(57)【要約】末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に局所注入し、前記ウイルスベクターを前期神経に感染させ、感染した神経内で前記機能を有するタンパク質を発現させ、該タンパク質により前記ウイルスベクターに感染した神経の機能を操作し、該神経が連絡している該脳および脊髄を除く臓器の機能を変化させることを特徴とする、疾病の予防または治療方法を提供する。医療産業に治療薬および治療手段として活用できる。特に、がん医療においては、術後にがんの残組織にウイルスベクターを局所注入して再発や転移を抑制するような形で、国内外で、広く使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に局所注入し、前記ウイルスベクターを前期神経に感染させ、感染した神経内で前記機能を有するタンパク質を発現させ、該タンパク質により前記ウイルスベクターに感染した神経の機能を操作し、該神経が連絡している該脳および脊髄を除く臓器の機能を変化させることを特徴とする、疾病の予防または治療方法。
【請求項２】
末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に局所注入する工程を含むことを特徴とする、末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質を発現する遺伝子を組み込んだウイルスベクターによる該神経への順行性または逆行性感染方法。
【請求項３】
末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に局所注入し、該臓器特異的、該腫瘍または腫瘍を切除した該部位において該機能を発生させる方法。
【請求項４】
末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に局所注入させることを特徴とする末梢神経を操作する方法。
【請求項５】
末梢神経が、遠心性または求心性の交感神経、遠心性または求心性の副交感神経、遠心性または求心性の迷走神経であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
末梢神経が、体性感覚神経（触覚、圧覚、冷覚、温覚、痛覚、痒み、しびれ）、内臓感覚神経、または特殊感覚神経（嗅覚、視覚、聴覚、平衡感覚、味覚）であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
末梢神経が、腸神経であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ウイルスベクターが神経種特異的なプロモーター配列を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
疾病が、細菌性感染症、ウイルス感染症、真菌症、その他の感染症または寄生虫症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
疾病が、口唇，口腔、咽頭、食道、胃、小腸、結腸、直腸Ｓ状結腸移行部、直腸、肛門、肛門管、肝、肝内胆管、胆のう（嚢）、膵、内耳、喉頭、気管支、肺、心臓、縦隔、胸膜、末梢神経、自律神経、後腹膜、腹膜、結合組織、軟部組織、骨、軟骨、皮膚、乳房、子宮頚部、子宮体部、卵巣、胎盤、陰茎、前立腺、精巣（睾丸）、腎盂を除く腎、腎盂、尿管、膀胱、甲状腺、副腎、内分泌組織、リンパ組織、造血組織、眼、眼付属器、髄膜の悪性新生物、これらの続発部位の悪性新生物、これらの上皮内新生物、これらの良性新生物、もしくは部位不明の悪性新生物、性状不詳もしくは不明の新生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
疾病が、貧血、凝固障害、紫斑病、出血性病態、脾機能低下症、脾機能亢進症、サルコイドーシスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
疾病が、甲状腺機能低下症、甲状腺中毒症（甲状腺機能亢進症）、甲状腺炎、甲状腺障害、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、糖尿病、低血糖症、副甲状腺（上皮小体）機能低下症、副甲状腺（上皮小体）機能亢進症、副甲状腺（上皮小体）障害、アルドステロン症、副腎皮質機能亢進症、原発性副腎皮質機能不全（症）、アジソン（Ａｄｄｉｓｏｎ）クリーゼ（発症）、薬物誘発性副腎皮質機能不全（症）、副腎皮質機能不全（症）、副腎髄質機能亢進症、副腎障害、エストロゲン過剰（症）、アンドロゲン過剰（症）、多嚢胞性卵巣症候群、原発性卵巣機能不全（症）、卵巣機能障害、精巣（睾丸）機能亢進（症）、精巣（睾丸）機能低下（症）、精巣（睾丸）機能障害、その他の内分泌障害、肥満（症）、過栄養（過剰摂食）、アミロイドーシス（アミロイド症）または代謝障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
疾病が、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）病の認知症、血管性認知症、その他の認知症、人格障害、気分（感情）障害、身体表現性障害、不安障害、強迫性障害（強迫神経症）、適応障害、統合失調症、躁病、双極性感情障害（躁うつ病）、うつ病、反復性うつ病性障害、摂食障害、性機能不全、器質性障害、恐慌性（パニック）障害（挿間性発作性不安）、外傷後ストレス障害、広汎性発達障害、自閉症、その他の精神障害または行動の障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
疾病が、パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病、続発性パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）症候群、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）病、睡眠障害、錐体外路障害、神経変性疾患、三叉神経障害、顔面神経障害、嗅神経障害、舌咽神経障害、迷走神経障害、舌下神経障害、その他の脳神経障害、脳性麻痺、片麻痺、対麻痺及び四肢麻痺、その他の麻痺性症候群、ニューロパチ（シ）ー、神経根もしくは神経叢の障害、自律神経系の障害、その他の末梢神経系の障害、その他の神経系の疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
疾病が、緑内障、視神経もしくは視（覚）路の障害、視機能障害もしくは盲（失明）、その他の眼の疾患または付属器の疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
疾病が、外耳疾患、中耳疾患、乳様突起疾患、難聴、または内耳疾患、その他の耳の疾患または乳様突起の疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
疾病が、本態性（原発性（一次性））高血圧（症）、高血圧性心疾患、高血圧性腎疾患、高血圧性心腎疾患、二次性（続発性）高血圧（症）、狭心症、心筋梗塞、その他の急性虚血性心疾患、慢性虚血性心疾患、心筋症、不整脈、心膜炎、心内膜炎、肺塞栓症、くも膜下出血、脳出血、脳梗塞、脳卒中、動脈の塞栓症もしくは血栓症、動脈炎、大動脈瘤及び解離、静脈の塞栓症もしくは血栓症、静脈炎、静脈瘤、その他の循環器系の疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
疾病が、気管炎、肺炎、インフルエンザ、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気管支拡張症、肺線維症、成人呼吸窮〈促〉迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺水腫、アレルギー性鼻炎（鼻アレルギー）、咽頭炎、副鼻腔炎、扁桃炎、喉頭炎、その他の呼吸器系の疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
疾病が、食道炎、食道潰瘍、胃食道逆流症、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、クローン（Ｃｒｏｈｎ）病（限局性腸炎）、潰瘍性大腸炎、麻痺性イレウス及び腸閉塞、過敏性腸症候群、便秘、機能性下痢、大腸（結腸）のポリープ、アルコール性肝疾患、中毒性肝疾患、慢性肝炎、肝線維症もしくは肝硬変、胆石症、胆のう（嚢）炎、胆管炎、急性膵炎、慢性膵炎、その他の消化器系の疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
疾病が、皮膚もしくは皮下組織の感染症、水疱症、アトピー性皮膚炎、皮膚炎、湿疹、丘疹落せつ（屑）（りんせつ（鱗屑））性障害、蕁麻疹、紅斑、じょく（褥）瘡性潰瘍、その他の皮膚の疾患または皮下組織の疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
疾病が、感染性関節障害、炎症性多発性関節障害、関節症、関節リウマチ、膝内障、軟部組織障害、骨障害、軟骨障害、その他の筋骨格系の疾患または結合組織の疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
疾病が、急性腎炎症候群、急速進行性腎炎症候群、慢性腎炎症候群、ネフローゼ症候群、尿細管間質性腎炎、水腎症、急性腎不全、慢性腎不全、腎結石もしくは尿管結石、緊張性（腹圧性）尿失禁、前立腺肥大（症）、精巣（睾丸）捻転、精巣（睾丸）炎、精巣上体（副睾丸）炎、男性不妊（症）、卵管炎、卵巣炎、子宮内膜症、無月経、過少月経、過多月経、閉経期もしくはその他の閉経周辺期障害、女性不妊症、その他の腎尿路生殖器系の疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
疾病が、妊娠高血圧（症）、妊娠に関連するその他の母体障害、周産期に発生した病態である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
疾病が、咳、悪心、嘔吐、胸やけ、めまい（眩暈）感、または疼痛、しびれ、痒み、皮膚知覚障害、嗅覚障害、味覚障害、感覚障害、不明熱、その他の症状、徴候、異常臨床所見、もしくは異常検査所見のある、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターである請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを含むことを特徴とする末梢神経投与剤。
【請求項２７】
末梢神経投与剤の製造のための、末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターの使用。
【請求項２８】
末梢神経投与のために使用される、末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢神経を操作する方法、脳および脊髄を除く臓器などにおいて神経細胞機能を変化させる機能を発生させる方法、および新規疾病の予防または治療方法、ならびに末梢神経投与用医薬に関する。より詳細には、生物薬理活性を有するタンパク質を発現する遺伝子を組み込んだウイルスベクターを利用して、癌、高血圧、糖尿病、心不全または肥満などの疾患を予防・治療するための治療剤および治療方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
自律神経系（交感神経および副交感神経）は、身体のすべての器官に分布してその器官機能を調節しているが、その調節は全身一様ではなく、器官別や局所性に行われている。自律神経系は、健康状態においては循環、呼吸、代謝、免疫などの生体恒常性の維持に重要な役割を果たしているが、一方、疾患においては、特定の器官の神経動態が不合理であり、むしろ病勢を増悪させる場合がある（非特許文献１）。また求心性神経も、身体のすべての器官に分布して局所の生体情報を感知し、生体恒常性の維持に重要な役割を果たしているが、一方、疾患においては、特定の器官の神経動態が不合理であり、むしろ病勢を増悪させる場合がある。【０００３】
ここで、非特許文献２には、脳科学での特定の神経線維に選択的な光遺伝子の導入の発展を勘案すると、治療目的として、末梢局所の神経入力を選択的に操作する他の新興技術を想像できるかもしれないと、仮定法過去（ｃｏｕｌｄ  ｅｎｖｉｓｉｏｎ）で記載されている。それにもかかわらず、今日に至るまでそれが実現されなかったことは、当業者といえども容易に相当し得なかったことの証左である。【０００４】
すなわち、現在、特定の器官の特定の神経種に選択的な形で、局所の末梢神経機能を操作できるような医療技術、さらにはそのような技術分野はない。まず薬剤は、全身作用であり、目的外器官への作用による副作用を避けることが出来ないために、投与量や治療効果が制限される。例えば、治療目的器官への治療効果を得るために相応量の薬剤を投与したい場合に、同時に生じる他器官での副作用のために投与量を減らす必要が生じてしまい、結果として、治療目的器官への治療効果が減ってしまう。【０００５】
また、現在の薬剤以外の神経への介入医療として、神経の電気刺激や焼灼切断やブロックがある。ところが末梢神経は、神経線維の束であり、複数の器官についての遠心性線維（中枢神経系である脳又は脊髄から器官へと電気情報を伝える神経線維）や、また複数の器官についての求心性線維（逆に、器官から中枢神経系である脳又は脊髄へと電気情報を伝える神経線維）を内部に含む。従って、神経の電気刺激は、神経束や神経節に含まれる複数の神経線維（複数の器官、遠心性線維と求心性線維、さらに交感神経や副交感神経等の多様な神経種）を刺激するために、目的としない神経線維の刺激による副作用を避けることが出来ず、医療適用や治療効果が制限される。例えば、心疾患治療で、心臓に分布する副交感神経（遠心性線維）を刺激するために頚部迷走神経を刺激すると、消化管等に分布する求心性神経をも同時に刺激することになるため、嘔気や疼痛などの副作用が生じる危険がある。また同様に、神経の焼灼切断も、神経束や神経節に含まれる複数の神経線維を破壊するために、目的外の神経線維の破壊による副作用を避けることが出来ないため、治療効果が制限され得る。また同様に、神経のブロック（麻酔薬や神経破壊薬や神経遮断薬や生理食塩水等の神経近傍への局所注入や、圧迫や減圧などの物理的負荷）も、神経束や神経節に含まれる複数の神経線維を破壊するために、目的外の神経線維の破壊による副作用を避けることが出来ないため、治療効果が制限され得る。【０００６】
一方、中枢神経系（脳又は脊髄）では、ウイルスベクターを用いた特定の神経種に選択的な形での神経への遺伝子導入や遺伝子操作が行われている。この際に、神経の細胞体にウイルスベクターを感染させて遺伝子導入する方法（順行性感染、順行性遺伝子導入、順行性とは、神経の細胞体から終末への方向の意味）、および、神経の終末からウイルスベクターを感染させて遺伝子導入する方法がある（逆行性感染、逆行性遺伝子導入、逆行性とは、神経の終末から細胞体への方向の意味）。ウイルスベクターで、神経種に特異的なプロモーター等配列（プロモーターおよびエンハンサー等の関連する遺伝子発現調節配列）を用いることによって、神経種に特異的な遺伝子操作が可能となっている。この神経操作用遺伝子配列として、例えば、神経を破壊する場合にはＤＴＡ、神経活動を刺激する場合は光応答性チャネル（ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ関連）やバクテリア由来チャネルＮａＣｈＢａｃ、また神経活動を抑制する場合にはＫｉｒ２．１などが使用されている。【０００７】
また、中枢神経系（脳又は脊髄）では、ウイルスベクターを用いた特定の神経経路に選択的な形での神経への遺伝子導入や遺伝子操作が行われている。神経細胞は長い軸索を持ち、中枢神経系（脳又は脊髄）内のある場所と別の場所を配線する。どの場所にも、それぞれ別の場所につながるような配線の神経細胞が多く存在し、多数の神経細胞の連絡によるネットワークを形成している。神経ネットワークの多様な配線のうち、特定の配線の神経細胞だけを遺伝子操作する方法として、配線上の２か所（神経の細胞体への順行性感染、および、神経終末への逆行性感染）に２種類のウイルスベクター（ドライバーベクターとレポーターベクター）を局所注入し、重複感染した細胞でのみ操作用遺伝子配列が発現するようなウイルスベクター技術（２重感染法）（非特許文献３）が報告されている。ドライバーベクターとレポーターベクターを、両者が協調して遺伝子発現を調節するように設定する。非特許文献３では、既知の遺伝子発現調節機構であるｔｅｔスイッチが使用されており、ドライバーベクターでｔＴＡを発現させ、薬剤（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）誘導性に操作用遺伝子配列を発現させている。しかし、別の遺伝子発現調節機構も使用可能であり、たとえば、ドライバーベクターでＣｒｅ組み換え酵素を発現させてレポーターベクターの挿入塩基配列を変化させて操作用遺伝子配列の発現を調節（誘導あるいは停止）させることが出来る。【０００８】
医療実用のためには、ウイルスベクターの中でも、安全性に優れたものを使用することが望ましい。現在、最も安全性に優れ、人体への病原性が低い（ほとんどない）と評価されているものは、アデノ随伴ウイルスベクターであり（非特許文献４）、中枢神経系（脳又は脊髄）では、パーキンソン病の臨床治療に使用されている（非特許文献５）。ところがアデノ随伴ウイルスベクターは、中枢神経系（脳又は脊髄）の神経への逆行性感染や逆行性遺伝子導入が弱いことが知られている。しかしながら、末梢神経の自律神経系や求心性神経への逆行性感染や逆行性遺伝子導入が出来るか否かについては知られていなかった。またアデノ随伴ウイルスベクターは、挿入できる遺伝子サイズが４．５ｋｂ長に制限されることが知られているため、万一、末梢神経の自律神経や求心性神経に遺伝子導入できたとしても、短い挿入遺伝子で神経機能を操作できるかどうか、その神経操作によって疾患治療ができるかどうか、あるいは、それらを可能とするための挿入遺伝子の核酸塩基配列について知られていなかった。【０００９】
レンチウイルスベクターは、中枢神経系（脳又は脊髄）の神経において、神経への逆行性感染や逆行性遺伝子導入が可能なことが知られている。しかしながら、末梢神経の自律神経や求心性神経への逆行性感染や逆行性遺伝子導入が出来るか否かについては知られていなかった。また、それら神経の機能を実際に操作できるか否か、その神経操作によって疾患治療ができるか否か、さらには、それらを可能とするための挿入遺伝子の核酸塩基配列について知られていなかった。【００１０】
すなわち、疾患において局所の神経操作の有用性自体を誰も気づいていなかった。これまで、局所の神経操作を実現する方法を考案することも、そのような方法を実験することもなされようともしなかったし、事実、今日までなされていない。本発明者は疾患における局所の神経操作の有用性に気づき、それを実現する方法を考案して開発し実験で実証し、局所神経操作というこれまでにはなかった全く新しい技術分野を見出した。この局所の神経操作とは、末梢神経の自律神経と求心性神経を、特定器官や局所組織においてだけ、さらに特定の神経種（交感神経、副交感神経、求心性神経）だけを選択的に操作することである。末梢神経の自律神経と求心性神経は局所性に働いており、疾患においてはその局所の神経の機能が不合理（病勢の増悪や、治療の阻害等）であるのにも関わらず、従来法である薬剤や神経介入（電気刺激・焼灼切断・ブロック）は、そのような局所性をもって神経を操作することは出来ないばかりか、そのような局所性の神経操作の有用性自体を誰も気づいていなかった。【００１１】
より詳しくは、例えば、ラットの腎臓に腎交感神経を刺激する機能を有するタンパク質をコードする操作用遺伝子を組み込んだウイルスベクターを局所注入し、腎臓に特異的に連絡又は分布している腎交感神経に逆行性感染させ、該腎交感神経を刺激することで高血圧を誘導した。
さらにこの高血圧ラットに対して、薬物誘導的に腎交感神経を除去することにより、血圧を低下させた。また、高血圧ラットに対して、求心性神経を刺激する機能を有するタンパク質をコードする操作用遺伝子を組み込んだウイルスベクターを頚部動脈の圧受容器領域組織に局所注入し、該求心性神経を刺激することで血圧を低下させた。
また、高血圧ラットに対して、交感神経を破壊する機能を有するタンパク質をコードする操作用遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、腎臓に局所注入し、腎臓に特異的に連絡又は分布している腎交感神経に逆行性感染させ、該腎交感神経を破壊することで高血圧を改善した。【００１２】
さらに、糖尿病モデルラットの膵臓に副交感神経を刺激する機能を有するタンパク質をコードする操作用遺伝子を組み込んだウイルスベクターを局所注入し、該膵臓に特異的に連絡又は分布している副交感神経に逆行性感染（一部は順行性感染）させ、該副交感神経を刺激することで、糖尿病モデルラットにおける耐糖能を改善した。【００１３】
さらには、乳がん組織にも交感神経および副交感神経を含む自律神経が特異的に連絡又は分布していることを見出した。該乳がん組織に、交感神経を破壊する機能を有するタンパク質をコードする操作用遺伝子を組み込んだウイルスベクターを局所注入し、該乳がん組織に特異的に連絡又は分布している交感神経に逆行性感染させ、その乳がん組織に特異的に連絡又は分布している交感神経を除去することにより、乳がん組織の増大を抑制し、また乳がんの発生、転移または再発を抑制した。さらに、乳がん組織に連絡又は分布している副交感神経を破壊する機能を有するタンパク質をコードする操作用遺伝子を組み込んだウイルスベクターの局所注入によって副交感神経を除去することで、乳がん組織が増大すること、および乳がん組織に連絡又は分布している副交感神経を刺激する機能を有するタンパク質をコードする操作用遺伝子を組み込んだウイルスベクターの局所注入によって該副交感神経を刺激することで、乳がん組織の増大を抑制し、また乳がんの発生、転移または再発を抑制した。【００１４】
さらには、皮膚がん組織にも自律神経が特異的に連絡又は分布連絡又は分布していることを見出した。該皮膚がん組織に、交感神経を破壊する機能を有するタンパク質をコードする操作用遺伝子を組み込んだウイルスベクターを局所注入し、該皮膚がん組織に特異的に連絡又は分布連絡又は分布している交感神経に逆行性感染させ、その皮膚がん組織に特異的に連絡又は分布連絡又は分布している交感神経を除去することにより、皮膚がん組織の増大を抑制し、または皮膚がんの再発を抑制した。さらに、皮膚がん組織に連絡又は分布連絡又は分布している副交感神経を刺激する機能を有するタンパク質をコードする操作用遺伝子を組み込んだウイルスベクターの局所注入によって該副交感神経を刺激することで、皮膚がん組織の増大を抑制し、または皮膚がんの再発を抑制した。【００１５】
その上、胃に連絡又は分布連絡又は分布している求心性迷走神経を選択的に刺激することを目的として、まず、Ｃｒｅ組換えタンパク質を発現させる遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、該求心性迷走神経の神経終末の存在する胃（胃体部）に局所注入して該求心性迷走神経に逆行性感染させ、該求心性迷走神経においてＣｒｅ組換えタンパク質を発現させるとともに、求心性迷走神経を刺激する機能を有するタンパク質をコードする操作用遺伝子をｌｏｘＰシステムを利用してＣｒｅ応答性に発現させるように（より詳しくは、発現させる遺伝子配列を２ペアのｌｏｘ配列（例えば、ｌｏｘＰとｌｏｘ２２７２）に挟んだ状態で逆向きに挿入するｄｏｕｂｌｅｆｌｏｘｅｄ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｏｐｅｎ−ｒｅａｄｉｎｇ−ｆｒａｍｅ（ＤＩＯ）という構造で）、組み込んだウイルスベクターを、該求心性迷走神経の細胞体のある節状神経節に局所注入して順行性感染させ、該求心性迷走神経をＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムにより発現したタンパク質で刺激することで、摂食量および体重を減少させた。さらに、該Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用して、該求心性迷走神経を抑制する機能を有するタンパク質をコードする操作用遺伝子を組み込んだウイルスベクターを求心性迷走神経に順行性感染させることで、摂食量および体重を増加させた。【００１６】
さらに、心筋梗塞性の心不全モデルラットの頚部動脈の圧受容器領域組織に、求心性神経を刺激する機能を有するタンパク質をコードする操作用遺伝子を組み込んだウイルスベクターを局所注入し、該頚部動脈の圧受容器領域組織に特異的に連絡又は分布連絡又は分布している圧反射求心性神経を刺激することで、心不全モデルラットの心機能を改善した。【００１７】
さらに、ラットの頚部動脈の圧受容器領域組織に、求心性神経を刺激する機能を有するタンパク質をコードする操作用遺伝子を組み込んだウイルスベクターを局所注入し、該頚部動脈の圧受容器領域組織に特異的に連絡又は分布連絡又は分布している圧反射求心性神経を刺激することで、血圧を低下させた。【００１８】
さらには、ラットの大腿骨に、副交感神経を刺激する機能を有するタンパク質をコードする操作用遺伝子を組み込んだウイルスベクターを逆行性感染させ、該大腿骨に特異的に連絡している副交感神経を刺激することで、骨量を増加させ、骨芽細胞の数や骨形成機能（骨石灰化速度、骨形成速度）を増加させ、また同時に、破骨細胞の骨吸収機能を低下させた。【００１９】
さらには、ラットの小腸において、腸神経のコリン作動性神経が抗原を取込むと共に抗原を含む小胞を細胞外に分泌することを発見し、該コリン作動性神経の細胞外への小胞の分泌を抑制するｓｈＲＮＡ（例えば、Ｎｅｕｔｒａｌ  ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ  ２（ｓｍｐｄ３）に対するｓｈＲＮＡ等）をコードする塩基配列を組み込んだウイルスベクターを逆行性感染（一部は順行性感染）させ、小腸内に存在するコリン作動性神経の機能を変化させることによって、一部抗原を含む小胞を細胞外へ分泌するのを抑制し、免疫機能を変化させた。【００２０】
さらには、神経細胞に発現するすべての受容体を対象として、特定の受容体の遺伝子配列もしくは、その変異体遺伝子配列を組み込んだウイルスベクター、または、その受容体の遺伝子発現を抑制するｓｈＲＮＡ塩基配列、その遺伝子発現を変化させるｍｉＲＮＡ塩基配列等を組み込んだウイルスベクターを局所の求心性神経（または他の末梢神経）に逆行性感染（一部は順行性感染）させることによって、その神経が生体内の物理的信号（温度、圧、メカノ刺激等）、化学的信号（ｐＨ等）、生理活性物質（ＡＴＰ、イオン、ペプチド、サイトカイン等）、神経伝達物質（アセチルコリン、ペプチドなど）などの生体信号等に応答する際の応答特性（閾値、感度等）を変化させて、疾患治療に資するような生体応答を誘導及び／又は増強したり、疾患治療に有害な生体応答を抑制したりすることが出来る。例えば、気道の求心性神経の気道内分泌液、粘液等への応答特性（閾値、感度等）を変化させて、該求心性神経の活動を抑制し、過剰な咳を抑制することが出来る。また例えば、足の求心性神経の痛み、しびれ等に関連する生理活性物質への応答特性（閾値、感度等）を変化させて、該求心性神経の活動を抑制し、痛み、しびれ等を抑制することが出来る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】ＰＲＩＭＥＲ  ＯＮ  ＴＨＥ  ＡＵＴＯＮＯＭＩＣ  ＮＥＲＶＯＵＳ  ＳＹＳＴＥＭ，ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ，ＥＤＩＴＥＤ  ＢＹ  ＤＡＶＩＤ  ＲＯＢＥＲＴＳＯＮ，ＩＴＡＬＯ  ＢＩＡＧＧＩＯＮＩ，ＧＥＯＦＦＲＥＹ  ＢＵＲＮＳＴＯＣＫ，ＰＨＩＬＬＩＰ  Ａ．ＬＯＷ，ＪＵＬＩＡＮ  Ｆ．Ｒ．ＰＡＴＯＮ，ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ
【非特許文献２】Ｎｅｕｒａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｈａｎｏｕｎ  Ｍ１，Ｍａｒｙａｎｏｖｉｃｈ  Ｍ１，Ａｒｎａｌ−Ｅｓｔａｐｅ  Ａ１，Ｆｒｅｎｅｔｔｅ  ＰＳ２．Ｎｅｕｒｏｎ．２０１５  Ａｐｒ  ２２；８６（２）：３６０−７３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１５．０１．０２６．
【非特許文献３】Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｉｔ  ｆｏｒ  ｈａｎｄ  ｄｅｘｔｅｒｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｍａｓａｈａｒｕ  Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｒｙｏｓｕｋｅ  Ｍａｔｓｕｉ，Ｓｈｉｇｅｋｉ  Ｋａｔｏ，Ｔａｋｕ  Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｈｉｒｏｎｏｒｉ  Ｋａｓａｈａｒａ，Ｋａｏｒｕ  Ｉｓａ，Ａｋｉｙａ  Ｗａｔａｋａｂｅ，Ｔｅｔｓｕｏ  Ｙａｍａｍｏｒｉ，Ｙｕｋｉｏ  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｂｒｏｒ  Ａｌｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｄａｉ  Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋａｚｕｔｏ  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔａｄａｓｈｉ  Ｉｓａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８７，２３５−２３８，２０１２
【非特許文献４】遺伝子治療用ベクターの定義と適用範囲，国立医薬品食品衛生研究所  内田  恵理子，第３回遺伝子治療臨床研究に関する指針の見直しに関する専門委員会，２０１３．８．３０，参考資料１
【非特許文献５】Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｈｉｎ−ｉｃｈｉ  Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｍ．Ｄ．Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２０１２；５２：８９６−８９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的は、末梢神経を対象として、特定器官や局所組織において、さらに特定の神経種（例えば、遠心性神経と求心性神経の別に、また交感神経、副交感神経、迷走神経、体性知覚神経、内臓感覚神経、特殊感覚神経の求心性神経、腸神経）を選択的に遺伝子操作する疾病の新規な予防または治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、中枢神経系（脳又は脊髄）の神経を対象に使用されているウイルスベクターの一部が、末梢神経の自律神経（交感神経又副交感神経または迷走神経）、求心性神経または腸神経に逆行性感染することを発見し、特定器官や局所組織においてだけ、そこに分布する局所の末梢神経を神経種特異的に（交感神経、副交感神経、迷走神経、求心性神経、または腸神経だけを選択的に）操作することが可能であることを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成するに至った。【００２４】
本発明者らは、まず自律神経について、神経種特異的な遺伝子発現調節機構（神経種特異的プロモーター等配列と治療用遺伝子の組合せ）を挿入したウイルスベクターを特定器官や局所組織へ局所注入することによって、そこに分布する局所の自律神経に神経種特異的に（交感神経、副交感神経に選択的に投与される）治療用遺伝子を発現させて神経機能を操作して、疾患治療を行うような医療技術を創案し、動物実験で、その治療有効性を実証した（がん、高血圧、糖尿病、骨量増加）。【００２５】
次に本発明者らは、求心性神経について、ほぼ求心性神経だけが分布している局所組織にウイルスベクターを局所注入して逆行性感染させたり、あるいは、求心性神経の２点（神経細胞体の存在する神経節・脊髄等と、神経終末の存在する特定器官や局所組織内）に協調して働く２種のウイルスベクターを局所注入して重複感染させたりして、局所の求心性神経に治療用遺伝子を発現させて神経機能を操作して、疾患治療を行うような医療技術を創案し、動物実験で、その治療有効性を実証した（高血圧、心不全、肥満）。
このような、末梢神経の自律神経、または求心性神経にウイルスベクターを感染させることができる技術は本発明において初めて見出されたものであり、発明者らはこれらの知見に基づきさらに研究を進め、本発明を完成するに至った。【００２６】
なお、上記した段落［００１１］〜［００２０］の記載は、公知技術に対する相違の説明のみならず、本発明の［課題を解決するための手段］をも構成するから、上記段落［００１１］〜［００２０］をこの段落［００２６］にも余すことなく全て記載されているものとして引用する。【００２７】
すなわち、本発明は、
（１）末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に局所注入し、前記ウイルスベクターを前記神経に感染させ、感染した神経内で前記機能を有するタンパク質を発現させ、該タンパク質により前記ウイルスベクターに感染した神経の機能を操作し、該神経が連絡している該脳および脊髄を除く臓器の機能を変化させることを特徴とする、疾病の予防または治療方法。
（２）末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に局所注入する工程を含むことを特徴とする、末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質を発現する遺伝子を組み込んだウイルスベクターによる該神経への順行性または逆行性感染方法。
（３）末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に局所注入し、該臓器特異的、該腫瘍または腫瘍を切除した該部位において該機能を発生させる方法。
（４）末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に局所注入させることを特徴とする末梢神経を操作する方法。
（５）末梢神経が、遠心性または求心性の交感神経、遠心性または求心性の副交感神経、遠心性または求心性の迷走神経であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）末梢神経が、体性感覚神経（触覚、圧覚、冷覚、温覚、痛覚、痒み、しびれ）、内臓感覚神または特殊感覚神経（嗅覚、視覚、聴覚、平衡感覚、味覚）であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（７）末梢神経が、腸神経であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（８）ウイルスベクターが神経種特異的なプロモーター配列を有することを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）疾病が、細菌性感染症、ウイルス感染症、真菌症、その他の感染症または寄生虫症である、前記（１）に記載の方法。
（１１）疾病が、口唇，口腔、咽頭、食道、胃、小腸、結腸、直腸Ｓ状結腸移行部、直腸、肛門、肛門管、肝、肝内胆管、胆のう（嚢）、膵、内耳、喉頭、気管支、肺、心臓、縦隔、胸膜、末梢神経、自律神経、後腹膜、腹膜、結合組織、軟部組織、骨、軟骨、皮膚、乳房、子宮頚部、子宮体部、卵巣、胎盤、陰茎、前立腺、精巣（睾丸）、腎盂を除く腎、腎盂、尿管、膀胱、甲状腺、副腎、内分泌組織、リンパ組織、造血組織、眼、眼付属器、髄膜の悪性新生物、これらの続発部位の悪性新生物、これらの上皮内新生物、これらの良性新生物、もしくは部位不明の悪性新生物、性状不詳もしくは不明の新生物である、前記（１）に記載の方法。
（１５）疾病が、貧血、凝固障害、紫斑病、出血性病態、脾機能低下症、脾機能亢進症、サルコイドーシスである、前記（１）に記載の方法。
（１９）疾病が、甲状腺機能低下症、甲状腺中毒症（甲状腺機能亢進症）、甲状腺炎、甲状腺障害、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、糖尿病、低血糖症、副甲状腺（上皮小体）機能低下症、副甲状腺（上皮小体）機能亢進症、副甲状腺（上皮小体）障害、アルドステロン症、副腎皮質機能亢進症、原発性副腎皮質機能不全（症）、アジソン（Ａｄｄｉｓｏｎ）クリーゼ（発症）、薬物誘発性副腎皮質機能不全（症）、副腎皮質機能不全（症）、副腎髄質機能亢進症、副腎障害、エストロゲン過剰（症）、アンドロゲン過剰（症）、多嚢胞性卵巣症候群、原発性卵巣機能不全（症）、卵巣機能障害、精巣（睾丸）機能亢進（症）、精巣（睾丸）機能低下（症）、精巣（睾丸）機能障害、その他の内分泌障害、肥満（症）、過栄養（過剰摂食）、アミロイドーシス（アミロイド症）または代謝障害である、前記（１）に記載の方法。
（２３）疾病が、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）病の認知症、血管性認知症、その他の認知症、人格障害、気分（感情）障害、身体表現性障害、不安障害、強迫性障害（強迫神経症）、適応障害、統合失調症、躁病、双極性感情障害（躁うつ病）、うつ病、反復性うつ病性障害、摂食障害、性機能不全、器質性障害、恐慌性（パニック）障害（挿間性発作性不安）、外傷後ストレス障害、広汎性発達障害、自閉症、その他の精神障害または行動の障害である、前記（１）に記載の方法。
（２７）疾病が、パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病、続発性パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）症候群、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）病、睡眠障害、錐体外路障害、神経変性疾患、三叉神経障害、顔面神経障害、嗅神経障害、舌咽神経障害、迷走神経障害、舌下神経障害、その他の脳神経障害、脳性麻痺、片麻痺、対麻痺及び四肢麻痺、その他の麻痺性症候群、ニューロパチ（シ）ー、神経根もしくは神経叢の障害、自律神経系の障害、その他の末梢神経系の障害、その他の神経系の疾患である、前記（１）に記載の方法。
（３１）疾病が、緑内障、視神経もしくは視（覚）路の障害、視機能障害もしくは盲（失明）、その他の眼の疾患または付属器の疾患である、前記（１）に記載の方法。
（３３）疾病が、外耳疾患、中耳疾患、乳様突起疾患、難聴、または内耳疾患、その他の耳の疾患または乳様突起の疾患である、前記（１）に記載の方法。
（３６）疾病が、本態性（原発性（一次性））高血圧（症）、高血圧性心疾患、高血圧性腎疾患、高血圧性心腎疾患、二次性（続発性）高血圧（症）、狭心症、心筋梗塞、その他の急性虚血性心疾患、慢性虚血性心疾患、心筋症、不整脈、心膜炎、心内膜炎、肺塞栓症、くも膜下出血、脳出血、脳梗塞、脳卒中、動脈の塞栓症もしくは血栓症、動脈炎、大動脈瘤及び解離、静脈の塞栓症もしくは血栓症、静脈炎、静脈瘤、その他の循環器系の疾患である、前記（１）に記載の方法。
（４０）疾病が、気管炎、肺炎、インフルエンザ、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気管支拡張症、肺線維症、成人呼吸窮〈促〉迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺水腫、アレルギー性鼻炎（鼻アレルギー）、咽頭炎、副鼻腔炎、扁桃炎、喉頭炎、その他の呼吸器系の疾患である、前記（１）に記載の方法。
（４４）疾病が、食道炎、食道潰瘍、胃食道逆流症、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、クローン（Ｃｒｏｈｎ）病（限局性腸炎）、潰瘍性大腸炎、麻痺性イレウス及び腸閉塞、過敏性腸症候群、便秘、機能性下痢、大腸（結腸）のポリープ、アルコール性肝疾患、中毒性肝疾患、慢性肝炎、肝線維症もしくは肝硬変、胆石症、胆のう（嚢）炎、胆管炎、急性膵炎、慢性膵炎、その他の消化器系の疾患である、前記（１）に記載の方法。
（４８）疾病が、皮膚もしくは皮下組織の感染症、水疱症、アトピー性皮膚炎、皮膚炎、湿疹、丘疹落せつ（屑）（りんせつ（鱗屑））性障害、蕁麻疹、紅斑、じょく（褥）瘡性潰瘍、その他の皮膚の疾患または皮下組織の疾患である、前記（１）に記載の方法。
（５２）疾病が、感染性関節障害、炎症性多発性関節障害、関節症、関節リウマチ、膝内障、軟部組織障害、骨障害、軟骨障害、その他の筋骨格系の疾患または結合組織の疾患である、前記（１）に記載の方法。
（５７）疾病が、急性腎炎症候群、急速進行性腎炎症候群、慢性腎炎症候群、ネフローゼ症候群、尿細管間質性腎炎、水腎症、急性腎不全、慢性腎不全、腎結石もしくは尿管結石、緊張性（腹圧性）尿失禁、前立腺肥大（症）、精巣（睾丸）捻転、精巣（睾丸）炎、精巣上体（副睾丸）炎、男性不妊（症）、卵管炎、卵巣炎、子宮内膜症、無月経、過少月経、過多月経、閉経期もしくはその他の閉経周辺期障害、女性不妊症、その他の腎尿路生殖器系の疾患である、前記（１）に記載の方法。
（６１）疾病が、妊娠高血圧（症）、妊娠に関連するその他の母体障害、周産期に発生した病態である、前記（１）に記載の方法。
（６７）疾病が、咳、悪心、嘔吐、胸やけ、めまい（眩暈）感、または疼痛、しびれ、痒み、皮膚知覚障害、嗅覚障害、味覚障害、感覚障害、不明熱、その他の症状、徴候、異常臨床所見、もしくは異常検査所見のある、前記（１）に記載の方法。
（７５）ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターである前記（１）〜（９）、（１１）、（１５）、（１９）、（２３）、（２７）、（３１）、（３３）、（３６）、（４０）、（４４）、（４８）、（５２）、（５７）、（６１）および（６７）のいずれかに記載の方法。
（７６）末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを含むことを特徴とする末梢神経投与剤。
（７７）末梢神経投与剤の製造のための、末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターの使用。
（７８）末梢神経投与のために使用される、末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクター。に関する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明により、特定の器官や身体局所に分布する、特定の神経種の末梢神経を操作し、この機能を変化させることが出来る。本発明により、従来の医療技術（薬剤、神経の電気刺激、および神経の切除焼灼など）よりも副作用の少ない（つまり、他の器官や他の神経種への影響の少ない）治療を行うことが出来る。さらに、この副作用が少ないために、特定の器官や身体局所に強く介入でき、より大きな予防または治療効果を得ることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、神経刺激用遺伝子ＮａＣｈＢａｃ、その変異体ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の電位変化を示す図である。この結果により、神経刺激用遺伝子ＮａＣｈＢａｃ、その変異体ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａを遺伝子導入することで、細胞の神経活動を増加させることができることが示された。
【図２】図２のａ〜ｃは、ＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター、またはＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ以上）を局所注入した腎臓の腎臓交感神経の電気信号および血圧の測定結果を示す図である。この結果により、偽神経刺激ベクター群では、ベクター側の腎臓交感神経活動は、対側の腎臓交感神経活動と同様であるのに対し（図２ａ）、ＮａＣｈＢａｃ神経刺激ベクター群では、ベクター側の腎臓交感神経活動は、対側に比して増加し（図２ｂ，対側の１８２％）、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ神経刺激ベクター群では、ベクター側の腎臓交感神経活動は、対側に比して、さらに大きく増加することが示された（図２ｃ，対側の２５１％）。
【図３】図３のａ〜ｃは、ＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター、またはＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ以上）を局所注入した腎臓の腎臓交感神経の電気信号および該腎臓のノルエピネフリン含量の定量結果を示す図である。図３のｄは、ＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター、またはＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ以上）を局所注入したラットの収縮期血圧および拡張期血圧の測定結果を定量した値を示す図である。この結果により、ＮａＣｈＢａｃ神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）では、ベクター側の腎臓交感神経活動の量（図３ａ）と脈拍当り発火頻度（図３ｂ）が対側に比して増加し（対側の１８２％）、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）では、これらは、さらに大きく増加することが示された（対側の２５１％）。また、偽神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）では、このような神経活動の増加は起こらないことが示された。腎臓ノルエピネフリン量は、神経活動の結果とよく一致した。すなわち、ＮａＣｈＢａｃ神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）では、ベクター側腎臓で対側よりも高く、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）では、さらに高いことが示された（図３ｃ）。さらに、ＮａＣｈＢａｃ神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）では収縮期血圧と拡張期血圧が増加して高血圧となり、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）ではさらに重篤な高血圧となることが示された（図３ｄ、＃Ｐ〈０．０５ｖｓ．対側交感神経活動，＊Ｐ〈０．０５ＮａＣｈＢａｃ神経刺激ベクター群ｖｓ．ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ神経刺激ベクター群）。
【図４】図４のａ〜ｄは、ＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター、またはＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ以上）を局所注入した腎臓および腹腔神経節の切片の免疫染色像を示す図である。図４のｅは、ＡＡＶベクターを局所注入していない腎臓の切片の免疫染色像を示す図である。図４中の矢印は、蛍光タンパク質陽性シグナル、または各マーカー陽性シグナルを示している。ただし、図４ｅのＲＦＰの図における矢印は、蛍光タンパク質陽性シグナルが無いことを示している。この結果より、作製したＡＡＶベクターを腎臓に局所注入することで、逆行性に腎臓に分布する神経に感染し、交感神経特異的に挿入遺伝子を発現させることができることが示された。
【図５】図５は、ＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター、ＴＨ−ＣｒｅＥＲ  ＡＡＶベクターおよびＦｌｅｘ−ＤＴＡ  ＡＡＶベクターを同時に局所注入し、局所注入後９週間経過した時点で薬剤誘導的に腎臓交感神経を除去したラットの収縮期血圧および拡張期血圧の経時変化を示す図である。この結果により、コントロール群（Ｎ＝８、コントロールＡＡＶベクター液を腎臓に局所注入）では、２４週まで血圧は変化しなかったのに対し（図５、▽）、神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）では、ベクター局所注入後９週まで血圧が増加して高血圧となり９週以降も高血圧が持続することが示された（図５、△）。また、神経刺激後神経除去ベクター群（Ｎ＝８）では、ベクター局所注入後９週までは神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）と同様に血圧が増加して高血圧となったが、９週目のタモキシフェン投与後に血圧が徐々に低下し２４週目には、ベクター局所注入前のレベルに戻ることから（図５，●）、腎臓の交感神経を除去するウイルスベクターの局所注入によって、高血圧を改善するような治療効果を得られることが示された。（＃Ｐ〈０．０５ｖｓ．コントロール群，＊Ｐ〈０．０５神経刺激ベクター群ｖｓ．神経刺激後神経除去ベクター群）
【図６】図６は、ＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター、ＴＨ−ＣｒｅＥＲ  ＡＡＶベクターおよびＦｌｅｘ−ＤＴＡ  ＡＡＶベクターを同時に局所注入した腎臓の切片の免疫染色像（右図）、および該３種ＡＡＶ混合ベクターを局所注入後に薬剤誘導的に腎臓交感神経を除去した腎臓の切片の免疫染色像（左図）を示す図である。図６中の矢印は、ＴＨ陽性シグナルを示している。この結果により、神経刺激ベクター群では腎臓内にＴＨ陽性の腎臓交感神経が認められたが、神経刺激後神経除去ベクター群では腎臓交感神経が消失していたことから、腎臓の交感神経を除去するウイルスベクターの局所注入によって、実際に交感神経を除去できることが示された。
【図７】図７は、ＣｈＡＴ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター、ＣｈＡＴ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター、またはＰＢＳを膵臓に局所注入したラットの血糖値の経時変化を示す図である。この結果により、副交感神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）では、コントロール群（Ｎ＝８）および副交感神経偽刺激ベクター群（Ｎ＝８）に比して、空腹時血糖が低く、また耐糖能試験における血糖値（０，１５，３０，６０，１２０分値）が低かったことから、膵臓の副交感神経を刺激するウイルスベクターの局所注入によって、糖尿病の耐糖能を改善するような治療効果が得られることが示された。（＃Ｐ〈０．０５ｖｓ．グルコース負荷前，＊Ｐ〈０．０５神経刺激ベクター群ｖｓ．神経偽刺激ベクター群およびコントロール群）
【図８】図８は、ＣｈＡＴ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター、またはＣｈＡＴ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクターを膵臓に局所注入したラット延髄の迷走神経背側運動核および疑核における免疫染色像を示す図である。図８中の矢印は、ＲＦＰ陽性シグナルを示している。この結果により、副交感神経刺激ベクター群では、延髄の迷走神経背側運動核および疑核に、ＲＦＰ陽性の神経細胞が存在し、コントロール群では、観察されなかったことから、作成したＡＡＶベクターは、膵臓に局所注入すると、逆行性に膵臓に分布する副交感神経に感染して副交感神経特異的に挿入遺伝子（ｔｕｒｂｏＲＦＰ）を発現することが示された。
【図９】図９は、ＴＨ−ＣｒｅＥＲ  ＡＡＶベクター，Ｆｌｅｘ−ＤＴＡ  ＡＡＶベクターをラットの乳がん組織に局所注入した後、薬剤誘導的に乳がん交感神経を除去したラットの乳がん組織の大きさ変化を経時的に測定した結果を示す図である。この結果により、コントロール群（Ｎ＝８）および交感神経偽除去ベクター群（Ｎ＝８）では、がんは著明に増大するが、交感神経除去ベクター群（Ｎ＝８）では、がんの増大は強く抑制されることから、乳がんに分布する交感神経を除去するウイルスベクター局所注入によって乳がん増大を抑制するような治療効果が得られることが示された。（＃Ｐ〈０．０５ｖｓ．コントロール群）
【図１０】図１０は、ＴＨ−ＣｒｅＥＲ  ＡＡＶベクター，Ｆｌｅｘ−ＤＴＡ  ＡＡＶベクターをラットの乳がん組織に局所注入した後、薬剤誘導的に乳がん交感神経を除去したラットの乳がん組織におけるノルエピネフリン含量の測定結果を示す図である。この結果により、乳がん組織ノルエピネフリン量は、コントロール群および交感神経偽除去ベクター群に比して、交感神経除去ベクター群では著減することが示された。
【図１１】図１１は、ＴＨ−ＣｒｅＥＲ  ＡＡＶベクター，Ｆｌｅｘ−ＤＴＡ  ＡＡＶベクターをラットの乳がん組織に局所注入した後、薬剤誘導的に乳がん交感神経を除去したラットの乳がん組織切片の免疫染色像を示す図である。図１１中の矢印は、ＴＨ陽性シグナルを示し、図１１中の矢頭は、Ｌｅｃｔｉｎ陽性シグナルを示している。この結果により、コントロール群および交感神経偽除去ベクター群では乳がん組織内にＴＨ陽性の交感神経線維が認められるが、交感神経除去ベクター群では、乳がん組織内の交感神経が消失していることが示された。
【図１２】図１２は、ＣｈＡＴ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ−２Ａ−ＧＣａＭＰ６ｆ  ＡＡＶベクター、またはＣｈＡＴ−ＧＣａＭＰ３  ＡＡＶベクターを局所注入したラットの乳がん組織の大きさ変化を経時的に測定した結果を示す図である。この結果により、コントロール群（Ｎ＝８）および副交感神経偽刺激ベクター群（Ｎ＝８）では同程度にがんが増大したが、副交感神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）ではがん増大が抑制されたことから、乳がんに分布する副交感神経を刺激するウイルスベクター局所注入によって乳がん増大を抑制するような治療効果が得られることが示された。（＃Ｐ〈０．０５ｖｓ．コントロール群）
【図１３】図１３は、ＣｈＡＴ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ−２Ａ−ＧＣａＭＰ６ｆ  ＡＡＶベクター、またはＣｈＡＴ−ＧＣａＭＰ３  ＡＡＶベクターを局所注入したラットの乳がん組織切片の免疫染色像を示す図である。この結果により、副交感神経刺激ベクター群および副交感神経偽刺激ベクター群では、ＶＡＣｈＴ陽性の副交感神経がＧＦＰ陽性であり、逆行性ウイルスベクターによる副交感神経への遺伝子発現ができることが示された。
【図１４】図１４は、ＴＨ−ＤＴＡ  ＡＡＶベクター、またはＴＨ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクターを局所注入したマウスの皮膚がん組織の大きさ変化を経時的に測定した結果を示す図である。この結果により、コントロール群（Ｎ＝８）および交感神経偽除去ベクター群（Ｎ＝８）では、がんは著明に増大したが、交感神経除去ウイルスベクター群（Ｎ＝８）では、がんの増大は強く抑制されたことから、皮膚がんに分布する交感神経を除去するウイルスベクター局所注入によって皮膚がん増大を抑制するような治療効果が得られることが示された。（＃Ｐ〈０．０５ｖｓ．コントロール群）
【図１５】図１５は、ＣｈＡＴ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ−２Ａ−ＧＣａＭＰ６ｆ  ＡＡＶベクター、またはＣｈＡＴ−ＧＣａＭＰ３  ＡＡＶベクターを局所注入したマウスの皮膚がん組織の大きさ変化を経時的に測定した結果を示す図である。この結果により、コントロール群（Ｎ＝８）および副交感神経偽刺激ベクター群（Ｎ＝８）では同程度にがんが増大したが、副交感神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）ではがん増大が抑制されたことから、皮膚がんに分布する副交感神経を刺激するウイルスベクター局所注入によって皮膚がん増大を抑制するような治療効果が得られることが示された。（＃Ｐ〈０．０５ｖｓ．コントロール群）
【図１６】図１６のａ及びｂはそれぞれ、ＨｉＲｅｔ−Ｃｒｅレンチウイルスベクターを胃に局所注入し、ＦＬＥＸ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクターを右節状神経節に局所注入したラットの摂食量（図１６ａ）および体重（図１６ｂ）の経時変化を示す図である。この結果により、神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）では、コントロール群（Ｎ＝８）と比して、摂食量が低下し（図１６ａ）、おくれて、体重増加が抑制されたことから（図１６ｂ）、胃に分布する求心性神経を刺激するウイルスベクター局所注入によって摂食や肥満を抑制する効果が得られることが示された。（＃Ｐ〈０．０５ｖｓ．コントロール群）
【図１７】図１７のａ及びｂはそれぞれ、ＨｉＲｅｔ−Ｃｒｅレンチウイルスベクターを胃に局所注入し、ＦＬＥＸ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクターを右節状神経節に局所注入したラットの節状神経節（図１７ａ）および延髄切片（図１７ｂ）の免疫染色像を示す図である。この結果により、神経刺激ベクター群では、節状神経節（図１７ａ）にｔｕｒｂｏＲＦＰ発現による赤色蛍光の神経細胞体が存在し、また、延髄の孤束核（図１７ｂ）には、ｔｕｒｂｏＲＦＰ発現による赤色蛍光の神経終末が存在したことから（神経の細胞体はｔｕｒｂｏＲＦＰが発現しなかった）、２重ベクター法によって、胃の求心性神経にだけ選択的に、遺伝子発現を誘導できることが示された。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に局所注入させ、前記ウイルスベクターを前記神経に感染させ、感染した神経内で前記機能を有するタンパク質を発現させ、該タンパク質により前記ウイルスベクターに感染した神経の機能を操作し、該神経が連絡している該脳および脊髄を除く臓器の機能を変化させることを特徴とする、疾病の予防または治療方法を提供する。
【００３１】
また本発明は、末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に局所注入させる工程を含むことを特徴とする、末梢神経を、死滅させる、刺激する、または抑制する機能を有するタンパク質を発現する遺伝子を組み込んだウイルスベクターによる該神経への順行性または逆行性感染方法を提供する。
【００３２】
さらに本発明は、末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に局所注入させ、該臓器特異的、該腫瘍または腫瘍を切除した該部位において該機能を発生させる方法を提供する。
【００３３】
本発明は、末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に局所注入させることを特徴とする末梢神経の遺伝子操作方法を提供する。
【００３４】
本発明において、末梢神経は、特に限定されないが、特に交感神経や副交感神経（あるいは迷走神経）等の自律神経、体性感覚神経（触覚、圧覚、冷覚、温覚、痛覚、痒み、しびれ等）や内臓感覚神経や特殊感覚神経（嗅覚、視覚、聴覚、平衡感覚、味覚等の脳神経が関与する感覚）等の求心性神経（末梢組織での生体情報を中枢に伝達する神経）、腸神経系（Ｄｏｇｉｅｌ  ｔｙｐｅ  Ｉ，Ｄｏｇｉｅｌ  ｔｙｐｅ  ＩＩ，Ｄｏｇｉｅｌ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩなどのコリン作動性神経、セロトニン神経等）等であることが好ましい。
【００３５】
本発明において、末梢神経を死滅させる機能とは、特に限定されないが、例えば、末梢神経細胞をアポトーシスまたはネクローシス等で死滅させる機能等をいう。また、遺伝子発現の後で、該遺伝子と協調して細胞を死滅させる薬液を投与することによって、末梢神経細胞をアポトーシスまたはネクローシス等で死滅させる機能等をいう。
【００３６】
本発明において、末梢神経を刺激する機能とは、特に限定されないが、例えば、末梢神経にイオンチャネルやイオンポンプを発現させて脱分極応答を起こし易くするなどして、末梢神経の細胞（単一神経線維）レベルでの活動電位の発生頻度を増加させる、あるいは末梢神経の細胞群（神経線維群）レベルでの電気的神経活動の量や大きさや頻度を増加させる機能等をいう。また神経の電気活動に応じて生じる、神経終末からの神経伝達物質の放出を増加するような機能、放出された神経伝達物質の再取込等を抑制するなどして神経伝達物質濃度を高める機能等を言う。
【００３７】
本発明において、末梢神経を抑制する機能とは、特に限定されないが、例えば、末梢神経にイオンチャネルやイオンポンプを発現させて再分極応答や過分極応答や整流性を変化させるなどして、末梢神経の細胞（単一神経線維）レベルでの活動電位の発生頻度を低下させる、あるいは末梢神経の細胞群（神経線維群）レベルでの電気的神経活動の量や大きさや頻度を低下させる機能等をいう。また神経の電気活動に応じて生じる、神経終末からの神経伝達物質の放出を抑制するような機能、放出された神経伝達物質の再取込等を促進するなどして神経伝達物質濃度を低下させる機能等を言う。
【００３８】
本発明において、末梢神経の神経細胞機能を変化させる機能とは、特に限定されないが、例えばｍｉＲＮＡ，ＰＩＷＩ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ），ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）等によるＲＮＡ干渉を利用して特定の遺伝子発現を抑制したり変化させたりする機能等をいう。また、特定の遺伝子や特定の遺伝子変異体を発現させたり、その発現の量や時期を調節したりする機能等をいう。またさらに、これらの遺伝子発現の抑制や調節によって、神経細胞の代謝や情報伝達や分泌などの細胞機能を変化させる機能等をいう。ｓｈＲＮＡとして、例えば、Ｎｅｕｔｒａｌ  ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ  ２  （ｓｍｐｄ３）に対するｓｈＲＮＡ等が挙げられる。
【００３９】
本発明において、タンパク質は、末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の機能を変化させる機能のいずれかを有していればよい。末梢神経を死滅させる機能を有するタンパク質は、例えば、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）、ジフテリア毒素受容体（ＤｉｐｈｔｈｅｒｉａＴｏｘｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；１  ＤＴＲ）、インターロイキン２受容体（ＩＬ２Ｒα）等が挙げられる。末梢神経を刺激する機能を有するタンパク質は、例えば、光応答性チャネル（ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、バクテリア由来チャネルのＮａＣｈＢａｃ（、ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ、ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２９Ａ、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２１９Ａ、チャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）、変異型チャネルロドプシン２（ＣｈＲ２／Ｈ１３４Ｒ、ＣｈＲ２／Ｃ１２８Ｘ（ＸはＴ，ＡまたはＳ）ＣｈＲ２／Ｄ１５６Ａ、ＣｈＲ２／Ｅ１２３Ｔ（ＣｈＥＴＡ）、キメラ型ＣｈＲ等）、ボルボックスチャネルロドプシン１等が挙げられる。末梢神経を抑制する機能を有するタンパク質は、例えば、Ｋｉｒ２．１、ＥＧＦＰ−ｅＴｅＮＴ−ＰＥＳＴ、ハロロドプシン、アーキロドプシン３、アーキロドプシンＴ等が挙げられる。末梢神経のその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質は、例えば、神経のフェノタイプや神経伝達物質を変化させるｇｐ１３０並びにＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路及びＭＡＰキナーゼ経路のシグナル伝達タンパク質並びにその変異体等が挙げられる。また、細胞に発現するすべての受容体が挙げられ、例えば、Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ受容体（ＰＡＲ，特に、ＰＡＲ１，ＰＡＲ２，ＰＡＲ３，ＰＡＲ４），ブラジキニン受容体（特に、Ｂ１，Ｂ２），プロスタノイド受容体，プロスタグランジンＤ受容体，プロスタグランジンＥ受容体（特に、ＥＰ１，ＥＰ２，ＥＰ３，ＥＰ４），プロスタグランジンＦ受容体，プロスタグランジンＩ受容体，プロスタグランジンＴ受容体，ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＲＰ）受容体（特に、ＴＲＰＶ１，ＴＲＰＶ２，ＴＲＰＶ３，ＴＲＰＶ４，ＴＲＰＭ２，ＴＲＰＭ４，ＴＲＰＭ５，ＴＲＰＭ８，ＴＲＰＡ１），アデノシン受容体（特に、Ａ１，Ａ２Ａ，Ａ２Ｂ，Ａ３）、ＡＴＰ受容体（特に、Ｐ２Ｘ１，Ｐ２Ｘ２，Ｐ２Ｘ３，Ｐ２Ｘ４，Ｐ２Ｘ５，Ｐ２Ｘ６，Ｐ２Ｘ７，Ｐ２Ｘ８，Ｐ２Ｙ１，Ｐ２Ｙ２，Ｐ２Ｙ３，Ｐ２Ｙ４，Ｐ２Ｙ５，Ｐ２Ｙ６，Ｐ２Ｙ７，Ｐ２Ｙ８，Ｐ２Ｙ９，Ｐ２Ｙ１０，Ｐ２Ｙ１１，Ｐ２Ｙ１２，Ｐ２Ｙ１３），セロトニン受容体（特に、５−ＨＴ１Ａ，５ＨＴ１Ｂ，５ＨＴ１Ｄ，５ＨＴ１Ｅ，５ＨＴ１Ｆ，５−ＨＴ２Ａ，５−ＨＴ２Ｂ，５−ＨＴ２Ｃ，５−ＨＴ３，５−ＨＴ４，５−ＨＴ５Ａ，５−ＨＴ５Ｂ，５−ＨＴ６，５−ＨＴ７），ヒスタミン受容体（特に、Ｈ１，Ｈ２，Ｈ３，Ｈ４）、アドレナリン受容体（特に、α１Ａ，α１Ｂ，α１Ｄ，α２Ａ，α２Ｂ，α２Ｃ，α２Ｄ，β１，β２，β３），神経栄養因子受容体（特に、ＴｒｋＡ，ＴｒｋＢ，ＧＦＲα１，ＡＭＰＫ型グルタミン酸受容体（特に、ＧｌｕＲ１−４，またはＧｌｕＲα１−α４）），カイニン酸型グルタミン酸受容体（特に、ＧｌｕＲ５−７、または、ＧｌｕＲβ１−β３）），ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体（特に、ＮＡ２Ａ−Ｄ、またはＧｌｕＲε１−ε４）、ＮＲ１（ＧｌｕＲζ）、ＮＲ３Ａ，３Ｂ（ＧｌｕＲκ１）），代謝型グルタミン酸受容体（特に、ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ５、ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ７、ｍＧｌｕＲ８）、ＧＡＢＡ受容体（特に、ＧＡＢＡＡ，ＧＡＢＡＢ，ＧＡＢＡＣ）、グリシン受容体、オピオイド受容体、シグマ受容体、カンナビノイド受容体（特に、ＣＢ１受容体、ＣＢ２受容体）、タキキニン受容体（特に、ＮＫ１，ＮＫ２，ＮＫ３受容体）、ＣＧＲＰ受容体、ＶＩＰ受容体、ＰＡＣ受容体、ソマトスタチン受容体（特に、ｓｓｔ１，ｓｓｔ２Ａ，ｓｓｔ２Ｂ，ｓｓｔ３，ｓｓｔ４，ｓｓｔ５），ＣＣＫ受容体（特に、ＣＣＫ１，ＣＣＫ２），ガラニン受容体（ＧａｌＲ１，ＧａｌＲ２），ＮＰＹ受容体（特に、Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６）、ニコチン性アセチルコリン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ドーパミン受容体、エンドセリン受容体、オレキシン受容体、サイトカイン受容体（特に、ＩＬ１受容体，ＩＬ２受容体，ＩＬ３受容体，ＩＬ４受容体，ＩＬ５受容体，ＩＬ６受容体，ＩＬ７受容体，ＩＬ８受容体，ＩＬ９受容体，ＩＬ１０受容体，ＩＬ１１受容体，ＩＬ１２受容体，ＩＬ１３受容体，ＩＬ１４受容体，ＩＬ１５受容体，ＩＬ１６受容体，ＩＬ１７受容体，ＩＬ１８受容体，ＩＬ１９受容体，ＩＬ２０受容体，ＬＩＦ受容体、ＯＳＭ受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＣＴ−１受容体、ＰＲＬ受容体、ＧＨ受容体、ＥＰＯ受容体、ＴＰＯ受容体、ＧＣＳＦ受容体、ＩＦＮ−α，ＩＦＮ−β，ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ受容体、Ｆａｓ受容体、ＣＤ２８受容体、ＣＤ３０受容体、ＣＤ４０受容体、ＳＣＦ受容体、ＥＤＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、Ｍ−ＣＳＦ受容体、インスリンＩＧＦ受容体、ＴＧＦβ受容体、Ａｃｔｉｖｉｎ受容体、ケモカイン受容体、ＭＰ−１受容体、ＲＡＮＴＥＳ受容体）、アンギオテンシン受容体（特に、ＡＴ１，ＡＴ２）、アンギオテンシン（１−７）受容体、血小板膜糖タンパク質受容体、ＣＲＦ受容体、グルココルチコイド受容体、Ｔｏｌｌ様受容体（特に、ＴＬＲ１，ＴＬＲ２，ＴＬＲ３，ＴＬＲ４，ＴＬＲ５，ＴＬＲ６，ＴＬＲ７，ＴＬＲ８，ＴＬＲ９，ＴＬＲ１０）、レチノイン酸受容体、ＩＰ３受容体、リアノジン受容体、ＲＩＧ−Ｉ−ｌｉｋｅ受容体，ＮＯＤ−ｌｉｋｅ受容体，Ａｃｉｄ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ（ＡＳＩＣ，特に、ＡＳＩＣ１，ＡＳＩＣ１ａ，ＡＳＩＣ１ｂ，ＡＳＩＣ２，ＡＳＩＣ２ａ，ＡＳＩＣ２ｂ，ＡＳＩＣ３，ＡＳＩＣ４，ＥＮａＣ／Ｄｅｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（ＥＮａＣは、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ）（特に、αＥＮａＣ，βＥＮａＣ，γＥＮａＣ）等やこれらの変異体が挙げられる。
また本発明で用いられるタンパク質がヒトの治療に用いられる場合には、例えばヒトの生体において機能するタンパク質（ヒト、マウス、ラット等の哺乳動物由来のタンパク質など）であってもよく、なかでもヒト由来のタンパク質であることが好ましい。
【００４０】
本発明において、遺伝子は、末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードするものであってもよく、又は末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有し、タンパク質をコードしないものであってもよい。例えば、ジフテリア毒素をコードする遺伝子（配列番号１等で示される配列で表される）、ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子，インターロイキン２受容体をコードする遺伝子、光応答性チャネルをコードする遺伝子、ＮａＣｈＢａｃをコードする遺伝子（配列番号２等で示される配列で表される）、ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａをコードする遺伝子（配列番号３等で示される配列で表される）、ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２９Ａをコードする遺伝子（配列番号４等で示される配列で表される）、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２１９Ａをコードする遺伝子、チャネルロドプシン２をコードする遺伝子、変異型チャネルロドプシン２（ＣｈＲ２／Ｈ１３４Ｒ、ＣｈＲ２／Ｃ１２８Ｘ（ＸはＴ，ＡまたはＳ）ＣｈＲ２／Ｄ１５６Ａ、ＣｈＲ２／Ｅ１２３Ｔ（ＣｈＥＴＡ）キメラ型ＣｈＲ等）をコードする遺伝子、ボルボックスチャネルロドプシン１をコードする遺伝子、Ｋｉｒ２．１をコードする遺伝子（配列番号５、配列番号６等で示される配列で表される）、ＥＧＦＰ−ｅＴｅＮＴ−ＰＥＳＴをコードする遺伝子（配列番号７等で示される配列で表される）、ハロロドプシンをコードする遺伝子、アーキロドプシン３をコードする遺伝子、アーキロドプシンＴをコードする遺伝子をコードする遺伝子、神経のフェノタイプ及び神経伝達物質を変化させるｇｐ１３０並びにＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路及びＭＡＰキナーゼ経路のシグナル伝達タンパク質並びにその変異体タンパク質等をコードする遺伝子などが挙げられる。
末梢神経のその他の神経細胞機能を変化させる機能を有する塩基配列は、例えば、細胞の小胞分泌を抑制するｓｈＲＮＡ（例えば、Ｎｅｕｔｒａｌ  ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ  ２（ｓｍｐｄ３）に対するｓｈＲＮＡ等）の塩基配列、また、細胞に発現するすべての受容体を対照として、これを個別に抑制するｓｈＲＮＡの塩基配列や、またこれを変化させるｍｉＲＮＡの塩基配列が挙げられ、例えば、Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ受容体（ＰＡＲ，特に、ＰＡＲ１，ＰＡＲ２，ＰＡＲ３，ＰＡＲ４），ブラジキニン受容体（特に、Ｂ１，Ｂ２）プロスタノイド受容体，プロスタグランジンＤ受容体，プロスタグランジンＥ受容体（特に、ＥＰ１，ＥＰ２，ＥＰ３，ＥＰ４），プロスタグランジンＦ受容体，プロスタグランジンＩ受容体，プロスタグランジンＴ受容体，ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＲＰ）受容体（特に、ＴＲＰＶ１，ＴＲＰＶ２，ＴＲＰＶ３，ＴＲＰＶ４，ＴＲＰＭ２，ＴＲＰＭ４，ＴＲＰＭ５，ＴＲＰＭ８，ＴＲＰＡ１），アデノシン受容体（特に、Ａ１，Ａ２Ａ，Ａ２Ｂ，Ａ３）、ＡＴＰ受容体（特に、Ｐ２Ｘ１，Ｐ２Ｘ２，Ｐ２Ｘ３，Ｐ２Ｘ４，Ｐ２Ｘ５，Ｐ２Ｘ６，Ｐ２Ｘ７，Ｐ２Ｘ８，Ｐ２Ｙ１，Ｐ２Ｙ２，Ｐ２Ｙ３，Ｐ２Ｙ４，Ｐ２Ｙ５，Ｐ２Ｙ６，Ｐ２Ｙ７，Ｐ２Ｙ８，Ｐ２Ｙ９，Ｐ２Ｙ１０，Ｐ２Ｙ１１，Ｐ２Ｙ１２，Ｐ２Ｙ１３），セロトニン受容体（特に、５−ＨＴ１Ａ，５ＨＴ１Ｂ，５ＨＴ１Ｄ，５ＨＴ１Ｅ，５ＨＴ１Ｆ，５−ＨＴ２Ａ，５−ＨＴ２Ｂ，５−ＨＴ２Ｃ，５−ＨＴ３，５−ＨＴ４，５−ＨＴ５Ａ，５−ＨＴ５Ｂ，５−ＨＴ６，５−ＨＴ７），ヒスタミン受容体（特に、Ｈ１，Ｈ２，Ｈ３，Ｈ４）、アドレナリン受容体（特に、α１Ａ，α１Ｂ，α１Ｄ，α２Ａ，α２Ｂ，α２Ｃ，α２Ｄ，β１，β２，β３），神経栄養因子受容体（特に、ＴｒｋＡ，ＴｒｋＢ，ＧＦＲα１，ＡＭＰＫ型グルタミン酸受容体（特に、ＧｌｕＲ１−４，またはＧｌｕＲα１−α４）），カイニン酸型グルタミン酸受容体（特に、ＧｌｕＲ５−７、または、ＧｌｕＲβ１−β３）），ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体（特に、ＮＡ２Ａ−Ｄ、またはＧｌｕＲε１−ε４）、ＮＲ１（ＧｌｕＲζ）、ＮＲ３Ａ，３Ｂ（ＧｌｕＲκ１）），代謝型グルタミン酸受容体（特に、ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ５、ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ７、ｍＧｌｕＲ８）、ＧＡＢＡ受容体（特に、ＧＡＢＡＡ，ＧＡＢＡＢ，ＧＡＢＡＣ）、グリシン受容体、オピオイド受容体、シグマ受容体、カンナビノイド受容体（特に、ＣＢ１受容体、ＣＢ２受容体）タキキニン受容体（特に、ＮＫ１，ＮＫ２，ＮＫ３受容体）、ＣＧＲＰ受容体、ＶＩＰ受容体、ＰＡＣ受容体、ソマトスタチン受容体（特に、ｓｓｔ１，ｓｓｔ２Ａ，ｓｓｔ２Ｂ，ｓｓｔ３，ｓｓｔ４，ｓｓｔ５），ＣＣＫ受容体（特に、ＣＣＫ１，ＣＣＫ２），ガラニン受容体（ＧａｌＲ１，ＧａｌＲ２），ＮＰＹ受容体（特に、Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６）、ニコチン性アセチルコリン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ドーパミン受容体、エンドセリン受容体、オレキシン受容体、サイトカイン受容体（特に、ＩＬ１受容体，ＩＬ２受容体，ＩＬ３受容体，ＩＬ４受容体，ＩＬ５受容体，ＩＬ６受容体，ＩＬ７受容体，ＩＬ８受容体，ＩＬ９受容体，ＩＬ１０受容体，ＩＬ１１受容体，ＩＬ１２受容体，ＩＬ１３受容体，ＩＬ１４受容体，ＩＬ１５受容体，ＩＬ１６受容体，ＩＬ１７受容体，ＩＬ１８受容体，ＩＬ１９受容体，ＩＬ２０受容体，ＬＩＦ受容体、ＯＳＭ受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＣＴ−１受容体、ＰＲＬ受容体、ＧＨ受容体、ＥＰＯ受容体、ＴＰＯ受容体、ＧＣＳＦ受容体、ＩＦＮ−α，ＩＦＮ−β，ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ受容体、Ｆａｓ受容体、ＣＤ２８受容体、ＣＤ３０受容体、ＣＤ４０受容体、ＳＣＦ受容体、ＥＤＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、Ｍ−ＣＳＦ受容体、インスリンＩＧＦ受容体、ＴＧＦβ受容体、Ａｃｔｉｖｉｎ受容体、ケモカイン受容体、ＭＰ−１受容体、ＲＡＮＴＥＳ受容体）、アンギオテンシン受容体（特に、ＡＴ１，ＡＴ２）、アンギオテンシン（１−７）受容体、血小板膜糖タンパク質受容体、ＣＲＦ受容体、グルココルチコイド受容体、Ｔｏｌｌ様受容体（特に、ＴＬＲ１，ＴＬＲ２，ＴＬＲ３，ＴＬＲ４，ＴＬＲ５，ＴＬＲ６，ＴＬＲ７，ＴＬＲ８，ＴＬＲ９，ＴＬＲ１０）、レチノイン酸受容体、ＩＰ３受容体、リアノジン受容体、ＲＩＧ−Ｉ−ｌｉｋｅ受容体，ＮＯＤ−ｌｉｋｅ受容体，Ａｃｉｄ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ（ＡＳＩＣ，特に、ＡＳＩＣ１，ＡＳＩＣ１ａ，ＡＳＩＣ１ｂ，ＡＳＩＣ２，ＡＳＩＣ２ａ，ＡＳＩＣ２ｂ，ＡＳＩＣ３，ＡＳＩＣ４，ＥＮａＣ／Ｄｅｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（ＥＮａＣは、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ）（特に、αＥＮａＣ，βＥＮａＣ，γＥＮａＣ）等−を抑制するｓｈＲＮＡの塩基配列や、またこれらを変化させるｍｉＲＮＡの塩基配列などが挙げられる。
機能操作用遺伝子として、市販の遺伝子を用いることができ、また市販の遺伝子を公知の方法、または自体公知の方法により変異させたものを用いてもよい。
【００４１】
本発明において、遺伝子を発現させる方法は、特に限定されないが、プロモーター下で遺伝子を発現させる方法、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム（例えば、配列番号８で示される核移行シグナルを付加したＣｒｅ、配列番号９及び配列番号１０で示されるｌｏｘＰ配列を用いる）を使用して遺伝子を発現させる方法、薬剤誘導的に遺伝子の発現を操作する方法（例えば、ｔｅｔ−ｏｎシステム（ＴＲＥプロモーター（配列番号１１）とｒｔＴＡ（配列番号１２））、ｔｅｔ−ｏｆｆシステム（ＴＲＥプロモーター（配列番号１１）とｔＴＡ（配列番号１３）））等が挙げられる。
【００４２】
本発明において、ウイルスベクターは、特に限定されないが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルス（ＨＩＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ボックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、エプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シンピスウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター等が挙げられる。
【００４３】
より好ましくは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルス（ＨＩＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等が挙げられる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターには種々の血清型が存在し、本発明では２型若しくは５型アデノ随伴ウイルスを使用することが好ましいが、他の血清型でも構わない。アデノ随伴ウイルスベクターは、宿主細胞ゲノムへの組込みが（ほとんど）起こらないこと、病原性がないことが知られており、安全性が担保されているため、この観点からアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いることはさらに好ましい。レンチウイルスベクターやレトロウイルスベクターは、導入遺伝子の宿主ゲノムへの組込みがあるが、例えば、がん等の致死性疾患を対象とする場合に使用することができる。アデノウイルスには種々の血清型が存在するが、本発明では、特に血清型を限定しない。
【００４４】
ウイルスベクターはウイルス遺伝子を完全又はほぼ完全に欠失する複製欠失ウイルスベクターが好ましい。アデノウイルスベクターは少なくともＥ１領域が非機能的であることが好ましい。また、他の領域も改変してよく、特にＥ３領域（ＷＯ９５／０２６７）、Ｅ２領域（ＷＯ９４／２８９３８）、Ｅ４領域（ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７）又は後期遺伝子Ｌ１からＬ５の任意のものを改変することができる。複製欠失ウイルスのような改変ウイルスベクターは、自体公知の方法により作成することができる。また、改変ウイルスベクターは、自体公知の方法により回収（さらには精製）することができる。
【００４５】
ウイルスベクターを感染させる動物としては特に限定されず、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類等が挙げられる。中でも、ヒト、サル、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、ネズミ、ウサギ、ウシ等の哺乳類が好ましく、ラット、マウス又はヒトがより好ましく、ヒト又はマウスがさらに好ましい。ウイルスベクターを感染させる細胞としては、このような動物の細胞が好ましい。
【００４６】
本発明において、臓器とは、脳及び脊髄を除く臓器であれば特に限定されないが、例えば、口腔、咽頭、食道、胃、十二指腸、小腸、盲腸、虫垂、大腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、膵臓、脾臓、リンパ節、リンパ管、扁桃、喉頭、声門、気管、気管支、肺、横隔膜、心臓、血管（動脈と静脈を含む）、腎臓、副腎、尿管、尿道、膀胱、前立腺、精巣、精巣上体、陰茎、卵巣、卵管、子宮、膣、骨、骨髄、軟骨、筋、腱、靭帯、皮膚、脂肪組織、甲状腺、副甲状腺、鼻、眼、耳（外耳と中耳と内耳）、舌、顔面などであってもよく、また、これら臓器の内部や膜や周辺の組織であってもよく、特に腎臓皮質、膵臓、胃、頚部動脈の圧受容器領域組織が好ましい。
【００４７】
本発明において、腫瘍とは、例えば、良性腫瘍であっても、悪性腫瘍であっても良い。腫瘍とは、例えば、［００４６］に記載の臓器に発生した原発性腫瘍であっても良く、［００４６］に記載の臓器に他臓器から転移した転移性腫瘍であっても良い。また腫瘍とは、口腔がん、咽頭がん、食道がん、胃がん、小腸腫瘍、大腸がん、肝臓がん、胆嚢がん、胆管癌、膵臓がん、リンパ腫、喉頭がん、肺がん、腎臓がん、副腎がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、、膵嚢胞性腫瘍、胆道がん、膵臓がん、大腸がん、直腸がん、乳がん、肺がん、各骨軟部腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、精巣がん、腎がん、腎盂尿管がん、陰茎がん、後腹膜腫瘍、副腎がん、頭頸部がん、甲状腺がん、子宮がん、卵巣がん、皮膚がん、肉腫（筋肉や神経や骨などに発生）、白血病、縦隔腫瘍、転移性肺がん、転移性肺腫瘍、転移性肝がん、転移性肝腫瘍、転移性骨腫瘍の悪性腫瘍であってもよく、これらの良性腫瘍であっても良い。
【００４８】
本発明において、腫瘍を切除した部位とは、がんの一部又は全部を切除後の組織とも言い換えることができる。
【００４９】
本発明において、腫瘍を切除する方法は、例えば、外科手術等が挙げられる。
【００５０】
本発明において、遺伝子を組み込むとは、該遺伝子が宿主細胞の染色体中に、必要によりプロモーター、レギュレーター等を伴った状態で組み込まれるか、あるいは発現ベクターに該遺伝子が適当なプロモーター等を伴って組み込まれた状態で、宿主細胞中に含まれることを意味する。
【００５１】
本発明において、ウイルスベクターを局所注入させる方法は、注射剤もしくは噴霧剤を直接、脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に直接注射もしくは噴霧するか、あるいは徐放性製剤（デポ剤）を脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に埋め込むのが好ましい。また、局所注入量は、局所注入対象、局所注入臓器、剤形、疾患の程度又は局所注入方法等に応じて適宜選択されるが、通常、ウイルスベクター液の局所注入量は、組織１００ｍｍ３当たり、一回に０．５μｌ〜５μｌである。局所注入されるウイルスベクター液に含まれるウイルスベクターのゲノムコピー濃度は、１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ以上であってもよい。また、局所注入回数も剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択され、１回局所注入とするか、ある間隔をおいて持続投与とすることもできる。持続局所注入の場合、局所注入間隔は１日１回から数ヶ月に１回であってもよい。
【００５２】
具体的な局所注入方法としては、例えば、ＤＴＡなどの神経細胞を死滅させるタンパクをコードする遺伝子、ジフテリア毒素受容体（ＤｉｐｈｔｈｅｒｉａＴｏｘｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＤＴＲ）、インターロイキン２受容体（ＩＬ２Ｒα等）等をコードする遺伝子、ＮａＣｈＢａｃ及びその変異体（ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２１９Ａなど）などの神経刺激作用のあるタンパクをコードする遺伝子、チャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）、その変異型チャネルロドプシン２（ＣｈＲ２／Ｈ１３４Ｒ、ＣｈＲ２／Ｃ１２８Ｘ（ＸはＴ，ＡまたはＳ）ＣｈＲ２／Ｄ１５６Ａ、ＣｈＲ２／Ｅ１２３Ｔ（ＣｈＥＴＡ）、キメラ型ＣｈＲ等）、ボルボックスチャネルロドプシン１等の光刺激で活性化して神経刺激作用のあるタンパクをコードする遺伝子、Ｋｉｒ２．１、ｅＴｅＮＴ等の神経抑制作用のあるタンパクをコードする遺伝子、ハロロドプシン、アーキロドプシン３及びアーキロドプシンＴ等の光刺激で活性化して神経抑制作用のあるタンパクの遺伝子、ｓｈＲＮＡ（例えば、Ｎｅｕｔｒａｌ  ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ  ２（ｓｍｐｄ３）に対するｓｈＲＮＡ等）、ｍｉＲＮＡ等の遺伝子発現調節作用をもつ塩基配列が組み込まれたウイルスベクター等を特定の組織、腫瘍または腫瘍を切除した部位へ局所注射する方法、又は、患者の病変部位の組織を体外に取り出して、該細胞にＤＴＡなどの神経細胞を死滅させるタンパクをコードする遺伝子、ジフテリア毒素受容体（ＤｉｐｈｔｈｅｒｉａＴｏｘｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＤＴＲ）、インターロイキン２受容体（ＩＬ２Ｒα等）等をコードする遺伝子、ＮａＣｈＢａｃ及びその変異体（ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２１９Ａなど）などの神経刺激作用のあるタンパクをコードする遺伝子、チャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）、その変異型チャネルロドプシン２（ＣｈＲ２／Ｈ１３４Ｒ、ＣｈＲ２／Ｃ１２８Ｘ（ＸはＴ，ＡまたはＳ）ＣｈＲ２／Ｄ１５６Ａ、ＣｈＲ２／Ｅ１２３Ｔ（ＣｈＥＴＡ）、キメラ型ＣｈＲ等）、ボルボックスチャネルロドプシン１等の光刺激で活性化して神経刺激作用のあるタンパクをコードする遺伝子、Ｋｉｒ２．１、ｅＴｅＮＴ等の神経抑制作用のあるタンパクをコードする遺伝子、ハロロドプシン、アーキロドプシン３及びアーキロドプシンＴ等の光刺激で活性化して神経抑制作用のあるタンパクの遺伝子、ｓｈＲＮＡ（例えば、Ｎｅｕｔｒａｌ  ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ  ２（ｓｍｐｄ３）に対するｓｈＲＮＡ等）、ｍｉＲＮＡ等の遺伝子発現調節作用をもつ塩基配列が組み込まれたウイルスベクターを導入し形質転換させた後に、形質転換された前記細胞を、患者の特定の組織、腫瘍または腫瘍を切除した部位に移植する方法等が挙げられる。
本発明において、遺伝子発現させた後に薬液投与によって神経細胞を死滅等させてもよい。例えば、ジフテリア毒素受容体遺伝子を発現させた後にジフテリア毒素含有薬液を投与して神経細胞を死滅させてもよく、インターロイキン２受容体遺伝子を発現させた後にｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ含有薬液を投与して神経細胞を死滅させてもよい。
【００５３】
本発明において、ウイルスベクター液の局所注入量は、組織１００ｍｍ３あたり一回に０．５μｌ〜５μｌのウイルスベクター液であってもよい。組織の体積は、公知の方法を用いて測定することができる。
【００５４】
本発明において、局所注入されるウイルスベクター液に含まれるウイルスベクターのゲノムコピー濃度は、細胞培養液の液１ｍＬあたり１−５ｘ１０１１ＧＣ以上であってもよい。ウイルスベクターのゲノムコピー濃度は、公知の方法を用いて測定することができる。
【００５５】
本発明において、ウイルスベクターを末梢神経に感染させるとは、ウイルスベクターに組み込まれた外来性遺伝子を細胞や生体に導入すること等をいう。感染には、順行性または逆行性感染がある。順行性感染とは、例えば、末梢神経の細胞体から終末への方向に感染させることをいう。逆行性感染とは、例えば、末梢神経の終末から細胞体への方向に感染させることをいう。このようなウイルスベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞又は動物に感染させる工程を含む外来性遺伝子の導入方法も本発明に含まれる。
【００５６】
本発明では、末梢臓器内からウイルスベクターを逆行性に末梢神経に感染させることが好ましく、末梢臓器内でウイルスベクターを順行性に末梢神経に感染させることが好ましく、またこれらと組み合わせる形では、末梢臓器外でウイルスベクターを順行性に末梢神経に感染させることが好ましい。
【００５７】
本発明において、ウイルスベクターを末梢神経に感染させることにより、感染した末梢神経内で末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の機能を変化させる機能を有するタンパク質を発現させることができる。
【００５８】
本発明において、末梢神経を操作するとは、例えば、末梢神経の機能を促進させたり、抑制させたり、末梢神経等を死滅させたり、またはその他の神経細胞機能を変化させること等をいう。この操作の目的に応じて、ウイルスベクターに組み込む遺伝子を適宜選択することができる。
【００５９】
本発明において、疾病とは、予防または治療を要するものであれば特に限定されないが、例えば、世界保健機関憲章に基づき世界保健機関（ＷＨＯ）が作成した、疾病及び関連保健問題の国際統計分類（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ、以下「ＩＣＤ」と略）である、ＩＣＤ−１０（２００３年版）に準拠した基本分類表に記載の疾患であってもよい（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／ｔｏｕｋｅｉ／ｓｉｐｐｅｉ／を参照）。この場合において、第１−１９章に記載の疾患には脳や脊髄の病気も含まれるが、この病態や病因や症状等に末梢臓器の関わる場合には本発明の対象となる。
【００６０】
ア．ＩＣＤ−１０（２００３年版）準拠  基本分類表
【００６１】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【００６２】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【表２−１５】
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【表２−１６】
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【表２−１７】
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【表２−１８】
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【表２−１９】
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【００６３】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【００６４】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【００６５】
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【表５−９】
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【００６６】
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【表６−８】
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【表６−９】
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【００６７】
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【００６８】
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【００６９】
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【表９−１０】
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【表９−１１】
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【００７０】
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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【表１０−７】
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【００７１】
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１１−４】
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【表１１−５】
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【表１１−６】
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【表１１−７】
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【表１１−８】
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【表１１−９】
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【表１１−１０】
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【００７２】
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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【表１２−６】
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【表１２−７】
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【表１２−８】
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【表１２−９】
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【００７３】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【表１３−５】
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【表１３−６】
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【表１３−７】
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【表１３−８】
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【表１３−９】
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【表１３−１０】
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【表１３−１１】
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【表１３−１２】
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【表１３−１３】
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【表１３−１４】
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【表１３−１５】
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【００７４】
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
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【表１４−５】
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【表１４−６】
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【表１４−７】
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【表１４−８】
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【表１４−９】
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【表１４−１０】
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【００７５】
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
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【表１５−５】
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【表１５−６】
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【表１５−７】
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【表１５−８】
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【表１５−９】
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【表１５−１０】
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【表１５−１１】
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【００７６】
【表１６−１】
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【表１６−２】
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【表１６−３】
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【表１６−４】
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【表１６−５】
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【表１６−６】
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【表１６−７】
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【表１６−８】
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【表１６−９】
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【００７７】
【表１７−１】
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【表１７−２】
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【表１７−３】
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【表１７−４】
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【表１７−５】
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【表１７−６】
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【表１７−７】
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【表１７−８】
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【表１７−９】
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【表１７−１０】
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【表１７−１１】
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【表１７−１２】
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【表１７−１３】
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【表１７−１４】
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【表１７−１５】
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【表１７−１６】
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【００７８】
【表１８−１】
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【表１８−２】
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【表１８−３】
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【表１８−４】
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【表１８−５】
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【表１８−６】
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【表１８−７】
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【表１８−８】
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【００７９】
【表１９−１】
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【表１９−２】
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【表１９−３】
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【表１９−４】
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【表１９−５】
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【表１９−６】
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【表１９−７】
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【表１９−８】
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【表１９−９】
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【表１９−１０】
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【表１９−１１】
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【表１９−１２】
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【表１９−１３】
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【表１９−１４】
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【表１９−１５】
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【表１９−１６】
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【表１９−１７】
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【表１９−１８】
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【表１９−１９】
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【表１９−２０】
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【表１９−２１】
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【表１９−２２】
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【表１９−２３】
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【表１９−２４】
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【表１９−２５】
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【表１９−２６】
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【表１９−２７】
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【表１９−２８】
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【表１９−２９】
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【表１９−３０】
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【表１９−３１】
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【表１９−３２】
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【表１９−３３】
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【００８０】
なお、細菌，ウイルス及びその他の病原体（Ｂ９５−Ｂ９７）は、通常疾病を惹起する。これらの細菌，ウイルス及びその他の病原体（Ｂ９５−Ｂ９７）が惹起する疾病は従来十分に研究され当業者に周知されているから、本発明においてもそれらに従ってよい。
【００８１】
本発明において、疾病とは、例えば、循環器疾患やその関連疾患（心不全、高血圧、不整脈、虚血性心疾患（心筋梗塞、狭心症）、心臓弁膜症、周産期心筋症、脳卒中、慢性腎臓病、腎不全、胸部大動脈瘤、腹部大動脈瘤、大動脈解離、閉塞性動脈硬化症、閉塞性血栓性血管炎、原発性肺高血圧症、動脈硬化、糖尿病）、肥満、高脂血症、高尿酸血症、痛風、感染症、敗血症、感染性呼吸器疾患（かぜ症候群、インフルエンザ、急性気管支炎、細菌性肺炎、肺膿瘍、肺結核、非結核性肺抗酸菌症、肺真菌症、肺寄生虫症、日和見感染症（ニューモシスチス肺炎、サイトメガロウイルス肺炎）、誤嚥性肺炎等）、気道閉塞性疾患（慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、びまん性汎細気管支炎）、アレルギー性肺疾患（気管支ぜんそく、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、薬剤性肺炎、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症）、間質性肺疾患（特発性間質性肺炎、放射線肺炎、サルコイドーシス、特発性器質化肺炎、膠原病肺）、肺血管性病変（肺血栓塞栓症、肺動脈性肺高血圧症、肺水腫）、胸膜疾患（胸膜炎、膿胸、気胸）、呼吸不全（急性呼吸不全、ＡＲＤＳ、慢性呼吸不全）、気管支拡張症、じん肺、原発性肺胞低換気症候群、過換気症候群、睡眠時無呼吸症候群、リンパ脈管筋腫症、肺移植、アレルギー性疾患（花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支炎、気管支喘息、レフレル症候群、口内炎、食事性アレルギー性胃炎、腸炎（アレルギー性下痢）、潰瘍性大腸炎、心内膜炎、結節性動脈周囲炎、閉塞性動脈内膜炎、蕁麻疹、クインケ浮腫、結節性紅斑、湿疹、接触性皮膚炎、アレルギー性角膜炎、結膜炎、交換性眼炎等）、自己免疫性疾患（ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性胃炎、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、潰瘍性大腸炎、クローン病、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎、高安動脈炎、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、バセドウ病、橋本病、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病、１型糖尿病、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、天疱瘡、膿疱性乾癬、尋常性乾癬、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、尋常性白斑、サットン後天性遠心性白斑・サットン母斑、原田病、自己免疫性視神経症、自己免疫性内耳障害、特発性無精子症、習慣性流産、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、シェーグレン症候群、ＩｇＧ４関連疾患、血管炎症候群、混合性結合組織病）、消化器疾患（胃食道逆流症、Ｂａｒｒｅｔｔ食道、食道アカラシア、食道・胃静脈瘤、Ｍａｌｌｏｒｙ−Ｗｅｉｓｓ症候群、急性胃炎、急性胃粘膜病変、慢性胃炎、機能性ディスペプシア、胃・十二指腸潰瘍、胃ＭＡＬＴリンパ腫、胃悪性リンパ腫、胃腺腫、胃ポリープ、感染性腸炎、薬剤性腸炎、虫垂炎、腸閉塞症  （イレウス）、虚血性腸炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、Ｓ状結腸軸捻転症、大腸憩室症、大腸ポリープ、痔等）、肝臓疾患（急性肝炎、Ｂ型慢性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、肝硬変、薬物性肝障害、アルコール性肝障害、自己免疫性肝炎、原発性胆���性肝硬変、代謝性肝障害（ウィルソン病、ヘモクロマトーシス）、肝膿瘍）、胆嚢結石、胆嚢炎、総胆管結石、肝内結石、胆管炎、胆嚢ポリープ、胆嚢腺筋腫症、急性膵炎、慢性膵炎、膵嚢胞、膵嚢胞性腫瘍、腹膜炎、消化管ヘルニア、骨量低下、骨粗しょう症、骨折、脱臼、変形性膝関節症、内分泌疾患、しびれ、痛み、精神疾患（双極性障害、うつ）、てんかん、がんなどが挙げられる。
【００８２】
悪性新生物（本発明において、がんともいう。）は、口腔がん、咽頭がん、食道がん、胃がん、小腸腫瘍、大腸がん、肝臓がん、胆嚢がん、胆管癌、膵臓がん、膵嚢胞性腫瘍、リンパ腫、喉頭がん、肺がん、腎臓がん、副腎がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆道がん、膵臓がん、大腸がん、直腸がん、乳がん、肺がん、各骨軟部腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、精巣がん、腎がん、腎盂尿管がん、陰茎がん、後腹膜腫瘍、副腎がん、頭頸部がん、甲状腺がん、子宮がん、卵巣がん、皮膚がん、肉腫（筋肉や神経や骨などに発生）、白血病、縦隔腫瘍、転移性肺がん、転移性肺腫瘍、転移性肝がん、転移性肝腫瘍、転移性骨腫瘍等の悪性新生物が挙げられる。
【００８３】
本発明において、疾病の「予防」とは、例えば、疾病の完全な発症を阻止することをいい、疾病の「治療」とは、例えば、疾病による症状の緩解、又は完治させることをいう。
【００８４】
本発明において、プロモーターは、翻訳開始コドンの上流に位置する非翻訳配列であり、特定のＤＮＡの転写をコントロールする。
本発明で用いられるプロモーターは、神経特異的プロモーターであることが好ましく、さらに末梢の自律神経、求心性神経、迷走神経、求心性神経、又は腸神経系（例えば、セロトニン神経）特異的プロモーターであることが好ましく、例えば配列番号１４、配列番号１５等で示される配列、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００３  Ｖｏｌｕｍｅ  １１２（１−２）：８−２３．Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ等に記載されている配列等で表されるＴＨプロモーター、配列番号１６等で示される配列、Ｊ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．１９９２ｖｏｌ．２６７（２８）：２０３９２−２０３９９．Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｈｏｌｉｎｅ  Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｅｉｏｎ、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１１０３等に記載されている配列等で表されるＣｈＡＴプロモーター、配列番号１７等で示される配列で表されるＳｙｎＩプロモーター、配列番号１８等で示される配列で表されるＴｐＨ−２プロモーター、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００９  １６：６８１−６８８．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｓｅｒｏｔｏｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ等に記載されている配列等で表されるＴｐＨ−３プロモーター、配列番号１９等で示される配列等で表されるＴｐＨ−４プロモーター、配列番号２０、配列番号２１等で示されるＮＳＥプロモーター、配列番号２２等で示される配列等で表されるＤＢＨプロモーター、配列番号２３等で示される配列、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００４．１２（１４）：１７３１−１７４０．Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｔｈａｔ  Ｄｒｉｖｅｓ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｎ  Ｎｏｒａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  Ｎｅｕｒｏｎｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ４１（２００６）３６４−３７０  Ｎｏｒａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎＮＯＳ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ  ｎｅｒｖｅｓ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ等に記載されている配列等で表されるＰＲＳ×８プロモーター、前半の配列（配列番号２４、配列番号２５等で示される配列）＋機能操作用遺伝子配列＋後半の配列（配列番号２６、配列番号２７等で示される配列）で示される配列、Ｃｅｌｌ  １９９５．８３（２）：２６９−２７８．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｇｒｏｗｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧＡＰ−４３  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｎｅｒｖｅ  ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉ��  ｍｉｃｅ、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９０．９（３）：８３３−８４０．Ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｙ−１  ｇｅｎｅ等に記載されている配列等で表されるＴｈｙ−１．２カセットプロモーター、配列番号２８、配列番号２９等で示される配列等で表されるＴｈｙ１Ｓプロモーター、ＣＲ−Ｉ（配列番号３０で示される配列）＋転写開始配列（配列番号３１）で示される配列等で表されるプロモーター、ＣＲ−ＩＩ（配列番号３２で示される配列）＋転写開始配列（配列番号３１）で示される配列等で表されるプロモーター、ＣＲ−ＩＩＩ（配列番号３３で示される配列）＋転写開始配列（配列番号３１）で示される配列等で表されるプロモーター、ＣＲ−ＩＶ（配列番号３４で示される配列）＋転写開始配列（配列番号３１）で示される配列等で表されるプロモーター、ＣＲ−Ｖ（配列番号３５で示される配列）＋転写開始配列（配列番号３１）で示される配列等で表されるプロモーター、ＳＥＲＴプロモーターであることが好ましく、特に配列番号１４、配列番号１５等で示される配列、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００３  Ｖｏｌｕｍｅ  １１２（１−２）：８−２３．Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ等に記載されている配列等で表されるＴＨプロモーター、配列番号１６等で示される配列、Ｊ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．１９９２ｖｏｌ．２６７（２８）：２０３９２−２０３９９．Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｈｏｌｉｎｅ  Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｅｉｏｎ、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１１０３等に記載されている配列等で表されるＣｈＡＴプロモーター、配列番号１７等で示される配列で表されるＳｙｎＩプロモーターであることが好ましい。
また本発明で用いられるプロモーターがヒトの治療に用いられる場合には、例えばヒトの生体において神経特異的に機能するプロモーター（ヒト、マウス、ラット等の哺乳動物のゲノム配列由来の神経特異的プロモーターなど）であってもよく、なかでもヒトのゲノム配列情報由来の神経特異的プロモーターが好ましい。
また本発明で用いられるプロモーターとして、ウイルスベクターを脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を除去した部位に特異的に連絡している神経に摂取させる場合には、ウイルスベクターを導入する細胞内で自己複製可能なものであればよく、さらに好ましくはＣＡＧプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターであり、特にＣＡＧプロモーターであることが好ましい。
プロモーターとして、市販品を用いることができ、また市販品のプロモーターを公知の方法、または自体公知の方法により変異させたものを用いてもよい。
【００８５】
機能操作用遺伝子、組換え発現ベクター、またはウイルスベクターに付加されるか、または組み込まれる蛍光タンパク質としては、特に限定されないが、例えば、配列番号３６等で示される配列で表されるｔｕｒｂｏＲＦＰ、配列番号３７等で示される配列で表されるＧＣａＭＰ３、配列番号３８等で示される配列で表されるＧＣａＭＰ６ｆ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＦＰ、ＹＦＰ等が挙げられる。
蛍光タンパク質として、市販の蛍光タンパク質を用いることができ、また市販の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を公知の方法、または自体公知の方法により変異させたものを用いてもよい。
【００８６】
ウイルスベクター作製用プラスミドとして、一般的には、細菌、酵母、糸状菌、植物細菌、哺乳動物細胞等でタンパク質を発現させることのできるＤＮＡあるいはＲＮＡウイルスベクター作製用のプラスミドが挙げられる。本発明において、ベクターは特定のプラスミドにプロモーター及び機能操作用遺伝子を、公知の方法または自体公知の方法により組み込み、作製し得る。遺伝子の発現の程度、遺伝子発現部位などを確認する場合などにおいて、適宜蛍光タンパク質コード遺伝子を該プラスミドに組み込んでもよい。本発明において、プラスミド、プロモーター、機能操作用遺伝子（必要に応じて、さらに蛍光タンパク質発現遺伝子）の組み合わせは、前記したプラスミド、プロモーター、機能操作用遺伝子（、蛍光タンパク質発現遺伝子）のあらゆる組み合わせを包含する。プラスミドとして、市販品を用いることができ、また市販品のプラスミドを公知の方法、または自体公知の方法により変異させたものを用いてもよい。
【００８７】
本発明はまた、末梢神経を、死滅させる、刺激する、抑制する、またはその他の機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを含む末梢神経投与剤を提供する。本発明の末梢神経投与剤は局所神経操作用医薬として非常に有用である。本発明において、局所は、脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位と言い換えることもできる。
【００８８】
本発明において、末梢神経投与剤を投与する方法として、注射剤もしくは噴霧剤を直接、脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に直接注射もしくは噴霧するか、あるいは徐放性製剤（デポ剤）を脳および脊髄を除く臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に埋め込む方法等が挙げられる。また、投与量は、投与対象、投与臓器、剤形、疾患の程度又は投与方法等に応じて適宜選択されるが、通常、末梢神経投与剤の投与量は、組織１００ｍｍ３当たり一回に０．５μｌ〜５μｌである。ウイルスベクター液に含まれるウイルスベクターのゲノムコピー濃度は、１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ以上であってもよい。また、投与回数も剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択され、１回投与とするか、ある間隔をおいて持続投与とすることもできる。持続投与の場合、投与間隔は１日１回から数ヶ月に１回であってもよい。
【００８９】
具体的な投与方法としては、例えば、ＤＴＡなどの神経細胞を死滅させるタンパクをコードする遺伝子、ジフテリア毒素受容体（ＤｉｐｈｔｈｅｒｉａＴｏｘｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＤＴＲ）、インターロイキン２受容体（ＩＬ２Ｒα等）等をコードする遺伝子、ＮａＣｈＢａｃ及びその変異体（ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２１９Ａなど）などの神経刺激作用のあるタンパクをコードする遺伝子、チャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）、その変異型チャネルロドプシン２（ＣｈＲ２／Ｈ１３４Ｒ、ＣｈＲ２／Ｃ１２８Ｘ（ＸはＴ，ＡまたはＳ）ＣｈＲ２／Ｄ１５６Ａ、ＣｈＲ２／Ｅ１２３Ｔ（ＣｈＥＴＡ）、キメラ型ＣｈＲ等）、ボルボックスチャネルロドプシン１等の光刺激で活性化して神経刺激作用のあるタンパクをコードする遺伝子、Ｋｉｒ２．１、ｅＴｅＮＴ等の神経抑制作用のあるタンパクをコードする遺伝子、ハロロドプシン、アーキロドプシン３及びアーキロドプシンＴ等の光刺激で活性化して神経抑制作用のあるタンパクの遺伝子、ｓｈＲＮＡ（例えば、Ｎｅｕｔｒａｌ  ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ２（ｓｍｐｄ３）に対するｓｈＲＮＡ等）、ｍｉＲＮＡ等の遺伝子発現調節作用をもつ塩基配列が組み込まれたウイルスベクター等を特定の組織、腫瘍または腫瘍を切除した部位へ局所注射する方法、又は、患者の病変部位の組織を体外に取り出して、該細胞にＤＴＡなどの神経細胞を死滅させるタンパクをコードする遺伝子、ジフテリア毒素受容体（ＤｉｐｈｔｈｅｒｉａＴｏｘｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＤＴＲ）、インターロイキン２受容体（ＩＬ２Ｒα等）等をコードする遺伝子、ＮａＣｈＢａｃ及びその変異体（ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２１９Ａなど）などの神経刺激作用のあるタンパクをコードする遺伝子、チャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）、その変異型チャネルロドプシン２（ＣｈＲ２／Ｈ１３４Ｒ、ＣｈＲ２／Ｃ１２８Ｘ（ＸはＴ，ＡまたはＳ）ＣｈＲ２／Ｄ１５６Ａ、ＣｈＲ２／Ｅ１２３Ｔ（ＣｈＥＴＡ）、キメラ型ＣｈＲ等）、ボルボックスチャネルロドプシン１等の光刺激で活性化して神経刺激作用のあるタンパクをコードする遺伝子、Ｋｉｒ２．１、ｅＴｅＮＴ等の神経抑制作用のあるタンパクをコードする遺伝子、ハロロドプシン、アーキロドプシン３及びアーキロドプシンＴ等の光刺激で活性化して神経抑制作用のあるタンパクの遺伝子、ｓｈＲＮＡ（例えば、Ｎｅｕｔｒａｌ  ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ  ２（ｓｍｐｄ３）に対するｓｈＲＮＡ等）、ｍｉＲＮＡ等の遺伝子発現調節作用をもつ塩基配列が組み込まれた組換え発現ベクターを導入し形質転換させた後に、形質転換された前記細胞を、患者の特定の組織、腫瘍または腫瘍を切除した部位に移植する方法等が挙げられる。
本発明において、遺伝子発現させた後に薬液投与によって神経細胞を死滅等させてもよい。例えば、ジフテリア毒素受容体遺伝子を発現させた後にジフテリア毒素含有薬液を投与して神経細胞を死滅させてもよく、インターロイキン２受容体遺伝子を発現させた後にｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ含有薬液を投与して神経細胞を死滅させてもよい。
本発明はまた、末梢神経投与剤の製造のための、末梢神経を、死滅させる、刺激する、または抑制する、またはその他の神経細胞機能を変化させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターの使用を提供する。
【００９０】
本発明において、末梢神経投与剤の投与量は、組織１００ｍｍ３あたり一回に０．５μｌ〜５μｌのウイルスベクター液であってもよい。
【００９１】
本発明において、ウイルスベクター液に含まれるウイルスベクターのゲノムコピー濃度は、１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ以上であってもよい。
【００９２】
【表２０】
2018008770.tif 000222
【００９３】
本発明は、ヒトを含む哺乳動物の（Ａ）臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に（又はそこにある末梢神経に）、（Ｂ）遺伝子を組み込んだウイルスベクターを投与することを特徴とする（Ｃ）疾病の予防又は治療方法を包含する。
本発明は（Ａ）臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に（又はそこにある末梢神経に）（Ｂ）遺伝子を組み込んだウイルスベクターを注入することを特徴とする前記（Ｂ）含有医薬を包含する。
本発明は（Ａ）臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に（又はそこにある末梢神経に）（Ｂ）遺伝子を組み込んだウイルスベクターを注入することを特徴とする（Ｂ）含有（Ｃ）疾病の予防又は治療用医薬を包含する。
本発明は（Ａ）臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に（又はそこにある末梢神経に）注入するために使用される（Ｂ）遺伝子を組み込んだウイルスベクターを包含する。
本発明は（Ｃ）疾病の予防又は治療のために使用される（Ａ）臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に（又はそこにある末梢神経に）注入することを特徴とする（Ｂ）遺伝子を組み込んだウイルスベクター含有医薬を包含する。
本発明は（Ａ）臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位（又はそこにある末梢神経に）注入剤製造の為の（Ｂ）遺伝子を組み込んだウイルスベクターの使用を包含する。
本発明は（Ａ）臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位（又はそこにある末梢神経に）注入に投与される（Ｃ）疾病の予防又は治療剤製造の為の（Ｂ）遺伝子を組み込んだウイルスベクター含有医薬を包含する。
（Ｂ）遺伝子は、対象疾病のあらゆるメカニズムからどの末梢神経の機能をどのように変化させればよいかという観点から選択され、本発明はそのようにして選択された（Ｂ）遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、その疾病治療又は予防のために、ヒトを含む哺乳動物の（Ａ）臓器、腫瘍または腫瘍を切除した部位に（又はそこにある末梢神経に）注入する実施態様を包含する。
本発明者は、上記表２０で示される（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の組合わせにおいて、（Ｃ）疾病の予防又は治療効果を確認している。
例えば、表２０の上から第２段では、腎臓に交感神経機能を死滅させるタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだウイルスベクターを注入し高血圧が治療されたことが示されている。他の段も同様である。
【００９４】
本発明は、疾患における局所神経の働きが既知であったり予想できたりする疾患において局所神経操作による予防や治療を可能とする。また、本発明は、現時点では、疾患における局所神経の働きが不明ないし不明確である疾患において、その働きを調べるための実験技術として有用であり、さらには、その実験等を経てその疾患における神経の働きをおよそ理解した後においては、局所神経操作による予防や治療を可能とする。従って、各疾患において特定臓器の局所神経を刺激するような予防や治療、抑制するような予防や治療、除去するような予防や治療、神経機能を変化させるような予防や治療を、疾患に応じて、その疾患における神経の働きの理解の程度に応じて、どのようにも選択して行うことが出来る。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、これらの実施例は本発明の一例であり、本発明の技術的範囲はこれらに限定されるものではない。【００９６】
＜実施例１＞  組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの構築
ヒト組織由来の培養細胞、マウスまたはラット組織由来の培養細胞または組織からＲＮＡを公知の方法で抽出した後、逆転写反応をして各生物由来のｃＤＮＡライブラリを作製した。これらのｃＤＮＡライブラリを鋳型として、段落［００４０］で列挙した機能操作用遺伝子をＰＣＲで増幅した。ＣｒｅリコンビナーゼおよびｌｏｘＰ配列、段落［００８５］で列挙した蛍光タンパク質遺伝子をＰＣＲで増幅して取得した。ヒト組織由来の培養細胞、マウスまたはラット組織由来の培養細胞または組織からゲノムＤＮＡを用いて、プロモーター配列をＰＣＲで取得した。以上の方法により取得したプロモーター配列、機能操作用遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子を選択し、ＡＡＶベクタープラスミド（ｐＡＡＶ−ＭＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号４１）：ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＡＢＳ，ＩＮＣ．，ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＶＰＫ−４１０−ＳＥＲ２）に組み込み、ｐＡＡＶ−ＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ、ｐＡＡＶ−ＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ、ｐＡＡＶ−ＴＨ−ＣｒｅＥＲ、ｐＡＡＶ−ＴＨ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ、ｐＡＡＶ−ＴＨ−ＤＴＡ、ｐＡＡＶ−ＣｈＡＴ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ、ｐＡＡＶ−ＣｈＡＴ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ−２Ａ−ＧＣａＭＰ６ｆ、ｐＡＡＶ−ＣｈＡＴ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ、ｐＡＡＶ−ＣｈＡＴ−ＧＣａＭＰ３、ｐＡＡＶ−Ｆｌｅｘ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ、ｐＡＡＶ−Ｆｌｅｘ−ＤＴＡを作製した。本実施例において、ＴＨプロモーターとして、配列番号１５で示される配列で表されるプロモーターを使用し、ＣｈＡＴプロモーターとして、配列番号１６で示される配列で表されるプロモーターを使用した。これらのいずれか１以上と、ｐＡＡＶ−ＲＣおよびｐＨｅｌｐｅｒと５０ｍＬファルコンチューブ内で混合した（具体的な組み合わせについては実施例２以降を参照）。トランスフェクション前日に、３×１０６ｃｅｌｌｓ／１０ｃｍ  ｄｉｓｈになるように播種した２９３ＡＡＶ細胞にリン酸カルシウム法でトランスフェクションした。トランスフェクションに使用した各プラスミド量を以下に示した。
ｐＡＡＶ−ＲＣ２（配列番号３９）                    ６μｇ／１０ｃｍ  ｄｉｓｈ
ｐＨｅｌｐｅｒ（配列番号４０）                      ６μｇ／１０ｃｍ  ｄｉｓｈ
ｐＡＡＶ−ＭＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号４１）−特異的プロモーター−機能操作用遺伝子
６μｇ／１０ｃｍ  ｄｉｓｈ【００９７】
トランスフェクション後、２９３ＡＡＶ細胞を３７℃で４８時間ダルベッコ変法イーグル培地で培養後に上清を回収して、ＡＡＶ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いてＡＡＶを精製、濃縮（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ以上）した。【００９８】
＜実施例２＞  神経刺激用遺伝子の発現の効果の確認
逆行性のＡＡＶウイルスベクターによる感染と遺伝子発現、および、神経刺激用遺伝子ＮａＣｈＢａｃとその変異体の実際の神経活動増加作用を確認する実験を行なった。まず、Ｉｒｉｅ  Ｋ１，Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ  Ｔ，Ｆｕｊｉｙｏｓｈｉ  Ｙ．Ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｂｕｎｄｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１２  Ａｐｒ  ２４；３：７９３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１７９７．およびＩｒｉｅ  Ｋ，Ｋｉｔａｇａｗａ  Ｋ，Ｎａｇｕｒａ  Ｈ，Ｉｍａｉ  Ｔ，Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ  Ｔ，Ｆｕｊｉｙｏｓｈｉ  Ｙ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｔｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ  ａｎｄ  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５，３６８５−３６９４（２００９）に記載の方法に従って、ＮａＣｈＢａｃおよびその変異体ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａをリン酸カルシウム法（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で遺伝子導入して１２時間から３６時間後の培養ヒト胎児由来腎臓２９３細胞（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ培地，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））の電位をホールセルパッチクランプ法で測定した（パッチクランプアンプ装置，ＥＰＣ−１０，ＨＥＫＡ社製を使用）。図１に神経活動の測定結果を示す。電極内液の組成は、１０５ｍＭ  ＣｓＦ，３５ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＥＧＴＡ，ａｎｄ  １０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）．Ｔｈｅ  ｂａｔｈ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｏｎｔａｉｎｅｄ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），ａｎｄ  １０ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅとした。すべての実験は、２５±２℃で実施した。【００９９】
図１の結果から、神経刺激用遺伝子ＮａＣｈＢａｃとその変異体のＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａを細胞にトランスフェクションすることにより、細胞の電位変化が観察された。この結果により、神経刺激用遺伝子ＮａＣｈＢａｃとその変異体のＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａが神経活動を増加させる作用を有することが確認された。【０１００】
さらに交感神経刺激を目的として、ＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター、およびＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ以上）を使用した（ＴＨは、Ｔｙｒｏｓｉｎ  Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅプロモーターを意味する）。コントロール実験用ベクターとして、神経刺激作用のないＴＨ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ以上）を使用した。これは、交感神経特異的なＴＨプロモーターの調節下に、遺伝子発現確認用の赤色蛍光タンパクＲＦＰのみを発現する。ＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクターに感染して遺伝子導入された細胞では、交感神経特異的なＴＨプロモーターの調節下に、神経刺激用遺伝子としてＮａＣｈＢａｃあるいはＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ（ＮａＣｈＢａｃの変異体）を発現し、同時に、遺伝子発現確認用の赤色蛍光タンパクＲＦＰ（ｔｕｒｂｏＲＦＰ）の両者を発現する。
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）ラット）（体重３００−４００ｇ，♂）を、麻酔下（吸入麻酔フローセン（ハロタン）、武田薬品工業、０．５−１％）に、右側臥位の後腹膜切開から左の腎臓を剖出した。左腎臓（主に皮質）に、ＮａＣｈＢａｃ神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）では上記ＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰベクター液を、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）では上記ＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰベクター液を、偽神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）では上記ＴＨ−ｔｕｒｂｏＲＦＰベクター液を、ｓｙｒｉｎｇｅ（７１０５，Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を用いて１０ｕｌ局所注入した（１ｕｌずつ、１０箇所に局所注入）。その後、切開部分を縫合して麻酔から覚醒させ、飼養した。【０１０１】
ベクターを局所注入して１８週後に、Ｋａｍｉｙａ  Ａ，Ｋａｗａｄａ  Ｔ，Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｓ，Ｓｕｇｉｍａｃｈｉ  Ｍ．Ｃｌｏｓｅｄ−ｌｏｏｐ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｂａｒｏｒｅｆｌｅｘ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｉｎａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  ｆｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ａｒｃ  ｂｕｔ  ｐａｒｔｌｙ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｒｃ：ｐｒｅｄｉｃｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２０１１  Ａｐｒ  １；５８９（Ｐｔ  ７）：１７６９−９０．ＰＭＩＤ：２１４８６８３９に記載の方法に従って、左および右の腎臓交感神経活動、体血圧を測定した。麻酔下（吸入麻酔フローセン（ハロタン）、武田薬品工業、０．５−１％）に、右側臥位の後腹膜切開から左の腎動脈の領域（腎神経を含む）を剖出した。左腎神経に、ステンレススチールワイヤ電極（Ｂｉｏｆｌｅｘ  ｗｉｒｅ  ＡＳ６３３，Ｃｏｏｎｅｒ  Ｗｉｒｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を２か所装着して、シリコンゲル（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｌｏｗ  Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ，ＫＷＩＫ−ＳＩＬ，Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）で覆って電極を固定し、電極装着部の末梢側に手術糸を結んだ。次に、左側臥位の後腹膜切開から、同様に右腎神経にもステンレススチールワイヤ電極（同上）を装着した。こうして得た、左右の腎臓交感神経（ｍｕｌｔｉｕｎｉｔ，神経節後性）の電気信号を、ｂａｎｄ−ｐａｓｓ  ｆｉｌｔｅｒ  （１５０−１０００Ｈｚ）  （生体アンプＭＥＧ−６１０８およびＡＢ−６１０Ｊ，日本光電）を通し、全波整流積分して、Ａ／Ｄ変換して２００Ｈｚで記録し、保存した。図２及び図３ａ、３ｂ、３ｃに神経活動の結果を示す。
また一方、右頚部皮膚を切開して右総頚動脈を剖出し、高精度圧トランスデューサー（ＳＰＲ−３２０，Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を右総頚動脈から下方に（心臓に向かう方向に）挿入し、血圧用生体アンプ（ＡＰ６４１Ｇ，日本光電）を用いて体血圧を測定した。図３ｄに体血圧の測定結果を示す
その後、左右の腎臓の半分を摘出し、均質化（ＢＲＡＮＳＯＮ，ＳＯＮＩＦＩＥＲ  ２５０）して、腎臓のノルエピネフリン量を測定した（Ｌａｂｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  Ｎｏｒｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。組織固定用４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（１６３−２０１４５，Ｗａｋｏ）で還流固定および後固定し、左右の残りの腎臓と腹腔神経節を摘出して、凍結切片を作成し、免疫染色解析を行った。使用した抗体および染料は、ＤＡＰＩ（４‘，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅで細胞核の染色，１０２３６２７６００１  ＲＯＣＨＥ，ロシュライフサイエンス社），ＲＦＰ抗体（ａｂ２８６６４，Ａｂｃａｍ社），ＴＨ抗体（Ｔｙｒｏｓｉｎ  Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，ｓｃ−７８４７，Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社），Ｔｕｊ−１抗体（ｂｅｔａ  ｔｕｂｕｌｉｎ  ＩＩＩ，ｓｃ−５８８８８，Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）であった。組織形態は、共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００，オリンパス）で観察した。図４に免疫染色解析の結果を示す。【０１０２】
図２の結果から、偽神経刺激ベクター群では、ベクター側の腎臓交感神経活動は、対側の腎臓交感神経活動と同様であった（図２ａ）。ＮａＣｈＢａｃ神経刺激ベクター群では、ベクター側の腎臓交感神経活動は、対側に比して増加した（図２ｂ，対側の１８２％）。ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ神経刺激ベクター群では、ベクター側の腎臓交感神経活動は、対側に比して、さらに大きく増加した（図２ｃ，対側の２５１％）。【０１０３】
図３の結果から、ＮａＣｈＢａｃ神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）では、ベクター側の腎臓交感神経活動の量（図３ａ）と脈拍当り発火頻度（図３ｂ）が対側に比して増加し（対側の１８２％）、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）では、これらは、さらに大きく増加した（対側の２５１％）。偽神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）では、このような神経活動の増加は起こらなかった。腎臓ノルエピネフリン量は、神経活動の結果とよく一致した。すなわち、ＮａＣｈＢａｃ神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）では、ベクター側腎臓で対側よりも高く、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）では、さらに高かった（図３ｃ）。さらに、ＮａＣｈＢａｃ神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）では収縮期血圧と拡張期血圧が増加して高血圧となり、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ神経刺激ベクター群（Ｎ＝６）ではさらに重篤な高血圧となった（＃Ｐ〈０．０５ｖｓ．対側交感神経活動，＊Ｐ〈０．０５  ＮａＣｈＢａｃ神経刺激ベクター群ｖｓ．ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ神経刺激ベクター群）。【０１０４】
図４の結果から、ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ神経刺激ベクター群において、ＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクターを局所注入した側の左腎臓にＴＨ陽性ＲＦＰ陽性（図４ｂ、４ｃ、４ｄ）が存在したが、このＲＦＰ陽性神経はＴｕｊ１陽性であったため確かに神経であった。一方、ベクターを局所注入しなかった対側の右腎臓にはＲＦＰ陽性の交感神経は存在しなかった（図２ｅ）。腹腔神経節にも、ＴＨ陽性ＲＦＰ陽性の交感神経の細胞体が存在し（図４ａ）、これは左腎臓交感神経の細胞体だと思われた。以上より、作成したＡＡＶベクターは、腎臓に局所注入すると、逆行性に腎臓に分布する神経に感染し、交感神経特異的に挿入遺伝子（ｔｕｒｂｏＲＦＰ）を発現することを確認できた。
以上の結果から、ＮａＣｈＢａｃおよびＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａは、実際に神経活動を増加させる作用があることを確認できた。【０１０５】
＜実施例３＞  高血圧に対する治療効果の確認
実施例１で作製したＡＡＶベクター（ＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター）（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ以上）を交感神経刺激を目的として、および実施例１で作製したＡＡＶベクター（ＴＨ−ＣｒｅＥＲ  ＡＡＶベクター、Ｆｌｅｘ−ＤＴＡ  ＡＡＶベクター）（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ以上）を薬剤誘導性の交感神経除去を目的として用いた。ＴＨ−ＣｒｅＥＲ  ＡＡＶベクターに感染して遺伝子導入された細胞では、交感神経特異的プロモーターＴＨの制御下にＣｒｅＥＲ（Ｃｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅと、ｈｕｍａｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒのｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎの融合タンパク）が発現するが、この細胞にＦｌｅｘ−ＤＴＡ  ＡＡＶベクターが重複して感染し遺伝子導入されると、タモキシフェン投与によりＣｒｅＥＲが核に移行し、ｆｌｅｘスイッチ（Ｃｒｅ−ｌｏｘｐシステム）によりＣｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが働いてＤＴＡ（ジフテリア毒素）が発現し、細胞は死に至る。これら神経刺激用のＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰまたは神経刺激作用のないＴＨ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ、および、薬剤誘導性神経除去用のＴＨ−ＣｒｅＥＲおよびＦｌｅｘ−ＤＴＡの、３種のＡＡＶベクターを等量（１０ｕｌ／匹）ずつ混合し、動物投与用の３種ＡＡＶ混合ベクター液（各ベクター１０ｕｌずつで合計３０ｕｌ／匹）を調製した。
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）ラット）（体重３００−４００ｇ，♂）を、麻酔下（吸入麻酔フローセン（ハロタン）、武田薬品工業、０．５−１％）に、右側臥位の後腹膜切開から左の腎臓を剖出した。神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）および神経刺激後神経除去ベクター群（Ｎ＝８）では、左腎臓（その皮質）に、３種ＡＡＶ混合ベクター液（ＴＨ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ、ＴＨ−ＣｒｅＥＲおよびＦｌｅｘ−ＤＴＡ）をｓｙｒｉｎｇｅ（７１０５，Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を用いてそれぞれ３０ｕｌ局所注入した（３ｕｌずつ、１０箇所に）。コントロール群（Ｎ＝８）では同量のコントロールＡＡＶベクター液（ＴＨ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ、ＴＨ−ＣｒｅＥＲおよびＦｌｅｘ−ＤＴＡ）を同様に局所注入した。次に、左側臥位の後腹膜切開から右の腎臓を剖出し、右腎臓（その皮質）に、神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）および神経刺激後神経除去ベクター群（Ｎ＝８）では上記３種ＡＡＶ混合ベクター液を、コントロール群（Ｎ＝８）ではコントロールＡＡＶベクター液を、左腎臓の場合と同様にして同量を局所注入した。その後、切開部分を縫合して麻酔から覚醒させ、ベクター（あるいはＰＢＳ）の局所注入後２４週まで飼養した。
ベクターを局所注入して９週後の血圧測定後に、神経刺激後神経除去ベクター群（Ｎ＝８）ではタモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  Ｔ５６４８，Ｗａｋｏ）をＤｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）等（４％  ＤＭＳＯ（０４６−２１９８１，Ｗａｋｏ），６％  Ｅｔｈａｎｏｌ（０５７−００４５６，Ｗａｋｏ），９０％  胡麻油（ＳｅｓａｍｅＯｉｌ，２５６２０−６５，ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ））に溶解した薬液を調製して腹腔内投与（タモキシフェン１３０ｍｇ／ｋｇ体重）した。一方、神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）では対照として同量のＰＢＳを腹腔内投与した。ベクター局所注入の直後から２４週まで、３週毎に血圧（収縮期血圧および拡張期血圧）を尾動脈から測定した（マウス・ラット用無加温型非観血式血圧計  ＭＫ−２０００ＳＴ，室町機械株式会社）。図５に血圧の測定結果を示す。また、ベクターを局所注入して２４週後に、動物を組織固定用４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（１６３−２０１４５，Ｗａｋｏ）で還流固定し、左右の腎臓と腹腔神経節を摘出して後固定し、凍結切片を作成し、免疫染色解析を行った。使用した抗体および染料は、ＤＡＰＩ（４‘，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅで細胞核の染色，１０２３６２７６００１  ＲＯＣＨＥ，ロシュライフサイエンス社），ＴＨ抗体（Ｔｙｒｏｓｉｎ  Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，ｓｃ−７８４７，Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）であった。組織形態は、共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００，オリンパス）で観察した。図６に免疫染色の結果を示す。【０１０６】
図５の結果から、コントロール群（Ｎ＝８、コントロールＡＡＶベクター液を腎臓に局所注入）では、２４週まで血圧は変化しなかった（図５、▽）。神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）では、ベクター局所注入後９週まで血圧が増加して高血圧となり９週以降も高血圧が持続した（高血圧モデル動物の作成）（図５、△）。神経刺激後神経除去ベクター群（Ｎ＝８）では、ベクター局所注入後９週までは神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）と同様に血圧が増加して高血圧となったが、９週目のタモキシフェン投与後に血圧が徐々に低下し２４週目には、ベクター局所注入前のレベルに戻った（図５，●）（＃Ｐ〈０．０５ｖｓ．コントロール群，＊Ｐ〈０．０５神経刺激ベクター群ｖｓ．神経刺激後神経除去ベクター群）。また図５の結果から、高血圧モデル動物を作製できたことが確認された。【０１０７】
図６の結果から、神経刺激ベクター群では腎臓内にＴＨ陽性の腎臓交感神経が認められたが、神経刺激後神経除去ベクター群では腎臓交感神経が消失していた。以上より、腎臓の交感神経を除去するウイルスベクターの局所注入によって、実際に交感神経を除去できた。
以上の結果から、腎臓の交感神経を除去するウイルスベクターの局所注入によって、高血圧を改善するような治療効果を認めた。【０１０８】
＜実施例４＞  糖尿病に対する治療効果の確認
実施例１で作製したＡＡＶベクター（ＣｈＡＴ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター）（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ）を副交感神経刺激を目的として使用した。このＣｈＡＴ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクターに感染して遺伝子導入された細胞では、副交感神経特異的なＣｈＡＴプロモーターの制御下に、神経刺激用遺伝子としてＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ（ＮａＣｈＢａｃの変異体）と、遺伝子発現確認用の赤色蛍光タンパクｔｕｒｂｏＲＦＰの両者を発現する。また、コントロール実験を目的として、実施例１で作製したＡＡＶベクター（ＣｈＡＴ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター）を使用した。このＣｈＡＴ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクターに感染して遺伝子導入された細胞では、、遺伝子発現確認用の赤色蛍光タンパクｔｕｒｂｏＲＦＰが発現する。この２種のＡＡＶベクターをそれぞれ、動物投与用のＡＡＶベクター液として調製した（５ｕｌ／匹）。
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）ラット）（体重３００−４５０ｇ，♂）を、麻酔下（吸入麻酔フローセン（ハロタン）、武田薬品工業、０．５−１％）に、ストレプトゾシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ，Ｓ０１３０，Ｓｉｇｍａ）を腹腔内に投与（２日間隔で２回、各回３０ｍｇ／ｋｇ体重ずつ）した。１回目の腹腔内投与の日から、毎日、糖尿病肥満研究用飼料（Ｈｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ３２、総カロリーに占める脂肪由来カロリー比率（Ｆａｔ  ｋｃａｌ％）が約６０％，日本クレア）を、８週間に渡って摂食させた（摂食量は動物の自由とした）。【０１０９】
ストレプトゾシン高脂肪食投与８週間後に、麻酔下（吸入麻酔フローセン（ハロタン）、武田薬品工業、０．５−１％）に、腹部正中切開にて膵臓を剖出し、副交感神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）には上記ＣｈＡＴ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター液を、副交感神経偽刺激ベクター群（Ｎ＝８）にはＣｈＡＴ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター液（１０ｕｌ／匹）を、さらにコントロール群（Ｎ＝８）にはＰＢＳ（１０ｕｌ／匹）を、ｓｙｒｉｎｇｅ（７１０５，Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を用いて１０ｕｌずつ局所注入した（２ｕｌずつ、５箇所に）。その後、切開部分を縫合して麻酔から覚醒させた。ベクター（あるいはＰＢＳ）の局所注入後４週まで飼養した。この間も、糖尿病肥満研究用飼料（Ｈｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ  ３２，日本クレア）を摂食させた（摂食量は動物の自由とした）。
ＡＡＶベクター、あるいはＰＢＳの局所注入後４週の時点で、絶食後グルコース負荷試験を行った。まず、測定前日の２１時から１３時間絶食させた。測定日の朝、麻酔下（吸入麻酔フローセン（ハロタン）、武田薬品工業、０．５−１％）にて、鎖骨上部の頚部皮膚を切開して頚静脈を剖出し、さらに鼠径部皮膚を切開して大腿静脈を剖出した。朝１０時に、頚静脈および大腿静脈に２６ゲージ注射針（ＴＥＲＵＭＯ）を浅く穿刺して少量出血させ、検査用グルコースキット（ＧＬＵＣＯＣＡＲＤ  Ｇ  ＢＬＡＣＫ，ＧＴ−１８３０，ａｒｋｒａｙ社製、および、Ｇｓｅｎｓｏｒ，ａｒｋｒａｙ社製）によって空腹時血糖を各々測定し、２値の平均値を計算した。次に、耐糖能試験を行い、血糖値を測定した。２ｇ／ｋｇ体重のｇｌｕｃｏｓｅ（５０％  ブドウ糖注射液，大塚製薬製）を腹腔内に投与し、その０，１５，３０，６０，１２０分後に、同様にして頚静脈および大腿静脈から血糖値を測定し、２値の平均値を計算した。図７に血糖値の測定結果を示す。
その後、動物を組織固定用４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（１６３−２０１４５，Ｗａｋｏ）で還流固定し、延髄を摘出して後固定し、凍結切片を作成し、免疫染色解析を行った。使用した抗体および染料は、ＲＦＰ抗体（ａｂ２８６６４，Ａｂｃａｍ社）とＤＡＰＩ（４‘，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅで細胞核の染色，１０２３６２７６００１  ＲＯＣＨＥ，ロシュライフサイエンス社）であった。組織形態は、共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００，オリンパス）で観察した。図８に免疫染色の結果を示す。【０１１０】
図７の結果から、副交感神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）では、コントロール群（Ｎ＝８）および副交感神経偽刺激ベクター群（Ｎ＝８）に比して、空腹時血糖が低く、また耐糖能試験における血糖値（０，１５，３０，６０，１２０分値）が低かった（＃Ｐ〈０．０５ｖｓ．グルコース負荷前，＊Ｐ〈０．０５神経刺激ベクター群ｖｓ．神経偽刺激ベクター群およびコントロール群）。【０１１１】
図８の結果から、副交感神経刺激ベクター群では、延髄の迷走神経背側運動核および疑核に、ＲＦＰ陽性の神経細胞が存在した。これはコントロール群では、観察されなかった。以上より、作成したＡＡＶベクターは、膵臓に局所注入すると、逆行性に膵臓に分布する副交感神経に感染して副神経特異的に挿入遺伝子（ｔｕｒｂｏＲＦＰ）を発現することを確認できた。
以上より、膵臓の副交感神経を刺激するウイルスベクターの局所注入によって、糖尿病の耐糖能を改善するような治療効果が認められた。【０１１２】
＜実施例５＞  がんに対する治療効果の確認
（１）ラット乳がんに対する治療効果の確認（交感神経操作ウイルスベクターを使用する場合）
実施例１で作製したＡＡＶベクター（ＴＨ−ＣｒｅＥＲ  ＡＡＶベクター，Ｆｌｅｘ−ＤＴＡ  ＡＡＶベクター）（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ）を薬剤誘導性の交感神経除去を目的として使用した。ＴＨ−ＣｒｅＥＲ  ＡＡＶベクターに感染して遺伝子導入された細胞では、交感神経特異的なＴＨプロモーターの調節下にＣｒｅＥＲ（Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅと、ｈｕｍａｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒのｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎの融合タンパク）が発現するが、この細胞にＦｌｅｘ−ＤＴＡ  ＡＡＶベクターが重複して感染し遺伝子導入されると、タモキシフェン投与によりＣｒｅＥＲが核に移行し、ｆｌｅｘスイッチ（Ｃｒｅ−ｌｏｘｐシステム）によりＣｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが働いてＤＴＡ（ジフテリア毒素）が発現し、細胞は死に至る。この２種のＡＡＶベクターを等量（５ｕｌ／匹）ずつ混合し、動物投与用のＡＡＶベクター液（両ＡＡＶベクター合計１０ｕｌ／匹）を調製した。
Ｈｒａｓ１２８ラット（日本クレア，体重２５０−４００ｇ，♀）に、発がん性のあるＮ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）５０ｍｇ／ｋｇ体重を腹腔内投与して、乳がんを誘発し、乳がんモデル動物を作製した。乳がんの有無を体表から視診と触診で検査し、乳がんが認められた場合には、その大きさをノギス（株式会社ミツトヨ）で測定した。乳がんの大きさが８００ｍｍ３以上１０００ｍｍ３以下に達した時点で、麻酔下（吸入麻酔フローセン（ハロタン）、武田薬品工業、０．５−１％）に、上記ＡＡＶベクター液（交感神経除去ベクター群Ｎ＝８、交感神経偽除去ベクター群Ｎ＝８）あるいはＰＢＳ（コントロール群，Ｎ＝８）を、ｓｙｒｉｎｇｅ（７１０５，Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を用いて、その乳がん組織に１０ｕｌ局所注入した。さらに、交感神経除去ベクター群（Ｎ＝８）では、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  Ｔ５６４８，Ｗａｋｏ）をＤｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）等（４％  ＤＭＳＯ（０４６−２１９８１，Ｗａｋｏ），６％  Ｅｔｈａｎｏｌ（Ｅｔｈａｎｏｌ  ９９．５，０５７−００４５６，Ｗａｋｏ），９０％  胡麻油（Ｓｅｓａｍｅ  Ｏｉｌ，２５６２０−６５，ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ））に溶解した薬液を作成して腹腔内投与（タモキシフェン１３０ｍｇ／ｋｇ体重）し、一方、交感神経偽除去群（Ｎ＝８）では対照として同量のＰＢＳを腹腔内投与した。その後、麻酔から覚醒させ、ベクター（あるいはＰＢＳ）局所注入後１４週まで飼養した。ベクター局所注入後、２週毎に１４週まで、乳がんの大きさをノギスで測定した。図９に乳がんの大きさ変化の測定結果を示す。その後、乳がん組織の半分を摘出し、均質化（ＢＲＡＮＳＯＮ，ＳＯＮＩＦＩＥＲ  ２５０）して、組織ノルエピネフリン量を測定した（Ｌａｂｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  Ｎｏｒｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。図１０に乳がん組織ノルエピネフリン量の測定結果を示す。その後、動物を組織固定用４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（１６３−２０１４５，Ｗａｋｏ）で還流固定し、残りの乳がん組織を摘出して後固定し、凍結切片を作成し、免疫染色解析を行った。使用した抗体および染料は、ＤＡＰＩ（４‘，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅで細胞核の染色，１０２３６２７６００１  ＲＯＣＨＥ，ロシュライフサイエンス社），Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  Ｌｅｃｔｉｎ（ＤＬ１１７４，ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ），ＴＨ抗体（Ｔｙｒｏｓｉｎ  Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，ｓｃ−７８４７，Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）であった。組織形態は、共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００，オリンパス）で観察した。図１１に免疫染色の結果を示す。【０１１３】
図９の結果から、コントロール群（Ｎ＝８）および交感神経偽除去ベクター群（Ｎ＝８）では、がんは著明に増大したが、一方、交感神経除去ベクター群（Ｎ＝８）では、がんの増大は強く抑制された（＃Ｐ〈０．０５ｖｓ．コントロール群）。【０１１４】
図１０の結果から、乳がん組織ノルエピネフリン量は、コントロール群および交感神経偽除去ベクター群に比して、交感神経除去ベクター群では著減した。【０１１５】
図１１の結果から、免疫染色解析（２０ｕｍ厚凍結切片）で、コントロール群および交感神経偽除去ベクター群では乳がん組織内にＴＨ陽性の交感神経線維が認められたが、一方、交感神経除去ベクター群では、乳がん組織内の交感神経が消失していることが観察された。
以上より、乳がんに分布する交感神経を除去するウイルスベクター局所注入によって乳がん増大を抑制するような治療効果が認められた。【０１１６】
＜実施例６＞  がんに対する治療効果の確認
（２）ラット乳がんに対する治療効果の確認（副交感神経操作ウイルスベクターを使用する場合）
実施例１で作製したＡＡＶベクター（ＣｈＡＴ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ−２Ａ−ＧＣａＭＰ６ｆ  ＡＡＶベクター）（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ）を副交感神経刺激を目的として使用した。このＣｈＡＴ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ−２Ａ−ＧＣａＭＰ６ｆ  ＡＡＶベクターに感染して遺伝子導入された細胞では、副交感神経特異的なＣｈＡＴプロモーターの制御下に、神経刺激用遺伝子としてＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ（ＮａＣｈＢａｃの変異体）と、遺伝子発現確認および神経活動測定用の緑色蛍光タンパクＧＣａＭＰ６ｆの両者を発現する。また、コントロール実験を目的として、ＣｈＡＴ−ＧＣａＭＰ３  ＡＡＶベクターを使用した（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ）。このＣｈＡＴ−ＧＣａＭＰ３  ＡＡＶベクターに感染して遺伝子導入された細胞では、、遺伝子発現確認および神経活動測定用の緑色蛍光タンパクＧＣａＭＰ３が発現する。この２種のＡＡＶベクターをそれぞれ、動物投与用のＡＡＶベクター液として調製した（５ｕｌ／匹）。
実施例５で作製した乳がんモデル動物を使用した。乳がんの有無を体表から視診と触診で検査し、乳がんが認められた場合には、その大きさをノギス（株式会社ミツトヨ）で測定した。乳がんの大きさが８００ｍｍ３以上１０００ｍｍ３以下に達した時点で、麻酔下（吸入麻酔フローセン（ハロタン）、武田薬品工業、０．５−１％）に、副交感神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）では上記ＣｈＡＴ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ−２Ａ−ＧＣａＭＰ６ｆ  ＡＡＶベクター液（５ｕｌ／匹）を、副交感神経偽刺激ベクター群（Ｎ＝８）ではＣｈＡＴ−ＧＣａＭＰ３  ＡＡＶベクター液（５ｕｌ／匹）を、さらに、コントロール群（Ｎ＝８）ではＰＢＳ（５ｕｌ／匹）を、ｓｙｒｉｎｇｅ（７１０５，Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を用いて、その乳がん組織に局所注入した。その後、麻酔から覚醒させ、ベクター（あるいはＰＢＳ）局所注入後１４週まで飼養した。ベクター局所注入後、２週毎に１４週まで、乳がんの大きさをノギスで測定した。図１２に乳がんの大きさ変化の測定結果を示す。その後、動物を組織固定用４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（１６３−２０１４５，Ｗａｋｏ）で還流固定し、残りの乳がん組織を摘出して後固定し、凍結切片を作成し、免疫染色解析を行った。使用した抗体および染料は、ＤＡＰＩ（４‘，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅで細胞核の染色，１０２３６２７６００１  ＲＯＣＨＥ，ロシュライフサイエンス社），ＧＦＰ抗体（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｂ１３９７０，Ａｂｃａｍ社，ＶＡＣｈＴ抗体（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，ａｂ６８９８６，Ａｂｃａｍ社）であった。組織形態は、共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００，オリンパス）で観察した。図１３に免疫染色の結果を示す。【０１１７】
図１２の結果から、コントロール群（Ｎ＝８）および副交感神経偽刺激ベクター群（Ｎ＝８）では同程度にがんが増大したが、副交感神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）ではがん増大が抑制された（＃Ｐ〈０．０５ｖｓ．コントロール群）。【０１１８】
図１３の結果から、副交感神経刺激ベクター群および副交感神経偽刺激ベクター群では、ＶＡＣｈＴ陽性の副交感神経がＧＦＰ陽性であり、逆行性ウイルスベクターによる副交感神経への遺伝子発現を示した。
以上より、乳がんに分布する副交感神経を刺激するウイルスベクター局所注入によって乳がん増大を抑制するような治療効果が認められた。【０１１９】
＜実施例７＞  がんに対する治療効果の確認
（３）マウス皮膚がんに対する治療効果の確認（交感神経操作ウイルスベクターを使用する場合）
実施例１で作製したＡＡＶベクター（ＴＨ−ＤＴＡ  ＡＡＶベクター）（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ）を交感神経除去を目的として使用した。ＴＨ−ＤＴＡ  ＡＡＶベクターに感染して遺伝子導入された細胞では、交感神経特異的なＴＨプロモーターの調節下にＤＴＡ（ジフテリア毒素）が発現し、細胞は死に至る。また、コントロール実験を目的として、ＴＨ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクターを使用した（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ）。それぞれのＡＡＶベクターについて、動物投与用のＡＡＶベクター液（５ｕｌ／匹）を調製した。
ｒａｓＨ２マウス（Ｊｉｃ：ＣＢ６Ｆ１−ＴｇｒａｓＨ２＠Ｊｃｌマウス，日本クレア，体重２７−３３ｇ，♂および♀）に、発がん性のあるＮ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）５０ｍｇ／ｋｇ体重を腹腔内投与して、皮膚がんを誘発し、皮膚がんモデル動物を作製した。がんの有無を体表から触診で検査し、皮膚がんが認められた場合には、その大きさをノギス（株式会社ミツトヨ）で測定した。皮膚がんの大きさが４０ｍｍ３以上６０ｍｍ３以下に達した時点で、麻酔下（吸入麻酔フローセン（ハロタン）、武田薬品工業、０．５−１％）に、その皮膚がん組織に、交感神経除去ベクター群（Ｎ＝８）ではＴＨ−ＤＴＡ  ＡＡＶベクター液を、交感神経偽除去ベクター群（Ｎ＝８）ではＴＨ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター液を、コントロール群（Ｎ＝８）ではＰＢＳを、ｓｙｒｉｎｇｅ（７１０５，Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を用いて５ｕｌ局所注入した。その後、麻酔から覚醒させ、ベクター局所注入後１６週まで飼養した。ベクター局所注入後、２週毎に１６週まで、皮膚がんの大きさをノギスで測定した。図１４に皮膚がんの大きさ変化の測定結果を示す。【０１２０】
図１４の結果から、コントロール群（Ｎ＝８）および交感神経偽除去ベクター群（Ｎ＝８）では、がんは著明に増大したが、一方、交感神経除去ウイルスベクター群（Ｎ＝８）では、がんの増大は強く抑制された（＃Ｐ〈０．０５ｖｓ．コントロール群）。
以上より、皮膚がんに分布する交感神経を除去するウイルスベクター局所注入によって皮膚がん増大を抑制するような治療効果が認められた。【０１２１】
＜実施例８＞  がんに対する治療効果の確認
（４）マウス皮膚がんに対する治療効果の確認（副交感神経操作ウイルスベクターを使用する場合）
実施例１で作製したＡＡＶベクター（ＣｈＡＴ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ−２Ａ−ＧＣａＭＰ６ｆ  ＡＡＶベクター）（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ）を副交感神経刺激を目的として使用した。このＣｈＡＴ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ−２Ａ−ＧＣａＭＰ６ｆ  ＡＡＶベクターに感染して遺伝子導入された細胞では、副交感神経特異的なＣｈＡＴプロモーターの制御下に、神経刺激用遺伝子としてＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ（ＮａＣｈＢａｃの変異体）と、遺伝子発現確認および神経活動測定用の緑色蛍光タンパクＧＣａＭＰ６ｆの両者を発現する。また、コントロール実験を目的として、ＣｈＡＴ−ＧＣａＭＰ３  ＡＡＶベクターを使用した（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ）。このＣｈＡＴ−ＧＣａＭＰ３  ＡＡＶベクターに感染して遺伝子導入された細胞では、遺伝子発現確認および神経活動測定用の緑色蛍光タンパクＧＣａＭＰ３が発現する。この２種のＡＡＶベクターをそれぞれ、動物投与用のＡＡＶベクター液として調製した（５ｕｌ／匹）。
実施例７で作製した皮膚がんモデル動物を使用した。がんの有無を体表から触診で検査し、皮膚がんが認められた場合には、その大きさをノギス（株式会社ミツトヨ）で測定した。皮膚がんの大きさが４０ｍｍ３以上６０ｍｍ３に達した時点で、麻酔下（吸入麻酔フローセン（ハロタン）、武田薬品工業、０．５−１％）に、その皮膚がん組織に、副交感神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）では上記ＣｈＡＴ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｔ２２０Ａ−２Ａ−ＧＣａＭＰ６ｆ  ＡＡＶベクター液を、副交感神経偽刺激ベクター群（Ｎ＝８）ではＣｈＡＴ−ＧＣａＭＰ３  ＡＡＶベクター液を、さらに、コントロール群（Ｎ＝８）ではＰＢＳを、ｓｙｒｉｎｇｅ（７１０５，Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を用いて皮膚がん組織に局所注入した。その後、麻酔から覚醒させ、ベクター局所注入後１６週まで飼養した。ベクター局所注入後、２週毎に１６週まで、皮膚がんの大きさをノギスで測定した。図１５に皮膚がんの大きさ変化の測定結果を示す。【０１２２】
図１５の結果から、コントロール群（Ｎ＝８）および副交感神経偽刺激ベクター群（Ｎ＝８）では同程度にがんが増大したが、副交感神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）ではがん増大が抑制された。（＃Ｐ〈０．０５ｖｓ．コントロール群）
以上より、皮膚がんに分布する副交感神経を刺激するウイルスベクター局所注入によって皮膚がん増大を抑制するような治療効果が認められた。【０１２３】
＜実施例９＞  レンチウイルスベクターの構築
公知のファージライブラリを鋳型にして、Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅの全長をＰＣＲで増幅し、Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅのＮ末端側に核移行シグナル（ＮｌＳ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）を付加した状態でＨｉＲｅｔベクターに導入し、ＨｉＲｅｔ−Ｃｒｅプラスミドを作製した。
作製したＨｉＲｅＴ−Ｃｒｅベクター、エンベロープ、パッケージングプラスミドをリン酸カルシウム法でヒト胎児由来腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）にトランスフェクションした。レンチウイルス粒子は超遠心（５０，０００ｘｇ、９０分）でペレットにした後、ＰＢＳに懸濁した。さらにインジェクション用に、ベクター粒子を１０，０００ｇ、１６−１８時間遠心し、ＰＢＳに懸濁した。ベクター粒子はＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｑ  ＦＦイオン交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）に入れ、２６０／２８０ｎｍの吸光度でモニターしながら、線形勾配０．０〜１．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。その後、１０ｃｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈに播種したＨＥＫ２９３Ｔ、Ｎｅｕｒｏ２Ａ及びＮ１Ｅ−１１５に適当量を形質導入し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｎｉｐｐｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、およびベクターストック溶液のウイルスＲＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡウイルスキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）で単離し、ＲＮＡゲノムのコピー数をレンチ−Ｘ  ｑＲＴ−ＰＣＲ滴定キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で決定した。【０１２４】
＜実施例１０＞  肥満および／または過食に対する治療効果の確認
実施例９で作製したレンチウイルスベクター（ＨｉＲｅｔ−Ｃｒｅレンチウイルスベクター）、および実施例１で作製したＡＡＶベクター（ＦＬＥＸ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクター）（１−５ｘ１０１１ＧＣ／ｍｌ）を２重感染法による求心性神経の刺激を目的として使用した。ＨｉＲｅｔ−Ｃｒｅレンチウイルスベクターに感染した細胞では、ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｒとｃｈｉｃｋｅｎ  β−ａｃｔｉｎで構成されたＣＡＧ  ｐｒｏｍｏｔｅｒの調節下にＣｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを発現する。ＨｉＲｅｔ−Ｃｒｅレンチウイルスベクターと、ＦＬＥＸ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクターが２重感染した細胞では、ｆｌｅｘスイッチ（Ｃｒｅ−ｌｏｘｐシステム）によりＣｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが働いて神経刺激作用のあるＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａが発現する。本実施例では、ＨｉＲｅｔ−Ｃｒｅレンチウイルスベクターを胃に局所注入し、ＦＬＥＸ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクターを節状神経節に局所注入したため、２重感染する細胞は、胃に神経終末が存在し節状神経節に細胞体が存在する胃の求心性神経のみである。こうして、胃の求心性神経のみにＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａが発現し、胃の求心性神経の活動を選択的に刺激するように、神経操作をデザインした。
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）ラット，日本チャールズリバー）（体重４００−４６０ｇ，♂）を使用した。まず神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）では、麻酔下（吸入麻酔フローセン（ハロタン），武田薬品工業，０．５−１％）に、腹部正中切開によって胃を剖出し、胃体部に上記ＨｉＲｅｔ−Ｃｒｅレンチウイルスベクターをｓｙｒｉｎｇｅ（７１０５，Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を用いて２０ｕｌ局所注入した（２ｕｌずつ、１０箇所に）。さらに、頚部正中切開によって右節状神経節を剖出し、上記ＦＬＥＸ−ＮａＣｈＢａｃ  Ｇ２２９Ａ−２Ａ−ｔｕｒｂｏＲＦＰ  ＡＡＶベクターをｓｙｒｉｎｇｅ（７０１５，Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を用いて２ｕｌ局所注入し、その後、左節状神経節を剖出して同じベクターを同様に同量局所注入した。コントロール群（Ｎ＝８）では、胃と両側節状神経節に、ウイルスベクターの代わりにＰＢＳを同量局所注入した。ベクター局所注入の後、切開部分を縫合して麻酔から覚醒させた。ベクター（あるいはＰＢＳ）の局所注入後１２週まで飼養した。毎週、摂食量（１日摂食量，個別ケージを使用，ＥＫ−２００ｉ，Ａ＆Ｄ社製で測定）と体重（ＳＫ−１０００，Ａ＆Ｄ社製）を測定した。図１６に摂食行動の結果を示す。その後、動物を組織固定用４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（１６３−２０１４５，Ｗａｋｏ）で還流固定し、節状神経節および延髄を摘出して後固定し、凍結切片を作成し、組織形態を共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００，オリンパス）で観察した。図１７に組織形態観察の結果を示す。【０１２５】
図１６の結果から、神経刺激ベクター群（Ｎ＝８）では、コントロール群（Ｎ＝８）と比して、摂食量が低下し（図１６ａ）、おくれて、体重増加が抑制された（図１６ｂ）（＃Ｐ〈０．０５ｖｓ．コントロール群）。【０１２６】
図１７の結果から、神経刺激ベクター群では、節状神経節（図１７ａ）にｔｕｒｂｏＲＦＰ発現による赤色蛍光の神経細胞体が存在した。また、延髄の孤束核（図１７ｂ）には、ｔｕｒｂｏＲＦＰ発現による赤色蛍光の神経終末が存在した（神経の細胞体はｔｕｒｂｏＲＦＰが発現しなかった）。このため、２重ベクター法によって、胃の求心性神経にだけ選択的に、遺伝子発現を誘導できた。
以上より、胃に分布する求心性神経を刺激するウイルスベクター局所注入によって摂食や肥満を抑制する効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
医療産業に治療薬および治療手段として活用できる。特に、がん医療においては、術後にがんの残組織にウイルスベクターを局所注入して再発や転移を抑制するような形で、国内外で、広く使用され得る。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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