(57)【要約】【解決課題】  生細胞に適応可能なフローサイトメーターに用いることができるＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブを提供すること【解決手段】  一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩であって、以下の条件で測定したＨＰＬＣクロマトグラムの保持時間は、当該化合物のアルデヒド型の場合においては６．９分より大きく、当該化合物のカルボン酸型の場合においては６．９分以下である、前記化合物又はその塩。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩であって、
2018105667.tif 000055
（式中、
Ｒａは、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し；
Ｔは、以下の二価の基：
−Ｎ（Ｒｂ）−、
−Ｃ（Ｒｃ）２−
−Ｏ−
から選択され（Ｒｂは、炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒｃは、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、各々のＲｃは、同じであってもこ異なっていてもよい）；
Ｌは、リンカーを表し；
2018105667.tif 000056
は、蛍光団を表し、
前記蛍光団は、キサンテン系色素、ＢＯＤＩＰＹ系蛍光団又はシアニン系蛍光団から選択される）
以下の条件で測定したＨＰＬＣクロマトグラムの保持時間は、当該化合物のアルデヒド型の場合においては６．９分より大きく、当該化合物のカルボン酸型の場合においては６．９分以下である、前記化合物又はその塩。
（ＨＰＬＣ条件：溶媒Ａを０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水、溶媒Ｂを８０％アセトニトリル  ０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水とし、２０％の溶媒Ｂで２．５分に続いて２０％から１００％の溶媒Ｂ、５分間のリニアグラジエント（流速５００μｌ／分）の条件で行う。）
【請求項２】
前記リンカーが、Ｙ−（Ｓ）で表され、Ｙは結合基を表し、Ｓは存在する場合は架橋基を表す、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
前記結合基が、−ＣＯＮＨ−、−Ｒ−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、−Ｒ−ＣＯＯ−、−ＲＯ−又は−Ｒ−ＣＯ−（ここで、Ｒは炭化水素基を表す）から選択される、請求項２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
前記架橋基が、炭素数１〜６の置換又は無置換のアルキレン基、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−（ｍは１又は２である）、又はこれらの組合せから選択される、請求項２又は３に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
式（Ｉ）における
2018105667.tif 000057
は、以下の式（ＩＩ）で表される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
2018105667.tif 000058
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ２は、水素原子、一価の置換基又は結合を示し； 
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基、アリール基又は結合を示し、但し、Ｘが酸素原子の場合は存在しない；
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し；
Ｘは、酸素原子又は珪素原子を示し；
＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表し、
ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２〜Ｒ８のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。）
【請求項６】
以下の式（ＩＩａ）で表される、請求項５に記載の化合物又はその塩。
2018105667.tif 000059
（式中、Ｒａ、Ｒｂ及びＬは式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８は、式（ＩＩ）で定義した通りである。）
【請求項７】
式（Ｉ）における
2018105667.tif 000060
は、以下の式（ＩＩＩ）で表される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
2018105667.tif 000061
（式中、Ｒ１〜Ｒ８、Ｘは、式（ＩＩ）で定義した通りであり；
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３個のアルキル基又は結合を示し、
Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ４又はＲ８と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表し、
ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２〜Ｒ１０のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する）
【請求項８】
式（Ｉ）における
2018105667.tif 000062
は、以下の式（ＩＶ）で表される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
2018105667.tif 000063
（式中、Ｒ１〜Ｒ８、Ｘは、式（ＩＩ）で定義した通りであり；
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３個のアルキル基又は結合を示し、
Ｒ１１及びＲ１２は一緒になってＲ１１及びＲ１２が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ１１又はＲ１２は、或いは、Ｒ１１及びＲ１２の両方は、夫々、Ｒ４又はＲ８と一緒になって、Ｒ１１又はＲ１２が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表し、
ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２〜Ｒ１２のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。）
【請求項９】
式（Ｉ）における
2018105667.tif 000064
は、以下の式（Ｖ）で表される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
2018105667.tif 000065
（式中、
Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し；
Ｒ１５は、それぞれ独立に、水素原子、カルボキシル基又はスルホン酸基を示し：
ｎは、１〜３の整数を示し；
＊は、式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表す。）
【請求項１０】
式（Ｉ）における
2018105667.tif 000066
は、以下の式（ＶＩ）で表される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
2018105667.tif 000067
（式中、Ｒ１６〜Ｒ２２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、カルボニル基、アリル基、アリール基、ピロール基、チオフェン基、 フラン基、スルホン酸基、スルホニルアミド基、カルボキシル基、メトキシ基又は結合を示し；
Ｌは、Ｒ１６〜Ｒ２２のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。）
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む、ＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な蛍光プローブ。より具体的には、ＡＬＤＨ３Ａ１を検出できる蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＬＤＨは種々のアルデヒドをカルボン酸に酸化する酵素である。ヒトのＡＬＤＨは１９のアイソフォームが知られており、それぞれ得意とする基質を有する（基質特異性）。
幹細胞や癌の研究分野において比較的盛んに研究が行われているＡＬＤＨアイソフォームとその特徴を表１に示す。【０００３】
マーカーとしての知見が蓄積しているアイソフォームはＡＬＤＨ１Ａ１及びＡＬＤＨ１Ａ３であり、正常および癌細胞において幹細胞マーカーであるとの多くの報告がなされている。一方で、ＡＬＤＨ３Ａ１は一部の抗がん剤を代謝・無効化することから抗がん剤耐性との観点から研究されている。また、ＡＬＤＨ３Ａ１が肺癌細胞株のノックダウン実験により、細胞の増殖に関与しているという報告(非特許文献１)や、前立腺癌細胞においてはＡＬＤＨ３Ａ１がスフェロイド形成能や癌組織の更なる悪性化に関与しているとの報告(非特許文献２)がある。【０００４】
表１   主なＡＬＤＨアイソフォームとその特徴
2018105667.tif 000002
【０００５】
このように、ＡＬＤＨ３Ａ１は重要な機能を持つと考えられるが、ＡＬＤＨ１と比較してその研究は大幅に遅れている。その理由の１つとして、ＡＬＤＨに対する蛍光プローブの有無があげられる。ＡＬＤＨ１には生細胞におけるＡＬＤＨ１活性を判別し、その高低に基づいて細胞を分取し、連続して更なる実験を行うことを可能とする蛍光プローブ（ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標））がすでに存在している。幹細胞能として自己複製能および分化能があるが、ＡＬＤＨ１が幹細胞マーカーであることを示すにはこれを実験で示す必要がある。この場合、生細胞を使ってＡＬＤＨ１活性の高低に従って細胞をソート・アウトする必要がある。また、抗癌剤の効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調べる場合、ＭＴＴ  ａｓｓａｙという色素を用いた生細胞の定量法があり、簡便でＨｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔにも対応していることから、広く用いられている。【０００６】
上記のようにＡＬＤＨの活性は同じ細胞株内でも高低が細胞ごとに異なっているが、このＡＬＤＨ活性の高低と抗癌剤耐性には関連があるとの報告が多数ある（非特許文献３）。抗癌剤投与前後で生細胞のＡＬＤＨ活性の分布をみることにより、抗癌剤耐性とＡＬＤＨ活性の関連性を詳細に検討することが可能である。【０００７】
このように生細胞に適応可能なＡＬＤＨ３Ａ１のプローブがあればさまざまな研究へ展開することが可能であるが、未だ有用なＡＬＤＨ３Ａ１のプローブは実現していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mol Caner 2008, 7, 87.
【非特許文献２】Br J Cancer 2014, 110, 2593.
【非特許文献３】Biomed Pharmacother. 2013 Sep;67(7):669-80. “The role of aldehyde dehydrogenase (ALDH) in cancer drug resistance.”
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、生細胞に適応可能なフローサイトメーターに用いることができるＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意検討したところ、ＡＬＤＨ３Ａ１との反応基質として、ベンズアルデヒドが有効であることを見出し、更にベンズアルデヒドと蛍光団を特定の構造を有するリンカーで結合することにより、ＡＬＤＨ３Ａ１と特異的に反応する蛍光プローブを提供できることを見出した。【００１１】
また、本発明者等は、蛍光プローブを用いてＡＬＤＨ３Ａ１高活性細胞を検出する際のメカニズムとして、アルデヒド型の蛍光プローブは疎水性で細胞膜を透過可能であるが、ＡＬＤＨ３Ａ１の活性によりプローブがカルボン酸型に代謝されると、カルボン酸の陰性電荷のため水溶性となり膜不透過となるため、ＡＬＤＨ３Ａ１の活性が高い細胞にのみ膜不透過となったカルボン酸型プローブが滞留及び蓄積されるという原理を用いた（図１参照）。
本発明者等は、種々検討したところ、反応部位のベンズアルデヒドの疎水性が高いことから、疎水性の高い蛍光団を組み合わせると、カルボン酸型に代謝されてもプローブ全体としての水溶性が低いために過剰な膜透過性を有し、カルボン酸型プローブを細胞内に滞留及び蓄積できないことを知見した。そこで、蛍光プローブがカルボン酸型になった時の親水性のレベルを特定の範囲とすることにより、生細胞に適応可能なフローサイトメーターに用いることができるＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブを提供できることを見出し、本発明を完成した。【００１２】
即ち、本発明は、
［１］以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩であって、
2018105667.tif 000003
（式中、
Ｒａは、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し；
Ｔは、以下の二価の基：
−Ｎ（Ｒｂ）−、
−Ｃ（Ｒｃ）２−
−Ｏ−
から選択され（Ｒｂは、炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒｃは、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、各々のＲｃは、同じであっても異なっていてもよい）；
Ｌは、リンカーを表し；
2018105667.tif 000004
は、蛍光団を表し、
前記蛍光団は、キサンテン系色素、ＢＯＤＩＰＹ系蛍光団又はシアニン系蛍光団から選択される）
以下の条件で測定したＨＰＬＣクロマトグラムの保持時間は、当該化合物のアルデヒド型の場合においては６．９分より大きく、当該化合物のカルボン酸型の場合においては６．９分以下である、前記化合物又はその塩。
（ＨＰＬＣ条件：溶媒Ａを０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水、溶媒Ｂを８０％アセトニトリル  ０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水とし、２０％の溶媒Ｂで２．５分に続いて２０％から１００％の溶媒Ｂ、５分間のリニアグラジエント（流速５００μｌ／分）の条件で行う。）
［２］前記リンカーが、Ｙ−（Ｓ）で表され、Ｙは結合基を表し、Ｓは存在する場合は架橋基を表す、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］前記結合基が、−ＣＯＮＨ−、−Ｒ−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、−Ｒ−ＣＯＯ−、−ＲＯ−又は−Ｒ−ＣＯ−（ここで、Ｒは炭化水素基を表す）から選択される、［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］前記架橋基が、炭素数１〜６の置換又は無置換のアルキレン基、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−（ｍは１又は２である）又はこれらの組合せから選択される、［２］又は［３］に記載の化合物又はその塩。
［５］式（Ｉ）における
2018105667.tif 000005
は、以下の式（ＩＩ）で表される、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
2018105667.tif 000006
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ２は、水素原子、一価の置換基又は結合を示し； 
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基、アリール基又は結合を示し、但し、Ｘが酸素原子の場合は存在しない；
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し；
Ｘは、酸素原子又は珪素原子を示し；
＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表し、
ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２〜Ｒ８のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。）
［６］以下の式（ＩＩａ）で表される、［５］に記載の化合物又はその塩。
2018105667.tif 000007
（式中、Ｒａ、Ｒｂ及びＬは式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８は、式（ＩＩ）で定義した通りである。）
［７］式（Ｉ）における
2018105667.tif 000008
は、以下の式（ＩＩＩ）で表される、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
2018105667.tif 000009
（式中、Ｒ１〜Ｒ８、Ｘは、式（ＩＩ）で定義した通りであり；
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３個のアルキル基又は結合を示し、
Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ４又はＲ８と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表し、
ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２〜Ｒ１０のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する）
［８］式（Ｉ）における
2018105667.tif 000010
は、以下の式（ＩＶ）で表される、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
2018105667.tif 000011
（式中、Ｒ１〜Ｒ８、Ｘは、式（ＩＩ）で定義した通りであり；
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３個のアルキル基又は結合を示し、
Ｒ１１及びＲ１２は一緒になってＲ１１及びＲ１２が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ１１又はＲ１２は、或いは、Ｒ１１及びＲ１２の両方は、夫々、Ｒ４又はＲ８と一緒になって、Ｒ１１又はＲ１２が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表し、
ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２〜Ｒ１２のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。）
［９］式（Ｉ）における
2018105667.tif 000012
は、以下の式（Ｖ）で表される、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
2018105667.tif 000013
（式中、
Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し；
Ｒ１５は、それぞれ独立に、水素原子、カルボキシル基又はスルホン酸基を示し：
ｎは、１〜３の整数を示し；
＊は、式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表す。）
［１０］式（Ｉ）における
2018105667.tif 000014
は、以下の式（ＶＩ）で表される、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
2018105667.tif 000015
（式中、Ｒ１６〜Ｒ２２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、カルボニル基、アリル基、アリール基、ピロール基、チオフェン基、 フラン基、スルホン酸基、スルホニルアミド基、カルボキシル基、メトキシ基又は結合を示し；
Ｌは、Ｒ１６〜Ｒ２２のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。）
［１１］［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む、ＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブ。
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、生細胞に適応可能なフローサイトメーターに用いることができるＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブを提供することが可能である。
本発明の蛍光プローブにより、ＡＬＤＨ３Ａ１の細胞としての活性を生きた細胞を用いて検出することが可能である。即ち、すりつぶした細胞を用いればＡＬＤＨ３Ａ１の発現量や活性を評価することは従来の技術でも可能であるが、細胞が生きた状態でＡＬＤＨ３Ａ１の活性を調べることにより、高活性の細胞が、その後、どのような運命をたどるか等の生物学の本質により迫ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】プローブを用いたＡＬＤＨ３Ａ１高活性細胞検出の原理
【図２】各プローブにおけるアルデヒド型およびカルボン酸型のRetention time（保持時間）
【図３】Ｐｒｏｂｅ５を用いた細胞イメージングの結果（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  １００μｍ）
【図４】Ｐｒｏｂｅ５を用いたフローサイトメトリー
【図５ａ】ＯＥ２１細胞をｓｉＲＮＡにてノックダウン後６日目に、ウエスタン・ブロッティングを行った結果を示す。
【図５ｂ】ノックダウンされた細胞を用いてフローサイトメトリーを行った結果を示す。（上段は陰性コントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞によるアッセイ。下段はノックダウンされた細胞によるアッセイ。）
【図６】Ｐｒｏｂｅ５を用いてセルソーターでＰｒｏｂｅ５の高輝度細胞(Top)と低輝度細胞（Bottom）をソート・アウトしウエスタン・ブロッティングを行った結果を示す。
【図７ａ】３７℃下での同一視野におけるタイムラプス観察結果。Ｐｒｏｂｅ５  ４０μＭ、ＭＫ−５７１なし（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  １００μＭ）
【図７ｂ】３７℃下での同一視野におけるタイムラプス観察結果。Ｐｒｏｂｅ５  ４０μＭ、ＭＫ−５７１  ２００μＭ（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  １００μＭ）
【図７ｃ】フローサイトメトリー。（ＯＥ２１  ｃｅｌｌ、Ｐｒｏｂｅ５  ５０μＭ、ＭＫ−５７１  ２００μＭ）
【図８】ＯＥ２１細胞に対しｓｉＲＮＡを用いてＡＬＤＨ３Ａ１をノックダウンした後にフローサイトメトリーを行った結果を示す。（Ｐｒｏｂｅ５  ５０μＭとともにＭＫ−５７１  ２００μＭを併用した。陰性コントロールにはＣＢ７  ２０μＭによりＡＬＤＨ３Ａ１を阻害したＯＥ２１細胞を用いた。）
【図９ａ】Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｈＲＮＡ（ｃｔｒｌ）もしくはＡＬＤＨ３Ａ１に対するｓｈＲＮＡ（ＫＤ）を導入したＯＥ２１細胞のウエスタン・ブロッティグを示す。
【図９ｂ】ｓｈＲＮＡを導入したＯＥ２１細胞を用いたフローサイトメトリーを示す（Ｐｒｏｂｅ５  ５０μＭ、ＭＫ−５７１  ２００μＭ）。
【図９ｃ】ｃｔｒｌ／ＫＤ＝１：１混合サンプルを用いてセルソーターで輝度の上位／下位２５％（Ｔｏｐ／Ｂｏｔｔｏｍ）をそれぞれ分取しウエスタン・ブロッティングを行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個、更に好ましくは炭素数１〜３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。
【００１６】
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
【００１７】
本発明の１つの態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
2018105667.tif 000016
【００１８】
式（Ｉ）において、Ｒａは、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒａは、ベンゼン環上において、１〜４個存在し、これらは同一又は異なっていてもよい。
本発明の１つの好ましい態様においては、Ｒａはいずれも水素原子である。
【００１９】
式（Ｉ）において、Ｔは、以下の二価の基：
−Ｎ（Ｒｂ）−、
−Ｃ（Ｒｃ）２−
−Ｏ−
から選択される。
ここで、Ｒｂは、炭素数１〜４のアルキル基を表し、好ましくは、メチル基、エチル基である。
Ｒｃは、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、各々のＲｃは、同じであっても異なっていてもよい。
本発明の１つの好ましい態様においては、Ｔが−Ｎ（Ｒｂ）−である。
【００２０】
式（Ｉ）において、Ｌは、リンカーを表す。リンカーとしては、蛍光団と窒素原子を結合する種々の置換基が挙げられる。
本発明の１つの好ましい態様において、リンカーは、Ｘ−（Ｓ）で表され、Ｘは結合基を表し、Ｓは存在する場合は架橋基を表す。
【００２１】
前記結合基は、好ましくは、アミド基（−ＣＯＮＨ−）、アルキルアミド基（−Ｒ−ＣＯＮＨ−）、エステル基（−ＣＯＯ−）、アルキルエステル基（−Ｒ−ＣＯＯ−）、アルキルエーテル基（−ＲＯ−）又はアルキルカルボニル基（−Ｒ−ＣＯ−）から選択される。ここで、Ｒは炭化水素基を表し、好ましくは炭素数１〜８のアルキルである。
【００２２】
前記架橋基は、好ましくは、炭素数１〜６の置換又は無置換のアルキレン基；エチレングリコール基、ジエチレングルコール基（即ち、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−（ｍは１又は２である））；又はこれらの組合せから選択される。  
【００２３】
式（Ｉ）において、アルデヒド基（−ＣＨＯ）は、ベンゼン環上のいずれの位置に導入することができるが、Ｔに対してｐ位に導入することが好ましい、
【００２４】
式（Ｉ）における
2018105667.tif 000017
は、蛍光団を表す。
蛍光団としては、好ましくは、キサンテン系色素（Tokyo Magenta系蛍光団、Tokyo Green系蛍光団、ローダミン系蛍光団、ロドール系蛍光団）、ＢＯＤＩＰＹ系蛍光団又はシアニン系蛍光団から選択される。
【００２５】
本発明においては、蛍光プローブを用いてＡＬＤＨ３Ａ１高活性細胞を検出する際のメカニズムとして図１で模式的に示した原理を用いた。つまり、アルデヒド型のプローブは疎水性で細胞膜を透過可能であるが、ＡＬＤＨ３Ａ１の活性によりプローブがカルボン酸型に代謝されると、カルボン酸の陰性電荷のため水溶性となり膜不透過となり、ＡＬＤＨ３Ａ１の活性が高い細胞にのみ膜不透過となったカルボン酸型プローブが滞留・蓄積するという原理である。
【００２６】
ここで、本発明の式（Ｉ）の化合物の反応部位であるベンズアルデヒドの疎水性が比較的高いため、疎水性の高い蛍光団を組み合わせると、カルボン酸型に代謝されてもプローブ全体としての水溶性が低いために過剰な膜透過性を有し、カルボン酸型プローブを細胞内に滞留及び蓄積できない。そこで、式（Ｉ）の化合物においてカルボン酸型になった場合の親水性のレベルを特定の範囲とすることにより、生細胞に適応可能なフローサイトメーターに用いることができるＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブを提供することが可能である。
【００２７】
本発明においては、親水性の尺度としてＨＰＬＣクロマトグラムの保持時間を用いるのが好ましい。
本発明の１つの好ましい態様は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩であって、以下の条件で測定したＨＰＬＣクロマトグラムの保持時間は、当該化合物のアルデヒド型の場合においては６．９分より大きく、当該化合物のカルボン酸型の場合においては６．９分以下である、前記化合物又はその塩である。
ＨＰＬＣ条件：溶媒Ａを０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水、溶媒Ｂを８０％アセトニトリル  ０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水とし、２０％の溶媒Ｂで２．５分に続いて２０％から１００％の溶媒Ｂ、５分間のリニアグラジエント（流速５００μｌ／分）の条件で行う
カラムとしては、例えば、Ｃ１８カラム（ＨＰ  ３  μｍ、内径：２．１ｍｍ、長さ：１５０ｍｍ、ジーエル  サイエンス）を好適に用いることができる。
【００２８】
本発明においては、式（Ｉ）で表される化合物が上記のＨＰＬＣクロマトグラムの保持時間を具備するように、キサンテン系色素（Tokyo Magenta系蛍光団、Tokyo Green系蛍光団、ローダミン系蛍光団、ロドール系蛍光団）、ＢＯＤＩＰＹ系蛍光団又はシアニン系蛍光団から選択される任意の蛍光団を用いることができる。
【００２９】
本発明の１つの側面においては、式（Ｉ）における
2018105667.tif 000018
は、以下の式（ＩＩ）で表される。
2018105667.tif 000019
【００３０】
式（ＩＩ）において、Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示す。
Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。
本発明の１つの好ましい態様においては、Ｒ１はいずれも水素原子である。
【００３１】
式（ＩＩ）において、Ｒ２は、水素原子、一価の置換基又は結合を示す。Ｒ２が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、Ｒ１と同様に、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基等が挙げられる。
本発明の１つの好ましい態様においては、Ｒ２は、炭素数１〜６個のアルキル基であり、好ましくは、メチル基、カルボキシル基，メトキシ基，ハイドロキシメチル基である。
【００３２】
式（ＩＩ）において、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示す。
Ｒ３又はＲ４がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ３又はＲ４が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ３及びＲ４がともに水素原子である場合、又はＲ３及びＲ４がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
【００３３】
式（ＩＩ）において、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基、アリール基又は結合を示す、但し、Ｘが酸素原子の場合はＲ５及びＲ６は存在しない。
Ｘが珪素原子の場合は、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数１〜３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ５及びＲ６がともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ５及びＲ６が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ５又はＲ６が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ５又はＲ６がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
【００３４】
式（ＩＩ）において、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し、Ｒ３及びＲ４について説明したものと同様である。Ｒ７及びＲ８が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又は共にフッ素原子であることが好ましい。
【００３５】
Ｘは、酸素原子又は珪素原子を示す。好ましくは、Ｘは、酸素原子である。
【００３６】
＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所(結合点、以下同様）を表す。ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２〜Ｒ８のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合することができる。好ましくは、Ｌは、キサンテン環骨格に結合しているベンゼン環の任意の位置に結合することができるが、当該ベンゼン環の４位または５位に結合することが好ましい。
【００３７】
本発明の１つの好ましい態様は、以下の式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩である。
2018105667.tif 000020
【００３８】
式（ＩＩａ）において、Ｒａ、Ｒｂ及びＬは式（Ｉ）について記載した通りであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８は、式（ＩＩ）について記載した通りである。
【００３９】
本発明の１つの側面においては、式（Ｉ）における
2018105667.tif 000021
は、以下の式（ＩＩＩ）で表される。
2018105667.tif 000022
【００４０】
式（ＩＩＩ）におけるＲ１〜Ｒ８、Ｘは、式（ＩＩ）で定義した通りである。
【００４１】
式（ＩＩＩ）において、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３個のアルキル基又は結合を示す。
また、Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。
また、Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ４又はＲ８と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
式（ＩＩＩ）において、＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表す。ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２〜Ｒ１０のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。
好ましくは、Ｌは、キサンテン環骨格に結合しているベンゼン環の任意の位置に結合することができるが、当該ベンゼン環の４位または５位に結合することが好ましい。
【００４３】
本発明の１つの側面においては、式（Ｉ）における
2018105667.tif 000023
は、以下の式（ＩＶ）で表される。
2018105667.tif 000024
【００４４】
式（ＩＶ）において、Ｒ１〜Ｒ８、Ｘは、式（ＩＩ）について記載した通りである。
【００４５】
式（ＩＶ）において、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す。
また、Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。ヘテロシクリルとしては、アゼチジン、ピロリジン等があげられ、これらヘテロシクリルは炭素数１〜６個のアルキル等の置換基で置換されていてもよい。
また、Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
式（ＩＶ）において、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３個のアルキル基又は結合を示す。
Ｒ１１及びＲ１２は一緒になってＲ１１及びＲ１２が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。ヘテロシクリルとしては、アゼチジン、ピロリジン等があげられ、これらヘテロシクリルは炭素数１〜６個のアルキル等の置換基で置換されていてもよい。
また、Ｒ１１又はＲ１２は、或いは、Ｒ１１及びＲ１２の両方は、夫々、Ｒ４又はＲ８と一緒になって、Ｒ１１又はＲ１２が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
式（ＩＶ）において、＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表す。ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２〜Ｒ１２のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。
【００４８】
本発明の１つの側面においては、式（Ｉ）における
2018105667.tif 000025
は、以下の式（Ｖ）で表される。
2018105667.tif 000026
【００４９】
式（Ｖ）において、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す。
また、Ｒ１５は、それぞれ独立に、水素原子、カルボキシル基又はスルホン酸基を示す。
【００５０】
式（Ｖ）において、ｎは、１〜３の整数を示す。
また、＊は、式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表す。
【００５１】
本発明の１つの側面においては、式（Ｉ）における
2018105667.tif 000027
は、以下の式（ＶＩ）で表される。
2018105667.tif 000028
【００５２】
式（ＶＩ）において、Ｒ１６〜Ｒ２２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、カルボニル基、アリル基、アリール基、ピロール基、チオフェン基、フラン基、スルホン酸基、スルホニルアミド基、カルボキシル基、メトキシ基又は結合を示す。
【００５３】
式（ＶＩ）において、Ｌは、Ｒ１６〜Ｒ２２のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。
【００５４】
本発明の化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
【００５５】
本発明のもう１つの態様は、一般式（Ｉ）で表され、上記のＨＰＬＣクロマトグラムの保持時間を有する化合物又はその塩を含む、ＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブである。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。【００５７】
［原料及び測定方法］
有機合成に用いた試薬及び溶媒は、東京化成工業、和光純薬、アルドリッチ社から供給を受け、精製せずに用いた。
水素核磁来共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）及び炭素ＮＭＲ（１３Ｃ  ＮＭＲ）スペクトルはＪＥＯＬ  ＪＭＮ−ＬＡ３００及びＪＭＮ−ＬＡ４００測定器で測定した。マススペクトルはＪＥＯＬ  ＪＭＳ−Ｔ１００ＬＣ  ＡｃｃｕＴＯＦで測定した。【００５８】
ＲＰ−ＵＰＬＣ分析はＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ／ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＰＤＡ  ｅλ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ／Ｘｅｖｏ  ＴＱＤ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＭＳ／ＭＳ  ａｎａｌｙｚｅｒで測定した。
ＬＣ／ＭＳ分析はＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ／６１３０  ｑｕａｄｒｕｐｌｅ  ＭＳ  ａｎａｌｙｚｅｒで測定した。
イメージングはＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８により画像を取得した。フローサイトメトリーは分析をＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩで行い、セル・ソーティングをＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａで行った。【００５９】
［合成実施例１及び２］
以下のスキーム１によりＰｒｏｂｅ１及びＰｒｏｂｅ２を合成した。
2018105667.tif 000029
【００６０】
（１）Ｎ−（４−ジメトキシメチルベンジル）−３−（１，３−ジメチル−４，４−ジフルオロ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−５−イル）−プロイオンアミド（化合物４）の合成
（２）  
2018105667.tif 000030
【００６１】
化合物３は，論文既知（Giulio Cas et al.  ”Site-specific traceless coupling of potent cytotoxic drugs to recombinant antibodies for pharmacodelivery” J. Am. Chem. Soc., 2012 134, pp5887-5892）の方法に基づき，４−シアノベンズアルデヒドから合成した．５０ｍＬ丸底フラスコに化合物３（１０ｍｇ、２５．６μｍｏｌ）および蒸留ＴＨＦ８ｍＬを加えた．反応液に、ＤＩＥＡ（５．４μＬ、３６．５μｍｏｌ）およびＴＨＦ１ｍＬに溶解させたＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  ＳＥを順に加え、オイルバス上で４０°Ｃに加熱し、３時間攪拌した。室温下まで冷却した後に反応液をＣＨ２Ｃｌ２  ２０ｍＬで希釈し、これをクエン酸水溶液（１０ｗ／ｖ％）１０ｍＬ、２Ｍ  ＮａＨＣＯ３水溶液１０ｍＬ、飽和食塩水１０ｍＬで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶液をろ過し、濾液を減圧下、濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物４を得た。精製物には一部、アセタールが脱保護された化合物の混入がみられたが、そのまま次の反応に用いた。【００６２】
（２）Ｎ−（４−ホルミルベンジル）−３−（１，３−ジメチル−４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−５−イル）−プロピオンアミド（Ｐｒｏｂｅ１）の合成
2018105667.tif 000031
【００６３】
上述の方法で得た化合物４（粗精製）を３０ｍＬ丸底フラスコに入れ、蒸留ＴＨＦ１．５ｍＬ、濃塩酸０．６ｍＬ、蒸留水１ｍＬの混合溶液をこれに加えた。１時間、室温下で激しく攪拌した後、反応溶液に飽和食塩水１０ｍＬ、およびＡｃＯＥｔ１０ｍＬを加えた。得られた溶液をＡｃＯＥｔ５ｍＬで２回抽出し、得られた有機層を炭酸ナトリウム水溶液１０ｍＬ、飽和食塩水１０ｍＬで洗浄を行った。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後にろ過し、濾液を減圧下、濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーにより精製し、Ｐｒｏｂｅ１を赤色固体として１０ｍｇ、収率９８％（ｉｎ  ２  ｓｔｅｐｓ）で得た。【００６４】
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2): δ 2.25 (s, 3H); 2.51 (s, 3H); 2.70 (t, J = 8.2 Hz, 2H); 3.25 (t, J = 8.2 Hz, 2H); 4.45 (d, J = 6.1 Hz, 2H); 6.15 (s, 1H); 6.25 (br, 1H); 6.28 (d, J = 3.6 Hz, 1H); 6.91 (d, J = 3.6 Hz, 1H); 7.14 (s, 1H); 7.32 (d, J = 8.1 Hz, 2H); 7.75 (d, J = 8.1 Hz, 2H); 9.94 (s, 1H).  13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ 11.5, 15.1, 25.0, 35.9, 43.4, 117.4, 120.9, 124.3, 128.3, 128.5, 130.1, 133.7, 135.6, 135.9, 144.9.146.2, 157.4, 161.0, 171.8, 192.1.  HRMS (ESI+): m/z calcd for C22H22BFN3O2, [M-F]+, 390.17891; found 390.17920 (-0.29 mmu).【００６５】
（３）Ｎ−（４−ジメトキシメチルフェニル）−３−（１，３−ジメチル−４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−５−イル）プロピオンアミド（化合物８）の合成
2018105667.tif 000032
【００６６】
化合物７は論文既知（Dalla Via et al. ”DNA-targeting pyrroloquinoline-linked butenone and chalcones: Synthesis and biological evaluation”Eur. J. Med. Chem., 2009 44, pp2854-2861）の方法により合成した。２ｍＬのガラスバイアルに、７（２ｍｇ、１４μｍｏｌ）およびＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（３ｍｇ、７μｍｏｌ）を秤量し、ＣＨ２Ｃｌ２１５０μＬを加えた。溶液にＨＡＴＵ（１５．６ｍｇ  ３９．５μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（５０μＬ）を加え、アルゴン雰囲気下で室温終夜攪拌を行った。得られた溶液は後処理を行わず、シリカゲルを担体とするカラムクロマトグラフィーにより直接精製し、化合物８を赤色固体として得た。精製物には一部、アセタールが脱保護された化合物の混入がみられたが、そのまま次の反応に用いた。【００６７】
（４）Ｎ−（４−ホルミルフェニル）−３−（１，３−ジメチル−４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−５−イル）−プロピオンアミド（Ｐｒｏｂｅ２）の合成
アセタールの脱保護は，ｐｒｏｂｅ１の合成法に則り，同様に行った。化合物８（３ｍｇ）およびＴＨＦ３００μＬ、Ｈ２Ｏ  ２００μＬ、１２０μＬを用い、Ｐｒｏｂｅ２を赤色固体として１．８ｍｇ、収率６７％（ｉｎ  ２  ｓｔｅｐｓ）で得た。【００６８】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2.27 (s, 3H);2.60 (s, 3H); 2.85 (t, J = 7.3 Hz, 2H); 3.36 (t, J = 7.3 Hz, 2H); 6.16 (s, 1H); 6.29 (d, J = 3.7 Hz, 1H); 6.86 (d, J = 3.7 Hz, 1H); 7.10 (s, 1H); 7.65 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.80 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.89 (br, 1H); 9.89 (s, 1H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): d 11.4, 15.0, 24.8, 38.0, 117.6, 119.1, 119.2, 120.8, 124.9, 128.3, 131.1, 132.1, 133.4, 143.6, 144.6, 156.0, 161.0, 170.5, 191.0.  HRMS (ESI+): m/z calcd for C21H20BFN3O2 [M-F]+, 376.16326; found, 376.16131 (-1.95 mmu). 【００６９】
［合成実施例３及び４］
以下のスキーム２によりＰｒｏｂｅ３及びＰｒｏｂｅ４を合成した。
2018105667.tif 000033
【００７０】
（１）２−（Ｎ−エチル−Ｎ−（４−ジメトキシメチルフェニル）アミノ）エチルアジド（化合物１３）の合成
2018105667.tif 000034
【００７１】
化合物１２は論文既知（Julien Massin, J. et al, ”Near-infrared solid-state emitters based on isophorone: Synthesis, crystal structure and spectroscopic properties” Chem. Mater., 2011, 23, pp862-873）の方法により合成した。５０ｍＬ丸底フラスコに化合物１２（７３０ｍｇ）を秤量し、蒸留ＭｅＯＨ４０ｍＬ、トリエチルオルトホルメート１．０９ｍＬを加えた。濃塩酸１２滴を滴下した後、４０°Ｃで３時間加熱し、その後、室温まで冷却した。反応液をＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２、ｓａｔ．  ＮａＨＣＯ３  ａｑで希釈し、混合溶液をＣＨ２Ｃｌ２２０ｍＬで抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、濾液を減圧下濃縮し、シリカゲルを担体とするカラムクロマトグラフィーで精製、化合物１２を無色液体として７５３ｍｇ、収率８５％で得た。【００７２】
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2): δ 1.67 (t, J = 6.6 Hz, 3H); 3.28 (s, 6H); 3.39-3.65 (m, 6H); 5.26 (s, 1H); 6.69 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.24 (d, J = 8.8 Hz, 2H).  13C-NMR (75 MHz, CD2Cl2): δ 12.3, 45.8, 49.4, 49.9, 52.8, 104.0, 111.9, 1226.6, 128.2, 147.8.  HRMS (ESI+): m/z calcd for C13H21N4O2, [M+H]+, 265.16645, found 265.16582 (-0.63 mmu).【００７３】
（２）２−（Ｎ−エチル−Ｎ−（４−ジメトキシメチルフェニル）アミノ）エチルアミン（化合物１４）の合成
2018105667.tif 000035
【００７４】
乾燥させた２０ｍＬの丸底フラスコに化合物１３（５００ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）を秤量し、蒸留ＴＨＦ２ｍＬを加えた。溶液を氷浴上で５分間攪拌した後に、蒸留ＴＨＦ５ｍＬに懸濁させたＬｉＡｌＨ４（１４３ｍｇ、３．７８ｍｍｏｌ）を、氷冷下、滴下してこれに加えた。滴下後、反応溶液を室温中で１２時間攪拌し、反応停止のため飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１．５ｍＬを加えた。懸濁液に、六シェル塩水溶液１０ｍＬを加え、均一な溶液となるまで攪拌した後、溶液をろ過した。濾液をＡｃＯＥｔ３０ｍＬで３回抽出した後、抽出液を飽和食塩水で洗浄、無水炭酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮を行った。濃縮残渣をＮＨシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物１４を無色液体として３４８ｍｇを収率７７％で得た。【００７５】
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2): δ 1.43 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 1.43 (br, 2H); 2.86 (t, J = 6.6 Hz, 2H); 3.28 (s, 6H); 3.29-3.45 (m, 6H); 5.25 (s, 1H); 6.78 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.22 (d, J = 8.8 Hz, 2H).  13C-NMR (75 MHz, CD2Cl2): δ12.2, 40.3, 45.7, 52.8, 54.0, 104.1, 111.7, 125.7, 128.0, 148.6.  HRMS (ESI+): m/z calcd for C13H23N2O2, [M+H]+, 239.17595; found 239.17701 (+1.06 mmu).【００７６】
（３）２−（Ｎ−エチル−Ｎ−（４−ホルミルフェニル）アミノ）エチル−３−（１，３−ジメチル−４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−５−イル）−プロピオンアミド（Ｐｒｏｂｅ３）の合成
2018105667.tif 000036
【００７７】
化合物４と同様の方法で合成を行った．化合物１４（１１ｍｇ、３９μｍｏｌ）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  ＳＥ（１５ｍｇ、３９μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ  ７．８μＬ、４６μｍｏｌ）を用いた。シリカゲルを担体とするカラムクロマトグラフィーで精製を行うと、アセタールが脱保護されたｐｒｏｂｅ  ３を赤色固体として１７ｍｇ、収率９３％で得た。【００７８】
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.15 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 2.26 (s, 3H); 2.55 (s, 3H); 2.65 (d, J = 7.3 Hz, 2H); 3.26 (t, J = 7.3 Hz, 2H); 3.40 (m, 6H); 6.09 (br, 1H); 6.14 (s, 1H); 6.28 (d, J = 3.7 Hz, 1H); 6.70 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 6.87 (d, J = 3.7 Hz, 1H); 7.09 (s, 1H); 7.67 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 9.68 (s, 1H).  13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 11.3, 12.1, 15.0, 24.8, 35.9, 37.2, 45.3, 49.1, 110.9, 117.4, 120.6, 123.8, 125.3, 128.2, 132.2, 133.3, 135.3, 144.3, 152.4, 156.8, 160.7, 172.2, 190.1.  HRMS (ESI+): m/z calcd for C25H29BFN4O2, [M-F]+, 447.23676; found 447.23230 (-4.46 mmu).【００７９】
（４）２−（Ｎ−エチル−Ｎ−（４−ホルミルフェニル）アミノ）エチル−３−メチル−４−（６−ヒドロキシキサンテン−３−オン−９−イル）−ベンズアミド（Ｐｒｏｂｅ４）の合成
2018105667.tif 000037
【００８０】
２ｍＬのガラスバイアルに２−Ｍｅ−４−ＣＯＯＨ  ＴＧ（１０ｍｇ、２９μｍｏｌ）と化合物１４（８．３ｍｇ、４７μｍｏｌ）を秤量し、ＤＭＦ２７０μＬを加えた。この溶液に、ＨＡＴＵ（１３．２ｍｇ、３５μｍｏｌ）とＤＩＥＡ  １５μＬを加え、アルゴン雰囲気下、室温、遮光下で終夜攪拌した。反応溶液に２Ｎ  ＨＣｌ  ａｑ．２７０μＬを加え１５分間室温下で攪拌した後、溶液を反応溶液を分取ＨＰＬＣ用の溶出溶媒（Ａ／Ｂ＝６／４、Ａ：０．１Ｍ  Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ；Ｂ：Ａ／ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌ＝２／８）で希釈した。その後、希釈溶液を分取ＨＰＬＣにより精製し、目的物を含むフラクションを２Ｎ  ＨＣｌ  ａｑで酸性化した後、飽和食塩水で希釈した。希釈溶液をＡｃＯＥｔ  ５０ｍＬで３回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後にろ過、濾液を減圧下濃縮し、Ｐｒｏｂｅ４を黄色固体として７．５ｍｇ、収率５０％で得た。【００８１】
1H-NMR (300 MHz, CD3OD): δ 1.24 (t, J = 8.0 Hz, 3H); 2.08 (s, 3H); 3.58-3.73 (m, 6H); 6.73 (m, 4H); 6.98 (m, 4H); 7.32 (d, J = 7.4 Hz, 1H); 7.71 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.80 (m, 2H); 9.58 (s, 1H) .  HRMS (ESI+): m/z calcd for C29H31NO8, [M+H]+, 521.20497; found 521.20133 (-3.64 mmu).【００８２】
［合成実施例５］
以下のスキーム３によりＰｒｏｂｅ５を合成した。
2018105667.tif 000038
【００８３】
（１）Ｎ−エチル−２−（２−ベンジルオキシエトキシ）−Ｎ−フェニルアセトアミド（化合物１９）の合成
2018105667.tif 000039
【００８４】
化合物１８は文献既知（Lorella Pasquinucci et al, ”Evaluation of N-substitution in 6,7-benzomorphan compounds” Bioorg. Med. Chem., 2010, 18,  pp4975-4982）の方法で合成した．乾燥した１００ｍＬ丸底二頸フラスコに，２−ベンジルオキシエタノール４ｇ、２６．２ｍｍｏｌを秤量し、蒸留ＴＨＦ２０ｍＬに溶解させた後、アルゴンで満たした風船を装着した三方コックを用いて容器内をアルゴン雰囲気に置換しゴムセプタムで密栓した。この溶液に、ＮａＨ  １．１９ｇ（６０％  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温中で３０分攪拌し、ナトリウム  ２−ベンジルオキシエトキシドの溶液を調整した。別途用意した丸底フラスコに化合物１７  ３ｍＬを秤量し、蒸留ＴＨＦに溶解させた後、上で用意したナトリウム  ２−ベンジルオキシエトキシド溶液をシリンジを用いて加え、室温下で１時間攪拌した。反応を停止させるため、氷水５０ｍＬを徐々に加え、混合液をＡｃＯＥｔ  ３０ｍＬで３回抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後減圧濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーで精製、化合物１９を無色液体として７．０４ｇ、収率９４％で得た。【００８５】
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2): δ 1.10 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 3.58 (s, 4H); 3.71 (q, J =7.3 Hz, 2H); 3.82 (s, 2H); 4.49 (s, 2H); 7.15-7.18 (m,2H); 7.27-7.41 (m, 8H).  13C-NMR (75 MHz, CD2Cl2): δ 13.1, 44.3, 69.8, 70.1, 70.9, 73.4, 127.8, 128.0, 128.5, 128.6, 128.7 .130.0, 138.9 ,141.3, 168.6.  HRMS (ESI+): m/z calcd for C19H23NNaO3, [M+Na]+, 336.15756; found 336.15517 (-2.39 mmu).【００８６】
（２）Ｎ−エチル−２−（２−ヒドロキシエトキシ）−Ｎ−フェニルアセトアミド（化合物２０）の合成
2018105667.tif 000040
【００８７】
２００ｍＬの丸底フラスコに化合物１９（３ｇ、９．５８ｍｍｏｌ）を秤量し、蒸留ＭｅＯＨ１５０ｍＬに溶解させた。１０％Ｐｄ／Ｃ  ３ｇを溶液に懸濁させ、水素雰囲気下、室温で攪拌した。ＴＬＣで反応の進行を確認し、原料消失後、反応液をろ過した。得られた濾液を減圧下濃縮し、化合物２０を淡黄色液体として２．０５ｇ、収率９６％で得た。【００８８】
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.13 (t, 3H); 3.60 (t, J =4.0 Hz, 2H); 3.69 (t, J = 4.0 Hz, 2H); 3.72-3.80 (m, 3H); 3.84 (s, 2H); 7.15 (d, J = 6.6 Hz, 2H); 7.43 (m, 3H). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ 12.5, 44.0, 61.2, 68.9, 73.7, 127.8, 128.2, 129.6, 139.9, 169.4.  HRMS (ESI+): m/z calcd for C12H17NNaO3, [M+Na]+, 246.11061; found 246.11242 (+1.80 mmu).【００８９】
（３）２−（２−（Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ）エトキシ）エタノール（化合物２１）の合成
2018105667.tif 000041
【００９０】
乾燥させた１００ｍＬ丸底フラスコに化合物２０（２．０４ｇ、９．１６ｍｍｏｌ）を秤量し、蒸留ＴＨＦ１００ｍＬに溶解させた。フラスコ内をアルゴン雰囲気に置換した後、溶液にＢＨ３  ＴＨＦ溶液（０．９ｍｍｏｌ／ｍＬ）５１ｍＬを室温下、滴下し加えた。反応の進行をＴＬＣでモニターし、室温中で攪拌、原料の消失後、蒸留水の添加により反応を停止させ、減圧下、反応液を濃縮した。濃縮した溶液をＡｃＯＥｔ５０ｍＬで３回抽出し、抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、これをろ過した。得られた濾液を減圧下濃縮し、化合物２１を無色液体として１．８４ｇ、収率９６％
で得た。【００９１】
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ1.15 (t, J =6.6 Hz, 3H); 3.42 (q, J = 6.6 Hz, 2H); 3.50 (t, J =5.8 Hz, 2H); 3.56 (t, J = 5.2 Hz, 2H); 3.64 (t, J = 5.8 Hz, 2H); 3.71 (t, J = 5.1 Hz, 2H); 6.69 (m, 3H); 7.21 (m, 2H).  13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ 12.1, 45.4, 50.0, 61.8. 68.9. 72.3, 112.0 116.0, 129.3, 147.8.  HRMS (ESI+): m/z calcd for C12H20NO2, [M+H]+, 210.14940; found 210.15041 (+1.01 mmu).【００９２】
（４）２−（２−（Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ）エトキシ）エチル  ｐ−トルエン  スルホネート（化合物２２）の合成
2018105667.tif 000042
【００９３】
乾燥させた５０ｍＬ丸底フラスコに化合物２１（１．８４ｇ、８．８ｍｍｏｌ）とＴｓＣｌ（２．５２ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）を秤量した。このフラスコを氷浴上に設置し、蒸留ＣＨ２Ｃｌ２３０ｍＬを加えた。この反応溶液に対し、氷冷下、ピリジン（１．０６ｍＬ、１３．２ｍｍｏｌ）を滴下した後、反応溶液を室温中で終夜攪拌した。得られた反応溶液に蒸留水３０ｍＬを加えた後、混合液をＣＨ２Ｃｌ２３０ｍＬで２回抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した。得られた濾液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物２２を，６．１５ｇ、収率７０％で得た。得られた化合物２２は不安定であり、すぐに次の反応へと用いた。【００９４】
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ1.11 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 2.43 (s, 3H); 3.35 (q, J = 7.3 Hz, 2H); 3.42 (t, J = 5.9 Hz, 2H); 3.56 (t, J = 5.8 Hz, 2H); 4.15 (t, J = 4.3 Hz, 2H); 6.65 (m, 3H); 7.19 (m, 2H); 7.33 (d, J = 8.1 Hz, 2H); 7.79 (d, J = 8.1 Hz, 2H). HRMS (ESI+): m/z calcd for C19H26NO4S, [M+H]+, 364.15825; found 364.15403 (-4.23 mmu).【００９５】
（５）２−（２−（Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ）エトキシ）エチル  アジド（化合物２３）の合成
2018105667.tif 000043
【００９６】
５０ｍＬ丸底フラスコに化合物２２（２．２１ｇ、６．０９ｍｍｏｌ）およびＮａＮ３（４７４ｍｇ、７．３ｍｍｏｌ）を加え、ＤＭＦ１０ｍＬを加えた。反応溶液を９０°Ｃに加熱し、終夜攪拌した。得られた反応液を、蒸留水５０ｍＬで希釈し、これをＡｃＯＥｔ３０ｍＬで３回抽出した。抽出液を、蒸留水２０ｍＬで２回、飽和食塩水で１回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した。得られた濾液を減圧下濃縮し、濃縮残渣をＮＨシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーで精製、化合物２３を得た。【００９７】
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ1.16 (t, J = 7.5 Hz, 3H); 3.36 (t, J = 5.1 Hz, 2H); 3.42 (q, J = 7.5 Hz, 2H); 3.51 (t, J = 5.9 Hz, 2H); 3.64 (m, 4H); 6.63-6.70 (m, 3H); 7.18-7.24 (m, 2H).  13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ 12.1, 45.4, 50.0, 50.8, 69.1, 70.1, 111.8, 115.8.128.9, 129.3, 147.7.  HRMS (ESI+): m/z calcd for C12H10N4O, [M+H]+, 235.15589; found 235.15256 (-3.32 mmu) .【００９８】
（６）２−（２−（Ｎ−エチル−Ｎ−（４−ホルミルフェニル）アミノ）エトキシ）エチル  アジド（化合物２４）の合成
2018105667.tif 000044
【００９９】
乾燥させた５０ｍＬ丸底フラスコに、化合物２３（１．２１ｇ、５．１８ｍｍｏｌ）を秤量し、蒸留ＤＭＦ５ｍＬに溶解させた。フラスコを氷浴上で５分間攪拌し、続いてＰＯＣｌ３（９６６ｍＬ、１０．３７ｍｍｏｌ）を滴下した。その後、反応液を終夜４０°Ｃに加熱し、攪拌した。その後、フラスコを氷浴上で冷却し、ＮａＨＣＯ３溶液５０ｍＬを加えた。得られた溶液のＡｃＯＥｔ３０ｍＬで３回抽出した後、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物２４を薄緑色の液体として１．０３ｇ、収率７６％で得た。【０１００】
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ1.21 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 3.37 (t, J = 4.4 Hz, 2H); 3.55 (q, J = 7.3 Hz, 2H); 3.60-3.70 (m, 6H); 6.72 (d, J = 9.5 Hz, 2H); 7.71 (d, J = 8.9 Hz, 2H); 9.73 (s, 1H).  13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ 12.0, 45.8, 50.1, 50.7, 68.8, 70.2, 110.8, 125.1, 132.2, 152.3, 190.0.  HRMS (ESI+): m/z calcd for C13H18N4NaO2, [M+Na]+, 285.13274; found 285.13462 (-1.87 mmu).【０１０１】
（７）２−（２−（Ｎ−エチル−Ｎ−（４−ジメトキシメチルフェニル）アミノ）エトキシ）エチル  アジド（化合物２５）の合成
2018105667.tif 000045
【０１０２】
化合物２４のアセタール保護は、化合物１３の合成に示した手法を用いて行った。化合物２４（１．１６ｇ、６．３３ｍｍｏｌ）、トリメチルオルトホルメート（２．０８ｍＬ、１９．０ｍｍｏｌ）、ｃ．ＨＣｌ（１０滴）を用い、化合物２５を淡褐色液体として収率１００％で得た。【０１０３】
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ1.15 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 3.31 (s, 6H); 3.33-3.65 (m, 10H); 5.28 (s, 1H); 6.65 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.20 (d, J = 8.8 Hz, 2H).  13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ 12.0, 45.4, 49.7, 50.0, 50.7 .52.6, 52.8, 53.8, 68.9, 70.0, 103.6, 110.8, 111.1, 125.1, 127.6, 147.7.  HRMS (ESI+): m/z calcd for C15H24N4NaO3, [M+Na]+, 331.17461; found 331.17097 (-3.64 mmu).【０１０４】
（８）２−（２−（Ｎ−エチル−Ｎ−（４−ジメトキシメチルフェニル）アミノ）エトキシ）エチルアミン（化合物２６）の合成
2018105667.tif 000046
【０１０５】
化合物２５のアジド基の還元は，上に示した化合物１４の合成法に則り、合成した。化合物２５（８２３ｍｇ、２．６７ｍｍｏｌ）、ＬｉＡｌＨ４（２０３ｍｇ、５．３４ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ１０ｍＬを用い、化合物２６を無色液体として６２９ｍｇ、収率８３％で得た。【０１０６】
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2): δ1.14 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 1.41 (br, 2H); 2.77 (t, J = 5.9 Hz, 2H); 3.26 (s, 6H); 3.40-3.50 (m, 6H); 3.59 (t, J = 6.6 Hz, 2H); 5.23 (s, 1H); 6.66 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.20 (d, J = 8.8 Hz, 2H).  13C-NMR (75 MHz, CD2Cl2): δ 12.3, 42.3, 45.7, 50.5, 52.8, 69.0, 74.1, 104.1, 111.4, 125.7, 128.0, 148.4.  HRMS (ESI+): m/z calcd for C14H23N2O2, [M-OCH3]+, 251.1795; found 251.17451 (-1.45 mmu).【０１０７】
（９）２−（２−（Ｎ−エチル−Ｎ−（４−ホルミルフェニル）アミノ）エトキシ）エチル−３−メチル−４−（６−ヒドロキシキサンテン−３−オン−９−イル）−ベンズアミド（Ｐｒｏｂｅ５）の合成
2018105667.tif 000047
【０１０８】
化合物２６は、上に示したｐｒｏｂｅ  ４の合成法に則り、合成した。化合物２９（２１．４ｍｇ、７５μｍｏｌ）、２−Ｍｅ４−ＣＯＯＨ  ＴＧ（２０ｍｇ、５８μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２６ｍｇ、６９μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２２ｍＬ、１７３μｍｏｌ）を用い、Ｐｒｏｂｅ５を橙色固体として１５ｍｇ、収率４９％で得た。【０１０９】
1H-NMR (300 MHz, CD3OD): δ 1.19 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 2.11 (s, 3H); 3.56-3.73 (m, 11H); 6.70-6.73 (m, 4H); 6.83 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.32 (d, J = 8.0 Hz, 1H); 7.65 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.79 (d, 6.6 Hz, 1H); 7.87 (br, 1H); 9.53 (s, 1H). HRMS (ESI+): m/z calcd for C34H33N2O6, [M+H]+, 565.2386 ; found 565.23793.【０１１０】
［参考例１〜３］
上記で合成したＰｒｏｂｅ１〜３についてＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＡＬＤＨ３Ａ１に対する反応性を調べた。
2018105667.tif 000048
【０１１１】
ヒトｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＬＤＨ１Ａ１／１Ａ３／３Ａ１を購入し、Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）にＫＣＬ  １００ｍＭ、ＤＴＴ  ２ｍＭ、ＮＡＤ（Ｐ）１ｍＭおよび各ＡＬＤＨ１０〜１００ｎＭ、各化合物１０〜８０μＭを混和し３７℃、３０分反応させ等量のアセトニトリルを加え反応を停止させた。反応液はＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ）で解析した。ＵＰＣＬクロマトグラムは５％アセトニトリル  ０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水から９５％アセトニトリル  ０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水のリニアグラジエントを流速＝８００μＬ／分で５分かけて行った。アルデヒド型およびカルボン酸型プローブは５０４ｎｍの波長における吸光で検出し、それぞれのピークにおけるＭＳスペクトルのｍ／ｚが予想されるｍ／ｚと合致していることを確認した。
また、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲに関してはＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ３に反応することは既知であるため、ＡＬＤＨ３Ａ１に関してのみ行った。結果を表２に示す。
ベンズアルデヒドを反応部とする化合物１は実験を行った３つのアイソフォームすべてに反応したが、化合物２はＡＬＤＨ１Ａ１としか反応性を示さなかった。一方、ＤＥＡＢを反応部とした化合物３はＡＬＤＨ１Ａ１とＡＬＤＨ３Ａ１に反応し、３つのプローブのなかでは最もＡＤＬＨ３Ａ１に特異的といえる結果であった。また、予想された通り、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲはＡＬＤＨ３Ａ１には反応性を示さなかった。【０１１２】
表２  Ｐｒｏｂｅ１〜３の各ＡＬＤＨアイソフォームに対する反応性
2018105667.tif 000049
【０１１３】
ＡＬＤＨ３Ａ１に反応性を示したＰｒｏｂｅ１とＰｒｏｂｅ３を用いて細胞イメージングを行った。細胞はＡＬＤＨ３Ａ１高発現細胞である食道扁平上皮癌細胞株（ＯＥ２１  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を用いた。様々なＰｒｏｂｅ濃度および反応時間でイメージングを試みたがＡＬＤＨ３Ａ１特異的インヒビター（ＣＢ７）を用いた陰性コントロールに対し明らかな輝度の差は認めなかった。また、Ｐｒｏｂｅ２はＡＬＤＨ１高活性細胞を検出可能なＡＬＤＥＦＬＵＯＲと同様の使用が可能であると考えられたためＡＬＤＥＦＬＵＯＲでＡＬＤＨ１Ａ１高活性細胞が検出可能であると文献的に報告があるＡ５４９細胞を用いてイメージングを行ったが、陰性コントロールに対し明らかな輝度の差は認めなかった。【０１１４】
［実施例１及び参考例４］
次に、上記で合成したＰｒｏｂｅ４及び５についてＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＡＬＤＨ３Ａ１に対する反応性を調べた。
2018105667.tif 000050
【０１１５】
Ｐｒｏｂｅ１〜３について意図した結果が得られなかった原因として過剰な膜透過性が原因であると考えた。ＢＯＤＩＰＹは疎水性プローブであるが、Ｐｒｏｂｅ１〜３はＡＬＤＥＦＬＵＯＲの反応部に含まれる短鎖脂肪族アルデヒドと違い疎水性の強い芳香族アルデヒドである。つまり、疎水性同士の組み合わせがプローブ全体としての水溶性を疎水性側にシフトさせており、カルボン酸型となっても膜非透過となるほどには親水性にはならないと考えた。そこで、Ｐｒｏｂｅ４及び５では、プローブをより親水性にするために、ＢＯＤＩＰＹよりも親水性である蛍光団を使用することとし、蛍光団としてＴｏｋｙｏ  Ｇｒｅｅｎ（ＴＧ）を使用した。反応部はＡＬＤＨ３Ａ１に対する特異性が比較的高かったＤＥＡＢを用いることとした。また、Ｐｒｏｂｅ１、２の結果より、結合部もＡＬＤＨに対する反応性に影響を及ぼしていたことから、Ｐｒｏｂｅ４及び５では結合部の長さが違う２種類のリンカーを用いた。【０１１６】
ＡＬＤＨに対する反応性を確認したところ、Ｐｒｏｂｅ４は全く反応性を示さなくなったが、Ｐｒｏｂｅ５はＰｒｏｂｅ３と同様にＡＬＤＨ１Ａ１とＡＬＤＨ３Ａ１に反応性を示した。以上作成した５つのプローブとＡＬＤＥＦＬＵＯＲの膜透過性を比較するためにＬＣ／ＭＳによる中性条件下での水溶性を検証した。それぞれのプローブを適切なアイソフォーム・濃度のＡＬＤＨを用いてカルボン酸型とアルデヒド型がともに存在する程度にまで反応を進行させた後に反応を停止させＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００／６１３０  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＬＣ／ＭＳシステム）にて解析した。カラムはＣ１８カラム（ＨＰ  ３μｍ、内径：２．１ｍｍ、長さ：１５０ｍｍ、ジーエル  サイエンス）を用いた。ＨＰＣＬクロマトグラムは溶媒Ａを０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水、溶媒Ｂを８０％アセトニトリル  ０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水とし、２０％Ｂ  ２．５分に続いて２０％から１００％  Ｂ、５分間のリニアグラジエント（流速５００μｌ／ｍｉｎ）の条件で行った。ＢＯＤＩＰＹを含むプローブを５０４ｎｍ、ＴＧを含むプローブを４９５ｎｍの波長における吸光で検出し、それぞれのピークにおけるＭＳスペクトルのｍ／ｚが予想されるｍ／ｚと合致していることを確認した。３回の独立した実験を行い平均±Ｓ．Ｄ．を算出した。得られたデータを表３及び図２に示す。化合物１、２、３のアルデヒド型プローブは８分以降に検出されたが、アルデヒド型のＰｒｏｂｅ４、５およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲは７分台前半で検出された。一方でカルボン酸型のＰｒｏｂｅ１、２、３のなかで最も検出時間が早かったＰｒｏｂｅ１は７．０９８分であったが、カルボン酸型のＡＬＤＥＦＬＵＯＲは６．７４１分でカルボン酸型のＰｒｏｂｅ５はさらにそれより早い時間に検出された。Ｐｒｏｂｅ１のイメージングが成功していないことから、この６．７４１分から７．０９８分の間（図２の帯）に膜透過性が急激に変化する閾値が存在すると考えられた。【０１１７】
表２  Ｐｒｏｂｅ４及び５の各ＡＬＤＨに対する反応
2018105667.tif 000051
【０１１８】
表３  各プローブにおけるアルデヒド型およびカルボン酸型の保持時間
2018105667.tif 000052
【０１１９】
（プローブの速度論的特性）
各プローブにおいて反応性を示した各ＡＬＤＨアイソフォームについてＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式におけるＫｍ，  Ｋｃａｔを求めた。反応はＴｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  （１００ｍＭ、ｐＨ７．５）にＫＣＬ  １００ｍＭ、ＤＴＴ  ２ｍＭ、ＮＡＤ（Ｐ）１ｍＭおよび各ＡＬＤＨ１０〜１００ｎＭ、各プローブ０．１〜８０μＭの範囲で５〜６点での濃度を選択、混和し３７℃、５分反応させ等量のアセトニトリルを加え反応を停止させた。アルデヒド型／カルボン酸型プローブの検出はＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて前述と同様の方法で行った。得られた各プローブ濃度における反応速度をＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式にフィッティングさせることでＫｍ，  Ｋｃａｔを算出した。フィッティングにはＫａｌｅｉｄａ  Ｇｒａｐｈ  ｖｅｒ．４．１（ＨＵＬＩＮＫＳ  ｉｎｃ．）を用いた。得られたデータを表４に示す。
Ｋｍが比較的小さいことから実際のプローブ使用濃度ではプローブの反応速度はＶｍａｘに近いと考えられたため、ＡＬＤＨ１Ａ１／ＡＬＤＨ３Ａ１の特異性の指標としてＰｒｏｂｅ１、Ｐｒｏｂｅ３、Ｐｒｏｂｅ５に関してＫｃａｔ比（ＡＬＤＨ３Ａ１のＫｃａｔ／ＡＬＤＨ１Ａ１のＫｃａｔ）を算出した（表５）。Ｐｒｏｂｅ５はＡＬＤＨの濃度が同一条件下、反応速度がＶｍａｘに近いプローブ濃度下ではＡＬＤＨ１Ａ１に比べＡＬＤＨ３Ａ１の方が約６倍反応性が高いことになり、よりＡＬＤＨ３Ａ１に対し特異性の高いプローブとなった。【０１２０】
表４  各プローブの速度論的な特徴
2018105667.tif 000053
【０１２１】
表５  Probe 1,3,5のKcat比(ALDH3A1のKcat/ALDH1A1のKcat)
2018105667.tif 000054
【０１２２】
［実施例２］
（Ｐｒｏｂｅ５を用いた細胞イメージング）
Ｐｒｏｂｅ５、及び、ＡＬＤＨ３Ａ１高発現細胞である食道扁平上皮癌細胞株（ＯＥ２１  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を用いてイメージングを行った。培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄフリー）に４０μＭのＰｒｏｂｅ５を加え３７℃、９０分培養した後、氷冷した培地で細胞を洗浄し、共焦点顕微鏡下で観察した。特異的ＡＬＤＨ３Ａ１インヒビター（１−［（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌ］−２−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−  ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ＣＢ７１０μＭ）を添加したサンプルを陰性コントロールとした。４８８ｎｍのレーザーで励起し、検出は５００〜５７０ｎｍの波長で観察を行った。図３に示すように陰性コントロールに対し、高輝度な細胞を観察できた。【０１２３】
［実施例３］
（Ｐｒｏｂｅ５を用いたフローサイトメトリー）
Ｐｒｏｂｅ５、および、ＯＥ２１細胞を用いフローサイトメトリーを行った。細胞をトリプシン処理し、セルストレイナー（４０μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に通した後に細胞密度を計測した。４０μＭのＰｒｏｂｅ５を含む培地に２．５〜５×１０５／ｍｌとなるように５００μｌの細胞懸濁液を作成し、３７℃、９０分培養した。反応後に１５００ｒｐｍ、３分間遠心し上清を除去した後、氷冷した培地で細胞を洗浄、遠心し、培地を除去した。１００μｌの培地に再度細胞を懸濁し死細胞除去目的でＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｒｅｄ  ｄｅａｄ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を４μｌ添加し、氷上で５分間静置後、培地を１５０μｌ加えた。陰性コントロールにはＣＢ７（１０μＭ）を加えたサンプルを用いた。解析はＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて行った。Ｂｌｕｅ  ｌａｙｓｅｒ（４８８ｎｍ）で励起し、ＦＩＴＣチャンネル（５１５〜５４５ｎｍ）で各細胞におけるＰｒｏｂｅ５の輝度を検出した。各サンプルはダブレットの除去、死細胞の除去を行った上で３０，０００個程度の細胞を解析した。陽性ゲートはＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイにならい、陰性コントロールにおける輝度の上限付近からそれ以上の領域に設定し、陰性コントロールサンプルでゲート内に存在する細胞が高くとも３％を下回るようにした。独立した実験を３回行った。図４に示すように陽性率１０〜１５％を示した。【０１２４】
［実施例４］
（ＡＬＤＨ３Ａ１ノックダウンによるフローサイトメトリー）
ＯＥ２１細胞と化合物５を用いたフローサイトメトリーにおける陽性群がＡＬＤＨ３Ａ１の活性によることを確認する目的でｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いたＡＬＤＨ３Ａ１のノックダウンを行い、フローサイトメトリーを行った。ｓｉＲＮＡはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社より有効性が確認されているものを２つ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ、ｓ１２４３およびｓ１２４４）、および、陰性コントロール（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ＃１）を購入した。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ＲｅａｇｅｎｔとしてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(登録商標）  ＲＮＡｉＭＡＸ、希釈液としてＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）をＴｈｏｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒより購入した。手順書に従い、ｓｉＲＮＡを１０ｎＭ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを３％となるように手順書にしたがってｓｉＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘを３００μｌ作成し、そのうち２５０μｌとＯＥ２１細胞懸濁液２．５ｍｌを混合し、６  ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈに播種した。ノックダウンの効果は６日後にウエスタン・ブロッティングにより確認した（Ｆｉｇｕｒｅ  ６ａ）。この条件下でＰｒｏｂｅ  ５を用いて前述の条件と同様の条件でフローサイトメトリーを行ったところ、ＡＬＤＨ３Ａ１ノックダウン群で陽性率が著明に低下し、Ｐｒｏｂｅ  ５陽性細胞がＡＬＤＨ３Ａ１の活性によることが示された（図５）。【０１２５】
［実施例５］
（ソート・アウトによるＡＬＤＨ３Ａ１発現量の確認）
ＡＬＤＨの活性は発現量により調節されている。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイでは少なくともＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＡＬＤＨ２の活性を区別なく検出してしまうためソート・アウトした際には目的のＡＬＤＨアイソフォームに対する抗体を用いてウエスタン・ブロッティングを行うのが通例である。これに倣いＰｒｏｂｅ５とＯＥ２１細胞を用いて高輝度群と低輝度群をソート・アウトしウエスタン・ブロッティングを行った。セル・ソーターはＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。通常のフローサイトメトリーと同様にアッセイし、陽性ゲート（Ｔｏｐ）、および、低輝
度側下位１０〜１５％にゲート（Ｂｏｔｔｏｍ）を設置し、細胞をソート・アウトした。
得られた細胞からライセートを作成し、ウエスタン・ブロッティングを行った。各バンドは発光法によりＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ４０００ｍｉｎｉ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出・定量した。ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢでＡＬＤＨ３Ａ１の発現量を標準化し、ＴｏｐとＢｏｔｔｏｍでのＡＬＤＨ３Ａ１の発現量を比較した。図６に示すように予想に反しそれほどの発現量の差は認めなかった。【０１２６】
［実施例６］
（Ｐｒｏｂｅの細胞外能動排出とその制御による最適化）
細胞は細胞内の物質に対する能動排出機構を有しており、同じｃｅｌｌ  ｌｉｎｅであっても能動排出機能は細胞により異なることが知られている。能動排出を考慮し、イメージングおよびフローサイトメトリーでは氷冷した培地を用いていたが、能動排出を評価するため３７℃の条件下で同一視野の経時的観察を行った（図７ａ）。
その結果、観察開始から１０分程度経過した時点で著名な蛍光輝度の低下がみられた。
ＴＧはフルオレセインの誘導体であるが、フルオレセインはトランスポーターであるｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＲＰ）の働きにより細胞外に排出されることが知られている。ＭＲＰの阻害剤はこの能動排出を抑制するとの報告があることから幾つかのＭＲＰ阻害剤を用いて、化合物５の輝度低下が抑制されるか実験を試みた。ＭＫ−５７１はＭＲＰの複数のアイソフォームを阻害する薬剤である。ＭＫ−５７１を２００μＭの濃度で用いたところＰｒｏｂｅ５の能動排出が著明に抑制された（図７ｂ）。そこで、ＭＫ−５７１（２００μＭ）を添加した状態でフローサイトメトリーを行ったところ（図７ｃ）、陽性率が９０％程度と著明な改善が得られた。【０１２７】
［実施例７］
（ＭＫ−５７１を併用したＡＬＤＨ３Ａ１ノックダウン細胞によるフローサイトメトリー）
ＭＫ−５７１を併用したフローサイトメトリーでは陽性率が著名に改善したが、この陽性細胞がＡＬＤＨ３Ａ１の活性によるものであることを確認するためｓｉＲＮＡを用いてＯＥ２１細胞のＡＬＤＨ３Ａ１をノックダウンしフローサイトメトリーを行った（図８）。ＭＫ−５７１  ２００μＭ、Ｐｒｏｂｅ５  ５０μＭ、陰性コントロールのＣＢ７を２０μＭとしアッセイを行ったところ、陰性コントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞では陽性率が９０％程度であったものが、ノックダウンにより１０％台と著名に低下したことからＭＫ−５７１を用いて陽性率が著名に改善したアッセイにおける陽性細胞がＡＬＤＨ３Ａ１の活性に由来することが確認された。【０１２８】
［実施例８］
（陽性細胞陰性細胞の分離とソートアウト）
陽性細胞と陰性細胞を分離・ソート・アウト可能であることを示すためｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）により恒常的にＡＬＤＨ３Ａ１がノックダウンされた細胞を作成した。ＡＬＤＨ３Ａに対するｓｈＲＮＡおよび陰性コントロールとしてＮｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｈＲＮＡをレンチウイルスを用いてＯＥ２１細胞に導入した。ＡＬＤＨ３Ａ１がノックダウンされていない陰性コントロール細胞（ｃｔｒｌ）とＡＬＤＨ３Ａ１が恒常的にノックダウンされた細胞（ＫＤ）を用いてライセートを作成しウエスタン・ブロッティングを行い、ＡＬＤＨ３Ａ１が著名にノックダウンされていることを確認した（図９ａ）。この細胞を用いてＭＫ−５７１、Ｐｒｏｂｅ５を用いたフローサイトメトリーを前述と同様のプロトコールで行った（図９ｂ）ところ、ノックダウン細胞（ＫＤ）ではＣＢ７を用いた時とほぼ同程度の陽性率となり、さらに、ノックダウン細胞（ＫＤ）と非ノックダウン細胞（ｃｔｒｌ）を１：１で混和したサンプルの解析ではＰｒｏｂｅ５の陽性・陰性率は約１：１となった。なお、同時に行ったＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｒｅｄ  ｄｅａｄ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎによるアッセイでは死細胞はほとんど認めず、プローブなどの影響による細胞死はほとんど起きていないことを確認した。この陽性と陰性がよく分離されたサンプルを用いて蛍光輝度の上位２５％（Ｔｏｐ）と下位２５％（Ｂｏｔｔｏｍ）をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩを用いてソート・アウトした。それぞれのライセートを作成し、それらを用いてウエスタン・ブロッティングを行いＡＬＤＨ３Ａ１の発現量を比較検討した（図９ｃ）。するとフローサイトメトリーの結果と一致してＰｒｏｂｅ  ５陽性群でＡＬＤＨ３Ａ１の著名な発現を認め、陰性群ではＡＬＤＨ３Ａ１はほとんど認めなかった。【０１２９】
以上より、化合物５はＭＲＰ阻害剤と併用することによってＡＬＤＨ３Ａ１高活性細胞を検出可能であることが示された。また、セル・ソーターを用いることで、ＡＬＤＨ３Ａ１高活性細胞／低活性細胞をそれぞれ分取可能で、連続して生物学的実験に使用可能である。
【図１】
2018105667.tif 000068
【図２】
2018105667.tif 000069
【図３】
2018105667.tif 000070
【図４】
2018105667.tif 000071
【図５ａ】
2018105667.tif 000072
【図５ｂ】
2018105667.tif 000073
【図６】
2018105667.tif 000074
【図７ａ】
2018105667.tif 000075
【図７ｂ】
2018105667.tif 000076
【図７ｃ】
2018105667.tif 000077
【図８】
2018105667.tif 000078
【図９ａ】
2018105667.tif 000079
【図９ｂ】
2018105667.tif 000080
【図９ｃ】
2018105667.tif 000081
【国際調査報告】
2018105667.tif 000082
2018105667.tif 000083
2018105667.tif 000084
2018105667.tif 000085
2018105667.tif 000086
2018105667.tif 000087