(57)【要約】  ＤＮＡを作製する方法は、（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を用いて、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に、下記の（１）〜（６）のいずれかの塩基を付加することを含む。  （１）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）  （２）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）  （３）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）  （４）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）  （５）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ  （６）前記（１）〜（５）のいずれかの修飾塩基
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を用いて、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に、下記の（１）〜（６）のいずれかの塩基を付加することを含む、ＤＮＡを作製する方法。
（１）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（２）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）
（３）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）
（４）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
（５）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（６）前記（１）〜（５）のいずれかの修飾塩基
【請求項２】
前記二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端への塩基の付加が、前記塩基の付加を促進する化合物の存在下で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一方又は両方の鎖の３’末端に、（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を用いて下記の（７）〜（１２）のいずれかの塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、前記（７）〜（１２）のいずれかの塩基と相補的な塩基を３’末端に有する塩基からなる一本鎖アダプターＤＮＡと前記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかとを用いて、前記一本鎖アダプターＤＮＡ及びその相補鎖ＤＮＡからなる二本鎖アダプターＤＮＡが連結したＤＮＡを作製する方法。
（７）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（８）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）
（９）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）
（１０）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
（１１）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（１２）前記（７）〜（１１）のいずれかの修飾塩基
【請求項４】
前記（７）〜（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）であり、前記一本鎖アダプターＤＮＡは１〜１０個のシトシン（Ｃ）を３’末端に有するか、又は
前記（７）〜（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）であり、前記一本鎖アダプターＤＮＡは１〜１０個のグアニン（Ｇ）を３’末端に有する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記一本鎖アダプターＤＮＡはＮ1Ｎ2Ｎ3…Ｎnで示される配列を有し、Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3…Ｎnは各々同一であっても異なってもよいアデニン、シトシン、グアニン、又はチミンを示し、ｎは１から１００の整数である請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加が、前記塩基の付加を促進する化合物の存在下で行われる請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法と、
前記一本鎖アダプターＤＮＡを前記相補鎖ＤＮＡから解離させることと
を含む、前記相補鎖ＤＮＡが付加された二本鎖ＤＮＡを製造する方法。
【請求項８】
一方又は両方の鎖の３’末端に、（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を用いて下記の（１３）〜（１８）のいずれか塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、前記（１３）〜（１８）のいずれかの塩基と相補的な塩基が一方又は両方の鎖の３’末端に付加された二本鎖アダプターＤＮＡを、リガーゼを用いて連結することを含む、二本鎖ＤＮＡが結合したＤＮＡを作製する方法。
（１３）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（１４）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）
（１５）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）
（１６）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
（１７）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（１８）前記（１３）〜（１７）のいずれかの修飾塩基
【請求項９】
前記二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加が、前記塩基の付加を促進する化合物の存在下で行われる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
一方又は両方の鎖の３’末端に下記の（１９）〜（２４）のいずれかの塩基が付加された二本鎖ＤＮＡを作製するためのキットであって、
（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を収容する第１の容器
を備えたキット。
（１９）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（２０）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）
（２１）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）
（２２）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
（２３）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（２４）前記（１９）〜（２３）のいずれかの修飾塩基
【請求項１１】
デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のうちの少なくとも一つを収容する第２の容器をさらに備える請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記塩基の付加を促進する化合物をさらに備える請求項１０又は１１に記載のキット。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末端が加工されたＤＮＡ断片の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、平滑化２本鎖ＤＮＡの３’末端に１塩基を付加する方法として、ＤＮＡ複製酵素であるＴａｑポリメラーゼ等を作用させる方法が用いられてきた(非特許文献１）。例えばＴａｑポリメラーゼにより、平滑化２本鎖ＤＮＡ末端のうち３’末端にアデニン（Ａ）を１個付加させた産物を、チミン（Ｔ）を３'端に突出させたアダプターＤＮＡと連結反応させることが行われてきた。アダプターＤＮＡと連結させたＤＮＡは、ＰＣＲ増幅を経て、あるいはＰＣＲ増幅を経ることなく、イルミナ株式会社あるいはPacific Biosciences Inc.社等が提供しているシーケンサーでの塩基配列決定に供されている。【０００３】
これにとどまらずＤＮＡポリメラーゼを使用してＤＮＡの末端に１塩基を突出させて連結反応等に利用することは、ＤＮＡの加工技術として、ＴＡ−クローニングなどに幅広く用いられている。【０００４】
これまでに知られているポリメラーゼによる末端塩基付加活性のうち、実際に利用可能な程度の強い活性を有するのは、アデニン（Ａ）の付加活性のみであり付加される塩基の数も最大で１である。【０００５】
平滑化２本鎖ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素として、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）も用いられている。ＴｄＴは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３’末端にデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰの各々）を重合する反応を触媒するが、この場合、塩基が３０〜６０個と多数付加され、この数をコントロールすることができない。【０００６】
ＤＮＡの突出末端は制限酵素処理によっても作成できるが、各制限酵素は特定の認識配列のみを切断するため、制約が大きい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nucleic Acid Research 16(20) p. 9677-9686, 1988
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、二本鎖ＤＮＡへ塩基を付加する新規な方法を提供することである。【０００９】
本発明の別の目的は、一方又は両方の鎖の３’末端に塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、かかる塩基と相補的な塩基が一方又は両方の鎖の３’末端に付加された二本鎖アダプターＤＮＡを連結する新規な方法を提供することにある。【００１０】
本発明のまた別の目的は、一方又は両方の鎖の３’末端に塩基が付加された二本鎖ＤＮＡを作成するための新規なキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, ＭＭＬＶ）の逆転写酵素は、一本鎖のＲＮＡから相補的ＤＮＡ鎖を合成することが知られている公知のＤＮＡポリメラーゼであるが、本発明者らは、期せずして、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素を用いると、二本鎖ＤＮＡの３’末端に１〜２０個程度のアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）を付加できることを見出すとともに、突出させた付加塩基と相補的な塩基を有する一本鎖ＤＮＡと、かかる逆転写酵素とを作用させることで、一本鎖ＤＮＡの相補鎖が二本鎖ＤＮＡのかかる突出末端から合成されることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
本発明の一態様によれば、（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を用いて、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に、下記の（１）〜（６）のいずれかの塩基を付加することを含む、ＤＮＡを作製する方法が提供される。【００１３】
（１）１個、２個、３個又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（２）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）
（３）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）
（４）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
（５）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（６）前記（１）〜（５）のいずれかの修飾塩基【００１４】
本発明の別の態様によれば、一方又は両方の鎖の３’末端に、（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を用いて下記の（７）〜（１２）のいずれかの塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、前記（７）〜（１２）のいずれかの塩基と相補的な塩基を３’末端に有する塩基からなる一本鎖アダプターＤＮＡと前記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかとを用いて、二本鎖アダプターＤＮＡが連結したＤＮＡを作製する方法が提供される。【００１５】
（７）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（８）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）
（９）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）
（１０）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
（１１）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（１２）前記（７）〜（１１）のいずれかの修飾塩基【００１６】
本発明のまた別の態様によれば、一方又は両方の鎖の３’末端に、（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を用いて下記の（１３）〜（１８）のいずれか塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、前記（１３）〜（１８）のいずれかの塩基と相補的な塩基が一方又は両方の鎖の３’末端に付加された二本鎖アダプターＤＮＡを、リガーゼを用いて連結することを含む、二本鎖ＤＮＡが結合したＤＮＡを作製する方法が提供される。【００１７】
（１３）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（１４）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）
（１５）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）
（１６）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
（１７）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（１８）前記（１３）〜（１７）のいずれかの修飾塩基
本発明のさらに別の態様によれば、一方又は両方の鎖の３’末端に下記の（１９）〜（２４）のいずれかの塩基が付加された二本鎖ＤＮＡを作製するためのキットであって、  （ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列（配列番号１）と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質を収容する第１の容器
を備えたキットが提供される。【００１８】
（１９）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（２０）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）
（２１）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）
（２２）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
（２３）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（２４）前記（１９）〜（２３）のいずれかの修飾塩基
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、二本鎖ＤＮＡへアデニン、チミンであれば１〜４個程度、シトシン、グアニンであれば１〜２０個程度を簡便に付加することができる。また、かかる付加反応を利用して、二本鎖ＤＮＡに任意の配列のアダプターＤＮＡを高効率で連結することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】二本鎖ＤＮＡへの１個、２個、３個、又は４個のアデニン、シトシン、グアニン、又はチミンの付加反応について説明する略図。
【図２】二本鎖ＤＮＡへの二本鎖アダプターＤＮＡの連結反応について説明する略図。
【図３】二本鎖ＤＮＡへの二本鎖アダプターＤＮＡの連結反応について説明する略図。
【図４】ＦＡＭ標識された７０ｂｐ  ＤＮＡの調製方法について説明する略図。
【図５】二本鎖ＤＮＡの平滑末端へＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを付加させた場合の産物のフラグメント解析結果を示すグラフ。縦軸はシグナル強度、横軸は時間を示す。（Ａ）ＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片、（Ｂ）（Ａ）のＤＮＡ断片にアデニン付加したもの（Ｃ）（Ａ）のＤＮＡ断片にシトシン付加したもの、（Ｄ）（Ａ）のＤＮＡ断片にグアニン付加反応、及び（Ｅ）（Ａ）のＤＮＡ断片にチミン付加したもの。
【図６】二本鎖ＤＮＡの末端へグアニン（Ｇ）を付加し、さらにガイドアダプターオリゴヌクレオチド（ＧＡＯ）を作用させた産物のフラグメント解析結果を示すグラフ。（Ａ）ＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片、（Ｂ）（Ａ）のＤＮＡ断片にグアニン付加したもの、（Ｃ）（Ｂ）の断片にガイドアダプターオリゴヌクレオチドを作用させた産物、及び（Ｄ）（Ｃ）の産物をＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理したもの。
【図７】二本鎖ＤＮＡの末端へグアニン（Ｇ）を付加し、さらにガイドアダプターオリゴヌクレオチド（ＧＡＯ）を作用させた産物のフラグメント解析結果を示すグラフ。（Ａ）ＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片、（Ｂ）（Ａ）のＤＮＡ断片にグアニン付加したもの、及び（Ｃ）（Ｂ）の断片にガイドアダプターオリゴヌクレオチドを作用させた産物。
【図８】各種ＤＮＡ産物を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染色後撮影した図。レーン１：ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて調製した３００ｂｐのＰＣＲ産物。レーン２：このＤＮＡ断片の３’末端にグアニン付加反応を行った反応産物。レーン３：グアニン付加反応後にさらにガイドアダプターオリゴヌクレオチド（ＧＡＯ）を用いてＤＮＡ断片にアダプター配列を付加した反応産物。レーン４：１００ｂｐマーカー。
【図９】二本鎖ＤＮＡの末端へグアニン（Ｇ）を付加し、さらに二本鎖アダプターＤＮＡを連結した場合の産物のフラグメント解析結果を示すグラフ。（Ａ）ＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片、（Ｂ）（Ａ）のＤＮＡ断片にグアニン付加したもの、及び（Ｃ）（Ｂ）の断片に二本鎖アダプターＤＮＡを連結したもの。
【図１０】各種ＤＮＡ産物を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染色後撮影した図。レーン１：ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて調製した３００ｂｐのＰＣＲ産物。レーン２：このＤＮＡ断片の３’末端にグアニン付加反応を行った反応産物。レーン３：アデニン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ  Ｔ１〜Ｔ４の等量混合物であるＴmix1-4とライゲーション反応を行った産物。レーン４：シトシン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ  Ｇ１〜Ｇ４の等量混合物であるＧmix1-4とライゲーション反応を行った産物。レーン５：グアニン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ  Ｃ１〜Ｃ４の等量混合物であるＣmix1-4とライゲーション反応を行った産物。レーン６：チミン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ  Ａ１〜Ａ４の等量混合物であるＡmix1-4とライゲーション反応を行った産物。両側レーン：１００ｂｐマーカー。
【図１１】二本鎖ＤＮＡの末端へ修飾塩基を付加し、さらにクリベージミックスを作用させた場合の産物のフラグメント解析結果を示すグラフ。（Ａ）ＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片、（Ｂ）（Ａ）のＤＮＡ断片に修飾塩基を付加したもの、及び（Ｃ）（Ｂ）の断片にクリベージミックスを作用させたもの。
【図１２】二本鎖ＤＮＡの平滑末端へＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを付加させた場合の、添加物が無い場合又は有る場合の産物のフラグメント解析結果を示すグラフ。縦軸はシグナル強度、横軸は時間を示す。（Ａ）未反応のサイズコントロール、（Ｂ）添加物がない場合、（Ｃ）ｄＡＭＰの添加、（Ｄ）ｄＣＭＰの添加、（Ｅ）ｄＧＭＰの添加、（Ｆ）ｄＴＭＰの添加。
【図１３】二本鎖ＤＮＡの平滑末端へＧを付加させた場合の、（Ａ）添加する化合物が無い場合、（Ｂ）デオキシシチジンを添加した場合、（Ｃ）デオキシシチジン一リン酸を添加した場合のＧの付加数を示すグラフ。
【図１４】二本鎖ＤＮＡの平滑末端へ各種添加物の存在下で付加反応を行った場合の産物のフラグメント解析結果を示すグラフ。縦軸はシグナル強度、横軸は時間を示す。ＤＮＡ断片に（Ａ）シトシン、（Ｂ）グアニン、(Ｃ) チミンを付加したときのもの。添加物の反応溶液中の濃度を括弧内に示した。
【図１５】二本鎖ＤＮＡの平滑末端へ各種添加物の存在下で付加反応を行った場合の産物のフラグメント解析結果を示すグラフ。縦軸はシグナル強度、横軸は時間を示す。反応前のＤＮＡ断片（Ａ）、Ｃの付加反応を促進化合物無し（Ｂ）、グアノシン一リン酸（Ｃ）、グアノシン二リン酸（Ｄ）添加で行ったもの、Ｇの付加反応を促進化合物なし（Ｅ）、及びシチジン二リン酸添加（Ｆ）で行ったもの。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２２】
なお、本明細書において、「相補的」とは、必ずしも完全に相補的である必要はなく、相補的な核酸配列の一方又は両方に１つは複数の塩基の置換、付加及び／又は欠失を含んでよいことを意味する。
【００２３】
また、本明細書において、ＤＮＡ鎖に「塩基が付加」されているとは、特にはデオキシヌクレオシド三リン酸を材料として用いてＤＮＡ鎖にデオキシヌクレオシド一リン酸が付加されることによりその構成要素として塩基が付加されていることを意味する。本明細書において「１〜Ｎ個」とは、１からＮまでの整数のいずれかであることを指す。例えば「１〜１０個」とは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個を指す。
【００２４】
本発明は、モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, ＭＭＬＶ）逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に下記の（１）〜（６）のいずれかの塩基を付加することを含む、ＤＮＡを作製する方法を提供する。
【００２５】
（１）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（２）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）
（３）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）
（４）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
（５）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（６）前記（１）〜（５）のいずれかの修飾塩基
【００２６】
モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素は、一本鎖のＲＮＡから相補的ＤＮＡ鎖を合成することが知られている公知のＤＮＡポリメラーゼである。従来、ＭＭＬＶ逆転写酵素にはＤＮＡの３’末端に塩基を付加して突出部（オーバーハング）を形成する作用は無いと考えられていたところ、本発明者らは期せずして、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素を用いて、平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡとデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、又はデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）を反応させると、二本鎖ＤＮＡの３’末端に１個、２個、３個、又は４個のアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）を付加できることを見出した（図１）。
【００２７】
本発明によれば、（ｉ）天然型のモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（アクセッション番号  ＮＰ ９５５９１、配列番号１）のみならず、その変異型タンパク質も使用することができる。
【００２８】
以下、本明細書において「変異型タンパク質」とは、
（ｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入され、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質、
（ｉｉｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｉｖ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質
を指す。
【００２９】
（ｉｉ）のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入の数は、好ましくは１〜２００個、より好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜６０個、より好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個である。（ｉｉ）の二本鎖ＤＮＡへ付加される塩基の数は、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、より好ましくは１個、２個、３個又は４個である。
【００３０】
欠失には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列の一部の配列を、例えば変異タンパク質の二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を高める目的、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素のある活性を増大又は減少させる目的、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素のある特性を改善させる目的、もしくはその他の目的で欠失させることが含まれる。
【００３１】
（ｉｉｉ）の変異タンパク質は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性、好ましくは９２％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の同一性、より好ましくは９６％以上の同一性、より好ましくは９８％以上の同一性、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００３２】
（ｉｖ）の変異タンパク質は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と４０％以上の同一性、好ましくは５０％以上の同一性、より好ましくは６０％以上の同一性、より好ましくは７０％以上の同一性、より好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは８５％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、より好ましくは９２％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の同一性、より好ましくは９６％以上の同一性、より好ましくは９８％以上の同一性、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加作用を有するタンパク質である。
【００３３】
二本鎖ＤＮＡの３’末端に付加される塩基の数は反応時間、ＤＮＡ濃度等によって変更可能であり、付加される塩基の数はキャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析にて確認することができる。付加される塩基の数は、アデニン、チミンで１〜４個、シトシン、グアニンで１〜２０個であるが、アデニン、チミンは２〜４個であることが好ましく、２又は３個であることがより好ましく、２であることがさらに好ましい。シトシン、グアニンは１〜１０個であることが好ましく、１〜６個であることがより好ましく、２〜４個であることがさらに好ましい。
【００３４】
付加反応により、塩基が複数通りに付加された二本鎖ＤＮＡの混合物が生じる場合もあるが（例えばグアニンが１個付加された二本鎖ＤＮＡと、グアニンが２個付加された二本鎖ＤＮＡと、グアニンが３個付加された二本鎖ＤＮＡとが同時に生じる）、３’末端に塩基が２個付加された二本鎖ＤＮＡとは、塩基が他の個数（１個、３個、又は４個）で付加された二本鎖ＤＮＡが共存する場合も本発明の範囲に包含される。なお、図１では二本鎖ＤＮＡの両方の鎖の３’末端に塩基が付加されているが、二本鎖ＤＮＡのいずれか一方の鎖の３’末端に塩基が付加されていてもよい。
【００３５】
好ましい一実施形態では、上記（１）〜（６）の各塩基の数は以下の通りである。
（１）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（２）１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するシトシン（Ｃ）
（３）１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するグアニン（Ｇ）
（４）１個、２個、３個、又は４個のチミン（Ｔ）
（５）２個、３個、４個、５個、又は６個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（６）前記（１）〜（５）のいずれかの修飾塩基
【００３６】
塩基は一般に、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びシトシン（Ｃ）の順でＤＮＡに付加されやすいが、特異性の点でグアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）が好ましく、グアニン（Ｇ）がより好ましい。
【００３７】
３’末端に付加される塩基は、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に直接的に付加されてもよいし、又は間接的に付加されてもよい。例えば、平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に１個のアデニンをＴａｑポリメラーゼで３’末端に付加した後で、かかるアデニンを付加した二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に、上記（１）〜（６）のいずれかの塩基をモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて付加してもよい。このような場合も本発明の範囲に含まれる。
【００３８】
３’末端に付加される塩基は、上記の（１）〜（５）のいずれかの修飾塩基であってもよい。修飾塩基は、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に付加することができる塩基であれば特に限定されないが、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）をＯ−アルキル化（例えばＯ−メチル化）、Ｏ−アルコキシアルキル化（例えばＯ−メトキシメチル化）、Ｏ−アジドメチル化、Ｏ−オキシム化、Ｏ−アリル化したものや、フルオロ化、アミノ化、チオ化、蛍光色素等により標識化したもの等が挙げられる。このうち、例えばＯ−メチル化した塩基はＭＭＬＶ逆転写酵素による取り込み活性が認められている（Metzker et al. vol22, No.20 4259-4267）。
【００３９】
二本鎖ＤＮＡは、天然の供給源（例えば、種々の生物体の細胞、組織、又は器官）から得られたＤＮＡであってもよいし、当業者に周知の標準的なＤＮＡ合成法に従って合成されたものであってもよい。生物体としては原核生物、真核生物、植物、動物等が挙げられる。二本鎖ＤＮＡは好ましくは、塩基の付加前に平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡである。二本鎖ＤＮＡはさらに、化学的修飾又は酵素的修飾をされてもよい。化学的修飾としては、側鎖のメチル化、ビオチン化、脱リン酸化、リン酸化、蛍光標識化（フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド及びその誘導体等）、ダイデオキシ化、ホスホロチオエート化等が挙げられる。酵素的修飾としては、メチル化、ビオチン化、脱リン酸化、リン酸化、蛍光標識化（フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド及びその誘導体等）、酵素標識化（アルカリホスファターゼ等）が挙げられる。
【００４０】
また本発明者らは、Ｍｎ2+がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）の付加を促進することを見出すとともに、各塩基の付加反応を促進する化合物を見出した。Ｍｎ2+はＭｎＣｌ等のマンガン塩の形で提供され、反応溶液中の濃度は好ましくは０．１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．５〜１０ｍＭである。
【００４１】
よって好ましくは、本発明のＤＮＡを作製する方法は、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端への塩基の付加を、当該Ｍｎ2+及び塩基の付加を促進する化合物の存在下で行うことで促進することができる。
【００４２】
具体的には、反応容器に、上記の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかのタンパク質；二本鎖ＤＮＡへ塩基を付加する材料となるデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ又はその組み合わせ）；当該塩基の付加を促進する化合物；ＭｎＣｌ2；必要な追加の試薬（例えば緩衝液）を入れて反応させることにより、二本鎖ＤＮＡの３’末端への塩基の付加を促進することができる。塩基の付加を促進する化合物を添加することにより、塩基の付加を促進する化合物無しで同じ時間反応させた場合に比べて、二本鎖ＤＮＡの３’末端へ付加する塩基の数を増加させることができる。  塩基の付加を促進する化合物（以下、促進化合物と称する）は、好ましくは当該塩基と対合する化合物であり、より好ましくは当該塩基と対合する塩基、ヌクレオシド、又はヌクレオチドである。
【００４３】
二本鎖ＤＮＡの３’末端へ付加する塩基がシチジンの場合、好ましい促進化合物は、グアニン、グアノシン若しくはデオキシグアノシン、グアノシン若しくはデオキシグアノシンを有するヌクレオチド（一リン酸、二リン酸、又は三リン酸）、これらの環化物、又は塩基の付加を促進する作用を有するこれらの誘導体である。好ましい具体例としては、グアノシン、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、グアノシン三リン酸、デオキシグアノシン、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシグアノシン二リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、サイクリックグアノシン一リン酸、グアニンが挙げられる。より好ましくは促進化合物は、グアノシン、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、グアノシン三リン酸、デオキシグアノシン、デオキシグアノシン一リン酸、グアニンであり、さらにより好ましくはグアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、又はデオキシグアノシンである。１〜４個のＣを付加するにはデオキシグアノシン、デオキシグアノシン一リン酸が特に適している。 ５個以上のＣを付加するか、可逆的にブロックされた修飾塩基を用いて１個ずつ塩基を付加する場合には、グアノシン一リン酸及びグアノシン二リン酸が適している。 
【００４４】
理論に束縛されないが、これらのグアニン、グアニンを含むヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又はその誘導体は、付加される塩基の材料となるｄＣＴＰと一過的にワトソン−クリック対合することでＣの付加反応を促進すると考えられる。
【００４５】
グアニン、グアニンを含むヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又はその誘導体である促進化合物の反応溶液中の濃度は、化合物によって異なり得るが、好ましくは０．１〜１００ｍＭである。グアノシンの反応溶液中の濃度は好ましくは、グアノシンの飽和濃度の約２０〜４０％、より好ましくは約４０％である。
【００４６】
グアノシン一リン酸の濃度は好ましくは０．１〜１００ｍＭ、最も好ましくは約２ｍＭ〜２０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭである。グアノシン二リン酸の濃度は好ましくは０．１〜１００ｍＭ、好ましくは約２ｍＭ〜約１０ｍＭ、最も好ましくは約５ｍＭである。グアノシン三リン酸の濃度は好ましくは約２ｍＭである。 デオキシグアノシンの濃度は好ましくは、デオキシグアノシンの飽和濃度の約３０〜約５０％、より好ましくは約４０％である。 デオキシグアノシン一リン酸の濃度は好ましくは約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭである。グアニンの濃度は好ましくは約２ｍＭである。 
【００４７】
二本鎖ＤＮＡの３’末端へ付加する塩基がチミンの場合、好ましい促進化合物は、アデニン、アデノシン若しくはデオキシアデノシン、アデノシン若しくはデオキシアデノシンを有するヌクレオチド（一リン酸、二リン酸、又は三リン酸）、これらの環化物、又は塩基の付加を促進する作用を有するこれらの誘導体である。好ましい具体例としては、アデノシン、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、デオキシアデノシン、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシアデノシン二リン酸、デオキシアデノシン三リン酸、サイクリックアデノシン一リン酸、アデニンが挙げられる。より好ましくは促進化合物は、アデノシン、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、デオキシアデノシン、デオキシアデノシン一リン酸、アデニンであり、さらにより好ましくはアデノシン及びデオキシアデノシンである。
【００４８】
理論に束縛されないが、これらのアデニン、アデニンを含むヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又はその誘導体は、付加される塩基の材料となるｄＴＴＰと一過的にワトソン−クリック対合することでＴの付加反応を促進すると考えられる。
【００４９】
アデニン、アデニンを含むヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又はその誘導体である促進化合物の反応溶液中の濃度は、化合物によって異なり得るが、好ましくは０．１〜１００ｍＭである。アデノシンの濃度は、好ましくはアデノシンの飽和濃度の約２０〜４０％、最も好ましくは約４０％である。デオキシアデノシンの濃度は、好ましくはデオキシアデノシンの飽和濃度の約３０〜約４０％であり、最も好ましくは約４０％である。アデノシン二リン酸の濃度は好ましくは１ｍＭから１０ｍＭであり、最も好ましくは約５ｍＭである。アデノシン一リン酸の濃度は、好ましくは０．１〜１００ｍＭ、好ましくは約２ｍＭ〜約２０ｍＭであり、最も好ましくは約１０ｍＭである。デオキシアデノシン一リン酸の濃度は好ましくは約５ｍＭ〜約２０ｍＭであり、最も好ましくは約１０ｍＭである。アデニンの濃度は好ましくは１０ｍＭである。アデノシン三リン酸の濃度は好ましくは２ｍＭである。 
【００５０】
二本鎖ＤＮＡの３’末端へ付加する塩基がグアニンの場合、好ましい促進化合物は、シトシン、シチジン若しくはデオキシシチジン、シチジン若しくはデオキシシチジンを有するヌクレオチド（一リン酸、二リン酸、又は三リン酸）、これらの環化物、又は塩基の付加を促進する作用を有するこれらの誘導体である。好ましい具体例としては、シチジン、シチジン一リン酸、シチジン二リン酸、シチジン三リン酸、デオキシシチジン、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン二リン酸、デオキシシチジン三リン酸、シトシンが挙げられる。より好ましくは促進化合物は、シチジン、シチジン一リン酸、シチジン二リン酸、シチジン三リン酸、デオキシシチジン、デオキシシチジン一リン酸、シトシンであり、さらにより好ましくはデオキシシチジ及びシチジンである。
【００５１】
６個以下のＧを付加するにはデオキシシチジンが適しており、５個以下のＧを付加するにはシチジンが適している。 ５個以上のＣを付加するか、可逆的ブロックされた修飾塩基を用いて１個ずつ塩基を付加する場合には、シチジン二リン酸が適している。 
【００５２】
理論に束縛されないが、これらのシチジン、シチジンを含むヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又はその誘導体は、付加される塩基の材料となるｄＧＴＰと一過的にワトソン−クリック対合することでＧの付加反応を促進すると考えられる。
【００５３】
シチジン、シチジンを含むヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又はその誘導体の反応溶液中の濃度は、化合物によって異なり得るが、好ましくは０．１〜１０００ｍＭである。シチジンの濃度は好ましくは０．１〜１００ｍＭ、より好ましくは約３０ｍＭ〜約７０ｍＭ、最も好ましくは約５０ｍＭである。シチジン一リン酸の濃度は好ましくは約０．１〜約１００ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ〜３０ｍＭ、最も好ましくは約３０ｍＭである。シチジン二リン酸の濃度は好ましくは約１〜約１０ｍＭ、より好ましくは約２ｍＭである。 シチジン三リン酸の濃度は好ましくは約１〜約１０ｍＭ、より好ましくは約２ｍＭである。 デオキシシチジンの濃度は好ましくは約１００ｍＭから約３００ｍＭ、最も好ましくは約２００ｍＭである。 デオキシシチジン一リン酸の濃度は好ましくは約０．１〜約１００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、最も好ましくは約１５ｍＭである。シトシンの濃度は好ましくは約０．１〜約１００ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭである。 
【００５４】
二本鎖ＤＮＡの３’末端へ付加する塩基がアデニンの場合、好ましい促進化合物は、チミン；５−メチルウリジン、チミジン、ウリジン、若しくはデオキシウリジン５−メチルウリジン、チミジン、ウリジン、若しくはデオキシウリジンを有するヌクレオチド（一リン酸、二リン酸、又は三リン酸）、これらの環化物、又は塩基の付加を促進する作用を有するこれらの誘導体である。
【００５５】
理論に束縛されないが、これらのチミン、チミンを含むヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又はその誘導体は、付加される塩基の材料となるｄＡＴＰと一過的にワトソン−クリック対合することでＡの付加反応を促進すると考えられる。
【００５６】
チミン、チミンを含むヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又はその誘導体である促進化合物の反応溶液中の濃度は、化合物によって異なり得るが、好ましくは０．１〜１００ｍＭである。 
【００５７】
本発明はさらに、一方又は両方の鎖の３’末端にモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて下記の（７）〜（１２）のいずれかの塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、（７）〜（１２）のいずれかの塩基と相補的な塩基を３’末端に有する塩基からなる一本鎖アダプターＤＮＡとモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて、前記一本鎖アダプターＤＮＡ及びその相補鎖ＤＮＡからなる二本鎖アダプターＤＮＡが連結したＤＮＡを作製する方法を提供する（図２）。
【００５８】
（７）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（８）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）
（９）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）
（１０）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
（１１）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（１２）前記（７）〜（１１）のいずれかの修飾塩基
【００５９】
好ましい一実施形態では、上記（７）〜（１２）の各塩基の数は以下の通りである。
（７）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（８）１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するシトシン（Ｃ）
（９）１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するグアニン（Ｇ）
（１０）１個、２個、３個、又は４個のチミン（Ｔ）
（１１）２個、３個、４個、５個、又は６個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（１２）前記（７）〜（１１）のいずれかの修飾塩基
【００６０】
一本鎖アダプターＤＮＡの３’末端の相補的な塩基の数は限定されないが、一つの好ましい実施形態では、一本鎖アダプターＤＮＡは３’末端に、連続する１〜１０個のアデニン（Ａ）、１〜１０個のシトシン（Ｃ）、１〜１０個のグアニン（Ｇ）、１〜１０個のチミン（Ｔ）又はそれらのいずれかの修飾塩基を有する。別の好ましい実施形態では、一本鎖アダプターＤＮＡは３’末端に、連続する２個以上のアデニン（Ａ）、連続する２個以上のシトシン（Ｃ）、連続する２個以上のグアニン（Ｇ）、連続する２個以上のチミン（Ｔ）又はそれらのいずれかの修飾塩基を有する。この場合、塩基の上限は好ましくは１０個以下、より好ましくは６個以下である。  好ましい実施形態では、一本鎖アダプターＤＮＡは３’末端に、１〜６個のアデニン（Ａ）、１〜６個のシトシン（Ｃ）、１〜６個のグアニン（Ｇ）、１〜６個のチミン（Ｔ）又はそれらのいずれかの修飾塩基を有する。より好ましい実施形態では、一本鎖アダプターＤＮＡは３’末端に、２〜６個のアデニン（Ａ）、２〜６個のシトシン（Ｃ）、２〜６個のグアニン（Ｇ）、２〜６個のチミン（Ｔ）又はそれらのいずれかの修飾塩基を有する。さらに好ましい実施形態では、一本鎖アダプターＤＮＡは３’末端に、２〜６個のシトシン（Ｃ）、２〜６個のグアニン（Ｇ）、又はそれらのいずれかの修飾塩基を有する。
【００６１】
一本鎖アダプターＤＮＡの３’末端の相補的な塩基を構成するオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドより形成してもよいし、部分的に又は全部をリボヌクレオチドより形成してもよい。例えば、一本鎖アダプターＤＮＡは３’末端の連続する１〜１０個のアデニン（Ａ）、１〜１０個のシトシン（Ｃ）、１〜１０個のグアニン（Ｇ）、１〜１０個のチミン（Ｔ）又はそれらのいずれかの修飾塩基を構成するオリゴヌクレオチドを、すべてデオキシリボヌクレオチドとしてもよいし、リボヌクレオチドとしてもよい。本明細書において、一本鎖アダプターＤＮＡの一部がリボヌクレオチドより構成されている場合も「一本鎖アダプターＤＮＡ」の用語に含まれる。
【００６２】
平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡの３’末端に、（７）〜（１２）のいずれかの塩基を突出させた上で（図２の反応（１））、ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて、任意の短い塩基配列を有する一本鎖アダプターＤＮＡを鋳型として相補鎖ＤＮＡを合成することにより、二本鎖を伸張させることができる（図２の反応（２））。
【００６３】
本発明は、平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡの３’末端に、（７）〜（１２）のいずれかの塩基を突出させた上で（図２の反応（１））、ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて、突出塩基と相補的な塩基配列を有しかつ３’末端がデオキシ末端である任意の短い塩基配列を有する一本鎖アダプターＤＮＡを鋳型として相補鎖ＤＮＡを合成し、一本鎖アダプターＤＮＡを上記相補鎖ＤＮＡから解離させ、上記相補鎖ＤＮＡが付加された上記二本鎖ＤＮＡを製造する方法も提供する。３’末端がデオキシ末端である一本鎖アダプターＤＮＡと上記平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡとの間にはニックがあるため、熱を加えることにより３’末端がデオキシ末端である一本鎖アダプターＤＮＡは、これに相補的な付着末端を有する二本鎖ＤＮＡから解離させることができる。
【００６４】
一本鎖アダプターＤＮＡの全体の長さの下限値は、好ましくは４塩基以上であり、例えば８塩基以上、１２塩基以上、１６塩基以上、又は２０塩基以上である。一本鎖アダプターＤＮＡの全体の長さの上限値は、好ましくは１００塩基以下、より好ましくは７５塩基以下である。
【００６５】
二本鎖ＤＮＡの３’末端に突出させた塩基と一本鎖アダプターＤＮＡの３’末端の塩基の少なくとも一部は相補的であり、好ましくは、二本鎖ＤＮＡに付加される塩基が１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のグアニン（Ｇ）であり、一本鎖アダプターＤＮＡが１〜１０個のシトシン（Ｃ）を３’末端に有するか、二本鎖ＤＮＡに付加される塩基が１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のシトシン（Ｃ）であり、一本鎖アダプターＤＮＡが１〜１０個のグアニン（Ｇ）を３’末端に有する。
【００６６】
一本鎖アダプターＤＮＡを鋳型に作製した二本鎖アダプターＤＮＡの、二本鎖ＤＮＡへの付加効率は、好ましくは９０％以上である。
【００６７】
一実施形態において、一本鎖アダプターＤＮＡはＮ1Ｎ2Ｎ3…Ｎnで示される配列を有し、Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3…Ｎnは各々同一であっても異なってもよいアデニン、シトシン、グアニン、又はチミンを示す。ｎは整数であり、好ましくは１から１００、より好ましくは４から３０の整数である。つまり、一本鎖アダプターＤＮＡは一つの分子内に塩基をｎ個含み、ｎ個の塩基の各々は同一又は異なってアデニン、シトシン、グアニン、又はチミンである。一つの分子内の塩基はアデニン、シトシン、グアニン、又はチミンのうちの一種類、二種類、三種類又は四種類であってもよい。
【００６８】
好ましくは、一本鎖アダプターＤＮＡはＮに関してアデニン、シトシン、グアニン、及びチミンを等量ずつ含むＤＮＡの混合物である。一本鎖アダプターＤＮＡをいわゆるミックス塩基の構成とすることで、かかる一本鎖ＤＮＡは分子タグなどと呼ばれるお互いに異なる配列をこの部分に有することとなる。アダプターＤＮＡを結合させたＤＮＡをＰＣＲなどによって増幅させた場合に、もともと同じＤＮＡ分子に由来するＤＮＡ分子が同じ配列をこの部分に有することを利用すると、一様ではないＰＣＲによる増幅の影響を取り除いてデータを解析できる。
【００６９】
一本鎖アダプターＤＮＡは、天然の供給源（例えば、種々の生物体の細胞、組織、又は器官）から得られたＤＮＡ又はそれを加工したものであってもよいし、当業者に周知の標準的なＤＮＡ合成法に従って合成されたものであってもよい。生物体としては原核生物、真核生物、植物、動物等が挙げられる。
【００７０】
一本鎖アダプターＤＮＡはさらに、化学的修飾又は酵素的修飾をされてもよい。化学的修飾又は酵素的修飾については二本鎖ＤＮＡに関して上述した通りである。一本鎖アダプターＤＮＡの３’末端にホスホロチオエート基を導入すると反応中の一本鎖アダプターの分解が抑制されるため好ましい。また、一本鎖アダプターＤＮＡの３’末端をデオキシ末端にすると一本鎖アダプターＤＮＡ同士がアニーリングして逆転写酵素による伸長反応が起きることを抑制できるため好ましい。
【００７１】
本発明はさらに、一方又は両方の鎖の３’末端にモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて下記の（１３）〜（１８）のいずれか塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、前記（１３）〜（１８）のいずれかの塩基と相補的な塩基が一方又は両方の鎖の３’末端に付加された二本鎖アダプターＤＮＡを、リガーゼを用いて連結することを含む、二本鎖アダプターＤＮＡが連結したＤＮＡを作製する方法を提供する（図３）。
【００７２】
（１３）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（１４）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）
（１５）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）
（１６）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
（１７）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（１８）前記（１３）〜（１７）のいずれかの修飾塩基
【００７３】
好ましい一実施形態では、上記（１３）〜（１８）の各塩基の数は以下の通りである。  （１３）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（１４）１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するシトシン（Ｃ）
（１５）１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するグアニン（Ｇ）
（１６）１個、２個、３個、又は４個のチミン（Ｔ）
（１７）２個、３個、４個、５個、又は６個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（１８）前記（１３）〜（１７）のいずれかの修飾塩基
二本鎖アダプターＤＮＡは、一方又は両方の鎖の３’末端に、１〜４個の連続するアデニン（Ａ）、１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）、１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）、１〜４個の連続するチミン（Ｔ）又はそれらのいずれかの修飾塩基の突出を有する。
【００７４】
平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡの３’末端に、（１３）〜（１６）のいずれかの塩基を突出させた上で、これと相補的な３’突出末端を有する二本鎖アダプターＤＮＡを作用させることで、二本鎖アダプターＤＮＡが二本鎖ＤＮＡに従来達成し得なかった高い効率で付加される。
【００７５】
好ましくは、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に付加される塩基が１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するグアニン（Ｇ）であり、二本鎖アダプターＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの３’末端に対応する３’末端に１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するシトシン（Ｃ）を有するか、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖に付加される塩基が１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するシトシン（Ｃ）であり、二本鎖アダプターＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの３’末端に対応する３’末端に１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するグアニン（Ｇ）を有する。
【００７６】
二本鎖アダプターＤＮＡの５’末端にはリン酸基が付加されていることが好ましい。
【００７７】
二本鎖アダプターＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの付加効率は、好ましくは９０％以上である。
【００７８】
二本鎖アダプターＤＮＡは、天然の供給源（例えば、種々の生物体の細胞、組織、又は器官）から得られたＤＮＡ又はそれを加工したものであってもよいし、当業者に周知の標準的なＤＮＡ合成法に従って合成されたものであってもよい。生物体としては原核生物、真核生物、植物、動物等が挙げられる。
【００７９】
二本鎖アダプターＤＮＡはさらに、化学的修飾又は酵素的修飾をされてもよい。化学的修飾又は酵素的修飾については二本鎖ＤＮＡに関して上述した通りである。また、二本鎖アダプターＤＮＡはさらに、制限酵素切断部位を有していてもよい。制限酵素の例としては、AluI、Eco47III、EcoRV、FspI、HpaI、MscI、NruI、PvuII、RsaI、ScaI、SmaI、SspI、StuI、ThaI、AvaI、BamHI、BanII、BglII、ClaI、EcoRI、HindIII、HpaII、KpnI、MseI、NcoI、NdeI、NotI、PstI、PvuI、SacI/SstI、SalI、XbaI、XhoI、及びI-CeuIが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
本発明はさらに、一方又は両方の鎖の３’末端に下記の（１９）〜（２４）のいずれかの塩基が付加された二本鎖ＤＮＡを作製するためのキットであって、
モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を収容する第１の容器
を備えたキットを提供する。
【００８１】
（１９）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（２０）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）
（２１）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）
（２２）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
（２３）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（２４）前記（１９）〜（２３）のいずれかの修飾塩基
【００８２】
好ましい一実施形態では、上記（１９）〜（２４）の各塩基の数は以下の通りである。  （１９）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（２０）１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するシトシン（Ｃ）
（２１）１個、２個、３個、４個、５個、又は６個の連続するグアニン（Ｇ）
（２２）１個、２個、３個、又は４個のチミン（Ｔ）
（２３）２個、３個、４個、５個、又は６個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（２４）前記（１９）〜（２３）のいずれかの修飾塩基
また、上記キットは、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のうちの少なくとも一つを収容する第２の容器をさらに備えていてもよい。
【００８３】
デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のうちの少なくとも一つは上記（１９）〜（２４）の付加される塩基の構成成分として使用されるヌクレオチドである。
【００８４】
本発明のキットはさらに、上述の塩基の付加を促進する化合物を備えていてもよい。上記促進化合物の種類と濃度は上述の通りである。上記促進化合物は、上記第２の容器に収容されてもよいし、第１の容器及び第２の容器とは異なる第３の容器に収容されてもよい。
【００８５】
二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’平滑末端に上記（１９）〜（２４）のいずれかの塩基を付加する方法については、図１を参照しながら上記に説明した通りである。二本鎖ＤＮＡへの上記（１９）〜（２４）のいずれかの塩基の付加は、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて行うことができる。
【００８６】
本発明のキットはさらに、ＭｎＣｌ2、二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加に必要な追加の試薬（例えば緩衝液）などを備えてもよい。
【００８７】
なお、上記（１）〜（４）、（７）〜（１０）、（１３）〜（１６）、（１９）〜（２２）の各々に関して、一種類の塩基を付加する場合は、当業者に理解されるように、例えば一種類のデオキシヌクレオチド（アデニンを付加する場合はｄＡＴＰ、シトシンを付加する場合はｄＣＴＰ、グアニンを付加する場合はｄＧＴＰ、チミンを付加する場合はｄＴＴＰ）を用いてＤＮＡの３’末端にデオキシヌクレオチドを重合することができる。
【００８８】
また、上記（１）〜（６）、（７）〜（１２）、（１３）〜（１８）、（１９）〜（２４）の各々に関して、一種類の塩基又は二種類以上の塩基の組み合わせを付加する場合は、当業者に理解されるように、例えば３’端がアジドメチル基等の官能基により可逆的にブロックされた修飾塩基を用いて１塩基を突出させた後に、ブロックを外し、修飾のないアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のいずれか１つが３’端に突出した二本鎖ＤＮＡを作製し、次に、これに対して更に３’端が可逆的にブロックされた修飾塩基を伸長させ、ブロックを外し、更に１つアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のいずれか１つであって先の塩基と同一又は異なる塩基を伸長させ、これを繰り返すことで、ＧＧ、ＡＧ、ＡＧ、ＧＡ、ＣＧ、ＣＡ等、制御した様式で塩基を付加することができる。
【００８９】
本明細書中に引用されているすべての特許出願及び文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００９０】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００９１】
実施例１  片方の末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐ  ＤＮＡの調製方法
３００ｂｐのＤＮＡ断片をＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン水和物）標識されたプライマーでＰＣＲ増幅した。これをＰｖｕＩＩ処理して生じた７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片をポリアクリルアミドゲルより精製した（図４）。当該ＤＮＡ断片のＦＡＭ標識されていない方の５’末端にはリン酸基がついている。【００９２】
実施例２  二本鎖ＤＮＡの平滑末端へのＡ、Ｃ、Ｇ又はＴの付加
片方の５’末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片（Ａ）、このＤＮＡ断片の３’末端にＭＭＬＶ逆転写酵素（SMARTSCRIBETM、タカラバイオ株式会社）を用いてアデニン付加反応を行った反応産物（Ｂ）、シトシン付加反応を行った反応産物（Ｃ）、グアニン付加反応を行った反応産物（Ｄ）、及びチミン付加反応を行った反応産物（Ｅ）を、キャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析に用いた。各反応は、１０ｎＭ  ＤＮＡ、２ｍＭ  ＭｎＣｌ2、及びそれぞれ ４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの各々の存在下で、３７℃で６０分行った。【００９３】
キャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析では、各ＤＮＡサンプルを、予めLIZ500サイズスタンダードと混合したHiDi Formamide（ThermoFisher SCIENTIFIC社）に加え、９６度で４分熱変性し、Applied Biosystemsのモデル3130xlシーケンサーにより解析した。【００９４】
解析結果を図５に示す。青線がＦＡＭ、オレンジ線がLIZ500サイズスタンダードによるシグナルを表す。以下、実施例３、４、６のフラグメント解析も実施例２と同じ条件及び装置で行った。【００９５】
図５に示すように、本実施例の条件では、アデニン付加反応では２個、３個、及び４個のアデニンが付加されたＤＮＡ断片のピークが観察され、シトシン付加反応では１個及び２個のシトシンが付加されたＤＮＡ断片のピークが観察され、グアニン付加反応では２個及び３個のグアニンが付加されたＤＮＡ断片のピークが観察され、チミン付加反応では１個、２個及び３個のチミンが付加されたＤＮＡ断片のピークが観察された。【００９６】
実施例３  一本鎖ＤＮＡを用いた二本鎖ＤＮＡの末端へのアダプターＤＮＡの連結
片方の５’末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片（Ａ）、このＤＮＡ断片の３’末端にグアニン付加反応を行った反応産物（Ｂ）、グアニン付加反応後にさらにガイドアダプターオリゴヌクレオチド（ＧＡＯ）とＭＭＬＶ逆転写酵素（SMARTScribeTM、タカラバイオ株式会社）を用いてＤＮＡ断片にアダプター配列を連結した反応産物（Ｃ）、及び（Ｃ）をＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理したＧＡＯ連結反応産物（Ｄ）を、キャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析に用いた。使用したＧＡＯはアダプターオリゴヌクレオチド１（ＳＡ５７７とも称する）：５’−ＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＣＣ−３’（配列番号２）である。グアニン付加反応は５０ｎＭ  ＤＮＡ、２ｍＭ  ＭｎＣｌ2、４ｍＭ  ｄＧＴＰの条件で３０℃で１５分行った。ＧＡＯとの反応には、０．１ｐｍｏｌの（Ｂ）のグアニン付加反応の反応産物と２ｐｍｏｌのＳＡ５７７を使用し、反応は３７℃で３０分間行った。【００９７】
解析結果を図６に示す。ピークの面積より、上記ＤＮＡ断片へのＧＡＯの連結効率は９７％と測定され、一本鎖ＤＮＡであるアダプターオリゴヌクレオチドを用いて、二本鎖ＤＮＡアダプターをＤＮＡ断片に高効率で連結できることが確認された。【００９８】
実施例４  一本鎖ＤＮＡを用いた二本鎖ＤＮＡの末端へのアダプターＤＮＡの連結
片方の５’末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片（Ａ）、このＤＮＡ断片の３’末端にグアニン付加反応を行った反応産物（Ｂ）、及びグアニン付加反応後にガイドアダプターオリゴヌクレオチド（ＧＡＯ）とＭＭＬＶ逆転写酵素（SMARTScribeTM、タカラバイオ株式会社）を用いてＤＮＡ断片にアダプター配列を連結した反応産物（Ｃ）を、キャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析に用いた。使用したＧＡＯはアダプターオリゴヌクレオチド２（ＳＡ６１７とも称する）：５’−ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣ＊Ｃ＊ＣｄＯＨ−３’（配列番号３）である。配列の３’末端のｄＯＨはデオキシ末端であることを、＊はホスホロチオエート基を表す。グアニン付加反応は１００ｎＭ  ＤＮＡ、４ｍＭ  ＭｎＣｌ2、４ｍＭ  ｄＧＴＰの条件で３０℃で１時間行った。ＧＡＯとの反応には、０．１ｐｍｏｌの（Ｂ）のグアニン付加反応の反応産物と２ｐｍｏｌのＳＡ６１７を使用し、反応は３７℃で２時間行った。
解析結果を図７に示す。ピークの面積より、上記ＤＮＡ断片へのＧＡＯの連結効率は９３％と測定され、一本鎖ＤＮＡであるアダプターオリゴヌクレオチドを用いて、二本鎖ＤＮＡアダプターをＤＮＡ断片に高効率で連結できることが確認された。【００９９】
実施例５  一本鎖ＤＮＡを用いた二本鎖ＤＮＡの末端へのアダプターＤＮＡの連結のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染色による確認
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて調製した３００ｂｐのＰＣＲ産物（レーン１）、このＤＮＡ断片の３’末端にＭＭＬＶ逆転写酵素（SMARTScribeTM、タカラバイオ株式会社）を用いてグアニン付加反応を行った反応産物（レーン２）、及びグアニン付加反応後にさらにガイドアダプターオリゴヌクレオチド（ＧＡＯ）とＭＭＬＶ逆転写酵素とを用いてＤＮＡ断片にアダプター配列を連結した反応産物（レーン３）、及び１００ｂｐマーカー（レーン４）を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染色後撮影した。グアニン付加反応は５０ｎＭ  ＤＮＡ、４ｍＭ  ＭｎＣｌ2、４ｍＭ  ｄＧＴＰの条件で３０℃で４０分行った。ＧＡＯとの反応には、０．１ｐｍｏｌのグアニン付加反応の反応産物と２ｐｍｏｌのＳＡ５７７を使用し、反応は３７℃で２時間行った。【０１００】
結果を図８に示す。画像は１つの泳動画像を加工したものであり、黒の縦線は画像を張り合わせた部分を示す。レーン１及びレーン２にはそれぞれＰＣＲ産物とグアニン付加反応後の反応産物のバンドが観察され、レーン３には二本のバンドが観察された。レーン３で見られるサイズの小さいバンドは片側末端に、大きいバンドは両側末端にＧＡＯが付加した産物である。【０１０１】
実施例６  二本鎖ＤＮＡの末端への二本鎖アダプターＤＮＡのリガーゼによる連結
片方の５’末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片（Ａ）、このＤＮＡ断片の３’末端にＭＭＬＶ逆転写酵素（SMARTScribeTM、タカラバイオ株式会社）を用いてグアニン付加反応を行った反応産物（Ｂ）、及びグアニン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ  Ｃ１〜Ｃ４の等量混合物であるＣmix1-4とライゲーション反応を行った産物（Ｃ）を、キャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析に用いた。グアニン付加反応は１００ｎＭ  ＤＮＡ、２ｍＭ  ＭｎＣｌ2、４ｍＭ  ｄＧＴＰの条件で３０℃で９０分行った。ライゲーション反応には、TAKARA Bio社のLigation kitを使用し、０．１ｐｍｏｌの（Ｂ）のグアニン付加反応の反応産物と２ｐｍｏｌのＣmix1-4を使用し、１６℃で１０分間行った。【０１０２】
二本鎖アダプターＤＮＡ  Ｃ１〜Ｃ４の配列は以下に示す通りである。Ｐはリン酸基を表す。【０１０３】
解析結果を図９に示す。ピークの面積より、上記ＤＮＡ断片へのＧＡＯの連結効率は９８％と測定され、二本鎖ＤＮＡであるアダプターＤＮＡをＤＮＡ断片に高効率で連結できることが確認された。【０１０４】
Ｃ１    ５’  Ｐ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
３’−ＣＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号５）
Ｃ２    ５’  Ｐ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
３’−ＣＣＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号６）
Ｃ３    ５’  Ｐ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
３’−ＣＣＣＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号７）
Ｃ４    ５’  Ｐ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
３’−ＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号８）【０１０５】
実施例７  二本鎖ＤＮＡの末端への二本鎖アダプターＤＮＡの連結のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染色による確認
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて調製した３００ｂｐのＰＣＲ産物（レーン１）、このＤＮＡ断片の３’末端にＭＭＬＶ逆転写酵素（SMARTScribeTM、タカラバイオ株式会社）を用いてグアニン付加反応を行った反応産物（レーン２）、アデニン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ  Ｔ１〜Ｔ４の等量混合物であるＴmix1-4とライゲーション反応を行った産物（レーン３）、シトシン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ  Ｇ１〜Ｇ４の等量混合物であるＧmix1-4とライゲーション反応を行った産物（レーン４）、グアニン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ  Ｃ１〜Ｃ４の等量混合物であるＣmix1-4とライゲーション反応を行った産物（レーン５）、チミン付加反応後に４種の二本鎖アダプターＤＮＡ  Ａ１〜Ａ４の等量混合物であるＡmix1-4とライゲーション反応を行った産物（レーン６）及び１００ｂｐマーカー（両側のレーン）をライゲーションした産物を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染色後撮影した。シトシン付加反応、グアニン付加反応及びチミン付加反応は４ｍＭ  ＭｎＣｌ2、１０ｎＭ  ＤＮＡ、４ｍＭ  ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ又はｄＴＴＰの条件で３０℃で４５分行った。アデニン付加反応はＭｎＣｌ2を含まない反応溶液でｄＡＴＰの存在下で同様の条件で行った。【０１０６】
Ｔmix1-4、Ｇmix1-4、Ｃmix1-4、Ａmix1-4は、配列番号９の２０ｂｐのＤＮＡの一方のＤＮＡ末端からＴ、Ｇ、Ｃ、Ａが１〜４塩基突出したものを等量ずつ混合したものである。Ｃmix1-4は実施例６で説明した通りである。二本鎖アダプターＤＮＡ Ｔ１〜Ｔ４、Ｇ１〜Ｇ４、Ａ１〜Ａ４の配列は以下に示す通りである。Ｐはリン酸基を表す。【０１０７】
３’−ＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号９）
結果を図１０に示す。レーン１及びレーン２にはそれぞれＰＣＲ産物とグアニン付加反応後の反応産物のバンドが観察された。レーン３から６で３本見えるバンドは、下側のバンドはライゲーションされなかったＤＮＡ断片であり、真ん中のバンドはＤＮＡ断片の片側末端にアダプターが連結された産物であり、上側のバンドはＤＮＡ断片の両側末端にアダプターが連結された産物である。本実施例でも、二本鎖ＤＮＡであるアダプターＤＮＡをＤＮＡ断片に高効率で連結できることが確認された。
Ｔ１    ５’  Ｐ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
３’−ＴＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号１０）
Ｔ２    ５’  Ｐ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
３’−ＴＴＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号１１）
Ｔ３    ５’  Ｐ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
３’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号１２）
Ｔ４    ５’  Ｐ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
３’−ＴＴＴＴＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号１３）
Ｇ１    ５’  Ｐ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
３’−ＧＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号１４）
Ｇ２    ５’  Ｐ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
３’−ＧＧＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号１５）
Ｇ３    ５’  Ｐ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
３’−ＧＧＧＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号１６）
Ｇ４    ５’  Ｐ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
３’−ＧＧＧＧＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号１７）
Ａ１    ５’  Ｐ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
３’−ＡＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号１８）
Ａ２    ５’  Ｐ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
３’−ＡＡＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号１９）
Ａ３    ５’  Ｐ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
３’−ＡＡＡＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号２０）
Ａ４    ５’  Ｐ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
３’−ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＡＧ−５’（配列番号２１）【０１０８】
実施例８  二本鎖ＤＮＡの末端への修飾塩基の付加
イルミナ株式会社のMiSeq Reagent Kit v3のwell 5 (アンプリフィケーションミックス; AMS1)の内容物をフェノール/クロロフォールム/イソアミルアルコール処理し、遠心した上清をエタノール沈殿した。沈殿をTE bufferに溶解し、260 nmに吸収があることを確認した。AMS1はチミジンのピリミジン塩基の5位が蛍光色素で修飾され、かつ糖の３’端にアジドメチル基が付加されたヌクレオチドを含み、塩基には4種類の修飾塩基を含んでいる。 【０１０９】
片方の５’末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片（Ａ）、このＤＮＡ断片とAMS1の当該溶液を、４ｍＭ  ＭｎＣｌ2の存在下でモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素と３０℃で３０分反応させた産物（Ｂ）、さらにこの産物を上記キットのReagent Trayのwell 4 (クリベージミックス)の内容物と６５℃で３０分反応させた産物（Ｃ）をキャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析に用いた。 【０１１０】
結果を図１１に示す。パネル（Ｂ）で見られるブロードなピークは、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素が、かかる修飾塩基を２本鎖ＤＮＡ末端に付加可能であることを示している。 また、パネルＣではクリベージミックスと作用させることでピークの位置が大きく変わっているが、これは塩基の部分にある発蛍光団がクリベージミックスの作用で脱離したことがＤＮＡ分子の負電荷を減少させたことによると推測される。 【０１１１】
実施例９  塩基の付加を促進する添加物の影響
実施例１に記載の片方の５’末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片に、野生型MMLV逆転写酵素(M-MLV Reverse Transcriptase、株式会社ニッポンジーン) を用いて、４ｍＭのＭｎＣｌ2存在下でそれぞれ ４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々を用いてＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの付加反応を３０℃を超える温度で５分間行った。反応産物を、キャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析に用いた。【０１１２】
反応溶液中に添加物を加えないときの結果と、終濃度１０ｍＭとなるようｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰを添加物として加えたときの結果を図１２（Ａ）〜（Ｆ）に示す。その結果、Ｃの付加反応をｄＧＭＰが、Ｇの付加反応をｄＣＭＰが、Ｔの付加反応をｄＡＭＰが促進することが確認された。【０１１３】
実施例１０  塩基の付加を促進する添加物の有無の効果の比較
ＦＡＭ標識されたプライマーで増幅して得られた片方の５’末端をＦＡＭ標識した２８０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片に、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素（M-MLV Reverse Transcriptase、株式会社ニッポンジーン）を用いて、４ｍＭ  ＭｎＣｌ2、４ｍＭ  ｄＧＴＰ存在下で、Ｇの付加反応を３０℃で行った。（Ａ）はデオキシシチジンを添加せず、（Ｂ）はデオキシシチジンを終濃度２００ｍＭで添加した場合、（Ｃ）デオキシシチジン一リン酸を最終濃度２ｍＭで添加した結果を図１３に示す。【０１１４】
デオキシシチジン及びデオキシシチジン一リン酸を反応溶液に加えた場合、これらの化合物を添加しない場合に比べて、末端のグアニンの付加数が多い平滑末端ＤＮＡの割合が増大しており、デオキシシチジン及びデオキシシチジン一リン酸は平滑末端ＤＮＡへのグアニンの付加を促進することが確認された。【０１１５】
実施例１１  塩基の付加を促進する添加物の種類の検討
実施例９と同様に、片方の５’末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片に、野生型MMLV逆転写酵素(M-MLV Reverse Transcriptase、株式会社ニッポンジーン) を用いて、４ｍＭのＭｎＣｌ2存在下でそれぞれ ４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々を用いてＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの付加反応を３０℃を超える温度で５分間行った。付加反応前、反応溶液中に化合物を添加しない場合、各種化合物を付加した場合で、反応溶液をフラグメント解析に用いた。結果を図１４に示す。【０１１６】
シトシンの付加に対し、グアノシン、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、グアノシン三リン酸、デオキシグアノシン、デオキシグアノシン一リン酸、グアニンは促進効果があることが判明した。【０１１７】
また、グアニンの付加に対し、シチヂン、シチヂン一リン酸、シチヂン二リン酸、シチヂン三リン酸、デオキシシチヂン、デオキシシチヂン一リン酸、シトシンは促進効果があることが判明した。【０１１８】
さらに、チミンの付加に対し、アデノシン、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、デオキシアデノシン、デオキシアデノシン一リン酸、アデニンは促進効果があることが判明した。【０１１９】
実施例１２  最大２０個の付加を促進する添加物
実施例９と同様に、片方の５’末端がＦＡＭ標識された７０ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片に、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素（M-MLV Reverse Transcriptaseｅ、株式会社ニッポンジーン）を用いて、４ｍＭ  ＭｎＣｌ2の存在下で、(Ｂ)から（Ｄ）はＣの付加を、(Ｅ)と(Ｆ)はＧの付加反応を３０℃で２時間行った。（Ａ）は反応前、(Ｃ)は５ｍＭのグアノシン一リン酸存在下で、(Ｄ)は１０ ｍＭのグアノシン二リン酸存在下で行った。 (Ｆ)は２ｍＭのシチジン二リン酸存在下で行った。結果を図１５に示す。シトシンの付加に対し、グアノシン一リン酸が強力な促進効果を示し、最大２０個のシトシンが付加することが判明した。またグアニンの付加に対し、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸が強力な促進効果を示し、最大２０個のグアニンが付加することが判明した。【０１２０】
以上、本発明の実施形態及び実施例について具体的に説明したが、本発明は、上述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想に基づく各種の変形が可能である。【０１２１】
例えば、上述の実施形態及び実施例において挙げた構成、方法、工程、形状、材料及び数値などはあくまでも例に過ぎず、必要に応じてこれと異なる構成、方法、工程、形状、材料及び数値などを用いてもよい。【０１２２】
また、上述の実施形態の構成、方法、工程、形状、材料及び数値などは、本発明の主旨を逸脱しない限り、互いに組み合わせることが可能である。【０１２３】
また、本発明は以下の構成を採用することもできる。
［項１］モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて、二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端に、下記の（１）〜（６）のいずれかの塩基を付加することを含む、ＤＮＡを作製する方法。
（１）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（２）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）
（３）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）
（４）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
（５）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（６）前記（１）〜（５）のいずれかの修飾塩基
［項２］前記付加される塩基は、２個、３個、若しくは４個のアデニン（Ａ）；２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）；２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）；又は２個、３個、若しくは４個のチミン（Ｔ）である［項１］に記載の方法。
［項３］前記付加される塩基は、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）；若しくは２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）である［項１］に記載の方法。【０１２４】
［項４］  前記二本鎖ＤＮＡの一方又は両方の鎖の３’末端への塩基の付加が、前記塩基の付加を促進する化合物の存在下で行われる［項１］〜［項３］のいずれか一項に記載の方法。
［項５］一方又は両方の鎖の３’末端にモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて下記の（７）〜（１２）のいずれかの塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、前記（７）〜（１２）のいずれかの塩基と相補的な塩基を３’末端に有する塩基からなる一本鎖アダプターＤＮＡと前記モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質とを用いて、一本鎖アダプターＤＮＡとその相補鎖ＤＮＡからなる二本鎖アダプターＤＮＡが連結したＤＮＡを作製する方法。
（７）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（８）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）
（９）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）
（１０）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
（１１）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（１２）前記（７）〜（１１）のいずれかの修飾塩基
［項６］前記（７）〜（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、又は４個のアデニン（Ａ）であり、前記一本鎖アダプターＤＮＡは１〜１０個のチミン（Ｔ）を３’末端に有するか、
前記（７）〜（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）であり、前記一本鎖アダプターＤＮＡは１〜１０個のシトシン（Ｃ）を３’末端に有するか、
前記（７）〜（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）であり、前記一本鎖アダプターＤＮＡは１〜１０個のグアニン（Ｇ）を３’末端に有するか、
前記（７）〜（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、又は４個のチミン（Ｔ）であり、前記一本鎖アダプターＤＮＡは１〜１０個のアデニン（Ａ）を３’末端に有する［項４］に記載の方法。【０１２５】
［項７］前記（７）〜（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）であり、前記一本鎖アダプターＤＮＡは１〜１０個のシトシン（Ｃ）を３’末端に有するか、又は
前記（７）〜（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）であり、前記一本鎖アダプターＤＮＡは１〜１０個のグアニン（Ｇ）を３’末端に有する［項５］に記載の方法。
［項８］前記一本鎖アダプターＤＮＡの長さが４塩基以上１００塩基以下である［項５］〜［項７］のいずれかに記載の方法。
［項９］前記一本鎖アダプターＤＮＡの長さが８塩基以上である［項５］〜［項７］のいずれかに記載の方法。
［項１０］前記一本鎖アダプターＤＮＡの長さが１２塩基以上である［項５］〜［項７］のいずれかに記載の方法。
［項１１］前記一本鎖アダプターＤＮＡの長さが１６塩基以上である［項５］〜［項７］のいずれかに記載の方法。
［項１２］前記一本鎖アダプターＤＮＡの長さが２０塩基以上である［項５］〜［項７］のいずれかにに記載の方法。
［項１３］前記一本鎖アダプターＤＮＡの長さが１００塩基以下である［項５］〜［項１２］のいずれかに記載の方法。
［項１４］前記一本鎖アダプターＤＮＡの長さが７５塩基以下である［項５］〜［項１２］のいずれかに記載の方法。
［項１５］前記一本鎖アダプターＤＮＡはＮ1Ｎ2Ｎ3…Ｎnで示される配列を有し、Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3…Ｎnは各々同一であっても異なってもよいアデニン、シトシン、グアニン、又はチミンを示し、ｎは１から１００の整数である［項５］〜［項１４］のいずれかに記載の方法。
［項１６］前記二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加が、前記塩基の付加を促進する化合物の存在下で行われる［項５］〜［項１５］のいずれか一項に記載の方法。【０１２６】
［項１７］［項５］〜［項１６］のいずれか一項に記載の方法と、
前記一本鎖アダプターＤＮＡを前記相補鎖ＤＮＡから解離させることと
を含む、前記相補鎖ＤＮＡが付加された二本鎖ＤＮＡを製造する方法。
［項１８］一方又は両方の鎖の３’末端にモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を用いて下記の（１３）〜（１８）のいずれか塩基が付加された二本鎖ＤＮＡに、前記（１３）〜（１８）のいずれかの塩基と相補的な塩基が一方又は両方の鎖の３’末端に付加された二本鎖アダプターＤＮＡを、リガーゼを用いて連結することを含む、二本鎖ＤＮＡが結合したＤＮＡを作製する方法。
（１３）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（１４）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）
（１５）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）
（１６）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
（１７）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（１８）前記（１３）〜（１７）のいずれかの修飾塩基
［項１９］前記（１３）〜（１８）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、又は４個のアデニン（Ａ）であり、前記二本鎖アダプターＤＮＡは１個、２個、３個、又は４個のチミン（Ｔ）を３’末端に有するか、
前記（１３）〜（１８）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）であり、前記二本鎖アダプターＤＮＡは１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）を３’末端に有するか、
前記（１３）〜（１８）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）であり、前記二本鎖アダプターＤＮＡは１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）を３’末端に有するか、
前記（１３）〜（１８）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、又は４個のチミン（Ｔ）であり、前記二本鎖アダプターＤＮＡは１個、２個、３個、又は４個のアデニン（Ａ）を３’末端に有する［項１８］に記載の方法。【０１２７】
［項２０］前記（７）〜（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）であり、前記二本鎖アダプターＤＮＡは１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）を３’末端に有するか、又は
前記（７）〜（１２）のいずれかの塩基が１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）であり、前記二本鎖アダプターＤＮＡは１個、２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）を３’末端に有する［項１５］に記載の方法。
［項２１］  前記二本鎖ＤＮＡへの塩基の付加が、前記塩基の付加を促進する化合物の存在下で行われる［項１８］〜［項２０］のいずれか一項に記載の方法。
［項２２］一方又は両方の鎖の３’末端に下記の（１９）〜（２４）のいずれかの塩基が付加された二本鎖ＤＮＡを作製するためのキットであって、
モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素又はその変異型タンパク質を収容する第１の容器
を備えたキット。
（１９）１個、２個、３個、又は４個の連続するアデニン（Ａ）
（２０）１〜２０個の連続するシトシン（Ｃ）
（２１）１〜２０個の連続するグアニン（Ｇ）
（２２）１個、２個、３個、又は４個の連続するチミン（Ｔ）
（２３）２〜２０個の連続する塩基であって、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はチミン（Ｔ）のうちの２種以上の組み合わせ
（２４）前記（１９）〜（２３）のいずれかの修飾塩基
［項２３］デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のうちの少なくとも一つを収容する第２の容器をさらに備える［項２２］に記載のキット。
［項２４］前記付加される塩基は、２個、３個、若しくは４個のアデニン（Ａ）；２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）；２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）；又は２個、３個、若しくは４個のチミン（Ｔ）である［項２２］又は［項２３］に記載のキット。
［項２５］前記付加される塩基は、２個、３個、４個、５個若しくは６個のシトシン（Ｃ）；若しくは２個、３個、４個、５個若しくは６個のグアニン（Ｇ）である［項２２］又は［項２３］に記載のキット。
［項２６］  前記塩基の付加を促進する化合物をさらに備える［項２２］〜［項２５］のいずれか一項に記載のキット。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明の方法によれば、任意の配列の二本鎖ＤＮＡに任意の配列の二本鎖アダプターＤＮＡを高効率で連結することができるため、従来の技術を使用した場合よりも解析を実施するのに必要なＤＮＡ量を減らすことができる。例えば、化石由来のＤＮＡ、培養が困難な細菌のＤＮＡなど、多量にＤＮＡを得ることが難しかった場合の解析が可能となるだけでなく、単一のあるいは限定された数の細胞を解析対象とする解析にも用いることができる。またヒトの臨床診断に際してＤＮＡを調整するのに用いる生体試料の量を低減することが可能である。発明の方法及びキットは、二本鎖ＤＮＡ及びアダプターＤＮＡの塩基配列に制約が無いため、医学、薬学、遺伝子工学、分析等を含む広範な分野で使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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