(57)【要約】  凍結細胞集塊は、間葉系幹細胞が粒状に形成され、凍結状態の細胞集塊である。凍結細胞集塊の製造方法は、間葉系幹細胞にコラーゲンを産生させる因子を含有する増殖培地にて間葉系幹細胞を培養し、間葉系幹細胞から産生されるコラーゲンを含有する粒状の細胞集塊を形成させ、増殖培地から分離した細胞集塊を凍結保存剤とともに凍結保存する。
2017187941.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞が粒状に形成され、凍結状態の細胞集塊である、
ことを特徴とする凍結細胞集塊。
【請求項２】
前記凍結細胞集塊が０．５ｍｍ〜１．５ｍｍ径の粒状である、
ことを特徴とする請求項１に記載の凍結細胞集塊。
【請求項３】
前記凍結細胞集塊が０．８ｍｍ〜１．２ｍｍ径の粒状である、
ことを特徴とする請求項２に記載の凍結細胞集塊。
【請求項４】
間葉系幹細胞にコラーゲンを産生させる因子を含有する増殖培地にて前記間葉系幹細胞を培養し、
前記間葉系幹細胞から産生されたコラーゲンを含有する粒状の細胞集塊を形成させ、
前記増殖培地から分離した前記細胞集塊を凍結保存剤とともに凍結保存する、
ことを特徴とする凍結細胞集塊の製造方法。
【請求項５】
間葉系幹細胞にコラーゲンを産生させる因子を含有する増殖培地にて前記間葉系幹細胞を培養して細胞シートを形成し、
前記細胞シートの周囲を自由縁にして自己凝集作用によって粒状の細胞集塊を形成し、
前記増殖培地から分離した前記細胞集塊を凍結保存剤とともに凍結保存する、
ことを特徴とする凍結細胞集塊の製造方法。
【請求項６】
培養容器にて前記間葉系幹細胞を培養してコンフルエントになるまで増殖させ、
前記培養容器の周壁に接着した前記細胞シートの縁を前記培養容器の周壁から離間させることにより、前記細胞シートの周囲を自由縁にする、
ことを特徴とする請求項５に記載の凍結細胞集塊の製造方法。
【請求項７】
１．５ｃｍ２〜２．５ｃｍ２の円筒状の前記培養容器を用い、０．５ｍｍ〜１．５ｍｍ径の粒状の前記細胞集塊を得る、
ことを特徴とする請求項６に記載の凍結細胞集塊の製造方法。
【請求項８】
増殖培地にて間葉系幹細胞を培養して凝集させ、
前記増殖培地に前記間葉系幹細胞にコラーゲンを産生させる因子を添加して、前記間葉系幹細胞から産生されるコラーゲンを含有する粒状の細胞集塊を形成させ、
前記増殖培地から分離した前記細胞集塊を凍結保存剤とともに凍結保存する、
ことを特徴とする凍結細胞集塊の製造方法。
【請求項９】
予備凍結を行わずに凍結保存する、
ことを特徴とする請求項４乃至８のいずれか一項に記載の凍結細胞集塊の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結細胞集塊及び凍結細胞集塊の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ：Mesenchymal stem cell）は多分化能・自己増殖能を有しており、遺伝子導入などが不要であるとともに、患者から確実に得られるため、組織再生療法に適した細胞である。【０００３】
例えば、骨折や歯周炎などの骨破壊疾患に対して、現在のＭＳＣ移植治療法では、患者からＭＳＣを分離、増殖させ、細胞数を十分に確保して一旦凍結保存しておく。その後、患者への移植手術の直前に、凍結保存しておいたＭＳＣを融解し、ＣＰＣ（Cell Processing Center）で培養してＭＳＣが集塊状の形態となったＭＳＣ移植体の形態に加工する。【０００４】
例えば、融解したＭＳＣを人工足場材料（ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウムアパタイト、ポリ乳酸、キトサン、アテロコラーゲンゲル、ヒアルロン酸ゲルなど）と混和して培養することで、ＭＳＣ移植体が作成される。そして、このＭＳＣ移植体が患者の欠損組織に移植され、ＭＳＣの組織再生能を発揮させる。【０００５】
また、近年では、人工足場材料を要しないＭＳＣ移植体があり、このようなＭＳＣ移植体として、細胞シートや細胞スフェロイドのほか、細胞集塊（非特許文献１）がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】M KITTAKA, M KAJIYA, H SHIBA, M TAKEWAKI, K TAKESHITA, R KHUNG, T FUJITA, T IWATA, T Q NGUYEN, K OUHARA, K TAKEDA, T FUJITA, H KURIHARA; "Clumps of a mesenchymal stromal cell/extracellular matrix complex can be a novel tissue engineering therapy for bone regeneration"; International Society for Cellular Therapy; Cytotherapy, 2015, 17, 860-873
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまでのＭＳＣ移植体は、移植手術の直前に、凍結保存しておいたＭＳＣを融解してから製造されている。移植手術の直前の限られた期間内に、その都度ＭＳＣ移植体を作製することから、ＭＳＣ移植体に含まれる細胞数や細胞機能を均一にできる保証はない。このため、所望のＭＳＣ移植体を製造できなかった場合には、移植手術が延期されることがある。【０００８】
本発明は上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、集塊状で凍結保存可能な凍結細胞集塊及び凍結細胞集塊の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の観点に係る凍結細胞集塊は、
間葉系幹細胞が粒状に形成され、凍結状態の細胞集塊である、
ことを特徴とする。【００１０】
また、前記凍結細胞集塊が０．５ｍｍ〜１．５ｍｍ径の粒状であることが好ましい。【００１１】
また、前記凍結細胞集塊が０．８ｍｍ〜１．２ｍｍ径の粒状であることが好ましい。【００１２】
本発明の第２の観点に係る凍結細胞集塊の製造方法は、
間葉系幹細胞にコラーゲンを産生させる因子を含有する増殖培地にて前記間葉系幹細胞を培養し、
前記間葉系幹細胞から産生されるコラーゲンを含有する粒状の細胞集塊を形成させ、
前記増殖培地から分離した前記細胞集塊を凍結保存剤とともに凍結保存する、
ことを特徴とする。【００１３】
本発明の第３の観点に係る凍結細胞集塊の製造方法は、
間葉系幹細胞にコラーゲンを産生させる因子を含有する増殖培地にて前記間葉系幹細胞を培養して細胞シートを形成し、
前記細胞シートの周囲を自由縁にして自己凝集作用によって粒状の細胞集塊を形成し、
前記増殖培地から分離した前記細胞集塊を凍結保存剤とともに凍結保存する、
ことを特徴とする。【００１４】
また、培養容器にて前記間葉系幹細胞を培養してコンフルエントになるまで増殖させ、
前記培養容器の周壁に接着した前記細胞シートの縁を前記培養容器の周壁から離間させることにより、前記細胞シートの周囲を自由縁にしてもよい。【００１５】
１．５ｃｍ２〜２．５ｃｍ２の円筒状の前記培養容器を用い、０．５ｍｍ〜１．５ｍｍ径の粒状の細胞集塊を得てもよい。【００１６】
本発明の第４の観点に係る凍結細胞集塊の製造方法は、
増殖培地にて間葉系幹細胞を培養して凝集させ、
前記増殖培地に前記間葉系幹細胞にコラーゲンを産生させる因子を添加して、前記間葉系幹細胞から産生されるコラーゲンを含有する粒状の細胞集塊を形成させ、
前記増殖培地から分離した前記細胞集塊を凍結保存剤とともに凍結保存する、
ことを特徴とする。【００１７】
予備凍結を行わずに凍結保存してもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る凍結細胞集塊は、ＭＳＣが集塊状の形態で凍結されているので、移植手術等において、直前の限られた期間内にＭＳＣ移植体の製造を行う必要がない。このため、移植手術が延期される事態を防ぐことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】細胞生存活性の測定結果を示すグラフである。
【図２】図２はＣ−ＭＳＣｓの位相差顕微鏡像を示す写真であり、図２（Ａ）は凍結保存しなかったＣ−ＭＳＣｓの写真、図２（Ｂ）はＤＭＳＯ凍結保存液で凍結保存したＣ−ＭＳＣｓの写真、図２（Ｃ）はＢａｍｂａｎｋｅｒ（商品名：和光純薬工業株式会社）で凍結保存したＣ−ＭＳＣｓの写真、図２（Ｄ）はＣｅｌｌ  Ｂａｎｋｅｒ（商品名：タカラバイオ株式会社）で凍結保存したＣ−ＭＳＣｓの写真である。
【図３】Ｃ−ＭＳＣのＨＥ染色像を示す写真であり、図３（Ａ）は凍結前の写真、図３（Ｂ）は図３（Ａ）の部分拡大写真、図３（Ｃ）は融解１日後の写真、図３（Ｄ）は図３（Ｃ）の部分拡大写真、図３（Ｅ）は融解５日後の写真、図３（Ｆ）は図３（Ｅ）の部分拡大写真である。
【図４】細胞シートのＨＥ染色像を示す写真であり、図４（Ａ）は凍結前の写真、図４（Ｂ）は図４（Ａ）の部分拡大写真、図４（Ｃ）は融解１日後の写真、図４（Ｄ）は図４（Ｃ）の部分拡大写真、図４（Ｅ）は融解５日後の写真、図４（Ｆ）は図４（Ｅ）の部分拡大写真である。
【図５】細胞スフェロイドのＨＥ染色像を示す写真であり、図５（Ａ）は凍結前の写真、図５（Ｂ）は図５（Ａ）の部分拡大写真、図５（Ｃ）は融解１日後の写真、図５（Ｄ）は図５（Ｃ）の部分拡大写真、図５（Ｅ）は融解５日後の写真、図５（Ｆ）は図５（Ｅ）の部分拡大写真である。
【図６】凍結前のＣ−ＭＳＣｓ、並びに、凍結して融解した５日後のＣ−ＭＳＣｓ、細胞シート及び細胞スフェロイドの細胞死の割合を示すグラフである。
【図７】図７（Ａ）〜（Ｄ）は、コラゲナーゼを添加しなかったＣ−ＭＳＣｓの凍結保存前の状態を示す写真であり、図７（Ａ）はＨＥ染色写真、図７（Ｂ）はＴＵＮＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図７（Ｃ）は図７（Ｂ）の部分拡大写真、図７（Ｄ）は免疫染色写真、図７（Ｅ）〜（Ｈ）は、コラゲナーゼを添加したＣ−ＭＳＣｓの凍結保存前の状態を示す写真であり、図７（Ｅ）はＨＥ染色写真、図７（Ｆ）はＴＵＮＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図７（Ｇ）は図７（Ｆ）の部分拡大写真、図７（Ｈ）は免疫染色写真である。
【図８】図８（Ａ）〜（Ｃ）は、コラゲナーゼを添加しなかったＣ−ＭＳＣｓを凍結保存して融解５日後の状態を示す写真であり、図８（Ａ）はＨＥ染色写真、図８（Ｂ）はＴＵＮＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図８（Ｃ）は図８（Ｂ）の部分拡大写真、図８（Ｄ）〜（Ｆ）は、コラゲナーゼを添加したＣ−ＭＳＣｓの凍結保存して融解５日後の状態を示す写真であり、図８（Ｄ）はＨＥ染色写真、図８（Ｅ）はＴＵＮＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図８（Ｆ）は図８（Ｅ）の部分拡大写真である。
【図９】Ｃ−ＭＳＣｓの融解５日後における死細胞の割合を示すグラフである。
【図１０】図１０（Ａ）〜（Ｄ）は、アスコルビン酸を培地に添加せずに製造した細胞スフェロイドの凍結保存前の状態を示す写真であり、図１０（Ａ）はＨＥ染色写真、図１０（Ｂ）はＴＵＮＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図１０（Ｃ）は図１０（Ｂ）の部分拡大写真、図１０（Ｄ）は免疫染色写真、図１０（Ｅ）〜（Ｈ）は、アスコルビン酸を培地に添加して製造した細胞スフェロイドの凍結保存前の状態を示す写真であり、図１０（Ｅ）はＨＥ染色写真、図１０（Ｆ）はＴＵＮＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図１０（Ｇ）は図１０（Ｆ）の部分拡大写真、図１０（Ｈ）は免疫染色写真である。
【図１１】図１１（Ａ）〜（Ｃ）は、アスコルビン酸を培地に添加せずに製造した細胞スフェロイドを凍結保存して融解５日後の状態を示す写真であり、図１１（Ａ）はＨＥ染色写真、図１１（Ｂ）はＴＵＮＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図１１（Ｃ）は図１１（Ｂ）の部分拡大写真、図１１（Ｄ）〜（Ｆ）は、アスコルビン酸を培地に添加して製造した細胞スフェロイドの凍結保存前の状態を示す写真であり、図１１（Ｄ）はＨＥ染色写真、図１１（Ｅ）はＴＵＮＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図１１（Ｆ）は図１１（Ｅ）の部分拡大写真である。
【図１２】細胞スフェロイドの融解５日後における死細胞の割合を示すグラフである。
【図１３】石灰化誘導培地で培養したＣ−ＭＳＣｓ内のカルシウム沈着量を示すグラフである。
【図１４】ラット頭蓋冠にＣ−ＭＳＣｓを移植して４週間後のＣＴ写真であり、図１４（Ａ）が移植を行わなかった写真、図１４（Ｂ）がＤＭＳＯ凍結保存液で凍結保存したＭ−ＭＳＣｓを移植した写真、図１４（Ｃ）がＣｅｌｌ  Ｂａｎｋｅｒ（商品名：タカラバイオ株式会社）で凍結保存したＣ−ＭＳＣｓを移植した写真、図１４（Ｄ）がＢａｍｂａｎｋｅｒ（商品名：和光純薬工業株式会社）で凍結保存したＣ−ＭＳＣｓを移植した写真である。
【図１５】長期凍結保存して融解したＣ−ＭＳＣｓの状態を示す写真であり、図１５（Ａ）がＨＥ染色写真、図１５（Ｂ）がＴＵＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色写真、図１５（Ｃ）がＴＵＮＥＬ染色した部分拡大写真、図１５（Ｄ）がＴＵＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色した部分拡大写真である。
【図１６】Ｃ−ＭＳＣｓの移植効果を示すラット頭蓋冠のＣＴ写真であり、図１６（Ａ）が移植を行わなかった写真、図１６（Ｂ）はＣ−ＭＳＣｓを移植して４週間後の写真である。
【図１７】Ｃ−ＭＳＣｓの移植効果を示すラット頭蓋冠のＨＥ染色断面写真であり、図１７（Ａ）が移植を行わなかった写真、図１７（Ｂ）はＣ−ＭＳＣｓを移植して４週間後の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本実施の形態に係る凍結細胞集塊は、複数の間葉系幹細胞が集塊状に、粒状に形成された凍結状態の細胞集塊である。
【００２１】
凍結細胞集塊は、使用される形態に応じた大きさであればよく、例えば、凍結細胞集塊が骨折や歯周炎などの骨破壊疾患に対する移植体として使用される場合移植手術時に欠損組織に移植しやすい大きさであることが好ましく、０．５ｍｍ〜１．５ｍｍ径、より好ましくは０．８ｍｍ〜１．２ｍｍ径である。
【００２２】
なお、ここで移植体とは、骨欠損部位など直接埋め込まれて使用される形態のほか、注射等による体内への注入により組織再生を図る形態など、手法を問わず、組織再生に用いられる形態全般をいう。
【００２３】
凍結細胞集塊は、移植手術等の前に融解されて、移植手術等に用いられる。凍結細胞集塊は、融解後もその形態を保持し、細胞機能を失うことがないので、例えば、欠損組織に移植することで組織再生能を発揮する。なお、凍結細胞集塊の融解は、凍結細胞集塊が入れられている凍結保存容器をフリーザー等から取り出し、室温に置くことや温浴（例えば、４０℃〜６０℃）に置くなど種々の手法で行うことができる。
【００２４】
上記の凍結細胞集塊は、以下のようにして製造することができる。まず、採取した間葉系幹細胞を培養皿等の培養器を用い、ＭＳＣにコラーゲンを産生させる因子を含有する増殖培地で培養する。間葉系幹細胞は、患者の髄、脂肪組織、胎盤組織又は臍帯組織、歯髄等、種々の組織から採取されたものが用いられる。
【００２５】
増殖培地は、間葉系幹細胞を増殖させ得る培地であればよく、一般に市販されている増殖培地（例えば、ＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)＋１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum））を用いればよい。また、ＭＳＣにコラーゲンを産生させる因子は、化合物やタンパク質など、結果としてＭＳＣにコラーゲンを産生させ得るものであれば限定されず、アスコルビン酸のほか、デキサメタゾン等のステロイドやサイトカイン等が挙げられ、アスコルビン酸であることが好ましい。
【００２６】
間葉系幹細胞が増殖すると、シート状の細胞集団（以下、細胞シート）が形成される。そして、細胞シートの周囲が培養器の縁に接着し、コンフルエントに達するまで増殖させる。
【００２７】
次いで、培養器の周壁に接着した細胞シートの縁を培養器から離間させる。例えば、細い棒体を細胞シートの縁が接着している培養器の内壁に差し込み、培養器の内壁に沿って棒体を一周移動させることにより、細胞シートを培養器から離間させることができる。これにより、細胞シートは浮遊することになる。
【００２８】
この浮遊する細胞シートは自己凝集作用により、くるまってゆく。そして、間葉系幹細胞自身が産生する細胞外マトリクス（ＥＣＭ：extracellular matrix）を利用して塊状の間葉系幹細胞集塊となる。このようにして、粒状の細胞集塊を得ることができる。
【００２９】
なお、培養器は１．５ｃｍ２〜２．５ｃｍ２の円筒状のものを用いると、０．５ｍｍ〜１．５ｍｍの粒径の細胞集塊が得られる。培養器として、例えば、表面積２ｃｍ２の２４ウェルプレートなどを用いればよい。
【００３０】
また、スフェロイド形態の細胞集塊を得る場合、以下のようにして製造することができる。増殖培地でＭＳＣが浮遊するように培養すると、細胞間接着によってＭＳＣ同士が凝集、粒状になる。その後、ＭＳＣにコラーゲンを産生させる物質を増殖培地に添加する。これによりＭＳＣがコラーゲンを産生し、通常の細胞スフェロイドに比べて、コラーゲンを豊富に含んだスフェロイド形態の細胞集塊が得られる。
【００３１】
得られたＭＳＣ移植体を凍結保存剤とともに凍結用バイアル等の凍結保存用の容器に入れ、凍結保存する。このようにして凍結移植体を得ることができる。
【００３２】
凍結保存剤として、種々の細胞凍結用の保存液を用いればよく、例えば、１０％ＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide）、２０％ＦＢＳ、７０％ＤＭＥＭを含有する凍結保存液のほか、市販のＣｅｌｌ  ｂａｎｋｅｒ（商品名：タカラバイオ株式会社）、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ（商品名：和光純薬工業株式会社）などの凍結保存液が挙げられる。
【００３３】
凍結保存は、−７０℃〜−９０℃、好ましくは−７５℃〜−８５℃の温度で行えばよい。また、凍結保存は、保存容器をフリーザーに置くなど、種々の手法で行うことができる。また、一ヶ月以上の長期保存を行う場合では、保存容器を上記温度に２４時間置いた後、液体窒素タンク（−１９６℃）に移して保存してもよい。
【００３４】
なお、凍結保存に際し、予備凍結を行わなくてもよい。予備凍結を行わずに直接凍結保存しても、ＭＳＣ移植体の細胞組織が崩壊することはほぼない。
【００３５】
なお、人工足場材料（例えば、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウムアパタイト、ポリ乳酸、キトサン、アテロコラーゲンゲル、ヒアルロン酸ゲルなど）を用いたＭＳＣ移植体では、凍結させると人工足場材料の物性が変わってしまい、融解後にＭＳＣ移植体としての機能を発揮しないため、凍結保存はなされていない。また、足場材料を用いない移植体として、細胞シートや細胞スフェロイドがあるが、これらは後述の実施例でも記すように、凍結、融解後にそれぞれの形態を維持できないため、凍結保存はできなかった。
【００３６】
一方、本実施の形態に係る凍結細胞集塊については、ＭＳＣ細胞集塊を作製した後に凍結保存された状態であることから、患者から分離したＭＳＣからＭＳＣ細胞集塊を作製し、その細胞機能や細胞の均一性を事前に検査することができる。そして、検査して一定品質のもののみを選別し、凍結細胞集塊として凍結保存される。これにより、品質管理されたＭＳＣ細胞集塊であるＭＳＣ移植体を移植日当日に確実に供給することが可能になり、移植手術が延期されるという事態を防ぐことができる。
【００３７】
例えば、歯周炎患者から分離した骨髄間葉系幹細胞をＭＳＣ移植体の形にし、細胞機能・異物混入などの検査を行った後に凍結保存しておく。その間に移植前に必要となる感染源除去、炎症の軽減などの歯周基本治療を済ませておき、その後、移植日当日に品質管理されたＭＳＣ移植体を融解して欠損組織に移植することで歯周組織再生が実現できる。
【００３８】
更には、ＭＳＣはその低い抗原性のため、他家移植に応用可能な細胞であると考えられている。したがって、ＭＳＣバンクなどの他家移植のためのＭＳＣ供給システムが構築された場合、ＭＳＣのまま凍結するのではなく、ＭＳＣ細胞集塊の形態で凍結保存することで、患者に必要な際に速やか且つ確実に良好なＭＳＣ細胞集塊を提供できる細胞製剤医療が行えるようにもなる。
【実施例】
【００３９】
（凍結移植体の作製、融解）
３週齢ラットの大腿骨の骨髄から間葉系幹細胞を採取した。ＤＭＥＭ（Sigma）に１０％ＦＢＳ（Biowest）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Sigma）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Sigma）、及び、５００ｎｇ／ｍＬアムホテリシンＢ（Invitrogen）を添加した増殖培地（以下、ＧＭ培地）にて、採取した間葉系幹細胞を培養した。２４時間後、非接着性の細胞を取り除き、接着性の細胞を更に培養して得た第三継代細胞を以下の実験に用いた。【００４０】
２４ｗｅｌｌ培養プレートに、ＭＳＣを７．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの割合で播種し、Ｌ−アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）を添加した増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）で７時間培養した。【００４１】
培養することにより、ＭＳＣ自身が産生した細胞外マトリクスによりＭＳＣ/ＥＣＭ複合体からなる細胞シートが形成され、そして、細胞シートの周囲が２４ｗｅｌｌ培養プレートの周壁に接してコンフルエントまで達した後、マイクロピペットの先端を使って、細胞シートの周囲を２４ｗｅｌｌ培養プレートから剥がした。これにより、細胞シートは浮遊し、自らくるまっていった。【００４２】
そして、１日培養した後、直径０．９〜１．２ｍｍの粒状の細胞集塊であるＭＳＣ移植体（以下、Ｃ−ＭＳＣｓと記す）を得た。【００４３】
Ｃ−ＭＳＣｓを１塊（２×１０５ｃｅｌｌｓ）、凍結保存液５００μＬに浸漬し、１．５ｍＬ凍結バイアルを用いて、予備凍結を行わずに、−８０℃のｄｅｅｐ  ｆｒｅｅｚｅｒ内に置いて凍結した。【００４４】
凍結保存液として、１０％ＤＭＳＯ、２０％ＦＢＳ、７０％ＤＭＥＭを混合した凍結保存液（以下、ＤＭＳＯ凍結保存液）、Ｃｅｌｌ  ｂａｎｋｅｒ（商品名：タカラバイオ株式会社）、及び、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ（商品名：和光純薬工業株式会社）の３種を用い、それぞれについて行った。【００４５】
４８時間凍結後、３７℃に設定した恒温水槽で急速解凍して融解し、Ｃ−ＭＳＣｓを取り出した。そして、５００μＬ通常培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を入れた２４ｗｅｌｌ培養プレートにＣ−ＭＳＣｓを浸漬し、再度培養した。【００４６】
（細胞生存活性の検証）
それぞれのＣ−ＭＳＣｓを融解した後、Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｋｉｔを用い、細胞生存活性を測定した。図１に、その結果を示す。なお、凍結しなかったＣ−ＭＳＣｓ（コントロール）についても行い、図１のＣｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙはコントロールに対する相対値として示している。【００４７】
図１を見ると、いずれの凍結保存液で凍結させたＣ−ＭＳＣｓについても、コントロールに対して有意差はなく、凍結させたＣ−ＭＳＣｓの細胞生存活性は、凍結を行わなかった場合に比べて劣ることはなかった。【００４８】
また、それぞれについて、位相差顕微鏡像を撮影した。その結果を図２に示す。図２を見ると、全てのＣ−ＭＳＣｓから細胞が遊出してくることが確認された。これにより、移植体としての正常な機能を発揮し得ることを確認した。【００４９】
（ＨＥ染色による検証）
Ｃ−ＭＳＣｓの凍結保存前、凍結保存して融解１日後、融解５日後について、ＨＥ（Hematoxylin-Eosin）染色を行って、ＨＥ染色像を撮影し、組織形態を観察した。ＨＥ染色像を図３に示す。【００５０】
図３を見ると、凍結保存前、融解１日後、融解５日後にかけて、Ｃ−ＭＳＣｓの形態はほぼ崩れておらず、Ｃ−ＭＳＣｓを凍結保存しても細胞及び基質が残存していることがわかる。【００５１】
また、Ｃ−ＭＳＣｓに代えて、細胞シート（２×１０５ｃｅｌｌｓ）、細胞スフェロイド（２×１０５ｃｅｌｌｓ）を用い、上記と同様にＤＭＳＯ凍結保存液を使用して凍結、融解を行った。そして、これらを上記と同様に、ＨＥ染色像を撮影した。図４に細胞シートのＨＥ染色像を、図５に細胞スフェロイドのＨＥ染色像を示す。なお、細胞シート、細胞スフェロイドは、それぞれ「Akabane M et al., 2008, J Tissue Eng Regen Med」、「Priya R et al., 2012, Cell Tissue Res」を参照して作製して用いた。【００５２】
図４を見ると、細胞シートの形態は時間依存的に崩壊していることがわかる。また、図５を見ると細胞シートと同様、細胞スフェロイドの形態は時間依存的に崩壊している。【００５３】
このように、細胞シート、細胞スフェロイドについては、凍結保存すると形態が崩壊し、移植体として利用できないことがわかる。Ｃ−ＭＳＣｓと比較して、細胞シートは基質が粗であったこと、細胞スフェロイドは基質（細胞外マトリクス）が少なく細胞間接着によって形成されているものであることから、いずれも凍結保存すると、凍結による氷晶がその形態を損傷したものと考えられる。【００５４】
（ＴＵＮＥＬ（TdT-mediated dUTP nick end labeling）法による検証）
また、凍結前のＣ−ＭＳＣｓ、並びに、凍結して融解した５日後のＣ−ＭＳＣｓ、細胞シート及び細胞スフェロイドについて、ＴＵＮＥＬアッセイを行った。【００５５】
その結果を図６に示す。凍結前のＣ−ＭＳＣｓの細胞死の割合は１．９６％であり、凍結、融解後のＣ−ＭＳＣｓでは５．４１％であった。Ｃ−ＭＳＣｓでは凍結、融解を経ても、さほど細胞死は増えていない。一方、凍結、融解後の細胞シート及び細胞スフェロイドでは、細胞死の割合が６５．６％、及び４４．８％と非常に高く、Ｃ−ＭＳＣｓに比べて非常に高い割合となっている。【００５６】
このように、Ｃ−ＭＳＣｓでは凍結、融解を経ても、細胞死はさほど生じず、凍結保存が可能であること、一方、細胞シート及び細胞スフェロイドでは凍結させると多くの細胞死が生じ、凍結保存ができないことを確認した。【００５７】
（凍結Ｃ−ＭＳＣｓにおける細胞外マトリクスの役割の検討）
Ｃ−ＭＳＣｓにおいては、細胞シートや細胞スフェロイドと異なり、細胞から細胞外マトリクスが豊富に産生されていることから凍結保存が可能になったと考えられる。これを検証すべく、細胞外マトリクスの主成分であるコラーゲンの分解酵素を用い、以下の検証実験を行った。【００５８】
上記と同様にしてＣ−ＭＳＣｓを作製した後、Ｃ−ＭＳＣｓを凍結する直前に３ｍｇ／ｍｌのコラーゲン分解酵素（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｓｉｇｍａ））を１５分間作用させた（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（＋）群）。【００５９】
このＣ−ＭＳＣｓを一塊ずつＤＭＳＯ凍結保存液５００μｌに浸漬し、上記と同様の手法で凍結保存した。４８時間後に上記と同様の手法で融解し、ＧＭ培地５００μｌで培養した。Ｃ−ＭＳＣｓを解凍５日後、１％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋を行い、連続して５μｍ、２０μｍの切片を作製した。５μｍの切片をＨＥ染色し、光学顕微鏡で組織学的構造を観察した。２０μｍ切片をDeadEnd Fluorometric terminal deoxynucleotidyl transferase SystemでＴＵＮＥＬ染色し、共焦点レーザー顕微鏡にて死細胞数を観察した。【００６０】
また、コントロール実験として、コラーゲン分解酵素を作用させないもの（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（−）群）も同様に行った。【００６１】
図７（Ａ）〜（Ｄ）、及び、図８（Ａ）〜（Ｃ）にｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（−）群の凍結保存前、及び、融解５日後の状態を、また、図７（Ｅ）〜（Ｈ）、及び、図８（Ｄ）〜（Ｆ）にｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（＋）群の凍結保存前、及び、融解５日後の状態を示す。なお、図７（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｆ）、（Ｇ）、図８（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｆ）において、輝度が高い部位（一例として、破線で囲っている部位）が死細胞の細胞核を表している。【００６２】
図７（Ｄ）を見ると、Ｃ−ＭＳＣｓをｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ処理することで、凍結保存前にＴｙｐｅＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎの発現レベルが低下したことがわかる。そして、図８（Ｄ）〜（Ｆ）を見ると、このｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（＋）群は、凍結融解後に形態が崩れ、死細胞が増加することが観察された。【００６３】
一方、通常のＣ−ＭＳＣｓであるｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（−）群は、図８（Ａ）〜（Ｃ）を見ると、凍結融解後もその形態を保持しており、死細胞の数も僅かであった。【００６４】
また、図９にｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（−）群、及び、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（＋）群における細胞死の割合を示す。図９から、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（−）群とｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（＋）とでは、細胞死の割合において、有意差が現れている。以上のことから、Ｃ−ＭＳＣｓでは、コラーゲンを主成分とするＥＣＭが凍結に対する保護効果を発揮していることが示唆された。【００６５】
（コラーゲンを産生させて作製した細胞スフェロイド形態のＭＳＣの凍結保存の検証）
Ｃ−ＭＳＣｓではＥＣＭの保護効果により、凍結保存が可能であることから、細胞スフェロイドの形態においても、細胞からコラーゲンが産生されていれば、凍結保存が可能であると考え、スフェロイドの形態でも凍結保存が可能か否か検証を行った。【００６６】
ＭＳＣをｕｌｔｒａ  ｌｏｗ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ２４ｗｅｌｌプレートに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、ＧＭ培地で４日間培養することで、ＭＳＣから構成される細胞スフェロイド（ＶＣ（−）群）を得た。【００６７】
また、培養中、ＭＳＣが凝集した後に、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）をＧＭ培地に添加して培養した細胞スフェロイドも作成した（ＶＣ（＋）群）。【００６８】
凍結保存前の細胞スフェロイドの生存性およびＥＣＭとしてのＴｙｐｅＩ  Ｃｏｌｌａｇｅｎの発現をＨＥ染色、ＴＵＮＥＬ染色、および免疫染色にて観察した。【００６９】
更に、細胞スフェロイドを一塊ずつＤＭＳＯ凍結保存液５００μｌに浸漬し、１．５ｍｌ凍結バイアル（Ｔｒｕｅ  ｌｉｎｅ）を用いて−８０℃で凍結した。４８時間後、３７℃に設定した恒温水槽で急速解凍後、２４ｗｅｌｌ培養プレートに再播種し、５００μｌＧＭ培地で培養した。【００７０】
細胞スフェロイドを解凍して５日後に１％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋を行い、連続して５μｍ、２０μｍの切片を作製した。５μｍの切片をヘマトキシリン−エオジン染色（ＨＥ染色）し、光学顕微鏡で組織学的構造を観察した。２０μｍ切片をＤｅａｄＥｎｄ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）でＴＵＮＥＬ染色し、共焦点レーザー顕微鏡にて死細胞数を観察した。【００７１】
図１０（Ａ）〜（Ｄ）及び図１１（Ａ）〜（Ｃ）に、ＶＣ（−）群の凍結保存前、及び、融解５日後の状態を、また、１０（Ｅ）〜（Ｈ）及び図１１（Ｄ）〜（Ｆ）に、ＶＣ（＋）群の凍結保存前、及び、融解５日後の状態をそれぞれ示す。なお、図１０（Ｂ）、（Ｆ）、（Ｇ）、図１１（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｆ）において、輝度が高い部位（一例として、破線で囲っている部位）が死細胞の細胞核を表している。【００７２】
図１０（Ｄ）を見ると、アスコルビン酸無添加のＶＣ（−）群のスフェロイドでは、ＴｙｐｅＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎの発現レベルは低い。そして、図１１（Ａ）〜（Ｃ）を見ると、凍結融解後、その形態は崩れ、死細胞の増加が観察された。【００７３】
一方、図１０（Ｈ）を見ると、アスコルビン酸添加のＶＣ（＋）群のスフェロイドでは高いＴｙｐｅＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎの発現が観察された。そして、図１１（Ｄ）〜（Ｆ）を見ると、凍結融解後もその形態が保持され、死細胞の数も僅かであった。【００７４】
また、図１２に、ＶＣ（＋）群及びＶＣ（−）群の融解５日後の死細胞の割合を示す。図１２から、ＶＣ（＋）群とＶＣ（−）群とでは、細胞死の割合において、有意な差が現れている。以上のことから、細胞スフェロイドにおいても、ＥＣＭを豊富に産生させておくことで、凍結保存可能であることがわかった。【００７５】
（石灰分化能の検証）
続いて、Ｃ−ＭＳＣｓの石灰化分化能について検証した。低接着培養皿を用い、通常培地（ＧＭ）及び石灰化誘導培地（ＯＩＭ）にて、それぞれＣ−ＭＳＣｓを培養した。そして、培養５日後、及び、１０日後に、Ｃ−ＭＳＣｓ内のカルシウム沈着量を定量した。【００７６】
その結果を図１３に示す。図１３を見ると、凍結、融解しなかったＣ−ＭＳＣｓと同様、凍結、融解したＣ−ＭＳＣｓは、石灰化誘導培地での培養によってカルシウム沈着量が上昇しており、石灰化分化能が失われていないことを確認した。【００７７】
（骨再生の検証）
続いて、Ｃ−ＭＳＣｓの移植による骨再生の検証を行った。ラットの頭蓋冠１．６ｍｍ径骨欠損モデルに対し、凍結保存、融解したＣ−ＭＳＣｓを移植した。【００７８】
そして、移植して４週間後にＣＴ（Computed Tomography）撮影を行い、骨再生の有無について検証した。【００７９】
図１４にＣＴ写真を示す。いずれの凍結剤で凍結保存させたＣ−ＭＳＣｓについても、移植を行わなかったものと比較して、骨再生が誘導されている。【００８０】
（Ｃ−ＭＳＣｓの長期凍結保存による影響の検証）
上記と同様の手法にて、ＤＭＳＯ凍結保存液を用い、Ｃ−ＭＳＣｓを６ヶ月間凍結保存した。そして、上記と同様の手法にて、Ｃ−ＭＳＣｓを融解した。このＣ−ＭＳＣｓのＨＥ染色、ＴＵＮＥＬ染色、ＤＩＰＩ染色を行った。その結果を図１５に示す。【００８１】
図１５から、６ヶ月凍結保存されたＣ−ＭＳＣｓにおいてもその形態は保持されており、顕著な死細胞の増加は観察されなかった。【００８２】
更に、この６ヶ月凍結保存の後に融解したＣ−ＭＳＣｓを、上記と同様の手法にて、ラット頭蓋冠欠損モデルに移植し、骨再生の有無について検証した。図１６にＣＴ写真を示す。また、図１７にＨＥ染色した断面写真を示す。図１６（Ａ）、図１７（Ａ）のコントロールに対して、図１６（Ｂ）、図１７（Ｂ）のＣ−ＭＳＣｓを移植した頭蓋冠では、骨再生が促進されていることがわかる。したがって、Ｃ−ＭＳＣｓを６ヶ月間もの長期凍結保存をしても、これを融解し、移植することで骨再生を促進させ得ることを確認した。【００８３】
以上の検証から、凍結保存されたＣ−ＭＳＣｓは、融解しても移植体としての機能を損なわず、移植手術による再生医療に利用できることを立証した。【００８４】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。【００８５】
本出願は、２０１６年４月２７日に出願された、日本国特許出願特願２０１６−８９１８８号に基づく。本明細書中に日本国特許出願特願２０１６−８９１８８号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明に係る凍結細胞集塊は、移植再生医療等にて利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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