(57)【要約】  増幅処理を行っていないサンプルであっても、サンプル量にかかわらず、核酸の特異的な分析を可能とする核酸分析方法を提供する。  本発明の核酸分析方法は、生体由来のサンプルとコントロールプローブとを混合する混合工程、および、前記混合物において、前記サンプル中の核酸と前記コントロールプローブとのハイブリダイゼーションを検出する検出工程を含み、前記コントロールプローブは、核酸分子にシグナル発生物質が結合したフルオロジェニックプローブであり、前記核酸分子は、生体に恒常的に存在する所定のコントロール核酸に対してハイブリダイズする核酸分子であり、前記シグナル発生物質は、標的へのハイブリダイゼーションにより発光シグナルを発生し、前記標的との解離により発光シグナルを消失する物質であり、前記検出工程は、前記ハイブリダイゼーションの検出により、前記サンプルにおける前記コントロール核酸を検出することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体由来のサンプルとコントロールプローブとを混合する混合工程、および、
前記混合物において、前記サンプル中の核酸と前記コントロールプローブとのハイブリダイゼーションを検出する検出工程を含み、
前記コントロールプローブは、
核酸分子にシグナル発生物質が結合したフルオロジェニックプローブであり、
前記核酸分子は、生体に恒常的に存在する所定のコントロール核酸に対してハイブリダイズする核酸分子であり、
前記シグナル発生物質は、標的へのハイブリダイゼーションにより発光シグナルを発生し、前記標的との解離により発光シグナルを消失する物質であり、
前記検出工程は、
前記ハイブリダイゼーションの検出により、前記サンプルにおける前記コントロール核酸を検出することを特徴とする核酸分析方法。
【請求項２】
前記サンプルが、増幅処理を行っていないサンプルである、請求項１記載の核酸分析方法。
【請求項３】
前記コントロール核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１または２記載の核酸分析方法。
【請求項４】
前記コントロール核酸が、アクチンをコードするＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分析方法。
【請求項５】
前記コントロールプローブが、１分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも２つの蛍光性原子団を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分析方法。
【請求項６】
前記混合工程において、同じコントロール核酸に対する複数の前記コントロールプローブを使用し、
前記複数のコントロールプローブが、それぞれ、前記コントロール核酸に対して、異なる領域にハイブリダイズする核酸分子を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸分析方法。
【請求項７】
さらに、トータル核酸の検出工程と、前記コントロール核酸の割合の算出工程とを含み、
前記トータル核酸の検出工程は、
前記サンプル中のトータル核酸を検出する工程であり、
前記割合の算出工程は、
前記トータル核酸の検出結果と、前記コントロール核酸の検出結果とに基づいて、前記トータル核酸における前記コントロール核酸の割合を算出する工程である、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分析方法。
【請求項８】
さらに、相関関係と、前記サンプルにおける前記コントロール核酸の検出結果とに基づいて、前記サンプルの細胞数、組織量または体液量を算出する算出工程を含み、
前記相関関係が、細胞の個数、組織量または体液量と、それらに含まれる前記コントロール核酸の量との相関関係である、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分析方法。
【請求項９】
さらに、前記サンプルと標的プローブとを混合する混合工程、および、
前記混合物において、前記サンプル中の核酸と前記標的プローブとのハイブリダイゼーションを検出する検出工程を含み、
前記標的プローブは、
標的核酸に対してハイブリダイズするプローブであり、
前記検出工程は、
前記ハイブリダイゼーションの検出により、前記サンプルにおける前記標的核酸を検出する、請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分析方法。
【請求項１０】
前記標的プローブは、
核酸分子にシグナル発生物質が結合したフルオロジェニックプローブであり、
前記核酸分子は、前記標的核酸に対してハイブリダイズする核酸分子であり、
前記シグナル発生物質は、標的へのハイブリダイゼーションにより発光シグナルを発生し、前記標的との解離により発光シグナルを消失する物質であり、
前記コントロールプローブにおけるシグナル発生物質の発光シグナルと、前記標的プローブにおけるシグナル発生物質の発光シグナルとは、異なる蛍光特性である、請求項９記載の核酸分析方法。
【請求項１１】
前記標的プローブが、１分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも２つの蛍光性原子団を有する、請求項１０記載の核酸分析方法。
【請求項１２】
前記混合工程において、同じ標的核酸に対する複数の前記標的プローブを使用し、
前記複数の標的プローブが、それぞれ、前記標的核酸に対して、異なる領域にハイブリダイズする核酸分子を有する、請求項９から１１のいずれか一項に記載の核酸分析方法。
【請求項１３】
さらに、トータル核酸の検出工程と、前記標的核酸の割合の算出工程とを含み、
前記トータル核酸の検出工程は、
前記サンプル中のトータル核酸を検出する工程であり、
前記割合の算出工程は、
前記トータル核酸の検出結果と、前記標的核酸の検出結果とに基づいて、前記トータル核酸における前記標的核酸の割合を算出する、請求項９から１２のいずれか一項に記載の核酸分析方法。
【請求項１４】
前記エキシトン効果を示す一対の蛍光性原子団を有する塩基が、下記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、または（１７ｂ）で表される構造を有する、請求項５から１３のいずれか一項に記載の核酸分析方法。
【化１】
2018008435.tif 000029
【化２】
2018008435.tif 000030
【化３】
2018008435.tif 000031
【化４】
2018008435.tif 000032
【請求項１５】
前記検出工程が、融解曲線解析による検出工程である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の核酸分析方法。
【請求項１６】
生体由来のサンプルと標的プローブとを混合する混合工程、および、
前記混合物において、前記サンプル中の核酸と前記標的プローブとのハイブリダイゼーションを検出する検出工程を含み、
前記標的プローブは、
核酸分子にシグナル発生物質が結合したフルオロジェニックプローブであり、
前記核酸分子は、標的核酸に対してハイブリダイズする核酸分子であり、
前記シグナル発生物質は、標的へのハイブリダイゼーションにより発光シグナルを発生し、前記標的との解離により発光シグナルを消失する物質であり、
前記検出工程は、
前記ハイブリダイゼーションの検出により、前記サンプルにおける前記標的核酸を検出することを特徴とする核酸分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サンプル中の標的核酸の分析を行う場合、一般的に、サンプル中の核酸を特異的プライマーにより増幅させ、その増幅の有無を検出する方法、または、得られた増幅産物と特異的プローブとのハイブリダイズを検出する方法が採用されている。このように、標的核酸を特異的に検出するには、精度および感度の点から、核酸の増幅は必須である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、サンプル中の核酸を増幅させた場合、得られる分析結果は、増幅した核酸の結果であるため、サンプルに元来含まれていた核酸量が不明である。他方、サンプル中の核酸を増幅することなく検出する場合、例えば、サンプル量が少ないと、プローブを使用しても十分なシグナルを得ることができない。このため、例えば、二本鎖ＤＮＡに非特異的に結合する蛍光試薬の使用が試みられているが、この方法では、非特異的な結合であるため、非特異的なＤＮＡの検出が行われるにとどまっている。【０００４】
そこで、本発明は、例えば、増幅処理を行っていないサンプルであっても、サンプル量にかかわらず、核酸の特異的な分析を可能とする核酸分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明の第１の核酸分析方法は、
生体由来のサンプルとコントロールプローブとを混合する混合工程、および、
前記混合物において、前記サンプル中の核酸と前記コントロールプローブとのハイブリダイゼーションを検出する検出工程を含み、
前記コントロールプローブは、
核酸分子にシグナル発生物質が結合したフルオロジェニックプローブであり、
前記核酸分子は、生体に恒常的に存在する所定のコントロール核酸に対してハイブリダイズする核酸分子であり、
前記シグナル発生物質は、標的へのハイブリダイゼーションにより発光シグナルを発生し、前記標的との解離により発光シグナルを消失する物質であり、
前記検出工程は、
前記ハイブリダイゼーションの検出により、前記サンプルにおける前記コントロール核酸を検出することを特徴とする。【０００６】
本発明の第２の核酸分析方法は、
生体由来のサンプルと標的プローブとを混合する混合工程、および、
前記混合物において、前記サンプル中の核酸と前記標的プローブとのハイブリダイゼーションを検出する検出工程を含み、
前記標的プローブは、
核酸分子にシグナル発生物質が結合したフルオロジェニックプローブであり、
前記核酸分子は、標的核酸に対してハイブリダイズする核酸分子であり、
前記シグナル発生物質は、標的へのハイブリダイゼーションにより発光シグナルを発生し、前記標的との解離により発光シグナルを消失する物質であり、
前記検出工程は、
前記ハイブリダイゼーションの検出により、前記サンプルにおける前記標的核酸を検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の核酸分析方法によれば、例えば、増幅処理を行っていないサンプルであっても、サンプル量にかかわらず、前記フルオロジェニックプローブを使用することにより、核酸の特異的な分析が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
＜第１の核酸分析方法＞
本発明の第１の核酸分析方法は、前述のように、
生体由来のサンプルとコントロールプローブとを混合する混合工程、および、
前記混合物において、前記サンプル中の核酸と前記コントロールプローブとのハイブリダイゼーションを検出する検出工程を含み、
前記コントロールプローブは、
核酸分子にシグナル発生物質が結合したフルオロジェニックプローブであり、
前記核酸分子は、生体に恒常的に存在する所定のコントロール核酸に対してハイブリダイズする核酸分子であり、
前記シグナル発生物質は、標的へのハイブリダイゼーションにより発光シグナルを発生し、前記標的との解離により発光シグナルを消失する物質であり、
前記検出工程は、
前記ハイブリダイゼーションの検出により、前記サンプルにおける前記コントロール核酸を検出することを特徴とする。
【０００９】
本発明によれば、前記コントロールプローブを使用することによって、例えば、前記サンプルの増幅処理を行うことなく、また、前記サンプルの量に影響されることなく、前記コントロール核酸を検出できる。また、本発明によれば、増幅処理が不要であり、且つ、生体に恒常的に存在するコントロール核酸に結合するコントロールプローブを使用するため、前記コントロール核酸の検出によって、後述するように、前記サンプル中の細胞数を推定することも可能になる。診断等の分野においては、細胞あたりの量を知ることが重要となる。本発明によれば、サンプル中の細胞数の推定も可能であることから、診断等の分野において、非常に有用な方法であると言える。
【００１０】
本発明の第１の核酸分析方法は、例えば、前記核酸サンプルが、増幅処理を行っていない核酸サンプルである。
【００１１】
本発明の第１の核酸分析方法は、例えば、前記コントロール核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００１２】
本発明の第１の核酸分析方法は、例えば、前記コントロール核酸が、アクチンをコードするＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００１３】
本発明の第１の核酸分析方法は、例えば、前記コントロールプローブが、１分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも２つの蛍光性原子団を有する。
【００１４】
本発明の第１の核酸分析方法は、例えば、前記混合工程において、同じコントロール核酸に対する複数の前記コントロールプローブを使用し、
前記複数のコントロールプローブが、それぞれ、前記コントロール核酸に対して、異なる領域にハイブリダイズする核酸分子を有する。
【００１５】
本発明の第１の核酸分析方法は、例えば、さらに、トータル核酸の検出工程と、前記コントロール核酸の割合の算出工程とを含み、
前記トータル核酸の検出工程は、
前記サンプル中のトータル核酸を検出する工程であり、
前記割合の算出工程は、
前記トータル核酸の検出結果と、前記コントロール核酸の検出結果とに基づいて、前記トータル核酸における前記コントロール核酸の割合を算出する。
【００１６】
本発明の第１の核酸分析方法は、例えば、さらに、相関関係と、前記サンプルにおける前記コントロール核酸の検出結果とに基づいて、前記サンプルの細胞数、組織量または体液量を算出する算出工程を含み、
前記相関関係が、細胞の個数、組織量または体液量と、それらに含まれる前記コントロール核酸の量との相関関係である。
【００１７】
本発明の第１の核酸分析方法は、例えば、さらに、前記サンプルと標的プローブとを混合する混合工程、および、
前記混合物において、前記サンプル中の核酸と前記標的プローブとのハイブリダイゼーションを検出する検出工程を含み、
前記標的プローブは、
標的核酸に対してハイブリダイズするプローブであり、
前記検出工程は、
前記ハイブリダイゼーションの検出により、前記サンプルにおける前記標的核酸を検出する。
【００１８】
本発明の第１の核酸分析方法は、例えば、前記標的プローブは、
核酸分子にシグナル発生物質が結合したフルオロジェニックプローブであり、
前記核酸分子は、前記標的核酸に対してハイブリダイズする核酸分子であり、
前記シグナル発生物質は、標的へのハイブリダイゼーションにより発光シグナルを発生し、前記標的との解離により発光シグナルを消失する物質であり、
前記コントロールプローブにおけるシグナル発生物質の発光シグナルと、前記標的プローブにおけるシグナル発生物質の発光シグナルとは、異なる蛍光特性である。
【００１９】
本発明の第１の核酸分析方法は、例えば、前記標的プローブが、１分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも２つの蛍光性原子団を有する。
【００２０】
本発明の第１の核酸分析方法は、例えば、前記混合工程において、同じ標的核酸に対する複数の前記標的プローブを使用し、
前記複数の標的プローブが、それぞれ、前記標的核酸に対して、異なる領域にハイブリダイズする核酸分子を有する。
【００２１】
本発明の第１の核酸分析方法は、例えば、さらに、トータル核酸の検出工程と、前記標的核酸の割合の算出工程とを含み、
前記トータル核酸の検出工程は、
前記サンプル中のトータル核酸を検出する工程であり、
前記割合の算出工程は、
前記トータル核酸の検出結果と、前記標的核酸の検出結果とに基づいて、前記トータル核酸における前記標的核酸の割合を算出する。
【００２２】
本発明の第１の核酸分析方法は、例えば、前記エキシトン効果を示す一対の蛍光性原子団を有する塩基が、後述する式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、または（１７ｂ）で表される構造を有する。
【００２３】
本発明の第１の核酸分析方法は、例えば、前記検出工程が、融解曲線解析による検出工程である。
【００２４】
以下に、本発明の第１の核酸分析方法について、具体的に説明する。なお、本発明の方法は、これらの記載には限定されない。
【００２５】
本発明において、「フルオロジェニック」とは、例えば、標的に特異的に結合した状態で、シグナルを発生し、未結合の状態で、シグナルを消失することをいい、シグナルの発生と消失とが可逆的であることを意味する。本発明において、「分析」とは、例えば、定性分析でもよいし、定量分析でもよい。
【００２６】
本発明において、前記サンプルは、例えば、増幅処理を行っていないサンプルでもよいし、増幅処理を行ったサンプルでもよい。本発明は、前述のように、増幅処理を行わない場合でも、コントロール核酸の検出が可能であることから、特に、前者の増幅処理を行っていないサンプルの分析に有用である。
【００２７】
前記サンプルは、特に制限されず、生体由来であればよい。前記生体由来サンプルの種類は、特に制限されず、例えば、体液、組織、細胞等があげられる。前記体液は、例えば、全血、血漿、血清等の血液、房水等の眼球内液、リンパ液、脳脊髄液、涙、汗、精液、唾液、粘液、尿、鼻水、鼻腔ぬぐい液（スワブ）等があげられる。前記組織としては、例えば、硝子体等の眼球内組織、腫瘍等の病原を有する組織等があげられる。また、前記細胞としては、例えば、腫瘍等の病原細胞、血球細胞（例えば、赤血球、白血球等）等があげられる。前記生体の種類は、特に制限されず、例えば、ヒト、非ヒト哺乳類（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギおよびウマ等）、鳥類、魚類等の動物があげられる。
【００２８】
本発明において、前記コントロールプローブは、生体に恒常的に存在するコントール核酸に対するプローブである。したがって、前記コントロールプローブは、例えば、分析対象である前記サンプルの種類に応じて、前記コントロール核酸を設定することによって、適宜決定できる。前記コントロール核酸は、例えば、前記サンプルの種類において恒常的に存在することが既知である核酸、また、今後、恒常的に存在することが既知となる核酸があげられる。前記コントロール核酸としては、例えば、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ(glyceraldehyde  3-phosphate  dehydrogenase)、ユビキチン等をコードする核酸があげられる。アクチン等のコントロール核酸は、例えば、動物の種類（例えば、ヒト）に応じて、体液あたりの量、組織あたりの量、または細胞あたりの量が規定できる。
【００２９】
本発明において、分析対象である前記コントロール核酸は、例えば、ＤＮＡでもよいし、ＲＮＡでもよい。また、前記コントロール核酸は、例えば、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。後者の場合、例えば、前記二本鎖核酸を構成する一対の一本鎖核酸のうち、いずれの一本鎖核酸を、前記コントロールプローブがハイブリダイズする核酸に設定してもよい。具体的には、前記一対の一本鎖核酸のうち、例えば、センス鎖を、ハイブリダイズする核酸に設定してもよいし、アンチセンス鎖を、ハイブリダイズする核酸に設定してもよい。
【００３０】
前記コントロールプローブは、核酸分子にシグナル発生物質が結合したフルオロジェニックプローブであり、前記核酸分子は、生体に恒常的に存在する所定のコントロール核酸に対してハイブリダイズする核酸分子である。前記核酸分子は、前記コントロール核酸にハイブリダイズできればよく、前記核酸分子の配列は、前記コントロール核酸の配列に応じて適宜設計できる。前記核酸分子は、例えば、前記コントロール核酸が一本鎖であり、前記コントロール核酸へのハイブリダイズにより二本鎖を形成する核酸分子でもよいし、前記コントロール核酸が二本鎖であり、前記コントロール核酸へのハイブリダイズにより三本鎖を形成する、フーグスティーン型塩基対を利用する核酸分子でもよい。
【００３１】
前記核酸分子は、例えば、３’末端が、伸長不可なように修飾されてもよく、具体的には、例えば、３’末端をリンカーＯＨ基で化学修飾したものでもよい。
【００３２】
前記コントロールプローブにおいて、前記シグナル発生物質は、標的へのハイブリダイゼーションにより発光シグナルを発生し、前記標的との解離により発光シグナルを消失する物質である。前記シグナルの発生または消失は、例えば、ＦＲＥＴ（Fluorescence  resonance  energy  transfer）を利用してもよいし、ＦＲＥＴを利用しなくてもよい。
【００３３】
前記コントロールプローブにおける前記シグナル発生物質は、例えば、エトキシン効果を示す蛍光原子団等があげられる。前記コントロールプローブは、例えば、１分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも２つの蛍光性原子団を有することが好ましい（以下、「Ｅプローブ」ともいう）。前記Ｅプローブは、例えば、特許第４３７０３８５号公報、国際公開公報ＷＯ２０１４／０１３９５４号パンフレットを参照できる。
【００３４】
前記Ｅプローブは、２つの蛍光性原子団（例えば、チアゾールオレンジやその類似物）が導入されたプローブである。前記Ｅプローブは、例えば、１本鎖の状態では、２つの蛍光性原子団がエキシプレックスを形成するエキシトン効果により、蛍光をほとんど発しないが、標的とハイブリダイズして２本鎖の状態または３本鎖の状態をとると、２つの蛍光性原子団がお互いに離れ、エキシトン効果を解消することによって大きく蛍光を発するという性質を持つ。なお、「Ｅプローブ」は、株式会社ダナフォームの商品名（「Eprobe」は登録商標）であるが、本発明における「Ｅプローブ」は、「Ｅプローブ」または「Eprobe」の商品名を付された商品と同一であっても、同一でなくても良い。
【００３５】
前記Ｅプローブを構成する核酸分子の塩基配列において、前記２つの蛍光原子団の結合位置は、特に制限されず、任意の位置に設定できる。前記２つの蛍光原子は、例えば、前記核酸分子内の同一塩基に結合されてもよいし、それぞれが、互いに隣接する２つの塩基に結合されてもよい。前記核酸分子が、前記コントロール核酸と２本鎖を形成する核酸分子の場合、前記２つの蛍光原子は、例えば、少なくとも一方が、前記核酸分子の３’末端または５’末端から数塩基内側の塩基に結合されることが好ましく、前記末端の塩基を１番目として、３塩基内側の塩基に結合されることが好ましい。また、前記核酸分子が、前記コントロール核酸と３本鎖を形成するフーグスティーン型塩基対を利用するオリゴヌクレオチドの場合、例えば、前記２つの蛍光原子は、例えば、５’末端または３’末端に結合されることが好ましい。
【００３６】
前記２つの蛍光原子団は、例えば、直接的に前記オリゴヌクレオチドに結合してもよいし、間接的に前記オリゴヌクレオチドに結合してもよい。後者の場合、前記２つの蛍光原子団は、例えば、リンカーを介して前記オリゴヌクレオチドに結合している。
【００３７】
前記Ｅプローブにおいて、前記エキシトン効果を示す蛍光性原子団は、
（ｉ）１つの分子内の２つの平面化学構造が同一平面内ではなく、ある一定の角度をもって存在するが、その分子が核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング（溝結合）するときには２つの平面化学構造が同一平面内に並ぶように配置することによって蛍光発光が生じるものであるか、
（ii）２つ以上の色素分子が並行に集合するために生じるエキシトン効果によって蛍光発光を示さないが、それらの分子が標的分子、たとえば核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング（溝結合）するときには、前記集合状態が解けることにより蛍光発光が生じる２つ以上の色素分子群からなるものであるか、または、
（iii）２つ以上の色素分子が並行に集合するために生じるエキシトン効果によって蛍光発光を示さないが、それらの分子が標的分子、たとえば核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング（溝結合）するときには、前記集合状態が解けることにより蛍光発光が生じる２つ以上の色素分子の化学構造を同一分子内に有することを特徴とするものである。
前記（ii）または（iii）の場合において、前記色素分子が、前記（ｉ）記載の分子であることが好ましい。
【００３８】
前記Ｅプローブにおいて、前記エキシトン効果を示す一対の蛍光原子団を有する塩基は、例えば、下記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）または（１８ｂ）で表される構造を有する。また、これらの式で表される構造に対する、互変異性体もしくは立体異性体、またはそれらの塩も、本発明における前記構造に含まれる。以下、蛍光性を示す原子団Ｚ１１およびＺ１２を有する、下記各式で表される構造を、「標識構造」ということがある。
【００３９】
【化１】
2018008435.tif 000002
【化２】
2018008435.tif 000003
【化３】
2018008435.tif 000004
【化４】
2018008435.tif 000005
【化５】
2018008435.tif 000006
【化６】
2018008435.tif 000007
【００４０】
式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｂは、天然核酸塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル）骨格または人工核酸塩基骨格を有する原子団であり、
Ｅは、
（ｉ）デオキシリボース骨格、リボース骨格、もしくはそれらのいずれかから誘導される構造を有する原子団、または
（ｉｉ）ペプチド構造もしくはペプトイド構造を有する原子団であり、
Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ、蛍光性を示す原子団であり、同一でも異なっていてもよく、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ、リンカー（架橋原子または原子団）であり、主鎖長（主鎖原子数）は任意であり、主鎖中に、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＰおよびＳｉを、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、主鎖中に、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合およびチオエステル結合を、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、互いに同一でも異なっていても良く、
Ｄは、ＣＲ、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、ＢもしくはＳｉＲであり、Ｒは、水素原子、アルキル基または任意の置換基であり、
ｂは、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、
または、前記式（１６）および（１６ｂ）中、Ｌ１およびＬ２は前記リンカーであり、Ｌ３、Ｄおよびｂは存在せず、Ｌ１およびＬ２がＢに直接結合していてもよく、
ただし、
式（１６）、（１７）および（１８）中、Ｅは、前記（ｉ）の原子団であり、リン酸架橋中の少なくとも一つのＯ原子がＳ原子で置換されていても良く、
式（１６ｂ）、（１７ｂ）および（１８ｂ）中、Ｅは、前記（ｉｉ）の原子団であり、
式（１７）および（１７ｂ）中、各Ｂは、同一でも異なっていても良く、各Ｅは、同一でも異なっていても良い。
【００４１】
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖長（主鎖原子数）は、それぞれ２以上の整数であることが好ましい。Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖長（主鎖原子数）は、上限は特に制限されないが、例えば１００以下であり、より好ましくは３０以下であり、特に好ましくは１０以下である。
【００４２】
Ｚ１１およびＺ１２は、エキシトン効果を示す蛍光性原子団である。これにより、標的配列と結合したときの蛍光色素周りの環境変化、例えば、二重らせん構造となったときの蛍光の増大が大きく、標的配列をいっそう効果的に検出することができる。
【００４３】
Ｚ１１およびＺ１２は、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であればよく、特に制限されない。Ｚ１１およびＺ１２は、例えば、それぞれ独立に、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、シアニン、ヘミシアニン、その他のシアニン色素、メチルレッド、アゾ色素またはそれらの誘導体から誘導される基であることがより好ましい。また、その他の公知の色素から誘導される基も、適宜用いることができる。ＤＮＡ等の核酸に結合することによって蛍光強度を変化させる蛍光色素は、数多く報告されている。典型的な例では、エチジウムブロミドがＤＮＡの二重らせん構造にインターカレーションして強い蛍光を示すことが知られており、ＤＮＡ検出に多用されている。また、ピレンカルボキシアミドやプロダンのような微視的極性に応じて蛍光強度を制御できる蛍光色素も知られている。また、前記チアゾールオレンジは、ベンゾチアゾール環とキノリン環をメチン基で連結した蛍光色素であり、通常微弱な蛍光を示すが、二重らせん構造をもつＤＮＡにインターカレーションすることによって強い蛍光発光を与えるようになる。その他、例えば、フルオレセインやＣｙ３等の色素もあげられる。
【００４４】
Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立に、下記式（７）から（９）のいずれかで表される原子団であることがより好ましい。
【化７】
2018008435.tif 000008
【化８】
2018008435.tif 000009
【化９】
2018008435.tif 000010
【００４５】
式（７）〜（９）中、
Ｘ１およびＸ２は、Ｓ、ＳｅまたはＯであり、
ｎ’’は、０または正の整数であり、
Ｒ１〜Ｒ１０、Ｒ１３〜Ｒ２１は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、またはアミノ基であり、
Ｒ１１およびＲ１２のうち、一方は、前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中のＬ１もしくはＬ２に結合する連結基であり、他方は、水素原子または低級アルキル基であり、
Ｒ１５は、式（７）、（８）または（９）中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Ｒ１６は、式（７）、（８）または（９）中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Ｚ１１中のＸ１、Ｘ２およびＲ１〜Ｒ２１と、Ｚ１２中のＸ１、Ｘ２およびＲ１〜Ｒ２１とは、互いに同一でも異なっていてもよい。
【００４６】
前記式（７）〜（９）中、Ｒ１〜Ｒ２１において、前記低級アルキル基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルキル基であり、前記低級アルコキシ基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルコキシ基であることがさらに好ましい。
【００４７】
前記式（７）〜（９）中、Ｒ１１およびＲ１２において、前記連結基が、炭素数２以上のポリメチレンカルボニル基であり、カルボニル基部分で前記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中のＬ１もしくはＬ２に結合することがさらに好ましい。前記ポリメチレンカルボニル基の炭素数は、その上限は特に制限されないが、例えば１００以下、好ましくは５０以下、より好ましくは３０以下、特に好ましくは１０以下である。
【００４８】
Ｚ１１およびＺ１２は、前記式（７）〜（９）で表される場合は、例えば、それぞれ独立に、下記式（１９）または（２０）で示される基であることがより好ましい。
【化１０】
2018008435.tif 000011
【化１１】
2018008435.tif 000012
【００４９】
前記式（１９）および（２０）中、Ｘ１は−Ｓ−又は−Ｏ−を示す。Ｒ１からＲ１０、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、又はアミノ基を示す。Ｒ１１およびＲ１２の一方は、前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中のＬ１およびＬ２に結合する連結基を示し、Ｒ１１およびＲ１２の他方は水素原子、または低級アルキル基を示す。
【００５０】
また、Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、下記の各化学式のいずれかで表される原子団であることが特に好ましい。
【化１２】
2018008435.tif 000013
【化１３】
2018008435.tif 000014
【化１４】
2018008435.tif 000015
【化１５】
2018008435.tif 000016
【化１６】
2018008435.tif 000017
【化１７】
2018008435.tif 000018
【００５１】
上記各化学式中、
ｎは、正の整数であり、２〜６の範囲であることが特に好ましい。
【００５２】
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、Ｂは、天然核酸塩基骨格を有していても良いが、前述の通り、人工核酸塩基骨格を有していてもよい。例えば、Ｂが、Ｐｙ（ピリミジン環）、Ｐｙ  ｄｅｒ．、Ｐｕ（プリン環）、またはＰｕ  ｄｅｒ．で表される構造であることが好ましい。ただし、
前記Ｐｙとは、下記式（１１）で表記される６員環のうち、１位にＥと結合する共有結合手を有し、５位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Ｐｙ  ｄｅｒ．とは、前記Ｐｙの６員環の全原子の少なくとも一つがＮ、Ｃ、ＳまたはＯ原子で置換された原子団であり、前記Ｎ、Ｃ、ＳまたはＯ原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良く、
前記Ｐｕとは、下記式（１２）で表記される縮合環のうち、９位にＥと結合する共有結合手を有し、８位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Ｐｕ  ｄｅｒ．とは、前記Ｐｕの５員環の全原子の少なくとも一つがＮ、Ｃ、ＳまたはＯ原子で置換された原子団であり、前記Ｎ、Ｃ、ＳまたはＯ原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良い。
【００５３】
【化１８】
2018008435.tif 000019
【００５４】
また、前記Ｅプローブにおける前記オリゴヌクレオチドは、例えば、下記化学式１０６、１１０、１１３、１１７、１２０、１２２、１２３、１２４または１１４−２で表されるヌクレオチド構造、またはそれらの幾何異性体、立体異性体もしくは塩である構造を少なくとも一つ含んでいても良い。
【化１９】
2018008435.tif 000020
【化２０】
2018008435.tif 000021
【化２１】
2018008435.tif 000022
【化２２】
2018008435.tif 000023
【化２３】
2018008435.tif 000024
【化２４】
2018008435.tif 000025
【化２５】
2018008435.tif 000026
【化２６】
2018008435.tif 000027
【化２７】
2018008435.tif 000028
【００５５】
上記化学式１０６、１１０、１１３、１１７、１２０、１２２、１２３、１２４および１１４−２中、リンカー長ｎは、正の整数であり、２〜６の範囲であることが好ましい。
【００５６】
前記Ｅプローブに含まれる前記標識構造の数は、特に限定されないが、例えば、１〜１００個程度、１〜２０個程度である。また、前記Ｅプローブにおいて、前記標識構造が含まれる部位も特に制限されない。
【００５７】
前記コントロールプローブにおける核酸分子は、例えば、天然ヌクレオチド残基、非ヌクレオチド残基、修飾ヌクレオチド残基および非天然主骨格のいずれから構成されてもよく、いずれか一種類でもよいし、いずれか二種類でもよいし、前記三種類を含んでもよいし、前記四種類を含んでもよい。前記非天然主骨格は、特に制限されず、例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡおよび修飾型リン酸ジエステル結合をもつ核酸等があげられる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、特に制限されず、Ｓ化ヌクレオチド残基であり、前記ヌクレオチド残基が硫黄原子（Ｓ）を含んでもよいし、硫黄原子（Ｓ）で修飾されてもよい。
【００５８】
前記コントロールプローブにおける核酸分子の基本骨格は、特に制限されず、例えば、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、修飾オリゴヌクレオシド、ポリヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、修飾ポリヌクレオシド、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、または、これらキメラ分子のいずれであっても良いし、その他の構造であっても良い。また、前記核酸の基本骨格は、天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。前記核酸がプローブの場合、例えば、塩基対結合を形成し得るものであればよく、核酸試料や標的核酸配列の場合、例えば、相補鎖合成のための鋳型として機能すればよい。このため、前記核酸は、例えば、部分的に、または、全体が完全に人工的な構造からなるヌクレオチド誘導体であってもよい。前記核酸を構成する人工塩基としては、例えば、2-amino-6-(N,N-dimethylamino)purinepyridin-2-one、5-methylpyridin-2-one、2-amino-6-(2-thienyl)purine、pyrrole-2-carbaldehyde、9-Methylimidazo[(4,5)-b]pyridine、5-iodo-2-oxo(1H)pyridine  2-oxo-(1H)pyridine、2-amino-6-(2-thiazolyl)purine、7-(2-thienyl)-imidazo[4,5-b]pyridine等があげられるが、これには限定されない。
【００５９】
本発明の分析方法において、「ヌクレオチド」とは、例えば、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのいずれであってもよく、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、例えば、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのいずれか一方から構成されてもよいし、両者を含んでもよい。前記プローブにおいて、核酸の構成塩基数は、特に制限されない。核酸という用語は、一般に、ポリヌクレオチドという用語と同義である。オリゴヌクレオチドという用語は、一般に、ポリヌクレオチドの中でも、特に構成塩基数が少ないものを示す用語として用いる。一般には、例えば、２〜１００塩基長、より一般的には２〜５０塩基長程度のポリヌクレオチドを「オリゴヌクレオチド」と呼ぶが、これらの数値に限定されるものではない。ポリヌクレオチドという用語は、第１の分析方法において、例えば、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、ならびに、ペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、Ｓ−オリゴ核酸などの人工合成核酸をも含むものとする。
【００６０】
前記ＰＮＡ（ペプチド核酸）は、一般に、オリゴヌクレオチドのデオキシリボース主鎖が、ペプチド主鎖で置換された構造を有する。前記ペプチド主鎖としては、例えば、アミド結合によって結合したＮ−（２−アミノエチル）グリシンの反復単位があげられる。ＰＮＡのペプチド主鎖に結合させる塩基としては、例えば、チミン、シトシン、アデニン、グアニン、イノシン、ウラシル、５−メチルシトシン、チオウラシルおよび２，６−ジアミノプリン等の天然に存在する塩基、ブロモチミン、アザアデニンおよびアザグアニン等の人工塩基があげられるが、これに限定されない。
【００６１】
前記ＬＮＡは、一般に、糖−リン酸骨格において、リボースの２’位の酸素原子と４’位の炭素原子との間がメチレン架橋で結合された、２つの環状構造を持つ核酸である。ＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドがＤＮＡとアニールすると、二本鎖のコンフォメーションが変化し、熱安定性が上昇する。ＬＮＡは、通常のオリゴヌクレオチドに比較して核酸に対する結合力が強いため、例えば、オリゴヌクレオチドの設計条件によって、より確実、強固なハイブリダイゼーションが可能となる。
【００６２】
前記コントロールプローブにおいて前記核酸分子に含まれる塩基数は、特に限定されず、例えば、５〜１００程度、６〜５０程度、６〜２５程度である。
【００６３】
本発明において前記混合工程は、生体由来のサンプルとコントロールプローブとを混合する工程である。前記生体由来のサンプルの量は、特に制限されない。本発明によれば、例えば、十分なサンプル量の場合であっても、少ないサンプル量の場合であっても、前記コントロールプローブを使用することで、増幅処理を行わなくても、発光によりサンプル中のコントロール核酸を検出することができる。使用するサンプル量は、例えば、ナノリットルオーダー、マイクロリットルオーダー、ミリリットルオーダーのいずれでもよく、例えば、０．１ｎＬ〜１ｍＬであり、具体例としては、例えば、０．１ｎＬ〜１０ｎＬ、１０ｎＬ〜１００ｎＬであり、または、０．１μＬ〜１０μＬ、１０μＬ〜１０００μＬである。
【００６４】
前記混合工程において、前記コントロールプローブの添加量は、特に制限されず、例えば、サンプル量に応じて適宜設定できる。前記添加量は、例えば、サンプル１μＬに対して、１ｘ１０−１２〜１ｘ１０−９μｍｏｌ、１ｘ１０−９〜１ｘ１０−６μｍｏｌ、１ｘ１０−６〜１ｘ１０−３μｍｏｌである。前記コントロールプローブは、例えば、溶媒に混合したプローブ試薬として、前記サンプルと混合することが好ましい。前記プローブ試薬において、前記コントロールプローブの濃度は、特に制限されず、例えば、１ｘ１０−６〜１ｘ１０−３μｍｏｌ／Ｌ、１ｘ１０−３〜１μｍｏｌ／Ｌ、１〜１ｘ１０3μｍｏｌ／Ｌである。
【００６５】
前記混合工程において使用する前記コントロールプローブの種類の数は、特に制限されず、設定するコントロール核酸の種類または数によって適宜設定できる。具体例として、コントロール核酸が１種類の場合、例えば、１種類のコントロールプローブを使用してもよいし、２種類以上のコントロールプローブを使用してもよい。後者の場合は、例えば、前記混合工程において、同じコントロール核酸に対する複数の前記コントロールプローブを使用し、前記複数のコントロールプローブが、それぞれ、前記コントロール核酸に対して、異なる領域にハイブリダイズする核酸分子を有することが好ましい。この場合、前記複数のコントロールプローブは、それぞれ異なる領域にハイブリダイズする核酸分子を有するが、同じシグナル発生物質を有し、ハイブリダイズによって同じ発光シグナルを発することが好ましい。この形態によれば、例えば、１種類のコントロール核酸の複数箇所に、複数の前記コントロールプローブをハイブリダイズさせ、且つ、ハイブリダイズによる発光シグナルの総量を大きくすることができる。
【００６６】
また、設定するコントロール核酸が複数の場合、例えば、各コントロール核酸に対して、１種類のコントロールプローブを使用してもよいし、２種類のコントロールプローブを使用してもよい。各コントロール核酸に対するコントロールプローブは、例えば、それぞれ、異なるシグナル発光物質を有することが好ましい。このように、異なるシグナル発光物質を有することで、各コントロール核酸を検出し分けることができる。異なるシグナル発光物質とは、例えば、異なる蛍光特性を有することを意味し、具体的には、例えば、異なる励起波長を有すること、異なる蛍光波長を有すること、または異なる励起波長と異なる蛍光波長を有することを意味する。
【００６７】
前記混合工程において、前記サンプルと前記コントロールプローブとの混合液は、例えば、前記サンプル中の核酸と前記コントロールプローブとのハイブリダイゼーションが起こりやすい温度（ハイブリダイゼーション温度）で処理することが好ましい。前記コントロール核酸が二本鎖核酸であり、一本鎖核酸に解離させて、前記コントールプローブとハイブリダイズさせる場合は、例えば、前記サンプルを解離温度で処理した後に、前記コントロールプローブと混合し、ハイブリダイゼーション温度で処理してもよいし、前記混合液を解離温度で処理した後に、前記混合液をハイブリダイゼーション温度で処理してもよい。前記ハイブリダイゼーション温度は、例えば、１５〜７０℃であり、前記解離温度は、例えば、９０〜１００℃である。
【００６８】
本発明において前記検出工程は、前記混合物において、前記サンプル中の核酸と前記コントロールプローブとのハイブリダイゼーションを検出する工程である。前記ハイブリダイゼーションの検出により、前記サンプルにおける前記コントロール核酸を検出することができる。
【００６９】
前記ハイブリダイゼーションの検出方法は、特に制限されず、前記コントロールプローブにおける前記シグナル発生物質によって、適宜決定できる。前記コントロールプローブと前記コントロール核酸とのハイブリダイズは、例えば、融解曲線解析による検出があげられる。
【００７０】
本発明は、さらに、前記サンプルに対する、トータル核酸の検出工程と、前記コントロール核酸の割合の算出工程とを含んでもよい。
【００７１】
前記トータル核酸の検出工程は、前記サンプル中のトータル核酸を検出する工程である。前記トータル核酸を検出する方法は、特に制限されず、例えば、前記サンプル中の核酸を非特異的に検出する方法があげられる。前記トータル核酸が二本鎖ＤＮＡの場合、例えば、二本鎖にインターカレートするインターカレータ（例えば、ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ等）を前記サンプルに混合し、その蛍光シグナルを検出することによって、前記トータル核酸を検出できる。
【００７２】
前記トータル核酸の検出工程は、例えば、前記コントロールプローブを用いた検出と同じ系（前記混合液）に対して行ってもよいし、別の系でおこなってもよいが、使用するサンプルのトータル量を低減できることから、前者が好ましい。つまり、サンプルに対して、前記コントロールプローブおよび前記インターカレータを混合し、前記コントロールプローブとのハイブリダイゼーションの検出と、前記トータル核酸の検出との両方を行うことが好ましい。なお、前記サンプルに対する前記コントロールプローブの添加と前記インターカレータの添加は、例えば、いずれが先でもよいし、同時でもよく、また、前記ハイブリダイゼーションの検出と前記トータル核酸の検出は、例えば、いずれを先に行ってもよい。
【００７３】
そして、前記割合の算出工程によれば、前記トータル核酸の検出結果と、前記コントロール核酸の検出結果とに基づいて、前記トータル核酸における前記コントロール核酸の割合を算出することができる。
【００７４】
また、本発明は、さらに、相関関係と、前記サンプルにおける前記コントロール核酸の検出結果とに基づいて、前記サンプルの細胞数、組織量または体液量を算出する算出工程を含んでもよい。前記相関関係は、例えば、細胞の個数、組織量または体液量と、それらに含まれる前記コントロール核酸の量との関係である。前記コントロール核酸は、前述のように、細胞、組織または体液において恒常的に存在するため、例えば、予め、目的の細胞、組織、または体液あたりのコントロール核酸の量から、前記相関関係を求めることができる。そして、前記コントロールの検出結果と前記相関関係に基づけば、前記サンプルにおける細胞数、組織量、または体液量を算出できる。前記サンプルにおける標的核酸の分析において、例えば、前記標的核酸の量を分析できても、診断等においては、それがどれだけの細胞等に由来するものであるかの判断が重要である。本発明によれば、前記コントロール核酸の検出を行うことで、さらに、サンプルに含まれる細胞、組織、または体液の量も判断することが可能になる。
【００７５】
また、本発明は、さらに、前記サンプルに対して、標的核酸を検出する工程を含んでもよい。具体的に、本発明は、例えば、さらに、前記サンプルと標的プローブとを混合する混合工程、および、前記混合物において、前記サンプル中の核酸と前記標的プローブとのハイブリダイゼーションを検出する検出工程を含む。前記検出工程によれば、前記ハイブリダイゼーションの検出により、前記サンプルにおける前記標的核酸を検出することができる。本発明によれば、前述のように、生体に恒常的に存在するコントロール核酸を検出できるため、さらに、前記標的核酸を検出することで、例えば、前記コントロール核酸に対する相対的な前記標的核酸の量を求めることができる。
【００７６】
前記標的プローブは、特に制限されず、標的核酸に対してハイブリダイズするプローブが使用できるが、前記コントロールプローブと同様に、核酸分子にシグナル発生物質が結合したフルオロジェニックプローブが好ましい。前記標的プローブがフルオロジェニックプローブの場合、例えば、前記核酸分子は、前記標的核酸に対してハイブリダイズする核酸分子であり、前記シグナル発生物質は、標的へのハイブリダイゼーションにより発光シグナルを発生し、前記標的との解離により発光シグナルを消失する物質であり、前記コントロールプローブと、前記標的プローブとは、異なる蛍光特性である。
【００７７】
前記標的プローブは、前記標的核酸に対してハイブリダイズする以外は、前記コントロールプローブの記載を援用できる。
【００７８】
前記標的プローブの種類の数は、特に制限されず、設定する標的核酸の種類または数によって適宜設定できる。具体例として、標的核酸が１種類の場合、例えば、１種類の標的プローブを使用してもよいし、２種類以上の標的プローブを使用してもよい。後者の場合は、例えば、前記混合工程において、同じ標的核酸に対する複数の前記標的プローブを使用し、前記複数の標的プローブが、それぞれ、前記標的核酸に対して、異なる領域にハイブリダイズする核酸分子を有することが好ましい。この場合、前記複数の標的プローブは、それぞれ異なる領域にハイブリダイズする核酸分子を有するが、同じシグナル発生物質を有し、ハイブリダイズによって同じ発光シグナルを発することが好ましい。この形態によれば、例えば、１種類の標的核酸の複数箇所に、複数の前記標的プローブをハイブリダイズさせ、且つ、ハイブリダイズによる発光シグナルの総量を大きくすることができる。
【００７９】
また、設定する標的核酸が複数の場合、例えば、各標的核酸に対して、１種類の標的プローブを使用してもよいし、２種類の標的プローブを使用してもよい。各標的核酸に対する標的プローブは、例えば、それぞれ、異なるシグナル発光物質を有することが好ましい。このように、異なるシグナル発光物質を有することで、各標的核酸を検出し分けることができる。異なるシグナル発光物質とは、例えば、異なる蛍光特性を有することを意味し、具体的には、例えば、異なる励起波長を有すること、異なる蛍光波長を有すること、または異なる励起波長と異なる蛍光波長を有することを意味する。
【００８０】
前記混合工程において、前記サンプルと前記標的プローブとの混合液は、例えば、前記サンプル中の核酸と前記標的プローブとのハイブリダイゼーションが起こりやすい温度（ハイブリダイゼーション温度）で処理することが好ましい。前記標的核酸が二本鎖核酸であり、一本鎖核酸に解離させて、前記標的プローブとハイブリダイズさせる場合は、例えば、前記サンプルを解離温度で処理した後に、前記標的プローブと混合し、ハイブリダイゼーション温度で処理してもよいし、前記混合液を解離温度で処理した後に、前記混合液をハイブリダイゼーション温度で処理してもよい。前記ハイブリダイゼーション温度および前記解離温度は、例えば、前述の通りである。
【００８１】
前記ハイブリダイゼーションの検出方法は、特に制限されず、例えば、前記標的プローブの種類によって適宜決定でき、具体例として、前記シグナル発生物質によって、適宜決定できる。
【００８２】
前記標的核酸の検出工程は、例えば、前記コントロールプローブを用いた検出と同じ系（前記混合液）に対して行ってもよいし、別の系で行ってもよいが、使用するサンプルのトータル量を低減できることから、前者が好ましい。つまり、サンプルに対して、前記コントロールプローブおよび前記標的プローブを混合し、前記コントロールプローブとのハイブリダイゼーションの検出と、前記標的プローブとのハイブリダイゼーションの検出との両方を行うことが好ましい。なお、前記サンプルに対する前記コントロールプローブの添加と前記標的プローブの添加は、例えば、いずれが先でもよいし、同時でもよく、また、前記コントロールプローブとのハイブリダイゼーションの検出と、前記標的プローブとのハイブリダイゼーションの検出は、例えば、いずれを先に行ってもよい。
【００８３】
本発明は、さらに、前記サンプルに対する、トータル核酸の検出工程と、前記標的核酸の割合の算出工程とを含んでもよい。前記トータル核酸の検出工程は、例えば、前述と同様である。
【００８４】
そして、前記割合の算出工程によれば、前記トータル核酸の検出結果と、前記標的核酸の検出結果とに基づいて、前記トータル核酸における前記標的核酸の割合を算出することができる。また、本発明によれば、前記コントロール核酸の検出結果も得られていることから、前記サンプルについて、前記トータル核酸と、前記コントロール核酸と、前記標的核酸との割合を得ることができる。
【００８５】
本発明において、前記コントロールプローブ、および任意で前記標的プローブ、任意でインターカレータは、例えば、反応容器に添加してもよいし、前記反応容器に予め添加してもよいし、必要量の前記サンプルを採取するピペットチップに保持させてもよい。前記ピペットチップに保持させる場合は、例えば、前記サンプルの吸引により、前記ピペットチップから遊離するように保持させることが好ましい。
【００８６】
本発明の第１の核酸分析方法について、前記コントロール核酸、前記標的核酸およびトータル核酸を検出する例をあげて説明する。
【００８７】
サンプル採取用のピペットチップの内壁に、前記コントロール核酸に対するコントロールプローブ、前記標的核酸に対する標的プローブおよびトータル核酸に対するインターカレータを、乾燥試薬として配置する。前記コントロールプローブと前記標的プローブは、例えば、それぞれＥプローブであり、異なる蛍光特性とする。
【００８８】
そして、前記ピペットチップを使用して、必要量のサンプルを吸引する。吸引後、前記ピペットチップで排出と吸引とを繰り返し、前記ピペットに配置した前記乾燥試薬と前記サンプルとを混合する。
【００８９】
そして、混合した混合液を容器に排出し、前記混合液について、前記コントロール核酸とコントロールプローブとのハイブリダイズ、前記標的核酸と前記標的プローブとのハイブリダイズ、前記トータル核酸に対するインターカレータのインターカレーションを、それぞれ検出する。前記コントロールプローブと前記標的プローブが、異なる励起波長で同じ蛍光波長の場合、それぞれの励起波長で励起させ、各励起波長により得られる蛍光シグナルを、それぞれ同じ蛍光波長で検出する。また、前記コントロールプローブと前記標的プローブが、同じ励起波長で異なる蛍光波長の場合、同じ励起波長で励起させ、各蛍光波長の蛍光シグナルを検出する。
【００９０】
前記検出によって、前記サンプルについて、前記コントロール核酸と前記標的核酸と前記トータル核酸の量が検出される。これらの結果に基づけば、前記サンプルにおける細胞数、組織量または体液量を算出でき、さらに、前記トータル核酸に対する前記コントロール核酸の割合、前記トータル核酸または前記コントロール核酸に対する前記標的核酸の割合を知ることができる。
【００９１】
＜第２の核酸分析方法＞
本発明の第２の核酸分析方法は、前述のように、
生体由来のサンプルと標的プローブとを混合する混合工程、および、
前記混合物において、前記サンプル中の核酸と前記標的プローブとのハイブリダイゼーションを検出する検出工程を含み、
前記標的プローブは、
核酸分子にシグナル発生物質が結合したフルオロジェニックプローブであり、
前記核酸分子は、標的核酸に対してハイブリダイズする核酸分子であり、
前記シグナル発生物質は、標的へのハイブリダイゼーションにより発光シグナルを発生し、前記標的との解離により発光シグナルを消失する物質であり、
前記検出工程は、
前記ハイブリダイゼーションの検出により、前記サンプルにおける前記標的核酸を検出することを特徴とする。
【００９２】
本発明によれば、前記標的プローブを使用することによって、例えば、前記サンプルの増幅処理を行うことなく、また、前記サンプルの量に影響されることなく、前記標的核酸を検出できる。本発明の第２の核酸分析方法は、特に示さない限り、前記第１の核酸分析方法の記載を援用できる。
【００９３】
本発明の第２の核酸分析方法は、例えば、前記サンプルが、増幅処理を行っていないサンプルである。
【００９４】
本発明の第２の核酸分析方法は、例えば、前記標的核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００９５】
本発明の第２の核酸分析方法は、例えば、前記標的プローブが、１分子あたり、前記シグナル発生物質として、エキシトン効果を示す少なくとも２つの蛍光性原子団を有する。
【００９６】
本発明の第２の核酸分析方法は、例えば、前記混合工程において、同じ標的核酸に対する複数の前記標的プローブを使用し、
前記複数の標的プローブが、それぞれ、前記標的核酸に対して、異なる領域にハイブリダイズする核酸分子を有する。
【００９７】
本発明の第２の核酸分析方法は、例えば、さらに、トータル核酸の検出工程と、前記標的核酸の割合の算出工程とを含み、
前記トータル核酸の検出工程は、
前記サンプル中のトータル核酸を検出する工程であり、
前記割合の算出工程は、
前記トータル核酸の検出結果と、前記標的核酸の検出結果とに基づいて、前記トータル核酸における前記標的核酸の割合を算出する。
【００９８】
本発明の第２の核酸分析方法は、例えば、前記検出工程が、融解曲線解析による検出工程である。
【００９９】
[実施形態１]
アクチン用プローブとしてフルオロジェニックプローブを使用し、非増幅のサンプルについて、コントロール核酸であるアクチンＤＮＡの検出を行う。
【０１００】
（１）アクチン用プローブ
下記配列のＤＮＡ核酸分子を合成し、３’末端から７塩基に、前記式（１１３）で表される構造となるようにシグナル発生物質を結合させ、Ｅプローブを調製する。前記Ｅプローブの濃度が、１ｘ１０−７ｍｏｌ／Ｌになるように、Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌ緩衝液に混合して、プローブ試薬を調製する。
プローブの配列（配列番号１）：  ＧＧＣＧＡＡＣＺＧＧＴＧＧＣ  (Ｚ：標識されたＴ塩基)
【０１０１】
（２）サンプル
サンプルは、Mouse  Brain  Total  RNA(ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ社製)を使用する。なお、前記サンプルに対して、増幅処理は行わない。
【０１０２】
（３）検出方法
エッペンドルフチューブに前記サンプル１０μＬを注入し、さらに、前記プローブ試薬１０μＬを注入し、混合する。この混合液を、温度５０℃で１０分間インキュベートした後、前記混合液を波長５１０ｎｍで励起し、発光スペクトルを確認する。
【０１０３】
以上、実施形態を参照して、本発明を説明したが、本発明は、上記発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
【０１０４】
この出願は、２０１６年７月４日に出願された日本出願特願２０１６−１３２８３７を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明の核酸分析方法によれば、例えば、増幅処理を行っていないサンプルであっても、サンプル量にかかわらず、前記フルオロジェニックプローブを使用することにより、核酸の特異的な分析が可能となる。
【配列表】
2018008435000001.app
【国際調査報告】
2018008435.tif 000033
2018008435.tif 000034
2018008435.tif 000035
2018008435.tif 000036