(57)【要約】  高い検出感度を維持しながら、偽陽性を大幅に低減することができる着色セルロース微粒子、これを用いたイムノクロマト診断キットの提供。平均粒子径が６０〜９００ｎｍであり、発色強度が１．０〜１０．０であり、微粒子表面に親水層を有し、かつ、微粒子表面にスペーサーを介してカルボキシル基が導入されていることを特徴とする着色セルロース微粒子、該着色セルロース微粒子のカルボキシル基にリガンドが共有結合されている構造体、及び該構造体を含むイムノクロマト診断キット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒子径が６０〜９００ｎｍであり、発色強度が１．０〜１０．０であり、微粒子表面に、親水層を有し、かつ、スペーサーを介してカルボキシル基が導入されていることを特徴とする着色セルロース微粒子。
【請求項２】
前記カルボキシル基の導入量が、前記着色セルロース微粒子１ｇ当たり０．２０〜３．００ｍｍｏｌである、請求項１に記載の着色セルロース微粒子。
【請求項３】
前記親水層が、シラン層、ポリエチレングリコール層（ＰＥＧ）、又はシラン層とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）層の混合層のいずれかである、請求項１又は２に記載の着色セルロース微粒子。
【請求項４】
前記スペーサーが、炭化水素系の構造体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の着色セルロース微粒子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の着色セルロース微粒子の前記カルボキシル基にリガンドが共有結合されている構造体。
【請求項６】
請求項５に記載の構造体を含むイムノクロマト診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微粒子表面に、親水層を有し、かつ、スペーサーを介してカルボキシル基が導入されている着色セルロース微粒子、並びにそれを用いた診断薬キット及びインビトロ診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療分野や食品分野において、簡便かつ迅速に疾患や病原菌等の有無が判断できる技術が望まれている。これらのニーズに応えるべく様々な技術が開発されている。現在ではインフルエンザなどの病原体感染の有無、妊娠の有無、癌マーカーや心筋マーカーの有無、食品中のアレルギー物質や食中毒の原因となる物質の有無など様々な検査を簡便かつ迅速に行うことが可能となってきている。これらの技術としては、イムノクロマト測定法、蛍光イムノクロマト測定法、酵素免疫測定法、ラテックス凝集測定法、化学発光測定法など多くの測定方法が開発されている。その中でも、目視で判断できるイムノクロマト測定法は、特別な装置や専門的な知識が不要であり、誰でも簡便に迅速な診断が可能であるという特徴から、幅広く使用されている。例えば、イムノクロマト測定法の一種である妊娠検査薬などは、一般薬局で入手可能なほど、消費者にとって汎用性の高いものとなっている。【０００３】
イムノクロマト測定法（以下、「イムノクロマト」という）は、抗原抗体反応を利用したものであり、サンドウィッチ法や競合法という方法がある。測定方法は、検出物をメンブレンに対して水平方向に展開させるラテラルフロー式と、垂直方向に展開させるフロースルー式に大別される。簡便性の観点から、ラテラルフロー式でサンドウィッチ法を用いて、抗原を抗体で捕捉する方法が多く使用されている。測定手順は以下のようなものである：
（ｉ）ニトロセルロース等のメンブレンに、検出対象となる抗原等と反応する抗体を特定部位（テストライン）に固定化する；
（ｉｉ）発色粒子と呼ばれる標識物質に、検出対象と反応する抗体を担持した検出試薬を作製し、コンジュゲートパット上に塗布後乾燥させ、前記メンブレン、サンプルパット、吸収パットを組み合わせてイムノクロマトキットを作製する；
（ｉｉｉ）抗原の有無を検査したい検体を混合した展開液をサンプルパット上に滴下し、テストライン（ＴＬ）の発色の有無を目視（あるいは簡易的なイムノクロマトリーダー）で観察し、抗原の有無を判断する。検体中に抗原がある場合、テストラインに線が発色する。
一般的に、目視で判定する場合の多くは、検出対象となる抗原の有無のみを判断する定性分析として使用されている。【０００４】
イムノクロマトに使用される発色粒子として、例えば、以下の特許文献１には、金コロイドが、そして以下の特許文献２には、着色ラテックスが開示されている。これらの発色粒子の問題点は、微粒子表面が疎水性のため、タンパク質などの生体分子が吸着する非特異吸着という現象を引き起こしてしまうことである。非特異吸着がおこると、イムノクロマトにおいて最大の問題の一つである偽陽性が発生するおそれがある。偽陽性とは、検体中に検出対象が存在しないにも拘らず、テストラインに線が発色することを指す。偽陽性が発生すると誤診につながるため、イムノクロマトキットを市販する場合、偽陽性を発生させないことが必要不可欠である。偽陽性の発生メカニズムの一つとして、発色粒子に非特異吸着した物質を介して、テストラインに塗布した抗体に発色粒子が吸着してしまうと考えられている。そこで以下の特許文献３には、疎水性の金コロイド表面に親水性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させる手法により、非特異吸着が抑制され、偽陽性を低減することが開示されている。しかしながら、この方法では、微粒子表面のＰＥＧ鎖の立体構造によって抗体抗原反応が阻害され、検出感度が低下するおそれがある。このように一般的に、偽陽性の低減対策を行うと検出感度が低下してしまうケースが多くみられる。【０００５】
かかる状況下、以下の特許文献４には、着色セルロース微粒子と抗体を化学的に結合させることで非常に高い検出感度を達成したことが開示されている。この微粒子はセルロース由来のものであるのため、金コロイドなどと比べると、表面は若干親水性になっているものの、未だ疎水性であるため、非特異吸着が起こる可能性があり、これまでの発色粒子と同様に偽陽性の発生リスクは未だある。【０００６】
以上のように、高い検出感度を維持しながら、偽陽性を低減する技術を提供する必要は未だあり、その一つとして、抗体抗原反応を阻害せず、非特異吸着を大幅に抑制することができる発色粒子の開発が強く望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１６３３８４Ａ１号
【特許文献２】特開２００９−１６８４９５号公報
【特許文献３】国際公開第２０１３／１４１１２２Ａ１号
【特許文献４】国際公開第２０１１／０６２１５７Ａ１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記した従来技術の現状に鑑み、本発明が解決しようとする課題は、高い検出感度を維持しながら、偽陽性が大幅に低減可能な発色粒子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討し実験を重ねた結果、微粒子表面に、親水層を付与し、かつ、スペーサーを介してカルボキシル基を導入することで、タンパク質などの生体分子の非特異吸着を驚くべきほど低減したセルロース微粒子が得られることを見出し、これを発色粒子として使用したイムノクロマトが、高い検出感度を維持しながら偽陽性を大幅に低減することができることを確認し、本発明を完成するに至ったものである。【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりのものである。
［１］平均粒子径が６０〜９００ｎｍであり、発色強度が１．０〜１０．０であり、微粒子表面に、親水層を有し、かつ、スペーサーを介してカルボキシル基が導入されていることを特徴とする発色セルロース微粒子。
［２］前記カルボキシル基の導入量が、前記発色セルロース微粒子１ｇ当たり０．２０〜３．００ｍｍｏｌである、前記［１］に記載の発色セルロース微粒子。
［３］前記親水層が、シラン層、ポリエチレングリコール層（ＰＥＧ）、又はシラン層とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）層の混合層のいずれかである、前記［１］又は［２］に記載の発色セルロース微粒子。
［４］前記スペーサーが、炭化水素系の構造体である、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の発色セルロース微粒子。
［５］前記［１］〜［４］のいずれかに記載の発色セルロース微粒子の前記カルボキシル基にリガンドが共有結合されている構造体。
［６］前記［５］に記載の構造体を含むイムノクロマト診断キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る着色セルロース微粒子は、生体分子の非特異吸着が低減されているため、これをイムノクロマトの発色粒子として使用すれば、高い検出感度を維持しながら偽陽性を大幅に低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】親水化度を求めるための、緩和時間の変化割合（Ｒｓｐ値）と微粒子の総表面積値（ＴＳＡ値）をプロットしたグラフである。
【図２】ムノクロマト診断キットの測定におけるテストライン（ＴＬ）の発色強度（０−１０の１１段階の目視グレード）を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、着色セルロース微粒子に所定の親水層と、所定のスペーサーを組み合わせることで、予想外に驚くべきことに偽陽性の大幅な低減効果と、高い検出感度の維持が可能であることを見出した。
特許文献４に開示されているように、粒子径が大きく、かつ、色が濃い着色セルロース微粒子と抗体を化学結合させることで、検出感度が向上することは判明している。しかしながら、かかる微粒子表面の親水性は不十分であるため、タンパク質などの生体分子が非特異吸着しやすく、イムノクロマトに使用した際に偽陽性が発生するおそれがある。そこで展開液に界面活性剤などの添加剤を加えるなどの偽陽性低減対策を行うが、同時に感度も低下させてしまう。本発明者らは、微粒子そのものが非特異吸着しにくくなり、かつ、抗体を多量に微粒子表面に導入可能にすることで、高い検出感度を維持しつつ、偽陽性が低減可能になるのではないかと考えた。かかる仮説の下、実験を重ねた結果、着色セルロース微粒子表面に、親水層を付与し、かつ、炭化水素系のスペーサーを介して多量にカルボキシル基を導入し、微粒子表面へのタンパク質などの生体分子の非特異吸着を低減させながら、多量の抗体を微粒子に導入することを可能ならしめることによって、偽陽性の大幅な低減を達成しながら、高い検出感度は維持可能であることを見出した。
【００１４】
特許文献３に開示されているように、微粒子表面に親水層を付与することで偽陽性が低減可能なことは判明している。他方、一般的に炭化水素系の化合物は、偽陽性の原因となるタンパク質などの生体分子が吸着しやすいと言われている。かかる状況下、本発明者らは、親水層付与に加えて、炭化水素系の疎水性スペーサーを組み合わせることで大幅に偽陽性低減が可能であることを予想外に見出した。特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明者らは、炭化水素系のスペーサーが親水層に反発して微粒子表面に立った状態となり、かつ、スペーサー同士の疎水性相互作用によって微粒子表面に密に導入されるため、偽陽性の原因となるタンパク質などの生体分子が微粒子表面に入る込む隙間がなくなり、非特異吸着が抑制されると、換言すれば、線状の炭化水素系スペーサーの側面は、該スペーサー同士が略平行して微粒子表面に並んで配置されているため、その側面には偽陽性の原因となるタンパク質が吸着することはできないものの、スペーサーの先端にあるカルボキシル基には、抗体が共有結合することができるため、偽陽性の大幅な低減に成功したと、考えている。
【００１５】
以下、実施形態について詳細に説明する。
本実施形態の着色セルロース微粒子は、平均粒子径が６０〜９００ｎｍであり、発色強度が１．０〜１０．０であり、微粒子表面に、親水層を有し、かつ、スペーサーを介してカルボキシル基が導入されていることを特徴とする。
用語「平均粒子径」とは、動的光散乱法で測定した場合の体積平均メジアン径を指す。本実施形態では、平均粒子径は６０〜９００ｎｍの範囲にある。平均粒子径がこの範囲にあると、微粒子の表面積が大きいためにイムノクロマトとして用いる場合にテストラインがより濃くなる、すなわち検出感度が高くなる。平均粒子径が６０ｎｍ未満であると、表面積が小さくなるため、微粒子一個あたりの発色強度が低下するため、検出感度が下がる場合があり、また、微粒子の凝集が起こる場合もある。以上の点から粒子径の下限は、好ましくは７０ｎｍ、より好ましくは８０ｎｍである。他方、微粒子径が９００ｎｍより大きくなるとメンブレンの孔に詰まってしまうため、診断時間が長くなってしまったり、検査後にメンブレン表面が着色し検査結果の判断に悪影響を及ぼしたり、検出感度が悪くなったりする場合がある。以上の点から粒子径の上限は、好ましくは８００ｎｍ、より好ましくは７００ｎｍである。尚、ここで述べている平均粒子径はあくまで平均値であり、粒子径分布の一部が上記範囲から外れていても構わない。
【００１６】
粒子径として、体積平均を用いる理由は、イムノクロマトにおいては、あまりに大きな微粒子はメンブレン中に詰まってしまうが、体積平均であれば、大きい微粒子ほど影響が大きくなるので、大きい粒子が僅かに存在するだけでもその影響が反映されるためである。粒子径としては、体積平均以外にも、数平均、面積平均など様々な表し方がある。当然ながら表し方が異なると粒子径の値も変わってくる。
【００１７】
用語「発色強度」とは、反応性基導入後、抗体結合前の微粒子の色の濃さを定義した値であり、本実施形態では、１．０〜１０．０の範囲にある。この値が大きいほど微粒子の色の濃さが濃く、イムノクロマトとして用いる場合に検出感度が高い。もちろん値が大きければ大きいほどよく、色の濃い染料を利用する、染色回数を増やす、スペーサーとして何らかの化合物を介して連結させる、微粒子の非晶領域を増やし染料が入り込みやすくする、微粒子を多孔性にして染料が入り込みやすくする、などの方法を採用することができる。しかしながら、経済性を考慮すると上限は、好ましくは７．０、より好ましくは５．０である。また、値が小さいほどイムノクロマトとして用いた場合に検出感度が低下するため、下限は、好ましくは１．５、より好ましくは２．０である。
【００１８】
発色強度の測定方法は、濃度既知の微粒子の純水分散液を調製し、光路長１０ｍｍとして、４００〜８００ｎｍの範囲で積分球を用いた可視吸光度測定を行い、得られた吸光度曲線のピーク値（ＡＢＳ）を測定し、得られた値を発色粒子の重量パーセントで割り返し、発色粒子０．０１ｗｔ％辺りの吸光度に換算した値として定義する。例えば、調製した微粒子の濃度が０．００４５ｗｔ％であり、吸光度曲線のピーク値が１．０であるとき、その発色強度は（１×０．０１）÷０．００４５＝２．２となる。
【００１９】
微粒子の色の濃さの測定に積分球を用いた可視吸光度測定を行う理由は、液体に分散した状態の微粒子の色の濃さを最も正確に測定できるためである。微粒子の色の濃さを測る方法としては、微粒子を乾燥させて得られた固体を測色計などで測定する方法もあるが、このような方法では微粒子の色の濃さを正確に測定できない。例えば、金属コロイドなどは粒子径に応じて色調や最大波長が異なり、乾燥した凝集状態は液体に分散した状態の色の濃さを正確に反映できない。また、液体中に同じ粒子濃度で分散させても凝集が発生すると色の濃さは薄くなる。更に、可視吸光度測定を行う際に積分球を用いる理由は、粒子自体の散乱による影響を除去するためである。通常の可視吸光度測定は透過光を測定する方法であり、入射光に対し着色成分による吸収だけでなく微粒子自体の散乱による影響も反映されてしまう。例えば、イムノクロマトに一般的に使われる金コロイドは、粒子径が４０ｎｍ〜６０ｎｍ、時には１００ｎｍのものが用いられる場合もあるがいずれも粒子径が小さいため散乱光の影響はほとんどない。それに反し、ラテックス粒子は粒子径が大きく明らかに散乱光の影響が大きい。上記のような理由から、粒子径や粒子素材が違う場合であっても、微粒子自体の色の濃さをより正確に反映するために、積分球を用いた可視吸光度測定を使用する。
【００２０】
用語「親水層」とは、文字通り親水性の高い構造体で構成された層のことであり、微粒子の水酸基と化学的に結合している層である。この親水層の構造は特に限定されるものではなくシラン層、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）層、ホスホリルコリン層などを用いることができる。場合によっては、前記層のうちの２つの層の混合体でもよい。例えば、シラン層とＰＥＧ層が１：１の割合で含まれた層を形成することも可能である。ここでいう、シラン層とはＳｉ基を含む構造体が粒子の水酸基と結合してできた層のことである。同様に、ＰＥＧ層、ホスホリルコリン層もそれぞれ、ＰＥＧ基、ホスホリルコリン基を含む構造体が粒子の水酸基と結合してできた層のことである。その後の反応剤との結合性という点では、親水層を形成する構造体の１つにはアミノ基が含まれていることが好ましい。親水層が形成されたか否かは、赤外分光法、顕微鏡観察、元素分析などにより判断する。
尚、本明細書中、「スペーサー」は、「親水層」中の反応基と結合する点で、「親水層」とは相違する。
【００２１】
親水層を付与するための親水化剤としては、特に限定されるものではないが、具体例としては以下のものが挙げられる：ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトエリエトキシシラン、ｐ−スチリルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−トリエトキシシリルーＮ−（１，３−ジメチルーブチリデン）プロピルアミン、Ｎ−フェニルー３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、３−イソシアネーとプロピルトリメトキシシラン、ポリエチレングリコールトリメトキシシラン、ポリエチレングリコールトリエトキシシラン、アミノ−ＰＥＧ１２−プロピオン酸、アミノ−ＰＥＧ８−プロピオン酸、アミノ−ＰＥＧ４−プロピオン酸、ポリ（エチレングリコール）２−アミノエチル酢酸、ＦＭＯＣ−ＰＥＧ  ５ｋ−スクシンイミドブタネート、ＨＯ−ＰＥＧ  ５ｋ−ＮＨＳ、Ｏ−〔２−（Ｆｍｏｃ−アミノ）―エチル〕―Ｏ’−２−カルボエチル）ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールビスアミン、１−Ｏ−オクタデシル−２−Ｏ−メチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン。この中で好ましくは、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−トリエトキシシリル−Ｎ−（１，３−ジメチルーブチリデン）プロピルアミン、アミノ−ＰＥＧ１２−プロピオン酸、アミノ−ＰＥＧ８−プロピオン酸、アミノ−ＰＥＧ４−プロピオン酸、ポリ（エチレングリコール）２−アミノエチル酢酸、ポリエチレングリコールビスアミンであり、より好ましくはＮ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−トリエトキシシリル−Ｎ−（１，３−ジメチルーブチリデン）プロピルアミンである。
【００２２】
アミノ基を有する親水層を用いる場合、カルボキシル基を導入した後の残存反応性アミノ基量は、着色セルロース微粒子１ｇあたり０．２０ｍｍｏｌ未満であることが望ましい。この範囲にあることで、疎水性物質の吸着を抑制できるだけでなく、イオン性物質、水素結合性物質の吸着も抑制可能であるため、飛躍的に生体分子の吸着量を減少させることができる。カルボキシル基を導入した後の残存反応性アミノ基量は、着色セルロース微粒子１ｇあたり０．２０ｍｍｏｌ以上では特に水素結合による吸着が増大するため、偽陽性の低減効果が小さくなってしまう。以上の点から、残存反応性アミノ基量の上限は好ましくは０．１５ｍｍｏｌ、より好ましくは０．１０ｍｍｏｌである。
【００２３】
残存反応性アミノ基量の測定方法としては、蛍光測定を用いる。アミノ基と反応した場合のみ発光する蛍光試薬を使用する。まず、アミノ基量が既知のサンプルで、アミノ基量と発光強度の関係について検量線を作成する。その後、蛍光試薬を微粒子に反応させる。その微粒子の蛍光強度を測定し、発光強度を得る。得られた発光強度を検量線に代入して、アミノ基量を算出する。
【００２４】
親水層の親水化の程度を表す指標として、「親水化度」を定義する。本明細書中、「親水化度」とは、微粒子表面の濡れやすさ、すなわち水との親和性を表す指標である。親水化度はパルスＮＭＲ法により測定する。パルスＮＭＲ法は、微粒子分散液にラジオ波を照射して水分子のプロトンを励起させた後、基底状態に戻るまでの時間（緩和時間）を測定する分析手法である。微粒子表面に吸着している水分子は運動性が制限されるため緩和時間が短く、バルク水分子（微粒子表面と吸着していない水分子）は運動性に制限が少なく自由に運動できるため緩和時間が長い。したがって、パルスＮＭＲ法により得られる微粒子分散液の緩和時間は、微粒子表面に吸着している水分子とバルク水分子の比率により変化する。すなわち、微粒子表面の親水性が高いほど、より多くの水分子を吸着できるため緩和時間は短くなる。
【００２５】
パルスＮＭＲの測定には、ブルカー社製のＭｉｎｉｓｐｅｃ  ｍｑ２０装置を用いる。濃度１％（ｗｔ／ｖｏｌ）の微粒子分散液を撹拌後、０．５ｍＬを外径１０ｍｍのガラス製ＮＭＲ管に移し、３０℃に設定されたパルスＮＭＲ装置に設置し、各種パラメータを以下の通りに設定し測定する。
・観測核：１Ｈ
・測定する緩和時間：横緩和時間Ｔ２（ｍｓ）
・測定モード：ＣＰＭＧ法
・積算回数：３２回
・Ｒｅｃｙｃｌｅ  Ｄｅｌａｙ：１０（ｓ）
・９０°−１８０°Ｐｕｌｓｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ（τ）：２（ｍｓ）
・Ｔｏｔａｌ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｅｃｈｏｅｓ：２０００点。
【００２６】
得られた磁化減衰曲線（磁化強度の経時変化を示す曲線）を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌの指数近似機能を用いて最小二乗法により下記式（１）：
Ｍ（ｔ）＝Ｍ０・ｅｘｐ（−ｔ／Ｔ２）・・・式（１）
｛式中、Ｍ（ｔ）：ある時間ｔにおける信号強度、Ｍ０：信号強度の初期値、Ｔ２：緩和時間。｝にフィッティングした。
測定した緩和時間から親水化度を算出するためには、縦軸に緩和時間の変化割合（Ｒｓｐ値）を、横軸に微粒子の総表面積値（ＴＳＡ値）をプロットしたグラフを用意し、最小二乗法により近似直線を作成し、その傾きを親水化度と定義する。
・Ｒｓｐ値の計算方法
Ｒｓｐ値＝Ｒａｖ÷Ｒｂ−１
｛式中、Ｒａｖ：平均緩和時定数（試料の緩和時間逆数）、Ｒｂ：バルク水分子の緩和時定数（ブランク水の緩和時間逆数）。｝、
・ＴＳＡ値（ｍ２）の計算方法
ＴＳＡ値＝ＳＡ×Ｖ×Ψｐ×ρ
｛式中、ＳＡ：微粒子の比表面積（ｍ２／ｇ）＝６÷（ρ×ｄ）、ここで、ρ：微粒子密度（ｇ／ｃｍ３）（微粒子密度：１．４ｇ／ｃｍ３、ラテックス粒子密度：１．０ｇ／ｃｍ３、金コロイド粒子密度：１９．３ｇ／ｃｍ３）、ｄ：微粒子直径（μｍ）、Ｖ：ラジオ波が照射される部分のＮＭＲ管体積（ｃｍ３）（≒試料量）、Ψｐ：微粒子体積比、ここで、微粒子体積（ｉ）＝微粒子濃度（ｗｔ％）÷１００÷微粒子密度、水の体積（ｉｉ）＝（１−微粒子体積（ｉ））÷水の密度（０．９９７ｇ／ｃｍ３）、Ψｐ（微粒子体積比）＝、微粒子体積（ｉ）÷水の体積（ｉｉ）、ρ：同上。｝。
例えば、図１に示すように、Ａ微粒子（ＴＳＡ値０．５、Ｒｓｐ値１０）とＢ微粒子（ＴＳＡ値１、Ｒｓｐ値５）の数値をグラフにプロットし、最小二乗法により各々の近似直線を作成する。Ａ微粒子の場合はＹ＝２０ｘ、Ｂ微粒子の場合はＹ＝５ｘとなる。近似直線の傾き（親水化度）が大きい方、すなわちＡ微粒子の方を親水化度が大きいと判定する。
【００２７】
本実施形態においては、親水化度は３０．０〜２００．０の範囲であることが好ましい。親水化度がこの範囲にあると、粒子表面が親水的なために、メンブレン中を移動しやすくなることに加え、微粒子表面へのタンパク質などの吸着量が低減する。その結果、イムノクロマトに使用した際に偽陽性が低減する。それに加えて驚くべきことに、この範囲にある微粒子は親水層が保護層として機能するため、カルボキシル基の導入の際に発色強度の低下を起こしにくくなる。そのため、過酷な反応条件に耐えうる微粒子となるので、カルボキシル基の導入量を多量にすることが可能となる。その結果、抗体も多量に微粒子に担持できるため、高い検出感度を維持した微粒子となりうる。親水化度が３０．０未満であると微粒子表面は疎水的となるため、微粒子表面にタンパク質などが吸着してしまい、偽陽性が発生しやすくなってしまう。加えてメンブレン中での流れが悪くなり、診断時間も長くなってしまう。また、３０．０未満であるとカルボキシル基導入反応を行う際に微粒子の発色強度の低下がおこりやすくなるので、検出感度が低下してしまう。以上の点から、親水化度の下限は、より好ましくは３５．０、さらに好ましくは４０．０である。他方、親水化度が２００．０より大きくなると、水素結合が支配的になるためにタンパク質などの生体分子の吸着量が増加し、偽陽性が発生するおそれがあるため、親水化度の上限はより好ましくは１９０．０、さらに好ましくは１８０．０である。
【００２８】
用語「スペーサー」とは、「親水層」を介して、微粒子とカルボキシル基をつなぐ化学基のことである。本実施形態においては、「スペーサー」は「親水層」の反応性基と結合する一方で、「親水層」は、微粒子の水酸基と結合する。例えば、微粒子に結合したシラン層を介して１８−ブロモステアリン酸を反応させた場合、親水層はシラン層、スペーサーは（ＣＨ２）１７となる。スペーサーの構造は特に限定されるものではなく、アルキル基、アルケン基、アルカン基、およびベンゼン環といった炭化水素系などの疎水性の構造体を用いることができる。炭素数についても特に限定されるものではないが、粒子表面の電気二重層の影響を受けず感度向上が期待できるという点では、３以上が好ましい。一般的には親水性の構造体が生体分子の吸着抑制に効果的であるため、微粒子表面が疎水的な金コロイド、ラテックス粒子、シリカ粒子などはＰＥＧなどの親水性のスペーサーがよく使用される。例えば、長崎らは、金表面に長さの異なるＰＥＧ鎖を導入することで、非特異吸着を大幅に低減できることを報告している（長崎ら、高分子  ６１巻２号  ２０１２年参照）。炭化水素系などの疎水性のスペーサーでは疎水性相互作用により、微粒子表面にスペーサーが吸着してしまうと考えられているからである。そのため、カルボキシル基と抗体との反応性が悪くなり、抗体が微粒子に必要量固定できず、検出感度が低下するおそれがある。また、一般的に疎水性の構造体はタンパク質などと疎水性相互作用をしやすい。つまりスペーサーに使用するとタンパク質などの生体分子が吸着してしまい、偽陽性が発生する可能性が高い。これに反し、本発明らは、かかる常識を覆し、微粒子表面の親水層と炭化水素系などの疎水性のスペーサーを組み合わせることで、驚くべきことに偽陽性の原因となる生体分子の吸着量を大幅に低減することに成功し、検出感度を維持しながら、偽陽性が大幅に低減できることを確認した。スペーサーが親水性であると、微粒子表面に親水層が存在するため、親水層と水素結合などの相互作用がおこると考えられる。そのため、スペーサーが親水層に吸着してしまい、抗体が微粒子に必要量固定化できずに検出感度が低下することに加え、生体分子の吸着量も低減できず、偽陽性の抑制も達成できなかった。他方、炭化水素系などの疎水性のスペーサーを用いた実施形態では、スペーサーが親水層へ吸着しないばかりでなく、スペーサー同士が疎水性相互作用により綺麗に整列し、微粒子上に隙間なくしっかり導入されるため、生体分子が微粒子表面やスペーサーに近づく隙間がなくなり、吸着量が大幅に低減でき、偽陽性も大幅に低減できたと考えられる。
例えば、以下の表１に示すように、ＰＥＧ鎖を用いた実施例１５の偽陽性発生率が１％であるのに対し、疎水性スペーサーを用いた実施例２の偽陽性発生率は０％であり、ＰＥＧ鎖を用いた実施例１７の偽陽性発生率が１％であるのに対し、疎水性スペーサーを用いた実施例１の偽陽性発生率は０％であり、ＰＥＧ鎖を用いた実施例１８の偽陽性発生率が２％であるのに対し、疎水性スペーサーを用いた実施例１６の偽陽性発生率は１％であり、そしてＰＥＧ鎖を用いた実施例２０の偽陽性発生率が２％であるのに対し、疎水性スペーサーを用いた実施例１９の偽陽性発生率は１％である。
【００２９】
スペーサーの同定方法には、赤外分光法、元素分析、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、質量分析（ＭＳ）法などを用いることができる。例えば、カルボキシル基が導入された微粒子に強酸又は強塩基を高温で反応させ、スペーサー部を微粒子から脱離させる。その後、遠心分離などにより微粒子を分離し、上澄み液をＮＭＲやＭＳ測定することでスペーサーの構造を同定することができる。
【００３０】
用語「カルボキシル基の導入量」とは、着色セルロース微粒子１ｇあたりに導入されたカルボキシル基の量のことである。かかる導入量は０．２０〜３．００ｍｍｏｌ／ｇであることが好ましい。この範囲にあることで、抗体やブロッキング剤に用いるタンパク質などが微粒子と化学的に強固にかつ多量に結合可能となるため、高感度化と偽陽性低減の両立が可能となる。導入量が０．２０ｍｍｏｌ／ｇ未満では抗体などのタンパク質の結合量が十分でないため、添加剤を加えるなどの偽陽性低減対策を行うと、検出感度が低下するおそれがある。さらに、０．２０ｍｍｏｌ／ｇ未満では、導入されたカルボキシル基同士の距離が遠いため、抗体などと反応しなかったカルボキシル基は分子内ではなく分子間の水素結合を誘発しやすくなる。つまりタンパク質などが水素結合を介して吸着し、偽陽性が発生するおそれがある。そのため、カルボキシル基の導入量の下限は好ましくは０．２５ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは０．３０ｍｍｏｌ／ｇである。他方、導入量が３．００ｍｍｏｌ／ｇを超えると粒子１個あたりの重量が重くなるため、微粒子１個あたりの発色強度が低下する。発色強度が低下すると、イムノクロマトに使用した際に検出感度が低下するおそれがあるため、上限は好ましくは２．５０ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは２．００ｍｍｏｌ／ｇである。
【００３１】
導入量の算出方法としては、蛍光測定法、中和滴定法、赤外分光法などが挙げられる。本実施形態では、抗体やタンパク質と反応可能なカルボキシル基量を正確に測定するために、主に蛍光測定法を使用する。カルボキシル基と反応した場合のみ発光する蛍光試薬を使用する。まず、カルボキシル基量が既知のサンプルで、カルボキシル基量と発光強度の関係について検量線を作成する。その後、蛍光試薬を微粒子に反応させる。その微粒子の蛍光強度を測定し、発光強度を得る。得られた発光強度を検量線に代入して、カルボキシル基量を算出する。
【００３２】
カルボキシル基を導入する際のカルボキシル化剤としては、特に限定されるものではないが、具体例としては以下のものが挙げられる：２−ブロモ酢酸、３−ブロモプロピオン酸、４−ブロモ酪酸、５−ブロモペンタン酸、６−ブロモヘキサン酸、７−ブロモヘプタン酸、８−ブロモオクタン酸、１１−ブロモウンデカン酸、１８−ブロモステアリン酸、１６−ヘプタデセン酸、５−ヘキセン酸、エピクロロヒドリン、４−アミノ酪酸、３−アミノプロピオン酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、アジピン酸、エイコサン二酸、１，８−オクタンジカルボン酸、１，４−ブタンジカルボン酸、１，６―ヘキサンジカルボン酸、２−クロロ酢酸、３−クロロプロピオン酸、４−クロロ酪酸、５−クロロペンタン酸、６−クロロヘキサン酸、７−クロロヘプタン酸、８−クロロオクタン酸、１１−クロロウンデカン酸、１８−クロロステアリン酸、アミノ−ＰＥＧ１２−プロピオン酸、アミノ−ＰＥＧ８−プロピオン酸、アミノ−ＰＥＧ４−プロピオン酸、α，ｗ−ビス［２−｛（３−カルボキシ−１−オキソプロピル）アミノ｝エチル］ポリエチレングリコール、ＨＯ−ＰＥＧ１２−ＣＯＯＨ，ＨＯ−ＰＥＧ１２−プロピオン酸、ＨＯ−ＰＥＧ８−プロピオン酸、Ｏ−（２−カルボキシエチル）ポリエチレングリコール、ＣＯＯＨ−ＰＥＧ１２−ＣＯＯＨ、ポリ（エチレングリコール）ビス（カルボキシメチル）エーテル、プロピオン酸−ＰＥＧ１２−プロピオン酸、プロピオン酸−ＰＥＧ８−プロピオン酸、プロピオン酸−ＰＥＧ４−プロピオン酸。この中で好ましくは、３−ブロモプロピオン酸、４−ブロモ酪酸、５−ブロモペンタン酸、６−ブロモヘキサン酸、７−ブロモヘプタン酸、８−ブロモオクタン酸、１１−ブロモウンデカン酸、１８−ブロモステアリン酸、アジピン酸、エイコサン二酸、１，８−オクタンジカルボン酸、１，４−ブタンジカルボン酸、１，６−ヘキサンジカルボン酸であり、より好ましくは８−ブロモオクタン酸、１１−ブロモウンデカン酸、１８−ブロモステアリン酸、アジピン酸、エイコサン二酸、１，８−オクタンジカルボン酸である。
【００３３】
本明細書中、「微粒子」とは、長径（Ｌ）と短径（Ｄ）の長さが近く形状が球に近い構造体を指す。具体的には、Ｌ÷Ｄで表されるＬ／Ｄ比が１．０〜３．０である構造体を指す。Ｌ／Ｄがこの範囲にあるとイムノクロマト診断キットとして用いる場合に目詰まりを起こしにくくなり、より好ましくは１．０〜２．０、更に好ましくは１．０〜１．５、最も好ましくは１．０〜１．３である。測定方法としては、粒子の電子顕微鏡画像を撮影し、１００個の粒子の長径（Ｌ）と短径（Ｄ）を測定し、その１００個の平均値を算出する。
【００３４】
着色セルロース微粒子の製造方法は、特に限定されない。微粒子をまず成形し、色素、染料などの着色成分を担持させる方法、微粒子を成形し、金属コロイドや顔料などのより小さい発色微粒子を担持させる方法、微粒子の成形時に色素、染料、顔料、金属コロイドなどの着色成分も一緒に加えて成形する方法などが挙げられる。中でも粒子径の調整、色の濃さの調整、色の種類の調整、微粒子表面状態の調整などの微粒子の特徴の調整のしやすさから、微粒子をまず成形し、色素、染料などの着色成分を担持させる方法が好ましい。また、担持させる着色成分としては、担持の容易さから染料が好ましい。
【００３５】
着色成分として染料を用いる場合、染料の種類は特に限定されない。反応染料、直接染料、含金染料、酸性染料、塩基性染料、分散染料、硫化染料、植物染料、ナフトール染料、蛍光染料などの染料を用いることができる。もちろん任意の染料を組み合わせても構わない。中でもセルロースの水酸基と共有結合で結合する反応性染料が、大量に染料を保持できる点や安定性の面から特に好ましい。
【００３６】
セルロース微粒子をまず成形し、その後着色成分を担持させる場合、セルロース微粒子の成形方法は特に限定されない。天然のセルロースをボールミルや高圧ホモジナイザーで物理的に微細化する方法、酸やアルカリなどで化学的に処理し微細化する方法、セルロースをその良溶媒に一度溶解させ粒子状に成形する方法などが挙げられる。また、誘導体化されたセルロースを溶解、粒子状に成形し、誘導体化された置換基を水酸基に戻しセルロース微粒子を調製してもよい。更にそれらの成形方法を組み合わせてもよい。またセルロースの種類も特に限定されるものではなく、再生セルロース、精製セルロース、天然セルロース、誘導体化された置換基を水酸基に戻したセルロースなどを用いることができる。中でも粒子径の調整、粒子形状の調整などの点から良溶媒に一度溶解させ粒子状に成形する方法が好ましく、セルロースの種類としては再生セルロースが好ましい。
【００３７】
セルロースをその良溶媒に一度溶解させ粒子状に成形する場合、セルロースを溶解させる良溶媒の種類も特に限定されるものではなく、銅アンモニア溶液、ビスコース溶液、Ｎ−メチルモルホリン、各種のイオン性液体などセルロースを溶解することのできる様々な良溶媒を用いることができる。中でも粒子径の調整、粒子形状の調整などの点から銅アンモニア溶液が好ましい。また、溶解させたセルロースを粒子に成形する方法も特に限定されるものではない。本実施形態では、相分離による方法を用いた。
【００３８】
用語「リガンド」とは、特定の検査対象物質に選択的かつ特異的に結合する性質をもつ物質である。その種類は特に限定されるものではないが、例えば、抗体、酵素、遺伝子、ホルモン、核酸、ペプチド、タンパク質などが挙げられる。
【００３９】
用語「イムノクロマト診断キット」とは、様々な検体中の検査対象物質の有無を簡便に検出するための抗原抗体反応を利用した物品である。イムノクロマト診断キットの種類としては、ラテラルフロー式やフロースルー式がある。発色粒子やサンプルパッドを用いるものであれば特に限定されないが、好ましくはラテラルフロー式である。また、ラテラルフロー式の中でも、ディップスティックタイプとカセットタイプがあるが、それらのタイプは特に限定されない。イムノクロマト診断キットの構成は、特に限定されるものではなく、当該分野で一般的に用いられる構成であればいずれでも構わない。発色粒子とサンプルパッド以外の部材の種類は、当該分野で用いられるものであれば特に限定されず、例えば、コンジュゲートパッド（抗体感作発色粒子を含む）、ニトロセルロース等のメンブレン、吸収パッド、及び台紙が挙げられる。また、必要に応じそれら部材を一部省いていてもかまわない。
【００４０】
イムノクロマト診断キットを使用する「診断方法」とは、イムノクロマト診断キットを用いて行われる様々な診断を指す。診断対象は特に限定されるものではなく、人用、動物用、食品用、植物用、その他環境検査など様々な診断対象であることができる。一般的な診断の手順では、検査対象から検体試料を採取し、必要であればそれを抽出やろ過などの前処理を行い、サンプルパッドに滴下し、検査開始から所定時間待ち、検査対象物質の有無によって異なる発色より診断結果を判断する。もちろんこの手順に限定されず、同じような手順、原理の診断にも用いることができる。好ましいのは、検体試料を予めろ過しておくことで余分な異物や夾雑物を除去でき、それによりより一層の診断時間の短縮化や、診断精度の向上が期待できる。
【００４１】
イムノクロマト診断キットで診断できる対象は特に限定されるものではないが、具体例としては以下のものが挙げられる：癌マーカー、ホルモン、感染症、自己免疫、血漿蛋白、ＴＤＭ、凝固・線溶、アミノ酸、ペプチド、蛋白、遺伝子、細胞。より具体的には、ＣＥＡ、ＡＦＰ、フェリチリン、β２マイクロ、ＰＳＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＢＦＰ、エラスターゼ１、ペプシノーゲン１・２、便潜血、尿中β２マイクロ、ＰＩＶＫＡ−２、尿中ＢＴＡ、インスリン、Ｅ３、ＨＣＧ、ＨＰＬ、ＬＨ、ＨＣＶ抗原、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体、ＨＴＬＶ−１抗体、ＨＩＶ抗体、トキソプラズマ抗体、梅毒、ＡＳＯ、Ａ型インフルエンザ抗原、Ａ型インフルエンザ抗体、Ｂ型インフルエンザ抗原、Ｂ型インフルエンザ抗体、ロタ抗原、アデノウィルス抗原、ロタ・アデノウィルス抗原、Ａ群レンサ球菌、Ｂ群レンサ球菌、カンジダ抗原、ＣＤ菌、クリプトロッカス抗原、コレラ菌、髄膜炎菌抗原、顆粒菌エラスターゼ、ヘリコバクターピロリ抗体、Ｏ１５７抗体、Ｏ１５７抗原、レプトスピラ抗体、アスペルギルス抗原、ＭＲＳＡ、ＲＦ、総ＩｇＥ、ＬＥテスト、ＣＲＰ、ＩｇＧ，Ａ，Ｍ、ＩｇＤ、トランスフェリン、尿中アルブミン、尿中トランスフェリン、ミオグロビン、Ｃ３・Ｃ４、ＳＡＡ、ＬＰ（ａ）、α１−ＡＣ、α１−Ｍ、ハプトグロビン、マイクロトランスフェリン、ＡＰＲスコア、ＦＤＰ、Ｄダイマー、プラスミノーゲン、ＡＴ３、α２ＰＩ、ＰＩＣ、ＰＡＩ−１、プロテインＣ、凝固第Ｘ３因子、ＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸、ＧＨｂＡ１ｃ、その他の各種抗原、各種抗体、各種ウィルス、各種菌、各種アミノ酸、各種ペプチド、各種蛋白質、各種ＤＮＡ、各種細胞、各種アレルゲン、各種残留農薬、各種有害物。
【００４２】
以下、セルロース微粒子の作製方法、セルロース微粒子の着色方法、着色セルロース微粒子の親水化方法、カルボキシル基の導入方法、イムノクロマト診断キットの作製方法などの一例を記載する、もちろん、本実施形態は、それらにより限定されるべきではない。
【００４３】
〔セルロース微粒子の作製方法〕
セルロースリンターをセルロースの良溶媒に溶解させる。良溶媒として公知の方法で調製した銅アンモニア溶液を用いる。そして凝固液としては有機溶媒＋水＋アンモニア混合系を主に用いる。この凝固液を攪拌しながら、調製しておいた銅アンモニアセルロ−ス溶液を加えて凝固を行う。さらに硫酸を加え中和、再生を行うことで、目的のセルロ−ス微粒子を含有したスラリーを得ることができる。この際スラリーは再生に用いた酸の残留により酸性であり、さらに中和で発生したアンモニウム塩などの不純物を含んでいるため、セルロース微粒子と媒体からなるセルロース分散液へと精製する操作が必要となる。この精製操作として遠心分離−デカンテーション−分散媒液体による希釈の処理の繰り返しを用いる。得られたセルロース微粒子分散液中のセルロース微粒子は、精製操作の過程において凝集する場合もあるので、この場合は剪断などによる分散処理を行うことができる。剪断を与える手段としては高圧ホモジナイザーを用いる。
【００４４】
〔セルロース微粒子の着色方法〕
得られたセルロース微粒子の水分散体に対し、硫酸ナトリウム、反応性染料を加え、マグネティックスターラーで撹拌しながら恒温槽で適温に昇温する。昇温後にアルカリとして炭酸ナトリウムを加え染色を開始する。所定時間経過後に目的の着色セルロース微粒子を含有したスラリーを得ることができる。この際スラリーはアルカリ性であり、さらに硫酸ナトリウム、未反応の染料などを含んでいるため、着色セルロース微粒子と媒体からなる着色セルロース微粒子分散液へと精製する操作が必要となる。前記同様に遠心分離による精製を行い、着色セルロース微粒子分散液を得る。得られた着色セルロース微粒子分散液中の着色セルロース微粒子は、精製操作の過程において凝集する場合もあるので、この場合は剪断などによる分散処理を行うことができる。剪断を与える手段としては高圧ホモジナイザーを用いる。
【００４５】
〔着色セルロース微粒子の親水化方法〕
得られた着色セルロース微粒子の水分散体に対し、有機溶媒、水を加え、マグネティックスターラーで撹拌しながら恒温槽で適温に昇温する。昇温後に市販の親水化剤を加え反応を開始する。所定時間経過後に目的の親水化着色セルロース微粒子を含有したスラリーを得ることができる。この際スラリーはアルカリ性であり、さらに有機溶媒、未反応の親水化剤などを含んでいるため、親水化着色セルロース微粒子と媒体からなる親水化着色セルロース微粒子分散液へと精製する操作が必要となる。前記同様に遠心分離による精製を行い、親水化着色セルロース微粒子分散液を得る。得られた親水化着色セルロース微粒子分散液中の親水化着色セルロース微粒子は、精製操作の過程において凝集する場合もあるので、この場合は剪断などによる分散処理を行うことができる。剪断を与える手段としては高圧ホモジナイザーを用いる。
【００４６】
〔親水化着色セルロース微粒子へのカルボキシル基導入方法〕
得られた親水化着色セルロース微粒子の水分散体に対し、有機溶媒、塩基を加え、マグネティックスターラーで撹拌しながら恒温槽で適温に昇温する。昇温後にカルボキシル基を有する反応剤を加え反応を開始する。所定時間経過後に目的のカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を含有したスラリーを得ることができる。この際スラリーは、有機溶媒、塩基、未反応の反応剤などを含んでいるため、カルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子と媒体からなるカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子分散液へと精製する操作が必要となる。前記同様に遠心分離による精製を行い、カルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子分散液を得る。得られたカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子分散液中のカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子は、精製操作の過程において凝集する場合もあるので、この場合は剪断などによる分散処理を行うことができる。剪断を与える手段としては高圧ホモジナイザーを用いる。
【００４７】
〔イムノクロマト診断キットの作製方法〕
所定の濃度に調整したカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子の分散液を準備し、緩衝液、抗体を加え、温度調整を行いながら一定時間撹拌し、カルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子に抗体を結合させる。一定時間撹拌後、更にブロッキング剤を加え温度調整を行いながら一定時間撹拌することで、カルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子のブロッキングを行う。ブロッキング剤としては、検査対象物質や検体又はそれを希釈する溶液の組成などに応じ様々なブロッキング剤を用いることができる。カゼインは、カルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子のブロッキングに特に好ましい。抗体結合＆ブロッキング後のカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を洗浄するため、遠心分離を行い、余剰な抗体とブロッキング剤が含まれた上澄み液と沈降した微粒子を分離し、上澄み液をデカンテーションにて除去する。沈降した微粒子に緩衝液などの液体を加え、必要に応じ超音波などで分散処理を行う。この遠心分離による沈降、上澄みの除去、液体の添加という一連の操作による洗浄を必要回数行い、抗体吸着＆ブロッキングを行った微粒子を所定の濃度含有した分散液を調整する。この分散液に必要に応じタンパク質、界面活性剤、スクロースやトレハロースなどの糖を加え、得られた溶液をガラス繊維製のコンジュゲートパッドに一定量塗布し、乾燥させ、検出試薬含有部を調整する。また、再生セルロース連続長繊維不織布に必要に応じ緩衝液、界面活性剤、タンパク、検体試料中の夾雑物をトラップする試薬、防腐剤、抗菌剤、酸化防止剤、吸湿剤、などを塗布し、乾燥させ、サンプルパッドを調製する。更に所定の位置に抗体を固定化したニトロセルロース多孔膜製のメンブレン、検体を吸収するためのセルロース濾紙製の吸収パッドを調製する。それらをバッキングシートと呼ばれる接着部位を有するシートに固定化し、所定のサイズに裁断することでイムノクロマト診断キットを作製する。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。また、特に記載のない全ての操作は温度２３℃、相対湿度５５％ＲＨの環境下で行った。
まず、用いた各種物性等の測定方法等について説明する。【００４９】
〔微粒子の平均粒子径〕
装置としては日機装社製のナノトラック粒度分布測定装置ＵＰＡ−ＥＸ１５０（動的光散乱式）を用いた。測定サンプルとして、微粒子が０．０１ｗｔ％、純水９９．９９ｗｔ％のサンプルを用いた。測定条件としては積算回数を３０回、１測定辺りの測定時間を３０秒とし、体積平均の粒子径分布を用いそのメジアン径を平均粒子径とした。【００５０】
〔微粒子の発色強度〕
装置としては日本分光社製の紫外可視近赤外分光光度計ＪＡＳＣＯ  Ｖ−６５０に同社製の積分球ユニットＩＳＶ−７２２を取り付けた装置を用いた。測定するサンプルとして微粒子が０．０１ｗｔ％、純水９９．９９ｗｔ％のサンプルを用い、光路長１０ｍｍの石英セルにサンプルを入れ測定した。得られた吸光度ピークのうち、４００〜８００ｎｍ可視光範囲での最大値（ＡＢＳ）を発色強度とした。【００５１】
〔微粒子のＬ／Ｄ（真球度）〕
装置としては日本電子社製の走査型電子顕微鏡ＪＳＭ-６７００を用いた。微粒子が０．０１ｗｔ％、純水９９．９９ｗｔ％のサンプルを雲母板に滴下し、１０秒経過させることで微粒子を雲母板上に吸着させ、キムワイプで余分な液体を吸い取り乾燥させた。得られた雲母板をプラチナでコーティングし、電子顕微鏡測定用のサンプルを調製した。加速電圧１．６ｋＶ、測定倍率５万倍で観測を行い、微粒子画像が１００個以上になるように必要枚数の画像を撮影し、それぞれの微粒子の長径（Ｌ）と短径（Ｄ）を測定し、微粒子１００個のＬ／Ｄの平均値を算出した。【００５２】
〔スペーサー構造の同定〕
装置としてはブルカー社製の核磁気共鳴装置（ＡＶＡＮＣＥ  ＩＩ４００）を用いた。スペーサーを導入した微粒子の１．０ｗｔ％分散液に、０．１ｍＬ、１．０Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬社製、７２０８２１００）、又は１．０Ｍの塩酸水溶液（和光純薬社製、０８０−１００３５）１０．０ｍＬを加え、６０℃で５時間加熱撹拌する。その後、遠心分離により上澄み液を採取し、微粒子から切断されたスペーサーが溶解又は分散した溶液を得た。この溶液を最適な重溶媒で希釈し、核磁気共鳴装置によりＮＭＲ測定し得られたスペクトルから構造物を同定した。【００５３】
〔カルボキシル基の導入量〕
装置としては日本分光社製の分光蛍光光度計ＦＰ−８３００を用いた。カルボキシル基と反応した場合のみ蛍光を発する試薬を微粒子に結合させ、その蛍光強度から導入量を測定した。以下に、測定例を示す。導入量を測定したい微粒子の１．０ｗｔ％分散液０．１ｍＬ、蛍光試薬ＡＤＡＭ（ＫＡＫ社製、ＦＫ−１０１）の２．３ｍＭのエタノール溶液４．０ｍＬ、エタノール（関東化学社製、１４０３３−７０）３．９ｍＬを容器に入れ、６０℃で５分反応させる。その後、得られた反応液１０．０μＬにエタノール２．０ｍＬを添加しＦＰ−８３００にて３６５ｎｍの励起光を照射し、４１０ｎｍの蛍光強度を測定した。検量線には、オクタン酸（東京化成社製、Ｏ００２７）を使用した。【００５４】
〔残存反応性アミノ基量〕
装置としては日本分光社製の分光蛍光光度計ＦＰ−８３００を用いた。アミノ基と反応した場合のみ蛍光を発する試薬を微粒子に結合させ、その蛍光強度から導入量を測定した。以下に測定例を示す。残存反応性アミノ基量を測定したい微粒子の１．０ｗｔ％分散液０．１ｍＬ、蛍光試薬ＮＢＤ−Ｆ（同仁化学社製）の２．５ｍＭのエタノール溶液４．０ｍＬ、エタノール（関東化学社製、１４０３３−７０）３．９ｍＬを容器に入れ、３０℃で６０分反応させる。その後、得られた反応液１０．０μＬにエタノール２．０ｍＬを添加しＦＰ−８３００にて４８０ｎｍの励起光を照射し、５３０ｎｍの蛍光強度を測定した。検量線には、オクチルアミン（東京化成社製、Ｏ００４５）を使用した。【００５５】
〔微粒子の親水化度〕
微粒子分散液を濃度１％（ｗｔ／ｖｏｌ）に調製し試料溶液とした。試料溶液を撹拌後、０．５ｍＬを外径１０ｍｍのガラス製ＮＭＲ管に移し、３０℃に設定されたパルスＮＭＲ装置に設置した。パルスＮＭＲ装置はブルカー社製のＭｉｎｉｓｐｅｃ  ｍｑ２０装置を用いた。各種パラメータを以下の通りに設定し測定した。
・観測核：１Ｈ
・測定する緩和時間：横緩和時間Ｔ２（ｍｓ）
・測定モード：ＣＰＭＧ法
・積算回数：３２回
・Ｒｅｃｙｃｌｅ  Ｄｅｌａｙ：１０（ｓ）
・９０°−１８０°Ｐｕｌｓｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ（τ）：２（ｍｓ）。
得られた磁化減衰曲線（磁化強度の経時変化を示す曲線）を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌの指数近似機能を用いて最小二乗法により下記式（１）にフィッティングした。
Ｍ（ｔ）＝Ｍ０・ｅｘｐ（−ｔ／Ｔ２）・・・（式１）
｛式中、Ｍ（ｔ）：ある時間ｔにおける信号強度、Ｍ０：信号強度の初期値、Ｔ２：緩和時間。｝。
次に、図１に示すように、縦軸に緩和時間の変化割合（Ｒｓｐ値）を、横軸に微粒子の総表面積値（ＴＳＡ値）をプロットしたグラフを作成した。最小二乗法により近似直線を作成し、その傾きを親水化度と定義し、微粒子の親水化度を比較した。Ｒｓｐ値とＴＳＡ値の計算方法は以下のとおりである。
・Ｒｓｐ値の計算方法
Ｒｓｐ値＝Ｒａｖ÷Ｒｂ−１
｛式中、Ｒａｖ：平均緩和時定数（試料の緩和時間逆数）、Ｒｂ：バルク水分子の緩和時定数（ブランク水の緩和時間逆数）。｝。
・ＴＳＡ値（ｍ２）の計算方法
ＴＳＡ値＝ＳＡ×Ｖ×Ψｐ×ρ
｛式中、ＳＡ：微粒子の比表面積（ｍ２／ｇ）＝６÷（ρ×ｄ）、ここで、ρ：微粒子密度（ｇ／ｃｍ３）（微粒子密度：１．４ｇ／ｃｍ３、ラテックス粒子密度：１．０ｇ／ｃｍ３、金コロイド粒子密度：１９．３ｇ／ｃｍ３）、ｄ：微粒子直径（μｍ）、Ｖ：ラジオ波が照射される部分のＮＭＲ管体積（ｃｍ３）（≒試料量）、Ψｐ：微粒子体積比、ここで、微粒子体積（ｉ）＝微粒子濃度（ｗｔ％）÷１００÷微粒子密度、水の体積（ｉｉ）＝（１−微粒子体積（ｉ））÷水の密度（０．９９７ｇ／ｃｍ３）、Ψｐ（微粒子体積比）＝微粒子体積（ｉ）÷水の体積（ｉｉ）、ρ：同上。｝。【００５６】
〔タンパク質吸着量〕
装置としては日本分光社製の紫外可視近赤外分光光度計ＪＡＳＣＯ  Ｖ−６５０を用いた。タンパク質の一例として牛血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ）という、シグマアルドリッチ社製、Ａ７９０６）の吸着量の算出方法を示す。吸着量を測定したい微粒子の１．０ｗｔ％分散液を３０．０μＬ、ｐＨ＝５．０  濃度１００ｍＭのリン酸緩衝液（キシダ化学社製）２７０．０μＬ、１．０ｗｔ％のＢＳＡ溶液３．０μＬを、３７℃で２時間反応させ、その後遠心分離により上澄み液を採取する。この上澄み液を市販のＢＣＡ試薬（和光純薬社製、２９７−７３１０１）と反応させ、Ｖ−６５０により５６２ｎｍの吸光度を測定し、上澄み液中のＢＳＡ量を算出する。その後仕込んだＢＳＡ量から上澄み液中のＢＳＡ量を引き、使用した微粒子量を除してどれだけ吸着したかを算出した。【００５７】
〔カルボキシル基が導入された親水化セルロース微粒子と抗体の結合方法〕
２−モルホリノエタンスルホン酸（以下、「ＭＥＳ」という、東京化成社製、Ｍ０６０６）、苛性ソーダ、純水を用いてｐＨ＝６．０、濃度が１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液を調製した。得られたＭＥＳ緩衝液６３．０μＬ、カルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子１．０ｗｔ％分散液７．０μＬ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、「ＥＤＣ」という、東京化成社製、Ｄ１６０１）の１．０ｗｔ％溶液３．５μＬ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（以下、「ＮＨＳ」という、東京化成社製、Ｂ０２４９）の１．０ｗｔ％溶液７．０μＬを、容器に入れ、室温で１５分間した。その後、遠心分離により上澄み液を捨てて未反応のＥＤＣ、ＮＨＳを除去した。ＭＥＳ緩衝液７０．０μＬを入れ、微粒子を分散させた後、カルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子に対して１０．０ｗｔ％となるように抗ｈＣＧ抗体（Ｆｉｔｚｇｅｌａｒｄｈ製、♯５０１４）をスピッツ管に添加し、３７℃で２時間反応させた。その後、１．０ｗｔ％カゼイン（和光純薬工業社製、０３０−０１５０５）を含有するブロッキング溶液（１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液、ＰＨ＝８．５）８４０．０μＬを、スピッツ管に添加し、３７℃の乾燥機内で１時間静置した。１時間後、遠心分離機（クボタ商事社製、６２００）と遠心分離ローター（クボタ商事社製、ＡＦ−５００８Ｃ）を用い、１４０００ｇの遠心を３０分間行い、抗体結合カルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を沈降させた後、上澄み液を廃棄した。次いで、ホウ酸緩衝液（５０ｍＭ、ＰＨ＝１０．０）８４０．０μＬをスピッツ管に加え、超音波分散機（エスエムテー社製、ＵＨ−５０）で１０秒間処理し、抗体結合カルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を分散させた。十分に分散させた後、１４０００ｇの遠心を２０分間行い、上澄み液を廃棄した。抗体結合カルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子の濃度が０．０４ｗｔ％となるようにホウ酸緩衝液（５０ｍＭ、ＰＨ＝１０．０）を添加し、超音波分散機により十分に分散させた。以上の方法により、抗体結合カルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子（以下、「検出試薬」ともいう。）を得た。【００５８】
〔コンジュゲートパッドへの検出試薬の含浸と乾燥〕
ポリエチレンテレフタレート製コンジュゲートパッド（Ａｈ製、６６１５）を０．０５ｗｔ％のＴｗｅｅｎ−２０（シグマアルドリッチ社製、Ｔ２７００）に浸漬し、余分な液を取り除いた後に５０℃で６０分乾燥させた。次いで、高さ１０ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。次いで、マイクロピペットを用い、検出試薬を２７２μＬ／８００ｍｍ２となるように均等に塗布し、３７℃で３０分乾燥させた。【００５９】
〔サンプルパッドの前処理〕
再生セルロース連続長繊維不織布を、大過剰の２．０ｗｔ％のＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製、Ａ７９０６）と２．０ｗｔ％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ緩衝液（６６ｍＭ、ＰＨ７．４）に含浸し、余分な液を取り除いた後、５０℃で６０分乾燥させた。次いで、高さ２０ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。【００６０】
〔捕捉抗体塗布メンブレンの調製〕
ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＳＨＦ０９００４２５）を幅２５ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。液体塗布装置（武蔵エンジニアリング社製、３００ＤＳ）を用い、０．１ｗｔ％抗ｈＣＧ−βマウス抗体（ＭｅｄｉｘＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製、６６０１）を含むＰＢＳ溶液（６６ｍＭ、ＰＨ７．４）を０．１μＬ／ｍｍの割合で高さ１２ｍｍの部分に塗布した。次いで、３７℃で３０分間乾燥させた。【００６１】
〔イムノクロマト診断キットの調製〕
バッキングカード（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅｒｃｈ社製、ＡＲ９０２０）に、前記にようにして得た捕捉抗体塗布メンブレン、吸収パッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃ０８３）、検出試薬を含有したコンジュゲートパッド、及びサンプルパッドを張り合わせた。次いで、裁断機にて５ｍｍの幅にカットし、幅５ｍｍ、高さ６０ｍｍのイムノクロマト診断キットを得た。【００６２】
〔イムノクロマト診断キットの偽陽性判定〕
妊娠していない１００人分の尿を用いて偽陽性測定を実施した。１５分経過後のテストライン（ＴＬ）の発色強度を０−１０の１１段階のグレード評価を目視で行った。図２に示すように、目視グレードは値が大きいほどＴＬの線の色が濃いことを示し、０は線が見えないことを示す。この測定を５回行い、得られた値の平均値で目視グレードが０であれば偽陽性はないと判断した。１００検体中、偽陽性が発生した検体数を数え、１００で除して偽陽性の発生率とした。また、偽陽性が発生した検体については、目視グレードを記録した。【００６３】
〔イムノクロマト診断キットの診断時間〕
５ｍｍ幅にカットしたイムノクロマト診断キットをプラスチックのハウジングに入れた。得られたハウジング入りの診断キットを、０−１０の１１段階の目視グレードで判定した。検査対象物質には抗ｈＣＧ−βマウス抗体を用いた。前記ｈＣＧ抗体を１．０ｗｔ％のＢＳＡを含む６６ｍＭ、ＰＨ７．４のリン酸緩衝液（以下「ＰＢＳ」という）で希釈し、前記ｈＣＧ抗体が１０．０ｍＩＵ／ｍＬの陽性検体を調製した。この陽性検体１２０．０μＬを診断キットのサンプル滴下部に滴下し、以降２０秒毎に目視で測定を行い、ＴＬの経時変化を測定した。イムノクロマトリーダーで得られるＴＬの発色強度が１．０以上になった時間を測定した。ここで１．０以上とした理由は、個人差もあるが１．０以上になれば目視でもＴＬの存在を確認できるからである。この測定を５回行い、平均の時間を診断時間とした。【００６４】
〔イムノクロマト診断キットの検出限界〕
５ｍｍ幅にカットしたイムノクロマト診断キットをプラスチックのハウジングに入れた。得られたハウジング入りの診断キットを、０−１０の１１段階の目視グレードで判定した。検査対象物質にはヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下「ｈＣＧ」という）を用いた。ｈＣＧを１．０ｗｔ％のＢＳＡを含む６６ｍＭ、ＰＨ７．４のリン酸緩衝液（以下「ＰＢＳ」という）で希釈し、前記ｈＣＧ濃度が１．６００ｍＩＵ／ｍＬ、０．８００ｍＩＵ／ｍＬ、０．４００ｍＩＵ／ｍＬ、０．２００ｍＩＵ／ｍＬ、０．１００ｍＩＵ／ｍＬ、０．０５０ｍＩＵ／ｍＬ、０．０２５ｍＩＵ／ｍＬ、０．０１３ｍＩＵ／ｍＬ、０．００７ｍＩＵ／ｍＬ、０．００２５ｍＩＵ／ｍＬと段階的に薄くしていった陽性検体を調製した。この陽性検体１２０．０μＬを診断キットのサンプル滴下部に滴下し、１５分経過後のＴＬの発色強度を目視で判定した。この測定を各濃度で５回行い、得られた値の平均値が１．０以上の場合は陽性と判定し、１．０未満の場合は検出限界以下と見なした。この陽性判定が得られる下限のｈＣＧ濃度を検出限界とした。【００６５】
〔実施例１〕
従来公知の方法で、セルロース濃度０．３７ｗｔ％、銅濃度０．１３ｗｔ％、アンモニア濃度１．００ｗｔ％の銅アンモニアセルロース溶液を調製した。さらにテトラヒドロフラン濃度８９．００ｗｔ％、水濃度１１．００ｗｔ％、の凝固液を調製した。
マグネティックスターラーを用い凝固液５０００ｇをゆっくり攪拌しながら、調製しておいた銅アンモニアセルロース溶液５００ｇを添加した。５秒程度攪拌を継続した後、１０ｗｔ％の硫酸１０００ｇを加え中和、再生を行い、セルロース微粒子を含有したスラリー６５００ｇを得た。
得られたスラリーを１００００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した。沈殿物をデカンテーションにより取り出し、脱イオン水を注入して攪拌し、再び遠心分離した。ｐＨが６．０〜７．０になるまでこの操作を数回繰り返し、その後、高圧ホモジナイザーによる分散処理を行い、セルロース微粒子分散液１５０ｇを得た。得られたセルロース微粒子の平均粒径を測定した結果、２６１ｎｍであった。【００６６】
次に、前記のようにして調製したセルロース微粒子の染色を行った。微粒子濃度を１．００ｗｔ％に調整したセルロース微粒子分散体１００ｇに対し、硫酸ナトリウム３０ｇ、反応性染料（ダイスター株式会社製Ｌｅｖａｆｉｘ Ｒｅｄ ＣＡ ＧＲ．（登録商標））１．００ｇ、を加え攪拌させながら恒温槽を用いて６０℃まで昇温した。６０℃に昇温後に炭酸ナトリウム４ｇを加え、２時間染色を行った。得られた粗着色微粒子を水酸化ナトリウム５％水溶液で洗浄し、遠心分離で回収、純水にて水洗した後遠心分離で回収するという一連の操作を１サイクルとし、同様の操作を計３サイクルまで実施し、着色セルロース微粒子を得た。【００６７】
次に、前記のようにして調製した着色セルロース微粒子の表面親水化反応を行った。１０．０ｗｔ％に調整した着色セルロース微粒子分散液１０．０ｍＬに対し、親水化剤としてＮ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（東京化成社製、Ａ０７７４）１０．０ｍＬ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（東京化成社製、Ｄ０９３９）５０．０ｍＬを加え、撹拌させながら恒温槽を用いて５０℃まで昇温し、４時間反応させた。反応後、遠心分離で回収、純水にて水洗した後遠心分離で回収した。ｐＨが１１．００以下になるまで上記水洗を繰り返し、親水化着色セルロース微粒子分散液を得た。親水化度などの粒子物性を以下の表１に示す。【００６８】
次に、前記のようにして調製した親水化着色セルロース微粒子へのカルボキシル基導入反応を行った。５．０ｗｔ％に調整した親水化着色セルロース微粒子分散液１０．０ｍＬに対して、反応剤として６−ブロモヘキサン酸（東京化成社製，Ｂ１２９０）６．０ｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（東京化成社製、Ｄ０９３９）５０．０ｍＬ、塩基として炭酸ナトリウム（キシダ化学社製，０００−７１２４５）０．１ｇを加え、撹拌させながら恒温槽を用いて５０℃まで昇温し、６時間反応させた。反応後、遠心分離で回収、２−プロパノール（東京化成社製、Ｉ０２７７）にて３回遠心分離による洗浄後、純水にて３回遠心分離による洗浄を行い、カルボキシル基導入表面親水化着色セルロース微粒子を得た。得られた微粒子はカルボン酸ナトリウム型なので、０．１Ｍ  ＨＣｌ溶液（和光純薬社製、０８３−０１１１５）１５．０ｍＬ、純水３５．０ｍＬ添加し、室温で２時間反応させた。その後、遠心分離で回収、純水にて水洗した後遠心分離で回収した。ｐＨが４．０以上になるまで水洗を実施し、カルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子分散液を得た。カルボキシル基の導入量などの物性、及びこの微粒子を発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。親水層とスペーサーの効果により、タンパク質の吸着が大幅に低減できた。その結果、偽陽性発生率が０％となった。検出感度については、カルボキシル基量が多いことで、微粒子表面に抗体が十分量固定されたために、高い検出感度を維持した。また、親水層の影響で微粒子がメンブレンに吸着することなく、迅速に移動できたために、診断時間が短縮できた。【００６９】
〔実施例２〕
カルボキシル基導入反応において、炭酸ナトリウムの量を９．９ｇに変更した以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。実施例１と同様に、親水層による親水化、疎水性のスペーサー及びカルボキシル基が多量に導入されたことで、タンパク質の吸着が大幅に低減できた。その結果、偽陽性発生率が０％となった。検出感度については、カルボキシル基量が多いことで、微粒子表面に抗体が十分量固定されたために、高い検出感度を維持した。また、親水層の影響で微粒子がメンブレンに吸着することなく、迅速に移動できたために、診断時間が短縮できた。【００７０】
〔実施例３〕
カルボキシル基導入反応において、炭酸ナトリウムの量を２９．７ｇに変更した以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。実施例１と同様に、親水層による親水化、疎水性のスペーサー及びカルボキシル基が多量に導入されたことで、タンパク質の吸着が大幅に低減できた。その結果、偽陽性発生率が０％となった。検出感度については、カルボキシル基量が多いことで、微粒子表面に抗体が十分量固定されたために、高い検出感度を維持した。また、親水層の影響で微粒子がメンブレンに吸着することなく、迅速に移動できたために、診断時間が短縮できた。【００７１】
〔実施例４〕
染色反応を５サイクル、カルボキシル基導入反応において、炭酸ナトリウムの量を９．９ｇに変更した以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。実施例１と同様に、親水層による親水化、疎水性のスペーサー及びカルボキシル基が多量に導入されたことで、タンパク質の吸着が大幅に低減できた。その結果、偽陽性発生率が０％となった。検出感度については、カルボキシル基量が多いことで、微粒子表面に抗体が十分量固定されたために、高い検出感度を維持した。また、親水層の影響で微粒子がメンブレンに吸着することなく、迅速に移動できたために、診断時間が短縮できた。【００７２】
〔実施例５〕
カルボキシル基導入反応において、反応剤を１１−ブロモウンデカン酸（東京化成社製、Ｂ０３８９）７．２ｇ、炭酸ナトリウムの量を９．９ｇに変更した条件に変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。実施例１と同様に、親水層による親水化、疎水性のスペーサー及びカルボキシル基が多量に導入されたことで、タンパク質の吸着が大幅に低減できた。その結果、偽陽性発生率が０％となった。検出感度については、カルボキシル基量が多いことで、微粒子表面に抗体が十分量固定されたために、高い検出感度を維持した。また、親水層の影響で微粒子がメンブレンに吸着することなく、迅速に移動できたために、診断時間が短縮できた。【００７３】
〔実施例６〕
カルボキシル基導入反応において、反応剤をエイコサン二酸（東京化成社製、Ｅ０３２０）１０．０ｇ、炭酸ナトリウムの量を９．９ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。実施例１と同様に、親水層による親水化、疎水性のスペーサー及びカルボキシル基が多量に導入されたことで、タンパク質の吸着が大幅に低減できた。その結果、偽陽性発生率が０％となった。検出感度については、カルボキシル基量が多いことで、微粒子表面に抗体が十分量固定されたために、高い検出感度を維持した。また、親水層の影響で微粒子がメンブレンに吸着することなく、迅速に移動できたために、診断時間が短縮できた。【００７４】
〔実施例７〕
カルボキシル基導入反応において、反応剤をテレフタル酸（東京化成社製、Ｔ０１６６）６．５ｇ、炭酸ナトリウムの量を９．９ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。実施例１と同様に、親水層による親水化、疎水性のスペーサー及びカルボキシル基が多量に導入されたことで、タンパク質の吸着が大幅に低減できた。その結果、偽陽性発生率が０％となった。検出感度については、カルボキシル基量が多いことで、微粒子表面に抗体が十分量固定されたために、高い検出感度を維持した。また、親水層の影響で微粒子がメンブレンに吸着することなく、迅速に移動できたために、診断時間が短縮できた。【００７５】
〔実施例８〕
セルロース微粒子の凝固反応において、凝固液を酢酸エチル（東京化成社製、Ｑ００４０）濃度９４．０ｗｔ％、水濃度６．０ｗｔ％に変更し、カルボキシル基導入反応において、炭酸ナトリウムの量を９．９ｇに変更したこと以外は実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。実施例１と同様に、親水層による親水化、疎水性のスペーサー及びカルボキシル基が多量に導入されたことで、タンパク質の吸着が大幅に低減できた。その結果、偽陽性発生率が０％となった。検出感度については、カルボキシル基量が多いことで、微粒子表面に抗体が十分量固定されたために、高い検出感度を維持した。また、親水層の影響で微粒子がメンブレンに吸着することなく、迅速に移動できたために、診断時間が短縮できた。【００７６】
〔実施例９〕
セルロース微粒子の凝固反応において、凝固液をアセトン濃度２７．０ｗｔ％、水濃度０．２ｗｔ％、アンモニア濃度７２．８ｗｔ％に変更し、カルボキシル基導入反応において、炭酸ナトリウムの量を９．９０ｇに変更したこと以外は実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。実施例１と同様に、親水層による親水化、疎水性のスペーサー及びカルボキシル基が多量に導入されたことで、タンパク質の吸着が大幅に低減できた。その結果、偽陽性発生率が０％となった。検出感度については、カルボキシル基量が多いことで、微粒子表面に抗体が十分量固定されたために、高い検出感度を維持した。また、親水層の影響で微粒子がメンブレンに吸着することなく、迅速に移動できたために、診断時間が短縮できた。【００７７】
〔実施例１０〕
カルボキシル基導入反応において、炭酸ナトリウムの量を９．９ｇ、反応剤を３−ブロモプロピオン酸（東京化成社製、Ｂ０６４５）４．２ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。実施例１と同様に、親水層による親水化、疎水性のスペーサー及びカルボキシル基が多量に導入されたことで、タンパク質の吸着が大幅に低減できた。その結果、偽陽性発生率が０％となった。検出感度については、カルボキシル基量が多いことで、微粒子表面に抗体が十分量固定されたために、高い検出感度を維持した。また、親水層の影響で微粒子がメンブレンに吸着することなく、迅速に移動できたために、診断時間が短縮できた。【００７８】
〔実施例１１〕
表面親水化反応において、親水化剤をＮ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（東京化成社製、Ａ０７７４）１０．０ｍＬ、及びポリエチレングリコールシラン  Ｍｗ２０００（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧＷｏｒｋｓ社製、ＰＬＳ−２０１２）１０．０ｍＬの混合体に変更し、カルボキシル基導入反応において、反応剤を１１−ブロモウンデカン酸７．２ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。実施例１と同様に、親水層による親水化、疎水性のスペーサー及びカルボキシル基が多量に導入されたことで、タンパク質の吸着が大幅に低減できた。その結果、偽陽性発生率が０％となった。検出感度については、カルボキシル基量が多いことで、微粒子表面に抗体が十分量固定されたために、高い検出感度を維持した。また、親水層の影響で微粒子がメンブレンに吸着することなく、迅速に移動できたために、診断時間が短縮できた。【００７９】
〔実施例１２〕
表面親水化反応において、親水化剤をアミノ−ＰＥＧ１２−プロピオン酸（シグマアルドリッチ社製、ＪＫＡ１２００６）１０．０ｍＬ、カルボキシル基導入反応において、反応剤を１１−ブロモウンデカン酸７．２ｇ、炭酸ナトリウムを９．９ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。実施例１と同様に、親水層による親水化、疎水性のスペーサー及びカルボキシル基が多量に導入されたことで、タンパク質の吸着が大幅に低減できた。その結果、偽陽性発生率が０％となった。検出感度については、カルボキシル基量が多いことで、微粒子表面に抗体が十分量固定されたために、高い検出感度を維持した。また、親水層の影響で微粒子がメンブレンに吸着することなく、迅速に移動できたために、診断時間が短縮できた。【００８０】
〔実施例１３〕
カルボキシル基導入反応において、反応剤をＢｒ−（ＣＨ２）３０−ＣＯＯＨ１１．０ｇ、炭酸ナトリウムの量を９．９ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。実施例１と同様に、親水層による親水化、疎水性のスペーサー及びカルボキシル基が多量に導入されたことで、タンパク質の吸着が大幅に低減できた。その結果、偽陽性発生率が０％となった。検出感度については、カルボキシル基量が多いことで、微粒子表面に抗体が十分量固定されたために、高い検出感度を維持した。また、親水層の影響で微粒子がメンブレンに吸着することなく、迅速に移動できたために、診断時間が短縮できた。【００８１】
〔実施例１４〕
カルボキシル基導入反応において、炭酸ナトリウム量を０．０１ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。親水層及び疎水性スペーサーの効果により、タンパク質の吸着量は、以下の比較例１などと比べると低減でき、偽陽性低減効果も認められた。【００８２】
〔実施例１５〕
カルボキシル基導入反応において、反応剤をポリ（エチレングリコール）ビス（カルボキシメチル）エーテル  Ｍｗ６００（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧ  Ｗｏｒｋｓ社製、ＰＳＢ−３６２）１６．４ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。タンパク質の吸着量は、以下の比較例１などと比べると若干低減でき、偽陽性低減効果があった。【００８３】
〔実施例１６〕
表面親水化反応において親水化剤の量を４０．０ｍＬ、カルボキシル基導入反応において、反応剤を１１−ブロモウンデカン酸７．２ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。親水層及び疎水性スペーサーの影響で、以下の比較例１と比べるとタンパク質の吸着量は低減でき、偽陽性低減効果があった。【００８４】
〔実施例１７〕
表面親水化反応において、親水化剤の量を８．０ｍＬ、カルボキシル基導入反応において、反応剤をポリ（エチレングリコール）ビス（カルボキシメチル）エーテル  Ｍｗ６００（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧ  Ｗｏｒｋｓ社製、ＰＳＢ−３６２）１６．４ｇ、炭酸ナトリウムの量を０．０１ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。タンパク質の吸着量は、以下の比較例１などと比べると若干低減でき、偽陽性低減効果が認められた。【００８５】
〔実施例１８〕
表面親水化反応において親水化剤の量を４０．０ｍＬ、カルボキシル基導入反応において、反応剤をポリ（エチレングリコール）ビス（カルボキシメチル）エーテル  Ｍｗ６００（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧ  Ｗｏｒｋｓ社製、ＰＳＢ−３６２）１６．４ｇ、炭酸ナトリウム量を９．９ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。タンパク質の吸着量は、以下の比較例１と比べると若干改善された。その結果、若干ではあるが偽陽性低減効果も認められた。【００８６】
〔実施例１９〕
反応剤を１１−ブロモウンデカン酸７．２ｇ、炭酸ナトリウム量を０．０１ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。親水層及び疎水性スペーサーの効果により、以下の比較例１と比べるとタンパク質の吸着量は低減した。その結果、偽陽性低減効果も認められた。【００８７】
〔実施例２０〕
カルボキシル基導入反応において、反応剤をポリ（エチレングリコール）ビス（カルボキシメチル）エーテル  Ｍｗ６００（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧ  Ｗｏｒｋｓ社製、ＰＳＢ−３６２）１６．４ｇ、炭酸ナトリウム量を０．０１ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。タンパク質の吸着量は、以下の比較例１と比べると若干改善された。その結果、偽陽性低減効果が認められた。【００８８】
〔実施例２１〕
カルボキシル基導入反応において、反応剤をポリ（エチレングリコール）ビス（カルボキシメチル）エーテル  Ｍｗ５０００（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧ  Ｗｏｒｋｓ社製、ＰＳＢ−３６６）６５．６ｇ、炭酸ナトリウム量を９．９ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表１に示す。スペーサーはＰＥＧであったが、長さが長いために排除体積効果が働き、タンパク質の吸着量は０となった。その結果、偽陽性低減効果があった。【００８９】
実施例１〜２１で作製した微粒子ついては親水層が保護層として機能したためか抗体を結合させる前の段階での微粒子の発色強度は、反応活性基の導入によっても低下しなかった。
〔比較例１〕
表面親水化反応とカルボキシル基導入反応を行わないこと以外は、実施例１と同様の方法で着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表２に示す。微粒子表面は疎水的なため、微粒子表面にタンパク質が多量に吸着しやすかったと思われる。その結果、非特異吸着が起こり偽陽性発生率は３％であった。【００９０】
〔比較例２〕
特許文献４に記載の方法でスペーサーが（ＣＨ２）１６のカルボキシル基導入着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表２に示す。特許文献４とは抗体の使用量が異なるため、特許文献４より感度が飛躍的に向上したが、微粒子表面は疎水的なため、微粒子表面にタンパク質が多量に吸着したため、非特異吸着が起こり偽陽性発生率は３％であった。【００９１】
〔比較例３〕
表面親水化を行わないこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表２に示す。カルボキシル基が若干多量に導入されたためか、タンパク質の吸着量が比較例１又は２と比べると若干改善された。しかし、親水層が存在しないため、親水化度が低く、タンパク質が吸着してしまい、偽陽性の低減効果はほとんどなかった。【００９２】
〔比較例４〕
表面親水化を行わず、特許文献４に記載の方法で微粒子表面にアミノ基を導入した。その後、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表２に示す。残存反応性アミノ基量が多い上に親水層も存在しないため、タンパク質の吸着量低減効果は見られなかった。その結果、偽陽性低減効果も認められなかった。【００９３】
〔比較例５〕
表面親水化を行わず、カルボキシル基導入反応において、反応剤をポリ（エチレングリコール）ビス（カルボキシメチル）エーテル  Ｍｗ６００（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧ  Ｗｏｒｋｓ社製、ＰＳＢ−３６２）１６．４０ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表２に示す。親水層が存在せず、スペーサーもＰＥＧであったため、微粒子表面とスペーサーが電気的な相互作用で吸着してしまうことに加え、微粒子表面の親水性も十分ではないのでタンパク質が吸着してしまい、吸着量の低減効果は見られなかった。その結果、偽陽性低減効果も認められなかった。【００９４】
〔比較例６〕
表面親水化は行わず、比較例４と同様の方法で微粒子にアミノ基を導入した。その後、カルボキシル基導入反応において、反応剤に１１−ブロモウンデカン酸、炭酸ナトリウムの量を０．０１ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表２に示す。親水層が存在せず、残存反応性アミノ基量が多いため、微粒子表面の親水性が十分ではなくタンパク質の吸着低減効果は見られなかった。その結果、偽陽性低減効果も認められなかった。【００９５】
〔比較例７〕
表面親水化を行わず、比較例４と同様の方法で微粒子にアミノ基を導入した。その後、カルボキシル基導入反応において、反応剤をポリ（エチレングリコール）ビス（カルボキシメチル）エーテル  Ｍｗ６００（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧ  Ｗｏｒｋｓ社製、ＰＳＢ−３６２）１６．４ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表２に示す。親水層が存在せず、残存反応性アミノ基量が多いため、微粒子表面の親水性が十分ではない上に、スペーサーもＰＥＧであったために、タンパク質の吸着低減効果は見られなかった。その結果、偽陽性低減効果も認められなかった。【００９６】
〔比較例８〕
表面親水化を行わず、比較例４と同様の方法で微粒子にアミノ基を導入した。その後、カルボキシル基導入反応において、反応剤をポリ（エチレングリコール）ビス（カルボキシメチル）エーテル  Ｍｗ６００（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧ  Ｗｏｒｋｓ社製、ＰＳＢ−３６２）１６．４ｇ、炭酸ナトリウム量を０．０１ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表２に示す。親水層が存在せず、残存反応性アミノ基量が多いため、微粒子表面の親水性が十分ではない上に、スペーサーもＰＥＧであったために、タンパク質の吸着低減効果は見られなかった。その結果、偽陽性低減効果も認められなかった。【００９７】
〔比較例９〕
染色反応を１サイクルとしたこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表２に示す。発色強度が低いために、実施例より検出感度は劣り、それに伴い診断時間も長くなってしまった。【００９８】
〔比較例１０〕
凝固液をジメチルスルホキシド（東京化成社製、Ｄ０７９８）５０．００ｗｔ％、水５０．００ｗｔ％に変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表２に示す。粒子径が小さいために、実施例より検出感度は劣り、それに伴い診断時間も長くなってしまった。【００９９】
〔比較例１１〕
表面親水化反応において親水化剤の量を１．０ｍＬに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表２に示す。親水層が少なすぎたために、カルボキシル基導入反応時に微粒子の発色強度が著しく低下してしまった。【０１００】
〔比較例１２〕
セルロース微粒子の凝固反応において、凝固液をテトラヒドロフラン濃度９７．０ｗｔ％、水濃度３．０ｗｔ％に変更し、カルボキシル基導入反応において、炭酸ナトリウムの量を９．９ｇ、反応剤を１１−ブロモウンデカン酸７．２ｇに変更したこと以外は実施例１と同様の方法でカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を作製した。この微粒子の物性、及び発色粒子として使用した際のイムノクロマト性能を以下の表２に示す。微粒子の粒径が大きすぎたために、メンブレン中を展開できなかった。【０１０１】
〔比較例１３〕
粒径が５０ｎｍでかつカルボキシル基が導入されたカルボキシル基修飾金ナノ粒子２０００Ｄａ  ＰＥＧリンカー（ＣＴＤ社製）を発色粒子として使用し、イムノクロマト性能を評価した。結果を以下の表２に示す。微粒子表面が疎水的なため、メンブレン中を移動する際に時間がかかり発色時間は遅かった。また、微粒子表面が疎水的なため、タンパク質も微粒子表面に吸着しやすく、偽陽性も起こりやすかった。【０１０２】
〔比較例１４〕
粒径が４７０ｎｍ、発色強度が０．５でかつカルボキシル基が導入されたラテックス粒子（Ｂａｎｇｓ社製）を発色粒子として使用し、イムノクロマト性能を評価した。結果を以下の表２に示す。微粒子表面が疎水的なため、タンパク質も微粒子表面に吸着しやすく、偽陽性も起こりやすかった。【０１０３】
〔比較例１５〕
実施例１と同様の方法で、親水化着色セルロース微粒子を作製した。その後カルボキシル基導入反応は行わず、そのまま発色粒子として使用した。粒子物性とイムノクロマト性能を表２に示す。粒子が親水性にも拘わらず、抗体との結合部位が存在しないために、抗体が粒子上に担持できなかったので感度が非常に低いものとなった。【０１０４】
【表１】
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【０１０５】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明に係る親水化着色セルロース微粒子は、高い検出感度を維持しながら、迅速な診断も可能であり、偽陽性の発生リスクが驚くほど低減したイムノクロマト診断キットの発色粒子として好適に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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