(57)【要約】  膵がんの新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、これにより、当該ポリヌクレオチド又はそれにコードされるポリペプチドを検出して、当該ポリヌクレオチド又はポリペプチド陽性の被験者を選別する方法及び治療の適応対象となる被験者を同定することに有用であることが期待される方法、並びにそのためのプライマーセット、及び検出用キットを提供することを課題とする。  前記方法では、ＣＬＤＮ１８遺伝子の一部とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチド又はＣＬＤＮ１８遺伝子の一部とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子の一部との融合部を含むポリヌクレオチド、又はそれにコードされる融合蛋白質を検出する。前記プライマーセットは、ＣＬＤＮ１８をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者から得た試料中の、クローディン１８（ＣＬＤＮ１８）遺伝子とロージーティーピーアーゼアクティベーティングプロテイン６（ＡＲＨＧＡＰ６）遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチド又はクローディン１８（ＣＬＤＮ１８）遺伝子とロージーティーピーアーゼアクティベーティングプロテイン２６（ＡＲＨＧＡＰ２６）遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含む、ＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、下記（１）又は（２）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法：
（１）配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３】
前記（１）又は（２）のポリペプチドが、腫瘍進展能を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、下記（３）又は（４）のポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法：
（３）配列番号１７若しくは１９に示される塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（４）配列番号１７若しくは１９に示される塩基配列において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１７、１８、１９、２０又は２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドの存在を検出するために、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程、及び／又は、被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
以下のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、請求項７に記載の方法：
ＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、ＣＬＤＮ１８をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含み、該アンチセンスプライマーは、前記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは、前記ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、プライマーセット。
【請求項９】
試料が体液又は体腔洗浄液である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
試料が腹水又は腹腔洗浄液である、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＡＲＨＧＡＰ６阻害剤若しくはＡＲＨＧＡＰ２６阻害剤、及び／又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子若しくはＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象となる膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者を同定する方法であって、請求項１から１０のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６融合遺伝子又はＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
クローディン１８（ｃｌａｕｄｉｎ  １８；ＣＬＤＮ１８）遺伝子は、ヒト３番染色体長腕に存在し、コードする蛋白質は４回膜貫通型の蛋白質である。機能としては、同一の遺伝子ファミリーに属するクローディン１（ｃｌａｕｄｉｎ  １；ＣＬＤＮ１）とクローディン２（ｃｌａｕｄｉｎ  ２；ＣＬＤＮ２）が、同様に４回膜貫通型蛋白質であるオクルディン（ｏｃｃｌｕｄｉｎ；ＯＣＬＮ）と複合体を形成しタイトジャンクションを構成すること（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９８；１４３（２）：３９１−４０１）、ＣＬＤＮ１８遺伝子のノックアウトマウスでは胃上皮細胞間でのタイトジャンクションの構造異常が認められると共に、胃液の組織への漏出により胃炎を来すこと（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１２；１４２（２）：２９２−３０４）が報告されていることから、タイトジャンクションによる細胞間結合に寄与すると考えられる。がんとの関連としては、スプライシングバリアントの１つであるＣＬＤＮ１８．２の発現量が各種がんで亢進していることが報告されている（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００８；１４（２３）：７６２４−７６３４）一方で、ＣＬＤＮ１８発現量が高い胃癌患者では予後が良好であるとの報告（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｕｒｇ．  ２０１４；１２（２）：１５６−１６２）も存在する。【０００３】
ジーティーピーアーゼ活性化因子であるロージーティーピーアーゼアクティベーティングプロテイン２６（Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２６；ＡＲＨＧＡＰ２６）遺伝子は、ヒト５番染色体長腕に存在し、コードする蛋白質は、中心部にＲｈｏ−ＧＡＰドメインを有するＧＴＰａｓｅ活性化蛋白質である。機能としては、ｓｍａｌｌ  ＧＴＰａｓｅ蛋白質ファミリー、特にはラスホモログファミリーメンバーＡ（ｒａｓ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  Ａ；ＲｈｏＡ）とセルディビジョンサイクル４２（ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ  ４２；ＣＤＣ４２）のＧＴＰ加水分解活性を亢進させることが知られている（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２０００；２７５（４９）：３８６０５−３８６１０）。ＡＲＨＧＡＰ２６は、がんとの関連としては、胃癌で（特許文献１）、特に胃癌の３％で上記ＣＬＤＮ１８遺伝子との融合遺伝子が（非特許文献１）、また特には未分化型胃癌患者の１５％で該融合遺伝子が（非特許文献２）、それぞれ原発巣において確認されている他、ミックストリニエージロイケミア（ｍｉｘｅｄ−ｌｉｎｅａｇｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＭＬＬ）遺伝子との融合遺伝子が白血病患者で確認されている（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０００；９７（１６）：９１６８−９１７３、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４；４１（４）：４００−４０４）。【０００４】
ジーティーピーアーゼ活性化因子であるロージーティーピーアーゼアクティベーティングプロテイン６（Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６；ＡＲＨＧＡＰ６）遺伝子は、ヒトＸ染色体短腕に存在し、コードする蛋白質は、上記ＡＲＨＧＡＰ２６と同様、中心部にＲｈｏ−ＧＡＰドメインを有するＧＴＰａｓｅ活性化蛋白質である。機能としては、これもＡＲＨＧＡＰ２６と同様、ｓｍａｌｌ  ＧＴＰａｓｅ蛋白質ファミリー、特にはＲｈｏＡのＧＴＰ加水分解活性を亢進させることが知られている（Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．  ２０００；９（４）：４７７−４８８）。がんとの関連としては、少ない割合ながら未分化型胃癌患者の原発巣で、上記ＣＬＤＮ１８遺伝子との融合遺伝子が確認されている（非特許文献２）。【０００５】
これまでにＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ２６が融合している融合遺伝子、又はＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ６が融合している融合遺伝子は、胃癌以外のがんではいかなる報告もなされていない。例えば、膵癌検体の変異解析結果を報告しているＮａｔｕｒｅ  ２０１６；５３１：４７−５２では、膵癌腫瘍検体及び膵癌細胞株（合計でｎ＝４５６）の変異解析から、３２種の遺伝子について同一の変異が繰り返し検出されたことを報告している。一方、融合遺伝子については、検出されたとしてもいずれも各１検体ずつでしか検出されなかったことが報告され（「Ｎｏ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｅｖｅｎｔｓ  ｗｅｒｅ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ」）、さらにＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ２６が融合している融合遺伝子、又はＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ６が融合している融合遺伝子についての記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１４２２９３号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  ２０１５；１２（２）：２７２−２８５
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４；５１３（７５１７）：２０２−２０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
膵がんの新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、これにより、該ポリヌクレオチド又はそれにコードされるポリペプチドを検出して、該ポリヌクレオチド又はポリペプチド陽性の被験者を選別する方法、及び治療の適応対象となる被験者を同定することに有用であることが期待される方法、並びにそのためのプライマーセット、プローブ、プローブセット又は検出用キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、膵がん患者からＣＬＤＮ１８遺伝子の一部とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子の一部とが融合した融合部を含むポリヌクレオチド又はＣＬＤＮ１８遺伝子の一部とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子の一部とが融合した融合部を含むポリヌクレオチドを検出できる（実施例１）ことを見出した。本発明者は、この知見から、該融合遺伝子の融合部を含むポリヌクレオチドの検出工程を構築し、そのためのプライマーセットを提供し、該融合遺伝子の融合部を含むポリヌクレオチドを検出することにより、ＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子陽性の膵がん患者を選別することが期待される方法の提供を可能とした。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［２５］に関する。
［１］膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者から得た試料中の、クローディン１８（ＣＬＤＮ１８）遺伝子とロージーティーピーアーゼアクティベーティングプロテイン６（ＡＲＨＧＡＰ６）遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチド又はクローディン１８（ＣＬＤＮ１８）遺伝子とロージーティーピーアーゼアクティベーティングプロテイン２６（ＡＲＨＧＡＰ２６）遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含む、ＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法。
［２］前記ポリヌクレオチドが、下記（１）又は（２）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、［１］に記載の方法：
（１）配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
［３］前記（１）又は（２）のポリペプチドが、腫瘍進展能を有する、［２］に記載の方法。
［４］前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、［２］に記載の方法。
［５］前記ポリヌクレオチドが、下記（３）又は（４）のポリヌクレオチドである、［１］に記載の方法：
（３）配列番号１７若しくは１９に示される塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（４）配列番号１７若しくは１９に示される塩基配列において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［６］前記ポリヌクレオチドが、配列番号１７、１８、１９、２０、又は２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、［５］に記載の方法。
［７］前記ポリヌクレオチドの存在が検出された場合に、被験者がＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者であると判定し、検出されなかった場合に該融合遺伝子陽性の被験者でないと判定する工程をさらに包含する、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記ポリヌクレオチドの存在を検出するために、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程、及び／又は、被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程を包含する、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］以下のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、［８］に記載の方法：
ＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、ＣＬＤＮ１８をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含み、該アンチセンスプライマーは、前記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは、前記ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、プライマーセット。
［１０］センスプライマーが、配列番号１の塩基番号１から７５０からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号１の塩基番号７５１から３０８７からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるか、
センスプライマーが、配列番号３の塩基番号１から７５０からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号３の塩基番号７５１から２４６０からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるか、
センスプライマーが、配列番号５の塩基番号１から７５０からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号５の塩基番号７５１から２０８８からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるか、又は
センスプライマーが、配列番号７の塩基番号１から７５０からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号７の塩基番号７５１から１９２３からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、［９］に記載の方法。
［１１］センスプライマーが、配列番号１の塩基番号１から７５０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号１の塩基番号７５１から３０８７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるか、
センスプライマーが、配列番号３の塩基番号１から７５０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号３の塩基番号７５１から２４６０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるか、
センスプライマーが、配列番号５の塩基番号１から７５０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号５の塩基番号７５１から２０８８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるか、又は
センスプライマーが、配列番号７の塩基番号１から７５０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号７の塩基番号７５１から１９２３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなる、［９］又は［１０］に記載の方法。
［１２］増幅された核酸断片が目的とするサイズで得られたか否かを検出する工程をさらに包含する、［９］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］増幅された核酸断片が目的とするサイズで得られた場合に、被験者がＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者であると判定し、得られなかった場合に該融合遺伝子陽性の被験者でないと判定する工程をさらに包含する、［１２］に記載の方法。
［１４］増幅された核酸断片の塩基配列を決定する工程をさらに包含する、［９］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１５］増幅された核酸断片がＣＬＤＮ１８をコードする部分の塩基配列とＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分の塩基配列又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分の塩基配列とを同一断片に含む場合に、被験者がＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者であると判定し、同一断片に含まない場合に該融合遺伝子陽性の被験者でないと判定する工程をさらに包含する、［１４］に記載の方法。
［１６］前記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むプローブを、被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、［８］に記載の方法。
［１７］被験者から得た試料、前記ポリヌクレオチドのＣＬＤＮ１８をコードする部分から設計されるプローブ、及び前記ポリヌクレオチドのＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるプローブを用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行う工程を包含する、［１６］に記載の方法。
［１８］ＣＬＤＮ１８をコードする部分から設計される複数種のプローブ、及びＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計される複数種のプローブを用いる、［１７］に記載の方法。
［１９］被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程で、
配列番号１の塩基番号１から７５０の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号１の塩基番号７５１から３０８７の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種用いるか、
配列番号３の塩基番号１から７５０の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号３の塩基番号７５１から２４６０の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種用いるか、
配列番号５の塩基番号１から７５０の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号５の塩基番号７５１から２０８８の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種用いるか、又は
配列番号７の塩基番号１から７５０の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号７の塩基番号７５１から１９２３の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種用いる、［１７］又は［１８］に記載の方法。
［２０］ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させる工程をさらに包含する、［１７］〜［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］ＣＬＤＮ１８をコードする部分から設計されるプローブからのシグナルとＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるプローブからのシグナルとの重なりを検出する工程をさらに包含する、［１７］〜［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］２つのシグナルが同じ場所にあることが検出された場合に、被験者がＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者であると判定し、検出されなかった場合に前記融合遺伝子陽性の被験者でないとする判定する工程をさらに包含する、［２１］に記載の方法。
［２３］被験者から試料を得る工程を包含する、［１］〜［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］試料が体液又は体腔洗浄液である、［１］〜［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］試料が腹水又は腹腔洗浄液である、［１］〜［２４］のいずれかに記載の方法。【００１１】
また、本発明は、以下の［２６］〜［３１］に関する。
［２６］ＡＲＨＧＡＰ６阻害剤若しくはＡＲＨＧＡＰ２６阻害剤、及び／又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子若しくはＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象となる膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者を同定する方法であって、［１］〜［２２］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［２７］被験者から試料を得る工程を包含する、［２６］に記載の方法。
［２８］ＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチド又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチドが被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者がＡＲＨＧＡＰ６阻害剤若しくはＡＲＨＧＡＰ２６阻害剤、及び／又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子若しくはＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象であると判定し、検出されなかった場合に該被験者が該治療の適応対象でないと判定する工程をさらに包含する、［２６］又は［２７］に記載の方法。
［２９］［１２］に記載の工程、及び、増幅された核酸断片が目的とするサイズで得られた場合に、被験者がＡＲＨＧＡＰ６阻害剤若しくはＡＲＨＧＡＰ２６阻害剤、及び／又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子若しくはＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象であると判定し、得られなかった場合に該被験者が該治療の適応対象でないと判定する工程をさらに包含する、［２６］又は［２７］に記載の方法。
［３０］［１４］に記載の工程、及び、増幅された核酸断片がＣＬＤＮ１８をコードする部分の塩基配列とＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分の塩基配列又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分の塩基配列とを同一断片に含む場合に、被験者がＡＲＨＧＡＰ６阻害剤若しくはＡＲＨＧＡＰ２６阻害剤、及び／又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子若しくはＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象であると判定し、含まなかった場合に該被験者が該治療の適応対象でないと判定する工程をさらに包含する、［２６］又は［２７］に記載の方法。
［３１］［２１］に記載の工程、及び、２つのシグナルが同じ場所にあることが検出された場合に、被験者がＡＲＨＧＡＰ６阻害剤若しくはＡＲＨＧＡＰ２６阻害剤、及び／又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子若しくはＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象であると判定し、検出されなかった場合に該被験者が該治療の適応対象でないと判定する工程をさらに包含する、［２６］又は［２７］に記載の方法。【００１２】
また、本発明は、以下の［３２］〜［３４］に関する。
［３２］膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者から得た試料中のＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、ＣＬＤＮ１８をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含み、該アンチセンスプライマーは、［１］〜［６］のいずれかに記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは、該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、プライマーセット。
［３３］センスプライマーが、配列番号１の塩基番号１から７５０からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号１の塩基番号７５１から３０８７からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるか、
センスプライマーが、配列番号３の塩基番号１から７５０からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号３の塩基番号７５１から２４６０からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるか、
センスプライマーが、配列番号５の塩基番号１から７５０からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号５の塩基番号７５１から２０８８からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるか、又は
センスプライマーが、配列番号７の塩基番号１から７５０からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号７の塩基番号７５１から１９２３からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、［３２］に記載のプライマーセット。
［３４］センスプライマーが、配列番号１の塩基番号１から７５０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号１の塩基番号７５１から３０８７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるか、
センスプライマーが、配列番号３の塩基番号１から７５０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号３の塩基番号７５１から２４６０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるか、
センスプライマーが、配列番号５の塩基番号１から７５０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号５の塩基番号７５１から２０８８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるか、又は
センスプライマーが、配列番号７の塩基番号１から７５０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号７の塩基番号７５１から１９２３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなる、［３２］又は［３３］に記載のプライマーセット。【００１３】
また、本発明は、以下の［３５］〜［３８］に関する。
［３５］膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者から得た試料中のＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプローブであって、［１］〜［６］のいずれかに記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、プローブ。
［３６］［３５］に記載のプローブを複数含むプローブセットであって、［１］〜［６］のいずれかに記載のポリヌクレオチドのＣＬＤＮ１８をコードする部分から設計されるプローブ及びＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるプローブを含む、プローブセット。
［３７］ＣＬＤＮ１８をコードする部分から設計される複数種のプローブ、及びＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計される複数種のプローブを含む、［３６］に記載のプローブセット。
［３８］配列番号１の塩基番号１から７５０の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号１の塩基番号７５１から３０８７の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種含むか、
配列番号３の塩基番号１から７５０の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号３の塩基番号７５１から２４６０の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種含むか、
配列番号５の塩基番号１から７５０の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号５の塩基番号７５１から２０８８の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種含むか、又は
配列番号７の塩基番号１から７５０の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号７の塩基番号７５１から１９２３の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種含む、［３６］又は［３７］のプローブセット。【００１４】
また、本発明は、以下の［３９］〜［４１］に関する。
［３９］膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者から得た試料中のＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するための検出用キットであって、［３２］〜［３４］のいずれかに記載のプライマーセットを含む、融合遺伝子の検出用キット。
［４０］膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者から得た試料中のＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するための検出用キットであって、［３５］〜［３８］のいずれかに記載のプローブ又はプローブセットを含む、検出用キット。
［４１］ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅する試薬をさらに含む、［４０］に記載の検出用キット。【００１５】
また、本発明は、以下の［４２］〜［４７］に関する。
［４２］膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者から得た試料中の、下記（１）又は（２）のポリペプチドの存在を検出する工程を含む、ＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ６との融合蛋白質陽性の被験者又はＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ２６との融合蛋白質陽性の被験者を選別する方法：
（１）配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
［４３］前記ポリペプチドが、腫瘍進展能を有する、［４２］に記載の方法。
［４４］前記ポリペプチドが、配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［４２］に記載の方法。
［４５］前記ポリペプチドの存在を検出する工程が、被験者から得た試料に該ポリペプチドのＣＬＤＮ１８遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び該ポリペプチドのＡＲＨＧＡＰ６遺伝子由来部分又はＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）を接触させる工程を含む、［４２］〜［４４］のいずれかに記載の方法。
［４６］下記ｉ）〜ｖ）に記載の工程をさらに包含する、［４５］に記載の方法：
ｉ）一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドが連結された二次抗体を添加する工程、ｉｉ）該二次抗体に連結された該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド及びそれらが近接した際に該二種類のオリゴヌクレオチドをライゲーションさせて環状構造を形成することができるライゲースを含有するライゲーション溶液を添加し、ライゲーション反応させる工程、ｉｉｉ）形成された環状構造に沿って核酸を伸長させる工程、ｉｖ）伸長した核酸にハイブリダイズすることのできる標識されたオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程、及び、ｖ）該標識シグナルを検出する工程。
［４７］被験者から試料を得る工程を包含する、［４２］〜［４６］のいずれかに記載の方法。【００１６】
また、本発明は、以下の［４８］〜［５０］に関する。
［４８］ＡＲＨＧＡＰ６阻害剤若しくはＡＲＨＧＡＰ２６阻害剤、及び／又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子若しくはＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象となる膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者を同定する方法であって、［４２］〜［４６］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［４９］被験者から試料を得る工程を包含する、［４８］に記載の方法。
［５０］［４２］〜［４４］のいずれかに記載のポリペプチドが被験者から得た試料から検出された場合に該被験者がＡＲＨＧＡＰ６阻害剤若しくはＡＲＨＧＡＰ２６阻害剤、及び／又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子若しくはＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象であると判定し、検出されなかった場合に該被験者が該治療の適応対象でないと判定する工程をさらに包含する、［４８］又は［４９］に記載の方法。【００１７】
また、本発明は、以下の［５１］〜［５２］に関する。
［５１］膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者から得た試料中のＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ６との融合蛋白質又はＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ２６との融合蛋白質を検出するための検出用キットであって、［４２］〜［４４］のいずれかに記載のポリペプチドのＣＬＤＮ１８遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び該ポリペプチドのＡＲＨＧＡＰ６遺伝子由来部分又はＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）を含む、融合蛋白質の検出用キット。
［５２］一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドが連結された二次抗体、該二次抗体に連結された該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド、それらが近接した際に該二種類のオリゴヌクレオチドをライゲーションさせて環状構造を形成することができるライゲース、環状構造に沿って核酸を伸長させることができるポリメラーゼ、及び標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、［５１］に記載の検出用キット。【００１８】
また、本発明は、以下の［５３］に関する。
［５３］下記（１）又は（２）に記載のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。【００１９】
また、本発明は、以下の［５４］に関する。
［５４］下記（１）〜（３）のいずれかに記載のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍進展能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍進展能を有するポリペプチド、又は、配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍進展能を有するポリペプチド、
（３）配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の方法は、ＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子（以下、「ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６融合遺伝子」又は「ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子」とも、「ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６／２６融合遺伝子」とも、「本発明の融合遺伝子」とも称する）陽性の膵がんを検出すること又は本発明の融合遺伝子により惹起されるシグナルを遮断する薬剤等による治療の適応対象となる被験者を同定することに有用であることが期待される。本発明のプライマーセット、プローブ、プローブセット及び検出用キットは、本発明の方法に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】膵癌患者腹水沈渣から精製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡを調製後、該ｃＤＮＡを鋳型として、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６融合遺伝子の融合部を含む領域をＰＣＲ法により増幅し、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。
【００２２】
【図２】膵癌患者腹水沈渣から精製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡを調製後、該ｃＤＮＡを鋳型として、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子の融合部を含む領域をＰＣＲ法により増幅し、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。
【００２３】
【図３】ＰＣＲ法により増幅したＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６／２６融合遺伝子産物の融合部を含む領域の塩基配列解析結果を示す。下線部の配列部分はＡＲＨＧＡＰ６又はＡＲＨＧＡＰ２６に相当する部分を示す。
【００２４】
【図４】胃癌細胞株ＮＳＣ−４７Ｃから調製したｃＤＮＡを鋳型としてＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子の融合部を含む領域をＰＣＲ法により増幅し、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。
【００２５】
【図５】ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合蛋白質の発現が、ＣＬＤＮ１８  ｓｉＲＮＡ群及びＡＲＨＧＡＰ２６  ｓｉＲＮＡ（Ｗｉｌｄ＆Ｆｕｓｉｏｎ）群で抑制されていることを確認したウェスタンブロットの結果を示す。
【００２６】
【図６】胃癌細胞株ＮＳＣ−４７Ｃに対してＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡで処理することで、胃癌細胞の生存能が有意に減弱することを確認した細胞生存試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
《本発明の方法》
本発明の方法には、１．融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法と、２．融合遺伝子にコードされる融合蛋白質陽性の被験者を選別する方法（以下にまとめて「本発明の選別方法」ともいう。）とが含まれる。さらに、本発明の方法には、３．ＡＲＨＧＡＰ６阻害剤若しくはＡＲＨＧＡＰ２６阻害剤、及び／又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子若しくはＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法（以下、「本発明の同定方法」ともいう。）が含まれる。本発明の方法は、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドの存在を検出する工程を含む。
【００２８】
本発明の方法において、被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、例えば任意の採取された細胞、組織、体液、体腔洗浄液を用いてよい。好ましくは、体液である腹水又は体腔洗浄液である腹腔洗浄液、特に腹水を用いる。体腔洗浄液として、例えば、開腹手術時に又はカテーテル挿入により洗浄液（例えば生理的食塩水）を被験者の体腔（腹腔等）内に導入し、該体腔を洗浄し、その後採取した洗浄液を使用できる。かかる洗浄液を細胞診に供することは知られている。被験者から得た試料からゲノムＤＮＡを抽出して用いることができ、又はその転写産物（ゲノムが転写又は翻訳される結果生じる産物；例えば、ＲＮＡ、蛋白質）やＲＮＡから調製したｃＤＮＡを用いることができる。特には、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製して用いることが好ましい。試料は、被験者から採取したものを、必要に応じて希釈若しくは濃縮、遠心分離による沈殿処理又はヘパリンのような血液凝固阻止剤を添加する等の前処理を行った後に使用してもよいし、そのような前処理を行うことなく、そのまま使用してもよい。また、試料をホルマリン固定してパラフィンに包埋して安定化した標本（Ｆｏｒｍａｌｉｎ‐Ｆｉｘｅｄ  Ｐａｒａｆｆｉｎ‐Ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｓａｍｐｌｅ；ＦＦＰＥ標本）を用いることができる。ＦＦＰＥ標本を薄くスライスしたＦＦＰＥ切片を用いてもよい。ＦＦＰＥ切片を用いれば、そこに存在するポリヌクレオチドやポリペプチドを直接検出することもできる。１つの実施形態において、本発明の方法は、被験者から試料を得る工程を包含する。
【００２９】
本発明の方法において、「ＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子」又は「ＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子」は、ＣＬＤＮ１８遺伝子の一部とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子の一部とを含む融合遺伝子又はＣＬＤＮ１８遺伝子の一部とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子の一部とを含む融合遺伝子である。例示的なＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子としては配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。例示的なＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子としては、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３０】
配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＣＬＤＮ１８遺伝子（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿００１００２０２６．２）の塩基番号５４（コーディングシーケンス（以下、ＣＤＳ）の５’末端に対応）から８０３と、ＡＲＨＧＡＰ６遺伝子（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿０１３４２７．２）の塩基番号１４６２から３７９８までの塩基配列のポリヌクレオチドである。
配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＣＬＤＮ１８遺伝子（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿００１００２０２６．２）の塩基番号５４（ＣＤＳの５’末端に対応）から８０３と、ＡＲＨＧＡＰ６遺伝子（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿００６１２５．２）の塩基番号１４６２から３１７１までの塩基配列のポリヌクレオチドである。
配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＣＬＤＮ１８遺伝子（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿００１００２０２６．２）の塩基番号５４（ＣＤＳの５’末端に対応）から８０３と、ＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿０１５０７１．４）の塩基番号１１４３から２４８０までの塩基配列のポリヌクレオチドである。
配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＣＬＤＮ１８遺伝子（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿００１００２０２６．２）の塩基番号５４（ＣＤＳの５’末端に対応）から８０３と、ＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿００１１３５６０８．１）の塩基番号１１４３から２３１５までの塩基配列のポリヌクレオチドである。
【００３１】
配列番号１に示される塩基配列の内、塩基番号１から７５０の配列はＣＬＤＮ１８遺伝子に由来し、塩基番号７５１から３０８７の配列はＡＲＨＧＡＰ６遺伝子に由来し、配列番号３に示される塩基配列の内、塩基番号１から７５０の配列はＣＬＤＮ１８遺伝子に由来し、塩基番号７５１から２４６０の配列はＡＲＨＧＡＰ６遺伝子に由来する。一方で、配列番号５に示される塩基配列の内、塩基番号１から７５０の配列はＣＬＤＮ１８遺伝子に由来し、塩基番号７５１から２０８８の配列はＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子に由来し、配列番号７に示される塩基配列の内、塩基番号１から７５０の配列はＣＬＤＮ１８遺伝子に由来し、塩基番号７５１から１９２３の配列はＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子に由来する。
【００３２】
配列番号１、３、５又は７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを「融合ポリヌクレオチド」とも称する。配列番号１の塩基番号１〜３０８７（ストップコドン含む）にコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示し、配列番号３の塩基番号１〜２４６０（ストップコドン含む）にコードされるアミノ酸配列を配列番号４に示す。配列番号５の塩基番号１〜２０８８（ストップコドン含む）にコードされるアミノ酸配列を配列番号６に示し、配列番号７の塩基番号１〜１９２３（ストップコドン含む）にコードされるアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００３３】
１．融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法
本発明の融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法における「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」（本明細書において、本発明の「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」と称する。）において、その検出対象となるポリヌクレオチド（本明細書中において「検出対象ポリヌクレオチド」と称する）としては、ＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチド又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチドが挙げられる。検出対象ポリヌクレオチドにおける「融合部」とは、検出対象ポリヌクレオチドにおけるＣＬＤＮ１８遺伝子由来の部分とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子由来の部分又はＣＬＤＮ１８遺伝子由来の部分とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子由来の部分とが融合した部分を意味する。
【００３４】
１つの実施形態において、検出対象ポリヌクレオチドとして、下記（１）又は（２）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
（１）配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
前記ポリペプチドは、さらに腫瘍進展能を有していてもよい。
【００３５】
前記ポリペプチドにおいて、「配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列との同一性」は、好ましくは９５％以上であり、より好ましくは９８％以上である。
【００３６】
なお、本明細書におけるアミノ酸配列の「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９７０；４８（３）：４４３−４５３）で以下のパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＢＬＯＳＵＭ６２
【００３７】
前記ポリペプチドにおいて、配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列に欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸の個数は、１〜数個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００３８】
あるポリペプチドが「腫瘍進展能を有する」ことを確認する具体的な方法としては、例えば、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを標的とするｓｉＲＮＡを、該ポリペプチドを発現する細胞に導入することによって、該細胞の生存能が低下することを確認する方法が挙げられ、参考例２に記載の方法が例示できる。
【００３９】
１つの実施形態において、検出対象ポリヌクレオチドは、下記（１）又は（２）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
（１）配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍進展能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２、４、６若しくは８に示されるアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍進展能を有するポリペプチド。
【００４０】
１つの実施形態において、検出対象ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００４１】
「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、「配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド」が挙げられる。「配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、「配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド」が挙げられる。「配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、「配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド」が挙げられる。「配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、「配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド」が挙げられる。１つの実施態様において、検出対象ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５又は７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００４２】
配列番号５、７に示される塩基配列のうち、塩基番号７１１〜７９０の配列（融合部の前後各４０塩基、全８０塩基を含む配列）は配列番号１７に示される。配列番号１、３に示される塩基配列の内、塩基番号７１１〜７９０の配列（融合部の前後各４０塩基、全８０塩基を含む配列）は配列番号１９に示される。配列番号１９において一塩基置換された配列は、配列番号１８、２０、２１に示される。
【００４３】
１つの実施形態において、検出対象ポリヌクレオチドとして、下記（３）又は（４）に記載のポリヌクレオチドが挙げられる。
（３）配列番号１７若しくは１９に示される塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（４）配列番号１７若しくは１９に示される塩基配列において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【００４４】
前記ポリヌクレオチドにおいて、「配列番号１７若しくは１９に示される塩基配列との同一性」は、好ましくは９５％以上であり、より好ましくは９８％以上である。
【００４５】
なお、本明細書における塩基配列の「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９７０；４８（３）：４４３−４５３）で以下のパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝  ＤＮＡｆｕｌｌ
【００４６】
前記ポリヌクレオチドにおいて、配列番号１７又は１９に示される塩基配列に欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基の個数は、１〜数個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個、いっそう好ましくは１〜３個、よりいっそう好ましくは１又は２個である。配列番号１９に示される塩基配列において１塩基が置換された塩基配列として、例えば、配列番号１８、２０又は２１を挙げることができる。
【００４７】
１つの実施形態において、検出対象ポリヌクレオチドは、配列番号１７、１８、１９、２０又は２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００４８】
本発明の融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法は、ＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者を同定することと、ＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子陰性の被験者を同定することのいずれも包含し得る。
【００４９】
１つの実施形態において、本発明の融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法は、検出対象ポリヌクレオチドが検出された場合に、被験者がＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者であると判定し、検出されなかった場合に前記融合遺伝子陽性の被験者でないと判定する工程をさらに包含し得る。
【００５０】
本発明の融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法は、検出対象ポリヌクレオチドを検出するために、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程（追加工程Ａ）、及び／又は、被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程（追加工程Ｂ）を包含し得る。
【００５１】
使用する核酸は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＲＮＡから調製したｃＤＮＡであってもよい。ゲノムＤＮＡの抽出、ＲＮＡの抽出、ＲＮＡからｃＤＮＡの調製の方法は当該分野で公知であり、市販のＤＮＡ抽出キット、ＲＮＡ抽出キット、ｃＤＮＡ合成キットを用いて簡便に行うことができる。
【００５２】
被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程は、公知の核酸増幅方法を用いて実施することができる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、例えば、リアルタイム定量ＰＣＲ）、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等が挙げられ、好ましい方法としては、ＰＣＲが挙げられる。
【００５３】
具体的には、被験者から得た試料中の核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＲＮＡから調製したｃＤＮＡ等）を、検出対象ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計されるプライマーセットを用いて核酸増幅反応に供して増幅させる。使用されるプライマーセットは、検出対象ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるものであれば、特には限定されず、例えば、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等を利用して、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて当業者に容易に設計され得る。より具体的には、プライマーセットは、検出対象ポリヌクレオチドのＣＬＤＮ１８をコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（特にはｃＤＮＡ）のＣＬＤＮ１８遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるセンスプライマー（５’−プライマー）と、検出対象ポリヌクレオチドのＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（特にはｃＤＮＡ）のＡＲＨＧＡＰ６又はＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるアンチセンスプライマー（３’−プライマー）を含み、該アンチセンスプライマーは検出対象ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、高度にストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは検出対象ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下（好ましくは、高度にストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる。あるいは、センスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方を、検出対象ポリヌクレオチドにおける融合部を含む領域に対応するように設計してもよい。
【００５４】
本明細書中において「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、４２℃で一晩」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「高度にストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、４２℃で一晩」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
【００５５】
本明細書において、検出対象ポリヌクレオチドにおける「融合部を含む領域」とは、例えば、検出対象ポリヌクレオチドが配列番号１、３、５又は７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである場合、それぞれ、塩基番号７５０及び７５１の塩基を含む領域を意味する。例えば、検出対象ポリヌクレオチドが配列番号１７、１８、１９、２０又は２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである場合、それぞれ、塩基番号４０及び４１の塩基を含む領域を意味する。
【００５６】
１つの実施形態において、プライマーセットとして、後述の本発明のプライマーセットを用いることができる。
【００５７】
好ましい実施形態において、本発明の融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法は、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程に加え、増幅された核酸断片が目的とするサイズで得られたか否かを検出する工程（追加工程Ｃ）をさらに包含する。増幅された核酸断片が目的とするサイズで得られたか否かを検出する工程は、例えば、電気泳動法を用いて実施することができる。電気泳動法では、例えば、核酸断片をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって増幅された核酸断片が目的とするサイズで得られたか否かを確認できる。
【００５８】
また、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター（リアルタイム定量ＰＣＲ）法（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １９９６；６（１０）：９８６−９９４）を実施することにより、増幅された核酸断片について、より定量的な解析を行うことが可能である。ＰＣＲ増幅モニター法としては、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いることができる。
【００５９】
増幅された核酸断片が目的とするサイズで得られた場合は、被験者から得た試料において、検出対象ポリヌクレオチドが存在していたことになる。１つの実施形態において、本発明の融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法では、増幅された核酸断片が目的とするサイズで得られた場合に、被験者がＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者であると判定し、得られなかった場合に前記融合遺伝子陽性の被験者でないと判定する工程をさらに含んでもよい。
【００６０】
別の好ましい実施形態において、本発明の融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法は、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程に加え、増幅された核酸断片の塩基配列を決定する工程をさらに包含する（追加工程Ｄ）。核酸断片の塩基配列を決定する工程は、例えば、サンガーシーケンス法（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いることができる）、一塩基合成反応法（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法）を含む次世代シーケンス法（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；２６（１０）：１１３５−１１４５）（例えば、ＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いることができる）等の当該分野で公知の配列決定法を用いることができる。
【００６１】
核酸断片の塩基配列を決定する工程には、核酸断片の全長の配列を決定する工程だけでなく、核酸断片の両端の部分配列又は融合部を含む部分配列を決定する工程も含まれる。
【００６２】
配列決定した核酸断片が検出対象ポリヌクレオチドのＣＬＤＮ１８をコードする部分の塩基配列とＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分の塩基配列又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分の塩基配列とを同一断片に含む場合は、被験者から得た試料において、検出対象ポリヌクレオチドが存在していたことになる。１つの実施形態において、本発明の融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法は、増幅された核酸断片が検出対象ポリヌクレオチドのＣＬＤＮ１８をコードする部分の塩基配列とＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分の塩基配列又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分の塩基配列とを同一断片に含む場合に、被験者がＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者であると判定し、同一断片に含まない場合に前記融合遺伝子陽性の被験者でないと判定する工程をさらに含んでもよい。
【００６３】
被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程は、検出対象ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、高度にストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むプローブを用いて、公知のハイブリダイゼーション方法を用いて実施することができる。このような方法としては、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＮＡプロテクション法、インサイチュハイブリダイゼーション等が挙げられ、好ましい方法としては、インサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、公知の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）法、又は、シルバーインサイチュハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）法で実施することができる。ハイブリダイゼーションに用いるプローブの鎖長は、使用するハイブリダイゼーション方法に応じて当業者に適宜選択され得るが、プローブは、好ましくは少なくとも１６塩基の鎖長を有する。１つの実施態様において、プローブとして、後述の本発明のプローブを用いることができる。
【００６４】
１つの実施形態において、被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程は、公知のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＲＮＡ  ＩＳＨ）法（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ．  ２０１２；１４（１）：２２−２９）に従って実施することができる。より具体的には、被験者から得た試料（例えば、腹水、腹腔洗浄液等）、検出対象ポリヌクレオチドのＣＬＤＮ１８をコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチドのＣＬＤＮ１８遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるプローブ、及び検出対象ポリヌクレオチドのＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチドのＡＲＨＧＡＰ６又はＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるプローブを用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行う。各プローブは、検出対象ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、高度にストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
【００６５】
１つの実施形態において、インサイチュハイブリダイゼーションにおいて、ＣＬＤＮ１８をコードする部分から設計される複数種の検出プローブ、及びＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計される複数種の検出プローブを用いる。
【００６６】
１つの実施形態において、インサイチュハイブリダイゼーションにおいて、後述の本発明のプローブを用いる。
【００６７】
さらなる実施形態において、インサイチュハイブリダイゼーションにおいて使用するプローブペアには、ＣＬＤＮ１８遺伝子の５’側非翻訳領域（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿００１００２０２６．２の塩基番号１〜５３からなる）の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペア、及び／又は、ＡＲＨＧＡＰ６遺伝子の３’側非翻訳領域（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿０１３４２７．２の塩基番号３７９９〜５１１８からなるか、ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿００６１２５．２の塩基番号３１７２〜３６３２からなる）又はＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子の３’側非翻訳領域（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿０１５０７１．４の塩基番号２４８１〜９０４１からなるかＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿００１１３５６０８．１の塩基番号２３１６〜８８７６からなる）の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを含んでもよい。
【００６８】
本明細書において「隣接したプローブペア」とは、検出対象ポリヌクレオチドに隣り合ってハイブリダイズする２種のプローブからなる。各プローブは、検出対象ポリヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドの長さは、通常、少なくとも１６塩基、好ましくは少なくとも１８塩基である。１つの実施形態において、該オリゴヌクレオチドの長さは、１６〜３０塩基、好ましくは１８〜２５塩基である。
【００６９】
好ましい実施形態において、本発明の融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法は、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程に加え、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させる工程をさらに包含する（追加工程Ｅ）。ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させる工程は、例えば、試料中の核酸にハイブリダイズしたプローブに、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させる試薬をハイブリダイズさせることにより行うことができる。
【００７０】
インサイチュハイブリダイゼーションにおいて使用されるハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させる試薬としては、例えば、ＰｒｅＡｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｍｉｘ  ＱＴ、Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｍｉｘ  ＱＴ、Ｌａｂｅｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｘ、及びＬａｂｅｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ＱＦがあり、これらはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社より入手できる。
【００７１】
より好ましい実施形態において、本発明の融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法は、ＣＬＤＮ１８をコードする部分から設計されるプローブからのシグナルとＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるプローブからのシグナルとの重なりを検出する工程をさらに包含する（追加工程Ｆ）。ＣＬＤＮ１８をコードする部分から設計されるプローブとＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるプローブを検出する蛍光試薬又は発色試薬を別にすることにより、当該異なる２つのプローブからのシグナルが同じ場所（同一分子内）にあるか否かを観察することができる。当該２つのシグナルが同じ場所（同一分子内）にあることが検出された場合は、被験者から得た試料において、検出対象ポリヌクレオチドが存在していたことになる。１つの実施形態において、本発明の融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法は、２つのシグナルが同じ場所（同一分子内）にあることが検出された場合に、被験者がＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者であると判定し、検出されなかった場合に前記融合遺伝子陽性の被験者でないと判定する工程をさらに含んでもよい。
【００７２】
各プローブは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【００７３】
２．融合遺伝子にコードされる融合蛋白質陽性の被験者を選別する方法
本発明の融合蛋白質陽性の被験者を選別する方法は、「ＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ６との融合蛋白質又はＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ２６との融合蛋白質」（本明細書において、「本発明の融合蛋白質」と称する。）陽性の被験者を検出する方法であり、当該融合蛋白質は、ＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子にコードされる融合蛋白質又はＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子にコードされる融合蛋白質である。
【００７４】
本発明の融合蛋白質陽性の被験者を選別する方法における「ポリペプチドの存在を検出する工程」（本明細書において、「ポリペプチドの存在を検出する工程」と称する。）において、その検出対象となるポリペプチド（本明細書中において「検出対象ポリペプチド」と称する）としては、検出対象ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが挙げられる。
【００７５】
本発明の融合蛋白質陽性の被験者を選別する方法は、ＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ６との融合蛋白質又はＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ２６との融合蛋白質陽性の被験者を同定することと、ＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ６との融合蛋白質又はＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ２６との融合蛋白質陰性の被験者を同定することのいずれも包含し得る。
【００７６】
本発明の融合蛋白質陽性の被験者を選別する方法は、検出対象ポリペプチドが検出された場合に、被験者がＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ６との融合蛋白質陽性の被験者又はＣＬＤＮ１８とＡＲＨＧＡＰ２６との融合蛋白質陽性の被験者であると判定し、検出されなかった場合に前記融合蛋白質陽性の被験者でないと判定する工程をさらに包含し得る。
【００７７】
例えば、ポリペプチドの存在を検出する工程は、被験者から得た試料（例えば、被験者から得たがん組織や細胞、又は腹水等の体液）由来の可溶化液を調製し、その中に含まれる検出対象ポリペプチドを、融合蛋白質を構成する各蛋白質に対する抗体を組み合わせることによる免疫学的測定法又は酵素活性測定法あるいはこれらを組み合わせた検出方法、又は質量分析法により実施することができる。また、本工程は、適宜前処理（例えば、パラフィンの除去又は遠心分離）してある被験者から得た試料（例えば、ＦＦＰＥ切片又は沈渣）に含まれる検出対象ポリペプチドを、融合蛋白質を構成する各蛋白質に対する抗体を組み合わせることによる免疫組織染色技術による検出方法により実施してもよい。又は、本工程は、前記の各検出方法において、融合蛋白質を構成する各蛋白質に対する抗体に代えて、融合蛋白質の融合部を認識する抗体を用いて実施してもよい。これらの手法としては、検出対象ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた、酵素免疫測定法、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織染色、免疫沈降法と質量分析法を組み合わせた検出法、等の手法が挙げられる。
【００７８】
本明細書において、融合蛋白質の「融合部」とは、検出対象ポリペプチドにおけるＣＬＤＮ１８遺伝子由来の部分とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子由来の部分又はＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子由来の部分とが融合した部分を意味する。
【００７９】
免疫組織染色技術を利用した検出は、例えば、ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ（Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００６；３（１２）：９９５−１０００）に従って実施することができる。より具体的には、検出対象ポリペプチドのＣＬＤＮ１８遺伝子由来部分を認識する抗体及び検出対象ポリペプチドのＡＲＨＧＡＰ６遺伝子由来部分又はＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子由来部分を認識する抗体を用いて、当該二つの抗体が同一分子を認識していることを上記技術によって検出することにより、検出対象ポリペプチドの存在を検出することができる。さらに具体的には、検出は、ｉ）被験者から得た試料に検出対象ポリペプチドのＣＬＤＮ１８遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び検出対象ポリペプチドのＡＲＨＧＡＰ６遺伝子由来部分又はＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）を接触させる工程、ｉｉ）該一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドが連結された二次抗体を添加する工程、ｉｉｉ）該二次抗体に連結された該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド及びそれらが近接した際に該二種類のオリゴヌクレオチドをライゲーションさせて環状構造を形成することができるライゲースを含有するライゲーション溶液を添加し、ライゲーション反応させる工程、ｉｖ）形成された環状構造に沿って核酸を伸長させる工程、ｖ）伸長した核酸にハイブリダイズすることのできる標識されたオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程、ｖｉ）該標識シグナルを検出する工程、により実施することができる。このような検出は、ＰＬＡプローブと、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）ＩＩ試薬キット又はＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標）ＩＩ  Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ試薬キット（Ｏｌｉｎｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に含まれる試薬を用いて実施することができる。
【００８０】
３．本発明の同定方法
また、本発明の「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」及び本発明の「ポリペプチドの存在を検出する工程」は、ＡＲＨＧＡＰ６阻害剤若しくはＡＲＨＧＡＰ２６阻害剤、及び／又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子若しくはＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象となる被験者（膵がん患者）を同定する方法にも使用することができる。ＡＲＨＧＡＰ６又はＡＲＨＧＡＰ２６の阻害剤として、例えば、機能阻害剤又は発現阻害剤を挙げることができる。機能を阻害するとは、ＡＲＨＧＡＰ６又はＡＲＨＧＡＰ２６の蛋白質としての機能を阻害することをいう。発現を阻害するとは、本発明の融合遺伝子をコードする核酸の転写、及び／若しくは蛋白質への翻訳を阻害すること、又は当該蛋白質の分解を亢進することをいう。ＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルとして、これらの融合遺伝子非発現下に比較してこれらの融合遺伝子発現下で亢進又は抑制されるシグナル、例えば細胞増殖を亢進するシグナル又はプログラム細胞死を抑制するシグナルなどが挙げられる。ＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤として、例えば、細胞増殖亢進シグナルを下方制御する薬剤又はプログラム細胞死抑制シグナルを解除する薬剤を挙げることができる。
【００８１】
本発明の同定方法は、当該検出工程に加えて、本発明の選別方法において挙げたさらなる工程（例えば追加工程Ａ−Ｆのうちのいずれか１又は複数）を含んでもよい。さらに、本発明の選別方法において利用されるプライマーセット、プローブ、プローブセット及び検出キットを利用してもよい。さらに、本発明の同定方法は、検出対象ポリヌクレオチド又は検出対象ポリペプチドが被験者から得た試料から検出された場合や、増幅された核酸断片が目的とするサイズで得られた場合、増幅された核酸断片がＣＬＤＮ１８をコードする部分の塩基配列とＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分の塩基配列又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分の塩基配列とを同一断片に含む場合、あるいは、ＣＬＤＮ１８をコードする部分から設計されるプローブからのシグナルとＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分からのシグナルとの２つのシグナルが同じ場所（同一分子内）にあることが検出された場合に、該被験者がＡＲＨＧＡＰ６阻害剤若しくはＡＲＨＧＡＰ２６阻害剤、及び／又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子若しくはＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子阻害剤若しくは該融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象であると判定し、前記の場合に該当しなかったときには、該被験者が該治療の適応対象でないと判定する工程を含んでもよい。
【００８２】
《本発明のプライマーセット、プローブ、プローブセット及び検出用キット》
本発明は、本発明の方法で使用されるプライマーセット、プローブ、プローブセット及び検出用キットを包含する。
【００８３】
本発明のプライマーセットは、ＣＬＤＮ１８をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含み、該アンチセンスプライマーは検出対象ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、高度にストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは検出対象ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下（好ましくは、高度にストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる。
【００８４】
本発明のプライマーセットにおいて、センスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方を、検出対象ポリヌクレオチドの融合部を含む領域に対応するように設計してもよい。
【００８５】
本発明のプライマーセットの具体的な態様としては、以下のプライマーセットが挙げられる：
配列番号１の塩基番号１から７５０からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び、配列番号１の塩基番号７５１から３０８７からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
配列番号３の塩基番号１から７５０からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び、配列番号３の塩基番号７５１から２４６０からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
配列番号５の塩基番号１から７５０からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び、配列番号５の塩基番号７５１から２０８８からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、又は
配列番号７の塩基番号１から７５０からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び、配列番号７の塩基番号７５１から１９２３からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【００８６】
本発明のプライマーセットのより具体的な態様としては、以下のプライマーセットが挙げられる：
配列番号１の塩基番号１から７５０間の任意の連続する少なくとも１６塩基からなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号７５１から３０８７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
配列番号３の塩基番号１から７５０間の任意の連続する少なくとも１６塩基からなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号７５１から２４６０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
配列番号５の塩基番号１から７５０間の任意の連続する少なくとも１６塩基からなるセンスプライマー及び配列番号５の塩基番号７５１から２０８８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、又は
配列番号７の塩基番号１から７５０間の任意の連続する少なくとも１６塩基からなるセンスプライマー及び配列番号７の塩基番号７５１から１９２３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【００８７】
プライマーセットにおいては、増幅させる核酸断片のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスプライマーにより増幅される核酸断片の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。また、本発明のプライマーは、通常、少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも１６塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基の鎖長を有する。１つの実施形態において、当該プライマーは、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、より好ましくは１８〜２４塩基の鎖長を有する。
【００８８】
本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【００８９】
本発明のプローブ及び本発明のプローブセットに含まれる各プローブは、検出対象ポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下（好ましくは、高度にストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。本発明のプローブ及び本発明のプローブセットに含まれる各プローブの鎖長は、使用するハイブリダイゼーション方法に応じて当業者に適宜選択され得るが、プローブは、好ましくは少なくとも１６塩基の鎖長を有する。
【００９０】
１つの実施形態において、本発明のプローブは、検出対象ポリヌクレオチドにおける融合部を中心にその上流及び下流のそれぞれ少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチド（具体的な例として、配列番号１、３、５又は７の塩基番号７３５〜７６６の配列）又はそれに相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
【００９１】
１つの実施形態において、本発明のプローブセットは、ＣＬＤＮ１８をコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチドのＣＬＤＮ１８遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるプローブ、及びＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチドのＡＲＨＧＡＰ６遺伝子又はＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるプローブを含む、プローブセットである。
【００９２】
１つの実施形態において、本発明のプローブセットは、ＣＬＤＮ１８をコードする部分から設計される複数種のプローブ、及びＡＲＨＧＡＰ６をコードする部分又はＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計される複数種のプローブを含む。
【００９３】
１つの実施形態において、本発明のプローブセットは、以下を含む：
配列番号１の塩基番号１から７５０の任意の連続する少なくとも１６塩基（好ましくは１６〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基）のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種（好ましくは１０〜２５種、より好ましくは１８〜２２種、さらに好ましくは２０種のプローブペア）、及び配列番号１の塩基番号７５１から３０８７の任意の連続する少なくとも１６塩基（好ましくは１６〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基）のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種（好ましくは１０〜２５種、より好ましくは１８〜２２種、さらに好ましくは２０種のプローブペア）、
配列番号３の塩基番号１から７５０の任意の連続する少なくとも１６塩基（好ましくは１６〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基）のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種（好ましくは１０〜２５種、より好ましくは１８〜２２種、さらに好ましくは２０種のプローブペア）、及び配列番号３の塩基番号７５１から２４６０の任意の連続する少なくとも１６塩基（好ましくは１６〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基）のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペア複数種（好ましくは１０〜２５種、より好ましくは１８〜２２種、さらに好ましくは２０種のプローブペア）、
配列番号５の塩基番号１から７５０の任意の連続する少なくとも１６塩基（好ましくは１６〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基）のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種（好ましくは１０〜２５種、より好ましくは１８〜２２種、さらに好ましくは２０種のプローブペア）、及び配列番号５の塩基番号７５１から２０８８の任意の連続する少なくとも１６塩基（好ましくは１６〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基）のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種（好ましくは１０〜２５種、より好ましくは１８〜２２種、さらに好ましくは２０種のプローブペア）、又は
配列番号７の塩基番号１から７５０の任意の連続する少なくとも１６塩基（好ましくは１６〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基）のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種（好ましくは１０〜２５種、より好ましくは１８〜２２種、さらに好ましくは２０種のプローブペア）、及び配列番号７の塩基番号７５１から１９２３の任意の連続する少なくとも１６塩基（好ましくは１６〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基）のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペア複数種（好ましくは１０〜２５種、より好ましくは１８〜２２種、さらに好ましくは２０種のプローブペア）。
【００９４】
本発明のプローブ及び本発明のプローブセットに含まれる各プローブは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【００９５】
本発明は、本発明のプライマーセット、本発明のプローブ又は本発明のプローブセットを含む、検出用キットを包含する。本発明の検出用キットには、本発明のプライマーセット、本発明のプローブ又は本発明のプローブセットに加え、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅する試薬等、検出対象ポリヌクレオチドを検出するために該プライマーセット、プローブ又はプローブセットと共に用いる構成要素を含んでもよい。
【００９６】
本発明はまた、検出対象ポリペプチドを検出するための検出用キットを包含する。好ましくは、当該検出用キットは、検出対象ポリペプチドのＣＬＤＮ１８遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び検出対象ポリペプチドのＡＲＨＧＡＰ６遺伝子由来部分又はＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）を含む。より好ましくは、該一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドが連結された二次抗体、該二次抗体に連結された該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド、それらが近接した際に該二種類のオリゴヌクレオチドをライゲーションさせて環状構造を形成することができるライゲース、環状構造に沿って核酸を伸長させることができるポリメラーゼ、及び標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含んでもよい。
【００９７】
本発明のプライマーセット、プローブ、プローブセット、及び検出用キットは、本発明の選別方法、及び患者の同定方法に使用することができる。１つの実施形態において、本発明のプライマーセット、プローブ、プローブセット、及び検出用キットに関して、被験者は、膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者である。
【実施例】
【００９８】
特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書又はプロトコルに従って実施可能である。
［実施例１］
ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６／２６融合遺伝子の融合部を含むポリヌクレオチドの検出
国立がん研究センター中央病院及び要町病院の膵癌患者２６人から包括同意に基づき回収した腹水沈渣を、試薬の標準プロトコルに従いＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）に懸濁、保存の上、上記保存溶液からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。その後、１μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、Ｈｉｇｈ―Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて試薬の標準プロトコルに従い逆転写反応を行うことで、ｃＤＮＡを合成した。次に、上記ｃＤＮＡを鋳型（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ換算で１００ｎｇ）として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｃｃｕＰｒｉｍｅＴＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して２０μＬの反応容量でＰＣＲ（９４℃２分に続いて９４℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃１分を３０サイクル又は３５サイクル）を行い、当該融合遺伝子の融合部を含む領域の増幅を行った。この際にＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６の増幅には、配列番号９に示されるＣＬＤ−ＡＲＨ＿Ｃ６Ａ１２＿ｐａｒｔｉａｌ  ｆｗｄ０１及び配列番号１０に示されるＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６＿ＣＤＳ＿Ｒ８９３をプライマーとして用いた。一方でＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６の増幅には、上記ＣＬＤ−ＡＲＨ＿Ｃ６Ａ１２＿ｐａｒｔｉａｌ  ｆｗｄ０１と配列番号１１に示されるＣＬＤ−ＡＲＨ＿Ｃ６Ａ１２＿ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｖ０１をプライマーとして用いた。その後、得られたＰＣＲ産物２μＬを鋳型として上記と同じ条件でｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。その際にＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６の増幅には、配列番号１２に示されるＣＬＤ−ＡＲＨ＿Ｃ６Ａ１２＿ｐａｒｔｉａｌ  ｆｗｄ０２及び配列番号１３に示されるＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６＿ＣＤＳ＿Ｒ８１５をプライマーとして用いた。一方でＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６の増幅には、上記ＣＬＤ−ＡＲＨ＿Ｃ６Ａ１２＿ｐａｒｔｉａｌ  ｆｗｄ０２と配列番号１４に示されるＣＬＤ−ＡＲＨ＿Ｃ６Ａ１２＿ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｖ０２をプライマーとして用いた。上記プライマーにより、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６融合遺伝子が存在する場合には３００ｂｐ程度の鎖長のＰＣＲ産物が、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子が存在する場合には５００ｂｐ程度の鎖長のＰＣＲ産物が、それぞれ生じることが予想される。また、鋳型ｃＤＮＡの量が一定であることを確認するため、配列番号１５に示されるＡＣＴＢ＿Ｆ２及び配列番号１６に示されるＡＣＴＢ＿Ｒ２のプライマーを用いて、上記と同じＤＮＡポリメラーゼを使用してＡＣＴＢ（β―アクチン）のＰＣＲ（９４℃２分に続いて９４℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃１分を２５サイクル）を行った。その後、ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル（ロンザ社）で電気泳動したところ、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６に関して全９検体において上記と同程度の鎖長を有するＰＣＲ産物を（９検体のうち１検体（Ｎｏ．１９３）について図１に示す）、またＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６に関しても１検体（Ｎｏ．１６４）において上記と同程度の鎖長のＰＣＲ産物を（図２）、確認した。
次に、上記ＰＣＲ反応で増幅産物が確認された全症例について、そのＰＣＲ産物をクローニングベクター（ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）  Ｋｉｔ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）にクローニングした。インサートの塩基配列はユーロフィンジェノミクス株式会社のＤＮＡシーケンス受託サービスを利用して決定した。この結果、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６に関しては、増幅産物が確認された９検体全てにおいて、既に胃癌で報告されているＣＬＤＮ１８（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿００１００２０２６．２）の塩基番号８０３と、ＡＲＨＧＡＰ６（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿０１３４２７．２又はＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿００６１２５．２）の塩基番号１４６２とが融合した転写産物が存在していることを確認した。融合部の前後各４０塩基、合計８０塩基の配列を示す（図３）。またＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６に関しても、増幅産物が確認された１検体で、既に胃癌で報告されているＣＬＤＮ１８（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿００１００２０２６．２）の塩基番号８０３と、ＡＲＨＧＡＰ２６（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿０１５０７１．４又はＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿００１１３５６０８．１）の塩基番号１１４３とが融合した転写産物が存在していることを確認した。融合部の前後各４０塩基、合計８０塩基の配列を示す（図３）。以上から、これまで報告のある胃癌だけでなく、膵がんにおいても、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６／２６融合遺伝子が存在することを明らかにした。【００９９】
［参考例１］樹立細胞株におけるＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子の検出
国立がん研究センター研究所バイオマーカー探索部門にて樹立済みの胃癌細胞株ＮＳＣ−４７Ｃに加えて、胃癌細胞株ＨＳＣ−３９（国立がん研究センター研究所動物実験部門から譲受）、胃癌細胞株ＫＡＴＯ−ＩＩＩ（ＪＣＲＢ０６１１、ＪＣＲＢ細胞バンク）、及び国立がん研究センター研究所バイオマーカー探索部門にて樹立済みの胃癌細胞株ＮＳＣ−９Ｃの、合計４細胞株から調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡに対して、逆転写酵素を含むキットであるＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  （サーモフィッシャーサイエンティフィック社）及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（オリゴ（ｄＴ）２０プライマー；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、試薬の標準プロトコルに従って逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。【０１００】
次に、実施例１で使用した配列番号１２に示されるＣＬＤ−ＡＲＨ＿Ｃ６Ａ１２＿ｐａｒｔｉａｌ  ｆｗｄ０２及び配列番号１４に示されるＣＬＤ−ＡＲＨ＿Ｃ６Ａ１２＿ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｖ０２のプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ換算で２００ｎｇ）として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｃｃｕＰｒｉｍｅＴＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用してＰＣＲ（９４℃２分に続いて９４℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃１分を３０サイクル）を行った。ＰＣＲ反応後、２％アガロースゲル（ロンザ社）で電気泳動したところ、胃癌細胞株ＮＳＣ−４７Ｃでのみ予想分子量付近（５００ｂｐ程度）にＰＣＲ産物が確認された（図４）。一方、鋳型ｃＤＮＡの量が一定であることの確認は、配列番号１５に示されるＡＣＴＢ＿Ｆ２及び配列番号１６に示されるＡＣＴＢ＿Ｒ２のプライマーを用いて、上記と同じＤＮＡポリメラーゼを使用してＡＣＴＢ（β−アクチン）のＰＣＲ（９４℃２分に続いて９４℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃１分を２５サイクル）により行った。この結果より、胃癌細胞株ＮＳＣ−４７ＣはＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６を内在的に発現していることが示された。【０１０１】
［参考例２］ｓｉＲＮＡを用いたＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子発現胃癌細胞株でのＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合蛋白質発現抑制能評価と、同条件下での当該細胞株の生存能評価
参考例１に示した、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子を内在的に発現する胃癌細胞株ＮＳＣ−４７Ｃを、１０％ウシ胎児血清（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（和光純薬）で培養後、遺伝子導入試薬ＤｈａｒｍａＦＥＣＴＴＭ１（ＧＥヘルスケア社）の標準プロトコルに従って目的のｓｉＲＮＡの導入（「ｓｉＲＮＡ処理」とも称する）を行った。具体的には、上記胃癌細胞株を６ウェルプレート（１４０６７５、ヌンク社）に１ウェルあたり２×１０５細胞播種した後、ＣＬＤＮ１８を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓ２７６８８、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＡＲＨＧＡＰ２６を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓ２３０１３及びｓ２３０１５、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）及びコントロールｓｉＲＮＡ（ＡＭ４６１１、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を、７５ｐｍｏｌ（終濃度７５ｎＭ）となるようそれぞれ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で７２時間培養した。ＡＲＨＧＡＰ２６を標的とするｓｉＲＮＡのうち、ｓ２３０１３はその配列から野生型遺伝子及び当該融合遺伝子を標的とし、ｓ２３０１５はその配列から野生型遺伝子のみを標的とし当該融合遺伝子は標的としないことが期待される。またＣＬＤＮ１８を標的とするｓｉＲＮＡはその配列から野生型遺伝子及び当該融合遺伝子を標的とすることが期待される。以下、コントロールｓｉＲＮＡで処理した群をＣｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ群、ＣＬＤＮ１８を標的とするｓｉＲＮＡで処理した群をＣＬＤＮ１８  ｓｉＲＮＡ群、ＡＲＨＧＡＰ２６を標的とするｓｉＲＮＡのうちｓ２３０１３で処理した群をＡＲＨＧＡＰ２６  ｓｉＲＮＡ（Ｗｉｌｄ＆Ｆｕｓｉｏｎ）群、ｓ２３０１５で処理した群をＡＲＨＧＡＰ２６  ｓｉＲＮＡ（Ｗｉｌｄ）群、とそれぞれ称する。【０１０２】
ｓｉＲＮＡの導入によるＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合蛋白質の発現抑制は、ウェスタンブロッティング法により評価した。具体的には、培養後の細胞ペレットをＰＢＳで洗浄し、ＲｈｏＡ  Ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ＫｉｔＴＭ（サイトスケルトン社）に付属するＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  １２０μＬに溶解し、４℃、１００００ｘｇ、１分間遠心分離して、上清を回収した。この上清を蛋白質抽出液として用いた。この蛋白質抽出液の蛋白質濃度はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（マッハライ・ナーゲル社）により測定した。その後、ＡＲＨＧＡＰ２６の検出に際しては以下の実験を行った。具体的には、上記蛋白質抽出液を１レーンあたり２０μｇとなるようＮｏｖｅｘＴＭ  ＷｅｄｇｅＷｅｌｌＴＭ  ４−２０％  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｇｅｌ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）にローディングし、２２５Ｖの条件で２５分間、ゲル電気泳動を行った。Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）  ＴｕｒｂｏＴＭ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（バイオラッド社）を用いて標準プロトコルに従ってＰＶＤＦ膜（メルクミリポア社）へと転写した。転写後、ＥＣＬ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社）を５％含有したＰＢＳ（以下、ブロッキングバッファーと称する）により室温で２時間ブロッキングを行った上で、抗ＡＲＨＧＡＰ２６抗体（ＨＰＡ０３５１０７、シグマアルドリッチ社）をブロッキングバッファーにより１：５００の倍率で希釈した一次抗体溶液にメンブレンを振とうさせ、４℃にて一晩反応した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ２０（和光純薬）含有ＰＢＳ（以下、洗浄バッファーと称する）による洗浄後、ＨＲＰ標識抗ウサギ抗体（Ｐ０３９９、ダコ社）をブロッキングバッファーにより１：３０００の倍率で希釈した二次抗体溶液にメンブレンを振とうさせ、室温で１時間反応させた。洗浄バッファーによる洗浄後、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｐｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）をメンブレンに添加し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ  ＬＡＳ  ４０００  ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア社）を用いてメンブレン上の化学発光を検出した（ＡＲＨＧＡＰ２６の検出）。β−アクチン検出に際しては、ＡＲＨＧＡＰ２６を検出した後のメンブレンを１４ｍＬのＲｅｓｔｏｒｅＴＭ  ＰＬＵＳ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  （サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で室温で１５分間浸透させ、上記洗浄バッファーで洗浄したメンブレンを使用し、上記と同様の実験操作を施した。この時に使用した抗体は抗β−アクチン抗体（４９６７、セルシグナリングテクノロジー社）、希釈倍率は１：３０００とした。ウェスタンブロットの結果、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合蛋白質の発現が、ＣＬＤＮ１８  ｓｉＲＮＡ群及びＡＲＨＧＡＰ２６  ｓｉＲＮＡ（Ｗｉｌｄ＆Ｆｕｓｉｏｎ）群で抑制されていることを確認した（図５）。【０１０３】
次にＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子による癌細胞の生存能への影響を評価するため、上記と同様の条件で胃癌細胞株ＮＳＣ−４７ＣへのｓｉＲＮＡ処理を行った。２４時間後に１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地へと培地交換し、１ウェルあたり１０００細胞となるように９６ウェルプレート（１６７００８、ヌンク社）に１００μＬずつ各群それぞれ３ウェルに播種するとともに、コントロールとして細胞を播種せずに１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地のみを添加したウェルを用意した（以下、培地群と称する）。このプレートを合計３枚用意し、細胞播種当日に生細胞数を測定（ｄａｙ１と称する）すると共に、３７℃、５％ＣＯ２環境下で更に４８時間（ｄａｙ３と称する）、１２０時間（ｄａｙ６と称する）、それぞれ培養した。生細胞数は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）  ３Ｄ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（プロメガ社）の標準プロトコルに従い、ＳｙｎｅｒｇｙＴＭ  Ｈ１  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  （バイオテック社）を用いて測定パラメータを一定にして発光強度を測定した。各ｓｉＲＮＡ処理群の生存率は、各群の発光強度から培地群の発光強度を引いた値（以下、補正値と称する）を元に、ｄａｙ１の各ｓｉＲＮＡ処理群の補正値を１として算出した。誤差範囲は標準偏差を採用、有意差検定にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定（両側検定）を用い、ｐ＜０．０１の場合を有意差ありとした。【０１０４】
その結果、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子を内在的に発現する細胞株である胃癌細胞株ＮＳＣ−４７Ｃにおいて、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合蛋白質の発現を抑制することにより、細胞の生存能が有意に減弱することが判明した（図６）。従って、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子を内在的に発現する癌細胞における当該融合遺伝子の発現抑制は、癌細胞の増殖能を抑制させる、及び／又は生存能を減弱させることが明らかになった。【０１０５】
以上より、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６は腫瘍進展能に関与していることが明らかとなった。一方、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６についても、ＡＲＨＧＡＰ６はＡＲＨＧＡＰ２６と同じ機能（ＲｈｏＡのＧＴＰ加水分解活性の亢進）を有することが知られており、かつ、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６融合遺伝子を構成するＡＲＨＧＡＰ６由来配列部分には、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子を構成するＡＲＨＧＡＰ２６由来配列部分と同様に、ＧＴＰ加水分解活性の亢進機能を担うＲｈｏ−ＧＡＰドメインが保持されていることから、ＣＬＤＮ１８−ＡＲＨＧＡＰ６も腫瘍進展能に関与していることが予期される。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明の方法は、ＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はＣＬＤＮ１８遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法であり、薬剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法として有用であることが期待される。また、本発明のプライマーセット、プローブ、プローブセット及び検出用キットは、本発明の方法に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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