(57)【要約】  高純度かつ高収率の変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法が開示されている。当該方法は，形質転換哺乳動物細胞に変異型ヒトエリスロポエチンを産生させ，培養上清を疎水性カラムクロマトグラフィー，マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィー，陰イオン交換カラムクロマトグラフィー，リン酸基親和性カラムクロマトグラフィー，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにこの順で付すことによる，変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法である。
2017154869.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んでなる変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法であって，
（ａ）該変異型ヒトエリスロポエチンを産生する変異型ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞を準備するステップと，
（ｂ）該変異型ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞を無血清培地で培養して該変異型ヒトエリスロポエチンを培養液中に分泌させるステップと，
（ｃ）該培養液から該細胞を除去することにより培養上清を調製するステップと，
（ｄ）該培養上清を疎水性カラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップと，
（ｅ）直前のステップで回収された該画分を，マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップと，
（ｆ）直前のステップで回収された該画分を，陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップと，
（ｇ）直前のステップで回収された該画分を，リン酸基に対する親和性を有する固定相材料を用いたカラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップと，
（ｈ）直前のステップで回収された該画分を，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップとを，
この順で含んでなる，製造方法。
【請求項２】
該疎水性カラムクロマトグラフィーに用いられる疎水性樹脂がフェニル基を有するものであり，該マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに用いられるイオン交換体が疎水性相互作用および水素結合に基づく選択性を併せ持つ強陰イオン交換体であり，該リン酸基に対する親和性を有する固定相材料が，ヒドロキシアパタイト又はフルオロアパタイトである，請求項１の製造方法。
【請求項３】
該リン酸基に対する親和性を有する固定相材料がヒドロキシアパタイトである，請求項１又は２の製造方法。
【請求項４】
該マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに用いられるイオン交換体が，官能基としてＮ−ベンジルーＮ−メチルエタノールアミン基を有するものである，請求項１〜３の何れかの製造方法。
【請求項５】
該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに用いられるイオン交換体が，官能基としてジエチルアミノエチル基を有するものである，請求項１〜４の何れかの製造方法。
【請求項６】
上記ステップ（ｈ）で回収された該画分を，ウイルス除去処理又はウイルス不活化処理に付すステップを更に含んでなる，請求項１〜５の何れかの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法に関し，特に形質転換哺乳動物細胞に変異型ヒトエリスロポエチンを産生させて培養上清を取得し，これを複数の特定のクロマトグラフィーを特定の順序で行う精製方法に付して精製することによる，変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）は，ヒトにおいて赤芽球前駆細胞に働いて赤血球へと分化させることによって，赤血球の産生を促進する糖蛋白質である。このため，ｈＥＰＯは，ヒトの腎性貧血治療剤として，また手術に備えた自己血の貯血に際して用いられている。エリスロポエチンは，１６５個のアミノ酸残基からなる糖蛋白質であり，Ｎ末端側から２４，３８及び８３番目のアスパラギン残基がＮ結合型糖鎖により，また１２６番目のセリン残基がＯ結合型糖鎖により，それぞれ修飾されている。すなわち，ｈＥＰＯは，そのペプチド鎖が４箇所において糖鎖により修飾されている。これら糖鎖はｈＥＰＯの生体内での安定性に寄与しており，糖鎖が除去されたｈＥＰＯは，生体内で速やかに分解されるため，ほとんど活性を示さない。【０００３】
ｈＥＰＯの生体内での安定性を高めるため，更に多くの糖鎖により修飾されるよう，アミノ酸配列が改変された変異型ｈＥＰＯの構築が種々試みられている。ダルベポエチンは，そのような変異型ｈＥＰＯの一つである。ダルベポエチンは，ｈＥＰＯのペプチド鎖を構成する１６５個のアミノ酸残基に，Ａｌａ３０Ａｓｎ，Ｈｉｓ３２Ｔｈｒ，Ｐｒｏ８７Ｖａｌ，Ｔｒｐ８８Ａｓｎ，及びＰｒｏ９０Ｔｈｒという５箇所の変異を導入した変異型ｈＥＰＯである（特許文献１）。これら変異の中で，Ａｌａ３０ＡｓｎとＴｒｐ８８Ａｓｎの２箇所のアスパラギン残基は新たなＮ結合型糖鎖の結合部位となる。天然型のｈＥＰＯは上述の通り４箇所の糖鎖結合部位を有するため，ダルベポエチンは計６箇所の糖鎖結合部位を有することになる。実際，チャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞を用いて製造されたダルベポエチンは，これら６箇所で糖鎖修飾されている。このようなダルベポエチンは，日本においてはネスプ（登録商標）（Nesp（登録商標））の名称で医療用医薬品として２０１０年に製造承認されている。【０００４】
ネスプ（登録商標）の用法及び用量は，概ね，血液透析を受けている患者については，初回用量として週１回２０μｇを静脈内投与，維持用量として２週に１回３０〜１２０μｇを静脈内投与し，腹膜透析を受けている患者及び保存期慢性腎臓病患者については，初回用量として２週に１回３０μｇを皮下又は静脈内投与，維持用量として４週に１回６０〜１８０μｇを皮下又は静脈内投与するものとされている。エリスロポエチン製剤が，概ね，週２〜３回の投与を必要することと比較すると，ネスプ（登録商標）では投与頻度が少なくて済むことから，患者の負担が軽減される。【０００５】
ＣＨＯ細胞を用いた変異型のエリスロポエチンの製造方法については，無血清培地で形質転換ＣＨＯ細胞を培養して発現させた変異型のエリスロポエチンを，混合方式カラム（Capto Adhereカラム），第１の陽イオン交換カラム，第２の陽イオン交換カラム及び陰イオン交換カラム（又はCapto Adhereカラム）を用いた４ステップのクロマトグラフィーにより精製する方法が報告されている（特許文献２，３）。ここで報告された方法は，等電点が低い変異型のエリスロポエチンのアイソフォームを単離するためのものであり，混合方式カラム工程において，変異型のエリスロポエチンを樹脂に吸着させた後，樹脂を酸性条件（ｐＨ４．０）で洗浄すること等を特徴とする。【０００６】
この他，形質転換ＣＨＯ細胞を用いた変異型のエリスロポエチンの製造方法については，そのようなＣＨＯ細胞を培養して発現させた変異型のエリスロポエチンを，レクチン／ｍ−アミノフェニルベースのマトリックスを使用したアフィニティーカラム，陰イオン交換カラム及び疎水性カラムを用いた３ステップのクロマトグラフィーにより精製する方法が報告されている（特許文献４）。また，無血清培地で形質転換ＣＨＯ細胞を培養して発現させた変異型のエリスロポエチンを，疎水性カラム，陰イオン交換カラム，弱陽イオン交換カラム及び強陽イオン交換カラムカラムを用いた４ステップのクロマトグラフィーにより精製する方法が報告されている（特許文献５）。更に，無血清培地で形質転換ＣＨＯ細胞を培養して発現させた変異型のエリスロポエチンを，第１の陰イオン交換カラム，ハイドロキシアパタイトカラム，第２の陰イオン交換カラムカラムを用いた３ステップのクロマトグラフィーにより精製する方法が報告されている（特許文献６）。更に，形質転換ＣＨＯ細胞を培養して発現させた変異型のエリスロポエチンを，色素アフィニティー，ハイドロキシアパタイトカラム，陰イオン交換カラムを用いた３ステップのクロマトグラフィーにより精製する方法（特許文献７），変異型のエリスロポエチンを吸着させた陰イオン交換カラムをアルギニン含有緩衝液で洗浄するステップを含む変異型のエリスロポエチンの精製方法（特許文献８）等が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表平０８−５０６０２３号公報
【特許文献２】特表２０１１−５２５４９２号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１１／０６３１９５
【特許文献４】特表２００９−５０２１１７号公報
【特許文献５】ＷＯ２０１１／０２４０２４
【特許文献６】特表２０１４−５３２０８０号公報
【特許文献７】ＷＯ２０１４／２０４０２３
【特許文献８】ＷＯ２０１５／０８０５０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は，変異型ヒトエリスロポエチン産生細胞の培養液中から，腎性貧血の治療剤等の医薬品として使用できる高い純度にまで，効率よく，変異型ヒトエリスロポエチンを精製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的に向けた研究において，本発明者らは，無血清培地中で培養した変異型ヒトエリスロポエチン産生細胞の培養液の培養上清中に含まれる変異型ヒトエリスロポエチンを，疎水性カラムクロマトグラフィー，マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィー，陰イオン交換カラムクロマトグラフィー，リン酸基に親和性を有する固定相を用いたカラムクロマトグラフィー，及びゲルろ過カラムクロマトグラフィーにこの順で付すことによって，高い純度で効率よく精製できることを見出した。本発明は，これらの知見に基づき更に検討を加えて完成させたものである。すなわち，本発明は以下を提供する。
１．配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んでなる変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法であって，
（ａ）該変異型ヒトエリスロポエチンを産生する変異型ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞を準備するステップと，
（ｂ）該変異型ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞を無血清培地で培養して該変異型ヒトエリスロポエチンを培養液中に分泌させるステップと，
（ｃ）該培養液から該細胞を除去することにより培養上清を調製するステップと，
（ｄ）該培養上清を疎水性カラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップと，
（ｅ）直前のステップで回収された該画分を，マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップと，
（ｆ）直前のステップで回収された該画分を，陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップと，
（ｇ）直前のステップで回収された該画分を，リン酸基に対する親和性を有する固定相材料を用いたカラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップと，
（ｈ）直前のステップで回収された該画分を，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップとを，
この順で含んでなる，製造方法。
２．該疎水性カラムクロマトグラフィーに用いられる疎水性樹脂がフェニル基を有するものであり，該マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに用いられるイオン交換体が疎水性相互作用および水素結合に基づく選択性を併せ持つ強陰イオン交換体であり，該リン酸基に対する親和性を有する固定相材料が，ヒドロキシアパタイト又はフルオロアパタイトである，上記１の製造方法。
３．該リン酸基に対する親和性を有する固定相材料がヒドロキシアパタイトである，上記１又は２の製造方法。
４．該マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに用いられるイオン交換体が，官能基としてＮ−ベンジルーＮ−メチルエタノールアミン基を有するものである，上記１〜３の何れかの製造方法。
５．該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに用いられるイオン交換体が，官能基としてジエチルアミノエチル基を有するものである，上記１〜４の何れかの製造方法。
６．上記ステップ（ｈ）で回収された該画分を，ウイルス除去処理又はウイルス不活化処理に付すステップを更に含んでなる，上記１〜５の何れかの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば，変異型ヒトエリスロポエチン産生細胞の培養液中から，腎性貧血の治療剤として使用できる高い純度の変異型ヒトエリスロポエチンを，効率よく精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は，SDS-PAGE電気泳動の結果を示し，レーン１は精製したダルベポエチンの，そしてレーンＭは分子量マーカーの，それぞれの電気泳動パターンを示す。
【図２】図２は，精製したダルベポエチンのSE-HPLCチャートを示す。縦軸及び横軸は，２１５ｎｍでの吸光度及び保持時間（分）をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において，「ヒトエリスロポエチン」又は「ｈＥＰＯ」というときは，配列番号１で示される１６５個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を有する糖蛋白質のことをいう。天然に存在するヒトエリスロポエチンは，Ｎ末端側から２４，３８及び８３番目のアスパラギン残基がＮ結合型糖鎖で修飾されており，Ｎ末端側から１２６番目のセリン残基がＯ結合型糖鎖により修飾されている。ＣＨＯ細胞を用いて発現させた組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）も，この４か所のアミノ酸残基が糖鎖で修飾される。これらの糖鎖はｈＥＰＯの生体内での安定性に寄与しており，糖鎖が除去されたｈＥＰＯは生体内で速やかに分解されるため，生体内ではほとんど活性を示さない。
【００１３】
本発明において，「変異型ヒトエリスロポエチン」又は「変異型ｈＥＰＯ」というときは，ｈＥＰＯのペプチド鎖を構成する１又は複数のアミノ酸残基を，新たな糖鎖結合部位となるアミノ酸残基が新たに少なくとも１箇所に生ずるように，置換，欠失，挿入，付加させたペプチド鎖を有する糖蛋白質のことをいう。ここで，新たな糖鎖結合部位となるアミノ酸残基は，Ｎ結合型糖鎖で修飾され得るアスパラギン残基か若しくはＯ結合型糖鎖で修飾され得るセリン又はスレオニン残基である。より具体的には，アミノ酸残基を置換して新たな糖鎖結合部位生じさせる場合，置換されるアミノ酸残基は，配列番号１で示されるヒトエリスロポエチンを構成する１６５個のアミノ酸残基において，３０番目，６８番目，６９番目，７１番目，８８番目，１２５番目，及び１２７番目のアミノ酸残基から選ばれ，これらのアミノ酸残基のうちの１つ又は２つ以上がアスパラギン残基，スレオニン残基又はセリン残基で置換される。アミノ酸残基をアスパラギン残基で置換する場合は，置換後のアミノ酸配列中に，Asn−Ｘ−Ser又はAsn−Ｘ−Thr（Ｘはプロリン以外アミノ酸残基）の配列が現れるよう，必要に応じて，アスパラギン残基で置換されるアミノ酸残基のＣ末端側の隣接する１又は２個のアミノ酸残基も置換される。
【００１４】
変異型ヒトエリスロポエチンの好ましい１形態として，ダルベポエチンが挙げられ，これはｈＥＰＯのペプチド鎖を構成する１６５個のアミノ酸残基に，Ala30Asn，His32Thr，Pro87Val，Trp88Asn及びPro90Thrの５箇所の変異を導入したものに相当し，配列番号２で示される１６５個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を有している。これら変異の中で，Ala30AsnとTrp88Asnの２箇所のアスパラギン残基が，Ｎ結合型糖鎖の結合部位である。天然型のｈＥＰＯは４箇所の糖鎖結合部位を有することから，ダルベポエチンは６箇所の糖鎖結合部位を有することになる。
【００１５】
本発明において，変異型ヒトエリスロポエチンは，変異型エリスロポエチン遺伝子をコードするＤＮＡ断片を発現ベクターに組込み，これを用いて細胞（例えばＣＨＯ細胞）を形質転換して得られる変異型ヒトエリスロポエチン産生細胞（変異型ｈＥＰＯ産生細胞）を，培地中で培養することにより生産することができる。それにより，変異型ｈＥＰＯは，新たに導入された１か所以上の糖鎖結合部位を含む，５か所以上のアミノ酸残基が糖鎖修飾を受けた糖蛋白質として培地中に蓄積される。
【００１６】
変異型エリスロポエチン遺伝子をコードするＤＮＡ断片を組み込んで発現させるために用いる発現ベクターは，ＣＨＯ細胞内に導入したときに，該遺伝子を発現させるベクターであれば特に限定なく用いることができる。発現ベクターに組み込まれた該遺伝子は，哺乳動物細胞内で遺伝子の転写の頻度を調節することができるＤＮＡ配列（遺伝子発現制御部位）の下流に配置されていることができる。本発明において用いることのできる遺伝子発現制御部位としては，例えば，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子−１アルファ（ＥＦ−１α）プロモーターが挙げられるが，これらに限定されない。
【００１７】
変異型ｈＥＰＯ産生細胞の培養に用いる培地としては，無血清培地が好ましい。例えば，アミノ酸を３〜７００ｍｇ／Ｌ，ビタミン類を０．００１〜５０ｍｇ／Ｌ，単糖類を０．３〜１０ｇ／Ｌ，無機塩類を０．１〜１００００ｍｇ／Ｌ，微量元素を０．００１〜０．１ｍｇ／Ｌ，ヌクレオシドを０．１〜５０ｍｇ／Ｌ，脂肪酸を０．００１〜１０ｍｇ／Ｌ，ビオチンを０．０１〜１ｍｇ／Ｌ，ヒドロコルチゾンを０．１〜２０μｇ／Ｌ，インスリンを０．１〜２０ｍｇ／Ｌ，ビタミンＢ１２を０．１〜１０ｍｇ／Ｌ，プトレッシンを０．０１〜１ｍｇ／Ｌ，ピルビン酸ナトリウムを１０〜５００ｍｇ／Ｌ，及び水溶性鉄化合物を含有する培地が好適に用いられる。所望により，チミジン，ヒポキサンチン，慣用のｐＨ指示薬及び抗生物質等を培地に添加してもよい。
【００１８】
無血清培地は，更に，炭酸水素ナトリウム，Ｌ−グルタミン，Ｄ−グルコース，インスリン，亜セレン酸，ジアミノブタン，ヒドロコルチゾン，硫酸第二鉄（ＩＩ），アスパラギン，アスパラギン酸，セリン，及びポリビニルアルコールから選択されるものを添加されたものであってもよい。更には市販の無血清培地，例えば，ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ（登録商標）培地，ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ培地又はＣＤ ＣＨＯ培地（Thermo Fisher Scientific社），ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地又はＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３２５−ＰＦ培地（SAFC Biosciences社）等を基本培地として使用し，これに適宜，抗生物質等を添加した培地を用いてもよい。例えば，１６μｍｏｌ／Ｌ チミジン，１００μｍｏｌ／Ｌ ヒポキサンチン，及び２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む無血清培地であるＣＤ ｏｐｔｉＣＨＯＴＭ培地は，変異型ｈＥＰＯ産生細胞の培養に好適に用いることができる。
【００１９】
変異型ｈＥＰＯは，変異型ｈＥＰＯ産生細胞を無血清培地中で培養することにより培地中に蓄積される。本発明において，変異型ｈＥＰＯは，変異型ｈＥＰＯ産生細胞の培養終了後に回収された培養上清から，疎水性カラムクロマトグラフィーステップ，マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィーステップ，陰イオン交換カラムクロマトグラフィーステップ，リン酸基に対する親和性を有する固定相材料を用いたカラムクロマトグラフィーステップ，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーステップをこの順で用いた精製工程に付すことで，医薬品として使用し得るレベルの純度にまで精製される。
【００２０】
精製工程の第１ステップである疎水性カラムクロマトグラフィーは，変異型ｈＥＰＯ及び夾雑物と疎水性樹脂に取り付けられた疎水性リガンドとの間の疎水性相互作用を利用して夾雑物を除去するためのステップである。疎水性カラムクロマトグラフィーにおいてどのような疎水性リガンドを用いるかにつき特に具体的な限定はないが，好ましいのはフェニル基を有するリガンドであり，より好ましくは，Ｒ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ５等（Ｒは樹脂本体を表す。）のような，スペーサーアームを介して樹脂本体に結合したフェニル基を有するリガンドである。このための特に好ましいカラム材料の一例として，Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare社）が挙げられるが，これにおいてはSepharose 6 Fast Flowマトリックスに，特定のスペーサーアームを介して共有結合によりフェニル基が固定されている。
【００２１】
この疎水性カラムクロマトグラフィーにおいて，培養上清をカラムに負荷するとき，予め，培養上清の導電率は，中性塩を添加することにより１５Ｓ／ｍ以上，例えば１５〜２０Ｓ／ｍに調整され，また，そのｐＨは好ましくはｐＨ７．０〜８．０，より好ましくはｐＨ７．３〜７．７，更に好ましくはｐＨ７．５に調整される。また，疎水性カラムの疎水性樹脂は，予め，好ましくは１．５Ｍ〜２．５Ｍの中性塩を含むｐＨ７．０〜８．０に調整された１５〜２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液，より好ましくは１．８Ｍ〜２．２Ｍの中性塩を含むｐＨ７．３〜７．７に調整された１５〜２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液，更に好ましくは２．０Ｍの中性塩を含むｐＨ７．５に調整された２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液によって平衡化される。なお，このとき用られる中性塩は，好ましくはＮａＣｌ又はＫＣｌであり，より好ましくはＮａＣｌである。本ステップにおいて，活性を有するカラム非吸着画分が回収される（疎水性カラムクロマトグラフィー回収画分）。この回収画分が次の精製工程，例えば以下に例示される精製工程の第２ステップに供される。この回収画分が下記の精製工程の第２ステップに供される場合にあっては、例えば、この回収画分を予め脱塩処理したものが供される。
【００２２】
精製工程の第２ステップであるマルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィーは，変異型ｈＥＰＯ及び夾雑物とマルチモーダル陰イオン交換樹脂との間の，静電相互作用，疎水性相互作用及び水素結合に基づく選択性を利用して夾雑物を除去するためのステップである。マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにおいて用いられるマルチモーダル陰イオン交換樹脂としては，マルチモーダル強陰イオン交換樹脂が好ましく，このための特に好ましいカラム材料は，Capto adhere（GE Healthcare社）であり，これにおいては，強陰イオン交換体の官能基はＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン基を有するものである。
【００２３】
マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにおいて，マルチモーダル陰イオン交換樹脂は，予め，好ましくはｐＨ７．０〜８．０に調整された１５〜２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液，より好ましくはｐＨ７．３〜７．７に調整された１５〜２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液，更に好ましくはｐＨ７．５に調整された２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液によって平衡化される。この予め平衡化したマルチモーダル陰イオン交換樹脂に，脱塩した疎水性カラムクロマトグラフィー回収画分を負荷して，樹脂に変異型ｈＥＰＯを吸着させる。
【００２４】
樹脂に吸着した変異型ｈＥＰＯは，好ましくは１４０〜２５０ｍＭの中性塩を含むｐＨ７．３〜７．７に調整された１５〜２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液，より好ましくは１４０〜２５０ｍＭの中性塩を含むｐＨ７．５に調整された２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液により溶出される。このとき用いられる中性塩は，好ましくはＮａＣｌ又はＫＣｌであり，より好ましくはＮａＣｌである。本ステップにおいて，活性を有する溶出画分が回収される（マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィー回収画分）。この回収画分が次の精製工程，例えば以下に例示される精製工程の第３ステップに供される。この回収画分が下記の精製工程の第３ステップに供される場合にあっては、例えば、この回収画分を予め純水で希釈したものが供される。
【００２５】
精製工程の第３ステップである陰イオン交換カラムクロマトグラフィーは，陰イオン交換樹脂の静電相互作用に基づく選択性を利用したステップである。陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに用いられる樹脂としては，弱陰イオン交換樹脂が好ましく，イオン交換樹脂の官能基がジエチルアミノエチル基であるものが特に好ましい。
【００２６】
陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにおいては，陰イオン交換樹脂は予め，好ましくはｐＨ７．０〜８．０に調整された１５〜２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液，より好ましくはｐＨ７．３〜７．７に調整された１５〜２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液，更に好ましくはｐＨ７．５に調整された２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液によって平衡化される。この予め平衡化した陰イオン交換樹脂に，希釈したマルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィー回収画分を負荷して，樹脂に変異型ｈＥＰＯを吸着させる。
【００２７】
樹脂に吸着した変異型ｈＥＰＯは，好ましくは８０〜２００ｍＭの中性塩を含むｐＨ７．３〜７．７に調整された１５〜２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液，より好ましくは８０〜２００ｍＭ中性塩を含むｐＨ７．５に調整された２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液により溶出される。このとき用いられる中性塩は，好ましくはＮａＣｌ又はＫＣｌであり，より好ましくはＮａＣｌである。本ステップにおいて，活性を有する溶出画分が回収される（陰イオン交換カラムクロマトグラフィー回収画分）。この回収画分が次の精製工程，例えば以下に例示される精製工程の第４ステップに供される。
【００２８】
精製工程の第４ステップであるリン酸基に対する親和性を有する固定相材料を用いたカラムクロマトグラフィーは，当該固定相材料のリン酸基に対する親和性を利用して夾雑物を除去するためのステップである。このとき用いられる固定相材料としては，ハイドロキシアパタイト又はフルオロアパタイトが好ましく，特に，ハイドロキシアパタイトが好ましい。
【００２９】
リン酸基に対する親和性を有する固定相材料を用いたカラムクロマトグラフィーにおいては，先行の陰イオン交換カラムクロマトグラフィー回収画分の導電率を，０．３Ｓ／ｍ未満，例えば，０．１〜０．２９Ｓ／ｍに，またｐＨを好ましくはｐＨ６．８〜７．２，より好ましくはｐＨ７．０に予め調整する。また，固定相材料は，好ましくは１．８〜２．２ｍＭの塩化カルシウムと１．８〜２．２ｍＭのリン酸ナトリウムとを含むｐＨ６．５〜７．５に調整された４０〜６０ｍＭのＭＥＳ緩衝液，より好ましくは２ｍＭの塩化カルシウムと２ｍＭのリン酸ナトリウムを含むｐＨ７．０に調整された５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液によって，予め平衡化される。この予め平衡化した固定相材料に，上記で導電率及びｐＨを調整した陰イオン交換カラムクロマトグラフィー回収画分を負荷して，固定相材料に変異型ｈＥＰＯを吸着させる。
【００３０】
上記固定相材料に吸着した変異型ｈＥＰＯは，好ましくは０．８〜１．２ｍＭの塩化カルシウムと２．８〜３．２ｍＭのリン酸ナトリウムとを含むｐＨ６．５〜７．５に調整された４０〜６０ｍＭのＭＥＳ緩衝液，より好ましくは１ｍＭの塩化カルシウムと３ｍＭのリン酸ナトリウムを含むｐＨ７．０に調整された５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液により溶出される。本ステップにおいて，活性を有する画分が回収される（リン酸基親和性カラムクロマトグラフィー回収画分）。この回収画分が次の精製工程，例えば以下に例示される精製工程の第５ステップに供される。
【００３１】
精製方法の第５ステップであるゲルろ過カラムクロマトグラフィーは，エンドドキシン等のような低分子量の不純物や，変異型ｈＥＰＯの多量体又は分解産物を除去するためのステップである。当該ステップは常法により行うことができる。こうして，上記第１〜第５のステップを含む精製工程により，医薬品として使用し得るまでに精製された変異型ｈＥＰＯが得られる。
【００３２】
本発明の製造方法の好適な一例は，配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んでなる変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法であって，（ａ）該変異型ヒトエリスロポエチンを産生する変異型ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞を準備するステップと，（ｂ）変異型ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞を無血清培地で培養して変異型ヒトエリスロポエチンを培養液中に分泌させるステップと，（ｃ）該培養液から該細胞を除去することにより培養上清を調製するステップと，（ｄ）疎水性カラムクロマトグラフィーを用いた精製ステップと，（ｅ）マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いた精製ステップと，（ｆ）陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いた精製ステップと，（ｇ）リン酸基に対する親和性を有する固相材料を用いたカラムクロマトグラフィーを用いた精製ステップと，（ｈ）ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを用いた精製ステップとを，この順で含んでなる，製造方法である。
【００３３】
ここで，所望により，上記精製工程の第１の精製ステップ（ステップ（ｄ））の前，第１の精製ステップ〜第５の精製ステップ（ステップ（ｄ）〜（ｈ））の隣接するステップ間，又は第５の精製ステップ（ステップ（ｈ））の後に，１又は２の精製工程を追加することもできる。追加することのできる精製工程の例としては，色素親和性カラムクロマトグラフィー，陰イオン交換カラムクロマトグラフィー，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー，疎水性カラムクロマトグラフィー，ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー又はフルオロアパタイトカラムクロマトグラフィーが挙げられるが，これらに限定されない。
【００３４】
本発明の製造方法の更なる好適な一例は，配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んでなる変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法であって，（ａ）該変異型ヒトエリスロポエチンを産生する変異型ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞を準備するステップと，（ｂ）変異型ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞を無血清培地で培養して該変異型ヒトエリスロポエチンを培養液中に分泌させるステップと，（ｃ）該培養液から該細胞を除去することにより培養上清を調製するステップと，（ｄ）該培養上清を疎水性カラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップと，（ｅ）直前のステップで回収された該画分を，マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップと，（ｆ）直前のステップで回収された該画分を，陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップと，（ｇ）直前のステップで回収された該画分を，リン酸基に対する親和性を有する固定相材料を用いたカラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップと，（ｈ）直前のステップで回収された該画分を，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップとを，この順で含んでなる，製造方法である。
【００３５】
ここで，所望により，上記精製工程を構成するステップ（ｄ）の前，ステップ（ｄ）〜ステップ（ｈ）の何れかの隣接するステップの間，又はステップ（ｈ）の後に，１又は２の精製工程を追加することもできる。追加することのできる精製工程の例としては，色素親和性カラムクロマトグラフィー，陰イオン交換カラムクロマトグラフィー，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー，疎水性カラムクロマトグラフィー，ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー又はフルオロアパタイトカラムクロマトグラフィーが挙げられるが，これらに限定されない。例えば，上記ステップ（ｄ）とステップ（ｅ）との間に追加のクロマトグラフィーステップを加える場合，ステップ（ｅ）における「直前のステップ」の語は，当該追加のステップを指す。
【００３６】
色素親和性カラムクロマトグラフィーを精製工程として追加するとき，色素親和性カラムクロマトグラフィー用にどの樹脂を用いるかにつき特に限定はないが，ブルートリアジン色素が特に好ましく用いられ，他のトリアジン色素もまた適している。特に好ましいカラムはBlue Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare）であり，そこでは色素CibacronTM Blue F3GAが，Sepharose 6 Fast Flowマトリックスに共有結合で固定されている。
【００３７】
本発明の製造方法の更なる好適な一例は，配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んでなる変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法であって，（ａ）該変異型ヒトエリスロポエチンを産生する変異型ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞を準備するステップと，（ｂ）該変異型ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞を無血清培地で培養して該変異型ヒトエリスロポエチンを培養液中に分泌させるステップと，（ｃ）該培養液から該細胞を除去することにより培養上清を調製するステップと，（ｄ）該培養上清を疎水性カラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップと，（ｅ）上記ステップ（ｄ）で回収された該画分を，マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップと，（ｆ）上記ステップ（ｅ）で回収された該画分を，陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップと，（ｇ）上記ステップ（ｆ）で回収された該画分を，リン酸基に対する親和性を有する固定相材料を用いたカラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップと，（ｈ）上記ステップ（ｇ）で回収された該画分を，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して該変異型ヒトエリスロポエチンを有する画分を回収するステップとを，この順で含んでなる，製造方法である。
【００３８】
ウイルス不活化処理又はウイルス除去処理の工程を，本発明における精製工程に所望により加えることができる。どのウイルス不活化法又はウイルス除去法を適用するかについて特に限定はないが，それぞれ，溶媒−界面活性剤法及びナノフィルトレーション法が好適である。このようなウイルス不活化又は除去のための追加的工程は，精製工程中の隣接した如何なる２つのステップ間にも挿入することができ，又原薬組成に影響がない限り精製工程の最後のステップの完了後に実施してもよい。好適にはナノフィルトレーション法が，上記の精製工程の最後のステップの完了後に実施される。
【実施例】
【００３９】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。【００４０】
〔ダルベポエチン発現ベクターの構築〕
ダルベポエチンをコードする塩基配列の３’側にＷＡＰ−３’ＵＴＲ（whey acidic proteinの３’非翻訳領域）を配置させた塩基配列を含む配列番号３で示されるＤＮＡ断片を化学合成した。配列番号３において，5’側から４〜９ｂｐがＭｌｕ認識配列，９８〜５９２ｂｐがダルベポエチンのアミノ酸配列に対応する塩基配列，５９９〜７０９ｂｐがＷＡＰ−３’ＵＴＲの配列，７１０〜７１７ｂｐがＮｏｔＩ認識配列である。このＤＮＡ断片を，ＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＥ−ｎｅｏベクターのＭｌｕＩとＮｏｔＩの間に組み込み，これをダルベポエチン発現ベクターとして用いたｐＥ−ｎｅｏ（ＤＥＰＯ）とした。なお，ｐＥ−ｎｅｏベクターは国際公開公報（ＷＯ２０１３／１６１９５８）に記載の方法で構築した。【００４１】
〔ダルベポエチン発現用細胞の樹立〕
ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）をＡＴＣＣより入手した。ＣＨＯ細胞を，Gene Pulser XcellＴＭエレクトロポレーションシステム（BioRad社）を用いて，エレクトロポレーション法によりｐＥ−ｎｅｏ（ＤＥＰＯ）ベクターで形質転換した。形質転換後の細胞を，選択培地を用いて選択培養を行い，限界希釈法によりダルベポエチン発現細胞株を得た。このとき選択培地としては，１ｘHT Supplement，１０ｍｇ／Ｌの遺伝子組換えヒトインスリン，４ｍＭのGlutaMaxＴＭ（Thermo Fisher社）及び０．７８ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む無血清培地であるＣＤ ｏｐｔｉＣＨＯＴＭ培地（Life Science社）を用いた。得られた細胞株は，ダルベポエチンの製造に使用するまで液体窒素中で凍結して保存した。【００４２】
〔ダルベポエチン発現細胞の前培養〕
前記の凍結保存細胞を，３７℃水浴中で融解し，１６μＭのチミジン，１００μＭのヒポキサンチン，１０ｍｇ／Ｌの遺伝子組換えヒトインスリン，４ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン及び０．８ｇ／ＬのＧ−４１８を含む無血清培地のＣＤ ｏｐｔｉＣＨＯＴＭ培地（前培養用培地）に懸濁させて遠心して細胞を沈殿させ，上清を除去した。沈殿させた細胞を，２×１０５個／ｍＬの密度で前培養用培地に懸濁し，３７℃，５％ＣＯ２存在下で３〜４日間培養した。細胞数が少なくとも４×１０１１個に増殖するまで培養規模を拡大させながら，この培養を繰り返した。【００４３】
〔ダルベポエチン発現細胞の生産培養〕
前培養で増殖させた細胞を，細胞濃度が２×１０５個／ｍＬの密度で，２０００Ｌの容量の１６μＭのチミジン，１００μＭのヒポキサンチン及び２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む無血清培地であるＣＤ ｏｐｔｉＣＨＯＴＭ培地（生産培養用培地）に懸濁させ，ジャーファーメンターを用いて，６０ｒｐｍの速度で撹拌しながら３７℃で８日間培養した。【００４４】
〔ダルベポエチンの精製（疎水性カラムクロマトグラフィーステップ）〕
生産培養終了後，培養液を，Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣポッドフィルターグレードＤ０ＨＣ（１．１ｍ２×１８，Merck社）で，次いでMillistak＋ＨＣポッドフィルターグレードＡ１ＨＣ（１．１ｍ２×８，Merck社）でろ過して細胞を除去し，更に，Durapore Opticap XLT20（孔径：０．２２μｍ，Merck社）でろ過して培養上清を得た。次いで，培養上清を限外ろ過膜であるPellicon 3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane，３０ｋＤａ（Merck社）を用い，液量が約１０分の１となるまで濃縮した。濃縮中は５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を添加しながら溶液の導電率を５０Ｓ／ｍ以上に維持した。濃縮後の溶液（濃縮液）に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）緩衝液を添加して，そのｐＨ及び導電率をそれぞれ７．５及び１５Ｓ／ｍ以上となるように調整した。【００４５】
このｐＨ調整後の濃縮液を，予めカラム体積の３倍容の２ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液で平衡化しておいた，疎水性カラムであるPhenyl Sepharose 6 Fast Flow（high sub）（カラム体積：約１９．２Ｌ，ベッド高：２０ｃｍ，GE Healthcare社）に，１００ｃｍ／時の線流速で負荷した。このときカラムから流出する非吸着画分を回収した。次いで，カラムに２倍容の２ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を引き続き同流速で負荷し，カラムを洗浄した。このときカラムから流出する洗浄液を回収した。回収した非吸着画分と洗浄液を合わせた画分を，次の精製ステップに供した。【００４６】
〔ダルベポエチンの精製（マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィーステップ）〕
疎水性カラムクロマトグラフィーステップで得られた画分を，限外ろ過膜であるPellicon 3 Cassette w/Ultracel PLCTK membrane（分画分子量：３０ｋＤａ，Merck社）を用いて，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を添加しながら濃縮した。【００４７】
この濃縮液を，予めカラム体積の３倍容の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液で平衡化しておいた，マルチモーダル陰イオン交換カラムである，Capto adhere（カラム体積：約１９．２Ｌ，ベッド高：２０ｃｍ，GE Healthcare社）に，１５０ｃｍ／時の線流速で負荷した。次いで，カラムに２倍容の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を引き続き同流速で負荷し，カラムを洗浄した。次いで，カラムに３．５倍容の１４０〜２５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を引き続き同流速で負荷し，得られた画分を，次の精製ステップに供した。【００４８】
〔ダルベポエチンの精製（陰イオン交換カラムクロマトグラフィーステップ）〕
マルチモーダル陰イオン交換カラムクロマトグラフィーステップで得られた画分に純水を添加して希釈した。この溶液を，予めカラム体積の３倍容の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液で平衡化しておいた，陰イオン交換カラムクロマトグラフィーであるDEAE Sepharose Fast Flow（カラム体積：約１９．２Ｌ，ベッド高：２０ｃｍ，GE Healthcare）に，１５０ｃｍ／時の線流速で負荷した。次いで，カラムに１０倍容の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を引き続き同流速で負荷し，カラムを洗浄した。次いで，カラムに４．５倍容の８０〜２００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を引き続き同流速で負荷し，得られた画分を，次の精製ステップに供した。【００４９】
〔ダルベポエチンの精製（ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーステップ）〕
陰イオン交換カラムクロマトグラフィーステップで得られた画分に，導電率が０．３Ｓ／ｍ未満となるまで１０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ７．０）緩衝液を添加し，次いで希塩酸を添加してｐＨを７．０に調製した。【００５０】
この溶液を，予めカラム体積の４倍容の２ｍＭのＣａＣｌ２と２ｍＭのリン酸ナトリウムを含む５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ７．０）緩衝液で平衡化しておいた，ＣＨＴセラミックハイドロキシアパタイトタイプＩ（カラム体積：約１９．２Ｌ，ベッド高：２０ｃｍ，BioRad社）に，３００ｃｍ／時の線流速で負荷した。次いで，カラムに３倍容の２ｍＭのＣａＣｌ２と２ｍＭのリン酸ナトリウムを含む５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ７．０）緩衝液を引き続き同流速で負荷し，カラムを洗浄した。次いで，カラムに７．５倍容の１ｍＭのＣａＣｌ２と３ｍＭのリン酸ナトリウムを含む５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ７．０）緩衝液を引き続き同流速で負荷し，得られた画分を，次の精製ステップに供した。【００５１】
〔ダルベポエチンの精製（ゲルろ過カラムクロマトグラフィーステップ）〕
ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーステップで得られた画分を，限外ろ過膜であるPellicon 3 Cassette w/Ultracel PLCTK membrane（分画分子量：１０ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ社）で濃縮した。【００５２】
この濃縮液を，予めカラム体積の１．５倍容の１３７ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのリン酸（ｐＨ６．２）緩衝液で平衡化しておいた，ゲルろ過カラムであるSuperdex 200 prep grade column（カラム体積：約３８．５Ｌ，ベッド高：４０ｃｍ，GE Healthcare社）に，２５ｃｍ／時の線流速で負荷した。この同じ緩衝液を引き続き同流速で負荷し，２８０ｎｍで吸収ピークを示した画分を，精製ダルベポエチンを含む画分として回収した。【００５３】
〔各精製ステップにおけるダルベポエチンの定量〕
上記精製各ステップ後のダルベポエチンの量を，以下に記載したＥＬＩＳＡ法を用いて定量した。表１に示すように，上記精製工程において，精製工程の第１ステップである疎水性カラムクロマトグラフィーに４５．３ｇのダルベポエチンが供され，最終的に１０．２８ｇのダルベポエチンの精製品が得られた。すなわち，上記精製方法におけるダルベポエチンの回収率は２３％となり，この精製方法が，ダルベポエチンの精製方法として極めて効率の良いものであることが判明した。なお，表１において，「回収率／ステップ」は，各ステップにおける負荷したダルベポエチン量に対する回収されたダルベポエチン量の比率を意味し，「回収率／全体」は，精製工程に供したダルベポエチンの初期量に対する各ステップで回収されたダルベポエチン量の比率を意味する。【００５４】
【表１】
2017154869.tif 000003
【００５５】
〔ＥＬＩＳＡ法によるダルベポエチンの定量方法〕
Coating solution (Kirkegaard & Perry Laboratories社)でマウス抗ｈＥＰＯ抗体を２．５μｇ／ｍＬの濃度に希釈し，この抗体希釈液を９６ウェルプレート（Thermo Scientific社）の各ウェルに１００μＬずつ加えた。プレートを４℃で12時間若しくは室温で1時間静置して，抗体をプレートに固定させた。液を除去した後，各ウェルに１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ溶液（０．０１Ｍ リン酸ナトリウム，０．１３８Ｍ ＮａＣｌ，０．００２７Ｍ ＫＣｌ，０．０５％ Tween20，ｐＨ７．４）を３００μＬずつ加え，プレートを室温で３０分静置してブロッキングした。液を捨てた後，各ウェルをＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄し，適当な濃度に希釈した検体を各ウェルに８０μＬずつ加え，プレートを室温にて１時間プレートミキサーで振とうした。これと並行して，本発明により製造されアミノ酸分析法により定量されたダルベポエチンの精製品を希釈して０．５〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度とすることにより調製しておいた標準溶液を，ウェルに加えた。【００５６】
液を捨て，各ウェルをＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄し，次いでビオチン標識したマウス抗ｈＥＰＯモノクロナール抗体を２次抗体として各ウェルに８０μＬずつ加えた。続いてNeutrAvidin-HRP溶液８０μＬを各ウェルに加え，室温で１時間プレートミキサーで振とうした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後，ＴＭＢ基質溶液（Kirkegaard & Perry Laboratories社）を加え，室温で４〜８分間静置した後，TMB Stop Solution（Kirkegaard & Perry Laboratories社）を１００μＬずつ加えて反応を停止させた。マイクロウエルプレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準溶液の測定値から検量線を作成し，この検量線に各検体の測定値を内挿することにより，各検体に含まれるダルベポエチン濃度を算出した。【００５７】
〔ダルベポエチンの純度の評価（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動）〕
上記工程により精製されたダルベポエチンを，還元性且つ加熱（７０℃，１０分）条件下に，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に付した。クマジーブリリアントブルーによるゲルの染色の結果，ダルベポエチンは分子量約４５ｋＤの位置に単一のバンドとして示された（図１）。【００５８】
〔ダルベポエチンの純度の評価（ＳＥ−ＨＰＬＣ分析）〕
ＳＥ−ＨＰＬＣ分析は，LC-20Aシステム，SPD-20AV,UV/VIS検出器（島津製作所）を用いて行った。TSKgel g3000SWXLカラム（７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ，TOSOH）をＬＣ−２０Ａシステムにセットし，０．５ｍＬ／分の線流速でリン酸緩衝液（２００ｍＭリン酸ナトリウム，２００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．８）を流してカラムを平衡化させた後，このカラムに，上記工程により精製されたダルベポエチンを０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する溶液の１００μＬを負荷した。引き続き同流速でＰＢＳを負荷し，２１５ｎｍでの吸光度をモニターすることにより，溶出プロフィールを作成した。上記工程により精製されたダルベポエチンは，ＳＥ−ＨＰＬＣ分析で得られた溶出プロファイルで単一のピークのみを示した（図２）。【００５９】
上記のダルベポエチンの純度の評価の結果は，上記精製工程により精製されたダルベポエチンが，不純物を実質的に含まず，腎性貧血の治療剤等の医薬品としてそのまま使用し得る高い純度のものであることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば，腎性貧血の治療剤等の医薬品として使用できる，高い純度の変異型ヒトエリスロポエチンを提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００６１】
配列番号２：ダルベポエチン
配列番号３：ダルベポエチンコード領域を含む合成ＤＮＡ
【図１】
2017154869.tif 000004
【図２】
2017154869.tif 000005
【配列表】
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【国際調査報告】
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