(57)【要約】本発明の目的は、樹状細胞に抗原を効率的に送達し、抗原のワクチン効果を向上させ得るペプチドを提供することである。配列番号1からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１位及び２位のアミノ酸残基の少なくともいずれかを変異させたアミノ酸配列からなるモチーフ配列を少なくとも１個有するペプチドを、抗原タンパク質又は抗原ペプチドに結合させることによって、当該抗原タンパク質又は抗原ペプチドが効率的に樹状細胞に送達され、格段に優れたワクチン効果を奏することが可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(i)及び(ii)に示すアミノ酸配列から選ばれるモチーフ配列を少なくとも１個有するペプチド：
(i)配列番号１に示すアミノ酸配列、
(ii)配列番号１に示すアミノ酸配列における１位及び２位のアミノ酸残基の少なくともいずれかがアラニン残基に置換されたアミノ酸配列。
【請求項２】
前記(i)に示すアミノ酸配列からなるモチーフ配列を１〜５個有している、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペプチドをコードしているＤＮＡ分子。
【請求項４】
抗原タンパク質又は抗原ペプチドに、請求項１又は２に記載のペプチドが結合している、ペプチド融合体。
【請求項５】
抗原タンパク質又は抗原ペプチドのＣ末端側に、請求項１又は２に記載のペプチドのＮ末端が結合している、請求項４に記載のペプチド融合体。
【請求項６】
前記抗原タンパク質又は抗原ペプチドが、癌抗原タンパク質又は癌抗原ペプチドである、請求項４又は５に記載のペプチド融合体。
【請求項７】
前記抗原タンパク質又は抗原ペプチドが、病原ウイルスの抗原タンパク質又は抗原ペプチドである、請求項４又は５に記載のペプチド融合体。
【請求項８】
前記抗原タンパク質又は抗原ペプチドが、病原細菌の抗原タンパク質又は抗原ペプチドである、請求項４又は５に記載のペプチド融合体。
【請求項９】
請求項４〜８のいずれかに記載のペプチド融合体を含む、ワクチン製剤。
【請求項１０】
経肺投与用である、請求項９に記載のワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞に抗原を効率的に送達させ、抗原のワクチン効果を向上させ得るペプチドに関する。また、本発明は、当該ペプチドが抗原タンパク質又は抗原ペプチドに結合したペプチド融合体、及び当該ペプチド融合体を使用したワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンによる感染症や癌の予防の基本的原理は、人為的な疑似感染により、獲得免疫を誘導し、特定の病原体に対する抗体産生や細胞性免疫を誘導することにある。近年、ワクチンによる感染症の予防は、安全性を重現し、弱毒株などを用いる生ワクチンから、病原体そのものではなく、病原体由来のタンパク質やペプチドを抗原として用いたワクチン開発に期待が寄せられている。【０００３】
しかしながら、抗原となるタンパク質やペプチドを単独で投与しても、免疫誘導の場であるリンパ節へ殆ど移行せず、免疫担当細胞である樹状細胞に取り込まれないため、免疫応答が誘導され難い。よって、ワクチンを開発する上で、抗原の体内動態制御が不可欠になっている。更に、病原体に対する防御免疫を十分に誘導するために、免疫賦活化剤（アジュバント）を併用することが重要になるが、十分な免疫応答を誘導し得るアジュバントに乏しいことがワクチン開発における大きな障壁の一つになっている。【０００４】
従来、抗原を樹状細胞に効率的に送達するためのキャリアーとしてペプチドを利用することが試みられている。例えば、非特許文献１には、ペプチドＷＨ（アミノ酸配列：WPRFHSSVFHTH）が、樹状細胞に発現しているＣｌｅｃ９ａに選択的に結合できるので、樹状細胞へのキャリアーペプチドとして使用できることが開示されている。また、非特許文献２には、ＮＷペプチド（アミノ酸配列：NWYLPWLGTNDW）は、樹状細胞への結合能が高く、樹状細胞への抗原の送達に使用できることが開示されている。しかしながら、非特許文献１及び２に開示されているキャリアーペプチドでは、アジュバントと併用しなければワクチン効果を十分に奏することができないという欠点がある。【０００５】
一方、非特許文献３には、Neuropilin-1は、癌細胞に発現しており、R/K-X-X-R/K（Ｘは任意のアミノ酸）からなるモチーフ配列を有するペプチドは、癌細胞表面のNeuropilin-1に結合し、癌細胞内に取り込まれることが報告されており、当該モチーフ配列を有するペプチドを用いた癌組識への薬物送達が試みられている。【０００６】
また、一部の免疫細胞（樹状細胞、制御性Ｔ細胞）にも、Neuropilin-1が発現していることが知られている。しかしながら、従来、R/K-X-X-R/Kからなるモチーフ配列を有するペプチドについて、免疫制御に応用した研究はなされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Zhongyi et al. A novel peptide targeting Clec9a on dendritic cell for cancer immunotherapy. Oncotarget, Vol.7, No.26, 40437-40450
【非特許文献２】Sioud et al. A novel peptide carrier for efficient targeting of antigens and nucleic acids to dendritic cells. FASEB J., Vol.27, 3272-3283
【非特許文献３】Sugahara et al., Tissue-penetrating delivery of compounds and nanoparticles into tumors. Cancer cell, Vol.16, No.5, 510-520
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、樹状細胞に抗原を効率的に送達させ、抗原タンパク質又は抗原ペプチドのワクチン効果を向上させ得るペプチド（キャリアーペプチド）を提供することである。更に、本発明の目的は、当該ペプチドが抗原タンパク質又は抗原ペプチドに結合したペプチド融合体、及び当該ペプチド融合体を使用したワクチン製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、前記課題を解決すべく、鋭意検討を行った。具体的には、本発明者は、先ず、ランダムな７個以下のアミノ酸からなる約１０億種類のランダムペプチドを表面提示したファージライブラリを用いた網羅的スクリーニング法により、樹状細胞選択的に結合し得るペプチドとして約３０種類のペプチドを同定した。同定されたペプチドの多くは、R/K-X-X-R/K（Ｘは任意のアミノ酸）からなるモチーフ配列を有していた。次いで、同定されたペプチドを抗原タンパク質又は抗原ペプチドと結合させて、マウスに免疫したところ、配列番号１からなるアミノ酸配列を有しているペプチドを使用した場合のみ、格段に優れた免疫応答を誘導し、他のR/K-X-X-R/Kからなるモチーフ配列を有するペプチドを使用した場合とは異なる作用を有していた。更に、抗原タンパク質又は抗原ペプチドに配列番号１からなるアミノ酸配列を有しているペプチドを結合させたペプチド融合体は、アジュバントを使用せずとも、優れたワクチン効果を奏し得る場合があることを確認した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  以下の(i)及び(ii)に示すアミノ酸配列から選ばれるモチーフ配列を少なくとも１個有するペプチド：
(i)配列番号１に示すアミノ酸配列、
(ii)配列番号１に示すアミノ酸配列における１位及び２位のアミノ酸残基の少なくともいずれかがアラニン残基に置換されたアミノ酸配列。
項２．  前記(i)に示すアミノ酸配列からなるモチーフ配列を１〜５個有している、項１に記載のペプチド。
項３．  項１又は２に記載のペプチドをコードしているＤＮＡ分子。
項４．  抗原タンパク質又は抗原ペプチドに、項１又は２に記載のペプチドが結合している、ペプチド融合体。
項５．  抗原タンパク質又は抗原ペプチドのＣ末端側に、項１又は２に記載のペプチドのＮ末端が結合している、項４に記載のペプチド融合体。
項６．  前記抗原タンパク質又は抗原ペプチドが、癌抗原タンパク質又は癌抗原ペプチドである、項４又は５に記載のペプチド融合体。
項７．  前記抗原タンパク質又は抗原ペプチドが、病原ウイルスの抗原タンパク質又は抗原ペプチドである、項４又は５に記載のペプチド融合体。
項８．  前記抗原タンパク質又は抗原ペプチドが、病原細菌の抗原タンパク質又は抗原ペプチドである、項４又は５に記載のペプチド融合体。
項９．  項４〜８のいずれかに記載のペプチド融合体を含む、ワクチン製剤。
項１０．  経肺投与用である、項９に記載のワクチン製剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のペプチドは、樹状細胞に対して選択的に結合できるので、抗原タンパク質又は抗原ペプチドと融合させることによって、当該抗原タンパク質又は抗原ペプチドを効率的に樹状細胞に送達することができる。また、本発明のペプチドは、結合させた抗原タンパク質又は抗原ペプチドによる免疫応答を誘導する作用が格段に高く、アジュバントを使用せずとも、優れたワクチン効果を奏する場合が認められる。このように、本発明のペプチドは、抗原タンパク質又は抗原ペプチドの効率的な樹状細胞への送達、及び優れたワクチン効果を奏することが可能になっているので、抗原タンパク質又は抗原ペプチドの投与量を減らすことも可能になる。このような効果は、R/K-X-X-R/Kからなるモチーフ配列を有している他のペプチドを使用した場合には認められず、本願発明のペプチドに特有のものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】試験例１において、樹状細胞の結合するファージを得るためにパニング操作を３回行い、各操作回数において回収されたるファージの数を求めた結果を示す図である。
【図２】試験例１において、クローン化されたファージとマウス由来樹状細胞を混合し、フローサイトメトリー解析にてファージの樹状細胞への結合性を評価した結果の代表例を示す図である。
【図３】試験例２において、各種ペプチド融合体を投与したマウスにおける血清中のPspA特異的IgG量を測定した結果である。
【図４】試験例２において、各種ペプチド融合体を投与したマウスにおける血清中のPspA特異的IgG1量を測定した結果である。
【図５】試験例２において、各種ペプチド融合体を投与したマウスにおける血清中のPspA特異的IgG2c量を測定した結果である。
【図６】試験例３において、ペプチド融合体で免疫したマウスに肺炎球菌を投与して、体重変化及び生存率を経時的に観察した結果である。
【図７】試験例４において、ビオチン化ペプチド／ストレプトアビジン複合体を投与したマウスにおける血清中のストレプトアビジン特異的抗体（全IgG、IgG1及びIgG2c）量を測定した結果である。
【図８】試験例５において、樹状細胞及び脾臓細胞のNeuropilin-1の発現をフローサイトメトリー解析にて評価した結果である。
【図９】試験例６において、ファージクローン（FL4及びFL8）の脾臓細胞に含まれる樹状細胞への結合性を評価した結果である。
【図１０】試験例６において、ファージクローン（FL4及びFL8）の脾臓細胞に含まれるB細胞、CD4+T細胞及びCD8+T細胞への結合性を評価した結果である。
【図１１】試験例７において、ビオチン化ペプチド／ストレプトアビジン複合体の骨髄由来の樹状細胞（FL-DC）への結合性を評価した結果である。
【図１２】試験例７において、ビオチン化ペプチド／ストレプトアビジン複合体の脾臓から精製した樹状細胞への結合性を評価した結果である。
【図１３】試験例７において、ビオチン化ペプチド／ストレプトアビジン複合体の脾臓細胞への結合性を評価した結果である。
【図１４】試験例８において、各種ペプチド融合体を投与したマウスの所属リンパ節について、テトラマーアッセイを行った結果である。
【図１５】試験例９において、EG7細胞を移植したマウスに、SL8とFL4のペプチド融合体又はSL8を投与し、経時的に腫瘍サイズを測定した結果である。
【図１６】試験例１０において、G12D由来ペプチドとFL4のペプチド融合体、又はG12D由来ペプチドを投与したマウスの所属リンパ節から回収された免疫細胞を用いて、抗原特異的CD8+CTLの誘導能（IFN-γ産生能）を評価した結果である。
【図１７】試験例１１において、ビオチン化ペプチド／ストレプトアビジン複合体の樹状細胞への結合性を評価した結果である。
【図１８】試験例１２において、ビオチン化ペプチド／ニュートラアビジン複合体を投与したマウスにおける血清中のニュートラアビジン特異的抗体（全IgG）量を測定した結果である。
【図１９】試験例１３においてSL8とFL4のペプチド融合体を経肺投与したマウスの肺所属リンパ節、肺組織、及び脾臓について、テトラマーアッセイを行った結果である。
【図２０】試験例１４において、SL8とFL4のペプチド融合体を経肺投与又は皮下投与したマウスの脾臓及び肺所属リンパ節について、テトラマーアッセイを行った結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、配列表以外では、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することがある。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
【００１４】
また、本明細書において、表示するアミノ酸配列は、左端がＮ末端、右端がＣ末端である。
【００１５】
１．ペプチド（キャリアーペプチド）
［アミノ酸配列］
本発明のペプチドは、以下の(i)及び(ii)に示すアミノ酸配列から選ばれるモチーフ配列を少なくとも１個有するペプチドである：
(i)配列番号１に示すアミノ酸配列（以下、当該アミノ酸配列を「(i)のモチーフ配列」と表記することがある）
(ii)配列番号１に示すアミノ酸配列における１位及び２位のアミノ酸残基の少なくともいずれかがアラニン残基に置換されたアミノ酸配列（以下、当該アミノ酸配列を「(ii)のモチーフ配列」と表記することがある）。
【００１６】
(i)のモチーフ配列は、VSYKAIR（配列番号１）からなるアミノ酸配列である。配列番号１に示すアミノ酸配列における７位のアルギニン残基は、樹状細胞への選択的な結合又はワクチン効果に関与していると考えられる。配列番号１に示すアミノ酸配列における４位のリジン残基についても、樹状細胞への選択的な結合又はワクチン効果に関与していると考えられる。
【００１７】
(ii)のモチーフ配列は、(i)のモチーフ配列において、１番目及び２番目のアミノ酸残基の少なくともいずれかがアラニン残基に置換されたアミノ酸配列であれば特に限定されないが、樹状細胞への選択的な結合又はワクチン効果を好ましく奏させる観点から、好ましくは、１番目のアミノ酸残基がアラニン残基に置換されたASYKAIR（配列番号２）からなるアミノ酸配列、及び、２番目のアミノ酸配列がアラニン残基に置換されたVAYKAIR（配列番号３）からなるアミノ酸配列が挙げられ、より好ましくは、配列番号２からなるアミノ酸配列が挙げられる。
【００１８】
本発明のペプチドは、前記(i)又は(ii)のモチーフ配列を１つのみ有するものであってもよく、また、前記(i)及び(ii)のモチーフ配列の内、２個以上のモチーフ配列が繰り返し結合しているものであってもよい。より一層優れたワクチン効果を奏するという観点から、本発明のペプチドに含まれる前記モチーフ配列の数として、１個以上、好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個が挙げられる。
【００１９】
本発明のペプチドにおいて、２個以上のモチーフ配列が繰り返し結合している場合、各モチーフ間の結合は、一方のモチーフ配列のＣ末端と他方のモチーフ配列のＮ末端が直接ペプチド結合によって結合していてもよく、また、一方のモチーフ配列のＣ末端と他方のモチーフ配列のＮ末端が、１〜１５個程度、好ましくは１〜１２個程度、更に好ましくは１〜１０個程度の任意のアミノ酸からなるリンカー配列を介してペプチド結合によって結合していてもよい。当該リンカー配列のアミノ酸配列については、特に制限されないが、例えば、GGGGS等が挙げられる。
【００２０】
本発明のポリペプチドとして、より一層効果的にワクチン効果を奏させるという観点から、好ましくは(i)のモチーフ配列を１個以上有するペプチド、更に好ましくは(i)のモチーフ配列を１〜５個有するペプチド、特に好ましくは(i)のモチーフ配列を１〜３個含むペプチドが挙げられる。
【００２１】
本発明のペプチドは、１個以上のモチーフ配列と必要に応じて各モチーフ配列間に設けられるリンカー配列とからなるペプチドであってもよい。このようなペプチドのアミノ酸配列は、［モチーフ配列］1−［（リンカー配列）0〜1−（モチーフ配列1）］0〜X-1（Xは本発明のペプチドに含まれるモチーフ配列の数である）になる。
【００２２】
また、本発明のペプチドは、１個以上のモチーフ配列と必要に応じて設けられる前記リンカー配列以外に、Ｎ末端及び／又はＣ末端側に１〜１００個、好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜５個の任意のアミノ酸が付加されているペプチドであってもよい。このようなペプチドのアミノ酸配列は、［付加された配列］0〜1−［モチーフ配列］1−［（リンカー配列）Y−（モチーフ配列1）］0〜X-1−［付加された配列］Z（Xは本発明のペプチドに含まれるモチーフ配列の数、Y及びZは1又は0であって、Y及びZの少なくとも一方は1である）になる。但し、本発明のペプチドのＣ末端は、モチーフ配列のＣ末端になっていること（即ち、Ｃ末端には前記付加された配列を有していないこと）が望ましい。
【００２３】
［製造方法］
本発明のペプチドの製造方法については、特に制限されず、アミノ酸を所定の配列となるように結合させることにより化学的に合成してもよく、また、後述する本発明のペプチドをコードしているＤＮＡ分子を使用して遺伝子工学的手法を用いて製造してもよい。
【００２４】
以下、本発明のペプチドを遺伝子工学的手法によって製造する手法について説明する。
【００２５】
本発明のペプチドを遺伝子工学的手法によって製造するには、本発明のペプチドを産生する形質転換体を培養すればよい。
【００２６】
本発明のペプチドを産生する形質転換体は、本発明のペプチドをコードしているＤＮＡ分子を含む発現ベクターを作製し、これを用いて宿主を形質転換することによって得ることができる。
【００２７】
本発明のペプチドをコードしているＤＮＡ分子の塩基配列については、当業者であれば、本発明のペプチドのアミノ酸配列に従って適宜設計可能である。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドをコードしている塩基配列としては、配列番号４に示す塩基配列が挙げられる。また、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列がリンカーを介することなく３つ結合しているペプチドをコードしている塩基配列としては、配列番号５に示す塩基配列が挙げられる。
【００２８】
本発明のペプチドをコードしているＤＮＡ分子については、化学合成によって得ることができ、また、本発明のペプチドをコードしているＤＮＡ分子を鋳型として用いて増幅させることにより得ることもできる。
【００２９】
本発明のペプチドをコードしているＤＮＡ分子は、コドン利用頻度を宿主に最適化したものが好ましい。例えば、宿主として大腸菌を使用する場合であれば、コドン利用頻度を大腸菌に最適化させたＤＮＡ分子が好適である。
【００３０】
本発明のペプチドをコードしているＤＮＡ分子を含む発現ベクターには、当該ＤＮＡ分子に作動可能に連結されたプロモーター等の制御因子が含まれる。制御因子としては、代表的にはプロモーターが挙げられるが、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。また、作動可能に連結とは、本発明のペプチドをコードしているＤＮＡ分子を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の制御因子と本発明のＤＮＡ分子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。当該発現ベクターでは、前記ＤＮＡ分子の下流に転写終結シグナルを含んでいることが好ましい。当該発現ベクターは、更に形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。また、発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。
【００３１】
形質転換体の製造に使用される宿主としては、前記発現ベクターが安定であり、且つ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質を発現できるものであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等のエッシェリキア属、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属等に属する細菌；酵母等が好適な例として挙げられるが、その他、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等であってもよい。これらの中でも大腸菌が特に好ましい。
【００３２】
当該形質転換体は、宿主に前記発現ベクターを導入することによって得ることができ、宿主に前記発現ベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法及びエレクトロポレーション法（電気穿孔法）等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。
【００３３】
前記形質転換体の培養条件は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。また、工業的製造を行う場合であれば、通気撹拌培養が好ましい。
【００３４】
前記形質転換体を培養し、培養液を遠心分離等の方法により培養上清又は菌体を回収する。本発明のペプチドが菌体内に蓄積されている場合であれば、菌体を超音波、フレンチプレス等の機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、本発明のペプチドを含む水溶性画分を得ることができる。
【００３５】
斯くして得られた培養液又は水溶性画分を、必要に応じて濃縮した後に、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製することによって、本発明のペプチドを得ることができる。
【００３６】
［用途］
本発明のペプチドは、抗原タンパク質又は抗原ペプチドと融合させた状態で投与すると、樹状細胞に結合して効率的に取り込まれるため、優れたワクチン効果を奏する。よって、ワクチンに用いる抗原タンパク質又は抗原ペプチドの樹状細胞へのキャリアーペプチドとして使用される。
【００３７】
また、本発明のペプチドは、CpGオリゴデオキシヌクレオチド等のアジュバントと複合化させて、アジュバントの樹状細胞への送達能を向上させることによってアジュバント活性を増強させることも期待できるので、アジュバントの樹状細胞へのキャリアーペプチドとして使用することもできる。
【００３８】
２．ペプチド融合体
本発明のペプチド融合体は、抗原タンパク質又は抗原ペプチドに前記ペプチドを結合させた融合体である。
【００３９】
本発明のペプチド融合体において、前記ペプチドを結合させる抗原の種類については、生体内で免疫応答を誘導し得るタンパク質又はペプチドであればよく、防御対象となる感染症や疾患の種類等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、インフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＡＩＤＳウイルス、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、ジカウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、エンテロウイルス、ポリオウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、コレラウイルス、狂犬病ウイルス、ウイルス性出血熱（エボラ出血熱、マールブルグ病、ラッサ熱、クリミア・コンゴ出血熱等）の原因ウイルス等の病原ウイルス（好ましくは、インフルエンザウイルス、ジカウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、エンテロウイルス、ポリオウイルス、ムンプスウイルス等の病原ウイルス）の抗原タンパク質又は抗原ペプチド；ジフテリア、破傷風、結核菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、ブドウ球菌、緑膿菌、百日咳菌、炭疽菌、リッケチア、サルモネラ等の病原細菌（好ましくは、ジフテリア、破傷風、肺炎球菌、髄膜炎菌、百日咳菌等の病原細菌）の抗原タンパク質又は抗原ペプチド；クリプトコッカス・アスペルギルス等の病原真菌の抗原タンパク質又は抗原ペプチド；マラリア原虫等の病原性生物の抗原タンパク質又は抗原ペプチド；悪性黒色腫、肺癌、乳癌、胃癌、食道癌、肝癌、大腸癌、舌癌、甲状腺癌、腎臓癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、すい臓癌、胆道癌、皮膚癌、咽頭癌、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病癌等の癌抗原タンパク質又は癌抗原ペプチド等が挙げられる。
【００４０】
本発明のペプチド融合体において、抗原タンパク質又は抗原ペプチドのＮ末端及びＣ末端の一方又は双方に前記ペプチド（キャリアーペプチド）が結合していればよい。より一層効果的にワクチン効果を奏させるという観点から、好ましくは抗原タンパク質又は抗原ペプチドのＣ末端に前記ペプチド（キャリアーペプチド）が結合している態様が挙げられる。
【００４１】
本発明のペプチド融合体において、抗原タンパク質又は抗原ペプチドのＮ末端に前記ペプチド（キャリアーペプチド）が結合している態様では、抗原タンパク質又は抗原ペプチドのＮ末端と前記ペプチド（キャリアーペプチド）Ｃ末端が、ペプチド結合によって直接結合していてもよく、また１〜１５個、好ましくは１〜１２個、更に好ましくは１〜１０個の任意のアミノ酸からなるリンカー配列を介してペプチド結合によって結合していてもよい。当該リンカー配列のアミノ酸配列については、特に制限されないが、例えば、GGGGS等が挙げられる。
【００４２】
また、本発明のペプチド融合体において、抗原タンパク質又は抗原ペプチドのＣ末端に前記ペプチド（キャリアーペプチド）が結合している態様では、抗原タンパク質又は抗原ペプチドのＣ末端と前記ペプチド（キャリアーペプチド）Ｎ末端が、ペプチド結合によって直接結合していてもよく、また１〜１５個、好ましくは１〜１２個、更に好ましくは１〜１０個の任意のアミノ酸からなるリンカー配列を介してペプチド結合によって結合していてもよい。当該リンカー配列のアミノ酸配列については、特に制限されないが、例えば、GGGGS等が挙げられる。
【００４３】
本発明のペプチド融合体の製造方法については、特に制限されず、例えば、抗原タンパク質又は抗原ペプチドと前記ペプチド（キャリアーペプチド）とを、必要に応じて前記リンカー配列を介して結合させることにより製造する方法；本発明のペプチド融合体をコードしているＤＮＡ分子を作製し、当該ＤＮＡ分子を用いて遺伝子工学的手法によって製造する方法等が挙げられる。
【００４４】
本発明のペプチド融合体は、前記ペプチド（キャリアーペプチド）によって、樹状細胞に抗原タンパク質又は抗原ペプチドを効率的に送達でき、しかも、アジュバントを使用せずとも優れたワクチン効果を奏する場合があるので、ワクチンとして使用され得る。
【００４５】
３．ワクチン製剤
本発明のワクチン製剤は、前記ペプチド融合体を含む。本発明のワクチン製剤は、前記ペプチド融合体の他に、薬学的に許容される担体や賦形剤を適宜組み合わせて配合し、公知の製剤化手法に従って製剤化することにより調製することができる。
【００４６】
前記ペプチド融合体は、アジュバントを使用せずとも、優れたワクチン効果を奏する場合があるため、本発明のワクチン製剤には、アジュバントが含まれていなくてもよい。本発明のワクチン製剤にアジュバントが含まれていない場合は、必要に応じて、ワクチン投与の前又は後にアジュバントを投与して、ワクチン効果の更なる向上を図ってもよい。一方、本発明のワクチン製剤に、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、フロイント、水酸化アルミニウム（Alum）、ミョウバン等のアジュバントを含有させておくことで、ワクチン効果の更なる向上を図ってもよい。
【００４７】
本発明のワクチン製剤の剤型については、特に制限されないが、例えば、注射剤、錠剤、座剤、カプセル剤、シロップ剤、マイクロカプセル剤、貼付剤、エアゾール剤、スプレー剤等が挙げられる。
【００４８】
本発明のワクチン製剤の投与対象については、前記ペプチド融合体によって免疫誘導が求められる動物である限り、特に制限されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ等の哺乳動物；ニワトリ、ダチョウ等の鳥類が挙げられる。
【００４９】
本発明のワクチン製剤の投与形態については、非経口投与又は経口投与のいずれであってもよく、前記ペプチド融合体に含まれる抗原タンパク質又は抗原ペプチドによって誘導される防御免疫の種類等に応じて適宜設定すればよい。非経口投与としては、具体的には、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、関節内投与、粘膜投与等が挙げられる。粘膜投与としては、経肺投与、経鼻投与等が挙げられる。上記投与形態の中でも、ワクチン効果をより一層向上させるという観点から、好ましくは非経口投与、更に好ましくは皮内投与、皮下投与、又は粘膜投与が挙げられ、一層好ましくは粘膜投与が挙げられ、粘膜投与の中でも経肺投与が特に好ましく挙げられる。
【００５０】
本発明のワクチン製剤の投与量については、前記ペプチド融合体に含まれる抗原タンパク質又は抗原ペプチドの種類、投与対象の年齢や体重、期待する作用等に応じて適宜設定されるが、投与対象動物がヒトである場合、通常、１日１回〜数回、好ましくは１日１回、０．０１〜４００００μｇ／ｋｇに相当する量の前記ペプチド融合体を投与すればよい（初回免疫）。また、本発明のワクチン製剤は、初回免疫から通常２〜６週間後に初回免疫と同様条件で再投与してもよい（追加免疫）。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されて解釈されるものではない。【００５２】
なお、以下の試験例において、特記しない限り、マウス由来樹状細胞は、マウスの骨髄細胞をFlt3-L(終濃度100ng/ml)存在下で1週間培養することにより分化誘導させた樹状細胞（FL-DC）を使用した。また、以下の試験例において、FL-DCは、Plasmacytoid DC (pDC)、CD11b陽性樹状細胞（CD11b+DC）、及びCD11b陰性樹状細胞（CD11b-DC）に分けて解析を行っている場合がある。pDCとは、マウス由来樹状細胞の内、CD11c陽性且つB220陽性の細胞群；CD11b+DCとは、マウス由来樹状細胞の内、CD11c陽性、B220陰性、且つCD11b陽性の細胞群；CD11b-DCとは、マウス由来樹状細胞の内、CD11c陽性、B220陰性、且つCD11b陰性の細胞群である。【００５３】
試験例１：樹状細胞に対して選択的に結合するペプチドの一次スクリーニング
ランダムな７個以下のアミノ酸からなる約１０億種類のランダムペプチドを提示しているファージライブラリーを用いて、以下に示すパニング操作を行った。【００５４】
5×1010 pfu/mLのファージライブラリー200μLと1×108 cellsのEL4細胞（マウスリンパ腫由来細胞）を混合し25℃で60分インキュベートした後、遠心し上清を回収することで、EL4細胞に結合しないファージクローンを回収した。その後、6穴プレートで培養した1×106 cellsのB16F10細胞（マウスメラノーマ細胞）に加え、25℃で60分インキュベートした後、上清を回収することで、B16F10細胞に結合しないファージクローンを回収した。その後、6穴プレートで培養した2×106 cellsのマウス由来樹状細胞にファージを加え、4℃で60分静置した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で10回洗浄し、1%NP40を含むPBSを加え、ファージを回収した。回収したファージを大腸菌に感染させ、増幅させた。【００５５】
回収したファージを用いて、前記パニング操作を再度２回実施すると、回収されるファージ数が増加した（図１参照）。このことから、前記パニング操作を合計３回行うことにより、樹状細胞に結合し得るペプチドを提示しているファージクローンが濃縮されることが示唆された。【００５６】
３回のパニング操作で回収されたファージを単クローン化し増幅した。マウス由来樹状細胞 1×105 cellsと1.6×1010 pfu/mLの各ファージクローンを混合した後、ファージに対する抗体を用いたフローサイトメトリー解析により、ファージの樹状細胞への結合性を評価した。代表的な結果を図２に示す。FL9はいずれの樹状細胞にも結合しない一方で、FL4（配列番号1）は全ての樹状細胞に結合することを確認した。【００５７】
得られたファージクローン約60個に対して前記するフローサイトメトリー解析を行った結果、樹状細胞に結合し得るクローンとして、表１に示す37個のクローンを同定した。その後、樹状細胞に結合し得るファージクローンの表面提示されたペプチドのアミノ酸配列を同定するため、各ファージのゲノムにおいてペプチドが挿入された部位をPCRで増幅した後、シークエンス解析した。得られた結果を表１に示す。その結果、樹状細胞に結合し得るファージクローンでは、N末端から4番目及び7番目のアミノ酸がリジン又はアルギニンであるペプチドを提示しているものが多いことを確認した。【００５８】
【表１】
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【００５９】
試験例２：樹状細胞に対して選択的に結合するペプチドの二次スクリーニング
（１）ペプチド融合体の製造
前記試験例１で同定されたFL4、FL5、FL8、及びFL20のアミノ酸配列をタンデムに３個直接結合しているペプチドのＮ末端を、PspAのＣ末端に結合させたペプチド融合体を製造した。なお、製造したペプチド融合体のアミノ酸配列は、例えば、FL4の場合には、［PspAのアミノ酸配列］-［VSYKAIR］-［VSYKAIR］-［VSYKAIR］である。【００６０】
具体的には、PspAをコードしているＤＮＡ分子（配列番号６）に、FL4、FL5、FL8、及びFL20のアミノ酸配列がタンデムに３個直接結合しているペプチドをコードしているＤＮＡ分子を、ホスホジエステル結合によって結合させ、ペプチド融合体をコードしているＤＮＡ分子を作製した。次いで、当該ＤＮＡ分子を用いて、大腸菌BL21DE3株に導入し、当該ＤＮＡ分子を大腸菌に導入した形質転換体を得た。次いで、当該形質転換体を用いて、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシドで蛋白質発現を誘導した後、菌を集菌して破砕した。その後、ニッケルカラム及びゲルろ過カラムによりタンパク質を精製することによって、所定のアミノ酸配列を有するペプチド融合体を得た。【００６１】
（２）ペプチド融合体を投与したマウスにおける血清中のPspA特異的抗体価の測定
7週齢のC57BL/6JJmsSlcマウス（以下、C57BL/6マウスと略すこともある）の尾根部に、PspA量換算で1μgの前記ペプチド融合体又はPspAを含む生理食塩水50μLをDay 0及びDay 10に投与し、Day 17に血液を回収した。コントロールとして、生理食塩水のみを同様に投与した場合についても試験を行った。更に、PspA量換算で1μgの前記ペプチド融合体又はPspAと共に、10μgのCpGオリゴデオキシヌクレオチド（Ｋ３型、製品名「K3 Et-Free」、製品番号「CN-65003」、ジーンデザイン社製）を含む生理食塩水50μLを同様に投与した場合についても試験を行った。なお、本試験では、各群5匹のマウスを使用した。【００６２】
Day 17に回収した血液から血清を得て、血清中のPspA特異的抗体価（IgG、IgG1、IgG2a）をELISAにて測定した。得られた結果を図３〜５に示す。図３〜５中、「PspA WT」とはPspAを指しており、「PspA-FL4」とは、FL4のアミノ酸配列をタンデムに３個直接結合しているペプチドのＮ末端をPspAのＣ末端に結合させたペプチド融合体を指しており、「PspA WT+CpG」とは、PspAとCpGオリゴデオキシヌクレオチドを投与した場合を指している。また、図３〜５において、「PspA-FL4」及び「PspA WT+CpG」と同じ表示形式のものについても、同様の意味である。また、図３〜５において、「cont」とは、生理食塩水を投与した場合を指している。また、図３〜５には、血清の希釈倍率（8×102倍、40×102倍、及び200×102倍）毎の抗体価（OD値450-570）を示している。【００６３】
図３〜５から明らかなように、樹状細胞に対して選択的に結合できるペプチドの中でも、FL4のアミノ酸配列がPspAに結合しているペプチド融合体では、PspA特異的抗体の産生能を格段に向上できることが明らかとなった。特に、当該ペプチド融合体は、PspAとアジュバント（CpGオリゴデオキシヌクレオチド）を同時に投与した場合よりも、PspA特異的抗体価が格段に高く、当該ペプチド融合体を使用すれば、アジュバントを使用せずとも、優れたワクチン効果を奏することが確認された。【００６４】
以上の結果から、FL4アミノ酸配列を含むペプチドは、抗原タンパク質又は抗原ペプチドによるワクチン効果を格段顕著に奏させることができ、抗原タンパク質又は抗原ペプチドのキャリアーペプチドとして有用であることが明らかとなった。【００６５】
試験例３：ペプチド融合体によるワクチン効果の評価
前記試験例２で作成したFL4のアミノ酸配列をタンデムに３個直接結合しているペプチドのＮ末端をPspAのＣ末端に結合させたペプチド融合体（FL4-PspA、アミノ酸配列：［PspAのアミノ酸配列］-［VSYKAIR］-［VSYKAIR］-［VSYKAIR］）を用いて、以下の試験を行った。【００６６】
7週齢のC57BL/6マウスの尾根部に、PspA量換算で1μgのFL4-PspA又はPspAを含む生理食塩水50μLをDay 0及びDay 10に投与して免疫誘導を行った。次いで、Day18に、肺炎球菌(1.7×109 cfu/ml:5.1×107 cfu/mouse)を経鼻投与(片鼻15 μL)し、肺炎球菌投与後のマウスの体重と生存率を求めた。また、コントロールとして、免疫を行わず、生理食塩水のみを同様に投与した場合についても試験を行った。更に、PspA量換算で1μgのFL4-PspA又はPspAと共に、10μgのCpGオリゴデオキシヌクレオチド（Ｋ３型、製品名「K3 Et-Free」、製品番号「CN-65003」、ジーンデザイン社製）を含む生理食塩水50μLを同様に投与した場合についても試験を行った。なお、本試験では、各群5匹のマウスを使用した。【００６７】
得られた結果を図６に示す。なお、図６では、肺炎球菌を投与した日をDay0として示す。また、図６中の略号の意味は、前記試験例２の欄に示す通りである。この結果、ペプチド融合体（FL4-PspA）を投与したマウスでは、肺炎球菌投与後でも体重の減少が認められず、肺炎球菌投与から10日でも生存率が100％であり、強い感染防御能が確認された。【００６８】
試験例４：ペプチドによるワクチン効果の評価
（１）ビオチン化ペプチド／ストレプトアビジン複合体の製造
前記試験例１で同定されたFL4のアミノ酸配列からなるペプチド並びにFL39のアミノ酸配列からなるペプチド又はそのスクランブルペプチド（アミノ酸配列：RPSVSRA）にビオチンを結合させたビオチン化ペプチドを合成した。次いで、得られたビオチン化ペプチドにストレプトアビジンを結合させることにより、ビオチン化ペプチド／ストレプトアビジン複合体を製造した。【００６９】
（２）前記複合体を投与したマウスにおける血清中のストレプトアビジン特異的抗体価の測定
7週齢のC57BL/6マウスの尾根部に、ストレプトアビジン量換算で5μgの前記複合体又はストレプトアビジンを含む生理食塩水50μLをDay 0及びDay 10に投与し、Day 17に血液を回収した。コントロールとして、生理食塩水のみを同様に投与した場合についても試験を行った。更に、5μgのストレプトアビジンと共に、10μgのCpGオリゴデオキシヌクレオチド（Ｋ３型、製品名「K3 Et-Free」、製品番号「CN-65003」、ジーンデザイン社製）を含む生理食塩水50μLを同様に投与した場合についても試験を行った。なお、本試験では、各群5匹のマウスを使用した。【００７０】
Day 17に回収した血液から血清を得て、血清中のストレプトアビジン特異的抗体価（IgG、IgG1、IgG2a）をELISAにて測定した。得られた結果を図７に示す。図７中、「ST」とはストレプトアビジンを投与した場合を指しており、「ST-FL4」とは、FL4のアミノ酸配列からなるビオチン化ペプチド／ストレプトアビジン複合体を投与した場合を指している。「cont」とは、生理食塩水を投与した場合を指している。また、図７には、血清の希釈倍率（8×102倍、40×102倍、及び200×102倍）毎の抗体価（OD値450-570）を示している。【００７１】
図7から明らかなように、前記試験例２の結果と同様に、FL4のアミノ酸配列を含む複合体を投与した群において、ストレプトアビジン特異的抗体の産生能が格段に優れていた。【００７２】
試験例５：樹状細胞におけるNeuropilin-1の発現の確認
R/K-X-X-R/Kからなるモチーフ配列を有するペプチドはNeuropilin-1に結合することが知られているので、樹状細胞におけるNeuropilin-1の発現を検討した。【００７３】
具体的には、マウスの骨髄細胞をFlt3-L(終濃度100ng/ml)存在下で1週間培養することにより分化誘導させたFL-DCと、脾臓からMACSを用いて精製したCD11c陽性細胞（脾臓由来樹状細胞）について、pDC、CD11b+DC、及びCD11b-DCに分けて、Neuropilin-1の発現の解析を行った。また、マウスの脾臓細胞について、B細胞、CD4+T細胞、及びCD8+T細胞に分けて、Neuropilin-1の発現の解析を行った。各細胞におけるNeuropilin-1の発現は、蛍光標識した抗Neuropilin-1抗体を用いて各細胞をフローサイトメトリー解析することによって確認した。【００７４】
得られた結果を図８に示す（横軸：蛍光強度、縦軸：細胞数）。この結果から、FL-DCでは、全ての樹状細胞でNeuropilin-1の強い発現が認められたが、脾臓由来樹状細胞ではpDCにおいてのみNeuropilin-1の強い発現が認められた。一方、脾臓細胞では、CD4+T細胞で若干のNeuropilin-1の発現が認められた。制御性T細胞でNeuropilin-1が発現しているという報告があるため、脾臓細胞のCD4+T細胞で認められたNeuropilin-1の発現は、制御性T細胞に由来していると考えられる。【００７５】
試験例６：ペプチドを提示するファージを用いた脾臓細胞へ結合能の評価
前記試験例１において、骨髄由来の樹状細胞に対する結合が確認されたファージクローン（FL4及びFL8）を使用して、脾臓細胞への結合能を評価した。具体的には、マウスから回収した脾臓細胞1×105 cellsと1.6×1010 pfu/mLの各ファージクローンを混合した後、ファージに対するビオチン化抗体を加え、更に蛍光色素で修飾されたストレプトアビジンを加えて、フローサイトメトリー解析により、ファージの脾臓細胞への結合性を評価した。また、陰性コントロールとして、前記試験例１において、骨髄由来の樹状細胞に対する結合が確認されなかったファージクローン（FL44）を用いて、同様に試験を行った。【００７６】
得られた結果を図９及び１０に示す（横軸：蛍光強度、縦軸：細胞数）。図９から明らかなように、FL4及びFL8のファージクローンは、脾臓細胞に含まれる全ての樹状細胞に結合することが確認された。また、図１０から分かるように、これらのファージクローンは、脾臓細胞に含まれるCD4+T細胞にも結合することが確認されたが、これはCD4+T細胞にNeuropilin-1が発現していること（前記試験例５の結果）に起因していると考えられる。【００７７】
FL4のファージクローンの樹状細胞に対する結合能は、FL8の場合と同等であったにも拘らず、前記試験例２及び４では、FL4のアミノ酸配列を含むペプチドが、FL8のアミノ酸配列を含む場合に比して、優れたワクチン効果が認められた。これらの結果から、FL4のアミノ酸配列を含むペプチドは、R/K-X-X-R/Kからなるモチーフ配列を有する他のペプチドとは、異なる作用を有することが裏付けられた。【００７８】
試験例７：ビオチン化ペプチド／ストレプトアビジン複合体を用いた樹状細胞へ結合能の評価
（１）ビオチン化ペプチド／ストレプトアビジン複合体の製造
前記試験例１で同定されたFL4のアミノ酸配列からなるペプチド及びそのスクランブルペプチド（アミノ酸配列：YRSIVKA）を用いて、前記試験例４と同様の方法で、ビオチン化ペプチド／ストレプトアビジン複合体を製造した。また、従来、Neuropilin-1への結合性が報告されている陽性コントロールペプチド（アミノ酸配列：RPARPAR）を使用して、前記と同様の方法でビオチン化ペプチド／ストレプトアビジン複合体を製造した。なお、ストレプトアビジンは、蛍光（PE）標識を付したものを使用した。【００７９】
（２）樹状細胞及び脾臓細胞への結合能の測定
対象となる各種細胞と0.6μgの各種複合体を混合した後、フローサイトメトリー解析により、各種複合体の細胞への結合性を評価した。使用した細胞は、FL-DCが1×105 cells、脾臓からMACSを用いて精製したCD11c陽性細胞（脾臓由来樹状細胞）が1×106 cells、及びマウス脾臓細胞が1×106 cellsである。【００８０】
FL-DCに対する結合性を評価した結果を図１１、脾臓からMACSを用いて精製した樹状細胞に対する結合性を評価した結果を図１２、及びマウスの脾臓細胞に対する結合性を評価した結果を図１３に示す（横軸：蛍光強度、縦軸：細胞数）。図１１及び１２から明らかなように、骨髄由来の樹状細胞に対しては、ビオチン化ペプチド／ストレプトアビジン複合体は、いずれのペプチドを使用した場合でも、結合能が認められた。また、図１３から明らかなように、脾臓細胞に対しては、CD4陽性細胞に対してのみ、いずれのペプチドを使用した複合体でも弱い結合が認められ、前記試験例６の結果と同じ傾向が確認された。【００８１】
即ち、本試験結果からも、FL4のアミノ酸配列からなるペプチドの樹状細胞に対する結合能は、FL8のアミノ酸配列からなるペプチドと同等であることが示された。前記試験例２及び４では、FL4のアミノ酸配列を含むペプチドが、FL8のアミノ酸配列を含む場合に比して、優れたワクチン効果が認められていることから、FL4のアミノ酸配列を含むペプチドはR/K-X-X-R/Kからなるモチーフ配列を有する他のペプチドとは別異の作用を有していることが、本試験結果からも裏付けられた。【００８２】
試験例８：CD8+細胞傷害性T細胞(CTL)誘導能の評価
（１）ペプチド融合体の製造
FL4のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端を、ニワトリ卵白アルブミン（OVA）中のMHCクラスIエピトープペプチドであるSL8（SIINFEKL）のＣ末端に結合させたペプチド融合体（SL8-FL4）を作製した。当該ペプチド融合体のアミノ酸配列は、具体的には、［SL8のアミノ酸配列（SIINFEKL）］-［VSYKAIR］であり、当該ペプチド融合体の製造方法は、SL8をコードしているＤＮＡ分子を使用したこと以外は、PspA-FL4の場合と同様である。また、FL8、及びFL4のスクランブルペプチド（FL4Scr、アミノ酸配列：YRSIVKA）を用いて、同様にSL8と融合させたペプチド融合体（SL8-F8、及びSL8-FL4Scr）をそれぞれ作製した。【００８３】
（２）CD8+CTL誘導能の評価
7週齢のC57BL/6マウスの耳部の皮下に、SL8量換算で50μgの各ペプチド融合体及び10μgのCpGオリゴデオキシヌクレオチド（Ｋ３型、製品名「K3 Et-Free」、製品番号「CN-65003」、ジーンデザイン社製）を含む生理食塩水50μLを、Day 0に投与し、Day 7に所属リンパ節を採取して、テトラマーアッセイを行った。また、SL8 50μgを単独で含む生理食塩水50μLを投与した場合、SL8 50μgとCpGオリゴデオキシヌクレオチド50μgを含む生理食塩水50μLを投与した場合、並びに生理食塩水のみを投与した場合（コントロール）についても、同様に試験を行った。なお、本試験では、各群5匹のマウスを使用した。【００８４】
テトラマーアッセイは、所属リンパ節からリンパ球を回収した後、CD44、CD8に対する蛍光標識抗体およびH-2Kbに提示されたSL8ペプチドを認識する蛍光標識テトラマーで染色し、その後、フローサイトメーターを用いて解析することにより行った。【００８５】
得られた結果を図１４に示す（横軸：蛍光強度、縦軸：細胞数）。SL8及びCpGオリゴデオキシヌクレオチドを投与した場合には、抗原特異的CD8+CTLを誘導できなかった。また、SL8-FL8、及びSL8-FL4Scrについても、CpGオリゴデオキシヌクレオチドと共投与しても、抗原特異的CD8+CTLを誘導できなかった。これに対して、SL8-FL4とCpGオリゴデオキシヌクレオチドを投与した場合には、抗原特異的CD8+CTLの強い誘導が認められた。【００８６】
試験例９：CD8+細胞傷害性T細胞誘導能の評価
本試験では、SL8-FL4で誘導されるSL8特異的CD8+CTLにより、がんの退縮効果が認められるかを評価した。本試験では、がん細胞として、EG7細胞（C57BL/6マウスの胸腺種に由来するEL4細胞にOVAタンパク質を発現させたがん細胞）を使用した。具体的試験方法は、以下の通りである。【００８７】
7週齢のC57BL/6マウスの腹部にEG7細胞1 ( 106 cellsを移植し、担がんマウスを作製した。EG7細胞を移植してから腫瘍の直径が約5mm程度になった時点（移植後約5日）で、耳部の皮下に、SL8量換算で50μgのSL8-FL4及び50μgのCpGオリゴデオキシヌクレオチド（Ｋ３型、製品名「K3 Et-Free」、製品番号「CN-65003」、ジーンデザイン社製）を含む生理食塩水50μLを投与した。その後、マウスを飼育しながら、腫瘍サイズを経時的に計測した。また、SL8 50μgとCpGオリゴデオキシヌクレオチド50μgを含む生理食塩水50μLを投与した場合、並びに生理食塩水のみを投与した場合（コントロール）についても、同様に試験を行った。なお、本試験では、各群5匹のマウスを使用した。【００８８】
得られた結果を図１５に示す。SL8とCpGオリゴデオキシヌクレオチドを共投与した場合は、生理食塩水を投与した場合に比べて若干の腫瘍退縮効果が認めたが、SL8-FL4とCpGオリゴデオキシヌクレオチドを共投与した場合には、完全治癒マウスも認められる等、非常に強い腫瘍退縮効果が認められた。即ち、本結果から、FL4のペプチド融合体は、腫瘍が生着している状態であったとしても、抗原特異的CD8+CTLを強く誘導し、更に腫瘍の退縮効果を誘導できることが明らかとなった。【００８９】
試験例１０：Kras変異体由来ペプチドを使用したCD8+細胞傷害性T細胞誘導能の評価
Kras遺伝子は、肺がん、膵がん、大腸がん等の多くのがんで変異が認められるドライバー遺伝子である。特に、KrasのN末端側から12番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されたG12D変異は多く認められる。そのため、G12D変異を含むKrasの部分配列は、がん特異的抗原としてがんワクチンの開発の標的になり得るものとして期待されている。そこで本試験では、G12D変異を含むKrasの部分ペプチドを使用して、FL4の抗原特異的CD8+CTL誘導能を評価した。【００９０】
（１）ペプチド融合体の製造
FL4のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端を、G12D変異を含むKrasの部分ペプチド（G12D由来ペプチド；LVVVGADGV；G12D変異を含むKrasのN末端側から6〜14番目のアミノ酸配列）のＣ末端に結合させたペプチド融合体（G12D-FL4）を作製した。当該ペプチド融合体のアミノ酸配列は、具体的には、［G12D変異を含むKrasの部分配列（LVVVGADGV）］-［VSYKAIR］であり、当該ペプチド融合体の製造方法は、G12D由来ペプチドをコードしているＤＮＡ分子を使用したこと以外は、PspA-FL4の場合と同様である。【００９１】
（２）抗原特異的CD8+CTL反応の測定
7週齢のC57BL/6マウスの耳部の皮下に、G12D由来ペプチド量換算で50μgのG12D-FL4及び10μgのCpGオリゴデオキシヌクレオチド（Ｋ３型、製品名「K3 Et-Free」、製品番号「CN-65003」、ジーンデザイン社製）を含む生理食塩水50μLを、Day 0に投与し、Day 7に所属リンパ節を採取して、免疫細胞を回収した。次いで、回収した免疫細胞1 ( 106 cellsを、RPMI培地100 μLに加え、37℃で24時間培養した後に、培養液中のIFN-γ濃度を測定した。また、G12D由来ペプチド50μgとCpGオリゴデオキシヌクレオチド10μgを含む生理食塩水50μLを投与した場合、並びに生理食塩水のみを投与した場合（コントロール）についても、同様に試験を行った。なお、本試験では、各群5匹のマウスを使用した。【００９２】
得られた結果を図１６に示す。G12D由来ペプチドとCpGオリゴデオキシヌクレオチドを投与した場合では、抗原特異的CD8+CTLの誘導は全く認められなかった。これに対して、G12D-FL4とCpGオリゴデオキシヌクレオチドを投与した場合には、抗原特異的CD8+CTLの誘導が非常に強く認められた。以上の結果から、FL4は、OVA等のモデル抗原のみならず、がんワクチンに適用可能な抗原においても、強いワクチン効果を誘導し得ることが明らかとなった。【００９３】
試験例１１：ビオチン化ペプチド／ストレプトアビジン複合体を用いた樹状細胞へ結合能の評価
（１）ビオチン化ペプチドの製造
前記試験例１で同定されたFL4のアミノ酸配列からなるペプチド及びその１番目のアミノ酸残基をアラニン残基に置換したペプチドMut 1（アミノ酸配列：ASYKAIR（配列番号２））それぞれのＮ末端にビオチンを結合させたビオチン化ペプチドを合成した。【００９４】
（２）樹状細胞への結合能の測定
マウス樹状細胞（DC2.4細胞）1×105 cellsに、0.6μgの各種ビオチン化ペプチドを４℃条件下で加えた後、蛍光（PE）標識ストレプトアビジンを加えることによってビオチン化ペプチド／ストレプトアビジン複合体を得て、フローサイトメトリー解析により、各種複合体の細胞への結合性を評価した。【００９５】
マウス樹状性細胞に対する結合性を評価した結果を図１７に示す。図１７中、「FL4」及び「Mut 1」はそれぞれ、ビオチン化FL4／ストレプトアビジン複合体及びビオチン化Mut 1／ストレプトアビジン複合体を指している。また、図１７において、「cont」とは、ビオチン化ペプチドの代わりに生理食塩水を加えた場合を指している。さらに、図１７では、平均蛍光強度「MFI」を示している。図１７から明らかなように、いずれのペプチドを使用した場合でも、結合能が認められた。【００９６】
試験例１２：ペプチドによるワクチン効果の評価
（１）ビオチン化ペプチド／NA複合体の製造
前記試験例１で同定されたFL4、その１番目のアミノ酸残基をアラニン残基に置換したペプチドMut 1（アミノ酸配列：ASYKAIR（配列番号２））、及びその２番目のアミノ酸残基をアラニン残基に置換したペプチドMut 2（アミノ酸配列：VAYKAIR（配列番号３））、並びに、その３番目のアミノ酸残基をアラニン置換したペプチドMut 3（アミノ酸配列：VSAKAIR）、及びその５番目のアミノ酸残基をアラニン置換したペプチドMut 4（アミノ酸配列：VSYKAAR）それぞれのＮ末端にビオチンを結合させた、ビオチン化ペプチドを合成した。次いで、得られたビオチン化ペプチドとニュートラアビジンとを混合させることにより、ビオチン化ペプチド／ニュートラアビジン複合体を製造した。【００９７】
（２）前記複合体を投与したマウスにおける血清中のNA特異的抗体価の測定
7週齢のC57BL/6マウスの尾根部に、ニュートラアビジン量換算で5μgの前記複合体又はニュートラアビジンを含む生理食塩水50μLをDay 0及びDay 10に投与し、Day 17に血液を回収した。コントロールとして、生理食塩水のみを同様に投与した場合についても試験を行った。なお、本試験では、各群5匹のマウスを使用した。【００９８】
Day 17に回収した血液から血清を得て、血清中のニュートラアビジン特異的抗体価（IgG）をELISAにて測定した。得られた結果を図１８に示す。図１８中、「NA」とはニュートラアビジンを投与した場合を指しており、「NA-FL4」とは、ビオチン化FL4／ニュートラアビジン複合体を投与した場合を指している。他のペプチドについても同じ表示形式で示している。また、図１８において、「cont」とは、生理食塩水を投与した場合を指している。さらに、図１８には、血清の希釈倍率（8×102倍、40×102倍、及び200×102倍）毎の抗体価（OD値450-570）を示している。【００９９】
図１８から明らかなように、FL4のアミノ酸配列、Mut 1のアミノ酸配列、及びMut 2のアミノ酸配列を含む複合体を投与した群において、優れたストレプトアビジン特異的抗体産生能が確認された。これらFL4、Mut 1 及びMut 2のアミノ酸配列を含む場合において、 Mut 3及びMut 4のアミノ酸配列を含む場合とは異なり、優れた抗体産生能が認められていることから、FL4、Mut 1 及びMut 2のアミノ酸配列を含むペプチドは、Mut 3及びMut 4のアミノ酸配列を含むペプチドとは別異の作用を有していることが、本試験結果から裏付けられた。【０１００】
試験例１３：経肺投与によるCD8+細胞傷害性T細胞誘導能の評価
従来の注射型ワクチンでは、肺組織等の粘膜面での免疫応答を効率的に誘導できないことが知られている。そのため、肺がん等を標的とした治療薬の開発では、肺組織で強く抗原特異的CD8+CTLを誘導できるワクチンが待望されている。そこで、本試験では、SL8-FL4を使用して、経肺投与による抗原特異的CD8+CTL誘導能を評価した。【０１０１】
7週齢のC57BL/6マウスに、SL8量換算で50μgのSL8-FL4及び10μgのCpGオリゴデオキシヌクレオチド（Ｋ３型、製品名「K3 Et-Free」、製品番号「CN-65003」、ジーンデザイン社製）を含む生理食塩水40μLを、Day 0及びDay 7に経肺投与し、Day 14に所属リンパ節、肺組織、及び脾臓を採取して、試験例８と同様の手法でテトラマーアッセイを行った。また、SL8 50μgを単独で含む生理食塩水40μLを経肺投与した場合、SL8 50μgとCpGオリゴデオキシヌクレオチド10μgを含む生理食塩水50μLを経肺投与した場合、並びに生理食塩水のみを経肺投与した場合（コントロール）についても、同様に試験を行った。なお、本試験では、各群5匹のマウスを使用した。【０１０２】
得られた結果を図１９に示す。SL8-FL4とCpGオリゴデオキシヌクレオチドを投与した場合は、肺所属リンパ節、肺組織、及び脾臓のいずれでも、抗原特異的CD8+CTLを強く誘導できていた。即ち、本結果から、FL4のペプチド融合体は、経粘膜投与でも、抗原特異的CD8+CTLを強く誘導し得ることが明らかとなった。【０１０３】
試験例１４：経肺投与と皮下投与によるCD8+細胞傷害性T細胞誘導能の比較評価
本試験では、SL8-FL4を使用して、経肺投与と皮下投与によるCD8+細胞傷害性T細胞誘導能の比較を行った。7週齢のC57BL/6マウスに、SL8量換算で50μgのSL8-FL4及び10μgのCpGオリゴデオキシヌクレオチド（Ｋ３型、製品名「K3 Et-Free」、製品番号「CN-65003」、ジーンデザイン社製）を含む生理食塩水40μLを、Day 0及びDay 7に経肺投与又は皮下投与し、Day 14に所属リンパ節、及び脾臓を採取して、前記試験例８と同様の手法でテトラマーアッセイを行った。また、生理食塩水のみを皮下投与した場合（コントロール）についても、同様に試験を行った。なお、本試験では、各群5匹のマウスを使用した。【０１０４】
得られた結果を図２０に示す。脾臓における抗原特異的CD8+CTLの誘導は、皮下投与した場合に強く認められたのに対し、肺所属リンパ節における抗原特異的CD8+CTLの誘導は、経肺投与した場合に強く認められた。以上の結果から、FL4のペプチド融合体の経肺投与によって、肺組織や肺所属リンパ節における抗原特異的CD8+CTLを強く誘導可能であり、今後の肺がんワクチンの開発に大きく寄与し得ると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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