(57)【要約】【解決課題】  肥満リスクの診断キット及び肥満の発症リスクの分析方法を提供する。【解決手段】  肥満である者とそうでない者の遺伝情報を分析し，肥満である者には，シノビオリン遺伝子が多く発現していることを利用した，肥満マーカーであるシノビオリン遺伝子を同定するためのプローブを含む肥満リスクの診断キット。対象となる生物から採取された試料におけるシノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程と，シノビオリン遺伝子の発現量を用いて，肥満の発症リスクを求める工程を含む肥満の発症リスクの分析方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肥満マーカーであるシノビオリン遺伝子を同定するためのプローブを含む，肥満リスクの診断キット。
【請求項２】
対象となる生物から採取された試料におけるシノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程と，
前記シノビオリン遺伝子の発現量を用いて，肥満の発症リスクを求める工程を含む，
肥満の発症リスクの分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は肥満リスクの診断キット，及び肥満の発症リスクの分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許第５２７９４９２号公報には，肥満遺伝子の多型解析に使用するためのプローブが開示されている。このように肥満遺伝子を分析することで，対象が肥満を発症する遺伝的なリスクを解析する技術が開発されている。【０００３】
一方，国際公開２０１４−１０３８６３号パンフレットには，シノビオリンの発現を抑制することで肥満を防止できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５２７９４９２号公報
【特許文献１】国際公開２０１４−１０３８６３号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は，肥満リスクの診断キット及び肥満の発症リスクの分析方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は，基本的には，肥満である者とそうでない者の遺伝情報を分析し，肥満である者には，シノビオリン遺伝子が多く発現しているという実施例による知見に基づくものである。すなわち，肥満である者のシノビオリン遺伝子の発現量は，統計上有意差をもって，そうでない者のシノビオリン遺伝子の発現量よりも多い。このため，シノビオリン遺伝子は，遺伝的に肥満となる傾向が高いか否かのリスク（罹患可能性）を判断するための肥満マーカーとなりうると考えられる。また，対象のこのシノビオリン遺伝子の発現量を求めて所定の値（あらかじめ測定し，求めておいたシノビオリン遺伝子の発現量に関する閾値）と比較することで，対象が遺伝的に肥満を発症するリスクがあるか否か分析することができる。【０００７】
本発明の第１の側面は，肥満リスクの診断キットに関する。この肥満リスクの診断キットは，肥満マーカーであるシノビオリン遺伝子を同定するためのプローブを含む。【０００８】
本発明の第２の側面は，肥満の発症リスクの分析方法に関する。この方法は，対象となる生物から採取された試料におけるシノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程と，シノビオリン遺伝子の発現量を用いて，肥満の発症リスクを求める工程を含む。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は，肥満リスクの診断キット及び肥満の発症リスクの分析方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は，シノビオリン遺伝子及びＡＴＦ６遺伝子の発現量を示す箱ひげ図である。
【図２】図２は，ＸＢＰ１遺伝子及びえｌＦ２遺伝子の発現量を示す箱ひげ図である。
【図３】図３は，ＧＲＰ７８遺伝子及びＩＲＥＩ１遺伝子の発現量を示す箱ひげ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下，図面を用いて本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
【００１２】
本発明の第１の側面は，肥満リスクの診断キットに関する。この診断キットは，対象となる生物（たとえばヒト）から試料（たとえば，血液，唾液，爪，毛髪）を採取し，採取した試料に含まれるシノビオリン遺伝子の発現量を測定することで，対象が遺伝的に肥満となる可能性があるか（肥満リスク）を分析し，評価するものに関する。そのため，この肥満リスクの診断キットは，肥満マーカーであるシノビオリン遺伝子を同定するためのプローブを含む。このプローブを用いることで，シノビオリン遺伝子の発現量を求めることができる。この診断キットは，たとえば，肥満になりやすい遺伝子を有しているか否かを判別するといった遺伝子診断に用いることができる。この診断キットは，プローブのほか，対象のシノビオリン遺伝子の発現量を測定するための公知の要素を含んでいてもよい。そのような要素の例は，ＰＣＲに用いられるプライマーであり，ＰＣＲ測定装置を含んでもよい。
【００１３】
シノビオリン遺伝子の発現量を求める方法は，公知の方法を適宜採用すればよい。シノビオリン遺伝子の発現量を求める方法の例は，ＰＣＲである。シノビオリン遺伝子の発現量は，例えば，ｍＲＮＡレベルの発現量を測定してもよいし，タンパク質レベルの発現量を測定してもよい。シノビオリン遺伝子の発現量を求める方法の例は，ノーザンブロット法，定量的ＲＴ−ＰＣＲ法，ウエスタンブロット法，ＥＬＩＳＡ法及び免疫染色法である。これらの方法は，公知であり，これらの方法を実現するためのキットが販売されているので，そのキットの取扱説明書を参酌し，シノビオリン遺伝子の発現量を求めることができる。
【００１４】
シノビオリン遺伝子を同定するためのプローブは，公知である。シノビオリン遺伝子を同定するためのプローブの例は，ロッシュ社のユニバーサルブローブライブラリーの１６番である。このプローブで増幅される領域は，配列番号１のものである。
配列番号１：
ccagtacctcaccgtgctggcctccttggggcccccccggcctgccacttcagtcaactccactgaggagactgccactacagttgttgctgctgcctcctccaccagcatccctagctcaga
【００１５】
本発明の肥満リスクの診断キットは，上記のプローブ以外に遺伝子診断を行うための公知の要素を適宜含んでもよい。
【００１６】
本発明の第２の側面は，肥満の発症リスクの分析方法に関する。この方法は，対象となる生物から採取された試料におけるシノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程と，シノビオリン遺伝子の発現量を用いて，肥満の発症リスクを求める工程を含む。シノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程は，先に説明したとおりである。シノビオリン遺伝子の発現量を用いて，肥満の発症リスクを求めるためには，対象となる健常人から採取された試料におけるシノビオリン遺伝子の発現量と比較してもよい。また，あらかじめ複数の肥満者又は非肥満者の試料を用いて，シノビオリン遺伝子の発現量に関する閾値を求めておき，その閾値と比較するようにしてもよい。
【００１７】
この肥満の発症リスクの分析方法は，コンピュータを用いて自動的に求められるようにされていてもよい。コンピュータは，入出力部，演算部，制御部及び記憶部を有しており，これらはバスなどを用いて，情報の授受を行うことができるようにされている。そして記憶部は，試料（たとえば，血液，唾液，爪，毛髪）に応じた，シノビオリンの遺伝子の発現量に関する閾値を記憶している。入出力部から，対象に関する情報（ＩＤなど）と，試料に関する情報と，シノビオリン遺伝子の発現量に関する情報がコンピュータ内に入力される。すると，制御部は，記憶部に記憶される演算プログラムを読み出し，記憶部から試料に応じた閾値を読み出し，演算部にシノビオリン遺伝子の発現量と閾値とを比較させる。そして，演算部は，比較した結果に基づいて，肥満の発症リスクに関する分析結果を求める。求めた分析結果は，制御部により適宜記憶部へ送られて記憶されるとともに，入出力部から出力される。このようにして，対象の肥満の発症リスクが求められる。
【実施例】
【００１８】
以下，実施例を用いて本発明を具体的に説明する。本発明は，以下の実施例に限定されるものではない。【００１９】
ＲＮＡの回収とリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ
３３人の健常人から採血し，フィコール分離法を用いて，リンパ球を回収した。回収したリンパ球を用い，ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて，トータルＲＮＡを生成した。表１に実施例における健常人（ヘルシードナー）の年齢や性別，身長，ＢＭＩ値に関する情報を示す。【００２０】
【表１】
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【００２１】
１μｇのトータルＲＮＡを，ランダムプライマーを用いたＲｅｖｅｒＴｒａ（東洋紡製）を用いて逆転写した後，ライトサイクラー４８０プローブズマスター（ロッシュ社製）を用いたリアルタイムＰＣＲを用いて，シノビオリン遺伝子や，商標体ストレス関連遺伝子の発現量を検証した。内在のコントロールとして，リボソーマルプロテイン，ラージ，ＰＯ（ＲＰＬＰＯ）を用いた。【００２２】
実施例において用いたプライマーとプローブは以下の通りであった。【００２３】
ＳＹＶＮ１:（ シノビオリン遺伝子）
フォワードプライマー：５′− ccagtacctcaccgtgctg −３（配列番号２）  
リバースプライマー：５′− tctgagctagggatgctggt −３′（配列番号３）  
プローブとして，ロッシュ社のユニバーサルブローブライブラリーの１６番を用いた。【００２４】
ＡＴＦ６: 
フォワードプライマー：５′− gcagaaggggagacacattt −３′（配列番号４）  
リバースプライマー：５′− tgtggtcttgttatgggtggt −３′, （配列番号５）  
プローブとして，ロッシュ社のユニバーサルブローブライブラリーの６２番を用いた。【００２５】
ＸＢＰ１: 
フォワードプライマー：５′− ggagttaagacagcgcttgg −３′（配列番号６）  
リバースプライマー：５′− cactggcctcacttcattcc −３′, （配列番号７）  
プローブとして，ロッシュ社のユニバーサルブローブライブラリーの３７番を用いた。【００２６】
ＩＲＥ１: 
フォワードプライマー：５′− gaagcatgtgctcaaacacc −３′（配列番号８）  
リバースプライマー：５′− tctgtcgctcacgtcctg −３′, （配列番号９）  
プローブとして，ロッシュ社のユニバーサルブローブライブラリーの５０２番を用いた。【００２７】
ｅＩＦ２ａ:
フォワードプライマー：５′− gaagctaagaaagctgcaaagc −３′（配列番号１０）  
リバースプライマー：５′− cagtgtttcgtggtgtgctc −３′, （配列番号１１）  
プローブとして，ロッシュ社のユニバーサルブローブライブラリーの４３番を用いた。【００２８】
ＧＲＰ７８: 
フォワードプライマー：５′− catcaagttcttgccgttca −３′（配列番号１２）  
リバースプライマー：５′− ttcaggagcaaatgtctttgttt −３′, （配列番号１３）  
プローブとして，ロッシュ社のユニバーサルブローブライブラリーの１０番を用いた。【００２９】
ＲＰＬＰＯ:
フォワードプライマー：５′− gcagaaggggagacacattt −３′（配列番号１４）  
リバースプライマー：５′− tgtggtcttgttatgggtggt −３′, （配列番号１５）  
プローブとして，ロッシュ社のユニバーサルブローブライブラリーの６２番を用いた。【００３０】
ＲＴ−ＰＣＲには，東洋紡社製の高効率逆転写酵素であるＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）を使用した。
ＲＴ−ＰＣＲの条件は以下の通りであった。ＲＴ−ＰＣＲは，用いたキットの使用説明書に基づいて温度設定等の条件を定めた。
全ＲＮＡ  １μｇと，ＲＮａｓｅフリー水を合わせて１０μＬとし，６５℃で５分インキュベートした後，氷上で５分冷却した。【００３１】
その後以下の原料を添加した。
５×バッファ                                ４μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ミクスチャ            ２μＬ
ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（Ｒ）              １μＬ
ＲＮａｓｅ  阻害剤                          ０．５μＬ
ランダムプライマー  （２５ピコモル／μＬ）  １μＬ
ＲＮａｓｅフリー水                          １．５μＬ
ＲＮＡ溶液                                  １０μＬ
合計                                        ２０μＬ【００３２】
３０℃で１０分間インキュベートした後，４２℃で３０分インキュベートし，その後，９９℃で５分間インキュベートした。【００３３】
得られた発現量を，ＳＳＲＩジャパン社製エクセル統計ソフト２０１２（ｔｈｅ Ｅｘｃｅｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ ２０１２）を用いて，統計解析を行った。各遺伝子のＲＮＡ発現量を，対象者のＢＭＩ（ボディマス指数）が２５ｋｇ／ｍ２以上と以下とで分けて，対応のない（ｕｎｐａｉｒｅｄ）ステューデントのｔ検定により，統計学的な有意差を検証した。その際に，ｐ値が０．０５以下であれば，統計学上有意差があると判断した。【００３４】
図１〜図３は，各ＲＮＡ発現量を示す箱ひげ図である。図１は，シノビオリン遺伝子及びＡＴＦ６遺伝子の発現量を示す箱ひげ図である。図２は，ＸＢＰ１遺伝子及びえｌＦ２遺伝子の発現量を示す箱ひげ図である。図３は，ＧＲＰ７８遺伝子及びＩＲＥＩ１遺伝子の発現量を示す箱ひげ図である。【００３５】
図１に示される通り，ＢＭＩ（ボディマス指数）が２５ｋｇ／ｍ２以上と以下において，シノビオリン遺伝子及びＡＴＦ６遺伝子の発現量に統計学上の有意差がみられた。すなわち，ＢＭＩが２５ｋｇ／ｍ２以上の者は，統計学的な有意差をもって，シノビオリン遺伝子の発現量が２５ｋｇ／ｍ２以下の者に比べて多いことがわかる。すなわち，このため，シノビオリン遺伝子の発現量を求めることで，遺伝的に肥満となるリスクを評価できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は，遺伝子診断機器の分野や診断業において利用されうる。
【配列表フリーテキスト】
【００３７】
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
配列番号１５：プライマー
【図１】
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【図２】
2017159592.tif 000005
【図３】
2017159592.tif 000006
【配列表】
2017159592000001.app
【国際調査報告】
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2017159592.tif 000008
2017159592.tif 000009
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