(57)【要約】  再生医療において、多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を用いた新たな医療用途を提供することを目的とする。本発明は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞を含む、新生児の慢性肺疾患を改善及び治療するための細胞製剤及び医薬組成物を提供する。本発明の細胞製剤は、上記疾患を有する対象に対し、Ｍｕｓｅ細胞を投与することにより、肺組織に生着させ、上記疾患を改善及び治療する機構に基づく。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞を含む、慢性肺疾患を改善及び／又は治療するための細胞製剤。
【請求項２】
外部ストレス刺激によりＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分を含む、請求項１に記載の細胞製剤。
【請求項３】
前記多能性幹細胞が、ＣＤ１０５陽性である、請求項１又は２に記載の細胞製剤。
【請求項４】
前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項５】
前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性、及びＣＤ２７１陰性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項６】
前記多能性幹細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性、及びＤｃｔ陰性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項７】
前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
【請求項８】
慢性肺疾患が、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、ウィルソン・ミキティ症候群（ＷＭＳ）、新生児遷延性肺高血圧症（ＰＰＨＮ）、及び新生児高血圧症からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項９】
前記多能性幹細胞が肺組織に生着する能力を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項１０】
ヒト新生児、乳児又は幼児対象に前記多能性幹細胞を治療上有効量として約１×１０４細胞／個体〜約３×１０８細胞／個体で投与する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項１１】
ヒト新生児、乳児又は幼児対象に前記多能性幹細胞を治療上有効量として、該対象一個体あたり約３×１０４細胞／ｋｇ〜約３×１０７細胞／ｋｇを体重換算した細胞量を投与する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療における細胞製剤に関する。より具体的には、多能性幹細胞を含有する、慢性肺疾患の治療に有効な細胞製剤及び新規な治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＬＤ）、特に新生児の慢性肺疾患は、新生児医療の重大かつ頻度の高い合併症であり、呼吸窮迫症候群などの呼吸障害のために人工換気療法を受けた早産児の一群に認められる、慢性的な肺の病変である。今般、新生児医療の進歩に伴い、この２０年間で先進諸国における出生体重１５００ｇ未満の児の生存率は、７０％未満から８０％以上へ上昇しているが、ＣＬＤの罹患率は在胎２８週未満の児で５３．２％、出生体重１０００ｇ未満の児で４０％と依然として高率である。【０００３】
新生児慢性肺疾患に関して、２００１年に国際的に提唱された定義では、「在胎３２週未満の早産児では、修正３６週または退院前までに２１％を越える酸素療法を２８日以上必要とした児」とあり、その酸素依存度により重症度分類がされている。慢性肺疾患は退院後も在宅酸素療法を必要とする場合もあり、さらに、幼児期における呼吸器感染症の入院など、医療経済を考慮する上で重要な疾患である。また、慢性肺疾患は、新生児及び幼児のみならず、青年期にまで及ぶ呼吸機能の低下も大きな問題となっている。【０００４】
これまで、新生児慢性肺疾患は、肺未熟性やサーファクタント欠乏状態に、感染、動脈管開存症、酸素毒性、人工換気などの損傷が加わり、肺組織の異形成に起因して、気腫化、線維化に至ると考えられていたが、近年、新生児慢性肺疾患は単なる肺の傷害だけではなく、発達途上の未熟肺が胎外に出て成長していく過程で様々な損傷が加わり、肺胞や血管系の発達が停止した状態と考えられている。【０００５】
この疾患の治療法は、対症療法として投与する酸素濃度の制限、水分の制限、利尿薬による肺循環への水分負荷軽減、気管支拡張剤や呼吸刺激剤の投与、抗炎症作用や抗浮腫作用を期待してのステロイド投与などが行なわれている。例えば、特許文献１では、呼吸窮迫症候群患者が新生児慢性肺疾患に陥るリスクを低減させるために、ステロイド剤及び肺サーファクタントを組み合わせた、気管内投与に適用される医薬組成物が提案されている。しかしながら、ステロイドについては、成長期の中枢神経系への副作用が危惧されているため、重症例に対してのみレスキュー的に短期少量投与を行っているのが現状である。このように慢性肺疾患に対しては、対症療法的に治療が行われ、該疾患の根治を目指す治療薬及び治療法について報告されていない。【０００６】
近年、再生医療分野において、幹細胞を用いた細胞療法が様々な疾患に対して研究が行われ、臨床への応用も行われつつ中で、慢性肺疾患、例えば、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）の改善や治療に幹細胞の適用が期待されている（非特許文献１〜３）。例えば、骨髄間葉系細胞画分（ＭＳＣ）は、成体から単離され、骨、軟骨、脂肪細胞、神経細胞、骨格筋等に分化する能力を有することが知られている（非特許文献４及び５）。しかしながら、ＭＳＣは様々な細胞を含む細胞群であり、その分化能の実体が分かっておらず、治療効果にバラつきが大きい。また、成体由来の多能性幹細胞としてｉＰＳ細胞（特許文献２）が報告されているが、ｉＰＳ細胞の樹立には、間葉系細胞である皮膚線維芽細胞画分に特定の遺伝子や特定の化合物を体細胞に導入するという極めて複雑な操作を必要とすることに加え、ｉＰＳ細胞が高い腫瘍形成能力を有することから、臨床応用への極めて高いハードルが存在している。【０００７】
本発明者らの一人である出澤氏の研究により、間葉系細胞画分に存在し、誘導操作なしに得られる、ＳＳＥＡ−３（Ｓｔａｇｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ−３）を表面抗原として発現している多能性幹細胞（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ；Ｍｕｓｅ細胞）が間葉系細胞画分の有する多能性を担っており、組織再生を目指した疾患治療に応用できる可能性があることが明らかになってきた。また、Ｍｕｓｅ細胞は、間葉系細胞画分を種々のストレスで刺激することにより濃縮できることも分かってきた（特許文献３；非特許文献６）。しかしながら、慢性肺疾患の改善及び／又は治療にＭｕｓｅ細胞を使用し、期待される治療効果が得られることを明らかにした例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−２６２０６４号公報
【特許文献２】特許第４１８３７４２号公報
【特許文献３】国際公開第２０１１／００７９００号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｈｏｕ，Ｈ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．８，ｐ．３４２−３５３（２０１６）
【非特許文献２】Ｋｉｍ，Ｙ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓ．，２０１６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｐｒ．２０１６．８８
【非特許文献３】Ｌｕａｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｒｅｐ．，Ｖｏｌ．１１，ｐ．１９４５−１９５０（２０１５）
【非特許文献４】Ｄｅｚａｗａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．１１３，ｐ．１７０１−１７１０（２００４）
【非特許文献５】Ｄｅｚａｗａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３０９，ｐ．３１４−３１７（２００５）
【非特許文献６】Ｗａｋａｏ，Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１０８，ｐ．９８７５−９８８０（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、再生医療において、多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を用いた新たな医療用途を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、Ｍｕｓｅ細胞を含む、慢性肺疾患（ＣＬＤ）の治療に有効な細胞製剤及び医薬組成物、並びに新規な治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、高酸素負荷による慢性肺疾患モデルラットを作製し、静脈注射によりＭｕｓｅ細胞を投与することによって、慢性肺疾患が改善されることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞を含む、慢性肺疾患を改善及び／又は治療するための細胞製剤。
［２］外部ストレス刺激によりＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分を含む、上記［１］に記載の細胞製剤。
［３］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１０５陽性である、上記［１］又は［２］に記載の細胞製剤。
［４］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞製剤。
［５］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性、及びＣＤ２７１陰性である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の細胞製剤。
［６］前記多能性幹細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性、及びＤｃｔ陰性である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞製剤。
［７］前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
［８］慢性肺疾患が、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、ウィルソン・ミキティ症候群（ＷＭＳ）、新生児遷延性肺高血圧症（ＰＰＨＮ）、及び新生児高血圧症からなる群から選択される、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の細胞製剤。
［９］前記多能性幹細胞が肺組織に生着する能力を有する、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の細胞製剤。
［１０］ヒト新生児、乳児又は幼児対象に前記多能性幹細胞を治療上有効量として約１×１０４細胞／個体〜約３×１０8細胞／個体で投与する、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の細胞製剤。
［１１］ヒト新生児、乳児又は幼児対象に前記多能性幹細胞を治療上有効量として、該対象一個体あたり約３×１０４細胞／ｋｇ〜約３×１０７細胞／ｋｇを体重換算した細胞量を投与する、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の細胞製剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、慢性肺疾患を患っている対象（主に新生児）に対し、Ｍｕｓｅ細胞を静脈等から投与することにより、抗炎症作用及び組織修復作用を発揮させ、正常な肺組織を構築させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＧＦＰ標識されたＭｕｓｅ細胞が、日齢１５の慢性肺疾患モデルラットの肺組織において生着したことを示す。
【図２】Ｍｕｓｅ細胞投与群（「Ｍｕｓｅ」）、細胞懸濁液（ＨＡＮＫ’Ｓ  ＢＡＬＡＮＣＥＤ  ＳＡＬＴ  ＳＯＬＵＴＩＯＮ：ＨＢＳＳ）のみを添加した群（「ベヒクル」）、及びシャムオペ群（「シャム」）の慢性肺疾患モデルラットの肺組織を評価した結果を示す。短期群は日齢１５のラットを被験対象とし、長期群は日齢２９のラットを被験対象とした。縦軸は、組織の割合を示す。
【図３】Ｍｕｓｅ細胞投与群（「Ｍｕｓｅ」）、非Ｍｕｓｅ細胞投与群（「非Ｍｕｓｅ」）、細胞懸濁液（ＨＢＳＳ）のみ添加をした群（「ベヒクル」）、及びシャムオペ群（「シャム」）の慢性肺疾患モデルラットの肺組織を評価した結果を示す。短期群は日齢１５のラットを被験対象とし、長期群は日齢２９のラットを被験対象とした。縦軸は、組織の割合を示す。
【図４】日齢２９のラットの肺組織における肺胞壁の割合を評価した結果を示す。肺胞壁割合が高いほど、肺胞壁が密に形成され肺組織が修復されていることを表わす。
【図５】日齢１５の慢性肺疾患モデルラットの肺組織において発現した炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示す。縦軸は、シャムオペ群を１とした相対的な発現量を示す。
【図６】Ｍｕｓｅ細胞投与群（「Ｍｕｓｅ群」）、細胞懸濁液（ＨＢＳＳ）のみを添加した群（「ベヒクル群」）、及びシャムオペ群（「シャム群」）の慢性肺疾患モデルラットの心臓評価を行った結果を示す。縦軸は、右室壁の重量を左室壁と中隔の重量で除したものを示す。
【図７】Ｍｕｓｅ細胞投与群（「Ｍｕｓｅ群」）、非Ｍｕｓｅ細胞投与群（「非Ｍｕｓｅ細胞」）、細胞懸濁液（ＨＢＳＳ）のみを添加した群（「ベヒクル群」）、及びシャムオペ群（「シャム群」）の慢性肺疾患モデルラットの心臓評価を行った結果を示す。縦軸は、右室壁の重量を左室壁と中隔の重量で除したものを示す。
【図８】肺動脈血管の内壁率の変化を指標にして、各種投与群における肺動脈血管壁の肥厚の軽減を検討した結果を示す。図８（Ａ）は、肺動脈血管を断面にした組織を抗α−ＳＭＡ抗体を用いて染色した図である。図８（Ｂ）は、短期群及び長期群における肺動脈細胞の内壁率を測定した結果を示す。
【図９】慢性肺疾患に伴い亢進される肺動脈細胞の新生の抑制を各種投与群において検討した結果を示す。図９（Ａ）は、組織学的に染色した結果を示し、増殖中の肺動脈細胞の核を抗Ｋｉ−６７抗体で染色（緑色）し、α−平滑筋アクチンを抗α−ＳＭＡ抗体で染色（赤色）し、肺動脈細胞の核をＤＡＰＩで染色（青色）した。図９（Ｂ）は、抗Ｋｉ−６７抗体による陽性率を示す。
【図１０】肺胞洗浄液中の炎症性細胞の数を検討した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む、慢性肺疾患を改善及び／又は治療するための細胞製剤及び医薬組成物、並びに新規な治療方法に関する。本発明を以下に詳細に説明する。
【００１６】
１．適用疾患とその診断
本発明は、ＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む細胞製剤又は医薬組成物を用いて、慢性肺疾患の改善及び治療を目指す。わが国では１９９６年に厚生労働省研究班により、新生児の「慢性肺障害」を「先天奇形を除く肺の異常により、酸素投与を必要とするような呼吸窮迫症状が新生児期に始まり、日齢２８日を越えて続くもの」と定義し、さらに、肺障害のうち大部分を占める低出生体重児の慢性肺障害を疾患として特徴付けるために、「慢性肺疾患」を「胸部Ｘ線写真でびまん性不透亮像、泡沫状陰影など明らかな異常所見を伴う慢性肺障害のある場合」と定め、背景因子及び胸部Ｘ線所見から以下の表１に示すようにＩ〜ＶＩの病型に分類される。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
慢性肺疾患の診断は、上記基準に記載されるように、呼吸窮迫症候群における多呼吸を主とした症状と胸部Ｘ線により診断されるが、他の呼吸器疾患の可能性を否定した後の除外診断が基本となる。
【００１９】
一般的に、新生児慢性肺疾患は、肺の未熟性、酸素毒性、人工換気、炎症、感染、動脈管開存症などが危険因子として知られ、肺胞や血管系の発達が抑制された状態に起因した疾患であると捉えることができるが、本発明の適用疾患としての慢性肺疾患には、限定されないが、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、ウィルソン・ミキティ症候群（ＷＭＳ）、新生児遷延性肺高血圧症（ＰＰＨＮ）、新生児高血圧症なども含めることができる。なお、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）は、１９６７年にＮｏｒｔｈｗａｙらが初めて報告したものであり、一般に欧米では慢性肺疾患の別名となっている。
【００２０】
新生児慢性肺疾患は、早産児に多い疾患であり、日齢２８日又は修正３６週を超えても酸素を必要とする呼吸障害が持続する疾患である。慢性肺疾患の病因としては、上記に記載の通りであるが、特に、高酸素療法（長期の高濃度吸収酸素、高圧の人工呼吸器管理など）や炎症を起因とするところが大きい。炎症（感染）との関連では、絨毛羊膜炎、臍帯炎などの出生前感染により慢性肺障害の病因となり、これらもまた本発明の適用対象となり得る。絨毛羊膜炎は、胎児を包む羊膜に炎症が波及し、胎盤炎症が起きた感染症の１つである。絨毛羊膜炎が起こると、胎内で炎症性物質が高値になり、そのため、気管支や肺胞上皮の剥離、肺胞構造の再生に必要な物質の低下を来たし、慢性肺障害を発症すると考えられている。
【００２１】
本発明によれば、上記の適用疾患を治療するために、後述する細胞製剤及び医薬組成物を対象に投与（以下、総じて「移植」と記述することがある。）し、適用疾患の改善及び／又は治療を可能にする。ここで、「改善」とは、慢性肺疾患に伴う各種の症状の緩和及び進行の抑制を意味し、好ましくは、日常生活に差し支えない程度にまで症状を緩和することを意味する。また、「治療」とは、慢性肺疾患に伴う各種の症状を抑制すること又は完全に消失させることをいう。
【００２２】
２．細胞製剤及び医薬組成物
（１）多能性幹細胞
本発明の細胞製剤及び医薬組成物に使用される多能性幹細胞は、典型的には、本発明者らの一人である出澤氏が、ヒト生体内にその存在を見出し、「Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞」と命名した細胞である。Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液、脂肪組織（Ｏｇｕｒａ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．，Ｎｏｖ  ２０，２０１３（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎ  Ｊａｎ  １７，２０１４））や真皮結合組織等の皮膚組織から得ることができ、各臓器の結合組織にも散在する。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞であり、例えば、それぞれの細胞表面マーカーである「ＳＳＥＡ−３（Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ−３）」と「ＣＤ１０５」のダブル陽性として同定される。したがって、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、これらの抗原マーカーを指標として生体組織から分離することができる。また、Ｍｕｓｅ細胞はストレス耐性であり、間葉系組織又は培養間葉系細胞から種々のストレス刺激により濃縮することができる。本発明の細胞製剤には、ストレス刺激によりＭｕｓｅ細胞が濃縮された細胞画分を用いることもできる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に開示されている。また、Ｗａｋａｏら（２０１１、上述）によって報告されているように、骨髄、皮膚などから間葉系細胞を培養し、それをＭｕｓｅ細胞の母集団として用いる場合、ＳＳＥＡ−３陽性細胞の全てがＣＤ１０５陽性細胞であることが分かっている。したがって、本発明における細胞製剤及び医薬組成物において、生体の間葉系組織又は培養間葉系幹細胞からＭｕｓｅ細胞を分離する場合は、単にＳＳＥＡ−３を抗原マーカーとしてＭｕｓｅ細胞を精製し、使用することができる。なお、本明細書においては、慢性肺疾患を改善及び／又は治療するための細胞製剤及び医薬組成物において使用され得る、ＳＳＥＡ−３を抗原マーカーとして、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から分離された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を単に「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」と記載することがある。また、本明細書においては、「非Ｍｕｓｅ細胞」とは、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織に含まれる細胞であって、「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」以外の細胞を指す。
【００２３】
簡単には、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、細胞表面マーカーであるＳＳＥＡ−３に対する抗体を単独で用いて、又はＳＳＥＡ−３及びＣＤ１０５に対するそれぞれの抗体を両方用いて、生体組織（例えば、間葉系組織）から分離することができる。ここで、「生体」とは、哺乳動物の生体をいう。本発明において、生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物には、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。本発明の細胞製剤及び医薬組成物に使用されるＭｕｓｅ細胞は、生体の組織から直接マーカーを用いて分離される点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）やｉＰＳ細胞と明確に区別される。また、「間葉系組織」とは、骨、滑膜、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、歯髄、臍帯、臍帯血などの組織及び各種臓器に存在する組織をいう。例えば、Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄や皮膚、脂肪組織から得ることができる。例えば、生体の間葉系組織を採取し、この組織からＭｕｓｅ細胞を分離し、利用することが好ましい。また、上記分離手段を用いて、線維芽細胞や骨髄間葉系幹細胞などの培養間葉系細胞からＭｕｓｅ細胞を分離してもよい。本発明の細胞製剤及び医薬組成物においては、使用されるＭｕｓｅ細胞は、レシピエントに対して自家であってもよく、又は他家であってもよい。
【００２４】
上記のように、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ−３陽性、及びＳＳＥＡ−３とＣＤ１０５の二重陽性を指標にして生体組織から分離することができるが、ヒト成人皮膚には、種々のタイプの幹細胞及び前駆細胞を含むことが知られている。しかしながら、Ｍｕｓｅ細胞は、これらの細胞と同じではない。このような幹細胞及び前駆細胞には、皮膚由来前駆細胞（ＳＫＰ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、メラノブラスト（ＭＢ）、血管周囲細胞（ＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。これらの細胞に固有のマーカーの「非発現」を指標として、Ｍｕｓｅ細胞を分離することができる。より具体的には、Ｍｕｓｅ細胞は、ＣＤ３４（ＥＰ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）（ＭＢのマーカー）、ＣＤ１４６（ＰＣ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）（ＮＣＳＣのマーカー）、ＮＧ２（ＰＣのマーカー）、ｖＷＦ因子（フォンビルブランド因子）（ＥＰのマーカー）、Ｓｏｘ１０（ＮＣＳＣのマーカー）、Ｓｎａｉ１（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｌｕｇ（ＳＫＰのマーカー）、Ｔｙｒｐ１（ＭＢのマーカー）、及びＤｃｔ（ＭＢのマーカー）からなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、限定されないが、ＣＤ１１７及びＣＤ１４６の非発現を指標に分離することができ、さらに、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ及びＣＤ２７１の非発現を指標に分離することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。
【００２５】
また、本発明の細胞製剤及び医薬組成物に使用される上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、以下：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。本発明の一局面では、本発明の細胞製剤及び医薬組成物に使用されるＭｕｓｅ細胞は、上記性質を全て有する。ここで、上記（ｉ）について、「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、ＴＲＡＰＥＺＥ  ＸＬ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、例えば、体細胞であるヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はＨｅｌａ細胞に比べて１／５以下、好ましくは１／１０以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。上記（ｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、三胚葉（内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系）に分化する能力を有し、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導培養することにより、肝細胞、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、脂肪細胞等に分化し得る。また、ｉｎ  ｖｉｖｏで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を示す場合がある。さらに、静注により生体に移植することで損傷を受けた臓器（心臓、皮膚、脊髄、肝、筋肉等）に遊走及び生着し、組織に応じた細胞に分化する能力を有する。上記（ｉｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、浮遊培養では増殖速度約１．３日で増殖するが、浮遊培養では１細胞から増殖し、胚様体様細胞塊を作り１４日間程度で増殖が止まる、という性質を有するが、これらの胚様体様細胞塊を接着培養に持っていくと、再び細胞増殖が開始され、細胞塊から増殖した細胞が広がっていく。さらに精巣に移植した場合、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。また、上記（ｉｖ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、セルフリニューアル（自己複製）能を有する。ここで、「セルフリニューアル」とは、１個のＭｕｓｅ細胞から浮遊培養で培養することにより得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞から３胚葉性の細胞への分化が確認できると同時に、胚様体様細胞塊の細胞を再び１細胞で浮遊培養に持っていくことにより、次の世代の胚様体様細胞塊を形成させ、そこから再び３胚葉性の分化と浮遊培養での胚様体様細胞塊が確認できることをいう。セルフリニューアルは１回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。
【００２６】
また、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞を含む細胞画分は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に外的ストレス刺激を与え、該外的ストレスに耐性の細胞を回収することを含む方法によって得られる、以下の性質の少なくとも１つ、好ましくは全てを有する、ＳＳＥＡ−３陽性及びＣＤ１０５陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分であってもよい。
（ｉ）ＳＳＥＡ−３陽性；
（ｉｉ）ＣＤ１０５陽性；
（ｉｉｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｖ）三胚葉に分化する能力を持つ；
（ｖ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｖｉ）セルフリニューアル能を持つ。
【００２７】
上記外的ストレスは、プロテアーゼ処理、低酸素濃度での培養、低リン酸条件下での培養、低血清濃度での培養、低栄養条件での培養、熱ショックへの暴露下での培養、低温での培養、凍結処理、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養、振とう処理下での培養、圧力処理下での培養又は物理的衝撃のいずれか又は複数の組み合わせであってもよい。例えば、上記プロテアーゼによる処理時間は、細胞に外的ストレスを与えるために合計０．５〜３６時間行うことが好ましい。また、プロテアーゼ濃度は、培養容器に接着した細胞を剥がすとき、細胞塊を単一細胞にばらばらにするとき、又は組織から単一細胞を回収するときに用いられる濃度であればよい。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ又はＮ末端スレオニンプロテアーゼであることが好ましい。さらに、前記プロテアーゼがトリプシン、コラゲナーゼ又はジスパーゼであることが好ましい。
【００２８】
また、本発明の細胞製剤に使用される上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、静脈投与等により生体に投与後、慢性肺疾患の肺組織に生着し、その後、Ｍｕｓｅ細胞は、該組織を構成する細胞に分化し、慢性肺疾患を改善及び／又は治療するものと考えられる。
【００２９】
（２）細胞製剤及び医薬組成物の調製及び使用
本発明の細胞製剤及び医薬組成物は、限定されないが、上記（１）で得られたＭｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を生理食塩水や適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、ＨＢＳＳ）に懸濁させることによって得られる。この場合、自家又は他家の組織から分離したＭｕｓｅ細胞数が少ない場合には、投与前に細胞を培養して、所定の細胞濃度が得られるまで増殖させてもよい。なお、すでに報告されているように（国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレット）、Ｍｕｓｅ細胞は、腫瘍化しないため、生体組織から回収した細胞が未分化のまま含まれていても癌化の可能性が低く安全である。また、回収したＭｕｓｅ細胞の培養は、特に限定されないが、通常の増殖培地（例えば、１０％仔牛血清を含むα−最少必須培地（α−ＭＥＭ））において行うことができる。より詳しくは、上記国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号を参照して、Ｍｕｓｅ細胞の培養及び増殖において、適宜、培地、添加物（例えば、抗生物質、血清）等を選択し、所定濃度のＭｕｓｅ細胞を含む溶液を調製することができる。ヒト対象に本発明の細胞製剤又は医薬組成物を投与する場合には、ヒトの腸骨から数ｍＬ程度の骨髄液を採取し、例えば、骨髄液からの接着細胞として骨髄間葉系幹細胞を培養して有効な治療量のＭｕｓｅ細胞を分離できる細胞量に達するまで増やした後、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ−３の抗原マーカーを指標として分離し、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。あるいは、例えば、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ−３の抗原マーカーを指標として分離後、有効な治療量に達するまで細胞を培養して増やした後、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。
【００３０】
また、Ｍｕｓｅ細胞の細胞製剤及び医薬組成物への使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を細胞製剤及び医薬組成物に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）や間葉系幹細胞に含まれるＭｕｓｅ細胞以外の細胞又は成分を細胞製剤及び医薬組成物に含有させてもよい。当業者は、これら因子及び薬剤を適切な濃度で細胞製剤及び医薬組成物に添加することができる。
【００３１】
上記で調製される細胞製剤及び医薬組成物中に含有するＭｕｓｅ細胞数は、慢性肺疾患の改善及び／又は治療において所望の効果（例えば、死亡率低下、人工呼吸管理日数の短縮、酸素投与日数の短縮）が得られるように、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜、調整することができる。後述する実施例２〜７において、高酸素負荷による慢性肺疾患モデルラットを用いて、Ｍｕｓｅ細胞移植による各種の効果を検討したが、体重約５〜１５ｇの該モデルラットに対しては、ＳＳＥＡ３陽性細胞を１×１０４細胞／頭（一個体あたり）で投与することにより、非常に優れた効果が得られた。この結果からヒト新生児（生後２８日以内）、乳児（生後１年未満）、又は幼児（生後１〜６年）の一個体あたり約３×１０４細胞／ｋｇ〜約３×１０７細胞／ｋｇを体重換算した細胞量を投与することで優れた効果が得られることが期待される。例えば、新生児及び乳児の体重を約４００〜１０，０００ｇとした場合、投与量としては概算で約１×１０４細胞／個体〜約３×１０８細胞／個体が有効であると考えられる。一方で、血管への細胞投与による閉塞を防ぐために、１回投与分の量として、例えば、ＳＳＥＡ−３陽性細胞を３×１０７細胞／ｋｇ以下で細胞製剤に含有させるとよい。ここで個体はラット、ヒトを含むがこれに限定されない。また、本発明の細胞製剤及び医薬組成物は、所望の治療効果が得られるまで、複数回（例えば、２〜１０回）、適宜、間隔（例えば、１日に２回、１日に１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回）をおいて投与されてもよい。したがって、対象の状態にもよるが、治療上有効量としては、例えば、一個体あたり約１×１０４細胞〜約３×１０８細胞で１〜１０回の投与量が好ましい。一個体における投与総量としては、限定されないが、１×１０４細胞〜３×１０９細胞、１×１０４細胞〜１×１０９細胞、１×１０４細胞〜５×１０８細胞、１×１０４細胞〜３×１０８細胞、１×１０４細胞〜１×１０８細胞、１×１０４細胞〜５×１０７細胞、１×１０４細胞〜３×１０７細胞、１×１０４細胞〜１×１０７細胞、１×１０４細胞〜５×１０６細胞、１×１０４細胞〜３×１０６細胞、１×１０４細胞〜１×１０６細胞、１×１０４細胞〜５×１０５細胞、１×１０４細胞〜３×１０５細胞、１×１０４細胞〜１×１０５細胞、１×１０５細胞〜３×１０９細胞、１×１０５細胞〜１×１０９細胞、１×１０５細胞〜５×１０８細胞、１×１０５細胞〜３×１０８細胞、１×１０５細胞〜１×１０８細胞、１×１０５細胞〜５×１０７細胞、１×１０５細胞〜３×１０７細胞、１×１０５細胞〜１×１０７細胞、１×１０５細胞〜５×１０６細胞、１×１０５細胞〜３×１０６細胞、１×１０５細胞〜１×１０６細胞、１×１０６細胞〜３×１０９細胞、１×１０６細胞〜１×１０９細胞、１×１０６細胞〜５×１０８細胞、１×１０６細胞〜３×１０８細胞、１×１０６細胞〜１×１０８細胞、１×１０６細胞〜５×１０７細胞、１×１０６細胞〜３×１０７細胞、１×１０６細胞〜１×１０７細胞、１×１０７細胞〜３×１０９細胞、１×１０７細胞〜１×１０９細胞、１×１０７細胞〜５×１０８細胞、１×１０７細胞〜３×１０８細胞、１×１０７細胞〜１×１０８細胞、１×１０５細胞���３×１０８細胞、１×１０５細胞〜１×１０８細胞、１×１０５細胞〜５×１０７細胞、１×１０５細胞〜３×１０７細胞、１×１０５細胞〜１×１０７細胞、１×１０５細胞〜５×１０６細胞、１×１０５細胞〜３×１０６細胞、１×１０５細胞〜１×１０６細胞、５×１０５細胞〜３×１０８細胞、５×１０５細胞〜１×１０８細胞、５×１０５細胞〜５×１０７細胞、５×１０５細胞〜３×１０７細胞、５×１０５細胞〜１×１０７細胞、５×１０５細胞〜５×１０６細胞、５×１０５細胞〜１×１０６細胞、１×１０６細胞〜１×１０８細胞、１×１０６細胞〜５×１０７細胞、１×１０６細胞〜１×１０７細胞、１×１０６細胞〜５×１０６細胞などが挙げられる。
【００３２】
本発明の細胞製剤及び医薬組成物は、慢性肺疾患を改善及び治療対象とするが、投与時期としては、出生後の小児科的な所見、胸部レントゲン写真やＣＴ等により慢性肺疾患と診断された後であって、診断直後から数カ月以内であってもよい。あるいは、生後早期でも、呼吸状態が悪く、慢性肺疾患となる可能性が高いと判断された時（例えば、生後１週目）でもよい。一方、本発明によれば、該細胞製剤等は、受傷直後に投与されることが好ましいが、受傷後の遅い時期、例えば、受傷から１週間後、１カ月後、３カ月後、６カ月、１２カ月後であっても、本発明の細胞製剤等の効果が期待できる。また、使用されるＭｕｓｅ細胞は、他家由来の場合でも免疫応答を惹起しないことが本発明者らの実験で確認されているので、慢性肺疾患の改善及び治療において所望の効果が得られるまで適宜投与されてもよい。なお、後述する実施例２〜７において示されるように、慢性肺疾患モデルラットを用いたＭｕｓｅ細胞による該疾患の改善について肺組織評価及び心臓評価を行うと、短期（生後１５日）の治療効果よりも長期（生後２９日）の治療効果が顕著である傾向にある。
【００３３】
３．慢性肺疾患モデルラットの作製
本明細書においては、本発明の細胞製剤による慢性肺疾患の改善及び治療効果を検討するために慢性肺疾患モデルラットを構築し、使用することができる。該モデルとして使用されるラットには、限定されないが、一般的に、Ｗｉｓｔａｒ／ＳＴ系ラット、スプラーグドーリー（ＳＤ）系ラットが挙げられる。慢性肺疾患モデルラットを作製する方法は公知であり、例えば、Ｌｕ，Ａ．ら（Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．，７７，７８４−７９２（２０１５））の方法に従って慢性肺疾患モデルラットを作製することができる。また、上記方法によって作製されたモデルラットが、慢性肺疾患を有するかどうかを肺組織の評価により確認することができる。
【００３４】
本発明の細胞製剤及び医薬組成物に使用されるＭｕｓｅ細胞は、疾患部位に集積する性質を有する。したがって、細胞製剤又は医薬組成物の投与において、それらの投与部位（例えば、腹腔内、筋内、疾患部位）、投与される血管の種類（静脈及び動脈）等は限定されない。また、投与されたＭｕｓｅ細胞が疾患部位に到達し、生着したことを確認する方法としては、例えば、予め蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））を発現するように遺伝子導入されたＭｕｓｅ細胞を作製し、生体に投与後、蛍光を検出できる方法（例えば、免疫組織染色）によって観察し、Ｍｕｓｅ細胞の動態を確認することができる。なお、本発明の細胞製剤及び医薬組成物に使用されるＭｕｓｅ細胞はヒト由来であるため、ラットとは異種の関係にある。モデル動物において異種の細胞等が投与される実験では、異種細胞の生体内で拒絶反応を抑制するために、異種細胞の投与前又は同時に免疫抑制剤（シクロスポリンなど）が投与されてもよい。
【００３５】
４．慢性肺疾患モデルラットにおけるＭｕｓｅ細胞による改善及び治療効果
本発明の実施形態では、本発明の細胞製剤及び医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物における慢性肺疾患及びそれに伴う各種症状を改善及び／又は治療することができる。本発明によれば、上記で作製した慢性肺疾患モデルラットを用いて、実験的に慢性肺疾患のラットにおけるＭｕｓｅ細胞による症状の改善等を検討し、該Ｍｕｓｅ細胞の効果を評価することができる。評価方法としては、ラットを用いた肺機能を評価する一般的な測定系を用いて行うことができ、例えば、ＦｉｎｅＰｏｉｎｔｅ（商標）−呼吸・肺機能評価システム  Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  Ａｉｒｗａｙ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ（ＮＡＭ）などのラットの呼吸及び肺機能評価システムを利用することができる。また、モデルラットから取り出した肺組織について、例えば、肺胞壁の測定（肺胞間腔の拡大）、炎症性サイトカインなどのｍＲＮＡ発現量の測定、あるいは、慢性肺疾患と関連付けられる右室心筋評価、肺血管評価を行うことにより評価することができる。
【００３６】
（１）肺組織の評価
本発明によれば、肺組織の評価の１つのとして、組織体積密度（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定することにより、慢性肺疾患の治療改善効果を評価することができる。簡単には、被験対象から取り出した肺組織を４％パラフォルムアルデヒドで固定し、パラフィンブロック切片を作成後、ヘマトキシリン・エオジンで染色する。顕微鏡下で所定数のグリッドのうち肺組織の割合をカウントし、肺組織の病変を評価することができる（後述する実施例４を参照）。肺組織に損傷があると、肺胞腔率が高くなる。
【００３７】
別の態様では、肺組織において発現した炎症性サイトカインの発現量を測定することにより、慢性肺疾患に対する本発明の細胞製剤又は医薬組成物の有効性を評価することができる。一般的に、炎症性サイトカインには、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ等が例示される。組織中に発現した炎症性サイトカインの発現量を常法により、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定することができる。後述する実施例５に記載されるように、Ｍｕｓｅ細胞を投与した群では、ベヒクルを投与した対照群と比較して、炎症性サイトカインの発現量を顕著に低下させることができ、Ｍｕｓｅ細胞は、慢性肺疾患の治療に期待され得る。
【００３８】
（２）心臓評価（肺高血圧評価）
高酸素負荷に起因した慢性肺疾患では、適用される高酸素濃度により、肺血管の肥厚が生じ、これに伴い心臓の肥厚が確認される。新生児の慢性肺疾患では、（重症になるほど）２次的な肺高血圧症を合併する。この２次的な肺高血圧症も生命予後を決める重要な要因である。持続的な肺高血圧は、右心負荷による右心室壁肥厚につながるため、心臓（心筋）の評価を用いて肺高血圧を評価することができる。後述する実施例６に示されるように、慢性肺疾患モデルラットにおいても右心負荷によると考えられる右室壁肥厚が観察され、この肥厚をＭｕｓｅ細胞の投与により低減させることができる。
【００３９】
（３）肺胞洗浄液中の炎症性細胞数の測定
慢性肺疾患においては、炎症性細胞数の増加が観察されるが、各種処置による慢性肺疾患の治療効果を肺胞からの洗浄液中の炎症性細胞数を測定することにより評価することができる。後述する実施例７に示されるように、Ｍｕｓｅ細胞は、慢性肺疾患モデルラットにおける炎症性細胞数を有意に減少させることができる。
【００４０】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
実施例１：Ｍｕｓｅ細胞の調製
ヒトＭｕｓｅ細胞の分離及び同定に関する国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に記載された方法に準じて、Ｍｕｓｅ細胞を得た。【００４２】
実施例２：慢性肺疾患モデルラットの作製とＭｕｓｅ細胞の投与
本研究に使用された実験動物に関するプロトコールは、名古屋大学医学部動物実験委員会によって承認されたものである。妊娠ＳＤラットを日本エスエルシー株式会社（日本、静岡県）より入手した。出生後すぐ（２４時間以内）より、母ラットと仔ラットは、実験期間中、食餌と水を自由に摂取できるようにされ、高酸素負荷がかけられるケージ（酸素コントローラーとセンサーアダプターを備えたアニマルチャンバー）内で、１２時間の明暗サイクル下で飼育された。動物室とケージ内を常に２３℃に維持した。母ラットもまた高酸素化で受傷するため、代理母ラットを２日毎に交替させた。【００４３】
日齢５で上記慢性肺疾患モデルラットにイソフルラン吸入により麻酔を施し、処置群に対しては、Ｍｕｓｅ細胞（１×１０４細胞／個体）を右外頸静脈から投与した（処置群）。対照群では、Ｍｕｓｅ細胞に代えて、同体積のＨＢＳＳのみが投与された。Ｍｕｓｅ細胞及びＨＢＳＳがともに供されず、また、高酸素負荷がされないラットをシャム群とした。以下の実験では、日齢１５と日齢２９のラットをそれぞれ短期群及び長期群として、各種評価に用いた。なお、短期評価を行う日齢１５まで、ラットは高酸素濃度（８０％）に曝露され、その後、長期評価を行う日齢２９まで、通常の酸素濃度（２１％）に曝露された。【００４４】
実施例３：肺組織におけるＭｕｓｅ細胞の生着確認
移植に使用されたＭｕｓｅ細胞が、肺組織に生着したことを確認する実験を行った。まず、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現し、Ｍｕｓｅ細胞がこれにより標識されるように、予めレンチウイルス−ＧＦＰ遺伝子をＭｕｓｅ細胞に導入した。ＧＦＰで標識されたＭｕｓｅ細胞をＧＦＰとＳＳＥＡ−３の二重の陽性細胞としてＦＡＣＳにて分離した。その後、実施例２に記載した通りに、Ｍｕｓｅ細胞を投与した。【００４５】
次に、Ｍｕｓｅ細胞が投与された日齢１５のラット（高酸素負荷後１４日目）の肺において、以下の通り、Ｍｕｓｅ細胞が肺組織に生着したことを確認した。ラットを安楽死させた後、肺を切除し、常法に従って肺組織の切片を作製した。凍結切片を作製し、ＨｉｓｔｏＶＴ  ｏｎｅ（ナカライテスク株式会社）にて抗原賦活を行った。抗体の非特異的結合を防ぐためにロバ血清でブロッキングを行った後、抗ＧＦＰ抗体にて４℃一晩インキュベーションを行った。続いて、適切な２次抗体でさらにインキュベ−ションした。その後、ＤＮＡを染色するＤＡＰＩを含んだ封入剤で封入した。この結果から、ラットの右外頸静脈から移植されたＭｕｓｅ細胞は、肺障害を受けた肺組織に生着したことが示された（図１）。【００４６】
実施例４：肺組織評価
慢性肺疾患モデルラットの肺組織の評価を以下のように行った。上記の短期群と長期群の該モデルラットを安楽死させ、右心室から生理食塩水を注入し肺血管を灌流した後、気管カテーテルを介して４％パラフォルムアルデヒド水溶液で肺を膨張させた（２０ｃｍＨ２Ｏ、２０分間）。肺を摘出し、４％パラフォルムアルデヒド溶液中で１８〜２４時間（４℃）固定した後、各肺葉に切り分けた。切り分けた肺葉をエタノール水溶液、キシレンで脱水し、パラフィン包埋後、肺葉を厚さ５μｍの切片とし、ヘマトキシリン−エオジン染色（ＨＥ染色）して標本を作製した。倒立顕微鏡（オリンパス社製、型番ＩＸ８３）を使用し、顕微鏡ソフトウェア（Ｓｔｅｒｅｏ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ）上で１００のグリッド（×３カ所×６切片）を置き、それぞれのグリッド下が空間又は肺組織のいずれかであるかを確認した。１００（計１，８００）のグリッドのうち何％が肺組織であるかを評価した。通常、正常な肺組織では４０％程度を占め、肺組織の損傷に伴って肺胞腔が大きくなる。図２に示されるように、短期群（日齢１５）のラットにおいて、Ｍｕｓｅ細胞が投与された処置群（Ｍｕｓｅ群）及びＨＢＳＳが投与された処置群（ベヒクル群）は、正常状態のシャム群と比較して同程度であったが、長期群（日齢２９）のラットでは、ベヒクル群と比較して、Ｍｕｓｅ群では有意な効果を示し、正常状態に近くに軽快することが示された。【００４７】
上記と同様に、新たにＭｕｓｅ細胞を投与した群、ベヒクル群、シャム群の他に、非Ｍｕｓｅ細胞を投与した群を加え、短期群及び長期群のラットにおいて肺組織を再評価した（図３）。短期群においては、非Ｍｕｓｅ細胞が投与された処置群（非Ｍｕｓｅ群）は、ベヒクル群と同程度に肺組織の損傷の軽減効果は観察されなかったが、Ｍｕｓｅ細胞が投与された群（Ｍｕｓｅ群）では、以前の結果（図２）と同様に、Ｍｕｓｅ細胞による肺組織の損傷の顕著な軽減効果が観察された。一方、長期群においては、非Ｍｕｓｅ群では、ベヒクル群と比較して、肺組織の損傷の軽減効果は観察されたが、その効果は、Ｍｕｓｅ群と比較して小さかった。Ｍｕｓｅ細胞が投与されたラットでは、肺組織の損傷が、以前の結果と同様に正常状態近くに軽快することが示された。【００４８】
さらに、日齢２９のラットにおいて、肺胞壁割合を計測することによって肺組織を評価した。作製した標本を顕微鏡用デジタルカメラ（オリンパス社製、型番ＤＰ７３）で撮影した。撮影画像をイメージングソフトウェア（オリンパス株式会社製、商品名ｃｅｌｌＳｅｎｓ）を用いて解析した。標本切片全体の面積から気管、血管及び障害部位の面積を除いて肺胞の面積とし、そのうち、肺胞壁が占める面積の割合（肺胞壁割合）を下記式によって算出した。
肺胞壁割合（％）＝肺胞壁面積÷｛肺標本全体面積−（気管部位面積＋血管部位面積＋障害部位面積）｝×１００
この肺胞壁割合が高いほど、肺胞壁が密に形成され肺組織が修復されていることを表わす。結果を図４に示す。シャム群では、肺胞壁割合は約２２〜２３％であり、慢性肺疾患モデルラットにＭｕｓｅ細胞を投与した群では、破壊された肺胞壁が２１％前後までに回復した。また、非Ｍｕｓｅ細胞群においても回復の効果が見られたが、Ｍｕｓｅ細胞群ほどには至らなかった。このように、上記の肺組織評価から、肺Ｍｕｓｅ群では有意な効果を示し、正常状態に近くに軽快することが示された。【００４９】
実施例５：炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現測定
慢性肺疾患では、肺組織において各種炎症性サイトカインの発現が増大するが、Ｍｕｓｅ細胞の移植によりこれらの発現量を低減させ得るのかを検討した。日齢１５のラットから肺組織を採取し、常法に従って総ＲＮＡを抽出後、炎症性サイトカインであるＣＣＬ２及びＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現量を処置群とベヒクル群で比較した。具体的な手法としては、肺組織を素早く取り出した容器にＴＲＩ試薬を添加し、Ｄｏｕｎｃｅホモゲナイザー、２１Ｇ針付きシリンジにてホモゲナイズした。クロロホルムを添加後、遠心分離し、ＲＮＡを含む水層を得た。イソプロパノールにてＲＮＡを沈殿させ、指摘濃度にて溶解させたＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ（商標）ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＫｉｔにてｃＤＮＡを合成した。その後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いて、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。結果を図５に示す。縦軸は、シャム群の発現量を１とした時の各サイトカインのｍＲＮＡの相対的な発現量を示す。Ｍｕｓｅ細胞を投与した処置群（Ｍｕｓｅ群）は、ＨＢＳＳが投与された処置群（ベヒクル群）と比較して、いずれの炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現量を有意に低下させることができた。【００５０】
実施例６：心臓評価（肺高血圧評価）
Ｍｕｓｅ細胞による慢性肺疾患の治療効果として、ラットの心臓を用いた評価を行った。上記の短期群及び長期群のモデルラットから心臓を取り出し、右室壁（ＲＶ）と中隔＋左室壁（ＩＶＳ＋ＬＶ）の２つに分離後、充分（６０℃、４８時間）に乾燥機にて乾燥させ、それぞれの重量を測定した。持続的な肺高血圧があると右室壁が肥厚（＝重くなる）する。図６のシャム群は正常値であるが、慢性肺疾患（ベヒクル群）になると、０．４程度まで上昇した。これは、右室が肥厚したことを示す。これに対して、Ｍｕｓｅ細胞を投与した群（Ｍｕｓｅ群）では、ほぼ正常化することが分かった。【００５１】
上記と同様に、新たにＭｕｓｅ細胞を投与した群、ベヒクル群、シャム群の他に、非Ｍｕｓｅ細胞を投与した群を加え、短期群及び長期群のラットにおいて肺高血圧の改善効果について再評価した（図７）。短期群及び長期群の両方において、非Ｍｕｓｅ細胞が投与された処置群（非Ｍｕｓｅ群）は、ベヒクル群と同程度に肺高血圧の軽減効果は観察されなかった。一方、Ｍｕｓｅ細胞が投与された群（Ｍｕｓｅ群）では、以前の結果（図６）と同様に、Ｍｕｓｅ細胞による肺高血圧の顕著な軽減効果が観察された。【００５２】
続いて、高酸素負荷により損傷した肺組織の修復について、組織学的に評価を行った。最初に、肺動脈の血管壁を抗α−ＳＭＡ（α−平滑筋アクチン）抗体により組織学的に染色し、各種投与群について肺動脈血管壁の肥厚の軽減効果を内壁率の変化を指標にして評価した。同時に、慢性肺疾患に伴い亢進される肺動脈細胞の新生が、Ｍｕｓｅ細胞の投与により抑制されるのかどうかについて、細胞周期関連核タンパク質であるＫｉ−６７を細胞増殖マーカーとして検討した。上記の実施例と同様にパラフィン切片を作製し、その後、クエン酸バッファーにて抗原賦活を行った。抗体の非特異的結合を防ぐためにロバ血清でブロッキング行った後、抗α−ＳＭＡ抗体、及び抗Ｋｉ−６７抗体にて４℃一晩インキュベーションを行った。適切な２次抗体でさらにインキュベ−ションした後、ＤＮＡを染色するＤＡＰＩを含んだ封入剤で封入した。【００５３】
肺動脈血管の断面における組織染色の結果を図８（Ａ）に示す。これらの画像に基づいて、各群の内壁率を以下の式：
内壁率（％）＝｛（血管外径−血管内径）／血管外径｝×１００
に従って算出し、結果を図８（Ｂ）に示す。この図に示される通り、短期群及び長期群はともに類似した結果であり、Ｍｕｓｅ細胞群では、肺高血圧に起因する肺動脈血管壁の肥厚を顕著に抑制することができた。また、非Ｍｕｓｅ細胞群においても抑制効果は観察されたが、Ｍｕｓｅ細胞群と比較してその効果は小さかった。【００５４】
増殖中の肺動脈細胞の核を抗Ｋｉ−６７抗体により組織学的に染色し、肺動脈細胞の新生率について評価した。図９（Ａ）では、抗α−ＳＭＡ抗体、抗Ｋｉ−６７抗体、及びＤＡＰＩによる三重染色を行った結果を示す。図に示された肺動脈標本は、非Ｍｕｓｅ細胞を投与した群のものであり、抗Ｋｉ−６７抗体により染色された増殖中の肺動脈細胞が観察された。【００５５】
次に、このような三重染色を各群について行い、ＤＡＰＩによって核染色された肺動脈細胞のうち、Ｋｉ−６７陽性である細胞の割合を算出した（図９（Ｂ））。短期群では、Ｍｕｓｅ細胞群において肺動脈細胞の新生は、ベヒクル群及び非Ｍｕｓｅ群と比較して、Ｋｉ−６７陽性細胞の割合が減少していた。また、長期群では、Ｍｕｓｅ細胞群は、シャム群と同定までＫｉ−６７陽性細胞の割合が減少し、短期群よりもその効果は顕著であった。以上の肺高血圧評価から、Ｍｕｓｅ細胞は、慢性肺疾患の治療において有意な効果を奏することが示された。【００５６】
実施例７：肺胞洗浄液中の炎症性細胞数の測定
慢性肺疾患においては、炎症性細胞数の増加が観察されるが、Ｍｕｓｅ細胞の投与により、これらの細胞数が減少するか否かを検討した。短期群のラットを安楽死させた後、肺動脈より血管を生理食塩水で灌流し、挿管されている気管カニューレから生理食塩水０．４ｍｌ（０．２ｍｌ×２回）を注入して、肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行い、ＢＡＬ液（ＢＡＬＦ）を回収した。ＢＡＬＦ中の白血球、マクロファージ、好中球、及びリンパ球の数を以下の手法により計測した。具体的には、気管支肺胞洗浄液１０μＬにＴｕｒｋ溶液２０μＬを加えて染色し、Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ血球計算盤を用いて総細胞数を測定した。次いで、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ４（登録商標）を使用して、気管支肺胞洗浄液１００μＬの塗抹標本を作製し、作製した塗抹標本をＭａｙ−Ｇｉｅｍｓａ染色で染色した。顕微鏡下に、１標本あたり少なくとも２００個の細胞をカウントして白血球分画を測定し、マクロファージ数、好中球数、及びリンパ球数を算出した。結果を図１０に示す。慢性肺疾患に伴い増加した各種炎症性細胞の数が、Ｍｕｓｅ細胞の投与により軽減した。この結果から、Ｍｕｓｅ細胞は、慢性肺疾患の治療において有意な効果を奏することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の細胞製剤及び医薬組成物は、新生児慢性肺疾患の改善及び治療に応用できる。【００５８】
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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