(57)【要約】  非侵襲的にＮＡＳＨを識別するための指標を得る方法を提供する。非侵襲的に被験動物の肝臓におけるレドックス反応をリアルタイムで検出し、フリーラジカル消費速度の情報を取得する方法を含むＮＡＳＨの判定方法であって、  プローブを体内に投与後、測定対象となる肝臓に磁気共鳴法を適用して、フリーラジカル濃度のデータを得る工程（１）と、  前記得られたフリーラジカル濃度のデータを処理して画像化情報を得る工程（２）と、  前記画像化情報を経時的に動態計測し、フリーラジカル消費速度を求める工程（３）と、を含み、  前記被験動物に適用して得られたフリーラジカル消費速度情報に基づいて、被験動物がＮＡＳＨか否かを判定する工程を含むことを特徴とするＮＡＳＨの判定方法。
2017217340.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非侵襲的に被験動物の肝臓におけるレドックス反応をリアルタイムで検出し、フリーラジカル消費速度の情報を取得する方法であって、
プローブを被験動物の体内に投与後、測定対象となる肝臓に磁気共鳴法を適用して、フリーラジカル濃度のデータを得る工程（１）と、
前記得られたフリーラジカル濃度のデータを処理して画像化情報を得る工程（２）と、
前記画像化情報を経時的に動態計測し、フリーラジカル消費速度を求める工程（３）と、を含む、前記方法。
【請求項２】
被験動物の非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の識別のための指標としてフリーラジカル消費速度の情報を取得する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブが、ニトロキシルラジカル化合物である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記磁気共鳴法が、ＤＮＰ−ＭＲＩ法である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
被験動物の肝臓全体が対象となるように磁気共鳴法を適用する請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の方法を、被験動物に適用して得られたフリーラジカル消費速度情報に基づいて、被験動物がＮＡＳＨか否かを判定する工程を含むことを特徴とするＮＡＳＨの判定方法。
【請求項７】
被験動物が、ＮＡＦＬＤと診断された被験動物である請求項６に記載の判定方法。
【請求項８】
判定されるＮＡＳＨが、初期ＮＡＳＨである請求項６または７に記載の判定方法。
【請求項９】
前記被験動物がＮＡＳＨか否かを判定する工程が、既知のＮＡＳＨ罹患動物群及び既知の非ＮＡＳＨ罹患動物群のそれぞれ肝臓におけるフリーラジカル消費速度情報に基づいてフリーラジカル消費速度の閾値を設定し、
評価対象の被験動物の肝臓におけるフリーラジカル消費速度が、当該閾値以下になった場合にＮＡＳＨであると判定する工程である請求項６から８のいずれかに記載の判定方法。
【請求項１０】
コンピュータに、請求項６から９のいずれかに記載の判定方法を少なくとも実行させることを特徴とするＮＡＳＨ判定用プログラム。
【請求項１１】
ＮＡＳＨの治療薬の候補物質の投与後の被験動物に対して、請求項１から５のいずれかに記載の方法を適用して得られたフリーラジカル消費速度情報に基づいて、候補物質のＮＡＳＨに対する治療作用を判別することを特徴とするＮＡＳＨの治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本国際出願は，２０１６年６月１３日に日本国特許庁に出願された特許出願である特願２０１６−１１７３３５に基づく優先権を主張するものであり、特願２０１６−１１７３３５の全内容を参照により本国際出願に援用する。【０００２】
本発明は、非侵襲的に被験動物の肝臓におけるフリーラジカル消費速度情報を取得する方法、並びに当該方法を利用したＮＡＳＨ判定方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、食生活や運動不足、肥満などの飲酒以外の生活習慣を要因とする非アルコール性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が増加している。
ＮＡＦＬＤは、ウィルス性肝疾患、自己免疫疾患性肝疾患、ヘマクロトーシスやＷｉｌｓｏｎ病等の代謝性肝疾患などを除外して、飲酒歴のない人に発生する単純脂肪肝から脂肪性肝炎、線維症、肝硬変までの肝障害を含む疾患群と定義され、肝硬変に進行しない単純脂肪肝（ＳＳ）と、非アルコール性脂肪肝炎(ＮＡＳＨ)に大別される。
ＮＡＦＬＤのうち約８０％は非進行性で良性の経過を辿るが、残りの２０％はＮＡＳＨへ進行し、肝硬変、肝癌へと進展する。
単なる脂肪肝がどのようにしてＮＡＳＨまで進展するかについては、いわゆるtwo hit theoryが広く知られており、まず、first hitによって脂肪肝が発症し、さらにsecond hitとして酸化ストレス、脂質過酸化、エンドトキシンなどにより怠起されるサイトカインの放出などによって肝細胞障害が引き起こされ脂肪性肝炎、肝硬変へと進展していくと考えられている。これらの根底に存在するのがインスリン抵抗性であり、second hitの選択性については遺伝的要因が推定されている。【０００４】
そのため、ＮＡＦＬＤの中からＮＡＳＨを鑑別し、治療につなげていくことが重要である。しかしながら、血液検査でＡＬＴの上昇を認めるが重症度は反映されないことが知られており、さらに、腹部超音波検査、ＣＴなどの画像検査では一様に脂肪肝の所見を呈するため、良性の経過をたどる単純性脂肪肝（ＳＳ）と肝炎増悪、線維化、肝硬変、肝癌と進行性の病態を示すＮＡＳＨとの鑑別が困難である。【０００５】
現在、非アルコール性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）/非アルコール性脂肪肝炎(ＮＡＳＨ)の確定診断には肝生検による組織診断が用いられている（例えば、特許文献１、２）。
しかしながら、肝生検は苦痛を伴う侵襲的な検査で、しばしば炎症など検査自体のリスクが指摘されるとともに、採取する組織は肝全体に対し一部（極微量）であるため、採取された肝組織が必ずしも肝臓全体（病変）の状態を反映していないことや、組織診断の評価が診断する医師の間で相違が見られるなど診断の精度が低い点が問題である。
このような背景から、新たなバイオマーカー、画像検査、総合的スコアリングシステムなど非侵襲的診断法の開発が進められているが、ＮＡＳＨの確定診断が可能な判定方法は、これまでに実用化されていなかった。【０００６】
一方、本出願の発明者らは、特許文献３において、磁気共鳴法を利用した生体内の生体内因性分子の検出方法として、生体内因性分子をリアルタイムで画像化するための方法であって、測定対象となる生体に磁気共鳴法を適用して生体内因性分子の情報を得る工程と；前記得られた生体内因性分子の情報を処理して画像化情報を得る工程と；前記得られた画像化情報を表示する工程と、を含む方法を開示している。しかしながら、特許文献３にはＮＡＳＨを鑑別するための具体的な手法は開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５８３７５８１号公報
【特許文献２】特許第５２５２４４４号公報
【特許文献３】国際公開２０１１/０５２７６０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このようにＮＡＳＨの確定診断法として、より低侵襲かつ定量的な診断法が求められている。かかる状況下、本発明の目的は、非侵襲的にＮＡＳＨを識別するための指標を得る方法、およびＮＡＳＨ判定方法を提供することである。また、本発明の他の目的は、前記ＮＡＳＨ判定方法に使用するプログラム、前記ＮＡＳＨ判定方法によるＮＡＳＨ治療薬のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、被験動物の肝臓におけるレドックス反応をリアルタイムで検出し、フリーラジカル消費速度の情報を磁気共鳴法によって、定量的に画像化し、これを経時的に動態計測することにより、肝臓における全体のフリーラジカル消費速度を求めることができ、得られるフリーラジカル消費速度を、ＮＡＦＬＤ/ＮＡＳＨの進展に係る指標できることを見出し、本発明に至った。【００１０】
＜１＞  非侵襲的に被験動物の肝臓におけるレドックス反応をリアルタイムで検出し、フリーラジカル消費速度の情報を取得する方法であって、
プローブを被験動物の体内に投与後、測定対象となる肝臓に磁気共鳴法を適用して、フリーラジカル濃度のデータを得る工程（１）と、
前記得られたフリーラジカル濃度のデータを処理して画像化情報を得る工程（２）と、
前記画像化情報を経時的に動態計測し、フリーラジカル消費速度を求める工程（３）と、を含む、前記方法。
＜２＞  被験動物の非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の識別のための指標としてフリーラジカル消費速度の情報を取得する、＜１＞に記載の方法。
＜３＞  前記プローブが、ニトロキシルラジカル化合物である、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞  前記磁気共鳴法が、ＤＮＰ−ＭＲＩ法である、＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の方法。
＜５＞  被験動物の肝臓全体が対象となるように磁気共鳴法を適用する、＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の方法。
＜６＞  ＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の方法を、被験動物に適用して得られたフリーラジカル消費速度情報に基づいて、被験動物がＮＡＳＨか否かを判定する工程を含む、ＮＡＳＨの判定方法。
＜７＞  被験動物が、ＮＡＦＬＤと診断された被験動物である、＜６＞に記載の判定方法。
＜８＞  判定されるＮＡＳＨが、初期ＮＡＳＨである、＜６＞または＜７＞に記載の判定方法。
＜９＞  前記被験動物がＮＡＳＨか否かを判定する工程が、既知のＮＡＳＨ罹患動物群及び既知の非ＮＡＳＨ罹患動物群のそれぞれ肝臓におけるフリーラジカル消費速度情報に基づいてフリーラジカル消費速度の閾値を設定し、
評価対象の被験動物の肝臓におけるフリーラジカル消費速度が、当該閾値以下になった場合にＮＡＳＨであると判定する工程である、＜６＞から＜８＞のいずれかに記載の判定方法。
＜１０＞  コンピュータに、＜６＞から＜９＞のいずれかに記載の判定方法を少なくとも実行させることを特徴とするＮＡＳＨ判定用プログラム。
＜１１＞  ＮＡＳＨの治療薬の候補物質の投与後の被験動物に対して、＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の方法を適用して得られたフリーラジカル消費速度情報に基づいて、候補物質のＮＡＳＨに対する治療作用を判別することを特徴とするＮＡＳＨの治療薬のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、非侵襲的にＮＡＳＨを識別するための指標を得る方法、およびＮＡＳＨ判定方法が提供され、非侵襲的に肝臓のレドックス動態を可視化することによりＮＡＳＨの病勢の評価が可能となり、他の診断法では検出できない超早期のＮＡＳＨの確定診断を行うことが可能となる。
また、本発明によれば、前記ＮＡＳＨ判定方法に使用するプログラム、前記ＮＡＳＨ判定方法によるＮＡＳＨ治療薬のスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本実施の形態のＮＡＳＨ判定システムの構成を示す図である。
【図２】ＤＮＰ−ＭＲＩ評価の様子を示す模式図である。
【図３】レドックス造影剤（ＣｍＰ）を静注により投与した後のマウス上腹部のＤＮＰ-ＭＲＩによる経時的なＤＮＰ-ＭＲＩ画像（インビボイメージンング）である（上段：正常マウス（コントロールマウス）、下段：ＮＡＳＨ病態モデルマウス）。
【図４】正常マウス群（コントロールマウス群）及びＮＡＳＨ病態モデルマウス群におけるフリーラジカル消費速度と病変の進行度を示す図であり、図３の画像から肝臓部分を関心領域（ＲＯＩ）として抽出し、肝臓におけるレドックス代謝速度を算出した値をプロットした図である。
【図５】本発明に係るインビボＤＮＰ-ＭＲＩによる肝臓におけるレドックス代謝速度の経時測定結果である（左側：正常マウス群とＮＡＳＨ病態モデルマウス群のフリーラジカル消費速度の比較、右側：正常マウス群と高脂肪食（ＨＦ）モデルマウス群のフリーラジカル消費速度の比較）。
【図６】本発明に係るインビボＤＮＰ-ＭＲＩによるＮＡＳＨ早期病変変動の画像である。
【図７】本発明に係るレドックス造影剤（ＣｍＰ）の反応メカニズムの説明図である。
【符号の説明】
【００１３】
１  ＮＡＳＨ判定システム
２  データ取得部
３  演算制御部
４  記憶部
５  出力部
６  ＭＲＩ装置
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について例示物等を示して詳細に説明するが、本発明は以下の例示物等に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において任意に変更して実施できる。また、本明細書において、「〜」とはその前後の数値又は物理量を含む表現として用いるものとする。
【００１５】
本発明の第１の態様は、非侵襲的に被験動物の肝臓におけるレドックス反応をリアルタイムで検出し、フリーラジカル消費速度の情報を取得する方法であって、測定対象となる肝臓に磁気共鳴法を適用して、フリーラジカル濃度のデータを得る工程（１）と、前記得られたフリーラジカル濃度のデータを処理して画像化情報を得る工程（２）と、前記画像化情報を経時的に動態計測し、フリーラジカル消費速度を求める工程（３）と、を含む方法（以下、「本発明のフリーラジカル消費情報取得方法」と称す場合がある。）である。
【００１６】
本発明の第１の態様によれば、工程（１）により肝臓に磁気共鳴法を適用して得られたフリーラジカル濃度のデータを、工程（２）により肝臓の画像化情報として視覚化し、工程（３）により画像化情報を経時的に動態計測し、肝臓のフリーラジカル消費速度を求めることができる。肝臓におけるミトコンドリアによるレドックス反応を介してフリーラジカルが消失し造影効果を失う特性を応用したものであり、これによりＮＡＳＨ識別のための指標となるフリーラジカル消費速度の情報を視覚化して取得することができる。
【００１７】
被験動物は、評価に使用する磁気共鳴装置が適用でき、フリーラジカル消費速度を求めることができる動物であればよく、ヒト、及びヒト以外の動物が対象となる。ヒト以外の動物としては、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ等が挙げられるがこれらに特に制限されない。
【００１８】
また、本発明において、フリーラジカルを有する物質であれば磁気共鳴法の画像化の対象となりうるが、外部から生体内に取り込まれた生体外物質（プローブ）が好適に用いられる。その中でも、より強いシグナルが得られ、被験動物に有害でないプローブを選択することが好ましい。
このような生体外物質として、例えば、ヒトに対して有害でない化合物である、ニトロキシルラジカル化合物が挙げられる。ニトロキシルラジカル化合物としては、Carboxy PROXYL、Tempol、Methoxycarbonyl PROXYL、Carbamoyl-PROXYL等が挙げられる。なお、肝組織はニトロキシルラジカルの代謝が非常に早い臓器であり、TempolやMethoxycarbonyl PROXYLなどのプローブでは検出が困難である。またCarboxy PROXYLは細胞膜透過性が無いため、血管内のレドックス解析には有効であるが、肝細胞内の解析は困難で有る。Carbamoyl-PROXYLは、毒性が低く、細胞膜透過性を有し、代謝反応が緩やかであるため好適である。
【００１９】
そのため、通常、プローブを被験動物の体内に投与後、測定対象となる肝臓に磁気共鳴法を適用する。すなわち、通常は、プローブが体内に投与された被験動物の肝臓に磁気共鳴法を適用して、フリーラジカル濃度のデータを得る。
【００２０】
本発明において用いる磁気共鳴法は一般的な磁気共鳴法であり、測定対象物に外部から電磁波又は振動磁場を加えると、特定の周波数に対して一種の共鳴を起こして電磁波が強く吸収される現象（磁気共鳴）を利用して、共鳴吸収の起こる周波数や吸収の波形から物質内部の電子や原子核の状態を測定する方法である。
【００２１】
前記磁気共鳴法としては、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）法、ＤＮＰ−ＭＲＩ法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、電子スピン共鳴（ＥＰＲ）法等を挙げることができる。特に、動的核偏極（Dynamic Nuclear Polarization: ＤＮＰ）-ＭＲＩ装置を使用したＤＮＰ−ＭＲＩ法や電子スピン共鳴法等を挙げることができ、これらの磁気共鳴法を用いることで、より正確な計測画像を得ることができる。特に高感度であるＤＮＰ−ＭＲＩ法であれば、フリーラジカル濃度を定量的に画像化できるので、ＮＡＳＨを識別する指標となるフリーラジカル消費速度の情報をより正確に取得することができる。
【００２２】
本発明では、肝臓の一部だけでなく、肝臓全体が対象となるように磁気共鳴法を適用することが好ましい。このようにすることにより、肝臓全体におけるフリーラジカル消費速度の情報を判別することができる。これにより、肝臓全体のレドックス動態を定量的に視覚化することができる。
【００２３】
本発明の第２の態様は、上記本発明の第１の態様の方法を、被験動物に適用して得られたフリーラジカル消費速度情報に基づいて、被験動物がＮＡＳＨか否かを判定する工程を含むＮＡＳＨ判定方法（以下、「本発明のＮＡＳＨ判定方法」と称す。）である。上述の通り、本発明の第１の態様であるフリーラジカル消費情報取得方法では、肝臓に磁気共鳴法を適用して得られたフリーラジカル濃度のデータを、肝臓の画像化情報として視覚化し、画像化情報を経時的に動態計測し、非侵襲的に被験動物の肝臓における肝臓のフリーラジカル消費速度をリアルタイムで求めることができ、このフリーラジカル消費速度の情報から、被験動物がＮＡＳＨか否かを判定する。
【００２４】
本発明のＮＡＳＨ判定方法では、従来の非侵襲的では識別が困難であった初期ＮＡＳＨについても判定を行うことができる。他の公知の方法により、ＮＡＦＬＤと診断された被験動物に対し、本発明のＮＡＳＨ判定方法を適用することにより、効果的に初期ＮＡＳＨの確定診断を行うことができる。
【００２５】
なお、本明細書において、「初期ＮＡＳＨ」とは、Ｂｒｕｎｔ病理分類でＳｔａｇｅ１−２のものをいい、「進行ＮＡＳＨ」とは、Ｂｒｕｎｔ病理分類でＳｔａｇｅ３−４のものをいう。
【００２６】
本発明のＮＡＳＨ判定方法の好適な態様は、前記被験動物がＮＡＳＨか否かを判定する工程が、既知のＮＡＳＨ罹患動物群及び既知の非ＮＡＳＨ罹患動物群のそれぞれ肝臓におけるフリーラジカル消費速度情報に基づいてフリーラジカル消費速度の閾値を設定し、評価対象の被験動物の肝臓におけるフリーラジカル消費速度が、当該閾値以下になった場合にＮＡＳＨであると判定する工程である方法である。
【００２７】
本発明の第３の態様は、コンピュータに、上記本発明のＮＡＳＨ判定方法を実行させるためのＮＡＳＨ判定用プログラム（以下、「本発明のプログラム」と称す）である。本発明のプログラムには、本発明のＮＡＳＨ判定方法のみならず、これ以外の方法を実行させるデータが組み入れていてもよい。
【００２８】
また、本発明のＮＡＳＨ判定方法（本発明の第２の態様）を応用し、ＮＡＳＨの治療薬のスクリーニングを行うことができる。
すなわち、本発明の第４の態様は、ＮＡＳＨの治療薬の候補物質の投与後の被験動物に対して、本発明のフリーラジカル消費情報取得方法を適用して得られたフリーラジカル消費速度情報に基づいて、候補物質のＮＡＳＨに対する治療作用を判別することを特徴とするＮＡＳＨの治療薬のスクリーニング方法である。上述の通り、本発明のＮＡＳＨ判定方法によれば、初期ＮＡＳＨについても判別できるため、より効率よく、有益なＮＡＳＨの治療薬をスクリーニングすることができる。
【００２９】
以下、本発明の実施形態の一例として、本発明のＮＡＳＨ判定方法を行うＮＡＳＨ判定システムについて、図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態はすべての点で例示であって制限的なものではない。特に、今回開示された実施形態において、明示的に開示されていない事項、例えば、運転条件や操業条件、各種パラメータ、構成物の寸法、重量、体積などは、当業者が通常実施する範囲を逸脱するものではなく、通常の当業者であれば、容易に想定することが可能な値を採用している。
【００３０】
図１に本発明の実施の形態に係るＮＡＳＨ判定システム１の構成を示す。ＮＡＳＨ判定システム１は、機能的には、データ取得部２と、演算制御部３と、記憶部４と、出力部５とを有するコンピュータと、ＭＲＩ装置６により構成される。
【００３１】
データ取得部２は、ＭＲＩ装置６と接続されており、磁気共鳴法のデータを取得する機能を有しており、ＭＲＩ装置６にて撮像したＭＲＩデータを取得する。データ取得部２とＭＲＩ装置６との接続は有線でも無線であってもよい。また、他の病院など外部機関で取得したＭＲＩデータを、ネットワークを介して受信する構成としてもよい。
【００３２】
演算制御部３は、記憶部４に保存されたＮＡＳＨ判別プログラムを実行し、データ取得部２にて取得したＭＲＩデータを用いて、検査対象の被験動物がＮＡＳＨであるか否かを判定する機能を有する。
【００３３】
記憶部４は、ＮＡＳＨ判定システム１を作動させるためのプログラム及びＮＡＳＨ判別プログラムが保存されている。また、ＮＡＳＨを判別するための閾値（カットオフ値）が記憶されている。記憶部４における閾値は、被験動物の種類、年齢、性別等に対応して決定される。
【００３４】
出力部５は、演算制御部３からのＮＡＳＨ判別結果を外部に出力する。出力方法としては、通常、ＮＡＳＨ判定システム１が有するモニタへの表示であるが、ネットワークを介して外部へ送信する構成であってもよい。
【００３５】
ＭＲＩ装置６は、ＤＮＰ-ＭＲＩ法（オーバーハウザーＭＲＩ法）を実行することができるＤＮＰ-ＭＲＩ装置である。このような磁気共鳴法による画像化のための装置としては、例えば国際公開２０１０／１１０３８４号に開示されている装置、すなわち、「計測対象物の磁気共鳴を励起させるための磁場を発生させる磁場発生手段と、計測対象物または磁場発生手段を移動させることにより計測対象物を磁場発生手段の磁場中を移動させる移動手段と、移動手段による移動中に停止することなく、計測対象物の磁場発生手段に対する移動方向ｙおよびこの移動方向ｙに対して直交する方向ｘのいずれか一方または両方に傾斜磁場を掛けて位相エンコードおよび周波数エンコードのいずれか一方または両方により、計測対象物中の計測画像信号を得る計測手段と、計測画像信号に対し、ｙ方向の移動の影響を補正した補正画像信号を得る補正手段と、を有する装置」を用いることができる。
【００３６】
以下、本実施形態のＮＡＳＨ判定システム１に準じる構成のシステムを使用し、ＮＡＳＨ病態モデルマウスを被験動物とし、フリーラジカル消費速度の情報を取得し、被験動物がＮＡＳＨか否かを判定した例（実施例）について説明する。なお、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
（実験動物）
ＮＡＳＨ病態モデルマウスは、以下の手順で作製した。なお、全ての手順および動物の取扱いは、九州大学薬学部動物実験倫理委員会により承認されており、九州大学薬学部動物実験ガイドラインに沿って実験を行った。
Ｃ５７ＢＬ６マウス（雌、５週齢）は、日本チャールズリバー（横浜、日本）から購入し、実験前に１週間順応させ実験を開始した。マウスはケージ当たりに５匹で、温度および概日リズムを調整した室内で、メチオニンーコリン欠乏食または通常食を与えて、飼育した。メチオニンーコリン欠乏食群（ＮＡＳＨ病態モデルマウス群）、通常食群（正常マウス群）はそれぞれ５群ずつに分けられ、１，２，４，６，８週毎にＤＮＰ−ＭＲＩの測定を行い病態評価のため採血、解剖、肝組織採取を行った。【００３８】
（ＤＮＰ−ＭＲＩ評価）
図２にＤＮＰ−ＭＲＩ評価の様子を示す模式図に示す。
マウス（ＮＡＳＨ病態モデルマウス）を、イソフルラン（導入４％、維持２％）で麻酔し、胃側を下にして粘着性の皮膚用テープで肝計測用局所検出器（サーフェイスコイル）とホルダーに固定した。実験中のマウスの体温は３７±１℃だった。マウスをＤＮＰ−ＭＲＩ共鳴装置に移し、肝臓全体が測定対象となるように設置した後に、ＮＡＳＨ病態モデルマウスにＣｍＰ（Ｃａｒｂａｍｏｙｌ−ＰＲＯＸＹＬ、レドックス造影剤）を静注し、ＤＲＩ−ＭＲＩ測定を開始した。
ＤＲＩ−ＭＲＩの条件は以下の通りである。
ＴＲ、１２００ｍｓ；ＴＥ、２５ｍｓ；ＴＥＰＲ、６００ｍｓ；ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｐｈａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｓｔｅｐｓ、６４；ＮＥＸ、４；ＦＯＶ、４８ｍｍ´４８ｍｍ；Ｍａｔｒｉｘ  ｓｉｚｅ、６４´６４(ｉｍｐｌａｎｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ０．７５ｍｍ)；ｓｌｉｃｅ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ、３０ｍｍ；ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ａｖｅｒａｇｅ、１、ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｔｉｍｅ、７９ｓ。ＯＭＲＩデータは、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（http://rsb.info.nih.gov/ij/）を使用し、解析を行った。【００３９】
また、対照として、通常食を与えたマウス群（正常マウス群）についても、同様のＤＲＩ−ＭＲＩ評価を行った。【００４０】
（結果）
図３に、レドックス造影剤（ＣｍＰ）を静注により投与した後のマウス上腹部のＤＮＰ-ＭＲＩによる経時的なＤＮＰ-ＭＲＩ画像（インビボイメージンング）を示す（上段：正常マウス（コントロールマウス）、下段：ＮＡＳＨ病態モデルマウス）。
正常マウス（コントロール）においては、ＣｍＰは上腹部に均一に分布した後、時間経過と共に速やかにＣｍＰラジカルがレドックス代謝を受け消失し、ＣｍＰ投与から５．５分以降はほとんど消失していることがわかる。一方、ＮＡＳＨ病態モデルマウス（ＮＡＳＨモデル）においては、ＣｍＰ投与後、上腹部ＣｍＰに由来する高い強度のシグナルが観測され、その後徐々にレドックス代謝が進んでいることがわかる。このように、ＮＡＳＨ病態モデルマウスでは、ＣｍＰラジカルの減少速度は、正常マウスの場合と比較して明らかに遅く、ＣｍＰ投与から１３分後においてもＣｍＰラジカルが残存していた。【００４１】
ＮＡＳＨ病態モデルマウス及び正常マウスそれぞれの画像強度の領域を関心領域として選定し、強度の変化をプロットすると、ＮＡＳＨ病態モデルマウスにおけるＣｍＰの消失は正常マウスに比べ有意に遅かった。この結果から、本発明のフリーラジカル消費情報取得方法により、マウス肝臓でのＣｍＰラジカルの消費速度の情報が得られることが確認された。【００４２】
また、図４に、正常マウス群（コントロールマウス群）及びＮＡＳＨ病態モデルマウス群におけるレドックス代謝速度（フリーラジカル消費速度）と病変の進行度を示す図であり、図３の画像から肝臓部分を関心領域（ＲＯＩ）として抽出し、肝臓におけるレドックス代謝速度を算出した値をプロットした図を示す。
ＮＡＳＨ病態モデルマウス群に関して、メチオニンーコリン欠乏食（ＭＣＤ）開始後１週（ＭＣＤ１），２週（ＭＣＤ２），４週（ＭＣＤ４），６週（ＭＣＤ６），８週週（ＭＣＤ８）においてＤＮＰ-ＭＲＩ計測を行い、肝臓におけるＣｍＰラジカルのレドックス代謝速度を算出した。レドックス代謝速度が有意に低下する場合にはＮＡＳＨ病態として判定する。
正常マウス群に関しても、同様に通常食開始後１週（ＮＤ１），２週（ＮＤ２），４週（ＮＤ４），６週（ＮＤ６），８週週（ＮＤ８）においてＤＮＰ-ＭＲＩ計測を行い、肝臓におけるＣｍＰラジカルのレドックス代謝速度を算出した。
図４に示されるように、正常マウスにおいて、肝臓におけるＣｍＰのレドックス代謝速度は０．１７〜０．２３ｍｉｎ−１を示し、ミトコンドリア電子伝達系におけるレドックス代謝を主として比較的早いレドックス代謝速度を示している。
一方、ＮＡＳＨ病態モデルマウス群においては１週（ＭＣＤ１）から有意にレドックス代謝速度（消失速度）の低下が見られ、時間経過とともにレッドクス代謝速度は減少している。
図４においては、ＮＡＳＨを判別するための閾値を、０．１６ｍｉｎ−１に設定し、被験マウスのレドックス代謝速度がこの閾値を下回った場合であれば、ＮＡＳＨと判定する。【００４３】
ヒトの場合も同様に、このレドックス代謝速度を利用してヒトにおけるＮＡＳＨを診断することが可能となる。すなわち、健康な肝臓もしくはただの脂肪肝のヒトにおいては、レドックス代謝速度はある程度の範囲での代謝速度を示すことが想定される。一方ＮＡＳＨ患者の肝臓では早期段階で優位に低下することから、健常のヒトもしくは脂肪肝のヒトのレドックス代謝速度の閾値を決定すれば、それを下回った場合ＮＡＳＨと診断することが可能となる。【００４４】
また、図５に本発明に係るインビボＤＮＰ-ＭＲＩによる肝臓におけるレドックス代謝速度（フリーラジカルの消費速度）の経時測定結果を示す。図５は、図４と同様の方法で正常マウス群またはＮＡＳＨ病態モデルマウス群の肝臓におけるレドックス代謝速度を算出した値の平均を示すものであり、高脂肪食投与の脂肪肝マウス群の結果も併せて示す。図５（左）は、正常マウス群とＮＡＳＨ病態モデルマウス群の結果であり、図５（右）は正常マウス群と高脂肪食投与の脂肪肝（ＨＦ）マウス群の結果である。マウスに脂肪肝のみの状態を誘発する高脂肪食（ＨＦ）モデルマウスを用いた実験においては、肝臓におけるフリーラジカルの代謝に正常マウス群との有意な差は見られなかった。この結果は、脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）の状態においては、本発明のＮＡＳＨ判定方法では、ＮＡＳＨと判定されず、肝臓がＮＡＳＨ病態を示したときにのみその病態を、レドックス代謝反応を元に検出できることを示している。すなわち、ＮＡＦＬＤとＮＡＳＨを区別して判定できることを示している。
ヒトの場合も同様に、ただの脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）をもつヒトとＮＡＳＨ患者に対して本発明のＮＡＳＨ判定方法を用いることで、両者を精密に区別して診断することが可能となる。【００４５】
図６として、本発明に係るインビボＤＮＰ-ＭＲＩによるＮＡＳＨ早期病変変動の画像化の説明図を示す。図６に示すように、視覚的にＮＡＳＨを診断するために、レドックス代謝画像が有効である。なお、図６はグレー図であるが、実際の診断においてはカラー図が使用され、肝臓が正常の場合の色とＮＡＳＨ病変の色とが肝臓内のフリーラジカルの消費速度に基づいて区別される。これにより、肝臓が正常の場合の色（例えば、青色）から変化して特定の色から特定の色（例えば、黄色から赤色）へシフトした場合にはＮＡＳＨであると視覚的に容易に診断が可能となる。【００４６】
また、図７に本発明に係るＣｍＰ（レドックス造影剤）の反応メカニズムの説明図を示す。今回用いたレドックス造影剤（プローブ）であるＣｍＰは細胞質成分や血液成分との反応はほとんどないことが実験により明らかになっている。図７に示すように、ＣｍＰは肝臓のホモジネート溶液によりレドックス代謝されるが、ミトコンドリア電子伝達系阻害剤であるＫＣＮの添加により代謝が止まることから、ＣｍＰがミトコンドリア電子伝達系を介したレドックス代謝を指標としていることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によれば、被験動物に対し、非侵襲的にＮＡＳＨの確定診断を行うことができるため、有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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