(57)【要約】  腎臓への集積を投与早期から低減できる放射性標識薬剤が得られる化合物等に関する。〔１〕式（１）で表される化合物等、〔２〕上記〔１〕に記載の化合物等に、標的分子認識素子を結合させてなる化合物等、〔３〕放射性金属及び放射性原子標識金属から選ばれる１種の金属と、前記金属に配位した〔１〕又は〔２〕に記載の化合物等と、を有する金属錯体化合物等、〔４〕上記〔１〕又は〔２〕に記載の化合物等を含む、放射性標識薬剤の調製用薬剤、〔５〕上記〔１〕又は〔２〕に記載の化合物等の放射性標識薬剤の製造のための使用、〔６〕上記〔３〕に記載の金属錯体化合物等を含む、放射性標識薬剤、及び〔７〕上記〔３〕に記載の金属錯体化合物等を含む放射線画像診断薬。2017150549.tif 000032
2017150549.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩。
【化１】
2017150549.tif 000028
〔式中、
Ａ1は、アミノ酸残基であり、
ｍは、０〜３の整数であり、
Ａ2は、側鎖にアミノ基又はカルボキシ基を有するアミノ酸残基であり、
Ａ3は、アミノ酸残基であり、
ｎは、０〜３の整数であり、
Ｒ1は、Ａ2の側鎖のアミノ基又はカルボキシ基と結合し、標的分子認識素子又はその連結基と結合可能な官能基を有する基、又は、Ａ2の側鎖のアミノ基若しくはカルボキシ基の水素原子であり、
Ｒ2は、それぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜８の炭化水素基である。
ただし、Ｒ1は、環構成原子の一つとしてＡ2の側鎖のアミノ基の窒素原子を含む炭素数３〜１０の複素環基を形成していてもよい。〕
【請求項２】
Ａ1が、バリン、ロイシン、イソロイシン又はフェニルアラニンの残基である、請求項１に記載の化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩。
【請求項３】
Ａ2が、リシン、オルニチン又はアルギニンの残基である、請求項１又は２に記載の化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩。
【請求項４】
ｍが、１である、請求項１〜３のいずれか1項に記載の化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩。
【請求項５】
ｎが、０である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩。
【請求項６】
前記化合物が、下記式（１ａ）で表される、請求項１〜５のいずれか1項に記載の化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩。
【化２】
2017150549.tif 000029
〔式中、Ｒ2は、それぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜８の炭化水素基であり、Ｒ3は、水素原子又はメチル基、Ｒ４，Ｒ5は、それぞれ独立に、水素原子、又は、官能基ａを有する総炭素数２〜２０のアシル基、官能基ａを有する総炭素数２〜２０のアルキル基、官能基ａを有する総炭素数２〜２０のアルキルカルバモイル基、若しくは官能基ａを有する総炭素数２〜２０のアルキルチオカルバモイル基である。ただし、Ｒ４及びＲ5は、隣接する窒素原子を含む複素環を形成していてもよく、その場合、式：
【化３】
2017150549.tif 000030
で表される基は、式：
【化４】
2017150549.tif 000031
で表される基である。〕
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか1項に記載の化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩に、標的分子認識素子を結合させてなる化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩。
【請求項８】
前記標的分子認識素子が、標的分子に結合するポリペプチドである、請求項７に記載の化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、抗体のＦａｂ断片である、請求項８に記載の化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩。
【請求項１０】
放射性金属及び放射性原子標識金属から選ばれる１種の金属と、前記金属に配位した請求項１〜９のいずれか1項に記載の化合物又はその薬理的に許容可能な塩と、を有する金属錯体化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩。
【請求項１１】
前記金属が、67Ga、68Ga、18F-Al、64Cu又は67Cuである、請求項１０に記載の金属錯体化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか1項に記載の化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩を含む、放射性標識薬剤の調製用薬剤。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか1項に記載の化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩の放射性標識薬剤の製造のための使用。
【請求項１４】
請求項１０又は１１に記載の金属錯体化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩を含む、放射性標識薬剤。
【請求項１５】
請求項１０又は１１に記載の金属錯体化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩を含む、放射線画像診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物、それを含む放射性標識薬剤、及び当該放射性標識薬剤の調製用薬剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
放射性標識薬剤を用いて、単一光子放射断層撮影（Single Photon Emission Computed Tomography, 以下単に「SPECT」ともいう）、陽電子放射断層撮影（Positron Emission Tomography, 以下単に「PET」ともいう）等の放射線画像診断が行われている。これらの放射線画像診断には、様々な放射性核種が使用されるが、そのなかでも放射性ガリウムは、SPECTには、ガリウム-67(67Ga)が使用され、PETには、ガリウム-68(68Ga)が使用でき、いずれの装置にも対応可能である。特に、68Gaは、ゲルマニウム-68を用いたジェネレータから溶出できることから、近年注目されている。68Gaの半減期は68分と短いために、血液クリアランスの早い低分子化抗体等の分子量の小さいペプチドを標識母体として使用する。しかしながら放射性同位体（RI）標識低分子ペプチドを生体に投与すると、標的組織への特異的な集積の他に腎臓への非特異的な集積が観察される。この場合、腎臓に近い標的組織に対する画像化を困難にする。腎臓への放射活性の集積（以下「腎集積」ともいう）は、RI標識低分子ペプチドが腎臓に取り込まれた後、リソソームに運ばれ、代謝された後に生成する放射性代謝物が腎臓に残存することに基因する。【０００３】
この問題に対して、非特許文献１に記載された放射性ガリウム標識薬剤では、67Ga-NOTA-Bn-Met（明細書中の式参照）が腎臓リソソーム画分から尿中へと排泄されることを利用し、放射性ガリウム標識抗体フラグメントが腎組織に取り込まれた後、リソソーム内で67Ga-NOTA-Bn-Metを遊離することで、従来法に比べ、腎集積を有意に低減している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Bioconjugate Chem., 2014, 25, 2038 - 2045.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
68Gaの半減期は68分と短いことから、投与後早期から腎臓への集積を低減することが望ましい。上述の方法では、これまでの標識方法に比べ、投与後１時間より後について腎臓の放射活性を有意に低減しているが、投与後1時間以前の投与早期には低減できていない。
そこで本発明は、腎臓への集積を投与早期から低減できる放射性標識薬剤が得られる化合物等に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の発明に関する。
〔１〕下記式（１）で表される化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩。
【化１】
2017150549.tif 000003
〔式中、
Ａ1は、アミノ酸残基であり、
mは、０〜３の整数であり、
Ａ2は、側鎖にアミノ基又はカルボキシ基を有するアミノ酸残基であり、
Ａ3は、アミノ酸残基であり、
nは、０〜３の整数であり、
Ｒ1は、Ａ2の側鎖のアミノ基又はカルボキシ基と結合し、ポリペプチド又はその連結基と結合可能な官能基を有する基であり、
Ｒ2は、それぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜８の炭化水素基である。
ただし、Ｒ1は、環構成原子の一つとしてＡ2の側鎖のアミノ基の窒素原子を含む炭素数３〜１０の複素環基を形成していてもよい。〕
〔２〕上記〔１〕に記載の化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩に、標的分子認識素子を結合させてなる化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩。
〔３〕放射性金属及び放射性原子標識金属から選ばれる１種の金属と、前記金属に配位した〔１〕又は〔２〕に記載の化合物又はその薬理的に許容可能な塩と、を有する金属錯体化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩。
〔４〕上記〔１〕又は〔２〕に記載の化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩を含む、放射性標識薬剤の調製用薬剤。
〔５〕上記〔１〕又は〔２〕に記載の化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩の放射性標識薬剤の製造のための使用。
〔６〕上記〔３〕に記載の金属錯体化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩を含む、放射性標識薬剤。
〔７〕上記〔３〕に記載の金属錯体化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩の放射線画像診断薬。
〔８〕前記化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩が、放射性標識薬剤の調製用である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩。
〔９〕上記〔３〕に記載の金属錯体化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩の放射性標識薬剤の製造のための使用。
〔１０〕上記〔３〕に記載の金属錯体化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩の放射線画像診断のための使用。
〔１１〕上記〔３〕に記載の金属錯体化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩を投与する放射線画像診断方法。
〔１２〕上記〔１〕に記載の化合物若しくはその薬理学的に許容可能な塩、又は、上記〔１〕に記載の化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩に、標的分子認識素子を結合させてなる化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩と、放射性金属及び放射性原子標識金属から選ばれる１種の金属を含む薬剤とを、別々の包装単位として含む、キット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、腎臓への集積を投与早期から低減できる放射性標識薬剤が得られる化合物等が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、放射性金属標識Fabのマウス血漿中安定性の検討の結果を示す。
【図２】図２は、（ａ）腎臓放射活性（腎臓での時間-放射線量曲線）及び（ｂ）放射活性の腎臓血液比の経時変化を示す。
【図３】図３は、（ａ）67Ga-NOTA-MVK-Fab、（ｂ）67Ga-NOTA-MI-Fab、（ｃ）67Ga-NOTA-SCN-Fabの投与6時間後までの尿中放射活性のSE-HPLCによる分析結果を示す。
【図４】図４は、（ａ）67Ga-NOTA-MVK-Fab、（ｂ）67Ga-NOTA-MI-Fab、（ｃ）67Ga-NOTA-SCN-Fabの投与6時間後までの尿中放射活性のRP-HPLCによる分析、及び（ｄ）67Ga-NOTA-Met標品、（ｅ）67Ga-NOTA-Lys標品のRP-HPLCによる分析結果を示す。
【図５】図５は、67Ga-NOTA-MVK-Fab、67Ga-NOTA-MI-Fab及び67Ga-NOTA-SCN-Fabの腫瘍腎臓比を示す。
【図６】図６は、各67Ga標識Fab 溶液をSY皮下腫瘍モデルマウスに投与し、3時間後のSPECT/CT画像である。
【図７】図７は、64Cu-NOTA-MVK-Fab (図中、64Cu-MVK-Fabと示す)及び64Cu-NOTA-Fab(図中64Cu-SCN-Fabと示す)を正常マウスに投与した時に3時間後のPET画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［化合物等］
＜化合物（１）等＞
本発明の化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩（以下、単に「化合物（１）等」ともいう）は、下記式（１）で表される。
【化２】
2017150549.tif 000004
〔式中、
Ａ1は、アミノ酸残基であり、
mは、０〜３の整数であり、
Ａ2は、側鎖にアミノ基又はカルボキシ基を有するアミノ酸残基であり、
Ａ3は、アミノ酸残基であり、
nは、０〜３の整数であり、
Ｒ1は、Ａ2の側鎖のアミノ基又はカルボキシ基と結合し、標的分子認識素子又はその連結基と結合可能な官能基を有する基、又は、Ａ2の側鎖のアミノ基若しくはカルボキシ基の水素原子であり、
Ｒ2は、それぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜８の炭化水素基である。
ただし、Ｒ1は、環構成原子の一つとしてＡ2の側鎖のアミノ基の窒素原子を含む炭素数３〜１０の複素環基を形成していてもよい。〕
本発明によれば、腎臓への集積を投与早期から低減できる放射性標識薬剤が得られる化合物が提供できる。このように腎集積が低いという特徴を有する本発明の放射性標識薬剤は、放射線画像診断において腹部のバックグラウンドとなる放射能が少ないため、腹部の病巣部位の検出・診断が容易となる。更に、本発明の放射性標識薬剤は、標的分子認識素子を有するため、標的部位に特異的に結合することができ、そのため標的部位に効率的に集積する。このような性質のため、本発明の放射性標識薬剤は、放射線画像診断の感度、精度を向上させることができる。
【００１０】
本発明の効果が得られる理由は定かではないが、以下のように考えられる。なお、以下の説明では、金属として67Gaを使用した場合を例にとり説明する。
放射性標識薬剤の投与後、当該薬剤が腎細胞に取り込まれる際に、効率よく尿排泄性の放射性代謝物を遊離することができれば、腎臓への放射活性の集積を低減することができると考えられる。放射性代謝物としては、下記67Ga-NOTA-Bn-Metが想定される。
【化３】
2017150549.tif 000005
非特許文献１の方法では、これまでの標識方法に比べ、投与後1時間以降について腎臓の放射特性を有意に低減しているが、投与早期には低減できていない。これは放射性ガリウム標識薬剤が腎細胞に取り込まれ、リソソーム画分まで運ばれた後に67Ga-NOTA-Bn-Metが遊離することに基因すると考えられる。
放射性標識薬剤が腎細胞に取り込まれる際に、効率よく67Ga-NOTA-Bn-Metを遊離できるように、ポリペプチドと67Ga-NOTA-Bn-Metとの間に腎刷子縁膜酵素の基質配列を導入することで、腎細胞に取り込まれる前に、67Ga-NOTA-Bn-Metがポリペプチドから遊離され、腎臓への放射性物質の取り込みを抑制し投与早期から腎臓への集積を低減することができるものと推測される。
特に、アミノ酸配列のカルボキシル末端を化学修飾しないことで腎刷子縁膜酵素による67Ga-NOTA-Bn-Metの遊離が促進され、本発明の効果が得られたものと推測される。
【００１１】
本発明の化合物（１）等は、式（１）において、Ａ1は、腎臓への集積を投与早期から低減する観点から、好ましくは脂溶性アミノ酸残基であり、より好ましくは、バリン、ロイシン、イソロイシン又はフェニルアラニンの残基であり、腎臓への集積を投与早期から低減する効果をより顕著にする観点から、更に好ましくはバリンの残基である。
なお、mは、０〜３の整数であり、好ましくは１である。
Ａ2は、アミノ酸配列の側鎖に、ポリペプチド又はその連結基と結合可能な官能基を導入する観点から、側鎖にアミノ基又はカルボキシ基を有するアミノ酸残基であり、好ましくは、リシン、オルニチン、アルギニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸の残基であり、より好ましくは、リシン、オルニチン又はアルギニンの残基であり、更に好ましくはリシンの残基である。
なお、Ａ3として、他のアミノ酸残基を有していてもよい。Ａ3としては、任意のアミノ酸が用いられる。
ｎは、０〜３の整数であり、好ましくは０である。
【００１２】
Ｒ1は、標的分子認識素子又はその連結基と結合可能な官能基を有する基、又は、Ａ2の側鎖のアミノ基若しくはカルボキシ基の水素原子であり、Ａ2の側鎖のアミノ基又はカルボキシ基と結合する。ただし、Ｒ1は、環構成原子の一つとしてＡ2の側鎖のアミノ基の窒素原子を含む炭素数３〜１０の複素環基を形成していてもよい。
Ｒ1は、スペーサーとして機能し、官能基を介してポリペプチド等の標的分子認識素子を本発明の化合物に結合することができる。Ｒ1は、Ａ2の側鎖のアミノ基又はカルボキシ基と結合することで、アミノ酸配列末端を化学修飾せず、本発明の化合物とポリペプチドとを結合することができる。
Ｒ1は、側鎖のアミノ基の窒素原子と結合していてもよいし、側鎖のカルボキシ基とエステル結合を形成していてもよい。
Ｒ1の標的分子認識素子又はその連結基と結合可能な官能基は、特に限定されないが、例えば、カルボキシ基又はその活性エステル；マレイミド基、アクリロイル基等のC=C結合を有する基；カルバモイル基、イソチオシアナート基、及びアミノ基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基（以下「官能基ａ」ともいう）が挙げられる。カルボキシ基の活性エステルとしては、クロロアセチル基、ブロモアセチル基、ヨードアセチル基等が挙げられる。これらの中でも、官能基ａは、C=C結合を有する基、カルバモイル基が好ましい。
Ｒ1の総炭素数は、特に限定されないが例えば、好ましくは１以上、より好ましくは２以上、更に好ましくは３以上であり、そして、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下、更に好ましくは８以下である。
Ｒ1としては、例えば、官能基ａを有する総炭素数２〜２０のアシル基、官能基ａを有する総炭素数２〜２０のアルキル基、官能基ａを有する総炭素数２〜２０のアルキルカルバモイル基、官能基ａを有する総炭素数２〜２０のアルキルチオカルバモイル基が挙げられる。
Ｒ1が複素環基を形成する場合、複素環基はマレイミド基が好ましい。
Ｒ1が複素環基を形成する場合、複素環基の炭素数は、好ましくは３〜１０、より好ましくは３〜５、更に好ましくは４又は５である。
Ｒ1は、Ａ2の側鎖のアミノ基若しくはカルボキシ基の水素原子であってもよい。つまり、Ａ2のアミノ基若しくはカルボキシ基は、修飾されていなくてもよい。
Ｒ1の中でも、環構成原子の一つとしてＡ2の側鎖のアミノ基の窒素原子を含む炭素数３〜１０の複素環基が好ましく、環構成原子の一つとしてＡ2の側鎖のアミノ基の窒素原子を含むマレイミド基がより好ましい。
【００１３】
Ｒ2は、それぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜８の炭化水素基である。
Ｒ2の炭化水素基は、特に限定されないが、保護基として用いられる炭化水素基が好ましく、例えば、メチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基等が挙げられる。
これらのＲ2の中でも、水素原子が好ましい。
【００１４】
以上の本発明の化合物（１）の中でも、下記式（１ａ）で表される化合物が好ましい。
【化４】
2017150549.tif 000006
〔式中、Ｒ2は、それぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜８の炭化水素基であり、Ｒ3は、水素原子又はメチル基、Ｒ４，Ｒ5は、それぞれ独立に、水素原子、又は、官能基ａを有する総炭素数２〜２０のアシル基、官能基ａを有する総炭素数２〜２０のアルキル基、官能基ａを有する総炭素数２〜２０のアルキルカルバモイル基、若しくは官能基ａを有する総炭素数２〜２０のアルキルチオカルバモイル基である。ただし、Ｒ４及びＲ5は、隣接する窒素原子を含む複素環を形成していてもよく、その場合、式：
【化５】
2017150549.tif 000007
で表される基は、式：
【化６】
2017150549.tif 000008
で表される基である。〕
Ｒ４，Ｒ5は、好ましくは官能基ａを有する、総炭素数２〜２０のアシル基であり、より好ましくはカルバモイル基を有する総炭素数３〜６のアシル基である。カルバモイル基を有する総炭素数３〜６のアシル基としては、例えば、式：―Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ2）ａ（＝Ｏ）ＮＨ２〔式中、ａは１〜４の整数である。〕で表される基が挙げられる。
【００１５】
上記本発明の化合物（１）の好ましい具体例として、下記の化合物１−１〜化合物１−４が挙げられる。
【００１６】
【化７】
2017150549.tif 000009
【００１７】
【化８】
2017150549.tif 000010
【００１８】
【化９】
2017150549.tif 000011
【００１９】
【化１０】
2017150549.tif 000012
【００２０】
本発明の化合物（１）等は、上記化合物の薬理学的に許容される塩であってもよい。
薬理学的に許容される塩としては、例えば、酸付加塩、塩基付加塩が挙げられる。
酸付加塩としては、無機酸塩、有機酸塩のいずれであってもよい。
無機酸塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等が挙げられる。
有機酸塩としては、例えば、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等が挙げられる。
塩基付加塩としては、無機塩基塩、有機塩基塩のいずれであってもよい。
無機塩基塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
有機塩基塩としては、例えば、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩等が挙げられる。
【００２１】
＜化合物（２）等＞
本発明の化合物（２）等は、化合物（１）、又はその薬理学的に許容可能な塩に、標的分子認識素子を結合させてなる化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩である。標的分子認識素子は、化合物（１）、又はその薬理学的に許容可能な塩に、連結基を介して結合していてもよいし、直接結合していてもよい。連結基としては、2-イミノチオランから誘導されるイミノチオールが挙げられる。
【００２２】
〔標的分子認識素子〕
「標的分子認識素子」とは、生体内において、標的分子に結合する等の標的分子を認識可能な分子、置換基、官能基又は原子団である。
標的分子認識素子としては、例えば、ポリペプチド、その他、標的分子に結合するリガンドが挙げられる。
ポリペプチドは、通常、標的分子に結合するポリペプチドであり、好ましくは標的分子に特異的に結合するポリペプチドである。特異的に結合するとは、標的分子に結合するが、標的分子以外の分子には結合しないか、弱い結合であることをいう。
標的分子とは、放射性標識薬剤による診断の対象となる標的部位、例えば、組織や細胞に存在する分子、好ましくは特異的に発現する分子をいう。「特異的に発現する」とは、標的部位に発現するが、標的部位以外の部位には発現しないか、低い発現であることをいう。
【００２３】
標的分子認識素子としては、例えば、炎症や腫瘍細胞浸潤等に伴う組織構築において高い発現が認められるタンパク質や腫瘍細胞に特異的に発現するタンパク質に結合するリガンド、並びに、抗体及び抗体の抗原結合領域断片等が挙げられる。
【００２４】
抗体としては、例えば、抗CD25抗体、抗CD20抗体等のモノクローナル抗体が挙げられる。
抗体の抗原結合領域断片としては、例えば、Fab断片（以下単に「Fab」ともいう）、F(ab')2断片、F(ab)2断片、可変領域断片（以下、「Fv断片」ともいう）が挙げられる。
Fab断片とは、抗体のパパイン分解により生ずるN末端側の産物及びこれと同様のドメイン構造を有する断片を意味する。
F(ab')2断片とは、抗体のF(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を還元することにより得られる断片及びこれと同様のドメイン構造を有する断片を意味する。
F(ab)2断片とは、2分子のFab断片が互いにジスルフィド結合で結合した二量体を意味する。
Fv断片とは、抗体の断片であって抗原との結合活性を有する最小の断片を意味する。
抗体の抗原結合領域断片としては、より具体的には、特定のがん細胞に特異的に発現するタンパク質に対する抗体、及び、そのFab断片若しくはFv断片が挙げられる。
【００２５】
その他の標的分子認識素子としては、がんの新生血管に高発現が認められるインテグリンに親和性を有する環状ペンタペプチド、例えばシクロ-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys（以下、「c(RGDfK)」ともいう）が挙げられる。その他、造骨性のがん（骨転移）に多く存在するヒドロキシアパタイトへの親和性を有するビスフォスフォン酸やオリゴアスパラギン酸、オリゴグルタミン酸、マクロファージの表面に存在する走査因子の受容体と親和性があるペプチドであるfMet-Leu-Phe（fMLP）、がん細胞に発現が認められる葉酸受容体と結合する葉酸とその誘導体等が挙げられる。
なお、標的分子認識素子は、これら例示されたポリペプチドに限定されず、標的分子に結合するポリペプチドであればいずれを使用することもできる。
【００２６】
標的分子認識素子は、例えば、2-イミノチオラン等のチオール化試薬を用いて、化合物の官能基と反応する連結基を導入して結合させてもよい。Fab断片への当該連結基の導入は、上記チオール化試薬をpH7-9の条件で反応させることによって、Fab断面のアミノ基に対してするスルフヒドリル基を付加させることができる。
【００２７】
標的分子認識素子としては、例えば、Asn-urea-Lys 部位又はGlu-urea-Lys 部位を有するリガンドを用いてもよい。当該リガンドによれば、前立腺がんにおいて発現が著しく上昇する前立腺特異的膜抗原（prostate specific membrane antigen）のレセプターに選択的に結合する。
Asn-urea-Lys 部位とは、式：
【化１１】
2017150549.tif 000013
〔式中、＊は結合部位である。〕で表される部位である。
Glu-urea-Lys 部位とは、式：
【化１２】
2017150549.tif 000014
〔式中、＊は結合部位である。〕で表される部位である。
【００２８】
本発明の化合物（２）等を使用して、当該化合物を含む放射性標識薬剤の調製用薬剤を提供できる。
放射性標識薬剤の調製用薬剤は、当該化合物の他に、水性緩衝液などのｐＨ調節剤、アスコルビン酸、p-アミノ安息香酸等の安定化剤等を含んでいてもよい。
【００２９】
本発明の化合物（２）としては、例えば、以下の式（２）で表される化合物が挙げられる。
【００３０】
【化１３】
2017150549.tif 000015
〔式中、Ａ1，m，Ａ2，Ａ3，n，Ｒ1，Ｒ2は式（１）と同様であり、
Ｌ1は、Ｒ1とＰ1を連結する連結基であり、
ｐは０又は１であり、
Ｐ1は、標的分子認識素子である。〕
Ｌ1は、Ｒ1の連結基と連結可能な官能基により結合を形成し、標的分子認識素子とも結合を形成する。Ｌ1は、好ましくは、2-イミノチオランから誘導されるイミノチオール等である。
ｐは、好ましくは１である。
P1は、例えば、上述の標的分子認識素子であり、好ましくはポリペプチド、又はその他、標的分子に結合するリガンドである。
【００３１】
＜金属錯体化合物（３）等＞
本発明の金属錯体化合物、又はその薬理学的に許容可能な塩（以下「金属錯体化合物（３）等」ともいう）は、放射性金属及び放射性原子標識金属から選ばれる１種の金属と、前記金属に配位した本発明の化合物又はその薬理的に許容可能な塩と、を有する。
【００３２】
本発明の金属錯体化合物（３）等を含む、放射性標識薬剤は、金属錯体化合物（３）等の他に未反応物や不純物を含んでいてもよいし、製造後に高速液体クロマトグラフィ（HPLC）法等により精製された金属錯体化合物（３）等を含むものであってもよい。
【００３３】
用語「錯体」とは、金属及び金属類似元素の原子又はイオンを中心にして、配位子が配位した物質を意味し、配位化合物ともいう。配位とは、配位子が中心の金属と配位結合を形成して中心金属の周囲に配列することをいう。錯体は、配位子と金属との配位結合により形成される。配位子と金属による錯体の形成を、錯形成と称することがある。配位結合とは、1本の結合にあずかる2個の原子価電子が、一方の原子のみから提供されている結合をいう。
【００３４】
〔金属〕
金属としては、例えば、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、18F-Al等が挙げられる。
18F-Alは、18Fで標識されたAlであり、例えば、[Bioconjugate Chem., 2014, 25, 2038- 2045]に記載された方法で、化合物（２）等に導入することができる。
金属は、好ましくは67Ga、68Ga、18F-Al、64Cu及び67Cuからなる群から選ばれる少なくとも１種であり、より好ましくは67Ga、68Ga、及び18F-Alからなる群から選ばれる少なくとも１種であり、更に好ましくは67Ga、及び68Gaからなる群から選ばれる少なくとも１種である。
【００３５】
金属は、これら具体例に限定されず、放射性標識薬剤を用いた診断等の目的に適当な放射線、放射線量、半減期を有する限りにおいていずれも使用することができる。放射線画像診断において正常な組織や細胞への影響を少なくするという観点から、短半減期金属放射性同位体が好ましく使用される。
【００３６】
金属錯体化合物（３）等の製造は、標的分子認識素子と結合させた上記化合物を配位子として用い、金属放射性同位体とインビトロで錯形成させることにより実施できる。錯形成は、従来知られている錯形成反応を利用する簡便な操作で実施できる。
【００３７】
本発明の金属錯体化合物（３）等は、
好ましくは、放射性金属及び放射性原子標識金属から選ばれる１種の金属と、前記金属に配位した、式（１）で表される化合物等に標的分子認識素子を結合させてなる化合物とを有する金属錯体化合物等であり、
より好ましくは、67Ga、68Ga、18F-Al、64Cu及び67Cuからなる群から選ばれる１種の金属と、前記金属に配位した、式（１）で表される化合物等に標的分子認識素子を結合させてなる化合物とを有する金属錯体化合物等であり、
更に好ましくは、67Ga、68Ga、18F-Al、64Cu及び67Cuからなる群から選ばれる１種の金属と、前記金属に配位した、式（１ａ）で表される化合物等に標的分子認識素子を結合させてなる化合物とを有する金属錯体化合物等であり、
更に好ましくは、67Ga、68Ga、18F-Al、64Cu及び67Cuからなる群から選ばれる１種の金属と、前記金属に配位した、式（１ａ）で表される化合物等にタンパク又はその他、標的分子に結合するリガンドを結合させてなる化合物とを有する金属錯体化合物等である。
なお、上記化合物は、金属が、67Ga、及び68Gaからなる群から選ばれる１種であることが好ましい。
【００３８】
本発明の金属錯体化合物（３）としては、例えば、以下の式（３−１）又は式（３−２）で表される金属錯体化合物が挙げられる。
【００３９】
【化１４】
2017150549.tif 000016
〔式中、Ａ1，m，Ａ2，Ａ3，n，Ｒ1は、式（１）と同様であり、
Mは、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、又は18F-Alである。〕
【００４０】
【化１５】
2017150549.tif 000017
〔式中、Ａ1，m，Ａ2，Ａ3，n，Ｒ1は、式（１）と同様であり、
Ｌ1，p，Ｐ1は、式（２）と同様であり、
Mは、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、又は18F-Alである。〕
【００４１】
本発明の放射性標識薬剤は、上記放射性標識ポリペプチドを有効成分として含むほか、必要に応じて、1種類又は2種類以上の医薬的に許容される担体（医薬用担体）を含む医薬組成物として調製できる。医薬用担体として、水性緩衝液、酸、及び塩基などのpH調節剤、アスコルビン酸やp-アミノ安息香酸などの安定化剤、D-マンニトールなどの賦形剤、等張化剤、並びに保存剤などを例示できる。また、放射化学的純度を改良するのに役立つクエン酸、酒石酸、マロン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコヘプトン酸ナトリウムなどの化合物を添加してもよい。本発明の放射性標識薬剤は、水溶液の形態、凍結溶液の形態、及び凍結乾燥品のいずれでも提供が可能である。
【００４２】
本発明のキットは、上記化合物と、上記金属を含む薬剤とを、別々の包装単位として含む。
本発明のキットは、例えば、化合物（１）等と、標的分子認識素子を含む薬剤と、放射性金属及び放射性原子標識金属から選ばれる１種の金属を含む薬剤とを、別々の包装単位として含むキット；化合物（１）等に標的分子認識素子を結合させてなる化合物（２）と、放射性金属及び放射性原子標識金属から選ばれる１種の金属を含む薬剤とを、別々の包装単位として含むキットが挙げられる。
キットに含まれる化合物及び薬剤はいずれも、必要に応じて、上記のような1種類又は2種類以上の医薬的に許容される担体（医薬用担体）を含むことができる。
【００４３】
［製造方法］
本発明の化合物（１）等、及び、当該化合物（１）等に標的分子認識素子を結合させてなる化合物（２）等は、公知の方法を用いて合成することができ、例えば、本明細書の実施例に記載された方法により製造することができる。
本発明の金属錯体化合物（３）等は、化合物（２）等を配位子として用い、金属放射性同位体とインビトロで錯形成させることにより、製造することができる。錯形成は、公知の方法を用いて行うことができる。
【００４４】
［用法容量］
本発明の金属錯体化合物等は、例えば、放射線画像診断に用いられる放射性標識薬剤として使用される。
放射線画像診断としては、例えば、単一光子放射断層撮影（Single Photon Emission Computed Tomography, 以下単に「SPECT」ともいう）、陽電子放射断層撮影（Positron Emission Tomography, 以下単に「PET」ともいう）等が挙げられる。
診断としては、特に限定されず、腫瘍、炎症、感染症、心循環器疾患、脳・中枢系疾患等の各種疾患及び臓器・組織の放射線画像診断等に用いられ、好ましくは、がんの放射線画像診断に使用される。
診断の対象となる標的の特性にしたがって、標的分子認識素子を選択することにより、多種類多様な標的の診断や治療が可能であり、本発明の放射性標識薬剤は診断の分野で広く使用できる。
【００４５】
本発明の放射性標識薬剤の投与経路としては、例えば、静脈内投与若しくは動脈内投与などの非経口投与、経口投与が挙げられ、静脈内投与が好ましい。
投与経路はこれら経路に限定されず、放射性標識薬剤の投与後に、その作用が有効に発現し得る経路であればいずれも利用できる。
【００４６】
本発明の放射性標識薬剤の放射活性強度は、本薬剤を投与することにより目的を達成し得る強度であり、且つ、被験者の放射線被爆が可能な限り低い臨床投与量である限りにおいて任意である。
放射性強度は、放射性標識薬剤を使用する一般的な診断方法や治療方法で使用されている放射活性強度を参考にして決定できる。その投与量は患者の年齢、体重、適当な放射線イメージング装置、及び対象疾患の状態等の諸条件を考慮し、イメージングが可能と考えられる放射能及び投与量が決定される。
【００４７】
ヒトを対象とする場合、各種金属における放射能量は、以下のとおりである。
67Gaを用いた場合、通常、SPECTに使用されることが想定され、その診断薬剤の投与量は、特に限定されないが、例えば、67Gaの放射能量として1.1MBq/kg〜1.5MBq/kgである。
68Gaを用いた場合、通常、PETに使用されることが想定され、診断薬剤の投与量は、68Gaの放射能量として1.5MBq/kg〜3MBq/kgである。
18F-Alを用いた場合、通常、PETに使用されることが想定され、診断薬剤の投与量は、18Fの放射能量として1.5MBq〜4MBqである。
64Cuを用いた場合、通常、PET及び放射線治療に使用されることが想定され、診断薬剤の投与量は、64Cuの放射能量として1.5MBq/kg〜4MBq/kgであり、放射線治療の放射能量として0.93GBq/m2〜2.22GBq/m2である。
67Cuを用いた場合、通常、放射線治療に使用されることが想定され、診断薬剤の投与量は、67Cuの放射能量として0.93GBq/m2〜2.22GBq/m2である。
【００４８】
以上、本発明によれば、腎臓への集積を投与早期から低減できる放射性標識薬剤が得られる化合物が提供できる。このように本発明の放射性標識薬剤は、従来に比べて、鮮明な画像を与え、精度の高い放射線画像診断を可能とする。
【実施例】
【００４９】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。なお、以下の実験は、千葉大学の動物倫理委員会によって承認された後に実施された。【００５０】
下記実施例及び比較例で、置換基、化合物、及び有機溶媒について、下記の略号を使用した。
Fmoc：フルオレニルメトキシカルボニル基
Boc：tert-ブトキシカルボニル基
Trt(2-Cl)：２-クロロトリチル基
p-SCN-Bn-NOTA：2-S-(4-イソチオシアナトベンジル)-1,4,7-トリアザシクロノナン-1,4,7-トリ酢酸
Cl-Trt(2-Cl)Resin：２‐クロロトリチルクロライドレジン（2-Chlorotrityl chloride resin）
Fmoc-Lys(Dde)-OH：N-α-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-N-ε-[1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル]-L-リシン
Fmoc-Lys-OH・HCl：N-α-(9-フルオレニルメトキシカルボニル) -L-リシン塩酸塩
TFA：トリフルオロ酢酸
MeCN：アセトニトリル
DIPEA：N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DMF：ジメチルホルムアミド
DIC：N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド
HOBt：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
NMCM：N-メトキシカルボニルマレイミド
EDTA：エチレンジアミン四酢酸
DPS：2,2'-ジピリジルジスルフィド
EtOH：エタノール
FBS：ウシ胎児血清
D-PBS：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液
EGTA：グリコールエーテルジアミン四酢酸
MGTA：DL-2-メルカプトメチル-3-グアニジノエチルチオプロパン酸【００５１】
［測定方法、実験動物］
下記実施例及び比較例において、各種物性等の測定方法は下記の方法で行った。【００５２】
〔NMR（核磁気共鳴）〕
1H-NMRによる分析はJEOL ECS - 400 spectrometer (日本電子株式会社)を使用した。
〔ESI-MS（エレクトロスプレーイオン化質量分析）〕
ESI-MSによる分析はHPLC1200 series-6130 quadrupole LC/MS mass spectrometer (アジレント・テクノロジー株式会社)を使用した。【００５３】
〔薄層クロマトグラフィ(TLC)〕
薄層クロマトグラフィ(TLC)による分析にはシリカプレート (TLC aluminium sheets Silica gel 60 RP-18 F254s, メルク株式会社)を使用し、0.1 M 酢酸アンモニウム水溶液:メタノール= 1 : 1の展開溶媒で10 cm展開したものを5 mmずつ切断し、オートウェルガンマシステム(WIZARD3, パーキンエルマー社)によりそれぞれの画分の放射活性を測定した。【００５４】
〔セルロースアセテート膜電気泳動(CAE)〕
セルロースアセテート膜電気泳動(以下「CAE」ともいう)では泳動膜に11 cm x 1 cmの大きさに切ったセルロースアセテート膜(ADVANTEC SELECA-V, 東洋濾紙株式会社), 緩衝液に(veronal buffer, pH 8.6, I=0.06)又はsolvent 2 (20 mM P.B. (pH 6.0))を用いて、一定電流(1 mA/cm)にて泳動した。泳動後のセルロースアセテート膜を5 mmずつ切断し、オートウェルガンマシステムによりそれぞれの画分の放射活性を測定した。【００５５】
〔逆相高速液体クロマトグラフィ(RP-HPLC)及び分子ふるい高速液体クロマトグラフィ(SE-HPLC)〕
（分析）
逆相高速液体クロマトグラフィ(以下「RP-HPLC」ともいう)による分析はUV検出器としてL-7405 (株式会社日立製作所)、送液ポンプとしてL-7100(株式会社日立製作所)、分析用カラムとしてCosmosil 5C18-AR-300 column (4.6 x 150 mm，ナカライテスク株式会社)を使用した。
移動相には0.1% (v/v) TFA/H2O (A相)と0.1% (v/v) TFA/MeCN (B相)を用い、0-20 minまでA相95% (v/v)、B相5%(v/v)からA相70%(v/v)、B相30%(v/v)まで変化させ、20-40 minでA相70%(v/v)、B相30%(v/v)からA相0%(v/v)、B相100%(v/v)まで変化させる直線グラジエント法により流速1.0 mL/minで溶出した。【００５６】
（分取）
RP-HPLCによる分取にはガードカラムCadenza 5CD-C18 guard column (10 x 8 mm，インタクト株式会社)を連結したCadenza 5CD-C18 column (20 x 150 mm，インタクト株式会社)を使用した。
移動相には0.1%(v/v) TFA/H2O (A相)と0.1%(v/v) TFA/MeCN (B相)を用い、0-30 minまでA相90%(v/v)、B相10%(v/v)からA相20%(v/v)、B相80%(v/v)まで変化させ、30-40 minでA相20%(v/v)、B相80%(v/v)からA相0%(v/v)、B相100%(v/v)まで変化させる直線グラジエント法により流速5.0 mL/minで溶出した。【００５７】
分子ふるいHPLC (以下「SE-HPLC」ともいう)による分析はCosmosil 5 Diol-300II (7.5×600 mm, ナカライテスク株式会社)にCosmosil 5 Diol-300II ガードカラム (7.5×50mm, ナカライテスク株式会社) を接続し、移動相に0.1 M リン酸緩衝液 (pH 6.8) を使用して流速1.0 mL/minで溶出した。【００５８】
溶出液はRP-HPLCでは254 nm、SE-HPLCでは280 nmの吸光度を計測し、67Ga標識化合物の分析にはγ線検出器 Gabi star (Raytest社) をオンラインで接続、もしくは溶出液をフラクションコレクター (Frac-920, GEヘルスケア・ジャパン株式会社) により0.5分間隔で分取後、オートウェルガンマシステムにより放射活性を測定することで分析した。【００５９】
〔実験動物〕
動物実験は、雄性のddY系SPFマウス6週齢 及び雄性のBALB/c-nu/nuマウス(日本エスエルシー株式会社)を使用した。【００６０】
［配位子の合成］
合成例1：化合物R1(NOTA-Bn-Met-OH)の合成
p-SCN-Bn-NOTA (10 mg, 0.022 mmol)を最終濃度が10〜100 mg/mlとなるように0.1 M ホウ酸緩衝pH 9.0に溶解し、0.1N NaOH水溶液でpH8〜9に調整後、L-メチオニン(4.97 mg, 0.33 mmol)を加え、室温で２時間反応した。分取用RP-HPLCにより精製し、化合物R1 2.5 mg (4.2 μmol, 収率19%)を白色個体として得た。
化合物R1：ESI-MS m/z [M + H]+ 600, Found 600.【００６１】
実施例１：NOTA-MVK(Mal) の合成
NOTA-MVK(Mal)の合成は、以下のスキームにより、合成した。【００６２】
【化１６】
2017150549.tif 000018
【００６３】
（合成例2(a)：中間体1-1 (H-Lys(Dde)-Trt(2-Cl)Resin)の合成）
Cl-Trt(2-Cl)Resin (195 mg, 0.313 mmol、渡辺化学工業株式会社)、Fmoc-Lys(Dde)-OH (250 mg, 0.469 mmol)及びDIPEA ( 327 μL, 1.876 mmol)をジクロロメタン (2 mL)中1.5時間反応させた。メタノール (1 mL)及びDIPEA (327 μL, 1.876 mmol)を加えて反応を停止した。樹脂をDMF、次いでジクロロメタンで洗浄した。次いで20%(v/v) ピペリジン/DMF (3 mL)を加え、20分間室温で撹拌することで、中間体1-1を作製した。
樹脂の一部を採取してカイザーテスト[Analytical Biochemistry, 1970, 34,  595-598]を行い、Nα-Fmoc基の脱保護を確認した。樹脂をDMF及びジクロロメタンで洗浄し、乾燥させた後、ピペリジン処理の際に生成するN-(9-フルオレニルメチル)ピペリジンのA301における吸光度を測定することによりFmoc-Lys(Dde)-OHの樹脂への導入量を定量した(0.280 mmol, 収率89.5%) [Journal of Organic Chemistry, 2004, 69, 4586-4594]。【００６４】
（合成例2(b)：中間体1-2 (H-Val-Lys(Dde)-Trt(2-Cl)Resin)の合成）
中間体1-1 (0.280 mmol)に、Fmoc固相合成法により2.5等量のFmoc-Val-OH (237 mg, 0.783 mmol)、DIC (108 μL, 0.783 mmol)、HOBt (107 mg、0.783 mmol)をDMF (3 mL)中、室温で2時間撹拌した。樹脂の一部を採取してカイザーテストを行うことで、縮合反応の終了を確認した後、DMFで樹脂を洗浄した。次いで、20%(v/v) ピペリジン/DMF (3mL)を加え、20分間室温で撹拌し、中間体1-2を作製した。樹脂の一部を採取してカイザーテストを行い、Nα-Fmoc基の脱保護を確認した。【００６５】
（合成例2(c)：中間体1-3 (Boc-Met-Val-Lys(Dde)-Trt(2-Cl)Resin)の合成）
中間体1-2 (0.280 mmol)に、Fmoc固相合成法により2.5等量のBoc-Met-OH (249 mg, 0.783 mmol)、DIC (108 μL, 0.783 mmol)、HOBt (107 mg、0.783 mmol)をDMF (3 mL)中、室温で2時間撹拌し、中間体1-3を作製した。樹脂の一部を採取してカイザーテストを行うことで、縮合反応の終了を確認した後、DMF及びジクロロメタンで樹脂を洗浄した。【００６６】
（合成例2(d)：中間体1-4 (Boc-Met-Val-Lys(H)-Trt(2-Cl)Resin)の合成）
中間体1-3 (0.280 mmol)を 2%(v/v) ヒドラジン/DMF (3 mL)中室温で１時間攪拌した後、樹脂をDMF及びジクロロメタンで洗浄した後、減圧乾燥することで、中間体1-4を作製した。【００６７】
（合成例2(e)：中間体1-5 (Boc-Met-Val-Lys(H)-OH)の合成）
中間体1-4 (0.280 mmol)を酢酸 : 2,2,2-トリフルオロエタノール: ジクロロメタン= 3 : 1 : 6 (2 mL, 容量比)の混液中室温で2時間攪拌した。樹脂をろ去した後、ろ液を減圧留去して得られた残渣にジエチルエーテル(3 mL)を加えることで結晶化させた。結晶をろ取し、ジエチルエーテルで洗浄した後、減圧乾燥することで中間体1-5 84 mg (0.177 mmol, 収率63%)を白色固体として得た。
中間体1-5 ：1H-NMR (CD3OD) : δ 0.97 - 0.99 [6H, m, CH3] 1.44 [9H, s, OtBu]1.65 - 2.11[12H, m, CH2,CH, SCH3] 2.48 - 2.56 [2H, m, CH2NH2] 2.88 - 2.93 [2H, t, SCH2] 4.15 - 4.87[3H, m, CHCO]; ESI-MS m/z [M + H]+ 477, Found 477.【００６８】
（合成例2(f)：中間体1-6 (Boc-Met-Val-Lys(Mal)-OH)の合成）
中間体1-5 (6.60 mg, 13.9 μmol)を氷冷下でsat. NaHCO3 aq. (100 μL)に溶解し、NMCM (3.22 mg, 20.8 μmol)を加えた。氷冷下2時間攪拌した後、5%(wt/wt) クエン酸溶液を加え中和した。クロロホルム (5 mL x 3)で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を減圧蒸留することで、中間体1-6  7.26 mg(13.1 μmol, 収率94.1%)を白色固体として得た。
中間体1-6：1H-NMR (CDCl3) : δ 0.90 - 0.95 [6H, m, CH3] 1.32 - 1.44 [2H, m, CH2] 1.44 [9H, s, Boc] 1.48 - 1.70 [2H, m, CH2CH2-maleimide] 1.70 - 1.92 [1H, m, CH] 1.92 - 2.10 [2H, m, CH2CHCO] 2.10 - 2.28 [5H, m, CH2CH2SCH3, SCH3] 2.54 [2H, t, SCH2] 3.48 - 3.53 [2H, m, CH2-maleimide] 4.05 - 4.44 [3H, m, CHCO] 6.72 [2H, s, maleimide]; ESI-MS m/z [M + H]+ 557, Found 557【００６９】
（合成例2(g)：中間体1-7 (H-Met-Val-Lys(Mal)-OH)の合成）
中間体1-6 (7.26 mg, 13.1 μmol)を4 N HCl/酢酸エチルに溶解し、室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、ヘキサンで共沸することで、中間体1-7の塩酸塩5.92 mg (12.1 μmol, 収率92.4%)を白色固体として得た。
中間体1-7：ESI-MS m/z [M + H]+ 457, Found 457. 【００７０】
（合成例2(h)：化合物1-1 (NOTA-Met-Val-Lys(Mal)-OH)の合成）
中間体1-7の塩酸塩 (5 mg, 10.2 μmol)を乾燥DMF(100 μL)に溶解し、トリエチルアミン(6 μL)を加えた。p-SCN-Bn-NOTA (7.4 mg, 16.4 μmol)を加え、室温で２時間攪拌した後、H2Oで10倍に希釈し、分取用RP-HPLCにより精製し、化合物1-1(以下、「NOTA-MVK(mal)」ともいう)2.8 mg (3.1 μmol, 収率28.2%)を白色固体として得た。
化合物1-1：1H-NMR (D2O) : 0.90 - 0.95 [6H, m, CH3] 1.28 - 1.30 [2H, m, CH2] 1.52 - 1.56 [2H, m, CH2CH2-maleimide] 1.75 - 1.86 [2H, m, CH2CHCO], 2.04 - 2.10 [6H, m, CH, CH2CH2SCH3, SCH3] 2.50 - 2.57 [2H, m, SCH2] 2.57 - 3.88 [21H, m, CH2-maleimide, CH2, CH, CH2COOH] 4.13 - 4.25 [3H, m, CHCO] 6.78 [ 2H, s, maleimide] 7.26 - 7.34 [4H, m, phenyl]; ESI-MS m/z [M + H]+ 907, Found 907; HRMS m/z [M + H]+ calculated for C40H59N8O12S2 907.36938, observed 907.36338.【００７１】
参考例１：NOTA-MVK(Bzo)の合成
NOTA-MVK(Bzo)の合成は、以下のスキームにより、合成した。【００７２】
【化１７】
2017150549.tif 000019
【００７３】
(合成例3(a): N-(Benzoyloxy)succinimideの合成)
Benzoic acid (1 g, 8.20 mmol)及びN-hydroxysuccinimide (1.04 g, 9.02 mmol)を30 mlの乾燥DMF に溶解し、アルゴン雰囲気下0oC で10 mLの乾燥DMFに溶解したdicyclohexylcarbodiimide (1.86 g, 9.02 mmol)を滴下した。室温に戻し、12時間撹拌後、沈殿を濾去し、溶媒を減圧留去することでN-(Benzoyloxy)succinimideの粗精製物2.06 gを白色固体として得た。この化合物は少量のウレアを含むが、そのまま次の反応に用いた。1H-NMR (CDCl3): δ 2.91 (4H, t, CH2), 8.00-8.24 (5H, m, Ar-H); ESI-MS m/z [M + H]+ 220, Found 220.【００７４】
(合成例3(b):中間体2-1 Fmoc-Lys(Bzo)-OHの合成)
N-(Benzoyloxy)succinimide (27 mg, 0.12 mmol)をdichloromethane(1 mL)に溶解し、milliQ (1 mL)に溶解したFmoc-Lys-OH・HCl (50 mg, 0.12 mmol)及び炭酸水素ナトリウム(20 mg, 0.12 mmol)に滴下後、室温で激しく撹拌した。24時間撹拌後、1 N塩酸で酸性とした後、dichloromethane (5 ml x 3)で抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、hexane: ethyl acetate : acetic acid = 1 : 2 : 0.1を溶出溶媒とするオープンカラムクロマトグラフィーにより精製し、中間体2-1(Fmoc-Lys(Bzo)-OH) 57 mg (0.12 mmol, 49%)を得た。1H-NMR (CDCl3): δ 1.48-1.94 (6H, m, CH2), 3.46 (2H, t, CH2), 3.73-4.40 (4H, m, CH, CH2), 7.23-8.06 (13H, m, Ar-H); ESI-MS m/z [M + H]+ 473, Found 473.【００７５】
(合成例3(c): 中間体2-2  H-Lys(Bzo)-Trt(2-Cl)Resin の合成)
Cl-Trt(2-Cl)Resin (32 mg, 0.052 mmol、渡辺化学工業株式会社)、Fmoc-Lys(Bzo)-OH (37 mg, 0.078 mmol)及びDIPEA (36 μL, 0.209 mmol)をdichloromethane (0.5 mL)中1.5時間反応させた。Methanol (0.2 mL)及びDIPEA (36 μL, 0.209 mmol)を加えて反応を停止した。樹脂をDMF次いでdichloromethaneで洗浄した。次いで20% piperidine/DMF (3mL)を加え、20分間室温で撹拌することで、中間体2-2 (H-Lys(Bzo)-Trt(2-Cl)Resin) を作製した。樹脂の一部を採取してKaiser testを行い、Nα-Fmoc基の脱保護を確認した。樹脂をDMF及びdichloromethaneで洗浄し、乾燥させた後、piperidine処理の際に生成するN-(9-fluorenylmethyl)piperidineのA301における吸光度を測定することによりFmoc-Lys(Bzo)-OHの樹脂への導入量を定量した(0.040 mmol, 76%)。【００７６】
(合成例3(d): 中間体2-3 H-Val-Lys(Bzo)-Trt(2-Cl)Resin の合成)
H-Lys(Bzo)-Trt(2-Cl)Resin (0.026 mmol)に、Fmoc固相合成法により2.5等量のFmoc-Val-OH (22 mg, 0.065 mmol)、N,N’-diisopropylcarbodiimide (DIC, 10 μL, 0.065 mmol)、1-hydroxybenzotriazole (HOBt, 10 mg、0.065 mmol)をDMF (3 mL)中、室温で2時間撹拌した。樹脂の一部を採取してKaiser testを行うことで、縮合反応の終了を確認した後、DMFで樹脂を洗浄した。次いで、20% piperidine/DMF (3mL)を加え、20分間室温で撹拌し、中間体2-3 (H-Val-Lys(Bzo)-Trt(2-Cl)Resin)を作製した。樹脂の一部を採取してKaiser testを行い、Nα-Fmoc基の脱保護を確認した。【００７７】
(合成例3(e): 中間体2-4 H-Met-Val-Lys(Bzo)-Trt(2-Cl)Resinの合成)
H-Val-Lys(Bzo)-Trt(2-Cl)Resin (0.026 mmol)を出発物質として、 Fmoc固相合成法により2.5等量のFmoc-Met-OH (24 mg, 0.065 mmol)、N,N’-diisopropylcarbodiimide (10 μL, 0.065 mmol)、HOBt (9.9 mg、0.065 mmol) をDMF (1 mL) 中、室温で2時間撹拌した。樹脂の一部を採取してKaiser testを行うことで、縮合反応の終了を確認した後、20% piperidine/DMF (3mL)を加え、20分間室温で撹拌し、中間体2-4 (H-Met-Val-Lys(Bzo)-Trt(2-Cl)Resin)を作製した。樹脂の一部を採取してKaiser testを行い、Nα-Fmoc基の脱保護を確認した。【００７８】
(合成例3(f): 中間体2-5 H-Met-Val-Lys(Bzo)-OH の合成)
H-Met-Val-Lys(Bzo)-Trt(2-Cl)Resinをacetic acid : 2,2,2-trifluoroethanol: dichloromethane = 3 : 1 : 6 (2 mL)の混液中室温で2時間攪拌した。樹脂をろ去した後、ろ液を減圧留去して得られた残渣にdiethylether (3 mL)を加えることで結晶化させた。結晶をろ取し、diethyletherで洗浄した後、減圧乾燥することで中間体2-4 (H-MetValLys(Bzo)-OH)の酢酸塩(9.7mg, 69.0%)を白色結晶として得た。1H-NMR (D2O):  δ 0.90-0.92 (6H, m, CH3), 1.37-1.88 (6H, m, CH2), 1.97-2.06 (6H, m, SCH3, COCHCH, SCH2CH2), 2.44-2.49 (2H, m, SCH2), 3.30-3.38 (2H, m, NHCH2), 4.04-4.17 (3H, m, COCH), 7.48-7.73 (5H, m, Ar-H); ESI-MS m/z [M + H]+ 481, Found 481; m.p.: 179-180oC.【００７９】
(合成例3(g): NOTA-MVK(Bzo)の合成)
p-SCN-Bn-NOTA (5.6 mg, 12.5 μmol)を最終濃度が10~100 mg/mlとなるように0.1 M ホウ酸緩衝pH 9.0に溶解し、0.1 N 水酸化ナトリウム水溶液でpH 8~9に調整後、H-MetValLys(Bzo)-OH (4.0 mg, 8.3 μmol)を加え、室温で２時間反応した。分取用RP-HPLCにより精製し、下記式に示すNOTA-MVK(Bzo) 2.5 mg (2.69 μmol, 32.4%)を白色個体として得た。1H-NMR (DMSO-d6): δ 0.85-0.90 (6H, m, CH3), 1.23-1.68 (6H, m, CH2), 1.98-2.10 (6H, m SCH3, COCHCH, SCH2CH2), 2.41-4.28 (26H, m, CH2, CH, SCH2, COCH), 7.43-8.16 (9H, m, Ar-H); ESI-MS m/z [M + H]+ 931, Found 931; HRMS m/z [M + H]+ calculated for C43H63N8O11S2 931.40577, observed 931.41015; m.p.: 146-148oC. 
【化１８】
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【００８０】
参考例２：NOTA-MIK(Bzo) の合成
合成例2(b)のFmoc-Val-OHをFmoc-Ile-OHに代えた以外は参考例１と同様にして、下記に示すNOTA−MIK(Bzo)を合成した。
【化１９】
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【００８１】
[二官能性キレート試薬結合Fabの作製]
（合成例4-1: Fabの作製）
C-kit (9 mg、12A8、免疫生物研究所)を 10 mM Na2EDTA及び20 mM システインを含む20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0、1.5 mL)に溶解し、Immobilized papain 50% slurry (サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社) 500 μLを加え、37°Cで42 時間インキュベートした。反応終了後、10 mMトリス塩酸バッファー(Tris-HCl) (pH 7.5)を2 mL加え、0.45 μmのフィルターでろ過し、ろ液を回収した。ろ液を10 kDaの限外ろ過膜を用いて20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)に置換し、1 mLに濃縮した。その後、Protein Aカラムを用いて精製を行い、Fabを得た。得られたFabは、0.1 M リン酸緩衝液(pH 6.8)を溶出溶媒とした流速1.0 mL/minで溶出するSE-HPLCにより生成を確認し、A280を測定することで濃度を算出した。【００８２】
（合成例4-2: IT-Fabの作製）
十分脱気した2 mM EDTA含有 0.16 M ホウ酸緩衝液 (pH 8.0)を用いてFab溶液(200 μL, 2.0 mg/mL)を調製し、同じ緩衝液に溶解した2-イミノチオラン(2-IT) (7.5 μL, 2.0 mg/mL)を加え、37oCで30分間反応した。反応後、十分脱気した2 mM EDTA 含有 0.1 M リン酸緩衝液 (pH 6.0)で平衡化したSephadex G-50 Fineを用いるスピンカラム法[Analytical Biochemistry,  1984, 142, 68-78]により反応溶液中の過剰の 2-ITを除去した。Fab一分子あたりに導入されたチオール基の数は、2,2'-ジピリジルジスルフィド (DPS)を用いて測定した[Archives of Biochemistry and Biophysics, 1967, 119, 41-49]。【００８３】
[Fab結合がした配位子の作製]
実施例２：NOTA-MVK-Fabの作製
2-ITによりチオール化したFab 溶液(100 μL)にDMFに溶解したNOTA-MVK(mal) (50 mg/mL)を1.25 μL 加え、37oCで1時間反応した。次いで0.1 M リン酸緩衝液(pH 6.0)を用いてヨードアセトアミド溶液(10 mg/mL)を調製し、これを12.5 μL 加えた後、37oCで1時間反応を行い、未反応のチオール基をアルキル化した。その後、0.25 M 酢酸緩 衝液(pH 5.5) で平衡化したSephadex G-50 Fineを用いるスピンカラム法で精製し、下記化合物2-1（以下、「NOTA-MVK-Fab」ともいう）を得た。Fab一分子あたりに導入されたNOTA-MVK(mal)由来の単位数は、ヨードアセトアミドを加える前にDPSを用いて測定した[Archives of Biochemistry and Biophysics, 1967, 119, 41-49]チオール数を先に求めたチオール数を差し引くことにより求めた。
【化２０】
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【００８４】
比較例１：NOTA-MI-Fabの作製
NOTA-MVK(mal)を下記NOTA-MI(mal) ([Bioconjugate Chem. 2014, 25, 2038-2045]に記載の方法に従い合成したもの)に変更した以外は、実施例１と同様の方法で、NOTA-MI-Fabを作成した。【００８５】
【化２１】
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【００８６】
比較例２：NOTA-SCN-Fabの作製
0.1 Mホウ酸緩衝液(pH 9.0)を用いてFab溶液(100 μL, 5.0 mg/mL) を調製し、0.1M ホウ酸緩衝液(pH 9.0)に溶解したp-SCN-Bn-NOTA (5.0 mg/mL)を2.25 μL加え、室温で12時間撹拌した。反応後、十分脱気した0.25 M 酢酸緩衝液(pH 5.5)で平衡化したSephadex G-50 Fineを用いるスピンカラム法で精製し、NOTA-SCN-Fabを得た。【００８７】
[放射性金属標識Fabの作成]
実施例３：67Ga-NOTA-MVK-Fabの作製
67GaCl3(5 μL、富士フイルムRIファーマ株式会社)を0.25 M 酢酸緩衝液(pH 5.5, 5 μL)に混和し、室温で5分間静置した。NOTA-MVK-Fab溶液(10 μL)を混合した後、37oCで1時間インキュベートした。20 mM EDTA溶液(20 μL)を加えた後、0.1 M リン緩衝液(pH 7.0)で平衡化したSephadex G-50 Fineを用いるスピンカラム法で精製することで、下記金属錯体化合物3-1（以下、「67Ga-NOTA-MVK-Fab」ともいう）を作製した。TLC、CAE、SE-HPLCにおいて放射化学的収率95%以上を確認した。
【化２２】
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【００８８】
比較例３：67Ga- NOTA-MI-Fabの作製
NOTA-MVK-Fab溶液をNOTA-MI-Fab溶液に変更した以外は、実施例３と同様の方法で、67Ga-NOTA-MI-Fabを作製した。TLC、CAE、SE-HPLCにおいて放射化学的収率95%以上を確認した。【００８９】
比較例４：67Ga-NOTA-SCN-Fabの作製
NOTA-MVK-Fab溶液をNOTA-SCN-Fab溶液に変更した以外は、実施例３と同様の方法で、67Ga-NOTA-SCN-Fabを作製した。TLC、CAE、SE-HPLCにおいて放射化学的収率95%以上を確認した。【００９０】
参考例３：非放射性Ga-NOTA-Bn-Metの合成
GaCl3(1.2 mg, 6.77 μmol) を0.25 M 酢酸ナトリウム緩衝液 (50 μL) に溶解し化合物R1 (3.0 mg, 4.51 μmol) を加えた。室温で1時間反応後、分析用RP-HPLCにより精製し、非放射性Ga-NOTA-Bn-Met 0.5 mg (0.83 μmol, 収率18.5%)を白色固体として得た。
非放射性Ga-NOTA-Bn-Met：ESI-MS m/z [M + H]+ 600, Found 600.【００９１】
参考例４：67Ga-NOTA-MVK(Bzo)の作製
NOTA-MVK-Fab溶液をNOTA-MVK(Bzo)溶液に変更した以外は、実施例３と同様の方法で、67Ga- NOTA-MVK(Bzo)を作製した。TLC、CAE、SE-HPLCにおいて放射化学的収率95%以上を確認した。【００９２】
参考例５：67Ga-NOTA-MIK(Bzo)の作製
NOTA-MVK-Fab溶液をNOTA-MIK(Bzo)溶液に変更した以外は、実施例３と同様の方法で、67Ga- NOTA-MIK(Bzo)を作製した。TLC、CAE、SE-HPLCにおいて放射化学的収率95%以上を確認した。【００９３】
実施例4：64Cu-NOTA-MVK-Fabの作製
64CuCl2(5 μL)を 0.1M クエン酸アンモニウム緩衝液(pH 5.5, 5 μL)に混和し、室温で5分間静置した。NOTA-MVK-Fab溶液(10 μL)を混合した後、37oCで1時間インキュベートした。20 mM EDTA溶液(20 μL)を加えた後、0.1 M リン緩衝液(pH 7.0)で平衡化したSephadex G-50 Fineを用いるスピンカラム法で精製することで、下記金属錯体化合物3-2（以下、「64Cu-NOTA-MVK-Fab」ともいう）を作製した。TLC、SE-HPLCにおいて放射化学的収率95%以上を確認した。【００９４】
【化２３】
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【００９５】
比較例５：64Cu-NOTA-SCN-Fabの作製
NOTA-MVK-Fab溶液をNOTA-SCN-Fab溶液に変更した以外は、実施例４と同様の方法で、67Ga- NOTA-SCN-Fabを作製した。TLC、SE-HPLCにおいて放射化学的収率95%以上を確認した。【００９６】
[特性の検討]
〔BBMVsとのインキュベート試験〕
（腎刷子縁膜小胞）
腎刷子縁膜小胞 （BBMVs） はWistar系雄性ラット(200-250 g)の腎臓から作製した。全ての操作は氷上で行った。皮質に重量で2~3倍の300 mM mannitol、及び5 mM EGTAを含む12 mMトリス塩酸緩衝液 (pH 7.1)を加え、ポリトロンホモジナイザー(PT-3100 Kinematica GmgH Littau, Switzerland)で2分間ホモジナイズし, 同じ緩衝液で希釈することで10%ホモジネートとした。次いで、蒸留水で2倍に希釈した後，最終濃度が10 mMとなるように1.0 M MgCl2水溶液を加え、15分間放置した。その後、ホモジネートを1,900 gで遠心し、上清をさらに30分間24,000 gで遠心した。沈殿を皮質重量の20倍に相当する150 mM mannitol及び2.5 mM EGTAを含む6 mM トリス塩酸緩衝液(pH 7.1)に再懸濁し、テフロン（登録商標）ホモジナイザー(1,000 rpm, 10 strokes)によりホモジナイズした。次いで、最終濃度が10 mMとなるように1.0 M MgCl2水溶液を加え、懸濁液を15分間放置し、その後、ホモジネートを1,900 gで遠心し、上清をさらに30分間24,000 gで遠心した。得られた沈殿を皮質重量の10倍に相当する0.1 M リン酸緩衝液(pH 7.0)に懸濁し、再度テフロンホモジナイザー(1,000 rpm, 10 strokes)によりホモジナイズした。次いで、ホモジネートを30分間24,000 gで遠心し、BBMVsを沈殿として得た。BBMVsの沈殿を0.1 M リン酸緩衝液 (pH 7.0)に再懸濁し、0.4 × 19 mmの針に10回通すことで小胞の大きさを一定にした。インキュベート実験には、タンパク質濃度が10 mg/mLとなるように希釈して用いた。調製したBBMVsについて、リソソームマーカー酵素であるβ-galactosidase活性をp-nitrophenyl-β-D-galacto- pyranosideを用いて測定することにより、リソソーム画分の混入を評価した。また、γ-glutamyl transferase、aminopeptidaseの活性を、L-γ-glutamyl-p-nitroanilide、L-leucine-p-nitroanilideを用いて測定した。【００９７】
（インキュベート試験）
BBMVsと67Ga-NOTA-MVK(Bzo)のインキュベート実験は以下の方法で行った。タンパク質濃度を10 mg/mLとなるように調製したBBMVs (10 μL)を、37oCで10分間プレインキュベートした。67Ga-NOTA-MVK(Bzo)は、RP-HPLCにより過剰の配位子を除去した後、D-PBS (-)に再溶解した。67Ga-NOTA-MVK(Bzo)溶液(10 μL)をBBMVs溶液に加え、37oCで2時間インキュベート後に溶液の一部を採取し、RP-TLCで分析した。また、EtOHを40 μL加え、1分間15,000 gで遠心することでタンパク質を沈殿させた後、回収した上清をD-PBS (-)で希釈してRP-HPLCにより分析した。
酵素阻害剤共存下でのBBMVsによる代謝の評価は、同様にプレインキュベートしたBBMVs (10 μL)に各酵素阻害剤(5 μL)を最終濃度が1 mMになるように加え、10分間、37oCでインキュベートした後、67Ga-NOTA-MVK(Bzo)溶液(5 μL)を加えることにより行った。阻害剤には、carboxypeptidase Mの阻害剤である MGTA、renal dipeptidaseの阻害剤cilastatin、angiotensin-converting enzymeの阻害剤captpril、neutral endopeptidaseの特異的阻害剤であるphosphoramidonを用いた。また、67Ga-NOTA-MVK(Bzo)と67Ga-NOTA-MIK(Bzo)の比較は上記と同様の方法により行い、RP-HPLC及びTLCにより分析した。
結果、67Ga-NOTA-MVK(Bzo)では、67Ga-NOTA-Metを80.6%遊離したのに対して、67Ga-NOTA-MIK(Bzo)では、67Ga-NOTA-Metを94.8%遊離した。これらの結果から、67Ga-NOTA-MVKの配列構造又は67Ga-NOTA-MIKの配列構造を有する場合、腎への集積が低く抑えられると考えられる。【００９８】
〔放射性金属標識Fabのマウス血漿中安定性の検討〕
実施例及び比較例で作成した放射性金属標識Fabの溶液(30 μL)を、それぞれマウス血漿(270 μL)に加え、37oCでインキュベートした。1, 3, 6, 24時間後に各群3つの溶液をTLC及びCAEにより分析することで、未変化体の放射活性の割合を算出した。図１は、放射性金属標識Fabのマウス血漿中安定性の検討の結果を示す。なお、図中、67Ga-NOTA-MVK-Fabの結果は「MVK」、67Ga-NOTA-MI-Fabの結果は「MI」、67Ga-NOTA-SCN-Fabの結果は「SCN」として表す（以下同様）。結果、24時間後においても95%以上の放射活性がFab画分に存在した。【００９９】
〔放射性金属標識Fabのマウス体内動態の検討〕
実施例及び比較例で作成した放射性金属標識Fabをリン酸緩衝生理食塩水(1 mM, pH 7.4)で希釈した。マウス尾静脈より、Fab濃度を 5 μg/100 μLに調整した各放射性金属標識Fab溶液(0.3 μCi/100 μL/匹)を投与した。投与10分、30分、1時間、3時間、6時間、24時間後に各群 5 匹のマウスを屠殺し、血液及び関心臓器を採取し、重量を測定後、オートウェルガンマシステムにより放射活性を測定した。また、投与6時間、24 時間後までの糞尿を採取し、糞尿中に含まれる放射活性をオートウェルガンマシステムにより測定した。
67Ga-NOTA-MVK-Fab、67Ga-NOTA-MI-Fab及び67Ga-NOTA-SCN-Fabを正常マウスに投与後の、体内放射活性分布の経時変化を表１に示す。図２は、（ａ）腎臓放射活性（腎臓での時間-放射線量曲線）及び（ｂ）放射活性の腎臓血液比の経時変化を示す。【０１００】
【表１】
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【０１０１】
67Ga-NOTA-SCN-Fabは、投与早期から腎臓に高い放射活性が観察され、投与6時間後においても、63 %ID/gと高い放射活性が認められた。また、67Ga-NOTA-MI -Fabは、投与1時間で最大値44 %ID/gを示したが、その後経時的に減少し、6時間後においては腎臓に23 ％ID/gの放射活性が観察された。一方で、67Ga-NOTA-MVK-Fabは、投与早期から腎臓への集積は低値を示し、30分後において最大値20 %ID/gを示したが、その後経時的に減少し、6時間後においては8 %ID/gと67Ga-NOTA-MI-Fab及び67Ga-NOTA-SCN-Fabと比較し顕著に低値を示した。また、腎臓血液比においても、67Ga-NOTA-MVK-Fabは67Ga-NOTA-MI-Fab及び67Ga-NOTA-SCN-Fabと比較し、顕著に低値を示した。【０１０２】
〔尿中放射活性の分析〕
マウス尾静脈より実施例及び比較例で作成した放射性金属標識Fab (20 μCi, 100 μL)を投与し、6時間後までに集積した尿を0.45 μmのフィルターで濾過した後、SE-HPLCにて化学形を分析した。また、回収した尿に２倍量のEtOHを加えることでタンパクを沈殿させ、15,000 gで5分間遠心した後に上清を回収した。上清を回収した後に66質量% EtOH溶液300 μL (D-PBS (-) 100 μL + EtOH 200 μL)を用いてペレットを洗浄し、再度遠心して上清を回収する作業を2回行い、「(上清の活性)/[(上清の活性)＋(ペレットに残った活性)]×100」の計算式より、上清への回収率(上清に回収できた放射活性の割合)を算出した。その後、EtOH濃度が15質量％以下になるよう上清をD-PBS (-)で希釈し、RP-HPLCによる分析を行った。
67Ga-NOTA-MVK-Fab、67Ga-NOTA-MI-Fab、67Ga-NOTA-SCN-Fabの投与6時間後までに尿中に排泄された放射活性の分析結果を（図３及び図４）に示す。
図３は、（ａ）67Ga-NOTA-MVK-Fab、（ｂ）67Ga-NOTA-MI-Fab、（ｃ）67Ga-NOTA-SCN-Fabの投与6時間後までの尿中放射活性のSE-HPLCによる分析結果を示す。SE-HPLC分析では、いずれも70〜80％ID/gの放射活性が保持時間24〜25分の低分子画分に存在した。
図４は、（ａ）67Ga-NOTA-MVK-Fab、（ｂ）67Ga-NOTA-MI-Fab、（ｃ）67Ga-NOTA-SCN-Fabの投与6時間後までの尿中放射活性のRP-HPLCによる分析、及び（ｄ）67Ga-NOTA-Bn-Met標品（上述の非放射性Ga-NOTA- Bn-Met）、（ｅ）67Ga-NOTA-Bn-Lys標品のRP-HPLCによる分析結果を示す。エタノール沈殿法によりタンパクを除去した後、RP-HPLCによる分析を行った結果、67Ga-NOTA-SCN-Fabでは主に67Ga-NOTA-Bn-Lysと同じ保持時間8分の画分に放射活性が溶出されたことに対し、67Ga-NOTA-MVK-Fab及び 67Ga-NOTA-MI-Fabの主たる放射活性は67Ga-NOTA-Bn-Metと同じ保持時間15.5分の画分に溶出された。67Ga-NOTA-Bn-Lys標品は、「Bioconjugate Chem., 1997, 8, 365-369」に記載の方法に従って合成した。
以上、尿中の放射活性の分析により図３に示すSE-HPLCによる分析で、大部分の放射活性が低分子画分で排泄され、図４に示すRP-HPLCの結果から、67Ga-NOTA-MVK-Fabでは、低分子画分における主たる放射活性は67Ga-NOTA-Bn-Metであることがわかる。【０１０３】
〔SY皮下腫瘍モデルマウス体内分布試験〕
（細胞培養）
SY cellsの培養は150 mm Cell Culture Dish-Treated (トゥルーライン社)を用いて行った。10% (v/v) FBS (株式会社日本生物材料センター) 及び1% (v/v) ペニシリン/ストレプトマイシン(5000 unit-5000 μg/ml, Invitrogen, ライフ・テクノロジーズ・ジャパン社)となるようFBS及びペニシリン/ストレプトマイシを添加したRDMI-1640 with L-グルタミン酸及びフェノールレッド(和光純薬工業株式会社)を使用し、37 oC, 5%(v/v) CO2, 飽和水蒸気圧下でインキュベートした。【０１０４】
（動物実験モデル）
皮下腫瘍モデルマウスを用いた体内動態実験には、左足大腿部に3×106個のSY cellsを移植し、4〜5週間後に腫瘍サイズが 0.4 g〜1.0 g に成長したBALB/c-nu/nuマウス(雄性, 8〜10週齢)を使用した。【０１０５】
（体内分布試験）
上述の方法により調製した実施例及び比較例で作成した放射性金属標識Fabをリン酸緩衝生理食塩水(1 mM, pH 7.4)で希釈した。上記皮下腫瘍モデルマウスの尾静脈より、Fab濃度を5 μg/100 μLに調製した各放射性金属標識Fab 溶液(0.3 μCi/100 μL/匹)を投与した。投与3時間、6時間後(6時間後は67Ga-NOTA-MVK-Fab及び67Ga-NOTA-SCN-Fabのみ)に各群5匹のマウスを屠殺し、血液及び関心臓器を採取、重量を測定後、オートウェルガンマシステムにより放射活性を測定した。【０１０６】
【表２】
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【０１０７】
67Ga-NOTA-MVK-Fab、67Ga-NOTA-MI-Fab及び67Ga-NOTA-SCN-FabをSY皮下腫瘍モデルマウスに投与後の、体内放射活性分布を表２に示す。図５は、67Ga-NOTA-MVK-Fab、67Ga-NOTA-MI-Fab及び67Ga-NOTA-SCN-Fabの腫瘍腎臓比を示す。投与3時間後において、67Ga-NOTA-MVK-Fabは0.63と高い腫瘍腎臓比を示した。一方で、67Ga-NOTA-MI-Fab及び67Ga-NOTA-SCN-Fabは、投与3時間後において腎臓にそれぞれ64%ID/g、97%ID/gと高い放射活性が観察されたため、腫瘍腎臓比はそれぞれ0.16、0.09と低値を示した。【０１０８】
（SPECT撮像）
上述の方法により調製した実施例及び比較例で作成した放射性金属標識Fabをリン酸緩衝生理食塩水(1 mM, pH 7.4)で希釈した。上記SY皮下腫瘍モデルマウスの尾静脈より、Fab濃度を5 μg/100 μLに調製した各放射性金属標識Fab 溶液(100 μCi/100 μL/匹)を投与した。各群2匹のマウスをSPECT/CT装置（SPECT4CT, Trifoil Imaging, CA）を用いて、開口径1 mm、5穴ピンホールコリメータを360度収集、64プロジョエクション、1 分/プロジェクションの条件にて、投与後2.5時間から撮像した。
67Ga-NOTA-MVK-Fab、67Ga-NOTA-MI-Fab及び67Ga-NOTA-SCN-FabをSY皮下腫瘍モデルマウスに投与後のSPECT/CT画像を図６に示す。図６は、各67Ga標識Fab 溶液をSY皮下腫瘍モデルマウスに投与し、3時間後のSPECT/CT画像である。腫瘍(T)、腎臓(K)、膀胱(B)を示す。投与3時間後において、67Ga-NOTA-MVK-Fabは腎臓への集積が低く、腫瘍を明瞭に画像化した。一方で、67Ga-NOTA-MI-Fab及び67Ga-NOTA-SCN-Fabでは、腫瘍を画像化したが、腎臓にも高い放射活性が観察された。
以上、放射性標識薬剤は、腎臓への集積が低く、放射線画像診断の感度、精度を向上させることができる。【０１０９】
（PET撮像）
64Cu-NOTA-MVK-Fab及び64Cu-NOTA-Fabを正常マウスに投与し（0.09-0.14 mCi）、3時間後に30分かけてPET(Inveon, Siemens Medical Solutions, USA)撮像した。
図７は、64Cu-NOTA-MVK-Fab (図中、64Cu-MVK-Fabと示す)及び64Cu-NOTA-Fab(図中64Cu-SCN-Fabと示す)を正常マウスに投与した時に3時間後のPET画像を示す。64Cu -NOTA-MVK-Fabは腎臓への集積が低い。一方で、64Ga-NOTA-SCN-Fabでは、腎臓に高い放射活性が観察された。
以上、64Cu -NOTA-MVK-Fabに係る放射性標識薬剤は、腎臓への集積が低いことがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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