(57)【要約】アミン類化合物の分析をより正確に、かつより簡便に行うことを可能とする液体クロマトグラフィー充填剤、それが充填された液体クロマトグラフィーカラム、およびそれを用いたアミン類化合物の分析方法を提供する。本発明の液体クロマトグラフィー充填剤は、カルボキシル基が充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ以上導入されたポリマー充填剤からなり、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）による、前記ポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数が１．３０以上、かつ前記ポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数が１．００以上１．３０以下であることを特徴とする。
2018043098.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシル基を有するポリマー充填剤であって、
前記カルボキシル基が、前記ポリマー充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ以上導入され、
親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）による、前記ポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数が１．３０以上であり、かつ
前記ポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数が１．００以上１．３０以下であることを特徴とする液体クロマトグラフィー充填剤、
前記ポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数は、テオブロミン（Ｔｂ）とテオフィリン（Ｔｐ）を、ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定を行った際の分離係数α１（Ｔｂ／Ｔｐ）で定義され、
前記ポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数は、ウリジン（Ｕ）と２’−デオキシウリジン（２ｄＵ）を、ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定を行った際の分離係数α２（Ｕ／２ｄＵ）で定義され、
各分離係数α１，α２は、それぞれの物質の保持係数ｋの比であり、
保持係数ｋはいずれも、トルエンの溶出時間をｔ０とし、それぞれの物質の溶出時間をｔとした場合、ｋ＝（ｔ−ｔ０）／ｔ０で定義され、
ただし、前記ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定条件としては、
カラム温度が３０℃であり、
移動相が、（アセトニトリル）：（酢酸１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび酢酸アンモニウム１０ｍｍｏｌ／Ｌを添加した水）＝９０／１０（混合前の容積）の混合液体である。
【請求項２】
前記ポリマー充填剤が、カルボキシル基が導入されたポリビニルアルコール樹脂またはポリヒドロキシ（メタ）アクリレート樹脂を含む請求項１に記載の液体クロマトグラフィー充填剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の液体クロマトグラフィー充填剤と、
前記液体クロマトグラフィー充填剤が充填された液体クロマトグラフィー用ハウジングと、
を備える液体クロマトグラフィーカラム。
【請求項４】
請求項３に記載の液体クロマトグラフィーカラムを用い、
前記液体クロマトグラフィーカラムによる分離モードが、移動相として水溶性有機溶媒と水の混合溶媒を用いたＨＩＬＩＣ分離モード、または逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードであるアミン類化合物の分析方法。
【請求項５】
前記水溶性有機溶媒が、アセトニトリル、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項４に記載のアミン類化合物の分析方法。
【請求項６】
前記水溶性有機溶媒が、アセトニトリルである請求項５に記載のアミン類化合物の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィー充填剤、液体クロマトグラフィーカラムおよびアミン類化合物の分析方法に関する。
本願は、２０１６年８月２９日に、日本に出願された特願２０１６−１６７０３８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
アミン類化合物は、医薬、食品、肥料、工業用薬品等の様々な物質に含まれる重要な化合物である。また、アミン類化合物は、各種工業における研究開発、品質試験等において分析の対象とされる化合物である。また、環境分野においては、水道水中に含まれる人体に悪影響を及ぼすアミン類化合物が広く分析対象となる。【０００３】
アミン類化合物の分析方法としては、一般的に液体クロマトグラフィーによる分析方法が用いられている。液体クロマトグラフィーによるアミン類化合物の分析方法としては、例えば、ＯＤＳカラムを用いた逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）モードでの分析方法が広く知られている（例えば、特許文献１参照）。ＯＤＳカラムは、アミン類化合物の吸着を抑制するためのエンドキャッピング処理を行ったオクタデシルシリカゲル（ＯＤＳ）等のシリカゲル系充填剤が充填された分析カラムである。【０００４】
しかしながら、ＲＰモードによるアミン類化合物の分析方法では、親水性の高いアミン類化合物がカラム内にて十分に保持されないことがある。例えば、ＯＤＳカラムを用いたＲＰ法では、親水性の高いアミン類化合物がカラムに保持されない。そこで、アミン類化合物をカラム内に十分に保持させるために、１−ペンタンスルホン酸ナトリウム等のイオンペア試薬の添加が必要となる場合がある。このようにイオンペア試薬を添加すると、カラムの寿命を著しく悪化させることがある。【０００５】
また、近年、両性イオン基であるスルホベタイン基が導入されたシリカゲル充填剤が充填されたカラムを用いた親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）分離モードによる分析方法も一般的に知られている。しかし、このＨＩＬＩＣ分離モードによる分析方法では、逆に疎水性の高いアミン類化合物がカラム内にて十分に保持されないという課題があった。さらに、このＨＩＬＩＣ分離モードによる分析方法では、ＲＰ用またはＨＩＬＩＣ用のシリカゲル充填剤中に残存するシラノール基により、塩基性物質であるアミン類化合物がカラム内に吸着してしまい、分析結果に悪影響を及ぼすなどの課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平６−１７４７０８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】共立出版、高速液体クロマトグラフ法、１９８６年、ｐ９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、かかる状況に鑑みてなされたものであり、アミン類化合物の分析をより正確に、かつより簡便に行うことを可能とする液体クロマトグラフィー充填剤、それが充填された液体クロマトグラフィーカラム、およびそれを用いたアミン類化合物の分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、カルボキシル基が充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ以上導入され、決められたＨＩＬＩＣ分離モードによる分析方法に基づいて、表面のｐＨ性および親水性をコントロールされたポリマー粒子を充填剤に用いたカラムを用いることにより、ＨＩＬＩＣ分離モードのみでなく、ＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードも作用することにより、アミン類化合物の分離分析に十分な性能を発現するカラムが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は以下の事項に関する。
［１］カルボキシル基を有するポリマー充填剤であって、前記カルボキシル基が前記ポリマー充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ以上導入され、
親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）による、前記ポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数が１．３０以上であり、かつ前記ポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数が１．００以上１．３０以下であることを特徴とする液体クロマトグラフィー充填剤。前記ポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数は、テオブロミン（Ｔｂ）とテオフィリン（Ｔｐ）を、ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定を行った際の分離係数α１（Ｔｂ／Ｔｐ）で定義される。また、前記ポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数は、ウリジン（Ｕ）と２’−デオキシウリジン（２ｄＵ）を、ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定を行った際の分離係数α２（Ｕ／２ｄＵ）で定義される。各分離係数α１，α２は、それぞれの物質の保持係数ｋの比であり、保持係数ｋはいずれも、トルエンの溶出時間をｔ０とし、それぞれの物質の溶出時間をｔとした場合、ｋ＝（ｔ−ｔ０）／ｔ０で定義される。ただし、前記ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定条件としては、カラム温度が３０℃、移動相が、（アセトニトリル）：（酢酸１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび酢酸アンモニウム１０ｍｍｏｌ／Ｌを添加した水）＝９０／１０（混合前の容積）の混合液体である。【００１１】
［２］前記ポリマー充填剤が、カルボキシル基が導入されたポリビニルアルコール樹脂またはポリヒドロキシ（メタ）アクリレート樹脂を含む［１］に記載の液体クロマトグラフィー充填剤。【００１２】
［３］［１］または［２］に記載の液体クロマトグラフィー充填剤と、前記液体クロマトグラフィー充填剤が充填された液体クロマトグラフィー用ハウジングと、を備える液体クロマトグラフィーカラム。【００１３】
［４］［３］に記載の液体クロマトグラフィーカラムを用い、前記液体クロマトグラフィーカラムによる分離モードが、移動相として水溶性有機溶媒と水の混合溶媒を用いたＨＩＬＩＣ分離モード、または逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードであるアミン類化合物の分析方法。【００１４】
［５］前記水溶性有機溶媒が、アセトニトリル、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選ばれる少なくとも１種である［４］に記載のアミン類化合物の分析方法。【００１５】
［６］前記水溶性有機溶媒が、アセトニトリルである［５］に記載のアミン類化合物の分析方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、アミン類化合物の分析をより正確に、かつより簡便に行うことを可能とする液体クロマトグラフィー充填剤、それが充填された液体クロマトグラフィーカラム、およびそれを用いたアミン類化合物の分析方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１のポリマー充填剤の分離係数α１（Ｔｂ／Ｔｐ）および分離係数α２（Ｕ／２ｄＵ）を測定したときのクロマトグラムである。
【図２】実施例１の液体クロマトグラフィーカラムの評価におけるウラシルとアドレナリンのクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を適用した液体クロマトグラフィー充填剤、それが充填された液体クロマトグラフィーカラム、およびそれを用いたアミン類化合物の分析方法の実施の形態について説明する。
なお、本実施の形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
【００１９】
［液体クロマトグラフィー充填剤］
本発明の液体クロマトグラフィー充填剤は、カルボキシル基を有するポリマー充填剤である。前記カルボキシル基が前記ポリマー充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ以上導入されることを特徴とする。また、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）による、前記ポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数が１．３０以上であり、かつ前記ポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数が１．００以上１．３０以下である。
【００２０】
（ｐＨ性を示す指数、親水性を示す指数の定義）
ここで、本発明に係るポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数およびポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数について説明する。
ポリマー充填剤の表面における、ｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数は、２０１１年に池上らによって提唱されたＨＩＬＩＣカラムの性能評価指数であり、一般的に適用可能な技術に基づく評価法によって定義される値である（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，１２１８号，２０１１年，５９０３−５９１９頁）。これらの指数は、市販されている液体クロマトグラフ分析装置（例えば、Ｎｅｘｅｒａ−ｉ（商品名、株式会社島津製作所製）、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（アジレント・テクノロジー株式会社製）等）を用いることにより、メーカー、機種によらず再現良く得ることができる。ただし、これらの指数は、ＨＩＬＩＣ分離モードで測定される。そのＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定条件は、検出器として紫外検出器（ＵＶ、波長：２５４ｎｍ）を用い、カラム温度が３０℃、移動相が、（アセトニトリル）：（酢酸１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび酢酸アンモニウム１０ｍｍｏｌ／Ｌを添加した水）＝９０／１０（混合前の容積）の混合液体である。
【００２１】
本発明におけるポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数およびポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数は、ポリマー充填剤を、内径２．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍまたは内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍの円筒型の液体クロマトグラフィー用ハウジングに充填して、液体クロマトグラフィーカラムを作製し、その液体クロマトグラフィーカラムを用いて、上記述の測定条件により求められる。また、上記の池上らの文献に基づいて、このときの移動相の線流速を３．３ｃｍ／ｍｉｎ（内径２．０ｍｍのハウジングを用いる場合、移動相の流量は０．１１ｍＬ／ｍｉｎ。内径４．６ｍｍのハウジングを用いる場合、移動相の流量は０．５５ｍＬ／ｍｉｎ。）に固定する。
【００２２】
ｐＨ性を示す指数は、酸塩基相互作用を含むイオン性相互作用（イオン交換作用）に対応する充填剤表面のｐＨ性を示す指標として、テオブロミン（Ｔｂ）とテオフィリン（Ｔｐ）を、ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定を行った際の分離係数α１（Ｔｂ／Ｔｐ）で定義される。ｐＨ性を示す指数が１．００以上であれば、ポリマー充填剤がアニオン性を示すためカチオン交換作用を発現する。一方、ｐＨ性を示す指数が１．００未満では、ポリマー充填剤がカチオン性を示すためアニオン交換作用を発現する。したがって、ｐＨ性を示す指数が１．００からの差が大きいほど、ポリマー充填剤に高いイオン交換性を発現させることができる。
【００２３】
親水性を示す指数は、充填剤表面の水和相の厚みによる親水性基の選択性を示す指標として、ウリジン（Ｕ）と２’−デオキシウリジン（２ｄＵ）を、ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定を行った際の分離係数α２（Ｕ／２ｄＵ）で定義される。親水性を示す指数が１．００以上であれば、ポリマー充填剤による親水性相互作用が発現される。
【００２４】
ここで、分離係数α１，α２は、それぞれの物質の保持係数ｋの比である。保持係数ｋはいずれも、ＨＩＬＩＣでは、カラム内に保持されずに溶出されるトルエンの溶出時間をｔ０とし、それぞれの物質の溶出時間をｔとした場合、ｋ＝（ｔ−ｔ０）／ｔ０で定義される。つまり、分離係数α１（Ｔｂ／Ｔｐ）＝ｋ１／ｋ２であり、ｋ１はテオブロミンの保持係数、ｋ２はテオフィリンの保持係数である。また、分離係数α２（Ｕ／２ｄＵ）＝ｋ３／ｋ４であり、ｋ３はウリジンの保持係数、ｋ４は２’−デオキシウリジンの保持係数である。
【００２５】
なお、ＨＩＬＩＣ分離モードにおいても、ポリマー充填剤に導入されたカルボキシル基により、イオン交換作用は発現すると推定されるが、一般的にはＨＩＬＩＣ分離モードでは、イオン交換作用も包括した分離手法として扱われることが多い。そのため、本明細書においても、ＨＩＬＩＣ分離モードの名称で説明を行う。
【００２６】
（ポリマー充填剤）
本発明に係るポリマー充填剤としては、少なくともカルボキシル基が導入された親水性ポリマーが用いられるが、カルボキシル基の他に、カルボキシアルキル基、スルホ基、スルホアルキル基等が導入された親水性ポリマーを用いることができる。
カルボキシル基が導入されたポリマー充填剤としては、カルボキシル基が化学修飾または被覆により導入されたポリマー充填剤が好ましい。このようなカルボキシル基が導入されたポリマー充填剤としては、ポリビニルアルコール樹脂またはポリヒドロキシ（メタ）アクリレート樹脂が好ましい。
【００２７】
ポリマー充填剤におけるカルボキシル基の導入量は、ポリマー充填剤に対する化学修飾量または被覆量にて調節することができる。本発明の液体クロマトグラフィー充填剤が、ＨＩＬＩＣ分離モード、または逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードによる十分な分析性能を得るためには、ポリマー充填剤におけるカルボキシル基の導入量が充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ以上であり、１．６０ｍｍｏｌ以上であることが好ましく、１．８０ｍｍｏｌ以上であることがより好ましい。ポリマー充填剤におけるカルボキシル基の導入量が充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ未満では、ＨＩＬＩＣ分離モードの液体クロマトグラフィー測定を行った際のｐＨ性を示す指数が１．３０未満となり、十分なイオン交換作用が発現されないため、アミン類化合物をカラムに十分に保持させることができないことがある。
【００２８】
ポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数は１．３０以上であり、１．３０以上１．６０以下であることがより好ましく、１．４０以上１．６０以下であることがさらに好ましい。ｐＨ性を示す指数が１．３０未満では、ポリマー充填剤が十分なイオン交換作用を発現しないため、ＨＩＬＩＣ分離モード、またはＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードにて、アミン類化合物がカラムに十分に保持されず溶出されてしまうことがある。また、ｐＨ性を示す指数が１．６０以下であれば、ポリマー充填剤のイオン交換作用が強くなりすぎることがなく、アミン類化合物がカラムに十分に保持される。
【００２９】
ポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数は１．００以上１．３０以下であり、１．０５以上１．２５以下であることが好ましく、１．１０以上１．２０以下であることがより好ましい。親水性を示す指数が１．００未満では、ウリジンと２’−デオキシウリジンが親水性相互作用に基づいて、アミン類化合物が溶出していないことを示しており、ＨＩＬＩＣ用カラムに用いられる液体クロマトグラフィー充填剤としての本質を損なう。また、親水性を示す指数が１．３０を超えると、充填剤の親水性が高すぎるため、ＰＲとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードが作用しないことがある。
【００３０】
ポリマー充填剤の形状は、充分な分離性能および高感度を有し、１ＭＰａ〜３０ＭＰａの圧力に耐え得る強度を得るために、体積平均粒径が１μｍ〜３０μｍの球状であることが好ましく、体積平均粒径が３μｍ〜１０μｍの球形であることがより好ましい。
本発明における体積平均粒径は、コールターカウンター法を用いて次のように測定される。すなわち、測定装置として精密粒度分布測定装置（商品名：Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ４、ベックマン・コールター株式会社製）を用い、ポリマー充填剤０．２ｇにアイソトン（希釈液）２５ｍＬを添加し、超音波を３分間加えて分散させた後、約１０００個の測定個数にて体積平均粒径を測定する。ポリマー充填剤の体積平均粒径を好ましい範囲に制御するには、風力分級、ふるい分けによる分級、沈殿を利用した分級等が用いられる。
【００３１】
本発明におけるカルボキシル基が導入されたポリマー充填剤の製造方法としては、例えば、特開２００７−１９１５８１号公報に記載されている方法等が挙げられる。この方法では、ポリビニルアルコール樹脂基材またはポリヒドロキシ（メタ）アクリレート樹脂基材をカルボキシル基含有水溶性高分子で被膜した後、カルボキシル基含有水溶性高分子を架橋させることによって、前記の樹脂基材にカルボキシル基を導入する。また、カルボキシル基の導入量は、滴定により求めることができる。
【００３２】
本発明の液体クロマトグラフィー充填剤によれば、カルボキシル基が充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ以上導入されたポリマー充填剤からなり、ＨＩＬＩＣによる、ポリマー充填剤の表面のｐＨ性を示す指数が１．３０以上、かつポリマー充填剤の表面の親水性を示す指数が１．００以上１．３０以下であるため、アミン類化合物の分析をより正確に、かつより簡便に行うことが可能となる。
【００３３】
［液体クロマトグラフィーカラム］
本発明の液体クロマトグラフィーカラムは、例えば、円筒型等をなす液体クロマトグラフィー用ハウジング（以下、「ハウジング」と略す。）と、そのハウジングの内部に充填された充填剤とを備えるカラムが挙げられる。本発明の液体クロマトグラフィーカラムでは、充填剤としては、本発明の液体クロマトグラフィー充填剤が用いられる。
【００３４】
（ハウジング）
ハウジングの材質および大きさは、特に限定されない。ハウジングとしては、一般的に液体クロマトグラフィー用ハウジングとして用いられているステンレス製またはポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）樹脂製の円筒型ハウジングを用いることが好ましい。
【００３５】
ハウジングが円筒型である場合、十分な分離性能および高い検出感度を得るためには、その内径は、１．０ｍｍ〜８．０ｍｍであることが好ましく、２．０ｍｍ〜６．０ｍｍであることがより好ましく、２．０ｍｍ〜４．６ｍｍであることがさらに好ましい。円筒型ハウジングの内径が１．０ｍｍ以上であれば、ハウジング内に液体クロマトグラフィー充填剤を容易かつ十分に充填することができる。一方、円筒型ハウジングの内径が８．０ｍｍ以下であれば、高速分析時においてもカラム性能が十分に得られる。また、カラム圧力が高くなりすぎることがなく、測定可能な移動相の流速の範囲を広くすることができる。
【００３６】
ハウジングの長さは、３５ｍｍ〜３００ｍｍであることが好ましく、３５ｍｍ〜２５０ｍｍであることがより好ましく、５０ｍｍ〜２５０ｍｍであることがさらに好ましい。ハウジングの長さが３５ｍｍ以上であれば、アミン類化合物をカラムに十分に保持させることができ、結果として、アミン類化合物を分離することができる。一方、ハウジングの長さが３００ｍｍ以下であれば、カラム圧力が高くなりすぎることがなく、カラムからアミン類化合物を十分に溶出させることができる。
【００３７】
本発明の液体クロマトグラフィーカラムによれば、本発明の液体クロマトグラフィー充填剤がハウジングに充填されたものであるため、アミン類化合物の分析をより正確に、かつより簡便に行うことが可能となる。
【００３８】
［アミン類化合物の分析方法］
本発明のアミン類化合物の分析方法は、本発明の液体クロマトグラフィーカラムを用い、その液体クロマトグラフィーカラムによる分離モードが、移動相として水溶性有機溶媒と水の混合溶媒を用いたＨＩＬＩＣ分離モード、または逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードの分析方法である。ここで、アミン類化合物としては、アンモニアの水素原子の一部または全部を炭化水素基等の有機基で置換した構造を有する化合物を挙げることができる。
【００３９】
（移動相）
本発明のアミン類化合物の分析方法における移動相としては、水溶性有機溶媒と水の混合溶媒が用いられる。
水溶性有機溶媒としては、アセトニトリル、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、および、テトラヒドロフラン等のエーテル類等が挙げられる。これらの中でも、水溶性有機溶媒としては、アセトニトリル、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、アセトニトリルであることがより好ましい。本発明のアミン類化合物の分析方法では、これらの水溶性有機溶媒の１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４０】
（分離モード）
本発明のアミン類化合物の分析方法では、液体クロマトグラフィーカラムによる分離モードが、ＨＩＬＩＣ分離モード、またはＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードであるから、移動相である混合溶媒における水溶性有機溶媒と水の組成比率を調節することにより、ＨＩＬＩＣ分離モードとミックスモードとを選択して発現させることができる。
【００４１】
移動相は、分析対象（アミン類化合物）の種類に応じて適宜選択することができる。通常、混合溶媒における水溶性有機溶媒の組成比率（混合前体積比）は５０％〜７０％に境界がある。その境界よりも水溶性有機溶媒の組成比率（混合前体積比）を低くすると、ＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードが発現する。一方、その境界よりも水溶性有機溶媒の組成比率（混合前体積比）を高くすると、ＨＩＬＩＣ分離モードが発現する。すなわち、分析するアミン類化合物の種類に応じて、発現させたい分離モードが決まり、その分離モードに応じて、混合溶媒における水溶性有機溶媒の組成比率（混合前体積比）を決定する。
混合溶媒における水溶性有機溶媒と水の組成比率（混合前体積比）は、通常、水溶性有機溶媒：水＝１：９９〜９９：１であることが好ましく、５：９５〜９５：５であることがより好ましい。
【００４２】
ＨＩＬＩＣ分離モードでは、混合溶媒における水溶性有機溶媒と水との組成比率（混合前体積比）は、通常、水溶性有機溶媒：水＝５０：５０〜９９：１であることが好ましく、６０：４０〜９９：１であることがより好ましく、７０：３０〜９５：５であることがさらに好ましく、７５：２５〜９５：５であることが特に好ましい。
【００４３】
ＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードでは、混合溶媒における水溶性有機溶媒と水との組成比率（混合前体積比）は、通常、水溶性有機溶媒：水＝１：９９〜７０：３０であることが好ましく、１：９９〜５０：５０であることがより好ましく、５：９５〜５０：５０であることがさらに好ましく、１０：９０〜５０：５０であることが特に好ましい。
【００４４】
また、本発明のアミン類化合物の分析方法では、移動相には、親水性レベルおよび試料の保持時間を調整する目的で、任意の割合でギ酸、酢酸、硝酸等の酸、またはギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の塩を添加してもよい。
【００４５】
本発明のアミン類化合物の分析方法では、分析時のカラム流速は、特に限定されない。カラム流速、すなわち、アミン類化合物の分析時において、本発明の液体クロマトグラフィーカラム内を流れるアミン類化合物を含む移動相の線流速は、１．５ｃｍ／ｍｉｎ〜１５．０ｃｍ／ｍｉｎ（例えば、ハウジングの内径が２．０ｍｍの場合、流量は０．０５ｍＬ／ｍｉｎ〜０．５０ｍＬ／ｍｉｎ）であることが好ましく、３．０ｃｍ／ｍｉｎ〜９．０ｃｍ／ｍｉｎ（例えば、ハウジングの内径が２．０ｍｍの場合、流量は０．１０ｍＬ／ｍｉｎ〜０．３０ｍＬ／ｍｉｎ）であることがより好ましい。
【００４６】
本発明のアミン類化合物の分析方法によれば、本発明の液体クロマトグラフィーカラムを用い、その液体クロマトグラフィーカラムによる分離モードが、移動相として水溶性有機溶媒と水の混合溶媒を用いたＨＩＬＩＣ分離モード、またはＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードであるため、アミン類化合物の種類に応じて、ＨＩＬＩＣ分離モードとミックスモードを適切に選択して、アミン類化合物の分析をより正確に、かつより簡便に行うことが可能となる。
後述の実施例で示すように、カルボキシル基を充填剤１ｇ当たり１．５０ｍｍｏｌ以上導入することにより、陽イオン交換作用が十分に働いてＲＰモードとイオン交換クロマトグラフィーとのミックスモードが発現するため、ＲＰモードのみでは保持が難しいアミン類を十分に保持させることができるようになる。このとき、例えば、ウラシルをＲＰ指標物質としたときのアドレナリンの保持係数は、２．０以上が好ましく、２．５以上がより好ましい。これが達成したときに、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードが機能したとみなすことができる。
本発明のアミン類化合物の分析方法では、１つ以上のアミン類化合物を分離および分析でき、特に上記のミックスモードによれば、ＲＰモードで保持されやすい芳香族化合物等の化合物と、ＲＰモードだけでは親水性が強すぎて保持されないアミン類等のイオン性物質を1回の分析で同時に測定することも可能となる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例および比較例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４８】
（ｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数の妥当性評価）
ＨＩＬＩＣによる、ｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数について、上記の非特許文献（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，１２１８号，２０１１年，５９０３−５９１９頁）に従って文献データの妥当性確認を行った。
カラムとしては、上記の非特許文献に記載されているＺＩＣ（登録商標）  ＨＩＬＩＣ（内径２．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、メルク株式会社製）を用いた。上記の非特許文献に記載されているｐＨ性を示す指数は１．２０、親水性を示す指数は２．０３である。
液体クロマトグラフ分析装置としては、Ｎｅｘｅｒａ−ｉ（商品名、株式会社島津製作所製）を用いた。測定条件は、上記の非特許文献に従って、検出器として紫外検出器（ＵＶ、波長：２５４ｎｍ）を用い、カラム温度が３０℃、移動相組成が、（アセトニトリル）：（酢酸１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび酢酸アンモニウム１０ｍｍｏｌ／Ｌを添加した水）＝９０／１０の比率（混合前の容積）の混合液体とした。また、移動相の流量を０．１１ｍＬ／ｍｉｎ（線流速：３．３ｃｍ／ｍｉｎ）として、トルエン１０００μｇ／ｍＬ、テオフィリン１００μｇ／ｍＬ、テオブロミン１００μｇ／ｍＬ、ウリジン１００μｇ／ｍＬ、２−デオキシウリジン１００μｇ／ｍＬ（いずれも移動相に溶解）の試験サンプルを順番に１μＬ注入して溶出時間を確認した後、ｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数を算出した。
その結果、ｐＨ性を示す指数が１．２４、親水性を示す指数が１．９９であり、上記の非特許文献に記載されている値を再現できることが確認できた。
以下の実施例および比較例において、本装置および測定条件により、ｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数を求めた。ただし、比較例２のみ内径が４．６ｍｍのカラムを用いたため、移動相の流量を０．５５ｍＬ／ｍｉｎ（線流速：３．３ｃｍ／ｍｉｎ）、それぞれの試験サンプルの注入量を４μＬとした。【００４９】
［実施例１］
（ゲルとカラムの作製）
充填剤には特開２００７−１９１５８１号公報に記載されている方法に準じて、ポリビニルアルコール樹脂（粒子径５．０μｍ）基材に、カルボキシル基を基材１ｇ当たり２．０９ｍｍｏｌ導入した、実施例１のポリマー充填剤（カルボキシル基が導入されたポリマー充填剤）を作製した。
なお、ポリビニルアルコール樹脂基材に導入されたカルボキシル基量を滴定により定量した。
このポリマー充填剤０．３５ｇを、０．５ｍｏｌ／Ｌギ酸水溶液１．２ｍｌに加えた後、超音波バスにて分散処理を施し、ギ酸水溶液にカルボキシル基導入充填剤が均一に分散したスラリー溶液を調製した。
得られたスラリー溶液を用いて、円筒型であり、内径２．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍのＰＥＥＫ製ハウジング（株式会社巴製作所製）に、上記のポリマー充填剤を充填した。
すなわち、ハウジング内に、上記のスラリー溶液を注入し、ハウジングの入口側から出口側に向かって、水を通液することにより、スラリー溶液を２９ＭＰａ（定圧）にて２０分加圧し、ハウジング内にポリマー充填剤をからなる充填層を形成し、実施例１の液体クロマトグラフィーカラムを得た。
上述の方法に従って、実施例１の充填剤のｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数を求めた結果、ｐＨ性を示す指数（テオブロミンとテオフィリンの分離係数α１（Ｔｂ／Ｔｐ））は１．４４、親水性を示す指数（ウリジンと２’−デオキシウリジンの分離係数α２（Ｕ／２ｄＵ））は１．０９であり、ウリジンが２’ −デオキシウリジンの後に溶出されていることから、ＨＩＬＩＣ用充填剤としての性能を有していることが確認できた。
実施例１のポリマー充填剤の分離係数α１（Ｔｂ／Ｔｐ）および分離係数α２（Ｕ／２ｄＵ）を測定したときのクロマトグラムを図１に示す。なお、図１において、符号１はトルエンのピークを示し、符号２はテオフィリン（Ｔｐ）のピークを示し、符号３は２’−デオキシウリジン（２ｄＵ）のピークを示し、符号４はウリジン（Ｕ）のピークを示し、符号５はテオブロミン（Ｔｂ）のピークを示す。【００５０】
（カラムの評価）
液体クロマトグラフ分析装置としては、Ｎｅｘｅｒａ−ｉ（商品名、株式会社島津製作所製）を用い、検出器としては、紫外検出器（ＵＶ、波長：２７５ｎｍ）を用いて、実施例１の液体クロマトグラフィーカラムの評価を行った。
移動相としては、アセトニトリルと５０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸水溶液を、アセトニトリル：５０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸水溶液＝２０：８０（混合前体積比）の割合で混合した混合溶液を用いた。
カラムの温度を４０℃とし、カラム内における移動相の流量を０．２ｍＬ／ｍｉｎ（線流速：６．０ｃｍ／ｍｉｎ）として、ウラシル（ＲＰモードにおけるｔ０指標物質）５０μｇ／ｍＬと、アミン類化合物であるアドレナリン１０００μｇ／ｍＬとの混合試料を２μＬ注入して、ウラシルとアドレナリンを分離分析した。
カラムの評価結果を表１に、実施例１のカラムの評価におけるクロマトグラムを図２に示す。なお、図２において、符号１はウラシルのピークを示し、符号２はアドレナリンのピークを示す。【００５１】
表１の結果から、アドレナリンの溶出時間は９．０６分、アドレナリンの保持係数（ｋ＝（ｔアドレナリンの溶出時間−ｔ０指標物質の溶出時間）／ｔ０指標物質の溶出時間、にて定義される）は４．１０であり、実施例１の液体クロマトグラフィーカラムは十分にＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードとしての性能も有していることが確認できた。【００５２】
［実施例２］
（ゲルとカラムの作製）
実施例１と同じポリビニルアルコール樹脂基材を用い、かつ実施例１と同様の方法により、カルボキシル基を基材１ｇ当たり１．７６ｍｍｏｌ導入した、実施例２のポリマー充填剤（カルボキシル基が導入されたポリマー充填剤）を作製した。
このポリマー充填剤を、実施例１と同じハウジングに、実施例１と同様の方法により充填し、実施例２の液体クロマトグラフィーカラムを得た。
上述の方法に従って、実施例２のポリマー充填剤のｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数を求めた結果、ｐＨ性を示す指数は１．３７、親水性を示す指数は１．１９であり、ＨＩＬＩＣ用充填剤としての性能を有していることが確認できた。【００５３】
（カラムの評価）
実施例１と同じ装置を用い、かつ実施例１と同様の測定条件により、ウラシル５０μｇ／ｍＬと、アドレナリン１０００μｇ／ｍＬとの混合試料を２μＬ注入して、ウラシルとアドレナリンを分離分析した。
カラムの評価結果を表１に示す。【００５４】
表１の結果から、アドレナリンの溶出時間は６．５６分、アドレナリンの保持係数は２．６３であり、実施例１と比べてアドレナリンの保持力に低下がみられたものの、十分にＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードとしての性能も有していることが確認できた。【００５５】
［実施例３］
（ゲルとカラムの作製）
実施例１と同じポリビニルアルコール樹脂基材を用い、かつ実施例１と同様の方法により、カルボキシル基を基材１ｇ当たり１．６２ｍｍｏｌ導入した、実施例３のポリマー充填剤（カルボキシル基が導入されたポリマー充填剤）を作製した。
このポリマー充填剤を、実施例１と同じハウジングに、実施例１と同様の方法により充填し、実施例３の液体クロマトグラフィーカラムを得た。
上述の方法に従って、実施例３のポリマー充填剤のｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数を求めた結果、ｐＨ性を示す指数は１．３３、親水性を示す指数は１．１９であり、ＨＩＬＩＣ用充填剤としての性能を有していることが確認できた。【００５６】
（カラムの評価）
実施例１と同じ装置を用い、かつ実施例１と同様の測定条件により、ウラシル５０μｇ／ｍＬと、アドレナリン１０００μｇ／ｍＬとの混合試料を２μＬ注入して、ウラシルとアドレナリンを分離分析した。
カラムの評価結果を表１に示す。【００５７】
表１の結果から、アドレナリンの溶出時間は６．４４分、アドレナリンの保持係数は２．５７であり、実施例１と比べてアドレナリンの保持力に低下がみられたものの、十分にＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードとしての性能も有していることが確認できた。【００５８】
［比較例１］
（ゲルとカラムの作製）
実施例１と同じポリビニルアルコール樹脂基材を用い、かつ実施例１と同様の方法により、カルボキシル基を基材１ｇ当たり１．３８ｍｍｏｌ導入した、比較例１のポリマー充填剤（カルボキシル基が導入されたポリマー充填剤）を作製した。
このポリマー充填剤を、実施例１と同じハウジングに、実施例１と同様の方法により充填し、比較例１の液体クロマトグラフィーカラムを得た。
上述の方法に従って、比較例１のポリマー充填剤のｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数を求めた結果、ｐＨ性を示す指数は１．２２、親水性を示す指数は１．３６であり、ＨＩＬＩＣ用充填剤としての性能を有していることが確認できた。【００５９】
（カラムの評価）
実施例１と同じ装置を用い、かつ実施例１と同様の測定条件により、ウラシル５０μｇ／ｍＬと、アドレナリン１０００μｇ／ｍＬとの混合試料を２μＬ注入して、ウラシルとアドレナリンを分離分析した。
カラムの評価結果を表１に示す。【００６０】
表１の結果から、アドレナリンとウラシルが分離せずに溶出してしまった。これは、ｐＨ性を示す指数が低いため、特にイオン交換作用が発現しないことにより、十分にＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードとしての性能を有していないからであると考えられる。【００６１】
［比較例２］
市販のカラムとして、カルボキシル基が導入されていないジオール基導入型の充填剤が充填されているＨＩＬＩＣ用カラム（商品名：ＨＩＬＩＣ−１、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いた。
上述の方法に従って、比較例２のジオール基導入型の充填剤のｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数を求めた結果、ｐＨ性を示す指数は１．００、親水性を示す指数は０．８９であり、ＨＩＬＩＣ用カラムでありながら、親水性を示す指数が１．００よりも低いことが確認できた。【００６２】
（カラムの評価）
実施例１と同じ装置を用い、カラム内における移動相の流量を１．０ｍＬ／ｍｉｎ（線流速：６．０ｃｍ／ｍｉｎ）としたこと以外は実施例１と同様の測定条件により、ウラシル５０μｇ／ｍＬと、アドレナリン１０００μｇ／ｍＬとの混合試料を１０μＬ注入して、ウラシルとアドレナリンを分離分析した。
カラムの評価結果を表１に示す。【００６３】
表１の結果から、アドレナリンがウラシルよりも前に溶出してしまった。これは、ｐＨ性を示す指数が低いため、特にイオン交換作用が発現しないことにより、十分にＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードとしての性能を有していないからであると考えられる。【００６４】
［比較例３］
市販カラムとして、カルボキシル基が導入されていないアミド基導入型の充填剤が充填されているＨＩＬＩＣ用カラム（商品名：Ａｍｉｄｅ−８０、内径２．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、東ソー株式会社製）を用いた。
上述の方法に従って、比較例３のアミド基導入型の充填剤のｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数を求めた結果、ｐＨ性を示す指数は１．３１、親水性を示す指数は１．６５であり、ＨＩＬＩＣ用充填剤としての性能を有していることが確認できた。【００６５】
（カラムの評価）
実施例１と同じ装置を用い、かつ実施例１と同様の測定条件により、ウラシル５０μｇ／ｍＬと、アドレナリン１０００μｇ／ｍＬとの混合試料を２μＬ注入して、ウラシルとアドレナリンを分離分析した。
カラムの評価結果を表１に示す。【００６６】
表１の結果から、アドレナリンの溶出時間は３．３４分、アドレナリンの保持係数は０．６７であり、わずかにアドレナリンを保持したものの、実施例１と比べて大幅にアドレナリンの保持力に低下がみられた。また、親水性を示す指標が高いため、特にＲＰ作用が発現しないことにより、十分にＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードとしての性能を有していなかった。【００６７】
［比較例４］
市販カラムとして、ｐＨ性を示す指数および親水性を示す指数の妥当性評価に用いた、ＺＩＣ（登録商標）  ＨＩＬＩＣ（内径２．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、メルク株式会社製）を用いた。
上述の通り、ｐＨ性を示す指数は１．２４、親水性を示す指数は１．９９であり、ＨＩＬＩＣ用充填剤としての性能を有していることが確認できた。【００６８】
（カラムの評価）
実施例１と同じ装置を用い、かつ実施例１と同様の測定条件により、ウラシル５０μｇ／ｍＬと、アドレナリン１０００μｇ／ｍＬとの混合試料を２μＬ注入して、ウラシルとアドレナリンを分離分析した。
カラムの評価結果を表１に示す。【００６９】
表１の結果から、アドレナリンの溶出時間は２．９４分、アドレナリンの保持係数は０．３８であり、わずかにアドレナリン保持したものの、実施例１と比べて大幅にアドレナリンの保持力に低下がみられた。また、ｐＨ性を示す指数が低く、かつ親水性を示す指標が高いため、十分にＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードとしての性能を有していなかった。【００７０】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、アミン類化合物を分析するための液体クロマトグラフィー充填剤であって、カルボキシル基が導入されたポリマー充填剤からなる充填剤、それが充填された液体クロマトグラフィーカラム、およびそれを用いたアミン類化合物の分析方法に関するものであり、ＨＩＬＩＣ分離モード、またはＲＰとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせたミックスモードにより、各種アミン類化合物を良好に保持、分離させることができる。そのため、本発明は、医薬、食品、肥料、工業用薬品等の様々な物質に含まれる重要な化合物であるアミン類化合物を、各種工業における研究開発、品質試験、また環境分析等において分析する場合に有用となる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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