(57)【要約】  本発明は、ナイーブ型多能性幹細胞の未分化と多能性（多分化能）を維持しつつ、ナイーブ型多能性幹細胞を効率よく増殖させるためのナイーブ型多能性幹細胞培養用培地を提供する。本発明の培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含む、ナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
【請求項２】
ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２である、請求項１に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
【請求項３】
ＭＥＫ阻害剤を含んでいない、請求項１または２に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
【請求項４】
フィーダー細胞および細胞外マトリクスを含んでいない、請求項１〜３のいずれか１項に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
【請求項５】
増殖因子を更に含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
【請求項６】
浮遊培養に使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
【請求項７】
ナイーブ型多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
【請求項８】
ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含む培地中でナイーブ型多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞のナイーブ型を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とする、多能性幹細胞の培養方法。
【請求項９】
ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２である、請求項８に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１０】
培地中にＭＥＫ阻害剤を含んでいない、請求項８または９に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１１】
培地中にフィーダー細胞および細胞外マトリクスを含んでいない、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１２】
浮遊培養で実施される、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１３】
ナイーブ型多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナイーブ型多能性幹細胞の未分化と多能性（多分化能）を維持しつつ、ナイーブ型多能性幹細胞を効率よく増殖させるためのナイーブ型多能性幹細胞培養用培地を提供することを目的とする。また、本発明は、多能性幹細胞の未分化性と多能性（多分化能）を維持しつつ、かつナイーブ型を維持しながら多能性幹細胞を増殖する方法を提供することを目的とする。
【背景技術】
【０００２】
ヒトｉＰＳ細胞は、体細胞に３〜４因子の遺伝子を導入することにより誘導でき、生体内の殆ど全ての細胞に分化する能力（多能性）を有する細胞である。この特性から、生体組織をｉＰＳ細胞から人工的に作製し、患者の体内に移植することにより、これまで治療が困難であった疾患を治療する再生医療への応用が期待されている。また、従来、入手できなかったヒト細胞を作製できる可能性があることから、疾患解明モデルや新規薬剤の効果、あるいは、安全性評価などのスクリーニングへの応用も期待されている。【０００３】
ヒトｉＰＳ細胞を含むヒト多能性幹細胞は、マウスあるいはヒトなどの胎児由来線維芽細胞や、あるいは胎盤由来細胞などをフィーダー細胞として用いたオンフィーダー培養、またはマトリジェルや、ビトロネクチン、ラミニン、ファイブロネクチンなどの細胞外マトリックスや、あるいは組換えタンパク質などを細胞外マトリックスでコーティングした表面を有するフラスコを用いたフィーダーレス培養により、継代維持することができる。【０００４】
しかしながら、これら手法は細胞をフラスコ表面に接着させながら２次元的に培養するものであるため、細胞の大量調製には非効率的である。したがって、ヒトｉＰＳ細胞を３次元的に浮遊培養することができれば、少ないコストで大量の細胞を培養することが可能になると期待される。【０００５】
接着細胞は、マイクロキャリアビーズなどを用いない限り、浮遊培養することはできない。ヒト多能性幹細胞は、浮遊させると、凝集塊を作製し、自発的に分化することが知られている。また、ヒトｉＰＳ細胞を浮遊培養する場合には、ヒトｉＰＳ細胞を単一細胞または数個〜数１０個の細胞群に分散する必要があるが、このとき、ヒトｉＰＳ細胞はアポトーシスを起こすという問題を有している。この問題に対しては、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ）阻害剤であるＹ−２７６３２を培地に添加することにより、細胞間接着が促進され、単一細胞または数個〜数１０個の細胞群の状態にしたときのヒトｉＰＳ細胞のアポトーシスを抑制することが知られている（非特許文献１）。【０００６】
近年、多能性幹細胞は「ナイーブ型」と「プライム型」に分類されている。マウスにおいては、着床前のエピブラストの性質をもつナイーブ型と、着床後のエピブラストの性質をもつプライム型を培養する条件が知られている。「ナイーブ型」の方がより未分化な状態であり、キメラ個体を作り出す能力が高く、特に精子や卵子などの生殖細胞に分化する能力があるため、プライム型よりも質的に優れていることが挙げられる。また、重層化したドーム状コロニーを形成し、均一で安定に増殖する。また、凝集塊として無血清培養下に浮遊培養できるとの報告もある（非特許文献２）。一方、ヒトの場合は、着床前受精卵内部細胞塊から作製した場合は「プライム型」になることが知られている。また、ヒトｉＰＳ細胞もプライム型である。【０００７】
既報のヒトｉＰＳ細胞の浮遊培養系には、Ｙ−２７６３２が１０μＭ濃度で添加されるのが一般的であるが（非特許文献３〜８）、この場合、ヒトｉＰＳ細胞は細胞の形状やマーカー遺伝子の発現パターンから「プライム型」であると考えられる。【０００８】
マウスＥＳ細胞においてはＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ阻害剤およびＬＩＦを含む２ｉ／Ｌ培地中で培養することにより、ナイーブ型に移行することが報告されている。一方、２ｉ／Ｌ培地中でマウスのエピブラスト幹細胞やヒトの多能性幹細胞を培養すると細胞は分化することが知られている。【０００９】
ヒトｉＰＳ細胞を「ナイーブ型」に誘導する方法としては、ＭＥＫ阻害剤（ＰＤ０３２５９０１）、ＧＳＫ阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１、ＩＭ１２、またはＢＩＯ）、ＪＮＫ阻害剤（ＳＰ６００１２５）、Ｐ３８阻害剤（ＳＢ２０３５８０）、ＰＫＣ阻害剤（Ｇｏ６９８３）、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）、ＢＭＰ阻害剤（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、ＢＲＡＦ阻害剤（ＳＢ５９０８８５）、ＳＲＣ阻害剤（ＷＨ−４−０２３）のいずれかまたは複数のシグナル阻害剤を含む培地を用いたフィーダー培養またはフィーダーレス培養を行うことで「ナイーブ型」を誘導する方法が報告されている（非特許文献９〜１４）。【００１０】
上記「ナイーブ型」誘導法の共通点は、培地がＭＥＫ阻害剤とＧＳＫ阻害剤を必ず含み、フィーダー細胞またはマトリジェルを用いた接着培養により細胞を増殖させる点である。これら方法により誘導された「ナイーブ型」細胞では一般的な培地中で見られる「プライム型」と比較してＳＴＥＬＬＡやＴＦＣＰ２Ｌ１などの「ナイーブ型」に特有の遺伝子の発現が顕著に増加することが知られている。【００１１】
ヒトｉＰＳ細胞を、ＭＥＫ阻害剤を含まないで培養することにより、「ナイーブ型」のヒトｉＰＳ細胞を誘導した例は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Watanabe K. el. Al., NATURE BIOTECHNOLOGY VOLUME 25, p.681
【非特許文献２】Hayashi Yohei et al. Stem Cells. 25, 3005-15 (2007)
【非特許文献３】Ayumi Horiguchi et al. Journal of Bioscience and Bioengineering VOL. 118 No. 5, 588-592, 2014
【非特許文献４】Methods Enzymol., 325 (2000), pp. 273-284
【非特許文献５】Nature Biotechnology 25, 681 - 686 (2007)
【非特許文献６】Guokai Chen et al. Cell Stem Cell 7, 240-248 (2010)
【非特許文献７】Nil Emre et al. PLoS One 5, e12148 (2010)
【非特許文献８】Yuehong Wu et al. Theriogenology (2015) [Epub ahead of print]
【非特許文献９】Yasuhiro Takashima et al., Cell 158, 1254-1269 (2014)
【非特許文献１０】Thorold W. Theunissen et al. Cell Stem Cell 15, 471-487 (2014)
【非特許文献１１】Carol B. Ware et al. PNAS 111, 4484-4489 (2014)
【非特許文献１２】Bahram Valamehr et al. Stem Cell Reports 2, 366-381 (2014)
【非特許文献１３】Yun-Shen Chan et al. Cell Stem Cell 13, 663-675 (2013)
【非特許文献１４】Ohad Gafni et al. Nature 504, 282-286 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ナイーブ型多能性幹細胞の未分化と多能性（多分化能）維持しつつ、ナイーブ型多能性幹細胞を効率よく増殖させるためのナイーブ型多能性幹細胞培養用培地を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤を培地中に存在させることにより上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成させた。【００１５】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（９）に関する。
（１）ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含む、ナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
（２）ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２である、（１）に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
（３）ＭＥＫ阻害剤を含んでいない、（１）または（２）に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
（４）フィーダー細胞および細胞外マトリクスを含んでいない、（１）〜（３）のいずれか１に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
（５）増殖因子を更に含む、（１）〜（４）のいずれか１に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
（６）浮遊培養に使用される、（１）〜（５）のいずれか１に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
（７）ナイーブ型多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、（１）〜（６）のいずれか１に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
（８）ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含む培地中でナイーブ型多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞のナイーブ型を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とする、多能性幹細胞の培養方法。
（９）ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２である、（８）に記載の多能性幹細胞の培養方法。
（１０）培地中にＭＥＫ阻害剤を含んでいない、（８）または（９）に記載の多能性幹細胞の培養方法。
（１１）培地中にフィーダー細胞および細胞外マトリクスを含んでいない、（８）〜（１０）のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
（１２）浮遊培養で実施される、（８）〜（１１）のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
（１３）ナイーブ型多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、（８）〜（１２）のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地によれば、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤を含むことにより、ナイーブ型多能性幹細胞の未分化と多能性（多分化能）維持しつつ、ナイーブ型多能性幹細胞を効率よく増殖させることができる。また、本発明の多能性幹細胞の培養方法によれば、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中でナイーブ型多能性幹細胞を培養することにより、未分化と多能性（多分化能）維持しつつ、多能性幹細胞のナイーブ型を効率よく維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下でのｉＰＳ細胞の増殖を観察した結果を示す図である。
【図２】図２は、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下でのｉＰＳ細胞の数、およびｉＰＳ細胞の生存率を測定した結果を示すグラフである。
【図３】図３Ａ〜図３Ｄは、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下での、ｉＰＳ細胞の未分化マーカー遺伝子であるＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ３／４、ナイーブ型に特異的なマーカー遺伝子であるＳＴＥＬＬＡ、並びに中肺葉分化に特異的なマーカー遺伝子であるＮＣＡＭの発現量をリアルタイムＰＣＲにより確認した結果をそれぞれ示すグラフである。
【図４】図４は、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤および増殖因子存在下における、ｉＰＳ細胞の増殖を示すグラフである。
【図５】図５Ａ〜図５Ｄは、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤および増殖因子存在下における、ｉＰＳ細胞の未分化マーカー遺伝子およびナイーブ型に特異的なマーカー遺伝子の発現を示すグラフである。
【図６】図６は、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤および低分子化合物の存在下における、ｉＰＳ細胞の増殖率を示すグラフである。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤および低分子化合物の存在下における、ｉＰＳ細胞の未分化マーカー遺伝子の発現を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１．ナイーブ型多能性幹細胞培養用培地
本発明は、ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含む、ナイーブ型多能性幹細胞培養用培地（以下、「本発明の培地」ともいう。）である。本発明の培地は、多能性幹細胞用基礎培地に、５μＭ以下のＲＯＣＫ阻害剤を含んでなる。
【００１９】
前記多能性幹細胞用基礎培地としては、ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で添加することにより、ナイーブ型多能性幹細胞の未分化と多能性（多分化能）を維持しつつ、ナイーブ型多能性幹細胞を効率よく増殖させることのできる培地であれば、特に制限されないが、調製が容易であり、ロットごとのばらつきを防ぐ点から化学合成培地が好ましい。
【００２０】
前記多能性幹細胞用基礎培地は、１種類以上の糖（類）、１種類以上の無機塩（類）、１種類以上のアミノ酸（類）、１種類以上のビタミン（類）、および１種類以上の微量成分（類）を含むことが好ましい。また、薬剤感受性試験に使用するためにカナマイシン等の抗生物質を適宜含むこともできる。
【００２１】
前記糖（類）としては、例えば、グルコース、ラクトース、マンノース、フルクトースおよびガラクトース等の単糖類、並びにスクロース、マルトースおよびラクトース等の二糖類が挙げられる。これらの中でもグルコースが特に好ましい。これら糖類は、１または２以上組み合わせて添加することもできる。
【００２２】
前記無機塩（類）としては、例えば、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸銅五水和物、硝酸鉄（ＩＩＩ）九水和物、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、塩化マグネシウム六水和物、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム二水和物および硫酸亜鉛七水和物が挙げられる。多能性幹細胞の未分化状態の維持に有利に作用する成分であればいずれの無機塩類またはその組合せも用いることができる。
【００２３】
前記アミノ酸（類）としては、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン等が挙げられ、Ｌ−体のアミノ酸が好ましい。前記アミノ酸（類）には、これらの誘導体、塩および水和物などの派生物を含めることができる。
【００２４】
アルギニンの派生物としては、例えば、Ｌ−塩酸アルギニンおよびＬ−アルギニン一塩酸塩等が挙げられる。アスパラギン酸の派生物としては、例えば、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム塩一水和物、Ｌ−アスパラギン酸一水和物、Ｌ−アスパラギン酸カリウム、Ｌ−アスパラギン酸マグネシウム等が挙げられる。
【００２５】
システインの派生物としては、例えば、Ｌ−システイン二塩酸塩およびＬ−システイン塩酸塩一水和物等が挙げられる。リジンの派生物としては、例えば、Ｌ−リジン塩酸塩等が挙げられる。グルタミン酸の派生物としては、Ｌ−グルタミン酸一ナトリウム塩等が挙げられる。
【００２６】
アスパラギンの派生物としては、例えば、Ｌ−アスパラギン一水和物等が挙げられる。チロシンの派生物としては、例えば、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物等が挙げられる。ヒスチジンの派生物としては、例えば、ヒスチジン塩酸塩およびヒスチジン塩酸塩一水和物等が挙げられる。リジンの派生物としては、例えば、Ｌ−リジン塩酸塩等が挙げられる。
【００２７】
前記ビタミン（類）としては、例えば、アスコルビン酸、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ナイアシン、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２およびパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）が挙げられる。これらの中でも、アスコルビン酸は添加されることが好ましい。前記ビタミン（類）には、これらの誘導体、塩および水和物などの派生物を含めることができる。
【００２８】
アスコルビン酸の派生物としては、例えば、アスコルビン酸２−リン酸エステル（Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸硫酸ナトリウム、リン酸アスコルビルアミノプロピルおよびアスコルビン酸リン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００２９】
コリンの派生物としては、例えば、塩化コリン等が挙げられる。ナイアシンの派生物としては、例えば、ニコチン酸、ニコチン酸アミドおよびニコチニックアルコール等が挙げられる。パントテン酸の派生物としては、例えば、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウムおよびパンテノール等が挙げられる。
【００３０】
ピリドキシンの派生物としては、例えば、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール塩酸塩、リン酸ピリドキサールおよびピリドキサミン等が挙げられる。チアミンの派生物としては、例えば、塩酸チアミン、硝酸チアミン、硝酸ビスチアミン、チアミンジセチル硫酸エステル塩、塩酸フルスルチアミン、オクトチアミンおよびベンフォチアミン等が挙げられる。
【００３１】
前記微量成分は多能性幹細胞の未分化状態の維持に有利に作用する成分であることが好ましい。前記微量成分としては、例えば、グルタチオン、ヒポキサンチン、リポ酸、リノレン酸、フェノールレッド、プトレシン、ピルビン酸、チミジンおよびＮａＨＣＯ３等通常培地成分として用いられている成分が挙げられる。前記微量成分には、これらの誘導体、塩および水和物などの派生物を含めることができる。派生物としては、例えば、プトレシン二塩酸を挙げることができる。
【００３２】
多能性幹細胞用基礎培地として具体的には、例えば、市販のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０培地およびＦ１２培地等の公知の化学合成培地などの培地、並びにＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＭＥＭとＦ１２培地を１：１で混合した培地）等のこれらの培地のいずれか２以上を適当な割合で混合した培地、およびこれらの培地に前記アスコルビン酸、好ましくはアスコルビン酸２−リン酸エステルを添加した培地が挙げられる。
【００３３】
特にアニマルプロダクトフリーの基礎培地として、Miho Furue et al. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 41, 19-28 (2005)に示されるＥＳＦ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（以下、「ｍＥＳＦ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ」ともいう）を好適に例示することができる。
【００３４】
ＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏキナーゼの活性を阻害する物質を意味する。Ｒｈｏキナーゼとは、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）の分解酵素であるＧＴＰアーゼの範疇に含まれる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（低分子量Ｇタンパク質）の１種で、アミノ末端にセリン／スレオニンキナーゼ領域、中央部にコイルドコイル領域およびカルボキシ末端にＲｈｏ相互作用領域を有する。
【００３５】
ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩（Ｙ−２７６３２）、１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン（Ｈ−７）、１−（５−イソキノリンスルホニル）−３−メチルピペラジン（イソＨ−７）、Ｎ−２−（メチルアミノ）エチル−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ−８）、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ−９）、Ｎ−［２−（ｐ−ブロモシンナミルアミノ）エチル］−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ−８９）、Ｎ−（２−グアニジノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミド塩酸塩（ＨＡ−１００４）、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン二塩酸塩（Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ−１０７７）および（Ｓ）−（＋）−２−メチル−４−グリシル−１−（４−メチルイソキノリニル−５−スルホニル）ホモピペリジン二塩酸塩（Ｈ−１１５２）等が挙げられる。これらの中でも、（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩（Ｙ−２７６３２）が好ましい。
【００３６】
本発明の培地に含まれるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、５μＭ以下であり、好ましくは４μＭ以下であり、更に好ましくは３μＭ以下であり、より更に好ましくは２μＭ以下であり、特に好ましくは１．５μＭ以下である。また、ＲＯＣＫ阻害剤濃度の下限値は特に制限されないが、通常０．３μＭ以上とすることが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が５μＭを超えると、多能性幹細胞のナイーブ型の割合が低下する。また、０．３μＭ以上とすることにより、多能性幹細胞の増殖が低下するのを抑制することができる。
【００３７】
多能性幹細胞のナイーブ型を維持するためには、通常、ＭＥＫ阻害剤を培地に含有する必要があったが、本発明の培地には、５μＭ以下のＲＯＣＫ阻害剤が含まれていることにより、該培地を用いて多能性幹細胞を培養した場合に、多能性幹細胞のナイーブ型が維持されるので、培地にＭＥＫ阻害剤を含有させる必要はない。
【００３８】
本発明の培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含んでいるため、多能性幹細胞を単細胞細胞または数個から数１０個の細胞群に分散した場合にアポトーシスを起こしにくくなっている。このため、本発明の培地は、多能性幹細胞を浮遊培養する場合にも、好ましく用いられる。このように、多能性幹細胞を浮遊培養することができるので、少ないコストで大量の細胞を生産することが可能になる。
【００３９】
したがって、本発明の培地には、浮遊培養を行うときに、接着培養に必要であった、フィーダー細胞および細胞外マトリクスを含まなくてもよい。
【００４０】
本発明の培地には、増殖因子を更に含有させてもよい。本発明の培地は、そのＲＯＣＫ阻害剤の含有量が低いため、多能性幹細胞の増殖が低下する場合がある。本発明の培地に、増殖因子を含有させることにより、多能性幹細胞の増殖が回復するという効果が発揮される。
【００４１】
増殖因子としては、例えば、アクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ）トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、マクロファージ炎症蛋白質−１α（ＭＩＰ−１α）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子−１、２、３、４、５、６、７、８または９（ＦＧＦ−１、２、３、４、５、６、７、８または９）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、ケモカイン、Ｎｏｔｃｈリガンド（例えば、Ｄｅｌｔａ１など）、Ｗｎｔ蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質２、３、５または７（Ａｎｇｐｔ２、３、５または７）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）およびヘパラン硫酸等が挙げられる。これらの中でも、ＦＧＦ２、ＬＩＦまたはヘパラン硫酸が好ましい。
【００４２】
本発明の培地においては、増殖因子を単独で用いてもよく、または２種以上を組み合わせて用いてもよい。増殖因子を用いる場合、その濃度は、通常０．１〜１０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、より好ましくは１〜２０ｎｇ／ｍＬである。
【００４３】
また、本発明の培地には、ＧＳＫ３阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤またはＢＭＰを阻害する内在性タンパク質等を含有させてもよい。このような化合物を培地に含有させることによって、ナイーブ型多能性幹細胞の未分化と多能性（多分化能）を維持しつつ、ナイーブ型多能性幹細胞を効率よく増殖させることができる。
【００４４】
ＧＳＫ３阻害剤としては、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１（６−｛２−［４−（２，４−ジクロロ−フェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチルアミノ｝−ニコチノニトリル）、ＣＨＩＲ９８０１４（２−［［２−［（５−ニトロ−６−アミノピリジン−２−イル）アミノ］エチル］アミノ］−４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ピリミジン）、ＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＴＤＺＤ−８（４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）およびＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、１−ＡｚＫｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−ピリド［３’，２’：２，３］アゼピノ［４，５−ｂ］インドール−６（５Ｈ）−オン）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ−［３，２−ｄ］−［１］ベンズアゼピン−６（５Ｈ）−オン）等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの中でもＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。
【００４５】
ＢＲＡＦ阻害剤としては、例えば、ＧＤＣ−０８７９、ＢＡＹ  ７３０４５０６（レゴラフェニブ）、ＲＡＦ２６５（ＣＨＩＲ−２６５）、ＳＢ５９０８８５およびソラフェニブが挙げられるが、これらに限定されない。これらの中でもＳＢ５９０８８５が好ましい。
【００４６】
ＢＭＰ阻害剤としては、転写因子であるＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５またはＳＭＡＤ８を活性化する、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６またはＢＭＰ７を阻害する化合物、例えば、Ｎｏｇｇｉｎ、ｃｈｏｒｄｉｎおよびｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ等が挙げられる。これらの中でもＮｏｇｇｉｎが好ましい。
【００４７】
ＭＥＫ阻害剤としては、例えば、ＭＥＫ１を阻害するＰＤ１８４３５２及びＰＤ９８０５９、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２を阻害するＰＤ０３２５９０１、Ｕ０１２６及びＳＬ３２７等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４８】
本発明の培地においては、前記ＧＳＫ３阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤またはＢＭＰを阻害する内在性タンパク質等を単独で用いてもよく、または２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、その濃度は、通常０．００１〜２０μＭが好ましく、より好ましくは０．０２〜１０μＭである。
【００４９】
本発明のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地は、ナイーブ型多能性幹細胞の未分化と多能性（多分化能）を維持しつつ、ナイーブ型多能性幹細胞を効率よく増殖させるために使用されるが、具体的にはヒトの多能性幹細胞を対象とする。
【００５０】
多能性幹細胞としては、例えば、初期胚より単離される胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）；胎児期の始原生殖細胞から単離される胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＧ細胞）（例えば、Proc Natl Acad Sci U S A. 1998, 95:13726-31参照）；出生直後の精巣から単離される生殖細胞系列幹細胞（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＧＳ細胞）（例えば、Nature. 2008, 456:344-9参照）；腸骨骨髄または顎骨骨髄等の骨髄由来の幹細胞；脂肪組織由来の幹細胞などの間葉系幹細胞；皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入することで、被検体自身の体細胞の脱分化を誘導し、ＥＳ細胞同様の多能性を有する体細胞由来人工多能性幹細胞［または誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ｉＰＳ細胞）］が挙げられる。
【００５１】
具体的には、例えば、ヒトＥＳ細胞Ｈ９株（ＷＡ０９）；ヒトＥＳ細胞Ｈ１（ＷＡ０１）株（ウィスコンシン大学、ＷＩＳＣ  Ｂａｎｋ）；ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２およびＫｈＥＳ−３（京大再生研付属幹細胞医学研究センター、理化学研究所バイオリソースセンター）並びにＨＥＳ３、ＨＥＳ４およびＨＥＳ６（モナッシュ大学、ＷＩＳＣ  Ｂａｎｋ、）などのヒトＥＳ細胞；Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ−Ｍｙｃ遺伝子およびＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（京都大学ｉＰＳ細胞研究所、理化学研究所バイオリソースセンター）；Ｔｉｃ（ＪＣＲＢ１３３１株）、Ｄｏｔｃｏｍ（ＪＣＲＢ１３２７株）、Ｓｑｕｅａｋｙ（ＪＣＲＢ１３２９株）、Ｔｏｅ（ＪＣＲＢ１３３８株）、およびＬｏｌｌｉｐｏｐ（ＪＣＲＢ１３３６株）（以上成育医療センター、医薬基盤健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンク）；ＵＴＡ−１株（東京大学）およびＵＴＡ−１−ＳＦ−２−２株（ＪＣＲＢ１４９３）（東京大学、医薬基盤健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンク）；Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子およびＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106）（京都大学ｉＰＳ細胞研究所、理化学研究所バイオリソースセンター、医薬基盤健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンク）等のｉＰＳ細胞が挙げられる。
【００５２】
２．多能性幹細胞の培養方法
次に、本発明の多能性幹細胞の培養方法について説明する。本発明の多能性幹細胞の培養方法は、ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含む培地中でナイーブ型多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞のナイーブ型を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とする方法（以下、「本発明の培養方法」ともいう。）である。ＲＯＣＫ阻害剤については上述した通りであり、その好ましい濃度についても上述した通りである。
【００５３】
多能性幹細胞のナイーブ型を維持するためには、通常、ＭＥＫ阻害剤を培地に含有させる必要があったが、本発明の培養方法においては、培地中に５μＭ以下のＲＯＣＫ阻害剤が含まれており、このため、この培地を用いて多能性幹細胞を培養した場合に、多能性幹細胞のナイーブ型が維持されるので、本発明の培養方法においては、培地にＭＥＫ阻害剤を含有させる必要はない。
【００５４】
本発明の培養方法は浮遊培養で行うことが好ましい。浮遊培養で培養を行うことにより、少ないコストで大量の細胞を生産することが可能になる。したがって、本発明の培養方法は、浮遊培養で培養を行う時に、接着培養に必要であったフィーダー細胞および細胞外マトリクスを用いて細胞培養を行う必要がない。
【００５５】
本発明の培養方法では、多能性幹細胞の増殖効率を高めるために、増殖因子を用いてもよい。本発明の培養方法に用いられる増殖因子の種類、培地への添加量は上述した通りである。
【００５６】
また、本発明の培養方法では、ＧＳＫ３阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤またはＢＭＰを阻害する内在性タンパク質等を用いてもよい。ＧＳＫ３阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤またはＢＭＰを阻害する内在性タンパク質等の種類、培地への添加量は上述した通りである。
【００５７】
本発明の培養方法における培養は、通常３３〜４０℃、好ましくは３４〜３９℃、より好ましくは３７℃にて、通常１〜２０％、好ましくは３〜１５％、より好ましくは８〜１０％の二酸化炭素の存在下で、通常７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは１００％の高湿度下で行なうことが好ましい。
【００５８】
使用することのできる多能性幹細胞としては上述した通りである。
【００５９】
本発明の培養方法により培養される細胞が未分化性、およびナイーブ型を維持している細胞であるか否かを確認する方法としては、例えば、各種マーカー（タンパク質）に対する抗体を用いて、未分化マーカーの発現の検出および／または分化マーカーの発現の不検出により判定する方法、各種マーカー（遺伝子）の発現の検出により判定する方法、細胞の形態学的特徴を観察する方法、並びに特定の分化誘導因子の刺激により特定の細胞に分化する能力を発揮できるか否かを判定する方法が挙げられる。
【００６０】
前記マーカーを用いて判定する方法においては、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３／４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−２−５４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８０、ＣＤ９０またはアルカリホスファターゼ等の未分化マーカーが発現している場合は、本発明の培養方法で培養した多能性幹細胞が未分化性を維持していると判断することができる。また、ＳＴＥＬＬＡ等のマーカーが発現している場合は、本発明の培養方法で培養した多能性幹細胞がナイーブ型であると判断することができる。
【００６１】
前記未分化および／または分化マーカーの発現をタンパク質レベルで確認する場合には、例えば、各マーカーの特異抗体を用いて、フローサイトメトリー法、免疫染色法またはＥＬＩＳＡ等により確認することができる。前記マーカーの発現を遺伝子レベルで確認する場合には、例えば、各マーカー遺伝子の、特異的プライマー対を用いたＲＴ−ＰＣＲまたは特異的プローブを用いたノーザンブロッティング若しくはマイクロアレイ解析等によって確認することができる。
【００６２】
前記フローサイトメトリー法によりマーカー発現の有無を確認する方法としては、例えば、次の方法が挙げられる。本発明の方法で培養した細胞を１ｍｌの１０％ヤギ血清中に３０分間懸濁後遠心分離し、次に対象のマーカータンパク質に対するマウス抗体とともに３０時間インキュベートし、その後当該培養細胞を、１％ヤギ血清を含有するＰＢＳで３回洗浄し、蛍光標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、１％ヤギ血清を含有するＰＢＳで３回洗浄し、再懸濁した細胞を適切なフローサイトメトリー用機器を用いて判定することができる。
【００６３】
前記免疫染色法によりマーカー発現の有無を確認する方法としては、例えば、次の方法が挙げられる。本発明の方法で培養した細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定後、複数回ＰＢＳにて洗浄後、トライトンＸなどで培養細胞の透過性を増加させ、１０％ヤギ血清でブロッキングを行った後、対象マーカータンパク質に対するマウス抗体を用いて免疫染色し、蛍光標識ヤギ抗マウスＩｇＧと反応させ、蛍光顕微鏡観察により判定することができる。
【００６４】
前記アルカリホスファターゼの発現の有無を確認する方法としては、例えば、次の方法が挙げられる。本発明の方法で培養した細胞を、４．５ｍＭクエン酸、２．２５ｍＭクエン酸ナトリウム、３ｍＭ塩化ナトリウム、６５％メタノールおよび４％パラホルムアルデヒドで５分間固定し、洗浄し、次にＦａｓｔＲｅｄ基質キット（シグマ社製）等の適当なキットを用い、アルカリホスファターゼを可視化する、いわゆるアルカリホスファターゼ染色することができる。
【実施例】
【００６５】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。【００６６】
［実施例１］
ＲＯＣＫ阻害剤存在下でのｉＰＳ細胞の増殖における影響
以下の実施例においては、ｍＥＳＦ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（和光純薬社製、１３６−１７８０５）に２０μｍフィルターを通過して滅菌した下記成分を、表１に示す添加量で混合したものをｈＥＳＦ−ＦＸ培地として使用した。【００６７】
ｒＨＳＡ−Ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄは５０ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬ  組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ、ミリポア社製、９５０１−２０）に２３５μＬの２００ｍｇ／ｍＬのＯｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（シグマアルドリッチ社製、Ｏ１３８３−５Ｇ）を添加し、終夜混合することにより調製した。【００６８】
【表１】
2017170849.tif 000002
【００６９】
また、ｉＰＳ細胞としては、Ｔｉｃ−ＦＸ細胞［ｉＰＳ細胞Ｔｉｃ株（ＪＣＲＢ１３３１）を、フィーダーフリー・ゼノフリー培養（ＦＸ）に順化させた株］を使用した。【００７０】
ｈＥＳＦ−ＦＸ培地にＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）を、１μＭ、３μＭおよび１０μＭとなるように溶解した。それぞれの培地を、超低接着６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に３ｍＬずつ加え、上記Ｔｉｃ−ＦＸ細胞を、１０％のＣＯ２存在下、３７℃にて培養した（浮遊培養）。【００７１】
培養１日後、３日後、５日後のプレートの様子を観察した。結果を図１Ａおよび図１Ｂに示す。図１Ａは倍率４倍、図１Ｂは倍率２倍の顕微鏡写真である。また、培養５日後のウェル当たりの細胞数および細胞の生存率を測定した。その結果を図２に示す。【００７２】
図１Ａおよび図１Ｂに示すように、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が高いほど細胞数は増えていた。また、図２に示すように、ウェルあたりの細胞数、細胞の生存率は、いずれもＲＯＣＫ阻害剤の濃度が高くなるにつれ上昇していた。【００７３】
［実施例２］
未分化マーカー遺伝子およびナイーブ型に特異的なマーカー遺伝子の発現
マーカー遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲで確認した。リアルタイムＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオシステムズ社製７３００）にて、下記の反応手順およびプライマーにより実施した。【００７４】
（反応手順）９５℃３０秒→［（９５℃５秒→６０℃３１秒）×４０サイクル］→Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｃｙｃｌｅ【００７５】
（プライマー）
ＮＡＮＯＧフォワードプライマー  tgaacctcagctacaaacag（配列番号１）
ＮＡＮＯＧリバースプライマー  tggtggtaggaagagtaaag（配列番号２）
ＯＣＴ３／４フォワードプライマー  gacagggggaggggaggagctagg（配列番号３）
ＯＣＴ３／４リバースプライマー  cttccctccaaccagttgccccaaa（配列番号４）
ＳＴＥＬＬＡフォワードプライマー  gttactgggcggagttcgta（配列番号５）
ＳＴＥＬＬＡリバースプライマー  tgaagtggcttggtgtcttg（配列番号６）
ＮＣＡＭフォワードプライマー  ggcatttacaagtgtgtggttac（配列番号７）
ＮＣＡＭリバースプライマー  ttggcgcattcttgaacatga（配列番号８）
ＧＡＰＤＨフォワードプライマー  caaagttgtcatggatgacc（配列番号９）
ＧＡＰＤＨリバースプライマー  ccatggagaaggctgggg（配列番号１０）【００７６】
実施例１で培養した細胞について、培養後５日後の細胞中の、未分化マーカー遺伝子であるＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ３／４、ナイーブ型に特異的なマーカー遺伝子であるＳＴＥＬＬＡ、並びに神経細胞分化に特異的なマーカー遺伝子であるＮＣＡＭの発現量を、前記リアルタイムＰＣＲにより確認した。結果を図３Ａ〜図３Ｄに示す。【００７７】
図３Ａ〜図３Ｄ中、縦軸は、内部標準として使用したＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）に対する各サンプルの目的遺伝子の発現量の比を意味する。具体的には、グラフの値はＧＡＰＤＨのＣｐ値と目的遺伝子のＣｐ値の差から求められる増幅前のＤＮＡ量の相対値（単位はｆｏｌｄ）を意味する。【００７８】
なおここで、内部標準は細胞の状態によらず常に発現量が一定となる遺伝子である。また、Ｃｐ値とは、ＰＣＲ反応によってＤＮＡを増幅させたとき、測定器で検出可能な量まで増幅させるのに必要なサイクル数（理論上、１サイクルでＤＮＡ量は２倍になる）である。【００７９】
図３Ａおよび図３Ｂに示すように、未分化マーカー遺伝子であるＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ３／４は、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が１μＭおよび３μＭの時には、対照（図３Ａおよび図３Ｂ中、Ｔｉｃ−ＦＸ）よりも発現量が多かったのに対し、ＲＯＣＫ阻害剤を１０μＭ濃度で用いた場合には、両者の発現量は対照よりも低くなった。【００８０】
また、図３Ｃに示すように、ナイーブ型に特異的なＳＴＥＬＬＡ遺伝子は、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が１０μＭでは、対照よりもわずかに発現量が多かったが、ＲＯＣＫ遺伝子の濃度を１μＭおよび３μＭとした場合には、発現量が対照よりも多くなっていた。【００８１】
この結果から、ＲＯＣＫ阻害剤を、従来用いられている１０μＭ濃度よりも低濃度（１μＭおよび３μＭ）で用いた場合に、未分化を維持しつつ、ナイーブ型多能性幹細胞を効率よく増殖できることがわかった。【００８２】
また、図３Ｄに示すように、中肺葉分化に特異的なマーカー遺伝子であるＮＣＡＭは、ＲＯＣＫ阻害剤濃度が１μＭでは対照とほとんど変わらず、３μＭおよび１０μＭでは、発現量は対照よりも上昇していた。【００８３】
［実施例３］
増殖因子存在下における、ｉＰＳ細胞の増殖
上記基礎培地に、１μＭのＹ−２７６３２と、表２に示す成分を加えた培地を作製し、超低接着６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）中、１０％のＣＯ２存在下、３７℃にてＴｉｃ−ＦＸ細胞の増殖を浮遊培養で行った。播種の５日後、１０日後、１５日後に継代し、２０日後まで培養を行った。継代はＡｃｃｕｔａｓｅ（ミリポア社製、ＳＣＲ００５）を用いて細胞塊を３７℃で１０分間処理することにより行った。播種の５日後、１０日後、１５日後および２０日後に細胞数をカウントした。その結果を図４に示す。【００８４】
【表２】
2017170849.tif 000003
【００８５】
図４に示すように、１μＭのＹ−２７６３２の存在下では、５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＦＧＦ２を加えたもの（Ｎｏ．１）と、５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＦＧＦ２および２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＬＩＦを加えたもの（Ｎｏ．２）では、増殖率は低かった。これに対し、４０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２および２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＬＩＦを加えたもの（Ｎｏ．３）と、組換えヒトＬＩＦ、組換えヒトＦＧＦ２およびヘパラン硫酸ナトリウムを、それぞれ２０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬおよび１００ｎｇ／ｍＬ加えたもの（Ｎｏ．４）では増殖率が上昇した。【００８６】
この結果から、浮遊細胞の効率的な培養には、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤とともに、組換えヒトＬＩＦ、組換えヒトＦＧＦ２、ヘパラン硫酸ナトリウム等の増殖因子を培地に加えることが好ましいことがわかった。【００８７】
［実施例４］
未分化マーカー遺伝子およびナイーブ型に特異的なマーカー遺伝子の発現
実施例３で培養した細胞（表２のＮｏ．３および４の細胞）について、マーカー遺伝子の発現を、実施例２と同様にしてリアルタイムＰＣＲで確認した。ＴＦＣＰ２Ｌ１遺伝子の発現の確認に用いたプライマーの塩基配列を下記に示す。【００８８】
ＴＦＣＰ２Ｌ１フォワードプライマー  tgtgaggccaaagatgaccattta（配列番号１１）
ＴＦＣＰ２Ｌ１リバースプライマー  caatcagctccaaggtggtcag（配列番号１２）【００８９】
結果を図５Ａ〜図５Ｄに示す。なお、対照として、培地に組換えヒトＬＩＦ、組換えヒトＦＧＦ２およびヘパラン硫酸ナトリウムをいずれも添加しないものを用いた（図５Ａ〜図５Ｄにおいて、Ｔｉｃ−ＦＸと表わす）。【００９０】
図５Ａおよび図５Ｂに示すように、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２が低濃度で存在する場合でも、培地に増殖因子を添加した場合には、多能性マーカー（未分化マーカー遺伝子）である、ＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ３／４の発現が増大していることがわかった。また、図５Ｃおよび図５Ｄに示すように、ナイーブ型に特異的なＳＴＥＬＬＡ遺伝子およびＴＦＣＰ２Ｌ１遺伝子も、両者で発現していることがわかった。【００９１】
［実施例５］
低分子化合物の存在下における、ｉＰＳ細胞の培養
上記基礎培地に、１μＭのＹ−２７６３２と、２０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦおよび４０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２とを加えた培地を作製し、それぞれに、下記に示す各種阻害剤を、それぞれ１μＭ（ＰＤ０３２５９０１）、０．３μＭ（ＣＨＩＲ９９０２１）、０．５μＭ（ＳＢ５９０８８５）、１μＭ（ＷＨ−４−０２３）、１０μＭ（ＳＰ６００１２５）、１０μＭ（ＳＢ２０３５８０）、５μＭ（Ｇｏ６９８３）、５μＭ（ＧＦ１０９２０３Ｘ）、２μＭ（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、４００ｎｇ／ｍＬ（Ｎｏｇｇｉｎ）の濃度となるように加えた培地を作製した。【００９２】
それぞれの培地を超低接着６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）中、１０％のＣＯ２存在下、３７℃にてＴｉｃ−ＦＸ細胞の増殖を浮遊培養で行った。培養を５日間行い、細胞数をカウントした。結果を図６に示す。図６において、−と示すものは、阻害剤を添加しなかった培地を用いた結果である。【００９３】
（培地に添加した阻害剤）
ＰＤ０３２５９０１：Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド、ＴＯＣＲＩＳ社製、４１９２
ＣＨＩＲ９９０２１：６−｛２−［４−（２，４−ジクロロ−フェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチルアミノ｝−ニコチノニトリル、ＴＯＣＲＩＳ社製、４４２３
ＳＢ５９０８８５：５−（２−（４−（２−ジメチルアミノエトキシ）フェニル）−５−（４−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−ｙｌ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドエン−１−オン  オキシム、Ｒ＆Ｄシステムズ社製、２６５０／１０
ＷＨ−４−０２３：２，６−ジメチルフェニル  Ｎ−（２，４−ジメトキシフェニル）−Ｎ−［２−［［４−（４−メチル−１−ピペラジニル）フェニル］アミノ］−４−ピリミジニル］カルバメート、ＭｅｄＣｈｅｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓ社製、ＨＹ−１２２９９
ＳＰ６００１２５：１，９−ピラゾロアントロン、シグマアルドリッチ社製、Ｓ５５６７−１０ＭＧ
ＳＢ２０３５８０：４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）１Ｈ−イミダゾール、和光純薬社製、１９３−１５６１１
Ｇｏ６９８３：３−［１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、１３３１１
ＧＦ１０９２０３Ｘ：３−（Ｎ−［ジメチルアミノ］プロピル−３−インドリル）−４−（３−インドリル）マレイミド，３−［１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］１Ｈ−インドール−３−イル］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、ＴＯＣＲＩＳ社製、７４１
Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ：６−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、シグマアルドリッチ社製、Ｐ５４９９−５ＭＧ
Ｎｏｇｇｉｎ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ：Ｒ＆Ｄシステムズ社製、６０５７−ＮＧ−０２５／ＣＦ）【００９４】
図６に示すように、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ５９０８８５またはＮｏｇｇｉｎを添加した培地では、細胞の増殖率が高かった。【００９５】
次いで、細胞の増殖率が高かった阻害剤を加えた培地で増殖した細胞の多能性マーカー（ＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ３／４）の発現について、実施例２と同様にしてリアルタイムＰＣＲで確認した。結果を図７Ａおよび図７Ｂに示す。なお、対照として、基礎培地で培養したものを用いた（図７Ａおよび図７Ｂにおいて、Ｔｉｃ−ＦＸと表わす）。【００９６】
図７Ａおよび図７Ｂから明らかなように、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ５９０８８５、またはＮｏｇｇｉｎを添加した培地では、ＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ３／４の発現が増大していることがわかった。【００９７】
このことより、本発明の培地に加え、更にＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ５９０８８５またはＮｏｇｇｉｎを添加することによって、細胞の未分化状態を維持したまま、生産性を更に高めることができることがわかった。【００９８】
本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１６年３月３０日付けで出願された日本特許出願（特願２０１６−０６８７１８）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
【図１】
2017170849.tif 000004
【図２】
2017170849.tif 000005
【図３】
2017170849.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2017170849000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月27日(2018.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１３）に関する。 
（１）ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含む、ナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。（２）ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２である、（１）に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。 
（３）ＭＥＫ阻害剤を含んでいない、（１）または（２）に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。 
（４）フィーダー細胞および細胞外マトリクスを含んでいない、（１）〜（３）のいずれか１に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。
（５）増殖因子を更に含む、（１）〜（４）のいずれか１に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。 
（６）浮遊培養に使用される、（１）〜（５）のいずれか１に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。 
（７）ナイーブ型多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、（１）〜（６）のいずれか１に記載のナイーブ型多能性幹細胞培養用培地。 
（８）ＲＯＣＫ阻害剤を５μＭ以下の濃度で含む培地中でナイーブ型多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞のナイーブ型を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とする、多能性幹細胞の培養方法。
（９）ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２である、（８）に記載の多能性幹細胞の培養方法。 
（１０）培地中にＭＥＫ阻害剤を含んでいない、（８）または（９）に記載の多能性幹細胞の培養方法。 
（１１）培地中にフィーダー細胞および細胞外マトリクスを含んでいない、（８）〜（１０）のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
（１２）浮遊培養で実施される、（８）〜（１１）のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。 
（１３）ナイーブ型多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、（８）〜（１２）のいずれか１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下でのｉＰＳ細胞の増殖を観察した結果を示す図である。
【図２】図２は、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下でのｉＰＳ細胞の数、およびｉＰＳ細胞の生存率を測定した結果を示すグラフである。
【図３】図３Ａ〜図３Ｄは、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下での、ｉＰＳ細胞の未分化マーカー遺伝子であるＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ３／４、ナイーブ型に特異的なマーカー遺伝子であるＳＴＥＬＬＡ、並びに中胚葉分化に特異的なマーカー遺伝子であるＮＣＡＭの発現量をリアルタイムＰＣＲにより確認した結果をそれぞれ示すグラフである。
【図４】図４は、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤および増殖因子存在下における、ｉＰＳ細胞の増殖を示すグラフである。
【図５】図５Ａ〜図５Ｄは、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤および増殖因子存在下における、ｉＰＳ細胞の未分化マーカー遺伝子およびナイーブ型に特異的なマーカー遺伝子の発現を示すグラフである。
【図６】図６は、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤および低分子化合物の存在下における、ｉＰＳ細胞の増殖率を示すグラフである。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤および低分子化合物の存在下における、ｉＰＳ細胞の未分化マーカー遺伝子の発現を示すグラフである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
アスパラギンの派生物としては、例えば、Ｌ−アスパラギン一水和物等が挙げられる。チロシンの派生物としては、例えば、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物等が挙げられる。ヒスチジンの派生物としては、例えば、ヒスチジン塩酸塩およびヒスチジン塩酸塩一水和物等が挙げられる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
また、図３Ｄに示すように、中胚葉分化に特異的なマーカー遺伝子であるＮＣＡＭは、ＲＯＣＫ阻害剤濃度が１μＭでは対照とほとんど変わらず、３μＭおよび１０μＭでは、発現量は対照よりも上昇していた。
【国際調査報告】
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