(57)【要約】【課題】  従来の抗体よりも増強された、ＡＭＰ依存的に抑制されたヒトＴ細胞機能の回復能を有する抗ヒトＣＤ７３抗体を提供することにある。【解決手段】  配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号８９から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＣＤ７３抗体を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号８９から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される請求項１又は２に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＣＤ７３抗体；並びに、
（ｂ）（ａ）に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体の翻訳後修飾により生じた抗体である抗ヒトＣＤ７３抗体。
【請求項４】
下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される請求項３に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＣＤ７３抗体；並びに、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１から４５２までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＣＤ７３抗体。
【請求項５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項４に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸番号１から４５２までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項４に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメントと他のペプチドや蛋白質が融合した融合体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメントと修飾剤が結合した修飾体。
【請求項９】
下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択される請求項７に記載の融合体：
（ａ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む融合体；
（ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む融合体；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む融合体；
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む融合体；並びに、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）に記載の融合体の翻訳後修飾により生じた融合体。
【請求項１０】
下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ａ）請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド；及び、
（ｂ）請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される、請求項１０に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）請求項５に記載の抗体の重鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド；及び
（ｂ）請求項５に記載の抗体の軽鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される、請求項１１に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）請求項９に記載の融合体の重鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド；及び
（ｂ）請求項９に記載の融合体の軽鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
下記（ａ）及び／又は（ｂ）を含む、発現ベクター：
（ａ）請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド；及び、
（ｂ）請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
下記（ａ）及び／又は（ｂ）を含む、請求項１３に記載の発現ベクター：
（ａ）請求項５に記載の抗体の重鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド；及び、
（ｂ）請求項５に記載の抗体の軽鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
下記（ａ）及び／又は（ｂ）を含む、請求項１４に記載の発現ベクター：
（ａ）請求項９に記載の融合体の重鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド；及び、
（ｂ）請求項９に記載の融合体の軽鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、宿主細胞：
（ａ）請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド及び請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに、
（ｄ）請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１７】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、請求項１６に記載の宿主細胞：
（ａ）請求項５に記載の抗体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）請求項５に記載の抗体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）請求項５に記載の抗体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチド及び請求項５に記載の抗体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに、
（ｄ）請求項５に記載の抗体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、請求項５に記載の抗体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、請求項１７に記載の宿主細胞：
（ａ）請求項９に記載の融合体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）請求項９に記載の融合体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）請求項９に記載の融合体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチド及び請求項９に記載の融合体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに、
（ｄ）請求項９に記載の融合体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、請求項９に記載の融合体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１９】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＤ７３抗体、その抗原結合フラグメント又はそれらのいずれかの融合体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＣＤ７３抗体、その抗原結合フラグメント又はそれらのいずれかの融合体を生産する方法：
（ａ）請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２０】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＤ７３抗体又はその融合体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＣＤ７３抗体又はその融合体を生産する方法：
（ａ）請求項５に記載の抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと請求項５に記載の抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）請求項５に記載の抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと請求項５に記載の抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）請求項５に記載の抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、請求項５に記載の抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２１】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＤ７３抗体の融合体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＣＤ７３抗体の融合体を生産する方法：
（ａ）請求項９に記載の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと請求項９に記載の融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）請求項９に記載の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと請求項９に記載の融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）請求項９に記載の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、請求項９に記載の融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２２】
請求項３に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
がんの予防又は治療用医薬組成物である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
請求項３に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体の治療有効量を投与する工程を包含する、がんを予防又は治療する方法。
【請求項２５】
がんの予防又は治療に使用するための、請求項３に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体。
【請求項２６】
がんの予防又は治療用医薬組成物の製造における、請求項３に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体の使用。
【請求項２７】
請求項９に記載の融合体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
がんの予防又は治療用医薬組成物である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
請求項９に記載の融合体の治療有効量を投与する工程を包含する、がんを予防又は治療する方法。
【請求項３０】
がんの予防又は治療に使用するための、請求項９に記載の融合体。
【請求項３１】
がんの予防又は治療用医薬組成物の製造における、請求項９に記載の融合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物の有効成分として有用な抗ヒトＣＤ７３抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ７３（エクト５’ヌクレオチダーゼ）はＡＭＰ（アデノシン一リン酸）をアデノシンに分解する酵素である。ＣＤ７３はＧＰＩアンカー型蛋白質として細胞膜表面において２量体として存在し、リンパ球細胞、内皮細胞を始め、大腸、脳、腎臓、肝臓、肺、心臓など様々な組織に発現している。またＣＤ７３は、リンパ球細胞の細胞膜表面より切断されて可溶型ＣＤ７３として存在し、可溶型ＣＤ７３もＡＭＰを分解する酵素活性を持つことが報告されている。ＡＭＰの分解によって産生されたアデノシンはＴ細胞を始めとした免疫系細胞の機能を抑制するため、ＣＤ７３は免疫応答の調節に重要な役割を果たしている。（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．、２００８、Ｖｏｌ．２８、ｐ．１８‐２６）（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．、２０１３、Ｖｏｌ．１９、ｐ．３５５‐３６７）（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１５、Ｖｏｌ．４５、ｐ．５６２‐５７３）【０００３】
病態との関連性としては、ＣＤ７３の発現が大腸癌細胞株で確認されている（Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ．、２０１４、Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ８７９８９５）。また大腸癌患者は正常組織よりも癌組織においてＣＤ７３発現が上昇しており、ＣＤ７３発現の高い患者は発現の低い患者よりも全生存率が低いことが報告されている（Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．、２０１２、Ｖｏｌ．１０６、ｐ．１３０‐１３７）。【０００４】
他の種類のがんに関しては、副腎癌、乳癌、悪性黒色腫、多形性膠芽腫、卵巣癌、髄芽腫、膀胱癌の細胞株においてＣＤ７３発現が、乳癌、胃癌、膵癌、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、膠芽腫においてＣＤ７３活性の上昇が認められる（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．、２０００、Ｖｏｌ．８７、ｐ．１６１‐１７３）（Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．、２０１４、  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６０６５４ ）。また頭頸部癌、甲状腺癌におけるＣＤ７３発現上昇や、ＣＤ７３の発現が前立腺癌において癌細胞の増殖を促進することも報告されている（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．、２０１３、Ｖｏｌ．１９、ｐ．３５５‐３６７）。【０００５】
ＡＭＰを分解するＣＤ７３の酵素活性を阻害することは、抑制されたＴ細胞など免疫系細胞の機能を回復させ、抗腫瘍免疫の活性化に繋がるため、ＣＤ７３はがんの治療標的として研究されている。また、そのような酵素阻害活性を有する抗ＣＤ７３抗体が、動物モデルで抗腫瘍活性を示すことが知られている。（非特許文献１）【０００６】
ヒトＣＤ７３酵素活性を阻害する抗体についての複数の研究が行われている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、非特許文献１）。特許文献１及び非特許文献１で報告されているＭＥＤＩ９４４７は可溶型ＣＤ７３に対してベルシェイプ型の阻害を示すという特徴を有している。ＭＥＤＩ９４４７は固形癌を適応症とした第一相試験を開始しているが、特許文献２及び特許文献３で報告されている抗体も含め、臨床における治療効果はまだ確認されていない。【０００７】
イムノサイトカインと称される、抗体又はその抗原結合フラグメントとサイトカインとの融合体が知られており、抗腫瘍免疫を活性化させる目的で複数の研究が行われている（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１６、Ｖｏｌ．４０、ｐ．９６−１０２）。【０００８】
抗腫瘍免疫を活性化させる可能性があるサイトカインの例としてはＩＬ−７及びＩＬ−２１の研究が行われているが、ヒトへの高用量の投与で毒性を示す可能性が報告されている（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０１０、Ｖｏｌ．１６、ｐ．７２７−７３５）（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００７、Ｖｏｌ．１３、ｐ．３６３０−３６３６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開番号２０１６/０７５１７６号
【特許文献２】国際公開番号２０１６/０５５６０９号
【特許文献３】国際公開番号２０１６/０８１７４８号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】「マブス（ｍＡｂｓ）」、（米国）、２０１６；８（３）：４５４−４６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、抗ヒトＣＤ７３抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、抗ヒトＣＤ７３抗体の作製において相当の創意検討を重ねた結果、配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号８９から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ヒトＣＤ７３抗体ＣＤＳ−１を作製し（実施例１）、当該抗体がヒトＣＤ７３に結合し（実施例２）、ヒトＣＤ７３の酵素活性を阻害すること（実施例３及び４）、ＡＭＰ依存的に抑制されたヒトＴ細胞機能を回復すること（実施例５）を見出した。これらの結果、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体を提供し、本発明を完成させた。【００１３】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［３１］に関する。
［１］
配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号８９から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメント。
［２］
配列番号２のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、［１］に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメント。
［３］
下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される［１］又は［２］に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＣＤ７３抗体；並びに、
（ｂ）（ａ）に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体の翻訳後修飾により生じた抗体である抗ヒトＣＤ７３抗体。
［４］
下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される［３］に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＣＤ７３抗体；並びに、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１から４５２までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＣＤ７３抗体。
［５］
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［４］に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体。
［６］
配列番号２のアミノ酸番号１から４５２までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［４］に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体。
［７］
［１］〜［６］のいずれかに記載の抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメントと他のペプチドや蛋白質が融合した融合体。
［８］
［１］〜［６］のいずれかに記載の抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメントと修飾剤が結合した修飾体。
［９］
下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択される［７］に記載の融合体：
（ａ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む融合体；
（ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む融合体；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む融合体；
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む融合体；並びに、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）に記載の融合体の翻訳後修飾により生じた融合体。
［１０］
下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ａ）［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド；及び、
（ｂ）［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
［１１］
下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される、［１０］に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）［５］に記載の抗体の重鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド；及び
（ｂ）［５］に記載の抗体の軽鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
［１２］
下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される、［１１］に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）［９］に記載の融合体の重鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド；及び
（ｂ）［９］に記載の融合体の軽鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
［１３］
下記（ａ）及び／又は（ｂ）を含む、発現ベクター：
（ａ）［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド；及び、
（ｂ）［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
［１４］
下記（ａ）及び／又は（ｂ）を含む、［１３］に記載の発現ベクター：
（ａ）［５］に記載の抗体の重鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド；及び、
（ｂ）［５］に記載の抗体の軽鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
［１５］
下記（ａ）及び／又は（ｂ）を含む、［１４］に記載の発現ベクター：
（ａ）［９］に記載の融合体の重鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド；及び、
（ｂ）［９］に記載の融合体の軽鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
［１６］
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、宿主細胞：
（ａ）［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド及び［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに、
（ｄ）［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［１７］
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、［１６］に記載の宿主細胞：
（ａ）［５］に記載の抗体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）［５］に記載の抗体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）［５］に記載の抗体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチド及び［５］に記載の抗体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに、
（ｄ）［５］に記載の抗体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、［５］に記載の抗体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［１８］
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、［１７］に記載の宿主細胞：
（ａ）［９］に記載の融合体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）［９］に記載の融合体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）［９］に記載の融合体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチド及び［９］に記載の融合体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに、
（ｄ）［９］に記載の融合体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、［９］に記載の融合体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［１９］
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＤ７３抗体、その抗原結合フラグメント又はそれらのいずれかの融合体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＣＤ７３抗体、その抗原結合フラグメント又はそれらのいずれかの融合体を生産する方法：
（ａ）［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［２０］
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＤ７３抗体又はその融合体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＣＤ７３抗体又はその融合体を生産する方法：
（ａ）［５］に記載の抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと［５］に記載の抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）［５］に記載の抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと［５］に記載の抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）［５］に記載の抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、［５］に記載の抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［２１］
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＤ７３抗体の融合体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＣＤ７３抗体の融合体を生産する方法：
（ａ）［９］に記載の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと［９］に記載の融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）［９］に記載の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと［９］に記載の融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）［９］に記載の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、［９］に記載の融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［２２］
［３］に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［２３］
がんの予防又は治療用医薬組成物である、［２２］に記載の医薬組成物。
［２４］
［３］に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体の治療有効量を投与する工程を包含する、がんを予防又は治療する方法。
［２５］
がんの予防又は治療に使用するための、［３］に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体。
［２６］
がんの予防又は治療用医薬組成物の製造における、［３］に記載の抗ヒトＣＤ７３抗体の使用。
［２７］
［９］に記載の融合体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［２８］
がんの予防又は治療用医薬組成物である、［２７］に記載の医薬組成物。
［２９］
［９］に記載の融合体の治療有効量を投与する工程を包含する、がんを予防又は治療する方法。
［３０］
がんの予防又は治療に使用するための、［９］に記載の融合体。
［３１］
がんの予防又は治療用医薬組成物の製造における、［９］に記載の融合体の使用。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体は、ヒトＣＤ７３酵素阻害活性を有し、がんの予防又は治療剤として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＣＤＳ−１、ＭＥＤＩ９４４７、６Ｅ１及びＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆによる、ヒトＣＤ７３酵素阻害活性を示した図である。
【図２】図２は、ＣＤＳ−１、ＭＥＤＩ９４４７、６Ｅ１及びＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆによる、ヒトＴ細胞からのＩＦＮγ産生量を指標にしてヒトＴ細胞機能の回復を示した図である。
【図３】図３は、ＣＤＳ−１、ＭＥＤＩ９４４７、６Ｅ１及びＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆによる、ヒトＴ細胞の増殖を指標にしてヒトＴ細胞機能の回復を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、本発明について詳述する。
【００１７】
抗体にはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの５つのクラスが存在する。抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２万〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してＩｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ、Ｉｇεとよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブクラスが存在し、それぞれに対応する重鎖はＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、Ｉｇγ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれＩｇλ、Ｉｇκとよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
【００１８】
鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位又はドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにアミノ末端（Ｎ末端）に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（若しくはＶＨ）及び軽鎖可変領域（若しくはＶＬ）とよばれている。可変領域よりカルボキシ末端（Ｃ末端）側のアミノ酸配列は、各クラス又は各サブクラスにほぼ一定で定常領域とよばれている。定常領域の各ドメインは、それぞれ、可変領域側から順にＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＬと表される。
【００１９】
抗体の抗原結合部位はＶＨ及びＶＬによって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種エフェクター細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。軽鎖と重鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と呼んでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。
【００２０】
抗体のＶＨ及びＶＬを含む各種抗原結合フラグメントも抗原結合活性を有し、このような代表的な抗原結合フラグメントとして、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2が挙げられる。Ｆａｂは、軽鎖と、ＶＨ、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される、一価の抗体フラグメントである。Ｆａｂ’は、軽鎖と、ＶＨ、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される、一価の抗体フラグメントであり、このヒンジ領域の部分には重鎖間Ｓ−Ｓ結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、２つのＦａｂ’フラグメントがヒンジ領域中の重鎖間Ｓ−Ｓ結合で結合した二価の抗体フラグメントである。ｓｃＦｖは、リンカーで連結されたＶＨとＶＬから構成される、一価の抗体フラグメントである。
【００２１】
本明細書中で使用される抗体のアミノ酸残基番号は、Ｋａｂａｔナンバリング又はＥＵインデックス（Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）を指定することで、それらのナンバリングシステムに従って規定することができる。
【００２２】
＜本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体＞
本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体には、以下の特徴を有する抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメントが含まれる：
配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号８９から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００２３】
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体は、以下の抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメントである：
配列番号２のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００２４】
本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の重鎖定常領域としては、Ｉｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ又はＩｇεのいずれの定常領域も選択可能である。Ｉｇγとしては、例えば、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３又はＩｇγ４から選択することが可能である。１つの実施形態として、重鎖定常領域はＩｇγ１定常領域であり、例えば、ヒトＩｇγ１定常領域である。
【００２５】
本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の重鎖定常領域は、抗体の抗体依存性細胞傷害活性や補体依存性傷害活性を低下させることを目的とした変異を有していてもよい。Ｌ２３４Ａとは、ヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸２３４位のロイシンのアラニンでの置換である。Ｌ２３５Ａとは、ヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸２３５位のロイシンのアラニンでの置換である。Ｐ３３１Ｓとは、ヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸３３１位のプロリンのセリンでの置換である。Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３３１Ｓのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域としては、例えば、配列番号２のアミノ酸番号１２４から４５３までのアミノ酸配列からなるヒトＩｇγ１定常領域が挙げられる。当該変異は、抗体の抗体依存性細胞傷害活性や補体依存性傷害活性を低下させることが知られている（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９２、Ｖｏｌ．２９、ｐ．６３３−６３９）（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、Ｖｏｌ．１６４、ｐ．４１７８−４１８４）。
【００２６】
本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の軽鎖定常領域としては、Ｉｇλ又はＩｇκのいずれの定常領域も選択可能であり得る。１つの実施形態として、軽鎖定常領域はＩｇκ定常領域であり、例えば、ヒトＩｇκ定常領域である。ヒトＩｇκ定常領域の例として、配列番号４のアミノ酸番号１１０から２１５までのアミノ酸配列からなるヒトＩｇκ定常領域が挙げられる。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）2である抗原結合フラグメントである。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＣＤ７３抗体である。
【００２９】
抗体を細胞内で発現させる場合、抗体が翻訳後に修飾を受けることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖Ｃ末端のリジンのカルボキシペプチダーゼによる切断、重鎖及び軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾、グリコシル化、酸化、脱アミド化、糖化等が挙げられ、種々の抗体において、このような翻訳後修飾が生じることが知られている（Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．、２００８、Ｖｏｌ．９７、ｐ．２４２６−２４４７）。
【００３０】
本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体には、翻訳後修飾により生じた抗体である抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。翻訳後修飾により生じた抗体とは、翻訳後修飾により生じた抗体のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む抗体が含まれる。翻訳後修飾により生じた抗体である本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の例としては、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失を受けた抗ヒトＣＤ７３抗体が挙げられる。このようなＮ末端のピログルタミル化又はＣ末端リジン欠失による翻訳後修飾が抗体の活性に影響を及ぼすものではないことは当該分野で知られている（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００６、Ｖｏｌ．３４８、ｐ．２４−３９）。
【００３１】
１つの実施形態において、翻訳後修飾により生じた抗体である本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体は、以下の抗ヒトＣＤ７３抗体である：
配列番号２のアミノ酸番号１から４５２までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＣＤ７３抗体。
【００３２】
本明細書における「抗ヒトＣＤ７３抗体」とは、ヒトＣＤ７３に結合する抗体を意味する。ヒトＣＤ７３に結合するか否かは、公知の結合活性測定方法を用いて確認することができる。結合活性を測定する方法としては、例えば、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）等の方法が挙げられる。ＥＬＩＳＡを用いる場合は、例えば、ヒトＣＤ７３蛋白質（例えば、ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、７１１８４）をＥＬＩＳＡプレートに固相化し、これに対して被験抗体を添加して反応させた後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素で標識した抗ＩｇＧ抗体等の二次抗体を反応させる。反応後に洗浄操作を行い、その活性を検出する試薬（例えば、ＨＲＰ標識の場合、ＴＭＢ＋ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（Ｄａｋｏ社））等を用いた活性測定により、二次抗体の結合を同定することで、被験抗体がヒトＣＤ７３に結合するか否かを確認することができる。具体的な評価方法としては、例えば後記実施例２に記載される方法を用いることができる。
【００３３】
本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体には、ヒトＣＤ７３に結合する抗体であれば、ヒトＣＤ７３への結合に加え、他の動物由来のＣＤ７３（例えば、サルＣＤ７３）にも結合する抗体も含まれる。
【００３４】
本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の活性を評価する方法として、ヒトＣＤ７３の酵素阻害活性を評価してもよい。このような活性の評価方法としては、例えば後記実施例３及び４に記載される方法を用いることができる。本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体には、ヒトＣＤ７３に結合し、ヒトＣＤ７３の酵素阻害活性を有する抗体が含まれる。
【００３５】
また、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の活性を評価する方法として、ＡＭＰ依存的に抑制されたヒトＴ細胞の機能を回復させる活性を評価してもよい。このような活性の評価方法としては、後記実施例５に記載されるような方法を用いることができる。本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体には、ヒトＣＤ７３に結合し、ＡＭＰ依存的に抑制されたヒトＴ細胞の機能を回復させる活性を有する抗体が含まれる。
【００３６】
本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体は、本明細書に開示される、本発明の抗体のＶＨ及びＶＬの配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体は、特に限定されるものではないが、例えば、後述の＜本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体又は本発明の融合体を生産する方法及び該方法により生産できる抗ヒトＣＤ７３抗体又はその融合体＞に記載の方法に従い製造することができる。
【００３７】
本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体は、必要によりさらに精製された後、定法に従って製剤化され、がんの予防又は治療に用いることができる。本発明による予防又は治療の対象となるがんは、特に限定されないが、例えば肺癌、大腸癌、副腎皮質癌、乳癌、悪性黒色腫、膠芽腫、卵巣癌、髄芽腫、膀胱癌、胃癌、膵癌、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、グリア芽腫、頭頸部癌、甲状腺癌、又は前立腺癌等が挙げられる。
【００３８】
＜本発明の融合体及び修飾体＞
当業者であれば、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体を利用して、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメントと他のペプチドや蛋白質が融合した融合体を作製することや、修飾剤が結合した修飾体を作製することも可能である。本発明の融合体及び修飾体は、ヒトＣＤ７３に結合する限り、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメントと他のペプチドや蛋白質が融合した融合体又は修飾剤が結合した修飾体を含む。融合に用いられる他のペプチドや蛋白質は特に限定されず、例えば、ヒト血清アルブミン、各種タグペプチド、人工ヘリックスモチーフペプチド、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、各種毒素、サイトカイン、ケモカイン、その他多量体化を促進しうるペプチド又は蛋白質等が挙げられる。修飾に用いられる修飾剤は特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、糖鎖、リン脂質、リポソーム、低分子化合物等が挙げられる。当該融合又は修飾は、直接融合又は修飾してもよく、また、任意のリンカーを介して融合又は修飾してもよい。本発明の融合体は、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメントにサイトカインが融合した融合体を含む。本発明の融合体に使用されるサイトカインは、天然に存在するサイトカインに限られず、その機能を有する改変体であってもよい。１つの実施形態において、本発明の融合体に含まれるサイトカインは、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）又はそれらの改変体である。また、本発明の融合体に使用されるサイトカインは、ＩＬ−７あるいはＩＬ−２１の生理活性を低下させた改変体であってもよい。
【００３９】
本発明の融合体において重鎖とは、融合体に含まれる抗体の重鎖及び該重鎖に融合した他のペプチドや蛋白質を含む。本発明の融合体において軽鎖とは、融合体に含まれる抗体の軽鎖及び該軽鎖に融合した他のペプチドや蛋白質を含む。
【００４０】
ＩＬ−７は、ＩＬ−７受容体に対してリガンドとして機能するサイトカインである。ＩＬ−７はＴ細胞やＢ細胞などの生存、増殖及び分化に寄与することが報告されている（Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．、２００６、Ｖｏｌ．７、ｐ．１５７１−１５８２）。本発明において、ＩＬ−７には、天然に存在するＩＬ−７及びその機能を有する改変体が包含される。１つの実施形態において、ＩＬ−７は、ヒトＩＬ−７である。本発明において、ヒトＩＬ−７には、天然に存在するヒトＩＬ−７及びその機能を有する改変体が包含される。１つの実施形態において、ヒトＩＬ−７は、以下の（１）〜（３）からなる群より選択される：（１）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００８７１．１に示されるアミノ酸配列を含み、かつ、ヒトＩＬ−７の機能を有するポリペプチド、（２）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００８７１．１に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＩＬ−７の機能を有するポリペプチド、並びに（３）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００８７１．１に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ、ヒトＩＬ−７の機能を有するポリペプチド。１つの実施形態において、本発明で使用されるヒトＩＬ−７はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００８７１．１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ここで、ヒトＩＬ−７の機能とは、各種ヒト免疫細胞に対しての生存、増殖及び分化作用をいう。
【００４１】
ＩＬ−２１は、ＩＬ−２１受容体に対してリガンドとして機能するサイトカインである。ＩＬ−２１はＴ細胞やＢ細胞などの生存、増殖及び分化に寄与することが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．、２０１５、Ｖｏｌ．３５８、ｐ．１０７−１１４）。本発明において、ＩＬ−２１には、天然に存在するＩＬ−２１及びその機能を有する改変体が包含される。１つの実施形態において、ＩＬ−２１は、ヒトＩＬ−２１である。本発明において、ヒトＩＬ−２１には、天然に存在するヒトＩＬ−２１及びその機能を有する改変体が包含される。１つの実施形態において、ヒトＩＬ−２１は、以下の（１）〜（３）からなる群より選択される：（１）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０６８５７５．１に示されるアミノ酸配列を含み、かつ、ヒトＩＬ−２１の機能を有するポリペプチド、（２）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０６８５７５．１に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＩＬ−２１の機能を有するポリペプチド、並びに（３）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０６８５７５．１に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ、ヒトＩＬ−２１の機能を有するポリペプチド。１つの実施形態において、本発明で使用されるヒトＩＬ−２１はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０６８５７５．１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ここで、ヒトＩＬ−２１の機能とは、各種ヒト免疫細胞に対しての生存、増殖及び分化作用をいう。
【００４２】
本発明の融合体には、翻訳後修飾により生じた融合体も含まれる。翻訳後修飾の例としては、＜本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体＞において記載した種々の翻訳後修飾が挙げられる。
【００４３】
１つの実施形態において、本発明の融合体は、下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択される融合体である：
（ａ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む融合体；
（ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む融合体；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む融合体；
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む融合体；並びに、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）に記載の融合体の翻訳後修飾により生じた融合体。
【００４４】
１つの実施形態において、翻訳後修飾により生じた融合体である本発明の融合体は、以下の融合体である：
配列番号２のアミノ酸番号１から４５２までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む融合体。
【００４５】
１つの実施形態において、翻訳後修飾により生じた融合体である本発明の融合体は、以下の融合体である：
配列番号２のアミノ酸番号１から４５２までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む融合体。
【００４６】
＜本発明のポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドには、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体のＶＨをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体のＶＬをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
【００４７】
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体のＶＨをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなるＶＨをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００４８】
配列番号２のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなるＶＨをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の塩基配列１から３６９までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４９】
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体のＶＬをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなるＶＬをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００５０】
配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなるＶＬをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３の塩基配列１から３２７までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５１】
本発明のポリヌクレオチドには、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
【００５２】
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００５３】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１又は１１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５４】
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００５５】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３又は８に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドには、本発明の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、本発明の融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
【００５７】
１つの実施形態において、本発明の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００５８】
配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号５又は６に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５９】
１つの実施形態において、本発明の融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００６０】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３又は８に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６１】
１つの実施形態において、本発明の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００６２】
配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号９又は１６に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６３】
１つの実施形態において、本発明の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００６４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１又は１１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明の融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００６６】
配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１２に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６７】
１つの実施形態において、本発明の融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００６８】
配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６９】
本発明のポリヌクレオチドは、その塩基配列に基づき、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、ＷＯ９０／０７８６１に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
【００７０】
＜本発明の発現ベクター＞
本発明の発現ベクターには、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体のＶＨをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体のＶＬをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体のＶＨをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体のＶＬをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターが含まれる。
【００７１】
本発明の発現ベクターには、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターが含まれる。
【００７２】
本発明の発現ベクターには、本発明の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、本発明の融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び本発明の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターが含まれる。
【００７３】
本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いる発現ベクターとしては、真核細胞（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母）及び／又は原核細胞（例えば、大腸菌）の各種の宿主細胞中で本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体若しくはその融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び／又は本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体若しくはその融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、これらによりコードされるポリペプチドを産生できるものである限り、特に制限されるものではない。このような発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等が挙げられる。１つの実施形態において、ｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）を発現ベクターとして使用することができる。
【００７４】
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドに動作可能なように連結されたプロモーターを含み得る。動物細胞で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０などのウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。細菌（例えば、エシェリキア属菌）で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが挙げられる。
【００７５】
宿主細胞として、動物細胞、昆虫細胞又は酵母を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン及び終止コドンを含み得る。この場合、エンハンサー配列、本発明の抗体又はその重鎖若しくは軽鎖をコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、あるいは複製可能単位などを含んでいてもよい。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位を含み得る。本発明の発現ベクターは、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
【００７６】
＜本発明の形質転換された宿主細胞＞
本発明の形質転換された宿主細胞には、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる：
（ａ）本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体のＶＨをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体のＶＬをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体のＶＨをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体のＶＬをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体のＶＨをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体のＶＬをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００７７】
本発明の形質転換された宿主細胞には、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる：
（ａ）本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００７８】
本発明の形質転換された宿主細胞には、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる：
（ａ）本発明の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）本発明の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）本発明の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００７９】
本発明の形質転換された宿主細胞の例としては、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞が挙げられる。
【００８０】
形質転換する宿主細胞としては、使用する発現ベクターに適合し、該発現ベクターで形質転換されて、抗体又は融合体を発現することができるものである限り、特に限定されるものではない。形質転換する宿主細胞としては、例えば、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞又は人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、細菌（エシェリキア属菌など）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）など）が挙げられる。１つの実施形態において、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳ０細胞等の培養細胞を宿主細胞として使用することができる。
【００８１】
宿主細胞を形質転換する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等を用いることができる。
【００８２】
＜本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体又は本発明の融合体を生産する方法及び該方法により生産できる抗ヒトＣＤ７３抗体又はその融合体＞
本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体又は本発明の融合体を生産する方法には、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＤ７３抗体、その抗原結合フラグメント又はそれらのいずれかの融合体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＣＤ７３抗体、その抗原結合フラグメント又はそれらのいずれかの融合体を生産する方法が含まれる：
（ａ）本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体のＶＨをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体のＶＬをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体のＶＨをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体のＶＬをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体のＶＨをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体のＶＬをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００８３】
本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体又は本発明の融合体を生産する方法には、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＤ７３抗体又はその融合体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＣＤ７３抗体又はその融合体を生産する方法が含まれる：
（ａ）本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００８４】
本発明の融合体を生産する方法には、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＤ７３抗体の融合体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＣＤ７３抗体の融合体を生産する方法が含まれる：
（ａ）本発明の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）本発明の融合体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該融合体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００８５】
本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体又は本発明の融合体を生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＤ７３抗体、その抗原結合フラグメント又はそれらのいずれかの融合体を発現させる工程を包含している限り、特に限定されるものではない。該方法で使用される宿主細胞の例としては、前述の本発明の形質転換された宿主細胞が挙げられる。
【００８６】
形質転換された宿主細胞の培養は公知の方法により行うことができる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ及び培養時間は、適宜選択される。宿主細胞が動物細胞の場合、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９５９、Ｖｏｌ．１３０、ｐ．４３２−４３７）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌ．、１９５９、Ｖｏｌ．８、ｐ．３９６）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ  Ａｍ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ．、１９６７、Ｖｏｌ．１９９、ｐ．５１９）、１９９培地（Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．、１９５０、Ｖｏｌ．７３、ｐ．１−８）等を用いることができる。培地のｐＨは、例えば、約６〜８であり、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約３０〜４０℃で約１５〜３３６時間行われる。宿主細胞が昆虫細胞の場合、培地としては、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、１９８５、Ｖｏｌ．８２、ｐ．８４０４）等を用いることができる。培地のｐＨは、例えば、約５〜８であり、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０〜４０℃で約１５〜１００時間行われる。宿主細胞が大腸菌又は酵母である場合、培地としては、例えば、栄養源を含有する液体培地が適当である。栄養培地は、例えば、形質転換された宿主細胞の生育に必要な炭素源、無機窒素源、又は有機窒素源を含んでいる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖等が、無機窒素源又は有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等が挙げられる。所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類）、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン）等を含んでいてもよい。培地のｐＨは、例えば、約５〜８である。宿主細胞が大腸菌の場合、培地としては、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｖｏｌ．３、Ａ２．２）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約１４〜４３℃で約３〜２４時間行われる。宿主細胞が酵母の場合、培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、１９８０、Ｖｏｌ．７７、ｐ．４５０５）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行われる。上述のような培養により、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体を発現させることができる。
【００８７】
本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体又は本発明の融合体を生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＤ７３抗体、その抗原結合フラグメント又はそれらのいずれかの融合体を発現させる工程に加えて、さらには、該形質転換された宿主細胞から抗ヒトＣＤ７３抗体、その抗原結合フラグメント又はそれらのいずれかの融合体を回収、単離又は精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。１つの実施形態において、培養上清中に蓄積された抗体は、各種クロマトグラフィー、例えば、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。
【００８８】
本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体又は本発明の融合体には、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体又は本発明の融合体を生産する方法で生産された抗ヒトＣＤ７３抗体、その抗原結合フラグメント又はそれらのいずれかの融合体も含まれる。
【００８９】
＜本発明の医薬組成物＞
本発明の医薬組成物には、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体、その抗原結合フラグメント又は本発明の融合体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。
【００９０】
本発明の医薬組成物は、複数種の本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体を含み得る。例えば、Ｃ末端リジンの欠失及びＮ末端のピログルタミル化を受けていない抗体又はその抗原結合フラグメント、及び／あるいは、Ｃ末端リジンの欠失及び／又はＮ末端のピログルタミル化を受けた抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物も本発明に含まれる。
【００９１】
本発明の医薬組成物は、複数種の本発明の融合体を含み得る。例えば、Ｃ末端リジンの欠失及びＮ末端のピログルタミル化を受けていない融合体、及び／あるいは、Ｃ末端リジンの欠失及び／又はＮ末端のピログルタミル化を受けた融合体を含有する医薬組成物も本発明に含まれる。
【００９２】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、配列番号２のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメント、並びに、該抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗ヒトＣＤ７３抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する。
【００９３】
本発明の医薬組成物には、重鎖Ｃ末端リジンの欠失抗体、Ｎ末端のピログルタミル化を受けた抗体又はその抗原結合フラグメント、重鎖Ｃ末端リジンを欠失しＮ末端のピログルタミル化を受けた抗体、及び／あるいは重鎖Ｃ末端リジンを有しＮ末端のピログルタミル化を受けていない抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物も含まれる。
【００９４】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＣＤ７３抗体、該抗ヒトＣＤ７３抗体の翻訳後修飾により生じた抗体のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む抗ヒトＣＤ７３抗体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
【００９５】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＣＤ７３抗体の融合体、該融合体の翻訳後修飾により生じた融合体のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む融合体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
【００９６】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＣＤ７３抗体の融合体、該融合体の翻訳後修飾により生じた融合体のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む融合体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
【００９７】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＣＤ７３抗体の融合体、該融合体の翻訳後修飾により生じた融合体のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む融合体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
【００９８】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＣＤ７３抗体の融合体、該融合体の翻訳後修飾により生じた融合体のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む融合体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
【００９９】
製剤化における本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体、融合体及び修飾体の添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いることができる。
【０１００】
本発明の医薬組成物は、がんの治療剤として用いることができる。
【０１０１】
本発明には、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体、融合体又は修飾体を含む、がんの予防又は治療用医薬組成物が含まれる。また、本発明には、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体、融合体又は修飾体の治療有効量を投与する工程を包含する、がんを治療又は予防する方法が含まれる。また、本発明には、がんの予防又は治療に使用するための、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体、融合体及び修飾体が含まれる。また、本発明には、がんの予防又は治療用医薬組成物の製造における、本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体、融合体及び修飾体の使用が含まれる。本発明による予防又は治療の対象となるがんは、特に限定されないが、例えば肺癌、大腸癌、副腎皮質癌、乳癌、悪性黒色腫、膠芽腫、卵巣癌、髄芽腫、膀胱癌、胃癌、膵癌、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、グリア芽腫、頭頸部癌、甲状腺癌、又は前立腺癌等が挙げられる。
【０１０２】
本発明についてさらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１０３】
特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。【０１０４】
［実施例１：抗ヒトＣＤ７３抗体の作製］
ヒトモノクローナル抗体開発技術「ベロシミューン」（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社（米国特許６５９６５４１号））マウスを用いて抗ヒトＣＤ７３抗体を作製した。当該技術により取得される抗体は、可変領域がヒト由来、定常領域がマウス由来のキメラ抗体である。ベロシミューンマウスに、免疫反応を惹起するアジュバントと共に、ヒトＣＤ７３蛋白質を免疫した。ヒトＣＤ７３蛋白質は以下の手法によって調製した。遺伝子工学的手法によってヒトＣＤ７３遺伝子（ＯＲＩＧＥＮＥ社  ＲＣ２０９５６８）の塩基番号１から１６４１までの塩基配列の３’末端に対しＨｉｓＴａｇ配列（Ｈｉｓ×６）及び終止コドンをコードする塩基配列を付加し、哺乳類細胞発現用ベクターに挿入したものを発現ベクターとした。発現ベクターをＥｘｐｉ２９３ＦTM細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にトランスフェクションし、回収した上清からヒトＣＤ７３及びＨｉｓＴａｇの融合蛋白質（ヒトＣＤ７３−Ｈｉｓ蛋白質）を精製した。精製したヒトＣＤ７３−Ｈｉｓ蛋白質をマウスへ数回免疫した後に、定法に従いハイブリドーマを作製した。そしてハイブリドーマ上清より精製した抗体を用いて、ヒトＣＤ７３酵素活性を阻害する機能を有する抗体を産生するハイブリドーマクローンを選抜した。その後ハイブリドーマクローンから抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子をクローニングした。遺伝子クローニングは定法に従い、ハイブリドーマの抽出ＲＮＡより作製したｃＤＮＡの抗体遺伝子配列を解析して配列決定を行った。さらにアミノ酸配列を解析し、Ｋａｂａｔらのデータベース（Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）を参照してＣＤＲ配列及びＦＲ配列を決定した。一部のクローンは物性及び安定性向上のため、重鎖及び軽鎖ＦＲをそれぞれ他のヒト抗体重鎖及び軽鎖のＦＲと置き換えた。置換した抗体配列のＶＨ及びＶＬをそれぞれＰＣＲ法によってヒトＩｇγ１定常領域（一部のクローンには、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３３１Ｓのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域）、ヒトＩｇκ定常領域と連結し、哺乳類細胞発現用ベクターであるＧＳベクター（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）へ挿入して発現ベクターを構築した。具体的には抗体の重鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１９８７、Ｖｏｌ．１、ｐ．４９９−５０５）をコードする遺伝子を、そして３’側にヒトＩｇγ１定常領域をコードする遺伝子をそれぞれ繋げ、この重鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ６．４に挿入した。また軽鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１９８７、Ｖｏｌ．１、ｐ．４９９−５０５）をコードする遺伝子を、そして３’側にヒトκ鎖の定常領域遺伝子をそれぞれ繋げ、この軽鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ１２．４に挿入した。【０１０５】
これらの抗体重鎖及び抗体軽鎖を含む発現ベクターを用いて一過性発現あるいは安定発現株により精製抗体を取得した。一過性発現に関して具体的にはＭａｘＣｙｔｅ  ＳＴＸ（商品名）（ＭａｘＣｙｔｅ社）を用いて前述の抗体重鎖及び抗体軽鎖の両発現ベクターをＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）にトランスフェクションし、約７日間培養した。一過性発現あるいは安定発現株の培養上清をＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、Ｖｉｖａｐｕｒｅ（商品名）  Ｑ  Ｍａｘｉ  Ｈ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）等を用いて精製し、精製抗体を得た。【０１０６】
複数の精製抗体の中からヒトＣＤ７３酵素活性を阻害する機能を有するクローンを選抜したところ、ＣＤＳ−１と命名した抗ヒトＣＤ７３抗体が最も強く酵素活性を阻害することが明らかとなった。【０１０７】
ＣＤＳ−１の重鎖の、Ｋａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までをコードする塩基配列を配列番号１に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に、該抗体の軽鎖の、Ｋａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までをコードする塩基配列を配列番号３に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。【０１０８】
ＣＤＳ−１のＶＨは、配列番号２のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなり、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２のアミノ酸番号３１から３５、５０から６６、９９から１１２までのアミノ酸配列からなる。当該抗体のＶＬは、配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４のアミノ酸番号２４から３４、５０から５６、８９から９８までのアミノ酸配列からなる。【０１０９】
ＣＤＳ−１の重鎖のＣ末端側にヒトＩＬ−７を融合した融合体を取得し、ＣＤＳ−３と命名した。ＣＤＳ−３の重鎖の、Ｋａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までとリンカーを介したヒトＩＬ−７をコードする塩基配列を配列番号５及び６に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号７に、該融合体の軽鎖の、Ｋａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までをコードする塩基配列を配列番号３及び８に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。ＣＤＳ−３の重鎖は、配列番号７のアミノ酸番号４６４から６１５までのアミノ酸配列からなるヒトＩＬ−７のアミノ酸配列を、該配列番号のアミノ酸番号４５４から４６３までのアミノ酸配列からなるリンカーを介してＣＤＳ−１の重鎖のＣ末端側に融合したアミノ酸配列からなる。【０１１０】
ＣＤＳ−１の重鎖のＣ末端側にヒトＩＬ−７改変体を融合した融合体を取得し、ＣＤＳ−６と命名した。ＣＤＳ−６の重鎖の、Ｋａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までとリンカーを介したヒトＩＬ−７改変体をコードする塩基配列を配列番号９及び１６に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１０に、該融合体の軽鎖の、Ｋａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までをコードする塩基配列を配列番号３及び８に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。ＣＤＳ−６の重鎖は、配列番号１０のアミノ酸番号４６４から６１５までのアミノ酸配列からなるヒトＩＬ−７改変体のアミノ酸配列を、該配列番号のアミノ酸番号４５４から４６３までのアミノ酸配列からなるリンカーを介してＣＤＳ−１の重鎖のＣ末端側に融合したアミノ酸配列からなる。【０１１１】
ＣＤＳ−１の軽鎖のＣ末端側にヒトＩＬ−２１を融合した融合体を取得し、ＣＤＳ−７と命名した。ＣＤＳ−７の重鎖の、Ｋａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までをコードする塩基配列を配列番号１１に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に、該融合体の軽鎖の、Ｋａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までとリンカーを介したヒトＩＬ−２１をコードする塩基配列を配列番号１２に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１３にそれぞれ示す。ＣＤＳ−７の軽鎖は、配列番号１３のアミノ酸番号２２６から３５８までのアミノ酸配列からなるヒトＩＬ−２１のアミノ酸配列を、該配列番号のアミノ酸番号２１６から２２５までのアミノ酸配列からなるリンカーを介してＣＤＳ−１の軽鎖のＣ末端側に融合したアミノ酸配列からなる。【０１１２】
ＣＤＳ−１の軽鎖のＣ末端側にヒトＩＬ−２１改変体を融合した融合体を取得し、ＣＤＳ−８と命名した。ＣＤＳ−８の重鎖の、Ｋａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までをコードする塩基配列を配列番号１１に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に、該融合体の軽鎖の、Ｋａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までとリンカーを介したヒトＩＬ−２１改変体をコードする塩基配列を配列番号１４に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１５にそれぞれ示す。ＣＤＳ−８の軽鎖は、配列番号１５のアミノ酸番号２２６から３５８までのアミノ酸配列からなるヒトＩＬ−２１改変体のアミノ酸配列を、該配列番号のアミノ酸番号２１６から２２５までのアミノ酸配列からなるリンカーを介してＣＤＳ−１の軽鎖のＣ末端側に融合したアミノ酸配列からなる。【０１１３】
精製ＣＤＳ−３、ＣＤＳ−６、ＣＤＳ−７及びＣＤＳ−８は、前述の方法に従って取得された。【０１１４】
特許文献１のＦｉｇ．１Ｃ及びＦｉｇ．１Ｄに示される情報を基に、ＭＥＤＩ９４４７と命名された抗体を発現する発現ベクターを作製した。特許文献２の配列番号２１及び配列番号２２で示される情報を基に、６Ｅ１と命名された抗体を発現する発現ベクターを作製した。特許文献３の配列番号１３３及び配列番号１０２で示される情報を基に、ＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆと命名された抗体を発現する発現ベクターを作製した。これらの発現ベクターには、定法に従ってシグナル配列をコードする遺伝子を挿入した。【０１１５】
ＭＥＤＩ９４４７、ＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ及び６Ｅ１は、定法に従って精製抗体を取得し、比較対照として用いた。【０１１６】
精製したＣＤＳ−1、ＣＤＳ−７及びＣＤＳ−８のアミノ酸修飾を分析した結果、精製抗体の大部分において、重鎖Ｃ末端のリジンの欠失が生じていた。【０１１７】
精製したＣＤＳ−３のアミノ酸修飾を分析した結果、重鎖は配列番号７に、軽鎖は配列番号４に相当する配列であった。【０１１８】
精製したＣＤＳ−６のアミノ酸修飾を分析した結果、軽鎖は配列番号４に相当する配列であった。重鎖は完全に糖鎖切断が出来なかったためアミノ酸修飾の種類は特定できていない。【０１１９】
［実施例２：抗ヒトＣＤ７３抗体のヒトＣＤ７３蛋白質に対する結合活性の評価］
実施例１で取得したＣＤＳ−１、ＣＤＳ−３、ＣＤＳ−６、ＣＤＳ−７及びＣＤＳ−８のヒトＣＤ７３に対する結合活性を評価するために、ヒトＣＤ７３蛋白質を用いてＥＬＩＳＡを行った。マキシソープ３８４ウェルプレートクリアー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にＰＢＳ（ライフテクノロジーズ社）で４μｇ／ｍＬの濃度に希釈したヒトＣＤ７３蛋白質（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、７１１８４）を２０μＬ／ウェル添加し、４℃で一晩固相化した。翌日洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ））で１回ウェルを洗浄し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（ナカライテスク社）を１００μＬ／ウェル添加して室温で３０分ブロッキングを行った。再び洗浄液で１回洗浄し、実施例１で作製した精製ＣＤＳ−１、精製ＣＤＳ−３、精製ＣＤＳ−６、精製ＣＤＳ−７及び精製ＣＤＳ−８をそれぞれ２０μＬ／ウェル添加した。これらの精製抗体の希釈はＰＢＳ及びＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅを等量混合した反応緩衝液を用いて行い、１０μｇ／ｍＬから５６ｐｇ／ｍＬまで１２段階に希釈した。室温で１時間反応した後に洗浄液で３回洗浄を行った。Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ−ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｃｒｏｓｓ−ａｄｓｏｒｂｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ａ８０−２１９Ｐ）を４０００倍に反応緩衝液で希釈したものを２０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応した。洗浄液で３回洗浄し、ＴＭＢ＋ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社、Ｓ１５９９）を２０μＬ／ウェル添加した。５分後に１Ｍ硫酸（和光純薬工業社）を２０μＬ／ウェル添加して反応を停止した。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ社）で吸光度４５０ｎｍ及び５４０ｎｍを測定し、ＣＤＳ−１、ＣＤＳ−３、ＣＤＳ−６、ＣＤＳ−７及びＣＤＳ−８のヒトＣＤ７３蛋白質に対するＥＣ50値を算出した。ＥＣ50値算出にあたっては、縦軸を吸光度４５０ｎｍと５４０ｎｍの測定値の差、横軸を抗体濃度値とし、グラフ上に描いたシグモイド曲線の形状から、抗体濃度の上昇に伴い測定値が収束値に達したと判断できる測定値を１００％、抗体濃度の下降に伴い測定値が収束値に達したと判断できる測定値を０％に設定した。本アッセイは独立して試行を行い、ＥＣ50値を４パラメーターロジスティック曲線回帰により算出した（表１）。
【表１】
2018110555.tif 000002
【０１２０】
その結果、ＣＤＳ−１、ＣＤＳ−３、ＣＤＳ−６、ＣＤＳ−７及びＣＤＳ−８はヒトＣＤ７３蛋白質に結合することが明らかとなった。【０１２１】
［実施例３：抗ヒトＣＤ７３抗体のヒトＣＤ７３蛋白質に対する酵素阻害活性の評価］
実施例１で取得したＣＤＳ−１、ＣＤＳ−３、ＣＤＳ−６、ＣＤＳ−７及びＣＤＳ−８が、ヒトＣＤ７３が持つ酵素活性を阻害することを評価するため、ヒトＣＤ７３蛋白質を用いた酵素アッセイを実施した。本実施例では、比較対照としてＭＥＤＩ９４４７、ＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ及び６Ｅ１を用いた。５ｍＭ塩化マグネシウム含有２５ｍＭトリス緩衝生理食塩水を塩酸でｐＨ７．５に調製し、アッセイバッファーとした。９６ウェルアッセイプレートクリアー（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）にアッセイバッファーで終濃度１５ｎｇ／ｍＬとなるように調製したヒトＣＤ７３蛋白質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、５７９５−ＥＮ）と、アッセイバッファーで希釈した精製ＣＤＳ−１、精製ＣＤＳ−３、精製ＣＤＳ−６、精製ＣＤＳ−７、精製ＣＤＳ−８、精製ＭＥＤＩ９４４７、精製ＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ及び精製６Ｅ１をそれぞれ２０μＬ／ウェル添加して室温で３０分反応した。これらの精製抗体の希釈はアッセイバッファーを用いて行い、終濃度２０μｇ／ｍＬから０．３３９ｎｇ／ｍＬとなるように１１段階に希釈した。アッセイバッファーで希釈したＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ａ１７５２−１Ｇ）を終濃度３０μＭとなるように２０μＬ／ウェル添加し室温で４５分反応した。アセトニトリルを６０μＬ／ウェル添加することで反応を停止し、ＬＣ／ＭＳ（ＬＣ：島津製作所社  ＳＩＬ−ＨＴｃあるいはＷａｔｅｒｓ社  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  Ｉ−Ｃｌａｓｓ、カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ａｑ  １．８μｍ  ２．１×３０ｍｍ、ＭＳ：ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ社  ＡＰＩ４０００）によりアデノシン濃度を測定した。測定したアデノシン濃度を元にＣＤＳ−１等のヒトＣＤ７３酵素活性に対する阻害を、算出したＥＣ50値に基づき評価した。ＥＣ50値算出にあたっては、縦軸を測定したアデノシン濃度値、横軸を抗体濃度値とし、グラフ上に描いたシグモイド曲線の形状から、抗体濃度の上昇に伴いアデノシン濃度値が収束値に達したと判断できるアデノシン濃度値を０％、抗体濃度の下降に伴いアデノシン濃度値が収束値に達したと判断できるアデノシン濃度値を１００％に設定した。本アッセイは独立して試行を行い、ＥＣ50値を４パラメーターロジスティック曲線回帰により算出した（表２）。非特許文献１で報告されていた通り、ＭＥＤＩ９４４７はベルシェイプ型の阻害を示すという特徴を有していた（図１）。また、ＣＤＳ−１の抗体濃度の上昇に伴うアデノシン濃度値の収束値と比較してＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆの収束値は高い値を示した。
【表２】
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【０１２２】
その結果、ＣＤＳ−１、ＣＤＳ−３、ＣＤＳ−６、ＣＤＳ−７及びＣＤＳ−８はヒトＣＤ７３蛋白質の酵素活性を阻害することが明らかとなった。【０１２３】
［実施例４：抗ヒトＣＤ７３抗体のヒトＣＤ７３発現細胞における酵素阻害活性の評価］
実施例１で取得したＣＤＳ−１、ＣＤＳ−３、ＣＤＳ−６、ＣＤＳ−７及びＣＤＳ−８のヒトＣＤ７３が持つ酵素活性を阻害することを評価するため、ヒトＣＤ７３を内在的に発現する癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１３７３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−５８６６）を用いた酵素アッセイを実施した。ＮＣＩ−Ｈ１３７３細胞をＰＢＳ（ライフテクノロジーズ社）で懸濁し、最終的な細胞密度が４×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように９６ウェルＶ底プレート（住友ベークライト社）に３０μＬ／ウェルで播種した。その後すぐに精製ＣＤＳ−１、精製ＣＤＳ−３、精製ＣＤＳ−６、精製ＣＤＳ−７及び精製ＣＤＳ−８をそれぞれ１０μＬ／ウェル添加した。これらの精製抗体の希釈はＰＢＳを用いて行い、終濃度５０．０μｇ／ｍＬから０．８４７ｎｇ／ｍＬとなるように１１段階に希釈した。室温で３０分反応した後に、ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を終濃度１８０μＭとなるように１０μＬ／ウェル添加した。室温で３０分反応した後に、プレートを４℃、３４０×ｇで２分間遠心した。遠心したプレートから新たに用意した９６ウェルＶ底プレート（住友ベークライト社）に上清を１５μＬ／ウェル移し、アセトニトリルを１５μＬ／ウェル添加した。ＬＣ／ＭＳ（実施例３に記載）によりアデノシン濃度を測定し、ＣＤＳ−１、ＣＤＳ−３、ＣＤＳ−６、ＣＤＳ−７及びＣＤＳ−８のヒトＣＤ７３酵素活性に対する阻害を、算出したＥＣ50値に基づき評価した。本アッセイは独立して試行を行い、実施例３に記載の算出方法によりＥＣ50値を算出した（表３）。
【表３】
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【０１２４】
その結果、ＣＤＳ−１、ＣＤＳ−３、ＣＤＳ−６、ＣＤＳ−７及びＣＤＳ−８はＮＣＩ−Ｈ１３７３細胞におけるヒトＣＤ７３の酵素活性を阻害することが明らかとなった。【０１２５】
［実施例５：抗ヒトＣＤ７３抗体のＡＭＰ依存的に抑制されたヒトＴ細胞機能回復の評価］
実施例１で取得したＣＤＳ−１によるＡＭＰ依存的に抑制されたヒトＴ細胞機能回復を評価するため、ヒトＣＤ７３を発現するヒトＴ細胞を用いたアッセイを実施した。本アッセイは、ヒトＴ細胞機能の回復を指標として、ＡＭＰによって抑制されていた免疫系細胞の機能を回復させることで抗腫瘍免疫を活性化させる抗体の評価が可能である。本実施例では、比較対照としてＭＥＤＩ９４４７、６Ｅ１及びＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆを用いた。ヒト末梢血単核細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社、ＰＢ００３Ｆ）からＰａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０−０９６−５３５）を用いてヒトＴ細胞を単離し、ＴｅｘＭＡＣＳTM培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０−０９７−１９６）で懸濁後、最終的な細胞密度が１×１０5ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるよう９６ウェル平底プレート（ＡＧＣ  ＴＥＣＨＮＯ  ＧＬＡＳＳ社）に５０μＬ／ウェルで播種した。その後すぐに精製ＣＤＳ−１、精製ＭＥＤＩ９４４７、精製６Ｅ１及び精製ＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆをそれぞれ２５μＬ／ウェル添加した。これら精製抗体の希釈はＴｅｘＭＡＣＳTM培地を用いて行い、終濃度１５μｇ／ｍＬから０．０５ｎｇ／ｍＬとなるように１２段階に希釈した。さらにＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を終濃度２５０μＭとなるように５０μＬ／ウェル添加した。その後すぐにＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ‐Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１１１３１Ｄ）を終濃度１×１０5ｄｙｎａｂｅａｄｓ／ウェルとなるように５０μＬ／ウェル添加した。そして各ウェルの反応溶液が２００μＬとなるようにＴｅｘＭＡＣＳTM培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ内で３日間培養した。３日後の培養上清を１００μＬ回収し、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（商品名）  ＩＦＮγ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ＡＬ２１７Ｃ）のプロトコルに基づき、上清中のインターフェロンγ（ＩＦＮγ）濃度を測定した。またヒトＴ細胞の増殖を解析するため、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（商品名）  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｇ８０８１）のプロトコルに基づき、上清１００μＬを除いた前述のプレートにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ  Ｒｅａｇｅｎｔを２０μＬ／ウェル添加した。ＥｎＶｉｓｉｏｎTM（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて４時間後に各ウェルの蛍光を測定した（励起波長５６０ｎｍ／蛍光波長５９０ｎｍ）。ＡＭＰ依存的に抑制されたヒトＴ細胞の機能をＣＤＳ−１が回復させることを、ＩＦＮγの濃度及びヒトＴ細胞の増殖を指標に算出したＥＣ50値に基づき評価した。ＥＣ50値算出にあたっては、縦軸を測定値から算出したＩＦＮγ濃度値あるいは蛍光値、横軸を抗体濃度値とし、グラフ上に描いたシグモイド曲線の形状から、抗体濃度の上昇に伴いＩＦＮγ濃度値あるいは蛍光値が収束値に達したと判断できる測定値を１００％、抗体濃度の下降に伴いＩＦＮγ濃度値あるいは蛍光値が収束値に達したと判断できる測定値を０％に設定した。ＩＦＮγ及びヒトＴ細胞の増殖を指標に４パラメーターロジステ��ック曲線回帰によりＥＣ50値を算出した（表４）。比較対象のうち、ＣＤＳ−１の抗体濃度の上昇に伴うＩＦＮγ濃度値及びヒトＴ細胞の増殖値の収束値に対しＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆの収束値が低かったため、また、ＭＥＤＩ９４４７はシグモイド曲線を描かなかったため、ＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆとＭＥＤＩ９４４７のＣＤＳ−１と比較可能なＥＣ50値は算出できなかった（図２及び図３）。
【表４】
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【０１２６】
その結果、ＣＤＳ−１は比較対照として用いたＭＥＤＩ９４４７、６Ｅ１及びＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆのいずれの抗体よりも、ＡＭＰ依存的に抑制されたヒトＴ細胞機能を強力に回復させることが示され、抗腫瘍免疫を活性化し得ることが明らかとなった。【０１２７】
［実施例６：ＣＤＳ−３及びＣＤＳ−６のＩＬ−７生理活性の評価］
実施例１で取得したＣＤＳ−３及びＣＤＳ−６によるＩＬ−７生理活性を評価するため、ヒトＩＬ−７添加により用量依存的な細胞増殖活性を示す２Ｅ８細胞株（ＡＴＣＣ：ＴＩＢ−２３９）を用いたアッセイを実施した。本実施例では、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ＡＬＸ−８０４−１３３−Ｃ１００）をネガティブコントロールとして用いた。培地は、Ｌ−グルタミン溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、２−メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及び非働化した２０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社）を含有したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｉ３３９０）を用いた。精製ＣＤＳ−３、精製ＣＤＳ−６及びリコンビナントヒトＩＬ−７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、２００−０７）を３８４ウェル平底プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にそれぞれ１０μＬ／ウェル添加した。精製ＣＤＳ−３、精製ＣＤＳ−６及びリコンビナントヒトＩＬ−７の希釈は培地を用いて行い、精製ＣＤＳ−３及び精製ＣＤＳ−６の分子量は１８００００として、終濃度１００ｎＭから０．００１ｎＭとなるように１１段階に希釈した。２Ｅ８細胞を培地で懸濁し、最終的な細胞密度が２×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるよう４０μＬ／ウェルで播種した。その後すぐに３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ内で３日間培養した。３日後の細胞増殖を解析するため、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商品名）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｇ７５７３）のプロトコルに基づき、前述のプレートにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｒｅａｇｅｎｔを５０μＬ／ウェル添加した後、ＡＲＶＯ−ＨＴＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて各ウェルの発光強度を測定した。測定した発光強度を元に精製ＣＤＳ−３、精製ＣＤＳ−６及びリコンビナントヒトＩＬ−７の細胞増殖活性を、算出したＥＣ50値に基づき評価した。ＥＣ50値算出にあたっては、縦軸を測定した発光強度、横軸を薬剤濃度値とし、１００ｎＭ  リコンビナントヒトＩＬ−７の発光強度値を１００％、ネガティブコントロールの発光強度値を０％に設定してシグモイド曲線を描画した。４パラメーターロジスティック曲線回帰により算出した精製ＣＤＳ−３、精製ＣＤＳ−６及びリコンビナントヒトＩＬ−７のＥＣ50値は０．０５０ｎＭ、１．８ｎＭ及び０．０５１ｎＭであった。【０１２８】
その結果、ＣＤＳ−３及びＣＤＳ−６はＩＬ−７生理活性を有することが明らかとなった。また、ＣＤＳ−３と比較してＣＤＳ−６のＩＬ−７生理活性が低下していることが明らかになった。【０１２９】
［実施例７：ＣＤＳ−７及びＣＤＳ−８のＩＬ−２１生理活性の評価］
実施例１で取得したＣＤＳ−７及びＣＤＳ−８のＩＬ−２１生理活性を評価するため、ヒトＩＬ−２１濃度依存的にＳＴＡＴ３リン酸化が誘導されるヒト細胞株Ｒａｍｏｓ（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５９６）を用いたアッセイを実施した。ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｒ８７５８）を用いてＲａｍｏｓ細胞をディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ内で１６時間培養した。Ｒａｍｏｓ細胞を回収後、前述の培地で懸濁し、最終的な細胞密度が２×１０5ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるよう９６ウェルプレート（日本ジェネティクス社、３５８００）に４５μＬ／ウェルで播種し、精製ＣＤＳ−７、精製ＣＤＳ−８又はリコンビナントヒトＩＬ−２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、２００−２１）をそれぞれ５μＬ／ウェル添加して反応させた。精製ＣＤＳ−７、精製ＣＤＳ−８及びリコンビナントヒトＩＬ−２１の希釈はＰＢＳ（ライフテクノロジーズ社）を用いて行い、精製ＣＤＳ−７及び精製ＣＤＳ−８の分子量は１８００００として、終濃度１２００ｎＭから０．０２ｎＭとなるように１１段階、又は４００ｎＭから０．０２ｎＭとなるように１０段階に希釈した。３７℃で３０分間反応させた後、全量を、予めＦｉｘ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、５５７８７０）を２００μＬ／ウェル添加しておいた９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、３５１１７７）に移し、３７℃で１０分間反応させて細胞を固定した。染色バッファーで洗浄後、Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、５５８０５０）を２００μＬ／ウェル添加し、氷上で３０分間反応させて細胞を透過処理した。染色バッファーとしては、Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＦＢＳ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、５５４６５６）を用いた。前述の染色バッファーで洗浄し懸濁した後、ＰＥ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｓｔａｔ３（ｐＹ７０５）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、５６２０７２）を用いてリン酸化ＳＴＡＴ３を染色した後、ＦＡＣＳＡｒｒａｙTM（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて細胞の蛍光強度を測定した。蛍光強度としてはＧｅｏｍｅｔｒｉｃ  ＭＦＩ値を用いた。測定した蛍光強度を元に精製ＣＤＳ−７、精製ＣＤＳ−８及びリコンビナントヒトＩＬ−２１のＥＣ50値を算出し、ＳＴＡＴ３リン酸化誘導活性を評価した。ＥＣ50値算出にあたっては、縦軸を測定した蛍光強度、横軸を薬剤濃度値とし、グラフ上に描いたシグモイド曲線の形状から、薬剤濃度の上昇に伴い収束値に達したと判断できる蛍光強度値を１００％、薬剤濃度の下降に伴い収束値に達したと判断できる蛍光強度値を０％に設定した。４パラメーターロジスティック曲線回帰により算出した精製ＣＤＳ−７、精製ＣＤＳ−８及びリコンビナントヒトＩＬ−２１のＥＣ50値は１．３ｎＭ、２８．３ｎＭ及び８．０ｎＭであった。【０１３０】
その結果、ＣＤＳ−７及びＣＤＳ−８はＩＬ−２１生理活性を有することが明らかとなった。また、ＣＤＳ−７と比較してＣＤＳ−８のＩＬ−２１生理活性が低下していることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明の抗ヒトＣＤ７３抗体及びその融合体は、がんの予防又は治療に有用であると期待される。また、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換された宿主細胞、及び抗体を生産する方法は、前記抗ヒトＣＤ７３抗体及びその融合体を産生するのに有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１３２】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号１及び３で示される塩基配列は、それぞれＣＤＳ−１の重鎖及び軽鎖のＫａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までをコードする塩基配列であり、配列表の配列番号２及び４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び３によりコードされる重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号５又は６で示される塩基配列は、ＣＤＳ−３の重鎖のＫａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までとリンカーを介したヒトＩＬ−７をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号５又は６によりコードされる重鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号８で示される塩基配列は、ＣＤＳ−３の軽鎖のＫａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までをコードする塩基配列である。配列表の配列番号９又は１６で示される塩基配列は、ＣＤＳ−６の重鎖のＫａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までとリンカーを介したヒトＩＬ−７改変体をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列番号９又は１６によりコードされる重鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号１１で示される塩基配列は、ＣＤＳ−７の重鎖のＫａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までをコードする塩基配列である。配列表の配列番号１２で示される塩基配列は、ＣＤＳ−７の軽鎖のＫａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までとリンカーを介したヒトＩＬ−２１をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号１３で示されるアミノ酸配列は、配列番号１２によりコードされる軽鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号１４で示される塩基配列は、ＣＤＳ−８の軽鎖のＫａｂａｔナンバリングに従う可変領域の残基番号１から定常領域のＣ末端までとリンカーを介したヒトＩＬ−２１改変体をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、配列番号１４によりコードされる軽鎖のアミノ酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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