(57)【要約】  本発明は、Ｍ．カンサシイを種特異的に検出するための新たな手段を提供する。  本発明のプライマーセットは、マイコバクテリウム・カンサシイのゲノムＤＮＡにおける、配列番号１、９、１１、１３、１５、２、１０、１２、１４又は１６に示す第１塩基配列或いは第１塩基配列に相補的な第２塩基配列の全体又は一部分を含む標的領域の、５’末端の部分塩基配列である塩基配列Ａと同一又は相同な塩基配列Ａ’を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第１プライマーと、前記標的領域の３’末端の部分塩基配列である塩基配列Ｂの相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列Ｂ’を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第２プライマーとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリウム・カンサシイのゲノムＤＮＡにおける、配列番号１、９、１１、１３、１５、２、１０、１２、１４又は１６に示す第１塩基配列或いは第１塩基配列に相補的な第２塩基配列の全体又は一部分を含む標的領域の、５’末端の部分塩基配列である塩基配列Ａと同一又は相同な塩基配列Ａ’を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第１プライマーと、
前記標的領域の３’末端の部分塩基配列である塩基配列Ｂの相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列Ｂ’を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第２プライマーと
を含む、プライマーセット。
【請求項２】
塩基配列Ａ及び塩基配列Ｂが、それぞれ、配列番号１７、１８、１９、２０又は２１に示す第４塩基配列或いは第４塩基配列に相補的な第５塩基配列に含まれる、連続した８塩基以上の部分塩基配列である、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
第１プライマーが
（２ｆ）配列番号３、５又は７に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列２ｆａに含まれる連続した８塩基以上の塩基配列２ｆｂを３’末端に含む４０塩基以下のポリヌクレオチド
を含み、
第２プライマーが
（２ｒ）配列番号４、６又は８に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列２ｒａに含まれる連続した８塩基以上の塩基配列２ｒｂを３’末端に含む４０塩基以下のポリヌクレオチド
を含む
請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
第１プライマーが
（１ｆ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列１ｆａに含まれる連続した８塩基以上の塩基配列１ｆｂを３’末端に含む４０塩基以下のポリヌクレオチド
を含み、
第２プライマーが
（１ｒ）配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列１ｒａに含まれる連続した８塩基以上の塩基配列１ｒｂを３’末端に含む４０塩基以下のポリヌクレオチド
を含む
請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項５】
第１プライマー及び第２プライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質である標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項６】
配列番号１、９、１１、１３、１５、２、１０、１２、１４又は１６に示す第１塩基配列或いは第１塩基配列に相補的な第２塩基配列の部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むプローブ。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、
（２ｐ）配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列又はその相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列２ｐａに含まれる連続した８塩基以上の塩基配列２ｐｂを含むポリヌクレオチド
である、請求項６に記載のプローブ。
【請求項８】
標識物質と結合可能なタグ又は標識物質である標識部、及び／又は、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、請求項６又は７に記載のプローブ。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドの５’末端に連結されたレポーター蛍光色素、及び、３’末端に連結されたクエンチャー色素を更に含む、請求項６又は７に記載のプローブ。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のプライマーセットを含む、マイコバクテリウム・カンサシイ及び／又はマイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出するためのキット。
【請求項１１】
請求項５に記載のプライマーセットを含み、且つ、
前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体を更に含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
請求項６〜９のいずれか１項に記載のプローブを含む、マイコバクテリウム・カンサシイ及び／又はマイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出するためのキット。
【請求項１３】
試料中のマイコバクテリウム・カンサシイ及び／又はマイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出する方法であって、
試料中の、配列番号１、９、１１、１３、１５、２、１０、１２、１４又は１６に示す第１塩基配列、第１塩基配列に相補的な第２塩基配列、或いは、第１塩基配列又は第２塩基配列における任意のＴがＵに置換された第３塩基配列を含むポリヌクレオチドを検出すること
を含む方法。
【請求項１４】
試料中のポリヌクレオチドを鋳型とし、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、及び、
核酸増幅反応により増幅したポリヌクレオチド断片を検出すること
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
試料中のポリヌクレオチド、又は、試料中のポリヌクレオチドを鋳型とし核酸増幅反応を行い増幅したポリヌクレオチド断片と、請求項６〜９のいずれか１項に記載のプローブとを、ハイブリダイズ可能な条件下でインキュベートすること、及び、
前記ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチド断片と、前記プローブとのハイブリダイゼーションを検出すること
を含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーセットに関する。【０００２】
本発明は、マイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能なプローブに関する。【０００３】
本発明は、マイコバクテリウム・カンサシイ及び／又はマイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出するためのキットに関する。【０００４】
本発明は、マイコバクテリウム・カンサシイ及び／又はマイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
抗酸菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、抗酸性、非運動性のグラム陽性桿菌である。抗酸菌は、結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）と非結核性抗酸菌（Ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ；ＮＴＭ）の２つに大別される。【０００６】
近年、ＮＴＭによる感染症が世界的に増加している。ＮＴＭとは、抗酸菌の中で、結核菌群と特殊栄養要求菌を除いた菌群の総称であり、我が国でも３０種類以上の菌種による感染症（ＮＴＭ症）が報告されている。【０００７】
ＮＴＭ症の原因菌としては、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＡＣ）が最も多く（約７割）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ（マイコバクテリウム・カンサシイ，Ｍ．カンサシイ）がそれに続く（約１〜２割）。【０００８】
Ｍ．カンサシイは、ｈｓｐ６５ＲＰＡ解析から７種のタイプ（サブタイプ）に分類される。Ｉ型は呼吸器疾患患者から多く分離され、ＩＩ型はＨＩＶ患者からも分離される。その他のＩＩＩ〜ＶＩＩ型についても病原性が示唆されている。【０００９】
Ｍ．カンサシイは、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ（マイコバクテリウム・ガストライ，Ｍ．ガストライ）と遺伝的に近縁である（非特許文献１）。両者は１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列が１００％一致する（非特許文献２）。【００１０】
従来、抗酸菌症は、抗酸染色と、培養し次いで生化学的アッセイ（カタラーゼ生成、ウレアーゼ活性、Ｔｗｅｅｎ加水分解、硝酸還元、光発色性など）を行うことにより診断されている。【００１１】
培養法、生化学的アッセイ以外の抗酸菌症原因菌の判別方法として次のような報告がある。【００１２】
非特許文献３では、Ｈｕａｎｇ  ＺＨ．らにより、Ｍ．カンサシイに特異的なＤＮＡプローブを用いた方法が報告されている。【００１３】
非特許文献４では、Ｒｏｇａｌｌ  Ｔ．らにより、１６Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＣＲによる同定法が報告されている。【００１４】
特許文献１は、Ｍ．カンサシイに特有の配列を開示し、該配列を標的としたプローブ又はＰＣＲ増幅によりＭ．カンサシイを検出することを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開平１１−１５５５８９号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｋｉｍ  Ｈ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５，５５，１６４９−１６５６
【非特許文献２】日本臨床微生物学雑誌，ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２，２０１０，１２５−１２９
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９１  Ｏｃｔ；２９（１０）：２１２５−２１２９
【非特許文献４】Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９０  Ｓｅｐ；１３６（９）：１９１５−２０．
【非特許文献５】Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｕｎｃ．２０１６  Ｊｕｎ  ２；４（３）．ｐｉｉ：ｅ００４５６−１６．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｇｅｎｏｍｅＡ．００４５６−１６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上記の通り、Ｍ．カンサシイを検出し同定するために、培養し生化学的アッセイを行う方法が知られているが、この方法は手順が複雑であるという問題がある。特に、光発色能は、Ｍ．カンサシイを同定するための指標として知られているが、光発色能の決定には純粋培養が必要であり、時間が掛かること、この形質は変化し易く、確実性が低いことから、Ｍ．カンサシイの同定指標として必ずしも望ましいものではない。【００１８】
一方、上記の通り、Ｍ．カンサシイが有する核酸の塩基配列に着目して、ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法により、Ｍ．カンサシイを検出する方法として非特許文献３、４、特許文献１等に記載の方法が報告されている。【００１９】
しかし、非特許文献３に開示のＤＮＡプローブは、Ｍ．カンサシイの核酸だけでなくＭ．ガストライの核酸ともクロスハイブリダイズし、遺伝的に遠いＭ．カンサシイのタイプとはハイブリダイズせず検出できないという問題があった。【００２０】
非特許文献４に記載の方法は、１６Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＣＲによる同定法であるが、上記の通り、Ｍ．カンサシイとＭ．ガストライとは１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列が同一であるため、Ｍ．カンサシイを、Ｍ．ガストライと区別して検出することはできない。【００２１】
また、特許文献１の実施例３では、特許文献１に記載のＭ．カンサシイの検出方法では、Ｍ．カンサシイだけでなくＭ．ガストライもクロスハイブリダイズするという実験結果が示されている。【００２２】
そこで本発明は、Ｍ．カンサシイを種特異的に検出するための新たな手段を提供することを目的とする。ここで「Ｍ．カンサシイを種特異的に検出する」とは、典型的には、Ｍ．ガストライ等の近縁種は検出せず、Ｍ．カンサシイについてはタイプに関わらず検出することを指す。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、上記課題を解決する手段として以下の発明を開示する。
（１）マイコバクテリウム・カンサシイのゲノムＤＮＡにおける、配列番号１、９、１１、１３、１５、２、１０、１２、１４又は１６に示す第１塩基配列或いは第１塩基配列に相補的な第２塩基配列の全体又は一部分を含む標的領域の、５’末端の部分塩基配列である塩基配列Ａと同一又は相同な塩基配列Ａ’を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第１プライマーと、
前記標的領域の３’末端の部分塩基配列である塩基配列Ｂの相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列Ｂ’を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第２プライマーと
を含む、プライマーセット。
（２）塩基配列Ａ及び塩基配列Ｂが、それぞれ、配列番号１７、１８、１９、２０又は２１に示す第４塩基配列或いは第４塩基配列に相補的な第５塩基配列に含まれる、連続した８塩基以上の部分塩基配列である、（１）に記載のプライマーセット。
（３）第１プライマーが
（２ｆ）配列番号３、５又は７に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列２ｆａに含まれる連続した８塩基以上の塩基配列２ｆｂを３’末端に含む４０塩基以下のポリヌクレオチド
を含み、
第２プライマーが
（２ｒ）配列番号４、６又は８に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列２ｒａに含まれる連続した８塩基以上の塩基配列２ｒｂを３’末端に含む４０塩基以下のポリヌクレオチド
を含む
（１）又は（２）に記載のプライマーセット。
（４）第１プライマーが
（１ｆ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列１ｆａに含まれる連続した８塩基以上の塩基配列１ｆｂを３’末端に含む４０塩基以下のポリヌクレオチド
を含み、
第２プライマーが
（１ｒ）配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列１ｒａに含まれる連続した８塩基以上の塩基配列１ｒｂを３’末端に含む４０塩基以下のポリヌクレオチド
を含む
（１）又は（２）に記載のプライマーセット。
（５）第１プライマー及び第２プライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質である標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、（１）〜（４）のいずれかに記載のプライマーセット。
（６）配列番号１、９、１１、１３、１５、２、１０、１２、１４又は１６に示す第１塩基配列或いは第１塩基配列に相補的な第２塩基配列の部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むプローブ。
（７）前記ポリヌクレオチドが、
（２ｐ）配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列又はその相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列２ｐａに含まれる連続した８塩基以上の塩基配列２ｐｂを含むポリヌクレオチド
である、（６）に記載のプローブ。
（８）標識物質と結合可能なタグ又は標識物質である標識部、及び／又は、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、（６）又は（７）に記載のプローブ。
（９）前記ポリヌクレオチドの５’末端に連結されたレポーター蛍光色素、及び、３’末端に連結されたクエンチャー色素を更に含む、（６）又は（７）に記載のプローブ。
（１０）（１）〜（５）のいずれかに記載のプライマーセットを含む、マイコバクテリウム・カンサシイ及び／又はマイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出するためのキット。
（１１）（５）に記載のプライマーセットを含み、且つ、
前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体を更に含む、（１０）に記載のキット。
（１２）（６）〜（９）のいずれかに記載のプローブを含む、マイコバクテリウム・カンサシイ及び／又はマイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出するためのキット。
（１３）試料中のマイコバクテリウム・カンサシイ及び／又はマイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出する方法であって、
試料中の、配列番号１、９、１１、１３、１５、２、１０、１２、１４又は１６に示す第１塩基配列、第１塩基配列に相補的な第２塩基配列、或いは、第１塩基配列又は第２塩基配列における任意のＴがＵに置換された第３塩基配列を含むポリヌクレオチドを検出すること
を含む方法。
（１４）試料中のポリヌクレオチドを鋳型とし、（１）〜（５）のいずれかに記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと、及び、
核酸増幅反応により増幅したポリヌクレオチド断片を検出すること
を含む、（１３）に記載の方法。
（１５）試料中のポリヌクレオチド、又は、試料中のポリヌクレオチドを鋳型とし核酸増幅反応を行い増幅したポリヌクレオチド断片と、（６）〜（９）のいずれかに記載のプローブとを、ハイブリダイズ可能な条件下でインキュベートすること、及び、
前記ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチド断片と、前記プローブとのハイブリダイゼーションを検出すること
を含む、（１３）に記載の方法。【００２４】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１７−００７８７１号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明が提供するＭ．カンサシイの検出手段によれば、Ｍ．カンサシイの検出漏れによる偽陰性、及び、Ｍ．ガストライの誤同定による偽陽性の可能性を低減し、Ｍ．カンサシイの同定の精度を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１−１】図１−１は、Ｍ．カンサシイの各タイプ及び他の抗酸菌のゲノムＤＮＡの、特異領域１の近傍での比較結果を示す。
【図１−２】図１−２は図１−１の続きである。
【図２−１】図２−１は、Ｍ．カンサシイの各タイプ及び他の抗酸菌のゲノムＤＮＡの、特異領域２の近傍での比較結果を示す。
【図２−２】図２−２は図２−１の続きである。
【図２−３】図２−３は図２−２の続きである。
【図３】図３は、実施例１で得られたＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動法により解析した結果を示す写真である。
【図４】図４はラテラルフロー型核酸検出デバイス１０の模式図を示す。１：固相担体、２：コンジュゲートパッド（標識物質保持部）、３：サンプルパッド（反応系受容部）、４：吸収パッド、５：基材、６：固相担体１の、タグ捕捉手段を含む部分。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１．マイコバクテリウム・カンサシイのゲノムＤＮＡ＞
２０１６年に公開された非特許文献５に、Ｍ．カンサシイのタイプ（又はサブタイプ）Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖのドラフトゲノム配列が公開された。
【００２８】
非特許文献５で公開されＧｅｎＢａｎｋに登録されたドラフトゲノム配列は以下の通り。
【００２９】
【表１】
2018135560.tif 000002
【００３０】
本発明者らは、この公開情報を用い、Ｍ．カンサシイの各タイプで保存性が高く、他の抗酸菌と相違するゲノムＤＮＡ中の領域を探索した。その結果、ＳｉｇＦ遺伝子の上流と下流に、それぞれ、Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡでの保存性が高く、Ｍ．ガストライのゲノムＤＮＡでは相同性の高い配列が存在しない領域を見出した。以下の説明では、ＳｉｇＦ遺伝子の上流側の前記領域を「特異領域１」、下流側の前記領域を「特異領域２」とする。
【００３１】
Ｍ．カンサシイのタイプＩのゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＬＷＣＬ００００００００）における、特異領域１の塩基配列を配列番号１に示し、特異領域２の塩基配列を配列番号２に示す。配列番号１７に、Ｍ．カンサシイのタイプＩのゲノムＤＮＡのうち、特異領域１及び特異領域２を含む部分の部分塩基配列を示す。配列番号１７の、１５２０位のｇから１８５２位のｇまでが特異領域１に該当し、３５３２位のｔから４００６位のｇまでが特異領域２に該当する。
【００３２】
Ｍ．カンサシイのタイプＩＩのゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＬＷＣＭ００００００００）における、特異領域１の塩基配列を配列番号９に示し、特異領域２の塩基配列を配列番号１０に示す。配列番号１８に、Ｍ．カンサシイのタイプＩＩのゲノムＤＮＡのうち、特異領域１及び特異領域２を含む部分の部分塩基配列を示す。配列番号１８の、１５４１位のｇから１８７８位のｇまでが特異領域１に該当し、３５６５位のｔから４０４０位のｇまでが特異領域２に該当する。
【００３３】
Ｍ．カンサシイのタイプＩＩＩのゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＬＷＣＪ００００００００）における、特異領域１の塩基配列を配列番号１１に示し、特異領域２の塩基配列を配列番号１２に示す。配列番号１９に、Ｍ．カンサシイのタイプＩＩＩのゲノムＤＮＡのうち、特異領域１及び特異領域２を含む部分の部分塩基配列を示す。配列番号１９の、１５４５位のｇから１８８２位のｇまでが特異領域１に該当し、３５７０位のｃから４０３５位のｇまでが特異領域２に該当する。
【００３４】
Ｍ．カンサシイのタイプＩＶのゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＬＷＣＩ００００００００）における、特異領域１の塩基配列を配列番号１３に示し、特異領域２の塩基配列を配列番号１４に示す。配列番号２０に、Ｍ．カンサシイのタイプＩＶのゲノムＤＮＡのうち、特異領域１及び特異領域２を含む部分の部分塩基配列を示す。配列番号２０の、１５５２位のｔから１８９１位のｇまでが特異領域１に該当し、３５７１位のｔから４０４７位のｇまでが特異領域２に該当する。
【００３５】
Ｍ．カンサシイのタイプＶのゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＬＷＣＨ００００００００）における、特異領域１の塩基配列を配列番号１５に示し、特異領域２の塩基配列を配列番号１６に示す。配列番号２１に、Ｍ．カンサシイのタイプＶのゲノムＤＮＡのうち、特異領域１及び特異領域２を含む部分の部分塩基配列を示す。配列番号２１の、１５５１位のｇから１８８９位のｇまでが特異領域１に該当し、３５７８位のｔから４０５３位のｇまでが特異領域２に該当する。
【００３６】
また、Ｍ．カンサシイの各タイプと、Ｍ．ガストライ、マイコバクテリウム（Ｍ．）  ツベルクロシス（結核菌）、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーエのゲノムＤＮＡの、特異領域１の近傍での比較結果を図１（図１−１及び図１−２からなる）に、特異領域２の近傍での比較結果を図２（図２−１、図２−２及び図２−３からなる）にそれぞれ示す。
【００３７】
本発明者らは、ゲノムＤＮＡに由来するポリヌクレオチド中の特異領域１又は特異領域２を指標として用いることで、Ｍ．カンサシイを、Ｍ．ガストライ等の近縁種は検出せず、Ｍ．カンサシイについてはタイプに関わらず検出することが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
＜２．用語＞
本発明において「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。ＲＮＡにおいては、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）と読み替えることができる。ポリヌクレオチドとしては、任意の位置のＴをＵに置換して合成したＵを含むＤＮＡや、任意の位置のＵをＴに置換して合成したＴを含むＲＮＡも使用することができる。ポリヌクレオチドはイノシン（Ｉ）等の修飾ヌクレオチドを一部に含んでいてもよい。
【００３８】
ポリヌクレオチドは一本鎖として存在していてもよいし、二本鎖として存在していてもよい。ポリヌクレオチドが二本鎖として存在する場合は、少なくとも一方の鎖が、以下に規定する所定の特徴を備えるポリヌクレオチドであればよい。
【００３９】
ポリヌクレオチドの製造方法は特に限定されず、ポリヌクレオチド合成装置を利用して製造してもよいし、受託合成サービスを利用して製造してもよい。
【００４０】
本発明において「塩基配列Ｘと相同な塩基配列Ｙ」、或いは、「塩基配列Ｘと塩基配列Ｙとが相同である」、というとき、塩基配列Ｘの相補配列からなるポリヌクレオチドと、塩基配列Ｙからなるポリヌクレオチドとが、核酸増幅反応のアニーリング条件においてハイブリダイズして安定な二本鎖を形成するのに十分な水素結合を形成することができる組み合わせである限り、塩基配列ＸとＹとが部分的に異なっていてもよい。例えば、塩基配列Ｘの相補配列からなるポリヌクレオチドと、塩基配列Ｙからなるポリヌクレオチドとが、１０ヌクレオチド中に１ミスマッチ、２０ヌクレオチド中に１ミスマッチ、または３０ヌクレオチド中に１ミスマッチなど、いくつかのミスマッチが存在していてもよい。典型的には、塩基配列Ｘと「相同な」塩基配列Ｙというとき、塩基配列ＸとＹとが以下の関係のいずれかを満たすことを指す。
【００４１】
（Ａ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘにおいて１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列である。
【００４２】
（Ｂ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘと７０％以上の同一性を有する塩基配列である。
【００４３】
（Ｃ）塩基配列Ｙからなるポリヌクレオチドが、配列番号Ｘと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることができる。
【００４４】
（Ｄ）塩基配列Ｘと塩基配列Ｙの一方における任意の位置のチミン（Ｔ）が、他方におけるウラシル（Ｔ）に置換されている。
【００４５】
前記（Ａ）において「１若しくは数個」とは好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個又は２個を指し、最も好ましくは１個である。
【００４６】
前記（Ｂ）において、同一性の値は、複数の塩基配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡＳＩＳ、及びＢＬＡＳＴ）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。塩基配列の同一性の値は、一致度が最大となるように一対の塩基配列をアライメントした際に一致する塩基の数を算出し、当該一致する塩基の数の、比較した塩基配列の全塩基数に対する割合として算出される。ここで、ギャップがある場合、上記の全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数である。同一性の決定方法の詳細については、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２，１９７７及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，１９９０を参照されたい。
【００４７】
前記（Ｂ）において、同一性はより好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性である。
【００４８】
前記（Ｃ）において、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，４ｔｈ  Ｅｄ  （２０１２），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション工程では、ナトリウム濃度が２５〜５００ｍＭ、好ましくは２５〜３００ｍＭであり、温度が４０〜６８℃、好ましくは４０〜６５℃である。より具体的には、ハイブリダイゼーションは、１〜７×ＳＳＣ、０．０２〜３％  ＳＤＳ、温度４０℃〜６０℃で行うことができる。また、ハイブリダイゼーションの後に洗浄工程を行っても良く、洗浄工程は、例えば０．１〜２×ＳＳＣ、０．１〜０．３％  ＳＤＳ、温度５０〜６５℃で行うことができる。
＜３．プライマーセット＞
本発明は、
Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡにおける、配列番号１、９、１１、１３、１５、２、１０、１２、１４又は１６に示す第１塩基配列或いは第１塩基配列に相補的な第２塩基配列の全体又は一部分を含む標的領域の、５’末端の部分塩基配列である塩基配列Ａと同一又は相同な塩基配列Ａ’を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第１プライマーと、
前記標的領域の３’末端の部分塩基配列である塩基配列Ｂの相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列Ｂ’を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、第２プライマーと
を含む、プライマーセットに関する。
【００４９】
Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡは上記の通りである。
【００５０】
「第１塩基配列」は、ゲノムＤＮＡ上の特異領域１又は特異領域２の塩基配列に相当する。「第２塩基配列」は、特異領域１又は特異領域２の塩基配列の相補塩基配列に相当する。
【００５１】
本発明のプライマーセットは、Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡにおける、第１塩基配列又は第２塩基配列の全体又は一部分を含む領域（「標的領域」という）を、核酸増幅反応において増幅することができるように設計されている。
【００５２】
標的領域は、ゲノムＤＮＡ中の、第１塩基配列又は第２塩基配列の全体又はその一部分のみからなる領域であってもよいし、ゲノムＤＮＡ中の、第１塩基配列又は第２塩基配列の全体又はその一部分とそれに隣接する他の部分とからなる連続した領域であってもよい。前記他の部分は、ゲノムＤＮＡ中の第１塩基配列又は第２塩基配列の上流（５’末端）側に位置してもよいし、下流（３’末端）側に位置してもよいし、上流に位置する部分と下流に位置する部分の両方を含んでもよい。例えば、標的領域の上流側端が第１塩基配列又は第２塩基配列の上流側に隣接する部分に位置し、標的領域の下流側端が第１塩基配列又は第２塩基配列の下流側に隣接する部分に位置するとき、標的領域は、ゲノムＤＮＡの、第１塩基配列又は第２塩基配列の全体と、その上流側に隣接する部分と、その下流側に隣接する部分とを含んだ連続した領域である。
【００５３】
例えば、後述するプライマーセット１により増幅される標的領域は、ゲノムＤＮＡ中の特異領域２の一部分のみからなる連続した領域であり、タイプＩのＭ．カンサシイのゲノムＤＮＡにおいては、配列番号１７の第３７１９位から第３８８５位までの１７６塩基の領域（及び該領域の相補鎖）である。後述するプライマーセット２により増幅される標的領域は、ゲノムＤＮＡ中の特異領域２の一部分のみからなる連続した領域であり、タイプＩのＭ．カンサシイのゲノムＤＮＡにおいては、配列番号１７の第３５９６位から第３６９０位までの９５塩基の領域（及び該領域の相補鎖）である。後述するプライマーセット３により増幅される標的領域は、ゲノムＤＮＡ中の特異領域２の一部分と、該一部分の下流側に隣接する他の部分からなる連続した領域であり、タイプＩのＭ．カンサシイのゲノムＤＮＡにおいては、配列番号１７の第３９００位から第４０１６位までの１１７塩基の領域（及び該領域の相補鎖）である。
【００５４】
標的領域は、特異領域１の全体又は一部分と、特異領域２の全体又は一部分の両方を含む、ゲノムＤＮＡ上の領域であってもよい。
【００５５】
標的領域の長さは特に限定されない。検出精度を高めるためには、標的領域が、第１塩基配列又は第２塩基配列の好ましくは２０塩基以上、より好ましくは３０塩基以上、より好ましくは４０塩基以上、より好ましくは５０塩基以上、より好ましくは６０塩基以上の連続した部分を含むことが好ましい。標的領域の全体の長さとしては、例えば４０塩基以上、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは６０塩基以上、より好ましくは７０塩基以上とすることができ、長さの上限は特に限定されないが、通常は１０００塩基以下又は５００塩基以下である。
【００５６】
本発明のプライマーセットが備える第１プライマーは、Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡにおける標的領域の、５’末端の部分塩基配列である塩基配列Ａと同一又は相同な塩基配列Ａ’を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む。
【００５７】
塩基配列Ａは、標的配列の、「５’末端の部分塩基配列」であり、具体的には、標的配列の５’末端の塩基から下流側に連続した部分の部分塩基配列である。塩基配列Ａの長さは、例えば８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上とすることができ、典型的には４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。
【００５８】
塩基配列Ａは、Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡのなかでも、特に、特異領域１及び２並びにそれらに隣接する領域の部分塩基配列であることが好ましく、配列番号１７、１８、１９、２０又は２１に示す第４塩基配列或いは第４塩基配列に相補的な第５塩基配列に含まれる、連続した８塩基以上の部分塩基配列であることが特に好ましい。前記部分塩基配列は、より好ましくは、配列番号１７、１８、１９、２０又は２１における特異領域１と、特異領域１の上流に隣接する１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは１０塩基以下の領域と、特異領域１の下流に隣接する１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは１０塩基以下の領域とからなる塩基配列又はその相補的な塩基配列に含まれる連続した８塩基以上の部分塩基配列、或いは、配列番号１７、１８、１９、２０又は２１における特異領域２と、特異領域２の上流に隣接する１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは１０塩基以下の領域と、特異領域２の下流に隣接する１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは１０塩基以下の領域とからなる塩基配列又はその相補的な塩基配列に含まれる連続した８塩基以上の部分塩基配列であり、特に好ましくは、配列番号１７、１８、１９、２０又は２１における特異領域１からなる塩基配列又はその相補的な塩基配列に含まれる連続した８塩基以上の部分塩基配列、或いは、配列番号１７、１８、１９、２０又は２１における特異領域２からなる塩基配列又はその相補的な塩基配列に含まれる連続した８塩基以上の部分塩基配列である。
【００５９】
第１プライマー中のポリヌクレオチドは、塩基配列Ａと同一又は相同な塩基配列Ａ’を３’末端に含むように設計することができる。「相同」については既述の通りである。第１プライマー中のポリヌクレオチドは、塩基配列Ａ’を３’末端に含むものであればよく、塩基配列Ａ’の５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。第１プライマー中のポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上とすることができ、典型的には４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。
【００６０】
本発明のプライマーセットが備える第２プライマーは、Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡにおける標的領域の、３’末端の部分塩基配列である塩基配列Ｂの相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列Ｂ’を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む。
【００６１】
塩基配列Ｂは、標的配列の、「３’末端の部分塩基配列」であり、具体的には、標的配列の３’末端の塩基から上流側に連続した部分の部分塩基配列である。塩基配列Ｂの長さは、例えば８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上とすることができ、典型的には４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。
【００６２】
塩基配列Ｂは、Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡのなかでも、特に、特異領域１及び２並びにそれらに隣接する領域の部分塩基配列であることが好ましく、配列番号１７、１８、１９、２０又は２１に示す第４塩基配列或いは第４塩基配列に相補的な第５塩基配列に含まれる、連続した８塩基以上の部分塩基配列であることが特に好ましい。前記部分塩基配列の好適な範囲は塩基配列Ａに関して既述の通りである。
【００６３】
なお、塩基配列Ｂは、その５’末端塩基が、標的領域における、塩基配列Ａの５’末端塩基よりも下流側に位置するように設定すればよく、好ましくは、塩基配列Ｂは、その５’末端塩基が、標的領域における、塩基配列Ａの３’末端塩基よりも下流側に位置するように設定する。
【００６４】
第２プライマー中のポリヌクレオチドは、塩基配列Ｂの相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列Ｂ’を３’末端に含むように設計することができる。「相同」については既述の通りである。第２プライマー中のポリヌクレオチドは、塩基配列Ｂ’を３’末端に含むものであればよく、塩基配列Ｂ’の５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。第２プライマー中のポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上とすることができ、典型的には４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。
【００６５】
第１プライマーと第２プライマーとの組み合わせは特に限定されず、ゲノムＤＮＡの標的領域をポリヌクレオチド断片として増幅することができるように組み合わせることができる。
【００６６】
本発明において、Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡのうち、特異領域２、すなわち、配列番号２、１０、１２、１４又は１６に示す第１塩基配列或いは第１塩基配列に相補的な第２塩基配列の一部分を含む標的領域を、ポリヌクレオチド断片として増幅するためのプライマーセットの好ましい具体例としては、
第１プライマーが、
（２ｆ）配列番号３、５又は７に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列２ｆａに含まれる連続した８塩基以上の塩基配列２ｆｂを３’末端に含む４０塩基以下のポリヌクレオチド
を含むプライマーであり、
第２プライマーが、
（２ｒ）配列番号４、６又は８に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列２ｒａに含まれる連続した８塩基以上の塩基配列２ｒｂを３’末端に含む４０塩基以下のポリヌクレオチド
を含むプライマーである、プライマーセットが例示できる。
【００６７】
配列番号３は、配列番号１７の第３７１０位〜第３７２９位に該当する（図２−１中ＫＡＮ−１ｆで示す）。
【００６８】
配列番号５は、配列番号１７の第３５９６位〜第３６１５位に該当する（図２−１中ＫＡＮ−２ｆで示す）。
【００６９】
配列番号７は、配列番号１７の第３９００位〜第３９１９位に該当する（図２−２中ＫＡＮ−３ｆで示す）。
【００７０】
配列番号４は、配列番号１７の第３８６６位〜第３８８５位の相補塩基配列に該当する（図２−２中ＫＡＮ−１ｒで示す）。
【００７１】
配列番号６は、配列番号１７の第３６７１位〜第３６９０位の相補塩基配列に該当する（図２−１中ＫＡＮ−２ｒで示す）。
【００７２】
配列番号８は、配列番号１７の第３９９７位〜第４０１６位の相補塩基配列に該当する（図２−３中ＫＡＮ−３ｒで示す）。
【００７３】
前記（２ｆ）において、塩基配列２ｆａは、配列番号３、５又は７の塩基配列と同一であるか、相同、即ち、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号３、５又は７の塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列２ｆａが塩基配列Ｙに相当する）。
【００７４】
塩基配列２ｆａが配列番号３、５又は７の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列２ｆａは、配列番号３、５又は７の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列、特に好ましくは配列番号３、５又は７の塩基配列において５’末端のみから１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列２ｆａが配列番号３、５又は７の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合、より好ましくは、塩基配列２ｆａは、配列番号３、５又は７の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは、配列番号１７の塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号３、５又は７の塩基配列と、配列番号３、５又は７の塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【００７５】
塩基配列２ｆａが配列番号３、５又は７の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合の他の好ましい態様は、例えば次の態様である。上記の通り、配列番号３、５及び７の塩基配列は、それぞれ、Ｍ．カンサシイのタイプＩのＤＮＡ中の配列番号１７の塩基配列中の部分塩基配列である。一方、Ｍ．カンサシイの他のタイプのＤＮＡは、配列番号１７に対応する、配列番号１８、１９、２０又は２１に示す塩基配列を含み、その中には、配列番号３、５又は７の塩基配列に対応する部分塩基配列が存在する。そこで、配列番号１８、１９、２０又は２１に示す塩基配列を、配列番号１７に示す塩基配列と、特異領域２の塩基配列の一致度が最大となるようにアライメントしたときの、配列番号１８、１９、２０又は２１に示す塩基配列中の、配列番号３、５及び７の塩基配列のそれぞれに対応する部分塩基配列を、部分塩基配列３’、５’及び７’とする。部分塩基配列３’、５’又は７’が、それぞれ、配列番号３、５又は７に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された変異を含む塩基配列である場合、配列番号３、５又は７に示す塩基配列において、前記変異（欠失、置換、付加及び／又は挿入）の少なくとも１つが導入された塩基配列を、塩基配列２ｆａとすることができ、より好ましくは、部分塩基配列３’、５’又は７’を塩基配列２ｆａとすることができる。
【００７６】
前記（２ｆ）において、塩基配列２ｆａは、特に好ましくは、配列番号３、５又は７の塩基配列と同一である。
【００７７】
前記（２ｆ）において、塩基配列２ｆｂは、塩基配列２ｆａに含まれる連続した８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上の塩基配列であり、塩基配列２ｆａと同一であってもよいし、塩基配列２ｆａの部分塩基配列であってもよい。塩基配列２ｆｂは、好ましくは、塩基配列２ｆａ中の３’末端の塩基を含む連続した塩基配列である。
【００７８】
前記（２ｆ）において、塩基配列２ｆｂは、特に好ましくは、塩基配列２ｆａと同一である。
【００７９】
前記（２ｆ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列２ｆｂを含んでいればよく、塩基配列２ｆｂの５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（２ｆ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下のポリヌクレオチドである。
【００８０】
前記（２ｆ）のポリヌクレオチドは、特に好ましくは、塩基配列２ｆｂからなる。
【００８１】
前記（２ｒ）において、塩基配列２ｒａは、配列番号４、６又は８の塩基配列と同一であるか、相同、即ち、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号４、６又は８の塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列２ｒａが塩基配列Ｙに相当する）。
【００８２】
塩基配列２ｒａが配列番号４、６又は８の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列２ｒａは、配列番号４、６又は８の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列、特に好ましくは配列番号４、６又は８の塩基配列において５’末端のみから１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列２ｒａが配列番号４、６又は８の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合、より好ましくは、塩基配列２ｒａは、配列番号４、６又は８の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは、配列番号１７の塩基配列の相補塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号４、６又は８の塩基配列と、配列番号４、６又は８の塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【００８３】
塩基配列２ｒａが配列番号４、６又は８の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合の他の好ましい態様は、例えば次の態様である。配列番号１８、１９、２０又は２１に示す塩基配列の相補塩基配列を、配列番号１７に示す塩基配列の相補塩基配列と、特異領域２の相補塩基配列の一致度が最大となるようにアライメントしたときの、配列番号１８、１９、２０又は２１に示す塩基配列の相補塩基配列中の、配列番号４、６及び８の塩基配列のそれぞれに対応する部分塩基配列を、部分塩基配列４’、６’及び８’とする。部分塩基配列４’、６’又は８’が、それぞれ、配列番号４、６又は８に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された変異を含む塩基配列である場合、配列番号４、６又は８に示す塩基配列において、前記変異（欠失、置換、付加及び／又は挿入）の少なくとも１つが導入された塩基配列を、塩基配列２ｒａとすることができ、より好ましくは、部分塩基配列４’、６’又は８’を塩基配列２ｒａとすることができる。
【００８４】
前記（２ｒ）において、塩基配列２ｒａは、特に好ましくは、配列番号４、６又は８の塩基配列と同一である。
【００８５】
前記（２ｒ）において、塩基配列２ｒｂは、塩基配列２ｒａに含まれる連続した８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上の塩基配列であり、塩基配列２ｒａと同一であってもよいし、塩基配列２ｒａの部分塩基配列であってもよい。塩基配列２ｒｂは、好ましくは、塩基配列２ｒａ中の３’末端の塩基を含む連続した塩基配列である。
【００８６】
前記（２ｒ）において、塩基配列２ｒｂは、特に好ましくは、塩基配列２ｒａと同一である。
【００８７】
前記（２ｒ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列２ｒｂを含んでいればよく、塩基配列２ｒｂの５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（２ｒ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下のポリヌクレオチドである。
【００８８】
前記（２ｒ）のポリヌクレオチドは、特に好ましくは、塩基配列２ｒｂからなる。
【００８９】
前記（２ｆ）のポリヌクレオチドを含む第１プライマーと、前記（２ｒ）のポリヌクレオチドを含む第２プライマーとの組み合わせは特に限定されず、ゲノムＤＮＡの標的領域をポリヌクレオチド断片として増幅することができるように組み合わせることができ、具体例としては以下の組み合わせが挙げられる。
【００９０】
前記（２ｆ）における「配列番号３、５又は７に示す塩基配列」が「配列番号３に示す塩基配列」である場合、前記（２ｒ）における「配列番号４、６又は８に示す塩基配列」は、「配列番号４又は８に示す塩基配列」であり、好ましくは「配列番号４に示す塩基配列」である。特に、前記（２ｆ）のポリヌクレオチドが配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＫＡＮ−１ｆ）であり、前記（２ｒ）のポリヌクレオチドが配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＫＡＮ−１ｒ）である組み合わせであるプライマーセット１が好ましい。
【００９１】
前記（２ｆ）における「配列番号３、５又は７に示す塩基配列」が「配列番号５に示す塩基配列」である場合、前記（２ｒ）における「配列番号４、６又は８に示す塩基配列」はいずれであってもよく、好ましくは「配列番号６に示す塩基配列」である。特に、前記（２ｆ）のポリヌクレオチドが配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＫＡＮ−２ｆ）であり、前記（２ｒ）のポリヌクレオチドが配列番号６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＫＡＮ−２ｒ）である組み合わせであるプライマーセット２が好ましい。
【００９２】
前記（２ｆ）における「配列番号３、５又は７に示す塩基配列」が「配列番号７に示す塩基配列」である場合、前記（２ｒ）における「配列番号４、６又は８に示す塩基配列」は、「配列番号８に示す塩基配列」である。特に、前記（２ｆ）のポリヌクレオチドが配列番号７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＫＡＮ−３ｆ）であり、前記（２ｒ）のポリヌクレオチドが配列番号８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＫＡＮ−３ｒ）である組み合わせであるプライマーセット３が好ましい。
【００９３】
本発明において、Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡのうち、特異領域１、すなわち、配列番号１、９、１１、１３又は１５に示す第１塩基配列或いは第１塩基配列に相補的な第２塩基配列の一部分を含む標的領域を、ポリヌクレオチド断片として増幅するためのプライマーセットの好ましい具体例としては、
第１プライマーが、
（１ｆ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列１ｆａに含まれる連続した８塩基以上の塩基配列１ｆｂを３’末端に含む４０塩基以下のポリヌクレオチド
を含み、
第２プライマーが、
（１ｒ）配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７に示す塩基配列と同一又は相同な塩基配列１ｒａに含まれる連続した８塩基以上の塩基配列１ｒｂを３’末端に含む４０塩基以下のポリヌクレオチド
を含む、プライマーセットが例示できる。
【００９４】
配列番号２２は、配列番号１７の第１５４４位〜第１５６３位に該当する。
【００９５】
配列番号２４は、配列番号１７の第１５４９位〜第１５６８位に該当する。
【００９６】
配列番号２６は、配列番号１７の第１５４１位〜第１５６１位に該当する。
【００９７】
配列番号２８は、配列番号１７の第１６８２位〜第１７０１位に該当する。
【００９８】
配列番号３０は、配列番号１７の第１５３８位〜第１５５６位に該当する。
【００９９】
配列番号３２は、配列番号１７の第１５３８位〜第１５５７位に該当する。
【０１００】
配列番号３４は、配列番号１７の第１６８３位〜第１７０２位に該当する。
【０１０１】
配列番号３６は、配列番号１７の第１７２４位〜第１７４２位に該当する。
【０１０２】
配列番号２３は、配列番号１７の第１８２６位〜第１８４５位の相補塩基配列に該当する。
【０１０３】
配列番号２５は、配列番号１７の第１８２５位〜第１８４４位の相補塩基配列に該当する。
【０１０４】
配列番号２７は、配列番号１７の第１６８２位〜第１７００位の相補塩基配列に該当する。
【０１０５】
配列番号２９は、配列番号１７の第１８２４位〜第１８４２位の相補塩基配列に該当する。
【０１０６】
配列番号３１は、配列番号１７の第１６８２位〜第１７０１位の相補塩基配列に該当する。
【０１０７】
配列番号３３は、配列番号１７の第１５８９位〜第１６０７位の相補塩基配列に該当する。
【０１０８】
配列番号３５は、配列番号１７の第１８２３位〜第１８４２位の相補塩基配列に該当する。
【０１０９】
配列番号３７は、配列番号１７の第１８２４位〜第１８４４位の相補塩基配列に該当する。
【０１１０】
前記（１ｆ）において、塩基配列１ｆａは、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６の塩基配列と同一であるか、相同、即ち、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６の塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列１ｆａが塩基配列Ｙに相当する）。
【０１１１】
塩基配列１ｆａが配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列１ｆａは、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列、特に好ましくは配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６の塩基配列において５’末端のみから１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列１ｆａが配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合、より好ましくは、塩基配列１ｆａは、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは、配列番号１７の塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６の塩基配列と、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６の塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【０１１２】
塩基配列１ｆａが配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合の他の好ましい態様は、例えば次の態様である。配列番号１８、１９、２０又は２１に示す塩基配列を、配列番号１７に示す塩基配列と、特異領域１の塩基配列の一致度が最大となるようにアライメントしたときの、配列番号１８、１９、２０又は２１に示す塩基配列中の、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６の塩基配列のそれぞれに対応する部分塩基配列を、部分塩基配列２２’、２４’、２６’、２８’、３０’、３２’、３４’及び３６’とする。部分塩基配列２２’、２４’、２６’、２８’、３０’、３２’、３４’又は３６’が、それぞれ、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された変異を含む塩基配列である場合、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６に示す塩基配列において、前記変異（欠失、置換、付加及び／又は挿入）の少なくとも１つが導入された塩基配列を、塩基配列１ｆａとすることができ、より好ましくは、部分塩基配列２２’、２４’、２６’、２８’、３０’、３２’、３４’又は３６’を塩基配列１ｆａとすることができる。
【０１１３】
前記（１ｆ）において、塩基配列１ｆａは、特に好ましくは、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６の塩基配列と同一である。
【０１１４】
前記（１ｆ）において、塩基配列１ｆｂは、塩基配列１ｆａに含まれる連続した８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上の塩基配列であり、塩基配列１ｆａと同一であってもよいし、塩基配列１ｆａの部分塩基配列であってもよい。塩基配列１ｆｂは、好ましくは、塩基配列１ｆａ中の３’末端の塩基を含む連続した塩基配列である。
【０１１５】
前記（１ｆ）において、塩基配列１ｆｂは、特に好ましくは、塩基配列１ｆａと同一である。
【０１１６】
前記（１ｆ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列１ｆｂを含んでいればよく、塩基配列１ｆｂの５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（１ｆ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下のポリヌクレオチドである。
【０１１７】
前記（１ｆ）のポリヌクレオチドは、特に好ましくは、塩基配列１ｆｂからなる。
【０１１８】
前記（１ｒ）において、塩基配列１ｒａは、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７の塩基配列と同一であるか、相同、即ち、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７の塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列１ｒａが塩基配列Ｙに相当する）。
【０１１９】
塩基配列１ｒａが配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列１ｒａは、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列、特に好ましくは配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７の塩基配列において５’末端のみから１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列１ｒａが配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合、より好ましくは、塩基配列１ｒａは、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは、配列番号１７の塩基配列の相補塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７の塩基配列と、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７の塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【０１２０】
塩基配列１ｒａが配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合の他の好ましい態様は、例えば次の態様である。配列番号１８、１９、２０又は２１に示す塩基配列の相補塩基配列を、配列番号１７に示す塩基配列の相補塩基配列と、特異領域１の相補塩基配列の一致度が最大となるようにアライメントしたときの、配列番号１８、１９、２０又は２１に示す塩基配列の相補塩基配列中の、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７の塩基配列のそれぞれに対応する部分塩基配列を、部分塩基配列２３’、２５’、２７’、２９’、３１’、３３’、３５’及び３７’とする。部分塩基配列２３’、２５’、２７’、２９’、３１’、３３’、３５’又は３７’が、それぞれ、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された変異を含む塩基配列である場合、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７に示す塩基配列において、前記変異（欠失、置換、付加及び／又は挿入）の少なくとも１つが導入された塩基配列を、塩基配列１ｒａとすることができ、より好ましくは、部分塩基配列２３’、２５’、２７’、２９’、３１’、３３’、３５’又は３７’を塩基配列１ｒａとすることができる。
【０１２１】
前記（１ｒ）において、塩基配列１ｒａは、特に好ましくは、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７の塩基配列と同一である。
【０１２２】
前記（１ｒ）において、塩基配列１ｒｂは、塩基配列１ｒａに含まれる連続した８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上の塩基配列であり、塩基配列１ｒａと同一であってもよいし、塩基配列１ｒａの部分塩基配列であってもよい。塩基配列１ｒｂは、好ましくは、塩基配列１ｒａ中の３’末端の塩基を含む連続した塩基配列である。
【０１２３】
前記（１ｒ）において、塩基配列１ｒｂは、特に好ましくは、塩基配列１ｒａと同一である。
【０１２４】
前記（１ｒ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列１ｒｂを含んでいればよく、塩基配列１ｒｂの５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（１ｒ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２２塩基以下のポリヌクレオチドである。
【０１２５】
前記（１ｒ）のポリヌクレオチドは、特に好ましくは、塩基配列１ｒｂからなる。
【０１２６】
前記（１ｆ）のポリヌクレオチドを含む第１プライマーと、前記（１ｒ）のポリヌクレオチドを含む第２プライマーとの組み合わせは特に限定されず、ゲノムＤＮＡの標的領域をポリヌクレオチド断片として増幅することができるように組み合わせることができ、具体例としては以下の組み合わせが挙げられる。
【０１２７】
前記（１ｆ）における「配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６に示す塩基配列」が「配列番号２２に示す塩基配列」である場合、前記（１ｒ）における「配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７に示す塩基配列」は、いずれであってもよく、好ましくは「配列番号２３に示す塩基配列」である。特に、前記（１ｆ）のポリヌクレオチドが配列番号２２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＭＫＳ−４０ｆ）であり、前記（１ｒ）のポリヌクレオチドが配列番号２３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＭＫＳ−４０ｒ）である組み合わせであるプライマーセット４が好ましい。
【０１２８】
前記（１ｆ）における「配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６に示す塩基配列」が「配列番号２４に示す塩基配列」である場合、前記（１ｒ）における「配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７に示す塩基配列」は、いずれであってもよく、好ましくは「配列番号２５に示す塩基配列」である。特に、前記（１ｆ）のポリヌクレオチドが配列番号２４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＭＫＳ−４１ｆ）であり、前記（１ｒ）のポリヌクレオチドが配列番号２５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＭＫＳ−４１ｒ）である組み合わせであるプライマーセット５が好ましい。
【０１２９】
前記（１ｆ）における「配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６に示す塩基配列」が「配列番号２６に示す塩基配列」である場合、前記（１ｒ）における「配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７に示す塩基配列」は、いずれであってもよく、好ましくは「配列番号２７に示す塩基配列」である。特に、前記（１ｆ）のポリヌクレオチドが配列番号２６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＭＫＳ−４２ｆ）であり、前記（１ｒ）のポリヌクレオチドが配列番号２７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＭＫＳ−４２ｒ）である組み合わせであるプライマーセット６が好ましい。
【０１３０】
前記（１ｆ）における「配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６に示す塩基配列」が「配列番号２８に示す塩基配列」である場合、前記（１ｒ）における「配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７に示す塩基配列」は、「配列番号２３、２５、２９、３５又は３７に示す塩基配列」であり、好ましくは「配列番号２９に示す塩基配列」である。特に、前記（１ｆ）のポリヌクレオチドが配列番号２８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＭＫＳ−４３ｆ）であり、前記（１ｒ）のポリヌクレオチドが配列番号２９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＭＫＳ−４３ｒ）である組み合わせであるプライマーセット７が好ましい。
【０１３１】
前記（１ｆ）における「配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６に示す塩基配列」が「配列番号３０に示す塩基配列」である場合、前記（１ｒ）における「配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７に示す塩基配列」は、いずれであってもよく、好ましくは「配列番号３１に示す塩基配列」である。特に、前記（１ｆ）のポリヌクレオチドが配列番号３０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＭＫＳ−４４ｆ）であり、前記（１ｒ）のポリヌクレオチドが配列番号３１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＭＫＳ−４４ｒ）である組み合わせであるプライマーセット８が好ましい。
【０１３２】
前記（１ｆ）における「配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６に示す塩基配列」が「配列番号３２に示す塩基配列」である場合、前記（１ｒ）における「配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７に示す塩基配列」は、いずれであってもよく、好ましくは「配列番号３３に示す塩基配列」である。特に、前記（１ｆ）のポリヌクレオチドが配列番号３２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＭＫＳ−４５ｆ）であり、前記（１ｒ）のポリヌクレオチドが配列番号３３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＭＫＳ−４５ｒ）である組み合わせであるプライマーセット９が好ましい。
【０１３３】
前記（１ｆ）における「配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６に示す塩基配列」が「配列番号３４に示す塩基配列」である場合、前記（１ｒ）における「配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７に示す塩基配列」は、「配列番号２３、２５、２９、３５又は３７に示す塩基配列」であり、好ましくは「配列番号３５に示す塩基配列」である。特に、前記（１ｆ）のポリヌクレオチドが配列番号３４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＭＫＳ−４６ｆ）であり、前記（１ｒ）のポリヌクレオチドが配列番号３５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＭＫＳ−４６ｒ）である組み合わせであるプライマーセット１０が好ましい。
【０１３４】
前記（１ｆ）における「配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４又は３６に示す塩基配列」が「配列番号３６に示す塩基配列」である場合、前記（１ｒ）における「配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７に示す塩基配列」は、「配列番号２３、２５、２９、３５又は３７に示す塩基配列」であり、好ましくは「配列番号３７に示す塩基配列」である。特に、前記（１ｆ）のポリヌクレオチドが配列番号３６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＭＫＳ−４７ｆ）であり、前記（１ｒ）のポリヌクレオチドが配列番号３７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＭＫＳ−４７ｒ）である組み合わせであるプライマーセット１１が好ましい。
【０１３５】
【表２】
2018135560.tif 000003
【０１３６】
第１プライマーは、前記ポリヌクレオチドのみからなっていてもよいし、後述する標識部又は結合部を更に含んでもよい。前記ポリヌクレオチドと標識部又は結合部とは、後述する適当なスペーサーを介して化学的に連結することができる。第１プライマーにおいて、標識部及び結合部の一方が前記ポリヌクレオチドに連結される位置は、前記ポリヌクレオチドと標的領域を含むポリヌクレオチド又はその相補鎖とのアニーリング及び核酸増幅反応における伸長を阻害しない位置であれば特に限定されないが、好ましくは、前記ポリヌクレオチドの５’末端である。
【０１３７】
第２プライマーは、前記ポリヌクレオチドのみからなっていてもよいし、後述する標識部又は結合部を更に含んでもよい。前記ポリヌクレオチドと標識部又は結合部とは、後述する適当なスペーサーを介して化学的に連結することができる。第２プライマーにおいて、標識部及び結合部の一方が前記ポリヌクレオチドに連結される位置は、前記ポリヌクレオチドと標的領域を含むポリヌクレオチド又はその相補鎖とのアニーリング及び核酸増幅反応における伸長を阻害しない位置であれば特に限定されないが、好ましくは、前記ポリヌクレオチドの５’末端である。
【０１３８】
第１プライマー及び第２プライマーの少なくとも一方が、標識部を含む場合、これを用いた核酸増幅反応では、標識部を含む増幅産物が得られるため、増幅産物の検出が容易である。
【０１３９】
第１プライマー及び第２プライマーの少なくとも一方が、結合部を含む場合、これを用いた核酸増幅反応では、結合部を含む増幅産物が得られるため、増幅産物を固相担体に固定することが可能であり、増幅産物の検出が容易である。
【０１４０】
より好ましくは、第１プライマー及び第２プライマーの一方が、標識部を更に含み、他方が、結合部を更に含む。この態様のプライマーペアを用いた核酸増幅反応では、標識部と結合部とを含む二本鎖の増幅産物が得られるため、核酸クロマトグラフィーによる検出が容易である。以下に、この態様について説明する。
（本発明のプライマーセットの好適な態様）
（標識部）
標識部は、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質のいずれかであり、好ましくは標識物質と結合可能なタグである。本明細書では、標識物質と結合可能なタグを標識用タグと呼ぶ場合がある。標識部が標識用タグである場合、核酸増幅反応の増幅産物と標識物質とを接触させることにより増幅産物の一端に含まれるタグを標識することができる。標識部が標識物質である場合、核酸増幅反応の増幅産物として標識物質を一端に含む増幅産物を得ることができる。
【０１４１】
標識物質は増幅産物の検出を可能とするものであればよく特に限定はされないが、好ましくは増幅産物の目視検出を可能とするものである。このような標識物質としては、着色粒子、色素、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ等）等が挙げられるが、好ましくは着色粒子である。「着色粒子」とは、金属（例えば、金、銀、銅、白金等）粒子、金属ロッド、着色されたラテックス粒子、色素を包含するシリカナノ粒子等が挙げられるが、これらに限定はされない。標識物質の大きさは増幅産物を後述する固相担体に捕捉するのを妨げるものでなければよい。標識物質は検出の際に発色の良いものであることが好ましく、後述する固相担体や、固相担体を備える核酸検出デバイスの各種多孔質部材の孔径よりも小さなサイズとなるように、適宜選択することができる。例えば、標識物質の大きさはおよそ５００ｎｍ以下、好ましくはおよそ０．１ｎｍ〜２５０ｎｍ、より好ましくはおよそ１ｎｍ〜１００ｎｍの粒径とすることができる。色素として、蛍光色素（フルオロセイン、シアニン等）等も使用可能であるが、その場合は各蛍光色素の励起波長光を照射し、検出することが好ましい。
【０１４２】
標識部として利用可能な標識用タグは、標識物質と結合可能なものであればよく、標識物質の構造に応じて適宜選択すればよく特に限定されないが、例えば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、タンパク質、ペプチド、もしくは他の化合物（例えば、ビオチン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等の低分子化合物）、またはそれらの組合せからなるものを利用することができる。標識用タグの一つの好ましい形態としては、ポリヌクレオチドを含むか、ポリヌクレオチドからなるものである。標識用タグに含まれ得る該ポリヌクレオチドは、本発明のプライマーセットによる核酸増幅反応の実質的な支障とならないものであれば特に限定されないが、塩基数が例えば５〜５０、好ましくは１０〜３５であるポリヌクレオチドであり、より好ましくは、配列番号４１又は４２に示す塩基配列又はその部分塩基配列或いはそれらの相補塩基配列を含む（又はからなる）ポリヌクレオチドを用いることができる。標識用タグのもう一つの好ましい形態としては、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ等の低分子化合物からなるものである。
【０１４３】
標識部が上記の標識用タグである場合、標識物質と標識用タグとの結合は、直接的結合であっても、間接的結合であってもよく、結合手段は利用する標識物質と標識用タグとの組合せに応じて適宜好適なものを選択することができる。例えば、標識用タグがポリヌクレオチドを含む場合、標識物質を当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド（例えば、当該ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列を含むポリヌクレオチド）に結合させ、両者のポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせることによって、標識物質と標識用タグとを間接的に結合することができる。標識物質とポリヌクレオチドとの結合はペプチド、タンパク質、核酸などを介して行ってもよいし、適当な官能基を介して行ってもよい。ハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーションが生じる条件であればよく特に限定はされないが、例えば２０℃〜４０℃にて、１０ｍＭ〜５０ｍＭのリン酸を含む緩衝液（ｐＨ６〜７）中で反応させることにより行うことができる。ハイブリダイゼーション効率を高めるべく、緩衝液にはさらに塩化ナトリウム等の塩を含めることができる。
【０１４４】
また、標識用タグが低分子化合物の場合、それと特異的に結合するタンパク質（例えばビオチンに結合するアビジン、ＦＩＴＣに結合するタンパク質）、抗体（例えば抗ＤＩＧ抗体）、アプタマー等の結合性物質と連結した標識物質により標識することができる。この場合、標識用タグと結合性物質とは、各種中性付近の緩衝液を用いて結合させることができる。
【０１４５】
標識部（標識用タグ又は標識物質）と、第１プライマーに含まれるポリヌクレオチド、又は、第２プライマーに含まれるポリヌクレオチドとは任意の手段により結合することができ、直接的に、又は間接的に結合することができる。ただし、標識部のうち少なくとも前記ポリヌクレオチドと接続する部分がポリヌクレオチドよりなる場合、核酸増幅反応により当該部分が前記ポリヌクレオチドと共に二本鎖化されないように、ＤＮＡポリメラーゼ反応の進行を抑制または停止することが可能なスペーサーを介して、前記ポリヌクレオチドと標識部とが結合される。このような「スペーサー」としては、ＤＮＡポリメラーゼ反応の進行を抑制または停止することができ、標識部の二本鎖化を防ぐものであればよく、例えば、強固なヘアピン構造やシュードノット構造を有する核酸配列、Ｌ型核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）もしくはＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ））、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、下記式Ｉで表されるアゾベンゼン構造を含む二価基、脂肪鎖（アルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖）、５’−５’結合、３’−３’結合のような逆位配列構造を含む二価基等が挙げられるがこれらに限定はされない。
【０１４６】
【化１】
2018135560.tif 000004
【０１４７】
式Ｉで表される二価基を介して２つのポリヌクレオチド分子を接続する場合、該二価基の一方の端のリン酸基は、一方のポリヌクレオチド分子の３’末端又は５’末端のヌクレオチドのリン酸基を指し、他方の端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の３’末端又は５’末端のヌクレオチドのリン酸基とリン酸エステル結合を形成する。
【０１４８】
脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の式（ＩＩ）で表されるスペーサーが挙げられる。
−Ｏ−ＣmＨ2m−Ｏ− 式（ＩＩ）
（式中、一方の端の酸素原子は、一方のポリヌクレオチド分子の３’末端又は５’末端のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、他方の端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の３’末端又は５’末端のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｍは１以上４０以下の整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）
式（ＩＩ）においてｍは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（ＩＩ）中のＨは、置換基により置換されていてもよく、置換基としては、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。置換基としてのアルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１〜８であることが好ましく、より好ましくは１〜４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。
【０１４９】
また、他のスペーサーとしては、以下の式（ＩＩＩ）で表されるスペーサーが挙げられる。
−（ＯＣnＨ2n）Ｌ−Ｏ− 式（ＩＩＩ）
（式中、一方の端の酸素原子は、一方のポリヌクレオチド分子の３’末端又は５’末端のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、他方の端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の３’末端又は５’末端のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、Ｌは、１以上の整数であって、（ｎ＋１）×Ｌは４０以下となる整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）
式（ＩＩＩ）において（ｎ＋１）×Ｌは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（ＩＩＩ）中のＨの置換基は、式（ＩＩ）中の置換基と同様の態様が適用される。
【０１５０】
他の脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の二価基が挙げられる。
【０１５１】
【化２】
2018135560.tif 000005
【０１５２】
これらの二価基を介して２つのポリヌクレオチド分子を接続する場合、各二価基の一方の端のリン酸基は、一方のポリヌクレオチド分子の３’末端又は５’末端のヌクレオチドにリン酸基を指し、他方の端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の５’末端又は３’末端のヌクレオチドのリン酸基とリン酸エステル結合を形成する。
（結合部及び固相担体）
結合部は、後述する固相担体と結合可能なタグである。本明細書では、固相担体と結合可能なタグを固定化用タグと呼ぶ場合がある。
【０１５３】
結合部として利用可能な固定化用タグは、固相担体と結合可能なものであればよく、固相担体の構造に応じて適宜選択すればよく特に限定されないが、例えばポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、タンパク質、ペプチド、もしくは他の化合物（例えば低分子化合物）、またはそれらの組合せからなるものを利用することができる。固定化用タグは、好ましくは、ポリヌクレオチドを含むか、ポリヌクレオチドからなるものである。固定化用タグに含まれ得る該ポリヌクレオチドは、本発明のプライマーセットによる核酸増幅反応の実質的な支障とならないものであれば特に限定されないが、塩基数が例えば５〜５０、好ましくは１０〜３５であるポリヌクレオチドであり、より好ましくは、配列番号４１又は４２に示す塩基配列又はその部分塩基配列或いはそれらの相補塩基配列を含む（又はからなる）ポリヌクレオチドを用いることができる。
【０１５４】
固相担体は特に限定はされないが、樹脂、金属、多糖類、鉱物等からなるものを利用することができ、メンブレン、フィルム、不織布、プレート、ゲル等の形状とすることができる。好ましくは固相担体は、溶液中の増幅産物や標識物質が展開できるように多孔質構造を有するものである。本発明において利用可能な固相担体としては、例えば、ろ紙、ニトロセルロースメンブレン、ポリエーテルスルフォンメンブレン、ナイロンメンブレン、乾燥させた各種ゲル（シリカゲル、アガロースゲル、デキストランゲル、ゼラチンゲル）、シリコン、ガラス、プラスチック等が挙げられる。固相担体の大きさ及び形態は、各種操作や検出に適切なものを適宜選択することができる。
【０１５５】
固相担体は、少なくとも一部の部分が固定化用タグと結合可能なように構成されていればよく、より好ましくは一部の部分のみが固定化用タグと結合可能なように構成されている。固相担体の特定の部分のみを固定化用タグと結合可能なように構成することによって、固相担体に捕捉された増幅産物は前記部分のみに限局して検出されるため、陽性又は陰性の判別を容易にすることができる。
【０１５６】
固相担体と固定化用タグとの結合は、直接的結合であっても、間接的結合であってもよく、結合手段は利用する固相担体と固定化用タグとの組合せに応じて適宜好適なものを選択することができる。例えば、固定化用タグがポリヌクレオチドを含む場合、固相担体に当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド（例えば、当該ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列を含むポリヌクレオチド）を固定化してタグ捕捉手段とし、両者のポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせることによって、固相担体と固定化用タグとを間接的に結合することができる。固相担体へのポリヌクレオチドの固定化はペプチド、タンパク質、核酸などを介して行ってもよいし、適当な官能基を介して行ってもよい。ハイブリダイゼーションの条件は、標識用タグと標識物質との結合に関して上記した条件により行うことができる。ポリヌクレオチドを固相担体に固定化する場合、特定の部分に限局して固定化することによって、捕捉された増幅産物は所定の部分のみに限局して検出されるため、陽性又は陰性の判別を容易にすることができる。
【０１５７】
結合部（固定化用タグ）と、第１プライマーに含まれるポリヌクレオチド、又は、第２プライマーに含まれるポリヌクレオチドとは任意の手段により結合することができ、直接的に、又は間接的に結合することができる。ただし、固定化用タグのうち少なくとも前記ポリヌクレオチドと接続する部分が核酸よりなる場合、核酸増幅反応により当該部分が前記ポリヌクレオチドと共に二本鎖化されないように、ＤＮＡポリメラーゼ反応の進行を抑制または停止することが可能なスペーサーを介して、前記ポリヌクレオチドと固定化用タグとが結合される。結合部とポリヌクレオチドとの間に設けるスペーサーの具体例は、標識部とポリヌクレオチドとの間に設けるスペーサーに関して上述したものと同様である。
＜４．プローブ＞
本発明はまた、配列番号１、９、１１、１３、１５、２、１０、１２、１４又は１６に示す第１塩基配列或いは第１塩基配列に相補的な第２塩基配列の部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むプローブに関する。
【０１５８】
本発明のプローブは、第１塩基配列又は第２塩基配列或いは第１塩基配列又は第２塩基配列における任意のＴがＵに置換された第３塩基配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることができる。このため、本発明のプローブは、核酸ハイブリダイゼーション法（例えばサザンハイブリダイゼーション）や、リアルタイムＰＣＲ法（例えばＴａｑＭａｎＴＭ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ法）等に用いることができる。
【０１５９】
本発明のプローブにおけるポリヌクレオチドは、第１塩基配列又は第２塩基配列の部分塩基配列（以下「部分塩基配列Ｐ」とする）と同一又は相同な塩基配列を含む。
【０１６０】
前記の部分塩基配列Ｐは、第１塩基配列又は第２塩基配列中の連続した部分の塩基配列であり、特異性を維持するために必要な塩基数を有するものであればよく、その塩基数は特に限定されないが、第１塩基配列又は第２塩基配列中の連続した好ましくは８塩基以上、１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上の部分塩基配列である。部分塩基配列Ｐの塩基数の上限は特に限定されないが、例えば第１塩基配列又は第２塩基配列中の連続した４００塩基以下、３００塩基以下又は２００塩基以下の部分塩基配列であることができる。本発明のプローブにおけるポリヌクレオチドは、部分塩基配列Ｐと同一又は相同な塩基配列（以下「塩基配列Ｑ」とする）のみからなる必要はなく、塩基配列Ｑの５’末端側及び３’末端側の一方又は両方に他の塩基配列が付加されていてもよい。塩基配列Ｑは、部分塩基配列Ｐと同一であることが特に好ましい。
【０１６１】
本発明のプローブにおけるポリヌクレオチドの全体の塩基数は特に限定されないが、８塩基以上、１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上とすることができ、好ましくは４００塩基以下、３００塩基以下又は２００塩基以下とすることができる。本発明のプローブをリアルタイムＰＣＲ法に用いる場合は、ポリヌクレオチドは５０塩基以下が好ましく、４０塩基以下又は３５塩基以下がより好ましい。
【０１６２】
本発明のプローブにおける、特異領域２の塩基配列、具体的には、配列番号２、１０、１２、１４又は１６に示す第１塩基配列又は第２塩基配列或いは第１塩基配列又は第２塩基配列における任意のＴがＵに置換された第３塩基配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの具体例としては、
（２ｐ）配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列又はその相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列２ｐａに含まれる連続した８塩基以上の塩基配列２ｐｂを含むポリヌクレオチド
が例示できる。
【０１６３】
配列番号３８は、配列番号２の第１１３位〜第１３９位、配列番号１７の第３６４４位〜第３６７０位に該当する。
【０１６４】
配列番号３９は、配列番号２の第２６２位〜第２９２位、配列番号１７の第３７９３位〜第３８２３位に該当する。
【０１６５】
配列番号４０は、配列番号２の第４３５位〜第４６４位、配列番号１７の第３９６６位〜第３９９５位に該当する。
【０１６６】
前記（２ｐ）において、塩基配列２ｐａは、配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列又はその相補塩基配列と同一であるか、相同、即ち、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列又はその相補塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列２ｐａが塩基配列Ｙに相当する）。
【０１６７】
塩基配列２ｐａが配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列又はその相補塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列２ｐａは、配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列又はその相補塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列２ｐａが配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列又はその相補塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合、より好ましくは、塩基配列２ｐａは、配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列又はその相補塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは、配列番号１７の塩基配列又はその相補塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列又はその相補塩基配列と、配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列又はその相補塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【０１６８】
塩基配列２ｐａが配列番号３８、３９又は４０の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合の他の好ましい態様は、例えば次の態様である。配列番号１８、１９、２０又は２１に示す塩基配列を、配列番号１７に示す塩基配列と、特異領域２の塩基配列の一致度が最大となるようにアライメントしたときの、配列番号１８、１９、２０又は２１に示す塩基配列中の、配列番号３８、３９及び４０の塩基配列のそれぞれに対応する部分塩基配列を、部分塩基配列３８’、３９’及び４０’とする。部分塩基配列３８’、３９’又は４０’が、それぞれ、配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された変異を含む塩基配列である場合、配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列において、前記変異（欠失、置換、付加及び／又は挿入）の少なくとも１つが導入された塩基配列又はその相補塩基配列を、塩基配列２ｐａとすることができ、より好ましくは、部分塩基配列３８’、３９’又は４０’或いはその相補塩基配列を塩基配列２ｐａとすることができる。
【０１６９】
前記（２ｐ）において、塩基配列２ｐａは、特に好ましくは、配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列又はその相補塩基配列と同一である。
【０１７０】
前記（２ｐ）において、塩基配列２ｐｂは、塩基配列２ｐａに含まれる連続した８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２５塩基以上の塩基配列であり、塩基配列２ｐａと同一であってもよいし、塩基配列２ｐａの部分塩基配列であってもよい。塩基配列２ｐｂは、好ましくは、塩基配列２ｐａ中の３’末端の塩基を含む連続した塩基配列である。
【０１７１】
前記（２ｐ）において、塩基配列２ｐｂは、特に好ましくは、塩基配列２ｐａと同一である。
【０１７２】
前記（２ｐ）のポリヌクレオチドは塩基配列２ｐｂを含んでいればよく、塩基配列２ｐｂの３’末端側及び／又は５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（２ｐ）のポリヌクレオチドの全体の塩基数は特に限定されないが、１００塩基以下又は５０塩基以下が好ましく、４０塩基以下又は３５塩基以下がより好ましい。
【０１７３】
前記（２ｐ）のポリヌクレオチドは、特に好ましくは、塩基配列２ｐｂからなる。
【０１７４】
前記（２ｐ）のポリヌクレオチドの具体例としては、配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列又はその相補塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１７５】
本発明のプローブは、前記のポリヌクレオチドに、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質である標識部が更に付加されたものであってもよい。このような標識部の具体例はプライマーに関して既述の通りである。標識部を含む本発明のプローブと、第１塩基配列、第２塩基配列又は第３塩基配列を含むポリヌクレオチドとがハイブリダイズして生成する複合体は、標識部を指標に検出することが容易である。
【０１７６】
本発明のプローブはまた、前記のポリヌクレオチドに、固相担体と結合可能なタグである結合部が更に付加されたものであってもよい。このような結合部の具体例はプライマーに関して既述の通りである。結合部を含む本発明のプローブと、第１塩基配列、第２塩基配列又は第３塩基配列を含むポリヌクレオチドとがハイブリダイズして生成する複合体は、結合部を介して固相担体に固定することが可能であり、複合体の検出及び単離が容易である。
【０１７７】
結合部を含む本発明のプローブは、結合部を介して予め固相担体に固定した状態で提供してもよい。固相担体に固定した本発明のプローブは、第１塩基配列、第２塩基配列又は第３塩基配列を含むポリヌクレオチドを捕捉することができる。
【０１７８】
本発明のプローブを、リアルタイムＰＣＲ法に用いる場合、増幅産物のリアルタイム検出において通常用いられている標識物質で標識化することが好ましい。例えば、ポリヌクレオチドの５’末端にレポーター蛍光物質が連結され、３’末端にクエンチャー色素を連結される。レポーター蛍光物質としては、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）等が例示できる。クエンチャー色素として、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）等の蛍光物質、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ色素（ＢＨＱ），４−（（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）ａｚｏ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＡＢＣＹＬ）等の非蛍光物質等が例示できる。
【０１７９】
リアルタイムＰＣＲ法に用いるための本発明のプローブの具体例としては、５’末端にレポーター蛍光物質が連結され、３’末端にクエンチャー色素を連結された、前記（２ｐ）のポリヌクレオチドを含むプローブが例示できる。前記（２ｐ）において「配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列」が「配列番号３８に示す塩基配列」であるポリヌクレオチドを含むリアルタイムＰＣＲ法用プローブは、プライマーセット２によるＰＣＲにおいて増幅産物をリアルタイム検出するために好適である。前記（２ｐ）において「配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列」が「配列番号３９に示す塩基配列」であるポリヌクレオチドを含むリアルタイムＰＣＲ法用プローブは、プライマーセット１によるＰＣＲにおいて増幅産物をリアルタイム検出するために好適である。前記（２ｐ）において「配列番号３８、３９又は４０に示す塩基配列」が「配列番号４０に示す塩基配列」であるポリヌクレオチドを含むリアルタイムＰＣＲ法用プローブは、プライマーセット３によるＰＣＲにおいて増幅産物をリアルタイム検出するために好適である。
＜５．検出方法＞
本発明はまた、
試料中のＭ．カンサシイ及び／又はＭ．カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出する方法であって、
試料中の、配列番号１、９、１１、１３、１５、２、１０、１２、１４又は１６に示す第１塩基配列、第１塩基配列に相補的な第２塩基配列、或いは、第１塩基配列又は第２塩基配列における任意のＴがＵに置換された第３塩基配列を含むポリヌクレオチドを検出すること
を含む方法に関する。
【０１８０】
上記の通り、第１塩基配列、第２塩基配列又は第３塩基配列は、Ｍ．カンサシイに由来するポリヌクレオチドに特異的に含まれる配列であり、この配列を指標として、Ｍ．カンサシイ及び／又はＭ．カンサシイに由来するポリヌクレオチドを種特異的に検出することが可能となる。
【０１８１】
ここで、第１塩基配列、第２塩基配列又は第３塩基配列を含むポリヌクレオチドを検出するとは、試料中のポリヌクレオチドが、第１塩基配列、第２塩基配列又は第３塩基配列の全体を含んでいることまでを検出する必要はなく、第１塩基配列、第２塩基配列又は第３塩基配列に特徴的な部分を含んでいることを検出すれば十分である。
【０１８２】
本発明において対象となる試料としては、Ｍ．カンサシイ及び／又はＭ．カンサシイに由来するポリヌクレオチドを含んでいる可能性のある試料であればよく、例えば、動物植物等の生体の一部（器官、組織、細胞等）、糞便、体液（血液、唾液、尿、喀痰、リンパ液等）、飲食品、微生物培養物、ＰＣＲの生成物等を含む試料が挙げられる。
【０１８３】
検出しようとするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドであってもよいし、天然に存在するポリヌクレオチドから人為的に調製されたポリヌクレオチドであってもよい。このようなポリヌクレオチドとしては、例えばゲノムＤＮＡ、該ゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ、これらのポリヌクレオチドを増幅して得た増幅産物等が挙げられ、ゲノムＤＮＡ又はその増幅産物が特に好ましい。ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等の各用語はその断片も包含する。検出しようとするポリヌクレオチドは二本鎖の形態で試料中に存在するものであってもよい。
【０１８４】
試料中の、第１塩基配列、第２塩基配列、又は、第３塩基配列を含むポリヌクレオチドを検出する手段としては、具体的には、本発明のプライマーセットを用いる方法と、本発明のプローブを用いる方法が挙げられる。以下に各態様について説明する。
＜５．１．本発明のプライマーセットを用いる検出方法＞
本発明の検出方法の一態様は、
試料中のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行う工程１、及び、
核酸増幅反応により増幅したポリヌクレオチド断片を検出する工程２
を含む。
【０１８５】
工程１で鋳型として用いるポリヌクレオチドは、典型的にはＤＮＡである。該ポリヌクレオチドは、試料から抽出され精製された形態であってもよいし、試料から抽出され粗精製された形態であってもよい。あるいは、細胞や組織の一部等の比較的高濃度でポリヌクレオチドを含む試料であれば、試料自体をそのまま核酸増幅反応に含めることもできる。
【０１８６】
工程１における核酸増幅反応は、一般的なＰＣＲ法に従って行うことができる。すなわち、第１塩基配列、第２塩基配列、又は、第３塩基配列を含むポリヌクレオチドが存在すると仮定し、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合に、所定の標的領域の断片が増幅されるＰＣＲ条件にて行うことができる。
【０１８７】
ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼであればよく、特に限定はされない。本発明においては、市販のＤＮＡポリメラーゼを利用することが可能であり、例えばＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）等を好適に利用することができる。また、温度、時間、緩衝液の組成等は、用いるＤＮＡポリメラーゼや、各プライマーの濃度等に応じて、適宜選択することができる。
【０１８８】
ホットスタートＰＣＲ法は、プライマーダイマーの形成を抑制する効果が期待できることから有用である。ホットスタートＰＣＲ法は、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ）等の市販のホットスタートＰＣＲ用試薬を用いて行うことができる。また、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ＨＳ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ，ＵＮＧ  ｐｌｕｓ（登録商標）を使用することもでき、このキットを用いることで核酸増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションを抑制する効果も期待できる。
【０１８９】
ＰＣＲ法でのサイクル数は２５サイクル以上が好ましく、３０サイクル以上がより好ましい。サイクル数の上限は特に限定されないが通常は６０サイクル以下、好ましくは５０サイクル以下である。
【０１９０】
ＰＣＲ法での反応系中の開始時のプライマー濃度は特に限定されず、鋳型となるポリヌクレオチド等に応じて適宜調整することができる。反応系中の反応開始時の好ましいプライマー濃度としては、第１プライマー及び第２プライマーが各々０．０５μＭ以上、１．０μＭ以下という濃度が挙げられる。０．０５μＭ未満の場合、検出感度が低下して基準となる検出感度の低下が生じる可能性がある。また、プライマー濃度の上限は特に限定されないが、好ましくは１.０μＭである。
【０１９１】
工程１では、試料中に第１塩基配列、第２塩基配列、又は、第３塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれている場合、増幅産物として所定の標的領域を含むポリヌクレオチド断片が生じる。
【０１９２】
工程２では、工程１での核酸増幅反応により増幅したポリヌクレオチド断片を検出する。工程２における検出は特に限定されず、例えば、工程１終了後に、核酸増幅反応の反応液をゲル電気泳動により分画し、所定の標的領域を含むポリヌクレオチド断片に相当するサイズのバンドの有無を確認する方法や、核酸増幅反応の反応液又はその生成物に、所定の標的領域を含むポリヌクレオチド断片に特異的な標識化されたポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、複合体を検出する方法が例示できる。
【０１９３】
また、工程１の核酸増幅反応を、ポリヌクレオチドの５’末端にレポーター蛍光物質が連結され、３’末端にクエンチャー色素を連結された本発明のプローブの存在下で行い、所定の標的領域を含むポリヌクレオチド断片が増幅した場合に生じる蛍光を指標として、ポリヌクレオチド断片を検出することも工程２の一態様である。
【０１９４】
また、本発明のプライマーセットが、第１プライマー及び第２プライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質である標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む場合、以下の固相担体を用いた検出工程を工程２として行うことができる。
＜５．１．１．固相担体を用いた検出工程＞
この検出工程では、前記の工程１における核酸増幅反応の生成物を、結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体に接触させ、標識部を指標として固相担体の前記部分での増幅産物を検出する。
【０１９５】
標識部が上述の標識用タグである場合には、標識物質を標識用タグに結合させる標識工程を更に行えばよい。標識工程の詳細は後述する。標識部が上述の標識物質である場合には標識工程は不要である。検出工程において「標識部を指標として」とは、標識部が標識用タグである場合には標識工程を経て結合した標識物質を指標として増幅産物を検出することを指し、標識部が標識物質である場合には該標識物質を指標として増幅産物を検出することを指す。
【０１９６】
核酸増幅反応の生成物とは、増幅産物を含んでいる可能性のある核酸増幅反応の反応液や、該反応液から増幅産物を更に高濃度化した試料等を指す。
【０１９７】
固相担体の詳細は既述の通りである。
【０１９８】
固相担体の結合部と結合可能な部分への、前記生成物の接触は、固相担体と結合部との組合せに応じて、前記生成物中に増幅産物が含まれていた場合に前記部分に増幅産物の結合部が結合するように適宜調節された条件（例えば、ハイブリダイゼーションの条件、もしくはｐＨ５〜９程度の緩衝液条件）で行えばよい。
【０１９９】
増幅産物の検出は、固相担体に捕捉された増幅産物に結合した前記標識物質を検出、好ましくは目視検出することにより行うことができる。増幅産物が存在する場合には、固相担体に捕捉・結合された増幅産物の標識物質が検出される。当該検出の有無を指標にして、核酸増幅反応の反応系中の増幅産物（標的領域を含むポリヌクレオチド断片）の有無を判別することができるとともに、試料中でのＭ．カンサシイ及び／又はＭ．カンサシイに由来するポリヌクレオチドの有無を判別することができる。
＜５．１．２．標識工程＞
標識工程は、本発明のプライマーセットに含まれる前記標識部が上述の標識用タグである場合に行う工程であり、核酸増幅反応の生成物と標識物質とを接触させ、標識用タグに標識物質に結合させることにより行う。標識工程は、核酸増幅反応の生成物を固相担体に接触させる前に行ってもよいし、接触させた後に行ってもよいし、接触させると同時に行ってもよい。
【０２００】
標識物質と前記生成物との接触は、標識物質と標識用タグとの組合せに応じて、前記生成物中に増幅産物が含まれていた場合に標識物質と増幅産物の標識用タグとが結合するように適宜調節された条件（例えば既述のハイブリダイゼーションの条件、もしくはｐＨ５〜９程度の緩衝液条件）で行えばよい。
＜５．１．３．検出デバイス＞
上述の検出工程及び標識工程は、核酸クロマトグラフィーを利用する核酸検出デバイスを用いて行うことができる。当該核酸検出デバイスを利用することにより、核酸増幅反応の反応系中の増幅産物（標的領域を含むポリヌクレオチド断片）の有無を、特殊な装置を必要とすることなく検出・判別することができ、簡便かつ迅速に結果を得ることができる。
【０２０１】
核酸検出デバイスは、核酸クロマトグラフィー法により標識された核酸増幅産物を検出するために利用される公知の核酸検出デバイス（ＷＯ２０１２／０７０６１８）を利用することができる。
【０２０２】
本発明にて利用可能な核酸検出デバイスの一実施形態の模式図を図４に示すが、核酸検出デバイスは本実施形態に限定されるものではない。なお、以下の説明において、各部材に付された符号は、図４中に示される符号に対応する。
【０２０３】
図４の核酸検出デバイス１０は、基材５の上に、核酸増幅反応の反応系を受容するための反応系受容部であるサンプルパッド３、標識物質を保持するコンジュゲートパッド２、増幅産物に含まれる結合部と結合可能な部分６を一部に含む多孔質固相担体１、及び吸収パッド４を互いがこの順に接触するように配置して形成される。固相担体１の部分６は、増幅産物を捕捉するための手段（捕捉手段）（例えば、上記オリゴヌクレオチド等）が限局して配置・固定化された部分である。図示しないが、固相担体１の表面はフィルムにより覆われていてもよい。サンプルパッド３、コンジュゲートパッド２、固相担体１及び吸収パッド４は上記固相担体として利用可能な多孔質構造を有する部材により構成することができる。これらは同一の部材より構成されていてもよいし、異なる部材より構成されていてもよい。基材５はその上に配置された各種部材を支持することができ、核酸検出デバイスの操作を容易にするものであればよく、例えば樹脂、金属、鉱物等からなるものを利用することができる。標識物質を展開溶液中に混合する場合や、標識部が標識物質である場合には、コンジュゲートパッド２は省略することができる。
【０２０４】
工程１により得られた核酸増幅反応の反応系をサンプルパッド３に添加する。前記反応系をそのまま添加してもよいし、適当な展開溶液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ＳＳＣ緩衝液）と共に添加してもよい。展開溶液には必要に応じて、界面活性剤、塩、タンパク質、核酸等をさらに含めることができる。サンプルパッド３に添加された前記反応系は、図４中の矢印で示す方向に上流から下流に向かってキャピラリー現象により展開する。
【０２０５】
また別の態様としては、核酸増幅反応の生成物及び／又は展開溶液を保持した容器（例えば、ＰＣＲチューブ、エッペンチューブ、９６穴プレート等）に当該核酸検出デバイスを入れ、サンプルパッド３を核酸増幅反応の生成物及び／又は展開溶液に浸漬させる方法で展開することもできる。その場合、核酸増幅反応の生成物及び／又は展開溶液を保持した容器にサンプルパッド３が入るように、サンプルパッド３の幅は２.０〜１０．０ｍｍにすることが好ましく、２.０〜５．０ｍｍにすることがより好ましい。
【０２０６】
前記標識部が標識用タグである実施形態では、反応系中の増幅産物は標識物質が保持されたコンジュゲートパッド２を通過する際に、標識物質と接触し、標識用タグを介して標識物質により標識される。
【０２０７】
次いで、反応系中の増幅産物は、固相担体１を通過する際に、部分６に固定された捕捉手段と接触し、固定化用タグを介して固相担体１に捕捉・結合される。
【０２０８】
試料中に標的核酸が存在する場合には、捕捉手段を含む固相担体１の部分６に捕捉・結合された増幅産物に結合した標識物質が部分６に検出される。標識物質が目視確認できるものであれば、標識物質に起因して部分６が呈色する。当該標識物質の検出（呈色）の有無を指標にして、試料中の標的核酸の有無を判別することができる。
＜５．２．本発明のプローブを用いる検出方法＞
本発明の検出方法の他の一態様は、
試料中のポリヌクレオチド、又は、試料中のポリヌクレオチドを鋳型とし核酸増幅反応を行い増幅したポリヌクレオチド断片と、本発明のプローブとを、ハイブリダイズ可能な条件下でインキュベートする工程３、及び、
前記ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチド断片と、前記プローブとのハイブリダイゼーションを検出する工程４
を含む。
【０２０９】
工程３において、試料中のポリヌクレオチドを鋳型とし核酸増幅反応を行い増幅したポリヌクレオチド断片とは、本発明のプライマーセットを用いた上記の工程１の核酸増幅反応での増幅産物であることが好ましいがこれには限定されず、他のプライマーセットを用いた核酸増幅反応での増幅産物であってもよい。
【０２１０】
工程３における「ハイブリダイズ可能な条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，４ｔｈ  Ｅｄ（２０１２），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照して適宜決定することができる。具体的には前記＜２．用語＞において（Ｃ）に関して説明した「ストリンジェントな条件」と同様の条件が例示できる。
【０２１１】
工程４において、前記ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチド断片と、前記プローブとのハイブリダイゼーションを検出する手段は特に限定されない。
【０２１２】
例えば、本発明のプローブが前記の標識部を有する場合、工程３でのインキュベーション後の反応混合物から未反応のプローブを除去し、前記ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチド断片と前記プローブとの複合体を、標識部からの標識を指標として検出することができる。標識部が標識用タグである場合には必要に応じて標識物質を付加する標識工程を行えばよい。
【０２１３】
また、本発明のプローブが前記の結合部を有する場合、記ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチド断片と前記プローブとの複合体を、結合部を介して固相担体に固定させてから、適当な手段で固相担体上の前記複合体を検出することができる。結合部を含む本発明のプローブは、結合部を介して予め固相担体に固定した状態で提供してもよい。
＜６．キット＞
本発明はまた、
本発明のプライマーセット及び／又は本発明のプローブを含む、マイコバクテリウム・カンサシイ及び／又はマイコバクテリウム・カンサシイに由来するポリヌクレオチドを検出するためのキット
に関する。
【０２１４】
該キットは、本発明の検出方法において利用することができる。
【０２１５】
本発明のキットには、更に、核酸増幅反応のための各種試薬（例えばＤＮＡポリメラーゼ、核酸増幅反応用緩衝液、ｄＮＴＰｓ等）、インキュベーションのための各種試薬（インキュベーション用緩衝液）等を含めることができる。
【０２１６】
本発明のプライマーセット及び／又は本発明のプローブが前記の結合部を有する場合、本発明のキットは更に、前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体を含むことができる。固相担体の具体例としては上記の検出デバイスが特に好ましい。
【０２１７】
本発明のプライマーセット及び／又は本発明のプローブが前記の標識部を含み、標識部が標識用タグである場合には、本発明のキットは更に、標識用タグを標識するための標識物質を更に含むことが好ましい。
【実施例】
【０２１８】
本発明を以下の実験結果に基づき具体的に説明するが本発明はこれらによって限定されるものではない。
［実施例１］
（１）プライマーの設計
Ｍ．  ｋａｎｓａｓｉｉに特異領域２内に、プライマーデザイン用のＷｅｂツールＰｒｉｍｅｒ  ＢＬＡＳＴを用いてＰＣＲ増幅検出のためのプライマーセット１〜３を設計した。各プライマーの設計位置は図２−１、２−２及び２−３に示したとおり。プライマーセット１〜３のフォワードプライマー、リバースプライマーの塩基配列を以下に示す。【０２１９】
【表３】
2018135560.tif 000006
【０２２０】
（２）ＰＣＲ
上記のプライマーセット１〜３を用いて、ＴａＫａＲａ  ＴａｑＨＳ  ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｍｉｘのマニュアルに従い、下記のＰＣＲ用反応液を調製した。【０２２１】
【表４】
2018135560.tif 000007
【０２２２】
鋳型には、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ＡＴＣＣ１２４７８株、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ  ｔｙｐｅ  Ｉ  臨床分離株、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ  ｔｙｐｅ  ＶＩ  臨床分離株、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  臨床分離株、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ  ＡＴＣＣ１５７５４株のゲノムＤＮＡを用いた。各微生物株からのゲノムＤＮＡの調製は、次の手順で行った：マイコブロス（極東製薬）にて、１０８ｃｆｕ／ｍｌ以上となるよう各株を培養し、培養液１０μｌから、カネカ簡易ＤＮＡ抽出キットｖｅｒ．２（カネカ）を用い、当製品のプロトコルに従いＤＮＡを抽出した。これを抽出鋳型ＤＮＡ溶液とした。【０２２３】
ネガティブコントロールとして、上記鋳型ＤＮＡ溶液の代わりに滅菌蒸留水を１μＬ用いた以外は同様の組成のＰＣＲ反応液を調製した。【０２２４】
５μＭ  フォワードプライマー溶液及び５μＭ  リバースプライマー溶液は所定のプライマーを５μＭの濃度となるように滅菌蒸留水中に溶解させたものである。【０２２５】
ＰＣＲ反応液を、サーマルサイクラー（Ｂｉｏｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ＬｉｆｅＥｃｏ）にセットし、９４℃で１分間反応後、９４℃−５秒／６０℃−１０秒／７２℃−１５秒のサイクルを３５回繰り返し、ＰＣＲを行った。
（３）電気泳動
上記（２）で得られたＰＣＲ後の反応液５μＬを、２％アガロースゲルを用いた電気泳動法により分離した。次いでエチジウムブロマイドで染色後、紫外線を照射してバンドを検出した。【０２２６】
結果を図３に示す。【０２２７】
いずれのプライマーセットも、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉを鋳型にした場合のみ目的サイズの増幅産物を認め、ｔｙｐｅ  Ｉ、ｔｙｐｅ  ＩＩ及びｔｙｐｅ  ＶＩを含む全てのＭ．  ｋａｎｓａｓｉｉを検出可能であった。また、Ｍ．ｇａｓｔｒｉを鋳型にした場合は、増幅産物を認めなかったことから、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉとＭ．  ｇａｓｔｒｉとの識別が可能であることが確認された。
［実施例２］
結核菌群４種（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）および非結核性抗酸菌（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｇａｓｔｒｉなど）３８種、一般細菌１種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、プライマーセット２をプライマーセットとして使用した以外は、実施例１と同様の条件でＰＣＲを行い、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動法により確認した。結果を下記表に示す。【０２２８】
【表５】
2018135560.tif 000008
【０２２９】
プライマーセット２を用いたＰＣＲでは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉのゲノムＤＮＡを鋳型とした場合のみで増幅産物を生じ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ以外の抗酸菌、および、抗酸菌と近縁な一般細菌であるＮ．ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓではＰＣＲ増幅を認めなかった。【０２３０】
このことから、本発明の方法はＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの種特異的な検出に非常に有効であることが示された。
［実施例３］
プライマーセット２を用いたＰＣＲによる増幅産物を検出することができる核酸クロマトグラフィー検出系を構築した。この検出系を用いてＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの臨床分離株の検出が可能であることを確認した。
（Ｉ）プライマーの構造
実施例１に記載のプライマーセット２のフォワードプライマー（ＫＡＮ−２ｆ）の５’末端に、ポリメラーゼ反応を阻害するアゾベンゼン構造を含む、上記式Ｉで表される二価基を介して、以下のフォワードプライマー用タグ配列からなるＤＮＡを連結した。このとき、上記式Ｉに示すアゾベンゼンの構造を含む二価基の５’端と、フォワードプライマー用タグ配列からなるＤＮＡの３’末端のヌクレオチドのリン酸基とがリン酸エステル結合を形成し、該二価基の３’端のリン酸基と、前記フォワードプライマーのプライマー部分の５’末端のヌクレオチドのデオキシリボースの５’位の水酸基とがリン酸エステル結合を形成する。
５’−ＧＡＣＡＡＣＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡ−３’（配列番号４１）
実施例１に記載のプライマーセット２のリバースプライマー（ＫＡＮ−２ｒ）の５’末端には、ポリメラーゼ反応を阻害するアゾベンゼン構造を含む、上記式Ｉで表される二価基を介して、以下のリバースプライマー用タグ配列からなるＤＮＡを連結した。このとき、上記式Ｉに示すアゾベンゼンの構造を含む二価基の一方の端の酸素原子と、リバースプライマー用タグ配列からなるＤＮＡの３’末端のヌクレオチドのリン酸基とがリン酸エステル結合を形成し、該二価基の他方の端のリン酸基と、前記リバースプライマーのプライマー部分の５’末端のヌクレオチドのデオキシリボースの５’位の水酸基とがリン酸エステル結合を形成する。
５’−ＡＴＧＣＴＡＣＣＧＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＧ−３’（配列番号４２）
（ＩＩ）オリゴヌクレオチド結合金コロイドの作製
Ｇｏｌｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄ（４０ｎｍ，９．０×１０１０（粒子数／ｍｌ）、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）と下記の配列番号４３で表されるチオール基含有オリゴヌクレオチドを混合し、５０℃で１６時間インキュベートした。６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去し、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加し混和後、再度５０℃で４０時間インキュベートした。【０２３１】
インキュベート後、遠心（６０００ｒｐｍ、１５分間）を行い、上清を除去し、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加した。このバッファー置換を再度行った。【０２３２】
調製した金コロイド溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。【０２３３】
（チオール基含有オリゴヌクレオチド）：５’−ＴＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＧＴＴＧＴＣ−ＳＨ−３’（配列番号４３）
配列番号４３で示すチオール基含有オリゴヌクレオチドは、３’末端のシトシンヌクレオチドの３’位のリン酸基と、ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＳＨ（ｍは６）で表される化合物の水酸基とがリン酸エステル結合により結合したものである。
（ＩＩＩ）タグ捕捉手段を固定化したメンブレンの作製
タグ捕捉手段として、下記の配列番号４４で表されるオリゴヌクレオチドプローブを含む溶液を、メルクミリポア社製ニトロセルロースメンブレン（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ１８０）に、ディスペンサーを用いて、展開方向と直交する幅１ｍｍのライン状に塗布した。その後４０℃で３０分間乾燥させることでタグ捕捉手段を備えたメンブレンとした。【０２３４】
（オリゴヌクレオチドプローブ）：５’−ＣＡＣＴＧＧＧＣＡＴＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴ−３’（配列番号４４）
（ＩＶ）ラテラルフロー型核酸検出デバイスの作製
作製したラテラルフロー型核酸検出デバイスは、図４の模式図に示される検出デバイスに準拠して作製した。【０２３５】
すなわち、基材５としてポリプロピレン製バッキングシート（Ｌｏｈｍａｎｎ社）、コンジュゲートパッド２として上記（ＩＩ）で作製したコンジュゲートパッド、部分６に捕捉手段として上記（ＩＩＩ）で作製したタグ捕捉手段を備えたメンブレン（固相担体）１、サンプルパッド３としてグラスファイバー製のサンプルパッド、吸収パッド４としてセルロース製の吸収パッドを、それぞれ図４に示すように互いに重なり合わせて貼り合わせ、ラテラルフロー型核酸検出デバイス１０を作製した。
（Ｖ）ＰＣＲ
上記（Ｉ）に記載の、タグが付加されたプライマーセット２を用い、表５に示す各株のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた以外は実施例１と同様の条件によりＰＣＲを行った。【０２３６】
なお、各株の型は、ｈｓｐ６５ＲＰＡ解析を用いた常法により判別した。
（ＶＩ）核酸クロマトグラフィー検出系を用いた検出１
上記条件でのＰＣＲ後の反応液を、ラテラルフロー型核酸検出デバイス１０に適用して、増幅産物の検出を試みた。具体的には、前記デバイス１０上のサンプルパッド３にＰＣＲ後の反応液５μＬを添加し、さらに８０μＬの展開溶液（界面活性剤を配合したクエン酸緩衝液）を添加することで、反応液を展開した。室温で１０分後、メンブレン１上のライン状に固定化されたタグ捕捉手段を含む部分６の着色の有無を目視で確認した。着色が確認できた場合に「＋」、確認できなかった場合に「−」とした。【０２３７】
結果を下記表に示す。【０２３８】
【表６】
2018135560.tif 000009
【０２３９】
この結果、ｔｙｐｅ  Ｉ、ｔｙｐｅ  ＩＩ、ｔｙｐｅ  ＩＩＩ、及びｔｙｐｅ  ＶＩを含む全てのＭ．ｋａｎｓａｓｉｉを検出可能であることが確認された。【０２４０】
なお、表５に示すＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの各株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、プライマーセット２をプライマーセットとして使用した以外は、実施例１と同様の条件でＰＣＲを行い、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動法により確認したところ、全ての株について目的サイズの増幅産物の存在を確認することができた。
（ＶＩＩ）核酸クロマトグラフィー検出系を用いた検出２
上記（Ｉ）に記載の、タグが付加されたプライマーセット２を用い、表４に示す各株のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた以外は実施例１と同様の条件によりＰＣＲを行った。【０２４１】
次いで、ＰＣＲ後の反応液を、上記（ＶＩ）と同様の手順により、ラテラルフロー型核酸検出デバイス１０に適用して、メンブレン１上のライン状に固定化されたタグ捕捉手段を含む部分６の着色の有無を目視で確認して、増幅産物の検出を試みた。【０２４２】
その結果、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ（ＴｙｐｅＩ）ＡＴＣＣ１２４７８のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合のみ着色が検出され（＋）、表４に示す他の株のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合は着色は検出されなかった（−）。
［実施例４］
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ（Ｔｙｐｅ  Ｉ）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、表２に示すプライマーセット４（ＭＫＳ−４０ｆ（配列番号２２）及びＭＫＳ−４０ｒ（配列番号２３））、プライマーセット５（ＭＫＳ−４１ｆ（配列番号２４）及びＭＫＳ−４１ｒ（配列番号２５））、プライマーセット６（ＭＫＳ−４２ｆ（配列番号２６）及びＭＫＳ−４２ｒ（配列番号２７））又はプライマーセット７（ＭＫＳ−４３ｆ（配列番号２８）及びＭＫＳ−４３ｒ（配列番号２９））をプライマーセットとして使用した以外は、実施例１と同様の条件でＰＣＲを行い、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動法により確認した。どのプライマーセットを用いた場合も、標的サイズの増幅産物の存在を確認することができた。
［実施例５］
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ（Ｔｙｐｅ  ＩＩ）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、表２に示す、プライマーセット６又はプライマーセット７をプライマーセットとして使用した以外は、実施例１と同様の条件でＰＣＲを行い、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動法により確認した。どのプライマーセットを用いた場合も、標的サイズの増幅産物の存在を確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【０２４３】
本発明のプライマーセット、プローブ、方法及びキットは、マイコバクテリウム・カンサシイの正確な検出に有用である。【０２４４】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１−１】
2018135560.tif 000010
【図１−２】
2018135560.tif 000011
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
2018135560000001.app
【国際調査報告】
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