(57)【要約】  酸素濃度の影響を受けにくいヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するHbA1cデヒドロゲナーゼ、及びそれを用いたＨｂＡ1cの測定方法および測定試薬キットを提供する。  ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用し、コニオカエタ(Coniochaeta)属等由来のアマドリアーゼの２８０位、２６９位、５４位、２４１位又は２６７位に対応する位置で１又は複数のアミノ酸残基を置換することにより得られる、デヒドロゲナーゼ活性を有し、HbA1cに直接作用するHbA1cデヒドロゲナーゼ並びにこれを用いたHbA1cの測定方法、測定試薬キット及びセンサー。  本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは、ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用し、オキシダーゼ活性が低減し及び／又はデヒドロゲナーゼ活性が向上しており、ヘモグロビンＡ１ｃのプロテアーゼ処理が不要であるのみならず、HbA1c測定において電子メディエーターの利用が可能となり、酸素濃度の影響を低減させ、高感度でHbA1cを測定することができる。
2017183717.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料にヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するHbA1cデヒドロゲナーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素ではない還元型電子メディエーターもしくは消費される酸素ではない酸化型電子メディエーターを測定することを含む、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項２】
測定がHbA1cデヒドロゲナーゼ、HbA1cデヒドロゲナーゼを含む酵素電極、又は該酵素電極を作用電極として有する酵素センサー、及び酸素ではない電子メディエーターを用いる電気化学的測定であるか、或いは、HbA1cデヒドロゲナーゼ、発色基質、及び、酸素ではない電子メディエーターを用いる吸光度測定である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
改変前のヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼと比較して、オキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性の比（ＯＸ／ＤＨ）が低減されたHbA1cに直接作用するデヒドロゲナーゼであって、
(i)  アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位、２６９位、５４位、２４１位及び２６７位からなる群より選択される位置に対応する位置の１以上のアミノ酸が置換されており、ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するHbA1cデヒドロゲナーゼ、
(ii)  前記(i)のHbA1cデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位、２６９位、５４位、２４１位及び２６７位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するHbA1cデヒドロゲナーゼ、
(iii)  前記(i)のHbA1cデヒドロゲナーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１、配列番号３−１４のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、かつ、配列番号１の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有し、ここで配列番号１の相同性領域は配列番号１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなるものであり、ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するHbA1cデヒドロゲナーゼ、
(iv)  前記(i)のHbA1cデヒドロゲナーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１、配列番号３−１４のいずれかのアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するHbA1cデヒドロゲナーゼ、或いは
(v)  前記(i)のHbA1cデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１の保存領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの由来する天然アマドリアーゼの対応する保存領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有し、ここで配列番号１の保存領域は配列番号１の第１１、１２、１３、１５、１７、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３１、３６、３７、４１、４６、４７、５０、５１、５２、５４、５６、５７、５８、７５、７９、８２、８４、８５、９３、９５、１４９、１５８、１５９、１６２、１６５、１６６、１７７、１８０、２０２、２０８、２１８、２２０、２２１、２２２、２２４、２２８、２３３、２３９、２４３、２４６、２５０、２５５、２５８、２６０、２６６、２６７、２７０、２７２、２７７、２７８、２８０、２８１、２８２、２８４、２８５、２８６、３１８、３２１、３２６、３２９、３３４、３３９、３４６、３４７、３４８、３５１、３５２、３５４、３５８、３５９、３６２、３６３、３７０、３７３、３７６、３８２、３８５、３８６、３８９、４０６、４０７、４０９、４１８、４２５及び４２７位からなるものであり、ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するHbA1cデヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、トレオニン及びアスパラギンからなる群より選択される極性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群より選択される荷電アミノ酸、又はメチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン、トリプトファン、バリン又はアラニンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における５４位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン又はバリンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２４１位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸又はヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン、トリプトファン、バリン又はアラニンに置換されている、
請求項３に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
【請求項５】
配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン又はメチオニンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン又はトリプトファンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における５４位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン又はアラニンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２４１位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸又はリシンに置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン又はトリプトファンに置換されている、
請求項４に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
【請求項６】
配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン又はメチオニンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における５４位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン又はアラニンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２４１位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸又はリシンに置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
請求項５に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
【請求項７】
配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、又はセリンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２４１位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミンに置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
請求項５に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
【請求項８】
配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン又はヒスチジンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、
請求項５に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
【請求項９】
配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、
請求項５に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
【請求項１０】
オキシダーゼ活性が改変前のアマドリアーゼ（１００％）と比較して６０％未満に低減されている、又は、オキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性の比（ＯＸ／ＤＨ）が改変前のアマドリアーゼ（１００％）と比較して４０％未満に低減されている、請求項３〜９のいずれか１項に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
【請求項１１】
前記アマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、又はアルスロバクター(Arthrobacter)属由来である、請求項３〜１０のいずれか１項に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
【請求項１２】
配列番号１、配列番号３−１４、又は１６−２６のいずれかに示すアミノ酸配列を有し、請求項３〜９のいずれかに規定したアミノ酸置換を有する、請求項３〜１１のいずれか１項に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
【請求項１３】
さらに、HbA1cデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下からなる群より選択される位置に対応する位置にアミノ酸置換又は欠失を１以上有し、ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有する、請求項３〜１２のいずれか１項に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ、
（Ａ）６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９位、６８位、３５６位、６４位、及び／又は９９位への置換、
（Ｂ）２６２位、２５７位、２４９位、２５３位、３３７位、３４０位、２３２位、１２９位、１３２位、１３３位、４４位、２５６位、２３１位及び／又は８１位への置換、並びに
（Ｃ）カルボキシル末端の４３５位、４３６位及び４３７位の３アミノ酸残基の欠失。
【請求項１４】
さらに、HbA1cデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸の１以上が、以下からなる群より選択されるアミノ酸に置換されており又は欠失しており、ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有する、請求項１３に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ、
（Ａ）６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸の、アラニン、アスパラギン又はアスパラギン酸への置換、
６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸の、ヒスチジン又はアラニンへの置換、
１０２位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の、リジンへの置換 
１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸の、アラニン、リジン、又はアルギニンへの置換、
１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のロイシン又はチロシンへの置換、
１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のリジン又はアルギニンへの置換、
３５５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換、
４１９位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、
６８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、
３５６位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のトレオニンへの置換、
６４位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへの置換、
９９位のヒスチジンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換、
（Ｂ）２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、
２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステイン、セリン、トレオニンへの置換、
２４９位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
３３７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、
２３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
１２９位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
１３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
１３３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへの置換、
４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、
２５６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
２３１位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
８１位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、並びに（Ｃ）４３５位のプロリン、４３６位のリジン及び４３７位のロイシンに対応する位置のカルボキシル末端３アミノ酸の欠失。
【請求項１５】
請求項３〜１４のいずれか１項に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼを含むHbA1c測定試薬キット。
【請求項１６】
請求項３〜１４のいずれか１項に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼを含む酵素電極。
【請求項１７】
請求項１６に記載の酵素電極を作用電極として有する酵素センサー。
【請求項１８】
HbA1cデヒドロゲナーゼが請求項３〜１４のいずれか１項に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼである、請求項１又は２に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨｂＡ１ｃに作用する、デヒドロゲナーゼ活性が向上したアマドリアーゼ、オキシダーゼ活性が低減されたアマドリアーゼ、デヒドロゲナーゼ活性が向上しオキシダーゼ活性が低減されたアマドリアーゼ、その遺伝子および組換え体ＤＮＡならびに該アマドリアーゼの製造法に関する。また本発明は、糖尿病の診断用酵素として、センサーとして、また、糖尿病マーカーの測定キットに有利に利用され得るＨｂＡ１ｃに作用するデヒドロゲナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化タンパク質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、タンパク質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。タンパク質のアミノ基としてはアミノ末端のαアミノ基、タンパク質中のリジン残基側鎖のεアミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化タンパク質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。【０００３】
これら生体内で生じる糖化タンパク質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。【０００４】
このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、アマドリアーゼを用いる酵素的方法、すなわち、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端より遊離させたα−フルクトシルバリルヒスチジン（以降「αＦＶＨ」と表す。）もしくはα−フルクトシルバリン（以降「αＦＶ」と表す。）を定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１〜７参照。）。【０００５】
さらに、アマドリアーゼを用いたＨｂＡ１ｃの測定方法としては、ＨｂＡ１ｃをＧｌｕ−Ｃプロテアーゼを用いて消化し、糖化されたβ鎖アミノ末端のバリンを含む６アミノ酸からなるα−フルクトシルヘキサペプチド（α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸、以降αＦ６Ｐと表す）を遊離させたのちに、遊離したαＦ６Ｐを定量する方法がある（例えば、特許文献１６、１７、１８、１９参照。）。この方法は、ＩＦＣＣ（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine）により定められたＨｂＡ１ｃ測定法（非特許文献１０参照）に則った、酵素によるＨｂＡ１ｃの測定方法である。【０００６】
しかしながら、プロテアーゼやペプチダーゼは、アマドリアーゼ、ペルオキシダーゼ、及び他のタンパク質試薬にも作用しうる。そこで本発明者らはプロテアーゼを必要とせずＨｂＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼを開発した（特許文献２０）。また類似の報告例がある（特許文献２１）。これらのアマドリアーゼは糖化基質を酸化する際に、電子を酸素分子に伝達する。【０００７】
アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸もしくはその誘導体（「アマドリ化合物」ともいう）を酸化して、グリオキシル酸またはα−ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する。【０００８】
アマドリアーゼは、細菌、酵母、真菌から見出されているが、特にＨｂＡ１ｃの測定に有用である、αＦＶＨおよび／またはαＦＶに対する酵素活性を有するアマドリアーゼとしては、例えば、コニオカエタ（Coniochaeta）属、ユーペニシリウム（Eupenicillium）属、ピレノケータ（Pyrenochaeta）属、アルスリニウム（Arthrinium）属、カーブラリア（Curvularia）属、ネオコスモスポラ（Neocosmospora）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、フェオスフェリア（Phaeosphaeria）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、エメリセラ（Emericella）属、ウロクラディウム（Ulocladium）属、ペニシリウム（Penicillium）属、フザリウム（Fusarium）属、アカエトミエラ（Achaetomiella）属、アカエトミウム（Achaetomium）属、シエラビア（Thielavia）属、カエトミウム（Chaetomium）属、ゲラシノスポラ（Gelasinospora）属、ミクロアスカス（Microascus）属、レプトスフェリア（Leptosphaeria）属、オフィオボラス（Ophiobolus）属、プレオスポラ（Pleospora）属、コニオケチジウム（Coniochaetidium）属、ピチア（Pichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、デバリオマイセス（Debaryomyces）属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、６〜１５、非特許文献１〜１１参照。）。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。【０００９】
アマドリアーゼはペルオキシダーゼと共役させ、発色基質を利用することにより、試料中の糖化基質の測定に利用することができる。従来のアマドリアーゼは糖化基質を酸化する際に、酸素分子に電子を伝達することができる。この活性をオキシダーゼ活性という。一方で、従来のアマドリアーゼは糖化基質を酸化する際に、酸素分子とは異なる電子アクセプター（電子メディエーター）に電子を伝達することもできる。この活性をデヒドロゲナーゼ活性という。酵素のオキシダーゼ活性を低減しデヒドロゲナーゼ活性を増大させると、糖化基質を酸化する際に、電子アクセプター（電子メディエーター）に優先的に電子を伝達することができる。そのため、試料中の酸素の影響を受けることなく糖化基質に由来する電子の測定を行うことができる。【００１０】
公知の文献中にアマドリアーゼのデヒドロゲナーゼ活性の向上に関する開示がみられる：例えば、Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの５６位のアスパラギンをアラニンに置換することにより、デヒドロゲナーゼ活性におけるαＦＶに対するＶｍａｘ／Ｋｍが２．３倍向上することが示されている（特許文献１６参照）。しかしながら、開示されている変異体はオキシダーゼ活性におけるαＦＶに対するＶｍａｘ／Ｋｍも野生型と比較して１．２倍向上しているため、酸素の影響を依然として受けてしまうと考えられる。また開示されている変異体はαＦＶを基質とするが、ＨｂＡ１ｃそのものには直接作用しないと考えられる。【００１１】
特許文献２２は、アマドリアーゼの熱安定性を向上させる変異を報告しており、Coniochaeta属由来アマドリアーゼの267位のPheがTyrに改変された熱安定性向上変異体（F267Y）が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００４／１０４２０３号
【特許文献２】国際公開第２００５／４９８５７号
【特許文献３】特開２００１−９５５９８号公報
【特許文献４】特公平０５−３３９９７号公報
【特許文献５】特開平１１−１２７８９５号公報
【特許文献６】国際公開第９７／１３８７２号
【特許文献７】特開２０１１−２２９５２６号公報
【特許文献８】特開２００３−２３５５８５号公報
【特許文献９】特開２００４−２７５０１３号公報
【特許文献１０】特開２００４−２７５０６３号公報
【特許文献１１】特開２０１０−３５４６９号公報
【特許文献１２】特開２０１０−５７４７４号公報
【特許文献１３】国際公開第２０１０／４１７１５号
【特許文献１４】国際公開第２０１０／４１４１９号
【特許文献１５】国際公開第２０１１／１５３２５号
【特許文献１６】国際公開第２０１１／０１５３２５号
【特許文献１７】国際公開第２００８／１０８３８５号
【特許文献１８】国際公開第２０１５／００５２５８号
【特許文献１９】国際公開第２０１３／１６２０３５号
【特許文献２０】国際公開第２０１５／０６０４２９号
【特許文献２１】国際公開第２０１５／００５２５７号
【特許文献２２】国際公開第２０１３／１００００６号
【非特許文献】
【００１３】
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【非特許文献２】Biotechnol. Bioeng. 106, 358-66, 2010
【非特許文献３】J. Biosci. Bioeng. 102, 241-3, 2006
【非特許文献４】Eur. J. Biochem. 242, 499-505, 1996
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【非特許文献７】Biosci. Biotechnol. Biochem.59, 487-91,1995
【非特許文献８】Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 813-819, 2007
【非特許文献９】Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 1256-61, 2002
【非特許文献１０】Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 2323-29, 2002
【非特許文献１１】Biotechnol. Letters 27, 27-32,2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ＨｂＡ１ｃに作用する、オキシダーゼ活性が低下し、デヒドロゲナーゼ活性が増大したアマドリアーゼを提供することを目的とする。また本発明は、ＨｂＡ１ｃに作用する、活性が溶存酸素レベルの影響をほとんど受けないアマドリアーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
酵素のオキシダーゼ活性の低下およびデヒドロゲナーゼ活性を付与するための情報はほとんど開示されていない現状の中で、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼに対して、特定のアミノ酸残基の置換を導入することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成させた。【００１６】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
[１]  試料にヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するHbA1cデヒドロゲナーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素ではない還元型電子メディエーターもしくは消費される酸素ではない酸化型電子メディエーターを測定することを含む、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
[２]  測定がHbA1cデヒドロゲナーゼ、HbA1cデヒドロゲナーゼを含む酵素電極、又は該酵素電極を作用電極として有する酵素センサー、及び酸素ではない電子メディエーターを用いる電気化学的測定であるか、或いは、HbA1cデヒドロゲナーゼ、発色基質、及び、酸素ではない電子メディエーターを用いる吸光度測定である、１に記載の測定方法。
[３]  改変前のヘモグロビンＡ１ｃに直接作用する(親)アマドリアーゼと比較して、オキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性の比（ＯＸ／ＤＨ）が低減されたHbA1cに直接作用するデヒドロゲナーゼであって、
(i)  アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位、２６９位、５４位、２４１位及び２６７位からなる群より選択される位置に対応する位置の１以上のアミノ酸が置換されており、ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するHbA1cデヒドロゲナーゼ、
(ii)  前記(i)のHbA1cデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位、２６９位、５４位、２４１位及び２６７位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するHbA1cデヒドロゲナーゼ、
(iii)  前記(i)のHbA1cデヒドロゲナーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１、配列番号３−１４のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、かつ、配列番号１の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有し、ここで配列番号１の相同性領域は配列番号１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなるものであり、ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するHbA1cデヒドロゲナーゼ、
(iv)  前記(i)のHbA1cデヒドロゲナーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１、配列番号３−１４のいずれかのアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するHbA1cデヒドロゲナーゼ、或いは
(v)  前記(i)のHbA1cデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１の保存領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの由来する天然アマドリアーゼの対応する保存領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有し、ここで配列番号１の保存領域は配列番号１の第１１、１２、１３、１５、１７、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３１、３６、３７、４１、４６、４７、５０、５１、５２、５４、５６、５７、５８、７５、７９、８２、８４、８５、９３、９５、１４９、１５８、１５９、１６２、１６５、１６６、１７７、１８０、２０２、２０８、２１８、２２０、２２１、２２２、２２４、２２８、２３３、２３９、２４３、２４６、２５０、２５５、２５８、２６０、２６６、２６７、２７０、２７２、２７７、２７８、２８０、２８１、２８２、２８４、２８５、２８６、３１８、３２１、３２６、３２９、３３４、３３９、３４６、３４７、３４８、３５１、３５２、３５４、３５８、３５９、３６２、３６３、３７０、３７３、３７６、３８２、３８５、３８６、３８９、４０６、４０７、４０９、４１８、４２５及び４２７位からなるものであり、ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するHbA1cデヒドロゲナーゼ。
[４]  配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、トレオニン及びアスパラギンからなる群より選択される極性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群より選択される荷電アミノ酸、又はメチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン、トリプトファン、バリン又はアラニンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における５４位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン又はバリンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２４１位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸又はヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン、トリプトファン、バリン又はアラニンに置換されている、
３に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
[５]  配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン又はメチオニンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン又はトリプトファンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における５４位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン又はアラニンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２４１位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸又はリシンに置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン又はトリプトファンに置換されている、
４に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
[６]  配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン又はメチオニンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における５４位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン又はアラニンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２４１位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸又はリシンに置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
５に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
[７]  配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、又はセリンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２４１位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミンに置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
５に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
[８]  配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン又はヒスチジンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、
５に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
[９]  配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、
５に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
[１０]  オキシダーゼ活性が改変前のアマドリアーゼ（１００％）と比較して６０％未満に低減されている、又は、オキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性の比（ＯＸ／ＤＨ）が改変前のアマドリアーゼ（１００％）と比較して４０％未満に低減されている、３〜９のいずれか１項に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
[１１]  前記アマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、又はアルスロバクター(Arthrobacter)属由来である、３〜１０のいずれか１項に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
[１２]  配列番号１、配列番号３−１４、又は１６−２６のいずれかに示すアミノ酸配列を有し、３〜９のいずれかに規定したアミノ酸置換を有する、３〜１１のいずれか１項に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ。
[１３]  さらに、HbA1cデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下からなる群より選択される位置に対応する位置にアミノ酸置換又は欠失を１以上有し、ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有する、３〜１２のいずれか１項に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ、
（Ａ）６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９位、６８位、３５６位、６４位、及び／又は９９位への置換、
（Ｂ）２６２位、２５７位、２４９位、２５３位、３３７位、３４０位、２３２位、１２９位、１３２位、１３３位、４４位、２５６位、２３１位及び／又は８１位への置換、並びに
（Ｃ）カルボキシル末端の４３５位、４３６位及び４３７位の３アミノ酸残基の欠失。
[１４]  さらに、HbA1cデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸の１以上が、以下からなる群より選択されるアミノ酸に置換されており又は欠失しており、ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有する、１３に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼ、
（Ａ）６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸の、アラニン、アスパラギン又はアスパラギン酸への置換、
６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸の、ヒスチジン又はアラニンへの置換、
１０２位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の、リジンへの置換 
１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸の、アラニン、リジン、又はアルギニンへの置換、
１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のロイシン又はチロシンへの置換、
１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のリジン又はアルギニンへの置換、
３５５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換、
４１９位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、
６８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、
３５６位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のトレオニンへの置換、
６４位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへの置換、
９９位のヒスチジンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換、
（Ｂ）２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、
２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステイン、セリン、トレオニンへの置換、
２４９位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
３３７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、
２３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
１２９位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
１３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
１３３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへの置換、
４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、
２５６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
２３１位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
８１位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、並びに（Ｃ）４３５位のプロリン、４３６位のリジン及び４３７位のロイシンに対応する位置のカルボキシル末端３アミノ酸の欠失。
[１５]  ３〜１４のいずれか１項に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼを含むHbA1c測定試薬キット。
[１６]  ３〜１４のいずれか１項に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼを含む酵素電極。
[１７]  １６に記載の酵素電極を作用電極として有する酵素センサー。
[１８]  HbA1cデヒドロゲナーゼが３〜１４のいずれか１項に記載のHbA1cデヒドロゲナーゼである、１又は２に記載の測定方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-086592号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、プロテアーゼ等を処方することなくＨｂＡ１ｃを測定することができ、酸素の影響を受けにくく、さらに高感度測定が可能な糖尿病の診断用酵素として、また、糖尿病マーカー測定用センサーに用いることができる優れたアマドリアーゼ、およびそれをコードする遺伝子等を提供することができる。このアマドリアーゼを用いると、プロテアーゼ等を処方することなく、酸素存在下でもより正確に糖化ヘモグロビンの測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一性及び類似アミノ酸を例示する図である。Co、Et、Py、Ar、Cc、Nv、Cn、Pn、An、En、Ul及びPjをアライメントした。
【図１−２】図１−２は、図１−１の続きである。
【図１−３】図１−３は、図１−２の続きである。
【図１−４】図１−４は、図１−３の続きである。
【図１−５】図１−５は、図１−４の続きである。
【図２−１】各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一性及び類似アミノ酸を例示する図である。図１に示すアマドリアーゼに加え、Ao2、Af2、At、Fo、Ao1、Af1、Pi、Dhをアライメントした。
【図２−２】図２−２は、図２−１の続きである。
【図２−３】図２−３は、図２−２の続きである。
【図２−４】図２−４は、図２−３の続きである。
【図２−５】図２−５は、図２−４の続きである。
【図２−６】図２−６は、図２−５の続きである。
【図２−７】図２−７は、図２−６の続きである。
【図２−８】図２−８は、図２−７の続きである。
【図２−９】図２−９は、図２−８の続きである。
【図２−１０】図２−１０は、図２−９の続きである。
【図３】アマドリアーゼのオキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性を示す。図３は酵素反応を説明するための模式図であって、酵素の基質特異性等の特性を限定するものではない。
【図４】A1cDHを用いたHbA1c測定の結果を示す。
【図５】種々のHbA1c濃度における電流応答値をプロットした結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のアマドリアーゼは糖化タンパク質や糖化ペプチドを基質としうる。
【００２０】
（糖化タンパク質、ヘモグロビンA1c）
本発明における糖化タンパク質とは、非酵素的に糖化されたタンパク質を指す。糖化タンパク質は生体内、外を問わず存在し、生体内に存在する例としては、血液中の糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、糖化ヘモグロビンの中でもヘモグロビンのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）と言う。生体外に存在する例としては、タンパク質やペプチドと糖が共存する液状調味料などの飲食品や輸液などがある。
【００２１】
（糖化ペプチド、フルクトシルペプチド）
本発明における糖化ペプチドとは、糖化タンパク質由来の非酵素的に糖化されたペプチドを指し、ペプチドが直接非酵素的に糖化されたものや、プロテアーゼ等により糖化タンパク質が分解された結果生じたものや糖化タンパク質を構成する（ポリ）ペプチドが糖化されたものが含まれる。糖化ペプチドをフルクトシルペプチドと表記することもある。糖化タンパク質において、糖化を受けるペプチド側のアミノ基としては、アミノ末端のα−アミノ基、ペプチド内部のリジン残基側鎖のε−アミノ基などが挙げられるが、本発明における糖化ペプチドとは、より具体的には、α−糖化ペプチド（α−フルクトシルペプチド）である。α−糖化ペプチドは、Ｎ末端のα−アミノ酸が糖化された糖化タンパク質から何らかの手段、例えば、プロテアーゼによる限定分解などにより遊離させて形成される。例えば、対象の糖化タンパク質がヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）である場合、該当するα−糖化ペプチドは、Ｎ末端が糖化されているＨｂＡ１ｃのβ鎖から切り出される糖化されたペプチドを指す。１４６残基のアミノ酸により構成されているＨｂＡ１ｃのβ鎖もまたα−糖化ペプチドに該当する（αＦ１４６Ｐ）。
【００２２】
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質（基質）は、ＨｂＡ１ｃ、より具体的にはＨｂＡ１ｃのβ鎖である。別の実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質はＨｂＡ１ｃのβ鎖から切り出されるα−糖化ペプチド、例えばαＦＶ〜αＦ１２８Ｐ、αＦＶ〜αＦ６４Ｐ、αＦＶ〜αＦ３２Ｐ、αＦＶ〜αＦ１６Ｐ、例えばαＦ６Ｐ（α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸）である。別の実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質はαＦＶＨ（α−フルクトシルバリルヒスチジン）又はαＦＶ（α−フルクトシルバリン）である。
【００２３】
（アマドリアーゼ）
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等とも称され、酸素の存在下で、イミノ２酢酸またはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸またはα−ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物または植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母または細菌等から得ることができる。
【００２４】
（HbA1cオキシダーゼ）
種々のアマドリアーゼのうちHbA1cそのものを基質として認識し、HbA1cを直接酸化する活性を有するものを本明細書においてHbA1cオキシダーゼといい、これをA1cOXと記載することがある。HbA1cに直接作用するアマドリアーゼは、例えば国際公開第２０１５／０６０４２９号の記載に基づき取得することができる。またこれは国際公開第２０１５／００５２５７号の記載に基づき取得することもできる。参照によりそれらの全内容を本明細書に組み入れる。HbA1cオキシダーゼは、このような公知文献に記載された一又は複数のアミノ酸置換を有しうる。また公知のHbA1cオキシダーゼにさらに基質特異性を改変する変異等が導入されてもよい。
【００２５】
ＨｂＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが有しうるアミノ酸置換の例として、配列番号１のアミノ酸配列における以下の位置に対応する位置におけるアミノ酸置換が挙げられる。
（ａ）６２位（アルギニン）
（ｂ）６３位（ロイシン）
（ｃ）１０２位（グルタミン酸）
（ｄ）１０６位（アスパラギン酸）
（ｅ）１１０位（グルタミン）
（ｆ）１１３位（アラニン）
（ｇ）３５５位（アラニン）
（ｈ）４１９位（アラニン）
（ｉ）６８位（アスパラギン酸）
（ｊ）３５６位（アラニン）
（ｋ）６４位（アルギニン）
（ｌ）９９位（ヒスチジン）
この場合、好ましくは、（ａ）配列番号１の６２位に対応する位置のアミノ酸は、アスパラギン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）配列番号１の６３位に対応する位置のアミノ酸は、ヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換され得る。好ましくは（ｃ）配列番号１の１０２位に対応する位置のアミノ酸は、リジンへと置換され得る。好ましくは（ｄ）配列番号１の１０６位に対応する位置のアミノ酸は、アラニン、リジン、又はアルギニンへと置換され得る。好ましくは（ｅ）配列番号１の１１０位に対応する位置のアミノ酸はロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換され得る。好ましくは（ｆ）配列番号１の１１３位に対応する位置のアミノ酸はリジン又はアルギニンへと置換され得る。好ましくは（ｇ）配列番号１の３５５位に対応する位置のアミノ酸はセリンへと置換され得る。場合により（ｈ）配列番号１の４１９位に対応する位置のアミノ酸はリジンへと置換されていてもよい。場合により（ｉ）配列番号１の６８位に対応する位置のアミノ酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）配列番号１の３５６位に対応する位置のアミノ酸はスレオニンへと置換されてもよい。場合により（ｋ）配列番号１の６４位に対応する位置のアミノ酸はグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。場合により（ｌ）配列番号１の９９位に対応する位置のアミノ酸はセリンへと置換され得る。
【００２６】
特定の実施形態においてHbA1cオキシダーゼは上記の変異とは別に、または上記の変異に加えて、以下の位置またはこれに対応する位置において１以上のアミノ酸置換を有し得る：
（l）配列番号１の６７位、
（m）配列番号１の７２位、
（n）配列番号１の７６位、
（o）配列番号１の９６位、
（p）配列番号１の１０９位、
（q）配列番号１の１１６位
場合により（l）配列番号１の６７位に対応する位置のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により（m）配列番号１の７２位に対応する位置のアミノ酸はセリンでありうる。場合により（n）配列番号１の７６位に対応する位置のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により（o）配列番号１の９６位に対応する位置のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により（p）配列番号１の１０９位に対応する位置のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により（q）配列番号１の１１６位に対応する位置のアミノ酸はアルギニンでありうる。
【００２７】
これらの位置（62位/63位/102位/106位/110位/113位/355位/419位/68位/356位/64位/99位、並びに67位/72位/76位/96位/109位/116位）の変異は、アマドリアーゼの基質特異性を改変する変異の例である。ただしこれは例示であり、基質特異性を改変する変異はこれに限らない。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、一又は複数の基質特異性を改変する変異を有する。
【００２８】
（本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼ）
ある実施形態において、本発明はHbA1cデヒドロゲナーゼを提供する。HbA1cデヒドロゲナーゼは、アマドリアーゼに本発明の変異を導入することにより作製しうる。ある実施形態において、HbA1cデヒドロゲナーゼはHbA1cオキシダーゼ（A1cOX）に基づき取得することができる。HbA1cオキシダーゼとしては上記のものが例示されるがこれに限られず、HbA1cを基質として認識しHbA1cを直接酸化するものであればどのようなものでもよい。別の実施形態ではアマドリアーゼに本発明の変異を導入してデヒドロゲナーゼ活性の向上したアマドリアーゼを作製し、次いでこれに基質特異性を改変する変異を導入してHbA1ｃに直接作用する、HbA1cデヒドロゲナーゼを作製しうる。
【００２９】
本明細書においてHbA1cデヒドロゲナーゼとは、本発明の変異を導入する前の(親)アマドリアーゼと比較して、変異導入後のアマドリアーゼの、デヒドロゲナーゼ活性が向上した、オキシダーゼ活性が低減された、デヒドロゲナーゼ活性が向上しなおかつオキシダーゼ活性が低減された、又はオキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性の比（ＯＸ／ＤＨ）が低減された、HbA1cに作用するアマドリアーゼをいう。これは本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼがオキシダーゼ活性を有することを排除するものではない。また、HbA1cを基質として全く認識しない、すなわちHbA1cに全く作用しないアマドリアーゼは本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼに含まれない。
【００３０】
ある実施形態において、本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼ（配列番号１）に基づき作製されたHbA1cデヒドロゲナーゼである。ある実施形態において、本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号３）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号４）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号６）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号７）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号９）、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１０）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１３）、Aspergillus oryzae由来のアマドリアーゼAo2(配列番号１９)、Aspergillus fumigatus由来のアマドリアーゼAf2(配列番号２０)、Aspergillus terreus由来のアマドリアーゼAt(配列番号２１)、Fusarium oxysporum由来のアマドリアーゼFo（配列番号２２）、Aspergillus oryzae由来のアマドリアーゼAo1(配列番号２３)、Aspergillus fumigatus由来のアマドリアーゼAf1(配列番号２４)、Pichia sp.由来のアマドリアーゼPi（配列番号２５）、Debaryomyces hansenii由来のアマドリアーゼDh（配列番号２６）又はそれらの均等物に基づき作製されたHbA1cデヒドロゲナーゼである。
【００３１】
このようなHbA1cデヒドロゲナーゼの例としては、配列番号１、配列番号３−１４又は配列番号１６−２６のいずれかと高い配列同一性（例えば、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するアミノ酸配列を有するアマドリアーゼおよび配列番号１、配列番号３−１４又は配列番号１６−２６のいずれかにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼを挙げることができる。
【００３２】
なお、本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは例えば、Eupenicillium属、Pyrenochaeta属、Arthrinium属、Curvularia属、Neocosmospora属、Cryptococcus属、Phaeosphaeria属、Aspergillus属、Emericella属、Ulocladium属、Penicillium属、Fusarium属、Achaetomiella属、Achaetomium属、Thielavia属、Chaetomium属、Gelasinospora属、Microascus属、Leptosphaeria属、Ophiobolus属、Pleospora属、Coniochaetidium属、Pichia属、Corynebacterium属、Agrobacterium属、Arthrobacter属、Debaryomyces属などの生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでもよい。これらの中でもＨｂＡ１ｃに作用し、デヒドロゲナーゼ活性を有し、アミノ酸配列が上記のように配列番号１、配列番号３−１４又は配列番号１６−２６と高い配列同一性を有するものが好ましい。
【００３３】
HbA1cデヒドロゲナーゼは、HbA1cオキシダーゼのアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基を置換する、または付加する、または欠失させることによって得ることができる。
【００３４】
（デヒドロゲナーゼ活性の向上／オキシダーゼ活性の低減をもたらす置換）
デヒドロゲナーゼ活性の向上及び／又はオキシダーゼ活性の低減をもたらすアミノ酸の置換として、配列番号１のアミノ酸配列における以下の位置に対応する位置のアミノ酸置換が挙げられる。これらを本発明のデヒドロゲナーゼ活性を向上させる変異、本発明のオキシダーゼ活性を低減させる変異、本発明のデヒドロゲナーゼ活性を向上させ及び／又はオキシダーゼ活性を低減させる変異、或いは単に本発明の変異又は本発明の置換ということがある。
【００３５】
（１）２８０位に対応する位置の置換、例えば、グルタミン、セリン、トレオニン及びアスパラギンからなる群より選択される極性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択される荷電アミノ酸、又はメチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸への置換。
（２）２６７位に対応する位置の置換、例えばチロシン、ロイシン、メチオニン、トリプトファン、イソロイシン、バリン、システイン又はアラニンからなる群より選択される疎水性アミノ酸残基への置換。
（３）２６９位に対応する位置の置換、例えばチロシン、ロイシン、メチオニン、トリプトファン、イソロイシン、バリン、システイン又はアラニンからなる群より選択される疎水性アミノ酸残基への置換。
（４）５４位に対応する位置の置換、例えばアスパラギン、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン又はバリンへの置換。
（５）２４１位に対応する位置の置換、例えばグルタミン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン又はヒスチジンへの置換。
【００３６】
本明細書では便宜上、グルタミン、セリン、トレオニン及びアスパラギンを極性アミノ酸ということがある。またアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、及びヒスチジンを荷電アミノ酸ということがある。またアラニン、システイン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンを疎水性アミノ酸ということがある。またメチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリンを嵩高いアミノ酸ということがある。
【００３７】
本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは、上記アミノ酸置換を少なくとも１つ有していればよく、複数のアミノ酸置換を有していてもよい。例えば、上記アミノ酸置換の１、２、３、４、又は５を有している。
【００３８】
その中でも、以下のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸の置換を有しているデヒドロゲナーゼ活性が向上し、かつ、オキシダーゼ活性が低減した変異体が好ましい。 
【００３９】
（１）２８０位に対応する位置の置換、例えば、グルタミン、セリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、リシン、アルギニン、又はアスパラギンへの置換。
（２）２６７位に対応する位置の置換、例えばチロシン、ロイシン又はメチオニンへの置換。
（３）２６９位に対応する位置の置換、例えばチロシン、ロイシン又はメチオニンへの置換。
（４）５４位に対応する位置の置換、例えばアスパラギン、アラニンへの置換。
（５）２４１位に対応する位置の置換、例えばグルタミン、リシン、又はグルタミン酸への置換。
【００４０】
本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列における位置に対応する位置において、上記のデヒドロゲナーゼ活性の向上及び／又はオキシダーゼ活性の低減をもたらすアミノ酸の置換を有し得る。さらに、本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは、それらの置換アミノ酸以外の位置で、さらに１又は数個（例えば１〜３０個、１〜２０個、１〜１５個、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、挿入、付加および／または置換されていてもよい。さらに本発明は、上記のデヒドロゲナーゼ活性の向上及び／又はオキシダーゼ活性の低減をもたらすアミノ酸の置換、基質特異性等、デヒドロゲナーゼ活性向上以外の性質を向上させるアミノ酸の置換を有し、前記置換したアミノ酸を除いた部分のアミノ酸配列について、配列番号１、配列番号３−１４又は配列番号１６−２６のアミノ酸配列と比較して３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し、HbA1ｃに直接作用し、デヒドロゲナーゼ活性が改変されたアマドリアーゼ変異体を包含する。
【００４１】
なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼは、国際公開２００７／１２５７７９号においてpKK223-3-CFP-T7と称する組換え体プラスミド（寄託番号：FERM BP-10593）を保持する大腸菌が生産するConiochaeta属由来のアマドリアーゼ（CFP-T7）であり、先に出願人が見出した熱安定性の優れた改変型アマドリアーゼである。このCFP-T7は、天然型のConiochaeta属由来のアマドリアーゼに対し、２７２位、３０２位および３８８位に人為的な変異を順次導入することにより獲得した３重変異体である。
【００４２】
また国際公開第２０１５／０６０４２９号に開示されているCFP-T7-H35はCFP-T7にR62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113K、A355Sのアミノ酸置換を導入したものである。CFP-T7-H37（配列番号１４）はCFP-T7-H35に変異D68N/A356Tを導入したものである。
【００４３】
上記のアミノ酸置換において、アミノ酸の位置は配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を表しているが、他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列においては、配列番号１に示されるアミノ酸配列における位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている。「対応する位置」の意味については後述する。
【００４４】
（さらなる置換）
（アマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸置換について）
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりその界面活性剤耐性を向上させることができること報告した。例えば国際公開第２０１５／０２０２００号明細書を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。
【００４５】
アマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置に対応する位置におけるアミノ酸置換が挙げられる。 （i）２６２位、
（ii）２５７位、
（iii）２４９位
（iv）２５３位、
（v）３３７位、
（vi）３４０位、
（vii）２３２位、
（viii）１２９位、
（ix）１３２位、
（x）１３３位、
（xi）４４位、
（xii）２５６位、
（xiii）２３１位、及び
（xiv）８１位
場合により２６２位に対応する位置のアミノ酸はヒスチジンへと置換されてもよい。場合により２５７位に対応する位置のアミノ酸はシステイン、セリン、トレオニンへと置換されてもよい。場合により２４９位に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により２５３位に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により３３７位に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により３４０位に対応する位置のアミノ酸はプロリンへと置換されてもよい。場合により２３２位に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により１２９位に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により１３２位に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により１３３位に対応する位置のアミノ酸はアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により４４位に対応する位置のアミノ酸はプロリンへと置換されてもよい。場合により２５６位に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により２３１位に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により８１位に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
【００４６】
本明細書ではこれらの位置（44位/133位/253位/257位/262位/337位/340位並びに249位/232位/129位/132位/256位/231位/81位）の変異を、アマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させる変異と呼ぶことがある。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、さらに界面活性剤耐性を向上させる変異を有し得る。
【００４７】
（アマドリアーゼの熱安定性を向上させるアミノ酸欠失について）
本発明者らは以前に、アマドリアーゼのカルボキシル末端から、３アミノ酸残基を欠失させることにより、その熱安定性を向上させうることを報告した（国際公開第２０１３／１００００６号明細書を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは上記の置換に加え、さらにカルボキシル末端からの３アミノ酸残基を欠失していてもよい。本明細書においてカルボキシル末端からの３アミノ酸残基の欠失を、熱安定性を向上させる欠失と呼ぶことがある。
【００４８】
（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）
これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう。）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００４９】
次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
【００５０】
このようにして得られたアマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特開２００３−２３５５８５号公報）の例などが挙げられる。
【００５１】
これらのアマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Coniochaeta sp. NISL 9330株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡがpKK223-3 Vector（ＧＥヘルスケア社製）に挿入された組換え体プラスミドpKK223-3-CFP（特開２００３−２３５５８５号公報）が挙げられる。
【００５２】
（ベクター）
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、pBluescriptII SK+（STRATAGENE社製）等が好ましい。
【００５３】
（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；またはタンパク質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
【００５４】
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸または５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
【００５５】
上記接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件をとることが可能であり、現実に所望の変異をアマドリアーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４〜３０、１９８９年６月号）。
【００５６】
タンパク質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Site-Specific Mutagenesisとして知られる手法を用いることができる。例えば、Kramer法(Nucleic Acids Res.,12,9441(1984):Methods Enzymol., 154, 350 (1987): Gene,37,73(1985))、Eckstein法（Nucleic Acids Res.,13,8749(1985):Nucleic Acids Res.,13,8765(1985):Nucleic Acids Res,14,9679(1986))、Kunkel法(Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A.,82,488(1985):Methods Enzymol.,154,367(1987)）等が挙げられる。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット(Transformer Mutagenesis Kit;Clonetech社，EXOIII/Mung Bean Deletion Kit; Stratagene製， Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene製など）の利用が挙げられる。
【００５７】
また、一般的なＰＣＲ法（ポリメラーゼチェインリアクション、Polymerase Chain Reaction)として知られる手法を用いることもできる(Technique, 1, 11 (1989))。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。
【００５８】
上記方法により得られるアマドリアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定もしくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）またはApplied Biosystems 3130xl ジェネティックアナライザ（Thermo Fisher Scientific製）等を用いることにより行うことができる。
【００５９】
（形質転換・形質導入）
上述の如くして得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞もしくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、得られた組換え体ＤＮＡを用いて、任意の宿主、例えば、エッシェリシア属に属する微生物、具体例としては大腸菌Ｋ−１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）や大腸菌Ｂ株、好ましくは大腸菌ＢＬ２１株（ニッポンジーン社製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得ることができる。
【００６０】
（アミノ酸配列の同一性又は類似性）
アミノ酸配列の同一性又は類似性は、GENETYX Ver.11（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはDNASIS Pro（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、該２以上のアマドリアーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
【００６１】
また、２以上のアマドリアーゼにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばCLUSTALWを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてBlosum62を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域や保存領域を決定できる。
【００６２】
本明細書において「相同性領域」とは、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、ある基準となるアマドリアーゼと比較対象のアマドリアーゼの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図１では全長アミノ酸配列の配列同一性が７４％以上であるアマドリアーゼをアライメントした。このうち、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１０位〜３２位は同一又は類似アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位は相同性領域に該当しうる。
【００６３】
好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として、第１１位〜３２位、３６〜４１位、５０〜５２位、５４〜５８位、８４〜８６位、８８〜９０位、１４５〜１５０位、１５７〜１６８位、２０２〜２０５位、２０７〜２１２位、２１５〜２２５位、２３６〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、３４７〜３５４位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、及び４０５〜４１０位のアミノ酸配列からなる領域である。
【００６４】
さらに好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１１〜１８位、２０〜３２位、５０〜５２位、５４〜５８位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７７〜２８６位、及び３７０〜３８３位のアミノ酸配列からなる領域である。
【００６５】
本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは、配列番号１、配列番号３−１４又は配列番号１６−２６に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼとアライメントしたときに３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、例えば６０％以上、６５％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、HbA1cに直接作用し、デヒドロゲナーゼ活性を有する。さらに、本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼの相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号１における相同性領域のアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、例えば８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有する。
【００６６】
本明細書において「保存領域」とは、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、ある基準となるアマドリアーゼと比較対象のアマドリアーゼの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域をいう。例えば、図２では全長アミノ酸配列の配列同一性が３０％以上であるアマドリアーゼをアライメントした。このうち、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１１、１２、１３、１５、１７、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３１、３６、３７、４１、４６、４７、５０、５１、５２、５４、５６、５７、５８、７５、７９、８２、８４、８５、９３、９５、１４９、１５８、１５９、１６２、１６５、１６６、１７７、１８０、２０２、２０８、２１８、２２０、２２１、２２２、２２４、２２８、２３３、２３９、２４３、２４６、２５０、２５５、２５８、２６０、２６６、２６７、２７０、２７２、２７７、２７８、２８０、２８１、２８２、２８４、２８５、２８６、３１８、３２１、３２６、３２９、３３４、３３９、３４６、３４７、３４８、３５１、３５２、３５４、３５８、３５９、３６２、３６３、３７０、３７３、３７６、３８２、３８５、３８６、３８９、４０６、４０７、４０９、４１８、４２５、及び４２７位は同一又は類似アミノ酸からなり、よって保存領域に該当する。同様に、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１５、１７、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３１、４１、４６、４７、５１、５２、５４、５６、５７、７９、８２、９３、１４９、１５８、１５９、１６２、１７７、１８０、２０２、２０８、２２１、２２２、２３３、２４３、２５０、２５８、２６６、２６７、２７０、２７８、２８０、２８２、２８４、２８５、３１８、３３４、３４７、３４８、３５１、３６２、３６３、３７３、３７６、３８６、４０７、４０９及び４１８位は同一アミノ酸からなり、よって保存領域に該当する。
【００６７】
ただし上記の相同性領域及び保存領域は、あくまで天然のアマドリアーゼのアミノ酸配列同士の比較についての領域であり、天然のアマドリアーゼに基づき種々の変異を導入した改変アマドリアーゼについてはこれらの相同性領域又は保存領域中の各々対応するアミノ酸は置換されていてもよく、改変後は必ずしも同一又は類似アミノ酸でなくともよい。
【００６８】
例えば、ある実施形態では、天然のアマドリアーゼから出発して、変異を導入して改変アマドリアーゼ（例えばHbA1cオキシダーゼ）を取得することができる。次いで改変アマドリアーゼに本発明の変異を導入してHbA1cデヒドロゲナーゼとすることができる。このとき、保存領域の配列同一性の比較は、配列番号１のアミノ酸配列と改変アマドリアーゼとではなく、配列番号１のアミノ酸配列と改変アマドリアーゼの由来する天然アマドリアーゼのアミノ酸配列とで行うものとする。
【００６９】
したがって本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼの由来する天然のアマドリアーゼの保存領域のアミノ酸配列と、配列番号１の保存領域のアミノ酸配列との配列同一性は、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上であってもよく、例えばある実施形態では１００％である。さらに、本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは、配列番号１、配列番号３−１４又は配列番号１６−２６に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼとアライメントしたときに３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、例えば６０％以上、６５％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、HbA1cに直接作用し、デヒドロゲナーゼ活性を有する。
【００７０】
（対応する位置の特定）
本明細書において、ある位置に「対応する位置」とは、特に断らない限り、配列番号１に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における特定の位置に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。本明細書において対応する位置を相当する位置ということがある。また特定の位置に「対応する位置のアミノ酸」を対応アミノ酸ということがある。
【００７１】
あるアミノ酸配列中の特定の位置に対する他のアミノ酸配列中の「対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中に存在する挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００７２】
図１及び図２に種々の公知の生物種由来のアマドリアーゼの配列を例示する。配列番号１で示されるアミノ酸配列を最上段に示す。図１に示される各種配列は、いずれも配列番号１の配列と７０％以上の同一性を有し、公知のアルゴリズムを用いて整列させた。図２に示される各種配列は、いずれも配列番号１の配列と３０％以上の同一性を有し、公知のアルゴリズムを用いて整列させた。図１及び図２からConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を知ることができる。また対応する位置を知ることができるとともに、当該対応位置における対応アミノ酸を知ることができる。図１には、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼ（配列番号１）、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号３）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号４）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号６）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号７）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号９）、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１０）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２）およびPenicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１３）のアミノ酸配列を示してある。図２には、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼ（配列番号１）等図１に記載のものに加え、Aspergillus oryzae由来のアマドリアーゼAo2(別称FaoAo2、配列番号１９)、Aspergillus fumigatus由来のアマドリアーゼAf2(別称AmadoriaseII、配列番号２０)、Aspergillus terreus由来のアマドリアーゼAt(別称FAOD-A、配列番号２１)、Fusarium oxysporum由来のアマドリアーゼFo（配列番号２２）、Aspergillus oryzae由来のアマドリアーゼAo1(別称FaoAo 1、配列番号２３)、Aspergillus fumigatus由来のアマドリアーゼAf1(別称AmadoriaseI、配列番号２４)、Pichia sp.由来のアマドリアーゼPi（配列番号２５）、Debaryomyces hansenii由来のアマドリアーゼDh（配列番号２６）のアミノ酸配列を示してある。
【００７３】
（特定の位置に対応する位置のアミノ酸）
本発明において、「配列番号１のアミノ酸配列の２８０位に対応する位置のアミノ酸」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２８０位に対応する位置におけるアミノ酸を意味する。これは、上記の「対応する位置」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１又は図２より特定することができる。以下の、配列番号１に示すアミノ酸配列の２６７位、２６９位、５４位及び２４１位に対応する位置のアミノ酸についてもそれぞれ同様である。
【００７４】
すなわち「配列番号１のアミノ酸配列の２８０位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２８０位のシステイン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２７８位のシステイン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２８０位のシステイン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２７８位のシステイン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２８０位のシステイン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８０位のシステイン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２７６位のシステイン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８０位のシステイン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２８０位のシステイン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２７８位のシステイン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８０位のシステインである。
【００７５】
配列番号１及び３〜１３の各配列における、配列番号１のアミノ酸配列の２８０位、２６７位、２６９位、５４位、及び２４１位に対応するそれぞれの位置は次の表のとおりである。
【表１】
2017183717.tif 000003
【００７６】
例えば表中、配列番号１の２６７位に対応する位置のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ(配列番号３)では２６７位のフェニルアラニンである。他の位置についても同様に表から読み取ることができる。
【００７７】
さらに、Aspergillus oryzae由来のアマドリアーゼAo2(配列番号１９)、Aspergillus fumigatus由来のアマドリアーゼAf2(配列番号２０)、Aspergillus terreus由来のアマドリアーゼAt(配列番号２１)、Fusarium oxysporum由来のアマドリアーゼFo（配列番号２２）、Aspergillus oryzae由来のアマドリアーゼAo1(配列番号２３)、Aspergillus fumigatus由来のアマドリアーゼAf1(配列番号２４)、Pichia sp.由来のアマドリアーゼPi（配列番号２５）、及びDebaryomyces hansenii由来のアマドリアーゼDh（配列番号２６）の各配列における、配列番号１のアミノ酸配列の２８０位、２６７位、２６９位、５４位、及び２４１位に対応するそれぞれの位置は次の表のとおりである。
【００７８】
【表２】
2017183717.tif 000004
【００７９】
例えば表中、配列番号１の２８０位に対応する位置のアミノ酸は、Aspergillus oryzae由来のアマドリアーゼAo2(配列番号１９)では２７６位のシステインである。
【００８０】
（基質特異性改変変異の対応位置）
本明細書において、「配列番号１のアミノ酸配列の６２位に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１のアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１の６２位に対応する位置のアミノ酸を意味する。これは、上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１又は図２より特定することができる。以下の、配列番号１に示すアミノ酸配列の６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９位、６８位、３５６位、６４位及び９９位、さらには下記の２６２位、２５７位、２４９位、２５３位、３３７位、３４０位、２３２位、１２９位、１３２位、１３３位、４４位、２５６位、２３１位、及び８１位に対応する位置のアミノ酸についてもそれぞれ同様である。
【００８１】
配列番号１及び３〜１３の各配列における、配列番号１のアミノ酸配列の６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９位、６８位、３５６位、６４位及び９９位に対応するそれぞれの位置は次の表のとおりである。
【表３】
2017183717.tif 000005
【００８２】
さらに、Aspergillus oryzae由来のアマドリアーゼAo2(配列番号１９)、Aspergillus fumigatus由来のアマドリアーゼAf2(配列番号２０)、Aspergillus terreus由来のアマドリアーゼAt(配列番号２１)、Fusarium oxysporum由来のアマドリアーゼFo（配列番号２２）、Aspergillus oryzae由来のアマドリアーゼAo1(配列番号２３)、Aspergillus fumigatus由来のアマドリアーゼAf1(配列番号２４)、Pichia sp.由来のアマドリアーゼPi（配列番号２５）、及びDebaryomyces hansenii由来のアマドリアーゼDh（配列番号２６）の各配列における、配列番号１のアミノ酸配列の６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９位、６８位、３５６位、６４位及び９９位に対応するそれぞれの位置は次の表のとおりである。表中、Dhについては配列番号１の６８位に対応する位置は存在しない。そのためDhについてはアミノ酸を置換する位置として、配列番号１の６８位に対応する位置が選択されることはない。対応する位置が定義されない他の位置についても同様である。
【００８３】
【表４】
2017183717.tif 000006
【００８４】
（界面活性剤耐性向上変異の対応位置）
【００８５】
配列番号１及び３〜１３の各配列における、配列番号１のアミノ酸配列の４４位、１３３位、２５３位、２５７位、２６２位、３３７位、３４０位、２４９位、２３２位、１２９位、１３２位、２５６位、２３１位、及び８１位に対応するそれぞれの位置は次の表のとおりである。
【表５】
2017183717.tif 000007
【００８６】
さらに、Aspergillus oryzae由来のアマドリアーゼAo2(配列番号１９)、Aspergillus fumigatus由来のアマドリアーゼAf2(配列番号２０)、Aspergillus terreus由来のアマドリアーゼAt(配列番号２１)、Fusarium oxysporum由来のアマドリアーゼFo（配列番号２２）、Aspergillus oryzae由来のアマドリアーゼAo1(配列番号２３)、Aspergillus fumigatus由来のアマドリアーゼAf1(配列番号２４)、Pichia sp.由来のアマドリアーゼPi（配列番号２５）、及びDebaryomyces hansenii由来のアマドリアーゼDh（配列番号２６）の各配列における、配列番号１のアミノ酸配列の４４位、１３３位、２５３位、２５７位、２６２位、３３７位、３４０位、２４９位、２３２位、１２９位、１３２位、２５６位、２３１位、及び８１位に対応するそれぞれの位置は次の表のとおりである。
【００８７】
【表６】
2017183717.tif 000008
【００８８】
（熱安定性向上欠失の対応位置）
本明細書において「配列番号１のアマドリアーゼのカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置」とは、対象となるアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１のアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列のカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する３アミノ酸残基の位置を意味する。Coniochaeta属由来のアマドリアーゼにおける、この位置の３残基の配列は、４３５位のプロリン、４３６位のリジン及び４３７位のロイシンからなり、これらに対応する位置のアミノ酸配列も、上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１又は図２より特定することができる。
【００８９】
なお、真核生物においては、タンパク質をペルオキシソームへ輸送するためのシグナル配列であり、カルボキシル末端の３アミノ酸から構成されるモチーフである「ペルオキシソーム移行シグナル（Peroxisome Targeting Signal1;PTS1）配列」が知られている。よく知られた公知のＰＴＳ１モチーフとしては、（プロリン／セリン／アラニン／システイン）−（リジン／ヒスチジン／アルギニン／アスパラギン）−（ロイシン／メチオニン）配列からなるモチーフがある（例えばFEBS J., 272, 2362 (2005)、Plant Cell Physiol., 38, 759 (1997)、Eur. J. Cell Biol., 71, 248 (1996)参照）。この知見に基づけば、「配列番号１のアマドリアーゼのカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置」の領域が、アマドリアーゼにおけるいわゆるＰＴＳ１モチーフに相当する。したがって、ある一側面においては、「配列番号１のアマドリアーゼのカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置」は「ＰＴＳ１モチーフに相当する位置」と解釈することもできる。
【００９０】
すなわちEupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のヒスチジン及び４３７位のロイシンからなり、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３８位のアラニン、４３９位のリジン及び４４０位のロイシンからなり、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４５０位のヒスチジン、４５１位のリジン及び４５２位のロイシンからなり、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３８位のセリン、４３９位のリジン及び４４０位のロイシンからなり、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のアスパラギン及び４３７位のロイシンからなり、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３６位のアラニン、４３７位のリジン及び４３８位のメチオニンからなり、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３６位のアラニン、４３７位のリジン及び４３８位のメチオニンからなり、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３９位のアラニン、４４０位のリジン及び４４１位のロイシンからなり、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のリジン及び４３７位のロイシンからなる。
【００９１】
なお、ある実施形態において、「配列番号１のアマドリアーゼのカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置」、すなわち、「ＰＴＳ１モチーフに相当する位置」は、生来よりＣ末端側の１残基（ロイシン／メチオニン）が欠失していてもよい。例えば、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼにおいては、「配列番号１のアマドリアーゼのカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置」、すなわち、「ＰＴＳ１モチーフに相当する位置」は、４４０位のセリン、４４１位のアルギニンからなる。Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼについては、配列番号１記載のアマドリアーゼのカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置は存在しないものとする。
【００９２】
さらに、Aspergillus oryzae由来のアマドリアーゼAo2(配列番号１９)、Aspergillus fumigatus由来のアマドリアーゼAf2(配列番号２０)、Aspergillus terreus由来のアマドリアーゼAt(配列番号２１)、Fusarium oxysporum由来のアマドリアーゼFo（配列番号２２）、Aspergillus oryzae由来のアマドリアーゼAo1(配列番号２３)、Aspergillus fumigatus由来のアマドリアーゼAf1(配列番号２４)、Pichia sp.由来のアマドリアーゼPi（配列番号２５）、及びDebaryomyces hansenii由来のアマドリアーゼDh（配列番号２６）の各配列における、「配列番号１のアマドリアーゼのカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置」、すなわち、「ＰＴＳ１モチーフに相当する位置」は次の表のとおりである。Piについては４２４、４２５、４２６位を欠失させるときにさらに４２７位も欠失させてよい（カルボキシ末端４アミノ酸欠失）。このようなPiについてのカルボキシ末端４アミノ酸欠失も便宜上、配列番号１を基準としたアマドリアーゼのカルボキシル末端からの３アミノ酸残基欠失に含めるものとする。なお配列番号１を基準としたときの対応する位置が定義されない位置は、アミノ酸欠失を行う位置として選択されない。
【００９３】
【表７】
2017183717.tif 000009
【００９４】
（本発明のアマドリアーゼの生産）
上記のようにして得られたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
【００９５】
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーまたは大豆もしくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【００９６】
なお、培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調整するのが適当である。
また、培養は任意の条件を用いることができるが、例えば、２０〜４２℃の培養温度、好ましくは３０℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは３０℃前後の培養温度で８〜１６時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施することができる。
【００９７】
培養終了後、該培養物よりアマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪もしくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩または硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アマドリアーゼの粗酵素を得る。
【００９８】
上記アマドリアーゼの粗酵素よりさらにアマドリアーゼ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたアマドリアーゼ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望のデヒドロゲナーゼ活性が向上したアマドリアーゼを得ることができる。
【００９９】
本発明のキットに含まれるアマドリアーゼは、Eupenicillium属、Pyrenochaeta属、Arthrinium属、Curvularia属、Neocosmospora属、Cryptococcus属、Phaeosphaeria属、Aspergillus属、Emericella属、Ulocladium属、Penicillium属、Fusarium属、Achaetomiella属、Achaetomium属、Thielavia属、Chaetomium属、Gelasinospora属、Microascus属、Leptosphaeria属、Ophiobolus属、Pleospora属、Coniochaetidium属、Pichia属、Corynebacterium属、Agrobacterium属、Arthrobacter属などに由来する天然のアマドリアーゼ又はそれらの変異体であり得る。こうした変異体は、配列番号１に示すアミノ酸配列の２８０位のシステイン、２６７位のフェニルアラニン、２６９位のフェニルアラニン、５４位のアスパラギン酸、２４１位のチロシンよりなる群から選択される位置のアミノ酸に対応する位置で１またはそれ以上のアミノ酸置換を有する。当業者であれば、例えば後述する試験法等により、あるアマドリアーゼ又はその変異体が本発明のキットに使用可能か、すなわち所望のデヒドロゲナーゼ活性を有するか容易に調べることができる。
【０１００】
（本発明のアマドリアーゼにおけるデヒドロゲナーゼ活性の向上）
本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較してオキシダーゼ活性が低下し、かつ／又はデヒドロゲナーゼ活性が向上している。具体的には、改変前のものと比較して、「デヒドロゲナーゼ活性」に対する「オキシダーゼ活性」の割合が低減していることを特徴とする。オキシダーゼ活性とは、基質を酸化する際、酸素分子に電子を受け渡す活性をいう。デヒドロゲナーゼ活性とは、基質を酸化する際、ヒドリド（H-）を電子アクセプターに受け渡す活性をいう。
【０１０１】
センサーを用いた糖化ヘモグロビンの測定において、酸素の影響を低減するには、オキシダーゼ活性が低いことが望まれる。一方で、基質との反応性の観点からは、デヒドロゲナーゼ活性が高いことが好ましい。この両者を考慮すると、電子メディエーターを使用する糖化ヘモグロビン測定では、アマドリアーゼのオキシダーゼ活性（ＯＸ）とデヒドロゲナーゼ活性（ＤＨ）の比ＯＸ／ＤＨが低いことが好ましく、また、アマドリアーゼのオキシダーゼ活性（ＯＸ）が低く、かつ、デヒドロゲナーゼ活性（ＤＨ）が高いことが好ましい。そこで本明細書では便宜上、アマドリアーゼの特性を、オキシダーゼ活性に対するデヒドロゲナーゼ活性の割合を示すＤＨ／ＯＸ、又はデヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合ＯＸ／ＤＨを用いて表現することがある。ある実施形態において本発明の改変アマドリアーゼは、改変前のものと比較してデヒドロゲナーゼ活性が増大している。ある実施形態において本発明の改変アマドリアーゼは、改変前のものと比較してオキシダーゼ活性が低減されている。ある実施形態において本発明の改変アマドリアーゼは、改変前のものと比較してデヒドロゲナーゼ活性とオキシダーゼ活性の比ＯＸ／ＤＨ比が低い（ＤＨ／ＯＸ比が高い）。ある実施形態において本発明の改変アマドリアーゼは、改変前のものと比較してデヒドロゲナーゼ活性が増大しているのみならず、さらにオキシダーゼ活性が低減されている。具体的には、本発明の改変アマドリアーゼにおける、オキシダーゼ活性に対するデヒドロゲナーゼ活性の割合を示すＤＨ／ＯＸは、改変前（１．０倍）に対して１．３倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、２００倍以上、３００倍以上、４００倍以上、例えば４５０倍以上増大していることが好ましい。また、本発明の改変アマドリアーゼにおける、デヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合を示すＯＸ／ＤＨは改変前（１００％）と比較して、９０％未満、８０％未満、７５％未満、５０%未満、４０％未満、３１％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５%未満、４．５％未満、４％未満、３．６％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、例えば０．２％未満に低減していることが好ましい。
【０１０２】
デヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合は、公知のアマドリアーゼの測定法を用いて、任意の条件下で測定し、改変前のものと比較することができる。例えば、ｐＨ７．０において、１ｍＭのある糖化基質、例えばαＦＶを添加して測定したオキシダーゼ活性を、１ｍＭの該糖化基質、例えばαＦＶを添加して測定したデヒドロゲナーゼ活性で割った比率として求めることにより、デヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合を算出し、これを改変前のものと改変後のもので比較することができる。基質はHbA1cやαF6Pでもよい。
【０１０３】
（ハイスループットスクリーニング）
アマドリアーゼは、機能性アマドリアーゼ変異体、例えばさらなるHbA1cデヒドロゲナーゼを取得するためにハイスループットスクリーニングに供することができる。例えば変異導入したアマドリアーゼ遺伝子を有する形質転換又は形質導入株のライブラリーを作製し、これをマイクロタイタープレートに基づくハイスループットスクリーニングに供してもよく、または液滴型マイクロ流体に基づく超ハイスループットスクリーニングに供してもよい。例としてはバリアントをコードする変異遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築し、次いでファージディスプレイ(例えばChem. Rev. 105 (11): 4056-72, 2005)、イーストディスプレイ(例えばComb Chem High Throughput Screen. 2008;11(2): 127-34)、バクテリアルディスプレイ(例えばCurr Opin Struct Biol 17: 474-80, 2007)等を用いて、変異アマドリアーゼの大きな集団をスクリーニングする方法が挙げられる。またAgresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (9): 4004-4009 (Mar, 2010)を参照のこと。アマドリアーゼバリアントのスクリーニングに使用しうる超ハイスループットスクリーニング手法についての同文献の記載を参照により本明細書に組み入れる。例えばエラープローンPCR法によりライブラリーを構築することができる。また飽和突然変異誘発を用いて、本明細書に記載の位置又はそれに対応する位置を標的として変異導入しライブラリーを構築してもよい。ライブラリーを用いて電気コンピテントEBY-100細胞等の適当な細胞を形質転換し、約１０の７乗の変異体を取得しうる。該ライブラリーで形質転換した酵母細胞を次いでセルソーティングに供しうる。標準ソフトリトグラフィー法を用いて作製したポリジメトキシルシロキサン(PDMS)マイクロ流体デバイスを用いてもよい。フローフォーカスデバイスを用いて単分散の液滴を形成することができる。個別の変異体を含有する形成された液滴を適当なソーティングデバイスに供しうる。細胞を選別する際にはデヒドロゲナーゼ活性の有無を利用しうる。変異導入と選別は複数回反復してもよい。
【０１０４】
なお本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼを作製するに当たり、変異を導入する順番は特に限定されない。まず出発アマドリアーゼに本発明のデヒドロゲナーゼ活性向上変異を導入し、次いで得られたデヒドロゲナーゼ活性を有するアマドリアーゼについて、基質特異性を改変する変異等を導入し、且つ／又はスクリーニングを適宜行い、これをHbA1cに作用するデヒドロゲナーゼとすることもできる。
【０１０５】
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
アマドリアーゼの活性は、オキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性があり、これらは種々の方法により測定できる。以下に、アマドリアーゼ活性の測定方法を例示する。
【０１０６】
酵素の特性を評価するために、基質としてHbA1ｃ、αF6P、フルクトシルバリン（FV）等の糖化アミノ酸、及びフルクトシルバリルヒスチジン（FVH）等の糖化ペプチドを基質とすることもできる。FVやFVHは、阪上らの方法に基づき合成、精製することができる（特開２００１−９５５９８号参照）。αF6Pは合成基質を使用しうる。
【０１０７】
（αF6Pを基質としたオキシダーゼ活性の測定方法）
以下、αF6Pを基質として用いるオキシダーゼ活性測定を記載する。ある実施形態において、酵素力価は、αF6Pを基質としたときの、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義することができる。なお、これは酵素の特性評価や測定方法上の便宜であって、本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼがαF6Pのみを基質とすることを意味するものではない。デヒドロゲナーゼ活性測定法についても同様である。
【０１０８】
試薬の調製
（試薬１）：５Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ、０．４９ｍＭ  ４−アミノアンチピリンを含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液  ｐＨ６．５
５ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、１０００ｍｌに定容する。
（試薬２）：１５ｍＭ  ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム、同仁化学研究所製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（試薬３）：基質溶液（３０ｍＭ；  終濃度１ｍＭ）
αＦ６Ｐ（ペプチド研究所製）  ２５７．１ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。
【０１０９】
測定法
６７５μｌの試薬１、２５μｌの試薬２、および２５μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を２５μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度の経時変化を観測し、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔAs）を測定する。なお、対照液は、２５μｌの試薬３の代わりに２５μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔA0）を測定する。オキシダーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）は下記の式に従って算出する。
オキシダーゼ活性(U/ml)＝｛(ΔAs−ΔA0)×0.75×df｝÷(39.2×0.5×0.025)
ΔAs：反応液の1分間あたりの吸光度変化
ΔA0：対照液の1分間あたりの吸光度変化
39.2：反応により生成されるキノイミン色素のミリモル吸光係数(mM-1・cm-1)
0.5：1 molの過酸化水素による生成されるキノイミン色素のmol数
df：希釈係数。
【０１１０】
（αF6Pを基質としたデヒドロゲナーゼ活性の測定方法）
以下、αF6Pを基質として用いるデヒドロゲナーゼ活性測定法を記載する。ある実施形態において、酵素力価は、αF6Pを基質としたときの、１分間に1μmolのホルマザン色素を生成する酵素量を1Uと定義することができる。
【０１１１】
試薬の調製
（試薬４）：０．２５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）
（試薬５）：１０ｍＭ  ＷＳＴ−３溶液
６９０ｍｇのＷＳＴ−３（２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ、同仁化学研究所製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍＬに定容する。
（試薬６）：５．４ｍＭ  ｍＰＭＳ溶液
１８０ｍｇのｍＰＭＳ（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ、同仁化学研究所製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
【０１１２】
測定法
２７０μｌの試薬４、１５０μｌの試薬５，２５μｌの試薬６、２５５μｌのイオン交換水、および２５μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を２５μｌ加えてよく混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０、日立ハイテクノロジーズ社製）により、４３３ｎｍにおける吸光度を測定する。なお対照液は、２５μｌの酵素液の代わりに２５μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様に調製する。デヒドロゲナーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）は下記の式に従って算出する。
デヒドロゲナーゼ活性(U/ml)＝  ｛（ΔAs−ΔA0）×0.75×df｝÷(31×0.025)
ΔAs：反応液の１分間あたりの吸光度変化
ΔA0：対照液の１分間あたりの吸光度変化
31：反応により生成されるWST-3のホルマザン色素のミリモル吸光係数(mM-1・cm-1)
df：希釈係数。
【０１１３】
（HbA1cを基質としたデヒドロゲナーゼ活性測定方法）
以下、HbA1cを基質として用いるデヒドロゲナーゼ活性測定法を記載する。ある実施形態において、酵素力価は、HbA1cを基質としたときの、１分間に1μmolのホルマザン色素を生成する酵素量を1Uと定義することができる。
【０１１４】
試薬の調製
（試薬７）：１．８４ｍｇ／ｍｌ  ＨｂＡ１ｃ溶液
（試薬８)：１０％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド
（試薬９）：１８５ｍＭ  リン酸緩衝液  ｐＨ６．０
（試薬５）：１０ｍＭ  ＷＳＴ−３溶液
【０１１５】
測定法
まず、５４０μｌの試薬７と６０μｌの試薬８を混合して、９８℃で５分間加熱して、ＨｂＡ１ｃ試料前処理液を調製する。続いて、３０５μｌの試薬９に１２５μｌの試薬５、６２．５μｌの酵素液、および７．５μｌのイオン交換水を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、ＨｂＡ１ｃ試料前処理液を１２５μｌ加えて撹拌した後、分光光度計により４３３ｎｍにおける吸光度を測定する。対照実験は、６２．５μｌの酵素液の代わりに、６２．５μｌのＨｂＡ１ｃに作用しないアマドリアーゼを添加して実施する。デヒドロゲナーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）は下記の式に従って算出する。
デヒドロゲナーゼ活性(U/ml)＝｛（ΔAs−ΔA0）×0.625×df｝÷(31×0.0625)
ΔAs：反応液の１分間あたりの吸光度変化
ΔA0：対照液の１分間あたりの吸光度変化
31：反応により生成されるWST-3のホルマザン色素のミリモル吸光係数(mM-1・cm-1)
df：希釈係数。
【０１１６】
（測定試薬キット、センサー、測定方法）
ある実施形態において、本発明は、HbA1cデヒドロゲナーゼを含む、HbA1c測定キット及びHbA1c測定装置を提供する。このキット又は装置は、場合により電子メディエーターを含んでもよい。ある実施形態において、本発明はHbA1cデヒドロゲナーゼを用いるHbA1cの測定方法を提供する。
【０１１７】
ある実施形態において、本発明は、HbA1cデヒドロゲナーゼを含む固定した酵素電極を提供する。ある実施形態において、HbA1cデヒドロゲナーゼは酵素電極に塗布、吸着、又は固定化されていてもよい。別の実施形態では、電子メディエーターも電極に塗布、吸着、又は固定化してよい。電極としては炭素電極、白金、金、銀、ニッケル、パラジウムなどの金属電極などを用いることができる。炭素電極の場合、材料としてパイロリティック・グラファイトカーボン（PG）、グラッシーカーボン（GC）、カーボンペースト、プラスチックフォームドカーボン(PFC)などが挙げられる。測定システムは二電極系であっても三電極系であってもよく、例えば作用電極上に酵素を固定することができる。参照電極としては、標準水素電極、可逆水素電極、銀−塩化銀電極（Ag/AgCl）、パラジウム・水素電極、飽和カロメル電極等が挙げられ、安定性や再現性の観点から、Ag/AgClを用いることが好ましい。
【０１１８】
酵素は、架橋、透析膜による被覆、高分子マトリックスへの封入、光架橋性ポリマーの使用、電気伝導性ポリマーの使用、酸化／還元ポリマーの使用等により電極に固定することができる。また酵素を電子メディエーターと共にポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、これらの手法を組合せてもよい。
【０１１９】
本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは、ポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることにより、種々の電気化学的な測定手法に適用することができる。電気化学的測定法としては、アンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリーなどの様々な手法が挙げられる。例えばアンペロメトリー法により、還元されたメディエーターが印加電圧によって酸化される際に生じる電流値を測定することで、試料中の糖化基質の濃度を算出することができる。印加電圧はメディエーターや装置の設定にもよるが、例えば−１０００〜＋１０００ｍＶ（v.s. Ag/AgCl）などとすることができる。
【０１２０】
HbA1cの濃度の測定は、例えば以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、HbA1cを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のHbA1c溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のHbA1c濃度を計算することができる。
【０１２１】
さらに、測定に必要な溶液量を低減するために、印刷電極を用いることもできる。この場合、電極は絶縁基板上に形成されてなることが好ましい。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷などの印刷技術により、電極を基板上に形成されることが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどが挙げられるが、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものを用いるのがより好ましい。
【０１２２】
ある実施形態において、本発明は、該酵素電極を含むセンサーを提供する。
別の実施形態では、本発明の酵素電極を利用し、試料中のアマドリ化合物の濃度を、酵素反応により生じる電流を測定することにより決定することができる。一例として、酵素電極を作用電極とし、これを対電極及び参照電極と共に使用する。対電極は例えば白金電極とすることができ、参照電極は例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極とすることができる。温度を一定に保ち、電極をメディエーターを含む緩衝液中に挿入する。作用電極に電圧を印加し、試料を添加後、電流の変化を測定する。
【０１２３】
本発明の測定方法、キット、装置及びセンサーに用いるメディエーター（人工電子メディエーター、人工電子アクセプター、電子メディエーターともいう）は、本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼから電子を受け取ることができるものであれば特に限定されない。メディエーターとしてはキノン類、フェナジン類、ビオロゲン類、シトクロム類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、例えばフェリシアン化カリウム、フェレドキシン類、フェロセン、オスミウム錯体およびその誘導体等などが挙げられ、フェナジン化合物としては例えばＰＭＳ、メトキシＰＭＳが挙げられるがこれに限定されない。本願明細書では、特に断らない限り、電子メディエーターという用語には酸素、過酸化水素は含まれないものとする。
【０１２４】
ある実施形態において本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは、改変前の酵素と比較してデヒドロゲナーゼ活性が向上している。ある実施形態におて本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは改変前の酵素と比較してオキシダーゼ活性が低減されている。ある実施形態において、本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは改変前の酵素と比較してオキシダーゼ活性／デヒドロゲナーゼ活性比（ＯＸ／ＤＨ比）が低下している。またある実施形態において、本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは改変前の酵素と比較してデヒドロゲナーゼ活性が向上し、かつオキシダーゼ活性が低減されている。このような本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼが触媒する酵素反応は、酸素の影響を受けない、ほとんど受けない又は受けにくい。本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは、従来のアマドリアーゼと同じ用途に使用することができる。また、本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは、試料中のHbA1ｃ等の糖化基質濃度の測定に使用することができ、これは例えば糖尿病の診断に役立てることができる。また、本発明のアマドリアーゼは酵素電極として使用することができる。これは種々の電気化学的測定に用いることができる。また、本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは酵素センサーとして使用することができる。また、本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼは糖尿病マーカーの測定キットに利用することができる。ある実施形態において本発明は、試料にヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するHbA1cデヒドロゲナーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素ではない還元型電子メディエーターもしくは消費される酸素ではない酸化型電子メディエーターを測定することを含む、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法を提供する。測定系は溶液系であっても乾燥系であってもよい。また測定は酵素、酵素電極若しくは酵素センサー酵素電極を用いる電気化学的測定であってもよく、又は発色基質を用いる吸光度測定であってもよい。ただしこれは例示であり、本発明のHbA1cデヒドロゲナーゼの用途はこれに限られない。
【０１２５】
（実施例）
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【０１２６】
［実施例１］
（デヒドロゲナーゼ活性向上型変異について）
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８  ＤＮＡの調製
配列番号１４はConiochaeta sp.由来フルクトシルペプチドオキシダーゼを、フルクトシルヘキサペプチドに作用するように改変した酵素（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７）のアミノ酸配列である。ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７遺伝子（配列番号１５）を含む組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７）株（国際公開２０１５／０６０４２９号参照）を、ＬＢ−ａｍｐ培地［１％（Ｗ／Ｖ）  バクトトリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ］２．５ｍｌに接種して、３７℃で２０時間振とう培養し、培養物を得た。
【０１２７】
この培養物を７，０００ｒｐｍで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、この菌体よりＱＩＡＧＥＮ  ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７を抽出して精製し、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７のＤＮＡ２．５μｇを得た。
【０１２８】
（２）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７  ＤＮＡの部位特異的改変操作
得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号２７、２８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
【０１２９】
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
【０１３０】
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて決定し、その結果、配列番号１４記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがグリシンに置換された改変型アマドリアーゼ（配列番号１６）をコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ３８）を得た。
【０１３１】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ３８を鋳型として、配列番号２９、３０のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがグリシンに置換され、かつ１１０位のロイシンがチロシンに置換された改変型アマドリアーゼ（配列番号１７）をコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ３９）を得た。
【０１３２】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３９を鋳型として、配列番号３１、３２のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがグリシンに置換され、かつ１１０位のロイシンがチロシンに置換され、かつ９９位のヒスチジンがセリンに置換された改変型アマドリアーゼ（配列番号１８）をコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ４０）を得た。
【０１３３】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ３８を鋳型として、配列番号３３、３４のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがグリシンに置換され、かつ２６９位のフェニルアラニンがメチオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ３８−ｄｈ１）を得た。
【０１３４】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ３８を鋳型として、配列番号３５、３３のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがグリシンに置換され、かつ２８０位の２６９位のフェニルアラニンがロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ３８−ｄｈ２）を得た。
【０１３５】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ３８を鋳型として、配列番号３６、３７のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがグリシンに置換され、かつ２８０位のシステインがグルタミンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ３８−ｄｈ３）を得た。
【０１３６】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ４０を鋳型として、配列番号３３、３４のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがグリシンに置換され、かつ１１０位のロイシンがチロシンに置換され、かつ９９位のヒスチジンがセリンに置換され、かつ２６９位のフェニルアラニンがメチオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ４０−ｄｈ１）を得た。
【０１３７】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ４０を鋳型として、配列番号３５、３３のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがグリシンに置換され、かつ１１０位のロイシンがチロシンに置換され、かつ９９位のヒスチジンがセリンに置換され、かつ２６９位のフェニルアラニンがロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ４０−ｄｈ２）を得た。
【０１３８】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ４０を鋳型として、配列番号３６、３７のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがグリシンに置換され、かつ１１０位のロイシンがチロシンに置換され、かつ９９位のヒスチジンがセリンに置換され、かつ２８０位のシステインがグルタミンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ４０−ｄｈ３）を得た。
【０１３９】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ４０−ｄｈ３を鋳型として、配列番号３３、３４のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがグリシンに置換され、かつ１１０位のロイシンがチロシンに置換され、かつ９９位のヒスチジンがセリンに置換され、かつ２６９位のフェニルアラニンがメチオニンに置換され、かつ２８０位のシステインがグルタミンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ４０−ｄｈ４）を得た。
【０１４０】
（３）各種改変型アマドリアーゼの生産
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌ＪＭ１０９株を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地４ｍｌにおいて、２５℃で１６時間培養した。その後、各菌体をｐＨ７．５の１０ｍＭリン酸緩衝液で懸濁し、菌体を超音波破砕し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各粗酵素液０．５ｍｌを調製した。
【０１４１】
（４）各種改変型アマドリアーゼのオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性評価
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、αＦ６Ｐを基質とし、下記のオキシダーゼ活性測定法およびデヒドロゲナーゼ活性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼのオキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性の評価を行った。
【０１４２】
（αF6Pを基質としたオキシダーゼ活性の測定方法）
試薬の調製
（試薬１）：５Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン製）、０．４９ｍＭ  ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）を含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液  ｐＨ６．５
（試薬２）：１５ｍＭ  ＴＯＯＳ（同仁化学研究所製）溶液
（試薬３）：３０ｍＭ  αＦ６Ｐ（ペプチド研究所製）溶液（終濃度１ｍＭ）
【０１４３】
６７５μｌの試薬１、２５μｌの試薬２、および２５μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を２５μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度の経時変化を観測し、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔAs）を測定する。なお、対照液は、２５μｌの試薬３の代わりに２５μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔA0）を測定する。終濃度１ｍＭのαＦ６Ｐを基質としたときの、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量（酵素活性）を１Ｕと定義する。オキシダーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）は下記の式に従って算出する。
オキシダーゼ活性(U/ml)＝｛(ΔAs−ΔA0)×0.75×df｝÷(39.2×0.5×0.025)
ΔAs：反応液の1分間あたりの吸光度変化
ΔA0：対照液の1分間あたりの吸光度変化
39.2：反応により生成されるキノイミン色素のミリモル吸光係数(mM-1・cm-1)
0.5：1 molの過酸化水素による生成されるキノイミン色素のmol数
df：希釈係数。
【０１４４】
（αF6Pを基質としたデヒドロゲナーゼ活性の測定方法）
試薬の調製
（試薬３）：３０ｍＭ  αＦ６Ｐ（ペプチド研究所製）溶液（終濃度１ｍＭ）
（試薬４）：０．２５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）
（試薬５）：１０ｍＭ  ＷＳＴ−３（同仁化学研究所製）溶液
（試薬６）：５．４ｍＭ  ｍＰＭＳ（同仁化学研究所製）溶液
【０１４５】
２７０μｌの試薬４、１５０μｌの試薬５，２５μｌの試薬６、２５５μｌのイオン交換水、および２５μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を２５μｌ加えてよく混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０、日立ハイテクノロジーズ社製）により、４３３ｎｍにおける吸光度を測定する。なお対照液は、２５μｌの酵素液の代わりに２５μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様に調製する。終濃度１ｍＭのαＦ６Ｐを基質とした時の、１分間に1μｍｏｌのホルマザン色素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。デヒドロゲナーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）は下記の式に従って算出する。
デヒドロゲナーゼ活性(U/ml)＝｛（ΔAs−ΔA0）×0.75×df｝÷(31×0.025)
ΔAs：反応液の１分間あたりの吸光度変化
ΔA0：対照液の１分間あたりの吸光度変化
31：反応により生成されるWST-3のホルマザン色素のミリモル吸光係数(mM-1・cm-1)
df：希釈係数。
【０１４６】
結果を表８、表９に示す。表８において、ＣＦＰ−Ｈ３８は、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ３８）株由来のアマドリアーゼを示す。表９において、ＣＦＰ−Ｈ４０は、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｈ４０）株由来のアマドリアーゼを示す。なお、本実施例では大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７）株由来のアマドリアーゼであるＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７を変異元酵素としたため、表中に記載の「アミノ酸変異」の記載には、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７に既に導入済みの各種変異点は含めていない。表中、オキシダーゼ活性（％）とデヒドロゲナーゼ活性（％）は、元酵素ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８またはＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ４０のオキシダーゼ活性（Ｕ／ｍＬ）を１００とした場合のパーセンテージで示す。また表中のＯＸ／ＤＨ（％）は、元酵素ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８またはＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ４０のＯＸ／ＤＨ比を１００とした場合のパーセンテージを示す。
【０１４７】
【表８】
2017183717.tif 000010
【０１４８】
【表９】
2017183717.tif 000011
【０１４９】
表８に示す通り、CFP-H38を基準として、F269M、F269L、C280Qの各変異によりそれぞれの改変酵素のオキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性の比（OX/DH）が低減された。
【０１５０】
表９に示す通り、CFP-H40を基準として、F269M、F269L、C280Qの各変異によりそれぞれの改変酵素のオキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性の比（OX/DH）が低減された。またCFP-H40から作製したF269M/C280Q二重変異体について、オキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性の比（OX/DH）がさらに低減された。
【０１５１】
［実施例２］
（ＣＦＰ−Ｈ３８−ｄｈ３の生産および精製）
大腸菌ＪＭ１０９（ＣＦＰ−Ｈ３８−ｄｈ３）株を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地２００ｍｌに植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液４０ｍｌを調製した。
【０１５２】
Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を充てんしたカラムを１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した後、調製したＣＦＰ−Ｈ３８−ｄｈ３を含む各粗酵素液をアプライしてアマドリアーゼを陰イオン交換樹脂に結合させた。その後、３０ｍＭのＮａＣｌ濃度を含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で２０カラム体積分送液し、夾雑タンパク質を溶出させた後、８０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で樹脂に結合したタンパク質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
【０１５３】
得られたそれぞれのアマドリアーゼ活性を示す画分を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０Ｋ（ミリポア社製）により濃縮し、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００により精製した。樹脂の平衡化、溶出には１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた。溶出した各フラクションの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、夾雑タンパク質を含んでいないフラクションを回収し、ＣＦＰ−Ｈ３８−ｄｈ３の精製標品とした。
【０１５４】
［実施例３］
（ＣＦＰ−Ｈ３８−ｄｈ３の、ＨｂＡ１ｃに対するデヒドロゲナーゼ活性の評価）
分光光度計Ｕ−３０１０（日立ハイテクノロジーズ製）を利用して、下記の通りＣＦＰ−Ｈ３８−ｄｈ３のＨｂＡ１ｃに対するデヒドロゲナーゼ活性の評価を実施した。   
（試薬７）：１．８４ｍｇ／ｍｌ  ＨｂＡ１ｃ溶液（ＢＢＩ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ製）
（試薬８）：１０％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（同仁化学研究所製）
（試薬９）：１８５ｍＭ  リン酸緩衝液  ｐＨ６．０
（試薬５）：１０ｍＭ  ＷＳＴ−３溶液
（試薬１０）：８．８ｍｇ／ｍｌ（４．１Ｕ／ｍｌ）  ＣＦＰ−Ｈ３８−ｄｈ３溶液
（Ｕは１ｍＭのαＦ６Ｐを基質とした時のデヒドロゲナーゼ活性を示す。）
（試薬１１）：８．８ｍｇ／ｍｌ  ＣＦＰ−Ｔ７溶液
【０１５５】
まず、５４０μｌの試薬７と６０μｌの試薬８を混合して、９８℃で５分間加熱して、ＨｂＡ１ｃ試料前処理液を調製した。続いて、３０５μｌの試薬９に１２５μｌの試薬５、６２．５μｌの試薬１０、および７．５μｌのイオン交換水を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、ＨｂＡ１ｃ試料前処理液を１２５μｌ加えて撹拌した後、分光光度計により４３３ｎｍにおける吸光度を測定する。対照実験は、６２．５μｌの試薬１０の代わりに、６２．５μｌの試薬１１を添加して実施した。ＣＦＰ−Ｔ７はαＦ６ＰおよびＨｂＡ１ｃに対して反応性を示さないアマドリアーゼである（国際公開第２０１５／０６０４２９号参照）。
【０１５６】
結果を図４に示す。本発明のA1ｃDHを用いたところ、対照と比較して有意な吸光度上昇が確認された。すなわち、ＣＦＰ−Ｈ３８−ｄｈ３はＨｂＡ１ｃに対してデヒドロゲナーゼ活性を示すことが確認された。
【０１５７】
［実施例４］
（印刷電極によるＨｂＡ１ｃの定量）
まず、実施例３で調製したＨｂＡ１ｃ試料前処理液を用いて、２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）、１Ｍ  ＫＣｌ、０．６５％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドを含むＨｂＡ１ｃ溶液を調製した。ＨｂＡ１ｃ濃度は８３、１６６、２４９、３３２μｇ／ｍｌの４レベルとした。スクリーン印刷カーボン電極（ＤＲＰ−１１０、ＤｒｏｐＳｅｎｓ製）上に、調製済みのＨｂＡ１ｃ溶液１０μｌおよび５００ｍＭのＲｕＣｌ３（東京化成工業製）を４μｌ添加して混合した。スクリーン印刷カーボン電極を繋ぎケーブル（ＣＡＣ、ＤｒｏｐＳｅｎｓ製）を介して、ＡＬＳ電気化学アナライザー８１４Ｄ（ＢＡＳ製）に接続した後、３８．４ｍｇ／ｍｌ（１７．８Ｕ／ｍｌ）のＣＦＰ−Ｈ３８−ｄｈ３溶液６μｌを電極上に添加し、＋２００ｍＶ（ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電圧を印加して反応させ、６０秒後の電流値を測定した。各ＨｂＡ１ｃ濃度における電流応答値をプロットした結果を図５に示す。
【０１５８】
図５に示されるとおり、ＣＦＰ−Ｈ３８−ｄｈ３を用いて、精度よくＨｂＡ１ｃを定量することができた。
【０１５９】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列の簡単な説明
配列番号１  Coniochaeta属由来のアマドリアーゼ（CFP-T7）
配列番号２  CFP-T7遺伝子配列
配列番号３  Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ
配列番号４  Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号５  Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号６  Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号７  Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号８  Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号９  Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号１０  Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１１  Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号１２  Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１３  Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１４  CFP-T7-R62D/L63H/E102K/D106K/Q110L/A113K/A355S/D68N/A356T(CFP-T7-H37)のアミノ酸配列
配列番号１５  CFP-T7-H37塩基配列
配列番号１６  CFP-T7-H38  アミノ酸配列（CFP-T7-H37-R64G）
配列番号１７  CFP-T7-H39  アミノ酸配列（CFP-T7-H37-R64G/L110Y）
配列番号１８  CFP-T7-H40  アミノ酸配列（CFP-T7-H37-R64G/L110Y/H99S）
配列番号１９  Ao2 (Aspergillus oryzae由来、別称FaoAo2)
配列番号２０  Af2 (Aspergillus fumigatus由来、別称AmadoriaseII)
配列番号２１  At (Aspergillus terreus由来、別称FAOD-A)
配列番号２２  Fo (Fusarium oxysporum由来)
配列番号２３  Ao1 (Aspergillus oryzae由来、別称FaoAo 1)
配列番号２４  Af1 (Aspergillus fumigatus由来、別称AmadoriaseI)
配列番号２５  Pi (Pichia sp.由来)
配列番号２６  Dh (Debaryomyces hansenii由来)
配列番号２７  プライマー配列（R64G導入用）
配列番号２８  プライマー配列（R64G導入用）
配列番号２９  プライマー配列（L110Y導入用）
配列番号３０  プライマー配列（L110Y導入用）
配列番号３１  プライマー配列（H99S導入用）
配列番号３２  プライマー配列（H99S導入用）
配列番号３３  プライマー配列（F269M導入用）
配列番号３４  プライマー配列（F269M導入用）
配列番号３５  プライマー配列（F269L導入用）
配列番号３６  プライマー配列（C280Q導入用）
配列番号３７  プライマー配列（C280Q導入用）
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１−１】
2017183717.tif 000012
【図１−２】
2017183717.tif 000013
【図１−３】
2017183717.tif 000014
【図１−４】
2017183717.tif 000015
【図１−５】
2017183717.tif 000016
【図２−１】
2017183717.tif 000017
【図２−２】
2017183717.tif 000018
【図２−３】
2017183717.tif 000019
【図２−４】
2017183717.tif 000020
【図２−５】
2017183717.tif 000021
【図２−６】
2017183717.tif 000022
【図２−７】
2017183717.tif 000023
【図２−８】
2017183717.tif 000024
【図２−９】
2017183717.tif 000025
【図２−１０】
2017183717.tif 000026
【図３】
2017183717.tif 000027
【図４】
2017183717.tif 000028
【図５】
2017183717.tif 000029
【配列表】
2017183717000001.app
【国際調査報告】
2017183717.tif 000030
2017183717.tif 000031
2017183717.tif 000032
2017183717.tif 000033
2017183717.tif 000034