(57)【要約】  分解物、多量体、酸性側類縁体、塩基性側類縁体、不溶性異物の生成を抑制してなる、安定なＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有してなる、医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、ｐＨが４〜５．５であり、所望により、製薬学的に許容される緩衝剤、等張化剤、及び界面活性剤を更に含有することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有し、ｐＨが４〜５．５である、安定な医薬組成物であって、
該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント、及び
（２）（１）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント
から選択され、
前記ＰＥＧ化が、該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させたものである、医薬組成物。
【請求項２】
製薬学的に許容される緩衝剤、製薬学的に許容される等張化剤、及び製薬学的に許容される界面活性剤を更に含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ｐＨが４．５〜５．５である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
製薬学的に許容される緩衝剤が、クエン酸、酢酸、及びヒスチジン、並びにそれらの製薬学的に許容される塩からなる群より選択される１種又は２種以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
製薬学的に許容される緩衝剤が、クエン酸又はその製薬学的に許容される塩である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
製薬学的に許容される緩衝剤の濃度が、１〜２００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
医薬組成物が液体製剤、又は凍結乾燥製剤である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
医薬組成物が液体製剤である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
製薬学的に許容される等張化剤が、アルギニン、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、スクロース、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、イノシトール、ズルシトール、アラビトール、イソマルト、ラクチトール、及びマルチトールからなる群より選択される１種又は２種以上である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
製薬学的に許容される等張化剤の濃度が、１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
製薬学的に許容される界面活性剤が、ポリソルベート又はポロキサマーの少なくとも一方である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
製薬学的に許容される界面活性剤が、ポリソルベート８０である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
製薬学的に許容される界面活性剤の濃度が、０．００１〜１％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの濃度が、０．１〜２００ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾が重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化である、請求項１又は１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ｐＨを４〜５．５に調整することを特徴とする、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを安定化する方法であって、
該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント、及び
（２）（１）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント
から選択され、
前記ＰＥＧ化が、該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させたものである、前記方法。
【請求項１９】
製薬学的に許容される緩衝剤、製薬学的に許容される等張化剤、及び製薬学的に許容される界面活性剤を使用する、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエチレングリコールを結合させた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有してなる、安定な医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）は、神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）と総称される液性因子の一つであり、生体内においてニューロンの発生、分化、機能維持において重要な役割を担っている。【０００３】
本出願人により、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧ）を結合させた（以下、「ＰＥＧ化」と略記することもある）抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントが、ヒトＮＧＦが病態形成に関与する各種疾患の予防又は治療（例えば、変形性関節症に伴う関節痛（ＯＡ疼痛）、リウマチに伴う関節痛、癌性疼痛、神経因性疼痛、慢性腰痛、術後疼痛、帯状疱疹後神経痛、有痛性糖尿病性神経障害、骨折痛、膀胱痛症候群等の疼痛や、間質性膀胱炎、急性膵炎、慢性膵炎、子宮内膜症等）に有用であることが公表されている（特許文献１）。【０００４】
他方、近年様々な抗体等のタンパク質を含む医薬品が開発され、実際に医療の現場に提供されている。これらの医薬品の多くは、静脈内投与や皮下投与等により投薬されるため、医療の現場には、液体製剤、あるいは凍結乾燥製剤等の非経口医薬組成物の形態として提供される。とりわけ、非経口医薬組成物は、直接体内に投与されることを前提とされるため、安定な医薬品製剤であることが望ましい。
すなわち、抗体等のタンパク質を含有する溶液では、不溶性異物の形成等を抑制することが望ましく、また、有効性の観点から、分解物、多量体、類縁体等の形成を抑制することが望ましい。
したがって、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有してなる、安定な医薬組成物を開発するには、いまなお改善の余地がある。【０００５】
なお、抗ヒトＮＧＦ抗体又はヒトＮＧＦを含有する安定な医薬組成物に関する発明（特許文献２、３、及び４）が知られているが、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントに関するものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０２２０８３号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０３２２２０号
【特許文献３】国際公開第９５／０５８４５号
【特許文献４】国際公開第２０１１／１１６０９０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有してなる、安定な医薬組成物を提供することにある。
詳細には、本発明の目的は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有し、例えば、熱や温度条件等により増大する、分解物、多量体、酸性側類縁体、塩基性側類縁体の生成を抑制してなる、安定な医薬組成物を提供することにある。また、本発明の別の目的は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有し、例えば、凍結融解、物理的振動等により増大する、不溶性異物の生成を抑制してなる、安定な医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、溶液のｐＨを特定の範囲に調整し、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを製剤化することにより、安定な医薬組成物を調製することができること（後記実施例１）、また、特定の等張化剤を添加すること（後記実施例２）、界面活性剤を添加すること（後記実施例３）等により、さらに安定な医薬組成物を提供することができること等を知見して、本発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有し、ｐＨが４〜５．５である、安定な医薬組成物であって、
該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント、及び
（２）（１）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント
から選択され、
前記ＰＥＧ化が、該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させたものである、医薬組成物、
［２］製薬学的に許容される緩衝剤、製薬学的に許容される等張化剤、及び製薬学的に許容される界面活性剤を更に含有する、［１］の医薬組成物、
［３］ｐＨが４．５〜５．５である、［１］又は［２］の医薬組成物、
［４］製薬学的に許容される緩衝剤が、クエン酸、酢酸、及びヒスチジン、並びにそれらの製薬学的に許容される塩からなる群より選択される１種又は２種以上である、［１］〜［３］のいずれかの医薬組成物、
［５］製薬学的に許容される緩衝剤が、クエン酸又はその製薬学的に許容される塩である、［１］〜［４］のいずれかの医薬組成物、
［６］製薬学的に許容される緩衝剤の濃度が、１〜２００ｍｍｏｌ／Ｌである、［１］〜［５］のいずれかの医薬組成物、
［７］医薬組成物が液体製剤、又は凍結乾燥製剤である、［１］〜［６］のいずれかの医薬組成物、
［８］医薬組成物が液体製剤である、［１］〜［７］のいずれかの医薬組成物、
［９］製薬学的に許容される等張化剤が、アルギニン、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、スクロース、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、イノシトール、ズルシトール、アラビトール、イソマルト、ラクチトール、及びマルチトールからなる群より選択される１種又は２種以上である、［１］〜［８］のいずれかの医薬組成物、
［１０］製薬学的に許容される等張化剤の濃度が、１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌである、［１］〜［９］のいずれかの医薬組成物、
［１１］製薬学的に許容される界面活性剤が、ポリソルベート又はポロキサマーの少なくとも一方である、［１］〜［１０］のいずれかの医薬組成物、
［１２］製薬学的に許容される界面活性剤が、ポリソルベート８０である、［１］〜［１１］のいずれかの医薬組成物、
［１３］製薬学的に許容される界面活性剤の濃度が、０．００１〜１％（ｗ／ｖ）である、［１］〜［１２］のいずれかの医薬組成物、
［１４］ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの濃度が、０．１〜２００ｍｇ／ｍＬである、［１］〜［１３］のいずれかの医薬組成物、
［１５］ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する、［１］の医薬組成物、
［１６］ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する、［１］の医薬組成物、
［１７］抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾が重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化である、［１］又は［１６］の医薬組成物、
［１８］ｐＨを４〜５．５に調整することを特徴とする、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを安定化する方法であって、
該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント、及び
（２）（１）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント
から選択され、
前記ＰＥＧ化が、該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させたものである、前記方法、
［１９］製薬学的に許容される緩衝剤、製薬学的に許容される等張化剤、及び製薬学的に許容される界面活性剤を使用する、［１８］の方法
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有してなる安定な医薬組成物、詳細には、分解物、多量体、酸性側類縁体、塩基性側類縁体、不溶性異物の生成を抑制してなる、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有してなる、安定な医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】等張化剤（Ｄ−マンニトール）及び界面活性剤（ポリソルベート８０）を含むｐＨ４．０〜６．０の範囲の処方（試料Ｎｏ．Ｄ−１〜Ｄ−７）について、２５℃又は４０℃２週の保管条件における分解物の増加量（％）を示すグラフである。●は２０ｍｍｏｌ／Ｌ  クエン酸、■は２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ヒスチジンを緩衝剤として用いたサンプルの結果を示す。
【図２】等張化剤（Ｄ−マンニトール）及び界面活性剤（ポリソルベート８０）を含むｐＨ４．０〜６．０の範囲の処方（試料Ｎｏ．Ｄ−１〜Ｄ−７）について、２５℃又は４０℃２週の保管条件における酸性側類縁体の増加量（％）を示すグラフである。●は２０ｍｍｏｌ／Ｌ  クエン酸、■は２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ヒスチジンを緩衝剤として用いたサンプルの結果を示す。
【図３】等張化剤（Ｄ−マンニトール又はＤ−ソルビトール）及び界面活性剤（ポリソルベート８０）を含み、クエン酸により所定ｐＨ（４．６、４．９、５．２）に調整した処方について、５℃、２５℃、４０℃での保管後の多量体量（％）を示すグラフである。
【図４】等張化剤（Ｄ−マンニトール又はＤ−ソルビトール）及び界面活性剤（ポリソルベート８０）を含み、クエン酸により所定ｐＨ（４．６、４．９、５．２）に調整した処方について、５℃、２５℃、４０℃での保管後の分解物量（％）を示すグラフである。
【図５】等張化剤（Ｄ−マンニトール又はＤ−ソルビトール）及び界面活性剤（ポリソルベート８０）を含み、クエン酸により所定ｐＨ（４．６、４．９、５．２）に調整した処方について、５℃、２５℃、４０℃での保管後の酸性側類縁体量（％）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において「安定」とは、例えば、熱、光、温度、湿度、振とう、及び／又は凍結融解に対して安定であることを意味する。例えば、医薬組成物を所定条件下に保存後、前記医薬組成物中に含まれる、多量体、分解物、酸性側類縁体、又は塩基性側類縁体の量、あるいはそれらの総量がある特定量以下であることを意味する。また、ある態様として、医薬組成物を所定条件下に保存後、不溶性異物が、目視により観察されないことを意味する。
【００１３】
前記「多量体」は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントが集まって生成する複合体である。多量体を測定する方法としては、特に制限されないが、例えば、サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥ−ＨＰＬＣ法）、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、マイクロフローイメージング法等が含まれ、ある態様としては、ＳＥ−ＨＰＬＣ法である。ＳＥ−ＨＰＬＣ法においては、検出されたピークの面積を自動分析法により測定し、メインピークを含む全ピーク面積の総和で除することにより、百分率（％）として計算する。なお、メインピークとは、活性本体のピークを意味する。ＳＥ−ＨＰＬＣのメインピークより保持時間が短いピークを合わせて多量体とする。ＳＥ−ＨＰＬＣ法により測定される多量体の量としては、ある態様として１０％以下、別の態様として５％以下である。
【００１４】
前記「分解物」は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの一部が脱離して生成する断片体である。分解物を測定する方法としては、特に制限されないが、例えば、ＳＥ−ＨＰＬＣ法、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法等が含まれ、ある態様としては、ＳＥ−ＨＰＬＣ法である。ＳＥ−ＨＰＬＣ法による分解物の測定方法は前記したＳＥ−ＨＰＬＣ法による多量体の測定と同様にして行う。なお、ＳＥ−ＨＰＬＣのメインピークより保持時間が長いピークを合わせて分解物とする。ＳＥ−ＨＰＬＣ法により測定される分解物の量としては、ある態様として１０％以下、別の態様として５％以下である。
また、分解物の量の増加量（特定の条件で特定の期間保管後の分解物量と試験（保存）開始時の分解物量の差分）については、例えば、２．５％以下、ある態様として２．０％以下であり、ある態様としては、２５℃２週、１箇月（４週）又は４０℃２週保存後の分解物の量の増加量が例えば２．５％以下、ある態様として２．０％以下であり、別の態様としては、４０℃２週保存後の分解物の量の増加量が２．５％以下であり、他の態様としては、４０℃２週保存後の分解物の量の増加量が２．０％以下である。
【００１５】
前記「酸性側類縁体」は、陽イオン交換クロマトグラフ法、又はイメージングキャピラリー等電点電気泳動法による分析で主成分より早く溶出するピークとして認められる類縁体である。酸性側類縁体を測定する方法としては、特に制限されないが、例えば、陽イオン交換クロマトグラフ法（ＩＥ−ＨＰＬＣ法）、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、イメージングキャピラリー等電点電気泳動法（ｉｃＩＥＦ法）等が含まれ、ある態様としては、ＩＥ−ＨＰＬＣ法、又はｉｃＩＥＦ法である。ＩＥ−ＨＰＬＣ法及びｉｃＩＥＦ法は、前記したＳＥ−ＨＰＬＣ法と同様にしてピークの百分率（％）を計算する。ＩＥ−ＨＰＬＣ法及び／又はｉｃＩＥＦ法により測定される酸性側類縁体の量としては、ある態様として５０％以下、別の態様として３５％以下、他の態様として２５％以下である。
また、酸性側類縁体の量の増加量（特定の条件で特定の期間保管後の酸性側類縁体量と試験（保存）開始時の酸性側類縁量の差分）については、例えば、１５％以下、ある態様として１０％以下である。より具体的には、２５℃２週、１箇月（４週）又は４０℃２週保存後の酸性側類縁体の量の増加量が例えば１５％以下、ある態様として１０％以下である。
【００１６】
前記「塩基性側類縁体」は、ＩＥ−ＨＰＬＣ法又はｉｃＩＥＦ法による分析で主成分より遅く溶出するピークとして認められる類縁体である。塩基性側類縁体を測定する方法としては、特に制限されないが、例えば、ＩＥ−ＨＰＬＣ法、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、ｉｃＩＥＦ法等が含まれ、ある態様としては、ＩＥ−ＨＰＬＣ法又はｉｃＩＥＦ法である。ＩＥ−ＨＰＬＣ法及びｉｃＩＥＦ法は、前記したＳＥ−ＨＰＬＣ法と同様にしてピークの百分率（％）を計算する。ｉｃＩＥＦ法により測定される塩基性側類縁体の量としては、ある態様として５０％以下、別の態様として２５％以下、他の態様として２０％以下である。
【００１７】
前記「不溶性異物」は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントや医薬品添加物等が集まって生成する不溶性の複合体である。不溶性異物は例えば、第十六改正日本薬局方に記載の注射剤の不溶性異物検査法又はそれに準じて目視により確認することができる。
【００１８】
「安定な医薬組成物」とは、冷蔵温度（２〜８℃）で少なくとも１箇月（４週）、好ましくは３箇月、より好ましくは６箇月、さらに好ましくは１年、より好ましくは２年；又は室温（２２〜２８℃）で少なくとも２週、好ましくは１箇月、さらに好ましくは３箇月、より好ましくは６箇月、好適には１年；又は加速条件（３７〜４３℃）で少なくとも２週、好ましくは１箇月（４週）、多量体、分解物、酸性側類縁体又は塩基性側類縁体の量、あるいはそれらの総量が上述のある特定量以下である医薬組成物を意味する。
【００１９】
抗体にはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥの５つのクラスが存在する。抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２万〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してＩｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ、Ｉｇεとよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブクラスが存在し、それぞれに対応する重鎖はＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、Ｉｇγ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれＩｇλ、Ｉｇκとよばれる。抗体分子の基本構造のポリペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
【００２０】
鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位又はドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにアミノ末端（Ｎ末端）に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）とよばれている。可変領域よりカルボキシ末端（Ｃ末端）側のアミノ酸配列は、各クラス又はサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれており、各ドメインは、それぞれＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、又はＣＬと表される。
【００２１】
抗体の抗原結合部位は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域によって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。軽鎖と重鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）とよばれている。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。
【００２２】
抗体の重鎖定常領域のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間にある領域はヒンジ領域とよばれ、この領域は、プロリン残基を多く含み、２本の重鎖をつなぐ複数の鎖間Ｓ−Ｓ結合を含む。例えば、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の各ヒンジ領域には、重鎖間のＳ−Ｓ結合を構成している、それぞれ、２個、４個、１１個、２個のシステイン残基を含む。ヒンジ領域は、パパインやペプシン等のタンパク質分解酵素に対する感受性が高い領域である。抗体をパパインで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ−Ｓ結合よりもＮ末端側の位置で重鎖が切断され、２個のＦａｂフラグメントと１個のＦｃフラグメントに分解される。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される。抗体をペプシンで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ−Ｓ結合よりもＣ末端側の位置で重鎖が切断され、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが生成される。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２つのＦａｂ’フラグメントがヒンジ領域中の重鎖間Ｓ−Ｓ結合で結合した二量体構造のフラグメントである。Ｆａｂ’フラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成され、このヒンジ領域の部分には重鎖間Ｓ−Ｓ結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメントは、いずれも可変領域を含み、抗原結合活性を有する。
【００２３】
抗体を細胞で発現させる場合、抗体が翻訳後に修飾を受けることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖Ｃ末端のリジンのカルボキシペプチダーゼによる切断、重鎖及び軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾等が挙げられ、種々の抗体において、重鎖Ｃ末端のリジンが欠失することや重鎖Ｎ末端のグルタミンの大部分がピログルタミン酸への修飾を受けることが知られている（Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426）。また、このような翻訳後修飾が抗体の活性に影響を及ぼすものではないことも当該分野で知られている（Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39）。
【００２４】
本発明の医薬組成物は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、ＰＥＧ化した以下の（１）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント及び／又はＰＥＧ化した以下の（２）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する：
（１）配列番号１のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント、
（２）（１）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
（国際公開第２０１３／０２２０８３号）
【００２５】
１つの実施形態において、前記（２）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾は、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化である。１つの実施形態において、前記（２）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、配列番号１のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾されたアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントである。
【００２６】
本発明に用いられるＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの定常領域としては、どのようなサブクラスの定常領域（例えば、重鎖定常領域としてＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、又はＩｇγ４の定常領域、軽鎖定常領域としてＩｇλ又はＩｇκの定常領域）も選択可能であり得る。好ましくは、本発明に用いられるＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖定常領域として、ヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む。好ましくは、本発明に用いられるＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、軽鎖定常領域として、ヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む。好ましくは、本発明に用いられるＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、ヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域及びヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、以下の（３）及び／又は（４）のＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する：
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント、
（４）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【００２８】
１つの実施形態において、前記（４）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾は、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化である。１つの実施形態において、前記（４）のＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、配列番号１のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントである。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、ＰＥＧ化した以下の（１）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント及びＰＥＧ化した以下の（２）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する：
（１）配列番号１のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント、
（２）（１）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【００３０】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、以下の（３）及び（４）のＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する：
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント、
（４）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの翻訳後修飾により生じたＦａｂ’フラグメントである抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【００３１】
本発明には、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、以下の特徴を有する抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する医薬組成物も含まれる：
配列番号１の３１から３５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１の５０から６５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１の９８から１１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号３の２４から３９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３の５５から６１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３の９４から１０２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
【００３２】
本発明には、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択される宿主細胞を培養することで生産できる該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する医薬組成物も含まれる：
（ａ）配列番号１のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号３のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと配列番号３のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００３３】
本発明には、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとして、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択される宿主細胞を培養することで生産できる該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有する医薬組成物も含まれる：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００３４】
本発明において、Ｆａｂ’フラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖のフラグメントから構成される、１価の抗体のフラグメントであり、このヒンジ領域の部分には、重鎖−軽鎖間のＳ−Ｓ結合を構成しているシステイン残基以外の少なくとも１つのシステイン残基（本明細書中、「ヒンジ領域システイン」とも称する）が含まれる。ヒンジ領域システインは、ＰＥＧでの修飾部位として使用することができる。Ｆａｂ’フラグメント中のヒンジ領域システインの数は、使用する抗体のクラスによって１〜数個の間で異なり得るが、当業者によって容易に調整可能である。例えば、ヒトのＩｇＧ１クラス（通常、ヒンジ領域において、２個のヒンジ領域システインを有する）のＦａｂ’フラグメントを作製する場合、重鎖のヒンジ領域において、最初のヒンジ領域システインのコード部位と２番目のヒンジ領域システインのコード部位との間に停止コドンを挿入することによって、ヒンジ領域中に１個のヒンジ領域システインを有するＦａｂ’フラグメントを作製することができ、２番目のヒンジ領域システインのコード部位の後に停止コドンを挿入することによって、ヒンジ領域中に２個のヒンジ領域システインを有するＦａｂ’フラグメントを作製することができる。
【００３５】
本発明に用いられるＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ領域システインのチオール基に、チオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体のチオール反応基を共有結合させＰＥＧ化することにより作製することができる。Ｆａｂ’フラグメントへのＰＥＧの結合は、当該分野で公知の方法を使用して実施可能である（例えば、欧州特許第０９４８５４４号明細書）。本発明においては、直鎖又は分枝鎖の、任意の平均分子量のＰＥＧ又はその誘導体が使用可能であり、使用目的に応じて当業者により容易に選択され得る。ヒンジ領域システインへのＰＥＧの結合を容易にするために、ＰＥＧの誘導体を使用してもよい。例えば、マレイミドのようなチオール反応基をリンカーを介して結合させたＰＥＧ誘導体を使用し、ヒンジ領域システインのチオール基とマレイミド基を共有結合させることができる。一般的にＰＥＧの平均分子量は、約５００〜約５００００Ｄａであり、好ましくは、約５０００〜約４００００Ｄａであり、より好ましくは、約１００００〜約４００００Ｄａの範囲である。
【００３６】
本発明に用いられるＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、本明細書に開示される抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者に容易に作製され得る。本発明に用いられるＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの作製方法としては、国際公開第２０１３／０２２０８３号に開示された方法が挙げられる。
【００３７】
一単位医薬組成物（製剤）中のＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの量としては、Ｆａｂ’−ＰＥＧ換算で、例えば、０．１〜２００ｍｇ、ある態様として、０．１〜４０ｍｇ、別の態様として、２０〜４０ｍｇ、他の態様として、６０〜１５０ｍｇ、また他の態様として、４０〜１２０ｍｇが挙げられる。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
【００３８】
医薬組成物が固体状態（例えば、凍結乾燥製剤、噴霧乾燥製剤など）の場合、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの量としては、Ｆａｂ’−ＰＥＧ換算で、例えば、０．１〜２００ｍｇ、ある態様として、０．１〜４０ｍｇ、別の態様として、２０〜４０ｍｇ、他の態様として、６０〜１５０ｍｇ、また他の態様として、４０〜１２０ｍｇが挙げられる。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
用時溶解するとき、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの濃度としては、用時溶解後のＦａｂ’−ＰＥＧ換算で、例えば、０．１〜２００ｍｇ／ｍＬ、ある態様として、０．１〜４０ｍｇ／ｍＬ、別の態様として、２０〜４０ｍｇ／ｍＬ、他の態様として、６０〜１５０ｍｇ／ｍＬ、また他の態様として、４０〜１２０ｍｇ／ｍＬが挙げられる。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
【００３９】
医薬組成物が液体状態（溶液）の場合、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの濃度としては、Ｆａｂ’−ＰＥＧ換算で、例えば、０．１〜２００ｍｇ／ｍＬ、ある態様として、０．１〜４０ｍｇ／ｍＬ、別の態様として、２０〜４０ｍｇ／ｍＬ、他の態様として、６０〜１５０ｍｇ／ｍＬ、また他の態様として、４０〜１２０ｍｇ／ｍＬが挙げられる。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
用量としては、例えば、Ｆａｂ’−ＰＥＧ換算で、例えば、０．１〜２００ｍｇ、ある態様として、０．１〜４０ｍｇ、別の態様として、２０〜４０ｍｇ、他の態様として、６０〜１５０ｍｇ、また他の態様として、４０〜１２０ｍｇを含む。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
【００４０】
適応症としては、ヒトＮＧＦが病態形成に関与する各種疾患の予防及び／又は治療、例えば、変形性関節症に伴う関節痛（ＯＡ疼痛）、リウマチに伴う関節痛、癌性疼痛、神経因性疼痛、慢性腰痛、術後疼痛、帯状疱疹後神経痛、有痛性糖尿病性神経障害、骨折痛、膀胱痛症候群等の疼痛や、間質性膀胱炎、急性膵炎、慢性膵炎、子宮内膜症等を含む。
【００４１】
本発明に用いられる「製薬学的に許容される緩衝剤」としては、製薬学的に許容され、溶液状態において、所望のｐＨ範囲内で緩衝能を有するものであれば、特に制限されない。
【００４２】
具体的には、次のｐＨ範囲内で緩衝能を有するものである。例えば、４〜５．５、ある態様として４．０〜５．５、別の態様として４．５〜５．５、他の態様として４．６〜５．２である。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。また、ｐＨは、医薬組成物が液体製剤である場合には、該液体製剤のｐＨとし、医薬組成物が凍結乾燥製剤又は噴霧乾燥製剤である場合、該製剤が水に再溶解される時の該溶解液のｐＨとする。
【００４３】
緩衝剤成分としては、例えば、クエン酸、酢酸、若しくはヒスチジン、又はそれらの製薬学的に許容される塩等を含む。別の態様としては、クエン酸、酢酸、又はそれらの製薬学的に許容される塩等を含む。他の態様としては、無水クエン酸及び／又はクエン酸三ナトリウム二水和物を含む。
これらの緩衝剤成分は、１種又は２種以上適宜適量使用することができる。なお、ｐＨを所望のｐＨ範囲内に調整するために、塩酸や水酸化ナトリウム等を適宜加えてもよい。
【００４４】
緩衝剤の濃度は、ｐＨを所望のｐＨ範囲内に調整できる量であれば、特に制限されない。緩衝剤の濃度は、注射用水により溶解され溶液状態（液体製剤）の場合、例えば、１〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ、別の態様として、１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、他の態様として、５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、また他の態様として、１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
緩衝剤の量は、医薬組成物が凍結乾燥製剤又は噴霧乾燥製剤である場合、該製剤が水に再溶解される時の該溶解液中の緩衝剤が上述の濃度となる量である。
【００４５】
本発明に用いられる「製薬学的に許容される等張化剤」としては、製薬学的に許容され、等張作用を有し、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの安定性に影響を及ぼさないもの又は安定化作用を有するものであれば、特に制限されない。
【００４６】
具体的には、例えば、塩類、アミノ酸類、糖又は糖アルコール類を挙げることができる。
塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム等を挙げることができる。ある態様としては、塩化ナトリウムである。
アミノ酸類としては、例えば、アルギニン（Ｌ−アルギニン）又はその製薬学的に許容される塩（例えば、塩酸塩）、グリシン、リシン、オルニチン等を挙げることができる。ある態様としては、アルギニン、グリシンであり、別の態様としてはアルギニンである。
糖又は糖アルコール類としては、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、スクロース、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、イノシトール、ズルシトール、アラビトール、イソマルト、ラクチトール、マルチトール等を挙げることができる。ある態様として、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトールであり、別の態様として、Ｄ−ソルビトールである。
等張化剤としては、ある態様として、アルギニン又はその製薬学的に許容される塩、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、スクロース、キシリトール、エリスリトール、イノシトール、アラビトール、イソマルト、ラクチトール、マルチトールであり、別の態様としては、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｄ−ソルビトールである。
これらの等張化剤は、１種又は２種以上適宜選択され使用することができる。
なお、塩類、アミノ酸類、糖又は糖アルコールは、ＰＥＧ化抗ヒト抗体Ｆａｂ’フラグメントの安定性に影響をおよぼさない又は安定化する範囲内において、医薬組成物中に含まれる。
【００４７】
等張化剤の濃度は、等張作用を有し、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの安定性に影響を及ぼさない濃度であれば、特に制限されない。
注射用水により溶解され溶液状態（液剤）の場合の濃度として、例えば、１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、ある態様として、１〜４００ｍｍｏｌ／Ｌ、別の態様として、１〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ、他の態様として、５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、また他の態様として、１００〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ、また別の態様として、２００〜３００ｍｍｏｌ／Ｌであり、さらに別の態様として、１００〜２００ｍｍｏｌ／Ｌである。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
等張化剤の量は、医薬組成物が凍結乾燥製剤又は噴霧乾燥製剤である場合、該製剤が水に再溶解される時の該溶解液中の等張化剤が上述の濃度となる量である。
【００４８】
本発明に用いられる「製薬学的に許容される界面活性剤」としては、製薬学的に許容され、界面活性作用及びＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの安定化作用を有するものであれば、特に制限されない。
【００４９】
具体的には、例えば、非イオン性界面活性剤、例えば、モノカプリル酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン等のソルビタン脂肪酸エステル；モノカプリル酸グリセロール、モノミリスチン酸グリセロール、モノステアリン酸グリセロール等のグリセリン脂肪酸エステル；モノステアリン酸デカグリセリル、ジステアリン酸デカグリセリル、モノリノール酸デカグリセリル等のポリグリセロール脂肪酸エステル；モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；テトラステアリン酸ポリオキシエチレンソルビトール、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール等のポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル；モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ジステアリン酸ポリエチレングリコール等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等ポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビトールミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、例えば、ポリオキシエチレンオクタデカンアミド等の６〜１８のＨＬＢを有する界面活性剤；陰イオン性界面活性剤、例えば、セチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等のＣ１０〜Ｃ１８アルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、添加されたエチレンオキシド単位の平均モル数が２〜４であり、アルキル基の炭素原子の数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；スルホコハク酸ラウリルナトリウム等のＣ８〜Ｃ１８アルキル基を有するスルホコハク酸アルキル塩；レシチン、グリセロリン脂質等の天然の界面活性剤；スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質；又はＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸のショ糖エステルを含む。
【００５０】
これらの界面活性剤は、１種又は２種以上適宜選択され使用することができる。
【００５１】
ある態様として、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルであり、別の態様として、ポリソルベート又はプルロニック型界面活性剤であり、他の態様として、ポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０、８１、８５又はプルロニック型界面活性剤であり、また他の態様として、ポリソルベート２０、８０又はポロキサマー（ポロキサマー１８８）、別の態様として、ポリソルベート８０である。
【００５２】
なお、界面活性剤は、不溶性異物等の形成を抑制する作用を有しており、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを安定化させる範囲内において、医薬組成物中に含まれる。
界面活性剤の濃度は、界面活性作用及びＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの安定化作用を有する濃度であれば、特に制限されない。
注射用水により溶解され溶液状態（液体製剤）の場合、０．００１〜１％（ｗ／ｖ）、ある態様として０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）、別の態様として０．０１〜０．０３％（ｗ／ｖ）である。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
界面活性剤の量は、医薬組成物が凍結乾燥製剤又は噴霧乾燥製剤である場合、該製剤が水に再溶解される時の該溶解液中の界面活性剤が上述の濃度となる量である。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、溶液を容器に充填して、液体製剤として、また、溶液を凍結乾燥法や噴霧乾燥法により、凍結乾燥製剤又は噴霧乾燥製剤等の非経口医薬組成物として、提供することができる。好適には、液体製剤である。
本発明の医薬組成物の中でも特に、クエン酸、アルギニン及びポリソルベートを含む液体製剤、又は、クエン酸、Ｄ−ソルビトール及びポリソルベートを含む液体製剤が好適である。
【００５４】
本発明の医薬組成物には、所望により、懸濁剤、溶解補助剤、保存剤、吸着防止剤、含硫還元剤、酸化防止剤等の医薬品添加物を適宜添加することができる。
【００５５】
懸濁剤としては、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。
【００５６】
溶解補助剤としては、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができる。
【００５７】
保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができる。
【００５８】
吸着防止剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
【００５９】
含硫還元剤としては、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。
【００６０】
酸化防止剤としては、例えば、メチオニン、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。
各種医薬品添加物は、本発明の所望の効果を達成できる量の範囲で、適宜適量使用することができる。
【００６１】
本発明の医薬組成物の製造方法は、自体公知の製造方法により、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有し、ｐＨを４〜５．５に調整する方法を含み、所望により、製薬学的に許容される緩衝剤、製薬学的に許容される等張化剤、及び製薬学的に許容される界面活性剤を更に含有することができる。
【００６２】
本発明の医薬組成物を充填する容器は、使用目的に応じて選択することができる。例えば、バイアル、アンプル、注射器のような規定容量の形状のもの、瓶のような大容量の形状のものを含む。ある態様として注射器（ディスポーザブル注射器を含む）を含む。該注射器に予め溶液を充填して、プレフィルドシリンジ溶液製剤として提供することにより、医療現場において、溶解操作等の操作が不要となり、迅速な対応が可能となる。
【００６３】
容器の材質については、ガラス、プラスチック等が挙げられる。また、容器内の表面処理としては、シリカコート処理、シリコーンコート処理、サルファー処理、各種低アルカリ処理等が施されてもよい。
【００６４】
本発明には、ｐＨを４〜５．５に調整することを特徴とする、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを安定化する方法が含まれる。本発明の安定化方法では、所望により、製薬学的に許容される緩衝剤、製薬学的に許容される等張化剤、及び製薬学的に許容される界面活性剤を更に使用することができる。
本発明の安定化方法で用いる「ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント」、「製薬学的に許容される緩衝剤」、「製薬学的に許容される等張化剤」、及び「製薬学的に許容される界面活性剤」については、本発明の医薬組成物における当該説明をそのまま適用することができる。また、これらの各成分の配合量、配合方法等については、本発明の医薬組成物における当該説明をそのまま適用することができる。
本発明の安定化方法では、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを製造する際に、ｐＨを４〜５．５に調整することにより、また、所望により、製薬学的に許容される緩衝剤、製薬学的に許容される等張化剤、及び製薬学的に許容される界面活性剤を更に使用することにより、分解物、多量体、酸性側類縁体、塩基性側類縁体、不溶性異物の生成を抑制することができる。
【実施例】
【００６５】
以下、参考例、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定解釈されるものではない。【００６６】
実施例において用いられた、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、国際公開第２０１３／０２２０８３号の実施例１９に記載の製法又はそれに準じた方法により入手した。【００６７】
《参考例：ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの作製》
本実施例で用いた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号２に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１に、該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号４に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号３にそれぞれ示す。該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖可変領域における、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１の３１から３５、５０から６５、９８から１１０までのアミノ酸配列からなる。該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖可変領域における、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、配列番号３の２４から３９、５５から６１、９４から１０２までのアミノ酸配列からなる。【００６８】
国際公開第２０１３／０２２０８３号に従い、該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントと軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクター（Ｌｏｎｚａ社）を構築した。ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）にトランスフェクションすることによりＦａｂ’フラグメントの安定発現化株を取得し、Ｆａｂ’フラグメントを発現させた。培養上清をアフィニティークロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製し、Ｆａｂ’フラグメントを得た。なお、工程には、ウイルスの不活化工程とウイルス除去膜工程を含む。次いで、得られた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを還元剤で還元し、ＰＥＧマレイミド（製品名：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＭＡ、日油株式会社製）と結合させた。さらに陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製し、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを作製した。なお、精製したＦａｂ’フラグメントのアミノ酸修飾を分析した結果、その大部分において重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化が生じていた。【００６９】
《実施例１：至適ｐＨ選定による安定化効果》
ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント濃度がＦａｂ’換算で１０ｍｇ／ｍＬ（Ｆａｂ’−ＰＥＧ換算で約２０ｍｇ／ｍＬ）となるように、表１に示す緩衝液（濃度はいずれも２０ｍｍｏｌ／Ｌ）で希釈調製した処方液（試料Ｎｏ．Ａ−１〜Ａ−８）を０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、１．３ｍＬずつガラスバイアル（３ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を実施し、倒置状態で２５℃１箇月の保管を実施した。
なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
また、Ｆａｂ’換算濃度及びＦａｂ’−ＰＥＧ換算濃度は、紫外・可視分光光度計Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  ＭＡ，  Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて測定した。２μＬのサンプルをステージにアプライし、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。タンパク濃度は、得られた２８０ｎｍ吸光度、及び吸光係数１．４８ｍＬ／ｍｇ／ｃｍ（Ｆａｂ’換算濃度の場合）、又は０．７９ｍＬ／ｍｇ／ｃｍ（Ｆａｂ’−ＰＥＧ換算濃度の場合）を用いて算出した。【００７０】
ＳＥ−ＨＰＬＣ法、ＩＥ−ＨＰＬＣ法による評価結果を表１に示す。
ＳＥ−ＨＰＬＣ測定は、ＨＰＬＣシステムに、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（東ソー製）を接続し、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸／５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムｐＨ７．０の組成をもつ溶液に、１０％となるようアセトニトリルを添加した組成の移動相を０．５ｍＬ／分の流量で流した。サンプルはＦａｂ’換算で５０μｇ（Ｆａｂ’−ＰＥＧ換算で約１００μｇ）となる注入量とした。カラム温度は３０℃、サンプル温度は５℃に設定し、検出はＵＶ２８０ｎｍで実施した。【００７１】
ＳＥ−ＨＰＬＣ測定で検出されたピークの面積を自動分析法により測定し、メインピークを含む全ピーク面積の総和で除することにより、百分率（％）として計算した。なお、メインピークとは、活性本体のピークを意味する。
ＳＥ−ＨＰＬＣのメインピークより保持時間が短いピークを合わせて多量体、保持時間が長いピークを合わせて分解物とした。【００７２】
ＩＥ−ＨＰＬＣ測定は、ＨＰＬＣシステムに、Ｐｒｏｐａｃ  ＷＣＸ−１０  カラム（Ｄｉｏｎｅｘ製）を接続し、測定を行った。移動相Ａラインに２０ｍｍｏｌ／Ｌの２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）／ｐＨ６．０、移動相Ｂラインに２０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ／５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム／ｐＨ６．０の移動相を接続し、１ｍＬ／分の流速で流した。サンプルは移動相ＡでＦａｂ’換算濃度１ｍｇ／ｍＬに希釈し、１０μＬを注入した。グラジエントプログラムは、移動相Ｂを０％で２分間保持後、５０分間で５％まで移動相Ｂの割合を直線的に増加させた。続いて、１００％まで移動相Ｂの割合を直線的に増加させ、洗浄を行った後、移動相Ｂの割合を０％まで直線的に減少させ、約１０分間保持し、次のサンプル注入まで平衡化を行った。分析時間は約７０分で、検出はＵＶ２８０ｎｍで実施した。カラム温度は４０℃、サンプル温度は５℃に設定した。【００７３】
ピークの百分率はＳＥ−ＨＰＬＣと同様の方法により計算した。
上記試験におけるＩＥ−ＨＰＬＣの１２分付近のピークを酸性側類縁体とした。【００７４】
結果、ｐＨ７付近のＡ−５では多量体、分解物、酸性側類縁体の増加が認められた。
本結果より、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントはｐＨ４〜６付近で製剤化することで、多量体、分解物、及び酸性側類縁体の生成が抑制されることが示された。【００７５】
【表１】
2017164349.tif 000002
【００７６】
《実施例２：等張化剤の選択による安定化効果》
ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント濃度がＦａｂ’換算で２０ｍｇ／ｍＬ（Ｆａｂ’−ＰＥＧ換算で約４０ｍｇ／ｍＬ）、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸（ｐＨ５．５）の緩衝液の処方に６種の医薬品添加剤物（Ｌ−アルギニン塩酸塩、塩化ナトリウム、グリシン、Ｄ−ソルビトール、スクロース及びＤ−マンニトール）を等張となる濃度で加えた処方（試料Ｎｏ．Ｂ−１〜Ｂ−７）における、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの安定性（多量体量、分解物量、多分散度）を評価した。各処方組成に調製したサンプルを、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、０．３ｍＬずつガラスバイアル（３ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を実施し、正置状態で４０℃４週の保管を実施した。結果を表２に示す。
なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。【００７７】
多量体量、分解物量はＳＥ−ＨＰＬＣ法により、実施例１と同様にして分析した。
多分散度の測定はＤｙｎａＰｒｏ  Ｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ（Ｗｙａｔｔ製）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）法により測定した。【００７８】
塩化ナトリウム添加処方では、４０℃４週保管後の多量体量及び分解物量が、無添加処方と比較して、増加する傾向が認められた。
Ｌ−アルギニン塩酸塩添加処方、及びグリシン添加処方では、無添加処方と比較して、４０℃４週保管後の分解物量の増加が認められた。Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール添加処方では、４０℃４週保管後の、多量体量と分解物量、多分散度は無添加処方と同等であった。
なお、無添加の処方と比較して、分解物量の増加のあった処方について、多量体量、酸性側類縁体量、塩基性側類縁体量等の変動等を考慮のうえ、総合的に安定性を判断する。【００７９】
【表２】
2017164349.tif 000003
【００８０】
《実施例３：界面活性剤の添加による安定化効果》
ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント濃度がＦａｂ’換算で２０ｍｇ／ｍＬ（Ｆａｂ’−ＰＥＧ換算で約４０ｍｇ／ｍＬ）、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸（ｐＨ５．５）処方に、界面活性剤であるポリソルベート８０を３つの濃度水準（０．０１、０．０２、０．０５％（ｗ／ｖ））で添加したサンプル（試料Ｎｏ．Ｃ−１〜Ｃ−４）について、凍結融解ストレスに対する物理的安定性を評価した。サンプルは、各処方組成に調製し、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、０．３ｍＬずつガラスバイアル（３ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を行った。
凍結融解ストレス試験は、サンプルを正置状態で−８０℃の冷凍庫内に保管し凍結させた後、サンプルを冷凍庫から取り出し、５℃の冷蔵庫内に正置状態で保管し、融解させた。この凍結融解サイクルを３回繰り返すことにより行った。
なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。【００８１】
目視による、外観評価の結果を表３に示す。
外観評価では、ポリソルベート８０無添加処方で、凍結融解ストレスによる多数の不溶性異物の発生が認められたが、ポリソルベート８０を添加した処方では、いずれの濃度においても不溶性異物は認められなかった。【００８２】
【表３】
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【００８３】
《実施例４：等張化剤、界面活性剤を含む処方の至適ｐＨ選定による安定化効果１》
ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを濃度がＦａｂ’換算で２０ｍｇ／ｍＬ（Ｆａｂ’−ＰＥＧ換算で約４０ｍｇ／ｍＬ）含み、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸、又はヒスチジンを緩衝剤とし、２４０ｍｍｏｌ／ＬのＤ−マンニトール、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を添加した処方（試料Ｎｏ．Ｄ−１〜Ｄ−７）について、ｐＨ４．０〜６．０の範囲でサンプルを調製し、正置状態での２５℃及び４０℃保管時における安定性をＳＥ−ＨＰＬＣ法、ＩＥ−ＨＰＬＣ法、ＤＬＳ法で評価した。サンプルは、各処方組成に調製後、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過し、０．３ｍＬずつガラスバイアル（３ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を行った。
なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
ＳＥ−ＨＰＬＣ法及びＩＥ−ＨＰＬＣ法は実施例１と同様にして、ＤＬＳ法は実施例２と同様にして測定した。【００８４】
結果を図１、図２、及び表４に示す。
分解物は、ｐＨ５．０で、初期品に比較して、増加量が最小となった。また、酸性側類縁体は、いずれの保管条件においても、ｐＨが高くなるほど初期品からの増加量は大きくなる傾向が認められた。
表４のＤＬＳ測定結果からは、４０℃２週保管品において、ｐＨが低いほど平均粒子径及び多分散度の値が大きくなっており、凝集体を形成しやすい傾向が認められた。【００８５】
【表４】
2017164349.tif 000005
【００８６】
《実施例５：等張化剤、界面活性剤を含む処方の至適ｐＨ選定による安定化効果２》
ｐＨ４．６、ｐＨ４．９、及びｐＨ５．２にクエン酸（濃度はいずれも２０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いて調製した処方液に、２４０ｍｍｏｌ／ＬのＤ−マンニトール及び０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を加えた処方、及び２４０ｍｍｏｌ／ＬのＤ−マンニトールの代わりに２４０ｍｍｏｌ／ＬのＤ−ソルビトールを添加した処方（ｐＨ４．９）について、正置状態での５℃、２５℃、４０℃における保管安定性を評価した。なお、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを濃度がＦａｂ’換算で２０ｍｇ／ｍＬ（Ｆａｂ’−ＰＥＧ換算で約４０ｍｇ／ｍＬ）である。サンプルは、各処方組成に調製後、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過し、０．３ｍＬずつガラスバイアル（３ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を行った。
なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
多量体及び分解物はＳＥ−ＨＰＬＣ法により測定し、酸性側類縁体はＩＥ−ＨＰＬＣ法により測定した。ＳＥ−ＨＰＬＣ法及びＩＥ−ＨＰＬＣ法は実施例１と同様にして実施した。【００８７】
結果を図３〜図５に示す。
ｐＨ４．６〜５．２の範囲で、Ｄ−マンニトール処方及びＤ−ソルビトール処方ともに安定であることが確かめられた。【００８８】
《実施例６：等張化剤、界面活性剤を含む処方の緩衝剤選定による安定化効果》
表５に示す２つの処方（試料Ｎｏ．Ｅ−１及びＥ−２）について、正置状態で各条件（５℃、２５℃、４０℃）下４週保管後の安定性を評価した。サンプルは、各処方組成に調製後、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過し、１．３ｍＬずつガラスバイアル（３ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を行った。
なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
多量体及び分解物はＳＥ−ＨＰＬＣ法により測定し、酸性側類縁体はＩＥ−ＨＰＬＣ法により測定した。ＳＥ−ＨＰＬＣ法及びＩＥ−ＨＰＬＣ法は実施例１と同様にして実施した。【００８９】
結果を表６に示す。
Ｅ−１及びＥ−２ともに安定であった。【００９０】
【表５】
2017164349.tif 000006
【００９１】
【表６】
2017164349.tif 000007
【００９２】
《実施例７：緩衝剤、等張化剤、界面活性剤を含む処方の安定性評価》
２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸を用いてｐＨ４．９に調製した処方溶液に、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを濃度がＦａｂ’−ＰＥＧ換算で４０ｍｇ／ｍＬ（Ｆａｂ’換算で約２０ｍｇ／ｍＬ）、Ｄ−ソルビトール濃度が２４０ｍｍｏｌ／Ｌ、ポリソルベート８０濃度が０．０２％（ｗ／ｖ）となるように添加した表７に示す処方について、凍結融解あるいは振とうあるいは光ストレスを与えた後、及び、正置状態で各条件（−２０℃、５℃、２５℃）下３箇月保管後の安定性を評価した。なお、クエン酸とクエン酸三ナトリウム二水和物は合計がクエン酸として２０ｍｍｏｌ／Ｌとなり、ｐＨが４．９となる比率で添加した。塩酸又は水酸化ナトリウムは、必要に応じて緩衝液調製時にｐＨ４．６〜５．２となるように添加した。調製したサンプルは０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、３ｍＬバイアルに１．２ｍＬ充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を実施し、各条件で保管した。【００９３】
凍結融解試験については、実施例３と同様にして行った。
振とう安定性試験については、サンプルを横置状態で振とう機（ＲＥＣＩＰＲＯ  ＳＨＡＫＥＲ  ＳＲ−１；ＴＡＩＴＥＣ製）に設置し、室温下、１５０ｒｐｍの速度で４８時間振とうすることにより行った。
光安定性試験については、サンプルを横置状態で保管し、Ｄ６５ランプを用いて１０００ｌｕｘの光を４８時間照射することにより行った。
外観は目視観察、ｐＨはｐＨメーター、多量体及び分解物はＳＥ−ＨＰＬＣ法、酸性側類縁体はＩＥ−ＨＰＬＣ法、平均粒子径及び多分散度はＤＬＳ法により測定した。目視観察は室内光下で実施し、ｐＨは、校正用標準液を用いて校正を実施したｐＨメーターを用いて実施、ＳＥ−ＨＰＬＣ法及びＩＥ−ＨＰＬＣ法は実施例１と同様にして、また、ＤＬＳ法は実施例２と同様にして実施した。【００９４】
結果を表８及び表９に示すが、保管後においても安定であった。【００９５】
【表７】
2017164349.tif 000008
【００９６】
【表８】
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【００９７】
【表９】
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【００９８】
《実施例８：高濃度製剤の至適ｐＨ選定による安定化効果》
ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント濃度がＦａｂ’−ＰＥＧ換算で１００ｍｇ／ｍＬ（Ｆａｂ’換算で約５０ｍｇ／ｍＬ）となるように、表１０に示す組成になるようスピンカラムを用いて緩衝液交換・濃縮を実施し、０．０２ｗ／ｖ％となるようにポリソルベート８０を添加の上、０．２２μｍフィルターでろ過した。ろ過液を０．２５ｍＬ又は１．１５ｍＬずつ３ｍＬガラスバイアルに充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を実施し、２５℃、４０℃における、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの保管安定性（多量体量、分解物量、酸性側類縁体量）を評価した。
なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に水酸化ナトリウムを添加した。
多量体及び分解物はＳＥ−ＨＰＬＣ法により測定し、酸性側類縁体はｉｃＩＥＦ法により測定した。【００９９】
ＳＥ−ＨＰＬＣ測定は、ＨＰＬＣシステムに、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（東ソー製）を接続し、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸／４００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムｐＨ７．０の組成をもつ溶液に、１７．５％となるようアセトニトリルを添加した組成の移動相を０．５ｍＬ／分の流量で流した。サンプルはＦａｂ’−ＰＥＧ換算で５０μｇとなる注入量とした。カラム温度は３０℃、サンプル温度は５℃に設定し、検出はＵＶ２８０ｎｍで実施した。【０１００】
ｉｃＩＥＦ測定は、ｉＣＥ３システムに、ｃＩＥＦ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ＦＣ−Ｃｏａｔｅｄ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ製）を接続し、測定を行った。約０．２％メチルセルロース、約２．７％  Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ３−１０、約１．６％  Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ８−１０．５、約１．１％ＣＨＡＰＳ、約０．５％ｐＩマーカー５．８５、約０．５％ｐＩマーカー９．４６から成るサンプルマトリックス１２０μＬと、超純水でＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント濃度１０ｍｇ／ｍＬに希釈したサンプル５μＬを混和し、測定試料とした。Ｐｒｅｆｏｃｕｓｉｎｇは１５００Ｖで１分、Ｆｏｃｕｓｉｎｇは３０００Ｖで１６分実施し、検出はＵＶ２８０ｎｍで実施した。【０１０１】
表１１に多量体量測定結果、表１２に分解物測定結果、及び表１３に酸性側類縁体測定結果を示す。高濃度製剤においてもｐＨが高くなるほど、多量体、分解物、酸性側類縁体量が増加する傾向が認められた。【０１０２】
【表１０】
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【０１０３】
【表１１】
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【０１０４】
【表１２】
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【０１０５】
【表１３】
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【０１０６】
《実施例９：高濃度製剤の緩衝剤、等張化剤、界面活性剤を含む処方の安定性評価検討》
実施例８と同様にして、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸を用いて、表１４のｐＨに調製した処方溶液に、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを濃度がＦａｂ’−ＰＥＧ換算で１００ｍｇ／ｍＬ（Ｆａｂ’換算で約５０ｍｇ／ｍＬ）、Ｄ−ソルビトール濃度が２４０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−アルギニン塩酸塩濃度が１４０ｍｍｏｌ／Ｌ、ポリソルベート８０濃度が０．０２％（ｗ／ｖ）となるように添加した表１４に示す処方について、正置状態で各条件（５℃、２５℃）下１箇月又は３箇月保管後の安定性を評価した。調製したサンプルは０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、３ｍＬバイアルに０．８ｍＬ充填し、ゴム栓で打栓後、巻締を実施し、各条件で保管した。
多量体及び分解物はＳＥ−ＨＰＬＣ法により測定し、酸性側類縁体及び塩基性側類縁体はｉｃＩＥＦ法により測定した。ＳＥ−ＨＰＬＣ法及びｉｃＩＥＦ法は実施例８と同様にして実施した。【０１０７】
結果を表１５に示すが、クエン酸、アルギニン及びポリソルベートを含む高濃度製剤、又は、クエン酸、Ｄ−ソルビトール及びポリソルベートを含む高濃度製剤は保管後においても安定であった。【０１０８】
【表１４】
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【０１０９】
【表１５】
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【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明によれば、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有してなる、安定な医薬組成物、詳細には、分解物、多量体、酸性側類縁体、塩基性側類縁体、不溶性異物の生成を抑制してなる、ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを含有してなる、安定な医薬組成物を提供することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変法や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１１】
配列番号１の配列は、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントのアミノ酸配列であり、配列番号２の配列は、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖フラグメント遺伝子の塩基配列であり、配列番号３の配列は、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖のアミノ酸配列であり、配列番号４の配列は、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖遺伝子の塩基配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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