(57)【要約】  細胞外マトリクス上にヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織を立体培養し、３Ｄオルガノイドを得る工程１と、  前記工程１で得られた前記３Ｄオルガノイドを分散させて単一細胞を調製し、前記単一細胞を細胞外マトリクス上で単層培養し、分化した絨毛細胞及び杯細胞を含むヒト腸管内腔を構成する上皮細胞が単層構造となっている２Ｄオルガイドを取得する工程２によって得られる、ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
2018038042.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリクス上にヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織を立体培養し、３Ｄオルガノイドを得る工程１と、
前記工程１で得られた前記３Ｄオルガノイドを分散させて単一細胞を調製し、前記単一細胞を細胞外マトリクス上で単層培養し、分化した絨毛細胞及び杯細胞を含むヒト腸管内腔を構成する上皮細胞が単層構造となっている２Ｄオルガイドを取得する工程２によって得られる、ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
【請求項２】
前記工程１及び工程２の培養において、ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、ｉｉ）インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２；ＦＧＦ２）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及びエピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ）からなる群から選ばれる少なくとも一種、ｉｉｉ）骨形成因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤、ｉｖ）形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）阻害剤、及びｖ）γセクレターゼ阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む細胞培養培地を用いる請求項１に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
【請求項３】
前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔタンパク質、Ｒ−スポンジン、及びＧＳＫ−３β阻害剤からなる群から選択される少なくとも一種である請求項２に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
【請求項４】
前記細胞培養培地がＩＧＦ１及びＦＧＦ２を含む請求項２又は３に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
【請求項５】
前記Ｗｎｔタンパク質がその安定化物質アファミンとの複合体を形成している請求項３又は４に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
【請求項６】
前記Ｗｎｔタンパク質が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項３〜５のいずれか一項に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
【請求項７】
前記Ｒ−スポンジンが、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、及びＲ−スポンジン４からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項３〜６のいずれか一項に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
【請求項８】
前記ＢＭＰ阻害剤が、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、グレムリン、コーディン、コーディンドメインを含むコーディン様タンパク質、フォリスタチン、フォリスタチンドメインを含むフォリスタチン関連タンパク質、ＤＡＮ、ＤＡＮシステインノットドメインを含むＤＡＮ様タンパク質、スクレロスチン／ＳＯＳＴ、及びα−２マクログロブリンからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項２〜７のいずれか一項に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
【請求項９】
前記ＢＭＰ阻害剤がノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）である請求項２〜８のいずれか一項に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
【請求項１０】
前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔタンパク質及びＲ−スポンジンである請求項２〜９のいずれか一項に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
【請求項１１】
前記ＴＧＦ−β阻害剤が、Ａ８３−０１、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、ＳＤ−２０８、ＬＹ−３６４９４、及びＳＪＮ−２５１１からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項２〜１０のいずれか一項に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
【請求項１２】
前記ＴＧＦ−β阻害剤が、Ａ８３−０１である請求項２〜１１のいずれか一項に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
【請求項１３】
前記細胞培養培地が動物由来胆汁を更に含む請求項２〜１２のいずれか一項に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
【請求項１４】
前記工程１及び工程２における細胞外マトリクスがマトリゲル（登録商標）である請求項１〜１３のいずれか一項に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド培養物。
【請求項１６】
無血清である請求項１５に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド培養物。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイドに、ヒト下痢症ウイルスを感染させて、感染した２Ｄオルガノイドを培養してヒト下痢症ウイルスを感染・増殖培養する工程３を有するヒト下痢症ウイルスの製造方法。
【請求項１８】
ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、ｉｉ）インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２；ＦＧＦ２）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及びエピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ）からなる群から選ばれる少なくとも一種、ｉｉｉ）骨形成因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤、ｉｖ）形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）阻害剤、及びｖ）γセクレターゼ阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む細胞培養培地を備えるヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド培養キット。
【請求項１９】
前記細胞培養培地が動物由来胆汁を更に含む請求項１８に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド培養キット。
【請求項２０】
ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、ｉｉ）インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２；ＦＧＦ２）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及びエピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ）からなる群から選ばれる少なくとも一種、ｉｉｉ）骨形成因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤、ｉｖ）形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）阻害剤、及びｖ）γセクレターゼ阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む細胞培養培地を備えるヒト下痢症ウイルス製造キット。
【請求項２１】
前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔタンパク質及びＲ−スポンジンである請求項２０に記載のヒト下痢症ウイルス製造キット。
【請求項２２】
前記Ｗｎｔタンパク質がその安定化物質アファミンとの複合体を形成している請求項２１に記載のヒト下痢症ウイルス製造キット。
【請求項２３】
前記細胞培養培地が動物由来胆汁を更に含む請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のヒト下痢症ウイルス製造キット。
【請求項２４】
細胞外マトリクス上にヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織を立体培養し、３Ｄオルガノイドを得る工程１と、
前記工程１で得られた前記３Ｄオルガノイドを分散させて単一細胞を調製し、前記単一細胞を細胞外マトリクス上で単層培養し、分化した絨毛細胞及び杯細胞を含むヒト腸管内腔を構成する上皮細胞が単層構造となっている２Ｄオルガイドを取得する工程２と、を有し、
前記工程１及び工程２の培養において、ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、ｉｉ）インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２；ＦＧＦ２）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及びエピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ）からなる群から選ばれる少なくとも一種、ｉｉｉ）骨形成因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤、ｉｖ）形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）阻害剤、及びｖ）γセクレターゼ阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む細胞培養培地を用いるヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイドの製造方法。
【請求項２５】
前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔタンパク質及びＲ−スポンジンである請求項２４に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイドの製造方法。
【請求項２６】
前記Ｗｎｔタンパク質がその安定化物質アファミンとの複合体を形成している請求項２５に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイドの製造方法。
【請求項２７】
前記細胞培養培地が動物由来胆汁を更に含む請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイドの製造方法。
【請求項２８】
前記工程１及び工程２における細胞外マトリクスがマトリゲル（登録商標）である請求項２４〜２７のいずれか一項に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド及びその使用に関する。より詳細には、ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド、ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド培養物、ヒト下痢症ウイルスの製造方法、ヒト下痢症ウイルス製造キット、ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド培養キット及びヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイドの製造方法に関する。本願は、２０１６年８月２４日に、日本に出願された特願２０１６−１６３７１１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトノロウイルス等のヒト下痢症ウイルスに感染した場合に、治療効果の高い抗ウイルス薬は未だ存在していない。ヒト下痢症ウイルスの多くは腸管上皮でしか感染，増殖することができないため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで人工的に大量に作り出すことができず、治療薬開発の大きな問題となっている。【０００３】
係る問題に対して、マウスノロウイルスを用いた細胞培養系が確立されている（例えば、非特許文献１参照。）。しかしながら、非特許文献１記載の細胞培養系では、ヒトウイルスを用いることができないため、ヒトウイルスの研究へ応用することができずヒトウイルスの細胞培養系の開発が待たれていた。【０００４】
一方、ヒト腸管上皮細胞の長期培養は長らく不可能であった。これは、ヒト腸管上皮幹細胞の維持に必要な増殖因子が不明であったためと考えられる。近年、ヒト腸管上皮幹細胞を、細胞外マトリクス上に接着し、ＢＭＰ阻害剤、分裂促進増殖因子及びＷｎｔアゴニストが添加された、ヒト細胞用の基本培地を含む細胞培養培地の存在下で培養することにより、長期間のヒト腸管上皮幹細胞を維持し分化させたオルガノイド培養に成功している（例えば、特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５４５８１１２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】環境感染誌ｖｏｌ．２４，ｎｏ．６，２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１の細胞培養培地はｐ３８阻害剤を含むため、係る培地を用いた培養方法では、分化抑制又は細胞死を引き起こすことがあり、改良の余地があった。【０００８】
本発明は、上記課題を解決するために、ヒト下痢症ウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏで大量に製造する方法、並びに、そのためのオルガノイド及びそのオルガノイド作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒト小腸由来のオルガノイドの製造方法を改良して得られた培養オルガノイドを使用することにより、ヒト下痢症ウイルスを感染させ増殖培養できることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１０】
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］細胞外マトリクス上にヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織を立体培養し、３Ｄオルガノイドを得る工程１と、
前記工程１で得られた前記３Ｄオルガノイドを分散させて単一細胞を調製し、前記単一細胞を細胞外マトリクス上で単層培養し、分化した絨毛細胞及び杯細胞を含むヒト腸管内腔を構成する上皮細胞が単層構造となっている２Ｄオルガイドを取得する工程２によって得られる、ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
［２］前記工程１及び工程２の培養において、ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、ｉｉ）インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２；ＦＧＦ２）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及びエピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ）からなる群から選ばれる少なくとも一種、ｉｉｉ）骨形成因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤、ｉｖ）形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）阻害剤、及びｖ）γセクレターゼ阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む細胞培養培地を用いる［１］に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
［３］前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔタンパク質、Ｒ−スポンジン、及びＧＳＫ−３β阻害剤からなる群から選択される少なくとも一種である［２］に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
［４］前記細胞培養培地がＩＧＦ１及びＦＧＦ２を含む［２］又は［３］に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
［５］前記Ｗｎｔタンパク質がその安定化物質アファミンとの複合体を形成している［３］又は［４］に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
［６］前記Ｗｎｔタンパク質が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６からなる群から選ばれる少なくとも一種である［３］〜［５］のいずれか一つに記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
［７］前記Ｒ−スポンジンがＲ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、及びＲ−スポンジン４からなる群から選ばれる少なくとも一種である［３］〜［６］のいずれか一つに記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
［８］前記ＢＭＰ阻害剤がノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、グレムリン、コーディン、コーディンドメインを含むコーディン様タンパク質、フォリスタチン、フォリスタチンドメインを含むフォリスタチン関連タンパク質、ＤＡＮ、ＤＡＮシステインノットドメインを含むＤＡＮ様タンパク質、スクレロスチン／ＳＯＳＴ、及びα−２マクログロブリンからなる群から選ばれる少なくとも一種である［２］〜［７］のいずれか一つに記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
［９］前記ＢＭＰ阻害剤がノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）である［２］〜［８］のいずれか一つに記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
［１０］前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔタンパク質及びＲ−スポンジンである［２］〜［９］のいずれか一つに記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
［１１］前記ＴＧＦ−β阻害剤が、Ａ８３−０１、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、ＳＤ−２０８、ＬＹ−３６４９４、及びＳＪＮ−２５１１からなる群から選ばれる少なくとも一種である［２］〜［１０］のいずれか一つに記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
［１２］前記ＴＧＦ−β阻害剤が、Ａ８３−０１である［２］〜［１１］のいずれか一つに記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
［１３］前記細胞培養培地が動物由来胆汁を更に含む［２］〜［１２］のいずれか一つに記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
［１４］前記工程１及び工程２における細胞外マトリクスがマトリゲル（登録商標）である［１］〜［１３］のいずれか一つに記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド。
［１５］［１］〜［１４］のいずれか一つに記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド培養物。
［１６］無血清である［１５］に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド培養物。
［１７］［１］〜［１４］のいずれか一つに記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイドに、ヒト下痢症ウイルスを感染させて、感染した２Ｄオルガノイドを培養してヒト下痢症ウイルスを感染・増殖培養する工程３を有するヒト下痢症ウイルスの製造方法。
［１８］ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、ｉｉ）インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２；ＦＧＦ２）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及びエピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ）からなる群から選ばれる少なくとも一種、ｉｉｉ）骨形成因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤、ｉｖ）形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）阻害剤、及びｖ）γセクレターゼ阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む細胞培養培地を備えるヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド培養キット。
［１９］前記細胞培養培地が動物由来胆汁を更に含む［１８］に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド培養キット。
［２０］ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、ｉｉ）インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２；ＦＧＦ２）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及びエピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ）からなる群から選ばれる少なくとも一種、ｉｉｉ）骨形成因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤、ｉｖ）形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）阻害剤、及びｖ）γセクレターゼ阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む細胞培養培地を備えるヒト下痢症ウイルス製造キット。
［２１］前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔタンパク質及びＲ−スポンジンである［２０］に記載のヒト下痢症ウイルス製造キット。
［２２］前記Ｗｎｔタンパク質がその安定化物質アファミンとの複合体を形成している［２１］に記載のヒト下痢症ウイルス製造キット。
［２３］前記細胞培養培地が動物由来胆汁を更に含む［２０］〜［２２］のいずれか一つに記載のヒト下痢症ウイルス製造キット。
［２４］細胞外マトリクス上にヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織を立体培養し、３Ｄオルガノイドを得る工程１と、
前記工程１で得られた前記３Ｄオルガノイドを分散させて単一細胞を調製し、前記単一細胞を細胞外マトリクス上で単層培養し、分化した絨毛細胞及び杯細胞を含むヒト腸管内腔を構成する上皮細胞が単層構造となっている２Ｄオルガイドを取得する工程２と、を有し、
前記工程１及び工程２の培養において、ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、ｉｉ）インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２；ＦＧＦ２）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及びエピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ）からなる群から選ばれる少なくとも一種、ｉｉｉ）骨形成因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤、ｉｖ）形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）阻害剤、及びｖ）γセクレターゼ阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む細胞培養培地を用いるヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイドの製造方法。
［２５］前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔタンパク質及びＲ−スポンジンである［２４］に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイドの製造方法。
［２６］前記Ｗｎｔタンパク質がその安定化物質アファミンとの複合体を形成している［２５］に記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイドの製造方法。
［２７］前記細胞培養培地が動物由来胆汁を更に含む［２４］〜［２６］のいずれか一つに記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイドの製造方法。
［２８］前記工程１及び工程２における細胞外マトリクスがマトリゲル（登録商標）である［２４］〜［２７］のいずれか一つに記載のヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイドの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ヒト下痢症ウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖培養することにより大量に製造する方法、及びそのためのオルガノイドの製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本実施形態のヒト下痢症ウイルスの増殖培養による製造方法の説明図である。
【図２】実施例２におけるｑＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図３】上段は、実施例２におけるノロウイルスを感染させたオルガノイドの免疫染色像である。下段は、上段の模式図である。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は実験例３における２Ｄオルガノイドの光学顕微鏡写真である。
【図５】（ａ）及び（ｂ）は実験例４におけるｑＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［ヒト下痢症ウイルスの製造方法］
一実施形態として、本発明は、細胞外マトリクス上にヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織を立体培養し、３Ｄオルガノイドを得る工程１と、前記工程１で得られた前記３Ｄオルガノイドを分散させて単一細胞を調製し、前記単一細胞を細胞外マトリクス上で単層培養し、分化した絨毛細胞及び杯細胞を含むヒト腸管内腔を構成する上皮細胞が単層構造となっている２Ｄオルガイドを取得する工程２と、前記工程２で得られた２Ｄオルガノイドに、ヒト下痢症ウイルスを感染させて、感染した２Ｄオルガノイドを培養してヒト下痢症ウイルスを感染・増殖培養する工程３と、を有し、前記工程１、工程２、及び工程３の培養において、所定の細胞培養培地を用いるヒト下痢症ウイルスの製造方法を提供する。先ず、工程１、工程２、及び工程３の培養に用いられる培地について説明する。なお、本実施形態において、工程１、工程２、及び工程３の培養に用いられる培地は、全て同一の培地であってもよいし、それぞれ異なる培地であってもよい。
【００１４】
（細胞培養培地）
本実施形態に用いられる培地は、ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、ｉｉ）インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２；ＦＧＦ２）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及びエピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ）からなる群から選ばれる少なくとも一種、ｉｉｉ）骨形成因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤、ｉｖ）形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）阻害剤、及びｖ）γセクレターゼ阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む細胞培養培地である。
【００１５】
本実施形態に係る細胞培養培地によれば、実質的にｐ３８阻害剤を含まず、ヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織を長期間培養することができる。
【００１６】
本明細書において、ヒト腸管上皮細胞とはヒト腸管上皮組織から取得した分化したヒト腸管上皮細胞及びヒト腸管上皮幹細胞を含む。「ヒト腸管上皮幹細胞」とは、長期間の自己複製機能とヒト腸管上皮分化細胞への分化能をもつ細胞を意味し、ヒト腸管上皮組織に由来する幹細胞を意味する。
【００１７】
本明細書において、「オルガノイド」とは、細胞を制御した空間内に高密度に集積させることにより自己組織化した立体的な細胞組織体を意味する。
【００１８】
本明細書において、「実質的に含まない」とは、特定成分を全く含まない、若しくは特定成分が有する機能を発揮しない程度の濃度しか含まないことを意味する。
【００１９】
よって、「実質的にｐ３８阻害剤を含まない」とは、ｐ３８阻害剤を全く含まない、又はｐ３８阻害剤による分化抑制及び細胞死が起きない程度の濃度しか含まないことを意味する。
【００２０】
本実施形態に係る細胞培養培地は、ＩＧＦ１、ＦＧＦ２、ＥＧＦ及びエピレグリンからなる群から選ばれる少なくとも一種を含むことが好ましく、前記４種類の因子のいずれを含有するかは適宜選択することができる。中でも、本実施形態に係る細胞培養培地は、ＩＧＦ１及びエピレグリン、ＦＧＦ２及びエピレグリン、又は、ＩＧＦ１及びＦＧＦ２を含むことが好ましく、ＩＧＦ１及びＦＧＦ２を含むことがより好ましい。
【００２１】
上記因子を含むことにより、実質的にＥＧＦ及びｐ３８阻害剤を含まずとも、ヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
【００２２】
（細胞培養基本培地）
本実施形態に係る細胞培養培地には、あらゆる無血清の細胞培養基本培地が含まれる。本実施形態に係る細胞培養培地は、ヒト細胞用であることが好ましい。
【００２３】
係る無血清の細胞培養基本培地としては、例えば、炭酸系の緩衝液でｐＨ７．２以上ｐＨ７．６以下に緩衝化されている規定の合成培地等が挙げられる。より具体的には、グルタミン、インスリン、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎ（和光純薬）、ペニシリン又はストレプトマイシン、及びトランスフェリンが補充されたアドバンスト−ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ−１２混合培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２；ＤＭＥＭ／Ｆ１２）が挙げられる。
【００２４】
また、アドバンスト−ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ−１２混合培地に替えてＲＰＭＩ１６４０培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １６４０  ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、並びに、アドバンストＲＰＭＩ培地等も挙げられる。
【００２５】
上記本実施形態に係る細胞培養培地は、ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）又はｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）等の不確定な成分を実質的に含まない。また、上記細胞培養培地に５％血清を含んでもよい。
【００２６】
（Ｗｎｔアゴニスト）
本明細書において、「Ｗｎｔアゴニスト」とは、細胞内でＴ−ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（以下、ＴＣＦともいう。）／ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｆａｃｔｏｒ（以下、ＬＥＦともいう。）介在性の転写を活性化する薬剤を意味する。よって、Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔファミリータンパク質に限定されず、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーメンバーに結合して活性化するＷｎｔアゴニスト、細胞内β−カテニン分解の阻害剤、及びＴＣＦ／ＬＥＦの活性化物質を包含する。Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔタンパク質、Ｒ−スポンジン、及びＧＳＫ−３β阻害剤からなる群から選択される少なくとも一種であることが好ましく、Ｗｎｔタンパク質及びＲ−スポンジンであることがより好ましい。
【００２７】
Ｗｎｔアゴニストは、該Ｗｎｔアゴニストの非存在下でのＷｎｔ活性のレベルと比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％、細胞においてＷｎｔ活性を刺激する。Ｗｎｔ活性は、当業者にとって公知の方法を用いて、例えばｐＴＯＰＦＬＡＳＨ及びｐＦＯＰＦＬＡＳＨ  Ｔｃｆルシフェラーゼレポーターコンストラクトによって、Ｗｎｔの転写活性を測定することにより調べることができる（参考文献：Ｋｏｒｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１７８４−１７８７）。
【００２８】
ヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織の培養においては、Ｗｎｔアゴニストが含まれることが好ましい。本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるＷｎｔアゴニストとしては、Ｗｎｔタンパク質とアファミンとの複合体が含まれることがより好ましく、Ｗｎｔタンパク質とアファミンとの複合体及びＲ−スポンジン（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ）の両方が含まれることが更に好ましい。本実施形態に係る細胞培養培地において、Ｗｎｔタンパク質とアファミンとの複合体及びＲ−スポンジンを含むことで、ヒト腸管上皮幹細胞又はヒト腸管上皮細胞は、オルガノイドをより高効率で形成することができる。
【００２９】
（Ｗｎｔタンパク質）
Ｗｎｔアゴニストの一種であるＷｎｔタンパク質としては、由来は特に限定されず、各種生物由来のＷｎｔタンパク質を用いることができる。中でも、哺乳動物由来のＷｎｔタンパク質であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウサギ等が挙げられる。哺乳動物のＷｎｔタンパク質としては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６等が挙げられる。本実施形態に係る細胞培養培地において、Ｗｎｔタンパク質は複数種を組み合わせて用いてもよい。
【００３０】
Ｗｎｔタンパク質を製造する方法としては、例えば、Ｗｎｔタンパク質発現細胞を用いて製造する方法等が挙げられる。Ｗｎｔタンパク質発現細胞において、細胞の由来（生物種、培養形態等）は特に限定されず、Ｗｎｔタンパク質を安定発現する細胞であればよく、Ｗｎｔタンパク質を一過性に発現する細胞でもよい。Ｗｎｔタンパク質発現細胞としては、例えば、マウスＷｎｔ３ａを安定発現するＬ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６４７）、マウスＷｎｔ５ａを安定発現するＬ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２８１４）等が挙げられる。また、Ｗｎｔタンパク質発現細胞は、公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。すなわち、所望のＷｎｔタンパク質をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することにより、Ｗｎｔタンパク質発現細胞を作製することができる。所望のＷｎｔタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得することができる。
【００３１】
Ｗｎｔタンパク質発現細胞により発現されるＷｎｔタンパク質は、Ｗｎｔ活性を有する限り、Ｗｎｔタンパク質のフラグメントでもよく、Ｗｎｔタンパク質のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含むものでもよい。Ｗｎｔタンパク質のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列について、特に限定はなく、例えばアフィニティータグのアミノ酸配列等が挙げられる。また、Ｗｎｔタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列と完全に一致している必要はなく、Ｗｎｔ活性を有する限り、公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列であってもよい。
【００３２】
ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得できるＷｎｔタンパク質のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列等が挙げられる。
【００３３】
「１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法等により、欠失、置換若しくは付加できる程度の数（１０個以下が好ましく、７個以下がより好ましく、６個以下がさらに好ましい。）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていることを意味する。
【００３４】
また、実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列との同一性が、少なくとも８０％以上であり、好ましくは少なくとも８５％以上、より好ましくは少なくとも９０％以上、さらに好ましくは少なくとも９２％以上、特に好ましくは少なくとも９５％以上、最も好ましくは少なくとも９９％以上であるアミノ酸配列等が挙げられる。
【００３５】
Ｗｎｔタンパク質の活性は、例えば、ＴＣＦレポーターアッセイにより確認することができる。一般的に、ＴＣＦレポーターアッセイとは、Ｗｎｔシグナルが細胞に入ると特異的に活性化される転写因子であるＴ−ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＣＦ）の結合配列を持つルシフェラーゼ遺伝子を導入し、Ｗｎｔタンパク質の活性の強さをルシフェラーゼの発光によって、簡便に評価する方法である（参考文献：Ｍｏｌｅｎａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８６，３９１，１９９６．）。ＴＣＦレポーターアッセイ以外の方法としては、Ｗｎｔシグナルが入ると細胞内のβカテニンが安定化することを利用して、βカテニンの量をウエスタンブロッティグによって定量評価する方法（参考文献：Ｓｈｉｂａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｔｏ  ｃｅｌｌｓ，３，６５９，１９９８．）等が挙げられる。また、Ｗｎｔ５ａ等のように、ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｐａｔｈｗａｙを介して細胞にシグナルを与えるＷｎｔタンパク質については、細胞内アダプタータンパク質であるＤｖｌ２のリン酸化を評価することでＷｎｔタンパク質の活性を評価する方法（参考文献：Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２９，３４７０，２０１０．）等を用いることができる。
【００３６】
（Ｒ−スポンジン（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ））
Ｗｎｔアゴニストの一種であるＲ−スポンジンとしては、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、及びＲ−スポンジン４からなるＲ−スポンジンファミリーが挙げられる。Ｒ−スポンジンファミリーは、分泌タンパク質であり、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化及び制御に関わることが知られている。本実施形態に係る細胞培養培地において、Ｒ−スポンジンを複数種組み合わせて用いてもよい。
【００３７】
Ｒ−スポンジン活性を有する限り、Ｒ−スポンジンのフラグメントでもよく、Ｒ−スポンジンのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含むものでもよい。
【００３８】
（含有量）
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるＷｎｔタンパク質の濃度は、５０ｎｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、１００ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、２００ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましく、３００ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることが特に好ましい。ヒト腸管上皮幹細胞の培養中、好ましくは２日ごとにＷｎｔアゴニストを培養培地に添加し、好ましくは４日ごとに細胞培養培地を新鮮なものに交換する。
【００３９】
（ＧＳＫ−３β阻害剤）
公知のＧＳＫ−３β阻害剤は、ＣＨＩＲ−９９０２１、ＣＨＩＲ−９８０１４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、リチウム（Ｓｉｇｍａ）、ケンパウロン（Ｂｉｏｍｏｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｅｏｓｔ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６７，５９８３−５９９４）、６−ブロモインジルビン−３０−アセトキシム（Ｍｅｙｅｒ，Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０，１２５５−１２６６）、ＳＢ  ２１６７６３およびＳＢ  ４１５２８６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、並びにＧＳＫ−３とａｘｉｎとの相互作用を阻止するＦＲＡＴファミリーメンバー及びＦＲＡＴ由来ペプチドを含む。概説は、参照により本明細書に組み入れられる、Ｍｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２５，４７１−４８０に示されている。ＧＳＫ−３β阻害のレベルを決定するための方法およびアッセイは当業者に公知であり、例えば、Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４５（６）２９４１−２９４９に記載の方法およびアッセイを含む。
【００４０】
（アファミン）
本明細書において、「アファミン」とは、アルブミンファミリーに属する糖タンパク質を意味し、血液又は体液中に存在することが知られている。細胞培養に用いる培地に通常添加される血清には、当該血清を採取した動物由来のアファミンが含まれている。血清中にはアファミン以外の不純物等を含むため、本実施形態に係る細胞培養培地においては、血清を用いずに、アファミンを単独で使用することが好ましい。
【００４１】
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるアファミンは、由来は特に限定されず、各種生物由来のアファミンを用いることができる。中でも、哺乳動物由来のアファミンであることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、上述の［Ｗｎｔタンパク質］と同様のものが挙げられる。主な哺乳動物のアファミンのアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得することができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ヒトアファミンのアミノ酸配列はＡＡＡ２１６１２、これをコードする遺伝子の塩基配列はＬ３２１４０のアクセッション番号で登録されており、ウシアファミンのアミノ酸配列はＤＡＡ２８５６９、これをコードする遺伝子の塩基配列はＧＪ０６０９６８のアクセッション番号で登録されている。
【００４２】
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるアファミンは、血清等に含まれる天然のアファミンを公知の方法で精製したものでもよく、組換えアファミンであってもよい。組換えアファミンは、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。
【００４３】
組換えアファミンの製造方法としては、例えば、アファミンをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入して組換えアファミンを発現させ、公知の精製方法を用いて精製することにより製造することができる。組換えアファミンは、アフィニティータグを付加したアファミンであってもよい。付加するアフィニティータグは特に限定されず、公知のアフィニティータグから適宜選択して用いることができる。アフィニティータグとしては、特異的抗体により認識されるアフィニティータグであることが好ましく、例えば、ＦＬＡＧタブ、ＭＹＣタグ、ＨＡタグ、Ｖ５タグ等が挙げられる。
【００４４】
上述のＷｎｔタンパク質は、特定のセリン残基が脂肪酸（パルミトレイン酸）で修飾されているため、強い疎水性を有する。そのため、Ｗｎｔタンパク質は、水溶液中では凝集又は変性しやすいため、精製及び保存が非常に難しいことが広く知られている。
【００４５】
一方、この特定のセリン残基の脂肪酸による修飾は、Ｗｎｔタンパク質の生理活性に必須であり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーメンバーとの結合に関与することが報告されている。
【００４６】
また、水溶液中において、Ｗｎｔタンパク質がアファミンと１対１で結合し複合体を形成し、高い生理活性を保ちながら、可溶化する知見もある（Ａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄａｔｅｄ  Ｗｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  Ａ  ｓｅｒｕｍ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｆａｍｉｎ／α−ａｌｂｕｍｉｎ．Ｍｉｈａｒａ  Ｅ，Ｈｉｒａｉ  Ｈ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｈ，Ｔａｍｕｒａ−Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｋ，Ｍａｔａｎｏ  Ｍ，Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ａ，Ｓａｔｏ  Ｔ，Ｔａｋａｇｉ  Ｊ．Ｅｌｉｆｅ．２０１６  Ｆｅｂ  ２３；５．）。
【００４７】
係る知見に基づき、Ｗｎｔタンパク質及びアファミンの両方を発現する細胞を培養する方法により、Ｗｎｔタンパク質−アファミン複合体を製造してもよく、Ｗｎｔタンパク質発現細胞とアファミン発現細胞を共培養する方法により、Ｗｎｔタンパク質−アファミン複合体を製造してもよい。Ｗｎｔタンパク質−アファミン複合体中のＷｎｔタンパク質の活性は、上述の［Ｗｎｔタンパク質］と同様の方法を用いて、評価することができる。
【００４８】
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるアファミンの濃度は、特に限定されないが、５０ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１００ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、３００μｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
【００４９】
（インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１））
一般的に、「インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１）」は、別名ソマトメジンＣとも呼ばれ、主に、肝臓で成長ホルモン（ＧＨ）による刺激により分泌される因子である。人体の殆どの細胞（特に、筋肉、骨、肝臓、腎臓、神経、皮膚及び肺等の細胞）は、ＩＧＦ１の影響を受けることが知られている。ＩＧＦ１は、インスリン様効果に加え、細胞成長（特に、神経細胞）及び発達、並びに、細胞ＤＮＡ合成を調節する機能を有する。
【００５０】
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるＩＧＦ１の濃度は、特に限定されないが、５ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以上５００ｎｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
【００５１】
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるＩＧＦ１の濃度が上記範囲であることにより、実質的にｐ３８阻害剤を含まずとも、ヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織を長期間培養することができる。
【００５２】
また、ヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
【００５３】
また、ヒト腸管上皮幹細胞の培養中、２日ごとにＩＧＦ１を培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
【００５４】
（線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２；ＦＧＦ２））
一般的に、「線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２；ＦＧＦ２）とは、塩基性の線維芽細胞増殖因子であって、線維芽細胞増殖因子受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＦＧＦＲ）と結合し、血管内皮細胞の増殖促進と筒状構造への組織化、すなわち血管新生を促進する機能を有する。また、ヒトＦＧＦ２は低分子量型（ＬＷＬ）と高分子量型（ＨＷＬ）の２つのアイソフォームを持つことが知られている。ＬＷＬは主に細胞質に存在し、自己分泌（オートクリン）で作用し、一方、ＨＷＬは核内にあり、細胞内で作用するイントラクリン機構で活性を示す。
【００５５】
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるＦＧＦ２の濃度は、特に限定されないが、５ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以上５００ｎｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
【００５６】
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるＦＧＦ２の濃度が上記範囲であることにより、実質的にｐ３８阻害剤を含まずとも、ヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織を長期間培養することができる。
【００５７】
また、ヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
【００５８】
また、ヒト腸管上皮幹細胞の培養中、２日ごとにＦＧＦ２を培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
【００５９】
（エピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ））
一般的に、「エピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ）とは、チロシンキナーゼ（ＥｒｂＢ）ファミリー受容体（ＥｒｂＢ１〜４）のうち、ＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ４に特異的に結合するＥＧＦ様成長因子である。ケラチン生成細胞、肝細胞、繊維芽細胞、及び血管内皮細胞の増殖を刺激することが知られている。また、ＥＲＥＧは、主に膀胱、肺、腎臓、大腸等のガン腫瘍、胎盤、及び末梢血白血球において発現している。
【００６０】
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるＥＲＥＧの濃度は、特に限定されないが、５ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以上５００ｎｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
【００６１】
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるＥＲＥＧの濃度が上記範囲であることにより、実質的にｐ３８阻害剤を含まずとも、ヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織を長期間培養することができる。
【００６２】
また、ヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
【００６３】
また、ヒト腸管上皮幹細胞の培養中、２日ごとにＥＲＥＧを培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
【００６４】
（ＢＭＰ阻害剤）
骨形成因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）は、二量体リガンドとして二種類の異なる受容体セリン／スレオニンキナーゼ、Ｉ型及びＩＩ型受容体からなる受容体複合体に結合する。ＩＩ型受容体はＩ型受容体をリン酸化し、その結果、この受容体キナーゼが活性化される。このＩ型受容体は、続いて特異的な受容体基質（ＳＭＡＤ）をリン酸化し、その結果、シグナル伝達経路によって転写活性が導かれる。一般的に、ＢＭＰ阻害剤は、例えば、ＢＭＰ受容体へのＢＭＰ分子の結合を阻止又は阻害するものであって、ＢＭＰ活性を中和する複合体を形成するためにＢＭＰ分子に結合する薬剤である。また、ＢＭＰ阻害剤は、例えば、ＢＭＰ受容体と結合し、ＢＭＰ分子の受容体への結合を阻止又は阻害するものであって、アンタゴニスト又は逆アゴニストとして作用する薬剤である。
【００６５】
ＢＭＰ阻害剤は、この阻害剤の非存在下でのＢＭＰ活性レベルと比較して、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上の阻害活性を有する。ＢＭＰ阻害活性は、当業者にとって公知の方法（参考文献：Ｚｉｌｂｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，８：４１，２００７．）を用いて、ＢＭＰの転写活性を測定することによって、評価することができる。
【００６６】
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるＢＭＰ阻害剤としては、天然のＢＭＰ結合タンパク質であることが好ましく、例えば、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、グレムリン、コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、コーディンドメイン等のコーディン様タンパク質；フォリスタチン（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）、フォリスタチンドメイン等のフォリスタチン関連タンパク質；ＤＡＮ、ＤＡＮシステイン−ノットドメイン等のＤＡＮ様タンパク質；スクレロスチン／ＳＯＳＴ、デコリン、α−２マクログロブリン等が挙げられる。
【００６７】
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるＢＭＰ阻害剤としては、中でも、コーディン様タンパク質又はＤＡＮ様タンパク質が好ましく、コーディン様タンパク質がより好ましい。コーディン様タンパク質としては、ノギンが好ましい。コーディン様タンパク質やＤＡＮ様タンパク質は拡散性タンパク質であり、様々な親和度でＢＭＰ分子に結合し、シグナル伝達受容体へのＢＭＰ分子の接近を阻害することができる。上皮幹細胞を培養する場合において、これらのＢＭＰ阻害剤を細胞培養培地に添加することにより、幹細胞の喪失を妨げることができる。
【００６８】
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるＢＭＰ阻害剤の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、２０ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。幹細胞の培養中、２日ごとにＢＭＰ阻害剤を培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
【００６９】
（ＴＧＦ−β阻害剤）
形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）は、増殖因子の一種であり、腎臓、骨髄、血小板等ほぼすべての細胞で産生される。ＴＧＦ−βには、５種類のサブタイプ（β１〜β５）が存在する。また、ＴＧＦ−βは、骨芽細胞の増殖、並びに、コラーゲンのような結合組織の合成及び増殖を促進し、上皮細胞の増殖や破骨細胞に対しては抑制的に作用することが知られている。一般的に、ＴＧＦ−β阻害剤は、例えば、ＴＧＦ−β受容体へのＴＧＦ−βの結合を阻止又は阻害するものであって、ＴＧＦ−β活性を中和する複合体を形成するためにＴＧＦ−βに結合する薬剤である。また、ＴＧＦ−β阻害剤は、例えば、ＴＧＦ−β受容体と結合し、ＴＧＦ−βの受容体への結合を阻止又は阻害するものであって、アンタゴニスト又は逆アゴニストとして作用する薬剤である。
【００７０】
ＴＧＦ−β阻害剤は、この阻害剤の非存在下でのＴＧＦ−β活性レベルと比較して、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上の阻害活性を有する。ＴＧＦ−β阻害活性は、当業者にとって公知の方法で評価することができる。係る評価系としては、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を動かすヒトＰＡＩ−１プロモーター又はＳｍａｄ結合部位を含むレポーター構築物を用いて細胞が安定にトランスフェクトされている細胞アッセイが挙げられる（参考文献：Ｄｅ  Ｇｏｕｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１４５（２）：１６６−１７７，２００５．）。
【００７１】
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるＴＧＦ−β阻害剤としては、例えば、Ａ８３−０１（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１−フェニルチオカルバモイル−４−キノリン−４−イルピラゾール）、ＡＬＫ５  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉ（３−（ピリジン−２−イル）−４−（４−キノニル）−１Ｈ−ピラゾール）、ＬＤＮ１９３１８９（４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン）、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−ピリジン‐２‐イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩水和物）、ＳＤ−２０８（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）プテリジン−４−イル）ピリジン−４−イル−アミン）、ＳＢ−５２５３３４（６−［２−（１，１−ジメチルエチル）−５−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］キノキサリン）、ＬＹ−３６４９４７（４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン）、ＬＹ２１５７２９９（４−［２−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−３−イル］−キノリン−６−カルボン酸アミド）、ＴＧＦ−β  ＲＩ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ  ６１６４５２（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）、ＴＧＦ−β  ＲＩ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩＩ  ６１６４５３（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−４−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン，  ＨＣｌ）、ＴＧＦ−β  ＲＩ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＸ  ６１６４６３（４−（（４−（（２，６−ジメチルピリジン−３−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド）、ＴＧＦ−β  ＲＩ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＶＩＩ  ６１６４５８（１−（２−（（６，７−ジメトキシ−４−キノリル）オキシ）−（４，５−ジメチルフェニル）−１−エタノン）、ＴＧＦ−β  ＲＩ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ６１６４５９（６−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−キノキサリン）、ＡＰ１２００９（ＴＧＦ−β２アンチセンス化合物“Ｔｒａｂｅｄｅｒｓｅｎ”）、Ｂｅｌａｇｅｎｐｕｍａｔｕｃｅｌ−Ｌ（ＴＧＦ−β２アンチセンス遺伝子修飾同種異系腫瘍細胞ワクチン）、ＣＡＴ−１５２（Ｇｌａｕｃｏｍａ−ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ（抗−ＴＧＦ−β−２モノクローナル抗体））、ＣＡＴ−１９２（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ（ＴＧＦβ１を中和するヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体）、ＧＣ−１００８（抗−ＴＧＦ−βモノクローナル抗体）等が挙げられる。本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるＴＧＦ−β阻害剤としては、中でも、Ａ８３−０１が好ましい。
【００７２】
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるＴＧＦ−β阻害剤の濃度は、１００ｎＭ以上１０μＭ以下であることが好ましく、５００ｎＭ以上５μＭ以下であることがより好ましく、５００ｎＭ以上２μＭ以下であることがさらに好ましい。幹細胞の培養中、２日ごとにＴＧＦ−β阻害剤を培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
【００７３】
（γセクレターゼ阻害剤）
γセクレターゼ阻害剤は、この阻害剤の非存在下でのγセクレターゼ活性レベルと比較して、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上の阻害活性を有する。γセクレターゼ阻害活性は、当業者にとって公知の方法で評価することができる。
【００７４】
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるγセクレターゼとしては、例えば、ＢＭＳ２９９８９７、ＤＡＰＴ、ＤＢＺ，ＪＬＫ６、Ｌ−６８５，４５８、ＬＹ４１１５７５等が挙げられる。本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるγセクレターゼとしては、中でも、ＬＹ４１１５７５が好ましい。
【００７５】
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるγセクレターゼ阻害剤の濃度は、１ｎＭ以上１０μＭ以下であることが好ましく、１００ｎＭ以上１μＭ以下であることがさらに好ましい。
【００７６】
細胞１個あたりのヒト下痢症ウイルスの生産量増加の観点から、γセクレターゼ阻害剤は、工程２の単層培養で用いることが好ましい。幹細胞の培養中、２日ごとにγセクレターゼ阻害剤を培養培地に添加することが好ましく、４日間培養培地に添加することが好ましい。
【００７７】
（分裂促進増殖因子）
本実施形態に係る細胞培養培地に含まれていてもよい分裂促進増殖因子としては、例えば、上皮増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ；ＢＤＮＦ）、ケラチン生成細胞増殖因子（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＫＧＦ）等の増殖因子のファミリーが挙げられる。これらの分裂促進増殖因子は複数種類を組み合わせて用いてもよい。
【００７８】
ＥＧＦは、様々な培養外胚葉性細胞及び中胚葉性細胞に対する強力な分裂促進因子であり、一部の繊維芽細胞の、特異的細胞の分化に顕著な影響を有する。ＥＧＦ前駆体は、タンパク質分解により切断されて、細胞を刺激する５３−アミノ酸ペプチドホルモンを生成させる、膜結合分子として存在する。
【００７９】
前記細胞培養培地に含まれていてもよい分裂促進増殖因子としては、中でも、ＥＧＦが好ましい。本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるＥＧＦの濃度は、５ｎｇ／ｍＬ以上５００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以上４００ｎｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以２００ｎｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
【００８０】
また、前記細胞培養培地にＫＧＦを含む場合においても、ＫＧＦと同様の含有量であることが好ましい。複数のＫＧＦ、例えばＫＧＦ１及びＫＧＦ２（ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０としても知られている。）を使用する場合は、ＫＧＦの総含有量が上記範囲であることが好ましい。幹細胞の培養中、２日ごとに分裂促進増殖因子を培養培地に添加することが好ましく、４日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
【００８１】
（その他成分）
本実施形態に係る細胞培養培地は、さらに、Ｒｏｃｋ（Ｒｈｏ−キナーゼ）阻害剤を含んでいてもよい。Ｒｏｃｋ阻害剤としては、例えば、Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩一水和物）、ファスジル（ＨＡ１０７７）（５−（１，４−ジアゼパン−１−イルスルホニル）イソキノリン）、Ｈ−１１５２（（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］−ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピン二塩酸塩）等が挙げられる。Ｒｏｃｋ阻害剤として、Ｙ−２７６３２を用いる場合は、単細胞に分散された幹細胞の培養の最初の２日間に添加することが好ましい。本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるＹ−２７６３２は、約１０μＭであることが好ましい。
【００８２】
本実施形態に係る細胞培養培地は、さらに、ガストリン（又はＬｅｕ１５−ガストリン等の適切な代替物）が添加されてもよい。本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるガストリン（又は適切な代替物）濃度は、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬであってよく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であってよく、例えば５ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であってよい。
【００８３】
本実施形態に係る細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種のアミノ酸を含んでもよい。本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるアミノ酸としては、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、及びその組み合わせ等が挙げられる。一般的に、細胞培養培地に含まれるＬ−グルタミンの濃度は０．０５ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下（通常、０．１ｇ／Ｌ以上０．７５ｇ／Ｌ以下）である。細胞培養培地に含まれるその他のアミノ酸は、０．００１ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ（通常、０．０１ｇ／Ｌ以上０．１５ｇ／Ｌ以下）である。アミノ酸は合成由来でもよい。
【００８４】
本実施形態に係る細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種のビタミンを含んでいてもよい。本実施形態に係る細胞培養培地に含まれるビタミンとしては、例えば、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ナイアシン（ビタミンＢ３）、Ｄ−パントテン酸カルシウム（ビタミンＢ５）、ピリドキサール／ピリドキサミン／ピリドキシン（ビタミンＢ６）、葉酸（ビタミンＢ９）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、カルシフェロール（ビタミンＤ２）、ＤＬ−αトコフェロール（ビタミンＥ）、ビオチン（ビタミンＨ）、メナジオン（ビタミンＫ）等が挙げられる。
【００８５】
本実施形態に係る細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種の無機塩を含んでいてもよい。本実施形態に係る細胞培養培地に含まれる無機塩は、細胞の浸透圧平衡の維持を助けるために、および膜電位の調節を助けるためのものである。無機塩の具体例としては、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛の塩が挙げられる。塩は、通常、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及び重炭酸塩の形で用いられる。さらに具体的な塩には、ＣａＣｌ２、ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ、Ｆｅ（ＮＯ３）−９Ｈ２Ｏ、ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、ＭｇＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＫＣｌ、ＮａＨＣＯ３、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４−Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ等が挙げられる。
【００８６】
本実施形態に係る細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種の炭素エネルギー源となり得る糖を含んでいてもよい。本実施形態に係る細胞培養培地に含まれる糖としては、例えば、グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトース等が挙げられる。中でも、糖としては、グルコースが好ましく、Ｄ−グルコース（デキストロース）が特に好ましい。本実施形態に係る細胞培養培地に含まれる糖の濃度は、１ｇ／Ｌ以上１０ｇ／Ｌであることが好ましい。
【００８７】
本実施形態に係る細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種の微量元素を含んでいてもよい。本実施形態に係る細胞培養培地に含まれる微量元素としては、例えば、バリウム、ブロミウム、コバルト、ヨウ素、マンガン、クロム、銅、ニッケル、セレン、バナジウム、チタン、ゲルマニウム、モリブデン、ケイ素、鉄、フッ素、銀、ルビジウム、スズ、ジルコニウム、カドミウム、亜鉛、アルミニウム又はこれらのイオン等が挙げられる。
【００８８】
本実施形態に係る細胞培養培地は、さらに、少なくとも１種の付加的な薬剤を含んでいてもよい。係る薬剤としては、幹細胞培養を改善することが報告されている栄養素又は増殖因子、例えば、コレステロール／トランスフェリン／アルブミン／インシュリン／プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸塩／他の因子等が挙げられる。
【００８９】
本実施形態に係る細胞培養培地は、動物由来胆汁を更に含んでいてもよい。実施例において後述するように、細胞培養培地に動物由来胆汁を添加することにより、ヒト下痢症ウイルスの増殖を顕著に促進することができる。動物由来胆汁としては、ウシ胆汁抽出物、ブタ胆汁抽出物等が挙げられる。これらの胆汁抽出物は市販されているものであってもよい。
【００９０】
（工程１）
工程１は、細胞外マトリクス上にヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織を立体培養し、３Ｄオルガノイドを得る工程である。
【００９１】
工程１において、細胞外マトリクスを調製する細胞外マトリクス調製工程と、細胞外マトリクス中のヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織を、細胞外マトリクス上に接着させる接着工程と、前記接着工程後に、上述の細胞培養培地を添加し、前記ヒト腸管上皮幹細胞、前記ヒト腸管上皮細胞、又は前記これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織を培養し、オルガノイドを形成させるオルガノイド形成工程と、を備えることが好ましい。工程１が備える好ましい工程について、以下に詳細に説明する。
【００９２】
《細胞外マトリクス調製工程》
一般的に、「細胞外マトリクス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）」とは、生物において細胞の外に存在する超分子構造を意味する。このＥＣＭは、上皮幹細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれらを含む組織が増殖するための足場となる。
【００９３】
ＥＣＭは、様々な多糖、水、エラスチン、及び糖タンパク質を含む。糖タンパク質としては、例えば、コラーゲン、エンタクチン（ナイドジェン）、フィブロネクチン、ラミニン等が挙げられる。
【００９４】
ＥＣＭの調製方法としては、例えば、結合組織細胞を用いる方法等が挙げられる。より具体的には、ＥＣＭ産生細胞、例えば、線維芽細胞を培養した後に、これらの細胞を取り出し、上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれらを含む組織を添加することによって、ＥＣＭを足場として用いることができる。
【００９５】
ＥＣＭ産生細胞としては、例えば、主にコラーゲン及びプロテオグリカンを産生する軟骨細胞、主にＩＶ型コラーゲン、ラミニン、間質プロコラーゲン、及びフィブロネクチンを産生する線維芽細胞、主にコラーゲン（Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＶ型）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、及びテネイシン−Ｃを産生する結腸筋線維芽細胞等が挙げられる。または、市販のＥＣＭを用いてもよい。市販のＥＣＭとしては、例えば、細胞外マトリクスタンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞に由来する基底膜調製物（例えば、マトリゲル（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製））等が挙げられる。ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ（ＳｉｇｍａＺ３７８６６６）等の合成ＥＣＭを用いてもよい。また、天然ＥＣＭ及び合成ＥＣＭの混合物を用いてもよい。
【００９６】
幹細胞を培養するためにＥＣＭを使用する場合、幹細胞の長期生存及び未分化幹細胞の継続的存在を強化することができる。ＥＣＭの非存在下では、幹細胞培養物を長期間にわたって培養することができず、未分化幹細胞の継続的存在は観察されない。さらに、ＥＣＭが存在すると、ＥＣＭの非存在下では培養することができないオルガノイドを培養することができる。
【００９７】
ＥＣＭは、通常、細胞が懸濁されたディッシュの底に沈んでいる。例えば、ＥＣＭが３７℃で凝固するときに、上述の細胞培養培地を加えて、ＥＣＭの中に拡散させて用いてもよい。培地中の細胞は、ＥＣＭの表面構造と相互作用することによって、例えば、インテグリンと相互作用することによってＥＣＭに固着することができる。
【００９８】
ＥＣＭは培養容器等にコーティングして用いてもよい。ＥＣＭとして、フィブロネクチンを用いる場合、培養容器中にコーティングされる割合は、１μｇ／ｃｍ２以上２５０μｇ／ｃｍ２以下であることが好ましく、１μｇ／ｃｍ２以上１５０μｇ／ｃｍ２以下であることがより好ましく、８μｇ／ｃｍ２以上１２５μｇ／ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。
【００９９】
細胞外マトリクスとしては、マトリゲル（登録商標）を用いることが好ましい。実施例において後述するように細胞外マトリクスとしてマトリゲル（登録商標）を使用すると、２Ｄオルガノイドの培養基材への接着が良好になる傾向がある。
【０１００】
《接着工程》
続いて、ヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を準備する。
【０１０１】
ヒト腸管上皮組織からヒト腸管上皮細胞を単離する方法としては、当技術分野において公知の方法が挙げられる。例えば、キレート剤と単離組織とを恒温放置することによって、陰窩を単離することができる。この組織を洗浄した後、硝子スライドでヒト腸管上皮細胞層を粘膜下層から剥離し、細切する。この後、トリプシン又は、好ましくはＥＤＴＡ及びＥＧＴＡのうち少なくともいずれか一方を含む液中で恒温放置し、例えば、ろ過及び遠心機の少なくともいずれか一方を用いて、未消化の組織断片と陰窩由来の単一細胞とを分離する。トリプシンの代わりに、その他のタンパク質分解酵素、例えばコラゲナーゼ及びディスパーゼＩのうち少なくともいずれか一方を使用してもよい。
【０１０２】
ヒト腸管上皮組織から幹細胞を単離する方法として、当技術分野において公知の方法が挙げられる。幹細胞は、その表面上でＬｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方（Ｌｇｒ５及びＬｇｒ６は大型のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーに属する）を発現する。単離方法としては、ヒト腸管上皮組織から細胞縣濁液を調製し、この細胞縣濁液を、Ｌｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方と結合する化学物質に接触させ、このＬｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方と結合する化学物質を分離し、この結合化合物から幹細胞を単離する方法挙げられる。
【０１０３】
Ｌｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方と結合する化学物質としては、例えば、抗体、より具体的には、例えばＬｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方を特異的に認識し、それに結合するモノクローナル抗体（例えば、マウス及びラットモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体等）が挙げられる。このような抗体を用いて、例えば磁性ビーズを活用して、又は蛍光活性化細胞ソーターを通じて、Ｌｇｒ５及びＬｇｒ６のうち少なくともいずれか一方を発現している幹細胞を単離することができる。
【０１０４】
上述の方法により単離されたヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、ヒト腸管上皮腫瘍細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を、前記調製工程で得られた細胞マトリクスに包埋して、プレートに播種し、静置する。播種された細胞は、ＥＣＭの表面構造と相互作用することによって、例えば、インテグリンと相互作用することによってＥＣＭに接着することができる。
【０１０５】
《オルガノイド形成工程》
続いて、細胞播種後、細胞が乾かないうちに、上述の細胞培養培地を添加し、培養する。培養温度は３０℃以上４０℃以下が好ましく、３７℃程度がより好ましい。培養時間は用いる細胞によって適宜調製することができる。培養開始からから１〜２週間程度後で、オルガノイドを形成させることができる。また、従来では２〜３ヶ月しか細胞維持培養することができなかった細胞に対し、工程１では、３ヶ月以上の長期間（好ましくは、１０ヶ月程度）においても、細胞を維持培養することができる。工程１により、３Ｄオルガノイドが得られる（図１参照。）。
【０１０６】
また、オルガノイド形成工程において、低酸素下で培養を行ってもよい。低酸素下で培養を行うことにより、ヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又はヒト腸管上皮腫瘍細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
【０１０７】
本実施形態における低酸素下とは、酸素濃度が、０．１％以上１５％以下であることが好ましく、０．３％以上１０％以下であることがより好ましく、０．５％以上５％以下であることがさらに好ましい。
【０１０８】
（工程２）
工程２は、前記工程１で得られた３Ｄオルガノイドを分散させて単一細胞を調製し、前記単一細胞を細胞外マトリクス上で単層培養して２Ｄオルガノイドを得る工程である。
【０１０９】
図１に示すように、３Ｄオルガノイドにおいて、ヒト下痢症ウイルスに感染する部位は、腸管の内側の部分である。したがって、３Ｄオルガノイドを崩して、内側の部分を露呈させる必要がある。
【０１１０】
３Ｄオルガノイドを分散させて単一細胞を調製する方法としては、特に限定されず、物理的方法、酵素処理法等が挙げられるが、細胞を傷つけない観点から酵素処理法が好ましい。酵素処理法に用いられる酵素としては、トリプシン等、上記［接着工程］において挙げたものと同様のものが挙げられる。
【０１１１】
続いで、上記［細胞外マトリクス調製工程］と同様にして調製された細胞外マトリクス上に播種し、静置する。播種された細胞は、ＥＣＭの表面構造と相互作用することによって、例えば、インテグリンと相互作用することによってＥＣＭに接着することができる。
【０１１２】
続いて、細胞播種後、細胞が乾かないうちに、上述の分化培地を添加し、単層培養する。工程２により、２Ｄオルガノイドが得られる（図１参照。）。
【０１１３】
（工程３）
工程３は、前記工程２で得られた２Ｄオルガノイドに、ヒト下痢症ウイルスを感染させて、感染した２Ｄオルガノイドを培養する工程である（図１参照。）。２Ｄオルガノイドが液体培地と接する細胞表面は、３Ｄオルガノイドの内側の面も含むため、ヒト下痢症ウイルスが効率よく感染する。
【０１１４】
ヒト下痢症ウイルスとしては、ロタウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、アストロウイルス、腸管アデノウイルス、パレコウイルス、アイチウイルス等が挙げられ、ノロウイルスが好ましい。実施例にて後述するように、工程３により、ヒト下痢症ウイルスが増殖する。
【０１１５】
本実施形態のヒト下痢症ウイルスの製造方法によれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで人工的に大量にヒト下痢症ウイルス増殖培養することにより作り出すことができ、ヒト下痢症ウイルスに対する病態の解明、抗ウイルス薬や消毒薬の開発、ワクチンの開発等に役立てることができる。
【０１１６】
［キット］
１実施形態において、本発明は、ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、ｉｉ）インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２；ＦＧＦ２）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及びエピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ）からなる群から選ばれる少なくとも一種、ｉｉｉ）骨形成因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤、ｉｖ）形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）阻害剤、及びｖ）γセクレターゼ阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む細胞培養培地を備えるヒト下痢症ウイルス製造キットを提供する。
【０１１７】
本実施形態のキットは、ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド培養キットであるということもできる。
【０１１８】
本実施形態のキットにおいて、上記の細胞培養培地は動物由来胆汁を更に含んでいてもよい。実施例において後述するように、細胞培養培地に動物由来胆汁を添加することにより、ヒト下痢症ウイルスの増殖を顕著に促進することができる。
【０１１９】
動物由来胆汁としては、ウシ胆汁抽出物、ブタ胆汁抽出物等が挙げられる。これらの胆汁抽出物は市販されているものであってもよい。
【０１２０】
本実施形態のキットにおいて、上記の細胞培養培地は無血清であってもよい。
【０１２１】
本実施形態のキットは、上記細胞培養培地のほか、細胞培養器具、使用説明書等をさらに備えるものであってもよい。細胞培養器具等としては、細胞培養プレート等を挙げることができるが、これに限定されない。
【０１２２】
本実施形態のキットは、ヒト下痢症ウイルスの製造方法に好適に用いることができる。ヒト下痢症ウイルスの製造方法に使用する試薬類をキット化することにより、より簡便かつ短時間にヒト下痢症ウイルスを製造することができる。
【０１２３】
［オルガノイドの製造方法］
１実施形態において、本発明は、細胞外マトリクス上にヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又は、これらの細胞のうち、少なくともいずれかを含む組織を立体培養し、３Ｄオルガノイドを得る工程１と、前記工程１で得られた前記３Ｄオルガノイドからタンパク質分解酵素により分散して単一細胞を調製し、前記単一細胞を細胞外マトリクス上で単層培養し、分化した絨毛細胞及び杯細胞を含むヒト腸管内腔を構成する上皮細胞が単層構造となっている２Ｄオルガイドを取得する工程２と、を有し、前記工程１及び工程２の培養において、ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、ｉｉ）インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ１；ＩＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２；ＦＧＦ２）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及びエピレグリン（Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＲＥＧ）からなる群から選ばれる少なくとも一種、ｉｉｉ）骨形成因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）阻害剤、ｉｖ）形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）阻害剤、及びｖ）γセクレターゼ阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む細胞培養培地を用いるオルガノイドの製造方法を提供する。
【０１２４】
工程１及び工程２の詳細は、［ヒト下痢症ウイルスの製造方法］で述べた工程と同様である。実施例で後述するように、２Ｄオルガノイドは、Ｍｕｃｉｎ２陽性細胞である杯細胞を含む。
【０１２５】
２Ｄオルガノイドは、再生医療、上皮細胞の基礎医学研究、薬物応答のスクリーニング、疾患由来上皮オルガノイドを用いた創薬研究等に応用することができる。
【０１２６】
［培養物］
１実施形態において、本発明は、ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイド培養物を提供する。ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２Ｄオルガノイドは、上述したものと同様である。ここで、「培養物」は、２Ｄオルガノイドに加えて、細胞培養培地及び細胞外マトリクスを含むものである。本実施形態の培養物において、細胞培養培地は無血清であってもよい。また、細胞培養培地は動物由来胆汁を含んでいてもよい。また、細胞外マトリクスはマトリゲル（登録商標）であってもよい。
【０１２７】
［用途］
一実施形態として、本発明は、ヒト下痢症ウイルス、特にノロウイルスの消毒薬のスクリーニング方法、消毒薬創薬、該ウイルスの感染細胞、感染メカニズムの特定、該ウイルスによって生じる下痢症状の予防・治療薬のスクリーニング、予防・治療薬創薬の開発手段を提供する。
【０１２８】
ヒト下痢症ウイルスへの薬物応答のスクリーニングにおいて、上述の２Ｄオルガノイドを用いる場合、オルガノイドを例えば９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレート等のマルチウェルプレート中で培養する。分子のライブラリを使用して、このオルガノイド及び／又は感染ヒトウイルスに影響を与える分子を同定する。ライブラリとしては、例えば、抗体断片ライブラリ、ペプチドファージディスプレイライブラリ、ペプチドライブラリ（例えばＬＯＰＡＰ（商標）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、脂質ライブラリ（ＢｉｏＭｏｌ社製）、合成化合物ライブラリ（例えばＬＯＰＡＰ（商標）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）又は天然化合物ライブラリ（Ｓｐｅｃｓ、ＴｉｍＴｅｃ社製）等が挙げられる。さらに、遺伝子ライブラリを用いてもよい。遺伝子ライブラリとしては、例えば、ｃＤＮＡライブラリ、アンチセンスライブラリ、ｓｉＲＮＡ、又はその他の非コードＲＮＡライブラリ等が挙げられる。具体的な方法としては、ある一定の時間にわたりヒト下痢症ウイルス感染細胞及びヒト下痢症ウイルス試験薬剤の複数の濃度に曝露し、曝露時間終了時に、培養物を評価する方法が挙げられる。
【０１２９】
さらに、本実施形態の２Ｄオルガノイドは、新規候補薬物又は既知若しくは新規栄養補助食品の毒性アッセイにおいてＣａｃｏ−２細胞等の細胞株の使用に代わるものとなり得る。
【０１３０】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１３１】
［実験例１］
（細胞培養培地の調製）
まず、市販のＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｃｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に、終濃度１μｇ／ｍＬとなるようにヒト組換えＲ−スポンジン１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるようにノギン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加し、終濃度５００ｎＭとなるようにＡ８３−０１（Ｔｏｃｒｉｓ社製）を添加した（以下、「ＮＲＡ培地」と呼ぶ。）。【０１３２】
さらに、終濃度３００ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ、終濃度５００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｃｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）、終濃度１０μＭのＳＢ２０２１９０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、及び終濃度１μＭのＬＹ４１１５７５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）のそれぞれを以下の組み合わせで添加した培地を用意した。
・ＷＮＲＡ＋ＩＧＦ１＋ＦＧＦ２培地
・ＷＥＮＲＡＳ培地
・ＥＮＲＡ培地
・ＥＮＲＡＬ培地【０１３３】
略語の意味を以下に示す。
Ｗ；Ｗｎｔ３Ａ
Ｅ；ＥＧＦ
Ｎ；Ｎｏｇｇｉｎ
Ｒ；Ｒｓｐｏｎｄｉｎ１
Ａ；Ａ−８３−０１
Ｓ；ＳＢ２０２１９０
Ｌ；ＬＹ４１１５７５【０１３４】
［実験例２］
（オルガノイドを用いたノロウイルスの増殖）
《腸管幹細胞の培養》
慶應義塾大学医学部倫理委員会で承認された倫理研究計画に基づき、説明と同意を得られた健常者および消化管腫瘍患者より、消化管腫瘍から少なくとも５ｃｍ以上離れた部分を正常粘膜として採取した。採取した組織はＥＤＴＡ又はリベラーゼＴＨにより上皮細胞を抽出し、マトリゲル（登録商標）に包埋した。【０１３５】
上皮細胞（以下、「腸管幹細胞」と呼ぶ。）を含むマトリゲル（登録商標）を４８ウェルプレートに播種し、培養した。具体的には、下記の通りである。【０１３６】
培養した腸管幹細胞を、２５μＬのマトリゲル（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と共に、４８ウェルプレートに播種した。（１）で調製したＷＮＲＡ＋ＩＧＦ１＋ＦＧＦ２培地をウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃で培養した。培養から、２日毎に培地交換を行い、７日間培養し、３Ｄオルガノイドを得た。【０１３７】
《プレートの作製》
ＰＢＳ（−）で希釈した２．５％マトリゲル（登録商標）を、９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間以上インキュベートした。その後、各ウェルをＰＢＳ（−）で３回洗い、以下の細胞培養に使用した。【０１３８】
《オルガノイドの平面培養及びノロウイルス感染》
２Ｄオルガノイドを形成し、ノロウイルスを感染させた。具体的には、上記のオルガノイドをＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｃｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を用いて崩し、単一細胞にした。この単一細胞を３つに分け、各培地（ＷＥＮＲＡＳ培地（増殖培地）、ＥＮＲＡ培地（分化培地１）、ＥＮＲＡＬ培地（分化培地２））で洗浄した後、終濃度１０μＭのＹ−２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤；和光純薬社製）入りの各培地に懸濁した。この細胞懸濁液を、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルで各ウェルに撒き、３時間以上静置しプレートに接着させた。【０１３９】
次いで、１０％乳剤を各分化培地で１０倍希釈した糞便ノロウイルスを５μＬ／ウェル加えて３時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、各培地を２５０μＬ／ウェルいれると同時に２０μＬサンプリングした（ｄａｙ０）。その後、感染後１日、２日、３日、６日の培地を２０μＬサンプリングした（ｄａｙ１、ｄａｙ２、ｄａｙ３、ｄａｙ６）。【０１４０】
《ノロウイルスＲＮＡの精製》
サンプリングした培地からＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いてウイルスＲＮＡを精製し、３０μＬのウイルスＲＮＡ懸濁液を得た。【０１４１】
《リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによるノロウイルスゲノムの測定》
１０９コピー／μＬのテンプレートＤＮＡから１０倍の希釈系列を作製し、これをスタンダードとした。表１に示す組成で、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲミックスを作製した。また、表２に示すサイクルでｑＲＴ−ＰＣＲを行った。ｑＲＴ−ＰＣＲの結果を図２に示す。【０１４２】
【表１】
2018038042.tif 000003
【０１４３】
【表２】
2018038042.tif 000004
【０１４４】
図２に示すように、分化培地１を用いた場合の、オルガノイド培養上清中のノロウイルスゲノムの増加倍率は、増殖培地を用いた場合と比べて圧倒的に高かった。このことから、分化培地１を用いた培養オルガノイドにより、ヒトノロウイルスを感染・増殖させることが確認された。【０１４５】
また、感染後６日後の各培地で培養したオルガノイドを、ＤＡＰＩ染色、並びに、抗ヒトノロウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）抗体及び抗Ｍｕｃｉｎ２抗体で免疫染色した。このオルガノイドの蛍光染色像を図３に示す。【０１４６】
図３の真中図及び右図に示すように、ＲｄＲｐの発現が確認された。これにより、ノロウイルスがオルガノイドに感染して増殖していることが確認された。また、図３の真中図及び右図に示すように、Ｍｕｃｉｎ２の発現が確認された。これにより、オルガノイドが杯（ゴブレット）細胞に分化していることが確認された。【０１４７】
［実験例３］
（細胞外マトリクスの検討）
発明者らは、２Ｄオルガノイドの細胞接着が安定しない場合があることを見出した。
そこで、細胞外マトリクスを検討した。細胞外マトリクスとしてはコラーゲンＩ及びマトリゲル（登録商標）を使用した。【０１４８】
《プレートの作製》
ＰＢＳ（−）で希釈した２．５％マトリゲル（登録商標）又は１０％コラーゲンＩを、９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間以上インキュベートした。その後、各ウェルをＰＢＳ（−）で３回洗い、以下の細胞培養に使用した。また、比較のためにコーティングなしの９６ウェルプレートを使用した。【０１４９】
《３Ｄオルガノイドの形成》
実験例２と同様にして腸管幹細胞を培養し、３Ｄオルガノイドを得た。【０１５０】
《２Ｄオルガノイドの形成》
得られたオルガノイドをＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｃｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を用いて崩し、単一細胞にした。この単一細胞をＥＮＲＡ培地（分化培地１）で洗浄した後、終濃度１０μＭのＹ−２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤；和光純薬社製）入りのＥＮＲＡ培地に懸濁した。この細胞懸濁液を、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルで各ウェルに撒き、翌日細胞の接着を観察した。【０１５１】
図４（ａ）〜（ｃ）は各条件における２Ｄオルガノイドの光学顕微鏡写真である。図４（ａ）はコーティングなしの９６ウェルプレートを使用した結果であり、図４（ｂ）は細胞外マトリクスとしてコラーゲンＩを使用した結果であり、図４（ｃ）は細胞外マトリクスとしてマトリゲル（登録商標）を使用した結果である。【０１５２】
その結果、細胞外マトリクスとしてマトリゲルを使用すると、２Ｄオルガノイドの基材への培養基材への接着が良好であることが明らかとなった。【０１５３】
［実験例４］
（細胞培養培地の検討）
オルガノイドを用いたノロウイルスの増殖において、細胞培養培地に動物由来胆汁を添加し、その影響を検討した。また、３Ｄオルガノイドの培地及び２Ｄオルガノイドの培地として、実験例２で用いたＷＥＮＲＡＳ培地（増殖培地）及びＥＮＲＡ培地（分化培地１）を様々な組み合わせで用い、その影響を検討した。【０１５４】
《プレートの作製》
ＰＢＳ（−）で希釈した２．５％マトリゲル（登録商標）を、９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間以上インキュベートした。その後、各ウェルをＰＢＳ（−）で３回洗い、以下の細胞培養に使用した。【０１５５】
《３Ｄオルガノイドの形成》
実験例２と同様にして腸管幹細胞を培養し、３Ｄオルガノイドを得た。この時、培地として実験例２で用いたＷＥＮＲＡＳ培地（増殖培地）又はＥＮＲＡ培地（分化培地１）を使用した。【０１５６】
《２Ｄオルガノイドの形成》
得られた３ＤオルガノイドをＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｃｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を用いて崩し、単一細胞にした。この単一細胞をＷＥＮＲＡＳ培地（増殖培地）又はＥＮＲＡ培地（分化培地１）で洗浄した後、終濃度１０μＭのＹ−２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤；和光純薬社製）入りの各培地に懸濁した。また、各培地に０．１％ブタ胆汁抽出物（Ｂｉｌｅ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｐｏｒｃｉｎｅ、ＢＥＰ）を添加したものと添加しなかったものを用意した。この細胞懸濁液を、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルで各ウェルに撒き、３時間以上静置しプレートに接着させた。【０１５７】
３Ｄオルガノイドの培養及び２Ｄオルガノイドの培養に用いた培地の組み合わせを下記表３に示す。表３中、「＋」は添加したことを表し、「−」は添加していないことを表す。【０１５８】
【表３】
2018038042.tif 000005
【０１５９】
次いで、１０％乳剤を各分化培地で１０倍希釈した糞便ノロウイルスを５μＬ／ウェル加えて３時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、各培地を２５０μＬ／ウェルいれると同時に２０μＬサンプリングした（ｄａｙ０）。その後、感染後１日、２日、３日、６日の培地を２０μＬサンプリングした（ｄａｙ１、ｄａｙ２、ｄａｙ３、ｄａｙ６）。【０１６０】
《ノロウイルスＲＮＡの精製》
サンプリングした培地からＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いてウイルスＲＮＡを精製し、３０μＬのウイルスＲＮＡ懸濁液を得た。【０１６１】
《リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによるノロウイルスゲノムの測定》
実験例２と同様にしてリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲを行い、ノロウイルスの増殖を測定した。図５（ａ）及び（ｂ）はｑＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。図５（ａ）はグループ１〜４の結果を示し、図５（ｂ）はグループ５〜８の結果を示す。【０１６２】
その結果、３Ｄオルガノイドの培養及び２Ｄオルガノイドの培養の双方に分化培地を使用したグループ７及び８でノロウイルスの増殖が顕著に高いことが明らかとなった。また、培地に動物由来胆汁を含むグループ８でノロウイルスの増殖が更に顕著に高いことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明によれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで人工的に大量にヒト下痢症ウイルスを増殖培養することにより作り出すことができ、ヒト下痢症ウイルスに対する病態の解明、抗ウイルス薬や消毒薬の開発、ワクチンの開発等に役立てることができる。
【図１】
2018038042.tif 000006
【図２】
2018038042.tif 000007
【図３】
2018038042.tif 000008
【図４】
2018038042.tif 000009
【図５】
2018038042.tif 000010
【配列表】
2018038042000001.app
【国際調査報告】
2018038042.tif 000011
2018038042.tif 000012
2018038042.tif 000013
2018038042.tif 000014
2018038042.tif 000015