(57)【要約】  本発明は、従来技術よりも簡易に毛由来の核酸を検出するための方法を提供する。本発明による哺乳動物の毛の中の標的核酸を検出する方法は、哺乳動物の毛を溶液中で物理的手段により破砕する工程、破砕後の溶液を核酸増幅反応に供することにより標的核酸を増幅させる工程、および、増幅された該標的核酸を検出する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の毛の中の標的核酸を検出する方法であって、
哺乳動物の毛を溶液中で物理的手段により破砕する工程、
破砕後の溶液を核酸増幅反応に供することにより標的核酸を増幅させる工程、および、
増幅された該標的核酸を検出する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
核酸を抽出する工程が行われない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該毛が、毛根を含まない毛の断片である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該標的核酸の検出が、核酸クロマトグラフィー用ストリップを用いて行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物の毛を物理的に破砕するための器具、ならびに、
核酸クロマトグラフィー用ストリップおよび核酸増幅反応用プライマーセットの少なくとも１つ
を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトや動物の毛由来の核酸の検出技術に関する。
【従来技術】
【０００２】
ヒトや動物の毛由来の遺伝子の検査により種判別を行う技術が産業上求められている。状況によっては、たった一本の毛から種判別を行うことが求められる。
【０００３】
従来からの、一本の毛髪のような少量のサンプルから核酸を検出する手法としては、サンプルから核酸を抽出した後、抽出した核酸を精製し、核酸を増幅させるという手法が採られてきた（例えば、特許文献１、２）。さらなる技術として、毛を液体窒素で凍結させたり（特許文献３、４）、毛の状態を画像で確認したり（特許文献５）といった手法も採られている。
【０００４】
しかしながら、少量のサンプルにおいては、これらの作業は煩雑であり、サンプルから核酸を確実に取得することに不安があった。そのため、より簡易的に核酸検出を可能とする技術が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第5501570号公報
【特許文献２】特開2015-73478号公報
【特許文献３】特開2009-131253号公報
【特許文献４】特開2007-20559号公報
【特許文献５】特許第4356783号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
核酸検出技術においては、サンプルから核酸を取得することが技術常識であり、サンプルから核酸を抽出、精製、回収するといった段階を経ることで、核酸を増幅し、増幅した核酸を検出している。
しかしながら、一本の毛髪のような少量のサンプルから回収できる核酸はごく微量である。エタノール沈殿のような抽出処理や夾雑物を除くフィルトレーションなどのサンプルから核酸を回収する処理を行うと、核酸がせん断される、あるいは核酸が消失してしまうことがあり得る。
従来技術としては、化学的処理を用いたり、破砕方法を工夫するなどして、サンプルから核酸を回収する手法がとられてきており、工程そのものが見直されることはなかった。【０００７】
本発明は当該技術分野の上記現状に鑑み為されたものであり、従来技術よりも簡易に毛由来の核酸を検出するための方法を提供することをその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行い、核酸の抽出、精製、回収といった処理を行わず、工程そのものを簡略化することを着想した。具体的には、本発明者らは、毛髪を含むヒトや動物の毛を化学的処理を行うことなく液中で物理的手法により破砕し、その破砕液を用いて核酸の増幅反応を行い、増幅した核酸を検出することが可能であることを見出した。本発明者らは、かかる発見に基づいてさらに検討を進め、本発明を完成させるに至った。【０００９】
本発明は即ち、以下を提供する。
［１］哺乳動物の毛の中の標的核酸を検出する方法であって、
哺乳動物の毛を溶液中で物理的手段により破砕する工程、
破砕後の溶液を核酸増幅反応に供することにより標的核酸を増幅させる工程、および、
増幅された該標的核酸を検出する工程
を含む、前記方法。
［２］核酸を抽出する工程が行われない、上記［１］に記載の方法。
［３］該毛が、毛根を含まない毛の断片である、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］該標的核酸の検出が、核酸クロマトグラフィー用ストリップを用いて行われる、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］該核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］哺乳動物の毛を物理的に破砕するための器具、ならびに、
核酸クロマトグラフィー用ストリップおよび核酸増幅反応用プライマーセットの少なくとも１つ
を含む、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、毛由来の核酸の検出において、サンプルから核酸を抽出・精製・回収する一連の工程をなくすることにより、煩雑な作業を行う必要がなく、検出に要する時間も短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例で用いた核酸検出用ストリップを説明する図である。
【図２】実施例１における核酸検出用ストリップを用いた核酸の検出の結果を示す図である。
【図３】実施例２で用いたサンプルを説明する図である。
【図４】実施例２における核酸検出用ストリップを用いた核酸の検出の結果を示す図である。
【図５】実施例３で用いたサンプルを説明する図である。
【図６】実施例３における核酸検出用ストリップを用いた核酸の検出の結果を示す図である。
【図７】実施例４における核酸検出用ストリップを用いた核酸の検出の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（定義）
本発明において、哺乳動物の種類は特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができ、好ましくはヒトである。
【００１３】
毛の採取部位は特に限定されず、毛髪、眉毛、鼻毛、ひげ、陰毛、腋毛を含むあらゆる部位の毛を本発明では使用することができる。毛は、哺乳動物の身体表面において、根元から毛を引き抜くか、あるいは毛を切除することにより採取することができる。あるいは、自然に脱落した毛を用いてもよい。
毛は、毛根から先端までの全長であってもよいし、その断片であってもよい。断片の位置は限定されない。毛は毛根を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
後述の物理的破砕処理に供する毛は、長さが、通常０．１〜１０．０ｃｍであり、好ましくは０．５〜４．０ｃｍであり、より好ましくは１．０〜２．０ｃｍである。例えば、実施例で用いるような破砕器具による破砕のためには、１ｃｍ程度の長さの毛が使いやすい。
【００１４】
標的核酸は、検出の対象とするものであって、その種類は特に限定されない。核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。標的核酸としては、その発現が、特定の疾患または状態の発症やそのリスク、治療感受性、あるいは特定の体質などに関連することが知られているものが挙げられる。上記の疾患または状態としては、癌、生活習慣病（例えば、脂質異常症、高血圧、糖尿病、肥満）、薬の副作用などが挙げられ、上記の体質としては、アルコール耐性などが挙げられる。例えば、野生型とは異なる塩基配列を有する遺伝子多型（ＳＮＰ）は、特定の疾患または状態の発症やそのリスク、治療感受性、あるいは特定の体質などに関連することが知られている。従って、好ましい遺伝子としては、そのようなＳＮＰを有する遺伝子が挙げられる。具体的な遺伝子としては、例えば、アルコール耐性に関与するアルコール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ１Ｂ）やアセトアルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ２）などが挙げられるが、これらに限定されない。
あるいは、遺伝子検査による動物種の判別のために、動物種によって塩基配列が異なる、配列が既知のＤＮＡを標的核酸としてもよい。種判別のために用い得るＤＮＡとしては、ミトコンドリアＤＮＡなどが挙げられる。
【００１５】
また、標的核酸は、１つであってもよいし、２つ以上であってもよい。本発明の一つの実施形態によれば、複数の標的核酸をマルチプレックスの核酸増幅反応により増幅させ、増幅された該複数の標的核酸を一括に検出することもできる。
【００１６】
本明細書において、毛の物理的手段による破砕または物理的破砕とは、破砕に用いる器具と毛との間の物理的な接触を伴う毛の断片化処理をいう。破砕は、均質化（ホモジナイズ）、せん断、またはすりつぶしなどにより行うことができる。物理的破砕のための手段は特に限定されず、ホモジナイザーなどの機器を適宜用いることや、液体窒素で毛を凍結し、乳鉢や手動式ミルなどを用いて破砕することができる。例えば破砕器具などの使い捨て型ホモジナイザーは簡便に使用できるため、該手段として好ましく使用できる。使い捨て型ホモジナイザーの使用は手動で行ってもよいし、市販されている専用のグラインダーを用いてもよい。
【００１７】
（核酸検出方法）
本発明は、哺乳動物の毛の中の標的核酸を検出する方法（以下、本発明の方法ともいう。）を提供する。本発明の方法は、
（工程１）哺乳動物の毛を溶液中で物理的手段により破砕する工程、
（工程２）破砕後の溶液を核酸増幅反応に供することにより標的核酸を増幅させる工程、および、
（工程３）増幅された該標的核酸を検出する工程
を含む。本発明の方法は、好ましくは、核酸を抽出または精製する工程を含まない。また、本発明の方法は、好ましくは、化学的処理により毛を分解する工程を含まない。
【００１８】
（工程１）哺乳動物の毛を溶液中で物理的手段により破砕する工程
破砕は、上述したような物理的破砕用の手段を用いて行うことができる。破砕は、例えば、目視で毛を視認できなくなる程度まで行えばよい。また、破砕の前に、エタノールなどを用いて毛のサンプルに付着した夾雑物を除去してもよい。
【００１９】
上記の溶液は、本発明の方法による標的核酸の検出を有意に阻害しない限り任意の溶液であってよく、好ましくは、緩衝作用を有する液体である。後述の工程２における核酸増幅反応のサンプルとして、上記破砕処理後の溶液を用いるので、該溶液は後述の核酸増幅反応において用いる緩衝液（バッファー）と同じものであることが好ましい。１０〜４００μＬ程度の溶液中に０．５〜５ｃｍ程度の毛を入れ、破砕処理を行うことが好ましい。また、破砕後に、遠心分離により夾雑物を沈殿させ、除去してもよい。
【００２０】
（工程２）破砕後の溶液を核酸増幅反応に供することにより標的核酸を増幅させる工程
核酸増幅反応の方法としては、標的核酸を増幅できるものである限り制限されない。本明細書において、標的核酸の増幅とは、必ずしも標的核酸（例えば標的遺伝子）の全体を増幅するものでなくてもよく、少なくとも該核酸の検出対象領域を増幅できればよい。核酸増幅反応のための方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（最も基本的な原理に基づくＰＣＲ法のみならず、それを基にした各種改良法を含む。）、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法、ＣＬＲ（Cycling Ligation Reaction；特開2016-140287、特開2016-140288に記載の技術）法などを用いることができる。ＰＣＲ法は最も広く用いられている核酸増幅法であることから当該方法に最適化された様々な試薬や機器が容易に入手できるだけでなく、上記の通り様々なバリエーションの方法があり、汎用性が極めて高いため、本発明のために好適な手法として挙げられる。
【００２１】
核酸増幅用反応液とは、前記核酸増幅反応を行う上で必要な試薬等を含有する溶液である。核酸増幅用反応液の組成は、使用する核酸増幅法によって多少異なるが、通常は基質としての４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ：以下まとめてｄＮＴＰとする）と、酵素としてのＤＮＡポリメラーゼと、前記酵素の補因子としてのマグネシウムイオンと、核酸増幅反応用プライマーセットと、をバッファー中に含むことを基本とする。ｄＮＴＰの濃度は、４種の各終濃度が１００〜４００μＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。ＤＮＡポリメラーゼは、用いる核酸増幅法に適する性質を有したものを使用する。例えば、ＰＣＲ法であれば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、その他バイオサイエンス関連の各社により開発されたもの等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましく使用される。マグネシウムイオン濃度は、終濃度が１〜６ｍＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。
【００２２】
核酸増幅反応用プライマーセットに含まれる増幅プライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸や修飾核酸、またはそれらの組み合わせによって構成される。増幅プライマーの濃度は、終濃度が１０ｎＭから２μＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。増幅プライマーの数は、標的核酸を増幅可能であれば特に問わない。増幅プライマーの塩基数は、好ましくは１５〜６０塩基であり、より好ましくは２５〜４０塩基である。ただし、増幅プライマーの増幅に関係しないタグ領域の配列は塩基数として含まない。増幅プライマー間の距離、即ち検出領域は通常５０〜５０００塩基の範囲であり、好ましくは１００〜２０００塩基である。増幅プライマーの配列は、検出領域を前記核酸増幅法によって増幅可能であり、Ｔｍ値が通常５０℃から７５℃の範囲内であり、好ましくは５５℃から６８℃の範囲内であれば特に問わない。増幅プライマーの配列のデザインは、マニュアルで行ってもよいし、適当なプライマーデザイン用のソフトウェアを用いてもよい。例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェア（http://frodo.wi.mit.edu）等を用いてもよい。
【００２３】
上記のバッファーは、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性が得られる至適ｐＨ、および至適塩濃度を有する。使用する核酸増幅法によっては、更にリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）や逆転写酵素（ＲＴ）等を含んでいてもよい。また、核酸増幅用反応液は、各核酸増幅法の反応用として様々なタイプが市販されており、そのような市販のキットに添付されたものを用いてもよい。
【００２４】
核酸増幅反応のテンプレートを含むサンプルとして、上記破砕後の溶液が核酸増幅用反応液と混合される。容量比として、核酸増幅用反応液に対して５〜５０％程度、より好ましくは１０〜３０％の上記破砕後の溶液を混合することが好ましい。また、破砕後の溶液を遠心処理に供して夾雑物を沈殿させた後、その上清を反応液との混合に用いてもよい。
【００２５】
ＰＣＲを含む核酸増幅反応の条件、操作等は、この分野で通常行われている常法に従えばよい。また、核酸増幅反応は、市販の機器や試薬を用い、その説明書に従って行うことができる。
【００２６】
（工程３）増幅された該標的核酸を検出する工程
増幅された標的核酸の検出の方法は、該増幅産物を検出できるものであれば特に限定されない。ＰＣＲ法などに用いた反応液をそのまま利用し、核酸増幅の有無を迅速かつ簡便に確認できるという点で、核酸クロマトグラフィー用ストリップを用いた検出方法が好ましい。
【００２７】
本明細書において、核酸クロマトグラフィーとは、クロマトグラフィーを用いて標的核酸を検出するための方法であって、標的核酸を含むクロマトグラフィー溶液を、特定の領域に検出用プローブを固定した固相担体の内部または表面上を展開させて、標的核酸と検出用プローブとのハイブリダイズ産物を形成させ、ハイブリダイズ産物を検出することを含む。ハイブリダイズ産物の検出は、展開に先立って（例えば、核酸増幅時に）または展開の際に、標的核酸に対して付与したシグナル要素を利用して行う。核酸クロマトグラフィーとして、例えば、特開2014-018150、特開2013-059319、特開2013-059320、特開2013-059321、特開2014-057565、特開2014-079260、特許第5503021号などに記載の技術を用いることができる。核酸クロマトグラフィーの実施形態は特に限定されず、ほぼ水平状態での展開を意図したいわゆるラテラルフロー型であってもよいし、ほぼ鉛直方向での展開を意図したいわゆるディップスティック型であってもよい。
【００２８】
本明細書において、検出用プローブを固定した上記の固相担体をストリップと呼称する。ストリップは従来公知のものを用いることができる。例えば、ストリップはプラスチックであってもよいし、ガラスであってもよく、材質は特に限定されない。また、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン等の多孔質体であってもよい。この種の多孔質体は、特に、アフィニティークロマトグラフィーにより、ストリップに固定化した検出用プローブと増幅断片とをハイブリダイゼーションさせるのに好適である。また、代表的なストリップとしては、ＴＢＡ社製の商品Ｃ-ＰＡＳがあげられる。このストリップは、幅２ｍｍ×長さ１０ｃｍ程度の検査試験紙であり、表面のニトロセルロース膜上に核酸をプローブとしてプリントしたものである。このプローブと相補的にハイブリダイゼーションするタグを持つプライマーをセットで用いることで核酸の検出が可能となる。
【００２９】
（キット）
本発明はまた、上述した本発明の方法に用いるためのキット（以下、本発明のキットともいう。）も提供する。本発明のキットは、哺乳動物の毛を物理的に破砕するための器具、ならびに、上述の核酸クロマトグラフィー用ストリップおよび核酸増幅反応用プライマーセットの少なくとも一つを含む。上記の破砕器具は、上述したような器具を適宜用いることができる。一実施形態において、本発明のキットは、該破砕器具、該ストリップ、および該プライマーセットを含む。本発明のキットが該ストリップを含む場合、該キットは展開用緩衝液をさらに含むことが好ましい。また、本発明のキットが該プライマーセットを含む場合、該キットは、核酸増幅反応を行うために必要な、上述したようなその他の構成要素も含むことが好ましい。
【００３０】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
本発明の方法による毛由来の核酸の検出を以下の手順で行った。以下、これらの順序に従って説明する。なお、本実施例での検出は、核酸クロマトグラフィーのストリップを用いた目視による確認であるが、検出方法はあくまでも一例であり、その他の方法でも検出は可能である。
手順：
１．サンプルの調製
２．標的核酸の増幅反応
３．標的核酸の検出反応（核酸クロマトグラフィーを使用）【００３２】
１．サンプル調製
ヒトまたは動物の毛のサンプルを調製する。
１−１．サンプルの粉砕
サンプルをエタノールで洗浄し、サンプルに付着した夾雑物を除去した後、サンプルを任意の長さに切り取る（この時、毛根部は除去）。ＴＥバッファー２０μＬを入れた１．５ｍＬチューブに調製したサンプルを入れ、バイオマッシャー（登録商標）ＩＩ（ニッピ社製）を用いて、サンプルが視認できない程度まで粉砕する。そのサンプル調製液を増幅反応に用いる。【００３３】
２．標的核酸の増幅反応
２−１．反応液の調製
１の工程で得たサンプル調製液を用いて核酸の増幅反応を行う。反応液は０．２ｍＬチューブに下記表の通りに調製する。調製液は上清１μＬを増幅反応に用いる。サンプル増幅試薬としてＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いる。【００３４】
【表１】
2017164354.tif 000002
【００３５】
プライマー配列は、標的とする核酸を増幅できる限り、特に制限されない。
２−２．ＰＣＲ
ＰＣＲにはＶｅｒｉｔｉ（登録商標）サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いる。サーマルサイクル反応（９５℃で９分後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクル、その後７２℃で５分後、４℃に下げる）を行う。【００３６】
３．標的核酸の検出反応
検出用のストリップを用いて、核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応によって検出を行う。ストリップはＴＢＡ社製のものを使用した（図１）。
３−１．反応液の調製
２の工程で得られた増幅核酸を、核酸クロマトグラフィーを用いて検出する。反応液は下記表の通りに調製した。ＴＥバッファー、展開液（藤倉化成社製）、ラテックスビーズ（藤倉化成社製）を用いる。１サンプルにおける反応液の組成は下記の通りである。【００３７】
【表２】
2017164354.tif 000003
【００３８】
反応液を１．５ｍＬチューブに３０．０μＬ加え、５０℃で５分間以上加温する。その後、ＰＣＲ反応液１０．０μＬをこの反応液に加えて混合し、２分間静置する。
３−２．標的核酸の確認
上記の混合反応液に核酸クロマトグラフィーストリップを挿入し、４０分間静置する。標的の核酸があればストリップ上に青いラインとして現れるので、標的核酸の増幅可否を目視で判定する。【００３９】
実施例１
ヒトの毛髪由来の標的核酸の検出の有無を確認するため、全く別の由来の毛髪を３式用意して実験を行った。
実験方法の手順の通りに核酸検出を行った。サンプルはヒトの毛髪由来の核酸とし、１本の異なるヒトの毛髪を用意し、毛根を切り取り、長さを２ｃｍ程度にした。また、Ｎはネガティブコントロールである。
検出結果を図２に示す。この結果から、ヒト由来の毛髪から標的核酸が検出できることを確認できた。また、Ｎのラインからはラインが検出されず、サンプルがない状態では反応しないことが確認できた。【００４０】
実施例２
ヒトの毛髪由来の核酸の検出成功率が、毛髪中の採取部位によって変化するかを確認するため、２式の実験を行った。４７ｃｍの毛髪を用意し、毛根を含む１ｃｍ長の毛髪と５ｃｍ間隔に１ｃｍ長の毛髪を９式用意して実験を行った（サンプル１）。また、Ｎはネガティブコントロールである。４１ｃｍの毛髪を用意し、毛根を除いた５ｃｍ間隔に１ｃｍ長の毛髪を８式用意して実験を行った（サンプル２）。また、Ｎはネガティブコントロールである（図３を参照）。
実験方法の手順の通りに核酸検出を行った。検出結果を図４に示す。この結果から、毛根の有無や毛髪の部位に関係なく標的核酸が検出できることを確認できた。また、Ｎのラインからはラインが検出されず、サンプルがない状態では反応しないことが確認できた。【００４１】
実施例３
ヒトの毛髪由来の核酸の検出成功率が毛髪の長さによって影響するか確認するため、図５のように、毛髪の毛先から長さを０．５ｃｍ刻みに０．５−４．０ｃｍの毛髪を調製して実験を行った。また、Ｎはネガティブコントロールである（図５を参照）。
実験方法の手順の通りに核酸検出を行った。検出結果を図６に示す。この結果から、毛髪の長さが０．５ｃｍ以上であれば、標的核酸が検出できることを確認できた。また、Ｎのラインからはラインが検出されず、サンプルがない状態では反応しないことが確認できた。
なお、毛髪の長さが３．５ｃｍ、４．０ｃｍにおいてコモンプライマーのラインが薄いのは、毛髪量が過剰でそれに伴いＰＣＲ阻害物質も増加したためだと思われる。【００４２】
実施例４
ヒト以外の動物の標的核酸を検出できるか否かを確認するため、ヒトの毛髪とイヌとネコの獣毛を用いて実験を行った。
実験方法の手順の通りに核酸検出を行った。ポジティブコントロールとしてヒト、イヌ、ネコの既知ＤＮＡを用いた。また、Ｎはネガティブコントロールである。検出結果を図７に示す。サンプルとポジティブコントロールについて反応が確認できた。また、Ｎのラインからはラインが検出されず、サンプルがない状態では反応しないことが確認できた。この結果から、ヒトの毛髪とイヌやネコの獣毛を用いても標的核酸の検出により種判定ができることを確認できた。さらに、ヒトやイヌ、ネコの毛をマルチプレックスで検出できることが確認できた。【００４３】
結果：
従来の技術では、毛根をすりつぶして核酸を抽出することが一般的であった。しかしながら、状況によっては毛根のない毛や長さが短い毛などがあり、単純に毛から核酸を抽出することができない。
本発明により、毛根の有無や毛中の部位や長さに関係なく、酵素等による化学的な破砕処理を行わなくても、簡便、簡単、迅速に毛のサンプルを用いてマルチプレックスの遺伝子検査を行うことができる。さらには、核酸抽出を行わなくても、毛のサンプルを用いて、遺伝子検査を行えることが確認できた。【００４４】
本出願は、日本で出願された特願２０１６−０６０２０１（出願日：２０１６年３月２４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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