(57)【要約】  本発明は、ＦＸＲアゴニスト、好ましくは、オベチコール酸またはその薬学的に許容される塩、およびＡＲＢまたはその薬学的に許容される塩を含むＮＡＳＨの治療剤を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファルネソイドＸ受容体アゴニスト（ＦＸＲアゴニスト）またはその薬学的に許容される塩、およびアンジオテンシンII受容体拮抗剤（ＡＲＢ）またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、組み合わせ医薬。
【請求項２】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５、Ｐｘ−１０４またはＬＪＮ−４５２である、請求項１記載の医薬。
【請求項３】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５またはＰｘ−１０４である、請求項１または２記載の医薬。
【請求項４】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸またはＩＮＴ−７６７である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項５】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項６】
ＡＲＢが、ロサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、イルベサルタンまたはアジルサルタンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項７】
ＡＲＢが、ロサルタンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組み合わせ医薬を含む、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療剤。
【請求項９】
ファルネソイドＸ受容体アゴニスト（ＦＸＲアゴニスト）またはその薬学的に許容される塩とアンジオテンシンII受容体拮抗剤（ＡＲＢ）またはその薬学的に許容される塩とを併用することを特徴とする、請求項８記載の治療剤。
【請求項１０】
ＦＸＲアゴニストまたはその薬学的に許容される塩とＡＲＢまたはその薬学的に許容される塩を同時にまたは時間を変えて別々に投与することを特徴とする、請求項９記載の治療剤。
【請求項１１】
アンジオテンシンII受容体拮抗剤（ＡＲＢ）またはその薬学的に許容される塩と併用することを特徴とする、ファルネソイドＸ受容体アゴニスト（ＦＸＲアゴニスト）またはその薬学的に許容される塩を含む非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療剤。
【請求項１２】
ファルネソイドＸ受容体アゴニスト（ＦＸＲアゴニスト）またはその薬学的に許容される塩と併用することを特徴とする、アンジオテンシンII受容体拮抗剤（ＡＲＢ）またはその薬学的に許容される塩を含む非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療剤。
【請求項１３】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５、Ｐｘ−１０４またはＬＪＮ−４５２である、請求項１１または１２記載の治療剤。
【請求項１４】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５またはＰｘ−１０４である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１５】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸またはＩＮＴ−７６７である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の治療剤
【請求項１６】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸である、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１７】
ＡＲＢが、ロサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、イルベサルタンまたはアジルサルタンである、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１８】
ＡＲＢが、ロサルタンである、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１９】
前記ＮＡＳＨの治療が、ＮＡＳＨにおける肝線維化の抑制である、請求項８〜１８のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項２０】
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療剤を製造するための請求項１〜７のいずれか１項に記載の組み合わせ医薬の使用。
【請求項２１】
ＮＡＳＨにおける肝線維化抑制剤を製造するための請求項１〜７のいずれか１項に記載の組み合わせ医薬の使用。
【請求項２２】
治療上の有効量の、ＦＸＲアゴニストまたはその薬学的に許容される塩とアンジオテンシンII受容体拮抗剤（ＡＲＢ）またはその薬学的に許容される塩とを組み合わせて患者に投与することを特徴とする、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療方法。
【請求項２３】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５、Ｐｘ−１０４またはＬＪＮ−４５２である、請求項２２記載の治療方法。
【請求項２４】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５またはＰｘ−１０４である、請求項２２または２３記載の治療方法。
【請求項２５】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸またはＩＮＴ−７６７である、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項２６】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸である、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項２７】
ＡＲＢが、ロサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、イルベサルタンまたはアジルサルタンである、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項２８】
ＡＲＢが、ロサルタンである、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項２９】
前記ＮＡＳＨの治療が、ＮＡＳＨにおける肝線維化の抑制である、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の治療方法。
【請求項３０】
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療に使用するためのファルネソイドＸ受容体アゴニスト（ＦＸＲアゴニスト）またはその薬学的に許容される塩と、アンジオテンシンII受容体拮抗剤（ＡＲＢ）またはその薬学的に許容される塩との組み合わせ。
【請求項３１】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５、Ｐｘ−１０４またはＬＪＮ−４５２である、請求項３０記載の組み合わせ。
【請求項３２】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５またはＰｘ−１０４である、請求項３０または３１記載の組み合わせ。
【請求項３３】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸またはＩＮＴ−７６７である、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の組み合わせ。
【請求項３４】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸である、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の組み合わせ。
【請求項３５】
ＡＲＢが、ロサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、イルベサルタンまたはアジルサルタンである、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の組み合わせ。
【請求項３６】
ＡＲＢが、ロサルタンである、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の組み合わせ。
【請求項３７】
前記ＮＡＳＨの治療が、ＮＡＳＨにおける肝線維化の抑制である、請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の組み合わせ。
【請求項３８】
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を治療するためのキットであって、
１）ファルネソイドＸ受容体アゴニスト（ＦＸＲアゴニスト）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬；
２）アンジオテンシンII受容体拮抗剤（ＡＲＢ）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬；および
３）上記１）および２）を組み合わせて投与するための使用説明書
を含むキット。
【請求項３９】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５、Ｐｘ−１０４またはＬＪＮ−４５２である、請求項３８記載のキット。
【請求項４０】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５またはＰｘ−１０４である、請求項３８または３９記載のキット。
【請求項４１】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸またはＩＮＴ−７６７である、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４２】
ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸である、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４３】
ＡＲＢが、ロサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、イルベサルタンまたはアジルサルタンである、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４４】
ＡＲＢが、ロサルタンである、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４５】
前記ＮＡＳＨの治療が、ＮＡＳＨにおける肝線維化の抑制である、請求項３８〜４４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４６】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組み合わせ医薬を含む、肝疾患における肝線維化抑制剤。
【請求項４７】
肝疾患が、Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；寄生虫性肝疾患；移植後の細菌感染、移植後のウイルス感染、もしくは移植後の真菌感染；アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）；非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）；メトトレキサートにより誘発される肝疾患、イソニアジドにより誘発される肝疾患、オキシフェニスタチンにより誘発される肝疾患、メチルドパにより誘発される肝疾患、クロルプロマジンにより誘発される肝疾患、トルブタミドにより誘発される肝疾患、もしくはアミオダロンにより誘発される肝疾患；自己免疫肝炎；サルコイドーシス；ウィルソン病；ヘモクロマトーシス；ゴーシェ病；ＩＩＩ型糖原病、ＩＶ型糖原病、ＶＩ型糖原病、ＩＸ型糖原病、もしくはＸ型糖原病；α１アンチトリプシン欠損症；ツェルヴェーガー症候群；チロシン血症；果糖血症；ガラクトース血症；バッド−キアーリ症候群に関連する脈管障害、静脈閉塞病に関連する脈管障害、もしくは門脈血栓症に関連する脈管障害；または先天性肝線維症から選択される、請求項４６記載の肝線維化抑制剤。
【請求項４８】
肝疾患が、ＡＬＤまたはＮＡＦＬＤのいずれかである、請求項４６または４７記載の肝線維化抑制剤。
【請求項４９】
肝疾患が、ＮＡＦＬＤである、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の肝線維化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis：以下、本明細書において「ＮＡＳＨ」と記載することがある）の治療剤、特にＮＡＳＨにおける肝線維化に有効な治療剤に関する。さらに詳しくは、ファルネソイドＸ受容体（Farnesoid X receptor：以下、本明細書において「ＦＸＲ」と記載することがある）アゴニスト（特に、オベチコール酸）またはその薬学的に許容される塩、およびアンジオテンシンII受容体拮抗剤（Angiotensin Receptor Blocker：以下、本明細書において「ＡＲＢ」と記載することがある）またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含むＮＡＳＨの治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＡＳＨは、高頻度で認められる慢性肝疾患であり、肥満、II型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）などの代謝性疾患によって特徴付けられる。近年、メタボリックシンドロームの増加に伴い、メタボリックシンドロームに由来する個々の疾患の予防および治療に対する関心が高まってきている。その中でもＮＡＳＨは、関心の高い疾患の一つである。
ＮＡＳＨは、肝臓に脂肪が蓄積することで起こる肝炎であり、初期の脂肪肝に対する酸化ストレス、インスリン抵抗性、炎症性サイトカインなどの要因によって、脂肪肝からの移行や病態の悪化によってもたらされる。さらに、ＮＡＳＨの発症とそれに続く肝組織の線維化（肝線維化）が進行すると、致命的な肝硬変や肝細胞がんへと移行することが強く懸念されている。【０００３】
現在、下記の化学式で示されるオベチコール酸（Obeticholic acid）は、単剤でＮＡＳＨを含む各種肝疾患の線維化を阻害する効果を有することが知られており、ＮＡＳＨやＰＢＣ等の治療への用途が期待されている（特許文献１〜３）。オベチコール酸は、３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸、６α−エチル−３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸、６α−エチル−ケノデオキシコール酸、６−エチル−ＣＤＣＡ、６ＥＣＤＣＡ、コラン−２４−酸、６−エチル−３，７−ジヒドロキシ−（３α，５β，６α，７α）−、ＯＣＡ、ＤＳＰ−１７４７、およびＩＮＴ−７４７としても知られている。
【化１】
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【０００４】
ＡＲＢは、昇圧物質アンジオテンシンIIと拮抗し、当該昇圧物質がアンジオテンシンII受容体に結合することを阻害することにより血圧降下作用を示す薬物であり、ロサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、イルベサルタン、アジルサルタン等が降圧剤として臨床的に用いられている。ＡＲＢは単に降圧作用のみならず、抗炎症作用、内皮機能改善作用、心血管リモデリング抑制作用、酸化ストレス抑制作用、増殖因子抑制作用、インスリン抵抗性改善作用等の様々な作用により、心血管疾患、腎疾患、動脈硬化等にも有用であることが、臨床もしくは非臨床試験において多数報告されている（非特許文献１〜２）。
また、ＡＲＢについては肝線維化を低減しうることや、アンジオテンシンII受容体が肝線維化に関連することが報告されており、ＡＲＢは肝疾患における肝線維化を抑制することが期待されている（非特許文献３〜５）。【０００５】
このように肝疾患における肝線維化の抑制が期待される薬剤はいくつか知られているにもかかわらず、肝疾患における肝線維化に対する効果的な予防および治療剤は未だほとんど見出されておらず、その開発が切望されている。
これまでに本発明者らにより、ウルソデオキシコール酸とＡＲＢの組み合わせにより肝線維化進展が抑制されることは報告されているが（非特許文献６）、ＦＸＲアゴニスト（特に、オベチコール酸）とＡＲＢとの組み合わせを肝疾患（特に、ＮＡＳＨ）における肝線維化に用いた例は今まで報告されていない。ウルソデオキシコール酸はＦＸＲアゴニスト作用を有していない（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４０２１３２７号
【特許文献２】特許第５０９４３８４号
【特許文献３】特表第２０１５−５２１６２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】AMER. J. Hypertension, 18, 720-730 (2005)
【非特許文献２】Current Hypertension Report, 10, 261-267 (2008)
【非特許文献３】BMC Res Notes; 2: 70 (2009)
【非特許文献４】Hepatology, 34, 745-750 (2001)
【非特許文献５】Hepatol Res, 27, 51-56 (2003)
【非特許文献６】Journal of Gastroenterology, DOI: 10.1007/s00535-015-1104-x, pp1-11, First online: 21 July 2015
【非特許文献７】Journal of Lipid Research, 45, 132-138 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＦＸＲアゴニストまたはその薬学的に許容される塩、およびＡＲＢまたはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、ＮＡＳＨの予防および／または治療剤、特にＮＡＳＨにおける肝線維化の予防、抑制および／または改善に有用な治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、特にＮＡＳＨは種々の要因が複雑に絡み合って病態を形成していることに着想し、異なる機序を有する複数の薬剤を組み合わせることによる効果的な治療を求めて種々研究を試行し、鋭意検討した結果、ＦＸＲアゴニストまたはその薬学的に許容される塩、特にオベチコール酸またはその薬学的に許容される塩と、ＡＲＢまたはその薬学的に許容される塩を組み合わせて投与した場合に、ラットの非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）モデルにおいて肝線維化を顕著に抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。特に、本発明者らは、これらの薬剤を組み合わせることによって、従来のオベチコール酸またはＡＲＢの単独投与より治療効果が相乗的にかつ顕著に増強しうることを見出した。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様の発明を提供するものである。
［１］  ファルネソイドＸ受容体アゴニスト（ＦＸＲアゴニスト）またはその薬学的に許容される塩、およびアンジオテンシンII受容体拮抗剤（ＡＲＢ）またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、組み合わせ医薬。
［２］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５、Ｐｘ−１０４またはＬＪＮ−４５２である、［１］記載の医薬。
［３］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５またはＰｘ−１０４である、［１］または［２］記載の医薬。
［４］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸またはＩＮＴ−７６７である、［１］〜［３］のいずれかに記載の医薬。
［５］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸である、［１］〜［４］のいずれかに記載の医薬。
［６］  ＦＸＲアゴニストが、ＩＮＴ−７６７である、［１］〜［４］のいずれかに記載の医薬。
［７］  ＡＲＢが、ロサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、イルベサルタンまたはアジルサルタンである、［１］〜［６］のいずれかに記載の医薬。
［８］  ＡＲＢが、ロサルタンである、［１］〜［７］のいずれかに記載の医薬。
［９］  ＡＲＢが、カンデサルタンである、［１］〜［７］のいずれかに記載の医薬。
［１０］  ＡＲＢが、テルミサルタンである、［１］〜［７］のいずれかに記載の医薬。
［１１］  ＡＲＢが、バルサルタンである、［１］〜［７］のいずれかに記載の医薬。
［１２］  ＡＲＢが、オルメサルタンである、［１］〜［７］のいずれかに記載の医薬。
［１３］  ＡＲＢが、イルベサルタンである、［１］〜［７］のいずれかに記載の医薬。
［１４］  ＡＲＢが、アジルサルタンである、［１］〜［７］のいずれかに記載の医薬。【００１１】
［１５］  ［１］〜［１４］のいずれかに記載の組み合わせ医薬を含む、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療剤。
［１６］  ファルネソイドＸ受容体アゴニスト（ＦＸＲアゴニスト）またはその薬学的に許容される塩とアンジオテンシンII受容体拮抗剤（ＡＲＢ）またはその薬学的に許容される塩とを併用することを特徴とする、［１５］記載の治療剤。
［１７］  ＦＸＲアゴニストまたはその薬学的に許容される塩とＡＲＢまたはその薬学的に許容される塩を同時にまたは時間を変えて別々に投与することを特徴とする、［１６］記載の治療剤。
［１８］  アンジオテンシンII受容体拮抗剤（ＡＲＢ）またはその薬学的に許容される塩と併用することを特徴とする、ファルネソイドＸ受容体アゴニスト（ＦＸＲアゴニスト）またはその薬学的に許容される塩を含む非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療剤。
［１９］  ファルネソイドＸ受容体アゴニスト（ＦＸＲアゴニスト）またはその薬学的に許容される塩と併用することを特徴とする、アンジオテンシンII受容体拮抗剤（ＡＲＢ）またはその薬学的に許容される塩を含む非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療剤。
［２０］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５、Ｐｘ−１０４またはＬＪＮ−４５２である、［１８］または［１９］記載の治療剤。
［２１］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５またはＰｘ−１０４である、［１８］〜［２０］のいずれかに記載の治療剤。
［２２］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸またはＩＮＴ−７６７である、［１８］〜［２１］のいずれかに記載の治療剤。
［２３］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸である、［１８］〜［２２］のいずれかに記載の治療剤。
［２４］  ＦＸＲアゴニストが、ＩＮＴ−７６７である、［１８］〜［２２］のいずれかに記載の治療剤。
［２５］  ＡＲＢが、ロサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、イルベサルタンまたはアジルサルタンである、［１８］〜［２４］のいずれかに記載の治療剤。
［２６］  ＡＲＢが、ロサルタンである、［１８］〜［２５］のいずれかに記載の治療剤。
［２７］  ＡＲＢが、カンデサルタンである、［１８］〜［２５］のいずれかに記載の治療剤。
［２８］  ＡＲＢが、テルミサルタンである、［１８］〜［２５］のいずれかに記載の治療剤。
［２９］  ＡＲＢが、バルサルタンである、［１８］〜［２５］のいずれかに記載の治療剤。
［３０］  ＡＲＢが、オルメサルタンである、［１８］〜［２５］のいずれかに記載の治療剤。
［３１］  ＡＲＢが、イルベサルタンである、［１８］〜［２５］のいずれかに記載の治療剤。
［３２］  ＡＲＢが、アジルサルタンである、［１８］〜［２５］のいずれかに記載の治療剤。
［３３］  前記ＮＡＳＨの治療が、ＮＡＳＨにおける肝線維化の抑制である、［１５］〜［３２］のいずれかに記載の治療剤。【００１２】
［３４］  非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療剤を製造するための［１］〜［１４］のいずれかに記載の組み合わせ医薬の使用。
［３５］  ＮＡＳＨにおける肝線維化抑制剤を製造するための［１］〜［１４］のいずれかに記載の組み合わせ医薬の使用。【００１３】
［３６］  治療上の有効量の、ファルネソイドＸ受容体アゴニスト（ＦＸＲアゴニスト）またはその薬学的に許容される塩とアンジオテンシンII受容体拮抗剤（ＡＲＢ）またはその薬学的に許容される塩とを組み合わせて患者に投与することを特徴とする、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療方法。
［３７］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５、Ｐｘ−１０４またはＬＪＮ−４５２である、［３６］記載の治療方法。
［３８］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５またはＰｘ−１０４である、［３６］または［３７］記載の治療方法。
［３９］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸またはＩＮＴ−７６７である、［３６］〜［３８］のいずれかに記載の治療方法。
［４０］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸である、［３６］〜［３９］のいずれかに記載の治療方法。
［４１］  ＦＸＲアゴニストが、ＩＮＴ−７６７である、［３６］〜［３９］のいずれかに記載の治療方法。
［４２］  ＡＲＢが、ロサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、イルベサルタンまたはアジルサルタンである、［３６］〜［４１］のいずれかに記載の治療方法。
［４３］  ＡＲＢが、ロサルタンである、［３６］〜［４２］のいずれかに記載の治療方法。
［４４］  ＡＲＢが、カンデサルタンである、［３６］〜［４２］のいずれかに記載の治療方法。
［４５］  ＡＲＢが、テルミサルタンである、［３６］〜［４２］のいずれかに記載の治療方法。
［４６］  ＡＲＢが、バルサルタンである、［３６］〜［４２］のいずれかに記載の治療方法。
［４７］  ＡＲＢが、オルメサルタンである、［３６］〜［４２］のいずれかに記載の治療方法。
［４８］  ＡＲＢが、イルベサルタンである、［３６］〜［４２］のいずれかに記載の治療方法。
［４９］  ＡＲＢが、アジルサルタンである、［３６］〜［４２］のいずれかに記載の治療方法。
［５０］  前記ＮＡＳＨの治療が、ＮＡＳＨにおける肝線維化の抑制である、［３６］〜［４９］のいずれかに記載の治療方法。【００１４】
［５１］  非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療に使用するためのファルネソイドＸ受容体アゴニスト（ＦＸＲアゴニスト）またはその薬学的に許容される塩と、アンジオテンシンII受容体拮抗剤（ＡＲＢ）またはその薬学的に許容される塩との組み合わせ。
［５２］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５、Ｐｘ−１０４またはＬＪＮ−４５２である、［５１］記載の組み合わせ。
［５３］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５またはＰｘ−１０４である、［５１］または［５２］記載の組み合わせ。
［５４］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸またはＩＮＴ−７６７である、［５１］〜［５３］のいずれかに記載の組み合わせ。
［５５］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸である、［５１］〜［５４］のいずれかに記載の組み合わせ。
［５６］  ＦＸＲアゴニストが、ＩＮＴ−７６７である、［５１］〜［５４］のいずれかに記載の組み合わせ。
［５７］  ＡＲＢが、ロサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、イルベサルタンまたはアジルサルタンである、［５１］〜［５６］のいずれかに記載の組み合わせ。
［５８］  ＡＲＢが、ロサルタンである、［５１］〜［５７］のいずれかに記載の組み合わせ。
［５９］  ＡＲＢが、カンデサルタンである、［５１］〜［５７］のいずれかに記載の組み合わせ。
［６０］  ＡＲＢが、テルミサルタンである、［５１］〜［５７］のいずれかに記載の組み合わせ。
［６１］  ＡＲＢが、バルサルタンである、［５１］〜［５７］のいずれかに記載の組み合わせ。
［６２］  ＡＲＢが、オルメサルタンである、［５１］〜［５７］のいずれかに記載の組み合わせ。
［６３］  ＡＲＢが、イルベサルタンである、［５１］〜［５７］のいずれかに記載の組み合わせ。
［６４］  ＡＲＢが、アジルサルタンである、［５１］〜［５７］のいずれかに記載の組み合わせ。
［６５］  前記ＮＡＳＨの治療が、ＮＡＳＨにおける肝線維化の抑制である、［５１］〜［６４］のいずれかに記載の組み合わせ。【００１５】
［６６］  非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を治療するためのキットであって、
１）ファルネソイドＸ受容体アゴニスト（ＦＸＲアゴニスト）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬；
２）アンジオテンシンII受容体拮抗剤（ＡＲＢ）またはその薬学的に許容される塩を含む医薬；および
３）上記１）および２）を組み合わせて投与するための使用説明書
を含むキット。
［６７］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５、Ｐｘ−１０４またはＬＪＮ−４５２である、［６６］記載のキット。
［６８］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５またはＰｘ−１０４である、［６６］または［６７］記載のキット。
［６９］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸またはＩＮＴ−７６７である、［６６］〜［６８］のいずれかに記載のキット。
［７０］  ＦＸＲアゴニストが、オベチコール酸である、［６６］〜［６９］のいずれかに記載のキット。
［７１］  ＦＸＲアゴニストが、ＩＮＴ−７６７である、［６６］〜［６９］のいずれかに記載のキット。
［７２］  ＡＲＢが、ロサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、イルベサルタンまたはアジルサルタンである、［６６］〜［７１］のいずれかに記載のキット。
［７３］  ＡＲＢが、ロサルタンである、［６６］〜［７２］のいずれかに記載のキット。
［７４］  ＡＲＢが、カンデサルタンである、［６６］〜［７２］のいずれかに記載のキット。
［７５］  ＡＲＢが、テルミサルタンである、［６６］〜［７２］のいずれかに記載のキット。
［７６］  ＡＲＢが、バルサルタンである、［６６］〜［７２］のいずれかに記載のキット。
［７７］  ＡＲＢが、オルメサルタンである、［６６］〜［７２］のいずれかに記載のキット。
［７８］  ＡＲＢが、イルベサルタンである、［６６］〜［７２］のいずれかに記載のキット。
［７９］  ＡＲＢが、アジルサルタンである、［６６］〜［７２］のいずれかに記載のキット。
［８０］  前記ＮＡＳＨの治療が、ＮＡＳＨにおける肝線維化の抑制である、［６６］〜［７９］のいずれかに記載のキット。【００１６】
［８１］  ［１］〜［１４］のいずれかに記載の組み合わせ医薬を含む、肝疾患における肝線維化抑制剤。
［８２］  肝疾患が、Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；寄生虫性肝疾患；移植後の細菌感染、移植後のウイルス感染、もしくは移植後の真菌感染；アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）；非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）；メトトレキサートにより誘発される肝疾患、イソニアジドにより誘発される肝疾患、オキシフェニスタチンにより誘発される肝疾患、メチルドパにより誘発される肝疾患、クロルプロマジンにより誘発される肝疾患、トルブタミドにより誘発される肝疾患、もしくはアミオダロンにより誘発される肝疾患；自己免疫肝炎；サルコイドーシス；ウィルソン病；ヘモクロマトーシス；ゴーシェ病；ＩＩＩ型糖原病、ＩＶ型糖原病、ＶＩ型糖原病、ＩＸ型糖原病、もしくはＸ型糖原病；α１アンチトリプシン欠損症；ツェルヴェーガー症候群；チロシン血症；果糖血症；ガラクトース血症；バッド−キアーリ症候群に関連する脈管障害、静脈閉塞病に関連する脈管障害、もしくは門脈血栓症に関連する脈管障害；または先天性肝線維症から選択される、［８１］に記載の肝線維化抑制剤。
［８３］  肝疾患が、ＡＬＤまたはＮＡＦＬＤのいずれかである、［８１］または［８２］記載の肝線維化抑制剤。
［８４］  肝疾患が、ＮＡＦＬＤである、［８１］〜［８３］のいずれかに記載の肝線維化抑制剤。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ＦＸＲアゴニストまたはその薬学的に許容される塩、特にオベチコール酸またはその薬学的に許容される塩と、ＡＲＢまたはその薬学的に許容される塩を併用または合剤として投与することにより、それらの単独投与に比べて飛躍的に治療効果が増強され、ＮＡＳＨに対する治療および／または予防効果、特にＮＡＳＨにおける肝線維化の予防、抑制および／または改善効果を発揮することが期待できる。また、本発明によれば、前記２種の薬剤（活性成分）の併用または合剤としての投与で治療効果が増強することにより、各薬剤の単独投与よりも投与量を減らすことが可能となり、各薬剤が有する副作用の低減が期待できる。
また、本発明によれば、ＮＡＳＨに加えて、Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；寄生虫性肝疾患；移植後の細菌感染、移植後のウイルス感染、および移植後の真菌感染；アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）；非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）；メトトレキサートにより誘発される肝疾患、イソニアジドにより誘発される肝疾患、オキシフェニスタチンにより誘発される肝疾患、メチルドパにより誘発される肝疾患、クロルプロマジンにより誘発される肝疾患、トルブタミドにより誘発される肝疾患、またはアミオダロンにより誘発される肝疾患；自己免疫肝炎；サルコイドーシス；ウィルソン病；ヘモクロマトーシス；ゴーシェ病；ＩＩＩ型糖原病、ＩＶ型糖原病、ＶＩ型糖原病、ＩＸ型糖原病、およびＸ型糖原病；α１アンチトリプシン欠損症；ツェルヴェーガー症候群；チロシン血症；果糖血症；ガラクトース血症；バッド−キアーリ症候群に関連する脈管障害、静脈閉塞病に関連する脈管障害、および門脈血栓症に関連する脈管障害；および先天性肝線維症などの肝疾患全般における肝線維化においても治療効果を発揮することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１における各群（Ｇ１〜Ｇ５）のシリウスレッド染色肝切片の顕微鏡写真の典型例である。
【図２】図２は、実施例１における各群の線維化進展の組織学的特徴に関する半定量解析の結果である。なお、図中、棒グラフは各群の線維化領域の平均面積指数を示す。アスタリスク（＊＊）は指示した各群間で統計学的に有意な差（ｐ＜０．０１；Student's t-test）を示す。
【図３】図３は、実施例２における各群（Ｇ１〜Ｇ５）のα−平滑筋アクチン(α-smooth muscle actin：α−ＳＭＡ)免疫組織染色肝切片の顕微鏡写真の典型例である。
【図４】図４は、実施例２における各群の免疫組織学化学的特徴に関する半定量解析の結果である。なお、図中、棒グラフは各群のα-ＳＭＡ染色領域の平均面積指数を示す。アスタリスク（＊＊）は指示した各群間で統計学的に有意な差（ｐ＜０．０１；Student's t-test）を示す。
【図５】図５は、実施例２における各群のＴＧＦ−β１およびα1(I)-procollagenのｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲによる定量結果である。なお、図中、棒グラフはｍＲＮＡ発現量を示す。アスタリスク（＊；＊＊）は指示した各群間で統計学的に有意な差（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）を示す。
【図６】図６は、ＡＲＢとしてロサルタンを用いた場合における、実施例３における各群（Ｇ１、Ｇ２Ｌ、Ｇ２Ａ、Ｇ２ＡＬ、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）のヒト肝星細胞の増殖能抑制効果の検討結果である。
【図７】図７は、ＡＲＢとしてバルサルタンを用いた場合における、実施例３における各群（Ｇ１、Ｇ２ＡＬ、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）のヒト肝星細胞の増殖能抑制効果の検討結果である。
【図８】図８は、ＡＲＢとしてカンデサルタンを用いた場合における、実施例３における各群（Ｇ１、Ｇ２ＡＬ、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）のヒト肝星細胞の増殖能抑制効果の検討結果である。
【図９】図９は、ＡＲＢとしてロサルタンを用いた場合における、実施例３における各群（Ｇ１、Ｇ２Ｌ、Ｇ２Ａ、Ｇ２ＡＬ、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）の線維化マーカー遺伝子ＴＧＦ−β１の発現抑制効果の検討結果である。
【図１０】図１０は、ＡＲＢとしてバルサルタンを用いた場合における、実施例３における各群（Ｇ１、Ｇ２ＡＬ、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）の線維化マーカー遺伝子ＴＧＦ−β１の発現抑制効果の検討結果である。
【図１１】図１１は、ＡＲＢとしてカンデサルタンを用いた場合における、実施例３における各群（Ｇ１、Ｇ２ＡＬ、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）の線維化マーカー遺伝子ＴＧＦ−β１の発現抑制効果の検討結果である。
【図１２】図１２は、ＡＲＢとしてロサルタンを用いた場合における、実施例３における各群（Ｇ１、Ｇ２Ｌ、Ｇ２Ａ、Ｇ２ＡＬ、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）の線維化マーカー遺伝子α1(I)-procollagenの発現抑制効果の検討結果である。
【図１３】図１３は、ＡＲＢとしてバルサルタンを用いた場合における、実施例３における各群（Ｇ１、Ｇ２ＡＬ、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）の線維化マーカー遺伝子α1(I)-procollagenの発現抑制効果の検討結果である。
【図１４】図１４は、ＡＲＢとしてカンデサルタンを用いた場合における、実施例３における各群（Ｇ１、Ｇ２ＡＬ、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）の線維化マーカー遺伝子α1(I)-procollagenの発現抑制効果の検討結果である。
【図１５】図１５は、実施例７における各薬物投与群（Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）の肝細胞腫大改善効果の検討結果である。なお、図中、棒グラフは肝細胞腫大改善率を示す。
【図１６】図１６は、実施例８における各薬物投与群（Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）のＡＬＴ活性改善効果の検討結果である。なお、図中、棒グラフはＡＬＴ活性の変化値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明において「ファルネソイドＸ受容体アゴニスト」または「ＦＸＲアゴニスト」とは、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）に対して特異的なリガンドであり、ＦＸＲに結合することによってリガンド依存性ＦＸＲ転写活性を（いかなるリガンドもない状態で測定されるベースラインレベルとは異なるように）特異的に刺激する作用を有する化合物を指す（当該化合物は天然化合物、天然化合物からの半合成化合物および合成化合物を包含する）。当該作用は単に、ＦＸＲ刺激作用、またはＦＸＲ活性化作用ともいう。また「ＦＸＲアゴニスト」は同義語として、「ＦＸＲ作動薬」、「ＦＸＲ刺激薬」、「ＦＸＲ活性化リガンド」、「ＦＸＲ特異的リガンド」、または、単に「ＦＸＲリガンド」を用いてもよい。
ＦＸＲ（ファルネソイドＸ受容体）は、胆汁酸をリガンドとする核内受容体であり、胆汁酸代謝、コレステロール代謝および脂質代謝などに関与していることが知られており、ＦＸＲアゴニストは肝疾患や代謝性疾患あるいは臓器の線維化などに対して効果を示すことが期待されている。
天然の胆汁酸であるケノデオキシコール酸が、天然ＦＸＲリガンドの中で最も活性の高い分子として単離され、その後、半合成化合物のアルキル化胆汁酸の中で最もＦＸＲ刺激作用の強い分子としてオベチコール酸が見出された。
【００２０】
ＦＸＲアゴニストの例として、特に限定されるものではないが、下表に示される、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５、Ｐｘ−１０４、ＬＪＮ−４５２等が挙げられる。本発明におけるＦＸＲアゴニストは、好ましくは、オベチコール酸またはＩＮＴ−７６７、より好ましくはオベチコール酸である。
本発明におけるＦＸＲアゴニストは、２種類以上のＦＸＲアゴニストを含んでいてもよい。
【表１】
2017170434.tif 000004
【００２１】
ＦＸＲアゴニスト、特に前記した化合物はいずれも公知の化合物であり、公知の方法により製造することができる。例えば、オベチコール酸は特表第２０１５−５２１６２号公報に記載の方法により製造することができる。
【００２２】
本発明における「アンジオテンシンII受容体拮抗剤」または「ＡＲＢ」の例として、特に限定されるものではないが、下表に示される、ロサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、イルベサルタン、アジルサルタン等が挙げられる。本発明におけるＡＲＢは、好ましくはロサルタン、バルサルタンまたはイルベサルタン、より好ましくはロサルタンまたはイルベサルタン、さらに好ましくはロサルタンである。
別の態様においては、好ましくはカンデサルタン、テルミサルタン、オルメサルタンまたはアジルサルタン、より好ましくはテルミサルタン、オルメサルタンまたはアジルサルタン、さらに好ましくはテルミサルタンまたはオルメサルタン、最も好ましくはオルメサルタンであってもよい。
また別の態様においては、より好ましくはカンデサルタン、テルミサルタンまたはアジルサルタン、さらに好ましくはテルミサルタンまたはアジルサルタン、最も好ましくはテルミサルタンであってもよい。あるいは別の態様においては、より好ましくはカンデサルタン、オルメサルタンまたはアジルサルタン、さらに好ましくはオルメサルタンまたはアジルサルタン、最も好ましくはアジルサルタンであってもよい。さらに別の態様においては、より好ましくはカンデサルタン、テルミサルタンまたはオルメサルタンさらに好ましくはカンデサルタンまたはオルメサルタン、最も好ましくはカンデサルタンであってもよい。あるいは別の態様においては、より好ましくはロサルタン、バルサルタンまたはカンデサルタンであってもよい。
本発明におけるＡＲＢは、２種類以上のＡＲＢを含んでいてもよい。
【００２３】
本発明における「ロサルタン」との用語は、下表に構造式で示される、ロサルタンおよび市販薬として用いられているロサルタンのカリウム塩（ロサルタンカリウム）の両方を意味する。好ましくは、ロサルタンカリウムである。
本発明における「カンデサルタン」との用語は、下表に構造式で示される、カンデサルタンおよび市販薬として用いられているカンデサルタンのシレキセチルエステル（カンデサルタン  シレキセチル）の両方を意味する。好ましくは、カンデサルタン  シレキセチルである。
本発明における「オルメサルタン」との用語は、下表に構造式で示される、オルメサルタンおよび市販薬として用いられているオルメサルタンのメドキソミルエステル（オルメサルタン  メドキソミル）の両方を意味する。好ましくは、オルメサルタン  メドキソミルである。
【表２−１】
2017170434.tif 000005
【表２−２】
2017170434.tif 000006
【００２４】
ＡＲＢまたはその薬学的に許容される塩は公知の方法により製造することができる。また、市販のＡＲＢを用いてもよい。
【００２５】
本発明におけるＦＸＲアゴニストおよびＡＲＢは、薬学的に許容される塩の形態で用いてもよい。「薬学的に許容される塩」とは、薬学的に許容され、ＦＸＲアゴニストまたはＡＲＢ自身の活性に影響を与えない塩を形成するものであればいかなる塩でもよく、例えば、無機酸との塩、有機酸との塩、無機塩との塩、有機塩との塩等が挙げられる。
それらの薬剤が塩基性化合物である場合、当該塩として、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等）または有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等）との酸付加塩が挙げられる。
それらの薬剤が酸性化合物である場合、当該塩として、無機塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、バリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等）または有機塩（例えば、ピリジニウム塩、ピコリニウム塩、トリエチルアンモニウム塩等）との塩基付加塩が挙げられる。
【００２６】
本発明における「薬学的に許容される塩」には、水和物および溶媒和物が含まれる。それらを形成する溶媒としては、水、生理学的に許容される有機溶媒、例えばエタノール、アセトンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、複数種のＦＸＲアゴニストおよび／またはＡＲＢを組み合わせる場合においては、各種化合物の塩や溶媒和物の種類は同一でも異なっていてもよい。
【００２７】
本発明における「薬学的に許容される」との用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギ一応答、並びに他の問題及び合併症がなく、合理的なリスク対効果比に釣り合う、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適切な化合物、物質、組成物、担体および／または剤形の性質をいう。
【００２８】
ＦＸＲアゴニストおよびＡＲＢのプロドラッグまたはその薬学的に許容される塩もまた、本発明の範囲に含まれる。本発明における「プロドラッグ」とは、体内または目標部位に到達してから薬理活性をもつ化合物に変換され、薬理効果を発揮するように化学的に修飾された本発明の化合物の機能性誘導体である。
本発明のプロドラッグは、これらに限定されるものではないが、以下のタイプが挙げられる。
（１）本発明の化合物のヒドロキシルまたはアミノ基のリン酸エステルプロドラッグ；
（２）本発明の化合物のカルボキシル、ヒドロキシルまたはアミノ基のカルボネートまたはカルバメートプロドラッグ；
（３）本発明の化合物のカルボン酸またはアミノ基のアミドプロドラッグ；
（４）本発明の化合物のカルボン酸またはアミノ基のアミノ酸結合プロドラッグ；および
（５）本発明の化合物のケトン、アミジンまたはグアニジンのオキシムプロドラッグ。
本発明のプロドラッグは、例えば、Nature Reviews Drug Discovery 7; 255 - 270 (2008); or Journal of Medicinal Chemistry 2005, 48 (16), 5305-5320に記載の方法で製造することができる。
【００２９】
また、本発明におけるＦＸＲアゴニストは、アミノ酸抱合体として用いてもよい。本明細書における「アミノ酸抱合体」との用語は、化合物（例えば、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸等）と任意の適当なアミノ酸との抱合体を意味する。
天然の胆汁酸は生体内ではその大部分が、生合成により主にグリシンやタウリンのようなアミノ酸と縮合反応して結び付いたアミノ酸抱合体（抱合胆汁酸とも呼ばれる）の形で存在している。例えばヒトでは、コール酸がグリシンおよびタウリンそれぞれと結びつき、グリココール酸（glycocholic acid）およびタウロコール酸（taurocholic acid）という抱合胆汁酸を形成している。
本発明のＦＸＲアゴニスト、例えば、天然胆汁酸のケノデオキシコール酸および半合成アルキル化胆汁酸のオベチコール酸も同様にアミノ酸抱合体を形成する。好ましくは、こうした化合物のアミノ酸抱合体は、胆液または腸液中での安定性の向上という追加の利点を有しうる。任意の適当なアミノ酸には、好ましくはグリシンおよびタウリンを含むが、これらに限定されるものではない。特に、オベチコール酸はそのアミノ酸抱合体として用いられてもよく、当該アミノ酸抱合体としては、グリシンおよびタウリン抱合体を包含する。
【００３０】
本発明における「非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療剤」とは、ＮＡＳＨと診断された患者およびＮＡＳＨと疑われる患者を治療および／または予防するための剤である。日本消化器学会ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤ診療ガイドライン等によると、ＮＡＳＨを包含する上位概念疾患として、非アルコール性脂肪性肝疾患（nonalcoholic fatty liver disease：ＮＡＦＬＤ）があり、ＮＡＦＬＤは、組織診断あるいは画像診断で脂肪肝を認め、アルコール性肝障害など他の肝疾患を除外した病態である。なお、脂肪性肝疾患とは肝細胞に中性脂肪（ＴＧ）が沈着して肝障害をきたす疾患の総称である。ＮＡＦＬＤの多くは、肥満、糖尿病、脂質異常症、高血圧などを基盤に発症することから、メタボリックシンドロームの肝病変として捉えられている。ＮＡＦＬＤは組織学的に大滴性の肝脂肪変性を基盤に発症し、この疾患は非アルコール性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver：ＮＡＦＬ）とＮＡＳＨに分類される。ＮＡＦＬは単純性脂肪肝とも呼ばれ、病態がほとんど進行しないと考えられる予後良好なものである。ＮＡＳＨは、脂肪変性、炎症、肝細胞傷害（風船様変性）が特徴であり、さらにＮＡＳＨの重篤化は肝組織の線維化（肝線維化）の進行を伴う。ＮＡＳＨの予後は肝線維化の進行度で決定すると考えられており、予後不良のケースでは肝硬変や肝細胞がんへと移行しうる。
本発明における「ＮＡＳＨの治療剤」は、ＮＡＦＬＤの予防および／または治療、さらに、ＮＡＦＬからＮＡＳＨへの進行も予防することができる。
【００３１】
本明細書における「肝線維化抑制剤」は、肝線維化を予防、抑制および／または改善するための剤である。本発明における「線維化」は、線維症の状態、その状態に移行すること、および線維症が発症、進展または悪化することを包含する。「線維症」とは、組織または器官における過度の線維性結合組織（例えば、瘢痕組織）の発生を含む状態を指す。そのような瘢痕組織発生は、疾患、外傷、化学的毒性などに起因する、その器官の感染、炎症、または損傷に応答して生じうる。線維症は、種々の組織および器官（肝臓、腎臓、腸、肺、心臓など）において発症しうる。
本発明における「肝線維化」は、肝臓における肝組織の線維化を意味し、肝線維症の状態、その状態に移行すること、および肝線維症が発症、進展または悪化することを包含する。
また、本発明における肝線維化および肝線維症は、特に限定されるものではないが、Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；寄生虫性肝疾患；移植後の細菌感染、移植後のウイルス感染、もしくは移植後の真菌感染；アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）；非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を含む非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）；メトトレキサートにより誘発される肝疾患、イソニアジドにより誘発される肝疾患、オキシフェニスタチンにより誘発される肝疾患、メチルドパにより誘発される肝疾患、クロルプロマジンにより誘発される肝疾患、トルブタミドにより誘発される肝疾患、またはアミオダロンにより誘発される肝疾患；自己免疫肝炎；サルコイドーシス；ウィルソン病；ヘモクロマトーシス；ゴーシェ病；ＩＩＩ型糖原病、ＩＶ型糖原病、ＶＩ型糖原病、ＩＸ型糖原病、もしくはＸ型糖原病；α１アンチトリプシン欠損症；ツェルヴェーガー症候群；チロシン血症；果糖血症；ガラクトース血症；バッド−キアーリ症候群に関連する脈管障害、静脈閉塞病に関連する脈管障害、もしくは門脈血栓症に関連する脈管障害；または先天性肝線維症などの肝疾患全般に関連するものであり、本発明は、これらいずれの肝線維化の治療にも効果が期待される。
【００３２】
本発明は、好ましくはアルコール性肝疾患（ＡＬＤ）または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）（非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を含む）に関連する肝線維化、より好ましくはＮＡＦＬＤ（ＮＡＳＨを含む）に関連する肝線維化、特に好ましくはＮＡＳＨに関連する肝線維化に適用されうる。
【００３３】
また、本発明は、肥満やII型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）のような代謝性疾患に起因するＮＡＳＨの患者に対して優れた治療効果を示しうる。本発明は、代謝性疾患に起因するＮＡＳＨの治療に特に好適に使用できる。また、高血圧を伴うＮＡＳＨの治療にも好適に使用できる。
【００３４】
「治療」とは、疾患およびその症状のあらゆる治療（例えば、改善、軽減、進行の抑制など）が含まれる。また、疾患の発症および／または進行の阻止を含んでもよい。また、「治療」または「治療する」とは、任意の疾患状態の改善をもたらす任意の効果（例えば、減少させる、低下させる、進行を抑制する、緩和する、阻害する、調節する、または排除する等）を包含する。例えば、疾患状態を「治療する」または疾患状態の「治療」としては、疾患状態を阻害すること、すなわち、疾患状態またはその臨床症状の進行を止めること、あるいは疾患状態を軽減すること、すなわち、疾患状態またはその臨床症状を一時的もしくは永続的に、また部分的もしくは完全に取り除くこと等が挙げられる。
本発明における「治療」とは、患者、例えば、哺乳動物、特にヒトにおけるＮＡＳＨの治療および／または予防、さらに、肝線維化の予防、抑制、および／または改善を意味する。例えば、ＮＡＳＨの治療は、ＮＡＳＨの発生の予防、ＮＡＳＨの進展の抑制、ＮＡＳＨの治療、ＮＡＳＨ治療後の再発の抑制なども含まれる。また、ＮＡＦＬＤの予防および／または治療、およびＮＡＦＬからＮＡＳＨへの進行の予防も含まれる。
【００３５】
「患者」とは、ヒトおよびその他の動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなどを意味する。哺乳動物が好ましく、その中でも、ヒトが好ましい。
【００３６】
「治療上の有効量」とは、組織、系、動物またはヒトにおいて、研究者または医師によって要求される生物学的または医薬的応答を誘発する薬物または医薬の量を意味する。また、「治療上の有効量」とは、疾患を治療するために哺乳動物に投与される場合に、その疾患のそのような治療をもたらすために充分である、薬物（ＦＸＲアゴニスト、ＡＲＢ等）の量の意味を包含する。「治療上の有効量」は、薬物、疾患およびその重篤度、ならびに治療されるべき哺乳動物の年齢、体重などに依存して変わってくるであろう。
さらに、「有効量」とは、適切な用量での投与の際に、急性または慢性の治療効果を生じる、薬物（ＦＸＲアゴニスト、ＡＲＢ等）の量の意味を包含する。この治療効果としては、疾患／状態（例えば、肝線維症）および関連する合併症の症状、兆候および基礎にある病理の、検出可能な程度までの予防、矯正、阻害、または逆転が挙げられる。
かかる有効量として、本発明のＦＸＲアゴニストまたはＡＲＢ単独の量、本発明のＦＸＲアゴニストとＡＲＢの組み合わせの量および／または他のＮＡＳＨ治療剤と組み合わせた本発明の組み合わせ医薬の量が挙げられる。
【００３７】
本発明における、ＦＸＲアゴニストまたはその薬学的に許容される塩とＡＲＢまたはその薬学的に許容される塩の組み合わせ比率は、特に限定されるものではなく、所望のＮＡＳＨの予防および／または治療効果が達成されるように適宜選択することができる。当該組み合わせ比率は、特に限定されるものではないが、例えば１：１００〜１００：１、１：１０〜１０：１または１：３〜３：１の範囲で適宜選択してもよい。
【００３８】
本発明のＦＸＲアゴニストまたはその薬学的に許容される塩とＡＲＢまたはその薬学的に許容される塩との組み合わせにおいて、両剤は別々に投与してもよく、また単一製剤として一緒に投与してもよい。また、本発明の組み合わせの一方の成分を他方の成分に対して先に、同時に、または後に投与してもよい。これらの成分は、単一製剤形または分離した製剤形での医薬製剤に調製してもよい。
【００３９】
本発明のＦＸＲアゴニストまたはその薬学的に許容される塩とＡＲＢまたはその薬学的に許容される塩との組み合わせの形態の例として、特に限定されるものではないが、以下の（I）および（II）の形態が挙げられる：
（I）ＦＸＲアゴニストまたはその薬学的に許容される塩、およびＡＲＢまたはその薬学的に許容される塩の両成分を共に含有する単一製剤（１つの医薬組成物、配合剤）の形態；および
（II）ＦＸＲアゴニストまたはその薬学的に許容される塩を含有する製剤（医薬組成物）と、ＡＲＢまたはその薬学的に許容される塩を含有する製剤（医薬組成物）とをそれぞれ別々の製剤として有する形態。
【００４０】
当該（II）に係る形態の場合においては、各製剤を同時に投与するか、又は適宜の時間間隔をあけて別々に投与してもよく、所望のＮＡＳＨの予防及び／又は治療効果が達成されるように、適切な投与計画を採用することが可能である。また、当該（II）に係る形態の場合においては、両製剤を単一包装中に含む組み合わせのキット製剤として提供することもできる。
【００４１】
本発明の投与経路としては、限定されるものではないが、経口、舌下、口腔、非経口（例えば、皮下、筋肉内または静脈内）、直腸、局所、鼻腔内投与等が挙げられる。好ましくは、経口投与または非経口投与のいずれであり、より好ましくは、経口投与である。前記（II）に係る形態においては、一方を経口投与製剤とし、他方を非経口投与製剤とすることもできる。
経口投与製剤としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等が挙げられる。非経口投与製剤としては、例えば、注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、皮膚外用剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。
【００４２】
各投与経路に適した通常の無毒性の薬学的に許容される担体、補助剤、ベヒクルを含んだ適当な製剤中に、本発明の活性成分は単独であるいは一緒に製剤化されてもよい。これらの投与形態のうち、好ましい投与形態は経口投与製剤であり、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等が特に好ましい。前記の経口投与製剤および非経口投与製剤は、公知の製剤添加物を用いて、例えば、第１６改正日本薬局方製剤総則等に記載の公知の方法に基づいて製造することができる。
【００４３】
本発明の医薬は、薬学的に許容される担体、賦形剤、結合剤、安定剤その他の成分をさらに含んでいてもよい。例えば、本発明の医薬剤形が注射剤である場合、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤、ｐＨ調整剤を添加してもよい。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば、第１６改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
【００４４】
本発明の組み合わせの活性成分（ＦＸＲアゴニストまたはその薬学的に許容される塩とＡＲＢまたはその薬学的に許容される塩）の用量は特に限定されず、患者の年齢、体重、症状、投与形態、投与回数等の種々の条件に応じて適宜増減することができる。また本発明の組み合わせの一方の成分を他方の成分とは独立してその用量を適宜増減することができる。
また、本発明の組み合わせの活性成分（２種の薬剤として、ＦＸＲアゴニストまたはその薬学的に許容される塩とＡＲＢまたはその薬学的に許容される塩）の併用または合剤としての投与で治療効果が増強することにより、各薬剤の単独投与時よりも用量（または投与量）を減らすことが可能であり、その結果、各薬剤が有する副作用の低減が期待できる。例えば、ＦＸＲアゴニスト（例えば、オベチコール酸）には、掻痒等の副作用が生じることがあり、例えば、本発明のオベチコール酸とＡＲＢの組み合わせによって、併用または合剤としての投与で、単独投与時と比較して、用量を減らすことが可能であり、その結果、例えば掻痒の副作用を、頻度および／または重篤度の点で低減することができる。
【００４５】
ＦＸＲアゴニストまたはその薬学的に許容される塩は、一日あたり０．１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇの量で用いてもよい。例えば、ＦＸＲアゴニストがオベチコール酸である場合、成人に対して、オベチコール酸をフリー体として一日あたり０．１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇ、さらに好ましくは２ｍｇ〜１００ｍｇ、特に好ましくは５ｍｇ〜５０ｍｇの量で用いられ、１ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇまたは１００ｍｇ投与することが好ましい。
また、例えば、ＦＸＲアゴニストがＩＮＴ−７６７である場合、成人に対して、ＩＮＴ−７６７をフリー体として一日あたり０．１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇ、さらに好ましくは２ｍｇ〜１００ｍｇ、特に好ましくは５ｍｇ〜５０ｍｇの量で用いられ、１ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇまたは１００ｍｇ投与することが好ましい。
【００４６】
ＡＲＢまたはその薬学的に許容される塩は、一日あたり０．１ｍｇ〜２００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜１００ｍｇの量で用いてもよい。例えば、ＡＲＢがロサルタン、あるいは特にロサルタンカリウムである場合、成人に対して、一日あたり１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは２ｍｇ〜１００ｍｇ、さらに好ましくは５ｍｇ〜１００ｍｇ、特に好ましくは１０ｍｇ〜５０ｍｇの量で用いられ、１ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇまたは１００ｍｇ投与することが好ましい。
また、例えば、ＡＲＢがイルベサルタンである場合、成人に対して、一日あたり１ｍｇ〜２００ｍｇ、好ましくは２ｍｇ〜２００ｍｇ、さらに好ましくは５ｍｇ〜２００ｍｇ、特に好ましくは１０ｍｇ〜１００ｍｇの量で用いられ、１ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇまたは２００ｍｇ投与することが好ましい。
また、例えば、ＡＲＢがオルメサルタン、あるいは特にオルメサルタン  メドキソミルである場合、成人に対して、一日あたり１ｍｇ〜４０ｍｇ、好ましくは２ｍｇ〜４０ｍｇ、さらに好ましくは５ｍｇ〜４０ｍｇ、特に好ましくは１０ｍｇ〜２０ｍｇの量で用いられ、１ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇまたは４０ｍｇ投与することが好ましい。
また、例えば、ＡＲＢがテルミサルタンである場合、成人に対して、一日あたり１ｍｇ〜８０ｍｇ、好ましくは２ｍｇ〜８０ｍｇ、さらに好ましくは５ｍｇ〜８０ｍｇ、特に好ましくは１０ｍｇ〜４０ｍｇの量で用いられ、１ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇまたは８０ｍｇ投与することが好ましい。
また、例えば、ＡＲＢがカンデサルタン、あるいは特にカンデサルタン  シレキセチルである場合、成人に対して、一日あたり０．２ｍｇ〜１２ｍｇ、好ましくは０．５ｍｇ〜１２ｍｇ、さらに好ましくは１ｍｇ〜１２ｍｇ、特に好ましくは２ｍｇ〜８ｍｇの量で用いられ、０．２ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、８ｍｇ、１０ｍｇまたは１２ｍｇ投与することが好ましい。
また、例えば、ＡＲＢがバルサルタンである場合、成人に対して、一日あたり１ｍｇ〜１６０ｍｇ、好ましくは２ｍｇ〜１６０ｍｇ、さらに好ましくは５ｍｇ〜１６０ｍｇ、特に好ましくは１０ｍｇ〜８０ｍｇの量で用いられ、１ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、８０ｍｇまたは１６０ｍｇ投与することが好ましい。
また、例えば、ＡＲＢがアジルサルタンである場合、成人に対して、一日あたり１ｍｇ〜４０ｍｇ、好ましくは２ｍｇ〜４０ｍｇ、さらに好ましくは５ｍｇ〜４０ｍｇ、特に好ましくは１０ｍｇ〜２０ｍｇの量で用いられ、１ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇまたは４０ｍｇ投与することが好ましい。
【００４７】
投与間隔としては、前記の用量を１日１回または１日２回〜数回に分けて投与してもよい。
【００４８】
これらの活性成分が単一の製剤で調製される場合、特に限定されるものではないが、例えば、ＦＸＲアゴニストまたはその薬学的に許容される塩の１重量部あたりＡＲＢまたはその薬学的に許容される塩が０．０１〜１００重量部、好ましくは０．１〜１０重量部、より好ましくは０．３〜３重量部の比率で混合される。また、単一の製剤においては、特に限定されるものではないが、例えばその活性成分の和がその製剤の組成物に対して０．１〜７０重量％含まれている。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。【００５０】
実施例１
（方法）
ラットＮＡＳＨモデルとして、肥満性II型糖尿病自然発症ラットとして知られる大塚ロングエバンス徳島肥満（Otsuka Long-Evans Tokushima fatty：ＯＬＥＴＦ）ラットにブタ血清（pig serum：ＰＳ）を投与し、実験的に肝線維症を発症させたものを用い、蒸留水（ビークル投与群）、オベチコール酸（ＦＸＲアゴニスト）およびロサルタン（ＡＲＢ）（各投与群、併用投与群）の治療効果を、以下の方法により評価した。
［使用動物］
雄性、ＯＬＥＴＦラット（ｎ＝４０）およびロングエバンス徳島大塚（Long-Evans Tokushima Otsuka：ＬＥＴＯ）ラット（ｎ＝１０；非糖尿病性の陰性対照群として）
［使用薬物］
ＦＸＲアゴニストとしてはオベチコール酸（インターセプト社から大日本住友製薬を介して入手）を、ＡＲＢとしては市販のロサルタン（ロサルタンのカリウム塩を使用；本実施例においては単に「ロサルタン」と称する）を用いた。
［投与量、投与期間］
オベチコール酸（30 mg/kg/日）および／またはロサルタン（30 mg/kg/日）を強制経口投与；全投与期間は８週間
［実験方法］
１２週齢のＯＬＥＴＦラットを無作為に４群（Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）に分別し（各実験群あたりｎ＝１０）、ブタ血清（ＰＳ）1.0 ml/kgを週２回、８週間、腹腔内投与した。同じく１２週齢のＬＥＴＯラット（ｎ＝１０）をＧ１群とし、ＰＳを同様に投与した。Ｇ３群およびＧ４群のラットに、ＰＳ投与の開始日と同日から、オベチコール酸（30 mg/kg/日）およびロサルタン（30 mg/kg/日）をそれぞれ、毎日、８週間、強制経口投与し続けた。Ｇ５群のラットには、オベチコール酸（30 mg/kg/日）とロサルタン（30 mg/kg/日）の併用投与を毎日、８週間、同様に行った。Ｇ１群（ＬＥＴＯ）およびＧ２群（ＯＬＥＴＦ）のラットには薬物の代わりにビークルとして蒸留水を投与して、それぞれ陰性対照群および陽性対照群とした（投与方法は薬物の場合と同様）。
［組織学的解析］
肝線維化の進展を評価するため、前記の試験が完了したラットからホルマリン固定パラフィン包埋標本の肝切片（５μｍ幅）を採取し、シリウスレッド（Sirius Red）で染色した。当該染色切片の顕微鏡写真を撮影、収集し（全ラットを対象、１標本あたり計１０視野の顕微鏡画像を収集）、各群間の写真を比較した。各群での線維化進展の程度を定量化するため、ＮＩＨ（National Institution of Health）ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用い、収集した染色切片画像の組織学的特徴に関する半定量解析を行なった。【００５１】
（結果）
ラットＮＡＳＨモデルに対する薬物投与の結果を図１および図２に示す。
図１は、各群におけるシリウスレッド染色肝切片の顕微鏡写真の典型例を示す。陰性対照（Ｇ１）と陽性対照（Ｇ２）の比較から、ＰＳ投与によってＬＥＴＯラット（Ｇ１）では肝線維化の進展は認められないのに対してＯＬＥＴＦラット（Ｇ２）でのみ著しい肝線維化が進展した。そしてビークル投与のみでは陽性対照（Ｇ２）のように著しく進展するはずの線維化は、オベチコール酸単独投与（Ｇ３）およびロサルタン単独投与（Ｇ４）によりそれぞれ中程度抑制され、そして驚くべきことに、オベチコール酸とロサルタン両者の併用投与（Ｇ５）は、陰性対照（Ｇ１）と同等な程、完全に肝線維化を抑制した。この併用による効果（Ｇ５）は、それぞれの単独投与（Ｇ３、Ｇ４）に比べて極めて顕著であり、予期できないほどの相乗的効果といえるものである。
図２は、各群の線維化進展の組織学的特徴に関する半定量解析の結果を示す。図中グラフの縦軸、ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎｄｅｘ（ＦＩ）は各群のラット別に採取、収集した染色肝切片画像のコンピューター解析による線維化領域の平均面積指数を表す。本結果は、図１の顕微鏡写真から見て取れる組織学的特徴結果を定量的にサポートした。【００５２】
ＦＩ値は各群間で統計学的に有意な差（ｐ＜０．０１；Student's t-test）が認められた。陰性対照（Ｇ１）に比べて陽性対照（Ｇ２）が約２０倍の極めて高いＦＩ値であった。オベチコール酸（Ｇ３）およびロサルタン（Ｇ４）の単独投与ではそれぞれの陽性対照の６／１０および７／１０程度まで中程度ながら有意に低減した。そしてオベチコール酸とロサルタン両者の併用投与（Ｇ５）では陽性対照の約１／２０、つまり陰性対照（Ｇ１）と同程度まで、ＦＩ値の有意かつ著明な低減を示した。この結果は、併用投与が完全に肝線維化を抑制し、それぞれの単独投与に比べ極めて顕著な相乗的効果を有することを定量的かつ統計学的に有意に示している。【００５３】
実施例２
実施例１で得られた各群ラットの肝切片を用いて、α−平滑筋アクチン(α-smooth muscle actin：α−ＳＭＡ)の抗体を用いた免疫組織染色による免疫組織化学的検討およびトランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）とコラーゲン（α1(I)-procollagen）のｍＲＮＡの定量的解析を行なった。α−ＳＭＡは、肝星細胞（肝星状細胞ともいう）（hepatic stellate cell：ＨＳＣ）の活性化の指標（マーカー）であることが知られている。そして、肝星細胞（ＨＳＣ）の活性化と該活性化に伴うＴＧＦ−β１（線維化を促進するサイトカイン）の過剰産生、及びコラーゲン等の細胞外マトリックスの過剰産生が、ＮＡＳＨの肝線維化進展のメカニズムに中心的役割を果たしていると考えられている。そのため、ＴＧＦ−β１およびコラーゲン（α1(I)-procollagen）のｍＲＮＡ発現は、線維化の指標（マーカー）となりうる。【００５４】
（１）α−ＳＭＡ抗体を用いた免疫組織染色による免疫組織化学的検討
（方法）
シリウスレッドによる染色の代わりにα−ＳＭＡ抗体による免疫組織染色を用いること以外は、上記実施例１の［組織学的解析］と同様の方法にしたがって、各群間の写真比較及び収集した染色切片画像の免疫組織学化学的特徴に関する半定量解析を行い、オベチコール酸およびロサルタン（各投与群、併用投与群）の肝線維化進展時のＨＳＣ活性化に対する阻害効果を評価した。【００５５】
（結果）
結果を図３および図４に示す。
図３は、各群におけるα−ＳＭＡ免疫組織染色切片の顕微鏡写真の典型例を示す。実施例１の組織学的解析の結果（すなわち肝線維化の抑制）と同様に、陰性対照（Ｇ１）と陽性対照（Ｇ２）の比較から、ＬＥＴＯラット（Ｇ１）では活性化ＨＳＣ（activated hepatic stellate cell, Activated-HSC：Ａｃ−ＨＳＣ）はほとんど認められないのに対してＯＬＥＴＦラット（Ｇ２）でのみＡｃ−ＨＳＣの著しい増加が認められた。そしてＡｃ−ＨＳＣの増加は、オベチコール酸単独投与（Ｇ３）およびロサルタン単独投与（Ｇ４）によりそれぞれ中程度抑制され、オベチコール酸とロサルタン両者の併用投与（Ｇ５）は、陰性対照（Ｇ１）と同等な程、完全に抑制された（すなわち、ＨＳＣの活性化をほぼ完全に阻害した）。
図４は、各群の免疫組織学化学的特徴に関する半定量解析の結果を示す。図中グラフの縦軸、α−ＳＭＡ ｉｎｄｅｘ（α−ＳＩ）は各群のラット別に採取、収集した染色肝切片画像のコンピューター解析によるα-ＳＭＡ染色領域の平均面積指数を表す。本結果は、図３の顕微鏡写真から見て取れる免疫組織学化学的特徴結果を定量的にサポートした。【００５６】
α−ＳＩ値は各群間で統計学的に有意な差（ｐ＜０．０１；Student's t-test）が認められた。陰性対照（Ｇ１）に比べて陽性対照（Ｇ２）が極めて高いα−ＳＩ値であった。オベチコール酸（Ｇ３）およびロサルタン（Ｇ４）の単独投与ではそれぞれの陽性対照と比較して中程度ながら有意に低減した。そしてオベチコール酸とロサルタン両者の併用投与（Ｇ５）では陰性対照（Ｇ１）と同程度まで、α−ＳＩ値の有意かつ著明な低減を示した。この結果は、実施例１の組織学的解析の結果（すなわち肝線維化の抑制）と同様に、併用投与が完全にＡｃ−ＨＳＣの増加を抑制し、それぞれの単独投与に比べ極めて顕著な相乗的効果を有することを定量的かつ統計学的に有意に示している。【００５７】
（２）ＴＧＦ−β１およびコラーゲンのｍＲＮＡの定量的解析
（方法）
実施例１で得られた各群ラットの肝臓におけるＴＧＦ−β１およびコラーゲン（α1(I)-procollagen）のｍＲＮＡ発現を、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Quantitative real-time polymerase chain reaction：ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて定量し、比較検討した。当該ｍＲＮＡ発現レベルのＲＴ−ＰＣＲによる定量は、蛍光色素SYBR（登録商標） Greenを用いてStepOne PlusTM システム (Applied Biosystems（登録商標）社製)上で行われた。【００５８】
（結果）
結果を図５に示す。
図５は、各群のＴＧＦ−β１およびα1(I)-procollagenのｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲによる定量結果を示す。図中グラフの縦軸はｍＲＮＡ発現量を表す。ＴＧＦ−β１、α1(I)-procollagenともに、陰性対照（Ｇ１）に比べて陽性対照（Ｇ２）が極めて高いｍＲＮＡ発現量であった。オベチコール酸（Ｇ３）およびロサルタン（Ｇ４）の単独投与ではそれぞれの陽性対照と比較して中程度の低減傾向が認められた。そしてオベチコール酸とロサルタン両者の併用投与（Ｇ５）ではｍＲＮＡ発現量の有意かつ著明な低減を示した。この結果は、実施例１の組織学的解析の結果（すなわち肝線維化の抑制）と同様に、併用投与が著明にＴＧＦ−β１およびα1(I)-procollagen両者のｍＲＮＡ発現量の増加を抑制し、それぞれの単独投与に比べ極めて顕著な相乗的効果を有することを定量的かつ統計学的に有意に示している。【００５９】
また、Toll様受容体4（Toll-like receptor 4：ＴＬＲ４）のｍＲＮＡ発現についても同様の方法により定量した。実施例１の組織学的解析の結果（すなわち肝線維化の抑制）と同様に、併用投与が著明にＴＬＲ４のｍＲＮＡ発現量の増加を抑制した（本明細書にデータ開示なし）。肝ＴＬＲ４を介する細胞内シグナル伝達経路（エンドトキシンＬＰＳのシグナルを伝達する）は肝線維化進展機序において大きく寄与することが知られている。【００６０】
実施例３
（方法）
オベチコール酸と３種類のＡＲＢ（ロサルタン、バルサルタン、カンデサルタン）各々との併用効果を、in vitro細胞系実験において確認した。具体的には、ＮＡＳＨ肝線維化進展の主要なメカニズムに寄与するヒト肝星細胞（human hepatic stellate cell：ＨＨＳＣ）を用い、オベチコール酸と３種類のＡＲＢ各々との併用による、ＨＨＳＣの増殖能抑制効果および線維化マーカー発現抑制効果を、以下の方法により評価した。
［使用細胞］
ヒト肝星細胞（ＨＨＳＣ）（ヒト肝星状細胞ともいう）
［使用薬剤］
ＦＸＲアゴニストとしてはオベチコール酸（インターセプト社から大日本住友製薬を介して入手）を、ＡＲＢとしては各々市販のロサルタン（ロサルタンのカリウム塩を使用；本実施例においては単に「ロサルタン」と称する）、バルサルタンおよびカンデサルタン（カンデサルタンのシレキセチルエステルを使用；本実施例においては単に「カンデサルタン」と称する）を用いた。
［使用試薬］
アンジオテンシンII（angiotensin-II：ＡＴ−II）および／またはリポ多糖（lipopolysaccharide：ＬＰＳ）を用いた（ＡＴ１受容体を介したＡＴ−IIシグナル及びＴＬＲ４受容体を介したＬＰＳシグナルはともに、ＨＳＣの活性化及び肝線維化進展に重要な役割を果たしていると考えられている）。
［実験方法］
（１）ヒト肝星細胞（ＨＨＳＣ）の増殖能抑制効果の検討
ＨＨＳＣの増殖能抑制効果に関しては、ＷＳＴ−１試薬を用いた細胞増殖アッセイによって直接的作用を評価した。
１）ＨＨＳＣを、９６ウェル（well）プレートに１wellあたり３０００個／２００μＬで播種し、１％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培養液中で２４時間培養し生着させた。
２）２４時間の時点で、以下の７群に分け、以下の薬剤および／または試薬を添加した細胞培養液に交換した。ＡＲＢはロサルタンを使用した。
陰性対照（Ｇ１）： 薬剤非添加（Control）
陽性対照Ａ（Ｇ２Ａ）： ＡＴ−II（１０−６Ｍ）
陽性対照Ｌ（Ｇ２Ｌ）： ＬＰＳ（１０−５Ｍ）
陽性対照ＡＬ（Ｇ２ＡＬ）：ＡＴ−II（１０−６Ｍ）＋ＬＰＳ（１０−５Ｍ）
オベチコール酸投与（Ｇ３）： ＡＴ−II（１０−６Ｍ）＋ＬＰＳ（１０−５Ｍ）＋オベチコール酸（５×１０−６Ｍ）
ＡＲＢ投与（Ｇ４）： ＡＴ−II（１０−６Ｍ）＋ＬＰＳ（１０−５Ｍ）＋ＡＲＢ（１０−６Ｍ）
オベチコール酸＋ＡＲＢ併用投与（Ｇ５）：ＡＴ−II（１０−６Ｍ）＋ＬＰＳ（１０−５Ｍ）＋オベチコール酸（５×１０−６Ｍ）＋ＡＲＢ（１０−６Ｍ）
３）上記各群（Ｇ１、Ｇ２Ａ、Ｇ２Ｌ、Ｇ２ＡＬ、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）を２４時間培養した後、それぞれＷＳＴ−１細胞増殖アッセイを行い、薬物による細胞増殖の抑制効果を直接的に評価した。
バルサルタンおよびカンデサルタンもまた、上記１）〜３）にしたがってＨＨＳＣの増殖能抑制効果を評価した。なお、Ｇ１、Ｇ２ＡＬ、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５の５群で評価を行なった。
（２）線維化マーカー遺伝子発現抑制効果の検討
線維化マーカー遺伝子発現抑制効果に関しては、ＲＴ−ＰＣＲ法にてコラーゲン産生能、及びＴＧＦ−β産生能について評価した。
１）ＨＨＳＣを、６ウェル（well）プレートに１wellあたり３０万個／２ｍＬで播種し、１％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培養液中で２４時間培養し生着させた。
２）２４時間の時点で、以下の各群（７群）に分け、以下の薬剤および／または試薬を添加した細胞培養液に交換した。ＡＲＢはロサルタンを使用した。
陰性対照（Ｇ１）： 薬剤非添加（Control）
陽性対照Ａ（Ｇ２Ａ）： ＡＴ−II（１０−６Ｍ）
陽性対照Ｌ（Ｇ２Ｌ）： ＬＰＳ（１０−５Ｍ）
陽性対照ＡＬ（Ｇ２ＡＬ）：ＡＴ−II（１０−６Ｍ）＋ＬＰＳ（１０−５Ｍ）
オベチコール酸投与（Ｇ３）： ＡＴ−II（１０−６Ｍ）＋ＬＰＳ（１０−５Ｍ）＋オベチコール酸（５×１０−６Ｍ）
ＡＲＢ投与（Ｇ４）： ＡＴ−II（１０−６Ｍ）＋ＬＰＳ（１０−５Ｍ）＋ＡＲＢ（１０−６Ｍ）
オベチコール酸＋ＡＲＢ併用投与（Ｇ５）：ＡＴ−II（１０−６Ｍ）＋ＬＰＳ（１０−５Ｍ）＋オベチコール酸（５×１０−６Ｍ）＋ＡＲＢ（１０−６Ｍ）
３）上記各群（Ｇ１、Ｇ２Ａ、Ｇ２Ｌ、Ｇ２ＡＬ、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）を２４時間培養した後、各群の培養細胞からｍＲＮＡを抽出した。抽出されたｍＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを得、ＲＴ−ＰＣＲ法にて線維化マーカー遺伝子（ＴＧＦ−β１およびα1(I)-procollagen）の発現を評価した。
バルサルタンおよびカンデサルタンもまた、上記１）〜３）にしたがって線維化マーカー遺伝子発現抑制効果を評価した。なお、Ｇ１、Ｇ２ＡＬ、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５の５群で評価を行なった。【００６１】
（結果）
ヒト肝星細胞（ＨＨＳＣ）の増殖能抑制効果の検討結果を図６〜図８に示し、線維化マーカー遺伝子発現抑制効果の検討結果を図９〜図１４に示す。各図中の各グラフのバーは平均値±標準偏差を示す（ｎ＝８）。アスタリスクは、指し示された実験群間での統計学的に有意な差を表す（＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１）。【００６２】
図６、図７および図８はそれぞれ、ＡＲＢとしてロサルタン、バルサルタンおよびカンデサルタンを用いた場合における、各群のＨＨＳＣの増殖能抑制効果の検討結果を示す。各図中グラフの縦軸は吸光度（Absorption, OD）であり、生細胞数と強く相間する。吸光度を測定することにより、代謝活性のある細胞がＷＳＴ−１試薬から作り出すホルマザン色素を定量できる。ホルマザン色素と培地中の代謝活性のある細胞の数とが直線的な正の相関を示すため、細胞増殖能力や細胞生存能力をみることが可能である。
ＡＴ−IIおよびＬＰＳ両試薬の添加（Ｇ２ＡＬ）は、それぞれ単独の添加に比べて（Ｇ２ＡおよびＧ２Ｌ）、活性化されたＨＨＳＣの増殖を統計学的に有意に促進した（図６）。
ＡＲＢ単剤（ロサルタン、バルサルタンまたはカンデサルタン）の添加（Ｇ４）、あるいはオベチコール酸とＡＲＢ(ロサルタン、バルサルタンまたはカンデサルタン)両剤併用の添加（Ｇ５）は、陽性対照ＡＬ（Ｇ２ＡＬ）と比較して、ＡＴ−IIおよびＬＰＳ両試薬による、活性化されたＨＨＳＣの増殖促進を統計学的に有意に抑制した（図６、図７および図８）。【００６３】
図９、図１０および図１１はそれぞれ、ＡＲＢとしてロサルタン、バルサルタンおよびカンデサルタンを用いた場合における、各群の線維化マーカー遺伝子ＴＧＦ−β１の発現抑制効果の検討結果であり、図１２、図１３および図１４はそれぞれ、ＡＲＢとしてロサルタン、バルサルタンおよびカンデサルタンを用いた場合における、各群の線維化マーカー遺伝子α1(I)-procollagenの発現抑制効果の検討結果である。各図中グラフの縦軸はｍＲＮＡの相対的発現量を表す。
陽性対照ＡＬ（Ｇ２ＡＬ）で示された、ＡＴ−IIおよびＬＰＳで誘導されるＴＧＦ−β1およびα1(I)-procollagen（ＴＬＲ４）のｍＲＮＡ発現はともに、オベチコール酸単剤（Ｇ３）あるいはＡＲＢ（ロサルタン、バルサルタンまたはカンデサルタン）単剤（Ｇ４）の添加によって、統計学的に有意に抑制された。さらに、オベチコール酸とＡＲＢ(ロサルタン、バルサルタンまたはカンデサルタン)両剤併用の添加（Ｇ５）は、いずれか単剤の添加（Ｇ３、Ｇ４）と比較しても格段に著明かつ統計学的に有意なＴＧＦ−β1およびα1(I)-procollagenのｍＲＮＡ発現抑制効果を発揮した。【００６４】
以上の結果から、オベチコール酸とＡＲＢ（ロサルタン、バルサルタンまたはカンデサルタン）を組み合わせることにより、優れたＮＡＳＨの予防および治療効果が発揮されることが判明した。とりわけ、ＮＡＳＨにおける肝線維化の予防、抑制および改善に関して顕著な効果が期待できる。さらにはオベチコール酸とＡＲＢ、あるいはＦＸＲアゴニストとＡＲＢを組み合わせることにより、優れたＮＡＳＨの予防および治療効果が発揮されることが期待できる。【００６５】
実施例４
実施例１と同様の方法にしたがって、ただし、動物へのブタ血清（ＰＳ）投与後、一定の期間（例えば、４週間等）を置き、肝線維化が進行した後、薬剤等の投与を開始することで、ビークル投与群（蒸留水）、各投与群および併用投与群の治療効果を評価する。
より線維化が進展した病態でも、実施例１と同様に、優れたＮＡＳＨの予防および治療効果が発揮されることが期待される。【００６６】
実施例５
実施例１と同様の方法にしたがって、ただし、ラットＮＡＳＨモデル動物としてＯＬＥＴＦラットの代わりにコリン欠乏L-アミノ酸置換食（ＣＤＡＡ）誘導ラットを用い、また陰性対照群としてＬＥＴＯラットの代わりにコリン添加L-アミノ酸置換食（ＣＳＡＡ）ラットを用いて、ビークル投与群（蒸留水）、各投与群および併用投与群の治療効果を評価する。
別のＮＡＳＨモデルでも、実施例１と同様に、優れたＮＡＳＨの予防および治療効果が発揮されることが期待される。【００６７】
実施例６
（方法）
マウスＮＡＳＨモデルとして、メチオニン・コリン欠乏食（ＭＣＤ）餌負荷マウスを用い、0.5%カルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液（ビークル投与群）、オベチコール酸（ＦＸＲアゴニスト）およびロサルタン（ＡＲＢ）（各投与群、併用投与群）の治療効果を、以下の方法により評価する。
［使用動物］
雄性、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（ｎ＝５０〜７０）
［使用薬物］
ＦＸＲアゴニストとしてはオベチコール酸（インターセプト社から大日本住友製薬を介して入手）を、ＡＲＢとしては市販のロサルタン（ロサルタンのカリウム塩を使用；本実施例においては単に「ロサルタン」と称する）を用いる。
［投与量、投与期間］
オベチコール酸（3-30 mg/kg/日）および／またはロサルタン（0.1-30 mg/kg/日）を強制経口投与；全投与期間は１から６週間
［実験方法］
６から１２週齢のＣ５７Ｂｌ／６ＪマウスにＭＣＤを０から５週間与えた後、無作為に４群（Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）に分別する（各実験群あたりｎ＝１０）。同じく６週齢から１２週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（ｎ＝１０）には通常飼料を与えＧ１群とする。Ｇ３群およびＧ４群のマウスに、ＭＣＤ給餌の開始日と同日又は３〜５週間後から、オベチコール酸（3-30 mg/kg/日）およびロサルタン（0.1-30 mg/kg/日）をそれぞれ、毎日、１〜３週間、強制経口投与し続ける。Ｇ５群のマウスには、オベチコール酸（3-30 mg/kg/日）とロサルタン（0.1-30 mg/kg/日）の併用投与を毎日、１〜６週間、同様に行う。Ｇ１群（通常飼料群）およびＧ２群（ＭＣＤ負荷群）のマウスには薬物の代わりにビークルとして0.5% ＣＭＣ液を投与して、それぞれ陰性対照群および陽性対照群とする（投与方法は薬物の場合と同様）。
［組織学的解析］
肝線維化の進展を評価するため、前記の試験が完了したマウスからホルマリン固定パラフィン包埋標本の肝切片（５μｍ幅）を採取し、シリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ）で染色する。当該染色切片の顕微鏡写真を撮影、収集し（全マウスを対象、１標本あたり複数視野の顕微鏡画像を収集）、各群間の写真を比較する。各群での線維化進展の程度を定量化するため、解析用ソフトウェアを用い、収集した染色切片画像の組織学的特徴に関する半定量解析を行う。又は、肝切片（５μｍ幅）をオイルレッドＯ（Ｏｉｌ−Ｒｅｄ  Ｏ）で染色し、同様に当該染色切片の顕微鏡写真を撮影、収集し、各群間の写真を比較する。各群での肝脂肪化進展の程度を定量化するため、解析用ソフトウェアを用い、収集した染色切片画像の組織学的特徴に関する半定量解析を行う。あるいは肝臓から抽出したｍＲＮＡを用いて、半定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法にて線維化因子を測定する。
別のＮＡＳＨモデルでも、実施例１、４および５と同様に、優れたＮＡＳＨの予防および治療効果が発揮されることが期待される。【００６８】
実施例７
「肝細胞の大滴性脂肪化に加えて、炎症を伴う肝細胞の風船様変性を認めるもの」がＮＡＳＨと診断するための病理学的診断基準とされている。Matteoniらは、ＮＡＦＬＤ症例を病理所見より４つのＴＹＰＥ（ＴＹＰＥ１：脂肪肝のみ、ＴＹＰＥ２：脂肪変性に加え炎症細胞の浸潤、ＴＹＰＥ３：脂肪変性に加え肝細胞の風船様変性、ＴＹＰＥ４：脂肪変性・肝細胞の風船様変性に加えてマロリー・デンク体または線維化）に分類し長期フォローの結果を報告している。その結果、ＴＹＰＥ１，２に比較して、ＴＹＰＥ３，４では肝硬変への進展ならび肝疾患関連死が有意に多いことが証明され、病理分類は臨床上極めて重要であると考えられている。Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Networkは、観察者の判断差異や施設間差異の低減のために、脂肪化、炎症、肝細胞の風船様変性の程度をスコア化することで病理診断のスコア化（ＮＡＳ：NAFLD Activity Score）を提唱している（Matteoni CA, Younossi ZM, Gramlich T, Boparai N, Liu YC, McCullough AJ: Nonalchoholic fatty liver disease: A spectrum of clinical and pathological severity. Gastroenterology, 116; 1413-1419, 1999.）。そこで、ＮＡＳスコアを構成する病理学的診断基準を以下の動物モデルを用いた方法で評価し、ＦＸＲアゴニスト（オベチコール酸）とＡＲＢ（ロサルタン）単独及び併用投与による効果を検討した。【００６９】
（方法）
マウスＮＡＳＨモデルとして、コリン欠乏高脂肪飼料 メチオニン減量（ＣＤＡＨＦＤ）餌負荷マウスを用い、0.5%メチルセルロース（ＭＣ）溶液（ビークル投与群）、オベチコール酸（ＦＸＲアゴニスト）およびロサルタン（ＡＲＢ）（各投与群、併用投与群）の治療効果を、以下の方法により評価した。
［使用動物］
雄性、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（ｎ＝４９）
［使用薬物］
ＦＸＲアゴニストとしてはオベチコール酸（インターセプト社から大日本住友製薬を介して入手）を、ＡＲＢとしては市販のロサルタン（ロサルタンのカリウム塩を使用；本実施例においては単に「ロサルタン」と称する）を用いた。
［投与量、投与期間］
オベチコール酸（30 mg/kg/日）および／またはロサルタン（30 mg/kg/日）を強制経口投与；全投与期間は３週間
［実験方法］
６週齢のＣ５７Ｂｌ／６ＪマウスにＣＤＡＨＦＤを０から２．５週間与えた後、無作為に４群（Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）に分別した（各実験群あたりｎ＝９）。同じく６週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（ｎ＝１３）には通常飼料を与えＧ１群とした。Ｇ３群およびＧ４群のマウスに、ＣＤＡＨＦＤ給餌の開始２．５週間後から、オベチコール酸（30 mg/kg/日）およびロサルタン（30 mg/kg/日）をそれぞれ、毎日、３週間、強制経口投与し続けた。Ｇ５群のマウスには、オベチコール酸（30 mg/kg/日）とロサルタン（30 mg/kg/日）の併用投与を毎日、３週間、同様に行った。Ｇ１群（通常飼料群）およびＧ２群（ＣＤＡＨＦＤ負荷群）のマウスには薬物の代わりにビークルとして0.5% ＭＣ液を投与して、それぞれ陰性対照群および陽性対照群とした（投与方法は薬物の場合と同様）。
［組織学的解析］
肝線維化の進展を評価するため、前記の試験が完了したマウスからホルマリン固定パラフィン包埋標本の肝切片（３μｍ幅）を採取し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ）で染色した。当該染色切片の顕微鏡写真を撮影、収集し（全マウスを対象、１標本あたり複数視野の顕微鏡画像を収集）、各群間の写真を比較した。各群でのＮＡＳの程度を定量化するため、解析用ソフトウェアを用い、収集した染色切片画像の組織学的特徴に関する半定量解析を行った。肝細胞の脂肪化、風船様変性と類似の指標である肝細胞腫大（直径が正常な肝細胞の約１．５倍以上）については、当該病変の占める面積の比率をグレーディングした。炎症については、単位面積当たりの炎症細胞５個以上の集簇巣の数でグレーディングした。それらのグレーディングの総和をＮＡＳと定義した。【００７０】
（結果）
ＣＤＡＨＦＤ負荷ＮＡＳＨモデルに対する薬物投与による肝細胞腫大改善効果の検討結果を図１５に示す。図中グラフの縦軸は、陰性対照（Ｇ１）と陽性対照（Ｇ２）の差を１００％とした場合の各薬物投与群（Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）における肝細胞腫大の陽性面積率（肝細胞腫大改善率：％）を示す。陽性対照（Ｇ２）で有意に増加する肝細胞腫大は、オベチコール酸単独投与（Ｇ３）により抑制傾向が認められた。ロサルタン単独投与（Ｇ４）では、全く改善傾向が認められなかった。そして驚くべきことに、オベチコール酸とロサルタン両者の併用投与（Ｇ５）は、統計学的な有意差をもって肝細胞腫大を改善した。この併用による効果（Ｇ５）は、それぞれの単独投与（Ｇ３、Ｇ４）に比べて極めて顕著であり、予期できないほどの相乗的効果といえるものである。
肝細胞腫大の陽性面積率における改善率は、Ｇ５群でのみ統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０１；ｔｈｅ ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｄｕｎｎｅｔｔ ｔｅｓｔ）が認められた。この結果は、併用投与が肝細胞腫大を改善し、それぞれの単独投与に比べ極めて顕著な相乗的効果を有することを定量的かつ統計学的に有意に示している。
肝細胞の脂肪化やＮＡＳについても、細胞腫大の評価と同様、特にＧ５群において改善作用が認められた。【００７１】
実施例８
ＮＡＳＨ・ＮＡＦＬＤの診療ガイド２０１５（日本肝臓学会編．NASH・NAFLDの診療ガイド2015. 東京: 文光堂; 2015.）によるとＮＡＳＨ診断スクリーニングとして腹部エコー検査による脂肪肝の診断とＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）値異常が重要とされている。肝生検はＮＡＳＨの確定診断であるが、その実施基準のひとつとして肥満・高血圧・脂質異常のコントロールを行ってもなおトランスアミナーゼ（アミノトランスフェラーゼ）高値が続く症例で適応されるとなっている。また、ＡＬＴが高値の症例ではＮＡＳＨの病態が進展しやすいとされている。一方、ＮＡＳＨ患者を対象にビタミンEの有効性及び安全性を検討したPIVENS試験によると、ＡＬＴ 40 IU/L以下への低下、または、ベースラインからのＡＬＴ 30%以上の低下をＡＬＴ有効例とした場合、ビタミンE投与群ではＡＬＴ無効例に比べてＡＬＴ有効例でＮＡＳが有意に改善し、プラセボ投与群ではＮＡＳの改善だけでなく、線維化も有意に改善されたと報告されている（Hoofnagle JH, Van Natta ML, Kleiner DE, Clark JM, Kowdley KV, Loomba R, et al. Vitamin E and changes in serum alanine aminotransferase levels in patients with non-alcoholic steatohepatitis. Aliment Pharmacol Ther. 2013 Jul;38(2):134-43.）。以上のことから、ＡＬＴはＮＡＳＨ進展予後に関わる重要因子であることが期待されるため、治療によってＡＬＴが改善することはＮＡＳＨ病態の改善に繋がることが期待される。そこで、ＡＬＴを以下の動物モデルを用いた方法で評価し、ＦＸＲアゴニスト（オベチコール酸）とＡＲＢ（ロサルタン）単独及び併用投与による効果を検討した。【００７２】
（方法）
実施例７の（方法）と同様の方法を実施した。
［使用動物］
雄性、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（ｎ＝５０）
［使用薬物］
実施例７と同様の薬物を使用した。
［投与量、投与期間］
オベチコール酸（10 mg/kg/日）および／またはロサルタン（30 mg/kg/日）を強制経口投与；全投与期間は３週間
［実験方法］
６週齢のＣ５７Ｂｌ／６ＪマウスにＣＤＡＨＦＤを０から６週間与えた後、無作為に４群（Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）に分別した（各実験群あたりｎ＝１０）。同じく６週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（ｎ＝１０）には通常飼料を与えＧ１群とした。Ｇ３群およびＧ４群のマウスに、ＣＤＡＨＦＤ給餌の開始６週間後から、オベチコール酸（10 mg/kg/日）およびロサルタン（30 mg/kg/日）をそれぞれ、毎日、３週間、強制経口投与し続けた。Ｇ５群のマウスには、オベチコール酸（10 mg/kg/日）とロサルタン（30 mg/kg/日）の併用投与を毎日、３週間、同様に行った。Ｇ１群（通常飼料群）およびＧ２群（ＣＤＡＨＦＤ負荷群）のマウスには薬物の代わりにビークルとして0.5% ＣＭＣ液を投与して、それぞれ陰性対照群および陽性対照群とした（投与方法は薬物の場合と同様）。
［生化学検査］
血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性を評価するため、前記の試験が完了したマウスから採血し血清を分離した。体外診断用医薬品を用いて、血清試料中のＡＬＴ活性を酵素学的に測定した。
（結果）
ＣＤＡＨＦＤ負荷ＮＡＳＨモデルに対する薬物投与によるＡＬＴ活性改善効果の検討結果を図１６に示す。
図１６は、陽性対照（Ｇ２）のＡＬＴ活性の平均値を基準とした場合の各薬物投与群（Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）におけるＡＬＴ活性の変化値（ΔＵ／Ｌ；マイナス値が改善を示す）を示す。陰性対照（Ｇ１）に比べて陽性対照（Ｇ２）で統計学的有意に増加したＡＬＴ活性は、オベチコール酸単独投与（Ｇ３）ならびにロサルタン単独投与（Ｇ４）では、改善傾向のみであり、統計学的に有意な改善が認められなかった。そして驚くべきことに、オベチコール酸とロサルタン両者の併用投与（Ｇ５）は、統計学的有意差をもってＡＬＴ活性を改善した。この併用による効果（Ｇ５）は、それぞれの単独投与（Ｇ３、Ｇ４）に比べて極めて顕著であり、予期できないほどの相乗的効果といえるものである。
ＡＬＴ活性の改善は、Ｇ５群でのみ統計学的に有意な差（ｐ＜０．０１；ｔｈｅ ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｄｕｎｎｅｔｔ ｔｅｓｔ）が認められた。この結果は、併用投与が肝障害を改善し、それぞれの単独投与に比べ極めて顕著な相乗的効果を有することを定量的かつ統計学的に有意に示している。【００７３】
実施例９
使用薬物として、ＦＸＲアゴニストとしてはオベチコール酸を、ＡＲＢとしてはロサルタンの代わりにカンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、イルベサルタンまたはアジルサルタンを用いて、実施例１、２および４〜８と同様の方法にしたがって、ビークル投与群（蒸留水）、各投与群および併用投与群の治療効果を評価する。さらに、使用薬物として、ＦＸＲアゴニストとしてはオベチコール酸を、ＡＲＢとしてはロサルタン、バルサルタンまたはカンデサルタンの代わりにテルミサルタン、オルメサルタン、イルベサルタンまたはアジルサルタンを用いて、実施例３と同様の方法にしたがって、ＦＸＲアゴニストとＡＲＢの併用効果を確認する。
オベチコール酸と他のＡＲＢの組み合わせにおいても、オベチコール酸とロサルタンの組み合わせと同様に、優れたＮＡＳＨの予防および治療効果が発揮されることが期待される。【００７４】
実施例１０
使用薬物として、ＦＸＲアゴニストとしてはオベチコール酸の代わりにケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５、Ｐｘ−１０４またはＬＪＮ−４５２を、ＡＲＢとしてはロサルタンを用いて、実施例１、２および４〜８と同様の方法にしたがって、ビークル投与群（蒸留水）、各投与群および併用投与群の治療効果を評価する。さらに、使用薬物として、ＦＸＲアゴニストとしてはオベチコール酸の代わりにケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５、Ｐｘ−１０４またはＬＪＮ−４５２を、ＡＲＢとしてはロサルタンを用いて、実施例３と同様の方法にしたがって、ＦＸＲアゴニストとＡＲＢの併用効果を確認する。
他のＦＸＲアゴニストとロサルタンの組み合わせにおいても、オベチコール酸とロサルタンの組み合わせと同様に、優れたＮＡＳＨの予防および治療効果が発揮されることが期待される。【００７５】
実施例１１
使用薬物として、ＦＸＲアゴニストとしてはオベチコール酸の代わりにケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５、Ｐｘ−１０４またはＬＪＮ−４５２を、ＡＲＢとしてはロサルタンの代わりにカンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、イルベサルタンまたはアジルサルタンを用いて、実施例１、２および４〜８と同様の方法にしたがって、ビークル投与群（蒸留水）、各投与群および併用投与群の治療効果を評価する。さらに、使用薬物として、ＦＸＲアゴニストとしてはオベチコール酸の代わりにケノデオキシコール酸、ＩＮＴ−７６７、ＬＹ−２５６２１７５、Ｐｘ−１０４またはＬＪＮ−４５２を、ＡＲＢとしてはロサルタン、バルサルタンまたはカンデサルタンの代わりにテルミサルタン、オルメサルタン、イルベサルタンまたはアジルサルタンを用いて、実施例３と同様の方法にしたがって、ＦＸＲアゴニストとＡＲＢの併用効果を確認する。
他のＦＸＲアゴニストとＡＲＢの組み合わせにおいても、オベチコール酸とロサルタンの組み合わせと同様に、優れたＮＡＳＨの予防および治療効果が発揮されることが期待される。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の組み合わせ医薬は、肝疾患、特にＮＡＳＨの予防および／または治療に有用である。また、肝疾患全般、特にＮＡＳＨにおける肝線維化の予防、抑制および／または改善においても有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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