(57)【要約】本発明は、被験者から単離した生体試料におけるミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の程度を、該tRNALeu(UUR)を鋳型としてプライマーからの逆転写反応により測定する工程を含む、被験者の老化の測定方法を提供する。また、本発明は、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０〜２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーを含有する、老化の判定薬も提供する。さらに、本発明は、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０〜２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーおよび逆転写酵素を含有する、老化の判定キットも提供する。その上、本発明は、タウリンを有効成分として含有する、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善剤も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から単離した生体試料におけるミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の程度を、該tRNALeu(UUR)を鋳型としてプライマーからの逆転写反応により測定する工程を含む、被験者の老化の測定方法。
【請求項２】
プライマーが鋳型に相補的な１０〜２５塩基長からなるオリゴヌクレオチドであり、タウリン修飾の有無によるプライマー伸長産物の相違を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プライマーが配列番号３、４および５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を含む、少なくとも１種である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
タウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物と、タウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物との量比を算出する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
下記式（１）：
【数１】
2017170300.tif 000011
（式中、τｍ５Ｕはタウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示し、Ｕはタウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示す）で表される総タウリン修飾率を老化の指標とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
被験者が、tRNALeu(UUR)遺伝子コード領域のA3243G、T3271C、G3244A、T3258CおよびT3291Cからなる群より選ばれる一塩基置換を有する変異ミトコンドリアDNAを有すると疑われる者であり、前記式（１）に続いて、下記式（２）：
【数２】
2017170300.tif 000012
（上記式中、mtDNA点変異率は、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれる点変異の中で最も高い点変異率を示す）により求めた正常タウリン修飾率を老化の指標とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０〜２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーを含有する、老化の判定薬。
【請求項８】
プライマーが配列番号３、４および５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を含む、少なくとも１種である、請求項７に記載の判定薬。
【請求項９】
ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０〜２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーおよび逆転写酵素を含有する、老化の判定キット。
【請求項１０】
プライマーが配列番号３、４および５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を含む、少なくとも１種である、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
タウリンを有効成分として含有する、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善剤。
【請求項１２】
ミトコンドリアtRNALeu(UUR)が正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)である、請求項１１に記載の改善剤。
【請求項１３】
タウリン修飾率の改善が下記式（１）：
【数３】
2017170300.tif 000013
（式中、τｍ５Ｕはタウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示し、Ｕはタウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示す）により求めた総タウリン修飾率、および／または
下記式（２）：
【数４】
2017170300.tif 000014
（上記式中、mtDNA点変異率は、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれる点変異の中で最も高い点変異率を示す）により求めた正常タウリン修飾率の改善である、請求項１１または１２に記載の改善剤。
【請求項１４】
医薬または化粧品である、請求項１１または１２に記載の改善剤。
【請求項１５】
保健機能食品または食品添加物である、請求項１１または１２に記載の改善剤。
【請求項１６】
ミトコンドリア病を発症した患者、および／または発症リスクを有する対象のミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善用である、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の改善剤。
【請求項１７】
ミトコンドリア病がミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の欠損遺伝子変異に起因する、請求項１６に記載の改善剤。
【請求項１８】
ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の欠損遺伝子変異が、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれる点変異である、請求項１７に記載の改善剤。
【請求項１９】
ミトコンドリア病が、MELASあるいは糖尿病である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、老化を反映するミトコンドリアバイオマーカーに関し、老化を可視化し、健康寿命の指標を提供する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、体細胞の好気性代謝を担う細胞内小器官で、水素伝達系と酸化的リン酸化によってエネルギーとなるATPを産生する。このミトコンドリア機能は、ゲノムとは独立した複製機構をもつミトコンドリアDNAの変異を原因とするミトコンドリア病ばかりでなく、老化によっても障害されると考えられている。したがって、ミトコンドリア機能障害の早期診断や障害度評価は、ミトコンドリア病患者の治療方針の選択や予後判定に重要な役割を果たすばかりではなく、老化マーカーとしても注目される。【０００３】
MELASは、最も頻度の高いミトコンドリア病で、Myopathy、Encephalopathy、Lactic acidosis、Stroke-like episodeで代表される多彩かつ特徴的な症候を呈し、診断からの平均余命は5-10年、世界的に保険適応を獲得した医薬品が皆無の難治性希少疾患である。脳卒中様発作を繰り返し進行するため、その一刻も早い再発抑制療法が待望されている。MELASは、ミトコンドリアDNAのtRNALeu(UUR)遺伝子コード領域の一塩基置換（A3243G、T3271C、G3244A、T3258C、T3291C）が原因で発症するが、その基本病態は長らく不明であった。日本医科大学の太田らは、MELAS変異tRNALeu(UUR)では、正常で認められるアンチコドン1文字目のタウリン修飾が欠損して翻訳障害が惹起されるというユニークな基本病態を発見し、「tRNA転写後修飾異常病」という新規疾患概念を世界に先駆け提唱した(非特許文献１)。本発明者らは、太田らとの共同研究により、タウリン大量投与によって、MELASモデル細胞のミトコンドリア機能異常が改善し、2名の患者の頻発していた脳卒中様発作が10年以上完全に抑制されることを発表した（非特許文献２）。そこで、GCP試験薬タウリンのMELAS脳卒中様発作抑制効果の有効性を検証する多施設オープン3相医師主導治験（厚生労働科学研究費：平成24-26年度難治等（難治）-一般-068）を実施して、60％の患者で主要評価項目であるMELAS脳卒中様発作の完全抑制を達成した。【０００４】
ヒト疾患におけるtRNA修飾の役割に関する総説が刊行され（非特許文献３）、ヒトミトコンドリア病におけるミトコンドリアtRNAのタウリン修飾欠如に関する測定法（非特許文献4）および総説も刊行されている（非特許文献5）。また、ミトコンドリアtRNAに着目した診断または治療に関していくつかの特許出願がなされている。
1）ミトコンドリアtRNAを含むtRNAの化学修飾、具体的にはリジンをコードするtRNAのチオメチル修飾率を測定することで２型糖尿病を診断する方法が知られている（特許文献１）。
2）高齢化に伴う代謝の変化、特にミトコンドリアの機能不全に結びつく変化を予防または修復することによって高齢動物の健康状態を改善する方法が知られている（特許文献２）。グルタチオンはミトコンドリアDNA（mtDNA）の酸化的傷害を防止する主要な細胞内抗酸化システムであるが、高齢化に伴いグルタチオン自体の酸化が進んで抗酸化機能が低下する。これに対して、タウリンなどのチオール化合物を供給することでmtDNAの酸化的傷害を防止できることが記載されている。しかし、tRNALeu(UUR)のタウリン修飾率と老化との関係については記載がない。
3）タウリン、タウリンクロラミンまたはタウリン前駆物質等を有効成分とするミトコンドリア病の治療薬が知られている（特許文献３）。しかし、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が加齢や、遺伝的要因や生活・環境要因などの影響による老化(生体機能の低下)に伴い低下すること、および、その低下がタウリン投与により改善されることは開示も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１４−１３６８７０号
【特許文献２】特表２００４−５１９２４１号公報
【特許文献３】特開２００３−４８８２９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Yasukawa T, Suzuki T, Ueda T, Ohta S, Watanabe K. J Biol Chem. 2000; 275(6):4251-4257
【非特許文献２】Rikimaru M, Ohsawa Y, Wolf AM, Nishimaki K, Ichimiya H, Kamimura N, Nishimatsu S, Ohta S, Sunada Y. Intern Med. 2012; 51(24):3351-3357.
【非特許文献３】Adrian Gabriel Torres, Eduard Batlle, Lluis Ribas de Poulana, Trends in Molecular Medicine 2014; 20 (6):306-314
【非特許文献４】Kirino Y, Goto Y, Campos Y, Arenas J, SuzukiT. Proc Natl Acad Sci U S A.2005;102(20):7127-7132.
【非特許文献５】Tsutomu Suzuki, Asuteka Nagao, and Takeo Suzuki, WIREs RNA 2011; 2:376-386
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の第一の目的は、老化に伴う、ミトコンドリア機能障害の早期発見や障害度評価につながる新規バイオマーカーを提供することにある。
本発明の第二の目的は、ミコトンドリアの機能低下を惹起する、老化に伴う、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率低下の改善剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これまで臨床的にミトコンドリア病マーカーとして使われてきた血液および髄液の乳酸値ならびに乳酸値とピルビン酸値との比は、ミトコンドリア病で嫌気性代謝が亢進する病態によって上昇するばかりでなく、組織低酸素による解糖系代謝の亢進、すなわちショック、呼吸不全、播種性血管内凝固症候群など様々な病態によっても上昇が認められる特異性の低いマーカーである（Kraut JA, Madias NE. Lactic acidosis. N Engl J Med. 2015; 372(11):1078-1079）。本発明者らは、被験者の白血球検体のミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率を測定し、ミトコンドリア病マーカーとしての有用性について鋭意検討した。具体的には、ミトコンドリア病患者における変異ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下のみならず、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下も観測され、意外にも、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が老化の指標となり得ることを見出し、ミトコンドリア病患者のみならず健常者への適用が可能であることに想到し、本発明を完成するに至った。さらに、本発明者らは、タウリンの大量投与は、ミトコンドリア病患者における変異ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の増加のみならず、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の増加をももたらすことを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
本発明は、以下のものを提供する。
〔１〕  被験者から単離した生体試料におけるミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の程度を、該tRNALeu(UUR)を鋳型としてプライマーからの逆転写反応により測定する工程を含む、被験者の老化の測定方法。
〔２〕  プライマーが鋳型に相補的な１０〜２５塩基長からなるオリゴヌクレオチドであり、タウリン修飾の有無によるプライマー伸長産物の相違を検出する、〔１〕に記載の方法。
〔３〕  プライマーが配列番号３、４および５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を含む、少なくとも１種である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕  タウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物と、タウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物との量比を算出する工程をさらに含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕  下記式（１）：【００１０】
【数１】
2017170300.tif 000002
【００１１】
（式中、τｍ５Ｕはタウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示し、Ｕはタウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示す）で表される総タウリン修飾率を老化の指標とする、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕  被験者が、tRNALeu(UUR)遺伝子コード領域のA3243G、T3271C、G3244A、T3258CおよびT3291Cからなる群より選ばれる一塩基置換を有する変異ミトコンドリアDNAを有すると疑われる者であり、前記式（１）に続いて、下記式（２）：【００１２】
【数２】
2017170300.tif 000003
【００１３】
（上記式中、mtDNA点変異率は、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれる点変異の中で最も高い点変異率を示す）により求めた正常タウリン修飾率を老化の指標とする、〔５〕に記載の方法。
〔７〕  ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０〜２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーを含有する、老化の判定薬。
〔８〕  プライマーが配列番号３、４および５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を含む、少なくとも１種である、〔７〕に記載の判定薬。
〔９〕  ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０〜２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーおよび逆転写酵素を含有する、老化の判定キット。
〔１０〕  プライマーが配列番号３、４および５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を含む、少なくとも１種である、〔９〕に記載のキット。
〔１１〕  タウリンを有効成分として含有する、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善剤。
〔１２〕  ミトコンドリアtRNALeu(UUR)が正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)である、〔１１〕に記載の改善剤。
〔１３〕  タウリン修飾率の改善が下記式（１）：【００１４】
【数３】
2017170300.tif 000004
【００１５】
（式中、τｍ５Ｕはタウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示し、Ｕはタウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示す）により求めた総タウリン修飾率、および／または
下記式（２）：【００１６】
【数４】
2017170300.tif 000005
【００１７】
（上記式中、mtDNA点変異率は、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれる点変異の中で最も高い点変異率を示す）により求めた正常タウリン修飾率の改善である、〔１１〕に記載の改善剤。
〔１４〕  医薬または化粧品である、〔１１〕または〔１２〕に記載の改善剤。
〔１５〕  保健機能食品または食品添加物である、〔１１〕または〔１２〕に記載の改善剤。
〔１６〕  ミトコンドリア病を発症した患者、および／または発症リスクを有する対象のミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善用である、〔１１〕〜〔１５〕のいずれかに記載の改善剤。
〔１７〕  ミトコンドリア病がミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の欠損遺伝子変異に起因する、〔１６〕に記載の改善剤。
〔１８〕  ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の欠損遺伝子変異が、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれる点変異である、〔１７〕に記載の改善剤。
〔１９〕  ミトコンドリア病が、MELASあるいは糖尿病である、〔１６〕〜〔１８〕のいずれかに記載の改善剤。
【発明の効果】
【００１８】
本発明者らは、ミトコンドリアtRNAの中でも、正常なtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が、従来のミトコンドリア病のマーカーである、血中乳酸値、血中乳酸値とピルビン酸値との比、髄液乳酸値、髄液乳酸値とピルビン酸値とは異なり、加齢と相関することを見出した。したがって、正常なtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、ミトコンドリア病患者のみならず健常人の生理機能の状態を把握することのできるユニバーサルマーカーである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】プライマー伸長法によるミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾測定法の概略を示す。
【図２】MELAS患者の総タウリン修飾率、ならびに正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率と年齢との相関を示す。
【図３】血中乳酸値と、MELAS患者の正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率または年齢との関連を調べた図である。
【図４】血中乳酸/ピルビン酸比と、MELAS患者の正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率または年齢との関連を調べた図である。
【図５】髄液乳酸/ピルビン酸比と、MELAS患者の正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率または年齢との関連を調べた図である。
【図６】髄液乳酸値と、MELAS患者の正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率または年齢との関連を調べた図である。
【図７】MELAS患者へのタウリン投与による総タウリン修飾率の変化、ならびに正常tRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善を示す図である。
【図８】若年（10代）および老年（80代）健常人のミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率を調べた図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
【００２１】
定義
本発明において「老化」とは、加齢や、遺伝的要因や生活・環境要因などのその他の内的または外的な要因の影響により生体機能が低下することをいう。加齢とは、生まれてから死までの物理的な時間経過であり、暦年齢と同義である。その他の内的な要因とは、例えば、ミトコンドリア機能、過酸化ラジカル濃度、およびテロメア長などの細胞老化に係わるものなどがあげられる。また、その他の外的な要因とは、例えば、個々の運動量、喫煙の有無、食事習慣、および栄養状態などがあげられる。生体機能とは、例えば筋力、神経伝導速度、肺活量、病気に対する抵抗力などがあげられる。加齢による老化は、一般に生殖年齢に達した後に始まり、個体差があるが、ヒトでは２０歳から３０歳以降に始まる。老化は、環境要因や遺伝的素因が複雑に絡み合って関与していると考えられ、かかる機能低下の速さはすべてのヒトが同じではなく、必ずしも加齢という要因のみで規定できるものではなく、従来は明確な老化の指標がなかった。本発明が提供する老化の指標は、健康寿命の観点からも指標とすることができる。
本発明の「老化」は、身長や体重の減少、皮膚や頭髪の変化などの外的変化、運動機能の低下、感覚機能の低下、或いは、生理機能の低下などの所謂加齢に伴う身体機能の低下のみでなく、生体を構成する細胞の老化（細胞老化）、さらに呼吸・エネルギー代謝に重要な機能を果たすミトコンドリアの老化が含まれる。老化に伴いミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が低下すれば、当然、UUGコドン特異的な翻訳能が律速となって、UUGコドンを含むタンパク質の合成が低下する。ひいてはミトコンドリアの機能が低下し、生体やそれを構成する器官等の機能が低下するのは明らかであり、さらに修飾率の低下が進行すれば、例えば、高齢者に認められる呼吸困難や骨格筋の減弱のような重篤な症状を発症するに至る場合もあると考えられる。従って、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、ミトコンドリア自体の老化や機能低下の指標として用いることができることは言うに及ばず、生体、器官(臓器)、組織、細胞、或は、細胞内小器官の機能、とりわけ、生体やエネルギー需要の高い器官(臓器)、組織、細胞、或いは、細胞内小器官の老化や機能低下の指標としても有用である。
また、上記指標は、現在開発が進行中のミトコンドリア病患者に対するタウリン療法の対象者の選定や、その治療効果判定に用いるコンパニオン診断用途やその補助にも有用である。
【００２２】
ここで健康寿命とは、厚生労働省が定義する、健康上の問題で日常生活が制限されることなく生活できる期間をいう。世界保健機関を始めとして、各国が健康寿命を伸ばすことを目標としており、究極的には、健康寿命と平均寿命との差をゼロに近づけることが望まれている。
【００２３】
本発明においてミトコンドリアtRNALeu(UUR)は、ミトコンドリアDNAから転写され、ロイシンのコドンUUR (RはAまたはGである)を認識するtRNAである。ミトコンドリアtRNALeu(UUR)は、動物種によって17位、20位、47位の塩基が増減するため、アンチコドンに相当するヌクレオチド（UAA）の位置を統一して34位〜36位と定めている。ヒトミトコンドリアtRNALeu(UUR)をコードするDNAは、NCBIに登録されており、GenBankアクセッション番号AB026838（バージョンAB026838.1）（配列番号１）で公表されている。また、配列番号１で公表されているDNAから転写されるミトコンドリアtRNALeu(UUR)は、配列番号２で表される。配列番号２の36番目（上記定義によると34位）のウリジン（U）は、タウリン修飾されている場合と修飾されていない場合とがある。
本願明細書においては、「ミトコンドリアtRNALeu(UUR)」を単に「tRNALeu(UUR)」と省略する場合がある。
【００２４】
tRNALeu(UUR)には様々な変異が見出されている。本発明においては、配列番号２で表されるtRNALeu(UUR)のみならず、現在までに知られている変異tRNALeu(UUR)および将来見出される変異tRNALeu(UUR)をも測定対象とする。変異tRNALeu(UUR)の具体例は、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）、62位のT（T3291C）の点変異：これらの変異はタウリン修飾の欠損を生じさせ、MELAS患者で見出されている変異である；13位のG（A3242A）、21位のT（T3250C）、25位のC（C3254T）、51位のA（A3280G）の点変異：これらの変異はタウリン修飾に影響はなく、MELAS以外のミトコンドリア病で見出されている変異である；などがあげられる。その他の変異については、ＭＩＴＯＭＡＰ（www.mitomap.org/MITOMAP）を参照することができる。
本発明において変異tRNALeu(UUR)とは、タウリン修飾の欠損を生じさせる変異を有するmtDNAより転写されたtRNALeu(UUR)をいい、タウリン修飾に影響しない変異を有するtRNALeu(UUR)を含まないものとする。
また、正常tRNALeu(UUR)とは、上記変異tRNALeu(UUR)を除くtRNALeu(UUR)をいう。ヒトの場合、配列番号２で表されるtRNALeu(UUR)と同一の塩基配列を有するtRNALeu(UUR)および配列番号２で表されるtRNALeu(UUR)と異なる塩基配列を有するtRNALeu(UUR)であっても、該塩基配列の相違がtRNALeu(UUR)のタウリン修飾に影響しないtRNALeu(UUR)が含まれるが、タウリン修飾の有無にかかわらず正常なtRNALeu(UUR)の機能を有さないものは含まない。
ここで、上記14位のA、15位のG、29位のT、42位のTおよび62位のTは、ヒト以外に、ゴリラ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等においても保存されており、ラットおよびマウスの場合も、42位がCである以外は同様に保存されているため、tRNALeu(UUR)のタウリン修飾の欠損を生じさせる変異は、ヒトに限定されるものではなく、後述する霊長類、ペット、家畜、実験動物等の哺乳動物も対象となりうる。
【００２５】
本発明においてミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾とは、tRNALeu(UUR)のアンチコドン（UAA）１文字目（上記定義によると34位のwobble位）のウラシル塩基の５位にタウリノメチル基が結合した転写後修飾をいう。このようにタウリン修飾されたウリジンをτm5Uの略号で示す場合がある。
【００２６】
ミトコンドリアDNA（mtDNA）とヘテロプラスミーについて
細胞あたり数百のミトコンドリアが存在し、そのひとつひとつのミトコンドリアに5〜10個のミトコンドリアDNA（mtDNA）が含まれている。単一のmtDNAで構成されている状態を「ホモプラスミー」、正常と変異mtDNAが混在している状態を「ヘテロプラスミー」と呼ぶ。変異mtDNAの比率（ヘテロプラスミーの度合い）が高くなると、ミトコンドリアの呼吸機能に異常を来たし、ミトコンドリア病を発症する。ヘテロプラスミーの度合いは、骨格筋、血管、皮膚などの組織ごと、または細胞ごとに異なる。また、健常者の組織または細胞においても、変異mtDNAが微量に含まれていることが最近報告された（Brendan A.I. Payne et al.: Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Hum Mol Gent 22: 384 - 390 (2013)）。そこで、本発明においては、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の度合いを以下のように定義し、実質的に正常なmtDNAを有する被験者（健常者）と、変異mtDNAを一定の割合で含む被験者(例、MELAS患者、糖尿病患者)とに区別して、tRNALeu(UUR)のタウリン修飾率を測定する。
【００２７】
ミトコンドリア病患者のタウリン修飾率について
MELAS患者の細胞のミトコンドリアは、ヘテロプラスミーであるため、変異mtDNAと正常なmtDNAが含まれている。したがって、変異mtDNAより転写されたtRNALeu(UUR)のアンチコドン１番目のウラシルはタウリン修飾が欠損しているとしても、正常なmtDNAより転写されたtRNALeu(UUR)はタウリン修飾されていると考えられる。
MELAS患者を始めとする変異mtDNAを含む被験者由来の細胞に含まれる正常なmtDNAより転写されたtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率を「正常タウリン修飾率」と定義し、下記式（１）により求めた「総タウリン修飾率」に基づいて、下記式（２）により求めることができる。
【００２８】
本発明において総タウリン修飾率とは、被験者由来の検体中のミトコンドリアtRNALeu(UUR)におけるタウリン修飾tRNALeu(UUR)を、タウリン修飾tRNALeu(UUR)とタウリン非修飾tRNALeu(UUR)との総和で除した値をいう。
【００２９】
ここで被験者とは、ヒトを始めとする哺乳動物であり、哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー、ゴリラなどの霊長類等をあげることができる。被験者由来の検体とは、哺乳動物、好ましくはヒトから採取可能なものであれば特に限定されるものではなく、血液、リンパ液、尿などの体液試料、毛髪、頬粘膜、胃、大腸、肺、肝臓、脳などの生検組織をあげることができる。好ましくは血液試料であり、血液試料中の白血球がより好ましい。
【００３０】
総タウリン修飾率は、タウリン修飾tRNALeu(UUR)およびタウリン非修飾tRNALeu(UUR)の量を、プライマーを用いた逆転写反応（プライマー伸長法）によるプライマー伸長産物の量を測定することによって間接的に求め、下記式（１）：
【００３１】
【数５】
2017170300.tif 000006
【００３２】
（上記式中、τｍ５Ｕはタウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示し、Ｕはタウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示す）に代入して計算した値である。
【００３３】
ここで、被験者が、tRNALeu(UUR)遺伝子コード領域のA3243G、T3271C、G3244A、T3258CおよびT3291Cからなる群より選ばれる一塩基置換を有する変異ミトコンドリアDNAを有すると疑われる者である場合、前記式（１）に続いて、下記式（２）：
【００３４】
【数６】
2017170300.tif 000007
【００３５】
（上記式中、mtDNA点変異率（％）は、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれる点変異の中で最も高い変異率を示す）により、正常タウリン修飾率を求め、該数値を老化の指標とすることが望ましい。
【００３６】
mtDNAの点変異率の解析については、DNAシークエンス法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、denaturing high-performance liquid chromatography(DHPLC)法、 BiPlex Invader法、SnaP shot法、high-resolution melt(HRM)プロファイリング法、temporal temperature gradient gel electrophoresis (TTGE)法のほか、現在開発されている次世代シーケンサーを用いた方法などがあげられる。
【００３７】
総タウリン修飾率は、理論上０〜１００％の範囲内にある。しかし、MELAS患者の病態を考察すると、総タウリン修飾率が低下すると、重篤な症状を発症する場合がある。一方、正常タウリン修飾率については、健常者ではmtDNA点変異率がほぼ0%であるため、前記［数6］の計算式を用いて計算すると、総タウリン修飾率とほぼ同値となる。しかし、ミトコンドリア病患者の正常タウリン修飾率は、mtDNA点変異率により、計算上1OO%を超えることがあり得る。
医師主導治験において、tRNALeu(UUR)の正常タウリン修飾率を縦軸に、被験者年齢を横軸にプロットしたところ、被験者年齢が高くなるに従って正常タウリン修飾率が減少していることを発見した（図２）。また、MELAS患者のタウリン内服により、正常タウリン修飾率が回復し、変異mtDNAに由来するtRNALeu(UUR)のタウリン修飾も改善することが明らかとなった（図７、表１）。有効量のタウリン投与により、老化の進行を遅延させることが期待できる。
正常タウリン修飾率が低いほど、老化が進行していると判断することができる。すなわち、正常タウリン修飾率を用いて、老化の尺度を「タウリン年齢」として示すことができる。また、健常者においては、総タウリン修飾率と正常タウリン修飾率とが近似しており、便宜的に総タウリン修飾率を用いて、老化の尺度を「タウリン年齢」として示すことができる。
【００３８】
老化の測定方法
（1）被験者から単離した生体試料におけるミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の程度を、該tRNALeu(UUR)を鋳型としてプライマーからの逆転写反応により測定する工程
測定対象の生体試料としては、毛髪、頬粘膜、胃、大腸、肺、肝臓、脳などの生検組織や、血液、リンパ液、尿などの体液試料が限定なくあげられる。採取が容易な点から血液が好ましく、血液より得られる白血球がより好ましい。以下、白血球を例にして、老化の測定方法を説明するが、他の生体試料も同様に測定することができる。
【００３９】
測定に供する白血球は、被験者から血液を採取し、常法により白血球画分を回収することにより得ることができる。この目的のために、市販の試薬を好適に使用することができる。市販の試薬としては、Lymphoprep（登録商標）、Ficoll（登録商標）-Paqueなどがあげられる。白血球画分は、試薬の製造業者の指示書に従って、密度勾配遠心分離法を実施し、リンパ球や単球を含む血球層（末梢血単核球：PBMC）を分離することにより得られる。
【００４０】
被験者は、典型的には、ヒトであるが、ヒトを除く哺乳動物であってもよい。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー、ゴリラなどの霊長類等をあげることができる。
【００４１】
被験者由来の白血球画分から、常法によりRNAを含む試料を調製する。細胞からRNAを抽出する方法は、細胞破砕とRNaseの不活化を同時に行う方法を採用することが望ましく、細胞を破砕して可溶化剤によって可溶化した後、変性剤によってタンパク質を除去し、エタノール等で遺伝子を沈殿させることで、白血球からRNAを調製することができる。該操作には、市販の抽出キットを好適に使用することができる。例えば、Isogen（ニッポンジーン製）、Trizol (Ambion製）などがあげられる。
【００４２】
得られたRNAは、それ以上精製することなく逆転写反応に供することができる。得られたRNAに含まれるtRNALeu(UUR)を鋳型とするためには、該tRNALeu(UUR)に特異的にハイブリダイズするプライマーを用いる。本発明においては、プライマーは、該鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドとしては、DNA、RNA、DNAとRNAのハイブリッドであってもよいが、操作性の観点から、DNAが好ましい。オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、天然のヌクレオチドであっても人工のヌクレオチドであってもよい。
【００４３】
プライマーの長さは、tRNALeu(UUR)に特異的にハイブリダイズできる機能を保持できる限り特に限定されないが、８〜３０塩基長、好ましくは１０〜２５塩基長、より好ましくは１０〜２２塩基長である。
【００４４】
プライマーの具体的な塩基配列は、tRNALeu(UUR)のタウリン修飾の有無により、プライマー伸長産物の長さが相違する、あるいは、プライマー伸長産物の長さと塩基配列が相違するように設計される。好適な塩基配列は、配列番号２で表されるtRNALeu(UUR)の3’から5’の向き（56位→41位）にハイブリダイズするように設計された、下記：
5’-acctctgactgtaaag-3’（配列番号３）で表される塩基配列を含むDNAである。
プライマーは、本発明の目的の範囲内で、配列番号３に示される塩基配列において、5’末端および／または3’末端に1または複数個（例えば、2個）の塩基が付加されていてもよく、5’末端および／または3’末端から1または複数個（例えば、2個）の塩基が欠失してもよい。
さらに、プライマーとハイブリダイズする位置に、測定対象のtRNALeu(UUR)が変異した塩基配列を有することが想定される場合は、変異tRNALeu(UUR)の塩基配列と相補的となるように、配列番号３に示される塩基配列の任意の塩基を他の塩基に置換してもよい。具体的には、下記：
5’-acctctgactgtaagg-3’（配列番号４）：3271変異の場合、または
5’-acctctgactgcaaag-3’（配列番号５）：3280変異の場合
で表される塩基配列を含むDNAがあげられる。このようにして設計したプライマーは、１種のみならず、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００４５】
前記プライマーは、直接的または間接的に標識物質により標識されていてもよい。標識物質としては、蛍光物質（例、ＦＩＴＣ、ローダミン、FAMTM、VICTM、NEDTM、PETTM、前記４種はApplied Biosystems社の商品名である）、放射性物質（例、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ）、酵素（例、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ）、着色粒子（例、金属コロイド粒子、着色ラテックス）、ビオチンなどがあげられる。好ましくは、蛍光物質または放射性物質であり、標識される部位は、プライマーの5’末端が望ましい。
【００４６】
逆転写反応は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition (2012)等を参照して、公知の方法で行うことができる。逆転写酵素、上記プライマーおよびdNTP（ヌクレオチド混合物）を用いて、必要によりRNase阻害剤の共存下、得られたRNA中に含まれるtRNALeu(UUR)を鋳型として、逆転写反応を行う。
逆転写酵素は市販されており、tRNALeu(UUR)を鋳型として、逆転写反応を行える酵素であれば、市販の酵素キットを使用することができる。例えば、AMV逆転写酵素、M-MuLV逆転写酵素などがあげられるが、SuperscriptIII(Thermo Fisher Scientific Inc. 製)のような変異型の逆転写酵素はタウリン修飾部位で反応が停止しないため使用できない。
鋳型RNAは、総RNAとして1pg〜1μg程度を用いる。
プライマーは、0.1〜1μg程度を用いる。
dNTPは、4種のヌクレオチド（例、dATP、dGTP、dCTP、dTTP）の混合物を用いてもよく、鋳型の塩基配列に相補的な1〜3種のヌクレオチドを用いてもよい。dNTPは、通常、各ヌクレオチドあたり1-500μM程度の濃度で使用する。
RNase阻害剤は、逆転写反応の条件下でRNaseを阻害できる限り限定なく使用することができる。種々のRNase阻害剤が市販されており、市販品としては、RNaseOUT(Thermo Fisher Scientific  Inc. 製）、RNasin(Promega製）等があげられる。
逆転写反応溶液の組成は、用いる逆転写酵素により適宜設定することができる。また、市販の酵素キットに添付されている反応緩衝液を希釈して使用することができる。
【００４７】
逆転写反応は、鋳型とプライマーのアニーリング反応およびそれに続くプライマーからの伸長反応とに分けられる。
アニーリング反応の一例として、例えば、約80℃で1〜5分間インキュベートした後、37℃以下、通常は室温（25℃前後）にて10分〜数時間静置する条件があげられる。
プライマー伸長反応の一例として、例えば、42℃〜60℃で15分間〜2時間行い、反応終了後は95℃で1〜5分間熱処理することにより逆転写酵素を失活させる。
【００４８】
逆転写反応終了後、タウリン修飾の有無によるプライマー伸長産物の相違を検出する。例えば、プライマー伸長産物を電気泳動によりアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルで展開した後、サイズの相違によって検出する方法があげられる。この場合、プライマーの５'末端を予め蛍光標識または放射線標識しておき、電気泳動後、イメージングプレートにシグナルを取り込み、適当な検出装置を用いて検出することができる。
【００４９】
ここで、タウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)は、配列番号３で表される塩基配列を含むプライマーを用いて逆転写反応を実施すると、τｍ5U修飾が伸長反応に対してバリケードとして作用することにより、35位のUで伸長反応が停止する。タウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)の場合は、伸長反応に対する立体障害がなく伸長反応が進み、ジデオキシヌクレオチド（例、ddA、ddG、ddC、ddT）を反応液中に共存させておくことで、所望の位置で伸長反応を停止させることができる。例えば、ddGを用いた場合、図１に示すように、タウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)とタウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)との相違は、1塩基の長さが相違するプライマー伸長産物として表される。
【００５０】
さらに、電気泳動により分離したバンドを切り出し、常法により塩基配列を決定して、タウリン修飾の有無によるプライマー伸長産物の塩基配列の相違を測定することによって、バンドを同定してもよい。
【００５１】
（2）タウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物と、タウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物との量比を算出する工程
前記工程で、プライマー伸長産物を電気泳動後、イメージングプレートに取り込んだシグナルを、BAS 2000イメージアナライザー (GEヘルスケア製）等のデンシトメトリーを用いて定量する。
【００５２】
タウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物およびタウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量は、任意の単位で表すことができ、あるいは、量比で表してもよい。これらの値を、下記式（１）：
【００５３】
【数７】
2017170300.tif 000008
【００５４】
（式中、τｍ５Ｕはタウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示し、Ｕはタウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示す）に代入し、総タウリン修飾率を算出する。
【００５５】
ここで、被験者が変異mtDNAを有すると疑われる場合、下記式（２）：
【００５６】
【数８】
2017170300.tif 000009
【００５７】
（上記式中、mtDNA点変異率（％）は、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれる点変異の中で最も高い変異率を示す）により、正常タウリン修飾率を求め、該数値を老化の指標とすることが望ましい。
【００５８】
mtDNAの点変異率は、DNAシークエンス法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、denaturing high-performance liquid chromatography(DHPLC)法、BiPlex Invader法、SnaP shot法、high-resolution melt(HRM)プロファイリング法、temporal temperature gradient gel electrophoresis (TTGE)法のほか、現在開発されている次世代シーケンサーを用いた方法を用いて測定することができる。
例えば、A3243Gを有するMELAS患者の場合、PCR-RFLP法を用いて増幅したPCR産物を、制限酵素ApaIの切断部位の有無（変異のあるPCR産物は切断部位を有し、変異のないPCR産物は切断部位を有しない）により得られるバンドの長さの相違を定量し、A3243Gの点変異率を測定することができる。T3271Cを有するMELAS患者の場合、PCR-RFLP法を用いて増幅したPCR産物を、制限酵素AflIIの切断部位の有無（変異のあるPCR産物は切断部位を有し、変異のないPCR産物は切断部位を有しない）により得られるバンドの長さの相違を定量し、T3271Cの点変異率を測定することができる。
【００５９】
このようにして得られた総タウリン修飾率および正常タウリン修飾率は、本発明において老化の指標とすることができる。健常者は、総タウリン修飾率と正常タウリン修飾率がほぼ同一であるので、総タウリン修飾率を老化の指標とすることができる。
総タウリン修飾率１００％は、タウリン年齢の観点からは若年と判断することができる。
【００６０】
MELAS患者の解析結果では、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下は、患者の暦年齢と一定の相関関係を有することが今回新たに示された（図２）。また、健常者の解析結果においても、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下が、患者の暦年齢や、遺伝的要因や生活・環境要因などの影響による生体機能の状態と一定の相関関係を有することが今回新たに示された（図８）。上記結果は、tRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、健常者、ミトコンドリア病者を問わず、ミトコンドリアの老化のバイオマーカーとして用いることができることを示している。さらに、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、ミトコンドリア自体の老化や機能低下の指標として用いることができることは言うに及ばず、生体、器官(臓器)、組織、細胞、或いは、細胞内小器官の機能、とりわけ、生体やエネルギー需要の高い器官(臓器)、組織、細胞、或いは、細胞内小器官の老化や機能低下の指標としても有用であることを示している。
加えて、稀に、健常者、MELAS患者のいずれにおいても暦年齢と相関しない正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の例が認められることから、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、単に、被験者の加齢に伴う老化の指標となるだけでなく、栄養状態や代謝異常など疾患の有無なども含めた被験者の健康状態を反映した身体機能全般の老化の指標、或いは、健康寿命、とりわけ、特定死因を含まない健康寿命の指標としても利用できることを示している。
また、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、被験者が健常か未病の状態かの判定や被験者の生活改善や治療の要否の判定、それらの補助方法において用いるバイオマーカーとしても有用である。
また、MELAS患者のみでなく、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)の一塩基置換(A3243G)を有する糖尿病患者でもタウリン投与の有効性が確認されており、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が、革新的な新規バイオマーカーとして、現在開発が進行中のこれらミトコンドリア病患者に対するタウリン療法の対象者の選定やその治療効果判定に用いるコンパニオン診断用途やその補助にも有用であることを示している。
【００６１】
老化の判定薬
本発明の老化の判定薬に含まれる、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０〜２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーは、「老化の測定方法」に記載のプライマーと同様である。
【００６２】
プライマーは、凍結乾燥した状態で含まれてもよく、医薬上許容されうる担体とともに溶液状で含まれていてもよい。
医薬上許容されうる担体としては、本発明の判定薬を液剤として調製する場合、製剤素材として慣用されている各種担体、例えば希釈剤、溶剤、溶解補助剤、等張化剤、緩衝剤などを含んでいてもよい。
希釈剤としては、水、生理用食塩水などがあげられる。
溶剤としては、水、生理用食塩水、エタノールなどがあげられる。
溶解補助剤としては、シクロデキストリン類などがあげられる。
等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの無機塩類、グリセリン、マンニトール、ソルビトールなどの炭水化物などがあげられる。
緩衝剤としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液などがあげられる。
これらの担体の配合比は、当業者が適宜決定することができる。
プライマーは、使用直前まで凍結または氷上で保管しておくことが望ましい。
【００６３】
老化の判定キット
本発明の老化の判定キットは、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０〜２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーおよび逆転写酵素を含有する。
【００６４】
本発明の老化の判定キットに含まれる、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０〜２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーは、「老化の測定方法」に記載のプライマーと同様である。
【００６５】
上記逆転写酵素の好ましい態様および具体例は、「老化の測定方法」において説明した通りである。
【００６６】
本発明のキットはさらに、ヌクレオシド三リン酸、プライマー伸長反応用緩衝液、RNase阻害剤を含んでいてもよい。
【００６７】
ヌクレオシド三リン酸は、プライマーに組み込まれてプライマー伸長産物を構成する基質であり、通常dNTP混合物として使用される。dNTP混合物は、典型的には、dATP、dTTP、dCTPおよびdGTPからなる。
必要に応じて、プライマー伸長を所望の部位で停止させるためのジデオキシヌクレオチド（ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP）を少なくとも1種含んでいてもよい。
【００６８】
前記緩衝液としては、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられる緩衝液があげられ、そのｐＨも特に限定されないが、通常５〜９の範囲が好ましい。
【００６９】
前記RNase阻害剤は、「老化の測定方法」に記載のRNase阻害剤と同様である。
【００７０】
本発明のキットには、上記プライマー等に加えて、反応容器、プライマーを希釈するための緩衝液、陽性対照（例、正常人由来サイブリッド細胞RNA：Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(20):7127-7132参照）、陰性対照（例、MELAS患者由来サイブリッド細胞RNA：Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(20):7127-7132参照）、プロトコールを記載した指示書などをさらに含んでもよい。
【００７１】
ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善剤
加齢による正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下がタウリンの投与により改善できることから、試験例２の結果は、タウリンおよびそれを含有する組成物が、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善用、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率低下の予防用、とりわけ、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)の加齢により低下したタウリン修飾率の改善用の医薬品、医薬部外品、化粧品、或いは、食品として有用であることを示している。
本発明の改善剤は、タウリンを有効成分として含有する。タウリンは、アミノエチルスルホン酸または２−アミノエタンスルホン酸ともいう。タウリンは、常法に従って有機合成されたものであってもよく、動植物から抽出単離された天然物であってもよい。
【００７２】
タウリンは、生体内でタウリンとして作用する限りにおいては、タウリン誘導体の形態であってもよい。タウリン誘導体としては、Ｎ−メチルタウリン、Ｎ、Ｎ−ジメチルタウリン、Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルタウリン、グアニジノエタンスルホン酸、グアニジノエタンスルフィン酸、Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸、ピペラジノ−Ｎ,Ｎ'−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−［１'−アザ−シクロヘプタン−２'−イル］−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−［１'−アザ−シクロペンタン−２'−イル］−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−［１'−アザ−シクロヘプタン−２'−イル］−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−［１'−アザ−シクロペンタン−２'−イル］−３−アミノプロパンスルホン酸、２−アミノエチルホスホン酸、３−アミノプロピオン酸、エタノールアミン−Ｏ−サルフェート、アミノメタンスルホン酸、ホモタウリン、ピリジン−３−スルホン酸、ピペリジン−３−スルホン酸、アニリン−２−スルホン酸、（±）−２−アミノシクロヘキサンスルホン酸、２−アミノシクロペンタンスルホン酸、キノリン−８−スルホン酸、１,２,３,４−テトラヒドロキノリン−８−スルホン酸、３−アミノ−ビシクロ［２.２.１］ヘプタン−２−スルホン酸、６−アミノメチル−３−メチル−４−１,２,４−ベンゾチアジアジン−、１−ジオキサイド（ＴＡＧ）、グリシン、レチニリデンタウリン（ＴＡＵＲＥＴ）３−アセタミド−１−プロパンスルホン酸Ｃａ塩（ＡＣＡＭＰＲＯＳＡＴＥ）、５−タウリノメチルウリジン、５−タウリノメチル−２−チオウリジン、イセチオン酸、システインスルホン酸、リトラロン、２−アミノ−３−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−（２,３−ジヒドロキシ−ｎ−プロピル）タウリン、デカノイルサルコシルタウリンなどがあげられる。
【００７３】
本発明の改善剤を被験者に投与または摂取させることによって、投与または摂取前と比べて、該被験者におけるタウリン修飾率が改善される。ここで、改善されるタウリン修飾率とは、上述した式（１）で表される総タウリン修飾率および／または、上述した式（２）で表される正常タウリン修飾率である。
【００７４】
かかる目的のため、本発明の改善剤は、タウリン単独で、あるいは賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デンプン、シクロデキストリン等）、場合によっては、香料、色素、調味料、安定剤、保存剤等も含有し、錠剤、丸剤、顆粒、細粒、粉末、ペレット、カプセル、溶液、乳液、懸濁液、シロップおよびトローチ等に製剤化して、医薬、医薬部外品、化粧品または食品（好ましくは、保健機能食品）もしくは食品添加物として用いることができる。また、本発明の改善剤は、研究用試薬として用いることもできる。
【００７５】
本発明の改善剤に含まれるタウリンの量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されるものではないが、通常０．０００１〜１００重量％であり、好ましくは０．００１〜９９．０重量％である。
【００７６】
タウリンの有効量は、１日当たり体重１ｋｇ当たりのタウリンの量として表すことができる。推奨される有効量としては、０．０１〜１．０ｇ/ｋｇ体重/日であり、好ましくは０．０２〜０．５ｇ/ｋｇ体重/日である。
【００７７】
本発明の改善剤を医薬として用いる場合、有効量のタウリンおよび医薬として許容されうる担体を含有することが好ましい。
【００７８】
医薬として許容されうる担体としては、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、軽質無水ケイ酸等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク等）、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、マクロゴール類、ショ糖脂肪酸エステル等）、溶剤（例えば、水、食塩水、大豆油等）、保存剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸エステル等）などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
本発明の改善剤は、動物（例、哺乳動物、鳥類、魚類等）に対して、経口的あるいは非経口的に安全に投与することができる。
【００８０】
本発明の改善剤は、食品としてまたは食品添加物として、摂取することもできる。本発明の「食品」は、食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、厚生労働省の保健機能食品制度に規定される特定保健用食品や栄養機能食品等の保健機能食品をも含むものであり、ヘルスクレームや健康強調表示をした食品であってもよく、さらにサプリメント、飼料・餌料等も本発明の食品に包含される。
【００８１】
食品用途の場合、タウリンを、例えば、清涼飲料、パン、菓子等の一般食品（いわゆる健康食品を含む）に含有させて用いることもできる。また、タウリンを、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デンプン等）、場合によっては、香料、色素等と共に、錠剤、丸剤、顆粒、細粒、粉末、ペレット、カプセル、溶液、乳液、懸濁液、シロップおよびトローチ等に製剤化して、特定保健用食品や栄養機能食品等の保健機能食品、サプリメントとして用いることができる。また、本発明の食品および食品添加物は、飼料・餌料用途にも適用することができ、家禽や家畜等には、通常の飼料・餌料に添加して摂取または投与することができる。
【００８２】
食品または飼料・餌料として摂取する場合、食品または飼料・餌料の１日当たりの摂取回数および１回当たりの摂取量の目安を概算し、１日摂取量を規定した上で１日摂取量の食品または飼料・餌料に含まれるタウリンの量を決定する。タウリンの含有量は、後述する用量に基づいて決定することができる。
【００８３】
本発明の改善剤の摂取または投与量は、摂取または投与対象の年齢、体重、健康状態によって異なり、一概に決定することはできない。例えば、健康の維持、増進または改善を目的とする場合は、通常、ドリンク剤などの医薬部外品、食品または化粧品の形態にして、一方、タウリン修飾率の低下に起因する障害の治療や健康回復を目的とする場合には、通常、医薬品、医薬部外品または食品の形態にして、タウリンとして、成人１日当たり０．４〜４０ｇ、好ましくは０．８ｇ〜２０ｇ、より好ましくは４．０〜１５gを１日１回から数回に分けて摂取または投与することが好ましい。なお、体重が４０kg以下の場合には、通常、１日当たり０．３〜３０ｇ、好ましくは０．６ｇ〜１５ｇ、より好ましくは３．０〜１２gを１日１回から数回に分けて摂取または投与することが好ましい。
【００８４】
本発明の改善剤（医薬）の投与方法としては、タウリン修飾率の低下に対する予防的および治療的な効果が得られる経路であれば特に限定されない。例えば、非経口的投与（静脈内投与、筋肉内投与、組織内直接投与、鼻腔内投与、皮内投与、経皮投与、腹腔内投与、胃瘻、経管投与、経腸栄養投与など）または経口投与により投与することができ、特に、該医薬をヒトに適用するには、静脈内、筋肉内または経口投与によって投与することができる。また、剤型としても特に制限されることなく、各種投与剤型、例えば、経口剤（顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、ドリンク剤など）、注射剤、点滴剤、外用剤（経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤など）として投与することが可能である。外用剤（経皮製剤、軟膏剤など）は、医薬部外品または化粧品として投与することも可能である。
【００８５】
本発明のミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善剤は、ミトコンドリア病を発症した患者、好ましくは、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の欠損遺伝子変異によりミトコンドリア病を発症した患者、より好ましくは、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれるいずれかの点変異に起因するミトコンドリア病を発症した患者、特に好ましくは、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）の点変異に起因するミトコンドリア病を発症した患者、とりわけ、MELASや糖尿病を発症した患者において、またはそれらの発症リスクを有する対象において、加齢や、遺伝的要因や生活・環境要因などの影響による生体機能の状態などにより低下したミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善剤として用いられてもよい。さらに、本発明の改善剤は、これらの対象や患者おいて、加齢や、遺伝的要因や生活・環境要因などの影響による生体機能の状態などによるミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率低下の予防剤として用いられてもよい。また、本発明のミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の改善剤は、異常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善のみでなく、タウリン修飾率が低下した正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善ができる点がとりわけ有用である。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されるものではない。【００８７】
血液試料
治験に参加したMELAS患者から書面によるインフォームドコンセントを得て、患者血液を採取した。採取した血液から、Isogen（ニッポンジーン製）を用いて、製造業者の指示書に従って粗RNAを得た。
患者血液の取り扱いについては、川崎医科大学での倫理規定にも従った。【００８８】
実施例１  逆転写反応によるミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の検出
基本的には、桐野らの方法（Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102(20): 7127-7132）に準じて行った。桐野らによるプライマー伸長法の原理を図１に示す。
使用したプライマーの塩基配列は、以下の通りである。
5’-acctctgactgtaaag-3’（配列番号３）
予想される２種のプライマー伸長産物の塩基配列は、以下の通りである。
5’-acctctgactgtaaagTTTTAAG-3’（配列番号６：プライマーから伸長した配列を大文字で示す）
5’-acctctgactgtaaagTTTTAG-3’（配列番号７：プライマーから伸長した配列を大文字で示す）
上記プライマーおよびプライマー伸長産物の5’末端は、本実施例においては32Pで標識されている。【００８９】
（逆転写反応）
被験者白血球から得たRNA（0.2〜1μg）を鋳型として、tRNALeu(UUR)のアンチコドンの3'側に相当する32P 標識プライマー（配列番号３、0.1pmol）と80℃で2分間インキュベートした後、室温で１時間静置することにより、プライマーをアニーリングさせた。その後、逆転写酵素用反応緩衝液（Invitrogen製）中、dATP、dTTP、ddGTP（各1.5mM、AmershamPharmacia製）を添加し（最終濃度37.5μM）、M-MuLV Reverse transcriptase（RNase H-）1μL（40 units/μL、Invitrogen製）を混合し、42℃で１時間逆転写反応を行なった。T3271C変異を有するMELAS患者の場合は、配列番号３および配列番号４で示される32P 標識プライマー（混合プライマー、0.1pmol）を用いた。
反応終了後、反応混合物を、7M尿素を含む15%ポリアクリルアミド電気泳動に供した。RIで標識されたバンドを、BAS5000バイオイメージングアナライザー（富士フィルム製）で可視化した。【００９０】
アンチコドン（1文字目U：図１中、下線で示す）にタウリン修飾が欠損する(5U34)と反応はAAGまで、タウリン修飾が存在する(τm5U34)と反応はAGで停止する。このRI標識反応物を電気泳動で分離してBAS5000バイオイメージングアナライザー（富士フィルム製）で定量し、総タウリン修飾率を求めた。結果を図２に示す。【００９１】
医師主導治験に参加したMELAS患者はA3243G変異またはT3271C変異を有するため、これらの点変異率を以下のようにして求めた。後藤らのPCR-RFLP法を一部改変して行った（Goto Y. et al.: A new mtDNA mutation associated with mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes (MELAS). Biochimica et Biophysica Acta 1097: 238-240 (1991)）。A3243G変異の検出については、
For: 5’-gcccttcccccgtaaatgatat-3’（配列番号８）および
Rev: 5’-gaagaggaattgaacctctgactg-3’（配列番号９）の2本のプライマーでPCRを行い、増幅したPCR産物を制限酵素のApaIで切断した。正常mtDNAでは、制限酵素ApaIの切断部位がないため136 bpのバンドが１本であるのに対し、A3243G変異では、ApaIの切断部位があるため、切断されて84 bp、52 bpの２本のバンドが現れる。T3271C変異については、
For: 5’-taagaagaggaattgaacctctgaccttaa-3’ （配列番号１０）および
Rev: 5’-aggacaagagaaataaggcc-3’（配列番号１１）の2本のプライマーでPCRを行い、増幅したPCR産物を制限酵素のAflIIで切断した。正常mtDNAでは、制限酵素AflIIの切断部位がないため170 bpのバンドが１本であるのに対し、T3271C変異では、AflIIの切断部位があるため、切断されて140 bp、30 bpの２本のバンドが現れる。
上記制限酵素で切断したPCR産物を、15%ポリアクリルアミド電気泳動に供し、分離したバンドを臭化エチジウムで染色し、デンシトメーターを用いてバンドの強度を定量し、点変異率を求めた（表１）。【００９２】
上記総タウリン修飾率および点変異率を用いて、MELAS患者の正常タウリン修飾率を求めた。結果を図２に示す。【００９３】
試験例１  血中および髄液中の乳酸値およびピルビン酸値の測定
血液中および髄液中の乳酸値の測定は、L-乳酸に乳酸オキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を、パーオキシダーゼの存在下で生じる色素を比色測定することにより定量した。
ピルビン酸値の測定は、ピルビン酸にピルビン酸オキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を、パーオキシダーゼの存在下で生じる色素を比色測定することにより定量した。【００９４】
結果
治験参加MELAS患者の血中白血球におけるミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率を測定し、被験者の年齢を横軸にプロットしてグラフ化した。その結果、総タウリン修飾率と年齢とは相関がなかったのに対し、正常タウリン修飾率は、年齢依存性に低下した（図２）。一方、正常タウリン修飾率は、従来のミトコンドリア病マーカーとされる、血中および髄液乳酸値、乳酸/ピルビン酸比とは相関しなかったし、被験者の年齢と従来のミトコンドリア病マーカーとも相関しなかった（図３−６）。【００９５】
試験例２  MELAS患者へのタウリン投与によるタウリン修飾率の改善
上記医師主導治験において、MELAS患者にタウリンを投与した。投与量は、体重40kg以上の被験者の場合12g/日、25kg以上40kg未満の場合9g/日で、投薬期間は52週（１年間）であった。タウリン投与終了日（52週）に被験者から血液を採取し、実施例１に記載の方法に従って総タウリン修飾率および正常タウリン修飾率を測定した。結果を実施例1で求めた投与開始日（開始前0週）のデータと併せて図７に示す。また、個々のMELAS患者の、タウリン投与開始日および投与終了後の総タウリン修飾率、正常タウリン修飾率および点変異率をまとめて表1に示す。総タウリン修飾率をタウリン投与前と投与後とで比較した結果、有意差傾向があった（P＝0.0546）。タウリン内服により、正常タウリン修飾率が回復し、変異mtDNAに由来するtRNALeu(UUR)のタウリン修飾も改善することが明らかとなった。【００９６】
【表１】
2017170300.tif 000010
【００９７】
実施例１および試験例２の結果は、ミトコンドリアの正常tRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が加齢に伴い低下し、タウリン内服によりその低下したタウリン修飾率が上昇することを示している。さらに、正常tRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が100%を超える症例があることは、タウリン内服により変異tRNALeu(UUR)のタウリン修飾率も改善していることを示している。
これまで、MELASの発症原因は変異tRNALeu(UUR)のタウリン修飾の欠損にあると考えられてきたが、この結果は、MELASの発症に加齢に伴う正常tRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下が関与していることを示している。
周知のようにMELAS患者においてtRNALeu(UUR)のタウリン修飾機能自体に欠損はない。
実施例1で認められた現象は、MELAS患者の解析結果ではあるが、健常者でも同様に発生する現象を反映していると言える。つまりtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率はミトコンドリアの老化のバイオマーカーとして用いることができることを示している。
また、老化に伴いミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が低下すれば、当然、UUGコドン特異的な翻訳能が律速と成って、UUGコドンを含むタンパク質全般の合成が低下する。それに伴い、呼吸・エネルギー代謝に重要な機能を果たすミトコンドリアの機能が低下し、生体やそれを構成する器官等の機能が低下するのは明らかであり、さらに修飾率の低下が進行すれば、例えば、高齢者に認められる呼吸困難や骨格筋の減弱のような重篤な症状を発症するに至る場合もあると考えられる。
従って、実施例１および試験例の結果は、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、ミトコンドリア自体の老化や機能低下の指標として用いることができることは言うに及ばず、生体、器官(臓器)、組織、細胞、或いは、細胞内小器官の機能、とりわけ、生体やエネルギー需要の高い器官(臓器)、組織、細胞、或いは、細胞内小器官の老化や機能低下の指標としても有用であることを示している。加えて、試験例２の被験者年齢１４の患者のように暦年齢に比して正常タウリン修飾率の低い例や被験者年齢４６の患者のように暦年齢が比較的高いにも関わらず正常タウリン修飾率が比較的高い例が認められることや、後述の試験例４の若年健常者の正常タウリン修飾率にかなりの幅があることから、正常タウリン修飾率は、単に、被験者の加齢に伴う老化の指標となるだけでなく、栄養状態や代謝異常など疾患の有無なども含めた被験者の健康状態を反映した老化の指標、或いは、健康寿命、とりわけ、特定死因を含まない健康寿命の指標としても利用できることを示している。
さらに、加齢などによる老化に伴う正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下がタウリンの投与により改善できることから、試験例２および後述の試験例３の結果は、タウリンおよびそれを含有する組成物が、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善用、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率低下の予防用、とりわけ、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)の加齢により低下したタウリン修飾率の改善用の医薬品、医薬部外品、化粧品、或いは、食品として有用であることを示している。【００９８】
試験例３  糖尿病患者へのタウリン投与による糖尿病マーカーの改善
試験例２では、ミトコンドリア遺伝子の一塩基変異(A3243G)によるMELAS患者において、タウリン投与により病状の改善が認められたので、同じミトコンドリア遺伝子の一塩基変異(A3243G)に起因する糖尿病に対するタウリン投与の治療効果を確認した。具体的には、ミトコンドリア遺伝子の一塩基変異(A3243G)による糖尿病と診断され、心筋症を併発した患者(49歳 女性)に、タウリン(商品名  タウリン散98%「大正」、大正製薬株式会社製)を、毎日経口投与した。投与は、タウリンとして４g/回、３回/日(12g/日)で、投薬期間は約１年間であった。当該患者より、タウリン投与開始から終了まで経時的に血液を採取し、糖尿病マーカーであるヘモグロビンA1c(HbA1c)の値を測定したところ、開始時には7.7%あった値が、投与開始２３週目(約５カ月目)には6.9%に低下し、投与終了時には6.8%になった。上記結果が示すように、当該患者のHbA1cの値を、タウリン投与期間中を通じて、糖尿病の合併症を予防するための目標値である７％未満にコントロールした。さらに、タウリン投与開始時には１２単位必要であったインスリン投与を、投与終了時には9単位にまで低減することができ、タウリン内服により、ミトコンドリア遺伝子変異による糖尿病患者の症状改善が出来ることを確認した。
後述の試験例４から明らかなように、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の加齢や、遺伝的要因や生活・環境要因などの影響による生体機能の状態による低下は、MELASに限定されるものではなく健常者においても普遍的な現象であるので、ミトコンドリア遺伝子変異による糖尿病発症のメカニズムは、MELASの場合と同様に、異常ミトコンドリアtRNALeu(UURに加えて、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下によるものと考えられる。従って、当該糖尿病の場合でも、タウリンの投与による異常ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善に加えて、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が改善したことにより、臨床症状が改善したものと考えることができる。【００９９】
試験例４  健常者における正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の測定
試験例２において、MELAS患者で確認された正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が加齢に伴い低下することが確認されたので、健常者でも同様に、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が加齢に伴い低下することを、試験例２と同様の方法により確認した。その結果を図８に示す。実施例１に記載の方法に従った、若年（10代）および老年（80代）健常人各々３名の末梢血白血球検体を用いた解析では、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)修飾率は、若年者（10代）平均56.7±12.6% (Mean±SE)と比較して、高齢者（80代）では35.8±3.0%と、加齢による有意な低下が認められた。また、若年者間で比較した場合、かかる修飾率は約80%〜約40%と約２倍程度の幅が認められることから、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下は、加齢のみでなく、遺伝的要因や生活・環境要因などの影響による生体機能の低下をも反映していると考えられる。この結果は、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、MELAS患者のみでなく健常者においても、有用な老化のバイオマーカーとして用いることができることを示している。【０１００】
上記試験例は、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が、ミトコンドリア病患者、健常者を問わず、普遍的に、加齢あるいは遺伝的要因や生活・環境要因などの影響による老化に伴い低下することを示している。
また、前記タウリン修飾率の低下が、タウリン投与により改善することが確認されたため、本発明のミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾改善剤は、健常者はもとより、未病の対象や何らかの疾患を発症するリスクを有する対象、さらには、何らかの疾患を有する患者、とりわけ、ミトコンドリア病患者やその発症リスクを有する対象における、老化に伴うミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率低下、特に、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率低下の改善や予防に有用である。
さらに、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、バイオマーカーとして、現在開発が進行中のミトコンドリア病患者に対するタウリン療法の対象者の選定や、その治療効果判定に用いるコンパニオン診断用途やその補助にも有用である。【０１０１】
処方例１  顆粒剤（１包中）
タウリン                              ３０００ｍｇ
アスパルテーム                              ９ｍｇ
タルク                                    ２０ｍｇ
低置換ヒドロキシプロピルセルロース        ６０ｍｇ
常法により、上記処方からなる顆粒剤を調製した。【０１０２】
処方例２  内服用液剤（1剤中）
ケイヒ                                  １００ｍｇ
ローヤルゼリー                          １００ｍｇ
タウリン                              ５０００ｍｇ
７０％ソルビトール液                  １０００ｍｇ
エリスリトール                        １０００ｍｇ
ｐＨ調整剤                                    適量
精製水を加えて全量を１８０ｍＬとする。
常法により、上記処方からなる内服用の液剤を調製した。【０１０３】
処方例３  ドリンク剤（１剤中）
ビタミンB1硝酸塩                          １０ｍｇ
ビタミンＢ2                                 ２ｍｇ
塩化カルニチン                            ５０ｍｇ
タウリン                              ４０００ｍｇ
パントテン酸ナトリウム                    １０ｍｇ
安息香酸                                  ２０ｍｇ
パラオキシ安息香酸ブチル                ２．５ｍｇ
アスパルテーム                              ６ｍｇ
クエン酸                                １００ｍｇ
グリシン                                ３００ｍｇ
精製水を加え全量を５０ｍＬとする。
常法により、上記処方からなるドリンク剤を調製した。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明者らは、ミトコンドリアtRNAの中でも、正常なtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が老化の指標となることを見出した。正常なtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、ミトコンドリア病患者のみならず健常人の状態を把握することのできるユニバーサルマーカーである。タウリンは、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)の加齢や、例えば、強度疲労などの生活・環境要因や遺伝的要因などの影響等により低下したタウリン修飾率の改善用の医薬品、医薬部外品、化粧品、或いは、食品として有用である。【０１０５】
以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正および変更も、すべて後記の特許請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。【０１０６】
本発明は、日本で出願された特願２０１６−０６２９１０（出願日：２０１６年３月２６日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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