(57)【要約】【課題】癒着防止効果の高い癒着防止材が求められていた。【解決手段】少なくとも一部が硬化剤で架橋された、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩のスポンジ状の第１の層および第２の層を含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１０，０００〜２，０００，０００であり、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１，０００〜１，０００，０００であり、前記重量平均分子量が脱架橋処理後にＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定したものであり、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量よりも高い、滅菌された、生体に適用可能なスポンジ状積層体を含む、癒着防止材。
2018012605.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一部が硬化剤で架橋された、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩のスポンジ状の第１の層および第２の層を含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１０，０００〜２，０００，０００であり、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１，０００〜１，０００，０００であり、前記重量平均分子量が脱架橋処理後にＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定したものであり、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量よりも高い、滅菌された、生体に適用可能なスポンジ状積層体を含む、癒着防止材。
【請求項２】
第１の層および第２の層のいずれか一方が、硬化剤を含む請求項１
に記載の癒着防止材。
【請求項３】
第１の層および第２の層の両方が、硬化剤を含む請求項１または２に記載の癒着防止材。
【請求項４】
低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の第１の層と第２の層での使用量の合計が、０．１ｍｇ／ｃｍ２〜３ｍｇ／ｃｍ２の範囲である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の癒着防止材。
【請求項５】
第１の層と第２の層のアルギン酸の１価金属塩のエンドトキシン含有量が、５００ＥＵ／ｇ以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の癒着防止材。
【請求項６】
第１の層と第２の層のアルギン酸の１価金属塩が、アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸カリウムである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の癒着防止材。
【請求項７】
第１の層と第２の層の硬化剤が、ＣａＣｌ２、ＣａＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＳｒＣｌ２、ＦｅＣｌ３およびＢａＣｌ２からなる群より選択される少なくとも１つの金属イオン化合物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の癒着防止材。
【請求項８】
第１の層を創傷部側の表面に向けて適用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の癒着防止材。
【請求項９】
少なくとも一部が硬化剤で架橋された低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩をそれぞれ含む第１の層および第２の層を含む生体に適用可能なスポンジ状積層体を含み、第１の層の溶解速度が、第２の層よりも遅い、癒着防止材。
【請求項１０】
ｐＨ７．５のリン酸緩衝液に対するアルギン酸の１価金属塩の溶出を指標とする溶解試験において、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量を１００％としたときの、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量の割合が、測定開始から１時間の時点で５０％未満、２時間の時点で７０％未満である、請求項９の癒着防止材。
【請求項１１】
ｐＨ７．５のリン酸緩衝液に対するアルギン酸の１価金属塩の溶出を指標とする溶解試験において、第１の層は、アルギン酸の１価金属塩の２５±１０重量％が１時間以内に溶出し、８０±１０重量％が４時間以内に溶出するものであり、第２の層は、アルギン酸の１価金属塩の７０±１０重量％が１時間以内に溶出し、９０±１０重量％が４時間以内に溶出するものである、請求項９の癒着防止材。
【請求項１２】
スポンジ状積層体がプレスしたものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の癒着防止材。
【請求項１３】
少なくとも一部が硬化剤で架橋された低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩のスポンジ状の第１の層および第２の層を含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１０，０００〜２，０００，０００であり、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１，０００〜１，０００，０００であり、前記重量平均分子量が脱架橋処理後にＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定したものであり、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量よりも高い、滅菌された、生体に適用可能なスポンジ状積層体を、癒着防止を必要とする対象に、第１の層を創傷部側の表面に向けて適用することを含む、癒着防止方法。
【請求項１４】
以下の工程を含む、生体に適用可能なスポンジ状積層体を含む癒着防止材の製造方法。
（１）重量平均分子量１０，０００〜２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化させる工程、
（２）硬化したアルギン酸の１価金属塩を凍結する工程、
（３）（２）で得られたアルギン酸の１価金属塩の上で、重量平均分子量１，０００〜１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化して積層体を得る工程、
（４）得られた積層体を凍結乾燥してスポンジ状積層体を得る工程、
ここで、前記分子量がＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定したものであり、
前記スポンジ状積層体は、重量平均分子量１０，０００〜２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第１の層と、重量平均分子量１，０００〜１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第２の層とを含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い。
【請求項１５】
以下の工程（１）〜（４）により得られる生体に適用可能なスポンジ状積層体。
（１）重量平均分子量１０，０００〜２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化させる工程、
（２）硬化したアルギン酸の１価金属塩を凍結する工程、
（３）（２）で得られたアルギン酸の１価金属塩の上で、重量平均分子量１，０００〜１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化して積層体を得る工程、
（４）得られた積層体を凍結乾燥してスポンジ状積層体を得る工程、
ここで、前記分子量がＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定したものであり、
前記スポンジ状積層体は、重量平均分子量１０，０００〜２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第１の層と、重量平均分子量１，０００〜１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第２の層とを含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い。
【請求項１６】
癒着防止材として用いる、請求項１５のスポンジ状積層体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癒着防止材、その製造方法およびスポンジ状積層体に関する。
【背景技術】
【０００２】
癒着とは、互いに分離しているべき組織の表面が線維性の組織で連結または融合された状態のことをいう。癒着は、外傷や炎症に伴い組織の表面にフィブリンを含む滲出液が生じ、この滲出液が器質化して組織表面が連結または融合されることにより生じる。外科手術において組織の表面にできる外傷や、外傷により引き起こされる炎症、および外科手術において組織表面が乾燥することによる炎症は、癒着が生じる原因となっている。【０００３】
癒着は、時に、不妊、腸の通過障害、慢性骨盤痛の原因となり得る。また、外科手術後に生じた癒着を剥離するために、再度の外科手術が必要となることもある。例えば、肝臓がんの再発例に対しては複数回の手術が有効であるが、再手術適用の可否判断、治療のリスク、手術時の出血量、手術時間等は、いずれも前回の手術-後の癒着防止に大きく左右される。これらのことから、癒着を防止する必要があり、癒着防止のためにこれまでに様々な手段が講じられている。【０００４】
癒着防止のためのそのような手段のいくつかは、外傷または炎症部位とその隣接組織の間に配置して組織の連結または融合を防止する物理的バリアを設けることである。そのような物理的バリアとしては、シート状のものなどが知られている。【０００５】
具体的には、シート状のものとしては、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）フィルム（Ｐｒｅｃｌｕｄｅ（商品名）（ＷＬ  Ｇｏｒｅ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．））、ヒアルロン酸（ＨＡ）とカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含有するシート（Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  ＧｍｂＨ））、再生酸化セルロースシート（ＩＮＴＥＲＣＥＥＤ（商品名）（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ））などがある。このうちＰＴＦＥフィルムは、生分解性でないため、体内に残存するという問題がある。ＨＡとＣＭＣを含有するシートおよび再生酸化セルロースシートは、生分解性であるものの、肝切除後に生じる癒着のような重篤な癒着を完全に防止できず、癒着防止の効果の点で改善の余地があった。【０００６】
ここで、コラーゲンなどのタンパク質や、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、アルギン酸などの多糖から選択される生体適合性の材料をシート状、粒子状にして、医療用吸収物質、医療用貼付材、癒着防止材、生体組織補強材料などとして用いることが知られている（特許文献１〜６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭４８−７９８７０号公報
【特許文献２】特開２００３−１２６２３５号公報
【特許文献３】国際公開第２００５／２６２１４号
【特許文献４】特開２０１１−２５０１３号公報
【特許文献５】特開２０１３−１６５８８４号公報
【特許文献６】特表２０１６−５０２８７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような状況の下、癒着防止効果が高い、創傷部の癒着とｄｅ  ｎｏｖｏ癒着の両方を抑えることができる、適用した生体に悪影響を及ぼさない、創傷部の治癒を妨げない、腸管吻合などにも使用できる、内視鏡手術においてトロッカーを介した適用が容易である、貼付位置を調整して貼り直すことが可能である、等の少なくとも一つの性能を有する癒着防止材が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、臨床における種々の手術を想定した動物による癒着モデルにおいて、フィルム（シート）状癒着防止材の長所とスプレー（液・ゲル）状癒着防止材の長所とを兼備する癒着防止材について鋭意検討を重ねた結果、第１の層と第２の層の溶解速度が異なる、生体に適用可能なスポンジ状の癒着防止材、具体的には、重量平均分子量の比較的高い低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第１の層と、重量平均分子量の比較的低い低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第２の層とを含む生体に適用可能なスポンジ状積層体を含む癒着防止材が、術局所の癒着防止のみならず、適用領域の広い範囲において癒着防止効果を有することなどを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
本発明は以下のとおりである。
［１−１］  少なくとも一部が硬化剤で架橋された低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩のスポンジ状の第１の層および第２の層を含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１０，０００〜２，０００，０００であり、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１，０００〜１，０００，０００であり、前記重量平均分子量が脱架橋処理後にＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定したものであり、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量よりも高い、滅菌された、生体に適用可能なスポンジ状積層体を含む、癒着防止材。
［１−１ａ］  重量平均分子量１０，０００〜２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第１の層と、重量平均分子量１，０００〜１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第２の層を含み、前記重量平均分子量はＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定したものであり、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い、生体に適用可能なスポンジ状積層体を含む、癒着防止材。
［１−２］  第１の層および第２の層のいずれか一方が、硬化剤を含む上記［１−１］または［１−１ａ］に記載の癒着防止材。
［１−３］  第１の層および第２の層の両方が、硬化剤を含む上記［１−１］〜［１−２］のいずれか１項に記載の癒着防止材。
［１−４］  低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の第１の層と第２の層での使用量の合計が、０．１ｍｇ／ｃｍ２〜３ｍｇ／ｃｍ２の範囲である、上記［１−１］〜［１−３］のいずれか１項に記載の癒着防止材。
［１−５］  第１の層と第２の層のアルギン酸の１価金属塩のエンドトキシン含有量が、５００ＥＵ／ｇ以下である、上記［１−１］〜［１−４］のいずれか１項に記載の癒着防止材。
［１−６］  第１の層と第２の層のアルギン酸の１価金属塩が、アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸カリウムである、上記［１−１］〜［１−５］のいずれか１項に記載の癒着防止材。
［１−７］  第１の層と第２の層の硬化剤が、ＣａＣｌ２、ＣａＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＳｒＣｌ２、ＦｅＣｌ３およびＢａＣｌ２からなる群より選択される少なくとも１つの金属イオン化合物である、上記［１−１］〜［１−６］のいずれか１項に記載の癒着防止材。
［１−８］  第１の層を創傷部側の表面に向けて適用するための、上記［１−１］〜［１−７］のいずれか１項に記載の癒着防止材。
［１−９］  スポンジ状積層体が、吸収線量として１０ｋＧｙ〜１５０ｋＧｙの電子線および／またはγ線照射により滅菌されたものである、上記［１−１］〜［１−７］のいずれか１項に記載の癒着防止材。
［１−１０］  少なくとも一部が硬化剤で架橋された低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩をそれぞれ含む第１の層および第２の層を含む生体に適用可能なスポンジ状積層体を含み、第１の層の溶解速度が、第２の層よりも遅い、癒着防止材。
［１−１０ａ］  低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩をそれぞれ含む第１の層および第２の層を含む生体に適用可能なスポンジ状積層体を含み、第１の層の溶解速度が、第２の層よりも遅い、癒着防止材。
［１−１１］  ｐＨ７．５のリン酸緩衝液に対するアルギン酸の１価金属塩の溶出を指標とする溶解試験において、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量を１００％としたときの、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量の割合が、測定開始から１時間の時点で５０％未満、２時間の時点で７０％未満である、上記［１−１０］または［１−１０ａ］の癒着防止材。
［１−１２］  ｐＨ７．５のリン酸緩衝液に対するアルギン酸の１価金属塩の溶出を指標とする溶解試験において、第１の層は、アルギン酸の１価金属塩の２５±１０重量％が１時間以内に溶出し、８０±１０重量％が４時間以内に溶出するものであり、第２の層は、アルギン酸の１価金属塩の７０±１０重量％が１時間以内に溶出し、９０±１０重量％が４時間以内に溶出するものである、上記［１−１０］または［１−１０ａ］の癒着防止材。
［１−１３］  スポンジ状積層体がプレスしたものである、上記［１−１］〜［１−１２］のいずれか１項に記載の癒着防止材。
【００１１】
［２−１］  少なくとも一部が硬化剤で架橋された低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩のスポンジ状の第１の層および第２の層を含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１０，０００〜２，０００，０００であり、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１，０００〜１，０００，０００であり、前記重量平均分子量が脱架橋処理後にＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定したものであり、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量よりも高い、滅菌された、生体に適用可能なスポンジ状積層体を、癒着防止を必要とする対象に、第１の層を創傷部側の表面に向けて適用することを含む、癒着防止方法。
［２−１ａ］  重量平均分子量１０，０００〜２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第１の層と、重量平均分子量１，０００〜１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第２の層とを含み、前記分子量がＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定したものであり、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い、生体に適用可能なスポンジ状積層体を、癒着防止を必要とする対象に適用することを含む、癒着防止方法。
［２−２］  第１の層および第２の層のいずれか一方が、硬化剤を含む上記［２−１］または［２−１ａ］に記載の癒着防止方法。
［２−３］  第１の層および第２の層の両方が、硬化剤を含む上記［２−１］〜［２−２］のいずれか１項に記載の癒着防止方法。
［２−４］  低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の第１の層と第２の層での使用量の合計が、０．１ｍｇ／ｃｍ２〜３ｍｇ／ｃｍ２の範囲である、上記［２−１］〜［２−３］のいずれか１項に記載の癒着防止方法。
［２−５］  第１の層と第２の層のアルギン酸の１価金属塩のエンドトキシン含有量が、５００ＥＵ／ｇ以下である、上記［２−１］〜［２−４］のいずれか１項に記載の癒着防止方法。
［２−６］  第１の層と第２の層のアルギン酸の１価金属塩が、アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸カリウムである、上記［２−１］〜［２−５］のいずれか１項に記載の癒着防止方法。
［２−７］  第１の層と第２の層の硬化剤が、ＣａＣｌ２、ＣａＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＳｒＣｌ２、ＦｅＣｌ３およびＢａＣｌ２からなる群より選択される少なくとも１つの金属イオン化合物である、上記［２−１］〜［２−６］のいずれか１項に記載の癒着防止方法。
［２−８］  スポンジ状積層体が、吸収線量として１０ｋＧｙ〜１５０ｋＧｙの電子線および／またはγ照射により滅菌されたものである、上記［２−１］〜［２−７］のいずれか１項に記載の癒着防止方法。
［２−９］  少なくとも一部が硬化剤で架橋された低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩をそれぞれ含む第１の層および第２の層を含み、第１の層の溶解速度が第２の層よりも遅い、生体に適用可能なスポンジ状積層体を、癒着防止を必要とする対象に適用することを含む、癒着防止方法。
［２−９ａ］  低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩をそれぞれ含む第１の層および第２の層を含み、第１の層の溶解速度が第２の層よりも遅い、生体に適用可能なスポンジ状積層体を、癒着防止を必要とする対象に適用することを含む、癒着防止方法。
［２−１０］  ｐＨ７．５のリン酸緩衝液に対するアルギン酸の１価金属塩の溶出を指標とする溶解試験において、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量を１００％としたときの、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量の割合が、測定開始から１時間の時点で５０％未満、２時間の時点で７０％未満である、上記［２−９］または［２−９ａ］の癒着防止材。
［２−１１］  ｐＨ７．５のリン酸緩衝液に対するアルギン酸の１価金属塩の溶出を指標とする溶解試験において、第１の層は、アルギン酸の１価金属塩の２５±１０重量％が１時間以内に溶出し、８０±１０重量％が４時間以内に溶出するものであり、第２の層は、アルギン酸の１価金属塩の７０±１０重量％が１時間以内に溶出し、９０±１０重量％が４時間以内に溶出するものである、上記［２−９］または［２−９ａ］の癒着防止方法。
［２−１２］  スポンジ状積層体がプレスしたものである、上記［２−１］〜［２−１１］のいずれか１項に記載の癒着防止方法。【００１２】
［３−１］  以下の工程を含む、生体に適用可能なスポンジ状積層体を含む癒着防止材の製造方法。
（１）重量平均分子量１０，０００〜２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化させる工程、
（２）硬化したアルギン酸の１価金属塩を凍結する工程、
（３）（２）で得られたアルギン酸の１価金属塩の上で、重量平均分子量１，０００〜１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化して積層体を得る工程、
（４）得られた積層体を凍結乾燥してスポンジ状積層体を得る工程、
ここで、前記分子量がＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定したものであり、
前記スポンジ状積層体は、重量平均分子量１０，０００〜２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第１の層と、重量平均分子量１，０００〜１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第２の層とを含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い。
［３−２］  スポンジ状積層体が、吸収線量として１０ｋＧｙ〜１５０ｋＧｙの電子線および／またはγ照射により滅菌されたものである、上記［３−１］に記載の癒着防止材の製造方法。
［３−３］  （４）で得られた積層体をプレスする工程をさらに含む、上記［３−１］または［３−２］に記載の癒着防止材の製造方法。【００１３】
［４−１］  以下の工程（１）〜（４）により得られる生体に適用可能なスポンジ状積層体。
（１）重量平均分子量１０，０００〜２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化させる工程、
（２）硬化したアルギン酸の１価金属塩を凍結する工程、
（３）（２）で得られたアルギン酸の１価金属塩の上で、重量平均分子量１，０００〜１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化して積層体を得る工程、
（４）得られた積層体を凍結乾燥してスポンジ状積層体を得る工程、
ここで、前記分子量がＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定したものであり、
前記スポンジ状積層体は、重量平均分子量１０，０００〜２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第１の層と、重量平均分子量１，０００〜１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第２の層とを含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い。
［４−２］  癒着防止材として用いる、上記［４−１］のスポンジ状積層体。
［４−３］  スポンジ状積層体が、吸収線量として１０ｋＧｙ〜１５０ｋＧｙの電子線および／またはγ照射により滅菌されたものである、上記［４−１］または［４−２］に記載のスポンジ状積層体。
［４−４］  （４）で得られた積層体をプレスする工程をさらに含む、上記［４−１］〜［４−３］のいずれか１項に記載のスポンジ状積層体。【００１４】
［５−１］  重量平均分子量１０，０００〜２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含む第１の原料と、重量平均分子量１，０００〜１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含む第２の原料とを含み、第１の原料の重量平均分子量が第２の原料よりも高い、癒着防止材を製造するための原料の組合せ。
［５−２］スポンジ状積層体の製造に用いるためのものである、上記［５−１］に記載の原料の組合せ。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、癒着防止効果が高い、創傷部の癒着とｄｅ  ｎｏｖｏ癒着の両方を抑えることができる、適用した生体に悪影響を及ぼさない、創傷部の治癒を妨げない、腸管吻合などにも使用できる、内視鏡手術においてトロッカーを介した適用が容易である、貼付位置を調整して貼り直すことが可能である、等の少なくとも一つの性能を有する癒着防止材を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】癒着防止材の一例を示す図である。
【図２】癒着防止材の各層の溶解速度の評価を示す図である。
【図３】一部肝臓切除モデルでの癒着形成の評価を示す図である。（Ａ）離断面で癒着形成した個体の数、（Ｂ）離断面グレード、（Ｃ）離断面Ｅｘｔｅｎｔ（ｍｍ）。**  ｐ＜０．０１、*  ｐ＜０．０５。
【図４】一部肝臓切除モデルでの癒着形成の評価を示す図である。（Ａ）非離断面で癒着形成した個体の数、（Ｂ）非離断面グレード、（Ｃ）非離断面Ｅｘｔｅｎｔ（ｍｍ）。**  ｐ＜０．０１、*  ｐ＜０．０５。
【図５】一部肝臓切除モデルでの体重変化および脾臓重量の評価を示す図である。（Ａ）体重変化、（Ｂ）脾臓重量。
【図６】ペアン肝臓切除モデルでの癒着形成の評価を示す図である。（Ａ）離断面で癒着形成した個体の数、（Ｂ）離断面グレード、（Ｃ）離断面Ｅｘｔｅｎｔ（ｍｍ）。**  ｐ＜０．０１、*  ｐ＜０．０５。
【図７】ペアン肝臓切除モデルでの癒着形成の評価を示す図である。（Ａ）非離断面で癒着形成した個体の数、（Ｂ）非離断面グレード、（Ｃ）非離断面Ｅｘｔｅｎｔ（ｍｍ）。**  ｐ＜０．０１、*  ｐ＜０．０５。
【図８】ペアン肝臓切除モデルでの体重変化および脾臓重量の評価を示す図である。（Ａ）体重変化、（Ｂ）脾臓重量。
【図９】プレス前後のスポンジの膨潤試験結果を示す図である。
【図１０】霧吹き後の各試験片先端の高さ（Ａ）および試験台からの角度（Ｂ）の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の実施の形態は本発明を説明するための例示であり、本発明はその要旨を逸脱しない限りさまざまな形態で実施することができる。
【００１８】
１．癒着防止
「癒着」とは、互いに分離しているべき組織の表面が線維性の組織で連結または融合された状態のことをいう。癒着の原因は、外科手術において組織の表面にできる外傷や、外傷により引き起こされる炎症、外科手術において組織表面が乾燥することによる炎症などである。これらの外傷や炎症に伴い組織の表面にフィブリンを含む滲出液が生じ、この滲出液が器質化して組織表面が連結または融合されることにより癒着が形成される。
【００１９】
「癒着防止」とは、癒着の形成を減少させることをいう。癒着防止は、必ずしも癒着の形成を完全に防止することまでも必要とせず、本発明の癒着防止材を適用しなかった場合の状態と比較して、癒着の形成が防止されていればよい。すなわち「癒着防止」は癒着の軽減と言い換えてもよく、例えば、癒着の頻度、範囲および程度から選ばれる少なくとも１つが軽減されていればよい。「癒着防止」は、例えば、実施例に記載した癒着のグレード評価を行った場合に、本発明の癒着防止材を適用しなかった場合の平均癒着のグレードと比較して、平均癒着のグレードがより低くなっていればよい。あるいは、「癒着防止」は、例えば、実施例に記載した癒着のＥｘｔｅｎｔ評価を行った場合に、本発明の癒着防止材を適用しなかった場合の平均癒着のＥｘｔｅｎｔと比較して、平均癒着のＥｘｔｅｎｔがより低くなっていればよい。「癒着防止」は、好ましくは、外科手術に起因して生じる癒着、より好ましくは、外科手術に起因して生じる腹膜癒着の防止である。すなわち、「癒着防止」は、好ましくは、術後の癒着防止である。
また、実施例に示したとおり、対象となる癒着としては、手術時の対象臓器の切除した部位の癒着およびｄｅ  ｎｏｖｏ癒着（手術部位以外の周辺および腹腔および体内での広範な部位との癒着）がある。
【００２０】
２．癒着防止材
本発明は、少なくとも一部が硬化剤で架橋された低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩のスポンジ状の第１の層および第２の層を含み、重量平均分子量が比較的高い低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第１の層と、重量平均分子量が比較的低い低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第２の層を含む生体に適用可能なスポンジ状積層体を含む、癒着防止材（以下、「癒着防止材Ａ」という場合がある）を提供する。第１の層と第２の層で用いる低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量は、それぞれ、例えば、１０，０００〜２，０００，０００と、１，０００〜１，０００，０００である。このような重量平均分子量は脱架橋処理、例えばキレート剤溶液に溶解した後にＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定したものである。
なお、本明細書において、数値範囲に「〜」の記号を用いる場合、「下限値以上、上限値以下」を意味するものであり、記号の両端の数値は当該範囲に含まれる。
【００２１】
癒着防止材Ａは、スポンジ状積層体の第１の層と第２の層に、異なる分子量の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩が含まれる。具体的には、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い。アルギン酸の１価金属塩を含む層は、アルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が大きければ溶解速度が遅くなり、一方、重量平均分子量が小さければ溶解速度が速くなる。このため、第１の層を創傷部側、第２の層を腹腔側に向けて本発明の癒着防止材Ａを適用することで、第１の層は、創傷部に残留するとともに、第２の層は比較的速く溶解して腹腔内全般の癒着を抑えることが期待できる。
【００２２】
また、本発明は、少なくとも一部が硬化剤で架橋された低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩をそれぞれ含む第１の層および第２の層を含む生体に適用可能なスポンジ状積層体を含み、第１の層と第２の層の溶解速度が異なる、癒着防止材（「癒着防止材Ｂ」）を提供する。具体的には、第１の層の溶解速度が、第２の層よりも遅い。第１の層の溶解速度が第２の層の溶解速度よりも遅くなるようにするには、例えば、癒着防止材Ａのように第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量を第２の層よりも高いものとすること、架橋剤の種類を変更する、または架橋剤の濃度を変更する、等により第１の層のアルギン酸の１価金属塩の架橋度を第２の層よりも高いものとすること、などが挙げられる。
【００２３】
好ましくは、癒着防止材Ｂは、アルギン酸の１価金属塩の溶出を指標とする溶解試験において、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量を１００％としたときの、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量の割合が、測定開始から１時間の時点で５０％未満、２時間の時点で７０％未満であるものである。
別の好ましい例として、癒着防止材Ｂは、アルギン酸の１価金属塩の溶出を指標とする溶解試験において、第１の層は、アルギン酸の１価金属塩の２５±１０重量％が１時間以内に溶出し、８０±１０重量％が４時間以内に溶出するものであり、第２の層は、アルギン酸の１価金属塩の７０±１０重量％が１時間以内に溶出し、９０±１０重量％が４時間以内に溶出するものである。溶解試験は、具体的には、後述の実施例に記載の通りである。
【００２４】
ここで、本明細書中、「癒着防止材Ａ」と「癒着防止材Ｂ」を合わせて、「癒着防止材」という場合がある。また、「第１の層」は、スポンジ状積層体を対象に適用したときに下層となる層、すなわち、対象の適用すべき組織の表面と接触する側の層である。「第２の層」は、スポンジ状積層体を対象に適用したときに上層となる層、すなわち、対象の適用すべき組織の表面と接触しない側の層である。「生体に適用可能」とは、医療材料として適用すべき組織の表面に配置することが可能であることを意味する。
【００２５】
癒着防止材に用いられる生体に適用可能なスポンジ状の積層体は、上記の第１の層、第２の層以外に、任意の成分を含む第３の層を有していてもよく、また、多層構造を有していてもよい。また、各層が明瞭な境界面を持たず、分子量が連続的に漸増または漸減するような構造を有するスポンジ状積層体も含まれる。
【００２６】
癒着防止材の一例を、図１に示す。癒着防止材１は、第１の層２と第２の層３とを含むスポンジ状積層体４を含む。第１の層２と第２の層３は、それぞれスポンジ状である。「スポンジ状」とは、多孔性を有した状態を意味する。
【００２７】
生体に適用可能なスポンジ状積層体の形状は特に限定されず、適用する表面の範囲、形状、凹凸などを考慮し適宜選択することができる。スポンジ状積層体の形状は、例えば、図１に示すような平板状であってもよいし、あるいは円板状、円筒状、直方体状などの形状をとることができる。好ましくは平板状または円板状である。平板状や円板状のとき、適用する表面の範囲、形状、凹凸などに合わせて癒着防止材をさらに切断して表面に適用することができるため、平板や円板のサイズは特に限定されない。例えば、平板状の形状を、縦×横×高さ（厚さ）で表すと、縦と横の長さは特に限定されず、高さ（厚さ）は、好ましくは０．２ｍｍ〜３０ｍｍであり、より好ましくは０．３ｍｍ〜１５ｍｍ、さらに好ましくは０．５ｍｍ〜１０ｍｍである。さらに好ましくは、そのような高さ（厚さ）であることに加えて、縦と横の長さは、それぞれ、１ｍｍ〜３００ｍｍｘ１ｍｍ〜３００ｍｍであり、特に好ましくは、３ｍｍ〜２００ｍｍｘ３ｍｍ〜２００ｍｍであり、さらに好ましくは、５ｍｍ〜１５０ｍｍｘ５ｍｍ〜１５０ｍｍである。なお、厚さは均一でなくても良く、一方が厚くて他方が薄い、傾斜構造であってもよい。
【００２８】
本発明の癒着防止材のスポンジ状積層体は、Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）と比較して、柔軟性が高く、割れにくい。
【００２９】
いくつかの態様では、スポンジ状積層体はプレスしたものである。「プレス」は後述の通りである。スポンジ状積層体がプレスしたものである場合、その高さ（厚さ）は、好ましくは、０．０２ｍｍ〜３ｍｍであり、より好ましくは０．０３ｍｍ〜１．５ｍｍ、さらに好ましくは０．０５ｍｍ〜１ｍｍである。さらに好ましくは、そのような高さ（厚さ）であることに加えて、縦と横の長さは、それぞれ、１ｍｍ〜３００ｍｍｘ１ｍｍ〜３００ｍｍであり、特に好ましくは、３ｍｍ〜２００ｍｍｘ３ｍｍ〜２００ｍｍであり、さらに好ましくは、５ｍｍ〜１５０ｍｍｘ５ｍｍ〜１５０ｍｍである。なお、いくつかの態様ではプレス後の厚さは均一である。
【００３０】
３．アルギン酸の１価金属塩
「アルギン酸の１価金属塩」は、アルギン酸の６位のカルボン酸の水素原子を、Ｎａ＋やＫ＋などの１価金属イオンとイオン交換することでつくられる水溶性の塩である。アルギン酸の１価金属塩としては、具体的には、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムなどを挙げることができるが、特には、市販品により入手可能なアルギン酸ナトリウムが好ましい。アルギン酸の１価金属塩の溶液は、硬化剤と混合したときにゲルを形成する。
【００３１】
本発明に用いる「アルギン酸」は、生分解性の高分子多糖類であって、Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）とＬ−グルロン酸（Ｇ）という２種類のウロン酸が直鎖状に重合したポリマーである。より具体的には、Ｄ−マンヌロン酸のホモポリマー画分（ＭＭ画分）、Ｌ−グルロン酸のホモポリマー画分（ＧＧ画分）、およびＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸がランダムに配列した画分（ＭＧ画分）が任意に結合したブロック共重合体である。アルギン酸のＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸の構成比（Ｍ／Ｇ比）は、主に海藻等の由来となる生物の種類によって異なり、また、その生物の生育場所や季節による影響を受け、Ｍ／Ｇ比が約０．４の高Ｇ型からＭ／Ｇ比が約５の高Ｍ型まで高範囲にわたる。
【００３２】
アルギン酸の１価金属塩は高分子多糖類であり、分子量を正確に定めることは困難であり、天然物由来の高分子物質の分子量測定では、測定方法により値に違いが生じうることが知られている。
【００３３】
ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法によれば、絶対重量平均分子量を測定することができる。原料として用いるアルギン酸の１価金属塩の、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量は、スポンジ状積層体の第１の層では、例えば、１０，０００〜２，０００，０００であり、好ましくは、１５，０００〜１，５００，０００であり、より好ましくは、２０，０００〜１，０００，０００であり、特に好ましくは、２５，０００〜５００，０００である。そのような第１の層であることに加えて、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量は、第２の層では、例えば、１，０００〜１，０００，０００であり、好ましくは、１，０００〜５００，０００であり、より好ましくは、２，０００〜２５０，０００であり、特に好ましくは、３，０００〜１００，０００である。
【００３４】
いくつかの態様、例えば、電子線および／またはγ線滅菌による照射後においては、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量は、スポンジ状積層体の第１の層では、例えば、１０，０００〜３００，０００であり、好ましくは、１０，０００〜２００，０００であり、より好ましくは、１０，０００〜１００，０００であり、特に好ましくは、１０，０００〜８０，０００である。そのような第１の層であることに加えて、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量は、第２の層では、例えば、１，０００〜１００，０００であり、好ましくは、１，０００〜８０，０００であり、より好ましくは、２，０００〜６０，０００であり、特に好ましくは、３，０００〜６０，０００である。
少なくとも一部が硬化剤で架橋されたアルギン酸の１価金属塩については、任意の脱架橋処理後にＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定することにより、架橋されていないアルギン酸の１価金属塩としての重量平均分子量を測定することができる。脱架橋処理としては、例えば、任意のキレート剤、例えばＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、フィチン酸などのキレート剤溶液に溶解することが挙げられる。用いるキレート剤としてはＥＤＴＡが好ましい。
【００３５】
スポンジ状積層体の第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い。スポンジ状積層体の原料、あるいはスポンジ状積層体に含まれる第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量は、第２の層よりも、例えば１，０００〜１,０００,０００高く、好ましくは２，０００〜５００，０００高く、より好ましくは、３，０００〜３００，０００高い。
【００３６】
通常、高分子多糖類の分子量を上記のような手法で算出する場合、１０〜２０重量％の測定誤差を生じうる。例えば、１０，０００であれば８，０００〜１２，０００、１００，０００であれば８０，０００〜１２０，０００、２００，０００であれば１６０，０００〜２４０，０００、４００，０００であれば３２０，０００〜４８０，０００、５００，０００であれば４００，０００〜６００，０００程度の範囲で値の変動が生じうる。
アルギン酸類の分子量の測定は、常法に従い測定することができる。分子量測定にＧＰＣ−ＭＡＬＳを用いる場合の代表的な条件は、本明細書の実施例１に記載のとおりである。検出器として、例えば、ＲＩ検出器と光散乱検出器（ＭＡＬＳ）を用いることができる。
【００３７】
アルギン酸類は、褐藻類から抽出された当初は一般的に分子量が大きいが、熱による乾燥、精製などの過程で、徐々に分子量が小さくなる。製造工程の温度等の条件管理、原料とする褐藻類の選択、製造工程における分子量の分画などの手法により分子量の異なるアルギン酸類を製造することができる。さらに、異なる分子量を持つ別ロットのアルギン酸類と混合することにより、目的とする分子量を有するアルギン酸類とすることも可能である。
【００３８】
本発明で用いられるアルギン酸の１価金属塩は、低エンドトキシン処理されたものである。低エンドトキシン処理は、公知の方法またはそれに準じる方法によって行うことができる。例えば、ヒアルロン酸ナトリウムを精製する、菅らの方法（例えば、特開平９−３２４００１号公報など参照）、β１，３−グルカンを精製する、吉田らの方法（例えば、特開平８−２６９１０２号公報など参照）、アルギネート、ゲランガム等の生体高分子塩を精製する、ウィリアムらの方法（例えば、特表２００２−５３０４４０号公報など参照）、ポリサッカライドを精製する、ジェームスらの方法（例えば、国際公開第９３／１３１３６号パンフレットなど参照）、ルイスらの方法（例えば、米国特許第５５８９５９１号明細書など参照）、アルギネートを精製する、ハーマンフランクらの方法（例えば、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９４）４０：６３８−６４３など参照）等またはこれらに準じる方法によって実施することができる。本発明の低エンドトキシン処理は、それらに限らず、洗浄、フィルター（エンドトキシン除去フィルターや帯電したフィルターなど）によるろ過、限外ろ過、カラム（エンドトキシン吸着アフィニティーカラム、ゲルろ過カラム、イオン交換樹脂によるカラムなど）を用いた精製、疎水性物質、樹脂または活性炭などへの吸着、有機溶媒処理（有機溶媒による抽出、有機溶剤添加による析出・沈降など）、界面活性剤処理（例えば、特開２００５−０３６０３６号公報など参照）など公知の方法によって、あるいはこれらを適宜組合せて実施することができる。これらの処理の工程に、遠心分離など公知の方法を適宜組み合わせてもよい。アルギン酸の種類に合わせて適宜選択するのが望ましい。
【００３９】
エンドトキシンレベルは、公知の方法で確認することができ、例えば、リムルス試薬（ＬＡＬ）による方法、エンドスペシー（登録商標）ＥＳ−２４Ｓセット（生化学工業株式会社）を用いる方法などによって測定することができる。
【００４０】
本発明に用いられるアルギン酸の１価金属塩のエンドトキシンの処理方法は特に限定されないが、その結果として、生体内吸収性多糖類のエンドトキシン含有量が、リムルス試薬（ＬＡＬ）によるエンドトキシン測定を行った場合に、５００エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは、１００ＥＵ／ｇ以下、とりわけ好ましくは、５０ＥＵ／ｇ以下、特に好ましくは、３０ＥＵ／ｇ以下である。低エンドトキシン処理されたアルギン酸ナトリウムは、例えば、Ｓｅａ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）（持田製薬株式会社）、ＰＲＯＮＯＶＡＴＭ  ＵＰ  ＬＶＧ（ＦＭＣＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ）など市販品により入手可能である。
【００４１】
スポンジ状積層体におけるアルギン酸の１価金属塩の使用量は、癒着防止効果を考慮して、適宜選択することができる。アルギン酸の１価金属塩の使用量は、スポンジ状積層体の第１の層と第２の層の合計で、例えば、０．１ｍｇ／ｃｍ２〜１０．０ｍｇ／ｃｍ２が挙げられ、好ましくは、０．１ｍｇ／ｃｍ２〜３．０ｍｇ／ｃｍ２であり、より好ましくは、０．５ｍｇ／ｃｍ２〜２．５ｍｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは、１．８ｍｇ／ｃｍ２〜２．２ｍｇ／ｃｍ２であり、特に好ましくは、２．０ｍｇ／ｃｍ２である。アルギン酸の１価金属塩の使用量が、スポンジ状積層体の第１の層と第２の層の合計で、１．０ｍｇ／ｃｍ２〜３．０ｍｇ／ｃｍ２であることで、より高い癒着防止効果が期待できる。使用量が１０．０ｍｇ／ｃｍ２以下であれば、生体内の蓄積や特定臓器の肥大などの有害事象のおそれが少なく、使用量が０．１ｍｇ／ｃｍ２以上であれば十分な癒着防止効果が期待できる。
【００４２】
第１の層と第２の層のアルギン酸の１価金属塩の使用量の比（重量比）は、好ましくは、１：２０〜２０：１であり、より好ましくは、１：５〜５：１であり、さらに好ましくは、１：３〜３：１であり、特に好ましくは、１：２〜２:１である。
【００４３】
４．硬化剤（架橋剤）
癒着防止材は、第１の層および第２の層のいずれか一方が硬化剤を含有してもよく（すなわち、第１の層および第２の層のいずれか一方が硬化剤を含有しなくてもよく）、あるいは、第１の層および第２の層の両方が硬化剤を含有してもよい。
あるいは、癒着防止材は、第１の層および第２の層のいずれもが硬化剤を含有していなくてもよい。
【００４４】
ここで、いくつかの態様では、第１の層および第２の層は、少なくとも一部が硬化剤で架橋されたものである。
【００４５】
硬化剤は、アルギン酸の１価金属塩の溶液を架橋することにより、硬化するものである。硬化剤は、例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋などの２価以上の金属イオン化合物、分子内に２〜４個のアミノ基を有する架橋性試薬などが挙げられる。より具体的には、２価以上の金属イオン化合物として、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣａＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＢａＣｌ２、ＳｒＣｌ２等（好ましくは、ＣａＣｌ２、ＣａＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＳｒＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＢａＣｌ２等）を、分子内に２〜４個のアミノ基を有する架橋性試薬として、窒素原子上にリジル（ｌｙｓｙｌ）基（−ＣＯＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）４−ＮＨ２）を有することもあるジアミノアルカン、すなわちジアミノアルカンおよびそのアミノ基がリジル基で置換されてリジルアミノ基を形成している誘導体が包含され、具体的にはジアミノエタン、ジアミノプロパン、Ｎ−（リジル）−ジアミノエタン等を挙げることができる。
【００４６】
第１層および第２層における硬化剤の使用量は、アルギン酸の一価金属塩の使用量や分子量などに応じて適宜調節するのが望ましい。硬化剤を使用する場合、第１の層における硬化剤の使用量は、例えば、０．１μｍｏｌ／ｃｍ２〜１００μｍｏｌ／ｃｍ２であり、好ましくは、０．５μｍｏｌ／ｃｍ２〜２．０μｍｏｌ／ｃｍ２である。硬化剤を使用する場合、第２の層における硬化剤の使用量は、例えば、０．１μｍｏｌ／ｃｍ２〜１０μｍｏｌ／ｃｍ２であり、好ましくは、０．６μｍｏｌ／ｃｍ２〜２．４μｍｏｌ／ｃｍ２である。
【００４７】
５．癒着防止材の作製方法
生体適用可能なスポンジ状積層体を含む癒着防止材や生体適用可能なスポンジ状積層体は、例えば、以下の工程を経て作製することができる。
【００４８】
（１）重量平均分子量１０，０００〜２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化させる工程、
（２）硬化したアルギン酸の１価金属塩を凍結する工程、
（３）（２）で得られたアルギン酸の１価金属塩の上で、重量平均分子量１，０００〜１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化して積層体を得る工程、
（４）得られた積層体を凍結乾燥してスポンジ状積層体を得る工程。
【００４９】
上記工程（１）では、先ず、重量平均分子量１０，０００〜２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩（以下、「第１のアルギン酸塩」という）の溶液と硬化剤の溶液を準備する。第１のアルギン酸塩の溶液と硬化剤の溶液は、公知の方法またはそれに準じる方法により調製することができる。溶媒は、生体へ適用可能な溶媒であれば特に限定されないが、好ましくは水性溶媒であり、例えば、精製水、純水（例えば、蒸留水、イオン交換水）、ミリＱ水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ＤＭＳＯなどであり、より好ましくは、純水である。これらは、滅菌されていることが好ましく、低エンドトキシン処理されたものが好ましい。
【００５０】
そして、第１のアルギン酸塩の溶液と硬化剤の溶液を混合することにより、第１のアルギン酸塩を硬化させることができる。
【００５１】
上記工程（２）では、工程（１）で硬化させた第１のアルギン酸塩を、常法により凍結させる。工程（３）の前に一度凍結させることにより、第１の層と第２の層が混和する割合を低減することができる。凍結温度および時間は、例えば、−２０℃で４時間である。
【００５２】
上記工程（３）では、先ず、重量平均分子量１，０００〜１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩（以下、「第２のアルギン酸塩」という）の溶液と硬化剤の溶液を準備する。第２のアルギン酸塩の溶液と硬化剤の溶液は、公知の方法またはそれに準じる方法により調製することができる。溶媒は、上記工程（１）で説明したものと同様である。
【００５３】
そして、第２のアルギン酸塩の溶液と硬化剤の溶液を混合することにより、第２のアルギン酸塩を硬化させることができる。
【００５４】
さらに硬化させた第２のアルギン酸塩を、工程（４）の前に凍結させるようにしてもよい。凍結温度および時間は、例えば、−２０℃で４時間である。
【００５５】
上記工程（４）では、工程（３）で得られた積層体を凍結乾燥してスポンジ状積層体を得る。凍結乾燥は、公知の方法により行うことができる。凍結乾燥の条件は適宜調節可能であり、一次乾燥工程、二次乾燥工程等を設けてもよい。
【００５６】
これらの工程により、第１のアルギン酸塩と硬化剤を含むスポンジ状の第１の層と、第２のアルギン酸塩と硬化剤を含むスポンジ状の第２の層を含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い、生体適用可能なスポンジ状積層体、ならびにそのスポンジ状積層体を含む癒着防止材を得ることができる。
【００５７】
なお、上記の方法では、最初に、第１のアルギン酸塩と硬化剤を含むスポンジ状の第１の層を作製し、その上に、第２のアルギン酸塩と硬化剤を含むスポンジ状の第２の層を作製しているが、最初に、第２の層を作製し、その上に、第１の層を作製するようにしてもよい。この場合、スポンジ状積層体は、例えば、以下の工程を経て作製することができる。
（１’）第２のアルギン酸塩を硬化剤により硬化させる工程、
（２’）硬化した第２のアルギン酸塩を凍結する工程、
（３’）（２’）で得られた第２のアルギン酸塩の上で、第１のアルギン酸塩を硬化剤により硬化して積層体を得る工程、
（４’）得られた積層体を凍結乾燥してスポンジ状積層体を得る工程。
各工程の具体的な説明は、前記の方法と同様である。
【００５８】
あるいは、第１のアルギン酸塩を硬化させて凍結乾燥することでスポンジ状の第１の層を作製し、別途、第２のアルギン酸塩を硬化させて凍結乾燥することでスポンジ状の第２の層を作製し、得られたスポンジ状の各層を貼り合わせることにより、スポンジ状積層体を得ることも可能である。
各工程の具体的な説明は、前記の方法と同様である。
【００５９】
第１のアルギン酸塩および第２のアルギン酸塩を硬化させるときに、所望の大きさ、高さおよび形状の容器、型、基板、多孔膜、不織布、織布などを用いることで、所望の大きさ、高さおよび形状のスポンジ状積層体を含む、癒着防止材を得ることができる。
【００６０】
癒着防止材のスポンジ状積層体は、さらに、滅菌処理がなされていることが好ましい。滅菌は、γ線滅菌、電子線滅菌、エチレンオキシドガス滅菌、エタノール滅菌等が挙げられ、これらに限定されない。より好ましくは、癒着防止材は、電子線および／またはγ線照射により滅菌処理がされる。高分子材料をγ線、電子線等で照射処理することにより、好ましくは、生体内での貯留性を制御した生体適合性の高い医用材料が得られる（例えば、特開２０００−２３７２９４号参照）。
電子線および／またはγ線滅菌する場合の照射条件として、例えば、吸収線量が１０ｋＧｙ〜１５０ｋＧｙが挙げられ、より好ましくは２０ｋＧｙ〜１００ｋＧｙが挙げられ、さらに好ましくは４０ｋＧｙ〜８０ｋＧｙが挙げられる。電子線および／またはγ線滅菌する場合の照射条件の別の好ましい態様として、例えば、吸収線量が２０ｋＧｙ〜８０ｋＧｙ、２０ｋＧｙ〜６０ｋＧｙ、４０ｋＧｙ〜６０ｋＧｙ等が挙げられる。γ線滅菌よりも電子線滅菌が好ましい。
【００６１】
いくつかの態様では、上記工程（４）などで得られた積層体をプレスする工程をさらに含む。プレスは、手動で、あるいはプレス機によって積層体を挟み、加圧することで行う。また、一般的に用いられる圧縮、薄層化などの工程も、本発明でいうプレスに含まれるものとする。プレス圧力としては、例えば１ｋＰａ〜１００ＭＰａが挙げられ、より好ましくは１０ｋＰａ〜８０ＭＰａ、さらに好ましくは１００ｋＰａ〜６０Ｍｐａが挙げられる。手動でのプレスは、積層体に均一に圧がかかるように手で押圧できるもの、例えば、アクリル定規、アクリル板、ガラス板、金属板等を介して行う。また、用いるプレス機としては、例えば、ホットプレス機（アズワン株式会社製  ＡＨ−１Ｔ）が挙げられる。
【００６２】
６．使用方法
癒着防止材は、癒着防止を必要とする対象に適用することにより使用される。好ましくは、癒着防止材は、通常、癒着防止効果を奏するのに必要な１週間程度、適用局所に滞留した後に吸収分解され、最終的には１〜２カ月程度で代謝・排泄されてなくなるため、安全性に優れる。
【００６３】
癒着防止材は、創傷部の表面、例えば外科手術に関連した組織の表面に適用するようにしてもよい。
【００６４】
「外科手術に関連した組織」とは、外科手術において表面に外傷を負った組織や、外科手術において表面が乾燥することにより炎症が生じたまたは炎症が生じる恐れのある組織である。外科手術に関連した組織は、好ましくは、腹膜に包まれている臓器（例えば、胃、空腸、回腸、虫垂、結腸、肝臓、脾臓、十二指腸、および膵臓）である。本発明の好ましい態様の癒着防止材は、肝切除後に生じる癒着のような重篤な癒着を効果的に防止することができる。
【００６５】
また、「適用する」とは、癒着防止材を、創傷部の表面（例えば、外科出術に関連した組織の表面）に置くことをいう。具体的には、スポンジ状積層体の第１の層の表面が創傷部側の表面（例えば、組織の表面）と接触し、第２の層の表面が創傷部側の表面（例えば、組織の表面）とは反対側（例えば、腹腔側）を向くように、癒着防止材を創傷部側の表面（例えば、外科手術に関連した組織の表面）に置くようにする。スポンジ状積層体の第１の層は比較的重量平均分子量が高いため、組織の表面に癒着を防止するのに十分な時間分解されずに残留し、創傷面の物理的バリアとして働く。一方、スポンジ状積層体の第２の層は比較的重量平均分子量が低いため、速やかに溶けて広がり、非創傷面の癒着防止の役割を果たす。
【００６６】
好ましくは、癒着防止材のスポンジ状積層体は、Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）と比較して、柔軟性が高く、割れにくい。このため、好ましい態様では、癒着防止材は、適用する組織の表面に規定されず、例えば、腸管吻合の際にも腸管に巻き付けて使用できる。また、別の好ましい態様では、内視鏡を用いた外科手術の際にも、手術器具を対象において出し入れする通路から、容易に挿入できる。さらに別の好ましい態様では、癒着防止材は、貼りなおしが可能である。
また、好ましくは、癒着防止材のスポンジ積層体は、ＩＮＴＥＲＣＥＥＤ（商品名）と比較して、癒着防止対象が広範である。
【００６７】
好ましくは、癒着防止材は、適用する表面の範囲、形状、凹凸などに応じて適当な大きさのものを準備し、癒着防止すべき外科手術に関連した組織の表面に適用する。「対象」は、ヒト、またはヒト以外の生物、例えば、トリおよび非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、およびウマ）である。
【００６８】
癒着防止材のスポンジ積層体、とりわけスポンジ積層体がプレスしたものである場合には、コンパクトにまとめることができるので、例えば、内視鏡手術においてトロッカー等を介して癒着防止材を患部に比較的容易に適用することができる。そして、患部に適用された癒着防止材は、好ましくは、患部に存在する水分あるいは患部に適用された水分を吸収して厚みが回復する。
【００６９】
好ましくは、癒着防止材は、Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）やＩＮＴＥＲＣＥＥＤ（商品名）と同様に、対象において安全に使用できる。
【００７０】
外科手術に関連した組織の表面に適用した後、癒着防止材と外科手術に関連した組織の表面の縫合は通常は必要ないが、必要に応じて、癒着防止材と外科手術に関連した組織の表面を縫合してもよい。
【００７１】
また、スポンジ状積層体を、癒着防止を必要とする対象に適用することを含む、癒着防止方法が提供される。具体的な方法は、前述の通りである。
【００７２】
また、癒着防止材を製造するための、スポンジ状積層体の使用が提供される。具体的な使用は、前述の通りである。
【００７３】
さらに、癒着防止のためのスポンジ状積層体が提供される。具体的な、スポンジ状積層体は、前述の通りである。
【００７４】
７．併用薬
本発明の癒着防止材を外科手術に関連した組織に適用する前に、あるいは同時に、あるいは後で、ストレプトマイシン、ペニシリン、トブラマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、およびアンホテリシンＢ等の抗生物質、アスピリン、非ステロイド性解熱鎮痛剤（ＮＳＡＩＤｓ）、アセトアミノフェン等の抗炎症薬等の併用薬を投与するようにしてもよい。これらの薬剤は本発明の癒着防止材に混入して用いてもよい。
スポンジ状積層体は多孔性で吸水力もあるため、例えば、無孔性のＳｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）に比べて、用時調整による薬物担持が容易である。薬剤溶液をスポンジに含浸させ、投与することで、腹腔、胸腔、心腔等において、癒着防止と薬物の局所徐放が同時に達成できる。さらに溶解速度が異なる層に薬物を担持することにより、速い徐放速度と遅い徐放速度での薬物の徐放も可能となる。
【００７５】
なお、本明細書において引用した全ての刊行物、例えば、先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、その全体が本明細書において参照として組み込まれる。
【００７６】
以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではない。
【実施例】
【００７７】
実施例１：アルギン酸積層スポンジの作製
アルギン酸積層スポンジを、以下のように作製した。【００７８】
［試薬］
アルギン酸積層スポンジの調製に用いた各試薬は以下の通りである。
低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムは、持田製薬株式会社から入手した。
・ＡＬ１０：（Ｌｏｔ  ＮＯ．５Ｋ１２２０２），エンドトキシン量４ＥＵ／ｇ。
・ＡＬ５００：（Ｌｏｔ  ＮＯ．ＢＬ１５０７１３−５００），エンドトキシン量１９ＥＵ／ｇ。
塩化カルシウムは、和光純薬工業株式会社から入手した（商品コード：０３６−００４８５）。【００７９】
［使用機器］
３５ｍｍ無処理ディッシュ（ＩＷＡＫＩ社  商品コード１０００−０３５）
マイクロピペット（Ｇｉｌｓｏｎ社  ピペットマン（商品名））
純水製造装置（メルクミリポア社  Ｅｌｉｘ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ＵＶ５（商品名））
冷凍庫（ＳＨＡＲＰ社  ＳＪ−５６Ｓ（商品名））
凍結乾燥器（ＴＡＩＴＥＣ社  ＶＤ−５５０Ｒ（商品名））【００８０】
［調製手順］
（１）溶液の調製
ＡＬ５００を１．０ｗｔ％の濃度で純水に溶解させて、ＡＬ５００溶液を調製した。同様に、ＡＬ１０を１．０ｗｔ％の濃度で純水に溶解させて、ＡＬ１０溶液を調製した。さらに、塩化カルシウムを純水に溶解させ、１０ｍＭおよび１５ｍＭの塩化カルシウム水溶液をそれぞれ調製した。【００８１】
（２）ＡＬ５００層（下層）の調製
ＡＬ５００溶液１．０ｍＬおよび１０ｍＭ塩化カルシウム水溶液１．０ｍＬをマイクロピペットを使用して３５ｍｍ無処理ディッシュに加え、ピペッティングによって均一になるように混合した。これを一晩静置し、ゲル化させた。ディッシュを冷凍庫に移し、−２０℃で４時間凍結させた。【００８２】
（３）ＡＬ１０層（上層）の積層
ディッシュを冷凍庫から取り出し、凍結したＡＬ５００層の上に、ＡＬ１０溶液１．０ｍＬおよび１５ｍＭ塩化カルシウム水溶液１．０ｍＬをマイクロピペットで加え、ピペッティングによって均一になるように混合した。これを再びディッシュを冷凍庫に移し、−２０℃で４時間凍結させた。【００８３】
（４）スポンジの作製
凍結後のディッシュを凍結乾燥器にセットし、２晩凍結乾燥を行って、目的のアルギン酸積層スポンジを得た。【００８４】
目的のアルギン酸積層スポンジは、ＡＬ５００と塩化カルシウムを含むスポンジ状の下層（すなわち、第１の層）と、ＡＬ１０と塩化カルシウムを含むスポンジ状の上層（すなわち、第２の層）を含む。アルギン酸積層スポンジは、直径３５ｍｍ、厚み１．８３±０．１３ｃｍ（ｎ＝４）の略円状であった。アルギン酸ナトリウムの上層と下層での使用量の合計は、約２．０ｍｇ／ｃｍ２であった。また、アルギン酸ナトリウムの上層と下層での使用量の比（重量比）は、１：１であった。さらに、塩化カルシウムの使用量は、上層で、約１．０μｍｏｌ／ｃｍ２であり、下層で、約１．５μｍｏｌ／ｃｍ２であった。【００８５】
（５）重量平均分子量の測定
製造原料として用いたアルギン酸について、以下のＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により重量平均分子量を測定した。【００８６】
［前処理方法］
試料に溶離液を加え溶解後、０．４５μｍメンブランフィルター濾過したものを測定溶液とした。【００８７】
［測定条件（屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）測定）］
示差屈折率計：Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ
測定波長：６５８ｎｍ
測定温度：４０℃
溶媒：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
試料濃度：０．５〜２．５ｍｇ／ｍＬ（５濃度）【００８８】
［測定条件（絶対分子量分布測定）］
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＧＭＰＷ−ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ−ＸＬ（７．８ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ×３本）
溶離液：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ．
濃度：０．０５％
検出器：ＲＩ検出器、光散乱検出器（ＭＡＬＳ）
カラム温度：４０℃
注入量：２００μＬ【００８９】
［結果］
ＡＬ１０  ：  ５５，０００
ＡＬ５００：  ２８０，０００【００９０】
また、上記工程（１）、（２）および（４）の方法に準じて製造したＡＬ１０を含有する単層スポンジと、ＡＬ５００を含有する単層スポンジを電子線滅菌後、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液に溶解して、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法によりそれぞれ分子量を測定した。結果を以下に示す。【００９１】
［結果］
（電子線滅菌の照射線量が２０ｋＧｙの場合）
ＡＬ１０  ：３６，０００
ＡＬ５００：７５，０００
（電子線滅菌の照射線量が４０ｋＧｙの場合）
ＡＬ１０  ：２７，０００
ＡＬ５００：４５，０００【００９２】
後述の実施例３、実施例３−２、および４では、積層スポンジとして、得られた積層スポンジを電子線滅菌（２０ｋＧｙ）したものを用いた。
尚、後述の実施例６および７では、積層スポンジとして、非滅菌のものを用いた。【００９３】
実施例１−２：アルギン酸積層スポンジの作製
（１）スポンジの作製
以下の［試薬］に記載のアルギン酸を用い、ＡＬ１００またはＡＬ５００を下層の原料として、ＡＬ１０またはＡＬ２０を上層の原料として使用し、実施例１に記載の方法に準じて、ＡＬ１０（上層）−ＡＬ１００（下層）、ＡＬ２０（上層）−ＡＬ１００（下層）、ＡＬ２０（上層）−ＡＬ５００（下層）の組合せによる、各アルギン酸積層スポンジを作製した。【００９４】
［試薬］
・ＡＬ１０：実施例１と同じ
・ＡＬ２０：（Ｌｏｔ  ＮＯ．ＢＬ１５０７１３−２０），エンドトキシン量１３ＥＵ／ｇ。
・ＡＬ１００：（Ｌｏｔ  ＮＯ．５Ｇ１７２０１），エンドトキシン量６ＥＵ／ｇ。
・ＡＬ５００：実施例１と同じ【００９５】
（２）重量平均分子量の測定
また、スポンジ作製に用いたアルギン酸のうち、ＡＬ２０およびＡＬ１００について、実施例１に記載の方法を用いて、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により重量平均分子量を測定した。
［結果］
ＡＬ２０  ：  ８２，０００
ＡＬ１００：  １７０，０００【００９６】
また、実施例１に記載の方法に準じて製造したＡＬ２０を含有する単層スポンジと、ＡＬ１００を含有する単層スポンジについて、実施例１に記載の方法を用いて、電子線滅菌後の分子量を測定した。結果を以下に示す。【００９７】
［結果］
（電子線滅菌の照射線量が２０ｋＧｙの場合）
ＡＬ２０  ：４６，０００
ＡＬ１００：６３，０００
（電子線滅菌の照射線量が４０ｋＧｙの場合）
ＡＬ２０  ：３３，０００
ＡＬ１００：４０，０００【００９８】
実施例２：アルギン酸積層スポンジの各層の溶解速度の測定
上層または下層が蛍光修飾された積層スポンジをそれぞれ作製し、溶解速度の測定を行った。具体的な方法を以下に示す。なお、蛍光標識試薬としてはＦＴＳＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−５−Ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ）を使用し、アルギン酸の標識は常法により行った。
蛍光標識されたアルギン酸を用い、実施例１に記載の方法に準じて積層スポンジを作製した。【００９９】
［材料］
低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムは、実施例１に記載の通りである。リン酸緩衝液は、リン酸二水素ナトリウム（和光純薬社、１９７−０９７０５（商品名））、リン酸二水素カリウム（和光純薬社、１６６−０４２５５（商品名））、塩化ナトリウム（和光純薬社、１９１−０１６６５（商品名））、塩化カリウム（和光純薬社、１６６−１７９４５（商品名））を用いて調整した。エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（Ｎ００１）はＤｏｊｉｎｄｏ社から購入した。【０１００】
［使用機器］
直径８ｍｍ生検トレパン（Ｋａｉ  ｍｅｄｉｃａｌ社  ＢＰ−８０Ｆ（商品名））
９６穴黒色マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社  １３７１０１（商品名））
蛍光プレートリーダー  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社  ＡＲＶＯ  Ｘ３（商品名））【０１０１】
［手順］
まず、蛍光修飾された積層スポンジを直径８ｍｍの生検トレパン（Ｋａｉ  ｍｅｄｉｃａｌ社  ＢＰ−６０Ｆ（商品名））で打ち抜いた。これを１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＬ中に浸漬し、一定時間毎に浸漬液を２００μＬずつ回収した。回収した溶液を９６穴プレートに移し、蛍光プレートリーダーによって蛍光強度を測定することで、溶解したアルギン酸量を定量化した。【０１０２】
［結果］
積層スポンジの各層の溶解挙動の測定結果を、図２に示す。図２に示されているように、下層では、アルギン酸の１価金属塩の２５±１０重量％が１時間以内に溶出し、８０±１０重量％が４時間以内に溶出していた。一方、上層は、アルギン酸の１価金属塩の７０±１０重量％が１時間以内に溶出し、９０±１０重量％が４時間以内に溶出していた。また、上層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量を１００％としたときの、下層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量の割合は、測定開始から１時間の時点で３６％（５０％未満）、２時間の時点で５５％（７０％未満）であった。
このように上層の溶解速度が、下層に比べて速いことが確認できた。下層を創傷部側、上層を腹腔側に向けてアルギン酸スポンジを適用することで、下層は、創傷部に残留して創傷部の癒着を防止することができるとともに、上層は比較的速く溶解して創傷部から遠く離れた場所にも多数形成されるｄｅ  ｎｏｖｏ癒着、例えば、腹腔内全般の癒着等を抑えることができると考えられる。【０１０３】
なお、実施例１−２で作製した各積層スポンジ（ＡＬ１０（上層）−ＡＬ１００（下層）；ＡＬ２０（上層）−ＡＬ１００（下層）；ＡＬ２０（上層）−ＡＬ５００（下層））についても同様にして溶解速度の測定を行った結果、実施例１で作製した積層スポンジ（ＡＬ１０（上層）−ＡＬ５００（下層））と同様の溶解挙動を示した。【０１０４】
実施例３：ラット一部肝切除モデル
ラット一部肝切除モデルを用いて、癒着の形成を評価した。ラット一部肝切除モデルは、重篤な炎症を惹起し高い強度を有する癒着の形成を再現性高く観察できるモデルである（Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｓｕｒｇ  Ｔｏｄａｙ．（４４）：３１４−３２３）。具体的には、以下のように癒着の形成を評価した。【０１０５】
［材料］
低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムは、実施例１に記載の通りである。
Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）とヒアルロン酸を混合したシート状材料であり、Ｇｅｎｚｙｍｅ  ＧｍｂＨより入手した。
Ｉｎｔｅｒｃｅｅｄ（商品名）は、再生酸化セルロースシートであり、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎより入手した。【０１０６】
［実験群］
Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝８）：ｌｅｆｔ  ｌａｔｅｒａｌ  ｌｏｂｅの辺縁を３ｃｍ計測し切離し凝固止血した（無処置対照群）。
５００−１０積層スポンジ群（ｎ＝８）：実施例１で作製したアルギン酸スポンジを癒着防止材として適用した。
Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ群（ｎ＝８）：２×３ｃｍのＳｅｐｒａｆｉｌｍを癒着防止材として適用した。
Ｉｎｔｅｒｃｅｅｄ群（ｎ＝８）：２×３ｃｍのＩｎｔｅｒｃｅｅｄを癒着防止材として適用した。【０１０７】
［手順］
ペントバルビタール３５ｍｇ／ｋｇ相当の腹腔投与によりラットに麻酔をかけ、体重を電子天秤で測定した。その後、ラットを、正中切開で開腹した。次に、腹壁をピンセットでつまんで持ち上げ、腹壁を切断した。肝切除を行う前準備として、ｌｅｆｔ  ｌａｔｅｒａｌ  ｌｏｂｅを腹腔の奥から引き出し、その下にガーゼを敷いた。次に、実際の肝切除に移った。具体的には、ものさしを肝臓にあて、離断面が３ｃｍになる位置を探し、その両端に、バイポーラで焼灼し、印をつけた。印をつけた２点の間を直線的に切除していった。Ｃｏｎｔｒｏｌ群では、この後すぐ閉腹して処置を終了した。癒着防止材を適用する群では、この後、ガーゼを除去したのちに癒着防止材を適用した。次に、腹壁と皮膚を二回に分けて縫合し閉腹した。腹壁を縫合する際には生分解糸を用い、皮膚を縫合する際には非吸収糸を用いた。閉腹から一週間後に、ラットに過剰量の麻酔として約２ｍＬのペントバルビタールの過剰投与によって安楽死させ、体重を電子天秤で測定した。その後、再び開腹し、以下の通り癒着を評価した。脾臓重量は、腹腔から脾臓を摘出した後、電子天秤で測定した。【０１０８】
［癒着の評価］
以下の通り、癒着の評価を行った。【０１０９】
（１）離断面
上記［手順］に記載した肝離断面について、以下の（ａ）、（ｂ）の評価を行った。
（ａ）癒着グレード
癒着の評価は、目視により行った。肝離断面について、下記スコアリング法に基づき癒着スコアをつけた。
癒着スコア：
Ｇｒａｄｅ０：癒着が全く見られない。
Ｇｒａｄｅ１：自重により剥離する程度の癒着（生理的な癒着）
Ｇｒａｄｅ２：ピンセットによる剥離が可能な癒着（鈍的な癒着）
Ｇｒａｄｅ３：ハサミ、メスを使わないと剥離できない癒着（鋭的な癒着）【０１１０】
（ｂ）癒着Ｅｘｔｅｎｔ
３ｃｍの肝離断面のうち、癒着が形成された幅を定規（ものさし）にて計測し、長さ（単位：ｍｍ）で表した（従って、離断面の最大Ｅｘｔｅｎｔは３０ｍｍとなる）。【０１１１】
（２）非離断面
肝離断面以外、具体的には肝表面、大網、腹膜、小腸、正中創直下、等について、以下の（ａ）、（ｂ）の評価を行った。
（ａ）癒着グレード
癒着の評価は、目視により行った。肝離断面以外の部位について、下記スコアリング法に基づき癒着スコアをつけた。部位は特定せず、認められた癒着スコアの最大値を、その試験動物の癒着スコアとして記録した。
癒着スコア：
Ｇｒａｄｅ０：癒着が全く見られない。
Ｇｒａｄｅ１：自重により剥離する程度の癒着（生理的な癒着）
Ｇｒａｄｅ２：ピンセットによる剥離が可能な癒着（鈍的な癒着）
Ｇｒａｄｅ３：ハサミ、メスを使わないと剥離できない癒着（鋭的な癒着）【０１１２】
（ｂ）癒着Ｅｘｔｅｎｔ
肝離断面以外の部位について、癒着が形成された組織部分について、定規（ものさし）にて、その接着している幅を計測し、長さ（単位：ｍｍ）で表した。上記（２）（ａ）と同様、部位は特定せず、認められた癒着が形成された幅の最大値を、その試験動物の癒着Ｅｘｔｅｎｔとして記録した。【０１１３】
［結果］
癒着の評価の結果を図３（離断面）および図４（非離断面）に示した。また、体重測定および脾臓重量測定の結果を図５に示した。
離断面においては、各群とも、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて癒着が抑制される傾向が認められた（図３（Ａ）〜（Ｃ））。
非離断面において、５００−１０積層スポンジ群での顕著な癒着防止効果が確認された（図４（Ａ）〜（Ｃ））。陽性対照として用いたＳｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）およびＩｎｔｅｒｃｅｅｄ（商品名）では癒着防止効果は認められず、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて癒着が増悪する傾向が認められた。一方、５００−１０積層スポンジ群では顕著な癒着防止効果が確認された。
体重および脾臓重量については、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ群、Ｉｎｔｅｒｃｅｅｄ群、および５００−１０積層スポンジ群間で有意差はなく、５００−１０積層スポンジを適用しても、生体に悪影響がないことが確認された（図５（Ａ）および（Ｂ））。
ここで、実施例における有意差検定は、特に断りがない限りStudent’s t-testによって行い、Gradeの評価のみMann-Whitney U testで行った。【０１１４】
実施例３−２：ペアン鉗子を用いたラット一部肝切除モデル
肝臓の離断の際にペアン鉗子を用いたことを除き、実施例３と同じ材料、実験群、手順および癒着の評価方法を用いて、肝離断面と非離断面の癒着グレードと癒着Ｅｘｔｅｎｔを評価した。【０１１５】
ペアン鉗子を用いた肝臓の離断は、具体的には、次のように行った。すなわち、実施例３の［手順］において「印をつけた２点の間を直線的に切除する」のを、ペアン鉗子で肝実質を破砕し、露出した血管をバイポーラで焼灼することにより行った。【０１１６】
［結果］
癒着の評価の結果を図６（離断面）および図７（非離断面）に示した。また、体重測定および脾臓重量測定の結果を図８に示した。
離断面においては、各群（ｎ＝８）とも、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝８）に比べて癒着が抑制される傾向が認められ、５００−１０積層スポンジ群においては、Ｃｏｎｔｒｏｌ群との間に統計的に有意な差が認められた（図６（Ａ）〜（Ｃ））。
非離断面において、５００−１０積層スポンジ群での顕著な癒着防止効果が確認された（図７（Ａ）〜（Ｃ））。陽性対照として用いたＳｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）については癒着防止効果が認められず、Ｉｎｔｅｒｃｅｅｄ（商品名）についてはＣｏｎｔｒｏｌ群に比べて癒着が増悪する傾向が認められた。一方、５００−１０積層スポンジ群では顕著な癒着防止効果が確認された。
体重および脾臓重量については、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ群、Ｉｎｔｅｒｃｅｅｄ群、および５００−１０積層スポンジ群間で有意差はなく、５００−１０積層スポンジを適用しても、生体に悪影響がないことが確認された（図８（Ａ）および（Ｂ））。【０１１７】
実施例４：アルギン酸積層スポンジの各層の蛍光標識による可視化
アルギン酸積層スポンジの各層について蛍光標識による可視化の試験を以下のように行った。【０１１８】
［材料］
低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムは、実施例１に記載の通りである。【０１１９】
［使用機器］
ハンディー紫外線ランプ（ＵＶＰ社  ＵＶＧＬ−５８（商品名））【０１２０】
［手順］
ラットの肝臓切除の手順は、実施例３に記載の通りである。作製された肝臓の離断面に、第１の層または第２の層が蛍光標識されたアルギン酸スポンジを貼付した。貼付には、材料の残存を観察しやすくするために、実施例１よりも多い４．０ｍｇ／ｃｍ２のアルギン酸を使用した積層スポンジを実施例１の方法に準じて作製し、使用した。その後、実施例３に記載の手順で閉腹し、１週間後に開腹を行った。露出した腹腔内にランプで紫外線を照射し、蛍光標識されたアルギン酸の腹腔内分布を可視化した。【０１２１】
その結果、ＡＬ１０層は、離断面に加え、腹膜の表面にも広く分布することが確認できた。このことから、スポンジ状積層体の第２の層はアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が比較的低いため、速やかに腹腔内で溶けて広がることが示唆された。
また、ＡＬ５００層は、一部腹壁などでも見られるものの、離断面からの蛍光がより際立って観察された。このことから、スポンジ状積層体の第１の層はアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が比較的高いため、離断面に留まって物理的なバリアとなることが示唆された。【０１２２】
実施例５：巻き付け試験
アルギン酸積層スポンジの曲面への貼付追従性を示すために、巻き付け試験を以下のように行った。【０１２３】
［材料］
低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムは、実施例１に記載の通りである。寒天（０１０−０８７２５）は、和光純薬から購入した。【０１２４】
［手順］
寒天をお湯に溶解した後、円柱状の型に流し込んで冷やし、直径２０ｍｍのアガロースゲル円柱を作製した。これをモデル管状臓器とし、実施例１で作製したスポンジを巻き付けることで、巻き付けの追従性を検証した。【０１２５】
その結果、アルギン酸積層スポンジの柔軟性から、腸管を模した円柱への巻き付けが可能であることが確認できた。このことから、スポンジ状積層体を含む癒着防止材が、腸管吻合などにも使用が可能になることが示唆された。【０１２６】
実施例６：スポンジのプレスと膨潤試験
アルギン酸積層スポンジのプレス、プレス後の厚みの測定および膨潤試験を以下のように行った。【０１２７】
［材料］
アルギン酸積層スポンジ（ＡＬ１０（上層）−ＡＬ５００（下層））は、実施例１に記載の通りである。【０１２８】
［試薬］
アガロースは、和光純薬工業株式会社から入手した（商品コード：０１０−０８７２５）。【０１２９】
［手順］
（１）プレスおよびプレス後の厚みの測定
（１−１）手動プレス
アルギン酸積層スポンジを平面上に静置し、手のひらで、アクリル定規を介してスポンジ全体に均一に圧がかかるよう押圧した。押圧前後のスポンジの厚みを電子ノギスにて計測し、平均値を算出した（ｎ＝４）。【０１３０】
（１−２）プレス機によるプレス
アルギン酸積層スポンジをプレス機（アズワン株式会社製、製品名ＡＨ−１Ｔ）にセットした。１０ＭＰａの圧力で室温にてアルギン酸積層スポンジをプレスし、５分間保持した。プレス後のスポンジの厚みを電子ノギスで測定し、平均値を算出した（ｎ＝４）。【０１３１】
（２）膨潤試験
アガロースを熱湯に２重量％で溶解させ、室温まで冷却することでアガロースゲルを作製した。アガロースゲルを２ｃｍ×２ｃｍ角に切り取り、ガラスシャーレ上で純水に浸漬し、湿潤させた。
１ｃｍ×１ｃｍ角に切り取ったプレス前後のアルギン酸積層スポンジをアガロースゲル上に静置した。一定時間毎に横方向から撮影し、撮影した画像からスポンジの厚みを算出し、膨潤に及ぼすプレスの影響の有無を確認した（プレス前：ｎ＝３；プレス後：ｎ＝３。尚、膨潤試験では、プレスしたアルギン酸積層スポンジとして、プレス機によりプレスしたものを用いた。【０１３２】
［結果］
プレス後の厚みの測定結果を表１に示す。【０１３３】
【表１】
2018012605.tif 000003
【０１３４】
スポンジの厚みの平均値は、プレス前は約１．５ｍｍ、手動プレス後は約０．３３ｍｍ、プレス機によるプレス後は約０．１６ｍｍであった。なお、プレスしたスポンジは、時間経過により厚みが増すことなく、上記の厚みが維持された。【０１３５】
膨潤試験における経時的なスポンジの厚みの変化を図９に示す。膨潤試験の結果から、プレスしたアルギン酸積層スポンジは、吸水して、プレスしないアルギン酸スポンジとほぼ同等の厚みとなることが確認された。
このことから、スポンジをプレスすることによりコンパクトにまとめることができるので、内視鏡手術においてトロッカー等を介して癒着防止材であるスポンジを患部に比較的容易に適用できることが示唆された。
さらに、患部に適用されたプレスしたスポンジは、患部に存在する、または患部に適用される水分を吸収して、厚みが回復することも示唆された。厚みが回復することにより、積層スポンジとしての機能を発揮し得る。【０１３６】
実施例７：霧吹き試験
アルギン酸積層スポンジおよびＳｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）について、吸水時の脆弱性を評価するために以下の試験を行った。【０１３７】
［材料］
アルギン酸積層スポンジは実施例１に、Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）は実施例３に記載の通りである。また、アルギン酸積層スポンジのプレス有りものとして、実施例６に記載のプレス機によりプレスしたものを用いた。【０１３８】
［手順］
アルギン酸積層スポンジおよびＳｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）から１ｃｍ×２ｃｍの試験片を作成した。試験片の片端１ｃｍ×１ｃｍに両面テープを貼付し、試験台の端に把持した。これにより他方の端１ｃｍ×１ｃｍが中空に出るように試験片を固定した。
各試験片に対し、霧吹きを用いて純水を５回噴霧した。試験片が湿潤に伴って下方に折れ曲がっていく過程を動画で撮影した。
得られた動画の画像解析によって、試験片先端の試験台からの高さと角度の両方を算出し、その時間変化をプロットした。【０１３９】
［結果］
結果を図１０に示した。
高さについては、アルギン酸積層スポンジは、霧吹き後５０秒まで高さの低下は２ｍｍ以内であり、９０秒後においても３ｍｍ程度であった（図１０（Ａ））。また、プレス有りのアルギン酸積層スポンジも、霧吹き後９０秒後においても高さの低下は９ｍｍ程度であった。いっぽう、Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）は、霧吹き直後から著しい高さの低下が認められた（図１０（Ａ））。角度についても、高さの結果と同様の結果であった（図１０（Ｂ））。
このことから、アルギン酸積層スポンジは、プレスの有無に関わらず吸水状態にあっても暫くはその形状、強度が維持されることが示唆された。このため、癒着防止材として患部に適用した際に、貼付位置を調整して貼り直すことが可能である、あるいは、内視鏡手術の際、トロッカー等を介して癒着防止材であるスポンジを患部に適用する際に、トロッカー内の水分を吸収して上手く広げることができない等の事態が避けられる、などの利点がある。なお、アルギン酸積層スポンジが、患部、あるいはそのモデル系に対して好適な圧着性を有することは、実施例３、実施例５等において確認している。
【符号の説明】
【０１４０】
１    癒着防止材
２    第１の層
３    第２の層
４    スポンジ状積層体
【図１】
2018012605.tif 000004
【図２】
2018012605.tif 000005
【図３】
2018012605.tif 000006
【図４】
2018012605.tif 000007
【図５】
2018012605.tif 000008
【図６】
2018012605.tif 000009
【図７】
2018012605.tif 000010
【図８】
2018012605.tif 000011
【図９】
2018012605.tif 000012
【図１０】
2018012605.tif 000013
【国際調査報告】
2018012605.tif 000014
2018012605.tif 000015
2018012605.tif 000016
2018012605.tif 000017