(57)【要約】  本発明は、α鎖の相補性決定領域として、配列番号１〜３でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列、又は配列番号４〜６でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含み、β鎖の相補性決定領域として、配列番号７〜９でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列、又は配列番号１０〜１２でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含む、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体と結合しうる、Ｔ細胞受容体を提供する。また、本発明は、α鎖の相補性決定領域として、配列番号１３〜１５でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含み、β鎖の相補性決定領域として、配列番号１６〜１８でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含む、配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該ペプチドとＨＬＡ−Ａ０２との複合体と結合しうる、Ｔ細胞受容体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α鎖の相補性決定領域として、
配列番号１で示されるアミノ酸配列、
配列番号２で示されるアミノ酸配列、及び
配列番号３で示されるアミノ酸配列、
又は
配列番号４で示されるアミノ酸配列、
配列番号５で示されるアミノ酸配列、及び
配列番号６で示されるアミノ酸配列、
を含み、
β鎖の相補性決定領域として、
配列番号７で示されるアミノ酸配列、
配列番号８で示されるアミノ酸配列、及び
配列番号９で示されるアミノ酸配列
又は
配列番号１０で示されるアミノ酸配列、
配列番号１１で示されるアミノ酸配列、及び
配列番号１２で示されるアミノ酸配列
を含むT細胞受容体（TCR）であって、前記TCRは配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体と結合しうる、TCR。
【請求項２】
α鎖の相補性決定領域として、
配列番号１３で示されるアミノ酸配列、
配列番号１４で示されるアミノ酸配列、及び
配列番号１５で示されるアミノ酸配列
を含み、
β鎖の相補性決定領域として、
配列番号１６で示されるアミノ酸配列、
配列番号１７で示されるアミノ酸配列、及び
配列番号１８で示されるアミノ酸配列
を含むT細胞受容体（TCR）であって、前記TCRは配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ−Ａ０２との複合体と結合しうる、TCR。
【請求項３】
α鎖の可変領域として、
配列番号１９で示されるアミノ酸配列、
配列番号１９で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、若しくは
配列番号１９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
又は
配列番号２０で示されるアミノ酸配列、
配列番号２０で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、若しくは
配列番号２０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
を含み、
β鎖の可変領域として、
配列番号２１で示されるアミノ酸配列、
配列番号２１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、若しくは
配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
又は
配列番号２２で示されるアミノ酸配列、
配列番号２２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、若しくは
配列番号２２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
を含むT細胞受容体（TCR）であって、前記TCRは配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体と結合しうる、TCR。
【請求項４】
α鎖の可変領域として、
配列番号２３で示されるアミノ酸配列、
配列番号２３で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
配列番号２３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
を含み、
β鎖の可変領域として、
配列番号２４で示されるアミノ酸配列、
配列番号２４で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
を含むT細胞受容体（TCR）であって、前記TCRは配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ−Ａ０２との複合体と結合しうる、TCR。
【請求項５】
α鎖の定常領域として、
配列番号２５で示されるアミノ酸配列、
配列番号２５で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
配列番号２５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
をさらに含み、
β鎖の定常領域として、
配列番号２６で示されるアミノ酸配列、
配列番号２６で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
配列番号２６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体をコードする、核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸又は請求項７に記載のベクターを含む細胞。
【請求項９】
前記細胞がリンパ球又は多能性幹細胞である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞が細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項６に記載の核酸又は請求項７に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、請求項８に記載の細胞を製造する方法。
【請求項１２】
請求項６に記載の核酸又は請求項７に記載のベクターを含む多能性幹細胞から誘導されたＴ細胞。
【請求項１３】
以下の工程を含む、Ｔ細胞の製造方法。
（１）請求項６に記載の核酸又は請求項７に記載のベクターを含む多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させる工程、及び
（２）該造血前駆細胞をＴ細胞に分化させる工程、及び任意選択で
（３）該T細胞を増殖させる工程
【請求項１４】
前記T細胞が細胞傷害性T細胞、特にCD8陽性細胞傷害性T細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項８〜１０及び１２のいずれか１項に記載の細胞を含有してなる医薬。
【請求項１６】
癌の予防又は治療に使用するための、請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
請求項８〜１０及び１２のいずれか１項に記載の細胞を含有してなる、グリピカン３を発現する細胞の殺傷剤。
【請求項１８】
哺乳動物に対し、請求項８〜１０及び１２のいずれか１項に記載の細胞の有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物における癌の予防又は治療方法。
【請求項１９】
癌の予防又は治療に使用するための、請求項８〜１０及び１２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２０】
癌の予防剤又は治療剤を製造するための、請求項８〜１０及び１２のいずれか１項に記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリピカン３特異的な新規Ｔ細胞受容体に関する。【０００２】
（発明の背景）
原発性肝癌は、主として肝細胞癌(ＨＣＣ)であり、わが国で５番目に多くみられる癌であるが、予後が非常に悪く、死亡率が非常に高い。この予後不良の主な要因の１つとして、進行性ＨＣＣに対する治療の選択肢が限定されていることが挙げられる。進行性ＨＣＣの患者は、局所切除や多種キナーゼ阻害剤のソラフェニブの投与などの対症療法のみが可能であり、特に高齢者に対しては、ソラフェニブの奏効率は低く、副作用の発生率が高い。従って、副作用のリスクを最小限にし、進行性ＨＣＣ患者の生存率を向上させる新たな治療法の開発が求められている。【０００３】
免疫療法は、ＨＣＣに対する有力な治療法の１つであると考えられている。例えば、グリピカン３（Glypican-3）（ＧＰＣ３）は、ＨＣＣにおいて特に過剰発現しており、予後不良とも関連するため、ＨＣＣに対する癌免疫療法の理想的な標的である。そして、ＨＣＣに対する免疫治療法として、ＧＰＣ３特異的な抗体や、ＧＰＣ３を標的とするヒトキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いた治療法が報告されている（特許文献１）。また、ＨＬＡ-Ａ０２-拘束性ＧＰＣ３３６７−３７５ペプチドに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）についても報告されている（特許文献２）。【０００４】
ＴＣＲとは、Ｔ細胞が抗原を認識する際に使用する受容体であり、ＴＣＲはα鎖とβ鎖、あるいはγ鎖とδ鎖の二量体から構成される。ＴＣＲはＴ細胞表面上でＣＤ３分子群と複合体を形成し、抗原を認識してＴ細胞へ刺激シグナルを伝達する。それぞれのＴＣＲ鎖は可変領域と定常領域を有し、定常領域は細胞膜を貫通する短い細胞質部分を持ち、可変領域は細胞外に存在して、抗原-ＨＬＡ（ＭＨＣ）複合体と結合する。可変領域には、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域が３つ存在し、この領域が抗原-ＨＬＡ（ＭＨＣ）複合体と結合する。３つのＣＤＲはそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれている。【０００５】
本発明者らは、様々なＧＰＣ３１４４−１５２ペプチド特異的なＴＣＲを発現する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）クローンを、ＨＬＡ-Ａ０２拘束性ＧＰＣ３１４４−１５２ペプチドをワクチン接種した患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から樹立した（非特許文献１）。しかしながら、非特許文献１には、これらのＣＴＬクローンのＴＣＲ配列については開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０７０４６８号
【特許文献２】国際公開第２０１５／１７３１１２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yoshikawa T., et al., Cancer Sci 2011 (102): 918-925
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、グリピカン３（ＧＰＣ３）を特異的に認識する新規のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供することを課題とする。また、前記ＴＣＲを用いた（例えば、前記TCRを含む細胞傷害性T細胞を用いた）、ＧＰＣ３を発現する癌や腫瘍の予防又は治療のための医薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＧＰＣ３ペプチド（ＨＬＡ−Ａ２４-拘束性ＧＰＣ３２９８−３０６ペプチド又はＨＬＡ−Ａ０２-拘束性ＧＰＣ３１４４−１５２ペプチド）を接種した患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＣＴＬクローンを樹立し、その中から、特定のＣＴＬクローンのＴＣＲ配列を解読した。そのＴＣＲ配列を基に、鋭意研究した結果、これらのＴＣＲがＧＰＣ３発現癌細胞に対して応答性を有すること、ＴＣＲの定常領域に所定の改変を施したＴＣＲを細胞に遺伝子導入することで機能型ＴＣＲを効率的に発現できることなどを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１０】
即ち、本発明は以下を提供する。
［１］
α鎖の相補性決定領域として、
配列番号１で示されるアミノ酸配列、
配列番号２で示されるアミノ酸配列、及び
配列番号３で示されるアミノ酸配列、
又は
配列番号４で示されるアミノ酸配列、
配列番号５で示されるアミノ酸配列、及び
配列番号６で示されるアミノ酸配列、
を含み、
β鎖の相補性決定領域として、
配列番号７で示されるアミノ酸配列、
配列番号８で示されるアミノ酸配列、及び
配列番号９で示されるアミノ酸配列
又は
配列番号１０で示されるアミノ酸配列、
配列番号１１で示されるアミノ酸配列、及び
配列番号１２で示されるアミノ酸配列
を含むT細胞受容体（TCR）であって、前記TCRは配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体と結合しうる、TCR。
［２］
α鎖の相補性決定領域として、
配列番号１３で示されるアミノ酸配列、
配列番号１４で示されるアミノ酸配列、及び
配列番号１５で示されるアミノ酸配列
を含み、
β鎖の相補性決定領域として、
配列番号１６で示されるアミノ酸配列、
配列番号１７で示されるアミノ酸配列、及び
配列番号１８で示されるアミノ酸配列
を含むT細胞受容体（TCR）であって、前記TCRは配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ−Ａ０２との複合体と結合しうる、TCR。
［３］
α鎖の可変領域として、
配列番号１９で示されるアミノ酸配列、
配列番号１９で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、若しくは
配列番号１９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
又は
配列番号２０で示されるアミノ酸配列、
配列番号２０で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、若しくは
配列番号２０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
を含み、
β鎖の可変領域として、
配列番号２１で示されるアミノ酸配列、
配列番号２１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、若しくは
配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
又は
配列番号２２で示されるアミノ酸配列、
配列番号２２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、若しくは
配列番号２２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
を含むT細胞受容体（TCR）であって、前記TCRは配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体と結合しうる、TCR。
［４］
α鎖の可変領域として、
配列番号２３で示されるアミノ酸配列、
配列番号２３で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
配列番号２３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
を含み、
β鎖の可変領域として、
配列番号２４で示されるアミノ酸配列、
配列番号２４で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
を含むT細胞受容体（TCR）であって、前記TCRは配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ−Ａ０２との複合体と結合しうる、TCR。
［５］
α鎖の定常領域として、
配列番号２５で示されるアミノ酸配列、
配列番号２５で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
配列番号２５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
をさらに含み、
β鎖の定常領域として、
配列番号２６で示されるアミノ酸配列、
配列番号２６で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
配列番号２６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
をさらに含む、［１］〜［４］のいずれかに記載のＴ細胞受容体。
［６］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のＴ細胞受容体をコードする、核酸。
［７］  ［６］に記載の核酸を含む発現ベクター。
［８］  ［６］に記載の核酸又は［７］に記載のベクターを含む細胞。
［９］  前記細胞がリンパ球又は多能性幹細胞である、［８］に記載の細胞。
［１０］  前記細胞が細胞傷害性Ｔ細胞である、［８］に記載の細胞。
［１０−１］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のT細胞受容体をコードする外因性の核酸を含む細胞。
［１０−２］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のT細胞受容体をコードする外因性の核酸を含む多能性幹細胞。
［１０−３］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のT細胞受容体をコードする外因性の核酸を含む造血前駆細胞。
［１０−４］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のT細胞受容体をコードする外因性の核酸を含むT細胞。
［１１］  ［６］に記載の核酸又は［７］に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、［８］に記載の細胞を製造する方法。
［１２］  ［６］に記載の核酸又は［７］に記載のベクターを含む多能性幹細胞から誘導されたＴ細胞。
［１３］
以下の工程を含む、Ｔ細胞の製造方法。
（１）［６］に記載の核酸又は［７］に記載のベクターを含む多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させる工程、及び
（２）該造血前駆細胞をＴ細胞に分化させる工程、及び任意選択で
（３）該T細胞を増殖させる工程
［１４］  前記T細胞が細胞傷害性T細胞、特にCD8陽性細胞傷害性T細胞である、［１３］に記載の方法。
［１５］  ［８］〜［１０］及び［１２］のいずれかに記載の細胞を含有してなる医薬。
［１６］  癌の予防又は治療に使用するための、［１５］に記載の医薬。
［１７］  ［８］〜［１０］及び［１２］のいずれかに記載の細胞を含有してなる、グリピカン３を発現する細胞の殺傷剤。
［１８］  哺乳動物に対し、［８］〜［１０］及び［１２］のいずれかに記載の細胞の有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物における癌の予防又は治療方法。
［１９］  癌の予防又は治療に使用するための、［８］〜［１０］及び［１２］のいずれかに記載の細胞。
［２０］  癌の予防剤又は治療剤を製造するための、［８］〜［１０］及び［１２］のいずれかに記載の細胞の使用。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＴ細胞受容体は、ＧＰＣ３ペプチド（ＨＬＡ-Ａ２４-拘束性ＧＰＣ３２９８-３０６ペプチド若しくはＨＬＡ−Ａ０２-拘束性ＧＰＣ３１４４−１５２ペプチド）又は該ペプチドとＨＬＡ-Ａ分子（ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ０２）との複合体に対する結合能を有する。また、前記Ｔ細胞受容体をコードする核酸は、ＨＬＡ-Ａ分子とＧＰＣ３ペプチドを提示する細胞に対する細胞傷害活性をＴ細胞に付与し得ることから、ＧＰＣ３を発現する癌や腫瘍の予防又は治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、抗原特異的ＣＴＬ反応を測定するための、インターフェロン-γに対するＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。
【図２】図２は、ＧＰＣ３ペプチドとＨＬＡ-Ａ分子との複合体に対する各ＣＴＬクローンの認識効率を測定するための、ペプチドタイトレーションアッセイの結果を示す。
【図３】図３は、本発明のＴＣＲを導入した形質転換ＰＢＭＣのデキストラマー染色及びフローサイトメトリーの結果を示す。
【図４】図４は、ＴＣＲ１−１’遺伝子を導入したFf-l01s04細胞、もしくは遺伝子導入していないFf-I01s04細胞をを由来とする、分化T細胞におけるT細胞マーカーの発現を示す。図中、上段（A,BおよびC）は遺伝子導入していないFf-I01s04細胞を由来とする分化T細胞のT細胞マーカーの発現を、下段（D,EおよびF）は遺伝子を導入したFf-l01s04細胞、もしくは遺伝子導入していないFf-I01s04細胞を由来とする分化T細胞のマーカーの発現を示す。
【図５】図５は、GPC3抗原ペプチドを添加した、もしくは添加していない、ＨＬＡ-Ａ２４陽性またはＨＬＡ-Ａ２４陰性のリンパ芽球細胞系（LCL）に、対する、ＴＣＲ１−１’を発現するiPS細胞由来T細胞の細胞傷害活性試験の結果を示す。
【図６】図６は、GPC3陽性HLA-A*24:01陽性のヒト肝臓癌細胞株に対する、ＴＣＲ１−１’を発現するiPS細胞由来T細胞の細胞傷害活性試験の結果を示す。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
１．Ｔ細胞受容体
本発明は、ＧＰＣ３２９８−３０６ペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ-Ａ２４との複合体に結合しうるＴ細胞受容体（Ｔ細胞レセプター又はＴＣＲとも呼ばれる）（以下「本発明のＴＣＲ１」と略記する。）を提供する。また、本発明は、ＧＰＣ３１４４−１５２ペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ-Ａ０２との複合体に結合しうるＴ細胞受容体（以下「本発明のＴＣＲ２」と略記する）を提供する。以下では、「本発明のＴＣＲ１」と「本発明のＴＣＲ２」をまとめて、「本発明のＴＣＲ」と略記する場合がある。本発明のＴＣＲは、単離されたものでもよい。【００１４】
本発明において、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」とは、ＴＣＲ鎖（α鎖、β鎖）のダイマーから構成され、抗原又は該抗原-ＨＬＡ（ヒト白血球型抗原）（ＭＨＣ；主要組織適合遺伝子複合体）複合体を認識してＴ細胞へ刺激シグナルを伝達する受容体を意味する。それぞれのＴＣＲ鎖は可変領域と定常領域から構成され、可変領域には、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）が存在する。また、本発明のＴＣＲには、ＴＣＲのα鎖とβ鎖がヘテロダイマーを構成しているものだけでなく、ホモダイマーを構成しているものも包含される。さらに、本発明のＴＣＲには、定常領域の一部若しくは全部を欠損したものや、アミノ酸配列を組み換えたもの、可溶性ＴＣＲ(soluble TCR)としたものなども包含される。【００１５】
本発明において、「可溶性ＴＣＲ」とは、ＴＣＲの化学的修飾、Ｆｃ受容体との結合又は細胞膜貫通ドメインの除去等により、可溶化したＴＣＲを意味し、可溶性とは、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水(ＰＢＳ)(ＫＣｌ 2.7mM、ＫＨ2ＰＯ4 1.5mM、ＮａＣｌ 137mM及びＮａ2ＰＯ4 8 mM、pH 7.1〜7.5)中で単分散へテロ二量体として存在し、かつそのＴＣＲの９０％以上が、２５℃、１時間のインキュベーションの後に単分散へテロ二量体として残存できる性質を意味する。可溶性ＴＣＲは、安定性を高めるために各鎖の定常領域間に、新たに人工的にジスルフィド結合を導入してもよい。このような可溶性ＴＣＲは、例えば国際公開第２００４/０７４３２２号、Boulter et al., Clin Exp Immunol, 2005 ,142(3):454-460などに記載された方法にしたがって作成できる。可溶性TCRを用いる場合、該TCRが抗原又は該抗原-HLA複合体に結合しうる限りその濃度は特に制限されないが、例えばin vitroでの試験に用いる場合、40 μg/ml以上であることが好ましい。【００１６】
本発明において、「ＧＰＣ３２９８−３０６ペプチド」又は「ＨＬＡ-Ａ２４-拘束性ＧＰＣ３２９８−３０６ペプチド」とは、配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなるグリピカン３（ＧＰＣ３）のペプチド断片を意味する。好ましい実施態様において、本発明のＴＣＲ１は、ＧＰＣ３２９８−３０６ペプチドとＨＬＡ-Ａ２４との複合体を特異的に認識し結合しうる。同様に、本発明において、「ＧＰＣ３１４４−１５２ペプチド」又は「ＨＬＡ-Ａ０２-拘束性ＧＰＣ３１４４−１５２ペプチド」とは、配列表の配列番号２８で示されるアミノ酸配列からなるＧＰＣ３のペプチド断片を意味する。好ましい実施態様において、本発明のＴＣＲ２は、ＧＰＣ３１４４−１５２ペプチドとＨＬＡ−Ａ０２との複合体を特異的に認識し結合しうる。以下では、「ＧＰＣ３２９８−３０６ペプチド」と「ＧＰＣ３１４４−１５２ペプチド」をまとめて、「ＧＰＣ３ペプチド」と略記する場合がある。【００１７】
本発明のＴＣＲが上記複合体を特異的に認識し、結合しうることは公知の方法によって確認することができ、好適な方法としては、例えばＨＬＡ−Ａ２４分子又はＨＬＡ−Ａ０２分子とＧＰＣ３ペプチドを用いたデキストラマーアッセイ又はＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどが挙げられる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うことにより、該ＴＣＲを細胞表面に発現しているＴ細胞がＴＣＲにより標的細胞を認識し、そのシグナルが細胞内に伝達されたことを確認することができる。
本明細書で用いる「結合しうる(capable of binding)」という用語は、「結合する能力を有すること(having an ability to bind)」を意味し、1つ又はそれ以上の他の分子と非共有結合複合体を形成する能力を指す。本発明の複合体の例として、GPC3ペプチドとHLA分子（例：HLA-A24又はHLA-A02）との複合体、又はGPC3ペプチドとTCRとの複合体が挙げられる。本発明の複合体の別の例として、TCRとそれ自体HLAと複合体を形成するGPC3ペプチドとの複合体が挙げられる。結合能を決定するための様々な方法及びアッセイは、当技術分野で公知である。結合は、通常、高親和性を有する結合であり、KD値で測定される親和性は、好ましくは1 μM未満、より好ましくは100 nM未満、さらにより好ましくは10 nM未満、さらにより好ましくは1 nM未満、さらにより好ましくは100 pM未満、さらにより好ましくは10 pM未満、さらにより好ましくは1 pM未満である。「KD」または「KD値」という用語は、当技術分野で公知の平衡解離定数に関連する。本発明の文脈において、これらの用語は、目的の特定の抗原（例：本明細書中で定義されるGPC3のペプチド、又はペプチドとHLAとの各複合体）に対するTCRの平衡解離定数に関連し得る。平衡解離定数は、複合体（例：TCR-ペプチド-HLA複合体）が、その成分(例：TCR及びペプチド-HLA複合体)に可逆的に解離する傾向の尺度である。KD値を決定する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、表面プラズモン共鳴が例示される。【００１８】
本発明において、「単離された」とは、特定の成分（例：TCR）が、その天然環境の成分から同定、分離され、あるいは回収されている状態を意味する。
本発明において、「1又は数個のアミノ酸」とは、例えば、1,2,3,4又は5個のアミノ酸（例：1〜4個のアミノ酸、1〜3個のアミノ酸又は1〜2個のアミノ酸）を意味する。例えば、TCR CDR領域の文脈では、1又は数個は、好ましくは1、2又は3個のアミノ酸を意味する。TCR可変領域又はTCRの文脈では、1又は数個は、好ましくは1〜5、1〜4又は1〜3個、特に1、2又は3個のアミノ酸を意味する。
本発明において、「％ 同一性」とは、例えば、 90％以上の（例：91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％若しくは99％又はそれより高い）同一性を意味する。アミノ酸配列の同一性は、以下の条件下（expectancy =10; gap allowed; matrix=BLOSUM62; filtering=OFF）で、相同性計算アルゴリズムのNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いて計算することができる。％ 同一性を決定するため、全長にわたる本発明の配列を別の配列と比較することが理解される。言い換えれば、本発明における％同一性は、本発明の配列の短い断片（例えば1〜3アミノ酸）を別の配列と比較すること、またはその逆を除外する。【００１９】
本発明の一実施態様において、本発明のＴＣＲ１のα鎖の相補性決定領域として、配列番号１〜３でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列、又は配列番号４〜６でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含み、ＴＣＲ１のβ鎖の相補性決定領域として、配列番号７〜９でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列、又は配列番号１０〜１２でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含む。上記アミノ酸配列は、前記ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むTCRがＧＰＣ３２９８-３０６ペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ-Ａ２４との複合体に対する結合能を有する限り、１個ないし数個（例えば、２個、３個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されてもよい。好ましい実施態様において、本発明のＴＣＲ１は、配列番号１〜３でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含むＴＣＲα鎖、及び配列番号７〜９でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖を含み、該ＴＣＲのα鎖とβ鎖がヘテロダイマーを形成する。別の好ましい実施態様において、本発明のＴＣＲ１は、配列番号４〜６でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含むＴＣＲα鎖、及び配列番号１０〜１２でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖を含み、該ＴＣＲのα鎖とβ鎖がヘテロダイマーを形成する。
本発明の別の実施態様において、本発明のＴＣＲ１は、配列番号６で示されるＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、及び配列番号１２で示されるＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖を含み、該ＴＣＲのα鎖とβ鎖がヘテロダイマーを形成する。好ましくは、このヘテロダイマーは、GPC3298-306ペプチド又は該ペプチドとHLA-A24との複合体への結合能を有する。【００２０】
本発明のさらに別の実施態様において、本発明のＴＣＲ２のα鎖の相補性決定領域として、配列番号１３〜１５でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含み、本発明のＴＣＲ２のβ鎖の相補性決定領域として、配列番号１６〜１８でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含む。上記アミノ酸配列は、前記ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むTCRがＧＰＣ３１４４−１５２ペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ-Ａ０２との複合体に対する結合能を有する限り、１個ないし数個（例えば、２個、３個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されてもよい。好ましい実施態様において、本発明のＴＣＲ２は、配列番号１３〜１５でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含むＴＣＲα鎖、及び配列番号１６〜１８でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖を含み、該ＴＣＲのα鎖とβ鎖がヘテロダイマーを形成する。
本発明のさらにまた別の実施態様において、本発明のＴＣＲ２は、配列番号１５で示されるＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、及び配列番号１８で示されるＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖を含み、該ＴＣＲのα鎖とβ鎖がヘテロダイマーを形成する。好ましくは、前記ヘテロダイマーは、GPC3144-152ペプチド又は該ペプチドとHLA-A02との複合体への結合能を有する。【００２１】
本発明のさらなる別の実施態様において、本発明のＴＣＲ１のα鎖は、好ましくは、α鎖の前記可変領域を含むTCRがGPC3298-306ペプチド又は該ペプチドとHLA-A24との複合体に結合しうることを条件として、配列番号１９で示されるアミノ酸配列、配列番号１９で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１９で示されるアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列で示されるα鎖の可変領域を含む。あるいは、本発明のＴＣＲ１のα鎖は、好ましくは、α鎖の前記可変領域を含むTCRがGPC3298-306ペプチド又は該ペプチドとHLA-A24との複合体に結合しうることを条件として、配列番号２０で示されるアミノ酸配列、配列番号２０で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号２０で示されるアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列で示されるα鎖の可変領域を含む。該可変領域は、配列番号１〜３でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列、又は配列番号４〜６でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含んでいることが好ましい。なお、アミノ酸配列の同一性は、上記で記載したように計算することができる。下記のアミノ酸配列の同一性についても、同様に計算することができる。【００２２】
また、本発明のＴＣＲ１のβ鎖は、好ましくは、β鎖の前記可変領域を含むTCRがGPC3298-306ペプチド又は該ペプチドとHLA-A24との複合体に結合しうることを条件として、配列番号２１で示されるアミノ酸配列、配列番号２１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列で示されるβ鎖の可変領域を含む。あるいは、本発明のＴＣＲ１のβ鎖は、好ましくは、β鎖の前記可変領域を含むTCRがGPC3298-306ペプチド又は該ペプチドとHLA-A24との複合体に結合しうることを条件として、配列番号２２で示されるアミノ酸配列、配列番号２２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列のいずれかで示されるβ鎖の可変領域を含む。該可変領域は、配列番号７〜９でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列、又は配列番号１０〜１２でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含んでいることが好ましい。【００２３】
好ましい実施態様において、本発明のＴＣＲ１は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列含むＴＣＲα鎖、及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖を含み、該ＴＣＲのα鎖とβ鎖がヘテロダイマーを形成する。別の好ましい実施態様において、本発明のＴＣＲ１は、配列番号２０で示されるアミノ酸配列含むＴＣＲα鎖、及び配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖を含み、該ＴＣＲのα鎖とβ鎖がヘテロダイマーを形成する。【００２４】
本発明の別の実施態様において、本発明のＴＣＲ２のα鎖は、好ましくは、α鎖の前記可変領域を含むTCRがGPC3144-152ペプチド又は該ペプチドとHLA-A02との複合体に結合しうることを条件として、配列番号２３で示されるアミノ酸配列、配列番号２３で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号２３で示されるアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列で示されるα鎖の可変領域を含む。該可変領域は、配列番号１３〜１５でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含んでいることが好ましい。【００２５】
また、本発明のＴＣＲ２のβ鎖は、好ましくは、β鎖の前記可変領域を含むTCRがGPC3144-152ペプチド又は該ペプチドとHLA-A02との複合体に結合しうることを条件として、配列番号２４で示されるアミノ酸配列、配列番号２４で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列で示されるβ鎖の可変領域を含む。該可変領域は、配列番号１６〜１８でそれぞれ示されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の各アミノ酸配列を含んでいることが好ましい。【００２６】
好ましい実施態様において、本発明のＴＣＲ２は、配列番号２３で示されるアミノ酸配列含むＴＣＲα鎖、及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖を含み、該ＴＣＲのα鎖とβ鎖がヘテロダイマーを形成し得る。【００２７】
さらに、本発明のＴＣＲのα鎖は、好ましくは、α鎖の前記定常領域を含むTCRが刺激シグナルをT細胞に伝達しうることを条件として、配列番号２５で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号２５で示されるアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列で示されるα鎖の定常領域を含んでいることが好ましい。本発明の特定の実施態様において、α鎖の定常領域は配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含む。また、本発明のＴＣＲのβ鎖は、好ましくは、β鎖の前記定常領域を含むTCRが刺激シグナルをT細胞に伝達しうることを条件として、配列番号２６で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号２６で示されるアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列で示されるβ鎖の定常領域を含んでいることが好ましい。本発明の特定の実施態様において、β鎖の定常領域は配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含む。【００２８】
また、本発明のＴＣＲのα鎖又はβ鎖の定常領域は、その由来のＣＴＬクローンのＴＣＲのα鎖又はβ鎖の定常領域において、所定の改変が施されていることが好ましい。この改変としては、例えば、ＣＴＬクローンのＴＣＲの定常領域の特定のアミノ酸残基をシステイン残基に置換（例：ＴＣＲα鎖の定常領域の４８番目のスレオニンをシステインに置換（すなわちＴＣＲα鎖の定常領域を配列番号５３に置換）、ＣＴＬクローンのＴＣＲβ鎖の定常領域の５７番目のセリンをシステインに置換（すなわちＴＣＲβ鎖の定常領域を配列番号５４に置換））することで、α鎖とβ鎖間のジスルフィド結合によるダイマー発現効率を亢進することなどが挙げられるが、これらに限定されない。【００２９】
上述した可変領域と定常領域を有する本発明のＴＣＲ１のα鎖としては、例えば、配列番号２９、３０、４７又は４８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、上述した可変領域と定常領域を有する本発明のＴＣＲ１のβ鎖としては、例えば、配列番号３１、３２、４９又は５０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、これらのポリペプチドのアミノ酸配列において、好ましくは、前記α鎖又はβ鎖を含むTCRがGPC3298-306ペプチド又は該ペプチドとHLA-A24との複合体に結合しうることを条件として、１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は該ポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列のいずれかで示されるＴＣＲのα鎖又はβ鎖も、本発明に好適に用いることができる。本発明のＴＣＲ１としては、配列番号２９で示されるα鎖及び配列番号３１で示されるβ鎖により構成されたヘテロダイマー（本明細書中、上記へテロダイマーをＴＣＲ１-１と称することがある）、配列番号４７で示されるα鎖及び配列番号４９で示されるβ鎖から構成されたヘテロダイマー（本明細書中、上記へテロダイマーをＴＣＲ１-１’と称することがある）、配列番号３０で示されるα鎖及び配列番号３２で示されるβ鎖により構成されたヘテロダイマー（本明細書中、上記へテロダイマーをＴＣＲ１-２と称することがある）、又は配列番号４８で示されるα鎖及び配列番号５０で示されるβ鎖により構成されたヘテロダイマー（本明細書中、上記へテロダイマーをＴＣＲ１-２’と称することがある）が好ましい。【００３０】
上述した可変領域と定常領域を有する本発明のＴＣＲ２のα鎖としては、例えば、配列番号３３又は５１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドなどが挙げられるが、これに限定されない。また、上述した可変領域と定常領域を有する本発明のＴＣＲ２のβ鎖としては、例えば、配列番号３４又は５２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドなどが挙げられるが、これに限定されない。さらに、これらのポリペプチドのアミノ酸配列において、好ましくは、前記α鎖又はβ鎖を含むTCRがGPC3144-152ペプチド又は該ペプチドとHLA-A02との複合体に結合しうることを条件として、１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は該ポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列のいずれかで示されるＴＣＲのα鎖又はβ鎖も、本発明に好適に用いることができる。本発明のＴＣＲ２としては、配列番号３３で示されるα鎖及び配列番号３４で示されるβ鎖から構成されたヘテロダイマー（本明細書中、上記へテロダイマーをＴＣＲ２-１と称することがある）、又は配列番号５１で示されるα鎖及び配列番号５２で示されるβ鎖から構成されたヘテロダイマー（本明細書中、上記へテロダイマーをＴＣＲ２−１’と称することがある）が好ましい。【００３１】
本発明のＴＣＲは、後述する本発明の核酸又はベクターを使用して遺伝子工学的に生産することができる。例えば、本発明のＴＣＲのα鎖をコードする核酸及びβ鎖をコードする核酸の両方を細胞に導入してＴＣＲのα鎖、β鎖ポリペプチドを発現させることなどにより、当該細胞に、本発明のＴＣＲを発現させ、自体公知の方法により単離することができる。【００３２】
２．本発明の核酸
本発明は、上述した本発明のＴＣＲをコードする、核酸（以下「本発明の核酸」と略記する。）を提供する。本発明の核酸は、単離されたものでもよい。【００３３】
本発明の核酸としては、ＴＣＲのα鎖をコードする核酸、ＴＣＲのβ鎖をコードする核酸、及びＴＣＲのα鎖及びβ鎖の両方をコードする核酸のいずれであってもよい。
本発明はまた、本明細書に記載のいずれか若しくは複数のCDR、可変領域及び/又は定常領域をコードする核酸に関する。
本発明はまた、ストリンジェントな条件下で、本明細書で定義されるいずれかの核酸の相補体にハイブリダイズしうる核酸を包含する。好ましい実施態様において、ハイブリダイズしうる核酸は、本明細書に記載の機能を有する、CDR、可変領域又は定常領域のアミノ酸配列をコードする。具体的には、ハイブリダイズしうる核酸は、前記アミノ酸配列を含むTCRが、a）GPC3298-306ペプチドまたは該ペプチドとHLA-A24との複合体に結合する能力、又はb)GPC3144-152ペプチドまたは該ペプチドとHLA-A02との複合体に結合する能力有するようなアミノ酸配列をコードする。【００３４】
本発明のＴＣＲ１のα鎖をコードする核酸としては、上記で定義されたＴＣＲ１のα鎖をコードする核酸であればいかなるものでもよいが、例えば、配列番号２９、３０、４７又は４８で示されるポリペプチドをコードする核酸などが挙げられる。また、本発明のＴＣＲ１のβ鎖をコードする核酸としては、上記で定義されたＴＣＲ１のβ鎖をコードする核酸であればいかなるものでもよいが、例えば、配列番号３１、３２、４９又は５０で示されるポリペプチドをコードする核酸などが挙げられる。【００３５】
本発明のＴＣＲ２のα鎖をコードする核酸としては、上記で定義されたＴＣＲ２のα鎖をコードする核酸であればいかなるものでもよいが、例えば、配列番号３３又は５１で示されるポリペプチドをコードする核酸などが挙げられる。また、本発明のＴＣＲ２のβ鎖をコードする核酸としては、上記で定義されたＴＣＲ２のβ鎖をコードする核酸であればいかなるものでもよいが、例えば、配列番号３４又は５２で示されるポリペプチドをコードする核酸などが挙げられる。【００３６】
本発明の核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ/ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。核酸がＲＮＡである場合は、ＲＮＡの配列については、配列表におけるＴをＵと読み替えることとする。また、本発明の核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は細胞中で、ポリペプチドを発現できる限り、天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はこれらの混合物を含んでもよい。【００３７】
本発明の核酸は、自体公知の方法により構築することができる。例えば、配列表に記載したＴＣＲのアミノ酸配列又は核酸配列に基づき、化学的にＤＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法やGibson Assembly法を利用して接続することにより、本発明のＴＣＲの全長又は一部をコードするＤＮＡを構築することが可能である。【００３８】
３．本発明の核酸を含む発現ベクター
本発明の核酸は、発現ベクターに組み込むことができる。従って、本発明は、上述した本発明の核酸のいずれかを含む発現ベクター（以下「本発明のベクター」と略記する。）を提供する。
本発明のベクターは、標的細胞のゲノムに組み込まれないベクターであってもよい。一実施態様において、ゲノムに組み込まれないベクターは、標的細胞のゲノムの外側で複製しうる。ベクターは、標的細胞のゲノムの外側に複数のコピーで存在してもよい。本発明のさらなる実施態様において、ベクターは標的細胞のゲノムに組み込まれる。好ましい実施態様において、ベクターは、標的細胞のゲノムのあらかじめ決められた位置に組み込まれる。【００３９】
本発明のベクターに使用されるプロモーターとしては、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ-ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、TCR V α遺伝子プロモーター、TCR Vβ遺伝子プロモーターなどが用いられる。なかでも、ＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター等が好ましい。【００４０】
本発明のベクターは、上記プロモーターの他に、所望により、転写及び翻訳調節配列、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子などを含んでいてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。【００４１】
本発明の一実施態様において、上述した本発明のＴＣＲのα鎖をコードする核酸と、β鎖をコードする核酸とを含む発現ベクターを標的細胞内に導入し、標的細胞内や細胞表面にＴＣＲのα鎖とβ鎖のヘテロダイマーを構成することができる。この場合において、ＴＣＲのα鎖をコードする核酸と、β鎖をコードする核酸は、別々の発現ベクターに組み込んでもよいし、１つの発現ベクターに組み込んでもよい。1つの発現ベクターに組み込む場合には、これら２種類の核酸は、ポリシストロニック発現を可能にする配列を介して組み込むことが好ましい。ポリシストロニック発現を可能にする配列を用いることにより、1種類の発現ベクターに組み込まれている複数の遺伝子をより効率的に発現させることが可能になる。ポリシストロニック発現を可能にする配列としては、例えば、口蹄疫ウイルスのＴ２Ａ配列（PLoS ONE3, e2532, 2008、Stem Cells 25, 1707, 2007）、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）（U.S. Patent No. 4,937,190）などが挙げられるが、均一な発現量の観点からは、Ｔ２Ａ配列が好ましい。【００４２】
本発明に用いることができる発現ベクターは、細胞に導入された場合に、疾患の予防又は治療に十分な期間ＴＣＲを発現できれば特に限定されないが、ウイルスベクターやプラスミドベクターなどが挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターやシュードタイプベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルス、エピソーマルベクターなどが挙げられる。また、トランスポゾン発現システム（ＰｉｇｇｙＢａｃシステム）を用いてもよい。プラスミドベクターとしては、動物細胞発現プラスミド（例えば、ｐａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ/ＣＭＶ、ｐＲｃ/ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ/Ｎｅｏ）などが挙げられる。【００４３】
４．本発明の核酸又はベクターを含む細胞
本発明の核酸又はベクターを細胞に導入し、ＴＣＲ１が細胞表面に存在するときには、該細胞は標的細胞に対するＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＧＰＣ３２９８−３０６特異的な細胞傷害活性を有し得る。同様に、本発明の核酸又はベクターを細胞に導入し、本発明のＴＣＲ２が細胞表面に存在するときには、該細胞は標的細胞に対するＨＬＡ−Ａ０２拘束性のＧＰＣ３１４４−１５２特異的な細胞傷害活性を有し得る。従って、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含む細胞（言い換えれば、本発明の核酸又はベクターを有する細胞）（以下「本発明の細胞」と略記する。）を提供する。ここで、本発明の核酸は、本発明のベクターの形態で所望の細胞に導入されていていることが好ましい。本発明はまた、ゲノム編集（例えば、CRISPRシステム、TALENシステムなど）により本発明の核酸を宿主ゲノムに導入することを包含する。本発明の細胞の好適な態様としては、ＴＣＲα鎖をコードする核酸と、ＴＣＲβ鎖をコードする核酸の両方が導入されている細胞が挙げられるが、この態様に限定されない。本発明の細胞が細胞傷害活性を有することの確認は公知の方法によればよく、好適な方法として、例えばクロム放出アッセイなどのＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ０２陽性標的細胞に対する細胞傷害活性の測定が挙げられる。好ましい実施態様において、本発明の細胞はヒト細胞である。【００４４】
本発明の核酸又は発現ベクターを導入する細胞としては、例えば、リンパ球や、多能性幹細胞を含むリンパ球の前駆細胞が挙げられる。本発明において、「リンパ球」とは、脊椎動物の免疫系における白血球のサブタイプの一つを意味し、リンパ球としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が挙げられる。Ｔ細胞受容体はＴ細胞の抗原の認識に重要な役割を示すことから、本発明の核酸又はベクターを導入する細胞としては、Ｔ細胞が好ましい。本発明において、「Ｔ細胞」とは、リンパ器官あるいは末梢血中等に認められる白血球の一種で、主に胸腺で分化成熟しＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現することを特徴とするリンパ球の一分類を意味する。本発明に用いることができるＴ細胞としては、例えば、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞などが挙げられるが、好ましくは、細胞傷害性Ｔ細胞である。また、ＣＤ４／ＣＤ８両陽性細胞も、Ｔ細胞に包含される。本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞は、生体より採取されたＴ細胞に、本発明の核酸又はベクターを導入することにより、本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞を得ることができる。あるいは、本発明の核酸又はベクターが導入された、リンパ球の前駆細胞（例：多能性幹細胞）から誘導することで、本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞（即ち、該前駆細胞に由来するＴ細胞）を得ることができる。【００４５】
本発明の細胞（例：細胞傷害性Ｔ細胞）は、該細胞が本来有するＴＣＲ遺伝子に加えて、本発明の核酸又はベクターに由来する外因性のＴＣＲ遺伝子も有する。この点において、本発明の細胞は、生体より採取された細胞とは異なる。【００４６】
前記リンパ球は、ヒト又は非ヒト哺乳動物の例えば末梢血、骨髄及び臍帯血より採取することができる。本発明のＴＣＲ遺伝子導入細胞を癌などの疾患の治療に用いる場合には、当該細胞集団は治療対象本人、又は治療対象のＨＬＡタイプと一致したドナーから採取することが好ましい。好ましい対象又はドナーはヒトである。【００４７】
多能性幹細胞を含むリンパ球の前駆細胞としては、例えば、胚性幹細胞（embryonic stem cell：ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：ｉＰＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、造血幹細胞を含む造血前駆細胞、自己複製能を失った多能性前駆細胞（multipotent progenitor：ＭＭＰ）、ミエローリンフォイド共通前駆細胞（ＭＬＰ）、ミエロイド系前駆細胞（ＭＰ）、顆粒球単核前駆細胞（ＧＭＰ）、マクロファージ−樹状細胞前駆細胞（ＭＤＰ）、樹状細胞前駆細胞（ＤＣＰ）などが挙げられる。ヒト胚、特にES細胞に由来する任意の細胞は、胚を破壊して作製された細胞であっても、胚を破壊することなく作製された細胞であってもよい。倫理の観点からは、ｉＰＳ細胞、ＥＣ細胞、ＥＧ細胞、造血前駆細胞、ＭＭＰ、ＭＬＰ、ＭＰ、ＧＭＰ、ＭＤＰ、ＤＣＰ、胚を破壊することなく作製されたES細胞が好ましい。【００４８】
ｉＰＳ細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって製造することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（例えば、Takahashi K.及びYamanaka S. (2006） Cell，126；663-676：Takahashi K. et al． (2007) Cell，131;861-872：Yu J. et al． (2007） Science，318;1917-1920：Nakagawa M．et al．(2008) Nat．Biotechnol．26;101-106）。ｉＰＳ細胞を用いる場合、該iPS細胞は、自体公知の方法により体細胞から作製してもよいし、既に樹立され、ストックされているｉＰＳ細胞を用いてもよい。本発明に用いるiPS細胞の由来となる体細胞に制限はないが、好ましくは末梢血由来の細胞または臍帯血由来の細胞である。多能性幹細胞の由来となる動物に制限はなく、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、オランウータン、チンパンジー、ヒトなどの哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。【００４９】
本発明において、「造血前駆細胞」とは、CD34陽性細胞を意味し、好ましくは、CD34/CD43両陽性（DP）細胞である。本発明に用いる造血前駆細胞の由来は制限されず、例えば、下述の方法により、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる造血前駆細胞であってもよく、また、生体組織から、公知の手法により単離した造血前駆細胞であってもよい。【００５０】
本発明の核酸又はベクターを細胞に導入する方法に特に限定はなく、公知の方法を用いることができる。核酸やプラスミドベクターを導入する場合には、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法などにより行うことができる。例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），52巻，456 (1973)、日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）, 第119巻 (第6号), 345-351 (2002) などに記載の方法を用いることができる。ウイルスベクターを用いる場合には、本発明の核酸を適当なパッケージング細胞（例、Ｐｌａｔ−Ｅ細胞）や相補細胞株（例、２９３細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させることで、細胞に導入することができる。例えば、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段が国際公開第２００７/６９６６６号、Cell, 126, 663-676 (2006) 及び Cell, 131, 861-872 (2007)などに開示されている。特に、レトロウイルスベクターを用いる場合には、組換えフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６（タカラバイオ社製）を用いることにより、各種細胞に対して、高効率な遺伝子導入が可能となる。【００５１】
本発明の核酸はまた、ＲＮＡの形態で直接細胞に導入し、細胞内でＴＣＲを発現するために用いてもよい。ＲＮＡの導入方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、リポフェクション法や電気穿孔法などが好適に使用できる。【００５２】
本発明の核酸をＴ細胞に導入する場合には、本発明のＴＣＲの発現上昇、ミスペアＴＣＲの出現の抑制、又は非自己反応性の抑制の観点から、該Ｔ細胞が本来発現する内在性のＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の発現をｓｉＲＮＡによって抑制してもよい。前記の核酸を当該方法に適用する場合には、本発明のＴＣＲに対するｓｉＲＮＡの効果を避けるため、該ＴＣＲをコードする核酸の塩基配列を、内在性のＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の発現を抑えるｓｉＲＮＡが作用するＲＮＡに対応する塩基配列とは異なる配列（コドン変換型配列）とすることが好ましい。これらの方法は、例えば国際公開第２００８／１５３０２９号に記載されている。前記の塩基配列は、天然から取得されたＴＣＲをコードする核酸へのサイレント変異の導入や、人為的に設計した核酸を化学的に合成することで作製することができる。あるいは、内在性のＴＣＲ鎖とのミスペアを避けるため、本発明のＴＣＲをコードする核酸の定常領域の一部又は全部を、ヒト以外の動物、例えばマウス由来の定常領域に置換してもよい。【００５３】
５．本発明の細胞の製造方法
また本発明は、本発明の核酸又はベクターを細胞に導入する工程を含む、本発明の細胞の製造方法（以下「本発明の製法」と略記する。）を提供する。本発明の核酸又はベクターが導入される細胞、導入方法等は、４．に記載の通りである。【００５４】
本発明の製法の一態様において、(1)本発明の核酸又はベクターが導入された多能性幹細胞を、造血前駆細胞に分化させる工程、及び(2)該造血前駆細胞をＴ細胞に分化させる工程を含む、Ｔ細胞の製法が提供される。【００５５】
(1)多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させる工程（工程(1)）
多能性幹細胞から造血前駆細胞への分化方法としては、造血前駆細胞へ分化できる限り特に制限されないが、例えば、国際公開第２０１３／０７５２２２号、国際公開第２０１６／０７６４１５号及びLiu S. et al., Cytotherapy, 17 (2015);344-358などに記載されているように、造血前駆細胞への誘導培地中で多能性幹細胞を培養する方法が挙げられる。【００５６】
本発明において、造血前駆細胞への誘導培地は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）、これらの混合培地などが挙げられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清を使用してもよい。必要に応じて、基礎培地には、例えば、ビタミンＣ類（例：アスコルビン酸）、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどが含まれていてもよい。【００５７】
本発明においてビタミンC類とは、L-アスコルビン酸およびその誘導体を意味し、L-アスコルビン酸誘導体とは、生体内で酵素反応によりビタミンCとなるものを意味する。本発明に用いるアスコルビン酸の誘導体として、リン酸ビタミンC、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンCエステル、テトラヘキシルデカン酸アスコビル、ステアリン酸アスコビルおよびアスコルビン酸-2リン酸-6パルミチン酸が例示される。好ましくは、リン酸ビタミンCであり、例えば、リン酸-L-アスコルビン酸Naまたはリン酸-L-アスコルビン酸Mgなどのリン酸-L-アスコルビン酸塩が挙げられる。【００５８】
工程(1)で用いる好ましい基礎培地は、血清、インスリン、トランスフェリン、セリン、チオールグリセロール、L-グルタミン、アスコルビン酸を含むIMDM培地である。【００５９】
工程(1)で用いる培養液は、BMP4 (Bone morphogenetic protein 4)、VEGF (vascular endothelial growth factor)、SCF (Stem cell factor)およびFLT-3L (Flt3 Ligand)からなる群より選択される少なくとも１種類のサイトカインがさらに添加されていてもよい。より好ましくは、VEGF、SCFおよびFLT-3Lを添加された培養液である。【００６０】
工程(1)でビタミンC類を用いる場合、ビタミンＣ類は、４日毎、３日毎、２日毎、または１日毎に、別途添加（補充）することが好ましく、１日毎に添加することが好ましい。当該ビタミンC類は、培養液において、5 ng/ml〜500 ng/mlに相当する量（例：5 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/mlに相当する量）を添加ことが好ましい。【００６１】
工程(1)でBMP4を用いる場合、培養液中におけるBMP4の濃度は、特に制限されないが、10 ng/ml〜100 ng/ml（例：10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml）であることが好ましく、20 ng/ml〜40 ng/mlであることがより好ましい。【００６２】
工程(1)でVEGFを用いる場合、培養液中におけるVEGFの濃度は、特に制限されないが、10 ng/ml〜100 ng/ml（例：10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml）であることが好ましく、なかでも、20 ng/mlが好ましい。【００６３】
工程(1)でSCFを用いる場合、培養液中におけるSCFの濃度は、特に制限されないが、10 ng/ml〜100 ng/ml（例：10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml）であることが好ましく、なかでも、30 ng/mlが好ましい。【００６４】
工程(1)でFLT-3Lを用いる場合、培養液中におけるFLT-3Lの濃度は、特に制限されないが、1 ng/ml〜100 ng/ml（例：1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml）であることが好ましく、なかでも、10 ng/mlが好ましい。【００６５】
工程(1)において、多能性幹細胞の培養は、接着培養または浮遊培養であってもよく、接着培養の場合、コーティング剤をコーティングした培養容器を用いて行ってもよく、また他の細胞と共培養してもよい。共培養する他の細胞として、C3H10T1/2（Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830, 2010）、異種由来のストローマ細胞（Niwa A et al. J Cell Physiol. 2009 Nov;221(2):367-77.）が例示される。コーティング剤としては、マトリゲル（Niwa A, et al. PLoS One.6(7):e22261, 2011）が例示される。浮遊培養では、Chadwick et al. Blood 2003, 102: 906-15、Vijayaragavan et al. Cell Stem Cell 2009, 4: 248-62、およびSaeki et al. Stem Cells 2009, 27: 59-67に記載の方法が例示される。【００６６】
工程(1)において、培養温度の条件は、特に制限されないが、例えば、37℃〜42℃程度、37〜39℃程度が好ましい。また、培養期間については、当業者であれば造血前駆細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血前駆細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも6日間以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、14日以上であり、好ましくは14日である。培養期間が長いことについては、造血前駆細胞の製造においては通常問題とされないが、例えば３５日以下が好ましく、２１日以下がより好ましい。また、低酸素条件で培養してもよく、本発明において低酸素条件とは、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％またはそれら以下の酸素濃度が例示される。【００６７】
(2)造血前駆細胞をＴ細胞に分化させる工程（工程(2)）
造血前駆細胞からＴ細胞への分化方法としては、造血前駆細胞をＴ細胞へ分化できる限り特に制限されないが、例えば、国際公開第２０１６／０７６４１５号などに記載されているような、(2-1)造血前駆細胞からCD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程、及び(2-2)CD4CD8両陽性T細胞からCD8陽性T細胞を誘導する工程を含む方法が挙げられる。造血前駆体は、工程（１）により得られた細胞集団から、造血前駆細胞のマーカーを用いてあらかじめ単離することが好ましい。該マーカーとしては、ＣＤ４３、ＣＤ３４、ＣＤ３１及びＣＤ１４４からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。【００６８】
(2-1)造血前駆細胞からCD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程（工程(2-1)）
本発明において、CD4CD8両陽性T細胞への分化方法としては、例えば、CD4CD8両陽性T細胞への誘導培地中で造血前駆細胞を培養する方法が挙げられる。【００６９】
本発明において、CD4CD8両陽性T細胞への分化誘導培地としては、特に制限されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地には、上記工程(1)で用いたものと同様のものが挙げられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清を使用してもよい。必要に応じて、基礎培地には、例えば、ビタミンＣ類、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどが含まれていてもよい。【００７０】
工程(2-1)で用いる好ましい基礎培地は、血清、トランスフェリン、セリン、およびL-グルタミンを含むαMEM培地である。基礎培地へビタミンＣ類を添加する場合、ビタミンC類は、工程(1)の場合と同様である。【００７１】
工程(2-1)で用いる培養液は、サイトカインであるFLT-3L及び／又はIL-7をさらに含んでいてもよく、より好ましくは、FLT-3LおよびIL-7を添加された培養液である。【００７２】
工程(2-1)でIL-7を用いる場合、培養液中におけるIL-7の濃度は、1 ng/ml〜50 ng/ml（例：1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml）であることが好ましく、なかでも、5 ng/mlが好ましい。【００７３】
工程(2-1)でFLT-3Lを用いる場合、FLT-3Lは、上記工程(1)と同様に用いることができる。【００７４】
工程(2-1)において、造血前駆細胞を接着培養または浮遊培養してもよく、接着培養の場合、培養容器をコーティングして用いてもよく、またフィーダー細胞等と共培養してもよい。共培養するフィーダー細胞として、骨髄間質細胞株OP9細胞（理研BioResource Centerより入手可能）が例示される。当該OP9細胞は、好ましくは、Dll1を恒常的に発現するOP-DL1細胞である（Holmes R1 and Zuniga-Pflucker JC. Cold Spring Harb Protoc. 2009(2)）。本発明において、フィーダー細胞としてOP9細胞を用いる場合、別途用意したDll1またはDll1とFc等の融合タンパク質を適宜培養液に添加することによっても行い得る。本発明において、Dll1には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM#005618、マウスの場合、NM#007865に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらと高い配列同一性（例えば９０％以上）を有し、同等の機能を有する天然に存在する変異体が包含される。CD4CD8両陽性T細胞を製造する際にフィーダー細胞を用いる場合、当該フィーダー細胞を適宜交換して培養を行うことが好ましい。フィーダー細胞の交換は、予め播種したフィーダー細胞上へ培養中の対象細胞を移すことによって行い得る。当該交換は、５日毎、４日毎、３日毎、または２日毎にて行い得る。【００７５】
工程(2-1)において、培養温度の条件は、特に制限されないが、例えば、37℃〜42℃程度、37〜39℃程度が好ましい。また、培養期間については、当業者であればCD4CD8両陽性T細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血前駆細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも10日間以上、12日以上、14日以上、16日以上、18日以上、20日以上、22日以上、23日以上であり、好ましくは23日である。また、90日以下が好ましく、42日以下がより好ましい。【００７６】
(2-2)CD4CD8両陽性(DP)T細胞からCD8陽性T細胞を誘導する工程（工程(2-2)）
工程(2-1)により得られたCD4/CD8DP細胞を、CD8 single positive (SP)細胞に分化誘導する工程に付すことにより、CD8 single positive (SP)細胞へ分化誘導することができる。【００７７】
工程（2-2）で用いる基礎培地および培地としては、工程(1)に記載された基礎培地および培地と同様のものが挙げられる。【００７８】
前記培地は、副腎皮質ホルモン剤を含んでいてもよい。副腎皮質ホルモン剤としては、例えば、糖質コルチコイド及びその誘導体などが挙げられ、該糖質コルチコイドとしては、例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プロピオン酸ベクロメタゾンが挙げられる。なかでも、デキサメタゾンが好ましい。【００７９】
副腎皮質ホルモン剤としてデキサメタゾンを用いる場合、培養液中におけるデキサメタゾンの濃度は、1nM〜100nM（例：1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM）が好ましく、なかでも、10nMが好ましい。【００８０】
前記培地は、抗体（例：抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD2抗体）、サイトカイン（例：IL-7、IL-2、IL-15）などを含有していてもよい。【００８１】
工程(2-2)で抗CD3抗体を用いる場合、該抗CD3抗体としては、CD3を特異的に認識する抗体であれば特に限定されないが、例えば、OKT3クローンから産生される抗体が挙げられる。抗CD3抗体は、磁気ビーズ等が結合されているものであってもよく、また、前記抗CD3抗体を培地中に添加する代わりに、抗CD3抗体を表面に結合させた培養容器上で該Tリンパ球を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。抗CD3抗体の培地中における濃度は、10ng/ml〜1000ng/ml（例：10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、600 ng/ml、700 ng/ml、800 ng/ml、900 ng/ml、1000 ng/ml）が好ましく、なかでも、500 ng/mlが好ましい。その他の抗体の濃度についても、当業者は、培養条件等に基づき、適宜決定することができる。【００８２】
工程(2-2)でIL-2を用いる場合、培地中におけるIL-2の濃度は、10 U/ml〜1000 U/ml（例：10 U/ml、20 U/ml、30 U/ml、40 U/ml、50 U/ml、60 U/ml、70 U/ml、80 U/ml、90 U/ml、100 U/ml、200 U/ml、500 U/ml、1000 U/ml）が好ましく、なかでも、100 U/mlが好ましい。工程(2-2)で用いるIL-7又はIL15の培地中における濃度は、1 ng/ml〜100 ng/ml（例：1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml）が好ましく、なかでも、10 ng/mlが好ましい。【００８３】
工程(2-2)において、培養温度の条件は、特に制限されないが、37℃〜42℃程度が好ましく、37〜39℃程度がより好ましい。また、培養期間については、当業者であればCD8陽性T細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することができる。CD8陽性T細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、1日以上、3日以上、7日以上が好ましく、60日以下が好ましく、35日以下がより好ましい。【００８４】
６．本発明の核酸、ベクター又は細胞を含有してなる医薬
本発明は、本発明の核酸、ベクター又は細胞を有効成分として含有する医薬（以下「本発明の医薬」と略記する。）を提供する。本発明の核酸を含む細胞は、ＨＬＡ-Ａ２４分子とＧＰＣ３２９８-３０６ペプチド、あるいはＨＬＡ-Ａ０２分子とＧＰＣ３１４４−１５２ペプチドを提示する細胞に対して細胞傷害活性を示し得る。従って、本発明の核酸、ベクター又は細胞を含有してなる医薬は、ＧＰＣ３を発現する疾患の予防又は治療のために用いることができ、たとえば哺乳動物（例：マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト）、好ましくはヒト、に投与することができる。ＧＰＣ３を発現する疾患としては、特に限定されないが、例えばＧＰＣ３を発現する癌や腫瘍などが挙げられる。従って、本発明の好ましい実施態様において、ＧＰＣ３を発現する癌や腫瘍の予防又は治療のための抗癌剤が提供される。【００８５】
かかるＧＰＣ３を発現する癌や腫瘍は、例えば、“Daniel Baumhoer et al., Am J. Clin Pathol, 2008, 129, 899-906”などに記載されている。具体的には、肝臓癌（例：肝細胞癌）、卵巣癌（例：卵巣明細胞腺癌）、小児癌、肺癌（例：扁平上皮癌、肺小細胞癌）、精巣癌（例：非セミノーマ胚細胞腫瘍）、軟部腫瘍（例：脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫）、子宮癌（例：子宮頚部上皮内腫瘍、子宮頸部扁平上皮癌）、メラノーマ、副腎腫瘍（例：副腎の腺腫）、神経性腫瘍（例：シュワン腫）、胃癌（例：胃の腺癌）、腎臓癌（例：グラヴィッツ腫瘍）、乳癌（例：浸潤性小葉性癌、粘液性癌）、甲状腺癌（例：髄様癌）、喉頭癌（例：扁平上皮癌）、膀胱癌（例：浸潤性移行上皮癌）などが挙げられるが、これらに限定されない。この中でも、ＧＰＣ３の発現量の観点からは、肝臓癌、卵巣癌、小児癌、肺癌が好ましく、なかでも肝臓癌、特に肝細胞癌が好ましい。【００８６】
本発明の医薬の有効成分として、核酸又はベクターを用いる場合には、公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、希釈剤、増量剤、結合剤、滑沢剤、流動助剤、崩壊剤、界面活性剤等などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することが好ましい。賦形剤は、当業者にはよく知られており、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（例えば、０．０１Ｍリン酸塩、０．１３８Ｍ ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩を含有する水溶液、生理食塩液、グリコール又はエタノールなどの溶液及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩などが挙げられる。また、湿潤剤又は乳化剤などの補助剤、及びｐＨ緩衝剤も使用することができる。さらに、懸濁化剤、保存剤、安定化剤及び分散剤などの製剤補助剤などを用いてもよい。また、上記医薬組成物は、使用前に適切な無菌の液体により再構成するための乾燥形態であってもよい。該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて、全身的に又は局所的に、経口投与又は非経口投与することができる。非経口投与する場合には、静脈投与、皮内投与、皮下投与、直腸投与、経皮投与すること等が可能である。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。【００８７】
有効成分が核酸である場合の投与量としては、例えば、１回につき体重１ｋｇあたり該核酸が０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲で投与される。例えば、ヒト患者に投与する場合、体重６０ｋｇの患者に対し０．００１〜５０ｍｇの範囲で投与される。有効成分がウイルスベクター粒子である場合の投与量は、体重６０ｋｇの対象に対して、１回につき、例えばウイルスの力価として約１×１０３ｐｆｕ〜１×１０１５ｐｆｕの範囲で投与される。上記の投与量は例示であり、用いる核酸やベクターの種類や投与経路、投与対象又は患者の年齢、体重、症状などにより、投与量を適宜選択することができる。【００８８】
本発明の医薬の有効成分として、本発明の細胞を用いる場合には、該細胞は、対象に投与する前に適切な培地及び／又は刺激分子を使用して培養及び／又は刺激を行ってもよい。刺激分子としては、サイトカイン類、適当なタンパク質、その他の成分などが挙げられるが、これらに限定されない。サイトカイン類としては、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ等が例示され、好ましくは、ＩＬ−２を用いることができる。ＩＬ−２の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば、好適には０．０１〜１×１０５Ｕ／ｍＬ、より好適には１〜１×１０４Ｕ／ｍＬである。また、適当なタンパク質としては、例えばＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、抗ＩＬ−４抗体が例示される。また、この他、レクチン等のリンパ球刺激因子を添加することもできる。さらに、培地中に血清や血漿を添加してもよい。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、０体積％〜２０体積％が例示され、また培養段階に応じて使用する血清や血漿の量を変更することができる。例えば、血清又は血漿濃度を段階的に減らして使用することもできる。血清又は血漿の由来としては、自己又は非自己のいずれでも良いが、安全性の観点からは、自己由来のものが好ましい。【００８９】
本発明において、本発明の細胞を有効成分として含有する医薬は、非経口的に対象に投与して用いることが好ましい。非経口的な投与方法としては、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、及び皮下投与などの方法が挙げられる。投与量は、対象の状態、体重、年齢等応じて適宜選択されるが、通常、細胞数として、体重６０ｋｇの対象に対し、１回当り、通常１×１０６〜１×１０１０個となるように、好ましくは１×１０７〜１×１０９個となるように、より好ましくは５×１０７〜５×１０８個となるように投与される。また、１回で投与してもよく、複数回にわたって投与してもよい。本発明の医薬は、非経口投与に適した公知の形態、例えば、注射又は注入剤とすることができる。本発明の医薬は、適宜、薬理学的に許容できる賦形剤を含んでいてもよい。薬理学的に許容できる賦形剤としては、上記に記載したものが挙げられる。本発明の医薬は、細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含んでもよい。培地としては、特に限定するものではないが、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ１０などの培地が挙げられるが、これらに限定されない。また該医薬には医薬的に許容される担体（例：ヒト血清アルブミン）、保存剤等が安定化の目的で添加されていてもよい。【００９０】
さらに、本発明の細胞は、ＧＰＣ３を発現する細胞を殺傷し得るため、ＧＰＣ３を発現する細胞の殺傷剤として用いることができる。かかる殺傷剤は、前記医薬と同様にして作製し、使用することができる。【００９１】
また、本発明のＴＣＲは、例えばＴＣＲを抗ＣＤ３抗体の一本鎖抗体断片(ｓｃＦｖ)（又はＴ細胞に結合し、Ｔ細胞応答を活性化する類似の抗体断片）を組み合わせた融合タンパク質として用いることもできる。かかる融合タンパク質は、安定した、可溶性の高親和性ＴＣＲとするために、２つのＴＣＲ鎖のポリペプチドの各定常領域間に、新たに人工的にジスルフィド結合を導入してもよい。また、融合タンパク質のｓｃＦｖは、ＴＣＲのβ鎖の定常領域に融合していることが好ましい。このような融合タンパク質については、例えば、米国特許第7,569,664号、Liddy et al., Nat. Med. 18:908-7 (2012)、Oates and Jakobsen, OncoImmunology 2:e22891 (2013)などに記載されている。【００９２】
かかる融合タンパク質は、生体内に導入された場合に、ＴＣＲの特異的認識を通じて、ＧＰＣ３を発現する細胞に結合し、ｓｃＦｖが細胞傷害性Ｔ細胞の細胞表面に存在するＣＤ３に結合することで、ＧＰＣ３を発現する細胞を傷害し得る。従って、前記融合タンパク質や、このタンパク質をコードする核酸を含有する医薬も、本発明の核酸や細胞を含有する医薬と同様に、ＧＰＣ３を発現する疾患の予防又は治療のために用いることができる。医薬として用いる場合には、前述の記載と同様に調製等することができる。【００９３】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
（配列番号：１）ＴＣＲ１−１α鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
（配列番号：２）ＴＣＲ１−１α鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
（配列番号：３）ＴＣＲ１−１α鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
（配列番号：４）ＴＣＲ１−２α鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
（配列番号：５）ＴＣＲ１−２α鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
（配列番号：６）ＴＣＲ１−２α鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
（配列番号：７）ＴＣＲ１−１β鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
（配列番号：８）ＴＣＲ１−１β鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
（配列番号：９）ＴＣＲ１−１β鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
（配列番号：１０）ＴＣＲ１−２β鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
（配列番号：１１）ＴＣＲ１−２β鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
（配列番号：１２）ＴＣＲ１−２β鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
（配列番号：１３）ＴＣＲ２−１α鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
（配列番号：１４）ＴＣＲ２−１α鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
（配列番号：１５）ＴＣＲ２−１α鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
（配列番号：１６）ＴＣＲ２−１β鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列
（配列番号：１７）ＴＣＲ２−１β鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列
（配列番号：１８）ＴＣＲ２−１β鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列
（配列番号：１９）ＴＣＲ１−１α鎖の可変領域のアミノ酸配列
（配列番号：２０）ＴＣＲ１−２α鎖の可変領域のアミノ酸配列
（配列番号：２１）ＴＣＲ１−１β鎖の可変領域のアミノ酸配列
（配列番号：２２）ＴＣＲ１−２β鎖の可変領域のアミノ酸配列
（配列番号：２３）ＴＣＲ２−１α鎖の可変領域のアミノ酸配列
（配列番号：２４）ＴＣＲ２−１β鎖の可変領域のアミノ酸配列
（配列番号：２５）ＴＣＲα鎖の定常領域のアミノ酸配列
（配列番号：２６）ＴＣＲβ鎖の定常領域のアミノ酸配列
（配列番号：２７）ＧＰＣ３２９８−３０６ペプチドのアミノ酸配列
（配列番号：２８）ＧＰＣ３１４４−１５２ペプチドのアミノ酸配列
（配列番号：２９）ＴＣＲ１−１α鎖全長のアミノ酸配列
（配列番号：３０）ＴＣＲ１−２α鎖全長のアミノ酸配列
（配列番号：３１）ＴＣＲ１−１β鎖全長のアミノ酸配列
（配列番号：３２）ＴＣＲ１−２β鎖全長のアミノ酸配列
（配列番号：３３）ＴＣＲ２−１α鎖全長のアミノ酸配列
（配列番号：３４）ＴＣＲ２−１β鎖全長のアミノ酸配列
（配列番号：３５）ＴＣＲ１−２α鎖ＰＣＲ増幅用フォワードプライマー
（配列番号：３６）ＴＣＲ１−２α鎖ＰＣＲ増幅用リバースプライマー
（配列番号：３７）ＴＣＲ１−２β鎖ＰＣＲ増幅用フォワードプライマー
（配列番号：３８）ＴＣＲ１−２β鎖ＰＣＲ増幅用リバースプライマー
（配列番号：３９）ＴＣＲ１−２α鎖シークエンス用フォワードプライマー
（配列番号：４０）ＴＣＲ１−２α鎖シークエンス用リバースプライマー
（配列番号：４１）ＴＣＲ１−２α鎖シークエンス用リバースプライマー
（配列番号：４２）ＴＣＲ１−２α鎖シークエンス用リバースプライマー
（配列番号：４３）ＴＣＲ１−２β鎖シークエンス用フォワードプライマー
（配列番号：４４）ＴＣＲ１−２β鎖シークエンス用フォワードプライマー
（配列番号：４５）ＴＣＲ１−２β鎖シークエンス用リバースプライマー
（配列番号：４６）ＴＣＲ１−２β鎖シークエンス用リバースプライマー
（配列番号：４７）ＴＣＲ１−１’α鎖全長のアミノ酸配列
（配列番号：４８）ＴＣＲ１−２’α鎖全長のアミノ酸配列
（配列番号：４９）ＴＣＲ１−１’β鎖全長のアミノ酸配列
（配列番号：５０）ＴＣＲ１−２’β鎖全長のアミノ酸配列
（配列番号：５１）ＴＣＲ２−１’α鎖全長のアミノ酸配列
（配列番号：５２）ＴＣＲ２−１’β鎖全長のアミノ酸配列
（配列番号：５３）ＴＣＲα鎖の定常領域の改変アミノ酸配列
（配列番号：５４）ＴＣＲβ鎖の定常領域の改変アミノ酸配列【００９４】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明はこれらに限定されない。【００９５】
実施例中の略号は、本技術分野で現在通常用いられている用例に従うものであり、例えば、次のような意味である。
ＨＬＡ: ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen）
ＨＩＶ: ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus）
ＥＬＩＳＰＯＴ: 酵素免疫スポットアッセイ（Enzyme-Linked ImmunoSpot）
ＴＡＰ: 抗原プロセシング関連トランスポーター(Transporter associated with Antigen Processing)
【実施例】
【００９６】
実施例１
進行性の肝細胞癌患者に対し、適正製造基準（Good Manufacturing Practice）のガイドラインに従って合成された抗原（ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２-拘束性ＧＰＣ３２９８−３０６ペプチド（以下では「ＧＰＣ３２９８−３０６ペプチド」と略記する。）（配列番号２７：EYILSLEEL ; アメリカンペプチド社）又はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１-拘束性ＧＰＣ３１４４−１５２ペプチド（以下では「ＧＰＣ３１４４−１５２ペプチド」と略記する。）（配列番号２８：FVGEFFTDV ; アメリカンペプチド社））及びフロイントの不完全アジュバント（incomplete Freund’s adjuvant (IFA) ; Montanide ISA-51VG ; セピック社）を混合して乳剤化したワクチンを皮内投与し、投与後に得られた末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)又は肝腫瘍生検組織検体からＣＴＬクローンを樹立した。
以下にＣＴＬクローン樹立に関する具体的な方法を記す。
（１）抗原投与
進行性の肝細胞癌（ＨＣＣ）患者における、グリピカン３（ＧＰＣ３）ペプチドの用量漸増を伴う非ランダム、非盲検のフェーズ１治験  (試験名：進行肝細胞がん患者を対象としたＨＬＡ−Ａ２４及びＡ２結合性グリピカン３(ＧＰＣ３)由来ペプチドワクチンの臨床第I相試験、UMIN試験ID: UMIN000001395) において、ＨＬＡ−Ａ２ポジティブな患者にＧＰＣ３１４４−１５２ペプチド及びフロイントの不完全アジュバントを混合して乳剤化したワクチンを、１、１５、２９日目に皮内注射により投与（３０mgペプチド/body）した。３回目のワクチン投与から２週間後の末梢血を採取し、後述のＰＢＭＣの単離に供した。
また、別の臨床試験  (試験名：進行肝細胞がん患者を対象としたＨＬＡ−Ａ２４及びＡ２結合性グリピカン３(ＧＰＣ３)由来ペプチドワクチン療法の免疫学的有効性を評価する臨床試験、UMIN試験ID: UMIN000005093)において、ＨＬＡ−Ａ２４ポジティブな患者にＧＰＣ３２９８−３０６ペプチド及びフロイントの不完全アジュバントを混合して乳剤化したワクチンを２週毎に皮内注射により投与（３mgペプチド/body）した。６回目のワクチン投与後に肝腫瘍生検を行い、得られた組織を後述のＣＴＬクローン(具体的には、ＣＴＬ１−１)の樹立に供した。また、３回目のワクチン投与から２週間後の末梢血を採取し、後述のようにＰＢＭＣを単離したあと、ＣＴＬクローン(具体的には、ＣＴＬ１−２)の樹立に供した。【００９７】
（２）ＰＢＭＣの単離及びＣＴＬバルクの樹立
前記末梢血(３０ mL)をフィコールパック勾配(Ficoll-Paque gradient)を用いて遠心分離することでＰＢＭＣを単離した。
単離したＰＢＭＣ (2 x 106 個) を10 μg/mLのＧＰＣ３ペプチド（ＧＰＣ３２９８−３０６ペプチド又はＧＰＣ３１４４−１５２ペプチド）、10%ヒトAB血清、50 IU/mlの組み換えヒトインターロイキン-２、10 ng/mlの組み換えヒトインターロイキン-１５を添加したＡＩＭ−Ｖ培地中で１４日間培養し、ＣＴＬバルクを樹立した。【００９８】
（３）ＣＴＬ クローンの樹立
上記（２）で得られたＰＢＭＣ及びＧＰＣ３ペプチド反応性ＣＤ８＋ＣＴＬバルクからＣＤ８陽性かつＧＰＣ３デキストラマー陽性細胞、又はＣＤ８陽性かつＣＤ１０７ａ陽性細胞をFACSAria セルソーターを用いて単離した。また、上記（１）の生検腫瘍組織からＣＤ８陽性かつＧＰＣ３デキストラマー陽性細胞をFACSAria セルソーターを用いて単離した。なお、単離時に使用したＣＤ８特異的抗体はProImmune社から、ＣＤ１０７ａ特異的抗体はBD Bioscience社から、ＧＰＣ３２９８−３０６／ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２-デキストラマーとＧＰＣ３１４４−１５２／ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１デキストラマーはImmudex社からそれぞれ購入した。
上記単離により得られた各細胞を96ウェルプレートに播種(1 cell/well)し、10%ヒトAB血清、IL-2 (200 U/mL)及びフィトヘマグルチニン−Ｐ(PHA)(5 μg/mL)を添加したＡＩＭ−Ｖ培養液中で、放射線照射(100 Gy)した非自己由来のＰＢＭＣ(1ウェル当たり8 x 104 個)をフィーダー細胞として用いて、１４−２１日間刺激することで、ＣＴＬクローンを樹立した。本明細書中、ＨＬＡ−Ａ２ポジティブな患者から樹立したＣＴＬクローンをＣＴＬ２−１、ＨＬＡ−Ａ２４ポジティブな患者から樹立したＣＴＬクローンをＣＴＬ１−１（生検腫瘍組織由来）、ＣＴＬ１−２（ＰＢＭＣ由来）と称することがある。【００９９】
試験例１  ＥＬＩＳＰＯＴ アッセイ
抗原特異的ＣＴＬ反応を測定するため、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。
ＣＴＬ２−１ (1ウェル当たり1 x 104 個)、ＣＴＬ１−１ (1ウェル当たり1 x 105 個)及びＣＴＬ１−２ (1ウェル当たり1 x 105 個)を３７℃、５%ＣＯ２存在下で、ＧＰＣ３を強制発現させた癌細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ−１/ｈＧＰＣ３）もしくはそのＭｏｃｋコントロール癌細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ−１/ｖｅｃ）と共に２０時間培養した。その結果を図１（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
この結果、本試験に適用した各ＣＴＬは、ＧＰＣ３を発現する癌細胞に応答したインターフェロン-γ産生能を有することが判明した。【０１００】
試験例２  ペプチドタイトレーションアッセイ（Peptide titration assay）
実施例１で樹立した各ＣＴＬクローン（ＣＴＬ２−１、ＣＴＬ１−１及びＣＴＬ１−２）と、それぞれ対応するＴ２標的細胞を１０：１ (effector/target (E/T) = １０)になるように混合し、４時間共培養した。ＣＴＬ２−１に対応するＴ２標的細胞としては、カルセインＡＭで標識をしたＴ２細胞（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性, ＴＡＰ陰性）にＧＰＣ３１４４−１５２ペプチドをパルスしたものを使用し、ＣＴＬ１−１及びＣＴＬ１−２に対応するＴ２標的細胞としては、カルセインＡＭで標識をしたＨＬＡ−Ａ＊２４：０２強制発現Ｔ２細胞（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１/Ａ＊２４：０２陽性, ＴＡＰ陰性）にＧＰＣ３２９８−３０６ペプチドをパルスしたものを使用した。ネガティブコントロールをおく場合には、各細胞にＨＩＶペプチドをパルスしたものを用いた。【０１０１】
各ＣＴＬクローンについて、細胞傷害率(%)（下記計算式を用いて算出）をペプチド濃度に対してプロットした（図２（Ａ）及び(Ｂ)）。【０１０２】
【数１】
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【０１０３】
５０%細胞傷害活性と曲線が交差するペプチド濃度をそのクローンの認識効率とする場合、ＣＴＬ２−１の認識効率は約10-10Ｍであり、ＣＴＬ１−１の認識効率は約10-9Mであった。
この結果、ＣＴＬ２−１はＧＰＣ３１４４−１５２-ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１複合体を有する細胞に対し細胞傷害性を有すること、ＣＴＬ１−１ 及びＣＴＬ１−２はＧＰＣ３２９８-３０６-ＨＬＡ−Ａ＊ ２４：０２複合体を有する細胞に対し細胞傷害性を有することが示された。【０１０４】
実施例２  ＣＴＬ ＴＣＲ配列の解読
１．配列解読
ＣＴＬ１−１のＴＣＲ（すなわちＴＣＲ１−１）及びＣＴＬ２−１のＴＣＲ（すなわちＴＣＲ２−１）の各配列は以下の方法で分析した。
すなわち、Ｔ細胞のトータルＲＮＡはRNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用いて抽出した。Omniscript RT Kit (QIAGEN)及びオリゴｄＴプライマー(oligo dT primer: Invitrogen)を用いて、ファーストストランド(First-Strand) ｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲのプライマーとしては、Uemura Y. et al., J Immunol, 2003, 170:947-960又はMisko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96: 2279-2284に記載されている、再構成したＴ細胞受容体（TCR）α鎖用のＴＣＲＡＶファミリー特異的なオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー及びＴＣＲＡＣ(Ｃα)  定常領域のリバースプライマー、及び再編成したＴＣＲβ鎖用のＴＣＲＢＶファミリー特異的なオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー及びＴＣＲＢＣ(Ｃβ)  定常領域のリバースプライマーを用いた。α鎖及びβ鎖の増幅したＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔプラスミドベクター（プロメガ）にクローニングし、配列を解読した。得られた配列をＩＭＧＴ（ImMunoGeneTics）データベースを用いて分析した。
ＣＴＬ１−２のＴＣＲ（すなわちＴＣＲ１−２）配列分析は以下の方法で実施した。
すなわち、Ｔ細胞のトータルＲＮＡはRNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用いて抽出した。SuperScriptIII逆転写酵素(ThermoFisher Scientific)及びオリゴｄＴプライマー(oligo dT primer: Invitrogen)を用いて、ファーストストランド(First-Strand) ｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。これをネクストジェネレーションシーケンサー（MiSeq、Illumina）を用いて、レパトア解析を行い、予備的な配列解析を行った。この後、レパトア解析結果の部分配列データよりＶ領域（５’非翻訳領域）、Ｃ領域（３’非翻訳領域のポリＡ付加シグナル直前）にプライマーを設計し（ＴＣＲ１−２α鎖用フォワードプライマー: AAGCACTCTTCTAGCCCAGAGAA（配列番号：３５）、ＴＣＲ１−２α鎖用リバースプライマー: TAGCAGGGCCTCGATAATGA（配列番号：３６）、ＴＣＲ１−２β鎖用フォワードプライマー: AGAATGCTTACTACAGAGACACCA（配列番号：３７）、ＴＣＲ１−２β鎖用リバースプライマー: GTTTAGCCTATTTCGTACTTGG（配列番号：３８））、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅断片はカラム精製後、以下のシークエンシングプライマーを用いBigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit(ThermoFisher Scientific)にて反応した。使用したシークエンシングプライマーは以下のとおりである；
ＴＣＲ１−２α鎖用フォワードプライマー: 
ACGCCTTCAACAACAGCATTA（配列番号：３９）、
ＴＣＲ１−２α鎖用リバースプライマー: 
CAGACTTGTCACTGGATTTAGAG（配列番号：４０）、GGAGCACAGGCTGTCTTACAA（配列番号：４１）、ATAGCAGGGCCTCGATAATGA（配列番号：４２）、
ＴＣＲ１−２β鎖用フォワードプライマー: 
AGAATGCTTACTACAGAGACACCA（配列番号：４３）、GCTGTGTTTGAGCCATCAGAA（配列番号：４４）、
ＴＣＲ１−２β鎖用リバースプライマー: 
AGGCAGTATCTGGAGTCATTGAG（配列番号：４５）、GTTTAGCCTATTTCGTACTTGG（配列番号：４６）。
カラム精製後、ＡＢＩキャピラリーシークエンサーにて配列決定を行った。【０１０５】
試験例３  ＴＣＲを導入したＰＢＭＣを用いたデキストラマー染色及びフローサイトメトリー分析
１．ＴＣＲ発現レトロウィルスベクターの構築
上記の方法で同定したＴＣＲβ鎖の遺伝子配列とＴＣＲα鎖の遺伝子配列をもとに、システイン置換（具体的には、ＴＣＲα鎖の定常領域の４８番目のスレオニンをシステインに、ＣＴＬクローンのＴＣＲβ鎖の定常領域の５７番目のセリンをシステインに置換）を組み込んだアミノ酸配列（具体的には、配列番号４７：ＴＣＲ１−１α鎖から設計したＴＣＲ１−１’α鎖、配列番号４８：ＴＣＲ１−１β鎖から設計したＴＣＲ１−１’ β鎖、配列番号４９：ＴＣＲ１−２α鎖から設計したＴＣＲ１−２’α鎖、配列番号５０：ＴＣＲ１−２β鎖から設計したＴＣＲ１−２’ β鎖、配列番号５１：ＴＣＲ２−１α鎖から設計したＴＣＲ２−１’α鎖、配列番号５２：ＴＣＲ２−１β鎖から設計したＴＣＲ２−１’ β鎖）を設計した。ＴＣＲ１−１’ならびにＴＣＲ２−１’の各α鎖及びβ鎖のアミノ酸をコードする塩基配列を設計し、設計した塩基配列をバイシストロニック発現用配列Ｔ２Ａで繋いだオリゴDNAを人工合成（GenScript）して、レトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ−２（タカラバイオ社）のマルチクローニングサイト（Ｂｇｌ ＩＩ−Ｈｐａ Ｉサイト）に挿入した。【０１０６】
２．ＴＣＲ遺伝子導入
上記１．で得られたウイルスベクタープラスミドを、Ｇ３Ｔ−ｈｉ 細胞 (タカラバイオ社)に導入して一過性のレトロウイルスベクターを得た。これをＰＧ１３細胞に導入してレトロウイルスベクター産生細胞を得た。
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２又はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１が陽性の健康ドナーから実施例１（２）と同様の方法により単離したＰＢＭＣを、５%ヒト血漿Ｘ−ＶＩＶＯ２０で抗ＣＤ３抗体（クローンHIT3a）を用いて刺激、インキュベートした。３日後、レトロネクチン（タカラバイオ社）でコートした２４ウェルプレートを用いて、上記レトロウイルスベクター産生細胞から得られたレトロウイルスベクターにより、ＧＰＣ３（ＧＰＣ３２９８−３０６ペプチド又はＧＰＣ３１４４−１５２ペプチド）特異的なＴＣＲ（具体的には、ＴＣＲ１−１’又はＴＣＲ２−１'）を形質導入し、翌日再度形質導入した。【０１０７】
３．デキストラマー（Dextramer）染色及びフローサイトメトリー分析
２．で作製した形質転換ＰＢＭＣを、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ デキストラマー−ＲＰＥ (ＧＰＣ３１４４−１５２ (FVGEFFTDV), ＨＩＶ１９−２７(TLNAWVKVV); イムデックス社)又はＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ デキストラマー−ＲＰＥ (ＧＰＣ３２９８−３０６ (EYILSLEEL), ＨＩＶ５８３−５９１ (RYLKDQQLL); イムデックス社)で室温、３０分間染色し、次いで抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ(プロイミューン社)と共に４℃で２０分間染色した。フローサイトメトリーは、既報（Ueda N and Zhang R, et al., Cellular & Molecular Immunol. 13: 1-12, 2016）に記載の通り、FACSAccuri フローサイトメーター(BDバイオサイエンス社)を用いて行った。ＴＣＲ１−１’に関する検討結果を図３Ａに、ＴＣＲ２−１'に関する検討結果を図３Ｂに示す。
本結果においてＣＤ８ポジティブの細胞集団のなかにデキストラマー陽性の細胞集団が認められたことから、それぞれのＴＣＲを導入したＰＢＭＣにおいて機能型ＴＣＲが効率的に細胞表面に発現したことが判明した。【０１０８】
実施例３
本発明のＴＣＲをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターの作成、上記TCRを発現するｉＰＳ細胞由来T細胞の作成
１．本発明のＴＣＲをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターの作成
１）ＴＣＲ１−１’を組み込んだレンチウィルスベクターの作製
理化学研究所、三好浩之博士より提供されたＣＳ−ＵｂＣ−ＲｆＡ−ＩＲＥＳ２−ｈＫＯ１ベクターを用い、ＴＣＲ１−１’を組み込んだＧａｔｅｗａｙ  Ｅｎｔｒｙ  ベクターとＬＲ  クロナーゼ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）反応を行う事でＴＣＲ１−２’を導入したＣＳ−ＵｂＣ−ＲｆＡ−ＩＲＥＳ２−ｈＫＯ１／ＴＣＲ１−１’プラスミドを作製した。
２）ＴＣＲ１−１’を組み込んだレンチウィルス上清の作製
ＣＳ−ＵｂＣ−ＲｆＡ−ＩＲＥＳ２−ｈＫＯ１／ＴＣＲ１−１’をパッケージング細胞ＬｅｎｔｉＸ−２９３Ｔに導入し、レンチウィルスを含む培養上清を回収。超遠心を行い、ウィルスの濃縮を行った。
３）ＴＣＲ１−１’  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ−ｉＰＳ細胞の樹立
ｉＭａｔｒｉｘ（ニッピ）上で培養したｉＰＳ細胞（Ff-l01s04株）に、ＣＳ−ＵｂＣ−ＲｆＡ−ＩＲＥＳ２−ｈＫＯ１／ＴＣＲ１−１’ウィルス液を感染させた。
４）ＴＣＲ１−２’／ｉＰＳ細胞のT細胞分化
感染４日後に、感染ｉＰＳ細胞をＤｉｓｈより剥がし、染色せずにｈＫＯ１発現細胞をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ IIIを使用し、ｓｏｒｔｉｎｇ行った（本明細書中、sorting後の細胞をＴＣＲ１−１’遺伝子導入Ff-l01s04細胞と称することがある）。ｈＫＯ１陽性にてｓｏｒｔした細胞について、国際公開第２０１７／２２１９７５号に記載の方法に準じてＴ細胞方向への分化を行い、分化後の細胞における各種マーカーの発現をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ IIIを用いて検討した。
上記検討の結果を図４に示す。図４下段に示すように、ＴＣＲ１−１’遺伝子導入Ff-l01s04細胞を上記分化操作に供することにより、ＴＣＲ１−１’α鎖とＴＣＲ１−１’ β鎖の複合体が細胞膜表面に発現したT細胞を誘導可能であることが明らかとなった。【０１０９】
試験例４
本発明のＴＣＲを発現するｉＰＳ細胞由来T細胞の細胞傷害性試験
ＴＣＲ１−１’を発現するiPS細胞由来T細胞の細胞傷害性をクロムリリースアッセイにより測定した。具体的には、GPC3抗原ペプチドを添加した、もしくは添加していない、ＨＬＡ-*24:02陽性またはＨＬＡ-Ａ*24:02陰性のリンパ芽球細胞系（LCL）にＮａ２５１ＣｒＯ４水溶液（３．７ＭＢｑ）を添加、３７℃で１時間標識し、これを標的細胞とした。標的細胞に、エフェクター細胞を図５に示す比率で添加し、３７℃で４時間反応させた。反応後の上清に遊離された５１Ｃｒ量から、以下の式に基づいて、細胞傷害活性（％ｌｙｓｉｓ）を算出した。【０１１０】
【数２】
2018143454.tif 000003
【０１１１】
なお、上式において、最小放出値とはエフェクター細胞を加えないウェルにおける51Ｃｒ遊離量であり、標的細胞からの51Ｃｒの自然遊離量を示す。また、最大放出値とは１％ Triton Ｘ-１００を加えて標的細胞を破壊したときの51Ｃｒ遊離量を示す。
本試験の結果を図５に示す。図５より、ＴＣＲ１−１’を発現するiPS細胞由来T細胞はGPC３ペプチドを添加したＨＬＡ-Ａ２４陽性LCLに対してのみ細胞傷害活性を有することが示された。【０１１２】
試験例５
本発明のＴＣＲを発現するｉＰＳ細胞由来T細胞の細胞傷害性試験（２）
ＴＣＲ１−１’を発現するiPS細胞由来T細胞の細胞傷害性をＣｙｔｅＣｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍにより測定した。具体的には、標的細胞（JHH７株、HepG2株、またはSK-Hep-1株（いずれも、ヒト肝臓癌細胞株））にＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（Dojindo）溶液を添加、３７℃で３０分間標識した。その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）溶液を添加、３７℃で２０分間標識した。標的細胞に、エフェクター細胞を図５に示す比率で添加し、３７℃で４時間反応させた。緑色蛍光陽性および青色蛍光陽性の細胞を生存細胞（viable target cell count (VTCC)）として計測し、上記T細胞の細胞傷害活性（％ｌｙｓｉｓ）を以下の式にしたがって算出した。【０１１３】
【数３】
2018143454.tif 000004
【０１１４】
なお、上式において、最大放出VTCCとは１％ Triton Ｘ-１００を加えて標的細胞を破壊したときのVTCCを示す。
本試験の結果を図６に示す。図６より、ＴＣＲ１−１’を発現するiPS細胞由来T細胞は、ＨＬＡ-Ａ２４陽性かつＧＰＣ３陽性の肝臓癌細胞（JHH７株およびHepG2株）に対して細胞傷害性を有することが示された。【０１１５】
本出願は、日本国で出願された特願２０１７−０１９８８３（出願日：２０１７年２月６日）を基礎としており、ここで言及することにより、その内容は本明細書に全て包含される。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明により、ＧＰＣ３ペプチド（ＨＬＡ-Ａ２４-拘束性ＧＰＣ３２９８−３０６ペプチド及びＨＬＡ-Ａ０２-拘束性ＧＰＣ３１４４−１５２ペプチド）又は該ペプチドとＨＬＡ-Ａ分子（ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ０２）との複合体に対する結合能を有するＴ細胞受容体及びそれらをコードする核酸が提供される。前記Ｔ細胞受容体をコードする核酸は、ＨＬＡ−Ａ分子とＧＰＣ３ペプチドを提示する細胞に対する細胞傷害活性をＴ細胞に付与し得ることから、ＧＰＣ３を発現する疾患の予防又は治療に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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