(57)【要約】  本発明の課題は、細胞治療製剤として最適な体細胞を得るための内胚葉系細胞集団を提供することである。本発明の内胚葉系細胞集団は、細胞集団における未分化細胞の含有率が低減されており、且つ、細胞治療製剤として最適な体細胞へと分化可能な内胚葉系細胞を含む細胞集団である。さらに、本発明の内胚葉系細胞集団に由来する体細胞は、細胞治療製剤として優れた治療効果を有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＮａｎｏｇ遺伝子の相対発現量が０．８以下であり、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＨＮＦ１Ｂ遺伝子の相対発現量が１．０以上であり、ＳＯＸ１７の陽性を呈する細胞の比率が８０％以上である、内胚葉系細胞集団。
【請求項２】
さらに、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＨＮＦ４Ａ遺伝子の相対発現量が０．５以上である、請求項１に記載の内胚葉系細胞集団。
【請求項３】
さらに、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＥｐＣＡＭ遺伝子の相対発現量が０．６以上である、請求項１又は２に記載の内胚葉系細胞集団。
【請求項４】
さらに、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＶＩＭ遺伝子の相対発現量が１２以下である、請求項１から３のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞集団。
【請求項５】
さらに、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＳＯＸ２遺伝子の相対発現量が０．１１以下である、請求項１から４のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞集団。
【請求項６】
さらに、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するｃ−Ｍｙｃ遺伝子の相対発現量が０．１以下である、請求項１から５のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞集団。
【請求項７】
さらに、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−１遺伝子の相対発現量が１．０以上である、請求項１から６の何れか一項に記載の内胚葉細胞集団。
【請求項８】
さらに、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子の相対発現量が０．０１５以下である、請求項１から７の何れか一項に記載の内胚葉細胞集団。
【請求項９】
さらに、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＭａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ２遺伝子の相対発現量が０．０２０以下である、請求項１から８の何れか一項に記載の内胚葉細胞集団。
【請求項１０】
多能性幹細胞から内胚葉系細胞を製造する方法であって、以下に示す（ａ）〜（ｂ）：
（ａ）多能性幹細胞を２−メルカプトエタノールを含む培地を用いて浮遊培養し、細胞集団を調製する工程、
（ｂ）前記細胞集団を、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地で培養した後、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地で培養する工程、
を含む製造方法。
【請求項１１】
２−メルカプトエタノールを含む培地が、アクチビンＡを添加していない培地である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
２−メルカプトエタノールを含む培地が、ＷＮＴシグナル活性化剤を添加していない培地である、請求項１０又は１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
２−メルカプトエタノールを含む培地が、ＦＧＦ２を添加していない培地である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１４】
２−メルカプトエタノールを含む培地が、ＴＧＦβ１を添加していない培地である、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１５】
２−メルカプトエタノールを含む培地が、さらにインスリンを含む培地である請求項１０から１４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１６】
ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地が、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム及びエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも１種類以上を含む培地である請求項１０から１５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１７】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地が、さらに２−メルカプトエタノールを含む培地である請求項１０から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地が、グルコースを１．０ｇ／Ｌ以下の濃度で含有する培地である、請求項１０から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
多能性幹細胞から三胚葉のいずれかの細胞集団を製造する方法であって、以下に示す（ａ）〜（ｂ）：
（ａ）多能性幹細胞を２−メルカプトエタノールを含む培地を用いて浮遊培養し、細胞集団を調製する工程、
（ｂ）前記細胞集団を、内胚葉系細胞、中胚葉系細胞、又は外胚葉系細胞のいずれかに分化誘導できる条件下で培養する工程、
を含む製造方法。
【請求項２０】
２−メルカプトエタノールを含む培地が、ＦＧＦ２を添加していない培地である、請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
２−メルカプトエタノールを含む培地が、ＴＧＦβ１を添加していない培地である、請求項１９又は２０に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内胚葉系細胞集団に関する。本発明はさらに、多能性幹細胞を培養し、分化誘導することで三胚葉のいずれかの細胞集団を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療は、ドナー不足を課題とする臓器移植の代替法や難病の新たな治療法開発などにおいて大きな期待が寄せられている。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は多能性及び無限増殖性を有しているため、再生医療に必要とされる細胞を調製するための細胞ソースとして期待されている。これらの多能性幹細胞を用いた再生医療の実用化に際しては、多能性幹細胞を効率よく目的細胞に分化誘導させる技術の確立が必要であり、多様な分化誘導方法について報告されている。【０００３】
例えば、多能性幹細胞を三胚葉のいずれかに分化誘導させる培養方法として、非特許文献１には、マトリゲルでコートしたディッシュ上でヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞を接着培養しながら、三胚葉（内胚葉系細胞、外胚葉系細胞又は中胚葉系細胞）に分化誘導することが記載されている。また、分化誘導前にメチオニン不含培地で１０時間培養することにより細胞周期を停止させ、その後に三胚葉（内胚葉系細胞、外胚葉系細胞又は中胚葉系細胞）への分化を誘導することにより分化誘導効率を向上できることも示されている。【０００４】
多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導させるための培地についても幾つかの知見が報告されている。
例えば、特許文献１には、ＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子を多能性細胞培養物に供給することによって胚体内胚葉への分化を行い、次いで、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の細胞培養物または細胞集団でＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達を低減、除去（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ）または取り除く（ｒｅｍｏｖｉｎｇ）ことによって、胚体内胚葉細胞をＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞に分化させることが記載されている（段落０１４４〜０１５０）。【０００５】
また、特許文献２には、多能性細胞を造血前駆細胞または内皮細胞に分化させる方法であって、以下の逐次的工程：（ａ）少なくとも１つの成長因子を含む第１の特定培地中で複数の実質的に未分化の多能性細胞を培養または維持する工程、（ｂ）ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＧＭＣＳＦを本質的に含まない第２の特定培地中で細胞をインキュベートする工程、（ｃ）複数の細胞を増殖するか分化を促進するのに十分な量のＢＭＰ４およびＶＥＧＦを含む第３の特定培地中で細胞を培養する工程、および（ｄ）複数の細胞を増殖するか分化を促進するのに十分な量の（１）ＩＬ−３およびＦｌｔ３リガンド、または（２）ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２またはＦＧＦ−２模倣物、およびＩＧＦのいずれかを含む第４の特定培地中で細胞を培養する工程を含み、複数の多能性細胞が造血前駆細胞または内皮細胞に分化する方法が記載されている（段落０００９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１６−５０６７３６号公報
【特許文献２】特開２０１５−１９２６８１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Shiraki N et al., Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metab. 2014 May 6;19(5):780-94.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したとおり、多能性幹細胞から三胚葉（内胚葉系細胞、外胚葉系細胞又は中胚葉系細胞）を経て、体細胞のいずれかに分化誘導するための培養方法は報告されているが、細胞治療製剤としての治療効果の向上と未分化細胞を低減する観点から、より分化誘導の効率を向上させ、細胞の品質を高める必要がある。【０００９】
従って、本発明は、細胞治療製剤として最適な体細胞を得るための内胚葉系細胞集団を提供することを解決すべき課題とした。さらに、本発明は、多能性幹細胞を培養することを含む三胚葉のいずれかの細胞集団を製造する方法であって、細胞集団における未分化細胞の含有率を低減し、且つ、細胞治療製剤として最適な体細胞へと分化可能な細胞集団が得られる製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、多能性幹細胞を分化誘導する前に、特定の化合物を添加又は未添加で浮遊培養し、且つ、分化誘導においては、分化誘導に作用する因子を添加、低減、除去、又は取り除くことにより内胚葉系細胞への分化誘導の効率を大幅に向上できることを見出した。さらに、本発明者らは、得られた内胚葉系細胞集団から分化誘導した体細胞が、高い治療効果を発揮できるという点において、従来の内胚葉系細胞集団と比較して優れた内胚葉系細胞集団であることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。【００１１】
すなわち、本明細書によれば、以下の発明が提供される。
（１）  ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＮａｎｏｇ遺伝子の相対発現量が０．８以下であり、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＨＮＦ１Ｂ遺伝子の相対発現量が１．０以上であり、ＳＯＸ１７の陽性を呈する細胞の比率が８０％以上である、内胚葉系細胞集団。
（２）  さらに、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＨＮＦ４Ａ遺伝子の相対発現量が０．５以上である、（１）に記載の内胚葉系細胞集団。
（３）  さらに、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＥｐＣＡＭ遺伝子の相対発現量が０．６以上である、（１）又は（２）に記載の内胚葉系細胞集団。
（４）  さらに、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＶＩＭ遺伝子の相対発現量が１２以下である、（１）から（３）のいずれか一に記載の内胚葉系細胞集団。
（５）  さらに、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＳＯＸ２遺伝子の相対発現量が０．１１以下である、（１）から（４）のいずれか一に記載の内胚葉系細胞集団。
（６）  さらに、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するｃ−Ｍｙｃ遺伝子の相対発現量が０．１以下である、（１）から（５）のいずれか一に記載の内胚葉系細胞集団。
（７）  さらに、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−１遺伝子の相対発現量が１．０以上である、（１）から（６）の何れか一に記載の内胚葉細胞集団。
（８）  さらに、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子の相対発現量が０．０１５以下である、（１）から（７）の何れか一に記載の内胚葉細胞集団。
（９）  さらに、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＭａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ２遺伝子の相対発現量が０．０２０以下である、（１）から（８）の何れか一に記載の内胚葉細胞集団。【００１２】
（１０）  多能性幹細胞から内胚葉系細胞を製造する方法であって、以下に示す（ａ）〜（ｂ）：
（ａ）多能性幹細胞を２−メルカプトエタノールを含む培地を用いて浮遊培養し、細胞集団を調製する工程、
（ｂ）前記細胞集団を、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地で培養した後、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地で培養する工程、
を含む製造方法。
（１１）  ２−メルカプトエタノールを含む培地が、アクチビンＡを添加していない培地である、（１０）に記載の製造方法。
（１２）  ２−メルカプトエタノールを含む培地が、ＷＮＴシグナル活性化剤を添加していない培地である、（１０）又は（１１）に記載の製造方法。
（１３）  ２−メルカプトエタノールを含む培地が、ＦＧＦ２を添加していない培地である、（１０）から（１２）のいずれか一に記載の製造方法。
（１４）  ２−メルカプトエタノールを含む培地が、ＴＧＦβ１を添加していない培地である、（１０）から（１３）のいずれか一に記載の製造方法。
（１５）  ２−メルカプトエタノールを含む培地が、さらにインスリンを含む培地である（１０）から（１４）のいずれか一に記載の製造方法。
（１６）  ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地が、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム及びエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも１種類以上を含む培地である（１０）から（１５）のいずれか一に記載の製造方法。
（１７）  ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地が、さらに２−メルカプトエタノールを含む培地である（１０）から（１６）のいずれか一に記載の方法。
（１８）  ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地が、グルコースを１．０ｇ／Ｌ以下の濃度で含有する培地である、（１０）から（１７）のいずれか一に記載の方法。【００１３】
（１９）  多能性幹細胞から三胚葉のいずれかの細胞集団を製造する方法であって、以下に示す（ａ）〜（ｂ）：
（ａ）多能性幹細胞を２−メルカプトエタノールを含む培地を用いて浮遊培養し、細胞集団を調製する工程、
（ｂ）前記細胞集団を、内胚葉系細胞、中胚葉系細胞、又は外胚葉系細胞のいずれかに分化誘導できる条件下で培養する工程、
を含む製造方法。
（２０）  ２−メルカプトエタノールを含む培地が、ＦＧＦ２を添加していない培地である、（１９）に記載の製造方法。
（２１）  ２−メルカプトエタノールを含む培地が、ＴＧＦβ１を添加していない培地である、（１９）又は（２０）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の内胚葉系細胞集団は、細胞集団における未分化細胞の含有率が低減されており、且つ、細胞治療製剤として最適な体細胞へと分化可能な内胚葉系細胞を含む細胞集団である。さらに、本発明の内胚葉系細胞集団に由来する体細胞は、細胞治療製剤として優れた治療効果を有する。さらに、本発明の製造方法は、細胞集団における未分化細胞の含有率を低減し、且つ、細胞治療製剤として最適な体細胞へと分化可能な細胞集団が得られることから、高品質な細胞治療製剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、多能性幹細胞の接着培養と浮遊培養における未分化マーカー及び原始腸管細胞（ＰＧＴ）マーカーの発現を解析した結果を示す。
【図２】図２は、多能性幹細胞の接着培養と浮遊培養におけるＳＯＸ１７の発現を解析した結果を示す。
【図３】図３は、多能性幹細胞の接着培養と浮遊培養におけるＥｐＣＡＭ及びＶＩＭの発現を解析した結果を示す。
【図４】図４は、糖尿病モデルマウスへの細胞移植実験における血中ｃ−ｐｅｔｉｄｅ濃度の測定結果を示す。
【図５】図５は、糖尿病モデルマウスへの細胞移植実験における随時血糖値の測定結果を示す。
【図６】図６は、ヒトｉＰＳ細胞から内胚葉系細胞への分化誘導におけるＯＣＴ４、ＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２の発現レベルの測定結果を示す。
【図７】図７は、ヒトｉＰＳ細胞から内胚葉系細胞への分化誘導におけるＳＯＸ２及びＳＸＯ１７の陽性細胞の割合を測定した結果を示す。
【図８】図８は、ヒトｉＰＳ細胞から内胚葉系細胞への分化誘導におけるＤａｙ５における細胞密度を示す。
【図９】図９は、ヒトｉＰＳ細胞から内胚葉系細胞への分化誘導におけるＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２の陽性細胞の割合を測定した結果を示す。
【図１０】図１０は、多能性幹細胞の接着培養と浮遊培養におけるＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−１（ＦＮ１）の発現を解析した結果を示す。
【図１１】図１１は、多能性幹細胞の接着培養と浮遊培養におけるＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１の発現を解析した結果を示す。
【図１２】図１２は、多能性幹細胞の接着培養と浮遊培養におけるＣＤ４４の発現を解析した結果を示す。
【図１３】図１３は、多能性幹細胞の接着培養と浮遊培養におけるｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ２（ＭＭＰ２）の発現を解析した結果を示す。
【図１４】図１４は、多能性幹細胞の接着培養と浮遊培養におけるびｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ１（ＩＲＳ１）の発現を解析した結果を示す。
【図１５】図１５は、多能性幹細胞を異なるグルコース濃度で分化誘導した場合における細胞密度を示す。
【図１６】図１６は、多能性幹細胞を異なるグルコース濃度で分化誘導した場合におけるＳＯＸ２及びＮａｎｏｇの発現を解析した結果を示す。
【図１７】図１７は、多能性幹細胞を異なるグルコース濃度で分化誘導した場合におけるＳＯＸ２の発現を解析した結果を示す。
【図１８】図１８は、多能性幹細胞を異なるグルコース濃度で分化誘導した場合におけるＳＯＸ１７の発現を解析した結果を示す。
【図１９】図１９は、多能性幹細胞を異なるグルコース濃度で分化誘導した場合におけるＳＯＸ２及びＳＯＸ１７の陽性率を測定した結果を示す。
【図２０】図２０は、多能性幹細胞を異なるグルコース濃度で分化誘導した場合におけるＳＯＸ２及びＳＯＸ１７の陽性率を測定した結果を示す。
【図２１】図２１は、多能性幹細胞を異なるグルコース濃度で分化誘導した場合におけるＳＯＸ２及びＳＯＸ１７の発現を解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明するが、下記の説明は本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が下記の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も本発明の範囲に含まれる。
【００１７】
本発明の培地に関して、「を添加していない」という用語は、培養物又は馴化培地において添加していないと特定されたタンパク質、ペプチド及び化合物等の因子を外因的に加えないことを指す。なお、培養物又は馴化培地において添加していないと特定されたタンパク質、ペプチド及び化合物等の因子が培養の連続的な操作により持ち込んでいる場合は、１％未満（体積／体積）、０．５％（体積／体積）未満、０．１％（体積／体積）未満、０．０５％（体積／体積）未満、０．０１％（体積／体積）未満、０．００１％（体積／体積）未満になるように調整する。
【００１８】
本発明の細胞集団に関して、「が低減している」という用語は、細胞集団において含まれないと特定された細胞型（細胞表面マーカーの陽性や陰性の割合でもよい）が、細胞集団の総数において、３０％未満、２０％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満の量で存在することを意味する。
【００１９】
本発明の遺伝子発現量に関して、「が向上している」という用語は、比較対象となる細胞集団における特定の遺伝子発現量よりも遺伝子の発現が増加していることを指し、比較対象となる細胞集団に対して、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２．０倍以上、２．１倍以上、２．２倍以上、２．３倍以上、２．４倍以上、２．５倍以上、２．６倍以上、２．７倍以上、２．８倍以上、２．９倍以上、３．０倍以上、３．１倍以上、３．２倍以上、３．３倍以上、３．４倍以上、３．５倍以上、３．６倍以上、３．７倍以上、３．８倍以上、３．９倍以上、４．０倍以上、４．１倍以上、４．２倍以上、４．３倍以上、４．４倍以上、４．５倍以上、４．６倍以上、４．７倍以上、４．８倍以上、４．９倍以上、５．０倍以上、５．１倍以上、５．２倍以上、５．３倍以上、５．４倍以上、５．５倍以上、５．６倍以上、５．７倍以上、５．８倍以上、５．９倍以上、６．０倍以上、６．１倍以上、６．２倍以上、６．３倍以上、６．４倍以上、６．５倍以上、６．６倍以上、６．７倍以上、６．８倍以上、６．９倍以上、７．０倍以上、７．１倍以上、７．２倍以上、７．３倍以上、７．４倍以上、７．５倍以上、７．６倍以上、７．７倍以上、７．８倍以上、７．９倍以上、８．０倍以上、８．１倍以上、８．２倍以上、８．３倍以上、８．４倍以上、８．５倍以上、８．６倍以上、８．７倍以上、８．８倍以上、８．９倍以上、９．０倍以上、９．１倍以上、９．２倍以上、９．３倍以上、９．４倍以上、９．５倍以上、９．６倍以上、９．７倍以上、９．８倍以上、９．９倍以上、１０．０倍以上である。
【００２０】
本発明の遺伝子発現量に関して、「が減少している」という用語は、比較対象となる細胞集団における特定の遺伝子発現量よりも遺伝子の発現が減少していることを指し、比較対象となる細胞集団に対して、１．１倍以下、１．２倍以下、１．３倍以下、１．４倍以下、１．５倍以下、１．６倍以下、１．７倍以下、１．８倍以下、１．９倍以下、２．０倍以下、２．１倍以下、２．２倍以下、２．３倍以下、２．４倍以下、２．５倍以下、２．６倍以下、２．７倍以下、２．８倍以下、２．９倍以下、３．０倍以下、３．１倍以下、３．２倍以下、３．３倍以下、３．４倍以下、３．５倍以下、３．６倍以下、３．７倍以下、３．８倍以下、３．９倍以下、４．０倍以下、４．１倍以下、４．２倍以下、４．３倍以下、４．４倍以下、４．５倍以下、４．６倍以下、４．７倍以下、４．８倍以下、４．９倍以下、５．０倍以下、５．１倍以下、５．２倍以下、５．３倍以下、５．４倍以下、５．５倍以下、５．６倍以下、５．７倍以下、５．８倍以下、５．９倍以下、６．０倍以下、６．１倍以下、６．２倍以下、６．３倍以下、６．４倍以下、６．５倍以下、６．６倍以下、６．７倍以下、６．８倍以下、６．９倍以下、７．０倍以下、７．１倍以下、７．２倍以下、７．３倍以下、７．４倍以下、７．５倍以下、７．６倍以下、７．７倍以下、７．８倍以下、７．９倍以下、８．０倍以下、８．１倍以下、８．２倍以下、８．３倍以下、８．４倍以下、８．５倍以下、８．６倍以下、８．７倍以下、８．８倍以下、８．９倍以下、９．０倍以下、９．１倍以下、９．２倍以下、９．３倍以下、９．４倍以下、９．５倍以下、９．６倍以下、９．７倍以下、９．８倍以下、９．９倍以下、１０．０倍以下、２０倍以下、３０倍以下、４０倍以下、５０倍以下、６０倍以下、７０倍以下、８０倍以下、９０倍以下、１００倍以下、２５０倍以下、５００倍以下、７５０倍以下、１０００倍以下、５０００倍以下、１００００倍以下である。
【００２１】
本発明の凝集体に関して、「凝集塊」または「クラスター」という用語に言い換えて使用することができ、単細胞に解離していない一群の細胞を一般的に指す。
【００２２】
［１］多能性幹細胞
本発明の製造方法においては、多能性幹細胞を培養することによって三胚葉（内胚葉系細胞、中胚葉系細胞、又は外胚葉系細胞）の細胞集団を製造する。
多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての種類の細胞に分化することができる多分化能（多能性）を有する細胞であって、適切な条件下のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。具体的には胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９８，９５：１３７２６−３１）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞：Ｎａｔｕｒｅ．２００８，４５６：３４４−９）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、体性幹細胞（組織幹細胞）などが挙げられる。多能性幹細胞は、好ましくは、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞である。なお、「胚（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」とは、配偶子融合によって導出された胚に加えて、体細胞核移植によって、導出された胚も指す。
【００２３】
ＥＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、又はヒトが挙げられる。好ましくはヒトに由来する細胞を使用できる。
【００２４】
ＥＳ細胞の具体例としては、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等のＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞、及びこれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。各ＥＳ細胞は当分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。 マウスのＥＳ細胞は、１９８１年にエバンスら（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−６）や、マーチンら（Ｍａｒｔｉｎ  ＧＲ．ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７８：７６３４−８）によって樹立されている。 ヒトのＥＳ細胞は、１９９８年にトムソンら（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５−７）によって樹立されており、ＷｉＣｅｌｌ研究施設（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／、マジソン、ウイスコンシン州、米国）、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、京都大学などから入手可能であり、例えばＣｅｌｌａｒｔｉｓ社（ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ／、スウェーデン）から購入可能である。
【００２５】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。ｉＰＳ細胞の作製は、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ(Ｒｕｄｏｌｆ Ｊａｅｎｉｓｃｈ)らのグループ、ウイスコンシン大学のジェームス・トムソン（Ｊａｍｅｓ Ｔｈｏｍｓｏｎ）らのグループ、ハーバード大学のコンラッド・ホッケドリンガー（Ｋｏｎｒａｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ）らのグループなどを含む複数のグループが成功している。例えば、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報には、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。
【００２６】
ｉＰＳ細胞の製造に用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、又はヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。体細胞の具体例としては、例えば、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）、上皮細胞（例えば、胃上皮細胞、肝上皮細胞、肺胞上皮細胞）、内皮細胞（例えば血管、リンパ管）、神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞）、膵臓細胞、白血球細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞等）、骨髄細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、肝実質細胞、非肝実質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、歯周組織を構成する細胞（例えば、歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯肉線維芽細胞、骨芽細胞）、腎臓・眼・耳を構成する細胞などが挙げられる。
【００２７】
ｉＰＳ細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉系細胞、中胚葉系細胞又は内胚葉系細胞への何れにも多分化能を有する幹細胞である。また、ｉＰＳ細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。
【００２８】
体細胞からｉＰＳ細胞を製造するためには、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してｉＰＳ細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせをあげることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子
（ｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０  ｌａｒｇｅＴ遺伝子
（ｉｖ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子
【００２９】
上記以外にも、導入遺伝子をさらに減らした方法（Ｎａｔｕｒｅ．２００８  Ｊｕｌ  ３１；４５４（７２０４）：６４６−５０）、低分子化合物を利用した方法（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｊａｎ  ９；４（１）：１６−９、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｎｏｖ  ６；５（５）：４９１−５０３）、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｍａｙ  ８；４（５）：３８１−４）などが報告されており、いずれの方法で製造されたｉＰＳ細胞でもよい。
【００３０】
［２］三胚葉
本発明の方法によれば、多能性幹細胞から、内胚葉系細胞、外胚葉系細胞、中胚葉系細胞などの三胚葉のいずれかの細胞集団が製造される。
三胚葉としては、内胚葉系細胞、中胚葉系細胞、及び外胚葉系細胞が挙げられる。
内胚葉系細胞は、消化管、肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などへと分化する能力を有し、一般的に、胚体内胚葉（DE）と言われることがある。多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化は、内胚葉系細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内胚葉系細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、ＥＯＭＥＳ等を挙げることができる。なお、本明細書中において、内胚葉系細胞を胚体内胚葉と言い換えて使用することがある。
【００３１】
中胚葉系細胞は、体腔及びそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓、血管（血管内皮も含む）、血液（血液細胞も含む）、リンパ管、脾臓、腎臓、尿管、性腺（精巣、子宮、性腺上皮）などへと分化する。中胚葉系細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＦＯＸＦ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＨＡＮＤ１、ＥＶＸ１、ＩＲＸ３、ＣＤＸ２、ＴＢＸ６、ＭＩＸＬ１、ＩＳＬ１、ＳＮＡＩ２、ＦＯＸＣ１及びＰＤＧＦＲα等を挙げることができる。
【００３２】
外胚葉系細胞は、皮膚の表皮や男性の尿道末端部の上皮、毛髪、爪、皮膚腺（乳腺、汗腺を含む）、感覚器（口腔、咽頭、鼻、直腸の末端部の上皮を含む、唾液腺）水晶体などを形成する。外胚葉系細胞の一部は発生過程で溝状に陥入して神経管を形成し、脳や脊髄などの中枢神経系のニューロンやメラノサイトなどの元にもなる。また末梢神経系も形成する。外胚葉系細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＦＧＦ５、ＯＴＸ２、ＳＯＸ１、ＰＡＸ６等を挙げることができる。
【００３３】
本発明の方法で製造される三胚葉細胞集団は、内胚葉系細胞集団、中胚葉系細胞集団又は外胚葉系細胞集団の何れでもよいが、特に好ましくは内胚葉系細胞集団である。
【００３４】
本発明の方法によれば、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞集団を用いて、例えば、膵臓、肝臓、胃、腸などの消化器系の治療に用いることができる体細胞を得ることができる。以下に、各消化器系の治療における実施形態の一つを例示するが、これらに限定されるわけではない。
腸系では、クリプト細胞などの腸前駆細胞を得た場合には、これをカテーテルなどで移植することにより、潰瘍性大腸炎、クローン病、短腸症などの治療へ利用できる。
膵臓系では、膵臓β細胞（インスリン産生細胞と言い換える場合がある）を得た場合には、これをカテーテルなどであるいは免疫隔離デバイス等に封入して移植することにより、糖尿病の治療へ利用できる。
肝臓系では、例えばアルブミン産生細胞を得た場合には、これをカテーテルなどであるいは免疫遮断デバイスに封入して移植することにより、大量出血を伴う外傷治療などへ利用できる。
【００３５】
また、膵臓、肝臓、胃、腸などの消化器系における治療用組織を、高分子支持担体などを利用して培養することにより得ることもできる。例えば、肝臓組織を誘導して得た場合は、肝癌、肝硬変、急性肝不全や、ヘモクロマトーシスなどの肝代謝障害の治療へ利用できる。肺細胞組織を得た場合、これを患部へ移植することにより嚢胞性線維症や喘息などの肺呼吸器疾患治療へ利用できる。腎臓系では、メサンギウム細胞や尿細管上皮細胞、糸球体細胞など含む組織を得た場合、これを直接移植することにより、腎不全や腎炎の治療や透析治療などへ利用できる。肝臓系の、物質代謝が可能な細胞を得ることにより、アルブミン産生細胞、血液凝固因子産生細胞、α１アンチトリプシンなどの代謝酵素産生細胞を作製し、産生した代謝酵素を直接注射するか点滴投与することにより、これらのタンパク質の欠乏症の治療に用いることができる。例えば、膵臓β細胞などの物質代謝が可能な膵臓系の細胞を得ることにより、その膵臓β細胞が産生したインスリンを直接注射することにより、Ｉ型糖尿病の治療に用いることもできる。
【００３６】
さらに、本発明の方法で得られる三胚葉の何れの細胞集団ならびにそこから得られる体細胞は、被検物質の薬効／毒性評価や作用メカニズムの解明、あるいは生物現象メカニズムの解析に用いることも可能である。
【００３７】
［３］多能性幹細胞の維持培養
本発明の方法に従って多能性幹細胞の分化誘導を行う前の多能性幹細胞は、未分化維持培地を用いて未分化性を維持したものとすることが好ましい。未分化維持培地を用いて多能性幹細胞の未分化性を維持する培養のことを、多能性幹細胞の維持培養ともいう。
【００３８】
未分化維持培地は、多能性幹細胞の未分化性を維持できる培地であれば特に限定されないが、例えば、マウス胚性幹細胞及びマウス人工多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られているｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒを含む培地や、ヒトｉＰＳの未分化性を維持する性質を有していることが知られているｂａｓｉｃ  ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を含む培地等が挙げられる。例えば、ヒトｉＰＳ細胞培地（２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｇｉｂｃｏ社）、１ｘｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）、５５μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ；Ｇｉｂｃｏ社）、７．５ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ２（ＦＧＦ２；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、０．５ｘＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ；Ｗａｋｏ社）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｗａｋｏ社）、又はＥｓｓｅｎｔａｉｌ８培地（Tｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）  ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）等を使用することができるが、特に限定されない。
【００３９】
多能性幹細胞の維持培養は、好適なフィーダー細胞（例えば、ＳＬ１０フィーダー細胞、ＳＮＬフィーダー細胞等）上において上記の未分化維持培地を用いて行うことができる。また、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン又はマトリゲル等の細胞接着タンパク質や細胞外マトリックスをコートした細胞培養用ディッシュ上においても上記した未分化維持培地を用いて行うことができる。
【００４０】
培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃〜４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ2インキュベーターなどを利用して、約１〜１０％、好ましくは５％のＣＯ2濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【００４１】
多能性幹細胞の維持培養は継代しながら所望の期間行うことができ、例えば、維持培養後の継代数１〜１００、好ましくは継代数１０〜５０、より好ましくは継代数２５〜４０の多能性幹細胞を用いて、凝集体の形成や分化誘導を行うことが好ましい。
【００４２】
［４］多能性幹細胞の浮遊培養による凝集体の形成
多能性幹細胞の凝集体を形成するための実施形態の一つとしては、未分化で維持培養している細胞をＣＴＫＳｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ／ｉＰＳ  Ｃｅｌｌｓ：リプロセル社）等によりフィーダー細胞から剥がし、３〜４回ヒトｉＰＳ細胞培地でリンスをしてフィーダー細胞を除くことができる。次いで、ピペッティングにより小さな細胞塊又はシングルセルに砕き、それら細胞を培地中に懸濁した後に、懸濁液中の多能性幹細胞が凝集体を形成するまでの期間にわたって攪拌又は旋回させながら浮遊培養する。
【００４３】
浮遊培養は、培地の粘性等や凹凸を有するマイクロウェル等を用いた静置培養であってもよいし、スピナー等を利用して液体培地が流動する条件での培養であってもよいが、好ましくは液体培地が流動する条件での培養である。液体培地が流動する条件での培養としては、細胞の凝集を促進するように液体培地が流動する条件での培養が好ましい。細胞の凝集を促進するように液体培地が流動する条件での培養としては、例えば、旋回流、揺動流等の流れによる応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように液体培地が流動する条件での培養や、直線的な往復運動により液体培地が流動する条件での培養が挙げられ、旋回流及び／又は揺動流を利用した培養が特に好ましい。
【００４４】
浮遊培養に用いる培養容器は、好ましくは容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。このような容器内面への細胞の接着性が低い容器としては、例えば生体適合性がある物質で親水性表面処理されているようなプレートが挙げられる。例えば、ＮｕｎｃｌｏｎTMＳｐｈｅｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用できるが特に限定はされない。また、  培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ディッシュ状、フラスコ状、ウェル状、バッグ状、スピナーフラスコ状等の形状の培養容器が挙げられる。
【００４５】
凝集体を形成させる期間としては、６時間を超える期間であれば特に限定されないが、具体的には、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間の期間において凝集体を形成させることが好ましい。
【００４６】
浮遊培養培地としては、多能性幹細胞を増殖可能な成分が含まれるのであれば特に限定されないが、１〜１００μＭのＹ−２７６３２（Ｃａｙｍａｎ社）を含むｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）培地、又は１〜１００μＭのＹ−２７６３２（Ｃａｙｍａｎ社）、１〜１００ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ８TMなどを使用することができる。
【００４７】
浮遊培養における攪拌又は旋回の条件としては、懸濁液中において多能性幹細胞が凝集体を形成し得る範囲であれば特に限定されないが、上限は、好ましくは２００ｒｐｍ、より好ましくは１５０ｒｐｍ、さらに好ましくは１２０ｒｐｍ、より好ましくは１１５ｒｐｍ、より好ましくは１１０ｒｐｍ、より好ましくは１０５ｒｐｍ、もっと好ましくは１００ｒｐｍ、より好ましくは９５ｒｐｍ、特に好ましくは９０ｒｐｍとすることができる。下限は好ましくは１ｒｐｍ、より好ましくは１０ｒｐｍ、さらに好ましくは５０ｒｐｍ、より好ましくは６０ｒｐｍ、より好ましくは７０ｒｐｍ、さらに好ましくは８０ｒｐｍもっと好ましくは９０ｒｐｍとすることができる。旋回培養の際の旋回幅は特に限定されないが、下限は、例えば１ｍｍ、好ましくは１０ｍｍ、より好ましくは２０ｍｍ、最も好ましくは２５ｍｍとすることができる。旋回幅の上限は、例えば２００ｍｍ、好ましくは１００ｍｍ、好ましくは５０ｍｍ、より好ましくは３０ｍｍ、最も好ましくは２５ｍｍとすることができる。旋回培養の際の回転半径もまた特に限定されないが、好ましくは旋回幅が前記の範囲となるように設定される。回転半径の下限は例えば５ｍｍ、好ましくは１０ｍｍであり、上限は例えば１００ｍｍ、好ましくは５０ｍｍとすることができる。旋回培養の条件をこの範囲とすることで、適切な寸法の細胞凝集体を製造することが容易となるため好ましい。
【００４８】
また、浮遊培養は、揺動（ロッキング）撹拌により液体培地を流動させながら行う揺動培養であってもよい。揺動培養は、液体培地と細胞を収容した培養容器を概ね水平面に垂直な平面内で揺動させることにより行う。揺動速度は特に限定されないが、例えば１分間に２〜５０回、好ましくは４〜２５回（一往復を１回とする）揺動させることができる。揺動角度は特に限定されないが、例えば０．１°〜２０°、より好ましくは２°〜１０°とすることができる。揺動培養の条件をこの範囲とすることで、適切な寸法の細胞凝集塊を製造することが可能となるため好ましい。
【００４９】
更に、上記のような旋回と揺動とを組み合わせた運動により撹拌しながら培養することもできる。
【００５０】
スピナーフラスコ状の培養容器を用いた浮遊培養は、培養容器の中に攪拌翼を使用して、液体培地を攪拌しながら行う培養である。回転数や培地量は特に限定されない。市販のスピナーフラスコ状の培養容器であれば、メーカー推奨の培養液量を好適に使用することができ、例えばエイブル社のスピナーフラスコ等も好適に用いることができる。
【００５１】
本発明において、浮遊培養における細胞の播種密度は、細胞が凝集体を形成する播種密度であれば特に限定されないが、１×１０5〜１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが好ましい。細胞の播種密度は、２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、３×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、又は５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上が好ましく、９×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、８×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、７×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、６×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、４×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、３×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．９×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．８×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．７×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．６×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下が好ましい。特に、５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬから１．５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲の細胞密度が好適である。
【００５２】
細胞の凝集体は、凝集体当たり数百から数千の細胞を含む。本発明において、細胞凝集体の大きさ（直径）は、特に限定されないが、例えば、５０μｍ以上、５５μｍ以上、６０μｍ以上、６５μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、１００μｍ以上、１１０μｍ以上、１２０μｍ以上、１３０μｍ以上、１４０μｍ以上、１５０μｍ以上、であり、且つ、１０００μｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下が挙げられる。１５０μｍ〜４００μｍの範囲の直径を有する細胞凝集体は本発明で好適である。上記範囲以外の直径を有する細胞凝集体が混在していても良い。
【００５３】
浮遊培養の際の培養液量は使用する培養容器によって適宜調整することができるが、例えば１２ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が３．５ｃｍ2）を使用する場合は０．５ｍｌ／ウェル以上、１．５ｍｌ／ウェル以下とすることができ、より好ましくは１ｍｌ／ウェルとすることができる。例えば６ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が９．６ｃｍ2）を使用する場合は、１．５ｍＬ／ウェル以上、好ましくは２ｍＬ／ウェル以上、より好ましくは３ｍＬ／ウェル以上とすることができ、６．０ｍＬ／ウェル以下、好ましくは５ｍＬ／ウェル以下、より好ましくは４ｍＬ／ウェル以下とすることができる。例えば１２５ｍＬ三角フラスコ（容量が１２５ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、１０ｍＬ／容器以上、好ましくは１５ｍＬ／容器以上、より好ましくは２０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２５ｍＬ／容器以上、より好ましくは２０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２５ｍＬ／容器以上、より好ましくは３０ｍＬ／容器以上とすることができ、５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは４５ｍＬ／容器以下、より好ましくは４０ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば５００ｍＬ三角フラスコ（容量が５００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、１００ｍＬ／容器以上、好ましくは１０５ｍＬ／容器以上、より好ましくは１１０ｍＬ／容器以上、より好ましくは１１５ｍＬ／容器以上、より好ましくは１２０ｍＬ／容器以上とすることができ、１５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１４５ｍＬ／容器以下、より好ましくは１４０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１３５ｍＬ／容器以下、より好ましくは１３０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１２５ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば１０００ｍＬ三角フラスコ（容量が１０００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、２５０ｍＬ／容器以上、好ましくは２６０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２７０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２８０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２９０ｍＬ／容器以上とすることができ、３５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３４０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３３０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３２０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３１０ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば２０００ｍＬ三角フラスコ（容量が２０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、５００ｍＬ／容器以上、より好ましくは５５０ｍＬ／容器以上、より好ましくは６００ｍＬ／容器以上とすることができ、１０００ｍＬ／容器以下、より好ましくは９００ｍＬ／容器以下、より好ましくは８００ｍＬ／容器以下、より好ましくは７００ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば３０００ｍＬ三角フラスコ（容量が３０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、１０００ｍＬ／容器以上、好ましくは１１００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１２００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１３００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１４００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１５００ｍＬ／容器以上とすることができ、２０００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１９００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１８００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１７００ｍＬ／容器以下、より好ましく���１６００ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば２Ｌ培養バッグ（容量が２Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは２００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは３００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは４００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは５００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは６００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは７００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは８００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは９００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは１０００ｍＬ／バッグ以上とすることができ、２０００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１９００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１８００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１７００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１６００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１５００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１４００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１３００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１２００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１１００ｍＬ／バッグ以下とすることができる。例えば１０Ｌ培養バッグ（容量が１０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、５００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは３Ｌ／バッグ以上、より好ましくは４Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上とすることができ、１０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは９Ｌ／バッグ以下、より好ましくは８Ｌ／バッグ以下、より好ましくは７Ｌ／バッグ以下、より好ましくは６Ｌ／バッグ以下とすることができる。例えば、２０Ｌ培養バッグ（容量が２０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは３Ｌ／バッグ以上、より好ましくは４Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは６Ｌ／バッグ以上、より好ましくは７Ｌ／バッグ以上、より好ましくは８Ｌ／バッグ以上、より好ましくは９Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１０Ｌ／バッグ以上とすることができ、２０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１９Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１８Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１７Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１６Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１４Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１３Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１２Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１１Ｌ／バッグ以下とすることができる。例えば５０Ｌ培養バッグ（容量が５０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１０Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２０Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２５Ｌ／バッグ以上とすることができ、５０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは４５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは４０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは３５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは３０Ｌ／バッグ以下とすることができる。培養液量がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集体が形成され易い。
【００５４】
使用する培養容器の容量は適宜選択することができ特に限定されないが、液体培地を収容する部分の底面を平面視したときの面積として、下限が、例えば０．３２ｃｍ2、好ましくは０．６５ｃｍ2、より好ましくは０．６５ｃｍ2、さらに好ましくは１．９ｃｍ2、もっと好ましくは３．０ｃｍ2、３．５ｃｍ2、９．０ｃｍ2、又は９．６ｃｍ2の培養容器を用いることができ、上限としては、例えば１０００ｃｍ2、好ましくは５００ｃｍ2、より好ましくは３００ｃｍ2、より好ましくは１５０ｃｍ2、より好ましくは７５ｃｍ2、もっと好ましくは５５ｃｍ2、さらに好ましくは２５ｃｍ2、さらにより好ましくは２１ｃｍ2、さらにもっと好ましくは９．６ｃｍ2、又は３．５ｃｍ2の培養容器を用いることができる。
【００５５】
培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃〜４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ2インキュベーターなどを利用して、約１〜１０％、好ましくは５％のＣＯ2濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【００５６】
［５］多能性幹細胞の前培養
上記多能性幹細胞の凝集体又は多能性幹細胞を三胚葉のいずれかの細胞集団に分化誘導する前に、２−メルカプトエタノールを含む培地を用いて浮遊培養し、細胞集団を調製する。
前培養に用いる培地は、細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ６TM培地（Tｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等を用いることができる。
【００５７】
多能性幹細胞の前培養は、浮遊培養にて実施する。上述した浮遊培養の条件によって行うことができ、さらに、予めマイクロキャリア等に接着させて浮遊培養しても良いし、細胞のみで構成された細胞凝集塊の状態で浮遊培養しても良いし、細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子が混在していても良く、形態は特に限定しない。
【００５８】
前培養に用いる培地中における２−メルカプトエタノールの濃度としては、分化誘導の効率が向上する範囲であれば特に限定されないが、例えば、２−メルカプトエタノールの濃度として、１μＭ以上、２μＭ以上、５μＭ以上、１０μＭ以上、２０μＭ以上、３０μＭ以上、４０μＭ以上、又は５０μＭ以上が好ましく、２００μＭ以下、１５０μＭ以下、１２０μＭ以下、１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、又は６０μＭ以下が好ましい。
【００５９】
前培養に用いる培地は、ＦＧＦ２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ  ２）を添加していない培地であることも好ましい。ＦＧＦ２を添加していない培地を使用することにより、三胚葉のいずれかの細胞集団への分化効率をより向上することができることが本発明により見出されている。
前培養に用いる培地は、ＴＧＦβ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β１）を添加していない培地であることも好ましい。ＴＧＦβ１を添加していない培地を使用することにより、三胚葉のいずれかの細胞集団への分化効率をより向上することができることが本発明により見出されている。
【００６０】
前培養に用いる培地は、ＷＮＴシグナル活性化剤を添加していない培地であることも好ましい。ＷＮＴシグナル活性化剤を添加していない培地を使用することにより、三胚葉のいずれかの細胞集団への分化効率をより向上することができることが本発明により見出されている。
前培養に用いる培地は、アクチビンＡ（本明細書中において「ＡＣＴＩＶＩＮ  Ａ」と言い換える場合がある）を添加していない培地であることも好ましい。アクチビンＡを添加していない培地を使用することにより、三胚葉のいずれかの細胞集団への分化効率をより向上することができることが本発明により見出されている。
【００６１】
前培養に用いる培地は、さらにインスリンを含む培地であることも好ましい。インスリンを含む培地を使用することにより、三胚葉のいずれかの細胞集団への分化効率をより向上することができることが本発明により見出されている。
【００６２】
前培養用の培地には、アミノ酸、抗生物質、抗酸化剤、その他の添加物を加えてもよい。例えば０．１〜２％（体積／体積）の非必須アミノ酸、０．１〜２％（体積／体積）のペニシリン／ストレプトマイシン、０．１〜２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ又は１〜２０％（体積／体積）のＫｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ （ＫＳＲ）などを添加してもよい。
【００６３】
培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃〜４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ2インキュベーターなどを利用して、約１〜１０％、好ましくは５％のＣＯ2濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【００６４】
多能性幹細胞の前培養の培養期間は、多分化能が向上するまで培養する日数であれば特に限定されないが、例えば１週間を超えない期間であれば良い。より具体的には、６日未満、５日未満、４日未満、３日未満、または、６時間〜４８時間であり、１２時間〜３６時間程度であり、１８時間〜２４時間である。
【００６５】
［６］三胚葉のいずれかの細胞集団への分化誘導
本発明においては、上記の前培養で得られた細胞集団を、内胚葉系細胞、中胚葉系細胞、又は外胚葉系細胞のいずれかに分化誘導できる条件下で培養することによって、三胚葉のいずれかの細胞集団を製造することができる。
【００６６】
多能性幹細胞を三胚葉のいずれかの細胞集団に分化誘導する際には、分化誘導化培地を使用して多能性幹細胞の培養を行う。
分化誘導化培地としては、多能性幹細胞を分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、例えば、血清含有培地や、血清代替成分を含有した無血清培地等が挙げられる。
【００６７】
用いる細胞の種類に応じて、霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（リプロセル培地）、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの培地から任意に選択した２種以上の培地を混合した培地などが使用できる。なお、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
【００６８】
分化誘導培地は、血清成分又は血清代替成分を含んでいてもよい。血清成分又は血清代替成分としては、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ−２７サプリメント（Tｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｎ２サプリメント、Ｎ２１サプリメント（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ−２１サプリメント（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ社）、ＫＳＲ２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール、並びにこれらの均等物が挙げられる。
【００６９】
分化誘導培地には、さらに各種の添加物、抗生物質、抗酸化剤などを加えてもよい。例えば、０．１ｍＭ〜５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１〜２％（体積／体積）の非必須アミノ酸、０．１〜２％（体積／体積）のペニシリン、０．１〜２％（体積／体積）のストレプトマイシン、０．１〜２％（体積／体積）のアンフォテリシンＢ、カタラーゼ、グルタチオン、ガラクトース、レチノイン酸（ビタミンＡ）、スーパーオキシドディスムターゼ、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、Ｄ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）などを添加してもよい。
【００７０】
分化誘導培地にはさらに、分化誘導因子を添加する。分化誘導因子の詳細については後記する。
【００７１】
分化誘導時における多能性幹細胞の培養は、浮遊培養であることが好ましい。細胞はマイクロキャリア等に接着させて浮遊培養しても良いし、細胞のみで構成された細胞凝集塊の状態で浮遊培養しても良いし、細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子が混在していても良く、形態は特に限定しない。
【００７２】
分化誘導のための培養における培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃〜４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ2インキュベーターなどを利用して、約１〜１０％、好ましくは５％のＣＯ2濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【００７３】
多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化培養の培養期間は、内胚葉系列の細胞特性が呈する細胞型になっているのであれば特に限定されないが、例えば、2週間以内であればよく、より具体的には２日以上８日以内であり、より好ましくは２日以上７日以内であり、さらに好ましくは３日以上６日以内であり、一例としては５日である。
【００７４】
［７］内胚葉系細胞への分化誘導に用いる分化誘導因子、及びその他の添加物
本発明の内胚葉系細胞の製造方法においては、多能性幹細胞を、ＴＧＦβ(Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β)スーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地で培養した後に、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）を添加していない培地で培養する。
【００７５】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナルとは、細胞増殖の調節、分化、広汎な生物学的システムでの発達において大変重要な役割を演じている。一般的に、リガンドにより惹起されるセリン／スレオニン受容体キナーゼの多量体形成と、骨形態発生蛋白（ＢＭＰ）経路についてはＳｍａｄ１／５／８ といった細胞内シグナル分子のリン酸化によって、また、ＴＧＦβ／アクチビン経路ならびにＮＯＤＡＬ／アクチビン経路についてはＳｍａｄ２/３のリン酸化によってシグナルは開始される。活性化受容体によるＳｍａｄｓのカルボキシル基末端のリン酸化は、それらと共通のシグナルトランスデューサーであるＳｍａｄ４とのパートナーを形成し、核への移行を促す。活性化Ｓｍａｄｓは、転写因子とパートナーを組むことで様々な生物学的効果を制御し、細胞の状態に特異的な転写調節を行うが知られている。
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル経路に関与する遺伝子としては、ＢＭＰ２遺伝子、ＢＭＰ４遺伝子、ＢＭＰ５遺伝子、ＢＭＰ６遺伝子、ＢＭＰ７遺伝子、ＢＭＰ８遺伝子、ＧＤＦ５（Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ５）遺伝子、ＧＤＦ６遺伝子、ＧＤＦ７遺伝子、ＧＤＦ８遺伝子、ＡＭＨ（ａｎｔｉ−ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ）遺伝子、ｐａｉｒｅｄ  ｌｉｋｅ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ２（ＰＩＴＸ２）遺伝子、及びＮＯＤＡＬ遺伝子などが挙げられる。
【００７６】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤としては、骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ）経路、ＴＧＦβ／アクチビン経路、及び／又はＮＯＤＡＬ／アクチビン経路のシグナルを活性化する物質であれば特に限定されないが、
例えば、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＡＭＨ、ＰＩＴＸ２、及び／又はＮＯＤＡＬなどを用いることができる。特に、ＴＧＦβ／アクチビン経路のシグナルを活性化する物質を好適に用いることができ、具体的には、アクチビンＡ、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４からなる群から選択される少なくとも１種類を使用することが好ましく、アクチビンＡ、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４の全てを使用することが特に好ましい。
【００７７】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地においてアクチビンＡを使用する場合、アクチビンＡの添加初期濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、２ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、４０ｎｇ／ｍＬ以上、又は５０ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１,０００ｎｇ／ｍＬ以下、９００ｎｇ／ｍＬ以下、８００ｎｇ／ｍＬ以下、７００ｎｇ／ｍＬ以下、６００ｎｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ以下又は１００ｎｇ／ｍＬ以下である。
【００７８】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地においてＦＧＦ２を使用する場合、ＦＧＦ２の添加初期濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、２ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、又は４０ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１,０００ｎｇ／ｍＬ以下、９００ｎｇ／ｍＬ以下、８００ｎｇ／ｍＬ以下、７００ｎｇ／ｍＬ以下、６００ｎｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ以下、９０ｎｇ／ｍＬ以下、８０ｎｇ／ｍＬ以下、又は７０ｎｇ／ｍＬ以下である。
【００７９】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地においてＢＭＰ４を使用する場合、ＢＭＰ４の添加初期濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、２ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、６ｎｇ／ｍＬ以上、７ｎｇ／ｍＬ以上、８ｎｇ／ｍＬ以上、９ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、１１ｎｇ／ｍＬ以上、１２ｎｇ／ｍＬ以上、１３ｎｇ／ｍＬ以上、１４ｎｇ／ｍＬ以上、又は１５ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１,０００ｎｇ／ｍＬ以下、９００ｎｇ／ｍＬ以下、８００ｎｇ／ｍＬ以下、７００ｎｇ／ｍＬ以下、６００ｎｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ以下、９０ｎｇ／ｍＬ以下、８０ｎｇ／ｍＬ以下、７０ｎｇ／ｍＬ以下、６０ｎｇ／ｍＬ以下、５０ｎｇ／ｍＬ以下、４０ｎｇ／ｍＬ以下、又は３０ｎｇ／ｍＬ以下である。
【００８０】
ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地は、アクチビンＡを含むことが好ましい。
ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地がアクチビンＡを含む場合におけるアクチビンＡの添加初期濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、２ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、４０ｎｇ／ｍＬ以上、又は５０ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１,０００ｎｇ／ｍＬ以下、９００ｎｇ／ｍＬ以下、８００ｎｇ／ｍＬ以下、７００ｎｇ／ｍＬ以下、６００ｎｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ以下又は１００ｎｇ／ｍＬ以下である。
【００８１】
ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地は、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム及びエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも１種類以上を含むことが好ましい。
インスリンの添加濃度は、好ましくは０．００１μｇ／ｍＬ以上、０．０１μｇ／ｍＬ以上、０．０５μｇ／ｍＬ以上、０．１μｇ／ｍＬ以上、０．２μｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１０，０００μｇ／ｍＬ以下、１，０００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、１０μｇ／ｍＬ以下、９μｇ／ｍＬ以下、８μｇ／ｍＬ以下、７μｇ／ｍＬ以下、６μｇ／ｍＬ以下、５μｇ／ｍＬ以下、４μｇ／ｍＬ以下、３μｇ／ｍＬ以下、２μｇ／ｍＬ以下である。トランスフェリンの添加濃度は、好ましくは０．００１μｇ／ｍＬ以上、０．０１μｇ／ｍＬ以上、０．０５μｇ／ｍＬ以上、０．０６μｇ／ｍＬ以上、０．０７μｇ／ｍＬ以上、０．０８μｇ／ｍＬ以上、０．０９μｇ／ｍＬ以上、０．１μｇ／ｍＬ以上、０．１１μｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１０，０００μｇ／ｍＬ以下、１，０００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、１０μｇ／ｍＬ以下、９μｇ／ｍＬ以下、８μｇ／ｍＬ以下、７μｇ／ｍＬ以下、６μｇ／ｍＬ以下、５μｇ／ｍＬ以下、４μｇ／ｍＬ以下、３μｇ／ｍＬ以下、２μｇ／ｍＬ以下、１．９μｇ／ｍＬ以下、１．８μｇ／ｍＬ以下、１．７μｇ／ｍＬ以下、１．６μｇ／ｍＬ以下、１．５μｇ／ｍＬ以下、１．４μｇ／ｍＬ以下、１．３μｇ／ｍＬ以下、１．２μｇ／ｍＬ以下、１．１μｇ／ｍＬ以下である。亜セレン酸ナトリウムの添加濃度は、好ましくは０．００１ｎｇ／ｍＬ以上、０．０１ｎｇ／ｍＬ以上、０．１ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１０，０００ｎｇ／ｍＬ以下、１，０００ｎｇ／ｍＬ以下、１００ｎｇ／ｍＬ以下、１０ｎｇ／ｍＬ以下、１ｎｇ／ｍＬ以下である。エタノールアミンの添加濃度は、好ましくは０．００１μｇ／ｍＬ以上、０．０１μｇ／ｍＬ以上、０．０２μｇ／ｍＬ以上、０．０３μｇ／ｍＬ以上、０．０４μｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１０，０００μｇ／ｍＬ以下、１，０００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、１０μｇ／ｍＬ以下、１μｇ／ｍＬ以下、０．９μｇ／ｍＬ以下、０．８μｇ／ｍＬ以下、０．７μｇ／ｍＬ以下、０．６μｇ／ｍＬ以下、０．５μｇ／ｍＬ以下、０．４μｇ／ｍＬ以下である。
【００８２】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地は、さらに２−メルカプトエタノールを含むことが好ましい。２−メルカプトエタノールを作用することにより、内胚葉系細胞への分化誘導効率を高めることができる。
【００８３】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地は、さらにＷＮＴシグナル活性化剤を含むことが好ましい。
【００８４】
ＷＮＴシグナルとは、β−カテニンの核移行を促し、転写因子としての機能を発揮する一連の作用をいう。ＷＮＴシグナルは細胞間相互作用に起因し、例えば、ある細胞から分泌されたＷＮＴ３Ａというタンパクがさらに別の細胞に作用し、細胞内のβ−カテニンが核移行し、転写因子として作用する一連の流れが含まれる。一連の流れは上皮間葉相互作用を例とする器官構築の最初の現象を引き起こす。ＷＮＴシグナルはβ−カテニン経路、ＰＣＰ経路、Ｃａ2+経路の三つの経路を活性化することにより、細胞の増殖や分化、器官形成や初期発生時の細胞運動など各種細胞機能を制御することで知られる。
ＷＮＴシグナル経路に関与する遺伝子としては、ＷＮＴ３Ａ遺伝子などがある。
【００８５】
ＷＮＴシグナル活性化剤としては、特に限定されないが、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の阻害活性を示すものであればいかなるものでもよく、例えばビス−インドロ（インジルビン）化合物（ＢＩＯ）（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、そのアセトキシム類似体ＢＩＯ−アセトキシム（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム）、チアジアゾリジン（ＴＤＺＤ）類似体（４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、オキソチアジアゾリジン―３−チオン類似体（２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン）、チエニルα−クロロメチルケトン化合物（２−クロロ−１−（４，４−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物（α−４−ジブロモアセトフェノン）、チアゾール含有尿素化合物（Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ユレア）やＧＳＫ−３βペプチド阻害剤、例えばＨ−ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ2、などを使用することができ、特に好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ：２５２９１７−０６−９）を使用することができる。ＷＮＴ３Ａも好適に用いることができる。
【００８６】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地においてＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合、添加初期濃度は、好ましくは０．０１μＭ以上、０．０２μＭ以上、０．０３μＭ以上、０．０４μＭ以上、０．０５μＭ以上、０．１μＭ以上、０．２μＭ以上、０．３μＭ以上、０．４μＭ以上、０．５μＭ以上、０．６μＭ以上、０．７μＭ以上、０．８μＭ以上、０．９μＭ以上、１μＭ以上、又は２μＭ以上であり、好ましくは１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、６０μＭ以下、５０μＭ以下、４５μＭ以下、４０μＭ以下、３５μＭ以下、３０μＭ以下、２５μＭ以下、２０μＭ以下、１５μＭ以下、１０μＭ以下又は５μＭ以下である。より好ましくは３μＭまたは４μＭである。
【００８７】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地は、少なくともグルコースを含む。前記培地中に含まれるグルコース濃度の下限は、細胞が増殖できる濃度であれば特に限定されないが、０．０１ｇ／Ｌ以上が好ましい。また、前記培地中に含まれるグルコース濃度の上限は、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、例えば１０ｇ／Ｌ以下が好ましい。他の実施態様として、内胚葉系列の体細胞に効率的に分化させる観点においては、グルコースを２．０ｇ／Ｌ未満で含有する培地が好ましい。ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地におけるグルコースの濃度は、１．０ｇ／Ｌ以下でもよく、０．９ｇ／Ｌ以下でもよく、０．８ｇ／Ｌ以下、０．７ｇ／Ｌ以下、０．６ｇ／Ｌ以下でもよい。ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地がグルコースを含む場合における、グルコースの濃度の下限は特に限定されないが、０．０１ｇ／Ｌ以上でもよく、０．０２ｇ／Ｌ以上、０．０５ｇ／Ｌ以上、０．１ｇ／Ｌ以上、０．２ｇ／Ｌ以上、０．３ｇ／Ｌ以上、０．４ｇ／Ｌ以上、０．５ｇ／Ｌ以上でもよい。
【００８８】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地として、グルコースを１．０ｇ／Ｌ以下の濃度で含有する培地を使用することによって、ＳＯＸ２陽性細胞は減少し、ＳＯＸ１７陽性細胞が増加することから、体細胞に分化誘導するのにより好適な細胞集団を取得することができる。
【００８９】
[８]内胚葉系細胞集団
本発明によれば、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＮａｎｏｇ遺伝子の相対発現量が０．８以下であり、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＨＮＦ1Ｂ遺伝子の相対発現量が１．０以上であり、ＳＯＸ１７の陽性を呈する細胞の比率が８０％以上である、内胚葉系細胞集団が提供される。
【００９０】
ＯＡＺ１（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ａｎｔｉｚｙｍｅ  1, 遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されているＩＤ：４９４６を参照）遺伝子の発現量に対するＮａｎｏｇ（Ｎａｎｏｇ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ, 遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されているＩＤ：７９９２３を参照）遺伝子の相対発現量は０．８以下であるが、好ましくは０．７以下であり、０．６５以下、０．６以下であり、０．５５以下であり、０．５以下であり、０．４５以下であり、０．４以下であり、０．３５以下であってもよい。Ｎａｎｏｇは未分化マーカーであることから、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＮａｎｏｇ遺伝子の相対発現量が０．８以下であることは、未分化の度合いが低いこと、即ち、細胞集団において未分化細胞が低減していることを示していることから、効率的な分化誘導が行われていることを意味する。
【００９１】
ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＨＮＦ1Ｂ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ １  ｂｅｔａ, 遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されているＩＤ：６９２８を参照）遺伝子の相対発現量は１．０以上であるが、好ましくは１．１以上であり、１．２以上であり、１．５以上であり、１．７以上であり、２．０以上であり、２．３以上であり、２．５以上であってもよい。ＨＮＦ1Ｂは原始腸管細胞（ＰＧＴ）マーカーであることから、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＨＮＦ1Ｂ遺伝子の相対発現量が１．０以上であることは、内胚葉系列の体細胞に分化誘導するのにより好適な細胞集団であることを意味する。
【００９２】
本発明の内胚葉系細胞集団においては、ＳＯＸ１７（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ−ｂｏｘ  １７）の陽性を呈する細胞の比率は８０％以上であるが、好ましくは８５％以上であり、９０％以上であり、９１％以上であり、９２％以上であり、９３％以上であり、９４％以上であり、９５％以上であり、９６％以上であり、９７％以上であり、９８％以上であり、９９％以上であり、９９．５以上であり９９．９以上であってもよい。ＳＯＸ１７は内胚葉系マーカーであることから、ＳＯＸ１７の陽性を呈する細胞の比率が８０％以上であることは、胚体内胚葉（ＤＥ）への分化誘導が効率的に行われていることを意味する。なお、ＳＯＸ１７の陽性を呈する細胞の比率を測定する場合においては、Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社の抗ＳＯＸ１７抗体（カタログ番号：５６２５９４）を用いることが好ましい。
【００９３】
好ましくは、本発明の内胚葉系細胞集団においては、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＨＮＦ４Ａ（ｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４, 遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されているＩＤ：３１７２を参照）遺伝子の相対発現量が０．５以上であるが、好ましくは０．６以上であり、０．６５以上であり、０．７以上であり、０．７５以上であり、１．０以上であり、１．５以上であり、２．０以上であり、２．３以上であり、３以上であってもよい。ＨＮＦ４Ａは原始腸管細胞（ＰＧＴ）マーカーであることから、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＨＮＦ４Ａ遺伝子の相対発現量が０．５以上であることは、内胚葉系列の体細胞に分化誘導するのにより好適な細胞集団であることを意味する。
【００９４】
好ましくは、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＥｐＣＡＭ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ, 遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されているＩＤ：４０７２を参照）遺伝子の相対発現量は０．６以上であり、より好ましくは０．７以上であり、０．８以上であり、０．９以上であり、１．０以上であり、１．１以上であり、１．２以上であり、１．３以上であり、１．５以上であり、２．０以上であってもよい。ＥｐＣＡＭは内胚葉系マーカーであることから、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＥｐＣＡＭ遺伝子の相対発現量は０．６以上であることは、内胚葉系列の体細胞に分化誘導するのにより好適な細胞集団であることを意味する。
【００９５】
好ましくは、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＶＩＭ（ｖｉｍｅｎｔｉｎ, 遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されているＩＤ：７４３１を参照）遺伝子の相対発現量は１２以下であり、より好ましくは１１以下であり、１０以下であり、９以下であり、８以下であり、７以下であり、６以下であり、５以下であり、４以下であり、３．５以下であり、３．０以下であってもよい。ＶＩＭは、間充織マーカーであることから、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＶＩＭ遺伝子の相対発現量は１２以下であることは、内胚葉系列の体細胞に分化誘導するのにより好適な細胞集団であることを意味する。
【００９６】
好ましくは、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＳＯＸ２（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ  −ｂｏｘ  ２, 遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されているＩＤ：６６５７を参照）遺伝子の相対発現量は０．１１以下であり、より好ましくは０．１０以下であり、０．０７以下であり、０．０５以下であり、０．０１以下であり、０．００６以下であり、０．００４５以下でもあってもよい。ＳＯＸ２は未分化マーカーであることから、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＳＯＸ２遺伝子の相対発現量が０．１１以下であることは、未分化の度合いが低いこと、即ち、細胞集団において未分化細胞が低減していることを示していることから、効率的な分化誘導が行われていることを意味する。
【００９７】
好ましくは、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するｃ−Ｍｙｃ（ｖ−ｍｙｃ  ａｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ, 遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されているＩＤ：４６０９を参照）遺伝子の相対発現量は０．１以下であり、より好ましくは０．０９５以下であり、０．０５以下であり、０．０４５以下であり、０．０３５以下であり、０．０２以下であり、０．０１５以下であり、０．０１以下であってもよい。ｃ−Ｍｙｃは未分化マーカーであることから、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するｃ−Ｍｙｃ遺伝子の相対発現量が０．１以下であることは、未分化の度合いが低いこと、即ち、細胞集団において未分化細胞が低減していることを示していることから、効率的な分化誘導が行われていることを意味する。
【００９８】
好ましくは、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＯＣＴ４（ｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４, 遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されているＩＤ：５４６０を参照）遺伝子の相対発現量は０．４以下であり、より好ましくは０．３５以下であり、０．３以下であり、０．２５以下であり、０．２以下であり、０．１５以下であり、０．１以下であり、０．０５以下であり、０．０１以下であってもよい。ＯＣＴ４は未分化マーカーであることから、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＯＣＴ４遺伝子の相対発現量が０．４以下であることは、未分化の度合いが低いこと、即ち、細胞集団において未分化細胞が低減していることを示していることから、効率的な分化誘導が行われていることを意味する。
【００９９】
好ましくは、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−１（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−１遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されているＩＤ：２３３５を参照）遺伝子の相対発現量は１．０以上であり、より好ましくは１．１以上であり、１．２以上であり、１．３以上であり、１．４以上であり、１．５以上であり、１．６以上であってもよい。Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−１は、ＥＣＭ（細胞外マトリックス：Extracellular matrix）レセプター相互作用に関与する分子である。ＥＣＭは細胞にとって足場になるだけではなく、組織の形態形成・分化・ホメオスタシスに必要とされるシグナルを出す働きすることが知られている。従って、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−１の相対発現量が１．０以上であることは、内胚葉系列の体細胞に分化誘導するのにより好適な細胞集団であることを意味する。
【０１００】
好ましくは、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１（Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されているＩＤ：５９５を参照）遺伝子の相対発現量は０．０１５以下であり、より好ましくは０．０１４以下であり、０．０１３以下であり、０．０１２以下であり、０．０１１以下であってもよい。Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１は細胞周期に関与している。従って、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子の相対発現量が０．０１５以下であることは、細胞周期が停止しやすい状態（細胞の増殖が抑制される状態）であることを示していることから、より効率的な分化誘導が行われていることを意味する。
【０１０１】
好ましくは、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＭａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ２（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ２遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されているＩＤ：４３１３を参照）遺伝子の相対発現量は０．０２０以下であり、より好ましくは０．０１９以下であり、０．０１８以下であり、０．０１７以下であってもよい。Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ２はがんにおける血管新生などに関与することが知られており、基底膜を構成しているコラーゲンなどの細胞外マトリックスを分解することが知られている。従って、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＭａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ２遺伝子の相対発現量が０．０２０以下であることは、細胞外マトリックスの分解が抑制され、前記Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−１などのＥＣＭとの接触が安定化され、組織の形態形成・分化・ホメオスタシスに必要とされるシグナルが入りやすいことを示していることから、より効率的な分化誘導が行われていることを意味する。
【０１０２】
好ましくは、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣＤ４４（ＣＤ４４遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されているＩＤ：９６０を参照）遺伝子の相対発現量は０．０２０以下であり、より好ましくは０．０１９以下であり、０．０１８以下であり、０．０１７以下、０．０１６以下、０．０１５以下、０．０１４以下、０．０１３以下、０．０１２以下、０．０１１以下、０．０１０以下、０．００９以下であってもよい。ＣＤ４４はヒアルロン酸をおもなリガンドとする接着分子として知られており、癌細胞の増殖能などに関与することが知られている。ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣＤ４４遺伝子の相対発現量が０．０２０以下であることは、細胞の増殖が抑制されることを示していることから、より効率的な分化誘導が行われていることを意味する。
【０１０３】
好ましくは、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ１（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ１遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースに登録されているＩＤ：３６６７を参照）遺伝子の相対発現量は０．００１０以下であり、より好ましくは０．０００９以下であり、０．０００８以下であり、０．０００７以下であってもよい。ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ１はＰＩ３Ｋ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ）―Ａｋｔシグナル伝達経路に関与する分子であり、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナルが活性化されると分化が抑制されることが知られている。ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ１遺伝子の相対発現量が０．００１０以下であることは、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナルが入りにくいことを示していることから、より効率的な分化誘導が行われていることを意味する。
【０１０４】
ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＮａｎｏｇ遺伝子の相対発現量、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＨＮＦ1Ｂ遺伝子の相対発現量、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＨＮＦ４Ａ遺伝子の相対発現量、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＥｐＣＡＭ遺伝子の相対発現量、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＶＩＭ遺伝子の相対発現量、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＳＯＸ２遺伝子の相対発現量、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＯＣＴ４遺伝子の相対発現量、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するｃ−Ｍｙｃ遺伝子の相対発現量、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−１遺伝子の相対発現量、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子の相対発現量、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＭａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ２遺伝子の相対発現量、ＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するＣＤ４４遺伝子の相対発現量、並びにＯＡＺ１遺伝子の発現量に対するｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ１遺伝子の相対発現量とは、ＯＡＺ１遺伝子の発現量を１とした場合における、Ｎａｎｏｇ遺伝子、ＨＮＦ1Ｂ遺伝子、ＨＮＦ４Ａ遺伝子、ＥｐＣＡＭ遺伝子、ＶＩＭ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＯＣＴ４遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−１遺伝子、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子、Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ２遺伝子、ＣＤ４４遺伝子、ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ１遺伝子の発現量の比率を意味する。各遺伝子の発現量の測定は、当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、分化誘導した内胚葉系細胞のｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡの合成を行い、このｃＤＮＡを鋳型とし、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施することにより、各遺伝子の発現量を測定することができる。Ｎａｎｏｇ遺伝子、ＨＮＦ１Ｂ遺伝子、ＨＮＦ４Ａ遺伝子、ＥｐＣＡＭ遺伝子、ＶＩＭ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＯＣＴ４遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−１遺伝子、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子、Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ２遺伝子、ＣＤ４４遺伝子、ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ１遺伝子の発現量は、ＯＡＺ１遺伝子の発現量により標準化される。
【０１０５】
ＳＯＸ１７の陽性を呈する細胞の比率は、フローサイトメトリーにより測定することができるが、特に限定されない。蛍光標識抗体を用いるフローサイトメトリーにおいて、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
［９］膵臓β細胞への分化誘導
内胚葉系細胞から膵臓β細胞への分化誘導は、一般的に内胚葉系細胞（胚体内胚葉：Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ：ＤＥ）→原始腸管細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｔｕｂｅ：ＰＧＴ）→後前腸細胞（Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ Ｆｏｒｅｇｕｔ：ＰＦＧ）→膵臓前駆細胞（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：ＰＰ）→内分泌前駆細胞（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ：ＥＰ）→膵臓β細胞（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃβｃｅｌｌ：β）という順番で行うことができる。
【０１０７】
膵臓β細胞への分化誘導における培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃〜４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ2インキュベーターなどを利用して、約１〜１０％、好ましくは５％のＣＯ2濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【０１０８】
内胚葉系細胞（胚体内胚葉）から原始腸管細胞への分化誘導に用いる培地としては、基礎培地（例えば、ＤＭＥＭ培地など）に、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＦＧＦ−２及びＦＧＦ−７、ＥＣ２３、ＳＢ４３１５４２、ドルソモルフィン及びＳＡＮＴ１を添加した培地を用いることができる。
【０１０９】
内胚葉系細胞（胚体内胚葉）から原始腸管細胞への分化誘導の培養期間は、一般的には、一般的には２４時間〜７２時間であり、好ましく３６時間〜６０時間程度である。
【０１１０】
原始腸管細胞から後前腸細胞への分化誘導に用いる培地としては、基礎培地（例えば、ＤＭＥＭ培地など）に、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＦＧＦ−２、ＥＣ２３、ＳＢ４３１５４２、ドルソモルフィン及びＳＡＮＴ１を添加した培地を用いることができる。
【０１１１】
原始腸管細胞から後前腸細胞への分化誘導の培養期間は、一般的には、一般的には４８時間〜１４４時間であり、好ましく７２時間〜１２０時間程度である。
【０１１２】
後前腸細胞から膵臓前駆細胞への分化誘導に用いる培地としては、基礎培地（例えば、ＤＭＥＭ培地など）に、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＦＧＦ−１０、ＥＣ２３、ドルソモルフィン、ＡＬＫインヒビターＩＩ、インドラクタムＶ及びＥｘｃｅｄｉｎ−４を添加した培地を用いることができる。
【０１１３】
後前腸細胞から膵臓前駆細胞への分化誘導の培養期間は、一般的には、一般的には２４時間〜１２０時間であり、好ましく４８時間〜９６時間程度である。
【０１１４】
膵臓前駆細胞から内分泌前駆細胞への分化誘導に用いる培地としては、基礎培地（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ−ＤＭＥＭ培地など）に、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＥＣ２３、ドルソモルフィン、ＡＬＫインヒビターＩＩ、ＳＡＮＴ１及びＥｘｃｅｄｉｎ−４を添加した培地を用いることができる。
【０１１５】
膵臓前駆細胞から内分泌前駆細胞への分化誘導の培養期間は、一般的には、一般的には２４時間〜１２０時間であり、好ましく４８時間〜９６時間程度である。
【０１１６】
内分泌前駆細胞から膵臓β細胞への分化誘導に用いる培地としては、基礎培地（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ−ＤＭＥＭ培地など）に、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＦＧＦ−２、ＢＭＰ−４、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＡＬＫインヒビターＩＩ、Ｅｘｃｅｄｉｎ−４、ニコチンアミド、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎを添加した培地を用いることができる。
【０１１７】
内分泌前駆細胞から膵臓β細胞への分化誘導の培養期間は、一般的には、一般的には９６時間〜２４０時間程度である。
【０１１８】
上記の方法により得られる膵臓β細胞は、インスリン分泌能が高く、糖尿病に対して高い治療効果を発揮できる。
【０１１９】
［１０］中胚葉系細胞又は外胚葉系細胞への分化誘導
本発明において、多能性幹細胞を中胚葉系細胞に分化誘導させる場合には、例えば、特表２０１３−５３０６８０号公報に記載されている方法を使用することができる。特表２０１３−５３０６８０号公報には、（ｉ）アクチビンＡおよびＷｎｔを含む培地中でヒト多能性幹細胞を培養する工程、および（ｉｉ）ＢＭＰおよびＷｎｔもしくはＷｎｔの機能等価物を含む培地中で、工程（ｉ）で得られた細胞を培養する工程を含む、ヒト多能性幹細胞から中間中胚葉系細胞の製造方法が記載されている。また、Ａｌｂｅｒｔ  Ｑ  Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２５：１２１１−１２２２５，２０１５には、ヒト多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１で処理した後に、ＦＧＦ２及びレチノイン酸で処理することにより効率的に中胚葉系細胞に分化誘導できることが記載されている。本発明においても、上記文献に記載されている分化誘導因子を用いて、多能性幹細胞を中胚葉系細胞に分化誘導させることができる。
【０１２０】
本発明において、多能性幹細胞を外胚葉系細胞に分化誘導させる場合には、例えば、ＢＭＰ阻害剤（Ｎｏｇｇｉｎ等）及びＴＧＦβ／ＡＣＴＩＶＩＮ阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養する方法（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ＳＭ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７，２７５−２８０（２００９））、ＢＭＰ阻害剤（Ｎｏｇｇｉｎ等）及びＮｏｄａｌ／ＡＣＴＩＶＩＮ阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養する方法（Ｂｅａｔａ  Ｓｕｒｎａｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２０１２；３０：１８７５−１８８４）を採用することができる。
【０１２１】
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【０１２２】
［実施例１］
＜多能性幹細胞の維持培養＞
（ＴＫＤＮ４−Ｍ株）
ヒトｉＰＳ細胞株ＴＫＤＮ４−Ｍ(東京大学医科学研究所)はＭＩＴＯＭＹＣＩＮ−Ｃ(ＷＡＫＯ社)で処理をしたＳＮＬ ＦＥＥＤＥＲ細胞上でヒトｉＰＳ細胞培地(２０％ ＫＮＯＣＫＯＵＴ ＳＥＲＵＭ ＲＥＰＬＡＣＥＭＥＮＴ（ＫＳＲ；ＧＩＢＣＯ社)、１Ｘ ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ（ＮＥＡＡ；ＷＡＫＯ社)、５５μｍｏＬ／Ｌ  ２−ＭＥＲＣＡＰＴＥＴＨＡＮＯＬ（２−ＭＥ；ＧＩＢＣＯ社)、７．５ＮＧ／ＭＬ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＨＵＭＡＮ  ＦＩＢＲＯＢＬＡＳＴ  ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲ（ＦＧＦ２；ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）、０．５Ｘ  ＰＥＮＩＣＩＬＬＩＮ  ＡＮＤ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮ  （ＰＳ；ＷＡＫＯ者）を含むＤＭＥＭ／ＨＡＭ‘Ｓ  Ｆ１２（ＷＡＫＯ社））で未分化維持培養を行った。または、ＶＩＴＲＯＮＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ）でコーティングしたプレート上で、１ＸＰＥＮＩＣＩＬＬＩＮ  ＡＮＤ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮ  ＡＮＤ  ＡＭＰＨＯＴＥＲＩＣＩＮ  Ｂ（ＷＡＫＯ社）を含むＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ８培地（Ｅ８；ＧＩＢＣＯ社）で未分化維持培養した。なお、播種時のみ最終濃度１０μＭとなるように Ｙ２７６３２を添加して培養した。
（４５４Ｅ２株）
ヒトｉＰＳ細胞株454E2(CIRA)はＭＩＴＯＭＹＣＩＮ−Ｃ(ＷＡＫＯ社)で処理をしたＳＮＬ ＦＥＥＤＥＲ細胞上でヒトｉＰＳ細胞培地(２０％ ＫＮＯＣＫＯＵＴ ＳＥＲＵＭ ＲＥＰＬＡＣＥＭＥＮＴ（ＫＳＲ；ＧＩＢＣＯ社)、１Ｘ ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ（ＮＥＡＡ；ＷＡＫＯ社)、５５μｍｏＬ／Ｌ  ２−ＭＥＲＣＡＰＴＥＴＨＡＮＯＬ（２−ＭＥ；ＧＩＢＣＯ社)、７．５ＮＧ／ＭＬ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＨＵＭＡＮ  ＦＩＢＲＯＢＬＡＳＴ  ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲ（ＦＧＦ２；ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）、０．５Ｘ  ＰＥＮＩＣＩＬＬＩＮ  ＡＮＤ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮ  （ＰＳ；ＷＡＫＯ者）を含むＤＭＥＭ／ＨＡＭ‘Ｓ  Ｆ１２（ＷＡＫＯ社））で未分化維持培養を行った。または、ＶＩＴＲＯＮＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ）でコーティングしたプレート上で、１ＸＰＥＮＩＣＩＬＬＩＮ  ＡＮＤ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮ  ＡＮＤ  ＡＭＰＨＯＴＥＲＩＣＩＮ  Ｂ（ＷＡＫＯ社）を含むＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ８培地（Ｅ８；ＧＩＢＣＯ社）で未分化維持培養した。なお、播種時のみ最終濃度１０μＭとなるように Ｙ２７６３２を添加して培養した。
＜凝集塊の作製＞
（ＴｋＤＮ４−Ｍ株）
ヒトｉＰＳ細胞株ＴｋＤＮ４−Ｍ（東京大学医科学研究所）は、Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ−Ｃ（Ｗａｋｏ社）で処理をしたＳＮＬｆｅｅｄｅｒ細胞から剥がすために培地にて３回リンスした後、さらに１回ＰＢＳでリンスを行い、ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）にて３７℃で１５分インキュベートしてからピペッティングによりシングルセルにした。３×１０7細胞のシングルセルにしたＴｋＤＮ４−Ｍを３０ｍＬの１０μＭのＹ２７６３２を含むｍＴｅＳＲ１の培地中に懸濁し、３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）へ移し６チャネルマグネチックスターラー（ＡＢＬＥ社）に装着して浮遊培養を１日間行った。【０１２３】
（４５４Ｅ２株）
ヒトｉＰＳ細胞株４５４Ｅ２（Ｃｉｒａ）は、ＰＢＳで２回リンスしてから、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で３７℃、５分程インキュベートを行い、ピペッティングにより回収したシングルセルにした後に、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２でリンスした。３×１０7細胞のシングルセルにした４５４Ｅ２を３０ｍＬの１０μＭのＹ２７６３２を含むｍＴｅＳＲ１に懸濁し、３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（エイブル社）へ移し６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着して浮遊培養を１日間行った。【０１２４】
＜多能性幹細胞の前培養＞
維持培養にて得られた凝集体を形成した細胞集団を、２０％（体積／体積）  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｇｉｂｃｏ社）、１ｘｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）、５５μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ；Ｇｉｂｃｏ社）、７．５ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ２；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、０．５×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ；Ｗａｋｏ社）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｗａｋｏ社）に懸濁し、３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）へ移し、６チャネルマグネチックスターラー（ＡＢＬＥ社）に装着して浮遊培養を１日間行った。【０１２５】
＜内胚葉系細胞 (胚体内胚葉)への分化誘導＞
前培養にて得られた凝集体を形成した細胞集団を、最初の２日間は、０．５％Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ；  ｓｉｇｍａ）、０．４×ＰＳ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｗａｋｏ社）、１ｘＮＥＡＡ、８０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  アクチビンＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、２０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＢＭＰ４；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、３μｍｏｌ／Ｌ  ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｗａｋｏ社）で浮遊培養した。３日目はこの培地からＢＭＰ４、ＦＧＦ２、ＣＨＩＲ９９０２１を除いて浮遊培養を行い、４日目はさらに１％  ＫＳＲを加えた培地で浮遊培養を１日間行った。なお、浮遊培養は、６チャネルマグネチックスターラー（エイブル社）に装着して行い、サンプルを調整した。【０１２６】
［参考例１］
＜多能性幹細胞の維持培養＞
実施例１に記載の方法で同様に培養した。【０１２７】
＜多能性幹細胞の前培養＞
維持培養にて得られた細胞集団を、ＴｋＤＮ４−Ｍ株は  Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ−Ｃで処理をしたＳＮＬｆｅｅｄｅｒ細胞上で、４５４Ｅ２株はＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎでコートしたディッシュ上で、２０％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１×ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、５５μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール、７．５ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、０．５×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２にて、フィーダー細胞又はディッシュ上に接着させた状態で培養を１日間行った。【０１２８】
＜内胚葉系細胞（胚体内胚葉）への分化誘導＞
前培養にて得られた細胞集団を、最初の２日間は、０．５％Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  、０．４×ＰＳ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、８０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎアクチビンＡ、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、２０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４、３μｍｏｌ／Ｌ  ＣＨＩＲ９９０２１を含むＲＰＭＩ１６４０でディッシュ上に接着させた状態で培養した。３日目はこの培地からＣＨＩＲ９９０２１を除いてディッシュ上に接着させた状態で培養を行い、４日目はさらに１％（体積／体積）  ＫＳＲを加えた培地でディッシュ上に接着させた状態で培養を１日間行った。【０１２９】
［分化効率の解析］
実施例１及び参考例１にて作製した内胚葉系細胞集団における胚体内胚葉（ＤＥ）への分化効率を調べるために、以下に示す手順にて、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびフローサイトメトリー解析にて分析した。【０１３０】
＜定量的ＲＴ−ＰＣＲ＞
分化誘導した内胚葉系間細胞のｔｏｔａｌＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（Ｗａｋｏ社）により単離・精製し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。ここで合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＧｏＴａｑ  ｑＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使いＭｙｉＱ  ｑＰＣＲ  ｍａｃｈｉｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）によりｑＰＣＲを実行した。検出はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎによるインターカレーション法で、遺伝子発現量比較は検量線作成による相対定量法で行った。各遺伝子の発現レベルはハウスキーピング遺伝子であるＯＡＺ１により標準化した。なお、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＨＮＨ１Ｂ及びＨＮＦ４Ａの遺伝子に関しては、サンプル１及び２を分析した。Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−１（ＦＮ１）、ＣｙｃｌｉｎＤ１、ＣＤ４４、ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ２（ＭＭＰ２）、ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ １(ＩＲＳ１)についてはｎ＝３で分析を行い、得られた分析値から平均値と標準偏差値を算出した。その詳細については、［表１］に記載する。【０１３１】
ｑＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列は次のとおりである。
C-MYC F：GTC TCC ACA CAT CAG CAC AAC TAC（配列番号１）
C-MYC R：TTC GGT TGT TGC TGA TCT GTC  （配列番号２）
HNF1B F：GAG ATC CTC CGA CAA TTC AAC C（配列番号３）
HNF1B R：AAA CAG CAG CTG ATC CTG ACT G（配列番号４）
HNF4A F：AAG AGA TCC ATG GTG TTC AAG GAC（配列番号５）
HNF4A R：AGG TAG GCA TAC TCATTG TCA TCG（配列番号６）
NANOG F：CGA AGA ATA GCA ATG GTG TGA C（配列番号７）
NANOG R：GTT GCT CCA GGT TGA ATT GTT C（配列番号８）
OAZ1 F ：GTC AGA GGG ATC ACA ATC TTT CAG（配列番号９）
OAZ1 R ：GTC TTG TCG TTG GAC GTT AGT TC（配列番号１０）
OCT4 F：CGC TTC AAG AAC ATG TGT AAG CTG C（配列番号１１）
OCT4 R：CTC TCA CTC GGT TCT CGA TAC TG（配列番号１２）
SOX2 F ：ATA AGT ACT GGC GAA CCA TCT CTG（配列番号１３）
SOX2 R ：AAT TAC CAA CGG TGT CAA CCT G（配列番号１４）
EPCAM  F：ATG ATC CTG ACT GCG ATG AGA G（配列番号１５）
EPCAM  R：CAG TGT CCT TGT CTG TTC TTC TGA C（配列番号１６）
VIM F：GTC ACC TTC GTG AAT ACC AAG AC（配列番号１７）
VIM R：AGG CAG AGA AAT CCT GCT CTC（配列番号１８）
Fibronectin-1(FN1)F: CTC TGT CAA CGA AGG CTT GAA C （配列番号２７）
Fibronectin-1(FN1)R: CAC TTC CAA AGC CTA AGC ACT G  （配列番号２８）
CD44 F: ATA GAA GGG CAC GTG GTG ATT C  （配列番号２９）
CD44 R: ATG TGT CAT ACT GGG AGG TGT TG  （配列番号３０）
Cyclin D1 F: CCG CAC GAT TTC ATT GAA C  （配列番号３１）
Cyclin D1 R: ACT TCA CAT CTG TGG CAC AGA G  （配列番号３２）
matrix metallopeptidase 2(MMP2) F: CAC CCA TTT ACA CCT ACA CCA AG（配列番号３３）
matrix metallopeptidase 2(MMP2) R: TTG CAG ATC TCA GGA GTG ACA G（配列番号３４）
insulin receptor substrate 1(IRS1) F: GTT TCA TCT CCT CGG ATG AGT ATG（配列番号３５）
insulin receptor substrate 1(IRS1) R: TAG TTG CTT AGC TCC TCC TCA CC（配列番号３６）【０１３２】
＜測定の結果＞
遺伝子発現量を測定した結果を図１〜図３及び図１０〜図１４に示す。
図１０〜図１４の結果は、下記表にまとめて示す。【０１３３】
【表１】
2018139600.tif 000003
【０１３４】
参考例１に記載の方法にて分化誘導した内胚葉系細胞に対して、実施例１に記載の方法にて分化誘導した内胚葉系細胞は、未分化マーカー（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ及びＮａｎｏｇ）の遺伝子発現量が、減少していた（図１）。
参考例１に記載の方法にて分化誘導した内胚葉系細胞に対して、実施例１に記載の方法にて分化誘導した内胚葉系細胞は、原始腸管細胞（ＰＧＴ）マーカー（ＨＮＦ１Ｂ及びＨＮＦ４Ａ）の遺伝子発現量が向上していた（図１）。【０１３５】
参考例１に記載の方法にて分化誘導した内胚葉系細胞に対して、実施例１に記載の方法にて分化誘導した内胚葉系細胞は、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−１（ＦＮ１）の遺伝子発現量が向上していた（図１０）。
参考例１に記載の方法にて分化誘導した内胚葉系細胞に対して、実施例１に記載の方法にて分化誘導した内胚葉系細胞は、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、ＣＤ４４、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ２（ＭＭＰ２）、及びｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ１（ＩＲＳ１）の遺伝子発現量が減少していた（図１１〜図１４）。【０１３６】
＜フローサイトメトリー解析＞
回収してシングルセルまで分散した細胞を４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）により室温で２０分間固定後、ＰＢＳで３回洗浄し、冷メタノールにより−２０℃で一晩透過処理を行った。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで３回洗浄後、３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳによりブロッキングし、下記表の蛍光標識済抗体により４℃で３０分〜１時間染色した。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで１回洗浄後、セルストレーナーに通過させた細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ；ＢＤ社）にて解析した。【０１３７】
【表２】
2018139600.tif 000004
【０１３８】
参考例１に記載の方法にて分化誘導した内胚葉系細胞に対して、実施例１に記載の方法にて分化誘導した内胚葉系細胞は、内胚葉系マーカーであるＥｐＣＡＭの遺伝子発現量が向上しており、ＳＯＸ１７の陽性を呈する細胞が９０％以上を占めた（図２及び図３）。
参考例１に記載の方法にて分化誘導した内胚葉系細胞に対して、実施例１に記載の方法にて分化誘導した内胚葉系細胞は、間充織マーカーであるＶＩＭの遺伝子発現量が減少していた（図３）。【０１３９】
［実施例２］
＜膵臓β細胞への分化誘導＞
実施例１及び参考例１に記載の方法にて得られた内胚葉系細胞から膵臓β細胞への分化誘導は、Yabe SG, Fukuda S, Takeda F, Nashiro K, Shimoda M, Okochi H. Efficient generation of functional pancreatic β-cells from human induced pluripotent stem cells. J Diabetes. 2017 Feb;9(2):168-179に記載の方法に基づいて実施した。具体的にはＰｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｇｕｔ  Ｔｕｂｅ（ＰＧＴ）分化は０．５％ＢＳＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、２％Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．６７μｍｏｌ／Ｌ  ＥＣ２３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）、１μｍｏｌ／Ｌ  ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（Ｗａｋｏ社）、１０μｍｏｌ／Ｌ  ＳＢ４３１５４２（ｗａｋｏ社）、０．２５ｍｏｌ／Ｌ  ＳＡＮＴ１（Ｗａｋｏ社）を含むＲＰＭＩ１６４０で２日間培養した。【０１４０】
Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  Ｆｏｒｅ  Ｇｕｔ（ＰＦＧ）分化は０．４×ＰＳ、１×ＮＥＡＡ、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、２％  Ｂ２７、０．６７μｍｏｌ／Ｌ  ＥＣ２３、１μｍｏｌ／Ｌ  ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、１０μｍｏｌ／Ｌ  ＳＢ４３１５４２、０．２５μｍｏｌ／Ｌ  ＳＡＮＴ１を含むＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｗａｋｏ社）で４日間培養した。【０１４１】
Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ（ＰＰ）分化は０．４×ＰＳ、１×ＮＥＡＡ、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、２％Ｂ２７、０．５μｍｏｌ／Ｌ  ＥＣ２３、１μｍｏｌ／Ｌ  ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、０．２５μｍｏｌ／Ｌ  ＳＡＮＴ１、５μｍｏｌ／Ｌ  Ａｌｋ５  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ社）、０．３μｍｏｌ／Ｌ  ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ  Ｖ（ＩＬＶ；Ｃａｙｍａｎ社）を含むＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅで３日間培養した。【０１４２】
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ分化は０．４×ＰＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、２％Ｂ２７、０．２μｍｏｌ／Ｌ  ＥＣ２３、１μｍｏｌ／Ｌ  ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、０．２５μｍｏｌ／Ｌ  ＳＡＮＴ１、５μｍｏｌ／Ｌ  Ａｌｋ５  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ、５０ｎｇ／ｍＬ  Ｅｘｅｎｄｉｎ４（Ｓｉｇｍａ社）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ−ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）で３日間培養した。【０１４３】
膵臓β細胞分化は、０．４×ＰＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、２％Ｂ２７、１０ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＨＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、５０ｎｇ／ｍＬ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １（ＩＧＦ１；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、５μｍｏｌ／Ｌ  Ａｌｋ５  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ、５０ｎｇ／ｍＬ  Ｅｘｅｎｄｉｎ４、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社）、５μｍｏｌ／Ｌ  ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｗａｋｏ社）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ−ＤＭＥＭで６日間培養した。これにより得られた細胞をｉＰＳ−β細胞と称する。【０１４４】
＜糖尿病モデルマウスへの移植実験（糖尿病モデルｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ（ＮＯＤ）−ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｄｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウス実験）＞
上記膵臓β細胞への分化誘導において得られたｉＰＳ−β細胞を、ＨＢＳＳで一回リンスした後に、３．３３μｇ／ｍＬのｉＭａｔｒｉｘ−５１１（Ｗａｋｏ社）を含むＨＢＳＳに懸濁し、懸濁した細胞をハミルトンシリンジ（ハミルトン社）により糖尿病モデルＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（日本クレア社）の左腎被膜下に移植した（マウス個体９Ａ−１、９Ａ−２、９Ｂ−２は４×１０6個の細胞を投与、２７Ｂ−１は６×１０6個の細胞を投与）。糖尿病モデルＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは１３０ｍｇ／ｋｇのｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（ＳＴＺ；Ｓｉｇｍａ社）を尾静脈より投与し血糖値が２５０ｍｇ／ｄＬ以上となった個体を使用した。移植（０日）はＳＴＺ投与（−１４日）から１４日後に行った。随時血糖値は尾静脈より血液を採取しグルテストＮｅｏアルファ（三和化学社）を用いて測定した。マウス血中ヒトｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ測定は移植後に血液サンプルを尾静脈からＦｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ  ヘパリン処理ヘマトクリット管（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に採取し、遠心分離（１０分、４℃、８００×ｇ）により血清を分離した後にｈｕｍａｎ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ社）を用いて行った。参考例１に記載の方法により得られた内胚葉系細胞から作製されたｉＰＳ−β細胞を移植したマウス個体９Ａ−１、９Ａ−２、９Ｂ−２については移植後１２週、実施例１に記載の方法により得られた内胚葉系細胞から作製されたｉＰＳ−β細胞を移植したマウス個体２７Ｂ−１は移植後２、６、１１、１６週で血液サンプル採取を行った。【０１４５】
生体内での機能を調べるためにマウス血中ヒトｃ−ｐｅｐｔｉｄｅの濃度を調べた結果を図４に示す。参考例１に記載の方法により得られた内胚葉系細胞から作製されたｉＰＳ−β細胞の移植後１２週において、マウス血中ヒトｃ−ｐｅｐｔｉｄｅの濃度は１０数ｐＭ程度であったが、実施例１に記載の方法により得られた内胚葉系細胞から作製されたｉＰＳ−β細胞の移植後２週においては、マウス血中ヒトｃ−ｐｅｐｔｉｄｅの濃度が５０ｐＭを超え、さらに、それ以降もＣ−ｐｅｐｔｉｄｅ量が増加していき、１６週において３００ｐＭ近くにまで増加した。上記の通り、本発明の方法により、マウスに移植したヒトｉＰＳ細胞由来膵臓β細胞が分泌するマウス血中ヒトｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ量を大幅に増加させることができた。【０１４６】
また糖尿病モデルマウスの随時血糖を測定した結果を図５に示す。
細胞の移植なしのマウス個体では血糖値が４００〜６００ｍｇ／ｄＬと非常に高い値を移植後１４０日間示していたのに対し、実施例１に記載の方法により得られた内胚葉系細胞から作製されたｉＰＳ−β細胞を移植した個体では、移植後に血糖値が低下していき、移植後６０日で２５０ｍｇ／ｄＬまで低下し、移植後１４０日では１２５ｍｇ／ｄｌとほぼ正常値を示した。このことから本発明の方法により分化誘導して得られた体細胞（膵臓β細胞）は、糖尿病の治療に非常に効果的であることが明らかとなった。【０１４７】
［実施例３］
＜多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化誘導におけるＢＳＡとＩＴＳの効果＞
多能性幹細胞の維持培養及び前培養については、実施例１に記載の方法により行い、多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化誘導におけるＢＳＡとＩＴＳの添加の有用性については以下の方法にて検証した。ｉＰＳ細胞株としては、２５３Ｇ１（Ｃｉｒａ）及び４５４Ｅ２（Ｃｉｒａ）を使用した。【０１４８】
一つ目の条件では最初の２日間は１０ｍｇ／ｍＬ（１．０％）Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ、０．４×ＰＳ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、８０ｎｇ／ｍＬ  アクチビンＡ、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、２０ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ４、３μｍｏｌ／Ｌ  ＣＨＩＲ９９０２１、１：５００００ＩＴＳ−Ｘ（Ｇｉｂｃｏ社）を含むＲＰＭＩ１６４０で培養した。３日目はこの培地からＢＭＰ４、ＦＧＦ２、ＣＨＩＲ９９０２１を除いて培養を行い、さらに１％  ＫＳＲを加えた培地で一日間培養した。【０１４９】
２つ目の条件では最初の２日間は２．５ｍｇ／ｍＬ（０．２５％）  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ、０．４ｘ  ＰＳ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、８０ｎｇ／ｍＬ  アクチビンＡ、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、２０ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ４、３μｍｏｌ／Ｌ  ＣＨＩＲ９９０２１、１：５０００ＩＴＳ−Ｘを含むＲＰＭＩ１６４０で培養した。３日目はこの培地からＢＭＰ４、ＦＧＦ２、ＣＨＩＲ９９０２１を除いて培養を行い、さらに１％  ＫＳＲを加えた培地で一日間培養した。【０１５０】
内胚葉系細胞への分化効率を調べるために、これらの方法により分化誘導した内胚葉系細胞集団のｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（Ｗａｋｏ社）により単離・精製し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。ここで合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＧｏＴａｑ  ｑＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使いＭｙｉＱ  ｑＰＣＲ  ｍａｃｈｉｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）によりｑＰＣＲを実行した。検出はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎによるインターカレーション法で、遺伝子発現量比較は検量線作成による相対定量法で行った。未分化マーカーであるＯＣＴ３／４、分化マーカーであるＳＯＸ１７の発現レベルはハウスキーピング遺伝子であるＯＡＺ１により標準化した。【０１５１】
ｑＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列は次のとおりである。
OAZ1-F: GTC AGA GGG ATC ACA ATC TTT CAG（配列番号１９）
OAZ1-R: GTC TTG TCG TTG GAC GTT AGT TC（配列番号２０）
OCT4-F: CGC TTC AAG AAC ATG TGT AAG CTG C（配列番号２１）
OCT4-R: CTC TCA CTC GGT TCT CGA TAC TG（配列番号２２）
SOX17-F: TAC ACA CTT CCT GGA GGA GCT AAG（配列番号２３）
SOX17-R: CCA AAC TGT TCA AGT GGC AGA C（配列番号２４）
FOXA2-F: GAG ATC TAC CAG TGG ATC ATG GAC（配列番号２５）
FOXA2-R: CAC CTT CAG GAA ACA GTC GTT G（配列番号２６）【０１５２】
上記の測定結果を図６に示す。
１％ＢＳＡ−１：５００００ＩＴＳ−Ｘの条件及び０．２５％ＢＳＡ−１：５０００ＩＴＳ−Ｘの条件の何れにおいても、ＤＥマーカーのＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２の発現レベルが高いことから、効率的な分化誘導が行われていることが確認された。なお、１％ＢＳＡ−１：５００００ＩＴＳ−Ｘの条件より０．２５％ＢＳＡ−１：５０００ＩＴＳ−Ｘの条件で培養したサンプルの方が、未分化マーカーであるＯＣＴ４の発現レベルがより顕著に低下し、逆に内胚葉系マーカーのＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２の発現レベルがより顕著に高まったことから１％ＢＳＡ−１：５００００ＩＴＳ−Ｘの条件より０．２５％ＢＳＡ−１：５０００ＩＴＳ−Ｘの方がより効果的であることが確認できた。【０１５３】
［実施例４］
＜多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化誘導における２−メルカプトエタノールの効果＞
多能性幹細胞の維持培養及び前培養については、実施例１に記載の方法により行い、多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化誘導における２−メルカプトメタノールの添加の有用性については以下の方法にて検証した。【０１５４】
サブコンフルエント（８０％程度）まで培養した細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（（Ｉｎｎｏｖａ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で剥がして回収し、ペレット化した後、１ｍＬあたり５×１０5個の細胞を含むように、１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０μＭ  Ｙ２７６３２を含むＥｓｓｅｎｔｉｌ８を添加して細胞を再懸濁し、浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト株式会社）に４ｍｌ／ウェルの割合で播種した。オービタルシェーカー（オプティマ社）上で９０ｒｐｍの回転速度で一晩培養して細胞凝集塊を作製した。その後、２０％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１×ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、５５μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトメタノール、７．５ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、１ｘＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ａｎｄ  Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂに培地交換して１日培養した後、胚体内胚葉（ＤＥ）分化は４日間行い、最初の１日間は０．５％  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ、１×ＰＳＢ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、８０ｎｇ／ｍＬ  アクチビンＡ、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、２０ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ４、３μｍｏｌ／Ｌ  ＣＨＩＲ９９０２１を含むＲＰＭＩ１６４０に５５μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノールまたは１％  Ｎ２１ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を添加して培養した。２日目と３日目はこの培地からＢＭＰ４、ＦＧＦ２、ＣＨＩＲ９９０２１を除いてアクチビンＡの濃度を１００  ｎｇ／ｍＬにして、５５μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノールまたは１％  Ｎ２１  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを添加して培養を行い、４日目はさらに１％  ＫＳＲを加えた培地で一日間培養した。【０１５５】
＜細胞密度計数＞
内胚葉系細胞への分化誘導後、Ａｃｃｕｔａｓｅにより３７℃で５〜１０分処理し、ピペッティングによって細胞を単分散させ、トリパンブルー染色した後、血球計算盤を用いて、内胚葉系細胞へ分化誘導した細胞集団の細胞数を計数し、細胞密度を測定した。【０１５６】
＜フローサイトメトリー解析＞
内胚葉系細胞への分化誘導後、回収してシングルセルまで分散した細胞を４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）により室温で２０分間固定後、ＰＢＳで３回洗浄し、冷メタノールにより−２０℃で一晩透過処理を行った。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで３回洗浄後、３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳによりブロッキングし、下記表の蛍光標識済抗体により４℃で３０分〜１時間染色した。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで１回洗浄後、セルストレーナーに通過させた細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ；ＢＤ社）にて解析した。【０１５７】
【表３】
2018139600.tif 000005
【０１５８】
上記において５５μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノールを使用しないこと以外は同様の方法にして培養を行う実験も行った。
上記において、５５μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノールの代わりに、Ｎ２１−ＭＡＸ  Ｍｅｄｉａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）（ただしインスリンを含まないもの）を使用したこと以外は、同様の方法にして培養を行う実験も行った。
Ｎ２１−ＭＡＸ  Ｍｅｄｉａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔからインスリンを除外した組成は以下の通りである。
アルブミン（ウシ）、Ｌ−カルニチン、カタラーゼ、コルチコステロン、エタノールアミン、グルタチオン、ガラクトース、トランスフェリン、リノール酸、リノレン酸、リポ酸、プロゲステロン、プトレシン、レチニルアセテート、レチノール、亜セレン酸塩、スーパーオキシド・ジムスターゼ、トリヨード−Ｌ−チロニン、Ｄ，Ｌ−アルファ−トコフェノール、Ｄ，Ｌ−アルファ−トコフェノールアセテート【０１５９】
上記培養後（５日目）の細胞について、ＦＡＣＳにてＳＯＸ２、ＳＯＸ１７が陽性である細胞の割合を測定した結果を図７に示す。また、上記培養後（５日目）の細胞の細胞密度を測定した結果を図８に示す。【０１６０】
２−メルカプトエタノールを添加した場合及び２−メルカプトエタノールを添加しない場合の何れにおいても、内胚葉系細胞への分化は認められた。さらに、２−メルカプトエタノールを添加した場合は、細胞密度の測定結果から、生存細胞数の増加も認められた。また、Ｎ２１−ＭＡＸ  Ｍｅｄｉａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔからインスリンを除外した組成物を用いた場合においても、生存細胞数の増加が認められた。さらに、２−メルカプトエタノールを添加した場合、未分化残存率（ＳＯＸ２陽性細胞率）が低下することが分かった。２−メルカプトエタノールを添加しても、内胚葉系分化効率（ＳＯＸ１７陽性細胞率、ＦＯＸＡ２陽性細胞率）は実質的に変化しなかった。【０１６１】
［実施例５］
＜多能性幹細胞の前培養におけるＦＧＦ２とＴＧＦβ１の検討＞
ＴｋＤＮ４−Ｍ株を実施例１に記載の未分化維持を行った後、サブコンフルエント（８０％程度）まで培養した細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで剥がして回収し、ペレット化した後、４ｍＬ／ウェルに１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０μＭ  Ｙ２７６３２を含むＥｓｓｅｎｔｉｌ８を添加した後、ペレット化した細胞をウェルに懸濁し、オービタルシェーカーにて９０ｒｐｍの回転速度で１２時間培養して細胞凝集体を作製した。【０１６２】
作製した細胞凝集体を前培養する際に、５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１ｘＮＥＡＡ、５５μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール、１ｘＰＳを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ６培地（ＦＧＦ２不含かつＴＧＦβ１不含）で一日培養してから、実施例１に記載の分化誘導を開始したサンプル１を調整した。また、別途、作製した細胞凝集体を前培養する際に、５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１×ＮＥＡＡ、５５μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール、１ｘＰＳを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地で一日培養してから、実施例１に記載の分化誘導を開始したサンプル２を調整した。そして、調整したサンプル１及び２を、以下に示すフローサイトメトリー解析により分化誘導効率を検証した。【０１６３】
＜フローサイトメトリー解析＞
内胚葉系細胞への分化誘導後、細胞を回収してシングルセルまで分散した細胞を４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）により室温で２０分間固定後、ＰＢＳで３回洗浄し、冷メタノールにより−２０℃で一晩透過処理を行った。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで３回洗浄後、３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳによりブロッキングし、下記表の蛍光標識済抗体により４℃で３０分〜１時間染色した。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで１回洗浄後、セルストレーナーに通過させた細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ；ＢＤ社）にて解析した。【０１６４】
【表４】
2018139600.tif 000006
【０１６５】
上記培養後（４日目）の細胞について、ＦＡＣＳにてＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２が陽性である細胞の割合を測定した結果を図９に示す。
サンプル１及び２のそれぞれにおいて、内胚葉系細胞への分化誘導が認められた。さらに、サンプル１の方が、内胚葉系細胞への分化誘導の効率がサンプル２より高いことが明らかになった。すなわち、多能性幹細胞の前培養において、ＦＧＦ２とＴＧＦβ１を添加しない培地を用いると内胚葉系細胞への分化誘導の効率が向上することが明らかとなった。【０１６６】
［実施例６］
＜多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化誘導におけるグルコースの効果＞
（凝集塊の作製）
実施例１の方法で維持培養したＴｋＤＮ−４株を１回ＰＢＳでリンスを行い、Ａｃｃｕｔａｓｅで３から５分間処理して剥離し、単細胞まで分散した。この細胞を最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（和光純薬工業株式会社）及び１０μＭのＹ−２７６３２（和光純薬工業株式会社）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して細胞数を調べた。１ｍＬあたり５×１０5個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト株式会社）に４ｍｌ／ウェルの割合で播種した。細胞を播種したプレートは、ロータリーシェーカー（株式会社オプティマ）上で９０ｒｐｍのスピードで水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回培養し、５％ＣＯ２、３７℃の環境下で浮遊培養を１日間行った。【０１６７】
（前培養）
上記の維持培養にて得られた凝集体を形成した細胞集団を、２０％（体積／体積）  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｇｉｂｃｏ社）、１ｘｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）、５５μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ；Ｇｉｂｃｏ社）、７．５ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ２；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、０．５×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ；Ｗａｋｏ社）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｗａｋｏ社）に再懸濁し、浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト株式会社）に４ｍｌ／ウェルの割合で播種した。細胞を播種したプレートは、ロータリーシェーカー（株式会社オプティマ）上で９０ｒｐｍのスピードで水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回培養し、５％ＣＯ２、３７℃の環境下で浮遊培養を１日間行った。【０１６８】
（内胚葉系細胞 (胚体内胚葉)への分化誘導）
前培養にて得られた凝集体を形成した細胞集団を、最初の１日目は、０．５％Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ；  ｓｉｇｍａ）、０．４×ＰＳ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｗａｋｏ社）、１ｘＮＥＡＡ、８０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  アクチビンＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、２０ｎｇ／ｍＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＢＭＰ４；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、３μｍｏｌ／Ｌ  ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含むグルコース不含ＲＰＭＩ１６４０（Ｗａｋｏ社）に各最終濃度(０ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、又は４ｇ／Ｌ)になるようにグルコースを添加して浮遊培養した。【０１６９】
２日目及び３日目は、この培地からＢＭＰ４、ＦＧＦ２、ＣＨＩＲ９９０２１を除いて浮遊培養を行った。なお、２日目及び３日目の培地中のグルコース濃度は、１日目と同様に、０ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、又は４ｇ／Ｌである。浮遊培養は、浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト株式会社）に４ｍｌ／ウェルの割合で播種し、ロータリーシェーカー（株式会社オプティマ）上で９０ｒｐｍのスピードで水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回培養し、５％ＣＯ２、３７℃の環境下で行った。。【０１７０】
４日目（Ｄａｙ４）に、以下の手順で内胚葉系細胞へ分化誘導した細胞集団における細胞密度の測定を行った。
＜細胞密度計数＞
内胚葉系細胞への分化誘導後、Ａｃｃｕｔａｓｅにより３７℃で５〜１０分処理し，ピペッティングによって細胞を単分散させ、トリパンブルー染色した後、血球計算盤を用いて細胞数を計数し、内胚葉系細胞へ分化誘導した細胞集団の細胞密度を測定した。【０１７１】
細胞密度の測定結果を図１５に示す。グルコース濃度が低いほど細胞密度が高くなることが判明した。ただし、グルコース濃度が０ｇ／Ｌの場合は細胞が死滅した。【０１７２】
１日目〜４日目（Ｄａｙ１〜Ｄａｙ４）に、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（手順は実施例１及び参考例１に記載した通りである）による内胚葉系細胞へ分化誘導した細胞集団の遺伝子発現の解析を行った。結果を図１６〜図１８に示す。
図１６及び図１７の結果から、グルコース濃度が１．０ｇ／Ｌ以下である場合には、未分化細胞（ＳＯＸ２陽性細胞、Ｎａｎｏｇ陽性細胞）が少なくなる傾向があることが分かった。
図１８の結果から、グルコース濃度が低い方が、内胚葉分化が早い段階から進むことが示唆された。【０１７３】
４日目に、以下の手順の通りのフローサイトメトリー解析によりＳＯＸ２及びＳＯＸ１７の陽性率を測定した。
＜フローサイトメトリー解析＞
内胚葉系細胞への分化誘導後、回収してシングルセルまで分散した細胞を４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）により室温で２０分間固定後、ＰＢＳで３回洗浄し、冷メタノールにより−２０℃で一晩透過処理を行った。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで３回洗浄後、３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳによりブロッキングし、下記表の蛍光標識済抗体により４℃で３０分〜１時間染色した。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで１回洗浄後、セルストレーナーに通過させた細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ；ＢＤ社）にて解析した。【０１７４】
【表５】
2018139600.tif 000007
【０１７５】
フローサイトメトリー解析の結果を図１９に示す。
図１９の結果から、グルコース濃度が１．０ｇ／Ｌ以下である場合には、未分化細胞（ＳＯＸ２陽性細胞）が少なくなる傾向が分かる。未分化なｉＰＳ細胞（ＳＯＸ２陽性細胞）はグルコース要求性が高いことから、グルコース濃度が１．０ｇ／Ｌ以下である条件では、未分化細胞（ＳＯＸ２陽性細胞）は生存できずに死滅したことが推測される。【０１７６】
［実施例７］
＜多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化誘導におけるグルコースの効果＞
１日目、２日目及び３日目の培地中のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）を以下の表に示す通り変更したこと以外は、実施例６と同様に、多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化誘導を行った。【０１７７】
【表６】
2018139600.tif 000008
【０１７８】
４日目に、実施例６と同様の手順でフローサイトメトリー解析により、内胚葉系細胞へ分化誘導した細胞集団のＳＯＸ２及びＳＯＸ１７の陽性率を測定した結果を図２０に示す。
図２０の結果から、グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌで培養する期間が長いほど、ＳＯＸ２陽性細胞は減少し、ＳＯＸ１７陽性細胞は増加することが分かる。【０１７９】
また、上記のフローサイトメトリー解析の結果を図２１に示す。図２１の左の図は、実験１の場合を示し、図２１の右の図は、実験４の場合を示す。
図２１の結果から、グルコース添加濃度が０．５ｇ／Ｌで培養すると、ＳＯＸ２陽性細胞は減少し、ＳＯＸ１７陽性細胞は増加することが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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