(57)【要約】  合成高分子と、粒子の全質量基準で1０質量％以上の凝集性発光材料と、を含み、アナライトと結合する結合パートナーを表面に有する診断薬用蛍光粒子。毒性がなく、視認性と再現性が向上された、アナライトに対する結合パートナーを担持した診断薬用蛍光粒子が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成高分子と、
粒子の全質量基準で1０質量％以上の凝集性発光材料と、を含み、
アナライトと結合する結合パートナーを表面に有することを特徴とする診断薬用蛍光粒子。
【請求項２】
前記粒子のＣＶ値が２０％以下であり、平均粒子径が０．０５〜３．０μｍであることを特徴とする請求項１記載の診断用蛍光粒子。
【請求項３】
前記合成高分子がスチレン及びスチレン−（メタ）アクリル酸共重合体からなる群から選択される少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の診断用蛍光粒子。
【請求項４】
前記凝集性発光材料の数平均分子量は、１００００以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の診断用蛍光粒子。
【請求項５】
前記凝集性発光材料が、４つ以上のフェニル基もしくはフェニル基誘導体により置換された、エチレン誘導体もしくはベンゼン誘導体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の診断用蛍光粒子。
【請求項６】
前記凝集性発光材料が、テトラフェニルエチレン、１−（４−ブロモフェニル）−１，２，２−トリフェニルエチレン、テトラキス（４−ヒドロキシフェニル）エチレンからなる群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の診断用蛍光粒子。
【請求項７】
前記凝集性発光材料が、ヘキサフェニルシロール及び／又はヘキサフェニルベンゼンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の診断用蛍光粒子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の診断薬用蛍光粒子を用いることを特徴とする免疫測定試薬。
【請求項９】
合成高分子を含む種粒子を分散させた種粒子分散液を調製する工程と、
凝集性発光材料と有機溶剤を含む乳化液を調製する工程と、
前記種粒子分散液に前記乳化液を加え、前記種粒子に前記凝集性発光材料と前記有機溶剤を吸収させて膨潤粒子液滴分散液を得る工程と、
前記膨潤粒子液滴中の前記有機溶剤を液中乾燥させて凝集発光性材料含有粒子を得る工程と、を有することを特長とする凝集発光性材料含有粒子の製造方法。
【請求項１０】
前記凝集性発光材料質と有機溶剤の量が前記種粒子質量の０．１〜６４倍となるように、前記種粒子分散液に前記乳化液を加えることを特長とする請求項９に記載の凝集発光性材料含有粒子の製造方法。
【請求項１１】
アナライトを含む可能性がある試料溶液と、前記アナライトとの結合パートナーを有する凝集蛍光材料含有粒子を含む溶液を混合して混合液を調製する工程と、
前記アナライトとの結合パートナーが固定化された検出部を少なくとも１つ有する不溶性担体に、前記混合液を展開させる工程と、
前記検出部において前記凝集蛍光材料含有粒子から発生する蛍光強度を測定する工程と、
アナライト濃度に対する蛍光強度の検量線と前記蛍光強度を対比して、前記蛍光強度と前記混合液中のアナライト濃度を関連付ける工程と、を備えることを特徴とするアナライト測定法。
【請求項１２】
イムノクロマトグラフィー用のテストストリップであって、
（ａ）アナライトを含む可能性がある試料溶液の供給部と、
（ｂ）前記アナライトとの結合パートナーを表面に有する凝集蛍光材料含有粒子を含むコンジュゲートパッドと、
（ｃ）前記アナライトとの結合パートナーが固定化された検出部を少なくとも１つ有する不溶性メンブレン担体と、を備え、
前記凝集蛍光材料含有粒子は、
（イ）合成高分子と、
（ロ）粒子の全質量基準で1０質量％以上の凝集性発光材料と、を含むことを特徴とするイムノクロマトグラフィー用のテストストリップ。
【請求項１３】
凝集蛍光材料含有粒子のＣＶ値が２０％以下であり、平均粒子径が０．０５〜３．０μｍであることを特徴とする請求項１２に記載のテストストリップ。
【請求項１４】
凝集蛍光材料粒子に含まれる合成高分子が、スチレンモノマー及び（メタ）アクリル酸からなる群から選択される少なくとも一種を含む共重合体であることを特徴とする請求項１２又は１３に記載のテストストリップ。
【請求項１５】
凝集蛍光材料粒子に含まれる凝集性発光材料の数平均分子量は、１００００以下であることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のテストストリップ。
【請求項１６】
凝集蛍光材料粒子に含まれる凝集性発光材料が、４つ以上のフェニル基もしくはフェニル基誘導体により置換された、エチレン誘導体もしくはベンゼン誘導体であることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のテストストリップ。
【請求項１７】
凝集蛍光材料粒子に含まれる凝集性発光材料が、テトラフェニルエチレン、１−（４−ブロモフェニル）−１，２，２−トリフェニルエチレン、テトラキス（４−ヒドロキシフェニル）エチレンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のテストストリップ。
【請求項１８】
凝集蛍光材料粒子に含まれる凝集性発光材料が、ヘキサフェニルシロール又はヘキサフェニルベンゼンであることを特徴とする請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のテストストリップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断薬用蛍光粒子及びそれを用いた免疫測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査薬（以下、診断薬ということがある）においては、アナライトに対する結合パートナー（例えば、抗体など）を担持した担体微粒子を利用するイムノクロマト法による測定試薬が多数実用化されている。そして、アナライトの検出感度向上のために、光を照射することにより発光する蛍光粒子を担体微粒子として用いることが提案されている（例えば、特許文献１参照）。
特許文献１には、イムノクロマトグラフィーに用いる蛍光粒子として、有機系蛍光物質を含有するシリカ粒子が開示されている。このシリカ粒子は粒子表面が親水性であることより、疎水性相互作用に起因する非特異的反応を抑制できる一方、アナライトに対する結合パートナーを担持させる際、物理的吸着法を使用しにくく、化学的結合法を使用する必要があった。
特許文献２には、無機系蛍光微粒子を本態とするコア／シェル型微粒子蛍光体が開示されている。この無機系蛍光微粒子は、抗原−抗体反応等のバイオテクノロジー分野に適する微粒子性と、蛍光観察に適した励起波長とを備えるが、無機系微粒子であるがゆえに毒性を有するという問題があった。また分散性にも問題があった。
また、バイオテクノロジー分野への適用を意図した微粒子ではないものの、特許文献３には有機系蛍光微粒子を本態とする蛍光発光微粒子とその製造方法が開示されている。この有機系蛍光微粒子によれば、上述の毒性の問題は解消されるが、診断薬の材料として用いた場合、発光強度等に課題が残されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１５−０２２９１４号公報
【特許文献２】国際公開第２００７−１０２４５８号公報
【特許文献３】特開２００３−３１３５４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
以上より、診断薬の材料として用いた場合に、アナライトに対する結合パートナーの担持が容易であり、毒性がなく、アナライトの検出感度（特に視認性）と検出再現性を備えた微粒子が求められていた。
本発明は、診断薬の材料として用いた場合に、アナライトに対する結合パートナーの担持が容易であり、毒性がなく、検出感度（特に視認性）と検出再現性が向上された、アナライトに対する結合パートナーを担持した診断薬用蛍光粒子、及び当該蛍光粒子を用いた測定試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下に記載されるものを含む。
（１）合成高分子と、粒子の全質量基準で1０質量％以上の凝集性発光材料と、を含み、
アナライトと結合する結合パートナーを表面に有することを特徴とする診断薬用蛍光粒子。
（２）粒子のＣＶ値が２０％以下であり、平均粒子径が０．０５〜３．０μｍである（１）記載の診断用蛍光粒子。
（３）合成高分子がスチレンモノマー及び（メタ）アクリル酸からなる群から選択される少なくとも一種を含む共重合体である（１）又は（２）に記載の診断用蛍光粒子。
（４）凝集性発光材料の数平均分子量は、１００００以下である（１）〜（３）のいずれかに記載の診断用蛍光粒子。
（５）凝集性発光材料が、４つ以上のフェニル基もしくはフェニル基誘導体により置換された、エチレン誘導体もしくはベンゼン誘導体である（１）〜（４）のいずれか記載の診断用蛍光粒子。
（６）凝集性発光材料が、テトラフェニルエチレン、１−（４−ブロモフェニル）−１，２，２−トリフェニルエチレン、テトラキス（４−ヒドロキシフェニル）エチレンからなる群から選択される（１）〜（４）のいずれかに記載の診断用蛍光粒子。
（７）凝集性発光材料が、ヘキサフェニルシロール又はヘキサフェニルベンゼンである（１）〜（４）のいずれかに記載の診断用蛍光粒子。
（８）（１）〜（７）のいずれか一項に記載の診断薬用蛍光粒子を用いる免疫測定試薬。
（９）合成高分子を含む種粒子を分散させた種粒子分散液を調製する工程と、凝集性発光材料と有機溶剤を含む乳化液を調製する工程と、種粒子分散液に乳化液を加え、種粒子に凝集性発光材料と有機溶剤を吸収させて膨潤粒子液滴分散液を得る工程と、膨潤粒子液滴中の有機溶剤を液中乾燥させて凝集発光性材料含有粒子を得る工程と、を有する凝集発光性材料含有粒子の製造方法。
（１０）凝集性発光材料質量が種粒子質量の０．１〜６４倍となるように、種粒子分散液に乳化液を加える、（９）に記載の凝集発光性材料含有粒子の製造方法。
（１１）アナライトを含む可能性がある試料溶液と、アナライトとの結合パートナーを有する凝集蛍光材料含有粒子を含む溶液を混合して混合液を調製する工程と、アナライトとの結合パートナーが固定化された検出部を少なくとも１つ有する不溶性担体に、混合液を展開させる工程と、検出部において凝集蛍光材料含有粒子から発生する蛍光強度を測定する工程と、アナライト濃度に対する蛍光強度の検量線と蛍光強度を対比して、蛍光強度と混合液中のアナライト濃度を関連付ける工程と、を備えるアナライト測定法。
（１２）イムノクロマトグラフィー用のテストストリップであって、
（ａ）アナライトを含む可能性がある試料溶液の供給部と、（ｂ）アナライトとの結合パートナーを表面に有する凝集蛍光材料含有粒子を含むコンジュゲートパッドと、（ｃ）アナライトとの結合パートナーが固定化された検出部を少なくとも１つ有する不溶性メンブレン担体と、を備え、
凝集蛍光材料含有粒子は、（イ）合成高分子と、（ロ）粒子の全質量基準で1０質量％以上の凝集性発光材料と、を含むイムノクロマトグラフィー用のテストストリップ。
（１３）凝集蛍光材料含有粒子のＣＶ値が２０％以下であり、平均粒子径が０．０５〜３．０μｍである（１２）記載のテストストリップ。
（１４）凝集蛍光材料粒子に含まれる合成高分子が、スチレンモノマー及び（メタ）アクリル酸からなる群から選択される少なくとも一種を含む共重合体である（１２）又は（１３）に記載のテストストリップ。
（１５）凝集蛍光材料粒子に含まれる凝集性発光材料の数平均分子量は、１００００以下である（１２）〜（１４）のいずれかに記載のテストストリップ。
（１６）凝集蛍光材料粒子に含まれる凝集性発光材料が、４つ以上のフェニル基もしくはフェニル基誘導体により置換された、エチレン誘導体もしくはベンゼン誘導体である（１２）〜（１５）のいずれか記載のテストストリップ。
（１７）凝集蛍光材料粒子に含まれる凝集性発光材料が、テトラフェニルエチレン、１−（４−ブロモフェニル）−１，２，２−トリフェニルエチレン、テトラキス（４−ヒドロキシフェニル）エチレンからなる群から選択される（１２）〜（１６）のいずれかに記載のテストストリップ。
（１８）凝集蛍光材料粒子に含まれる凝集性発光材料が、ヘキサフェニルシロール又はヘキサフェニルベンゼンである（１２）〜（１７）のいずれかに記載のテストストリップ。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、毒性がなく、アナライトの検出感度（特に視認性）と検出再現性が向上された、アナライトに対する結合パートナーを担持した診断薬用蛍光粒子が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、本発明の凝集性発光材料含有粒子表面のＳＥＭ写真である。
【図２】図２は、本発明の凝集性発光材料含有粒子に波長３６５ｎｍの紫外線（ＵＶ）を照射した際の凝集発光の様子を示す写真である。
【図３】図３は、図２の一部拡大図である。
【図４】図４は、比較例１の凝集発光性材料含有粒子に波長３６５ｎｍの紫外線（ＵＶ）を照射した際の凝集発光の様子を示す写真である。
【図５】図５は、図４の一部拡大図である。
【図６】図６は、イムノクロマトグラフィー用のテストストリップの概念図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下に、実施形態を挙げて本発明の説明を行うが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【０００９】
［診断薬用蛍光粒子］
本発明者等は、上述の課題を解決するために研究を重ねた結果、溶液に分散した状態ではほとんど発光しないにもかかわらず、凝集させることにより高い発光性を示す蛍光材料（以下、「凝集発光性材料」ともいう。）をポリマー微粒子に高含有させることにより、高い発光強度を有する蛍光粒子が得られることを見出した。即ち本発明は、合成高分子と、粒子の全質量基準で1０％質量以上の凝集性発光材料と、を含み、アナライトに対する結合パートナーを担持した診断薬用蛍光粒子に関する。なお、本明細書において、アナライトに対する結合パートナーを粒子に「担持」させることを、「結合」と表現することがある。
【００１０】
診断薬用蛍光粒子を構成する合成高分子としては特に限定はないが、例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、イタコン酸重合体、スチレン−親水性カルボキシルモノマー共重合体：例えば、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−イタコン酸共重合体等が挙げられる。その中で、好ましくはスチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−イタコン酸共重合体、スチレンおよびスチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体である。特に好ましくは、スチレン及びスチレン−（メタ）アクリル酸共重合体である。
【００１１】
スチレンスルホン酸塩の塩としては、特に限定されず、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。なかでも、スチレンスルホン酸ナトリウムが好ましく用いられる。本発明に使用される親水性カルボキシルモノマーとしては、メタクリル酸、アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸などを用いることができる。好ましくは、メタクリル酸、アクリル酸を用いることができる。
【００１２】
親水性カルボキシルモノマーを用いる際には、重合後の合成高分子が有するカルボキシ基量が蛍光粒子の発光強度に影響するので、粒子表面におけるカルボキシ基量を０．００１〜０．６ｍｅｑ／ｇとすると、蛍光粒子はカルボキシ基量依存的に強い発光を示す。粒子表面におけるカルボキシ基量は、好ましくは０．１〜０．６ｍｅｑ／ｇ、より好ましくは０．２〜０．６ｍｅｑ／ｇである。粒子表面のカルボキシル基量は、通常の測定方法により測定できる。例えば、電位差自動滴定装置を用いて測定できる。
【００１３】
診断薬用蛍光粒子を構成する凝集発光性材料としては特に限定はないが、例えば、ケトイミンホウ素錯体誘導体、ジイミンホウ素錯体誘導体、テトラフェニルエチレン誘導体、アミノマレイミド誘導体、アミノベンゾピロキサンテン誘導体、トリフェニルアミン誘導体、ヘキサフェニルベンゼン誘導体、ヘキサフェニルシロール誘導体等が挙げられる。上述の誘導体の中でも、合成が簡便であり、市販もされていることからテトラフェニルエチレン誘導体が好ましい。
【００１４】
テトラフェニルエチレン誘導体としては、例えば、４つ以上のフェニル基もしくはフェニル基誘導体により置換されたエチレン誘導体が挙げられる。具体的には、次式（１）で示されるようなエチレン誘導体が挙げられる。
【化１】
2018043687.tif 000002
（式中、Ｒ１は水素原子、臭素原子、水酸基のいずれかを表し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４のそれぞれは水素原子又は水酸基を表す。）
より具体的には、テトラフェニルエチレン、１−（４−ブロモフェニル）−１，２，２−トリフェニルエチレン、テトラキス（４−ヒドロキシフェニル）エチレンが挙げられる。
【００１５】
ヘキサフェニルベンゼン誘導体としては、例えば４つ以上のフェニル基もしくはフェニル基誘導体により置換されたベンゼン誘導体が挙げられる。具体的には、ヘキサフェニルシロール又はヘキサフェニルベンゼンが挙げられる。
トリフェニルアミン誘導体のとしては、例えば４−（ジ−ｐ−トリアミノ）ベンズアルデヒドが挙げられる。
【００１６】
凝集性発光材料の数平均分子量は、１００００以下であることが好ましい。上記上限を超えると凝集発光性材料が溶解しづらくなり粒子形態に加工できなくなったり、含有量が低下する傾向があるからである。
【００１７】
上述の各誘導体は、それ自体が診断薬用蛍光粒子内に含まれる他にも、ポリマーの主鎖や側鎖に組み込まれた形態として診断薬用蛍光粒子内に含まれても構わない。しかしポリマー鎖に導入した場合には含有量が低下する、あるいは粒子合成に他段階のプロセスを要する等の理由から各誘導体自体が診断薬用蛍光粒子内に含まれることが好ましい。
【００１８】
粒子の全質量基準での凝集性発光材料の割合は、視認性向上の観点より、１０質量％以上であり、３０質量％以上であることが好ましく、９５質量％以下であることが好ましい。９５質量％を超えると、粒子のＣＶ値が大きくなり、測定試薬の再現性が低下することがある。
【００１９】
診断薬用蛍光粒子の平均粒子径に特に限定はなく、診断薬用着色ラテックス粒子診断薬用蛍光粒子として使用できればいかなる平均粒子径でもよい。なかでもクロマトグラフィーで展開され得る平均粒子径であれば特段問題はないが、小径な粒子を使用すると、充分な検出感度が得られないことがあるため、より好ましくは３００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の粒子である。
【００２０】
尚、本願における「平均粒子径」は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて１視野に約１００個の凝集性発光材料含有粒子が観察できる倍率で粒子を観察し、任意に選択した５０個の凝集発光性材料含有粒子の最長径をノギスで測定し、この値の数平均値を求め、これを平均粒子径とした。
【００２１】
上記粒子の粒子径の変動係数（ＣＶ値）は、２０％以下であることが好ましい。２０％を超えると、試薬調製時のロット再現性が悪く、測定試薬の再現性が低下することがある。より好ましくは１５％以下である。尚、上記粒子径の変動係数は、次の式により算出される。
粒子径の変動係数（ＣＶ値）＝粒子径の標準偏差／平均粒子径
【００２２】
診断薬用蛍光粒子を調製する方法としては特に限定されず、公知の方法を用いることができるが、均一粒径の粒子を得られることから、シード膨潤法を用いることが好ましい。上記シード膨潤法とは、あらかじめ合成された均一粒径のスチレンポリマー粒子等を凝集発光性材料を溶解した溶液で膨潤させる方法である。これにより、凝集発光性材料を含有した均一液滴が調製され、適時乾燥させることにより、目的とする蛍光粒子が得られる。
【００２３】
例えば、スチレンおよびスチレンスルホン酸ナトリウム、親水性カルボキシルモノマーとしてメタクリル酸を用いた場合は、得られた粒子は均一な粒度分布、優れた分散安定性を有し、分散安定性は、各々の診断薬用蛍光粒子の表面に存在するスチレンスルホン酸由来のスルホン酸基同士の静電的な反発力によるものである。また、粒子表面にカルボキシ基が存在する場合には、分散安定性に寄与する一方で、抗体との化学結合部位として利用することもできるので好ましい。
【００２４】
［診断薬用蛍光粒子の製造方法］
診断薬用蛍光粒子の製造方法としては特に限定はされず、一例としては以下の方法（シード膨潤法）が挙げられる。
（イ）まず種粒子を構成する合成高分子を調製する。合成高分子を調製する方法としては特に限定されず、公知の方法を用いることができるが、乳化剤（界面活性剤）を使用しないソープフリー乳化重合法が好ましい。この乳化重合法に用いられる重合開始剤としては過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウムなどが挙げられるが、好ましくは過硫酸カリウムが良い。本発明では、反応容器にイオン交換水、例えば、モノマー、重合開始剤を仕込み、攪拌しながら反応容器内を窒素置換した後、６５℃〜８０℃で１２〜４２時間反応を行うことにより製造することができる。得られた粒子は低いＣＶ値、優れた分散安定性を有する。合成高分子としては、上述の合成高分子を用いることができる。その際、診断薬用蛍光粒子の分散度を高め、視認性評価の制限性を高める観点より、合成高分子からなる種粒子は、平均粒子径を０．０５〜３．０μｍ、ＣＶ値を１〜２０％とすることが好ましい。
（ロ）次に、得られた種粒子を溶媒に分散させた種粒子分散液を調製する。溶媒としては特に制限はないが、水を用いることができる。
（ハ）凝集性発光材料を有機溶剤に溶解した溶液を含む乳化液を調製する。例えば、凝集性発光材料であるテトラフェニルエチレンを酢酸エチルに溶解し、得られたテトラフェニルエチレン溶液を、スチレンスルホン酸ナトリウムを水に溶解した水溶液に添加することにより乳化液を調製することができる。
（ニ）種粒子分散液に乳化液を撹拌しながら加えて膨潤粒子液滴分散液を得る。その後、種粒子分散液に乳化液を加えた溶液を１分〜３６時間程度、好ましくは１時間〜３０時間程度、より好ましくは１２時間〜２４時間程度、さらに好ましくは２０時間〜２４時間程度撹拌し続けることにより、種粒子に凝集性発光材料と有機溶剤を吸収させることができる。膨潤粒子液滴の分散液を得る際に、凝集性発光材料質量が種粒子質量の０．１倍以上、６４倍以下なるように乳化液を加えることが好ましい。
（ホ）膨潤粒子液滴中の有機溶剤を液中乾燥させて凝集発光性材料含有粒子を得る。液中乾燥の条件は、有機溶剤の沸点や気化点により定まる。有機溶剤として、例えば酢酸エチルを用いた場合は、得られた膨潤粒子液滴の分散液を６５℃で２００ｒｐｍの速度で２４時間程度攪拌することにより、酢酸エチルを乾燥させることができる。なお、加熱に換えて（もしくは加熱と併せて）減圧させてもよい。
以上により、凝集発光性材料含有粒子が製造される。
【００２５】
［粒子の用途］
本発明の診断薬用蛍光粒子は、粒子表面にアナライトに対する結合パートナーとして抗原（または抗体）等を結合することにより、抗原-抗体反応を利用した酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、ラテックス凝集法、イムノクロマトグラフ法等の生物学的反応を利用した種々の方法に好適に用いることができる。
本発明によれば上述の診断薬用蛍光粒子を用いる免疫測定試薬が提供される。
【００２６】
診断薬用蛍光粒子の粒子表面に抗原（または抗体）を結合させる方法としては特に限定はされず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、抗原（または抗体）を含む緩衝液中に診断薬用蛍光粒子を浸漬させ、一定温度で一定時間インキュベートするなどの物理吸着による結合方法や、化学結合による結合方法がある。物理吸着は粒子表面と抗原（または抗体）との疎水性相互作用を利用するもので、操作が容易である特長を有し、化学結合は粒子表面の反応性官能基と抗原（または抗体）中の特定の基との化学反応を利用するもので、粒子と抗原（または抗体）との距離の制御が可能になる等の特長を有する。合成高分子がカルボキシ基を有する場合、抗原（または抗体）の含有するアミノ基を架橋させ、結合させることができる。これらは、アナライトに対する結合パートナーの特性等を考慮して適宜に選択することができる。
【００２７】
本発明によれば、充分に強い発光を示す診断薬用蛍光粒子を作製できることにより、診断薬用蛍光粒子を免疫測定用試薬として使用した際に、目視判定性が格段に向上し、検出感度を向上させることができる。また粒子分散度が低いことから、試薬調製時のロット再現性が向上する。
【００２８】
以下に診断薬用蛍光粒子の具体的用途と用語について説明する。
（アナライト測定法）
本発明によれば、アナライトを含むまたは含む可能性がある試料溶液と、アナライトとの結合パートナーを有する凝集蛍光材料含有粒子を含む溶液（当該溶液が、図６ｆに示すような、いわゆるコンジュゲート塗布パッド中において、乾燥状態で存在する場合を含む）と、を混合して混合液を調製する工程と；アナライトとの結合パートナーが固定化された検出部を少なくとも１つ有する不溶性担体に、混合液を展開させる工程と；検出部において凝集蛍光材料含有粒子から発生する蛍光強度を測定する工程と；アナライト濃度に対する蛍光強度の検量線と蛍光強度を対比して、蛍光強度と混合液中のアナライト濃度を関連付ける工程（当該蛍光強度と混合液中のアナライト濃度を関連付ける工程には、基準となる蛍光強度との強弱関係により、アナライトの存在の有無を判断する定性的あるいは判定量的な関連付けを含む）と；を備えるアナライト測定法が提供される。
この測定法によれば、上述の感度の高い凝集蛍光材料含有粒子を用いることより、アナライト濃度が低い場合であっても、アナライトの存否やアナライト濃度を精度よく測定できる。前記、関連付けは、目視で行っても、装置により行ってもよい。目視で行う場合、本発明は特に有利である。
またさらに、後述の第一試液（Ｒ１）と第二試液（Ｒ２）からなる測定試薬を、適宜、組み合わせて用いることで、既存の測定装置を用いて、広いレンジ幅でアナライト測定を行なうことができる。
【００２９】
（テストストリップ）
本発明によれば、図６に示すような、プラスチック製粘着シートａと；プラスチック製粘着シート上に配置された、アナライトとの結合パートナーが固定化された検出部ｃを少なくとも１つ有する不溶性メンブレン担体ｂと；不溶性メンブレン担体ｂの一端側に配置された、アナライトを含む可能性がある試料溶液の供給部ｅ、アナライトとの結合パートナーを有する凝集蛍光材料含有粒子が固定化されたコンジュゲートｆを有するコンジュゲート塗布パッドｄと；不溶性メンブレン担体ｂの他端側に配置された吸収パッドｇと；を備えるイムノクロマトグラフィー用のテストストリップが提供される。
このテストストリップによれば、上述の感度の高い凝集蛍光材料含有粒子を用いることより、従来のテストストリップよりも、目視確認が極めて容易になる。
なお、図６のように検出部を複数設けることにより、他項目の検査が可能になる。図６では、測定時間の短縮と視認性の向上を図るために、コンジュゲートｆは、コンジュゲート塗布パッドｄの裏面と不溶性メンブレン担体ｂの表面が接する領域における、試料の流れ方向の下流側端を除いた部分に、ライン状に形成した。しかし、コンジュゲートｆの配置位置や形状は特に制限されることはない。
【００３０】
（試料）
測定対象としては、特に限定されないが、種々の生体試料が挙げられる。例えば血液、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻汁、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、涙液などの体液である。
【００３１】
（アナライト）
アナライトとしては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖、核酸、ハプテンなど、当該アナライトに結合するパートナーが存在することを限度として理論的に測定可能な分子であれば特に制限はない。例として、インフルエンザウイルスなどのウイルス、細菌、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、Ｌｐ（ａ）（リポプロテイン（ａ））、ＭＭＰ３（マトリクスメタロプロテイナーゼ３）、抗ＣＣＰ（環状シトルリン化ペプチド）抗体、抗リン脂質抗体、抗梅毒抗原抗体、ＲＰＲ、ＩＶ型コラーゲン、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、インスリン、マイクロアルブミン、シスタチンＣ、ＲＦ（リウマチ因子）、ＣＡ―ＲＦ、ＫＬ−６、ＰＩＶＫＡ―ＩＩ、ＦＤＰ、Ｄダイマー、ＳＦ（可溶性フィブリン）、ＴＡＴ（トロンビン-アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、ＰＩＣ、ＰＡＩ、ＸＩＩＩ因子、ペプシノーゲンＩ・ＩＩや、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バルプロ酸、テオフィリンなどが挙げられる。
【００３２】
（結合パートナー）
結合パートナーとしては、アナライトに結合する物質としてタンパク質、ペプチド、ア
ミノ酸、脂質、糖、核酸、ハプテンなどが挙げられるが、特異性および親和性の点から抗体や抗原の利用が一般的である。また、アナライトに対する結合特異性、親和性が所望の範囲に含まれていることを限度として、分子量の大小（例えば、抗体であれば、イムノグロブリン全体である場合や、アナライト結合性機能断片である場合などを含む）、天然や合成といった由来（例えば、抗体であれば、動物体液由来のものや遺伝子組み換え技術によるものを含む）に特に制限はない。
【００３３】
（測定試薬）
本発明の測定法に供される測定試薬の構成に関して特に制限はないが、上述のテストストリップを含むイムノクロマトグラフィー用の試薬が好適である。また、臨床検査の分野で汎用される自動分析装置での使用を考慮した場合には、緩衝液からなる第一試液（Ｒ１）とアナライトに対する結合パートナーを担持した凝集蛍光材料含有粒子を含む第二試液（Ｒ２）の２液で構成された測定試薬が一般的である。
【００３４】
（測定試薬の成分）
本発明の凝集蛍光材料含有粒子を用いる測定試薬の成分は、反応の主成分である結合パートナーを担持した微粒子の他に、試料のイオン強度や浸透圧などを緩衝する成分として、例えば、酢酸、クエン酸、リン酸、トリス、グリシン、ホウ酸、炭酸、及びグッドの緩衝液や、それらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などを含んでも良い。またアナライトと当該アナライトに結合するパートナーの結合（例えば、抗原抗体反応）を促進、増強する成分としてポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマーなどの高分子を含んでも良い。また、アナライトと当該アナライトに結合するパートナーの結合をコントロールする成分として高分子物質、タンパク質、アミノ酸、糖類、金属塩類、界面活性剤類、還元性物質やカオトロピック物質など汎用される成分を１種類、または複数の成分を組み合わせて含んでも良い。また消泡成分を含んでも良い。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例、比較例により本発明の詳細について説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００３６】
［実施例１]
（種粒子の製造）
攪拌機、還流用冷却器、温度検出器、窒素導入管及びジャケットを備えたガラス製反応容器（容量１Ｌ）に、超純水４００ｇ、スチレンモノマー１０ｇ、過硫酸カリウム０．２０ｇを添加し、容器内を窒素ガスで置換した後、６５℃で２００ｒｐｍの速度で攪拌しながら２４時間重合を行った（ソープフリー乳化重合法）。
重合終了後、上記溶液をペーパーろ紙にてろ過処理し、ラテックス粒子を取り出した。その後、透析膜にて４８時間透析処理を行い、種粒子となる、精製された測定試薬用ラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の平均粒子径０．１５μｍ、粒子径のＣＶ値は５．１％であった。
（凝集発光性材料含有粒子の製造）
凝集性発光材料としてヘキサフェニルシロール０．５９ｇを酢酸エチル３１ｇに溶解した溶液を、スチレンスルホン酸ナトリウム０．１ｇを水１５０ｇに溶解した水溶液に添加して混合することで、乳化液を調製した。
上記で合成した種粒子の分散液に、種粒子重量の０．４３倍のヘキサフェニルシロールとなるように乳化液を加え、２４時間撹拌して、ヘキサフェニルシロールと酢酸エチルを吸収した種粒子の膨潤粒子液滴の分散液を得た。
得られた膨潤粒子液滴の分散液を６５℃で２００ｒｐｍの速度で２４時間攪拌しながら酢酸エチルを乾燥することにより、凝集発光性材料含有粒子を得た（シード膨潤法）。【００３７】
（実施例２）
ヘキサフェニルシロールをヘキサフェニルベンゼンに変更したこと以外は実施例１と同様にして、凝集発光性材料含有粒子を得た。【００３８】
（実施例３）
ヘキサフェニルシロールを４−（ジ−ｐ−トリルアミノ）ベンズアルデヒドに変更したこと以外は実施例１と同様にして、凝集発光性材料含有粒子を得た。【００３９】
（実施例４）
ヘキサフェニルシロールを種粒子重量の０．１１倍のテトラフェニルエチレンに変更したこと以外は実施例１と同様にして、凝集発光性材料含有粒子を得た。【００４０】
（実施例５）
ヘキサフェニルシロールをテトラフェニルエチレンに変更したこと以外は実施例１と同様にして、凝集発光性材料含有粒子を得た。【００４１】
（実施例６）
ヘキサフェニルシロールを種粒子重量の等倍のテトラフェニルエチレンに変更したこと以外は実施例１と同様にして、凝集発光性材料含有粒子を得た。【００４２】
（実施例７）
ヘキサフェニルシロールを種粒子重量の２．３３倍のテトラフェニルエチレンに変更したこと以外は実施例１と同様にして、凝集発光性材料含有粒子を得た。【００４３】
（実施例８）
ヘキサフェニルシロールを種粒子重量の９倍のテトラフェニルエチレンに変更したこと以外は実施例１と同様にして、凝集発光性材料含有粒子を得た。【００４４】
（実施例９）
（種粒子の製造）
攪拌機、還流用冷却器、温度検出器、窒素導入管及びジャケットを備えたガラス製反応容器（容量１Ｌ）に、超純水４００ｇ、スチレンモノマー１０ｇ、メタクリル酸１g、過硫酸カリウム０．２０ｇを添加し、容器内を窒素ガスで置換した後、６５℃で２００ｒｐｍの速度で攪拌しながら２４時間重合を行った（ソープフリー乳化重合法）。
重合終了後、上記溶液をペーパーろ紙にてろ過処理し、ラテックス粒子を取り出した。その後、透析膜にて４８時間透析処理を行い、種粒子となる精製された測定試薬用ラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の平均粒子径０．１６μｍ、粒子径のＣＶ値は８．６％であった。
（凝集発光性材料含有粒子の製造）
凝集性発光材料としてテトラフェニルエチレン０．５９ｇを酢酸エチル３１ｇに溶解した溶液を、スチレンスルホン酸ナトリウム０．１ｇを水１５０ｇに溶解した水溶液に添加して混合することで、乳化液を調製した。
上記で合成した種粒子の分散液に、種粒子重量の０．１１倍のテトラフェニルエチレンとなるように乳化液を加え、２４時間撹拌して、テトラフェニルエチレンと酢酸エチルを吸収した種粒子の膨潤粒子液滴の分散液を得た。
得られた膨潤粒子液滴の分散液を６５℃で２００ｒｐｍの速度で２４時間攪拌しながら酢酸エチルを乾燥することにより、凝集発光性材料含有粒子を得た（シード膨潤法）。【００４５】
（実施例１０）
ヘキサフェニルシロールを１−（４−ブロモフェニル）−１，２，２−トリフェニルエチレンに変更したこと以外は実施例１と同様にして、凝集発光性材料含有粒子を得た。【００４６】
（実施例１１）
ヘキサフェニルシロールをテトラキス（４−ヒドロキシフェニル）エチレンに変更したこと以外は実施例１と同様にして、凝集発光性材料含有粒子を得た。【００４７】
（比較例１）
ヘキサフェニルシロールを種粒子重量の０．０５倍に変更したこと以外は実施例４と同様にして、凝集発光性材料含有粒子を得た。【００４８】
（比較例２）
（種粒子の製造）
スチレンスルホン酸ナトリウム０．１ｇを溶解した超純水４００ｇにアゾイソブチロニトリル０．０１ｇを溶解したスチレンモノマー１０ｇを加えホモジナイザーを用いて１２０００ｒｐｍ、５ｍｉｎの条件で攪拌し、乳化液を得た。得られた乳化液を攪拌機、還流用冷却器、温度検出器、窒素導入管及びジャケットを備えたガラス製反応容器（容量１Ｌ）に加え、６５℃で２００ｒｐｍの速度で攪拌しながら２４時間重合を行った（懸濁重合）。
重合終了後、上記溶液をペーパーろ紙にてろ過処理し、ラテックス粒子を取り出した。その後、透析膜にて４８時間透析処理を行い、種粒子となる精製された測定試薬用ラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の平均粒子径０．２２μｍ、粒子径のＣＶ値は３４．５％であった。
（凝集発光性材料含有粒子の製造）
凝集性発光材料としてテトラフェニルエチレン０．５９ｇを酢酸エチル３１ｇに溶解した溶液を、スチレンスルホン酸ナトリウム０．１ｇを水１５０ｇに溶解した水溶液に添加して混合することで、乳化液を調製した。
上記で合成した種粒子分散液に、種粒子重量の０．１１倍のテトラフェニルエチレンとなるように乳化液を加え、２４時間撹拌して、テトラフェニルエチレンと酢酸エチルを吸収した種粒子の膨潤粒子液滴の分散液を得た。
得られた膨潤粒子液滴の分散液を６５℃で２００ｒｐｍの速度で２４時間攪拌しながら酢酸エチルを乾燥することにより、凝集発光性材料含有粒子を得た【００４９】
【表１】
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【００５０】
（１）平均粒子径と分散度の測定
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて１視野に約１００個の凝集性発光材料含有粒子が観察できる倍率で粒子を観察し、任意に選択した５０個の凝集発光性材料願湯粒子の最長径をノギスで測定し、この値の数平均値と変動係数を求め、これを平均粒子径と分散度とした。
（２）凝集発光性材料含有率
熱分解ガスクロマトグラフィー（Ｑ１０００、日本電子社製）を用いて、凝集性発光材料含有粒子０．０１ｇ中に含まれる凝集発光性材料の含有量（質量）を測定した。
（３）合成高分子含有率
熱分解ガスクロマトグラフィー（Ｑ１０００、日本電子社製）を用いて、凝集性発光材料含有粒子０．０１ｇ中に含まれる合成高分子の含有量を測定した。
（４）視認性
後述の適用例の欄における「１．」〜「５．」に従って作製したインフルエンザウイルス測定用イムノクロマトグラフ試薬１３種類を用いて、Ａ型インフルエンザウイルスを同欄「６．」に記載の検体抽出液により３．８ｘ１０５〜４．８ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬに調整した試料をサンプルとし、「８.試薬性能評価測定」に準じて視認性を評価した。
（５）再現性
上記視認性評価を繰り返し３回行った。その結果、すべて一致したものを◎、誤差１以
内を○、誤差２以上を×として評価した。
（６）表面観察
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて凝集性発光材料含有粒子の表面を観察した。得られた、ＳＥＭ写真の中から、実施例１０に係るＳＥＭ写真を図１に示した。また図２に凝集性発光材料含有粒子に波長３６５ｎｍの紫外線（ＵＶ）を照射した際の凝集発光の様子を示した。図３に図２の一部拡大図を示した。また、図４に比較例１の凝集発光性粒子に波長３６５ｎｍの紫外線（ＵＶ）を照射した際の凝集発光の様子を示した。図５に図４の一部拡大図を示した。【００５１】
［適用例］
＜インフルエンザウィルス測定用イムノクロマトグラフ法試薬の作製＞
１．凝集発光性材料含有粒子標識抗Ａ型インフルエンザウィルス抗体の調製
（１）下記（ｉ）から（iv）を準備し、（ｉ）５ｍＬ、（ii）０．２ｍＬ及び（iii）０．８ｍＬを加えて攪拌後、これに（iv）を４ｍＬ添加し、室温で２時間攪拌した。
（２）上記（１）で得られた溶液を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去後、１０％スクロース含有２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を１０ｍＬ添加し、さらに２時間攪拌後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１３種類のコンジュゲートを得た。
（３）上記（２）により得られたコンジュゲートに対し、１０％スクロース含有２％ＢＳＡ水溶液を１０ｍＬ添加しコンジュゲートを懸濁させて、青色着色ラテックス粒子標識抗A型インフルエンザウィルス抗体を得た。
（ｉ）2%青色凝集発光性材料含有粒子（実施例１〜実施例１１、及び比較例１、２の計１３種類）をそれぞれ含む20mM MES(pH6.5)緩衝液
（ii）20mM MES(pH6.5)緩衝液
（iii）架橋剤1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide(EDC) 15mg/mL
（iv）2.5mg/mL抗A型インフルエンザウィルスモノクロナール抗体を含む20mM MES(pH6.5)緩衝液試薬性能評価において、コンジュゲートの吸光度の測定は、凝集発光性材料の最大吸収波長で測定した。【００５２】
３.コンジュゲート塗布パッドの作製
上記１.および上記２.で調製したコンジュゲート１３種類を、それぞれ６．４ＯＤ／ｍＬとなるように、０．５％カゼイン及び１０％スクロース含有トリス緩衝液（ｐＨ８．５）と混合してコンジュゲート溶液を作製した。次に、２２．０ｍｍ×２５４ｍｍ×０．５６ｍｍ（幅×長さ×厚さ）のグラスファイバー製パッド（Ｌｙｄａｌｌ社製）にイムノクロマトグラフ法用のディスペンサー「ＸＵＺ３０５０」（ＢＩＯ  ＤＯＴ社製）を用いて該コンジュゲート溶液を１０μＬ／ｃｍで滲みこませた。その後、ドライオーブン内で７０℃、３０分間加温して乾燥させ、コンジュゲート塗布パッドとした。なお、界面活性剤（例えば、エマルゲン１５０（花王社製）、アミート３２０（花王社製））などを添加する場合には、上述のコンジュゲート溶液に必要量を添加後、同様の操作を行うことができる。【００５３】
４.抗インフルエンザウィルス抗体固定化膜の作製
２５．０ｍｍ×２５４ｍｍ×０．２３５ｍｍ（短辺×長辺×厚さ）のニトロセルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）に、０．７５ｍｇ／ｍＬに調製した上述の青色着色ラテックス粒子標識抗Ａ型インフルエンザウィルス抗体とはエピトープを異にする抗Ａ型インフルエンザウィルス抗体、０．７５ｍｇ／ｍＬに調製した抗ＫＬＨ抗体、及び２．５％スクロースを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を、幅約１ｍｍのライン状に塗布した。塗布は、イムノクロマトグラフ法用のディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯ  ＤＯＴ社製）を用い、吐出量を１μＬ／ｃｍとなるように設定した。ライン塗布後のニトロセルロース膜をドライオーブン内で７０℃、４５分間乾燥させ、抗インフルエンザウィルス抗体固定化膜とした。【００５４】
５.テストストリップの作製
プラスチック製粘着シートに上記抗インフルエンザウィルス抗体固定化膜を貼り、上記３.で作製した１３種類のコンジュゲート塗布パッドをそれぞれ配置装着し、反対側の端には吸収パッド（Ｗｈａｔｍａｎ社製、７４０−Ｅ）を配置装着した（図６参照）。最後に、抗体固定化膜および吸収パッドを被覆するように上面にポリエステルフィルムを配置装着し、ラミネートした。このように各構成要素を重ね合わせた構造物を４ｍｍ幅に切断し、テストストリップを作成した。該テストストリップの該寸は、４ｍｍ×９８ｍｍ（幅×長さ）であり、イムノクロマトテストストリップの形態にした。【００５５】
６.検体抽出液の調製
２００ｍＭ塩化カリウム、１５０ｍＭアルギニン、０．５％Ｂｒｉｊ３５、０．２５％ＢＳＡ、及び０．０５％プロクリン（登録商標）９５０を含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）を検体抽出液とした。【００５６】
７.サンプルの調製
ａ．鼻腔吸引検体の場合
鼻腔吸引液に綿棒1本を浸し、検体をしみこませた綿棒を３２０μＬのＰＢＳへ入れて、検体成分をＰＢＳへ溶解させて試薬性能評価のサンプルとした。この時のＡ型インフルエンザウイルスの濃度は、３．８ｘ１０５〜４．８ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ相当である。
ｂ．鼻腔拭い検体の場合
綿棒２本で鼻腔を拭い、綿棒を３２０μＬのＰＢＳへ溶解させて試薬性能評価のサンプルとした。この時のＡ型インフルエンザウイルスの濃度は、３．８ｘ１０５〜４．８ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ相当である。【００５７】
８.試薬性能評価測定
サンプルに上記５.で作製した１３種類のテストストリップを浸し、１０分後にＡライン（検出部Ｃ１）、コントロールライン（図示せず）にＵＶ光を照射し、発光強度を測定した。なお、発光強度（視認性）は５段階で評価し、ｎ＝３で測定した。表１に示す視認性と同様の成績が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の診断薬用蛍光粒子及びこれを用いた免疫測定試薬を用いることにより、イムノクロマト法等の免疫測定法の粒子として使用した場合、目視判定性や検出感度に優れるため、疾患の早期診断、誤判断の防止に貢献する。また、測定感度を従来程度とすれば、使用する抗体量を減少させることができ、コストダウンにもつながり有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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