(57)【要約】  本発明は、ｎ種類のＩＩｓ型制限酵素を使用し、第１〜第ｍのＤＮＡ断片が昇順で並ぶように連結して目的ＤＮＡ断片を得る方法であって、（ｉ）ｍ個のＤＮＡ断片を複数の反応系に分ける工程と、（ｉｉ）各反応系中のＤＮＡ断片をＩＩｓ型制限酵素を利用して順特異的に連結する工程と、（ｉｉｉ）得られたＤＮＡ連結断片を１又は複数の反応系に分ける工程と、（ｉｖ）各反応系中のＤＮＡ連結断片をＩＩｓ型制限酵素を利用して順特異的に連結する工程と、（ｖ）目的ＤＮＡ断片が得られるまで（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の工程を繰り返す工程と、を備える、方法を提供する。
2018147071.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１〜第ｍ１のｍ１個のＤＮＡ断片を、第１〜第ｎ１のｎ１種類（ただし、ｎ１及びｍ１は３以上の自然数を表し、かつｎ１＜ｍ１である。）のＩＩｓ型制限酵素を使用して、第１のＤＮＡ断片から第ｍ１のＤＮＡ断片まで昇順で並ぶように連結することにより目的ＤＮＡ断片を得る方法であって、
ｍ１個のＤＮＡ断片はそれぞれ、両末端部に異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を有し、かつ隣接して連結するＤＮＡ断片はそれぞれ、連結する側の末端部に同一のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び当該ＩＩｓ型制限酵素で切断されたときに相補的な粘着末端を形成する塩基配列を有しており、
（ｉ）ｍ１個のＤＮＡ断片を、ｋ１個（ただし、ｋ１は２以上の自然数を表し、かつｋ１≦ｎ１−１である。）の連続したＤＮＡ断片を含む複数の反応系に分ける工程と、
（ｉｉ）各反応系において、ｎ１種類のＩＩｓ型制限酵素で処理し、ＩＩｓ型制限酵素による切断で形成された粘着末端で反応系中のＤＮＡ断片を順特異的に連結する工程と、
（ｉｉｉ）得られたＤＮＡ連結断片を、連続したＤＮＡ断片を含むようにｌ１個（ただし、ｌ１は２以上の自然数を表し、かつｌ１≦ｎ１−１である。）のＤＮＡ連結断片を含む１又は複数の反応系に分ける工程と、
（ｉｖ）１又は複数の各反応系において、ｎ１種類のＩＩｓ型制限酵素で処理し、ＩＩｓ型制限酵素による切断で形成された粘着末端で反応系中のＤＮＡ連結断片を順特異的に連結する工程と、
（ｖ）目的ＤＮＡ断片が得られるまで（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の工程を繰り返す工程と、
を備える、方法。
【請求項２】
第１〜第ｍ２のｍ２個のＤＮＡ断片を、第１〜第ｎ２のｎ２種類（ただし、ｎ２及びｍ２は３以上の自然数を表し、かつｎ２＜ｍ２である。）のＩＩｓ型制限酵素を使用して、第１のＤＮＡ断片から第ｍ２のＤＮＡ断片まで昇順で並ぶように連結することにより目的ＤＮＡ断片を得る方法であって、
以下の工程（１）〜工程（５）：
（１）以下の（ａ）〜（ｅ）を満たすｍ２個の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片を準備する工程、
（ａ）第１のｄｓＤＮＡ断片は、第２のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部とは反対の末端部に、第１のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を有し、かつ第２のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部には、第２のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第２のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第２のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する、
（ｂ）第ｋ２のｄｓＤＮＡ断片（ただし、ｋ２は２以上（ｎ２−１）以下の自然数を表す。）は、第（ｋ２−１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部に、第ｋ２のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第ｋ２のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｋ２−１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有し、かつ第（ｋ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部には、第（ｋ２＋１）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第（ｋ２＋１）のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｋ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する、
（ｃ）第ｎ２のｄｓＤＮＡ断片は、第（ｎ２−１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部に、第ｎ２のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第ｎ２のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｎ２−１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有し、かつ第（ｎ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部には、第１のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第１のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｎ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する、
（ｄ）第ｌ２のｄｓＤＮＡ断片（ただし、ｌ２は（ｎ２＋１）以上（ｍ２−１）以下の自然数を表す。）は、第（ｌ２−１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部に、第（ｌ２−ａ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第（ｌ２−ａ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｌ２−１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有し、かつ第（ｌ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部には、第（ｌ２＋１−ａ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第（ｌ２＋１−ａ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｌ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する（ただし、ａはｌ２／ｎ２の整数部分の数値である。）、
（ｅ）第ｍ２のｄｓＤＮＡ断片は、第（ｍ２−１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部に、第（ｍ２−ｂ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第（ｍ２−ｂ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｍ２−１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有し、かつ第（ｍ２−１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部とは反対側の末端部には、第（ｍ２＋１−ｂ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を有する（ただし、ｂはｍ２／ｎ２の整数部分の数値である。）、
（２）ｍ２個のｄｓＤＮＡ断片を、第１のｄｓＤＮＡ断片から昇順で、（ｎ２−１）個づつ、それぞれ異なるｃ個の反応容器（ただし、ｃはｍ／（ｎ−１）の整数部分の数値である。）に入れ、更に必要に応じて残余のｄｓＤＮＡ断片をｃ個の反応容器とは異なる１個の反応容器に入れる工程、
（３）ｄｓＤＮＡ断片を含む反応容器それぞれに第１〜第ｎ２のｎ２種類のＩＩｓ型制限酵素を全て入れ、全ＩＩｓ型制限酵素で処理した後、切断により形成された粘着末端で反応容器中のｄｓＤＮＡ断片を順特異的に連結する工程、
（４）得られたｄｓＤＮＡ連結断片を、連続したｄｓＤＮＡ断片を含むように（ｎ２−１）個づつ、それぞれ異なる反応容器に入れ、更に必要に応じて残余のｄｓＤＮＡ連結断片を異なる１個の反応容器に入れ、工程（３）と同様の操作でｄｓＤＮＡ連結断片を更に連結する工程、
（５）全てのｄｓＤＮＡ断片が連結されるまで工程（４）を繰り返す工程、
を備える、方法。
【請求項３】
ＩＩｓ型制限酵素がＡａｒＩ、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＰＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｓｔＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏｐ１５Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＭｂｏＩＩ、ＭｍｅＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＳａｐＩ及びＳｆａＮＩからなる群より選ばれる少なくとも１種のＩＩｓ型制限酵素である、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的ＤＮＡ断片を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＩｓ型制限酵素は、当該制限酵素により認識される塩基配列（認識部位）と、切断される部位（切断部位）が異なる制限酵素である。【０００３】
これまでに、ＩＩｓ型制限酵素の認識部位をクローニングベクターに導入し、ＩＩｓ型制限酵素を使用して部位特異的にＤＮＡ断片をサブクローニングする方法（特許文献１）、及び認識部位と切断部位との位置関係を適切に設計することにより、ＩＩｓ型制限酵素による切断で形成される粘着末端（スティッキー・エンド）の塩基配列を制御し、１反応容器中で１種類のＩＩｓ型制限酵素を利用して、９個の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片を目的とする順に順特異的に連結する方法（非特許文献１）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０２９１６３３号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９年，４（５），ｅ５５５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１に記載の方法では、１種類のＩＩｓ型制限酵素を利用して１反応容器中で目的ＤＮＡ断片を得ることができる。しかしながら、１反応容器中で連結できるｄｓＤＮＡ断片の数には限りがあり、また、煩雑な操作を要することなく準備できるｄｓＤＮＡ断片の長さが１００〜１０００塩基対（ｂｐ）程度であることから、非特許文献１に記載の方法は、高分子の目的ＤＮＡ断片を得ることには向いていない。【０００７】
本発明は、上述した問題に鑑み、目的ＤＮＡ断片が高分子の場合であっても、ＩＩｓ型制限酵素を利用して、複数のＤＮＡ断片を順特異的に連結して目的ＤＮＡ断片を得る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
第１〜第ｍ１のｍ１個のＤＮＡ断片を、第１〜第ｎ１のｎ１種類（ただし、ｎ１及びｍ１は３以上の自然数を表し、かつｎ１＜ｍ１である。）のＩＩｓ型制限酵素を使用して、第１のＤＮＡ断片から第ｍ１のＤＮＡ断片まで昇順で並ぶように連結することにより目的ＤＮＡ断片を得る方法であって、
ｍ１個のＤＮＡ断片はそれぞれ、両末端部に異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を有し、かつ隣接して連結するＤＮＡ断片はそれぞれ、連結する側の末端部に同一のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び当該ＩＩｓ型制限酵素で切断されたときに相補的な粘着末端を形成する塩基配列を有しており、
（ｉ）ｍ１個のＤＮＡ断片を、ｋ１個（ただし、ｋ１は２以上の自然数を表し、かつｋ１≦ｎ１−１である。）の連続したＤＮＡ断片を含む複数の反応系に分ける工程と、
（ｉｉ）各反応系において、ｎ１種類のＩＩｓ型制限酵素で処理し、ＩＩｓ型制限酵素による切断で形成された粘着末端で反応系中のＤＮＡ断片を順特異的に連結する工程と、
（ｉｉｉ）得られたＤＮＡ連結断片を、連続したＤＮＡ断片を含むようにｌ１個（ただし、ｌ１は２以上の自然数を表し、かつｌ１≦ｎ１−１である。）のＤＮＡ連結断片を含む１又は複数の反応系に分ける工程と、
（ｉｖ）１又は複数の各反応系において、ｎ１種類のＩＩｓ型制限酵素で処理し、ＩＩｓ型制限酵素による切断で形成された粘着末端で反応系中のＤＮＡ連結断片を順特異的に連結する工程と、
（ｖ）目的ＤＮＡ断片が得られるまで（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の工程を繰り返す工程と、
を備える、方法。
［２］
第１〜第ｍ２のｍ２個のＤＮＡ断片を、第１〜第ｎ２のｎ２種類（ただし、ｎ２及びｍ２は３以上の自然数を表し、かつｎ２＜ｍ２である。）のＩＩｓ型制限酵素を使用して、第１のＤＮＡ断片から第ｍ２のＤＮＡ断片まで昇順で並ぶように連結することにより目的ＤＮＡ断片を得る方法であって、
以下の工程（１）〜工程（５）：
（１）以下の（ａ）〜（ｅ）を満たすｍ２個の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片を準備する工程、
（ａ）第１のｄｓＤＮＡ断片は、第２のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部とは反対の末端部に、第１のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を有し、かつ第２のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部には、第２のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第２のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第２のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する、
（ｂ）第ｋ２のｄｓＤＮＡ断片（ただし、ｋ２は２以上（ｎ２−１）以下の自然数を表す。）は、第（ｋ２−１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部に、第ｋ２のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第ｋ２のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｋ２−１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有し、かつ第（ｋ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部には、第（ｋ２＋１）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第（ｋ２＋１）のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｋ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する、
（ｃ）第ｎ２のｄｓＤＮＡ断片は、第（ｎ２−１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部に、第ｎ２のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第ｎ２のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｎ２−１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有し、かつ第（ｎ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部には、第１のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第１のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｎ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する、
（ｄ）第ｌ２のｄｓＤＮＡ断片（ただし、ｌ２は（ｎ２＋１）以上（ｍ２−１）以下の自然数を表す。）は、第（ｌ２−１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部に、第（ｌ２−ａ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第（ｌ２−ａ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｌ２−１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有し、かつ第（ｌ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部には、第（ｌ２＋１−ａ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第（ｌ２＋１−ａ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｌ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する（ただし、ａはｌ２／ｎ２の整数部分の数値である。）、
（ｅ）第ｍ２のｄｓＤＮＡ断片は、第（ｍ２−１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部に、第（ｍ２−ｂ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第（ｍ２−ｂ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｍ２−１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有し、かつ第（ｍ２−１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部とは反対側の末端部には、第（ｍ２＋１−ｂ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を有する（ただし、ｂはｍ２／ｎ２の整数部分の数値である。）、
（２）ｍ２個のｄｓＤＮＡ断片を、第１のｄｓＤＮＡ断片から昇順で、（ｎ２−１）個づつ、それぞれ異なるｃ個の反応容器（ただし、ｃはｍ／（ｎ−１）の整数部分の数値である。）に入れ、更に必要に応じて残余のｄｓＤＮＡ断片をｃ個の反応容器とは異なる１個の反応容器に入れる工程、
（３）ｄｓＤＮＡ断片を含む反応容器それぞれに第１〜第ｎ２のｎ２種類のＩＩｓ型制限酵素を全て入れ、全ＩＩｓ型制限酵素で処理した後、切断により形成された粘着末端で反応容器中のｄｓＤＮＡ断片を順特異的に連結する工程、
（４）得られたｄｓＤＮＡ連結断片を、連続したｄｓＤＮＡ断片を含むように（ｎ２−１）個づつ、それぞれ異なる反応容器に入れ、更に必要に応じて残余のｄｓＤＮＡ連結断片を異なる１個の反応容器に入れ、工程（３）と同様の操作でｄｓＤＮＡ連結断片を更に連結する工程、
（５）全てのｄｓＤＮＡ断片が連結されるまで工程（４）を繰り返す工程、
を備える、方法。
［３］
ＩＩｓ型制限酵素がＡａｒＩ、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＰＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｓｔＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏｐ１５Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＭｂｏＩＩ、ＭｍｅＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＳａｐＩ及びＳｆａＮＩからなる群より選ばれる少なくとも１種のＩＩｓ型制限酵素である、［１］又は［２］に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、目的ＤＮＡ断片が高分子の場合であっても、ＩＩｓ型制限酵素を利用して、複数のＤＮＡ断片を順特異的に連結して目的ＤＮＡ断片を得ることができる。また、上記［２］に係る本発明の方法は、ｄｓＤＮＡ断片又はｄｓＤＮＡ連結断片を規則的かつ機械的に連結反応に供するものであることから、自動化が容易であるという利点もある。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施形態に係る方法により、目的ＤＮＡ断片を得る原理を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
一実施形態に係る目的ＤＮＡ断片を得る方法は、第１〜第ｍ１のｍ１個のＤＮＡ断片を、第１〜第ｎ１のｎ１種類（ただし、ｎ１及びｍ１は３以上の自然数を表し、かつｎ１＜ｍ１である。）のＩＩｓ型制限酵素を使用して、第１のＤＮＡ断片から第ｍ１のＤＮＡ断片まで昇順で並ぶように連結することにより目的ＤＮＡ断片を得る方法に関し、（ｉ）ｍ１個のＤＮＡ断片を、ｋ１個（ただし、ｋ１は２以上の自然数を表し、かつｋ１≦ｎ１−１である。）の連続したＤＮＡ断片を含む複数の反応系に分ける工程と、（ｉｉ）各反応系において、ｎ１種類のＩＩｓ型制限酵素で処理し、ＩＩｓ型制限酵素による切断で形成された粘着末端で反応系中のＤＮＡ断片を順特異的に連結する工程と、（ｉｉｉ）得られたＤＮＡ連結断片を、連続したＤＮＡ断片を含むようにｌ１個（ただし、ｌ１は２以上の自然数を表し、かつｌ１≦ｎ１−１である。）のＤＮＡ連結断片を含む１又は複数の反応系に分ける工程と、（ｉｖ）１又は複数の各反応系において、ｎ１種類のＩＩｓ型制限酵素で処理し、ＩＩｓ型制限酵素による切断で形成された粘着末端で反応系中のＤＮＡ連結断片を順特異的に連結する工程と、（ｖ）目的ＤＮＡ断片が得られるまで（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の工程を繰り返す工程と、を備える。ここで、ｍ１個のＤＮＡ断片はそれぞれ、両末端部に異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を有し、かつ隣接して連結するＤＮＡ断片はそれぞれ、連結する側の末端部に同一のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び当該ＩＩｓ型制限酵素で切断されたときに相補的な粘着末端を形成する塩基配列を有している。
【００１３】
他の実施形態に係る目的ＤＮＡ断片を得る方法は、第１〜第ｍ２のｍ２個のＤＮＡ断片を、第１〜第ｎ２のｎ２種類（ただし、ｎ２及びｍ２は３以上の自然数を表し、かつｎ２＜ｍ２である。）のＩＩｓ型制限酵素を使用して、第１のＤＮＡ断片から第ｍ２のＤＮＡ断片まで昇順で並ぶように連結することにより目的ＤＮＡ断片を得る方法に関し、以下の工程（１）〜工程（５）を備える。
（１）以下の（ａ）〜（ｅ）を満たすｍ２個の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片を準備する工程。
（ａ）第１のｄｓＤＮＡ断片は、第２のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部とは反対の末端部に、第１のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を有し、かつ第２のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部には、第２のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第２のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第２のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する。
（ｂ）第ｋ２のｄｓＤＮＡ断片（ただし、ｋ２は２以上（ｎ２−１）以下の自然数を表す。）は、第（ｋ２−１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部に、第ｋ２のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第ｋ２のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｋ２−１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有し、かつ第（ｋ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部には、第（ｋ２＋１）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第（ｋ２＋１）のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｋ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する。
（ｃ）第ｎ２のｄｓＤＮＡ断片は、第（ｎ２−１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部に、第ｎ２のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第ｎ２のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｎ２−１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有し、かつ第（ｎ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部には、第１のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第１のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｎ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する。
（ｄ）第ｌ２のｄｓＤＮＡ断片（ただし、ｌ２は（ｎ２＋１）以上（ｍ２−１）以下の自然数を表す。）は、第（ｌ２−１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部に、第（ｌ２−ａ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第（ｌ２−ａ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｌ２−１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有し、かつ第（ｌ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部には、第（ｌ２＋１−ａ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第（ｌ２＋１−ａ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｌ２＋１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する（ただし、ａはｌ２／ｎ２の整数部分の数値である。）。
（ｅ）第ｍ２のｄｓＤＮＡ断片は、第（ｍ２−１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部に、第（ｍ２−ｂ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び第（ｍ２−ｂ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｍ２−１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有し、かつ第（ｍ２−１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部とは反対側の末端部には、第（ｍ２＋１−ｂ×ｎ２）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を有する（ただし、ｂはｍ２／ｎ２の整数部分の数値である。）。
（２）ｍ２個のｄｓＤＮＡ断片を、第１のｄｓＤＮＡ断片から昇順で、（ｎ２−１）個づつ、それぞれ異なるｃ個の反応容器（ただし、ｃはｍ／（ｎ−１）の整数部分の数値である。）に入れ、更に必要に応じて残余のｄｓＤＮＡ断片をｃ個の反応容器とは異なる１個の反応容器に入れる工程。
（３）ｄｓＤＮＡ断片を含む反応容器それぞれに第１〜第ｎ２のｎ２種類のＩＩｓ型制限酵素を全て入れ、全ＩＩｓ型制限酵素で処理した後、切断により形成された粘着末端で反応容器中のｄｓＤＮＡ断片を順特異的に連結する工程。
（４）得られたｄｓＤＮＡ連結断片を、連続したｄｓＤＮＡ断片を含むように（ｎ２−１）個づつ、それぞれ異なる反応容器に入れ、更に必要に応じて残余のｄｓＤＮＡ連結断片を異なる１個の反応容器に入れ、工程（３）と同様の操作でｄｓＤＮＡ連結断片を更に連結する工程。
（５）全てのｄｓＤＮＡ断片が連結されるまで工程（４）を繰り返す工程。
【００１４】
図１は、本発明の一実施形態に係る方法により、目的ＤＮＡ断片を得る原理を説明する図である。図１に示す方法は、１０個のｄｓＤＮＡ断片（ＤＮＡ  ｆｇ１〜ｆｇ１０）を、３種類のＩＩｓ型制限酵素（第１〜第３のＲＥ）を使用して、第１のｄｓＤＮＡ断片（ＤＮＡ  ｆｇ１）から第１０のｄｓＤＮＡ断片（ＤＮＡ  ｆｇ１０）まで昇順で並ぶように連結することにより目的ＤＮＡ断片を得る方法である（ｍ＝１０，ｎ＝３）。
【００１５】
図１中、「第１のＲＥ」〜「第３のＲＥ」で示される領域は、それぞれ第１〜第３のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を含む領域である。また、各ｄｓＤＮＡ断片は、第１〜第３のＩＩｓ型制限酵素により切断されたときに、それぞれ第１〜３のＲＥで示される領域が、目的ＤＮＡ断片の塩基配列の一部からなる領域（図１中、白抜きの領域）から切り離され、かつ隣接して連結するｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的な塩基配列を有する粘着末端が形成されるように設計されている。
【００１６】
図１（Ａ）は、１０個のｄｓＤＮＡ断片（ＤＮＡ  ｆｇ１〜ｆｇ１０）が示されている。図１（Ａ）に示すとおり、１０個のｄｓＤＮＡ断片はそれぞれ、両末端部に異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を有し、かつ隣接して連結するＤＮＡ断片はそれぞれ、連結する側の末端部に同一のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列、及び当該ＩＩｓ型制限酵素で切断されたときに相補的な粘着末端を形成する塩基配列を有している。
【００１７】
具体的には、（ａ）第１のｄｓＤＮＡ断片（ＤＮＡ  ｆｇ１）は、第２のｄｓＤＮＡ断片（ＤＮＡ  ｆｇ２）と連結する側の末端部とは反対の末端部に、第１のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を含む領域（第１のＲＥ）を有し、かつ第２のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部には、第２のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を含む領域（第２のＲＥ）を有しており、更に目的ＤＮＡ断片の塩基配列の一部からなる領域（白抜きの領域）中に、第２のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第２のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する。
【００１８】
（ｂ）第２のｄｓＤＮＡ断片は、第１のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部に、第２のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を含む領域（第２のＲＥ）を有し、更に目的ＤＮＡ断片の塩基配列の一部からなる領域（白抜きの領域）中に、第２のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第１のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する。第２のｄｓＤＮＡ断片はまた、第３のｄｓＤＮＡ断片（ＤＮＡ  ｆｇ３）と連結する側の末端部には、第３のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を含む領域（第３のＲＥ）を有しており、更に目的ＤＮＡ断片の塩基配列の一部からなる領域（白抜きの領域）中に、第３のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第３のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する。
【００１９】
（ｃ）第３のｄｓＤＮＡ断片は、第２のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部に、第３のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を含む領域（第３のＲＥ）を有しており、更に目的ＤＮＡ断片の塩基配列の一部からなる領域（白抜きの領域）中に、第３のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第２のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する。第３のｄｓＤＮＡ断片はまた、第４のｄｓＤＮＡ断片（ＤＮＡ  ｆｇ４）と連結する側の末端部には、第１のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を含む領域（第１のＲＥ）を有し、更に目的ＤＮＡ断片の塩基配列の一部からなる領域（白抜きの領域）中に、第１のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第４のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する。
【００２０】
（ｄ）第ｌのｄｓＤＮＡ断片（ＤＮＡ  ｆｇｌ：ただし、ｌは４以上９以下の自然数を表す。）は、第（ｌ−１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部に、第（ｌ−ａ×３）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を含む領域（第（ｌ−ａ×３）のＲＥ）を有しており、更に目的ＤＮＡ断片の塩基配列の一部からなる領域（白抜きの領域）中に、第（ｌ−ａ×３）のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｌ−１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する。第ｌのｄｓＤＮＡ断片はまた、第（ｌ＋１）のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部には、第（ｌ＋１−ａ×３）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を含む領域（第（ｌ＋１−ａ×３）のＲＥ）を有しており、更に目的ＤＮＡ断片の塩基配列の一部からなる領域（白抜きの領域）中に、第（ｌ＋１−ａ×３）のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第（ｌ＋１）のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する。ただし、ａはｌ／３の整数部分の数値であり、例えば、ｌ＝５の場合は１であり、ｌ＝７の場合は２である。
【００２１】
（ｅ）第１０のｄｓＤＮＡ断片（ＤＮＡ  ｆｇ１０）は、第９のｄｓＤＮＡ断片（ＤＮＡ  ｆｇ９）と連結する側の末端部に、第（１０−ｂ×３）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を含む領域（第１のＲＥ）を有しており、更に目的ＤＮＡ断片の塩基配列の一部からなる領域（白抜きの領域）中に、第１のＩＩｓ型制限酵素で切断されて形成される粘着末端が、第９のｄｓＤＮＡ断片の粘着末端と相補的になる塩基配列を有する。第１０のｄｓＤＮＡ断片はまた、第９のｄｓＤＮＡ断片と連結する側の末端部とは反対側の末端部に、第（１０＋１−ｂ×３）のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を含む領域（第２のＲＥ）を有する。ただし、ｂはｍ／ｎの整数部分の数値であり、図１の例では３である。
【００２２】
上述したｄｓＤＮＡ断片は、両端が平滑末端であるｄｓＤＮＡであってもよく、一端又は両端に一本鎖オーバーハング領域を有するｄｓＤＮＡであってもよい。ｄｓＤＮＡ断片は、従来公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、設計されたｄｓＤＮＡ断片の塩基配列を有するオリゴＤＮＡ、及びその相補配列を有するオリゴＤＮＡを常法に従って合成し、これらをハイブリダイズさせてｄｓオリゴＤＮＡを調製することにより、ｄｓＤＮＡ断片を得ることができる。
【００２３】
図１に示す例では、まず（Ａ）において、１０個のｄｓＤＮＡ断片を、第１のｄｓＤＮＡ断片から昇順で２個づつそれぞれ異なる５つの反応系（例えば、異なる反応容器）に分ける。すなわち、反応系１は、ＤＮＡ  ｆｇ１及びＤＮＡ  ｆｇ２を含み、反応系２は、ＤＮＡ  ｆｇ３及びＤＮＡ  ｆｇ４を含み、反応系３は、ＤＮＡ  ｆｇ５及びＤＮＡ  ｆｇ６を含み、反応系４は、ＤＮＡ  ｆｇ７及びＤＮＡ  ｆｇ８を含み、反応系５は、ＤＮＡ  ｆｇ９及びＤＮＡ  ｆｇ１０を含む。もし残余のｄｓＤＮＡ断片があれば（例えば、ＤＮＡ  ｆｇ１１があれば）、残余のｄｓＤＮＡ断片を反応系６とすればよい。
【００２４】
各反応系には、それぞれ第１〜第３の３種類のＩＩｓ型制限酵素を全て添加する。このようにすることで、１種類のＩＩｓ型制限酵素溶液（全てのＩＩｓ型制限酵素を含む溶液）を用意して各反応系に分注すればよいため、工程が簡便化され、自動化が容易になる。
【００２５】
ＩＩｓ型制限酵素としては、例えば、表１に記載したＩＩｓ型制限酵素を挙げることができる。
【表１】
2018147071.tif 000003
【００２６】
次いで、ＩＩｓ型制限酵素により各ｄｓＤＮＡ断片が切断される。これにより、隣接して連結するｄｓＤＮＡ断片はそれぞれ、連結する側の末端部に相補的な粘着末端が形成される。すると、隣接して連結するｄｓＤＮＡ断片は、粘着末端を介して特異的にハイブリダイズすることになる。反応系に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、デキストラン等の密集剤を添加することにより、ハイブリダイズを促進することができる。
【００２７】
ハイブリダイズした後、反応系にＤＮＡリガーゼを添加しておくことで、ニック（すなわち、ホスホジエステル結合が欠如している部分）が繋ぎ合わされ、ｄｓＤＮＡ連結断片が得られることになる。
【００２８】
ＤＮＡリガーゼとしては、例えば、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｔｆｉ  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，  Ｉｎｃ社製）等を挙げることができる。
【００２９】
上述した反応を経ることにより、例えば、図１（Ｂ）に示すとおり、反応系１では、第２のＲＥで示される領域部分でＤＮＡ  ｆｇ１とＤＮＡ  ｆｇ２が連結したｄｓＤＮＡ連結断片が得られる。当該ｄｓＤＮＡ連結断片は、第２のＲＥで示される領域は、除去されており、また両末端部に第１のＲＥで示される領域、及び第３のＲＥで示される領域を含んでいる。反応系２〜５についても同様である。
【００３０】
次いで、得られたｄｓＤＮＡ連結断片を、連続したｄｓＤＮＡ断片を含むように２個づつ、それぞれ異なる反応容器に入れる。図１に示す例では、反応系１で得られたｄｓＤＮＡ連結断片と、反応系２で得られたｄｓＤＮＡ連結断片（計２個）を第１の反応容器に入れ、反応系３で得られたｄｓＤＮＡ連結断片と、反応系４で得られたｄｓＤＮＡ連結断片（計２個）を第２の反応容器に入れている。例えば、反応系１で得られたｄｓＤＮＡ連結断片は、第１のｄｓＤＮＡ断片及び第２のｄｓＤＮＡ断片を含んでおり、反応系２で得られたｄｓＤＮＡ連結断片は、第３のｄｓＤＮＡ断片及び第４のｄｓＤＮＡ断片を含んでいるため、これら（２個）を入れた第１の反応容器（反応系）には、第１〜第４の連続したｄｓＤＮＡ断片が含まれている。
【００３１】
図１に示す例では、反応系５で得られたｄｓＤＮＡ連結断片が残余のものとなっている。この場合、反応系５で得られたｄｓＤＮＡ連結断片（１個）を第３の反応容器に入れることになる。
【００３２】
第１〜第３の反応容器には、それぞれ第１〜第３の３種類のＩＩｓ型制限酵素を全て添加する。これにより、ＩＩｓ型制限酵素により各ｄｓＤＮＡ連結断片が切断され、隣接して連結するｄｓＤＮＡ連結断片はそれぞれ、連結する側の末端部に相補的な粘着末端が形成される。すると、隣接して連結するｄｓＤＮＡ連結断片は、粘着末端を介して特異的にハイブリダイズし、ＤＮＡリガーゼにより、ニックが繋ぎ合わされ、より大きなｄｓＤＮＡ連結断片が得られることになる。当該反応の詳細は上述したとおりである。
【００３３】
そして、図１（Ｃ）〜（Ｅ）に示すとおり、上述した反応を繰り返すことで、全てのｄｓＤＮＡ断片が連結されて目的ＤＮＡ断片が得られることになる。
【００３４】
また、図１に示した例では、得られた目的ＤＮＡ断片の両末端部に第１のＲＥで示される領域、及び第２のＲＥで示される領域が含まれている。これらの領域は、例えば、クローニングベクターに目的ＤＮＡ断片をクローニングする等の操作に利用することができる。
【図１】
2018147071.tif 000004
【国際調査報告】
2018147071.tif 000005
2018147071.tif 000006
2018147071.tif 000007
2018147071.tif 000008