(57)【要約】【課題】  本発明は、毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚を提供することを課題とした。【解決手段】  毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚の製造方法であって、前記製造方法は、下記の各ステップ；（Ａ）：真皮層および表皮層を有する人工皮膚、または、真皮層のみを有する人工皮膚を準備するステップ；および、（Ｂ）：ステップ（Ａ）で準備した人工皮膚に、単離された毛包を移植するステップ；を含み、ここで、前記単離された毛包は、皮脂腺を有するものであり、前記単離された毛包は、前記人工皮膚の前記真皮層の表面と、前記単離された毛包の毛穴部の位置とが一致するように、前記人工皮膚に移植される、ことを特徴とする、方法を提供する。【選択図】図１Ａ
2017221870.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚の製造方法であって、
前記製造方法は、下記の各ステップ
（Ａ）：真皮層および表皮層を有する人工皮膚、または、真皮層のみを有する人工皮膚を準備するステップ；および、
（Ｂ）：ステップ（Ａ）で準備した人工皮膚に、単離された毛包を移植するステップ；
を含み、ここで、
前記単離された毛包は、皮脂腺を有するものであり、
前記単離された毛包は、前記人工皮膚の前記真皮層の表面と、前記単離された毛包の毛穴部の位置とが一致するように、前記人工皮膚に移植される、
ことを特徴とする、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記ステップ（Ａ）において、真皮層のみを有する人工皮膚が使用され、
前記ステップ（Ｂ）の後に、以下のステップ
（Ｃ）：前記人工皮膚の前記真皮層上に、表皮層を形成させるステップ；
を含むことを特徴とする、
方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記ステップ（Ａ）における人工皮膚の真皮層は、線維芽細胞、コラーゲン、および、培養液を含む混合液をゲル化させることにより形成されたものである、
ことを特徴とする、
方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記ステップ（Ａ）における人工皮膚の真皮層は、線維芽細胞、コラーゲン、および、培養液を含む混合液をゲル化させた後、さらに、コラーゲンおよび培養液を含む混合液を添加し、ゲル化させることを少なくとも１回以上繰り返すことにより形成されたものである、
ことを特徴とする、
方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
前記ステップ（Ａ）における「真皮層および表皮層を有する人工皮膚」の表皮層は、前記真皮層の表面に、角化細胞および培養液を含む混合液を適用し、これらを培養することにより形成されたものである、
ことを特徴とする、
方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法であって、
前記ステップ（Ｃ）は、前記人工皮膚の前記真皮層の表面に、角化細胞および培養液を含む混合液を適用し、これらを培養することにより、表皮層を形成させるステップ、
であることを特徴とする、
方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記ステップ（Ａ）が、
（Ａ）：真皮層、表皮層、および、脂肪組織層を有する人工皮膚を準備するステップ、であることを特徴とする、
方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記ステップ（Ａ）の後、かつ、前記ステップ（Ｂ）の前に、以下のステップ
（Ａ’）：ステップ（Ｂ）において単離された毛包が移植される人工皮膚の部位に、脂肪前駆細胞を埋め込むステップ；
を含むことを特徴とする、
方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、前記単離された毛包は、動物の皮膚から単離された毛包であることを特徴とする、
方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記動物がヒトであることを特徴とする、
方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、前記単離された毛包は、人工的に誘導された再生毛包であることを特徴とする、
方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記再生毛包は、
間葉系細胞から実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮系細胞から実質的に構成される第２の細胞集合体とを密着させて支持体内部で培養することにより製造される再生毛包であることを特徴とする、
方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記間葉系細胞または前記上皮系細胞の少なくともいずれかが、未分化細胞を誘導することにより得られたものであることを特徴とする、
方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、前記間葉系細胞または前記上皮系細胞の少なくともいずれかが、動物の毛包由来の単一化された細胞であることを特徴とする、
方法。
【請求項１５】
毛包、皮脂腺を有する人工皮膚であって、
さらに、毛穴を有することを特徴とする、
人工皮膚。
【請求項１６】
請求項１５に記載の人工皮膚であって、
線維芽細胞、コラーゲン、および培養液を含むゲルからなる真皮層、
前記真皮層の表面に形成され、実質的に角化細胞からなる表皮層、および、
皮脂腺を有する毛包、を含み、
前記毛包は、前記表皮層を貫いて前記真皮層へ埋没しており、
前記毛包の毛穴部が、前記表皮層と接続している、
人工皮膚。
【請求項１７】
請求項１６に記載の人工皮膚であって、
前記真皮層の下部に、さらに脂肪組織層を有することを特徴とする、
人工皮膚。
【請求項１８】
請求項１６に記載の人工皮膚であって、
前記毛包が、前記真皮層中で脂肪前駆細胞に覆われていることを特徴とする、
人工皮膚。
【請求項１９】
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の人工皮膚であって、
前記人工皮膚は、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法によって作製されることを特徴とする、
人工皮膚。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工皮膚の製造方法、および、当該方法により製造される人工皮膚に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、欧州を中心として、動物愛護の観点から動物実験を廃止し、医薬品や化粧品の薬効評価や安全性評価を動物実験代替法で行うための技術開発が進められている。また、近年、生体より取り出した細胞を人為的に増殖させるための細胞培養技術の開発の進展により、様々な臓器や組織の生理的機能を保持しつつ生体外培養することが可能となってきている。その結果、ヒト由来培養細胞を用いた各種の試験評価法が開発され、これらの代替評価法を用いて、医薬品候補物質が人体に対してどのような影響を与えるか、またどのような投与量により所望の効果や有害作用を及ぼすかを調べることも可能となってきている。さらに、培養細胞、細胞足場材料および培養液を組み合わせることによる人工皮膚の製造方法の開発が進められ、Ｈ．Ｇｒｅｅｎ博士により、天然の皮膚と同等の機能と構造を持つ三次元培養皮膚が発明されたことを契機として、皮膚科学分野は動物実験代替法の開発における草分けとなっている。これまでにも、皮膚に対する医薬品や化粧品の薬効評価や安全性評価を、実験動物を用いずに行うための、人工皮膚の開発と製品化、および、人工皮膚を用いた動物実験代替法が提案されている（例えば、特許文献１）。【０００３】
表皮と真皮組織および皮下組織より構成される皮膚は、体の表面をくまなく覆い、体内と外界を隔てている巨大な器官である。皮膚には、毛包、皮脂腺、および汗腺といった多様な外胚葉性器官が分布し、これらが構造的かつ機能的に連携することにより外皮系（皮膚器官系）を構成している。外皮系は毛を伸ばすことにより様々な外的侵害から体表を防御し、皮脂や汗の分泌により体表の環境調節や老廃物の排泄を行い、さらに循環器系や神経系といった他の器官系とも連携することにより、体温調節や感覚受容といった多彩な生理的機能を担っている。皮膚付属器により皮膚表面に分泌される種々の水溶性および脂溶性成分は、強固な角化重層上皮である表皮層の物質透過性や水分含有量を変化させることから、アレルギー性疾患や加齢にともなう審美的変化との関連が示唆されている。【０００４】
しかし、これまで提案されている人工皮膚は、単純に表皮層と真皮層を含むのみで皮膚付属器官を有しないものや、皮膚付属器官様の構造（例えば毛包様の構造）を含むものであっても、正常な皮膚の構造および機能を再現するものではなかった。機能的な皮膚付属器官を有しない人工皮膚は、皮脂等による皮膚のバリア機能が存在しないため、実験動物の代替物としての使用には限界がある。【０００５】
例えば、特許文献１では、収縮剤細胞（例えば線維芽細胞）を含むコラーゲンマトリックス層と、組織付属器官を構成する細胞（例えば毛乳頭細胞）を含むコラーゲンマトリックス層とを重層させて培養することにより、培養物内に毛包様の構造物が発生し得ることを示している。しかし、特許文献１においては、単に、外形上毛包に似た構造物が発生したことが示されているに過ぎず、皮膚付属器官の正常な構造および機能を再現した人工皮膚は示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−１３６９７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、動物の皮膚のバリア機能を再現し得る人工皮膚を製造するために鋭意研究を重ねた結果、機能的な皮膚付属器官を有する人工皮膚の製造に成功した。【０００９】
すなわち本発明は、一実施態様において、
毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚の製造方法であって、
前記製造方法は、下記の各ステップ
（Ａ）：真皮層および表皮層を有する人工皮膚、または、真皮層のみを有する人工皮膚を準備するステップ；および、
（Ｂ）：ステップ（Ａ）で準備した人工皮膚に、単離された毛包を移植するステップ；
を含み、ここで、
前記単離された毛包は、皮脂腺を有するものであり、
前記単離された毛包は、前記人工皮膚の前記真皮層の表面と、前記単離された毛包の毛穴部の位置とが一致するように、前記人工皮膚に移植される、
ことを特徴とする、方法に関する。【００１０】
また、本発明の方法は、一実施態様において、
前記ステップ（Ａ）において、真皮層のみを有する人工皮膚が使用され、
前記ステップ（Ｂ）の後に、以下のステップ
（Ｃ）：前記人工皮膚の前記真皮層上に、表皮層を形成させるステップ；
を含むことを特徴とする。【００１１】
また、本発明の方法は、一実施態様において、
前記ステップ（Ａ）における人工皮膚の真皮層は、線維芽細胞、コラーゲン、および、培養液を含む混合液をゲル化させることにより形成されたものである、ことを特徴とする。【００１２】
また、本発明の方法は、一実施態様において、
前記ステップ（Ａ）における人工皮膚の真皮層は、線維芽細胞、コラーゲン、および、培養液を含む混合液をゲル化させた後、さらに、コラーゲンおよび培養液を含む混合液を添加し、ゲル化させることを少なくとも１回以上繰り返すことにより形成されたものである、ことを特徴とする。【００１３】
また、本発明の方法は、一実施態様において、
前記ステップ（Ａ）における「真皮層および表皮層を有する人工皮膚」の表皮層は、前記真皮層の表面に、角化細胞および培養液を含む混合液を適用し、これらを培養することにより形成されたものである、ことを特徴とする。【００１４】
また、本発明の方法は、一実施態様において、
前記ステップ（Ｃ）は、前記人工皮膚の前記真皮層の表面に、角化細胞および培養液を含む混合液を適用し、これらを培養することにより、前記表皮層を形成させるステップ、であることを特徴とする。【００１５】
また、本発明の方法は、一実施態様において、前記ステップ（Ａ）が、
（Ａ）：真皮層、表皮層、および、脂肪組織層を有する人工皮膚を準備するステップ、であることを特徴とする。【００１６】
また、本発明の方法は、一実施態様において、前記ステップ（Ａ）の後、かつ、前記ステップ（Ｂ）の前に、以下のステップ
（Ａ’）：ステップ（Ｂ）において単離された毛包が移植される人工皮膚の部位に、脂肪前駆細胞を埋め込むステップ；
を含むことを特徴とする。【００１７】
また、本発明の方法は、一実施態様において、前記単離された毛包が、動物の皮膚から単離された毛包であることを特徴とする。【００１８】
また、本発明の方法は、一実施態様において、前記単離された毛包が、ヒトの皮膚から単離された毛包であることを特徴とする。【００１９】
また、本発明の方法は、一実施態様において、前記単離された毛包が、人工的に誘導された再生毛包であることを特徴とする。【００２０】
また、本発明の方法は、一実施態様において、前記再生毛包が、間葉系細胞から実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮系細胞から実質的に構成される第２の細胞集合体とを密着させて支持体内部で培養することにより製造される再生毛包であることを特徴とする。【００２１】
また、本発明の方法は、一実施態様において、前記間葉系細胞または前記上皮系細胞の少なくともいずれかが、未分化細胞を誘導することにより得られたものであることを特徴とする。【００２２】
また、本発明の方法は、一実施態様において、前記間葉系細胞または前記上皮系細胞の少なくともいずれかが、動物の毛包由来の単一化された細胞であることを特徴とする。【００２３】
本発明は、他の実施形態において、毛包、皮脂腺を有する人工皮膚であって、さらに、毛穴を有することを特徴とする、人工皮膚に関する。【００２４】
また、本発明は、一実施形態において、
線維芽細胞、コラーゲン、および培養液を含むゲルからなる真皮層、
前記真皮層の表面に形成され、実質的に角化細胞からなる表皮層、および、
皮脂腺を有する毛包、を含み、
前記毛包は、前記表皮層を貫いて前記真皮層へ埋没しており、
前記毛包の毛穴部が、前記表皮層と接続している、
人工皮膚に関する。【００２５】
また、本発明の人工皮膚は、一実施形態において、前記真皮層の下部に、さらに脂肪組織層を有することを特徴とする。【００２６】
また、本発明の人工皮膚は、一実施形態において、前記毛包が、前記真皮層中で脂肪前駆細胞に覆われていることを特徴とする。【００２７】
また、本発明は、一実施形態において、上記に述べた本発明の人工皮膚の製造方法によって製造される人工皮膚であることを特徴とする。【００２８】
上記に述べた本発明の一または複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の方法によれば、機能的な毛包、皮脂腺および毛穴を備え、正常皮膚のバリア機能を再現した人工皮膚を製造することができる。これにより、医薬品や化粧品の薬効評価や安全性評価（特に、毛に関する医薬品や化粧品の薬効評価や安全性評価）に有用な人工皮膚を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、本発明の方法によって製造される、毛包、皮脂腺を有し、これらと表皮層とが毛穴部を介して連結した人工皮膚の模式図である。図１Ａは毛包などの皮膚付属器官を組み込んだ人工皮膚の三次元的な模式図である。図１Ｂは図１Ａの四角で示した部分の毛包を含む断面の模式図を示す。人工皮膚の毛包および皮脂腺の開口部は、人工皮膚の角化表皮層と連続しており、その表面より毛を萌出し、体表面へと皮脂分泌が行われる。
【図２】図２は、本発明の人工皮膚の製造方法の２つの実施態様を示した図である。本発明の方法は、人工皮膚の角化表皮層形成および皮脂腺を含む毛包の組み込み時期により、毛包組み込み後に表皮形成を行う方法と、表皮層形成後に毛包を組み込む方法の二種に大別される。
【図３】図３は、本発明の方法の一実施態様により、真皮層のみを有する人工皮膚に単離された毛包を移植し、その後表皮層を形成させ、培養した結果を示す。図３Ａは、真皮層のみを有する人工皮膚（細胞含有コラーゲンゲル）の形成をＤａｙ０として、Ｄａｙ１に人工真皮層内に成体マウス頬ヒゲ毛包を組み込み、同日中に培養ケラチノサイトを人工真皮上に重層播種して表皮層の形成を実施し、Ｄａｙ８まで観察を行った際の写真である。図３Ｂは、図３Ａの手順において、移植する毛包としてマウス頬ヒゲの毛包を用いた場合の人工皮膚の組織像を示す。人工皮膚に組み込んだ毛包を含む組織の連続切片の弱拡大像を写真左上下に示し、左上および左下の四角にて示した部分の拡大写真をａ−ｃに示す。拡大写真の部位は弱拡大中のａ−ｃの記号にて示す。毛包の毛穴部の上皮と人工皮膚の角化表皮層が連続している部分をａの矢印にて示し、毛球部はｂの矢尻にて示す。図３Ｃは、図３Ａの手順において、マウス体毛の毛包を組み込み、７日間培養した後の人工皮膚より連続切片を作製して観察した組織像を上下写真として示す。写真左は弱拡大像であり、四角にて示した領域の拡大像を写真右の上下にそれぞれ示す。拡大像の矢印部において人工皮膚へ組み込まれた毛包と、人工皮膚の角化表皮層とが毛穴部を介して接続している。また、写真右下段の毛球部のＨＥ像に矢尻にて示す毛球部は組織学的に健全である。
【図４】図４は、本発明の方法の一実施態様により、真皮層および表皮層を有する人工皮膚に単離された毛包を移植し、培養した結果を示す。図４Ａは、真皮層および表皮層を有する人工皮膚（細胞含有コラーゲンゲル）の形成をＤａｙ０として、Ｄａｙ４に毛包（マウス頬ヒゲの毛包）の移植を実施し、Ｄａｙ１０まで観察を行った際の写真である。図４Ｂは、毛包移植後の人工皮膚の組織像（Ｈ＆Ｅ染色）を示す。矢印部において、移植した毛包の毛穴部と人工皮膚の表皮層とが接続しており、矢頭部において、毛母細胞と毛乳頭細胞が生存しており、毛球部は組織学的に健全であることが示されている。
【図５】図５は、人工皮膚へ組み込まれた毛包より成長した毛幹を経時的に観察して画像解析により毛幹長を計測した結果を示す。図５Ａは、成体マウス頬ヒゲの毛包を人工皮膚へ移植した後に表皮層を形成させた場合における毛幹成長の観察結果である。人工皮膚へ組み込んだ複数の毛包をそれぞれ識別してそれぞれの毛幹成長を経時的に追跡した。成長した毛幹を赤矢印にて示し、成長しなかった毛幹を白矢印にて示す。図５Ｂは、成体マウス体毛の毛包を人工皮膚へ移植した後に表皮層を形成させた場合における毛幹成長の観察結果である。マウス頬ヒゲにおける経時的観察と同様に、人工皮膚に組み込んだ毛包を識別して、毛成長した毛包（赤矢印）の毛幹長を計測した。図５Ｃは、ヒト頭髪の毛包を人工皮膚へ移植した後に表皮層を形成させた場合における毛幹成長の観察結果である。マウス毛包と同様に毛幹長を計測してプロットを行った。
【図６】図６は、真皮層および表皮層を有する人工皮膚へ毛包を移植した後の毛幹成長を観察した結果を示す。毛包の移植前に毛幹の実体顕微鏡写真を撮影し、毛球部最上端よりクラブヘアーと成長期毛幹の長さを計測し、人工皮膚への移植後３、６、１２日目に人工皮膚より毛幹と毛包を摘出して、同様に実体顕微鏡による撮影を行って毛幹成長量を計測した。クラブヘアーの長さを内部標準として成長期毛の伸長量を計測プロットした。
【図７】図７は、マウス頬ヒゲ毛包の器官培養における経時変化を示す。成長期のマウス頬ヒゲを採取してコラーゲン鞘を含むインタクト毛包（上段）および可変領域のコラーゲン鞘を除去した毛包（下段）を作製した。それぞれの条件の毛包を６ｃｍプラスチック培養皿の底面に薄層コラーゲンゲルにて接着し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）中にて５％ＣＯ２環境下において浸漬培養を３日目まで行った。培養開始時（Ｄａｙ  ０）より毎日実体顕微鏡により経過観察を行った。矢印は毛幹先端を示し、矢尻は毛球部の位置を示す。右列には培養３日目の毛球部拡大像を示す。点腺は毛球部の間葉組織境界を示す。毛球部位置と毛球部の間葉組織境界のズレは退行期または休止期であることを示す。
【図８】図８は、表皮および真皮のみの人工皮膚モデルと、表皮、真皮および脂肪組織層を有する人工皮膚モデルの比較を示す。図８ａは、本実験の流れを示す。成長期のマウス頬ヒゲを採取して可変領域のコラーゲン鞘を除去した毛包を作製した。これを６ｗｅｌｌフォーマットとして作製した表皮＋真皮モデルまたは表皮＋真皮＋脂肪組織モデルの人工皮膚に組み込みこみ、３日間の器官培養を行った。器官培養条件は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、５％ＣＯ２環境下として、半気相培養により実施した。図８ｂは、器官培養３日目の組織像を示す。表皮＋真皮モデルに組み込まれた毛包（左図）は退行期を示す線状の毛包間葉像（矢印）であったのに対して、表皮＋真皮＋脂肪組織モデルに組み込まれた毛包（右図）は成長期毛球部であることが示された、写真右の点腺は真皮（Ｄｅｒ）と脂肪組織（Ａｄｐ）の境界を示す。
【図９】図９は、人工的に作製した再生毛包を用いて本発明の人工皮膚を作製した結果を示す。図９ａは本実験の流れを示す。図９ｂ上段は「表皮＋真皮モデル」、中段は「表皮＋真皮＋脂肪組織モデル」、下段は「表皮＋真皮＋ＲＥＣ由来脂肪前駆細胞モデル」の結果を示す。図９ｂ左列の弱拡大図中に示した四角の範囲を拡大したものを右列に示す。いずれのモデルにおいても、移植した毛包の上皮組織は人工皮膚表皮層と接続していることが示された。
【図１０】図１０は、「表皮＋真皮モデル」、「表皮＋真皮＋脂肪組織モデル」、「表皮＋真皮＋ＲＥＣ由来脂肪前駆細胞モデル」のそれぞれにおいて、毛幹の成長を比較した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚およびその製造方法に関する。本発明の方法により製造される人工皮膚は、皮脂腺を有する毛包を有しており、前記毛包は表皮層を貫いて真皮層へ埋没しており、前記毛包の毛穴部が前記表皮層と接続していることを特徴とする。
【００３２】
生体において、毛包は毛乳頭、毛母体、毛根鞘、毛線維、毛隆起、立毛筋、皮脂腺、毛包漏斗部（いわゆる毛穴）等の構造を有する、毛を産生する皮膚付属器官を意味する。しかし、本明細書において、「毛包」は、これらの全ての構造を含むものに限定されず、これらの構造の少なくとも一部を含み、毛を産生する機能を有する構造が維持されているものを広く含む。
【００３３】
本願明細書において、「人工皮膚」とは、少なくとも真皮層を備える人工的な皮膚様の構造物をいい、好ましくはさらに表皮層を備えるものをいう。本発明において、「真皮層」は主としてコラーゲンや線維芽細胞から構成される構造物を意味し、「表皮層」は主として角化細胞（ケラチノサイト）から構成される構造物を意味する。本発明において用いる人工皮膚（単離された毛包を移植する前の人工皮膚）は、毛包の移植前に調製してもよく、表皮層と真皮層を備える市販の人工皮膚を用いてもよい。
【００３４】
本発明において用いる人工皮膚（単離された毛包を移植する前の人工皮膚）の製造方法は限定されないが、真皮層については、例えば、線維芽細胞、コラーゲン、および、培養液を含む混合液をゲル化することによって作製することができる。好ましくは、線維芽細胞、コラーゲン、および、培養液を含む混合液をゲル化させた後、さらに、コラーゲンおよび培養液を含む混合液を添加し、ゲル化させることを少なくとも１回以上繰り返すことにより真皮層を形成させてよい。人工皮膚の真皮層の作製に用いる線維芽細胞の由来は限定されないが、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット由来の線維芽細胞を用いることができる。また、人工皮膚の真皮層の作製に用いる線維芽細胞は、生体のいずれの部位由来であってもよく、例えば、新生児、胎児、成人の臀部、頭皮、手の平、足裏、包皮由来の線維芽細胞を用いることができる。
【００３５】
また、本発明の人工皮膚の表皮層は、例えば上記の方法により作製された真皮層の表面に、角化細胞および培養液を含む混合液を適用し、これらを培養することにより形成させることができる。人工皮膚の表皮層の作製に用いる角化細胞の由来は限定されないが、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット由来の角化細胞を用いることができる。また、人工皮膚の表皮層の作製に用いる角化細胞は、生体のいずれの部位由来であってもよく、例えば、新生児、胎児または成人の、臀部、頭皮、手の平、足裏、包皮由来の角化細胞を用いることができる。
【００３６】
また、本発明の人工皮膚は、真皮層の下部に、さらに脂肪組織層を有していてよい。本発明における「脂肪組織層」は、脂肪細胞を含み、細胞の培養が可能な組成を有する構造物である限り特に限定されないが、例えば脂肪組織を含むコラーゲンゲルであってよい。
【００３７】
また、本発明の人工皮膚においては、毛包が、表皮層を貫いて真皮層へ埋没しているが、前記毛包が、前記真皮層中で脂肪前駆細胞に覆われるように構成してよい。そのような構成を有する人工皮膚の作製方法は限定されないが、例えば、表皮層および真皮層からなる人工皮膚へ毛包を移植する前に、毛包の移植部位に脂肪前駆細胞を埋め込み、その後、毛包を移植することによって、所望の構成を得ることができる。また、例えば、移植用の毛包の周囲に脂肪前駆細胞を接着させた後に、表皮層および真皮層からなる人工皮膚へ毛包を移植することにより、所望の構成を得ることもできる。
【００３８】
本発明において用いる脂肪前駆細胞の由来は特に限定されず、市販の脂肪前駆細胞であってもよく、市販の、あるいは生体から単離された間葉系幹細胞から公知の方法で誘導した脂肪前駆細胞であってもよく、生体の組織から直接単離された脂肪前駆細胞であってもよい。
【００３９】
本発明において用いる単離された毛包は、動物の皮膚から採取された単離された毛包であってよい。この場合、毛包を採取する動物の種類は限定されず、例えばヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット由来の単離された毛包を用いることができる。動物の皮膚から採取された毛包のトリミング方法は限定されず、例えば、採取された皮膚から、皮脂腺を傷つけないように毛包を単離することで、本発明に用いる単離された毛包を得ることができる。
【００４０】
また、本発明において用いる単離された毛包として、人工的に誘導された毛包を用いることもできる。人工的に誘導された毛包の製造方法は限定されず、例えばＷＯ２０１２／１０８０６９やＷＯ２０１２／１１５０７９に記載の方法を用いて人工的に誘導された毛包を用いることができる。具体的には、間葉系細胞から実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮系細胞から実質的に構成される第２の細胞集合体とを密着させて支持体内部で培養することにより製造される再生毛包原基由来の毛包を、本発明において用いることができる。この場合、前記間葉系細胞または前記上皮系細胞の少なくともいずれかは、未分化細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、各種の組織幹細胞、各種の前駆細胞）を誘導することによって得られる間葉系細胞または上皮系細胞であってよい。また、前記間葉系細胞または前記上皮系細胞の少なくともいずれかは、動物の毛包由来の単一化された細胞から得られる間葉系細胞または上皮系細胞であってよい。また、上記の方法によって得られた再生毛包原基を生体の皮膚へ移植し、毛包がある程度成長した後に再び採取し、本発明に用いてもよい。
【００４１】
また、例えば、ＷＯ２０１６／０３９２７９に記載の方法を用いて人工的に誘導された毛包を本発明に用いることもできる。具体的には、Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性物質で多能性幹細胞由来の胚様体を刺激した後に、当該胚様体を足場材料と結合し、当該結合体を動物の生体へ移植する。すると、当該移植部位に、毛包や皮脂腺等の皮膚付属器官を高頻度に含むテラトーマが形成されるので、当該テラトーマから採取した毛包を本発明に用いることができる。
【００４２】
本発明の人工皮膚の製造方法においては、単離された毛包を、人工皮膚の真皮層の表面と、前記単離された毛包の毛穴部の位置とが実質的に一致するように、人工皮膚に移植する。この工程により、毛包の移植後、毛包の毛穴部と人工皮膚の表皮層が接続され、毛包および皮脂腺が皮膚付属器官として機能的なものとなる。本発明において、毛包の毛穴部と人工皮膚の表皮層とが「接続する」（あるいは、毛包の毛穴部と人工皮膚の表皮層とが「連続する」）とは、毛包の毛穴部と人工皮膚の表皮層とが、少なくとも部分的に、組織学的に結合していることを意味する。
【００４３】
本明細書において用いられる用語は、特に定義されたものを除き、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【００４４】
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
【００４５】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【００４６】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００４７】
実施例１：毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚の製造【００４８】
本発明の方法によって製造される人工皮膚の模式図を図１に示した。また、本実施例において実施した、本発明の人工皮膚の製造方法の２つの実施態様の手順を、図２に示した。【００４９】
１．材料と方法
（１）実験動物
Ｂ５７／Ｂ６マウスは清水実験材料（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて購入した。マウスの管理および操作はＮＩＨの実験動物指針に従った。全ての実験は理化学研究所の動物実験委員会の審査を受けその認可の上実施した。【００５０】
（２）ヒト材料
本研究においてヒト材料は、「ヘルシンキ宣言」（１９７５年東京改訂）の主旨に沿い、理化学研究所および提供医療機関における研究倫理審査委員会に諮り承認を得た上、「人を対象とする医学系研究に関する倫理指針（平成２６年文部科学省・厚生労働省告示第３号）および関連規制に従い、提供者よりインフォームドコンセントを得た上で共同研究医療機関により採取提供を受け、理化学研究所多細胞システム形成研究センターの所定施設において使用した。本研究におけるヒト材料とは日本国内の医療機関より提供を受けた頭皮組織および、これより分離した毛包および周辺組織を指し、購入した培養ヒト由来細胞は含まれない。【００５１】
（３）細胞培養
正常ヒト新生児包皮線維芽細胞（ＨＤＦｎ）と正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＨＥＫｎ）は第一継代後の凍結細胞としてクラボウより購入した。ＨＤＦｎとＨＥＫｎ細胞は３７℃の温浴にて急速に解凍したのち、１０％ウシ胎児血清と５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ１０）にて洗浄し、ＨＤＦｎ細胞はＤＭＥＭ１０培地、ＨＥＫｎ細胞はＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（クラボウ）を満たした培養プラスチックディッシュに２，５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度として播種し、これを第二継代細胞とした。継代培養は常法に従い、Ｄ−ＰＢＳ（−）（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）に、０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた溶液を用いて消化し、分散させたうえ、細胞密度を調整して各細胞に設定した培地条件にて継代した。正常ヒト細胞は第三継代まで継代培養して人工皮膚作製に供するか、または凍結ストックとし解凍後第四継代細胞として人工皮膚の作製に用いた。凍結ストックとする場合、両者とも６０−８０％コンフレントまで培養を継続し、人工皮膚の作製においては８０％以上のコンフレントとなった状態にて使用した。【００５２】
（４）線維芽細胞含有コラーゲンゲルの作製
（３）において継代培養したＨＤＦｎ細胞を、トリプシンＥＤＴＡ溶液により消化してシングルセル化した。次いで終濃度３．８ｍｇ／ｍｌコラーゲン（Ｉ−ＡＣ  ５ｍｇ／ｍＬ、ＫＯＫＥＮ）、１ｘＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（和光純薬）、１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４となるように滴定調整、和光純薬）、５％ウシ胎児血清を含むコラーゲン中性溶液を作製し、氷温条件にて穏やかに攪拌しながら遠心分離によりペレット化したＨＤＦｎ細胞を分散させた。コラーゲン酸性溶液を中和して細胞生存環境とするための添加剤として、１０倍濃度ＤＭＥＭ、１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒを作製し、ストックとして４℃冷蔵保管した。コラーゲン中性溶液に分散したＨＤＦｎ細胞を１２ｗｅｌｌ用セルカルチャーインサート（０．４μｍ／高密度ポア）に４００μｌずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度条件下に３０分間静置してゲル化させ、厚さ３−４ｍｍの人工真皮層を形成させた。線維芽細胞含有コラーゲンゲルの表面がセルカルチャーインサート天部のフィルター面と水平となるように、また一様にゲル化を進行させるために、コラーゲン液調製および細胞分散は氷上にて行い、調整したコラーゲン液はセルカルチャーインサートへの分注時まで氷中に埋没させて保存した。細胞含有コラーゲン溶液のゲル化より人工真皮層を形成したセルカルチャーインサートは、１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２（和光純薬）を含むＤＭＥＭ１０培地を満たした１２ｗｅｌｌ培養プレートに設置して一晩培養した。以下の培養条件は全て３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度条件とした。【００５３】
ヒト線維芽細胞含有コラーゲンゲルを一晩培養した後に、マイクロフィブリル形成によりゲル収縮したことを目視により確認した。その後、新しいセルカルチャーインサートに１００μｌの終濃度３．８ｍｇ／ｍｌのウシ由来天然型コラーゲン１酸性溶液（Ｉ−ＡＣ  ５ｍｇ／ｍＬ、ＫＯＫＥＮ）、１ＸＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（和光純薬）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）、５％ウシ胎児血清を含むコラーゲン溶液を入れ、収縮したゲルをピンセットにより移した。その後、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度条件下に３０分間静置してゲル化させ、外周の間隙を細胞不含コラーゲンゲルにより補充することにより１２ｗｅｌｌプレートの培地成分がセルカルチャーインサート内に流入することを防止した。同様の処理をゲル形成後３日間に渡り一日一回の割合で実施した。各処理時に線維芽細胞含有コラーゲンゲルのマクロ写真を撮影し、３日目まで急速に収縮が進行し、その後ほぼ定常状態となることを計測し、線維芽細胞含有コラーゲンゲルが生理的に適切に機能するよう作製されたことを確認した。【００５４】
２．真皮層への毛包組み込み後に表皮形成を行うことによる人工皮膚の作製（図３）【００５５】
上記の（１）〜（４）の方法によって作製した線維芽細胞含有コラーゲンゲルに毛包を組み込み、その後表皮層を重層することによって人工皮膚を作成した。【００５６】
具体的な方法は次のとおりである。まず、線維芽細胞含有コラーゲンゲルの形成後１日目に、当該コラーゲンゲルに対して毛包組み込み用の切開を行った。眼科用マイクロメス（ストレートナイフ  Ｓｔｒａｉｇｈｔ  ２２．５°、マニー）を用いて、ゲル表面へ、毛包の約１．２倍幅のスリットを形成した。スリット深度はセルカルチャーインサートの底部フィルター面に損傷を与えない限界までの深度とし、約３０度の傾斜角とした。このスリット内に、頬ヒゲの毛包、躯幹背部皮膚の体毛の毛包、またはヒト頭髪の毛包（いずれも単離された毛包）を表面側より挿入した。挿入される毛包から伸びている毛幹のみをピンセットにより掴み、毛球部や毛穴部には触れないようにした。挿入の際に細胞不含コラーゲン中性液に毛包を浸してスリット内への組み込みを行った。毛包の毛穴部と線維芽細胞含有コラーゲンゲルの表面とがほぼ一致するように、移植毛包の深度の調節を行った。【００５７】
その後、後述する「３．真皮層および表皮層形成後に毛包組み込みを行うことによる人工皮膚の作製」と同様の方法により、線維芽細胞含有コラーゲンゲルの表面に表皮層を形成させ、エアカルチャーを行った。【００５８】
人工皮膚へ組み込む毛包は、生後５−７日齢のＢ５７／Ｂ６マウスの頬ヒゲと躯幹背部皮膚の体毛およびヒト頭髪毛包のうち成長期ＶＩ期にあり、体表面より毛種を特定可能な毛幹を成長させているものを用いた。またクラブヘアーが残存しているマウス頬ヒゲと背部皮膚体毛、およびヒト頭皮毛包を、それぞれ先行文献（Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（ＮＡＴＵＲＥ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ｜３：７８４｜ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１７８４，２０１２），Ａｓａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＲＥＰＯＲＴＳ，２：４２４｜ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ００４２４，２０１２），Ｕｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈａｉｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５ｔｈ  ｅｄｎ（２０１０）））に記載された毛包器官の皮膚内移植技術に基づいて、実体顕微鏡を用いて分離および加工を行った。マウス頬ヒゲは、コラーゲン鞘を保持し、皮脂腺と外毛根鞘の損傷しないよう、毛包狭部より上方に位置する真皮性組織およびコラーゲン鞘と皮膚表皮層をサージカルメスにより切除した。体毛は１０−１５本の完全毛包よりなる毛群として、皮膚表皮層・真皮層・皮下脂肪層を含むよう、毛包に対して水平となるように皮膚より切り分けて分離した。ヒト毛包は１毛包または２毛包よりなる毛群の状態となるように分離し、ヒゲと同様に毛包上部の真皮性組織および皮膚表皮層のトリミングを行った。【００５９】
３．真皮層および表皮層形成後に毛包組み込みを行うことによる人工皮膚の作製（図４）【００６０】
上記の（１）〜（４）の方法によって作製した線維芽細胞含有コラーゲンゲルの表面に表皮層を形成させ、その後、毛包を組み込むことによって、人工皮膚を作製した。【００６１】
具体的な方法は次のとおりである。６０％−８０％コンフレントまで増殖させたＨＥＫｎ細胞を、トリプシン消化によりシングルセル化し、２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地にて懸濁させた。１ｗｅｌｌあたり５００μlの細胞懸濁液を、（４）で作成した線維芽細胞含有コラーゲンゲル上に重層播種し、培養することにより、線維芽細胞含有コラーゲンゲル上に角化表皮層を形成させた。重層したＨＥＫｎ細胞は播種後４日目までＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地またはＤＭＥＭ１０培地中にて培養し、ＨＥＫｎ細胞播種後１、２、３日目に重層播種時と同じ培地条件として全量培地交換を行った。上述の操作は線維芽細胞含有コラーゲンゲルの収縮にともなうコラーゲンゲルの補充後に行った。Ｗｅｌｌ内の１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２を含むＤＭＥＭ１０培地量は、セルカルチャーインサート内のＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地の液面と同じになるように調整した。ＨＥＫｎ細胞重層後４日目にセルカルチャーインサート内の培地を除去することにより、表皮層が直接大気の酸素分圧条件にさらされる培養条件であるエアカルチャーを開始した。【００６２】
次に、表皮層が形成された線維芽細胞含有コラーゲンゲルに対して、毛包の組み込みを行った。ＨＤＦｎ細胞含有コラーゲンゲルにＨＥＫｎ細胞を重層して３日目に毛包の組み込みを行い、４日目にエアカルチャーを開始した。本実施例においては、「２．真皮層への毛包組み込み後に表皮形成を行うことによる人工皮膚の作製」に記載の方法により準備した、単離されたマウス頬ヒゲを用いた。人工皮膚への毛包組み込みは「２．真皮層への毛包組み込み後に表皮形成を行うことによる人工皮膚の作製」に記載した方法と同様に、表皮層と細胞含有コラーゲンゲル層の両者を貫くスリットを形成して行った。スリット形成において重層化表皮層と細胞含有コラーゲンゲル層の剥離を防ぐために、まず眼科用マイクロメスを水平方向に浅く動かすことにより表皮層の切り込みを形成し、その後に真皮層に切り込みを入れた。【００６３】
４．人工皮膚へ組み込んだ毛包の機能評価【００６４】
４−１．上皮間接続
毛包や汗腺などの外胚葉性器官は、毛穴や導管の開口部を介して、皮膚表皮層と連結することにより皮膚器官系（外皮系）として機能する。すなわち、毛包と共に人工皮膚に組み込んだ皮脂腺が機能的なものとなるためには、組み込んだ毛包の毛穴部と人工皮膚の表皮層とが連続していることが重要となる。【００６５】
毛包組み込み後４日目と７日目に培地を取り除き、ホルマリン固定液（ＳｕｐｅｒＦｉｘ、ＫＵＲＡＢＯ）をセルカルチャーインサート内とプレートＷｅｌｌ内にそれぞれ１ｍｌと２ｍｌずつ入れて組織固定を行った。室温環境において６時間−１２時間組織固定を行い、固定終了後に室温のＰＢＳ（−）中に移し、毛包組み込み型人工皮膚の正中と毛穴と毛成長方向を含む表皮層に対して垂直となる割面を切り出し、パラフィン包枚ブロックを作製した。その後通法に従い１０μｍ厚の連続切片を作製し、Ｈ＆Ｅ染色を行い、毛包と表皮層の連続位置およびそれに連なる毛球部を追跡した。【００６６】
図３Ｂおよび図３Ｃに示すとおり、真皮層への毛包組み込み後に表皮形成を行った人工皮膚において、人工皮膚に組み込んだ毛包の上部毛穴領域において毛包外毛根鞘と人工皮膚の表皮層が連結していることが示された。【００６７】
また、図４Ｂに示すとおり、真皮層および表皮層形成後に毛包組み込みを行った人工皮膚においても、人工皮膚に組み込んだ毛包の上部毛穴領域において毛包外毛根鞘と人工皮膚の表皮層は連結していることが示された。【００６８】
これらの結果より、本発明の方法によって作製される人工皮膚中の毛包は、毛穴を介して人工皮膚表皮層と連結しており、機能的な皮膚付属器官を有することが示された。【００６９】
４−２．組織学的評価
毛包組み込み後４日目と７日目のＨ＆Ｅ染色像を用いて、毛球部の毛母細胞および毛乳頭細胞の非生理的な変性や細胞死に伴う核形態や細胞質染色性の変化と、それぞれの組織に特有な細胞配置を組織学的に解析し、天然毛包の組織と比較した。【００７０】
人工皮膚に組み込まれた毛包の毛球部を構成する細胞が生存して毛幹形成を維持していることを組織学的に解析したところ、真皮層への毛包組み込み後に表皮形成を行った人工皮膚においても（図３Ｂ、図３Ｃ）、真皮層および表皮層形成後に毛包組み込みを行った人工皮膚においても（図４Ｂ）、毛球部の毛母および毛乳頭細胞は生存していることが示された。【００７１】
４−３．毛幹成長
実体顕微鏡（Ｓｔｅｍｉ２０００、Ｚｅｉｓｓ）を用いて、毛包組み込み時（Ｄａｙ  ０）よりＤａｙ３、４、７、１４まで経時的にマクロ写真撮影を行い、画像解析ソフトウェアー（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ、ＺｅｉｓｓおよびＩｍａｇｅ  Ｊ、ＮＩＨ）を用いて毛幹長の変化を計測した。また、移植前の毛包および毛幹長および、毛包組み込み型人工皮膚より経時的に毛包を採取して毛包および毛幹長を同様に画像解析により計測し、毛幹成長を定量的に機能評価した。【００７２】
その結果、真皮層への毛包組み込み後に表皮形成を行った人工皮膚において、人工皮膚に組み込んだ毛包から４日間にわたり毛幹が成長することが示された（図５Ａ−Ｃ）。さらに、真皮層および表皮層形成後に毛包組み込みを行った人工皮膚においても、毛幹成長が継続することが示された（図６）。【００７３】
これらの結果から、本発明の方法によって得られる人工皮膚は、機能的な皮膚付属器官を有していることが示された。【００７４】
実施例２：脂肪組織層をさらに有する人工皮膚の製造【００７５】
１．６−ｗｅｌｌフォーマット人工皮膚の作製
６−ｗｅｌｌフォーマット人工皮膚の作製は、以下の手順で行った。【００７６】
＜細胞培養＞
正常ヒト新生児包皮線維芽細胞（ＨＤＦｎ）と正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＨＥＫｎ）は第一継代後の凍結細胞としてクラボウより購入した。ＨＤＦｎとＨＥＫｎ細胞は３７℃の温浴にて急速に解凍したのち、１０％ウシ胎児血清と５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ１０）にて洗浄し、ＨＤＦｎ細胞はＤＭＥＭ１０培地、ＨＥＫｎ細胞はＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（クラボウ）を満たした培養プラスチックディッシュに２，５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度として播種し、これを第二継代細胞とした。継代培養は常法に従い、Ｄ−ＰＢＳ（−）（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）に、０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた溶液を用いて消化し、分散させたうえ、細胞密度を調整して各細胞に設定した培地条件にて継代した。正常ヒト細胞は第二継代まで継代培養して人工皮膚作製に供するか、または凍結ストックとし解凍後第三継代細胞として人工皮膚の作製に用いた。凍結ストックとする場合、両者とも６０−８０％コンフレントまで培養を継続し、人工皮膚の作製においては８０％以上のコンフレントとなった状態にて使用した。【００７７】
＜線維芽細胞含有コラーゲンゲルの作製＞
継代培養したＨＤＦｎ細胞を、トリプシンＥＤＴＡ溶液により消化してシングルセル化した。次いで終濃度３．８ｍｇ／ｍｌコラーゲン（Ｉ−ＡＣ  ５ｍｇ／ｍＬ、ＫＯＫＥＮ）、１ｘＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（和光純薬）、１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４となるように滴定調整、和光純薬）、５％ウシ胎児血清を含むコラーゲン中性溶液を作製し、氷温条件にて穏やかに攪拌しながら遠心分離によりペレット化したＨＤＦｎ細胞を分散させた。コラーゲン酸性溶液を中和して細胞生存環境とするための添加剤として、１０倍濃度ＤＭＥＭ、１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒを作製し、ストックとして４℃冷蔵保管した。コラーゲン中性溶液に分散したＨＤＦｎ細胞を６ｗｅｌｌ用セルカルチャーインサート（０．４μｍ／高密度ポア）に４００μｌずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度条件下に３０分間静置してゲル化させ、厚さ１．０−１．５ｍｍの人工真皮層を形成させた。線維芽細胞含有コラーゲンゲルの表面がセルカルチャーインサート天部のフィルター面と水平となるように、また一様にゲル化を進行させるために、コラーゲン液調製および細胞分散は氷上にて行い、調製したコラーゲン液はセルカルチャーインサートへの分注時まで氷中に埋没させて保存した。細胞含有コラーゲン溶液のゲル化より人工真皮層を形成したセルカルチャーインサートは、１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２（和光純薬）を含むＤＭＥＭ１０培地を満たした６ｗｅｌｌ培養プレートに設置して表皮層形成まで培養を継続した。以下の培養条件は全て３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度条件とした。【００７８】
＜表皮層の形成＞
上記の方法により作製した繊維芽細胞含有コラーゲンゲルの表面に表皮層を形成させ、人工皮膚を作製した。
具体的な方法は次のとおりである。６０％−８０％コンフレントまで増殖させたＨＥＫｎ細胞を、トリプシン消化によりシングルセル化し、３．７ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地にて懸濁させた。１ｗｅｌｌあたり１ｍｌの細胞懸濁液を、実施例１の（４）で作成した線維芽細胞含有コラーゲンゲル上に重層播種し、培養することにより、線維芽細胞含有コラーゲンゲル上に角化表皮層を形成させた。重層したＨＥＫｎ細胞は播種後４日目までＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地またはＤＭＥＭ１０培地中にて培養し、ＨＥＫｎ細胞播種後１、２、３日目に重層播種時と同じ培地条件として全量培地交換を行った。上述の操作は線維芽細胞含有コラーゲンゲルの収縮にともなうコラーゲンゲルの補充後に行った。Ｗｅｌｌ内の１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２を含むＤＭＥＭ１０培地量は、セルカルチャーインサート内のＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地の液面と同じになるように調整した。ＨＥＫｎ細胞重層後４日目にセルカルチャーインサート内の培地を除去することにより、表皮層が低酸素分圧条件にさらされる培養条件であるエアカルチャー（３７℃、５％ＣＯ２、１２．５％Ｏ２、１００％湿度条件下）を開始した。【００７９】
エアカルチャーを２日間行った上記の人工皮膚を、後述する皮下脂肪含有コラーゲンゲル（脂肪組織層）の上に重層し、その後、毛包の組み込みに供した。【００８０】
２．皮下脂肪含有コラーゲンゲル（脂肪組織層）の作製
マウス背部皮膚組織より結合組織等の不要部位をトリミングした皮膚組織をリボン状に裁断したのち、ピンセットを用いて脂肪組織を採取した。細切した脂肪組織を、実施例１の（４）に記載の方法で調製したコラーゲン中性溶液内に分散し、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度条件下に３０分間静置することによりゲル化させたものをさらに３ｍｍ角に切り、コラーゲンゲル中性溶液内に配置し、上記と同様の方法でゲル化させたものを皮下脂肪層とした。対照として脂肪組織を含まないコラーゲンゲルも作成した。【００８１】
３．移植用毛包の準備（図７）
本実施例に用いた毛包は、実施例１の「２．真皮層への毛包組み込み後に表皮形成を行うことによる人工皮膚の作製」に記載の方法により準備し、コラーゲン鞘を取り外したマウス頬ヒゲを用いた。【００８２】
成長期のマウス頬ヒゲを採取してコラーゲン鞘を含むインタクト毛包（図７上段）および可変領域のコラーゲン鞘を除去した毛包（図７下段）を作製した。それぞれの条件の毛包を６ｃｍプラスチック培養皿の底面に薄層コラーゲンゲルにて接着し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）中にて５％ＣＯ２環境下において浸漬培養を３日目まで行った。【００８３】
培養開始時（Ｄａｙ  ０）より、毎日実体顕微鏡により経過観察を行った。矢印は毛幹先端を示し、矢尻は毛球部の位置を示す。右列には培養３日目の毛球部拡大像を示す。点腺は毛包最外層の間葉組織境界を示す。通常、成長期より退行期を経て休止期へ至る毛包の構造変化において、毛球部は毛包上部へと移動して二次毛芽と呼ばれる構造を形成することが知られている。そのため、毛球部位置の上昇と毛包の間葉組織境界のズレは退行期または休止期であることを示す。【００８４】
なお、マウス頬ヒゲ毛包はコラーゲン鞘に包まれた状態で生体内にあり、成長期の毛包をコラーゲン鞘付きの状態で生体外培養を行うと毛幹が伸長し、成長期を維持することが知られている（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３６７  （２００８）  ２９９−３０４）。一方で、単毛包移植術等に供する毛包は退行期を経て休止期に突入することが植毛医療現場ではよく知られている。これと同様に、コラーゲン鞘を取り外す等の外的処置により刺激された成長期のマウス頬ヒゲ毛包を生体外培養すると、毛球部位置と毛球部の間葉組織境界のズレを生じ、退行期または休止期に移行することが見いだされた（図７）。【００８５】
４．皮下脂肪付人工皮膚の作製および毛包の組込み（図８ａ）
脂肪組織層の上にエアカルチャー２日後の人工皮膚を配置したのち、毛包の組込みを行った。人工皮膚への毛包組み込みは、実施例１の「２．真皮層への毛包組み込み後に表皮形成を行うことによる人工皮膚の作製」に記載した方法と同様に、表皮層と脂肪組織層の両者を貫くスリットを形成し、上記のコラーゲン鞘を取り外した毛包を作製し、ピンセットを用いて組み込むことによって行った。毛包の組み込み後、３日間の器官培養を行った。器官培養条件は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、５％ＣＯ２環境下として、半気相培養により実施した。【００８６】
５．脂肪組織層の有無による毛包成長の比較（図８ｂ）
図８ｂは、器官培養３日目の移植毛包の組織像を示す。脂肪組織層を有しない人工皮膚に組み込まれた毛包（図８ｂ左）は退行期を示す線状の毛包間葉像（矢印）であったのに対して、脂肪組織層を有する人工皮膚に組み込まれた毛包（図８ｂ右）は成長期毛球部であることが示された。写真右の点腺は真皮（Ｄｅｒ）と脂肪組織（Ａｄｐ）の境界を示す。【００８７】
以上の結果から、脂肪組織は、毛包の成長を促進する効果があることが示された。すなわち、本発明の人工皮膚は、毛包と皮下脂肪組織の相互作用による毛包成長の評価が可能であることが示された。【００８８】
実施例３：再生毛包原基を用いた人工皮膚の製造【００８９】
１．ＲＥＣ細胞からの脂肪前駆細胞の誘導
脂肪前駆細胞は、市販の間葉系幹細胞であるＲＥＣ（Ｒａｐｉｄｌｙ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｃｅｌｌ、ベイバイオサイエンスより購入）より先行文献（Ｍａｂｕｃｈｉ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１，１５２−１６５，２０１３）に従い誘導した。【００９０】
ＲＥＣは３７℃の温浴にて急速に解凍したのち、Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ）にて洗浄し、同培地を満たした培養プラスチックディッシュに２１，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度として播種し、３日間培養を行った。次に脂肪細胞へ分化誘導するため、Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｍｅｄｉｕｍを除去後、Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ）に置換し、さらに２日間培養を行った。細胞の回収は常法に従い、Ｄ−ＰＢＳ（−）（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）に、０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた溶液を用いて行った。得られた細胞における脂肪前駆細胞マーカーＰＰＡＲγ遺伝子の発現を確認し、ＲＥＣ由来脂肪前駆細胞として用いた。【００９１】
２．移植用の再生毛包の作製（図９ａ）
Ｅ１８．５マウス背部皮膚より、酵素処理によりシングルセル化した皮膚上皮と間葉系細胞を調製し、これらを用いて再生毛包原基を作製した。再生毛包原基の作成は、ＷＯ２０１２／１０８０６９およびＷＯ２０１２／１１５０７９に記載の方法を用いて行った。【００９２】
再生毛包原基をセルカルチャーインサート上に移し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地を用いてマルチガスチャンバーによりガス分圧を調製しながら７日間器官培養を行った。７日後に毛包発生が実体顕微鏡下において求められた（図９ａ中央左）。これを毛群毎に分割し（図９ａ中央右）、人工皮膚への組み込みに供した。【００９３】
３．再生毛包の人工皮膚への移植（図９ａ）
準備した再生毛包を、以下の３種類の人工皮膚へ組み込み、３日間器官培養（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地、５％ＣＯ２環境）した後、組織学的解析を行った。【００９４】
１．表皮＋真皮モデル（実施例１における、毛包組み込み前の人工皮膚）
２．表皮＋真皮＋脂肪組織モデル（実施例２における、毛包組み込み前の人工皮膚）
３．表皮＋真皮＋ＲＥＣモデル（１の人工皮膚において、毛包が移植される移植孔にＲＥＣより誘導された脂肪前駆細胞を組み込んだ人工皮膚）【００９５】
いずれの人工皮膚においても、２５Ｇ注射針を用いて、人工皮膚の下層まで進達する移植孔を形成し、人工皮膚表面と、分割した毛包の毛穴部となる位置とが一致する深度となるように組み込みを行った。【００９６】
「表皮＋真皮＋ＲＥＣモデル」においては、マイクロピペットを用いて、移植孔内に培養液を除去したＲＥＣ由来脂肪前駆細胞集塊０．２μｌを注入し、その後、上記と同様の方法にて毛包を組み込んだ。【００９７】
４．移植した毛包の組織学的解析（図９ｂ）
図９ｂ上段は「表皮＋真皮モデル」、中段は「表皮＋真皮＋脂肪組織モデル」、下段は「表皮＋真皮＋ＲＥＣ由来脂肪前駆細胞モデル」の結果を示す。図９ｂ左列の弱拡大図中に示した四角の範囲を拡大したものを右列に示す。いずれのモデルにおいても、移植した毛包の上皮組織は人工皮膚表皮層と接続していることが示された。【００９８】
「表皮＋真皮モデル」へ移植された再生毛包組織は毛包組織の分化傾向より外れており、上皮組織により包まれた間葉細胞（図９ｂ上段右矢印）は認められたものの上皮細胞の毛母細胞分化は見られなかった。【００９９】
「表皮＋真皮+脂肪組織モデル」では、移植された毛包中に、上皮により包み込まれた間葉細胞の集塊が多数認められたものの（図９ｂ中段右矢印）、間葉細胞周囲の上皮細胞には毛球部特有な分化傾向は低い結果となった。また両モデルとも上皮組織の伸長（＊アスタリスク）が見られたが、毛包上皮への分化傾向は組織学的には認められなかった。【０１００】
「表皮＋真皮＋ＲＥＣ由来脂肪前駆細胞モデル」に移植された毛包では、毛母への分化傾向が強い上皮により間葉細胞が取り込まれていた（図９ｂ下段白矢印）。さらに、移植された毛包の上皮中央には角化傾向が強い毛幹状の構造（ＨＳ）が認められた。毛包周囲にはＲＥＣ由来脂肪前駆細胞が分布していた（矢尻）。人工皮膚における構造として、Ｅｐｉは表皮層、Ｄｅｒは真皮層を示し、またＡｄｐは皮下脂肪組織を示す。【０１０１】
実施例４：人工皮膚内の毛包の毛幹成長に対する脂肪組織と脂肪前駆細胞の効果【０１０２】
成長期のマウス頬ヒゲを採取して可変領域のコラーゲン鞘を除去した毛包を作製した。当該毛包を、実施例３の「表皮＋真皮モデル（脂肪組織なし）」、「表皮＋真皮＋脂肪組織モデル」または「表皮＋真皮＋ＲＥＣ由来脂肪前駆細胞（誘導期間２日あるいは７日）モデル」の人工皮膚に組み込み、３日間の器官培養を行った。【０１０３】
器官培養条件は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、５％ＣＯ２、Ｏ２大気分圧環境下として、半気相培養により実施した。培養３日目の毛幹成長は実体顕微鏡（Ｓｔｅｍｉ２０００、Ｚｅｉｓｓ）を用いて、マクロ写真撮影を行い、画像解析ソフトウェアー（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ、ＺｅｉｓｓおよびＩｍａｇｅ  Ｊ、ＮＩＨ）を用いて毛幹長の変化を計測した。また、移植前の毛包および毛幹長および、毛包組み込み型人工皮膚より経時的に毛包を採取して毛包および毛幹長を同様に画像解析により計測し、毛幹成長を定量的に機能評価した。【０１０４】
結果を図１０に示す。「表皮＋真皮モデル」に対し、「表皮＋真皮＋脂肪組織モデル」あるいは「表皮＋真皮＋ＲＥＣ由来脂肪前駆細胞モデル」は、毛幹成長効果を示し、特に誘導期間７日間のＲＥＣ由来前駆細胞が最も高い毛包成長効果を示した。【０１０５】
以上のとおり、本発明の方法によって製造された人工皮膚における毛包は、生体の皮膚における毛包と類似した挙動を示すことが示された。すなわち、本発明の方法によって製造された人工皮膚は、従来の人工皮膚よりも生体の皮膚に近い構造や機能が再現されていた。また、本発明における人工皮膚においては、毛包などの皮膚付属器のみならず、脂肪およびそれに類する細胞の導入も可能であることも示された。それゆえ、本発明の人工皮膚は、例えば、皮膚に対する医薬品や化粧品の薬効評価や安全性評価における有用性が極めて高いと言える。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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