(57)【要約】  硬さを容易、かつ、可逆的に変化させることができ、しかも、その硬さに応じて細胞の形を制御させることを可能とする、培地用高分子ゲル及び培地、また、当該培地を使用した細胞の培養方法を提供する。  培地用高分子ゲルは、可逆的結合によって架橋された架橋構造体と溶媒とを含む。培地用高分子ゲルは、硬さを容易、かつ、可逆的に変化させることができる。ゆえに、本発明に係る培地用高分子ゲルによれば、その硬さに応じて細胞の形および機能を可逆的に制御させることが可能である。
2018021289.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可逆的結合によって架橋された架橋構造体と溶媒とを含む、培地用高分子ゲル。
【請求項２】
前記可逆的結合が、ホスト基とゲスト基との結合、疎水性相互作用、水素結合、イオン結合、配位結合、π電子相互作用及びこれら以外の分子間相互作用の群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の培地用高分子ゲル。
【請求項３】
前記可逆的結合が、ホスト基とゲスト基との結合である、請求項１又は２に記載の培地用高分子ゲル。
【請求項４】
前記架橋構造体は、
下記一般式（１ａ）
【化１】
2018021289.tif 000006
［式中、Ｒａは水素原子またはメチル基を示す。Ｒ１はヒドロキシル基、チオール基、１個以上の置換基を有していてもよいアルコキシ基、１個以上の置換基を有していてもよいチオアルコキシ基、１個以上の置換基を有していてもよいアルキル基、１個の置換基を有していてもよいアミノ基、１個以上の置換基を有していてもよいアミド基、アルデヒド基及びカルボキシル基からなる群より選択される１価の基から１個の水素原子を除去することにより形成される２価の基を示す。ＲＡはホスト基を示す］
で表される繰り返し構成単位、
下記一般式（２ａ）
【化２】
2018021289.tif 000007
［式中、Ｒａは前記式（１ａ）と同じである。水素原子またはメチル基、Ｒ２はヒドロキシル基、チオール基、１個以上の置換基を有していてもよいアルコキシ基、１個以上の置換基を有していてもよいチオアルコキシ基、１個以上の置換基を有していてもよいアルキル基、１個の置換基を有していてもよいアミノ基、１個以上の置換基を有していてもよいアミド基、アルデヒド基及びカルボキシル基からなる群より選択される１価の基から１個の水素原子を除去することにより形成される２価の基を示す。ＲＢはゲスト基を示す］
で表される繰り返し構成単位、及び、
下記一般式（３ａ）
【化３】
2018021289.tif 000008
［式中、Ｒａは前記式（１ａ）と同じである。Ｒ３はハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、１個の置換基を有していてもよいアミノ基、１個の置換基を有していてもよいカルボキシル基又は１個以上の置換基を有していてもよいアミド基を示す］
で表される繰り返し構成単位
を有する重合体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培地用高分子ゲル。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の培地用高分子ゲルを含む、培地。
【請求項６】
請求項５に記載の培地で細胞を培養する、細胞の培養方法。
【請求項７】
前記培地に前記可逆的結合の形成を阻害する性質を有する競争物質を添加する工程をさらに含む、請求項６に記載の細胞の培養方法。
【請求項８】
前記培地に添加された前記競争物質の濃度を増大又は減少させる、請求項７に記載の細胞の培養方法。
【請求項９】
前記培地に含まれる前記競争物質の濃度を１０ｍｏｌ／Ｌ以下の範囲に調節する、請求項７又は８に記載の細胞の培養方法。
【請求項１０】
請求項５に記載の培地を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培地用高分子ゲル、培地、細胞の培養方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療等の分野の研究とその応用が急激に発展する中、所望の組織を簡便、かつ、安価に培養する技術の構築が急務となっている。そのため、様々な視点から、細胞培養、細胞の分化を制御する研究開発が盛んにおこなわれている。【０００３】
再生医療の分野においては、幹細胞を培養するための培地の種類が、多能性細胞の分化に対して大きな影響をおよぼすことが知られている。例えば、最近の研究においては、培地の硬さを静的に制御して培養された幹細胞について、その培地の硬さに応じて分化に違いが生じることが報告されている（例えば、非特許文献１を参照）。このような報告例においては、培地としてアクリルアミド系の高分子ゲルが使用されており、この高分子ゲルの構造等を制御することで、培地の硬さが調節されている。上記の技術のように、細胞培養の培地の特性に着目して細胞の培養挙動を把握することは、再生医療・組織工学等の分野において極めて興味深い研究であるといえる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Cell 126, 677-689, August 25, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、上記技術のように従来のアクリルアミドゲルのような共有結合で架橋される培地では、培地の硬さは静的にしか（例えば、架橋度や分子量、濃度等の調節により）制御できないため、必要なタイミングで培地の硬さを変化させることができない。そのため、細胞の培養挙動を動的に制御するための自由度がなく、しかも、実用化の観点においても多くの課題が残されていた。このような観点から、培地を動的に制御することを可能にして、所望のタイミングで培地の硬さを調節することができれば、従来にはない細胞分化の制御技術を確立できることが期待される。【０００６】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、硬さを容易、かつ、可逆的に変化させることができ、しかも、その硬さに応じて細胞の形を制御させることを可能とする、培地用高分子ゲル及び培地を提供することを目的とする。また、本発明は、当該培地を使用した細胞の培養方法、並びに培地を構成要素として含むキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、可逆的結合を有する架橋構造体を必須の成分として含むことで、上記目的を達成できることを見出すと共に、可逆的結合を有する架橋構造体の架橋密度を制御しながら細胞を培養することにより、上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、例えば、以下の項に記載の主題を包含する。
項１．可逆的結合によって架橋された架橋構造体と溶媒とを含む、培地用高分子ゲル。
項２．前記可逆的結合が、ホスト基とゲスト基との結合、疎水性相互作用、水素結合、イオン結合、配位結合、π電子相互作用及びこれら以外の分子間相互作用の群から選ばれる少なくとも１種である、項１に記載の培地用高分子ゲル。
項３．前記可逆的結合が、ホスト基とゲスト基との結合である、項１又は２に記載の培地用高分子ゲル。
項４．前記架橋構造体は、
下記一般式（１ａ）【０００９】
【化１】
2018021289.tif 000003
【００１０】
［式中、Ｒａは水素原子またはメチル基を示す。Ｒ１はヒドロキシル基、チオール基、１個以上の置換基を有していてもよいアルコキシ基、１個以上の置換基を有していてもよいチオアルコキシ基、１個以上の置換基を有していてもよいアルキル基、１個の置換基を有していてもよいアミノ基、１個以上の置換基を有していてもよいアミド基、アルデヒド基及びカルボキシル基からなる群より選択される１価の基から１個の水素原子を除去することにより形成される２価の基を示す。ＲＡはホスト基を示す］
で表される繰り返し構成単位、
下記一般式（２ａ）【００１１】
【化２】
2018021289.tif 000004
【００１２】
［式中、Ｒａは前記式（１ａ）と同じである。水素原子またはメチル基、Ｒ２はヒドロキシル基、チオール基、１個以上の置換基を有していてもよいアルコキシ基、１個以上の置換基を有していてもよいチオアルコキシ基、１個以上の置換基を有していてもよいアルキル基、１個の置換基を有していてもよいアミノ基、１個以上の置換基を有していてもよいアミド基、アルデヒド基及びカルボキシル基からなる群より選択される１価の基から１個の水素原子を除去することにより形成される２価の基を示す。ＲＢはゲスト基を示す］
で表される繰り返し構成単位、及び、
下記一般式（３ａ）【００１３】
【化３】
2018021289.tif 000005
【００１４】
［式中、Ｒａは前記式（１ａ）と同じである。Ｒ３はハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、１個の置換基を有していてもよいアミノ基、１個の置換基を有していてもよいカルボキシル基又は１個以上の置換基を有していてもよいアミド基を示す］
で表される繰り返し構成単位
を有する重合体である、項１〜３のいずれか１項に記載の培地用高分子ゲル。
項５．項１〜４のいずれか１項に記載の培地用高分子ゲルを含む、培地。
項６．項５に記載の培地で細胞を培養する、細胞の培養方法。
項７．前記培地に前記可逆的結合の形成を阻害する性質を有する競争物質を添加する工程をさらに含む、項６に記載の細胞の培養方法。
項８．前記培地に添加された前記競争物質の濃度を増大又は減少させる、項７に記載の細胞の培養方法。
項９．前記培地に含まれる前記競争物質の濃度を１０ｍｏｌ／Ｌ以下の範囲に調節する、項７又は８に記載の細胞の培養方法。
項１０．項５に記載の培地を含む、キット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る培地用高分子ゲルは、可逆的結合によって架橋された架橋構造体と溶媒とを含むため、硬さを容易、かつ、可逆的に変化させることができる。ゆえに、本発明に係る培地用高分子ゲルによれば、その硬さに応じて細胞の形および機能を可逆的に制御させることが可能である。よって、上記培地用高分子ゲルは、各種様々な細胞を培養するための培地として適した材料である。【００１６】
本発明に係る細胞の培養方法は、上記培地を使用するので、培地の硬さを調節しながら、細胞の形を簡便な方法で制御することを可能とする。【００１７】
本発明に係るキットは、上記培地を含むので、各種細胞の培養に適している。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】架橋構造体中に形成されているホスト−ゲスト相互作用の様子を説明する模式図である。
【図２】高分子ゲルの製造方法の一例を示す反応スキームである。
【図３】（ａ）は時間変化に伴う培地の硬さの変化を測定した結果を示すグラフ、（ｂ）は競争物質の濃度と高分子ゲルのヤング率との関係を示すグラフである。
【図４】時間変化に伴う培養した細胞の形態変化の様子を顕微鏡で観察した結果である。
【図５】（ａ）は、細胞の面積の変化、（ｂ）は細胞の真円度の変化を示すグラフである。
【図６】試験例４及び５の様子を説明する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００２０】
＜培地用高分子ゲル＞
本実施形態に係る培地用高分子ゲルは、可逆的結合によって架橋された架橋構造体と溶媒とを含む。この高分子ゲルは、例えば、後述するように競争物質を存在させること等により、可逆的結合の形成及び切断を制御できるように形成されている。そのため、高分子ゲルの硬さ、すなわち、弾性率等の物性を、動的に制御することが可能な材料である。このように、本実施形態に係る培地用高分子ゲルは、硬さを容易、かつ、可逆的に変化させることができるため、このような培地用高分子ゲルを用いて形成される培地で、細胞を培養すると、高分子ゲルの硬さに応じて、細胞の形および機能を容易に制御させることができる。
【００２１】
以下、上記培地用高分子ゲルの形態について詳述する。なお、本明細書において、本実施形態の培地用高分子ゲルを単に「高分子ゲル」と表記することもある。
【００２２】
上記高分子ゲルは、可逆的結合によって架橋された架橋構造体をマトリックスとし、このマトリックス中に溶媒が存在することによってゲル状に形成される。例えば、架橋構造体は溶媒によって膨潤した状態となる。
【００２３】
架橋構造体は、高分子鎖が三次元網目構造に形成された構造を有する。このような三次元網目構造を有する架橋構造体は、高分子鎖どうしが架橋することによって形成される。
【００２４】
本実施形態の高分子ゲルでは、架橋構造体は、可逆的結合を架橋点として形成されている。
【００２５】
ここでいう可逆的結合とは、結合の形成及び切断が可逆的に起こることをいう。例えば、可逆的結合とは、非共有結合のことをいう。
【００２６】
より具体的な可逆的結合としては、ホスト基とゲスト基との結合、疎水性相互作用、水素結合、イオン結合、配位結合、π電子相互作用及びこれら以外の分子間相互作用の群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。これらの結合はいずれも、結合の形成及び切断を容易に制御することができる。
【００２７】
上記可逆的結合は、特に、ホスト基とゲスト基との結合、いわゆる、ホスト−ゲスト相互作用であることが好ましい。このようなホスト−ゲスト相互作用であれば、特に、その結合の形成及び切断を制御することが容易であるからであり、また、高分子ゲルの硬さ、特に弾性率を所望の範囲に調節しやすい。例えば、ホスト−ゲスト相互作用は、後述するように、競争物質の存在によって、容易にその結合の形成及び切断を制御できる。
【００２８】
従って、高分子ゲルに含まれるマトリックスとしての架橋構造体は、ホスト−ゲスト相互作用を架橋点として三次元網目構造に形成されていることが好ましい。
【００２９】
ホスト−ゲスト相互作用は、例えば、ホスト分子とゲスト分子との疎水性相互作用、水素結合、分子間力、静電相互作用、配位結合、π電子相互作用等によって生じ得るが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
架橋構造体を形成する高分子鎖の種類は特に限定されない。
【００３１】
高分子鎖は、例えば、側鎖に可逆的結合することが可能な官能基を有する構造が挙げられる。可逆的結合することが可能な官能基とは、例えば、ホスト−ゲスト相互作用、疎水性相互作用、水素結合、イオン結合、配位結合、π電子相互作用及びこれら以外の分子間相互作用を形成することが可能な官能基である。
【００３２】
側鎖に可逆的結合することが可能な官能基を有する重合体を含むことにより、重合体どうしが架橋されて架橋構造体が形成される。このような架橋構造体は、ある一つの重合体側鎖の可逆的結合可能な官能基と、他の重合体側鎖の可逆的結合可能な官能基とが結合し、この結合部位が架橋点となることにより形成され得るものである。
【００３３】
より具体的な高分子鎖としては、側鎖にホスト分子及びゲスト分子が共有結合的に結合した構造を有する高分子鎖が例示される。ホスト分子及びゲスト分子が共有結合的に高分子側鎖に結合する場合は、ホスト分子及びゲスト分子はそれぞれ、例えば、ホスト分子及びゲスト分子から水素原子又は水酸基等が除された１価の基として結合する。言い換えれば、高分子鎖は、側鎖にホスト基及びゲスト基を有することができ、ホスト基及びゲスト基はいずれも、共有結合的に高分子側鎖に結合する。
【００３４】
上記ホスト分子及びゲスト分子は、互いにホスト−ゲスト相互作用が生じることが可能な分子で細胞毒性がない限り、特にその種類は制限されない。
【００３５】
ホスト分子としては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、カリックス［６］アレーンスルホン酸、カリックス［８］アレーンスルホン酸、１２−クラウン−４、１８−クラウン−６、［６］パラシクロファン、［２，２］パラシクロファン、ククルビット［６］ウリル及びククルビット［８］ウリルの群から選ばれる少なくとも１種が例示され、これらは置換基を有していてもよい。このようなホスト分子をホスト基として側鎖に有している重合体は、後述のゲスト基とのホスト−ゲスト相互作用が起こりやすいので、安定した架橋構造を有する架橋構造体が形成され、また、高分子ゲルの硬さの制御も容易となる。
【００３６】
上記ゲスト基としては、炭素数４〜１８のアルキル化合物が挙げられる。その具体例としては、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン、ドデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン、オクタデカン、アダマンタン等が挙げられ、いずれの化合物も直鎖状及び分岐鎖状のいずれであってもよい。また、上記炭素数４〜１８の炭化水素は、有機金属錯体であるフェロセンを置換基として結合させたアルキル基でもよい。このようなゲスト分子をゲスト基として側鎖に有している重合体は、上記のホスト基とのホスト−ゲスト相互作用が起こりやすいので、安定した架橋構造を有する架橋構造体が形成され、また、高分子ゲルの硬さの制御も容易となる。
【００３７】
ホスト−ゲスト相互作用が起こりやすく、硬さの調節をより行いやすくするという観点から、ホスト分子としては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンの群から選ばれる少なくとも１種の分子又はこれらいずれかの誘導体であることが好ましい。ここでいうシクロデキストリンの誘導体とは、例えば、シクロデキストリンの水素原子又は水酸基が他の置換基で置換された化合物をいう。置換基としては特に限定されず、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルケニル基及びアセチル基等のＣ＝Ｏ結合を有する基等が例示される。
【００３８】
同様の理由により、ゲスト基としては、ｎ−ブチル基、ｎ−ドデシル基、ｔ−ブチル基及びアダマンチル基の群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００３９】
ホスト基とゲスト基の組み合わせとしては、ホスト基を構成するホスト分子がα−シクロデキストリンである場合、ゲスト基はｎ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基及びｎ−ドデシル基の群から選ばれる少なくとも１種が好ましく、ホスト基を構成するホスト分子がβ−シクロデキストリンである場合、ゲスト基はアダマンチル基、ヒドロキシル基置換アダマンチル基、エチル基置換アダマンチル基、及びイソボルニル基の群から選ばれる少なくとも１種が好ましく、ホスト基を構成するホスト分子がγ−シクロデキストリンである場合、ゲスト基はｎ−オクチル基、ｎ−ドデシル基及びシクロドデシル基等の群から選ばれる少なくとも１種が好ましい。
【００４０】
上記のように、高分子鎖は側鎖に上記ホスト基及びゲスト基を有するが、高分子鎖の主鎖の構造については特に限定されない。
【００４１】
例えば、架橋構造体に含まれる高分子鎖の主鎖の構造としては、前記一般式（１ａ）、一般式（２ａ）及び一般式（３ａ）で表される繰り返し構成単位のすべてを有することが好ましい。
【００４２】
なお、以下では、前記一般式（１ａ）、一般式（２ａ）及び一般式（３ａ）で表される繰り返し構成単位のすべてを有する重合体を「重合体Ａ」と表記する。
【００４３】
架橋構造体を構成する重合体は１種又は２種以上を含むことができる。例えば、架橋構造体を構成する重合体は、１種類の重合体Ａのみを含んでもよいし、異なる２種類以上の重合体Ａを含んでもよい。なお、架橋構造体は、本発明の効果を阻害しない程度である限り、ホスト基及びゲスト基を有しない重合体を含んでもよい。
【００４４】
重合体Ａは、側鎖にホスト基及びゲスト基を有しているので、ホスト−ゲスト相互作用による架橋点が発生し、これにより、架橋構造体が形成される。
【００４５】
式（１ａ）中、Ｒ１がアルコキシ基から１個の水素原子を除去することにより形成される２価の基である場合、当該アルコキシ基として炭素数１〜１０のアルコキシ基が例示され、直鎖状及び分枝鎖状のいずれであってもよい。
【００４６】
式（１ａ）中、Ｒ１がチオアルコキシ基から１個の水素原子を除去することにより形成される２価の基である場合、当該チオアルコキシ基として炭素数１〜１０のチオアルコキシ基が例示され、直鎖状及び分枝鎖状のいずれであってもよい。
【００４７】
式（１ａ）中、Ｒ１がアルキル基から１個の水素原子を除去することにより形成される２価の基である場合、当該アルキル基として炭素数１〜３０のアルキル基が例示され、直鎖状及び分枝鎖状のいずれであってもよい。
【００４８】
式（１ａ）中、Ｒ１が１個の置換基を有していてもよいアミノ基から１個の水素原子を除去することにより形成される２価の基であれば、アミノ基の窒素原子が主鎖（Ｃ−Ｃ結合）の炭素原子と結合し得る。
【００４９】
式（１ａ）中、Ｒ１が１個の置換基を有していてもよいアミド基であれば、アミド基の炭素原子が主鎖（Ｃ−Ｃ結合）の炭素原子と結合し得る。
【００５０】
式（１ａ）中、Ｒ１がアルデヒド基であれば、アルデヒド基の炭素原子が主鎖（Ｃ−Ｃ結合）の炭素原子と結合し得る。
【００５１】
式（１ａ）中、Ｒ１がカルボキシル基であれば、カルボキシル基の炭素原子が主鎖（Ｃ−Ｃ結合）の炭素原子と結合し得る。
【００５２】
式（１ａ）中、ＲＡとしては、上述したホスト基が例示される。
【００５３】
式（１ａ）中、Ｒ１はアミド基及びカルボキシル基からなる群より選択される１価の基から１個の水素原子を除去することにより形成されていることが好ましい。すなわち、式（１ａ）で表される繰り返し構成単位は、水素原子がＲＡで置換されたアミド基を側鎖に有する構造及び水素原子がＲＡで置換されたカルボキシル基を側鎖に有する構造の少なくともいずれか一方を有していることが好ましい。この場合、重合体Ａの合成が容易である。また、硬さの制御が容易な高分子ゲルを得ることができる。
【００５４】
式（２ａ）中、Ｒ２の定義は上記式（１ａ）中のＲ１と同様であり、主鎖（Ｃ−Ｃ結合）への結合の仕方も同様である。
【００５５】
式（２ａ）中、ＲＢとしては、上述したゲスト基が例示される。
【００５６】
また、式（２ａ）中、Ｒ２はアミド基及びカルボキシル基からなる群より選択される１価の基から１個の水素原子を除去することにより形成されていることが好ましい。すなわち、式（２ａ）で表される繰り返し構成単位は、水素原子がＲＢで置換されたアミド基を側鎖に有する構造及び水素原子がＲＢで置換されたカルボキシル基を側鎖に有する構造の少なくともいずれか一方を有していることが好ましい。この場合、重合体Ａの合成が容易である。また、硬さの制御が容易な高分子ゲルを得ることができる。
【００５７】
式（３ａ）中、Ｒ３が１個の置換基を有するカルボキシル基としては、例えば、カルボキシル基の水素原子がアルキル基（例えば、メチル基、エチル基）、ヒドロキシアルキル基（例えば、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基）で置換されたカルボキシル基が挙げられる。
【００５８】
式（３ａ）中、Ｒ３が１個以上の置換基を有するアミド基、すなわち、第２級アミド又は第３級アミドである場合、第１級アミドの少なくとも一つの水素原子又は２個の水素原子がアルキル基（例えば、メチル基、エチル基）、ヒドロキシアルキル基（例えば、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基）で置換されたアミド基が挙げられる。
【００５９】
また、式（３ａ）中、Ｒ３は、アミノ基；アミド基；水素原子がアルキル基、水酸基又はアルコシル基で置換されたアミド基；カルボキシル基；水素原子がアルキル基、ヒドロキシアルキル基（例えばヒドロキシエチル基）又はアルコシル基で置換されたカルボキシル基；であることが好ましい。この場合、重合体Ａの合成が容易である。また、硬さの制御が容易な高分子ゲルを得ることができる。
【００６０】
重合体Ａ中、各繰り返し構成単位は、規則的に配列していてもよいし、あるいはランダムに配列していてもよい。すなわち、重合体Ａは、ブロックポリマー、交互ポリマー及びランダムポリマーのいずれであってもよく、また、グラフトポリマーであってもよい。
【００６１】
重合体Ａを構成する一般式（１ａ）、一般式（２ａ）及び一般式（３ａ）で表される繰り返し構成単位各々の含有割合は特に限定されない。例えば、重合体Ａのすべての繰り返し構成単位に対して、一般式（１ａ）で表される繰り返し構成単位が０．５〜１０モル％、一般式（２ａ）で表される繰り返し構成単位が０．５〜１０モル％とすることができる。この場合、ホスト基とゲスト基との相互作用が生じやすく、重合体Ａが架橋構造を形成しやすくなるので、安定した架橋構造体となりやすく、しかも、硬さの制御が容易な高分子ゲルが形成されやすい。
【００６２】
重合体Ａのすべての繰り返し構成単位に対して、一般式（１ａ）で表される繰り返し構成単位が１〜５モル％、一般式（２ａ）で表される繰り返し構成単位が１〜５モル％であることがより好ましい。一般式（１ａ）で表される繰り返し構成単位が２〜４モル％、一般式（２ａ）で表される繰り返し構成単位が２〜４モル％であることが特に好ましい。
【００６３】
高分子ゲルに含まれる溶媒は、水が例示され、その他、公知の細胞培養液を広く使用することができる。
【００６４】
高分子ゲルは、本発明の効果が損なわれない限り、その他添加剤をさらに含有してもよい。その他添加剤としては、例えば、酸化防止剤、紫外線吸収剤、光安定化剤、各種フィラー、電解質等が挙げられる。また、高分子材料の機械特性等を改良する目的で、架橋構造体とは別の高分子化合物を含んでもよい。
【００６５】
高分子ゲルは、本発明の効果が損なわれない程度であれば、可逆的結合による架橋点の他、共有結合によって形成される架橋点を有していてもよい。
【００６６】
高分子ゲルの形状は特に限定されず、培地に適合するように形成され得る。例えば、高分子ゲルは、公知の手段により、シート状等に形成され得る。
【００６７】
高分子ゲルの製造方法は特に限定されない。例えば、重合性単量体の重合によって高分子ゲルを製造することができる。重合性単量体は、高分子ゲルを構成する繰り返し単位を生じさせるための化合物である。
【００６８】
例えば、高分子ゲルは、上記一般式（１ａ）、一般式（２ａ）及び一般式（３ａ）で表される繰り返し構成単位を形成するための重合性単量体を重合する方法によって製造され得る。この場合、上記各々の重合性単量体を水性媒体中、重合開始剤の存在下で重合することにより、高分子ゲルを製造することができる。なお、上記一般式（１ａ）、一般式（２ａ）及び一般式（３ａ）で表される繰り返し構成単位を形成するための重合性単量体をそれぞれ、「単量体（１）」、「単量体（２）」及び「単量体（３）」と略記する。
【００６９】
重合性単量体としては、例えば、上記ホスト基を分子構造中に有する重合性単量体、上記ゲスト基を分子構造中に有する重合性単量体、並びに、ホスト基及びゲスト基のいずれをも有しない重合性単量体の混合物を使用できる。
【００７０】
ホスト基を分子構造中に有する重合性単量体（以下、「単量体（１）」と略記する）としては、例えば、（メタ）アクリルアミド−α−シクロデキストリン、（メタ）アクリルアミド−β−シクロデキストリン、（メタ）アクリルアミド−γ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンメタクリレート、β−シクロデキストリンメタクリレート、γ−シクロデキストリンメタクリレート、α−シクロデキストリンアクリレート、β−シクロデキストリンアクリレート、γ−シクロデキストリンアクリレート、ヒドロキシメチル（メタ）アクリルアミド−α−シクロデキストリン、ヒドロキシメチル（メタ）アクリルアミド−β−シクロデキストリン、ヒドロキシメチル（メタ）アクリルアミド−γ−シクロデキストリン、アクリルアミドメチル−α−シクロデキストリン、アクリルアミドメチル−β−シクロデキストリン、アクリルアミドメチル−γ−シクロデキストリンが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。上記単量体（１）は公知の方法で製造することができる。
【００７１】
なお、本明細書において（メタ）アクリルとは、アクリル又はメタクリルのいずれかを意味する。
【００７２】
ゲスト基を分子構造中に有する重合性単量体（以下、「単量体（２）」と略記する）としては、例えば、（メタ）アクリル酸ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸ｔ−ブチル、（メタ）アクリル酸ｎ−ヘキシル、（メタ）アクリル酸ｎ−ドデシル、１‐アクリルアミドアダマンタン、Ｎ−（１−アダマンチル）（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシアダマンチル（メタ）アクリレート、エチルアダマンチル（メタ）アクリレート、Ｎ−ベンジル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−１−ナフチルメチル（メタ）アクリルアミド、イソボルニルアクリレート等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。なお、単量体（２）の代わりにスチレンを使用してもよい。上記単量体（２）は公知の方法で製造することができる。
【００７３】
ホスト基及びゲスト基のいずれをも有していない重合性単量体（以下、「単量体（３）」と略記する）としては、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００７４】
重合性単量体（１）、（２）及び（３）の配合割合は、目的とする高分子ゲルの特性に応じて適宜決めることができる。例えば、重合性単量体（１）、（２）及び（３）の総量に対して重合性単量体（１）を０．５〜１０モル％、重合性単量体（２）を０．５〜１０モル％とすることができる。この場合、得られた重合体のホスト基とゲスト基との相互作用が生じやすく、架橋構造を形成しやすい。重合性単量体（１）、（２）及び（３）の総量に対して重合性単量体（１）を１〜５モル％、重合性単量体（２）を１〜５モル％とすることがより好ましい。また、重合性単量体（１）、（２）及び（３）の総量に対して重合性単量体（１）を２〜４モル％、重合性単量体（２）を２〜４モル％とすることが特に好ましい。
【００７５】
重合性単量体の重合反応は、水性媒体中、特に水中で行うことができる。この場合、製造される高分子ゲルは、架橋構造体と水とを含む。高分子ゲルの形成が阻害されない程度であれば、水性媒体は水とその他の溶媒の混合溶媒であってもよい。その他の溶媒としては、上述の水よりも沸点が高い親水性の溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ等）が挙げられ、その他、水と相溶性のある有機溶媒、例えば、低級アルコールであってもよい。
【００７６】
重合性単量体の重合反応で使用する重合開始剤としては、過硫酸アンモニウム（以下、ＡＰＳと称することもある）、アゾビスイソブチロニトリル（以下、ＡＩＢＮと称することもある）、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロライド（以下、ＶＡ−０４４と称することもある）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、過酸化ベンゾイル、光重合開始剤（イルガキュア（登録商標）シリーズ等）等が挙げられる。好ましくは、ＡＰＳ、ＶＡ−０４４である。
【００７７】
重合開始剤の濃度は、重合性単量体の総量に対し、０．５〜５モル％とすることができる。
【００７８】
水性媒体と、重合開始剤と、重合性単量体との混合物は、各々、所定の配合量で混合することで調製することができる。なお、混合物を調製するにあたり、単量体（１）と単量体（２）とをあらかじめ加熱混合してから、その他の原料を混合してもよい。この場合、単量体（１）と単量体（２）とのホスト−ゲスト相互作用による包接錯体が形成された状態で重合が進行し得るので、安定した架橋構造体を含む高分子ゲルが製造され得る。
【００７９】
重合反応には必要に応じて、その他の添加剤を添加してもよい。その他の添加剤としては、重合促進剤、架橋剤等が例示される。上記重合促進剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン等である。
【００８０】
上記重合反応は、使用する単量体の重合性や使用量、重合開始剤の半減期温度等に応じて適宜の条件で行うことができる。例えば、重合反応は、０〜１００℃、好ましくは、２０〜２５℃で行う。重合反応の時間は、例えば、１〜２４時間であり、好ましくは、１２〜２４時間である。なお、重合開始剤として、光重合開始剤を用いる場合は、例えば、上記混合物に波長２００〜４００ｎｍのＵＶ光を照射することにより重合反応を行う。
【００８１】
上記のように重合反応を行うことで、単量体（１）、単量体（２）及び単量体（３）が重合してなる共重合体が得られる。ここでいう共重合体は上記の重合体Ａに相当する。
【００８２】
上記重合反応の後、必要に応じて毒性を持ちうる単量体や低分子重合体の除去、精製及び乾燥を行うなどすることで、架橋構造体と溶媒とを含む高分子ゲルが得られる。
【００８３】
なお、ホスト基及びゲスト基を有する高分子ゲルの別の製造方法として、ホスト基及びゲスト基を有していない重合体をあらかじめ製造しておき、この重合体とホスト分子及びゲスト分子を反応させて、重合体側鎖にホスト基及びゲスト基を導入する方法も挙げられる。
【００８４】
上記製造方法は、生成物がホスト−ゲスト相互作用によって架橋された架橋構造体と溶媒とを含む高分子ゲルである場合の例であるが、その他の可逆的結合によって架橋された架橋構造体と溶媒とを含む高分子ゲルも、使用する重合性単量体を適宜変更すれば、同様の製造方法で得ることができる。
【００８５】
以上のように形成される培地用高分子ゲルの一つの特徴として、その硬さを容易に調節できる点が挙げられる。例えば、高分子ゲルの硬さは、架橋構造体の架橋点である可逆的結合の数に依存しやすい。高分子ゲルの種類にもよるが、例えば、架橋構造体の架橋点が多くなるほど、高分子ゲルがより硬くなることがあり、つまり、可逆的結合の数が多いほど、高分子ゲルがより硬くなることがある。従って、高分子ゲルに含まれる架橋構造体の可逆的結合の形成及び切断を制御することで、高分子ゲルの硬さを容易に調節することが可能となる。
【００８６】
高分子ゲルの硬さを調節する方法は特に制限されず、可逆的結合の性質に応じて適宜の方法を採用することができる。可逆的結合がホスト基とゲスト基との結合であれば、高分子ゲルに競争物質を加えてその量を変化させることで硬さを調節する方法が挙げられる。
【００８７】
ホスト基とゲスト基とを有する高分子ゲルでは、高分子ゲルに加える競争物質の量を変化させることで硬さを調節する方法が好ましい。この方法では、架橋構造体の架橋点である可逆的結合の形成又は切断を促進しやすいので、高分子ゲルの硬さを正確に制御できる。
【００８８】
ここでいう「競争物質」とは、例えば、架橋構造体に形成されている可逆的結合の形成及び切断に寄与する性質を有する物質をいう。特には、「競争物質」とは、架橋構造体に形成されている可逆的結合の形成及び切断を促進させる作用を有する物質をいう。より具体的には、架橋構造体中の高分子鎖が有している可逆的結合可能な官能基に対して、可逆的に結合することが可能である物質を「競争物質」ということができる。
【００８９】
競争物質は、細胞の性質、寿命等に影響を与えるおそれが少ない化合物であることが特に好ましい。
【００９０】
競争物質は、架橋構造体が有している可逆的結合可能な基を形成することができる分子同様であってもよいし、あるいは、異なる分子であってもよい。
【００９１】
競争物質が高分子ゲルに添加されると、高分子鎖の架橋点を形成している可逆的結合が切断されて、その可逆的結合を形成していた基は、添加された競争物質の方と可逆的結合を形成し得る。これにより、架橋構造体の架橋点の数が変化し、その結果、高分子ゲルの硬さ、例えば、高分子ゲルの弾性率に変化がもたらされる。
【００９２】
可逆的結合が、ホスト基とゲスト基との結合（ホスト−ゲスト相互作用）である架橋構造体を含む高分子ゲルであれば、上記競争物質としては、ホスト分子及びゲスト分子の少なくとも一方が挙げられる。競争物質としてのホスト分子及びゲスト分子は、高分子鎖に結合しているホスト分子又はゲスト分子と同様の分子であってもよいし、あるいは、異なる構造の分子であってもよい。
【００９３】
図１は、架橋構造体に形成されているホスト−ゲスト相互作用による架橋点の数が、競争物質の存在によって変化する様子を模式的に説明した図である。具体的に、図１は、高分子ゲルＢの状態において（図１（ａ））、競争物質を加えた場合の架橋点の変化の様子（（図１（ｂ））及び競争物質を除去した場合の架橋点の変化の様子（図１（ａ））を示している。
【００９４】
図１（ａ）に示すように、この形態の高分子ゲルＢは、架橋構造体１を含む。架橋構造体１は、側鎖にホスト基１１及びゲスト基１２を有する高分子鎖１０の架橋体である。この架橋体は、ホスト基１１及びゲスト基１２とのホスト−ゲスト相互作用によって架橋点１５（図１（ａ）の破線丸枠）が形成されている。なお、ホスト基１１は、例えば、βシクロデキストリンから１個の水素原子が除された基であり、ゲスト基１２は、例えば、アダマンタンから１個の水素原子が除された基である。
【００９５】
このような高分子ゲルＢに、競争物質としてのホスト分子２１を添加すると、図１（ｂ）に示すように、ホスト分子２１は、高分子鎖に結合しているゲスト分子１２（ゲスト基）と結合、つまり、ホスト−ゲスト相互作用をする。そして、ホスト分子１１（ホスト基）及びゲスト分子１２（ゲスト基）とのホスト−ゲスト相互作用により形成されていた架橋点１５が消失する。なお、図１において、ホスト分子２１はβシクロデキストリンである。
【００９６】
このようにして、架橋構造体中の架橋点の数が減少し、その結果として、高分子ゲル自体の弾性率に変化がもたらされる。
【００９７】
図１（ｂ）において、競争物質であるホスト分子２１に代えてゲスト分子を添加した場合にあっても上記同様、架橋点１５が消失し、競争物質であるゲスト分子が、高分子鎖に結合しているホスト基１１とホスト−ゲスト相互作用をする。
【００９８】
高分子ゲルに競争物質を含ませる方法は、特に限定されない。例えば、競争物質を含む液体中に高分子ゲルを浸漬させることで、高分子ゲルに競争物質を含ませることができる。以下、この方法を「浸漬法」と称することがある。また、競争物質を含む液体を「液体Ａ」と表記する。この浸漬法によれば、競争物質が高分子ゲルの架橋構造体中に浸透する。従って、液体Ａ中の競争物質の濃度を調節することで、高分子ゲルに含まれる競争物質量を制御でき、これにより、架橋構造体の架橋点の数を変化させることができる結果、高分子ゲルの硬さを制御できる。
【００９９】
浸漬法における液体Ａの種類は特に限定されず、例えば、高分子ゲルに含まれる溶媒と同じにすることができる。もちろん、浸漬法に用いる液体Ａは高分子ゲルに含まれる溶媒と異なる種類であってもよい。浸漬法に用いる液体Ａは２種以上の溶媒を含んでもよい。また、浸漬法に用いる液体Ａは、培地で培養させる細胞が含まれた培養液を含むものであってもよい。
【０１００】
上記浸漬法においては、高分子ゲルを溶媒又は培養液に浸し、この高分子ゲルが浸されている溶媒又は培養液中に上記競争物質を直接又は溶媒に溶解させた状態で添加することで、高分子ゲルに競争物質を含ませることができる。あるいは、液体Ａをあらかじめ調製して、この液体Ａへ高分子ゲルを浸漬させることで、高分子ゲルに競争物質を含ませることができる。液体Ａを調製する方法は特に限定されず、例えば、競争物質を直接溶媒に添加する方法を採用できる。
【０１０１】
また、液体Ａは、送液ポンプを用いて連続的に、高分子ゲルが浸された溶媒に添加することができる。この送液する競争物質の濃度を調節すれば、高分子ゲルが浸されている液体Ａ中の競争物質濃度を連続的に変化させることができ、高分子ゲルに含まれる競争物質の濃度を簡便な方法で制御できる。
【０１０２】
また、競争物質が加えられた高分子ゲルから、競争物質を除去するなどして競争物質の濃度を減少させれば、再度、可逆的結合が形成され、架橋が生じる。これにより、高分子ゲルの硬さを回復させることが可能となり、高分子ゲルの硬さを元の状態に戻す又は近づけることができる。このように、高分子ゲル中の競争物質の濃度を調節することにより、高分子ゲルの硬さを可逆的に変えることができるので、本実施形態の高分子ゲルでは、その硬さを動的に制御することができる。なお、本明細書中において、高分子ゲルの硬さを「動的に制御する」とは、高分子ゲルの硬さを経時的に変化及び調節できることをいい、高分子ゲルの硬さを「静的に制御する」とは、初期状態からの変化及び調節ができないことをいう。
【０１０３】
高分子ゲル中の競争物質の濃度を減少させる方法としては、例えば、高分子ゲルを、競争物質を含まない溶媒で洗浄又は置換させればよい。また、上記送液ポンプを使用する場合は、競争物質を含む液体Ａに代えて競争物質を含まない溶媒を送液ポンプで注入して、高分子ゲルが浸されている液体Ａを希釈させればよい。
【０１０４】
＜培地＞
本実施形態の培地は、上記した培地用高分子ゲルを含んで構成される。培地用高分子ゲルとは、培地において細胞を培養させるための支持体となり得る基材である。培地は、基材としての当該培地用高分子ゲルを含む限りは、その形態は限定されない。例えば、細胞を培養させるための支持体は、本実施形態の培地用高分子ゲルのみで構成されていてもよいし、他の部材と組み合わせて構成されていてもよい。また、培地は、上記培地用高分子ゲルが培養液に浸されて形成されていてもよい。あるいは、培地は、上記培地用高分子ゲルを減圧脱水又は凍結乾燥等により溶媒を減少又は除去して乾燥状態（例えば、キセロゲル）としたところに、培養液を加えて再度膨潤させて形成させてもよい。
【０１０５】
培養液の組成は特に限定されず、例えば、公知の培養液と同様とすることができる。培養液は、その他、公知の成分、例えば、糖分、脂質、アミノ酸やミネラル、ビタミン等の細胞培養のための栄養成分、細胞培養の増殖因子となる成分、細胞を遊走させる遊走因子、ｐＨ調整剤等が含まれていてもよい。
【０１０６】
上記培地は、培地用高分子ゲルを含み、上述の方法によって基材としての高分子ゲルの硬さを容易に制御することができるので、培地の硬さを制御することが可能となる。なお、念のための注記に過ぎないが、本明細書でいう「培地の硬さ」とは、特には細胞を培養するために支持する基材の弾性率のこという。特に、細胞の培養においては、培地の硬さが細胞の分化や細胞周期に大きな影響を与え得るため、硬さを自在に制御できる上記培地は、これまでにない細胞の分化や細胞周期、増殖、形態等の制御を可能とするものである。
【０１０７】
本実施形態の培地で培養できる細胞の種類は特に限定されず、幹細胞のような未分化の細胞でも、筋芽細胞のような分化途中の細胞でも、線維芽細胞のような分化の進んだ細胞でも、終末分化細胞でもよい。細胞は、初代培養細胞であってもよいし、細胞株であってもよい。本実施形態の培地を用いて未分化の細胞を培養することにより、その細胞周期、具体的には分化や分化を伴わない増殖などを動的に制御し得る。未分化の細胞としては、受精卵；胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞；栄養外胚葉幹細胞（ＴＳ細胞）、胚体外内胚葉細胞（ＸＥＮ細胞）、エピブラスト幹細胞、間葉系幹細胞；造血幹細胞；脂肪由来幹細胞；精子幹細胞（ＧＳ細胞）；歯髄幹細胞；神経幹細胞；膵幹細胞；肝幹細胞；皮膚幹細胞；がん幹細胞などが挙げられる。幹細胞より分化の進んだ分化途中の細胞としては、前駆細胞が挙げられる。前駆細胞の例としては、膵前駆細胞、神経前駆細胞が挙げられる。終末分化細胞の例としては、神経細胞、筋細胞、肝細胞が挙げられる。細胞は、一種類のみであってもよく、二種類以上でもよい。
【０１０８】
また、本実施形態の培地により、細胞培養用のキットを製作することもできる。このようなキットは、上記培地を含むことで、細胞の培養に適したものである。
【０１０９】
＜細胞の培養方法＞
培養の方法は特に限定されず、公知の方法で行うことができる。特に、上記培地は、硬さを制御できる点に特徴があるので、例えば、次のように培地の硬さを変化させつつ、細胞を培養することができる。
【０１１０】
まず、培地用高分子ゲルを含む培地を準備する。例えば、シャーレ等の容器に高分子ゲルを収容し、それを細胞培養液等で馴化することで、高分子ゲルが液体（例えば、前記液体Ａ）に浸された培地を得ることができる。
【０１１１】
高分子ゲルを培養液等の液体に浸すにあたっては、高分子ゲルに含まれる溶媒の置換を行うことができる。この溶媒の置換は、公知の方法によって行うことができる。置換後の高分子ゲルに含まれる溶媒は、例えば、培養液の溶媒と同じとすることができる。
【０１１２】
上記により培地が得られ、細胞が培養される。
【０１１３】
次いで、培地における高分子ゲルの硬さを変化させるべく、競争物質を高分子ゲルが浸されている液体中へ添加する。競争物質を添加するにあたっては、直接、液体中へ競争物質を添加してもよいし、あるいは、競争物質を溶解又は希釈して添加してもよい。また、競争物質は、送液ポンプを用いて連続的に高分子ゲルが浸されている液体中へ添加することができる。具体的に、高分子ゲルが収容されている容器に注入口と排出口を設け、送液ポンプを注入口に接続することで、競争物質を含む液体を連続的に液体中へ添加することができる。容器に注入させた液体は、必要に応じて排出口から排出させればよい。
【０１１４】
上記のようにして、液体中に競争物質が添加されると、高分子ゲル中の架橋構造体の架橋点の数が減少し、培地の硬さが変化し得る。
【０１１５】
本実施形態の細胞の培養方法では、培地に可逆的結合の形成を阻害する競争物質を添加する操作を有することにより、細胞を培養している培地の硬さを変化させることができるので、細胞の動的応答をその場で観測しながら培地の硬さを調節することができる。
【０１１６】
さらに、培地に加えられた競争物質の濃度を減少させれば、再度、高分子ゲル中の架橋構造体の高分子鎖の間の可逆的結合によって架橋が生じるので、高分子ゲルの硬さを徐々に回復させることができる。これによって、細胞の培養挙動も可逆的に制御することが可能となる。
【０１１７】
競争物質の濃度を減少させる方法としては、例えば、上記送液ポンプを使用するなどして競争物質を含まない液体（例えば、競争物質を含まない培養液）を培地に添加し、培地中の液体を置換すればよい。これにより、培地に含まれる競争物質が希釈され、競争物質の濃度を減少させることができる。
【０１１８】
競争物質の濃度を減少させた後、さらに、上記同様の操作により、競争物質の濃度を増加させる操作を行ってもよい。このように、競争物質の濃度を増加及び減少させる操作を繰り返し行うことができる。
【０１１９】
以上のように、本実施形態の細胞の培養方法では、培地中の競争物質の濃度を減少させる操作及び増加させる操作により、細胞を培養している培地の硬さを自在に変化させることができる。その結果、細胞の培養挙動を動的に変化させることができる。
【０１２０】
前記培地に含まれる前記競争物質の濃度を１０ｍｏｌ／Ｌ以下の範囲に調節することが好ましい。この範囲で、競争物質の量を調節できれば、培地の硬さは、細胞の安定な培養に適した範囲となり得る。ここでいう競争物質の濃度とは、培地用高分子ゲルが浸されている液体に対する濃度である。
【０１２１】
前記競争物質の濃度は、１ｍｏｌ／Ｌ以下の範囲に調節することができ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ以下の範囲に調節することがより好ましい。前記競争物質の濃度の下限は特に限定的ではないが、例えば、０．０００１ｍｏｌ／Ｌである。
【０１２２】
以上のように、本実施形態の細胞の培養方法によれば、細胞の培養挙動も可逆的に制御することができることから、従来にはない細胞分化の制御技術を確立できることが期待される。しかも、培地の硬さを、競争物質の濃度に応じて変化させることができるので、細胞に悪影響をおよぼすおそれが小さい条件にて細胞の培養挙動を制御することができる。
【実施例】
【０１２３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の態様に限定されるものではない。【０１２４】
（調製例１：培地用高分子ゲルの調製）
図２に示す反応スキームにより、高分子ゲルを調製した。【０１２５】
具体的には、水中にて、ホスト基含有重合性単量体（単量体（１））として６−アクリルアミド−β−シクロデキストリン（βＣＤ−ＡＡｍ）及びゲスト基含有重合性単量体（単量体（２））としてＮ−（１−アダマンチル）アクリルアミド（Ａｄ−ＡＡｍ）をそれぞれ４０ｍｍｏｌ／ｋｇの濃度になるように混合した。この混合液を密封状態にて、９０℃で３時間の撹拌を行った。得られた混合液を室温まで放冷し、そこに単量体（３）としてアクリルアミドを１．９２ｍｏｌ／ｋｇの濃度になるように溶解することで、重合性単量体の総濃度が２ｍｏｌ／ｋｇとなる溶液を調製した。【０１２６】
その後、重合開始剤である過硫酸アンモニウム２０ｍｍｏｌ／ｋｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルエチレンジアミン２０ｍｍｏｌ／ｋｇの濃度になるようにこの順に加え、ガラス基板上に薄く広げ室温で１時間放置することにより、ゲル化を進行させ、ホスト基とゲスト基との可逆的結合によって架橋された架橋構造体を得た。このように得られた架橋構造体を、さらにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と水の混合溶媒にて溶媒を交換しながら洗浄し、最終的に架橋構造体に含まれる溶媒を水に置換することで、厚さ約７０μｍ、２５ｍｍ四方の高分子ゲルを得た。当該高分子ゲルは、βＣＤ−ＡＡｍ由来の繰り返し構成単位及びＡｄ−ＡＡｍ由来の繰り返し構成単位を、いずれも重合体中に２モル％の割合で含む。なお、図２において、全ての重合性単量体に対するホスト基含有重合性単量体、ゲスト基含有重合性単量体の仕込みｍｏｌ％をそれぞれｘ、ｙとしてβＣＤ−Ａｄ ｇｅｌ（ｘ,ｙ）と表記している。【０１２７】
（試験例１：弾性率の測定）
調製例１で調製した高分子ゲルを、一方に注入口を、その反対側に排出口を備える３５ｍｍ径のプラスチック製ディッシュ内に固定し、そこにRoswell Park Memorial Institute培地（以下、「ＲＰＭＩ培地」という。）を添加して高分子ゲルを浸漬させ、試験を開始した。実験開始から１０分毎に高分子ゲルの弾性率を測定した。なお、弾性率の測定は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により行った。具体的には、カンチレバーを高分子ゲルに押し込み、その際のカンチレバーの変位とひずみに基づいて、弾性率を算出した。【０１２８】
試験開始から２５分後に、１０ｍＭのβ−ＣＤを含むＲＰＭＩ培地を注入口から添加してディッシュ内の溶液を置換し、試験開始８５分後まで維持した。８５分経過後、β−ＣＤを含まないＲＰＭＩ培地を注入してディッシュ内の溶液を置換し、試験開始２３５分後まで維持した。同様に、試験開始２３５分経過後から２９５分後まで１０ｍＭのβ−ＣＤを含むＲＰＭＩ培地を注入して維持し、試験開始２９５分経過後から４４５分後までβ−ＣＤを含まないＲＰＭＩ培地を注入して維持し、試験開始４４５分経過後、再度１０ｍＭのβ−ＣＤを含むＲＰＭＩ培地を注入した。弾性率の測定結果を図３（ａ）に白丸で示す。本試験において、β−ＣＤを含むＲＰＭＩ培地を注入する流速、及び、β−ＣＤを含まないＲＰＭＩ培地の注入はいずれも、４．３ｍＬ／ｍｉｎとした。【０１２９】
（試験例２）
１０ｍＭのβ−ＣＤを含むＲＰＭＩ培地の代わりに２．５ｍＭのβ−ＣＤを含むＲＰＭＩ培地を用いたこと以外は試験例１と同様にして弾性率を測定した。結果を図３（ａ）に黒丸で示す。【０１３０】
試験例１、２の結果から、溶液中に競争物質であるβ−ＣＤが存在することにより、架橋構造体中の架橋点が減少し、高分子ゲルの弾性率が低下すること、β−ＣＤ濃度が高いほど弾性率の低下も大きいこと、及び、溶液中のβ−ＣＤ濃度の増減に対応して高分子ゲルの弾性率も変化すること、すなわち、高分子ゲルの弾性率を動的に制御し得ることが示された。【０１３１】
（試験例３）
調製例１で調製した高分子ゲルを、試験例１と同様のプラスチックディッシュ内に固定し、β−ＣＤを含まないＲＰＭＩ培地中で静置した後、０．５ｍＭのβ−ＣＤを含むＲＰＭＩ培地を注入口から添加しディッシュ内の溶液を置換し、試験例１と同様にして高分子ゲルの弾性率を測定した。β−ＣＤを１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ及び２５ｍＭ含むＲＰＭＩ培地を用いて、それぞれ同様に弾性率を測定した。弾性率を縦軸に、β−ＣＤ濃度を対数目盛の横軸にプロットした結果を図３（ｂ）に示す。図３（ｂ）に示す結果から、競争物質であるβ−ＣＤの濃度が増えると、架橋構造体中の架橋点が減少することにより、高分子ゲルの弾性率が対数関数的に減少することが明らかである。すなわち、添加するβ−ＣＤの量及び濃度等によって、高分子ゲルの弾性率を所望の値に動的に制御できることが示された。【０１３２】
（試験例４：マウス筋芽細胞の形態観察）
調製例１で調製した高分子ゲルを、試験例１と同様のプラスチックディッシュ内に固定し、次いで、１０％ウシ胎児血清ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（以下、「β−ＣＤを含まないＲＰＭＩ培地」という。）をディッシュ内に注入し、ここに１００００ｃｅｌｌｓのマウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を播種し、測定開始まで２４時間インキュベーションした。【０１３３】
細胞の形態を倒立型顕微鏡（オリンパス社製ＩＸ８１）で観察、撮影した。図４の左側から、測定開始時（図４（ａ））、測定開始から０．５時間後（図４（ｂ））、１．５時間後（図４（ｃ））、１０．１時間後（図４（ｄ））、１０．４時間後（図４（ｅ））、１５．６時間後（図４（ｆ））及び２２.３時間後（図４（ｇ））の細胞の写真を示す。なお、各写真の１辺の長さが１０８μｍに相当する。この測定においては、まず、測定開始３０分後から１０ｍＭのβ−ＣＤを含むＲＰＭＩ培地を注入口から添加し、ディッシュ内の溶液を置換して測定開始２時間後まで維持した。その後、β−ＣＤを含まないＲＰＭＩ培地を注入して測定開始２０時間後まで高分子ゲルを弾性率が高い（固い）状態に維持した。次いで、１０ｍＭのβ−ＣＤを含むＲＰＭＩ培地を注入し、測定開始２４時間後まで高分子ゲルを弾性率が低い（柔らかい）状態に維持した。【０１３４】
測定開始直後及び測定開始から３０分後の高分子ゲルの弾性率が高い（固い）状態では、図４（ａ）、（ｂ）の２枚の写真から明らかな通り、細胞が広がった状態であるものの、高分子ゲルの弾性率を低くした１．５時間後（図４（ｃ））では、細胞は丸い形状に変化した。高分子ゲルの弾性率を再び高くしてから８時間を経過した時点（測定開始から１０．１時間後）では、図４（ｄ）に示す通り依然丸い形状であったが、１０．４時間後（図４（ｅ））には急に広がった形状へと変化を始め、約１５時間経過後には図４（ｆ）から明らかな通り、大きく広がった。再び、高分子ゲルの弾性率を低くした２２．３時間後の時点では、図４（ｇ）から明らかな通り、細胞は再び丸い形状となった。【０１３５】
以上の結果から、高分子ゲルの弾性率が高いとき（固いとき）は、細胞は広がった形状となり、競争物質を添加し弾性率が低くなったとき（柔らかいとき）は、細胞は球に近い形状となること、この形状変化は繰り返すことができること、特に球状から広がった形状への変化には時間を要することが明らかとなった。【０１３６】
（試験例５）
試験例４の観察と同時に、デジタルデータを２値化処理し、細胞の面積と細胞の真円度を求めた。細胞の面積を図５（ａ）に、細胞の真円度を図５（ｂ）に示す。なお、細胞の真円度は下記式
（４π×面積）／｛（細胞の外周の長さ）＾２｝
より求め、真円度が１に近いほど円形に近い。【０１３７】
図５（ａ）、（ｂ）に示す結果から、高分子ゲルの弾性率が低下すると（図５（ａ）、（ｂ）におけるβＣＤと表示された網掛け領域）、比較的急速に細胞が円形に向かって変形し、細胞の面積も減少すること、及び、高分子ゲルの弾性率が低い状態から高い状態へと変化すると、細胞はすぐには変形せず、しばらく面積を変えずにいるものの、一定時間経過後急速に変形することが明らかである。また、測定開始２０時間経過後に再び高分子ゲルの弾性率を低下した際、再度細胞が円形に近づいたことから、本発明の高分子ゲルの弾性を変えることにより細胞の形状を変化できること、いいかえると、本発明の高分子ゲルを用いて細胞を培養することにより、細胞の性状を動的に制御できることが示された。【０１３８】
図６は、上記試験例４、５の様子を示す模式図である。図６に示すように、競争物質の濃度が低く、培地が硬い状態の場合では細胞が拡がった形態となり、逆に培地が柔らかい状態の場合では細胞が収縮した球状に近い形態となる。【０１３９】
以上より、培地用高分子ゲルによれば、その硬さに応じて細胞の形および機能を可逆的に制御させることが可能であることが示された。
【図１】
2018021289.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月18日(2018.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可逆的結合によって架橋された架橋構造体と溶媒とを含み、
前記可逆的結合が、ホスト基とゲスト基との結合であり、
前記架橋構造体は、
下記一般式（１ａ）
【化１】
2018021289.tif 000015
［式中、Ｒａは水素原子またはメチル基を示す。Ｒ１はヒドロキシル基、チオール基、１個以上の置換基を有していてもよいアルコキシ基、１個以上の置換基を有していてもよいチオアルコキシ基、１個以上の置換基を有していてもよいアルキル基、１個の置換基を有していてもよいアミノ基、１個以上の置換基を有していてもよいアミド基、アルデヒド基及びカルボキシル基からなる群より選択される１価の基から１個の水素原子を除去することにより形成される２価の基を示す。ＲＡはホスト基を示す］
で表される繰り返し構成単位、
下記一般式（２ａ）
【化２】
2018021289.tif 000016
［式中、Ｒａは前記式（１ａ）と同じである。水素原子またはメチル基、Ｒ２はヒドロキシル基、チオール基、１個以上の置換基を有していてもよいアルコキシ基、１個以上の置換基を有していてもよいチオアルコキシ基、１個以上の置換基を有していてもよいアルキル基、１個の置換基を有していてもよいアミノ基、１個以上の置換基を有していてもよいアミド基、アルデヒド基及びカルボキシル基からなる群より選択される１価の基から１個の水素原子を除去することにより形成される２価の基を示す。ＲＢはゲスト基を示す］
で表される繰り返し構成単位、及び、
下記一般式（３ａ）
【化３】
2018021289.tif 000017
［式中、Ｒａは前記式（１ａ）と同じである。Ｒ３はハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、１個の置換基を有していてもよいアミノ基、１個の置換基を有していてもよいカルボキシル基又は１個以上の置換基を有していてもよいアミド基を示す］
で表される繰り返し構成単位
を有する重合体である、細胞培養用基材。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
請求項１に記載の細胞培養用基材を含む、培地。
【請求項６】
培地で細胞を培養する、細胞の培養方法であって、
前記培地は、培地用高分子ゲルを含む細胞培養用基材を含み、
前記培地用高分子ゲルは、可逆的結合によって架橋された架橋構造体と溶媒とを含み、
前記培地に前記可逆的結合の形成を阻害する性質を有する競争物質を添加する工程をさらに含み、前記培地に添加された前記競争物質の濃度を増大又は減少させる操作を繰り返し行う、細胞の培養方法。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
前記培地に含まれる前記競争物質の濃度を１０ｍｏｌ／Ｌ以下の範囲に調節する、請求項６に記載の細胞の培養方法。
【請求項１０】
請求項５に記載の培地を含む、キット。
【請求項１１】
前記可逆的結合が、ホスト基とゲスト基との結合、疎水性相互作用、水素結合、イオン結合、配位結合、π電子相互作用及びこれら以外の分子間相互作用の群から選ばれる少なくとも１種である、請求項６に記載の細胞の培養方法。
【請求項１２】
前記可逆的結合が、ホスト基とゲスト基との結合である、請求項１１に記載の細胞の培養方法。
【請求項１３】
前記架橋構造体は、
下記一般式（１ａ）
【化４】
2018021289.tif 000018
［式中、Ｒａは水素原子またはメチル基を示す。Ｒ１はヒドロキシル基、チオール基、１個以上の置換基を有していてもよいアルコキシ基、１個以上の置換基を有していてもよいチオアルコキシ基、１個以上の置換基を有していてもよいアルキル基、１個の置換基を有していてもよいアミノ基、１個以上の置換基を有していてもよいアミド基、アルデヒド基及びカルボキシル基からなる群より選択される１価の基から１個の水素原子を除去することにより形成される２価の基を示す。ＲＡはホスト基を示す］
で表される繰り返し構成単位、
下記一般式（２ａ）
【化５】
2018021289.tif 000019
［式中、Ｒａは前記式（１ａ）と同じである。水素原子またはメチル基、Ｒ２はヒドロキシル基、チオール基、１個以上の置換基を有していてもよいアルコキシ基、１個以上の置換基を有していてもよいチオアルコキシ基、１個以上の置換基を有していてもよいアルキル基、１個の置換基を有していてもよいアミノ基、１個以上の置換基を有していてもよいアミド基、アルデヒド基及びカルボキシル基からなる群より選択される１価の基から１個の水素原子を除去することにより形成される２価の基を示す。ＲＢはゲスト基を示す］
で表される繰り返し構成単位、及び、
下記一般式（３ａ）
【化６】
2018021289.tif 000020
［式中、Ｒａは前記式（１ａ）と同じである。Ｒ３はハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、１個の置換基を有していてもよいアミノ基、１個の置換基を有していてもよいカルボキシル基又は１個以上の置換基を有していてもよいアミド基を示す］
で表される繰り返し構成単位
を有する重合体である、請求項１２に記載の細胞の培養方法。
【請求項１４】
可逆的結合によって架橋された架橋構造体と溶媒とから構成される高分子ゲルを含む細胞培養基材と、競争物質とを含み、
前記競争物質は、前記可逆的結合の形成を阻害する性質を有すると共に、培地の硬さを可逆的に変化させることができる性質を有する、培地。
【国際調査報告】
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