(57)【要約】  本発明は、フィーカリバクテリウム属菌の産生を促進するための新規な組成物および用剤並びにフィーカリバクテリウム属菌の産生促進方法の提供をその目的とする。本発明によれば、カカオ由来ルミナコイドを含んでなるフィーカリバクテリウム属菌の産生促進のための組成物およびフィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤が提供される。本発明によればまた、有効量のカカオ由来ルミナコイドを摂取させることを含む、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カカオ由来ルミナコイドを含んでなる、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進のための組成物。
【請求項２】
フィーカリバクテリウム属菌の産生促進に有効な１日分の摂取量のカカオ由来ルミナコイドを含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
１日分の有効摂取量ごとに包装されてなる、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
フィーカリバクテリウム属菌の産生促進に有効な１日分の摂取量が０．５〜１１．９ｇ（カカオ由来ルミナコイド量）である、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
カカオ由来ルミナコイドを１週間以上摂取させることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
油脂加工組成物の形態である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
フィーカリバクテリウム属菌の産生により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善に用いるための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
有効量のカカオ由来ルミナコイドを摂取させることを含んでなる、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進方法。
【請求項９】
カカオ由来ルミナコイドをフィーカリバクテリウム属菌の産生促進に有効な１日分の摂取量で１週間以上摂取させることを含んでなる、請求項８に記載のフィーカリバクテリウム属菌の産生促進方法。
【請求項１０】
フィーカリバクテリウム属菌の産生促進に有効な１日分の摂取量が０．５〜１１．９ｇ（カカオ由来ルミナコイド）である、請求項９に記載のフィーカリバクテリウム属菌の産生促進方法。
【請求項１１】
カカオ由来ルミナコイドを油脂加工組成物の形態で摂取させることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のフィーカリバクテリウム属菌の産生促進方法。
【請求項１２】
有効量のカカオ由来ルミナコイドを摂取させるか、或いは投与することを含んでなる、フィーカリバクテリウム属菌の産生により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善方法。
【請求項１３】
フィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤の製造のための、フィーカリバクテリウム属菌の産生により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療剤、予防剤または改善剤の製造のための、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤としての、あるいは、フィーカリバクテリウム属菌の産生により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療剤、予防剤または改善剤としての、カカオ由来ルミナコイドの使用。
【請求項１４】
フィーカリバクテリウム属菌の産生促進に用いるための、あるいは、フィーカリバクテリウム属菌の産生により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善に用いるための、カカオ由来ルミナコイド。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、先行する日本国出願である特願２０１６−１８４９０６（出願日：２０１６年９月２１日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、腸内菌叢改善促進するための組成物に関し、詳細には、カカオ由来ルミナコイドを含んでなるフィーカリバクテリウム属菌の産生を促進するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
フィーカリバクテリウム属菌（Faecalibacterium）は、クロストリジウム  クラスター（Clostridium cluster IV、C. leptum subgroup）に属し、ヒトやヒト以外の哺乳類（ブタ、マウス、子牛など）や家禽でも検出される。フィーカリバクテリウム属菌は、主として大腸上皮粘膜上に分泌された粘液層に付着する短鎖脂肪酸産生菌（主に酪酸を一次代謝産物として産生）である（非特許文献１）。また、フィーカリバクテリウム属菌は、制御性Ｔ細胞（Treg）の誘導能を示すことから、抗炎症・抗アレルギー作用が見出されている（非特許文献２）。さらに、フィーカリバクテリウム属菌は、ヒトの腸内菌叢における占有率が数％と高く、フィーカリバクテリウム属菌の減少が、腸内菌共生バランス失調（Dysbiosis）に起因すると考えられる疾病（クローン病など）と関連する可能性が示唆されている（非特許文献３）。【０００４】
カカオ豆は発芽に必要なアミノ酸源やエネルギー源としてたんぱく質や脂質を貯蔵しており、また細胞壁の構造物質として食物繊維を豊富に含んでいる。これらはカカオ豆から調製された菓子原料であるカカオマスにも含まれている。以前より多糖類やリグニン等の食物繊維が整腸やコレステロール排泄等の機能性を示すことはよく知られていたが、最近、プロテアーゼ耐性を示す一部のたんぱく質（難消化性たんぱく質）が、便秘の緩解などの、食物繊維や難消化性デキストリン等と似た生理的機能を示すことが明らかになってきた（非特許文献４）。しかし、カカオ豆由来のルミナコイドに関しての詳細な知見は得られていない。一方で、カカオ豆からアルカリ抽出および酸沈殿にて調製したたんぱく質画分をマウスに摂取させると糞便量が増大したことが報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１３３７９２号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Int J Syst Evol Microbiol. 2002, 52(6): 2141-2146
【非特許文献２】Curr Opin Microbiol. 2013, 16(3): 255-261
【非特許文献３】Proc Natl Acad Sci U S A 2008, 105(43):16731-16736
【非特許文献４】J Nutr Sci Vitaminol. 2002, 48(1): 1-5
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、新規なフィーカリバクテリウム属菌の産生促進用組成物およびフィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明者らは、今般、カカオ豆由来ルミナコイドを高濃度で含有する油脂加工組成物が、ヒト腸内菌叢中のフィーカリバクテリウム属菌の占有率（％）を有意に増加させることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００９】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］カカオ由来ルミナコイドを含んでなる、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進のための組成物（以下、「本発明の組成物」ということがある）およびフィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤（以下、「本発明の用剤」ということがある）。
［１−１］カカオ由来ルミナコイドが、カカオ豆由来ルミナコイドである、前記［１］に記載のフィーカリバクテリウム属菌の産生促進用組成物およびフィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤
［１−２］カカオ由来ルミナコイドを０．５ｇ以上含んでなるものである、前記［１］または［１−１］に記載のフィーカリバクテリウム属菌の産生促進用組成物およびフィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤。
［２］フィーカリバクテリウム属菌の産生促進に有効な１日分の摂取量のカカオ由来ルミナコイドを含んでなる、前記［１］、［１−１］または［１−２］に記載のフィーカリバクテリウム属菌の産生促進用組成物およびフィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤。
［３］１日分の有効摂取量ごとに包装されてなる、前記［２］に記載のフィーカリバクテリウム属菌の産生促進用組成物およびフィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤。
［４］フィーカリバクテリウム属菌の産生促進に有効な１日分の摂取量が０．５〜１１．９ｇ［カカオ由来ルミナコイド量］である、前記［２］または［３］に記載のフィーカリバクテリウム属菌の産生促進用組成物およびフィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤。
［５］カカオ由来ルミナコイドを２週間以上摂取させることを特徴とする、前記［１］、［１−１］、［１−２］および［２］〜［４］のいずれかに記載のフィーカリバクテリウム属菌の産生促進用組成物およびフィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤。
［５−１］カカオ由来ルミナコイドを、１日当たり０．５〜１１．９ｇで１週間以上摂取させることを特徴とする、前記［１］、［１−１］、［１−２］および［２］〜［５］のいずれかに記載のフィーカリバクテリウム属菌の産生促進用組成物およびフィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤。
［６］油脂加工組成物の形態である、前記［１］、［１−１］、［１−２］、［２］〜［５］および［５−１］のいずれかに記載のフィーカリバクテリウム属菌の産生促進用組成物およびフィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤。
［７］フィーカリバクテリウム属菌の産生により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善に用いるための、前記［１］、［１−１］、［１−２］、［２］〜［５］、［５−１］および［６］のいずれかに記載の組成物。
［８］有効量のカカオ由来ルミナコイドを摂取させることを含んでなる、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進方法。
［９］カカオ由来ルミナコイドをフィーカリバクテリウム属菌の産生促進に有効な１日分の摂取量で１週間以上摂取させることを含んでなる、前記［８］に記載のフィーカリバクテリウム属菌の産生促進方法。
［１０］フィーカリバクテリウム属菌の産生促進に有効な１日分の摂取量が０．５〜１１．９ｇ（カカオ由来ルミナコイド）である、前記［９］に記載のフィーカリバクテリウム属菌の産生促進方法。
［１１］カカオ由来ルミナコイドを油脂加工組成物の形態で摂取させることを特徴とする、前記［８］〜［１０］のいずれかに記載のフィーカリバクテリウム属菌の産生促進方法。
［１２］有効量のカカオ由来ルミナコイドを摂取させるか、或いは投与することを含んでなる、フィーカリバクテリウム属菌の産生により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善方法。
［１３］フィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤の製造のための、フィーカリバクテリウム属菌の産生により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療剤、予防剤または改善剤の製造のための、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤としての、あるいは、フィーカリバクテリウム属菌の産生により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療剤、予防剤または改善剤としての、カカオ由来ルミナコイドの使用。
［１４］フィーカリバクテリウム属菌の産生促進用の、あるいは、フィーカリバクテリウム属菌の産生により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善用の、カカオ由来ルミナコイド。
【００１０】
本発明の組成物および用剤は、長年食品の原料として用いられてきたカカオに含まれる成分を利用するものであることから、本発明の組成物および用剤は、長期間にわたって服用しても副作用が少なく、安全性が高い点において有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】試験例１における排便回数の推移を試験食品群と対照食品群について示した図である。
【図２】試験例１における便色の推移を試験食品群と対照食品群について示した図である。
【図３】試験例１における摂取前に対する摂取後のフィーカリバクテリウム属菌の腸内菌叢全菌数の占有率の変化を、試験食品群と対照食品群について示した図である。
【図４】試験例２における試験開始後１１〜１３日目の乾燥糞便重量を試験飼料群と対照飼料群について示した図である。
【図５】試験例２における解剖時の盲腸内容物重量を試験飼料群と対照飼料群について示した図である。
【図６Ａ】試験例２における盲腸内短鎖脂肪酸量（酪酸）を試験飼料群と対照飼料群について示した図である。
【図６Ｂ】試験例２における盲腸内短鎖脂肪酸量（プロピオン酸）を試験飼料群と対照飼料群について示した図である。
【図６Ｃ】試験例２における盲腸内短鎖脂肪酸量（酢酸）を試験飼料群と対照飼料群について示した図である。
【発明の具体的説明】
【００１２】
本発明において「カカオ由来ルミナコイド」は、カカオに含まれるルミナコイドを意味し、典型的には、カカオ豆由来ルミナコイドである。従って、本発明においては、カカオの植物体またはその加工品から抽出（粗抽出を含む）あるいは精製（粗精製を含む）したカカオのルミナコイドを本発明の有効成分として使用することができる。
【００１３】
ここで、「ルミナコイド」とは、小腸で消化吸収されず大腸に到達する全ての食品成分の総称で、非デンプン性のルミナコイドとデンプン性のルミナコイドに分類される。非デンプン性のルミナコイドは、難消化性タンパク質（レジスタントプロテイン、RP）、食物繊維、オリゴ糖、糖アルコール、その他に分類される。食物繊維はさらに、リグニンと多糖類に分類される。多糖類には、植物性多糖類、動物性多糖類、微生物性多糖類、化学修飾性多糖類がある。デンプン性ルミナコイドは、難消化性デンプン、難消化性デキストリンがある。カカオ由来ルミナコイドとしては、難消化性たんぱく質および食物繊維が挙げられる。
【００１４】
本発明において、カカオ由来ルミナコイドの原料となりうるカカオの植物体またはその加工品としては、カカオ樹皮、カカオ葉、カカオ豆、カカオシェル、カカオマス、脱脂カカオマス、ココアパウダー等、植物体の各種部位またはカカオ豆加工品を挙げることができる。カカオマスはカカオ豆を磨砕したものであり、脱脂カカオマスはカカオマスから油脂を除去することにより得ることができる。油脂の除去方法は特に制限されず、圧搾などの公知の方法に従って行うことができる。脱脂カカオマスを粉砕すればココアパウダーとなる。また、カカオの植物体またはその加工品を原料として抽出を行う場合は、抽出効率の観点から、磨砕、粉砕等の微粒化処理が施されているカカオマスやココアパウダーを用いるのが好ましい。なお、カカオの植物体には、意図してないしは意図せずにカカオの植物体以外の物も含めることができる。また、カカオの植物体またはその加工品を原料として抽出を行う際にも、意図してないしは意図せずにカカオの植物体以外の物も含めることができる。さらに、カカオマスやココアパウダーにも、意図してないしは意図せずにカカオの植物体以外の物も含めることができる。
【００１５】
カカオの植物体またはその加工品を原料とする抽出方法は公知であり、例えば、特開２００９−１８３２２９号公報や特開２０１１−９３８０７号公報の記載に従ってカカオ由来ルミナコイド含有組成物を調製することができる。抽出溶媒は、特に限定されるものではないが、水またはアルカリ性の水溶液を用いることが好ましい。また、カカオの植物体またはその加工品を原料とする精製方法は、合成吸着剤、イオン交換樹脂、限外ろ過、活性白土処理等の公知の方法を使用することができ、特に限定されるものではない。
【００１６】
本発明においてカカオ由来ルミナコイド含量は、難消化性たんぱく質含量と食物繊維含量により求められる。難消化性たんぱく質含量は、実施例に記載の難消化性たんぱく質の抽出方法により抽出した後、ケルダール法（たんぱく質定量の公定法）により定量できる。また、実施例に記載の人工消化試験を行うことにより、タンパク質が難消化性たんぱく質であることが確認できる。また、食物繊維含量は、酵素−重量法（エーオーエーシ―インターナショナルAOAC Internationalによる公定法、AOAC Method 985.29、別名：プロスキー法）により定量できる。
【００１７】
カカオ由来ルミナコイドはカカオの植物体を原料にして調製することができるため、本発明の組成物および用剤は、カカオ由来ルミナコイド以外のカカオ豆由来の成分を含んでいてもよい。そのような成分としては、ポリフェノール、テオブロミン、カフェイン、アミノ酸類、ペプチド、脂肪酸等が挙げられる。また、本発明の組成物および用剤は、カカオに由来しない成分を含んでいてもよい。
【００１８】
本発明の組成物および用剤は、カカオ由来ルミナコイド単独で提供することができ、あるいは、カカオ由来ルミナコイドと他の成分とを混合して提供することもできる。本発明の組成物および用剤におけるカカオ由来ルミナコイドの配合量は、その目的、用途、形態、剤型、症状、体重等に応じて任意に定めることができ、本発明はこれに限定されない。例えば、本発明の組成物および用剤におけるカカオ由来ルミナコイドの含量は、固形分中の乾燥質量割合で２％以上とすることができ、好ましくは、２〜９０質量％、より好ましくは２〜５０質量％、より一層好ましくは５〜３５質量％、さらに好ましくは１０〜２１質量％とすることができる。本発明においては、本発明の用剤をカカオ由来ルミナコイドからなるものとし、本発明の組成物をカカオ由来ルミナコイドと他の成分とを含んでなるものとすることができる。
【００１９】
後記実施例に示されるように、カカオ由来ルミナコイドは腸内菌叢改善促進作用、具体的には、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進作用を有する。従って、カカオ由来ルミナコイド（特に、カカオ豆由来ルミナコイド）は腸内菌叢改善促進剤およびフィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤として使用することができるとともに、腸内菌叢改善促進方法およびフィーカリバクテリウム属菌の産生促進方法に使用することができる。また、カカオ由来ルミナコイド（特に、カカオ豆由来ルミナコイド）は腸内菌叢改善促進のための組成物およびフィーカリバクテリウム属菌の産生促進のための組成物としても使用することができる。
【００２０】
ここで、「フィーカリバクテリウム属菌の産生促進」とは、フィーカリバクテリウム属菌の発現や増殖を促進することを意味し、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進の程度は、腸内細菌の占有率を指標にして評価することができる（実施例参照）。具体的には、カカオ由来ルミナコイド（特に、カカオ豆由来ルミナコイド）の摂取または投与後の腸内細菌に占めるフィーカリバクテリウム属菌の割合が、摂取または投与前の腸内菌叢中のフィーカリバクテリウム属菌を上回る場合に、好ましくは約１．１倍以上である場合に、より好ましくは約１．２倍以上である場合に、より一層好ましくは約１．３倍以上、さらに好ましくは１．４倍以上、特に好ましくは１．５倍以上、さらに特に好ましくは１．６倍以上、さらに特に好ましくは１．８倍以上、最も好ましくは２倍以上である場合に、フィーカリバクテリウム属菌の産生を促進したと判定することができる。
【００２１】
本発明のフィーカリバクテリウム属菌の産生促進方法は、有効量のカカオ由来ルミナコイドをヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、あるいは投与することにより実施することができる。
【００２２】
なお、本発明におけるカカオ由来ルミナコイドの使用はヒトおよび非ヒト動物並びにこれらに由来する試料における使用であってもよく、治療的使用と非治療的使用のいずれもが意図される。ここで、「非治療的」とはヒトを手術、治療または診断する行為（すなわち、ヒトに対する医療行為）を含まないことを意味し、具体的には、医師または医師の指示を受けた者がヒトに対して手術、治療または診断を行う方法を含まないことを意味する。
【００２３】
本発明ではフィーカリバクテリウム属菌の産生促進がその治療、予防または改善に有効である疾患および症状の治療、予防または改善にカカオ由来ルミナコイドを使用することができる。
【００２４】
フィーカリバクテリウム属菌の産生促進により治療、予防または改善しうる疾患および症状としては、炎症性疾患（例えば、潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患）、アレルギー性疾患（例えば、食品アレルギー、花粉症、喘息、アレルギー性鼻炎、薬物アレルギー、アトピー性皮膚炎、ダニアレルギー）および腸内菌共生バランス失調（Dysbiosis）に起因すると考えられる疾病（例えば、クローン病、大腸がん、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、小腸細菌異常増殖症（SIBO）、偽膜性大腸炎（クロストリジウム・ディフィシル腸炎）、抗菌薬起因性下痢、アルコール性脂肪性肝炎（ASH）や非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）などの肝臓疾患、肥満、２型糖尿病、アレルギー疾患、自閉症などの精神疾患、多発性硬化症）が挙げられる。後記実施例に示される通り、カカオ豆由来ルミナコイドはフィーカリバクテリウム属菌の産生を促進することができ、これまでにフィーカリバクテリウム属菌の増加が、抗炎症・抗アレルギー作用に繋がることや、フィーカリバクテリウム属菌の減少が腸内菌共生バランス失調（Dysbiosis）に起因すると考えられる疾病（クローン病など）と関連することが示されている（非特許文献２および３並びにProc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013, 105(43): 16731-16736）。従って、カカオ由来ルミナコイドは、炎症性疾患、アレルギー性疾患および腸内菌共生バランス失調（Dysbiosis）に起因すると考えられる疾病（クローン病など）の治療用、予防用または改善用組成物あるいは治療剤、予防剤または改善剤として使用できるとともに、炎症性疾患、アレルギー性疾患および腸内菌共生バランス失調（Dysbiosis）に起因すると考えられる疾病（クローン病など）の治療方法、予防方法および改善方法に使用することができる。
【００２５】
本発明の組成物および用剤、本発明の治療剤、予防剤および改善剤並びに本発明の治療用、予防用および改善用組成物は、医薬品、医薬部外品、飲食品、飼料などの形態で提供することができ、下記の記載に従って実施することができる。また本発明のフィーカリバクテリウム属菌の産生促進方法並びに本発明の治療方法、予防方法および改善方法は下記の記載に従って実施することができる。本発明の治療用、予防用および改善用組成物が医薬品を目的としている場合には、これらは治療用医薬組成物、予防用医薬組成物および改善用医薬組成物とすることができる。
【００２６】
本発明の有効成分であるカカオ由来ルミナコイドをヒトおよび非ヒト動物に投与ないし摂取させる場合、カカオ豆に由来するルミナコイドの含有率を高めた組成物を使用することができ、このような組成物は、カカオ豆に由来する脂肪分をほとんど含まず、苦味および収斂味をほとんど有しないため、種々の飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料、化成品等の素材として有用である。
【００２７】
本発明の有効成分であるカカオ由来ルミナコイドはヒトおよび非ヒト動物に経口投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学上許容される担体としては、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。
【００２８】
本発明の有効成分であるカカオ由来ルミナコイドはヒトおよび非ヒト動物に経管投与、経鼻管投与、点滴、座薬等の経口投与以外の体内への投与も本発明の組成物および用剤の形状に応じて可能である。例えば、カカオ由来ルミナコイドを含む粘性を有する液状の組成物、または、カカオ由来ルミナコイドを含む半固形状の組成物とすることで、咀嚼や嚥下の機能が低下し、経口摂取ないしは経口投与ができないヒトおよび非ヒト動物に対しても投与することができる。本発明の組成物および用剤を経口摂取以外で摂取させるか、あるいは投与することにより、咀嚼や嚥下の機能が加齢などにより低下したとしても、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進が期待でき、これらのヒトおよび非ヒト動物の炎症性疾患、アレルギー性疾患、腸内菌共生バランス失調（Dysbiosis）に起因すると考えられる疾病（クローン病など）の治療、予防および改善が期待できる。
【００２９】
本発明の有効成分であるカカオ由来ルミナコイドはヒトおよび非ヒト動物に経口摂取させることができる。カカオ由来ルミナコイドを経口摂取させる場合にカカオ由来ルミナコイドは単離、精製または粗精製された形態のものであっても、カカオ由来ルミナコイドを含む食品あるいは食品の原料の形態であってもよい。また、カカオ由来ルミナコイドはヒトおよび非ヒト動物に経口摂取させるにあたり、常温の状態、温かい状態、冷たい状態等から任意に選択することができる。
【００３０】
本発明の有効成分であるカカオ由来ルミナコイドを食品として提供する場合には、カカオ由来ルミナコイドをそのまま食品に含有させることができ、該食品はカカオ由来ルミナコイドを有効量含有した食品である。ここで、カカオ由来ルミナコイドを「有効量含有した」とは、個々の食品において通常喫食される量を摂取した場合に後述するような範囲でカカオ由来ルミナコイドが摂取されるような含有量をいう。また「食品」とは、健康食品、機能性食品、保健機能食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）、特別用途食品（例えば、幼児用食品、妊産婦用食品、病者用食品）を含む意味で用いられる。「食品」の形態は特に限定されるものではなく、例えば、飲料の形態であっても、半液体やゲル状の形態であっても、固形状の形態であってもよい。
【００３１】
カカオ由来ルミナコイドはフィーカリバクテリウム属菌の産生促進作用を有するため、日常摂取する食品や、サプリメントとして摂取する食品に含有させて提供することができる。本発明で提供される食品としては、その形態や形状に特に制限はないが、好ましくは、カカオ豆を主原料とする食品が挙げられ、より好ましくは、油脂加工組成物であり、より一層好ましくはチョコレートおよびココアなどの油脂加工食品である。
【００３２】
前記の通り、カカオ豆由来ルミナコイドを効率よく摂取させるためには濃縮されたカカオ豆由来ルミナコイド組成物を本発明に使用することができる。従って、カカオ豆を主原料とする食品およびサプリメントは、例えば、カカオ豆由来ルミナコイドを高濃度で含むものであることが好ましく、より好ましくはカカオ豆由来ルミナコイドを高濃度で含む油脂加工組成物であり、より一層好ましくはカカオ豆由来ルミナコイドを高濃度で含む油脂加工食品（具体的には、チョコレートおよびココア）である。
【００３３】
ここで、食品およびサプリメント中のカカオ豆由来ルミナコイドの含有量はカカオ豆由来ルミナコイドの摂取が可能である限り特に限定されるものではないが、カカオ豆由来ルミナコイドの効率的な摂取の観点から、油脂加工組成物中の含有量は組成物の固形分当たり、例えば、２〜９０質量％とすることができ、好ましくは２〜５０質量％、より好ましくは５〜３５質量％、より一層好ましくは１０〜２１質量％である。また、食品およびサプリメント中のカカオ豆由来ルミナコイドの含有量はカカオ豆由来ルミナコイドの摂取が可能である限り特に限定されるものではないが、カカオ豆由来ルミナコイドの効率的な摂取の観点から、油脂加工組成物中の含有量は組成物の固形分２５ｇ当たり、例えば、好ましくは０．５〜１１．９ｇ、より好ましくは１．４〜８．８ｇ、さらに好ましくは２．６〜５．２ｇである。
【００３４】
ここで、食品およびサプリメント中のカカオ豆由来食物繊維の含有量はカカオ豆由来難消化性タンパク質の摂取が可能である限り特に限定されるものではないが、カカオ豆由来食物繊維の効率的な摂取の観点から、油脂加工組成物中の含有量は組成物の固形分当たり、例えば、１〜４０質量％とすることができ、好ましくは４〜２８質量％、より好ましくは６〜２０質量％、より一層好ましくは８〜１６質量％である。また、食品およびサプリメント中のカカオ豆由来食物繊維の含有量はカカオ豆由来難消化性タンパク質の摂取が可能である限り特に限定されるものではないが、カカオ豆由来食物繊維の効率的な摂取の観点から、油脂加工組成物中の含有量は組成物の固形分２５ｇ当たり、例えば、好ましくは０．３〜９．４ｇ、より好ましくは１．０〜７．０ｇ、さらに好ましくは２．０〜４．０ｇである。
【００３５】
ここで、食品およびサプリメント中のカカオ豆由来難消化性タンパク質の含有量はカカオ豆由来難消化性タンパク質の摂取が可能である限り特に限定されるものではないが、カカオ豆由来難消化性タンパク質の効率的な摂取の観点から、油脂加工組成物中の含有量は組成物の固形分当たり、例えば、０．５〜１５質量％とすることができ、好ましくは１〜１０質量％、より好ましくは１．５〜８質量％、より一層好ましくは２〜５質量％である。また、食品およびサプリメント中のカカオ豆由来難消化性タンパク質の含有量はカカオ豆由来難消化性タンパク質の摂取が可能である限り特に限定されるものではないが、カカオ豆由来難消化性タンパク質の効率的な摂取の観点から、油脂加工組成物中の含有量は組成物の２５ｇ固形分当たり、例えば、好ましくは０．２〜２．５ｇ、より好ましくは０．４〜１．８ｇ、さらに好ましくは０．６〜１．２ｇである。
【００３６】
本発明で提供される食品としては、チョコレートやココアのようにカカオ豆を主原料とする食品はもちろんのこと、カカオ由来ルミナコイドを含有させることができる食品であれば特に限定されない。例えば、パン類、ビスケット類、麺類、クラッカー、栄養補給バー等の澱粉系食品；キャンディー類、ガム類、グミ、スナック等の各種菓子類；牛乳、加工乳、アイスクリーム類、発酵乳（ヨーグルト等）、乳飲料、チーズ類、バター類、クリーム類等の乳および乳製品；プリン、ゼリー、ババロア、ムース等のデザート類；非アルコール飲料、アルコール飲料等の飲料類；ハム、ソーセージ等の畜肉加工品；カマボコ、竹輪、魚肉ソーセージ等の魚肉加工品；ジャム、ピューレ等の果実加工品；ルウ、ソース等の調味料類等が挙げられる。カカオ豆由来ルミナコイドは各食品の特性、目的に応じ、適当な製造工程の段階で適宜配合することができる。
【００３７】
本発明の医薬品および食品は、食品として古くから重用されていたカカオに含まれる成分を利用することから、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に対し安全に用いることができる。カカオ由来ルミナコイド（特に、カカオ豆由来ルミナコイド）の投与量または摂取量は、受容者の性別、年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与経路並びに組み合わせる薬剤等に依存して決定できる。例えば、カカオ由来ルミナコイド（特に、カカオ豆由来ルミナコイド）を医薬として経口投与する場合、成人１日当たり、０．５〜１１．９ｇ、好ましくは１．４〜８．８ｇ、より好ましくは２．６〜５．２ｇの範囲となるように、投与することができる。また、カカオ由来ルミナコイド（特に、カカオ豆由来ルミナコイド）を食品として摂取させる場合には、成人１日当たり、０．５〜１１．９ｇ、好ましくは１．４〜８．８ｇ、より好ましくは２．６〜５．２ｇの範囲となるように、投与することができる。
【００３８】
本発明の組成物および用剤は、他の経口摂取できる組成物と併用することに制限はない。例えば、抗炎症・抗アレルギー作用、腸内菌共生バランス失調（Dysbiosis）に起因すると考えられる疾病（クローン病など）の予防、治療または改善効果が期待できる素材や組成物と併用することで、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進効果をさらに高めることができる。
【００３９】
本発明の組成物および用剤は、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進に有効な１日分の摂取量のカカオ由来ルミナコイドを含んでなる組成物で提供することができる。この場合、本発明の組成物および用剤は、１日分の有効摂取量を摂取できるように包装されていてもよく、１日分の有効摂取量が摂取できる限り、包装形態は一包装であっても、複数包装であってもよい。包装形態で提供する場合、１日分の有効摂取量が摂取できるように摂取量に関する記載が包装になされているか、または該記載がなされた文書を一緒に提供することが望ましい。また、１日分の有効摂取量を複数包装で提供する場合には、摂取の便宜上、１日分の有効摂取量の複数包装をセットで提供することもできる。
【００４０】
本発明の組成物および用剤を提供するための包装形態は一定量を規定する形態であれば特に限定されず、例えば、包装紙、袋、ソフトバック、紙容器、缶、ボトル、カプセルなどの収容可能な容器などが挙げられる。
【００４１】
本発明の組成物および用剤は、その効果をよりよく発揮させるために、１週間以上継続的に投与または摂取させることが好ましく、投与および摂取期間はより好ましくは１〜２週間、特に好ましくは１〜４週間である。ここで、「継続的に」とは毎日投与または摂取を続けることを意味する。本発明の組成物および用剤を包装形態で提供する場合には、継続的摂取のために一定期間（例えば、１週間）の有効摂取量をセットで提供してもよい。
【００４２】
本発明の別の面によれば、有効量のカカオ由来ルミナコイドをヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、或いは投与することを含んでなる、腸内菌叢改善促進方法およびフィーカリバクテリウム属菌の産生促進方法が提供される。本発明の促進方法は、本発明の組成物および用剤に関する記載に従って実施することができる。
【００４３】
本発明のさらに別の面によれば、有効量のカカオ由来ルミナコイドをヒトまたは非ヒト動物に摂取させるか、或いは投与することを含んでなる、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善方法が提供される。本発明の治療、予防または改善方法は、本発明の組成物および用剤に関する記載に従って実施することができる。
【００４４】
本発明のさらにまた別の面によれば、腸内菌叢改善促進剤またはフィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤の製造のための、カカオ由来ルミナコイドの使用と、腸内菌叢改善促進剤またはフィーカリバクテリウム属菌の産生促進剤としての、カカオ由来ルミナコイドの使用が提供される。本発明によればまた、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療剤、予防剤または改善剤の製造のための、カカオ由来ルミナコイドの使用と、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療剤、予防剤または改善剤としての、カカオ由来ルミナコイドの使用が提供される。本発明の使用は、本発明の組成物および用剤に関する記載に従って実施することができる。
【００４５】
本発明のさらにまた別の面によれば、腸内菌叢改善促進に用いるための、あるいは、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進に用いるための、カカオ由来ルミナコイドが提供される。本発明によればまた、フィーカリバクテリウム属菌の産生促進により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善に用いるための、カカオ由来ルミナコイドが提供される。上記のカカオ由来ルミナコイドは、本発明の組成物および用剤に関する記載に従って実施することができる。
【実施例】
【００４６】
以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。【００４７】
試験例１：カカオ豆由来ルミナコイドによるフィーカリバクテリウム属菌の産生促進効果の検討（１）
カカオ豆由来ルミナコイドがフィーカリバクテリウム属菌の産生に与える影響を検証するために以下の試験を行った。【００４８】
２０歳以上５０歳未満の健康な日本人女性で、スクリーニングにより選抜した４０名を被験者とし、評価者盲検並行群間比較試験を行った。途中で試験を中断した９名を除いて、試験食品群１６名、対照食品群１５名の結果が得られた。試験期間中は、食事制限およびその他の制限（食事制限およびその他の制限の詳細は、下記に示す。）を行った。【００４９】
スクリーニングは、摂取開始７日前（−７日目、−１Ｗ）に、生活習慣アンケート（年齢、既往歴、合併症、食物アレルギーの有無、医薬品や健康食品の摂取状況、飲酒等の確認）、自覚アンケート（整腸に関する自覚症状の調査）、理学的検査（身長、体重、血圧、脈拍数、ＢＭＩ）を実施し、排便の状態（排便回数、便性、便量）、年齢、食習慣（カカオ製品、納豆、乳製品等の日常的な摂取状況）による除外基準を満たした（除外基準の詳細は、下記に示す。）、排便回数が週平均４回以下の４０名を選抜した。【００５０】
スクリーニングにおける除外基準
以下の者をスクリーニング対象から除外した。
・現在、何らかの慢性疾患を有し、薬物治療を受けている者
・チョコレート、牛乳、大豆にアレルギーを有する者
・乳糖不耐症を有する者
・スクリーニング前３か月間に、カカオ製品を週４回以上摂取している者
・スクリーニング前３か月間に、納豆を週４回以上摂取している者
・スクリーニング前３か月間に、ヨーグルト、乳酸菌飲料、整腸剤等の乳酸菌含有食品を週４回以上摂取している者
・本試験結果に影響する可能性がある医薬品、医薬部外品、サプリメント、健康食品、特定保健用食品（トクホ）を日常において服用・摂取している者、または試験中に服用・摂取する予定のある者
・スクリーニング前１か月間に、他の臨床試験およびモニター試験に参加した者、あるいは本臨床試験同意後に他の臨床試験に参加する予定のある者
・妊娠している者、試験期間中に妊娠の予定、希望がある者
・授乳中の者
・アルコール多飲用者（純アルコール換算で、１日平均６０ｇ以上を超える飲酒者）
・その他、被験者として不適当と判断した者【００５１】
試験期間中の食事制限およびその他の制限
被験者には、試験期間中は通常通りの生活を送らせるとともに、次の制限事項を遵守するよう指導した。
食事、飲み物および嗜好品に関する事項
・食事は、これまでの食生活（食事量、食事内容）を大きく変えず、日常範囲を大きく逸脱する過度な節食や過食は控える。但し、スクリーニングから摂取２週後の採便が終了するまで、納豆の摂取を禁止する。
・飲料の摂取は、緑茶やコーヒー等、摂取量や回数は制限しないが、これまでの摂取の程度（量、種類等）を大きく変えることは控える。
・間食は、原則として自由とするが、通常摂取している量を超えないようにする。但し、スクリーニングから摂取２週後の採便が終了するまで、試験食品以外のカカオを含む飲食品の摂取を禁止する。
・アルコールの摂取は、原則として制限しないが、これまでのアルコール摂取の程度（量、種類等）を大きく変えることは控える。
・本試験に影響を及ぼす可能性がある医薬品（一般用医薬品を含む）、医薬部外品、サプリメント、特定保健用食品または健康食品は、スクリーニング時から、摂取２週後の採便が終了するまで使用や摂取を禁止する。抗生物質、下剤、便秘薬、整腸剤、便秘や、下痢、消化不良を改善する作用を有する芍薬、黄柏、大黄、大棗、桂皮、人蔘等を含む漢方処方（桂枝加芍薬大黄湯、人蔘湯、五苓散料、半夏瀉心湯、加味逍遥散、大柴胡湯、乙字湯、桃核承気湯、防風通聖散）および生薬（芍薬、黄柏、大黄、大棗、桂皮、人蔘等）を含有する医薬品（一般用医薬品を含む）、医薬部外品、サプリメント、特定保健用食品（トクホ）または健康食品が該当する。
・試験期間中、生活日誌は毎日記録する。
・スクリーニング時から、摂取２週後の採便が終了するまで、大きな生活の変化は、可能な限り控える。【００５２】
試験食品は、市販のカカオ豆由来ルミナコイド高含有油脂加工組成物（「チョコレート効果カカオ７２％」株式会社明治）を毎日２５ｇ（１枚５ｇの油脂加工組成物を５枚）ずつ２週間継続して摂取させた。上記油脂加工組成物は１枚当たりカカオポリフェノールを１２７ｍｇ（総ポリフェノール量）含んでいることから、被験者が１日に摂取するカカオポリフェノールは６３５ｍｇとなる。また、上記油脂加工組成物は１枚当たり食物繊維０．６ｇ、難消化性たんぱく質０．１８ｇを含んでいることから、被験者が１日に摂取する食物繊維量は３．０ｇとなり、難消化性たんぱく質量は０．８８ｇとなる。すなわち、被験者が１日に摂取するカカオ豆由来ルミナコイド量は３．８８ｇとなる。対照食品は、市販のチョコレート（「ホワイトチョコレート」株式会社明治）を毎日２５ｇ（１枚４．２ｇの油脂加工組成物を６枚）ずつ２週間継続して摂取させた。対照食品は、ポリフェノール、食物繊維、難消化性たんぱく質を含まない。【００５３】
また、試験食品における、１日に摂取する１〜４量体のポリフェノールの含量は７６ｍｇであった。主な成分の内訳として、カテキン（単量体）が１０．４ｍｇ、エピカテキン（単量体）が２７．８ｍｇ、プロシアニジンＢ２（２量体）が１５．８ｍｇ、プロシアニジンＢ５（２量体）が４．４ｍｇ、プロシアニジンＣ１（３量体）が９．６ｍｇ、シンナムタンニンＡ２（４量体）が７．１ｍｇであった。なお、各成分については、ＨＰＬＣを用いて測定した。カラムは、Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ−ＯＤＳ−ＨＧ５（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、φ５μ、野村化学株式会社製)を使用した。溶離液は、Ａ液とＢ液で構成され、Ａ液は０．１%トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液は０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル溶液を使用した。カラムへ通す溶離液の流速は０．８ｍｌ／分、グラジェントの条件は、溶離液全体に占めるＢ液の割合を、開始時点で１０％、開始５分後で１０％、開始３５分後で２５％、開始４０分後で１００％、開始４５分後で１００％とした。サンプルインジェクション量は１０μＬであり、エピカテキンを標準品として、各成分をエピカテキン当量で定量した。また、ポリフェノール含量は、プルシアンブルー法により測定した。具体的には、Martin L. Price and Larry G. Butler, J. Agric Food Chem. 1977, 25(6): 1268-1273に記載の方法に従い、市販のエピカテキンを標準物質としてポリフェノール含量を算出した。【００５４】
また、試験食品における、１日に摂取する食物繊維の含量は３．０ｇであった。具体的には（エーオーエーシ―インターナショナルAOAC Internationalによる公定法）である酵素−重量法により算出した。【００５５】
また、試験食品における、１日に摂取する難消化性タンパク質の含量は０．８８ｇであった。具体的には、下記、難消化性タンパク質の抽出方法に従い抽出したたんぱく質量を、ケルダール法（たんぱく質定量の公定法）により算出した。また、下記、人工消化試験により、抽出したたんぱく質が難消化性タンパク質であることを確認した。【００５６】
難消化性たんぱく質の抽出方法
チョコレートを湯煎にて溶解し、チョコレートの５倍量のヘキサンを添加して３時間撹拌した。１０，０００ｒｐｍ、４℃で１０分遠心し、沈殿を回収した。回収した沈殿を、初発チョコレート量の３倍量のヘキサンに懸濁し１時間撹拌した。１０，０００ｒｐｍ、４℃で１０分遠心し、沈殿を一晩風乾した（チョコパウダーという）。前述のチョコパウダーを２０倍量の脱イオン水に懸濁し、１０分ほど撹拌した。ｐＨを確認し、ＮａＯＨでｐＨ１２に調整した。再び１０分撹拌した後、ｐＨを確認し、ＮａＯＨでｐＨ１２に調整した。５０℃に加温し、到達したらｐＨを確認し、ＮａＯＨでｐＨ１２に調整した。７０℃に加温し、到達したら３０分抽出した。１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温で遠心し、上清を回収した。得られた上清にリン酸を添加してｐＨを２．０に調整し、一晩４℃で静置した。１０，０００ｒｐｍ、で１０分、室温で遠心し、沈殿を回収した。沈殿に原料（チョコパウダー重量）の５倍量の脱イオン水を加えて懸濁し、１０，０００ｒｐｍ、で１０分、２５℃で遠心し上清を除去した。洗浄は２回実施した。沈殿を回収し８０℃で７２時間減圧乾燥した。【００５７】
人工消化試験
（１）ペプシン消化
被験サンプルに水を加えて１０％とした後、塩酸でｐＨを２．０に調整した。そこにペプシン（１６３−００６４２、和光純薬工業社）を採取量の１／１００を添加して３７℃で４時間反応させた。【００５８】
（２）パンクレアチン消化
上記（１）の反応物を水酸化ナトリウムでｐＨを８〜１０に調整し、パンクレアチン（１６３−００１４２、和光純薬工業社）を採取量の１／５０を添加して３７℃で１６時間反応させた。酵素反応終了後、１００℃、５分間加熱して酵素反応を止めた。また、（１）、（２）ともに、酵素に代えて酵素添加量と等量（重量）の水を加え、他を酵素処理と同様に操作したブランク区を検体と同時に処理した。【００５９】
（３）未消化物（残渣）の回収
上記（２）の反応物を塩酸でｐＨを２．０に調整し、１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し、沈殿を回収した。回収した沈殿物に、試料採取量の５倍量の水を加えて沈殿物を溶解・洗浄して再度遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）を行った。この操作を合計２回行った。【００６０】
（４）乾燥
回収した沈殿は凍結乾燥した。その際、凍結乾燥前後における重量（以下、残渣回収量とする）を測定した。なお成分量はケルダール法にて求めた。
以下の計算式にて消化率を算出した。【００６１】
【数１】
2018056284.tif 000002
【００６２】
結果、難消化性たんぱく質含有物中のタンパク質の消化率は２０％、同時に試験を実施したカゼインは９９．３％であった。【００６３】
以上のことからチョコレートより抽出したたんぱく質が難消化性であることが確認できた。【００６４】
評価および結果
摂取開始日を１日目とし、摂取開始７日前（−７日目、−１Ｗ）から摂取最終日（１４日目、２Ｗ）までの間、生活日誌（試験食品摂取の確認、自覚症状の記録、摂取開始日７日前よりの排便状況（排便回数、便性、便量）、性周期等、医薬品の服用状況等の記録）による記録を行った。摂取開始７日前（−７日目、−１Ｗ）および摂取最終日（１４日目、２Ｗ）に、生活習慣アンケート、自覚アンケート、理学的検査（身長、体重、血圧、脈拍数、ＢＭＩ）採便を実施した。また、便中菌叢解析（Nagashima法による便中菌叢のT-RFLP解析）、便中ビフィズス菌数および総菌数の定量・ビフィズス菌占有率の測定（リアルタイムＰＣＲ法）、便の網羅的菌叢解析（ＤＧＧＥ法、次世代アンプリコンシーケンス法：メタゲノム解析による被験者腸内菌叢（属レベル）の評価を行った。得られたデータは平均値±標準誤差で示した。統計解析は以下の通り行った。便色・便量などの群間比較：「独立サンプルのt検定」（解析ソフトウェア：「IBM  SPSS  Statistics  23」）。排便回数の群間比較：「Mann-WhitneyのU検定」（解析ソフトウェア：「IBM  SPSS  Statistics  23」）。網羅的菌叢解析の群間比較：エクセル統計(SSRI)を用い、対照食品群と試験食品群の比較をｔ−ｔｅｓｔで評価した（有意水準は５％未満とした）。【００６５】
排便回数は、試験食品群において顕著な経時的増加を示すとともに、−７日目〜−１日目（−１Ｗ〜０Ｗ）に対して、０日目〜７日目（０Ｗ〜１Ｗ）、８日目〜１４日目（１Ｗ〜２Ｗ）ともに有意差（危険率（ｐ値）５％未満）があった。対照食品群に比べ試験食品群において明らかな排便回数の増加が認められた（図１）。【００６６】
便性は、便色と排便量により評価した。便色は５段階の便色スコアにより評価した。具体的には、便色スコア値は、１：黄色〜黄褐色、２：褐色、３：茶褐色、４：暗褐色、５：黒褐色〜黒色とし（腸内細菌学雑誌.2004, 18(2); 107-115参照）、被験者には、目視にて比色するため、上記５段階の便色スコア値および名称が表記され、対応する便色がカラー印刷された便色スケールを渡し、便の色を被験者自身に観測させた。その結果、試験食品群の摂取１４日後の便色スコア値が、対照食品群の便色スコア値よりも有意に低い値を示していた（図２）。すなわち、便色において試験食品摂取群に摂取１４日後には改善傾向がみられたが、対照食品摂取群では、ほとんど変化がみられなかった（図２）。便量については、−７日目〜−１日目（−１Ｗ〜０Ｗ）の摂取前１週間の全排便量(前)に対する０日目〜７日目（０Ｗ〜１Ｗ）、または８日目〜１４日目（１Ｗ〜２Ｗ）までのそれぞれ１週間の全排便量の比を求めた。その結果、試験食品群の便量が経時的に増加する傾向がみられた（データ示さず）。【００６７】
図１および図２の結果から、カカオ豆由来ルミナコイド摂取により排便回数、排便量が増加すること、便色が改善することが確認された。【００６８】
また、次世代アンプリコンシーケンス法（Proc Natl Acad Sci U S A. 2011, 108(Suppl 1): 4516-4522参照）を用いたメタゲノム解析をMiSeqシステム（イルミナ社製）により実施した。菌叢を構成する各菌の分類は、16SrDNA配列情報に従って行った（Nucl Acids Res. 2007, 35:18. e120参照）。その結果、被験者腸内菌叢（属レベル）では、腸内菌叢全菌数を１００％とした場合のフィーカリバクテリウム属菌の占有率が、試験食品摂取群において、摂取前（０日目）と比較して摂取後（１４日目）で有意に増加した（図３）。すなわち、排便回数の増加、排便量の増加、便色の改善は、フィーカリバクテリウム属菌の増加によるものであることが確認された。【００６９】
以上の結果から、カカオ豆由来ルミナコイドはフィーカリバクテリウム属菌の産生を促進することが確認された。従って、カカオ豆由来ルミナコイドは、炎症性疾患、アレルギー疾患、腸内菌共生バランス失調（Dysbiosis）に起因すると考えられる疾病（クローン病など）などのフィーカリバクテリウム属菌の産生促進により改善される疾患や病状の改善効果を有することが示された。【００７０】
試験例２：カカオ豆由来ルミナコイドによるフィーカリバクテリウム属菌の産生促進効果の検討（２）
カカオ豆由来ルミナコイドがフィーカリバクテリウム属菌の産生に与える影響を検証するために、チョコレートから抽出したルミナコイドを用いて以下の試験を行った。【００７１】
（１）ルミナコイドの調製
市販のカカオ豆由来ルミナコイド高含有油脂加工組成物（「チョコレート効果カカオ７２％」株式会社明治）１６０３ｇを湯煎で溶かし、チョコレートの５倍量のヘキサン（８Ｌ）を添加後、３時間撹拌することで脱脂した。遠心分離後（１００００ｒｐｍ、１０分、４℃）、上清を除去し沈殿物を回収した。沈殿物にチョコレートの３倍量のヘキサン（４．８Ｌ）を添加後、１時間撹拌した。遠心分離後、上清を除去し沈殿物を回収後、ドラフト内で一晩乾燥させた。乾燥させた沈殿物をミルサーで粉砕することでチョコレートパウダー９８１ｇを得た。【００７２】
上記のようにして得たチョコレートパウダー（９８１ｇ）を２０倍量の水（１９．６Ｌ）に懸濁し、８Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨ１２．０に調整後、７０℃に加温し３０分間抽出を行った。遠心分離後（１００００ｒｐｍ、１０分、２５℃）、上清を回収した。【００７３】
回収した上清をリン酸でｐＨ２．０に調整し、４℃で一晩静置した。遠心分離後（１００００ｒｐｍ、１０分、２５℃）、上清を除去し沈殿物を回収した。【００７４】
沈殿物に、チョコレートパウダーの５倍量の水（４．９Ｌ）を加え水洗を行い、遠心分離後（１００００ｒｐｍ、１０分、２５℃）、上清を捨てた。水洗を２回繰り返して得られた沈殿物を８０℃で６時間、減圧乾燥機にて乾燥させ、カカオプロテイン含有物１２９ｇを得た（たんぱく質：４６．６％、食物繊維：４３．３％）。得られたカカオプロテイン含有物に含まれるたんぱく質と食物繊維は難消化性であることから、カカオプロテイン含有物はカカオ豆由来ルミナコイドに相当する。【００７５】
（２）試験方法
試験は、上記（１）で調製したカカオ豆由来ルミナコイド（カカオプロテイン含有物）を配合した飼料（試験飼料）を摂取させる試験飼料群と、カカオ豆由来ルミナコイドを配合しない飼料（対照飼料）を摂取させる対照飼料群の２群に対して行った。試験飼料としては、ＡＩＮ９３Ｇの５％セルロース分を５％カカオプロテイン含有物に置換した飼料を用いた。対照飼料としては、ＡＩＮ９３Ｇのうち不溶性食物繊維である５％セルロース分を５％コーンスターチに置換した飼料を用いた。ＡＩＮ９３Ｇからセルロース分を除いた飼料は、オリエンタル酵母工業社製のものを用いた。【００７６】
ＢＡＬＢ／ｃＡマウス（メス、６週齢、日本クレア社）１２匹を対照飼料にて１週間予備飼育した後、平均体重が同等となるように群分けを行った。群分けは各群６匹となるようにした。【００７７】
試験開始時から各飼料および水は自由摂取とした。週に２回の体重測定および摂餌量測定を行った。また、試験開始後１１〜１３日目の２日分の糞便を回収し、凍結乾燥後、乾燥重量を測定した。【００７８】
試験開始後１４日目にイソフルラン麻酔下にて腹部下行大静脈より全採血を行った。盲腸内容物を採取後、重量を測定し−８０℃にて保存した。また、盲腸内短鎖脂肪酸濃度の測定は、以下の測定機器および条件で行った。
測定機器：島津有機酸分析システム
カラム：Shim-Pack SCR-102(H),300mm×8mm ID、２本直列で使用
ガードカラム：Shim-Pack SCR-102(H),50mm×6mm ID
溶離液：５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐ−トルエンスルホン酸
反応液：５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐ−トルエンスルホン酸、１００μｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ
流速：０．８ｍＬ／分
オーブン温度：４５℃
検出器：電気伝導度検出器ＣＤＤ−１０Ａ
参照文献：Advances in Microbiology. 2015, 5(7):531-540およびBenef Microbes. 2016 Jun, 7(3):337-344【００７９】
得られたデータは平均値±標準誤差で示した。統計解析はエクセル統計 (SSRI)を用い、対照飼料群と試験飼料群の比較をｔ−ｔｅｓｔで評価した。有意水準は５％未満とした。なお、試験開始時および終了時の体重と総摂餌量については、いずれも各群間に有意な差はなかった（データ示さず）。【００８０】
（３）結果
試験開始後１１〜１３日目の乾燥糞便重量は図４に、解剖時の盲腸内容物重量は図５にそれぞれ示す。また、盲腸内の短鎖脂肪酸量（酪酸、プロピオン酸、酢酸）は図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃに示す。【００８１】
図４に示されるように、対照飼料群と比較して、試験飼料群において糞便重量の有意な増加が認められた。この結果は、試験例１における「チョコレート効果カカオ７２％」の摂取による便通改善効果の有効成分がカカオプロテイン含有物（ルミナコイド）であることを示している。【００８２】
また、図５に示されるように、対照飼料群と比較して、試験飼料群において盲腸内容物重量の有意な増加が認められた。さらに、図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃに示されるように、対照飼料群と比較して、試験飼料群において盲腸内の短鎖脂肪酸量の有意な増加が認められた。これらのことから、カカオプロテイン含有物（ルミナコイド）は、便の嵩増し効果による糞便量増加に加えて、盲腸内の短鎖脂肪酸の産生による糞便量増加効果を有することが示された。盲腸内の短鎖脂肪酸は、フィーカリバクテリウム属菌により産生され、フィーカリバクテリウム属菌の占有率の変化量とヒト糞便中の短鎖脂肪酸濃度の変化量との間には強い正の相関が見られることから（例えば、Brit J Nutr. 2010, 104(5): 693-700参照）、試験例１の結果と併せると、カカオプロテイン含有物（ルミナコイド）は、フィーカリバクテリウム属菌の産生を促進し、腸内菌叢の改善を促進する効果を有することが示された。【００８３】
試験例３：カカオ豆由来ルミナコイドによるフィーカリバクテリウム属菌の産生促進効果の検討（３）
カカオ豆由来ルミナコイドが糞便中の短鎖脂肪酸の産生に与える影響を検証するために以下の試験を行った。【００８４】
２０歳以上５０歳未満の健康な日本人女性から被験者をスクリーニングにより選抜し、評価者盲検並行群間比較試験を行った（試験食品群、対照食品群、各３０名）。試験期間中は、食事制限およびその他の制限を行った。試験期間中の食事制限およびその他の制限、並びに食事、飲み物および嗜好品に関する事項については、試験例１に記載された基準と同じ基準を採用した。【００８５】
スクリーニングは、摂取開始７日前（−７日目、−１Ｗ）に、生活習慣アンケート（年齢、既往歴、合併症、食物アレルギーの有無、医薬品や健康食品の摂取状況、飲酒等の確認）、自覚アンケート（整腸に関する自覚症状の調査）、理学的検査（身長、体重、血圧、脈拍数、ＢＭＩ）を実施し、排便の状態（排便回数、便性、便量）、年齢、食習慣（カカオ製品、納豆、乳酸菌含有食品等の日常的な摂取状況）による所定の除外基準を満たした、排便回数が週平均４回の６０名を選抜した。スクリーニングにおける除外基準は、試験例１に記載される基準と同じ基準を採用した。【００８６】
試験食品と対照食品は、試験例１に記載された手順と同様の手順で調製し、評価したものを用いた。【００８７】
評価は以下の通り行った。摂取開始日を１日目とし、摂取開始７日前（−７日目、−１Ｗ）から摂取最終日（１４日目、２Ｗ）までの間、生活日誌（試験食品摂取の確認、自覚症状の記録、摂取開始日７日前よりの排便状況（排便回数、便性、便量）、性周期等、医薬品の服用状況等の記録）による記録を行った。摂取開始７日前（−７日目、−１Ｗ）および摂取最終日（１４日目、２Ｗ）に、生活習慣アンケート、自覚アンケート、理学的検査（身長、体重、血圧、脈拍数、ＢＭＩ）、採便を実施した。【００８８】
また、便中の短鎖脂肪酸濃度を測定した。便中短鎖脂肪酸濃度は、試験例２に記載された測定機器を用いて、試験例２に記載された条件に従って測定した。その結果、試験食品を摂取させることにより便中短鎖脂肪酸濃度が増大することが確認された（データ示さず）。大腸内の短鎖脂肪酸は、フィーカリバクテリウム属菌により産生され、フィーカリバクテリウム属菌の占有率の変化量とヒト糞便中の短鎖脂肪酸濃度の変化量との間には強い正の相関が見られることから（例えば、Brit J Nutr. 2010, 104(5): 693-700参照）、試験例１の結果と併せると、カカオプロテイン含有物（ルミナコイド）は、フィーカリバクテリウム属菌の産生を促進し、腸内菌叢の改善を促進する効果を有することが本試験例でも示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【国際調査報告】
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