(57)【要約】  本発明は、線維状タンパク質の抗原性を被覆した新規の組成物であり、例えばエビ由来のトロポミオシンなどの線維状タンパク質と例えばマルトペンタオース又はマルトヘプタオースなどのマルトオリゴ糖とをメイラード反応により結合させた複合体を含有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維状タンパク質とマルトオリゴ糖とを結合させた複合体を含有する、線維状タンパク質の抗原性を被覆した組成物。
【請求項２】
前記線維状タンパク質が、トロポミオシンである、請求項１記載の線維状タンパク質の抗原性を被覆した組成物。
【請求項３】
前記トロポミオシンが、エビ由来のものである請求項２記載の線維状タンパク質の抗原性を被覆した組成物。
【請求項４】
前記マルトオリゴ糖の分子サイズが、五糖のマルトペンタオースから七糖のマルトヘプタオースの間である請求項１記載の線維状タンパク質の抗原性を被覆した組成物。
【請求項５】
線維状タンパク質とマルトオリゴ糖とをメイラード反応させることを特徴とする、線維状タンパク質の抗原性を被覆した組成物の製造方法。
【請求項６】
前記線維状タンパク質及びマルトオリゴ糖の混合物を６時間以上乾燥加熱してメイラード反応をさせる請求項５記載の線維状タンパク質の抗原性を被覆した組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、線維状タンパク質の抗原性を被覆した新規な組成物及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、例えばスギ花粉アレルゲン等の球状タンパク質と例えばガラクトマンナン等の多糖類とをメイラード反応させて、球状タンパク質の抗原構造をマスキングするものが考えられている（例えば特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−３４０６５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、複雑な高次構造を持たない例えばエビ由来のトロポミオシン等の線維状タンパク質に対しては、その有効性は明らかになっていない。実際、本願発明者が、ガラクトマンナンとトロポミオシンとをメイラード反応させても、その抗原構造の低減化を見い出すことはできていない。【０００５】
一方で、本願発明者は、線維状タンパク質の抗原性の低減化を図るべく、種々の検討を行った。その中で、線維状タンパク質の抗原性を低減化することのできる糖類を見い出した。【０００６】
本発明は、本願発明者の上記知見に基づいてなされたものであり、線維状タンパク質の抗原性を被覆した新規の組成物を提供することをその主たる課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち本発明に係る線維状タンパク質の抗原性を被覆した組成物は、線維状タンパク質とマルトオリゴ糖とを結合させた複合体を含有することを特徴とする。
ここで、前記線維状タンパク質が、例えばエビ由来のトロポミオシンであることが望ましい。
また、前記マルトオリゴ糖の分子サイズが、五糖（５分子の単糖で生成されるオリゴ糖）のマルトペンタオース（分子量約８２９）から七糖のマルトヘプタオース（分子量約１１５３）の間であることが望ましい。【０００８】
さらに本発明に係る線維状タンパク質の抗原性を被覆した組成物の製造方法は、線維状タンパク質とマルトオリゴ糖とをメイラード反応させることを特徴とする。
ここで、前記線維状タンパク質及びマルトオリゴ糖の混合物を６時間以上乾燥加熱してメイラード反応をさせることが望ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、線維状タンパク質とマルトオリゴ糖とをメイラード反応により結合させることにより、線維状タンパク質の抗原性を低減化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】乾燥加熱によるＰｅｎ  ｊ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ａ）、Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ｂ）及びＩｇＥ抗体との結合度の結果（ｐａｎｅｌ  Ｃ）である。
【図２】Ｐｅｎ  ｊ１及びグルコースの複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ａ）、Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ｂ）及びＩｇＥ抗体との結合度の結果（ｐａｎｅｌ  Ｃ）である。
【図３】Ｐｅｎ  ｊ１及びＤ（＋）−マルトトリオースの複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ａ）、Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ｂ）及びＩｇＥ抗体との結合度の結果（ｐａｎｅｌ  Ｃ）である。
【図４】Ｐｅｎ  ｊ１及びマルトペンタオースの複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ａ）、Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ｂ）及びＩｇＥ抗体との結合度の結果（ｐａｎｅｌ  Ｃ）である。
【図５】Ｐｅｎ  ｊ１及びマルトヘプタオースの複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ａ）、Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ｂ）及びＩｇＥ抗体との結合度の結果（ｐａｎｅｌ  Ｃ）である。
【図６】Ｐｅｎ  ｊ１及びガラクトマンナンの複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ａ）、Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ｂ）及びＩｇＥ抗体との結合度の結果（ｐａｎｅｌ  Ｃ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に本発明を詳述する。
【００１２】
本実施形態に係る線維状タンパク質の抗原性を被覆した組成物は、線維状タンパク質とマルトオリゴ糖とを結合させた複合体を含有するものである。
【００１３】
線維状タンパク質としては、エビ由来のトロポミオシンを用いることが考えられる。このエビ由来のトロポミオシンは、分子量約３５ｋＤａであり、α−ヘリックス構造に富む線維状タンパク質である。なお、トロポミオシンは、甲殻類、軟体動物、昆虫等において高い相同性があり、高頻度に交叉性を示す。
なお、その他の線維状タンパク質としては、コラーゲン、ミオシン、ケラチン、エラスチンなども考えられる。
【００１４】
マルトオリゴ糖としては、マルトペンタオース又はマルトヘプタオースを用いることが考えられる。
【００１５】
本実施形態の線維状タンパク質の抗原性を被覆した組成物は、線維状タンパク質であるトロポミオシン及びマルトオリゴ糖であるマルトペンタオース又はマルトヘプタオースの混合物を６時間以上乾燥加熱してメイラード反応をさせることで製造することができる。
【００１６】
具体的な製造方法は次のとおりである。
トロポミオシン／マルトペンタオース（マルトヘプタオース）のモル比が、エビトロポミオシン：糖＝約１：５０となる量のトロポミオシン及びマルトペンタオース（マルトヘプタオース）を、水に混合溶解し、水溶液中のトロポミオシンの合計含量が０．１質量％となるようにして必要量のマルトペンタオース（マルトヘプタオース）を含有させて調製する。得られた水溶液を凍結乾燥することにより粉末化する。得られた粉末を温度５０〜８０℃、より好ましくは５５〜６５℃、相対湿度３０〜５０％、より好ましくは３０〜４０％の条件下で、６時間以上、メイラード反応させることにより本発明の複合体を製造することができる。
【００１７】
本実施形態では、タンパク質１分子に対して最大何分子の糖が結合できるかを調べ（アミノ酸配列から予測）、両分子の構造や分子量から反応効率予測をして、その上でモル比で何：何にするかを設定している。エビトロポミオシン及びマルトオリゴ糖は分子量がほぼ均一なのでこれが可能となる。今回のエビトロポミオシンの場合では分子表面に露出したリジン残基（糖と結合しうるアミノ酸残基）が２５個あり、オリゴ糖の反応効率が高いことを考慮してエビトロポミオシン１分子中のリジン残基（２５残基）に対して２倍の５０分子のオリゴ糖を加える設定としている。すなわちトロポミオシン１モル：オリゴ糖５０モルとしている。モル比やモル濃度での溶液調製では物質（分子量）が異なれば１モル当たりの質量も変わるので溶液の質量％は一定ではない。ただし、タンパク質の溶解度や均一性に係わる溶液の粘性等を考慮して、水溶液中のタンパク質の合計含量は０．１％程度が適切である。
【００１８】
［実施例］
えび由来のトロポミオシンに対する糖修飾のエピトープ被覆効果についての実験結果について説明する。
エビ由来のトロポミオシンは、クルマエビ加食部より、非加熱条件下で抽出し、等電点沈殿法、硫安分画及びイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
【００１９】
生成されたトロポミオシン（Ｐｅｎ  ｊ１）のメイラード型糖修飾には、単糖としてグルコース、マルトオリゴ糖としてＤ（＋）−マルトトリオース、マルトペンタオース、マルトヘプタオース、多糖としてガラクトマンナンを使用した。
【００２０】
低分子量の糖類（ガラクトマンナン以外）は、Ｐｅｎ  ｊ１：糖＝１：５０となるように混合し、ガラクトマンナンは重量比でＰｅｎ  ｊ１の１０倍となるように混合し、恒温恒湿器内で６０℃、相対湿度３５％の条件の下で、乾燥加熱した。糖修飾の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）解析にて行い、エピトープ被覆効果の評価は患者血清を用いてＤｏｔ  ｂｌｏｔ解析で行い、ＩｇＥ抗体との結合度を測定した。
【００２１】
なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、一般的に行われるＬａｅｍｍｌｉの方法に従って行った。０．１％タンパク質溶液に同量のサンプル処理液を加えたものを泳動用サンプルとした。泳動用ゲルは、プレキャストゲルｅ−ＰＡＧＥＬ（ゲル濃度１２．５％、アトー株式会社、東京）を使用した。電気泳動はＥｚＲｕｎ泳動用緩衝溶液(アトー株式会社)を用いて、２０ｍＡで泳動させた。泳動後、タンパク質をＥｚ  Ｓｔａｉｎ  Ａｑｕａ（アトー株式会社）でクマシー染色した。
【００２２】
また、複合体の抗原性評価はＤｏｔ  ｂｌｏｔ解析にて行った。ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｈｙｂｏｎｄ−ｐ、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社、東京）をメタノールに浸して親水化させた後に１×ＰＢＳに浸し洗浄した。乾燥させたＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅに各サンプルを１０μｌずつスポットした。ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅを乾燥させた後に５％のＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔを含むＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ２０に浸して室温で１時間振盪しブロッキングした。ブロッキングしたＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅをＰＢＳですすいだ後にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。洗浄したＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ上にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で５０倍希釈したエビ陽性患者血清（２２５１５−ＪＨ）を２ｍｌ加え室温にて１時間反応させた。反応後ＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ２０にて洗浄した後、ＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ２０で４，０００倍希釈したａｎｔｉ-Ｈｕｍａｎ  ＩｇＥ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＨＲＰを２ｍｌ加え、１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０にて洗浄し、発光基質（ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）をＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ上に加えて、５分間反応させた。抗原抗体反応による化学発光はＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ,  Ｉｎｃ.、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて撮影した。このＤｏｔ  ｂｌｏｔ解析を、エビ陽性患者血清を変えて（２２４２９−ＨＬ、２２５９６−ＡＷ）同様に行った。
【００２３】
さらに、ＩｇＥ抗体との結合度の測定は、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋で撮影したＤｏｔ  ｂｌｏｔ解析画像に対しデシントメトリー解析を行い各スポットの濃度を数値化した。各スポット内の８か所の平均値を求め、さらに同複合体間の平均値を算出して複合体ごとの結合度とした。各混合物の乾燥加熱０時間を１００％として、乾燥加熱時間ごとの結合度をグラフにプロットし、増減の有意差をｔ検定による統計処理で判定した。なお、図４及び図５における「＊＊＊」は、ｐ値が０．００５未満であることを示し、「＊＊」は、ｐ値が０．０１未満であることを示し、「＊」は、ｐ値が０．０５未満であることを示している。
【００２４】
図１は、乾燥加熱によるＰｅｎ  ｊ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ａ）、Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ｂ）及びＩｇＥ抗体との結合度の結果（ｐａｎｅｌ  Ｃ）である。
図２は、Ｐｅｎ  ｊ１及びグルコースの複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ａ）である。
図３は、Ｐｅｎ  ｊ１及びＤ（＋）−マルトトリオースの複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ａ）、Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ｂ）及びＩｇＥ抗体との結合度の結果（ｐａｎｅｌ  Ｃ）である。
図４は、Ｐｅｎ  ｊ１及びマルトペンタオースの複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ａ）、Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ｂ）及びＩｇＥ抗体との結合度の結果（ｐａｎｅｌ  Ｃ）である。
図５は、Ｐｅｎ  ｊ１及びマルトヘプタオースの複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ａ）、Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ｂ）及びＩｇＥ抗体との結合度の結果（ｐａｎｅｌ  Ｃ）である。
図６は、Ｐｅｎ  ｊ１及びガラクトマンナンの複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ａ）、Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ解析の結果（ｐａｎｅｌ  Ｂ）である。
【００２５】
図２に示すように、Ｐｅｎ  ｊ１及びグルコースの複合体では、乾燥加熱３時間後にＰｅｎ  ｊ１の分子量に数ｋＤａの増加が確認されたが、それ以降のサンプルは不溶化が激しく解析不能であった。同様に、図３に示すように、Ｐｅｎ  ｊ１及びＤ（＋）−マルトトリオースの複合体では全ての乾燥加熱サンプルで不溶化が起こった。
【００２６】
図４及び図５に示すように、Ｐｅｎ  ｊ１及びマルトペンタオースの複合体、Ｐｅｎ  ｊ１及びマルトヘプタオースの複合体では、１日後から１４日後にかけてＰｅｎ  ｊ１の高分子化が確認された。図６に示すように、Ｐｅｎ  ｊ１及びガラクトマンナンの複合体では、３日後から１４日後にかけて３５ｋＤａ付近から約２００ｋＤａを超えるものまでの広範囲に及ぶＰｅｎ  ｊ１の高分子化が確認された。
【００２７】
また、図４及び図５に示すように、Ｐｅｎ  ｊ１及びマルトペンタオースの複合体、Ｐｅｎ  ｊ１及びマルトヘプタオースの複合体では、乾燥加熱後６時間経過時から、ａｎｔｉ−Ｐｅｎ  ｊ１  ＩｇＥ抗体との結合率が有意に低下し、未修飾エビトロポミオシン（１００％）に対して約４０％にまで低減することができた。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明によれば、線維状タンパク質とマルトオリゴ糖とをメイラード反応により結合させることにより、線維状タンパク質の抗原性を低減化することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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