(57)【要約】  本発明は、ＳＧＬＴ２阻害薬を含有する、老化細胞除去薬又はそのための医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＧＬＴ２阻害薬を含有する、老化細胞除去薬。
【請求項２】
ＳＧＬＴ２阻害薬が、低分子化合物、ＳＧＬＴ２発現阻害薬及びＳＧＬＴ２特異的結合物質からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項１記載の老化細胞除去薬。
【請求項３】
ＳＧＬＴ２阻害薬が、カナグリフロジン、エンパグリフロジン、イプラグリフロジン、ダパグリフロジン、ルセオグリフロジン、トホグリフロジン、セルグリフロジンエタボナート、レモグリフロジンエタボナート、エルツグリフロジン、ソタグリフロジン、及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項１又は２記載の老化細胞除去薬。
【請求項４】
ＳＧＬＴ２阻害薬及び薬学的に許容される担体を含有する、老化細胞除去用医薬組成物。
【請求項５】
老化細胞を除去することにより病態の改善が見込まれる疾患を予防又は治療するための、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
老化細胞を除去することにより病態の改善が見込まれる疾患が老化関連疾患である、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＳＧＬＴ２阻害薬及び薬学的に許容される担体を含有する、老化関連疾患の予防又は治療のために使用される医薬組成物。
【請求項８】
老化関連疾患が、心不全、動脈硬化症、動脈硬化性の脳心血管疾患、高血圧症、脳梗塞、脳出血、脂質異常症、肺線維症、肺気腫、骨格筋萎縮（サルコペニア）、変形性関節症、認知症、フレイル、がん、慢性腎臓病、白内障、緑内障、加齢黄斑変性症、老眼、加齢性脱毛、加齢性難聴、加齢に伴う腰痛・関節痛などの痛み、皮脂欠乏性湿疹、皮膚掻痒症、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、骨粗鬆症、変形性骨関節症、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、ウエルナー症候群、コケイン症候群、及びロスモンド・トムソン症候群からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項６又は７記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＳＧＬＴ２阻害薬が、カナグリフロジン、エンパグリフロジン、イプラグリフロジン、ダパグリフロジン、ルセオグリフロジン、トホグリフロジン、セルグリフロジンエタボナート、レモグリフロジンエタボナート、エルツグリフロジン、ソタグリフロジン、及びこれらの薬学的に許容される塩から選択される少なくとも１つである、請求項４〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
老化細胞除去用医薬を製造することにおける、ＳＧＬＴ２阻害薬の使用。
【請求項１１】
老化細胞を除去することにより病態の改善が見込まれる疾患を予防又は治療するための医薬を製造することにおける、ＳＧＬＴ２阻害薬の使用。
【請求項１２】
老化細胞を除去するための方法であって、有効量のＳＧＬＴ２阻害薬を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項１３】
老化細胞を除去することにより病態の改善が見込まれる疾患を予防又は治療するための方法であって、有効量のＳＧＬＴ２阻害薬を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＧＬＴ２阻害薬の新規な用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
過剰なカロリー摂取により、肥満や糖尿病患者の人口は増加の一途をたどり、深刻な社会問題となっている。肥満や糖尿病では、内臓脂肪組織において細胞老化を介した慢性炎症が生じ、全身の代謝不全が惹起されることが知られている。また、脂肪細胞老化を抑制すると、脂肪炎症が改善し、肥満に伴う全身の代謝不全が抑制されることが報告されている（例えば、非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Minamino T., et al., A crucial role for adipose tissue p53 in the regulation of insulin resistance., Nat. Med., 15, 1082-1087, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このような背景のもと、老化細胞を除去する技術が求められている。そこで、本発明は老化細胞除去薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討を重ねたところ、糖尿病治療薬として知られているナトリウム依存性グルコース共輸送体２（ｓｏｄｉｕｍ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｃｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ２、以下、「ＳＧＬＴ２」という。）阻害薬が、老化細胞除去作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
［１］  ＳＧＬＴ２阻害薬を含有する、老化細胞除去薬。
［２］  ＳＧＬＴ２阻害薬が、低分子化合物、ＳＧＬＴ２発現阻害薬及びＳＧＬＴ２特異的結合物質からなる群より選ばれる少なくとも１つである、上記［１］記載の老化細胞除去薬。
［３］  ＳＧＬＴ２阻害薬が、カナグリフロジン、エンパグリフロジン、イプラグリフロジン、ダパグリフロジン、ルセオグリフロジン、トホグリフロジン、セルグリフロジンエタボナート、レモグリフロジンエタボナート、エルツグリフロジン、ソタグリフロジン、及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる少なくとも１つである、上記［１］又は［２］記載の老化細胞除去薬。
［４］  ＳＧＬＴ２阻害薬及び薬学的に許容される担体を含有する、老化細胞除去用医薬組成物。
［５］  老化細胞を除去することにより病態の改善が見込まれる疾患を予防又は治療するための、上記［４］記載の医薬組成物。
［６］  老化細胞を除去することにより病態の改善が見込まれる疾患が老化関連疾患である、上記［５］記載の医薬組成物。
［７］  ＳＧＬＴ２阻害薬及び薬学的に許容される担体を含有する、老化関連疾患の予防又は治療のために使用される医薬組成物。
［８］  老化関連疾患が、心不全、動脈硬化症、動脈硬化性の脳心血管疾患、高血圧症、脳梗塞、脳出血、脂質異常症、肺線維症、肺気腫、骨格筋萎縮（サルコペニア）、変形性関節症、認知症、フレイル、がん、慢性腎臓病、白内障、緑内障、加齢黄斑変性症、老眼、加齢性脱毛、加齢性難聴、加齢に伴う腰痛・関節痛などの痛み、皮脂欠乏性湿疹、皮膚掻痒症、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、骨粗鬆症、変形性骨関節症、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、ウエルナー症候群、コケイン症候群、及びロスモンド・トムソン症候群からなる群より選ばれる少なくとも１つである、上記［６］又は［７］記載の医薬組成物。
［９］  ＳＧＬＴ２阻害薬が、カナグリフロジン、エンパグリフロジン、イプラグリフロジン、ダパグリフロジン、ルセオグリフロジン、トホグリフロジン、セルグリフロジンエタボナート、レモグリフロジンエタボナート、エルツグリフロジン、ソタグリフロジン、及びこれらの薬学的に許容される塩から選択される少なくとも１つである、上記［４］〜［８］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１０］  老化細胞除去用医薬を製造することにおける、ＳＧＬＴ２阻害薬の使用。
［１１］  老化細胞を除去することにより病態の改善が見込まれる疾患を予防又は治療するための医薬を製造することにおける、ＳＧＬＴ２阻害薬の使用。
［１２］  老化細胞を除去するための方法であって、有効量のＳＧＬＴ２阻害薬を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
［１３］  老化細胞を除去することにより病態の改善が見込まれる疾患を予防又は治療するための方法であって、有効量のＳＧＬＴ２阻害薬を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、老化細胞を除去することができ、また、老化細胞を除去することにより病態の改善が見込まれる疾患を予防及び／又は治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１（ａ）〜（ｃ）は、老化関連酸性β−ガラクトシダーゼ染色の結果を示す写真である（実験例２）。図１（ａ）は通常食群のマウスの結果を示す。スケールバーは５ｍｍを示す。図１（ｂ）は、高脂肪食群のマウスの結果を示し、図１（ｃ）は高脂肪食＋ＳＧＬＴ２ｉ群のマウスの結果を示す。
【図２】図２は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である（実験例３）。
【図３】図３は、ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲの結果を示したグラフである（実験例４）。データは、平均値±２  ＳＥ（ｎ＝６）で表示。ＮＣ：通常食、ＨＦＤ：高脂肪食、Ｓｉ３ｄ：ＳＧＬＴ２阻害薬３日間投与、Ｓｉ７ｄ：ＳＧＬＴ２阻害薬７日間投与。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（一元配置分散分析後のＴｕｒｋｅｙ補正の多重比較法で検定）。
【図４】図４（ａ）は、ＨＥ染色の結果を示す写真である。スケールバーは２００μｍを示す。図４（ｂ）は、ＣＬＳ数の計数結果を示したグラフである。（実験例５）  データは、平均値±２  ＳＥ（ｎ＝６）で表示。ＮＣ：通常食、ＨＦＤ：高脂肪食、Ｓｉ７ｄ：ＳＧＬＴ２阻害薬７日間投与。＊＊Ｐ＜０．０１（一元配置分散分析後のＴｕｒｋｅｙ補正の多重比較法で検定）。
【図５】図５（ａ）は、ＤＨＥ染色によって酸化ストレスを評価した結果を示す写真である。スケールバーは１００μｍを示す。図５（ｂ）は、ＤＨＥ陽性エリアの測定結果のグラフである。（実験例５）  データは、平均値±２  ＳＥ（ｎ＝６）で表示。ＮＣ：通常食、ＨＦＤ：高脂肪食、Ｓｉ７ｄ：ＳＧＬＴ２阻害薬７日間投与。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（一元配置分散分析後のＴｕｒｋｅｙ補正の多重比較法で検定）。
【図６】図６（ａ）は、ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲの結果を示したグラフである。データは、平均値±２  ＳＥ（ｎ＝６）で表示。ＮＣ：通常食、ＨＦＤ：高脂肪食、Ｓｉ３ｄ：ＳＧＬＴ２阻害薬３日間投与、Ｓｉ７ｄ：ＳＧＬＴ２阻害薬７日間投与。＊Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析後のＴｕｒｋｅｙ補正の多重比較法で検定）。図６（ｂ）はＦ４／８０の免疫蛍光染色を示した写真である。データは、平均値±２  ＳＥ（ｎ＝３）で表示。ＮＣ：通常食、ＨＦＤ：高脂肪食、Ｓｉ３ｄ：ＳＧＬＴ２阻害薬３日間投与、Ｓｉ７ｄ：ＳＧＬＴ２阻害薬７日間投与。＊Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析後のＴｕｒｋｅｙ補正の多重比較法で検定）  （実験例５）
【図７】図７は、ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲの結果を示したグラフである（実験例６）。データは、平均値±２  ＳＥ（ｎ＝５ないし６）で表示。ＮＣ：通常食、ＨＦＤ：高脂肪食、Ｓｉ７ｄ：ＳＧＬＴ２阻害薬７日間投与。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（一元配置分散分析後のＴｕｒｋｅｙ補正の多重比較法で検定）。
【図８】図８（ａ）は、老化関連β−ガラクトシダーゼ染色の結果を示す写真である。スケールバーは２ｍｍを示す。図８（ｂ）は、血管の老化関連β−ガラクトシダーゼ染色性を定量した結果を示したグラフである。データは、平均値±２  ＳＥ（ｎ＝４）で表示。＊Ｐ＜０．０５（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）。  （実験例７）
【図９】図９は、若齢及び老齢ＨＵＶＥＣに２ＤＧ、３ＨＢ又はＡＩＣを添加した際、及び試薬を何も添加しなかった場合（Ｃｏｎ）の細胞生存率とアポトーシス誘導率を示したグラフである（実験例９）。データは、平均値±２  ＳＥ（ｎ＝３）で表示。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（一元配置分散分析後のＴｕｒｋｅｙ補正の多重比較法で検定）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
一実施態様において、本発明は、ＳＧＬＴ２阻害薬を含有する老化細胞除去薬又はそのための医薬組成物を提供する。
別の実施態様において、本発明は、老化細胞除去用医薬或いは老化細胞を除去することにより病態の改善が見込まれる疾患を予防又は治療するための医薬を製造することにおける、ＳＧＬＴ２阻害薬の使用を提供する。
更に別の実施態様において、本発明は、老化細胞を除去するための方法或いは老化細胞を除去することにより病態の改善が見込まれる疾患を予防又は治療するための方法であって、有効量のＳＧＬＴ２阻害薬を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
なお更に別の実施態様において、本発明は、老化細胞を除去するために使用される又は老化細胞を除去することにより病態の改善が見込まれる疾患を予防又は治療するために使用されるＳＧＬＴ２阻害薬を提供する。
特に好ましい実施態様においては、上記の老化細胞除去薬、医薬組成物、医薬などにおいて、ＳＧＬＴ２阻害薬を有効成分として含有する。
【００１０】
（老化細胞）
本明細書における「老化細胞」とは、正常な細胞に比べて老化マーカーの発現量の上昇を示す細胞を意味する。老化マーカーとしては、老化関連酸性β−ガラクトシダーゼ、Ｐ５３、Ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ２１ＣＩＰ１などが挙げられる。老化細胞は、Ｇ１期の不可逆的な増殖停止によって特徴付けられ、細胞周期の進行を促す遺伝子の抑制と、細胞周期を阻害するｐ５３、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐ２１ＣＩＰ１の発現上昇が関与して形成されることが知られている。
老化細胞は、分裂が停止しているが代謝的には活性なままの細胞であり得る。非分裂細胞は、何週間も生存可能であり得るが、培地中の十分な空間、栄養素、増殖因子の存在にもかかわらず、ＤＮＡを増殖・複製することができない。したがって、老化細胞に生理的刺激を加えても、老化細胞を刺激して増殖させることはできないので、この分裂の停止は、本質的に永久的なものとなる。
老化細胞は、非老化細胞とは、以下の１つ又はそれ以上の点において、異なり得る：１）老化細胞は増殖を停止し、生理的なマイトジェンによる細胞周期に再び入るように刺激することができない；２）老化細胞は、アポトーシス性の細胞死に耐性になる；３）老化細胞は、変化した分化機能を獲得する。
【００１１】
老化細胞は、複製性の細胞老化、早熟性の細胞老化、又は治療により誘発される細胞老化などに起因するものであり得る。複製性の細胞老化に起因する老化細胞は、複数回の細胞分裂、例えば、４０回以上、５０回以上、６０回以上、７０回以上、８０回以上の細胞分裂を経たものであってもよい。早熟性の細胞老化に起因する老化細胞は、限定されるものではないが、紫外線、活性酸素種、環境毒素、喫煙、電離放射線、クロマチン構造の歪み、過剰なマイトジェンシグナリング、発がん性突然変異などにより誘発されうる。特定の実施態様において、早熟性の細胞老化は、電離放射線によって誘導され得る。別の特定の実施態様において、早熟性の細胞老化は、Ｒａｓタンパク質を用いた異所性トランスフェクションによって誘導され得る。治療により誘発される細胞老化に起因する老化細胞は、放射線療法、化学療法、ＤＮＡ損傷療法などにより誘導され得る。
【００１２】
本発明が対象とする老化細胞は、一般には、真核細胞であり得る。老化細胞の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：乳腺上皮細胞、ケラチノサイト、心筋細胞、軟骨細胞、内皮細胞（大血管）、内皮細胞（微小血管）、上皮細胞、線維芽細胞、毛乳頭細胞、肝細胞、メラニン細胞、骨芽細胞、脂肪前駆細胞、免疫系の細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞、収縮性細胞、外分泌性上皮細胞、細胞外マトリックス細胞、ホルモン分泌細胞、角化上皮細胞、膵島細胞、水晶体細胞、間葉幹細胞、膵臓の腺がん細胞、小腸のパネト細胞、造血系の細胞、神経系の細胞、感知器官及び末梢神経細胞を支持する細胞、並びに、湿性重層バリア上皮細胞。
【００１３】
更に、本発明が対象とする老化細胞は、血管系、造血系、上皮器官及び間質を含む再生可能な組織にも見られ得る。老化細胞はまた、老化した部位や老化に関連する慢性的な病状（例えば、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症）の部位にも見出され得る。更に、老化細胞は、良性の形成障害の病変、前がん性の病変、良性の前立腺過形成に関連し得る。一実施態様において、老化細胞は、ＤＮＡ損傷療法後の正常及び／または腫瘍組織に見出され得る。別の特定の実施態様では、老化細胞は、老化に関連する病状の部位に見出され得る。
【００１４】
様々な器官や組織における老化細胞の数は、通常、年齢と共に増加する。老化細胞の蓄積は、老化及び老化関連疾患下の劣化をより進め得る。例えば、老化した組織における老化細胞の蓄積は、年齢関連組織機能障害、再生能力の減少、及び疾患に寄与し得る。一実施態様において、老化細胞が蓄積した老化組織は、増殖が必要とされるストレスに応答する能力を欠いており、それにより、老化とともに見られる健康性の低減が生じる。
【００１５】
（老化細胞除去）
本明細書における「老化細胞除去」とは、老化細胞を組織又は器官などから取り除くことを意味するか、又は老化細胞を死滅させることを意味する。同じ濃度で老化細胞ではない細胞（以下、「非老化細胞」という。）が有意には死滅されず、老化細胞が選択的又は特異的に死滅されることが特に好ましい。
したがって、好ましくは、本発明で使用されるＳＧＬＴ２阻害薬の非老化細胞における５０％致死濃度（Ｌｅｔｈａｌ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ５０、以下、「ＬＣ５０」という。）は、当該ＳＧＬＴ２阻害薬の老化細胞におけるＬＣ５０よりも、約２〜約５０倍高くあり得る。ＬＣ５０とは、細胞サンプル中の細胞の半分を死滅させるのに必要な濃度である。例えば、非老化細胞におけるＬＣ５０は、老化細胞におけるＬＣ５０よりも、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上、又はそれ以上高くてもよい。或いは、非老化細胞におけるＬＣ５０は、老化細胞におけるＬＣ５０よりも、約１０倍以上、約１５倍以上、約２０倍以上、約２５倍以上、約３０倍以上、約３５倍以上、約４０倍以上、約４５倍以上、約５０倍以上、又はそれ以上高くてもよい。
【００１６】
老化細胞の集積は、老化関連疾患などの病態を促進することが知られている。したがって、本発明に係る老化細胞除去薬又はそのための医薬組成物を投与して老化細胞を除去することによって、老化関連疾患などの老化細胞を除去することにより病態の改善が見込まれる疾患を予防又は治療することができる。
【００１７】
（老化関連疾患）
本明細書における「老化関連疾患」には、対象における細胞若しくは細胞集団における非増殖性又は老化性の状態が誘導されるか或いは維持されることによって全体的又は部分的に媒介される任意の疾患或いは状態が含まれ得る。老化関連疾患には、病状の兆候を目視することができないような組織又は器官の衰退、或いは、変性疾患や機能低下障害などの目視可能な病状が含まれ得る。
【００１８】
老化関連疾患の例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、白内障、黄斑変性、緑内障、アテローム性動脈硬化症、急性冠症候群、心筋梗塞、脳卒中、高血圧、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、変形性関節症、冠動脈疾患、脳血管疾患、歯周病、種々の組織における萎縮や線維症、脳又は心臓の損傷、治療関連骨髄異形成症候群などが挙げられる。また、老化関連疾患には、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、ウェルナー症候群、コケイン症候群、色素性乾皮症、毛細血管拡張性小脳失調症、ファンコニ貧血、神経障害性貧血なども含まれ得る。
【００１９】
老化関連疾患の更なる例としては、狭心症などの心血管疾患、大動脈瘤、不整脈、脳動脈瘤、心拡張期機能不全、心線維症、心筋症、頚動脈疾患、冠動脈血栓症、心内膜炎、高コレステロール血症、高脂血症、僧帽弁逸脱症、末梢血管疾患などの循環器疾患；椎間板ヘルニア、口腔粘膜炎、紅斑、間質性膀胱炎、強皮症、脱毛症などの炎症性又は自己免疫疾患；認知症、ハンチントン病、運動神経機能障害、老化に伴う記憶低下、抑うつ、気分障害などの神経変性疾患；代謝症候群などの代謝性疾患；老化に伴う肺機能の低下、喘息、気管支拡張症、嚢胞性線維症、気腫などの肺疾患；バレット食道などの胃腸疾患；肝臓線維症、筋疲労、口腔内粘膜線維症、膵臓線維症、良性前立腺過形成症（ＢＰＨ）、睡眠障害などの老化に伴う疾患；更年期、卵子供給低下、精子生存率低下、繁殖能低下、性欲低下、勃起機能低下、興奮などの生殖障害；アトピー性皮膚炎、皮膚紅斑、皮膚リンパ腫、ジセステジア、湿疹、好酸球性皮膚炎、皮膚の線維性増殖、色素増加症、免疫性水疱症、母斑、尋常性天疱瘡、掻痒、乾癬、発疹、反応性好中球皮膚疾患、皺、蕁麻疹などの皮膚疾患；移植後腎臓線維症；頚動脈血栓症などが挙げられる。
【００２０】
更に、老化関連疾患の好ましい例としては、心不全、動脈硬化症、動脈硬化性の脳心血管疾患、高血圧症などの循環器疾患；脳梗塞、脳出血などの脳血管疾患；脂質異常症などの代謝性疾患；肺線維症、肺気腫などの呼吸器疾患；骨格筋萎縮（サルコペニア）、変形性関節症などの運動器症候群；認知症、フレイルなどの老年症候群；がん；慢性腎臓病；白内障、緑内障、加齢黄斑変性症、老眼などの眼疾患；加齢性脱毛；加齢性難聴；加齢に伴う腰痛や関節痛などの痛み；皮脂欠乏性湿疹や皮膚掻痒症などの皮膚疾患；脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変などの肝疾患；骨粗鬆症や変形性骨関節症などの骨疾患；ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、ウエルナー症候群、コケイン症候群、ロスモンド・トムソン症候群などの早老症などが挙げられる。
（ＳＧＬＴ２阻害薬）
【００２１】
本発明で用いられるＳＧＬＴ２阻害薬としては、ＳＧＬＴ２による糖の再吸収を阻害する薬物が挙げられる。より具体的なＳＧＬＴ２阻害薬としては、低分子化合物、ＳＧＬＴ２発現阻害薬、ＳＧＬＴ２特異的結合物質などが挙げられる。
【００２２】
（低分子化合物）
ＳＧＬＴ２阻害薬である低分子化合物としては、例えば、カナグリフロジン［（１Ｓ）−１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−１−Ｃ（−３｛［５−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｐｈｅｎ−２−ｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ｝−４−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−Ｄ−ｇｌｕｃｉｔｏｌ］、エンパグリフロジン［（１Ｓ）−１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−１−Ｃ−｛４−ｃｈｌｏｒｏ−３−［（４−｛［（３Ｓ）−ｏｘｏｌａｎ−３−ｙｌ］ｏｘｙ｝ｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ｝−Ｄ−ｇｌｕｃｉｔｏｌ］、イプラグリフロジン［（１Ｓ）−１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−１−Ｃ−｛３−［（１−ｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎ−２−ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］−４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ｝−Ｄ−ｇｌｕｃｉｔｏｌ］、ダパグリフロジン［（１Ｓ）−１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−１−Ｃ−｛４−ｃｈｌｏｒｏ−３−［（４−ｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ｝−Ｄ−ｇｌｕｃｉｔｏｌ］、ルセオグリフロジン［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−２−｛５−［（４−Ｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ｝−６−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｔｈｉａｎｅ−３，４，５−ｔｒｉｏｌ］、トホグリフロジン［（１Ｓ，３’Ｒ，４’Ｓ，５’Ｓ，６’Ｒ）−６−［（４−Ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］−６’−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−３’，４’，５’，６’−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−３Ｈ−ｓｐｉｒｏ［２−ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１，２’−ｐｙｒａｎ］−３’，４’，５’−ｔｒｉｏｌ］、セルグリフロジンエタボナート［２−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ  ６−Ｏ−（ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］、レモグリフロジンエタボナート［５−Ｍｅｔｈｙｌ−１−（ｐｒｏｐａｎ−２−ｙｌ）−４−［［４−［（ｐｒｏｐａｎ−２−ｙｌ）ｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌ−３−ｙｌ  ６−Ｏ−（ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］、エルツグリフロジン［（１Ｓ，２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−５−［４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−［（４−ｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］−１−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−６，８−ｄｉｏｘａｂｉｃｙｃｌｏ［３．２．１］ｏｃｔａｎｅ−２，３，４−ｔｒｉｏｌ］、ソタグリフロジン［Ｍｅｔｈｙｌ  （５Ｓ）−５−Ｃ−［４−ｃｈｌｏｒｏ−３−［（４−ｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］−１−ｔｈｉｏ−β−Ｌ−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］、及びこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。これらの化合物は、公知の製造方法又は当該方法に改変を施した任意の製造方法により、製造することができる。
【００２３】
ＳＧＬＴ２阻害薬である低分子化合物の薬学的に許容される塩としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウム、マグネシウムなどの第２族金属との塩；亜鉛又はアルミニウムとの塩；アンモニア、コリン、ジエタノールアミン、リジン、エチレンジアミン、ｔ−ブチルアミン、ｔ−オクチルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ−メチル−グルコサミン、トリエタノールアミン、デヒドロアビエチルアミンなどのアミンとの塩；塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマール酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩；アスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。
【００２４】
更に、ＳＧＬＴ２阻害薬である低分子化合物の薬学的に許容される塩には、当該低分子化合物の分子内塩、水和物、Ｌ−プロリン等との共結晶、（２Ｓ）−プロパン−１，２−ジオール等との溶媒和物なども包含される。
【００２５】
（ＳＧＬＴ２発現阻害薬）
ＳＧＬＴ２発現阻害薬としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、低分子化合物などが挙げられる。これらの発現阻害薬を投与することにより、ＳＧＬＴ２の発現を阻害することができる。
【００２６】
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１〜２３塩基対の低分子２本鎖ＲＮＡである。
細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
【００２７】
ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０〜９５℃で約１分程度変性させた後、３０〜７０℃で約１〜８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
【００２８】
ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、ベクターによって細胞に導入し、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターで発現させてもよいし、ｓｈＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成し、ｓｉＲＮＡと同様の方法によりセルフアニーリングさせることによって調製してもよい。細胞内に導入されたｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
【００２９】
ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）は、ゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て最終的に約２０塩基の微小ＲＮＡとなる機能性核酸である。ｍｉＲＮＡは、機能性のｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ、非コードＲＮＡ：タンパク質に翻訳されないＲＮＡの総称）に分類されており、他の遺伝子の発現を調節するという、生命現象において重要な役割を担っている。特定の塩基配列を有するｍｉＲＮＡを生体に投与することにより、ＳＧＬＴ２の発現を阻害することができる。
【００３０】
リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、ＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となっている。リボザイムは、グループＩイントロン型、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡ等の４００ヌクレオチド以上の大きさのものであってもよく、ハンマーヘッド型、ヘアピン型などと呼ばれる４０ヌクレオチド程度のものであってもよい。
【００３１】
アンチセンス核酸は、標的配列に相補的な核酸である。アンチセンス核酸は、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が形成された部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等により、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【００３２】
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。
【００３３】
（ＳＧＬＴ２特異的結合物質）
ＳＧＬＴ２特異的結合物質としては、ＳＧＬＴ２に特異的に結合してＳＧＬＴ２の機能を阻害するものが挙げられ、例えば、抗体、抗体断片、アプタマーなどが挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に、ＳＧＬＴ２タンパク質又はその断片を抗原として免疫することによって作製することができる。或いは、抗体は、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどが挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、抗体は、市販の抗体であってもよい。アプタマーは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマーなどが挙げられる。標的ペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＦＬＥＸ）法などにより選別することができる。また、標的ペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法などにより選別することができる。
【００３４】
一実施態様において、本発明は、ＳＧＬＴ２阻害薬及び薬学的に許容される担体を含有する、老化細胞除去用医薬組成物を提供する。本実施態様の医薬組成物を投与することによって、老化細胞を除去することができる。また、老化細胞を除去することによって、老化細胞を除去することにより病態の改善が見込まれる疾患（好ましくは、老化関連疾患）を予防又は治療することができる。すなわち、本実施態様は、老化細胞を除去することにより病態の改善が見込まれる疾患の予防又は治療用医薬組成物も提供する。
【００３５】
本実施態様の医薬組成物は、経口的に使用される剤型又は非経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよい。経口的に使用される剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などが挙げられる。非経口的に使用される剤型としては、例えば、注射剤、軟膏剤、貼付剤などが挙げられる。
【００３６】
薬学的に許容される担体としては、医薬組成物の製造に通常用いられるものであれば、特に制限なく用いることができる。具体的な例としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤などが挙げられる。
【００３７】
医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤などが挙げられる。
【００３８】
医薬組成物は、ＳＧＬＴ２阻害薬、薬学的に許容される担体及び所望により添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００３９】
ＳＧＬＴ２阻害薬を投与する対象としては、限定されるものではないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、及びそれらの細胞などが挙げられる。なかでも、哺乳動物又は哺乳動物細胞が好ましく、ヒト又はヒト細胞が特に好ましい。
【００４０】
ＳＧＬＴ２阻害薬の投与量は、投与する具体的な対象、対象の症状、体重、年齢、性別などによって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、成人であれば、例えば、投与単位形態あたり約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重のＳＧＬＴ２阻害薬を投与すればよい。また、注射剤の場合には、成人であれば、例えば、投与単位形態あたり約０．０１〜約５０ｍｇのＳＧＬＴ２阻害薬を投与すればよい。
【００４１】
また、ＳＧＬＴ２阻害薬の１日投与量は、投与する具体的な対象、対象の症状、体重、年齢、性別などによって異なり、一概には決定できないが、例えば、成人であれば、１日あたり約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重のＳＧＬＴ２阻害薬を１日１回又は２〜３回程度に分けて投与すればよい。
【００４２】
本発明に係るＳＧＬＴ２阻害薬は、ＳＧＬＴ２阻害薬以外の老化細胞除去薬及び他の疾患の治療薬からなる群より選択される少なくとも１つと組合せて、使用してもよい。ＳＧＬＴ２阻害薬と他の薬剤とは、同一の製剤にしてもよいし、別々の製剤にしてもよい。また、各製剤は、同一の投与経路で投与してもよいし、別々の投与経路で投与してもよい。投与経路としては、例えば、経口又は注射が挙げられる。更に、各製剤は、同時に投与してもよいし、逐次的に投与してもよいし、一定の時間ないし期間を空けて別々に投与してもよい。一実施態様において、ＳＧＬＴ２阻害薬と他の薬剤とは、これらを包含するキットとしてもよい。
【実施例】
【００４３】
以下に、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらにより何ら限定されるものではない。【００４４】
［実験例１］
（肥満モデルマウスの作製）
４週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒ）に８週間高脂肪食を与え、摂餌性肥満モデルマウスを作製した。続いて、作製した肥満モデルマウスにＳＧＬＴ２阻害薬であるカナグリフロジンを０．０３％Ｗ／Ｗ混餌経口投与した（以下、「高脂肪食＋ＳＧＬＴ２ｉ群」という。）。【００４５】
また、比較のために、４週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒ）に８週間通常食を与えたマウス（以下、「通常食群」という。）、及びカナグリフロジンを投与しなかった点以外は上記と同様の肥満モデルマウス（以下、「高脂肪食群」という。）を用意した。【００４６】
［実験例２］
（老化関連酸性β−ガラクトシダーゼ活性の検討）
実験例１において、カナグリフロジンの投与開始から１週間後に各群のマウスから内臓脂肪組織（精巣周囲脂肪組織）を採取した。【００４７】
続いて、各群のマウスから採取した内臓脂肪組織中の老化細胞を、定法（Dimri G. P.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(20), 9363-9367, 1995）にしたがって検出した。具体的には、各内臓脂肪組織を老化関連酸性β−ガラクトシダーゼ染色し、老化細胞を検出した。この染色により、老化細胞が青く染色された。【００４８】
結果を、図１（ａ）〜（ｃ）に示す。図１（ａ）は通常食群のマウスの結果を示す。スケールバーは５ｍｍを示す。図１（ｂ）は、高脂肪食群のマウスの結果を示し、図１（ｃ）は高脂肪食＋ＳＧＬＴ２ｉ群のマウスの結果を示す。【００４９】
その結果、ＳＧＬＴ２阻害薬の投与により、１週間という短期間内に内臓脂肪組織の老化細胞が顕著に減少したことが明らかとなった。短期間に老化細胞が減少していることから、ＳＧＬＴ２阻害薬の投与により、老化細胞が除去されたと判断された。また、高脂肪食＋ＳＧＬＴ２ｉ群のマウスでは、内臓脂肪の炎症所見の軽減も認められた。【００５０】
［実験例３］
（ｐ５３タンパク質の発現量の検討）
ｐ５３タンパク質は、細胞老化を促進する老化促進分子として中心的役割を担うことが知られている。本発明者は、以前に、肥満ストレスを加えると、内臓脂肪組織においてｐ５３シグナルの上昇を介した細胞老化反応が促進され、内臓脂肪炎症が惹起され、全身の代謝不全が生じ、糖尿病の病態が形成、増悪することを明らかにした。そこで、肥満モデルマウスの脂肪組織におけるｐ５３タンパク質の発現を検討した。【００５１】
具体的には、実験例２で採取した内臓脂肪組織の一部を用いて、ウエスタンブロッティング法により、ｐ５３タンパク質の発現量を測定した。抗ｐ５３抗体としては、型式「１Ｃ１２」（ＣＳＴ）を用いた。また、ローディングコントロールとして、抗β−アクチン抗体（型式「１３Ｅ５」、ＣＳＴ）を用いてβ−アクチンタンパク質を検出した。【００５２】
図２は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
その結果、肥満モデルマウスにＳＧＬＴ２阻害薬を投与することにより、内臓脂肪組織におけるｐ５３の発現量が頑著に低下することが明らかとなった。この結果は、ＳＧＬＴ２阻害薬の投与により、老化細胞が除去されることを更に支持するものである。【００５３】
［実験例４］
（老化マーカーｐ２１（Ｃｄｋｎ１ａ）及びｐ１６（Ｃｄｋｎ２ａ）のｍＲＮＡ発現量の検討）
Ｐ５３と共に老化シグナルとして重要な働きを担っているｐ２１及びｐ１６のｍＲＮＡ発現について検討した。【００５４】
具体的には、カナグリフロジンの投与開始から３日後及び１週間後に各群のマウスから採取した内臓脂肪組織（精巣周囲脂肪）の一部から、ＲＮＡ−Ｂｅｅ（商標）（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）でＲＮＡを抽出した。採取したＲＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ）で定量後、１μｇのＲＮＡをＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使ってｃＤＮＡ化した。このｃＤＮＡを用いて、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ）とＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）とを用いたｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法にて、Ａｃｔｂをハウスキーピング遺伝子として用いたｐ２１及びｐ１６のｍＲＮＡの相対発現量を定量した。各ＲＮＡに対するｐｒｉｍｅｒは、Ｒｏｃｈｅホームページ内にあるＰｒｏｂｅ  ｆｉｎｄｅｒを用いてデザインした。【００５５】
図３は、ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲの結果を示したグラフである。ＳＧＬＴ２阻害薬の投与により、高脂肪食負荷によるｐ２１  ｍＲＮＡレベルの増加が有意に抑制され、ｐ１６も同様の傾向を認めた。この結果からも、ＳＧＬＴ２阻害薬によって老化細胞が除去されていることが強く示唆された。【００５６】
［実験例５］
（脂肪炎症及び脂肪組織の酸化ストレスへの影響の検討）
肥満の内臓脂肪組織ではマクロファージを主体とした炎症細胞浸潤が生じ、ｃｒｏｗｎ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（ＣＬＳ）と呼ばれる細胞死に陥った脂肪細胞をマクロファージが取り囲み貪食・処理する特徴的な組織構造がみられると共に、酸化ストレスが亢進する。そこで、ＳＧＬＴ２阻害薬の肥満モデルマウスの白色脂肪組織における脂肪老化、脂肪炎症への影響について検討した。【００５７】
具体的には、実験例４で採取した内臓脂肪の一部を１０％マイルドホルム（和光）にて２４時間以上浸潤固定した。サンプルを脱水後パラフィンに包埋し、５μｍ厚で薄切した切片をスライドガラスに貼り付け、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色及びｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ（ＤＨＥ）染色、Ｆ４／８０抗体による免疫蛍光染色に供した。染色した切片は、Ｂｉｏｒｅｖｏ（Ｋｅｙｅｎｃｅ  Ｃｏ．）又は必要に応じて共焦点顕微鏡で撮像した。ＨＥ染色像では４００倍での撮影のほか、４０倍視野１枚におけるｃｒｏｗｎ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅの平均個数を計測した。ＤＨＥ染色ではランダムに撮影した４００倍視野像より一定の値以上の赤色値の視野あたりの割合（％）をＩｍａｇｅＪを用いて計測した。Ｆ４／８０抗体による免疫蛍光染色では１視野中の核数あたりのＦ４／８０陽性細胞の割合（％）を計測した。また、実験例４に記載した方法に準じて、ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法によってＣＣＬ２及びＴＮＦαのｍＲＮＡを定量した。【００５８】
図４（ａ）は、ＨＥ染色の結果を示す写真である。スケールバーは２００μｍを示す。図４（ｂ）は、ＣＬＳ数の計数結果を示したグラフである。高脂肪食負荷によって亢進したマクロファージの浸潤とＣＬＳ構造の増加が、ＳＧＬＴ２阻害薬の投与によって顕著に減少した。
図５（ａ）は、ＤＨＥ染色によって酸化ストレスを評価した結果を示す写真である。スケールバーは１００μｍを示す。図５（ｂ）は、ＤＨＥ陽性エリアの測定結果のグラフである。高脂肪食によって亢進した酸化ストレスも、ＳＧＬＴ２阻害薬の投与で顕著に抑制された。
図６（ａ）は、ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲの結果を示したグラフである。図６（ｂ）はＦ４／８０の免疫蛍光染色を示した写真である。ＳＧＬＴ２阻害薬の投与により、脂肪組織中へのマクロファージの浸潤は残るものの、ＣＣＬ２及びＴＮＦαといった炎症関連分子のｍＲＮＡ発現の低下傾向が見られた。以上の結果から、ＳＧＬＴ２阻害薬は肥満モデルにおいて、脂肪老化の改善に伴って脂肪炎症や酸化ストレスをも軽減させることが明らかとなった。【００５９】
［実験例６］
（内臓脂肪組織以外の臓器における老化シグナルに及ぼす影響の検討）
ＳＧＬＴ２阻害薬が内臓脂肪組織以外の臓器の老化シグナルに対しても抑制効果を示すか否かについても検討した。【００６０】
具体的には、実験例２で内臓脂肪組織を採取した際に同じマウスから採材した心臓、腎臓、骨格筋（四頭筋）、褐色脂肪組織のｐ１６及びｐ２１のｍＲＮＡ発現量を、実験例４に記載したものと同じ方法を使って定量した。【００６１】
図７は、ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲの結果を示したグラフである。ＳＧＬＴ２阻害薬の投与により、心臓のｐ２１、腎臓のｐ１６及びｐ２１、骨格筋のｐ２１、褐色脂肪組織のｐ１６のｍＲＮＡレベルがそれぞれ低下する傾向が認められた。この結果から、ＳＧＬＴ２阻害薬は、内臓脂肪組織以外の複数の臓器においても老化細胞除去効果を発揮しているものと考えられた。【００６２】
［実験例７］
（動脈硬化モデルマウスでの検討）
ＳＧＬＴ２阻害薬が動脈硬化モデルマウスの血管の老化細胞を除去する効果を示すか否かについて検討した。【００６３】
４週齢のＡｐｏＥ欠失（ＡｐｏＥ−／−）マウスに１２週間高脂肪食を与え、続いてＳＧＬＴ２阻害薬カナグリフロジンを０．０３％Ｗ／Ｗ混餌経口投与した（以下、「ＨＦＤ＋ＳＧＬＴ２ｉ群」という。）。また、比較のために、カナグリフロジンを投与しなかった点以外は上記と同様のマウス（以下、「ＨＦＤ群」という。）を用意した。カナグリフロジンの投与開始から２週間後に各群のマウスから血管（大動脈基部から下行大動脈横隔膜上まで）を採取した。続いて、各群のマウスから採取した血管中の老化細胞を、実験例２に記載した方法に準じて検出した。染色性については上行大動脈より弓部左鎖骨下動脈分枝部までの範囲を計測した。【００６４】
図８（ａ）は、老化関連β−ガラクトシダーゼ染色の結果を示す写真である。スケールバーは２ｍｍを示す。図８（ｂ）は、血管の老化関連β−ガラクトシダーゼ染色性を定量した結果を示したグラフである。ＳＧＬＴ２阻害薬の投与によって、青く染色される老化細胞が減少しており、血管においても老化細胞が除去されることが明らかとなった。【００６５】
［実験例８］
（早老症モデルマウスでの検討）
１３週齢のハッチンソン・ギルフォード早老症モデルマウス（Ｚｍｐｓｔｅ２４欠失マウス）にＳＧＬＴ２阻害薬カナグリフロジンを０．０３％Ｗ／Ｗ混餌経口投与し、マウスの一般状態を観察した。【００６６】
カナグリフロジンの投与開始から３〜４週間後のカナグリフロジン投与早老症モデルマウス（以下、「ＫＯ＋ＳＧＬＴ２ｉ」という。）とカナグリフロジンを投与しなかった早老症モデルマウス（以下、「ＫＯ」という。）とを比較すると、ＫＯでは毛並の悪化や脱毛が観察されたが、ＫＯ＋ＳＧＬＴ２ｉではそのような変化は軽減された。この結果から、ＳＧＬＴ２阻害薬の投与が早老症モデルマウスの病態進行を抑制する可能性を示唆するものと考えられた。【００６７】
［実験例９］
（培養老化細胞での検討）
短期間のＳＧＬＴ２阻害薬の投与で老化細胞が減少したマウスの血液及び各種組織のメタボローム解析を実施した結果、血中ならびに各組織におけるケトン体濃度の増加や血中ＡＩＣＡＲ（５−Ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ−４−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ−１−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ）の有意な増加を認めた。また、ＳＧＬＴ２阻害により脂肪酸酸化が亢進し解糖系の抑制がみられること、及び老化細胞では解糖系の亢進がみられることが知られている。そこで、３−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ（以下、「３ＨＢ」という。）、ＡＩＣＡＲ（以下、「ＡＩＣ」という。）及び解糖系抑制効果を持つ２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ（以下、「２ＤＧ」という。）が老化細胞の細胞死誘導作用を有するかについて検討した。【００６８】
具体的には、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ（ＨＵＶＥＣ）、Ｌｏｎｚａ）を所定の培養液（ＥＢＭ−２／ＥＧＭ−２、Ｌｏｎｚａ）で培養した。１０継代未満を若齢、１５継代以上経たものを老齢として取り扱った。若年または老齢ＨＵＶＥＣに対し、２ＤＧ、３ＨＢ、ＡＩＣをそれぞれ１ｍＭ、２０ｍＭ、２００μＭの濃度となるよう培養液中に添加し、４８時間後に細胞を回収した。回収した細胞に対して、ＡｐｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）  Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた蛍光／吸光度測定による生存率の評価を実施した。また、ＡｎｎｅｘｉｎＶ（Ｂｅｃｔｏｎ  ＆  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ））、ＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｔｃｈ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて死細胞染色を施し、ＦＡＣＳによる解析でアポトーシス誘導細胞の割合を定量した。【００６９】
図９は、若齢及び老齢ＨＵＶＥＣに２ＤＧ、３ＨＢ又はＡＩＣを添加した際、及び試薬を何も添加しなかった場合（Ｃｏｎ）の細胞生存率とアポトーシス誘導率を示したグラフである。Ｃｏｎと比べて、２ＤＧ及び３ＨＢは老齢細胞選択的にアポトーシス誘導率を上昇させ、細胞生存率の低下を引き起こすことが明らかとなった。ＡＩＣでもアポトーシス誘導率の増加と細胞生存率の低下を認めたが、２ＤＧや３ＨＢのような老齢細胞選択的ではなく、むしろ若齢細胞でより強力な効果を示した。以上の結果から、２ＤＧ及び３ＨＢに老化細胞選択的な細胞除去効果があることが明らかとなり、ＳＧＬＴ２阻害薬は解糖系抑制及びケトン体の上昇を介して老化細胞を除去している可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明によれば、老化細胞を除去することができ、また、老化細胞を除去することにより病態の改善が見込まれる疾患を予防及び／又は治療することができる。【００７１】
本明細書において、単数で記載される物は、特段異なる規定がなされていない限り、また、文脈上明らかに異なることを意味しない限り、複数で用いてもよいことは、当業者には明らかである。
また、本発明の精神から逸脱することなく、本明細書に記載した実施態様に任意の改変を加えることができることは当業者には明らかであり、そのような改変物も、本発明の範囲に包含される。【００７２】
本出願は、日本国で出願された特願２０１６−１６７６７９号の優先権を主張するものであり、その開示内容全てを参照により本明細書に援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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