となり、当該分離剤は工業的に有用である。
さらに、本発明の第２実施形態によるヒトインスリンの精製方法を用いることで、従来のインスリン製造における精製工程の負荷が低減され、製造制約やコストの削減が期待できる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に本発明について詳述するが、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々に変更して実施することができる。なお、本明細書において、「〜」という表現を用いる場合、その前後の数値を含む表現として用いるものとする。
【００２４】
なお、本明細書において、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル」と「メタクリル」の一方又は双方をさし、「（メタ）アクリレート」についても同様である。
【００２５】
〔第１実施形態〕
＜ヒトインスリン精製用分離剤＞
本発明の第１実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、下記式（１）で表されるヒトインスリン及び下記式（２）で表されるｄｅｓＢ３０インスリンを含む溶液（以下、「インスリン溶液１」と称することがある。）から、前記分離剤を用いて下記液体クロマトグラフィーの分離条件により下記式（１）で表されるヒトインスリンを単離する際に、９９．５％純度で回収したときの下記式（１）で表されるヒトインスリンの回収率が、７０％以上である。
なお、上記「純度」及び「回収率」は、実施例に記載の方法で算出することができる。
【００２６】
（液体クロマトグラフィーの分離条件）
カラムサイズ：１５０ｍｍ×４．６ｍｍ  内径
溶離液：水／ｐＨ調整剤／水溶性有機溶媒／塩
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃
測定波長：ＵＶ２８０ｎｍ
サンプル：下記式（１）で表されるヒトインスリン９６質量％及び下記式（２）で表されるｄｅｓＢ３０インスリン４質量％を含むインスリン混合物を１００ｍｇ／ｍＬに調製した溶液
サンプル注入量：１００μＬ
【００２７】
【化３】
2018147393.tif 000004
【００２８】
［インスリン溶液１］
本発明の第１実施形態で用いるインスリン溶液１は、上記式（１）で表されるヒトインスリン及び上記式（２）で表されるｄｅｓＢ３０インスリンを含む溶液である。
【００２９】
インスリン溶液１を得る方法としては、特に限定されないが、例えば、遺伝子工学的手法により大腸菌や酵母に合成させて得られたインスリン前駆体から、上記式（１）で表されるヒトインスリンとなるように、酵素を用いた反応により切断する方法が挙げられる。
【００３０】
その酵素反応の際に、通常、上記式（１）で表されるヒトインスリンからアミノ酸１分子（Ｂ３０位のトレオニン）のみが脱離した上記式（２）で表されるｄｅｓＢ３０インスリンが副生する。ｄｅｓＢ３０インスリンの副生量は、反応に用いる種々の酵素比率や反応ｐＨ、反応系内の金属イオン濃度等の違いによって変化し得る。
【００３１】
インスリン溶液１には、ｄｅｓＢ３０インスリン以外の不純物が含まれていてもよい。また、インスリン溶液１には、ヒトインスリン及びｄｅｓＢ３０インスリンの調製並びに処理に使用された各種物質が含まれていてもよい。
【００３２】
インスリン溶液１中の溶媒は、ヒトインスリンを十分溶解するものであればよく、水、ｐＨ調整剤、有機溶媒、塩類等の液体クロマトグラフィーで一般的に使用される物質を含む。インスリン溶液１に含まれる溶媒は、溶離液と類似した組成及びｐＨであることが好ましいが、必ずしも限定されるものではない。
【００３３】
［多孔性粒子］
本発明の第１実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、多孔性粒子と、前記多孔性粒子に結合したイオン交換基とを有することが好ましい。
【００３４】
本発明の第１実施形態で好ましく用いられる多孔性粒子は、架橋性合成高分子からなる多孔質の粒子であれば特に限定されない。架橋性合成高分子としては、例えば、ポリビニルアルコール系重合体、スチレン−ジビニルベンゼン系重合体や（メタ）アクリル系重合体が挙げられ、好ましくは（メタ）アクリル系重合体である。
【００３５】
なお、本明細書において、スチレン−ジビニルベンゼン系とは、重合体を構成する原料となる単量体の５０質量％以上、好ましくは８０質量％以上が、スチレン及びジビニルベンゼンからなることを言う。また、本明細書において、（メタ）アクリル系とは、重合体を構成する原料となる単量体の５０質量％以上、好ましくは８０質量％以上が、（メタ）アクリレートからなることを言う。
【００３６】
本発明の第１実施形態で好ましく用いられる架橋構造を持つ、球状の多孔性粒子は、典型的には、重合性モノビニル単量体、重合性ポリビニル単量体、多孔質化剤、重合開始剤等を含むモノマー相を分散安定剤等を含む水相に分散させ、加熱等による重合反応を行うことによって得られる。この際、後述するイオン交換基を多孔性粒子に結合させるために、多孔性粒子の表面に反応性基が存在することが好ましい。前記反応性基は、上述の重合性モノビニル単量体又は重合性ポリビニル単量体として、反応性基となり得る官能基を有する単量体を選択することで導入することができる。
【００３７】
発明の第１実施形態で好ましく用いられる多孔性粒子は、懸濁重合法、又は粒子分布の狭い（粒子径単分散の）種粒子を用い、これにさらにビニル単量体を含浸させて重合する、所謂シード重合法を利用して製造することにより容易に得られる。
【００３８】
反応性基としては、例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、ハロゲン基、エポキシ基、ビニル基等が挙げられるが、反応性基自体がイオン性を持つことを避ける場合には、エポキシ基又はビニル基が好ましい。
【００３９】
多孔性粒子の重合に用いられる重合性モノビニル単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸等の不飽和カルボン酸類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル等の（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸フェニル、（メタ）アクリル酸３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸２−クロロエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸２，３−ジヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸ジエチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸テトラヒドロフルフリル等の（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド誘導体；スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、α−メチルスチレン、クロロスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン及びそのアルキル又はハロゲン置換体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類；メチルビニルエーテル、エチルビニルエーテル等のビニルエーテル類；アリルアルコール及びそのエステル又はエーテル類；（メタ）アクリロニトリル、ビニルスルホン酸、ｐ−スチレンスルホン酸、ビニルピリジン、ビニルピロリドン等、その他のビニル化合物；等が挙げられる。これらの重合性モノビニル単量体は、必ずしも添加する必要はなく、また、単独でも二種類以上の混合においても用いることができる。
【００４０】
また、重合性ポリビニル単量体としては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、２，４，６−トリビニルエチルベンゼン等の芳香族ポリビニル化合物；（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンジ（メタ）アクリレート、ヒドロキノンジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリレート類；グリセリントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート等のトリ（メタ）アクリレート類；テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート等のテトラ（メタ）アクリレート類；ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート等のペンタ（メタ）アクリレート類；ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）アクリレート等のヘキサ（メタ）アクリレート類；アジピン酸ジビニル、マレイン酸ジアリル、フタル酸ジアリル、１，３，５−ベンゼントリカルボン酸トリアリル等のポリカルボン酸ポリビニルエステル、ポリカルボン酸ポリアリルエステル類；ジビニルエーテル、（ポリ）エチレングリコールジビニルエーテル、トリメチロールプロパンジアリルエーテル、ペンタエリスリトールトリアリルエーテル等のポリオールポリビニルエーテル、ポリオールポリアリルエーテル類；ブタジエン、メチレンビスアクリルアミド等その他のポリビニル化合物；等が挙げられ、好ましくはポリ（メタ）アクリレート類であり、より好ましくはジ（メタ）アクリレート類である。
【００４１】
これらの重合性ポリビニル単量体は、単独でも二種類以上の混合においても用いることができる。重合性ポリビニル単量体の全重合性ビニル単量体に対する割合は、３０〜１００質量％であり、好ましくは５０〜１００質量％である。重合性ポリビニル単量体の全重合性ビニル単量体に対する割合が３０質量％以上の場合、得られる高分子粒子の機械的強度に優れる。
【００４２】
本発明の第１実施形態で好ましく用いられる多孔性粒子は、（メタ）アクリル系重合体からなることが好ましく、公知の多孔質（メタ）アクリル系重合体をベースとして、所望の官能基を導入することにより製造することができる。例えば、重合性モノビニル単量体としてエポキシ基等の官能基を有するモノビニル（メタ）アクリレートと、重合体ポリビニル単量体として架橋性（メタ）アクリレートとの共重合で得られる、架橋構造を有する多孔性粒子が挙げられる。モノビニル（メタ）アクリレート及び架橋性（メタ）アクリレートの有する官能基が、多孔性粒子の反応性基として働く。
【００４３】
官能基を有するモノビニル（メタ）アクリレートとしては、例えば、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート等の水酸基を１個以上有する（メタ）アクリル酸の多価アルコールエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等のＮ−置換（メタ）アクリルアミド、アクリルアミド、メタアクリルアミド、グリシジル（メタ）アクリレートあるいはこれらの混合物等が挙げられる。特に、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレートあるいはこれらの混合物が好ましい。
【００４４】
例えば、多孔性粒子表面に親水性を持たせる場合には、（メタ）アクリル系重合体を構成する単量体の５質量％以上がグリセリンモノ（メタ）アクリレート及び／又はグリシジル（メタ）アクリレートであることが好ましく、より好ましくは２０質量％以上である。グリシジル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有モノビニル単量体を用いる場合には、重合後にエポキシ基を開環することで、多孔性粒子表面に親水性を持たせることができる。
【００４５】
また、架橋性（メタ）アクリレートとしては、例えば、多価アルコールのポリ（メタ）アクリレートやアルキレンポリ（メタ）アクリルアミドが好ましい。具体的には、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、アリル（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラヒドロキシブタンジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、メチレンビスアクリルアミド、ピペラジンジアクリルアミド、ジアリル酒石酸ジアミド等が挙げられ、これらは単独でも混合物としても用いられるが、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート及びトリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【００４６】
例えば、多孔性粒子表面に反応性基としてビニル基を導入する場合には、（メタ）アクリル系重合体を構成する単量体の５０質量％以上がエチレングリコールジ（メタ）アクリレート及び／又はトリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレートであることが好ましく、より好ましくは７０質量％以上である。また、多孔性粒子表面に親水性を持たせる場合には、（メタ）アクリル系重合体を構成する単量体の１質量％以上がグリセリンジ（メタ）アクリレートであることが好ましく、より好ましくは５質量％以上である。
【００４７】
本発明の第１実施形態で好ましく用いられる多孔性粒子は、懸濁重合又は、シード重合を多孔質化剤の存在下実施することにより所望の多孔質性を得ることができる。
【００４８】
そのための多孔質化剤すなわち多孔質化溶媒としては、例えば、重合時に相分離剤として作用し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒であり、重合性ビニル単量体を溶解するがその重合体は溶解しないものであり、具体的には、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ドデカン、シクロヘキサン等の脂肪族及び脂環式炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン等の芳香族炭化水素類；メチルエチルケトン等のケトン類；ジブチルエーテル等のエーテル類；ヘキサノール、オクタノール、ドデカノール、シクロヘキサノール、ラウリルアルコール等の脂肪族及び脂環式アルコール類；酢酸エチル、酢酸ブチル、フタル酸ジメチル、フタル酸ジエチル等のエステル類；ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエチレン等のハロゲン化炭化水素類；クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等の芳香族ハロゲン化炭化水素類；等が挙げられる。これらの溶媒は、単独でも二種類以上の混合においても用いることができる。
【００４９】
また、多孔質化溶媒の添加量については、全重合性ビニル単量体に対して５０〜４００質量％、好ましくは１００〜２５０質量％の範囲である。多孔質化溶媒の添加量が下限値以上の場合、クロマトグラフィーにおける分離性を充分に発揮するための細孔が十分形成され、また、多孔質化溶媒の添加量が上限値以下の場合、得られる多孔性粒子の機械的強度に優れる。
【００５０】
重合開始剤としては、例えば、２，２′−アゾビスイソブチロニトリル、２，２′−アゾビス（イソ酪酸メチル）、２，２′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４−アゾビス（４−シアノペンタン酸）等のアゾ系重合開始剤；ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ジ−ｔ−ブチルペルオキシド、ベンゾイルペルオキシド、ジ−イソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ−ブチルペルオキシイソブチレート等の過酸化物系重合開始剤；等が挙げられる。
【００５１】
その他、モノマー相には、重合反応の調節のために連鎖移動剤や重合禁止剤が適宜添加されてもよい。
水相中には、モノマー相の分散安定性を増すために分散安定剤を添加することが好ましい。分散安定剤としては、例えば、公知のアニオン系、ノニオン系の界面活性剤、及びポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミン、ビニルアルコール−酢酸ビニル共重合体等の合成高分子が挙げられる。
その他、水相には、重合中の高分子粒子の凝集防止等のために重合禁止剤や塩類が適宜添加されてもよい。
【００５２】
本発明の第１実施形態で好ましく用いられる多孔性粒子は、以下の１）〜４）の少なくとも１つの物理的性質を持つものが好ましく、以下の１）〜４）の少なくとも２つの物理的性質を持つものがより好ましく、以下の１）〜４）の少なくとも３つの物理的性質を持つものがさらに好ましく、以下の１）〜４）のすべての物理的性質をもつものが特に好ましい。
【００５３】
１）多孔性粒子の最頻度細孔半径が１０〜２０００Åである。より好ましくは５０Å以上、さらに好ましくは１００Å以上であって、より好ましくは１０００Å以下、さらに好ましくは５００Å以下である。最頻度細孔半径が下限値以上であることで、インスリン分子が粒子内に拡散しやすくなり、分離性能の向上や処理量の増大を見込めるため好ましい。また、最頻度細孔半径が上限値以下であると、分離剤の機械的強度が向上し、通液時の圧力損失が低下するため好ましい。
【００５４】
２）細孔容積が多孔性粒子の単位質量当たり０．１〜２．５ｍＬ／ｇである。より好ましくは０．４ｍＬ／ｇ以上、さらに好ましくは０．７ｍＬ／ｇ以上であって、より好ましくは２．０ｍＬ／ｇ以下、さらに好ましくは１．５ｍＬ／ｇ以下である。細孔容積が下限値以上であることで、インスリン分子が粒子内に拡散しやすくなり、分離性能の向上や処理量の増大を見込めるため好ましい。また、細孔容積が上限値以下であると、粒子内の空隙率が低下しカラム体積当たりの吸着量が大きくなるため好ましい。
【００５５】
３）比表面積が多孔性粒子の単位質量当たり１０〜１０００ｍ２／ｇである。より好ましくは５０ｍ２／ｇ以上、さらに好ましくは１００ｍ２／ｇ以上であって、より好ましくは５００ｍ２／ｇ以下、さらに好ましくは３００ｍ２／ｇ以下である。比表面積が下限値以上であることで、インスリン分子が分離剤表面と相互作用する頻度が高くなり、分離性能の向上や処理量の増大を見込めるため好ましい。また、比表面積が上限値以下であると、分離性能悪化の原因となる不要な相互作用を減らすことができるため好ましい。
【００５６】
４）多孔性粒子の体積平均粒子径が１〜５０μｍである。より好ましくは３〜２０μｍであって、さらに好ましくは５〜１４μｍである。体積平均粒子径が上限値以下であって、小さいほど高い理論段数を与えることができる。一方で、体積平均粒子径が下限値以上であると、圧力損失が低下し、設備上の問題が低下し、工業的な使用が容易になるため好ましい。
【００５７】
本発明の第１実施形態のヒトインスリン精製用分離剤の体積平均粒子径、最頻度細孔半径、細孔容積、比表面積は、前述の多孔性粒子の特徴と同じ範囲を有することが好ましい。基本的には、本発明の第１実施形態のヒトインスリン精製用分離剤の粒径や細孔物性は、用いる多孔性粒子の特徴が反映されるものである。
【００５８】
なお、体積平均粒子径は、コールターカウンター法によって測定される。試料を所定の塩化ナトリウム水溶液の分散液とし、測定する粒径の範囲がアパチャー径の２〜６０％となるアパチャーを使用する。コールターカウンターを用いて濃度計の数値が５〜１０％になるように試料を７質量％の塩化ナトリウム水溶液に分散した懸濁液を用いて測定する。測定により得られる体積統計値の平均径を体積平均粒子径とする。
【００５９】
上記体積平均粒子径を有する本発明の第１実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、例えば、既知の分級方法により得られる。分級法としては、例えば、篩による分別、水流を用いる水篩、気流を用いる風篩、沈降速度差を利用した沈降分級、遠心力を利用した遠心分級等が利用できる。また、日本国特願昭６３−１１６９１６（日本国特開平１−２８９８０２号公報）に記載されている均一粒径製造技術によっても、上記均一係数を有する本発明の第１実施形態のヒトインスリン精製用分離剤を得ることができる。
【００６０】
（均一係数）
本発明の第１実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、粒度分布がシャープであることが好ましく、下記算出法により示される均一係数が通常１．７以下、好ましくは１．５以下、さらに好ましくは１．３以下である。均一係数が上限値以下であると逆相クロマトグラフィー分離の為に多孔質架橋重合体粒子をカラムに充填した時、カラムの理論段数が上がり、十分な分離性が得られる。
【００６１】
〔均一係数算出法〕
均一係数は、測定により得られる体積統計値の２５％径及び７５％径より、次式（Ｉ）によって求めることができる。
均一係数＝｛２５％径（μｍ）｝／｛７５％径（μｍ）｝・・・（Ｉ）
【００６２】
［イオン交換基］
本発明の第１実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、上述のとおり、多孔性粒子と、前記多孔性粒子に結合したイオン交換基とを有することが好ましい。
イオン交換基は、イオン性官能基が多孔性粒子に結合することで形成される。その際、イオン交換基は、直接多孔性粒子に結合されていてもよいし、イオン性官能基以外の構造を有する側鎖を介して結合されていてもよい。
【００６３】
本発明の第１実施形態で好ましく用いられるイオン性官能基としては、例えば、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アンモニウム基等の塩基性官能基、又はカルボキシル基、スルホ基、フェノール基等の酸性官能基が挙げられるが、ヒトインスリンの等電点（５．３〜５．４）より低いｐＨで精製を行う際に良好な分離を得るためには、酸性官能基が好ましく、より好ましくは強酸性官能基であり、さらに好ましくはスルホ基である。
一方で、ヒトインスリンの等電点より高いｐＨで精製を行う際に良好な分離を得るためには、イオン性官能基が塩基性官能基であることが好ましい。
【００６４】
イオン交換基としては、上記のとおり、イオン性官能基そのものでも、イオン性官能基とイオン性官能基以外の構造を有する側鎖であってもよい。よって、イオン交換基は、直接多孔性粒子に結合されていてもよいし、イオン性官能基以外の構造を有する側鎖を介して結合されていてもよい。
【００６５】
イオン性官能基とイオン性官能基以外の構造を有する側鎖としては、例えば、スルホプロピル基等のスルホアルキル基やスルホフェニル基等の芳香族スルホ基、３−スルホプロピルメタクリレート（及びその塩）や２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（及びその塩）等のスルホ基含有モノマーを含む重合体等が挙げられる。
【００６６】
強酸性官能基に代表されるイオン性官能基導入量の好適な範囲は、水による湿潤状態の分離剤における単位質量当たり、０．０１〜０．３ｍｅｑ／ｇであり、さらに好ましくは０．０４５〜０．２５ｍｅｑ／ｇであり、さらに好ましくは、０．１〜０．２ｍｅｑ／ｇである。
なお、本願明細書において、湿潤状態とは、純水に分散した分離剤粒子をメンブレンフィルター（親水性デュラポアＳＶＬＰ０４７００（孔サイズ５μｍ）、メルクミリポア社製）上で真空濾過を行い、水分が落ちなくなった時点で回収した状態である。
【００６７】
強酸性官能基に代表されるイオン性官能基導入量が下限値以上であると、クロマトグラフィーにおいてインスリンが十分に保持されやすく、所望の分離性が達成できやすくなる。また、イオン交換基導入量が上限値以下であると、クロマトグラフィーにおいてインスリンの保持が強くなり過ぎず、溶離が困難となることを防ぎやすくなる。
【００６８】
また、イオン交換基は、液体クロマトグラフィー分離におけるインスリンの溶離性向上及び非特異吸着抑制の観点から、イオン性官能基を含む水溶性高分子であることが好ましい。
【００６９】
イオン性官能基を含む水溶性高分子としては、例えば、３−スルホプロピルメタクリレート及びその塩や、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸及びその塩等のスルホ基含有モノマーを含む重合体、デキストランやプルラン等の非イオン性高分子にイオン性官能基を導入したもの等が挙げられる。
【００７０】
多孔性粒子表面にイオン交換基を導入する方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、多孔性粒子表面の反応性基であるエポキシ基や水酸基、ビニル基等の官能基を介して公知の官能基化剤を反応させることでイオン交換基を導入できる。多孔性粒子表面に側鎖として高分子化合物を結合させる場合には、事前に調製された高分子化合物を多孔性粒子表面の官能基を介して結合させてもよいし、表面グラフト重合等により高分子化合物の調製と多孔性粒子表面への結合を同時に行ってもよい。
【００７１】
側鎖として高分子化合物を用いる場合、その分子量や多孔性粒子表面への結合量は、適宜選択され得るが、分子量や結合量が増加するにつれて分離剤をカラムに充填した場合の通液圧力が高くなるため、実用上問題ない範囲で選択されることが好ましい。
【００７２】
本発明の第１実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、多孔性粒子の親水性／疎水性を制御するために、イオン交換基を含まない親水性、疎水性を持つ側鎖が導入されていてもよい。親水性官能基としては、例えば、ヒドロキシル基やアミド基、シアノ基等が挙げられ、疎水性官能基としては、例えば、オクチル基やオクタデシル基等のアルキル基、フェニル基やベンジル基等の芳香族基が挙げられる。
【００７３】
［ヒトインスリン精製用分離剤の特性］
本発明の第１実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、以下の液体クロマトグラフィー条件によりヒトインスリンを単離した際に、９９．５％純度で回収した際のヒトインスリン回収率が７０％以上となることを特徴とする。
精製効率の観点からヒトインスリン回収率は、高い方が好ましく、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。
【００７４】
（液体クロマトグラフィーの分離条件）
カラムサイズ：１５０ｍｍ×４．６ｍｍ  内径
溶離液：水／ｐＨ調整剤／水溶性有機溶媒／塩
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃
測定波長：ＵＶ２８０ｎｍ
サンプル：下記式（１）で表されるヒトインスリン９６質量％及び下記式（２）で表されるｄｅｓＢ３０インスリン４質量％を含むインスリン混合物を１００ｍｇ／ｍＬに調製した溶液
サンプル注入量：１００μＬ
【００７５】
【化４】
2018147393.tif 000005
【００７６】
上記回収率の値は、使用する分離剤の体積平均粒子径、細孔物性、表面官能基量及び官能基種の組合せ、液体クロマトグラフィーにおける移動相中の有機溶媒濃度やｐＨによって、適宜調整することができる。
【００７７】
液体クロマトグラフィー溶離液は、ヒトインスリンを十分溶解するものであればよく、水、ｐＨ調整剤、水溶性有機溶媒、塩等の液体クロマトグラフィーで一般的に使用される物質を含む。溶離液は、インスリン溶液１に含まれる溶媒と類似した組成及びｐＨであることが好ましいが、必ずしも限定されるものではない。
【００７８】
水溶性有機溶媒としては、例えば、アルコール類やアセトニトリル等が用いられ、高い分離性を得るため、及び通液時の圧力を低減するために、好ましくはアセトニトリルが用いられる。
【００７９】
溶離液中の水溶性有機溶媒濃度は、５〜５０体積％が好ましく、より好ましくは１０体積％以上、さらに好ましくは２０体積％以上であって、より好ましくは４０体積％以下である。水溶性有機溶媒濃度が５体積％以上であると、インスリンの溶離が容易になり、５０体積％以下であると、溶離液中に添加した塩類の析出を抑制することができる。
【００８０】
本発明の第一実施形態で用いる液体クロマトグラフィー溶離液としては、アセトニトリルを１０〜５０体積％含む溶離液が特に好ましい。
【００８１】
また、溶離液中の水の含有量は、インスリン及びｐＨ調整剤等の溶解性の観点から、４０〜９５体積％が好ましく、より好ましくは５０〜９０体積％、さらに好ましくは６０〜８０体積％である。
【００８２】
さらに、溶離液中のｐＨ調整剤の含有量は、十分なｐＨ調整能を得るため、溶離液体積当たり０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上が好ましく、クロマトグラフィーにおける分離剤とインスリンの相互作用を阻害しないために１ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましい。
【００８３】
ｐＨ調整剤は、酸、塩基及びｐＨ緩衝能をもつ塩類が適宜用いられる。ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、リン酸等の無機酸；これらの無機酸の塩；酢酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸；これらの有機酸の塩等が挙げられ、好ましくは有機酸、有機酸の塩であり、より好ましくは酢酸である。
【００８４】
溶離液のｐＨは、好ましくは５．０以下又は６．０以上、より好ましくは４．０以下又は７．０以上である。溶離液のｐＨが５．０以下又は６．０以上であると、インスリンの溶解性が十分で、精製時に析出等の支障を抑制することができる。
【００８５】
溶離工程における溶離液のｐＨは、液体クロマトグラフィーに用いる分離剤の種類、特にイオン交換基の種類に応じて設定することが好ましい。例えば、イオン交換基として酸性官能基が導入された分離剤を用いる場合には、精製対象となるインスリンの等電点（５．３〜５．４）より低いｐＨとし、イオン交換基として塩基性官能基が導入された分離剤を用いる場合には、精製対象となるインスリンの等電点より高いｐＨに設定するのが好ましい。
【００８６】
溶離液中の塩は、主に分離剤に吸着されたインスリンをイオン交換作用により溶離させる目的で添加される。塩としては、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等の無機塩；酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム等の有機塩等が挙げられ、精製設備の材質や溶離液に対する溶解度等に鑑みて適宜選択される。工業スケールで使用した場合に低コストとなり、化学物質としての危険性及び有害性が低いことから、溶離液中の塩は、過塩素酸及び過塩素酸塩以外の塩が好ましい。
溶離液中の塩濃度は、溶離工程において適宜変化し得るが、塩の析出防止の観点から２ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、さらに好ましくは１ｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００８７】
＜ヒトインスリンの精製方法＞
本発明の第１実施形態の精製方法は、本発明の第１実施形態のヒトインスリン精製用分離剤を用いることを特徴とする。
【００８８】
本発明の第１実施形態の精製方法は、分離剤充填カラムを用いた液体クロマトグラフィーで実施され、上述のインスリン溶液１を準備する工程、分離剤充填カラムを準備する工程、前記カラムへの負荷工程、及び溶離液をカラムに通液することによる各成分の溶離工程が含まれる。本発明の第１実施形態の精製方法について、各工程に分けて以下に説明する。
【００８９】
［インスリン溶液１準備工程］
本発明の第１実施形態の精製方法で用いられるインスリン溶液１は、＜ヒトインスリン精製用分離剤＞で記したインスリン溶液１と同様のものを用いる。
【００９０】
本発明の第１実施形態の精製方法では、上記インスリン溶液１から、主としてｄｅｓＢ３０インスリンを分離除去してヒトインスリンを単離することができる。
【００９１】
［分離剤充填カラム準備工程］
本発明の第１実施形態の精製方法は、本発明の第１実施形態のヒトインスリン精製用分離剤を用いた液体クロマトグラフィーにて実施される。
そのため、当該分離剤を準備し、当該分離剤をカラムに充填することを要する。
【００９２】
本発明の第１実施形態の精製方法において、当該分離剤は、液体クロマトグラフィー用充填カラムに充填された状態で用いられるが、カラムの構造及びサイズは、特に限定されるものではない。また、カラムへの当該分離剤充填方法についても特に限定されるものではないが、均一な充填層を形成するうえでは、当該分離剤を充填用溶媒に分散させたスラリー状態でカラムに投入して充填する湿式充填が好ましい。
【００９３】
［分離剤充填カラムへの負荷工程］
本発明の第１実施形態の精製方法では、本発明の第１実施形態のヒトインスリン精製用分離剤を充填したカラムへインスリン溶液１を負荷し、液体クロマトグラフィーにて実施される。
【００９４】
カラムへインスリン溶液１を負荷する工程においては、ヒトインスリン及びｄｅｓＢ３０インスリンと当該分離剤との相互作用により、ヒトインスリン及びｄｅｓＢ３０インスリンがカラム内に保持される。本工程で、当該分離剤と相互作用せずカラムに保持されない不純物が、カラム外に出ることで除去される。
【００９５】
負荷するインスリン溶液１は、ヒトインスリン及びｄｅｓＢ３０インスリンが十分溶解されるように調整しておくことが好ましく、水、ｐＨ調整剤、有機溶媒、塩類等の液体クロマトグラフィーで一般的に使用される物質を含む。インスリン溶液１に含まれる溶媒は、前述の溶離液と類似した組成であることが好ましいが、必ずしも限定されるものではない。
【００９６】
有機溶媒としては、例えば、アルコール類やアセトニトリル等の水溶性有機溶媒が用いられ、高い分離性を得るため、及び通液時の圧力を低減するために好ましくはアセトニトリルが用いられる。
【００９７】
インスリン溶液１中の有機溶媒濃度は、負荷工程での不要なインスリン溶離を防止するために５０体積％以下が好ましく、さらに好ましくは３０体積％以下である。また、インスリン溶液１のｐＨについては、負荷工程でのインスリン析出やその後の溶離工程でのカラム内ｐＨ変動を抑制するため、前述の溶離液とのｐＨ差が、好ましくは１以下であり、さらに好ましくは０．５以下である。
【００９８】
インスリン溶液１中のヒトインスリン濃度及びｄｅｓＢ３０インスリン濃度の合計濃度は、精製目的により適宜選択され得るが、インスリン溶解性及び分離効率の観点から１０００ｍｇ／ｍＬ以下が好ましい。より好ましくは５００ｍｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１００ｍｇ／ｍＬ以下であって、充分な精製効率を得るためには、０．１ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、より好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上である。インスリン溶液１中のヒトインスリン濃度及びｄｅｓＢ３０インスリン濃度の合計濃度は、水や有機溶媒、その他ｐＨ調整剤等の添加剤の量によって調整し得る。
【００９９】
ｐＨ調整剤は、酸、塩基及びｐＨ緩衝能をもつ塩類が適宜用いられる。ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、リン酸等の無機酸；これらの無機酸の塩；酢酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸；これらの有機酸の塩等が挙げられ、好ましくは有機酸、有機酸の塩であり、より好ましくは酢酸である。
【０１００】
調整後のインスリン溶液１のｐＨは、好ましくは５．０以下又は６．０以上、より好ましくは４．０以下又は７．０以上である。インスリン溶液１のｐＨが５．０以下又は６．０以上であると、インスリンの溶解性が十分で、精製時に析出等の支障を抑制することができる。
【０１０１】
インスリン溶液１中の塩濃度は、負荷工程での不要なインスリン溶離を防止するために０．５ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、さらに好ましくは０．２ｍｏｌ／Ｌ以下である。
【０１０２】
インスリン溶液１中に含まれるｄｅｓＢ３０インスリンの濃度は、特に限定されるものではないが、ヒトインスリン量に対しｄｅｓＢ３０インスリン量が一定量以下であると精製効率が上昇するため、ヒトインスリン及びｄｅｓＢ３０インスリンの合計量に対し、好ましくは５０質量％以下、さらに好ましくは１０質量％以下である。
【０１０３】
また、一回の精製における分離剤充填カラムに対するインスリン負荷量についても精製目的により適宜選択され得るが、負荷量が一定量以下であると精製効率が上昇するため、カラムに充填された分離剤体積に対して好ましくは１００ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ以下で負荷する。
【０１０４】
カラムへのインスリン溶液１の負荷前後には、必要に応じ、溶離工程で用いられる溶離液と同じ又は類似組成の洗浄液にてカラム内を洗浄・平衡化する。洗浄液中の有機溶媒濃度は、負荷後のインスリン溶離が不要に早まることを防止するために、溶離液に含まれる有機溶媒濃度以下であることが好ましい。また、洗浄液のｐＨについては、負荷後のインスリン析出や溶離工程でのカラム内ｐＨ変動を抑制するため、前述の溶離液とのｐＨ差が、好ましくは１以下であり、さらに好ましくは０．５以下である。
【０１０５】
［溶離工程］
本発明の第１実施形態の精製方法では、前述の溶離液を、インスリン溶液１を負荷したカラムに通液することによりヒトインスリンを溶離し、各成分の溶離を行う工程を有する。特に、塩を含む溶離液によってヒトインスリンを溶離する工程を有することが好ましく、その場合は、経時的に溶離液中の塩濃度を変化させるグラジエント溶離及び塩濃度が一定であるイソクラティック溶離が用いられる。
【０１０６】
本発明の第１実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、ヒトインスリンとｄｅｓＢ３０インスリンを効果的に分離することができることから、ヒトインスリンの精製に好適に用いることができる。
上記精製は、本発明の第１実施形態のヒトインスリン精製用分離剤をカラムに充填し、不純物としてｄｅｓＢ３０インスリンを含むヒトインスリン溶液を前記カラムに通過させることで行うことができる。
【０１０７】
〔第２実施形態〕
＜ヒトインスリン精製用分離剤＞
本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、下記式（１）で表されるヒトインスリン及び下記式（３）で表されるＡ２１デスアミドインスリンを含む溶液（以下、「インスリン溶液２」と称することがある。）から、前記分離剤を用いて下記液体クロマトグラフィーの分離条件によりヒトインスリンを単離する際に、９９．９％純度で回収したときのヒトインスリンの回収率が、９７％以上である。
なお、上記「純度」及び「回収率」は、実施例に記載の方法で算出することができる。
【０１０８】
（液体クロマトグラフィーの分離条件）
カラムサイズ：１５０ｍｍ×４．６ｍｍ  内径
溶離液：水／ｐＨ調整剤／水溶性有機溶媒
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃
測定波長：ＵＶ２８０ｎｍ
サンプル：下記式（１）で表されるヒトインスリン９６質量％及び下記式（３）で表されるＡ２１デスアミドインスリン４質量％を含むインスリン混合物を１００ｍｇ／ｍＬに調製した溶液
サンプル注入量：４００μＬ
【０１０９】
【化５】
2018147393.tif 000006
【０１１０】
［インスリン溶液２］
本発明の第２実施形態で用いるインスリン溶液２は、上記式（１）で表されるヒトインスリン及び上記式（３）で表されるＡ２１デスアミドインスリンを含む溶液である。
【０１１１】
上記式（３）で表されるＡ２１デスアミドインスリンは、例えば、上記式（１）で表されるヒトインスリンを酸性溶液中で保持することで、不純物として生成する。
【０１１２】
インスリン溶液２には、Ａ２１デスアミドインスリン以外の不純物が含まれていてもよい。また、インスリン溶液２には、ヒトインスリン及びＡ２１デスアミドインスリンの調製並びに処理に使用された各種物質が含まれていてもよい。
【０１１３】
インスリン溶液２中の溶媒は、ヒトインスリンを十分溶解するものであればよく、水、ｐＨ調整剤、有機溶媒、塩類等の液体クロマトグラフィーで一般的に使用される物質を含む。インスリン溶液２に含まれる溶媒は、溶離液と類似した組成及びｐＨであることが好ましいが、必ずしも限定されるものではない。
【０１１４】
［多孔性粒子］
本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、多孔性粒子と、前記多孔性粒子に結合した疎水性官能基と、前記多孔性粒子に結合したイオン交換基とを有することが好ましい。
【０１１５】
本発明の第２実施形態で好ましく用いられる多孔性粒子は、架橋性合成高分子からなる多孔質の粒子であれば特に限定されない。架橋性合成高分子としては、例えば、ポリビニルアルコール系重合体、スチレン−ジビニルベンゼン系重合体や（メタ）アクリル系重合体が挙げられ、好ましくは（メタ）アクリル系重合体である。
【０１１６】
なお、本明細書において、スチレン−ジビニルベンゼン系とは、重合体を構成する原料となる単量体の５０質量％以上、好ましくは８０質量％以上が、スチレン及びジビニルベンゼンからなることを言う。また、本明細書において、（メタ）アクリル系とは、重合体を構成する原料となる単量体の５０質量％以上、好ましくは８０質量％以上が、（メタ）アクリレートからなることを言う。
【０１１７】
本発明の第２実施形態で好ましく用いられる架橋構造を持つ、球状の多孔性粒子は、典型的には、重合性モノビニル単量体、重合性ポリビニル単量体、多孔質化剤、重合開始剤等を含むモノマー相を、分散安定剤等を含む水相に分散させ、加熱等による重合反応を行うによって得られる。この際、後述する疎水性官能基及びイオン交換基を多孔性粒子の表面に結合させるために、多孔性粒子の表面上には、反応性基が存在する必要がある。前記反応性基は、上述の重合性モノビニル単量体又は重合性ポリビニル単量体として、反応性基となり得る官能基を有する単量体を選択することで導入することができる。
【０１１８】
本発明の第２実施形態で好ましく用いられる多孔性粒子は、懸濁重合法、又は粒子分布の狭い（粒子径単分散の）種粒子を用い、これにさらにビニル単量体を含浸させて重合する、所謂シード重合法を利用して製造することにより容易に得られる。
【０１１９】
反応性基としては、例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、ハロゲン基、エポキシ基、ビニル基等が挙げられるが、官能基導入のし易さの観点から、ビニル基、エポキシ基が好ましい。
【０１２０】
多孔性粒子の重合に用いられる重合性モノビニル単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸等の不飽和カルボン酸類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル等の（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸フェニル、（メタ）アクリル酸３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸２−クロロエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸２，３−ジヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸ジエチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸テトラヒドロフルフリル等の（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド誘導体；スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、α−メチルスチレン、クロロスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン及びそのアルキル又はハロゲン置換体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類；メチルビニルエーテル、エチルビニルエーテル等のビニルエーテル類；アリルアルコール及びそのエステル又はエーテル類；（メタ）アクリロニトリル、ビニルスルホン酸、ｐ−スチレンスルホン酸、ビニルピリジン、ビニルピロリドン等、その他のビニル化合物；等が挙げられる。これらの重合性モノビニル単量体は、必ずしも添加する必要はなく、また、単独でも二種類以上の混合においても用いることができる。
【０１２１】
また、重合性ポリビニル単量体としては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、２，４，６−トリビニルエチルベンゼン等の芳香族ポリビニル化合物；（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンジ（メタ）アクリレート、ヒドロキノンジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリレート類；グリセリントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート等のトリ（メタ）アクリレート類；テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート等のテトラ（メタ）アクリレート類；ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート等のペンタ（メタ）アクリレート類；ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）アクリレート等のヘキサ（メタ）アクリレート類；アジピン酸ジビニル、マレイン酸ジアリル、フタル酸ジアリル、１，３，５−ベンゼントリカルボン酸トリアリル等のポリカルボン酸ポリビニルエステル、ポリカルボン酸ポリアリルエステル類；ジビニルエーテル、（ポリ）エチレングリコールジビニルエーテル、トリメチロールプロパンジアリルエーテル、ペンタエリスリトールトリアリルエーテル等のポリオールポリビニルエーテル、ポリオールポリアリルエーテル類；ブタジエン、メチレンビスアクリルアミド等その他のポリビニル化合物；等が挙げられ、好ましくはポリ（メタ）アクリレート類であり、より好ましくはジ（メタ）アクリレート類である。
【０１２２】
これらの重合性ポリビニル単量体は、単独でも二種類以上の混合においても用いることができる。重合性ポリビニル単量体の全重合性ビニル単量体に対する割合は、３０〜１００質量％であり、好ましくは５０〜１００質量％である。重合性ポリビニル単量体の全重合性ビニル単量体に対する割合が３０質量％以上の場合、得られる多孔性粒子の機械的強度に優れる。
【０１２３】
本発明の第２実施形態で好ましく用いられる多孔性粒子は、（メタ）アクリル系重合体からなることが好ましく、公知の多孔質（メタ）アクリル系重合体をベースとして、所望の官能基を導入することにより製造することができる。例えば、重合性モノビニル単量体としてエポキシ基等の官能基を有するモノビニル（メタ）アクリレートと、重合体ポリビニル単量体として架橋性（メタ）アクリレートとの共重合で得られる、架橋構造を有する多孔性粒子が挙げられる。モノビニル（メタ）アクリレート及び架橋性（メタ）アクリレートの有する官能基が、多孔性粒子の反応性基として働く。
【０１２４】
官能基を有するモノビニル（メタ）アクリレートとしては、例えば、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート等の水酸基を１個以上有する（メタ）アクリル酸の多価アルコールエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等のＮ−置換（メタ）アクリルアミド、アクリルアミド、メタアクリルアミド、グリシジル（メタ）アクリレートあるいはこれらの混合物等が挙げられる。特に、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレートあるいはこれらの混合物が好ましい。
【０１２５】
例えば、十分な分離性能を示すために必要な官能基を導入するのに必要との理由から、（メタ）アクリル系重合体を構成する単量体の１０質量％以上がグリシジル（メタ）アクリレートであることが好ましく、より好ましくは２０質量％以上である。
【０１２６】
また、架橋性（メタ）アクリレートとしては、例えば、多価アルコールのポリ（メタ）アクリレートやアルキレンポリ（メタ）アクリルアミドが好ましい。具体的には、例えばエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、アリル（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラヒドロキシブタンジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、メチレンビスアクリルアミド、ピペラジンジアクリルアミド、ジアリル酒石酸ジアミド等が挙げられ、これらは単独でも混合物としても用いられるが、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート及びトリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【０１２７】
例えば、多孔性粒子の機械的強度の維持や通液時の耐圧性確保の理由から、（メタ）アクリル系重合体を構成する単量体の３０質量％以上がエチレングリコールジ（メタ）アクリレートであることが好ましく、より好ましくは５０質量％以上である。
【０１２８】
高い分離性能を発揮するのに必要な官能基導入量と低い圧力損失による良好な通液性能を両立する、モノビニル（メタ）アクリレートと架橋性（メタ）アクリレートの割合は、モノビニル（メタ）アクリレート／架橋性（メタ）アクリレート（質量比）＝７０／３０〜０／１００であることが好ましく、より好ましくは３０／７０〜１０／９０である。
【０１２９】
本発明の第２実施形態で好ましく用いられる多孔性粒子は、懸濁重合又はシード重合を、多孔質化剤の存在下、実施することにより所望の多孔質性を得ることができる。
【０１３０】
そのための多孔質化剤すなわち多孔質化溶媒としては、重合時に相分離剤として作用し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒であり、重合性ビニル単量体を溶解するがその重合体は、溶解しないものであり、具体的には、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ドデカン、シクロヘキサン等の脂肪族及び脂環式炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン等の芳香族炭化水素類；メチルエチルケトン等のケトン類；ジブチルエーテル等のエーテル類；ヘキサノール、オクタノール、ドデカノール、シクロヘキサノール、ラウリルアルコール等の脂肪族及び脂環式アルコール類；酢酸エチル、酢酸ブチル、フタル酸ジメチル、フタル酸ジエチル等のエステル類；ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエチレン等のハロゲン化炭化水素類；クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等の芳香族ハロゲン化炭化水素類；等が挙げられる。これらの溶媒は、単独でも二種類以上の混合においても用いることができる。
【０１３１】
また、多孔質化溶媒の添加量については、全重合性ビニル単量体に対して５０〜４００質量％、好ましくは１００〜２５０質量％の範囲である。多孔質化溶媒の添加量が下限値以上の場合、クロマトグラフィーにおける分離性を充分に発揮するための細孔が十分形成され、また、多孔質化溶媒の添加量が上限値以下の場合、得られる多孔性粒子の機械的強度に優れる。
【０１３２】
重合開始剤としては、例えば、２，２′−アゾビスイソブチロニトリル、２，２′−アゾビス（イソ酪酸メチル）、２，２′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４−アゾビス（４−シアノペンタン酸）等のアゾ系重合開始剤；ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ジ−ｔ−ブチルペルオキシド、ベンゾイルペルオキシド、ジ−イソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ−ブチルペルオキシイソブチレート等の過酸化物系重合開始剤；等が挙げられる。
【０１３３】
その他、モノマー相には、重合反応の調節のために連鎖移動剤や重合禁止剤が適宜添加されてもよい。
水相中には、モノマー相の分散安定性を増すために分散安定剤を添加することが好ましい。分散安定剤としては、例えば、公知のアニオン系、ノニオン系の界面活性剤、及びポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミン、ビニルアルコール−酢酸ビニル共重合体等の合成高分子が挙げられる。
【０１３４】
その他、水相には、重合中の高分子粒子の凝集防止等のために重合禁止剤、懸濁安定剤や塩類が適宜添加されてもよい。
【０１３５】
本発明の第２実施形態で好ましく用いられる多孔性粒子は、以下の１）〜４）の少なくとも１つの物理的性質を持つものが好ましく、以下の１）〜４）の少なくとも２つの物理的性質を持つものがより好ましく、以下の１）〜４）の少なくとも３つの物理的性質を持つものがさらに好ましく、以下の１）〜４）のすべての物理的性質をもつものが特に好ましい。
【０１３６】
１）多孔性粒子の最頻度細孔半径が１０〜１０００Åである。より好ましくは５０Å以上、さらに好ましくは１５０Å以上であって、より好ましくは５００Å以下、さらに好ましくは３００Å以下である。最頻度細孔半径が下限値以上であることで、ヒトインスリンや蛋白質といった高分子が粒子内に拡散しやすくなり、分離性能の向上や処理量の増大を見込めるため好ましい。また、最頻度細孔半径が上限値以下であると、機械的強度が向上し、通液時の圧力損失が低下するため好ましい。
【０１３７】
２）細孔容積が多孔性粒子の単位質量当たり０．１〜２．５ｍＬ／ｇである。より好ましくは０．２ｍＬ／ｇ以上、さらに好ましくは０．５ｍＬ／ｇ以上であって、より好ましくは１．５ｍＬ／ｇ以下、さらに好ましくは１．２ｍＬ／ｇ以下である。細孔容積が上記の範囲を満たすことによりヒトインスリンや蛋白質といった高分子の吸着サイトを確保することで処理量の増大を見込めるため好ましい。また、細孔容積が上限値以下であると、粒子内の空隙率が低下しカラム体積当たりの吸着量が大きくなるため好ましい。
【０１３８】
３）比表面積が多孔性粒子の単位質量当たり１０〜１０００ｍ２／ｇである。より好ましくは５０ｍ２／ｇ以上、さらに好ましくは１００ｍ２／ｇ以上であって、より好ましくは５００ｍ２／ｇ以下、さらに好ましくは３００ｍ２／ｇ以下である。比表面積が下限値以上であることで、インスリン分子が分離剤表面と相互作用する頻度が高くなり、分離性能の向上や処理量の増大を見込めるため好ましい。また、比表面積が上限値以下であると、分離性能悪化の原因となる不要な相互作用を減らすことができるため好ましい。
【０１３９】
４）多孔性粒子の体積平均粒子径が１〜５０μｍである。より好ましくは４〜３０μｍであって、さらに好ましくは１０〜２０μｍである。体積平均粒子径が上限値以下であって、小さいほど高い理論段数を与えることができる。一方で、体積平均粒子径が下限値以上であると、圧力損失が低下し、設備上の問題が低下し、工業的な使用が容易になるため好ましい。
【０１４０】
本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤の体積平均粒子径、最頻度細孔半径、細孔容積、比表面積は、前述の多孔性粒子の特徴と同じ範囲を有することが好ましい。基本的には、本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤の粒径や細孔物性は、用いる多孔性粒子の特徴が反映されるものである。
【０１４１】
なお、体積平均粒子径は、コールターカウンター法によって測定される。試料を所定の塩化ナトリウム水溶液の分散液とし、測定する粒径の範囲がアパチャー径の２〜６０％となるアパチャーを使用する。コールターカウンターを用いて濃度計の数値が５〜１０％になるように試料を７質量％の塩化ナトリウム水溶液に分散した懸濁液を用いて測定する。測定により得られる体積統計値の平均径を体積平均粒子径とする。
【０１４２】
上記体積平均粒子径を有する本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、例えば、既知の分級方法により得られる。分級法としては、例えば、篩による分別、水流を用いる水篩、気流を用いる風篩、沈降速度差を利用した沈降分級、遠心力を利用した遠心分級等が利用できる。また、日本国特願昭６３−１１６９１６（日本国特開平１−２８９８０２号公報）に記載されている均一粒径製造技術によっても、上記均一係数を有する本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤を得ることができる。
【０１４３】
［疎水性官能基］
本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、上述のとおり、多孔性粒子と、前記多孔性粒子に結合した疎水性官能基と、前記多孔性粒子に結合したイオン交換基とを有することが好ましい。
当該疎水性官能基は、当該多孔性粒子の表面上に存する反応性基との反応により直接結合されていることが好ましい。
【０１４４】
疎水性官能基としては、特に限定されないが、例えば、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−オクタデシル基等の飽和アルキル基；プロペニル基、ブテニル基、ブタジエニル基、ヘキセニル基等の不飽和アルキル基；ベンジル基、フェニル基、ナフチル基等のアリール基が挙げられ、好ましくは飽和アルキル基、不飽和アルキル基、及びアリール基のうち少なくとも１種であり、より好ましくは炭素数４〜３０の飽和アルキル基、さらに好ましくは炭素数８〜１８の飽和アルキル基である。アルキル基鎖長が長いと十分な疎水相互作用を発揮することができ、上限値よりも短いと目的物質の粒子内拡散を阻害することなく、分離性能が向上するため好ましい。
【０１４５】
疎水性官能基の導入量は、乾燥状態の分離剤における単位質量当たり０．０１ｇ／ｇ以上であることが好ましく、より好ましくは０．０３ｇ／ｇ以上、さらに好ましくは０．０５ｇ／ｇ以上であって、好ましくは０．５ｇ／ｇ以下、より好ましくは０．２５ｇ／ｇ以下、さらに好ましくは０．２ｇ／ｇ以下である。
なお、本願明細書において、乾燥状態とは、５０℃の減圧下において分離剤の質量変化が無くなるまで水分を蒸発させた状態である。
【０１４６】
疎水性官能基の導入量が、上限値以下であると疎水性相互作用が必要以上に発揮されて、親水性相互作用を阻害してしまい分離性能が低下することを防止できることから好ましく、下限値以上であると疎水性相互作用が十分に発揮されて高い分離性能が得られることから好ましい。
【０１４７】
［イオン交換基］
本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、上述のとおり、多孔性粒子と、前記多孔性粒子に結合した疎水性官能基と、前記多孔性粒子に結合したイオン交換基とを有することが好ましい。
【０１４８】
当該イオン交換基は、当該多孔性粒子の表面上に存する反応性基との反応により直接結合されていることが好ましい。
イオン交換基としては、特に限定されないが、例えば、４級アンモニウム基、３級アミノ基、２級アミノ基、１級アミノ基等のアニオン交換基、又はスルホ基、カルボキシル基等のカチオン交換基から選択され、好ましくはアニオン交換基であり、より好ましくは４級アンモニウム基、３級アミノ基、長鎖アルキルアミノ基であり、さらに好ましくは長鎖アルキルアミノ基である。
【０１４９】
長鎖アルキル基を持つアニオン交換基を導入することにより、イオン交換基の立体的な自由度が増して分離対象物との相互作用がより強くなり、分離性能が向上するため好ましい。本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤を用いてヒトインスリンの精製を行う場合には、イオン交換基を長鎖アルキルアミノ基とすることが特に好ましい。
【０１５０】
イオン交換基の導入量は、乾燥状態の分離剤における単位質量当たり０．０１ｍｅｑ／ｇ以上であることが好ましく、より好ましくは０．０５ｍｅｑ／ｇ以上、さらに好ましくは０．１ｍｅｑ／ｇ以上であって、好ましくは２．０ｍｅｑ／ｇ以下、より好ましくは１．０ｍｅｑ／ｇ以下、さらに好ましくは０．８ｍｅｑ／ｇ以下である。イオン交換基の導入量が、上限値以下であると必要以上のイオン相互作用により疎水相互作用が阻害されることによる分離性能の低下を防止できることから好ましく、下限値以上であるとイオン相互作用が十分に発揮されて高い分離性能が得られることから好ましい。
【０１５１】
［ヒトインスリン精製用分離剤の製造方法］
本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤の製造方法は、多孔性粒子の表面に、直接、疎水性官能基を導入する工程とイオン交換基を導入する工程を有することが好ましい。
【０１５２】
従来技術のように、一分子中に疎水性部分とイオン交換性部分の両方を持つ側鎖のみを結合した有機高分子粒子では、疎水相互作用と親水相互作用が十分に発揮されず分離性能が不十分となることがある。
本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤による好ましい形態は、かかる問題点を解決した点で技術上の意義がある。
【０１５３】
多孔性粒子の表面に、疎水性官能基を導入する工程とイオン交換基を導入する工程とは、どの順番で行ってもよく、同時に行ってもよいが、好ましくは疎水性官能基を化学結合により導入し、次いでイオン交換基を化学結合により導入する方法である。
【０１５４】
（疎水性官能基を導入する工程）
疎水性官能基の導入は、多孔性粒子表面の反応性基に、疎水性化合物を公知の方法で反応させて化学結合させることによって導入する。多孔性粒子表面の反応性基としては、上述の通り、ビニル基、クロロメチル基、エポキシ基等が挙げられ、疎水性化合物は該反応性基と反応して化学結合を形成する官能基を持っていればよい。疎水性化合物としては、例えば、クロル基等のハロゲン基、アミノ基、チオール基等の官能基を有する化合物が好ましく、例えば、アルキルチオール、アルキルアミン、又はアルキルハライド等の飽和脂肪族アルキル化合物が挙げられる。特に好ましくは、アルキルチオールを多孔性粒子表面のビニル基及び／又はエポキシ基と反応させることによりアルキル基を導入することである。
【０１５５】
疎水性官能基の導入にあたっては、多孔性粒子を適当な溶媒中で疎水性化合物と接触させ、触媒の存在下で導入することが特に好ましい。溶媒としては、例えば、多孔性粒子を膨潤させかつ、疎水性化合物、特に飽和脂肪族アルキル化合物が溶解する溶媒が好ましく、多孔性粒子を分散可能であれば特に制限はない。また、疎水性化合物としてアルキルチオールを用いる場合、触媒として水酸化ナトリウムや水酸化リチウム等のアルカリを用いることが望ましく、該反応は窒素雰囲気で行うことが望ましい。かかる方法は容易に実施可能であり、しかも本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤の生産効率が良好だからである。
【０１５６】
（イオン交換基を導入する工程）
イオン交換基の導入は、多孔性粒子表面の反応性基に、イオン性化合物を公知の方法で反応させて化学結合させることによって導入する。多孔性粒子表面の反応性基としては、上述の通り、ビニル基、クロロメチル基、エポキシ基等が挙げられ、イオン性化合物は、該反応性基と反応して化学結合を形成し、イオン交換基を形成する化合物であればよい。
【０１５７】
イオン性化合物としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミンやジエチルエタノールアミン等の３級アミン類；ジメチルアミン、ジエチルアミン等の２級アミン類；１，２−ジアミノエタン、１，６−ジアミノヘキサン等の１級アミン類が挙げられる。特に好ましくは、イオン性化合物としてジアミノアルカンやトリメチルアミン等を用いて、多孔性粒子表面のエポキシ基と反応させることにより長鎖アルキルアミノ基や４級アンモニウム基を導入することである。
【０１５８】
イオン交換基の導入にあたっては、多孔性粒子を適当な媒体中でイオン性化合物と接触させ、加熱して導入することが特に好ましい。かかる方法は容易に実施可能であり、しかも本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤の生産効率が良好だからである。
【０１５９】
［ヒトインスリン精製用分離剤の特性］
本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、下記式（１）で表されるヒトインスリン及び下記式（３）で表されるＡ２１デスアミドインスリンを含む溶液から、前記分離剤を用いて下記液体クロマトグラフィーの分離条件によりヒトインスリンを単離する際に、９９．９％純度で回収したときのヒトインスリンの回収率が、９７％以上であることを特徴とする。
精製効率の観点からヒトインスリン回収率は、高い方が好ましく、好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
【０１６０】
（液体クロマトグラフィーの分離条件）
カラムサイズ：１５０ｍｍ×４．６ｍｍ  内径
溶離液：水／ｐＨ調整剤／水溶性有機溶媒
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃
測定波長：ＵＶ２８０ｎｍ
サンプル：下記式（１）で表されるヒトインスリン９６質量％及び下記式（３）で表されるＡ２１デスアミドインスリン４質量％を含むインスリン混合物を１００ｍｇ／ｍＬに調製した溶液
サンプル注入量：４００μＬ
【０１６１】
【化６】
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【０１６２】
上記回収率の値は、使用する分離剤の体積平均粒子径、細孔物性、表面官能基量及び官能基種の組合せ、液体クロマトグラフィーにおける移動相中の有機溶媒濃度やｐＨによって、適宜調整することができる。
【０１６３】
液体クロマトグラフィー溶離液は、ヒトインスリンを十分溶解するものであればよく、水、ｐＨ調整剤、水溶性有機溶媒等の液体クロマトグラフィーで一般的に使用される物質を含む。溶離液は、インスリン溶液２に含まれる溶媒と類似した組成及びｐＨであることが好ましいが、必ずしも限定されるものではない。
【０１６４】
水溶性有機溶媒としては、例えば、アルコール類やアセトニトリル等が用いられ、高い分離性を得るため、及び通液時の圧力を低減するために、好ましくはアセトニトリルが用いられる。
【０１６５】
溶離液中の水溶性有機溶媒濃度は、液体クロマトグラフィーの各工程において、適宜変化し得るが、５〜６０体積％が好ましく、より好ましくは１０体積％以上、さらに好ましくは２０体積％以上であって、より好ましくは５０体積％以下である。水溶性有機溶媒濃度が５体積％以上であると、インスリンの溶離が容易になり、６０体積％以下であると、溶離液中に添加した塩類の析出を抑制することができる。
【０１６６】
本発明の第２実施形態で用いる液体クロマトグラフィー溶離液としては、アセトニトリルを１０〜５０体積％含む溶離液が特に好ましい。
【０１６７】
また、溶離液中の水の含有量は、インスリン及びｐＨ調整剤等の溶解性の観点から、４０〜９５体積％が好ましく、より好ましくは５０〜９０体積％、さらに好ましくは６０〜８０体積％である。
【０１６８】
さらに、溶離液中のｐＨ調整剤の含有量は、十分なｐＨ調整能を得るため、溶離液体積当たり０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上が好ましく、クロマトグラフィーにおける分離剤とインスリンの相互作用を阻害しないために１ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましい。
【０１６９】
ｐＨ調整剤は、酸、塩基及びｐＨ緩衝能をもつ塩類が適宜用いられる。ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、リン酸等の無機酸；これらの無機酸の塩；酢酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸；これらの有機酸の塩等が挙げられ、好ましくは有機酸、有機酸の塩であり、より好ましくは酢酸及び酢酸ナトリウムの混合系である。
【０１７０】
溶離液のｐＨは、好ましくは５．０以下又は６．０以上、より好ましくは４．０以下又は７．０以上である。溶離液のｐＨが５．０以下又は６．０以上であると、インスリンの溶解性が十分で、精製時に析出等の支障を抑制することができる。
【０１７１】
溶離工程における溶離液のｐＨは、液体クロマトグラフィーに用いる分離剤の種類、特にイオン交換基の種類に応じて設定することが好ましい。例えば、イオン交換基として酸性官能基が導入された分離剤を用いる場合には、精製対象となるインスリンの等電点（５．３〜５．４）より高いｐＨとし、イオン交換基として塩基性官能基が導入された分離剤を用いる場合には、精製対象となるインスリンの等電点より低いｐＨに設定するのが好ましい。
【０１７２】
（均一係数）
本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、粒度分布がシャープであることが好ましく、下記算出法により示される均一係数が通常１．７以下、好ましくは１．５以下、さらに好ましくは１．３以下である。均一係数が上限値以下であると、逆相クロマトグラフィー分離の為に多孔質架橋重合体粒子をカラムに充填した時、カラムの理論段数が上がり、十分な分離性が得られる。
【０１７３】
〔均一係数算出法〕
均一係数は、測定により得られる体積統計値の２５％径及び７５％径より、次式（Ｉ）によって求めることができる。
均一係数＝｛２５％径（μｍ）｝／｛７５％径（μｍ）｝・・・（Ｉ）
【０１７４】
（その他物性）
本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、分離対象物であるヒトインスリンが粒子内に拡散するための空間が必要なため、多孔質粒子である事が必要である。
【０１７５】
＜ヒトインスリンの精製方法＞
本発明の第２実施形態の精製方法は、本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤を用いることを特徴とする。
【０１７６】
本発明の第２実施形態の精製方法は、分離剤充填カラムを用いた液体クロマトグラフィーで実施され、上述のインスリン溶液２を準備する工程、分離剤充填カラムを準備する工程、前記カラムへの負荷工程、及び溶離液をカラムに通液することによる各成分の溶離工程が含まれる。本発明の第２実施形態の精製方法について、各工程に分けて以下に説明する。
【０１７７】
［インスリン溶液２準備工程］
本発明の第２実施形態の精製方法で用いられるインスリン溶液２は、＜ヒトインスリン精製用分離剤＞で記したインスリン溶液２と同様のものを用いる。
【０１７８】
本発明の第２実施形態の精製方法では、上記インスリン溶液２から、主としてＡ２１デスアミドインスリンを分離除去してヒトインスリンを単離することができる。
【０１７９】
［分離剤充填カラム準備工程］
本発明の第２実施形態の精製方法は、本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤を用いた液体クロマトグラフィーにて実施される。
そのため、当該分離剤を準備し、当該分離剤をカラムに充填することを要する。
【０１８０】
本発明の第２実施形態の精製方法において、当該分離剤は、液体クロマトグラフィー用充填カラムに充填された状態で用いられるが、カラムの構造及びサイズは、特に限定されるものではない。また、カラムへの当該分離剤充填方法についても特に限定されるものではないが、均一な充填層を形成するうえでは、当該分離剤を充填用溶媒に分散させたスラリー状態でカラムに投入して充填する湿式充填が好ましい。
【０１８１】
［分離剤充填カラムへの負荷工程］
本発明の第２実施形態の精製方法では、本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤を充填したカラムへインスリン溶液２を負荷し、液体クロマトグラフィーにて実施される。
【０１８２】
カラムへインスリン溶液２を負荷する工程においては、ヒトインスリン及びＡ２１デスアミドインスリンと当該分離剤との相互作用により、ヒトインスリン及びＡ２１デスアミドインスリンがカラム内に保持される。本工程で、当該分離剤と相互作用せずカラムに保持されない不純物が、カラム外に出ることで除去される。
【０１８３】
負荷するインスリン溶液２は、ヒトインスリン及びＡ２１デスアミドインスリンが十分溶解されるように調整しておくことが好ましく、水、ｐＨ調整剤、有機溶媒、塩類等の液体クロマトグラフィーで一般的に使用される物質を含む。インスリン溶液２に含まれる溶媒は、前述の溶離液と類似した組成であることが好ましいが、必ずしも限定されるものではない。
【０１８４】
有機溶媒としては、例えば、アルコール類やアセトニトリル等の水溶性有機溶媒が用いられ、高い分離性を得るため、及び通液時の圧力を低減するために好ましくはアセトニトリルが用いられる。
【０１８５】
インスリン溶液２中の有機溶媒濃度は、負荷工程での不要なインスリン溶離を防止するために５０体積％以下が好ましく、さらに好ましくは３０体積％以下である。また、インスリン溶液２のｐＨについては、負荷工程でのインスリン析出やその後の溶離工程でのカラム内ｐＨ変動を抑制するため、前述の溶離液とのｐＨ差が、好ましくは１以下であり、さらに好ましくは０．５以下である。
【０１８６】
インスリン溶液２中のヒトインスリン濃度及びＡ２１デスアミドインスリン濃度の合計濃度は、精製目的により適宜選択され得るが、インスリン溶解性及び分離効率の観点から１０００ｍｇ／ｍＬ以下が好ましい。より好ましくは５００ｍｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１００ｍｇ／ｍＬ以下であって、充分な精製効率を得るためには、０．１ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、より好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上である。インスリン溶液２中のヒトインスリン濃度及びＡ２１デスアミドインスリン濃度の合計濃度は、水や有機溶媒、その他ｐＨ調整剤等の添加剤の量によって調整し得る。
【０１８７】
ｐＨ調整剤は、酸、塩基及びｐＨ緩衝能をもつ塩類が適宜用いられる。ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、リン酸等の無機酸；これらの無機酸の塩；酢酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸；これらの有機酸の塩等が挙げられ、好ましくは有機酸、有機酸の塩であり、より好ましくは酢酸及び酢酸ナトリウムの混合系である。
【０１８８】
調整後のインスリン溶液２のｐＨは、好ましくは５．０以下又は６．０以上、より好ましくは４．０以下又は７．０以上である。インスリン溶液２のｐＨが５．０以下又は６．０以上であると、インスリンの溶解性が十分で、精製時に析出等の支障を抑制することができる。
【０１８９】
インスリン溶液２中に含まれるＡ２１デスアミドインスリンの濃度は、特に限定されるものではないが、ヒトインスリン量に対しＡ２１デスアミドインスリン量が一定量以下であると精製効率が上昇するため、ヒトインスリン及びＡ２１デスアミドインスリンの合計量に対し、好ましくは５０質量％以下、さらに好ましくは１０質量％以下である。
【０１９０】
また、一回の精製における分離剤充填カラムに対するインスリン負荷量についても精製目的により適宜選択され得るが、負荷量が一定量以下であると精製効率が上昇するため、カラムに充填された分離剤体積に対して好ましくは１００ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ以下で負荷する。
【０１９１】
カラムへのインスリン溶液２の負荷前後には、必要に応じ、溶離工程で用いられる溶離液と同じ又は類似組成の洗浄液にてカラム内を洗浄・平衡化する。洗浄液中の有機溶媒濃度は、負荷後のインスリン溶離が不要に早まることを防止するために、溶離液に含まれる有機溶媒濃度以下であることが好ましい。また、洗浄液のｐＨについては、負荷後のインスリン析出や溶離工程でのカラム内ｐＨ変動を抑制するため、前述の溶離液とのｐＨ差が、好ましくは１以下であり、さらに好ましくは０．５以下である。
【０１９２】
［溶離工程］
本発明の第２実施形態の精製方法では、前述の溶離液を、インスリン溶液２を負荷したカラムに通液することによりヒトインスリンを溶離し、各成分の溶離を行う工程を有する。特に、水溶性有機溶媒を含む溶離液によってヒトインスリンを溶離する工程を有することが好ましく、その場合は、経時的に溶離液中の水溶性有機溶媒濃度を変化させるグラジエント溶離及び水溶性有機溶媒濃度が一定であるイソクラティック溶離が用いられる。
【０１９３】
本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤は、ヒトインスリンとＡ２１デスアミドインスリンを効果的に分離することができることから、ヒトインスリンの精製に好適に用いることができる。
上記精製は、本発明の第２実施形態のヒトインスリン精製用分離剤をカラムに充填し、不純物としてＡ２１デスアミドインスリンを含むヒトインスリン溶液を前記カラムに通過させることで行うことができる。
【実施例】
【０１９４】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、その要旨を逸脱しない限り、以下の実施例の記載に限定されるものではない。【０１９５】
〔第１実施形態に係る実施例〕
本発明の第１実施形態に係る実施例を説明する。【０１９６】
［評価方法］
以下の製造例、実施例及び比較例で得られたヒトインスリン精製用分離剤の評価方法は、以下のとおりである。【０１９７】
＜体積平均粒子径＞
体積平均粒子径は、コールターカウンター法によって測定した。試料を所定の塩化ナトリウム水溶液の分散液とし、測定する粒径の範囲がアパチャー径の２〜６０％となるアパチャーを使用した。コールターカウンター（ベックマンコールター社製）を用いて濃度計の数値が５〜１０％になるように試料を７質量％の塩化ナトリウム水溶液に分散した懸濁液を用いて測定した。測定個数を３０，０００個とし、測定により得られる体積統計値の平均径を体積平均粒子径とした。【０１９８】
＜比表面積＞
比表面積は、窒素ガス吸着法により測定した。窒素ガス吸着法は、吸着前後の圧力変化からＢＥＴの式により単分子層吸着量を求める方法であり、窒素ガス１分子の断面積から比表面積を計算することができる。
乾燥処理した多孔性粒子を秤量し、マイクロメリテックス社製フローソーブＩＩＩ２３１０型を用いて比表面積を測定した。【０１９９】
＜細孔容積、最頻度細孔半径＞
細孔容積と最頻度細孔半径は、窒素ガス吸着法により測定した。窒素ガス吸着法は、窒素ガス分子が細孔内で凝縮した時の圧力と吸着量から、細孔径と細孔容積を求める方法である。
乾燥処理した多孔性粒子を秤量し、マイクロメリテックス社製アサップ２４２０型を用いて吸脱着等温線を測定した。得られた吸脱着等温線から、積算細孔容積分布とＬｏｇ微分細孔容積分布をプロットし、細孔容積と最頻度細孔半径を求めた。【０２００】
＜イオン交換基量＞
イオン交換基量は、滴定法によって測定した。カチオン交換担体の場合、湿潤状態の担体試料を２Ｎ塩酸に浸漬することで表面のイオン交換基を再生し、その後濾液が中性になるまで充分濾過水洗した。水洗後の試料を５質量％食塩水に分散させ、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで滴定し、中和点に至るまでの滴定量から湿潤状態の担体単位質量当たりのイオン交換基量を算出した。【０２０１】
＜製造例１−１＞
（シード重合による多孔性粒子の合成）
粒子径２．１μｍの均一粒径ポリメチルメタクリレートシード粒子１ｇにドデシル硫酸ナトリウム０．８ｇと脱イオン水２００ｇを加えてシード粒子水性分散液を調製した。単量体成分としてエチレングリコールジメタクリレート４０ｇ、多孔質化剤としてトルエン６０ｇ、重合開始剤として２，２′−アゾビスイソブチロニトリル０．８ｇを混合したモノマー相をドデシル硫酸ナトリウム１．８２ｇ及び脱イオン水４６０ｇに分散したモノマー相分散液を、上記シード粒子水性分散液に加え、室温にて２０時間撹拌することによりモノマー相をシード粒子に吸収させた。【０２０２】
次いでこの分散液に５質量％ポリビニルアルコール（ゴーセノール（登録商標）  ＧＨ−２０、日本合成化学社製）水溶液１７２ｇ、亜硝酸ナトリウム０．０８６ｇ、脱イオン水２９ｇを添加し、７０℃にて２時間重合することにより重合体粒子を得た。この重合体粒子を単離後、トルエン抽出操作を行いシード粒子由来の重合体を除去した後、乾燥することにより多孔性粒子１−１の粉末を得た。【０２０３】
得られた多孔性粒子１−１の体積平均粒子径は１０．０μｍであった。また、窒素ガス吸着法により測定した粒子の細孔容積は１．０２ｍＬ／ｇ、比表面積は４４５ｍ２／ｇ、最頻度細孔半径は２２８Åであった。【０２０４】
＜製造例１−２＞
製造例１−１において、エチレングリコールジメタクリレートを２８．６ｇ、トルエンを７１．４ｇ、２，２′−アゾビスイソブチロニトリルを０．５７ｇとした以外は同様の条件にて多孔性粒子１−２の合成を行った。
得られた多孔性粒子１−２の体積平均粒子径は９．９μｍであった。また、窒素ガス吸着法により測定した粒子の細孔容積は１．１０ｍＬ／ｇ、比表面積は５０１ｍ２／ｇ、最頻度細孔半径は２５５Åであった。【０２０５】
＜製造例１−３＞
製造例１−１において、シード粒子として体積平均粒子径１．７μｍのものを用いた以外は同様の条件にて多孔性粒子１−３の合成を行った。
得られた多孔性粒子１−３の体積平均粒子径は８．０μｍであった。また、窒素ガス吸着法により測定した粒子の細孔容積は０．８９ｍＬ／ｇ、比表面積は４２０ｍ２／ｇ、最頻度細孔半径は１９７Åであった。【０２０６】
＜製造例１−４＞
製造例１−３のシード重合段階において、重合開始剤として２，２′−アゾビス（イソ酪酸メチル）を用いた以外は同様の条件にて多孔性粒子１−４の合成を行った。
得られた多孔性粒子１−４の体積平均粒子径は８．０μｍであった。また、窒素ガス吸着法により測定した粒子の細孔容積は０．８８ｍＬ／ｇ、比表面積は４３４ｍ２／ｇ、最頻度細孔半径は１７６Åであった。【０２０７】
＜製造例１−５＞
製造例１−３のシード重合段階において、単量体成分としてエチレングリコールジメタクリレート２８ｇ及びグリセリンジメタクリレート１２ｇを用いた以外は同様の条件にて多孔性粒子１−５の合成を行った。
得られた多孔性粒子１−５の体積平均粒子径は８．０μｍであった。また、窒素ガス吸着法により測定した粒子の細孔容積は０．４３ｍＬ／ｇ、比表面積は２７１ｍ２／ｇ、最頻度細孔半径は２２７Åであった。【０２０８】
＜製造例１−６＞
製造例１−４のシード重合段階において、単量体成分としてエチレングリコールジメタクリレート３３．３ｇ、多孔質化剤としてトルエン６６．７ｇ、重合開始剤として２，２′−アゾビス（イソ酪酸メチル）０．６７ｇを用いた以外は同様の条件にて多孔性粒子１−６の合成を行った。
得られた多孔性粒子１−６の体積平均粒子径は８．０μｍであった。また、窒素ガス吸着法により測定した粒子の細孔容積は０．９８ｍＬ／ｇ、比表面積は４８１ｍ２／ｇ、最頻度細孔半径は２２９Åであった。【０２０９】
＜製造例１−７＞
製造例１−３のシード重合段階において、単量体成分としてエチレングリコールジメタクリレート３２ｇ及びグリシジルメタクリレート８ｇを用いた以外は同様の条件にて多孔性粒子１−７の合成を行った。
得られた多孔性粒子１−７の体積平均粒子径は８．０μｍであった。また、窒素ガス吸着法により測定した粒子の細孔容積は０．７０ｍＬ／ｇ、比表面積は２６９ｍ２／ｇ、最頻度細孔半径は２００Åであった。【０２１０】
＜製造例１−８＞
製造例１−３のシード重合段階において、単量体成分としてエチレングリコールジメタクリレート２８ｇ及びグリシジルメタクリレート１２ｇを用いた以外は同様の条件にて多孔性粒子１−８の合成を行った。
得られた多孔性粒子１−８の体積平均粒子径は８．０μｍであった。また、窒素ガス吸着法により測定した粒子の細孔容積は０．６４ｍＬ／ｇ、比表面積は１８９ｍ２／ｇ、最頻度細孔半径は１７３Åであった。【０２１１】
＜製造例１−９＞
製造例１−４のシード重合段階において、単量体成分としてエチレングリコールジメタクリレート２０ｇ及びグリシジルメタクリレート２０ｇを用いた以外は同様の条件にて多孔性粒子１−９の合成を行った。
得られた多孔性粒子１−９の体積平均粒子径は８．０μｍであった。また、窒素ガス吸着法により測定した粒子の細孔容積は０．４２ｍＬ／ｇ、比表面積は１０５ｍ２／ｇ、最頻度細孔半径は２５２Åであった。【０２１２】
＜実施例１−１＞
撹拌器、コンデンサー、温度計及び窒素ガス導入管を備えた反応器中に製造例１−１で合成した多孔性粒子１−１を３ｇ、及び脱塩水５０ｇ、メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム４．４６ｇ、２，２′−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］ｎ水和物（ＶＡ−０５７、和光純薬工業社製）０．１０４ｇを入れて混合し、窒素雰囲気下で７０℃に加熱して５時間反応を行った。反応液を冷却後、粒子を脱塩水で洗浄、濾過することにより、イオン交換基としてスルホン酸基が導入された湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）を得た。得られた湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）についてイオン交換基量を滴定法により測定したところ、０．０９５ｍｅｑ／ｇであった。【０２１３】
得られたイオン交換担体（分離剤）をカラムに充填し、以下の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／ｄｅｓＢ３０インスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。【０２１４】
（ヒトインスリン単離条件）
評価装置：島津製作所製  ＨＰＬＣシステム
カラムサイズ：１５０ｍｍ×４．６ｍｍ  内径
溶離液Ａ１：酢酸／水＝１／１００（体積比）
溶離液Ｂ１：酢酸／２Ｍ  ＮａＣｌ＝１／１００（体積比）
溶離液Ｃ１：酢酸／アセトニトリル＝１／１００（体積比）
カラム平衡化条件：溶離液Ｂ１  ０体積％、溶離液Ｃ１  ３５体積％
溶出条件：溶離液Ｂ１  ０体積％→５０体積％／４０分、５０体積％で５分保持
溶離液Ｃ１  ３５体積％（一定）
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃
測定波長：ＵＶ２８０ｎｍ
サンプル：上記式（１）で表されるヒトインスリン９６質量％及び上記式（２）で表されるｄｅｓＢ３０インスリン４質量％を含むインスリン混合物溶液を１００ｍｇ／ｍＬに調製した溶液
サンプル注入量：１００μＬ【０２１５】
以下にクロマトグラフィーの手順を示す。
（インスリン溶液の調製）
３％酢酸水溶液中にヒトインスリンが９６ｍｇ／ｍＬ、ｄｅｓＢ３０インスリンが４ｍｇ／ｍＬとなるようにインスリン溶液を調製した。【０２１６】
（カラム平衡化）
分離剤を充填したカラムに対し、上記平衡化条件にて平衡化を行った。【０２１７】
（インスリン溶出）
平衡化を行ったカラムに対し、上記インスリン溶液１００μＬをロードし、ＨＰＬＣ装置を用いた上記溶出条件にてクロマトグラフィー分離を行った。溶出液は、ＵＶ２８０ｎｍでモニターし、ヒトインスリン及び／又はｄｅｓＢ３０インスリンが含まれる部分は、０．３３ｍＬごとにフラクションとして回収した。【０２１８】
（インスリン純度及び回収率の測定）
回収した各フラクションについて逆相ＨＰＬＣカラムを用いて分析し、各フラクション中のヒトインスリン及びｄｅｓＢ３０インスリン含量を算出することで、上記溶出条件において、ヒトインスリン純度９９．５％となるように溶出液を回収した場合のヒトインスリン回収率を求めた。【０２１９】
「ヒトインスリン純度」とは、上記液体クロマトグラフィーにより回収された溶出液において、以下の計算式により算出される数値である。
純度（％）＝｛ヒトインスリンの質量（ｇ）／（ヒトインスリンの質量（ｇ）＋ｄｅｓＢ３０インスリンの質量（ｇ））｝×１００【０２２０】
「ヒトインスリン回収率」とは、上記液体クロマトグラフィーでロードされたサンプル及び回収された溶出液において、以下の計算式により算出される数値である。
回収率（％）＝（溶出液中のヒトインスリンの質量（ｇ）／ロードサンプル中のヒトインスリンの質量（ｇ））×１００【０２２１】
上記測定において算出された純度９９．５％でのヒトインスリン回収率は７５％であった。【０２２２】
＜実施例１−２＞
実施例１−１において、多孔性粒子を製造例１−３で合成した多孔性粒子１−３とし、２，２′−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］ｎ水和物の量を１．０４ｇとしたこと以外は同様にして、イオン交換基としてスルホン酸基が導入された湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）を得た。得られた湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）についてイオン交換基量を滴定法により測定したところ、０．１１３ｍｅｑ／ｇであった。【０２２３】
得られたイオン交換担体（分離剤）をカラムに充填し、実施例１−１と同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／ｄｅｓＢ３０インスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．５％でのヒトインスリン回収率は７７％であった。【０２２４】
＜実施例１−３＞
撹拌器、コンデンサー、温度計及び窒素ガス導入管を備えた反応器中に製造例１−４で合成した多孔性粒子１−４を３ｇ、及び脱塩水５０ｇ、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸５．１８ｇ、４８質量％水酸化ナトリウム２．０８ｇ、メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム０．１８ｇ、２，２′−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］ｎ水和物０．１０４ｇを入れて混合し、窒素雰囲気下で８０℃に加熱して５時間反応を行った。反応液を冷却後、粒子を脱塩水で洗浄、濾過することにより、イオン交換基として水溶性高分子に結合したスルホン酸基が導入された湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）を得た。得られた湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）についてイオン交換基量を滴定法により測定したところ、０．２０５ｍｅｑ／ｇであった。【０２２５】
得られたイオン交換担体（分離剤）をカラムに充填し、実施例１−１と同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／ｄｅｓＢ３０インスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．５％でのヒトインスリン回収率は７９％であった。【０２２６】
＜実施例１−４＞
実施例１−３において、多孔性粒子を製造例１−５で合成した多孔性粒子１−５としたこと以外は同様にして、イオン交換基としてスルホン酸基が導入された湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）を得た。得られた湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）についてイオン交換基量を滴定法により測定したところ、０．１０６ｍｅｑ／ｇであった。【０２２７】
得られたイオン交換担体（分離剤）をカラムに充填し、実施例１−１と同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／ｄｅｓＢ３０インスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．５％でのヒトインスリン回収率は８６％であった。【０２２８】
＜実施例１−５＞
実施例１−３において、多孔性粒子を製造例１−６で合成した多孔性粒子１−６としたこと以外は同様にして、イオン交換基としてスルホン酸基が導入された湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）を得た。得られた湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）についてイオン交換基量を滴定法により測定したところ、０．１８５ｍｅｑ／ｇであった。【０２２９】
得られたイオン交換担体（分離剤）をカラムに充填し、実施例１−１と同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／ｄｅｓＢ３０インスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．５％でのヒトインスリン回収率は８６％であった。【０２３０】
＜実施例１−６＞
実施例１−３において、多孔性粒子を製造例１−７で合成した多孔性粒子１−７としたこと以外は同様にして、イオン交換基としてスルホン酸基が導入された湿潤状態のイオン交換担体中間体を得た。得られた湿潤状態のイオン交換担体中間体についてイオン交換基量を滴定法により測定したところ、０．１３５ｍｅｑ／ｇであった。得られたイオン交換担体中間体を１０質量％硫酸中で６０℃、５時間処理することにより粒子表面の残存エポキシ基を開環し、湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）を得た。【０２３１】
得られたイオン交換担体（分離剤）をカラムに充填し、実施例１−１のカラム平衡化条件及び溶出条件における溶離液Ｃ１の割合を２５体積％としたこと以外は同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／ｄｅｓＢ３０インスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．５％でのヒトインスリン回収率は９３％であった。【０２３２】
＜実施例１−７＞
実施例１−６で得られたイオン交換担体（分離剤）をカラムに充填し、実施例１−１のカラム平衡化条件及び溶出条件における溶離液Ｃ１の割合を３０体積％としたこと以外は同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／ｄｅｓＢ３０インスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．５％でのヒトインスリン回収率は９２％であった。【０２３３】
＜実施例１−８＞
撹拌器、コンデンサー、温度計及び窒素ガス導入管を備えた反応器中に製造例１−８で合成した多孔性粒子１−８を６ｇ、及び脱塩水１００ｇ、メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム３．５６ｇ、２，２′−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］ｎ水和物０．２０７ｇを入れて混合し、窒素雰囲気下で７０℃に加熱して５時間反応を行った。反応液を冷却後、粒子を脱塩水で洗浄、濾過することにより、イオン交換基としてスルホン酸基が導入された湿潤状態のイオン交換担体中間体を得た。【０２３４】
得られた湿潤状態のイオン交換担体中間体についてイオン交換基量を滴定法により測定したところ、０．０５９ｍｅｑ／ｇであった。得られたイオン交換担体中間体を１０質量％硫酸中で６０℃、５時間処理することにより粒子表面の残存エポキシ基を開環し、湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）を得た。【０２３５】
得られたイオン交換担体（分離剤）をカラムに充填し、実施例１−１のカラム平衡化条件及び溶出条件における溶離液Ｃ１の割合を２５体積％としたこと以外は同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／ｄｅｓＢ３０インスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．５％でのヒトインスリン回収率は７３％であった。【０２３６】
＜実施例１−９＞
実施例１−６において、多孔性粒子を製造例１−８で合成した多孔性粒子１−８としたこと以外は同様にして、イオン交換基としてスルホン酸基が導入された湿潤状態のイオン交換担体中間体を得た。得られた湿潤状態のイオン交換担体中間体についてイオン交換基量を滴定法により測定したところ、０．１０７ｍｅｑ／ｇであった。得られたイオン交換担体中間体を１０質量％硫酸中で６０℃、５時間処理することにより粒子表面の残存エポキシ基を開環し、湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）を得た。【０２３７】
得られたイオン交換担体（分離剤）をカラムに充填し、実施例１−１のカラム平衡化条件及び溶出条件における溶離液Ｃ１の割合を２５体積％としたこと以外は同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／ｄｅｓＢ３０インスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．５％でのヒトインスリン回収率は９６％であった。【０２３８】
＜実施例１−１０＞
実施例１−９で得られたイオン交換担体（分離剤）をカラムに充填し、実施例１−１のカラム平衡化条件及び溶出条件における溶離液Ｃ１の割合を３０体積％としたこと以外は同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／ｄｅｓＢ３０インスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．５％でのヒトインスリン回収率は９６％であった。【０２３９】
＜実施例１−１１＞
撹拌器、コンデンサー、温度計及び窒素ガス導入管を備えた反応器中に製造例１−８で合成した多孔性粒子１−８を３ｇ、及び脱塩水５０ｇ、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸２．５９ｇ、ヒドロキシエチルアクリルアミド１．４４ｇ、４８質量％水酸化ナトリウム１．０４ｇ、メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム０．１８ｇ、２，２′−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］ｎ水和物０．１０４ｇを入れて混合し、窒素雰囲気下で８０℃に加熱して５時間反応を行った。反応液を冷却後、粒子を脱塩水で洗浄、濾過することにより、イオン交換基としてスルホン酸基が導入された湿潤状態のイオン交換担体中間体を得た。【０２４０】
得られた湿潤状態のイオン交換担体中間体についてイオン交換基量を滴定法により測定したところ、０．０５４ｍｅｑ／ｇであった。得られたイオン交換担体中間体を１０質量％硫酸中で６０℃、５時間処理することにより粒子表面の残存エポキシ基を開環し、湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）を得た。【０２４１】
得られたイオン交換担体（分離剤）をカラムに充填し、実施例１−１のカラム平衡化条件及び溶出条件における溶離液Ｃ１の割合を２０体積％としたこと以外は同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／ｄｅｓＢ３０インスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．５％でのヒトインスリン回収率は８４％であった。【０２４２】
＜実施例１−１２＞
実施例１−６において、多孔性粒子を製造例１−９で合成した多孔性粒子１−９としたこと以外は同様にして、イオン交換基としてスルホン酸基が導入された湿潤状態のイオン交換担体中間体を得た。得られた湿潤状態のイオン交換担体中間体についてイオン交換基量を滴定法により測定したところ、０．０４７ｍｅｑ／ｇであった。得られたイオン交換担体中間体を１０質量％硫酸中で６０℃、５時間処理することにより粒子表面の残存エポキシ基を開環し、湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）を得た。【０２４３】
得られたイオン交換担体（分離剤）をカラムに充填し、実施例１−１のカラム平衡化条件及び溶出条件における溶離液Ｃ１の割合を２０体積％としたこと以外は同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／ｄｅｓＢ３０インスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．５％でのヒトインスリン回収率は８７％であった。【０２４４】
＜比較例１−１＞
実施例１−１において、多孔性粒子を製造例１−２で合成した多孔性粒子１−２とし、メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウムの量を０．４５ｇとしたこと以外は同様にして、イオン交換基としてスルホン酸基が導入された湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）を得た。得られた湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）についてイオン交換基量を滴定法により測定したところ、０．０４３ｍｅｑ／ｇであった。【０２４５】
得られたイオン交換担体（分離剤）をカラムに充填し、実施例１−１と同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／ｄｅｓＢ３０インスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．５％でのヒトインスリン回収率は６７％であった。【０２４６】
＜比較例１−２＞
実施例１−２において、メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウムの量を０．１８ｇとし、２，２′−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］ｎ水和物の量を０．０１ｇとしたこと以外は同様にして、イオン交換基としてスルホン酸基が導入された湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）を得た。得られた湿潤状態のイオン交換担体（分離剤）についてイオン交換基量を滴定法により測定したところ、０．０２４ｍｅｑ／ｇであった。【０２４７】
得られたイオン交換担体（分離剤）をカラムに充填し、実施例１−１と同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／ｄｅｓＢ３０インスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．５％でのヒトインスリン回収率は５７％であった。【０２４８】
上記実施例及び比較例の結果を表１に示す。【０２４９】
【表１】
2018147393.tif 000008
【０２５０】
〔第２実施形態に係る実施例〕
本発明の第２実施形態に係る実施例を説明する。【０２５１】
［評価方法］
以下の製造例、実施例及び比較例で得られたヒトインスリン精製用分離剤の評価方法は、以下のとおりである。【０２５２】
＜体積平均粒子径＞
体積平均粒子径は、コールターカウンター法によって測定した。試料を所定の塩化ナトリウム水溶液の分散液とし、測定する粒径の範囲がアパチャー径の２〜６０％となるアパチャーを使用した。コールターカウンター（ベックマンコールター社製）を用いて濃度計の数値が５〜１０％になるように試料を７質量％の塩化ナトリウム水溶液に分散した懸濁液を用いて測定した。測定個数を３０，０００個とし、測定により得られる体積統計値の平均径を体積平均粒子径とした。【０２５３】
＜比表面積＞
比表面積は、窒素ガス吸着法により測定した。窒素ガス吸着法は、吸着前後の圧力変化からＢＥＴの式により単分子層吸着量を求める方法であり、窒素ガス１分子の断面積から比表面積を計算することができる。
乾燥処理した多孔性粒子を秤量し、マイクロメリテックス社製フローソーブＩＩＩ２３１０型を用いて比表面積を測定した。【０２５４】
＜細孔容積、最頻度細孔半径＞
細孔容積と最頻度細孔半径は、窒素ガス吸着法により測定した。窒素ガス吸着法は、窒素ガス分子が細孔内で凝縮した時の圧力と吸着量から、細孔径と細孔容積を求める方法である。
乾燥処理した多孔性粒子を秤量し、マイクロメリテックス社製アサップ２４２０型を用いて吸脱着等温線を測定した。得られた吸脱着等温線から、積算細孔容積分布とＬｏｇ微分細孔容積分布をプロットし、細孔容積と最頻度細孔半径を求めた。【０２５５】
＜イオン交換基量＞
イオン交換基量は、滴定法によって測定した。アニオン交換担体の場合、湿潤状態の担体試料を２Ｎ水酸化ナトリウムに浸漬することで表面のイオン交換基を再生し、その後濾液が中性になるまで充分濾過水洗した。水洗後の試料を５質量％食塩水に分散させ、０．１Ｎ塩酸で滴定し、中和点に至るまでの滴定量を求めた。その後、さらに水洗濾過した試料を乾燥させた際の質量から、分離剤の乾燥質量当たりのイオン交換基量を算出した。【０２５６】
＜製造例２−１＞
（シード重合による多孔性粒子の合成）
粒子径１．７μｍの均一粒径ポリメチルメタクリレートシード粒子１ｇにドデシル硫酸ナトリウム０．８ｇと脱イオン水２００ｇを加えてシード粒子水性分散液を調製した。単量体成分としてエチレングリコールジメタクリレート４０ｇ、グリシジルメタクリレート１０ｇ、多孔質化剤としてトルエン５０ｇ、重合開始剤として２，２′−アゾビスイソブチロニトリル１ｇを混合したモノマー相をドデシル硫酸ナトリウム１．８２ｇ及び脱イオン水４６０ｇに分散したモノマー相分散液を、上記シード粒子水性分散液に加え、室温にて２０時間撹拌することによりモノマー相をシード粒子に吸収させた。【０２５７】
次いでこの分散液に５質量％ポリビニルアルコール（ゴーセノール（登録商標）  ＧＨ−２０、日本合成化学社製）水溶液１７２ｇ、亜硝酸ナトリウム０．０８６ｇ、脱イオン水２９ｇを添加し、７０℃にて２時間重合することにより重合体粒子を得た。この重合体粒子を単離後、トルエン抽出操作を行いシード粒子由来の重合体を除去した後、乾燥することにより多孔性粒子２−１の粉末を得た。【０２５８】
得られた多孔性粒子２−１の体積平均粒子径は８．０μｍであった。また、窒素ガス吸着法により測定した粒子の細孔容積は０．６３ｍＬ／ｇ、比表面積は２５０ｍ２／ｇ、最頻度細孔半径は１７３Åであった。【０２５９】
＜製造例２−２＞
製造例２−１におけるエチレングリコールジメタクリレートを２８ｇ、グリシジルメタクリレートを１２ｇ、トルエンを６０ｇ、２，２′−アゾビスイソブチロニトリルを０．８ｇとした以外は同様の条件にて多孔性粒子２−２の合成を行った。【０２６０】
得られた多孔性粒子２−２の体積平均粒子径は８．０μｍであった。また、窒素ガス吸着法により測定した粒子の細孔容積は０．６１ｍＬ／ｇ、比表面積は１６１ｍ２／ｇ、最頻度細孔半径は１９３Åであった。【０２６１】
＜製造例２−３＞
製造例２−１におけるエチレングリコールジメタクリレートを３２ｇ、グリシジルメタクリレートを８ｇ、トルエンを６０ｇ、２，２′−アゾビスイソブチロニトリルを０．８ｇとした以外は同様の条件にて多孔性粒子２−３の合成を行った。【０２６２】
得られた多孔性粒子２−３の体積平均粒子径は８．０μｍであった。また、窒素ガス吸着法により測定した粒子の細孔容積は０．７５ｍＬ／ｇ、比表面積は２６８ｍ２／ｇ、最頻度細孔半径は２２９Åであった。【０２６３】
＜製造例２−４＞
製造例２−１において、シード粒子の粒子径を２．１μｍとし、単量体成分をエチレングリコールジメタクリレート４０ｇとし、トルエンを６０ｇ、２，２′−アゾビスイソブチロニトリルを０．８ｇとした以外は同様の条件にて多孔性粒子２−４の合成を行った。【０２６４】
得られた多孔性粒子２−４の体積平均粒子径は１０．０μｍであった。また、窒素ガス吸着法により測定した粒子の細孔容積は０．９０ｍＬ／ｇ、比表面積は４５０ｍ２／ｇ、最頻度細孔半径は１９６Åであった。【０２６５】
＜実施例２−１＞
（疎水性官能基の導入）
５．００ｇの製造例２−１で合成した多孔性粒子２−１をテトラヒドロフラン５０ｍＬに分散させ、オクタデシルメルカプタン２．２６ｇを加え１０℃で３０分間撹拌した。窒素雰囲気下に触媒として水酸化リチウム水溶液（１９．４４ｇ／Ｌ）５ｍＬを加え、２５℃で７時間緩やかに攪拌しながら反応を行った。反応終了後、得られた粒子を水、メタノール、トルエンで洗浄した後、さらにメタノール、水で洗浄し、疎水化多孔性粒子を得た。疎水性官能基導入による、乾燥状態での多孔性粒子の質量増加率は１３．６％であった。【０２６６】
(イオン交換基の導入)
上記疎水化多孔性粒子１０．０ｇを水３０ｍＬに分散させ５０℃に加熱した後、トリメチルアミン水溶液（５８．６ｇ／Ｌ）１２．７ｍＬを滴下し緩やかに撹拌しながら５時間反応を行った。反応終了後、２ｍｏｌ／Ｌ塩酸で系内を中和した後、粒子を濾別し水でろ液が中性になるまで洗浄して分離剤を得た。
得られた分離剤の乾燥質量当たりのイオン交換容量は０．２００ｍｅｑ／ｇであった。【０２６７】
(インスリン分離試験)
上記分離剤をカラムに充填し、以下の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／Ａ２１デスアミドインスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。【０２６８】
（ヒトインスリン単離条件）
評価装置：島津製作所製  ＨＰＬＣシステム
カラムサイズ：１５０ｍｍ×４．６ｍｍ  内径
溶離液Ａ２：２．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）／水／アセトニトリル＝１０／８０／１０（体積比）
溶離液Ｂ２：２．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）／水／アセトニトリル＝１０／４０／５０（体積比）
カラム平衡化条件：溶離液Ｂ２  ３０体積％
溶出条件：溶離液Ｂ２  ３０体積％→６５体積％／３５分、６５体積％で２分保持
カラム温度：２５℃
流速：１ｍＬ／分
測定波長：ＵＶ２８０ｎｍ
サンプル：ヒトインスリン９６質量％及びＡ２１デスアミドインスリン４質量％を含むインスリン混合物溶液を１００ｍｇ／ｍＬに調製した溶液
サンプル注入量：４００μＬ【０２６９】
以下にクロマトグラフィーの手順を示す。
（インスリン溶液の調製）
３％酢酸水溶液中にヒトインスリンが９６ｍｇ／ｍＬ、Ａ２１デスアミドインスリンが４ｍｇ／ｍＬとなるようにインスリン溶液を調製した。【０２７０】
（カラム平衡化）
分離剤を充填したカラムに対し、上記平衡化条件にて平衡化を行った。【０２７１】
（インスリン溶出）
平衡化を行ったカラムに対し、上記インスリン溶液１００μＬをロードし、ＨＰＬＣ装置を用いた上記溶出条件にてクロマトグラフィー分離を行った。溶出液は、ＵＶ２８０ｎｍでモニターし、ヒトインスリン及び／またはＡ２１デスアミドインスリンが含まれる部分は、０．６ｍＬごとにフラクションとして回収した。【０２７２】
（インスリン純度及び回収率の測定）
回収した各フラクションについて逆相ＨＰＬＣカラムを用いて分析し、各フラクション中のヒトインスリン及びＡ２１デスアミドインスリン含量を算出することで、上記溶出条件において、ヒトインスリン純度９９．９％となるように溶出液を回収した場合のヒトインスリン回収率を求めた。【０２７３】
「ヒトインスリン純度」とは、上記液体クロマトグラフィーにより回収された溶出液において、以下の計算式により算出される数値である。
純度（％）＝｛ヒトインスリンの質量（ｇ）／（ヒトインスリンの質量（ｇ）＋Ａ２１デスアミドインスリンの質量（ｇ））｝×１００【０２７４】
「インスリン回収率」とは、上記液体クロマトグラフィーでロードされたサンプル及び回収された溶出液において、以下の計算式により算出される数値である。
回収率（％）＝（溶出液中のヒトインスリンの質量（ｇ）／ロードサンプル中のヒトインスリンの質量（ｇ））×１００【０２７５】
上記測定における溶出液を逆相クロマトグラフィーで分析することによって算出された純度９９．９％でのヒトインスリン回収率は９８％であった。【０２７６】
＜実施例２−２＞
（疎水性官能基の導入）
５．００ｇの製造例２−２で合成した多孔性粒子２−２をテトラヒドロフラン６０ｍＬに分散させ、オクタデシルメルカプタン３．３９ｇを加え１０℃で３０分間撹拌した。窒素雰囲気下に触媒として水酸化リチウム水溶液（２９．４ｇ／Ｌ）５ｍＬを加え、２５℃で７時間緩やかに攪拌しながら反応を行った。反応終了後、得られた粒子を水、メタノール、トルエンで洗浄した後、さらにメタノール、水で洗浄し、疎水化多孔性粒子を得た。疎水性官能基導入による、乾燥状態での多孔性粒子の質量増加率は８．５％であった。【０２７７】
(イオン交換基の導入)
上記疎水化多孔性粒子を用い、トリメチルアミン水溶液の代わりにジメチルアミン水溶液（０．０７３ｇ／ｇ）１１．７ｇを用いた以外は実施例２−１と同様の条件でイオン交換基の導入を行うことで分離剤を得た。
得られた分離剤の乾燥質量当たりのイオン交換容量は０．１７１ｍｅｑ／ｇであった。【０２７８】
(インスリン分離試験)
上記分離剤をカラムに充填し、実施例２−１と同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／Ａ２１デスアミドインスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．９％でのヒトインスリン回収率は９９％以上であった。【０２７９】
＜実施例２−３＞
（疎水性官能基の導入）
５．００ｇの製造例２−２で合成した多孔性粒子２−２をジグライム５０ｍＬに分散させ、オクタデシルメルカプタン２．２４ｇを加え１０℃で３０分間撹拌した。窒素雰囲気下に触媒として水酸化リチウム水溶液（１９．４４ｇ／Ｌ）５ｍＬを加え、２５℃で５時間緩やかに攪拌しながら反応を行った。反応終了後、得られた粒子を水、メタノール、トルエンで洗浄した後、さらにメタノール、水で洗浄し、疎水化多孔性粒子を得た。疎水性官能基導入による、乾燥状態での多孔性粒子の質量増加率は１４．１％であった。【０２８０】
(イオン交換基の導入)
上記疎水化多孔性粒子を用い、トリメチルアミン水溶液の代わりに１，６−ジアミノヘキサン水溶液（０．１８ｇ／ｇ）１２．２ｇを用いた以外は実施例２−１と同様の条件でイオン交換基の導入を行うことで分離剤を得た。
得られた分離剤の乾燥質量当たりのイオン交換容量は０．５０９ｍｅｑ／ｇであった。【０２８１】
(インスリン分離試験)
上記分離剤をカラムに充填し、実施例２−１と同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／Ａ２１デスアミドインスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．９％でのヒトインスリン回収率は９９％以上であった。【０２８２】
＜実施例２−４＞
（疎水性官能基の導入）
製造例２−３で合成した多孔性粒子２−３を用い、オクタデシルメルカプタンの代わりにオクチルメルカプタン１．１３ｇを用いた以外は実施例２−１と同様の条件で疎水性官能基の導入を行うことで疎水化多孔性粒子を得た。疎水性官能基導入による、乾燥状態での多孔性粒子の質量増加率は６．１％であった。【０２８３】
(イオン交換基の導入)
上記疎水化多孔性粒子を用い、トリメチルアミンの代わりに１，６−ジアミノヘキサン（０．１３ｇ／ｇ）１１．５ｇを用いた以外は実施例２−１と同様の条件でイオン交換基の導入を行うことで分離剤を得た。
得られた分離剤の乾燥質量当たりのイオン交換容量は０．３１２ｍｅｑ／ｇであった。【０２８４】
(インスリン分離試験)
上記分離剤をカラムに充填し、実施例２−１と同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／Ａ２１デスアミドインスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．９％でのヒトインスリン回収率は９９％以上であった。【０２８５】
＜比較例２−１＞
（イオン交換基の導入）
実施例２−４で得られた疎水化多孔性粒子の代わりに、製造例２−３で合成した多孔性粒子２−３を用いた以外は実施例２−４と同様の条件でイオン交換基の導入を行うことで、イオン交換基のみが導入された分離剤を得た。
得られた分離剤の乾燥質量当たりのイオン交換容量は０．８７１ｍｅｑ／ｇであった。【０２８６】
（インスリン分離試験)
上記分離剤を湿式法によって内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレス製カラムに充填した分離剤充填カラムを用い、実施例２−１と同様の条件でヒトインスリン及びＡ２１デスアミドインスリンの分離試験を行ったが、ヒトインスリン及びＡ２１デスアミドインスリンはほとんど保持されず、算出された純度９９．９％でのヒトインスリン回収率は１０％未満であった。【０２８７】
＜比較例２−２＞
（疎水性官能基の導入）
多孔性粒子２−１の代わりに、製造例２−４で合成した多孔性粒子２−４を用いた以外は実施例２−１と同様の条件で疎水性官能基の導入を行うことで疎水性官能基のみが導入された多孔性粒子（分離剤）を得た。疎水性官能基導入による、乾燥状態での多孔性粒子の質量増加率は１２．３％であった。【０２８８】
（インスリン分離試験)
上記分離剤をカラムに充填し、実施例２−１と同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／Ａ２１デスアミドインスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．９％でのヒトインスリン回収率は８５％であった。【０２８９】
＜比較例２−３＞
（インスリン分離試験)
シリカ系分離剤が充填された市販の逆相クロマトグラフィー用カラム（Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）  １００−１０−Ｃ８，ＡｋｚｏＮｏｂｅｌ社製）を用い、実施例２−１と同様の条件を用いた液体クロマトグラフィーにより、ヒトインスリン／Ａ２１デスアミドインスリン混合物からヒトインスリンの単離を行った。算出された純度９９．９％でのヒトインスリン回収率は９６％であった。【０２９０】
上記実施例及び比較例の結果を表２に示す。【０２９１】
【表２】
2018147393.tif 000009
【０２９２】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは、当業者にとって明らかである。本出願は、２０１７年２月１０日出願の日本特許出願（特願２０１７−０２３３３６）、２０１７年２月１０日出願の日本特許出願（特願２０１７−０２３３３７）、２０１７年３月２７日出願の日本特許出願（特願２０１７−０６１９７１）及び２０１７年６月２２日出願の日本特許出願（特願２０１７−１２２５３３）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【国際調査報告】
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