(57)【要約】  本発明は、ヒト潰瘍性大腸炎患者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の特定のメチル化可変領域中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の可能性を判定する判定工程を有し、前記基準値が、各メチル化可変領域のメチル化率に対してそれぞれ設定された、発癌潰瘍性大腸炎患者と非癌潰瘍性大腸炎患者を識別するための値であり、前記多変量判別式が、特定のメチル化可変領域のうちの１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定する方法等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定する方法であって、
ヒト潰瘍性大腸炎患者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、表１〜４に記載のメチル化可変領域番号１〜１１２で表される各メチル化可変領域中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の可能性を判定する判定工程
を有し、
前記メチル化可変領域の平均メチル化率が、当該メチル化可変領域中のＣｐＧサイトのうち、前記測定工程においてメチル化率が測定された全てのＣｐＧサイトのメチル化率の平均値であり、
前記基準値が、各メチル化可変領域の平均メチル化率に対してそれぞれ設定された、発癌潰瘍性大腸炎患者と非癌潰瘍性大腸炎患者を識別するための値であり、
前記多変量判別式が、前記メチル化可変領域番号１〜１１２で表されるメチル化可変領域のうちの１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、
大腸癌発症可能性の判定方法。
【表１】
2018008740.tif 000024
【表２】
2018008740.tif 000025
【表３】
2018008740.tif 000026
【表４】
2018008740.tif 000027
【請求項２】
前記判定工程において、メチル化可変領域番号１、３〜２０、２３〜２８、３１〜４６、４９〜６０、６２、６５〜６９、７１、７３、７４、７９、８１、８２、８４、８６、８７、９０〜９２、９５、１０１、１０３、１０９、１１０、及び１１２で表されるメチル化可変領域のうち１か所以上が、平均メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、メチル化可変領域番号２、２１、２２、２９、３０、４７、４８、６１，６３、６４、７０、７２、７５〜７８、８０、８３、８５、８８、８９、９３、９４、９６〜１００、１０２、１０４〜１０８、及び１１１で表されるメチル化可変領域のうち１か所以上が、平均メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項１に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項３】
前記測定工程において、前記多変量判別式がその平均メチル化率を変数として含むメチル化可変領域中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項１に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項４】
前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１〜１１２で表されるメチル化可変領域から選択される２か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、請求項３に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項５】
前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１〜１１２で表されるメチル化可変領域から選択される３か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、請求項３に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項６】
前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１〜５８で表されるメチル化可変領域からなる群より選択される１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、請求項３に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項７】
前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１〜１１で表されるメチル化可変領域からなる群より選択される１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、請求項３に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項８】
ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定する方法であって、
ヒト潰瘍性大腸炎患者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、配列番号１〜８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたメチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の可能性を判定する判定工程
を有し、
前記基準値が、各ＣｐＧサイトのメチル化率に対してそれぞれ設定された、発癌潰瘍性大腸炎患者と非癌潰瘍性大腸炎患者を識別するための値であり、
前記多変量判別式が、前記配列番号１〜８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む、
大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項９】
前記測定工程において、２〜１０個のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する、請求項８に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１０】
前記判定工程において、配列番号１、２、１１、１２、１４〜１８、２１〜２４、２６、２７、２９、３１、４５、６４、６５、６７、７７、７９、及び８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号３〜１０、１３、１９、２０、２５、２８、３０、３２〜４４、４６〜６３、６６、６８〜７６、及び７８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８又は９に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１１】
前記測定工程において、配列番号１〜３２で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号１、２、１１、１２、１４〜１８、２１〜２４、２６、２７、２９、及び３１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号３〜１０、１３、１９、２０、２５、２８、３０、及び３２で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１２】
前記判定工程において、配列番号１、２、１１、１２、１４〜１８、２１〜２４、２６、２７、２９、及び３１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号３〜１０、１３、１９、２０、２５、２８、３０、及び３２で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が３以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１３】
前記測定工程において、配列番号１〜１６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号１、２、１１、１２、１４〜１６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号３〜１０、１３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１４】
前記判定工程において、配列番号１、２、１１、１２、１４〜１６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号３〜１０、１３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が３以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１０及び１３のいずれか一項に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１５】
前記測定工程において、配列番号１〜９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号１及び２で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号３〜９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１６】
前記判定工程において、配列番号１及び２で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号３〜９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が３以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１０及び１５のいずれか一項に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１７】
前記測定工程において、配列番号３３〜６６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号４５、６４、及び６５で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号３２〜４４、４６〜６３、及び６６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１８】
前記判定工程において、配列番号４５、６４、及び６５で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号３２〜４４、４６〜６３、及び６６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１０及び１７のいずれか一項に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項１９】
前記測定工程において、配列番号３３、３５、３６、４３、６７〜８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号６７、７７、７９、及び８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号３３、３５、３６、４３、６８〜７６、及び７８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２０】
前記判定工程において、配列番号６７、７７、７９、及び８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号３３、３５、３６、４３、６８〜７６、及び７８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８〜１０及び１９のいずれか一項に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２１】
前記和が５以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項１２、１４、１６、１８、又は２０に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２２】
前記多変量判別式が、配列番号３３〜６６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含み、
前記測定工程において、前記多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８又は９に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２３】
前記多変量判別式が、配列番号３３、３５、３６、４３、６７〜８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含み、
前記測定工程において、前記多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８又は９に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２４】
前記多変量判別式が、ロジスティック回帰式、線形判別式、ナイーブベイズ分類器で作成された式、又はサポートベクターマシンで作成された式である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２５】
前記生体試料が、腸管組織である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２６】
前記生体試料が、直腸粘膜組織である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２７】
前記直腸粘膜組織が、
採取具と、採取補助具とを備え、
前記採取具は、
一方の端部に大腸粘膜を挟持する第１の挟持面が形成されている板状の第１の挟持片と、
一方の端部に大腸粘膜を挟持する第２の挟持面が形成されている板状の第２の挟持片と、
前記第１の挟持片と前記第２の挟持片を、互いに対向した状態で、前記第１の挟持面及び前記第２の挟持面が形成されていない端部において連結する連結部と、
を有し、
前記第１の挟持面及び前記第２の挟持面の少なくとも一方がカップ形状であり、
前記採取補助具は、
側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
棒状の把持部と、
を有し、
前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい方の辺縁部近傍に連結しており、
前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい方の辺縁部から外径が大きい方の辺縁部に向かって設けられており、
前記スリットの幅が、前記第１の挟持片の一方の端部と前記第２の挟持片の一方の端部の幅よりも広く、
前記採取具導入部の大きい方の外径が３０〜７０ｍｍであり、回転軸方向の長さが５０〜１５０ｍｍである、大腸粘膜採取用キットによって採取されたものである、請求項２６に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２８】
前記採取具が、
前記第１の挟持片の中心部よりも前記第１の挟持面が形成されている端部側に、第１の屈曲部を有し、
前記第２の挟持片の中心部よりも前記第２の挟持面が形成されている端部側に、第２の屈曲部を有する、請求項２７に記載の大腸癌発症可能性の判定方法。
【請求項２９】
採取具と、採取補助具とを備える大腸粘膜採取用キットであり、
前記採取具は、
一方の端部に大腸粘膜を挟持する第１の挟持面が形成されている板状の第１の挟持片と、
一方の端部に大腸粘膜を挟持する第２の挟持面が形成されている板状の第２の挟持片と、
前記第１の挟持片と前記第２の挟持片を、互いに対向した状態で、前記第１の挟持面及び前記第２の挟持面が形成されていない端部において連結する連結部と、
を有し、
前記第１の挟持面及び前記第２の挟持面の少なくとも一方がカップ形状であり、
前記採取補助具は、
側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
棒状の把持部と、
を有し、
前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい方の辺縁部近傍に連結しており、
前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい方の辺縁部から外径が大きい方の辺縁部に向かって設けられており、
前記スリットの幅が、前記第１の挟持片の一方の端部と前記第２の挟持片の一方の端部の幅よりも広く、
前記採取具導入部の大きい方の外径が３０〜７０ｍｍであり、回転軸方向の長さが５０〜１５０ｍｍである、大腸粘膜採取用キット。
【請求項３０】
前記採取具が、
前記第１の挟持片の中心部よりも前記第１の挟持面が形成されている端部側に、第１の屈曲部を有し、
前記第２の挟持片の中心部よりも前記第２の挟持面が形成されている端部側に、第２の屈曲部を有する、請求項２９に記載の大腸粘膜採取用キット。
【請求項３１】
前記第１の挟持面と前記第２の挟持面の両方がカップ形状である、請求項２９又は３０に記載の大腸粘膜採取用キット。
【請求項３２】
前記採取補助具が、回転軸方向に貫通孔を有し、前記採取具導入部の大きい方の外径が３０〜７０ｍｍ、回転軸方向の長さが５０〜１５０ｍｍであり、
前記カップ形状の辺縁部の内径が２〜３ｍｍである、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の大腸粘膜採取用キット。
【請求項３３】
前記第１の挟持面と前記第２の挟持面の辺縁部が鋸歯状である、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の大腸粘膜採取用キット。
【請求項３４】
配列番号１〜８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトを含む部分塩基配列を有するＤＮＡ断片からなり、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定するために用いられる、ＤＮＡメチル化率分析用マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の可能性を判定する方法、及び当該方法に供される直腸粘膜検体を採取するためのキットに関する。
本願は、２０１６年７月８日に出願されたＰＣＴ／ＪＰ２０１６／７０３３０および２０１７年１月１９日に日本に出願された特願２０１７−００７７２５号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
潰瘍性大腸炎は、主に大腸粘膜に潰瘍やびらんができる、原因不明の炎症性腸疾患である。完治は非常に困難であり、緩解・再燃を繰り返す。症状としては、下痢や腹痛、粘血便等の大腸の局所症状や、発熱、嘔吐、頻脈、貧血などの全身症状がある。潰瘍性大腸炎患者では大腸癌を発症しやすい。このため、潰瘍性大腸炎患者では、大腸癌の早期発見及び治療が重要である。【０００３】
一般的に大腸癌の早期発見のための検査は、通常、内視鏡検査により行われる。しかしながら、早期の大腸癌を視認により検出することは、手技者の技量によるところが大きく、一般的に困難である。特に潰瘍性大腸炎患者では、元々腸粘膜の炎症が酷いため、早期大腸癌の検出は非常に難しい。また、内視鏡検査は侵襲性が高く、患者の負担も大きいという問題もある。【０００４】
一方で、特許文献１には、潰瘍性大腸炎患者において、腫瘍性組織におけるｍｉＲ−１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１３７、及びｍｉＲ−３４ｂ／ｃの５種のｍｉＲＮＡ遺伝子のメチル化率は、非腫瘍性潰瘍性大腸炎組織に比べて有意に高いこと、よって、非癌部である結腸粘膜から採取された生体試料中の前記５種のｍｉＲＮＡ遺伝子のメチル化率は、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症のマーカーとし得ることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１５１５５１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の可能性を、内視鏡検査よりも侵襲性が低く、より患者の負担が小さい方法で判定する方法、及び当該方法に供される直腸粘膜検体を採取するためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、潰瘍性大腸炎患者のゲノムＤＮＡ中のＣｐＧサイト（シトシン−ホスホジエステル結合−グアニン）のメチル化率を網羅的に調べたところ、大腸癌を発症した患者と大腸癌を発症していない患者においてメチル化率に顕著な差がある、８０種のＣｐＧサイトを見出し、また、別に１１２のメチル化可変領域（differentially methylated region、「ＤＭＲ」ということがある。）を見出し、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［３４］の大腸癌発症可能性の判定方法、ＤＮＡメチル化率分析用マーカー、及び大腸粘膜採取用キットを提供する。
［１］ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定する方法であって、
ヒト潰瘍性大腸炎患者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、表１〜４に記載のメチル化可変領域番号１〜１１２で表される各メチル化可変領域中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の可能性を判定する判定工程
を有し、
前記メチル化可変領域の平均メチル化率が、当該メチル化可変領域中のＣｐＧサイトのうち、前記測定工程においてメチル化率が測定された全てのＣｐＧサイトのメチル化率の平均値であり、
前記基準値が、各メチル化可変領域の平均メチル化率に対してそれぞれ設定された、発癌潰瘍性大腸炎患者と非癌潰瘍性大腸炎患者を識別するための値であり、
前記多変量判別式が、前記メチル化可変領域番号１〜１１２で表されるメチル化可変領域のうちの１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、
大腸癌発症可能性の判定方法。【０００９】
【表１】
2018008740.tif 000002
【００１０】
【表２】
2018008740.tif 000003
【００１１】
【表３】
2018008740.tif 000004
【００１２】
【表４】
2018008740.tif 000005
【００１３】
［２］  前記判定工程において、メチル化可変領域番号１、３〜２０、２３〜２８、３１〜４６、４９〜６０、６２、６５〜６９、７１、７３、７４、７９、８１、８２、８４、８６、８７、９０〜９２、９５、１０１、１０３、１０９、１１０、及び１１２で表されるメチル化可変領域のうち１か所以上が、平均メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、メチル化可変領域番号２、２１、２２、２９、３０、４７、４８、６１，６３、６４、７０、７２、７５〜７８、８０、８３、８５、８８、８９、９３、９４、９６〜１００、１０２、１０４〜１０８、及び１１１で表されるメチル化可変領域のうち１か所以上が、平均メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［１］の大腸癌発症可能性の判定方法。
［３］  前記測定工程において、前記多変量判別式がその平均メチル化率を変数として含むメチル化可変領域中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［１］の大腸癌発症可能性の判定方法。
［４］  前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１〜１１２で表されるメチル化可変領域から選択される２か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記［３］の大腸癌発症可能性の判定方法。
［５］  前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１〜１１２で表されるメチル化可変領域から選択される３か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記［３］の大腸癌発症可能性の判定方法。
［６］  前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１〜５８で表されるメチル化可変領域からなる群より選択される１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記［３］の大腸癌発症可能性の判定方法。
［７］  前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１〜１１で表されるメチル化可変領域からなる群より選択される１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記［３］の大腸癌発症可能性の判定方法。【００１４】
［８］  ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定する方法であって、
ヒト潰瘍性大腸炎患者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、配列番号１〜８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
前記測定工程において測定されたメチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の可能性を判定する判定工程
を有し、
前記基準値が、各ＣｐＧサイトのメチル化率に対してそれぞれ設定された、発癌潰瘍性大腸炎患者と非癌潰瘍性大腸炎患者を識別するための値であり、
前記多変量判別式が、前記配列番号１〜８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む、
大腸癌発症可能性の判定方法。
［９］前記測定工程において、２〜１０個のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する、前記［８］の大腸癌発症可能性の判定方法。
［１０］  前記判定工程において、配列番号１、２、１１、１２、１４〜１８、２１〜２４、２６、２７、２９、３１、４５、６４、６５、６７、７７、７９、及び８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号３〜１０、１３、１９、２０、２５、２８、３０、３２〜４４、４６〜６３、６６、６８〜７６、及び７８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］又は［９］の大腸癌発症可能性の判定方法。
［１１］  前記測定工程において、配列番号１〜３２で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号１、２、１１、１２、１４〜１８、２１〜２４、２６、２７、２９、及び３１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号３〜１０、１３、１９、２０、２５、２８、３０、及び３２で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１０］のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
［１２］  前記判定工程において、配列番号１、２、１１、１２、１４〜１８、２１〜２４、２６、２７、２９、及び３１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号３〜１０、１３、１９、２０、２５、２８、３０、及び３２で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が３以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１１］のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
［１３］  前記測定工程において、配列番号１〜１６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号１、２、１１、１２、１４〜１６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号３〜１０、１３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１０］のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
［１４］  前記判定工程において、配列番号１、２、１１、１２、１４〜１６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号３〜１０、１３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が３以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１０］及び［１３］のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
［１５］  前記測定工程において、配列番号１〜９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号１及び２で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号３〜９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１０］のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
［１６］  前記判定工程において、配列番号１及び２で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号３〜９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が３以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１０］及び［１５］のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
［１７］  前記測定工程において、配列番号３３〜６６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号４５、６４、及び６５で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号３３〜４４、４６〜６３、及び６６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１０］のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
［１８］  前記判定工程において、配列番号４５、６４、及び６５で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号３３〜４４、４６〜６３、及び６６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１０］及び［１７］のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
［１９］  前記測定工程において、配列番号３３、３５、３６、４３、６７〜８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、配列番号６７、７７、７９、及び８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号３３、３５、３６、４３、６８〜７６、及び７８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１０］のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
［２０］  前記判定工程において、配列番号６７、７７、７９、及び８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号３３、３５、３６、４３、６８〜７６、及び７８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］〜［１０］及び［１９］のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
［２１］  前記和が５以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［１２］、［１４］、［１６］、［１８］、又は［２０］の大腸癌発症可能性の判定方法。
［２２］  前記多変量判別式が、配列番号３３〜６６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含み、  前記測定工程において、前記多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］又は［９］の大腸癌発症可能性の判定方法。
［２３］  前記多変量判別式が、配列番号３３、３５、３６、４３、６７〜８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含み、
前記測定工程において、前記多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］又は［９］の大腸癌発症可能性の判定方法。
［２４］  前記多変量判別式が、ロジスティック回帰式、線形判別式、ナイーブベイズ分類器で作成された式、又はサポートベクターマシンで作成された式である、前記［１］〜［２３］のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
［２５］  前記生体試料が、腸管組織である、前記［１］〜［２４］のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。
［２６］  前記生体試料が、直腸粘膜組織である、前記［１］〜［２５］のいずれかの大腸癌発症可能性の判定方法。【００１５】
［２７］  前記直腸粘膜組織が、
採取具と、採取補助具とを備え、
前記採取具は、
一方の端部に大腸粘膜を挟持する第１の挟持面が形成されている板状の第１の挟持片と、
一方の端部に大腸粘膜を挟持する第２の挟持面が形成されている板状の第２の挟持片と、
前記第１の挟持片と前記第２の挟持片を、互いに対向した状態で、前記第１の挟持面及び前記第２の挟持面が形成されていない端部において連結する連結部と、
を有し、
前記第１の挟持面及び前記第２の挟持面の少なくとも一方がカップ形状であり、
前記採取補助具は、
側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
棒状の把持部と、
を有し、
前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい方の辺縁部近傍に連結しており、
前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい方の辺縁部から外径が大きい方の辺縁部に向かって設けられており、
前記スリットの幅が、前記第１の挟持片の一方の端部と前記第２の挟持片の一方の端部の幅よりも広く、
前記採取具導入部の大きい方の外径が３０〜７０ｍｍであり、回転軸方向の長さが５０〜１５０ｍｍである、大腸粘膜採取用キットによって採取されたものである、前記［２６］の大腸癌発症可能性の判定方法。
［２８］  前記採取具が、
前記第１の挟持片の中心部よりも前記第１の挟持面が形成されている端部側に、第１の屈曲部を有し、
前記第２の挟持片の中心部よりも前記第２の挟持面が形成されている端部側に、第２の屈曲部を有する、前記［２７］の大腸癌発症可能性の判定方法。
［２９］  採取具と、採取補助具とを備える大腸粘膜採取用キットであり、
前記採取具は、
一方の端部に大腸粘膜を挟持する第１の挟持面が形成されている板状の第１の挟持片と、
一方の端部に大腸粘膜を挟持する第２の挟持面が形成されている板状の第２の挟持片と、
前記第１の挟持片と前記第２の挟持片を、互いに対向した状態で、前記第１の挟持面及び前記第２の挟持面が形成されていない端部において連結する連結部と、
を有し、
前記第１の挟持面及び前記第２の挟持面の少なくとも一方がカップ形状であり、
前記採取補助具は、
側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
棒状の把持部と、
を有し、
前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい方の辺縁部近傍に連結しており、
前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい方の辺縁部から外径が大きい方の辺縁部に向かって設けられており、
前記スリットの幅が、前記第１の挟持片の一方の端部と前記第２の挟持片の一方の端部の幅よりも広く、
前記採取具導入部の大きい方の外径が３０〜７０ｍｍであり、回転軸方向の長さが５０〜１５０ｍｍである、大腸粘膜採取用キット。
［３０］  前記採取具が、
前記第１の挟持片の中心部よりも前記第１の挟持面が形成されている端部側に、第１の屈曲部を有し、
前記第２の挟持片の中心部よりも前記第２の挟持面が形成されている端部側に、第２の屈曲部を有する、前記［２９］の大腸粘膜採取用キット。
［３１］  前記第１の挟持面と前記第２の挟持面の両方がカップ形状である、前記［２９］又は［３０］の大腸粘膜採取用キット。
［３２］  前記採取補助具が、回転軸方向に貫通孔を有し、前記採取具導入部の大きい方の外径が３０〜７０ｍｍ、回転軸方向の長さが５０〜１５０ｍｍであり、
前記カップ形状の辺縁部の内径が２〜３ｍｍである、前記［２９］〜［３１］のいずれかの大腸粘膜採取用キット。
［３３］  前記第１の挟持面と前記第２の挟持面の辺縁部が鋸歯状である、前記［２９］〜［３２］のいずれかの大腸粘膜採取用キット。
［３４］  配列番号１〜８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトを含む部分塩基配列を有するＤＮＡ断片からなり、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定するために用いられる、ＤＮＡメチル化率分析用マーカー。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る大腸癌発症可能性の判定方法により、潰瘍性大腸炎患者から採取された生体試料について、ゲノムＤＮＡ中の特定のＣｐＧサイトのメチル化率又は特定のＤＭＲの平均メチル化率を調べることによって、大腸癌発症の可能性を判定することができる。  また、本発明に係る直腸粘膜採取用キットにより、患者の肛門から比較的安全かつ簡便に直腸粘膜を採取することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、採取具の一実施態様である採取具２Ａ及びその変形例である採取具２Ｂの説明図である。
【図２】図２は、採取具２Ａの変形例である採取具２Ｃの説明図である。
【図３】図３は、採取補助具１１の一実施態様である採取補助具１１Ａの説明図である。
【図４】図４は、採取補助具１１Ａの変形例である採取補助具１１Ｂの説明図である。
【図５】図５は直腸粘膜採取用キットの使用態様の説明図である。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例１において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された３２ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づくクラスター解析の結果である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例１において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された３２ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づく主成分分析の結果である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、実施例１において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された１６ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づくクラスター解析の結果である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、実施例１において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された１６ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づく主成分分析の結果である。
【図６Ｅ】図６Ｅは、実施例１において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された９ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づくクラスター解析の結果である。
【図６Ｆ】図６Ｆは、実施例１において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された９ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づく主成分分析の結果である。
【図７Ａ】図７Ａは、実施例１において、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１３７、及びｍｉＲ−３４ｂ／ｃの５種のｍｉＲＮＡ遺伝子にあるＣｐＧサイトのうち、DiffScoreの絶対値が３０超であった２７個のＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づくクラスター解析の結果である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実施例１において、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１３７、及びｍｉＲ−３４ｂ／ｃの５種のｍｉＲＮＡ遺伝子にあるＣｐＧサイトのうち、DiffScoreの絶対値が３０超であった２７個のＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づく主成分分析の結果である。
【図８Ａ】図８Ａは、実施例２において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された３４ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づくクラスター解析の結果である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、実施例２において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された３４ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づく主成分分析の結果である。
【図９】図９は、実施例２において、配列番号３４で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ１０９３１１９０）、配列番号３７で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ１３６７７１４９）、及び配列番号５６で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ１４５１６１００）の３個のＣｐＧサイトのメチル化率をマーカーとした場合の、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の有無の検査のＲＯＣ曲線である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、実施例３において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された１８ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づくクラスター解析の結果である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、実施例３において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された１８ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づく主成分分析の結果である。
【図１１】図１１は、実施例４において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜されたＤＭＲ１１２か所（１１２ＤＭＲセット）のメチル化率に基づくクラスター解析の結果である。
【図１２】図１２は、実施例４において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された１１２ＤＭＲセットのメチル化率に基づく主成分分析の結果である。
【図１３】図１３は、実施例４において、ＤＭＲ番号２で表されるＤＭＲ、ＤＭＲ番号１０で表されるＤＭＲ、及びＤＭＲ番号５５で表されるＤＭＲの３個のＤＭＲの平均メチル化率をマーカーとした場合の、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の有無の検査のＲＯＣ曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
＜大腸癌発症可能性の判定方法＞
ゲノムＤＮＡ中のＣｐＧサイトのシトシン塩基は、５位の炭素がメチル化修飾を受け得る。本発明及び本願明細書において、ＣｐＧサイトのメチル化率とは、一の生物個体から採取された生体試料中のＣｐＧサイトのうち、メチル化されているシトシン塩基（メチル化シトシン）量とメチル化されていないシトシン塩基（非メチル化シトシン）量とを測定し、両者の和に対するメチル化シトシン量の割合（％）を意味する。また、本発明及び本願明細書において、ＤＭＲの平均メチル化率とは、ＤＭＲに存在する複数のＣｐＧサイトのメチル化率の相加平均値（算術平均値）又は相乗平均値（幾何平均値）を意味するが、これ以外の平均値でもよい。
【００１９】
本発明に係る大腸癌発症可能性の判定方法（以下、「本発明に係る判定方法」ということがある。）は、ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定する方法であって、ゲノムＤＮＡ中のＣｐＧサイト又はＤＭＲのうち、メチル化率が、大腸癌を発症していない潰瘍性大腸炎患者（非癌潰瘍性大腸炎患者）群と大腸癌を発症した潰瘍性大腸炎患者（発癌潰瘍性大腸炎患者）群とで差があるものをマーカーとすることを特徴とする。これらのマーカーとなるＣｐＧサイトのメチル化率又はＤＭＲの平均メチル化率を指標として、ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性の高低を判定する。特定のＣｐＧサイトのメチル化率又は特定のＤＭＲの平均メチル化率を潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定するために用いられるマーカーとすることにより、視認判別が非常に困難である潰瘍性大腸炎患者における早期大腸癌をより客観的かつ感度よく検出することができ、早期発見が期待できる。
【００２０】
マーカーとするＣｐＧサイトのメチル化率に基づくヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性の判定は、測定されたＣｐＧサイトのメチル化率の値自体に基づいて行ってもよく、マーカーとするＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む多変量判別式を用い、この多変量判別式から求められる判別値に基づいて行ってもよい。
【００２１】
マーカーとするＤＭＲの平均メチル化率に基づくヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性の判定は、ＤＭＲ中の２以上のＣｐＧサイトのメチル化率から算出されたＤＭＲの平均メチル化率の値自体に基づいて行ってもよく、マーカーとするＤＭＲの平均メチル化率を変数として含む多変量判別式を用い、この多変量判別式から求められる判別値に基づいて行ってもよい。
【００２２】
本発明においてマーカーとされるＣｐＧサイト及びＤＭＲとしては、メチル化率が非癌潰瘍性大腸炎患者群と発癌潰瘍性大腸炎患者群とで大きく相違するものが好ましい。両群の差が大きいほど、大腸癌の発症の有無をより確実に検出することができる。本発明においてマーカーとされるＣｐＧサイト及びＤＭＲは、発癌潰瘍性大腸炎患者のメチル化率が非癌潰瘍性大腸炎患者よりも有意に高い、すなわち、大腸癌の発症によりメチル化率が高くなるものであってもよく、発癌潰瘍性大腸炎患者のメチル化率が非癌潰瘍性大腸炎患者よりも有意に低い、すなわち、大腸癌の発症によりメチル化率が低くなるものであってもよい。
【００２３】
本発明においてマーカーとされるＣｐＧサイト及びＤＭＲとしては、同一の発癌潰瘍性大腸炎患者において、大腸の非癌部位と癌部位とのメチル化率の差が小さいものがより好ましい。このようなＣｐＧサイトのメチル化率又はＤＭＲの平均メチル化率を指標とすることにより、発癌潰瘍性大腸炎患者の非癌部位から採取された生体試料が用いられた場合であっても、癌部位から採取された生体試料を用いた場合と同様に、高感度に大腸癌の発症の有無を判定することができる。例えば、大腸深部の粘膜は内視鏡等を用いて採取する必要があり、患者の負担が大きいが、肛門付近の直腸粘膜は比較的容易に採取できる。大腸の非癌部位と癌部位とのメチル化率の差が小さいＣｐＧサイト又はＤＭＲをマーカーとすることにより、癌部位が形成される位置にかかわらず、肛門付近の直腸粘膜を生体試料として大腸癌を発症した患者を漏れなく検出することができる。
【００２４】
本発明に係る判定方法のうち、測定されたＣｐＧサイトのメチル化率の値自体に基づいて判定を行う方法は、具体的には、ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定する方法であって、ヒト潰瘍性大腸炎患者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、本発明においてマーカーとする特定の複数のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、前記測定工程において測定されたメチル化率と、各ＣｐＧサイトに対して予めそれぞれ設定された基準値に基づいて、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の可能性を判定する判定工程を有する。
【００２５】
本発明においてマーカーとされるＣｐＧサイトは、具体的には、配列番号１〜８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトである。各塩基配列を表５〜１２に示す。表の塩基配列中、括弧内のＣＧは、実施例１〜３で示す網羅的ＤＮＡメチル化解析で検出されるＣｐＧサイトである。これらのＣｐＧサイトを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片は、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定するためのＤＮＡメチル化率分析用マーカーとして用いることができる。
【００２６】
【表５】
2018008740.tif 000006
【００２７】
【表６】
2018008740.tif 000007
【００２８】
【表７】
2018008740.tif 000008
【００２９】
配列番号１〜３２で表される塩基配列中の括弧内の３２個のＣｐＧサイト（以下、まとめて「３２ＣｐＧセット」ということがある。）は、後記実施例１における網羅的ＤＮＡメチル化解析において、メチル化率が非癌潰瘍性大腸炎患者群と発癌潰瘍性大腸炎患者群とで大きく相違するものである。このうち、発癌潰瘍性大腸炎患者のメチル化率が非癌潰瘍性大腸炎患者よりもかなり低いものが、配列番号１、２、１１、１２、１４〜１８、２１〜２４、２６、２７、２９、及び３１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトであり（表中、「−」）、発癌潰瘍性大腸炎患者のメチル化率が非癌潰瘍性大腸炎患者よりもかなり高いものが、配列番号３〜１０、１３、１９、２０、２５、２８、３０、及び３２で表される塩基配列中のＣｐＧサイトである（表中、「＋」）。マーカーとされるＣｐＧサイトは、これら３２個のＣｐＧサイトに限定されるものではなく、配列番号１〜３２で表される塩基配列中の他のＣｐＧサイトも含まれる。
【００３０】
【表８】
2018008740.tif 000009
【００３１】
【表９】
2018008740.tif 000010
【００３２】
【表１０】
2018008740.tif 000011
【００３３】
配列番号３３〜６６で表される塩基配列中の括弧内の３４個のＣｐＧサイト（以下、まとめて「３４ＣｐＧセット」ということがある。）は、後記実施例２における網羅的ＤＮＡメチル化解析において、メチル化率が非癌潰瘍性大腸炎患者群と発癌潰瘍性大腸炎患者群とで大きく相違するものである。このうち、発癌潰瘍性大腸炎患者のメチル化率が非癌潰瘍性大腸炎患者よりもかなり低いものが、配列番号４５、６４、及び６５で表される塩基配列中のＣｐＧサイトであり（表中、「−」）、発癌潰瘍性大腸炎患者のメチル化率が非癌潰瘍性大腸炎患者よりもかなり高いものが、配列番号３３〜４４、４６〜６３、及び６６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトである（表中、「＋」）。マーカーとされるＣｐＧサイトは、これら３４個のＣｐＧサイトに限定されるものではなく、配列番号３３〜６６で表される塩基配列中の他のＣｐＧサイトも含まれる。
【００３４】
【表１１】
2018008740.tif 000012
【００３５】
【表１２】
2018008740.tif 000013
【００３６】
配列番号３３、３５、３６、４３、６７〜８０で表される塩基配列中の括弧内の１８個のＣｐＧサイト（以下、まとめて「１８ＣｐＧセット」ということがある。）は、後記実施例３における網羅的ＤＮＡメチル化解析において、メチル化率が非癌潰瘍性大腸炎患者群と発癌潰瘍性大腸炎患者群とで大きく相違するものである。このうち、発癌潰瘍性大腸炎患者のメチル化率が非癌潰瘍性大腸炎患者よりもかなり低いものが、配列番号６７、７７、７９、及び８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトであり（表中、「−」）、発癌潰瘍性大腸炎患者のメチル化率が非癌潰瘍性大腸炎患者よりもかなり高いものが、配列番号３３、３５、３６、４３、６８〜７６、及び７８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトである（表中、「＋」）。マーカーとされるＣｐＧサイトは、これら１８個のＣｐＧサイトに限定されるものではなく、配列番号３３、３５、３６、４３、６７〜８０で表される塩基配列中の他のＣｐＧサイトも含まれる。
【００３７】
各ＣｐＧサイトについては、予め、発癌潰瘍性大腸炎患者と非癌潰瘍性大腸炎患者を識別するための基準値を設定しておく。３２ＣｐＧセットのうち表５〜７で「＋」と記されているＣｐＧサイトと３４ＣｐＧセット及び１８ＣｐＧセットのうち表８〜１２で「＋」と記されているＣｐＧサイトとの場合には、測定されたメチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高い、と判定する。３２ＣｐＧセットのうち表５〜７で「−」と記されているＣｐＧサイトと３４ＣｐＧセット及び１８ＣｐＧセットのうち表８〜１２で「−」と記されているＣｐＧサイトとの場合には、測定されたメチル化率が予め設定された基準値以下である場合に、ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高い、と判定する。
【００３８】
各ＣｐＧサイトの基準値は、発癌潰瘍性大腸炎患者群と非癌潰瘍性大腸炎患者群の当該ＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、両群を区別することができる閾値として実験的に求めることができる。具体的には、任意のＣｐＧサイトのメチル化の基準値は、一般的な統計学的手法によって求められる。下記にその例を示すが、本発明における基準値の決め方はこれらに限定されるものではない。
【００３９】
基準値の求め方の一例としては、例えば、まず、任意のＣｐＧサイトについて、潰瘍性大腸炎患者のうち内視鏡検査での生検組織による病理検査により大腸癌と診断されなかった患者（非癌潰瘍性大腸炎患者）の直腸粘膜のＤＮＡメチル化を測定する。複数の患者について測定した後に、その平均値又は中央値などによりこれらの患者群のメチル化を代表する数値を算出し、これを基準値とすることができる。
【００４０】
その他、複数の非癌潰瘍性大腸炎患者と複数の発癌潰瘍性大腸炎患者に対して、それぞれ直腸粘膜のＤＮＡメチル化を測定し、平均値又は中央値などにより発癌潰瘍性大腸炎患者群と非癌潰瘍性大腸炎患者群のメチル化を代表する数値とばらつきをそれぞれ算出した後、ばらつきも考慮して両数値が区別されるような閾値を求め、これを基準値とすることができる。
【００４１】
本発明においてマーカーとされるＣｐＧサイトとしては、配列番号１〜１６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのみを用いてもよい。これらの１６個のＣｐＧサイト（以下、まとめて「１６ＣｐＧセット」ということがある。）は、３２ＣｐＧセットのうち、発癌潰瘍性大腸炎患者の大腸の非癌部位と癌部位とのメチル化率の差が小さいものである。本発明においてマーカーとされるＣｐＧサイトとしては、配列番号１〜９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのみを用いることも好ましい。これらの９個のＣｐＧサイト（以下、まとめて「９ＣｐＧセット」ということがある。）は、１６ＣｐＧセットのうち、発癌潰瘍性大腸炎患者の大腸の非癌部位と癌部位とのメチル化率の差がより小さいものである。
【００４２】
前記判定工程においては、配列番号１、２、１１、１２、１４〜１８、２１〜２４、２６、２７、２９、３１、４５、６４、６５、６７、７７、７９、及び８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号３〜１０、１３、１９、２０、２５、２８、３０、３２〜４４、４６〜６３、６６、６８〜７６、及び７８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。本発明に係る判定方法においては、配列番号１、２、１１、１２、１４〜１８、２１〜２４、２６、２７、２９、３１、４５、６４、６５、６７、７７、７９、及び８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号３〜１０、１３、１９、２０、２５、２８、３０、３２〜４４、４６〜６３、６６、６８〜７６、及び７８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上、好ましくは３以上、より好ましくは５以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定することにより、より精度よく判定を行うことができる。
【００４３】
前記３２ＣｐＧセットを本発明においてマーカーとする場合、すなわち、前記測定工程において前記３２ＣｐＧセットのメチル化率を測定する場合には、前記判定工程においては、配列番号１、２、１１、１２、１４〜１８、２１〜２４、２６、２７、２９、及び３１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号３〜１０、１３、１９、２０、２５、２８、３０、及び３２で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。本発明に係る判定方法においては、配列番号１、２、１１、１２、１４〜１８、２１〜２４、２６、２７、２９、及び３１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号３〜１０、１３、１９、２０、２５、２８、３０、及び３２で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が３以上、好ましくは５以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定することにより、より精度よく判定を行うことができる。
【００４４】
前記３４ＣｐＧセットを本発明においてマーカーとする場合には、前記判定工程においては、配列番号４５、６４、及び６５で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号３３〜４４、４６〜６３、及び６６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。本発明に係る判定方法においては、配列番号４５、６４、及び６５で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号３３〜４４、４６〜６３、及び６６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上、好ましくは３以上、より好ましくは５以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定することにより、より精度よく判定を行うことができる。
【００４５】
前記１８ＣｐＧセットを本発明においてマーカーとする場合には、前記判定工程においては、配列番号６７、７７、７９、及び８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号３３、３５、３６、４３、６８〜７６、及び７８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。本発明に係る判定方法においては、配列番号６７、７７、７９、及び８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号３３、３５、３６、４３、６８〜７６、及び７８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上、好ましくは３以上、より好ましくは５以上である場合に、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高いと判定することにより、より精度よく判定を行うことができる。
【００４６】
本発明においては、配列番号１〜８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトをマーカーとして用いることができる。本発明においてマーカーとするＣｐＧサイトとしては、配列番号１〜８０で表される塩基配列中の括弧内の８０個のＣｐＧサイトの全て（以下、まとめて「８０ＣｐＧセット」ということがある。）であってもよく、前記３２ＣｐＧセットであってもよく、前記１６ＣｐＧセットであってもよく、前記９ＣｐＧセットであってもよく、前記３４ＣｐＧセットであってもよく、前記１８ＣｐＧセットであってもよい。前記３２ＣｐＧセットのＣｐＧサイト、前記１６ＣｐＧセットのＣｐＧサイト、及び前記９ＣｐＧセットのＣｐＧサイトは、いずれも、非癌潰瘍性大腸炎患者群と発癌潰瘍性大腸炎患者群のメチル化率の分散が小さく、非癌潰瘍性大腸炎患者群と発癌潰瘍性大腸炎患者群の識別能が高い点で優れている。一方で、前記３４ＣｐＧセット及び前記１８ＣｐＧセットは、前記３２ＣｐＧセット、前記１６ＣｐＧセットのＣｐＧサイト、及び前記９ＣｐＧセットのＣｐＧサイトに比べて特異度はやや低くなるものの、感度が非常に高く、例えば、発癌潰瘍性大腸炎の一次スクリーニング検査には非常に好適である。
【００４７】
本発明に係る判定方法のうち、特定のＤＭＲの平均メチル化率の値自体に基づいて判定を行う方法は、具体的には、ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定する方法であって、ヒト潰瘍性大腸炎患者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、本発明においてマーカーとする特定のＤＭＲ中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたＤＭＲの平均メチル化率と、各ＤＭＲの平均メチル化率に対して予めそれぞれ設定された基準値に基づいて、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の可能性を判定する判定工程を有する。なお、各ＤＭＲの平均メチル化率は、当該ＤＭＲ中のＣｐＧサイトのうち、前記測定工程においてメチル化率が測定された全てのＣｐＧサイトのメチル化率の平均値として算出する。
【００４８】
本発明においてマーカーとされるＤＭＲは、具体的には、ＤＭＲ番号１〜１１２で表されるＤＭＲからなる群より選択される１か所以上のＤＭＲである。各ＤＭＲの染色体上の位置及び対応する遺伝子を表１３〜１６に示す。表中のＤＭＲの開始点と終点の塩基位置は、ヒトゲノム配列のデータセット「ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９」に基づく。これらのＤＭＲ中に存在するＣｐＧサイトを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片は、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定するためのＤＮＡメチル化率分析用マーカーとして用いることができる。
【００４９】
【表１３】
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【００５０】
【表１４】
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【００５１】
【表１５】
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【００５２】
【表１６】
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【００５３】
ＤＭＲ番号１〜１１２で表されるＤＭＲ（以下、まとめて「１１２ＤＭＲセット」ということがある。）は、各領域中に含まれる複数のＣｐＧサイトのメチル化率が、非癌潰瘍性大腸炎患者群と発癌潰瘍性大腸炎患者群とで大きく相違するものである。このうち、発癌潰瘍性大腸炎患者のＤＭＲの平均メチル化率（ＤＭＲ中に存在している複数のＣｐＧサイトのメチル化率の平均値）が非癌潰瘍性大腸炎患者よりもかなり低いものが、ＤＭＲ番号１、３〜２０、２３〜２８、３１〜４６、４９〜６０、６２、６５〜６９、７１、７３、７４、７９、８１、８２、８４、８６、８７、９０〜９２、９５、１０１、１０３、１０９、１１０、及び１１２で表されるＤＭＲであり（表中、「−」）、発癌潰瘍性大腸炎患者のＤＭＲの平均メチル化率が非癌潰瘍性大腸炎患者よりもかなり高いものが、ＤＭＲ番号２、２１、２２、２９、３０、４７、４８、６１，６３、６４、７０、７２、７５〜７８、８０、８３、８５、８８、８９、９３、９４、９６〜１００、１０２、１０４〜１０８、及び１１１で表されるＤＭＲである（表中、「＋」）。
【００５４】
本発明において、ＤＭＲの平均メチル化率をマーカーとする場合には、ＤＭＲ番号１〜１１２で表されるＤＭＲのうちの１か所をマーカーとしてもよく、ＤＭＲ番号１〜１１２で表されるＤＭＲからなる群より選択される任意の２か所以上をマーカーとしてもよく、ＤＭＲ番号１〜１１２で表されるＤＭＲの全てをマーカーとしてもよい。本発明においては、判定精度をより高められることから、ＤＭＲ番号１〜１１２で表されるＤＭＲからなる群のうちマーカーとして用いるＤＭＲは、２か所以上であることが好ましく、３か所以上であることがより好ましく、４か所以上であることがさらに好ましく、５か所以上であることがよりさらに好ましい。
【００５５】
より高い判定精度が得られることから、本発明においてそのメチル化率がマーカーとして用いられるＤＭＲは、ＤＭＲ番号１〜５８で表されるＤＭＲ（以下、まとめて「５８ＤＭＲセット」ということがある。）からなる群より選択される１か所以上であることが好ましく、５８ＤＭＲセットから選択される２か所以上であることがより好ましく、５８ＤＭＲセットから選択される３か所以上であることがさらに好ましく、５８ＤＭＲセットから選択される４か所以上であることがよりさらに好ましく、５８ＤＭＲセットから選択される５か所以上であることが特に好ましい。なかでも、ＤＭＲ番号１〜１１で表されるＤＭＲ（以下、まとめて「１１ＤＭＲセット」ということがある。）からなる群より選択される１か所以上であることが好ましく、１１ＤＭＲセットから選択される２か所以上であることがより好ましく、１１ＤＭＲセットから選択される３か所以上であることがさらに好ましく、１１ＤＭＲセットから選択される４か所以上であることがよりさらに好ましく、１１ＤＭＲセットから選択される５か所以上であることが特に好ましい。
【００５６】
各ＤＭＲの平均メチル化率は、それぞれのＤＭＲ中に含まれる全てのＣｐＧサイトのメチル化率の平均値としてもよく、それぞれのＤＭＲ中に含まれる全てのＣｐＧサイトから少なくとも１個のＣｐＧサイトを任意に選出し、この選出されたＣｐＧサイトのメチル化率の平均値としてもよい。各ＣｐＧサイトのメチル化率は、配列番号１等で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率の測定と同様にして測定することができる。
【００５７】
各ＤＭＲの平均メチル化率については、予め、発癌潰瘍性大腸炎患者と非癌潰瘍性大腸炎患者を識別するための基準値を設定しておく。前記１１２ＤＭＲセットのうち表１３〜１６で「＋」と記されているＤＭＲの場合には、測定されたＤＭＲの平均メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高い、と判定する。１１２ＤＭＲセットのうち表１３〜１６で「−」と記されているＤＭＲの場合には、測定されたＤＭＲの平均メチル化率が予め設定された基準値以下である場合に、ヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性が高い、と判定する。
【００５８】
各ＤＭＲの平均メチル化率の基準値は、発癌潰瘍性大腸炎患者群と非癌潰瘍性大腸炎患者群の当該ＤＭＲの平均メチル化率を測定し、両群を区別することができる閾値として実験的に求めることができる。具体的には、ＤＭＲの平均メチル化率の基準値は、一般的な統計学的手法によって求められる。
【００５９】
前記８０ＣｐＧセット等のＣｐＧサイトのメチル化率をマーカーとする場合には、本発明に係る判定方法は、前記判定工程を、前記測定工程において測定されたメチル化率と、予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の可能性を判定することができる。当該多変量判別式は、前記配列番号１〜８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む。
【００６０】
前記１１２ＤＭＲセットからなる群より選択される１か所以上のＤＭＲの平均メチル化率をマーカーとする場合には、本発明に係る判定方法は、前記判定工程を、前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたＤＭＲの平均メチル化率と、予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の可能性を判定することができる。当該多変量判別式は、前記１１２ＤＭＲセット中のＣｐＧサイトのうち１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む。
【００６１】
本発明において用いられる多変量判別式は、２群を判別するために用いられる一般的な手法により求めることができる。当該多変量判別式としては、例えば、ロジスティック回帰式、線形判別式、ナイーブベイズ分類器で作成された式、又はサポートベクターマシンで作成された式が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの多変量判別式は、例えば、発癌潰瘍性大腸炎患者群と非癌潰瘍性大腸炎患者群について、前記配列番号１〜８０で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所又は２か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、得られたメチル化率を変数として、常法により作成することができる。また、発癌潰瘍性大腸炎患者群と非癌潰瘍性大腸炎患者群について、前記１１２ＤＭＲセット中のＤＭＲのうち１か所又は２か所以上のＤＭＲの平均メチル化率を測定し、得られたメチル化率を変数として、常法により作成することができる。
【００６２】
本発明において用いられる多変量判別式には、予め、発癌潰瘍性大腸炎患者と非癌潰瘍性大腸炎患者を識別するための基準判別値を設定しておく。基準判別値は、発癌潰瘍性大腸炎患者群と非癌潰瘍性大腸炎患者群について、使用する多変量判別式の値である判別値を求め、発癌潰瘍性大腸炎患者群の判別値と非癌潰瘍性大腸炎患者群の判別値とを比較し、両群を区別することができる閾値として実験的に求めることができる。
【００６３】
多変量判別式を用いて判定を行う場合、具体的には、前記測定工程において、使用する多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むＣｐＧサイトのメチル化率又はＤＭＲの平均メチル化率を測定し、前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、この判別値と予め設定した基準判別値とに基づいて、ＣｐＧサイトのメチル化率又はＤＭＲの平均メチル化率が測定されたヒト潰瘍性大腸炎患者が大腸癌を発症している可能性の高低を判定する。当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、当該ヒト潰瘍性大腸炎患者が、大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。
【００６４】
本発明において用いられる多変量判別式としては、前記３４ＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む式が好ましく、前記３４ＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がより好ましく、前記３４ＣｐＧサイトからなる群より任意に選択される２〜１０か所のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がさらに好ましく、前記３４ＣｐＧサイトからなる群より任意に選択される２〜５か所のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がよりさらに好ましい。
【００６５】
本発明において用いられる多変量判別式としては、前記１８ＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む式が好ましく、前記１８ＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がより好ましく、前記１８ＣｐＧサイトからなる群より任意に選択される２〜１０か所のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がさらに好ましく、前記１８ＣｐＧサイトからなる群より任意に選択される２〜５か所のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がよりさらに好ましい。
【００６６】
前記３４ＣｐＧセット及び前記１８ＣｐＧセットを構成するＣｐＧサイトは、これらのセットから任意で２〜１０個、好ましくは２〜５個のＣｐＧサイトを選択し、この選択されたＣｐＧサイトのみを用いた場合でも、充分な感度及び特異度で、ヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定することができる。例えば、後記実施例２に示す通り、前記３４ＣｐＧセットのうち、配列番号３４で表される塩基配列中のＣｐＧサイト、配列番号３７で表される塩基配列中のＣｐＧサイト、及び配列番号５６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトの３個のＣｐＧサイトをマーカーとして用い、これらの３個のＣｐＧサイトのメチル化率を変数としてロジスティック回帰により作成された多変量判別式を用いた場合には、ヒト潰瘍性大腸炎患者について、感度約９６％、特異度約９２％で大腸癌の発症可能性を判定することができる。臨床検査等において、メチル化率を測定するＣｐＧサイトの数が多いと、労力とコストが過大となるおそれがある。マーカーとするＣｐＧサイトを前記３４ＣｐＧセット及び前記１８ＣｐＧセットを構成するＣｐＧサイトから選抜することにより、２〜１０個という、臨床検査において測定可能な妥当な数のＣｐＧサイトで、精度よくヒト潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症可能性を判定することができる。
【００６７】
本発明において用いられる多変量判別式としては、前記１１２ＤＭＲセットからなる群より選択される１か所以上のＤＭＲの平均メチル化率を変数として含む式が好ましく、前記１１２ＤＭＲセットからなる群より選択される２か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がより好ましく、前記１１２ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される３か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がさらに好ましく、前記１１２ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される４か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がよりさらに好ましく、前記１１２ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される５か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式が特に好ましい。中でも、前記５８ＤＭＲセットからなる群より選択される１か所以上のＤＭＲの平均メチル化率を変数として含む式が好ましく、前記５８ＤＭＲセットからなる群より選択される２か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がより好ましく、前記５８ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される２〜１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がさらに好ましく、前記５８ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される３〜１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がよりさらに好ましく、前記５８ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される５〜１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式が特に好ましい。より好ましくは、前記１１ＤＭＲセットからなる群より選択される１か所以上のＤＭＲの平均メチル化率を変数として含む式が好ましく、前記１１ＤＭＲセットからなる群より選択される２か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がより好ましく、前記１１ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される２〜１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がさらに好ましく、前記１１ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される３〜１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がよりさらに好ましく、前記１１ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される５〜１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式が特に好ましい。
【００６８】
本発明に係る判定方法に供される生体試料は、ヒト潰瘍性大腸炎患者から採取された生体試料であって、当該患者のゲノムＤＮＡが含まれているものであれば特に限定されるものではなく、血液、血漿、血清、涙液、唾液等であってもよく、消化管粘膜や、肝臓等のその他の組織から採取された組織片であってもよい。本発明に係る判定方法に供される生体試料としては、大腸の状態をより強く反映していることから、大腸粘膜であることが好ましく、比較的低侵襲に採取可能であることから直腸粘膜であることがより好ましい。大腸の直腸粘膜は、例えば、後記の大腸粘膜採取用キットを用いて簡便に採取することができる。
【００６９】
また、当該生体試料は、ＤＮＡが抽出可能な状態であればよく、各種前処理が施されているものであってもよい。例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織であってもよい。生体試料からのＤＮＡの抽出は常法により行うことができ、各種市販のＤＮＡ抽出・精製キットを使用することもできる。
【００７０】
ＣｐＧサイトのメチル化率を測定する方法としては、特定のＣｐＧサイトについてメチル化シトシン塩基とメチル化されていないシトシン塩基を区別して定量可能な方法であれば、特に限定されるものではない。当該技術分野において公知の方法をそのまま又は必要に応じて適宜改変することによりＣｐＧサイトのメチル化率を測定できる。ＣｐＧサイトのメチル化率の測定方法としては、例えば、バイサルファイトシーケンス法、ＣＯＢＲＡ（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）法、ｑＡＭＰ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）法等が挙げられる。その他、ＭＩＡＭ（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｉｓｏｓｃｈｉｚｏｍｅｒｓ）法を用いて行ってもよい。
【００７１】
＜大腸粘膜採取用キット＞
本発明に係る大腸粘膜採取用キットは、直腸粘膜を挟んで採取するための採取具と、肛門を拡張し、当該採取具を肛門から大腸粘膜表面へ到達させるための採取補助具とを備える。以下、図１〜５を参照しながら、本発明に係る大腸粘膜採取用キットについて説明する。
【００７２】
図１（Ａ）〜図１（Ｃ）は大腸粘膜採取用キット１の採取具２の一実施態様である採取具２Ａの説明図である。図１（Ａ）は採取具２Ａの第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂが加力されていない状態の斜視図であり、図１（Ｂ）は加力された状態の斜視図である。また、図１（Ｃ）は採取具２Ａの挟持面を有する先端部の一部拡大図である。図１（Ａ）に示すように、採取具２Ａは、第１の挟持片３ａと、第２の挟持片３ｂと、連結部４と、第１の挟持面５ａと、第２の挟持面５ｂと、を有する。
【００７３】
第１の挟持片３ａは、一方の端部に大腸粘膜を挟持する第１の挟持面５ａが形成されている板状の部材であり、第２の挟持片３ｂは、一方の端部に大腸粘膜を挟持する第２の挟持面５ｂが形成されている板状の部材である。第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂは、連結部４において、互いに対向した状態で、第１の挟持面５ａ及び第２の挟持面５ｂが形成されていない端部において連結されている。第１の挟持片３ａ及び第２の挟持片３ｂの形状は、板状の他、棒状であってもよく、直腸粘膜を挟んで採取するための一定の長さを有するように形成されていれば形状にこだわらない。
【００７４】
第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂへの加力により、両者は互いに近接する。このため、採取具２Ａの第１の挟持面５ａと第２の挟持面５ｂを大腸粘膜に接触させた状態で、第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂに加力することによって、第１の挟持面５ａと第２の挟持面５ｂにより大腸粘膜を挟持することができる。より詳細には、第１の挟持面５ａの辺縁部６ａと第２の挟持面５ｂの辺縁部６ｂが大腸粘膜を挟んだ状態で接する。この状態で採取具２Ａを大腸粘膜から離すことにより、第１の挟持面５ａと第２の挟持面５ｂに挟持された大腸粘膜が引きちぎられて採取される。
【００７５】
第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂの長さは、５０〜２５０ｍｍが好ましく、１００〜２００ｍｍがより好ましく、７０〜２００ｍｍがさらに好ましく、７０〜１５０ｍｍがよりさらに好ましい。第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂが前記範囲の長さであることにより、肛門から大腸粘膜を直接挟持して採取しやすい。
【００７６】
大腸粘膜を比較的組織の破損が少ない状態で採取するために、第１の挟持面５ａと第２の挟持面５ｂの少なくとも一方はカップ形状であることが好ましい。両者の少なくとも一方がカップ形状の場合であるため、第１の挟持面５ａの辺縁部６ａと第２の挟持面５ｂの辺縁部６ｂが接した場合に、内部に空間が形成される。第１の挟持面５ａと第２の挟持面５ｂに挟持された大腸粘膜のうち、当該空間内に収容された部分は、大腸粘膜を引きちぎる際に負荷があまりかからず、よって組織の破壊を抑制できる。図１に示すように、両方がカップ形状であることにより、大腸粘膜の採取がより容易であり、かつ組織の破壊を抑制できる。
【００７７】
第１の挟持面５ａと第２の挟持面５ｂがカップ形状の場合、辺縁部６ａと辺縁部６ｂの内径は、必要な量の大腸粘膜が採取できる大きさに設定すればよい。本発明に係る判定方法に供される大腸粘膜の場合、少量の粘膜が採取できれば十分である。例えば、辺縁部６ａと辺縁部６ｂの内径を、１〜５ｍｍ、好ましくは２〜３ｍｍとすることにより、大腸粘膜を過度に傷つけることなく、充分量の大腸粘膜を採取することができる。
【００７８】
辺縁部６ａと辺縁部６ｂは、互いに密接することが可能であればよく、平坦であってもよいが、図１（Ｃ）に示すように、鋸歯状であることが好ましい。鋸歯状の場合には、辺縁部６ａ’と辺縁部６ｂ’により挟持することによって比較的弱い力で大腸粘膜を切断し採取することができる。
【００７９】
第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂのいずれか一方の内側に突起部８ａを、他方に筒部９ａを、互いに対向するように形成していてもよい。第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂへ加力し、辺縁部６ａと辺縁部６ｂが互いに接する状態において、突起部８ａの先端は筒部９ａに嵌る。突起部８ａの先端が筒部９ａに嵌っていることにより、採取具２を大腸粘膜から離す際に辺縁部６ａと辺縁部６ｂがずれることなく、安定して大腸粘膜を採取することができる。
【００８０】
図１（Ｄ）は採取具２Ａの変形例である採取具２Ｂの説明図であり、より詳細には、採取具２Ｂの第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂが加力されていない状態の斜視図である。第１の挟持片３ａは、中心部よりも第１の挟持面５ａが形成されている端部側に、第１の屈曲部７ａを有していてもよい。第２の挟持片３ｂは、中心部よりも第２の挟持面５ｂが形成されている端部側に、第２の屈曲部７ｂを有していてもよい。第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂが、中心部よりも挟持面が形成されている先端側において、互いに対向している状態を維持したまま、傾斜していることにより、採取補助具１１のスリット１３を貫通して大腸粘膜に接することが容易になる。具体的には、図１（Ｄ）に示すように、第１の挟持片３ａの中心部から連結部４側と第２の挟持片３ｂの中心部から連結部４側とを載せた仮想平面Ｐに交差するように屈曲している。屈曲の角度θ１は、１０〜５０°が好ましく、２０〜４０°がより好ましく、２５〜３５°がさらに好ましい。また、第１の屈曲部７ａから第１の挟持面５ａの先端部までの長さ、及び第２の屈曲部７ｂから第２の挟持面５ｂの先端部までの長さは、２０〜６０ｍｍが好ましく、３０〜５０ｍｍがより好ましい。屈曲部から挟持面の先端部までの長さが前記範囲内であることにより、採取補助具１１のスリット１３を貫通した状態での粘膜採取がより容易になる。
【００８１】
図２（Ａ）〜図２（Ｅ）は、採取具２Ａの別の変形例である採取具２Ｃの説明図である。図２（Ａ）は、採取具２の第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂが加力されていない状態の正面図であり、図２（Ｂ）は、採取具２Ｃの平面図である。図２（Ｃ）は、採取具２Ｃの突起部８ｂの拡大図であり、図２（Ｄ）は、採取具２Ｃの先端部分の、突起部８ｂの係止爪が筒部９ｂの開口縁部の張り出し部に係止されている状態の平面図であり、図２（Ｅ）は、採取具２Ｃの先端部分の、第１の挟持面５ａと第２の挟持面５ｂが接着した状態の平面図である。
【００８２】
被検者の直腸から粘膜組織を採取する際に、採取具２は、第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂの距離が開いた状態よりも閉じた状態のほうが、採取補助具１１のスリット１３を貫通させやすい。そこで、図２の突起部８ｂが示すように、採取具２の突起部は、係止爪であってもよい。突起部８ｂの係止爪は、１つ又は２つ以上であってもよく、筒部９ｂの開口縁部の張り出し部に係止できれば幾つであってもよい。この場合には、突起部８ｂを篏合させる筒部９ｂは、開口縁部に径方向内側に張り出し部を設けたものとし、突起部８ｂの係止爪が筒部９ｂの開口縁部の張り出し部に係止させることができる（図２（Ｄ））。突起部８ｂの係止爪の高さは、筒部９ｂの張り出し部に係止させた状態のときに、第１の挟持面５ａと第２の挟持面５ｂの先端部が近接しているが、第１の挟持面５ａと第２の挟持面５ｂが接着していない状態となり、かつ第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂをさらに加力することによって、突起部８ｂの先端部が筒部９ｂの底部を突き抜けることなく第１の挟持面５ａと第２の挟持面５ｂを接着させることが可能となるように調整することが好ましい。これにより、採取具２の第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂを加力することなく、第１の挟持面５ａと第２の挟持面５ｂの先端部を近接した状態で安定させることができる。採取具２は、図２（Ｄ）の状態で採取補助具１１のスリット１３を貫通させ、先端部が直腸粘膜組織に接触したら、第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂを加力し、粘膜組織の一部を挟み込むようにして図２（Ｅ）の状態にし、粘膜組織を採取する。
【００８３】
採取具２は、第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂに、それぞれ、連結部と屈曲部の間に対応する緩衝部１０ａを設けてもよい。緩衝部１０ａは、その先端に弾性部１０ｂを備えており、突起部８ｂの係止爪が筒部９ｂの開口縁部の張り出し部に係止させた状態では、互いに弾性部１０ｂで接着する（図２（Ｄ））。この緩衝部により、採取具２はより安定的に、突起部８ｂの係止爪が筒部９ｂの開口縁部の張り出し部に係止した状態を維持できる。第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂをさらに加力した場合にも、先端の弾性部１０ｂが押圧により変形するため、第１の挟持面５ａと第２の挟持面５ｂを接着させることができる（図２（Ｅ））。
【００８４】
図３（Ａ）及び図３（Ｂ）は採取補助具１１の一実施態様である採取補助具１１Ａの説明図である。図３（Ａ）は採取補助具１１Ａの下側からみた斜視図であり、図３（Ｂ）は採取補助具１１Ａのスリット側からみた底面図である。図３（Ａ）に示すように、採取補助具１１Ａは、採取具導入部１２と、スリット１３と、把持部１４と、を有する。
【００８５】
採取具導入部１２は、側壁にスリット１３を有する円錐台形状の部材である。採取具導入部１２は、外径が小さい先端辺縁部１５から肛門に挿入し、外径が大きい手元辺縁部１６から採取具２を挿入する。採取具導入部１２は、回転軸方向に貫通孔を有していてもよい。肛門への挿入のしやすさの点から、手元辺縁部１６の外径は３０〜７０ｍｍが好ましく、４０〜５０ｍｍがより好ましい。また、採取具２の大腸粘膜表面への導入しやすさの点から、先端辺縁部１５の外径は１０〜３０ｍｍが好ましく、１５〜２５ｍｍがより好ましい。同様に、採取具導入部１２の回転軸方向の長さは５０〜１５０ｍｍが好ましく、７０〜１３０ｍｍがより好ましく、８０〜１２０ｍｍがさらに好ましい。
【００８６】
スリット１３は、採取具導入部１２の先端辺縁部１５から手元辺縁部１６に向かって設けられている。採取具導入部１２の側壁の一部分に先端辺縁部１５に達するスリット１３があることにより、腸管内における採取具２の先端部の動きの自由度が高まり、内部構造が複雑な直腸内において、大腸粘膜をより容易に採取することができる。スリット１３は、採取具導入部１２のいずれの位置に設定されていてもよい。例えば、スリット１３は、図３（Ａ）に示すように、把持部１４に近い側にあることが好ましい。また、採取具導入部１２に設けられるスリット１３の数は、１つであってもよく、２以上であってもよい。
【００８７】
スリット１３を貫通して採取具２は大腸粘膜表面に達するため、スリット１３の幅は、辺縁部６ａと辺縁部６ｂとが接した状態における、採取具２の第１の挟持面５ａと第２の挟持面５ｂの幅よりも広く設計される。また、スリット１３の幅は、一定であってもよいが、図３（Ｂ）に示すように、先端辺縁部１５から手元辺縁部１６側にいくにつれて広くなっているほうが好ましい。例えば、辺縁部６ａと辺縁部６ｂとが接した状態における、採取具２の第１の挟持面５ａと第２の挟持面５ｂの幅Ｌ１（図１（Ｂ）参照。）が３〜８ｍｍの場合、スリット１３の先端辺縁部１５側の幅Ｌ２（図３（Ｂ）参照。）は７〜１５ｍｍが好ましく、スリット１３の手元辺縁部１６側の幅Ｌ３（図３（Ｂ）参照。）は１０〜２０ｍｍが好ましい。なお、スリット１３は、採取具導入部１２の壁面に２以上形成されていてもよい。
【００８８】
把持部１４は、その一端が、採取具導入部１２の手元辺縁部１６近傍に、採取具導入部１２から遠ざかる方向に連結している。把持部１４の長さは、手による握りやすさ等から、５０〜１５０ｍｍが好ましく、７０〜１３０ｍｍがより好ましい。把持部１４の形状は、握りやすい形状であればどのような形状であってもよく、例えば、板状であってもよく、棒状であってもよく、その他の形状であってもよい。
【００８９】
図４は、採取補助具１１Ａの変形例である採取補助具１１Ｂの説明図である。図４（Ａ）は採取補助具１１Ｂの上側からみた斜視図であり、図４（Ｂ）は下側からみた斜視図である。また、図４（Ｃ）〜図４（Ｇ）は、それぞれ、採取補助具１１Ｂの正面図、平面図、底面図、左側面図、及び右側面図である。採取補助具の把持部は、把持部１４に示すように、下方が開口した中空の棒状であって、リブで補強されているものであってもよい。
【００９０】
図５は、本発明に係る大腸粘膜採取用キット１の使用の態様を示す説明図である。まず、大腸粘膜を採取される被検者の肛門に、採取補助具１１を先端辺縁部１５から挿入する。把持部１４を片手で持ち安定させた状態で、手元辺縁部１６側の開口部から採取具２を導入する。導入された採取具２は、先端部からスリット１３を貫通して大腸粘膜表面に達する。採取具２の挟持面５ａと挟持面５ｂとで大腸粘膜を挟持した状態（挟持面５）で、採取具２をスリット１３から引き出すことにより、大腸粘膜が採取できる。
【実施例】
【００９１】
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００９２】
［実施例１］
潰瘍性大腸炎患者のうち、内視鏡検査での生検組織による病理診断により大腸癌と診断され、外科手術を施行した患者（ＵＣ癌患者）８名（男性７名、女性１名）と、内科的治療不応潰瘍性大腸炎患者であり、癌以外で外科手術を施行した患者（非癌ＵＣ患者）８名（男性７名、女性１名）とから採取された大腸粘膜中のＤＮＡに対して、ＣｐＧサイトのメチル化率を網羅的に解析した。なお、ＵＣ癌患者８名の平均年齢は４７．１±１２．４歳であり、罹病期間の平均は１１．４±７．３年であった。非癌ＵＣ患者８名の平均年齢は４４．３±１６．４歳であり、罹病期間の平均は６．５±５．２年であった。【００９３】
＜ＣｐＧサイトのメチル化レベルの網羅的解析＞
（１）生検及びＤＮＡ抽出
同一患者の大腸３か所から粘膜組織を採取し、常法に従いホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルを作製した。採取部位は、ＵＣ癌患者は盲腸、直腸、及び癌部とし、非癌ＵＣ患者は盲腸、横行結腸、直腸とした。ＦＦＰＥサンプルから切片を切り出し、QIAmp DNA FFPE tissue kit（Qiagen社製）を使用してＤＮＡを抽出した。【００９４】
（２）ＤＮＡサンプルの品質評価
得られたＤＮＡの濃度は次のようにして求めた。すなわち、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Life Technologies社製）を用いて各サンプルの蛍光強度を測定し、キット付属のλ−ＤＮＡの検量線を用いて濃度を算出した。
次に、各サンプルをＴＥ（ｐＨ８．０）にて１ｎｇ／μＬに希釈し、Illumina FFPE QC Kit（Illumina社製）及びFast SYBR Green Master Mix（Life Technologies社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｔ値を求めた。サンプルとポジティブコントロールとのＣｔ値の差（以下、ΔＣｔ値）をサンプルごとに算出し、品質を評価した。ΔＣｔ値が５未満のサンプルは品質良好と判断し、以降のステップに進めた。【００９５】
（３）バイサルファイト処理
EZ DNA Methylation Kit（ZYMO RESEARCH社製）を使用して、ＤＮＡサンプルに対してバイサルファイト処理を実施した。【００９６】
（４）分解ＤＮＡの修復及び全ゲノム増幅
バイサルファイト処理後のＤＮＡに対して、Infinium HD FFPE Restore Kit（Illumina社製）を使用し、分解ＤＮＡを修復した。修復されたＤＮＡをアルカリ変性した後、中和させ、HumanMethylation450 DNA Analysis Kit（Illumina社製）の全ゲノム増幅用の酵素とプライマーを添加し、３７℃のIncubation Oven（Illumina社製）で２０時間以上、等温で反応させることによって、全ゲノムを増幅させた。【００９７】
（５）全ゲノム増幅したＤＮＡの断片化と精製
全ゲノム増幅したＤＮＡに、HumanMethylation450 DNA Analysis Kit（Illumina社製）の断片化用の酵素を添加し、Microsample Incubator（SciGene）で３７℃、１時間反応させた。断片化したＤＮＡに、共沈剤と２−プロパノールを加えて遠心分離処理し、ＤＮＡを沈澱させた。【００９８】
（６）ハイブリダイゼーション
沈澱させたＤＮＡに、Hybridization bufferを加え、４８℃のHybridization Oven（Illumina社製）で１時間反応させ、ＤＮＡを溶解させた。溶解させたＤＮＡを９５℃のMicrosample Incubator（SciGene社製）で２０分間インキュベートして１本鎖に変性させた後、HumanMethylation450 DNA Analysis Kit（Illumina社製）のBeadChip上に分注した。４８℃のHybridization Ovenで１６時間以上反応させ、BeadChip上のプローブと１本鎖ＤＮＡをハイブリダイズした。【００９９】
（７）標識反応及びスキャニング
ハイブリダイゼーション後のBeadChip上のプローブを伸長反応させ、蛍光色素を結合させた。次いで、当該BeadChipをiSCANシステム（Illumina社製）でスキャンし、メチル化蛍光強度及び非メチル化蛍光強度を測定した。実験終了時に、スキャンデータが全て揃っていること、及びスキャンが正常に行われたことを確認した。【０１００】
（８）ＤＮＡメチル化レベルの定量及び比較解析
ＤＮＡメチル化解析ソフトウェアGenomeStudio（Version：V2011.1）を用いてスキャンデータを解析した。ＤＮＡメチル化レベル（β値）は、次の式により算出した。【０１０１】
［β値］＝
［メチル化蛍光強度］÷ (［メチル化蛍光強度］＋［非メチル化蛍光強度］＋100)【０１０２】
メチル化レベルが高い場合、β値は１に近づき、メチル化レベルが低い場合、β値は０に近づく。非癌ＵＣ患者直腸サンプル群（ｎ＝８）に対するＵＣ癌患者直腸サンプル群（ｎ＝８）のＤＮＡメチル化レベルの比較解析には、GenomeStudioにより算出されるDiffScoreを用いた。両者のＤＮＡメチル化レベルが近い場合、DiffScoreは０に近づき、ＵＣ癌患者でのレベルが高い場合は正の値を示し、低い場合は負の値を示す。両群のメチル化レベルの差異が大きいほど、DiffScoreの絶対値は大きくなる。また、ＵＣ癌患者直腸サンプル群（ｎ＝８）の平均β値から非癌ＵＣ患者直腸サンプル群（ｎ＝８）の平均β値を差し引いた値（Δβ値）も比較解析に用いた。【０１０３】
なお、ＤＮＡメチル化定量とＤＮＡメチル化レベル比較解析には、GenomeStudioとソフトウェアMethylation Module（Version:1.9.0）を用いた。GenomeStudioの設定条件は、下記の通りである。【０１０４】
ＤＮＡメチル化定量；
Normalization：  有り（Ｃｏｎｔｒｏｌｓ）
Subtract Background：  有り
Content Descriptor：       HumanMethylation450_15017482_v.1.2.bpm【０１０５】
ＤＮＡメチル化レベル比較解析；
Normalization：  有り(Controls)
Subtract Background：  有り
Content Descriptor：  HumanMethylation450_15017482_v.1.2.bpm
Ref Group：  比較解析4. Group-3
Error Model：  Illumina custom
Compute False Discovery Rate：  無し【０１０６】
（９）多変量解析
ＤＮＡメチル化レベルの定量及び比較解析の結果を用いて、統計解析ソフトウェアＲ（Version: 3.0.1、64bit、Windows（登録商標））を用いて、DiffScoreの算出、クラスター解析及び主成分分析を実施した。【０１０７】
クラスター解析のＲスクリプト：
> data.dist<-as.dist(1-cor(data.frame,use="pairwise.complete.obs",method="p"))> hclust(data.dist,method="complete")
# data.frame: CpG（行）x サンプル（列）から成るデータフレーム
# 1-ピアソン相関係数を距離として定義し、complete linkage法により実施【０１０８】
主成分分析のＲスクリプト：
> prcomp(t(data.frame),scale=T)
# data.frame: CpG（行）x サンプル（列）から成るデータフレーム【０１０９】
＜ＣｐＧバイオマーカーの選択＞
（１）ＣｐＧバイオマーカー候補の抽出
網羅的ＤＮＡメチル化解析データからＧｐＧバイオマーカー候補を選定する手段として、DiffScore及びΔβ値に基づいた絞り込みが報告されている（BMC Med genomics vol.4, p.50, 2011; Sex Dev vol.5, p.70, 2011）。前者はDiffScoreの絶対値が３０超、及びΔβ値の絶対値が０．２超に設定し、後者はDiffScoreの絶対値が３０超、及びΔβ値の絶対値が０．３超に設定して、バイオマーカー候補を抽出している。これらの方法に準じて、BeadChipに搭載されている４８５，５７７個のＣｐＧサイトからバイオマーカー候補を抽出した。【０１１０】
具体的には、まず、４８５，５７７個のＣｐＧサイトから、DiffScoreの絶対値が３０超である７２，９０５個のＣｐＧサイトを選択した。BeadChipには、特許文献１に記載されているｍｉＲ−１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−３４ｂ／ｃの各遺伝子領域に位置する８６個のＣｐＧサイトも搭載されていたが、このうち、DiffScoreの絶対値が３０超であったのは２７個であった。
次に、この７２，９０５個のＣｐＧサイトの中から、Δβ値の絶対値が０．３超である３２個のＣｐＧサイトを抽出した。以下、この３２個のＣｐＧサイトをまとめて「３２ＣｐＧセット」という。この時点で、特許文献１に記載されている各遺伝子領域に位置するＣｐＧサイトは、全て除外されてしまった。
さらに、癌患者を取りこぼしなく判別することを目的に、癌患者サンプル内でＤＮＡメチル化レベルの変動が少ないものを絞り込んだ。すなわち、ＵＣ癌患者２４サンプル（３部位×各部位８サンプル）のβ値の不偏分散ｖａｒを求め、不偏分散ｖａｒの値が０．０５より小さい１６個のＣｐＧサイトを選抜した。以下、この１６個のＣｐＧサイトをまとめて「１６ＣｐＧセット」という。１６ＣｐＧセットからさらに、不偏分散ｖａｒの値が０．０３より小さい９個のＣｐＧサイトを絞り込んだ。以下、この９個のＣｐＧサイトをまとめて「９ＣｐＧセット」という。【０１１１】
３２ＣｐＧセットの各ＣｐＧサイトの結果を表１７に示す。表中、「１６ＣｐＧ」欄に＃があるＣｐＧサイトは１６ＣｐＧセットに含まれるものを、「９ＣｐＧ」欄に＃があるＣｐＧサイトは９ＣｐＧセットに含まれるものを、それぞれ示す。【０１１２】
【表１７】
2018008740.tif 000018
【０１１３】
（２）ＣｐＧバイオマーカー候補を用いた臨床サンプルの多変量解析
前記３２ＣｐＧセット、１６ＣｐＧセット、９ＣｐＧセットを用いて、全４８サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行ったところ、図６Ａ、６Ｃ、及び６Ｅに示すように、いずれのＣｐＧセットでも、クラスター解析では、全てのＵＣ癌患者サンプルが同一クラスター（図中、枠内）に集積した。また、図６Ｂ、６Ｄ、及び６Ｆに示すように、主成分分析（縦軸は第２主成分）では、ＵＣ癌患者サンプル（●）と非癌ＵＣ患者サンプル（▲）が第１主成分（横軸）方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。すなわち、いずれのＣｐＧセットでも、ＵＣ癌患者２４サンプルと非癌ＵＣ患者２４サンプルを明確に区別することができた。一方、特許文献１に記載されている各遺伝子領域に位置するＣｐＧサイトから選抜された２７個のＣｐＧサイトを用いて、同様にクラスター解析及び主成分分析を行ったところ、図７Ａ及び７Ｂに示すように、ＵＣ癌患者サンプルと非癌ＵＣ患者サンプルを明確に区別することは出来なかった。これらの結果から、表１７に記載の３２ＣｐＧは、潰瘍性大腸炎患者における大腸癌の発症のバイオマーカーとして極めて有用であり、これらを用いることにより、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌の発症の有無を高い感度と特異度によって判定できることが明らかである。【０１１４】
［実施例２］
実施例１の潰瘍性大腸炎患者とは別に、内視鏡検査での生検組織による病理診断により大腸癌と診断され、外科手術を施行した患者（ＵＣ癌患者）２４名と、内科的治療不応潰瘍性大腸炎患者であり、癌以外で外科手術を施行した患者（非癌ＵＣ患者）２４名とから採取された大腸粘膜中のＤＮＡに対して、ＣｐＧサイトのメチル化率を網羅的に解析した。【０１１５】
ＣｐＧサイトのメチル化率の解析に供したＤＮＡは、潰瘍性大腸炎患者の直腸の粘膜組織から採取したＦＦＰＥサンプルから、実施例１と同様にしてＤＮＡを抽出し、全ゲノム増幅し、ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルの定量及び比較解析を行い、その結果を用いてDiffScoreの算出、クラスター解析及び主成分分析を実施した。【０１１６】
（１）ＣｐＧバイオマーカー候補の抽出
次いで、網羅的ＤＮＡメチル化解析データからＣｐＧバイオマーカー候補を抽出した。  具体的には、まず、４８５，５７７個のＣｐＧサイトから、Δβ値の絶対値が０．２超である３２４個のＣｐＧサイトを抽出した。【０１１７】
次に、下記の２種類のロジスティック回帰モデルを作成した。
（１）３２４個のＣｐＧサイトから２群のｔ−ｔｅｓｔ検定で上位１００個のＣｐＧサイトを選択し、１００個のＣｐＧから選んだ３個のＣｐＧ全ての組み合わせに基づく１６１，７００個のロジスティック回帰モデル。（２）３２４個のＣｐＧサイトから選んだ２個のＣｐＧの全ての組み合わせに基づく、５２，３２６個のロジスティック回帰モデル。【０１１８】
両ロジスティック回帰モデルの判別式について、下記の４つの基準について、それぞれ充足するＣｐＧサイトを選定し、出現するＣｐＧサイトの頻度を算出した。
［基準１］感度が９０％超、特異度が９０％超、かつ判別式の係数ｐ値が０．０５未満。［基準２］感度が９０％超、特異度が９０％超、判別式の係数ｐ値が０．０５未満、かつＡＩＣ（赤池の情報量基準）が３０未満。
［基準３］感度が９５％超、特異度が８５％超、かつ判別式の係数ｐ値が０．０５未満。［基準４］感度が９５％超、特異度が８５％超、判別式の係数ｐ値が０．０５未満、かつＡＩＣが３０未満。【０１１９】
４つの基準のそれぞれについて、上位１０ＣｐＧサイトを選択したところ、表８〜１０に記載の３４個のＣｐＧサイト（３４ＣｐＧセット）が選抜された。各ＣｐＧサイトの結果を表１８に示す。【０１２０】
【表１８】
2018008740.tif 000019
【０１２１】
（２）ＣｐＧバイオマーカー候補を用いた臨床サンプルの多変量解析
前記３４ＣｐＧセットのメチル化レベルに基づき、全４８サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行った。この結果、クラスター解析（図８Ａ）では、大多数のＵＣ癌患者サンプルが同一クラスター（図中、枠内）に集積した。また、主成分分析（図８Ｂ、縦軸は第２主成分）では、ＵＣ癌患者サンプル（●）と非癌ＵＣ患者サンプル（▲）が第１主成分（横軸）方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。すなわち、いずれのＣｐＧセットでも、ＵＣ癌患者２４サンプルと非癌ＵＣ患者２４サンプルを明確に区別することができた。【０１２２】
（３）ＣｐＧバイオマーカー候補を用いた臨床サンプルの大腸癌発症可能性の評価
前記３４ＣｐＧセットのうち、配列番号３４で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ１０９３１１９０）、配列番号３７で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ１３６７７１４９）、及び配列番号５６で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ１４５１６１００）の３個のＣｐＧサイトのメチル化率をマーカーとした場合の、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の有無の判定の精度を調べた。【０１２３】
具体的には、２４名のＵＣ癌患者及び２４名の非癌ＵＣ患者の直腸から採取された検体の前記３つのＣｐＧサイトのメチル化レベルの数値（β値）を用いてロジスティック回帰モデルに基づく判別式を作成してＵＣ癌患者と非癌ＵＣ患者の判別を行った。この結果、感度（ＵＣ癌患者のうち、陽性と評価された患者の割合）が９５．８％、特異度（非癌ＵＣ患者のうち、陰性と評価された患者の割合）が９１．７％、陽性的中率（陽性と評価された患者のうち、ＵＣ癌患者の割合）が９２％、陰性的中率（陰性と評価された患者のうち、非癌ＵＣ患者の割合）が９５．６％であり、いずれも９０％以上と高かった。また、図９にＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を示す。ＡＵＣ（ＲＯＣ曲線下面積）は０．９８であった。これらの結果から、前記３４ＣｐＧセットから選択された数個のＣｐＧサイトのメチル化率に基づいて、高感度かつ高特異度で、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の可能性を評価できることが確認された。【０１２４】
［実施例３］
実施例１において求めた潰瘍性大腸炎患者の直腸から採取した検体の各ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベル（β値）と、実施例２において求めた潰瘍性大腸炎患者の各ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベル（β値）から、ＣｐＧバイオマーカー候補を抽出した。【０１２５】
（１）ＣｐＧバイオマーカー候補の抽出
具体的には、まず、４８５，５７７個のＣｐＧサイトから、Δβ値の絶対値が０．２超である１７２個のＣｐＧサイトを抽出した。次いで、この１７２個のＣｐＧサイトから、実施例２と同様にして、２種類のロジスティック回帰モデルを作成し、前記４つの基準のそれぞれについて、上位１０ＣｐＧサイトを選択した。この結果、表１１及び表１２に記載の１８個のＣｐＧサイト（１８ＣｐＧセット）が選抜された。各ＣｐＧサイトの結果を表１９に示す。【０１２６】
【表１９】
2018008740.tif 000020
【０１２７】
（２）ＣｐＧバイオマーカー候補を用いた臨床サンプルの多変量解析
前記１８ＣｐＧセットのメチル化レベルに基づき、全６４サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行った。この結果、クラスター解析（図１０Ａ）では、大多数のＵＣ癌患者サンプルが同一クラスター（図中、枠内）に集積した。また、主成分分析（図１０Ｂ、縦軸は第２主成分）では、ＵＣ癌患者サンプル（●）と非癌ＵＣ患者サンプル（▲）が第１主成分（横軸）方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。すなわち、いずれのＣｐＧセットでも、ＵＣ癌患者３２サンプルと非癌ＵＣ患者３２サンプルを明確に区別することができた。【０１２８】
［実施例４］
実施例２において取得したＵＣ癌患者２４名及び非癌ＵＣ患者２４名の直腸から採取した検体の各ＤＭＲの平均メチル化率（平均β値；各ＤＭＲ中に存在するＣｐＧサイトのメチル化レベル（β値）の相加平均値）から、ＤＭＲバイオマーカー候補を抽出した。【０１２９】
（１）ＤＭＲバイオマーカー候補の抽出
具体的には、まず、４８５，５７７個のＣｐＧサイトのメチル化データ（ＩＤＡＴ形式）を、ＣｈＡＭＰパイプライン（Bioinformatics、30、428、2014；http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ChAMP.html）に入力し、ＵＣ癌患者と非癌ＵＣ患者の２群間で有意と判定されたＤＭＲ２，５４９か所を抽出した。この中でΔβ値（［平均β値（ＵＣ癌）］−［平均β値（非癌ＵＣ）］）の絶対値を０．１５超に設定したところ、３９か所に絞り込まれた。さらにΔβ値の絶対値が０．１超である４８４か所のうち、実施例１で取得したＵＣ癌患者と非癌ＵＣ患者とのΔβ値が０．１５超である８０か所を追加し、総数１１２か所（ＤＭＲ番号１〜１１２）をＤＭＲバイオマーカー候補とした。この１１２か所のＤＭＲ（１１２ＤＭＲセット）の結果を表２０〜２２に示す。【０１３０】
【表２０】
2018008740.tif 000021
【０１３１】
【表２１】
2018008740.tif 000022
【０１３２】
【表２２】
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【０１３３】
次に、前記１１２ＤＭＲセットから選んだ３か所のＤＭＲ全ての組み合わせに基づく２２７，９２０個のロジスティック回帰モデルを作成した。得られた判別式について、感度が９５％である判別式７９個を選択したところ、この中に出現するＤＭＲは５８か所であった（表中、５８ＤＭＲ）。さらに、判別式７９個に出現するＤＭＲの頻度を求めたところ、４回以上出現するものは１１か所であった（表中、１１ＤＭＲ）。【０１３４】
（２）ＤＭＲバイオマーカー候補を用いた臨床サンプルの多変量解析
前記１１２ＤＭＲセットのメチル化率に基づき、実施例２の全４８サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行った。この結果、クラスター解析では、大多数のＵＣ癌患者サンプルが同一クラスター（図１１中、枠内）に集積した。また、主成分分析（図１２）では、ＵＣ癌患者サンプル（●）と非癌ＵＣ患者サンプル（▲）が第１主成分方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。【０１３５】
（３）ＤＭＲバイオマーカー候補を用いて臨床サンプルの大腸癌発症可能性の評価
前記１１２ＤＭＲセットのうち、ＤＭＲ番号２（ＳＩＸ１０）、１０（ＣＥＰ１１２）、５５（ＨＮＦ４Ａ）の領域のメチル化率をマーカーとした場合の、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の有無の判定の精度を調べた。【０１３６】
具体的には、２４名のＵＣ癌患者及び２４名の非癌ＵＣ患者の直腸から採取された検体の前記３か所のＤＭＲのメチル化レベルの数値（β値）を用いてロジスティック回帰モデルに基づく判別式を作成してＵＣ癌患者と非癌ＵＣ患者の判別を行った。この結果、感度（ＵＣ癌患者のうち、陽性と評価された患者の割合）が９５．８％、特異度（非癌ＵＣ患者のうち、陰性と評価された患者の割合）が９５．８％、陽性的中率（陽性と評価された患者のうち、ＵＣ癌患者の割合）が９５．８％、陰性的中率（陰性と評価された患者のうち、非癌ＵＣ患者の割合）が９５．８％であり、いずれも９５％以上と高かった。また、図１３にＲＯＣ曲線を示す。この結果、ＡＵＣ（ＲＯＣ曲線下面積）は０．９７４であった。これらの結果から、前記１１２ＤＭＲセットから選択された数か所のＤＭＲの平均メチル化率に基づいて、高感度かつ高特異度で、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症の可能性を評価できることが確認された。
【符号の説明】
【０１３７】
１…大腸粘膜採取用キット、２、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ…採取具、３ａ…第１の挟持片、３ｂ…第２の挟持片、４…連結部、５…挟持面、５ａ…第１の挟持面、５ｂ…第２の挟持面、６ａ、６ａ’…第１の挟持面５ａの辺縁部、６ｂ、６ｂ’…第２の挟持面５ｂの辺縁部、７ａ…第１の屈曲部、７ｂ…第２の屈曲部、８ａ、８ｂ…突起部、９ａ、９ｂ…筒部、１０ａ…緩衝部、１０ｂ…弾性部、１１、１１Ａ、１１Ｂ…採取補助具、１２…採取具導入部、１３…スリット、１４…把持部、１５…先端辺縁部、１６…手元辺縁部。
【図１】
2018008740.tif 000028
【図２】
2018008740.tif 000029
【図３】
2018008740.tif 000030
【図４】
2018008740.tif 000031
【図５】
2018008740.tif 000032
【図６Ａ】
2018008740.tif 000033
【図６Ｂ】
2018008740.tif 000034
【図６Ｃ】
2018008740.tif 000035
【図６Ｄ】
2018008740.tif 000036
【図６Ｅ】
2018008740.tif 000037
【図６Ｆ】
2018008740.tif 000038
【図７Ａ】
2018008740.tif 000039
【図７Ｂ】
2018008740.tif 000040
【図８Ａ】
2018008740.tif 000041
【図８Ｂ】
2018008740.tif 000042
【図９】
2018008740.tif 000043
【図１０Ａ】
2018008740.tif 000044
【図１０Ｂ】
2018008740.tif 000045
【図１１】
2018008740.tif 000046
【図１２】
2018008740.tif 000047
【図１３】
2018008740.tif 000048
【配列表】
2018008740000001.app
【国際調査報告】
2018008740.tif 000049
2018008740.tif 000050
2018008740.tif 000051
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