(57)【要約】【課題】免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対する結合性が強いペプチドを提供する。【解決手段】本発明に係るペプチドは配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。但し、同アミノ酸配列中、Ｎ末端のアミノ酸から１６番目のアミノ酸（Ｘ16）がＬ、Ｍ、Ｉ又はＦであり、Ｎ末端のアミノ酸から１７番目のアミノ酸（Ｘ17）がＲ、Ｋ、Ｙ又はＱであり、Ｎ末端のアミノ酸から１９番目のアミノ酸（Ｘ19）は任意のアミノ酸であり、Ｎ末端のアミノ酸から２０番目のアミノ酸（Ｘ20）は任意のアミノ酸であり、Ｎ末端のアミノ酸から２６番目のアミノ酸（Ｘ26）はＧ又はＥ若しくは欠失しており、Ｎ末端のアミノ酸から２９番目のアミノ酸（Ｘ29）は任意のアミノ酸であり、Ｎ末端のアミノ酸から３０番目のアミノ酸（Ｘ30）は任意のアミノ酸であり、Ｎ末端のアミノ酸から３２番目のアミノ酸（Ｘ32）は任意のアミノ酸であり、Ｎ末端のアミノ酸から３３番目のアミノ酸（Ｘ33）が任意のアミノ酸である。【選択図】図３
2017159655.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド。
但し、同アミノ酸配列中、
Ｎ末端のアミノ酸から１６番目のアミノ酸（Ｘ16）がＬ、Ｍ、Ｉ又はＦであり、
Ｎ末端のアミノ酸から１７番目のアミノ酸（Ｘ17）がＲ、Ｋ、Ｙ又はＱであり、
Ｎ末端のアミノ酸から１９番目のアミノ酸（Ｘ19）は任意のアミノ酸であり、
Ｎ末端のアミノ酸から２０番目のアミノ酸（Ｘ20）は任意のアミノ酸であり、
Ｎ末端のアミノ酸から２６番目のアミノ酸（Ｘ26）はＧ又はＥ若しくは欠失しており、
Ｎ末端のアミノ酸から２９番目のアミノ酸（Ｘ29）は任意のアミノ酸であり、
Ｎ末端のアミノ酸から３０番目のアミノ酸（Ｘ30）は任意のアミノ酸であり、
Ｎ末端のアミノ酸から３２番目のアミノ酸（Ｘ32）は任意のアミノ酸であり、
Ｎ末端のアミノ酸から３３番目のアミノ酸（Ｘ33）が任意のアミノ酸である。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド。
但し、同アミノ酸配列中、
Ｎ末端のアミノ酸から１６番目のアミノ酸（Ｘ16）がＬ、Ｍ、Ｉ又はＦであり、
Ｎ末端のアミノ酸から１７番目のアミノ酸（Ｘ17）がＲ、Ｋ、Ｙ又はＱであり、
Ｎ末端のアミノ酸から１９番目のアミノ酸（Ｘ19）がＶ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｆ又はＩであり、
Ｎ末端のアミノ酸から２０番目のアミノ酸（Ｘ20）は任意のアミノ酸であり、
Ｎ末端のアミノ酸から２６番目のアミノ酸（Ｘ26）はＧ又はＥ若しくは欠失しており、
Ｎ末端のアミノ酸から２９番目のアミノ酸（Ｘ29）がＩ、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｍ又はＦであり、
Ｎ末端のアミノ酸から３０番目のアミノ酸（Ｘ30）が任意のアミノ酸であり、
Ｎ末端のアミノ酸から３２番目のアミノ酸（Ｘ32）がＡ、Ｌ、Ｆ、Ｍ又はＩであり、
Ｎ末端のアミノ酸から３３番目のアミノ酸（Ｘ33）がＮ、Ｄ、Ｈ、Ａ、Ｔ又はＧである、
請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列中、
Ｎ末端のアミノ酸から１６番目のアミノ酸（Ｘ16）がＬ又はＭであり、
Ｎ末端のアミノ酸から１７番目のアミノ酸（Ｘ17）がＲ又はＫであり、
Ｎ末端のアミノ酸から１９番目のアミノ酸（Ｘ19）がＶ、Ａ、Ｌ又はＭであり、
Ｎ末端のアミノ酸から２９番目のアミノ酸（Ｘ29）がＩ、Ａ、Ｌ、Ｖ又はＭであり、
Ｎ末端のアミノ酸から３２番目のアミノ酸（Ｘ32）がＡ，Ｌ又はＦであり、
Ｎ末端のアミノ酸から３３番目のアミノ酸（Ｘ33）がＮ、Ｄ、Ｈ、Ａ又はＴである、
請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列中、
Ｎ末端のアミノ酸から１６番目のアミノ酸（Ｘ16）がＬ又はＭであり、
Ｎ末端のアミノ酸から１７番目のアミノ酸（Ｘ17）がＲ又はＫであり、
Ｎ末端のアミノ酸から１９番目のアミノ酸（Ｘ19）がＡ叉はＶであり、
Ｎ末端のアミノ酸から２０番目のアミノ酸（Ｘ20）がＧ、Ｑ、Ｒ又はＡであり、
Ｎ末端のアミノ酸から２６番目のアミノ酸（Ｘ26）はＧであり、
Ｎ末端のアミノ酸から２９番目のアミノ酸（Ｘ29）がＩ、Ａ、Ｌ又はＶであり、
Ｎ末端のアミノ酸から３０番目のアミノ酸（Ｘ30）がＡ、Ｔ、Ｑ、Ｅ又はＳであり、
Ｎ末端のアミノ酸から３２番目のアミノ酸（Ｘ32）がＡ、Ｌ又はＦであり、
Ｎ末端のアミノ酸から３３番目のアミノ酸（Ｘ33）がＡ又はＮである、
請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端のアミノ酸から１２番目のアミノ酸（Ｉ12）が任意のアミノ酸である請求項１〜４の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端のアミノ酸から１２番目のアミノ酸（I12）がＡである請求項１〜４の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端のアミノ酸から３９番目のアミノ酸（L39）がＡである請求項１〜６の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステインとＣ末端のシステインがジスルフィド結合した請求項１〜７の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項９】
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステイン及び／又はＣ末端のシステインが任意のアミノ酸で置換された請求項１〜７の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステイン及び／又はＣ末端のシステインがグルタミンで置換された請求項１〜７の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項１１】
ヒト免疫グロブリンＧに対する解離定数（ＫＤ）が、３０００ｎＭ以下、好ましくは１０００ｎＭ以下、望ましくは１００ｎＭ以下である請求項１〜１０の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項１２】
配列番号２〜５１の何れかのアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項１３】
配列番号２〜５１の何れかのアミノ酸配列を有し、アミノ酸配列のＮ末端から５番目のシステインと、同アミノ酸配列のＣ末端のシステインがジスルフィド結合したペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫グロブリンＧに対する結合性を有するペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液や血漿などの体液成分から、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を本体とする自己抗体及び免疫複合体を特異的に吸着体に吸着除去することで、生体免疫機能に関係した自己免疫疾患の進行を防止し、疾患の症状を軽減せしめる方法が知られている。【０００３】
このような目的に使用されうる吸着材として、例えば特許文献１には、ヘリックス−ループ−ヘリックス構造を有するＩｇＧ結合性ペプチドをＩｇＧ型抗体として担体に結合させたＩｇＧ型抗体吸着材が開示されている。また、非特許文献１にも、同じくヘリックス−ループ−ヘリックス構造を有するＩｇＧ結合性ペプチドが開示されている。【０００４】
しかしながら、これらのＩｇＧ結合性ペプチドのＩｇＧに対する結合性はまだ十分であるとは言えず、更に結合性の高いＩｇＧ型抗体が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−７４６２６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】K. Kawabata, et ail., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 22(2014), 1845-1849
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、さらに結合性の強いヘリックス−ループ−ヘリックス構造のＩｇＧ結合性ペプチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明に係るペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。ここで配列番号１に示すアミノ酸配列中のアミノ酸Ｘは下記のとおりである。
【発明の効果】
【０００９】
本願発明に係るペプチドは、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）に対して強い結合性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は本発明に係るペプチドのデザインを示す図である。同図（Ａ）は基本構造となるＨＬＨの構造を、同図（Ｂ）はデザインされたペプチドの構造を示す。
【図２】図２はＩｇＧ結合性ペプチドライブラリーのスクリーニングを示す図であって、（Ａ）は参考となるＩｇＧ結合性ペプチド（FK60）の結果を、（Ｂ）は第１ラウンド後の結果を、（Ｃ）は第２ラウンド後の結果を、（Ｄ）は第３ラウンド後の結果を示す。
【図３】図３は蛍光プレートリーダーによるＩｇＧ結合性ペプチドの活性を示す図である。
【図４】図４は選択された強いＩｇＧ結合性を有するペプチドの改変部位におけるアミノ酸の出現頻度を表す図である。
【図５】図５は得られたＩｇＧ結合性ペプチドのＣＤスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係るペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列（FNMQCQAEFYEILHEXXAXXGGGGGXGKXXAXXAKIAALRDAC：但しXは下記に示す。）を有する。当該ペプチドは、非環状ペプチドであるか、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端から５番目のシステイン(Ｃ5：アミノ酸コードに付加された数字は各アミノ酸配列におけるＮ末端からの位置を示す（以下同じ。）とＣ末端のシステインがジスルフィド結合により環状化した環状ペプチドである。
【００１２】
本発明に係るペプチドは、各種動物、特にヒトのＩｇＧに対して強い結合性を示す。本発明において結合性はヒトＩｇＧに対する解離定数（ＫＤ）で評価される。解離定数の算出方法は当業者に公知であり、例えば実施例に記載の測定方法により求められる。好ましい解離定数（ＫＤ）は３０００ｎＭ以下であり、好ましくは１０００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下、望ましくは５０ｎＭ以下、さらに望ましくは１０ｎＭ以下である。
【００１３】
本発明に係るペプチドは、論理的にはＮ末端側及びＣ末端側のそれぞれ１４アミノ酸残基からなる２本のα−ヘリックスが６つ又は７つのグリシン残基で結合したヘリックス−ループ−ヘリックス構造（ＨＬＨ構造）を有する。このＨＬＨ構造を有するペプチドでは、２本のα−ヘリックスは、内側に存在するロイシン側鎖の疎水相互作用等により安定なＨＬＨ構造を形成し、さらに、N末端およびC末端にシステインを導入して分子内ジスルフィド架橋することでさらに立体構造の安定性が向上する（Suzuki, N., Fujii, I., Optimization of the loop length for folding of a helix-loop-helix peptide, Tetrahedron Lett. 40, 6013（1999）、Fujii I, Takaoka Y., Suzuki K., Tanaka, T., A Conformationally Purified α−Helical Peptide Library, Tetrahedron Lett. 42, 3323（2001））。本発明においては、このようなＨＬＨ構造を有するペプチドが好ましいが、ＩｇＧ結合性を有する限り必ずしもこのようなＨＬＨ構造を有するペプチドでなくとも差し支えない。
【００１４】
本発明に係るペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。このアミノ酸配列中のＸはそれぞれ、Ｘ16（配列番号１に示すＮ末端のアミノ酸から１６番目のアミノ酸）がＬ、Ｍ、Ｉ又はＦであり、Ｘ17（配列番号１に示すＮ末端のアミノ酸から１７番目のアミノ酸）がＲ、Ｋ、Ｙ又はＱであり、Ｘ19（配列番号１に示すＮ末端のアミノ酸から１９番目のアミノ酸）、Ｘ20（配列番号１に示すＮ末端のアミノ酸から２０番目のアミノ酸）、Ｘ29（配列番号１に示すＮ末端のアミノ酸から２９番目のアミノ酸）、Ｘ30（配列番号１に示すＮ末端のアミノ酸から３０番目のアミノ酸）、Ｘ32（配列番号１に示すＮ末端のアミノ酸から３２番目のアミノ酸）及びＸ33（配列番号１に示すＮ末端のアミノ酸から３３番目のアミノ酸）はそれぞれ任意のアミノ酸である。また、Ｘ26（配列番号１に示すＮ末端のアミノ酸から２６番目のアミノ酸）はＧ又はＥあるいは欠失している。
【００１５】
本願発明に係るペプチドは、上記ペプチドの中でも、好ましくはＸ16がＬ、Ｍ、Ｉ又はＦであり、Ｘ17がＲ、Ｋ、Ｙ又はＱであり、Ｘ19がＶ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｆ又はＩであり、Ｘ29がＩ、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｍ又はＦであり、Ｘ32がＡ、Ｌ、Ｆ、Ｍ又はＩであり、Ｘ33はＮ、Ｄ、Ｈ、Ａ、Ｔ又はＧである。さらには、Ｘ16がＬ又はＭであり、Ｘ17がＲ又はＫであり、Ｘ19がＶ、Ａ、Ｌ又はＭであり、Ｘ29がＩ、Ａ、Ｌ、Ｖ又はＭであり、Ｘ32がＡ、Ｌ又はＦであり、Ｘ33はＮ、Ｄ、Ｈ、Ａ又はＴであるペプチドがより好ましい。また、上記ペプチドの中でも、Ｘ16がＬ又はＭであり、Ｘ17はＲ又はＫであり、Ｘ19がＡ又はＶであり、Ｘ20がＧ、Ｑ、Ｒ又はＡであり、Ｘ26がＧであり、Ｘ29がＩ、Ａ、Ｌ又はＶであり、Ｘ30がＡ、Ｔ、Ｑ、Ｅ又はＳであり、Ｘ33はＡ又はＮであるペプチドが好ましい。より具体的にはペプチドは配列番号２〜５１に示すペプチドが好ましく、特に好ましいペプチドは配列番号９（FK6014：FNMQCQAEFYEILHELRAVGGGGGGGGKVAALNAKIAALRDAC）、配列番号２１（FK6032：FNMQCQAEFYEILHEMRAVQGGGGGGGKITALNAKIAALRDAC）、配列番号３３（FK6053：FNMQCQAEFYEILHELKAVRGGGGGGGKIQALNAKIAALRDAC）、配列番号４１（KF6063：FNMQCQAEFYEILHEMRAVAGGGGGGGKLEAFNAKIAALRDAC）、配列番号４３（FK6065：FNMQCQAEFYEILHELRAVQGGGGGGGKISALNAKIAALRDAC）の何れかの配列番号に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１６】
さらに、本発明のペプチドは、配列番号１において、Ｉ12（配列番号１に示すＮ末端のアミノ酸から１２番目のアミノ酸であるイソロイシン）及び／又はＬ39（配列番号１に示すＮ末端のアミノ酸から３９番目のアミノ酸であるロイシン）が任意のアミノ酸であるペプチドでもあり得る。例えば１２番目のアミノ酸及び／又は３９番目のアミノ酸がアラニンであるペプチドである。
【００１７】
本発明において、上記ペプチドを構成するアミノ酸は、ペプチドが所望のＩｇＧ結合性を有する限り、天然アミノ酸であっても、天然アミノ酸の誘導体や非天然アミノ酸であってもよい。好ましくは、上記ペプチドを構成するアミノ酸は天然アミノ酸である。天然アミノ酸の誘導体としては、例えば、ヒドロキシル基が導入されたアミノ酸であるヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン等、アミノ基が導入されたアミノ酸であるジアミノプロピオン酸等が挙げられるがこれらに限定されない。非天然アミノ酸の例としては、主鎖の構造が天然型と異なる、α，α−二置換アミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｎ−アルキル−α−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、α−ヒドロキシ酸など；側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するホモアミノ酸（ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）など；が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１８】
また、本発明に係るペプチドは、配列番号１の何れかに示すアミノ酸配列のシステインＣ5とＣ末端のシステインＣがジスルフィド結合して環状化したものが好ましい。環化することでペプチドの立体構造がより安定化する。環化に際しては、好ましくは環状化に利用されるＮ末端側のシステインと、ＨＬＨ構造のＮ末端側のα−ヘリックスのＮ末端アミノ酸の間に１〜３個程度のアミノ酸を有し、ＨＬＨ構造のＣ末端側のα−ヘリックスのＣ末端アミノ酸と環状化に利用されるＣ末端側のシステインとの間に１〜３個程度のアミノ酸が挿入され得る。例えば、配列番号１のアミノ酸配列では、環状化に利用されるＮ末端のシステインＣ5とα−ヘリックスのＮ末端のアラニンＡ7の間にグルタミンＱ6を、環状化に利用されるＣ末端のシステインＣ43とα−ヘリックスのＣ末端のアスパラギン酸Ｄ41の間にアラニンＡ42を有する。また、配列番号１〜５１に何れかに記載のアミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目及びＣ末端の２つのシステインは、相互に結合して環状ペプチドを形成するアミノ酸でそれぞれ置換されていてもよく、置換されたペプチドの相互結合により環化され得る。
【００１９】
本発明に係るペプチドは、配列番号１〜５１の何れかに記載のアミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステイン及びＣ末端のシステインのいずれか又は両方が任意のアミノ酸（例えば、荷電を有さないアミノ酸、好ましくはＱ）で置換されたペプチドでもあり得る。本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドと構造が類似し、Ｎ末端から５番目及びＣ末端にシステインを有するペプチドにおいて、５番目のシステインを同じく荷電を有さないグルタミンに置換しても、ＩｇＧに対する解離定数に大きな影響がなかったことを確認している。
【００２０】
本発明に係るペプチドは、配列番号１〜５１のアミノ酸配列に１〜数個、好ましくは１〜３個のアミノ酸が付加又は欠損、置換されたペプチドでもあり得る。アミノ酸配列の全長は３８以上、５０以下である。
【００２１】
上記ペプチドのうち非環状のペプチドは、種々の公知であるペプチド合成方法に従って合成することが出来る。例えばＦｍｏｃ固相合成法、フラグメント縮合法等の液相合成法が挙げられる。操作が簡便である点から、固相合成法が好ましく用いられる。また、環状のペプチドは、非環状のペプチドを得た後これを環化して得ることができる。例えば、アミノ酸配列中の２つのシステイン間に、公知の手法によってジスルフィド結合を形成することにより環化できる。また、公知の手法によって、分子内でチオエステルやチオエーテル結合を形成することによっても環化できる。さらに、例えば高度希釈法など公知の手法により分子内でカルボキシ基とアミノ基を縮合させることで環化してもよい。
【００２２】
非環状ペプチドは、上述の固相合成法及び液相合成法等の化学合成法によらず、遺伝子工学的手法を用いることでも製造できる。例えば、前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を適切な発現ベクターに組み込み、得られた発現ベクターによって適切な宿主細胞（例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌）を形質転換する。そして、上記宿主細胞をペプチドの発現に適する条件下で培養した後、培養物からペプチドを分離すればよい。
【００２３】
以下、下記の実施例に基づき本願発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されないのは言うまでもない。
【実施例１】
【００２４】
〔ペプチドライブラリーの作製〕
特許文献１に記載されたＨＬＨ構造を有する非環状ペプチド（配列番号５２に示すアミノ酸配列を有する）に種々の改変を加えて、環状構造を有する環状ペプチドライブラリー（配列番号１に示すアミノ酸配列を有する）を作製した（図１参照）。なお、ここでは配列番号１に示すアミノ酸配列中のＸ16，Ｘ19，Ｘ29，Ｘ32はPhe、Leu、lle、Met、Valの何れかのアミノ酸となり、Ｘ17，Ｘ20，Ｘ30，Ｘ33は天然タンパク質に見いだされる２０種類のアミノ酸のいずれか１種となり、Ｘ26は、Gly又はGlu若しくは欠失するようにライブラリーを構成した。ペプチドライブラリーを構成する各ペプチドはα−ヘリックス部分のＮ末側にペプチドを環化するための２つのアミノ酸（Ｃ5とＱ6）と３つのアミノ酸からなるスペーサ（Ｎ2、Ｍ3、Ｑ4）を介して結合したフェニルアラニン（Ｆ1）と、α−ヘリックス部分のＣ末側にペプチドを環化するための２つのアミノ酸（Ａ42とＣ43（Ｘ26が欠失している場合は41番目のＡ及び42番目のＣを示す。））を有し、２つのシステインＣ5、Ｃ43はジスルフィド結合している。【００２５】
（１）L-Random酵母表層ペプチドライブラリーの構築
overlap extension PCR および2nd PCRにより上記で設計したアミノ酸配列を有するL-Random ペプチドライブラリーをコードした遺伝子断片を作製し、制限酵素NcoIおよびXhoIで処理した。同様に処理した酵母表層提示用ベクターpYD11-BxXNとライゲーションすることによりL-Randomペプチドライブラリーのプラスミドを構築した。大腸菌にエレクトロポレーション法により形質転換して増幅した後、酵母細胞に酢酸リチウム法により形質転換することで9.4×106のライブラリーサイズをもつL-Random酵母表層提示ペプチドライブラリーを得た。【００２６】
（２）human IgG-Fcに対するスクリーニング
得られたライブラリーに対してセルソーターBD FACSAria（登録商標）II(BDバイオサイエンス社）を用いてhuman IgG-Fcに対する結合性スクリーニングを行った。ペプチドファイブラリーをSG/RCAA培地（で培養することでペプチドの細胞表層への提示を誘導した。PBSで洗浄した後、bio-human IgG-Fc（最終濃度100nM：Bethyl laboratory社）およびmouse anti-FLAG抗体（Sigma社）と反応させた後、SA-PE（Streptavidin-R-phycoerythrin：Invitrogen社）およびanti-mouse-Alexa488（Alexa Flour（商標名）488 goat anti-mouse IgG（H+L）：Invitrogen社）を結合させることで蛍光ラベルした。BD FACSAria（商標名）を用いて３回ソートした。【００２７】
このとき、human IgG-Fcに対する解離定数（ＫＤ）が既知である配列番号５３で示されるアミノ酸配列（FNMQCQAEFYEILHESAADEGGGGGGGKEAARNAKIAALRDAC）を有するペプチド（FK60）が提示したクローンの蛍光強度よりも高い領域（P5領域)に設定して、スクリーニングを行った。なお、このペプチドFK60は、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを改変することで得られた。【００２８】
Round1では、1×108細胞をBulk sortモードによりソートし、全体の0.4％に設定したP5エリアに存在する細胞群1.4×105細胞を回収した。Round2ではRound1で回収した細胞を全てBurk sortモードでソートし、P5エリアを全体の9％に設定して9000細胞を回収した。さらに、Round3ではRound2で回収した細胞をsingle-cell sortモードでソートし、P5エリアを全体の13％に設定して96細胞を96 well SDプレート培地に回収した（図２参照）。RoundごとにP5のエリアを狭めて、蛍光強度の高い酵母細胞のみを選別した。これを30℃で2日間培養した。【００２９】
（３）human IgG-Fc結合性クローンの活性解析
前記（２）のRound3で96well SDプレートに回収した酵母細胞96クローンをSDCAA培地で培養して増幅させた後、SG/RCAA培地で再び提示を誘導して、それぞれのbio-human IgG-Fcに対する結合活性を、蛍光プレートリーダー（Varioskan）を用いて測定した。結合活性を示すR-PEの相対蛍光強度（RFU）と同時に測定したペプチドの提示量を示すAlexa-488の相対蛍光強度（RFU）との関係を図にプロットした（図３参照）。そのうち、R-PEの相対蛍光強度の高い約５０のクローン（図に薄い黒丸で示される）を選択して、コロニーPCRによってそれぞれのクローンが保持するペプチドをコードした遺伝子断片を増幅させた。得られた遺伝子断片を鋳型としてシーケンシング反応を行い、遺伝子断片のDNA配列を解析することで提示するクローンが保持するペプチドのアミノ酸配列を決定した（表１）。そして、スクリーニングによって得られたペプチドのアミノ酸の出現頻度をweb logoを用いて調べたところ、図４に示す結果となった。【００３０】
【表１】
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【００３１】
（４）human IgG-Fc結合性ペプチドの結合性
（解離定数の算出）
アミノ酸配列を決定したhuman IgG-Fc結合性ペプチドのうちランダムに５個（FK6014、FK6032、FK6053、FK6063、FK6065）を選択し、アミドレジンを用いて0.023μmolスケールでFmoc固相合成法によりそれぞれを化学合成し、SPR法を用いてhuman IgG-Fcに対する結合活性測定を行った。【００３２】
100mgのFmoc-PAL-PEG-PS（商標名）アミドレジン（置換率：0.2 mmol/g）をリアクションベッセル量り取り、ペプチド自動合成機PSSM-8（SHIMAZU社）のプロトコルに従ってそれぞれのFmocアミノ酸（10equiv.）を、HCTU（10equiv）、DIEA（20equiv）、30%ピペリジン、5%無水酢酸を調製して、各ペプチドを化学合成した。終了後、レジンをジエチルエーテルで洗浄し乾燥させ、クリベージ溶液（TFA：EMS：Anisole：EDT＝93：3：3：1）を2mL添加して、室温で4時間反応させた。クリベージ溶液をろ過したのち、氷冷したジエチルエーテルを過剰量添加することでペプチドを析出させた。氷上で10分間静置し、6500rpm、4℃で10分間遠心分離して上清を捨てた。回収した沈殿物に再び氷冷したジエチルエーテルを加えて激しく撹拌させた後、氷上で10分間静置して6500rpm、4℃で10分間遠心分離して上製を除去することで沈殿物を洗浄した。この洗浄行為を2回繰り返した。沈殿物を減圧下で乾燥させたのち、2 mLの滅菌水に溶解し、0.22μmのフィルターでろ過してペプチド溶液（非環状ペプチド）を得た。ペプチド溶液をRP-HPLCで精製し、MALDI-TOF-MSで質量分析したところ、ほぼ計算値どおりの実測値が得られたことで目的とするペプチドが合成されたことを確認した。【００３３】
その後、滅菌水で溶解したペプチド溶液を30mM Tris-HCl（pH8.5）に常温で一晩かけて滴下しながら撹拌することで酸化反応させ、分子内ジスルフィド架橋を施した。反応溶液をRP-HPLCを用いて上記と同様の条件で精製した。MALDI-TOF-MSで質量分析したところ、ほぼ計算値どおりの実測値が得られたことで目的とするペプチドが合成されたことを確認した。【００３４】
得られた環状ペプチドを、Biacore T200（GEヘルスケア社）とThiol coupling kit（GE ヘルスケア社）を用いて５つのペプチドの各濃度における結合活性を測定した。全ての工程において、ランニングバッファーはHBS-EP+を用いた。Serise S CM5 センサーチップに、human IgG-Fcの固定化用としてフローセル2を用いて、流速10μL/min、25℃の条件で行った。予備試験によりhuman IgG-Fcの固定化に最適なpHを決定した後、フローセル2に前記キット中のEDCとNHSを混合した（容量比で1：1）液を調製し、7分間センサーチップに流すことでカルボキシル基を活性化させた。5μg/mL human IgG-Fcを10mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）で調製し、活性化させたフローセル2に7分間流すことでhumanIgG-Fcを固定化した。固定化量は2000RUであった。未反応の活性化されたカルボキシル基はエタノールアミンを7分間流すことによって、全て不活性化した。フローセル1をEDCおよびNHSによる活性化とエタノールアミンによるブロッキングを施すことでリファレンスセルとして使用した。各ペプチドをHBS-EP+バッファーで0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μMに段階希釈し，流速30μL/min.でそれぞれの結合活性を測定した。測定結果は、BIA evaluation 4.1ソフトウェアで、平衡値解析により解離定数（KD）を算出した。その結果を表２に示した。【００３５】
５つのペプチドはどれも非常に高い結合活性（FK6014：ＫＤ＝９nM、FK6032：ＫＤ＝８nM、FK6053：ＫＤ＝５nM、FK6063：ＫＤ＝１２nM、FK6065：ＫＤ＝８nM）を示した。比較対照としたペプチドFK60（ＫＤ＝２１μM）や非特許文献１に記載された環状化されたペプチド（ＫＤ＝１９μM）に比べて1000倍以上結合活性が向上した。【００３６】
【表２】
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【００３７】
（ＣＤスペクトルの測定）
各ペプチドのCDスペクトルを測定した。ペプチドを20mM Phosphate buffer（pH7.4）に最終濃度20μMとなるように調製し、円二色性分散計J-720（JASCO社）、温度コントローラー Peltier PTC-423L（TOMY SEIKO)を用いて、20℃の温度における190nmから260nmの波長でのCDスペクトルを0.2nm間隔で測定した。その結果を図５に示す。それぞれのペプチドは208nmおよび222nmに明瞭な負の極大を有しており、安定なα−ヘリックス構造を保持していることがわかった。α−ヘリックスの内側の適切な位置に疎水性アミノ酸が配置されるようデザインしたことにより、α−ヘリックス構造の形成に必要な両親媒性を獲得し、安定な立体構造を形成しているものと推測される。
【実施例２】
【００３８】
次に、２本のα−ヘリックスの内側に位置すると考えられる数カ所のアミノ酸をそれぞれアラニンに置換して、ＩｇＧに対する結合性を測定した。測定に際しては、実施例１で得られたペプチドのうち、最もＩｇＧに最も高い結合活性を示したFK6053を用いた。結合性は、当該ペプチドのＮ末端のアミノ酸にチオレドキシンを融合したチオレドキシン融合ペプチドを用い、FK6053を用いた場合との相対比較を行った。下記方法に従いチオレドキシン融合ペプチドを作製し、実施例１に記載の方法に準じて表面プラズモン共鳴法によりHuman IgG-Fcに対する結合活性（解離定数ＫＤ）を測定した。FK6053のチオレドキシン融合ペプチドのアミノ酸配列を配列番号５４に示した。置換したアミノ酸はFK6053におけるＮ末端から１２番目のイソロイシン（I12）、同じく１９番目のバリン（V19）、同じく２０番目のアルギニン（R20）、同じく２９番目のイソロイシン（I29）、同じく３０番目のグルタミン（Q30）、同じく３２番目のロイシン（L32）、同じく３３番目のアスパラギン（N33）、同じく３９番目のロイシン（L39）である。置換後のFK6053のペプチドに対応するアミノ酸配列及び比較試験の結果を表３に示した。結果は、FK6053における結合活性と同程度の場合を「＋＋＋」とし、結合活性がその１／１０〜１／１００となった場合を「＋＋」として表した。ＩｇＧに対して高い結合性を示した場合、アラニンと置換した位置のアミノ酸は、その安定な立体構造からＩｇＧへの結合性に影響を与えることが小さく、当該位置のアミノ酸は任意のアミノ酸に置換し得るものと考えられる。
【表３】
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【００３９】
（結合活性測定用チオレドキシン融合ペプチドの作製）
ペプチドFK6053とその変異体のTrx融合ペプチドを、pETシステムで合成した。ホスト大腸菌には、BL21 CodonPlus (DE3)-RPを、ベクターにはpET32a(+)(Navagen)を使用した。FK6053の遺伝子が導入されたpET32a(+)ベクターを鋳型として、メガプライマー法により変異体のDNAを作製し、PCRを実施した。反応終了後、3％アガロース電気泳動で分離し、目的のバンドを切り出し、Gel Extraction Kit（QIAGEN）で精製した。精製したPCR産物をメガプライマーとし、再びPCRを実施した。反応終了後、先ほどと同様に目的のPCR産物をアガロースゲル電気泳動に供し、目的のバンドを切り出し精製した。精製したDNAは、制限酵素(NcoIとXhoI)で処理し、同様に制限酵素処理したpET32a(+)とライゲーションすることでFK6053変異体のTrx融合ペプチド発現用ベクターを構築した。構築したベクターを用いて形質転換したホスト大腸菌をLB培地/Ampで培養した。その後、培地を18℃に冷却し、10μLの1M IPTGを加え、18℃で一晩振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心(4℃、6000g、10分)して沈殿をPBSに懸濁した。大腸菌を超音波破砕して遠心分離した後、その上精をフィルター（0.45μm）でろ過して、精製用サンプルを得た。精製用サンプルを、25mMイミダゾールで平衡化したNi Sepharose High Performance (GE Healthcare)をした充填カラムに吸着させた後、500mMイミダゾールで溶出した。得られた溶出液をPBS中４℃でセルロース膜（Spectra/Par MWCO:6-8000、SpectrumLaboratories Inc.）で透析し、その後遠心フィルター（Amicon Ultra-0.5, 3K device, Millipore）を用いて濃縮し、結合活性用のサンプルとした。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、ＩｇＧに対して強い結合性を有するＩｇＧ結合性ペプチドを提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年8月31日(2017.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド。
但し、同アミノ酸配列中、
Ｎ末端のアミノ酸から１６番目のアミノ酸（Ｘ１６）がＬ、Ｍ、Ｉ又はＦであり、
Ｎ末端のアミノ酸から１７番目のアミノ酸（Ｘ１７）がＲ、Ｋ、Ｙ又はＱであり、
Ｎ末端のアミノ酸から１９番目のアミノ酸（Ｘ１９）は任意のアミノ酸であり、
Ｎ末端のアミノ酸から２０番目のアミノ酸（Ｘ２０）は任意のアミノ酸であり、
Ｎ末端のアミノ酸から２６番目のアミノ酸（Ｘ２６）はＧ又はＥ若しくは欠失しており、
Ｎ末端のアミノ酸から２９番目のアミノ酸（Ｘ２９）は任意のアミノ酸であり、
Ｎ末端のアミノ酸から３０番目のアミノ酸（Ｘ３０）は任意のアミノ酸であり、
Ｎ末端のアミノ酸から３２番目のアミノ酸（Ｘ３２）は任意のアミノ酸であり、
Ｎ末端のアミノ酸から３３番目のアミノ酸（Ｘ３３）が任意のアミノ酸である。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド。
但し、同アミノ酸配列中、
Ｎ末端のアミノ酸から１６番目のアミノ酸（Ｘ１６）がＬ、Ｍ、Ｉ又はＦであり、
Ｎ末端のアミノ酸から１７番目のアミノ酸（Ｘ１７）がＲ、Ｋ、Ｙ又はＱであり、
Ｎ末端のアミノ酸から１９番目のアミノ酸（Ｘ１９）がＶ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｆ又はＩであり、
Ｎ末端のアミノ酸から２０番目のアミノ酸（Ｘ２０）は任意のアミノ酸であり、
Ｎ末端のアミノ酸から２６番目のアミノ酸（Ｘ２６）はＧ又はＥ若しくは欠失しており、
Ｎ末端のアミノ酸から２９番目のアミノ酸（Ｘ２９）がＩ、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｍ又はＦであり、
Ｎ末端のアミノ酸から３０番目のアミノ酸（Ｘ３０）が任意のアミノ酸であり、
Ｎ末端のアミノ酸から３２番目のアミノ酸（Ｘ３２）がＡ、Ｌ、Ｆ、Ｍ又はＩであり、
Ｎ末端のアミノ酸から３３番目のアミノ酸（Ｘ３３）がＮ、Ｄ、Ｈ、Ａ、Ｔ又はＧである、
請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列中、
Ｎ末端のアミノ酸から１６番目のアミノ酸（Ｘ１６）がＬ又はＭであり、
Ｎ末端のアミノ酸から１７番目のアミノ酸（Ｘ１７）がＲ又はＫであり、
Ｎ末端のアミノ酸から１９番目のアミノ酸（Ｘ１９）がＶ、Ａ、Ｌ又はＭであり、
Ｎ末端のアミノ酸から２９番目のアミノ酸（Ｘ２９）がＩ、Ａ、Ｌ、Ｖ又はＭであり、
Ｎ末端のアミノ酸から３２番目のアミノ酸（Ｘ３２）がＡ，Ｌ又はＦであり、
Ｎ末端のアミノ酸から３３番目のアミノ酸（Ｘ３３）がＮ、Ｄ、Ｈ、Ａ又はＴである、
請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列中、
Ｎ末端のアミノ酸から１６番目のアミノ酸（Ｘ１６）がＬ又はＭであり、
Ｎ末端のアミノ酸から１７番目のアミノ酸（Ｘ１７）がＲ又はＫであり、
Ｎ末端のアミノ酸から１９番目のアミノ酸（Ｘ１９）がＡ叉はＶであり、
Ｎ末端のアミノ酸から２０番目のアミノ酸（Ｘ２０）がＧ、Ｑ、Ｒ又はＡであり、
Ｎ末端のアミノ酸から２６番目のアミノ酸（Ｘ２６）はＧであり、
Ｎ末端のアミノ酸から２９番目のアミノ酸（Ｘ２９）がＩ、Ａ、Ｌ又はＶであり、
Ｎ末端のアミノ酸から３０番目のアミノ酸（Ｘ３０）がＡ、Ｔ、Ｑ、Ｅ又はＳであり、
Ｎ末端のアミノ酸から３２番目のアミノ酸（Ｘ３２）がＡ、Ｌ又はＦであり、
Ｎ末端のアミノ酸から３３番目のアミノ酸（Ｘ３３）がＡ又はＮである、
請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端のアミノ酸から１２番目のアミノ酸（Ｉ１２）が任意のアミノ酸である請求項１〜４の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端のアミノ酸から１２番目のアミノ酸（Ｉ１２）がＡである請求項１〜４の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端のアミノ酸から３９番目のアミノ酸（Ｌ３９）がＡである請求項１〜６の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステインとＣ末端のシステインがジスルフィド結合した請求項１〜７の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項９】
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステイン及び／又はＣ末端のシステインが任意のアミノ酸で置換された請求項１〜７の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステイン及び／又はＣ末端のシステインがグルタミンで置換された請求項１〜７の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項１１】
ヒト免疫グロブリンＧに対する解離定数（ＫＤ）が、３０００ｎＭ以下、好ましくは１０００ｎＭ以下、望ましくは１００ｎＭ以下である請求項１〜１０の何れか１項に記載のペプチド。
【請求項１２】
配列番号２〜５１の何れかのアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項１３】
配列番号２〜５１の何れかのアミノ酸配列を有し、アミノ酸配列のＮ末端から５番目のシステインと、同アミノ酸配列のＣ末端のシステインがジスルフィド結合したペプチド。
【請求項１４】
配列番号９、配列番号２１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３の何れかのアミノ酸配列を有するペプチド。
【国際調査報告】
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