(57)【要約】アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）と神経細胞との結合に対する結合阻害能を有するペプチドの提供。一態様において、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される、合成、単離、又は精製されたポリペプチド。  Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4      （Ｉ）  式（Ｉ）において、    Ｘ1は、Ｒ、Ｈ、又はＫであり、    Ｘ2は、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｈ、Ｗ、Ｑ、Ｙ、又はＴであり、    Ｘ3は、任意のアミノ酸であり、    Ｘ4は、Ｗ、Ｆ、又はＹである。  Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4      （ＩＩ）  式（ＩＩ）において、    Ｘ1は、Ｒ、Ｈ、又はＫであり、    Ｘ2は、任意のアミノ酸であり、    Ｘ3は、Ｌ、Ｇ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、又はＫであり、    Ｘ4は、Ｗ、Ｆ、又はＹである。
2017179647.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成、単離、又は精製されたポリペプチドであって、
下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を含み、
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4      （Ｉ）（配列番号１）
Ｘ1は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、又はリジン（Ｌｙｓ）であり、
Ｘ2は、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、又はトレオニン（Ｔｈｒ）であり、
Ｘ3は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ4は、トリプトファン（Ｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、又はチロシン（Ｔｙｒ）である、ポリペプチド。
【請求項２】
Ｘ3は、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、又はバリン（Ｖａｌ）である、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｘ2は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、又はトレオニン（Ｔｈｒ）である、請求項１又は２記載のポリペプチド。
【請求項４】
合成、単離、又は精製されたポリペプチドであって、
下記式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含み、
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4      （ＩＩ）（配列番号２）
Ｘ1は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、又はリジン（Ｌｙｓ）であり、
Ｘ2は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ3は、ロイシン（Ｌｅｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、又はリジン（Ｌｙｓ）であり、
Ｘ4は、トリプトファン（Ｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、又はチロシン（Ｔｙｒ）である、ポリペプチド。
【請求項５】
Ｘ2は、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、又はバリン（Ｖａｌ）である、請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
Ｘ3は、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、又はリジン（Ｌｙｓ）である、請求項４又は５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
合成、単離、又は精製されたポリペプチドであって、
ＨＡＮＷ、ＨＶＮＷ、ＨＦＨＷ、又はＨＦＹＷで表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項８】
Ｎ末端に前記式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）、又は、ＨＡＮＷ、ＨＶＮＷ、ＨＦＨＷ若しくはＨＦＹＷで表わされるアミノ酸配列を有する、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列の長さが、４〜５０アミノ酸である、請求項１から８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
Ｃ末端のカルボキシル基が、除去又はアミド化されている、請求項１から９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ペプチド結合の少なくとも１つがＮ−アルキル化されている、請求項１から１０のいずれか記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ＡＳＰＤと神経細胞との結合に対する結合阻害能を有する、請求項１から１１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載のポリペプチドの構造を模した構造を有するペプチドミミックであって、ＡＳＰＤと神経細胞との結合に対する結合阻害能を有する、ペプチドミミック。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、前記ポリペプチドを発現するためのベクター。
【請求項１５】
請求項１から１２のいずれかに記載のポリペプチド又は請求項１３に記載のペプチドミミックを含む、組成物。
【請求項１６】
アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）と神経細胞との結合を阻害する物質を評価する方法であって、
評価対象物質及びＡＳＰＤを含有する混合液を、培養神経細胞に接触させること、又は、評価対象物質存在下の培養神経細胞に、ＡＳＰＤを接触させること、
前記接触後に、ＡＳＰＤ及び神経細胞にそれぞれ異なる標識をしてイメージングを行うこと、及び、
前記イメージングのデータから神経細胞に対するＡＳＰＤの結合の指標を得て、前記指標を用いて評価対象物質を評価すること、を含む、評価方法。
【請求項１７】
アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）による神経毒性を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
候補物質及びＡＳＰＤを含有する混合液を、培養神経細胞に接触させること、又は、候補物質存在下の培養神経細胞に、ＡＳＰＤを接触させること、
前記接触後に、ＡＳＰＤ及び神経細胞にそれぞれ異なる標識をしてイメージングを行うこと、及び、
前記イメージングのデータから神経細胞に対するＡＳＰＤの結合の指標を得て、前記指標を用いて候補物質を選択すること、を含む、スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）と神経細胞との結合に対する結合阻害能を有するペプチド、並びに、その評価方法及びそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロスフェロイド（amylospheroids（ＡＳＰＤ））は、アミロイドβタンパク質（Ａβ）が約３０個集まった直径約１０ｎｍの球状のＡβ集合体であって、アルツハイマー病が発症する不可逆的段階において重要な役割を果たすと考えられる構造体である。【０００３】
ＡＳＰＤは、最初に、強い神経毒性を示すin vitroで合成されたＡβ集合体（すなわち、合成ＡＳＰＤ）として単離された（非特許文献１）。この合成ＡＳＰＤに対する特異的な抗体が作製され（特許文献１及び２）、この抗体を用い、アルツハイマー病のヒト患者の脳から、実際に、生体内で形成されたＡＳＰＤ（すなわち、ネイティブＡＳＰＤ）が単離された（非特許文献１）。【０００４】
ネイティブＡＳＰＤ及び合成ＡＳＰＤは、同様に、成熟神経細胞に対して選択的に細胞死を誘発する。この神経細胞死におけるＡＳＰＤのターゲットが、神経の生存と機能に極めて重要な役割を果たしているシナプスタンパク質「Ｎａ+，Ｋ+−ＡＴＰａｓｅポンプのα３サブユニット（以下、ＮＡＫα３）」であることが発見され、ＡＳＰＤの結合によりＮＡＫα３の機能が低下し、神経細胞が過剰に興奮することで神経細胞が死に至ることが明らかにされた（特許文献３、非特許文献２）。また、ＡＳＰＤとＮＡＫα３との相互作用を阻害できるペプチドも報告されている（特許文献３、非特許文献２）。【０００５】
アルツハイマー病における臨床症状と最も相関するのが神経細胞の脱落である。神経細胞脱落が認められるアルツハイマー病患者の大脳皮質におけるネイティブＡＳＰＤ量は、アルツハイマー病の重症度に相関して増加し、そして、神経細胞脱落があまり認められないアルツハイマー病患者の小脳におけるネイティブＡＳＰＤ量は微量しか存在しないことが明らかとなった（非特許文献３）。したがってＡＳＰＤは、アルツハイマー病が発症する不可逆的段階において重要な役割を果たすと考えられる。さらに、ネイティブＡＳＰＤは、レビー小体型認知症患者の脳からも検出されており（非特許文献３）、レビー小体型認知症においてもＡＳＰＤはその発症において重要な役割を果たすと考えられる。【０００６】
ネイティブＡＳＰＤと等価であると考えられる合成ＡＳＰＤは、Ａβを含む液体をゆっくり撹拌することにより製造されうる（非特許文献１、特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０１６６４４
【特許文献２】ＷＯ２００９／０５７６６４
【特許文献３】ＷＯ２０１３／０９９８０６
【特許文献４】ＷＯ２０１３／０９４６１４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hoshi et al., Spherical aggregates of β-amyloid (amylospheroid) show high neurotoxicity and activate tau protein kinase I/glycogen synthase kinase-3β, PNAS May 27, 2003 vol. 100 no. 11 6370-6375
【非特許文献２】Ohinishi et al., Na, K-ATPase α3 is a death target of Alzheimer patient amyloid-β assembly, PNAS August 11, 2015 vol. 112 no. 32 E4465-E4474
【非特許文献３】Noguchi et al., Isolation and characterization of patient-derived, toxic, high mass amyloid beta-protein (Abeta) assembly from Alzheimer disease brains, J Biol Chem. 2009 Nov 20;284(47):32895-905
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＡＳＰＤと神経細胞との結合を阻害できれば、ＡＳＰＤと神経細胞との相互作用を阻害でき、ＡＳＰＤに起因する神経細胞死を回避できると考えられる。また、ＡＳＰＤと神経細胞との結合を阻害できる物質を得ることができれば、アルツハイマー病やレビー小体型認知症などに対する治療方法の開発に寄与できると考えられる。【００１０】
そこで、本開示は、一態様において、ＡＳＰＤと神経細胞との結合を阻害できるペプチドを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示は、一態様において、合成、単離、又は精製されたポリペプチドであって、下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を含み、
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4      （Ｉ）（配列番号１）
Ｘ1は、Ｒ、Ｈ、又はＫであり、
Ｘ2は、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｈ、Ｗ、Ｑ、Ｙ、又はＴであり、
Ｘ3は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ4は、Ｗ、Ｆ、又はＹである、ポリペプチドに関する。【００１２】
本開示は、一態様において、合成、単離、又は精製されたポリペプチドであって、下記式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含み、
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4      （ＩＩ）（配列番号２）
Ｘ1は、Ｒ、Ｈ、又はＫであり、
Ｘ2は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ3は、Ｌ、Ｇ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、又はＫであり、
Ｘ4は、Ｗ、Ｆ、又はＹである、ポリペプチドに関する。【００１３】
本開示は、一態様において、合成、単離、又は精製されたポリペプチドであってＨＡＮＷ、ＨＶＮＷ、ＨＦＨＷ、又はＨＦＹＷで表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。【００１４】
本開示は、一態様において、本開示に係るポリペプチドの構造を模した構造を有するペプチドミミックであって、ＡＳＰＤと神経細胞との結合に対する結合阻害能を有するペプチドミミックに関する。【００１５】
本開示は、一態様において、本開示に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、前記ポリペプチドを発現するためのベクターに関する。また、その他の態様において、本開示に係るポリペプチド又は本開示に係るペプチドミミックを含む組成物に関する。【００１６】
本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤと神経細胞との結合を阻害する物質を評価する方法であって、
評価対象物質及びＡＳＰＤを含有する混合液を、培養神経細胞に接触させること、又は、評価対象物質存在下の培養神経細胞に、ＡＳＰＤを接触させること、
前記接触後に、ＡＳＰＤ及び神経細胞にそれぞれ異なる標識をしてイメージングを行うこと、及び、
前記イメージングのデータから神経細胞に対するＡＳＰＤの結合の指標を得て、前記指標を用いて評価対象物質を評価すること、を含む評価方法に関する。【００１７】
本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤによる神経毒性を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
候補物質及びＡＳＰＤを含有する混合液を、培養神経細胞に接触させること、又は、候補物質存在下の培養神経細胞に、ＡＳＰＤを接触させること、
前記接触後に、ＡＳＰＤ及び神経細胞にそれぞれ異なる標識をしてイメージングを行うこと、及び、
前記イメージングのデータから神経細胞に対するＡＳＰＤの結合の指標を得て、前記指標を用いて候補物質を選択すること、を含む、スクリーニング方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、神経細胞とＡＳＰＤとを蛍光免疫染色して蛍光顕微鏡観察した結果の一例である。ＡＳＰＤ単独を神経細胞と接触させた場合と、所定のペプチドでＡＳＰＤを前処理した場合とで、添加するＡＳＰＤの濃度を変化させて比較している。
【図２】図２は、顕微鏡観察の結果から作成されうる、添加したＡＳＰＤ濃度と神経細胞に結合したＡＳＰＤ量との関係を示すグラフの一例を示す。
【図３】図３は、横軸に示すペプチドについて、ＡＳＰＤと神経細胞との結合に対する結合阻害能を評価したグラフの一例を示す。
【図４】図４は、横軸に示すペプチドについて、ＡＳＰＤと神経細胞との結合に対する結合阻害能を評価したグラフの一例を示す。
【図５】図５は、横軸に示すペプチドについて、ＡＳＰＤと神経細胞との結合に対する結合阻害能を評価したグラフの一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、一態様において、下記の第１及び第２のペプチドに関する。すなわち、本開示は、一態様において、下記式（Ｉ）、又は（ＩＩ）で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドに関する。
【００２０】
［第１のペプチド］
本開示は、一態様において、下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を含む、合成、単離、又は精製されたポリペプチド（以下、「第１のペプチド」ともいう）に関する。
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4      （Ｉ）（配列番号１）
式（Ｉ）において、
Ｘ1は、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、又はリジン（Ｋ）であり、
Ｘ2は、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、又はチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ3は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ4は、トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はチロシン（Ｙ）である。
【００２１】
式（Ｉ）においてＸ1は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤと神経細胞との結合を阻害する観点から、Ｒ又はＨが好ましく、Ｈがより好ましい。
【００２２】
式（Ｉ）においてＸ2は、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、
Ｈ、Ｗ、Ｑ、Ｙ、又はＴが好ましく、
Ｈ、又はＴがより好ましい。
【００２３】
式（Ｉ）においてＸ3は、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、
アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、又はバリン（Ｖ）が好ましく、
Ｎ、Ｌ、Ｇ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｋ、Ｈ、又はＹがより好ましく、
Ｎ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｄ、Ｋ、Ｈ、又はＹがさらに好ましく、
Ｎ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、又はＹがさらにより好ましい。
【００２４】
式（Ｉ）においてＸ4は、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、Ｗが好ましい。
【００２５】
式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の一又は複数の実施形態として、下記表１のペプチド０２〜１１のアミノ酸配列が挙げられ、ＨＨＮＷ、ＨＷＮＷ、ＨＱＮＷ、ＨＹＮＷ及びＨＴＮＷが挙げられ、又は、ＨＨＮＷ及びＨＴＮＷが挙げられる。
【００２６】
［第２のペプチド］
本開示は、一態様において、下記式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含む、合成、単離、又は精製されたポリペプチド（以下、「第２のペプチド」ともいう。）に関する。
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4      （ＩＩ）（配列番号２）
式（ＩＩ）において、
Ｘ1は、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、又はリジン（Ｋ）であり、
Ｘ2は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ3は、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、トリプトファン（Ｗ）、アルギニン（Ｒ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、又はリジン（Ｋ）であり、
Ｘ4は、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、又はチロシン（Ｙ）である。
【００２７】
式（ＩＩ）においてＸ1は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤと神経細胞との結合を阻害する観点から、Ｒ又はＨが好ましく、Ｈがより好ましい。
【００２８】
式（ＩＩ）においてＸ2は、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、
アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、又はバリン（Ｖ）が好ましく、
Ｆ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｈ、Ｗ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ａ、又はＶがより好ましく、
Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ａ、又はＶがさらに好ましく、
Ｆ、Ｈ、Ｔ、Ａ、又はＶがさらにより好ましい。
【００２９】
式（ＩＩ）においてＸ3は、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、
Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｄ、又はＫがより好ましく、
Ｒ、又はＫがさらに好ましい。
【００３０】
式（ＩＩ）においてＸ4は、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、Ｗが好ましい。
【００３１】
式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列の一又は複数の実施形態として、下記表２のペプチド１２〜２４のアミノ酸配列が挙げられ、ＨＦＬＷ、ＨＦＩＷ、ＨＦＷＷ、ＨＦＲＷ、ＨＦＤＷ、及びＨＦＫＷが挙げられ、又は、ＨＦＲＷ及びＨＦＫＷが挙げられる。
【００３２】
［第３のペプチド］
本開示は、その他の態様において、ＨＡＮＷ、ＨＶＮＷ、ＨＦＨＷ、又はＨＦＹＷで表わされるアミノ酸配列を含む、合成、単離、又は精製されたポリペプチド（以下、「第３のペプチド」ともいう。）に関する。
【００３３】
本開示に係る第１〜第３のペプチドは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤと神経細胞との結合を阻害できることが好ましい。
本開示に係る第１〜第３のペプチドは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤとＮＡＫα３との相互作用に対する阻害能を有することが好ましい。
本開示に係る第１〜第３のペプチドは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに対して結合能を有することが好ましい。
本開示に係る第１〜第３のペプチドは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤが誘導する神経細胞の細胞死を抑制できることが好ましい。
なお、本開示において、単にアミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）という場合には、ネイティブＡＳＰＤ及び合成ＡＳＰＤを含みうる。
【００３４】
本開示に係る第１〜第３のペプチドは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤと神経細胞との結合を阻害する観点から、Ｎ末端に前記式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）、又は、ＨＡＮＷ、ＨＶＮＷ、ＨＦＨＷ若しくはＨＦＹＷで表わされるアミノ酸配列を有すること、すなわち、Ｎ末端の最初のアミノ酸がＸ1又はＨであることが好ましい。
【００３５】
本開示に係る第１〜第３のペプチドの長さは、一又は複数の実施形態において、４以上であり、また、５０以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、又は５以下であることが挙げられる。よって、ペプチドの長さとしては、４〜５０、４〜２５、４〜２０、４〜１５、４〜１０、又は４〜５が挙げられる。
【００３６】
本開示に係る第１〜第３のペプチドは、一又は複数の実施形態において、前記式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）、又は、ＨＡＮＷ、ＨＶＮＷ、ＨＦＨＷ若しくはＨＦＹＷで表わされるアミノ酸配列と脳移行性ペプチドとが直接又はリンカーペプチドを介して結合した形態が挙げられる。脳移行性ペプチドを結合させることで、本開示のポリペプチドが血液脳関門を越えて脳に移行される効率を高めることができる。脳移行性ペプチドをとしては、従来公知のものを利用できる。
【００３７】
本開示に係る第１〜第３のペプチドには、該ペプチドが修飾された形態のペプチドも含まれうる。一又は複数の実施形態において、該ペプチドの末端及び／又はペプチド結合が修飾された形態も含まれうる。末端修飾としては、Ｃ末端のカルボキシル基の除去又はアミド化、Ｎ末端のアミノ基の除去又はアセチル化が挙げられる。ペプチド結合の修飾としては、Ｎ−アルキル化が挙げられる。
【００３８】
本開示に係る第１〜第３のペプチドは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤと神経細胞との結合を阻害する観点から、Ｃ末端のカルボキシル基が、除去又はアミド化されていることが好ましく、除去されていることがより好ましい。Ｃ末端のカルボキシル基のアミド化としては、−ＣＯＮＨ2、−ＣＯＮＨＲ、及び−ＣＯＮＲＲ’（Ｒ、Ｒ’は炭化水素基）が挙げられ、好ましくは、−ＣＯＮＨ2である。
【００３９】
Ｎ末端のアミノ基は、そのままでもよく、又は、アセチル化若しくは除去してもよいが、ＡＳＰＤと神経細胞との結合を阻害する観点から、そのままが好ましい。
【００４０】
本開示に係る第１〜第３のペプチドは、一又は複数の実施形態において、該ペプチドのＡＳＰＤへの結合を促進する観点から、ペプチド結合の少なくとも１つがＮ−アルキル化されていてもよい。Ｎ−アルキル化としては、Ｎ−メチル化、Ｎ−エチル化、Ｎ−シクロプロピル化などが挙げられる。
【００４１】
本開示に係る第１〜第３のペプチドは、通常の合成方法によって適宜合成し、精製することによって調製することができる。
【００４２】
［ペプチドミミック］
本開示は、その他の態様において、本開示に係る第１〜第３のペプチドの構造を模した構造を有するペプチドミミックに関する。
本開示における「ペプチドミミック」の一又は複数の実施形態としては、ペプチド様化合物が挙げられ、あるいは、ペプチド結合の構造及び修飾されたペプチド結合の構造を有さない合成化合物が挙げられる。
ペプチド様化合物の一又は複数の実施形態としては、ペプトイド（S.M.Miller, R.J.Simon, S.Ng, R.N.Zuckermann, J.S. Kerr, W.H.Moos, Bioorg.Med.Chem Lett., 4, 2657(1994)）、タンパク質のβ/γターン構造をミミックした非ペプチド化合物（M. Kahn Tetrahedron, 49, 3433(1993)、「コンビナトリアルケミストリー」出版：化学同人、p44-64, 1997）等が挙げられる。
【００４３】
本開示に係るペプチドミミックは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤと神経細胞との結合を阻害できることが好ましい。本開示に係るペプチドミミックは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤとＮＡＫα３との相互作用に対する阻害能を有することが好ましい。本開示に係るペプチドミミックは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに対して結合能を有することが好ましい。本開示に係るペプチドミミックは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤが誘導する神経細胞の細胞死を抑制できることが好ましい。
【００４４】
［ポリヌクレオチド及びベクター］
本開示は、その他の態様として、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、また、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドを発現するためのベクターに関する。前記ベクターは、本開示のポリヌクレオチドを発現可能とする調節配列等を含む発現カセットを有することが好ましい。前記ベクターとしては、前記ポリヌクレオチドを遺伝子導入できるものであれば特に限定されないが、安全性の観点からＡＶＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクターが好ましい。本開示のベクターの好ましい実施形態として脳移行性ペプチドと結合した形態が挙げられる。脳移行性ペプチドを結合させることで、本開示のベクターが血液脳関門を越えて脳に移行される効率を高めることができる。脳移行性ペプチドをとしては、従来公知のものを利用できる。
【００４５】
［組成物］
本開示は、その他の態様として、本開示に係るペプチド、本開示に係るペプチドミミック、又は、本開示に係るベクターを含む組成物に関する。前記組成物は、一又は複数の実施形態において、医薬組成物である。
【００４６】
［医薬組成物］
本開示が医薬組成物である場合、その剤形は、投与方法に応じて適宜選択でき、例えば、注射剤、液体製剤、カプセル剤、咀嚼剤、錠剤、懸濁剤、クリーム剤、軟膏等が挙げられる。また、投与方法も特に制限されず、経口投与、非経口投与が挙げられる。本開示の医薬組成物は、投与形態や剤形に応じた従来公知の添加物（例えば、賦形剤又は希釈剤）を含有してもよい。
【００４７】
経口投与に適した剤形としては、錠剤、粒子、液体又は粉末含有カプセル、トローチ、咀嚼剤、多粒子及びナノ粒子、ゲル、フィルムなどの固形製剤；懸濁液、溶液、シロップ及びエリキシルなどの液体製剤が挙げられる。前記賦形剤としては、セルロース、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、マンニトール及びクエン酸ナトリウムなどの担体；ポリビニルピロリジン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びゼラチンなどの造粒結合剤；澱粉グリコール酸ナトリウム及びケイ酸塩などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸などの滑沢剤；ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤；保存剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤及び着色剤が挙げられる。
【００４８】
本開示の医薬組成物の非経口投与としては、血流中、筋肉中又は内部器官中に直接投与することが挙げられる。非経口投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内及び皮下の投与を含む。非経口投与は、例えば、針注射器、針なし注射器及びその他の注入技術で行える。また、非経口投与に適した剤形としては、例えば、賦形剤及び／又は緩衝剤を含む水溶液が挙げられる。
【００４９】
［予防、改善、及び／又は治療方法］
本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病及び／又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療に使用できる。
本開示において、アルツハイマー病及び／又はレビー小体型認知症の予防とは、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の発症を抑制すること、或いは可逆的な軽度な認知障害よりも病態の進行を進めないことを含む。また、本開示において、アルツハイマー病及び／又はレビー小体型認知症の改善とは、アルツハイマー病及び／又はレビー小体型認知症の可逆的な軽度な認知障害の病態の進行が止まること、或いは、病態が軽度になることを含む。さらに、本開示において、アルツハイマー病及び／又はレビー小体型認知症の治療とは、病態の進行を遅らせる、或いはほとんど止まらせることを含む。
【００５０】
［評価方法］
本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤと神経細胞との結合を阻害する物質を評価する方法に関する。
第１の評価方法としては、評価対象物質及びＡＳＰＤを含有する混合液を、培養神経細胞に接触させること、前記接触後にＡＳＰＤ及び神経細胞にそれぞれ異なる標識をしてイメージングを行うこと、及び、前記イメージングのデータから神経細胞に対するＡＳＰＤの結合量の指標を得て、前記指標を用いて評価対象物質を評価することを含みうる。
第２の評価方法としては、評価対象物質存在下の培養神経細胞に、ＡＳＰＤを接触させること、前記接触後にＡＳＰＤ及び神経細胞にそれぞれ異なる標識をしてイメージングを行うこと、及び、前記イメージングのデータから神経細胞に対するＡＳＰＤの結合量の指標を得て、前記指標を用いて評価対象物質を評価することを含みうる。
【００５１】
第１の評価方法によれば、ＡＳＰＤと結合又は相互作用をする物質の、ＡＳＰＤと神経細胞との結合に対する結合阻害能を評価できる。
第２の評価方法によれば、神経細胞と結合又は相互作用をする物質の、ＡＳＰＤと神経細胞との結合に対する結合阻害能を評価できる。
【００５２】
前記神経細胞は、成熟神経細胞であることが好ましい。成熟神経細胞は、一又は複数の実施形態において、少なくとも１つの軸索、及び、少なくとも１つの樹状突起を有する神経細胞であることが挙げられる。
【００５３】
前記イメージング方法は、一又は複数の実施形態において、蛍光免疫染色及び蛍光顕微鏡観察が挙げられる。一又は複数の実施形態において、前記接触後、標識を行う前に、神経細胞及びＡＳＰＤを固定してもよい。
【００５４】
本態様は、ＡＳＰＤの結合量又はその指標を算出する場合、イメージデータからＡＰＳＤの大きな凝集体の情報、及び／又は、神経細胞に結合していない非特異的ＡＳＰＤの情報を排除することが容易である。これにより、一又は複数の実施形態において、定量性の向上、及び／又は、評価の感度の向上が可能になる。
【００５５】
ＡＳＰＤの結合量の指標は、一又は複数の実施形態において、神経細胞に対するＡＳＰＤの結合量そのものであってもよく、実施例に記載のようにＥＤ50或いはその比であってもよい。例えば、評価物質とＡＳＰＤとが共存する場合のＥＤ50が高いほど、ＡＳＰＤの神経細胞への結合を阻害する能力が高いと評価できる。
【００５６】
［スクリーニング方法］
本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤによる神経毒性を阻害する物質をスクリーニングする方法に関する。
第１のスクリーニング方法としては、候補物質及びＡＳＰＤを含有する混合液を、培養神経細胞に接触させること、前記接触後にＡＳＰＤ及び神経細胞にそれぞれ異なる標識をしてイメージングを行うこと、及び、前記イメージングのデータから神経細胞に対するＡＳＰＤの結合の指標を得て、前記指標を用いて候補化合物を選択することを含みうる。
第２のスクリーニング方法としては、候補物質存在下の培養神経細胞に、ＡＳＰＤを接触させること、前記接触後にＡＳＰＤ及び神経細胞にそれぞれ異なる標識をしてイメージングを行うこと、及び、前記イメージングのデータから神経細胞に対するＡＳＰＤの結合の指標を得て、前記指標を用いて候補物質を選択することを含みうる。
【００５７】
第１のスクリーニング方法によれば、ＡＳＰＤと結合又は相互作用をする物質であって、ＡＳＰＤと神経細胞との結合に対する結合阻害能を有する物質を、ＡＳＰＤによる神経毒性を阻害する物質の候補物質として選択できる。
第２のスクリーニング方法によれば、神経細胞と結合又は相互作用をする物質であって、ＡＳＰＤと神経細胞との結合に対する結合阻害能を有する物質を、ＡＳＰＤによる神経毒性を阻害する物質の候補物質として選択できる。
【００５８】
前記神経細胞及びイメージング方法については、本開示に係る評価方法と同様とすることができる。また、ＡＳＰＤの結合量の指標も、一又は複数の実施形態において、神経細胞に対するＡＳＰＤの結合量そのものであってもよく、ＥＤ50若しくはその比であってもよい。例えば、候補物質とＡＳＰＤとが共存する場合のＥＤ50が高いほど、ＡＳＰＤの神経毒性を阻害する能力が高いと評価できる。
【００５９】
本態様は、ＡＳＰＤの結合量又はその指標を算出する場合、イメージデータからＡＰＳＤの大きな凝集体の情報、及び／又は、神経細胞に結合していない非特異的ＡＳＰＤの情報を排除することが容易である。これにより、一又は複数の実施形態において、定量性の向上、及び／又は、スクリーニングの感度の向上が可能になる。
【００６０】
本開示は、一又は複数の実施形態において、以下に関しうる；
［１］  合成、単離、又は精製されたポリペプチドであって、
下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を含み、
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4      （Ｉ）（配列番号１）
Ｘ1は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、又はリジン（Ｌｙｓ）であり、
Ｘ2は、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、又はトレオニン（Ｔｈｒ）であり、
Ｘ3は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ4は、トリプトファン（Ｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、又はチロシン（Ｔｙｒ）である、ポリペプチド。
［２］  Ｘ3は、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、又はバリン（Ｖａｌ）である、［１］記載のポリペプチド。
［３］  Ｘ2は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、又はトレオニン（Ｔｈｒ）である、［１］又は［２］記載のポリペプチド。
［４］  合成、単離、又は精製されたポリペプチドであって、
下記式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含み、
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4      （ＩＩ）（配列番号２）
Ｘ1は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、又はリジン（Ｌｙｓ）であり、
Ｘ2は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ3は、ロイシン（Ｌｅｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、又はリジン（Ｌｙｓ）であり、
Ｘ4は、トリプトファン（Ｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、又はチロシン（Ｔｙｒ）である、ポリペプチド。
［５］  Ｘ2は、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、又はバリン（Ｖａｌ）である、［４］記載のポリペプチド。
［６］  Ｘ3は、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、又はリジン（Ｌｙｓ）である、［４］又は［５］に記載のポリペプチド。
［７］  合成、単離、又は精製されたポリペプチドであって、
ＨＡＮＷ、ＨＶＮＷ、ＨＦＨＷ、又はＨＦＹＷで表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
［８］  Ｎ末端に前記式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）、又は、ＨＡＮＷ、ＨＶＮＷ、ＨＦＨＷ若しくはＨＦＹＷで表わされるアミノ酸配列を有する、［１］から［７］のいずれかに記載のポリペプチド。
［９］アミノ酸配列の長さが、４〜５０アミノ酸である、［１］から［８］のいずれかに記載のポリペプチド。
［１０］  Ｃ末端のカルボキシル基が、除去又はアミド化されている、［１］から［９］のいずれかに記載のポリペプチド。
［１１］  ペプチド結合の少なくとも１つがＮ−アルキル化されている、［１］から［１０］のいずれか記載のポリペプチド。
［１２］  ＡＳＰＤと神経細胞との結合に対する結合阻害能を有する、［１］から［１１］のいずれかに記載のポリペプチド
［１３］  ［１］から［１２］のいずれかに記載のポリペプチドの構造を模した構造を有するペプチドミミックであって、ＡＳＰＤと神経細胞との結合に対する結合阻害能を有する、ペプチドミミック。
［１４］  ［１］から［１２］のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、前記ポリペプチドを発現するためのベクター。
［１５］  ［１］から［１２］ののいずれかに記載のポリペプチド又は［１３］に記載のペプチドミミックを含む、組成物。
［１６］  アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）と神経細胞との結合を阻害する物質を評価する方法であって、
評価対象物質及びＡＳＰＤを含有する混合液を、培養神経細胞に接触させること、又は、評価対象物質存在下の培養神経細胞に、ＡＳＰＤを接触させること、
前記接触後に、ＡＳＰＤ及び神経細胞にそれぞれ異なる標識をしてイメージングを行うこと、及び、
前記イメージングのデータから神経細胞に対するＡＳＰＤの結合の指標を得て、前記指標を用いて評価対象物質を評価すること、を含む、評価方法。
［１７］  アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）による神経毒性を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
候補物質及びＡＳＰＤを含有する混合液を、培養神経細胞に接触させること、又は、候補物質存在下の培養神経細胞に、ＡＳＰＤを接触させること、
前記接触後に、ＡＳＰＤ及び神経細胞にそれぞれ異なる標識をしてイメージングを行うこと、及び、
前記イメージングのデータから神経細胞に対するＡＳＰＤの結合の指標を得て、前記指標を用いて候補物質を選択すること、を含む、スクリーニング方法。
【００６１】
以下に、実施例を用いて本発明の一又は複数の実施形態をさらに説明する。
【実施例】
【００６２】
１．ＡＳＰＤ阻害ペプチドの評価
ＡＳＰＤの神経細胞への結合を阻害するペプチドの評価を、以下の方法で行った。【００６３】
工程１：ペプチドとＡＳＰＤとを混合してインキュベートした混合液を、培養された成熟神経細胞に添加する。
工程２：前記神経細胞を変性（固定）する。
工程３：神経細胞及びＡＳＰＤをそれぞれ免疫染色して、イメージングする。
工程４：画像を解析して神経細胞に結合したＡＳＰＤを定量する。
工程５：ＡＳＰＤ結合量及び／又はそれから得られる分析値を用いてペプチドを評価する。【００６４】
工程１〜３を、以下のように行った。
ペプチドと合成ＡＳＰＤとの混合液を１５分４℃でインキュベートしてＡＳＰＤの前処理を行い、この混合液を、９６ウェルプレートで培養していた初代培養ラット海馬神経細胞に添加した。
ＣＯ2インキュベータで１５分３７℃のインキュベートをして、ＰＢＳでウェルを洗浄した後、２％パラホルムアルデヒト（５０μｌ／ウェル）を加えて２０分３７℃で固定したのち、さらに、４％パラホルムアルデヒト（５０μｌ／ウェル）を加えて２０分３７℃で固定する。
洗浄、ブロッキングした後、抗ＡＳＰＤ抗体（ｍＡＳＤ３）と抗ＭＡＰ２抗体（商品名：ｓｃ−２０１７２、ＳＡＮＴＡＣＲＵＺ製）を含む一次抗体溶液を添加し、オーバーナイトする。洗浄後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ（商標）５６８抗マウス抗体（商品名：Ａ１１０３１，ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ（商標）４８８抗ラビット抗体（商品名：Ａ１１０３４，ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、及び、ＤＡＰＩ（商品名：Ｄ５２３、Ｄｏｊｉｎｄｏ製）を含む二次抗体溶液を添加し、蛍光顕微鏡観察した。【００６５】
顕微鏡観察で得られた画像の結果の一例を図１に示す。図１は、ＡＳＰＤ単独を神経細胞と接触させた場合と、ペプチドでＡＳＰＤを前処理した場合とで、添加するＡＳＰＤの濃度を変化させて比較している。図１において、大きな丸い像（青）が核で、細長い像（緑）が神経細胞の軸索及び樹上突起で、小さな丸い像（赤）がＡＳＰＤである。同図に示すとおり、ＡＳＰＤ単独の場合、添加するＡＳＰＤの濃度を高くするにつれて神経細胞の周辺にＡＳＰＤが増加しているのに対し、前記ペプチドで処理したＡＳＰＤの場合、添加するＡＳＰＤの濃度を高くしてもＡＳＰＤは増加しなかった。すなわち、前記ペプチドによりＡＳＰＤと神経細胞との結合が阻害されていることが示された。【００６６】
続けて、工程４〜５を、以下のように行った。
顕微鏡観察のデータから図２のような検量線を描き、直線性が維持される範囲での近似曲線を作成し、ＥＤ50を算出した。ＡＳＰＤ単独のＥＤ50に対するペプチドで処理したＡＳＰＤのＥＤ50の比で定義する“力価”を指標にペプチドのＡＳＰＤ結合阻害能を評価した。表１に示すペプチド０１〜１１の結果を図３に示す。表２に示すペプチド０１及び１２〜２４の結果を図４に示す。
力価＝ＥＤ50［ＡＳＰＤ＋ペプチド］／ＥＤ50［ＡＳＰＤ］【００６７】
【表１】
2017179647.tif 000003
【表２】
2017179647.tif 000004
【００６８】
図３に示す通り、ペプチド０２〜１１では、それぞれ、ＡＳＰＤ結合阻害能（力価）は１．５以上を示した。なかでも、ペプチド０５（ＨＨＮＷ）、０９（ＨＴＮＷ）、１０（ＨＡＮＷ）及び１１（ＨＶＮＷ）は、公知のＡＳＰＤ中和ペプチド０１（ＨＦＮＷ）と同程度のＡＳＰＤ結合阻害能（力価）を示した。【００６９】
また、図４に示すとおり、ペプチド１２〜２４では、それぞれ、ＡＳＰＤ結合阻害能（力価）は１．５以上を示した。なかでも、ペプチド１６（ＨＦＲＷ）及びペプチド２２（ＨＦＫＷ）は、公知のＡＳＰＤ中和ペプチド０１（ＨＦＮＷ）よりも優れたＡＳＰＤ結合阻害能（力価）を示した。【００７０】
２．ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）
合成ＡＳＰＤをチップ上に固相化し、アナライトとして下記表３に示すペプチドを流して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により解離定数（ＫD）を求めた。
用いたペプチドは、図３及び４のペプチド０１、０５、０８、０９、１５、及び１８であり、いずれも、ＡＳＰＤの神経細胞への結合の阻害効果を示したペプチドである。ネガティブコントロールとして、上記１の評価においてＡＳＰＤの神経細胞への結合を阻害できなかった２つのペプチド（ＨＮＮＷ（配列番号２７）、ＨＰＮＷ（配列番号２８））を使用した。
その結果を下記表３に示す。【００７１】
【表３】
2017179647.tif 000005
【００７２】
上記表３に示すとおり、上記１の評価においてＡＳＰＤの神経細胞への結合の阻害効果が認められたペプチドは、ＡＳＰＤに対して結合能を有することが示された。【００７３】
３．ペプチド末端の処理
ペプチド２２（ＨＦＫＷ）のＣ末端のＣＯＯＨをアミド化（−ＣＯＮＨ2）又は除去したペプチド、及びＮ末端のアミノ基を除去したペプチドを用いて、上述と同様にＡＳＰＤ結合阻害能（力価）を算出した。その結果を図５に示す。図５に示すとおり、Ｃ末の処理（アミド化又はＣＯＯＨの除去）を行うとペプチドのＡＳＰＤ阻害能が向上することが示された。
また、ペプチド２２以外の他のペプチドでもＣ末の処理（アミド化又はＣＯＯＨの除去）を行うとペプチドのＡＳＰＤ阻害能が向上する傾向が示された。【００７４】
４．ペプチド結合のＮ−メチル化
ペプチド２２（ＨＦＫＷ）のペプチド結合の１つ又は２つをＮ−メチル化して、上記２と同様に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により解離定数（ＫD）を求めた。その結果、Ｎ−メチル化したペプチド２２は、いずれも、ＡＳＰＤに対して結合能が認められた。
【図１】
2017179647.tif 000006
【図２】
2017179647.tif 000007
【図３】
2017179647.tif 000008
【図４】
2017179647.tif 000009
【図５】
2017179647.tif 000010
【配列表】
2017179647000001.app
【国際調査報告】
2017179647.tif 000011
2017179647.tif 000012
2017179647.tif 000013
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