(57)【要約】【課題】アフリカ豚コレラの感染有無を簡易かつ迅速に検出しうる検出方法の開発。【解決手段】配列番号１で示されるアフリカ豚コレラウイルス遺伝子の塩基配列（GenBank accession No.AY578689）の1503番〜2072番の塩基配列（以下，「標的核酸」）から選ばれた任意の塩基配列，又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー，ならびに，これらオリゴヌクレオチドプライマーを用いたLAMP法などの核酸増幅方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アフリカ豚コレラウイルス検出を目的とした下記(i)から(iv)のオリゴヌクレオチドプライマーからなることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーセット。
(i)  インナープライマーF
(a)  5’−（配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号４の塩基配列）−3’
又は，
(b)  5’−（配列番号１３の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１４の塩基配列）−3’
(ii)  アウタープライマーF
(c)  配列番号２，又は，(d)  配列番号１２
(iii)  インナープライマーB
(e)  5’−（配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号６の塩基配列）−3’
又は，
(f)  5’−（配列番号１５の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１６の塩基配列）−3’
(iv)  アウタープライマーB
(g)  配列番号７，又は，(h)  配列番号１７
【請求項２】
前記(i)，(ii)，(iii)，(iv)のオリゴヌクレオチドプライマーが，それぞれ配列番号８，配列番号２，配列番号９，配列番号７の塩基配列からなることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項３】
前記(i)，(ii)，(iii)，(iv)のオリゴヌクレオチドプライマーが，それぞれ配列番号１８，配列番号１２，配列番号１９，配列番号１７の塩基配列からなることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項４】
前記配列番号２から９および１２から１９，もしくはこれらと相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーであって，
これら塩基配列と同一の少なくとも連続した15塩基を含む塩基配列のオリゴヌクレオチドプライマーからなることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項５】
請求項１から４に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを，単独もしくは組み合わせて用いることにより，アフリカ豚コレラウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするアフリカ豚コレラウイルスの検出方法。
【請求項６】
アフリカ豚コレラウイルスの標的核酸領域の増幅反応が，LAMP法であることを特徴とする請求項５に記載のアフリカ豚コレラウイルスの検出方法。
【請求項７】
請求項２に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットおよび配列番号１０，配列番号１１のオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせをプライマーセット１，
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットおよび配列番号２０，配列番号２１のオリゴヌクレオチドプライマーをプライマーセット２として，
これらプライマーセット１と２を組み合わせてアフリカ豚コレラウイルスの検出を行うことを特徴とする請求項６に記載のアフリカ豚コレラウイルスの検出方法。
【請求項８】
アフリカ豚コレラウイルス感染症の検出方法において，請求項１ないし４に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含むことを特徴とする検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，アフリカ豚コレラウイルスの検出に有用なオリゴヌクレオチドプライマー等に関する。さらに詳しくいうと本発明は，簡易・高感度かつ迅速な遺伝子検出法であるLAMP法に用いられるオリゴヌクレオチドプライマー，これを組み合わせたプライマーセット，ならびにプライマーセットを用いたアフリカ豚コレラの迅速検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アフリカ豚コレラウイルス（African swine fever virus）は，アフリカ豚コレラの原因ウイルスで，アスファウイルス科（Asfaviridae）に分類される大型の２本鎖DNAウイルスである。
アフリカ豚コレラは，豚に高い伝播性を持つとともに，罹患した豚に，発熱，食欲不振，結膜炎，リンパ節腫脹，呼吸障害，便秘，下痢，後躯麻痺や運動失調，起立困難などを主とした症状を引き起こし，最大で100％の致死率を示す。【０００３】
アフリカ豚コレラは，ウイルスの病原性の強さにより，甚急性，急性，亜急性，慢性および不顕性，これら５種類に分類される。
日本をはじめとするアフリカ豚コレラ清浄国において感染が確認された場合，他の家畜への感染拡大を防ぐために，罹患した患畜は，発見され次第，殺処分される。この殺処分措置による経済的被害は甚大なものとなることから，日本においてアフリカ豚コレラは，家畜伝染病予防法により法定伝染病に指定されている。
これらの事情から，アフリカ豚コレラの防疫，および海外からの侵入時の迅速診断ならびに摘発淘汰は，我が国においても最重要課題の一つとなっている。【０００４】
アフリカ豚コレラの被害拡大を抑制するためには，初発例を確実に診断するとともに，臨床症状を示す前の感染初期の個体を，迅速に診断し摘発淘汰することが極めて重要である。
アフリカ豚コレラの診断は，感染個体の血液等の材料から，微生物学的試験法であるPCR法，抗体測定，培養細胞を用いたウイルス分離などにより行われている。
これらの診断手法のうち，抗体測定では，感染初期の個体を摘発することは原理的に困難である。また，培養細胞を用いたウイルス分離は，培養のための日数を必要とするため，迅速診断という観点からは有用な診断方法とはいえない。
これらと比較してPCR法は，３つの検査法の中では最も迅速に結果を得ることが出来るが，それでも検体入手から，少なくとも約３時間を必要とすることが問題となっている。【０００５】
一方，LAMP法はPCR法よりも簡易迅速な検査法であり，口蹄疫等の様々な病原体を検出するプライマーセットが多数論文報告されている（非特許文献１，２）。また，アフリカ豚コレラウイルスを検出するためのLAMP法は，英国の１グループ（Jamesら）によって開発されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Yamazaki, W., V. Mioulet, L. Murray, M. Madi, T. Haga, N. Misawa, Y. Horii, and D.P. King. (2013). Development and evaluation of multiplex RT-LAMP assays for rapid and sensitive detection of foot-and-mouth disease virus. Journal of Virological Methods, 192 : 18-24.
【非特許文献２】Kasanga, C. J., Yamazaki, W., Mioulet, V., King, D.P., Mulumba, M., Ranga, E., Deve, J., Mundia, C., Chikungwa, P., Joao, L., Wambura, P. N. and Rweyemamu, M. M. (2014). Rapid, sensitive and effective diagnostic tools for foot-and-mouth disease virus in Africa. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 81: E1-E5.
【非特許文献３】James, H. E., K. Ebert, R. McGonigle, S. M. Reid, N. Boonham, J. A. Tomlinson, G. H. Hutchings, M. Denyer, C. A. Oura, J. P. Dukes, and D. P. King. (2010). Detection of African swine fever virus by loop-mediated isothermal amplification. J Virol Methods 164: 68-74
【非特許文献４】Aguero, M., J. Fernandez, L. Romero, C. Sanchez Mascaraque, M. Arias, and J. M. Sanchez-Vizcaino. (2003).Highly sensitive PCR assay for routine diagnosis of African swine fever virus in clinical samples. J Clin Microbiol 41:4431-4.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献３の報告によると，主にアフリカで分離されたアフリカ豚コレラウイルス株では，診断を行うのに充分なウイルス量を使用しているにも関わらず，陽性判定に40分以上を要するウイルス株（以下，「陽性判定遅延株」という。）が，使用したアフリカ豚コレラウイルス38株中5.2%にあたる2株で認められた。【０００８】
アフリカ豚コレラウイルスの全塩基配列情報は，塩基配列データベースであるGenBankに232データが登録されている。これらの塩基配列情報は，長年に亘って，主にアフリカから分離されたアフリカ豚コレラウイルス株に由来した塩基配列情報に基づき登録されている。
一般的に，LAMP法で使用する各プライマーの反応拠点側から５塩基の領域（以下，「反応重要領域」という。）にミスマッチが存在すると反応が阻害され，増幅効率が低下することが技術常識として知られている。
発明者は，前述の232のアフリカ豚コレラウイルスの塩基配列情報を用いて，Jamesらの報告しているLAMP法のプライマーの特異性を検証したところ，反応重要領域ならびにそれ以外の領域に多くのミスマッチがあることを確認した。これらのミスマッチがJamesらの報告において陽性判定遅延株が認められた原因と推測される。【０００９】
上記事情を背景として本発明では，アフリカ豚コレラの感染有無を簡易かつ迅速に検出しうるとともに，アフリカ豚コレラウイルスの多様性をカバーしうる検出方法の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者は，鋭意研究の結果，アフリカ豚コレラウイルスにおいて配列としての保存性が高く，検出に有用な部位を発見するとともに，これを基に設計されたプライマーセットの有用性を確認し，プライマーに関する発明を完成させたものである。
さらに発明者は，プライマーセットを組み合わせて使用したLAMP法による検出を行うことにより，アフリカ豚コレラウイルスの，より高感度かつ迅速な検出が可能であることを確認し，発明を完成させたものである。【００１１】
本発明は，以下の構成からなる。
本発明の第一の構成は，アフリカ豚コレラウイルス検出を目的とした下記(i)から(iv)の塩基配列からなることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
(i)  インナープライマーF
(a)  5’−（配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号４の塩基配列）−3’
又は，
(b)  5’−（配列番号１３の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１４の塩基配列）−3’
(ii)  アウタープライマーF
(c)  配列番号２，又は，(d)  配列番号１２
(iii)  インナープライマーB
(e)  5’−（配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号６の塩基配列）−3’
又は，
(f)  5’−（配列番号１５の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１６の塩基配列）−3’
(iv)  アウタープライマーB
(g)  配列番号７，又は，(h)  配列番号１７【００１２】
本発明の第二の構成は，前記(i)，(ii)，(iii)，(iv)のオリゴヌクレオチドプライマーが，それぞれ配列番号８，配列番号２，配列番号９，配列番号７の塩基配列からなることを特徴とする第一の構成に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
本発明の第三の構成は，前記(i)，(ii)，(iii)，(iv)のオリゴヌクレオチドプライマーが，それぞれ配列番号１８，配列番号１２，配列番号１９，配列番号１７の塩基配列からなることを特徴とする第一の構成に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
本発明の第四の構成は，前記配列番号２から９および１２から１９，もしくはこれらと相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーであって，これら塩基配列と同一の少なくとも連続した15塩基を含む塩基配列のオリゴヌクレオチドプライマーからなることを特徴とする第一の構成に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットである。【００１３】
本発明の第五の構成は，第一から第四の構成に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを，単独もしくは組み合わせて用いることにより，アフリカ豚コレラウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするアフリカ豚コレラウイルスの検出方法である。
本発明の第六の構成は，アフリカ豚コレラウイルスの標的核酸領域の増幅反応が，LAMP法であることを特徴とする第五の構成に記載のアフリカ豚コレラウイルスの検出方法である。
本発明の第七の構成は，第二の構成に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットおよび配列番号１０，配列番号１１のオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせをプライマーセット１，第三の構成に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットおよび配列番号２０，配列番号２１のオリゴヌクレオチドプライマーをプライマーセット２として，これらプライマーセット１と２を組み合わせてアフリカ豚コレラウイルスの検出を行うことを特徴とする第六の構成に記載のアフリカ豚コレラウイルスの検出方法である。
本発明の第八の構成は，アフリカ豚コレラウイルス感染症の検出方法において，第一から第四の構成に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含むことを特徴とする検出キットである。【００１４】
本発明において，オリゴヌクレオチドプライマー（もしくは，プライマー）とは，特に限定しない限り，複数の塩基配列を有する核酸断片をいい，DNAポリメラーゼによるDNA合成の際，用いることができるものをいう。
また，プライマーセットとは，複数個のプライマーの組合せのみならず，そのようなプライマーの組合せを複数個含むものも合わせてプライマーセットというものとする。
さらに，LAMP法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）とは，鋳型となるヌクレオチドに自身の3’末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに，このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより，等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法として定義される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により，アフリカ豚コレラの感染有無を簡易かつ迅速に検出しうるとともに，アフリカ豚コレラウイルスの多様性をカバーしうる検出方法の提供が可能となった。
すなわち，本発明における標的核酸領域を用いることにより，アフリカ豚コレラウイルスの検出に有用なプライマーを作製することが可能となる。加えて，作製されたプライマーを用いてLAMP法による検出を行うことにより，簡易かつ迅速に，アフリカ豚コレラウイルスの検出を可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】LAMP法にて，プライマーセット１を用いた場合の蛍光強度の変化を示した図
【図２】LAMP法にて，プライマーセット２を用いた場合の蛍光強度の変化を示した図
【図３】LAMP法にて，プライマーセット１ならびにプライマーセット２を組み合わせて用いた場合の蛍光強度の変化を示した図
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマー等について，説明を行う。
本発明は，アフリカ豚コレラウイルスの検出に有用な塩基配列領域として，アフリカ豚コレラウイルス遺伝子の塩基配列（GenBank accession No.AY578689）の1503番〜2072番の塩基配列（以下，「標的核酸領域」）を発明者が発見したことに基づくものである。また，発明者は，かかる標的核酸領域に模した塩基配列（配列番号２２）を陽性対照として，下記に示すオリゴヌクレオチドプライマー（以下，単に「プライマー」という）により，高感度かつ迅速な増幅が可能であることを確認し，アフリカ豚コレラウイルスの検出に有用なプライマーおよび検出方法等にかかる発明を完成させたものである。
(1)  プライマーセット１
ASF-IPF-1:5'-CGTTTACACGCTTGTGGATCGTACGCATTCTTTGTGCCG-3' （配列番号8)
ASF-OPF-1:5'-ACTCGCAGTAGTAAACCAA-3' （配列番号2）
ASF-IPB-1:5'-TCCGTTGCGAGGAAACGTTTGATGCTCCGATTCAGGGC-3' （配列番号9）
ASF-OPB-1:5'-TGTCATTCGTCCTGGCA-3' （配列番号７）
ASF-LPF-1:5'-CTTTTGGGAGACCCATTGT-3' （配列番号１０）
ASF-LPB-1:5'-CCCCCATCTGGGATGA-3' （配列番号１１）
(2)  プライマーセット２
ASF-IPF-2:5'-TTGAGTCAAATCGAAGAAACACATACACTTTATTGTATTCAAACCCTA-3' （配列番号18）
ASF-OPF-2:5'-GGAAAAAGTCTCCGTACTG-3' （配列番号１２）
ASF-IPB-2:5'-GCAAGTCTTGGGCCAAGATACTTTTTGTCTTATTGCTAACGATGG-3' （配列番号19）
ASF-OPB-2:5'-ATATGGCATCAGGAGGAG-3' （配列番号１７）
ASF-LPF-2:5'-GCATTTTAATGCACATTTTAAGCCTT-3' （配列番号２０）
ASF-LPB-2:5'-AATCTTGTCGGCCTTCC-3' （配列番号２１）
なお，詳細は後述するが，IPFはインナープライマーF，OPFはアウタープライマーF，IPBがインナープライマーB，OPBがアウタープライマーB，LPFがループプライマーF，LPBがループプライマーBの略である。
【００１８】
標的核酸領域は，232種のアフリカ豚コレラウイルスにおける保存性が高い部分として見出されたものであり，アフリカ豚コレラウイルスの多様性をカバーし増幅しうる核酸領域である。
本発明におけるプライマーは，かかる標的核酸領域を増幅対象として設計しうる限り特に限定する必要はなく，PCR法やLAMP法などの核酸増幅方法に用いる際のプライマーとして設計することができる。
【００１９】
また，本発明のアフリカ豚コレラウイルス検出方法は，標的核酸領域を増幅しうる限り特に限定する必要はなく，種々の核酸増幅による検出方法を用いることができ，典型的には，PCR法やLAMP法を用いることができる。
以下では，本発明において特に好適な核酸増幅方法であるLAMP法を例にとり説明を行う。
【００２０】
LAMP法は，納富らが開発した，PCR法で不可欠とされる温度制御が不要な新しい核酸増幅法であり，ループ媒介等温増幅法（Loop-mediated isothermal amplification method，特許公報国際公開第00/28082号パンフレット）の略称として称される方法である。
LAMP法は，鋳型となるヌクレオチドに自身の3’末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに，このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより，等温での相補鎖合成反応を可能とする。また，LAMP法では，プライマーの3’末端が，常に試料に由来する領域に対してアニールしており，塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能することとなり，結果として，高感度かつ特異性の高い核酸増幅反応を可能とするものである。
【００２１】
LAMP法においては，核酸増幅の際，鋳型核酸の塩基配列の計6領域に対応したプライマーを必要とする。
すなわち，LAMP法では，3’末端側からF3c，F2c，F1cという領域，5’末端側からB3，B2，B1という領域，これら6つの塩基配列を認識する少なくとも４種類のプライマーを必要とする。これらのプライマーはそれぞれ，インナープライマーF及びB，アウタープライマーF及びBと呼ばれる。
また，F1c，F2c，F3cと相補的な塩基配列は，F1，F2，F3と呼ばれる。一方，B1，B2，B3と相補的な塩基配列は，B1c，B2c，B3cと呼ばれる。
なお，各プライマーにおけるFとは，標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し，合成起点を提供するプライマー表示である。一方，Bとは，標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し，合成起点を提供するプライマー表示である。
【００２２】
インナープライマーとは，標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し，かつ合成起点を与える塩基配列を3’末端に有し，同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を5’末端に有するオリゴヌクレオチドである。
また，「F2より選ばれた塩基配列」及び「F1cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーF（以下，「IPF」），そして「B2より選ばれた塩基配列」と「B1cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーB（以下，「IPB」）と呼ぶ。
IPFならびにIPBともに，典型的には，その3'末端側から，F2領域（又はB2領域），F1c領域（又はB1c領域）とした塩基配列とすればよい。また，F2領域とF1c領域の間には，増幅に関与しない非特異的塩基配列領域（リンカー）を有していてもよいことが技術常識として知られており，この非特異的領域を含んだ配列としてもよい。非特異的領域の配列の長さについては，増幅に影響を及ぼさない配列長とすればよく，典型的には50配列以下とすればよい。
【００２３】
一方，アウタープライマーとは，標的塩基配列上の「『ある特定のヌクレオチド配列領域』の3’末端側に存在する，ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
また，「F3より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーF（以下，「OPF」），「B3より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーB（以下，「OPB」）と呼ぶ。
【００２４】
LAMP法の核酸増幅においては，インナープライマーとアウタープライマーに加え，さらにこれとは別のプライマー，すなわちループプライマーを用いることができる。
ループプライマー（Loop Primer）は，ダンベル構造の5’末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いると，核酸合成の起点が増加し，反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる（特許文献国際公開第02/24902号パンフレット）。
ループプライマーの塩基配列は，上述のダンベル構造の5’末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば，標的遺伝子の塩基配列あるいはその相補鎖から選ばれても良く，他の塩基配列でも良い。また，ループプライマーは１種類でも２種類でも良い。
【００２５】
本発明において，標的核酸領域を増幅のターゲットとして，その3’末端側からF3c，F2c，F1cの塩基配列領域，5’末端側からB3，B2，B1の塩基配列領域，これらそれぞれの塩基配列領域を選択する。また，これら選択された塩基配列領域と相補的な，F3，F2，F1の塩基配列領域，B3c，B2c，B1cの塩基配列領域，これらそれぞれの塩基配列領域を選択する。これら塩基配列領域を基に，下記のオリゴヌクレオチドプライマーが作製される。
(I)  3’末端側から，F2領域，非特異的塩基配列領域，F1c領域を有する塩基配列。
(II)  F3領域を有する塩基配列。
(III)  3’末端側から，B2領域，非特異的塩基配列領域，B1c領域を有する塩基配列。
(IV)  B3領域を有する塩基配列。
【００２６】
なお，プライマーとして作製される塩基配列の長さは，各領域に対する感度や特異度ないしはプライマーとしての安定性を考慮し適宜調整することができるが，上記(II)ないし(IV)に該当して作製するオリゴヌクレオチドプライマーは，10塩基以上とすることが好ましく，さらに好ましくは15塩基以上とすることができる。また，上記(I)ないし(III)に該当して作製するオリゴヌクレオチドプライマーは，20塩基以上とすることが好ましく，さらに好ましくは40塩基以上とすることができる。
【００２７】
本発明において，(I)の塩基配列はIPF，(II)の塩基配列はOPF，(III)の塩基配列はIPB，(IV)の塩基配列はOPBに該当するものである。
すなわち，本発明のオリゴヌクレオチドプライマーセットは，アフリカ豚コレラウイルス検出を目的とした下記(i)から(iv)のプライマーからなることを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
(i)  インナープライマーF
(a)  5’−（配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号４の塩基配列）−3’
又は，
(b)  5’−（配列番号１３の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１４の塩基配列）−3’
(ii)  アウタープライマーF
(c)  配列番号２，又は，(d)  配列番号１２
(iii)  インナープライマーB
(e)  5’−（配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号６の塩基配列）−3’
又は，
(f)  5’−（配列番号１５の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１６の塩基配列）−3’
(iv)  アウタープライマーB
(g)  配列番号７，又は，(h)  配列番号１７
【００２８】
IPFである配列(a)ないし(b)については，3’側からF2に相当する配列と，F1cに相当する配列を組み合わせて設計されている。また，F2に相当する塩基配列と，F1cに相当する塩基配列の間には，増幅に関与しない非特異的な塩基配列（リンカー）を有していてもよいことが技術常識として知られており，そのリンカーの長さとして特に限定する必要はないが，典型的には，塩基数50以下とすることができる。
【００２９】
同様に，IPBである配列(e)ないし(f)については，3’側からB2に相当する配列と，B1cに相当する配列を組み合わせて設計されている。また，IPF同様，IPBについても，B2に相当する塩基配列と，B1cに相当する塩基配列の間には，リンカーを有していてもよいことが技術常識として知られており，そのリンカーの長さとして特に限定する必要はないが，典型的には，塩基数50以下とすることができる。
【００３０】
本発明において，前記(i)，(ii)，(iii)，(iv)のプライマーは，それぞれ配列番号８，配列番号２，配列番号９，配列番号７，もしくは，配列番号１８，配列番号１２，配列番号１９，配列番号１７に記載の塩基配列として設計することが可能である。また，当然のことながら，前記(i)，(ii)，(iii)，(iv)のプライマーは，これらの塩基配列と相補的な塩基配列として設計してもよい。さらに前記(i)，(ii)，(iii)，(iv)のプライマーは，これらの塩基配列もしくは相補的な塩基配列における連続した塩基配列を含む場合であっても標的核酸領域の増幅しうるものであり，少なくとも連続する15塩基を含む塩基を含むオリゴヌクレオチドプライマーとして設計することができる。
【００３１】
本発明において，IPF，OPF，IPB，OPBを，LAMP法に用いる際のオリゴヌクレオチドプライマーの一つのセットとして用いることができ，これらに加え，ループプライマーを合わせて用いてもよい。これにより，核酸合成の起点が増加することとなり，反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる効果を有する。
ループプライマーは，LPFとして配列番号１０もしくは配列番号２０，LPBとして配列番号１１もしくは配列番号２１に記載の塩基配列のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。
【００３２】
さらに，本発明においては，単独のプライマーセットを用いて核酸増幅操作を行うこともできるし，複数を組み合わせて核酸増幅操作を行うこともできる。複数のプライマーセットを組み合わせて核酸増幅操作を行うことにより，アフリカ豚コレラウイルスの多様性をよりカバーしうるとともに，検出感度や特異度，迅速性を向上させる効果を有する。
これらの組み合わせの例として，前述のプライマーセット１ならびにプライマーセット２，これらを組み合わせて，アフリカ豚コレラウイルスの検出を行うなどである。
【００３３】
続いてLAMP法の一連の流れについて説明を行う。
LAMP法によるアフリカ豚コレラウイルス検出のためには，検体試料が必要である。この検体試料としては，通常用いられるあらゆる検体試料を用いることが可能であり，例えば，ウイルス，ウイルスを含む培養細胞ならびに培養液，豚，猪，イノブタなどの動物由来の検体などが挙げられる。この場合，動物由来の検体を検体試料として用いることがより好ましく，例えば血液，血清，体液，組織抽出液，あるいは組織拭い液ならびに組織拭き取り検体を検体試料として用いることができる。これにより，迅速なアフリカ豚コレラウイルス検出が可能となるという効果を有する。
【００３４】
アフリカ豚コレラウイルス検出のための検体試料については，通常用いられる前処理を行い後述するLAMP法に用いる際の試料とすることができる。例えば，タンパク質分解酵素等による組織細胞由来タンパク質を分解後，フェノール及びクロロホルムを用いて核酸抽出や精製を行ったり，市販されている抽出キット（例えばQiagen社のRNeasy Mini Kit）を用いて得られた核酸を抽出し検体として用いるなどである。
【００３５】
検体試料の準備ができたら，前述のプライマーセットを用いて，核酸増幅のための操作を行う。この核酸増幅の際の操作として，例えば，反応Buffer中，少なくとも４種類のプライマー（IPF，IPB，OPF，OPB），鋳型依存性核酸合成酵素，デオキシヌクレオチド3リン酸などの基質を，60から65℃で15分から1時間程度インキュベートすればよい。また，上述の通り，ループプライマーをさらに用いることもできる。
【００３６】
核酸合成で使用する酵素は，鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定する必要はない。このような酵素としては，Bst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント），Bca（exo-）DNAポリメラーゼ，Csa DNAポリメラーゼ，Gsp DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント），GspSSD DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント），Tin DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント），大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ，好ましくはBst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。
【００３７】
核酸増幅反応操作が終了したら，核酸増幅産物の検出を行う。核酸増幅産物の検出には，通常用いられるあらゆる検出方法を用いることができる。例えば，増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドを用いた検出や蛍光性インターカレーター法，アガロースゲル電気泳動法による検出などである。アガロースゲル電気泳動法においてLAMP増幅産物は，塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。
加えて，LAMP法では目視による検出ができる場合があり，迅速なアフリカ豚コレラウイルス検出が必要な場合に好ましい。すなわち，LAMP法では，核酸の合成により基質が大量に消費され，副産物であるピロリン酸が，共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり，反応液が肉眼で確認できる程度に白濁することからアフリカ豚コレラウイルスの検出が可能である。この場合，反応中の濁度上昇経過や反応終了後の濁度を光学的に観察できる分光光度計等の測定機器を用いて，アフリカ豚コレラウイルスの検出を確認することも可能である。
【００３８】
本発明のプライマーを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は，あらかじめパッケージングしてキット化することができる。具体的には，本発明のプライマーあるいはループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド，核酸合成の基質となる４種類のdNTP，鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素，酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類，酵素や鋳型を安定化する保護剤，さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される。
【実施例】
【００３９】
＜＜実験例１．LAMP法による検出感度の検討＞＞
設計を行った各種プライマーセットについて，LAMP法における検出感度を調べることを目的として実験を行った。また，比較対象として，PCR法による検出を合わせて行った。
なお，本実験例において検出感度は，１反応チューブあたりの検出可能な最小コピー数として示してあり，遺伝子検出における感度を示す指標の一つとして常用されるものである。【００４０】
＜実験方法＞
［検出対象試料の調製］
１．アフリカ豚コレラウイルスの配列（GenBank accession No.AY578689）の，1503番から2072番と同一の人工塩基配列（配列番号２２）をユーロフィン社から購入した。
２．この人工塩基配列を，TE緩衝液で溶解し，これを10倍ずつ，段階希釈して調整した各溶解液を，検出対象試料の鋳型DNAとして用いた。なお，各検出対象試料については，予めコピー数の算出を行った。【００４１】
［LAMP法］
１．LAMP法では，下記に示すプライマーセットを用いた。なお，プライマーの合成は北海道システムサイエンス社に依頼し，簡易カラム精製したものを使用した。
(1)  プライマーセット１
ASF-IPF-1:5'-CGTTTACACGCTTGTGGATCGTACGCATTCTTTGTGCCG-3' （配列番号8)
ASF-OPF-1:5'-ACTCGCAGTAGTAAACCAA-3' （配列番号2）
ASF-IPB-1:5'-TCCGTTGCGAGGAAACGTTTGATGCTCCGATTCAGGGC-3' （配列番号9）
ASF-OPB-1:5'-TGTCATTCGTCCTGGCA-3' （配列番号７）
ASF-LPF-1:5'-CTTTTGGGAGACCCATTGT-3' （配列番号１０）
ASF-LPB-1:5'-CCCCCATCTGGGATGA-3' （配列番号１１）
(2)  プライマーセット２
ASF-IPF-2:5'-TTGAGTCAAATCGAAGAAACACATACACTTTATTGTATTCAAACCCTA-3' （配列番号18）
ASF-OPF-2:5'-GGAAAAAGTCTCCGTACTG-3' （配列番号１２）
ASF-IPB-2:5'-GCAAGTCTTGGGCCAAGATACTTTTTGTCTTATTGCTAACGATGG-3' （配列番号19）
ASF-OPB-2:5'-ATATGGCATCAGGAGGAG-3' （配列番号１７）
ASF-LPF-2:5'-GCATTTTAATGCACATTTTAAGCCTT-3' （配列番号２０）
ASF-LPB-2:5'-AATCTTGTCGGCCTTCC-3' （配列番号２１）【００４２】
２．LAMP法による増幅のため，最終反応溶液25μＬ中の各試薬濃度が下記になるよう反応試薬を調製した。
・LAMP反応溶液組成
15.0μL Isothermal Master Mix for GenieIII（Optigene社製）
5.0μL 精製水
1.6μM IPF（配列番号８，又は配列番号１８）
1.6μM IPB（配列番号９，又は配列番号１９）
0.2μM OPF（配列番号２，又は配列番号１２）
0.2μM OPB（配列番号７，又は配列番号１７）
0.8μM LPF（配列番号１０，又は配列番号２０）
0.8μM LPB（配列番号１１，又は配列番号２１）
３．上記反応試薬20μＬに，鋳型DNAを含む各濃度の試料溶液5.0μＬを加え，最終反応溶液25.0μＬとして，各LAMP反応を２回ずつ行った。
４．専用チューブ内で65℃60分間，リアルタイム蛍光測定装置GenieIII（Optigene社製）を用いて，リアルタイムに反応を検出した。合わせて，リアルタイム蛍光測定装置GenieIIIに内蔵されているモニター上のグラフで，反応結果をリアルタイムに視認した。
５．所定時間内Amplification rateの蛍光強度比（Fluorescence Ratio）が0.02を超えた検体を陽性と判定した。【００４３】
［PCR法］
１．非特許文献４に開示されている方法を参考に行った。すなわち，PCR法で使用するプライマーとして，非特許文献４に開示されているPPA-1（配列番号２３）とPPA-2（配列番号２４）の組み合わせを用いた。【００４４】
２．PCR法による増幅のため，最終反応溶液25μＬ中の各試薬濃度が下記になるよう反応試薬を調製した。
・PCR反応溶液組成
PCR buffer×10（Qiagen社製）2.5μL
2mM dNTPs（Qiagen社製）2μL
dDW（滅菌超純水） 20.98μL
100pmol/μL OPF（配列番号23) 0.16μL
100pmol/μL OPB（配列番号24) 0.16μL
5U/μL Taq Polymerase（Qiagen社製）0.1μL
３．上記反応試薬20μＬに，鋳型DNAを含む各濃度の試料溶液5.0μＬを加え，最終反応溶液25.0μＬとして，各PCR反応を２回ずつ行った。
(1)  PCR反応の温度サイクル条件は，95℃2分静置後，熱変性95℃15秒，アニーリング62℃30秒，ポリメラーゼ伸長反応72℃30秒，これらの一連の反応を１サイクルとして合計30サイクル行い，最後に72℃にて7分間静置後，反応を終了した。所要時間は約２時間であった。
(2)  反応終了後の反応溶液３μＬを２％アガロースゲルで電気泳動を行い，エチジウムブロマイド染色した。【００４５】
＜実験結果＞
１．図１から図３に，LAMP法を用いた際の実験結果を示す。
(1)  それぞれの図中，横軸は核酸増幅反応を行った時間（分）を，縦軸は蛍光強度比を示す。核酸が増幅されればされるほど，反応溶液中の蛍光強度比が上昇することとなり，結果として，対象となるウイルスの検出が可能となる。
(2)  また，反応チューブ中の人工塩基配列のコピー数が多いほど，核酸増幅反応が容易に進むとともに，蛍光強度比の上昇が速く検出できる。逆にコピー数が少ないほど，核酸増幅反応は進みにくくなるため蛍光強度比の上昇が遅くなり，検出に時間がかかることになる。【００４６】
２．図１はプライマーセット１を用いた際の結果である。
(1)  1378.0コピー（well1ならびにwell2），137.8コピー（well3およびwell4）の反応チューブにおいて蛍光強度が，0.02を超えていた。
(2)  また，13.8コピーの反応チューブにおいては，0.02を超えるもの（well6）と超えないもの（well5）がそれぞれ見られた。
(3)  なお，1.4コピーのサンプルでは，0.02を超えず，蛍光強度の上昇は全く見られなかった（well7ならびにwell8）。
３．図２は，プライマーセット２を用いた際の結果である。図１と同様の結果であった。
４．図３は，プライマーセット１とプライマーセット２を組み合わせて用いた際の結果である。
(1)  1378.0コピー（well1ならびにwell2），137.8コピー（well3およびwell4），13.8コピー（well5ならびにwell6）の反応チューブにおいて蛍光強度が，0.02を超えていた。
(2)  また，1.4コピーのサンプルでは，0.02を超えず，蛍光強度の上昇は全く見られなかった（well7ならびにwell8）。
５．比較として行ったPCR法は，LAMP反応チューブあたり13.8コピーのものまで検出可能であった（不図示）。
６．上記より，各検討における検出感度をまとめた結果を，表１に示す。【００４７】
【表１】
2017212904.tif 000003
【００４８】
７．これらの結果から，下記のことが示された。
(1)  本発明のプライマーセットを単独でLAMP法に用いることにより，PCR法と同程度の検出感度を達成しうることが示された。
(2)  本発明のプライマーセットを組み合わせてLAMP法にて用いることにより，PCR法と同程度の検出感度を達成することが示された。
(3)  本発明のプライマーセットを用いた際の所要時間が，11分から39分であり，そのほとんどは，30分以内に検出可能であった。一方，PCRを用いた際の所要時間は，約2時間の増幅反応に加え，約30分の電気泳動分析を必要とする。これらのことから，本発明のLAMP法は，PCR法よりも，迅速かつ簡易に検出が可能であることが示された。【００４９】
＜＜実験例２，プライマーセットを用いた性能比較＞＞
各プライマーセットについて，アフリカ豚コレラウイルスの検出が可能かどうか，また，その検出時間などを確認することを目的に検討を行った。【００５０】
＜実験方法＞
実験例１に準じて実験を行った。【００５１】
＜実験結果＞
１．結果を表２に示す。
(1)  表中，LAMP1がプライマーセット１，LAMP2がプライマーセット２，LAMP Multiprexがプライマーセット１と２いずれもを用いて，LAMP法により検出を行った結果を示す。
(2)  また，リアルタイムPCRのカットオフ値を35サイクル（Ct），LAMP法のカットオフ値を30分に設定し，この時間以内に陽性判定が行えなかった場合は，表中，「No Ct」で記してある。
(3)  なお，いずれの検討においても，2回検討を行い，２回ともカットオフ値内の増幅があった場合にのみ，陽性と判定している。【００５２】
２．検討を行ったサンプル各種について，いずれもリアルタイムPCRよりも，本発明のプライマーセットを用いたLAMP法の方がより早い検出が可能であった。
３．また，プライマーセットを組み合わせて検出を行った方が，単独で検出を行うよりも早い検出がおおむね可能であった。【００５３】
【表２】
2017212904.tif 000004
【００５４】
＜考察＞
１．本願における実験結果と，先行技術３に開示された実験結果の簡単な比較を，表３に示す。
２．リアルタイムPCRでの陽性平均時間について，本願が25.35サイクル，先行技術が21.42サイクルであり，通常のリアルタイムPCRを考慮すると，本願の方が４サイクルほど高いことから，サンプルにおけるウイルス量は，本願における検討が総じて少ないと考えられた。
３．しかるに，プライマーセットを用いた結果において，陽性平均所要時間は，本願の方が19分から22分ほど先行技術より短かった。
４．これの比較から，本願技術の方が，先行技術と比較すると，迅速に検出が可能であると考えられた。【００５５】
【表３】
2017212904.tif 000005
【００５６】
５．さらに，本発明のプライマーセットと先行技術文献３におけるプライマーセットにおいて，対象配列とのミスマッチを調べた結果を表４から表６に示す。なお，各表における配列のアンダーラインが記されている塩基が，対象のミスマッチ部位である。
６．プライマーセット１においては，ミスマッチ数が合計10あったものの，反応重要領域におけるミスマッチはなかった。
７．プライマーセット２においては，ミスマッチ数が合計11あり，反応重要領域におけるミスマッチが3つあったが，配列としては，LPBの１配列のみに見られただけであった。
８．先行技術においては，ミスマッチ数が合計10あり，反応重要領域におけるミスマッチが4つ見られた。また，この反応重要領域におけるミスマッチは，F2，LF，LBの３つの配列に及んでいた。
９．これらより，本発明のプライマーセットは，先行技術と比較して，反応重要領域におけるミスマッチが無い，もしくは少ないものであり，この点が，前述の迅速な検出時間に関与しているものと考えられた。【００５７】
【表４】
2017212904.tif 000006
【００５８】
【表５】
2017212904.tif 000007
【００５９】
【表６】
2017212904.tif 000008
【図１】
2017212904.tif 000009
【図２】
2017212904.tif 000010
【図３】
2017212904.tif 000011
【配列表】
2017212904000001.app
【国際調査報告】
2017212904.tif 000012
2017212904.tif 000013
2017212904.tif 000014
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