(57)【要約】２以上のタンパク質を含む融合タンパク質であって、前記２以上のタンパク質が下記のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーを介して融合されていることを特徴とする、融合タンパク質。          Ｘm(ＰＹn)qＰＺrここで、Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）から独立して選択されるアミノ酸残基であって、Ｙのうち少なくとも１つはＫ、Ｌ、Ｎ、ＱまたはＲである。ｍは０〜５の整数であり、ｎは２または３であり、ｑは２〜１０の整数であり、ｒ＝０〜１０の整数である。
2017217460.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上のタンパク質を含む融合タンパク質であって、前記２以上のタンパク質が下記のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーを介して融合されていることを特徴とする、融合タンパク質。
Ｘm(ＰＹn)qＰＺr
ここで、Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）から独立して選択されるアミノ酸残基であって、Ｙのうち少なくとも１つはＫ、Ｌ、Ｎ、ＱまたはＲである。ｍは０〜５の整数であり、ｎは２または３であり、ｑは２〜１０の整数であり、ｒ＝０〜１０の整数である。
【請求項２】
前記タンパク質が抗原ペプチドである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記抗原ペプチドが細菌毒素ペプチドおよび／またはウイルス由来ペプチドである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記細菌毒素ペプチドが志賀毒素2eのBサブユニット（Stx2eB）、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット（LTB）およびコレラ毒素のBサブユニット(CTB)から選択される、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ウイルス由来ペプチドがイヌパルボウイルスのカプシドタンパク質VP2の中和エピトープ、ブタパルボウイルスのカプシドタンパク質VP2の中和エピトープ、ブタ流行性下痢ウイルスのスパイクタンパク質の中和エピトープおよびロタウイルスのカプシドタンパク質VP7の中和エピトープから選択される、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記２以上の抗原ペプチドを含む融合タンパク質が、志賀毒素2eのBサブユニット（Stx2eB）、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット（LTB）およびコレラ毒素のBサブユニット(CTB)から選択される２以上の毒素Bサブユニットと、イヌパルボウイルスのカプシドタンパク質VP2の中和エピトープ、ブタパルボウイルスのカプシドタンパク質VP2の中和エピトープ、ブタ流行性下痢ウイルスのスパイクタンパク質の中和エピトープおよびロタウイルスのカプシドタンパク質VP7の中和エピトープから選択される１以上のウイルス由来ペプチドを含む融合タンパク質である、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ペプチドリンカーにおいて、ＧとＳの含有率が６０％未満である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ペプチドリンカーは長さが１０〜３０アミノ酸である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ペプチドリンカーは、配列番号２、３７、３８、３９または４０のアミノ酸配列を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
分泌シグナルを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載のＤＮＡまたは請求項１２に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換体を培養して融合タンパク質を蓄積させることを特徴とする、融合タンパク質の製造方法。
【請求項１５】
請求項２〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１３に記載の形質転換体を含む、ワクチン。
【請求項１６】
請求項２〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１３に記載の形質転換体を非ヒト動物に投与することを特徴とする、非ヒト動物の前記抗原ペプチドに対する免疫賦活方法。
【請求項１７】
請求項２〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１３に記載の形質転換体を非ヒト動物に投与することを特徴とする、非ヒト動物の前記抗原ペプチドが関与する疾患の防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドリンカーで連結された２以上のタンパク質を含む融合タンパク質、これをコードするDNA、並びに該DNAを含む形質転換体に関する。本発明はまた、２以上の抗原ペプチドの融合タンパク質を含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
志賀毒素（Stx、ベロ毒素とも呼ばれる）は、病原性大腸菌のうち腸管出血性大腸菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli）が産生するタンパク質性外毒素である。志賀毒素は、出血性腸炎、溶血性尿毒症症候群、脳症などを引き起こす。
志賀毒素は、大きくStx1とStx2に分けられ、更にそれぞれがサブクラスに分けられる。Stx2としては、例えばブタ浮腫病を引き起こすStx2eが挙げられる。ブタ浮腫病は、離乳後１〜２週の子豚に高発生することが知られている。浮腫病菌の感染による致死率は、５０〜９０％と極めて高い。
また、大腸菌易熱性毒素（LT）は、毒素原性大腸菌（Enterotoxigenic Escherichia coli）が産生するタンパク質性内毒素である。LTは、下痢や嘔吐を引き起こすことが知られている。
また、コレラ毒素（CT）は、Vibrio choleraeが産生するタンパク質性外毒素である。CTは、激しい下痢や嘔吐を引き起こすことが知られている。
Stx、LT、CTのいずれの細菌毒素も、細胞への付着に関与するＢサブユニット５量体と毒性を持つＡサブユニット１量体からなることが知られている。また、LTとCTは、構造的にも機能的にも類似していることが知られている。
これらの細菌毒素による疾患を予防する方法としては、ワクチンを、注射もしくは経鼻スプレーにより投与したり、経口的に投与したりする方法が知られている。【０００３】
無毒化したStx2eタンパク質を組換え大腸菌を用いて生産させ、注射によりブタに投与する技術が知られている（非特許文献１）。しかしながら、組換え大腸菌による、無毒化したStx2eタンパク質の生産量は十分ではないという問題、ワクチンタンパク質の高度な精製の必要性、および注射によるワクチン投与の労力の問題があった。
また、ワクチンを経口的に投与する方法については、労力軽減の観点から畜産分野で関心が高まっている。このような背景において、細菌毒素タンパク質を、トランスジェニック技術を用いて酵母や植物に生産させる技術の開発が行われている。例えば、LTタンパク質のＢサブユニット（LTB）をコードするDNAを含み、該DNAを発現するトランスジェニック植物について記載されている（特許文献１、特許文献２）。また、LTタンパク質又はCTタンパク質をコードするDNAを発現するトランスジェニック植物について記載されている（特許文献３）。しかしながら、これらの技術では、タンパク質の生産量が十分でないという問題があった。また、植物由来の分泌シグナルペプチドがアミノ末端に付加されたStx2eタンパク質を、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5'−非翻訳領域（ADH 5'-UTR）を用いて発現させることにより、Stx2eタンパク質をレタス等の植物に生産させ、植物体に蓄積させる報告もある（特許文献４）。更に、酵母およびレタスにおいてStx2eBタンパク質またはCTBタンパク質を、アミノ酸１２から成るプロリンを有するペプチドリンカーを介してタンデムに連結することで当該タンパク質の蓄積を向上させた報告もある（特許文献５）。しかし、何れもタンパク質の蓄積量では、トランスジェニック生物を利用して細菌病の防除を効率的に行うには十分とはいえなかった。すなわち、目的の細菌毒素などのタンパク質を組換え生物（酵母もしくは植物等）の細胞内で効率良く生産、蓄積させる必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平１０−５０７９１６号公報
【特許文献２】特開２０００−１６６４１１号公報
【特許文献３】特表２００２−５３３０６８号公報
【特許文献４】特許第５２７９０８９号明細書
【特許文献５】特許第５３６０７２７号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Makino et al., Microbial Pathogenesis, Volume 31,Number 1, July2001, pp. 1-8(08)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は細菌毒素などのタンパク質を２以上含む融合タンパク質の発現量を増加させることのできる技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、抗原ペプチドの融合タンパク質を作製するにあたり、特定の配列を有するペプチドリンカーを使用して抗原ペプチドを連結することにより、得られる抗原ペプチド融合タンパク質の発現量が顕著に向上することを見出した。本発明は、このような知見に基づいてなされたものである。【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］２以上のタンパク質を含む融合タンパク質であって、前記２以上のタンパク質が下記のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーを介して融合されていることを特徴とする、融合タンパク質。
Ｘm(ＰＹn)qＰＺr
ここで、Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）から独立して選択されるアミノ酸残基であって、Ｙのうち少なくとも１つはＫ、Ｌ、Ｎ、ＱまたはＲである。ｍは０〜５の整数であり、ｎは２または３であり、ｑは２〜１０の整数であり、ｒ＝０〜１０の整数である。
［２］前記タンパク質が抗原ペプチドである、［１］に記載の融合タンパク質。
［３］前記抗原ペプチドが細菌毒素ペプチドおよび／またはウイルス由来ペプチドである、［２］に記載の融合タンパク質。
［４］前記細菌毒素ペプチドが志賀毒素2eのBサブユニット（Stx2eB）、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット（LTB）およびコレラ毒素のBサブユニット(CTB)から選択される、［３］に記載の融合タンパク質。
［５］前記ウイルス由来ペプチドがイヌパルボウイルスのカプシドタンパク質VP2の中和エピトープ、ブタパルボウイルスのカプシドタンパク質VP2の中和エピトープ、ブタ流行性下痢ウイルスのスパイクタンパク質の中和エピトープおよびロタウイルスのカプシドタンパク質VP7の中和エピトープから選択される、［３］に記載の融合タンパク質。
［６］前記２以上の抗原ペプチドを含む融合タンパク質が、志賀毒素2eのBサブユニット（Stx2eB）、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット（LTB）およびコレラ毒素のBサブユニット(CTB)から選択される２以上の毒素Bサブユニットと、イヌパルボウイルスのカプシドタンパク質VP2の中和エピトープ、ブタパルボウイルスのカプシドタンパク質VP2の中和エピトープ、ブタ流行性下痢ウイルスのスパイクタンパク質の中和エピトープおよびロタウイルスのカプシドタンパク質VP7の中和エピトープから選択される１以上のウイルス由来ペプチドとを含む融合タンパク質である、［３］に記載の融合タンパク質。
［７］前記ペプチドリンカーにおいて、ＧとＳの含有率が６０％未満である、［１］〜［６］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［８］前記ペプチドリンカーは長さが１０〜３０アミノ酸である、［１］〜［７］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［９］前記ペプチドリンカーは、配列番号２、３７、３８、３９または４０のアミノ酸配列を有する、［１］〜［８］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１０］分泌シグナルを含む、［１］〜［９］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１１］［１］〜［１０］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
［１２］［１１］に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
［１３］［１１］に記載のＤＮＡまたは［１２］に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
［１４］［１３］に記載の形質転換体を培養して融合タンパク質を蓄積させることを特徴とする、融合タンパク質の製造方法。
［１５］［２］〜［１０］のいずれかに記載の融合タンパク質または［１３］に記載の形質転換体を含む、ワクチン。
［１６］［２］〜［１０］のいずれかに記載の融合タンパク質または［１３］に記載の形質転換体を非ヒト動物に投与することを特徴とする、非ヒト動物の前記抗原ペプチドに対する免疫賦活方法。
［１７］［２］〜［１０］のいずれかに記載の融合タンパク質または［１３］に記載の形質転換体を非ヒト動物に投与することを特徴とする、非ヒト動物の前記抗原ペプチドが関与する疾患の防除方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、細菌毒素などの抗原ペプチド等のタンパク質を２以上含む融合タンパク質の発現量を向上させることができる。本発明の融合タンパク質は酵母や植物等の可食生物において効率的に生産させることができ、これらの可食生物に抗原ペプチド等の融合タンパク質を蓄積させ経口投与することにより、ワクチン接種の省コスト化、省力化、接種時の家畜に対するストレス軽減による生産性の向上が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例及び比較例で作製された融合タンパク質の構造を示す模式図。
【図２】各融合タンパク質の酵母における発現量を示す図。比較例１の発現量を１とした相対値を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の融合タンパク質は、２以上のタンパク質の融合タンパク質を含む。２以上としては、好ましくは、２〜５であり、より好ましくは２〜３である。同じ種類のタンパク質が２個以上連結した融合タンパク質でもよいし、異なる種類のタンパク質が２個以上連結した融合タンパク質でもよい。
タンパク質の種類は特に制限されず、例えば、成長因子、ホルモン、サイトカイン、血液タンパク質、酵素、抗原、抗体、転写因子、受容体またはそれらの部分ペプチドなどが挙げられる。ただし、融合タンパク質を構成する２以上の「タンパク質」にはシグナルペプチドやタグ配列は該当せず、シグナルペプチドやタグ配列が本発明のペプチドリンカーを介して上記のようなタンパク質１つに結合しているような態様は本発明の融合タンパク質には含まれない。
各タンパク質の長さは、好ましくは１０〜２００アミノ酸であり、より好ましくは１０〜１５０アミノ酸であり、さらに好ましくは２０〜１５０アミノ酸である。
【００１２】
酵素としては、例えば、リパーゼ、プロテアーゼ、ステロイド合成酵素、キナーゼ、フォスファターゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、酸化酵素、還元酵素、セルラーゼ、アロマターゼ、コラゲナーゼ、トランスグルタミナーゼ、グリコシダーゼおよびキチナーゼが挙げられる。
【００１３】
成長因子としては、例えば、上皮成長因子（EGF）、インスリン様成長因子（IGF）、トランスフォーミング成長因子（TGF）、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、血小板由来成長因子（PDGF）、エリスロポエチン（EPO）、トロンボポエチン（TPO）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、肝細胞増殖因子（HGF）が挙げられる。
【００１４】
ホルモンとしては、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、成長ホルモン（例えば、配列番号１）、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、レプチン、カルシトニンが挙げられる。
【００１５】
サイトカインとしては、例えば、インターロイキン、インターフェロン（IFNα、IFNβ（例えば、配列番号２）、IFNγ）、腫瘍壊死因子（TNF）が挙げられる。
【００１６】
血液タンパク質としては、例えば、トロンビン、血清アルブミン、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、組織プラスミノゲン活性化因子が挙げられる。
【００１７】
抗体としては、例えば、完全抗体、Fab、F（ab'）、F（ab'）2、Fc、Fc融合タンパク質、重鎖（H鎖）、軽鎖（L鎖）、単鎖Fv（scFv）、sc（Fv）2、ジスルフィド結合Ｆｖ（sdFv）、Diabodyが挙げられる。
【００１８】
抗原ペプチドとしては、病原体由来のペプチドが例示され、大腸菌、マイコプラズマ、サルモネラなどの病原性細菌が産生するペプチド、例えば、毒素や細胞壁構成タンパク質、哺乳類感染性ウイルス由来のペプチド、例えば、外被由来ペプチド、ヌクレオカプシド由来ペプチドなどが挙げられる。
病原性細菌が産生する毒素ペプチドとしては、例えば、志賀毒素2eのBサブユニット（Stx2eB）、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット（LTB）およびコレラ毒素のBサブユニット(CTB)が挙げられ、本発明の融合タンパク質としては、これらの毒素ペプチドから選択される２以上の毒素ペプチドの融合タンパク質が挙げられる。ここで、２以上の毒素ペプチドとは、Stx2eB、LTB及びCTBから選択されるいずれか１種類の毒素Bサブユニットが２つ以上含まれる態様でもよいし、Stx2eB、LTB及びCTBから選択される２種類の毒素が合計で２つ以上含まれる態様でもよいし、Stx2eB、LTB及びCTBが合計で３つ以上含まれる態様でもよい。また、本発明の融合タンパク質は、これらの毒素ペプチドと、後述のその他の抗原ペプチドとの融合タンパク質であってもよい。
以下、Stx2eB、LTB及びCTBについて説明する。
【００１９】
＜Stx2eB＞
志賀毒素（Stx）は、浮腫病の原因となる腸管出血性大腸菌(EHEC, STEC)が産生するタンパク質性毒素で、１型（Stx1）及び２型（Stx2）に分けられる。Stx1は、ａ〜ｄのサブクラスに、Stx2はａ〜ｇのサブクラスにそれぞれ分類される。毒性本体であるAサブユニット１分子と腸管粘膜への結合に働くBサブユニット５分子からなるホロ毒素で、真核細胞のリボソームに作用して、タンパク質合成を阻害する働きを持つ。
【００２０】
本発明で使用されるStx2eのBサブユニット（Stx2eB）は、例えば、配列番号８のアミノ酸配列で表される。配列番号８は、Stx2e Bサブユニットタンパク質（GenBank Accession No. AAQ63639）の成熟領域（ペリプラズムへの分泌シグナルペプチドを除く、Ala19〜Asn87）のアミノ酸配列を示す。
また、Stx2eBは、例えば、Asn73（すなわち、配列番号８のアミノ酸配列の55位のAsn残基）がSer残基に置換されている変異型でもよい。配列番号８のアミノ酸配列の55位のAsn残基がSerに置換されているアミノ酸配列（Asn73Ser）を配列番号１０で示す。
【００２１】
また、Stx2eBは、融合タンパク質として豚等の動物に投与してワクチン効果を引き起こすことができる限り、配列番号８または１０で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
また、Stx2eBは、配列番号８または１０で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつ融合タンパク質として豚等の動物に投与してワクチン効果を引き起こすことができるものであってもよい。ここで、ワクチン効果とは、抗原に対する抗体の産生を惹起させることをいい、以下、同様である。
【００２２】
＜LTB＞
大腸菌性下痢症は、毒素原性大腸菌(ETEC)が生産するタンパク質性毒素LTが原因であり、LTは大腸菌易熱性毒素とも呼ばれる。LTは、毒性本体であるAサブユニット１分子とBサブユニット５分子からなるホロ毒素である。LTのAサブユニット（LTA）は細胞質内に侵入し、細胞内cAMP濃度を上昇させ、細胞膜クロライドチャネルを活性化することで腸管内への水の漏出すなわち下痢の病態を引き起こす。LTのBサブユニット（LTB）は無毒であり、LT毒素と腸管細胞との接着に関与する。
【００２３】
本発明で使用されるLTBは、例えば、配列番号１２のアミノ酸配列で表される。LTBは、融合タンパク質として豚等の動物に投与してワクチン効果を引き起こすことができる限り、配列番号１２で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。配列番号１２で表されるアミノ酸配列は、GenBank Accession No. AAL55672として登録されている。
また、LTBは、配列番号１２で表されるアミノ酸配列と、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつ融合タンパク質として豚等の動物に投与してワクチン効果を引き起こすことができるものであってもよい。
本発明の他の実施形態では、LTBに糖鎖が付加されていてもよい。例えば、LTBの９０位（すなわち、配列番号１２の９０位）のAsn残基にN−結合型の糖鎖が付加される。
【００２４】
＜CTB＞
コレラ毒素（CT）タンパク質は、毒性本体である１つのAサブユニット（CTA）と、腸管粘膜への侵入へ関与する５つのBサブユニット（CTB）からなる。
本発明で使用されるCTBは、例えば、配列番号６のアミノ酸配列で表される。CTBは、融合タンパク質として豚等の動物に投与してワクチン効果を引き起こすことができる限り、配列番号６で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
また、CTBは、配列番号６で表されるアミノ酸配列と、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつ融合タンパク質として豚等の動物に投与してワクチン効果を引き起こすことができるものであってもよい。
【００２５】
＜その他の抗原ペプチド＞
その他の抗原ペプチドの例として、病原性ウイルス体由来のペプチドが挙げられ、具体的には、パルボウイルスのカプシドタンパク質VP2の中和エピトープ、ネコ免疫不全ウイルスのエンベロープタンパク質gp120の中和エピトープ、ブタ流行性下痢ウイルスのスパイクタンパク質の中和エピトープ、ロタウイルスのカプシドタンパク質VP7の中和エピトープが挙げられる。ただし、ウイルス由来の抗原ペプチドはこれらに限定されず、種々のウイルスに由来する種々のペプチドが適用でき、その配列も公知の配列のアラインメントなどから適宜設定できる。一種類のエピトープのみを利用することも可能であり、また複数のエピトープを多重連結して利用することもできる。
以下に、上記ウイルスペプチドの中和エピトープ由来の抗原ペプチドのアミノ酸配列を例示する。
イヌパルボウイルスのカプシドタンパク質VP2の中和エピトープ・・・配列番号６２
ブタパルボウイルスのカプシドタンパク質VP2の中和エピトープ・・・配列番号６４
ネコ免疫不全ウイルスのエンベロープタンパク質gp120の中和エピトープ・・・配列番号８５
ブタ流行性下痢ウイルスのスパイクタンパク質の中和エピトープ・・・配列番号６８
ロタウイルスA型のカプシドタンパク質VP7の中和エピトープ・・・配列番号８６
ロタウイルスC型のカプシドタンパク質VP7の中和エピトープ・・・配列番号６６
ただし、各ウイルスタンパク質に対する抗原抗体反応を惹起できるペプチドである限り、配列番号６２、６４、６６、６８、８５、または８６で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。また、抗原ペプチドは、配列番号６２、６４、６６、６８、８５、または８６で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するものであってもよい。
【００２６】
その他の病原性細菌由来の抗原ペプチドの一例として、大腸菌性下痢症の原因毒素である耐熱性毒素STが挙げられる。STは、18アミノ酸のSTp（豚型）と19アミノ酸STh（ヒト型）などがあるが、融合タンパク質の投与対象が豚である場合、STpを用いる。
抗原として使用されるSTpとしては、例えば、配列番号５６のアミノ酸配列を有する無毒化変異体（mSTp）（Sato et al., 1994）を使用することができる。ただし、STpに対する抗原抗体反応を惹起できるペプチドである限り、配列番号５６で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。また、STpは、配列番号５６で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するものであってもよい。
【００２７】
＜ペプチドリンカー＞
本発明の融合タンパク質において、２以上の上記タンパク質を連結するペプチドリンカーは下記の配列を有する。
【００２８】
Ｘm(ＰＹn)qＰＺr
【００２９】
ＸmとはＸがｍ個連続することを意味し、この場合のｍ個のＸはＲ（アルギニン）、Ｇ（グリシン）、Ｓ（セリン）、Ｋ（リジン）、Ｔ（スレオニン）、Ｌ（ロイシン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｑ（グルタミン）から選択される同じアミノ酸残基であってもよいし、異なるアミノ酸残基であってもよい。ｍは０〜５の整数であるが、好ましくは１〜５の整数、より好ましくは１〜３の整数である。
【００３０】
(ＰＹn)qとはＰＹn、すなわち、ｎが２または３なので、ＰＹＹまたはＰＹＹＹがq回連続することを意味する（Ｐはプロリンを示す）。ＰＹＹとＰＹＹＹが合計でq回連続していればよい。
ここで、それぞれのＹはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ｑから選択される同じアミノ酸残基であってもよいし、異なるアミノ酸残基であってもよいが、q回連続するＰＹnに含まれるＹのうち、少なくとも１つはＫ、Ｌ、Ｎ、ＱまたはＲである。q回連続するＰＹnに含まれるＹのうち、２つ以上がＫ、Ｌ、Ｎ、ＱまたはＲであることがより好ましい。ｑは２〜１０の整数であり、好ましくは２〜５の整数、より好ましくは２〜３の整数である。
【００３１】
ＰＺrとはＰの後にＺがｒ個連続することを意味し、この場合のｒ個のＺはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ｑから選択される同じアミノ酸残基であってもよいし、異なるアミノ酸残基であってもよい。ｒは０〜１０の整数であるが、好ましくは１〜１０の整数、より好ましくは１〜５の整数である。
【００３２】
本発明のペプチドは、長さが７〜５０アミノ酸であることが好ましく、１０〜３０アミノ酸であることがより好ましく、１２〜２５アミノ酸であることがさらに好ましく、１２〜２０アミノ酸であることが特に好ましい。
【００３３】
本発明のペプチドにおいて、全アミノ酸に対するグリシンとセリンを合わせた含有率が６０％未満であることが好ましく、５７％未満であることがより好ましい。
【００３４】
本発明のペプチドは、好ましくは、配列番号２、３７、３８、３９または４０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
なお、タンパク質を連結したときに得られる融合タンパク質の発現量を、例えば、配列番号14のPG12と比較して向上させることができる限りにおいて、これらのアミノ酸配列に対し、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
【００３５】
なお、タンパク質を上記ペプチドリンカーで連結する場合、タンパク質と上記ペプチドリンカーは直接連結されてもよいし、１〜数アミノ酸の他の配列を介して連結されてもよい。
【００３６】
上記のようなペプチドリンカーを用いることにより、融合タンパク質の安定性を向上させ、宿主細胞において高蓄積させることができる。
なお、本発明で用いる融合タンパク質は、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に前記ペプチドリンカーがさらに付加されていてもよい。
また、本発明で用いる融合タンパク質は、そのＮ末端側および／またはＣ末端側にＰＧ１２などの他のペプチドリンカーが付加されていてもよい。
【００３７】
本発明の融合タンパク質は、上記タンパク質と上記ペプチドリンカーのほかに、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＨＩＳ、ＧＳＴなどの精製や検出等に必要な配列が付加されていてもよい。
【００３８】
本発明の融合タンパク質は、例えば、配列番号３６のアミノ酸番号２２〜１９５で表されるアミノ酸配列を有する（2X2eB-SP-v7v7v7）。配列番号３６のアミノ酸番号２２〜１９５で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、２つのStx2eBが、配列番号２のペプチドを介してタンデムに連結され、さらに、１つ目のStx2eBのN末端および２つ目のStx2eBのC末端に配列番号２のペプチドが付加された構造を有する。そして、配列番号３６のアミノ酸配列（アミノ酸番号１〜１９５）は、この融合タンパク質のN末端側にGS配列を介してSUC2シグナルぺプチド（配列番号３）がさらに付加された配列である。
【００３９】
本発明の融合タンパク質は、植物や酵母で発現させる場合などは、そのアミノ末端に、植物または酵母由来の分泌シグナルペプチドが付加されていてもよい。ここで、「付加」とは、前記分泌シグナルペプチドが、融合タンパク質のアミノ末端に、直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む。
分泌シグナルペプチドは、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。分泌シグナルペプチドは、好ましくはタバコのβ-Dグルカンエキソヒドロラーゼ（β-D-glucan exohydrolase）、タバコの38kDa ペルオキシダーゼ(GenBank Accession D42064)に由来する。前記分泌シグナルペプチドとしては、例えば、タバコのβ-Dグルカンエキソヒドロラーゼに由来する、配列番号３０のアミノ酸配列を有しているペプチドが挙げられる。
また、酵母に由来する分泌シグナルペプチドとしては、酵母インベルターゼSUC2シグナルぺプチド（配列番号３）が挙げられる。
【００４０】
さらに、本発明で用いる融合タンパク質は、植物で発現させる場合などは、そのカルボキシル末端に、小胞体残留シグナルペプチド、液胞移行シグナルペプチド等のシグナルペプチドが付加されていてもよい。ここで、「付加」とは、シグナルペプチドが、前記融合タンパク質のカルボキシル末端に、直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む。小胞体残留シグナルペプチドは、例えば、国際公開WO2009/004842号パンフレット及び国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されているが、HDEL配列（配列番号３１）を利用することができる。他の液胞移行シグナルペプチドは、例えば、国際公開WO2009/004842号パンフレット及び国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
【００４１】
本発明で用いる融合タンパク質は、化学的に合成することもできるし、遺伝子工学的に生産することもできる。
【００４２】
遺伝子工学的に生産する場合、融合タンパク質をコードするDNAを含むDNA構築物を用いる。本発明で用いるDNA構築物は、Stx2eBをコードするDNA、LTBをコードするDNA、およびCTBをコードするDNAから選択される2つ以上のDNA（同じ種類でもよい）が、前記ペプチドリンカーをコードするDNAを介してタンデムに連結されているDNAを含む。前記ペプチドリンカーをコードするDNAは、例えば配列番号１で表される。Stx2eBをコードするDNAとして、例えば、Stx2eB（Asn73）をコードするDNA（配列番号７）、Stx2eB（Asn73Ser）をコードするDNA（配列番号９）が挙げられる。LTBをコードするDNAとして、例えば、LTB（Asn90）をコードするDNA（配列番号１１）が挙げられる。CTBをコードするDNAとして、例えば、配列番号５が挙げられる。
前記ペプチドリンカーをコードするDNA、各タンパク質をコードするDNAは、それぞれ終止コドンを除いて読み枠を合わせて連結される。
【００４３】
Stx2eB、LTB、CTBをコードするDNAは、例えば、配列番号７、９、１１、５の塩基配列に基づいて、一般的な遺伝子工学的な手法により得ることができる。具体的には、各毒素を生産する細菌より、常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、該ライブラリーから上記塩基配列に基づいて作製したプローブを用いて所望のクローンを選択する。また、上記塩基配列を基にした化学合成、上記塩基配列の５'及び３'末端の塩基配列をプライマーとし、ゲノムDNAを鋳型としたPCRなどにより合成することもできる。これらを公知の手法でリンカーをコードするDNAと連結させることにより融合タンパク質をコードするDNAが得られる。
【００４４】
本発明の融合タンパク質をコードするDNAは、例えば、配列番号３５の塩基番号６４〜５８５で表される塩基配列を有する。
また、本発明の融合タンパク質をコードするDNAは、配列番号３５の塩基番号６４〜５８５で表される塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い二つのDNAどうし、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有する２つのDNAがハイブリダイズするが、それより同一性の低い２つのDNAがハイブリダイズしない条件が挙げられる。例えば２×SSC（３３０ｍＭ NaCl、３０ｍＭ クエン酸）、４２℃で洗浄する条件が挙げられ、好ましくは０．１×SSC（３３０ｍＭ NaCl、３０ｍＭ クエン酸）、６０℃で洗浄する条件が挙げられる。
【００４５】
融合タンパク質をコードするDNAは、該タンパク質を生産させる宿主細胞に応じて、ハイブリッドタンパク質の翻訳量が増大するように、融合タンパク質を構成するアミノ酸を示すコドンが適宜改変されていることも好ましい。
コドン改変の方法としては、例えばKang et al. (2004)の方法を参考にすることができる。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、GC含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
【００４６】
本発明で用いるDNA構築物において、好ましくは、前記融合タンパク質をコードするDNAが、エンハンサーに発現可能に連結されている。ここで、「発現可能」とは、本発明で用いるDNA構築物が適切なプロモーターを含むベクターに挿入され、該ベクターが適切な宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞内で前記融合タンパク質が生産されることをいう。また、「連結」とは、２つのDNAが直接結合している場合も、他の塩基配列を介して結合している場合も含む。
エンハンサーとしては、Kozak配列や植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５'-非翻訳領域が挙げられる。アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５'-非翻訳領域とは、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写開始点から、翻訳開始点（ATG、メチオニン）の前までの塩基配列を含む領域をいう。前記領域は、植物に由来すればよいが、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５'-非翻訳領域としては、例えばタバコ（Nicotiana tabacum）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５'-非翻訳領域（NtADH5'UTR）（配列番号３２）を用いることができ、翻訳開始点上流３塩基を改変したNtADH5'UTR領域（NtADHmod 5'UTR）（配列番号３３）を用いることでさらに高翻訳が期待できる。植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５'-非翻訳領域を得る方法は、例えば、特開2012-19719号公報および国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
【００４７】
本発明で用いるDNA構築物は、例えば、配列番号３５（塩基番号１〜５８５）で表される塩基配列を有する。配列番号３５の塩基番号１〜５８５で表される塩基配列を有するDNA構築物は、２つのStx2eBタンパク質を、配列番号２のペプチドリンカーを介してタンデムに連結し、さらに、１つ目のStx2eBのN末端および２つ目のStx2eBのC末端に配列番号２のペプチドを付加し、かつ、アミノ末端に分泌シグナルペプチド＋GSを付加した融合タンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
【００４８】
本発明のDNAは、一般的な遺伝子工学的手法により作製することができ、例えば、本発明のペプチドリンカーをコードするDNA、及び有用タンパク質をコードするDNA等をPCRやDNAリガーゼ等を用いて連結することで構築することができる。
【００４９】
本発明の組換えベクターは、前記融合タンパク質をコードするDNAが、ベクターが導入される宿主細胞において発現可能なように、ベクター内に挿入されているものであればよい。ベクターは、宿主細胞において複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、プラスミドDNA、ウイルスDNA等が挙げられる。また、ベクターは薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを含むことが好ましい。具体的なプラスミドベクターとして、例えば、pTrcHis2ベクター、pUC119、pBR322、pBluescript II KS+、pYES2、pAUR123、pQE-Tri、pET、pGEM-3Z、pGEX、pMAL、pRI909、pRI910、pBI221、pBI121、pBI101、pIG121Hm、pTrc99A、 pKK223、pA1−11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNA I/Neo、p3×FLAG-CMV-14、pCAT3、pcDNA3.1、pCMV等が例示される。
【００５０】
ベクター内で用いられるプロモーターは、ベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、酵母で発現させる場合、GAL1プロモーター、PGK1プロモーター、TEF1プロモーター、ADH1プロモーター、TPI1プロモーター、PYK1プロモーターなどが使用可能である。植物で発現させる場合、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーター、レタスのユビキチンプロモーターなどが使用可能である。
誘導可能なプロモーターであってもよく、例えば、IPTGにより誘導可能なプロモーターであるlac、tac、trcの他、IAAで誘導可能なtrp、L-アラビノースで誘導可能なara、テトラサイクリンを用いて誘導可能なPzt-1、高温（42℃）で誘導可能なPLプロモーター、コールドショック遺伝子の一つであるcspA遺伝子のプロモーターなどが使用できる。
また、必要に応じ、ターミネーター配列も宿主細胞に応じて含めることができる。
【００５１】
本発明で用いる組換えベクターは、例えば、前記DNA構築物を適当な制限酵素で切断又はＰＣＲによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することで得ることができる。
【００５２】
本発明で用いる形質転換体は、前記組換えベクターで形質転換されていることを特徴とする。形質転換に用いられる宿主細胞は真核細胞及び原核細胞の何れでもよい。
真核細胞としては、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞などでもよいが、植物細胞が好ましく用いられ、中でもアキノノゲシ属（Lactuca）などのキク科（Asteraceae）、ナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、バラ科（Rosaceae）、アカザ科（Chenopodiaceae）に属する植物の細胞が好ましく用いられる。さらに、アキノノゲシ属（Lactuca）に属する植物の細胞、中でもレタス（Lactuca sativa）細胞が好ましく用いられる。宿主細胞としてレタス細胞を用いる場合は、ベクターは、カリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター等を用いることができる。酵母としては、Saccharomyces cerevisiaeやCandida utilisやSchizosaccharomyces pombeなどが挙げられる。さらに、麹菌（Aspergillus）等の微生物を用いることもできる。
原核細胞としては、大腸菌（Escherichia coli）、乳酸菌（Lactobacillus）、枯草菌（Bacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）、放線菌などが挙げられる。
【００５３】
本発明で用いる形質転換体は、一般的な遺伝子工学的手法を用いて、本発明の組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。例えば、エレクトロポレーション法（Tada, et al., 1990, Theor．Appl．Genet, 80：475）、プロトプラスト法(Gene, 39, 281-286(1985))、ポリエチレングリコール法（Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81：437）、アグロバクテリウムを利用した導入方法（Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2：218，Hiei, et al.，1994 Plant J. 6：271）、パーティクルガン法（Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci.tech. 5：27）、ポリカチオン法（Ohtsuki, et al., FEBS Lett. 1998 May 29;428(3):235-40.）などの方法を用いることが可能である。なお、遺伝子発現は一過的発現でもよく、染色体に組み込まれる安定的発現でもよい。
【００５４】
本発明で用いるベクターを宿主細胞に導入した後、選択マーカーの表現型によって前記形質転換体を選抜することができる。また、選抜した形質転換体を培養することにより、前記融合タンパク質を生産することができる。培養に用いる培地及び条件は、形質転換体の種に応じて適宜選択することができる。
また、宿主細胞が植物細胞の場合には、選抜した植物細胞を常法に従って培養することにより、植物体を再生することができ、植物細胞内又は植物細胞の細胞膜外に前記融合タンパク質を蓄積させることができる。例えば、植物細胞の種類により異なるが、ジャガイモであればVisserら（Theor．Appl．Genet 78：594（1989））の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe（Planta 99：12（1971））の方法が挙げられる。
【００５５】
培地や細胞内に蓄積した本発明のペプチドリンカーが付加された融合タンパク質は、当業者によく知られた方法に従って分離精製することができる。例えば、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。ただし、融合タンパク質は必ずしも宿主から単離・精製される必要はなく、形質転換体のままワクチン等の用途に使用されてもよい。
【００５６】
すなわち、本発明の融合タンパク質は、安定性が高く、高レベルで植物細胞や酵母細胞などの宿主細胞内に蓄積する。よって、本発明のDNA構築物を用いて宿主細胞に本発明の融合タンパク質を生産させることで、効率よい、経口ワクチンまたは免疫賦活（免疫誘導）剤の生産が可能になる。すなわち、動物にトランスジェニック植物または酵母等を食餌することで、動物に本発明の融合タンパク質に含まれる細菌・ウイルス抗原に対する免疫を低コストで付与することを可能にする。
【００５７】
本発明の融合タンパク質及びそれを含む形質転換体は、融合タンパク質が抗原タンパク質の融合タンパク質である場合、動物における、志賀毒素、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素などの細菌毒素やロタウイルス、パルボウイルス、ブタ流行性下痢ウイルスなどの病原性ウイルスに対する免疫を賦活または誘導するためのワクチンとして有用である。投与対象は、ブタ、ウシ、ニワトリ等の産業用動物およびイヌ、ネコ等のコンパニオン動物などが挙げられる。本発明の融合タンパク質及びそれを含む形質転換体は、志賀毒素、コレラ毒素または大腸菌易熱性毒素が関与する疾患、例えば、ブタ浮腫病、ブタ大腸菌性下痢症、コレラ、炎症、免疫不全などに対するワクチンとして有用である。
【００５８】
本発明のワクチンは、本発明の融合タンパク質及び／又はそれを含む形質転換体を含む。形質転換体を含む場合、形質転換体の全部を含んでいても、一部を含んでいてもよい。また、形質転換体をそのまま用いることもでき、乾燥、粉砕するなどして用いることもできる。また、本発明のワクチンには、抗原ペプチドの免疫原性を高めるアジュバントを配合することもできる。一般的には、安全性を考慮して水酸化アルミニウムなどがアジュバントとして用いられる。
【００５９】
本発明の志賀毒素、コレラ毒素または大腸菌易熱性毒素などの細菌毒素やロタウイルス、パルボウイルス、ブタ流行性下痢ウイルスなどの病原性ウイルスが関与する疾患の防除方法は、本発明のワクチンをブタ等の非ヒト動物に投与することを特徴とする。例えば、ブタ浮腫病ワクチンとして使用する場合、免疫は、浮腫病の発生率が高い子豚に対して行うことが好ましい。免疫の方法としては、本発明のワクチンを母豚に投与して、母豚が産生した抗体を、乳汁により子豚に与える方法、本発明ワクチンを子豚に投与し、子豚を直接免疫する方法等が挙げられる。本発明のワクチンをブタ等の動物に投与する方法としては、ブタ等の動物の飼料に本発明のワクチンを混合してブタ等の動物に与える方法、ブタ等の動物に点鼻する方法などが挙げられる。この場合の投与量は、本発明の融合タンパク質の質量として、１日当たり好ましくは４ｍｇ以上、さらに好ましくは１６ｍｇ以上である。本発明のワクチンは、一定の間隔をおいて、複数回投与することが好ましい。例えば、４〜７日おきに、合計２〜３回投与する方法が挙げられる。
【００６０】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
(1) Stx2eB発現用プラスミドの構築
ブタ浮腫病の原因毒素タンパク質Stx2eは毒性を持つAサブユニット1分子と無毒のBサブユニット（Stx2eB、配列番号１０）5分子からなる。下記手順に従い2分子のStx2eBがペプチドを介し連結されたタンパク質を酵母で発現させるためのプラスミドを構築した。
Stx2eBをコードする人工合成DNA（配列番号９）をプラスミドpYES2（Invitrogen）に挿入し、プラスミド１を得た。
さらに、NotI、SalI、SfiI、XhoI、AscI認識配列からなるマルチクローニングサイトの5'末端に酵母インベルターゼSUC2シグナルぺプチド（SUC2SP、配列番号３、Hashimoto等, Protein Engineering, 1998 2; 75-77）および6×HNタグ（配列番号４）をコードするDNA配列を付加した人工合成DNA（配列番号１３）をpYES2のHindIII-XbaIサイトに挿入し、酵母発現用プラスミド２を作成した。【００６２】
次に、プラスミド構築に必要なDNA断片(1)〜(21)を得るために表１に示した鋳型プラスミド、フォワードプライマー、リバースプライマーの組み合わせによるPCRを実施した。
一部のプライマーの末端にはプラスミド構築に必要となる相同配列を付加した。【００６３】
【表１】
2017217460.tif 000003
なお、プラスミド３〜６は表２の記載の通り、プラスミド２にそれぞれ、PCR増幅断片（1）＋（2）、（1）＋（4）、（3）＋（4）、（1）＋（5）を挿入したものである。【００６４】
PCRはKOD-PLUS-Ver.2（東洋紡）を用い、2 pg/μl 鋳型プラスミド、0.3 μM フォワードプライマー、0.3 μM リバースプライマー、0.2 mM dNTPs、1×Buffer for KOD-Plus-Ver.2、1.5 mM MgSO4、0.02 U/μl KOD-PLUS-Ver.2 となるように50 μl反応液を調製し、94℃、5分間加熱した後、98℃、10秒間、60℃、 30秒間、68℃, 40秒間の加熱処理を25サイクル行い、最後に68℃で5分間加熱した。得られた増幅断片はQIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）で精製した。
プラスミド２はHindIII、AscIで消化後、0.8% SeaKem GTG Agarose（Lonza）を用いた電気泳動により分離し、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いゲルから抽出した。プラスミド３はBamHI、AscIで消化後、0.8% SeaKem GTG Agaroseを用いた電気泳動により分離し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いゲルから抽出した。【００６５】
【表２】
2017217460.tif 000004
【００６６】
表２に示すプラスミド３〜１５（図１の融合タンパク質をコードする遺伝子構築物を含有）を構築するために約50 ng分の抽出したプラスミド２と精製されたPCR増幅断片（2種）（表１）を混合し液量を5 μlに調整後、Gene Art Seamless PLUS Cloning and Assembly Kit（Applied Biosystem）添付の2×Enzyme Mix 5 μlと混合し、室温で30分間静置、その後5分間氷上に静置した。プラスミド１６〜２０の構築には上記プラスミド２の代わりに抽出したプラスミド３を用いた。反応液5 μlを上記キット添付のコンピテントセルDH10B T1 SAと混合し氷上で30分間静置後、37℃で10分間加温し、氷上で2分間静置後、SOCを250 μl添加し、37℃、200 rpmで1時間振盪した。その後、振盪物の50μlを100 mg/lアンピシリンを含む2×YT寒天培地（16 g/l Bacto tryptone、10 g/l Bacto Yeast Extract、5 g/l NaCl、15 g/l Bacto Agar）に塗布後、37℃で一晩静置培養し、形質転換コロニーを得た。コロニーを100 mg/lアンピシリンを含む2×YT液体培地（16 g/l Bacto tryptone、10 g/l Bacto Yeast Extract、5 g/l NaCl）に移植し、37℃、200 rpmで一晩振盪培養後、プラスミドを抽出し、塩基配列を確認後、酵母の形質転換に用いた。【００６７】
(2) LTB、Stx2eB融合タンパク質発現用プラスミドの構築
下記手順に従いLTB（配列番号１２）、Stx2eBがペプチドを介し連結されたタンパク質を酵母で発現させるためのプラスミドを構築した。【００６８】
【表３】
2017217460.tif 000005
【００６９】
まず、LTBをコードする人工合成DNA（配列番号１１）をプラスミドpYES2に挿入し、プラスミド２１を得た。
次に、プラスミド構築に必要なDNA断片(22)〜(24)を得るために表３に示した鋳型プラスミド、フォワードプライマー、リバースプライマーの組み合わせによるPCRを実施した。一部のプライマーの末端にはプラスミド構築に必要となる相同配列を付加した。
PCRはKOD-PLUS-Ver.2を用い、2 pg/μl 鋳型プラスミド、0.3 μM フォワードプライマー、0.3 μM リバースプライマー、0.2 mM dNTPs、1×Buffer for KOD-Plus-Ver.2、1.5 mM MgSO4、0.02 U/μl KOD-PLUS-Ver.2 となるように50 μl反応液を調製し、94℃、5分間加熱した後、98℃、10秒間、60℃、 30秒間、68℃, 40秒間の加熱処理を25サイクル行い、最後に68℃で5分間加熱した。得られた増幅断片はQIAquick PCR Purification Kitで精製した。
プラスミド４はBamHI、AscIで消化後、0.8% SeaKem GTG Agaroseを用いた電気泳動により分離し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いゲルから抽出した。【００７０】
表２に示すプラスミド２２〜２４（図１の融合タンパク質をコードする遺伝子構築物を含有）を構築するために約50 ng分の抽出したプラスミド４と精製PCR産物（2種）を混合し液量を5 μlに調整後、Gene Art Seamless PLUS Cloning and Assembly Kit添付の2×Enzyme Mix 5 μlと混合し、室温で30分間静置、その後5分間氷上に静置した。反応液5 μlを上記キット添付のコンピテントセルDH10B T1 SAと混合し氷上で30分間静置後、37℃で10分間加温し、氷上で2分間静置後、SOCを250 μl添加し、37℃、200 rpmで1時間振盪した。その後、振盪物の50μlを100 mg/lアンピシリンを含む2×YT寒天培地に塗布後、37℃で一晩静置培養し、形質転換コロニーを得た。コロニーを100 mg/lアンピシリンを含む2×YT液体培地に移植し、37℃、200 rpmで一晩振盪培養後、プラスミドを抽出し、塩基配列を確認後、酵母の形質転換に用いた。【００７１】
(3) LTB、Stx2eB、各種動物ウイルスエピトープ融合タンパク質発現用プラスミドの構築
下記手順に従いLTB、Stx2eBおよび各種動物ウイルスエピトープ（イヌパルボウイルス中和エピトープ（CP、配列番号６２）、ブタパルボウイルス中和エピトープ（PP、配列番号６４）、ブタロタウイルスC型 中和エピトープ（RoC、配列番号６６）、ブタ流行性下痢ウイルス中和エピトープ（PED、配列番号６８））がペプチドを介し連結されたタンパク質を酵母で発現させるためのプラスミドを構築した。【００７２】
まず、CP、PP、RoC、PEDをコードする人工合成DNA（配列番号６１、６３、６５、６７）をプラスミドpYES2に挿入し、プラスミド２５、２６、２７、２８を得た。
次に、プラスミド構築に必要なDNA断片(25)〜(35)を得るために表３に示した鋳型プラスミド、フォワードプライマー、リバースプライマーの組み合わせによるPCRを実施した。一部のプライマーの末端にはプラスミド構築に必要となる相同配列を付加した。
PCRはKOD-PLUS-Ver.2を用い、2 pg/μl 鋳型プラスミド、0.3 μM フォワードプライマー、0.3 μM リバースプライマー、0.2 mM dNTPs、1×Buffer for KOD-Plus-Ver.2、1.5 mM MgSO4、0.02 U/μl KOD-PLUS-Ver.2 となるように50 μl反応液を調製し、94℃、5分間加熱した後、98℃、10秒間、60℃、 30秒間、68℃, 40秒間の加熱処理を25サイクル行い、最後に68℃で5分間加熱した。得られた増幅断片はQIAquick PCR Purification Kitで精製した。
プラスミド２２はSalI、AscIで消化後、0.8% SeaKem GTG Agaroseを用いた電気泳動により分離し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いゲルから抽出した。プラスミド２３、２４に関しても同様の処理を行い抽出した。【００７３】
【表４】
2017217460.tif 000006
【００７４】
表４に示すプラスミド２９，３０（図１の融合タンパク質をコードする遺伝子構築物を含有）を構築するために約50 ng分の抽出したプラスミド２２と精製PCR産物（2種）を混合し液量を5 μlに調整後、Gene Art Seamless PLUS Cloning and Assembly Kit添付の2×Enzyme Mix 5 μlと混合し、室温で30分間静置、その後5分間氷上に静置した。プラスミド３１の構築には上記プラスミド２の代わりに抽出したプラスミド２３を、プラスミド３２〜３６の構築には上記プラスミド２の代わりに抽出したプラスミド２４を用いた。反応液5 μlを上記キット添付のコンピテントセルDH10B T1 SAと混合し氷上で30分間静置後、37℃で10分間加温し、氷上で2分間静置後、SOCを250 μl添加し、37℃、200 rpmで1時間振盪した。その後、振盪物の50μlを100 mg/lアンピシリンを含む2×YT寒天培地に塗布後、37℃で一晩静置培養し、形質転換コロニーを得た。コロニーを100 mg/lアンピシリンを含む2×YT液体培地に移植し、37℃、200 rpmで一晩振盪培養後、プラスミドを抽出し、塩基配列を確認後、酵母の形質転換に用いた。【００７５】
(4) 酵母の形質転換
酵母（Saccharomyces cerevisiae INVSc1、Invitrogen）をYPD培地（1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose (D-glucose)）で30℃、200rpmで一晩振盪培養した。10 mlのYPD 中に波長600 nmでの濁度（OD600）が0.2-0.4になるように希釈した後、OD600が0.6-1.0になるまで30℃、200 rpmで振盪培養した。500 x g、室温で5 分間遠心し、細胞をペレットにし、上清を捨てた。10 ml のSolution I（S. c. EasyComp Transformation Kit、Invitrogen）に懸濁した。500 x g、 室温で5 分間遠心し、細胞をペレットにし、上清を捨てた。1 mlのSolutionII（S. c. EasyComp Transformation Kit、Invitrogen）に懸濁し、50 μl ずつ分注し、コンピテントセルとした。使用するまで-80 ℃の冷凍庫に保管した。
得られたコンピテントセルを融解して室温に戻し、上記で作製したプラスミド７〜１５を1 μg添加した後、500 μlのSolutionIII（室温）を添加し、30℃にて1時間静置した（その間15分ごとにボルテックスを行った）。培養終了後、100 μlを2% glucoseおよび2% Bacto Agar を含むSC-Ura培地 (6.7 g/L yeast nitrogen base, 0.1 g/L adenine, 0.1 g/L arginine, 0.1 g/L cysteine, 0.1 g/L leucine, 0.1 g/L lysine, 0.1 g/L threonine, 0.1 g/L tryptophan, 0.05 g/L aspartic acid, 0.05 g/L histidine, 0.05 g/L isoleucine, 0.05 g/L methionine, 0.05 g/L phenylalanine, 0.05 g/L proline, 0.05 g/L serine, 0.05 g/L tyrosine, 0.05 g/L valine)に塗布後、30℃で2-3日静置培養し、形質転換コロニーを得た。【００７６】
(5) 酵母のタンパク質誘導培養
形質転換後のシングルコロニーをプレート培地（SC-Ura, 2％ dextrose）に塗株し、30℃、24時間インキュベーター中に静置し培養を行った。次に、培養後のプレート培地より1μl滅菌ディスポループで菌体をかきとり、3mlの前培養培地（SC-Ura, 2% galactose）を分注した滅菌ポリスチレン製14mlチューブに植菌し、30℃、200rpm、20時間振盪培養を行った。培養終了後、分光光度計600nmにて濁度を測定し、3ml培地に再懸濁した場合に濁度が0.4になる必要量の培養物を、滅菌済1.5mlエッペンドルフチューブに分取後、3,000×g、4℃、5分間遠心分離を行い、上清を除去後、沈殿を1ml誘導培地（SC-Ura, 1% galactose, 1% raffinose）に懸濁した。それら懸濁液を予め2mlの誘導培地を分注した滅菌ポリスチレン製14mlチューブに合せ、30℃、200rpm、24時間振盪培養を行った。培養終了後、培養液200μlを1.5mlエッペンドルフチューブに分取し、3,000×g、4℃、5分間遠心後、上清を除去した後、液体窒素中で凍結後、ディープフリザー中-80℃で保存した。【００７７】
(6) 酵母からのタンパク質抽出
タンパク質抽出はAkira Hosomi らの方法（Akira Hosomi, et al,: J Biol Chem, 285,(32), 24324-24334, 2010）に従い、液体窒素凍結後、-80℃で保存した遺伝子導入酵母菌体を用いて行った。保存サンプルに360μlの蒸留水を加えボルテックスミキサーにて撹拌後、40μlの1.0Ｎ  ＮａＯＨを加え、再度ボルテックスミキサーにて撹拌後、氷冷化10分静置した。次に、4℃、15,000g、5分間遠心分離を行い、上清を棄てた後、沈殿を回収した。【００７８】
(7) ウエスタン解析
得られたタンパク質沈殿に100μlのサンプルバッファー（EZ Apply、ATTO製）を加え、ボルテックスミキサーにて撹拌後、沸騰水中で10間加温し、サンプルのSDS化を行った。タンパク質定量時の標準物質には2×Stx2eB（比較例２）標品を用いた。これをサンプルバッファーで2倍希釈を繰り返すことにより希釈系列を作成し、これらをスタンダードとして用いた。
タンパク質の電気泳動（SDS-PAGE）は、電気泳動槽（Criterion cell、BIO RAD）およびCriterion TGX-ゲル（BIO RAD）を用いた。電気泳動バッファー（Tris/Glycine/SDS Buffer、BIO RAD）を入れ、ウェルにSDS化したサンプルを4 μlアプライし、200 V定電圧で40分間行った。
電気泳動後のゲルは、トランスブロット転写パック（BIO RAD）を用い、トランスブロットTurbo（BIO RAD）でブロッティングを行った。
ブロッティング後のメンブレンはブロッキング溶液（TBS系, pH7.2、ナカライテスク）に浸し、室温で1時間振盪または4℃で16時間静置後、TBS-T（137 mM 塩化ナトリウム、2.68 mM 塩化カリウム、1% ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、25 mM Tris-HCl、pH 7.4）中で室温、5分間の振盪を3回行い洗浄した。Stx2eBの検出には、抗血清Rat-monoclonal Anti-Stx2eB antibodyをTBS-Tで7,000倍希釈して使用した。本希釈液中にメンブレンを浸し、室温で2時間振盪することにより抗原抗体反応を行い、更にTBS-T中で室温、5分間の振盪を3回行い洗浄した。二次抗体には、TBS-Tで7,000倍希釈したAnti-Rat IgG, AP-linked Antibody（PROMEGA）を使用した。本希釈液中にメンブレンを浸し、室温で1時間振盪することにより抗原抗体反応を行い、TBS-T中で室温、5分間の振盪を3回行い洗浄した。アルカリホスファターゼによる発色反応は、発色液（0.1 M 塩化ナトリウム、5 mM 塩化マグネシウム、0.33 mg/mlニトロブルーテトラゾリウム、0.33 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸、0.1 M Tris-HCl、pH9.5）中にメンブレンを浸し、室温で15分間振盪することにより行い、メンブレンを蒸留水で洗浄した後、常温で乾燥した。
発色したメンブレンはスキャナー（PM-A900、エプソン）により解像度600 dpiで画像化し、画像解析ソフト（CS Analyzer ver. 3.0、アトー）を用い、Stx2eBタンパク質の定量を行った。【００７９】
［結果］
（１）ペプチドリンカーのアミノ酸組成と細菌毒素ワクチンの発現量の違い
図２に示されるように、PG12リンカーによって二つのStx2eBを連結し、さらにＣ末端側にPG12を連結した特許5360727号に記載の比較例2（2x2eB-nPGPG）は、二つのStx2eBをRS（アルギニン・セリン）のジぺプチドで連結した比較例1（2x2eB-nRSn）に比べ1.23倍のワクチンの発現量を示すに止まったが、PG12ペプチドリンカーのグリシンおよびセリン（合計6残基）を塩基性アミノ酸であるリジンで置換したPX12-20v7リンカーによってStx2eBを連結し、さらにＣ末端側にPX12-20v7を連結した実施例2x2eB-nV7V7では、比較例1の約2倍の発現量を示した。
また、Stx2eBをPG12リンカーで連結し、ＣおよびＮ末端にはリンカーを連結しない比較例3（2x2eB-nPGn）は、比較例1に対して約1.5倍の発現量の向上が認められたのに対し、比較例3のコンストラクトのリンカー部分をPX12-20v7に置換えた実施例2x2eB-nV7nでは、比較例1の3倍強の発現量が得られた。
以上の結果より、二つのStx2eBを連結するリンカーとしての有用性においてPX12-20v7はPG12を明らかに上回る性能を有するといえる。【００８０】
（２）ペプチドリンカー（PX12-20v7）の連結位置および連結数と細菌毒素ワクチンの発現量の違い
図２に示されるように、二つのStx2eBの間をPG12で連結し、さらにＣ末端側にPX12-20v7を連結した2x2eB-nPGV7（比較例4）では、比較例1とほぼ同等の発現量しか得られなかった。一方、二つのStx2eBの間をPX12-20v7で連結し、さらにＣ末端側にPG12を連結した実施例2x2eB-nV7PGでは、比較例1の約1.9倍と、実施例2x2eB-nV7V7と同程度の発現量を示した。
さらに、二つのStx2eBの間をPX12-20v7で連結し、さらにＮＣ両末端にPX12-20v7を連結した実施例2x2eB-V7V7V7では、Ｎ末端にPX12-20v7を連結したにも関わらず、比較例1の3.5倍強という最も高い発現量を示した。
以上の結果より、二つのStx2eBの間のPX12-20v7による連結と、それに加えたＮもしくはＣ末端、あるいはＮＣ両末端へのPX12-20v7の連結は、その組合せによってワクチンタンパク質であるタンデムStx2eB（2xStx2eB）の発現量を大きく変化させることが明らかになった。PX12-20v7リンカーの導入位置として最も有効性が高いのは、実施例2x2eB-V7V7V7にみられる3箇所への一括導入である。
一方、二つのStx2eBの間をPG12により連結し、それに加えNC両末端へPG12を連結した比較例5では、比較例１の0.88倍と発現量が低下した。本結果からも、有用性においてPX12-20v7は、PG12を上回る性能を有するといえる。【００８１】
（３）HAタグの連結の影響
図２に示されるように、実施例2x2eB-nV7V7のＣ末端側にエピトープタグのひとつであるHA配列（インフルエンザウイルスのヘマグルチニン配列）を連結した実施例2x2eB-nV7V7HAでは、比較例1の2.2倍強の発現量を示し、HAを付加しない実施例2x2eB-nV7V7に対して同等以上の発現量を示した。本結果から、HAタグのＣ末端側への導入は、本ワクチンタンパク質の発現に負の影響を与えないことが明らかになった。【００８２】
（４）ペプチドリンカーのバリエーションと細菌毒素ワクチンの発現量の違い
二つのStx2eBの間とNC両末端へPX12-20、PX12-40、PX12-41もしくはPX12-45を連結した実施例2x2eB-202020、2x2eB-404040、2x2eB-414141および2x2eB-454545は、比較例１に対し、1.82、2.45、2.76および3.78倍の発現量を示した。これらの結果から、PX12-20、PX12-40、PX12-41およびPX12-45もペプチドリンカーとしてPG12を上回る性能を有するといえる。また、本結果もペプチドリンカーへのリジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸の導入の有効性をも示している。【００８３】
（５）LTB、Stx2eBおよび各種抗原ペプチドの連結へのPX12-20v7リンカーの適用と当該ワクチンタンパク質の発現
LTBおよびStx2eBをPG12で連結し、さらにC末端側にPG12を連結した比較例6は、比較例1の1.20倍の発現量を示すに止まったが、LTBおよびStx2eBをPX12-20v7で連結し、さらにC末端側にPX12-20v7を連結した実施例LTB2eB-nv7v7では、1.90倍の発現量が得られ、LTBとStx2eBの連結においてもPX12-20v7がPG12に対し優位性を示した。【００８４】
また、LTBとStx2eBの間とNC両末端にPX12-20v7を連結した実施例LTB2eB-v7v7v7では、比較例1に対し、2.63倍の発現量を示した。すなわち、LTBとStx2eBの連結においても、Stx2eBの二連結の場合と同様に、実施例LTB2eB-v7v7v7にみられる3箇所への一括導入の有効性を示した。【００８５】
さらに、LTBとStx2eBに加え、イヌパルボウイルス抗原エピトープ（CP）をPG12で３連結した比較例8では、比較例１の1.24倍の発現量に止まったが、LTB、Stx2eBおよびCPをPX12-20v7で連結した実施例LTB2eBCP-nv7v7では、比較例1の2.17倍の発現量を示した。また、さらにN末端側にPX12-20v7を連結した実施例LTB2eBCP-v7v7v7nでは、比較例1の2.41倍の発現量が得られえ、NC両末端にPX12-20v7を連結した実施例LTB2eBCP-v7v7v7v7に至っては比較例1の3.21倍の発現量を示した。上記の結果からも、PG12に対するPX12-20v7の優位性と、PX12-20v7のLTB、Stx2eBおよびCPの間とNC両末端への一括導入の有効性が示された。【００８６】
実施例LTB2eBCP-v7v7v7nのCP部分を他の抗原性ペプチド（PP：豚パルボウイルスエピトープ、RoC：ロタウイルスエピトープ、PED：豚流行性下痢ウイルスエピトープ）に置換えた実施例LTB2eBPP-v7v7v7n、LTB2eBRoC-v7v7v7nおよびLTB2eBPED-v7v7v7n、においても、比較例１に対し2.65倍、1.99倍および2.39倍の発現量が得られた。本結果は、多岐にわたる別の抗原ペプチド導入によっても、高い発現量は維持されることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の融合タンパク質は畜産等の分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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