(57)【要約】［課題］  アルツハイマー病（ＡＤ）の診断補助方法、前記方法に使用するための検出試薬および診断キット、ならびに診断システムを提供すること。［解決手段］  対象から採取された尿に由来する尿試料中の尿バイオマーカーの量を測定する工程、および測定された尿バイオマーカーの量に基づいて、前記対象がＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いかを判定する工程を含み、前記尿バイオマーカーが、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＢ−４８、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＮＰＣ１Ｌ１、およびＭＴからなる群より選択される少なくとも１種の尿タンパク質である、ＡＤの診断補助方法を提供する。［選択図］なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病（ＡＤ）の診断補助方法であって、
対象から採取された尿に由来する尿試料中の尿バイオマーカーの量を測定する工程、および
測定された尿バイオマーカーの量に基づいて、前記対象がＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いかを判定する工程を含み、
前記尿バイオマーカーが、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（以下「Ａｐｏ」）Ａ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＢ−４８、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（以下「ＩＦＩＴＭ」）１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、Ｎｅｉｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  Ｃ（以下「ＮＰＣ」）１、ＮＰＣ２、ＮＰＣ１Ｌ１、およびＭｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ（以下「ＭＴ」）からなる群より選択される少なくとも１種の尿タンパク質である、方法。
【請求項２】
前記判定工程が、測定された尿バイオマーカーの量と前記尿バイオマーカーの量に関する閾値とを比較することを含み、
前記測定された尿バイオマーカーの量が前記閾値よりも大きい場合に、前記対象がＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いと判定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記尿バイオマーカーが、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、ＮＰＣ１、およびＭＴからなる群より選択される少なくとも１種の尿タンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＡＤの病態が、ＡＤによる認知症又はＡＤによる軽度認知障害である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
対象から採取された尿を用いて尿試料を調製する工程を含み、
前記尿試料調製工程が、尿由来の尿タンパク質含有複合体を富化する工程を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
対象から採取された尿を用いて尿試料を調製する工程を含み、
前記尿試料調製工程が、前記尿由来の尿タンパク質含有複合体から尿バイオマーカーを抽出する工程を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記測定工程が、遊離形態の尿バイオマーカーを測定する工程を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記尿バイオマーカーが、前記群より選択される少なくとも２種の尿タンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記尿バイオマーカーが、前記群より選択される少なくとも２種の尿タンパク質であり、
前記尿試料が前記尿由来の尿タンパク質含有複合体を含み、
前記少なくとも２種の尿バイオマーカーが前記複合体に共局在している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記測定工程が、前記尿タンパク質含有複合体の量を測定する工程であり、
前記判定工程が、該対象が心疾患に罹患している又はその発症リスクが高いかを判定することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記測定工程が、前記尿バイオマーカーとそれに対する検出試薬との会合体を形成させ、前記会合体に由来する尿バイオマーカーの量を反映するシグナルを検出することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出試薬が、尿バイオマーカーに対する抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体およびアプタマーからなる群より選択される少なくとも１種のプローブを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出試薬が、蛍光物質、放射性物質および酵素からなる群より選択される少なくとも１種の標識物質をさらに含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法に使用するための検出試薬であって、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＢ−４８、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＮＰＣ１Ｌ１、およびＭＴからなる群より選択される少なくとも１種の尿バイオマーカーに対する抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体およびアプタマーからなる群より選択される少なくとも１種のプローブを含む、試薬。
【請求項１５】
蛍光物質、放射性物質および酵素からなる群より選択される少なくとも１種の標識物質をさらに含む、請求項１４に記載の試薬。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の検出試薬を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法に使用するための診断キット。
【請求項１７】
対象から採取された尿に由来する尿試料中の尿バイオマーカーの量と、ＡＤに関しての前記尿バイオマーカーの量に関する閾値とを比較して、前記対象がＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いかを判定する判定部と、
前記判定部の判定結果を表示する表示部と、を含み、
前記尿バイオマーカーが、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＢ−４８、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＮＰＣ１Ｌ１、およびＭＴからなる群より選択される少なくとも１種の尿タンパク質である、診断システム。
【請求項１８】
前記システムは、前記群より選択される複数種の前記尿バイオマーカーそれぞれに対応する前記閾値を格納したデータベースを有し、
前記判定部は、前記対象から採取された尿に由来する尿試料中の前記尿バイオマーカーの種類を含む情報に基づいて、前記データベースより対応する前記閾値を取得し、前記取得した閾値に基づいて判定を行う、請求項１７に記載の診断システム。
【請求項１９】
前記尿試料中の尿バイオマーカーの量が、前記尿試料中の少なくとも２種の尿バイオマーカーが共局在している尿タンパク質含有複合体の量であり、
前記閾値が、前記少なくとも２種の尿バイオマーカーが共局在している尿タンパク質含有複合体の量に関する閾値である、請求項１７または１８に記載の診断システム。
【請求項２０】
前記判定部が、前記尿試料中の少なくとも２種の尿バイオマーカーが共局在している尿タンパク質含有複合体の量と、心疾患に関しての前記少なくとも２種の尿バイオマーカーが共局在している尿タンパク質含有複合体の量に関する閾値とを比較して、前記対象が心疾患に罹患している又はその発症リスクが高いかをさらに判定する、請求項１９に記載の診断システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の診断補助方法、前記方法に使用するための検出試薬および診断キット、ならびに診断システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＤ）は、記憶障害と認知症を引き起こす進行性の神経変性疾患であり、認知症の中で最も患者の割合が多いとされている。ＡＤは、記憶障害のみならず患者の人格も破壊し、患者の社会生活機能を喪失させてしまうため、ＡＤ患者本人だけでなく患者家族にも多大な負担を強いる病である。高齢化が進む我が国において、ＡＤおよび他の認知症の患者数は急激に増加しており、大きな社会問題となっている。【０００３】
近年、認知症の前段階として軽度認知機能障害（ＭＣＩ）が注目されている。ＭＣＩの病因は多様であるが、サブタイプの１つである健忘型ＭＣＩは高率でＡＤに移行することが報告されている。ＡＤの根本的な治療法がない状況下、ＡＤによる認知症を予防するために、無症状であってもＡＤ病変がある段階で治療介入することの重要性が議論されている。このような議論は、バイオマーカー研究によりＡＤの脳病理を推定可能になったことがその背景の１つに挙げられる。【０００４】
ＡＤを含む認知症の診断に広く用いられる診断方法に、被験者への問診に基づいた改訂  長谷川式簡易知能評価スケール（ＨＤＳ−Ｒ）およびＭｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｅ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ（ＭＭＳＥ）がある。これらの問診法は、認知症をスクリーニングする目的で使用されている。ＡＤと他の認知症とを鑑別するために、画像検査がさらに用いられている。米国ＮＩＡ／ＡＡ（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ／Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）は、２０１１年に、ＡＤの新たな診断基準を発表した。この診断基準では、臨床所見に基づいた臨床診断基準に加えてバイオマーカーに基づく診断基準が採用されている。【０００５】
バイオマーカーに基づくＡＤ診断には、例えば、神経画像的バイオマーカー（例えば、構造的磁気共鳴画像（ｆＭＲＩ）による内側側頭葉の委縮の定量）に基づく画像検査がある。ＡＤ診断で行われる画像検査では、一般に、ＭＲＩ、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）などの撮像装置が用いられる。これらの撮像装置は特殊な設備を必要とするため、画像検査ができる施設は限られてくる。このため、被検者は画像検査のために特定の医療機関へ赴く必要がある。また、検査には長時間（約２時間）かかる。このように、ＡＤ診断の画像検査は、地理的・時間的制約が大きく、簡便に行える検査ではない。また、検査費用も１回あたり数万円かかる（非特許文献１）。【０００６】
ＡＤを診断するための生化学的バイオマーカーとしては、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のアミロイドベータ（Ａβ）４２の低下またはリン酸化タウの増加が挙げられる。ＣＳＦ中のリン酸化タウを測定するためのＥＬＩＳＡキット（非特許文献２）が上市され、ＣＳＦ中のリン酸化タウ増加はバイオマーカーとして実用化されている。しかしながら、この方法ではＣＳＦ採取時に穿刺針を用いる必要があり、被検者に対する身体的負担が大きく（高侵襲性）、繰り返し検査して継続的に被検者の状態をモニターするのには適していない。【０００７】
ＣＳＦ採取に比べると侵襲性が低い生体試料として血液がある。特定のアポリポタンパク質の血液中濃度について、ＡＤ群と非ＡＤ群との間に統計学上の有意差があったことが報告された（非特許文献３〜６）。しかしながら、その差異はバイオマーカーとして実用できる程ではなく、また、血液の採取にあったって被験者には身体的負担が依然としてある。【０００８】
近年、細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＥＶｓ）が注目されている。細胞外小胞は、細胞から放出される脂質二重膜に囲まれたナノサイズからマイクロサイズの小胞である。細胞外小胞内部には、細胞内タンパク質だけでなく、生体内で遺伝子発現抑制に重要な働きを示すｍｉｃｒｏ  ＲＮＡが保持されていたことから、細胞外小胞は細胞間のコミュニケーションツールとして注目されている。血液、尿、母乳などの体液にも存在する細胞外小胞は、バイオマーカー探索のための生体試料としても注目さている（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】認知症疾患治療ガイドライン２０１０、医学書院（監修：日本神経学会）
【非特許文献２】荒井啓行 他、機器・試薬 (2013) 36(5): 713-717
【非特許文献３】Caramelli et al., Acta Neurol Scand (1999) 100: 61-63
【非特許文献４】Taddei et al., Neuroscience Letters (1997) 223: 29-32
【非特許文献５】Cudaback et al., Journal of Neuroinflammation (2012) 9(192):1-13
【非特許文献６】Uchida et al., Diagnosis, Assessment & Disease Monitoring (2015)1: 270-280
【非特許文献７】下田麻子 他、Drug Delivery System (2014)29-2: 108-115
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
当該分野には、被検者に対する身体的負担がほとんどなく、簡便に実施できるＡＤの診断補助方法に対する要求が存在する。【００１１】
血液中にはバイオマーカーとなり得る多種類のタンパク質が高濃度で存在している。このため、疾患バイオマーカーの探索には、血液が一般に用いられる。尿中に含まれるタンパク質（以下「尿タンパク質」という。）の量は、血液中のタンパク質量に比べて僅かである。尿タンパク質の多くは、腎臓や膀胱などの排尿に関連する臓器に由来すると一般的に考えられており、実際、ＡＤに関して、尿に着目したような報告は、知る限り、存在しない。【００１２】
本発明者らは、ＡＤ診断のためのバイオマーカーを鋭意検討し、驚くべきことに、ＡＤ群と非ＡＤ群とを比べた場合に、その量が顕著に変化している尿タンパク質を見出し、本発明を完成させた。発明者らが今回見出した知見から、血液中のＡＤ関連分子が血液から尿へ排泄される過程で選択的に濃縮される可能性が考えられるが、このような仮説または推測により本発明はいかようにも限定されない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下のアルツハイマー病の診断補助方法、前記方法に使用するための検出試薬および診断キット、ならびに診断システムを提供する。【００１４】
本発明の第１の態様は、（ｉ）対象から採取された尿に由来する尿試料中の尿バイオマーカーの量を測定する工程、および（ｉｉ）測定された尿バイオマーカーの量に基づいて、前記対象がＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いかを判定する工程を含み、前記尿バイオマーカーは、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（以下「Ａｐｏ」という）Ａ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＢ−４８、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（以下「ＩＦＩＴＭ」という）１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、Ｎｅｉｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  Ｃ（以下「ＮＰＣ」という）１、ＮＰＣ２、ＮＰＣ１Ｌ１、およびＭｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ（以下「ＭＴ」という）からなる群より選択される少なくとも１種の尿タンパク質である、アルツハイマー病の診断補助方法を提供する。【００１５】
工程（ｉ）では、例えば、尿バイオマーカーを含有し得る尿試料と前記尿バイオマーカーに対する検出試薬とを混合し、前記尿バイオマーカーと前記検出試薬との会合体を形成させる。次いで、例えば、前記会合体と未反応の尿バイオマーカーまたは検出試薬とを分離（Ｂ／Ｆ分離）する。検出試薬が蛍光物質または発光物質を標識物質として含む場合、前記会合体からは蛍光または発光のシグナルが検出される。前記会合体が尿試料中の尿バイオマーカーの量に依存（例えば、比例）して形成される場合、前記シグナルの定量的なパラメータ（例えば蛍光強度または発光強度）は、尿試料中の尿バイオマーカーの量を反映し得る。前記シグナルの定量的なパラメータから、尿試料中の尿バイオマーカーの量（例えば濃度または含有量）を算出できる。【００１６】
工程（ｉｉ）では、工程（ｉ）で測定された定量的なパラメータの測定値または前記測定値から算出された尿バイオマーカーの濃度または含有量に基づいて、測定した尿試料の提供者（対象）がＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いかを判定する。例えば、工程（ｉ）で測定された尿バイオマーカーの量と、その尿バイオマーカーの量に関する閾値とを比較し、測定した尿バイオマーカーの量が前記閾値よりも大きい場合に、前記対象がＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いと判定される。閾値は、例えば、予め設定されたＡＤ群と非ＡＤ群とを判別するための値である。【００１７】
本発明の第２の態様は、第１の態様に係る方法に使用するための検出試薬を提供する。前記検出試薬は、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＢ−４８、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＮＰＣ１Ｌ１、およびＭＴからなる群より選択される少なくとも１種の尿バイオマーカーに対する抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体およびアプタマーからなる群より選択される少なくとも１種のプローブを含む。検出試薬は、前記プローブに加えて、蛍光物質、放射性物質および酵素からなる群より選択される少なくとも１種の標識物質をさらに含んでもよい。【００１８】
本発明の第３の態様は、第２の態様に係る検出試薬を含む、第１の態様に係る方法に使用するための診断キットを提供する。診断キットは、さらに、プレートやビーズなどの担体、および／または検出試薬以外に必要な試薬を含む。診断キットは、さらに添付文書を含んでもよい。添付文書には、例えば、試薬の使用方法および判定基準が記載されている。判定基準には、例えば測定した尿試料中の尿バイオマーカーの量が、前記尿バイオマーカーの量に関する閾値よりも大きい場合に対象がＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いと判定すると記載されている。【００１９】
本発明の第４の態様は、対象から採取された尿に由来する尿試料中の尿バイオマーカーの量と、ＡＤに関しての前記尿バイオマーカーの量に関する閾値とを比較して、前記対象がＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いかを判定する判定部と、前記判定部の判定結果を表示する表示部と、を含み、前記尿バイオマーカーが、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＢ−４８、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＮＰＣ１Ｌ１、およびＭＴからなる群より選択される少なくとも１種の尿タンパク質である、ＡＤの診断システムを提供する。前記システムは、前記群より選択される複数種の前記尿バイオマーカーそれぞれに対応する前記閾値を格納したデータベースを有していてよく、前記判定部は、前記対象から採取された尿に由来する尿試料中の前記尿バイオマーカーの種類の情報、並びに判定対象疾患がＡＤおよび心疾患のいずれか、またはその両方であるかの情報に基づいて、前記データベースより対応する前記閾値を取得し、前記取得した閾値に基づいて判定を行ってもよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係る診断補助方法は、尿を生体試料として用いるため、その採取にあたって身体的負担はほとんどない（非侵襲的）。
尿試料を用いる本発明に係る診断補助方法は、ＣＳＦ中のバイオマーカーに基づく検査に比べて、非侵襲的に且つ簡便に実施することができる。このため、本発明に係る診断補助方法は、繰り返し検査をして継続的に対象の状態をモニターするのに適している。本発明に係る診断補助方法は、画像検査に比べて、地理的・時間的制約がほとんどなく、簡便に実施することができる。また、試料採取にあたって医師による施術を必要とせず、高価な撮像装置を必要としないため費用面でも有利であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】アルツハイマー病（ＡＤ）群、心疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＨＤ）群、健常者（ｈｅａｌｔｈｙ  ｓｕｂｊｅｃｔ：ＨＳ）群から採取した尿に由来する尿試料中の尿タンパク質（ａ）ＡｐｏＢ−１００、（ｂ）ＡｐｏＥ、（ｃ）ＡｐｏＣ−Ｉ、（ｄ）ＡｐｏＡ−Ｉ、（ｅ）ＩＦＩＴＭ２／３、（ｆ）ＮＰＣ１、および（ｇ）ＭＴの濃度の比較を示すドットプロットである。
【図２】（ａ）ＡｐｏＢ−１００、（ｂ）ＡｐｏＥ、（ｃ）ＩＦＩＴＭ２／３および（ｄ）ＭＴから選択した２種類の尿バイオマーカーの組合せによる診断補助方法を示す棒グラフである。
【図３】尿タンパク質量の変動に対するクレアチニン補正の影響を示す折れ線グラフである。
【図４】尿試料調製における富化（濃縮）処理の影響を示す折れ線グラフである。
【図５】尿試料調製において抽出処理（アルカリ法または凍結法）を行う場合および抽出処理を行わない場合（未処理）の、尿タンパク質（ａ）ＡｐｏＢ−１００、（ｂ）ＩＦＩＴＭ２／３および（ｃ）ＭＴの回収量に対する影響を示す折れ線グラフである。
【図６】２種類の尿バイオマーカー（上：ＡｐｏＢ−１００およびＡｐｏＥ、下：ＡｐｏＢ−１００およびＡｐｏＣ−Ｉ）の共局在を指標とした診断補助方法を示す棒グラフである。
【図７】診断システム全体の概略構成を示すブロック図である。
【図８】診断システムにおけるＡＤの診断フローを示すフローチャート図である。
【図９】データベースに格納されたＡＤに関する閾値のデータの例を示す表である。
【図１０】診断システムにおける心疾患の診断フローを示すフローチャート図である。
【図１１】データベースに格納された心疾患に関する閾値のデータの例を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ＡＤは、認知症に至る進行性の神経変性疾患である。本明細書において、ＡＤは、その病態に応じて「ＡＤによる認知症」と「ＡＤによる軽度認知障害」とに分ける場合がある。ＡＤによる認知症または軽度認知障害は、公知の臨床診断基準に基づいて認知症または軽度認知障害と診断され、かつ、バイオマーカーに基づく診断基準に基づいてＡＤであると診断された病態を示す。
【００２３】
「対象」は哺乳類が例示され、例えばイヌ、ウシ、ヒツジ、非ヒト霊長類およびヒトである。対象は、好ましくはヒトである。１つの実施形態において、対象は、臨床診断基準に基づいて、ＡＤと診断されたヒト、または軽度認知障害と診断されたヒトである。別の実施において、対象は、特段、認知症の兆候が認められないヒトである。他の実施形態において、対象は、ＡＤによる認知症と診断されたヒトまたはＡＤによる軽度認知障害と診断されたヒトである。
【００２４】
本明細書および請求の範囲において「尿試料」は、測定対象とする試料をいう。尿試料は、対象から採取された尿であってもよく、後述する、尿タンパク質を含有する複合体（細胞外小胞を含む）から尿タンパク質を抽出する抽出処理を行った試料であってもよい。尿試料は、また、前記複合体に存在する尿タンパク質および／または遊離形態の尿タンパク質を富化した試料であってもよい。尿の採取の方法は特に制限されない。尿は１日の蓄尿であってもよいし随時尿であってもよい。随時尿を用いる場合、随時尿における尿タンパク質量の変動を補正してもよい。尿タンパク質量の変動を補正する方法として、限定するものではないが、尿中クレアチニン補正が挙げられる。１つの実施形態において、尿試料は随時尿または随時尿から調製された試料である。対象から採取された尿に由来する尿試料は、尿タンパク質の測定に特に支障とならない範囲で、添加物を含んでいてもよい。そのような添加物は、限定するものではないが、例えば緩衝剤、プロテアーゼインヒビター、ｐＨ調整剤、界面活性剤、およびキレート剤が挙げられる。
【００２５】
「尿タンパク質」は、対象から採取された尿において見出されるタンパク質を意味し、その状態により区別するものではない。例えば、尿タンパク質は、対象から採取された尿において遊離形態で存在してもよく、又は脂質や他のタンパク質と複合体を形成していてもよい。
【００２６】
「遊離形態の尿タンパク質」は、タンパク質分子単独で又は非タンパク質性の分子を補因子として含むホロタンパク質として、尿または尿試料中に存在し得る尿タンパク質を示す。「尿タンパク質を含有する複合体」または「尿タンパク質含有複合体」は、尿タンパク質と他の成分との複合体を示し、限定するものではないが、特定の尿タンパク質と他の尿タンパク質との会合体、尿タンパク質とリン脂質との複合体（リポタンパク質）、および尿タンパク質を含有する細胞外小胞が挙げられる。前記複合体には、限定するものではないが、少なくとも１種、例えば１種、２種または３種もしくはそれ以上の尿タンパク質が存在している場合がある。本明細書および特許請求の範囲において、１個の前記複合体に２種以上の尿タンパク質が存在する場合、尿バイオマーカーが前記複合体に「共局在」しているという。
【００２７】
「細胞外小胞」は、脂質二重膜に囲まれた粒子を意味し、その発生機序やサイズにより区別するものではない。少なくとも１種の尿タンパク質を含有する細胞外小胞は、限定するものではないが、尿タンパク質の種類や対象の状態に応じて、尿タンパク質を、脂質二重膜内部に内包している、または脂質二重膜上に含んでいる、あるいはその両方である。
【００２８】
「尿バイオマーカー」は、ＡＤに関連してその含有量または濃度が変化し得る尿タンパク質もしくはその部分ペプチドであって、アポリポタンパク質、コレステロール輸送関連タンパク質またはメタロチオネインタンパク質を示す。
【００２９】
本発明に係るアポリポタンパク質の種類、それらの合成器官および主たる局在部分を表１に示す。
【表１】
2018030252.tif 000002
【００３０】
アポリポタンパク質は、血漿リポタンパク質上に特異的に存在するタンパク質である。
アポリポタンパク質には共通した構造が多く認められ、アポリポタンパク質遺伝子の観察からその起源の同一性が指摘されている。表１に記載のアポリポタンパク質は、複数種類あるアポリポタンパク質のなかでも、合成器官および局在が同じファミリータンパク質である。
【００３１】
本発明に係るコレステロール輸送関連タンパク質の種類、それらの発現組織、機能、およびＡＤでの発現変化を表２に示す。
【表２】
2018030252.tif 000003
【００３２】
ＩＦＩＴＭ２またはＩＦＩＴＭ３（本明細書において「ＩＦＩＴＭ２／３」ともいう。）は、細胞膜および小胞体膜に発現している細胞内コレステロール輸送関連タンパク質であり、ヒトではこれらの他に３種類のアイソフォームが存在している（ＩＦＩＴＭ−１、５および１０）。ＩＦＩＴＭ１、２および３は、それぞれウイルス感染で誘導されるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）によりその発現が亢進される。発現が亢進されると、ＩＦＩＴＭ１、２および３は小胞体上でコレステロール輸送体と拮抗して、コレステロール輸送を阻害することが報告されている。また、ＡＤ患者の死後脳のＲＮＡ発現解析により、ＩＦＩＴＭ１、２および３の発現が上昇していたことが報告されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（２００９）４（５）：１−１４、およびＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ（２００４）５６（６）：３４９−３５４）。このようにＩＦＩＴＭ１、２および３は、発現部位、ＩＦＮγおよびＡＤにおける発現変化の傾向が共通している。一方、ＩＦＩＴＭ５および１０は、ＩＦＮγで誘導されず、それらの機能は現在のこところ不明である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１５）２９０：２５９４６−２５９５９）。
【００３３】
ＮＰＣ１は、ニーマンピックＣ型病の原因遺伝子であり、コレステロール輸送に関与することが知られている。ＮＰＣ１はＡＤ患者の死後脳を用いたＲＮＡ発現解析から、海馬においてその発現が亢進されていたことが報告されている（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（２０１０）１８０１：８３１−８３８）。ニーマンピックＣ型病の原因遺伝子には、ＮＰＣ１のほかに、ＮＰＣ２がある。ＮＰＣ１およびＮＰＣ２は両方ともユビキタスに発現しており、細胞内コレステロール輸送機能を有する（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１４）７２：３７−４７）。このように、ＮＰＣ１およびＮＰＣ２タンパク質は発現部位および機能が共通している。ＮＰＣ１は、ＮＰＣ１−Ｌ１は、ヒトＮＰＣ１に対して４２％のアミノ酸相同性を有する（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ００２０２０）。
【００３４】
ＭＴは、亜鉛・銅・カドミウム等の重金属をキレートするタンパク質として知られている。ＭＴは、ヒトでは９種類のアイソフォームＭＴ−１Ａ、ＭＴ−１Ｂ、ＭＴ−１Ｅ、ＭＴ−１Ｆ、ＭＴ−１Ｇ、ＭＴ−１Ｈ、ＭＴ−１Ｘ、ＭＴ−２Ａ、ＭＴ−３が存在することが知られている。表３は、本発明に係るＭＴのアイソフォーム、およびそれらの発現組織を示す。
【表３】
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【００３５】
１つの実施形態において、尿バイオマーカーは、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＢ−４８、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＮＰＣ１Ｌ１、およびＭＴからなる群より選択される少なくとも１種（例えば１種、２種、３種またはそれ以上の組合せ）または前記群より選択される少なくとも２種（例えば２種、３種またはそれ以上の組合せ）の尿タンパク質である。
【００３６】
１つの実施形態において、尿バイオマーカーは、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、ＮＰＣ１、およびＭＴからなる群より選択される少なくとも１種、例えば、１種、２種、３種またはそれ以上の尿タンパク質の組合せである。他の実施形態において、尿バイオマーカーは、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＩＦＩＴＭ２、およびＩＦＩＴＭ３からなる群より選択される少なくとも１種、例えば１種、２種、３種またはそれ以上の尿タンパク質の組合せである。
【００３７】
１つの実施形態において、尿バイオマーカーは、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＢ−４８、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、およびＡｐｏＥからなる群より選択される少なくとも１種（例えば１種、２種、３種またはそれ以上の組合せ）または前記群より選択される少なくとも２種（例えば２種、３種またはそれ以上の組合せ）の尿タンパク質である。
【００３８】
１つの実施形態において、尿バイオマーカーは、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２およびＮＰＣ１Ｌ１からなる群より選択される少なくとも１種（例えば１種、２種、３種またはそれ以上の組合せ）または前記群より選択される少なくとも２種（例えば２種、３種またはそれ以上の組合せ）の尿タンパク質である。
【００３９】
１つの実施形態において、尿バイオマーカーは、ＭＴ−１Ａ、ＭＴ−１Ｂ、ＭＴ−１Ｅ、ＭＴ−１Ｆ、ＭＴ−１Ｇ、ＭＴ−１Ｈ、ＭＴ−１Ｘ、ＭＴ−２ＡおよびＭＴ−３からなる群より選択される少なくとも１種（例えば１種、２種、３種またはそれ以上の組合せ）または前記群より選択される少なくとも２種（例えば２種、３種またはそれ以上の組合せ）の尿タンパク質である。
【００４０】
「尿バイオマーカーの量」は、例えば、尿試料中の尿バイオマーカーの含有量および濃度である。これらの値は、タンパク質または部分ペプチドを定量的に測定できる方法により測定される。そのような方法としては、例えば、抗原抗体反応を利用する又は組み合わせたＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、質量分析法、およびフローサイトメトリーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
他の例において、尿バイオマーカーの量は、測定方法によって得られるパラメータの測定値（相対値）であってもよい。一例として、測定方法に蛍光ＥＬＩＳＡを用いる場合、尿バイオマーカーの量は、蛍光ＥＬＩＳＡの結果得られる蛍光強度であってもよい。対象から採取された尿に由来する尿試料中の尿バイオマーカーの量を蛍光ＥＬＩＳＡ測定する際に、濃度既知の前記尿バイオマーカーを含む標準試料の蛍光ＥＬＩＳＡ測定も実施してもよい。この場合、後述する判定工程は、尿試料の蛍光強度と標準試料の蛍光強度（閾値）とを比較して行ってもよい。
【００４２】
他の例において、フローサイトメトリーのように粒子の数を計測できる測定方法を用いる場合、尿バイオマーカーを含有する複合体（例えば細胞外小胞）の数を尿バイオマーカーの量としてもよい。
【００４３】
本発明において「判定」は、医師や検査技師などの専門知識を有する者の判断によらず、自動的／機械的に行うことができる。１つの実施形態において、判定は、測定された尿バイオマーカーの量（測定値）と、その尿バイオマーカーの量に関する「閾値」とを比較することにより、自動的／機械的に行われる。例えば、測定値が前記閾値よりも大きい場合に当該対象がＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いと判定すると予め定められた判定基準に従えば、専門知識を有する者でなくとも、測定値と閾値との大小に基づいて、判定することができる。この例では、測定値が閾値より大きい場合について説明したが、これに限定されるものではない。尿バイオマーカーの種類に応じて、測定値が閾値よりも小さい場合に、ＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いと判定されてもよい。
【００４４】
尿バイオマーカーの量に関する「閾値」は、尿バイオマーカーの量に基づいて、ＡＤに罹患しているか又はその発症リスクがあるかを判定するために設定される値である。一例として、閾値は、尿バイオマーカーの量に基づいてＡＤ群と非ＡＤ群とを判別するための値（診断閾値）である。前記閾値は、例えば、ＡＤ群の尿バイオマーカーの量と非ＡＤ群と前記尿バイオマーカーの量とを測定し、偽陰性率、偽陽性率、コストおよび有病率を考慮して設定される。前記閾値の設定には、ＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  Ｃｕｒｖｅ）を用いることができる。
【００４５】
他の例として、閾値は、尿バイオマーカーの量に基づいて、ＡＤの発症リスクが高いと予想され、予防医学的な見地から一定の対応が要求されるかを判別するための値（予防医学的閾値）であってよい。前記閾値は、例えば、コホート研究により得た特定の尿バイオマーカーの量とＡＤ発症率との関係から設定される。他の例として、閾値は、例えば、経験則から設定されてもよい。
【００４６】
一例として、１種類の尿バイオマーカーを用いる場合、閾値はその尿バイオマーカーについて１つ設定されてもよい。他の例として、２種以上の尿バイオマーカーの組合せを用いる場合、閾値は各尿バイオマーカーについて１つの閾値が設定されてよく、合計２つの閾値が用いられてもよい。この例において、判定は、例えば、一方の尿バイオマーカーの量（第１の測定値）がその尿バイオマーカーの量に関する閾値（第１の閾値）よりも大きい場合および他方の尿バイオマーカーの量（第２の測定値）がその尿バイオマーカーの量に関する閾値（第２の閾値）よりも大きい場合のいずれかであれば、ＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いと判定される。
【００４７】
他の例として、２種以上の尿バイオマーカーの組合せを用いる場合、閾値はその組合せについて１種類の閾値が設定されてもよい。前記２種類以上の尿バイオマーカーが１個の尿タンパク質含有複合体に共局在している場合、判定は、前記２種類の尿バイオマーカーが共局在する尿タンパク質含有複合体の量が前記尿タンパク質含有複合体の量に関する閾値よりも大きい場合に、ＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いと判定することができる。この場合、尿バイオマーカーの量は少なくとも２種類の尿バイオマーカーが共局在する尿タンパク質含有複合体の量（例えば、複合体の数）と同意義であり、尿バイオマーカーの量に関する閾値は前記尿タンパク質含有複合体の量（例えば、複合体の数）に関する閾値と同意義である。
【００４８】
以上の例では閾値を予め設定された値について説明したが、本発明に係る診断補助方法は、これに限定されない。例えば、閾値は、所定濃度の尿バイオマーカーを含む標準試薬を測定して得られる尿バイオマーカーの量であってよい。標準試薬における尿バイオマーカーの濃度は、例えば、上記した診断閾値に相当する濃度であってよい。
【００４９】
「ＡＤ群」はＡＤに罹患している対象の群を示す。「非ＡＤ群」はＡＤに罹患していない対象の群を示す。非ＡＤ群は、例えば、健常者群、他の認知症（例えば血管性認知症）の患者群またはＡＤに高頻度で認められる合併症（例えば糖尿病、心疾患）の患者群であってもよい。「健常者群」は、健常者から一定の除外基準を設けて選別した対象の群を示す。一定の除外基準は、例えば、認知症に関する兆候が認められないことであってよい。群の規模は、診断の感度、特異度、コストなどの要素を考慮して、当業者により適宜設定される。
【００５０】
ＡＤ群および非ＡＤ群は、例えば、対象の特徴（例えば年齢、性別および病態）に基づいてサブグループに分けてもよい。この場合、閾値は、各サブグループについて、ＡＤ群と非ＡＤ群とを判別するために設定される。例えば、ＡＤ群および非ＡＤ群を、対象の年齢（例えば、“１８歳〜６５歳未満”と“６５歳以上”）に基づいてサブグループに分る。この例において、閾値は各サブグループ（例えば、若年性ＡＤ群と若年性非ＡＤ群）においてＡＤ群と非ＡＤ群を判別するために設定されてよい。
【００５１】
上記例では、判定として、「ＡＤに罹患している又はその発症リスクが高い」としたが、本発明に係る診断補助方法はこれに限定されるものではなく、適宜設定されてよい。一例として、判定は「対象はＡＤに罹患している可能性が高い」または「尿試料はＡＤ患者由来である」であってもよい。
【００５２】
他の例として、判定は、測定する対象の病態に応じて適宜設定されてよい。例えば、対象が他の臨床診断方法において既に１）軽度認知障害または２）認知症の診断を受けている患者の場合、判定は、１）ＡＤによる軽度認知障害または２）ＡＤによる認知症である、であってよい。
【００５３】
対象が認知症の兆候が特に認められない者である場合、判定はＡＤ発症のリスクがある又は追加の検査が推奨される、であってよい。この場合、尿バイオマーカーの量に関する閾値は、健常者群において尿バイオマーカーの量を測定し、その測定値の中央９５％信頼区間（基準範囲）の上下限値であってもよく、または前記測定値の平均値±２標準偏差であってもよい。一例として、閾値は、その尿バイオマーカーの量に関する基準範囲の上限値であってよい。
【００５４】
本発明の第１の態様の１つの実施形態において、対象から採取された尿に由来する尿試料中のバイオマーカーの量を測定する工程は、前記尿バイオマーカーとそれに対する検出試薬との会合体を形成させ、前記会合体に由来する尿バイオマーカーの量を反映するシグナルを検出することを含む。他の実施形態において、前記測定工程は、検出したシグナルから尿バイオマーカーの量を算出することをさらに含む。
【００５５】
尿バイオマーカーに対する「検出試薬」は、目的とする尿バイオマーカーに特異的に結合できる「プローブ」を含む。プローブは、例えば、尿バイオマーカーに対する抗体および化合物が挙げられる。抗体は、限定するものではないが、インタクトな抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）、合成抗体（例えば、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ヒト化抗体）が挙げられる。抗体は、公知の方法、例えば、免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法により調製することができる。抗体は、市販の抗体をそのままプローブとして用いてもよい。当該化合物としては、尿バイオマーカーに特異的に結合できる物質、例えばアプタマーが例示される。
【００５６】
プローブは、遊離形態で存在してよく、又はビーズなどの担体に固相化されていてもよい。担体としては、例えばビーズまたはプレートが挙げられる。ビーズまたはプレートの材質は、特に制限されず、例えば樹脂であってよい。ビーズは、限定するものではないが、金属製粒子、樹脂製粒子および半導体粒子であってよい。ビーズは磁性を帯びていてもよい。ビーズは蛍光性の物質を含んでもよく、ビーズ自体が蛍光性を有するもの、例えば量子ドットであってよい。プレートは、限定するものではないが、樹脂製のまたはガラスの底面を含む樹脂製のマイクロタイタープレートであってよい。
【００５７】
尿試料中の尿バイオマーカーとそれに対するプローブを含む検出試薬とを、両者が接触できるような条件下に置くことで、尿バイオマーカーと検出試薬との「会合体」が形成される。会合体の形成は、例えば、溶液環境下で行われる。一例では、抗体がマイクロタイタープレートに固相化されている場合、溶液形態の尿試料を前記マイクロタイタープレートに加えることで、固相化された抗体と尿試料中の尿バイオマーカー（抗原）とが溶液環境下で接触する。それらの抗原抗体反応により、免疫複合体が形成し得る。会合体を形成させた後に、前記会合体と未反応の尿バイオマーカーまたは検出試薬とを分離（Ｂ／Ｆ分離）してもよい。
【００５８】
尿バイオマーカーと検出試薬との会合体形成は、尿中の尿バイオマーカーを濃縮または精製することにより促進し得る。一例として、尿試料は尿中の尿タンパク質または尿タンパク質含有複合体の濃度または含有量を高めるために富化されたものであってよい。
【００５９】
尿タンパク質の「富化」処理は、例えば、公知のタンパク質またはペプチドを濃縮または精製する方法を特に制限なく用いることができる。尿タンパク質含有複合体の「富化」処理では、例えば、脂質二重膜の小胞、例えば細胞外小胞を濃縮または精製するための公知の方法を、特に制限なく用いることができる。細胞外小胞の富化処理としては、限定するものではないが、遠心分離法、精密ろ過法、および表面抗原アフィニティー法が挙げられる。一例として、遊離形態の尿タンパク質の「富化」処理は、例えば、対象から採取された尿に遠心分離を行い、遊離形態の尿タンパク質を含む画分（例えばその上清）を回収することを含む。他の例として、遊離形態の尿タンパク質の「富化」処理は、例えば、尿タンパク質含有複合体を富化した尿試料を、後述する抽出処理することを含む。遊離形態で又は複合体に存在する尿タンパク質の富化処理により、尿試料中の夾雑タンパク質を含む夾雑物質が低減され、結果的に、尿タンパク質または尿タンパク質含有複合体は粗精製され得る。
【００６０】
細胞外小胞に内包されている又はその脂質二重膜に存在する尿バイオマーカーを測定対象とする場合、尿バイオマーカーに対する検出試薬が尿バイオマーカーに接触可能または接触が容易となるように、尿に抽出処理を施してもよい。前記抽出処理は、尿バイオマーカーを細胞外小胞の脂質二重膜内部から又は脂質二重膜から回収することを示す。細胞外小胞の脂質二重膜上に存在し、検出試薬が前記尿バイオマーカー上の対応する結合面に接触可能な場合、抽出処理は行わなくてもよい。この場合であっても、尿バイオマーカーと検出試薬との会合体の形成を促進する観点から、抽出処理を行ってもよい。
【００６１】
尿タンパク質含有複合体（例えば細胞外小胞）からの尿バイオマーカーの「抽出」処理は、タンパク質または部分ペプチドを脂質二重膜の小胞、例えば細胞外小胞から回収するための公知の方法を、特に制限なく用いることができる。抽出処理としては、限定するものではないが、アルカリ性溶液を用いて抽出する方法（以下「アルカリ抽出法」という。）、凍結融解によって抽出する方法（以下「凍結融解抽出法」という。）および界面活性剤を用いて抽出する方法（以下「界面活性剤抽出法」という。）が挙げられる。
尿タンパク質含有複合体（例えば細胞外小胞）から抽出された尿バイオマーカーは、尿試料中、通常、遊離形態であるが、プレートなどの担体に固相化されてもよい。
【００６２】
尿試料は、例えば、尿バイオマーカーとそれに対する検出試薬との会合体形成を促進する観点から、尿タンパク質含有複合体の富化処理および抽出処理を施したものであってもよい。１つの実施形態は、対象から採取された尿を用いて尿試料を調製する工程を含み、前記尿試料調製工程は、尿タンパク質含有複合体（例えば細胞外小胞）の富化処理および／または抽出処理を含んでよい。抽出処理を行わない場合、尿試料は、前記尿に由来する尿バイオマーカーを含有する尿タンパク質含有複合体（例えば細胞外小胞）を含み得る。この場合の１つの実施形態において、尿バイオマーカーは、好ましくは、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＢ−４８、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤおよびＡｐｏＥからなる群より選択される少なくとも１種、例えば１種、２種、３種またはそれ以上の尿タンパク質の組合せである。
尿タンパク質含有複合体（例えば細胞外小胞）における２種類以上の尿バイオマーカーの共局在を指標とする場合、細胞外小胞の富化処理は行われてもよいが、抽出処理は通常行われない。
【００６３】
検出試薬はプローブに加えて、シグナルを発する「標識物質」をさらに含んでもよい。標識物質としては、例えば、蛍光物質、放射性物質および酵素が挙げられる。蛍光物質、放射性物質および酵素は、公知の物質を特に制限なく用いることができ、それらは商業的に入手できる。蛍光物質および酵素は、例えば、公知の方法に従って製造することもできる。酵素を標識物質として用いる場合、検出試薬は前記酵素に対応する基質を含む。基質としては、例えば、発色基質、化学蛍光基質および化学発光基質が挙げられる。
【００６４】
標識物質は予めプローブに結合させて、標識化された状態で存在してもよい。標識化は、標識物質をプローブに直接的に結合させてもよく、少なくとも１つの他の物質を介して間接的に連結させてもよい。尿バイオマーカーに対するプローブにビオチンが結合されている場合、標識物質はアビジン類（例えばアビジン、ストレプトアビジン）に結合される。この場合、標識物質は、ビオチンとアビジン類の結合を介して、前記プローブに間接的に結合する。
【００６５】
検出試薬が標識物質を含む場合、尿バイオマーカーと前記検出試薬との会合体から尿バイオマーカーの量を反映するシグナルが標識物質から発せられ得る。前記会合体が、例えば尿試料中の尿バイオマーカーの量に依存（例えば、比例）して形成される場合、前記シグナルの強度は尿試料中の尿バイオマーカーの量を反映し得る。得られたシグナル強度（相対値）に基づいて、測定した尿試料の提供者（対象）がＡＤに罹患しているか又はその発症リスクが高いかを判定することができる。或いは、濃度既知の標準試料から得られたシグナル強度を用い、尿試料から得られたシグナル強度から尿試料中の尿バイオマーカーの濃度または含有量を算出し、算出された値に基づいて、測定した尿試料の提供者（対象）がＡＤに罹患しているか又はその発症リスクが高いかを判定することができる。
【００６６】
シグナルの種類は、例えば、用いる標識物質の種類に応じて変化する。シグナルの検出方法および検出装置は、シグナルの種類に応じて当業者により適宜設定される。例えば、蛍光物質を標識物質として用いる場合、蛍光シグナルが検出され得る。蛍光シグナルは、公知の検出装置、例えば蛍光分光計、顕微鏡、フローサイトメーター、マイクロプレートリーダーを用いて検出することができる。放射性物質を標識物質として用いる場合、放射線シグナルが検出され得る。放射線シグナルは、公知の検出装置、例えばシンチレーションカウンターを用いて検出することができる。
【００６７】
酵素を標識物質として用いる場合、前記酵素に対応する基質に応じて、色シグナル、蛍光シグナルまたは発光シグナルが検出され得る。例えば、酵素と発色基質とを用いる場合、発色または色変化がシグナルとして検出され、それは公知の検出装置により又は肉眼により検出することができる。例えば、酵素と化学蛍光基質または化学発光基質とを用いる場合、蛍光または発光がシグナルとして検出され、それは公知の検出装置を用いて検出することができる。
【００６８】
尿タンパク質の量は、抗原抗体反応を利用した質量分析法（ｉｍｍｕｎｏ−ＭＳ法またはｍａｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＡＬＩＳＡ）とも称される）により測定してもよい。この場合、シグナルは質量電荷比であり、標識物質は必ずしも必要ではない。測定方法として質量分析法を用いる場合、１アミノ酸置換により生じ得るアイソフォームや糖鎖修飾などの翻訳後修飾を区別して測定し得る。
【００６９】
本発明に係る検出試薬は、例えば、尿バイオマーカーの測定方法に応じて、当業者であれば適宜設定することができる。一例として、測定方法としてサンドイッチＥＬＩＳＡを用いる場合、検出試薬は、例えば、マイクロタイタープレートに固相化された尿バイオマーカーに対する第１の抗体、第１の抗体が結合する尿バイオマーカー上のエピトープとは異なるエピトープに結合する第２の抗体、第２の抗体に対する酵素で標識化された第３の抗体、前記酵素に対応する基質を含む。ＥＬＩＳＡの実施形態としては、サンドイッチＥＬＩＳＡに限定されず、他の形態（直接吸着法、競合法（直接競合ＥＬＩＳＡ法））を用いることができる。
【００７０】
１つの実施形態に関し、測定方法としてＥＬＩＳＡの直接蛍光抗体法を用いた診断補助方法について説明する。検出試薬は、例えば、蛍光物質で予め標識化した尿バイオマーカーに対する抗体（以下「蛍光標識化抗体」ともいう。）を含む。標準試料は、所定濃度（閾値）の遊離形態の精製尿バイオマーカーを含む。
溶液形態の尿試料をマイクロタイタープレートに分注して、尿試料中の尿バイオマーカーをマイクロタイタープレートに吸着させる。尿試料を除去（Ｂ／Ｆ分離）し、ブロッキング処理する。蛍光標識化抗体を含む溶液をマイクロタイタープレートに分注して、吸着（固相化）した尿バイオマーカーと蛍光標識化抗体との免疫複合体を形成させる。マイクロタイタープレートに収容された前記複合体を含む試料に励起光を照射し、前記免疫複合体に由来する蛍光シグナルを測定する。測定した蛍光シグナルを、同様に測定した標準試料の蛍光シグナルと比較して、ＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いかを判定する。
【００７１】
上記実施形態では、標識物質として蛍光物質を用いたが、これに限定されるものではなく、放射性物質または酵素であってもよい。
【００７２】
ＥＬＩＳＡにおけるマイクロタイタープレートに代えて、複数の尿バイオマーカーに対する各抗体またはアプタマーを担体（基板）上に整列（アレイ）固相化させたマイクロアレイ（マイクロチップ）を用いることもできる。
【００７３】
検出試薬が２種以上の尿バイオマーカーに対するプローブを含む場合、本発明に係る診断補助方法は、２種類の尿バイオマーカーの量（２つの測定値）と２つの閾値とをそれぞれ比較して判定を行う診断であってよい。この場合、判定は、いずれか一方の測定値がそれに対応する閾値よりも大きい場合に、ＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いと判定してもよい。少なくとも２種の尿バイオマーカーを用いる診断補助方法によれば、１種の尿バイオマーカーを用いる診断補助方法と比較して、より感度が高い診断が可能になり得る。
【００７４】
本発明に係る診断補助方法は、尿タンパク質含有複合体における２種以上の尿バイオマーカーの共局在を指標としてもよい。この場合、尿試料は、対象から採取した尿に由来する尿タンパク質含有複合体を富化した試料を用いても良いが、限定はされない。この実施形態によれば、以下の実施例で示されるように、感度の高いＡＤ診断が可能となる。さらに、この実施形態によれば、高い感度の心疾患の診断補助方法も提供され得る。
【００７５】
したがって、本発明の他の態様は、尿タンパク質含有複合体における少なくとも２種類の尿バイオマーカーの共局在に基づく、ＡＤおよび／または心疾患の診断補助方法を提供する。
この態様の１つの実施形態は、対象から採取された尿に由来する尿試料中の少なくとも２種類の尿バイオマーカーを含む尿タンパク質含有複合体の量を測定する工程、および測定された前記複合体の量に基づいて、前記対象がアルツハイマー病および／または心疾患に罹患している又はその発症リスクが高いかを判定する工程を含み、前記尿バイオマーカーが、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＢ−４８、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＮＰＣ１Ｌ１、およびＭＴからなる群より選択される少なくとも２種、例えば２種、３種またはそれ以上の尿タンパク質の組合せである、ＡＤおよび／または心疾患の診断補助方法を提供する。
【００７６】
この態様の実施形態では、検出方法として、例えばＥＬＩＳＡ法およびフローサイトメトリーを用いることができる。
【００７７】
一例として、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いる場合について説明する。検出試薬は、例えば、プレートに固相化された第１の尿バイオマーカーに対する第１のプローブと、標識物質で予め標識化された第２の尿バイオマーカーに対する第２のプローブとを含む。この例において、対象から採取した尿に由来する尿タンパク質含有複合体（細胞外小胞を含む）を含み得る尿試料を前記プレートに分注する。これにより、第１の尿バイオマーカーを含む前記尿タンパク質含有複合体が、第１のプローブを介してプレート上に固相化される。Ｂ／Ｆ分離した後、第２のプローブをプレートに分注する。これにより、第２のプローブが第２の尿バイオマーカーも含む尿タンパク質含有複合体に結合する。プレート上には、第１のプローブと、第２のプローブと、第１、第２の尿バイオマーカーが共局在した複合体との３者会合体が固相化される。Ｂ／Ｆ分離後に、前記３者会合体の量を測定する。その測定値を閾値と比較して、ＡＤおよび／または心疾患に罹患しているか否かを判定できる。
【００７８】
他の例として、例えばフローサイトメトリーを用いる場合について説明する。検出試薬は、例えば、第１の量子ドット（第１の標識物質）に固相化された第１の尿バイオマーカーに対する第１のプローブ、および第２の量子ドット（第２の標識物質）に固相化された第２の尿バイオマーカーに対する第２のプローブを含む。この例において、第１、第２の量子ドットはλ１で励起され、第１の量子ドットはピーク波長λ２の蛍光を発し、第２の量子ドットはピーク波長λ３の蛍光を発する。対象から採取した尿に由来する尿タンパク質含有複合体を含み得る尿試料と検出試薬とを接触させることで、第１、第２の尿バイオマーカーが共局在した前記複合体には、前記第１のプローブと前記第２のプローブとが結合した３者会合体が形成される。
【００７９】
第１のプローブおよび第２のプローブで二重染色された前記３者会合体をフローサイトメーターに導入してシグナルを測定する。フローサイトメーターは、流体力学的に集束された流体の流れに特定の波長の光線（例えば、レーザー光線）を照射し、前記流体に含まれる個々の粒子から生じる光学的情報に基づいて、個々の粒子の物理的および化学的特徴を解析する装置である。この例では、個々の会合体を含む流体の流速に、λ１励起光を照射することで、個々の会合体から蛍光（ピーク波長：λ２およびλ３）が測定され得る。ピーク波長λ２およびλ３を発する会合体を、第１、第２の尿バイオマーカーが共局在した尿タンパク質含有複合体として、計数することができる。計数した値（測定値）を尿タンパク質含有複合体に関する閾値と比較して、ＡＤおよび／または心疾患に罹患しているか否かを判定することできる。
【００８０】
１つの実施形態において、閾値は、例えば、心疾患群と非心疾患（例えば健常者）群とを判別するのに適した値（診断閾値）である。判定工程では、例えば、測定値が前記閾値よりも大きい場合に、対象が心疾患に罹患している又はその発症リスクが高いと判定してよい。この実施形態は、例えば、前記対象がＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いかを判定する工程に代えて、心疾患に罹患している又はその発症リスクが高いかを判定する工程を含む。従って、本発明の他の態様は、尿タンパク質含有複合体における少なくとも２種類の尿バイオマーカーの共局在に基づく、心疾患の診断補助方法を提供する。１つの実施形態において、前記実施形態における心疾患は心肥大症である。
【００８１】
１つの実施形態において、尿バイオマーカーは、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、ＮＰＣ１、およびＭＴからなる群より選択される少なくとも２種、例えば２種、３種またはそれ以上の尿タンパク質の組合せである。１つの実施形態において、尿バイオマーカーは、好ましくは、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＢ−４８、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤおよびＡｐｏＥからなる群より選択される少なくとも２種、例えば２種、３種またはそれ以上の尿タンパク質の組合せである。
【００８２】
本発明の第２の態様は、第１の態様に係る診断補助方法に使用するための検出試薬を提供する。検出試薬は、本明細書に記載の尿バイオマーカーに対するプローブを含み、場合により、標識物質をさらに含む。検出試薬におけるプローブは、限定するものではないが、液体または固体の形態であってよく、あるいは、遊離形態で存在してもよく、又はマイクロタイタープレートおよびビーズなどの担体に固相化されていてもよい。検出試薬における標識物質は、単独で存在してもよいし、または前記プローブに予め標識化されていてもよい。本明細書中に記載のプローブおよび標識物質などの要素に関する特徴は、この態様にかかる当該要素にも適用される。
【００８３】
本発明の第３の態様は、第１の態様に係る診断補助方法に使用するための診断キットを提供する。診断キットは、第２の態様に係る検出試薬を含み、さらに限定するものではないが、液体形態または固体形態の緩衝用、洗浄用、ブロッキング用、および反応停止用の試薬、並びにプレートおよびビーズなどの担体を含んでいてもよい。本明細書中に記載のプローブ、標識物質、担体、閾値および判定などの要素に関する特徴は、この態様に係る当該要素についても適用される。
【００８４】
診断キットは、例えば尿バイオマーカーなどの標準物質を所定濃度または所定量含む標準試料を含んでよい。診断キットにおいて、各試薬はそれぞれ試薬容器に個別に収容されていてもよく、共存しても尿バイオマーカーの測定に問題がない試薬は同一の試薬容器に収容されてもよい。さらに、診断キットは、添付文書を含んでよい。添付文書には、例えば試薬の使用方法、標準試薬の使用方法、標準曲線の作成方法、標準曲線から尿バイオマーカーの量を算出する方法、および判定基準などの情報が記載されていてよい。判定基準としては、例えば、算出した尿試料中の尿バイオマーカーの値が、前記尿バイオマーカーの量に関する閾値よりも、大きい又は小さい場合に、ＡＤに罹患している又はその発症リスクが高いと判定すると記載されている。
【００８５】
本発明の第４の態様は、ＡＤの診断システムを提供する。前記診断システムは、判定部と表示部とを含み、前記判定部は、対象から採取された尿に由来する尿試料中の尿バイオマーカーの量と、ＡＤに関しての前記尿バイオマーカーの量に関する閾値とを比較して、前記対象がＡＤに罹患しているか否かを判定し、前記表示部は判定部の判定結果を表示する。本明細書中に記載の尿バイオマーカー、尿バイオマーカーの量、尿バイオマーカーの量に関する閾値および判定などの要素に関する特徴は、この態様にかかる当該要素にも適用される。
【００８６】
図７は、１つの実施形態に係る診断システム１の概略構成を示すブロック図である。診断システム１は、測定部１１と、制御部１２と、入力部１６と、表示部１７とを備える。制御部１２は、データベース１４を格納した記憶装置１３と、判定部１５とを備える。
【００８７】
測定部１１は、タンパク質を定量的に測定可能な方法に使用される装置により構成される。測定部１１は、例えば、ＥＬＩＳＡに用いられるマイクロプレートリーダーまたはＣＣＤを用いて撮像するイメージング装置、ウェスタンブロット法もしくはマイクロアレイ（マイクロチップ）を利用した方法に用いられるイメージング装置、質量分析法に用いられる質量分析装置、およびフローサイトメトリーに用いられるフローサイトメーターであってよい。測定部１１は、測定データを制御部１２へ出力する機能を有する。
【００８８】
制御部１２は、ＣＰＵなどのプロセッサに対応する処理回路と、メモリ（主記憶装置）と、記憶装置１３とを備える。制御部１２には、例えばコンピュータを用いることができる。制御部１２のプロセッサは、メモリにロードされたコンピュータプログラムを実行する。
【００８９】
記憶装置１３は補助記憶装置であり、例えば、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）またはソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）であってよい。記憶装置１３には、例えば、コンピュータプログラムが格納されている。コンピュータプログラムは、メモリにロードされてプロセッサにより実行される。前記コンピュータプログラムは、オペレーティングシステムおよびアプリケーションプログラムを含む。前記アプリケーションプログラムは、データベース１４に格納されている尿バイオマーカーの量に関する閾値を取得する閾値取得プログラム、後述する判定機能を機能させる判定プログラム、及び判定結果などを表示させる表示プログラムを含む。この例では、記憶装置１３には、データベース１４が格納されている。
【００９０】
データベース１４には、尿バイオマーカーの量に関する閾値のデータが格納されている。閾値のデータには、例えば、ＡＤ群と非ＡＤ群とを判別するための、本明細書に記載の各種の尿バイオマーカーに対応する閾値のデータを複数含む。閾値のデータは、対象の特徴（例えば、年齢、性別および病態）に基づいてサブグループに分け、そのサブグループにおいてＡＤ群と非ＡＤ群とを判別するための、前記した各種の尿バイオマーカーに対応する閾値のデータを複数含んでよい。閾値のデータは、健常者群における各種の尿バイオマーカーに対応する基準範囲の上下限値に関する閾値のデータを複数含んでよい。データベース１４には、さらに測定部１１による測定データなどが格納されてもよい。ここでは、閾値のデータは、対象疾患としてＡＤについて説明したが、本発明に係る診断システムはこれに限定されず、例えば閾値のデータは、心疾患群と非心疾患群とを判別するための、本明細書に記載の各種尿バイオマーカーに対する心疾患に関する閾値のデータを含む。１つの実施形態において、判定部が、心疾患に関する閾値と、尿試料中の少なくとも２種の尿バイオマーカーが共局在している尿タンパク質含有複合体の量とを比較し、前記対象が心疾患に罹患している又はその発症リスクが高いかをさらに判定する、診断システムが提供される。他の実施形態において、判定部は、ＡＤに関する閾値に代えて、心疾患に関する閾値と、尿試料中の少なくとも２種の尿バイオマーカーが共局在している尿タンパク質含有複合体の量とを比較し、前記対象が心疾患に罹患している又はその発症リスクが高いかを判定する、診断システムが提供される。
【００９１】
データベース１４が磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、またはフラッシュメモリなどの記憶媒体に格納されている場合、記憶装置１３は、記憶媒体に対して情報を読み出す／書き込むドライブ装置と、その記憶媒体とにより構成されてもよい。
【００９２】
判定部１５は、対象から採取された尿に由来する尿試料中の尿バイオマーカーの量と、ＡＤおよび／または心疾患に関しての前記尿バイオマーカーの量に関する閾値とを比較して、対象がＡＤおよび／または心疾患に罹患している又はその発症リスクが高いかを判定する機能を有する。判定部１５の機能は、制御部１２のメモリにロードされた上述の閾値取得プログラム及び判定プログラムを含むアプリケーションプログラムを制御部１２のプロセッサを含む処理回路にて実行することで、実現される。
【００９３】
入力部１６は、ユーザが必要な情報（識別情報）および指示を制御部１２に入力するための機器または装置により構成される。入力部１６は、例えばキーボード、マウス、および音声認識装置であってよい。ユーザが入力する識別情報は、例えば尿バイオマーカーの種類、疾患の種類、対象の性別および年齢に関する情報を含む。
【００９４】
表示部１７は、判定部１５の判定結果などをユーザに知覚させることが可能な装置により構成され、例えばディスプレイ、表示灯、スピーカーおよびプリンターであってよい。
【００９５】
図７において、測定部１１と判定部１５とを繋ぐ実線は、それらの要素間の有線または無線によるデータおよび信号の送受信を機能させるインターフェースを含む送受信機により構成される。図７において、これら以外の各要素を繋ぐ実線も同様である。
【００９６】
上記例では、データベース１４は制御部１２内部の記憶装置１３に格納されたが、本発明に係る診断システムはこれに限定されない。データベース１４は、例えば診断システムの外部に存在する記憶装置に格納されていてもよい。このような記憶装置は、例えば、光ディスクなどの記憶媒体の全部または一部により構成されてよく、本発明に係る診断システムとネットワークにより接続されるサーバに記憶装置が設けられていてもよい。
【００９７】
上記例では、診断システムは測定部１１を含むが、本発明に係る診断システムはこれに限定されない。例えば、診断システムの外部に存在する測定装置を用いて得られた測定データを、制御部１２に読み込ませ、例えば、記憶装置１３に格納させてもよい。または、外部で得られた測定データは、例えば、上記のように診断システム外部の記憶装置に格納さてよい。
【００９８】
本発明に係るＡＤの診断システム（実施形態１）のフローを、図７および図８を用いて説明する。
ユーザが入力部１６を使用して、制御部１２に対する指示および必要な情報（識別情報）を入力する。この例では、識別情報は以下の情報を含む：測定試料は２個（試料１および２）であり；対象疾患はＡＤであり；尿バイオマーカーの種類はすべてＡｐｏＣ−Ｉであり；および対象の年齢は試料１が６０歳および試料２が７０歳である。制御部１２のプロセッサは、入力部１６を介してユーザからの指示および識別情報の入力があると、閾値の取得を行う（Ｓ１１）。
【００９９】
閾値取得ステップ（Ｓ１１）では、プロセッサは、記憶装置１３からメモリにロードされた閾値取得プログラムを実行する。実行された閾値取得プログラムは、ユーザが入力した識別情報を参照し、データベース１４に格納された閾値のデータから対応する閾値を取得する。図９は、データベース１４に格納された閾値のデータの例を示す。この閾値のデータにおいて、ＡＤ群および非ＡＤ群は、対象の年齢（“１８歳から６５歳未満”と“６５歳以上”）に基づいてサブグループに分けられている。閾値のデータは、各サブグループについて５種類の尿バイオマーカー（ＡｐｏＡ−１、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＮＰＣ１およびＭＴ）それぞれに対応する、アルツハイマー病（ＡＤ）群と健常者（ＨＳ）群とを判別する閾値（ａ１〜ｅ１およびａ２〜ｅ２）を含む。
この例では、まず、実行された閾値取得プログラムにより、試料１に関する識別情報（対象疾患：ＡＤ、尿バイオマーカー：ＡｐｏＣ−Ｉ、年齢：６０歳）に従って、閾値ｃ１が取得される。
【０１００】
制御部１２のプロセッサは、閾値が取得されると、測定部１１に測定開始信号を送信する。測定部１１は、制御部１２からの測定開始信号を受信すると、測定を開始する（Ｓ１２）。測定ステップ（Ｓ１２）では、測定部１１により、前記対象から採取された尿に由来する尿試料（１）が測定され、前記尿試料に含まれる尿バイオマーカー（ＡｐｏＣ−Ｉ）の量に関するデータ（測定データ（１））が生成される。測定部１１は、生成した測定データ（１）を制御部１２に送信する。生成された測定データ（１）は、前記対象の尿バイオマーカー（ＡｐｏＣ−Ｉ）の量に関する値（測定値）を含む。
【０１０１】
制御部１２は、測定部１１からの測定データ（１）を受信すると、判定を行う（Ｓ１３）。判定ステップ（Ｓ１３）では、制御部１２のプロセッサは、記憶装置１３からメモリにロードされた判定プログラムを実行する。実行された判定プログラムは、測定部１１から受信した測定データ（１）に含まれる測定値と、閾値取得ステップで取得された閾値ｃ１とを比較する。判定プログラムにより、前記測定値が閾値ｃ１よりも大きい場合にＡＤに罹患している（ＹＥＳ）と判定され、前記測定値が閾値ｃ１以下の場合にＡＤに罹患していない（ＮＯ）と判定され、その判定結果を含む判定データ（１）が生成される。
【０１０２】
制御部１２のプロセッサは、判定データ（１）が生成されると、表示部１７に判定結果を表示する（Ｓ１４）。判定結果表示ステップ（Ｓ１４）では、プロセッサは、記憶装置１３からメモリにロードされた表示プログラムを実行し、判定結果に応じた映像信号を表示部１７（例えばディスプレイ）に出力する。ディスプレイは、入力された映像信号をもとに、判定結果を表示する。
【０１０３】
制御部１２のプロセッサは、測定終了の判定を行う（Ｓ１５）。この時点では、２つある試料（１および２）のうち試料（２）の測定が終了していないため、測定終了の判定ステップ（Ｓ１５）では（ＮＯ）と判定され、Ｓ１１〜Ｓ１４が繰り返される。
具体的には、閾値取得ステップ（Ｓ１１）において、試料２に関する識別情報（対象疾患：ＡＤ、尿バイオマーカー：ＡｐｏＣ−Ｉ、年齢：７０歳）に従って、閾値のデータから閾値ｃ２が取得される。測定ステップ（Ｓ１２）では、測定部１１で前記対象から採取された尿に由来する尿試料（２）中の尿バイオマーカー（ＡｐｏＣ−Ｉ）の量に関する測定データ（２）が生成さる。判定ステップ（Ｓ１３）では、閾値取得ステップ（Ｓ１１）で取得した閾値ｃ２と、測定データ（２）に含まれる測定値との比較が行われ、判定データ（２）が生成される。判定結果表示ステップ（Ｓ１４）では、その判定結果が表示部１７に表示される。
この後、制御部１２のプロセッサは、測定が終了したとの判定を行い（ＹＥＳ）、測定が終了する。
【０１０４】
他の実施形態に係る心疾患の診断システム（実施形態２）のフローを、図７および図１０を用いて説明する。
ユーザが入力部１６を使用して、制御部１２に対する指示および必要な情報（識別情報）を入力する。この例では、識別情報は以下の情報を含む：測定試料は２個（試料１’および２’）であり；対象疾患は心疾患でり；尿バイオマーカーの種類はすべてＡｐｏＢとＡｐｏＣ−Ｉとの組合せであり；および対象の年齢は試料１’が６０歳および試料２’が７０歳である。制御部１２のプロセッサは、入力部１６を介してユーザからの指示および識別情報の入力があると、閾値の取得を行う（Ｓ２１）。
【０１０５】
閾値取得ステップ（Ｓ２１）では、プロセッサは、記憶装置１３からメモリにロードされた閾値取得プログラムを実行する。実行された閾値取得プログラムは、ユーザが入力した識別情報を参照し、データベース１４に格納された閾値のデータから対応する閾値を取得する。図１１は、データベース１４に格納された閾値のデータの例を示す。この閾値のデータにおいて、心疾患群および非心疾患群は、対象の年齢（“１８歳から６５歳未満”と“６５歳以上”）に基づいてサブグループに分けられている。閾値のデータは、各サブグループについて４種類の尿バイオマーカーの組合せそれぞれに対応する、心疾患群と健常者（ＨＳ）群とを判別する閾値（ｆ１〜ｉ１およびｆ２〜ｉ２）を含む。
この例では、まず、実行された閾値取得プログラムにより、試料１’に関する識別情報（対象疾患：心疾患、尿バイオマーカー：ＡｐｏＢとＡｐｏＣ−Ｉとの組合せ、年齢：６０歳）に従って、閾値ｇ１が取得される。
【０１０６】
制御部１２のプロセッサは、閾値が取得されると、測定部１１に測定開始信号を送信する。測定部１１は、制御部１２からの測定開始信号を受信すると、測定を開始する（Ｓ２２）。測定ステップ（Ｓ２２）では、測定部１１により、前記対象から採取された尿に由来する尿試料（１’）が測定され、前記尿試料に含まれる尿バイオマーカー（ＡｐｏＢとＡｐｏＣ−Ｉとの共局在）の量に関するデータ（測定データ（１’））が生成される。測定部１１は、生成した測定データ（１’）を制御部１２に送信する。生成された測定データ（１’）は、前記対象の尿バイオマーカー（ＡｐｏＢとＡｐｏＣ−Ｉとの共局在）の量に関する値（測定値）を含む。
【０１０７】
制御部１２は、測定部１１からの測定データ（１’）を受信すると、判定を行う（Ｓ２３）。判定ステップ（Ｓ２３）では、制御部１２のプロセッサは、記憶装置１３からメモリにロードされた判定プログラムを実行する。実行された判定プログラムは、測定部１１から受信した測定データ（１’）に含まれる測定値と、閾値取得ステップで取得された閾値ｇ１とを比較する。判定プログラムにより、前記測定値が閾値ｇ１よりも大きい場合に心疾患に罹患している（ＹＥＳ）と判定され、前記測定値が閾値ｇ１以下の場合に心疾患に罹患していない（ＮＯ）と判定され、その判定結果を含む判定データ（１’）が生成される。
【０１０８】
制御部１２のプロセッサは、判定データ（１’）が生成されると、表示部１７に判定結果を表示する（Ｓ２４）。判定結果表示ステップ（Ｓ２４）では、プロセッサは、記憶装置１３からメモリにロードされた表示プログラムを実行し、判定結果に応じた映像信号を表示部１７（例えばディスプレイ）に出力する。ディスプレイは、入力された映像信号をもとに、判定結果を表示する。
【０１０９】
制御部１２のプロセッサは、測定終了の判定を行う（Ｓ２５）。この時点では、２つある試料（１’および２’）のうち試料（２’）の測定が終了していないため、測定終了の判定ステップ（Ｓ２５）では（ＮＯ）と判定され、Ｓ２１〜Ｓ２４が繰り返される。
具体的には、閾値取得ステップ（Ｓ２１）において、試料２’に関する識別情報（対象疾患：心疾患、尿バイオマーカー：ＡｐｏＢとＡｐｏＣ−Ｉとの組合せ、年齢：７０歳）に従って、閾値のデータから閾値ｇ２が取得される。測定ステップ（Ｓ２２）では、測定部１１で前記対象から採取された尿に由来する尿試料（２’）中の尿バイオマーカー（ＡｐｏＢとＡｐｏＣ−Ｉとの共局在）の量に関する測定データ（２’）が生成さる。判定ステップ（Ｓ２３）では、閾値取得ステップ（Ｓ２１）で取得した閾値ｇ２と、測定データ（２’）に含まれる測定値との比較が行われ、判定データ（２’）が生成される。判定結果表示ステップ（Ｓ２４）では、その判定結果が表示部１７に表示される。
この後、制御部１２のプロセッサは、測定が終了したとの判定を行い（ＹＥＳ）、測定が終了する。
【０１１０】
上記の例では、閾値取得ステップ（Ｓ１１、Ｓ２１）は測定ステップ（Ｓ１２、Ｓ２２）に先行して実行されたが、本発明に係る診断システムはこれに限定されない。例えば、本発明に係る診断システムでは、判定ステップ（Ｓ１３、Ｓ２３）が実行されるまでに、閾値取得ステップ（Ｓ１１、Ｓ２１）および測定ステップ（Ｓ１２、Ｓ２２）が行われればよい。従って、閾値取得ステップ（Ｓ１１、Ｓ２１）は、測定ステップ（Ｓ１２、Ｓ２２）と同時に行われてもよく、測定ステップ（Ｓ１２、Ｓ２２）の後に行われてもよい。
【０１１１】
上記の例では、１つの尿試料（試料１、試料１’）についてのＳ１１〜Ｓ１４、Ｓ２１〜Ｓ２４を行い、残りの尿試料（試料２、試料２’）についてＳ１１〜Ｓ１４、Ｓ２１〜Ｓ２４を繰り返したが、本発明に係る診断システムはこれに限定されない。例えば、ユーザが入力した識別情報に従って、判定する全ての尿試料についての閾値を１度に取得し（Ｓ１１、Ｓ２１）、全ての尿試料中の尿バイオマーカーの量を測定し（Ｓ１２、Ｓ２２）、各尿試料についてＡＤ、心疾患に罹患しているか否かの判定をそれぞれ行い（Ｓ１３、Ｓ２３）、すべての判定結果を表示してもよい（Ｓ１４、Ｓ２４）。
【０１１２】
上記の例では、判定結果表示ステップ（Ｓ１４、Ｓ２４）は測定終了の判定ステップ（Ｓ１５、Ｓ２５）に先行して実施されたが、本発明に係る診断システムはこれに限定されない。例えば、ユーザが入力した識別情報に従って、指定された尿試料の全ての判定が終了した後に（Ｓ１５、Ｓ２５）、その判定結果を表示してもよい（Ｓ１４、Ｓ２４）。
【０１１３】
上記の例では、閾値取得はデータベースに予め格納された閾値のデータを用いたが、本発明に係る診断システムはこれに限定されない。例えば、ユーザは、標準試料（既知濃度の尿バイオマーカーＡｐｏＣ−Ｉまたは既知量の尿バイオマーカーの組合せを含有する複合体を含む）についての情報（識別情報）を入力する。測定部１１にて前記標準試料中の尿バイオマーカーの量に関する測定データ（測定値を含む）が生成される（Ｓ１２、Ｓ２２）。生成された前記測定データが測定部１１から制御部１２に送信されて、記憶装置１３に格納される。次いで、制御部１２のプロセッサが、メモリにロードされた閾値取得プログラムを実行する（Ｓ１１、Ｓ２１）。実行された閾値取得プログラムは、ユーザが入力した識別情報に従って、記憶装置１３に格納された閾値のデータから測定ステップ（Ｓ１２、Ｓ２２）で得られた測定データに含まれる測定値を閾値として取得する。後の判定ステップ（Ｓ１３、Ｓ２３）、判定結果表示ステップ（Ｓ１４、Ｓ２４）および測定終了判定ステップ（Ｓ１５、Ｓ２５）は上記したように行われてもよい。
【０１１４】
他の実施形態における診断システム（実施形態３）では、ＡＤ診断フローと、心疾患診断フローとが行われる。ＡＤ診断フローの後に心疾患診断フローが実施される診断システムのフローを、図７、図８および図１０を用いて説明する。
ユーザが入力部１６を使用して、制御部１２に対する指示および必要な情報（識別情報）を入力する。この例では、識別情報は以下の情報を含む：測定試料は２個（試料１”および２”）であり；対象疾患は試料１”はＡＤであり、試料２”は心疾患であり；尿バイオマーカーの種類は、試料１”はＡｐｏＣ−Ｉであり、試料２”はＡｐｏＢとＡｐｏＣ−Ｉとの組合せであり；および対象の年齢は試料１”が６０歳および試料２”が７０歳である。
【０１１５】
制御部１２のプロセッサは、入力部１６を介してユーザからの指示および識別情報の入力があると、上述のように、プロセッサは、試料１”について、閾値の取得（図８Ｓ１１、図９（ｃ１））、測定（図８Ｓ１２）、測定値と閾値との比較（図８Ｓ１３）、判定結果の表示（図８Ｓ１４）、測定終了の判断（図８Ｓ１５）を行う。試料１”の測定が終了すると、制御部１２のプロセッサは、試料２”について、閾値の取得（図１０Ｓ２１、図１１（ｇ２））、測定（図１０Ｓ２２）、測定値と閾値との比較（図１０Ｓ２３）、判定結果の表示（図１０Ｓ２４）、測定終了の判断（図１０Ｓ２５）を行う。
【０１１６】
上記の例では、ＡＤ診断フローに次いで心疾患診断フローが実施されたが、本発明に係る診断システムはこれに限定されない。例えば、心疾患診断フローに次いでＡＤ診断フローが実施されてもよく、又は同時に実施されてもよい。ＡＤ診断フローおよび心疾患診断フローのいずれか一方が先行して実施される場合のステップ（Ｓ１１〜Ｓ１５、Ｓ２１〜Ｓ２５）の順序は、実施形態１、２において述べたステップの順序についての特徴がこの実施形態にも適用される。
【０１１７】
ＡＤ診断フローおよび心疾患診断フローが同時に実施される場合の各ステップは、判定ステップ（Ｓ１３、Ｓ２３）が実行されるまでに、閾値取得ステップ（Ｓ１１、Ｓ２１）および測定ステップ（Ｓ１２、Ｓ２２）が行われればよい。従って、閾値取得ステップ（Ｓ１１、Ｓ２１）は、測定ステップ（Ｓ１２、Ｓ２２）と同時に行われてもよく、測定ステップ（Ｓ１２、Ｓ２２）の後に行われてもよい。例えば、ユーザが入力した識別情報に従って、判定する全ての尿試料についての閾値を１度に取得し（Ｓ１１、Ｓ２１）、全ての尿試料中の尿バイオマーカーの量を測定し（Ｓ１２、Ｓ２２）、各尿試料についてＡＤ、心疾患に罹患しているか否かの判定をそれぞれ行い（Ｓ１３、Ｓ２３）、すべての判定結果を表示してもよい（Ｓ１４、Ｓ２４）。
【０１１８】
判定結果表示ステップ（Ｓ１４、Ｓ２４）と判定ステップ（Ｓ１５、Ｓ２５）とは、例えば、ユーザが入力した識別情報に従って、指定された尿試料の全ての判定が終了した後に（Ｓ１５、Ｓ２５）、その判定結果を表示してもよい（Ｓ１４、Ｓ２４）。その他、実施形態１、２において述べた閾値に関する特徴は、この実施形態にも適用される。
【０１１９】
以下、本発明の実施形態として実施例を記載するが、それらは添付する特許請求の範囲に記載の発明をいかようにも限定するものではない。
【実施例】
【０１２０】
＜尿試料調製＞
（１）富化処理（濃縮および粗精製）
尿中のタンパク質は、基本的にＫｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２０１０）７７：７３６−７４２に記載の方法に従って濃縮した。
被検対象から採取した尿２５ｍｌを遠心分離（１７，０００ｇ、２５℃、１０分間）し、上清（ＳＮ１）を回収した。沈殿物に緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ７．６）、２００ｍｇ／ｍｌ  ジチオスレイトール、２５０ｍＭ  スクロース）２５０μｌを加えて懸濁し、３７℃にて１０分間静置した。懸濁液を遠心分離（１７，０００ｇ、２５℃、１０分間）し、上清（ＳＮ２）を回収した。上清（ＳＮ１）と上清（ＳＮ２）とを混合し、Ｔｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）２５ｍｌを加えて混合し、室温で１時間静置した。その混合液を遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、６０分間）し、沈殿物をＤ−ＰＢＳ（−）１００μｌに再懸濁し、尿タンパク質粗精製画分を得た。得られた粗精製画分を遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１５分間）し、上清（ＳＮ３）を回収した。上清（ＳＮ３）をＤ−ＰＢＳ（−）にて２倍希釈し、ゲルろ過カラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００）にロードした。ボイド溶出画分を回収し、遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１５分間）した。その上清（ＳＮ４）を、限外ろ過フィルター（３０Ｋ  ＭＷＣＯ）を用いて５０μｌに濃縮した。【０１２１】
（２）抽出処理
上記富化処理により得られた尿タンパク質は、細胞外小胞を含む尿タンパク質含有複合体に存在し得る。尿タンパク質含有複合体（細胞外小胞を含む）から尿タンパク質を抽出するために、アルカリ抽出法または凍結融解抽出法を用いた。
アルカリ抽出法：  尿由来の試料液５０μｌに対して５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−３０５を５μｌ、４Ｎ  ＮａＯＨを５μｌ添加し、氷上で２０分間静置した。その後、４Ｎ  ＨＣｌ／１Ｍ  ＨＥＰＥＳ溶液を５μｌ加えて中和した。
凍結融解抽出法：  尿由来の試料液５０μｌをマイナス２５℃で凍結して２週間で保存した。凍結した試料に５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−３０５を５μｌ、さらに１０％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を５μｌ加え、氷上で２０分間静置して融解させた。【０１２２】
＜サンドイッチＥＬＩＳＡ＞
（３）抗体の固相化
尿タンパク質に対する抗体（以下「捕捉用抗体」という。）を、９６ウェルマイクロタイタープレートに固相化した。
捕捉用抗体を、Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて濃度５０μｇ／ｍｌにした。捕捉用抗体溶液１００μｌを各ウェルに分注し、４℃で一晩インキュベートして固相化した。洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳ（−））で１回洗浄した後、ブロッキング液（１％ウシアルブミン血清（ＢＳＡ）を含むＤ−ＰＢＳ（−））３００μｌを添加してブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、９６ウェルマイクロタイタープレートを２５℃のインキュベータで乾燥させ、抗体固相プレートを得た。抗体固相プレートは使用まで４℃で保存した。【０１２３】
（４）検出用抗体の標識
捕捉用抗体とは異なる尿タンパク質上のエピトープに結合する抗体（以下「検出用抗体」という。）を、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を介して西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した。
検出用抗体５０μｇを、基本的にＢｉｏｔｉｎ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学研究所）に付属の使用説明書に従って、ビオチンで標識し、ビオチン標識抗体を得た。ビオチン標識抗体は、ＥＬＩＳＡ測定の間にＨＲＰで標識されたストレプトアビジンとの反応によって、ＨＲＰで標識化された検出用抗体とした。【０１２４】
（５）ＥＬＩＳＡ測定
尿タンパク質を含有する尿試料および当該尿タンパク質の精製物（標準試料）を、抗体固相プレートに添加し、２５℃で１時間振盪して反応させた（一次反応）。試料液を除去（Ｂ／Ｆ分離）し、プレートを洗浄液で３回洗浄した。ＥＬＩＳＡ  ｂｕｆｆｅｒ（１％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％  ＰｒｏＣｌｉｎ３００を含むＤ−ＰＢＳ（−））で０．１〜０．２５μｇ／ｍｌに希釈しておいたビオチン標識抗体の希釈液１００μｌをプレートに添加し、２５℃で１時間振盪して反応させた（二次反応）。前記希釈液を除去し、プレートを洗浄液で３回洗浄した。ＥＬＩＳＡ  ｂｕｆｆｅｒを用いて希釈しておいたＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液１００μｌを添加し、２５℃で１時間振盪して反応させた（三次反応）。ＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を除去し、プレートを洗浄液で３回洗浄した。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液をプレートに添加し、室温で１５分間発色反応を行わせ、１Ｎ  硫酸を１００μｌ添加して反応を停止させた。プレートの各ウェルの吸光度４５０ｎｍ（参照波長６５０ｎｍ）をマイクロプレートリーダーにて測定した。【０１２５】
［実施例１］
＜ＡＤ関連尿タンパク質の探索＞
ＡＤ患者３名から尿を採取した。また、３０〜６０歳台の健常者４名から尿を採取した。上記（１）富化処理に従ってＡＤ群（ｎ＝３）および健常者群（ｎ＝４）の各尿２５ｍｌをそれぞれ濃縮および粗精製し、上記（２）抽出処理に従って尿タンパク質を抽出して、尿試料をそれぞれ調製した。調製した尿試料のタンパク質濃度は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いて、ＢＣＡ法により定量した。【０１２６】
プロテオミクス解析は、メディカルプロテオリサーチ株式会社（横浜市金沢区福浦３−９  横浜市立大学  先端医科学研究棟）にて実施した。０．４〜１μｇ相当のタンパク質を含有する尿試料にトリクロロ酢酸（終濃度１０％）を加えて、タンパク質を沈澱させた。沈殿したタンパク質に溶解液（８Ｍ尿素を含む）を添加して溶解させた後、トリプシンを加えて尿タンパク質をペプチドに分解した。得られたペプチド溶液を、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計およびＵｌｔｉｍａｔｅ３０００液体クロマトグラフを用いてＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行った。得られたＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータはＭａｓｃｏｔソフトウェア２．４版を用いて分析することで、１２００種類の尿タンパク質が同定された。ＡＤ群のペプチド分析データと、非ＡＤ群のペプチド分析データとをＳｃａｆｆｏｌｄソフトウェア３．０を用いて比較することで、ＡＤに特異的な２３種の尿タンパク質が、ＡＤ診断のためのバイオマーカーの候補物質として特定された。【０１２７】
＜ＡＤ関連尿タンパク質の特定（１）＞
（尿の採取）
尿をＡＤ患者（ｎ＝５）から採取した。これらのＡＤ患者は高齢であり、その多くが合併症（虚血性心疾患および高血圧）を患っていた（ｎ＝３）。標準試料としては様々な年代の健常者（ｎ＝１２）に加えて、高齢で高血圧を患っており、さらに虚血性心疾患と類似した心疾患（ＣＨＤ）を患っている心肥大患者（ｎ＝３）および不安定狭心症患者（ｎ＝３）から採取した尿を用いた。表４は、尿試料の提供者リストを示す。【０１２８】
【表４】
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ＡＤ患者（ｎ＝５、平均年齢７７．２）；ＣＨＤ患者（ＨＴ患者およびＡｎｇ患者）（ｎ＝６、平均年齢７６．８）；ＨＳ（ｎ＝１２、平均年齢４８．６）。ＡＤ患者のＭＭＳＥスコアは１４〜１８であった。【０１２９】
（尿試料の調製）
ＡＤ群（ｎ＝５）、健常者群（ｎ＝１２）およびＣＨＤ群（ＨＴ患者およびＡｎｇ患者）（ｎ＝６）から採取した各尿５００μｌを、基本的に上記（１）富化処理に従って１０倍に濃縮および粗精製し、上記（２）抽出処理（アルカリ抽出法）に従って尿タンパク質を抽出して、尿試料をそれぞれ調製した。調製した試料５０μｌと、ＥＬＩＳＡ  ｂｕｆｆｅｒ（１％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％  ＰｒｏＣｌｉｎ３００を含むＤ−ＰＢＳ（−））５０μｌとを混合して、ＥＬＩＳＡ用の尿試料を調製した。【０１３０】
（ＥＬＩＳＡ測定）
プロテオミクス解析で特定された２３種の尿タンパク質のうちＡｐｏＤ以外の２２種の尿タンパク質について、上記“サンドイッチＥＬＩＳＡ”に記載の方法に従って、尿試料中の各因子の濃度を測定した。但し、２２種の尿タンパク質のうち、ＥＬＩＳＡ測定キットが市販されているものについては、キットに付属の使用説明書に従って、測定した。【０１３１】
（クレアチニン補正）
随時尿における尿タンパク質濃度の変動を補正するために、尿中クレアチニン補正を行った。尿中クレアチニン量は、Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＡＢＳ，ＩＮＣ．）を用いて測定した。尿タンパク質の測定結果（濃度）を１日あたりの総クレアチニン量（１ｇ）に基づいて補正した。【０１３２】
（分析）
ウェルチのｔ検定を用いて、ＡＤ群と健常者群またはＣＨＤ群との間の統計的有意差を検定した。その結果、７種の尿タンパク質については、ＡＤ群の結果と健常者群の結果との間に有意差または有意差傾向があった（図１）。【０１３３】
ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＢ１００、ＡｐｏＣ−ＩおよびＡｐｏＥは、血液中のコレステロール運搬体であることが知られているアポリポタンパク質である。ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＢ１００、ＡｐｏＣ−ＩおよびＡｐｏＥのいずれの尿試料中の濃度も、ＡＤ群とＨＳ群とを比較した場合、ＡＤ群で有意に高値を示した（図１（ａ〜ｄ））。ＡｐｏＢ１００およびＡｐｏＥの尿試料中の濃度は、ＡＤ群とＣＨＤ群とを比較した場合、ＡＤ群で有意に高値を示した（図１（ａおよびｂ））。【０１３４】
ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＢ１００、ＡｐｏＣ−ＩおよびＡｐｏＥはいずれも、肝臓あるいは小腸で産生され、ＨＤＬ、カイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ等に含まれるアポリポタンパク質である。これらのアポリポタンパク質には、合成器官および局在が共通するファミリータンパク質が存在する（表１）。【０１３５】
ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＣ−ＩおよびＡｐｏＡ−Ｉについては、それらの血中濃度がＡＤ群で変化しているという報告がある（非特許文献３〜６）。非特許文献３〜６は、ＡＤ群と非ＡＤ群とを比較した場合、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＣ−ＩおよびＡｐｏＡ−Ｉの血中濃度がＡＤ群で有意に高値であったことを示しているが、その差はバイオマーカーとして臨床で用いられる程度ではなかった。一方、実施例１では、尿試料中のＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＣ−ＩまたはＡｐｏＡ−Ｉをバイオマーカーとして用いた場合、大きな濃度差でもって、それらを測定できることが実証された（図１（ａ〜ｄ））。【０１３６】
ＩＦＩＴＭ２／３は、細胞内コレステロール輸送関連タンパク質である。ＩＦＩＴＭ２／３は、ＡＤ群とＨＳ群とを比較した場合およびＡＤ群とＣＨＤ群とを比較した場合、ＡＤ群で有意に高値を示した（図１（ｅ））。ＮＰＣ１もまた、細胞内コレステロール輸送関連タンパク質であることが知られている。ＮＰＣ１は、ＡＤ群とＨＳ群とを比較した場合、ＡＤ群で高値を示した（図１（ｆ））。【０１３７】
ＩＦＩＴＭ２／３およびＮＰＣ１は、ＡＤ死後脳においてＲＮＡ発現が増加していることが知られているが（表２）、この解析方法では脳サンプルのバイオプシーを要するため、生存中の診断に利用できない。また、これらのタンパク質は、通常、細胞内の小胞体に局在しているため、脳内の細胞から放出されて、それらが脳血液関門を通過するとは考え難かった。実際、脳内の状態をモニターするために、細胞外の体液において細胞内コレステロール輸送関連タンパク質に着目したような報告例は、知る限り、存在しない。実施例１は、予想外なことに、ＩＦＩＴＭ２／３およびＮＰＣ１が細胞外の体液、しかも尿において、ＡＤに関連してその含有量が顕著に変化したことを明らかにし、尿中の細胞内のコレステロール輸送関連タンパク質がＡＤ診断に有用であることを実証した。【０１３８】
ＭＴは、亜鉛・銅・カドミウム等の重金属をキレートするタンパク質として知られている。ＭＴは、ＡＤ群とＨＳ群とを比較した場合、ＡＤ群で高値を示した（図１（ｇ））。【０１３９】
ＭＴ１については、ＡＤ死後脳においてその発現が増加していたことが報告されている（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．（１９９８）１５：２１−２６）。しかしながら、この解析方法は脳サンプルのバイオプシーを要するため、生存中の診断に利用できない。また、血液中のＭＴ濃度をＡＤ群と非ＡＤ群とを比較した結果、両群でほとんど変化が無いことが報告されている（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１０）１３１９：１１８−１１３０）。実施例１は、予想外なことに、ＡＤに関連して尿中のＭＴ量が顕著に変化したことを明らかにし、尿中のＭＴがＡＤ診断に有用であることを実証した。【０１４０】
表５は、各尿タンパク質についてＡＤ群とＨＳ群とを比較した場合の結果を示す。表５はまた、各尿タンパク質をＥＬＩＳＡ測定する際に使用した抗体またはキットおよび標準試料を示す。
【表５】
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【０１４１】
［実施例２］
＜尿バイオマーカーの組合せによる診断補助方法＞
実施例２では、基本的に実施例１と同様にして、尿試料中のＩＦＩＴＭ２／３、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＥおよびＭＴの濃度を測定した（図２）。【０１４２】
（２−１）ＩＦＩＴＭ２／３と、ＡｐｏＢ−１００との組合せ：
第１の診断は、尿バイオマーカーＩＦＩＴＭ２／３を用い、第１の閾値は３．５［μｇ／ｇＣｒ］とした。第２の診断は、尿バイオマーカーＡｐｏＢ−１００を用い、第２の閾値は１．０［ｍｇ／ｇＣｒ］とした。
判定基準は以下のとおりとした：（判定１）測定値が第１の閾値よりも大きい場合、ＡＤに罹患している（陽性）；（判定２）測定値が第２の閾値よりも大きい場合、ＡＤに罹患している（陽性）；および（最終判定）判定１および判定２のいずれか一方が陽生の場合、ＡＤに罹患している（陽性）。【０１４３】
尿バイオマーカーＩＦＩＴＭ２／３を用いた第１の診断補助方法において、ＨＳ群およびＣＨＤ群の測定値はすべて第１の閾値以下であった（図２（ｃ））。ＡＤ群では、ＡＤ患者１〜４の測定値が第１の閾値より大きく、陽性と判定された（図２（ｃ）、表６）。尿バイオマーカーＡｐｏＢ−１００を用いた第２の診断補助方法において、ＨＳ群およびＣＨＤ群の測定値はすべて第２の閾値以下であった（図２（ａ））。ＡＤ群では、ＡＤ患者２〜５の測定値は第２の閾値より大きく、陽性と判定された（図２（ａ）、表６）。
上記判定基準に従い、ＡＤ群は最終的にすべて陽性と判定された（表６）。【０１４４】
【表６】
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【０１４５】
（２−２）ＩＦＩＴＭ２／３と、ＡｐｏＥとの組合せ：
第１の診断は、尿バイオマーカーＩＦＩＴＭ２／３を用い、第１の閾値は３．５［μｇ／ｇＣｒ］とした。第２の診断は、尿バイオマーカーＡｐｏＥを用い、第２の閾値は２５［μｇ／ｇＣｒ］とした。判定基準は実施例２−１と同じものを用いた。
第１の診断補助方法の判定１の結果は実施例２−１を参照のこと。尿バイオマーカーＡｐｏＥを用いた第２の診断補助方法では、ＨＳ群およびＣＨＤ群の測定値はすべて第２の閾値以下であった（図２（ｂ））。ＡＤ群では、ＡＤ患者２〜５の測定値が第２の閾値より大きく、陽性と判定された（図２（ｂ）、表７）。
判定基準に従い、ＡＤ群は最終的にすべて陽性と判定された（表７）。【０１４６】
【表７】
2018030252.tif 000008
【０１４７】
（２−３）ＩＦＩＴＭ２／３と、ＭＴとの組合せ：
第１の診断は、尿バイオマーカーＩＦＩＴＭ２／３を用い、第１の閾値は３．５［μｇ／ｇＣｒ］とした。第２の診断は、尿バイオマーカーＭＴを用い、第２の閾値は８０［ｎｇ／ｇＣｒ］とした。判定基準は実施例２−１と同じものを用いた。
第１の診断補助方法の判定１の結果は実施例２−１を参照のこと。尿バイオマーカーＭＴを用いた第２の診断補助方法では、ＨＳ群およびＣＨＤ群の測定値はすべて第２の閾値以下であった（図２（ｄ））。ＡＤ群では、ＡＤ患者１、２および５の測定値が第２の閾値より大きく、陽性と判定された（図２（ｄ）、表８）。
判定基準に従い、ＡＤ群は最終的にすべて陽性と判定された（表８）。【０１４８】
【表８】
2018030252.tif 000009
【０１４９】
（２−４）ＭＴと、ＡｐｏＢ−１００との組合せ：
第１の診断は、尿バイオマーカーＭＴを用い、第１の閾値は８０［ｎｇ／ｇＣｒ］とした。第２の診断は、尿バイオマーカーＡｐｏＢ−１００を用い、第２の閾値は１．０［ｍｇ／ｇＣｒ］とした。判定基準は実施例２−１と同じものを用いた。
尿バイオマーカーＭＴを用いた第１の診断補助方法において、ＨＳ群およびＣＨＤ群の測定値はすべて第１の閾値以下であった（図２（ｄ））。ＡＤ群では、ＡＤ患者１、２および５の測定値が第１の閾値より大きく、陽性と判定された（図２（ｄ）、表９）。尿バイオマーカーＡｐｏＢ−１００を用いた第２の診断補助方法では、ＨＳ群およびＣＨＤ群の測定値はすべて第２の閾値以下であった（図２（ａ））。ＡＤ群では、ＡＤ患者２〜５の測定値が第２の閾値より大きく、陽性と判定された（図２（ａ）、表９）。
判定基準に従い、ＡＤ群は最終的にすべて陽性と判定された（表９）。【０１５０】
【表９】
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【０１５１】
（２−５）ＭＴと、ＡｐｏＥとの組合せ：
第１の診断は、尿バイオマーカーＭＴを用い、第１の閾値は８０［ｎｇ／ｇＣｒ］とした。第２の診断は、尿バイオマーカーＡｐｏＥを用い、第２の閾値は２５［μｇ／ｇＣｒ］とした。判定基準は実施例２−１と同じものを用いた。
第１の診断補助方法の判定１の結果は実施例２−４を参照のこと。尿バイオマーカーＡｐｏＥを用いた第２の診断補助方法では、ＨＳ群およびＣＨＤ群の測定値はすべて第２の閾値以下であった（図２（ｂ））。ＡＤ群では、ＡＤ患者２〜５の測定値が第２の閾値より大きく、陽性と判定された（図２（ｂ）、表１０）。
判定基準に従い、ＡＤ群は最終的にすべて陽性と判定された（表１０）。【０１５２】
【表１０】
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【０１５３】
２種類の尿バイオマーカーを用いた診断補助方法によれば、１種類の尿バイオマーカーを用いた診断補助方法に比べて、感度の良くＡＤ診断が可能であることが示された。実施例２では、２種類の尿バイオマーカーを用いた診断補助方法の感度は１００％であった。【０１５４】
［実施例３］
＜尿タンパク質量の変動の影響＞
実施例１および２では、随時尿における尿タンパク質濃度の変動を補正するために、尿中クレアチニン補正を行った。随時尿における尿タンパク質量の変動の、尿バイオマーカー測定に対する影響を調べた。【０１５５】
ＡＤ群および非ＡＤ群から採取した随時尿を、基本的に実施例１と同じ方法で尿試料の調製およびＥＬＩＳＡ測定を行い、ＡｐｏＢ−１００の濃度（補正無）を測定した。さらに、実施例１と同じ方法を用いて、尿中クレアチニン補正を行って、ＡｐｏＢ−１００濃度（補正有）を算出した。これらの結果を図３に示す。図３で示されるように、クレアチニン補正の有無で、ＡＤ群および非ＡＤ群の測定結果にほとんど影響は認められなかった。【０１５６】
ＡｐｏＢ−１００以外の実施例１で特定した尿バイオマーカーについても同様にクレアチニン補正の有無を検討したが、いずれも測定結果にほとんど影響は認められなかった（データは示さず）。従って、本発明に係る尿バイオマーカーを用いた診断補助方法では、随時尿を尿試料として用いても、尿中クレアチニン補正を行う必要がなく、簡便に実施できる。【０１５７】
［実施例４］
＜尿試料の調製：富化処理の影響＞
ＡＤ群および非ＡＤ群から採取した尿（各５００μｌ）を、基本的に上記（１）富化処理に従ってそれぞれ１０倍濃縮した尿試料（濃縮有）と、各対象から採取した尿（各５０μｌ）そのままの尿試料（濃縮無）とを用いて、クレアチニン補正を行わないことを除いて基本的に実施例１と同じ方法で、ＡｐｏＢ−１００濃度をそれぞれ測定した（図４）。富化処理の有無に関わらず、ＡｐｏＢ−１００は、非ＡＤ群に比べてＡＤ群に特異的な増加の傾向を示した。尿タンパク質ＡｐｏＢ−１００は、富化処理の有無に関わらず測定可能であることが示された。【０１５８】
［実施例５］
＜尿試料の調製：抽出処理の影響＞
ＡＤ群および非ＡＤ群から採取した尿を、基本的に上記（１）富化処理に従って濃縮した。濃縮した試料を、上記（２）抽出処理をせずそのまま尿試料（未処理）とし、また、アルカリ抽出法により抽出処理を行って尿試料（アルカリ法）、および凍結融解法により抽出処理を行って尿試料（凍結法）を調製した。調製した尿試料は、クレアチニン補正を行わないことを除いて基本的に実施例１と同じ方法を用いて、ＡｐｏＢ−１００、ＩＦＩＴＭ２／３およびＭＴの濃度を測定した（図５）。【０１５９】
尿中のアポリポタンパク質ＡｐｏＢ−１００を測定した場合（図５（ａ））、抽出処理を行わなかった尿試料（未処理）とアルカリ抽出法を行った尿試料（アルカリ法）とで、測定結果にほとんど差異は認められなかった。また、尿試料（未処理）と凍結融解法を行った試料（凍結法）とでも同様に、測定結果にほとんど差異は認められなかった。従って、尿中のアポリポタンパク質ＡｐｏＢ−１００を尿バイオマーカーとして用いる診断補助方法の場合、尿試料は、抽出処理を行っても行わなくてもよい。【０１６０】
尿中のコレステロール輸送関連因子ＩＦＩＴＭ２／３を測定した場合（図５（ｂ））、抽出処理を行わなかった尿試料（未処理）と抽出処理を行った尿試料（アルカリ法／凍結法）とで測定結果に大きな変化があった。尿試料（未処理）ではＥＬＩＳＡ測定時にシグナル（吸光度）がほとんど得られなかった。一方、抽出処理を行った尿試料では、シグナルが得られた。得られたシグナルはアルカリ抽出法と凍結融解法とでほとんど差異は認められなかった。従って、尿中のコレステロール輸送関連因子ＩＦＩＴＭ２／３を測定対象とし、ＩＦＩＴＭ２／３を抗Ｈｕｍａｎ  ＩＦＩＴＭ２／ＩＦＩＴＭ３  Ａｎｔｉｂｏｄｙおよびｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｇｏａｔ  ＩｇＧ（ＡＦ４８３４）の組合せを用いて測定する場合、尿試料は、好ましくは抽出処理が行われた試料である。【０１６１】
尿中のＭＴを測定した場合（図５（ｃ））、抽出処理を行わなかった尿試料（未処理）と抽出処理を行った尿試料（凍結法）とで測定結果に大きな変化があった。尿試料（未処理）ではＥＬＩＳＡ測定時にシグナル（吸光度）がほとんど得られなかった。一方、抽出処理を行った尿試料では、シグナルが得られた。従って、尿中のＭＴを測定対象とし、ＭＴをＨｕｍａｎ  Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ＬＳ−Ｆ１０２９６）を用いて測定する場合、尿試料は、好ましくは抽出処理が行われた試料である。【０１６２】
［実施例６］
＜尿バイオマーカーの共局在を利用した診断補助方法＞
ＡＤ群、ＨＴ患者群、Ａｎｇ患者群およびＨＳ群から採取した尿を、基本的に上記（１）富化処理に従って濃縮および粗精製した試料を尿試料とした。なお、上記（２）抽出処理は行っていない。抗ＡｐｏＥ抗体（抗Ｈｕｍａｎ  ＡｐｏＥ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（ＷＵＥ−４  ＮＢ１１０  ６０５３１））および抗ＡｐｏＣ−Ｉ抗体（抗ＡｐｏＣ１ウサギポリクローナル抗体（ａｂ２０７９３１））をそれぞれ、上記（３）抗体の固相化に従って、９６ウェルマイクロタイタープレートに固相化した。抗ＡｐｏＢ−１００マウスモノクローナル抗体（（ＪＩＨ））を、上記（４）検出用抗体の標識に従って、ビオチン標識した。【０１６３】
調製した尿試料、抗ＡｐｏＥ抗体を固相化した９６ウェルマイクロタイタープレート、およびビオチン標識化抗ＡｐｏＢ−１００抗体を用い、上記（５）ＥＬＩＳＡ測定に従って、ＡｐｏＢ−１００とＡｐｏＥとを含む複合体（以下「ＡｐｏＢ−１００／ＡｐｏＥ複合体」ともいう。）をサンドイッチＥＬＩＳＡにて測定した。その測定結果（吸光度：Ａ４５０）を図６に示す。このサンドイッチＥＬＩＳＡにおける吸光度シグナルの検出は、調製した尿試料中に、ＡｐｏＢ−１００とＡｐｏＥとが共局在した尿タンパク質含有複合体が存在したことを示唆する。ＡｐｏＢ−１００／ＡｐｏＥ複合体は、ＡＤ群とＨＳ群を比較した場合、ＡＤ群で有意に高値であった（Ｐ＝０．００１）。この尿バイオマーカーの組合せの共局在測定によれば、１種類の尿バイオマーカーの測定（例えば、図１）に基づくＡＤ診断に比べて、また、２種類の尿バイオマーカーの順次測定（例えば、図２）に基づくＡＤ診断に比べて、より感度が高いＡＤ診断が可能となり得る。【０１６４】
図６上で示されるように、ＡｐｏＢ−１００／ＡｐｏＥ複合体は、ＣＨＤ群（ＨＴ群およびＡｎｇ群）のうちＨＴ群でも測定された。一方、Ａｎｇ群では測定されなかった。ＡｐｏＢ−１００／ＡｐｏＥ複合体は、ＨＴ群に特異的なバイオマーカーでもあり得る。従って、この尿バイオマーカーの組合せの共局在測定は、ＡＤとＨＴの診断に有用であり得る。【０１６５】
調製した尿試料、抗ＡｐｏＣ−Ｉ抗体を固相化した９６ウェルマイクロタイタープレート、およびビオチン標識化抗ＡｐｏＢ−１００抗体を用い、上記（５）ＥＬＩＳＡ測定に従って、ＡｐｏＢ−１００とＡｐｏＣ−Ｉとを含む複合体（以下「ＡｐｏＢ−１００／ＡｐｏＣＩ複合体」ともいう。）をサンドイッチＥＬＩＳＡにて測定した。その測定結果（吸光度：Ａ４５０）を図６に示す。このサンドイッチＥＬＩＳＡにおける吸光度シグナルの検出は、調製した尿試料中に、ＡｐｏＢ−１００とＡｐｏＣ−Ｉとが共局在した尿タンパク質含有複合体が存在したことを示唆する。ＡｐｏＢ−１００／ＡｐｏＣＩ複合体は、ＡＤ群とＨＳ群を比較した場合、ＡＤ群で有意に高値となった（Ｐ＝０．０２９）。この尿バイオマーカーの組合せの共局在測定によれば、１種類の尿バイオマーカーの測定、また、２種類の尿バイオマーカーの順次測定に基づくＡＤ診断に比べて、より感度が高いＡＤ診断が可能となり得る。【０１６６】
図６下で示されるように、ＡｐｏＢ−１００／ＡｐｏＣＩ複合体は、ＣＨＤ群でも測定された。ＡｐｏＢ−１００／ＡｐｏＣＩ複合体は、ＣＨＤ群に特異的なバイオマーカーでもあり得る。従って、この尿バイオマーカーの組合せの共局在測定は、ＡＤとＣＨＤの診断に有用であり得る。【０１６７】
少なくとも２種の尿バイオマーカー、特に少なくとも２種類のアポリポタンパク質の共局在に基づいた診断補助方法によれば、１種の尿バイオマーカーに基づく診断補助方法と比較して、また、少なくとも２種の尿バイオマーカーを別個に用いる診断補助方法と比較して、より感度が高い診断が可能になる。
少なくとも２種の尿バイオマーカー、特に少なくとも２種類のアポリポタンパク質の共局在に基づいた診断補助方法によれば、心肥大（ＨＴ）および不安定狭心症（Ａｎｇ）を含む心疾患（ＣＨＤ）を診断可能である。【０１６８】
従って、本発明の他の態様は、尿タンパク質含有複合体における少なくとも２種類の尿バイオマーカーの共局在に基づく、ＡＤおよび／または心疾患の診断補助方法を提供する。本発明の１つの実施形態は、ＭＭＳＥなどの診断基準に基づく認知機能検査および脳画像検査と組合せることで、ＡＤの特異的な診断補助方法を提供し得る。本発明の１つの実施形態は、心臓画像検査などの診断補助方法と組合せることで、心疾患の特異的な診断補助方法を提供し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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