(57)【要約】  放射線被曝に伴う放射線障害を有効に治療又は予防するための技術として、好酸球除去剤を有効成分として含有する、放射線被曝に伴う放射線障害の治療又は予防剤等を提供する。本発明に係る好酸球除去剤を含む治療又は予防剤等によれば、標的組織への好酸球の遊走、浸潤、及び／又は該組織中での増殖を抑制すること、及び／又は該好酸球の活性又は機能を阻害することにより、組織の炎症反応及び線維化などの病態を抑制して、放射線障害を効果的に治療又は予防し得る。また、放射線障害を抑制して効果的な放射線治療を行い得る。
2018139404.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
好酸球除去剤を有効成分として含有する、放射線被曝に伴う放射線障害の治療又は予防剤。
【請求項２】
放射線が、Ｘ線又はγ線である、請求項１記載の治療又は予防剤。
【請求項３】
放射線被曝が、放射線治療に伴う放射線被曝である、請求項１又は２記載の治療又は予防剤。
【請求項４】
放射線治療が、小腸がん、大腸がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管カルチノイド、胃がん、食道がん、肝臓がん、胆のう・胆道がん、膵がん、膵・消化管神経内分泌腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、腎細胞がん、腎盂・尿管がん、副腎腫瘍、骨肉腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、膀胱がん、尿道がん、前立腺がん、精巣腫瘍、陰茎がん、子宮体がん、子宮頸がん、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、女性器がん、肺がん、胸腺腫瘍、中皮腫、乳がん、造血器腫瘍、白血病、骨髄増殖性疾患および多発性骨髄腫からなる群から選ばれるいずれかのがんに対する放射線治療である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療又は予防剤。
【請求項５】
放射線障害が、早発性放射線障害又は晩発性放射線障害である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の治療又は予防剤。
【請求項６】
放射線障害が、小腸、大腸、胃、膀胱、肝臓及び腎臓からなる群から選択されるいずれか１以上の臓器に対する障害である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の治療又は予防剤。
【請求項７】
好酸球除去剤が、好酸球細胞表面上に発現している抗原に結合する抗体若しくはその断片又は該抗原に結合するリガンドに結合する抗体若しくはその断片である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療又は予防剤。
【請求項８】
抗体又はその断片が、ＩＬ−５受容体α鎖、ＩＬ−５受容体β鎖、ＣＲＴＨ２、Ｓｉｇｌｅｃ８、ＣＣＲ３、ＩＬ−５、ＰＧＤ２、Ｓｉｇｌｅｃ８リガンド、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、及びＣＣＬ２８からなる群から選択されるいずれかの抗原に結合する抗体又はその断片である、請求項７に記載の治療又は予防剤。
【請求項９】
抗体又はその断片が、抗体依存性細胞傷害活性及び／又は中和活性を有する抗体又はその断片である、請求項７又は８に記載の治療又は予防剤。
【請求項１０】
抗体又はその断片が、モノクローナル抗体又は遺伝子組換え抗体あるいはそれらの断片である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の治療又は予防剤。
【請求項１１】
抗体又はその断片が、ヒトＦｃ領域又はヒト定常領域を含む抗体又はその断片である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の治療又は予防剤。
【請求項１２】
抗体又はその断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択されるいずれかの抗体又はその断片である、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の治療又は予防剤。
【請求項１３】
抗体又はその断片が、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖（以下、Ｈ鎖と記す）相補性決定領域（以下、ＣＤＲと記す）１〜３及び配列番号４〜６に示すアミノ酸配列をそれぞれ含む軽鎖（以下、Ｌ鎖と記す）ＣＤＲ１〜３を含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体又はその断片である、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の治療又は予防剤。
【請求項１４】
放射線治療において、治療対象患者の放射線の耐容線量を増加させること、放射線治療の期間を延長させること、及び／又は放射線治療に伴う放射線障害を抑制することを特徴とする、好酸球除去剤を有効成分として含有する、放射線被曝に伴う放射線障害の治療又は予防剤。
【請求項１５】
放射線治療において、治療対象患者の放射線の耐容線量を５％以上増加させることを特徴とする、好酸球除去剤を有効成分として含有する、放射線被曝に伴う放射線障害の治療又は予防剤。
【請求項１６】
好酸球除去剤が、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列をそれぞれ含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３及び配列番号４〜６に示すアミノ酸配列をそれぞれ含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体又はその断片である、請求項１４又は１５記載の治療又は予防剤。
【請求項１７】
好酸球除去剤を有効成分として含有する治療剤又は予防剤を投与する手順を含む、放射線被曝に伴う放射線障害の治療又は予防方法。
【請求項１８】
好酸球除去剤が、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列をそれぞれ含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３及び配列番号４〜６に示すアミノ酸配列をそれぞれ含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体又はその断片である、請求項１７記載の治療又は予防方法。
【請求項１９】
好酸球除去剤を使用することを特徴とする、放射線治療方法。
【請求項２０】
放射線被曝による放射線障害を低下させた、請求項１９記載の放射線治療方法。
【請求項２１】
放射線被曝が、放射線治療に伴う放射線被爆である、請求項２０記載の放射線治療方法。
【請求項２２】
好酸球除去剤を投与しないときに比べて５％以上高い１回線量および／または合計線量の放射線の照射を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の放射線治療方法。
【請求項２３】
好酸球除去剤を投与しないときに比べ多い回数の放射線の照射を含む、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の放射線治療方法。
【請求項２４】
耐容線量より５％以上高い線量の放射線の照射を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の放射線治療方法。
【請求項２５】
放射線治療が、小腸がん、大腸がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管カルチノイド、胃がん、食道がん、肝臓がん、胆のう・胆道がん、膵がん、膵・消化管神経内分泌腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、腎細胞がん、腎盂・尿管がん、副腎腫瘍、骨肉腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、膀胱がん、尿道がん、前立腺がん、精巣腫瘍、陰茎がん、子宮体がん、子宮頸がん、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、女性器がん、肺がん、胸腺腫瘍、中皮腫、乳がん、造血器腫瘍、白血病、骨髄増殖性疾患および多発性骨髄腫からなる群から選ばれるいずれかのがんに対する放射線治療である、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の放射線治療方法。
【請求項２６】
好酸球除去剤が、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列をそれぞれ含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３及び配列番号４〜６に示すアミノ酸配列をそれぞれ含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体又はその断片である、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の放射線治療方法。
【請求項２７】
好酸球除去剤の投与および放射線の照射の併用を含むがんの治療方法。
【請求項２８】
放射線の照射が、好酸球除去剤を投与しないときに比べて５％以上高い１回線量および／または合計線量で行われる、請求項２７記載のがんの治療方法。
【請求項２９】
放射線の照射が、耐容線量より５％以上高い線量で行われる、請求項２７又は２８記載のがんの治療方法。
【請求項３０】
放射線の照射が、好酸球除去剤を投与しないときに比べ多い回数行われる、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のがんの治療方法。
【請求項３１】
がんが、小腸がん、大腸がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管カルチノイド、胃がん、食道がん、肝臓がん、胆のう・胆道がん、膵がん、膵・消化管神経内分泌腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、腎細胞がん、腎盂・尿管がん、副腎腫瘍、骨肉腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、膀胱がん、尿道がん、前立腺がん、精巣腫瘍、陰茎がん、子宮体がん、子宮頸がん、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、女性器がん、肺がん、胸腺腫瘍、中皮腫、乳がん、造血器腫瘍、白血病、骨髄増殖性疾患および多発性骨髄腫からなる群から選ばれるいずれかのがんである、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載のがんの治療方法。
【請求項３２】
好酸球除去剤が、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列をそれぞれ含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３及び配列番号４〜６に示すアミノ酸配列をそれぞれ含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体又はその断片である、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載のがんの治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射線障害の治療又は予防剤並びに治療又は予防方法に関する。より詳しくは、好酸球除去剤を有効成分として含有する、放射線被曝に伴う放射線障害の治療又は予防剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
放射線療法は、手術療法及び化学療法と並ぶがん治療法の一つであり、骨盤腔内がん及び前立腺がんなどの癌治療において広く適用されている治療法である。腫瘍に線量を集中させ、周囲の正常組織への線量を極力低減させることにより、がんを根治あるいは症状緩和することにその目的がある。【０００３】
一方、放射線療法の課題として、正常組織に対する放射線障害が挙げられる。放射線障害は、放射線治療中または治療後数カ月の間に発症する早発性放射線障害、及び、治療後数カ月から数十年の間に発症する晩発性放射線障害に大分される（非特許文献１）。【０００４】
放射線性腸炎は、放射線を腹部や骨盤腔内のがんに照射した際に惹起される、腸内の正常細胞に対する放射線障害である。放射線性腸炎の早発性放射線障害としては、例えば、嘔吐、摂食障害、粘膜炎症、出血、下痢、便秘、及び、血便などが挙げられる。また、放射線性腸炎の晩発性放射線性障害としては、腸管線維化症、消化管の潰瘍，狭窄・閉塞、瘻孔形成、出血、穿孔、潰瘍形成、便失禁、及び、慢性下痢などが挙げられる。早発性障害に対する治療法としては、排便コントロールを主として、ステイロイド剤、抗酸化剤、抗炎症薬、ラジカルスカベンジャー製剤、及び、抗生物質などの薬剤を用いた内服治療を中心に対処療法を行う。また、晩発性放射線障害に対する治療法としては、例えば、高気圧酸素療法、アルゴンプラズマ凝固法、及び、外科的切除などが行われる。【０００５】
放射線性腸炎における早発性放射線障害は、粘膜障害及び粘膜の炎症を主とした病態であり、放射線治療中の患者のｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ（ＱＯＬ）を著しく低下させる。さらに、重度の早発性放射線障害が発症した場合、治療の中断や治療スケジュールの変更などを余儀なくされる。早発性放射線障害の治療薬としては、ステイロイド剤、抗酸化剤、抗炎症薬、ラジカルスカベンジャー製剤、及び、抗生物質などが使用されているが、治療効果は限定的であり、十分な治療効果を期待できる治療薬は存在しない（非特許文献１、２）。【０００６】
一方、放射線性腸炎における晩発性放射線障害は、組織の線維化、粘膜の委縮、及び、血管硬化などを主とした、慢性症状を呈する進行性の病態であり、患者のＱＯＬを生涯にわたって著しく低下させる。晩発性放射線障害に対する有効な治療薬は存在せず、重篤な場合には外科的処置が施されるが、有効な治療方法は確立されていない（非特許文献１）。【０００７】
放射線性腸炎が惹起されるメカニズムとしては、野生型マウスの腹部に対して放射線を照射する放射線性腸炎モデルを用いた解析から、好酸球の関与が示唆されている（非特許文献３）。例えば、該放射線性腸炎モデルでは、放射線照射数ヶ月後から、主要な晩発性障害である小腸線維化の進行が惹起され、線維化発症部位である小腸粘膜下層における好酸球の浸潤および活性化が確認されている。【０００８】
また、好酸球が遺伝的に欠如しているΔｄｂｌＧＡＴＡマウスを用いた放射線性腸炎モデルの検討では、小腸粘膜下層の線維化が抑制されることが明らかになっている。一方、ΔｄｂｌＧＡＴＡマウスは、好酸球欠損マウスとして一般に広く使用されているが、好酸球欠損以外にも、好塩基球の減少や軽度の貧血が生じるなどの影響が報告されている（非特許文献４）。【０００９】
また、ΔｄｂｌＧＡＴＡマウスは、同じく好酸球欠損マウスとして広く使用されているＰＨＩＬマウスとも、喘息モデルなどにおいて表現型が異なることが報告されている（非特許文献５、６）。したがって、ΔｄｂｌＧＡＴＡマウスにおいて放射線性腸炎の発症が抑制されるメカニズムが、好酸球が存在しないことのみに起因しているかどうかについては、必ずしも明らかではない。【００１０】
小腸における好酸球を除去する方法として、例えば、好酸球活性化因子であるインターロイキン―５（ＩＬ−５）を枯渇させる方法が考えられる。しかし、ＩＬ−５欠損マウスを用いた解析では、血中好酸球は顕著に減少する一方、小腸好酸球は減少しないことが明らかにされている（非特許文献７）。また、ＩＬ−５受容体を欠損させたＩＬ−５Ｒａ欠損マウスを用いた解析では、血中好酸球が５０％程度減少するにとどまっている（非特許文献８）。【００１１】
ＩＬ−５リガンド又はＩＬ−５受容体に特異的に結合する抗体として、抗ＩＬ−５ヒト化抗体Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ１）、Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ４／κ）、並びに、抗ＩＬ−５Ｒα抗体Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ（ＭＥＤＩ−５６３）［Ｆａｓｅｎｒａ（登録商標）］（特許文献１、２及び非特許文献９、１０）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第１９９７／１０３５４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／３５５８３号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol., 2014, 11(8): 470-479
【非特許文献２】Nat. Rev. Cancer, 2011, 11(4): 239-253
【非特許文献３】Proceedings of the Japanese Society for Immunology, 2014, 43: 3-H-W50-4
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci., 2013, 110(46): 18620-18625
【非特許文献５】Science, 2004, 305: 1773-1776
【非特許文献６】Science, 2004, 305: 1776-1779
【非特許文献７】Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97(12): 6681-6686
【非特許文献８】Immunity, 1996, 4(5): 483-494
【非特許文献９】World Allergy Organization J., 2014, 7: 1-14
【非特許文献１０】Clinical Et. Experimental Allergy, 2010 42, 712-737
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、放射線被曝に伴う放射線障害を有効に治療又は予防するための技術を提供すること、及び放射線被曝に伴う放射線障害を抑制した放射線治療方法、又はがんの治療方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題解決のため、本発明者らは鋭意検討した結果、リガンド／受容体の中和活性を有する好酸球除去抗体及び高エフェクター活性を付与した好酸球除去抗体等の好酸球除去剤によって腸管好酸球を顕著に減少させられることを初めて明らかにした。そして、好酸球除去剤の投与が、組織中の好酸球を減少させ、放射線障害における病態の発症及び進行を抑制しうること、放射線被曝に伴う放射線障害を抑制することで放射線治療における耐容線量を増加させることを見出した。【００１６】
これらの知見に基づき、本発明は以下の［１］〜［７０］を提供する。
［１］  好酸球除去剤を有効成分として含有する、放射線被曝に伴う放射線障害の治療又は予防剤。
［２］  放射線が、Ｘ線またはγ線である、［１］の治療又は予防剤。
［３］  放射線被曝が、放射線治療に伴う放射線被曝である、［１］又は［２］の治療又は予防剤。
［４］  放射線治療が、小腸がん、大腸がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管カルチノイド、胃がん、食道がん、肝臓がん、胆のう・胆道がん、膵がん、膵・消化管神経内分泌腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、腎細胞がん、腎盂・尿管がん、副腎腫瘍、骨肉腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、膀胱がん、尿道がん、前立腺がん、精巣腫瘍、陰茎がん、子宮体がん、子宮頸がん、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、女性器がん、肺がん、胸腺腫瘍、中皮腫、乳がん、造血器腫瘍、白血病、骨髄増殖性疾患および多発性骨髄腫からなる群から選ばれるいずれかのがんに対する放射線治療である［３］の治療又は予防剤。
［５］  放射線障害が、早発性放射線障害又は晩発性放射線障害である、［１］〜［４］のいずれかの治療又は予防剤。
［６］  放射線障害が、小腸、大腸、胃、膀胱、肝臓及び腎臓からなる群から選択されるいずれか１以上の臓器に対する障害である、［１］〜［５］のいずれかの治療又は予防剤。
［７］  好酸球除去剤が、好酸球細胞表面上に発現している抗原に結合する抗体もしくはその断片又は該抗原に結合するリガンドに結合する抗体若しくはその断片である、［１］〜［６］のいずれかの治療又は予防剤。
［８］  抗体又はその断片が、ＩＬ−５受容体α鎖及び／又はβ鎖、ＣＲＴＨ２、Ｓｉｇｌｅｃ８、ＣＣＲ３、ＩＬ−５、ＰＧＤ２、Ｓｉｇｌｅｃ８リガンド、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、及びＣＣＬ２８からなる群から選択されるいずれかの抗原に結合する抗体又はその断片、好ましくはＩＬ−５受容体α鎖又はＩＬ−５リガンドに結合する抗体又はその断片である、［７］の治療又は予防剤。
［９］  抗体又はその断片が、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）及び／又は中和活性を有する抗体又はその断片である、［７］又は［８］の治療又は予防剤。
［１０］  抗体又はその断片が、モノクローナル抗体又は遺伝子組換え抗体あるいはそれらの断片である、［７］〜［９］のいずれかの治療又は予防剤。
［１１］  抗体又はその断片が、ヒトＦｃ領域又はヒト定常領域を含む抗体又はその断片である、［７］〜［１０］のいずれかの治療又は予防剤。
［１２］  抗体又はその断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選ばれるいずれかの抗体又はその断片である、［７］〜［１１］のいずれかの治療又は予防剤。
［１３］  放射線治療において、治療対象患者の放射線の耐容線量を増加させること、放射線治療の期間を延長させること、及び／又は放射線治療に伴う放射線障害を抑制することを特徴とする、好酸球除去剤を有効成分として含有する、放射線被曝に伴う放射線障害の治療又は予防剤。【００１７】
［１４］  放射線治療において好酸球除去剤を用いることを特徴とする、治療対象患者の放射線の耐容線量を増加させる方法、放射線治療の期間を延長させる方法、及び／又は放射線被曝に伴う放射線障害を抑制する方法。
［１５］  放射線が、Ｘ線又はγ線である、［１４］の方法。
［１６］  放射線被曝が、放射線治療に伴う放射線被曝である、［１４］又は［１５］の方法。
［１７］  放射線治療が、小腸がん、大腸がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管カルチノイド、胃がん、食道がん、肝臓がん、胆のう・胆道がん、膵がん、膵・消化管神経内分泌腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、腎細胞がん、腎盂・尿管がん、副腎腫瘍、骨肉腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、膀胱がん、尿道がん、前立腺がん、精巣腫瘍、陰茎がん、子宮体がん、子宮頸がん、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、女性器がん、肺がん、胸腺腫瘍、中皮腫、乳がん、造血器腫瘍、白血病、骨髄増殖性疾患および多発性骨髄腫からなる群から選ばれるいずれかのがんに対する放射線治療である［１４］〜［１６］のいずれかの方法。
［１８］  放射線障害が、早発性放射線障害又は晩発性放射線障害である、［１４］〜［１７］のいずれかの方法。
［１９］  放射線障害が、小腸、大腸、胃、膀胱、肝臓及び腎臓からなる群から選択されるいずれか１以上の臓器に対する障害である、［１４］〜［１８］のいずれかの方法。
［２０］  好酸球除去剤が、好酸球細胞表面上に発現している抗原に結合する抗体若しくはその断片又は該抗原に結合するリガンドに結合する抗体若しくはその断片である、［１４］〜［１９］のいずれかの方法。
［２１］  抗体又はその断片が、ＩＬ−５受容体α鎖及び／又はβ鎖、ＣＲＴＨ２、Ｓｉｇｌｅｃ８、ＣＣＲ３、ＩＬ−５、ＰＧＤ２、Ｓｉｇｌｅｃ８リガンド、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、及びＣＣＬ２８からなる群から選択されるいずれかの抗原に結合する抗体又はその断片、好ましくはＩＬ−５受容体α鎖又はＩＬ−５リガンドに結合する抗体又はその断片である、［２０］の方法。
［２２］  抗体又はその断片が、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）及び／又は中和活性を有する抗体又はその断片である、［２０］又は［２１］の方法。
［２３］  抗体又はその断片が、モノクローナル抗体又は遺伝子組換え抗体あるいはそれらの断片である、［２０］〜［２２］のいずれかの方法。
［２４］  抗体又はその断片が、ヒトＦｃ領域又はヒト定常領域を含む抗体又はその断片である、［２０］〜［２３］のいずれかの方法。
［２５］  抗体又はその断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択されるいずれかの抗体又はその断片である、［２０］〜［２４］のいずれかの方法。【００１８】
［２６］  好酸球除去剤を有効成分として含有する治療剤又は予防剤を投与する手順を含む、放射線被曝に伴う放射線障害の治療又は予防方法。
［２７］  放射線が、Ｘ線又はγ線である、［２６］の治療又は予防方法。
［２８］  放射線被曝が、放射線治療に伴う放射線被曝である、［２６］又は［２７］の治療又は予防方法。
［２９］  放射線治療が、小腸がん、大腸がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管カルチノイド、胃がん、食道がん、肝臓がん、胆のう・胆道がん、膵がん、膵・消化管神経内分泌腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、腎細胞がん、腎盂・尿管がん、副腎腫瘍、骨肉腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、膀胱がん、尿道がん、前立腺がん、精巣腫瘍、陰茎がん、子宮体がん、子宮頸がん、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、女性器がん、肺がん、胸腺腫瘍、中皮腫、乳がん、造血器腫瘍、白血病、骨髄増殖性疾患および多発性骨髄腫からなる群から選ばれるいずれかのがんに対する放射線治療である［２８］の治療又は予防方法。
［３０］  放射線障害が、早発性放射線障害又は晩発性放射線障害である、［２６］〜［２９］のいずれかの治療又は予防方法。
［３１］  放射線障害が、小腸、大腸、胃、膀胱、肝臓及び腎臓からなる群から選択されるいずれか１以上の臓器に対する障害である、［２６］〜［３０］のいずれかの治療又は予防方法。
［３２］  好酸球除去剤が、好酸球細胞表面上に発現している抗原に結合する抗体若しくはその断片又は該抗原に結合するリガンドに結合する抗体若しくはその断片である、［２６］〜［３１］のいずれかの治療又は予防方法。
［３３］  抗体又はその断片が、ＩＬ−５受容体α鎖及び／又はβ鎖、ＣＲＴＨ２、Ｓｉｇｌｅｃ８、ＣＣＲ３、ＩＬ−５、ＰＧＤ２、Ｓｉｇｌｅｃ８リガンド、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、及びＣＣＬ２８からなる群から選択されるいずれかの抗原に結合する抗体又はその断片、好ましくはＩＬ−５受容体α鎖又はＩＬ−５リガンドに結合する抗体又はその断片である、［３２］の治療又は予防方法。
［３４］  抗体又はその断片が、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）及び／又は中和活性を有する抗体又はその断片である、［３２］又は［３３］の治療又は予防方法。
［３５］  抗体又はその断片が、モノクローナル抗体又は遺伝子組換え抗体あるいはそれらの断片である、［３２］〜［３４］のいずれかの治療又は予防方法。
［３６］  抗体又はその断片が、ヒトＦｃ領域又はヒト定常領域を含む抗体又はその断片である、［３２］〜［３５］のいずれかの治療又は予防方法。
［３７］  抗体又はその断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択されるいずれかの抗体又はその断片である、［３２］〜［３６］のいずれかの治療又は予防方法。【００１９】
［３８］  好酸球除去剤を使用することを特徴とする、放射線治療方法。
［３９］  放射線被曝による放射線障害を低下させた、［３８］の放射線治療方法。
［４０］  放射線が、Ｘ線又はγ線である、［３８］又は［３９］の放射線治療方法。
［４１］  放射線被曝が、放射線治療に伴う放射線被曝である、［３９］又は［４０］のの放射線治療方法。
［４２］  好酸球除去剤を投与しないときに比べて５％以上高い１回線量および／または合計線量の放射線の照射を含む、［３８］〜［４１］のいずれかの放射線治療方法。
［４３］  耐容線量より５％以上高い線量の放射線の照射を含む、［３８］〜［４２］のいずれかの放射線治療方法。
［４４］  好酸球除去剤を投与しないときに比べ多い回数の放射線照射を含む、［３８］〜［４３］のいずれかの放射線治療方法
［４５］  放射線治療が、小腸がん、大腸がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管カルチノイド、胃がん、食道がん、肝臓がん、胆のう・胆道がん、膵がん、膵・消化管神経内分泌腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、腎細胞がん、腎盂・尿管がん、副腎腫瘍、骨肉腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、膀胱がん、尿道がん、前立腺がん、精巣腫瘍、陰茎がん、子宮体がん、子宮頸がん、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、女性器がん、肺がん、胸腺腫瘍、中皮腫、乳がん、造血器腫瘍、白血病、骨髄増殖性疾患および多発性骨髄腫からなる群から選ばれるいずれかのがんに対する放射線治療である［３８］〜［４４］のいずれかの放射線治療方法。
［４６］  放射線障害が、早発性放射線障害又は晩発性放射線障害である、［３９］〜［４５］のいずれかの放射線治療方法。
［４７］  放射線障害が、小腸、大腸、胃、膀胱、肝臓及び腎臓からなる群から選択されるいずれか１以上の臓器に対する障害である、［３９］〜［４６］のいずれかの放射線治療方法。
［４８］  好酸球除去剤が、好酸球細胞表面上に発現している抗原に結合する抗体若しくはその断片又は該抗原に結合するリガンドに結合する抗体若しくはその断片である、［３８］〜［４７］のいずれかの放射線治療方法。
［４９］  抗体又はその断片が、ＩＬ−５受容体α鎖及び／又はβ鎖、ＣＲＴＨ２、Ｓｉｇｌｅｃ８、ＣＣＲ３、ＩＬ−５、ＰＧＤ２、Ｓｉｇｌｅｃ８リガンド、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、及びＣＣＬ２８からなる群から選択されるいずれかの抗原に結合する抗体又はその断片、好ましくはＩＬ−５受容体α鎖又はＩＬ−５リガンドに結合する抗体又はその断片である、［４８］の放射線治療方法。
［５０］  抗体又はその断片が、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）及び／又は中和活性を有する抗体又はその断片である、［４８］又は［４９］の放射線治療方法。
［５１］  抗体又はその断片が、モノクローナル抗体又は遺伝子組換え抗体あるいはそれらの断片である、［４８］〜［５０］のいずれかの放射線治療方法。
［５２］  抗体又はその断片が、ヒトＦｃ領域又はヒト定常領域を含む抗体又はその断片である、［４８］〜［５１］のいずれかの放射線治療方法。
［５３］  抗体又はその断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択されるいずれかの抗体又はその断片である、［４８］〜［５２］のいずれかの放射線治療方法。
［５４］  好酸球除去剤の投与および放射線の照射の併用を含むがんの治療方法。
［５５］  放射線が、Ｘ線又はγ線である、［５４］のがんの治療方法。
［５６］  放射線の照射が、好酸球除去剤を投与しないときに比べて５％以上高い１回線量および／または合計線量で行われる、［５４］又は［５５］のがんの治療方法。
［５７］  放射線の照射が、耐容線量より５％以上高い線量で行われる、［５４］〜［５６］のいずれかのがんの治療方法。
［５８］  放射線の照射が、好酸球除去剤を投与しないときに比べ多い回数行われる、［５４］〜［５７］のいずれかのがんの治療方法。
［５９］  がんが、小腸がん、大腸がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管カルチノイド、胃がん、食道がん、肝臓がん、胆のう・胆道がん、膵がん、膵・消化管神経内分泌腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、腎細胞がん、腎盂・尿管がん、副腎腫瘍、骨肉腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、膀胱がん、尿道がん、前立腺がん、精巣腫瘍、陰茎がん、子宮体がん、子宮頸がん、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、女性器がん、肺がん、胸腺腫瘍、中皮腫、乳がん、造血器腫瘍、白血病、骨髄増殖性疾患および多発性骨髄腫からなる群から選ばれるいずれかのがんに対する放射線治療である、［５４］〜［５８］のいずれかのがんの治療方法。
［６０］  好酸球除去剤が、好酸球細胞表面上に発現している抗原に結合する抗体若しくはその断片又は該抗原に結合するリガンドに結合する抗体若しくはその断片である、［５４］〜［５９］のいずれかのがんの治療方法。
［６１］  抗体又はその断片が、ＩＬ−５受容体α鎖、ＩＬ−５受容体β鎖、ＣＲＴＨ２、Ｓｉｇｌｅｃ８、ＣＣＲ３、ＩＬ−５、ＰＧＤ２、Ｓｉｇｌｅｃ８リガンド、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、及びＣＣＬ２８からなる群から選択されるいずれかの抗原に結合する抗体又はその断片である、［６０］のがんの治療方法。
［６２］  抗体又はその断片が、抗体依存性細胞傷害活性及び／又は中和活性を有する抗体又はその断片である、［６０］又は［６１］のがんの治療方法。
［６３］  抗体又はその断片が、モノクローナル抗体又は遺伝子組換え抗体あるいはそれらの断片である、［６０］〜［６２］のいずれかのがんの治療方法。
［６４］  抗体又はその断片が、ヒトＦｃ領域又はヒト定常領域を含む抗体又はその断片である、［６０］〜［６３］のいずれかのがんの治療方法。
［６５］  抗体又はその断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択されるいずれかの抗体又はその断片である、［６０］〜［６４］のいずれかのがんの治療方法。
［６６］  放射線治療において、治療対象患者の放射線の耐容線量を５％以上増加させることを特徴とする、好酸球除去剤を有効成分として含有する、放射線被曝に伴う放射線障害の治療又は予防剤。【００２０】
［６７］  好酸球除去剤が、
（１）ヒトＩＬ−５Ｒαの細胞外領域１番目〜３１３番目のアミノ酸配列に存在するエピトープに結合する抗体（ここで、細胞外領域とは、ヒトＩＬ−５Ｒαのうち、膜貫通領域からＣ末端までを除く、Ｎ末端側領域をいう）、
（２）ヒトＩＬ−５Ｒαの細胞外領域の４１番目〜６１番目のアミノ酸配列に存在するエピトープに結合する抗体、
（３）ヒトＩＬ−５Ｒαの細胞外領域の５２番目〜６１番目のアミノ酸配列に存在するエピトープに結合する抗体、
（４）ヒトＩＬ−５Ｒαの細胞外領域の６１番目のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する抗体、
（５）抗ヒトＩＬ−５Ｒα抗体Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂが結合するエピトープに結合する抗体、
（６）抗ヒトＩＬ−５Ｒα抗体Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂと同じエピトープに結合する抗体、
（７）抗ヒトＩＬ−５Ｒα抗体ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＣＤＲを含む抗体、
（８）抗ヒトＩＬ−５Ｒα抗体Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂの重鎖可変領域（以下、ＶＨと略記する）及び軽鎖可変領域（以下、ＶＬと略記する）を含む抗体、
（９）抗ヒトＩＬ−５Ｒα抗体Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ、
（１０）配列番号１〜３に示すアミノ酸配列をそれぞれ含むＨ鎖ＣＤＲ１〜３及び配列番号４〜６に示すアミノ酸配列をそれぞれ含むＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体、
（１１）配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号８に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体、
（１２）配列番号９に示すアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体、
（１３）配列番号１４に示すアミノ酸配列に含まれるＨ鎖ＣＤＲ１〜３及び配列番号１７に示すアミノ酸配列に含まれるＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体、
（１４）配列番号１４に示すアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１７に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体、
（１５）抗ヒトＩＬ−５ヒト化抗体Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ１）が結合するエピトープに結合する抗体、
（１６）抗ヒトＩＬ−５ヒト化抗体Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ１）と同じエピトープに結合する抗体、
（１７）抗ヒトＩＬ−５ヒト化抗体Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ１）のＣＤＲを含む抗体、
（１８）抗ヒトＩＬ−５ヒト化抗体Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ１）のＶＨ及びＶＬを含む抗体、
（１９）抗ヒトＩＬ−５ヒト化抗体Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ１）
（２０）抗ヒトＩＬ−５抗体Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ４／κ）が結合するエピトープに結合する抗体、
（２１）抗ヒトＩＬ−５抗体Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ４／κ）と同じエピトープに結合する抗体、
（２２）抗ヒトＩＬ−５抗体Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ４／κ）のＣＤＲを含む抗体、
（２３）抗ヒトＩＬ−５抗体Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ４／κ）のＶＨ及びＶＬを含む抗体、及び
（２４）抗ヒトＩＬ−５抗体Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ４／κ）
からなる群から選ばれる１以上の抗体又はその断片である、［１］〜［１３］の治療又は予防剤、［１４］〜［２５］の方法、［２６］〜［３７］若しくは［６６］の治療又は予防方法、［３８］〜［５３］の放射線治療方法、又は［５４］〜［６５］のがんの治療方法。
［６８］  抗体又はその断片が、Ｆｃ領域の２９７番目に結合するコアフコースが低下又は欠損している、［１］〜［１３］の治療又は予防剤、［１４］〜［２５］の方法、［２６］〜［３７］若しくは［６６］の治療又は予防方法、［３８］〜［５３］の放射線治療方法、又は［５４］〜［６５］のがんの治療方法。【００２１】
［６９］  配列番号１４に示すアミノ酸配列に含まれるＨ鎖ＣＤＲ１〜３及び配列番号１７に示すアミノ酸配列に含まれるＬ鎖ＣＤＲ１〜３を含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体、又は
配列番号１４に示すアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１７に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体。
［７０］  遺伝子組換え型のラット抗体、ラット‐マウスキメラ抗体、ラット‐ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体からなる群から選択されるいずれか１である、［６９］の抗体又はその断片。
［７１］  ヒトＦｃ領域を含む、［６９］又は［７０］の抗体又はその断片。
［７２］  ［６９］〜［７１］のいずれかの抗体又はその断片をコードするＤＮＡ。
［７３］  ［７２］のＤＮＡが導入された抗体生産細胞。
［７４］  ［７３］の抗体生産細胞を培養して、該培養上清を取得して精製することを特徴とする、［６９］〜［７１］のいずれかの抗体又はその断片を製造する方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、放射線被曝に伴う放射線障害を有効に治療又は予防するための技術が提供される。本発明に係る好酸球除去剤を含む治療又は予防剤、及びそれを用いた治療又は予防方法によれば、標的組織への好酸球の遊走、浸潤、及び／又は該組織中での増殖を抑制すること、及び／又は該好酸球の活性又は機能を阻害することにより、組織の炎症反応及び線維化などの病態を抑制して、放射線障害を効果的に治療又は予防し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ｃｍ１Ｂ１２抗体のＩＬ５Ｒａ発現Ｂａ／Ｆ３細胞に対する特異的結合をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。白丸はＩＬ５Ｒａ発現Ｂａ／Ｆ３細胞に対する結合量を、黒丸はＢａ／Ｆ３細胞に対する結合量を示す。縦軸は抗体結合量（蛍光強度）を、横軸は抗体濃度を示す。
【図２】ｃｍ１Ｂ１２抗体のＩＬ５Ｒａ発現Ｂａ／Ｆ３細胞に対する細胞傷害活性を解析した結果を示す。黒丸は、ＩＬ５Ｒａ発現Ｂａ／Ｆ３細胞に対する細胞傷害活性を、白丸はＢａ／Ｆ３細胞に対する該抗体の細胞傷害活性を示す。縦軸は最大細胞傷害活性を１００％とした際の細胞傷害活性率（％）を、横軸は抗体濃度を示す。
【図３】（Ａ）は、マウスＩＬ−５により刺激したＢａ／Ｆ３細胞およびＩＬ５Ｒａ発現Ｂａ／Ｆ３細胞の細胞増殖を解析した結果を示す。縦軸は細胞増殖（吸光度ＯＤ４５０）を、横軸はマウスＩＬ−５濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。（Ｂ）は、マウスＩＬ−５とＩＬ−５Ｒの結合を介した細胞増殖に対するｃｍ１Ｂ１２抗体の中和活性を示す。縦軸は細胞増殖阻害活性（％）を、横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。
【図４Ａ】フローサイトメトリーによる血中好酸球画分のゲーティングを示す。
【図４Ｂ】ｃｍ１Ｂ１２抗体又はＴＲＦＫ−５抗体投与による血中好酸球の割合の変化を解析した結果を示す。縦軸は、図４（Ａ）で全細胞数と定義した画分における血中好酸球画分の割合（％）を示す。
【図５Ａ】フローサイトメトリーによる小腸好酸球画分のゲーティングを示す。
【図５Ｂ】ｃｍ１Ｂ１２抗体又はＴＲＦＫ−５抗体の投与による小腸好酸球の割合の変化を解析した結果を示す。縦軸は、図５（Ａ)で全細胞数と定義した画分における小腸好酸球画分の割合（％）を示す。
【図６】（Ａ）は、放射線照射１３週間後の血中好酸球の割合に対するｃｍ１Ｂ１２抗体又はＴＲＦＫ−５抗体の投与の影響を解析した結果を示す。縦軸は、図４（Ａ）で全細胞数と定義した画分中の血中好酸球画分の割合（％）を示す。（Ｂ）は、放射線照射１３週間後の小腸好酸球の割合に対するｃｍ１Ｂ１２抗体又はＴＲＦＫ−５抗体の投与の影響を解析した結果を示す。縦軸は、図５（Ａ）で全細胞数と定義した画分中の小腸好酸球画分の割合（％）を示す。
【図７Ａ】放射線照射１３週間後の小腸粘膜下層における好酸球の浸潤数に対するｃｍ１Ｂ１２抗体又はＴＲＦＫ−５抗体の投与による影響を解析した結果を示す。矢頭は好酸球を示す。
【図７Ｂ】放射線照射１３週間後の小腸粘膜下層における単位面積あたりの好酸球数に対するｃｍ１Ｂ１２抗体又はＴＲＦＫ−５抗体の投与による影響を解析した結果を示す。
【図８Ａ】放射線照射１３週間後の小腸粘膜下層の線維化に対するｃｍ１Ｂ１２抗体又はＴＲＦＫ−５抗体の投与による抑制効果を示す。
【図８Ｂ】放射線照射１３週間後の小腸粘膜下層の肥厚化に対するｃｍ１Ｂ１２抗体又はＴＲＦＫ−５抗体の投与による抑制効果を示す。縦軸は、粘膜下層の厚さ（μｍ）を示す。
【図９Ａ】放射線照射１３週間後の小腸好酸球の割合に対する８３１０３抗体の投与の影響を解析した結果を示す。縦軸は、単球と顆粒球画分を全細胞数と定義した、小腸好酸球画分の割合（％）を示す。
【図９Ｂ】放射線照射１３週間後の小腸粘膜下層における単位面積あたりの好酸球数に対する８３１０３抗体の投与による影響を解析した結果を示す。
【図９Ｃ】放射線照射１３週間後の小腸粘膜下層の肥厚化に対する８３１０３抗体の投与による抑制効果を示す。縦軸は、粘膜下層の厚さ（μｍ）を示す。
【図１０】放射線照射２０週間後の血中における好酸球数の変化、及びｃｍ１Ｂ１２抗体投与による血中好酸球の割合の変化を示す。縦軸は好酸球の割合（％）を示す。横軸は、合計線量、及び投与薬剤を示す。
【図１１】放射線照射２０週間後の腸管粘膜下層における好酸球の浸潤に対するｃｍ１Ｂ１２抗体投与による影響を解析した結果を示す。矢印は好酸球を示す。
【図１２】放射線照射２０週間後の腸管粘膜下層の肥厚化に対するｃｍ１Ｂ１２抗体投与による影響を解析した結果を示す。矢印は線維層を示す。
【図１３】放射線照射２０週間後の腸管粘膜下層における肥厚化と合計線量の相関、及びｃｍ１Ｂ１２抗体投与による影響を解析した結果を示す。縦軸は、粘膜下層の厚さ（μｍ）を示す。横軸は、合計線量、及び投与薬剤を示す。生存個体のデータは平均値で示す。安楽死個体のデータは黒丸で示す。
【図１４】放射線照射２０週間後の腸管の短縮と合計線量の相関、及びｃｍ１Ｂ１２抗体投与による影響を解析した結果を示す。縦軸（左）は、０Ｇｙ群を基準としたときの腸管短縮の長さ（ｃｍ）を示す。縦軸（右）は、０Ｇｙ群を基準としたときの腸管短縮の割合（％）を示す。横軸は、合計線量、及び投与薬剤を示す。生存個体のデータは平均値で示す。安楽死個体のデータは黒丸で示す。
【図１５】放射線照射による体重変動への影響、及びｃｍ１Ｂ１２抗体投与による影響を解析した結果を示す。縦軸は体重（ｇ）を示す。横軸は、初回放射線照射日からの日数（日）を示す。それぞれの線は０、８、１６、２４、３２若しくは４０Ｇｙの合計線量の放射線を照射したＰＢＳ投与群又は３２若しくは４０Ｇｙの合計線量の放射線を照射したｃｍ１Ｂ１２抗体投与群の平均値を示す。なお、４０Ｇｙ照射したＰＢＳ投与群またはｃｍ１Ｂ１２抗体投与群は致死個体を除いた平均値を示す。
【図１６】４０Ｇｙの合計線量の放射線を照射された群における生存曲線、及びｃｍ１Ｂ１２抗体投与による影響を解析した結果を示す。それぞれの線はＰＢＳ投与群またはｃｍ１Ｂ１２抗体投与群の生存曲線を示す。縦軸は生存個体数を示す。横軸は、初回放射線照射日からの日数（日）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２５】
本発明は、好酸球除去剤を含有する、放射線被曝に伴う放射線障害に対する治療又は予防剤、並びに該治療又は予防剤を用いた、放射線被曝に伴う放射線障害の治療又は予防方法に関する。
【００２６】
また、本発明には、好酸球除去剤を用いて放射線被曝に伴う放射線障害を抑制する方法、好酸球除去剤を用いることで放射線治療における治療対象患者の放射線耐容線量を増加させる方法、及び好酸球除去剤を用いることで放射線治療における治療対象患者の放射線治療期間を延長させる方法も含まれる。
【００２７】
本発明において、「放射線」とは、全ての電磁波および粒子線をいう。具体的には、放射性物質から放出されるα線、β線、γ線や、人工的に作り出したＸ線、陽子線、炭素線、中性子線、電子線等が挙げられる。
【００２８】
本発明において、「放射線被曝」とは、全身もしくは身体の一部が放射線に曝されることをいい、放射性物質を体内に取りこむことにより身体の内部から放射線にさらされる内部被曝、及び、身体の外部から放射線にさらされる外部被曝が含まれる。具体的には、放射線治療や放射線を用いた画像診断に伴う医療被曝、放射性物質や放射線発生装置の取扱いに伴う職業被曝、自然界に存在する放射性物質や宇宙線に由来する自然被曝、原子力発電所などの事故に伴う被曝などが挙げられるが、いずれの放射線被曝によるものも含まれる。
【００２９】
本発明において、「放射線障害」とは、全身もしくは身体の一部に放射線被曝を受けることに起因して生じる障害をいう。通常、放射線障害は、正常な細胞又は正常組織が放射線被曝を受けた際に望ましくない反応として起こる現象、即ち有害事象又は副作用である。
がん治療等の医療目的での放射線照射による局所性の放射線障害を含む放射線障害には、早発性（急性）放射線障害と晩発性（慢性）放射線障害が含まれる。
本発明において放射線障害としては、放射線被曝に起因する放射線性の病態であればよく、特に限定されない。
具体的には、放射線性上皮炎、放射線性食道炎、放射線性腎炎、放射線性神経炎、放射線性胃炎、放射線性壊死、放射線性潰瘍、放射線性火傷、放射線性肝炎、放射線性口内炎、放射線性脊髄症、放射線性線維症、放射線性腸炎、放射線性粘膜炎、放射線性肺炎、放射線性皮膚炎、放射線性膀胱炎、放射線性白内障、放射線性白血球減少症、放射線性宿酔、放射線性貧血、及び放射線性不妊症などが挙げられる。
【００３０】
本発明において、「早発性放射線障害」とは、放射線被曝直後から数カ月の間に発症する放射線障害をいう。例えば、放射線性腸炎における早発性放射線障害の例としては、限定されるものではないが、皮膚障害、口腔粘膜障害、消化管粘膜障害、脱毛、嘔吐、摂食障害、粘膜炎症、出血、下痢、便秘、及び血便などが挙げられる。
【００３１】
本発明において、「晩発性放射線障害」とは、放射線被曝後数カ月から数十年の間に発症する放射線障害をいう。例えば、放射線性腸炎における晩発性放射線障害の例としては、限定されるものではないが、腸管線維化症、消化管の潰瘍、狭窄・閉塞、瘻孔形成、出血、穿孔、潰瘍形成、便失禁、及び慢性下痢などが挙げられる。
【００３２】
本発明において、放射線障害が発生する臓器としては、皮膚、脳、口腔、咽頭、食道、胃、十二指腸、小腸（空腸及び回腸など）、大腸（盲腸、結腸及び直腸など）、肛門、肝臓、胆管、胆嚢、膵臓、腎臓、膀胱、腹膜、耳下腺、顎下線、耳下腺、リンパ管、リンパ節、神経系、脊髄、肺、気道、気管支、心臓、血管など、放射線性障害を受ける組織であればいずれの組織も含まれる。
【００３３】
本発明において、「放射線治療」又は「放射線療法」とは、放射線の治療線量を腫瘍に集中して照射し、腫瘍周囲の正常組織への治療線量の照射を低減させながら、がん細胞の増殖を抑制してがんを根治すること、あるいは症状を緩和することをいう。
【００３４】
本発明において、「放射線治療」もしくは「放射線療法」または「がんの治療」の対象となるがん種の例としては、限定されるものではないが、小腸がん、大腸がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管カルチノイド、胃がんおよび食道がんなどの消化管がん；肝臓がん、胆のう・胆道がん、膵がん、膵・消化管神経内分泌腫瘍およびランゲルハンス細胞組織球症、腎細胞がん、腎盂・尿管がん、副腎腫瘍などの、腸管近傍に発生するがん；膀胱がん、尿道がん、前立腺がん、精巣腫瘍、陰茎がん、子宮体がん、子宮頸がん、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、女性器がんなどの骨盤腔内がん；肺がん、胸腺腫瘍、中皮腫、乳がんなどの、胸部に発生するがん；造血器腫瘍、白血病、骨髄増殖性疾患および多発性骨髄腫などの骨髄系がん；ならびに腸管近傍に発生する骨肉腫、軟部肉腫および悪性リンパ腫などが挙げられる。
【００３５】
本発明において、放射線治療又は放射線療法には体外から放射線を照射する外部照射法と体内から放射線を照射する内部照射法が挙げられる。外部照射法に使用される放射線として短波長の電磁線（Ｘ線、γ線）、陽子線および重粒子線が挙げられる。内部照射法に使用される放射線としてはＸ線、γ線、陽子線、重粒子線、α線およびβ線などが挙げられる。本発明において、放射線治療又は放射線療法に使用される放射線は、短波長の電磁線であるγ線およびＸ線が好ましい。
【００３６】
本発明において、「耐容線量」とは、正常な組織に対して放射線照射を行った場合、組織が耐えうる放射線量をいい、臨床的には、最小耐容線量（ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｄｏｓｅ；ＴＤ５／５）及び最大耐容線量（ＴＤ５０／５）が用いられる。最小耐容線量とは、放射線照射後、５年間で組織の機能障害が５％の確率で発症する総放射線量をいう。また、最大耐容線量とは、放射線照射後、５年間で組織の機能障害が５０％の確率で発症する総放射線量をいう。なお、耐容線量は、１回当たりの放射線量あるいは放射線を照射する各組織により異なるが、各組織の最小耐容線量および最大耐容線量は、例えば、公知のガイドライン「放射線治療計画ガイドライン２０１２（日本放射線腫瘍学会）」を参照することによって定義されている（表１）。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
本発明において、「好酸球除去剤」とは、好酸球の細胞増殖、遊走、浸潤及び／又は脱顆粒などの活性化を抑制するか、好酸球のアポトーシス及び／又は細胞傷害誘導を行うことができるものであればいかなるものでもよく、好酸球の細胞表面上に発現している受容体及び接着分子などの抗原に作用するもの、及び該抗原に対するリガンドに作用するものいずれであってもよい。
【００３９】
好酸球の細胞表面上に発現する抗原としては、ＩＬ−５受容体（以下「ＩＬ−５Ｒ」とも記載する）、ＣＲＴＨ２（ＰＴＧＤＲ２；  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｄ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２，ＧＰＲ４４）、Ｓｉｇｌｅｃ８（ＳＡＦ−２）及びＣＣＲ３（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ，  ＣＣ−ｍｏｔｉｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３，  ｅｏｔａｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＤ１９３）などが挙げられる。また、該抗原に結合するリガンドとしては、ＩＬ−５リガンド（単に「ＩＬ−５」とも記載する）、ＰＧＤ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｄ２  ）、Ｓｉｇｌｅｃ８リガンド（シアル酸、６’−ｓｕｌｆｏ−ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ｘ又は該糖鎖を含むリガンド）並びにＣＣＬ１１（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ＣＣ−ｍｏｔｉｆ  ｌｉｇａｎｄ  １１、 ｅｏｔａｘｉｎ）、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、及びＣＣＬ２８などが挙げられる。
【００４０】
本発明において、好酸球除去剤として、好ましくはＩＬ−５Ｒ、ＣＲＴＨ２、Ｓｉｇｌｅｃ８及びＣＣＲ３、並びにそれらのリガンドの少なくともいずれか一つに結合して、好酸球の活性を低下させるものが挙げられる。好酸球除去剤として、より好ましくはＩＬ−５Ｒ、ＣＲＴＨ２、Ｓｉｇｌｅｃ８及びＣＣＲ３、並びにそれらのリガンドの少なくともいずれか一つに結合し、かつ好酸球の細胞増殖、遊走、浸潤及び／又は脱顆粒などの活性化の抑制活性（中和活性、又はアンタゴニスト活性ともいう）を有するか、及び／又は好酸球のアポトーシス誘導活性及び／又は細胞傷害誘導活性（細胞障害活性ともいう）を有するものが挙げられる。
【００４１】
本発明において、好酸球除去剤として、最も好ましくはＩＬ−５Ｒ、ＣＲＴＨ２、Ｓｉｇｌｅｃ８及びＣＣＲ３の少なくともいずれか一つに結合し、かつ好酸球の細胞増殖、遊走、浸潤及び／又は脱顆粒などの活性化を抑制する活性（中和活性、又はアンタゴニスト活性ともいう）を有するか、又は／及び好酸球のアポトーシス誘導活性及び／又は細胞傷害誘導活性（細胞傷害活性ともいう）を有するものが挙げられる。
【００４２】
本発明に用いられる好酸球除去剤としては、上述の特徴を有するものであれば、低分子であっても、高分子であってもいずれでもよい。好ましくは、抗体および該抗体断片が挙げられる。
【００４３】
「ＩＬ−５Ｒ」は、２種類のポリペプチド鎖、α鎖（以下「ＩＬ−５Ｒα鎖」とも記載する）とβ鎖（以下「ＩＬ−５Ｒα鎖」とも記載する）からなる。ＩＬ−５との結合はＩＬ−５Ｒα鎖によって担われており、ＩＬ−５Ｒβ鎖単独ではＩＬ−５に対する結合能を示さない。したがって、本発明で用いられる抗ＩＬ−５Ｒ抗体としては、ＩＬ−５Ｒα鎖に結合する抗体がより好ましい。
【００４４】
ＩＬ−５ＲとＩＬ−５との結合を阻害する抗体としては、ＩＬ−５Ｒに結合しかつＩＬ−５とＩＬ−５Ｒとの結合を阻害する抗体（抗ＩＬ−５Ｒ抗体）、及び、ＩＬ−５に結合しかつＩＬ−５ＲとＩＬ−５との結合を阻害する抗体（抗ＩＬ−５抗体）などが挙げられ、より好ましくは、ＩＬ−５ＲとＩＬ−５との結合を阻害した結果、ＩＬ−５Ｒのシグナルを阻害する抗体が挙げられる。抗ＩＬ−５Ｒ抗体としては、例えば、抗ヒトＩＬ−５Ｒα抗体Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂが挙げられる。また、抗ヒトＩＬ−５抗体としては、例えば、抗ヒトＩＬ−５ヒト化抗体Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ１）及び抗ヒトＩＬ−５抗体Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ４／κ）などが挙げられる。
【００４５】
ＩＬ−５Ｒ発現細胞に直接作用しＩＬ−５Ｒ依存的なシグナルを阻害する抗ＩＬ−５Ｒ抗体は、ＩＬ−５Ｒ発現細胞を抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）などのエフェクター活性によって除去できることに加え、ＩＬ−５Ｒ発現細胞の細胞増殖阻害、遊走阻害及び／又はアポトーシス誘導を引き起すことができることから、抗ＩＬ−５Ｒ抗体としてより好ましい。
【００４６】
本発明で用いられる抗ＩＬ−５Ｒ抗体は、ＩＬ−５ＲとＩＬ−５との結合に関与するＩＬ−５Ｒの「細胞外領域」をエピトープとする抗体が好ましい。そのようなエピトープとしては、ヒトＩＬ−５Ｒαの細胞外領域（ヒトＩＬ−５Ｒαのうち、膜貫通領域からＣ末端までを除く、Ｎ末端側領域）の１番目〜３１３番目のアミノ酸配列に存在するエピトープ、ヒトＩＬ−５Ｒαの細胞外領域の４１番目〜６１番目のアミノ酸配列に存在するエピトープ、ヒトＩＬ−５Ｒαの細胞外領域の５２番目〜６１番目のアミノ酸配列に存在するエピトープ、ヒトＩＬ−５Ｒαの細胞外領域の６１番目のアミノ酸残基を含むエピトープ、及び、抗ヒトＩＬ−５Ｒα抗体Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂが結合するエピトープがあげられる（Ｋｏｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０１０、１２５：１３４４−１３５３）。
本発明におけるＩＬ−５Ｒ抗体には、限定するものではないが、Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ、Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂと同じエピトープに結合する抗体、ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＣＤＲを含む抗体、Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂの重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体などが挙げられる。
【００４７】
本発明で用いられる抗ＩＬ−５Ｒ抗体あるいは抗ＩＬ−５抗体として、より具体的には配列番号１〜３に示すアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖（Ｈ鎖）ＣＤＲ１〜３及び配列番号４〜６に示すアミノ酸配列をそれぞれ含む軽鎖（Ｌ鎖）ＣＤＲ１〜３を含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体、配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号８に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体、配列番号９に示すアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体、ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＣＤＲを含む抗体、ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＶＨ及びＶＬを含む抗体、Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ１）のＣＤＲを含む抗体、Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ４／κ）のＣＤＲを含む抗体、Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ１）のＶＨ及びＶＬを含む抗体、Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ４／κ）のＶＨ及びＶＬを含む抗体、Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ、Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ１）及びＲｅｓｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ４／κ）などが挙げられる。
【００４８】
また本発明で用いられる抗ＩＬ−５Ｒ抗体として、より具体的には配列番号１４に示すアミノ酸配列に含まれる重鎖（Ｈ鎖）ＣＤＲ１〜３及び配列番号１７に示すアミノ酸配列に含まれる軽鎖（Ｌ鎖）ＣＤＲ１〜３を含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体、配列番号１４に示すアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１７に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＩＬ−５Ｒα抗体も挙げられる。
【００４９】
また、上述の抗体のＦｃ領域の２９７番目に結合するコアフコースが、低下又は欠損している抗体が好ましく、具体的には、抗ＩＬ−５Ｒヒト化抗体Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂがあげられる。
【００５０】
また本発明には、配列番号１４に示すアミノ酸配列に含まれる重鎖（Ｈ鎖）ＣＤＲ１〜３及び配列番号１７に示すアミノ酸配列に含まれる軽鎖（Ｌ鎖）ＣＤＲ１〜３を含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体、配列番号１４に示すアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１７に示すアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体が含まれる。本発明の抗体としては、モノクローナル抗体、遺伝子組換え型のラット抗体、ラット‐マウスキメラ抗体、ラット‐ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体いずれの抗体も含む。
【００５１】
「ＣＲＴＨ２」は、白血球の遊走に関与するプロスタグランジン Ｄ２（以下「ＰＧＤ２」とも記載する）の７回膜貫通型Ｇタンパク質共役型受容体であり、好酸球に強く発現する。ＣＲＴＨ２は、ＰＧＤ２との結合によりＣＲＴＨ２依存的な細胞内シグナルを伝達し、ＣＲＴＨ２を発現する細胞の遊走や、該細胞からのサイトカイン産生亢進、並びに、細胞径及び細胞表面積などの変化を伴う細胞形態変化を誘導する。
【００５２】
本発明で用いられる抗ＣＲＴＨ２抗体としては、ＣＲＴＨ２の細胞外領域をエピトープとして結合する抗体が好ましい。ヒトＣＲＴＨ２の細胞外領域としては、ヒトＣＲＴＨ２のＮ末端から１〜３３番目のアミノ酸残基を含むＮ末端側領域、９５〜１１１番目のアミノ酸残基を含むループ１領域、１６９〜２０６番目のアミノ酸残基を含むループ２領域、及び、２６４〜２８５番目のアミノ酸残基を含むループ３領域が挙げられる（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ, １９９９. １６２（３）： １２７８−８６.）。抗ＣＲＴＨ２抗体は、ＣＲＴＨ２発現細胞に直接作用し、ＣＲＴＨ２発現細胞を抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）などのエフェクター活性によって除去できることに加え、ＣＲＴＨ２依存的なシグナルを阻害した結果、ＣＲＴＨ２発現細胞の細胞増殖阻害、遊走阻害及び／又はアポトーシス誘導を引き起すことができる。例えば、ヒトＣＲＴＨ２に対する抗体として、３０１１０８（Ｒ＆Ｄ社）、ＢＭ１６（国際公開第９７／４６６７７号）、クローン１９Ａ２、８Ｂ１、３１Ａ５（国際公開第２０１４／１４４８６５号）、クローンＬｙｍ２（国際公開第２０１７／０１０５６７）が挙げられる。
【００５３】
「Ｓｉｇｌｅｃ８」は、Ｉ型膜貫通型タンパク質であり、好酸球に強く発現する。Ｓｉｇｌｅｃ８は、Ｓｉｇｌｅｃ８依存的な細胞内シグナルを伝達し、Ｓｉｇｌｅｃ８を発現する細胞のアポトーシスを誘導する。
【００５４】
本発明で用いられる抗ヒトＳｉｇｌｅｃ８抗体としては、Ｓｉｇｌｅｃ８発現細胞に直接作用し、Ｓｉｇｌｅｃ８依存的な細胞内シグナルを伝達した結果、Ｓｉｇｌｅｃ８発現細胞の細胞増殖阻害やアポトーシス誘導を引き起すと共に、Ｓｉｇｌｅｃ８発現細胞を抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）などのエフェクター活性によって除去できる抗体が好ましい。例えば、ヒトＳｉｇｌｅｃ８に結合する抗体として、８３７５３５（Ｒ＆Ｄ社）、７Ｃ９（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ. ２０１４ Ｊｕｎ １５；１９２（１２）：５４８１−９）などが挙げられる。
【００５５】
「ＣＣＲ３」は、７回膜貫通型Ｇタンパク質共役型受容体であり、好酸球に強く発現する。ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、及びＣＣＬ２８などのケモカインのＣＣＲ３への結合により好酸球の遊走が誘導される。
【００５６】
本発明で用いられるＣＣＲ３に結合する好酸球除去剤としては、例えば抗ＣＣＲ３抗体およびＣＣＲ３阻害活性を有する低分子が挙げられる。抗ＣＣＲ３抗体としては、ＣＣＲ３発現細胞に直接作用し、ケモカインの結合およびそれにより誘導される好酸球の遊走を阻害する抗ＣＣＲ３抗体が好ましい。例えば、ＣＣＲ３に結合する抗体として、８３１０３抗体（Ｒ＆Ｄ社）および６１８２８抗体（Ｒ＆Ｄ社）などが挙げられる。またＣＣＲ３阻害活性を有する低分子としては、例えば、ＡＸＰ−１２７５およびＭＴ−０８１４などが挙げられる。
【００５７】
本発明で用いられるＣＣＲ３のリガンドに結合する好酸球除去剤としては例えばＣＣＲ３のリガンドに選択的に結合する抗体が挙げられる。ＣＣＲ３のリガンドに選択的に結合する抗体としては、ＣＣＲ３のリガンドに結合し、ＣＣＲ３への結合およびそれにより誘導される好酸球の遊走を阻害する抗体が好ましい。例えば、抗エオタキシン−１抗体ＣＡＴ−２１２およびＣＡＴ２１３（Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２００６，３１９（３），１３９５−１４０４）や、抗ＣＣＬ２４抗体（ＵＳ２０１６０３６８９７９Ａ１）などが挙げられる。
【００５８】
本発明に用いられる抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、好ましくは単一のエピトープに結合するモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマから生産されるモノクローナル抗体であってもよいし、遺伝子組換え技術によって作製された遺伝子組換え抗体であってもよい。
【００５９】
本発明に用いられる抗体は、ヒトにおいて免疫原性を低下させるために、ヒトＦｃ領域を含む抗体、ヒト定常領域を含む抗体、ヒト型キメラ抗体（以下、単に「キメラ抗体」ともいう）、ヒト化抗体（「ヒト型ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ（ＣＤＲ）移植抗体」ともいう）及びヒト抗体などの遺伝子組換え抗体を用いることが好ましい。
【００６０】
キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域（以下「ＶＨ」と略記する）及び軽鎖可変領域（以下「ＶＬ」と略記する）と、ヒト抗体の重鎖定常領域（以下「ＣＨ」と略記する）及び軽鎖定常領域（以下「ＣＬ」と略記する）とからなる抗体である。可変領域についての動物の種類は、マウスやラット、ハムスター、ウサギなどのハイブリドーマを作製しうる動物であれば特に限定されない。
【００６１】
ヒト型キメラ抗体は、目的抗原に特異的に結合するヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることで作製できる。
【００６２】
ヒト型キメラ抗体のＣＨは、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと略記する）であれば特に限定されないが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましい。ヒト型キメラ抗体のＣＬは、ｈＩｇＧに属すれば特に限定されない。
【００６３】
ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植した抗体である。ヒト化抗体は、目的抗原に特異的に結合するヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲを任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのフレームワーク（以下「ＦＲ」と略記する）に移植した可変領域（以下「Ｖ領域」と略記する）をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡを有する発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることで作製できる。ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来のアミノ酸配列であれば特に限定されない。ヒト化抗体のＣＨは、ｈＩｇであれば特に限定されないが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましい。ヒト化抗体のＣＬは、ｈＩｇに属すれば特に限定されない。
【００６４】
本発明で用いられる抗体断片とは、上記各抗体の断片をいい、抗体断片の種類としては、限定されるものではないが、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＶＨＨ、ＣＤＲを含むペプチド及びＦｃを含む抗体断片などがあげられる。
【００６５】
「Ｆａｂ」は、ＩｇＧをパパイン（タンパク質分解酵素）で処理して得られる断片のうち、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明における抗体のＦａｂは、本発明の抗体をパパインで処理するか、前記抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入して発現させることで作製されうる。
【００６６】
「Ｆ（ａｂ’）２」は、ＩｇＧをペプシン（タンパク質分解酵素）で処理して得られる断片のうち、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明における抗体のＦ（ａｂ’）２は、本発明の抗体をペプシンで処理するか、Ｆａｂ’をチオエーテル結合又はジスルフィド結合で結合させることで作製されうる。
【００６７】
「Ｆａｂ’」は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明における抗体のＦａｂ’は、本発明の抗体のＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールで処理するか、前記抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることで作製されうる。
【００６８】
「ｓｃＦｖ」は、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカーを用いて連結した抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明における抗体のｓｃＦｖは、本発明の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることで作製されうる。
【００６９】
「Ｄｉａｂｏｄｙ」は、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明における抗体のｄｉａｂｏｄｙは、本発明の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｉａｂｏｄｙをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることで作製されうる。
【００７０】
「ｄｓＦｖ」は、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させた抗体断片である。本発明における抗体のｄｓＦｖは、本発明の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることで作製されうる。
【００７１】
「ＣＤＲを含むペプチド」は、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含むペプチドである。本発明における抗体のＣＤＲを含むペプチドは、本発明の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることで作製されうる。また、本発明における抗体のＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によっても作製することができる。好ましくは、本発明の抗体由来の６個のＣＤＲを含むペプチドがあげられる。
【００７２】
「Ｆｃを含む抗体断片」としては、上述の抗体断片又は該部分断片の適当な部分にＦｃを融合させたものが挙げられる。例えば、ｓｃＦｖ−Ｆｃ，（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃなどが挙げられる。
【００７３】
本発明の治療又は予防剤に用いられる抗体は、エフェクター活性を有することが好ましい。「エフェクター活性」とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる活性であって、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）や、マクロファージや樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＡＤＰ活性）などが知られている。
【００７４】
エフェクター活性を制御する方法としては、抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１）２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ結合複合型糖鎖の還元末端に結合するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα１−６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）又は、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。
【００７５】
抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖のコアフコースの含量を制御することで、抗体のエフェクター活性を増加又は低下させることができる。抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法としては、α１，６−フコース転移酵素遺伝子（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−８，ＦＵＴ８）が欠損したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現させることで、フコースが結合していない抗体を取得する方法があげられる。フコースが結合していない抗体は高いＡＤＣＣ活性を有する。
【００７６】
一方、抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法としては、α１，６−フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させることで、フコースが結合している抗体を取得できる。フコースが結合している抗体は、フコースが結合していない抗体よりも低いＡＤＣＣ活性を有する。
【００７７】
また、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性若しくはＣＤＣ活性を増加又は低下させることができる。Ｆｃ領域のアミノ酸残基改変を行うことで、ＦｃγＲへの結合活性を増加させる又は低下させることによりＡＤＣＣ活性を制御することができるし、Ｆｃ領域のアミノ酸残基改変を行うことで、補体の結合活性を増加させるあるいは低下させることによりＣＤＣ活性を制御することができる。
【００７８】
例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。また、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２９７，７７５号明細書、米国特許第７，３１７，０９１号明細書及び国際公開第２００５／０７０９６３号に記載のアミノ酸残基改変を行うことで、ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を、増加させることも低下させることもできる。
【００７９】
本発明で用いられる抗体は、上述した改変により、高いＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性、特に高いＡＤＣＣ活性を有することが好ましい。
【００８０】
また、本発明で用いられる抗体は、上述の抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド複合型糖鎖にフコースが結合していない割合が８０％以上、９０％以上、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％以上である抗体、より好ましくは当該糖鎖にフコースが結合していない抗体であることが好ましい。これにより、高いＡＤＣＣ活性が期待できる。
【００８１】
本発明で用いられる抗ＩＬ−５Ｒ抗体及び該抗体断片は、ＷＯ１９９７／１０３５４及びＷＯ２００５／３５５８３を参考にして製造することができる。
【００８２】
本発明の治療又は予防剤は、好酸球除去剤とその他の治療薬又は治療方法を併用するものであってもよい。例えば、ステイロイド剤、抗酸化剤、抗炎症薬、ラジカルスカベンジャー製剤、抗生物質などの薬剤を用いた薬剤療法、高気圧酸素療法、アルゴンプラズマ凝固法、外科的切除などと併用して、好酸球除去剤を用いることができる。この場合、好酸球除去剤と他の治療薬又は治療方法は同時に投与又は処置されても良いし、連続的に投与又は処置されてもよい。
【００８３】
本発明の治療又は予防剤は、上述の好酸球除去抗体を有効成分として含む医薬組成物であればいかなるものでもよいが、通常は薬学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供することが望ましい。
【００８４】
好ましくは水、あるいは食塩、グリシン、グルコース、ヒトアルブミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬学的に許容される添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム等を添加することもできる。また、凍結乾燥して貯蔵し、使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
【００８５】
本発明の治療又は予防剤の投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与、あるいは口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、髄腔内及び静脈内等の非経口投与を挙げることができるが、髄腔内投与又は静脈内投与が好ましい。
【００８６】
経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば、乳剤及びシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
【００８７】
カプセル剤、錠剤、散剤又は顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトール等の賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、又はグリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【００８８】
非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該抗体そのもの、ないしは受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。
【００８９】
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体及び用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【００９０】
本発明の治療又は予防剤の投与量又は投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【００９１】
本発明の耐容線量を増加させる方法では、好酸球除去剤を用いて好酸球の細胞増殖、遊走、浸潤及び／又は脱顆粒などの活性化を抑制するか、好酸球のアポトーシス及び／又は細胞傷害誘導を行うことで、放射線障害を抑えた状態で放射線治療を行うことができることから、最小耐容線量または最大耐容線量を増加させることができる。
【００９２】
同様に本発明の耐容線量よりも高い放射線量を用いた放射線治療とは、好酸球除去剤を用いない場合の最小耐容線量または最大耐容線量よりも高い放射線量を用いた放射線治療をいう。
【００９３】
本発明の予防方法又は予防剤を用いることにより、通常の最小耐容線量よりも高い放射線量、好ましくは１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上または７０％以上高い線量を用いた放射線治療においても、放射線照射後、５年間での組織の機能障害が５％の確率の発症に抑えることができる。また、本発明の予防方法又は予防剤を用いることにより、通常の最大耐容線量よりも高い放射線量を用いた放射線治療においても、放射線照射後、５年間での組織の機能障害が５０％の確率の発症に抑えることができる。
【００９４】
また、放射線治療において耐容線量を増加させることで、正常組織への影響を極力低くする一方、病変部位の治療への治療効果が継続かつ効率的に行うことができる。
【００９５】
本発明は、放射線治療において、放射線治療の期間を延長させる方法または放射線照射の回数を増やす方法も含む。本発明において、好酸球除去剤を用いて、好酸球の細胞増殖、遊走、浸潤及び／又は脱顆粒などの活性化を抑制するか、好酸球のアポトーシス及び／又は細胞傷害誘導を行うことで、放射線治療に伴い発生し得る放射線障害を遅らせることにより、放射線障害による放射線治療の停止、放射線治療の延期を避けることができる。これにより放射線被曝に伴う放射線障害を抑制、低下させた状態で患者の放射線治療を継続して行うことができる。
【００９６】
本発明は、好酸球除去剤を用いた放射線被曝に伴う放射線障害の治療又は予防方法も含む。本発明の治療又は予防方法は、好酸球除去剤を投与することを特徴としており、好酸球除去剤により好酸球の細胞増殖、遊走、浸潤及び／又は脱顆粒などの活性化を抑制するか、好酸球のアポトーシス及び／又は細胞傷害誘導を行うことで、放射線障害が発生している器官、組織における炎症反応、線維化反応を抑制することで、放射線被曝に伴う放射線障害を治療又は予防することができる。
【００９７】
本発明は、好酸球除去剤の投与および放射線の照射の併用を含むがんの治療方法も含む。本発明において好酸球除去剤を用いて、好酸球の細胞増殖、遊走、浸潤及び／又は脱顆粒などの活性化を抑制するか、好酸球のアポトーシス及び／又は細胞傷害誘導を行うことで、放射線障害を抑制し、また高い線量の放射線照射を可能とする。これにより安全で効果が高いがんの治療を行うことができる。
【００９８】
放射線被曝に伴う放射線障害の治療又は予防方法に用いられる好酸球除去剤としては、上述に記載の好酸球除去剤を用いることができ、用法及び用量のいずれも参照することができる。
【００９９】
本発明の治療又は予防剤、及び治療又は予防方法において、好酸球除去剤の使用と放射線治療とを同時に行う場合であっても、双方の治療が前後してする場合、交互に継続して行う場合いずれでもよい。
【０１００】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１０１】
［実施例１：抗マウスＩＬ−５受容体発現細胞の作製］
（１）マウスＩＬ−５Ｒα遺伝子発現ｐＥＦ６ベクターの構築
マウスＩＬ−５ＲαのｃＤＮＡ（配列番号１１）を全合成した。マウスＩＬ−５ＲαのｃＤＮＡをベクターｐＥＦ６／ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｃ（インビトロジェン社）に挿入し、マウスＩＬ−５Ｒα遺伝子発現ｐＥＦ６ベクターを構築した。【０１０２】
（２）マウスＩＬ−５Ｒα一過性発現Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞の作製
マウスＩＬ−５Ｒα発現ｐＥＦ６ベクターをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に、添付の説明書に従い、トランスフェクションした。その後、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ培地を用いて、３日間培養した。【０１０３】
（３）マウスＩＬ−５Ｒα安定発現Ｂａ／Ｆ３細胞の作製
Ｂａ／Ｆ３細胞に対して、マウスＩＬ−５Ｒα発現ｐＥＦ６ベクターをＣｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖ（Ｌｏｎｚａ社）を使用して、添付の説明書に従い、トランスフェクションした。
１０％ＦＢＳおよびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）・ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）混合液（ナカライテスク社）、０．５ｎｇ／ｍＬのマウスＩＬ−５（ＳｉｇｍａーＡｄｒｉｃｈ社）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（以下、「ＩＬ−５Ｒα／ＢａＦ３培地」とも記載する）に３０μｇ／ｍＬのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）で３週間継代を繰り返し、薬剤選抜を行った。細胞膜上のマウスＩＬ−５Ｒαの発現はＡＰＣ ａｎｔｉ−ＩＬ５ＲΑ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙ社、ＲＥＡ３４３）を用いて、フローサイトメトリーにより確認した。【０１０４】
［実施例２：抗マウスＩＬ−５Ｒαに対するモノクローナル抗体の作製］
（１）ラットへの免疫
９週齢の雌性ＷＫＹ／ＮＣｒｌＣｒｌｊラット（ＷＫＹラット）（チャールスリバー社）に免疫した。２５μｇのマウスＩＬ−５Ｒα−Ｆｃを１００μＬの生理食塩液（大塚製薬工場）に懸濁し、Ｓｉｇｍａ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（シグマアルドリッチ社）１００μＬと合わせて２００μＬの懸濁液を調製した。初回免疫では、ＷＫＹラットの尾根部に左右２ヶ所に、１ヶ所あたり懸濁液１００μＬを筋肉内投与した。また、初回投与２週間後に、２５μｇのマウスＩＬ−５Ｒα−Ｆｃを２００μＬの生理食塩液に懸濁し、同様の方法で投与を行った。【０１０５】
（２）ハイブリドーマの作製
（１）で２回目の免疫を行った３日後に、外科的にＷＫＹラットから腸骨リンパ節を摘出し、細胞融合に供した。まず、摘出した腸骨リンパ節をスライドガラスですりつぶし、組織をほぐした。この腸骨リンパ節組織をＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ（ＭＥＭ）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁し、セルストレーナーを通すことにより余分な組織を除いた。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより上清を除いた後、再びＭＥＭで懸濁し、腸骨リンパ節細胞とした。
細胞融合に供するマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｕ１（ＡＴＣＣ社）は、エス・クロン クローニングメディウムＣＭ−Ｂ（エーディア社）で馴化培養したものを使用した（以下、「無血清馴化Ｐ３−Ｕ１」とも記載する）。得られた腸骨リンパ節細胞数に対し、１／２細胞数の無血清馴化Ｐ３−Ｕ１を混合した。遠心分離により上清を除いた後、ＧｅｎｏｍＯＮＥ-ＣＦ（石原産業社）を使用して添付の説明書に従って細胞融合を行った。その後、細胞をＨＡＴ培地（５００ｍＬのエス・クロン クローニングメディウムＣＭ−Ｂ（エーディア社））に、１０ｍＬのＨＡＴ（ヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、チミジン（Ｔ））溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）と０．５ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン溶液（ナカライテスク社）を添加したもの）に懸濁し、９６ウェルプレートに播種し、培養した。【０１０６】
（３）ハイブリドーマスクリーニング
（２）で播種されたハイブリドーマを７日間培養した後、各ウェルの培養上清を採取し、マウスＩＬ−５Ｒαに対する反応性を解析した。陽性対照細胞及び陰性対照細胞は、それぞれマウスＩＬ−５Ｒα発現Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞及びＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞とした。まず、陽性対照細胞及び陰性対照細胞を１ウェルあたりそれぞれ１×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬとなるように９６ウェルプレートに播種し、５０μＬの培養上清を添加し、４℃で３０分間の反応を行った。
細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した後、０．０５％ＮａＮ３および１  ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ（ナカライテスク社）を添加した１％（ｗ/ｖ）ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）, ｐＨ７．０ ｗｉｔｈｏｕｔ ＫＣｌ（ナカライテスク社）（以下、「ＦＡＣＳバッファー１」とも記載する）で３００倍に希釈したＤｙＬｉｇｈｔ ６５０ ａｎｔｉ−Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｆｃ）（ａｂｃａｍ社）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で３０分間の反応を行った。細胞をＦＡＣＳバッファー１で洗浄した後、蛍光強度をＣｙＡｎ ＡＤＰ−ＨｙｐｅｒＣｙｔ（ベックマンコールター社）で解析した。【０１０７】
マウスＩＬ−５Ｒα一過性発現Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に特異的な反応が見られたウェルのハイブリドーマについて、クローニング培地（エス・クロン クローニングメディウムＣＭ−Ｂ（エーディア社）に、０．５ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン溶液（ナカライテスク社）、５ｍＬのＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を添加したもの）を用いて限界希釈法によるシングルセルクローニングを１回行った。最終的に、マウスＩＬ−５Ｒα安定発現細胞Ｂａ／Ｆ３に対して強いフローサイトメトリー反応性を示すハイブリドーマ（以下、「１Ｂ１２」とも記載する）を樹立した。【０１０８】
（４）ハイブリドーマ１Ｂ１２の培養上清に含まれる抗体のサブクラスの同定
ハイブリドーマ１Ｂ１２を数日間培養した培養上清をＤ−ＰＢＳで１０倍に希釈し、その希釈液を１５０μＬ用いてＲａｔ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社）を用いて添付の説明書に従いサブクラスの解析を行った。【０１０９】
その結果、１Ｂ１２の培養上清中に含まれるラット抗マウスＩＬ−５Ｒαモノクローナル抗体（以下、「１Ｂ１２抗体」とも記載する）はラットＩｇＧ１抗体であることが明らかになった。【０１１０】
（５）１Ｂ１２抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のクローニング
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、添付文書に従い、１Ｂ１２からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。ＳＭＡＲＴｅｒ ＲΑＣＥ ５／３ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、添付の説明書に従い、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。
得られたｃＤＮＡを鋳型に、ラット重鎖遺伝子およびラット軽鎖（κ鎖）遺伝子を、それぞれＰＣＲ法により増幅し、それぞれ塩基配列を解析した。Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列を配列番号１２、１５に、シグナル配列を含むＶＨ、ＶＬのアミノ酸配列を配列番号１３、１６に、及びシグナル配列を含まないＶＨ、ＶＬのアミノ酸配列を配列番号１４、１７に記載した。【０１１１】
［実施例３：ラット／マウスキメラ型１Ｂ１２抗体の作製］
（１）ラット／マウスキメラ型１Ｂ１２抗体発現ベクターの構築
抗マウスＩＬ−５Ｒαラット／マウスキメラ型１Ｂ１２抗体発現ベクターを、以下の方法により樹立した。実施例２−（５）で解析した１Ｂ１２抗体重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の遺伝子配列を、それぞれマウスＩｇＧ２ａ重鎖及びκ鎖の定常領域遺伝子配列に連結した人工合成遺伝子を作製し、ｐＣＩ ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に遺伝子導入した。大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社）に形質転換して、サブクローニングを行い、シーケンス確認を実施することで、ラット／マウスキメラ型１Ｂ１２抗体（以下、「ｃｍ１Ｂ１２抗体」とも記載する）発現ベクターを作製した。【０１１２】
（２）ｃｍ１Ｂ１２抗体の一過性発現細胞株の造成
ｃｍ１Ｂ１２抗体の一過性発現株を作製するため、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用い、添付の説明書に従って、（１）で作製された発現ベクターを宿主細胞に導入した。宿主細胞には、ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に馴化した株を使用した。ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞で生産された抗体は、α１，６−フコースを有さない糖鎖がＦｃ領域に結合した抗体であって、糖鎖にフコースを有する抗体よりも高いＡＤＣＣ活性を有する。
１ｍｇのｃｍ１Ｂ１２抗体発現ベクターを１６ｍＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、また、１０００μＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ＭＡＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１５ｍＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭにそれぞれ溶解し、室温で５分間放置した。上記二液を混合し、室温で１５分間放置した。該混合溶液を８００ ｍＬの宿主細胞培養液（１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に全量添加し、ｃｍ１Ｂ１２抗体の一過性発現細胞株を得た。【０１１３】
（３）ｃｍ１Ｂ１２抗体の精製
（２）で得られたｃｍ１Ｂ１２抗体の一過性発現細胞株を、８ｍＭのＬ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したＦｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ＣＨＯ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁し、三角フラスコで７日間培養した後、培養上清を回収した。回収した培養上清を遠心分離し、０．２２μｍフィルターを用いてろ過することでｃｍ１Ｂ１２抗体を含む培養上清を調製した。
調製した培養上清からＡｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ ＥｘＴＲα（ＰｒｏｔｅＮｏｖａ社）を用いて、ｃｍ１Ｂ１２抗体を精製した。まず、培養上清をカラムにロードし、Ｄ−ＰＢＳでカラムを洗浄した後、ｐＨ３．０の溶出バッファー（０．１Ｍクエン酸一水和物−ＮａＯＨ／ｐＨ３．０）で順に溶出した。溶出したフラクションは速やかに中和バッファー（２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ８．５）で中和した。
それぞれのフラクションの２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）を測定し、測定値の高い連続フラクションを抗体画分として回収した。ＮＡＰ−２５  ｃｏｌｕｍｎｓ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）用いて、添付文書に従い、溶媒をＤ−ＰＢＳに置換した。０．２２μｍのフィルターを通したものを精製タンパク質とした。２８０ｎｍの吸光係数を１．６１として、濃度を算出した。【０１１４】
［実施例４：ｃｍ１Ｂ１２抗体の抗原結合活性］
（１）マウスＩＬ−５Ｒα−Ｆｃに対する結合
ｃｍ１Ｂ１２抗体のマウスＩＬ−５Ｒα−Ｆｃへの結合活性は、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００を用いて解析した。ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にＨｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉt（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、添付の説明書に従い、９０００ＲＵを目安にＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ （Ｆｃ）を固相化した。リガンドとして、ＨＢＳ−ＥＰ（＋）に１ μｇ／ｍＬとなるように溶解したマウスＩＬ−５Ｒα−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ社）を流速３０ μＬ／ｍｉｎで２０ｓｅｃキャプチャーさせた後、アナライトとして１０００．００、３３３．３３、１１１．１１、３７．０４、１２．３５、および４．１２  ｎｇ／ｍＬの濃度に段階希釈したｃｍ１Ｂ１２抗体をマルチサイクル法によって添加した。
流速は３０ μＬ／ｍｉｎ、ｃｏｎｔａｃｔ  ｔｉｍｅおよびｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅはそれぞれ、１２０ｓｅｃ、６００ｓｅｃの条件で行った。解析はＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、Ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｏｕｎｄのＢｉｖａｌｅｎｔ  Ａｎａｌｙｔｅモードにより実施した。【０１１５】
その結果、表２に示すように、ｃｍ１Ｂ１２抗体はマウスＩＬ−５Ｒα−Ｆｃに対して、強い結合活性を示した。【０１１６】
【表２】
2018139404.tif 000004
【０１１７】
（２）ＩＬ−５Ｒα発現Ｂａ／Ｆ３細胞に対する結合
Ｂａ／Ｆ３細胞およびＩＬ−５Ｒα発現Ｂａ／Ｆ３細胞を細胞密度が１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＦＡＣＳバッファー１に懸濁した。９６−ｗｅｌｌ  Ｕ−ｆｏｒｍ  ｐｌａｔｅに５ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように細胞懸濁液を１００μＬずつ播種した。ｃｍ１Ｂ１２抗体を、ＦＡＣＳバッファー１で最終濃度が０．０００３、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、および１０μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、氷上で１時間反応させた。ＦＡＣＳバッファー１で洗浄した後、ＦＡＣＳバッファー１で５μｇ／ｍＬに希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、氷上で１時間反応させた。ＦＡＣＳバッファー１で洗浄した後、フローサイトメーターＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ社）により蛍光強度（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｎ）を測定した。【０１１８】
結果を図１に示す。ｃｍ１Ｂ１２抗体はＩＬ−５Ｒα発現Ｂａ／Ｆ３細胞に、濃度依存的に特異的結合した。【０１１９】
［実施例５：ｃｍ１Ｂ１２抗体のＩＬ−５Ｒα発現細胞に対する細胞傷害活性］
エフェクター細胞をヒト凍結ｐｅｒｉｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ（ＰＢＭＣ）（ＡＬＬＣＥＬＬＳ）、ターゲット細胞をＢａ／Ｆ３細胞もしくはｍＩＬ−５Ｒα発現Ｂａ／Ｆ３細胞として、ｃｍ１Ｂ１２抗体による細胞傷害活性を下記に記載の方法により評価した。
エフェクター細胞およびターゲット細胞を５％Ｄｉａｌｙｚｅｄ  ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ １６４０ Ｍｅｄｉｕｍ, ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ（ナカライテスク社）を用いて洗浄し、それぞれ細胞密度が、２×１０７  ｃｅｌｌｓ／ｍＬおよび５×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整した。９６−ｗｅｌｌ  Ｕ−ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅに最終濃度が０．０００１，０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００及び１０００ｎｇ／ｍＬになるように調整したｃｍ１Ｂ１２抗体、ターゲット細胞、及びエフェクター細胞の順にそれぞれ５０μＬずつ添加し、３７℃で４時間反応させた。
上清を９６−ｗｅｌｌ Ｆｌａｔ−ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅ（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ）に５０μＬ回収し、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、添付の説明書に従い、上清中のＬａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）活性を検出した。吸光度はプレートリーダーＳＰＥＣＴＲΑ  ＭＡＸ  ３４０  ＰＣ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により４９０ｎｍの吸光度を測定した。細胞傷害活性はバックグランド補正した測定値を用いて、以下の式により算出した。
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（％）＝［［サンプルの吸光度］−［ターゲット細胞の自然遊離の吸光度］−［エフェクター細胞の自然遊離の吸光度］］／［［ターゲット細胞全遊離の吸光度］−［ターゲット細胞自然遊離の吸光度］【０１２０】
結果を図２に示す。ｃｍ１Ｂ１２抗体は、ＩＬ−５Ｒα発現細胞に対して濃度依存的に細胞傷害活性を示した。【０１２１】
［実施例６：ｃｍ１Ｂ１２抗体のＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒシグナルに対するアンタゴニスト活性］
（１）ＩＬ−５依存的なＩＬ−５Ｒα発現Ｂａ／Ｆ３の細胞増殖評価
Ｂａ／Ｆ３細胞およびＩＬ−５Ｒα発現Ｂａ／Ｆ３細胞を１０％ＦＢＳおよびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）・ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）混合液（ナカライテスク社）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した後、細胞密度が１×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整した。９６−ｗｅｌｌ  Ｆｌａｔ−ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅにＢａ／Ｆ３細胞およびＩＬ−５Ｒα発現Ｂａ／Ｆ３細胞をそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌずつ播種し、最終濃度が０．００１、０．０１、０．１、１および１０ｎｇ／ｍＬになるように上記培地で調整したマウスＩＬ−５（ＳｉｇｍａーＡｄｒｉｃｈ社）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で７２時間反応させた。
その後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて、添付の説明書に従い、生細胞数を計測した。吸光度はプレートリーダーＳＰＥＣＴＲΑ  ＭＡＸ  ３４０  ＰＣ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０１２２】
結果を図３（Ａ）に示す。ＩＬ−５Ｒα発現Ｂａ／Ｆ３細胞はＩＬ−５濃度依存的に増殖した。【０１２３】
（２）ｃｍ１Ｂ１２抗体のＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒシグナルに対するアンタゴニスト活性
（１）と同様の培養条件において、最終濃度０．１ｎｇ／ｍＬマウスＩＬ−５（ＳｉｇｍａーＡｄｒｉｃｈ社）存在下、ｃｍ１Ｂ１２抗体を最終濃度が０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３および１０μｇ／ｍＬになるように添加して、ＩＬ−５Ｒα発現Ｂａ／Ｆ３細胞の生細胞数を計測した。陰性対照として、ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用した。
細胞増殖阻害活性はバックグランド補正した測定値を用いて、以下の式により算出した。阻害活性（％）＝１００×［１−［［サンプルの吸光度］−［ＩＬ−５非添加群の吸光度平均値］］／［［抗体非添加群の吸光度平均値］−［ＩＬ−５非添加群の吸光度平均値］］］【０１２４】
結果を図３（Ｂ）に示す。ｃｍ１Ｂ１２抗体は抗体濃度依存的に細胞増殖を阻害した。ｃｍ１Ｂ１２抗体は、ＩＬ−５依存的な細胞増殖を阻害するＩＬ−５Ｒアンタゴニスト抗体であることが明らかになった。【０１２５】
［実施例７：ｃｍ１Ｂ１２抗体の好酸球除去活性］
in vivoにおけるｃｍ１Ｂ１２抗体の好酸球の除去効果を検証するために、８−１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）にＤ−ＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬに希釈したｃｍ１Ｂ１２抗体、又は抗ＩＬ−５リガンドラットモノクローナル抗体ＴＲＦＫ−５（R&D systems社）を２５ｍｇ／ｋｇになるように腹腔内投与し、投与１週間後、２週間後、及び４週間後に血液を、投与４週間後に小腸を採取し、解析を行った。コントロール群では、Ｄ−ＰＢＳを投与した。【０１２６】
（１）血中好酸球の除去活性
（ｉ）細胞の調製
マウスから約１ｍＬの血液を採取し、ＥＤＴＡ−２Ｎａ粉末と混和した後、ＢＤ ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（ＢＤ社）を用いて、以下の方法で溶血処理を行った。マウス血液全量を５ｍＬの１ｘＬｙｓｉｓバッファーに添加し、転倒混和した後、常温で３分間反応させた。４℃で５分間、２０００ｒｐｍにて遠心して上清を除去し、細胞を１ｍＬの１×Ｌｙｓｉｓバッファーに再度懸濁し、常温で３分間反応させた。
４℃で３分間、５０００ｒｐｍにて遠心し、上清を除去した後、細胞を１ｍＬの１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社）、１０  ｍＭのＥＤＴＡ（ナカライテスク社）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）、１ｍＭのＳｏｄｉｕｍ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社）、１０μｇ／ｍＬの硫酸ポリミキシンＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｄｒｉｃｈ社）、およびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）・ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）混合液（ナカライテスク社）を添加したＤ−ＰＢＳ（以下、「ＦＡＣＳバッファー２」とも記載する）に懸濁し、洗浄した。【０１２７】
（ｉｉ）測定
（ｉ）で調製した血球細胞を、細胞密度が１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＦＡＣＳバッファー２で懸濁し、１．５ｍＬマイクロチューブに１００μＬ／ｔｕｂｅ添加した。Ｆｃ  ｂｌｏｃｋｅｒ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２．４Ｇ２）を１  μＬ／ｔｕｂｅ添加し、氷上で１５分間反応させた。その後、ＦＩＴＣ  ａｎｔｉ−ＣＤ１１ｂ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍ１／７０）、ＰＥ  ａｎｔｉ−Ｓｉｇｌｅｃ  Ｆ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｅ５０−２４４０）、ＰＥ−Ｃｙ７  ａｎｔｉ−ＣＤ１１ｃ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＨＬ３）、およびＡＰＣ  ａｎｔｉ−ＧＲ１（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＲＢ６−８Ｃ５）をそれぞれ１μＬ／ｔｕｂｅずつ添加し、氷上で２０分間反応させた。ＦＡＣＳバッファー２で洗浄した後、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ社）により測定した。
解析は図４（Ａ）に示すように、ＦＳＣ、ＳＳＣで展開し、単球と顆粒球画分を全細胞数として、顆粒球画分のうちＣＤ１１ｃ−／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１ｉｎｔ／Ｓｉｇｌｅｃ  Ｆ＋画分を好酸球画分とし、好酸球画分の割合（％）を算出した。図４（Ａ）には、各抗体を投与４週間後のマウス血液の解析結果を示した。【０１２８】
結果、図４（Ｂ）に示すように、ｃｍ１Ｂ１２抗体および抗ＩＬ−５抗体ＴＲＦＫ−５投与群では、コントロール群と比べて末梢血液中における顕著な好酸球画分の減少が確認された。また、ｃｍ１Ｂ１２抗体は、ＴＲＦＫ−５抗体よりも強く好酸球を減少させた。よって、ｃｍ１Ｂ１２抗体及びＴＲＦＫ−５抗体は末梢血好酸球を減少させられる抗体であることが明らかになった。【０１２９】
（２）小腸好酸球に対する除去活性
（ｉ）小腸粘膜固有層細胞の調製
マウスを安楽死させた後に開腹し、幽門と回盲弁にて小腸を切って回収した。腸壁に付着した脂肪組織とパイエル板を除去したあと、腸を縦に切開してＤ−ＰＢＳ中で濯いで内容物を洗浄除去した。細断した小腸片をＦＡＣＳバッファー２中で攪拌しながら３７℃で２０分間インキュベートした。小腸片をＤ−ＰＢＳで洗浄した後、さらに細かく細断し、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社）０．４２５ ｍｇ／ｍＬ  ＬｉｂｅＲαｓｅ  Ｔ−ｆｌｅｘ（Ｒｏｃｈｅ）、１００μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で攪拌しながら３７℃６０分間インキュベートした。１００μｍ孔ストレーナー（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で組織残渣を除去したのち、分離した細胞を４℃で５分間、１５００ｒｐｍにて遠心分離して回収した。細胞をさらに４０％および７５％パーコール溶液を用いた密度勾配遠心法にて分離した（２０℃、２０分間、２０００ｒｐｍ）。分離した細胞をＦＡＣＳバッファー２に懸濁し、洗浄した。【０１３０】
（ｉｉ）測定
（ｉ）で調製した小腸粘膜固有層細胞を、前述（１）（ｉｉ）と同様にしてＦＡＣＳ解析を行った。
解析は図５（Ａ）に示すように、ＦＳＣ、ＳＳＣで展開し、単球と顆粒球画分を全細胞数として、顆粒球画分のうちＣＤ１１ｃｉｎｔ／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１ｉｎｔ／Ｓｉｇｌｅｃ  Ｆ＋画分を好酸球画分とし、好酸球画分の割合（％）を算出した。【０１３１】
結果、図５（Ｂ）に示すように、抗体投与後４週間後においてｃｍ１Ｂ１２抗体又は抗ＩＬ−５抗体ＴＲＦＫ−５投与群では、コントロール群比べて小腸粘膜固有層内に存在する好酸球画分を顕著に減少させた。また、ｃｍ１Ｂ１２抗体は、ＴＲＦＫ−５抗体よりも強く好酸球を減少させた。従って、ｃｍ１Ｂ１２抗体及びＴＲＦＫ−５抗体は、末梢血液中の好酸球だけでなく、小腸粘膜固有層等の組織特異的に存在している好酸球を減少させることが明らかになった。【０１３２】
［実施例８：ｃｍ１Ｂ１２抗体による放射線性腸炎（晩発性障害）の抑制効果］
（１）放射線性腸炎（晩発性障害）の誘導
マウスにソムノペンチルで全身麻酔をかけた後、腹部以外を鉛ブロックで遮蔽した状態で１２Ｇｙのガンマ線を照射した（Ｇａｍｍａｃｅｌｌ ４０ Ｅｘａｃｔｏｒ  ＭＤＳ Ｎｏｒｄｉｏｎ）。照射した後は、餌および飲料水を自由に摂取させて飼育した。【０１３３】
（２）ｃｍ１Ｂ１２抗体による病態抑制効果
放射線照射の４週間前から放射線照射の１３週間後まで、４週間毎に計５回、Ｄ−ＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬに希釈したｃｍ１Ｂ１２抗体又はＴＲＦＫ−５抗体を２５ｍｇ／ｋｇになるように腹腔内投与した。放射線照射１３週間後に、血液および組織を採取し、解析を行った。【０１３４】
（ｉ）血中好酸球の減少
実施例７（１）記載の方法と同様にして好酸球画分の割合を解析した。結果を図６（Ａ）に示す。放射線照射無しのマウスと比べて、放射線照射したマウスでは、末梢血液中の好酸球数に大きな変化は認められなかったが、放射線照射マウスにｃｍ１Ｂ１２抗体又はＴＲＦＫ−５抗体を投与した群では、放射線照射マウスにＤ−ＰＢＳを投与したコントロール群と比べて末梢血液における好酸球の顕著な減少が確認された。また、その好酸球減少効果は、ｃｍ１Ｂ１２抗体の方がＴＲＦＫ−５抗体よりも高かった。よって、ｃｍ１Ｂ１２抗体及びＴＲＦＫ−５抗体は、放射線照射個体においても末梢血中の好酸球を減少させることが明らかになった。【０１３５】
（ｉｉ）小腸好酸球の減少
実施例７（２）記載の方法と同様にして好酸球画分の割合を解析した。結果を図６（Ｂ）に示す。放射線照射無しのマウスと比べて、放射線照射したマウスでは小腸粘膜固有層に存在する好酸球数に変化は認められなかったが、末梢血液中の好酸球と同様に、放射線照射マウスにおいてｃｍ１Ｂ１２抗体及びＴＲＦＫ−５抗体を投与した群では、コントロール群と比べて小腸粘膜固有層内に存在する好酸球の顕著な減少が確認された。従って、放射線照射マウスにおいても、ｃｍ１Ｂ１２抗体及びＴＲＦＫ−５抗体は、末梢血中の好酸球同様、小腸粘膜固有層に存在する好酸球を顕著に減少させることが明らかになった。【０１３６】
（ｉｉｉ）小腸における好酸球の浸潤
小腸のうちトライツ靭帯より２ｃｍ遠位の部分を１．５ｃｍ回収し、１０％ホルマリンを含むＰＢＳに１日浸漬して固定した。固定した小腸片のパラフィンブロックを作製して、厚さ５μｍの薄切片をスライドガラスに貼り付けて乾燥した。
パラフィン切片を０．１％ （ｗ/ｖ） ｐｅｐｓｉｎ （ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含む０．０１ Ｎ ＨＣｌで２０分、室温にて処理した後、抗マウスＭＢＰ（Ｍａｊｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）ラットモノクローナル抗体 （メイヨークリニックのＪａｍｅｓ Ｊ. Ｌｅｅ博士及びＮａｎｃｙ Ａ. Ｌｅｅ博士より分与）を用いて、４℃で一晩反応させた。
切片を洗浄した後、ビオチン標識抗ラットＩｇＧヤギ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で１時間、３７℃にて反応させた。再度洗浄したのち、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間室温にて反応させた。標識した細胞はジアミノベンジジンを基質として発色させた。ＭＢＰ陽性の細胞を好酸球と見なし、小腸粘膜下層において一定面積あたりに浸潤している好酸球数をＢＺ−ＩＩ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて測定した。【０１３７】
図７（Ａ）および（Ｂ）に示すように、放射線照射無しのマウスに比べて、放射線照射マウスでは小腸粘膜下層にＭＢＰ陽性の好酸球が多数浸潤していた。放射線性腸炎では、好酸球が小腸粘膜下層に特異的に浸潤していることが確認された。
一方、放射線照射マウスにおいて、ｃｍ１Ｂ１２抗体及びＴＲＦＫ−５抗体は、コントロールと比べて、小腸粘膜下層におけるＭＢＰ陽性の好酸球の浸潤を阻害した。また、小腸粘膜下層への好酸球の阻害効果は、ＴＲＦＫ−５抗体よりもｃｍ１Ｂ１２α抗体の方が強く、コントロールと比べてほぼ完全に好酸球の遊走、浸潤を阻害した。
従って、ｃｍ１Ｂ１２抗体及びＴＲＦＫ−５抗体は、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒの中和作用やＩＬ−５Ｒを標的としたＡＤＣＣ活性によって好酸球を阻害した結果、小腸粘膜固有層に限局する好酸球を減少させるだけでなく、小腸粘膜下層への遊走及び浸潤をも阻害することが明らかになった。特に、抗ＩＬ−５Ｒα抗体は、抗ＩＬ−５抗体と比べて小腸粘膜固有層及び粘膜下層いずれの好酸球も強く阻害できることが明らかになった。【０１３８】
（ｉｖ）小腸粘膜下層の線維化
光学顕微鏡にてコラーゲン繊維を観察するため、（ｉｉｉ）記載の方法で作製したパラフィン切片をＡｚａｎ染色した。粘膜下層に沈着したコラーゲン層の厚さはＢＺ−ＩＩ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて測定した。【０１３９】
図８（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、放射線照射無しのマウスと比べて、放射線照射をしたマウスでは、小腸粘膜下層の肥厚が認められたが、放射線照射マウスにおいてｃｍ１Ｂ１２α抗体及びＴＲＦＫ−５抗体を投与した群では、小腸粘膜下層の肥厚が減少し、かつ小腸粘膜下層におけるコラーゲンの集積が顕著に減少しており、粘膜下層の線維化が抑制されていることが確認された。
従って、ｃｍ１Ｂ１２抗体及びＴＲＦＫ−５抗体は、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒの中和作用やＩＬ−５Ｒを標的としたＡＤＣＣ活性によって好酸球を阻害した結果、放射線性腸炎における好酸球依存的な小腸粘膜下層の線維化を阻害できることが明らかになった。【０１４０】
以上、本実施例の結果から、抗ＩＬ−５Ｒ抗体および抗ＩＬ−５抗体は、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒの中和作用やＩＬ−５Ｒを標的としたＡＤＣＣ活性によって、腸管粘膜固有層及び粘膜下層への好酸球の遊走及び浸潤並びに好酸球細胞増殖を阻害することで、腸管炎症及び腸管線維化を抑制することができるため、放射線性障害の治療に有用であることが明らかになった。【０１４１】
［実施例９：抗ＣＣＲ３中和抗体による放射線性腸炎（晩発性障害）の抑制効果］
実施例８（１）記載の方法で放射線照射したマウスに、放射線照射の２週間前から放射線照射後１２週まで、２週間毎に計８回、ラット抗マウスＣＣＲ３中和抗体８３１０３（Ｒ＆Ｄ社）を５ｍｇ／ｋｇになるように腹腔内投与した。放射線照射１３週間後に血液および組織を採取し、実施例７（２）、実施例８（２）（ｉｉｉ）および（ｉｖ）にそれぞれ記載する方法で、小腸粘膜固有層の好酸球画分の割合、小腸粘膜下層に浸潤している好酸球数および小腸粘膜下層の線維化を評価した。【０１４２】
図９（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、抗ＩＬ−５抗体または抗ＩＬ−５Ｒ抗体を投与したときと同様に、小腸粘膜固有層の好酸球の減少、小腸粘膜下層への好酸球の遊走および浸潤の阻害、ならびに小腸粘膜下層の線維化の抑制が確認された。
ＣＣＲ３は腸管粘膜固有層及び粘膜下層への好酸球の遊走に関与することが確認されている（データ示さず）。本実施例の結果から、抗ＣＣＲ３中和抗体による好酸球の遊走阻害によっても、放射線性腸炎における好酸球依存的な小腸粘膜下層の線維化を阻害できることが明らかになった。以上の結果は、好酸球除去剤として、ＡＤＣＣ活性を有する好酸球除去剤、中和活性を有する好酸球除去剤、及び両方の活性を有する好酸球除去剤のいずれを用いた好酸球除去によっても、放射線性障害治療が可能であることを示す。【０１４３】
［実施例１０：ｃｍ１ｂ１２抗体によるＸ線分割照射療法に伴う放射線性腸炎の抑制効果］
（１）放射線性腸炎（晩発性障害）の誘導
マウスに３種混合麻酔で全身麻酔をかけた後、腹部以外を鉛板で遮蔽した状態で、Ｘ線照射装置ＭＢＲ−１５２０Ｒ−４（日立パワーソリューションズ）を用いて、８Ｇｙ（８０−９０ｃＧｙ／ｍｉｎ）のＸ線を週に１回、計１〜５回反復照射した。照射した後は、餌および飲料水を自由に摂取させて飼育した。【０１４４】
（２）ｃｍ１Ｂ１２抗体による病態抑制効果
放射線照射の４週間前から初回放射線照射の２０週間後まで、２週間毎に、Ｄ−ＰＢＳ、又はＤ−ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに希釈したｃｍ１Ｂ１２抗体を５ｍＬ／ｋｇで腹腔内投与をした。放射線照射２０週間後に、血液および組織を採取し、解析を行った。【０１４５】
（ｉ）血中好酸球の減少
実施例７（１）記載の方法と同様の方法で、好酸球画分の割合を解析した。結果を図１０に示す。放射線照射マウスにｃｍ１Ｂ１２抗体を投与した群では、末梢血中の好酸球が完全に除去された。よって、ｃｍ１Ｂ１２抗体は、放射線照射個体においても末梢血中の好酸球を減少させることが明らかになった。【０１４６】
（ｉｉ）腸管における好酸球の浸潤
腸管のうちトライツ靭帯より２ｃｍ遠位の部分を２ｃｍ回収し、１０％ホルマリンを含むＰＢＳに１日浸漬して固定した。固定した小腸片のパラフィンブロックを作製して、厚さ５μｍの薄切片をスライドガラスに貼り付けて乾燥した。パラフィン切片をヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色した。
図１１に示すように、放射線照射無しのマウス（Ａ）に比べて、放射線照射マウス（Ｂ及びＤ）では粘膜下層に好酸球が多数浸潤していた。一方、放射線照射マウスにおいて、ｃｍ１Ｂ１２抗体は、コントロールと比べて、完全に腸管の粘膜下層における好酸球の浸潤を阻害した（Ｃ及びＥ）。
従って、ｃｍ１Ｂ１２抗体は、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒの中和作用やＩＬ−５Ｒを標的としたＡＤＣＣ活性によって好酸球を阻害した結果、腸管粘膜固有層に限局する好酸球を減少させるだけでなく、粘膜下層への遊走及び浸潤をも阻害することが明らかになった。【０１４７】
（ｉｉｉ）腸管の線維化
光学顕微鏡にてコラーゲン繊維を観察するため、パラフィン切片をＡｚａｎ染色した。粘膜下層の厚さ、及び沈着したコラーゲン層の厚さはＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ  Ｖｅｒ．１２（Ｌｅｉｃａ）を用いて測定した。
図１２および図１３に示すように、ＰＢＳ群では照射された合計線量に相関して、腸管粘膜下層の肥厚が確認された（Ｂ及びＤ）。一方、ｃｍ１Ｂ１２抗体投与群では、同程度の放射線を照射されたＰＢＳ群に比べて、粘膜下層の肥厚、及びコラーゲンの集積が減少しており、粘膜下層の線維化が抑制されていることが確認された（Ｃ及びＥ）。また、合計線量２４Ｇｙを照射されたＰＢＳ群の粘膜下層の肥厚の程度に比べて、合計線量３２Ｇｙまたは４０Ｇｙを照射されたｃｍ１Ｂ１２抗体投与群では、粘膜下層の肥厚が同程度以下に抑制されていることが確認された。すなわち、ｃｍ１Ｂ１２抗体の投与により、少なくとも３０％〜７０％高い合計線量の放射線治療および照射回数が少なくとも１〜２回多い放射線治療が許容されることが示唆された。
従って、ｃｍ１Ｂ１２抗体は、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒの中和作用やＩＬ−５Ｒを標的としたＡＤＣＣ活性によって好酸球を阻害した結果、放射線性腸炎における好酸球依存的な腸管の炎症、及び線維化を阻害できること、及び放射線に対する腸管の耐容線量を増加させられることが明らかになった。即ち、好酸球除去剤を併用することで放射線障害を抑制するともに、高い線量で放射線治療を実施できることが明らかになった。【０１４８】
（ｉｖ）腸管障害
腹部放射線障害に伴う腸管への炎症・線維化などを含む総合的な影響を評価するために、胃幽門部から盲腸上部までの長さを測定した。
図１４に示すように、ＰＢＳ群では照射された合計線量に相関して、腸管の長さが短縮することが確認された。一方、ｃｍ１Ｂ１２抗体投与群では、同程度の放射線を照射されたＰＢＳ群に比べて腸管の短縮が抑制されることが確認された。また、合計線量２４Ｇｙを照射されたＰＢＳ群の腸管短縮の程度に比べて、合計線量３２Ｇｙまたは４０Ｇｙを照射されたｃｍ１Ｂ１２抗体投与群では、腸管短縮が同程度以下に抑制されていることが確認された。すなわち、ｃｍ１Ｂ１２抗体の投与により、少なくとも３０％〜７０％高い合計線量の放射線治療および少なくとも照射回数が少なくとも１〜２回多い放射線治療が許容されることが示唆された。
従って、ｃｍ１Ｂ１２抗体は、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒの中和作用やＩＬ−５Ｒを標的としたＡＤＣＣ活性によって好酸球を阻害した結果、放射線性腸炎における、腸管障害を低減できること、及び放射線に対する腸管の耐容線量を増加させられることが明らかになった。【０１４９】
（ｖ）病態発症に伴う体重減少
腹部放射線障害に伴う摂食・栄養吸収障害を中心とした全身性の影響を評価するために、体重変動を経時的に評価した。
図１５に示すように、病態惹起時には、照射回数依存的に体重減少したが、病態惹起が完了するとすべての個体で放射線照射前と同等の体重まですみやかに回復し、一定期間、放射線非照射群と同様に体重が増加し続けた。一方、長期的に飼育を継続すると、合計線量１６Ｇｙ以上照射した群では、非照射群に比べ、明らかに体重増加が障害され、合計線量２４Ｇｙ以上照射された群では、経過ともに体重減少が確認された。合計線量２４Ｇｙ、及び３２Ｇｙ照射されたＰＢＳ群、並びに合計線量３２Ｇｙ、及び４０Ｇｙ照射されたｃｍ１Ｂ１２抗体投与群の４群の間では、明らかな差は確認できなかった。一方、４０Ｇｙ照射されたＰＢＳ群では、他群に比べて著しい体重減少を示した。
従って、ｃｍ１Ｂ１２抗体は、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒの中和作用やＩＬ−５Ｒを標的としたＡＤＣＣ活性によって好酸球を阻害した結果、放射線障害に伴う、摂食・栄養吸収障害を中心とした障害を低減できうること、及び放射線に対する耐容線量を増加させられることが明らかになった。【０１５０】
（ｖｉ）生存曲線
腹部放射線障害に伴う全身性の影響を評価するために、生存率を評価した。生存曲線は、病態悪化に伴う自然死個体、及び安楽死個体の数を経時的に計測することで、算出した。また、安楽死は、病態惹起時を除き、動物愛護の観点から、生命維持の危機にさらされた個体、具体的には初期体重から１５％以上減少した個体に対して実施した。
図１６に示すように、合計線量４０Ｇｙ照射されたＰＢＳ投与群では、時間経過とともに生存率が顕著に低下したが、合計線量４０Ｇｙ照射されたｃｍ１Ｂ１２抗体投与群では、顕著に生存率が改善した。
従って、ｃｍ１Ｂ１２抗体は、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒの中和作用やＩＬ−５Ｒを標的としたＡＤＣＣ活性によって好酸球を阻害した結果、腹部放射線障害に伴う、生命予後にかかわる重篤な放射線障害を低減できることが明らかになった。【０１５１】
以上、本実施例の結果から、抗ＩＬ−５Ｒ抗体および抗ＩＬ−５抗体は、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒの中和作用やＩＬ−５Ｒを標的としたＡＤＣＣ活性によって、腸管粘膜固有層及び粘膜下層への好酸球の遊走及び浸潤、及び好酸球細胞増殖を阻害することで、長期生存率の改善、及び進行性の体重減少を伴う病態の軽減、並びに腸管短縮、腸管炎症及び腸管線維化などの腸管障害を抑制することができるため、放射線性障害の治療に有用であることが明らかになった。
【配列表フリーテキスト】
【０１５２】
配列番号１：ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２：ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３：ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４：ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５：ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６：ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７：ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＶＨのアミノ酸配列
配列番号８：ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＶＬのアミノ酸配列
配列番号９：ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＨ鎖のアミノ酸配列
配列番号１０：ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＬ鎖のアミノ酸配列
配列番号１１：マウスＩＬ−５Ｒα  ｃＤＮＡの塩基配列
配列番号１２：１Ｂ１２抗体  Ｈ鎖可変領域の塩基配列
配列番号１３：１Ｂ１２抗体  Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列（シグナル配列含む）
配列番号１４：１Ｂ１２抗体  Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
配列番号１５：１Ｂ１２抗体  Ｌ鎖可変領域の塩基配列
配列番号１６：１Ｂ１２抗体  Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列（シグナル配列含む）
配列番号１７：１Ｂ１２抗体  Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列（シグナル配列除く）
【図１】
2018139404.tif 000005
【図２】
2018139404.tif 000006
【図３】
2018139404.tif 000007
【図４Ａ】
2018139404.tif 000008
【図４Ｂ】
2018139404.tif 000009
【図５Ａ】
2018139404.tif 000010
【図５Ｂ】
2018139404.tif 000011
【図６】
2018139404.tif 000012
【図７Ａ】
2018139404.tif 000013
【図７Ｂ】
2018139404.tif 000014
【図８Ａ】
2018139404.tif 000015
【図８Ｂ】
2018139404.tif 000016
【図９Ａ】
2018139404.tif 000017
【図９Ｂ】
2018139404.tif 000018
【図９Ｃ】
2018139404.tif 000019
【図１０】
2018139404.tif 000020
【図１１】
2018139404.tif 000021
【図１２】
2018139404.tif 000022
【図１３】
2018139404.tif 000023
【図１４】
2018139404.tif 000024
【図１５】
2018139404.tif 000025
【図１６】
2018139404.tif 000026
【配列表】
2018139404000001.app
【国際調査報告】
2018139404.tif 000027
2018139404.tif 000028
2018139404.tif 000029
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