(57)【要約】  本発明は、Ｃ５−エピメリ化効率が向上した、ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物の製造方法、およびヘパラン硫酸の製造方法を提供する。具体的には、本発明は、以下（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるタンパク質の存在下において、ヘパロサン化合物からヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物を生成することを含む、ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物の製造方法を提供する：（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；（Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；（Ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質；（Ｅ）配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；および（Ｆ）配列番号５のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるタンパク質の存在下において、ヘパロサン化合物からヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物を生成することを含む、ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物の製造方法：
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ）配列番号５のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；および
（Ｆ）配列番号５のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
（Ｂ）のタンパク質が（Ｂ’）配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質であり、
（Ｅ）のタンパク質が（Ｅ’）配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質である、
請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が以下（Ｅ１）〜（Ｆ１）からなる群より選ばれるタンパク質である、請求項１または２記載の方法：
（Ｅ１）配列番号５６、５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ２）配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；および
（Ｆ１）配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列において１〜２５個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質がゼブラフィッシュに由来する、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質を産生する形質転換微生物、またはその抽出物の存在下において、ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物が生成される、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記形質転換微生物が、以下（ａ）〜（ｊ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む宿主細胞である、請求項５記載の方法：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号３のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号３のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号４のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号４のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｊ）（ａ）〜（ｉ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
【請求項７】
（ｂ）のポリヌクレオチドが（ｂ’）配列番号１のヌクレオチド配列と９０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
（ｅ）のポリヌクレオチドが（ｅ’）配列番号３のヌクレオチド配列と９０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
（ｈ）のポリヌクレオチドが（ｈ’）配列番号４のヌクレオチド配列と９０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、
請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが以下（ｅ１）〜（ｊ１）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドである、請求項６または７記載の方法：
（ｅ１）配列番号５５、５８、６１、６４、および６７からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ２）配列番号５８、６１、６４、および６７からなる群より選ばれるヌクレオチド配列と９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｊ１）（ｅ１）または（ｅ２）のポリヌクレオチドの縮重変異体。
【請求項９】
前記形質転換微生物が、エシェリヒア属細菌である、請求項６〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記形質転換微生物が、エシェリヒア・コリである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ヘパロサン化合物がＮ−硫酸化ヘパロサンである、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記ヘパロサン化合物が低分子化ヘパロサンである、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
ヘパラン硫酸の製造方法であって、
ヘパロサンを、ヘキスロン酸残基のＣ５−エピメリ化、ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−脱アセチル化、α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化、およびα−Ｄ−グルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸化を含む処理に供して、ヘパラン硫酸を生成することを含み、
Ｃ５−エピメリ化が、以下（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるタンパク質の存在下において行われる、方法：
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ）配列番号５のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；および
（Ｆ）配列番号５のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１４】
（Ｂ）のタンパク質が（Ｂ’）配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質であり、
（Ｅ）のタンパク質が（Ｅ’）配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質である、
請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が以下（Ｅ１）〜（Ｆ１）からなる群より選ばれるタンパク質である、請求項１３または１４記載の方法：
（Ｅ１）配列番号５６、５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ２）配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；および
（Ｆ１）配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列において１〜２５個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１６】
処理が、ヘパロサンの低分子化をさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
以下（Ｅ１）〜（Ｆ１）からなる群より選ばれるタンパク質：
（Ｅ１）配列番号５６、５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ２）配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；および
（Ｆ１）配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列において１〜２５個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物の製造方法、およびヘパラン硫酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは、ヘパラン硫酸の一種であり、抗凝固活性を有する化合物である。動物由来ヘパリンは、品質管理の面で問題があり、品質管理された非動物由来ヘパリンの製造開発が検討されてきた。非動物由来ヘパリンを製造する方法には、例えば、微生物を用いて生産されたヘパロサンを、硫酸化および異性化等の反応に供してヘパリンを製造する方法がある（特許文献１、２、非特許文献１〜３）。【０００３】
ヘパロサンは、Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基からなる二糖の繰り返し構造［→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］より構成される多糖である。ヘパリンは、ヘパロサンのＤ−グルクロン酸残基の一部が、エピマーであるα−Ｌ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）に異性化された構造を有する。したがって、ヘパロサンからヘパリン等のヘパラン硫酸を製造するためには、ヘキスロン酸残基の一部を異性化する反応、すなわちＤ−グルクロン酸残基の一部をα−Ｌ−イズロン酸に異性化する反応（Ｃ５−エピメリ化反応）が必要となる。Ｃ５−エピメリ化反応には、Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼを用いた酵素的手法がある。Ｃ５−エピメラーゼとしては、これまでに哺乳類由来のＣ５−エピメラーゼの利用が報告されている（特許文献１〜３、非特許文献１〜３）。その他、海性細菌由来のＣ５−エピメリ化反応を触媒するタンパク質も同定されている（非特許文献４）。しかしながら、いずれもＣ５−エピメリ化活性は十分ではなく、より効率的な酵素の取得が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第８，２２７，４４９号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１２−３２２１１４号
【特許文献３】国際公開第０２／４６３７９号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｉｎｄａｈｌ  Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８（２）：３４９−３５２
【非特許文献２】Ｚｈａｎｇ  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３０（３９）：１２９９８−１３００７
【非特許文献３】Ｃｈｅｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｄｅｃ  ３０；２８０（５２）：４２８１７−２５．
【非特許文献４】Ｊｏｈｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１３  Ａｕｇ  ２３；２８８（３４）：２４３３２−９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ヘパラン硫酸の効率的な製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意研究した結果、ヘパラン硫酸の製造に必要とされるＣ５−エピメリ化を、ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼと８０％以上の配列相同性を有する一連のタンパク質（表４を参照）を用いて効率良く実施できることを見出し、本願発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるタンパク質の存在下において、ヘパロサン化合物からヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物を生成することを含む、ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物の製造方法：
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ）配列番号５のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；および
（Ｆ）配列番号５のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
〔２〕（Ｂ）のタンパク質が（Ｂ’）配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質であり、
（Ｅ）のタンパク質が（Ｅ’）配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質である、
〔１〕の方法。
〔３〕前記タンパク質が以下（Ｅ１）〜（Ｆ１）からなる群より選ばれるタンパク質である、〔１〕または〔２〕の方法：
（Ｅ１）配列番号５６、５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ２）配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；および
（Ｆ１）配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列において１〜２５個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
〔４〕前記タンパク質がゼブラフィッシュに由来する、〔１〕〜〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕前記タンパク質を産生する形質転換微生物、またはその抽出物の存在下において、ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物が生成される、〔１〕〜〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕前記形質転換微生物が、以下（ａ）〜（ｊ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む宿主細胞である、〔５〕の方法：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号３のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号３のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号４のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号４のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｊ）（ａ）〜（ｉ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
〔７〕（ｂ）のポリヌクレオチドが（ｂ’）配列番号１のヌクレオチド配列と９０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
（ｅ）のポリヌクレオチドが（ｅ’）配列番号３のヌクレオチド配列と９０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
（ｈ）のポリヌクレオチドが（ｈ’）配列番号４のヌクレオチド配列と９０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、
〔６〕の方法。
〔８〕前記ポリヌクレオチドが以下（ｅ１）〜（ｊ１）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドである、〔６〕または〔７〕の方法：
（ｅ１）配列番号５５、５８、６１、６４、および６７からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ２）配列番号５８、６１、６４、および６７からなる群より選ばれるヌクレオチド配列と９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｊ１）（ｅ１）または（ｅ２）のポリヌクレオチドの縮重変異体。
〔９〕前記形質転換微生物が、エシェリヒア属細菌である、〔６〕〜〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕前記形質転換微生物が、エシェリヒア・コリである、〔９〕の方法。
〔１１〕前記ヘパロサン化合物がＮ−硫酸化ヘパロサンである、〔１〕〜〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕前記ヘパロサン化合物が低分子化ヘパロサンである、〔１〕〜〔１１〕のいずれかの方法。
〔１３〕ヘパラン硫酸の製造方法であって、
ヘパロサンを、ヘキスロン酸残基のＣ５−エピメリ化、ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−脱アセチル化、α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化、およびα−Ｄ−グルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸化を含む処理に供して、ヘパラン硫酸を生成することを含み、
Ｃ５−エピメリ化が、以下（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるタンパク質の存在下において行われる、方法：
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ）配列番号５のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；および
（Ｆ）配列番号５のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
〔１４〕（Ｂ）のタンパク質が（Ｂ’）配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質であり、
（Ｅ）のタンパク質が（Ｅ’）配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質である、
〔１３〕の方法。
〔１５〕前記タンパク質が以下（Ｅ１）〜（Ｆ１）からなる群より選ばれるタンパク質である、〔１３〕または〔１４〕の方法：
（Ｅ１）配列番号５６、５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ２）配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；および
（Ｆ１）配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列において１〜２５個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
〔１６〕処理が、ヘパロサンの低分子化をさらに含む、〔１３〕〜〔１５〕のいずれかの方法。
〔１７〕以下（Ｅ１）〜（Ｆ１）からなる群より選ばれるタンパク質：
（Ｅ１）配列番号５６、５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ２）配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；および
（Ｆ１）配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列において１〜２５個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼをコードする天然型の全長ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ３８８５１７．１、配列番号１）を示す図である。図中の枠内の配列は、部分アミノ酸配列（配列番号２におけるＧｌｙ７０−Ａｓｎ５８５：配列番号５）をコードする天然型ヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図２】図２は、ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの天然型の全長アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ３８８５１７．１、配列番号２）を示す図である。図中の枠内の配列（Ｇｌｙ７０−Ａｓｎ５８５の部分アミノ酸配列）は、配列番号５に相当する（実施例２を参照）。
【図３】図３は、ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（配列番号５）をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号４）を示す図である（実施例２を参照）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物の製造方法を提供する。本発明の方法は、以下（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるタンパク質の存在下において、ヘパロサン化合物からヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物を生成することを含む：
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ）配列番号５のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；および
（Ｆ）配列番号５のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１１】
本発明で用いられるタンパク質は、以下（Ｅ１）〜（Ｆ１）からなる群より選ばれるタンパク質であってもよい：
（Ｅ１）配列番号５６、５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ２）配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；および
（Ｆ１）配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列において１〜２５個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１２】
本発明における「ヘパロサン化合物」には、ヘパロサン、およびヘパロサンの誘導体が含まれる。ヘパロサンは、Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基からなる二糖の繰り返し構造［→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］より構成される多糖である。ヘパロサンは、例えば、ヘパロサン生産能を有する微生物を利用した発酵法により製造できる（例、ＷＯ２０１５／０５０１８４）。
【００１３】
本発明における「ヘパロサンの誘導体」とは、以下（１）〜（６）からなる群より選ばれる１以上（例、１、２、３、４、５または６）の修飾を有するヘパロサンをいう：
（１）低分子化；
（２）ヘパロサン中のα−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−アセチル基のＮ−脱アセチル化（例、部分的Ｎ−脱アセチル化）；
（３）ヘパロサン中のα−Ｄ−グルコサミン残基のアミノ基のＮ−硫酸化；
（４）ヘパロサン中のヘキスロン酸残基の２位の水酸基の硫酸化（２−Ｏ−硫酸化）；
（５）α−Ｄ−グルコサミン残基の３位の水酸基の硫酸化（３−Ｏ−硫酸化）；および
（６）α−Ｄ−グルコサミン残基の６位の水酸基の硫酸化（６−Ｏ−硫酸化）。
このような誘導体は、後述するような、α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−脱アセチル化、低分子化、α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−硫酸化、ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化、およびα−Ｄ−グルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸化の処理を利用することにより得ることができる。
【００１４】
一実施形態では、ヘパロサン化合物は、Ｎ−硫酸化ヘパロサンであってもよい。Ｎ−硫酸化ヘパロサンは、例えば、ヘパロサンを、後述するＮ−脱アセチル化（好ましくは部分的Ｎ−脱アセチル化）およびＮ−硫酸化の処理に供することにより得ることができる。
【００１５】
別の実施形態では、ヘパロサン化合物は、低分子化ヘパロサン化合物であってもよい。低分子化ヘパロサン化合物は、例えば、ヘパロサンを、後述する低分子化の処理に供することにより得ることができる。
【００１６】
好ましい実施形態では、ヘパロサン化合物は、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンであってもよい。Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンは、例えば、ヘパロサン化合物を、後述するＮ−脱アセチル化（好ましくは部分的Ｎ−脱アセチル化）、低分子化、およびＮ−硫酸化の処理に供することにより得ることができる。
【００１７】
本発明において、「ヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）」という用語は、β−Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）およびα−Ｌ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）の総称として用いる。「ヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）」という用語は、すなわち「β−Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）」および「α−Ｌ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）」という用語は、特記しない限り、本発明の方法の実施態様に応じて取り得る全ての誘導体を包含する。「α−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）」という用語は、特記しない限り、本発明の方法の実施態様に応じて取り得る全ての誘導体を包含する。なお、Ｃ４−Ｃ５間の結合が二重結合であるＨｅｘＡ残基は、ＩｄｏＡ残基とＧｌｃＡ残基の区別がないため、本発明の多糖等の多糖を特定する各パラメータを算出する際には、特記しない限り、ＨｅｘＡ残基には該当するが、ＩｄｏＡ残基とＧｌｃＡ残基のいずれにも該当しないものとして扱う。
【００１８】
本発明において、「ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物」とは、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基の一部がイズロン酸（ＩｄｏＡ）残基へ異性化されたヘパロサン化合物である。グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基のイズロン酸（ＩｄｏＡ）残基への異性化を、「Ｃ５−エピメリ化」と呼ぶ。「Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性」とは、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基のイズロン酸（ＩｄｏＡ）残基への異性化（Ｃ５−エピメリ化）を触媒できる活性である。Ｃ５−エピメリ化の反応条件は、当業者が適宜設定することができる。Ｃ５−エピメリ化の反応条件としては、例えば、既報（Ｃｈｅｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｄｅｃ  ３０；２８０（５２）：４２８１７−２５．）の条件を参照することができる。また、Ｃ５−エピメリ化の反応条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。Ｃ５−エピメリ化の程度（すなわちエピメリ化率）は、例えば、二糖分析により確認することができる。すなわち、エピメリ化率は、多糖を二糖分析に供した際の、ＩｄｏＡ残基またはＧｌｃＡ残基を有する二糖単位の総量に対する、ＩｄｏＡ残基を有する二糖単位の量の比率（モル比）として算出することができる。
【００１９】
配列番号５のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列（Ｇｌｙ７０−Ａｓｎ５８５）に相当し、膜アンカー部位を含むアミノ酸配列（Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ６９）を欠失させたものである。配列番号５６、５９、６２、６５、および６８のアミノ酸配列は、配列番号５のアミノ酸配列を改変したアミノ酸配列である。
【００２０】
タンパク質（Ｂ）または（Ｅ）では、配列番号２または５のアミノ酸配列との相同性％は、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。タンパク質（Ｅ２）では、配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列との相同性％は、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％以上であってもよい。上述したアミノ酸配列および後述するヌクレオチド配列の相同性（即ち、同一性または類似性）は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、相同性を計算してもよい。また、相同性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定で類似性をｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。あるいは、相同性は、ＮＥＥＤＬＥプログラム（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９７０；４８：４４３−４５３）検索において、デフォルト設定のパラメータ（Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、Ｅｘｔｅｎｄ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５、Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２）を用いて得られた値（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）であってもよい。これらの計算で導き出される相同性％の値のうち、最も低い値を採用してもよい。相同性％としては、好ましくは同一性％が利用される。
【００２１】
タンパク質（Ｃ）、（Ｆ）または（Ｆ１）では、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる１、２、３または４種の変異により、１個または数個のアミノ酸残基が改変され得る。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個または数個」は、タンパク質の活性を大きく損なわない個数を示す。タンパク質（Ｃ）、（Ｆ）において、用語「１個または数個」が示す数は、例えば、１〜１２０個、好ましくは１〜１１０個、より好ましくは１〜１００個、１〜９０個、１〜８０個、１〜７５個、１〜７０個、１〜６０個、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。タンパク質（Ｆ１）において、用語「１個または数個」が示す数は、例えば、１〜２５個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。
【００２２】
（Ａ）〜（Ｆ）および（Ｅ１）〜（Ｆ１）からなる群より選ばれるタンパク質は、Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有することから、ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物の特異的な生成に優れ得るという特性を有する。特定の測定条件で活性を測定した場合、タンパク質（Ｂ）および（Ｃ）はタンパク質（Ａ）の活性を基準として、（Ｅ）および（Ｆ）はタンパク質（Ｄ）の活性を基準として、ならびに（Ｅ２）および（Ｆ１）はタンパク質（Ｅ１）の活性を基準として、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上、または同等以上の活性を有することが好ましい。このような特定の測定条件としては、例えば、反応液（２ｍｇ／ｍＬ  Ｎ−硫酸化ヘパロサン、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ塩化カルシウム）に、目的のタンパク質を発現する微生物の無細胞抽出液（菌体の超音波破砕および遠心分離後の上清液）を３０％添加し、３７℃で３０分間または１２時間反応させる条件が挙げられる。
【００２３】
タンパク質（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｅ２）および（Ｆ１）は、目的特性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に、変異が導入されていてもよい。目的特性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかである。具体的には、当業者は、１）同種の特性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、本発明で用いられるタンパク質のアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
【００２４】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００２５】
本発明で用いられるタンパク質はまた、異種部分とペプチド結合を介して連結された融合タンパク質であってもよい。このような異種部分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、およびこれらの変異型等の目的タンパク質の精製に利用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ−ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能を有するペプチド成分（例、全長タンパク質またはその一部）、ならびにリンカーが挙げられる。
【００２６】
本発明で用いられるタンパク質としては、例えば、ゼブラフィッシュに由来するタンパク質、天然に生じるそのホモログ、または人為的に作出された変異タンパク質が挙げられる。変異タンパク質は、例えば、目的タンパク質をコードするＤＮＡに変異を導入し、得られた変異ＤＮＡを用いて変異タンパク質を産生させることにより、得ることができる。変異導入法としては、例えば、部位特異的変異導入、ならびに無作為変異導入処理（例、変異剤による処理、および紫外線照射）が挙げられる。
【００２７】
一実施形態では、本発明の方法は、本発明で用いられるタンパク質自体を用いて行うことができる。本発明で用いられるタンパク質として、天然タンパク質または組換えタンパク質を利用することができる。組換えタンパク質は、例えば、無細胞系ベクターを用いて、または本発明で用いられるタンパク質を産生する微生物から得ることができる。本発明で用いられるタンパク質は、未精製、粗精製または精製タンパク質として利用することができる。これらのタンパク質としては、反応において、固相に固定された固相化タンパク質として利用されてもよい。
【００２８】
本発明で用いられるタンパク質を公知の方法で単離し、場合によっては更に精製することにより、目的とするタンパク質が得られる。タンパク質を産生する微生物としては、形質転換微生物が好ましい。形質転換微生物を用いた場合には、不活性な目的タンパク質会合体、すなわちタンパク質封入体として目的タンパク質を得た後、これを適当な方法で活性化することも可能である。活性化後、活性型タンパク質を公知の方法で分離精製することにより目的タンパク質を得てもよい。
【００２９】
微生物を培養するための培地は公知であり、例えば、ＬＢ培地などの栄養培地や、Ｍ９培地などの最小培地に炭素源、窒素源、ビタミン源等を添加して用いることができる。形質転換微生物は宿主に応じて、通常、１６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で５〜１６８時間、好ましくは８〜７２時間培養される。宿主に依存して、振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌を行ってもよく、通気を行ってもよい。放線菌を発現宿主として選択する場合は、目的タンパク質を生産させるために使用し得る条件を適宜用いることが出来る。また、目的タンパク質の発現のために誘導型プロモーターを用いた場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。
【００３０】
産生された目的タンパク質は、形質転換微生物の抽出物から公知の塩析、等電点沈殿法もしくは溶媒沈殿法等の沈殿法、透析、限外濾過もしくはゲル濾過等の分子量差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の疎水度の差を利用する方法やその他アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、等電点電気泳動法等、またはこれらの組み合わせにより、精製および単離することが可能である。目的タンパク質を分泌発現させた場合には、形質転換微生物を培養して得られた培養液から、菌体を遠心分離等で除くことで目的タンパク質を含む培養上清が得られる。この培養上清からも目的タンパク質を精製および単離することが可能である。
【００３１】
例えば、形質転換微生物の培養終了後、遠心により集菌した菌体を菌体破砕用バッファー（２０〜１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波破砕を約１０分間行うことにより菌体を破砕することができる。菌体破砕は、トルエン等の溶媒を培養液に加え行うこともできる。この破砕処理液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を上述した精製操作をすることができる。また、前記遠心後の沈殿について必要に応じて塩酸グアニジウムまたは尿素などで可溶化したのち更に精製することもできる。目的タンパク質を分泌発現させた場合には、形質転換微生物の培養終了後、培養液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を上述した精製操作をすることができる。
【００３２】
具体的には、目的タンパク質の精製は、例えば以下のように行うことができる。宿主の培養終了後、培養上清または細胞抽出物に硫酸アンモニウム（２．８Ｍ）を加えて沈殿分画後、更に、ＣＭ  セファデックス  Ｃ−５０、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０イオン交換カラムクロマトグラフィー、オクチルセファロースＣＬ−４ＢおよびフェニルセファロースＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフィー等の操作を行うことによって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動した場合にゲル上で単一バンドを呈する程度にまで精製することができる。
【００３３】
得られた目的タンパク質の活性は、Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を測定することにより評価することができる（例、実施例を参照）。
【００３４】
別の実施形態では、本発明の方法は、本発明で用いられるタンパク質を産生する形質転換微生物、またはその抽出物の存在下で行うことができる。
【００３５】
本発明で用いられるタンパク質を産生する微生物の抽出物としては、任意の方法により処理された、目的タンパク質を含有する処理液を使用することができる。このような処理としては、例えば、上述した単離および精製で言及した方法、ならびに微生物の死滅を可能にする殺微生物処理方法が挙げられる。殺微生物処理方法としては、微生物の死滅を可能にする任意の方法を用いることができるが、例えば、熱処理、酸性処理、アルカリ性処理、界面活性剤処理、および有機溶媒処理が挙げられる。
【００３６】
好ましい実施形態では、形質転換微生物は、以下（ａ）〜（ｊ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む宿主細胞である：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号３のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号３のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号４のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号４のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｊ）（ａ）〜（ｉ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
【００３７】
本発明で用いられるポリヌクレオチドは、以下（ｅ１）〜（ｊ１）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドであってもよい：
（ｅ１）配列番号５５、５８、６１、６４、および６７からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ２）配列番号５８、６１、６４、および６７からなる群より選ばれるヌクレオチド配列と９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｊ１）（ｅ１）または（ｅ２）のポリヌクレオチドの縮重変異体。
【００３８】
上記（ａ）〜（ｊ）および（ｅ１）〜（ｊ１）のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。配列番号１のヌクレオチド配列は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする。配列番号３および４のヌクレオチド配列は、配列番号５のアミノ酸配列をコードする。配列番号１のヌクレオチド配列は、ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼをコードする天然型の全長ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ３８８５１７．１）である。配列番号３は、配列番号１のヌクレオチド配列の部分配列であり、Ｇ７０−Ａｓｎ５８５に相当する。配列番号４のヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド配列の縮重変異体である。配列番号５５、５８、６１、６４、および６７のヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号５６、５９、６２、６５、および６８のアミノ酸配列をコードする。
【００３９】
上記ポリヌクレオチド（ｂ）、（ｅ）、または（ｈ）では、配列番号１、３、または４のヌクレオチド配列に対するヌクレオチド配列の相同性％は、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。上記ポリヌクレオチド（ｅ２）では、配列番号５８、６１、６４、および６７からなる群より選ばれるヌクレオチド配列との相同性％は、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％以上であってもよい。
【００４０】
上記ポリヌクレオチド（ｃ）、（ｆ）、または（ｉ）において、用語「ストリンジェント条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、ストリンジェント条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。
【００４１】
上記ポリヌクレオチド（ｊ）および（ｊ１）において、用語「縮重変異体」とは、変異前のポリヌクレオチド中の所定のアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンが、同一アミノ酸残基をコードする別のコドンに変更されたポリヌクレオチド変異体をいう。このような縮重変異体はサイレント変異に基づく変異体であることから、縮重変異体によりコードされるタンパク質は、変異前のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質と同一である。
【００４２】
好ましくは、縮重変異体は、それが導入されるべき宿主細胞のコドン使用頻度に適合するようにコドンが変更されたポリヌクレオチド変異体である。ある遺伝子を異種宿主細胞（例、微生物）で発現させる場合、コドン使用頻度の相違により、対応するｔＲＮＡ分子種が十分に供給されず、翻訳効率の低下および／または不正確な翻訳（例、翻訳の停止）が生じることがある。例えば、エシェリヒア・コリでは、表１に示される低頻度コドンが知られている。
【００４３】
【表１】
2018135027.tif 000002
【００４４】
したがって、本発明では、後述するような宿主細胞（例、微生物）のコドン使用頻度に適合する縮重変異体を利用することができる。例えば、本発明の縮重変異体は、アルギニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、およびプロリン残基からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸残基をコードするコドンが変更されたものであってもよい。より具体的には、本発明の縮重変異体は、低頻度コドン（例、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＧＧＡ、ＡＵＡ、ＣＵＡ、およびＣＣＣ）からなる群より選ばれる１種以上のコドンが変更されたものであってもよい。好ましくは、縮重変異体は、以下からなる群より選ばれる１種以上（例、１種、２種、３種、４種、または５種）のコドンの変更を含んでいてもよい：
ｉ）Ａｒｇをコードする４種のコドン（ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、およびＣＧＡ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のコドンの、Ａｒｇをコードする別のコドン（ＣＧＵ、またはＣＧＣ）への変更；
ｉｉ）Ｇｌｙをコードする１種のコドン（ＧＧＡ）の、別のコドン（ＧＧＧ、ＧＧＵ、またはＧＧＣ）への変更；
ｉｉｉ）Ｉｌｅをコードする１種のコドン（ＡＵＡ）の、別のコドン（ＡＵＵ、またはＡＵＣ）への変更；
ｉｖ）Ｌｅｕをコードする１種のコドン（ＣＵＡ）の、別のコドン（ＵＵＧ、ＵＵＡ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、またはＣＵＣ）への変更；ならびに
ｖ）Ｐｒｏをコードする１種のコドン（ＣＣＣ）の、別のコドン（ＣＣＧ、ＣＣＡ、またはＣＣＵ）への変更。
本発明の縮重変異体がＲＮＡの場合、上記のとおりヌクレオチド残基「Ｕ」が利用されるべきであるが、本発明の縮重変異体がＤＮＡの場合、ヌクレオチド残基「Ｕ」の代わりに「Ｔ」が利用されるべきである。宿主細胞のコドン使用頻度に適合させるためのヌクレオチド残基の変異数は、変異前後で同一のタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、１〜４００個、１〜３００個、１〜２００個、または１〜１００個である。
【００４５】
低頻度コドンの同定は、当該分野で既知の技術を利用することにより、任意の宿主細胞の種類およびゲノム配列情報に基づいて容易に行うことができる。したがって、縮重変異体は、低頻度コドンの非低頻度コドン（例、高頻度コドン）への変更を含むものであってもよい。また、低頻度コドンのみならず、生産菌株のゲノムＧＣ含量への適合性などの要素を考慮して変異体を設計する方法が知られているので（Ａｌａｎ  Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ：  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ２００６  Ｊｕｎ  ６；７：２８５．）、このような方法を利用してもよい。このように、上述の変異体は、それが導入され得る任意の宿主細胞（例、後述するような微生物）の種類に応じて適宜作製できる。
【００４６】
用語「発現単位」とは、タンパク質として発現されるべき所定のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む、当該ポリヌクレオチドの転写、ひいては当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生を可能にする最小単位をいう。発現単位は、ターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。発現単位は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。
【００４７】
発現単位は、宿主細胞に対して同種であっても異種であってもよいが、好ましくは異種発現単位である。用語「異種発現単位」とは、発現単位が宿主細胞に対して異種であることを意味する。したがって、本発明では、発現単位を構成する少なくとも１つのエレメントが宿主細胞に対して異種である。宿主細胞に対して異種である、発現単位を構成するエレメントとしては、例えば、上述したエレメントが挙げられる。好ましくは、異種発現単位を構成する、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、もしくはプロモーターの一方、または双方が、宿主細胞に対して異種である。したがって、本発明では、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、もしくはプロモーターの一方、または双方が、宿主細胞以外の生物（例、原核生物および真核生物、または微生物、昆虫、植物、および哺乳動物等の動物）もしくはウイルスに由来するか、または人工的に合成されたものである。あるいは、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞に対して異種であってもよい。好ましくは、目的タンパク質が、宿主細胞に対して異種である。
【００４８】
異種発現単位を構成するプロモーターは、その下流に連結されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を宿主細胞で発現させることができるものであれば特に限定されない。例えば、プロモーターは、宿主細胞に対して同種であっても異種であってもよい。例えば、組換えタンパク質の産生に汎用される構成または誘導プロモーターを用いることができる。このようなプロモーターとしては、例えば、ＰｈｏＡプロモーター、ＰｈｏＣプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターが挙げられる。好ましくは、宿主細胞で強力な転写活性を有するプロモーターを用いることができる。宿主細胞で強力な転写活性を有するプロモーターとしては、例えば、宿主細胞で高発現している遺伝子のプロモーター、およびウイルス由来のプロモーターが挙げられる。
【００４９】
本発明において、形質転換微生物として使用される宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属細菌（例、エシェリヒア・コリ）、放線菌およびコリネ型細菌を含む種々の微生物が挙げられる。本発明において宿主細胞として用いられるエシェリヒア・コリには一般にクローニングや異種タンパク質の発現によく利用される菌株、例えば、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、ＪＭ１０９、ＣＪ２３６、ＭＶ１１８４が含まれる。本発明において宿主細胞として用いられる放線菌には一般に異種タンパク質の発現によく利用される菌株、例えば、Ｓ．リビダンス  ＴＫ２４やＳ．セリカラーＡ３（２）が含まれる。本発明において宿主細胞として用いられるコリネ型細菌とは好気性のグラム陽性桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４１，２５５（１９８１））、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。コリネ型細菌を使用することの利点には、これまでにタンパク質の分泌に好適とされてきたカビ、酵母やＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌と比べて本来的に菌体外に分泌されるタンパク質が極めて少なく、目的タンパク質を分泌生産した場合にその精製過程が簡略化、省略化できること、分泌生産した酵素を用いて酵素反応を行う場合には、培養上清を酵素源として用いることができるため、菌体成分、夾雑酵素等による不純物、副反応を低減させることができること、糖、アンモニアや無機塩等を含む単純な培地で容易に生育するため、培地代や培養方法、培養生産性の点で優れていることが含まれる。また、Ｔａｔ系分泌経路を利用することにより、これまでに知られていたＳｅｃ系分泌経路では分泌生産が困難なタンパク質であったイソマルトデキストラナーゼやプロテイングルタミナーゼ等産業上有用なタンパク質も効率良く分泌させることが可能である（ＷＯ２００５／１０３２７８）。その他、ＷＯ０１／２３４９１、ＷＯ０２／０８１６９４、ＷＯ０１／２３４９１等に開示されるコリネバクテリウム・グルタミカムを用いることもできる。
【００５０】
本発明で用いられる形質転換微生物は、当該分野において公知の任意の方法により作製することができる。例えば、このような発現単位は、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた形態、または宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれていない形態（例、発現ベクターの状態）において、宿主細胞に含まれる。発現単位を含む宿主細胞は、当該分野において公知の任意の方法（例、コンピテント細胞法、エレクトロポレーション法）により、発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じる組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれることができる。一方、発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じない非組込み型ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれず、宿主細胞内において、発現ベクターの状態のまま、ゲノムＤＮＡから独立して存在できる。あるいは、ゲノム編集技術（例、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ））により発現単位を宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むことが可能である。
【００５１】
本発明で用いられる発現ベクターは、発現単位として上述した最小単位に加えて、宿主細胞で機能するターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。
【００５２】
発現ベクターはまた、宿主細胞のゲノムＤＮＡとの相同組換えのために、宿主細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする領域をさらに含んでいてもよい。例えば、発現ベクターは、それに含まれる発現単位が一対の相同領域（例、宿主細胞のゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。発現単位が導入されるべき宿主細胞のゲノム領域（相同領域の標的）としては、特に限定されないが、宿主細胞において発現量が多い遺伝子のローカスであってもよい。
【００５３】
発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、または人工染色体であってもよい。発現ベクターはまた、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても非組込み型ベクターであってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクター、またはＲＮＡベクター（例、レトロウイルス）であってもよい。発現ベクターはまた、汎用される発現ベクターを用いてもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体が挙げられる。また、コリネバクテリウム・グルタミカムのようなコリネ型細菌を宿主細胞として選択する場合、高コピーベクターであるｐＰＫ４などを好適に利用することができる。
【００５４】
本発明の方法は、上述したように、上記タンパク質自体、および／または上記タンパク質を産生する微生物もしくはその処理液の存在下で、アミノ酸もしくはその塩およびカルボン酸もしくはその塩を含む反応系において行うことができる。
【００５５】
本発明はまた、ヘパラン硫酸の製造方法を提供する。本発明の方法は、ヘパロサンを、ヘキスロン酸残基のＣ５−エピメリ化、ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸化を含む処理に供して、ヘパラン硫酸を生成することを含む。
【００５６】
ヘパラン硫酸の製造方法において、Ｃ５−エピメリ化は、上述した方法により行うことができる。
【００５７】
ヘパラン硫酸の製造方法において、ヘパロサン化合物のＮ−脱アセチル化、ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化、およびα−Ｄ−グルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸化は、当該分野において周知の方法により行うことができる（例、米国特許第８，２２７，４４９号；米国特許出願公開第２０１２−３２２１１４号；Ｌｉｎｄａｈｌ  Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８（２）：３４９−３５２；Ｚｈａｎｇ  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３０（３９）：１２９９８−１３００７；Ｃｈｅｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｄｅｃ  ３０；２８０（５２）：４２８１７−２５．）。これらの処理の実施順序は、ヘパラン硫酸が得られる限り、特に制限されない。各処理の実施順序は、各処理を実施する手段や各処理に用いられる酵素の基質特異性等の諸条件に応じて適宜設定できる。上記処理は、同時または別個に実施してもよい。
【００５８】
上記処理の代表的な実施順序の例としては、下記の順序が挙げられる：
１．ヘパロサン化合物のＮ−脱アセチル化；
２．α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−硫酸化；
３．ヘキスロン酸残基のＣ５−エピメリ化；および
４．ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化、およびα−Ｄ−グルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸化。
また、２以上の処理は、並行して行うこともできる。
【００５９】
ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化、およびα−Ｄ−グルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸化は、いずれの順序により実施してもよい。代表的な順序の例として、ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化、およびα−Ｄ−グルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸化の順序、ならびに、ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸化、およびα−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化の順序が挙げられる。また、２以上の処理は、並行して行うこともできる。
【００６０】
Ｎ−脱アセチル化は、例えば、脱アセチル化剤を利用して化学的に実施できる。脱アセチル化剤としては、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩およびヒドラジン等の塩基性物質が挙げられる。アルカリ金属塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化ルビジウムおよび水酸化セシウムが挙げられる。アルカリ土類金属塩としては、例えば、水酸化ベリリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化ストロンチウムおよび水酸化バリウムが挙げられる。
【００６１】
Ｎ−脱アセチル化は、部分的Ｎ−脱アセチル化が好ましい。Ｎ−脱アセチル化は、例えば、Ｎ−アセチル基の残存率が下記のような値となるように実施することができる。すなわち、Ｎ−アセチル基の残存率は、例えば、１％以上、１．５％以上、３％以上、５％以上、７％以上、９％以上、または１１％以上であってもよく、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３３％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、または１７％以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。Ｎ−アセチル基の残存率は、具体的には、例えば、１％〜３３％、７％〜３３％、７％〜３０％、または１１％〜１７％であってもよい。例えば、Ｎ−アセチル基の残存率７％〜３０％は、概ね、Ｎ−アセチル基が６〜２８糖残基に１つ（二糖単位として３〜１４単位に１つ）の比率で存在していることに相当する。また、例えば、Ｎ−アセチル基の残存率１１％〜１７％は、概ね、Ｎ−アセチル基が１２〜１８糖残基に１つ（二糖単位として６〜９単位に１つ）の比率で存在していることに相当する。Ｎ−脱アセチル化の程度（すなわちＮ−アセチル基の残存率）は、例えば、二糖分析により確認することができる。すなわち、Ｎ−アセチル基の残存率は、多糖を二糖分析に供した際の、二糖単位の総量に対する、Ｎ−アセチル基を有する二糖単位の量の比率（モル比）として算出することができる。
【００６２】
水酸化ナトリウムを利用した部分的Ｎ−脱アセチル化の条件としては、例えば、既報（Ｋｕｂｅｒａｎ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）“Ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７８（５２）：  ５２６１３−５２６２１．やＵＳ２０１１２８１８２０Ａ１）の条件を参照することができる。ヒドラジンを利用した部分的Ｎ−脱アセチル化の条件としては、例えば、既報（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０（２０００）１５９−１７１；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９０（１９９６）８７−９６；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２１７（１９８４）１８７−１９７）の条件を参照することができる。
【００６３】
２−Ｏ−硫酸化は、ヘパロサン化合物中のヘキスロン酸残基の２位の水酸基を硫酸化する工程である。２−Ｏ−硫酸化は、例えば、２−Ｏ−硫酸化酵素（２−ＯＳＴ）を利用して酵素的に実施することができる。
【００６４】
Ｎ−硫酸化は、ヘパロサン化合物中のα−Ｄ−グルコサミン残基のアミノ基を硫酸化する工程である。Ｎ−硫酸化は、例えば、硫酸化試薬を利用して化学的に実施することができる。硫酸化試薬としては、三酸化硫黄ピリジン錯体（ＰｙＳＯ３）や三酸化硫黄トリメチルアミン錯体（ＴＭＡＳＯ３）等の三酸化硫黄錯体が挙げられる。
【００６５】
６−Ｏ−硫酸化は、ヘパロサン化合物中のα−Ｄ−グルコサミン残基の６位の水酸基を硫酸化する工程である。６−Ｏ−硫酸化は、例えば、６−Ｏ−硫酸化酵素（６−ＯＳＴ）を利用して酵素的に実施することができる。６−ＯＳＴとしては、例えば、６−ＯＳＴ−１、６−ＯＳＴ−２、６−ＯＳＴ−３が挙げられる。６−Ｏ−硫酸化はまた、例えば、硫酸化試薬を利用して化学的に実施することもできる。硫酸化試薬としては、三酸化硫黄ピリジン錯体（ＰｙＳＯ３）や三酸化硫黄トリメチルアミン錯体（ＴＭＡＳＯ３）等の三酸化硫黄錯体が挙げられる。
【００６６】
３−Ｏ−硫酸化は、ヘパロサン化合物中のα−Ｄ−グルコサミン残基の３位の水酸基を硫酸化する工程である。３−Ｏ−硫酸化は、例えば、３−Ｏ−硫酸化酵素（３−ＯＳＴ）を利用して酵素的に実施することができる。３−ＯＳＴとしては、例えば、３−ＯＳＴ−１、３−ＯＳＴ−２、３−ＯＳＴ−３、３−ＯＳＴ−４、３−ＯＳＴ−５が挙げられる。
【００６７】
本発明のヘパラン硫酸の製造方法において、処理は、ヘパロサン化合物の低分子化をさらに含んでもよい。
【００６８】
低分子化を実施する順序は、ヘパラン硫酸が得られる限り、特に制限されない。低分子化の実施順序は、低分子化、およびその他の各処理を実施する手段や各処理に用いられる酵素の基質特異性等の諸条件に応じて適宜設定できる。低分子化は、他の処理と同時または別個に実施してもよい。代表的には、低分子化は、ヘパロサン化合物のＮ−脱アセチル化の後であって、α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−硫酸化の前の順序に行われてもよい。
【００６９】
低分子化は、ヘパリナーゼを利用して酵素的に実施することができる。ヘパリナーゼとしては、例えば、ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ、およびヘパリナーゼＩＩＩが挙げられるが、ヘパリナーゼＩＩＩが好ましい。低分子化は、低分子化後のヘパロサンが低分子化前のヘパロサンよりも分子量が小さくなるように処理される限り特に限定されないが、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、１０００〜１５００００、好ましくは、８０００〜６００００の数平均分子量（Ｍｎ）および２０００〜３０００００、好ましくは、１００００〜１０００００の重量平均分子量（Ｍｗ）となるように実施することができる。
【００７０】
好ましくは、低分子化は、ヘパリナーゼＩＩＩを用いて行われる。「ヘパリナーゼＩＩＩ」とは、ヘパロサン等のグリコサミノグリカンの、Ｎ−硫酸化またはＮ−アセチル化されたグルコサミン残基の部位を切断する酵素（典型的には、ＥＣ４．２．２．８）をいう。本発明において用いられるヘパリナーゼＩＩＩは、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの、Ｎ−アセチル基を有するグルコサミン残基の部位を優先的に切断できるものであれば、特に制限されない。「Ｎ−アセチル基を有するグルコサミン残基の部位を優先的に切断する」とは、Ｎ−アセチル基を有するグルコサミン残基の部位を、Ｎ−アセチル基を有さないグルコサミン残基の部位よりも優先的に切断することをいう。「Ｎ−アセチル基を有するグルコサミン残基の部位を優先的に切断する」とは、Ｎ−アセチル基を有するグルコサミン残基の部位は切断するが、Ｎ−アセチル基を有さないグルコサミン残基の部位は実質的に切断しないことであってもよい。「グルコサミン残基の部位を切断する」とは、グルコサミン残基とその下流（還元末端側）のグルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基との間のα−１，４グリコシド結合を切断することをいう。
【００７１】
各工程による生成物は、各工程の反応液に含まれたまま次の工程に供してもよく、反応液から回収して次の工程に供してもよい。反応液から各生成物を回収する手段は、特に制限されない。各生成物を回収する手段としては、膜処理法や沈殿法等の、化合物の分離精製に用いられる公知の手法が挙げられる。各工程による生成物は、適宜、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解、酵素の失活等の処理に供してから、次の工程に供してもよい。精製は所望の程度に実施してよい。これらの処理は、単独で、あるいは適宜組み合わせて実施してよい。
【００７２】
本発明はまた、以下（Ｅ１）〜（Ｆ１）からなる群より選ばれるタンパク質を提供する：
（Ｅ１）配列番号５６、５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ２）配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質；および
（Ｆ１）配列番号５９、６２、６５、および６８からなる群より選ばれるアミノ酸配列において１〜２５個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
【００７３】
本発明のタンパク質は、ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの改変体である。ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼは、特定の測定条件で活性を測定した場合、他の生物種由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼと比較して優れたＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有する。また、本発明のタンパク質は、特定の測定条件で活性を測定した場合、野生型ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼと比較して同等または改善したＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有する。例えば、本発明のタンパク質は、野生型と比較して同等（１００％）以上、１１０％以上、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上、または２００％以上の活性を有する。したがって、本発明のタンパク質は、極めて優れたＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有する。このような特定の測定条件としては、例えば、反応液（２ｍｇ／ｍＬ  Ｎ−硫酸化ヘパロサン、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ塩化カルシウム）に、目的のタンパク質を発現する微生物の無細胞抽出液（菌体の超音波破砕および遠心分離後の上清液）を３０％添加し、３７℃で３０分間または１２時間反応させる条件が挙げられる。
【００７４】
本発明のタンパク質は、極めて優れたＤ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するので、Ｃ５−エピメリ化反応を高効率で行うための酵素として用いることができる。例えば、本発明のタンパク質は、ヘパロサンからのヘパリン等のヘパラン硫酸の製造においてＣ５−エピメリ化反応を高効率で行うために用いることができる。
【００７５】
本発明のタンパク質は、Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ活性を有する限りにおいて、上述したいかなる構造または形態で提供されていてもよい。すなわち、本発明のタンパク質は、例えば、上述した異種部分とペプチド結合を介して連結された融合タンパク質の構造で提供されていてもよく、または、上述した異種部分と連結していないタンパク質の構造で提供されていてもよい。また、本発明のタンパク質は、未精製物、粗精製物または精製タンパク質の形態で提供されていてもよく、固相に固定された固相化タンパク質の形態で提供されていてもよく、精製タンパク質の形態で提供されることが好ましい。本発明のタンパク質は、例えば、本発明のタンパク質を発現する微生物の培養液、培養上清、微生物菌体の超音波破砕物、微生物菌体の超音波破砕および遠心分離後の上清液（無細胞抽出液）から調製できる。
【実施例】
【００７６】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００７７】
実施例１：Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンの調製
（１）ヘパロサン発酵
ＷＯ２０１５／０５０１８４の実施例１に記載のヘパロサン生産菌（エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＫ９−ｋｆｉＡＢＣＤ株）および培養条件にてヘパロサンを含有する培養液を得た。【００７８】
（２）ヘパロサンの精製
培養液から遠心分離により培養上清を回収した。培地成分を除去するために１ｍＬの培養上清をＵＦ膜を用いてｍｉｌｌｉＱ水で洗浄し、２５０μＬまで濃縮した。ＵＦ膜濃縮液２５０μＬに５００μＬの１００％エタノールを加え、遠心分離によってヘパロサンを沈降させた。得られた沈殿を風乾させ、ヘパロサンを得た。残りの培養上清から同様の手順でヘパロサンを精製し、ヘパロサン計１０ｇを得た。【００７９】
（３）ヘパロサンのＮ−脱アセチル化
１）  ヘパロサン１．２２ｇにＨｙｄｒａｚｉｎｅ・Ｈ２Ｏ  ６１ｍＬおよび１Ｎ硫酸４．７ｍＬを添加し、気相を窒素置換後、１００℃に加温し、４．７５時間反応させた。【００８０】
２）  氷冷により反応を停止させた後、１６％ＮａＣｌ水溶液６１ｍＬおよびＭｅＯＨ  ６１０ｍＬを添加して遠心し、上清を除去した。得られた沈殿をＨ２Ｏ  ５０ｍＬに溶解させた後、ＡｍｉｃｏｎＵＦ膜（３ｋＤａ）を用いて脱塩濃縮した。【００８１】
３）  得られた濃縮液に２倍量のＨ２Ｏおよび等量の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３を添加後、０．２Ｍ  Ｉ２／０．４Ｍ  ＫＩ溶液を黄色に呈色するまで滴下した。その後Ｈｙｄｒａｚｉｎｅ・Ｈ２Ｏを滴下し、余剰のヨウ素をヨウ素イオンに還元後、再度ＡｍｉｃｏｎＵＦ膜（３ｋＤａ）を用いて脱塩濃縮し、濃縮液を減圧乾固してＮ−脱アセチル化ヘパロサンを得た。得られたＮ−脱アセチル化ヘパロサンにおけるアセチル基の残存率は１４．９％であった（後述）。【００８２】
（４）Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの低分子化
１）ヘパリナーゼＩＩＩの調製
＜Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来ｈｅｐＣ遺伝子の発現プラスミドの構築＞
Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ１３１２５）よりヘパリナーゼＩＩＩをコードするｈｅｐＣ遺伝子をｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０ベクター（米国特許出願公開２００５０１９６８４６号）にクローニングし、ｈｅｐＣ遺伝子の発現プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｈｅｐＣを構築した。ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｔｅｒには強力なｎｌｐ０プロモーター（Ｐｎｌｐ０）とｒｒｎＢターミネーターが組み込まれており、プロモーターとターミネーターの間に目的の遺伝子を挿入することで発現ユニットとして機能させることができる。「Ｐｎｌｐ０」はエシェリヒア・コリＫ−１２株由来の野生型ｎｌｐＤ遺伝子のプロモーターを示す。【００８３】
発現プラスミドの構築の詳細を以下に示す。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰ１（配列番号２２）及びプライマーＰ２（配列番号２３）を用いたＰＣＲによって、ｎｌｐＤ遺伝子のプロモーター領域（Ｐｎｌｐ０）約３００ｂｐを含むＤＮＡ断片を取得した。これらプライマーの５’末端には制限酵素ＳａｌＩ及びＰａｅＩのサイトがそれぞれデザインされている。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９５℃３分の後、９５℃６０秒、５０℃３０秒、７２℃４０秒を２サイクル、９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃１５秒を２５サイクル、最後に７２℃５分。得られた断片をＳａｌＩ及びＰａｅＩで処理し、ｐＭＩＶ−５ＪＳ（特開２００８−０９９６６８号）のＳａｌＩ−ＰａｅＩサイトに挿入し、プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０を取得した。このｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０プラスミドに挿入されたＰｎｌｐ０プロモーターのＰａｅＩ−ＳａｌＩ断片のヌクレオチド配列は配列番号２４に示したとおりである。【００８４】
次に、ＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰ３（配列番号２５）及びプライマーＰ４（配列番号２６）を用いたＰＣＲによって、ｒｒｎＢ遺伝子のターミネーター領域約３００ｂｐを含むＤＮＡ断片（配列番号２７）を取得した。これらプライマーの５’末端には制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩのサイトがそれぞれデザインされている。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９５℃３分の後、９５℃６０秒、５０℃３０秒、７２℃４０秒を２サイクル、９４℃２０秒、５９℃２０秒、７２℃１５秒を２５サイクル、最後に７２℃５分。得られた断片をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで処理し、ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｔｅｒを取得した。【００８５】
次に、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ１３１２５）のｈｅｐＣ遺伝子のＯＲＦ（Ｓｕ  Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９６，６２：２７２３−２７３４）を含むＤＮＡ鎖を人工合成した。そのＤＮＡ鎖をテンプレートとして、プライマーＰ５（配列番号２８）及びプライマーＰ６（配列番号２９）をプライマーとして用いたＰＣＲによって、ｈｅｐＣ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）を用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９４℃５分の後、９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃８分を３０サイクル、最後に４℃保温。また、ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０をテンプレートＤＮＡとし、プライマーＰ７（配列番号３０）及びプライマーＰ８（配列番号３１）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲによって、ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０のＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼを用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９４℃５分の後、９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃６分を３０サイクル、最後に４℃保温。得られた両ＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（クロンテック社製）を用いて連結し、ｈｅｐＣ遺伝子の発現プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｈｅｐＣを構築した。クローニングされたｈｅｐＣ遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号３２に、それがコードするヘパリナーゼＩＩＩ（ＨｅｐＣ）のアミノ酸配列を配列番号３３に示す。【００８６】
＜エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株のｈｅｐＣ遺伝子発現株の構築及びヘパリナーゼＩＩＩ酵素液の調製＞
ｈｅｐＣ遺伝子の発現プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｈｅｐＣをエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株（ライフテクノロジーズ社）へエレクトロポレーション（Ｃｅｌｌ：８０μＬ，２００Ω，２５μＦ，１．８ｋＶ，キュベット：０．１ｍＬ）により導入し、ヘパリナーゼＩＩＩ生産株としてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｈｅｐＣ株を得た。この株を２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール添加ＬＢ培地にて３７℃で一晩前培養を行った。その後、培養液を、坂口フラスコに３００ｍＬ張りこんだＬＢ培地中に終濃度２％ｖ／ｖとなるよう植菌した。３７℃にて４時間振とう培養を行い、培養を終了した。遠心分離後、菌体を０．８５％ＮａＣｌにて２回洗浄し、３０ｍＬの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）にて懸濁した。懸濁液を超音波破砕に供して菌体を破砕した。細胞破砕液を遠心分離し、上清（無細胞抽出液）としてヘパリナーゼＩＩＩ酵素液を調製した。【００８７】
２）ヘパリナーゼＩＩＩ反応による低分子化
上記（３）で得られたＮ−アセチル基残存率１４．９％のＮ−脱アセチル化ヘパロサン１ｇおよび３１．３ｍＩＵ／μＬのヘパリナーゼＩＩＩ溶液２ｍＬを１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＴｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ８．０）１００ｍＬに溶解し、３７℃にて５．３時間反応させた。反応液に１６％ＮａＣｌ水溶液１００ｍＬおよびＥｔＯＨ  ９００ｍＬを添加して混合し、遠心分離して上清を除去し、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを得た。ヘパリナーゼＩＩＩによる低分子化後の分子量について、プルランを標準としてＧＰＣにより測定した。その結果、数平均分子量（Ｍｎ）は、９８６０、重量平均分子量（Ｍｗ）は、１５４３０であった。【００８８】
（５）低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンのＮ−硫酸化
１）  上記（４）で得られた低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサン１ｇをｍｉｌｌｉＱ水５０ｍＬに溶解させ、２０ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＣＯ３／２０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ・ＳＯ３水溶液を５０ｍＬ添加して５５℃で一晩反応させた。【００８９】
２）  ＥｔＯＨ  １Ｌを添加して混合し、遠心分離して上清を除去し、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンを得た。【００９０】
３）  得られたＮ−硫酸化低分子化ヘパロサンをｍｉｌｌｉＱ水に溶解して５００μＬとし、二糖分析を行ってＮ−脱アセチル化ヘパロサンに対する収率を求めた。手順を以下に示す。【００９１】
＜二糖分析＞
Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンの二糖分析は、既報（Ｔ．Ｉｍａｎａｒｉ，ｅｔ．ａｌ．，“Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．”Ｊ．Ｏ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ．Ａ，７２０，２７５−２９３（１９９６））の条件に従い実施した。すなわち、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンをヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩを用いて不飽和二糖に分解し、分解物をＨＰＬＣで分析することにより、各構成二糖の量を定量した。【００９２】
同様に、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの二糖分析を実施した。なお、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの二糖分析は、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンをＮ−硫酸化してから実施した。すなわち、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンをＮ−硫酸化した後、ヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩを用いて不飽和二糖に分解し、分解物をＨＰＬＣで分析することにより、各構成二糖の量を定量した。Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンのＮ−硫酸化は、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンのＮ−硫酸化と同様に実施した。【００９３】
二糖分析は、具体的には、以下の手順で実施した。【００９４】
１）  ヘパリナーゼＩＩ  ０．２Ｕ（Ｓｉｇｍａ）、ヘパリナーゼＩＩＩ  ０．０２〜０．０３ｍＩＵ、多糖サンプル５μｇ、および酵素消化用ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ，１０ｍＭ（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｃａ，ｐＨ７．０）１０μＬを混合し、ｍｉｌｌｉＱ水で１００μＬにメスアップし、反応溶液とした。
２）  反応溶液を３７℃で１６時間以上反応させた後、１００℃にて２分間煮沸し、反応を停止させた。
３）  ０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去した溶液を二糖分析用サンプルとした。
４）  分析は、カラムにはＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  １５０ｍｍ×２．１ｍｍ、粒子径５μｍを用い、温度は５０℃、流速は０．２５ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２３０ｎｍ、溶離液はＡ液として４％Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、１．２ｍＭ  Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｅを用い、Ｂ液として４％Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、０．１Ｍ  ＣｓＣｌを用い、Ｂ液１−９０％のグラジエント条件で行った。
各多糖サンプルから生成した構成二糖の量の合計から、収率を算出した。すなわち、収率は、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンから生成した二糖の全量に対する、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンから生成した二糖の全量の比率（モル比）として算出した。また、この時、得られたＮ−硫酸化低分子化ヘパロサンにおいて、Ｎ−脱アセチル化により生じたアミノ基の９９％以上がＮ−硫酸化されていることを確認した。
また、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンから生成した各構成二糖の量に基づき、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンにおけるＮ−アセチル基の残存率を算出した。すなわち、アセチル基の残存率は、二糖の総量に対する、Ｎ−アセチル基を有する二糖の量の比率（モル比）として算出した。アセチル基の残存率は、１４．９％であった。【００９５】
実施例２：Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ（Ｄｌｃｅ）発現菌株の構築
（１）ヒト由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ（ｈｓｐＤｌｃｅ）発現菌株の構築
ｐＭＡＬ−ｃ２ｘ（配列番号２０、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）をテンプレートＤＮＡとし、配列番号３４および３５をプライマーとして用いたＰＣＲ反応によって、変異型Ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ＊）のＣ末端領域ＤＮＡ断片を得た。上記ＰＣＲ反応においては、５’末端に制限酵素ＢｇｌＩＩ、３’末端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＸｈｏＩ、およびＮｏｔＩの認識サイトを付加した。ｐＭＡＬ−ｃ２ｘプラスミドＤＮＡおよびＭＢＰ＊のＣ末端領域ＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、ライゲーション反応を行うことによりｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊プラスミドを得た。ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊プラスミドのヌクレオチド配列を配列番号２１に示す。【００９６】
ヒト由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの全長タンパク質のｃＤＮＡを人工遺伝子合成（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）により調製した。そのｃＤＮＡをテンプレートとして、ポリメラーゼとしてＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）を使用して、プロトコールに従って９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃２分の条件で３０サイクルのＰＣＲを行い、ヒト由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの触媒部位（Ｇｌｙ１０１−Ａｓｎ６１７）をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を取得した。プライマーとしては配列番号３６および３７の組み合わせを使用した。得られたＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化した後に、予めＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊プラスミドとライゲーション反応により連結した。該反応液でエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で終夜培養した。生育してきた形質転換微生物のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、３１００ジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてヌクレオチド配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドをｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｈｓｐＤｌｃｅ（Ｇ１０１）と名付けた。得られたｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｈｓｐＤｌｃｅ（Ｇ１０１）でエシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、目的プラスミドを有する形質転換微生物を得た。この形質転換微生物を、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｈｓｐＤｌｃｅ（Ｇ１０１）と命名し、ｈｓｐＤｌｃｅ発現菌株とした。挿入断片のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号６および配列番号７に示す。【００９７】
（２）その他の生物種由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ発現菌株の構築
ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊をテンプレートＤＮＡとして、ポリメラーゼとしてＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）を使用して、製造元のプロトコールに従って９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃２分の条件で３０サイクルのＰＣＲを行い、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊のＤＮＡ断片を得た。プライマーとしては配列番号３８および３９の組み合わせを使用した。【００９８】
オポッサム由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ、ニワトリ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ、カエル由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ、ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ、ホヤ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ、ショウジョウバエ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ、線虫由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの全長タンパク質のｃＤＮＡを人工遺伝子合成（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）により調製した。そのｃＤＮＡをテンプレートとして、（１）と同様の方法にて、オポッサム由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの触媒部位（Ｇｌｙ１００−Ａｓｎ６１７）、ニワトリ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの触媒部位（Ｇｌｙ８８−Ａｓｎ６０５）、カエル由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの触媒部位（Ｇｌｙ９２−Ａｓｎ６０７）、ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの触媒部位（Ｇ７０−Ａｓｎ５８５）、ホヤ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの触媒部位（Ｋ９２−Ａｓｎ６３７）、ショウジョウバエ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの触媒部位（Ｙ６６−Ａｓｎ６１４）、線虫由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの全長をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を取得した。プライマーとしてはそれぞれ、配列番号４０および４１、配列番号４２および４３、配列番号４４および４５、配列番号４６および４７、配列番号４８および４９、配列番号５０および５１、配列番号５２および５３の組み合わせを使用した。得られた各ＤＮＡ断片とｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊のＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（クロンテック社製）を用いて連結した。該反応液でエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換し、（１）と同様の方法にて、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｍｄｏＤｌｃｅ（Ｇ１００）、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｇｇａＤｌｃｅ（Ｇ８８）、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｘｔｒＤｌｃｅ（Ｇ９２）、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｄｒｅＤｌｃｅ（Ｇ７０）、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｃｉｎＤｌｃｅ（Ｋ９２）、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｄｍｅＤｌｃｅ（Ｙ６６）、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｃｅｌＤｌｃｅを得た。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）をそれぞれ形質転換し、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｍｄｏＤｌｃｅ（Ｇ１００）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｇｇａＤｌｃｅ（Ｇ８８）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｘｔｒＤｌｃｅ（Ｇ９２）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｄｒｅＤｌｃｅ（Ｇ７０）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｃｉｎＤｌｃｅ（Ｋ９２）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｄｍｅＤｌｃｅ（Ｙ６６）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｃｅｌＤｌｃｅと命名し、各生物種由来Ｄｌｃｅ発現菌株とした。挿入断片のヌクレオチド配列を、それぞれ配列番���８、１０、１２、１４、１６および１８に示し、それらによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９に示す。【００９９】
実施例３：各生物種由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ（Ｄｌｃｅ）の発現
エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｈｓｐＤｌｃｅ（Ｇ１０１）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｍｄｏＤｌｃｅ（Ｇ１００）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｇｇａＤｌｃｅ（Ｇ８８）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｘｔｒＤｌｃｅ（Ｇ９２）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｄｒｅＤｌｃｅ（Ｇ７０）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｃｉｎＤｌｃｅ（Ｋ９２）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｄｍｅＤｌｃｅ（Ｙ６６）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｃｅｌＤｌｃｅをＬＢ培地（１．０％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１．０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）に１００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加した培地に植菌し、３７℃で一晩前培養を行った。その後、培養液を３ｍＬのＬＢ培地中に終濃度１％となるよう植菌し３７℃にて３時間振とう培養後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（ナカライテスク社）を終濃度０．５ｍＭとなるよう添加し、さらに一晩２２℃にて培養を行い、各生物種由来Ｄｌｃｅを菌体において発現させた。【０１００】
培養液を遠心分離後、菌体を回収し、洗浄液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ）により１回洗浄し、培養液の１／１０量の同洗浄液にて懸濁した。次いで、菌体をＢｉｏｒａｐｔｏｒ（ソニック・バイオ株式会社）により超音波破砕し１４，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離後の上清液を、各生物種由来Ｄｌｃｅ含有無細胞抽出液として得た。【０１０１】
実施例４：各生物種由来Ｄｌｃｅ含有無細胞抽出液によるＣ５−エピメリ化反応
（１）Ｃ５−エピメリ化反応
反応液（２ｍｇ／ｍＬ  Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサン、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ塩化カルシウム）に各生物種由来Ｄｌｃｅ含有無細胞抽出液を３０％添加し、３７℃で３０分間または１２時間反応を行った。陰性対照として、反応液に無細胞抽出液の代わりに洗浄液を添加した条件で酵素反応を実施した。【０１０２】
（２）Ｃ５−エピメリ化率の定量
Ｃ５−エピメリ化率の定量は、亜硝酸分解による二糖組成分析により実施した。
＜試薬＞
ＮａＮＯ２（ＣＡＳ  Ｎｏ．：７６３２−００−０，ＭＷ：６９．０１）
クエン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．：７７−９２−９，ＭＷ：１９２．１）
２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１１９−２６−６，ＭＷ：１９８．１）５０％含水品（略：ＤＮＰＨ）
＜試験液＞
ＮａＮＯ２水溶液：試薬４９．５ｍｇをＨ２Ｏ  １ｍＬに溶解
クエン酸水溶液：試薬３８４．２ｍｇをＨ２Ｏ  １ｍＬに溶解
ＤＮＰＨ溶液：試薬２０．４ｍｇ（５０％含水）をアセトニトリル１ｍＬに溶解
＜分析手順＞
１．５ｍＬマイクロチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に反応液１０μＬ、クエン酸緩衝液２０μＬ、ＮａＮＯ２水溶液１０μＬを順に添加し、混合溶液を６５℃で２ｈｒ撹拌（１０００ｒｐｍ）し、亜硝酸分解液を得た。得られた亜硝酸分解液４０μＬにＤＮＰＨ溶液２０μＬを添加し、４５℃で２ｈｒ撹拌（１０００ｒｐｍ）し、誘導化液を得た。得られた誘導化液の組成を下記に示す条件によりＨＰＬＣで分析した。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：住化分析センター製ＯＤＳ  Ｚ−ＣＬＵＥ３μｍ  ２．０ｍｍ×２５０ｍｍ
カラム槽温度：５０℃
溶離液流量：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ３６５ｎｍ
注入量：５μＬ
溶離液組成：Ａ液  ５０ｍＭ−ＨＣＯＯＮＨ４（ｐＨ４．５）
Ｂ液  ＭｅＣＮ【０１０３】
【表２】
2018135027.tif 000003
【０１０４】
（３）結果
ＨＰＬＣ分析により求めたＧｌｃＡ−ＧｌｃＮ（ＮＳ）とＩｄｏＡ−ＧｌｃＮ（ＮＳ）の比率からＣ５−エピメリ化率を算出し、その結果を表３に示す。反応時間３０分間での比較から、ＭＢＰ＊−ｄｒｅＤｌｃｅ（Ｇ７０）を含有する無細胞抽出液が優位に高いＣ５−エピメリ化率を示すことが明らかとなった。表中の−はデータを取得していないことを示す。【０１０５】
【表３】
2018135027.tif 000004
【０１０６】
実施例５：改変Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ（Ｄｌｃｅ）発現菌株の構築
ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ（ｄｒｅＤｌｃｅ）の改変体であるＦｃＤｌｃｅ−０２、ＦｃＤｌｃｅ−０４、ＦｃＤｌｃｅ−０５、ＦｃＤｌｃｅ−０６、ＦｃＤｌｃｅ−０７の触媒部位（Ｇ７０−Ａｓｎ５８５）のｃＤＮＡを人工遺伝子合成（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）により調製した。野生型および各改変体の全長タンパク質間の改変度（ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて算出したアミノ酸配列相同性で示す）を表４に示す。【０１０７】
【表４】
2018135027.tif 000005
【０１０８】
これらのｃＤＮＡをテンプレートとして、実施例２と同様の方法にて、ＦｃＤｌｃｅ−０２の触媒部位（Ｇ７０−Ａｓｎ５８５）、ＦｃＤｌｃｅ−０４の触媒部位（Ｇ７０−Ａｓｎ５８５）、ＦｃＤｌｃｅ−０５の触媒部位（Ｇ７０−Ａｓｎ５８５）、ＦｃＤｌｃｅ−０６の触媒部位（Ｇ７０−Ａｓｎ５８５）、ＦｃＤｌｃｅ−０７の触媒部位（Ｇ７０−Ａｓｎ５８５）をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を取得した。プライマーとしてはそれぞれ、配列番号６９および７０、配列番号７１および４７、配列番号７２および４７、配列番号４６および４７、配列番号４６および４７の組み合わせを使用した。実施例２（２）と同様の方法にて、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０２（Ｇ７０）、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０４（Ｇ７０）、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０５（Ｇ７０）、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０６（Ｇ７０）、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０７（Ｇ７０）を得た。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）をそれぞれ形質転換し、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０２（Ｇ７０）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０４（Ｇ７０）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０５（Ｇ７０）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０６（Ｇ７０）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０７（Ｇ７０）と命名し、改変Ｄｌｃｅ発現菌株とした。挿入断片のヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号５５、５８、６１、６４、および６７に示し、それらによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５６、５９、６２、６５、および６８に示す。【０１０９】
実施例６：野生型および改変Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ（Ｄｌｃｅ）の発現
エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｄｒｅＤｌｃｅ（Ｇ７０）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０２（Ｇ７０）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０４（Ｇ７０）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０５（Ｇ７０）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０６（Ｇ７０）、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０７（Ｇ７０）を用いて、実施例３と同様の方法にて野生型および改変Ｄｌｃｅを菌体で発現させ、Ｄｌｃｅ含有無細胞抽出液を取得した。【０１１０】
実施例７：野生型および改変Ｄｌｃｅ含有無細胞抽出液によるＣ５−エピメリ化反応
野生型および改変Ｄｌｃｅ含有無細胞抽出液によるＣ５−エピメリ化反応、およびＣ５−エピメリ化率の定量を、実施例４と同様の方法にて行った。陰性対照は、実施例４と同様とした。
ＨＰＬＣ分析により求めたＧｌｃＡ−ＧｌｃＮ（ＮＳ）とＩｄｏＡ−ＧｌｃＮ（ＮＳ）の比率からＣ５−エピメリ化率を算出し、その結果を表５に示す。ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０２（Ｇ７０）、ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０４（Ｇ７０）、ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０５（Ｇ７０）、ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０６（Ｇ７０）、ＭＢＰ＊−ＦｃＤｌｃｅ−０７（Ｇ７０）を含有する無細胞抽出液がＭＢＰ＊−ｄｒｅＤｌｃｅ（Ｇ７０）を含有する無細胞抽出液と同等以上のＣ５−エピメリ化率を示すことが明らかとなった。【０１１１】
【表５】
2018135027.tif 000006
【配列表フリーテキスト】
【０１１２】
配列番号１は、ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼをコードする天然型の全長ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ３８８５１７．１）を示す。
配列番号２は、ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの天然型の全長アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ３８８５１７．１）を示す。
配列番号３は、ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（配列番号２におけるＧｌｙ７０−Ａｓｎ５８５）をコードする天然型ヌクレオチド配列を示す。
配列番号４は、ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（配列番号２におけるＧｌｙ７０−Ａｓｎ５８５）をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を示す。
配列番号５は、ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（配列番号２におけるＧｌｙ７０−Ａｓｎ５８５）を示す。
配列番号６は、ヒト由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（Ｇｌｙ１０１−Ａｓｎ６１７）をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号７は、ヒト由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（Ｇｌｙ１０１−Ａｓｎ６１７）を示す。
配列番号８は、オポッサム由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（Ｇｌｙ１００−Ａｓｎ６１７）をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号９は、オポッサム由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（Ｇｌｙ１００−Ａｓｎ６１７）を示す。
配列番号１０は、ニワトリ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（Ｇｌｙ８８−Ａｓｎ６０５）をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１は、ニワトリ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（Ｇｌｙ８８−Ａｓｎ６０５）を示す。
配列番号１２は、カエル由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（Ｇｌｙ９２−Ａｓｎ６０７）をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号１３は、カエル由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（Ｇｌｙ９２−Ａｓｎ６０７）を示す。
配列番号１４は、ホヤ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（Ｋ９２−Ａｓｎ６３７）をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号１５は、ホヤ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（Ｋ９２−Ａｓｎ６３７）を示す。
配列番号１６は、ショウジョウバエ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（Ｙ６６−Ａｓｎ６１４）をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号１７は、ショウジョウバエ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（Ｙ６６−Ａｓｎ６１４）を示す。
配列番号１８は、線虫由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号１９は、線虫由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの全長アミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘプラスミドのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２１は、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊プラスミドのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２２〜３１は、実施例１でｈｅｐＣ遺伝子発現プラスミドを構築するために使用したプライマーおよび断片のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２２は、プライマーＰ１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２３は、プライマーＰ２のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２４は、Ｐｎｌｐ０プロモーターのＰａｅＩ−ＳａｌＩ断片のヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２５は、プライマーＰ３のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２６は、プライマーＰ４のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２７は、ｒｒｎＢ遺伝子のターミネーター領域約３００ｂｐを含むＤＮＡ断片（配列番号６）のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２８は、プライマーＰ５のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２９は、プライマーＰ６のヌクレオチド配列を示す。
配列番号３０は、プライマーＰ７のヌクレオチド配列を示す。
配列番号３１は、プライマーＰ８のヌクレオチド配列を示す。
配列番号３２は、実施例１でクローニングされたｈｅｐＣ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号３３は、配列番号３２のヌクレオチド配列がコードするヘパリナーゼＩＩＩ（ＨｅｐＣ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号３４および３５は、実施例２でＭＢＰ＊を作成するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３６および３７は、実施例２でヒト由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３８および３９は、実施例２でｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊のＤＮＡ断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４０および４１は、実施例２でオポッサム由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４２および４３は、実施例２でニワトリ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４４および４５は、実施例２でカエル由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４６および４７は、実施例２でゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４８および４９は、実施例２でホヤ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号５０および５１は、実施例２でショウジョウバエ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号５２および５３は、実施例２で線虫由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号５４は、改変体ＦｃＤｌｃｅ−０２の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号５５は、改変体ＦｃＤｌｃｅ−０２のＧｌｙ７０−Ａｓｎ５８５部分アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号５６は、改変体ＦｃＤｌｃｅ−０２のＧｌｙ７０−Ａｓｎ５８５部分アミノ酸配列を示す。
配列番号５７は、改変体ＦｃＤｌｃｅ−０４の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号５８は、改変体ＦｃＤｌｃｅ−０４のＧｌｙ７０−Ａｓｎ５８５部分アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号５９は、改変体ＦｃＤｌｃｅ−０４のＧｌｙ７０−Ａｓｎ５８５部分アミノ酸配列を示す。
配列番号６０は、改変体ＦｃＤｌｃｅ−０５の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号６１は、改変体ＦｃＤｌｃｅ−０５のＧｌｙ７０−Ａｓｎ５８５部分アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号６２は、改変体ＦｃＤｌｃｅ−０５のＧｌｙ７０−Ａｓｎ５８５部分アミノ酸配列を示す。
配列番号６３は、改変体ＦｃＤｌｃｅ−０６の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号６４は、改変体ＦｃＤｌｃｅ−０６のＧｌｙ７０−Ａｓｎ５８５部分アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号６５は、改変体ＦｃＤｌｃｅ−０６のＧｌｙ７０−Ａｓｎ５８５部分アミノ酸配列を示す。
配列番号６６は、改変体ＦｃＤｌｃｅ−０７の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号６７は、改変体ＦｃＤｌｃｅ−０７のＧｌｙ７０−Ａｓｎ５８５部分アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号６８は、改変体ＦｃＤｌｃｅ−０７のＧｌｙ７０−Ａｓｎ５８５部分アミノ酸配列を示す。
配列番号６９および７０は、実施例５で改変体ＦｃＤｌｃｅ−０２の断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号７１は、実施例５で改変体ＦｃＤｌｃｅ−０４の断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号７２は、実施例５で改変体ＦｃＤｌｃｅ−０５の断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
【図１】
2018135027.tif 000007
【図２】
2018135027.tif 000008
【図３】
2018135027.tif 000009
【配列表】
2018135027000001.app
【国際調査報告】
2018135027.tif 000010
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