(57)【要約】  従来よりも安価であり、安定した品質管理が可能であり、精子の品質を向上させることができ、高い受胎性を有する精子の保存に用いる希釈液及びそれを用いた精子の保存方法を提供する。  フルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖の少なくともいずれかのオリゴ糖を含む水溶液であることを特徴とする精子用希釈液を用いて、精子を冷蔵又は凍結して保存することにより、コストを低減させた上で保存後の精子の品質を向上させることができ、受胎性の高い精子の提供をすることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、及びガラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも一種のオリゴ糖を含む水溶液であることを特徴とする、精子用希釈液。
【請求項２】
前記水溶液は、レシチン、卵黄、又は乳を含む、請求項１に記載の精子用希釈液。
【請求項３】
前記レシチンは、大豆レシチンである、請求項２に記載の精子用希釈液。
【請求項４】
前記水溶液のｐＨは、６．２〜７．０である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の精子用希釈液。
【請求項５】
前記オリゴ糖の濃度が２５〜３５ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の精子用希釈液。
【請求項６】
前記フルクトオリゴ糖として、１−ケストース、ニストース、又は１−フラクトフラノシルニストースを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の精子用希釈液。
【請求項７】
前記イソマルトオリゴ糖として、イソマルトース、イソマルトトリオース、又はパノースを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の精子用希釈液。
【請求項８】
緩衝剤として、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン又はクエン酸を含有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の精子用希釈液。
【請求項９】
耐凍剤として、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール又はジメチルスルホキシドを含有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の精子用希釈液。
【請求項１０】
前記耐凍剤の濃度が、６．５〜７．５％である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の精子用希釈液。
【請求項１１】
浸透圧計（オズモメーター）を用いて測定される浸透圧が、２３０〜３４１４ｍｍｏｌ／ｋｇである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の精子用希釈液。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の精子用希釈液と、ヒト以外の哺乳動物由来の精子とを含むことを特徴とする、精子希釈液。
【請求項１３】
請求項１２に記載の精子希釈液と、ストローとを含むことを特徴とする、人工授精用ストロー。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の精子用希釈液を用いて冷蔵又は凍結を行うことを特徴とする、精子の保存方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の精子希釈液を用いて冷蔵又は凍結を行うことを特徴とする、精子の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精子用希釈液及びそれを用いた精子の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
家畜の効率的な育種・繁殖、希少動物の種の保存、不妊治療の目的等において、精子の保存が行われている。一般的に、精子は、その運動性や代謝を抑えるために、希釈液で希釈した後、冷蔵もしくは凍結して低温保存される。この保存方法の違いは、精子の品質に影響し、受精能力や受胎性を左右すると考えられている。【０００３】
例えば、家畜の効率的な生産や育種という観点では、日本国では牛の繁殖はほぼ１００％人工授精によって行われている。しかしながら、牛の人工授精による受胎率は、年々低下しており、例えば乳用牛では、１９８９年の初回授精の受胎率が６２．４％、１〜３回授精の受胎率が６２．０％であったものが、２０１３年では初回授精の受胎率が４４．３％、１〜３回授精の受胎率が４４．１％にまで低下している（非特許文献１）。このような問題を解決するために、精子の品質を向上させ、受胎率を高める技術が検討されている（特許文献１、非特許文献２）。【０００４】
希釈液の組成を改良することにより、精子の品質を向上させる試みもある（特許文献２〜４）。しかしながら、これらの改良によっても、フィールド受胎率を向上させる効果が十分ではないのが実情である。また、これまで使用された希釈液は、ラフィノースのような高価な試薬も用いられているため、精子の品質向上のみならず、コストの低減も同時に求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５７３８３１４号
【特許文献２】特開２００８−２５９５０６号公報
【特許文献３】特開２０１３−７８２７２号公報
【特許文献４】特開２０１５−１７１３４６公報
【特許文献５】国際公開第２０１５／１３７４６６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】一般社団法人家畜改良事業団  平成２５年受胎調査成績  ２０１５年３月
【非特許文献２】社団法人畜産技術協会  牛の人工授精マニュアル  ２００３年３月
【非特許文献３】Ｇｕｔｈｒｉｅ et al.、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ６７、  １８１１−１８１６  （２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、精子の品質を向上させ、かつコストが低減できる希釈液及びそれを用いた精子の保存方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、精子保存用の希釈液について精子運動性、精子の生存かつアクロソーム正常性、本発明者らが開発した受胎性と相関の高い精子の検査法（特許文献５）、体外受精による精子侵入率、人工授精による受胎率等の観点から鋭意研究を行った結果、フルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、及びガラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも一種のオリゴ糖を含む水溶液を用いることで、著しく精子の品質が向上することを見出して、本発明に到った。【０００９】
したがって、本発明は、以下の発明を包含する。
［１］  フルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、及びガラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも一種のオリゴ糖を含む水溶液であることを特徴とする精子用希釈液。
［２］  前記オリゴ糖は、フルクトオリゴ糖又はイソマルトオリゴ糖である、［１］に記載の精子用希釈液。
［３］  前記水溶液は、レシチン、卵黄、又は乳を含む、［１］又は［２］に記載の精子用希釈液。
［４］  前記レシチンは、大豆レシチンである、［３］に記載の精子用希釈液。
［５］  前記卵黄は、ニワトリ由来の卵黄である、［３］又は［４］に記載の精子用希釈液。
［６］  前記乳は、牛乳である、［３］〜［５］のいずれかに記載の精子用希釈液。
［７］  前記水溶液のｐＨは、５．６〜８．０である、［１］〜［６］のいずれかに記載の精子用希釈液。
［８］  前記水溶液のｐＨは、６．２〜７．０である、［７］に記載の精子用希釈液。
［９］  前記水溶液のｐＨは、６．４〜６．８であることを特徴とする［８］に記載の精子用希釈液。
［１０］  前記水溶液は、浸透圧が２３０〜３４１４ｍｍｏｌ／ｋｇであることを特徴とする［１］〜［９］のいずれかに記載の精子用希釈液。
［１１］  前記水溶液は、浸透圧が１１９９〜１８０９ｍｍｏｌ／ｋｇである、［１０］に記載の精子用希釈液。
［１２］  前記水溶液は、浸透圧が１２４７〜１５７５ｍｍｏｌ／ｋｇである、［１１］に記載の精子用希釈液。
［１３］  前記オリゴ糖は、濃度が２０〜４０ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の精子用希釈液。
［１４］  前記オリゴ糖は、濃度が２５〜３５ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）である、［１３］に記載の精子用希釈液。
［１５］  前記フルクトオリゴ糖として、１−ケストース、ニストース、又は１−フラクトフラノシルニストースを含む、［１］〜［１４］のいずれかに記載の精子用希釈液。
［１６］  前記イソマルトオリゴ糖として、イソマルトース、イソマルトトリオース、又はパノースを含む、［１］〜［１５］のいずれかに記載の精子用希釈液。
［１７］  前記ゲンチオオリゴ糖として、ゲンチオビオース、ゲンチオトリオース、又はゲンチオテトラオースを含む、［１］〜［１６］のいずれかに記載の精子用希釈液。
［１８］  前記ガラクトオリゴ糖として、４’−ガラクトシルラクトースを含む、［１］〜［１７］のいずれかに記載の精子用希釈液。
［１９］  緩衝剤として、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン又はクエン酸を含有する、［１］〜［１８］のいずれかに記載の精子用希釈液。
［２０］  耐凍剤として、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール又はジメチルスルホキシドを含有する、［１］〜［１９］のいずれかに記載の精子用希釈液。
［２１］  前記耐凍剤の濃度が、６．５〜７．５％である、［１］〜［２０］のいずれかに記載の精子用希釈液。
［２２］  ［１］〜［２１］のいずれかに記載の精子用希釈液と、ヒト以外の哺乳動物由来の精子とを含むことを特徴とする、精子希釈液。
［２３］  ［２２］に記載の精子希釈液と、ストローとを含むことを特徴とする、人工授精用ストロー
［２４］  ［１］〜［２１］のいずれかに記載の精子用希釈液を用いて冷蔵又は凍結を行うことを特徴とする、精子の保存方法。
［２５］  ［２２］に記載の精子希釈液を用いて冷蔵又は凍結を行うことを特徴とする、精子の保存方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、フルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、及びガラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む希釈液を精子の保存に用いることにより、保存後の精子の品質が高く、受胎性の高い精子の提供ができる。また、既存の希釈液と比較しても、コストを低減した精子用希釈液を提供することができる。【００１１】
ラフィノースを用いた希釈液（従来）に対する本発明のフルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、又はガラクトオリゴ糖を用いた希釈液の試薬毎の価格を表１に示す。和光純薬工業株式会社のホームページ（http://www.siyaku.com/）の検索から、各々希釈液１リットルあたりの価格に換算している。希釈液にラフィノース単体を用いた場合よりも、フルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、又はガラクトオリゴ糖を用いることにより希釈液１リットルあたり１０００円以上、約４割程度のコスト低減効果が示される。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、フルクトオリゴ糖を含む希釈液のｐＨを６．６〜７．４の範囲で変更して牛精子を凍結保存し、融解した後の生存かつアクロソーム正常率（Sperm acrosomal integrity and viability  (%)）を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝６）。図１Ａから図４Ｃにおいて、Lは大豆レシチンを表し、Eは卵黄を表す。括弧内は希釈液のpHを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、フルクトオリゴ糖を含む希釈液のｐＨを６．６〜７．４の範囲で変更して牛精子を凍結保存し、融解した後の精子活力（Sperm motility (%)）及び維持率（Retention (%)）を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝６）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、フルクトオリゴ糖を含む希釈液のｐＨを６．６〜７．４の範囲で変更して牛精子を凍結保存し、融解した後のＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合（Sperm VCL more than 200 μm/s (%)）を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝６）。
【図２Ａ】図２Ａは、イソマルトオリゴ糖を含む希釈液のｐＨを６．６〜７．４の範囲で変更して牛精子を凍結保存し、融解した後の生存かつアクロソーム正常率を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝６）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、イソマルトオリゴ糖を含む希釈液のｐＨを６．６〜７．４の範囲で変更して牛精子を凍結保存し、融解した後の精子活力及び維持率を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝６）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、イソマルトオリゴ糖を含む希釈液のｐＨを６．６〜７．４の範囲で変更して牛精子を凍結保存し、融解した後のＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝６）。
【図３Ａ】図３Ａは、ゲンチオオリゴ糖を含む希釈液のｐＨを６．６〜７．４の範囲で変更して牛精子を凍結保存し、融解した後の生存かつアクロソーム正常率を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝６）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ゲンチオオリゴ糖を含む希釈液のｐＨを６．６〜７．４の範囲で変更して牛精子を凍結保存し、融解した後の精子活力及び維持率を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝６）。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ゲンチオオリゴ糖を含む希釈液のｐＨを６．６〜７．４の範囲で変更して牛精子を凍結保存し、融解した後のＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝６）。
【図４Ａ】図４Ａは、ガラクトオリゴ糖を含む希釈液のｐＨを６．６〜７．４の範囲で変更して牛精子を凍結保存し、融解した後の生存かつアクロソーム正常率を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝８）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ガラクトオリゴ糖を含む希釈液のｐＨを６．６〜７．４の範囲で変更して牛精子を凍結保存し、融解した後の精子活力及び維持率を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝８）。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ガラクトオリゴ糖を含む希釈液のｐＨを６．６〜７．４の範囲で変更して牛精子を凍結保存し、融解した後のＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝８）。
【図５Ａ】図５Ａは、フルクトオリゴ糖を含む希釈液のｐＨを５．６〜７．４の範囲で変更して牛精子を凍結保存し、融解した後の生存かつアクロソーム正常率を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝８）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、フルクトオリゴ糖を含む希釈液のｐＨを５．６〜７．４の範囲で変更して牛精子を凍結保存し、融解した後の精子活力を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝８）。
【図５Ｃ】図５Ｃは、フルクトオリゴ糖を含む希釈液のｐＨを５．６〜７．４の範囲で変更して牛精子を凍結保存し、融解した後のＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝８）。ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合は、希釈液のｐＨが低いほど値が向上することが示される。
【図６Ａ】図６Ａは、フルクトオリゴ糖又はイソマルトオリゴ糖の量を２０〜４０ｇの範囲で変更した希釈液を用いて牛精子を凍結保存し、融解した後の生存かつアクロソーム正常率を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝６）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、フルクトオリゴ糖又はイソマルトオリゴ糖の量を２０〜４０ｇの範囲で変更した希釈液を用いて牛精子を凍結保存し、融解した後の精子活力を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝６）。
【図６Ｃ】図６Ｃは、フルクトオリゴ糖又はイソマルトオリゴ糖の量を２０〜４０ｇの範囲で変更した希釈液を用いて牛精子を凍結保存し、融解した後のＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合を示したグラフである。値は、平均値を示す（ｎ＝６）。
【図７】図７は、フルクトオリゴ糖、フルクトオリゴ糖とイソマルトオリゴ糖の混合物、イソマルトオリゴ糖を含む希釈液を用いて牛精子を凍結保存し、融解した後のＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合を示したグラフである。値は、平均値と標準誤差を示す（ｎ＝２５）。ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合は、全ての試験区で対照区と比較して向上することが示される。
【図８Ａ】図８Ａは、フルクトオリゴ糖を含む希釈液を用いてストロー構成を一層にして牛精子を凍結保存し、融解した後のＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合を示したグラフである。値は、平均値と標準誤差を示す（ｎ＝３０）。ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合は、対照区と比較して向上することが示される。
【図８Ｂ】図８Ｂは、フルクトオリゴ糖を含む希釈液を用いてストロー構成を二層にして牛精子を凍結保存し、融解した後のＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合を示したグラフである。値は、平均値と標準誤差を示す（ｎ＝３０）。ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合は、対照区と比較して向上することが示される。
【図９】図９は、フルクトオリゴ糖又はイソマルトオリゴ糖を含む希釈液を用いて牛精子を凍結保存し、融解後の体外受精試験による精子侵入率を示したグラフである。精子侵入率は、対照区と比較して遜色ないことが示される。
【図１０】図１０は、フルクトオリゴ糖を含む希釈液を用いて牛精子を凍結保存し、融解後の人工授精試験による受胎率を示したグラフである。受胎率は、対照区より向上することが示される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、フルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、及びガラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも一種のオリゴ糖を含むことを特徴とする精子用希釈液及びそれを用いた精子の保存方法に関する。
【００１４】
オリゴ糖は、数個の単糖がグリコシド結合によって２〜２０個程度結合した糖類で、分子量は３００〜３０００程度である。天然物成分から抽出、多糖類を酵素により加水分解、澱粉や糖類等を原料として糖転移反応や縮合反応を行って合成、酵素や化学的な還元反応による異性化反応等により生産される。オリゴ糖は、生産過程で精製、濃縮、分画、結晶化、乾燥等が行われる。
【００１５】
本発明の精子用希釈液に用いられるオリゴ糖は、フルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、及びガラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも一種である。例えば、フルクトオリゴ糖単体、イソマルトオリゴ糖単体、フルクトオリゴ糖とイソマルトオリゴ糖の混合物、フルクトオリゴ糖とイソマルトオリゴ糖とガラクトオリゴ糖の混合物等が挙げられる。
精子用希釈液中のオリゴ糖濃度は、２０〜４０  g/L（w/v）が好ましく、２５〜３５  g/L（w/v）がより好ましい。
【００１６】
フルクトオリゴ糖は、スクロースのフルクトース残基に複数のフルクトースが結合した構造をもつオリゴ糖の総称である。１−ケストース、ニストース、１−フラクトフラノシルニストース等が挙げられる。例えば、スクロースを原料とし、β−フルクトシルフラノシダーゼを作用させて生産する。
【００１７】
イソマルトオリゴ糖は、複数のグルコースがα−１，２−結合、α−１，３−結合、α−１，４−結合のいずれかの結合様式を１つ以上含むオリゴ糖の総称である。イソマルトース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、パノース等が挙げられる。例えば、澱粉を原料とし、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼを作用させて生産する。
【００１８】
ゲンチオオリゴ糖は、複数のグルコースがβ−１，６−グルコシド結合したオリゴ糖の総称である。ゲンチオビオース、ゲンチオトリオース、ゲンチオテトラオース等が挙げられる。例えば、ブドウ糖を原料とし、β−グルコシダーゼを作用させて生産する。
【００１９】
ガラクトオリゴ糖は、ラクトースを酵素処理すると産生されるオリゴ糖の総称である。４’−ガラクトシルラクトース等が挙げられる。例えば、ラクトースを原料とし、β−ガラクトシダーゼを作用させて生産する。
【００２０】
本発明に供される精子は、任意の動物由来のものを用いることができる。動物は、例えば、ヒトを含む任意の哺乳動物、家畜動物、愛玩動物、動物園動物、実験動物、野生動物が挙げられる。家畜動物として、ウシ、水牛、ブタ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等が挙げられる。愛玩動物として、イヌ、ネコ、ウサギ等が挙げられる。動物園動物として、パンダ等の絶滅が恐れられている種等が挙げられる。実験動物として、マウス、ハムスター、ラット、ウニ、ヒトデ等が挙げられる。精子は、精巣、精巣上体、射出精液、幹細胞、精巣幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、培養細胞等由来の任意のものを用いることができる。これらの精子を取得する方法は、例えば、精巣由来の精子であれば精巣を採取し精子を吸い出す方法等、精巣上体由来の精子であれば精巣上体尾部等から精子を吸い出すもしくは掻き出す方法等、射出精液由来の精子であれば雌体内への射精後に回収する方法や電気刺激や人工腟を用いて採取する方法等、幹細胞、精巣幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、培養細胞由来の精子であれば細胞培養を行って回収する方法等が挙げられる。取得した精子は、取得直後の精漿に浮遊した精液の状態でも、一時的に任意の水溶液等で希釈または洗浄されていてもよい。
【００２１】
本発明の精子用希釈液は、所望の浸透圧及びｐＨを達成できれば、フルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、及びガラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも一種のオリゴ糖に加えて、任意の物質を含んでもよい。精子を冷蔵して保存する場合は、例えば、希釈液は緩衝剤、糖、卵黄、レシチン、乳、又は抗生物質を含んでもよい。精子を凍結して保存する場合は、例えば、希釈液は緩衝剤、糖、卵黄、レシチン、乳、抗生物質、及び耐凍剤を含む。
【００２２】
本発明の精子用希釈液に用いられる緩衝剤は、所望のｐＨを達成する目的で使用する。緩衝剤として、中性付近に緩衝作用を持つ緩衝剤であれば任意のものを選択することができ、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、メス、ヘペス、テス、トリシン等の緩衝剤、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液等が挙げられる。また、所望のｐＨに調整するため酸もしくはアルカリを用いることができる。酸は、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ギ酸、グルコン酸、乳酸、シュウ酸、酒石酸、アスコルビン酸等が挙げられる。アルカリは、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ金属水酸化物等が挙げられる。
【００２３】
本発明の精子用希釈液に用いられる緩衝剤として、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及びクエン酸を用いる場合は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン濃度は、好ましくは５０〜２００ｍＭ、さらに好ましくは８０〜１５０ｍＭ、クエン酸濃度は好ましくは２０〜８０ｍＭ、さらに好ましくは２５〜６０ｍＭである。
【００２４】
本発明の精子用希釈液に用いられる糖は、精子のエネルギー源とする目的で使用する。糖として、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース等が挙げられる。
【００２５】
本発明の精子用希釈液に用いられる糖として、例えばフルクトース及びラクトースを用いる場合は、フルクトース濃度は好ましくは１〜５０ｍＭ、さらに好ましくは５〜３０ｍＭ、ラクトース濃度は好ましくは１〜１００ｍＭ、さらに好ましくは２０〜６０ｍＭである。
【００２６】
本発明の精子用希釈液に用いられる糖として、例えばスクロース及びラクトースを用いる場合は、スクロース濃度は好ましくは１０〜１５０ｍＭ、さらに好ましくは３０〜７０ｍＭ、ラクトース濃度は好ましくは１０〜１５０ｍＭ、さらに好ましくは３０〜７０ｍＭである。
【００２７】
本発明の精子用希釈液に用いられる卵黄は、精子の保存性を向上する目的で使用する。例えば、卵黄は、ニワトリ、ウズラ、ホロホロチョウ等の鳥類由来のもの等が挙げられる。卵黄の濃度は、好ましくは５〜３５％（ｖ／ｖ）、さらに好ましくは１０〜３０％（ｖ／ｖ）、特に好ましくは１５〜２５％（ｖ／ｖ）である。
【００２８】
本発明の精子用希釈液に用いられるレシチンは、精子の保存性を向上する目的で使用する。例えば、レシチンは大豆、ヒマワリ、卵黄由来のものが挙げられる。大豆レシチンを用いることで、卵黄系希釈液における問題であった安定した品質管理ができない点、調製に手間がかかる点、大きなコストが発生する点、鳥インフルエンザ等の病原性ウィルスを媒介する懸念がある点が解決できる。大豆レシチンの濃度は、好ましくは０．１５〜１．０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．２〜０．４％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは０．２５〜０．３５％（ｗ／ｖ）である。
【００２９】
本発明の精子用希釈液に用いられる乳は、精子の保存性を向上する目的で使用する。例えば、ウシ、ロバ、ヤギ、ウマ、羊、又は水牛由来のものが挙げられる。また、乳は、一部の成分を除いた加工乳も含む。例えば、加工乳として、脂肪分を除いた低脂肪乳や無脂肪乳、乾燥させた脱脂粉乳の水溶液等が挙げられる。
【００３０】
本発明の精子用希釈液に用いられる抗生物質は、細菌の増殖を防ぐ目的で使用する。抗生物質として、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ジベカシン等が挙げられる。
【００３１】
本発明の精子用希釈液に用いられる耐凍剤は、凍結保存時の精子の耐凍能を向上する目的で使用する。耐凍剤として、例えば、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
【００３２】
本発明の精子用希釈液のうち、耐凍剤を含まない希釈液を１次希釈液といい、耐凍剤を含む希釈液を２次希釈液という。ただし、最終希釈時に所望の耐凍剤濃度を達成できれば、任意の濃度の耐凍剤を含む希釈液を用いることができる。また、最初から耐凍剤が最終濃度になるように一回で精液の希釈を行うこともできる。
【００３３】
本発明の精子用希釈液に用いられる耐凍剤として、グリセリンを用いる場合は、グリセリンの最終濃度は好ましくは５．０〜８．５％（ｖ／ｖ）、さらに好ましくは６．０〜８．０％（ｖ／ｖ）、特に好ましくは６．５〜７．５％（ｖ／ｖ）である。
【００３４】
本発明の精子用希釈液のｐＨの調整は、１又は２以上の緩衝剤、酸又はアルカリで行う。好ましくはｐＨ５．０〜９．０の範囲で使用することができ、さらに好ましくはｐＨ５．６〜８．０の範囲で使用する。さらに好ましくは、ｐＨ６．２〜７．０の範囲で使用する。特に好ましくは、ｐＨ６．４〜６．８の範囲で使用する。ｐＨは、ｐＨメータを用いて測定される。
【００３５】
本発明の精子用希釈液の浸透圧は、精子の運動活性及び受精活性が維持できる浸透圧であれば任意の浸透圧であってもよいが、通常は２３０〜３４１４ｍｍｏｌ／ｋｇである。下限の２３０ｍｍｏｌ／ｋｇは、非特許文献３の記載により、精子の運動活性を維持できる下限値として特定されている。上限の３４１４ｍｍｏｌ／ｋｇは、２次希釈液の浸透圧であり、凍結保存時に１次希釈液と混合した場合に精子の運動活性を維持できる上限値として特定されている。浸透圧は、溶質の濃度、解離度等から理論値を計算することもできるが、溶液を構成する物質の相互作用等を考慮して、浸透圧計（オズモメーター）を用いて測定される。
【００３６】
本発明の１次希釈液の浸透圧は、非特許文献３の記載により、好ましくは２３０〜４００ｍｍｏｌ／ｋｇ、さらに好ましくは２５０〜３５０ｍｍｏｌ／ｋｇ、特に好ましくは２６０〜３３０ｍｍｏｌ／ｋｇである。
【００３７】
本発明の２次希釈液の浸透圧は、好ましくは２１５２〜３４１４ｍｍｏｌ／ｋｇ、さらに好ましくは２３４９〜２９５７ｍｍｏｌ／ｋｇである。凍結保存した精液の融解直後の浸透圧は、好ましくは１１９９〜１８０９ｍｍｏｌ／ｋｇ、さらに好ましくは１２４７〜１５７５ｍｍｏｌ／ｋｇである。
【００３８】
本発明の精子の保存方法は、上記の希釈液に精子を懸濁し、冷蔵保存又は凍結保存を行う方法である。精子の冷蔵保存とは、１８℃以下であり凍結しない程度の低温に精子を保存することを意味する。精子の凍結保存とは、耐凍剤を含む本発明の精子用希釈液を用いて精子を希釈した後、凍結して保存することを意味する。例えば、牛精子を凍結保存する場合は、非特許文献２の方法に従って行う。
【００３９】
以下に実施例を挙げて、本発明の精子用希釈液及びそれを用いた精子の保存方法を具体的に説明する。本発明は、以下の実施例に限定されるものでなく、本発明の技術分野において通常の変更をすることができる。
【００４０】
実施例１．希釈液の調製例
１２．１ｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（和光純薬工業）、７．１ｇのクエン酸一水和物（和光純薬工業）、１．８ｇのクエン酸３ナトリウム２水和物（和光純薬工業）、３０．０ｇのフルクトオリゴ糖（和光純薬工業）、１４．４ｇのラクトース（和光純薬工業）、３．６ｇのフルクトース（和光純薬工業）、６０万ＵのペニシリンＧカリウム（万有製薬）、０．６ｇ（力価）のストレプトマイシン（明治製菓）を加え、３．０ｇの大豆レシチン（和光純薬工業）を加えて蒸留水で８６０ｍｌにメスアップして１次希釈液を得た。１次希釈液に１４０ｍｌのグリセリン（和光純薬工業）を加えて２次希釈液を得た。浸透圧は、蒸気圧法オズモメーター５５２０型（Ｗｅｓｃｏｒ社）で測定し、２５℃で１次希釈液が２８９ｍｍｏｌ／ｋｇであり、２次希釈液が２７０９ｍｍｏｌ／ｋｇであった。ｐＨは、ｐＨメータ（ＨＯＲＩＢＡ社）で測定し、２５℃で１次希釈液が６．５であり、２次希釈液が６．６であった。
【００４１】
実施例２．凍結精液の作製例
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛から採取した精液に対して、実施例１に記載の１次希釈液を用いて１億精子／ｍｌになるように希釈し、実施例１に記載の２次希釈液を用いて最終グリセリン濃度が７．０％になるように常法に従って５千万精子／ｍｌになるように希釈した。希釈開始から凍結まで５時間４℃に静置した。２次希釈した精子を綿栓入りのプラスチック製ストロー（富士平工業、０．５ｍｌ細１３３型）に注入し、注入口を熱圧着により密封し、人工授精用のストローを作製した。これらの人工授精用ストローは、液体窒素蒸気中で常法に従って凍結を行い、液体窒素中に保存した。このような凍結保存を行うことで、半永久的に、精子の品質を良好な状態のまま維持することができた。
【００４２】
実施例３．フルクトオリゴ糖を含む希釈液を用いた凍結精液の品質
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛から採取した精液を、酸又はアルカリを用いてｐＨを６．６〜７．４の範囲で０．２刻みに調整した実施例１に記載の１次希釈液及び２次希釈液を用いて、最終グリセリン濃度が７％となるように希釈して精子希釈液を得た。フルクトオリゴ糖を含まない大豆レシチンを用いた対照区は、特許文献４の実施例１に記載の最終グリセリン濃度が７％の希釈液を用いて希釈した（Ｌ対照）。フルクトオリゴ糖を含まない卵黄を用いた対照区は、特許文献１に記載の一般社団法人家畜改良事業団が作製し販売する凍結精液の作製で用いられている、最終グリセリン濃度が６．５％の希釈液を用いて希釈した（Ｅ対照）。これらの希釈液を用いて、１次希釈液で８千万精子／ｍｌになるように希釈した後、各々の１次希釈精液に２次希釈液を１：１の比率で加えて４千万精子／ｍｌに希釈して常法に従って人工授精用ストローを作製した。凍結保存は常法に従って液体窒素を用いて行った。常法に従って融解した人工授精用ストローの中身をチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、５０９−ＧＲＤ−Ｑ）に全量移し入れ、よく撹拌させてから、特許文献１に記載の精子洗浄液を用いて室温で５分間、２０００ｒｐｍで２回遠心洗浄を行い、精液の品質検査を行った。
【００４３】
生存かつアクロソームが正常な精子の割合は、以下の方法で確認した。洗浄した精子を１０００万／ｍｌに調整し、２μｇ／ｍｌのＰＩ（Ｓｉｇｍａ）及び２μｇ／ｍｌのＰＮＡ−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）を加えて２５℃で１０分間インキュベーションした。フローサイトメーター（Ｃｅｌｌ  Ｌａｂ  Ｑｕａｎｔａ  ＳＣ、ベックマン）を用いて、１サンプルあたり２万個の精子を検査し、ＰＩで染色されない精子を生存精子と判定し、ＰＮＡ−ＦＩＴＣで染色されない精子をアクロソーム正常精子と判定して、生存かつアクロソームが正常な精子の割合を得た。測定結果を図１Ａに示す。フルクトオリゴ糖を含む希釈液では、試験区は対照区と比較すると同等程度かそれ以上の値であった。特に、卵黄を用いた場合に、生存かつアクロソーム正常率が高かった。
【００４４】
精子運動性は、以下の方法で確認した。精子運動解析装置Ｃｅｒｏｓ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｔｈｏｒｎｅ）を用いて３８℃の温度条件下で測定し、１秒間に５０μｍ以上動いた精子の割合（精子活力（％））を得た。測定は、精子洗浄直後（０ｈ）、インキュベーション３時間後（３ｈ）、６時間後（６ｈ）に行った。精子運動性の維持率は６時間後の精子活力／精子洗浄直後の精子活力で示した。測定結果を図１Ｂに示す。フルクトオリゴ糖を含む希釈液では、試験区は対照区と比較すると同等程度かそれ以上の値であった。特に、卵黄を用いた場合に、精子活力が高かった。
【００４５】
受胎性と相関関係の高い精子の検査は、以下の方法で行なった。１０００万精子に対して特許文献５に記載の検査液を２５０μｌ添加し、３８℃で１０分間インキュベーションを行い、４％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドンＫ−９０（和光純薬工業）を添加した上記検査液を等量混合した。混合物を予め３８℃に温めた厚さ２０μｍのスライドチャンバー（Ｌｅｊａ）に滴下し、１／６０秒の撮像速度で精子運動解析装置Ｃｅｒｏｓ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｔｈｏｒｎｅ）を用いて測定し、受胎性と相関関係の高いＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合を解析した。測定結果を図１Ｃに示す。フルクトオリゴ糖を含む希釈液では、試験区は対照区と比較すると同等程度かそれ以上の値であった。特に、ｐＨ６．６の区で、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合が高かった。
【００４６】
実施例４．イソマルトオリゴ糖を含む希釈液を用いた凍結精液の品質
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛から採取した精液を、フルクトオリゴ糖をイソマルトオリゴ糖（和光純薬工業）に変更した以外は実施例１と同じ方法で調製され、酸又はアルカリを用いてｐＨを６．６〜７．４の範囲で０．２刻みに調整した１次希釈液及び２次希釈液を用いて、最終グリセリン濃度が７％となるように希釈して精子希釈液を得た。イソマルトオリゴ糖を含まない大豆レシチンを用いた対照区は、特許文献４の実施例１に記載の最終グリセリン濃度が７％の希釈液を用いて希釈した（Ｌ対照）。イソマルトオリゴ糖を含まない卵黄を用いた対照区は、特許文献１に記載の一般社団法人家畜改良事業団が作製し販売する凍結精液の作製で用いられている最終グリセリン濃度が６．５％の希釈液を用いて希釈した（Ｅ対照）。これらの希釈液を用いて、１次希釈液で８千万精子／ｍｌになるように希釈した後、各々の１次希釈精液に２次希釈液を１：１の比率で加えて４千万精子／ｍｌに希釈して常法に従って人工授精用ストローを作製した。凍結保存は常法に従って液体窒素を用いて行った。常法に従って融解した人工授精用ストローの中身をチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、５０９−ＧＲＤ−Ｑ）に全量移し入れ、よく撹拌させてから、特許文献１に記載の精子洗浄液を用いて室温で５分間、２０００ｒｐｍで２回遠心洗浄を行い、精液の品質検査を行った。
【００４７】
生存かつアクロソームが正常な精子の割合（図２Ａ）、精子運動性（図２Ｂ）、及び受胎性と相関関係の高い精子の検査（図２Ｃ）は、実施例３に記載の方法で行った。イソマルトオリゴ糖を含む希釈液では、試験区は対照区と比較すると同等程度かそれ以上の値であり、特に、卵黄を用いた場合に、生存かつアクロソーム正常率及び精子活力が高かった。ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合がｐＨ６．６〜７．２の区で高かった。
【００４８】
実施例５．ゲンチオオリゴ糖を含む希釈液を用いた凍結精液の品質
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛から採取した精液を、フルクトオリゴ糖をゲンチオオリゴ糖（和光純薬工業）に変更した以外は実施例１と同じ方法で調製され、酸又はアルカリを用いてｐＨを６．６〜７．４の範囲で０．２刻みに調整した１次希釈液及び２次希釈液を用いて、最終グリセリン濃度が７％となるように希釈して精子希釈液を得た。ゲンチオオリゴ糖を含まない大豆レシチンを用いた対照区は、特許文献４の実施例１に記載の最終グリセリン濃度が７％の希釈液を用いて希釈した（Ｌ対照）。ゲンチオオリゴ糖を含まない卵黄を用いた対照区は、特許文献１に記載の一般社団法人家畜改良事業団が作製し販売する凍結精液の作製で用いられている最終グリセリン濃度が６．５％の希釈液を用いて希釈した（Ｅ対照）。これらの希釈液を用いて、１次希釈液で８千万精子／ｍｌになるように希釈した後、各々の１次希釈精液に２次希釈液を１：１の比率で加えて４千万精子／ｍｌに希釈して常法に従って人工授精用ストローを作製し、凍結保存は常法に従って液体窒素を用いて行った。常法に従って融解した人工授精用ストローの中身をチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、５０９−ＧＲＤ−Ｑ）に全量移し入れ、よく撹拌させてから、特許文献１に記載の精子洗浄液を用いて室温で５分間、２０００ｒｐｍで２回遠心洗浄を行い、精液の品質検査を行った。
【００４９】
生存かつアクロソームが正常な精子の割合（図３Ａ）、精子運動性（図３Ｂ）、及び受胎性と相関関係の高い精子の検査（図３Ｃ）は、実施例３に記載の方法で行った。ゲンチオオリゴ糖を含む希釈液では、試験区は対照区と比較すると同程度かそれ以上の値であり、特に、卵黄を用いた場合に、生存かつアクロソームが正常率及び精子活力が高かった。ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合は、全ての試験区で高かった。
【００５０】
実施例６．ガラクトオリゴ糖を含む希釈液を用いた凍結精液の品質
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛から採取した精液を、フルクトオリゴ糖をガラクトオリゴ糖（和光純薬工業）に変更した以外は実施例１と同じ方法で調製され、酸又はアルカリを用いてｐＨを６．６〜７．４の範囲で０．２刻みに調整した１次希釈液及び２次希釈液を用いて、最終グリセリン濃度が７％となるように希釈して精子希釈液を得た。ガラクトオリゴ糖を含まない大豆レシチンを用いた対照区は、特許文献４の実施例１に記載の最終グリセリン濃度が７％の希釈液を用いて希釈した（Ｌ対照）。ガラクトオリゴ糖を含まない卵黄を用いた対照区は、特許文献１に記載の一般社団法人家畜改良事業団が作製し販売する凍結精液の作製で用いられている最終グリセリン濃度が６．５％の希釈液を用いて希釈した（Ｅ対照）。これらの希釈液を用いて、１次希釈液で８千万精子／ｍｌになるように希釈した。各々の１次希釈精液に２次希釈液を１：１の比率で加えて４千万精子／ｍｌに希釈して常法に従って人工授精用ストローを作製した。凍結保存は常法に従って液体窒素を用いて行った。常法に従って融解した人工授精用ストローの中身をチューブに全量移し入れ、よく撹拌後、特許文献１に記載の精子洗浄液を用いて室温で５分間、２０００ｒｐｍで２回遠心洗浄を行った後、精液の品質検査を行った。
【００５１】
生存かつアクロソームが正常な精子の割合（図４Ａ）、精子運動性（図４Ｂ）、及び受胎性と相関関係の高い精子の検査（図４Ｃ）は、実施例３に記載の方法で行った。ガラクトオリゴ糖を含む希釈液では、試験区は対照区と比較すると同等程度かそれ以上の値であり、特に生存かつアクロソームが正常な精子の割合が全ての区で高く、精子活力が大豆レシチンを用いた場合に高かった。
【００５２】
実施例７．希釈液のｐＨの違いが凍結融解後の精液品質に及ぼす影響
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛から採取した精液を、酸又はアルカリを用いてｐＨを５．６〜７．４の範囲で０．２刻みに調整した実施例１の１次希釈液及び２次希釈液を用いて、最終グリセリン濃度が７％となるように希釈して精子希釈液を得た。フルクトオリゴ糖を含まない対照区は、特許文献４の実施例１に記載の最終グリセリン濃度が７％の希釈液を用いて希釈した。これらの希釈液を用いて、１次希釈液で８千万精子／ｍｌになるように希釈し、各々の１次希釈精液に２次希釈液を１：１の比率で加えて４千万精子／ｍｌに希釈して常法に従って人工授精用ストローを作製した。凍結保存は常法に従って液体窒素を用いて行った。常法に従って融解した人工授精用ストローの中身をチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、５０９−ＧＲＤ−Ｑ）に全量移し入れ、よく撹拌させてから、特許文献１に記載の精子洗浄液を用いて室温で５分間、２０００ｒｐｍで２回遠心洗浄を行い、精液の品質検査を行った。
【００５３】
生存かつアクロソームが正常な精子の割合（図５Ａ）、精子運動性（図５Ｂ）、及び受胎性と相関関係の高い精子の検査（図５Ｃ）は、実施例３に記載の方法で行った。フルクトオリゴ糖を含む希釈液では、試験区は対照区と比較すると同等程度かそれ以上の値であり、特に、近似線（点線で表示）で示したように、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合はｐＨが下がると共に上昇した。なお、受胎性と相関関係の高い精子の検査では、ｐＨ５．６及び５．８の区で、凍結融解後の精子が凝集する場合が多かった。
【００５４】
実施例８．希釈液のオリゴ糖濃度の違いが凍結融解後の精液品質に及ぼす影響
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛から採取した精液を、フルクトオリゴ糖又はイソマルトオリゴ糖の量を２０〜４０ｇの範囲で５ｇ刻みに調整した以外は実施例１と同じ方法で調製された１次希釈液及び２次希釈液を用いて、最終グリセリン濃度が７％となるように希釈した。フルクトオリゴ糖又はイソマルトオリゴ糖を含まない対照区は、特許文献４の実施例１に記載の最終グリセリン濃度が７％の希釈液を用いて希釈した。これらの希釈液を用いて、１次希釈液で８千万精子／ｍｌになるように希釈した後、各々の１次希釈精液に２次希釈液を１：１の比率で加えて４千万精子／ｍｌに希釈して常法に従って人工授精用ストローを作製した。凍結保存は常法に従って液体窒素を用いて行った。常法に従って融解した人工授精用ストローの中身をチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、５０９−ＧＲＤ−Ｑ）に全量移し入れ、よく撹拌させてから、特許文献１に記載の精子洗浄液を用いて室温で５分間、２０００ｒｐｍで２回遠心洗浄を行い、精液の品質検査を行った。
【００５５】
生存かつアクロソームが正常な精子の割合（図６Ａ）、精子運動性（図６Ｂ）、及び受胎性と相関関係の高い精子の検査（図６Ｃ）は、実施例３に記載の方法で行った。フルクトオリゴ糖又はイソマルトオリゴ糖を含む希釈液を用いた試験区は対照区と比較すると同等程度かそれ以上の値であった。特に生存かつアクロソームが正常な精子の割合がほぼ全ての区で高く、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合は、フルクトオリゴ糖が２０〜３０ｇの場合と、イソマルトオリゴ糖が２５〜３５ｇの場合に上昇した。
【００５６】
実施例９．希釈液のオリゴ糖が凍結融解後の精液品質に及ぼす影響
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛から採取した精液を、フルクトオリゴ糖３０ｇ、フルクトオリゴ糖１５ｇとイソマルトオリゴ糖１５ｇの混合物、イソマルトオリゴ糖３０ｇに調整した以外は実施例１と同じ方法で調製された１次希釈液及び２次希釈液を用いて、最終グリセリン濃度が７％となるように希釈した。フルクトオリゴ糖又はイソマルトオリゴ糖を含まない対照区は、特許文献１に記載の一般社団法人家畜改良事業団が作製し販売する凍結精液の作製で用いられている最終グリセリン濃度が６．５％の希釈液を用いて希釈した。これらの希釈液を用いて、１次希釈液で８千万精子／ｍｌになるように希釈した後、各々の１次希釈精液に２次希釈液を１：１の比率で加えて４千万精子／ｍｌに希釈して常法に従って人工授精用ストローを作製した。凍結保存は常法に従って液体窒素を用いて行った。常法に従って融解した人工授精用ストローの中身をチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、５０９−ＧＲＤ−Ｑ）に全量移し入れ、よく撹拌させてから、特許文献１に記載の精子洗浄液を用いて室温で５分間、２０００ｒｐｍで２回遠心洗浄を行い、受胎性と相関関係の高い精子の検査を実施例３に記載の方法で行った。
【００５７】
フルクトオリゴ糖、フルクトオリゴ糖とイソマルトオリゴ糖の混合物、イソマルトオリゴ糖を含む希釈液では、いずれも対照区と比較して、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合が有意に向上した（図７）。
【００５８】
実施例１０．ストロー層構成がオリゴ糖希釈液での凍結融解後の精液品質に及ぼす影響
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛から採取した精液を、フルクトオリゴ糖の量を３０ｇに調整した以外は実施例１と同じ方法で調製された１次希釈液及び２次希釈液を用いて、最終グリセリン濃度が７％となるように希釈した。フルクトオリゴ糖又はイソマルトオリゴ糖を含まない対照区は、特許文献１に記載の一般社団法人家畜改良事業団が作製し販売する凍結精液の作製で用いられている最終グリセリン濃度が６．５％の希釈液を用いて希釈した。これらの希釈液を用いて、１次希釈液で８千万精子／ｍｌになるように希釈した後、各々の１次希釈精液に２次希釈液を１：１の比率で加えて４千万精子／ｍｌに希釈した。得られた精子希釈液を用いて特許文献１に記載に従って一層構成又は二層構成の人工授精用ストローを作製した。凍結保存は常法に従って液体窒素を用いて行った。常法に従って融解した人工授精用ストローの中身をチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、５０９−ＧＲＤ−Ｑ）に全量移し入れ、よく撹拌させてから、特許文献１に記載の精子洗浄液を用いて室温で５分間、２０００ｒｐｍで２回遠心洗浄を行い、受胎性と相関関係の高い精子の検査を実施例３に記載の方法で行った。
【００５９】
フルクトオリゴ糖を含む希釈液では、一層式（図８Ａ）又は二層式（図８Ｂ）のいずれも対照区と比較して、ＶＣＬ２００μｍ／秒以上の精子の割合が有意に向上した。
【００６０】
実施例１１．オリゴ糖希釈液を用いて作製した凍結精液の体外受精成績
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛から採取した精液を、フルクトオリゴ糖３０ｇ又はイソマルトオリゴ糖３０ｇに調整した以外は実施例１と同じ方法で調製された１次希釈液及び２次希釈液を用いて、最終グリセリン濃度が７％となるように希釈して精子希釈液を得た。フルクトオリゴ糖又はイソマルトオリゴ糖を含まない大豆レシチンを用いた対照区は、特許文献４の実施例１に記載の最終グリセリン濃度が７％の希釈液を用いて希釈した。フルクトオリゴ糖又はイソマルトオリゴ糖を含まない卵黄を用いた対照区は、特許文献１に記載の一般社団法人家畜改良事業団が作製し販売する凍結精液の作製で用いられている最終グリセリン濃度が６．５％の希釈液を用いて希釈した。これらの希釈液を用いて、１次希釈液で８千万精子／ｍｌになるように希釈した後、各々の１次希釈精液に２次希釈液を１：１の比率で加えて４千万精子／ｍｌに希釈して常法に従って人工授精用ストローを作製した。凍結保存は常法に従って液体窒素を用いて行った。常法に従って融解し、常法に従って体外受精試験を行い、正常受精率、分割率、８細胞率、胚盤胞率を測定した。
【００６１】
フルクトオリゴ糖又はイソマルトオリゴ糖を含む希釈液を用いた場合では、試験区は対照区と比較すると同等程度かそれ以上の値であったことから、精子の卵子への侵入能力及び受精卵子の発生能力には問題ないことが示された（図９）。
【００６２】
実施例１２．本発明のオリゴ糖希釈液を用いて作製した凍結精液の人工授精による受胎率
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の乳用牛２頭及び肉用牛１頭の種雄牛から採取した精液を、２千万／ストローになるように実施例１に記載の１次希釈液、１次希釈液にグリセリンを加えた２次希釈液を用いて、最終グリセリン濃度が７．０％になるように希釈して精子希釈液を（試験区）。対照区は、特許文献１に記載の一般社団法人家畜改良事業団が作製し販売する凍結精液の作製で用いられている最終グリセリン濃度が６．５％の希釈液を用いて希釈した。特許文献１の記載に従って二層構成の人工授精用ストローを作製し、凍結は常法に従って液体窒素を用いて行った。常法に従って融解した人工授精用ストローを注入器に装填し、明瞭な発情を示した雌牛に人工授精した。受胎の確認は、ノンリターン法又は胎膜触知法（６０日）で行い、受胎率を測定した。
【００６３】
種雄牛３頭平均の受胎率は、試験区で５５．１％（授精雌牛頭数１３８頭）、対照区で４９．５％（授精雌牛頭数１３４頭）であり、試験区の受胎率は対照区より優れていた（図１０）。種雄牛によっては、試験区で顕著に受胎率が向上した牛もあった。従来の希釈液で受胎率の低い種雄牛であっても、本発明の精子用希釈液を用いれば、受胎率が改善することが期待される。分娩状況は、試験区、対照区ともに正常の範囲であり、試験区の希釈液による胎児や母体への問題は確認されなかった。
【００６４】
人工授精に用いた凍結精液の品質評価結果を、以下の表２に示す。エリート精子率、精子活力、生存かつアクロソーム正常率、及びミトコンドリア高活性率の全ての評価基準において、概ね試験区の精液品質は、対照区より優れていた。
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の精子用希釈液は、フルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、及びガラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる少なくとも一種のオリゴ糖を用いることで、精子の品質を向上させ、高受胎性の精子を供給できるようになり、フィールドでの効率的な子牛生産が可能となることが期待できる。また、従来の精子用希釈液と比較して安価に調製できるため、精子保存のコストを低減できる。
なお、２０１６年３月１６日に出願された日本特許出願第２０１６−０５２８９９号の明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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