(57)【要約】【課題】１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［ＤＧＧＭＲ］をリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液において、例えアジ化物が混入しても、ＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができるリパーゼ活性測定用基質溶液、リパーゼ活性測定試薬、リパーゼ活性測定方法、及びアジ化物の影響の抑制方法を提供する。【解決手段】  １，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液において、還元剤を含有させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液において、還元剤を含有することを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液。
【請求項２】
請求項１に記載のリパーゼ活性測定用基質溶液を含むことを特徴とするリパーゼ活性測定試薬。
【請求項３】
１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液を使用するリパーゼ活性測定方法において、リパーゼ活性測定用基質溶液に還元剤を含有させることを特徴とするリパーゼ活性測定方法。
【請求項４】
１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液に還元剤を含有させることを特徴とするリパーゼ活性測定に対するアジ化物の影響の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リパーゼ活性測定に対するアジ化物の影響を抑制できる、リパーゼ活性測定用基質溶液、リパーゼ活性の測定試薬、及びリパーゼ活性の測定方法に関するものである。
また、本発明は、リパーゼ活性測定に対するアジ化物の影響を抑制できる方法に関するものである。【０００２】
本発明は、臨床検査などの生命科学分野、及び分析化学などの化学分野等において有用なものである。
【背景技術】
【０００３】
血清又は血漿中のリパーゼ活性は、急性膵炎、慢性膵炎又は膵臓癌等の膵疾患において上昇することから、これらの膵炎等のマーカーとして有用なものである。
このリパーゼは、長鎖脂肪酸の３分子がそれぞれグリセロールにエステル結合したトリグリセライド（ＴＧ）のα位（１位、３位）のエステル結合を加水分解して、２分子の脂肪酸及び１分子のβ−モノグリセライドを生成する反応を触媒する酵素である。
この１分子のβ−モノグリセライドは、α型に異性化され、これがリパーゼの作用を受けて加水分解されてグリセロールと脂肪酸とになる。【０００４】
血清又は血漿中のリパーゼ活性の測定方法としては、次のような方法が知られていた（非特許文献１及び非特許文献２参照。）。
例えば、オリーブ油のエマルジョンをリパーゼの基質として用い、このオリーブ油のエマルジョンを血清試料等と接触させ、３７℃で２４時間反応させた後、リパーゼによる加水分解反応により生成した脂肪酸をアルカリで滴定するＣｈｅｒｒｙ−Ｃｒａｎｄａｌｌの方法が知られていた。
しかし、この方法は反応時間が長く、測定しようとするリパーゼの不活性化や反応阻害が著しい方法であった。【０００５】
また、トリオレイン又はオリーブ油のエマルジョンをリパーゼの基質として用い、このトリオレイン又はオリーブ油のエマルジョンを血清試料等と接触させ、反応させて、リパーゼによる乳化ミセルの加水分解反応にともなって起こる反応液の濁度の減少からリパーゼ活性を測定するＶｏｇｅｌ−Ｚｉｅｖｅ法及びこの変法が知られていた。
しかし、これらの方法は、血清蛋白による阻害やリウマチ因子による凝集塊の干渉を受け、均一かつ安定なエマルジョンを作るのが難しく、再現性に乏しいという短所を有する方法であった。【０００６】
また、ＢＡＬＢ（２，３−ジメルカプト−１−プロパノール  三酪酸）をリパーゼの基質として用い、このＢＡＬＢを血清試料等と接触させ、反応させて、リパーゼによる加水分解反応により生成したＢＡＬ（２，３−ジメルカプト−１−プロパノール）をＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸）と反応させて、生じたＴＮＢアニオンの黄色の発色を４１２ｎｍで測定することによってリパーゼ活性を測定する方法が知られていた。
しかし、この方法は、高濃度の肝エステラーゼの存在下でその干渉を受けてしまうため、他の測定項目の測定試薬から反応セル又はノズル（プローブ）を介して混入する肝エステラーゼの影響を受けて測定値に誤差が生じるという短所を有する方法であった。【０００７】
また、天然型基質である１，２−ジリノレオイルグリセロールをリパーゼの基質として用い、この１，２−ジリノレオイルグリセロールを血清試料等と接触させ、反応させて、リパーゼによる加水分解反応により生成したリノール酸が、コエンザイムＡ、ＮＡＤ＋及びＡＴＰの存在下で、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ−３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ複合酵素の共同作用によってβ−酸化を受ける際に起こるＮＡＤＨの生成速度を測定することによってリパーゼ活性を測定する方法が知られていた。
しかし、この方法も、高濃度の肝エステラーゼの存在下でその干渉を受けてしまうため、他の測定項目の測定試薬から反応セル又はノズル（プローブ）を介して混入する肝エステラーゼの影響を受けて測定値に誤差が生じるという短所を有する方法であった。【０００８】
前記の各測定方法に加えて、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［以下、「ＤＧＧＭＲ」ということがある］をリパーゼの基質として用いる血清又は血漿中のリパーゼ活性の測定方法が開発された（特許文献１及び非特許文献２参照。）。
この方法では、この１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［ＤＧＧＭＲ］を血清試料等と接触させ、反応させることにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール及びグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルが生成する。
このグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルは不安定であって、容易に自然に加水分解されて６’−メチルレゾルフィン（λｍａｘ：５８０ｎｍ）を生成する。
この生成する６’−メチルレゾルフィンの増加を５８０ｎｍ又はその近辺の波長の吸光度を測ることによって測定し、試料中に含まれていたリパーゼの活性値を求めることができる。
このＤＧＧＭＲをリパーゼの基質として用いるリパーゼ活性の測定方法は、測定が一連の反応で進むシンプルなものであり、かつ他の測定試薬から反応セル又はノズル（プローブ）を介して混入するエステラーゼの影響を受けにくいという長所を有する方法である。【０００９】
また、血清又は血漿等に含まれるリパーゼは、エマルジョン化したトリグリセライド基質の水と油との界面で最も効率よく作用し、このリパーゼの反応速度は分散した基質の表面積に関係するので、このリパーゼの活性測定には安定で均一なミセル粒子からなる基質の調製が重要であるとされている（非特許文献２参照。）。
このため、従来、リパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液（リパーゼ活性測定用基質溶液）を製造するに当っては、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化（乳化）した基質溶液となるよう、種々の方法が考えられてきたが、基質を界面活性剤を含む水溶液に混合したり、基質をアルコールなどの有機溶媒を含む溶液に混合したり、基質含有液を滴々と滴下して溶液に混合したり、基質含有液を溶液に噴射注入したり、基質溶液を強力なミキサーで高速に撹拌したり、又は基質溶液に超音波を掛ける処理を行ったり等の煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理が必要であったり、又は特別な装置若しくは器具などの物等が必要であった。【００１０】
ところで、リパーゼ活性測定用基質を含有する溶液は一般に不安定であり、その保存安定性に問題があった。
このため、リパーゼ活性測定用基質を含有する溶液の保存安定性の改善を目的として種々の試みが行われた。【００１１】
例えば、リパーゼの基質となるトリグリセライド等の非水溶性物質を非イオン性界面活性剤を含む水溶液に加え、撹拌しながら加熱し、一度非イオン性界面活性剤の曇点より高い温度に上げ、更に撹拌を続けながら曇点以下に冷却することを特徴とする、非水溶性物質の透明な可溶化水溶液の製造方法が、従来困難であった非水溶性物質の可溶化を可能にし、しかも得られる可溶化水溶液は極めて安定であるとの効果を奏するものとして開示された（特許文献２参照。）。【００１２】
また、低濃度のｐＨ緩衝液、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系非イオン性界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を含有することを特徴とするリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液が、長期保存安定性に優れたジグリセリドの水溶液を提供すること等が可能であるとの効果を奏するものとして開示された（特許文献３参照。）。【００１３】
また、少なくともポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系非イオン性界面活性剤等の非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリドを基質として用いることを特徴とする植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物が、長期保存安定性に優れたジグリセリドの水溶液を含有するキット、組成物の提供が可能になる等の効果を奏するものとして開示された（特許文献４参照。）。【００１４】
また、前記のＤＧＧＭＲよりなるリパーゼ基質等に対して、新規なリパーゼ基質可溶化剤である１，２−ジフタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンにより可溶化した酵素活性測定用リパーゼ基質溶液等が、保存安定性が大きく、溶液の高い透明度を長期間にわたって保持することも可能であるとの効果を奏するものとして開示された（特許文献５参照。）。【００１５】
また、前記のＤＧＧＭＲよりなるリパーゼ基質と側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物を混合し混合物を調製し、当該混合物の全部又は一部を水又は水溶液と混合する工程を含むことを特徴とするリパーゼ活性測定溶液の製造方法として開示された（特許文献６参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開昭６１−２５４１９７号公報
【特許文献２】特開昭５８−１５６３３０号公報
【特許文献３】国際公開第０６／０５４６８１号パンフレット
【特許文献４】特開２００７−３０６８２１号公報
【特許文献５】特開平１１−３１８４９４号公報
【特許文献６】国際公開第２０１６／０２４５４９号パンフレット
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】臨床検査法提要，第３０版，第６７０頁〜第６７４頁，金井正光編著，金原出版，１９９３年８月２０日発行
【非特許文献２】臨床検査法提要，第３３版，第５４５頁〜第５４７頁，金井正光監修，金原出版，２０１０年４月１日発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
試薬には、不安定なものが多く、保存中に劣化して使用できなくなってしまうことが多々ある。
特に、臨床検査試薬を自動分析装置で使用するといった、試薬を開封状態で使用せざるを得ない場合には、開封状態とすることにより生じる種々の要因により、試薬の劣化は著しい。【００１９】
例えば、空気中の酸素が試薬に溶け込むことにより、試薬中の成分が酸化され、劣化してしまうことがある。
また、空気中の二酸化炭素が試薬中に溶け込むことにより、試薬のｐＨが低下し、本来の機能が果たせなくなってしまうことがある。
更に、試薬中に二酸化炭素が溶け込むことにより、被検物質（測定しようとする物質）が二酸化炭素により阻害を受けてしまい、正確な測定が出来なくなってしまう場合もある。【００２０】
本発明者らは、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定試薬を自動分析装置にセットして試料中のリパーゼ活性値の測定を行なってゆく際に、測定により得られる吸光度値が経時的に低下してゆくことに気付いた。【００２１】
本発明者らは、検討の結果、自動分析装置の試薬庫における近傍の他の臨床検査用試薬中に防腐剤として含有させたアジ化ナトリウム等のアジ化物がアジ化水素として気化し、その気化したアジ化物が同じ試薬庫中のリパーゼ活性測定用基質溶液に溶け込むことにより、当該リパーゼ活性測定用基質溶液に含まれるＤＧＧＭＲが劣化してしまい、試料中のリパーゼ活性値の測定により得られる吸光度値が経時的に低下してゆくことを見い出した。【００２２】
更に、本発明者らは、自動分析装置において、試薬に含まれるアジ化物が自動分析装置の試薬プローブ（試薬採取口）に付着することにより、この試薬プローブが次の試薬であるリパーゼ活性測定用基質溶液（ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含むもの）を採取した際に、試薬プローブに付着したアジ化物がそのリパーゼ活性測定用基質溶液に混入し、当該リパーゼ活性測定用基質溶液に含まれるＤＧＧＭＲを劣化させ、試料中のリパーゼ活性値の測定により得られる吸光度値が低下することを見い出した。【００２３】
このようにＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含む従来のリパーゼ活性測定用基質溶液は、他の臨床検査用試薬中に含まれるアジ化物が混入することにより、ＤＧＧＭＲが劣化してしまい、測定により得られる吸光度値が低下してしまうものであった。【００２４】
これに対して、本発明の課題は、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液において、例えアジ化物が混入しても、ＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができるリパーゼ活性測定用基質溶液を提供することである。【００２５】
また、本発明の課題は、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定試薬において、例えアジ化物が混入しても、ＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができるリパーゼ活性測定試薬を提供することである。【００２６】
また、本発明の課題は、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液を使用するリパーゼ活性測定方法において、例えアジ化物が混入しても、ＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができるリパーゼ活性測定方法を提供することである。【００２７】
更に、本発明の課題は、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として使用するリパーゼ活性測定において、例えアジ化物が混入しても、ＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができるアジ化物の影響の抑制方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明者らは、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液及びリパーゼ活性測定試薬、リパーゼ活性測定方法並びにアジ化物の影響の抑制方法について検討を重ねたところ、リパーゼ活性測定用基質溶液において、ＤＧＧＭＲと共に還元剤を含有させることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００２９】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液において、還元剤を含有することを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液。
（２）前記（１）に記載のリパーゼ活性測定用基質溶液を含むことを特徴とするリパーゼ活性測定試薬。
（３）１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液を使用するリパーゼ活性測定方法において、リパーゼ活性測定用基質溶液に還元剤を含有させることを特徴とするリパーゼ活性測定方法。
（４）１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液に還元剤を含有させることを特徴とするリパーゼ活性測定に対するアジ化物の影響の抑制方法。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、混入したアジ化物によるＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができるリパーゼ活性測定用基質溶液である。
また、本発明のリパーゼ活性測定試薬は、混入したアジ化物によるＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができるリパーゼ活性測定試薬である。
また、本発明のリパーゼ活性測定方法は、混入したアジ化物によるＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができるリパーゼ活性測定方法である。
また、本発明のアジ化物の影響の抑制方法は、混入したアジ化物によるＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができるアジ化物の影響の抑制方法である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
〔１〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液
Ｉ．総論
１．リパーゼ活性測定用基質溶液
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［ＤＧＧＭＲ］をリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液において、還元剤を含有することを特徴とするものである。
【００３２】
そして、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、上記の構成により、混入したアジ化物によるＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができるものである。
【００３３】
２．リパーゼ
本発明において、リパーゼは、リパーゼとしての活性、すなわちリパーゼ活性を有するものであればよく、このリパーゼ活性を有するものであれば特に限定はない。
【００３４】
本発明において、リパーゼとしては、例えば、長鎖脂肪酸の３分子がそれぞれグリセロールにエステル結合したトリグリセライド（ＴＧ）のα位（１位、３位）のエステル結合を加水分解して、２分子の脂肪酸及び１分子のβ−モノグリセライドを生成する反応を触媒する膵リパーゼ［ＥＣ  ３．１．１．３］等を挙げることができる。
【００３５】
本発明は、体液、臓器又は組織に存在するリパーゼの活性測定にとって好適であり、体液に存在するリパーゼの活性測定にとってより好適であり、血液、血清又は血漿に存在するリパーゼの活性測定にとって更に好適であり、血清又は血漿に存在するリパーゼの活性測定にとって特に好適である。
【００３６】
また、本発明は、膵リパーゼの活性測定にとって好適である。
【００３７】
ＩＩ．リパーゼ活性測定用基質溶液
１．総論
前記の通り、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル、及び界面活性剤よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液であって、還元剤を含有するものであることが好ましい。
【００３８】
本発明における、このＤＧＧＭＲ、及び界面活性剤よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液であって、還元剤を含有するものについて、以下説明する。
【００３９】
なお、この本発明におけるエマルジョン溶液［すなわち、ＤＧＧＭＲ、及び界面活性剤よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液であって、還元剤を含有するもの］は、後述の通り、ＤＧＧＭＲ、界面活性剤、及び還元剤以外の物を含んでよいものである。
【００４０】
２．リパーゼ活性測定用基質
（１）総論
本発明において、試料中に含まれるリパーゼの活性の測定に使用するためのリパーゼの基質、すなわちリパーゼ活性測定用基質は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［ＤＧＧＭＲ］である。
【００４１】
本発明においては、リパーゼ活性測定用基質であるＤＧＧＭＲを試料と接触させ、試料中に含まれるリパーゼと反応させることにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、ＤＧＧＭＲより１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール及びグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルが生成する。
このグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルは不安定であって、容易に自然に加水分解されて６’−メチルレゾルフィン（λｍａｘ：５８０ｎｍ）を生成する。
本発明においては、この生成する６’−メチルレゾルフィンの増加を５８０ｎｍ又はその近辺の波長の吸光度を測ることによって測定し、試料中に含まれていたリパーゼの活性値を求めることができる。
【００４２】
なお、ＤＧＧＭＲは、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］、又はシグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社［日本国］等より市販されている。
【００４３】
（２）リパーゼ活性測定用基質の濃度
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液におけるＤＧＧＭＲの濃度であるが、この本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液におけるＤＧＧＭＲの濃度が０．０５ｍＭ以上であることが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液とする上で好ましい。
【００４４】
なお、この本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液におけるＤＧＧＭＲの濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、特に好ましくは０．２ｍＭ以上である。
【００４５】
また、この本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液に含有させるＤＧＧＭＲの濃度であるが、前記の目的の上から、２ｍＭ以下であることが好ましい。
【００４６】
なお、この本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液におけるＤＧＧＭＲの濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは１ｍＭ以下であり、特に好ましくは０．８ｍＭ以下である。
【００４７】
３．還元剤
（１）総論
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液において、還元剤を含有することを特徴とするものである。
【００４８】
これにより、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、混入したアジ化物によるＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができるものである。
そして、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、ＤＧＧＭＲ、及び界面活性剤よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液であって、還元剤を含有するものであることが好ましい。
【００４９】
（２）本発明における還元剤
本発明における還元剤としては、特に限定はなく、還元能力を有するものであればよい。
【００５０】
この還元剤としては、例えば、ヒドロキシルアンモニウム塩、又はチオール化合物等を挙げることができる。
【００５１】
（ａ）ヒドロキシルアンモニウム塩
本発明において、このヒドロキシルアンモニウム塩としては、例えば、塩化ヒドロキシルアンモニウム、硝酸ヒドロキシルアンモニウム、又は硫酸ヒドロキシルアンモニウム等を挙げることができる。
【００５２】
（ｂ）チオール化合物
本発明において、このチオール化合物としては、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、チオグリセロール、還元型グルタチオン、システイン、ジチオエリスリトール、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、２−チオグルコース、チオグリコール酸、２−メルカプトエタノール、Ｎ−グアニル−Ｌ−システイン、メルカプト酢酸、メルカプトコハク酸、２−メルカプトエタンスルホン酸、又はシステアミン等のＳＨ基を有する化合物を挙げることができる。
【００５３】
（３）濃度
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における還元剤の濃度は、特に限定されないが、０．０１ｍＭ以上であることが好ましい。
【００５４】
なお、この還元剤の好ましい濃度の下限は、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、特に好ましくは０．５ｍＭ以上である。
【００５５】
また、この還元剤の濃度であるが、上限は特にはないが、コスト等のことを考えると１００ｍＭ迄で十分である。
【００５６】
なお、この還元剤の好ましい濃度の下限は、より好ましくは１０ｍＭ以下であり、特に好ましくは５ｍＭ以下である。
【００５７】
（４）還元剤の使用等
本発明において、還元剤は、１種類のものを使用してもよく、又は複数種類のものを使用してもよい。
【００５８】
本発明において、混入したアジ化物によるＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制する目的のためには、還元剤としては、ヒドロキシルアンモニウム塩が好ましく、特に塩化ヒドロキシルアンモニウムが好ましい。
【００５９】
４．界面活性剤
（１）総論
前記の通り、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、ＤＧＧＭＲ、及び界面活性剤よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液であって、還元剤を含有するものであることが好ましい。
【００６０】
この界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【００６１】
この、非イオン性界面活性剤としては、例えば、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物等を挙げることができる。
【００６２】
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル、又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物が好ましく、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルが特に好ましい。
【００６３】
ＤＧＧＭＲ、及び界面活性剤よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液であって、還元剤を含有するものであるリパーゼ活性測定用基質溶液は、すなわち、エマルジョン溶液であって、ＤＧＧＭＲ、界面活性剤、及び還元剤を含有するものである。
【００６４】
（２）側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル
側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル［以下、「本変性シリコーンオイル」ということがある］について、以下説明する。
【００６５】
シリコーン化合物は、シロキサン結合〔−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ−〕が主鎖であって、側鎖としてメチル基〔ＣＨ３−〕等の有機基がケイ素原子に結合した重合体化合物である。
そして、直鎖状のシリコーン化合物がシリコーンオイルである。
【００６６】
なお、変性シリコーンオイルは、直鎖状のジメチルシリコーン化合物〔Ｓｉ（ＣＨ３）３−Ｏ−［Ｓｉ（ＣＨ３）２−Ｏ−］ｍ−Ｓｉ（ＣＨ３）３〕の一部のケイ素原子に有機基を導入した化合物である。
この変性シリコーンオイルとしては、ポリシロキサンの側鎖の一部、ポリシロキサンのどちらか片方の末端、ポリシロキサンの両方の末端、又はポリシロキサンの側鎖の一部と両方の末端に、各種の有機基を導入したシリコーンオイルが存在する。
【００６７】
この内、ポリシロキサンの側鎖の一部に各種の有機基を導入したシリコーンオイルが、側鎖型の変性シリコーンオイル〔Ｓｉ（ＣＨ３）３−Ｏ−［Ｓｉ（ＣＨ３）２−Ｏ−］ｍ−［Ｓｉ（ＣＨ３）（有機基）−Ｏ−］ｎ−Ｓｉ（ＣＨ３）３〕である。
【００６８】
なお、この導入する有機基の性質によって、変性シリコーンオイルは、反応性シリコーンオイルと非反応性シリコーンオイルに分類される。
【００６９】
この内、非反応性の変性シリコーンオイルとしては、その導入有機基により、ポリエーテル変性タイプ、アラルキル変性タイプ、フロロアルキル変性タイプ、長鎖アルキル変性タイプ、高級脂肪酸エステル変性タイプ、高級脂肪酸アミド変性タイプ、ポリエーテル・長鎖アルキル・アラルキル変性タイプ、長鎖アルキル・アラルキル変性タイプ、又はフェニル変性タイプ等を挙げることができる。
【００７０】
そして、側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル〔Ｓｉ（ＣＨ３）３−Ｏ−［Ｓｉ（ＣＨ３）２−Ｏ−］ｍ−［Ｓｉ（ＣＨ３）（有機基）−Ｏ−］ｎ−Ｓｉ（ＣＨ３）３〕としては、その変性タイプが、例えば、ポリエーテル変性タイプのもの〔有機基：−Ｒ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂＲ’〕、ポリエーテル・長鎖アルキル・アラルキル変性タイプのもの〔有機基：−Ｒ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂＲ’、−ＣａＨ２ａ＋１、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ６Ｈ５〕、アラルキル変性タイプのもの〔有機基：−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ６Ｈ５〕、フロロアルキル変性タイプのもの〔有機基：−ＣＨ２ＣＨ２ＣＦ３〕、長鎖アルキル変性タイプのもの〔有機基：−ＣａＨ２ａ＋１〕、長鎖アルキル・アラルキル変性タイプのもの〔有機基：−ＣａＨ２ａ＋１、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ６Ｈ５〕、高級脂肪酸エステル変性タイプのもの〔有機基：−ＯＣＯＲ〕、高級脂肪酸アミド変性タイプのもの〔有機基：−ＲＮＨＣＯＲ’〕、又はフェニル変性タイプのもの〔有機基：−Ｃ６Ｈ５〕等を挙げることができる。
【００７１】
本発明においては、この側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル〔Ｓｉ（ＣＨ３）３−Ｏ−［Ｓｉ（ＣＨ３）２−Ｏ−］ｍ−［Ｓｉ（ＣＨ３）（有機基）−Ｏ−］ｎ−Ｓｉ（ＣＨ３）３〕［有機基：−Ｒ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂＲ’］を用いることが好ましい。
【００７２】
この側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルとしては、例えば、「ＫＦ−３５１Ａ」、「ＫＦ−３５４Ｌ」、「ＫＦ−３５５Ａ」、又は「ＫＦ−６０１１」［販売元はいずれの製品も信越化学工業株式会社（日本国）］等が市販されている。
【００７３】
（３）ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物
ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物［以下、「本ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物」ということがある］について、以下説明する。
【００７４】
前記の通り、非イオン性界面活性剤として、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物〔ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｃＨ〕を挙げることができる。
【００７５】
このポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物（本ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物）としては、例えば、ポリオキシエチレン（１６）ポリオキシプロピレングリコール（１７）〔医薬部外品原料規格名：ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（１６Ｅ．Ｏ．）（１７Ｐ．Ｏ．）〕、又はポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレングリコール（２０）〔医薬部外品原料規格名：ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（２０Ｅ．Ｏ．）（２０Ｐ．Ｏ．）〕等を挙げることができる。
【００７６】
この本ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物としては、例えば、ポリオキシエチレン（１６）ポリオキシプロピレングリコール（１７）［製品名：「プルロニック  Ｌ−３４」、販売元：株式会社ＡＤＥＫＡ（日本国）］、又はポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレングリコール（２０）［製品名：「プルロニック  Ｌ−４４」、販売元：株式会社ＡＤＥＫＡ（日本国）］等が市販されている。
【００７７】
（４）界面活性剤の濃度
ＤＧＧＭＲ、及び界面活性剤よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液であって、還元剤を含有するものであるリパーゼ活性測定用基質溶液において、界面活性剤の濃度は０．０１％（ｗ／ｖ）以上であることが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液とする上で好ましい。
【００７８】
なお、このリパーゼ活性測定用基質溶液における界面活性剤の濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上である。
【００７９】
また、このリパーゼ活性測定用基質溶液に含有させる界面活性剤の濃度であるが、前記の目的の上から、２０％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましい。
【００８０】
なお、このリパーゼ活性測定用基質溶液における界面活性剤の濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下である。
【００８１】
５．リパーゼ賦活化剤
（１）リパーゼ賦活化剤
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液には、リパーゼ賦活化剤を含有させてもよい。
【００８２】
本発明において、リパーゼ賦活化剤としては、リパーゼを賦活化することができる物質であればよく、特に限定はないが、例えば、胆汁酸又はその塩等を挙げることができる。
【００８３】
この胆汁酸としては、例えば、デオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、コール酸、リトコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、７−オキソリトコール酸、１２−オキソリトコール酸、１２−オキソケノデオキシコール酸、７−オキソデオキシコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、デヒドロコール酸、又はコール酸誘導体等を挙げることができる。
【００８４】
また、この胆汁酸の塩としては、例えば、胆汁酸とアルカリ金属若しくはアルカリ土類金属との塩又はアンモニウム塩等を挙げることができる。
このアルカリ金属としては、例えば、カリウム、ナトリウム又はリチウム等を挙げることができ、また、このアルカリ土類金属としては、例えば、マグネシウム又はカルシウム等を挙げることができる。
【００８５】
リパーゼ賦活化剤としては、そのリパーゼ賦活化能、リパーゼ活性測定用基質よりなる界面の形成能力、水溶性、及びコスト等の点から、胆汁酸又はその塩が好ましい。
【００８６】
そして、胆汁酸としては、リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲが安定な酸性域において溶解可能な点でタウロデオキシコール酸が好ましく、また、コストの点からデオキシコール酸が好ましい。
この胆汁酸としては、タウロデオキシコール酸が特に好ましい。
【００８７】
そして、胆汁酸の塩としては、胆汁酸とアルカリ金属の塩が好ましく、胆汁酸のカリウム塩又はナトリウム塩がより好ましく、胆汁酸のナトリウム塩が特に好ましい。
【００８８】
よって、胆汁酸の塩としては、デオキシコール酸又はタウロデオキシコール酸のアルカリ金属（カリウム若しくはナトリウム等）の塩が好ましく、タウロデオキシコール酸のアルカリ金属（カリウム又はナトリウム等）の塩がより好ましく、タウロデオキシコール酸のナトリウム塩が特に好ましい。
【００８９】
（２）リパーゼ賦活化剤の濃度
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、リパーゼ賦活化剤は、その濃度が０．２％（ｗ／ｖ）以上の濃度であることが好ましい。
【００９０】
なお、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、このリパーゼ賦活化剤の好ましい濃度は、より好ましくは０．４％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上である。
【００９１】
また、このリパーゼ賦活化剤の濃度であるが、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、２０％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましい。
【００９２】
なお、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、このリパーゼ賦活化剤の好ましい濃度は、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下である。
【００９３】
６．リパーゼ活性化剤
（１）リパーゼ活性化剤
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液には、リパーゼ活性化剤を含有させてもよい。
【００９４】
本発明において、リパーゼ活性化剤としては、リパーゼを活性化することができる物質であればよく、特に限定はないが、例えば、アルカリ土類金属イオン又はその塩等を挙げることができる。
【００９５】
このアルカリ土類金属イオン又はその塩としては、例えば、ベリリウムイオン若しくはベリリウム塩、マグネシウムイオン若しくはマグネシウム塩、又はカルシウムイオン若しくはカルシウム塩等を挙げることができる。
【００９６】
このカルシウム塩としては、例えば、水溶性のカルシウム塩等を挙げることができ、より具体的には、１価又は２価以上の陰イオンとカルシウムイオンよりなる塩であって水溶性であるもの等を挙げることができる。
【００９７】
なお、この陰イオンとしては、例えば、ハロゲンイオン、有機化合物よりなる酸基、又はその他の無機化合物よりなる酸基等を挙げることができる。
【００９８】
そして、ハロゲンイオンとしては、例えば、フッ素イオン、又は塩素イオン等を挙げることができる。
【００９９】
有機化合物よりなる酸基としては、例えば、酢酸イオン、クエン酸イオン、又はグルコン酸イオン等を挙げることができる。
【０１００】
その他の無機化合物よりなる酸基としては、例えば、硫酸イオン、リン酸イオン、又は炭酸イオン等を挙げることができる。
【０１０１】
このリパーゼ活性化剤としては、アルカリ土類金属イオン又はその塩が好ましい。
【０１０２】
なお、アルカリ土類金属イオン又はその塩としては、次の（ｉ）及び（ｉｉ）の点から、カルシウムイオン又はカルシウム塩が好ましい。
（ｉ）  リパーゼの活性化能。
（ｉｉ）  リパーゼの触媒作用を受けることによりリパーゼ活性測定用基質から遊離した脂肪酸は、リパーゼ活性測定用基質よりなる界面を壊すが、カルシウムイオン又はカルシウム塩はこの遊離した脂肪酸を捕捉し、当該界面が壊れるのを抑制することができる。
【０１０３】
そして、このカルシウム塩としては、陰イオンとカルシウムイオンよりなる塩であって水溶性であるものが好ましい。
【０１０４】
そして、この陰イオンとしては、ハロゲンイオン又は有機化合物よりなる酸基が好ましい。より具体的には、塩素イオン又は酢酸イオンが特に好ましい。
【０１０５】
よって、カルシウム塩としては、ハロゲンイオンのカルシウム塩又は有機化合物よりなる酸基のカルシウム塩が好ましく、より具体的には、塩化カルシウム又は酢酸カルシウムが特に好ましい。
【０１０６】
（２）リパーゼ活性化剤の濃度
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、リパーゼ活性化剤は、その濃度が０．１ｍＭ以上の濃度であることが好ましい。
【０１０７】
なお、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、このリパーゼ活性化剤の好ましい濃度は、より好ましくは１ｍＭ以上であり、特に好ましくは５ｍＭ以上である。
【０１０８】
また、このリパーゼ活性化剤の濃度であるが、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、１００ｍＭ以下であることが好ましい。
【０１０９】
なお、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、このリパーゼ活性化剤の好ましい濃度は、より好ましくは５０ｍＭ以下であり、特に好ましくは２５ｍＭ以下である。
【０１１０】
７．コリパーゼ
（１）コリパーゼ
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液には、コリパーゼを含有させてもよい。
【０１１１】
本発明において、コリパーゼとしては、コリパーゼの作用、機能又は活性を有しているものであればよく、特に限定はないが、例えば、ヒト、若しくはブタなどの哺乳類由来のコリパーゼ又は遺伝子工学等を用いて調製、修飾若しくは改変されたコリパーゼ等を挙げることができる。
【０１１２】
このコリパーゼとしては、ブタなどの哺乳類由来のコリパーゼが好ましく、ブタなどの哺乳類の膵臓由来のコリパーゼがより好ましい。
【０１１３】
（２）コリパーゼの活性値
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、コリパーゼは、その活性値が１５Ｋ単位／Ｌ（１５Ｋ Ｕｎｉｔ／Ｌ）以上であることが好ましい。
【０１１４】
なお、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、このコリパーゼの好ましい活性値は、より好ましくは１５０Ｋ単位／Ｌ以上であり、特に好ましくは７５０Ｋ単位／Ｌ以上である。
【０１１５】
また、このコリパーゼの活性値であるが、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、７，５００Ｋ単位／Ｌ以下であることが好ましい。
【０１１６】
なお、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、このコリパーゼの好ましい活性値は、より好ましくは３，７５０Ｋ単位／Ｌ以下であり、特に好ましくは２，２５０Ｋ単位／Ｌ以下である。
【０１１７】
なお、本明細書におけるコリパーゼの各活性値（単位／Ｌ）は、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］のブタ膵臓由来のコリパーゼの活性値の表示に基づくものである。［１ｍｇ／Ｌ＝７５Ｋ単位／Ｌ］
【０１１８】
なお、コリパーゼは、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］、又はシグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社［日本国］等より市販されている。
【０１１９】
８．水
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液には、水を含有させてもよい。
すなわち、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、水溶液又は水性懸濁液であってよい。
【０１２０】
この本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液に含有させる水は、特に限定はないが、例えば、純水、蒸留水又は精製水等を挙げることができる。
【０１２１】
９．ｐＨ
本発明におけるリパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲは、ｐＨ４又はその付近のｐＨにおいて安定である。
よって、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、そのｐＨはｐＨ４を中心とする一定の範囲内のものであることが好ましい。
【０１２２】
具体的には、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、ＤＧＧＭＲの安定性の点から、ｐＨ２〜ｐＨ７の範囲内にあることが好ましく、ｐＨ３〜ｐＨ５の範囲内にあることがより好ましく、そして、ｐＨ３．５〜ｐＨ４．５の範囲内にあることが特に好ましい。（前記のｐＨ値はいずれも２０℃での値である。）
【０１２３】
１０．緩衝剤
（１）緩衝剤
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液には、緩衝剤を含有させてもよい。
【０１２４】
本発明においては、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液のｐＨを、前記９に記載のｐＨ範囲に保つため、前記９記載のｐＨ範囲に緩衝能を有する緩衝剤を本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液に適宜含有させてもよい。
【０１２５】
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液に含有させることができる緩衝剤としては、特に限定はないが、例えば、酒石酸、コハク酸、マロン酸、若しくはクエン酸などの有機酸、又はグリシン、若しくはリン酸、或いはこれらの塩等を挙げることができる。
【０１２６】
（２）緩衝剤の濃度
本発明において、緩衝剤を本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液に含有させる場合の濃度は、特に限定はなく、設定するｐＨの範囲において緩衝能を発揮することができる濃度であればよい。
【０１２７】
例えば、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、この緩衝剤の濃度は、好ましくは５ｍＭ以上であり、より好ましくは１０ｍＭ以上であり、特に好ましくは３０ｍＭ以上である。
【０１２８】
また、この緩衝剤の濃度は、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、好ましくは５００ｍＭ以下であり、より好ましくは１００ｍＭ以下であり、特に好ましくは５０ｍＭ以下である。
【０１２９】
１１．リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径
先に記載した通り、リパーゼは、エマルジョン化したトリグリセライド基質の水と油との界面で最も効率よく作用し、このリパーゼの反応速度は分散した基質の表面積に関係するので、このリパーゼの活性測定には安定で均一なミセル粒子からなる基質の調製が重要であるとされている（非特許文献２参照。）。
【０１３０】
本発明において、リパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］を含有するリパーゼ活性測定用基質溶液は、そのエマルジョンのミセル径（ミセル粒子径）が６０〜１，５００ｎｍの範囲にあると、リパーゼとの反応の速度が高く、また、このエマルジョンが安定であり、リパーゼ活性測定用基質溶液を長期間保存・使用できるので好ましい。
【０１３１】
この理由により、リパーゼ活性測定用基質溶液は、そのエマルジョンのミセル径（ミセル粒子径）が７０〜１，０００ｎｍの範囲にあることがより好ましく、８０〜６００ｎｍの範囲にあることが更に好ましく、そして、１００〜２００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。
【０１３２】
ＩＩＩ．リパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法
１．総論
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を製造する方法であるが、上記の「ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液において、還元剤を含有することを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液」という構成の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を製造することができる方法であればよく、特に限定はない。
【０１３３】
なお、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を製造する方法としては、例えば、次の（ａ）及び（ｂ）の工程よりなる方法等を挙げることができる。なお、本発明において、この「次の（ａ）及び（ｂ）の工程よりなる方法」は、「次の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法」をも含むことを意味するものである。
この（ａ）及び（ｂ）の工程よりなる方法は、煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理、又は特別な装置若しくは器具などの物等を必要とせずに、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を製造することができるので、好ましい。
【０１３４】
（ａ）  ＤＧＧＭＲと、界面活性剤を混合し混合物を調製する工程
【０１３５】
（ｂ）  前記（ａ）の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程
【０１３６】
２．ＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合し混合物を調製する工程
前記１における（ａ）の工程、すなわち、「ＤＧＧＭＲと、界面活性剤を混合し混合物を調製する工程」について、以下、詳細に説明する。
【０１３７】
（１）ＤＧＧＭＲと界面活性剤の混合
前記１の（ａ）の工程、すなわち、「ＤＧＧＭＲと、界面活性剤を混合し混合物を調製する工程」においては、リパーゼ活性測定用基質であるＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合する。
すなわち、ＤＧＧＭＲと界面活性剤とを直接混合する。
【０１３８】
なお、界面活性剤は、１種類のものをＤＧＧＭＲと混合してもよく、又は複数種類のものをＤＧＧＭＲと混合してもよい。
【０１３９】
（２）ＤＧＧＭＲの混合量
リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲと、界面活性剤を混合し混合物を調製する工程において、このＤＧＧＭＲを混合する量は、特に限定されない。
【０１４０】
なお、このＤＧＧＭＲは、前記１の（ｂ）の工程である「ＤＧＧＭＲと界面活性剤の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程」における当該「ＤＧＧＭＲと界面活性剤の混合物の全部又は一部」と当該「水又は水溶液」との混合（以下、「第２混合」ということがある）の後に、その濃度が０．０５ｍＭ以上であることが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。
【０１４１】
なお、この第２混合の後（第２混合後）、このＤＧＧＭＲの好ましい濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、特に好ましくは０．２ｍＭ以上である。
【０１４２】
また、このＤＧＧＭＲの濃度であるが、第２混合後、前記の目的の上から、２ｍＭ以下であることが好ましい。
【０１４３】
なお、第２混合後、このＤＧＧＭＲの好ましい濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは１ｍＭ以下であり、特に好ましくは０．８ｍＭ以下である。
【０１４４】
第２混合後のＤＧＧＭＲの好ましい濃度は、以上述べた通りである。
なお、前記１の（ａ）の「ＤＧＧＭＲと、界面活性剤を混合し混合物を調製する工程」における当該ＤＧＧＭＲと当該界面活性剤との混合（以下、「第１混合」ということがある）の時の当該ＤＧＧＭＲ及び当該界面活性剤それぞれの混合量を、第２混合後にＤＧＧＭＲの濃度が上記の通りになるように、考慮の上決めてもよく、このようにすることが、その製造手順の上から好ましい。
【０１４５】
なお、このＤＧＧＭＲの混合量及び濃度であるが、例えば、次の（ａ）又は（ｂ）などのように考えることができる。
【０１４６】
（ａ）リパーゼ活性測定用基質と界面活性剤の混合物の全部を水又は水溶液と混合する場合
第１混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をＷｓ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とし、そしてリパーゼ活性測定用基質の分子量をＭＷｓとした場合、第２混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Ｃｓ［単位：ｍＭ］は次の式で表すことができる。
【０１４７】
Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０６）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）
【０１４８】
なお、リパーゼ活性測定用基質であるＤＧＧＭＲの分子量ＭＷｓは７５２．０５であるので、上記の式は次のようになる。
【０１４９】
Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０６）÷（Ｖｆ×７５２．０５）
【０１５０】
よって、この場合の第１混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質（ＤＧＧＭＲ）の混合量Ｗｓ［単位：グラム］は次のように表すことができる。
【０１５１】
Ｗｓ＝（Ｃｓ×Ｖｆ×ＭＷｓ）÷１０６
【０１５２】
すなわち、Ｗｓ＝（Ｃｓ×Ｖｆ×７５２．０５）÷１０６
【０１５３】
（ｂ）リパーゼ活性測定用基質と界面活性剤の混合物の一部を水又は水溶液と混合する場合
第１混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をＷｓ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とし、リパーゼ活性測定用基質の分子量をＭＷｓとし、そして第１混合時の混合物のＡ％（重量又は容量）を第２混合時に水又は水溶液と混合した場合、第２混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Ｃｓ［単位：ｍＭ］は次の式で表すことができる。
【０１５４】
Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０６）×（Ａ÷１００）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）＝（Ｗｓ×Ａ×１０４）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）
【０１５５】
なお、リパーゼ活性測定用基質であるＤＧＧＭＲの分子量ＭＷｓは７５２．０５であるので、上記の式は次のようになる。
【０１５６】
Ｃｓ＝（Ｗｓ×Ａ×１０４）÷（Ｖｆ×７５２．０５）
【０１５７】
よって、この場合の第１混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量Ｗｓ［単位：グラム］は次のように表すことができる。
【０１５８】
Ｗｓ＝（Ｃｓ×Ｖｆ×ＭＷｓ）÷（Ａ×１０４）
【０１５９】
すなわち、Ｗｓ＝（Ｃｓ×Ｖｆ×７５２．０５）÷（Ａ×１０４）
【０１６０】
（３）界面活性剤の混合量
リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合し混合物を調製する工程において、この界面活性剤を混合する量は、特に限定されない。
【０１６１】
なお、界面活性剤は、第２混合の後に、その濃度が０．０１％（ｗ／ｖ）以上であることが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。
【０１６２】
なお、第２混合の後（第２混合後）、この界面活性剤の好ましい濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上である。
【０１６３】
また、この濃度であるが、第２混合後、前記の目的の上から、２０％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましい。
【０１６４】
なお、第２混合後、この界面活性剤の好ましい濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下である。
【０１６５】
第２混合後の界面活性剤の好ましい濃度は、以上述べた通りである。
【０１６６】
なお、第１混合時の当該ＤＧＧＭＲ及び当該界面活性剤それぞれの混合量を、第２混合後に界面活性剤の濃度が上記の通りになるように、考慮の上決めてもよく、このようにすることが、その製造手順の上から好ましい。
【０１６７】
なお、この界面活性剤の混合量及び濃度であるが、例えば、次の（ａ）又は（ｂ）などのように考えることができる。
【０１６８】
（ａ）リパーゼ活性測定用基質と界面活性剤の混合物の全部を水又は水溶液と混合する場合
第１混合時に混合させる界面活性剤の混合量をＷｐ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とした場合、第２混合後の界面活性剤の濃度Ｃｐ［単位：％（ｗ／ｖ）］は次の式で表すことができる。
【０１６９】
Ｃｐ＝（Ｗｐ×１００）÷Ｖｆ
【０１７０】
よって、この場合の第１混合時に混合させる界面活性剤の混合量Ｗｐ［単位：グラム］は次のように表すことができる。
【０１７１】
Ｗｐ＝（Ｃｐ×Ｖｆ）÷１００
【０１７２】
（ｂ）リパーゼ活性測定用基質と界面活性剤の混合物の一部を水又は水溶液と混合する場合
第１混合時に混合させる界面活性剤の混合量をＷｐ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とし、そして第１混合時の混合物のＡ％（重量又は容量）を第２混合時に水又は水溶液と混合した場合、第２混合後の界面活性剤の濃度Ｃｐ［単位：％（ｗ／ｖ）］は次の式で表すことができる。
【０１７３】
Ｃｐ＝（Ｗｐ×１００）×（Ａ÷１００）÷Ｖｆ＝（Ｗｐ×Ａ）÷Ｖｆ
【０１７４】
よって、この場合の第１混合時に混合させる界面活性剤の混合量Ｗｐ（単位：グラム）は次のように表すことができる。
【０１７５】
Ｗｐ＝（Ｃｐ×Ｖｆ）÷Ａ
【０１７６】
（４）混合の方法
ＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合し混合物を調製する工程において、このＤＧＧＭＲと界面活性剤とを混合する方法は、このＤＧＧＭＲと界面活性剤が混合するのであればいずれの方法でもよく、特に限定はない。
【０１７７】
なお、当該混合においては、ＤＧＧＭＲをアルコールなどの有機溶媒及び界面活性剤を含む溶液に混合したり、ＤＧＧＭＲを含有する液を滴々と滴下して界面活性剤を含む溶液に混合したり、ＤＧＧＭＲを含有する液を界面活性剤を含む溶液に噴射注入したり、ＤＧＧＭＲ及び界面活性剤を含有する溶液を強力なミキサーで高速に撹拌したり、又はＤＧＧＭＲ及び界面活性剤を含有する溶液に超音波を掛ける処理を行ったり等の煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理や特別な装置等は必要なく、一般的なミキサーを用いて一般的な速度で撹拌する等、通常の方法で混合すればよく、これによりＤＧＧＭＲと界面活性剤の混合物を調製することができる。
【０１７８】
（５）混合時の温度
ＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合し混合物を調製する工程において、このＤＧＧＭＲと界面活性剤とを混合する時の温度は、特に限定されないが、用いる界面活性剤の曇点付近の温度又はこの曇点付近の温度以下の温度においてこの工程を行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。
【０１７９】
なお、曇点は、非イオン性の界面活性剤等の水溶液の温度を上げていった場合にその界面活性剤等のミセルが形成できなくなる温度であり、その水溶液が白濁する温度であって、その界面活性剤等毎に異なるものである。
【０１８０】
また、本発明において、界面活性剤の曇点付近の温度としては、その界面活性剤の曇点の温度のプラスマイナス（±）２５℃の範囲を意味する。
この界面活性剤の曇点付近の温度としては、その界面活性剤の曇点の温度のプラスマイナス（±）１５℃の範囲が好ましく、プラスマイナス（±）１０℃の範囲がより好ましく、プラスマイナス（±）５℃の範囲が特に好ましい。
【０１８１】
そして、本発明においては、上記の界面活性剤の曇点付近の温度以下の温度において、ＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合し混合物を調製する工程を行うことも好ましい。
【０１８２】
なお、例えば、界面活性剤である、ＫＦ−３５１Ａの曇点は５２℃（自己実測値）であり、ＫＦ−３５５Ａの曇点は６７℃（自己実測値）であり、そして、ＫＦ−６０１１の曇点は６４℃（自己実測値）である
なお、ＫＦ−３５４Ｌは、曇点の測定に使用した恒温水槽の設定温度の上限の７７℃においても曇点に至らなかったので、これの曇点は７７℃超である。
【０１８３】
前記のＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合し混合物を調製する工程は、前記の目的の上から、用いる界面活性剤の曇点の温度のプラスマイナス２５℃の範囲の温度若しくはこの範囲の温度以下の温度で行うことが好ましく、用いる界面活性剤の曇点の温度のプラスマイナス１５℃の範囲の温度若しくはこの範囲の温度以下の温度で行うことがより好ましく、用いる界面活性剤の曇点の温度のプラスマイナス１０℃の範囲の温度若しくはこの範囲の温度以下の温度で行うことが更に好ましく、そして、用いる界面活性剤の曇点の温度のプラスマイナス５℃の範囲の温度若しくはこの範囲の温度以下の温度で行うことが特に好ましい。
【０１８４】
また、本発明におけるＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合し混合物を調製する工程において、このＤＧＧＭＲと界面活性剤とを混合する時の温度であるが、この工程を、ＤＧＧＭＲ、及び用いる界面活性剤それぞれの融点以上の温度において行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。
【０１８５】
そして、このＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合し混合物を調製する工程は、前記の目的の上から、２℃以上で行うことがより好ましく、５℃以上で行うことが更に好ましく、１０℃以上で行うことが特に好ましい。
【０１８６】
（６）混合の時間
ＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合し混合物を調製する工程において、このＤＧＧＭＲと界面活性剤とを混合する時間であるが、このＤＧＧＭＲと界面活性剤とが均質に混合されればよく、特に限定されない。
通常は、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から、この混合を５分間又はそれ以上行うことが好ましい。なお、一般的には、５分間で十分である。
【０１８７】
また、このＤＧＧＭＲと界面活性剤とを混合する時間は、特に上限はなく、例えば数時間混合しても構わないのであるが、時間もコストであるという観点から考えると、念入りに行うとしても通常は１０分間以内でよい。
【０１８８】
３．ＤＧＧＭＲと界面活性剤の混合物を水又は水溶液と混合する工程
前記１における（ｂ）の工程、すなわち、『「ＤＧＧＭＲと、界面活性剤を混合し混合物を調製する工程」において調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程』について、以下、詳細に説明する。
【０１８９】
（１）水又は水溶液
前記１の（ｂ）の工程、すなわち、「前記１の（ａ）の工程において調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程」において、この水又は水溶液については、特に限定はない。
【０１９０】
この水としては、特に限定はないが、例えば、純水、蒸留水又は精製水等を挙げることができる。
【０１９１】
また、この水溶液としては、水を溶媒とするものであればよく、特に限定はないが、例えば、還元剤、リパーゼ賦活化剤、リパーゼ活性化剤、コリパーゼ、及び緩衝剤からなる群から選ばれる少なくとも一つのもの等を含有する水溶液等を挙げることができる。
【０１９２】
（ａ）還元剤
本発明において、前記の水溶液に含有させることができる還元剤としては、還元能力を有するものであればよく、特に限定はないが、例えば、ヒドロキシルアンモニウム塩、チオール化合物等を挙げることができる。
【０１９３】
この還元剤については、前記ＩＩの「３．還元剤」の項に記載した通りである。
【０１９４】
なお、この還元剤は、第２混合後、その濃度が０．０１ｍＭ以上であることが好ましい。
【０１９５】
なお、第２混合後、この還元剤の好ましい濃度は、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、特に好ましくは０．５ｍＭ以上である。
【０１９６】
また、この還元剤の濃度であるが、第２混合後、１００ｍＭ以下であることが好ましい。
【０１９７】
なお、第２混合後、この還元剤の好ましい濃度は、より好ましくは１０ｍＭ以下であり、特に好ましくは５ｍＭ以下である。
【０１９８】
この第２混合後の還元剤の好ましい濃度は、以上述べた通りである。
第２混合後の還元剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の「ＤＧＧＭＲ及び界面活性剤の混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液に還元剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。
【０１９９】
（ｂ）リパーゼ賦活化剤
本発明において、前記の水溶液に含有させることができるリパーゼ賦活化剤としては、リパーゼを賦活化することができる物質であればよく、特に限定はないが、例えば、胆汁酸又はその塩等を挙げることができる。
【０２００】
このリパーゼ賦活化剤としての胆汁酸又はその塩については、前記ＩＩの５の「（１）リパーゼ賦活化剤」の項に記載した通りである。
【０２０１】
なお、このリパーゼ賦活化剤は、第２混合後、その濃度が０．２％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。
【０２０２】
なお、第２混合後、このリパーゼ賦活化剤の好ましい濃度は、より好ましくは０．４％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上である。
【０２０３】
また、このリパーゼ賦活化剤の濃度であるが、第２混合後、２０％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましい。
【０２０４】
なお、第２混合後、このリパーゼ賦活化剤の好ましい濃度は、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下である。
【０２０５】
この第２混合後のリパーゼ賦活化剤の好ましい濃度は、以上述べた通りである。
第２混合後のリパーゼ賦活化剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の「ＤＧＧＭＲ及び界面活性剤の混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液にリパーゼ賦活化剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。
【０２０６】
（ｃ）リパーゼ活性化剤
本発明において、前記の水溶液に含有させることができるリパーゼ活性化剤としては、リパーゼを活性化することができる物質であればよく、特に限定はないが、例えば、アルカリ土類金属イオン又はその塩等を挙げることができる。
【０２０７】
このリパーゼ活性化剤としてのアルカリ土類金属イオン又はその塩については、前記ＩＩの６の「（１）リパーゼ活性化剤」の項に記載した通りである。
【０２０８】
なお、このリパーゼ活性化剤は、第２混合後、その濃度が０．１ｍＭ以上であることが好ましい。
【０２０９】
なお、第２混合後、このリパーゼ活性化剤の好ましい濃度は、より好ましくは１ｍＭ以上であり、特に好ましくは５ｍＭ以上である。
【０２１０】
また、このリパーゼ活性化剤の濃度であるが、第２混合後、１００ｍＭ以下であることが好ましい。
【０２１１】
なお、第２混合後、このリパーゼ活性化剤の好ましい濃度は、より好ましくは５０ｍＭ以下であり、特に好ましくは２５ｍＭ以下である。
【０２１２】
この第２混合後のリパーゼ活性化剤の好ましい濃度は、以上述べた通りである。
第２混合後のリパーゼ活性化剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の「ＤＧＧＭＲ及び界面活性剤の混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液にリパーゼ活性化剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。
【０２１３】
（ｄ）コリパーゼ
本発明において、水溶液に含有させることができるコリパーゼとしては、コリパーゼの作用、機能又は活性を有しているものであればよく、特に限定はない。
【０２１４】
このコリパーゼについては、前記ＩＩの７の「（１）コリパーゼ」の項に記載した通りである。
【０２１５】
なお、このコリパーゼは、第２混合後、その活性値が１５Ｋ単位／Ｌ（１５Ｋ Ｕｎｉｔ／Ｌ）以上であることが好ましい。
【０２１６】
なお、第２混合後、このコリパーゼの好ましい活性値は、より好ましくは１５０Ｋ単位／Ｌ以上であり、特に好ましくは７５０Ｋ単位／Ｌ以上である。
【０２１７】
また、このコリパーゼの活性値であるが、第２混合後、７，５００Ｋ単位／Ｌ以下であることが好ましい。
【０２１８】
なお、第２混合後、このコリパーゼの好ましい活性値は、より好ましくは３，７５０Ｋ単位／Ｌ以下であり、特に好ましくは２，２５０Ｋ単位／Ｌ以下である。
【０２１９】
この第２混合後のコリパーゼの好ましい活性値は、以上述べた通りである。
第２混合後のコリパーゼの活性値が上記の活性値となるよう、前記の「ＤＧＧＭＲ及び界面活性剤の混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液にコリパーゼを適当な活性値で含有させることが好ましい。
【０２２０】
（ｅ）ｐＨ
本発明においてリパーゼ活性測定用基質として用いるＤＧＧＭＲは、ｐＨ４又はその付近のｐＨにおいて安定である。
よって、第２混合後、そのｐＨはｐＨ４を中心とする一定の範囲内のものであることが好ましい。
【０２２１】
具体的には、第２混合後のｐＨは、ＤＧＧＭＲの安定性の点から、ｐＨ２〜ｐＨ７の範囲内にあることが好ましく、ｐＨ３〜ｐＨ５の範囲内にあることがより好ましく、そして、ｐＨ３．５〜ｐＨ４．５の範囲内にあることが特に好ましい。（前記のｐＨ値はいずれも２０℃での値である。）
【０２２２】
この第２混合後のｐＨは、以上述べた通りである。
第２混合後のｐＨが上記のｐＨとなるよう、前記水溶液のｐＨを適当なｐＨにすることが好ましい。
【０２２３】
（ｆ）緩衝剤
本発明においては、第２混合後のｐＨを、前記（ｅ）に記載のｐＨ範囲に保つため、前記（ｅ）のｐＨ範囲に緩衝能を有する緩衝剤を前記水溶液に適宜含有させてもよい。
【０２２４】
この緩衝剤については、前記ＩＩの１０の「（１）緩衝剤」の項に記載した通りである。
【０２２５】
この緩衝剤を含有する水溶液（すなわち、緩衝液）における緩衝剤の濃度は、特に限定はなく、設定するｐＨの範囲において緩衝能を発揮することができる濃度であればよい。
【０２２６】
例えば、第２混合後、この緩衝剤の濃度は、好ましくは５ｍＭ以上であり、より好ましくは１０ｍＭ以上であり、特に好ましくは３０ｍＭ以上である。
【０２２７】
また、この緩衝剤の濃度は、第２混合後、好ましくは５００ｍＭ以下であり、より好ましくは１００ｍＭ以下であり、特に好ましくは５０ｍＭ以下である。
【０２２８】
この第２混合後の緩衝剤の好ましい濃度は、以上述べた通りである。
第２混合後の緩衝剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の水溶液に緩衝剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。
【０２２９】
（２）ＤＧＧＭＲ及び界面活性剤の混合物の水又は水溶液との混合
前記１における（ｂ）の工程、すなわち、『「ＤＧＧＭＲと、界面活性剤を混合し混合物を調製する工程」において調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程』においては、当該「ＤＧＧＭＲと界面活性剤の混合物」の全部又は一部を、当該「水又は水溶液」と混合する。
【０２３０】
ところで、リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程であるが、特に限定はなく、例えば、「ＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合して調製した混合物」の全部又は一部を「水又は水溶液」へ添加し、混合するという態様でもよく、又は「水又は水溶液」を「ＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合して調製した混合物」の全部又は一部へ添加し、混合するという態様でもよく、或いはその他の態様でもよい。
【０２３１】
なお、前記の「ＤＧＧＭＲと界面活性剤の混合物」と、前記の「水又は水溶液」との混合の比率は、特に限定はなく適宜定めればよい。
【０２３２】
なお、この「ＤＧＧＭＲと界面活性剤の混合物」と「水又は水溶液」との混合については、例えば、次の（ｉ）及び（ｉｉ）のように考えることができる。
【０２３３】
（ｉ）ＤＧＧＭＲの濃度の面から
前記２の「（２）ＤＧＧＭＲの混合量」の項に詳述した通り、第２混合後、ＤＧＧＭＲの好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは０．０５ｍＭ以上であり、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、そして、特に好ましくは０．２ｍＭ以上である。
また、これも前記２の「（２）ＤＧＧＭＲの混合量」の項に詳述した通り、第２混合後、ＤＧＧＭＲの好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは２ｍＭ以下であり、より好ましくは１ｍＭ以下であり、そして、特に好ましくは０．８ｍＭ以下である。
【０２３４】
そして、このＤＧＧＭＲの好ましい濃度と、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量との関係は、例えば、次の（ａ）又は（ｂ）などのように考えることができる。
【０２３５】
（ａ）リパーゼ活性測定用基質と界面活性剤の混合物の全部を水又は水溶液と混合する場合
第１混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をＷｓ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とし、そしてリパーゼ活性測定用基質の分子量をＭＷｓとした場合、第２混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Ｃｓ［単位：ｍＭ］は次の式で表すことができる。
【０２３６】
Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０６）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）
【０２３７】
なお、リパーゼ活性測定用基質であるＤＧＧＭＲの分子量ＭＷｓは７５２．０５であるので、上記の式は次のようになる。
【０２３８】
Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０６）÷（Ｖｆ×７５２．０５）
【０２３９】
よって、この場合の第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］は、次のように表すことができる。
【０２４０】
Ｖｆ＝（Ｗｓ×１０６）÷（Ｃｓ×ＭＷｓ）
【０２４１】
すなわち、Ｖｆ＝（Ｗｓ×１０６）÷（Ｃｓ×７５２．０５）
【０２４２】
従って、上記の式により求めた容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］になるよう、第２混合時に水又は水溶液を混合することにより、希望するリパーゼ活性測定用基質（ＤＧＧＭＲ）の濃度のリパーゼ活性測定用基質溶液を得ることができる。
【０２４３】
（ｂ）リパーゼ活性測定用基質と界面活性剤の混合物の一部を水又は水溶液と混合する場合
第１混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をＷｓ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とし、リパーゼ活性測定用基質の分子量をＭＷｓとし、そして第１混合時の混合物のＡ％（重量又は容量）を第２混合時に水又は水溶液と混合した場合、第２混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Ｃｓ［単位：ｍＭ］は次の式で表すことができる。
【０２４４】
Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０６）×（Ａ÷１００）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）＝（Ｗｓ×Ａ×１０４）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）
【０２４５】
なお、リパーゼ活性測定用基質であるＤＧＧＭＲの分子量ＭＷｓは７５２．０５であるので、上記の式は次のようになる。
【０２４６】
Ｃｓ＝（Ｗｓ×Ａ×１０４）÷（Ｖｆ×７５２．０５）
【０２４７】
よって、この場合の第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］は、次のように表すことができる。
【０２４８】
Ｖｆ＝（Ｗｓ×Ａ×１０４）÷（Ｃｓ×ＭＷｓ）
【０２４９】
すなわち、Ｖｆ＝（Ｗｓ×Ａ×１０４）÷（Ｃｓ×７５２．０５）
【０２５０】
従って、上記の式により求めた容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］になるよう、第２混合時に水又は水溶液を混合することにより、希望するリパーゼ活性測定用基質（ＤＧＧＭＲ）の濃度のリパーゼ活性測定用基質溶液を得ることができる。
【０２５１】
（ｉｉ）界面活性剤の濃度の面から
前記２の「（３）界面活性剤の混合量」の項に詳述した通り、第２混合後、界面活性剤の好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上であり、そして、特に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上である。
【０２５２】
また、これも前記２の「（３）界面活性剤の混合量」の項に詳述した通り、第２混合後、界面活性剤の好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは２０％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下であり、そして、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下である。
【０２５３】
そして、この界面活性剤の好ましい濃度と、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量との関係は、例えば、次の（ａ）又は（ｂ）などのように考えることができる。
【０２５４】
（ａ）リパーゼ活性測定用基質と界面活性剤の混合物の全部を水又は水溶液と混合する場合
第１混合時に混合させる界面活性剤の混合量をＷｐ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とした場合、第２混合後の界面活性剤の濃度Ｃｐ［単位：％（ｗ／ｖ）］は次の式で表すことができる。
【０２５５】
Ｃｐ＝（Ｗｐ×１００）÷Ｖｆ
【０２５６】
よって、この場合の第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］は、次のように表すことができる。
【０２５７】
Ｖｆ＝（Ｗｐ×１００）÷Ｃｐ
【０２５８】
従って、上記の式により求めた容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］になるよう、第２混合時に水又は水溶液を混合することにより、希望する界面活性剤の濃度のリパーゼ活性測定用基質溶液を得ることができる。
【０２５９】
（ｂ）リパーゼ活性測定用基質と界面活性剤の混合物の一部を水又は水溶液と混合する場合
第１混合時に混合させる界面活性剤の混合量をＷｐ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とし、そして第１混合時の混合物のＡ％（重量又は容量）を第２混合時に水又は水溶液と混合した場合、第２混合後の界面活性剤の濃度Ｃｐ［単位：％（ｗ／ｖ）］は次の式で表すことができる。
【０２６０】
Ｃｐ＝（Ｗｐ×１００）×（Ａ÷１００）÷Ｖｆ＝（Ｗｐ×Ａ）÷Ｖｆ
【０２６１】
よって、この場合の第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］は、次のように表すことができる。
【０２６２】
Ｖｆ＝（Ｗｐ×Ａ）÷Ｃｐ
【０２６３】
従って、上記の式により求めた容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］になるよう、第２混合時に水又は水溶液を混合することにより、希望する界面活性剤の濃度のリパーゼ活性測定用基質溶液を得ることができる。
【０２６４】
なお、このリパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程は、二段階以上の複数の段階（ステップ）によって行ってもよい。
なお、このように、この工程を複数の段階（ステップ）によって行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。
【０２６５】
この工程を複数の段階によって行う方法であるが、これは当該工程を複数の段階によって行うものであればよく、特に限定はないが、例えば、次の［Ａ］及び［Ｂ］の段階によって行うもの等を挙げることができる。
【０２６６】
［Ａ］  ＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合して調製した混合物の全部又は一部を、一定量の水又は水溶液と混合する段階
［Ｂ］  前記［Ａ］の段階における当該混合物（ＤＧＧＭＲと界面活性剤との混合物）と水又は水溶液との混合後の混合液に、更に一定量の水又は水溶液を混合する段階
【０２６７】
なお、この場合、前記［Ａ］の段階において「ＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合して調製した混合物の全部又は一部」と混合する「水又は水溶液」の容量（一定量）をＶａ［単位：ｍＬ］とし、前記［Ｂ］の段階において当該混合液に「更に一定量の水又は水溶液」を混合した後の最終的な容量［すなわち、前記の第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量］（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］としたとき、ＶａによりＶｆを除した比の値（Ｖｆ／Ｖａ）は、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から、１〜５００の範囲にあることが好ましい。
【０２６８】
すなわち、ＶａによりＶｆを除した比の値（Ｖｆ／Ｖａ）が１〜５００の範囲内になるように、前記のＶａ及びＶｆの値（容量）を選択することが、前記の目的の上から好ましい。
【０２６９】
なお、同様に、前記の目的の上から、ＶａによりＶｆを除した比の値（Ｖｆ／Ｖａ）は、２〜２００の範囲にあることがより好ましく、５〜１００の範囲にあることが特に好ましい。
【０２７０】
すなわち、前記の目的の上から、ＶａによりＶｆを除した比の値（Ｖｆ／Ｖａ）が、２〜２００の範囲内になるように前記のＶａ及びＶｆの値（容量）を選択することがより好ましく、５〜１００の範囲内になるように前記のＶａ及びＶｆの値（容量）を選択することが特に好ましい。
【０２７１】
なお、前記［Ａ］の「ＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合して調製した混合物の全部又は一部を、一定量の水又は水溶液と混合する段階」であるが、特に限定はなく、例えば、「ＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合して調製した混合物」の全部又は一部を一定量の「水又は水溶液」へ添加し、混合するという態様でもよく、又は一定量の「水又は水溶液」を「ＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合して調製した混合物」の全部又は一部へ添加し、混合するという態様でもよく、或いはその他の態様でもよい。
【０２７２】
また、前記［Ｂ］の「前記［Ａ］の段階における当該混合物（ＤＧＧＭＲと界面活性剤との混合物）と水又は水溶液との混合後の混合液に、更に一定量の水又は水溶液を混合する段階」であるが、特に限定はなく、例えば、「前記［Ａ］の段階における当該混合物（ＤＧＧＭＲと界面活性剤との混合物）と水又は水溶液との混合後の混合液」を一定量の「水又は水溶液」へ添加し、混合するという態様でもよく、又は一定量の「水又は水溶液」を「前記［Ａ］の段階における当該混合物（ＤＧＧＭＲと界面活性剤との混合物）と水又は水溶液との混合後の混合液」へ添加し、混合するという態様でもよく、或いはその他の態様でもよい。
【０２７３】
（３）混合の方法
リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、当該混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する方法は、当該混合物と、当該水又は水溶液が混合するのであればいずれの方法でもよく、特に限定はない。
【０２７４】
なお、当該混合においては、リパーゼ活性測定用基質をアルコールなどの有機溶媒を含む溶液に混合したり、リパーゼ活性測定用基質含有液を滴々と滴下して溶液に混合したり、リパーゼ活性測定用基質含有液を溶液に噴射注入したり、リパーゼ活性測定用基質溶液を強力なミキサーで高速に撹拌したり、又はリパーゼ活性測定用基質溶液に超音波を掛ける処理を行ったり等の煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理や特別な装置等は必要なく、一般的なミキサーを用いて一般的な速度で撹拌する等、通常の方法で混合すればよく、これにより、リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲと界面活性剤の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合することができる。
【０２７５】
（４）混合時の温度
リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、当該混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する時の温度は、特に限定されないが、用いる界面活性剤の曇点以下の温度においてこの工程を行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。
【０２７６】
そして、このＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程は、前記の目的の上から、用いる界面活性剤の曇点より１０℃低い温度以下で行うことがより好ましく、２５℃以下で行うことが特に好ましい。
【０２７７】
また、このＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、このＤＧＧＭＲと界面活性剤の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液とを混合する時の温度であるが、この工程を、ＤＧＧＭＲ、及び用いる界面活性剤それぞれの融点以上の温度において行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。
【０２７８】
そして、このＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程は、前記の目的の上から、１０℃以上で行うことがより好ましく、１５℃以上で行うことが特に好ましい。
【０２７９】
（５）混合の時間
リパーゼ活性測定用基質としてのＤＧＧＭＲと界面活性剤を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、当該混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する時間であるが、このＤＧＧＭＲと界面活性剤の混合物と、この水又は水溶液とが、均質に混合されればよく、特に限定されない。
【０２８０】
通常は、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化したリパーゼ活性測定用基質の溶液を製造する目的の上から、この混合を５分間又はそれ以上行うことが好ましい。なお、一般的には、５分間で十分である。
【０２８１】
また、このＤＧＧＭＲと界面活性剤の混合物と、水又は水溶液とを混合する時間は、特に上限はなく、例えば数時間混合しても構わないのであるが、時間もコストであるという観点から考えると、念入りに行うとしても通常は１０分間以内でよい。
【０２８２】
〔２〕本発明のリパーゼ活性測定試薬
Ｉ．総論
本発明のリパーゼ活性測定試薬は、「１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［ＤＧＧＭＲ］をリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液において、還元剤を含有することを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液」を含むことを特徴とするリパーゼ活性測定試薬である。（なお、リパーゼ活性測定用基質溶液の詳細については、前記の「〔１〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液」の項に記載した通りである。）
【０２８３】
そして、本発明のリパーゼ活性測定試薬は、上記の構成により、混入したアジ化物によるＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができるものである。
【０２８４】
ＩＩ．リパーゼ活性測定試薬
１．リパーゼ活性測定試薬の構成等
本発明のリパーゼ活性測定試薬は、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液のみからなるものであってもよく、又は本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液と他の構成試薬からなるもの、すなわち試薬キットであってもよい。
【０２８５】
なお、次の（ａ）及び（ｂ）の理由から、本発明のリパーゼ活性測定試薬としては、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液と他の構成試薬からなる試薬キットであることが好ましい。
（ａ）  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］はｐＨ４又はその付近のｐＨにおいて安定であるのに対して、リパーゼはｐＨ８又はその付近のｐＨにおいてその活性は至適であり、それぞれ適するｐＨ域が異なっている。
（ｂ）  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］、コリパーゼ、及びリパーゼ賦活化剤としての胆汁酸又はその塩を、一つの試薬に共存させると、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］の安定性が良くなくなる。
【０２８６】
よって、本発明のリパーゼ活性測定試薬は、リパーゼ活性測定用基質溶液と他の構成試薬からなる試薬キットであることが好ましく、この場合、リパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］を含む試薬のｐＨはｐＨ４又はその付近のｐＨとし、これと組み合わせる他の構成試薬のうち少なくとも一つの試薬のｐＨはｐＨ８又はそれ以上とすることが好ましく、また、リパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］、コリパーゼ、及びリパーゼ賦活化剤としての胆汁酸又はその塩を、一つの試薬に共存させないことが好ましい。
【０２８７】
この本発明のリパーゼ活性測定試薬としては、リパーゼ活性測定用基質溶液と一つの他の構成試薬からなる２試薬系の試薬キットであることが好ましい。
【０２８８】
この場合、当該他の構成試薬を第１試薬とし、リパーゼ活性測定用基質溶液を第２試薬として用いるものであることがより好ましい。
【０２８９】
そして、この場合に、当該他の構成試薬のｐＨはｐＨ８又はそれ以上とし、リパーゼ活性測定用基質溶液のｐＨはｐＨ４又はその付近のｐＨとすることが更に好ましい。
【０２９０】
また、リパーゼ活性測定用基質溶液に、「コリパーゼ」、及び「リパーゼ賦活化剤としての胆汁酸又はその塩」の両方を含有させることはせず、「コリパーゼ」、及び「リパーゼ賦活化剤としての胆汁酸又はその塩」の少なくとも一方は当該他の構成試薬に含有させることが更に好ましい。
【０２９１】
本発明のリパーゼ活性測定試薬は、終点法（エンドポイント法）により測定を行うものであってもよく、又は反応速度法（レート法）により測定を行うものであってもよく、適宜選択すればよいが、反応速度法（レート法）によるものが好ましい。
【０２９２】
また、本発明のリパーゼ活性測定試薬においては、リパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］と試料を接触させ、反応させることにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール及びグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルが生成するが、このグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルは不安定であって、容易に自然に加水分解されて６’−メチルレゾルフィン（λｍａｘ：５８０ｎｍ）を生成する。
【０２９３】
よって、この生成する６’−メチルレゾルフィンの増加を５８０ｎｍ又はその近辺の波長の吸光度等を測ることによって測定し、試料中に含まれていたリパーゼの活性値を求めればよい。なお、この場合、一波長法でもよく、又は二波長法でもよい。
【０２９４】
また、本発明のリパーゼ活性測定試薬において、測定反応時の温度は、３０℃又は３７℃等測定反応が進行しかつ測定反応に係わる酵素等の反応成分が熱により失活、変性又は変質しない範囲内の温度を設定すればよい。
【０２９５】
また、本発明のリパーゼ活性測定試薬において、測定反応の開始方法は、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］等を加えることにより行う方法、又は試料を加えることにより行う方法等のいずれの方法のものでもよい。
【０２９６】
また、本発明のリパーゼ活性測定試薬において、その測定は、用手法により行うものであってもよく、又は自動分析装置等の装置を用いて行うものであってもよい。
【０２９７】
また、本発明のリパーゼ活性測定試薬は、その構成試薬の全て又は一部が液状試薬であってよい。
【０２９８】
なお、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中のリパーゼ活性の測定に使用することができる。
【０２９９】
また、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、前記の他の構成試薬又はそれ以外の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中のリパーゼ活性の測定に使用することもできる。
前記の他の構成試薬、又はそれ以外の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
【０３００】
２．本発明のリパーゼ活性の測定試薬の具体例
本発明のリパーゼ活性測定試薬の具体例を以下挙げる。
【０３０１】
（１）例１
（ａ）第１試薬  ［下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度で含む水溶液；ｐＨ８．３（２０℃）］
デオキシコール酸ナトリウム  ［リパーゼ賦活化剤］  ２％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム  ［リパーゼ活性化剤］  ５ｍＭ
コリパーゼ  （ブタ膵臓由来；ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）  ３７５Ｋ単位／Ｌ（５ｍｇ／Ｌ）
Ｂｉｃｉｎｅ  ［緩衝剤］  ４０ｍＭ
【０３０２】
（ｂ）第２試薬（本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液）  ［下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度で含む水溶液；ｐＨ４．０（２０℃）］
１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル  〔ＤＧＧＭＲ〕  （ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）  ［リパーゼ活性測定用基質］  ０．３ｍＭ
側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル  ０．３％（ｗ／ｖ）
塩化ヒドロキシルアンモニウム  ［還元剤］  ０．５ｍＭ
Ｌ−酒石酸  ［緩衝剤］  ４０ｍＭ
【０３０３】
（２）例２
（ａ）第１試薬  ［下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度で含む水溶液；ｐＨ８．４（２０℃）］
タウロデオキシコール酸ナトリウム  ［リパーゼ賦活化剤］  ２％（ｗ／ｖ）
デオキシコール酸ナトリウム  ［リパーゼ賦活化剤］  ０．２％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム  ［リパーゼ活性化剤］  ５ｍＭ
コリパーゼ  （ブタ膵臓由来；ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）  １５０Ｋ単位／Ｌ（２ｍｇ／Ｌ）
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ［緩衝剤］  ４０ｍＭ
【０３０４】
（ｂ）第２試薬（本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液）  ［下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度で含む水溶液］
１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル  〔ＤＧＧＭＲ〕  （ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）  ［リパーゼ活性測定用基質］  ０．６ｍＭ
側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル  ０．３％（ｗ／ｖ）
塩化ヒドロキシルアンモニウム  ［還元剤］  １ｍＭ
タウロデオキシコール酸ナトリウム  ［リパーゼ賦活化剤］  ２％（ｗ／ｖ）
【０３０５】
〔３〕本発明のリパーゼ活性測定方法
Ｉ．総論
本発明のリパーゼ活性の測定方法は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［ＤＧＧＭＲ］をリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液を使用するリパーゼ活性測定方法において、リパーゼ活性測定用基質溶液に還元剤を含有させることを特徴とするものである。（なお、リパーゼ活性測定用基質溶液の詳細については、前記の「〔１〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液」の項に記載した通りである。また、リパーゼ活性測定試薬の詳細については、前記の「〔２〕本発明のリパーゼ活性測定試薬」の項に記載した通りである。）
【０３０６】
そして、本発明のリパーゼ活性測定方法は、上記の構成により、混入したアジ化物によるＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができるものである。
【０３０７】
ＩＩ．リパーゼ活性の測定方法
１．リパーゼ活性測定方法
【０３０８】
（１）．試料
本発明において、リパーゼの活性を測定する試料は、リパーゼを含む可能性がある試料であればよく、リパーゼを含む可能性があるものであれば特に限定されない。
この試料としては、例えば、ヒト若しくは動物又は植物に由来する試料等を挙げることができる。
【０３０９】
ヒト若しくは動物に由来する試料としては、特に限定されず、例えば、ヒト或いは動物の、血液、血清、血漿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、若しくは羊水などの体液；尿若しくは大便などの排泄物；膵臓、肝臓、若しくは胃などの臓器；毛髪、皮膚、爪、筋肉、若しくは神経などの組織；又は細胞等を挙げることができる。
【０３１０】
本発明は、ヒト又は動物に由来する試料を試料とする場合に好適であり、ヒトに由来する試料を試料とする場合に特に好適である。
【０３１１】
また、本発明は、体液、臓器又は組織を試料とする場合に好適であり、体液を試料とする場合により好適であり、血液、血清又は血漿を試料とする場合に更に好適であり、血清又は血漿を試料とする場合に特に好適である。
【０３１２】
なお、本発明において、試料は、液体である場合に好適であるので、もし試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を既知の方法に従って行い、液体試料とすればよい。
また、試料は、必要に応じて、希釈又は濃縮処理等を行ってもよい。
【０３１３】
（２）測定の詳細
本発明のリパーゼ活性測定方法により、試料中のリパーゼ活性の測定を行う場合、その測定は終点法（エンドポイント法）により測定を行うものであってもよく、又は反応速度法（レート法）により測定を行うものであってもよく、適宜選択すればよいが、反応速度法（レート法）によるものが好ましい。
【０３１４】
また、本発明のリパーゼ活性測定方法により、試料中のリパーゼ活性の測定を行う場合、その測定は、一段階のステップにより行う１ステップ法、又は二段階若しくはそれ以上の多段階のステップにより行う多ステップ法を適宜選択して測定を行えばよい。
【０３１５】
なお、リパーゼ活性の測定に使用するリパーゼ活性測定試薬が、第１試薬、第２試薬、及び他の試薬（一つ又は二つ以上の試薬）よりなる場合、すなわち３以上の試薬よりなる場合は、これらの試薬を使用して測定を行うのに必要な数の段階（必要に応じ二段階又は三段階以上の段階）を経て測定反応を行わせ、試料中のリパーゼ活性の測定を行えばよい。
【０３１６】
また、本発明のリパーゼ活性測定方法においては、リパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］と試料を接触させ、反応させることにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール及びグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルが生成するが、このグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルは不安定であって、容易に自然に加水分解されて６’−メチルレゾルフィン（λｍａｘ：５８０ｎｍ）を生成する。
【０３１７】
よって、この生成する６’−メチルレゾルフィンの増加を５８０ｎｍ又はその近辺の波長の吸光度等を測ることによって測定し、試料中に含まれていたリパーゼの活性値を求めればよい。なお、この場合、一波長法でもよく、又は二波長法でもよい。
【０３１８】
なお、測定した吸光度（若しくは透過率）、又は吸光度（若しくは透過率）の変化量より、試料に含まれていたリパーゼの活性値を算出することは、６’−メチルレゾルフィンのモル吸光係数を基に測定した吸光度（若しくは透過率）より算出する方法、又はリパーゼ活性値が分かっている標準物質（標準液、若しくは標準血清等）の吸光度（若しくは透過率）と対比して算出する方法等の方法を適宜選択して行えばよい。
【０３１９】
また、試料を測定して得た吸光度（若しくは透過率）より試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いて、試料に含まれていたリパーゼの活性値を算出することが好ましい。
【０３２０】
また、本発明のリパーゼ活性測定方法において、その測定反応時の温度は、３０℃又は３７℃等測定反応が進行しかつ測定反応に係わる酵素等の反応成分が熱により失活、変性又は変質しない範囲内の温度を設定すればよい。
【０３２１】
また、本発明のリパーゼ活性測定方法において、その測定反応の開始方法は、リパーゼ活性測定用基質等を加えることにより行う方法、又は試料を加えることにより行う方法等のいずれの方法のものでもよい。
【０３２２】
また、本発明のリパーゼ活性測定方法において、その測定は、用手法により行うものであってもよく、又は自動分析装置等の装置を用いて行うものであってもよい。
【０３２３】
２．リパーゼ活性測定方法の具体例
本発明のリパーゼ活性測定方法の具体例を以下挙げる。
【０３２４】
（１）リパーゼ活性測定試薬
（ａ）第１試薬
前記の〔２〕のＩＩの２の（１）の（ａ）の第１試薬を、この測定方法の具体例における第１試薬として用いた。
【０３２５】
（ｂ）第２試薬
前記の〔２〕のＩＩの２の（１）の（ｂ）の第２試薬を、この測定方法の具体例における第２試薬として用いた。
【０３２６】
（２）試料
ヒトの血清を試料として用いた。
【０３２７】
（３）測定
（ａ）第１段階
前記（２）の試料と前記（１）の（ａ）の第１試薬を混合して、混合液を調製する。
【０３２８】
この混合する試料及び第１試薬それぞれの量は、第２試薬の量、試料に含まれるリパーゼの活性値、及び他の条件に応じて適宜決めればよい。
なお、一般的には、例えば、試料の量は０．５〜１００μＬ、第１試薬の量は２０〜１，０００μＬの範囲のもの等とすることが好ましい。
【０３２９】
この混合液の調製後、インキュベートを行う。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は２０分以内であることが好ましく、１０分以内であることがより好ましく、５分以内であることが特に好ましい。
【０３３０】
また、インキュベートする際の温度は、前記の混合液が凍結する温度より上の温度であればよい。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
なお、測定反応に係わる酵素等の成分が耐熱性酵素など耐熱性の成分であれば更に高温でもよい。
【０３３１】
この試料と第１試薬の混合液の調製及びインキュベートにより、試料に含まれていたリパーゼと、第１試薬に含まれる試薬成分とが接触し、これらの成分によるリパーゼの賦活化や活性化等が行われる。
【０３３２】
（ｂ）第２段階
前記の第１段階で調製した「試料と第１試薬の混合液」に、前記（１）の（ｂ）の第２試薬を混合する。これを最終反応液とする。
【０３３３】
この混合する第２試薬の量は、試料の量、第１試薬の量、試料に含まれるリパーゼの活性値、使用する分析装置の仕様等、及び他の条件に応じて適宜決めればよい。
なお、一般的には、例えば、第２試薬の量は１０〜１，０００μＬの範囲のもの等とすることが好ましい。
【０３３４】
この最終反応液の調製後、インキュベートを行う。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は２０分以内であることが好ましく、１０分以内であることがより好ましく、５分以内であることが特に好ましい。
【０３３５】
また、インキュベートする際の温度は、前記の最終反応液が凍結する温度より上の温度であればよい。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
なお、測定反応に係わる酵素等の成分が耐熱性酵素など耐熱性の成分であれば更に高温でもよい。
【０３３６】
この最終反応液の調製及びインキュベートにより、前記の第１段階におけるリパーゼの賦活化や活性化等に引き続き、この第２段階における測定反応が開始し、試料に含まれていたリパーゼの活性測定反応が進められる。
【０３３７】
すなわち、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化した基質溶液となっている第２試薬（リパーゼ活性測定用基質溶液）が、この第２段階において試料に含まれていたリパーゼと接触することにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、リパーゼ活性測定用基質［ＤＧＧＭＲ］より１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール及びグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルが生成する。
そして、このグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルは不安定であるので、容易に自然に加水分解されて、６’−メチルレゾルフィン（λｍａｘ：５８０ｎｍ）を生成する。
【０３３８】
この生成した６’−メチルレゾルフィンは、その極大吸収波長（λｍａｘ）が５８０ｎｍであるので、この６’−メチルレゾルフィンに由来する最終反応液の吸光度（又は透過率）を、５８０ｎｍ又はその近辺の波長の吸光度（又は透過率）を測ることによって測定する。
【０３３９】
次に、測定した吸光度（若しくは透過率）、又は吸光度（若しくは透過率）の変化量より、試料に含まれていたリパーゼの活性値を算出する。
【０３４０】
なお、これは、６’−メチルレゾルフィンのモル吸光係数を基に測定した吸光度（若しくは透過率）より算出する方法、又はリパーゼ活性値が分かっている標準物質（標準液、若しくは標準血清等）の吸光度（若しくは透過率）と対比して算出する方法等の方法を適宜選択して行う。
【０３４１】
なお、上記の試料に含まれていたリパーゼの活性値の算出は、試料を測定して得た最終反応液の吸光度（若しくは透過率）より試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いて求めた吸光度差（ΔＡｂｓ．）を用いて行うことが好ましい。
【０３４２】
〔４〕本発明のリパーゼ活性測定に対するアジ化物の影響の抑制方法
本発明のリパーゼ活性測定に対するアジ化物の影響の抑制方法は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［ＤＧＧＭＲ］をリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液に還元剤を含有させることを特徴とするものである。（なお、リパーゼ活性測定用基質溶液の詳細については、前記の「〔１〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液」の項に記載した通りである。また、リパーゼ活性測定試薬の詳細については、前記の「〔２〕本発明のリパーゼ活性測定試薬」の項に記載した通りである。また、リパーゼ活性測定方法の詳細については、前記の「〔３〕本発明のリパーゼ活性測定方法」の項に記載した通りである。）
【０３４３】
そして、本発明のリパーゼ活性測定に対するアジ化物の影響の抑制方法は、上記の構成により、混入したアジ化物によるＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができる方法である。
【実施例】
【０３４４】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【０３４５】
〔実施例１〕（本発明のアジ化物の影響の抑制効果の確認−１）
本発明におけるアジ化物の影響の抑制効果を確認した。【０３４６】
１．本発明のリパーゼ活性測定試薬
本発明のリパーゼ活性測定試薬の第１試薬及び第２試薬をそれぞれ調製した。【０３４７】
〔１〕第１試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．４（２０℃）に調整して、リパーゼ活性測定試薬の第１試薬を調製した。【０３４８】
デオキシコール酸ナトリウム  ［リパーゼ賦活化剤］  ２％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム  ［リパーゼ活性化剤］  ２０ｍＭ
コリパーゼ  （ブタ膵臓由来、販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）  ７５０Ｋ単位／Ｌ（１０ｍｇ／Ｌ）
Ｂｉｃｉｎｅ  ［緩衝剤］  ８０ｍＭ【０３４９】
〔２〕第２試薬（リパーゼ活性測定用基質溶液）
［１］アジ化物添加第２試薬（本発明）
本発明のリパーゼ活性測定試薬の第２試薬（リパーゼ活性測定用基質溶液）に、アジ化物混入の影響を確かめるため、アジ化物を添加した「アジ化物添加第２試薬（本発明）」を調製した。【０３５０】
（１）  リパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）の０．０４５グラム［ｇ］を、ビーカー（容量：１０ｍＬ）に量り取った。【０３５１】
（２）  次に、側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル（ポリエーテル変性タイプ）である、ＫＦ−３５５Ａ（販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）の０．６グラム［ｇ］を量り取り、これを前記（１）のビーカーに添加した。【０３５２】
（３）  前記（２）の添加後、このビーカーを６７℃において撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤であるＫＦ−３５５Ａとを混合した。【０３５３】
この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」を調製した。【０３５４】
なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０３５５】
（４）  次に、前記（３）のビーカー内の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」（全部）に、撹拌しながら「一定量（４．０ｍＬ）の１ｍＭの塩化ヒドロキシルアンモニウム（還元剤）を含む４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］」を室温（２５℃）においてマイクロピペットより添加した。【０３５６】
そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤を混合して調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の１ｍＭの塩化ヒドロキシルアンモニウムを含む４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］」との混合を行った。【０３５７】
なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０３５８】
（５）  次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物）と一定量の１ｍＭの塩化ヒドロキシルアンモニウムを含む４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］との混合後の混合液」に、更に一定量の１ｍＭの塩化ヒドロキシルアンモニウムを含む４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。【０３５９】
（６）  以上の操作により、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＫＦ−３５５Ａ、還元剤：塩化ヒドロキシルアンモニウム）」を調製した。
これを本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「第２試薬（本発明）」とした。【０３６０】
（７）  
前記（６）の「第２試薬（本発明）」の１０ｍＬに０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム水溶液の１０μＬを添加し、「アジ化物添加第２試薬（本発明）」とした。【０３６１】
（８）  なお、前記（１）〜（７）において調製した、「アジ化物添加第２試薬（本発明）」において、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．３ｍＭであり、界面活性剤（ＫＦ−３５５Ａ）の濃度は０．３％（ｗ／ｖ）であり、還元剤（塩化ヒドロキシルアンモニウム）の濃度は１ｍＭであり、そして  アジ化ナトリウムの濃度は０．０００１％（ｗ／ｖ）である。
また、この「アジ化物添加第２試薬（本発明）」において、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。【０３６２】
［２］アジ化物添加第２試薬（従来発明）
従来発明のリパーゼ活性測定試薬の第２試薬（リパーゼ活性測定用基質溶液）に、アジ化物混入の影響を確かめるため、アジ化物を添加した「第２試薬（従来発明）」を調製した。【０３６３】
（１）  リパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）の０．０４５グラム［ｇ］を、ビーカー（容量：１０ｍＬ）に量り取った。【０３６４】
（２）  次に、側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル（ポリエーテル変性タイプ）である、ＫＦ−３５５Ａ（販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）の０．６グラム［ｇ］を量り取り、これを前記（１）のビーカーに添加した。【０３６５】
（３）  前記（２）の添加後、このビーカーを６７℃において撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤であるＫＦ−３５５Ａとを混合した。【０３６６】
この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」を調製した。【０３６７】
なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０３６８】
（４）  次に、前記（３）のビーカー内の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」（全部）に、撹拌しながら「一定量（４．０ｍＬ）の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］」を室温（２５℃）においてマイクロピペットより添加した。【０３６９】
そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤を混合して調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］」との混合を行った。【０３７０】
なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０３７１】
（５）  次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物）と一定量の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］との混合後の混合液」に、更に一定量の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。【０３７２】
（６）  以上の操作により、従来発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＫＦ−３５５Ａ）」を調製した。
これを従来発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「第２試薬（従来発明）」とした。【０３７３】
（７）  
前記（６）の「第２試薬（従来発明）」の１０ｍＬに０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム水溶液の１０μＬを添加し、「アジ化物添加第２試薬（従来発明）」とした。【０３７４】
（８）  なお、前記（１）〜（７）において調製した、「アジ化物添加第２試薬（従来発明）」において、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．３ｍＭであり、界面活性剤（ＫＦ−３５５Ａ）の濃度は０．３％（ｗ／ｖ）であり、そして  アジ化ナトリウムの濃度は０．０００１％（ｗ／ｖ）である。
また、この「アジ化物添加第２試薬（従来発明）」において、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。【０３７５】
［３］対照第２試薬
対照としてのリパーゼ活性測定試薬の第２試薬（リパーゼ活性測定用基質溶液）である「対照第２試薬」を調製した。なお、この「対照第２試薬」にはアジ化物を添加していない。【０３７６】
（１）  リパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）の０．０４５グラム［ｇ］を、ビーカー（容量：１０ｍＬ）に量り取った。【０３７７】
（２）  次に、側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル（ポリエーテル変性タイプ）である、ＫＦ−３５５Ａ（販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）の０．６グラム［ｇ］を量り取り、これを前記（１）のビーカーに添加した。【０３７８】
（３）  前記（２）の添加後、このビーカーを６７℃において撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤であるＫＦ−３５５Ａとを混合した。【０３７９】
この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」を調製した。【０３８０】
なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０３８１】
（４）  次に、前記（３）のビーカー内の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」（全部）に、撹拌しながら「一定量（４．０ｍＬ）の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］」を室温（２５℃）においてマイクロピペットより添加した。【０３８２】
そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤を混合して調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］」との混合を行った。【０３８３】
なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０３８４】
（５）  次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物）と一定量の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］との混合後の混合液」に、更に一定量の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。【０３８５】
（６）  以上の操作により、「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＫＦ−３５５Ａ）」を調製した。
これを対照としてのリパーゼ活性測定用基質溶液である「対照第２試薬」とした。【０３８６】
（７）  なお、前記（１）〜（６）において調製した、「対照第２試薬」において、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．３ｍＭであり、界面活性剤（ＫＦ−３５５Ａ）の濃度は０．３％（ｗ／ｖ）である。
また、この「対照第２試薬」において、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。【０３８７】
２．試薬の保存
前記１の〔２〕の［１］において調製した「アジ化物添加第２試薬（本発明）」、及び前記１の〔２〕の［２］において調製した「アジ化物添加第２試薬（従来発明）」のそれぞれを、５℃で暗所に７日間保存した。【０３８８】
３．試料
下の「（１）標準物質」、「（２）標準血清」、及び「（３）管理血清」をそれぞれ試料として用いた。【０３８９】
（１）標準物質
「常用参照標準物質：ＪＳＣＣ常用酵素  ＪＣＣＬＳ  ＣＲＭ−００１ｃ」（販売元：特定非営利活動法人日本臨床検査標準協議会［日本国］）を、「標準物質」として用いた。【０３９０】
（２）標準血清
市販の標準血清である「シグナスオート  ＬＩＰ  標準血清」［製造番号：Ｇ５０１］（販売元：株式会社シノテスト［日本国］）を、「標準血清」として用いた。【０３９１】
（３）管理血清
市販の精度管理用管理血清である「シグナスオート  ＬＩＰ  コントロール」［製造番号：Ｇ５０１］（販売元：株式会社シノテスト［日本国］）を、「管理血清」として用いた。【０３９２】
４．試料中のリパーゼ活性の測定
「第１試薬」及び「対照第２試薬」、並びに前記２において５℃（暗所）にて７日間保存した「アジ化物添加第２試薬（本発明）」及び「アジ化物添加第２試薬（従来発明）を使用して、７１８０形汎用自動分析装置（販売元：株式会社日立ハイテクノロジーズ［日本国］）により、前記３の各試料の測定を行った。【０３９３】
（１）  前記の７１８０形汎用自動分析装置において、前記３のそれぞれの試料（「（１）標準物質」、「（２）標準血清」、及び「（３）管理血清」）について、これらの試料の２．６μＬに、それぞれ前記１の〔１〕で調製した「第１試薬」の１６０μＬを第１試薬として添加し、３７℃で反応させた。【０３９４】
（２）  次に、１６ポイント（第１試薬添加後２７０．０９３秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２８６．９７７秒）の間に、前記２で保存した「アジ化物添加第２試薬（本発明）」の９６μＬを第２試薬として添加し、３７℃で反応させた。【０３９５】
（３）  次に、２０ポイント（第１試薬添加後３４０．５１０秒）から２４ポイント（第１試薬添加後４１１．８８７秒）に掛けての吸光度変化量を主波長５７０ｎｍ、副波長７００ｎｍにて測定した。（試料中に含まれていたリパーゼの活性値に応じて生成する６’−メチルレゾルフィンの濃度増加に基づく吸光度変化量の測定）【０３９６】
（４）  また、試薬盲検（試薬ブランク）の測定のため、生理食塩水を用いた。
この生理食塩水を試料とすること以外は、前記（１）〜（３）の記載の通りに操作を行い、生理食塩水を測定したときの吸光度変化量を測定した。（試薬盲検の吸光度変化量の測定）【０３９７】
（５）  次に、前記（３）において求めた前記３のそれぞれの試料についての当該ポイント間の吸光度変化量から、前記（４）において求めた当該ポイント間の試薬盲検の吸光度変化量を差し引いて、「試料の吸光度変化量差の値」を求めた。【０３９８】
（６）  また、前記（２）における第２試薬を「アジ化物添加第２試薬（本発明）」から前記２で保存した「アジ化物添加第２試薬（従来発明）」に替えること以外は、前記（１）〜（５）の記載の通りに操作を行い、前記３の各試料のリパーゼ活性値（試料の吸光度変化量差の値）を求めた。【０３９９】
（７）  また、前記（２）における第２試薬を「アジ化物添加第２試薬（本発明）」から前記１の〔２〕の［３］で調製した「対照第２試薬」に替えること以外は、前記（１）〜（５）の記載の通りに操作を行い、前記３の各試料のリパーゼ活性値（試料の吸光度変化量差の値）を求めた。【０４００】
５．測定結果
前記４において測定し、求めた前記３の各試料のリパーゼ活性値（試料の吸光度変化量差の値）を表１に示した。【０４０１】
【表１】
2018056162.tif 000002
【０４０２】
なお、この表１において示した測定値（各試料のリパーゼ活性値）の単位は、「吸光度差（ΔＡｂｓ．）」である。【０４０３】
また、この表１において、（カッコ）の中の数値は、各測定値（リパーゼ活性値［試料の吸光度変化量差の値］）を、第２試薬としてアジ化物を添加していない「対照第２試薬」を使用したときの各試料の測定値（リパーゼ活性値［試料の吸光度変化量差の値］）で除した値をパーセント表示で表したものである。【０４０４】
６．考察
（１）  この表１より、第２試薬として「アジ化物添加第２試薬（従来発明）」を使用したときの測定値（リパーゼ活性値［試料の吸光度変化量差の値］）は、第２試薬としてアジ化物を添加していない「対照第２試薬」を使用したときに比べ、「（１）標準物質」においては６７％であり、「（２）標準血清」においては６７％であり、そして、「（３）管理血清」においては７０％であり、測定により得られた吸光度が大幅に低下していることが分かる。【０４０５】
（２）  これに対して、同じくこの表１より、第２試薬として「アジ化物添加第２試薬（本発明）」を使用したときの測定値（リパーゼ活性値［試料の吸光度変化量差の値］）は、第２試薬としてアジ化物を添加していない「対照第２試薬」を使用したときに比べ、「（１）標準物質」においては１０５％であり、「（２）標準血清」においては１０１％であり、そして、「（３）管理血清」においては１０１％であり、ほぼ差がないことが分かる。【０４０６】
（３）  すなわち、本発明においては、混入したアジ化物によるＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができることが確かめられた。【０４０７】
〔実施例２〕（本発明のアジ化物の影響の抑制効果の確認−２）
本発明におけるアジ化物の影響の抑制効果を再度確認した。【０４０８】
１．本発明のリパーゼ活性測定試薬
本発明のリパーゼ活性測定試薬の第１試薬及び第２試薬をそれぞれ調製した。【０４０９】
〔１〕第１試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．４（２０℃）に調整して、リパーゼ活性測定試薬の第１試薬を調製した。【０４１０】
デオキシコール酸ナトリウム  ［リパーゼ賦活化剤］  ２％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム  ［リパーゼ活性化剤］  ２０ｍＭ
コリパーゼ  （ブタ膵臓由来、販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）  ７５０Ｋ単位／Ｌ（１０ｍｇ／Ｌ）
Ｂｉｃｉｎｅ  ［緩衝剤］  ８０ｍＭ【０４１１】
なお、この第１試薬を個別に計３回調製し、これらをそれぞれリパーゼ活性測定試薬の第１試薬の第１ロット、第２ロット及び第３ロットとした。【０４１２】
〔２〕第２試薬（リパーゼ活性測定用基質溶液）
［１］アジ化物添加第２試薬（本発明）
本発明のリパーゼ活性測定試薬の第２試薬（リパーゼ活性測定用基質溶液）に、アジ化物混入の影響を確かめるため、アジ化物を添加した「アジ化物添加第２試薬（本発明）」を計３ロット調製した。【０４１３】
（１）  リパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）の０．０４５グラム［ｇ］を、ビーカー（容量：１０ｍＬ）に量り取った。【０４１４】
（２）  次に、側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル（ポリエーテル変性タイプ）である、ＫＦ−３５５Ａ（販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）の０．６グラム［ｇ］を量り取り、これを前記（１）のビーカーに添加した。【０４１５】
（３）  前記（２）の添加後、このビーカーを６７℃において撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤であるＫＦ−３５５Ａとを混合した。【０４１６】
この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」を調製した。【０４１７】
なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０４１８】
（４）  次に、前記（３）のビーカー内の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」（全部）に、撹拌しながら「一定量（４．０ｍＬ）の０．６ｍＭの塩化ヒドロキシルアンモニウム（還元剤）を含む４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］」を室温（２５℃）においてマイクロピペットより添加した。【０４１９】
そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤を混合して調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の０．６ｍＭの塩化ヒドロキシルアンモニウムを含む４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］」との混合を行った。【０４２０】
なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０４２１】
（５）  次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物）と一定量の０．６ｍＭの塩化ヒドロキシルアンモニウムを含む４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］との混合後の混合液」に、更に一定量の０．６ｍＭの塩化ヒドロキシルアンモニウムを含む４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。【０４２２】
（６）  以上の操作により、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＫＦ−３５５Ａ、還元剤：塩化ヒドロキシルアンモニウム）」を調製した。
これを本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「第２試薬（本発明）」の第１ロットとした。【０４２３】
（７）  
前記（６）の「第２試薬（本発明）」の１０ｍＬに０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム水溶液の１０μＬを添加し、「アジ化物添加第２試薬（本発明）」の第１ロットとした。【０４２４】
（８）  また、更に２回ずつ前記（１）〜（７）の記載の通りに操作を行うことにより、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＫＦ−３５５Ａ、還元剤：塩化ヒドロキシルアンモニウム）」にアジ化ナトリウムを添加したものを個別に２回調製した。
これらをそれぞれ「アジ化物添加第２試薬（本発明）」の第２ロット及び第３ロットとした。【０４２５】
（９）  なお、前記（１）〜（８）において調製した、「アジ化物添加第２試薬（本発明）」の第１ロット、第２ロット、及び第３ロットそれぞれにおいて、いずれもリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．３ｍＭであり、界面活性剤（ＫＦ−３５５Ａ）の濃度は０．３％（ｗ／ｖ）であり、還元剤（塩化ヒドロキシルアンモニウム）の濃度は０．６ｍＭであり、そして  アジ化ナトリウムの濃度は０．０００１％（ｗ／ｖ）である。
また、これらのいずれの「アジ化物添加第２試薬（本発明）」においても、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。【０４２６】
［２］アジ化物添加第２試薬（従来発明）
従来発明のリパーゼ活性測定試薬の第２試薬（リパーゼ活性測定用基質溶液）に、アジ化物混入の影響を確かめるため、アジ化物を添加した「第２試薬（従来発明）」を計３ロット調製した。【０４２７】
（１）  リパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）の０．０４５グラム［ｇ］を、ビーカー（容量：１０ｍＬ）に量り取った。【０４２８】
（２）  次に、側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル（ポリエーテル変性タイプ）である、ＫＦ−３５５Ａ（販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）の０．６グラム［ｇ］を量り取り、これを前記（１）のビーカーに添加した。【０４２９】
（３）  前記（２）の添加後、このビーカーを６７℃において撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤であるＫＦ−３５５Ａとを混合した。【０４３０】
この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」を調製した。【０４３１】
なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０４３２】
（４）  次に、前記（３）のビーカー内の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」（全部）に、撹拌しながら「一定量（４．０ｍＬ）の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］」を室温（２５℃）においてマイクロピペットより添加した。【０４３３】
そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤を混合して調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］」との混合を行った。【０４３４】
なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０４３５】
（５）  次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物）と一定量の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］との混合後の混合液」に、更に一定量の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。【０４３６】
（６）  以上の操作により、従来発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＫＦ−３５５Ａ）」を調製した。
これを従来発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「第２試薬（従来発明）」の第１ロットとした。【０４３７】
（７）  
前記（６）の「第２試薬（従来発明）」の１０ｍＬに０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム水溶液の１０μＬを添加し、「アジ化物添加第２試薬（従来発明）」の第１ロットとした。【０４３８】
（８）  また、更に２回ずつ前記（１）〜（７）の記載の通りに操作を行うことにより、従来発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＫＦ−３５５Ａ）」にアジ化ナトリウムを添加したものを個別に２回調製した。
これらをそれぞれ「アジ化物添加第２試薬（従来発明）」の第２ロット及び第３ロットとした。【０４３９】
（９）  なお、前記（１）〜（８）において調製した、「アジ化物添加第２試薬（従来発明）」の第１ロット、第２ロット、及び第３ロットそれぞれにおいて、いずれもリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．３ｍＭであり、界面活性剤（ＫＦ−３５５Ａ）の濃度は０．３％（ｗ／ｖ）であり、そして  アジ化ナトリウムの濃度は０．０００１％（ｗ／ｖ）である。
また、これらのいずれの「アジ化物添加第２試薬（従来発明）」においても、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。【０４４０】
［３］対照第２試薬（本発明）
対照としてのリパーゼ活性測定試薬の第２試薬（リパーゼ活性測定用基質溶液）である「対照第２試薬（本発明）」を計３ロット調製した。なお、この「対照第２試薬（本発明）」にはアジ化物を添加していない。【０４４１】
（１）  リパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）の０．０４５グラム［ｇ］を、ビーカー（容量：１０ｍＬ）に量り取った。【０４４２】
（２）  次に、側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル（ポリエーテル変性タイプ）である、ＫＦ−３５５Ａ（販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）の０．６グラム［ｇ］を量り取り、これを前記（１）のビーカーに添加した。【０４４３】
（３）  前記（２）の添加後、このビーカーを６７℃において撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤であるＫＦ−３５５Ａとを混合した。【０４４４】
この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」を調製した。【０４４５】
なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０４４６】
（４）  次に、前記（３）のビーカー内の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」（全部）に、撹拌しながら「一定量（４．０ｍＬ）の０．６ｍＭの塩化ヒドロキシルアンモニウムを含む４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］」を室温（２５℃）においてマイクロピペットより添加した。【０４４７】
そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤を混合して調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の０．６ｍＭの塩化ヒドロキシルアンモニウムを含む４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］」との混合を行った。【０４４８】
なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０４４９】
（５）  次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物）と一定量の０．６ｍＭの塩化ヒドロキシルアンモニウムを含む４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］との混合後の混合液」に、更に一定量の０．６ｍＭの塩化ヒドロキシルアンモニウムを含む４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。【０４５０】
（６）  以上の操作により、「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＫＦ−３５５Ａ）」を調製した。
これを対照としてのリパーゼ活性測定用基質溶液である「対照第２試薬（本発明）」の第１ロットとした。【０４５１】
（７）  また、更に２回ずつ前記（１）〜（６）の記載の通りに操作を行うことにより、対照としてのリパーゼ活性測定用基質溶液である「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＫＦ−３５５Ａ）」を個別に２回調製した。
これらをそれぞれ「対照第２試薬（本発明）」の第２ロット及び第３ロットとした。【０４５２】
（８）  なお、前記（１）〜（７）において調製した、「対照第２試薬（本発明）」の第１ロット、第２ロット、及び第３ロットそれぞれにおいて、いずれもリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．３ｍＭであり、界面活性剤（ＫＦ−３５５Ａ）の濃度は０．３％（ｗ／ｖ）であり、そして、還元剤（塩化ヒドロキシルアンモニウム）の濃度は０．６ｍＭである。
また、これらのいずれの「対照第２試薬（本発明）」においても、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。【０４５３】
［４］対照第２試薬（従来発明）
対照としてのリパーゼ活性測定試薬の第２試薬（リパーゼ活性測定用基質溶液）である「対照第２試薬（従来発明）」を計３ロット調製した。なお、この「対照第２試薬（従来発明）」にはアジ化物を添加していない。【０４５４】
（１）  リパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）の０．０４５グラム［ｇ］を、ビーカー（容量：１０ｍＬ）に量り取った。【０４５５】
（２）  次に、側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル（ポリエーテル変性タイプ）である、ＫＦ−３５５Ａ（販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）の０．６グラム［ｇ］を量り取り、これを前記（１）のビーカーに添加した。【０４５６】
（３）  前記（２）の添加後、このビーカーを６７℃において撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤であるＫＦ−３５５Ａとを混合した。【０４５７】
この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」を調製した。【０４５８】
なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０４５９】
（４）  次に、前記（３）のビーカー内の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」（全部）に、撹拌しながら「一定量（４．０ｍＬ）の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］」を室温（２５℃）においてマイクロピペットより添加した。【０４６０】
そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤を混合して調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］」との混合を行った。【０４６１】
なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０４６２】
（５）  次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物）と一定量の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］との混合後の混合液」に、更に一定量の４０ｍＭのＬ−酒石酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ４．０（２０℃）］を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。【０４６３】
（６）  以上の操作により、「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＫＦ−３５５Ａ）」を調製した。
これを対照としてのリパーゼ活性測定用基質溶液である「対照第２試薬（従来発明）」の第１ロットとした。【０４６４】
（７）  また、更に２回ずつ前記（１）〜（６）の記載の通りに操作を行うことにより、対照としてのリパーゼ活性測定用基質溶液である「リパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＫＦ−３５５Ａ）」を個別に２回調製した。
これらをそれぞれ「対照第２試薬（従来発明）」の第２ロット及び第３ロットとした。【０４６５】
（８）  なお、前記（１）〜（７）において調製した、「対照第２試薬（従来発明）」の第１ロット、第２ロット、及び第３ロットそれぞれにおいて、いずれもリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．３ｍＭであり、界面活性剤（ＫＦ−３５５Ａ）の濃度は０．３％（ｗ／ｖ）である。
また、これらのいずれの「対照第２試薬（従来発明）」においても、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。【０４６６】
２．試薬の保存
前記１の〔２〕の［１］において調製した「アジ化物添加第２試薬（本発明）」の第１ロット、第２ロット及び第３ロット、並びに前記１の〔２〕の［２］において調製した「アジ化物添加第２試薬（従来発明）」の第１ロット、第２ロット及び第３ロットのそれぞれを、５℃で暗所に７日間保存した。【０４６７】
３．試料
下の「（１）標準物質」、「（２）管理血清−１」、「（３）管理血清−２」、「（４）管理血清−３」、「（５）管理血清−４」、「（６）標準血清」、「（７）管理血清−５」、及び「（８）プール血清」をそれぞれ試料として用いた。【０４６８】
（１）標準物質
「常用参照標準物質：ＪＳＣＣ常用酵素  ＪＣＣＬＳ  ＣＲＭ−００１ｃ」（販売元：特定非営利活動法人日本臨床検査標準協議会［日本国］）を、「標準物質」として用いた。【０４６９】
（２）管理血清−１
市販の精度管理用管理血清である「液状コントロール血清Ｉワコー  Ｃ＆Ｃ」［製造番号：１５１５Ｉ］（販売元：和光純薬工業株式会社［日本国］）を、「管理血清−１」として用いた。【０４７０】
（３）管理血清−２
市販の精度管理用管理血清である「液状コントロール血清ＩＩワコー  Ｃ＆Ｃ」［製造番号：１５１５ＩＩ］（販売元：和光純薬工業株式会社［日本国］）を、「管理血清−２」として用いた。【０４７１】
（４）管理血清−３
市販の精度管理用管理血清である「Ａａｌｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｉ  Ｒ」（販売元：株式会社シノテスト［日本国］）を、「管理血清−３」として用いた。【０４７２】
（５）管理血清−４
市販の精度管理用管理血清である「Ａａｌｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩＩ  Ｓ」（販売元：株式会社シノテスト［日本国］）を、「管理血清−４」として用いた。【０４７３】
（６）標準血清
市販の標準血清である「シグナスオート  ＬＩＰ  標準血清」［製造番号：Ｇ５０１］（販売元：株式会社シノテスト［日本国］）を、「標準血清」として用いた。【０４７４】
（７）管理血清−５
市販の精度管理用管理血清である「シグナスオート  ＬＩＰ  コントロール」［製造番号：Ｇ５０１］（販売元：株式会社シノテスト［日本国］）を、「管理血清−５」として用いた。【０４７５】
（８）プール血清
ヒト血清を集めたものを、「プール血清」として用いた。【０４７６】
４．試料中のリパーゼ活性の測定
「第１試薬」、「対照第２試薬（本発明）」及び「対照第２試薬（従来発明）」、並びに前記２において５℃（暗所）にて７日間保存した「アジ化物添加第２試薬（本発明）」（第１ロット〜第３ロット）及び「アジ化物添加第２試薬（従来発明）」（第１ロット〜第３ロット）を使用して、７１８０形汎用自動分析装置（販売元：株式会社日立ハイテクノロジーズ［日本国］）により、前記３の各試料の測定を行った。【０４７７】
（１）  前記の７１８０形汎用自動分析装置において、前記３のそれぞれの試料について、これらの試料の２．６μＬに、それぞれ前記１の〔１〕で調製した「第１試薬」の第１ロットの１６０μＬを第１試薬として添加し、３７℃で反応させた。【０４７８】
（２）  次に、１６ポイント（第１試薬添加後２７０．０９３秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２８６．９７７秒）の間に、前記２で保存した「アジ化物添加第２試薬（本発明）」の９６μＬを第２試薬として添加し、３７℃で反応させた。【０４７９】
（３）  次に、２０ポイント（第１試薬添加後３４０．５１０秒）から２４ポイント（第１試薬添加後４１１．８８７秒）に掛けての吸光度変化量を主波長５７０ｎｍ、副波長７００ｎｍにて測定した。（試料中に含まれていたリパーゼの活性値に応じて生成する６’−メチルレゾルフィンの濃度増加に基づく吸光度変化量の測定）【０４８０】
（４）  また、試薬盲検（試薬ブランク）の測定のため、生理食塩水を用いた。
この生理食塩水を試料とすること以外は、前記（１）〜（３）の記載の通りに操作を行い、生理食塩水を測定したときの吸光度変化量を測定した。（試薬盲検の吸光度変化量の測定）【０４８１】
（５）  次に、前記（３）において求めた前記３のそれぞれの試料についての当該ポイント間の吸光度変化量から、前記（４）において求めた当該ポイント間の試薬盲検の吸光度変化量を差し引いて、「試料の吸光度変化量差の値」を求めた。【０４８２】
（６）  また、前記（２）における第２試薬を前記２で保存した「アジ化物添加第２試薬（本発明）」の第１ロットから第２ロットに替えること以外は、前記（１）〜（５）の記載の通りに操作を行い、第２試薬として第２ロットを用いた場合の前記３の各試料のリパーゼ活性値（試料の吸光度変化量差の値）を求めた。【０４８３】
（７）  また、前記（２）における第２試薬を前記２で保存した「アジ化物添加第２試薬（本発明）」の第１ロットから第３ロットに替えること以外は、前記（１）〜（５）の記載の通りに操作を行い、第２試薬として第３ロットを用いた場合の前記３の各試料のリパーゼ活性値（試料の吸光度変化量差の値）を求めた。【０４８４】
（８）  また、前記（２）における第２試薬を「アジ化物添加第２試薬（本発明）」から前記２で保存した「アジ化物添加第２試薬（従来発明）」に替えること以外は、前記（１）〜（７）の記載の通りに操作を行い、第２試薬として第１ロット〜第３ロットを用いた場合の前記３の各試料のリパーゼ活性値（試料の吸光度変化量差の値）を求めた。【０４８５】
（９）  また、前記（２）における第２試薬を「アジ化物添加第２試薬（本発明）」から前記１の〔２〕の［３］で調製した「対照第２試薬（本発明）」に替えること以外は、前記（１）〜（７）の記載の通りに操作を行い、第２試薬として第１ロット〜第３ロットを用いた場合の前記３の各試料のリパーゼ活性値（試料の吸光度変化量差の値）を求めた。【０４８６】
（１０）  また、前記（２）における第２試薬を「アジ化物添加第２試薬（本発明）」から前記１の〔２〕の［４］で調製した「対照第２試薬（従来発明）」に替えること以外は、前記（１）〜（７）の記載の通りに操作を行い、第２試薬として第１ロット〜第３ロットを用いた場合の前記３の各試料のリパーゼ活性値（試料の吸光度変化量差の値）を求めた。【０４８７】
５．測定結果
前記４において測定し、求めた前記３の各試料のリパーゼ活性値（試料の吸光度変化量差の値）を表２に示した。【０４８８】
【表２】
2018056162.tif 000003
【０４８９】
なお、この表２において示した測定値（各試料のリパーゼ活性値）の単位は、「吸光度差（ΔＡｂｓ．）」である。【０４９０】
また、この表２において、（カッコ）の中の数値は、第２試薬として「アジ化物添加第２試薬（本発明）」を使用したときの測定値（リパーゼ活性値［試料の吸光度変化量差の値］）を、第２試薬としてアジ化物を添加していない「対照第２試薬（本発明）」を使用したときの測定値（リパーゼ活性値［試料の吸光度変化量差の値］）で除した値をパーセント表示で表したもの、又は第２試薬として「アジ化物添加第２試薬（従来発明）」を使用したときの測定値（リパーゼ活性値［試料の吸光度変化量差の値］）を、第２試薬としてアジ化物を添加していない「対照第２試薬（従来発明）」を使用したときの測定値（リパーゼ活性値［試料の吸光度変化量差の値］）で除した値をパーセント表示で表したものである。【０４９１】
６．考察
（１）  この表２より、第２試薬として「アジ化物添加第２試薬（従来発明）」を使用したときの測定値（リパーゼ活性値［試料の吸光度変化量差の値］）は、第２試薬としてアジ化物を添加していない「対照第２試薬（従来発明）」を使用したときに比べ、第１ロットにおいては６７％〜７６％であり、第２ロットにおいては６５％〜７６％であり、そして、第３ロットにおいては６５％〜７９％であり、測定により得られた吸光度がいずれも大幅に低下していることが分かる。【０４９２】
（２）  これに対して、同じくこの表２より、第２試薬として「アジ化物添加第２試薬（本発明）」を使用したときの測定値（リパーゼ活性値［試料の吸光度変化量差の値］）は、第２試薬としてアジ化物を添加していない「対照第２試薬（本発明）」を使用したときに比べ、第１ロットにおいては９６％〜１００％であり、第２ロットにおいては９６％〜９９％であり、そして、第３ロットにおいては９６％〜１００％であり、いずれもほぼ差がないことが分かる。【０４９３】
（３）  すなわち、本発明において、混入したアジ化物によるＤＧＧＭＲの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができることが再度確かめられた。
【国際調査報告】
2018056162.tif 000004
2018056162.tif 000005
2018056162.tif 000006
2018056162.tif 000007