(57)【要約】  有機化合物の微小な構造変化を反映した変化特徴点を高精度に特定することができる有機化合物分析装置を提供するために、有機化合物を含む試料について複数の異なる外部刺激条件で測定されたスペクトルと、各スペクトルが測定された外部刺激条件と、を対にした実測データを記憶する実測データ記憶部２と、前記スペクトルの測定が行われた各波数に対する重み付けを示すローディングを設定する評価基準ベクトル設定部３と、前記ローディングと、前記実測データとに基づいて、前記スペクトルが測定された外部刺激条件ごとに前記ローディングに対応するスコアを算出するスコア算出部４と、外部刺激条件に対する前記スコアの変化に基づいて、前記有機化合物の変性温度を算出する変化特徴点特定部５と、を備えた。
2018034205.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機化合物を含む試料について複数の異なる外部刺激条件で測定された複数の実測スペクトルと、各実測スペクトルが測定された外部刺激条件と、を対にして記憶する実測データ記憶部と、
前記実測スペクトルについてスペクトル強度が測定された波数の測定点数と同じ要素数を有する評価基準ベクトルを設定する評価基準ベクトル設定部と、
前記実測スペクトルと前記評価基準ベクトルとの内積に基づいたスコアを複数の外部刺激条件について算出するスコア算出部と、
外部刺激条件に対する前記スコアの変化に基づいて、前記有機化合物の変化特徴点を特定する変化特徴点特定部と、を備えたことを特徴とする有機化合物分析装置。
【請求項２】
前記評価基準ベクトル設定部が、複数の異なる外部刺激条件で測定された複数の実測スペクトルからなるスペクトル行列に対して多変量解析を実行して前記評価基準ベクトルを設定するように構成されている請求項１記載の有機化合物分析装置。
【請求項３】
前記評価基準ベクトル設定部が、複数の異なる外部刺激条件で測定された複数の実測スペクトルからなるスペクトル行列に基づいて１又は複数のＰＣＡローディングを算出し、前記評価基準ベクトルとして設定するように構成されており、
前記スコア算出部が、前記スペクトル行列と前記ＰＣＡローディングの積を複数の外部刺激条件での前記スコアとして算出するように構成されている請求項１記載の有機化合物分析装置。
【請求項４】
前記評価基準ベクトル設定部が、前記スペクトル行列に基づいて寄与率が２番目以降のＰＣＡローディングを算出し、前記評価基準ベクトルとして設定するように構成されており、
前記変化特徴点特定部が、前記スコア算出部で算出される寄与率が２番目以降のＰＣＡローディングに対応する前記スコアの外部刺激条件に対する変化に基づいて変化特徴点を特定するように構成されている請求項３記載の有機化合物分析装置。
【請求項５】
前記評価基準ベクトル設定部が、既知の有機化合物のスペクトルに基づいて前記評価基準ベクトルとして設定するように構成されており、
前記スコア算出部が、複数の異なる外部刺激条件で測定された複数の実測スペクトルからなるスペクトル行列と前記評価基準ベクトルの積を複数の外部刺激条件での前記スコアとして算出するように構成されている請求項１記載の有機化合物分析装置。
【請求項６】
前記スペクトルが、ラマン分光法で測定されたラマン分光スペクトルである請求項１記載の有機化合物分析装置。
【請求項７】
前記有機化合物が抗体であり、前記試料が抗体医薬品である請求項１記載の有機化合物分析装置。
【請求項８】
前記外部刺激条件が、試料に添加された溶質の濃度、ｐＨ、界面における試料の存在時間、温度のいずれかである請求項１記載の有機化合物分析装置。
【請求項９】
前記有機化合物がタンパク質であり、前記外部刺激条件が温度である場合において、
前記変化特徴点特定部が、
複数の前記実測スペクトルから算出された前記スコアの温度に対する変化に基づいて、前記タンパク質の変性が完了した成分が出現し始める温度であるオンセット温度を算出するオンセット温度算出部と、
前記実測データ記憶部から前記オンセット温度よりも低い温度で測定された実測スペクトルを抽出するデータ抽出部と、
前記データ抽出部で抽出された実測データに基づいて前記スコア算出部が算出する前記スコアの温度に対する変化に基づいて変化特徴点である変性温度を算出する変性温度出力部と、を備えている請求項１記載の有機化合物分析装置。
【請求項１０】
有機化合物を含む試料について複数の異なる外部刺激条件で測定された複数の実測スペクトルと、各実測スペクトルが測定された外部刺激条件と、に基づいて有機化合物を分析する方法であって、
前記実測スペクトルについてスペクトル強度が測定された波数の測定点数と同じ要素数を有する評価基準ベクトルを設定する評価基準ベクトル設定工程と、
前記実測スペクトルと前記評価基準ベクトルとの内積に基づいたスコアを複数の外部刺激条件について算出するスコア算出工程と、
外部刺激条件に対する前記スコアの変化に基づいて、前記有機化合物の変化特徴点を算出する変化特徴点特定工程と、を備えたことを特徴とする有機化合物分析方法。
【請求項１１】
有機化合物を含む試料について複数の異なる外部刺激条件で測定された複数の実測スペクトルと、各実測スペクトルが測定された外部刺激条件と、を対にして記憶する実測データ記憶部と、
前記実測スペクトルについてスペクトル強度が測定された波数の測定点数と同じ要素数を有する評価基準ベクトルを設定する評価基準ベクトル設定部と、
前記実測スペクトルと前記評価基準ベクトルとの内積に基づいたスコアを複数の外部刺激条件について算出するスコア算出部と、
外部刺激条件に対する前記スコアの変化に基づいて、前記有機化合物の変化特徴点を算出する変化特徴点特定部と、しての機能をコンピュータに発揮させることを特徴とする有機化合物分析装置用プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スペクトルに基づいて有機化合物の分析を行う有機化合物分析装置、有機化合物分析方法、及び、有機化合物分析装置用プログラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、試料に含まれるタンパク質等の有機化合物の濃度推定を行うために試料のスペクトル（例えばラマンスペクトルや赤外吸収スペクトル等）を測定し、そのスペクトルの全波数領域のスペクトル強度情報を変量として取り扱う多変量解析（ケモメトリックス）の手法が用いられている（特許文献１参照）。【０００３】
また、タンパク質の構造を分析するための重要な指標の１つである変性温度を測定するためにタンパク質を含んだ試料を温度変化させながら赤外吸収スペクトルの測定が行われている。例えば、試料を温度変化させながらタンパク質の変性後の構造に由来する赤外吸収ピークでのスペクトル強度を測定し、スペクトル強度が増加し始める温度とスペクトル強度の変化がなくなる温度とのほぼ中間の温度を変性温度とすることが行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許５６４９８２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、熱変性前期において発生していると考えられる微小な構造変化やその変化に対応する変性温度は、従来のスペクトルを用いた分析方法では捉えにくい。【０００６】
このため、抗体医薬品のように微小な構造変化がその効果に大きな影響を与える恐れがあるものにおいて、高水準の品質管理を実現することは難しい。【０００７】
本発明は上述したような問題を鑑みてなされたものであり、例えばタンパク質の熱変性前期における微小な構造変化を反映した熱変性温度を高精度に特定することができる有機化合物分析装置、有機化合物分析方法、及び、有機化合物分析装置用プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明に係る有機化合物分析装置は、有機化合物を含む試料について複数の異なる外部刺激条件で測定された複数の実測スペクトルと、各実測スペクトルが測定された外部刺激条件と、を対にして記憶する実測データ記憶部と、前記実測スペクトルについてスペクトル強度が測定された波数の測定点数と同じ要素数を有する評価基準ベクトルを設定する評価基準ベクトル設定部と、前記実測スペクトルと前記評価基準ベクトルとの内積に基づいたスコアを複数の外部刺激条件について算出するスコア算出部と、外部刺激条件に対する前記スコアの変化に基づいて、前記有機化合物の変化特徴点を特定する変化特徴点特定部と、を備えたことを特徴とする。【０００９】
また、本発明に係る有機化合物分析方法は、有機化合物を含む試料について複数の異なる外部刺激条件で測定された複数の実測スペクトルと、各実測スペクトルが測定された外部刺激条件と、に基づいて有機化合物を分析する方法であって、前記実測スペクトルについてスペクトル強度が測定された波数の測定点数と同じ要素数を有する評価基準ベクトルを設定する評価基準ベクトル設定工程と、前記実測スペクトルと前記評価基準ベクトルとの内積に基づいたスコアを複数の外部刺激条件について算出するスコア算出工程と、外部刺激条件に対する前記スコアの変化に基づいて、前記有機化合物の変化特徴点を特定する変化特徴点特定工程と、を備えたことを特徴とする。【００１０】
ここで、複数の異なる外部刺激条件とは同じ種類のパラメータについてその度数や量が異なっていることを言う。【００１１】
このようなものであれば、測定された実測スペクトルを各波数に対して重みづけして評価したスコアの外部刺激条件に対する変化に基づいて有機化合物の変化特徴点を特定するので、全波数領域のスペクトル強度情報を加味して変化特徴点を特定することができる。【００１２】
したがって、例えば有機化合物がタンパク質である場合には、実測スペクトルのピーク以外に現れている変性前期の微小な構造変化に由来するスペクトルの変化を変化特徴点である変性温度に反映させることが可能となる。【００１３】
このため、従来の１つのピークにおけるスペクトル強度の変化に基づいて算出された変性温度よりも微小な構造変化に由来する変性温度を高精度に算出できる。【００１４】
多数の実測スペクトルデータに基づいて適切な前記評価基準ベクトルを設定できるようにするには前記評価基準ベクトル設定部が、複数の異なる外部刺激条件で測定された複数の実測スペクトルからなるスペクトル行列に対して多変量解析を実行して前記評価基準ベクトルを設定するように構成されていればよい。【００１５】
試料に含まれる有機化合物や、外部刺激条件により生じるであろう微小な構造変化がスペクトルに対して与える影響が未知であり、どのような評価基準ベクトルを設定するべきか不明である場合でも実測されたデータだけに基づいて妥当な分析を行えるようにするには、前記評価基準ベクトル設定部が、複数の異なる外部刺激条件で測定された複数の実測スペクトルからなるスペクトル行列に基づいて１又は複数のＰＣＡローディングを算出し、前記評価基準ベクトルとして設定するように構成されており、前記スコア算出部が、前記スペクトル行列と前記ＰＣＡローディングの積を複数の外部刺激条件での前記スコアとして算出するように構成されていればよい。すなわち、ＰＣＡ（主成分分析）の手法を用いれば、既知のスペクトルから評価基準ベクトルを設定しなくても、自動的にスペクトルの分布を説明するのに適した評価軸を設定できる。【００１６】
変性前期の微小な構造変化が反映された前記スコアを算出できるようにして、精度よく微小な構造変化に由来する変性温度を算出できるようにするには、前記評価基準ベクトル設定部が、前記スペクトル行列に基づいて寄与率が２番目以降のＰＣＡローディングを算出して前記評価基準ベクトルとして設定するように構成されており、前記変化特徴点特定部が、前記スコア算出部で算出される寄与率が２番目以降のＰＣＡローディングに対応する前記スコアの外部刺激条件に対する変化に基づいて変化特徴点を特定するように構成されていればよい。例えば有機化合物がタンパク質の場合、寄与率が最も高いＰＣＡローディングは主に変性前におけるタンパク質のスペクトルを反映するので、寄与率が２番目以降のＰＣＡローディングには微小な構造変化や変性後のタンパク質の影響のみが表れている可能性が高い。このような傾向を利用すれば微小な構造変化だけをスコアから抽出できる。また、タンパク質以外の有機化合物である場合でも、有機化合物において生じた微小な構造変化や組成変化を抽出する事が可能となる。【００１７】
例えば外部刺激条件の変化により有機化合物において生じる構造変化に由来するスペクトルが既知の場合等において、その構造変化の影響がよりスコアに現れやすくするには、前記評価基準ベクトル設定部が、既知の有機化合物のスペクトルに基づいて前記評価基準ベクトルを設定するように構成されており、前記スコア算出部が、複数の異なる外部刺激条件で測定された複数の実測スペクトルからなるスペクトル行列と前記評価基準ベクトルの積を複数の外部刺激条件での前記スコアとして算出するように構成されていればよい。【００１８】
例えば試料に光を照射してもほとんど透過できない程度に試料中の有機化合物の濃度が高い場合でも変化特徴点を精度よく特定できるようにするには、前記スペクトルが、ラマン分光法で測定されたラマン分光スペクトルであればよい。このようなものであれば、赤外吸収スペクトルが得られないような高濃度の試料であってもスペクトル強度を測定することが可能であるので、高濃度の試料でも変性温度の分析が可能となる。【００１９】
前記有機化合物が抗体であり、前記試料が抗体医薬品である場合に本発明を適用することにより微小な構造変化まで評価した高度な品質管理を実現できる。【００２０】
例えばタンパク質の様々な変性について解析できるようにするには、前記外部刺激条件が、試料に添加された溶質の濃度、ｐＨ、界面における試料の存在時間、温度のいずれかであればよい。【００２１】
実測データにおいて温度変化による例えばタンパク質の変性が完了してしまっているものを省き、温度変化による微小な構造変化が生じている間のデータだけを使用することで、微小な構造変化による変性温度の算出精度を高められるようにするには、前記有機化合物がタンパク質であり、前記外部刺激条件が温度である場合において、前記変化特徴点特定部が、複数の前記実測スペクトルから算出された前記スコアの温度に対する変化に基づいて、前記タンパク質の変性が完了した成分が出現し始める温度であるオンセット温度を算出するオンセット温度算出部と、前記実測データ記憶部から前記オンセット温度よりも低い温度で測定された実測スペクトルを抽出するデータ抽出部と、データ抽出部で抽出された実測データに基づいて前記スコア算出部が算出するスコアの温度に対する変化に基づいて変性温度を算出する変性温度出力部と、を備えていればよい。【００２２】
従来の有機化合物分析装置において、本発明と同様の機能を例えば後付けで実現できるようにするには、有機化合物を含む試料について複数の異なる外部刺激条件で測定された複数の実測スペクトルと、各実測スペクトルが測定された外部刺激条件と、を対にして記憶する実測データ記憶部と、前記実測スペクトルについてスペクトル強度が測定された波数の測定点数と同じ要素数を有する評価基準ベクトルを設定する評価基準ベクトル設定部と、前記実測スペクトルと前記評価基準ベクトルとの内積に基づいたスコアを複数の外部刺激条件について算出するスコア算出部と、外部刺激条件に対する前記スコアの変化に基づいて、前記有機化合物の変化特徴点を特定する変化特徴点特定部と、しての機能をコンピュータに発揮させることを特徴とする有機化合物分析装置用プログラムを既存の装置にインストールすればよい。なお、有機化合物分析装置用プログラムは、電子的に配信されるものであってもよいし、ＣＤ、ＤＶＤ、ＨＤ、フラッシュメモリ等の記憶媒体に記憶されていてもよい。すなわち、有機化合物分析装置用プログラム記憶媒体を用いてコンピュータへのインストール作業を行っても構わない。
【発明の効果】
【００２３】
このように本発明に係る有機化合物分析装置によれば、スペクトルの全波数でのスペクトル強度情報を反映させたスコアに基づいて変化特徴点を特定するので、例えば有機化合物がタンパク質であれば変性前期における微小な構造変化による変性温度を高精度に算出することが可能となる。したがって、算出される変性温度等に基づいてタンパク質に生じている微小な構造変化について分析することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の第１実施形態に係る有機化合物分析装置、及び、有機化合物分析システムを示した模式図。
【図２】第１実施形態における実測データに対するＰＣＡによる分析イメージを示す模式図。
【図３】第１実施形態における第２スコアの温度変化に基づくオンセット温度の算出手順を示す模式図。
【図４】第１実施形態における実測データの抽出温度領域を示す模式図。
【図５】第１実施形態における抽出後データに対するＰＣＡによる分析イメージを示す模式図。
【図６】第１実施形態における第３スコアの温度変化に基づく変性温度の算出手順を示す模式図。
【図７】第１実施形態における実測データの測定手順を示すフローチャート。
【図８】第１実施形態における仮変性温度の算出手順を示す模式図。
【図９】第１実施形態における最終変性温度の算出手順を示す模式図。
【符号の説明】
【００２５】
１００・・・有機化合物分析装置
２    ・・・実測データ記憶部
３    ・・・評価基準ベクトル設定部
４    ・・・スコア算出部
５    ・・・変化特徴点特定部
５１  ・・・温度−スコアデータ記憶部
５２  ・・・オンセット温度算出部
５３  ・・・データ抽出部
５４  ・・・抽出データ記憶部
５５  ・・・変性温度出力部
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の第１実施形態に係る有機化合物分析装置１００、及び、有機化合物分析システム２００について各図を参照しながら説明する。第１実施形態の有機化合物分析システム２００は、有機化合物としてタンパク質を含む試料Ｗについて温度変化をさせながら得られたスペクトルに基づき、その変性温度を特定するためのものである。より具体的には、前記タンパク質は抗体であり、試料Ｗは抗体医薬品の溶液である。また、スペクトルはラマン分光スペクトルである。
【００２７】
この有機化合物分析システム２００は、図１に示すようにラマン分光スペクトルの測定を行う測定装置１０１と、前記測定装置１０１で得られたデータに基づいて抗体で温度変化により生じている微小構造変化に由来する変性温度を算出する前記有機化合物分析装置１００と、からなる。
【００２８】
前記測定装置１０１は、試料Ｗである抗体医薬品の溶液が収容されたセルに対して所定の波長のレーザ光を照射する光源１２と、前記レーザ光により試料Ｗから発生するラマン散乱光を分光する分光器１３と、前記分光器１３を通過したラマン散乱光を検出し、その強度を出力する検出器１４と、前記試料Ｗの温度を加熱するヒータ１１と、前記光源１２、前記分光器１３、前記検出器１４、前記ヒータ１１の制御を司る制御器と、を備えたものである。
【００２９】
前記制御器は、前記ヒータ１１により試料Ｗを予め定められた温度となるようにフィードバック制御し、予め定められた温度となった時点で前記光源１２にレーザ光を射出させ、その温度でラマン分光スペクトルを前記検出器１４から前記有機化合物分析装置１００へと出力させるように構成してある。
【００３０】
前記有機化合物分析装置１００は、ＣＰＵ、メモリ、Ａ／Ｄ・Ｄ／Ａコンバータ、ディスプレイやキーボード等の入出力手段等を備えたいわゆるコンピュータであって、メモリに格納された有機化合物分析装置１００用プログラムが実行されて、各種機器と協業することにより各種機能が実現されるものである。より具体的には、前記有機化合物分析装置１００は、前記測定装置１０１で測定されたそれぞれ外部刺激条件である測定温度の異なるラマン分光スペクトルに対してＰＣＡ（主成分分析）を行い、算出されるスコアの温度変化に基づいて抗体において生じた微小な構造変化の変性温度を特定する。すなわち、第１実施形態の有機化合物分析装置１００は、少なくとも実測データ記憶部２、評価基準ベクトル設定部３、スコア算出部４、変化特徴点特定部５、抽出データ記憶部５４としての機能を発揮するように構成してある。
【００３１】
各部について詳述する。
【００３２】
前記実測データ記憶部２は、前記測定装置１０１から出力される実測スペクトルであるラマン分光スペクトルをその測定温度と対にした実測データとして記憶するものである。すなわち、ある温度で測定されたラマン分光スペクトルは複数のラマンシフトにおけるスペクトル強度を要素とする行ベクトルデータとして取り扱うことができる。本実施形態では、ＰＣＡのために各ラマンスペクトル強度については正規化してあり、複数のラマン分光スペクトルを測定温度が低いほうから順番に行ごとに並べたスペクトル行列として前記実測データ記憶部２に記憶してある。すなわち、Ｎ通りの測定温度においてＭ点のラマンシフトでラマン分光スペクトル強度が測定されている場合には、以下の式のような行列データとしとして各温度でのラマン分光スペクトルの実測データが記憶されることになる。
【００３３】
【数１】
2018034205.tif 000003
ここで、Ａ：Ｎ行Ｍ列のスペクトル行列であり、各行が各測定温度でのラマン分光スペクトルを表す、xij：測定温度Ｔ（ｉ）ラマンシフトＲＳ（ｊ）におけるラマン分光スペクトル強度である。なお、ｉの値が小さいほどラマン分光スペクトルが測定された測定温度は低くなるように並べてある。
【００３４】
前記評価基準ベクトル設定部３、及び、前記スコア算出部４はいわゆるＰＣＡの機能を司るものである。より具体的には、前記評価基準ベクトル設定部３は、前記実測スペクトルについてスペクトル強度が測定された波数の測定点数と同じ要素数を有する評価基準ベクトルを設定するものである。この第１実施形態では測定されたラマン分光スペクトルが複数のタンパク質や構造に由来する複数の基準ラマン分光スペクトルの重ね合わせであるとして、各基準分光スペクトルを代表するように評価基準ベクトルが設定されるようにしてある。すなわち、この第１実施形態では前記評価基準ベクトル設定部３は、図２に示すように各測定温度のラマン分光スペクトルを要素とするスペクトル行列に基づいてＰＣＡローディングとして第１〜第３のＰＣＡローディングを算出して評価基準ベクトルとして設定する。より具体的にはスペクトル行列をＡとした場合にＡの左側からＡの転置行列ＡＴをかけて算出される分散共分散行列ＡＴＡの固有ベクトルがＰＣＡローディングとして算出される。すなわち、ＰＣＡのアルゴリズムに基づいて各測定データの分散が最も大きくなるようにＰＣＡローディングが設定される。ここで、各ＰＣＡローディングは測定が行われたラマンシフトの数Ｍと同じ数の要素数を有する列ベクトルデータとして表現される。なお、第１ＰＣＡローディングが最も寄与率が高く、第２ＰＣＡローディング、第３ＰＣＡローディングとなるほど寄与率が小さい。なお、第１実施形態では第１ＰＣＡローディングは抗体及び変性途中又は変性後の成分のすべてについて影響を平均化したスペクトルを評価するための第１評価軸であるとも考えられる。また、第２ＰＣＡローディングは、抗体において変性が完了した成分に起因するスペクトルを評価するための第２評価軸であり、第３ＰＣＡローディングは抗体において微小変性途中の成分に起因するスペクトルを評価する第３評価軸であるとも解釈できる。
【００３５】
前記スコア算出部４は、前記ラマン分光スペクトルが測定された外部刺激条件である温度ごとに、前記各ＰＣＡローディングに対応するスコアを算出するものである。このスコアは、前記ＰＣＡローディングと前記スペクトル行列とに基づいた値である。さらに言い換えると、このスコアはＰＣＡローディングにより設定される１軸の評価軸に対して各測定温度で測定されたＮ次元のデータであるラマン分光スペクトルを投影し、１次元の量として評価できるようにした値である。第１実施形態では第１〜第３ＰＣＡローディングにそれぞれ対応する第１〜第３スコアを算出する。すなわち、各ＰＣＡローディングはスペクトル行列Ａに基づく分散共分散行列ＡＴＡの固有ベクトルであることから、各スコアを用いて以下のようにスペクトル行列は表される。
【００３６】
【数２】
2018034205.tif 000004
ここで、ｔｉは第ｉスコアを表す要素数Ｎの列ベクトル、ＰｉＴは第ｉＰＣＡローディングを表す行列Ｐｉの転置置行列であり、要素数Ｍの行ベクトルである。本実施形態では第３成分までを有効としているが、さらに多数のスコアとローディングの積でスペクトル行列を表すこともできる。
【００３７】
さらに、各スコアを示す列ベクトルについては以下のようにスペクトル行列ＡにＰＣＡローディングを右側から掛けることで算出される。
【００３８】
【数３】
2018034205.tif 000005
ここで、ｔnｉは測定温度ＴＥ（n）（１≦ｎ≦Ｎの整数）における第ｉＰＣＡローディングＰｉに対応する第ｉスコアである。
【００３９】
このように前記スコア算出部４は、各測定温度における前記ラマン分光スペクトルと前記各ＰＣＡローディングの内積に基づいて各測定温度における前記スコアとして算出するように構成してある。各測定温度に対して前記スコアはスカラ―量として１つずつ算出されるので、ラマン分光スペクトルが測定された時の測定温度と、その測定温度におけるラマン分光スペクトルに基づいて算出されたスコアの２次元のグラフを描くことができる。
【００４０】
前記変化特徴点特定部５は、第２ＰＣＡローディング又は第３ＰＣＡローティングに対応する第２スコア又は第３スコアの温度に対する変化に基づいて、前記抗体の変化特徴点である変性温度を算出するものである。第１実施形態の変化特徴点特定部５は変化特徴点として変性温度の算出し、その算出された変性温度に基づいて変性が完了していない状態を反映している実測データを抽出し、再びＰＣＡを繰り返させることで最終的な変性温度の算出精度を向上させるようにしてある。
【００４１】
より具体的には前記変化特徴点特定部５は、温度−スコアデータ記憶部５１と、オンセット温度算出部と、データ抽出部５３と、抽出後データ記憶部５４と、変性温度出力部５５とを備えている。
【００４２】
前記温度−スコアデータ記憶部５１は、前記スコア算出部４で算出される第１〜第３スコアのそれぞれについて、スコアの算出ために用いられたラマン分光スペクトルが測定された時の測定温度を対にした温度−スコアデータを記憶するものである。
【００４３】
前記オンセット温度算出部５２は、前記実測データから算出されており、変性完了後の成分のスペクトルを評価する第２ＰＣＡローディングにより算出される前記第２スコアの温度に対する変化に基づいて、前記抗体の変性が完了した成分が出現し始める温度であるオンセット温度を算出する。例えば、図３の第２スコアの温度変化グラフに示されるように第２スコアが一定値に保たれている状態が終了する点を探索し、その温度をオンセット温度として出力するように前記オンセット温度算出部５２は構成してある。例えば、温度が上昇する順番に前記第２スコアを並べた場合に、隣り合うスコアの値の差又は比が所定値よりも大きくなった温度がオンセット温度として出力される。
【００４４】
前記データ抽出部５３は、前記実測データ記憶部２から第２スコアから求められた前記オンセット温度よりも低い温度で測定されたラマン分光スペクトルを含む実測データを抽出後データとして抽出するものである。すなわち、図４に示されるように変性が始まる前から第２スコアから求められたオンセット温度までの領域に属するラマン分光スペクトルのデータだけが抽出されることになる。例えば前記データ抽出部５３は、図５におけるラマン分光スペクトルのイメージに示されるようにオンセット温度よりも高い温度で測定された点線で示されるラマン分光スペクトル以外のラマン分光スペクトルを抽出する。
【００４５】
前記抽出後データ記憶部は、前記データ抽出部５３で抽出された抽出後データを記憶するものである。図５に示されるようにこの抽出後データ記憶部に記憶されているラマン分光スペクトルは前記評価基準ベクトル設定部３及び前記スコア算出部４により再度ＰＣＡが実行されて第１スコア、第２スコア、第３スコアが再計算される。
【００４６】
前記変性温度出力部５５は、前記抽出後データから前記スコア算出部４が算出する第３スコアの温度に対する変化に基づいて変性温度を算出するものである。
【００４７】
例えば図６に示されるように第３スコアにおいて温度が上昇するにつれて一定値から増加し始める温度であるオンセット温度と、変性が終了し第３スコアの増加が終了して再び減少に転じる極値の温度である変性終端温度とを検出し、その中点温度を変性温度として出力するように前記変性温度出力部５５は構成してある。なお、第２スコアに基づいて前記変性温度出力部５５が変性温度を算出するようにしてもよい。例えば図４に示されるように第２スコアにおいて値が飽和し略一定値になっている箇所を変性終端温度とし、スコアが上昇し始める点をオンセット温度としてその中点温度を変性温度として前記変性温度出力部５５が動作するようにしてもよい。
【００４８】
このように構成された有機化合物分析システム２００の動作について図７乃至図９のフローチャートを参照しながら説明する。なお、図７は実測データを作成するための測定装置１０１の動作について示したフローチャートである。図８は実測データに基づいてＰＣＡを行い、抽出後データを得るための第２スコアに基づくオンセット温度を得るまでの有機化合物分析装置１００の動作を示したフローチャートである。図９は抽出後データに基づいてＰＣＡ行い、抗体において生じた温度変化による微小構造の変性温度を算出するまでの有機化合物分析装置１００の動作を示しフローチャートである。
【００４９】
図７に示されるように前記測定装置１０１の前記制御器は前記ヒータ１１により試料Ｗを昇温させ、予め定められた測定温度Ｔ（Ｎ）へ到達させる（ステップＳ１）。次に前記制御器１５は、前記光源１２からレーザ光を射出させて、試料Ｗでラマン散乱光を発生させる。この試料Ｗにおいて発生したラマン散乱光は前記分光器１３で分光されて前記検出器１４で検出される。前記検出器１４の出力はラマンシフトと測定されたラマンスペクトル強度の情報とからなるラマン散乱光スペクトルとして測定される（ステップＳ２）。に測定されたラマン散乱光スペクトルは、測定温度Ｔ（Ｎ）とともに対にして実測データとして前記有機化合物分析装置１００の前記実測データ記憶部２へと送信され記憶される（ステップＳ３）。その後、試料Ｗの温度が予め定められている最終温度Ｔ（Ｎ）に達しているかどうかの判定が行われ（ステップＳ４）、最終温度に達していない場合にはステップＳ１〜Ｓ４が繰り返される。このようにして前記測定装置１０１による全ての測定温度においてラマン分光スペクトルを測定が完了し、前記実測データ記憶部２に十分な量のデータが貯えられると前記有機化合物分析装置１００がＰＣＡによる分析を開始する。
【００５０】
すなわち、図８に示されるように前記有機化合物分析装置１００では、まず前記実測データ記憶部２から各測定温度で測定された全てのラマン分光スペクトルからなるスペクトル行列が読みだされる（ステップＳ５）。次に前記評価基準ベクトル設定部３及び前記スコア算出部４によるＰＣＡが読みだされたスペクトル行列に対して実施される（ステップＳ６）。まず、前記評価基準ベクトル設定部３により第１〜第３ＰＣＡローディングがＰＣＡのアルゴリズムにより読み出されたスペクトル行列から算出される分散共分散行列の固有ベクトルとして算出される。（ステップＳ７）。次に前記スコア算出部４が、読み出されているスペクトル行列に対して第１〜第３ＰＣＡローディングのそれぞれを右側から掛けることで第１〜第３スコアが算出される（ステップＳ８）。算出された第１〜第３スコアは第１行から第Ｎ行までの値に対して順番に測定温度Ｔ（１）からＴ（Ｎ）が紐づけられて前記温度−スコアデータ記憶部５１に記憶される（ステップＳ９）。
【００５１】
すべての測定温度のラマン散乱光スペクトルについてスコアの算出が完了し、前記温度−スコアデータ記憶部５１に記憶されると、前記オンセット温度算出部５２は前記温度−スコアデータ記憶部５１から第２スコアと対応する温度を読み出し（ステップＳ１０）、変性完了後の成分が増加し始める温度を例えば変化率が所定値以上変化している点を探索してオンセット温度を算出する。オンセット温度に相当する測定温度のインデックスが算出されて（ステップＳ１１）、前記データ抽出部５３は前記実測データ記憶部２からオンセット温度よりも低い温度で測定されたラマン散乱光スペクトルを抽出し（ステップＳ１２）、前記抽出後データ記憶部に記憶させる（ステップＳ１３）。
【００５２】
さらに前記有機化合物分析装置１００は図９に示されるようにステップＳ１３で抽出され、微小な構造変化が抗体に生じている間に測定されたラマン散乱光スペクトルだけからなるスペクトル行列に対してＰＣＡを実行し、最終的な変性温度を算出する。すなわち、前記抽出データ記憶部５４から読み出される抽出後データに対してステップＳ５〜ステップＳ９と同様の処理がステップＳ１４〜ステップＳ１８で繰り返される。そして、最後に前記変性温度出力部５５が前記温度−スコアデータ記憶部５１から第３スコアを含む温度−スコアデータを読み出し（ステップＳ１９）、により第３スコアの温度変化に基づいて変性温度が算出されて分析が終了となる（ステップＳ２０）。
【００５３】
このように構成された第１実施形態の有機化合物分析システム２００及び有機化合物分析装置１００によれば、ＰＣＡにより測定されたラマン分光スペクトルにおいてピークの波数だけでなく、全波数領域におけるスペクトル強度の情報を考慮して変性温度を算出することができる。このためピーク以外において埋もれている微小な構造変化に関する情報を取得し、変性温度の算出精度に反映させることができる。
【００５４】
また、ＰＣＡを実行することで温度変化により抗体において生じる構造変化に起因するラマン散乱光スペクトルの変化が良く分からない場合でも、その変化が反映されたローディングを適切に設定できる。したがって、予備実験等を行い、測定対象としたい構造のモデルとなるラマン分光スペクトルを取得しておく必要がない。
【００５５】
さらに、ラマン散乱光スペクトルを用いているので試料Ｗが高濃度であっても分析に必要とされるスペクトル強度を十分に得ることができる。
【００５６】
これらのことから、熱変性前期における微小な構造変化に由来する変性温度を高精度に算出することができ、この変性温度に基づいて温度変化により抗体医薬品中の抗体に生じている微小な構造変化に関する分析を実現できる。
【００５７】
次に第２実施形態に係る有機化合物分析装置１００について説明する。
【００５８】
第２実施形態の有機化合物分析装置１００は、第１実施形態の有機化合物分析装置１００と比較して変性温度の算出のためにスペクトルとして赤外吸収スペクトルを用いている点と、前記評価基準ベクトル設定部３が、ＰＣＡではなく既知のモデルスペクトルに基づいて評価基準ベクトルを設定する点が異なっている。例えば実測スペクトルとして測定されている測定点数と同数の別のスペクトルを評価儀順ベクトルとして設定してある。このようなものであっても、ピーク以外のスペクトル強度の情報を用いて温度変化に伴いタンパク質の微小な構造変化を反映した変性温度を高精度に算出することができる。なお、赤外線救出スペクトル以外でも蛍光スペクトルやＣＤスペクトル等、タンパク質から得られる各種スペクトルを複数の測定温度で測定し、そのスペクトル行列から変性温度を得るようにしてもよい。
【００５９】
その他の実施形態について説明する。
【００６０】
本発明の変性温度の測定対象は抗体に限られるものではなく、タンパク質であってもよい。また、ローディング、及び、スコアを算出するためのアルゴリズムはＰＣＡに限られない。例えば、モデルスペクトルを用意しなくてもよいようにするにはＣＡ，ＮＬＭ、ｋＮＮ、ＭＣＲ等のアルゴリズムを用いればよく、モデルスペクトルを用意する場合にはＭＬＲ，ＰＣＲ，ＰＬＳ、ＮＮ、ＬＤＡ等のアルゴリズムを用いてもよい。
【００６１】
評価基準ベクトル設定部、及び、スコア算出部は測定対象とするものだけを算出するようにしてもよい。例えば第２ＰＣＡローディングと第２スコアだけを算出する、あるいは、第３ＰＣＡローディングと第３スコアだけを算出するように有機化合物分析装置を構成してもよい。また、第１実施形態のように実測データから一部を抽出した抽出後データで変性温度を算出するのではなく、実測データから直に変性温度を算出するようにしてもよい。また、タンパク質の種類や抗体の種類によっては第２スコア又は第３スコアの何れに対して変性前期の微小な構造に由来するスコアの変化が生じるかは変化する事があり得る。したがって、オンセット温度や変性温度を測定するために用いるスコアは適宜第２スコア、第３スコアのいずれかを選べばよいし、さらに別の第４スコア等を用いても構わない。
【００６２】
前記各実施形態では、スペクトルの測定対象はタンパク質であったがタンパク質以外の有機化合物であってもよい。例えば、有機化合物としては、生体試料やアミノ酸などであってもよい。外部刺激条件は温度に限られるものではなく、その他のパラメータであってもよい。例えばタンパク質の変性に着目するのであれば、外部刺激条件は、試料に添加された溶質の濃度、ｐＨ、界面における試料の存在時間等を変化させてスペクトルをそれぞれ測定すればよい。タンパク質に添加されて変性を生じさせる溶質の具体例としてはグアジニン塩や尿素を挙げることができる。この場合、溶質の濃度変化に対してスコアが変化し始める濃度と、スコアの変化が終了する濃度との中点濃度を変化特徴点として前記変化特徴点特定部が特定するように構成さればよい。また、ｐＨを変化させてタンパク質を変性させる場合には、試料に添加された塩酸や水酸化ナトリウムの濃度やｐＨ自体の値の変化に対してスコアが変化し始める点とスコアが終了する点を探し、その中点を変化特徴点として特定してもよい。加えて、試料であるタンパク質が気液界面や固液界面に存在するとタンパク質自体が界面活性剤として作用し、自身が変性することになるが、タンパク質を界面に滞在させている時間に対するスコアの変化に基づいて変化特徴点を特定するようにしてもよい。なお、変化特徴点の特定方法は、前記各実施形態に示したものに限られず、例えばスコアの変化が生じ始める点を変化特徴点としてもよいし、スコアの変化が終了する点を変化特徴点として特定するようにしてもよい。
【００６３】
評価基準ベクトルについても前記各実施形態に示したものに限られず、様々な方法で設定してもよい。スコアについてはスペクトルと評価基準ベクトルの内積を直接演算するものではなく、個別に演算したり、結果的に内積と同じ値になるように演算したりしてもよい。
【００６４】
その他、本発明の趣旨に反しない限りにおいて様々な実施形態の変形や組み合わせを行っても構わない。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明であれば、例えばタンパク質の熱変性前期における微小な構造変化を反映した熱変性温度を高精度に特定することができる有機化合物分析装置を提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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