(57)【要約】  水溶性の中性ポリマーを表面に吸着させた酸化アルミニウムを担体として使用することで、少量の体液試料からセルフリーＤＮＡを効率よく回収することを可能とする。【選択図】なし
2018052011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液試料からセルフリーＤＮＡを回収する方法であって、以下の工程：
工程ａ）水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体と前記体液試料を混合し、前記担体にセルフリーＤＮＡを吸着させる工程、
工程ｂ）工程ａ）において混合した混合物から、前記セルフリーＤＮＡが吸着した担体を分離する工程、および
工程ｃ）工程ｂ）において分離した前記セルフリーＤＮＡが吸着した担体に溶出液を加えてセルフリーＤＮＡを回収する工程、
を含むセルフリーＤＮＡの回収方法。
【請求項２】
前記体液試料が、全血、血清、血しょう、尿または唾液である請求項１に記載のセルフリーＤＮＡの回収方法。
【請求項３】
前記水溶性の中性ポリマーが、ｐＨ７の溶液中で−１０ｍＶ以上＋１０ｍＶ以下のゼータ電位を有するポリマーである請求項１または２に記載のセルフリーＤＮＡの回収方法。
【請求項４】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）又はヒドロキシプロピルメチルセルロースである請求項１から３に記載のセルフリーＤＮＡの回収方法。
【請求項５】
前記溶出液が緩衝液である請求項１から４のいずれかに記載のセルフリーＤＮＡの回収方法。
【請求項６】
前記体液試料を、タンパク質変性剤で処理する請求項１から５のいずれかに記載のセルフリーＤＮＡの回収方法。
【請求項７】
前記タンパク質変性剤が、カオトロピック塩またはタンパク質変性酵素である請求項６に記載のセルフリーＤＮＡの回収方法。
【請求項８】
セルフリーＤＮＡの遺伝子配列を解析し、がんに特異的な遺伝子変異を検出する方法であって、請求項１〜７のいずれかに記載のセルフリーＤＮＡの回収方法を用いて被験者の体液試料からセルフリーＤＮＡを回収する工程、および当該回収したセルフリーＤＮＡからがんに特異的な遺伝子変異を検出する工程、を含む遺伝子変異の検出方法。
【請求項９】
被験者由来のセルフリーＤＮＡ量と、がんに罹患していない検体由来のセルフリーＤＮＡ量を比較することによってがんを検出方法であって、請求項１〜７のいずれかに記載のセルフリーＤＮＡの回収方法を用いて被験者およびがんに罹患していない検体の体液試料からセルフリーＤＮＡを回収する工程、および当該回収した被験者由来のセルフリーＤＮＡ量と、がんに罹患していない検体由来のセルフリーＤＮＡ量を比較してがんを検出する工程、を含むがんの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルフリーＤＮＡを回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を用いた実験技術の発展により新規遺伝子探索やその解析が可能となった。がんなどの疾患を特定するためにヒトのゲノムが解析され、病原体の感染を特定するためにそれらのゲノムが解析されるなど、医療現場においても遺伝子解析を利用したスクリーニング検査や臨床検査などが行われている。【０００３】
近年では核酸の中でも特にセルフリーＤＮＡが注目され、腫瘍由来のセルフリーＤＮＡに存在するがん特有の遺伝子変異を解析することで治療薬に対する効果の有無を判定するなどの、臨床に直結する研究が盛んに行われている。【０００４】
例えば、ＥＧＦＲ遺伝子変異が検出された肺がん患者にはエルロチニブ、ＢＲＡＦ遺伝子変異が検出された皮膚がん患者にはベムラフェニブ、ＢＲＣＡ遺伝子変異が検出された卵巣がん患者にはルカパリブ、といった治療薬が承認されている。また、これらの遺伝子変異に対する標的治療薬効果はがんの種類を超えて共通であることが知られており、例えば、ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００変異に対する治療薬ダラフェニブは皮膚がん及び非小細胞肺がんの患者の両方に推奨される。【０００５】
しかしながら、これまでがん特有の遺伝子を得るためには、手術切除したがん組織から遺伝子を回収することが一般的であった。切除組織の入手は患者への侵襲性が高く、多様ながん組織のどの部位を採取するかにより結果が異なってしまう問題があること、また手術前の治療には適さないこと、などの問題があった。近年、体液中に存在するセルフリーＤＮＡにもがん特異的な遺伝子変異が存在しうることが報告され、がん組織を切除せずに遺伝子変異を検出することが切望されている。【０００６】
また、がんに罹患すると、がん細胞からセルフリーＤＮＡが血中へ放出されるため、がん患者はがんに罹患していない者と比較し血中により多量なセルフリーＤＮＡを含有するとされる（特許文献７）。従って、セルフリーＤＮＡの量を正確に測定することができれば、体液試料を用いて低侵襲的に簡便にがんの検出が可能になる。特許文献７には、シリカゲルメンブランで回収したセルフリーＤＮＡの量を基にがんを検出する方法が記載されている。【０００７】
しかしながら、体液中に存在するセルフリーＤＮＡは少量であるうえ、セルフリーＤＮＡ配列上に存在するがん特有の変異点を解析するためには、セルフリーＤＮＡの中でも、血中の総ＤＮＡにおけるアレル頻度が０．１％〜数％程度しかない腫瘍細胞由来のｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）と呼ばれるセルフリーＤＮＡを検出する必要があり、高い収率でセルフリーＤＮＡを回収する技術が必要となる。【０００８】
現在、一般的に行われている核酸の回収方法としては、フェノール・クロロホルム抽出法、エタノール沈殿法及びシリカへの核酸吸着法などが代表的な方法として挙げられる。中でも最も汎用的な方法は、特許文献１に記載されている、シリカを含む金属酸化物へ核酸を吸着、溶出させて回収するＢｏｏｍ法である。この方法は、遠心操作により核酸の吸着したシリカから核酸を回収すると同時に核酸の濃縮ができる特徴がある。【０００９】
特許文献２にはＢｏｏｍ法をもとに、シリカに対してセルフリーＤＮＡを吸着させる技術が記載されている。これによると、フェノール・クロロホルム抽出を酸性条件化で行えば、ＲＮＡは水相に、ＤＮＡはクロロホルム相に分離され、中性条件で行えば、水相にＲＮＡとＤＮＡが分配される。つまり、抽出溶液の条件を変えることで取得したい核酸を選択的に抽出できるとしている。【００１０】
しかしながら、これら特許文献１、特許文献２に記載の方法では、核酸の吸着過程においてアルコールなどの有機溶媒の使用が不可欠であるため、溶媒廃棄の問題があり、回収操作も煩雑である。加えて、単離した核酸にこれら有機溶媒が混入し、その後の検出反応へ影響する問題もある。【００１１】
また、特許文献３には、３００塩基対以上１０００塩基対以下の塩基長を持つ核酸のシリカに対する吸着性は、それより短い塩基長を有する核酸の吸着性に劣ることが記載されており、さらに短いセルフリーＤＮＡを回収するにあたって、シリカを用いた方法は不向きであることも予想される。【００１２】
特許文献４及び５には、セルフリーＤＮＡに関する記載はないが、有機溶媒を利用しない核酸の回収方法が記載されている。特許文献４には、アルファ酸化アルミニウム粒子、ジルコニア粒子、チタニア粒子などに、核酸を吸着させ、効率的に回収する方法が記載されている。また、特許文献５には、イオン交換クロマトグラフィーの原理を用いて、核酸を吸着させ、回収する方法が記載されており、陰イオン交換材料として酸化アルミニウムが利用できると示されている。【００１３】
特許文献６には、核酸を溶解させる溶液に依存して、アルファ酸化アルミニウム、及びガンマ酸化アルミニウムに核酸を強固に結合させたり、逆に結合を阻止させたりすることができると記載されている。また、結合した核酸は、繰り返し洗浄しても、ほとんど溶出されないと記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５２３４８０９号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１６／００７７５５号
【特許文献３】特表２０１１−５２２５２９号公報
【特許文献４】国際公開第９２／１８５１４号
【特許文献５】特表２０１３−５０５７１９号公報
【特許文献６】特表２００５−５０５２６９号公報
【特許文献７】国際公開第２０１５／１１４６４１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、セルフリーＤＮＡを高い収率で回収するために、酸化アルミニウムを用いたセルフリーＤＮＡの回収方法を検討した。回収方法の検討にあたって、上記の特許文献４、５に記載の酸化アルミニウムを用いた核酸の回収方法によって、セルフリーＤＮＡの回収が可能であるかを検討した。しかし、後述する比較例１のとおり、これらの方法では、セルフリーＤＮＡを回収することができなかった。【００１６】
本発明は、酸化アルミニウムを用いてセルフリーＤＮＡを高い収率で回収する方法を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、酸化アルミニウムの表面に水溶性の中性ポリマーを吸着させることで、セルフリーＤＮＡを効率的に回収できることを見出した。【００１８】
本発明の構成は、以下（１）〜（９）である。
（１）体液試料からセルフリーＤＮＡを回収する方法であって、以下の工程：
工程ａ）水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体と前記体液試料を混合し、前記担体にセルフリーＤＮＡを吸着させる工程、
工程ｂ）工程ａ）において混合した混合物から、前記セルフリーＤＮＡが吸着した担体を分離する工程、および
工程ｃ）工程ｂ）において分離した前記セルフリーＤＮＡが吸着した担体に溶出液を加えてセルフリーＤＮＡを回収する工程、
を含むセルフリーＤＮＡの回収方法。
（２）前記体液試料が、全血、血清、血しょう、尿、または唾液である（１）に記載のセルフリーＤＮＡの回収方法。
（３）前記水溶性の中性ポリマーが、ｐＨ７の溶液中で−１０ｍＶ以上＋１０ｍＶ以下のゼータ電位を有するポリマーである（１）または（２）に記載のセルフリーＤＮＡの回収方法。
（４）前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）又はヒドロキシプロピルメチルセルロースである（１）から（３）のいずれかに記載のセルフリーＤＮＡの回収方法。
（５）前記溶出液が、緩衝液である（１）から（４）のいずれかに記載のセルフリーＤＮＡの回収方法。
（６）前記体液試料を、タンパク質変性剤で処理する（１）から（５）のいずれかに記載のセルフリーＤＮＡの回収方法。
（７）前記タンパク質変性剤が、カオトロピック塩またはタンパク質変性酵素である（６）に記載のセルフリーＤＮＡの回収方法。
（８）セルフリーＤＮＡの遺伝子配列を解析し、がんに特異的な遺伝子変異を検出する方法であって、（１）〜（７）のいずれかに記載のセルフリーＤＮＡの回収方法を用いて被験者の体液試料からセルフリーＤＮＡを回収する工程、および当該回収したセルフリーＤＮＡからがんに特異的な遺伝子変異を検出する工程、を含む遺伝子変異の検出方法。
（９）被験者由来のセルフリーＤＮＡ量と、がんに罹患していない検体由来のセルフリーＤＮＡ量を比較することによってがんを検出方法であって、（１）〜（７）のいずれかに記載のセルフリーＤＮＡの回収方法を用いて被験者およびがんに罹患していない検体の体液試料からセルフリーＤＮＡを回収する工程、および当該回収した被験者由来のセルフリーＤＮＡ量と、がんに罹患していない検体由来のセルフリーＤＮＡ量を比較してがんを検出する工程、を含むがんの検出方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のセルフリーＤＮＡの回収方法により、少量の試料から、簡便な方法でセルフリーＤＮＡを高収率に回収することが可能になる。また、本発明の回収方法によれば、セルフリーＤＮＡを高い収率で回収できるので、がんに特異的な遺伝子変異の検出感度や、がんの検出感度が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明のセルフリーＤＮＡ回収方法によって回収したセルフリーＤＮＡと市販セルフリーＤＮＡ回収キットで回収したセルフリーＤＮＡの電気泳動図
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のセルフリーＤＮＡの回収方法で回収するセルフリーＤＮＡは、体液中に漏出した正常細胞由来のｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｎｏｒｍａｌ  ＤＮＡおよび腫瘍細胞由来のｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の総称であり、本明細書ではセルフリーＤＮＡと記載する。
【００２２】
セルフリーＤＮＡの塩基長は、一般的にヒストン１単位に相当する１６６ｂｐ程度であるが、がんや、寄生虫に寄生された患者では、特徴的な塩基長のセルフリーＤＮＡが検出される場合がある。例えば、がん患者の検体には、ヒストン１単位まで分解が進まず、１６６ｂｐの単位が数個つながった３３２ｂｐ（１６６ｂｐ×２）、４９８ｂｐ（１６６ｂｐ×３）、６６４ｂｐ（１６６ｂｐ×４）などの塩基長のセルフリーＤＮＡも含まれている。また、熱帯熱マラリア原虫に寄生された患者の場合、血清中の２０５ｂｐなどの塩基長のセルフリーＤＮＡが、リューシュマニアに寄生された患者の場合は尿中に７０ｂｐなどの塩基長のセルフリーＤＮＡを漏出することが知られている（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、Ｍａｙ  ２０１６，Ｖｏ．３２，Ｎｏ．５）。
【００２３】
本発明で回収するセルフリーＤＮＡの塩基長は特に限定されないが、本発明の方法を用いると５００ｂｐ以下のセルフリーＤＮＡを効率よく回収することができる。
【００２４】
本発明で用いる体液試料は、セルフリーＤＮＡを含む任意の体液試料であれば特に限定されないが、例えば、全血、血しょう、血清、尿、唾液などを利用することができ、好ましくは、血しょうまたは血清である。
【００２５】
体液試料は、未処理のまま用いることもできるが、より収率よくセルフリーＤＮＡを回収するために、タンパク質変性剤を用いて処理したものを用いることもできる。
【００２６】
本発明で用いるタンパク質変性剤は特に限定されないが、例えば、ＳＤＳ、サルコシル、ＣＴＡＢなどの界面活性剤、セリンプロテアーゼの一種であり広い切断特異性をもつＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫなどのタンパク質変性酵素、塩化グアニジニウム、グアニジンチオシアン酸塩、及び尿素などのカオトロピック塩、その他メルカプトエタノールなどを好ましく用いることができる。また、タンパク質変性剤が含まれる市販の緩衝液も好ましく用いることができ、例えば、グアジニンチオシアン酸塩などを含むＲＬＴバッファー（キアゲン株式会社製）は、カオトロピック塩のタンパク質変性剤として好ましく用いることができる。これらのタンパク質変性剤の中でも、特にカオトロピック塩もしくはタンパク質変性酵素が好ましい。
【００２７】
また、タンパク質変性剤は、１種類だけ用いてもよいし、複数種類組み合わせて用いてもよい。タンパク質変性剤の組み合わせとしては、以下のような処理が挙げられる。例えば、体液試料に対して、１％のＳＤＳを添加した後、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加え６０℃２０ｍｉｎ加温することができる。また、体液試料に対して、４Ｍ以上の塩化グアニジニウム、グアニジンチオシアン酸塩、または尿素を添加した後、サルコシルを終濃度０．５％以上になるように、またはメルカプトエタノールを終濃度５０ｍＭ以上の濃度になるよう加えることができる。
【００２８】
また、上記の操作において、体液試料に含まれるセルフリーＤＮＡの分解を抑制するために、核酸を分解する酵素の阻害剤を添加してもよい。酵素の阻害剤は、例えばＥＤＴＡを体液試料に対し、終濃度１ｍＭ以下の濃度で添加することができる。また、ＲＮＡ分解酵素の阻害剤として市販されている“ＲＮａｓｉｎ”（登録商標）  Ｐｌｕｓ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（プロメガ株式会社）、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ株式会社）、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡株式会社）などを使用することができる。
【００２９】
本発明において体液試料は必要に応じて希釈してもよい。希釈する溶液は特に限定されないが、水やＴｒｉｓ−塩酸緩衝液などの核酸を含む溶液に汎用される溶液を使用することが好ましい。また、上記に挙げたタンパク質変性剤を含む溶液を用いてもよい。タンパク質変性剤を含む溶液で希釈する場合には、例えば、４Ｍ以上の塩化グアニジニウム、グアニジンチオシアン酸塩または尿素で希釈することができる。
【００３０】
本発明は、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体を用いることで、高収率なセルフリーＤＮＡの回収が達成される。本発明において、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体とは、水溶性の中性ポリマーが、粒状の酸化アルミニウムの周りに吸着した担体である。以後、本発明の担体と記載する。
【００３１】
本発明において、担体にセルフリーＤＮＡを吸着させるとは、可逆的に脱離可能となる吸着を指す。
【００３２】
セルフリーＤＮＡを定量する際の核酸量の定量の方法としては、吸光度測定、蛍光測定、発光測定、電気泳動、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイを使用した解析、シーケンサーを使った解析などが挙げられる。具体的には、吸光度測定による定量方法は、非修飾の核酸であれば、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することで核酸量を定量することができる。蛍光測定による定量方法は、核酸に蛍光色素で修飾し、その蛍光色素に由来する蛍光強度を、濃度既知の溶液における蛍光強度と比較することで核酸量を定量できる。電気泳動による定量方法は、濃度既知のサンプルと同時に回収操作を行ったサンプルを泳動し、ゲルを染色してバンドの濃度を画像解析により比較することで決定することができる。
【００３３】
ＰＣＲは、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎの略でＤＮＡサンプルの中から、特定の配列を選択的に増幅させることができる。ＰＣＲでは核酸の増幅反応終了後、その産物量から核酸の初期濃度を求めることができる。
【００３４】
リアルタイムＰＣＲは、定量的リアルタイムＰＣＲとも呼ばれ、ＰＣＲによる増幅を継時的に測定することで増幅率に基づいて鋳型となるＤＮＡの相対定量を行うことができる。また、標準サンプルを用いて、増幅率の検量線を作成すれば、絶対量を定量することもできる。増幅率は、増幅サイクル数（Ｃｑ値）として算出され、値が小さいほど、核酸量が多いことを示している。
【００３５】
デジタルＰＣＲでは、ＤＮＡサンプルを微細な仕切りの中に分配しＰＣＲ反応を行い、各分画ごとのＰＣＲ反応後のシグナル量から、核酸量を定量することができる。
【００３６】
また、リアルタイムＰＣＲでは、適切にプライマーを設計することで、回収したセルフリーＤＮＡの塩基長も検出することができる。例えば、ハウスキーピング遺伝子として知られるアクチン−βの任意の配列を増幅することでセルフリーＤＮＡの塩基長を検出することができる。たとえば、１６６ｂｐのセルフリーＤＮＡを回収したことを確認するためには、アクチン−β遺伝子のうち１００ｂｐ前後を増幅させるプライマーを使用することができる（Ｗ．ＳＵＮら、Ｔｈｅｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅＤＮＡ  ｄｅｔeｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．ＯＮＣＯＬＯＧＹ  ＲＥＰＯＲＴＳ  ３１：１４６６−１４７２，２０１４）。具体的には、アクチン−β遺伝子のうち９３ｂｐの塩基長を増幅させることができる配列番号１および２のプライマーを用いて、回収したセルフリーＤＮＡを検出することができる。
【００３７】
リアルタイムＰＣＲでは、一般的に、増幅サイクル数（Ｃｑ値）が４０以上は、検出限界以下とされている。
【００３８】
本発明で用いるポリマーは、基本単位である単量体やモノマーと呼ばれる繰り返し単位が多数繋がった化合物の総称である。上記ポリマーには、１種類の単量体からなるホモポリマーと２種類以上の単量体からなるコポリマーのいずれもが含まれ、任意の重合度のポリマーを用いることができる。また、上記ポリマーには、天然ポリマーと合成ポリマーのいずれもが含まれる。
【００３９】
本発明で用いる水溶性の中性ポリマーは、水に対して溶解可能な性質を有し、水に対する溶解度が、少なくとも０．０００１ｗｔ％以上のポリマーであり、好ましくは、０．００１ｗｔ％以上、より好ましくは０．０１ｗｔ％以上、さらに好ましくは０．１ｗｔ％以上である。
【００４０】
本発明で用いる水溶性の中性ポリマーは、好ましくは、ｐＨ７の溶液中でゼータ電位が−１０ｍＶ以上＋１０ｍＶ以下のポリマーである。より好ましくは−８ｍＶ以上＋８ｍＶ以下であり、さらに好ましくは−６ｍＶ以上＋６ｍＶ以下、特に好ましくは−４．０ｍＶ以上＋１．１ｍＶ以下のポリマーである。
【００４１】
ゼータ電位とは、溶液中におけるコロイドの界面の電気的性質を表す値の１つである。荷電したコロイドが溶液に分散していると、コロイドの表面ではコロイドの表面荷電に対する対イオンにより電気二重層が形成されている。このときのコロイド表面の電位を表面電位と呼ぶ。電気二重層は、コロイドの表面電荷の静電相互作用により形成されているため、コロイド側ほどイオンが強く固定されている。電気二重層の中でも静電相互作用により対イオンがコロイド表面に強く固定されている層を固定層、固定層の電位を固定電位と呼ぶ。溶液に対してコロイドを移動させると固定層はコロイドと共に移動する。このとき、コロイドから見て固定層よりも外側に、溶液が持つ粘性のためにコロイドと共に移動する境界面がある。これを、すべり面、または、ずり面と呼ぶ。コロイドから充分に離れた地点の電位をゼロ点としたときの、このすべり面の電位はゼータ電位と定義されている。このように、ゼータ電位はコロイドの表面電荷に依存して変化し、表面電荷はｐＨに依存するプロトンの着脱によって変化するため、本発明ではｐＨ７の溶液中での値を基準とする。また、一般にコロイドのサイズと比べてすべり面までの距離は小さいので、コロイドの表面をすべり面と近似的に表現することもできる。本発明で用いる水溶性の中性ポリマーの場合も同様に、溶液中に分散したコロイドの表面電位をゼータ電位とみなすことができる。
【００４２】
本発明において、ゼータ電位の測定は大塚電子株式会社のＥＬＳ−Ｚを用いたレーザー・ドップラー電気泳動法を用いて測定する。レーザー・ドップラー電気泳動法は、光や音波が電気泳動により運動している物体に当たり、散乱あるいは反射するとその周波数が変化するドップラー効果を利用した測定方法である。
【００４３】
ポリマーのゼータ電位を測定する場合には、コロイド分散溶液としてポリマー溶液を調製し、ゼータ電位を測定することができる。ポリマーを例えば、リン酸緩衝液や、塩化ナトリウム溶液、クエン酸緩衝液などの電解質に溶解させてポリマー溶液を調製し、溶液中に分散したポリマーの散乱光や、反射光を検出して測定を行う。コロイドのサイズが大きいほど、低い濃度で散乱光や反射光を検出することが可能となる。
【００４４】
ポリマーのゼータ電位をレーザー・ドップラー法で測定する具体的な条件は特に限定されないが、例えば、ポリマーの濃度を１ｗｔ％以上１０ｗｔ％以下となるようにリン酸緩衝液（１０ｍＭ，  ｐＨ７）に溶解し、この溶液を測定用セルに入れて、レーザー・ドップラー電気泳動法を原理とするゼータ電位測定装置に設置して室温で測定することができる。
【００４５】
本発明で用いる水溶性の中性ポリマーとしては、具体的には、以下のものが挙げられる。例えば、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンなどのポリビニル系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）又はポリ（Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミドなどのポリアクリルアミド系ポリマー、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリテトラメチレンエーテルグリコールなどのポリアルキレングリコール系のポリマー、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、（ヒドロキシプロピル）メチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、２−ヒドロキシエチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロースなどを用いることができる。また、上記のポリマーが含まれる共重合体も用いることができる。
【００４６】
また、フィコール、アガロース、キチン及びデキストランなどのポリサッカライド又はポリサッカライド類縁体並びにアルブミンなどのタンパク質やペプチドも本発明の水溶性の中性ポリマーに含まれる。
【００４７】
水溶性の中性ポリマーの官能基の一部をイオン化させたり、陽性や陰性を示す官能基に置換したり、側鎖にアセチル基など水溶性を発現する官能基を導入してもよい。
【００４８】
本発明において、水溶性の中性ポリマーの分子量としては、例えば、０．４ｋＤ以上のポリマーを好ましく用いることができ、より好ましくは６ｋＤ以上である。
【００４９】
本発明で用いる酸化アルミニウムは、Ａｌ２Ｏ３の組成式で表される両性酸化物であり、アルミナとも呼ばれる。
【００５０】
酸化アルミニウムは、天然に産出するものを用いてもよいし、工業的に作製したものを用いてもよい。酸化アルミニウムを作製する方法としては、例えば、ギブサイトを出発原料とするバイヤー法、アルコキシド法、中和法若しくはオイルドロップレット法等のベーマイト形態の水酸化物を経由する方法（ゾルーゲル法とも呼ばれる）、アルミニウム塩熱分解法または陽極酸化法などが挙げられる。
【００５１】
工業的に作製した酸化アルミニウムは、試薬メーカーや、触媒化学メーカー、一般社団法人触媒学会の参照触媒部会などから入手することができる。
【００５２】
酸化アルミニウムは、それらが持つ結晶構造によって、アルファ酸化アルミニウム、ロー酸化アルミニウム、カイ酸化アルミニウム、カッパ酸化アルミニウム、イータ酸化アルミニウム、ガンマ酸化アルミニウム、デルタ酸化アルミニウム、シータ酸化アルミニウムなどに分類される。本発明では、高比表面積を持つガンマ酸化アルミニウムが好ましい。
【００５３】
さらに酸化アルミニウムは、作製時の焼成温度に応じて、酸点（Ａｌ＋、Ａｌ−ＯＨ２＋）と塩基点（Ａｌ−Ｏ−）が変化する。酸化アルミニウムはこの酸点と塩基点の数に応じて、酸点が多ければ酸性アルミナ、塩基点が多ければ塩基性アルミナ、酸点と塩基点が同程度の中性アルミナとなる。この特性の違いは、ｐＨ指示薬であるＢＴＢ溶液を添加することで確認できる。ＢＴＢ溶液を加えて、酸化アルミニウムが黄色に呈色すれば酸性アルミナ、緑色に呈色すれば中性アルミナ、青色に呈色すれば塩基性アルミナであることが確認できる。このような特性上の違いがあるが、本発明においては、いずれの酸化アルミニウムも使用することができる。
【００５４】
本発明で用いる酸化アルミニウムは、粒状のものがよい。粒径はそろっていても、異なる粒径を混合して利用してもよい。粒径は、例えば、２１２μｍ未満の酸化アルミニウムを好ましく用いることができ、より好ましくは１００μｍ未満の酸化アルミニウムを用いることができる。
【００５５】
粒径は、本発明では日本工業規格に規格するＪＩＳ  Ｚ−８８０１−１：２００６に基づいたふるい目開きの寸法で定義する。例えば、上記ＪＩＳ標準による目開きにして４０μｍのふるいを通過し、３２μｍのふるいを通過できない粒子は、３２μｍ以上４０μｍ未満の粒径となる。
【００５６】
本発明で用いる溶出液は、本発明の担体に吸着したセルフリーＤＮＡを溶出させることができれば、特に限定されないが、緩衝液が好ましく、緩衝液にはキレート剤が含まれていてもよい。具体的には、クエン酸とクエン酸ナトリウムを含むクエン酸緩衝液、リン酸とリン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液や、トリスヒドロキシアミノメタンと塩酸を含むＴｒｉｓ−塩酸緩衝液にＥＤＴＡを添加したＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液などが挙げられる。
【００５７】
緩衝液のｐＨは、ｐＨ４以上ｐＨ９以下が好ましく、より好ましくは、ｐＨ５以上ｐＨ８以下である。
【００５８】
本発明で用いる緩衝液は、以下のように調製できる。例えば、０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）の調製は、以下のとおりである。０．５Ｍのリン酸水素二ナトリウム水溶液と０．５Ｍのリン酸二水素ナトリウムを調製する。０．５Ｍのリン酸水素二ナトリウム水溶液に対し、ｐＨを測定しながらリン酸二水素ナトリウム溶液を添加し、ｐＨ７となったところで添加を止める。同様の方法で、他のｐＨの緩衝液も調製することができる。
【００５９】
緩衝液に含まれるキレート剤は、複数の配位座を持つ配位子を持っており、金属イオンへ結合し、錯体を形成する物質を用いることができる。
【００６０】
具体的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ポリリン酸、メタリン酸及び／又は及びそれらの塩などが挙げられる。キレート剤の終濃度は特に限定されないが、５０ｍＭ以上であればよく、好ましくは１００ｍＭ以上、さらに好ましくは５００ｍＭ以上である。
【００６１】
また、上記以外のキレート剤となる化合物として、陰イオン性のポリマーを挙げることができる。カルボン酸を側鎖に持つポリマーは金属イオンを配位するため、これらが緩衝液に含まれていてもよい。このような機能を有するポリマーとして、ポリビニルスルホン酸及び／又はそれらの塩が挙げられる。その終濃度は特に限定されないが、１ｗｔ％以上であればよく、好ましくは１０ｗｔ％以上である。
【００６２】
本発明は、体液試料からセルフリーＤＮＡを回収する方法であって、工程ａ）水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体と体液試料を混合し、担体にセルフリーＤＮＡを吸着させる工程、工程ｂ）工程ａ）において混合した混合物から、前記セルフリーＤＮＡが吸着した担体を分離する工程、工程ｃ）工程ｂ）において前記セルフリーＤＮＡが吸着した担体に溶出液を加えてセルフリーＤＮＡを回収する工程を含む。以下、それぞれの工程について詳細に説明する。
【００６３】
本発明で用いる担体は、酸化アルミニウムの表面に水溶性の中性ポリマーを吸着させることにより作製する。ポリマーによる表面の被覆率は、７％以上であればよく、４０％以上であることが好ましい。また、水溶性の中性ポリマーは均一の厚さで吸着していなくてもよい。
【００６４】
本発明において、ポリマーによる酸化アルミニウムの被覆率は、表面電位顕微鏡（別名ケルビンプローブフォース顕微鏡；ＫＦＭ）によって取得した電位分布図を解析することで算出する。表面電位顕微鏡は例えば、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ社のＤｉｇｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製のＮａｎｏＳｃｏｐｅ  Ｉｖａ  ＡＦＭ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ３１００  ステージＡＦＭシステムなどが利用できる。
【００６５】
表面電位顕微鏡から表面被覆率を算出するにあたり、測定の視野スケールは、０．５μｍ×１μｍの範囲で行う。表面被覆率の算出方法は、まず酸化アルミニウムの表面電位画像を取得し視野内の平均電位を求める。次に水溶性の中性ポリマーの表面電位画像を取得し視野内の平均電位を求める。そして、水溶性の中性ポリマーが吸着した酸化アルミニウムの表面電位画像を取得し視野内の平均電位を求める。酸化アルミニウムのみの被覆率を０％、水溶性の中性ポリマーのみの被覆率を１００％とし、水溶性の中性ポリマーが吸着した酸化アルミニウムの平均電位と水溶性の中性ポリマーの平均電位の比をとることで、水溶性の中性ポリマーが吸着した酸化アルミニウムの表面被覆率を算出する。表面被覆率を求めるにあたり、使用する視野内の平均電位は、本発明の単体の粒子をランダムに３つ選んで、それぞれの測定値の平均値を使用する。
【００６６】
また、表面被覆率を算出する際の画像解析ソフトとして、Ａｄｏｂｅ社のＰｈｏｔｏｓｈｏｐなどを使用することができる。この場合、画像解析にあたって、酸化アルミニウムの表面電位の平均値をスケール下端、水溶性の中性ポリマーの表面電位の平均値をスケール上端とし、下端の色を黒（８ｂｉｔ、ＲＧＢ値０）、上端の色を赤（Ｒ値２５５）、または緑（Ｇ値２５５）、または青（Ｂ値２５５）などに設定する。設定したスケールで水溶性の中性ポリマーが吸着した酸化アルミニウムの表面電位画像を表示し、Ｒ値、またはＧ値、またはＢ値のいずれかの値を２５５で割り、その比を表面被覆率とする。
【００６７】
水溶性の中性ポリマーを表面に吸着させる前段階として、予め酸化アルミニウムを水やエタノールなどの溶液で洗浄し、表面に吸着している不純物を除いておいてもよく、本洗浄操作を省略してもよい。
【００６８】
水溶性の中性ポリマーを酸化アルミニウムに吸着させる方法は、例えば、水溶性の中性ポリマーを溶解させてポリマー溶液を調製し、酸化アルミニウムに接触させる方法が挙げられる。具体的には、ポリマー溶液に酸化アルミニウムを浸漬させたり、ポリマー溶液を酸化アルミニウムに滴下したり、ポリマー溶液を酸化アルミニウムに塗布したり、ポリマー溶液を霧状にして酸化アルミニウムに吹き付けたりすることができる。
【００６９】
ポリマー溶液に、酸化アルミニウムを浸漬させる方法は特に限定されない。例えば、ピペッティング、転倒混合、スターラー、ミキサー、ボルテックス、ミルなどの分散機や超音波処理装置などで撹拌してもよい。
【００７０】
水溶性の中性ポリマー濃度は特に限定されないが、０．０１ｗｔ％以上が好ましく、より好ましくは、０．１ｗｔ％以上である。
【００７１】
攪拌する際の混合時間は、ポリマーと酸化アルミニウムが均一に混合されれば、特に混合時間は限定されないが、ボルテックスの場合１分以上、好ましくは５分以上撹拌することが好ましい。
【００７２】
また、ふるいや、ざるなどを用いてディップコートすることもできる。溶液に浸す際の混合時間は、０．１ｗｔ％以上のポリマー濃度であれば５分以上であればよく、３０分以上であることが好ましい。
【００７３】
ポリマー溶液を滴下する場合には、スポイト、滴下漏斗、などを用いることができる。ポリマー溶液を滴下する際には、酸化アルミニウムを振動させたり、回転させたりしてもよく、スピンコーターなどを用いてもよい。
【００７４】
ポリマー溶液を塗布する場合には、刷毛、ローラー、ワイヤーバーを用いることができる。
【００７５】
ポリマー溶液を霧状にして吹き付ける場合には、エアースプレーやエアブラシなどを用いることができる。
【００７６】
上記に例示した方法で、酸化アルミニウムに水溶性の中性ポリマーを吸着させた後は、余分なポリマー溶液を遠心分離などによって取り除いてもよいし、取り除かずにそのままセルフリーＤＮＡの回収に用いてもよい。また、ポリマー溶液を溶媒に溶解させている場合、酸化アルミニウムに水溶性の中性ポリマーを吸着させた後、乾燥させて溶媒を取り除いてもよいし、乾燥させずに、セルフリーＤＮＡの回収に用いてもよい。
【００７７】
得られた本発明の担体は、作製して保存しておいたものを使用してもよく、用時調製して使用してもよい。
【００７８】
ポリマー溶液は、入手したポリマーが固体であれば水や有機溶媒に溶解することで調製でき、溶液であれば希釈することで調製できる。ポリマーが溶解しにくい場合や、溶液の粘度が高く混合しにくい場合、加熱処理や超音波処理を行ってもよい。有機溶媒は、例えば、エタノール、アセトニトリル、メタノール、プロパノール、tert-ブタノール、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトン、エチレングリコール、グリセロールなど、水と双溶性のあるものを使用することが好ましい。また、水に溶解しにくい場合には、上記の有機溶媒を添加してもよい。
【００７９】
酸化アルミニウムと水溶性の中性ポリマーを、リンカー分子などによって共有結合させて作製した担体は、本発明の担体に該当しない。具体的なリンカー分子には、シランカップリング剤などが挙げられる。
【００８０】
以降、本発明を工程毎に説明する。
【００８１】
工程ａ）は、上記の作製方法によって作製した酸化アルミニウムの表面に水溶性の中性ポリマーが吸着した担体（本明細書中では、本発明の担体と記載する。）と、体液試料を混合し、本発明の担体にセルフリーＤＮＡを吸着させる工程である。本発明の担体と体液試料との混合方法は特に限定されないが、例えば、ピペッティングや転倒混合により行ってもよく、ミキサー、ボルテックスなどの装置を使用してもよい。混合時間は、特に限定されないが、５分程度であればよく、それ以上の時間混合してもよい。また、本発明の担体をカラムに充填し、体液試料を通過させてもよい。さらに、本発明の担体と体液試料を混合する際に、タンパク質変性剤を添加してもよい。タンパク質変性剤は、工程ａ）の前段階として、あらかじめ体液試料に添加しておくこともできる。
【００８２】
工程ｂ）は、工程ａ）において混合した混合物から、前記セルフリーＤＮＡが吸着した担体を分離する工程である。分離の方法としては、工程ａ）で得られる混合物を遠心分離し、セルフリーＤＮＡが吸着した担体を沈殿させ、上清を除く方法が挙げられる。セルフリーＤＮＡが吸着した担体の比重は水より大きいため、遠心操作により容易に沈殿させることができる。遠心分離の条件は、６０００Ｇで１分間処理すればよく、１００００Ｇで１分間処理することがより好ましい。他の分離方法としては、限外ろ過膜を用いる方法が挙げられる。セルフリーＤＮＡが吸着した担体の粒径より小さな孔径を持つ限外ろ過膜に対し、工程ａ）で得られた混合物を通過させ、担体を分離する。このような限外ろ過膜はキット化されており、メルク株式会社のウルトラフリー（登録商標）やＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのナノセップ（登録商標）に代表される遠心ろ過キットを入手して利用することができる。
【００８３】
また、工程ｂ）の操作の後に、必要に応じて以下のような処理をしてもよい。これは、本発明の担体の表面に目的となるセルフリーＤＮＡ以外の生物学的試料由来物が吸着している可能性があるためである。例えば、より高純度にセルフリーＤＮＡを単離するため、洗浄や分解の処理を行うことができる。具体的には、非特異的に吸着した化合物を除去するために水で洗浄する、非特異的に吸着したタンパク質を除去するために界面活性剤で洗浄する、イオンや低分子化合物を除去するために界面活性剤を含む溶液で洗浄する、非特異的に吸着した疎水性化合物を除去するために有機溶媒で洗浄する、非特異的に吸着したタンパク質を分解するためにタンパク質分解酵素を添加する、ＤＮＡのみを単離するためにＲＮＡ分解酵素を添加する及びＲＮＡのみを単離するためにＤＮＡ分解酵素を添加する、などの様々な処理をすることができる。
【００８４】
工程ｃ）は、工程ｂ）において分離した前記セルフリーＤＮＡが吸着した担体に溶出液を加えてセルフリーＤＮＡを回収する工程である。セルフリーＤＮＡが吸着した担体に溶出液を加えて、吸着しているセルフリーＤＮＡを溶出液中に溶出させ、セルフリーＤＮＡを回収する工程である。
【００８５】
工程ｃ）において、本発明の担体と、セルフリーＤＮＡを溶出させた溶液を分離する方法としては、工程ｃ）において、セルフリーＤＮＡが吸着した担体に溶出液を加えて得られた混合物を遠心分離し、本発明の担体を沈殿させ、セルフリーＤＮＡが溶出している上清を取得する方法が挙げられる。本発明の担体の比重は水より大きいため、遠心操作により容易に沈殿させることができる。遠心分離の条件は、６０００Ｇで１分間処理すればよく、１００００Ｇで１分間処理することが好ましい。
【００８６】
他の分離方法としては、限外ろ過膜を用いる方法が挙げられる。本発明の担体の粒径より小さな孔径を持つ限外ろ過膜に対し、工程ｃ）において得られた混合物を通過させ、本発明の担体を分離する。このような限外ろ過膜はキット化されており、メルク株式会社のウルトラフリー（登録商標）やＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのナノセップ（登録商標）に代表される遠心ろ過キットを入手して利用することができる。
【００８７】
回収されたセルフリーＤＮＡは、必要に応じて、化学修飾を行うことができる。化学修飾には、セルフリーＤＮＡの末端に対する蛍光色素修飾、消光剤修飾、ビオチン修飾、アミノ化、カルボキシル化、マレインイミド化、スクシンイミド化、リン酸化及び脱リン酸化などが挙げられ、他にはインターカレーターによる染色が挙げられる。これらの修飾は化学反応により導入されてもよく、酵素反応により導入されてもよい。上記定量の前にこれらの修飾基を導入し、回収されたセルフリーＤＮＡ自身を定量するのではなく、化学修飾を経て導入された修飾基を定量することで、間接的にセルフリーＤＮＡを定量することができる。
【００８８】
本発明のセルフリーＤＮＡの回収方法を用いて回収したセルフリーＤＮＡを用いて、がんに特異的な遺伝子変異を検出したり、がんを検出したりすることができる。以降、これらの検出について説明する。
【００８９】
本発明のセルフリーＤＮＡの回収方法を用いて被験者の体液試料からセルフリーＤＮＡを回収し、セルフリーＤＮＡの遺伝子配列を解析して、がんに特異的な遺伝子変異を検出することができる。検出対象となるがんと、そのがんで変異が認められる遺伝子配列は、例えば“Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ”などのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｓｍｉｃ）に報告されているがんと、配列から選択することができる。具体的には、以下の遺伝子を例に挙げることができる。
【００９０】
肺がんで変異が認められる遺伝子として、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＴＭ、ＢＡＩ３、ＢＡＰ１、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ５、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＧＲＭ８、ＫＤＲ、ＫＥＡＰ１、ＫＩＴ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＲＡＳ、ＬＲＰ１Ｂ、ＭＤＭ２、ＭＥＴ、ＭＬＨ１、ＭＵＣ１６、ＭＹＣ、ＮＦ１、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＯＴＣＨ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＫＨＤ１、ＰＴＥＮ、ＲＡＲＢ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＯＸ２、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３などの遺伝子が挙げられる。
【００９１】
乳がんで変異が認められる遺伝子として、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＢＡＰ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＦＢ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＰ３００、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＳＲ１、ＥＸＯＣ２、ＥＸＴ２、ＦＢＸＯ３２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＧＡＴＡ３、ＩＲＡＫ４、ＩＴＣＨ、ＫＭＴ２Ｃ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＤＭ２、ＭＵＣ１６、ＭＹＣ、ＮＣＯＲ１、ＮＥＫ２、ＰＢＲＭ１、ＰＣＧＦ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＰＭ１Ｌ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＦＲ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＳＥＰＴ９、ＴＰ５３、ＴＲＡＦ５、ＷＥＥ１、ＺＢＥＤ４などの遺伝子が挙げられる。
【００９２】
大腸がんで変異が認められる遺伝子として、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＡＴＭ、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ２、ＢＡＸ、ＢＲＡＦ、ＣＡＳＰ８、ＣＤＣ２７、ＣＴＮＮＢ１、ＤＣＣ、ＤＭＤ、ＥＰ３００、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＦＺＤ３、ＧＰＣ６、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ７、ＭＩＥＲ３、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＹＯ１Ｂ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＰＮ１２、ＳＬＣ９Ａ９、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＴＣＥＲＧ１、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ５３、ＷＢＳＣＲ１７などの遺伝子が挙げられる。
【００９３】
骨髄増殖性腫瘍で変異が認められる遺伝子として、ＡＢＬ１、ＡＳＸＬ１、ＡＴＲＸ、ＢＣＯＲ、ＢＣＯＲＬ１、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＤＡＸＸ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＥＤ、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＦＬＴ３、ＧＡＴＡ１、ＧＮＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＫＺＦ１、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＡＴ６Ａ、ＫＩＴ、ＫＭＴ２Ａ、ＫＲＡＳ、ＭＰＬ、ＮＦ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＰＨＦ６、ＰＲＰＦ４０Ｂ、ＰＴＰＮ１１、ＲＡＤ２１、ＲＢ１、ＲＵＮＸ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＦ１、ＳＦ３Ａ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＨ２Ｂ３、ＳＭＣ１Ａ、ＳＭＣ３、ＳＴＡＧ２、ＳＵＺ１２、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＷＴ１、ＺＲＳＲ２などの遺伝子が挙げられる。
【００９４】
肝臓がんで変異が認められる遺伝子として、ＡＬＢ、ＡＭＰＨ、ＡＰＣ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ２、ＡＴＭ、ＡＸＩＮ１、ＢＡＺ２Ｂ、ＢＲＡＦ、ＣＣＤＣ１７８、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＳＭＤ３、ＣＴＮＮＢ１、ＤＳＥ、ＥＬＭＯ１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＲＦＩ１、ＧＸＹＬＴ１、ＨＮＦ１Ａ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＧＳＦ１０、ＫＥＡＰ１、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＯＴＯＰ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＡＭＤ９Ｌ、ＴＰ５３、ＵＢＲ３、ＵＳＰ２５、ＷＷＰ１、ＺＩＣ３、ＺＮＦ２２６などの遺伝子が挙げられる。
【００９５】
卵巣がんで変異が認められる遺伝子として、ＡＫＴ１、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＬＣ、ＣＣＮＥ１、ＣＤＫ１２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＳＭＤ３、ＣＴＮＮＢ１、ＣＵＢＮ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＡＴ３、ＧＡＢＲＡ６、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＫＲＥＭＥＮ１、ＭＡＳ１Ｌ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＮＦ１、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＵＳＰ１６などの遺伝子が挙げられる。
【００９６】
前立腺がんで変異が認められる遺伝子として、ＡＫＡＰ９、ＡＰＣ、ＡＲ、ＣＤＫ１２、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＧＬＩ１、ＩＫＺＦ４、ＫＤＭ４Ｂ、ＫＬＦ６、ＫＭＴ２Ｄ、ＭＥＤ１２、ＭＹＣ、ＮＣＯＡ２、ＮＩＰＡ２、ＮＫＸ３−１、ＮＲＣＡＭ、ＯＲ５Ｌ１、ＰＤＺＲＮ３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＳＣＮ１１Ａ、ＳＰＯＰ、ＳＹＮＥ３、ＴＢＸ２０、ＴＦＧ、ＴＨＳＤ７Ｂ、ＴＰ５３、ＺＦＨＸ３、ＺＮＦ４７３、ＺＮＦ５９５などの遺伝子が挙げられる。
【００９７】
胃がんで変異が認められる遺伝子として、ＡＰＣ、ＡＴＰ４Ａ、ＢＡＩ３、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＣＤＨ１、ＣＴＮＮＢ１、ＤＣＣ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＰＲ７８、ＬＰＡＲ２、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＲＫＤＣ、ＲＥＴ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＰＥＧ、ＳＳＴＲ１、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＯ、ＴＲＲＡＰ、ＷＮＫ２などの遺伝子が挙げられる。
【００９８】
これら遺伝子変異の検出方法として、既存の核酸検出方法を用いることができる。具体的には、対象となる遺伝子変異を選択し、対象となる遺伝子の遺伝子変異を特異的に検出できるプライマーまたはプローブを用いてＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、シーケンサー、マイクロアレイなどの核酸検出装置を用いて検出する。遺伝子変異の有無は、各検出法におけるネガティブコントロール測定値よりも有意に高いシグナルが測定された場合に、遺伝子変異が有ると判定することができる。より好ましくは、遺伝子変異が存在しないことが予め判明している検体と被験者の検体とについて同様の方法で遺伝子変異を測定し、遺伝子変異が存在しないことが予め判明している検体から得られた測定値と、被験者の検体から得られた測定値との間に統計学的に有意な差がある場合であって、被験者の検体から得られた測定値の方が高い場合に対象遺伝子の変異がある検出されたと判定する。
【００９９】
また、本発明のセルフリーＤＮＡの回収方法を用いて被験者およびがんに罹患していない検体の体液試料からセルフリーＤＮＡを回収し、被験者由来のセルフリーＤＮＡ量と、がんに罹患していない検体由来のセルフリーＤＮＡ量を比較することによってがんを検出することができる。具体的には、被験者由来のセルフリーＤＮＡ量と、がんに罹患していない検体由来のセルフリーＤＮＡ量を比較して、被験者由来のセルフリーＤＮＡ量が、がんに罹患していない検体由来のセルフリーＤＮＡ量よりも多い場合に、被験者の検体からがんが検出されたと判定することができる。望ましくは、被験者由来のセルフリーＤＮＡ量と、がんに罹患していない検体由来のセルフリーＤＮＡ量との間に統計学的に有意な差がある場合であって、被験者由来のセルフリーＤＮＡ量の方が多い場合にがんが検出されたと判定することができる。
【０１００】
本発明で用いるがんに罹患していない検体とは、悪性腫瘍があることを臨床的に診断されたり、病理検査で確認されたりした既往がないヒト由来の検体である。がんに罹患していない検体の身体的条件は、被験者と同一又は近似することが好ましい。身体的条件とは、例えば、人種等が該当する。
【０１０１】
また、被験者とがんに罹患していない検体の体液試料の種類は、同種の体液試料を用いることが好ましい。具体的には、被験者の検体が血しょうの場合、がんに罹患していない検体も血しょうを用いることが好ましい。また、被験者の検体が血清の場合は、がんに罹患していない検体も血清を用いることが好ましい。
【０１０２】
また、がんに罹患していない検体は、単数でも複数でもよい。がんに罹患していない検体を複数利用する場合には、セルフリーＤＮＡ量は、平均値、外れ値を除いた平均値、または中央値、などを用いることができる。
【０１０３】
回収されたセルフリーＤＮＡ量を定量する方法は、核酸量の定量方法として上記に記載した方法を用いることができる。
【０１０４】
この場合、定量対象となるセルフリーＤＮＡの塩基長は、特に限定されないが、１００ｂｐより長い塩基長のセルフリーＤＮＡが好ましく、３００ｂｐ以上の塩基長のセルフリーＤＮＡがより好ましい。また、定量対象の遺伝子配列は、セルフリーＤＮＡに含まれる配列であれば特に限定されず、たとえばＡＣＴＢやＧＡＰＤＨなどのハウスキーピング遺伝子でもよく、がん特徴的な遺伝子であってもよい。がんに罹患していない検体と被験者のセルフリーＤＮＡ量は、同じ方法で測定した値を利用することが好ましい。
【０１０５】
本明細書において、「統計学的に有意な差」とは、例えばコントロール群の９５％信頼下限区間をベースラインと設定し、被験者の測定値が当該ベースラインに達するかを判定することができる。また、得られた値の危険率（有意水準）が小さい場合、具体的には、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１又はｐ＜０．００１の場合が挙げられる。ここで、危険率である「ｐ」又は「ｐ値」とは、統計学的検定において、統計量が仮定した分布の中で、仮定が偶然正しくなる確率を示す。したがって「ｐ」又は「ｐ値」が小さいほど、仮定が真に近いことを意味する。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる。
【実施例】
【０１０６】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。【０１０７】
＜材料と方法＞
ポリエチレングリコールはメルク株式会社より、塩基性のガンマ酸化アルミニウム（Ｎ６１３Ｎ）は日揮触媒化成株式会社より購入した。実施例中で用いたポリマー水溶液は、それぞれの濃度になるよう水で溶解させた。また、実施例中で特に断らない限り、ガンマ酸化アルミニウムは塩基性のものを用いた。酸化アルミニウムは、ふるい分けなどせずに購入したまま実験に用いた。【０１０８】
変性剤としては、キアゲン株式会社よりＱＩＡＧＥＮ  ＰｔｏｒｅｉｎａｓｅＫおよびＲＬＴを、尿素は和光純薬工業株式会社より購入した。【０１０９】
また、電気泳動で用いた２０ｂｐ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒはタカラバイオ株式会社より、アクリルアミドゲルＮＯＶＥＸ−ＴＢＥ−Ｇｅｌｌｓ  ８％  １５ｗｅｌｌとＤＮＡ染色剤ＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅ  ｌ  Ｓｔａｉｎをサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社より購入した。リアルタイムＰＣＲ測定には、タカラバイオ株式会社のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＩＩを用いた。セルフリーＤＮＡを検出するために、アクチン−βの遺伝子配列のうち９３ｂｐ分の塩基長（ＡＣＴＩＮ９３）を増幅させるためのプライマーとして、配列番号１および２を用いた。また、セルフリーＤＮＡ量によるがんの検出には、アクチン−βの遺伝子配列のうち３０６ｂｐ分の塩基長を増幅させるためのプライマーとして、配列番号１および３を用いた。プライマーはＰｒｉｍｅＰＣＲ  Ａｓｓａｙｓ，Ｐａｎｅｌｓ，ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  （バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社）の記載を元に設計し、ユーロフィンジェノミクス株式会社より購入し、特に精製することなくそのまま用いた。その他の試薬については、和光純薬株式会社、東京化成株式会社、シグマーアルドリッチジャパン合同会社から購入し、特に精製することなくそのまま用いた。【０１１０】
ボルテックスは東京理化器械株式会社のＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を、ゼータ電位の測定には大塚電子株式会社のＥＬＳ−Ｚを用いた。電気泳動はミニゲルスラブ電気泳動装置（アズワン株式会社）を用いた。サーマルサイクラーはタカラバイオ株式会社のＰＣＲ  ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ  ＳＰ  ＴＰ−４００を、リアルタイムＰＣＲはバイオラッド社のＣＦＸ９６−Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍを用いた。ふるいはアズワン株式会社のＭＶＳ−１を用いた。染色したゲルはＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社のＴｙｐｈｏｏｎＦＬＡ９５００を用いて解析した。ゲルの画像解析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社のＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ（登録商標）を用いた。【０１１１】
また、リアルタイムＰＣＲでセルフリーＤＮＡを定量した際には、リアルタイムＰＣＲの結果、増幅サイクル数（Ｃｑ値）が３５以下の場合に、セルフリーＤＮＡを回収できていると判定した。また、４０以上の場合は、測定下限以下となるため、Ｎ．Ｄと記載する。【０１１２】
体液試料としては、がんに罹患していない検体としては、Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社から購入した複数人由来の混合血しょう、ＣｕｒｅＬｉｎｅ社より入手したがんに罹患していない女性及び男性由来の血しょうを用いた。がんに罹患している検体としては、ＣｕｒｅＬｉｎｅ社より入手したがん患者の血しょうを用いた。【０１１３】
＜比較例１＞ポリマーコーティングしていない酸化アルミニウム担体を用いたセルフリーＤＮＡ回収
特許文献４（実施例４、Ｔａｂｌｅ２）に記載の酸化アルミニウムＡと組成の近い塩基性のガンマ酸化アルミニウム（Ｎ６１３Ｎ：日揮触媒化成株式会社）を用いて、セルフリーＤＮＡを効率的に回収することができるかを検討した。体液試料としては、Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社から購入した複数人由来の混合血しょうを用いた。酸化アルミニウムに吸着させたセルフリーＤＮＡを溶出させる溶出液として、特許文献４、５に、リン酸緩衝液、又はＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液を溶出液として利用できることが記載されおり、特許文献６には、リン酸溶液が核酸と酸化アルミニウムとの結合を阻害する旨が記載されていたことから、リン酸緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ７）を溶出液として、以下の実験を行った。【０１１４】
１．５ｍＬチューブに０．５ｍｇずつガンマ酸化アルミニウムを量り取った。そこにエタノール４００μＬ添加し、ボルテックスで撹拌し、遠心機で遠心（１００００Ｇ、１ｍｉｎ）し上清を除いた。この操作を再度繰り返し、エタノールによって、ビーズ表面のごみなどを除去した。【０１１５】
洗浄を終えたガンマ酸化アルミニウムに血しょう３００μＬを添加し、１５分間ボルテックスで撹拌した。遠心機で遠心（１００００Ｇ、１ｍｉｎ）して上清を除き、血しょうを取り除いた。次に滅菌蒸留水４００μＬ添加し、ボルテックスで撹拌し、遠心機で遠心（１００００Ｇ、１ｍｉｎ）し上清を除いた。この操作を再度繰り返し、滅菌蒸留水によって、チューブ内の残血しょうを完全に除去した。チューブ内の滅菌蒸留水を極力取り除いた後に、溶出液としてリン酸緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ７．０）を５０μＬ添加し、すぐにボルテックスで１５分間撹拌した。遠心機で遠心（１００００Ｇ、１ｍｉｎ）し、セルフリーＤＮＡが含まれた上清を回収した。【０１１６】
回収したセルフリーＤＮＡ量を確認するために、リアルタイムＰＣＲにてアクチン−βの遺伝子配列のうち９３ｂｐ分の塩基長（ＡＣＴＩＮ９３）を増幅させた。増幅プライマーとして、配列番号１および２を用いた。リアルタイムＰＣＲは以下のような手順で実施した。【０１１７】
まず、氷上にてＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑを１２．５μＬ、０．５μＭに調製したプライマーを１．０μＬ、滅菌蒸留水を８．５μＬ、上記の方法で回収したセルフリーＤＮＡを含むサンプルを滅菌蒸留水で１０倍希釈したうちの２μＬを，１．５ｍＬチューブ内で混合した（計２５μＬ）。２５μＬ全量をリアルタイムＰＣＲ用プレートに添加し、プレートシートで蓋をし、装置へセットした。リアルタイムＰＣＲ測定条件は、９５℃３０ｓｅｃで２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに別れさせた後→９５℃５ｓｅｃ、５６℃１ｍｉｎの伸長反応を４０サイクル行い、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｕｒｖｅから、増幅サイクル数を得た。ＰＣＲ反応後、反応液の温度を６０℃から９５℃まで徐々に上昇させ融解曲線分析を行い、得られたＭｅｌｔＣｕｒｖｅからプライマーダイマーができていないことを確認した。【０１１８】
結果を表１に示した。リアルタイムＰＣＲの増幅サイクル数（Ｃｑ値）が検出限界以下の４０以上となった。【０１１９】
この結果により、ポリマーが吸着していないガンマ酸化アルミニウムを担体として用いた場合、セルフリーＤＮＡを回収できないことが分かった。従って、特許文献４および５に記載の方法ではセルフリーＤＮＡが回収できないことがわかった。【０１２０】
【表１】
2018052011.tif 000003
【０１２１】
＜比較例２＞水溶性の中性ポリマー以外の水溶性のポリマーが吸着した酸化アルミニウム担体を用いたセルフリーＤＮＡ回収
１．５ｍｌチューブに、０．５ｍｇずつガンマ酸化アルミニウムを量り取った。これにポリマー溶液として、ポリアクリル酸（ＰＡｃＡ，  ５．１ｋＤ，  １０ｗｔ％）、デキストラン硫酸（ＤＳ，  ４ｋＤ，  １０ｗｔ％）、ポリビニルスルホン酸（ＰＶＳＡ，  １０ｗｔ％）、ポリアリルアミン（ＰＡＡ，  １７ｋＤ，  １０ｗｔ％）、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ，  １５０ｋＤ，  １ｗｔ％）をそれぞれ５０μＬずつ加えて１０分間ミキサーで攪拌した。遠心機で遠心（１００００Ｇ，  １ｍｉｎ）して上清を除き、それぞれのポリマーが吸着したガンマ酸化アルミニウム得た。【０１２２】
水溶性の中性ポリマー以外の水溶性のポリマーが吸着した酸化アルミニウム担体に比較例１で用いた血しょう３００μＬとタンパク質変性剤としてグアジニン塩酸塩を含むＲＬＴ（株式会社キアゲン、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ）４５０μＬを予め混合したのちにポリマーが表面に吸着したガンマ酸化アルミニウム担体に添加した。その他の操作は比較例１と同様で行った。また、回収したセルフリーＤＮＡの検出は、比較例１と同様の方法で確認した。【０１２３】
結果を表２に示した。これらの結果から、いずれの担体を用いた場合でも、リアルタイムＰＣＲの検出下限以下の回収であったとわかる。これらの結果から、水溶性の中性ポリマー以外の水溶性のポリマーが吸着したガンマ酸化アルミニウムを担体として用いた場合、増幅サイクル数（Ｃｑ値）が３５以上もしくは検出限界以下（Ｎ．Ｄ）となり、セルフリーＤＮＡを回収できないことが分かった。【０１２４】
【表２】
2018052011.tif 000004
【０１２５】
＜比較例３＞シリカ担体を用いたセルフリーＤＮＡ回収
シリカ担体を用いたセルフリーＤＮＡ回収キット（サーモフィッシャー株式会社、ＭａｇＭａｘ  ｃｅｌｌ−ＦｒｅｅＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）を用いて血しょうセルフリーＤＮＡを効率的に回収することができるかを検討した。【０１２６】
タンパク質変性剤としては、キットプロトコルどおりのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫまたは、グアジニン塩酸塩を含むＲＬＴ（株式会社キアゲン、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ）を用いた。体液試料は、比較例１と同様の血しょうを用いた。タンパク質変性剤として、ＲＬＴを用いた場合は、比較例１で用いた血しょう３００μＬとＲＬＴ４５０μＬを予め混合したのちにシリカ担体に添加した。それ以外の回収操作はキットプロトコル通りでおこなった。
また、回収したセルフリーＤＮＡの検出は、比較例１と同様の方法で確認した。【０１２７】
結果を表３に示す。これらの結果から、シリカ担体を用いた場合はＣｑ値が３５以上となった。【０１２８】
さらに、図１に回収したセルフリーＤＮＡのゲル電気泳動の結果を示した。ゲル電気泳動の結果、回収したセルフリーＤＮＡはバンドが確認できなかった。【０１２９】
【表３】
2018052011.tif 000005
【０１３０】
＜実施例１＞水溶性の中性ポリマーであるＰＥＧが表面に吸着したガンマ酸化アルミニウム担体を用いたセルフリーＤＮＡ回収（タンパク質変性剤：ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）
１．５ｍＬチューブに０．５ｍｇずつガンマ酸化アルミニウムを量り取った。そこにエタノール４００μＬ添加し、ボルテックスで撹拌し、遠心機で遠心（１００００Ｇ、１ｍｉｎ）し上清を除いた。この操作を再度繰り返し、エタノールによって、ビーズ表面のごみなどを除去した。これにポリマー水溶液として、水溶性の中性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ，１０ｋＤ，１０ｗｔ％）を５０μＬ加えて１０分間ミキサーで撹拌した。遠心機で遠心（１００００Ｇ、１ｍｉｎ）して上清を除き、ポリマーが表面に吸着したガンマ酸化アルミニウム担体を得た。【０１３１】
続いて、ポリマーが表面に吸着したガンマ酸化アルミニウム担体が含まれる溶液に、比較例３のキットプロトコルと同一の血しょう条件とするために、タンパク質変性剤としてＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで６０℃２０ｍｉｎ変性処理した比較例１で用いた血しょう３００μＬを添加し、１５分間ボルテックスで撹拌した。その後の操作は比較例１と同様に行った。回収したセルフリーＤＮＡ量は比較例１と同様に確認した。結果を表３に示す。【０１３２】
＜実施例２＞水溶性の中性ポリマーであるＰＥＧが表面に吸着したガンマ酸化アルミニウム担体を用いたセルフリーＤＮＡ回収（タンパク質変性剤：Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ）
実施例１で行った、血しょうのタンパク質変性処理の変性剤は、グアジニン塩酸塩を含むＲＬＴ（株式会社キアゲン、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ）に変更した。使用方法は、比較例１で用いた血しょう３００μＬとＲＬＴ４５０μＬを予め混合したのちにポリマーが表面に吸着したガンマ酸化アルミニウム担体に添加した。その他の作業は比較例１と同様である。結果を表３に示す。  【０１３３】
さらに、図１に回収したセルフリーＤＮＡのゲル電気泳動の結果を示した。これらの結果から、比較例３で回収したセルフリーＤＮＡはバンドが確認できないのに対し、実施例２で回収したセルフリーＤＮＡは１６０ｂｐ付近でバンドを確認することができ、本発明の方法は、セルフリーＤＮＡが高い純度で回収されていることがわかった。【０１３４】
＜実施例３＞水溶性の中性ポリマーであるＰＥＧが表面に吸着したガンマ酸化アルミニウム担体を用いたセルフリーＤＮＡ回収（タンパク質変性剤：尿素）
実施例１で行った、血しょうのタンパク質変性処理の変性剤の種類を尿素に変更した。使用方法は、比較例１で用いた血しょう３００μＬと尿素（終濃度６Ｍ）４５０μＬを予め混合したのちにポリマーが表面に吸着したガンマ酸化アルミニウム担体に添加した。その他の作業は比較例１と同様である。結果を表３に示す。【０１３５】
＜実施例４＞水溶性の中性ポリマーであるＰＥＧが表面に吸着したガンマ酸化アルミニウム担体を用いたセルフリーＤＮＡ回収（タンパク質変性剤：なし）
実施例１で行った、血しょうのタンパク質変性処理を行わないで、血しょうをポリマーが表面に吸着したガンマ酸化アルミニウム担体に添加した。比較例１で用いた血しょう３００μＬに蒸留水４５μＬを添加した以外の作業は実施例１と同様である。結果を表３に示す。【０１３６】
表３の実施例１、２、３、４の結果から、Ｃｑ値は３５以下となり、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着したガンマ酸化アルミニウム担体を用いると、タンパク質変性剤の有無や、種類に関係なく、３００μＬの血しょうからセルフリーＤＮＡを回収できることがわかった。【０１３７】
＜実施例５＞水溶性の中性ポリマーが表面に吸着したガンマ酸化アルミニウム担体を用いたセルフリーＤＮＡ回収
水溶性の中性ポリマーとして、ゼータ電位が異なる以下にあげる各種ポリマーを各１０ｗｔ％水溶液に調製した。ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）、ＰＥＯｚ（ポリ（２−エチル−２オキサゾリン））、ＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）。調製した各ポリマー溶液とガンマ酸化アルミニウム担体を混合させ、各ポリマーが表面に吸着したガンマ酸化アルミニウム担体を作製した。それ以外の作業は実施例１と同様である。【０１３８】
その結果を表４に示す。リアルタイムＰＣＲの増幅サイクル数（Ｃｑ値）が３５以下であることから、ゼータ電位が±１０ｍＶの範囲である中性の水溶性ポリマーをガンマ酸化アルミニウム表面に吸着させた担体を用いれば、３００μＬという少量の血しょうから、セルフリーＤＮＡを効率的に回収できることができることが分かった。【０１３９】
【表４】
2018052011.tif 000006
【０１４０】
＜比較例４＞シリカ担体を用いたセルフリーＤＮＡ回収  
体液試料として、ＣｕｒｅＬｉｎｅ社より入手したがんに罹患していない女性及び男性由来の血しょう、並びにＣｕｒｅＬｉｎｅ社より入手した乳がん患者（女性）の血しょうを用いた以外は、比較例３と同様の方法でセルフリーＤＮＡの回収を行い、Ｑｕａｎｔｕｓ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（登録商標）を用いてＤＮＡ濃度を測定した。結果を表５に示す。【０１４１】
これらの結果から、いずれの検体も測定限界以下の値である０．００５ｎｇ／μＬとなり、シリカ担体を用いた場合、３００μＬのがんに罹患していない検体由来の血しょう及びがん患者由来の血しょうからセルフリーＤＮＡを回収できないことがわかった。【０１４２】
＜実施例６＞水溶性の中性ポリマーであるＰＥＧが表面に吸着したガンマ酸化アルミニウム担体を用いたセルフリーＤＮＡ回収（タンパク質変性剤：尿素）
実施例１で用いた担体を使用した以外は、比較例４と同様の検体から、比較例４と同様作業でセルフリーＤＮＡの回収を行った。回収したセルフリーＤＮＡの濃度を比較例４と同様の方法で確認した。結果を表５に示す。【０１４３】
その結果、がんに罹患していない男性由来の血しょうからは０．０１４９ｐｇ／μＬ、がんに罹患していない女性由来の血しょうからは０．００７７ｐｇ／μＬ、乳がん患者由来の血しょうからは０．０３２３ｐｇ／μＬ得られた。【０１４４】
【表５】
2018052011.tif 000007
【０１４５】
＜比較例５＞シリカ担体を用いたがん患者由来血しょう由来セルフリーＤＮＡからの遺伝子変異の検出
シリカ担体を用いたセルフリーＤＮＡ回収キット（サーモフィッシャー株式会社、ＭａｇＭａｘ  ｃｅｌｌ−ＦｒｅｅＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）を用いて、体液試料３００μＬからセルフリーＤＮＡを回収し、がん特異的な遺伝子変異を検出した。体液試料として、ＣｕｒｅＬｉｎｅ社より入手したがんに罹患していない女性及び男性由来の血しょう、並びにＣｕｒｅＬｉｎｅ社より入手した肺がん（男性）患者の血しょうを用いた。セルフリーＤＮＡの回収方法は、比較例３において変性剤にＲＬＴを用いた方法と同様に実施した。得られた溶出液の１／２５の体積を２０μＬにして用いて、肺がん患者に特異的なＥＧＦＲ  ｅｘｏｎ１９  ｄｅｌｅｔｉｏｎ変異をデジタルＰＣＲで検出した。結果を表６に示す。その結果、がんに罹患していない男性、女性の検体では遺伝子変異は検出されなかったが、肺がん患者のセルフリーＤＮＡからは４９．４５％の頻度でＥＧＦＲ  ｅｘｏｎ１９  ｄｅｌｅｔｉｏｎ変異を検出した。【０１４６】
＜実施例７＞ＰＥＧが表面に吸着したガンマ酸化アルミニウム担体を用いて回収したセルフリーＤＮＡからの遺伝子変異の検出
比較例３において変性剤にＲＬＴを用いた方法と同様の方法を用いて、比較例５と同じ検体であるがんに罹患していない男性、女性、及び肺がん患者の血しょう３００μＬからセルフリーＤＮＡを回収し、がん特異的な遺伝子変異を検出した。得られた溶出液の１／２５の体積を２０μＬにして用いて、肺がん患者に特異的なＥＧＦＲ  ｅｘｏｎ１９  ｄｅｌｅｔｉｏｎ変異をデジタルＰＣＲで検出した。その結果、がんに罹患していない男性、女性の検体では遺伝子変異は検出されなかったが、肺がん患者のセルフリーＤＮＡからは５５．８２％の頻度でＥＧＦＲ  ｅｘｏｎ１９  ｄｅｌｅｔｉｏｎ変異を検出した。この数値は比較例５の方法で得られた遺伝子変異検出頻度（４９．４５％）よりも高いことから（表６）、本発明の方法は既存の方法よりもがん特異的な遺伝子変異を高感度に検出できることが示された。【０１４７】
【表６】
2018052011.tif 000008
【０１４８】
＜比較例６＞シリカ担体を用いて回収したセルフリーＤＮＡ量によるがんの検出
シリカ担体を用いたセルフリーＤＮＡ回収キット（サーモフィッシャー株式会社、ＭａｇＭａｘ  ｃｅｌｌ−ＦｒｅｅＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）を用いて、体液試料３００μＬからセルフリーＤＮＡを回収し、リアルタイムＰＣＲで測定されたセルフリーＤＮＡ量を用いてがんの有無を検出した。体液試料として、ＣｕｒｅＬｉｎｅ社より入手したがんに罹患していない女性及び男性由来の血しょう、並びに、ＣｕｒｅＬｉｎｅ社より入手した肺がん（男性）、乳がん（女性）、及び大腸がん（男性）の血しょうを用いた。セルフリーＤＮＡの回収方法は、比較例３において変性剤にＲＬＴを用いた方法と同様に実施した。ＤＮＡは５０μＬに溶出し、１０倍希釈したうちの４μＬを分取し、がん由来のセルフリーＤＮＡをより検出し易くなるよう設計した配列１と配列３のプライマーから増幅されるアクチン配列遺伝子の断片である約３０６ｂｐをリアルタイムＰＣＲで検出した。検出対象の塩基長を３００ｂｐよりも長くすることで、非がん細胞では放出され難いが、がん細胞では放出されるセルフリーＤＮＡを捕捉し、非がんとがんの区別を試みた。がんに罹患していない男性、およびがんに罹患してない女性由来の検体測定値の９５％信頼下限区間をベースラインとし、これよりセルフリーＤＮＡ量が１．５倍以上多い（ＰＣＲサイクル数が約０．５９少ない）検体はがんが検出されたとしてがん陽性、そうでない検体はがんが検出されないとして、がん陰性と判定した。【０１４９】
上記の判断基準に、それぞれの検体のＰＣＲサイクル数当てはめると、肺がん患者と大腸がん患者由来の検体は、がんに罹患していない検体のベースラインよりもセルフリーＤＮＡ量が多く検出されたため、がん陽性と判定した。一方で、乳がん患者由来の検体は、がんに罹患していない検体由来の測定値のベースラインと重なり、陰性と判定した。従って、本法では３つのがん検体のうち１つの検体についてがんと判定できなかったため、感度は６６％であった。【０１５０】
＜実施例８＞ＰＥＧが表面に吸着したガンマ酸化アルミニウム担体を用いて回収したセルフリーＤＮＡ量によるがんの検出
実施例２において変性剤にＲＬＴを用いた方法と同様の方法を用いて、比較例６と同じ体液試料３００μＬからセルフリーＤＮＡを回収し、リアルタイムＰＣＲで測定されたセルフリーＤＮＡ量を用いてがんの有無を検出した。セルフリーＤＮＡの回収方法は、比較例３において変性剤にＲＬＴを用いた方法と同様に実施した。ＤＮＡは５０μＬに溶出し、１０倍希釈したうちの４μＬを分取し、がん由来のセルフリーＤＮＡをより検出し易くなるよう設計した配列１と配列３のプライマーから増幅されるアクチン配列遺伝子の断片をリアルタイムＰＣＲで検出した。がんの有無に関する判定については、比較例６と同様に実施した。その結果、肺がん（男性）、乳がん（女性）、大腸がん（男性）患者の血しょうは、それぞれ、がんに罹患していない検体のベースラインよりもセルフリーＤＮＡ量が多く検出され、全検体が、がん陽性と判定した。従って、本法では３つのがん検体のうち３つの検体全てが陽性であったため、感度は１００％であった。この感度は、比較例６の方法で得られた感度（６６％）よりも高いことから（表７）、本発明の方法は既存の方法よりも高感度にセルフリーＤＮＡからがんを検出できることが示された。【０１５１】
【表７】
2018052011.tif 000009
【図１】
2018052011.tif 000010
【配列表】
2018052011000001.app
【国際調査報告】
2018052011.tif 000011
2018052011.tif 000012
2018052011.tif 000013
2018052011.tif 000014