(57)【要約】  本発明は、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）を簡便かつ高い精度で検出する方法、及び前記方法に利用できる試薬を提供することを課題とする。検体中に存在するＧＤＦ１５プロペプチドをＣＲＰＣの新たな検出マーカーとして、その量を測定することにより、内分泌治療中又は治療後の前立腺患者における去勢抵抗性の獲得を検出する。また、ＧＤＦ１５プロペプチドを特異的に認識する抗体をＣＲＰＣの検出試薬に含める。
2017150314.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体において、インタクト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）プロペプチド量を測定することを含む、去勢抵抗性前立腺癌を検出する方法。
【請求項２】
検体において、ＧＤＦ１５プロペプチド断片量を測定することを含む、去勢抵抗性前立腺癌を検出する方法。
【請求項３】
検体において、インタクトＧＤＦ１５プロペプチド量とＧＤＦ１５プロペプチド断片量との合計量を測定することを含む、去勢抵抗性前立腺癌を検出する方法。
【請求項４】
前記ＧＤＦ１５プロペプチド断片が、以下の（Ａ）及び／又は（Ｂ）に記載のＧＤＦ１５プロペプチド断片を含む、請求項２又は３に記載の方法。
（Ａ）以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する、ＧＤＦ１５プロペプチド断片。
（ａ）配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の５８残基目のリジンから少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
（ｂ）還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約１７，０００に分画される。
（Ｂ）以下の（ｃ）及び（ｄ）の特徴を有する、ＧＤＦ１５プロペプチド断片。
（ｃ）配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の７４残基目のグルタミン酸から少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
（ｄ）還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約１５，０００に分画される。
【請求項５】
ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を用いた抗原抗体反応を用いて前記測定を行う、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
質量分析法を用いて前記測定を行う、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を含む、去勢抵抗性前立腺癌を検出するための試薬。
【請求項８】
以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する、ＧＤＦ１５プロペプチド断片。
（ａ）配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の５８残基目のリジンから少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
（ｂ）還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約１７，０００に分画される。
【請求項９】
以下の（ｃ）及び（ｄ）の特徴を有する、ＧＤＦ１５プロペプチド断片。
（ｃ）配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の７４残基目のグルタミン酸から少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
（ｄ）還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約１５，０００に分画される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中の増殖分化因子１５（Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＦａｃｔｏｒ １５、以降「ＧＤＦ１５」とも記す）タンパク質のプロペプチド及びその分解物、並びにそれらを測定対象とする去勢抵抗性前立腺癌の検出方法及び検出試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）は、マクロファージ阻害サイトカイン１（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １：ＭＩＣ−１）や非ステロイド系抗炎症薬活性化遺伝子１（Ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｇｅｎｅ １：ＮＡＧ−１）と同一のタンパク質であり、ＴＧＦ−βファミリーに属する。ＧＤＦ１５は分泌シグナル及びプロペプチドを含むプレプロＧＤＦ１５として発現後、分泌シグナルが切断されプロＧＤＦ１５として細胞外へ分泌される。プロＧＤＦ１５はプロペプチドを介して細胞外マトリックスに貯蔵され、フューリン様プロテアーゼによりプロペプチドから二量体を形成した状態でＧＤＦ１５が切り離され血中へ放出される（非特許文献１）。プロＧＤＦ１５は全長で分子量４０，０００付近、ＧＤＦ１５成熟体は分子量１５，０００付近に分画されることが報告されている（非特許文献２）。【０００３】
ＧＤＦ１５は、前立腺癌（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ：ＰＣａ）や卵巣癌さらには心疾患など様々な疾病において血中の成熟体量が増加し（特許文献１〜６、非特許文献３〜７）、他にも食欲調節や妊娠中の胎児検査への応用に関する知見がある（特許文献７〜８）。特に、前立腺疾患との関連においては、前立腺癌では前立腺肥大（Ｂｅｎｉｇｎ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ：ＢＰＨ）に比べて血中ＧＤＦ１５成熟体量が増加すること、ＰＳＡ測定値と組み合わせることで診断性能が高まること、骨転移と血中ＧＤＦ１５成熟体量に相関があり予後判定に有用であることが知られている（特許文献９〜１０、非特許文献８〜１０）。
しかし、これらの知見はいずれもＧＤＦ１５成熟体に関するものであり、ＧＤＦ１５プロペプチドは細胞外マトリクスに局在するものと考えられていた（非特許文献２）。網羅的プロテオーム解析のデータ（ＰｅｐｔｉｄｅＡｔｒａｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎａｍｅ：ＥＮＳＰ０００００２５２８０９、Ｂｕｉｌｄ：Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ Ｎｏｎ−Ｇｌｙｃｏ ２０１５−０９）からは、血中ＧＤＦ１５プロペプチドの存在は示唆されているものの、ＧＤＦ１５プロペプチドの分解物が存在することは今日まで知られていなかった。また、当該タンパク質を測定対象として疾患を検出することもその効果も不明であった。【０００４】
現在、日本における前立腺癌の年間罹患数は約６０，０００人、年間死亡者数は約１１，０００人であるが、その数は急激に増加している。前立腺癌は早期癌や局所進行癌の場合、外科療法または放射線療法が用いられ予後は良好である。一方、転移進行癌の場合、抗アンドロゲン剤によるホルモン療法が用いられ、約８０％は奏功するといわれる。しかし、一部の前立腺癌ではアンドロゲンが去勢レベルに抑えられているにもかかわらず再度病状が悪化する、去勢抵抗性前立腺癌（Ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ：ＣＲＰＣ）となる。
これまでＣＲＰＣ患者には抗癌剤治療が実施されてきたが、近年、日本でもＣＲＰＣを対象とした新規治療薬３種（ホルモン治療薬２種、抗癌剤１種）が保険適用となり、治療薬の使用順序や抗癌剤治療へ移行するタイミングの鑑別が重要視されている。【０００５】
全血、血球、血清、血漿などの血液成分から前立腺癌を検出する方法としては、前立腺特異抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ、ＰＳＡ）を検出対象とする方法が一般に知られている。ＰＳＡは、１９７９年にＷａｎｇらがヒト精漿から精製したセリンプロテアーゼであり、血液成分中に２０ｎｇ／ｍｌ以上のＰＳＡを検出すると高い陽性率で前立腺癌を示す。そのため、前立腺癌のスクリーニング、前立腺癌の治療効果の評価、治療後の経過観察などに有効な検査として広く利用されている。
しかしながら、血中ＰＳＡ濃度とＣＲＰＣの病態とは必ずしも一致しておらず、去勢抵抗性の獲得をＰＳＡの測定のみで判別することは困難である。そのため、他の検査方法を含めて包括的に経過観察が行われているのが現状である。また、グリソンスコアが高い患者や病期の進んだ患者では比較的去勢抵抗性の獲得が早いとされているが、ＰＳＡによる明確な診断ができず、人によって数ヶ月〜１０年と去勢抵抗性獲得期間の幅が広く骨転移など病態が悪化して判明する場合が多いため、血液診断による簡便かつより正確な去勢抵抗性獲得の鑑別方法が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許公開２０１１−１０２４６１
【特許文献２】特許公開２００９−５４５７３５
【特許文献３】特許公開２０１０−５２８２７５
【特許文献４】特許公開２０１１−５２３０５１
【特許文献５】特許公開２０１２−５１５３３５
【特許文献６】特許公開２０１５−１０８０７７
【特許文献７】特許公開２０１１−１９０２６２
【特許文献８】特許公開２００３−５３２０７９
【特許文献９】特許公開２０１３−１７４６１４
【特許文献１０】特許公開２０１１−５０９４０３
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓ． ２０１２；１５（４）：３２０−３２８
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００５；６５（６）：２３３０−２３３６
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ． ２０１３；８５：５９７−６０６
【非特許文献４】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００９；１５（２１）：６６５８−６６６４
【非特許文献５】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１１；１７：４８２５−４８３３
【非特許文献６】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００３；９：２６４２−２６５０
【非特許文献７】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００６；１２：４４２−４４６
【非特許文献８】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００６；１２（１）：８９−９６
【非特許文献９】Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ． ２００７；１６：５３２−５３７
【非特許文献１０】Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ． ２０１０；９：１０５７−１０６４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）を簡便かつ高い精度で検出する方法、及び前記方法に利用できる試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意検討した結果、癌細胞株の培養上清中にＧＤＦ１５プロペプチド及びその分解物が分泌されていることを見出し、さらに癌患者の血中においてもＧＤＦ１５プロペプチド及びその分解物が存在することを確認した。特に、前立腺癌（ＰＣａ）及び去勢抵抗性前立腺（ＣＲＰＣ）細胞株培養上清のプロテオーム解析を行ったところ、培養上清中にはＧＤＦ１５成熟体のみならずＧＤＦ１５プロペプチド及びその分解物が存在することを見出した。
さらに、鋭意検討の結果、前立腺腫瘍及び前立腺肥大において、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を用いたイムノアッセイにより、血液中のＧＤＦ１５プロペプチドは去勢抵抗性獲得後の前立腺癌検体で顕著な増加を示すという知見を得て、ＧＤＦ１５プロペプチドが去勢抵抗性前立腺癌の検出マーカーとなり得ることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］検体において、インタクトＧＤＦ１５プロペプチド量を測定することを含む、去勢抵抗性前立腺癌を検出する方法。
［２］検体において、ＧＤＦ１５プロペプチド断片量を測定することを含む、去勢抵抗性前立腺癌を検出する方法。
［３］検体において、インタクトＧＤＦ１５プロペプチド量とＧＤＦ１５プロペプチド断片量との合計量を測定することを含む、去勢抵抗性前立腺癌を検出する方法。
［４］前記ＧＤＦ１５プロペプチド断片が、以下の（Ａ）及び／又は（Ｂ）に記載のＧＤＦ１５プロペプチド断片を含む、［２］又は［３］に記載の方法。
（Ａ）以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する、ＧＤＦ１５プロペプチド断片。
（ａ）配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の５８残基目のリジンから少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
（ｂ）還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約１７，０００に分画される。
（Ｂ）以下の（ｃ）及び（ｄ）の特徴を有する、ＧＤＦ１５プロペプチド断片。
（ｃ）配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の７４残基目のグルタミン酸から少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
（ｄ）還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約１５，０００に分画される。
［５］ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を用いた抗原抗体反応を用いて前記測定を行う、［１］〜［４］の何れかに記載の方法。
［６］質量分析法を用いて前記測定を行う、［１］〜［５］の何れかに記載の方法。
［７］ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を含む、去勢抵抗性前立腺癌を検出するための試薬。
［８］以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する、ＧＤＦ１５プロペプチド断片。
（ａ）配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の５８残基目のリジンから少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
（ｂ）還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約１７，０００に分画される。
［９］  以下の（ｃ）及び（ｄ）の特徴を有する、ＧＤＦ１５プロペプチド断片。
（ｃ）配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の７４残基目のグルタミン酸から少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
（ｄ）還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約１５，０００に分画される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）の診断マーカーとなり得る新規ペプチド断片が提供される。また、本発明により、ＣＲＰＣを簡便かつ高い精度で検出する方法、及び前記方法に利用できる試薬が提供される。
また、本発明の試薬はＧＤＦ１５プロペプチドを検出するものであり、ＧＤＦ１５発現制御はｐ５３下流に位置しているため、既存の前立腺癌治療薬、特にタキサン系抗癌剤の治療効果を反映することが推測される。したがって、本発明の試薬は、前立腺癌の治療におけるコンパニオン診断薬にもなり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】癌細胞培養上清中から検出されたＧＤＦ１５のペプチドを示す図。網掛けの部分が、プロテオーム解析で検出されたペプチドを示す。
【図２−１】エピトープ解析用に作製した組換えＧＤＰＰの概略図。
【図２−２】ＥＬＩＳＡ法による各モノクローナル抗体のエピトープ解析結果を示す図。横軸は吸光度を示す。
【図３−１】３種のモノクローナル抗体によるＬｎＣａｐ上清のＩＰ産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した結果を示す図（Ｒｕｂｙ染色像）（写真）。
【図３−２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの各バンドから切り出したサンプルより質量分析装置で検出されたＧＤＰＰのペプチドを示す図。
【図４】ウエスタンブロット法による組換えｉＧＤＰＰの精製結果を示す図（写真）。
【図５】合成ペプチドを用いたＭＲＭによる定量用のＧＤＰＰ検量線を示す図。
【図６】ｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰ及びｍＧＤＦ１５の測定試薬による検量線を示す図。
【図７−１】各前立腺疾患パネルの血清及び血漿中ｉＧＤＰＰのＡＩＡ解析結果及び相関を示す図。横棒は各疾患群の中央値を示す。
【図７−２】各前立腺疾患パネルの血清及び血漿中ｔＧＤＰＰのＡＩＡ解析結果及び相関を示す図。横棒は各疾患群の中央値を示す。
【図７−３】ＰＣａ及びＣＲＰＣ群におけるｉＧＤＰＰ及びｔＧＤＰＰ測定値の血清血漿間差を示す図。
【図７−４】各前立腺疾患パネルの血清及び血漿中ｍＧＤＦ１５のＡＩＡ解析結果及び相関を示す図。横棒は各疾患群の中央値を示す。
【図８−１】ｉＧＤＰＰ及びｔＧＤＰＰのＰＣａ及びＣＲＰＣ検体のＲＯＣ曲線を示す図。実線が血漿、破線が血清の値を示す。
【図８−２】ｍＧＤＦ１５のＰＣａ及びＣＲＰＣ検体のＲＯＣ曲線を示す図。
【図９】前立腺疾患血漿中のＰＳＡ、ｍＧＤＦ１５及びｉＧＤＰＰのＡＩＡ解析結果を示す図。
【図１０】ＰＳＡ、ｍＧＤＦ１５及びｉＧＤＰＰのＰＣａ及びＣＲＰＣ検体のＲＯＣ曲線を示す図。細い実線がＰＳＡ、破線がｍＧＤＦ１５、太い実線がｉＧＤＰＰを示す。
【図１１】非ステロイド性抗炎症薬の投薬有無におけるｉＧＤＰＰ測定値を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜１＞本発明の増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）プロペプチド断片
本発明の第一の態様は、ＧＤＦ１５プロペプチドの分解物であるＧＤＦ１５プロペプチド断片である。
ＧＤＦ１５の発現・分泌様式から、ＧＤＦ１５成熟体分泌後もＧＤＦ１５プロペプチドは細胞外マトリックスに局在していると考えられてきた。本発明者らが、ＰＣａ及びＣＲＰＣ細胞株培養上清のプロテオーム解析を行ったところ、培養上清中にはＧＤＦ１５成熟体のみならずＧＤＦ１５プロペプチド及びその分解物が存在することが分かった。さらに、本発明者らは、ＧＤＦ１５プロペプチド及びその分解物が血中に分泌されることを見出した。発現量が増加するにつれてＧＤＦ１５プロペプチドも血中へ分泌されるようになり、ＧＤＦ１５プロペプチドはその過程で何らかの特徴的なプロセシングを経て、その分解物としてＧＤＦ１５プロペプチド断片が存在するものと推察される。なお、これまでＧＤＦ１５プロペプチドの分解物（断片）の存在は知られていなかった。
【００１４】
ＧＤＦ１５プロペプチド（以降、「ＧＤＰＰ」とも記す）は、プロＧＤＦ１５のＮ末端側に位置する１６５残基のポリペプチドである。より具体的には、本明細書におけるＧＤＦ１５プロペプチドは、配列番号１に示すヒトＧＤＦ１５のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｅｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿００４８６４）に基づくアミノ酸配列において、開始メチオニンから２９残基目のアラニンまでのシグナルペプチドに続く、３０残基目のロイシンから１９４残基目のアルギニンまでの配列を少なくとも含む、または、前記配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。
【００１５】
ＧＤＦ１５プロペプチド断片には複数のフォームが存在すると考えられるが、後述の実施例により確認されている以下の２種類が含まれる。
１つ目は、ＧＤＰＰにおいて配列番号２の５８残基目のリジンのＮ末端側でプロセシングが生じて５７残基目までが欠損した、ＧＤＦ１５プロペプチドのＣ末端側断片である（以降、「ｄＮＴ５７−ＧＤＰＰ」とも記す）。より具体的には、配列番号２の５８残基目のリジンから少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までの配列を含む、または、前記配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。
２つ目は、ＧＤＰＰにおいて配列番号２の７４残基目のグルタミン酸のＮ末端側でプロセシングが生じて７３残基目までが欠損した、ＧＤＦ１５プロペプチドのＣ末端側断片である（以降、「ｄＮＴ７３−ＧＤＰＰ」とも記す）。より具体的には、配列番号２の７４残基目のグルタミン酸から少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までの配列を含む、または、前記配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。
【００１６】
前記同一性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。また、本発明のポリペプチドは、前記配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。なお、数個とは、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個をいう。
また、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＧＤＦ１５プロペプチドは分子量２０，０００付近に、ｄＮＴ５７−ＧＤＰＰは分子量１７，０００付近に、ｄＮＴ７３−ＧＤＰＰは分子量１５，０００付近に検出される。より具体的には、例えば１０〜２０質量％のグラジエントのポリアクリルアミドゲルを用いて常法に従い還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した場合に、分子量マーカー、好ましくはプレシジョンＰｌｕｓプロテインプレステインドスタンダード（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）の分子量２０，０００、１７，０００及び１５，０００に相当するバンドとほぼ同じ位置で検出される。
【００１７】
＜２＞本発明の去勢抵抗性前立腺癌を検出する方法
本発明の第二の態様は、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）を検出する方法であり、検体においてＧＤＦ１５プロペプチド量を測定することを含む。これは、去勢抵抗性獲得前のＰＣaと比べて、ＣＲＰＣの血液等の生体試料中に特徴的にＧＤＦ１５プロペプチドが存在することに基づく方法である。この方法により、後述する実施例が示すように、従来知られた腫瘍マーカー（ＰＳＡ）やＧＤＦ１５成熟体単独を測定した場合に比べて、去勢抵抗性前立腺癌を高い感度と特異度で検出することができる。
【００１８】
本態様において測定対象であるＧＤＦ１５プロペプチドには、配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の３０残基目のロイシンから１９４残基目のアルギニンまでのアミノ酸配列からなるインタクトＧＤＦ１５プロペプチド（以降、「ｉＧＤＰＰ」とも記す）及び／又はＧＤＦ１５プロペプチド断片が含まれ、ＧＤＦ１５プロペプチド断片には、ｄＮＴ５７−ＧＤＰＰ、ｄＮＴ７３−ＧＤＰＰ、及びその他のペプチド断片が含まれる。なお、インタクトＧＤＦ１５プロペプチドは、分解されていないＧＤＦ１５プロペプチドを指す。
【００１９】
本発明の検出方法において、ＧＤＦ１５プロペプチド量を測定する方法は特に制限されない。例えば、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を用いる抗原抗体反応を利用した方法や、質量分析法を利用した方法が例示できる。
【００２０】
ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法の具体例としては、以下のものが挙げられる。
（ａ）標識した測定対象及び測定対象を認識する抗体を用い、標識した測定対象及び検体に含まれる測定対象が、前記抗体に競合的に結合することを利用した競合法。
（ｂ）測定対象を認識する抗体を固定化したチップに検体を接触させ、当該抗体と測定対象との結合に依存したシグナルを検出する表面プラズモン共鳴を用いた方法。
（ｃ）蛍光標識した測定対象を認識する抗体を用い、当該抗体と測定対象とが結合することで蛍光偏光度が上昇することを利用した蛍光偏光免疫測定法。
（ｄ）エピトープの異なる２種類の、測定対象を認識する抗体（うち１つは標識した抗体）を用い、当該２つの抗体と測定対象との３者の複合体を形成させるサンドイッチ法。
（ｅ）前処理として測定対象を認識する抗体により検体中の測定対象を濃縮後、その結合タンパクのポリペプチドを質量分析装置等により検出する方法。
（ｄ）、（ｅ）の方法が簡便かつ汎用性が高いが、多検体を処理する上では（ｄ）の方法が試薬及び装置に関する技術が十分確立されている点でより好ましい。
【００２１】
ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体としては、ＧＤＦ１５プロペプチドのＮ末端領域を認識する、例えば配列番号２の３０残基目のロイシンから５７残基目のアルギニンまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体が、ｉＧＤＰＰ量の測定に好ましく用いることができる。また、ＧＤＦプロペプチドのＣ末端領域を認識する、例えば配列番号２の７４残基目のグルタミン酸から１９４残基目のアルギニンまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体が、ｉＧＤＰＰ量とＧＤＰＰ断片量との合計量（総ＧＤＰＰ、以降「ｔＧＤＰＰ」とも記す）の測定に好ましく用いることができる。
【００２２】
ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体は、ＧＤＦ１５プロペプチドそのもの、ＧＤＦ１５プロペプチドの部分領域からなるオリゴペプチド、プロＧＤＦ１５タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドなどを免疫原として、動物に免疫することで得ることができる。
免疫に用いる動物は、抗体産生能を有するものであれば特に限定はなく、マウス、ラット、ウサギなど通常免疫に用いる哺乳動物でもよいし、ニワトリなど鳥類を用いてもよい。
【００２３】
なお、免疫原として、ＧＤＦ１５プロペプチドそのもの、またはＧＤＦ１５プロペプチドの部分領域からなるオリゴペプチドを用いると、前記タンパク質または前記オリゴペプチドを調製する過程でその構造が変化する可能性がある。そのため、得られた抗体が、所望の抗原に対して高い特異性や結合力を有さない可能性があり、結果として検体中に含まれるＧＤＦ１５プロペプチド量を正確に定量できなくなる可能性がある。一方、免疫原として、プロＧＤＦ１５タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いると、免疫された動物の体内で構造変化を受けずに導入した通りのＧＤＦ１５プロペプチドタンパク質のインタクトまたは部分領域が発現されるため、検体中のＧＤＦ１５プロペプチドに対し、高い特異性及び結合力（すなわち高親和性）を有した抗体が得られるため好ましい。
【００２４】
ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であるのが好ましい。
ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の樹立は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で免疫した動物からＢ細胞を採取し、前記Ｂ細胞とミエローマ細胞とを電気的にまたはポリエチレングリコール存在下で融合させ、ＨＡＴ培地により所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択を行ない、選択したハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりモノクローン化を行なうことで、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を樹立することができる。
【００２５】
本発明の去勢抵抗性前立腺癌を検出する方法で用いる、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体、例えば、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識するモノクローナル抗体の選定は、宿主発現系に由来する、ＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカー型ＧＤＦ１５プロペプチドまたは分泌型ＧＤＦ１５プロペプチドに対する親和性に基づいて行えばよい。
【００２６】
なお、前記宿主としては特に限定はなく、当業者がタンパク質の発現に通常用いる、大腸菌や酵母などの微生物細胞、昆虫細胞、動物細胞の中から適宜選択すればよいが、ジスルフィド結合もしくは糖鎖付加といった翻訳後修飾により、天然型のＧＤＦ１５プロペプチドに近い構造を有するタンパク質の発現が可能な、哺乳細胞を宿主として用いると好ましい。哺乳細胞の一例としては、従来用いられている、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞株、サル腎臓細胞ＣＯＳ７株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒトから単離された癌細胞などが挙げられる。
【００２７】
本発明の去勢抵抗性前立腺癌検出方法で用いる抗体の精製は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で樹立した、抗体を産生するハイブリドーマ細胞を培養後、その培養上清を回収し、必要に応じ硫酸アンモニウム沈殿による抗体濃縮後、プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＬなどを固定化した担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー及び／またはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体の精製が可能である。
なお、前述したサンドイッチ法で抗原抗体反応を行なう際に用いる標識した抗体は、前述した方法で精製した抗体をペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼなどの酵素等で標識すればよく、その標識も技術が十分確立された方法を用いて行なえばよい。
【００２８】
本発明の検出方法において、質量分析法を利用してＧＤＦ１５プロペプチドおよびＧＤＦ１５成熟体を検出する方法について、以下に具体的に説明する。
検体が血液である場合は、前処理工程として血液に多く含まれるアルブミン、イムノグロブリン、トランスフェリン等のタンパク質をＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎ １４等で除去した後、イオン交換、ゲル濾過または逆相ＨＰＬＣ等でさらに分画することが好ましい。
【００２９】
測定は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィ・タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔ−ｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）、表面増強レーザーイオン化質量分析（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＳＥＬＤＩ−ＭＳ）等により行うことができる。
【００３０】
本発明の検出方法では、測定により得たＧＤＦ１５プロペプチド量が、対照から算出した基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）を超えた場合に、去勢抵抗性前立腺癌が検出されたと判定することが好ましい。
判定に用いるＧＤＦ１５プロペプチド量は、測定値もしくは換算濃度値の何れでもよい。なお、換算濃度値は、ＧＤＦ１５プロペプチドを標準試料として作成された検量線に基づいて測定値から換算される値をいう。標準試料の濃度決定は、質量分析を用いた標準ペプチドの検量線に基づいて測定値から換算される値とした。
基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）は、去勢抵抗性獲得前の前立腺癌、その他の泌尿器癌、前立腺肥大、又は健常人などの去勢抵抗性前立腺癌ではない検体と、去勢抵抗性前立腺癌検体とをそれぞれ測定し、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析により最適な感度と特異度を示す測定値に適宜設定することができる。例えば、具体的には、血漿を検体として用いた際のＧＤＦ１５プロペプチド量の基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）は、濃度１．３３７ｎｇ／ｍＬに設定してもよい。
【００３１】
＜３＞本発明の去勢抵抗性前立腺癌を検出するための試薬
本発明の第三の態様は、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を含む、去勢抵抗性前立腺癌を検出するための試薬である。本態様は、去勢抵抗性前立腺癌の検出における、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体又はこれを含む試薬の使用、とも言い換えることができる。
前記抗体は、通常は、配列番号２で表されるプロＧＤＦ１５の３０残基目のロイシンから１９４残基目のアルギニンまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体である。
本態様において検出対象であるＧＤＦ１５プロペプチドには、インタクトＧＤＦ１５プロペプチド及び／又はＧＤＦ１５プロペプチド断片が含まれ、ＧＤＦ１５プロペプチド断片には、ｄＮＴ５７−ＧＤＰＰ、ｄＮＴ７３−ＧＤＰＰ、及びその他のペプチド断片が含まれる。
本発明の試薬を前述したサンドイッチ法に利用する場合は、前記抗体としてエピトープの異なる２種類の抗体を含むことが必要である。
【００３２】
本発明の検出試薬は、さらに、前立腺癌の腫瘍マーカーを認識する抗体を含む、前立腺癌の腫瘍マーカーの検出試薬を含んでいてもよい。前立腺癌の腫瘍マーカーとしては、例えばＰＳＡ等が挙げられる。
本発明の試薬に含まれる抗体は、抗体そのものであってもよく、標識されていてもよく、固相に固定化されていてもよい。
【００３３】
本発明の試薬のうち、前述したサンドイッチ法の一態様である２ステップサンドイッチ法に利用する場合について、以下に具体的に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３４】
まず、本発明の試薬は、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）に示す方法で作製することができる。
（Ｉ）まず、サンドイッチ法で用いる、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する、エピトープの異なる２種類の抗体（以下、「抗体１」及び「抗体２」とする）のうち、抗体１をイムノプレートや磁性粒子等のＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離可能な担体に結合させる。結合方法は、疎水結合を利用した物理的結合であってもよいし、２物質間を架橋可能なリンカー試薬などを用いた化学的結合であってもよい。
【００３５】
（ＩＩ）担体に前記抗体１を結合させた後、非特異的結合を避けるため、担体表面を牛血清アルブミン、スキムミルク、市販のイムノアッセイ用ブロッキング剤などでブロッキング処理を行ない１次試薬とする。
【００３６】
（ＩＩＩ）他方の抗体２を標識し、得られた標識抗体を含む溶液を２次試薬として準備する。抗体２に標識する物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼといった酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープなどの検出装置で検出可能な物質、又はビオチンに対するアビジンなど特異的に結合する相手が存在する物質等が好ましい。また、２次試薬の溶液としては、抗原抗体反応が良好に行える緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等が好ましい。
【００３７】
このようにして作製した本発明の試薬は必要に応じ凍結乾燥させてもよい。
なお、１ステップサンドイッチ法の場合は、前述した（Ｉ）〜（ＩＩ）同様に担体に抗体１を結合させブロッキング処理を行なったものを作製し、前記抗体固定化担体に、標識した抗体２を含む緩衝液をさらに添加して試薬を作製すればよい。
【００３８】
次に、前述した方法で得られた試薬を用いて、２ステップサンドイッチ法でＧＤＦ１５プロペプチドを検出し測定するには、以下の（ＩＶ）から（ＶＩ）に示す方法で行なえばよい。
【００３９】
（ＩＶ）（ＩＩ）で作製した１次試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（Ｖ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、続いて（ＩＩＩ）で作製した２次試薬と一定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（ＶＩ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、標識抗体の標識物質を定量し、既知濃度のＧＤＦ１５プロペプチド溶液を標準とし作成した検量線により、検体中のヒトＧＤＦ１５プロペプチド濃度を定量する。
【００４０】
なお、ＧＤＦ１５成熟体についても上記の方法で検出試薬を作製可能である。ＧＤＦ１５成熟体の検出試薬に関しては、前立腺癌の腫瘍マーカーの検出試薬としても適用できる。前立腺癌の腫瘍マーカーの検出試薬は、上記の本発明の試薬と同様に作製されたものであってもよく、従来市販されているものであってもよい。
【００４１】
検出試薬に含まれる抗体等の試薬成分の量は、検体量、検体の種類、試薬の種類、検出の手法等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。具体的には、例えば、後述するように検体として２．５倍希釈した血清や血漿を５０μＬ使用して、サンドイッチ法によりＧＤＦ１５プロペプチド量の測定を行う場合、当該検体５０μＬを抗体と反応させる反応系当たり、担体へ結合させる抗体量が１００ｎｇから１０００μｇであってよく、標識抗体量が２ｎｇから２０μｇであってよい。
本発明の去勢抵抗性前立腺癌検出試薬は、用手法での検出にも利用可能であり、自動免疫診断装置を用いた検出にも利用可能である。特に自動免疫診断装置を用いた検出は、検体中に含まれる内在性の測定妨害因子や競合酵素の影響を受けることなく検出が可能で、かつ短時間に検体中のＧＤＦ１５プロペプチド並びに去勢抵抗性前立腺癌の腫瘍マーカーの濃度が定量可能であるため、好ましい。
【００４２】
本発明の去勢抵抗性前立腺癌を検出する方法及び本発明の検出試薬の対象となる検体（被検試料）は、全血、血球、血清、血漿などの血液成分、細胞または組織の抽出液、尿、脳脊髄液などが挙げられる。血液成分や尿などの体液を検体として用いると、去勢抵抗性前立腺癌を簡便かつ非侵襲的に検出できるため好ましく、検体採取の容易性、他の検査項目への汎用性を考慮すると、血液成分を検体として用いるのが特に好ましい。検体の希釈倍率は無希釈から１００倍希釈の中から使用する検体の種類や状態に応じて適宜選択すればよく、例えば、血清や血漿の場合は、２．５倍希釈した検体を５０μＬ用いればよい。
なお、ＧＤＰＰ量を測定する方法により去勢抵抗性前立腺癌を臨床評価する場合は、後述の実施例に示されるように、血漿中のｉＧＤＰＰを測定する方法がより好ましい。
また本発明の去勢抵抗性前立腺癌を検出する方法及び本発明の検出試薬は、去勢抵抗性獲得後のＣＲＰＣ患者の経過観察にも有用である。特に既存の前立腺癌マーカーであるＰＳＡと比べて偽陽性が少ない等、病態を正確に反映することが期待されるものである。
【実施例】
【００４３】
以下に本発明を具体的に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。【００４４】
＜実施例１＞  泌尿器癌細胞株の分泌タンパク質のプロテオーム解析
去勢抵抗性前立腺癌が特徴的に産生するタンパク質を探索するために、まず培養泌尿器癌細胞株の分泌タンパク質の網羅的解析を行った。ＣＲＰＣ細胞株２２Ｒｖ、ＰＣ３及びＬｎＣａｐ−ＡＩ、比較対照として前立腺癌細胞株ＬｎＣａｐ、ＶＣａｐ及びＤＵ１４５、膀胱癌細胞株５６３７、Ｔ２４、ＴＣＣ及びＵＭＵＣ３、腎癌細胞株ＣＡＫＩ、ＡＣＨＮ、７８６−Ｏ及びＵ３を、それぞれφ１５０ｍｍ培養皿に１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中にて培養し、２４時間後、培地を４．０ｎＭの上皮増殖因子（シグマ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（無血清培地）２０ｍＬに交換した。さらに２日間培養後、培地を０．２２μｍのフィルターにて濾過し凍結乾燥した。得られた培養上清の粉末を７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳを含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で溶解し、アセトン沈殿により培養上清を脱塩濃縮し、界面活性剤ＲａｐｉＧｅｓｔ１％を含む10 mM重炭酸アンモニウム溶液にて再び溶解した。得られたタンパク質試料は、常法に従い、還元アルキル化、トリプシン消化を行った。得られたペプチド断片をナノＬＣ−ＬＴＱオービトラップ質量分析装置（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により測定した。得られたデータはＰｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．３ソフトウェア（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて解析し、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース上のアミノ酸配列に対して検索をかけてタンパク質を同定した。【００４５】
前立腺がん由来細胞株から同定されたタンパク質の中には、既存の前立腺腫瘍マーカーであるＰＳＡやＰＡＰが含まれており、ＧＤＦ１５に関しては、ＤＵ１４５を除く何れの前立腺癌細胞株においても、プロペプチド部が培養上清中に特徴的に検出された（図１）。【００４６】
＜実施例２＞  モノクローナル抗体作製
既知の方法（ＤＮＡ免疫：特開２０１３−０６１３２１号公報）により、ＧＤＦ１５プロペプチド及びＧＤＦ１５成熟体を認識するモノクローナル抗体を１０種類ずつ作製した。【００４７】
＜実施例３＞  各種モノクローナル抗体のエピトープ解析
実施例２で作製した各抗体の抗原認識部位を、インタクトＧＤＦ１５プロペプチド（ｉＧＤＰＰ）及びＮ末端欠損型ＧＤＦ１５プロペプチド断片（ｄＮＴ−ＧＤＰＰ）のバリアント発現細胞培養上清により同定した。
各種組換えＧＤＰＰの発現評価及び精製工程のため、５’末端にＦＬＡＧタグ及びＳｔｒｅｐＩＩ−ｔａｇを、３’末端にＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）のＣ末端側７アミノ酸からなるＢＮＣペプチド（特開２００９−２４０３００号公報）をコードするオリゴヌクレオチドをさらに挿入した、分泌型ｉＧＤＰＰ及び４種のｄＮＴ−ＧＤＰＰを発現可能なプラスミドを調製した。図２−１に、作製した各種組換えＧＤＰＰの構造を示す。具体的な調製方法を以下に示す。
（１）ヒトＧＤＦ１５のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｅｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿００４８６４）から設計したプライマーを表１に示す組み合わせで用いて、ｉＧＤＰＰ、ｄＮＴ３７−ＧＤＰＰ、ｄＮＴ５９−ＧＤＰＰ、ｄＮＴ−７７ＧＤＰＰ及びｄＮＴ９４−ＧＤＰＰに相当する各ポリヌクレオチドを、常法に従いＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。【００４８】
【表１】
2017150314.tif 000003
【００４９】
（２）Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅのＧＰＩアンカー領域を含むプラスミドｐＦＬＡＧ１（ＳＩＧＭＡ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位に、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）を用いて、プロトコルに従い、（１）のＲＴ−ＰＣＲ増幅産物を挿入し、各種分泌型ＧＤＰＰ発現プラスミドを構築した。【００５０】
（３）プラスミドｐＦＬＡＧ１に挿入したポリヌクレオチドにより発現される各種分泌型ＧＤＰＰにおいて、Ｎ末端側にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端側にＢＮＣタグが付加されていることを確認するために、一過性発現細胞である２９３Ｔ細胞株を用い、下記の方法で検証した。
（３−１）常法に従い、（２）で構築した各種分泌型ＧＤＰＰ発現プラスミドを２９３Ｔ細胞株へ導入して各種分泌型ＧＤＰＰを一過性発現させ、培養７２時間後の培養液を遠心分離し、上清を各種分泌型ＧＤＰＰ溶液として回収した。
（３−２）各種分泌型ＧＤＰＰ溶液を試料として用いて、（Ａ）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、及び（Ｂ）ウエスタンブロット（ＷＢ）法を行った。【００５１】
（Ａ）ＥＬＩＳＡ法
（Ａ−１）ウサギ抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を１００ｎｇ／ウェルになるようカーボネート緩衝液（ｐＨ９．８）で希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ９６穴プレート（ＮＵＮＣ社製）に固相化した。
（Ａ−２）４℃にて一晩反応後、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）により３回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＴＢＳ溶液を２５０μＬ／ウェルにて各ウェルに添加し、室温で２時間放置した。
（Ａ−３）ＴＢＳにより３回洗浄を行ない、各種分泌型ＧＤＰＰ溶液、及び、陰性対照として発現プラスミドを導入していない２９３Ｔ細胞株の培養上清を、５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。【００５２】
（Ａ−４）０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）により３回洗浄を行なった後、１％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ（１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ）で１μｇ／ｍＬになるよう希釈したマウス抗ＢＮＣモノクローナル抗体溶液を、５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間放置した。
（Ａ−５）ＴＢＳ−Ｔにより３回洗浄を行なった後、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで１００００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスイムノグロブリンＧ−Ｆｃ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）溶液を５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。
（Ａ−６）ＴＢＳ−Ｔにより４回洗浄を行ない、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加後、１ｍｏｌ／Ｌリン酸溶液で反応停止し、吸光測定プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光値を測定した。【００５３】
（Ｂ）ウエスタンブロット法
（Ｂ−１）（３−１）で得られた各種分泌型ＧＤＰＰ溶液、及び、陰性対照として発現プラスミドを導入していない２９３Ｔ細胞株の培養上清を常法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）に転写した。
（Ｂ−２）ブロッキングワン溶液（ナカライテスク社製）にてブロッキング後、当該ブロッキング溶液に添加しアルカリフォスファターゼ標識抗ＢＮＣ抗体を１μｇ／シートにて添加し、４℃で一晩反応させた。
（Ｂ−３）ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、ＥＣＬ Select試薬（ＧＥヘルスケア社製）を用い、得られた化学発光をＬＡＳ ４０００画像解析装置（ＧＥヘルスケア社製）により検出した。【００５４】
各種分泌型ＧＤＰＰ溶液（分泌型ＧＤＰＰ培養上清）では、陰性対照（２９３Ｔ培養上清）と比較して明瞭な添加量依存的なシグナルが認められ、各種分泌型ＧＤＰＰが培養上清中に産生されていることが確認された。
各種分泌型ＧＤＰＰ溶液（分泌型ＧＤＰＰ培養上清）では、分子量約２７，０００付近、約２０，０００付近、及び約１８，０００付近に明瞭なバンドが検出され、Ｎ末端にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端にＢＮＣタグを有する分泌型ＧＤＰＰが培養上清中に産生されていることが確認された。
上記のＥＬＩＳＡ法で、上記５種の組換えＧＤＰＰ培養上清と各モノクローナル抗体の反応を評価した。図２−２に示すＥＬＩＳＡ解析の結果から判明した各抗体の抗原認識部位を表２に示す。【００５５】
【表２】
2017150314.tif 000004
【００５６】
＜実施例４＞  各種モノクローナル抗体固定化磁気ビーズによる免疫沈降性能評価
実施例２で作製した１０種類のＧＤＦ１５プロペプチドモノクローナル抗体及びウサギ抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）の抗体固定化磁性微粒子を調製し、各抗体と特異的に結合する分泌型ＧＤＦ１５プロペプチドの培養上清及び前立腺癌細胞培養上清中のタンパク質を以下の方法により同定した。なお、前立腺癌細胞としてはＬｎＣａｐ、ＰＣ３及びＤＵ１４５の３種類を用いた。【００５７】
（１）実施例２で作製した精製モノクローナル抗体の一部を、常法に従いＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ磁性微粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に固定化後、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングし抗体固定化磁性微粒子を調製した。【００５８】
（２）免疫沈降−ウエスタンブロット法（ＩＰ−ＷＢ法）
（２−１）前記３種の癌細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬社製）にて１００％コンフルエント状態で３日間培養した。
（２−２）培養上清を遠心後、上清０．１ｍＬに対し、調製した１０種の抗体固定化磁性微粒子を各々添加し、室温で１時間撹拌して反応させた。
（２−３）ＰＢＳＴ−ＮＰ４０（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１％ ＮＰ４０）で２回洗浄後、界面活性剤を含まないＰＢＳで３回洗浄した。
（２−４）各抗体固定化磁性微粒子に結合したタンパク質を実施例３（Ｂ）記載のウエスタンブロットにより解析した。なお、分子量マーカーはＦｕｌｌ−Ｒａｎｇｅ Ｒａｉｎｂｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒｓ（ＧＥ社製）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルは１０〜２０％グラジェントゲル（マリソル社製）用いた。ウエスタンブロットの検出用抗体は、抗ＢＮＣ抗体をアルカリフォスファターゼ標識キット（同仁化学社製）にて標識したものを使用した。【００５９】
＜実施例５＞  質量分析法によるモノクローナル抗体結合タンパク質の同定
実施例４でＧＤＦ１５プロペプチドに親和性の高いことが確認されたＴＳ−ＧＤＰＰ０２抗体、ＴＳ−ＧＤＰＰ０４抗体、及びＴＳ−ＧＤＰＰ０８抗体の３種類の抗体固定化磁性微粒子を用いたＩＰの再検証を行った。また、ＴＳ−ＧＤＰＰ０２抗体及びＴＳ−ＧＤＰＰ０４抗体に結合するＧＤＦ１５プロペプチドのポリペプチドを質量分析法により解析した。前立腺癌培養上清としては実施例１で使用したＬｎＣａｐを用い、質量分析用に以下の通りサンプルを調製した。【００６０】
（１）ＬｎＣａｐサンプル溶液を、実施例４記載の方法で上記３種の抗体固定化磁性微粒子でＩＰ後、常法に従いＳＤＳ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで溶出した。ＩＰ前のＬｎＣａｐ上清、ＩＰ後のＬｎＣａｐ上清及びＩＰ産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、分離したタンパク質をＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ染色（インビトロジェン社製）により染色した。【００６１】
（２）染色が認められた分子量約２０，０００付近、約１７，０００付近及び約１５，０００付近のバンド（図３−１記載のＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ染色像における１、２、及び３の位置に該当）計３種類の断片を切り出し、ジチオスレイトール及びヨードアセトアミドを用いて還元アルキル化後、トリプシンによるゲル内消化を実施した。【００６２】
（３）トリプシン消化により生成したペプチド断片を、Ｃ１８逆相カラムを用いたナノＬＣ−ＬＴＱオービトラップ質量分析装置（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）によりＭＳ／ＭＳ測定を行なった。得られたデータはＰｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．３ソフトウェア（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて解析し、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース上のアミノ酸配列に対して検索をかけてタンパク質を同定した。【００６３】
Ｒｕｂｙ染色像を図３−１に、ＬｎＣａｐの分子量約２０，０００付近、約１７，０００付近、及び約１５，０００付近のＩＰ産物から同定されたペプチドを図３−２に示す（色の濃い部分が、質量分析で検出された領域を示す）。Ｒｕｂｙ染色像では、ＴＳ−ＧＤＰＰ０４抗体及びＴＳ−ＧＤＰＰ０８抗体の２種で分子量約２０，０００付近、約１７，０００付近、及び約１５，０００付近にＧＤＦ１５プロペプチドと推定されるシグナルが認められた。一方、Ｎ末端領域を認識するＴＳ−ＧＤＰＰ０２抗体では分子量約２０，０００付近のシグナルのみが検出された。
ＬｎＣａｐ ＩＰ産物の質量分析データより、Ｒｕｂｙ染色像で１，２及び３に位置する分子量約２０，０００付近、約１７，０００付近、及び約１５，０００付近のタンパク質は、ＧＤＦ１５プロペプチドであることが証明された。また、Ｒｕｂｙ染色像で２及び３に位置するＧＤＦ１５プロペプチドは、それぞれＮ末端から配列番号２の５７番目のアルギニンまで及び７３番目のロイシンまでが欠損し断片化したＮ末端欠損型ＧＤＦ１５プロペプチド断片（ｄＮＴ５７−ＧＤＰＰ、及びｄＮＴ７３−ＧＤＰＰ）であることが判明した。Ｃ末端に関しては、いずれのＧＤＰＰも配列番号２の１６７残基目のアスパラギン酸までが感度よく検出された。ｄＮＴ５７−ＧＤＰＰは１７０残基目のロイシンまで検出されていたが、測定間のバラつきによる可能性もあり、特にＧＤＰＰのＣ末端領域はアルギニンリッチで質量分析による正確な末端の同定は困難であると推察される。この結果から、ＧＤＰＰ及びｄＮＴ−ＧＤＰＰのＣ末端配列には、少なくとも配列番号２の１６７残基目のアスパラギン酸までの配列が含まれると考える。【００６４】
＜実施例６＞  ＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬の調製
実施例２で作製した抗ＧＤＰＰモノクローナル抗体を用い、抗体の組み合わせを変えて２種類のＧＤＰＰ測定試薬を作製した。１つはＧＤＰＰのＮ末端領域を認識する抗体（ＴＳ−ＧＤＰＰ０２）とＣ末端領域を認識する抗体（ＴＳ−ＧＤＰＰ０４）の組み合わせで、インタクトＧＤＰＰ（ｉＧＤＰＰ）を検出する。もう一方は、Ｃ末端領域を認識する抗体どうしの組み合わせ（ＴＳ−ＧＤＰＰ０４とＴＳ−ＧＤＰＰ０８）で、ｉＧＤＰＰとｄＮＴ−ＧＤＰＰの両方を検出する。後者で検出される値を、総ＧＤＰＰ（ｔＧＤＰＰ）とする。以下に、具体的な調製方法を記載する。【００６５】
（１）水不溶性フェライト担体に抗ＧＤＦ１５プロペプチドモノクローナル抗体（ＴＳ−ＧＤＰＰ０２及び０８）を１００ｎｇ／担体になるように室温にて一昼夜物理的に吸着させ、その後１％ＢＳＡを含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて４０℃・４時間ブロッキングを行なうことで、抗ＧＤＦ１５プロペプチド抗体固定化担体を調製した。【００６６】
（２）抗ＧＤＦ１５プロペプチドモノクローナル抗体（ＴＳ−ＧＤＰＰ０４）をアルカリフォスファターゼ標識キット（同仁化学社製）にて、抗ＧＤＦ１５プロペプチド標識抗体を調製した。【００６７】
（３）磁力透過性の容器（容量１．２ｍＬ）に、（１）で調製した１２個の抗体固定化担体を入れた後、（２）で調製した標識抗体を０．５μｇ／ｍＬ含む緩衝液（３％ＢＳＡを含むトリス緩衝液、ｐＨ８．０）５０μＬを添加し、凍結乾燥を実施することで、ＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬を作製した。なお、作製したＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬は窒素充填下にて密閉封印シールを施し、測定まで４℃で保管した。
また、ＧＤＦ１５成熟体（ｍＧＤＦ１５）についても同様に、実施例２で調製した抗ｍＧＤＦ１５モノクローナル抗体（ＴＳ−ｍＧＤ１８抗体とＴＳ−ｍＧＤ２０抗体）を使用して測定試薬を作製した。【００６８】
＜実施例７＞  ＧＤＦ１５プロペプチド標準品の調製
ＧＤＦ１５プロペプチドには市販品が存在しないため、実施例３で調製した分泌型ｉＧＤＰＰを標準品として使用した。ＧＤＦ１５成熟体に関しては、市販の組換えタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社製）を使用した。
しかし、組換えｉＧＤＰＰの中にも分解物が混在しているため、そのままでは正確な定量ができない。そこで、組換えｉＧＤＰＰのＮ末端側にあるＳｔｒｅｐ−ＩＩタグ（ＩＢＡ社製）を利用し、市販の精製キット（ＩＢＡ社製）で全長ＧＤＦ１５プロペプチドのみを精製した。精製後の分泌型ｉＧＤＰＰを、実施例３記載のウェスタンブロッティング法により評価した。ＧＤＰＰ精製品のウェスタンブロッティング結果を図４に示す。タグペプチドのために分子量が大きくなっているが、Ｎ末及びＣ末どちらのタグ抗体を用いても、全長ＧＤＦ１５プロペプチドのバンドが１本のみ検出された。【００６９】
＜実施例８＞  ＧＤＦ１５プロペプチド標準品の評価
実施例７で調製した全長ＧＤＦ１５プロペプチドについて、以下の手順で質量分析による定量を実施した。
安定同位体標識された合成ペプチド（Ｈｅａｖｙペプチド、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と未標識の合成ペプチド（Ｌｉｇｈｔペプチド、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用い、濃度とＬ／Ｈシグナル比による検量線を作成した（図５）。
実施例７で調製した精製ＧＤＦ１５プロペプチド標準品について、実施例４で調製したウサギ抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）の磁性微粒子を用い、実施例４に示す方法で免疫沈降を実施した。常法に従い、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で抗体磁性微粒子からＧＤＦ１５プロペプチドを溶出した。さらに、その溶出サンプルを実施例５に示す方法で質量分析測定前処理を実施した。【００７０】
前処理後のサンプルにＨｅａｖｙペプチドを添加し、ＱＴＲＡＰ５５００（ＡＢ ＳＣＩＥＸ社製）質量分析装置にてＬＣ−MRM（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）測定を実施した。得られたデータはＳｋｙｌｉｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。Ｈｅａｖｙペプチドとのシグナル比を図５に示す検量線と比較し、組換えｉＧＤＰＰの濃度を決定した。【００７１】
＜実施例９＞  ＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬の性能評価
ＧＤＦ１５プロペプチドを含むサンプルとして実施例３で作製した組換えＧＤＰＰ上清、及び実施例５で調製したＬｎＣａｐをそれぞれＦＢＳで１０倍希釈し、ＧＤＦ１５プロペプチドを含まないサンプルとしてＦＢＳのみの計３種の擬似検体サンプルをそれぞれ調製し、実施例６で作製した２種のＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬を用いて５点測定することで前記試薬を評価した。【００７２】
評価用装置は全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ−１８００（東ソー社製：製造販売届出番号１３Ｂ３Ｘ９０００２０００００２）を用いた。全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ−１８００による測定は、
（１）希釈サンプル２０μＬと界面活性剤を含む希釈液８０μＬを、実施例６で作製したＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬を収容した容器に自動で分注し、
（２）３７℃恒温下で１０分間の抗原抗体反応を行ない、
（３）界面活性剤を含む緩衝液にて８回の洗浄を行ない、
（４）４−メチルウンベリフェリルリン酸塩を添加する、
ことで行い、単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる４−メチルウンベリフェロン生成濃度をもって測定値（ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ））とした。【００７３】
ＡＩＡ測定の結果、ＦＢＳを除くいずれの擬似検体サンプルも５点測定の変動係数が３％以下を示し、実施例６で作製したＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬にて得られる結果が信頼し得る結果であることが証明された。
また、実施例８で濃度決定された精製ｉＧＤＰＰ及び市販のｍＧＤＦ１５をそれぞれＦＢＳで希釈し、ＡＩＡ測定用に作成した検量線を図６に示す。以下、臨床評価等のＧＤＰＰ定量値は、この検量線から算出されている。【００７４】
＜実施例１０＞  前立腺癌検体のＧＤＦ１５プロペプチド及びＧＤＦ１５成熟体の測定
本実施例で使用した検体パネル（血清５６例、血漿８５例）を表３に示す。本検体は横浜市立大泌尿器科にて同一プロトコルにて収集された血清及び血漿検体であり、インフォームドコンセントの承諾及び横浜市立大学倫理委員会の承認を受けている。【００７５】
【表３】
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【００７６】
全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ−１８００（東ソー社製）を評価用装置とし、実施例６で作製したｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰ及びｍＧＤＦ１５測定試薬を用いて測定した。比較データとして横浜市立大学泌尿器科のカルテから各検体のＰＳＡ測定値（採血日直近の値）を抜粋した。
表４−１及び表４−２に、血清及び血漿がそろった検体についてのｉＧＤＰＰ及びｔＧＤＰＰ測定結果を示す。図７−１及び図７−２の相関図が示すように、ｉＧＤＰＰは血漿に比べて血清で減少し、ｔＧＤＰＰはほぼ変わらなかった。ＰＣａ及びＣＲＰＣ群におけるｉＧＤＰＰ及びｔＧＤＰＰ血清血漿間差を、図７−３に示す。ＰＣａ群においてはｉＧＤＰＰ及びｔＧＤＰＰともに血清血漿間の差がほぼないのに対し、ＣＲＰＣ群ではｔＧＤＰＰこそ変化はないが、血清中のｉＧＤＰＰが血漿中に比べて減少傾向にある。この結果から、血清中ではｉＧＤＰＰの分解が生じており、高濃度で存在するＣＲＰＣ群においてその影響が大きく出ていることが推察された。血漿中のｉＧＤＰＰとｔＧＤＰＰの定量値がほぼ一致していることから、血漿中では分解がほとんど起こっていないことが示された。なお、今回使用した血漿検体はＥＤＴＡ血漿であるため、ＧＤＰＰの分解に関与するプロテアーゼはキレート剤により失活するものであると推察される。【００７７】
【表４−１】
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【００７８】
【表４−２】
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【００７９】
なお、表５及び図７−４に示す通り、ｍＧＤＦ１５については、血清及び血漿でほぼ変わらない結果が得られた。【００８０】
【表５】
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【００８１】
次に、血清及び血漿の場合における、ｉＧＤＰＰ及びｔＧＤＰＰの診断性能を比較した。表６−１、表６−２及び図８−１に示す通り、ｉＧＤＰＰ及びｔＧＤＰＰいずれも血漿で測定した場合の方が高い去勢抵抗性前立腺癌検出能を示す。血漿中にｄＮＴ−ＧＤＰＰがほぼ存在しないため、両者の診断性能はほぼ一致している。しかし、高発現の検体では一部が分解を受けるとみられ、血漿中でもｉＧＤＰＰのみを測定した方がやや高い診断性能を示した。
ｍＧＤＦ１５に関しては、図８−２に示す通り、血清及び血漿でほぼ変わらない診断性能を確認した。これらの結果、ＧＤＰＰによるＣＲＰＣの臨床評価については、血漿中のｉＧＤＰＰを測定する方法がより望ましいと見込まれる。【００８２】
【表６−１】
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【００８３】
【表６−２】
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【００８４】
以下、臨床検体のＡＩＡ測定結果については血漿の結果のみを記載し、ＧＤＦ１５プロペプチドはｉＧＤＰＰの結果のみを示す。
ｉＧＤＰＰ、ｍＧＤＦ１５の測定値及びＰＳＡ測定値を図９に示す。ｍＧＤＦ１５及びＰＳＡは前立腺癌全般で高値傾向を示すが、ＧＤＰＰは去勢抵抗性前立腺癌で特徴的に高値を示した。
本パネルを前立腺肥大、去勢抵抗性獲得前の前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌の３群に分類し解析した結果を図９に、ＧＤＦ１５プロペプチド及びＧＤＦ１５成熟体測定値及びＰＳＡ測定値の各群における最小値、２５パーセンタイル、中央値、７５パーセンタイル、最大値、９５％信頼区間における濃度範囲を表７に示す。ｍＧＤＦ１５およびＰＳＡは、前立腺肥大に比べ去勢抵抗性獲得前の前立腺癌でやや高値傾向、去勢抵抗性前立腺癌で顕著な高値を示した。しかし去勢抵抗性獲得の前後で重なる濃度域が広く、診断性能が高いとは言えない。一方、ＧＤＰＰは前立腺肥大と去勢抵抗性獲得前の前立腺癌でほぼ差がなく、去勢抵抗性前立腺癌でのみ顕著な高値を示した。【００８５】
ｍＧＤＦ１５とＧＤＰＰの差は、分泌機構の違いによるものと考えられる。去勢抵抗性獲得前の前立腺癌では、細胞外マトリックスに貯蔵されたプロＧＤＦ１５からＦｕｒｉｎ様プロテアーゼの作用によりｍＧＤＦ１５のみが放出されるのに対し、去勢抵抗性前立腺癌では発現量が増加し、ｍＧＤＦ１５に加えて細胞外マトリックスに貯蔵しきれなくなったＧＤＰＰも血中へ出てくるものと推察される。【００８６】
【表７】
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【００８７】
去勢抵抗性獲得前及び獲得後の前立腺癌群間におけるｉＧＤＰＰ測定系、ｍＧＤＦ１５測定系及びＰＳＡ測定データの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析の結果を図１０に、ＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ、ＲＯＣ曲線下面積）及び有意差検定におけるＰ値を表８に示す。去勢抵抗性獲得前及び獲得後の前立腺癌群間におけるｉＧＤＰＰ測定値の有意差はｐ＜０．０００１を示し、統計的有意差が認められ、ｉＧＤＰＰ測定試薬は去勢抵抗性前立腺癌の検出に有用であることが示された。また、ｍＧＤＦ１５測定系及びＰＳＡ測定値と比較して、Ｐ値ならびにＡＵＣも上回ることが示された。【００８８】
【表８】
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【００８９】
次に、ｉＧＤＰＰ及びｍＧＤＦ１５の各基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）を、上記ＲＯＣ解析から得られた値とし、及びＰＳＡの基準値は一般的な基準値付近である２０ｎｇ／ｍＬとした場合の、去勢抵抗性獲得前及び獲得後の前立腺癌群間における感度及び特異度を表９に示す。ＰＳＡにとっては不利な条件であるが、少なくとも去勢抵抗性前立腺癌を特異的に診断する目的ではｉＧＤＰＰの有用性が明らかとなった。【００９０】
【表９】
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【００９１】
ｉＧＤＰＰ及びｍＧＤＦ１５を上記基準値、ＰＳＡを一般的な基準値である２０ｎｇ／ｍＬとした場合の実施例１０記載の全臨床検体の陽性率を表１０に示す。ｉＧＤＰＰ測定試薬は、本パネルにおいて偽陽性率が低くかつ去勢抵抗性前立腺癌を高い確率で陽性と判別可能となり、去勢抵抗性前立腺癌診断マーカーとしての性能を有していることが示された。【００９２】
【表１０】
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【００９３】
ｉＧＤＰＰ、ｍＧＤＦ１５、ＰＳＡ及びｉＧＤＰＰとＰＳＡの組み合わせで去勢抵抗性獲得の鑑別能を比較した。表１１に示す通り、単独項目においてはｉＧＤＰＰが偽陽性率・偽陰性率ともに最も低く、最も高い正診率を有している。
また、ｉＧＤＰＰとＰＳＡを組み合わせることにより偽陰性率を低下させることができる。今後の検討により、ｉＧＤＰＰ高値の場合とＰＳＡ高値の場合でさらなるＣＲＰＣの特徴付けが可能となり得る。【００９４】
【表１１】
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【００９５】
疾患群ごとのｉＧＤＰＰと各種パラメータの相関係数を表１２に示す。
年齢やＰＳＡとｉＧＤＰＰとの間にはほぼ相関がなく、全く別の事象を反映していることが示唆された。一方、ｍＧＤＦ１５とｉＧＤＰＰとは、ＣＲＰＣで相関があるものの、去勢抵抗性獲得前のＰＣａで特徴的に相関が低下する。これは分泌機構の違いにより、ＣＲＰＣ特徴的にＧＤＰＰが分泌されるためと推察される。
骨転移の指標であるＥＯＤ（Ｅｘｔｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ）やＢＳＩ（Ｂｏｎｅ Ｓｃａｎ Ｉｎｄｅｘ）とも、高い相関は見られない。ｍＧＤＦ１５は骨転移のマーカーとしての報告があるものの、骨転移のないＰＣａにおいても高値傾向にあるため、必ずしも骨転移の有無を反映しているとは言えない結果となった。【００９６】
【表１２】
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【００９７】
＜実施例１１＞  去勢抵抗性獲得後の経過観察期間におけるＣＲＰＣ患者血漿検体の評価
去勢抵抗性を獲得し経過観察中のＣＲＰＣ患者血漿検体１０例のｉＧＤＰＰの測定結果とＰＳＡ値、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）の投与状況および病態を表１３に示す。
ＣＲＰＣ−０１およびＣＲＰＣ−０５を除く８例は、ＰＳＡおよびｉＧＤＰＰのいずれもが低値を示し、がんの進展は見られず良好な管理下と診断された。しかし、ＰＳＡがいずれも高値であったＣＲＰＣ−０５（ＰＳＡ高値／ｉＧＤＰＰ高値）とＣＲＰＣ−０１（ＰＳＡ高値／ｉＧＤＰＰ低値）の２例を比較すると、前者は骨転移等の悪性進展が認められたのに対し、後者はＰＳＡは高値ながらも悪性進展は認められず良好な管理下にあると診断されていた。本結果より、ｉＧＤＰＰはＰＳＡに比べてＣＲＰＣの悪性進展を正確に反映するマーカーとなりうることが示唆された。
悪性進展が認められたＣＲＰＣ−０５を除く９例を用いてＮＳＡＩＤＳ投与群および非投与群におけるｉＧＤＰＰの測定結果を図１１に示す。本検討ではＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定にて群間に有意差が認められなかったことから（ｐ＝０．９６４３）、ＮＳＡＩＤＳ投与と血中ｉＧＤＰＰ量は関連しない可能性が示唆された。【００９８】
【表１３】
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【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明により、去勢抵抗性前立腺癌の新規な検出マーカーとなるＧＤＦ１５プロペプチドを検出する方法及び試薬が提供される。これにより、従来の検出マーカーであるＰＳＡの測定だけでは判別の難しい去勢抵抗性の獲得を血液診断等で簡便かつ精度高く検出することができる。これらは、去勢抵抗性前立腺癌の診断を簡便にし、早い段階で治療法の検討が可能となるため、産業上非常に有用である。
癌の進行によって治療薬の変更が必要な前立腺癌において、去勢抵抗性の獲得を血液検査等の簡便な手段で同定することが可能となれば、去勢抵抗性前立腺癌スクリーニング及び最も治療効果の期待できる治療薬変更時期の特定への貢献が期待される。さらに、将来的には新規治療薬を含む前立腺癌化学療法のコンパニオン診断への貢献が期待される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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