(57)【要約】【解決課題】  蛍光ＯＮ／ＯＦＦの制御技術を用いた新規な細胞内タンパク質の蛍光標識の方法を提供すること。【解決手段】  細胞内タンパク質を蛍光標識する方法であって、標識対象タンパク質と抗ＤＮＰ抗体の融合タンパク質を細胞内で得ること、式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させること、及び前記融合タンパク質と式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含む、タンパク質を蛍光標識する方法。  【選択図】なし
2018135598.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象タンパク質と抗ＤＮＰ（ジニトロフェニル化合物）抗体の融合タンパク質を細胞内で得ること、
下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させること、及び
前記融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含む、
タンパク質を蛍光標識する方法。
2018135598.tif 000108
（前記式（Ｉ）中、
Ｓは、蛍光性基であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｒａは、一価の置換基であり、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数であり、
ｍが２の場合は、ｎは０であり、
ｍが１の場合は、ｎは１又は０であり、
ｍが０の場合は、ｎは２であり、
ｎが２の場合は、Ｒａの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。）
【請求項２】
Ｒａの一価の置換基が、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、シアノ基、エステル基、アミド基、アルキルスルホニル基、少なくとも１以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数１〜１０のアルキル基、及び少なくとも１以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数１〜１０のアルコキシ基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞内タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象タンパク質と抗ＤＮＰ（ジニトロフェニル化合物）抗体の融合タンパク質を細胞内で得ること、
下記式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させること、及び
前記融合タンパク質と下記式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含む、
タンパク質を蛍光標識する方法。
2018135598.tif 000109
（前記式（Ｉａ）中、
Ｓは、蛍光性基であり、
Ｌは、リンカーであり、
ｍ１は、１又は２である。）
【請求項４】
前記融合タンパク質における前記抗ＤＮＰ抗体は、
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖、並びに
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖
からなる抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメントである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
配列番号１：QEISGY
配列番号２：AAS
配列番号３：VQYASYPYT
配列番号４：GFTFSNYWMNW
配列番号５：IRLKSNNYAT
配列番号６：TGYYYDSRYGY
【請求項５】
前記抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメントが一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗ＤＮＰ抗体は、配列番号７のアミノ酸を９０％以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号１〜６で示されるアミノ酸配列を含む、請求項４又は５に記載の方法。
配列番号７：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
【請求項７】
前記アミノ酸配列が配列番号７である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記融合タンパク質における前記抗ＤＮＰ抗体は、配列番号７のアミノ酸を９０％以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号１〜６で示されるアミノ酸配列を含み、
かつ、配列番号１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列において以下の少なくとも１つの置換：
（ａ）Ｎ末端からの番号が３３位のグルタミン酸、３７位のチロシン、９４位のバリン、９５位のグルタミン、１５９位のグリシン、１６０位のフェニルアラニン、１６２位のフェニルアラニン、１６４位のアスパラギン、２３３位のグリシン、２３５位のチロシン、２３６位のチロシン、２３７位のアスパラギン酸、２３９位のアルギニン、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシンのいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（ｂ）Ｎ末端からの番号が９６位のチロシン又は２３４位のチロシンのいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記融合タンパク質における前記抗ＤＮＰ抗体は、配列番号７のアミノ酸において以下の置換：
（１）Ｎ末端からの番号が３３位のグルタミン酸、３７位のチロシン、９４位のバリン、９５位のグルタミン、１５９位のグリシン、１６０位のフェニルアラニン、１６２位のフェニルアラニン、１６４位のアスパラギン、２３３位のグリシン、２３５位のチロシン、２３６位のチロシン、２３７位のアスパラギン酸、２３９位のアルギニン、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシンのいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（２）Ｎ末端からの番号が９６位のチロシン又は２３４位のチロシンのいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記融合タンパク質を得ることが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記リンカーが、Ｔ−Ｙで表され、Ｙは蛍光性基であるＳと結合する結合基を表し、Ｔは架橋基を表す、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合基が、アミド基、アルキルアミド基、エステル基、アルキルエステル基、カルボニルアミノ基又はアルキルエーテル基から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｓが、以下の式（ＩＩ）で表される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
2018135598.tif 000110
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ２は、水素原子、一価の置換基又は結合を示し； 
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基、アリール基又は結合を示し、但し、Ｘが酸素原子の場合は存在しない；
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し；
Ｘは、酸素原子又は珪素原子を示し；
＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表す。）
【請求項１４】
Ｓが、以下の式（ＩＩＩ）で表される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
2018135598.tif 000111
（式中、Ｒ１〜Ｒ８、Ｘは、式（ＩＩ）で定義した通りであり；
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ１１及びＲ１２は一緒になってＲ１１及びＲ１２が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ１１又はＲ１２は、或いは、Ｒ１１及びＲ１２の両方は、夫々、Ｒ４又はＲ８と一緒になって、Ｒ１１又はＲ１２が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表す。）
【請求項１５】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖、並びに
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖
からなる抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメント。
配列番号１：QEISGY
配列番号２：AAS
配列番号３：VQYASYPYT
配列番号４：GFTFSNYWMNW
配列番号５：IRLKSNNYAT
配列番号６：TGYYYDSRYGY
【請求項１６】
前記抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメントが一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項１５に記載の抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項１７】
配列番号７のアミノ酸を９０％以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号１〜６で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１５又は１６に記載の抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメント。
配列番号７：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
【請求項１８】
前記アミノ酸配列が配列番号７である、請求項１７に記載の抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項１９】
配列番号７のアミノ酸を９０％以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号１〜６で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列において以下の少なくとも１つの置換：
（ａ）Ｎ末端からの番号が３３位のグルタミン酸、３７位のチロシン、９４位のバリン、９５位のグルタミン、１５９位のグリシン、１６０位のフェニルアラニン、１６２位のフェニルアラニン、１６４位のアスパラギン、２３３位のグリシン、２３５位のチロシン、２３６位のチロシン、２３７位のアスパラギン酸、２３９位のアルギニン、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシンのいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（ｂ）Ｎ末端からの番号が９６位のチロシン又は２３４位のチロシンのいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる、抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項２０】
配列番号７のアミノ酸において以下の置換：
（１）Ｎ末端からの番号が３３位のグルタミン酸、３７位のチロシン、９４位のバリン、９５位のグルタミン、１５９位のグリシン、１６０位のフェニルアラニン、１６２位のフェニルアラニン、１６４位のアスパラギン、２３３位のグリシン、２３５位のチロシン、２３６位のチロシン、２３７位のアスパラギン酸、２３９位のアルギニン、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシンのいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（２）Ｎ末端からの番号が９６位のチロシン又は２３４位のチロシンのいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる、抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項２１】
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸。
【請求項２２】
配列番号８に示される塩基配列からなる、請求項２１に記載の核酸。
配列番号８：
ATGGCGGACTACAAAGACATTGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCTTTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGTCAAGTCAGGAAATTAGTGGTTACTTAGGCTGGCTTCAGCAGAAACCAGATGGAAGTATTAAACGCCTGATCTACGCCGCATCCACTTTAGATTCTGGTGTCCCAAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGCAGACTATTATTGTGTACAATATGCTAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATGAAACGCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCCAGATTCAGCTTCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGACTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCGGTTATTACTACGATAGTAGGTACGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCG
【請求項２３】
請求項２０又は２１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の核酸を含むプラスミド又はベクター。
【請求項２５】
前記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法に用いる蛍光プローブ。
2018135598.tif 000112
（前記式（Ｉ）中、
Ｓは、蛍光性基であり、
Ｌは、リンカーであり、
ｍは、１又は２の整数である。）
【請求項２６】
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングに用いられる、請求項２５に記載の蛍光プローブ。
【請求項２７】
以下の式で表される化合物又はその塩。
2018135598.tif 000113
2018135598.tif 000114
2018135598.tif 000115
2018135598.tif 000116
2018135598.tif 000117
2018135598.tif 000118
2018135598.tif 000119
2018135598.tif 000120
【請求項２８】
標識対象タンパク質と抗ＤＮＰ（ジニトロフェニル化合物）抗体の融合タンパク質を細胞内で得ること、
下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させること、及び
前記融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含む、
超解像イメージング法。
2018135598.tif 000121
（前記式（Ｉ）中、
Ｓは、蛍光性基であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｒａは、一価の置換基であり、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数であり、
ｍが２の場合は、ｎは０であり、
ｍが１の場合は、ｎは１又は０であり、
ｍが０の場合は、ｎは２であり、
ｎが２の場合は、Ｒａの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。）
【請求項２９】
単一分子位置決定顕微鏡法を用いる、請求項２８に記載の超解像イメージング法。
【請求項３０】
前記融合タンパク質における前記抗ＤＮＰ抗体は、配列番号７のアミノ酸を９０％以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号１〜６で示されるアミノ酸配列を含み、
かつ、配列番号１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列において以下の少なくとも１つの置換：
（ａ）Ｎ末端からの番号が３３位のグルタミン酸、３７位のチロシン、９４位のバリン、９５位のグルタミン、１５９位のグリシン、１６０位のフェニルアラニン、１６２位のフェニルアラニン、１６４位のアスパラギン、２３３位のグリシン、２３５位のチロシン、２３６位のチロシン、２３７位のアスパラギン酸、２３９位のアルギニン、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシンのいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（ｂ）Ｎ末端からの番号が９６位のチロシン又は２３４位のチロシンのいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる、請求項２８又は２９に記載の超解像イメージング法。
【請求項３１】
前記融合タンパク質における前記抗ＤＮＰ抗体は、配列番号７のアミノ酸において以下の置換：
（１）Ｎ末端からの番号が３３位のグルタミン酸、３７位のチロシン、９４位のバリン、９５位のグルタミン、１５９位のグリシン、１６０位のフェニルアラニン、１６２位のフェニルアラニン、１６４位のアスパラギン、２３３位のグリシン、２３５位のチロシン、２３６位のチロシン、２３７位のアスパラギン酸、２３９位のアルギニン、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシンのいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（２）Ｎ末端からの番号が９６位のチロシン又は２３４位のチロシンのいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の超解像イメージング法。
【請求項３２】
以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の超解像イメージング法に用いられる蛍光プローブ。
2018135598.tif 000122
式（Ｉ）中、Ｓは、蛍光性基であり、Ｌは、リンカーであり、Ｒａは、一価の置換基である。ｍは、０〜２の整数であり、ｎは、０〜２の整数であり、ｍが２の場合は、ｎは０であり、ｍが１の場合は、ｎは１又は０であり、ｍが０の場合は、ｎは２であり、ｎが２の場合は、Ｒａの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。
【請求項３３】
Ｒａの一価の置換基が、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、シアノ基、エステル基、アミド基、アルキルスルホニル基、少なくとも１以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数１〜１０のアルキル基、及び少なくとも１以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数１〜１０のアルコキシ基からなる群から選択される、請求項３１に記載の蛍光プローブ。
【請求項３４】
以下の式（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩を含む、請求項３２又は３３に記載の超解像イメージング法に用いられる蛍光プローブ。
2018135598.tif 000123
式（Ｉｂ）中、Ｓは、蛍光性基であり、Ｌは、リンカーであり、Ｒｂ及びＲｃは、以下の組合せから選択される。
（Ｒｂ、Ｒｃ）：（ＮＯ２、ｐ−ＮＯ２）、（ＮＯ２、ｐ−Ｂｒ）、（ＮＯ２、ｐ−ＳＯ２Ｍｅ）、（ＮＯ２、ｐ−Ｃｌ）、（ＮＯ２、ｍ−ＣＮ）、（ＮＯ２、ｐ−ＣＮ）、（ＮＯ２、ｐ−ＣＯＯＭｅ）、（ＣＦ３、ｐ−ＣＦ３）、（ＮＯ２、ｐ−ＣＯＮＨＭｅ）、（ＮＯ２、ｍ−ＣＯＯＭｅ）、（ＮＯ２、Ｈ）
（ここで、ｐ−及びｍ−は、夫々、Ｒｃがベンゼン環上でＬに対してパラ位及びメタ位にあることを表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な細胞内タンパク質の蛍光標識方法、当該方法に用いる抗ＤＮＰ抗体及び蛍光プローブに関る。
【背景技術】
【０００２】
細胞機能の基盤となっている分子メカニズムの理解を目指す上では、細胞内における機能分子の分布がどのように時間発展していくのかをリアルタイムで追跡できる蛍光イメージング技術が有効な手段である。これまで細胞内でのタンパク質動態の解析においては解析対象のタンパク質に蛍光タンパク質ＧＦＰを遺伝子工学的に導入した融合タンパク質を用いた可視化解析が広く行われてきた（非特許文献１）。
ＧＦＰは２７ｋＤａの比較的小さい分子量のタンパク質であり蛍光を発する際に外部基質を必要とせず細胞内での対象タンパク質の簡便な蛍光標識に適しているため様々な蛍光標識のアプリケーションが試みられてきた。解析対象のタンパク質とＧＦＰの融合タンパク質を細胞に発現させてその局在や動態を解析することで、転写因子や細胞骨格、受容体などの種々の分子の機能の解明が進んできた（非特許文献２、３）。【０００３】
近年ケミカルバイオロジー的手法を導入したアプローチによる蛍光イメージングに有用な分子タグ技術が進展を遂げている。バクテリア由来のＨａｌｏアルカン脱ハロゲン化酵素の遺伝子改変によってＨａｌｏタグタンパク質として開発されている（非特許文献４）。
加えて、ほぼ同時期にＤＮＡ修復酵素のＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼの改変によってＳＮＡＰタグタンパク質も開発されてきた（非特許文献５）。【０００４】
これらのタグ技術では、Ｈａｌｏタグタンパク質とＳＮＡＰタグタンパク質それぞれに対して特異的な蛍光リガンドが共有結合することで標的分子に対して特異的な蛍光標識が可能である。例えば、Ｈａｌｏタグタンパク質に結合する光活性化色素を用いて化学固定標本及び生細胞で超解像イメージングを実現した報告や（非特許文献６）、ＳＮＡＰタグを介して標識した蛍光色素を用いた蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によってタンパク質の多量体形成の様子が計測されている（非特許文献７）。またリガンド指向型トシル化学と呼ばれるタンパク質標識法も報告されている（非特許文献８）。この方法では特定
のタンパク質に親和性を示す小分子リガンドが標的タンパク質に結合することで、リガンドに共有結合しているトシル基とタンパク質の活性中心付近のアミノ酸残基が反応し、リガンドが切り離されプローブ部分のみが標的タンパク質にラベル化される。【０００５】
ＨａｌｏタグやＳＮＡＰタグなどの分子タグ技術では用いる蛍光プローブは常に蛍光性であるため、蛍光プローブの標本へ非特異的に結合した蛍光プローブや細胞外に存在している未標識の蛍光分子由来の蛍光がバックグラウンドシグナルとして観察されてしまい、観察対象分子のコントラストの良い顕微鏡観察を妨げる要因となっている。このバックグラウンドシグナルを小さくするため、観察対象分子を蛍光標識した後、洗浄して、未反応の蛍光プローブを除去する必要がある。しなしながら、細胞内や生体内に存在する生体分子を洗浄するのは、一般的に困難であり、洗浄できない場合も多い。【０００６】
上記の問題の解決のためには、標的分子に結合していない蛍光プローブは無蛍光（蛍光ＯＦＦ）であり、蛍光プローブが標的分子に結合して初めて蛍光性（蛍光ＯＮ）となるような蛍光ＯＮ／ＯＦＦの制御技術が有望である。これまでに、いくつかの非蛍光性の色素が核酸（ＲＮＡ）アプタマーと結合することで蛍光ＯＮとなる性質を利用してＲＮＡアプタマー配列を付加したｒＲＮＡの検出が可能であることが示されている（非特許文献９、１０）。
しかしながら、未だ実用的に使用できるような蛍光ＯＮ／ＯＦＦの制御技術は開発されていない。【０００７】
また、近年、光の回折限界に制限されないナノスケールの空間解像度を実現する超解像顕微鏡技術が開発され、飛躍的に進歩してきた（非特許文献１１）。超解像顕微鏡技術では単一分子位置決定顕微鏡法（Single-molecule localization microscopy）超解像イメージの取得は、蛍光明滅条件下で蛍光色素の位置情報を取得することにより行われる。具体的には、測定視野の中の少数の蛍光分子のみを確率的に発光させ、発光場所の中心を数十ｎｍの精度で決定する作業を繰り返し、約１０，０００枚の画像を再構成して超解像イメージが得られる。
単一分子位置決定顕微鏡法では、蛍光明滅させるためシアニン色素によるチオール及び光依存性フォトスイッチングを用いるが（非特許文献１２）、この際に、還元剤としてチオール化合物を用いる必要がある。このチオール化合物は細胞毒性により生細胞への適用が困難であったため、細胞毒性のある還元剤等を使用せずに蛍光明滅ができる超解像イメージング技術が望まれているが、実用的な技術開発は未だに実現していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】D. M. Chudakov, S. Lukyanov, K. A. Lukyanov, Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology 23, 605-613 (2005).
【非特許文献２】A. Miyawaki, Fluorescence imaging of physiological activity in complex systems using GFP-based probes. Current Opinion in Neurobiology 13, 591-596 (2003).
【非特許文献３】R. Y. Tsien, The green fluorescent protein. Annual review of biochemistry 67, 509-544 (1998).
【非特許文献４】G. V. Los et al., HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS chemical biology 3, 373-382 (2008).
【非特許文献５】T. Gronemeyer, C. Chidley, A. Juillerat, C. Heinis, K. Johnsson, Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein engineering, design & selection : PEDS 19, 309-316 (2006).
【非特許文献６】H. L. Lee et al., Superresolution imaging of targeted proteins in fixed and living cells using photoactivatable organic fluorophores. Journal of the American Chemical Society 132, 15099-15101 (2010).
【非特許文献７】D. Maurel et al., Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nat Methods 5, 561-567 (2008).
【非特許文献８】S. Tsukiji, M. Miyagawa, Y. Takaoka, T. Tamura, I. Hamachi, Ligand-directed tosyl chemistry for protein labeling in vivo. Nature chemical biology 5, 341-343 (2009).
【非特許文献９】J. S. Paige, K. Y. Wu, S. R. Jaffrey, RNA mimics of green fluorescent protein. Science 333, 642-646 (2011).
【非特許文献１０】R. L. Strack, M. D. Disney, S. R. Jaffrey, A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nat Methods 10, 1219-1224 (2013).
【非特許文献１１】Huang, B. et al., Cell 143, 1047 (2010)
【非特許文献１２】Dempsey, G. T., et al. J. Am. Chem. Soc. 131, 18192 (2009)
【非特許文献１３】M. J. Rust, M. Bates, X. Zhuang, Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods 3, 793-795 (2006).
【非特許文献１４】M. Heilemann, S. van de Linde, M. Schuettpelz, R. Kasper, B. Seefeldt, A. Mukherjee, P. Tinnefeld, M. Sauer, Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl 47, 6172-6176 (2008).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、蛍光ＯＮ／ＯＦＦの制御技術を用いた新規な細胞内タンパク質の蛍光標識の方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、当該蛍光標識法に好適に使用することができる抗体及び蛍光プローブを提供することも目的とする。
また、本発明は、当該蛍光標識法を用いた超解像イメージング技術を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、細胞内で蛍光のＯＮ／ＯＦＦを制御する機能を付与した分子タグ技術を開発することを目的として、蛍光のＯＮ／ＯＦＦ制御のために、蛍光色素が蛍光消光能を有する原子団（消光団）と近接することで起こる消光現象を利用した。ここで、本発明者らは、消光団と抗消光団抗体との結合によって消光現象が解除され、蛍光がＯＮ（蛍光性）となることを蛍光ＯＮ／ＯＦＦ制御技術の基本原理として、鋭意検討した結果、抗ＤＮＰ（ジニトロフェニル化合物）抗体を用いて蛍光物質の蛍光消光能を制御することにより、優れた蛍光ＯＮ／ＯＦＦの制御技術を提供できることを見出し、本発明を完成した。【００１１】
また、本発明者らは、蛍光ＯＦＦである蛍光プローブ（ＱＯＤＥプローブ（Quenched Organic Dye Emission probe））と、抗消光団抗体と結合することで消光現象が解除され蛍光がＯＮとなった分子タグ（Ｄｅ−ＱＯＤＥタグ（De-Quenching of Organic Dye Emission tag））との結合解離キネティックスを制御することにより、実用性の高い超解像イメージングを実現できることを見出した。【００１２】
即ち、本発明は、
［１］細胞内タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象タンパク質と抗ＤＮＰ（ジニトロフェニル化合物）抗体の融合タンパク質を細胞内で得ること、
下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させること、及び  前記融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含む、
タンパク質を蛍光標識する方法。
2018135598.tif 000003
（前記式（Ｉ）中、
Ｓは、蛍光性基であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｒａは、一価の置換基であり、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数であり、
ｍが２の場合は、ｎは０であり、
ｍが１の場合は、ｎは１又は０であり、
ｍが０の場合は、ｎは２であり、
ｎが２の場合は、Ｒａの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。）
［２］Ｒａの一価の置換基が、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、シアノ基、エステル基、アミド基、アルキルスルホニル基、少なくとも１以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数１〜１０のアルキル基、及び少なくとも１以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数１〜１０のアルコキシ基からなる群から選択される、［１］に記載の方法。
［３］細胞内タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象タンパク質と抗ＤＮＰ（ジニトロフェニル化合物）抗体の融合タンパク質を細胞内で得ること、
下記式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させること、及び
前記融合タンパク質と下記式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含む、
タンパク質を蛍光標識する方法。
2018135598.tif 000004
（前記式（Ｉａ）中、
Ｓは、蛍光性基であり、
Ｌは、リンカーであり、
ｍ１は、１又は２である。）
［４］前記融合タンパク質における前記抗ＤＮＰ抗体は、
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖、並びに
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖
からなる抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメントである、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
配列番号１：QEISGY
配列番号２：AAS
配列番号３：VQYASYPYT
配列番号４：GFTFSNYWMNW
配列番号５：IRLKSNNYAT
配列番号６：TGYYYDSRYGY
［５］前記抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメントが一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、［４］に記載の方法。
［６］前記抗ＤＮＰ抗体は、配列番号７のアミノ酸を９０％以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号１〜６で示されるアミノ酸配列を含む、［４］又は［５］に記載の方法。
配列番号７：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
［７］前記アミノ酸配列が配列番号７である、［６］に記載の方法。
［８］前記融合タンパク質における前記抗ＤＮＰ抗体は、配列番号７のアミノ酸を９０％以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号１〜６で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列において以下の少なくとも１つの置換：
（ａ）Ｎ末端からの番号が３３位のグルタミン酸、３７位のチロシン、９４位のバリン、９５位のグルタミン、１５９位のグリシン、１６０位のフェニルアラニン、１６２位のフェニルアラニン、１６４位のアスパラギン、２３３位のグリシン、２３５位のチロシン、２３６位のチロシン、２３７位のアスパラギン酸、２３９位のアルギニン、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシンのいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（ｂ）Ｎ末端からの番号が９６位のチロシン又は２３４位のチロシンのいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［９］前記融合タンパク質における前記抗ＤＮＰ抗体は、配列番号７のアミノ酸において以下の置換：
（１）Ｎ末端からの番号が３３位のグルタミン酸、３７位のチロシン、９４位のバリン、９５位のグルタミン、１５９位のグリシン、１６０位のフェニルアラニン、１６２位のフェニルアラニン、１６４位のアスパラギン、２３３位のグリシン、２３５位のチロシン、２３６位のチロシン、２３７位のアスパラギン酸、２３９位のアルギニン、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシンのいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（２）Ｎ末端からの番号が９６位のチロシン又は２３４位のチロシンのいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］前記融合タンパク質を得ることが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含む、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］前記リンカーが、Ｔ−Ｙで表され、Ｙは蛍光性基であるＳと結合する結合基を表し、Ｔは架橋基を表す、［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法。
［１２］前記結合基が、アミド基、アルキルアミド基、カルボニルアミノ基、エステル基、アルキルエステル基又はアルキルエーテル基から選択される、［１１］に記載の方法。
［１３］Ｓが、以下の式（ＩＩ）で表される、［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の方法。
2018135598.tif 000005
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ２は、水素原子、一価の置換基又は結合を示し； 
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基、アリール基又は結合を示し、但し、Ｘが酸素原子の場合は存在しない；
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し；
Ｘは、酸素原子又は珪素原子を示し；
＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表す。）
［１４］Ｓが、以下の式（ＩＩＩ）で表される、［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の方法。
2018135598.tif 000006
（式中、Ｒ１〜Ｒ８、Ｘは、式（ＩＩ）で定義した通りであり；
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ１１及びＲ１２は一緒になってＲ１１及びＲ１２が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ１１又はＲ１２は、或いは、Ｒ１１及びＲ１２の両方は、夫々、Ｒ４又はＲ８と一緒になって、Ｒ１１又はＲ１２が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表す。）
［１５］配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖、並びに
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖
からなる抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメント。
配列番号１：QEISGY
配列番号２：AAS
配列番号３：VQYASYPYT
配列番号４：GFTFSNYWMNW
配列番号５：IRLKSNNYAT
配列番号６：TGYYYDSRYGY
［１６］前記抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメントが一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、［１５］に記載の抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメント。
［１７］配列番号７のアミノ酸を９０％以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号１〜６で示されるアミノ酸配列を含む、［１５］又は［１６］に記載の抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメント。
配列番号７：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
［１８］前記アミノ酸配列が配列番号７である、［１７］に記載の抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメント。
［１９］配列番号７のアミノ酸を９０％以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号１〜６で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列において以下の少なくとも１つの置換：
（ａ）Ｎ末端からの番号が３３位のグルタミン酸、３７位のチロシン、９４位のバリン、９５位のグルタミン、１５９位のグリシン、１６０位のフェニルアラニン、１６２位のフェニルアラニン、１６４位のアスパラギン、２３３位のグリシン、２３５位のチロシン、２３６位のチロシン、２３７位のアスパラギン酸、２３９位のアルギニン、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシンのいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（ｂ）Ｎ末端からの番号が９６位のチロシン又は２３４位のチロシンのいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる、抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメント。
［２０］配列番号７のアミノ酸において以下の置換：
（１）Ｎ末端からの番号が３３位のグルタミン酸、３７位のチロシン、９４位のバリン、９５位のグルタミン、１５９位のグリシン、１６０位のフェニルアラニン、１６２位のフェニルアラニン、１６４位のアスパラギン、２３３位のグリシン、２３５位のチロシン、２３６位のチロシン、２３７位のアスパラギン酸、２３９位のアルギニン、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシンのいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（２）Ｎ末端からの番号が９６位のチロシン又は２３４位のチロシンのいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる、抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメント。
［２１］［１５］〜［１８］のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸。
［２２］配列番号８に示される塩基配列からなる、［２１］に記載の核酸。
配列番号８：
ATGGCGGACTACAAAGACATTGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCTTTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGTCAAGTCAGGAAATTAGTGGTTACTTAGGCTGGCTTCAGCAGAAACCAGATGGAAGTATTAAACGCCTGATCTACGCCGCATCCACTTTAGATTCTGGTGTCCCAAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGCAGACTATTATTGTGTACAATATGCTAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATGAAACGCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCCAGATTCAGCTTCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGACTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCGGTTATTACTACGATAGTAGGTACGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCG
［２３］［２０］又は［２１］に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸。
［２４］［２１］〜［２３］のいずれか１項に記載の核酸を含むプラスミド又はベクター。
［２５］前記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法に用いる蛍光プローブ。
2018135598.tif 000007
（前記式（Ｉ）中、
Ｓは、蛍光性基であり、
Ｌは、リンカーであり、
ｍは、１又は２の整数である。）
［２６］ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングに用いられる、［２５］に記載の蛍光プローブ。
［２７］以下の式で表される化合物又はその塩。
2018135598.tif 000008
2018135598.tif 000009
2018135598.tif 000010
2018135598.tif 000011
2018135598.tif 000012
2018135598.tif 000013
2018135598.tif 000014
2018135598.tif 000015
［２８］標識対象タンパク質と抗ＤＮＰ（ジニトロフェニル化合物）抗体の融合タンパク質を細胞内で得ること、
下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させること、及び
前記融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含む、
超解像イメージング法。
2018135598.tif 000016
（前記式（Ｉ）中、
Ｓは、蛍光性基であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｒａは、一価の置換基であり、
ｍは、０〜２の整数であり、
ｎは、０〜２の整数であり、
ｍが２の場合は、ｎは０であり、
ｍが１の場合は、ｎは１又は０であり、
ｍが０の場合は、ｎは２であり、
ｎが２の場合は、Ｒａの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。）
［２９］単一分子位置決定顕微鏡法を用いる、［２８］に記載の超解像イメージング法。
［３０］前記融合タンパク質における前記抗ＤＮＰ抗体は、配列番号７のアミノ酸を９０％以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号１〜６で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列において以下の少なくとも１つの置換：
（ａ）Ｎ末端からの番号が３３位のグルタミン酸、３７位のチロシン、９４位のバリン、９５位のグルタミン、１５９位のグリシン、１６０位のフェニルアラニン、１６２位のフェニルアラニン、１６４位のアスパラギン、２３３位のグリシン、２３５位のチロシン、２３６位のチロシン、２３７位のアスパラギン酸、２３９位のアルギニン、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシンのいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（ｂ）Ｎ末端からの番号が９６位のチロシン又は２３４位のチロシンのいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる、［２８］又は［２９］に記載の超解像イメージング法。
［３１］前記融合タンパク質における前記抗ＤＮＰ抗体は、配列番号７のアミノ酸において以下の置換：
（１）Ｎ末端からの番号が３３位のグルタミン酸、３７位のチロシン、９４位のバリン、９５位のグルタミン、１５９位のグリシン、１６０位のフェニルアラニン、１６２位のフェニルアラニン、１６４位のアスパラギン、２３３位のグリシン、２３５位のチロシン、２３６位のチロシン、２３７位のアスパラギン酸、２３９位のアルギニン、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシンのいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（２）Ｎ末端からの番号が９６位のチロシン又は２３４位のチロシンのいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる、［２８］〜［３０］のいずれか１項に記載の超解像イメージング法。
［３２］以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、［２８］〜［３１］のいずれか１項に記載の超解像イメージング法に用いられる蛍光プローブ。
2018135598.tif 000017
式（Ｉ）中、Ｓは、蛍光性基であり、Ｌは、リンカーであり、Ｒａは、一価の置換基である。ｍは、０〜２の整数であり、ｎは、０〜２の整数であり、ｍが２の場合は、ｎは０であり、ｍが１の場合は、ｎは１又は０であり、ｍが０の場合は、ｎは２であり、ｎが２の場合は、Ｒａの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。
［３３］Ｒａの一価の置換基が、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、シアノ基、エステル基、アミド基、アルキルスルホニル基、少なくとも１以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数１〜１０のアルキル基、及び少なくとも１以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数１〜１０のアルコキシ基からなる群から選択される、［３１］に記載の蛍光プローブ。
［３４］以下の式（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩を含む、［３２］又は［３３］に記載の超解像イメージング法に用いられる蛍光プローブ。
2018135598.tif 000018
式（Ｉｂ）中、Ｓは、蛍光性基であり、Ｌは、リンカーであり、Ｒｂ及びＲｃは、以下の組合せから選択される。
（Ｒｂ、Ｒｃ）：（ＮＯ２、ｐ−ＮＯ２）、（ＮＯ２、ｐ−Ｂｒ）、（ＮＯ２、ｐ−ＳＯ２Ｍｅ）、（ＮＯ２、ｐ−Ｃｌ）、（ＮＯ２、ｍ−ＣＮ）、（ＮＯ２、ｐ−ＣＮ）、（ＮＯ２、ｐ−ＣＯＯＭｅ）、（ＣＦ３、ｐ−ＣＦ３）、（ＮＯ２、ｐ−ＣＯＮＨＭｅ）、（ＮＯ２、ｍ−ＣＯＯＭｅ）、（ＮＯ２、Ｈ）
（ここで、ｐ−及びｍ−は、夫々、Ｒｃがベンゼン環上でＬに対してパラ位及びメタ位にあることを表す。）
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、新規で有用な、細胞内で蛍光のＯＮ／ＯＦＦを制御する機能を付与した分子タグ技術を提供することができる。
本発明の分子タグ技術を用いることで、優れた細胞内タンパク質の蛍光標識方法を提供することができ、本発明の蛍光標識法により、生細胞において蛍光分子の局在を極めて低いバックグラウンド蛍光の下で高いコントラストで蛍光観察することが可能となった。更に、本発明の蛍光標識法によって、生細胞内中で標識した機能分子を対象としてライブセルイメージングや超解像イメージングである構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）が可能となる。
本発明の分子タグ技術をライブセルイメージングや超解像イメージングに応用することで、分子動態の追跡やナノスケールの空間解像度での微細構造の解析を実現し細胞機能の基盤となる分子メカニズムの解明に寄与することが期待される。
また、本発明により、蛍光ＯＦＦである蛍光プローブ（ＱＯＤＥプローブと、抗消光団抗体と結合することで消光現象が解除され蛍光がＯＮとなった分子タグ（Ｄｅ−ＱＯＤＥタグ）との結合解離キネティックスを制御することにより、実用性の高い超解像イメージングを実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明における蛍光のＯＮ／ＯＦＦ制御を可能にする分子タグ技術のデザイン
【図２】実施例における消光現象を利用した分子タグ技術開発のスキーム
【図３】抗ＤＮＰモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ及び蛍光スクリーニング（Ａ：ＥＬＩＳＡによる抗ＤＮＰモノクローナル抗体のスクリーニング結果、Ｂ：ＳＲＢ−ＤＮＰをハイブリドーマ上清蛍光強度の増加を指標とした抗ＤＮＰモノクローナル抗体のスクリーニング結果、Ｃ：  ＳＲＢ−ＤＮＰの蛍光変化率の上位２７ウェルのハイブリドーマ培養上清の４種類の蛍光団−ＤＮＰに対する蛍光変化率）
【図４】抗ＤＮＰ  ｓｃＦＶのアミノ酸配列
【図５】培養細胞での抗ＤＮＰ  ｓｃＦｖの発現テストの結果
【図６】６ＳｉＲ−ＤＮＰの吸収、蛍光スペクトル（Ａ：６ＳｉＲ−ＤＮＰの構造式、Ｂ：６ＳｉＲ−ＤＮＰの吸収スペクトル、Ｃ：６ＳｉＲ−ＤＮＰの蛍光スペクトル。破線は５Ｄ４非存在下、実線は２．５μＭの５Ｄ４存在下での蛍光スペクトル）
【図７】６ＯＧ−ＤＮＰ、６ＤＣＦ−ＤＮＰ、６ＪＦ５４９−ＤＮＰ、６ＳｉＲ６００−ＤＮＰ、６ＳｉＲ−ＤＮＰ及び６ＳｉＲ７００−ＤＮＰの蛍光スペクトル（短波長側から６ＯＧ−ＤＮＰ、６ＤＣＦ−ＤＮＰ、６ＪＦ５４９−ＤＮＰ、６ＳｉＲ６００−ＤＮＰ、６ＳｉＲ−ＤＮＰ、６ＳｉＲ７００−ＤＮＰの順で示される）
【図８】オルガネラに局在ペプチドを付加した分子タグを発現した細胞の蛍光像。ＤＩＣ（微分干渉顕微鏡）像とＥＣＦＰ及び６ＳｉＲ−ＤＮＰの蛍光像を示す。（Ａ：細胞質にＥＣＦＰのみを発現させた細胞の蛍光像。Ｂ：細胞質にＥＣＦＰ−５Ｄ４を発現させるが、６ＳｉＲ−ＤＮＰを負荷しない際の蛍光像。Ｃ：細胞質にＥＣＦＰ−５Ｄ４を発現させた細胞での蛍光像。Ｄ、Ｅ、Ｆ、核（Ｄ）、細胞膜（Ｅ）、小胞体（Ｆ）の局在化シグナル配列を付加したＥＣＦＰ−５Ｄ４を発現させたＨｅＬａ細胞のＤＩＣ像、ＥＣＦ及び６ＳｉＲ−ＤＮＰの蛍光像。Ｆの下の画像は黄色枠内を拡大した像。スケールバーは細胞の全体像では１０μｍ、拡大像のみ２μｍ。）
【図９】細胞内分子と分子タグの融合タンパク質を発現させた細胞の蛍光像。（Ａ：チューブリンと５Ｄ４の融合タンパク質を発現させたＨｅｌａ細胞での６ＳｉＲ−ＤＮＰの蛍光像。Ｂ：アクチンと５Ｄ４の融合タンパク質を発現させたＨｅｌａ細胞での６ＳｉＲ−ＤＮＰの蛍光像。Ｃ：アクチン結合ペプチドＬｉｆｅａｃｔと５Ｄ４の融合タンパク質を発現させたＨｅｌａ細胞での６ＳｉＲ−ＤＮＰの蛍光像。Ｄ：ＳＴＩＭ１と５Ｄ４の融合タンパク質を発現させたＨｅｌａ細胞での６ＳｉＲ−ＤＮＰの蛍光像。スケールバーは細胞の全体像は１０μｍ、拡大像は２μｍ。）
【図１０】ＳＴＩＭ１−５Ｄ４のライブセルイメージングの結果。ＳＴＩＭ１−５Ｄ４を発現させたＨｅＬａ細胞のタイムラプスイメージング画像。（黄色枠の拡大図をそれぞれの枠の下部に示す。矢じりは着目した分子を示す。スケールバーは細胞の全体像では１０μｍ、拡大像では２μｍ。）
【図１１】生きた細胞標本のＳＩＭによる超解像イメージングの結果。（Ａ：チューブリン−５Ｄ４を発現させたＨｅｌａ細胞の通常の蛍光像。Ｂ：チューブリン−５Ｄ４を発現させたＨｅｌａ細胞のＳＩＭ画像。Ｃ：チューブリン−５Ｄ４を発現させたＨｅｌａ細胞のタイムラプスＳＩＭ画像。Ｄ、Ｃの白枠で囲った部分の拡大図を２つの視野について示した。矢じりは着目した微細構造を示す。スケールバーはＡ、Ｂ、Ｃでは２μｍ、Ｄでは５００ｎｍ。）
【図１２】６ＤＣＦ−ＤＮＰと５Ｄ４との結合解離キネティックの模式図
【図１３】５Ｄ４の点変異導入スクリーニングの結果
【図１４】生きた細胞における小胞体の超解像イメージング
【図１５】５Ｄ４発現細胞の特異的なｉｎ  ｖｉｖｏイメージング
【図１６】タグ・プローブの結合解離平衡に基づく長期安定な蛍光イメージング
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の１つの実施態様は、細胞内タンパク質を蛍光標識する方法であって、標識対象タンパク質と抗ＤＮＰ（ジニトロフェニル化合物）抗体の融合タンパク質を細胞内で得ること、式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させること、及び前記融合タンパク質と式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含む、タンパク質を蛍光標識する方法である。
2018135598.tif 000019
式（Ｉ）中、Ｓは、蛍光性基であり、Ｌは、リンカーであり、Ｒａは、一価の置換基である。ｍは、０〜２の整数であり、ｎは、０〜２の整数であり、ｍが２の場合は、ｎは０であり、ｍが１の場合は、ｎは１又は０であり、ｍが０の場合は、ｎは２であり、ｎが２の場合は、Ｒａの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。
【００１６】
また、本発明のもう１つの実施態様は、細胞内タンパク質を蛍光標識する方法であって、標識対象タンパク質と抗ＤＮＰ（ジニトロフェニル化合物）抗体の融合タンパク質を細胞内で得ること、式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させること、及び前記融合タンパク質と式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含む、タンパク質を蛍光標識する方法である。
2018135598.tif 000020
式（Ｉａ）中、Ｓは、蛍光性基であり、Ｌは、リンカーであり、ｍ１は、１又は２である。
【００１７】
即ち、本発明においては、特定の抗ＤＮＰ抗体を用いて、抗体が蛍光団−色素に結合したときに消光が解除されるという化学的なメカニズムを利用して蛍光のＯＮ／ＯＦＦ制御を行うことが重要である。
【００１８】
本発明のＯＮ／ＯＦＦ制御を可能にする分子タグ技術の概念図を図１に示す。Ｆは蛍光色素、Ｑは消光団を示す。蛍光色素とＤＮＰ（ジニトロフェニル基）が近接した際は、定常時はＤＮＰにより消光され蛍光を発しない（図１のＡ；蛍光ＯＦＦの際の模式図）。一方、細胞内に発現させた抗ＤＮＰ抗体とＤＮＰが結合すると、ＤＮＰの消光能が消失し、蛍光団−色素が蛍光性となる（図１のＢ；蛍光ＯＮの際の模式図）。
【００１９】
本発明の蛍光標識の方法は、標識対象タンパク質と抗ＤＮＰ抗体の融合タンパク質を細胞内で得ることを含む。
【００２０】
本発明の方法において細胞内で得られる融合タンパク質における抗ＤＮＰ抗体（以下「本発明の抗ＤＮＰ抗体」とも言う。）、抗体の重鎖と軽鎖の可変領域のみを短いアミノ酸リンカーで繋いだ抗体又はその抗原結合性フラグメントである。
本発明の抗ＤＮＰ抗体は、好ましくは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。また、本発明の抗ＤＮＰ抗体は、好ましくは、分子量が３０ｋＤａ程度の抗体である。
通常の抗体は、重鎖と軽鎖がジスルフィド結合で繋がった分子量が６０ｋＤａ程度の分子である。全長の抗体は細胞内が還元的環境であるため正常なフォールディングに必要な複数のジスルフィド結合の形成に適しておらず、正常なフォールディング状態を保って細胞内で発現させることが困難である。これに対して、本発明の抗体は、抗体の重鎖と軽鎖の可変領域のみを短いアミノ酸リンカーで繋いだ構造を有しているため、細胞内で発現させることが比較的容易である。
【００２１】
本発明の好ましい態様においては、抗ＤＮＰ抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖からなる抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメントである。
配列番号１：QEISGY
配列番号２：AAS
配列番号３：VQYASYPYT
配列番号４：GFTFSNYWMNW
配列番号５：IRLKSNNYAT
配列番号６：TGYYYDSRYGY
【００２２】
上記の抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメントは、好ましくは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。
抗ＤＮＰ抗体はこれまでに免疫学領域の研究において広く用いられておりハプテン（不完全抗原）として知られている。しかしながら抗ＤＮＰ抗体による消光能の制御を介した色素化合物の蛍光性を制御するためには、抗ＤＮＰ抗体を細胞内に安定に発現させる必要がある。そのために抗、本発明の方法で用いる抗ＤＮＰ抗体では抗体を小型化して一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）化することで細胞内への発現効率の向上が可能である。
【００２３】
本発明の抗ＤＮＰ抗体の好ましい側面は、以下の配列番号７のアミノ酸を９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合性フラグメントである。
【００２４】
配列番号７：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
【００２５】
本発明の抗ＤＮＰ抗体の好ましい側面は、アミノ酸配列が配列番号７である抗体又はその抗原結合性フラグメントである。
【００２６】
本発明の蛍光標識の方法においては、上記で説明したようなマウス等に由来するｓｃＦｖの抗ＤＮＰ抗体を用いるのが好ましい。
一方、本発明の蛍光標識の方法においては、マウス等に由来するｓｃＦｖの抗体以外にもラマなどのラクダ科の動物が産生する重鎖抗体（ＶＨＨ）を使用することもできる。ＶＨＨは重鎖のみで構成され、分子量が約１５ｋＤａであり単一ドメイン抗体であるため、他のタンパク質やペプチドと融合する事や細胞内で発現させることが容易である。また、ＣＤＲ３領域が他のＩｇＧ抗体より長いため抗原と高いアフィニティーを持ちやすく、変性しても天然の構造へ巻き戻りやすい性質を備えているためタグとして非常に有用である。
【００２７】
本発明の蛍光標識の方法においては、標識対象タンパク質と抗ＤＮＰ抗体の融合タンパク質を得ることは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含んでもよい。
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、抗ＤＮＰ抗体をコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、融合タンパク質を発現可能なプラスミド又はベクターを調製することができる。
融合タンパク質は、標準的な技術（化学結合体化を含む）を使用して一般的に調製され得る。簡潔には、ポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列は、別個にアセンブリされ得、そして、適切な発現ベクターとして連結され得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてかまたはそれを用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に連結され、その結果、その配列のリーディングフレームの、フェーズ（相）は一致する。このことによって、成分ペプチドの両方の生物学的活性を保持する単一の融合ペプチドへと翻訳されることが可能となる。
また、十分な距離で第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを隔てるために、リンカー配列が使用され得、ポリペプチドの各々が、その高次構造にフォールドし、また、互いの機能を阻害しないことが期待できる。このようなリンカーは、ペプチド、ポリペプチド、アルキル鎖または他の従来型スペーサー分子であり得る。
【００２８】
標識対象タンパク質としては、任意のタンパク質を用いることができ、例えば、細胞骨格タンパク質、イオンチャネル、受容体が挙げられる。
【００２９】
本発明の蛍光標識の方法においては、融合タンパク質を発現可能なプラスミド又はベクターを細胞内又は生体内に導入することにより、融合タンパク質を得ることが好ましい。
【００３０】
本発明の蛍光標識の方法においては、上記の融合タンパク質が得られた細胞と、下記の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させることを含む。
2018135598.tif 000021
【００３１】
式（Ｉ）において、Ｓは、蛍光性基であり、Ｌは、リンカーであり、Ｒａは、一価の置換基である。
また、式（Ｉ）において、ｍは、０〜２の整数であり、ｎは、０〜２の整数であり、ｍが２の場合は、ｎは０であり、ｍが１の場合は、ｎは１又は０であり、ｍが０の場合は、ｎは２であり、ｎが２の場合は、Ｒａの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。
【００３２】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個、更に好ましくは炭素数１〜３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。
【００３３】
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
【００３４】
Ｒａの一価の置換基は、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、シアノ基、エステル基、アミド基、アルキルスルホニル基、少なくとも１以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数１〜１０のアルキル基、及び少なくとも１以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数１〜１０のアルコキシ基からなる群から選択される。
Ｒａの一価の置換基としてのアルキル基としては、好ましくはメチル基である。
アルコキシ基としては、好ましくはメトキシ基である。
エステル基としては、好ましくはメチルエステル基である。
アミド基としては、好ましくはメチルアミド基である。
アルキルスルホニル基としては、好ましくはメチルスルホニル基である。
少なくとも１以上の水素原子がフッ素原子で置換されているアルキル基としては、好ましくは三フッ化メチル基である。
少なくとも１以上の水素原子がフッ素原子で置換されているアルコキシ基としては、好ましくは三フッ化メトキシ基である。
【００３５】
式（Ｉ）において、ｍは、０〜２の整数であり、ｎは、０〜２の整数である。
ｍが２の場合は、ｎは０であり、即ち、式（Ｉ）の化合物は、ベンゼン環に２つのニトロ基が結合した構造を有する。
ｍが１の場合は、ｎは１又は０である。ここで、ｎが１の場合は、式（Ｉ）の化合物は、ベンゼン環に１つのニトロ基と１つのＲａが結合した構造を有し、ｎが０の場合は、式（Ｉ）の化合物は、ベンゼン環に１つのニトロ基が結合した構造を有する。
ｍが０の場合は、ｎは２であり、即ち、式（Ｉ）の化合物は、ベンゼン環に２つのＲａが結合した構造を有する。
【００３６】
式（Ｉ）において、ｍが２でｎが０である化合物、及び、ｍが１でｎが１である化合物は、以下の式（Ｉａ）によっても表される。
2018135598.tif 000022
式（Ｉａ）中、Ｓは、蛍光性基であり、Ｌは、リンカーであり、ｍ１は、１又は２である。
【００３７】
以下において式（Ｉ）で表される化合物又はその塩及び式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩を合わせて「本発明の化合物」とも言う。
【００３８】
即ち、本発明の蛍光標識の方法においては、上記の融合タンパク質が得られた細胞と、上記の式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させることも含む。
【００３９】
式（Ｉ）及び（Ｉａ）のリンカーは、Ｔ−Ｙで表すことができ、Ｙは蛍光性基であるＳと結合する結合基を表し、Ｔは架橋基を表す。
【００４０】
Ｙの結合基は、アミド基（−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＲ’−、−Ｒ−ＣＯＮＨ−、、−Ｒ−ＣＯＮＲ’−）、アルキルアミド基（−ＣＯＮＨ−Ｒ−、−ＣＯＮＲ’−Ｒ−、）、エステル基（−ＣＯＯ−）、アルキルエステル基（−Ｒ−ＣＯＯ−、−ＣＯＯ−Ｒ−）、カルボニルアミノ基（−ＮＨＣＯ−、−ＮＲ’ＣＯ−）又はアルキルエーテル基（−ＲＯ−、−ＯＲ−）から選択される。ここで、Ｒは二価の炭化水素基を表し、好ましくは炭素数１〜１０のアルキレン基、より好ましくは１〜５のアルキレン基である。また、Ｒ’は、炭素数１〜５のアルキルを表す。
【００４１】
Ｔの架橋基としては、Ｙの結合基と式（Ｉ）又は（Ｉａ）の化合物のベンゼン環とを連結させるスペーサーとして働く任意の架橋基を用いることができる。例えば、置換又は無置換の二価の炭化水素基（アルカン、アルケン、アルキン、シクロアルカン、芳香族炭化水素など）、ジアルキルエーテル基（例えば、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル等）、エチレングリコール基、ジエチレングリコール基、トリエチレングリコール基、ポリエチレングリコール基、アミド基、カルボニルなど、及び複素環基（例えば、二価のピペリジン環など）、これらの２以上の組合せなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、上記架橋基は、その片方または両方の端部に、Ｙ、式（Ｉ）又は（Ｉａ）の化合物のベンゼン環と結合することができる官能基を有してもよく、このような官能基として、例えば、アミノ基、アルキルアミノ基、アミノアルキル基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、アルキルアミド基などが挙げられる。
また、Ｔの架橋基には、Ｔ１−（Ｗ）−Ｔ２の式で表されるものも含まれる。ここで、Ｔ１及びＴ２として、各々上記で例示した架橋基を用いることができる。Ｗは、存在する場合は、Ｔ１とＴ２を連結する基であり、例えば、アミノ基、アルキルアミノ基、アミノアルキル基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、アルキルアミド基などが挙げられる。
このような架橋基の例として、トリエチレングリコール基と、ジエチレングルコール基をアミド基、アルキルアミド基等を介して結合させたものが挙げられるがこれらに限定されない。更に、Ｔ１−（Ｗ）−Ｔ２の式で表される架橋基は、その片方または両方の端部に、Ｙ、式（Ｉ）又は（Ｉａ）の化合物のベンゼン環と結合することができる官能基（例えば、アミノ基、アルキルアミノ基、アミノアルキル基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、アルキルアミド基など）を有してもよい。
【００４２】
式（Ｉａ）において、ｍ１は、１又は２であるが、好ましくは２である。
【００４３】
式（Ｉａ）の化合物において、ｍ１が１の場合、ニトロ基はＬに対してベンゼン環上のオルト位又はパラ位にあるのが好ましく、ｍ１が２の場合は、ニトロ基はＬに対してベンゼン環上のオルト位とパラ位にあるのが好ましい。
【００４４】
Ｓは、蛍光色素であり、好ましくはキサンテン色素、シアニン色素、クマリン色素、ジピロメテン色素、又はベンゾフェノキサジン色素である。
【００４５】
本発明の化合物の１つの好ましい側面において、Ｓは、以下の式（ＩＩ）で表される。
2018135598.tif 000023
【００４６】
式（ＩＩ）において、Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示す。
Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。
本発明の１つの好ましい態様においては、Ｒ１はいずれも水素原子である。
【００４７】
式（ＩＩ）において、Ｒ２は、水素原子、一価の置換基又は結合を示す。Ｒ２が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、Ｒ１と同様に、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基等が挙げられる。
本発明の１つの好ましい態様においては、Ｒ２は、炭素数１〜６個のアルキル基（好ましくは、メチル基）、カルボキシル基，メトキシ基，ハイドロキシメチル基又は結合（即ち、Ｌ（即ち、リンカー）がＲ２の位置に導入される）である。
【００４８】
式（ＩＩ）において、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示す。
Ｒ３又はＲ４がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ３又はＲ４が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ３及びＲ４がともに水素原子である場合、又はＲ３及びＲ４がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
【００４９】
式（ＩＩ）において、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基、アリール基又は結合を示す、但し、Ｘが酸素原子の場合はＲ５及びＲ６は存在しない。
Ｘが珪素原子の場合は、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数１〜３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ５及びＲ６がともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ５及びＲ６が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ５又はＲ６が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ５又はＲ６がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
【００５０】
式（ＩＩ）において、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し、Ｒ３及びＲ４について説明したものと同様である。Ｒ７及びＲ８が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又は共にフッ素原子であることが好ましい。
【００５１】
Ｘは、酸素原子又は珪素原子を示す。好ましくは、Ｘは、酸素原子である。
【００５２】
＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）又は式（Ｉａ）のＬとの結合箇所（結合点、以下同様）を表す。好ましくは、Ｌは、キサンテン環骨格に結合しているベンゼン環の任意の位置に結合することができるが、当該ベンゼン環の４位に結合することが好ましい。
【００５３】
本発明の化合物の１つの好ましい側面において、Ｓは、以下の式（ＩＩＩ）で表される。
2018135598.tif 000024
【００５４】
式（ＩＩＩ）において、Ｒ１〜Ｒ８、Ｘは、式（ＩＩ）について記載した通りである。
【００５５】
式（ＩＩＩ）において、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す。
また、Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。
また、Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。この場合、ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、１又は２以上の置換基を有することができる。
【００５６】
式（ＩＩＩ）において、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜３個のアルキル基を示す。
Ｒ１１及びＲ１２は一緒になってＲ１１及びＲ１２が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。
また、Ｒ１１又はＲ１２は、或いは、Ｒ１１及びＲ１２の両方は、夫々、Ｒ４又はＲ８
と一緒になって、Ｒ１１又はＲ１２が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。この場合、ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、１又は２以上の置換基を有することができる。
【００５７】
式（ＩＩＩ）において、＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）又は式（Ｉａ）のＬとの結合箇所（結合点、以下同様）を表す。好ましくは、Ｌは、キサンテン環骨格に結合しているベンゼン環の任意の位置に結合することができるが、当該ベンゼン環の４位に結合することが好ましい。
【００５８】
本発明の蛍光標識の方法は、上記の融合タンパク質と式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とを反応させることにより、対象タンパク質を蛍光標識することを含む。
本発明の蛍光標識の方法においては、融合タンパク質と式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とを反応させる工程は、融合タンパク質を発現する細胞内や生体内で行ってもよく、単離した融合タンパク質を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで行ってもよい。標識をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う場合、例えば、緩衝液中（ｐＨ７．４）で２５℃の温度で行ってもよい。
【００５９】
本発明の化合物は、定常時はＤＮＰにより消光され蛍光を発しないが（図１のＡを参照）、細胞内に発現させた抗ＤＮＰ抗体とＤＮＰが結合すると、ＤＮＰの消光能が消失し、蛍光団−色素が蛍光性となり、細胞内の標識対象タンパク質を蛍光標識することができる。
【００６０】
本発明の化合物は抗ＤＮＰ抗体と結合していない状態では十分に消光されていることから、細胞外に存在していても抗ＤＮＰ抗体と結合していない本発明の化合物に由来する蛍光は観察対象とする分子やオルガネラの観察における空間分解能への影響が無視できるレベルに抑え込まれる。本発明の蛍光標識の方法は、蛍光観察の際に系内にある不要な蛍光色素を除去するステップが必要ないという点は、創薬等におけるハイスループットスクリーニング（HTS）においては特に有用である。HTSではプローブの洗浄処理などの工程を減らすことによりスクリーニング系全体の効率を上げ、多数の検体を極めて高い効率でアッセイを行うことが求められる。洗浄などの処理を省略して反応と測定を続けて行う方法は“mix and measure”や“homogeneous”法と呼ばれ、特に数万から数十万の化合物をアッセイする薬剤スクリーニングでは望ましい方法と考えられている。本発明のDNPタグと蛍光団−色素を導入したスクリーニング系では余剰蛍光色素の洗浄プロセスを必要としないHTS系の構築が可能である。
【００６１】
本発明のもう１つの態様は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖、並びに配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖からなる抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメントである（以下「抗ＤＮＰ抗体１又はその抗原結合性フラグメント１」とも言う）。
配列番号１：QEISGY
配列番号２：AAS
配列番号３：VQYASYPYT
配列番号４：GFTFSNYWMNW
配列番号５：IRLKSNNYAT
配列番号６：TGYYYDSRYGY
【００６２】
本発明の抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメントは、好ましくは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。
【００６３】
本発明の抗ＤＮＰ抗体の好ましい側面は、以下の配列番号７のアミノ酸を９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合性フラグメントである（以下「抗ＤＮＰ抗体２又はその抗原結合性フラグメント２」とも言う）。
【００６４】
配列番号７：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
【００６５】
本発明の抗ＤＮＰ抗体の好ましい側面は、アミノ酸配列が配列番号７である抗体又はその抗原結合性フラグメントである（以下「抗ＤＮＰ抗体３又はその抗原結合性フラグメント３」とも言う）。
【００６６】
抗ＤＮＰ抗体の同一性および類似性は、既知の方法によって容易に計算可能である。こうした方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．監修， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．監修， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ニュージャージー（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．監修， Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９９１）；およびＣａｒｉｌｌｏら， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
本発明の抗ＤＮＰ抗体の別の好ましい側面は、配列番号７のアミノ酸を９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号１〜６で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列において以下の少なくとも１つ、好ましくは１つの置換：
（ａ）配列番号７におけるＮ末端からの番号が３３位のグルタミン酸、３７位のチロシン、９４位のバリン、９５位のグルタミン、１５９位のグリシン、１６０位のフェニルアラニン、１６２位のフェニルアラニン、１６４位のアスパラギン、２３３位のグリシン、２３５位のチロシン、２３６位のチロシン、２３７位のアスパラギン酸、２３９位のアルギニン、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシンのいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（ｂ）配列番号７におけるＮ末端からの番号が９６位のチロシン又は２３４位のチロシンのいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる、抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメントである（以下「抗ＤＮＰ抗体４又はその抗原結合性フラグメント４」とも言う）。
【００６８】
本発明の細胞内タンパク質を蛍光標識する方法を超解像イメージング法、特に単一分子位置決定顕微鏡法を用いる超解像イメージング法への適用を検討したところ、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３のいずれかにおいて、少なくとも１つのアミノ酸をアラニン又はフェニルアラニンで置換することにより、ＱＯＤＥプローブと、抗消光団抗体と結合することで消光現象が解除され蛍光がＯＮとなった分子タグ（Ｄｅ−ＱＯＤＥタグ）との結合解離キネティックス（ｋｏｆｆ）を増大させることができることを見出した。
より具体的には、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、ＶＬ−ＣＤＲ３、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２又はＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列において、Ｎ末端からの番号が３３位のグルタミン酸（ＶＬ−ＣＤＲ１のＥ３３に対応）、３７位のチロシン（ＶＬ−ＣＤＲ１のＹ３７に対応）、９４位のバリン（ＶＬ−ＣＤＲ３のＶ９４に対応）、９５位のグルタミン（ＶＬ−ＣＤＲ３のＱ９５に対応）、１５９位のグリシン（ＶＨ−ＣＤＲ１のＧ１５９に対応）、１６０位のフェニルアラニン（ＶＨ−ＣＤＲ１のＦ１６０に対応）、１６２位のフェニルアラニン（ＶＨ−ＣＤＲ１のＦ１６２に対応）、１６４位のアスパラギン（ＶＨ−ＣＤＲ１のＮ１６４に対応）、２３３位のグリシン（ＶＨ−ＣＤＲ３のＧ２３３に対応）、２３５位のチロシン（ＶＨ−ＣＤＲ３のＹ２３５に対応）、２３６位のチロシン（ＶＨ−ＣＤＲ３のＹ２３６に対応）、２３７位のアスパラギン酸（（ＶＨ−ＣＤＲ３のＤ２３７に対応）、２３９位のアルギニン（ＶＨ−ＣＤＲ３のＲ２３９に対応）、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシン（ＶＨ−ＣＤＲ３のＹ２４０又はＹ２４２に対応）のいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（２）Ｎ末端からの番号が９６位のチロシン（ＶＬ−ＣＤＲ３のＹ９６に対応）又は２３４位のチロシン（ＶＨ−ＣＤＲ３のＹ２３４）のいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸を有し、配列番号７のアミノ酸を９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同で有するアミノ酸配列からなる、抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメントである。
【００６９】
本発明の抗ＤＮＰ抗体の更に別の好ましい側面は、配列番号７のアミノ酸において以下の置換：
（１）Ｎ末端からの番号が３３位のグルタミン酸、３７位のチロシン、９４位のバリン、９５位のグルタミン、１５９位のグリシン、１６０位のフェニルアラニン、１６２位のフェニルアラニン、１６４位のアスパラギン、２３３位のグリシン、２３５位のチロシン、２３６位のチロシン、２３７位のアスパラギン酸、２３９位のアルギニン、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシンのいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（２）Ｎ末端からの番号が９６位のチロシン又は２３４位のチロシンのいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる、抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメントである（以下「抗ＤＮＰ抗体５又はその抗原結合性フラグメント５」とも言う）。
【００７０】
本発明の抗ＤＮＰ抗体の更に別の好ましい側面は、アミノ酸配列が以下の配列番号９〜２５のいずれかである抗体又はその抗原結合性フラグメントである（以下「抗ＤＮＰ抗体６又はその抗原結合性フラグメント６」とも言う）。
配列番号９：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQAISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号１０：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGAYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号１１：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCAQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号１２：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVAYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号１３：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQFASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号１４：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASAFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号１５：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGATFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号１６：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTASNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号１７：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSAYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号１８：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTAYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号１９：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGFYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号２０：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYAYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号２１：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYADSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号２２：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYASRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号２３：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSAYGYWGQGTTVTVSS
配列番号２４：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRAGYWGQGTTVTVSS
配列番号２５：
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGAWGQGTTVTVSS
【００７１】
本発明のもう１つの態様は、上記したいずれかの抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメント（即ち、抗ＤＮＰ抗体１〜５等、その抗原結合性フラグメント１〜５等）をコードする単離された核酸である。
【００７２】
本発明の核酸の好ましい側面は、以下の配列番号８に示される塩基配列からなる核酸である。
配列番号８：
ATGGCGGACTACAAAGACATTGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCTTTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGTCAAGTCAGGAAATTAGTGGTTACTTAGGCTGGCTTCAGCAGAAACCAGATGGAAGTATTAAACGCCTGATCTACGCCGCATCCACTTTAGATTCTGGTGTCCCAAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGCAGACTATTATTGTGTACAATATGCTAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATGAAACGCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCCAGATTCAGCTTCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGACTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCGGTTATTACTACGATAGTAGGTACGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCG
【００７３】
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸を含むプラスミド又はベクターである。
【００７４】
本発明のもう１つの実施態様は、以下の式（Ｉ）又は式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩を含む、本発明の細胞内タンパク質を蛍光標識する方法に用いられる蛍光プローブである。
2018135598.tif 000025
式（Ｉ）中、Ｓは、蛍光性基であり、Ｌは、リンカーであり、Ｒａは、一価の置換基である。ｍは、０〜２の整数であり、ｎは、０〜２の整数であり、ｍが２の場合は、ｎは０であり、ｍが１の場合は、ｎは１又は０であり、ｍが０の場合は、ｎは２であり、ｎが２の場合は、Ｒａの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。
2018135598.tif 000026
式（Ｉａ）中、Ｓは、蛍光性基であり、Ｌは、リンカーであり、ｍ１は、１又は２である。
【００７５】
式（Ｉ）及び（Ｉａ）で表される化合物又はその塩（本発明の化合物）については、上記で説明した通りである。
【００７６】
本発明の化合物の非限定的例を以下に示す。
2018135598.tif 000027
2018135598.tif 000028
2018135598.tif 000029
2018135598.tif 000030
2018135598.tif 000031
2018135598.tif 000032
2018135598.tif 000033
【００７７】
本発明の化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
【００７８】
本発明の化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物を製造することができる。
【００７９】
本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに本発明の化合物又はそれらの塩を溶解し、上記した融合タンパク質が発現された細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
【００８０】
本発明のもう１つの態様は、標識対象タンパク質と抗ＤＮＰ（ジニトロフェニル化合物）抗体の融合タンパク質を細胞内で得ること、下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させること、及び前記融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含む、超解像イメージング法である。
2018135598.tif 000034
式（Ｉ）中、Ｓ、Ｌ、Ｒａ、ｍ、ｎについては、上記で説明した通りである。
【００８１】
本発明の超解像イメージング法は、好適には単一分子位置決定顕微鏡法を用いて行われる。
単一分子位置決定顕微鏡法を用いる超解像イメージング法は、例えば、前記の非特許文献１３（M. J. Rust, M. Bates, X. Zhuang, Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods 3, 793-795 (2006)）や非特許文献１４（M. Heilemann, S. van de Linde, M. Schuettpelz, R. Kasper, B. Seefeldt, A. Mukherjee, P. Tinnefeld, M. Sauer, Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl 47, 6172-6176 (2008)）の記載に基づいて行うことができる。
【００８２】
本発明の超解像イメージング法の好ましい側面においては、融合タンパク質における抗ＤＮＰ抗体は、配列番号７のアミノ酸を９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号１〜６で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列において以下の少なくとも１つ、好ましくは１つの置換：
（ａ）Ｎ末端からの番号が３３位のグルタミン酸、３７位のチロシン、９４位のバリン、９５位のグルタミン、１５９位のグリシン、１６０位のフェニルアラニン、１６２位のフェニルアラニン、１６４位のアスパラギン、２３３位のグリシン、２３５位のチロシン、２３６位のチロシン、２３７位のアスパラギン酸、２３９位のアルギニン、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシンのいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（ｂ）Ｎ末端からの番号が９６位のチロシン又は２３４位のチロシンのいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメントである。
抗ＤＮＰ抗体として、上記のアミノ酸配列からなる抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメントを用いることにより、ＱＯＤＥプローブと、抗消光団抗体と結合することで消光現象が解除され蛍光がＯＮとなった分子タグ（Ｄｅ−ＱＯＤＥタグ）との結合解離キネティックス（ｋｏｆｆ）を増大させることができ、実用性の高い超解像イメージングを実現することができる。
【００８３】
本発明の超解像イメージング法の好ましい側面においては、融合タンパク質における抗ＤＮＰ抗体は、配列番号７のアミノ酸において以下の置換：
（１）Ｎ末端からの番号が３３位のグルタミン酸、３７位のチロシン、９４位のバリン、９５位のグルタミン、１５９位のグリシン、１６０位のフェニルアラニン、１６２位のフェニルアラニン、１６４位のアスパラギン、２３３位のグリシン、２３５位のチロシン、２３６位のチロシン、２３７位のアスパラギン酸、２３９位のアルギニン、２４０位のチロシン又は２４２位のチロシンのいずれか１のアミノ酸がアラニンにより置換；あるいは
（２）Ｎ末端からの番号が９６位のチロシン又は２３４位のチロシンのいずれか１つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる抗ＤＮＰ抗体又はその抗原結合性フラグメントである。
【００８４】
本発明のもう１つの態様は、以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、本発明の超解像イメージング法に用いられる蛍光プローブである。
2018135598.tif 000035
式（Ｉ）中、Ｓは、蛍光性基であり、Ｌは、リンカーであり、Ｒａは、一価の置換基である。ｍは、０〜２の整数であり、ｎは、０〜２の整数であり、ｍが２の場合は、ｎは０であり、ｍが１の場合は、ｎは１又は０であり、ｍが０の場合は、ｎは２であり、ｎが２の場合は、Ｒａの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。
【００８５】
Ｒａの一価の置換基が、ハロゲン原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、シアノ基、エステル基、アミド基、アルキルスルホニル基、少なくとも１以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数１〜１０のアルキル基、及び少なくとも１以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数１〜１０のアルコキシ基からなる群から選択される。
【００８６】
本発明のもう１つの態様は、以下の式（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩を含む、本発明の超解像イメージング法に用いられる蛍光プローブである。
2018135598.tif 000036
式（Ｉｂ）中、Ｓは、蛍光性基であり、Ｌは、リンカーであり、Ｒｂ及びＲｃは、以下の組合せから選択される。
（Ｒｂ、Ｒｃ）：（ＮＯ２、ｐ−ＮＯ２）、（ＮＯ２、ｐ−Ｂｒ）、（ＮＯ２、ｐ−ＳＯ２Ｍｅ）、（ＮＯ２、ｐ−Ｃｌ）、（ＮＯ２、ｍ−ＣＮ）、（ＮＯ２、ｐ−ＣＮ）、（ＮＯ２、ｐ−ＣＯＯＭｅ）、（ＣＦ３、ｐ−ＣＦ３）、（ＮＯ２、ｐ−ＣＯＮＨＭｅ）、（ＮＯ２、ｍ−ＣＯＯＭｅ）、（ＮＯ２、Ｈ）
（ここで、ｐ−及びｍ−は、夫々、Ｒｃがベンゼン環上でＬに対してパラ位及びメタ位にあることを表す。）
【００８７】
式（Ｉｂ）において、Ｓは、好ましくは、以下の式（ＩＩＩ）で表される。
2018135598.tif 000037
式（ＩＩＩ）において、Ｒ１〜Ｒ８、Ｘは、式（ＩＩ）について記載した通りである。
【００８８】
式（Ｉｂ）において、ＬはＴ−Ｙで表すことができ、Ｙは蛍光性基であるＳと結合する結合基を表し、Ｔは架橋基を表す。
【００８９】
Ｙの結合基は、アミド基（−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＲ’−、−Ｒ−ＣＯＮＨ−、、−Ｒ−ＣＯＮＲ’−）、アルキルアミド基（−ＣＯＮＨ−Ｒ−、−ＣＯＮＲ’−Ｒ−、）、エステル基（−ＣＯＯ−）、アルキルエステル基（−Ｒ−ＣＯＯ−、−ＣＯＯ−Ｒ−）、カルボニルアミノ基（−ＮＨＣＯ−、−ＮＲ’ＣＯ−）又はアルキルエーテル基（−ＲＯ−、−ＯＲ−）から選択される。ここで、Ｒは二価の炭化水素基を表し、好ましくは炭素数１〜１０のアルキレン基、より好ましくは１〜５のアルキレン基である。また、Ｒ’は、炭素数１〜５のアルキルを表す。
【００９０】
Ｔの架橋基としては、Ｙの結合基と式（Ｉｂ）の化合物のベンゼン環とを連結させるスペーサーとして働く任意の架橋基を用いることができる。例えば、置換又は無置換の二価の炭化水素基（アルカン、アルケン、アルキン、シクロアルカン、芳香族炭化水素など）、ジアルキルエーテル基（例えば、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル等）、エチレングリコール基、ジエチレングリコール基、トリエチレングリコール基、ポリエチレングリコール基、アミド基、カルボニルなど、及び複素環基（例えば、二価のピペリジン環など）、これらの２以上の組合せなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、上記架橋基は、その片方または両方の端部に、Ｙ、式（Ｉｂ）の化合物のベンゼン環と結合することができる官能基を有してもよく、このような官能基として、例えば、アミノ基、アルキルアミノ基、アミノアルキル基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、アルキルアミド基などが挙げられる。
また、Ｔの架橋基には、Ｔ１−（Ｗ）−Ｔ２の式で表されるものも含まれる。ここで、Ｔ１及びＴ２として、各々上記で例示した架橋基を用いることができる。Ｗは、存在する場合は、Ｔ１とＴ２を連結する基であり、例えば、アミノ基、アルキルアミノ基、アミノアルキル基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、アルキルアミド基などが挙げられる。
このような架橋基の例として、トリエチレングリコール基と、ジエチレングルコール基をアミド基、アルキルアミド基等を介して結合させたものが挙げられるがこれらに限定されない。更に、Ｔ１−（Ｗ）−Ｔ２の式で表される架橋基は、その片方または両方の端部に、Ｙ、式（Ｉｂ）の化合物のベンゼン環と結合することができる官能基（例えば、アミノ基、アルキルアミノ基、アミノアルキル基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、アルキルアミド基など）を有してもよい。
【００９１】
本発明の１つの好ましい側面は、以下の化合物又はその塩を含む、本発明の超解像イメージング法に用いられる蛍光プローブである。
2018135598.tif 000038
2018135598.tif 000039
【００９２】
本発明のもう１つの実施態様は、本発明の化合物又はその塩を含む本発明の蛍光標識の方法に用いられる蛍光プローブと、本発明の蛍光標識方法に用いられるプラスミド又はベクターとを含むタンパク質の蛍光標識方法用キットである。
本発明の蛍光標識方法用キットは、好適には超解像法イメージング法に用いることができる。
【実施例】
【００９３】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００９４】
本実施例では、蛍光のＯＮ／ＯＦＦ制御を可能にする分子タグ技術の開発を図２に示す工程で進めた。細胞内で発現可能な抗ＤＮＰ  ｓｃＦｖクローンの取得と抗ＤＮＰ  ｓｃＦｖクローンとの結合で蛍光強度を大きく増加させる蛍光団−ＤＮＰの合成を並行して進めた。蛍光団−ＤＮＰを負荷した際に抗ＤＮＰ  ｓｃＦｖを発現した培養細胞で大きな蛍光増加を示す蛍光団−ＤＮＰと抗ＤＮＰ  ｓｃＦｖの組み合わせを得た。ここで得られた組み合わせを用いて、培養細胞での蛍光イメージングへの適用の可否を調べた。【００９５】
１．実験方法
［抗ジニトロフェノールモノクローナル抗体の取得］
抗原としてＮＨＳ−ジニトロフェノールをＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に標識した複合体を用いた。ＮＨＳ−ジニトロフェノールとＫＬＨを室温で２時間反応させた後に未反応のＮＨＳ−ＤＮＰをＮＡＰ５カラム（ＧＥ）を用いて除去した。ジニトロフェノールのＫＬＨコンジュゲートとＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントを混合することでエマルジョンを調製し、５匹のＢａｌｂ／Ｃマウス（９週齢雌）の尾根部に０．１ｍｌずつ免疫した。免疫後１９日後にマウスからリンパ節を摘出、破砕することでＢ細胞を取得し、１，０００μｌのラボバンカー（十慈フィールド）に懸濁した後に５００μｌずつ２本のクライオチューブに分注して−８０℃で保存した。
回収したリンパ節細胞とミエローマ細胞（ＳＰ２、ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ）をＧｅｎｏｍＯＮＥ−ＣＦ（石原産業）を用いて細胞融合させた。細胞融合後の細胞懸濁液は１０％のＢＭ  Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（ロシュ）と１０％の血清を含む４４ｍｌのＨＡＴ培地（和光純薬）で希釈し、４枚の９６ウェルプレート（コーニング）に播種後、５％二酸化炭素、３７℃で培養した。細胞培養後７日後に各ウェルの培養上清３０μｌを用いて抗体価を評価した。ハイブリドーマの細胞上清が高い抗体価とＳＲＢ−ＤＮＰの蛍光強度増加を示したウェルの細胞を選別し、限界希釈法による単一クローン化を２回行い、ハイブリドーマ株を樹立した。【００９６】
［ＥＬＩＳＡ法による抗体価の評価］
スクリーニングではジニトロフェノールとＢＳＡのコンジュゲートを抗原として用いた。１０μｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＤＮＰコンジュゲート液をＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）に１００μｌずつ加え、３７℃で２時間吸着させた。抗原吸着後に抗原液をＰＢＳによる洗浄で除去し、ハイブリドーマ培養上清を３０μｌ加え、３７℃で２時間放置した。２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後に西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体と３７℃で３０分反応させた。２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後にＴＭＢ発色キット（ナカライテスク）を５０μｌ加え発色反応を行った。発色後に１Ｍ硫酸を５０μｌ加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）で５９０ｎｍをリファレンスとして４５０ｎｍの吸光度を測定した。【００９７】
［抗ＤＮＰモノクローナル抗体の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）化］
１０６個の抗ＤＮＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを回収し、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトータルＲＮＡを取得した。得られたトータルＲＮＡを鋳型にしてＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。得られたｃＤＮＡを鋳型にして縮重プライマー（S. D. R.Kontermann, Antibody Engineering. Springer 1,  (2010)）を用いたＰＣＲを行い、各抗ＤＮＰモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖領域をコードするｃＤＮＡ断片を増幅した。得られたｃＤＮＡ断片はＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）を用いて精製した後にオーバーラップＰＣＲによって軽鎖と重鎖を結合させたｃＤＮＡ断片を取得した。得られたｃＤＮＡ断片の両端に付加した制限酵素ＳｆｉＩサイトを介してｐＡＫ４００ベクター（A. Krebber et al., Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. Journal of immunological methods 201, 35-55 (1997).）にサブクローニングした。ｓｃＦｖをコードするｃＤＮＡ配列の解析を行った。【００９８】
［ＭＢＰ融合タンパク質の発現コンストラクト］
ｐＡＫ４００−ｓｃＦｖをＨｉｎｄＩＩＩ消化し、続いてＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＴＡＫＡＲＡ）で平滑化した。さらにＮｃｏＩ消化して得られたｓｃＦｖのｃＤＮＡ断片をＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＶ消化したｐＭａｌｃ５Ｅにサブクローニングした（ｐＭａｌｃ５Ｅ−ｓｃＦｖ）。【００９９】
［抗ＤＮＰ  ｓｃＦｖの発現、精製］
抗ＤＮＰ  ｓｃＦｖはマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として発現及び精製を行った。精製対象のｓｃＦｖ配列を挿入したｐＭａｌｃ５Ｅベクター（ｐＭａｌｃ５Ｅ−ｓｃＦｖ）で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ培地プレート上で一晩培養した。単一コロニーをピックアップし、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだ５ｍｌの液体ＬＢ培地で一晩培養した培養液１ｍｌを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだ１００ｍｌのＬＢ培地に継代した。６００ｎｍの光学密度が０．８になるまで３７℃、２００ｒｐｍで振蕩培養し、１５℃で３０分振蕩培養した後に終濃度０．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、引き続き一晩振蕩培養した。培養後に大腸菌を回収し、ソニケーターを用いて破砕した。大腸菌破砕液を遠心（３，０００ｇ）することで上清を回収し、Ｈｉｓ  ｔａｇ  アフィニティービーズＴＡＬＯＮ（タカラバイオ）で精製し、２５０μｌの精製タンパク質を得た。溶出液をＰＢＳに交換し、収量をブラッドフォード法により定量したのちに以降の計測に供した。【０１００】
［動物細胞への発現コンストラクトの作製］
細胞質発現コンストラクトの作製
抗ＤＮＰ  ｓｃＦｖと赤色蛍光タンパク質ＴａｇＲＦＰとの融合タンパク質を動物細胞で発現させるためにベクター構築をした。フォワードプライマーにＢｇｌＩＩサイトを、リバースプライマーにＥｃｏＲＩサイトをそれぞれ付加してｐＭａｌｃ５Ｅ−ｓｃＦｖを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで消化した後にｐＴａｇＲＦＰ−Ｃ（Ｅｖｒｏｇｅｎ）のＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングした（ｐＴａｇＲＦＰ−ｓｃＦｖ）。また、ｐＴａｇＲＦＰ−ｓｃＦｖ  をＮｈｅＩ／ＢｓｐＥＩ消化し、ＴａｇＲＦＰのｃＤＮＡ配列を切り出した後に、フォワードプライマーにＮｈｅＩサイトを、リバースプライマーにＥｃｏＲＩサイトをそれぞれ付加してＰＣＲで増幅したＥＣＦＰのｃＤＮＡ断片をＮｈｅＩ／ＢｓｐＥＩ消化し、ＮｈｅＩ／ＢｓｐＥＩ消化によりＴａｇＲＦＰのｃＤＮＡ配列を除去したｐＴａｇＲＦＰ−ｓｃＦｖにサブクローニングした（ｐＥＣＦＰ−ｓｃＦｖ）。【０１０１】
細胞膜発現５Ｄ４コンストラクトの作製
フォワードプライマーにＢｓｐＥＩサイトを、リバースプライマーにＥｃｏＲＩサイトを付加してｐＴａｇＲＦＰ−５Ｄ４を鋳型にしてＰＣＲを行った。取得したｃＤＮＡ断片をＢｓｐＥＩ／ＥｃｏＲＩ消化し、ｐｃＤＮＡＴａｇＲＦＰ−Ｍ１３（２５１−４５０ａａ）−ＣＡＡＸ（東京大学  有吉哲郎氏より供与）をＢｓｐＥＩ／ＥｃｏＲＩ消化してＭ１３（２５１−４５０ａａ）コード領域を除去したベクターにサブクローニングした（ｐＴａｇＲＦＰ−５Ｄ４−ＣＡＡＸ）。ｐＴａｇＲＦＰ−５Ｄ４−ＣＡＡＸをＮｈｅＩ／ＢｓｐＥＩ消化し、ＴａｇＲＦＰコード領域を除去し、ｐＥＣＦＰ−５Ｄ４からＮｈｅＩ／ＢｓｐＥＩ消化により切り出したＥＣＦＰ−５Ｄ４コード領域をサブクローニングした（ｐＥＣＦＰ−５Ｄ４−ＣＡＡＸ）。【０１０２】
核局在コンストラクトの作製
フォワードプライマーにＳｍａＩサイトを、リバースプライマーにＳａｌＩサイトをそれぞれ付加してｐＥＣＦＰ−５Ｄ４−ＣＡＡＸを鋳型にしたＰＣＲによって増幅しＳｍａＩ／ＳａｌＩ消化したｃＤＮＡ断片を、あらかじめＮｈｅＩサイトとＥｃｏＲＩサイトを除去してＳｍａＩ／ＳａｌＩ消化をしたｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴにサブクローニングした（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＥＣＦＰ−５Ｄ４）。ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＥＣＦＰ−５Ｄ４のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩサイトにＧＧＧＳリンカーと核移行シグナル（ＤＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶ）をコードするＤＮＡ配列をオリゴＤＮＡをアニールして挿入した（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＥＣＦＰ−５Ｄ４−ＮＬＳ）。【０１０３】
小胞体発現コンストラクトの作製
ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＥＣＦＰ−５Ｄ４のＳｍａＩ／ＮｈｅＩサイトにＥＲ局在化シグナル（ＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＡＨＳ）とＧＧＧＡＳアミノ酸リンカーをコードするＤＮＡ配列をオリゴＤＮＡをアニールすることで作製して挿入した。加えて、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩサイトにＧＧＧＳリンカーと小胞体局在化シグナル（ＳＥＫＤＥＬ）をコードするＤＮＡ配列をオリゴＤＮＡをアニールして作製して挿入した（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＥＣＦＰ−５Ｄ４−ＥＲ）。【０１０４】
チューブリン発現コンストラクトの作製
β−Ｔｕｂｕｌｉｎ−Ｈａｌｏの発現コンストラクト（ＴＢＢ−Ｈａｌｏ）（S.-n. Uno et al., A spontaneously blinking fluorophore based on intramolecular spirocyclization for live-cell super-resolution imaging. Nat Chem 6, 681-689 (2014)）をＳａｌＩ／ＮｏｔＩ消化し、ＨａｌｏＴａｇコード領域を除去した後に、ＰＣＲによってＳａｌＩ／ＮｏｔＩサイトを付加した５Ｄ４コード領域をＳａｌＩ／ＮｏｔＩ消化して得たＤＮＡ断片をサブクローニングした。得られたプラスミドを環状ＰＣＲによってＴＢＢ−５Ｄ４のチューブリンコード領域の直後と５Ｄ４コード領域の直前それぞれにＧＧＧＳが２回続くリンカーをコードする配列を付加した。ＰＣＲ産物を精製し、Ｔ４  ＰＮＫ  （東洋紡）でリン酸化した後に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２  （ＴＡＫＡＲＡ）を用いてセルフライゲーションを行った。ライゲーション産物で大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ培地プレート上で一晩培養した。大腸菌の単一コロニーから増殖させた大腸菌よりプラスミドを取得した（ｐＴＢＢ−ＧＧＧＳ４−５Ｄ４）。【０１０５】
５Ｄ４−アクチン発現コンストラクト
ｐ５Ｄ４−ａｃｔｉｎからＮｈｅＩ／ＢｓｐＥＩ消化によって５Ｄ４のｃＤＮＡ領域を、ｐｍＧＦＰ−ａｃｔｉｎ（生理学研究所村越研究室より供与）（H. Murakoshi, H. Wang, R. Yasuda, Local, persistent activation of Rho GTPases during plasticity of single dendritic spines. Nature 472, 100-104 (2011).）からＢｓｐＥＩ／ＢａｍＨＩ消化によってａｃｔｉｎのｃＤＮＡ領域をそれぞれ取得し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩサイトにサブクローニングした（ｐ５Ｄ４−ａｃｔｉｎ）。ｐ５Ｄ４−ａｃｔｉｎをＢｓｐＥＩ／ＢｇｌＩＩ消化し、アミノ酸ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳをコードするリンカーＤＮＡをオリゴＤＮＡのアニールによって形成してライゲーションした（ｐ５Ｄ４−ＧＧＧＳ４−ａｃｔｉｎ）。【０１０６】
Ｌｉｆｅａｃｔ発現コンストラクトの作製
ＬｉｆｅａｃｔペプチドをコードするｃＤＮＡ配列（J. Riedl et al., Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods 5, 605-607 (2008)）となるように２本のオリゴＤＮＡをそれぞれＴ４ＰＮＫで３７℃、１時間処理してリン酸化した後に、２本のリン酸化オリゴＤＮＡを混合し９５℃で５分間処理したのちに室温まで放冷することで２本鎖のリンカーを形成させた。ｐＥＣＦＰ−５Ｄ４をＮｈｅＩ消化しＢＡＰ処理による脱リン酸化を行ったベクターにリンカーをサブクローニングした（ｐＬｉｆｅａｃｔ−５Ｄ４）。【０１０７】
５Ｄ４−ＳＴＩＭ１発現コンストラクトの作製
フォワードプライマーにＥｃｏＲＶサイトを、リバースプライマーにＸｂａＩサイトをそれぞれ付加してｐＧＦＰ−ＳＴＩＭ１（Y. Wang et al., STIM protein coupling in the activation of Orai channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 7391-7396 (2009).）を鋳型にしたＰＣＲによって増幅したｃＤＮＡ断片をＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩ消化し、ＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩ消化したｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした（ｐ５Ｄ４−ＳＴＩＭ１）【０１０８】
２．蛍光色素とＤＮＰを組み合わせた蛍光プローブの作製
有機合成・化合物同定に用いた方法
すべての化学試薬および溶媒は、Ａｌｄｒｉｃｈ、ナカライテスク、東京化成工業、和光純薬工業、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、もしくは、関東化学から入手し、さらなる精製は行わずに使用した。
ＨＰＬＣ精製は、ポンプ（ＰＵ−２０８０）およびＵＶ検出器（ＭＤ−２０１０）を備え付けたＨＰＬＣシステム（日本分光）を利用し、また、逆相カラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（５μｍ、φ１０ｍｍ  ｏｒ  φ１４ｍｍ  ｘ  ２５０ｍｍ）（ＧＬサイエンス）を用いた。このとき、サンプルはＰＴＦＥフィルター（０．４５μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により濾過した上で、Ａ液（Ｈ２Ｏ  ｗｉｔｈ  ０．１％ＴＦＡ）：Ｂ液（ＣＨ３ＣＮ  ｗｉｔｈ  ０．１％ＴＦＡ）が９５：５から２０分掛けて５：９５になる線形勾配条件下で精製を行った。また、取得したフラクションに飽和食塩水を加えた後にジクロロメタンもしくは酢酸エチルによる抽出、硫酸ナトリウムによる乾燥、濃縮を行うことにより目的物を取得した。
１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、ＡＶＡＮＣＥ  ＩＩＩ  ４００  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて室温にて測定した。すべての化学シフト（δ）はｐｐｍを単位として記載し、内部標準としてテトラメチルシラン（０ｐｐｍ）もしくは残留溶媒（ＣＤＣｌ３，７．２６ｐｐｍ  ｆｏｒ  １Ｈ，  ７７．１６ｐｐｍ  ｆｏｒ  １３Ｃ；ＣＤ３ＯＤ，３．３１ｐｐｍ  ｆｏｒ  １Ｈ，４９．００ｐｐｍ  ｆｏｒ  １３Ｃ；Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６，２．０５ｐｐｍ  ｆｏｒ  １Ｈ，２９．８４ｐｐｍ  ｆｏｒ  １３Ｃ；ＣＤ３ＣＮ，１．９４ｐｐｍ  ｆｏｒ  １Ｈ，１．３２ｐｐｍ  ｆｏｒ  １３Ｃ；ＤＭＳＯ−ｄ６，２．５０ｐｐｍ  ｆｏｒ  １Ｈ，３９．５２ｐｐｍ  ｆｏｒ  １３Ｃ）を用いた。また、ピークの多重度は以下のように短縮して記載した：ｓ＝ｓｉｎｇｌｅｔ，ｄ＝ｄｏｕｂｌｅｔ，ｔ＝ｔｒｉｐｌｅｔ，ｑ＝ｑｕａｒｔｅｔ，ｍ＝ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ，ｄｄ＝ｄｏｕｂｌｅ  ｄｏｕｂｌｅｔ，ｂｒｓ＝ｂｒｏａｄ  ｓｉｎｇｌｅｔ。ＥＳＩ−ＴＯＦ（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）  質量分析はｍｉｃｒｏＴＯＦ  ＩＩ−ＴＭ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて行った。【０１０９】
略語
ＤＣＭ：ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ
ＤＩＥＰＡ：Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ
ＤＭＡＰ：Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ
ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ
ＤＳＣ：Ｎ，Ｎ’−Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ
ＨＡＴＵ：２−（１Ｈ−７−ａｚａｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｅｔｈａｎａｍｉｎｉｕｍ
ＨＲＭＳ：ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
ＴＥＡ：ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ
ＴＦＡ：ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ
ＴＳＴＵ：Ｏ−（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）−Ｎ,Ｎ,Ｎ‘,Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ Ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ【０１１０】
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅ（化合物１）の合成
１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン（７．９２ｇ、５３．４ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（９．３０ｍＬ、５３．４ｍｍｏｌ）が溶解した４ｍＬのＤＭＦ溶液に、１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（９９５ｍｇ、５．３４ｍｍｏｌ）が溶解した１６ｍＬのＤＭＦ溶液を０ｏＣでゆっくりと滴下した。反応混合物を室温で終夜撹拌した後、濃縮した。残渣にＤＣＭを加え、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄、硫酸ナトリウムで脱水、濾過、濃縮を行った。粗生成物はシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチルの後にメタノール）により精製し、ＤＮＰ−ａｍｉｎｅ（１．２０ｇ、３．８２ｍｍｏｌ）を黄色オイルとして取得した（収率７２％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.88 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.20 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 7.14 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 3.82 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.72-3.63 (m, 6H), 3.53 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.79 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 149.7, 136.9, 131.3, 130.9, 124.5, 116.0, 73.6, 71.5, 71.3, 69.7, 44.0, 42.1.【０１１１】
2018135598.tif 000040
【０１１２】
ＤＮＰの合成
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅ（４０．０ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）が溶解した０．５ｍＬのアセトニトリル溶液に無水酢酸（１２．０μＬ、０．１２７ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で終夜撹拌した後、濃縮した。粗生成物はシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：３％メタノール／酢酸エチル）により精製し、ＤＮＰ（４２．５ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）を黄色オイルとして取得した（収率９４％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.11 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.88 (br s, 1H), 8.27 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 6.96 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 6.27 (br s, 1H), 3.86 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.74-3.57 (m, 8H), 3.47 (q, 2H, J = 5.2 Hz), 2.00 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 170.4, 148.4, 136.1, 130.4, 124.3, 114.2, 70.7, 70.2, 68.2, 43.2, 39.4, 23.3. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 357.14102; found, 357.14158 (Δ0.56 mmu).【０１１３】
2018135598.tif 000041
【０１１４】
ｏＮＰ−ａｍｉｎｅの合成
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、２−フルオロニトロベンゼンを原料としてｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（４３．７ｍｇ、０．１６２ｍｍｏｌ）を橙色オイルとして取得した（収率７０％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.12-8.10 (m, 2H), 7.50-7.46 (m, 1H), 7.03-7.01 (m, 1H), 6.69-6.64 (m, 1H), 3.78 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.68-3.66 (m, 4H), 3.53-3.50 (m, 4H), 2.77 (br s, 2H). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 146.7, 137.4, 133.1, 127.5, 116.4, 115.4, 73.6, 71.5, 71.4, 70.1, 43.5, 42.1. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 270.14483; found, 270.14584 (Δ1.01 mmu).【０１１５】
2018135598.tif 000042
【０１１６】
ｏＮＰの合成
ＤＮＰの合成と同様のスキームで、ｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料としてｏＮＰ（４８．７ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）を橙色オイルとして取得した（収率８４％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.18 (t, 1H, J = 5.2 Hz), 8.07-8.04 (m, 2H), 7.85 (br s, 1H), 7.55-7.51 (m, 1H), 7.07-7.05 (m, 1H), 6.71-6.66 (m, 1H), 3.68 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.60-3.48 (m, 6H), 3.40 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.18 (q, 2H, J = 5.6 Hz), 1.79 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 169.3, 145.2, 136.6, 131.0, 126.2, 115.4, 114.6, 69.7, 69.6, 69.2, 68.4, 42.1, 38.6, 22.5. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 312.15540; found, 312.15452 (Δ-0.88 mmu).【０１１７】
2018135598.tif 000043
【０１１８】
ｐＮＰ−ａｍｉｎｅの合成
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、４−フルオロニトロベンゼンを原料としてｐＮＰ−ａｍｉｎｅ（４７．０ｍｇ、０．１７４ｍｍｏｌ）を黄色固体として取得した（収率７３％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.04-8.01 (m, 2H), 6.66-6.64 (m, 2H), 3.72-3.69 (m, 8H), 3.41 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.11 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 156.0, 138.1, 127.3, 111.9, 71.4, 71.3, 70.4, 67.9, 43.8, 40.6. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 270.14538; found, 270.14517 (Δ-0.21 mmu).【０１１９】
2018135598.tif 000044
【０１２０】
ｐＮＰの合成
ＤＮＰの合成と同様のスキームで、ｐＮＰ−ａｍｉｎｅを原料としてｐＮＰ（４６．８ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）を黄色オイルとして取得した（収率８１％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.93 (m, 2H), 7.87 (br s, 1H), 7.31 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 6.67 (m, 2H), 3.59-3.51 (m, 6H), 3.40-3.31 (m, 4H), 3.17 (q, 2H, J = 5.6 Hz), 1.79 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 169.3, 154.6, 135.7, 126.2, 110.9 (br s), 69.7, 69.6, 69.2, 68.7, 42.4, 38.6, 22.6. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 312.15540; found, 312.15644 (Δ1.04 mmu).【０１２１】
2018135598.tif 000045
【０１２２】
ＤＮＰ２−ａｍｉｎｅの合成
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、２，２’−オキシビス（エチルアミン）を原料としてＤＮＰ２−ａｍｉｎｅ（２５４ｍｇ、０．９３９ｍｍｏｌ）を黄色固体として取得した（収率７８％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.95 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.24 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 3.79 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.67 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.57 (t, 5.2 Hz, 2H), 2.82 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 149.8, 137.0, 131.5, 130.9, 124.9, 116.0, 73.6, 69.7, 44.0, 42.2. HRMS (ESI-) calcd for [M-H]-, 269.08914; found, 269.09115 (Δ 2.01 mmu).【０１２３】
2018135598.tif 000046
【０１２４】
ＤＮＰ４−ａｍｉｎｅの合成
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、１，１１−ジアミノ−３，６，９−トリオキサウンデカンを原料としてＤＮＰ４−ａｍｉｎｅ（１９７ｍｇ、０．５４９ｍｍｏｌ）を黄色オイルとして取得した（収率８３％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.96 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.24 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 7.19 (d, 1H, J = 9.6Hz), 3.81 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.69-3.60 (m, 10H), 3.51 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 149.8, 137.0, 131.5, 131.0, 124.6, 116.1, 73.4, 71.6, 71.58, 71.3, 69.9, 44.1, 42.
1. HRMS (ESI-) calcd for [M-H]-, 357.14157; found, 357.14466 (Δ 3.09 mmu).【０１２５】
2018135598.tif 000047
【０１２６】
ＤＮＰ−ＮＨＳの合成
ジスクシニミジルスベレート（１２０ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１１μＬ、０．０６４ｍｍｏｌ）が溶解した０．５ｍＬのＤＭＦ溶液に、３２μＬの１Ｍ  ＤＮＰ−ａｍｉｎｅ（１０ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ相当）のＤＭＦ溶液を０ｏＣで滴下した後、反応混合物を室温で２時間撹拌した。粗生成物はＨＰＬＣで精製を行い、ＤＮＰ−ＮＨＳ（７．９ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）を黄色固体として取得した（収率４４％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.15 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.88 (br s, 1H), 8.29 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 6.94 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 6.34 (br s, 1H), 3.84 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.73-3.66 (m, 4H), 3.51-3.47 (m, 4H), 2.84 (br s, 4H), 2.60 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 2.24 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 1.78-1.62 (m, 4H), 1.43-1.33 (m, 4H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.2, 169.4, 168.7, 148.4, 136.4, 130.6, 124.5, 114.1, 70.8, 70.3, 70.2, 68.3, 43.2, 39.6, 36.3, 31.0, 28.6, 28.4, 25.7, 25.5, 24.5. 
HRMS (ESI+) calcd. for [M+Na]+, 590.20688; found, 590.20688 (Δ 0.01 mmu).【０１２７】
2018135598.tif 000048
【０１２８】
［合成実施例１］
６ＤＣＦ−ＤＮＰ（２−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−４−（（２−（２−（２−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）安息香酸）の合成
３’，６’−ジアセチル−２’，７’−ジクロロ−６−カルボニルフルオレセインピリジニウム塩（Woodroofe, C. C., Masalha, R., Barnes, K. R., Frederickson, C. J. & Lippard, S. J. Membrane-permeable and-impermeable sensors of the Zinpyr family and their application to imaging of hippocampal zinc in vivo. Chem. Biol. 11, 1659-1666 (2004).）（２６ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）、ＤＮＰ−ａｍｉｎｅ（１９ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２３ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（４３μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）を３ｍＬのアセトニトリルに溶解した反応混合物を遮光下室温で３０分間撹拌した。反応混合物を濃縮した後、粗生成物はシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝３／１の後に１０％メタノール／ＤＣＭ）により精製し、中間体（２４ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）を取得した。取得した中間体をＴＨＦ／水（３ｍＬ／１ｍＬ）に溶解し、そこに１７０μＬの１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液を加え、反応溶液を遮光下室温で３０分間撹拌した。反応溶液に水を加え、酢酸エチルで洗浄した後に、水層に３００μＬの１Ｍ塩酸を加え、酢酸エチルで抽出を行った。取得した有機層は、硫酸ナトリウムで脱水した後、濾過、濃縮を行った。粗生成物はＨＰＬＣで精製を行い、６ＤＣＦ−ＤＮＰ（１５ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を黄色固体として取得した（２反応の収率４０％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.82 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 8.79 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 8.73 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 8.21 (dd, 1H, J = 9.6, 2.4 Hz), 8.14 (dd, 1H, J = 8.0, 1.2 Hz), 8.06 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.19 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 6.91 (s, 2H), 6.73 (s, 2H), 3.63-3.48 (m, 12H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 167.7, 164.7, 155.3, 151.8, 150.0, 148.3, 140.9, 134.9, 129.8, 129.6, 128.4, 127.9, 125.3, 123.5, 122.2, 116.4, 115.5, 110.0, 103.6, 81.7, 69.7, 69.5, 68.7, 68.2, 42.6. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 741.09970; found, 741.10088 (Δ1.18 mmu).【０１２９】
2018135598.tif 000049
【０１３０】
［合成実施例２］
６ＤＣＦ−ｏＮＰ（２−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−４−（（２−（２−（２−（（２−ニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）安息香酸）の合成
６ＤＣＦ−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、ｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＤＣＦ−ｏＮＰ（１２ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）を黄色固体として取得した（２反応の収率３３%）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 11.12 (s, 2H), 8.74 (t, 1H, J = 4.8 Hz), 8.14-8.02 (m, 4H), 7.69 (s, 1H), 7.53-7.49 (m, 1H), 7.02 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.91 (s, 2H), 6.74 (s, 2H), 6.69-6.65 (m, 1H), 3.62-3.43 (m, 12H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 696.11463; found, 696.11539 (Δ0.76 mmu).【０１３１】
2018135598.tif 000050
【０１３２】
［合成実施例３］
６ＤＣＦ−ｐＮＰ（２−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−４−（（２−（２−（２−（（４−ニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）安息香酸）の合成
６ＤＣＦ−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、ｐＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＤＣＦ−ｐＮＰ（７．７ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を黄色固体として取得した（２反応の収率２９%）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.16 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 8.14 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 8.10-7.95 (m, 2H), 7.65 (s, 1H), 6.82 (s, 2H), 6.66 (s, 1H), 6.55 (d, 2H, J = 9.6 Hz), 3.61-3.52 (m, 10H), 3.26-3.24 (m, 2H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 696.11463; found, 696.11560 (Δ0.97 mmu).【０１３３】
2018135598.tif 000051
【０１３４】
［合成実施例４］
６ＤＣＦ−ＤＮＰ２（２−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−４−（（２−（２−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エチル）カルバモイル）安息香酸）の合成
６ＤＣＦ−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、ＤＮＰ２−ａｍｉｎｅを原料として６ＤＣＦ−ＤＮＰ２ （４．７ｍｇ、０．００６７ｍｍｏｌ）を橙色固体として取得した（２反応の収率８．９%）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.94 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.82 (br s, 1H), 8.25-8.19 (m, 2H), 8.07-8.05 (m, 2H), 7.80 (br s, 1H), 7.27 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 7.00 (s, 2H), 6.86 (s, 2H), 3.81 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.71 (q, 2H, J = 5.2 Hz), 3.67 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.56 (q, 2H, J = 5.6 Hz). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 697.07349; found, 697.07700 (Δ 3.51 mmu).【０１３５】
2018135598.tif 000052
【０１３６】
［合成実施例５］
６ＤＣＦ−ＤＮＰ４（２−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−４−（（２−（２−（２−（２−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）安息香酸）の合成
６ＤＣＦ−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、ＤＮＰ４−ａｍｉｎｅを原料として６ＤＣＦ−ＤＮＰ４ （３．０ｍｇ、０．００３８ｍｍｏｌ）を橙色固体として取得した（２反応の収率５．０%）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.96 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.83 (br s,1H), 8.29-8.25 (m, 1H), 8.22 (dd, 1H, J = 1.2, 8.0 Hz), 8.07 (dd, 1H, J = 0.8, 8.0 Hz), 7.97 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 7.80 (br s, 1H), 7.26 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 7.00 (s, 2H), 6.86 (s, 2H), 3.78 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.69 (q, 2H, J = 5.2 Hz), 3.59-3.46 (m, 12H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 785.12592; found,785.12616(Δ 0.24 mmu).【０１３７】
2018135598.tif 000053
【０１３８】
［合成実施例６］
ＤＣＦ−ＤＮＰ（２−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−Ｎ−（２−（（２−（２−（２−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチルベンズアミド）の合成
２’，７’−ジクロロフルオレセイン（５１ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルサルコシネート塩酸塩（２８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（５８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１１１μｌ、０．６４ｍｍｏｌ）を１ｍｌのＤＭＦに溶解させ、反応混合物を遮光下室温で１日撹拌した。粗生成物はＨＰＬＣで精製を行い、ｔｅｒｔ−ブチルエステル中間体を取得した。この中間体およびトリエチルシラン（５６μｌ）を溶解した５ｍｌのＤＣＭに１ｍｌのＴＦＡを滴下した後、反応混合物を遮光下室温で終夜撹拌した。粗生成物はＨＰＬＣで精製を行い、カルボン酸を有する中間体を橙色固体として取得した。取得した中間体、化合物１（４６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（５６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１０６μｌ、０．６１ｍｍｏｌ）を１ｍｌのＤＭＦに溶解した反応混合物を遮光下室温で２時間撹拌した。粗生成物はＨＰＬＣで精製を行い、ＤＣＦ−ＤＮＰ（２９ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）を橙色固体として取得した（３反応の収率３０％）。
HRMS (ESI-) calcd. for [M-H]-, 766.13244; found, 766.13345 (Δ1.01 mmu).【０１３９】
2018135598.tif 000054
【０１４０】
［合成実施例７］
Ｒ１１０−ＤＮＰ（６−アミノ−９−（２−（（２−（（２−（２−（２−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−２−オキソエチル）（メチル）カルバモイル）フェニル）−３Ｈ−キサンテン−３−イミニウム）の合成
Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １１０  ｃｈｌｏｒｉｄｅを原料にして、ＤＣＦ−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、Ｒ１１０−ＤＮＰ（４．８ｍｇ、０．００６５ｍｍｏｌ）を橙色固体として取得した（３反応の収率１５％）。
HRMS (ESI+) calcd. for [M-Cl]+, 698.25690; found, 698.25345 (Δ-3.45 mmu).【０１４１】
2018135598.tif 000055
【０１４２】
［合成実施例８］
５ＯＧ−ＤＮＰ（２−（２，７−ジフルオロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（（２−（２−（２−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）安息香酸）の合成
５−カルボキシ−２’，７’−ジフルオロフルオレセイン（W.-C. Sun, K. R. Gee, D. H. Klaubert, R. P. Haugland, Synthesis of Fluorinated Fluoresceins. The Journal of Organic Chemistry 62, 6469-6475 (1997)）を原料にして、ＤＣＦ−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、５ＯＧ−ＤＮＰ（２．９ｍｇ、０．００４１ｍｍｏｌ）を橙色固体として取得した（収率３４％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.86-8.82 (m, 3H), 8.44 (m, 1H), 8.25-8.20 (m, 2H), 7.42 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 6.90 (s, 2H), 6.73 (s, 2H), 3.71 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.61-3.45 (m, 10H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 167.7, 164.7, 155.3, 153.6, 150.1, 148.4, 136.5, 134.9, 129.9, 129.7, 128.7, 128.4, 127.9, 126.4, 124.1, 123.9, 123.6, 116.4, 115.6, 110.0, 103.7, 69.8, 69.6, 68.8, 68.3, 48.6, 42.7. HRMS (ESI-) calcd. for [M-H]-, 707.14425; found, 707.14452 (Δ0.27 mmu).【０１４３】
2018135598.tif 000056
【０１４４】
［合成実施例９］
６ＳｉＲ−ＤＮＰ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（２−（２−（２−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
ＳｉＲ−カルボキシル（G. Lukinavicius et al., A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins. Nat Chem 5, 132-139 (2013)）（５．９ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）、ＤＳＣ（１３ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（１０μｌ、０．０７５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．２ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ）を１ｍｌのＤＭＦに溶解した反応混合物を遮光下室温で終夜撹拌した。粗生成物はＨＰＬＣで精製を行い、中間体を青色固体として取得した。この中間体および化合物１（ＤＮＰ−ａｍｉｎｅ）（３．９ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（５．３μｌ）を０．５ｍＬのＤＭＦに溶解した反応混合物を遮光下室温で１時間撹拌した。粗生成物はＨＰＬＣで精製を行い、６ＳｉＲ−ＤＮＰ（３．３ｍｇ、０．００４３ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（２反応の収率３４％）。
1H NMR (400 MHz, Acetone-d6): δ 8.92 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 8.79 (br s, 1H), 8.23 (dd, J = 2.8, 9.6 Hz, 1H), 8.10-8.08 (m, 1H), 7.97-7.95 (m, 2H), 7.77 (m, 1H), 7.15 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 6.75 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.64 (dd, J = 2.8, 8.8 Hz, 2H), 3.75 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.96 (s, 12H), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6): δ 170.0, 166.2, 156.0, 150.5, 149.5, 141.2, 138.3, 137.4, 136.6, 132.4, 130.7, 129.3, 129.0, 128.9, 126.2, 124.4, 124.0, 117.6, 116.0, 114.5, 71.1, 70.9, 70.1, 69.3, 43.8, 40.6, 40.3, 0.4, -1.1. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 769.30118; found, 769.30220 (Δ1.02 mmu).【０１４５】
2018135598.tif 000057
【０１４６】
［合成実施例１０］
５ＤＣＦ−ＤＮＰ（２−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（（２−（２−（２−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）安息香酸）の合成
６ＤＣＦ−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、３’，６’−ジアセチル−２’，７’−ジクロロ−５−カルボキシフルオレセイン（Woodroofe, C. C., Masalha, R., Barnes, K. R., Frederickson, C. J. & Lippard, S. J. Membrane-permeable and-impermeable sensors of the Zinpyr family and their application to imaging of hippocampal zinc in vivo. Chem. Biol. 11, 1659-1666 (2004).）を原料として５ＤＣＦ−ＤＮＰ（１７ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を黄色固体として取得した（２反応の収率２４％）。
1H NMR (400 MHz, Acetone-d6): δ 8.96 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.87 (br s, 1H), 8.44-8.43 (m, 1H), 8.32-8.30 (m, 1H), 8.26-8.23 (m, 1H), 8.12-8.09 (m, 1H), 7.46-7.44 (m, 1H), 7.27-7.24 (m, 1H), 6.98 (s, 2H), 6.84 (s, 2H), 3.89-3.86 (m, 2H), 3.73-3.68 (m, 8H), 3.66-3.62 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 167.8, 164.7, 155.3, 153.6, 150.1, 148.4, 136.5, 134.9, 129.9, 129.7, 128.7, 128.4, 127.9, 126.4, 124.1, 123.9, 123.6, 116.4, 115.6, 110.0, 103.7, 69.8, 69.6, 68.8, 68.3, 48.6, 42.7. HRMS (ESI+) calcd for [M+H]+, 741.10025; found, 741.09788 (Δ-2.37 mmu).【０１４７】
2018135598.tif 000058
【０１４８】
［合成実施例１１］
６ＯＧ−ＤＮＰ，ｄｉＡｃ（６−（（２−（２−（２−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）−２’，７’−ジフルオロ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル  ジアセテート）の合成
６−カルボキシ−２’，７’−ジフルオロフルオレセイン二酢酸ピリジニウム塩（Sun, W. C., Gee, K. R., Klaubert, D. H. & Haugland, R. P. Synthesis of fluorinated fluoresceins. J. Org. Chem. 62, 6469-6475 (1997).）（３１ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）、ＤＮＰ−ａｍｉｎｅ（２４ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２９ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（５５μＬ、０．３１ｍｍｏｌ）を３ｍＬのアセトニトリルに溶解した反応混合物を遮光下室温で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮した後、粗生成物はシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝３／１）により精製し、６ＯＧ−ＤＮＰ，ｄｉＡｃ（２８ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）を黄色固体として取得した（収率５９％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.82 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 8.80 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 8.72 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 8.22 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 8.18 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.10 (d, 1H, J = 8.0 Hz) , 7.81 (s, 1H), 7.51 (d, 2H, 4JHF = 6.4 Hz), 7.21 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 7.02 (d, 2H, 3JHF = 10.4 Hz), 3.63-3.47 (m, 12H), 2.34 (s, 6H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 793.17993; found, 793.17871 (Δ-1.22 mmu).【０１４９】
2018135598.tif 000059
【０１５０】
６ＯＧ−ＤＮＰ（２−（２，７−ジフルオロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−４−（（２−（２−（２−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）安息香酸）の合成
６ＯＧ−ＤＮＰ，ｄｉＡｃ（２８ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／水（２ｍＬ／１ｍＬ）に溶解し、そこに３２０μＬの１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液を加え、反応溶液を遮光下室温で３０分間撹拌した。反応溶液に水を加え、酢酸エチルで洗浄した後に、水層に４００μＬの１Ｍ塩酸を加え、酢酸エチルで抽出を行った。取得した有機層は、硫酸ナトリウムで脱水した後、濾過、濃縮を行った。粗生成物はＨＰＬＣで精製を行い、６ＯＧ−ＤＮＰ（１７ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）を黄色固体として取得した（収率６８％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.88 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.21 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 8.10-8.09 (m, 2H), 7.71 (m, 1H), 7.08 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 6.66-6.63 (m, 4H), 3.70 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.66-3.63 (m, 6H), 3.57 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.51 (t, 2H, J = 5.2 Hz). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 708.15153; found, 708.15223 (Δ0.70 mmu).【０１５１】
2018135598.tif 000060
【０１５２】
［合成実施例１２］
６ＪＦ５４９−ＤＮＰ（２−（３−（アゼチジン−１−イウム−１−イリデン）−６−（アゼチジン−１−イル）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−４−（（２−（２−（２−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
６ＳｉＲ−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６−カルボキシ−ＪＦ５４９（Grimm, J. B. et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat. Methods 12, 244-250 (2015).）を原料にして６ＪＦ５４９−ＤＮＰ（１２ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）を紫色固体として取得した（収率３０％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.82 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.32 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.20-8.16 (m, 2H), 7.78 (s, 1H), 7.10 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 7.00 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.53 (dd, 2H, J = 9.2, 1.6 Hz), 6.40 (d, 2H, J = 1.6 Hz), 4.26 (t, 8H, J = 7.6 Hz), 3.70-3.59 (m, 10H), 3.48 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.55 (quint, 4H, J = 7.6 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 168.0, 167.2, 160.0, 158.6, 157.9, 149.7, 139.5, 137.0, 135.5, 134.8, 132.8, 132.2, 131.2, 131.0, 130.1, 124.6, 116.1, 114.7, 113.5, 95.1, 71.5, 71.2, 70.5, 69.7, 52.8, 44.0, 41.2, 30.7, 16.8. HRMS (ESI+) calcd for [M+H]+, 751.27277; found, 751.27408 (Δ1.31mmu).【０１５３】
2018135598.tif 000061
【０１５４】
［合成実施例１３］
６ＪＦ６４６，ＮＨＳの合成
６−カルボキシ−ＪＦ６４６（Grimm, J. B. et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat. Methods 12, 244-250 (2015).）（７．７ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）、ＤＳＣ（１６ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（１３μＬ、０．０９３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．２ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦに溶解した反応混合物を遮光下室温で３時間撹拌した。
粗生成物はＨＰＬＣで精製を行い、６ＪＦ６４６，ＮＨＳ（５．６ｍｇ、０．００９４ｍｍｏｌ）を青色固体として取得した（収率６１％）。
1H NMR (400 MHz, Acetone-d6): δ 8.35 (dd, 1H, J = 1.2, 8.0 Hz), 8.18 (dd, 1H, J = 0.8, 8.0 Hz), 7.92-7.91 (m, 1H), 6.82-6.80 (m, 4H), 6.36 (dd, 2H, J = 2.8, 8.8 Hz), 3.90 (t, 8H, J = 7.2 Hz), 2.95 (s, 4H), 2.35 (quint, 4H, J = 7.2 Hz), 0.63 (s, 3H), 0.53 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6): δ 170.3, 169.4, 162.0, 156.5, 152.2, 137.0, 132.1 (including two peaks), 131.4, 131.3, 128.9, 128.0, 127.5, 126.6, 116.5, 113.6, 52.7, 26.4, 17.3, 0.1, -0.9. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 594.20549 found, 594.20799 (Δ2.50 mmu).【０１５５】
2018135598.tif 000062
【０１５６】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰ（２−（３−（アゼチジン−１−イウム−１−イリデン）−７−（アゼチジン−１−イル）−５，５−ジメチル−３,５−ジヒドロジベンゾ［ｂ,ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（２−（２−（２−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
６ＪＦ６４６，ＮＨＳ（５．０ｍｇ、０．００８４ｍｍｏｌ）、ＤＮＰ−ａｍｉｎｅ（５．３ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（７．３μＬ、０．０４２ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＤＭＦに溶解した反応混合物を遮光下室温で６時間撹拌した。粗生成物はＨＰＬＣで精製を行い、６ＪＦ６４６−ＤＮＰ（５．５ｍｇ、０．００６９ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率８２％）。
1H NMR (400 MHz, Acetone-d6): δ 8.92 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.59 (br s, 1H), 8.24 (dd, 1H, J = 2.8, 9.6 Hz), 8.10-8.07 (m, 1H), 7.96-7.94 (m, 2H), 7.77 (br s, 1H), 7.15 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 6.77 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 6.73 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.30 (dd, 2H, J = 2.4, 8.8 Hz), 3.87 (t, 8H, J = 7.2 Hz), 3.75 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.62-3.53 (m, 10H), 2.34 (quint, 4H, J = 7.2 Hz), 0.64 (s, 3H), 0.51 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6): δ 169.9, 166.2, 155.8, 152.1, 149.6, 149.4, 141.2, 137.3, 136.6, 133.1, 131.1, 130.7, 129.3, 128.9, 126.3, 124.4, 124.1, 116.4, 116.0, 113.3, 71.1, 70.9, 70.1, 69.3, 52.8, 43.8, 43.7, 40.6, 40.5, 17.4, 0.3, -1.2. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 793.30118; found, 793.30155 (Δ0.37 mmu).【０１５７】
2018135598.tif 000063
【０１５８】
［合成実施例１４］
６ＳｉＲ６００−ＤＮＰ（２−（７−アミノ−３−イミノ−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（２−（２−（２−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
６−カルボキシ−ＳｉＲ６００（１３ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）、ＴＳＴＵ（７．９ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１００μＬ、０．５７ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦに溶解した反応混合物を遮光下室温で１５分間撹拌した。１Ｍ  ＤＮＰ−ａｍｉｎｅのアセトニトリル溶液（８４μＬ）を滴下し、遮光下室温でさらに３０分間撹拌した。粗生成物はＨＰＬＣで精製を行い、中間体を緑色固体として取得した。中間体（１４ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２．４ｍｇ、０．００２１ｍｍｏｌ）および１，３−ジメチルバルビツール酸（１２ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）を５ｍＬの脱酸素ＤＣＭに溶解した反応混合物をアルゴン雰囲気下室温で終夜撹拌した。反応混合物は濃縮した後、ＨＰＬＣで精製を行い、６ＳｉＲ６００−ＤＮＰ（３．７ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（２反応の収率２４％）。
1H NMR (400 MHz, Acetone-d6 + TFA): δ 8.89 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.25 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 8.16 (dd, 1H, J = 8.0, 1.2 Hz), 8.10 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 8.04 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.00 (br s, 1H), 7.58 (dd, 2H, J = 8.8, 2.4 Hz), 7.44 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.25 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 3.80 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.69-6.60 (m, 8H), 3.51 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 0.82 (s, 3H), 0.70 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 713.23858; found, 713.24096 (Δ2.38mmu).【０１５９】
2018135598.tif 000064
【０１６０】
［合成実施例１５］
６ＳｉＲ７００−ＤＮＰ（４−（（２−（２−（２−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）−２−（１，９，１１，１１−テトラメチル−２，３，７，８，９，１１−ヘキサヒドロシリノ［３，２−ｆ：５，６−ｆ’］ジインドール−１−イウム−５−イル）ベンゾエート）の合成
６−カルボキシ−ＳｉＲ７００（Lukinavicius, G. et al. Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells. J. Am. Chem. Soc. 138, 9365-9368 (2016).）（８．３ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）、ＴＳＴＵ（５．６ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（７１μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦに溶解した反応混合物を遮光下室温で１５分間撹拌した。１Ｍ  ＤＮＰ−ａｍｉｎｅのアセトニトリル溶液（５９μＬ）を滴下し、遮光下室温でさらに３０分間撹拌した。粗生成物はＨＰＬＣで精製を行い、６ＳｉＲ７００−ＤＮＰ（８．６ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率７０％）。
1H NMR (400 MHz, Acetone-d6): δ 8.91 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.83 (br s, 1H), 8.28-8.24 (m, 1H), 8.05 (s, 2H), 7.95 (t, 1H, J = 5.2 Hz), 7.68 (s, 1H), 7.18 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 6.97 (br s, 2H), 6.66 (s, 2H), 3.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.64-3.60 (m, 8H), 3.54-3.45 (m, 6H), 2.95 (s, 6H), 2.85-2.77 (m, 4H), 0.65 (s, 3H), 0.51 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6): δ 166.0, 165.9, 159.5, 156.0, 149.5, 149.4, 136.5, 133.9, 131.0, 130.8, 128.3, 124.4, 118.0, 116.2, 116.0, 115.2, 113.5, 71.1, 70.9, 70.1, 69.3, 55.5, 43.8, 43.7, 40.6, 40.5, 34.6, 27.9, -0.4, -1.2. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 793.30118; found, 793.29938 (Δ-1.80 mmu). 【０１６１】
2018135598.tif 000065
【０１６２】
３．抗ＤＮＰ抗体産生ハイブリドーマ培養上清による蛍光団−ＤＮＰの蛍光増加効果の測定
１ｍＭ  ＳＲＢ−ＤＮＰ／ＤＭＳＯ溶液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈して５μＭ  ＳＲＢ−ＤＮＰ／ＰＢＳを調製し、９６ウェルプレート（ＢＤ  ３５３２１９  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ）の各ウェルに１０μｌずつ分注した。ＳＲＢ−ＤＮＰは、Ｓｕｎｂｕｌらの報告したＳＲ−ＤＮ１と同一で合成法も同様である（M. Sunbul, A. Jaschke, Contact-mediated quenching for RNA imaging in bacteria with a fluorophore-binding aptamer. Angewandte Chemie (International ed. in English) 52, 13401-13404 (2013).）。ハイブリドーマクローン培養液もしくは陰性対照としてハイブリドーマ培養培地を９０μｌ加え、Ｍｉｘｍａｔｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて１，０００ｒｐｍで３０秒撹拌した後、マイクロプレートリーダー  ＳＨ−９０００（ＣＯＲＯＮＡ  ＥＬＥＣＴＲＩＣ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で蛍光測定を行った。測定波長条件は、Ｅｘ／Ｅｍ＝５７０ｎｍ／６００ｎｍ。このスクリーニングで大きな蛍光変化率を示した上位２７ウェルのハイブリドーマの培養上清については、さらに４種類の蛍光団−ＤＮＰ（ＳＲＢ−ＤＮＰ、５ＯＧ−ＤＮＰ、Ｒ１１０−ＤＮＰ、ＤＣＦ−ＤＮＰ）に対する蛍光の増強効果を調べた。
ここで複数種類の蛍光団−ＤＮＰに対して大きな蛍光増加効果が見られた４ウェル（１Ｅ１０、１Ｈ４、３Ｂ１２、４Ｃ１２）のハイブリドーマについては限界希釈法によるクローン化を行った。【０１６３】
４．細胞培養とプラスミド導入
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とＨｅＬａ細胞は１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＳＩＧＭＡ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｗａｋｏ）中で二酸化炭素濃度５％、３７℃中で培養した。
ＨｅＬａ細胞への遺伝子導入はリポフェクションを用いた。２４ウェルディッシュで培養中のＨｅＬａ細胞に対して０．５μｇのｐｌａｓｍｉｄを加えたＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（ＧＩＢＣＯ）２５μｌを、２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と２５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉの混合溶液に加えて室温で５分インキュベートした。これを９０〜１００％コンフルエントのＨＥＫ２９３Ｔ細胞とＨｅＬａ細胞の培地５００μｌに加え、二酸化炭素濃度５％、３７℃で培養した。トランスフェクションから５〜８時間後に細胞濃度を１／１０に希釈してガラスディッシュに撒きなおした。トランスフェクションから２４時間経過した後に各種イメージング実験に供した。【０１６４】
５．ライブセルイメージング
細胞の観察はキセノンアークランプを備えた倒立顕微鏡（ＩＸ−７１、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて行われた。撮影はＥＭ−ＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎ  ＥＭ＋，  Ａｎｄｏｒ）を用いて取得した。６ＳｉＲ−ＤＮＰの蛍光画像を取得する際は６０８−６４８ｎｍの励起光フィルター、６６０  ｎｍのダイクロイックミラーと６７２−７１２ｎｍの吸収フィルターから構成されるＣｙ５−４０４０Ｃフィルターセット（Ｓｅｍｒｏｃｋ）を用いた。
ＣＦＰの蛍光画像を取得する際は４２４−４３８ｎｍの励起光フィルター、４５０ｎｍのダイクロイックミラーと４６０−５１０ｎｍの吸収フィルターから構成されるＵ−ＭＣＦＰＨＱフィルターセット（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いた。図３のスクリーニングでは対物レンズ（１０ｘ  ＮＡ  ０．３、２０ｘ  ＮＡ  ０．７５：Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用い、図５、８、９、１０の観察では油浸対物レンズ（１００ｘ  ＮＡ  １．４：Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いた。
細胞の観察は、ＨｅＬａ細胞の培地を吸いＨＢＳ緩衝液（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．４）で洗浄した後、濃度１００ｎＭもしくは１０ｎＭの６ＳｉＲ−ＤＮＰを含むＨＢＳ緩衝液中で行った。６ＳｉＲ−ＤＮＰを加えてから５分後に撮影を開始した。画像解析にはＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いた。【０１６５】
６．ＳＩＭイメージング
Ｈｅｌａ細胞にｐＴＢＢ−ＧＧＧＳ４−５Ｄ４をトランスフェクションし、５〜８時間後にトリプシン処理によって剥がした後に、コラーゲンとポリ−Ｌ−リジンでコートしたカバーガラス上に１／１０の密度となるように再播種し、さらに１８〜２５時間、３７℃、４％、ＣＯ２存在下で培養し、ＳＩＭイメージングに供した。構造化照明画像はＳＩＭシステム（Ｎｉｋｏｎ）を用いて取得した。励起として６４０ｎｍ半導体レーザーを用いて、対物レンズ（１００ｘ  ＳＲ  Ａｐｏ  ＴＩＲＦ、ＮＡ  １．４９：Ｎｉｋｏｎ）、ｓ−ＣＭＯＳカメラ（ＯＲＣＡ  Ｆｌａｓｈ  ４、Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を用いて２秒のフレームレートで蛍光像を取得した。取得した蛍光像はＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）を用いて解析した。【０１６６】
７．実験結果
［実施例１］
抗ＤＮＰ  ｓｃＦｖの取得
マウスを用いて抗ＤＮＰモノクローナル抗体を作製した（実験方法参照）。抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングにおいてはハイブリドーマ培養上清に対してＥＬＩＳＡ法による抗体価の評価を行った（図３Ａ）。その結果、多くの抗ＤＮＰ抗体が産生されたことが確認できた。加えて、蛍光消光の解除の効率が良いｓｖＦｖを取得するためにハイブリドーマ培養上清による蛍光団−ＤＮＰ（ＳＲＢ−ＤＮＰ）の蛍光増加率についても評価を行った（図３Ｂ）。
ここまでのスクリーニングで大きな蛍光変化率を示した上位２７ウェルのハイブリドーマの培養上清の４種類の蛍光団−ＤＮＰに対する蛍光の増強効果を調べ、複数種類の蛍光団−ＤＮＰに対して大きな蛍光増加効果が見られた４ウェル（１Ｅ１０、１Ｈ４、３Ｂ１２、４Ｃ１２）のハイブリドーマのクローン化を行った（図３Ｃ）。ここでは蛍光団−ＤＮＰとしてＳＲＢ−ＤＮＰ、５ＯＧ−ＤＮＰ、Ｒ１１０−ＤＮＰ、ＤＣＦ−ＤＮＰの４種類を用いた。
得られた４クローンの各ハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域のｃＤＮＡ断片を得た。オーバーラップＰＣＲ法によりリンカー配列を介して軽鎖及び重鎖の可変領域のｃＤＮＡ断片を繋ぎ、それぞれ１Ｅ１０、３Ｂ１２のウェルに由来するサブクローン（４Ｅ１０、５Ｄ４）のみからｓｃＦｖコンストラクトを構築できた。４Ｅ１０、５Ｄ４のリコンビナントタンパク質を大腸菌発現系で発現・精製し、蛍光団−ＤＮＰ（ＤＣＦ−ＤＮＰ）に対する蛍光強度変化への効果を調べたところ５Ｄ４のみが蛍光強度の増加（１０倍程度）を示した。シーケンシングにより５Ｄ４をコードするｃＤＮＡ配列の核酸配列を同定し（配列番号８）、その結果から決定したアミノ酸配列をＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を用いて解析し、ＣＤＲ領域を特定した（図４）【０１６７】
［実施例２］
培養細胞での抗ＤＮＰ  ｓｃＦｖの発現テスト
ｓｃＦｖで蛍光団−ＤＮＰの蛍光増加効果が見られた５Ｄ４クローンを蛍光タンパク質ＴａｇＲＦＰとの融合タンパク質としてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に発現させてｓｃＦｖの細胞内での発現の様子や蛍光団−ＤＮＰによる細胞質の蛍光標識の可否を評価した。蛍光団−ＤＮＰとして６ＯＧｄｉＡｃ−ＤＮＰを終濃度１μＭとなるように細胞に負荷して室温で１０分間放置した後にＨＢＳで細胞外の６ＯＧｄｉＡｃ−ＤＮＰを洗浄した。引き続き３７℃で１０分間放置した後に、蛍光顕微鏡で観察したところＴａｇＲＦＰ陽性のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞質にのみ緑色蛍光が確認された（図５）。得られた５Ｄ４クローンが抗ＤＮＰ  ｓｃＦｖとして機能する状態で細胞内に発現可能であることが確認できたため、５Ｄ４クローンを以降の開発工程に供した。【０１６８】
［実施例３］
蛍光団−ＤＮＰの蛍光性変化特性の解析
上記で作製した蛍光団−ＤＮＰのうち、近赤外領域の蛍光を示し、細胞へのアプリケーションにおいて自家蛍光の影響の大幅な軽減が期待できる６ＳｉＲ−ＤＮＰの吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを５Ｄ４有無の条件下で計測した。６ＳｉＲ−ＤＮＰは５Ｄ４存在時に、６５３ｎｍに吸収極大を持ち、６６８ｎｍに蛍光の極大を示した（図６Ａ、Ｂ）。この蛍光特性は細胞での蛍光イメージングで広く用いられているＣｙ５色素と類似している。５Ｄ４存在下では、５Ｄ４非存在下と比べて６ＳｉＲ−ＤＮＰの蛍光強度が９８倍に増加した（図６Ｂ）６ＳｉＲ−ＤＮＰの５Ｄ４との結合している状態での蛍光量子収率を測定したところ、過剰量の５Ｄ４存在下での蛍光量子収率は０．５７であった。この蛍光量子収率の値は大きく、細胞の標識実験においても汎用性の高い蛍光色素であるＣｙ５（量子収率＝０．２〜０．４）、Ｃｙ５．５（量子収率＝０．２４）と同等かそれ以上である（Q. Zheng et al., Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chem Soc Rev 43, 1044-1056 (2014).）。また、その他の蛍光団−ＤＮＰを評価したところ、５Ｄ４の存在下で同様に大きな蛍光強度の増大を示した（図７）。図７では、短波長側から、６ＯＧ−ＤＮＰ、６ＤＣＦ−ＤＮＰ、６ＪＦ５４９−ＤＮＰ、６ＳｉＲ６００−ＤＮＰ、６ＳｉＲ−ＤＮＰ、６ＳｉＲ７００−ＤＮＰについて５Ｄ４有無の条件下での蛍光スペクトルを示している。【０１６９】
［実施例４］
培養細胞内の任意の部位への発現させた５Ｄ４の蛍光標識
５Ｄ４を細胞内の任意の部位に発現させた際に６ＳｉＲ−ＤＮＰで標識され、蛍光顕微鏡で蛍光像が観察できるかどうかを調べた。ＥＣＦＰのみを発現させて６ＳｉＲ−ＤＮＰを細胞に負荷した際（図８Ａ）、及び５Ｄ４を付加したＥＣＦＰを細胞に発現させるが６ＳｉＲ−ＤＮＰを細胞に負荷しない際は６ＳｉＲ−ＤＮＰによる蛍光シグナルは観察されなかった（図８Ｂ）。５Ｄ４をＥＣＦＰとの融合タンパク質としてＨｅｌａ細胞に発現させた際には、ＴａｇＲＦＰとの融合タンパク質として発現させた際（図５）と同様に細胞質全体に渡る６ＳｉＲ−ＤＮＰの蛍光シグナルが観察された（図８Ｃ）。５Ｄ４をＥＣＦＰ及び核、細胞膜、小胞体への局在化ペプチドを付加してそれぞれを融合タンパク質として発現させた後に、細胞へ終濃度０．１μＭの６ＳｉＲ−ＤＮＰを負荷したところ、いずれの細胞においても狙った細胞内部位で蛍光標識された蛍光像が取得できた（図８Ｄ、Ｅ、Ｆ）。
以上の結果は５Ｄ４が細胞内で任意の部位で安定に発現してかつＤＮＰとの結合能を失っておらず、５Ｄ４とＤＮＰが結合したときのみ蛍光団−ＤＮＰが蛍光性となることを示す。以上より、蛍光団−ＤＮＰの洗浄せずに、細胞外液に未反応の６ＳｉＲ−ＤＮＰが存在しても細胞内オルガネラの構造を高いコントラストで蛍光イメージングできることが示された。【０１７０】
［実施例５］
任意のタンパク質との融合タンパク質として発現させた５Ｄ４の標識
細胞内に５Ｄ４との融合タンパク質として発現させたタンパク質を蛍光団−色素によって標識できるかどうかを調べた。
β−チューブリンタンパク質を観察対象として５Ｄ４との融合タンパク質の発現コンストラクトをＨｅｌａ細胞に遺伝子導入した。細胞外液に６ＳｉＲ−ＤＮＰが存在する条件で蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察したところ、チューブリンに特徴的な繊維状の構造が観察された（図９Ａ）。また、細胞内のb−アクチンを観察対象とすることを試みた。β−アクチンと５Ｄ４の融合タンパク質をＨｅＬａ細胞に発現させて細胞を観察したところ、β−アクチンに特徴的な繊維状の構造が観察された（図９Ｂ）。さらに細胞内に内在するＦ−アクチンを可視化するため、Ｆ−アクチンに特異的に結合するペプチド配列（Ｌｉｆｅａｃｔ配列）を５Ｄ４のＮ末端に付加した発現コンストラクトをＨｅｌａ細胞に遺伝子導入した。β−アクチンと５Ｄ４の融合タンパク質を細胞に発現させた際と同様な特徴的な繊維状の構造が観察された（図９Ｃ）。【０１７１】
小胞体上に局在しカルシウムシグナルを制御することが知られているＳＴＩＭ１タンパク質（Y. Baba et al., Coupling of STIM1 to store-operated Ca2+ entry through its constitutive and inducible movement in the endoplasmic reticulum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 16704-16709 (2006)）と５Ｄ４の融合タンパク質をＨｅｌａ細胞に発現させて、６ＳｉＲ−ＤＮＰで染色したところ小胞体と微小管に沿うような構造の蛍光像が観察された（図９Ｄ）。この結果は先行研究で報告されているＳＴＩＭ１の細胞内での分布と一致している。
以上のタンパク質の標識実験の結果は５Ｄ４を細胞内の観察対象分子との融合タンパク質として細胞に発現及び蛍光標識できる分子タグとして用いることが可能であることを示す。【０１７２】
５Ｄ４を介して蛍光標識したタンパク質のタイムラプスイメージングへの適用可能性をＳＴＩＭ１タンパク質の動態観察を通じて検証した。５Ｄ４を付加してＳＴＩＭ１を６ＳｉＲ−ＤＮＰで蛍光標識したＳＴＩＭ１が報告されているＧＦＰ−ＳＴＩＭ１と同様に５Ｄ４が付加したＳＴＩＭ１タンパク質の微小管に沿って移動する様子が観測された（図１０）。以上より、本分子タグを用いることで対象タンパク質のライブセルイメージングを行い細胞内でのタンパク質の動態の可視化解析が可能であることが示された。【０１７３】
［実施例６］
ライブセル超解像イメージング
近年の超解像顕微鏡技術の発展により、細胞内オルガネラの微細構造や機能分子の時空間動態についてナノメートルの解像度で高精細に解析する試みが進んでいる。そこで、超解像イメージングの一つである構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）でのライブセル超解像イメージングへの適用可能性を検証した。Ｈｅｌａ細胞に５Ｄ４とチューブリンの融合タンパク質を発現させ、通常の蛍光顕微鏡とＳＩＭ法による観察結果を比較したところ、通常の蛍光像では空間的に分離が不可能であった構造が、複数の繊維状の構造によって構成されている様子が観察できた（図１１Ａ、Ｂ）。またＳＩＭ法によるタイムラプス撮影を行ったところ、１５０秒程度までチューブリンの構造が安定して観察できた（図１１Ｃ）。また３０秒の時間解像度でチューブリンの微細構造の変化を検出することが出来た（図１１Ｄ）。以上より、本研究で開発した分子タグ技術を用いた細胞内分子の標識によりＳＩＭ法でのチューブリンのナノスケールの微細構造のライブセルイメージングに成功し、タイムラプス撮影に適用可能であり、連続的かつ高精細な細胞内分子の動態解析に利用できることが示された。【０１７４】
本発明においては、細胞内において解析対象とするタグ付き分子のみ蛍光を発せさせることにより、極めて低いバックグラウンド蛍光の下で細胞内分子やオルガネラを蛍光観察することが可能となった。Ｈａｌｏタグ技術やＳＮＡＰタグ技術では常に蛍光ＯＮの状態の色素を用いているため、低いバックグラウンド蛍光で観察するには色素を洗い流す作業が必要である。また、細胞内外への非特異的吸着が直ちに蛍光シグナルとして蛍光観察像に反映されてしまうためバックグラウンド蛍光を軽減する工夫が必要であった。これら既存の分子タグ技術に対して細胞外液に蛍光団−色素を添加するだけで簡便に低バックグラウンドでの蛍光観察ができる点がＤＮＰタグ技術の優位な点である。またライブセルイメージングにおけるタイムラプス撮影や超解像イメージングにも適用可能な点も重要である。さらに近赤外光の蛍光を発する６ＳｉＲ−ＤＮＰによる蛍光イメージングは、ＧＦＰの蛍光と比較して高い組織透過性と低い自家蛍光を示すことにより組織の蛍光イメージングにおいても高い有用性を持つ。【０１７５】
蛍光イメージング、特にレーザー顕微鏡などの細胞局所への強い励起光の照射を必要とする蛍光イメージング実験においては蛍光色素のブリーチングが高精細なイメージングや長期間にわたるイメージングを行う上で大きな障害になる場合がある。高いシグナル−ノイズ比で観察するには強い励起光を当てることや長時間励起光を当てて撮影する必要があるが、強い励起光を長時間当てると色素がブリーチングしてしまい高いシグナル−ノイズ比を維持したまま長時間の蛍光イメージングが出来なくなる。実施例において５Ｄ４を用いた蛍光イメージングでは、ＨａｌｏタグやＳＮＡＰタグと異なり共有結合を介さない標識方式であるので、ブリーチング後に機能しなくなった蛍光団−色素が解離すると考えられる。蛍光団−色素の解離後に周辺に存在している未反応の蛍光団−色素が再度５Ｄ４と結合し、蛍光ＯＮとなる過程が繰り返されることが期待できるため、長期間のタイムラプス撮影にも適していると考えられる。実際、強いレーザー強度の励起光を用いた連続的な画像取得がＳＩＭイメージングにおいて可能であることが示唆されている。【０１７６】
本発明の化合物の１つである６ＳｉＲ−ＤＮＰは５Ｄ４と結合していない状態では十分に消光されている。従って、細胞外に存在していても５Ｄ４に結合していない６ＳｉＲ−ＤＮＰに由来する蛍光は観察対象とする分子やオルガネラの観察における空間分解能への影響が無視できるレベルに抑え込まれている。蛍光観察の際に系内にある不要な蛍光色素を除去するステップが必要ないという点は、創薬等におけるハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）においては特に有用である。ＨＴＳではプローブの洗浄処理などの工程を減らすことによりスクリーニング系全体の効率を上げ、多数の検体を極めて高い効率でアッセイを行うことが求められる。洗浄などの処理を省略して反応と測定を続けて行う方法は“ｍｉｘ  ａｎｄ  ｍｅａｓｕｒｅ”や“ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ”法と呼ばれ、特に数万から数十万の化合物をアッセイする薬剤スクリーニングでは望ましい方法と考えられている。本発明で示された知見からＤＮＰタグと蛍光団−色素を導入したスクリーニング系では余剰蛍光色素の洗浄プロセスを必要としないＨＴＳ系の構築が可能である。【０１７７】
［実施例６］
１分子位置決定法による超解像イメージング
本発明の分子タグ（Ｄｅ−ＱＯＤＥタグ）を分子位置決定法による超解像イメージングに適用するに当たり、Ｄｅ−ＱＯＤＥタグ−プローブの結合解離キネティックスを制御することにより蛍光明滅を実現することを検討した。
図１２に、６ＤＣＦ−ＤＮＰと５Ｄ４との結合解離キネティックの模式図を示すが、この場合、蛍光ＯＦＦとなる解離定数（ｋｏｆｆ）は１．４×１０−２（／ｓ）である。Ｄｅ−ＱＯＤＥタグ−プローブの解離定数（ｋｏｆｆ）を増大させるため、Ｄｅ−ＱＯＤＥタグ及びプローブの両方について分子改変の検討を行った。【０１７８】
（１）抗ＤＮＰ  ｓｃＦｖ変異体タンパク質の発現コンストラクト
ＭＢＰ−ｓｃＦｖタンパク質のコード領域内へのアミノ酸変異導入は目的のアミノ酸変異に対応するように改変したコドンを含むフォワードプライマーとリバースプライマーと耐熱性ポリメラーゼＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてｐＭａｌｃ５Ｅ−５Ｄ４を鋳型とした環状ＰＣＲ法により導入した。得られた直鎖ＰＣＲ産物をＬｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて環状化してＭＢＰ−ｓｃＦｖ変異体の発現コンストラクトを得た。【０１７９】
（２）プローブの合成
ｐＣＮｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（４−（（２−（２−（２−アモノエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−３−ニトロベンゾニトリル）の合成
2018135598.tif 000066
【０１８０】
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、４−ブロモ−３−ニトロベンゾニトリルを原料としてｐＣＮｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（１．２２ｇ、４．１４ｍｍｏｌ）を黄色オイルとして取得した（収率７５％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 9.89 (br s, 1H), 9.83 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 9.02 (dd, 1H, J = 9.2, 2.0 Hz), 8.44 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 5.10 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 5.00-4.88 (m, 6H), 4.76 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 4.06 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100MHz, CD3OD): δ 196.1, 186.2, 180.6, 166.7, 166.0, 164.3, 145.9, 122.0, 118.8, 118.6, 117.0, 91.3, 90.2. HRMS (ESI) calcd for [M+Na]+, 317.12203 ; found, 317.12552 (Δ3.49 mmu).【０１８１】
ｐＢｒｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−４−ブロモ−２−ニトロアニリン）の合成
2018135598.tif 000067
【０１８２】
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、４−ブロモ−１−フルオロ−２−ニトロベンゼンを原料としてｐＢｒｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（１．３６ｇ、３．８９ｍｍｏｌ）を橙色オイルとして取得した（収率７７％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.21 (d, 1H, J = 2.4 Hz ), 7.55 (dd, 1H, J = 9.2, 2.4 Hz), 7.99 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 3.77 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.70-3.68 (m, 2H), 3.66-3.63 (m, 2H), 3.52 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 2.77 (t, 2H, J = 5.26 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 145.7, 139.9, 133.3, 129.4, 117.5, 107.0, 73.6, 71.5, 71.4, 70.0, 43.6, 42.1. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 348.05535; found, 348.05503 (Δ0.32 mmu).【０１８３】
ｐＣｌｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−４−クロロ−２−ニトロアニリン）の合成
2018135598.tif 000068
【０１８４】
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、４−クロロ−１−フルオロ−２−ニトロベンゼンを原料としてｐＣｌｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（１．１７ｇ、３．８５ｍｍｏｌ）を橙色オイルとして取得した（収率６９％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.03 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.99 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 6.59 (dd, 1H, J = 9.2, 2.0 Hz), 3.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.70-3.64 (m, 4H), 3.52 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.47 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.78 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 147.1, 143.6, 131.7, 129.1, 116.6, 114.7, 73.5, 71.5, 71.3, 70.0, 43.7, 42.1. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 304.10586; found, 304.10603 (Δ0.17 mmu).【０１８５】
ｐＭｅＯｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−４−メトキシ−２−ニトロアニリン）の合成
2018135598.tif 000069
【０１８６】
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、１−フルオロ−４−メトキシ−２−ニトロベンゼンを原料としてｐＭｅＯｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（１．０１ｇ、３．３９ｍｍｏｌ）を赤色オイルとして取得した（収率６９％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.45 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 7.12 (dd, 1H, J = 9.2, 2.8 Hz), 6.89 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 3.75-3.73 (m, 5H), 3.67-3.61 (m, 4H), 3.50 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.44 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 150.9, 142.4, 131.9, 128.0, 116.7, 107.7, 73.6, 71.5, 71.3, 70.2, 56.2, 43.7, 42.2. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 300.15540; found, 300.15689 (Δ1.49 mmu).【０１８７】
ｐＣＦ３ｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）アニリン）の合成
2018135598.tif 000070
【０１８８】
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、１−フルオロ−２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼンを原料としてｐＣＦ３ｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（１．５０ｇ、４．４５ｍｍｏｌ）を黄色オイルとして取得した（収率７７％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.36 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 7.67 (dd, 1H, J = 9.2, 2.4 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 3.79 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.71-3.64 (m, 4H), 3.59 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.52 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 148.3, 132.9 (q, J = 3.2 Hz), 132.0, 125.8 (q, J = 4.3 Hz), 125.3 (q, J = 268.3 Hz), 117.8 (q, J = 33.7 Hz), 116.6, 73.6, 71.6, 71.4, 69.9, 43.7, 42.1. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 338.13222; found, 338.13308 (Δ0.86 mmu).【０１８９】
ｐＣＯＯＭｅｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（４−（（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−３−ニトロ安息香酸メチル）の合成
2018135598.tif 000071
【０１９０】
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、４−フルオロ−３−ニトロ安息香酸メチルを原料としてｐＣＯＯＭｅｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（１．６０ｇ、４．９０ｍｍｏｌ）を黄色オイルとして取得した（収率８２％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.63 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.93 (dd, 1H, J = 9.2, 2.0 Hz), 7.01 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 3.86 (s, 1H), 3.79 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.71-3.69 (m, 2H), 3.66-3.64 (m, 2H), 3.56 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.52 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 167.0, 148.9, 136.9, 132.3, 129.9, 117.8, 115.3, 73.6, 71.5, 71.4, 69.8, 52.6, 43.7, 42.2. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 328.15031; found, 328.15102 (Δ0.71 mmu).【０１９１】
ｐＣＦ３ＯｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−２−ニトロ−４−（トリフルオロメトキシ）アニリン）の合成
2018135598.tif 000072
【０１９２】
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、１−フルオロ−２−ニトロ−４−（トリフルオロメトキシ）ベンゼンを原料としてｐＣＦ３ＯｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（１．１７ｇ、３．３１ｍｍｏｌ）を橙色オイルとして取得した（収率７３％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.99 (dd, 1H, J = 2.8, 0.8 Hz), 7.43 (ddd, 1H, J = 9.2, 2.8, 0.8 Hz), 7.11 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 3.79 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.71-3.64 (m, 4H), 3.56-3.52 (m, 4H), 2.79 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 145.7, 135.2 (q, JC-F = 571.9 Hz), 131.1, 122.0 (JC-F = 254.0 Hz), 120.0, 117.0, 73.6, 71.5, 71.3, 70.0, 43.8, 42.2. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 354.12713; found, 354.12835 (Δ1.22 mmu).【０１９３】
ｐＳＯ２ＭｅｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−４−（メチルスルホニル）−２−ニトロアニリン）の合成
2018135598.tif 000073
【０１９４】
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、１−フルオロ−４−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンゼンを原料としてｐＳＯ２ＭｅｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（０．８５５ｇ、２．４６ｍｍｏｌ）を橙色オイルとして取得した（収率５３％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.57 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.87 (dd, 1H, J = 9.2, 2.4 Hz), 7.19 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 3.80 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.71-3.63 (m, 4H), 3.61 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.52 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.13 (s, 3H), 2.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 149.0, 134.6, 131.9, 128.5, 127.7, 116.7, 73.5, 71.5, 71.3, 69.8, 44.6, 43.8, 42.1. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 348.12238 ; found, 348.12210 (Δ-0.28 mmu).【０１９５】
ｐＭｅｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−４−メチル−２−ニトロアニリン）の合成
2018135598.tif 000074
【０１９６】
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、１−フルオロ−４−メチル−２−ニトロベンゼンを原料としてｐＭｅｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（１．１８ｇ、４．１７ｍｍｏｌ）を橙色オイルとして取得した（収率６４％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.84 (d, 1H, J = 0.8 Hz), 7.29-7.26 (m, 1H), 6.87 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 3.75 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.69-3.63 (m, 4H), 3.52 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.46 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 144.9, 138.8, 132.6, 126.6, 126.1, 115.3, 73.6, 71.5, 71.3, 70.1, 43.6, 42.2, 20.0. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 284.16048; found, 284.16183 (Δ1.35 mmu).【０１９７】
ｍＣＦ３ｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−２−ニトロ−５−（トリフルオロメチル）アニリン）の合成
2018135598.tif 000075
【０１９８】
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、２−フルオロ−１−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼンを原料としてｍＣＦ３ｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（１．１２ｇ、３．３３ｍｍｏｌ）を橙色オイルとして取得した（収率６８％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.22 (dd, 1H, J = 8.8, 0.4 Hz), 7.28 (d, 1H, J = 0.4 Hz), 6.85 (dd, 1H, J = 8.8, 2.0 Hz), 3.80 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.72-3.64 (m, 4H), 3.56 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.52 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.78 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 146.3, 137.8 (q, JC-F= 32.2 Hz), 134.6, 128.8, 124.7 (q, JC-F = 271.1 Hz), 112.9 (q, JC-F = 4.1 Hz), 111.9 (q, JC-F = 3.3 Hz), 73.6, 71.6, 71.3, 70.2, 43.7, 42.2. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 338.13222; found, 338.13335 (Δ1.13 mmu).【０１９９】
ｍＣＮｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（３−（（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−４−ニトロベンゾニトリル）の合成
2018135598.tif 000076
【０２００】
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、３−フルオロ−４−ニトロベンゾニトリルを原料としてｍＣＮｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（１．４０ｇ、４．７４ｍｍｏｌ）を橙色オイルとして取得した（収率９７％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.29 (br s, 1H), 8.22 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.57 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 6.98 (dd, 1H, J = 8.8, 1.6 Hz), 3.82 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.68-3.60 (m, 8H), 3.33-3.29 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, (CD3)2CO): δ 145.9, 134.4, 128.4, 120.4, 119.6, 118.2, 117.6, 72.3, 71.2, 71.1, 69.7, 52.0, 43.6. HRMS (ESI+) calcd. for [M+Na]+, 317.12203; found, 317.12050 (Δ1.53 mmu).【０２０１】
ｍＭｅＯｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−５−メトキシ−２−ニトロアニリン）の合成
2018135598.tif 000077
【０２０２】
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、２−フルオロ−４−メトキシ−１−ニトロベンゼンを原料としてｍＭｅＯｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（１．２８ｇ、４．２７ｍｍｏｌ）を黄色オイルとして取得した（収率７３％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.03 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.27 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 6.23 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 3.86 (s, 3H), 3.78 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.70 - 3.63 (m, 4H), 3.52 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.48 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100MHz CD3OD): δ 167.6, 149.2, 129.8, 127.3, 106.2, 96.3, 73.6, 71.5, 71.3, 70.1, 56.3, 43.6, 42.2. HRMS (ESI) calcd for [M+Na]+, 322.13734; found, 322.13714 (Δ0.20 mmu).【０２０３】
ｍＣＯＯＭｅｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（３−（（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−４−ニトロ安息香酸メチル）の合成
2018135598.tif 000078
【０２０４】
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、３−フルオロ−４−ニトロ安息香酸メチルを原料としてｍＣＯＯＭｅｏＮＰ−ａｍｉｎｅ（１．１１ｇ、３．３９ｍｍｏｌ）を橙色オイルとして取得した（収率７０％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.98 (d. 1H, J = 9.2 Hz), 7.37 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.01 (dd, 1H, J = 8.8, 1.6 Hz), 3.88 (s, 3H), 3.76 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.71 (m, 4H), 3.51 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.44 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 166.7, 145.8, 137.3, 134.7, 127.7, 116.7, 115.9, 73.6, 71.5, 71.3, 69.9, 53.2, 43.5, 42.2. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 328.15031; found, 328.15150 (Δ1.19 mmu).【０２０５】
ｏＤＮＰ−ａｍｉｎｅ（Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−２，６−ジニトロアニリン）の合成
2018135598.tif 000079
【０２０６】
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、２−クロロ−１，３−ジニトロベンゼンを原料としてｏＤＮＰ−ａｍｉｎｅ（１．３８ｇ、４．４０ｍｍｏｌ）を褐色オイルとして取得した（収率８６％）。
1H NMR (400 MHz CD3OD): δ 8.23 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 6.85 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 3.68-3.64 (m, 6H), 3.52 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.15 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.80 (t, 2H, J = 5.2 Hz).
HRMS (ESI) calcd for [M+Na]+, 337.11186; found, 337.11280 (Δ 0.94 mmu).【０２０７】
ＤＣＦ３Ｐ−ａｍｉｎｅ（Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−２，４−ビス（トリフルオロメチル）アニリン）の合成
2018135598.tif 000080
【０２０８】
ＤＮＰ−ａｍｉｎｅの合成と同様のスキームで、２−フルオロ−１−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゼンを原料としてＤＣＦ３Ｐ−ａｍｉｎｅ（０．８４７ｇ、２．３５ｍｍｏｌ）を無色オイルとして取得した（収率５５％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.65-7.63 (m, 2H), 6.97 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 3.73 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.68-3.62 (m, 4H), 3.51 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.45 (t, 2H J = 5.2 Hz), 2.78 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 149.7, 131.4-131.3 (m), 129.9-121.8 (m), 125.0 (m), 118.2 (q, JC-F = 33.4 Hz), 113.6 (q, JC-F = 30.2 Hz), 113.2, 73.6, 71.5, 71.4, 70.0, 43.8, 42.2. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 361.13452; found, 361.13546 (Δ0.94 mmu).【０２０９】
ｐＣＮｏＮＰ（Ｎ−（２−（２−（２−（（４−シアノ−２−ニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）アセトアミド）の合成
2018135598.tif 000081
【０２１０】
ＤＮＰの合成と同様のスキームで、ｐＣＮｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料としてｐＣＮｏＮＰ（２２０ｍｇ、０．６５３ｍｍｏｌ）を黄色オイルとして取得した（収率９６％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.71 (br s, 1H), 8.50 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.62 (dd, 1H, J = 9.2, 2.0  Hz), 6.94 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.22 (br s, 1H), 3.83 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.73-3.70 (m, 2H), 3.67-3.65  (m, 2H), 3.59-3.54 (m, 2H), 3.49-3.45 (m, 2H), 1.99 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 170.4, 147.2, 137.8, 132.3, 131.5, 118.0, 115.0, 98.3, 70.7, 70.2, 70.2, 68.3, 42.9, 39.4, 23.3. HRMS (ESI+) calcd. for [M+Na]+, 359.13259; found, 359.13431 (Δ1.49 mmu).【０２１１】
６ＳｉＲ−ＮＨＳ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000082
【０２１２】
ＳｉＲ−カルボキシル（G. Lukinavicius et al., A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins. Nat Chem 5, 132-139 (2013)）（３０ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）、ＴＳＴＵ（２３ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２９０μＬ、１．７ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＤＭＦに溶解した反応混合物を遮光下室温で２時間撹拌した。ＴＦＡ（１３０μＬ、１．７ｍｍｏｌ）を加えた後、粗生成物はＨＰＬＣで精製を行い、６ＳｉＲ−ＮＨＳ（２５ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率６９％）。
1H NMR (400MHz DMSO-d6): δ 8.36 (dd, 1H, J = 8.0, 1.6 Hz), 8.20 (dd, 1H, J = 8.0, 0.4 Hz), 7.943 - 7.938 (m, 1H), 7.20(d, 2H, J = 2.8 Hz), 6.75 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 2.99 (s, 12H), 2.95 (s, 4H), 0.68 (s, 3H), 0.58 (s, 3H). 13C NMR (100MHz DMSO-d6): δ 170.3, 169.4, 162.0, 156.4, 150.4, 141.5, 137.3, 132.1, 132.0, 131.4, 131.3, 129.2, 127.5, 126.6, 118.1, 115.2, 40.5, 26.3, 0.1, -0.9. HRMS (ESI+) calcd for C31H32N3O6Si [M+H]+, 570.20549 ; found, 570.20454 (Δ-0.95 mmu).【０２１３】
［合成実施例１６］
６ＳｉＲ−ｐＣＮｏＮＰ（４−（（２−（２−（２−（（４−シアノ−２−ニトロベンジル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）−２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルアミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−ｙｌ）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000083
【０２１４】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびｐＣＮｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ｐＣＮｏＮＰ（２．４ｍｇ、０．００３２ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率９１％）。
1H NMR (400 MHz (CD3)2CO): δ 8.60 (br s, 1H), 8.43 (d, 1H, J = 2.0Hz), 8.09 (dd, 1H, J = 8.0, 1.2 Hz), 7.98 - 7.96 (m, 2H), 7.77 (d, 1H, J = 0.8 Hz), 7.71 (ddd, 1H, J = 8.8, 2.0, 0.8 Hz), 7.13-7.11 (m, 3H), 6.75 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.65 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.73 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.61-3.60 (m, 6H), 5.54-3.49 (m, 4H), 2.97 (s, 12H), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 749.31135 ; found, 749.31045 (Δ-0.90 mmu)【０２１５】
［合成実施例１７］
６ＳｉＲ−ｏＮＰ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（２−（２−（２−（（２−ニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000084
【０２１６】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ｏＮＰ（２．３ｍｇ、０．００３２ｍｍｏｌ）を緑黄色固体として取得した（収率９１％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.19 (br s, 1H), 8.10-8.05 (m, 2H), 7.98 (br s, 1H), 7.96-7.94 (dd, 1H, J =8.0, 0.4 Hz), 7.76 (d, 1H, J = 0.4 Hz), 7.51-7.49 (m, 1H), 7.09 (d, 2H, J =2.8 Hz), 6.97 (d,  1H, J = 8.0 Hz), 6.74 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.70-6.65 (m, 1H), 6.63 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.72 (t,  2H, J = 5.2 Hz), 3.62-3.60 (m, 6H), 3.55-3.53 (m, 2H), 3.45-3.41 (m, 2H), 2.96 (s, 12H), 0.68 (s, 3H),  0.55 (s, 3H) . HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 724.31610; found, 724.31450 (Δ-1.60mmu).【０２１７】
［合成実施例１８］
６ＳｉＲ−ｏＤＮＰ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルアミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（２−（２−（２−（（２，６−ジニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000085
【０２１８】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびｏＤＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ｏＤＮＰ（２．６ｍｇ、０．００３４ｍｍｏｌ）を黄色固体として取得した（収率９６％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.52 (br s, 1H), 8.22 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 8.07 (dd, 1H, J = 8.0, 1.2 Hz), 7.96-7.94 (m, 2H), 7.75 (d, 1H, J = 0.8 Hz), 7.09 (d, 2H, J= 2.8 Hz), 6.89 (t, 1H, J =8.0 Hz), 6.75 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.64 (dd, 2H, J = 9.2, 2.8 Hz), 3.65 (t, 2H, J = 2.8 Hz), 3.60-3.58 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 2H), 3.09-3.05 (m, 2H), 2.96 (s, 12H), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 769.30118; found, 769.30113 (Δ-0.05 mmu).【０２１９】
［合成実施例１９］
６ＳｉＲ−ｌｉｎｋｅｒ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000086
【０２２０】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよび２−（２−メトキシエトキシ）エタン−１−アミンを原料として６ＳｉＲ−ｌｉｎｋｅｒ（０．８ｍｇ、０．００１４ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率４０％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.11 (dd, 1H, J = 8.0, 1.2 Hz), 8.02 (br s, 1H), 7.99 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.75 (s, 1H), 7.11 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 6.75 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.65 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.59-3.51 (m, 6H), 3.43-3.41 (m, 2H), 3.20 (s, 3H), 2.97 (s, 12H), 0.68 (s, 3H), 0.56 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 574.27317; found, 574.27444 (Δ1.27 mmu).【０２２１】
［合成実施例２０］
６ＳｉＲ−ｍＣＮｏＮＰ（４−（（２−（２−（２−（（５−シアノ−２−ニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）−２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000087
【０２２２】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびｍＣＮｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ｍＣＮｏＮＰ（２．０ｍｇ、０．００２７ｍｍｏｌ）を黄色固体として取得した（収率７６％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.25 (br s, 1H), 8.19 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 8.08 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.96-7.94 (m, 2H), 7.75 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.10 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 6.97 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.76 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.64 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.75 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.61-3.60 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 4H), 2.96 (s, 12H), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 749.31135; found, 749.31022 (Δ-1.13 mmu).【０２２３】
［合成実施例２１］
６ＳｉＲ−ｐＣＦ３ｏＮＰ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（２−（２−（２−（（２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000088
【０２２４】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびｐＣＦ３ｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ｐＣＦ３ｏＮＰ（２．０ｍｇ、０．００２５ｍｍｏｌ）を黄緑色固体として取得した（収率７２％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.50 (br s, 1H), 8.36 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 8.08 (dd, 1H, J = 8.0, 1.6 Hz), 7.98 (br s, 1H), 7.95 (dd, 1H, J = 8.0, 0.4 Hz), 7.76 (s, 1H), 7.73 (dd, 1H, J = 9.2, 2.4 Hz), 7.17 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 6.75 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.64 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.74 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.64-3.60 (m, 6H), 3.59-3.48 (m, 4H), 2.95 (s, 12H), 0.68 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 792.303349; found, 792.30515 (Δ1.66 mmu).【０２２５】
［合成実施例２２］
６ＳｉＲ−ｐＣＯＯＭｅｏＮＰ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（２−（２−（２−（（４−（メトキシカルボニル）−２−ニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000089
【０２２６】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびｐＣＯＯＭｅｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ｐＣＯＯＭｅｏＮＰ（５．０ｍｇ、０．００６４ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率９１％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.69 (d, 1H, J = 2.4 Hz ), 8.56 (br s, 1H), 8.11 (dd, 1H, J = 8.0, 1.2 Hz), 8.01-7.96 (m, 3H), 7.82 (br s, 2H), 7.42 (br s, 2H), 7.07 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.91-6.86 (m, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.75 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.63-3.60 (m, 6H), 3.54-3.52 (m, 4H), 3.01 (s, 12H), 0.72 (s, 3H), 0.58 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 782.32158; found, 782.32129 (Δ-0.29 mmu).【０２２７】
［合成実施例２３］
６ＳｉＲ−ｐＢｒｏＮＰ（４−（（２−（２−（２−（（４−ブロモ−２−ニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルボニル）−２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］ｓｉｌｉｎ−１０−ｙｌ）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000090
【０２２８】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびｐＢｒｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ｐＢｒｏＮＰ（２．４ｍｇ、０．００３０ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率８５％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.22 (br s, 1H), 8.16 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.10 (dd, 1H, J =8.0, 1.2  Hz), 7.98-7.96 (m, 2H), 7.78 (s, 1H), 7.57 (dd, 1H, J =9.2, 2.4 Hz), 7.20 (br s, 2H), 6.98 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.79 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.73-6.71 (m, 2H), 3.71 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.62-3.59 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 2H), 3.45-3.41 (m, 2H), 2.98 (s, 12H), 0.70 (s, 3H), 0.56 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 802.22661; found, 802.22786 (Δ 1.25 mmu).【０２２９】
［合成実施例２４］
６ＳｉＲ−ｐＣＯＯＮＨＭｅｏＮＰ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（２−（２−（２−（（４−（メチルカルバモイル）−２−ニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000091
【０２３０】
６ＳｉＲ−ｐＣＯＯＭｅｏＮＰ（２．４ｍｇ、０．００３１ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＴＨＦに溶解し、０．５ｍＬの水を加えた後、遮光下室温で撹拌した。ＴＬＣで反応の進行を確認しながら、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を１１μＬずつ滴下した。計５５μＬを滴下した後、反応溶液に６０μＬの１Ｍ塩酸を加え、反応を止めた。反応混合物はジクロロメタンにより抽出を行った後、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで脱水、濾過、濃縮の操作を行った。粗生成物はＨＰＬＣで精製を行い、中間体（１．０ｍｇ、０．００１３ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した。中間体、ＴＳＴＵ（０．５ｍｇ、０．００１６ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（５．９μＬ、０．０３４ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＤＭＦに溶解した反応混合物を遮光下室温で１時間撹拌した。さらに、４０％メチルアミン水溶液（０．４μＬ、０．００４９ｍｍｏｌ）を加え、１５分撹拌した。粗生成物はＨＰＬＣで精製を行い、６ＳｉＲ−ｐＣＯＮＨＭｅｏＮＰ（１．０ｍｇ、０．００１３ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（２反応の収率４２％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.63 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 8.41 (br s, 1H), 8.09 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.00-7.99 (m, 2H), 7.95 (d, 1H, J =7.6 Hz), 7.76 (m, 2H), 7.09 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 7.04 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.74 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.63 (dd, 2H, J = 9.2, 2.4 Hz), 3.72 (t, 1H, J = 5.2 Hz), 3.61-3.59 (m, 6H), 3.55-3.47 (m, 4H), 2.95 (s, 12H), 2.87 (d, 3H, J = 4.4 Hz), 0.68 (s, 3H), 0.55 (s, 3H).
HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 781.33757; found, 781.33757 (Δ 0.00 mmu).【０２３１】
［合成実施例２５］
６ＳｉＲ−ｍＣＯＯＭｅｏＮＰ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（２−（２−（２−（（５−（メトキシカルボニル）−２−ニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000092
【０２３２】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびｍＣＯＯＭｅｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ｍＣＯＯＭｅｏＮＰ（３．０ｍｇ、０．００３８ｍｍｏｌ）を黄緑色固体として取得した（収率５５％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.15-8.13 (m, 2H), 8.00 (dd, 1H, J = 8.0, 1.6 Hz), 7.90-7.88 (m, 2H), 7.71-7.70 (m, 1H), 7.50 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.20 (dd, 1H, J = 8.8, 1.6 Hz), 7.09 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 6.78 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.65 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.92 (s, 3H), 3.72 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.62-3.60 (m, 6H), 3.54-3.49 (m, 2H), 3.39-3.35 (m, 2H), 2.95 (s, 12H), 0.69 (s, 3H), 0.54 (s, 3H)
. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 782.32158; found, 782.32292 (Δ1.34 mmu).【０２３３】
［合成実施例２６］
６ＳｉＲ−ｍＣＦ３ｏＮＰ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（２−（２−（２−（（２−ニトロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000093
【０２３４】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびｍＣＦ３ｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ｍＣＦ３ｏＮＰ（２．０ｍｇ、０．００２５ｍｍｏｌ）を黄緑色固体として取得した（収率７２％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.31 (br s, 1H), 8.25 (dd, 1H, J = 8.8, 0.4 Hz), 8.07 (dd, 1H, J =8.0, 1.6 Hz), 7.95-7.93 (m, 2H), 7.75-7.74 (m, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.09 (d, 2H, J = 3.2 Hz), 6.94 (dd, 1H, J = 8.8, 1.6 Hz), 6.75 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.64 (dd, 2H, J = 9.2, 3.2 Hz), 3.75 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.62-3.59 (m, 6H), 3.57-3.52 (m, 4H), 2.95 (s, 12H), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 792.30349; found, 795.30297 (Δ-0.52 mmu).【０２３５】
［合成実施例２７］
６ＳｉＲ−ｐＳＯ２ＭｅｏＮＰ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（２−（２−（２−（（４−（メチルスルホニル）−２−ニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000094
【０２３６】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびｐＳＯ２ＭｅｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ｐＳＯ２ＭｅｏＮＰ（１．７ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）を黄緑色固体として取得した（収率６０％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.63 (br s, 1H), 8.58 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.08 (dd, 1H, J = 8.0, 1.6  Hz), 7.97-7.95 (m, 2H), 7.91 (dd, 1H, J = 9.2, 2.4 Hz), 7.77 (d, 1H, J = 0.4 Hz), 7.21-7.18 (m, 3H), 6.81-6.73 (m, 4H), 3.76 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.63-3.60 (m, 6H), 3.56-3.51 (m, 4H), 3.10 (s, 3H), 2.98 (s, 12H), 0.70 (s, 3H), 0.56 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 824.27560; found, 824.27660 (Δ1.00 mmu).【０２３７】
［合成実施例２８］
６ＳｉＲ−ｐＣｌｏＮＰ（４−（（２−（２−（２−（（４−クロロ−２−ニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）−２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000095
【０２３８】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびｐＣｌｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ｐＣｌｏＮＰ（２．４ｍｇ、０．００３０ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率８５％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.25 (br s, 1H), 8.07-8.05 (m, 2H), 7.95-7.93 (m, 2H), 7.743-7.738 (m, 1H), 7.09 (d, 2H, J = 3.2 Hz), 7.05 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 6.76 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.68-6.62 (m, 3H), 3.72 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.63-3.60 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 2H), 3.44-3.40 (m, 2H), 2.96 (s, 12H), 0.70 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 758.27713; found, 758.28038 (Δ3.25 mmu).【０２３９】
［合成実施例２９］
６ＳｉＲ−ＬＣ−ｏＮＰ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（１−（（２−ニトロフェニル）アミノ）−１０−オキソ−３，６，１３，１６，１９−ペンタオキサ−９−アザヘニコサン−２１−イル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000096
【０２４０】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびＬＣ−ｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ＬＣ−ｏＮＰ（１．７ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率７１％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.22 (br s, 1H), 8.15-8.09 (m, 3H), 8.00-7.97 (dd, 1H, J = 8.0, 0.8 Hz), 7.80-7.79 (m, 1H), 7.53-7.49 (m, 1H), 7.10 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 7.07-7.04 (m, 2H), 6.75 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.71-6.67 (m, 1H), 6.65 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.65-3.43 (m, 22H), 3.31-3.27 (m, 2H), 2.97 (s, 12H), 2.29 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 949.41380; found, 949.41383 (Δ0.00 mmu)【０２４１】
［合成実施例３０］
６ＳｉＲ−ＬＣ−ｐＣＦ３ｏＮＰ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（１−（（２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）−１０−オキソ−３，６，１３，１６，１９−ペンタオキサ−９−アザヘニコサン−２１−イル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000097
【０２４２】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびＬＣ−ｐＣＦ３ｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ＬＣ−ｐＣＦ３ｏＮＰ（１．８ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率７０％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.55 (br s, 1H), 8.39 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 8.15-8.11 (m, 2H), 7.98 (dd, 1H, J = 8.0, 0.8 Hz), 7.80-7.79 (m, 1H), 7.56 (dd, 1H, J = 9.2, 2.4 Hz), 7.28 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 7.11-7.08 (m, 3H), 6.75 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.65 (dd, 2H, J = 9.2, 2.8 Hz), 3.80 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.66-3.42 (m, 22H), 3.31-3.27 (m, 2H), 2.96 (s, 12H), 2.29 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 1017.40119; found, 1017.39989 (Δ-1.30 mmu).【０２４３】
［合成実施例３１］
６ＳｉＲ−ＬＣ−ｐＣＯＯＭｅｏＮＰ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（１−（（４−（メトキシカルボニル）−２−ニトロフェニル）アミノ）−１０−オキソ−３，６，１３，１６，１９−ペンタオキサ−９−アザヘニコサン−２１−イル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000098
【０２４４】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびＬＣ−ｐＣＯＯＭｅｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ＬＣ−ｐＣＯＯＭｅｏＮＰ（１．３ｍｇ、０．００１３ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率５１％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.75 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 8.60 (br s, 1H), 8.15-8.03 (m, 2H), 8.03-8.01 (m, 1H), 7.99-7.97 (dd, 1H, J = 7.6,0.8 Hz), 7.798-7.795 (m, 1H), 7.15 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.07 (br s, 1H), 6.75 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.65 (dd, 2H, J = 9.2, 2.8 Hz), 3.86 (s, 3H), 3.80 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.65-3.42 (m, 22H), 3.32-3.27 (m, 2H), 2.97 (s, 12H), 2.28 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 1007.41928; found, 1007.41634 (Δ-2.94mmu) 【０２４５】
［合成実施例３２］
６ＳｉＲ−ｐＭｅｏＮＰ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（２−（２−（２−（（４−メチル−２−ニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000099
【０２４６】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびｐＭｅｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ｐＭｅｏＮＰ（１．７ｍｇ、０．００２３ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率８９％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.09-8.07 (m, 2H), 7.95-7.93 (m, 2H), 7.87 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 3.34 (dd, 1H, J= 8.8, 1.6 Hz), 7.09 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 6.89 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.74 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.63 (dd, 1H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.72 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.62-3.60 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 2H), 3.42-3.38 (m, 2H), 2.95 (s, 12H), 0.68 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 738.33175; found, 738.33238 (Δ0.63 mmu).【０２４７】
［合成実施例３３］
６ＳｉＲ−ｐＭｅＯｏＮＰ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（２−（２−（２−（（４−メトキシ−２−ニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000100
【０２４８】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびｐＭｅＯｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ｐＭｅＯｏＮＰ（１．３ｍｇ、０．００１７ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率６７％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.09-8.07 (m, 2H), 7.96-7.93 (m, 2H), 7.76 (s, 1H), 7.53 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 7.20 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 7.09 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 7.01-6.96 (m, 1H), 6.74 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.63 (dd, 2H, J = 9.2, 3.2 Hz), 3.79 (s, 3H), 3.70 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.62-3.61 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 2H), 3.43-3.39 (m, 2H), 2.96 (s, 12H), 0.68 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 754.32667; found, 754.32777 (Δ1.10 mmu).【０２４９】
［合成実施例３４］
６ＳｉＲ−ＤＣＦ３Ｐ（４−（（２−（２−（２−（（２，４−ビス（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）−２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000101
【０２５０】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびＤＣＦ３Ｐ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ＤＣＦ３Ｐ（２．１ｍｇ、０．００２６ｍｍｏｌ）を薄緑色固体として取得した（収率７３％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.10 (d, 1H, J = 8.0 Hz). 8.00-7.94 (m, 2H), 7.76 (s, 1H), 7.70-7.68 (m, 2H), 7.10 (d, 2H, 2.8 Hz), 6.99 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.75 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.64 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.68 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.61-3.59 (m, 6H), 3.55-3.52 (m, 2H), 3.42-3.38 (m, 2H), 2.96 (s, 12H), 0.68 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 815.30579; found, 815.30687 (Δ1.08 mmu).【０２５１】
［合成実施例３５］
６ＳｉＲ−ｐＣＦ３ＯｏＮＰ（２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）−４−（（２−（２−（２−（（２−ニトロ−４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000102
【０２５２】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ−ＮＨＳおよびｐＣＦ３ＯｏＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ−ｐＣＦ３ＯｏＮＰ（１．７ｍｇ、０．００２０ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率５８％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.26 (br s, 1H), 8.87 (dd, 1H, J = 8.0, 1.2 Hz), 8.05 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 7.96-7.94 (m, 2H), 7.76 (s, 1H), 7.50 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 7.12-7.09 (m, 3H), 6.75 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.64 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.73 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.63-3.60 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 2H), 3.48-3.44 (m, 2H), 2.96 (s, 12H), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 808.29840; found, 808.29775 (Δ-0.65 mmu).【０２５３】
［合成実施例３６］
６ＳｉＲ７２０−ＮＨＳ（２−（１，２，２，４，８，１０，１０，１１，１３，１３−デカメチル−２，１０，１１，１３−テトラヒドロシリノ［３，２−ｇ：５，６−ｇ’］ジキノリン−１−イウム−６−イル）−４−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000103
【０２５４】
６ＳｉＲ−ＮＨＳの合成と同様のスキームで、６−Ｃａｒｂｏｘｙ−ＳｉＲを原料として６ＳｉＲ７２０−ＮＨＳ（１１ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率６９％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.41 (dd, 1H, J = 8.0, 1.2 Hz), 8.34 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.03 (d, 1H, J = 1.2 Hz ), 7.14 (s, 2H), 6.64 (s, 2H), 5.472-5.470 (m, 2H), 3.14 (s, 6H), 2.95 (s, 4H), 1.63 (s, 3H), 1.62 (s, 3H), 1.42 (s, 6H), 1.40 (s, 6H), 0.66 (s, 3H), 0.58 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 702.29939; found, 702.30020 (Δ0.81 mmu).【０２５５】
［合成実施例３７］
６ＳｉＲ７２０−ＤＮＰ（２−（１，２，２，４，８，１０，１０，１１，１３，１３−デカメチル−２，１０，１１，１３−テトラヒドロシリノ［３，２−ｇ：５，６−ｇ’］ジキノリン−１−イウム−６−イル）−４−（（２−（２−（２−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000104
【０２５６】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ７２０−ＮＨＳおよびＤＮＰ−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ７２０−ＤＮＰ（７．０ｍｇ、０．００７８ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率７８％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.91 (d, 1H, J = 2.8 Hz ), 8.79 (br s, 1H), 8.23 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 8.11 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.01 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.95 (br t, 1H, J = 5.2 Hz), 7.82 (s, 1H),7.14 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 6.88 (s, 2H), 6.55 (s, 2H), 5.34 (s, 2H), 3.76 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.62-3.51 (m, 10H), 2.93 (s, 6H), 1.61 (s, 6H), 1.32 (s, 6H), 1.29 (s, 6H), 0.68 (s, 3H), 0.54 (s, 3H) 13C NMR (100 MHz, (CD3)2CO): δ 169.9, 166.2, 149.5, 145.8, 141.0, 136.6, 132.03, 131.98, 131.1, 130.7, 129.6, 129.0, 127.7, 126.6, 124.44, 124.40, 124.3, 123.3, 116.0, 115.8, 71.2, 70.9, 70.2, 69.3, 57.7, 43.9, 40.7, 31.3, 28.4, 27.8, 18.1, 0.24, -1.1. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 901.39508; found, 901. 39525 (Δ0.17 mmu).【０２５７】
［合成実施例３８］
６ＳｉＲ７２０−ｐＣＦ３ｏＮＰ（２−（１，２，２，４，８，１０，１０，１１，１３，１３−デカメチル−２，１０，１１，１３−テトラヒドロシリノ［３，２−ｇ：５，６−ｇ’］ジキノリン−１−イウム−６−イル）−４−（（２−（２−（２−（（２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート）の合成
2018135598.tif 000105
【０２５８】
６ＪＦ６４６−ＤＮＰの合成と同様のスキームで、６ＳｉＲ７２０−ＮＨＳおよびｐＣＦ３−ａｍｉｎｅを原料として６ＳｉＲ７２０−ｐＣＦ３（７．１ｍｇ、０．００７７ｍｍｏｌ）を緑色固体として取得した（収率７７％）。
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.49 (br s, 1H), 8.36-6.35 (m, 1H), 8.10 (dd, 1H, J = 8.0, 1.6 Hz), 8.01 (dd, 1H, J = 8.0, 0.4 Hz ), 7.97 (br t, 1H, J = 5.6 Hz), 7.81 (dd, 1H, J = 1.2, 0.8 Hz), 7.72 (dd, 1H, J = 9.2, 2.0 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.89 (s, 2H), 6.56 (s, 2H), 5.35-5.34 (m, 2H), 3.74(t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.63-3.59 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 4H), 2.94 (s, 6H), 1.614 (s, 3H), 1.611 (s, 3H), 1.31 (s, 6H), 1.30 (s, 6H), 0.67 (s, 3H), 0.54 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 924.39739; found, 924.39648 (Δ-0.91 mmu).【０２５９】
（３）抗ＤＮＰ  ｓｃＦｖとプローブの解離速度定数の算出
ストップトフロー装置（Ｂｉｏ−ｌｏｇｉｃ）内の流路をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ）に１％ｗ／ｖゼラチンを溶かした前処理液で満たし、室温で３０分間以上放置することでブロッキングを行った後、ＭｉｌｌｉＱ水で流路を十分に洗浄した。装置を用いて、１００ｎＭ以下のＭＢＰ−５Ｄ４もしくはその変異体と１μＭのプローブを溶解したＰＢＳと、競合物質となる１００μＭのＤＮＰを溶解したＰＢＳを１：１で混合し、蛍光変化を測定した。このとき、励起／蛍光波長は、ＤＣＦのプローブは５１０ｎｍ／５２９−５５６ｎｍ、ＳｉＲのプローブは６５０ｎｍ／６７２−７１２ｎｍを用い、計測は２５−２７℃の条件で行った。時間ｔに対して観測した蛍光強度Ｉ（ｔ）を式（１）でフィットすることにより、解離速度定数ｋｏｆｆを算出した（図１３及び表１）。
2018135598.tif 000106
このとき、ｃｎ（ｎ＝１−３）は定数である。【０２６０】
ｓｃＦｖの可変領域に対してアラニンスキャニング変異導入を行い、各変異体と６ＤＣＦ−ＤＮＰの解離速度をＤＮＰとの競合実験から算出したところ、Ｖ９４Ａ変異体は極大の解離速度０．３１ｓ−１を示し、オリジナルと比較して２５倍高速化した。また、アラニン変異により競合実験で蛍光変化が見られないデッドミュータントとなった９６番目と２３４番目のチロシンに着目して、他の芳香族アミノ酸で置換した変異体を評価したところ、Ｙ９６Ｆ変異体は解離速度が１．１ｓ−１と１００倍高速化することが明らかとなった（図１３参照）。
さらに、合成実施例１６〜３５で得た６ＳｉＲ−ＤＮＰの誘導体について５Ｄ４もしくは５Ｄ４（Ｙ９６Ｆ）との解離速度を評価した結果を表１に示す。表１に示されるように、５Ｄ４（Ｙ９６Ｆ）・６ＳｉＲ−ｐＣＮｏＮＰの組合せでは解離速度が１４ｓ−１と最大であった。【０２６１】
【表１】
2018135598.tif 000107
【０２６２】
（４）５Ｄ４（Ｙ９６Ｆ）のＥＲ発現コンストラクトの作製
５Ｄ４（Ｙ９６Ｆ）のＥＲ発現コンストラクトはｐＥＣＦＰ−５Ｄ４を鋳型として２種類のプライマー（Ｙ９６Ｆ＿ＦとＶＬＣＤＲ３）を用いた環状ＰＣＲ法により導入した。
得られた直鎖ＰＣＲ産物をＬｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて環状化してＭＢＰ−５Ｄ４（Ｙ９６Ｆ）の発現コンストラクトｐＥＣＦＰ−５Ｄ４（Ｙ９６Ｆ）を得た。【０２６３】
（５）１分子位置決定法による超解像イメージング
小胞体局在化シグナル配列を付加したＥＣＦＰ−５Ｄ４（Ｙ９６Ｆ）の発現プラスミド（ｐＥＣＦＰ−５Ｄ４（Ｙ９６Ｆ）−ＥＲ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００を用いて９６ウェルプレート上で培養したＨｅＬａ細胞に導入した。プラスミド導入後２０時間後にトリプシン・ＥＤＴＡ処理し細胞をはがした後にコラーゲン／ポリ―Ｌ―リジンでコートしたカバーガラスに再播種した。再播種後２０時間後に細胞をＨＢＳで洗浄し、１０ｎＭの６ＳｉＲ−ＤＮＰを負荷し、超解像イメージングに供した。６４０ｎｍの半導体レーザーを用いて標本を励起し、１分子の蛍光明滅像を背面照射型冷却ＥＭ−ＣＣＤカメラ（アンドールテクノロジー、ｉＸｏｎ）で１６ミリ秒の露光で連続的に取得した。各画像内の１分子蛍光の輝点の重心位置を決定して超解像イメージを再構成した。通常の蛍光顕微鏡のイメージと比較して、超解像イメージでは小胞体の構造が高い空間解像度で可視化された（図１４）。【０２６４】
［実施例６］
Ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング
自家蛍光低減飼料Ｄ１０００１（ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＤＩＥＴＳ  Ｉｎｃ．）で５日飼育した７週齢の雌のヌードマウスＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ（日本ＳＬＣ）に、ＥＧＦＰ−５Ｄ４もしくはＥＧＦＰを安定発現するＳＫＯＶ３細胞をそれぞれ左右の大腿の付け根に２００万細胞ずつ皮下投与した。自家蛍光低減飼料を用いてさらに５日間飼育した後、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング実験に供した。マウスをイソフルランで麻酔した後、１００μＬのＰＢＳに溶解した１０μＭの６ＳｉＲ７００−ｐＣＦ３ｏＮＰを静脈内に投与し、蛍光イメージャーＰｅａｒｌ  Ｔｒｉｌｏｇｙ（ＬＩ−ＣＯＲ，Ｉｎｃ．）を用いて観察を行った。励起／蛍光波長は６８５ｎｍ／７２０ｎｍを用いた。プローブを投与して５分後には、ＥＧＦＰ−５Ｄ４を発現するＳＫＯＶ３細胞が特異的に可視化された（図１５）。この結果は、開発したタグ・プローブ手法により近赤外蛍光を用いた目的の細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ標識が可能であることを明確に示している。【０２６５】
［実施例７］
タグ・プローブの結合解離平衡に基づく長期安定な蛍光イメージング
ＥＣＦＰ−５Ｄ４を発現するＨｅＬａ細胞を１０ｎＭの６ＳｉＲ−ｐＣＯＯＮＨＭｅｏＮＰを含むＨＢＳに室温で１時間浸し、そのままプローブが細胞外液に１０ｎＭ存在する条件で蛍光イメージングを行った。細胞全体に強力な励起光を照射したところ、光褪色の後に蛍光シグナルが回復する現象が見られた（図１６）。この現象は、タグとプローブの結合解離の平衡を基に一定の蛍光強度が観察された結果であり、安定した蛍光観察が可能であることを示している。従来、光褪色が深刻な問題となる超解像イメージング等の蛍光観察において、開発したタグ・プローブ手法は光褪色に制限されずに蛍光シグナルを半永
久的に得ることを可能にする画期的な特性を有している。
【図１】
2018135598.tif 000124
【図２】
2018135598.tif 000125
【図３】
2018135598.tif 000126
【図４】
2018135598.tif 000127
【図５】
2018135598.tif 000128
【図６】
2018135598.tif 000129
【図７】
2018135598.tif 000130
【図８】
2018135598.tif 000131
【図９】
2018135598.tif 000132
【図１０】
2018135598.tif 000133
【図１１】
2018135598.tif 000134
【図１２】
2018135598.tif 000135
【図１３】
2018135598.tif 000136
【図１４】
2018135598.tif 000137
【図１５】
2018135598.tif 000138
【図１６】
2018135598.tif 000139
【配列表】
2018135598000001.app
【国際調査報告】
2018135598.tif 000140
2018135598.tif 000141
2018135598.tif 000142
2018135598.tif 000143