(57)【要約】ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤の存在下に反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤の存在下に反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
【請求項２】
前記過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である請求項２記載の測定方法。
【請求項４】
前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項３記載の測定方法。
【請求項５】
前記フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である請求項４記載の測定方法。
【請求項６】
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、並びに、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含むヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬。
【請求項７】
さらに、過酸化水素測定試薬を含む、請求項６記載の測定試薬。
【請求項８】
前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である請求項７記載の測定試薬。
【請求項９】
前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項８記載の測定試薬。
【請求項１０】
前記フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である請求項９記載の測定試薬。
【請求項１１】
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含む第１試薬と、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第２試薬とを含むヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。
【請求項１２】
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第１試薬と、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含む第２試薬とを含むヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。
【請求項１３】
さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体を、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含む、請求項１１又は１２記載の測定キット。
【請求項１４】
前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項１３記載の測定キット。
【請求項１５】
前記フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である請求項１４記載の測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キットに関する。
本願は、２０１６年７月２９日に、日本に出願された特願２０１６−１５０４９８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
糖化タンパク質は、生体内の血液等の体液や毛髪等の生体試料中に含まれている。血液中に存在する糖化タンパク質の濃度は、血清中に溶解しているグルコース等の糖類の濃度に依存しており、臨床診断分野において、血液中の糖化タンパク質であるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）の濃度の測定が、糖尿病の診断やモニタリングに用いられている（非特許文献１参照）。ヘモグロビンは、α鎖及びβ鎖の２種類のサブユニットを各々２つ持つ、分子量６４，０００のヘムタンパク質である。ＨｂＡ１ｃは特にβ鎖のＮ末端バリン残基が糖化されたものと定義されている。このＨｂＡ１ｃを測定する方法としては、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を用いる機器分析的方法（非特許文献２参照）、抗原抗体反応を用いる免疫測定法（非特許文献３）等が知られていた。【０００３】
近年、汎用性のある自動分析装置への適用が可能であり、また、操作も簡便なＨｂＡ１ｃの酵素的測定法の開発が進んでおり、種々の方法が報告されている。これまで報告されているＨｂＡ１ｃの酵素的測定法は、主として、プロテアーゼと糖化ペプチドオキシダーゼとを用いる方法である。すなわち、血球中のＨｂＡ１ｃにプロテアーゼを作用させて、糖化ペプチドであるフルクトシルジペプチド(Ｆｒｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ)を生成させ、生成した当該フルクトシルジペプチドに対して、フルクトシルペプチドオキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を測定することにより、検体中のＨｂＡ１ｃを測定する方法（特許文献１参照）や、血球中のＨｂＡ１ｃにプロテアーゼを作用させて、糖化ペプチドであるフルクトシルヘキサペプチド(Ｆｒｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ)を生成させ、生成した当該フルクトシルヘキサペプチドに対して、フルクトシルヘキサペプチドオキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を測定することにより、検体中のＨｂＡ１ｃを測定する方法（特許文献２〜４参照）である。一方で、プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いて、検体中の糖化ヘモグロビンを測定する方法も知られている（特許文献４〜６参照）。【０００４】
また、少なくともアニオン性界面活性剤で前処理されたヘモグロビンを含む試料中のヘモグロビン測定を行い、更にヘモグロビン測定用反応液にフルクトシルバリルヒスチジンを生成するタンパク質分解酵素を作用させ、ＨｂＡ１ｃ濃度測定を行うことを特徴とするＨｂＡ１ｃ濃度及びＨｂＡ１ｃ濃度比の測定方法が報告されている（特許文献７参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−９５５９８号公報
【特許文献２】国際公開第２００８／１０８３８５号
【特許文献３】国際公開第２０１３／１６２０３５号
【特許文献４】国際公開第２０１５／００５２５８号
【特許文献５】国際公開第２０１５／００５２５７号
【特許文献６】国際公開第２０１５／０６０４２９号
【特許文献７】国際公開第２００５／０４９８５８号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Clin Chem Lab Med，第36巻、p.299-308(1998).
【非特許文献２】Diabetes，第27巻、第2号、p.102-107(1978).
【非特許文献３】日本臨床検査自動化学会会誌、第18巻、第4号、p.620 (1993).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまでの、プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いる方法は、感度が不十分である、という課題があった。
従って、本発明の目的は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いて、検体中の糖化ヘモグロビンを簡便かつ高感度で測定する方法、試薬及びキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、本課題を解決すべく鋭意検討し、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、特定のアニオン性界面活性剤の存在下に反応させることにより、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを簡便かつ高感度に測定方法できることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［１５］に関する。
［１］ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤の存在下に反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。【００１０】
［２］前記過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、［１］記載の測定方法。
［３］前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である［２］記載の測定方法。
［４］前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［３］記載の測定方法。
［５］前記フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である［４］記載の測定方法。【００１１】
［６］糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、並びに、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含むヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬。
［７］さらに、過酸化水素測定試薬を含む、［６］記載の測定試薬。
［８］前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である［７］記載の測定試薬。
［９］前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［８］記載の測定試薬。
［１０］前記フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である［９］記載の測定試薬。【００１２】
［１１］アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含む第１試薬と、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第２試薬とを含むヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。【００１３】
［１２］糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第１試薬と、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含む第２試薬とを含むヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。【００１４】
［１３］さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体を、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含む、［１１］又は［１２］記載の測定キット。
［１４］前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［１３］記載の測定キット。
［１５］前記フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である［１４］記載の測定キット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを簡便かつ高感度で測定する方法、試薬及びキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＦＰＯＸ−４７△３を第２試薬に含むキットＡを用いる、ヘモグロビン含有試料中のＨｂＡ１ｃの測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度差△Ｅとの関係を示すグラフである。縦軸は吸光度差△Ｅ（Ａｂｓ×１００００）を、横軸はＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（１）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤の存在下に反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定することを特徴とする方法である。
具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
【００１８】
（ｉ）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含む水性媒体中で反応させて、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（ｉｉｉ）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉ）及び（ｉｉ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
【００１９】
また、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総量）に対する割合を算出する方法をも包含する。この場合、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
【００２０】
（ｉ）ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン量を測定する工程；
（ｉｉ）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含む水性媒体中で反応させて、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で生成した前記過酸化水素を測定する工程； 
（ｉｖ）既知量の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を測定する工程；及び、
（ｖ）前記工程（ｉ）で測定した前記総ヘモグロビン量と、前記工程（ｉｖ）で測定した前記糖化ヘモグロビン量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
【００２１】
尚、前記工程（ｉ）の総ヘモグロビン量の測定は、ヘモグロビン含有試料に、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を添加して、ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを変性させた後に行うこともできる。
【００２２】
本発明の測定方法におけるヘモグロビン含有試料は、ヘモグロビンを含有し、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法が適用可能な試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血球、血球に血漿が混在した試料、これらの試料を溶血処理した試料等が挙げられる。溶血処理としては、全血、血球、血球に血漿が混在した試料を溶血させる処理であれば特に制限はなく、例えば物理的方法、化学的方法、生物学的方法等が挙げられる。物理的方法としては、例えば蒸留水等の低張液を用いる方法、超音波を用いる方法等が挙げられる。化学的方法としては、例えばメタノール、エタノール、アセトン等の有機溶媒を用いる方法、ポリオキシエチレン系界面活性剤を用いる方法等が挙げられる。生物学的方法としては、例えば抗体や補体を用いる方法等が挙げられる。
【００２３】
本発明における糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンにグルコース等の糖が結合して生成したものであり、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ＨｂＡ１ｃ等が挙げられ、ＨｂＡ１ｃが好ましい。
【００２４】
本発明においては、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤が使用される。
【００２５】
本発明における、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリンにおける置換基としては、例えばアルキル基、ハロゲン化アルキル基、フェニル基等が挙げられる。ハロゲン化アルキル基としては、例えばフルオロアルキル基、クロロアルキル基、ブロモアルキル基、ヨードアルキル基等が挙げられる。アルキル基及びハロゲン化アルキル基におけるアルキルとしては、例えば炭素数１〜６のアルキル等が挙げられる。炭素数１〜６のアルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
本発明における、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリンとしては、例えばＮ−アシルタウリン、Ｎ−アシル−Ｎ−アルキルタウリン等が挙げられ、Ｎ−アシル−Ｎ−アルキルタウリン等が好ましい。
【００２６】
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリンにおけるアシルとしては、例えば炭素数８〜２０のアシル等が挙げられ、炭素数１０〜１８のアシルが好ましい。炭素数８〜２０のアシルとしては、例えばオクタノイル、ノナノイル、デカノイル、ウンデカノイル、ドデカノイル（ラウロイル）、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル（パルミトイル）、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル（ステアロイル）、オレオイル、バクセノイル、リノレオイル、ノナデカノイル、エイコサノイル等が挙げられる。炭素数１０〜１８のアシルとしては、例えばデカノイル、ウンデカノイル、ドデカノイル（ラウロイル）、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル（パルミトイル）、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル（ステアロイル）、オレオイル、バクセノイル、リノレオイル等が挙げられる。
Ｎ−アシル−Ｎ−アルキルタウリンにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１〜６のアルキル等が挙げられる。炭素数１〜６のアルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
【００２７】
また、本発明において、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリンは、塩であってもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、又はその塩の具体例（製品）としては、例えばＮＩＫＫＯＬ  ＬＭＴ（Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチルタウリンナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ  ＰＭＴ（Ｎ−パルミトイル−Ｎ−メチルタウリンナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ  ＭＭＴ（Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチルタウリンナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ  ＳＭＴ（Ｎ−ステアロイル−Ｎ−メチルタウリンナトリウム；日光ケミカルズ社製）等が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法における、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、又はその塩の反応液中の濃度は、通常０．００１〜１０％であり、０．０１〜５％が好ましい。
【００２８】
本発明における、アルキルスルホ酢酸におけるアルキルとしては、例えば炭素数８〜２０のアルキル等が挙げられ、炭素数１０〜１８のアルキルが好ましい。炭素数８〜２０のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、オレイル、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数１０〜１８のアルキルとしては、例えばデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、オレイル等が挙げられる。
【００２９】
また、本発明において、アルキルスルホ酢酸は、塩であってもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
アルキルスルホ酢酸、又はその塩の具体例（製品）としては、例えばＮＩＫＫＯＬ  ＬＳＡ−Ｆ（ラウリルスルホ酢酸ナトリウム；日光ケミカルズ社製）等が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法における、アルキルスルホ酢酸、又はその塩の反応液中の濃度は、通常０．００１〜１０％であり、０．０１〜５％が好ましい。
【００３０】
本発明における、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸におけるアルキルとしては、例えば炭素数８〜２０のアルキル等が挙げられ、炭素数１０〜１８のアルキルが好ましい。炭素数８〜２０のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、オレイル、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数１０〜１８のアルキルとしては、例えばデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、オレイル等が挙げられる。
また、本発明において、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸は、塩であってもよい。ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩における塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、又はその塩の具体例（製品）としては、例えばＮＩＫＫＯＬ  ＡＫＹＰＯ  ＲＬＭ  ４５  ＮＶ（ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ  ＡＫＹＰＯ  ＲＬＭ  ４５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ  ＡＫＹＰＯ  ＲＬＭ  １００（ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ  ＥＣＴ−３ＮＥＸ（ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ  ＥＣＴＤ−３ＮＥＸ（ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ  ＥＣＴＤ−６ＮＥＸ（ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ネオハイテノールＥＣＬ−４５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム；第一工業製薬社製）等が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法におけるポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、又はその塩の反応液中の濃度は、通常０．００１〜１０％であり、０．０１〜５％が好ましい。
【００３１】
本発明における、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸における置換基としては、例えばアルキル基、ハロゲン化アルキル基、フェニル基等が挙げられる。ハロゲン化アルキル基としては、例えばフルオロアルキル基、クロロアルキル基、ブロモアルキル基、ヨードアルキル基等が挙げられる。アルキル基及びハロゲン化アルキル基におけるアルキルとしては、例えば炭素数１〜６のアルキル等が挙げられる。炭素数１〜６のアルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
本発明における、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸としては、例えばＮ−アシルアミノ酸、Ｎ−アシル−Ｎ−アルキルアミノ酸等が挙げられ、Ｎ−アシル−Ｎ−アルキルアミノ酸等が好ましい。
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸におけるアミノ酸としては、例えばグリシン、サルコシン、アラニン、β−アラニン，バリン、ロイシン、イソロイシン、リシン、アルギニン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、プロリン等が挙げられる。
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸におけるアシルとしては、例えば炭素数８〜２０のアシル等が挙げられ、炭素数１０〜１８のアシルが好ましい。炭素数８〜２０のアシルとしては、例えばオクタノイル、ノナノイル、デカノイル、ウンデカノイル、ドデカノイル（ラウロイル）、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル（パルミトイル）、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル（ステアロイル）、オレオイル、バクセノイル、リノレオイル、ノナデカノイル、エイコサノイル等が挙げられる。炭素数１０〜１８のアシルとしては、例えばデカノイル、ウンデカノイル、ドデカノイル（ラウロイル）、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル（パルミトイル）、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル（ステアロイル）、オレオイル、バクセノイル、リノレオイル等が挙げられる。
Ｎ−アシル−Ｎ−アルキルアミノ酸における、アルキルとしては、例えば炭素数１〜６のアルキル等が挙げられる。炭素数１〜６のアルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
また、本発明において、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸は、塩であってもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
【００３２】
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、又はその塩の具体例（製品）としては、例えばＮＩＫＫＯＬ  アラニネートＬＮ−３０（Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチル−β−アラニンナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ  サルコシネートＰＮ（Ｎ−パルミトイルサルコシンナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ  サルコシネートＬＮ（Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ  サルコシネートＭＮ（Ｎ−ミリストイルサルコシンナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ  サルコシネートＯＨ（Ｎ−オレオイルサルコシン；日光ケミカルズ社製）等が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法における、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、又はその塩の反応液中の濃度は、通常０．００１〜１０％であり、０．０１〜５％が好ましい。
【００３３】
本発明におけるポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸におけるアルキルとしては、例えば炭素数８〜２０のアルキル等が挙げられ、炭素数１０〜１８のアルキルが好ましい。炭素数８〜２０のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、オレイル、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数１０〜１８のアルキルとしては、例えばデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、オレイル等が挙げられる。
また、本発明において、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸は塩であってもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
【００３４】
ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、又はその塩の具体例（製品）としては、例えばプライサーフＡ２１２Ｃ（ポリオキシエチレントリデシルエーテルリン酸；第一工業製薬社製）、プライサーフＡ２１５Ｃ（ポリオキシエチレントリデシルエーテルリン酸；第一工業製薬社製）、プライサーフＡ２０８Ｂ（ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸；第一工業製薬社製）、プライサーフＡ２１９Ｂ（ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸；第一工業製薬社製）等が挙げられる。
【００３５】
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法におけるポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、又はその塩の反応液中の濃度は、通常０．００１〜１０％であり、０．０１〜５％が好ましい。
【００３６】
本発明におけるポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸における多環フェニルとは、基内に１つの芳香環を有する基（置換基）が２つ以上置換したフェニル基、基内に２つ以上の芳香環を有する基（置換基）が１つまたは複数置換したフェニル基等が挙げられる。
また、本発明において、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸は、塩であってもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
【００３７】
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、又はその塩の具体例（製品）としては、例えばプライサーフＡＬ（ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルリン酸；第一工業製薬社製）、プライサーフＡＬ１２Ｈ（ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルリン酸；第一工業製薬社製）等が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法におけるポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、又はその塩の反応液中の濃度は、通常０．００１〜１０％であり、０．０１〜５％が好ましい。
【００３８】
本発明におけるアルキルリン酸におけるアルキルとしては、例えば炭素数８〜２０のアルキル等が挙げられ、炭素数１０〜１８のアルキルが好ましい。炭素数８〜２０のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、オレイル、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数１０〜１８のアルキルとしては、例えばデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、オレイル等が挙げられる。
また、本発明において、アルキルリン酸は塩であってもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
【００３９】
アルキルリン酸、又はその塩の具体例（製品）としては、例えばＮＩＫＫＯＬ  ＳＬＰ−Ｎ（ラウリルリン酸ナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ  ホステン  ＨＬＰ（ラウリルリン酸；日光ケミカルズ社製）等が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法におけるアルキルリン酸、又はその塩の反応液中の濃度は、通常０．００１〜１０％であり、０．０１〜５％が好ましい。
【００４０】
総ヘモグロビン量は、公知の方法、例えばシアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ−ヘモグロビン法等によって測定することができる。総ヘモグロビン量は、ヘモグロビン含有試料そのもののみならず、ヘモグロビン含有試料に、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を添加して得られる試料に対して、シアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ−ヘモグロビン法等を適用することによっても測定することができる。
【００４１】
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含む水性媒体中での、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素が糖化ヘモグロビンに作用し得る条件であれば、いかなる条件下でも行うことができる。
【００４２】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応は、水性媒体中で行うことが好ましい。
水性媒体としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
水性媒体のｐＨは、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とするｐＨであれば特に制限はなく、例えばｐＨ４〜１０である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
【００４３】
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。
緩衝液の濃度は、通常０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌであり、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００４４】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応における反応温度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする反応温度であれば特に制限はなく、通常１０〜５０℃であり、２０〜４０℃が好ましく、また、当該反応における反応時間は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする反応時間であれば特に制限はなく、通常１分間〜３時間であり、２．５分間〜１時間が好ましい。糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の濃度としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常０．１〜３０ｋＵ／Ｌであり、０．２〜１５ｋＵ／Ｌが好ましい。
【００４５】
本発明において、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の酵素活性（Ｕ）は、以下の方法により算出した。
＜酵素活性測定用試薬＞
第１試薬
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）              ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）                                  ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        ３ｋＵ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                  ０．１ｇ／Ｌ
【００４６】
第２試薬
フルクトシルバリン水溶液                １．７ｍｍｏｌ／Ｌ
なお、上記フルクトシルバリン水溶液は、J. Agric. Food Chem., 第24巻、第1号、p.70-73 (1976) に記載された方法により調製した。
【００４７】
＜検体希釈液＞
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）              １０ｍｍｏｌ／Ｌ
牛血清アルブミン                        ０．１５％
＜サンプル＞
ＦＰＯＸ−４７△３（糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素）を上記の検体希釈液で希釈したもの
【００４８】
＜測定＞
反応セルへ、上記サンプル（２μＬ）と上記酵素活性測定用試薬の第１試薬（１５０μＬ）とを添加し、３７℃で３分間反応（第１反応）させた後、上記酵素活性測定用試薬の第２試薬（２０μＬ）を添加し、当該第２試薬を添加３分後の反応液の吸光度［Ａｂｓ酵素（３分後）］、及び、当該第２試薬を添加５分後の反応液の吸光度［Ａｂｓ酵素（５分後）］を、共に主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、Ａｂｓ酵素（５分後）からＡｂｓ酵素（３分後）を差し引き、吸光度差△Ａｂｓ’酵素を算出し、さらに算出した吸光度差△Ａｂｓ’酵素を２（分）で除して、１分間当たりの吸光度変化量△Ａｂｓ’酵素／分を算出した。
上記サンプルの代わりに上記検体希釈液を用いる以外は、同様の方法により、吸光度差△Ａｂｓ’ブランク／分を算出した。
算出した△Ａｂｓ’酵素／分から△Ａｂｓ’ブランク／分を差し引き、当該酵素に対する吸光度差△Ａｂｓ酵素／分を決定した。
【００４９】
＜酵素活性＞
上記で決定した△Ａｂｓ酵素／分を基に、以下の式（Ｉ）により酵素活性を算出した。
【００５０】
【数１】
2018021530.tif 000002
【００５１】
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに作用し、糖化ヘモグロビンから過酸化水素を生成させる酵素であれば特に制限はなく、例えば国際公開第２０１５／００５２５８号に記載の酵素、国際公開第２０１５／０６０４２９号に記載のアマドリア一ゼ等が挙げられる。具体的には、国際公開公報第２０１５／００５２５８号に記載されたFPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-18C、FPOX-18D、FPOX19〜46等が挙げられる。該酵素の改変体の具体例としては、例えば後述する参考例１で製造されるＦＰＯＸ−４７△３等が挙げられる。
【００５２】
生成した過酸化水素の測定方法としては、過酸化水素を測定し得る方法であれば特に制限はなく、例えば電極を用いる方法、過酸化水素測定用試薬を用いる方法等が挙げられ、過酸化水素測定用試薬を用いる方法が好ましい。過酸化水素測定用試薬は、過酸化水素を検出可能な物質に変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、光（発光）、蛍光等が挙げられ、色素が好ましい。
【００５３】
検出可能な物質が色素の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と酸化発色型色原体を含む試薬等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、酸化カップリング型色原体、ロイコ型色原体等が挙げられ、ロイコ型色原体が好ましい。
【００５４】
本発明において、ロイコ型色原体とは、過酸化水素および過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質をいう。過酸化活性物質としては、例えばペルオキシダーゼ等が挙げられる。
ロイコ型色原体としては、例えばフェノチアジン系色原体、トリフェニルメタン系色原体、ジフェニルアミン系色原体、ｏ−フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、フェノチアジン系色原体が好ましい。
フェノチアジン系色原体としては、例えば１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）等が挙げられる。フェノチアジン系色原体の中でも、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）が特に好ましい。
トリフェニルメタン系色原体としては、例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ−ＰＳ）等が挙げられる。ジフェニルアミン系色原体としては、例えばＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
【００５５】
本発明において、酸化カップリング型色原体とは、過酸化水素及び過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質をいう。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。
カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。
アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等があげられる。
フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等があげられる。
【００５６】
検出可能な物質が光（発光）の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と化学発光物質を含む試薬等が挙げられる。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。
検出可能な物質が蛍光の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と蛍光物質を含む試薬等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。
【００５７】
（２）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、並びに、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含む試薬であり、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定方法に用いられる。本発明の測定試薬は、さらに、過酸化水素測定試薬を含んでいてもよい。
【００５８】
本発明の測定試薬における、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素；アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤；並びに、過酸化水素測定試薬としては、例えば、前述の糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素；アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤；並びに、過酸化水素測定試薬等がそれぞれ挙げられる。
【００５９】
本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬は、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。凍結乾燥された状態の試薬を用いてヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解して使用される。
本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬における糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の含量としては、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．１〜３０ｋＵ／Ｌとなる含量であり、０．２〜１５ｋＵ／Ｌとなる含量が好ましい。
【００６０】
本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬における、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤の含量としては、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜１０％となる含量であり、０．０１〜５％となる含量が好ましい。
【００６１】
本発明の測定試薬には、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、塩類、干渉物質消去剤、有機溶媒等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硝酸カルシウム、フェロシアン化カリウム、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等のポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤、グリセリン、アルキレングリコール等が挙げられる。アルキレングリコールとしては、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等があげられる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム、ギ酸カリウム、酢酸カリウム等が挙げられる。干渉物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。有機溶媒としては、例えばロイコ型色原体の水性媒体への溶解補助剤としてのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
【００６２】
（３）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット
本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、キットの形態で保存、流通及び使用されてよい。本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。本発明の測定キットとしては、例えば２試薬系のキット、３試薬系のキット等が挙げられ、２試薬系キットが好ましい。
【００６３】
本発明において、２試薬系キットを用いてヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、例えば反応セルに、ヘモグロビン含有試料と第１試薬とを添加し、一定時間、一定温度で反応を行った後、第２試薬を添加し、生成した過酸化水素を測定することにより、糖化ヘモグロビンを測定することができる。
【００６４】
・キット１
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含む第１試薬；並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第２試薬を含むキット。
【００６５】
・キット２
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含む第１試薬；並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第２試薬を含み、過酸化水素測定試薬を、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含むキット。
【００６６】
過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
【００６７】
・キット３
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第１試薬；並びに、
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含む第２試薬
を含むキット。
【００６８】
・キット４
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第１試薬；並びに、
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含む第２試薬
を含み、過酸化水素測定試薬を、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含むキット。
【００６９】
過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
【００７０】
・キット５
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、並びに、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含む第１試薬；並びに、
過酸化水素測定試薬を含む第２試薬
を含むキット。
【００７１】
・キット６
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤と、過酸化水素測定試薬とを含む第１試薬；並びに、
過酸化水素測定試薬を含む第２試薬
を含むキット。
【００７２】
過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
【００７３】
・キット７
過酸化水素測定試薬を含む第１試薬；並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、並びに、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含む第２試薬
を含むキット。
【００７４】
・キット８
過酸化水素測定試薬を含む第１試薬；並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤と、過酸化水素測定試薬を含む第２試薬を含むキット。
【００７５】
過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
【００７６】
本発明の糖化ヘモグロビン測定キットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。凍結乾燥された状態のキットを用いてヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、当該キットを構成する試薬は水性媒体に溶解して使用される。
本発明の測定キットを構成する試薬における、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．２〜６０ｋＵ／Ｌとなる含量であり、０．４〜３０ｋＵ／Ｌとなる含量が好ましい。
【００７７】
本発明の測定キットを構成する試薬における、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ−アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン性界面活性剤の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００２〜２０％となる含量であり、０．０２〜１０％となる含量が好ましい。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例、比較例及び試験例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。【００７９】
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）、ＤＡ−６７（和光純薬工業社製）、４−アミノアンチピリン（アクテック社製）、ＥＭＳＥ（同仁化学研究所社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡社製）、フルクトシルバリン（J. Agric. Food Chem., 第24巻、第1号、p.70-73 (1976) に記載された方法により調製）【００８０】
ＮＩＫＫＯＬ  ＬＭＴ［Ｎ−アシルタウリン塩（Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチルタウリンナトリウム）；日光ケミカルズ社製］
ＮＩＫＫＯＬ  ＰＭＴ［Ｎ−アシルタウリン塩（Ｎ−パルミトイル−Ｎ−メチルタウリンナトリウム）；日光ケミカルズ社製］
ＮＩＫＫＯＬ  ＬＳＡ−Ｆ［アルキルスルホ酢酸塩（ラウリルスルホ酢酸ナトリウム）；日光ケミカルズ社製］
ＮＩＫＫＯＬ  ＡＫＹＰＯ  ＲＬＭ  ４５  ＮＶ［ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩（ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム）；日光ケミカルズ社製］
ＮＩＫＫＯＬ  アラニネートＬＮ−３０［Ｎ−アシルアミノ酸塩（Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチル−β−アラニンナトリウム）；日光ケミカルズ社製］
ＮＩＫＫＯＬ  サルコシネートＰＮ［Ｎ−アシルアミノ酸塩（Ｎ−パルミトイルサルコシンナトリウム）；日光ケミカルズ社製］
プライサーフＡ２１２Ｃ［ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸（ポリオキシエチレントリデシルエーテルリン酸）；第一工業製薬社製］
プライサーフＡＬ［ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸（ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルリン酸）；第一工業製薬社製］
ＮＩＫＫＯＬ  ＳＬＰ−Ｎ［アルキルリン酸塩（ラウリルリン酸ナトリウム）；日光ケミカルズ社製）］【００８１】
ネオゲンパウダーＷ（直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸；第一工業製薬社製）
ＮＩＫＫＯＬ  ＳＬＳ（ラウリル硫酸ナトリウム；日光ケミカルズ社製）
ＮＩＫＫＯＬ  ＯＳ−１４（α−オレフィンスルホン酸ナトリウム；日光ケミカルズ社製）
ＮＩＫＫＯＬ  ＳＢＬ−２Ｎ−２７（ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；日光ケミカルズ社製）
ノンサールＬＫ−２（天然脂肪酸のアルキル金属塩；日油社製）【００８２】
グリセリン（和光純薬工業社製）
エチレングリコール（純正化学社製）
プロピレングリコール（純正化学社製）【００８３】
ｎ−ドデシル−β−マルトシド（非イオン性界面活性剤；和光純薬工業社製）
ポリオキシエチレンセチルエーテル（Ｂｒｉｊ５８；シグマ−アルドリッチ社製）
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（Ｃ１４ＴＭＡ）（カチオン性界面活性剤；東京化成社製）
ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（Ｃ１６ＴＭＡ）（カチオン性界面活性剤；東京化成社製）【００８４】
［参考例１］FPOX-47△3の造成
（１）FPOX-47発現ベクターpTrc-FPOX-47の造成
配列番号１で表される塩基配列からなるDNAを含む発現プラスミドpTrc-FPOX-42をテンプレートDNAとして用い、配列番号２で表される塩基配列からなるFPOX-42 F342V-F及び配列番号３で表される塩基配列からなるFPOX-42 F342V-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ用いて、以下の試薬組成及びPCR条件により、PCRを行い、PCR産物を得た。pTrc-FPOX-42は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素であるFPOX-42をコードするDNAを含む発現プラスミドであり、国際公開第２０１５／００５２５８号に開示されている方法に従って造成することができる。PCRは、東洋紡社製のPCRキット、DNA polymerase「KOD-Plus-」のプロトコールに基づいて実施した。【００８５】
（試薬組成）
・KOD-Plus-バッファー
・テンプレートDNA（pTrc-FPOX-42）  1〜2 ng/μL
・フォワードプライマー（FPOX-42 F342V-F）  0.3 μmol/L
・リバースプライマー（FPOX-42 F342V-R）  0.3 μmol/L
・dNTP 混合液  各0.2 mmol/L
・MgSO4  1 mmol/L
・DNA ポリメラーゼ（KOD-Plus-）  0.02 U/μL
・滅菌水添加により、50 μLとした。【００８６】
（PCR条件）
1. 94℃  2分
2. 98℃  15秒
3. 60℃  30秒
4. 68℃  6分
5. 2〜4の繰り返し（全30サイクル）
6. 68℃  10分【００８７】
得られたPCR産物50 μLにニューイングランドバイオラボ社製「制限酵素Dpn I」1μLを添加し、37℃、1時間インキュベーションすることでテンプレートDNAを分解した。制限酵素処理したPCR産物をPromega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System」を用いて、当該キットのプロトコールに従って精製し、PCR産物の精製試料を得た。
次いで、得られたPCR産物の精製試料を用いて東洋紡社製の大腸菌コンピテントセル「Competent high DH5α」に形質転換した。50 mg/L アンピシリンを含有したLB寒天培地上に生育したコロニーを選択し、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用して、当該キットのプロトコールに従い、プラスミドを抽出した。
抽出したプラスミドをDNAシークエンサーで配列解析することにより、FPOX-47をコードする、配列番号４で表される塩基配列を有するDNAを含むプラスミド、pTrc-FPOX-47が造成されていることを確認した。配列解析には、pTrc99aベクター（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）のマルチクローニングサイト直前、直後の塩基配列を反映した配列番号５で表される塩基配列からなるpTrc-F及び配列番号６で表される塩基配列からなるpTrc-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ使用した。【００８８】
（２）FPOX-47△3発現ベクターpTrc-FPOX-47△3の造成
プラスミドpTrc-FPOX-47に含まれるFPOX-47をコードする塩基配列の3’末端側の終止コドンの直前に位置する9塩基を除き、終止コドンおよびBam HI制限酵素認識サイトを付加した、配列番号７で表される塩基配列からなるFPOX-47△3-R、及び、pTrc99aベクターのマルチクローニングサイト直前の塩基配列を反映した配列番号５で表される塩基配列からなるpTrc-Fを設計し、化学合成した。
pTrc-F及びFPOX-47△3-Rをプライマー対として用い、pTrc-FPOX-47をテンプレートとして、以下の試薬組成及びPCR条件によりPCRを行い、FPOX-47のＣ末端の３つのアミノ酸を欠失した欠失体FPOX-47△3をコードする塩基配列を含むDNA断片を含んだPCR産物を得た。PCRは、東洋紡社製のPCRキット、DNA polymerase「KOD-Plus-」のプロトコールに基づいて実施した。【００８９】
（試薬組成）
・KOD-Plus-バッファー
・テンプレートDNA（pTrc-FPOX-47）  0.2〜0.5 ng/μL
・フォワードプライマー（pTrc-F）  0.3 μmol/L
・リバースプライマー（FPOX-47△3-R）  0.3 μmol/L
・dNTP 混合液  各0.2 mmol/L
・MgSO4  1 mmol/L
・DNA  ポリメラーゼ（KOD-Plus-）  0.02 U/μL
・滅菌水添加により、50 μLとした。【００９０】
（PCR条件）
1. 94℃  2分
2. 98℃  15秒
3. 60℃  30秒
4. 68℃  2分
5. 2〜4の繰り返し（全30サイクル）
6. 68℃  5分【００９１】
得られたPCR産物の一部を用いて1%アガロースTAEゲルで電気泳動し、想定したサイズのDNA断片が得られていることを確認した。
得られたPCR産物を、Promega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system」を用いて、当該キットのプロトコールに従って精製し、FPOX-47△3をコードするDNAを含むDNA断片を得た。得られた当該DNA断片を２種類の制限酵素Nco I及びBam HI（共に、タカラバイオ社製）により37℃で1時間処理し、得られた反応混合物をPromega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system」を用いて、当該キットのプロトコールに従い精製し、制限酵素処理断片を得た。【００９２】
また、国際公開第２０１０／０４１７１５号パンフレットに記載されているフルクトシルヘキサペプチドを酸化する活性のない糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-15を発現させるpTrc-FPOX-15を同じ制限酵素で同様に処理し、1% アガロースTAEゲルで電気泳動し、ベクターに相当するDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up systemを用いてDNA断片を精製し、FPOX-15をコードするDNAが除去されたプラスミド断片を得た。
得られた制限酵素処理断片と、FPOX-15をコードするDNAが除去されたプラスミド断片とを混合し、DNA Ligation Kit（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションした後、ライゲーション産物を東洋紡社製の大腸菌コンピテントセル「Competent high DH5α」に導入した。
ライゲーション産物が導入された大腸菌を50 mg/L アンピシリンを含むLB寒天培地に植菌し、37℃で14時間培養し、出現したコロニーを選択した。選択したコロニーを、50 mg/L アンピシリンを含むLB液体培地で、37℃で14時間培養し、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用して、当該キットのプロトコールに従い、プラスミドを調製した。配列番号５で表される塩基配列からなるpTrc-F及び配列番号６で表される塩基配列からなるpTrc-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ用いてPCRを行い、調製したプラスミドの塩基配列を確認し、当該プラスミド上に、FPOX-47の塩基配列の、終止コドンを除いた3’側9塩基が欠失した配列番号８で表される塩基配列が含まれることを確認した。同プラスミドをpTrc-FPOX-47△3と称する。【００９３】
（３）FPOX-47△3の取得
上記（２）で得られたpTrc-FPOX-47△3を含む大腸菌を、アンピシリン50 mg/Lを含有するLB培地で、37℃、14時間振盪培養した。得られた培養液を用いて、国際公開第２０１０／０４１７１５号パンフレットに記載されている糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-9及びFPOX-15の精製方法に従って精製し、精製FPOX-47△3の溶液を得た。FPOX-47のアミノ酸配列を配列番号９に、FPOX-47△3のアミノ酸配列を配列番号１０にそれぞれ示す。【００９４】
（４）FPOX-47△3の糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素活性（以下、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性と称する）の確認
上記（３）で得られた精製FPOX-47△3の溶液を用いて、以下の測定キット及び測定手順により、FPOX-47△3のＨｂＡ１ｃに対する糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性を確認した。【００９５】
＜測定キットＡ＞
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）          ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ４０μｍｏｌ／Ｌ
ＮＩＫＫＯＬ  ＬＭＴ                    １ｇ／Ｌ
第２試薬
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）              １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−４７△３                      １．５ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        ２００ｋＵ／Ｌ【００９６】
＜測定キットａ＞
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）          ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ４０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）              １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−４７△３                      １．５ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        ２００ｋＵ／Ｌ【００９７】
測定キットａは、第１試薬中にＮＩＫＫＯＬ  ＬＭＴが含まれていないこと以外は、測定キットＡと同じである。【００９８】
＜サンプル＞
ヒトの血液を遠心分離して得られる血球を脱イオン水で希釈して溶血させて調製され、ＨｂＡ１ｃ測定の基準法であるＫＯ５００法と、総ヘモグロビン測定法の１つであるＳＬＳ−ヘモグロビン法とから、ＨｂＡ１ｃ濃度が２．６μｍｏｌ／Ｌ、４．５μｍｏｌ／Ｌ、６．４μｍｏｌ／Ｌ、８．４μｍｏｌ／Ｌと値付けされている溶血試料をサンプルとして用いた。【００９９】
＜測定手順＞
反応セルへ、上記の各サンプル（１０μＬ）と上記測定キットＡの第１試薬（１００μＬ）とを添加し、３７℃で５分間反応（第１反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に上記測定キットＡの第２試薬（４０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応（第２反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。Ｅ２からＥ１を差し引き、吸光度差△Ｅ’Ａを算出した。
反応セルへ、上記の各サンプル（１０μＬ）と上記測定キットａの第１試薬（１００μＬ）とを添加し、３７℃で５分間反応（第１反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ３）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に上記測定キットａの第２試薬（４０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応（第２反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ４）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。Ｅ４からＥ３を差し引き、吸光度差△Ｅ’ａを算出した。
△Ｅ’Ａから△Ｅ’ａを差し引き、各サンプルに対する吸光度差△Ｅとした。各サンプルにおけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を図１に示す。【０１００】
第１図から明らかな様に、アニオン性界面活性剤であるＮ−アシルタウリンを含む本発明のキット（キットＡ）を用いた測定において、ＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度との間に定量関係が認められた。従って、ＦＰＯＸ−４７△３が、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する活性を有する酵素であることを確認した。【０１０１】
［実施例１］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット１Ａ〜１Ｉ）を調製した。【０１０２】
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）          ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ４０μｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤Ａ〜Ｉ（第１表参照）
第２試薬
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）              １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−４７△３                      ０．９ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        ２００ｋＵ／Ｌ【０１０３】
［比較例１］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット１ａ〜１ｅ）を調製した。【０１０４】
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）          ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ４０μｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤ａ〜ｅ（第１表参照）
第２試薬
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）              １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−４７△３                      ０．９ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        ２００ｋＵ／Ｌ
界面活性剤ａ〜ｅは、国際公開第２０１５／０６０４２９号に記載されているアニオン性界面活性剤である。【０１０５】
［実施例２］
ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例１のキット１Ａを用い、試料として、ＨＰＬＣ法であるＫＯ５００法によって、ＨｂＡ１ｃ濃度がそれぞれ４．９％、５．６％、６．７％、７．５％、８．４％及び９．９％と値付けされている、６濃度の全血を用いて、以下の手順により、各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度（量）の総ヘモグロビン濃度（量）に対する割合［ＨｂＡ１ｃ（％）］を決定した。【０１０６】
（１）総ヘモグロビン濃度決定のための検量線の作成
総ヘモグロビン測定用キットであるヘモグロビンＢ−テストワコー（ＳＬＳ−ヘモグロビン法）（和光純薬工業社製）及びヘモグロビンＢ−テストワコーに付属の標準品（総ヘモグロビン濃度：１５．３ｍｇ／ｍＬ）を用いて、以下の手順に従って測定を行い、当該標準品に対する吸光度を測定した。
反応セルへ、当該標準品（１０μＬ）とヘモグロビンＢ−テストワコー（２５０μＬ）とを添加し、３７℃で１０分間反応させ、反応液の吸光度（Ｅ）を主波長５４６ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定し、当該標準品に対する吸光度とした。当該標準品の代わりに生理食塩水を用いる以外は同様の方法により測定し、生理食塩水に対する吸光度とした。当該標準品に対する吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該標準品に対するブランク補正吸光度とした。当該標準品に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度（０ Ａｂｓ）とから、総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。【０１０７】
（２）ＨｂＡ１ｃ濃度決定のための検量線の作成
ＫＯ５００法によりＨｂＡ１ｃ濃度が２．９８μｍｏｌ／Ｌ、６．１３μｍｏｌ／Ｌと値付けされている２つの血球画分について、実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａを用いて、以下の手順に従って測定し、各血球画分に対する吸光度を測定した。
反応セルへ、上記の各血球画分（１０μＬ）と実施例１のキット１Ａの第１試薬（１００μＬ）とを添加し、３７℃で５分間反応（第１反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に実施例１のキット１Ａの第２試薬（４０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応（第２反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。Ｅ２からＥ１を差し引き、吸光度差△Ｅ’１Ａを算出し、各血球画分に対する吸光度とした。上記の各血球画分の代わりに生理食塩水を用いる以外は同様の方法により、吸光度差△Ｅ’生理食塩水を算出し、生理食塩水に対する吸光度とした。当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度（０ Ａｂｓ）とから、ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。【０１０８】
（３）各血球画分における総ヘモグロビン濃度の決定
各試料に対して、２５℃、３０００ｒｐｍ（１５００×Ｇ）で５分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球画分について、ヘモグロビンＢ−テストワコーを用いて（１）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と（１）の検量線とから、各血球画分中の総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。【０１０９】
（４）各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度の決定
（３）で得られた各血球画分について、本発明の測定キット１Ａを用いて（２）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と（２）の検量線とから、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。【０１１０】
（５）ＨｂＡ１ｃ（％）（ＨｂＡ１ｃ濃度の総ヘモグロビン濃度に対する割合）の決定
上記（３）で決定した各血球画分における総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と、上記（４）で決定した各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とから、以下の式（ＩＩ）により、ＨｂＡ１ｃ（％）をＮＧＳＰ値（国際標準値）として算出した。【０１１１】
【数２】
2018021530.tif 000003
【０１１２】
（６）同一血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）のＫＯ５００法での決定
上記（５）でのＨｂＡ１ｃ（％）の決定に使用した血球画分と同一の血球画分を用いて、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）を、ＨＰＬＣを用いるＫＯ５００法により決定した。【０１１３】
（７）本発明の測定方法とＫＯ５００法との相関
本発明の測定方法を用いて、上記（５）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）と、ＫＯ５００法を用いて、上記（６）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）とから、本発明の測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。
その結果、両測定法間の相関係数が０．９４３となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例１のキット１Ａを用いる本発明の測定方法により、試料中のＨｂＡ１ｃを正確に測定できることが明らかとなった。
実施例１のキット１Ａの代わりに、実施例１のキット１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ及び１Ｉの各キットを用いる以外は上記と同様の手順により、各試料中のＨｂＡ１ｃ（％）を決定し、キット１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ及び１Ｉの各キットを用いる測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果を第１表に示す。【０１１４】
［比較例２］
実施例１のキット１Ａの代わりに、比較例１のキット１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ及び１ｅの各キットを用いる以外は実施例２と同様の手順により、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）を決定し、キット１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ及び１ｅの各キットを用いる測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果を第１表に示す。【０１１５】
【表１】
2018021530.tif 000004
【０１１６】
第１表から明らかな様に、本発明のキット１Ａ〜１Ｉを用いる測定においては、ＫＯ５００法との間に良好な相関関係が認められたが、比較例１のキット１ａ〜１ｅを用いる測定においては、ＫＯ５００法との間に良好な相関関係が認められなかった。従って、本発明のキット１Ａ〜１Ｉを用いることにより、試料中の糖化ヘモグロビンを正確に測定できることが明らかとなった。【０１１７】
［実施例３］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット２Ａ〜２Ｉ）を調製した。【０１１８】
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）          ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ４０μｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤Ａ〜Ｉ（第２表参照）
第２試薬
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）              １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−４７△３                      １．５ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        ２００ｋＵ／Ｌ【０１１９】
実施例３の各キット（キット２Ａ〜２Ｉ）は、第２試薬中のＦＰＯＸ−４７△３が１．５ｋＵ／Ｌであること以外は、実施例１の各キット（キット１Ａ〜１Ｉ）と同じである。【０１２０】
［比較例３］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット２ａ〜２ｅ）を調製した。【０１２１】
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）          ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ４０μｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤ａ〜ｅ（第２表参照）
第２試薬
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）              １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−４７△３                      １．５ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        ２００ｋＵ／Ｌ
界面活性剤ａ〜ｅは、国際公開第２０１５／０６０４２９号に記載されているアニオン性界面活性剤である。比較例３の各キット（キット２ａ〜２ｅ）は、第２試薬中のＦＰＯＸ−４７△３が１．５ｋＵ／Ｌであること以外は、比較例１の各キット（キット１ａ〜１ｅ）と同じである。【０１２２】
［実施例４］
ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例３のキット２Ａを用い、試料として、ＨＰＬＣ法であるＫＯ５００法によって、ＨｂＡ１ｃ濃度がそれぞれ４．９％、５．６％、６．７％、７．５％、８．４％及び９．９％と値付けされている６濃度の全血を用いて、以下の手順により、各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度（量）の総ヘモグロビン濃度（量）に対する割合［ＨｂＡ１ｃ（％）］を決定した。【０１２３】
（１）総ヘモグロビン濃度決定のための検量線の作成
総ヘモグロビン測定用キットであるヘモグロビンＢ−テストワコー（ＳＬＳ−ヘモグロビン法）（和光純薬工業社製）を用いて、実施例２の（１）と同様の測定を行い、総ヘモグロビン濃度と吸光度との関係を示す検量線を作成した。【０１２４】
（２）ＨｂＡ１ｃ濃度決定のための検量線の作成
ＫＯ５００法によりＨｂＡ１ｃ濃度が２．５４μｍｏｌ／Ｌ、６．４０μｍｏｌ／Ｌと値付けされている２つの血球画分について、実施例３のＨｂＡ１ｃ測定用キット２Ａを用いて、実施例２の（２）と同様の測定を行い、各血球画分に対する吸光度を測定した。当該血球画分の代わりに生理食塩水を用いて同様の測定を行い、生理食塩水に対する吸光度を測定した。当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度（０ Ａｂｓ）とから、ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。【０１２５】
（３）各血球画分における総ヘモグロビン濃度の決定
各試料に対して、２５℃、３０００ｒｐｍ（１５００×Ｇ）で５分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球画分について、ヘモグロビンＢ−テストワコーを用いて（１）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と（１）の検量線とから、各血球画分中の総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。【０１２６】
（４）各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度の決定
（３）で得られた各血球画分について、本発明の測定キット２Ａを用いて（２）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と（２）の検量線とから、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。【０１２７】
（５）ＨｂＡ１ｃ（％）（＝ＨｂＡ１ｃ濃度の総ヘモグロビン濃度に対する割合）の決定
上記（３）で決定した各血球画分における総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と、上記（４）で決定した各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とから、以下の式（ＩＩ）により、ＨｂＡ１ｃ（％）をＮＧＳＰ値（国際標準値）として算出した。【０１２８】
【数３】
2018021530.tif 000005
【０１２９】
（６）同一血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）のＫＯ５００法での決定
上記（５）でのＨｂＡ１ｃ（％）の決定に使用した血球画分と同一の血球画分を用いて、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）を、ＨＰＬＣを用いるＫＯ５００法により決定した。【０１３０】
（７）本発明の測定方法とＫＯ５００法との相関
本発明の測定方法を用いて、上記（５）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）と、ＫＯ５００法を用いて、上記（６）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）とから、本発明の測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果、両測定法間の相関係数が０．９９８となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例３のキット２Ａを用いる本発明の測定方法により、試料中のＨｂＡ１ｃを正確に測定できることが明らかとなった。【０１３１】
（８）ＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度との間の相関式〜感度の比較
上記（４）で決定した各血球画分中のＨｂＡ１ｃ濃度（ｘ軸）と、各血球画分に対する吸光度（ｙ軸）との間の関係を表す１次関数の傾きを決定し、ＨｂＡ１ｃ測定における感度の指標とした。当該傾きは、ＨｂＡ１ｃ（１μｍｏｌ／Ｌ）に対する吸光度である。その結果、傾きは０．０１０８であった。
実施例３のキット２Ａの代わりに、実施例３のキット２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、２Ｈ及び２Ｉの各キットを用いる以外は上記と同様の手順により、各試料中のＨｂＡ１ｃ（％）を決定し、キット２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、２Ｈ及び２Ｉの各キットを用いる測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果を第２表に示す。
また、実施例３のキット２Ａの代わりに、実施例３のキット２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、２Ｈ及び２Ｉの各キットを用いる以外は上記（８）と同様の手順により、各キットを用いる測定における、ＨｂＡ１ｃ（１μｍｏｌ／Ｌ）に対する吸光度を決定した。その結果を第２表に示す。【０１３２】
［比較例４］
実施例３のキット２Ａの代わりに、比較例３のキット２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ及び２ｅの各キットを用いる以外は実施例４と同様の手順により、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）を決定し、キット２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ及び２ｅの各キットを用いる測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果を第２表に示す。
また、比較例３のキット２ｂ、２ｃ及び２ｄの各キットを用いる測定における、各血球画分に対する吸光度（ｙ軸）との間の関係を表す１次関数の傾きを決定し、ＨｂＡ１ｃ測定における感度の指標とした。当該相関式の傾きは、ＨｂＡ１ｃ（１μｍｏｌ／Ｌ）当たりの吸光度である。その結果を第２表に示す。【０１３３】
【表２】
2018021530.tif 000006
【０１３４】
第２表から明らかな様に、本発明の実施例３のキット２Ａ〜２Ｉを用いる測定は、国際公開第２０１５／０６０４２９号に記載されているアニオン性界面活性剤を含む比較例３のキット２ａ〜２ｄを用いる測定と共に、ＫＯ５００法との間に良好な相関関係が認められた。なお、キット２ｅを用いた場合には、糖化ヘモグロビンを測定できなかった。
さらに、第２表から明らかな様に、本発明の実施例３のキット２Ａ〜２Ｉを用いる測定は、比較例３のキット２ａ〜２ｄを用いる測定に比較して、ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）当たりの吸光度が大きかった。従って、本発明の測定方法は、比較例３のキット２ａ〜２ｅを用いる測定方法に比較して感度が高く、本発明の測定方法により、糖化ヘモグロビンを高感度に測定できることが明らかとなった。【０１３５】
［実施例５］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット２Ｊ〜２Ｌ）を調製した。【０１３６】
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）          ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ４０μｍｏｌ／Ｌ
ＮＩＫＫＯＬ  ＬＭＴ                    １．０ｇ／Ｌ
第２試薬
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）              １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−４７△３                      １．５ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        ２００ｋＵ／Ｌ
安定化剤Ｊ〜Ｌ（第３表参照）【０１３７】
［実施例６］
実施例３のキット２Ａに加えて実施例５のキット２Ｊ、２Ｋ及び２Ｌの各キットを用いる以外は実施例４と同様の手順により、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）を決定し、キット２Ａ、２Ｊ、２Ｋ及び２Ｌの各キットを用いる測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果を第３表に示す。
また、実施例３のキット２Ａ並びに実施例５のキット２Ｊ、２Ｋ及び２Ｌの各キットを用いる測定における、各血球画分に対する吸光度（ｙ軸）との間の関係を表す１次関数の傾きを決定し、ＨｂＡ１ｃ測定における感度の指標とした。当該相関式の傾きは、ＨｂＡ１ｃ（１μｍｏｌ／Ｌ）当たりの吸光度である。その結果を第３表に示す。【０１３８】
【表３】
2018021530.tif 000007
【０１３９】
第３表から明らかな様に、本発明の実施例５のキット２Ｊ〜２Ｌを用いる測定は、本発明の実施例３のキット２Ａを用いる測定と同様に、ＫＯ５００法との間に良好な相関関係が認められた。
また、第３表から明らかな様に、本発明の実施例５のキット２Ｊ〜２Ｌを用いる測定は、実施例３のキット２Ａを用いる測定と同様に、ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）当たりの吸光度が０．００８以上であった。
したがって、アニオン性界面活性剤であるＮ−アシルタウリン塩を用いる本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法は、安定化剤であるグリセリン又はアルキレングリコールの存在下においても正確、かつ、高感度な測定方法であることが明らかとなった。【０１４０】
［実施例７］
（１）溶血検体の調製
ヒト血液を遠心分離して得られた血球画分を、総ヘモグロビン測定試薬であるヘモグロビンＢ−テストワコーを用いて実施例２の（１）と同様の測定を行い、得られた吸光度と実施例２の（１）で作成した総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線とから、該血球画分の総ヘモグロビン濃度を決定した。次いで、この値付けされた該血球画分を精製水で希釈して溶血させ、総ヘモグロビン濃度が４ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ及び８ｍｇ／ｍＬの各溶血検体を調製した。【０１４１】
（２）ＨｂＡ１ｃ濃度決定のための検量線の作成
ＫＯ５００法によりＨｂＡ１ｃ濃度が２．９８μｍｏｌ／Ｌ、６．１３μｍｏｌ／Ｌと値付けされている２つの血球画分について、実施例３のキット２Ａを用いて、以下の手順に従って測定し、各血球画分に対する吸光度を測定した。
反応セルへ、上記の各血球画分（９．６μＬ）と実施例３のキット２Ａの第１試薬（１２０μＬ）とを添加し、３７℃で５分間反応（第１反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に実施例３のキット２Ａの第２試薬（４０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応（第２反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。Ｅ２からＥ１を差し引き、吸光度差△Ｅ’２Ａを算出し、各血球分画に対する吸光度とした。上記の各血球画分の代わりに生理食塩水を用いる以外は同様の方法により、吸光度差△Ｅ’生理食塩水を算出し、生理食塩水に対する吸光度とした。当該血球分画に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球分画に対するブランク補正吸光度とした。当該血球分画に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度（０ Ａｂｓ）とから、ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。【０１４２】
（３）各溶血検体におけるＨｂＡ１ｃ濃度の決定
（１）で調製した各溶血検体について、実施例３のキット２Ａを用いて（２）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と（２）の検量線とから、各溶血検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を測定した。【０１４３】
（４）ＨｂＡ１ｃ（％）（＝ＨｂＡ１ｃ濃度の総ヘモグロビン濃度に対する割合）の決定
上記（１）で調製した各溶血検体における総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と、上記（３）で測定した各溶血検体におけるＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）  とから、以下の式（ＩＩ）により、ＨｂＡ１ｃ（％）をＮＧＳＰ値（国際標準値）として算出した。【０１４４】
【数４】
2018021530.tif 000008
【０１４５】
（５）総ヘモグロビン濃度の影響の評価
総ヘモグロビン濃度が６ｍｇ／ｍＬである溶血検体でのＨｂＡ１ｃ濃度（％）を基準０とし、その基準からの各溶血検体のＨｂＡ１ｃ濃度（％）の差［△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）］を算出した。その結果を第４表に示す。【０１４６】
ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例３のキット２Ａの代わりに、実施例３のキット２Ｂ〜２Ｉの各キットを用いて同様の測定を行い、各キットに対して、各溶血検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（％）を測定した。総ヘモグロビン濃度が６ｍｇ／ｍＬである溶血検体でのＨｂＡ１ｃ濃度（％）を基準０とし、その基準からの各溶血検体のＨｂＡ１ｃ濃度（％）の差［△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）］を算出した。その結果を第４表に示す。【０１４７】
［比較例５］
実施例３のキット２Ａの代わりに、比較例３のキット２ｂ〜２ｄの各キットを用いる以外は、実施例７と同様の方法により、各キットに対して、各溶血検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（％）を測定した。総ヘモグロビン濃度が６ｍｇ／ｍＬである溶血検体でのＨｂＡ１ｃ濃度（％）を基準０とし、その基準からの各溶血検体のＨｂＡ１ｃ濃度（％）の差［△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）］を算出した。その結果を第４表に示す。【０１４８】
【表４】
2018021530.tif 000009
【０１４９】
前述の通り、測定に用いた溶血検体は、同一のヒト血液より調製されたものであるため、総ヘモグロビンに対するＨｂＡ１ｃの割合（％）は、総ヘモグロビン濃度に拠らず一定である。従って、△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）が０に近い程、総ヘモグロビン濃度の影響を受けない、ということになる。第４表から明らかな通り、本発明のキット２Ａ〜２Ｇの各キットを用いる本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法は、比較例３のキット２ｂ〜２ｄの各キットを用いる糖化ヘモグロビンの測定方法と比較して、総ヘモグロビン濃度の影響を受けないことが判明した。【０１５０】
［比較例６］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット２ｆ〜２ｍ）を調製した。【０１５１】
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）          ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ４０μｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤ｆ〜ｍ（第５表参照）
第２試薬
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）              １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−４７△３                      １．５ｋＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        ２００ｋＵ／Ｌ【０１５２】
界面活性剤ｆ〜ｍは、国際公開第２０１５／０６０４２９号に記載されている非イオン性界面活性剤、又は、カチオン性界面活性剤である。比較例６の各キット（キット２ｆ〜２ｍ）は、第１試薬中の界面活性剤以外は、比較例３の各キット（キット２ａ〜２ｅ）と同じである。【０１５３】
［実施例８］
ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例３のキット２Ａを用い、試料として、ＨＰＬＣ法であるＫＯ５００法によって、ＨｂＡ１ｃ濃度がそれぞれ４．９％、５．６％、６．７％、７．５％、８．４％及び９．９％と値付けされている６濃度の全血を用いて、実施例４と同様の手順により、ＫＯ５００法との相関に係る相関係数、及び、感度の指標としてのＨｂＡ１ｃ（１μｍｏｌ／Ｌ）当たりの吸光度を決定した。その結果を第５表に示す。【０１５４】
［比較例７］
ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、比較例６のキット２f〜２ｍの各キットを用い、試料として、ＨＰＬＣ法であるＫＯ５００法によって、ＨｂＡ１ｃ濃度がそれぞれ４．９％、５．６％、６．７％、７．５％、８．４％及び９．９％と値付けされている６濃度の全血を用いて、実施例４と同様の手順により、ＫＯ５００法との相関に係る相関係数、及び、感度の指標としてのＨｂＡ１ｃ（１μｍｏｌ／Ｌ）当たりの吸光度を決定した。その結果を第５表に示す。【０１５５】
【表５】
2018021530.tif 000010
【０１５６】
第５表から明らかな様に、本発明の実施例３のキット２Ａを用いる測定は、比較例６のキット２ｆ〜２ｍを用いる測定に比較して、ＫＯ５００法との間により良好な相関が認められた。特に、カチオン性界面活性剤であるＣ１４ＴＭＡ及びＣ１６ＴＭＡをそれぞれ含むキット２ｆ及び２ｇにおいては、試料中の糖化ヘモグロビンを測定できなかった。
また、第５表から明らかな様に、本発明の実施例３のキット２Ａを用いる測定は、比較例６のキット２ｆ〜２ｍを用いる測定に比較して、ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）当たりの吸光度が大きかった。従って、本発明の測定方法は、比較例６のキット２ｆ〜２ｍを用いる測定に比較して感度が高く、本発明の測定方法により、糖化ヘモグロビンを高感度に測定できることが明らかとなった。【０１５７】
［実施例９］
以下の、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第１試薬、及び、アニオン性界面活性剤であるＮ−アシルタウリン塩を含む第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット３Ａ）を調製した。【０１５８】
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）          ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                              ４０μｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−４７△３                      ０．６ｋＵ／Ｌ
第２試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）          ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
アジ化ナトリウム                        ０．１ｇ／Ｌ
ＮＩＫＫＯＬ  ＬＭＴ                    ４．５ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                        ２００ｋＵ／Ｌ【０１５９】
［実施例１０］
ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例９のキット３Ａを用い、試料として、ＨＰＬＣ法であるＫＯ５００法によって、ＨｂＡ１ｃ濃度がそれぞれ３．７％、４．４％、５．４％、６．７％、及び９．２％と値付けされている５濃度の全血を用いて、以下の手順により、各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度（量）の総ヘモグロビン濃度（量）に対する割合［ＨｂＡ１ｃ（％）］を決定した。【０１６０】
（１）総ヘモグロビン濃度決定のための検量線の作成
総ヘモグロビン測定用キットであるヘモグロビンＢ−テストワコー（ＳＬＳ−ヘモグロビン法）（和光純薬工業社製）を用いて、実施例２の（１）と同様の測定を行い、総ヘモグロビン濃度と吸光度との関係を示す検量線を作成した。【０１６１】
（２）ＨｂＡ１ｃ濃度決定のための検量線の作成
ＫＯ５００法によりＨｂＡ１ｃ濃度が３．６４μｍｏｌ／Ｌ、９．１８μｍｏｌ／Ｌと値付けされている２つの血球画分について、実施例９のＨｂＡ１ｃ測定用キット３Ａを用いて、実施例７の（２）と同様の測定を行い、各血球画分に対する吸光度を測定した。当該血球画分の代わりに生理食塩水を用いて同様の測定を行い、生理食塩水に対する吸光度を測定した。当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度（０ Ａｂｓ）とから、ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。【０１６２】
（３）各血球画分における総ヘモグロビン濃度の決定
各試料に対して、２５℃、３０００ｒｐｍ（１５００×Ｇ）で５分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球画分について、ヘモグロビンＢ−テストワコーを用いて（１）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と（１）の検量線とから、各血球画分中の総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。【０１６３】
（４）各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度の決定
（３）で得られた各血球画分について、本発明の測定キット３Ａを用いて（２）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と（２）の検量線とから、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。【０１６４】
（５）ＨｂＡ１ｃ（％）（＝ＨｂＡ１ｃ濃度の総ヘモグロビン濃度に対する割合）の決定
上記（３）で決定した各血球画分における総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と、上記（４）で決定した各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とから、以下の式（ＩＩ）により、ＨｂＡ１ｃ（％）をＮＧＳＰ値（国際標準値）として算出した。【０１６５】
【数５】
2018021530.tif 000011
【０１６６】
（６）同一血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）のＫＯ５００法での決定
上記（５）でのＨｂＡ１ｃ（％）の決定に使用した血球画分と同一の血球画分を用いて、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）を、ＨＰＬＣを用いるＫＯ５００法により決定した。【０１６７】
（７）本発明の測定方法とＫＯ５００法との相関
本発明の測定方法を用いて、上記（５）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）と、ＫＯ５００法を用いて、上記（６）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）とから、本発明の測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果、両測定法間の相関係数が０．９７４となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。【０１６８】
（８）感度の比較
上記（４）で決定した各血球画分中のＨｂＡ１ｃ濃度（ｘ軸）と、各血球画分に対する吸光度（ｙ軸）との間の関係を表す１次関数の傾きを決定し、ＨｂＡ１ｃ測定における感度の指標とした。当該傾きは、ＨｂＡ１ｃ（１μｍｏｌ／Ｌ）に対する吸光度である。その結果、傾きは０．００５８であった。【０１６９】
したがって、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第１試薬と、アニオン性界面活性剤であるＮ−アシルタウリン塩を含む第２試薬とを含む本発明の糖化ヘモグロビン測定キットを用いる本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法は、正確、かつ、高感度な測定方法であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明により、糖尿病等の診断に有用なヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するための方法、試薬及びキットが提供される。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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