(57)【要約】  本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、ＤＰＰ４、ＩＬ−１７Ａ、ＩｇＥ、Ｓ１００Ａ９、ＰＣＳＫ９等の疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープとの複合体を含み、キャリアタンパク質の抗原性が低く、かつワクチンとして有効な抗体産生能を有するワクチンを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープとの複合体を含むワクチン。
【請求項２】
生体内タンパク質が、ＤＰＰ４、ＩＬ−１７Ａ、ＩｇＥ、Ｓ１００Ａ９およびＰＣＳＫ９からなる群より選択される１種である請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
ＩＬ−１７Ａのエピトープが、配列番号１０、１１、２９〜３６のいずれかに示されるアミノ酸配列、または配列番号１０、１１、２９〜３６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
ＤＰＰ４のエピトープが、配列番号２〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列、または配列番号２〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである請求項２に記載のワクチン。
【請求項５】
ＩｇＥのエピトープが、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、または配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである請求項２に記載のワクチン。
【請求項６】
Ｓ１００Ａ９のエピトープが、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、または配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである請求項２に記載のワクチン。
【請求項７】
ＰＣＳＫ９のエピトープが、配列番号１４〜１６のいずれかに示されるアミノ酸配列、または配列番号１４〜１６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである請求項２に記載のワクチン。
【請求項８】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドと生体内タンパク質のエピトープが、ε−アミノカプロン酸を介して連結されている請求項１〜７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項９】
前記複合体のＮ末端のアミノ酸がアセチル化されている請求項１〜８のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１０】
前記複合体のＣ末端のアミノ酸がアミド化されている請求項１〜９のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープとの複合体を含む免疫原性組成物。
【請求項１２】
生体内タンパク質が、ＤＰＰ４、ＩＬ−１７Ａ、ＩｇＥ、Ｓ１００Ａ９およびＰＣＳＫ９からなる群より選択される１種である請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープとの複合体の有効量を、動物に投与することを含む、前記生体内タンパク質が要因となる疾患の予防または治療方法。
【請求項１４】
生体内タンパク質が要因となる疾患の予防または治療に用いるための、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、前記生体内タンパク質のエピトープとの複合体。
【請求項１５】
生体内タンパク質が要因となる疾患の予防または治療用医薬を製造するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、前記生体内タンパク質のエピトープとの複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患の要因となる生体内タンパク質を標的とするコンジュゲートワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
天然痘などの感染症の予防に古くから使われてきたワクチンの技術を癌や生活習慣病などの治療に用いる試みがされている。このような治療用ワクチンでは、標的タンパクに対する抗体誘導等の免疫誘導を引き起こす部位（エピトープ部位）をキャリアタンパク質に結合して用いる場合がある。そのようなキャリアタンパクとしてはＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin：スカシガイヘモシアニン）、ＯＶＡ（Ovalbumin：オボアルブミン）、ＢＳＡ（Bovine serum albumin：ウシ血清アルブミン）等が知られている。例えば、ＩＮＦ−αの改変体を抗原部位として用いＫＬＨに結合したものを投与し全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療することが試みられている（非特許文献１）。【０００３】
しかしながら、ＫＬＨ、ＯＶＡ、ＢＳＡ等は、それ自体が抗原性を有しており、抗原性が高くないエピトープをコンジュゲートして免疫する場合に、キャリアタンパク自体の抗原性が問題となる場合があった（非特許文献２）。【０００４】
本発明者らは、ＤＰＰ４のエピトープペプチドとＫＬＨとのコンジュゲートを、糖尿病の予防または治療に用いることを開示している（特許文献１）。また、本発明者らは、ＩＬ−１７ＡのエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドとＢ型肝炎のウイルスコア抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡワクチンを、ＩＬ−１７Ａが増悪因子として関与する疾患（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ等）の予防または治療に用いることを開示している（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１５／０３３８３１
【特許文献２】ＷＯ２０１５／０９９１６７
【０００６】
【非特許文献１】ARTHRITIS & RHEUMATISM Vol. 65, No. 2, February 2013, pp 447-456.
【非特許文献２】N.E. van Houten, M.B. Zwick1, A. Menendez, and J.K. Scott Vaccine. 2006 May 8; 24(19): 4188-4200.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープにキャリアタンパク質を連結した複合体を含有するワクチンであって、キャリアタンパク質の抗原性が低く、かつワクチンとして有効な抗体産生能を有するワクチンを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープとの複合体を含むワクチン。
［２］生体内タンパク質が、ＤＰＰ４、ＩＬ−１７Ａ、ＩｇＥ、Ｓ１００Ａ９およびＰＣＳＫ９からなる群より選択される１種である前記［１］に記載のワクチン。
［３］ＩＬ−１７Ａのエピトープが、配列番号１０、１１、２９〜３６のいずれかに示されるアミノ酸配列、または配列番号１０、１１、２９〜３６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである前記［２］に記載のワクチン。
［４］ＤＰＰ４のエピトープが、配列番号２〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列、または配列番号２〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである前記［２］に記載のワクチン。
［５］ＩｇＥのエピトープが、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、または配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである前記［２］に記載のワクチン。
［６］Ｓ１００Ａ９のエピトープが、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、または配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである前記［２］に記載のワクチン。
［７］ＰＣＳＫ９のエピトープが、配列番号１４〜１６のいずれかに示されるアミノ酸配列、または配列番号１４〜１６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである前記［２］に記載のワクチン。
［８］配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドと生体内タンパク質のエピトープが、ε−アミノカプロン酸を介して連結されている前記［１］〜［７］のいずれかに記載のワクチン。
［９］前記複合体のＮ末端のアミノ酸がアセチル化されている前記［１］〜［８］のいずれかに記載のワクチン。
［１０］前記複合体のＣ末端のアミノ酸がアミド化されている前記［１］〜［９］のいずれかに記載のワクチン。
［１１］配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープとの複合体を含む免疫原性組成物。
［１２］生体内タンパク質が、ＤＰＰ４、ＩＬ−１７Ａ、ＩｇＥ、Ｓ１００Ａ９およびＰＣＳＫ９からなる群より選択される１種である前記［１１］に記載の免疫原性組成物。
［１３］配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープとの複合体の有効量を、動物に投与することを含む、前記生体内タンパク質が要因となる疾患の予防または治療方法。
［１４］生体内タンパク質が要因となる疾患の予防または治療に用いるための、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、前記生体内タンパク質のエピトープとの複合体。
［１５］生体内タンパク質が要因となる疾患の予防または治療用医薬を製造するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、前記生体内タンパク質のエピトープとの複合体の使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、キャリアタンパク質の抗原性が低く、かつワクチンとして有効な抗体産生能を有する、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープにキャリアタンパク質を連結した複合体を含有するワクチンを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＯＳＫ−１ペプチド（配列番号１）とマウスＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号１７）を、ε−Ａｃｐをリンカーとして連結したＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートによる抗体産生作用を評価した結果を示す図である。
【図２】ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートの抗体産生作用と、ＫＬＨとマウスＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号１７）とのコンジュゲート（ＫＬＨ−ＤＰＰ４）の抗体産生作用を比較した結果を示す図である。
【図３】ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートにより産生されたＩｇＧのサブクラスを解析し、ＫＬＨ−ＤＰＰ４コンジュゲートとＡｌｕｍ併用群およびＫＬＨ−ＤＰＰ４コンジュゲートとＯＳＫ−１併用群と比較した結果を示す図である。
【図４】ＯＳＫ−１ペプチド（配列番号１）とＷＴ１プペプチド（配列番号２８）を、ε−ＡｃｐをリンカーとしてコンジュゲートしたＯＳＫ−１−ＷＴ１コンジュゲートを予め投与したマウスにがん細胞を皮下移植し、腫瘍増殖抑制効果を評価した結果を示す図である。
【図５】ＯＳＫ−１−ＷＴ１コンジュゲートを予め投与したマウスにがん細胞を皮下移植し、延命効果を評価した結果を示す図である。
【図６】マウスにがん細胞を皮下移植し、移植と同日からＯＳＫ−１−ＷＴ１コンジュゲートの投与を開始した場合の腫瘍増殖抑制効果を評価した結果を示す図である。
【図７】マウスにがん細胞を皮下移植し、移植と同日からＯＳＫ−１−ＷＴ１コンジュゲートの投与を開始した場合の延命効果を評価した結果を示す図である。
【図８】ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートンによる標的タンパクに対するＩｇＥ産生を、ＫＬＨ−ＤＰＰ４コンジュゲートによる標的タンパクに対するＩｇＥ産生と比較した結果を示す図である。
【図９】ＯＳＫ−１ペプチドとマウスＩＬ−１７Ａのエピトープペプチド（配列番号２１）を、ε−ＡｃｐをリンカーとしてコンジュゲートしたＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートの（Ａ）アミノ酸分析結果および（Ｂ）ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図１０】ＯＳＫ−１ペプチドとマウスＩＬ−１７Ａのエピトープペプチド（配列番号３１）を、ε−ＡｃｐをリンカーとしてコンジュゲートしたＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートの（Ａ）アミノ酸分析結果および（Ｂ）ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図１１】ＯＳＫ−１ペプチドとマウスＩＬ−１７Ａのエピトープペプチド（配列番号３２）を、ε−ＡｃｐをリンカーとしてコンジュゲートしたＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートの（Ａ）アミノ酸分析結果および（Ｂ）ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図１２】ＯＳＫ−１ペプチドとマウスＩＬ−１７Ａのエピトープペプチド（配列番号４０）を、ε−ＡｃｐをリンカーとしてコンジュゲートしたＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートの（Ａ）アミノ酸分析結果および（Ｂ）ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図１３】ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートによる抗体産生作用を評価した結果を示す図である。
【図１４】イミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスの皮膚状態により、ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートの薬効を評価した結果を示す図である。
【図１５】イミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスの耳の厚さにより、ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートの薬効を評価した結果を示す図である。
【図１６】ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７ＡコンジュゲートまたはＫＬＨ−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートを投与したイミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスの乾癬誘導開始から６日目の皮膚状態を示す図である。
【図１７】イミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスの皮膚状態により、ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７ＡコンジュゲートとＫＬＨ−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートの薬効を比較した結果を示す図である。
【図１８】イミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスの耳の厚さにより、ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７ＡコンジュゲートとＫＬＨ−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートの薬効を比較した結果を示す図である。
【図１９】ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７ＡコンジュゲートまたはＫＬＨ−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートを投与したイミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスの乾癬誘導開始から１２日目の皮膚をインボルクリン染色した結果を示す図である。
【図２０】ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７ＡコンジュゲートまたはＫＬＨ−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートを投与したイミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスの乾癬誘導開始から１２日目の皮膚をＦ４／８０染色した結果を示す図である。
【図２１】ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７ＡコンジュゲートまたはＫＬＨ−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートを投与したイミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスの乾癬誘導開始から１２日目の皮膚をＧｒ−１染色した結果を示す図である。
【図２２】ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７ＡコンジュゲートまたはＫＬＨ−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートを投与したイミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスにおける血中ＩＬ−１７濃度を測定した結果を示す図である。
【図２３】血中ＰＣＳＫ９濃度により、ＯＳＫ−１−ＰＣＳＫ９コンジュゲートの薬効を評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、疾患の要因となる生体内タンパク質を標的とするコンジュゲートワクチンを提供する。本発明のワクチンは、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＥＬＫＬＩＦＬＨＲＬＫＲＬＲＫＲＬＫＲＫ）と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープとの複合体を含むワクチンであればよい。本明細書において、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをＯＳＫ−１ペプチドまたはＯＳＫ−１と記載する場合がある。なお、本明細書において、「コンジュゲート」と「複合体」は同義に使用される。
【００１２】
本明細書において「ワクチン」は、動物に投与することにより免疫反応を引き起こす免疫原を含む組成物を意味する。それゆえ、本発明のワクチンは、免疫原性組成物と換言することができる。本発明のワクチンは、予防的に投与されるものに限定されず、疾患が発症した後に治療的に投与されるものであってもよい。
【００１３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１〜４個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列が挙げられる。好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列である。配列番号１に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列をからなるペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドが好ましい。具体的には、生体内タンパク質のエピトープとの複合体による抗体産生能が、同一の生体内タンパク質のエピトープと配列番号１に示されるアミノ酸配列をからなるペプチドとの複合体による抗体産生能と同等（例えば、約０．５〜２倍）であることが挙げられる。
【００１４】
疾患の要因となる生体内タンパク質は特に限定されないが、例えば、ＤＰＰ４、ＩＬ−１７Ａ、ＩｇＥ、Ｓ１００Ａ９、ＰＣＳＫ９などが挙げられる。なお、本明細書において、「生体内タンパク質」は内在性タンパク質（endogenous protein）を意味する。
【００１５】
ＤＰＰ４（ジペプチジルペプチターゼ−４：Dipeptidyl Peptidase-4）は、インスリン分泌に関わるインクレチンを分解する酵素である。インクレチンは食事後などの高血糖時においてインスリン分泌を促進し、血糖値を低下させる消化管ホルモンである。そこで、ＤＰＰ４の機能を阻害してインクレチンの分解を抑えれば、インクレチン濃度が上昇し、インスリン分泌が促進されて糖尿病の症状を改善することができる。それゆえ、多数のＤＰＰ４阻害薬が糖尿病治療薬として開発、承認されている。したがって、抗ＤＰＰ４抗体を誘導するワクチンにより、糖尿病を治療することが期待できる。
【００１６】
ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートに使用されるヒトＤＰＰ４のエピトープは、ＤＰＰ４の機能を阻害する抗体（中和抗体）を産生可能なエピトープであれば特に限定されないが、以下のアミノ酸配列からなるペプチドを好適に用いることができる。
・ＥＮＳＴＦＤＥＦＧ（配列番号２）
・ＮＫＲＱＬＩＴＥＥ（配列番号３）
・ＫＮＴＹＲＬＫＬＹＳ（配列番号４）
・ＹＳＤＥＳＬＱＹＰＫ（配列番号５）
・ＰＰＨＦＤＫＳＫＫＹ（配列番号６）
・ＧＬＰＴＰＥＤＮＬＤ（配列番号７）
・ＦＳＫＥＡＫＹＹＱ（配列番号８）
・ＮＳＳＶＦＬＥＮＳＴＦＤＥＦＧ（配列番号９）
なお、ヒトＤＰＰ４のアミノ酸配列およびヒトＤＰＰ４をコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号は、それぞれNP_001926（NCBI）およびNM_001935（NCBI）である。
【００１７】
また、上記配列番号２〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ＤＰＰ４の機能を阻害する抗体を産生可能なペプチドも、ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートに使用されるヒトＤＰＰ４のエピトープとして好適である。
【００１８】
ＩＬ−１７Ａ（インターロイキン１７Ａ：interleukin-17A）は、ホモ２量体の糖タンパク質であり、単にＩＬ−１７とも称される。ＩＬ−１７Ａは主に活性化Ｔ細胞より産生され、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、マクロファージなど広範囲にわたる細胞に作用して、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞接着因子などの種々の因子を誘導して炎症を誘導することが知られている。ヒト型抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体（セクキヌマブ）は、尋常性乾癬および関節症性乾癬の治療薬として使用されている。また、ＩＬ−１７Ａは、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患などの自己免疫疾患、非小細胞性肺癌、大腸癌、膵臓癌をはじめとする様々な癌、動脈硬化症などに関与することが報告されている。したがって、抗ＩＬ−１７Ａ抗体を誘導するワクチンにより、これらのＩＬ−１７Ａが関与する疾患を治療することが期待できる。
【００１９】
ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートに使用されるヒトＩＬ−１７Ａのエピトープは、ＩＬ−１７Ａの機能を阻害する抗体（中和抗体）を産生可能なエピトープであれば特に限定されないが、以下のアミノ酸配列からなるペプチドを好適に用いることができる。
・ＲＳＳＤＹＹＮＲ（配列番号１０）
・ＰＫＲＳＳＤＹＹＮＲＳＴＳＰＷ（配列番号１１）
・ＣＰＮＳＥＤＫＮＦＰＲ（配列番号２９）
・ＲＮＥＤＰＥＲＹＰＳ（配列番号３０）
・ＮＲＳＴＳＰＷ（配列番号３１）
・ＬＨＲＮＥＤＰ（配列番号３２）
・ＲＹＰＳＶＩＷＥＡ（配列番号３３）
・ＰＫＲＳＳＤＹＹＮＲ（配列番号３４）
・ＴＮＰＫＲＳＳＤＹＹＮＲ（配列番号３５）
・ＴＮＴＮＰＫＲＳＳＤＹＹＮＲ（配列番号３６）
なお、ヒトＩＬ−１７Ａのアミノ酸配列およびヒトＩＬ−１７Ａをコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号は、それぞれNP_002181（NCBI）およびNM_002190（NCBI）である。
【００２０】
また、上記配列番号１０、１１、２９〜３６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ＩＬ−１７Ａの機能を阻害する抗体を産生可能なペプチドも、ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートに使用されるヒトＩＬ−１７Ａのエピトープとして好適に用いることができる。さらに、配列番号１１に示されるアミノ酸配列の第３−１０位のアミノ酸配列を含む部分配列からなるペプチドも、ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートに使用されるヒトＩＬ−１７Ａのエピトープとして好適である。
【００２１】
アレルギーは特定の物質（アレルゲン）により引き起こされ、アレルゲンが体内に入ると免疫系が作動しＩｇＥが産生される。産生されたＩｇＥ抗体は肥満細胞や好塩基球に結合した状態で保持され、再びアレルゲンが体内に入ってくるとＩｇＥとアレルゲンが結合しヒスタミンやロイコトリエンといったケミカルメディエーターが放出されアレルギー症状を引き起こす。あるアレルゲンに対してアレルギーを発症している場合、そのアレルゲンに対する特異的ＩｇＥが過剰に産生され、このことによりアレルギー症状は悪化していく。ＩｇＥの働きを阻害し、または無効化することによりアレルギー症状を緩和することが可能であり、抗ヒトＩｇＥ抗体（オマリズマブ）が気管支喘息の治療に用いられている。したがって、抗ＩｇＥ抗体を誘導するワクチンにより、気管支喘息、花粉症、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患を治療することが期待できる。
【００２２】
ＯＳＫ−１−ＩｇＥコンジュゲートに使用されるヒトＩｇＥのエピトープは、ＩｇＥの機能を阻害する抗体（中和抗体）を産生可能なエピトープであれば特に限定されないが、以下のアミノ酸配列からなるペプチドを好適に用いることができる。
・ＹＱＣＲＶＴＨＰＨＬＰ（配列番号１２）
なお、ヒト免疫グロブリンε鎖定常領域のアミノ酸配列およびヒト免疫グロブリンε鎖定常領域をコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号は、それぞれP01854（UniProtKB）およびNG_001019（NCBI）である。
【００２３】
また、上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ＩｇＥの機能を阻害する抗体を産生可能なペプチドも、ＯＳＫ−１−ＩｇＥコンジュゲートに使用されるヒトＩｇＥのエピトープとして好適である。
【００２４】
Ｓ１００タンパク質は、細胞種特異的に発現する２個のＥＦ−ｈａｎｄを持つカルシウム結合性タンパク質であり、現在までに２０種類のサブファミリーが確認されている。Ｓ１００Ａ９（ＭＲＰ１４とも称される。）は低分子量カルシウム結合性Ｓ１００タンパク質に属しており、種々の炎症性疾患に関連していることがわかっている。また、細胞性動脈炎、嚢胞性線維症、慢性関節リウマチ、皮膚病、慢性炎症性腸疾患、慢性気管支炎、いくつかの悪性腫瘍、および自己免疫疾患を含む数多くの炎症性疾患の患者において、Ｓ１００Ａ９血清レベルが亢進することが明らかにされている。また、Ｓ１００Ａ９を遮断すると、出血のリスクを上げずに血栓が予防される可能性があることが報告されている。したがって、抗Ｓ１００Ａ９抗体を誘導するワクチンにより、アテローム血栓症、心筋梗塞や脳梗塞における血栓形成を予防することが期待できる。
【００２５】
ＯＳＫ−１−Ｓ１００Ａ９コンジュゲートに使用されるヒトＳ１００Ａ９のエピトープは、Ｓ１００Ａ９の機能を阻害する抗体（中和抗体）を産生可能なエピトープであれば特に限定されないが、以下のアミノ酸配列からなるペプチドを好適に用いることができる。
・ＧＨＨＨＫＰＧＬＧＥ（配列番号１３）
なお、ヒトＳ１００Ａ９のアミノ酸配列およびヒトＳ１００Ａ９をコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号は、それぞれNP_002956（NCBI）およびNM_002965（NCBI）である。
【００２６】
また、上記配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｓ１００Ａ９の機能を阻害する抗体を産生可能なペプチドも、ＯＳＫ−１−Ｓ１００Ａ９コンジュゲートに使用されるヒトＳ１００Ａ９のエピトープとして好適である。
【００２７】
ＰＣＳＫ９（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9）は、家族性高コレステロール血症の原因遺伝子であることが同定され、その後の研究からＰＣＳＫ９は肝細胞表面に発現しているＬＤＬ受容体を分解し、肝臓が血中のＬＤＬ−Ｃを取り込む能力を低下させることがわかっている。ＰＣＳＫ９の機能を阻害することにより、ＬＤＬ受容体の分解を抑制し、血中コレステロールの肝臓への取り込みを促進することによって血中コレステロール値を低下させることが可能である。抗ヒトＰＣＳＫ９モノクローナル抗体（エボロクマブ）が家族性高コレステロール血症および高コレステロール血症の治療に使用されており、ＰＣＳＫ９の機能を阻害するＲＮＡｉ医薬が開発されている。したがって、抗ＰＣＳＫ９抗体を誘導するワクチンにより、高コレステロール血症を治療することが期待できる。
【００２８】
ＯＳＫ−１−ＰＣＳＫ９コンジュゲートに使用されるヒトＰＣＳＫ９のエピトープは、ＰＣＳＫ９の機能を阻害する抗体（中和抗体）を産生可能なエピトープであれば特に限定されないが、以下のアミノ酸配列からなるペプチドを好適に用いることができる。
・ＬＲＰＲＧＱＰＮＱＣ（配列番号１４）
・ＳＲＨＬＡＱＡＳＱ（配列番号１５）
・ＳＲＳＧＫＲＲＧＥＲ（配列番号１６）
なお、ヒトＰＣＳＫ９のアミノ酸配列およびヒトＰＣＳＫ９をコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号は、それぞれNP_777596（NCBI）およびNM_174936（NCBI）である。
【００２９】
また、上記配列番号１４〜１６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ＰＣＳＫ９の機能を阻害する抗体を産生可能なペプチドも、ＯＳＫ−１−ＰＣＳＫ９コンジュゲートに使用されるヒトＰＣＳＫ９のエピトープとして好適である。
【００３０】
なお、本発明のワクチンの効果を確認するために、実験動物（マウス等）を用いて実験を行う場合、上記のヒトエピトープ配列に対応する実験動物のエピトープ配列を用いて実験を行うことが好ましい。用いる実験動物の対応するエピトープ配列は、公知のデータベース（ＮＣＢＩ等）を用いて標的タンパク質のアミノ酸配列を取得し、対応するヒトのアミノ段配列とアライメントすることにより設計することができる。表１に、上記配列番号２〜１６のヒトエピトープ配列に対応するマウスエピトープ配列を示す。
【００３１】
【表１】
2017164409.tif 000002
【００３２】
表１において、ヒトＤＰＰ４の全長アミノ酸配列はNP_001926、マウスＤＰＰ４の全長アミノ酸配列はAAH22183、ヒトＩＬ−１７Ａの全長アミノ酸配列はNP_002181、マウスＩＬ−１７Ａの全長アミノ酸配列はNP_034682、ヒトＩｇＥの全長アミノ酸配列はP01854、マウスＩｇＥの全長アミノ酸配列はP06336、ヒトＳ１００Ａ９の全長アミノ酸配列はNP_002956、マウスＳ１００Ａ９の全長アミノ酸配列はCAC14292、ヒトＰＣＳＫ９の全長アミノ酸配列はNP_777596、マウスＰＣＳＫ９の全長アミノ酸配列はNP_705793の各アクセッション番号で登録されているアミノ酸配列に基づく。
【００３３】
本発明のワクチンに使用される生体内タンパク質のエピトープの大きさは特に限定されないが、２０アミノ酸以下が好ましく、１５アミノ酸以下がより好ましく、１３アミノ酸以下がさらに好ましく、１２アミノ酸以下がさらに好ましく、１１アミノ酸以下がさらに好ましく、１０アミノ酸以下がさらに好ましい。下限は特に限定されないが、３アミノ酸以上が好ましく、４アミノ酸以上がより好ましく、５アミノ酸以上がさらに好ましく、６アミノ酸以上がさらに好ましい。
【００３４】
ＯＳＫ−１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープとの複合体は、両者が直接連結されていてもよく、リンカー（スペーサーと同義）を介して連結されていてもよい。リンカーはＯＳＫ−１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープを連結できるものであれば特に限定されない。例えば、β−アミノアラニン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、１２−アミノラウリン酸、グルタミン酸、ｐ−アミノ安息香酸等のアミノカルボン酸を用いることができる。また、天然のタンパク質に存在するＬ−アミノ酸やそれらのＤ−アミノ酸も用いることができる。本願明細書の実施例ではε−アミノカプロン酸をリンカーとして使用しているが、これに限定されない。
【００３５】
ＯＳＫ−１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープとの複合体における連結順序は特に限定されず、Ｎ末端側がＯＳＫ−１ペプチドでＣ末端側が生体内タンパク質のエピトープでもよく、逆にＮ末端側が生体内タンパク質のエピトープでＣ末端側がＯＳＫ−１ペプチドでもよい。好ましくは、Ｎ末端側がＯＳＫ−１ペプチドでＣ末端側が生体内タンパク質のエピトープの順序である。
【００３６】
当該複合体はそのＮ末端のアミノ酸がアセチル化されていることが好ましい。また、当該複合体はそのＣ末端のアミノ酸がアミド化されていることが好ましい。より好ましくは、複合体のＮ末端のアミノ酸がアセチル化されており、かつＣ末端のアミノ酸がアミド化されていることである。
【００３７】
ＯＳＫ−１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープとの複合体は、融合タンパク質として製造することができる。具体的には、公知の遺伝子工学的手法により、ＯＳＫ−１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープの融合タンパク質をコードする融合遺伝子を作製し、当該遺伝子を発現可能に挿入した組み換え発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞に導入して組み換えタンパク質として発現させ、精製することにより製造することができる。ＯＳＫ−１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープとの複合体は、上記融合遺伝子と公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系（例えば、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽または大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系等）を用いて、製造することができる。また、バクテリオファージを用い、その表面にＯＳＫ−１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープとの複合体を組み換えタンパク質として発現させる場合は、当該複合体を単離、精製せずに、ファージ表面に発現させたままで対象動物に投与することも可能である。
【００３８】
また、ＯＳＫ−１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープとの複合体は、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）または液相合成法により製造することができる。複合体がＯＳＫ−１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープを直接連結したものである場合、または複合体がＯＳＫ−１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープとを適当なアミノ酸を介して連結したものである場合は、複合体の全体を一度に合成することができる。また、ＯＳＫ−１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープを別々に合成し、その後に２つのペプチドを、適当なリンカーを用いて連結してもよい。
【００３９】
リンカーの導入は、ペプチド合成化学でよく知られた方法で行うことができる。まず標準的な手法によりリンカー位置までのペプチド断片を作成し、リンカーとして用いるアミノカルボン酸のアミノ基を適切に保護したものを用いて標準的な条件下ペプチド合成化学で用いられる縮合剤で当該リンカー基を縮合し、次いで、リンカー基の保護基を脱保護してから、次の位置の目的のアミノ酸を導入すればよい。例えばペプチド自動合成機でよく用いられる固相法ペプチド合成法はその一例である。このような操作で用いられるアミノカルボン酸の保護基としては、ｔＢＯＣ（tert-Butyl Oxy Carbonyl）基、ＦＭＯＣ（Fluorenyl-MethOxy-Carbonyl）基等が挙げられる。縮合剤としては、例えばＤＣＣ（N,N’-Dicyclohexylcarbodiimide）、ＥＤＣ（（N-（3-Dimethylaminopropyl） -N'-ethylcarbodiimide）等のカルボジイミド系化合物、ＣＤＩ（1,1'- カルボニルジイミダゾール）等のイミダゾール系化合物、ＢＯＰ（benzotriazol-1-yloxytris（dimethylamino）phosphonium hexafluorophosphate）等のホスホニウム塩系化合物、ＨＢＴＵ（O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium hexafluorophosphate）、ＨＣＴＵ（O-(6-Chlorobenzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium hexafluorophosphate）等のウロニウム塩系化合物などを用いることができる。また、上記の条件を適切に組み合わせれば、ＯＳＫ−１の所定のペプチド断片と表的の生体内タンパクエピトープ部位配列のペプチド断片をそれぞれ作製して適切に保護した後、適切な保護を施したリンカー基を用い、縮合または脱保護のステップを適宜組み合わせて操作することにより所望のコンジュゲートを得ることもできる。
【００４０】
本発明のワクチンは、アジュバントを含まなくても疾患の要因となる生体内タンパク質の機能を阻害する抗体を誘導することができる点で有用性が高い点で有用である。ただし本発明のワクチンは、１種以上のアジュバントを含んでいてもよい。本発明のワクチンがアジュバントを含む場合、公知のアジュバントの中から適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩またはその組み合わせ）、フロイントアジュバント（完全または不完全）、ＴＬＲリガンド（例えば、ＣｐＧ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４など）、ＢＡＹ、ＤＣ−ｃｈｏｌ、ｐｃｐｐ、モノホスホリル脂質Ａ、ＱＳ−２１、コレラ毒素、ホルミルメチオニルペプチドなどが挙げられる。好ましくは、アルミニウムアジュバント、ＴＬＲリガンドまたはこれらの組み合わせである。本発明のワクチンがアジュバントを含む場合、アジュバントの配合量は特に限定されず、アジュバントの種類等により適宜選択すればよい。例えば、アルミニウムアジュバント（水酸化アルミニウム）およびＣｐＧを併用する場合、本発明の融合タンパク質に対して質量比でアルミニウムアジュバントが約１〜１００倍量、ＣｐＧが約１〜５０倍量を配合することが好ましい。
【００４１】
本発明のワクチンは、経口投与または非経口投与により投与することができる。非経口投与としては、例えば腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、鼻腔内投与、経皮投与、経粘膜投与、舌下投与、吸入投与などが挙げられる。好ましくは、非経口投与であり、より好ましくは、皮内投与、皮下投与または筋肉内投与である。また、非経口投与の手段には、マイクロニードル注射、無針注射、スタンプ等が含まれる。
【００４２】
本発明のワクチンは、ＯＳＫ−１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープとの複合体と薬学的に許容される担体、さらに添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口投与用製剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口投与用製剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００４３】
経口投与用の固形製剤に用いられる添加剤としては、例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン等の賦形剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等の結合剤；トウモロコシデンプン等の分散剤；繊維素グリコール酸カルシウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；グルタミン酸、アスパラギン酸等の溶解補助剤；安定剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子類等の水溶性高分子；白糖、粉糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、乳糖、還元麦芽糖水アメ、粉末還元麦芽糖水アメ、ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖、ハチミツ、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、アスパルテーム、サッカリン、サッカリンナトリウム等の甘味剤、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等のコーティング剤等が挙げられる。
経口投与用の液体製剤は、一般的に用いられる希釈剤に溶解、懸濁又は乳化されて製剤化される。希釈剤としては、例えば、精製水、エタノール、それらの混液等が挙げられる。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤等を含有していてもよい。
【００４４】
非経口投与用の注射剤に用いられる添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等の等張化剤；リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等の緩衝剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等の保存剤；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等の増粘剤；亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等の安定化剤；塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等のｐＨ調整剤等が挙げられる。また注射剤には、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、リソレシチン、プルロニックポリオール等の非イオン界面活性剤等をさらに配合してもよい。注射剤等の液状製剤は、凍結保存または凍結乾燥等により水分を除去して保存することもできる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
【００４５】
本発明のワクチンは、免疫系を有するあらゆる動物（ヒト、非ヒト）を投与対象とすることができる。例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス等の哺乳動物；ニワトリ、アヒル、ガチョウ等の鳥類が挙げられる。本発明のワクチンは動物薬として有用であるが、ヒトの小児および成人を対象とすることが好ましい。
【００４６】
本発明のワクチンの投与回数および投与間隔は特に限定されない。例えば、単回投与でもよく、約２日〜約８週間の間隔で複数回投与してもよい。ワクチン投与量は、投与対象、投与方法などにより異なるが、１回投与量を約０．０１μｇ〜約１０ｍｇとすることが好ましく、約０．１μｇ〜約１ｍｇとすることがより好ましく、約１μｇ〜約０．１ｍｇとすることがさらに好ましい。
【００４７】
本発明には、本発明のワクチンの有効量を動物に投与することを含む、標的生体タンパク質が要因となる疾患の予防または治療方法が含まれる。
また、本発明には、生体内タンパク質が要因となる疾患の予防または治療に用いるための、本発明のワクチンが含まれる。
さらに、本発明には、生体内タンパク質が要因となる疾患の予防または治療用医薬を製造するための、本発明のワクチンの使用が含まれる。
【００４８】
本発明のワクチンにおいて、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープのキャリアタンパク質として用いられるＯＳＫ−１は２０個のアミノ酸からなるペプチドであり、ＯＳＫ−１自身の抗原性は非常に低いので、キャリアタンパク質の抗原性に由来する好ましくない効果や副作用を低減することができる。一方、ＯＳＫ−１は短いペプチドであるにも関わらず強いアジュバント効果を有するので、ワクチンとして有効な抗体産生能を付与することができる。また、ＯＳＫ−１と生体内タンパク質のエピトープとの複合体により産生される抗体には、Ｔｈ２タイプのＩｇＧ１だけでなくＴｈ１タイプのＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３が多く含まれるので、アレルギー反応等の副作用を低減することができる点で非常に有用である。さらに、ＫＬＨ等の天然物由来のキャリアタンパク質を使用する場合には不純物の問題が生じるが、ＯＳＫ−１は合成により製造できるのでこのような問題を回避することができる。また、ＯＳＫ−１は短いペプチドであるので、製造コストを抑えることができる点でも有利である。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５０】
〔ペプチドの製造例〕
文献「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ（１９８４）、Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）」および「第５版  実験化学講座１６  有機化合物の合成ＩＶ」等に記載の方法に従い、全自動固相合成機を用いて、保護ペプチド樹脂をＦｍｏｃ法で合成した。得られた保護ペプチド樹脂にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）とスカベンジャー（チオアニオール、エタンジチオール、フェノール、トリイソプロピルシラン、水等の混合物）を加えて、樹脂から切り出すとともに脱保護して、粗ペプチドを得た。この粗ペプチドを、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ）を用いて、０．１％ＴＦＡ−Ｈ２０／ＣＨ３ＣＮの系でグラジエント溶出し、精製を行った。目的物を含む画分を集め凍結乾燥して、目的のペプチドを得た。合成したペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸シーケンサーＧ１０００Ａ（Hewlett Packard）、ＰＰＳＱ−２３Ａ（島津製作所）またはＰｒｏｃｉｓｃＬＣ（ABI社）を用いて確認し、得られたペプチドのＮ末端をアセチル化した。【００５１】
〔実施例１：ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートによる抗体産生の検討１〕
ＯＳＫ−１ペプチド（配列番号１）とマウスＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号１７）を、ε−Ａｃｐをリンカーとして連結（コンジュゲート）したＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲート（Ac-ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK-X-ENSTFESFG (X = ε-Acp)）による抗体産生作用を評価した。群構成は、生理食塩水群およびＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲート群（100μg/mouse）の２群とした（６匹／群）。Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回皮内投与した。投与前、投与から２週間おきに８週後まで採血し、ＤＰＰ４エピトープペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。【００５２】
結果を図１に示した。ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートの投与により、ＤＰＰ４エピトープペプチドに対する抗体産生が認められた。【００５３】
〔実施例２：ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートによる抗体産生の検討２〕
実施例１と同じＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートによる抗体産生作用を、ＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin：スカシガイヘモシアニン）とマウスＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号１７）とのコンジュゲート（ＫＬＨ−ＤＰＰ４）の抗体産生作用と比較した。群構成は、ＫＬＨ−ＤＰＰ４コンジュゲート群（20μg/mouse）、ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲート群（100μg/mouse）、ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲート（100μg/mouse）＋Ａｌｕｍ（Alhydrogel 2%（InvivoGen）1 mg/mouse）併用群の３群とした（２匹／群）。Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回皮内投与した。投与前、投与から２週間おきに６週後までと、１２週後に採血し、ＤＰＰ４エピトープペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。【００５４】
結果を図２に示した。ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートはＫＬＨ−ＤＰＰ４コンジュゲートと同等の抗体産生能が認められた。また、ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートとＡｌｕｍの併用群では、相乗効果が認められた。【００５５】
〔実施例３：産生された抗体のＩｇＧサブクラスの解析〕
実施例１および２と同じＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートにより産生されたＩｇＧ抗体のＩｇＧサブクラスを、実施例２と同じＫＬＨ−ＤＰＰ４コンジュゲートにより産生されたＩｇＧ抗体のＩｇＧサブクラスと比較した。群構成は、ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲート群（100μg/mouse）、ＫＬＨ−ＤＰＰ４コンジュゲート（20μg/mouse）＋Ａｌｕｍ（Alhydrogel 2%（InvivoGen）1 mg/mouse）併用群、ＫＬＨ−ＤＰＰ４コンジュゲート（20μg/mouse）＋ＯＳＫ−１（100μg/mouse）併用群の３群とした。Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回および投与開始から９週後に１回、合計４回皮内投与した後、投与後１１週に採血し、ＤＰＰ４エピトープペプチドに対するＩｇＧ抗体の抗体価をＩｇＧサブクラスごとにＥＬＩＳＡにより測定した。【００５６】
結果を図３に示した。ＫＬＨ−ＤＰＰ４コンジュゲートとＡｌｕｍの併用群では、Ｔｈ２タイプのＩｇＧであるＩｇＧ１が特に高い傾向であった。一方、ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲート群では、Ｔｈ１タイプのＩｇＧであるＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂにも高い産生が認められた。また、ＫＬＨ−ＤＰＰ４コンジュゲートとＯＳＫ−１の併用群では、同様にＴｈ１タイプであるＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３の抗体価が高かった。【００５７】
〔参考例１：ＯＳＫ−１−ＷＴ１コンジュゲートによるによる抗腫瘍効果の検討１〕
ＯＳＫ−１ペプチド（配列番号１）とＷＴ１ペプチド（配列番号２８）を、ε−ＡｃｐをリンカーとしてコンジュゲートしたＯＳＫ−１−ＷＴ１コンジュゲート（Ac-ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK-X-RMFPNAPYL (X = ε-Acp)）による抗腫瘍効果を評価した。また、ＷＴ１ペプチドワクチンの抗腫瘍効果に対するＯＳＫ−１ペプチドのアジュバント効果について検討した。群構成は、生理食塩水群、ＷＴ１ペプチド（100μg/mouse）＋ポリ（Ｉ：Ｃ）（InvivoGen；Poly(I:C) HMW VacciGrade、50μg/mouse）群、ＷＴ１ペプチド（100μg/mouse）＋ＯＳＫ−１ペプチド（100μg/mouse）群、ＳＫ−１−ＷＴ１コンジュゲート（350μg/mouse）群の４群とした（６匹／群）。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにワクチンを週に１回、４回投与し、４回目の投与から１週間後にＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（１×１０５cells/mouse）を背部皮内に移植した。細胞移植から１週間後に再度ワクチンを投与した。細胞移植後、週に２回体重および腫瘍径を測定した。腫瘍径はデジタルノギスを用いて測定し、長径×短径２を腫瘍体積とした。【００５８】
腫瘍体積の結果を図４に、生存率の結果を図５に示した。ＯＳＫ−１ペプチドをアジュバントとしてＷＴ１ペプチドワクチンと共に投与した場合、腫瘍増殖抑制効果および延命効果は認められなかった。ＳＫ−１−ＷＴ１コンジュゲート群では、腫瘍増殖抑制効果および延命効果が認められた。【００５９】
〔参考例２：ＯＳＫ−１−ＷＴ１コンジュゲートによるによる抗腫瘍効果の検討２〕
参考例１と同じＯＳＫ−１−ＷＴ１コンジュゲートによる抗腫瘍効果を評価した。群構成は、生理食塩水群、ＷＴ１ペプチド（100μg/mouse）＋ポリ（Ｉ：Ｃ）（InvivoGen；Poly(I:C) HMW VacciGrade、50μg/mouse）群、ＳＫ−１−ＷＴ１コンジュゲート（350μg/mouse）群、シスプラチン（5mg/kg）群の４群とした（１０匹／群）。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（３×１０５cells/mouse）を背部皮内に移植し、同じ日にワクチンを皮内投与した。細胞移植日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ７、１４、２１、２８、３５にワクチンを投与した。細胞移植後、週に２回、デジタルノギスを用いて腫瘍径を測定し、長径×短径２を腫瘍体積とした。【００６０】
腫瘍体積の結果を図６に、生存率の結果を図７に示した。細胞移植日と同時にワクチン投与を開始した場合、ＯＳＫ−１−ＷＴ１コンジュゲートの腫瘍増殖抑制効果は弱いものの、Ｄａｙ３２までは生理食塩水投与群（陰性対照）と比較して腫瘍体積は低い値を推移した。また、ＯＳＫ−１−ＷＴ１コンジュゲートは、ＷＴ１ペプチド＋ポリ（Ｉ：Ｃ）群およびシスプラチン群と同等の延命効果が認められた。【００６１】
〔実施例４：ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートによる抗体産生の検討３〕
ＯＳＫ−１ペプチド（配列番号１）と７種類のマウスＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号３，５，６，８，１８，１９，２０）および１種類のヒトＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号９）を、それぞれε−Ａｃｐをリンカーとしてコンジュゲートした８種類のＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートを製造した。以下、各ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートを「ＯＳＫ１−ＤＤＰ４−配列番号」で表記する。【００６２】
６種類のマウスＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号３，５，６，８，１８，１９）を含むＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートを、１匹あたり１００μｇの用量で、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回皮内投与した。投与前、投与から２週おきに採血し、各エピトープペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。
初回投与から４週後の抗体価を表２に示した。抗体価はhalf maximum値で示した。Half maximum値は、測定機における最大吸光度の半分の吸光度示す血清の希釈倍率であり、血清希釈倍率と吸光度のシグモイド曲線を作成して算出した。【００６３】
【表２】
2017164409.tif 000003
【００６４】
ＯＳＫ１−ＤＤＰ４−６、ＯＳＫ１−ＤＤＰ４−９およびＯＳＫ１−ＤＤＰ４−１２の３種類のＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートを、１匹あたり２５０μｇの用量で、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回皮内投与した。初回投与から４週後、９週後および１３週後に採血し、各エピトープペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。
結果を表３に示した。抗体価はhalf maximum値で示した。【００６５】
【表３】
2017164409.tif 000004
【００６６】
〔実施例５：ＨｂＡ１ｃ値によるＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートの評価〕
ＯＳＫ−１ペプチド（配列番号１）とＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号６）を、ε−ＡｃｐをリンカーとしてコンジュゲートしたＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートを、１匹あたり１００μｇの用量で、高脂肪食（DIO SERIES DIET D12492、日本クレア株式会社）を自由摂取させたＢａｌｂ／ｃマウスに２週間おきに３回皮内投与した。初回投与後５７日に採取した血液の一部を速やかにＥＤＴＡ処理済みチューブに分注し、転倒混和させて、ＥＤＴＡ処理血液を調製した。ＨｂＡ１ｃ測定用に約２０μＬをマイクロチューブに分注し、ＨｂＡ１ｃ測定機器クオラボ（ニプロ）を用いて測定した。その結果、ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲート群のＨｂＡ１ｃ値（％、NGSP）はコントロール群（ＫＬＨ投与群）のＨｂＡ１ｃ値と比較して、−０．４％の改善を示した。【００６７】
〔実施例６：経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）によるＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートの評価〕
ＯＳＫ−１ペプチド（配列番号１）と２種類のＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号６および配列番号９）を、それぞれε−Ａｃｐをリンカーとしてコンジュゲートした２種類のＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートを、１匹あたり２５０μｇの用量で、高脂肪食（DIO SERIES DIET D12492、日本クレア株式会社）を自由摂取させたＢａｌｂ／ｃマウスに２週間おきに３回皮内投与した。さらに初回投与後６３日目に１匹あたり２５０μｇのＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートを皮内投与した。初回投与後７７日目に経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）を実施した。ＯＧＴＴ実施前日から約１６時間の絶食を行い、ＯＧＴＴ実施中は絶食状態を維持した。２０％グルコース液を５ｍＬ／ｋｇの用量で単回経口投与した。採血および血糖値測定は無麻酔下で行った。動物の尾を軽く剃刀にて傷付け、漏出する血液中の糖濃度を血糖自己測定器（ニプロフリースタイルフリーダム）にて測定した。血糖値は、糖負荷前、糖負荷後３０、６０、９０および１２０分の計５時点で測定し、経時的な濃度推移より各投与群の血糖上昇曲線下面積ＡＵＣ（time*mg/dl）を算出した。その結果、２種類のＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲート投与群のＡＵＣは、どちらもコントロール群（ＫＬＨ投与群）のＡＵＣと比較して低下した。【００６８】
〔実施例７：ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４コンジュゲートによるＩｇＥ産生の検討〕
ＯＳＫ１−ＤＰＰ４−１７による標的タンパクに対するＩｇＥ産生を、キャリアタンパク質をＫＬＨに変更したＫＬＨ−ＤＰＰ４−１７と比較した。ＫＬＨ−ＤＰＰ４−１７群は、ＫＬＨ−ＤＰＰ４−１７が２０μｇ／ｍｏｕｓｅおよびＡｌｕｍ（Alhydrogel 2%（InvivoGen））が１ｍｇ／ｍｏｕｓｅになるように混合し皮内投与した。ＯＳＫ−１−ＤＰＰ４−１７群は１００μｇ／ｍｏｕｓｅで皮内投与した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回皮内投与し、さらに１１週目に４回目の投与を行った。２１週目に採血し、血清中のＤＰＰ４に対するＩｇＥ抗体量をＥＬＩＳＡにより測定した。【００６９】
結果を図８に示した。ＫＬＨ−ＤＰＰ４−１７群では、標的タンパクに対するＩｇＥ産生が見られたが、ＯＳＫ１−ＤＰＰ４−１７群では、標的タンパクに対するＩｇＥ産生は見られなかった。【００７０】
〔実施例８：ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートによる抗体産生の検討〕
（１）ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートの製造
ＯＳＫ−１ペプチド（配列番号１）と１０種類のマウスＩＬ−１７Ａのエピトープペプチド（配列番号２１，２２，３１〜３３，３７〜４１）を、それぞれε−Ａｃｐをリンカーとしてコンジュゲートした１０種類のＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートを製造した。以下、各ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートを「ＯＳＫ１−ＩＬ−配列番号」で表記する。これらの代表例として４種類のエピトープペプチド（配列番号２１，３１，３２，４０）を含むコンジュゲートについて、図９〜１２にそれぞれ（Ａ）アミノ酸分析結果および（Ｂ）ＨＰＬＣ分析結果を示した。他のコンジュゲートも実質的に同様の分析結果を得た。【００７１】
（２）抗体価の測定
１０種類のＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートを表４に記載の用量で、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回皮内投与した。投与前、投与から２週間おきに６週後まで採血し、各エピトープペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。
初回投与から６週後の結果を表４に示した。また、２，４，６週後の抗体価の変化を図１３に示した。抗体価はhalf maximum値で示した。【００７２】
【表４】
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【００７３】
〔実施例９：イミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスによるＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートの評価（１）〕
乾癬モデルとして、イミキモド誘発乾癬様皮膚炎モデルを使用した。６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに３種類のＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲート（OSK1-IL-31、OSK1-IL-32、OSK1-IL-40）を、１匹あたり５００μｇの用量で、２週間おきに３回皮内投与した。３回目のワクチン投与から２週間後に背中を剃毛し、さらに脱毛クリームを用いて脱毛した皮膚に、１日あたりイミキモド６２．５ｍｇ分のベセルナクリーム５％（商品名、持田製薬）を、８日間毎日塗布することにより乾癬を誘導した。耳に塗布する場合は、片耳につき１日あたりイミキモド０．３５ｍｇ分のベセルナクリーム５％を、８日間毎日塗布することにより乾癬症状を誘導した。【００７４】
乾癬誘導開始から８日間（０〜７日目）、皮膚状態（紅斑、肥厚度、白色鱗屑の症状範囲）を毎日観察し、各０〜４の５段階（０：なし、１：軽度、２：中等症、３：重症、４：きわめて重症）で点数化して評価した。耳の厚さは、乾癬誘導開始から８日間（０〜７日目）、デジタルノギスを用いて毎日測定した。皮膚状態の結果を図１４に、耳の厚さの結果を図１５に示した。用いた４種類のＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートは、イミキモド誘発乾癬様皮膚炎を抑制することが示された。【００７５】
〔実施例１０：イミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスによるＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートの評価（２）〕
（１）皮膚状態および耳の厚さ
ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７ＡコンジュゲートとしてＯＳＫ１−ＩＬ−２１を用い、１匹あたり１００μｇ、３００μｇまたは１０００μｇの用量で、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間おきに３回皮内投与した。また、キャリアタンパク質をＫＬＨに変更したＫＬＨ−ＩＬ−２１を、１匹あたり２０μｇの用量で、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間おきに３回皮内投与した。ＫＬＨ−ＩＬ−２１については、１回目の投与ではフロイント完全アジュバント（SIGMA）５０μＬ／ｍｏｕｓｅを、２回目および３回目の投与ではフロイント不完全アジュバント（SIGMA）５０μＬ／ｍｏｕｓｅを、アジュバントとして混合し投与した。用いたワクチンおよびベセルナクリーム５％を１３日間毎日塗布したこと以外は、上記実施例９と同じ手順で行った。【００７６】
乾癬誘導開始から６日目の皮膚状態を写真撮影し、図１６に示した。乾癬様皮膚炎誘発期間中（０〜１２日目）の皮膚の状態の変化を図１７に示し、乾癬様皮膚炎誘発期間中（０〜７日目）の耳の厚さの変化を図１８に示した。これらの結果により、ＫＬＨ−ＩＬ−１７ＡコンジュゲートよりＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートのほうが、イミキモド誘発乾癬様皮膚炎を強く抑制できることが示された。【００７７】
（２）免疫組織化学染色
イミキモド塗布により乾癬様皮膚炎を誘導した際に皮膚に存在している免疫細胞およびインボルクリンの発現を免疫組織化学染色により検出した。
乾癬誘導開始から１２日目の背部皮膚および耳介を採取し、４％ＰＦＡで固定後、パラフィン包埋を行った。切片作成後、脱パラフィン、抗原賦活化処理を行い、非特異反応ブロッキング、一次抗体反応、標識二次抗体反応を行った。角化の最終マーカーであるインボルクリン染色により角化傾向を、マクロファージのマーカーであるＦ４／８０および顆粒球のマーカーであるＧｒ−１でそれぞれ染色し、免疫細胞を検出した。【００７８】
インボルクリン染色の結果を図１９に、Ｆ４／８０染色の結果を図２０に、Ｇｒ−１染色の結果を図２１にそれぞれ示した。これらの結果から、正常皮膚では有棘層上部に認められるインボルクリンの発現が、イミキモド塗布により表皮の広い範囲に広がり角化の亢進が起こっていることが確認された。ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲート投与群では、ＫＬＨ−ＩＬ−１７Ａコンジュゲート投与群より、この現象が顕著に抑制されている所見が認められた。また、イミキモドを塗布した皮膚、耳介においてＦ４／８０に陽性を示すマクロファージや、Ｇｒ−１に陽性を示す顆粒球の増加がより顕著に認められた。一方、ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲート投与群では、ＫＬＨ−ＩＬ−１７Ａコンジュゲート投与群より、これらの免疫細胞の浸潤が顕著に抑制されていた。【００７９】
（３）ＩＬ−１７の血中濃度
乾癬誘導開始前（０日目）および乾癬誘導開始から１２日目に採血し、血清中のＩＬ−１７濃度を、Ｍｏｕｓｅ ＩＬ−１７Ａ／Ｆ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（R&D systems社）を用いて測定した。
結果を図２２に示した。（Ａ）はイミキモドを塗布していないマウス（０日目）の結果であり、（Ｂ）はイミキモドを塗布したマウス（１２日目）の結果である。（Ｂ）に示したように、ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲート投与群はＫＬＨ−ＩＬ−１７Ａコンジュゲート投与群に比べ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆの血中濃度が低かった。また、（Ａ）に示したように、コンジュゲート投与後イミキモド塗布開始前の血中ＩＬ−１７Ａ／Ｆは、ＫＬＨ−ＩＬ−１７Ａコンジュゲート投与群のみ上昇が認められた。【００８０】
（４）乾癬部位における炎症関連因子の発現
乾癬誘導開始から１２日目に乾癬部位の皮膚を採取し、ＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して皮膚組織中のＲＮＡを抽出した。Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓのプライマーおよびプローブを使用し、リアルタイムＰＣＲ法によって、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２２およびＩＬ−２３の炎症関連因子のメッセンジャーＲＮＡを測定した。
その結果、ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲート非投与のマウスでは各種因子のメッセンジャーＲＮＡが上昇したが、ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲート投与群では、各因子のメッセンジャーＲＮＡの発現は抑制されていた。【００８１】
上記実施例９，１０では、イミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスを用いたが、ＯＳＫ−１−ＩＬ−１７Ａコンジュゲートの薬効の評価には、ＩＬ−２３誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスを使用することもできる。具体的には、例えば、Ｗ. Ｊｉａｎｇら（”A Toll-Like Receptor 7, 8, and 9 Antagonist Inhibits Th1 and Th17 Responses and Inflammasome Activation in a Model of IL-23-Induced Psoriasis” W. Jiang, et al, 1784 Journal of Investigative Dermatology (2013), Volume 133）の記載に従って実施することができる。すなわち、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを用い、０．５ｍｇのマウスＩＬ−２３を２０ｍＬのＰＢＳに溶解し、例えば０、２、４、６、１０、１２および１４日目に、被験動物の左耳に皮内注射することにより、皮膚炎を誘導する。皮膚炎を誘導したマウスを無作為に群分けし、被験物質または対照物質（例えばＰＢＳ）を投与する。例えば、３、６、９、１２および１５日目に、被験物質または対照物質を皮下投与する。例えば１８日目に耳介の厚さをデジタルノギスで測定する。また、耳介を採取して、病理組織学的検査に供する。【００８２】
〔実施例１１：ＯＳＫ−１−ＩｇＥコンジュゲートによる抗体産生の検討〕
ＯＳＫ−１ペプチド（配列番号１）とマウスＩｇＥのエピトープペプチド（配列番号２３）を、ε−ＡｃｐをリンカーとしてコンジュゲートしたＯＳＫ−１−ＩｇＥコンジュゲートを製造し、１匹あたり１００μｇまたは２５０μｇの用量で、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回皮内投与した。投与から２週おきに採血し、各エピトープペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。
８週後の抗体価を表５に示した。抗体価はhalf maximum値で示した。【００８３】
【表５】
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【００８４】
〔実施例１２：ＯＳＫ−１−ＰＣＳＫ９コンジュゲートによる抗体産生の検討〕
ＯＳＫ−１ペプチド（配列番号１）と３種類のマウスＰＣＳＫ９のエピトープペプチド（配列番号２５，２６，２７）を、それぞれε−Ａｃｐをリンカーとしてコンジュゲートした３種類のＯＳＫ−１−ＰＣＳＫ９コンジュゲートを製造し、１匹あたり１００μｇまたは２５０μｇの用量で、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回皮内投与した。投与から２週おきに採血し、各エピトープペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。
８週後の抗体価を表６に示した。抗体価はhalf maximum値で示した。【００８５】
【表６】
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【００８６】
〔実施例１３：血中のＰＣＳＫ９濃度によるＯＳＫ−１−ＰＣＳＫ９コンジュゲートの評価〕
実施例１２において、ＯＳＫ１−ＰＣＳＫ９−２７を２５０μｇの用量で投与したマウス（ＯＳＫ−１−ＰＣＳＫ９コンジュゲート投与群）から、投与前および投与２、４、６週後に採取した血清中のＰＣＳＫ９濃度を測定した。コントロールとして、ＯＳＫ−１投与群を設け、同じスケジュールで投与および採血を行い、血清中のＰＣＳＫ９濃度を測定した。測定には、Ｍｏｕｓｅ Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ９／ＰＣＳＫ９ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（R&D systems）を使用した。ここで、ＰＣＳＫ９抗体を投与すると血中ＰＣＳＫ９濃度の上昇が認められることが報告されている。この現象は抗体によりＰＣＳＫ９タンパクが安定化し体内からの消失が遅くなるためだと考えられている。このことから、ワクチン投与による血中ＰＣＳＫ９値の上昇は、ワクチン投与により産生された抗体が標的タンパクと作用していることを示す現象のひとつであると考えられる（Peptide-Based Anti-PCSK9 Vaccines - An Approach for Long-Term LDLc Management, PLoS One. 2014; 9(12), An Anti-PCSK9 Antibody Reduces LDL-Cholesterol On Top Of A Statin And Suppresses Hepatocyte SREBP-Regulated Genes; Int.J.Biol.Sci.2012, 8(3):310-327） 。【００８７】
結果を図２３に示した。ＯＳＫ−１−ＰＣＳＫ９コンジュゲート投与群では、投与前にと比較して、投与後２〜６週間後の血中のＰＣＳＫ９値が上昇した。【００８８】
〔参考例３： ＫＬＨ−ＰＣＳＫ９コンジュゲートの血中脂質量に対する効果〕
ＫＬＨとマウスＰＣＳＫ９のエピトープペプチド（配列番号２６）をコンジュゲートしたＫＬＨ−ＰＣＳＫ９コンジュゲートを使用した。７週齢のＡｐｏＥ欠損マウスを日本チャールズリバーから購入した。ＫＬＨ−ＰＣＳＫ９コンジュゲート低用量群（5μg（PCSK9ペプチド）／mouse）、ＫＬＨ−ＰＣＳＫ９コンジュゲート高用量群（50μg（PCSK9ペプチド）／mouse）、ＫＬＨ投与群およびコントロールとして生理食塩水投与群を設けた。ＫＬＨ投与群のマウスには、コンジュゲート投与群に投与したコンジュゲートに含まれるＫＬＨと等量のＫＬＨを投与した。投与前にＫＬＨ−ＰＣＳＫ９コンジュゲートまたはＫＬＨ単独を等容積のフロイントアジュバント（和光純薬）と混合し、皮下投与した。初回はフロイント完全アジュバントを使用し、２回目以降はフロイント不完全アジュバントを使用した。合計３回（０、１４および２８日目）コンジュゲートを投与し、最終投与の２４週後に採血して脂質量を測定した。その結果、ＫＬＨ−ＰＣＳＫ９コンジュゲート投与群では、ＣＭ（カイロミクロン）、ＶＬＤＬの値が約半分に低下し、ＴＧ（中性脂肪）の値が約３分の２に低下した。【００８９】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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