(57)【要約】  一実施形態において、本発明は、レクチン経路及び第二経路を阻害する剤を提供すること等を課題とする。一実施形態において、本発明は、MASP-2タンパク質又はsMAPタンパク質の、CUB1ドメイン及びEGFドメインを含む第一の領域をN末端側に含み、factor Hタンパク質のSCRドメインを含む第二の領域をC末端側に含む融合ポリペプチド、該融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドを含むベクター等に関する。
2018070521.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
MASP-2タンパク質又はsMAPタンパク質の、CUB1ドメイン及びEGFドメインをN末端側から順番に含む第一の領域をN末端側に含み、
factor Hタンパク質のSCR1〜4ドメインからなる群から選択されるSCRドメインを3以上含む第二の領域をC末端側に含む、
融合ポリペプチド。
【請求項２】
CUB1ドメインが配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列、配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み、
EGFドメインが配列番号5又は7で示されるアミノ酸配列、配列番号5又は7で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号5又は7で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
第一の領域が、配列番号49、又は配列番号49で示されるアミノ酸配列において1個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を、EFGドメインのC末端側に含む、請求項１又は２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
第二の領域がSCR1〜4ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
第二の領域がSCR5ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
第二の領域がN末端側から順番にSCR1〜5ドメインを含む、請求項５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
SCR1ドメインが配列番号9又は11で示されるアミノ酸配列、配列番号9又は11で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号9又は11で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み、
SCR2ドメインが配列番号13又は15で示されるアミノ酸配列、配列番号13又は15で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号13又は15で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み、
SCR3ドメインが配列番号17又は19で示されるアミノ酸配列、配列番号17又は19で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号17又は19で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み、
SCR4ドメインが配列番号21又は23で示されるアミノ酸配列、配列番号21又は23で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号21又は23で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み、
SCR5ドメインが配列番号25又は27で示されるアミノ酸配列、配列番号25又は27で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号25又は27で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含む、
請求項５又は６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
第一の領域が配列番号29又は31で示されるアミノ酸配列、配列番号29又は31で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号29又は31で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み、
第二の領域が配列番号33又は35で示されるアミノ酸配列、配列番号33又は35で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号33又は35で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
第一の領域が、第二の領域とリンカーを介して連結されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
リンカーが、（GGGGS）で示されるアミノ酸配列を1〜8個含むペプチドリンカーである、請求項９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載のポリヌクレオチド又は請求項１２に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドからなる、補体活性化経路におけるレクチン経路及び第二経路の阻害剤。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、請求項１１に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１２に記載のベクターを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
補体活性化経路におけるレクチン経路及び第二経路を阻害するための、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
補体関連疾患を治療及び／又は予防するための、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
補体関連疾患が、虚血再灌流障害、加齢黄斑変性、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群（APS）、IgA腎症、C3腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、関節リウマチ、悪性関節リウマチ、IgG4関連疾患、混合型クリオグロブリン血症、溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、視神経脊髄炎、アルツハイマー病、血栓性微小血管障害症（TMA）、潰瘍性大腸炎、クローン病、及び敗血症からなる群から選択される、請求項１７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、MASP-2タンパク質又はsMAPタンパク質の、CUB1ドメイン及びEGFドメインを含む第一の領域、及びfactor Hタンパク質のSCRドメインを含む第二の領域を含む融合ポリペプチド、及び該融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド等に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体は、抗体及び貪食細胞を補助する体液成分を指し、活性化により病原体等の異物を排除する反応系（補体系）を構成する。補体系は、古典経路、レクチン経路、及び第二経路の三つの経路を介して開始され、宿主の免疫系においてきわめて重要な役割を果たす。一方、補体系の過剰な活性化は、全身性エリトマトーデス及び虚血再灌流障害等の補体関連疾患をもたらすことが知られている。【０００３】
これまでに、補体活性化経路の第二経路の阻害によって全身性エリトマトーデス及び虚血再灌流障害を治療できる可能性が示されている（それぞれ、非特許文献１及び非特許文献２）。さらに、特許文献１には、レクチン経路に関与するMASP-2タンパク質のインヒビターによって幾つかの疾患が治療され得ることが示されている。しかしながら、補体系は上記の通り三つの活性化経路を有するため、補体関連疾患を効果的に治療するためには、単一の経路だけでなく複数の補体活性化経路を阻害する必要があると考えられる。一方、補体活性化経路の三つ全てを阻害する場合にはその副作用が懸念される。【０００４】
したがって、複数の補体活性化経路を選択的に阻害できる薬剤が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表2014-515922号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Sekine H et al., Arthritis & Rheumatism, 63:1076-1085, 2011
【非特許文献２】Huang Y et al., The Journal of Immunology, 181:8068-8076, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、レクチン経路及び第二経路を阻害する剤を提供すること等を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、MASP-2タンパク質又はsMAPタンパク質の、CUB1ドメイン及びEGFドメインを含む第一の領域をN末端側に含み、factor Hタンパク質のSCRドメインを含む第二の領域をC末端側に含む融合ポリペプチドが、レクチン経路及び第二経路を阻害し得ることを見出し、本願発明を完成させた。【０００９】
したがって、本発明は以下の態様を包含する。
（１）MASP-2タンパク質又はsMAPタンパク質の、CUB1ドメイン及びEGFドメインをN末端側から順番に含む第一の領域をN末端側に含み、
factor Hタンパク質のSCR1〜4ドメインからなる群から選択されるSCRドメインを3以上含む第二の領域をC末端側に含む、
融合ポリペプチド。
（２）CUB1ドメインが配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列、配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み、
EGFドメインが配列番号5又は7で示されるアミノ酸配列、配列番号5又は7で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号5又は7で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含む、（１）に記載の融合ポリペプチド。
（３）第一の領域が、配列番号49、又は配列番号49で示されるアミノ酸配列において1個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を、EFGドメインのC末端側に含む、（１）又は（２）に記載の融合ポリペプチド。
（４）第二の領域がSCR1〜4ドメインを含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
（５）第二の領域がSCR5ドメインを含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
（６）第二の領域がN末端側から順番にSCR1〜5ドメインを含む、（５）に記載の融合ポリペプチド。
（７）SCR1ドメインが配列番号9又は11で示されるアミノ酸配列、配列番号9又は11で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号9又は11で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み、
SCR2ドメインが配列番号13又は15で示されるアミノ酸配列、配列番号13又は15で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号13又は15で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み、
SCR3ドメインが配列番号17又は19で示されるアミノ酸配列、配列番号17又は19で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号17又は19で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み、
SCR4ドメインが配列番号21又は23で示されるアミノ酸配列、配列番号21又は23で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号21又は23で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み、
SCR5ドメインが配列番号25又は27で示されるアミノ酸配列、配列番号25又は27で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号25又は27で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含む、
（５）又は（６）に記載の融合ポリペプチド。
（８）第一の領域が配列番号29又は31で示されるアミノ酸配列、配列番号29又は31で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号29又は31で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み、
第二の領域が配列番号33又は35で示されるアミノ酸配列、配列番号33又は35で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号33又は35で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含む、
（１）に記載の融合ポリペプチド。
（９）第一の領域が、第二の領域とリンカーを介して連結されている、（１）〜（８）のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
（１０）リンカーが、（GGGGS）で示されるアミノ酸配列を1〜8個含むペプチドリンカーである、（９）に記載の融合ポリペプチド。
（１１）（１）〜（１０）のいずれかに記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（１２）（１１）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（１３）（１１）に記載のポリヌクレオチド又は（１２）に記載のベクターを含む細胞。
（１４）（１）〜（１０）のいずれかに記載の融合ポリペプチドからなる、補体活性化経路におけるレクチン経路及び第二経路の阻害剤。
（１５）（１）〜（１０）のいずれかに記載の融合ポリペプチド、（１１）に記載のポリヌクレオチド、又は（１２）に記載のベクターを含む、医薬組成物。
（１６）補体活性化経路におけるレクチン経路及び第二経路を阻害するための、（１５）に記載の医薬組成物。
（１７）補体関連疾患を治療及び／又は予防するための、（１６）に記載の医薬組成物。
（１８）補体関連疾患が、虚血再灌流障害、加齢黄斑変性、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群（APS）、IgA腎症、C3腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、関節リウマチ、悪性関節リウマチ、IgG4関連疾患、混合型クリオグロブリン血症、溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、視神経脊髄炎、アルツハイマー病、血栓性微小血管障害症（TMA）、潰瘍性大腸炎、クローン病、及び敗血症からなる群から選択される、（１７）に記載の医薬組成物。【００１０】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2016-203024号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、レクチン経路及び第二経路を阻害し得る融合ポリペプチド、該融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、及びこれらを含むレクチン経路及び第二経路の阻害剤又は医薬組成物等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例1において調製した融合ポリペプチドsMAP-fHの模式図を示す。AはCUB1ドメイン及びEGFドメインを含むsMAPタンパク質部分を、Bは(GGGGS)4からなるリンカー部分を、CはSCR1〜5ドメインを含むfHタンパク質部分を指す。
【図２】図2は、sMAP-fHのSDS-PAGEのCBB染色結果（A）、及び抗マウスsMAPポリクローナル抗体又は抗マウスfactor H抗体を用いた際のウエスタンブロット（B:抗マウスsMAPポリクローナル抗体、C：抗マウスfactor H抗体）の結果を示す。
【図３】図3は、sMAP-fHのC3沈着アッセイの結果を示す。Wild type C57BL/6Jマウス血清に、各濃度のsMAP-fHを加えた場合のC3沈着レベルを示す。横軸は、血清に加えたsMAP-fHの濃度を、縦軸はOD450nmの吸光度を示す。
【図４】図4は、500μgのsMAP-fHのマウス腹腔内への投与の1、2、4、8、24、及び48時間後のsMAP-fHの血中濃度（μg/mL）の測定結果を示す。
【図５】図5は、500μgのsMAP-fHのマウス腹腔内への投与の0、1、2、4、8、24、及び48時間後の血清についてのC4沈着アッセイの結果を示す。結果は、PBS投与群を100とした場合の相対値（%PBS）で示す。
【図６】図6は、血清添加なしサンプル（a）、MASP-2欠損マウスの血清添加サンプル（b）、sMAP-fH投与前の血清添加サンプル（c）、及びsMAP-fHのマウス腹腔内への投与の1、2、4、8、24、及び48時間後の血清添加サンプル（それぞれ、d〜i）についてのフローサイトメトリーによるザイモサンアッセイの結果を示す。左軸はFITCの蛍光強度、縦軸は粒子数（カウント）を示す。
【図７】図7は、3種類のヒトsMAP-fH融合ポリペプチドのComplement System Screen kitを用いたレクチン経路、及び第二経路の評価結果を示す。ポリペプチド２、３、及び４はそれぞれ実施例４、５、及び６で調製したポリペプチドを指す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．定義
本明細書において用いられる用語の定義を以下に記載する。
【００１４】
本明細書において、「補体」とは、生体が病原体等の異物を排除する際に抗体及び貪食細胞を補助する体液成分を指す。補体は、第1成分C1から第9成分C9までの9成分（補体成分）を含み（C1にはさらにC1q、C1r、C1sが含まれる）、これに各種の反応因子等を含めて一連の反応系（補体系）を構成する。本明細書において、「補体活性化経路」は、補体又は補体系が活性化される経路を指し、古典経路（Classical Pathway）、レクチン経路（Lectin Pathway）、及び第二経路（Alternative Pathway、代替経路又は副経路とも呼ばれる）の三つの経路を含む。古典経路は補体成分C1qの抗原抗体複合体等への結合によって開始され、レクチン経路は血清タンパク質であるマンナン結合レクチン又はファイコリンと細菌又はウイルスのマンノース含有糖鎖への結合によって開始され、第二経路は自発的に活性化された補体成分の病原菌表面への結合によって開始される。
２．融合ポリペプチド
一態様において、本発明は、第一の領域をN末端側に含み、第二の領域をC末端側に含む融合ポリペプチドに関する。
【００１５】
融合ポリペプチドの第一の領域は、MASP-2タンパク質又はsMAPタンパク質の、CUB1ドメイン及びEGFドメインをN末端側から順番に含む。
【００１６】
本明細書において、「MASP-2」とは、Mannose-Binding Protein-Associated Serine Protease 2：マンノース結合タンパク質関連セリンプロテアーゼ2を指し、Mannan-binding lectin serine protease 2：マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ2とも呼ばれる。MASP-2は、MASP-1によって活性化され、補体活性化経路の下流の経路を活性化することが知られている。MASP-2は、6つのドメイン、すなわち2つのCUB（C1r/C1s/embryonic sea urchin protein/bone morphogenetic protein：C1r/C1s/胚性ウニタンパク質／骨形成タンパク質）ドメイン、EGF（epidermal growth factor like：上皮成長因子様）ドメイン、2つのCCP（complement control protein：補体制御タンパク質）ドメイン、及びSP（serine protease：セリンプロテアーゼ）ドメインを含む。
【００１７】
本明細書において「sMAP」とは、small mannose binding lectin（MBL）-associated protein：小マンノース結合レクチン（MBL）関連タンパク質を指し、MAp19（mannose-binding lectin associated protein 19：マンノース結合レクチン関連タンパク質19）又はMASP2-isoform（MASP2アイソフォーム）とも呼ばれる。sMAPは、MASP-2のスプライシングバリアントであり、MASP-2タンパク質のN末端のCUBドメイン（CUB1ドメイン）及びEGFドメインのみを含む。sMAPタンパク質及びそれをコードする塩基配列は当業者に公知であり、例えばヒトsMAPタンパク質は、配列番号37で示されるアミノ酸配列を含み、ヒトsMAPタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号38で示される塩基配列を含む。
【００１８】
sMAPタンパク質は、MASP-2タンパク質の活性を競合的に阻害することが知られている。sMAPタンパク質はMASP-2タンパク質と同じMASP-2遺伝子によってコードされることから、通常、MASP-2タンパク質のCUB1ドメイン及びEGFドメインと、sMAPタンパク質のCUB1ドメイン及びEGFドメインは同じアミノ酸配列を含む。
【００１９】
融合ポリペプチドの第一の領域に含まれるCUB1ドメイン及びEGFドメインの由来となる生物種は、限定されるものではないが、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物が挙げられ、好ましくはヒト又はマウス、最も好ましくはヒトである。各生物におけるMASP-2タンパク質又はsMAPタンパク質のCUB1ドメイン及びEGFドメインのアミノ酸配列又はこれらをコードする塩基配列は、当技術分野で公知の任意の方法により、例えば公のデータベース（例えば、NCBI（米国）、DDBJ（日本）、EMBL（欧州））より、入手することができ、アミノ酸配列中に含まれるドメインは、SMART及びPfam等の公のプログラムにより特定することができる。
【００２０】
第一の領域に含まれるCUB1ドメイン及びEGFドメインは、一つの種（例えばヒト）由来のアミノ酸配列又はそれと等価な配列と、他の種（例えばマウス）由来のアミノ酸配列又はそれと等価な配列のキメラポリペプチドであっても良いが、いずれかの生物種、好ましくはヒトに由来するアミノ酸配列又はそれと等価な配列のみを含むことが好ましい。
【００２１】
本明細書において、あるアミノ酸配列と「等価な配列」とは、あるアミノ酸配列に対して、例えば90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又はあるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含むものであってよい。同様に、ある塩基配列と「等価な配列」とは、ある塩基配列に対して、例えば90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列、又はある塩基酸配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列を含むものであってよい。本明細書において、アミノ酸配列及び塩基配列に関する同一性の値は、複数の配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。また、本明細書において、アミノ酸配列及び塩基配列に関する「１若しくは複数個」の範囲は、1から10個、好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは数個、例えば1から4個又は1から3個、あるいは1個又は2個である。
【００２２】
第一の領域に含まれるCUB1ドメインは、ヒトのMASP-2タンパク質又はsMAPタンパク質のCUB1ドメインのアミノ酸配列（配列番号1）、若しくはマウスのMASP-2タンパク質又はsMAPタンパク質のCUB1ドメインのアミノ酸配列（配列番号3）、又はこれらのアミノ酸配列と等価なアミノ酸配列を含んでよい。
【００２３】
したがって、第一の領域に含まれるCUB1ドメインは、配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列、配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含んでよい。
【００２４】
同様に、第一の領域に含まれるEGFドメインは、ヒトのMASP-2タンパク質又はsMAPタンパク質のEGFドメインのアミノ酸配列（配列番号5）、若しくはマウスのMASP-2タンパク質又はsMAPタンパク質のEGFドメインのアミノ酸配列（配列番号7）、又はこれらのアミノ酸配列と等価な配列を含んでよい。
【００２５】
したがって、第一の領域に含まれるEGFドメインは、配列番号5又は7で示されるアミノ酸配列、配列番号5又は7で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号5又は7で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含んでよい。
【００２６】
上記の通り、第一の領域に含まれるCUB1ドメイン及びEGFドメインは、いずれかの生物種、好ましくはヒトに由来するアミノ酸配列又はそれと等価な配列のみを含むことが好ましい。したがって、例えば第一の領域において、CUB1ドメインは配列番号1で示されるアミノ酸配列、配列番号1で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号1で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み；EGFドメインは配列番号5で示されるアミノ酸配列、配列番号5で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号5で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含むものであってよい。
【００２７】
第一の領域は、上記CUB1ドメイン及びEGFドメインに加えて、MASP-2タンパク質に存在しないsMAPタンパク質特有のアミノ酸配列、すなわちEQSL(配列番号49)、又は配列番号49で示されるアミノ酸配列において1個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を、好ましくはEFGドメインのC末端側に含み得る。すなわち、第一の領域は、CUB1ドメイン、EGFドメイン及びsMAPタンパク質特有のアミノ酸配列をN末端側から順番に含み得る。なお、sMAPタンパク質特有のアミノ酸配列は、ヒト及びマウスにおいて同一である。
【００２８】
第一の領域は、CUB1ドメイン、EGFドメインのみからなるものであってもよいし、CUB1ドメイン、EGFドメイン及びsMAPタンパク質特有のアミノ酸配列のみからなるものであってもよい。
【００２９】
第一の領域のアミノ酸長は、限定しないが、例えば150残基以上、160残基以上、170残基以上、又は180残基以上であってよく、また350残基以下、300残基以下、250残基以下、又は200残基以下であってよい。
【００３０】
第一の領域に含まれる各ドメインは、適宜リンカーを介して連結されてもよいが、リンカーを伴わずに直接連結されることが好ましい。
【００３１】
上記融合ポリペプチドは、第一の領域を一つだけ含んでもよいし、複数、例えば2〜8、2〜6、2〜5、2〜4、2〜3、又は2含んでもよい。第一の領域を複数含む場合、各領域は直接連結されてもよいし、リンカーを介して連結されてもよい。
【００３２】
融合ポリペプチドは、上記第一の領域に加えて、第二の領域を含む。融合ポリペプチドの第二の領域は、factor Hタンパク質のSCR1〜4ドメインからなる群から選択されるSCRドメインを3以上、4以上、又は5以上、また20以下、15以下、10以下、又は5以下、例えば3、4又は5含む。第二の領域は、同一のSCRドメインを2以上含んでもよいが、第二の領域に含まれるSCRドメインは、互いに異なるものであることが好ましい。
【００３３】
本明細書において、「factor H：H因子（fH）」とは、complement factor H：補体H因子（CfH）とも呼ばれ、補体活性化経路の第二経路の主要な調節因子である。fHタンパク質は、互いに相同な20個のドメイン、すなわちSCR（Short Consensus Repeat）1ドメイン〜SCR20ドメイン（本明細書においては、SCR1ドメイン〜SCR20ドメインを、まとめてSCR1〜20ドメインとも表記する。以下同じ）をN末端側から順番に含み、このうちN末端側のSCR1〜4ドメインがfHタンパク質の補体制御活性を有することが知られている。fHタンパク質及びそれをコードする塩基配列は当業者に公知であり、例えばヒトfHタンパク質は、配列番号39で示されるアミノ酸配列を含み、ヒトfHタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号40で示される塩基配列を含む。
【００３４】
融合ポリペプチドの第二の領域は、factor Hタンパク質のSCR1〜4ドメインからなる群から選択される異なるSCRドメインを3以上含むことが好ましく、例えば、SCR1、SCR2、及びSCR3ドメイン；SCR1、SCR2、及びSCR4ドメイン；SCR1、SCR3、及びSCR4ドメイン；SCR2、SCR3、及びSCR4ドメイン；又はSCR1〜4ドメインを、好ましくはN末端から順番に含む。
【００３５】
融合ポリペプチドの第二の領域は、SCR1〜4ドメインからなる群から選択されるSCRドメインに加えて、SCR5ドメインを含むことが好ましい。この場合、融合ポリペプチドの第二の領域は、例えばSCR1〜5ドメインをN末端から順番に含んでよい。
【００３６】
さらに、融合ポリペプチドの第二の領域は、SCR6〜20ドメインから選択されるSCRドメインを、1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、また15以下、14以下、13以下、12以下、11以下、又は10以下含んでよい。この場合、第二の領域は、SCRドメインの番号の小さいものをN末端から順番に含むことが好ましい。SCR6〜20ドメインから選択されるSCRドメインは、同一のSCRドメインを2以上含んでもよいが、互いに異なるものであることが好ましい。
【００３７】
第二の領域に含まれ得るSCR1〜20ドメイン、例えばSCR1〜5ドメイン又はSCR1〜4ドメインの由来となる生物種は、限定されるものではないが、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物が挙げられ、好ましくはヒト又はマウス、最も好ましくはヒトである。各生物におけるfHタンパク質のアミノ酸配列は、当技術分野で公知の任意の方法により、例えば公のデータベース（例えば、NCBI（米国）、DDBJ（日本）、EMBL（欧州））より、入手することができ、アミノ酸配列中に含まれるドメインは、SMART及びPfam等の公のプログラムにより特定することができる。
【００３８】
第二の領域に含まれ得るSCR1〜20ドメイン、例えばSCR1〜5ドメイン又はSCR1〜4ドメインは、一つの種（例えばヒト）由来のアミノ酸配列又はそれと等価な配列と、他の種（例えばマウス）由来のアミノ酸配列又はそれと等価な配列のキメラポリペプチドであっても良いが、いずれかの生物種、好ましくはヒトに由来するアミノ酸配列又はそれと等価な配列のみを含むことが好ましい。
【００３９】
第二の領域に含まれ得るSCR1ドメインは、ヒトのfHタンパク質のSCR1ドメインのアミノ酸配列（配列番号9）、若しくはマウスのfHタンパク質のSCR1ドメインのアミノ酸配列（配列番号11）、又はこれらのアミノ酸配列と等価な配列であってよい。
【００４０】
したがって、第二の領域に含まれ得るSCR1ドメインは、配列番号9又は11で示されるアミノ酸配列、配列番号9又は11で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号9又は11で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含んでよい。
【００４１】
同様に、第二の領域に含まれ得るSCR2ドメインは、ヒトのfHタンパク質のSCR2ドメインのアミノ酸配列（配列番号13）、若しくはマウスのfHタンパク質のSCR2ドメインのアミノ酸配列（配列番号15）、又はこれらのアミノ酸配列と等価な配列であってよい。
【００４２】
したがって、第二の領域に含まれ得るSCR2ドメインは、配列番号13又は15で示されるアミノ酸配列、配列番号13又は15で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号13又は15で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含んでよい。
【００４３】
同様に、第二の領域に含まれ得るSCR3ドメインは、ヒトのfHタンパク質のSCR3ドメインのアミノ酸配列（配列番号17）、若しくはマウスのfHタンパク質のSCR2ドメインのアミノ酸配列（配列番号19）、又はこれらのアミノ酸配列と等価な配列であってよい。
【００４４】
したがって、第二の領域に含まれ得るSCR3ドメインは、配列番号17又は19で示されるアミノ酸配列、配列番号17又は19で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号17又は19で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含んでよい。
【００４５】
同様に、第二の領域に含まれ得るSCR4ドメインは、ヒトのfHタンパク質のSCR4ドメインのアミノ酸配列（配列番号21）、若しくはマウスのfHタンパク質のSCR2ドメインのアミノ酸配列（配列番号23）、又はこれらのアミノ酸配列と等価な配列であってよい。
【００４６】
したがって、第二の領域に含まれ得るSCR4ドメインは、配列番号21又は23で示されるアミノ酸配列、配列番号21又は23で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号21又は23で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含んでよい。
【００４７】
同様に、第二の領域に含まれ得るSCR5ドメインは、ヒトのfHタンパク質のSCR5ドメインのアミノ酸配列（配列番号25）、若しくはマウスのfHタンパク質のSCR5ドメインのアミノ酸配列（配列番号27）、又はこれらのアミノ酸配列と等価な配列であってよい。
【００４８】
したがって、第二の領域に含まれ得るSCR5ドメインは、配列番号25又は27で示されるアミノ酸配列、配列番号25又は27で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号25又は27で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含んでよい。
【００４９】
上記の通り、第二の領域に含まれ得るSCR1〜20ドメイン、例えばSCR1〜5ドメイン又はSCR1〜4ドメインは、いずれかの生物種に由来するアミノ酸配列又はそれと等価な配列のみを含むことが好ましい。したがって、例えば第二の領域において、SCR1ドメインは配列番号9で示されるアミノ酸配列、配列番号9で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号9で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み；SCR2ドメインは配列番号13で示されるアミノ酸配列、配列番号13で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号13で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み；SCR3ドメインは配列番号17で示されるアミノ酸配列、配列番号17で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号17で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み；SCR4ドメインは配列番号21で示されるアミノ酸配列、配列番号21で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号21で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み；SCR5ドメインは配列番号25で示されるアミノ酸配列、配列番号25で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号25で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含んでよい。
【００５０】
第二の領域は、上記SCRドメインを含むものであってもよいし、これらのドメインのみからなるものであってもよい。また、第二の領域のアミノ酸長は、限定しないが、例えば150残基以上、200残基以上、又は250残基以上であってよく、また450残基以下、400残基以下、又は350残基以下であってよい。
【００５１】
第二の領域に含まれる各ドメインは、適宜リンカーを介して連結されてもよいが、リンカーを伴わずに直接連結されることが好ましい。
【００５２】
第一の領域は、特にヒトのMASP-2タンパク質又はsMAPタンパク質のCUB1ドメイン及びEGFドメインを含むアミノ酸配列（配列番号29）、若しくはマウスのMASP-2タンパク質又はsMAPタンパク質のCUB1ドメイン及びEGFドメインを含むアミノ酸配列（配列番号31）、又はこれらのアミノ酸配列と等価な配列を含んでよい。同様に、第二の領域は、特にヒトのfHタンパク質のSCR1〜5ドメインを含むアミノ酸配列（配列番号33）、若しくはマウスのfHタンパク質のSCR1〜5ドメインを含むアミノ酸配列（配列番号35）、又はこれらのアミノ酸配列と等価な配列を含んでよい。
【００５３】
したがって、本発明の融合ポリペプチドにおいて、第一の領域は配列番号29又は31で示されるアミノ酸配列、配列番号29又は31で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号29又は31で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み、第二の領域が配列番号33又は35で示されるアミノ酸配列、配列番号33又は35で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号33又は35で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含むものであってよい。この実施形態において、第一の領域は、そのC末端に配列番号49、又は配列番号49で示されるアミノ酸配列において1個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み得る。
【００５４】
第一の領域及び第二の領域は、一つの種（例えばヒト）由来のアミノ酸配列又はそれと等価な配列と、他の種（例えばマウス）由来のアミノ酸配列又はそれと等価な配列のキメラポリペプチドであっても良いが、いずれかの生物種、好ましくはヒトに由来するアミノ酸配列又はそれと等価な配列のみを含むことが好ましい。したがって、本発明の融合ポリペプチドにおいて、第一の領域は配列番号29で示されるアミノ酸配列、配列番号29で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号29で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含み、第二の領域は配列番号33で示されるアミノ酸配列、配列番号33で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号33で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含むものであってよい。
【００５５】
上記融合ポリペプチドにおいて、第一の領域と第二の領域は直接連結されてもよいが、各領域の機能、構造を維持するために適宜リンカーを介して連結されることが好ましい。本明細書におけるリンカーは、化学リンカー（例えば、ジスルフィドリンカー及びマレイミドリンカー等）であってもペプチドリンカーであってもよいが、好ましくはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは、例えば1〜50、5〜40、又は10〜30のアミノ酸配列からなるペプチドであってよく、リンカーの長さは、第一の領域と第二の領域の機能及び構造を考慮して、当業者であれば適宜定めることができる。ペプチドリンカーの例として、グリシンとセリンから構成されるリンカー（GGSリンカー及びGSリンカー）が挙げられる。GGSリンカーは、GGSを1〜複数個、例えば2〜6個又は2〜4個含む。一方、GSリンカーはGGGGSで示されるアミノ酸配列を1〜数個、例えば、1〜8個、3〜6個、好ましくは4個含む。リンカーは、グリシン及びセリン以外のアミノ酸残基を含んでもよいが、好ましくはグリシン及びセリンのみで構成される。グリシン及びセリンは、それ自体のサイズが小さく、リンカー内で高次構造が形成されにくいため、第一の領域と第二の領域の機能及び構造に負の影響を与えにくいからである。
【００５６】
同様に、上記融合ポリペプチドは、第二の領域を一つだけ含んでもよいし、複数、例えば2〜8、2〜6、2〜5、2〜4、2〜3、又は2含んでもよい。第二の領域を複数含む場合、各領域は直接連結されてもよいし、リンカーを介して連結されてもよい。
【００５７】
上記融合ポリペプチドは、当業者にとって公知の方法、例えば化学合成によって製造することもできるが、好ましくは、遺伝子組み換え法を用いて製造される。例えば、融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば以下の「３．ポリヌクレオチド及びベクター」に記載のベクターを導入した宿主細胞中を培養することにより、調製することができる。
【００５８】
調製されたペプチドは、常法により、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、HPLC等のクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過、及び免疫吸着法のいずれか一つ、又はこれらを二以上組み合わせて用いることによって回収又は精製することができる。
【００５９】
上記融合ポリペプチドの第一の領域はレクチン経路の重要な構成成分であるMASP-2の活性を直接的に阻害することによって、レクチン経路を阻害し得る。MASP-2はMASP-1によって活性化されるが、MASP-1なしでも活性化され得るため、MASP-2を直接的に阻害し得る点で第一の領域は優れた効果を有する。また、上記融合ポリペプチドの第二の領域は第二経路の重要な構成成分であるC3b、C3bBb、及びC3bBbPの活性を阻害することによって、効果的に第二経路を阻害し得る。したがって、第一の領域がレクチン経路を阻害し、第二の領域が第二経路を阻害し得ることから、上記融合ポリペプチドは、一分子でレクチン経路及び第二経路の二つの経路を阻害することによって、効果的に補体活性化経路を阻害し得る。
３．ポリヌクレオチド及びベクター
一態様において、本発明は、上記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００６０】
上記融合ポリペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、アミノ酸配列に基づいて、当業者であれば、容易に入手することができる。例えば、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、及び49に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドコードするポリヌクレオチドとして、それぞれ配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、及び50に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。当業者であれば、これらの対応関係に基づいて、上記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
【００６１】
例えば、第一の領域に含まれるCUB1ドメインが、配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列、配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号1又は3で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含む場合、CUB1ドメインをコードするポリヌクレオチドは、（a）配列番号2又は4で示される塩基配列、（b）配列番号2又は4で示される塩基配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列、（c）配列番号2又は4で示される塩基酸配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列、又は（d）上記（a）〜（c）の配列と異なる塩基配列を有するが縮重により同じタンパク質をコードする塩基配列を含んでよい。
【００６２】
同様に、第一の領域のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、（e）配列番号30又は32で示される塩基配列、（f）配列番号30又は32で示される塩基配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列、又は（g）配列番号30又は32で示される塩基酸配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列、又は（h）上記（e）〜（g）の配列と異なる塩基配列を有するが縮重により同じタンパク質をコードする塩基配列を含んでよく、第二の領域のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、（i）配列番号34又は36で示される塩基配列、（j）配列番号34又は36で示される塩基配列に対して90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列、（k）配列番号34又は36で示される塩基酸配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列、又は（l）上記（i）〜（k）の配列と異なる塩基配列を有するが縮重により同じタンパク質をコードする塩基配列を含んでよい。
【００６３】
上記ポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、上記ポリヌクレオチドは、哺乳動物、例えばヒト又はマウスの組織又は細胞から単離したmRNAを逆転写したcDNAを用いて、PCR法及びin fusion法等の遺伝子組み換え技術によって調製することができる。遺伝子組換え技術については、公知の方法（例えば、Sambrookら,“Molecular Cloning, A Laboratory Manual fourth edition”, Cold Spring Harber Laboratory Press, 2012）に従って実施することが可能である。
【００６４】
一態様において、本発明は、上記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００６５】
本発明において、ベクターの種類は特に限定しない。ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、及びウイルス等のベクターが挙げられる。プラスミドベクターとしては、限定するものではないが、大腸菌用のプラスミド（例えばpET22b(+)、pBR322、pBR325、及びpUC118等）、枯草菌用のプラスミド、及び酵母用のプラスミド、及び哺乳類用のプラスミド等が挙げられる。ファージベクターとしては、限定するものではないが、T7ファージディスプレイベクター、及びλファージベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、限定するものではないが、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、及びセンダイウイルス等の動物ウイルス、並びにバキュロウイルス等の昆虫ウイルス等が挙げられる。コスミドベクターとしては、限定するものではないが、Lorist 6、Charomid9-20、及びCharomid9-42等が挙げられる。ファージミドベクターとしては、限定するものではないが、例えばpSKAN、pBluescript、pBK、及びpComb3H等が挙げられる。
【００６６】
ベクターには、目的のDNAが発現可能なように調節配列や、目的DNAを含むベクターを選別するための選択マーカー、目的DNAを挿入するためのマルチクローニングサイト等が含まれ得る。そのような調節配列には、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、シャインダルガルノ配列又はリボソーム結合部位、複製開始点、及びポリAサイト等が含まれる。また、選択マーカーには、例えばアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、及びカナマイシン耐性遺伝子等が用いられ得る。
【００６７】
ベクターのうち、目的のDNAを発現することを目的とするものは、発現ベクターと呼ばれる。本発明において、ベクターは、好ましくは哺乳動物細胞での発現に適したベクター、又は複数の生物での発現に適したシャトルベクター（例えば、pCAG-Bsd PA tag-C）である。
【００６８】
融合ポリペプチドの回収を容易にするために、ペプチドの分泌を可能にするシグナルペプチド配列をコードするDNAを、目的ペプチドをコードするDNAの5'末端側に連結することにより、生成したペプチドを細胞外に分泌させてもよい。この場合、融合ペプチドは細胞膜に移行し、シグナルペプチダーゼによってシグナルペプチドが切断されて、目的のペプチドが培地に分泌放出される。あるいは、シグナルペプチドを付加せずに、細胞内に蓄積された目的ペプチドを回収することもできる。この場合、細胞を物理的又は化学的に破壊し、常法により目的ペプチドを精製又は回収することができる。
【００６９】
一態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞に関する。ベクターを導入するための宿主細胞として、大腸菌及び枯草菌等の細菌、酵母細胞、動物細胞（例えば昆虫細胞又は哺乳動物細胞）、及び植物細胞が挙げられるが、特に糖鎖付加等の翻訳後修飾が行われることから、動物細胞、特に哺乳動物細胞であることが好ましい。これらの細胞への形質転換又はトランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクル・ガン法、及びPEG法等により行うことができる。形質転換細胞の培養は、宿主生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。目的の遺伝子が導入された細胞を選抜するために、選択マーカーを用いて細胞を選抜することが好ましい。
【００７０】
本明細書において、「ポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞」は、ポリヌクレオチド又はベクターの形質転換又はトランスフェクションが行われた細胞であっても、その後代細胞であってもよい。
４．レクチン経路及び第二経路の阻害剤並びに医薬組成物
一態様において、本発明は、上記融合ポリペプチドからなる、補体活性化経路におけるレクチン経路及び第二経路の阻害剤に関する。
【００７１】
一態様において、本発明は、上記融合ポリペプチド、上記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、上記ベクター、又は上記阻害剤を含む組成物、例えば食品、サプリメント、及び医薬組成物に関する。
【００７２】
上記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は上記ベクターを含む医薬組成物は、生体内でポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現されて機能を発揮するDNAワクチンとして作用し得る。
【００７３】
本発明の組成物に含まれる上記融合ポリペプチド、上記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、上記ベクターの量は、当業者であれば、被験体の性別、体重、年齢、並びに疾患等の経過及び症状等の種々の要因を考慮して適宜定めることができる。例えば、本発明の組成物に含まれる融合ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はベクターの量は、限定するものではないが、約0.001〜100.0mg、0.010〜10mg、好ましくは0.010〜1.0mg又は0.010〜0.1mgであってよい。
【００７４】
本発明の組成物は、上記融合ポリペプチド、上記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は上記ベクターに加えて、他の成分、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、及び香料等を含んでもよい。
【００７５】
本発明の組成物は、常法により製剤化され得る。製剤化は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Merck Publishing Co．，Easton，Pa．）に記載の方法を参照することができる。
【００７６】
投与形態は特に制限されず、必要に応じ適宜選択されるが、一般には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、及びエリキシル剤等の経口剤、又は注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤、及び軟膏剤等の非経口剤として投与され得る。
【００７７】
賦形剤としては、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、及び無機塩類等が挙げられる。
【００７８】
結合剤としては、限定するものではないが、結晶セルロース、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、及びトラガントが挙げられる。
【００７９】
崩壊剤としては、限定するものではないが、結晶セルロース、メチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、デンプン、及びトラガント等が挙げられる。
【００８０】
界面活性剤としては、限定するものではないが、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００８１】
滑沢剤としては、限定するものではないが、デンプン、ステアリン酸、ステアリン酸塩、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、タルク、ロウ類、水素添加植物油、及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【００８２】
流動性促進剤としては、限定するものではないが、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、及びケイ酸マグネシウムが挙げられる。
【００８３】
本発明の阻害剤又は組成物は、レクチン経路及び第二経路の二つの経路を阻害することによって、効果的に補体活性化経路を阻害し得ることから、補体関連疾患の治療及び／又は予防に用いることができる。本明細書において、「補体関連疾患」とは、補体系の過剰な活性化によって生じる疾患を指す。補体関連疾患としては、例えば、虚血再灌流障害、加齢黄斑変性、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群（APS）、IgA腎症、C3腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、関節リウマチ、悪性関節リウマチ、IgG4関連疾患、混合型クリオグロブリン血症、溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、視神経脊髄炎、アルツハイマー病、血栓性微小血管障害症（TMA）、潰瘍性大腸炎、クローン病、及び敗血症からなる群から選択することができる。補体関連疾患は、好ましくは、虚血再灌流障害、加齢黄斑変性、全身性エリテマトーデス、及びIgA腎症からなる群から選択され、さらに好ましくは虚血再灌流障害、加齢黄斑変性、又はIgA腎症である。
【００８４】
本発明の阻害剤又は組成物が投与され得る被験体としては、限定されるものではないが、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物が挙げられ、好ましくはヒト又はマウス、最も好ましくはヒトである。
【００８５】
一態様において、本発明は、被験体に上記阻害剤又は組成物を投与することを含む、補体関連疾患を治療及び／又は予防するための方法に関する。被験体、及び補体関連疾患については上記阻害剤及び組成物について記載した通りであるから記載を省略する。
【００８６】
本方法における阻害剤又は組成物の投与量、投与間隔、及び投与期間は、当業者であれば、被験体の性別、体重、年齢、並びに疾患等の経過及び症状等の種々の要因を考慮して適宜定めることができる。例えば、本方法における阻害剤又は組成物の投与量は、約0.001〜100.0mg/kg体重、0.010〜10mg/kg体重、好ましくは0.010〜1.0mg/kg体重、又は0.010〜0.1mg/kg体重であってよい。また、投与回数は、限定するものではないが、1日3回、1日2回、1日1回、2日に1回、3日に1回、1週間に1回、2週間に1回、1カ月に1回等であってよい。また、投与期間は、限定するものではないが、1日、2日、3日、1週間、2週間、1カ月、半年、一年、又はそれ以上であってよい。
【００８７】
一態様において、本発明は、上記阻害剤又は組成物の、被験体における補体関連疾患を治療及び／又は予防するための使用に関する。被験体、及び補体関連疾患については上記阻害剤及び組成物について記載した通りであるから記載を省略する。
【実施例】
【００８８】
＜実施例1：sMAPとfactor Hの融合ポリペプチド(ポリペプチド１)の作製＞
（材料と方法）
１）マウスsMAP及びfactor H SCR1-5ドメインのcDNAのクローニング
マウス肝臓からRNAをTRIzol液（Thermo Fisher Scientific）で抽出し、Advantage RT-for-PCR Kit（Clontech）でcDNAに変換後、これを鋳型にPCR法でマウスsMAPとマウスfactor H SCR1-5ドメインのcDNAを、下記表１のプライマーを用いてクローニングした。sMAPの増幅のためのPCRは、98℃10秒、70℃15秒、72℃1分30秒のサイクルを35サイクルで行った。factor H SCR1-5ドメインの増幅のためのPCRは、98℃10秒、58℃15秒、72℃1分のサイクルを35サイクルで行った。【００８９】
【表１】
2018070521.tif 000003
【００９０】
得られたマウスsMAPをコードするcDNAとマウスfactor H SCR1-5ドメインをコードするcDNAを、それぞれZero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing（Thermo Fisher Scientific）を用いてpCR4 Blunt-TOPOベクターに組み込んだ。ベクターを大腸菌DH5α株に42℃１分間のヒートショック法で形質転換し、アンピシリン添加LB寒天培地へ散布し37℃で培養した。大腸菌コロニーを12個拾い上げ、アンピシリン添加LB液体培地で培養した。QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN)を用いてベクターを精製し、塩基配列を解読して目的の塩基発列（sMAP又はfHのSCR1〜5ドメインをコードする塩基配列）を保持するベクターを選別した。
２）sMAP-fH発現ベクターの構築
上記１）で得られたsMAP又はfHのSCR1〜5ドメインをコードする塩基配列を保持するベクターを鋳型に、sMAPとfHのSCR1〜5ドメインを接続するリンカー配列付加プライマーを用いて、マウスsMAPとマウスfactor H SCR1〜5ドメインのcDNAをPCR法で増幅した。PCRの条件は、98℃10秒、75℃15秒、72℃1分30秒のサイクルを35サイクルで行った。増幅に用いたPCRのプライマー配列を以下の表に示す。【００９１】
【表２】
2018070521.tif 000004
【００９２】
得られたリンカー配列を付加した、マウスsMAPをコードするcDNAとマウスfactor H SCR1-5ドメインをコードするcDNAを、In-Fusion HD Cloning Kit（Clontech）を用いてPAタグ付加発現ベクターpCAG-Bsd PA tag-C（和光純薬工業）のマルチクローニングサイトに組み込んだ。【００９３】
上記の発現ベクターを大腸菌DH5α株に42℃1分間のヒートショック法で形質転換し、ブラストサイジン添加LB寒天培地へ散布し37℃で培養した。大腸菌コロニーを12個拾い上げ、ブラストサイジン添加LB液体培地で培養した。QIAGEN Plasmid Midi Kit（QIAGEN）を用いてベクターを精製し、塩基配列を解読して目的の塩基発列（sMAP（配列番号31）、リンカー（(GGGGS)4）、及びfHのSCR1〜5ドメイン（配列番号35）をN末端から順番に含む融合ポリペプチド（以下、単にsMAP-fHとも記載する）をコードする塩基配列）を保持する発現ベクターを選別した。
３）sMAP-fHの作製
上記２）で得られたsMAP-fHをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを、CHO細胞にFugene6トランスフェクション試薬（Promega）を用いてトランスフェクトし、無血清培地（SIGMA ALDRICH、Ex cell325）を用いて、37℃5%炭酸ガス環境下でsMAP-fHを産生させた。培養上清を回収し、抗PA抗体結合アフィ二ティーカラム（和光純薬工業）で添付の説明書に従ってsMAP-fHを精製した。
４）sMAP-fHのウエスタンブロッティング
上記３）で得られたsMAP-fHを10%アクリルアミドゲルにてSDS-PAGEで展開し、PVDF膜に転写後Blocking one（ナカライ）でブロッキングを30分行った。PVDF膜に（ウサギにリコンビナントMASP-2を免疫し、その血清から精製して作製した）抗マウスsMAPポリクローナル抗体及びHRP標識抗ウサギ抗体（Dako）、又は抗ヒトfactor H抗体（abcom）及びHRP標識抗ヒツジ抗体（chemicon）を室温で30分ずつ反応させ、ECL prime kit(GE health)を添付の説明書に従って用いてsMAP-fHを検出した。
５）sMAP-fHのマススペクトロメトリー解析
上記３）で得られたsMAP-fHを10%アクリルアミドゲルにてSDS-PAGEで展開し、CBBで染色した。sMAP-fHに相当するバンドを切り出し、50%アセトニトリル（Thermo Fisher Scientific）で脱染色し、遠心乾燥した。これにtrypsin/lysyl endopeptidase溶液（和光純薬）を加えてゲルを膨潤させ、37℃で消化した。この溶液に0.1%TFA/50%アセトニトリル溶液40μL（Thermo Fisher Scientific）を加えて15分間超音波処理後、約2μLになるまで遠心濃縮し、50μLの0.1%TFA（Thermo Fisher Scientific）を加えてC18カラムを用いて脱塩と不溶物の除去を行った。これに20μLの0.1%ギ酸/80%アセトニトリル（Thermo Fisher Scientific）を加えてsMAP-fHのペプチド断片を2回溶出し、約2μLになるまで遠心濃縮後、20μLの0.1%ギ酸/2%アセトニトリル溶液（Thermo Fisher Scientific）を加え、C18カラム（75μmｘ15cm,200nL/min）を用いてQSTAR XL Hybrid LC/MS/MS System (Thermo Fisher Scientific) で液体クロマトグラフィー質量分析を行い、PEAKS Studio（Bioinformatics Solutions）でdata base検索を行って目的のタンパク質を同定した。
（結果）
sMAP及びfHのSCR1〜5ドメインを含む融合ポリペプチド（sMAP-fH）を得るため、発現ベクターを作製した。【００９４】
PCR及びIn-Fusion法を用いてsMAP-fHをコードする塩基配列をベクターに組込み、得られた発現ベクターの塩基配列を解読することによって、目的の塩基発列（sMAP、リンカー、及びfHのSCR1〜5ドメインをN末端から順番に含む融合ポリペプチドsMAP-fH（模式図を図１に示す）をコードする塩基配列）を保持する発現ベクターを選別した。この発現ベクターをCHO細胞にトランスフェクトし、発現させたポリペプチドについてCBB染色を行ったところ、目的のペプチドに対応する分子量付近にバンドが認められた（図2A）。発現させたポリペプチド対してウエスタンブロッティングを行ったところ、抗マウスsMAPポリクローナル抗体、及び抗ヒトfactor H抗体の両方と反応したことから、sMAP及びfactor HのSCR1〜5ドメインを含む融合ポリペプチドが発現していることが確認された（図2B及びC）。また、マススペクトロメトリー解析では、得られたデータのdata base検索の結果、作製したsMAP-fHが、マウスsMAPに相当するドメインのペプチドと、マウスfactor H SCR1-5ドメインに相当するドメインのペプチドとを含むことが確認された（データ示さず）。
＜実施例2：sMAP-fHによるin vitro での補体阻害作用＞
（材料と方法）
Maxisorp plate（Nunc）に0.1M Carbonate Buffer（pH9.6）で希釈した100μg/mL Mannan（Sigma Aldrich M3640）溶液を各ウェルに100μLずつ加え、4℃湿潤環境で一晩静置した。翌日、1％BSA（SIGMA A7882）を加えたPBSをブロッキング溶液とし、200μLずつ加え、室温の湿潤環境で2〜3時間静置し、mannan-coated microtiter plateとした。このplateのブロッキング溶液を除き、5mM CaCl2入りTBS溶液で2%に希釈した8〜12週齢のWild type C57BL/6Jマウス血清と実施例1で調製したsMAP-fH（ポリペプチド１）を125 nM〜1000 nMまで段階的に希釈したものを混合し、37℃で1時間反応した後、mannan-coated microtiter plateに添加し37℃で20分インキュベートした。0.05%Tween及び5mM CaCl2入りTBSでプレートを3回洗浄後、HRP標識ヤギ抗マウスC3抗体（Kamiya biomedical company、Complement C3 ELISA Kit）を5mM CaCl2入りTBSで8000倍に希釈し、各ウェル100μLずつ加え室温30分反応させた。TMB試薬（KPL）を各ウェル100μLずつ加え、micro mixerで混和し、発色を観察し、10分後、1Mリン酸を各ウェル100μLずつ加え反応を停止した。【００９５】
吸光度（OD450nm）をVarioscan Lux（Thermo Fisher Scientific）で測定し、マンナンプレート上への補体C3の沈着度（補体レクチン経路と第二経路の活性化能）を測定した。
（結果）
sMAP-fHによるin vitroでの補体活性化経路の阻害効果を評価するため、レクチン経路を介して第二経路が活性化される補体活性化経路の阻害効果を反映するC3沈着アッセイを行った。その結果、sMAP-fHを添加したマウス血清では、sMAP-fHの用量依存的にC3沈着の阻害効果が認められた（図3）。以上の結果から、sMAP-fHはin vitroにおいて補体活性化経路の阻害能を有すると示された。
＜実施例3：sMAP-fHのin vivoでの効果の検討＞
（材料と方法）
１）sMAP-fHの腹腔内投与後の血中濃度変化
マウス（日本クレア、C57BL/6J、雌、12-14週齢）に、sMAP-fHを500μg腹腔内に投与し、1、2、4、8、24、及び48時間後に眼窩静脈叢から採血した。また、対照としてPBSを腹腔内に投与したマウスも同様に採血した。Maxisorp plate（Nunc）に、carbonate buffer p9.6で10ng/mLに希釈した抗PA抗体（和光純薬工業 016-25861）を1ウェルに対して50μL加え、4℃湿潤環境で一晩静置後、1％BSA入りPBSを用いて室温で2〜3時間ブロッキングした。このplateに、遠心分離した血清を0.1%BSA入りPBS溶液で希釈し、併せて実施例1で調製した既知濃度のsMAP-fHを標準液として添加した。室温1時間インキュベート後、HRP標識抗PA抗体（和光純薬工業015-25951）を用いて室温30分反応後、TMB試薬（KPL）を各ウェル100μLずつ加え、micro mixerで混和し、発色を観察し、10分後、1Mリン酸を各ウェル100μLずつ加え反応を停止した。吸光度（OD450nm）をVarioscan Lux（Thermo Fisher Scientific）で測定し、血中のsMAP-fH濃度を測定した。
２）sMAP-fH腹腔内投与後のin vivoでのレクチン経路の阻害作用
Maxisorp plate（Nunc）に0.1M carbonate buffer pH9.6で希釈した100μg/mL mannan溶液（SIGMA M3640）を各ウェルに100μLずつ加え、湿潤状態、4℃で一晩反応させた。翌日、1％BSA入りPBSでブロッキング後、1％BSA及び5mM CaCl2入りTBSで上記１）のマウス血清を2%に希釈したサンプルを100μL加え、湿潤環境、37℃で30分反応させた。1％BSA及び5mM CaCl2入りTBSで1000倍希釈したヒトC4（Hycult）を100μL加え、氷上で30分反応後、1％BSA及び5mM CaCl2入りTBSで希釈したヤギ抗ヒトC4抗体（Capple）を加え室温30分反応させた。次に1％BSA及び5mM CaCl2入りTBSで希釈したビオチン標識抗ヤギ抗体（Dako）を室温30分反応後、VECTASTAIN ABC Kit（Vector laboratories）を添付の説明書に従って反応を行い、マンナンプレート上への補体C4の沈着度（補体レクチン経路の活性化能）を吸光度計(OD450nm)で測定し、PBSのみ投与されたマウスの値に対するC4の相対値を求めた。
３）sMAP-fH腹腔内投与後のin vivoでの第二経路の阻害作用
上記１）で採取した血清5μLに、20 mg/mLに調製したザイモサン（SIGMA Z4250）を5μL加え、10mM CaCl2及び10ｍM MgCl2入りTBS溶液で総量50μLに希釈し、37℃で10分反応させた。反応液に10mM EDTA（同仁化学研究所）及び0.05%Tween入りTBSを加えて補体活性化を停止して洗浄後、10mM CaCl2及び10mM MgCl2入りTBS溶液で希釈したFITC標識抗マウスC3抗体（Capple）を氷上で30分反応させ、ザイモサンへの補体C3の結合度（補体第二経路の活性化能）をMASP-2欠損マウス血清(m2KO)、sMAP-fH投与前(pre)、血清添加なし（zymosan only）と比較し、フローサイトメトリーでFITCの値からC3の沈着を測定した。
（結果）
in vivoでのsMAP-fHの動態を調べるため、sMAP-fHを腹腔内に投与し、1、2、4、8、24、及び48時間後の血中濃度を測定した。その結果、sMAP-fHの血中濃度は腹腔内投与後1時間をピークに、48時間まで次第に減少することが示された（図4）。【００９６】
続いて、sMAP-fH腹腔内投与によるin vivoでのレクチン経路の阻害効果を評価するため、レクチン経路の阻害効果を反映するC4沈着アッセイを、sMAP-fHを腹腔内に投与したマウスの血清を用いて行った。その結果、PBS投与群と比較して、sMAP-fH投与群ではマンナンコートプレートへのC4の沈着レベルの抑制効果が認められ、その効果はsMAP-fH腹腔内投与8時間後の血清において最大であった（図5）。【００９７】
さらに、sMAP-fH腹腔内投与によるin vivoでの第二経路の阻害効果を評価するため、第二経路の阻害効果を反映するザイモサンアッセイを、sMAP-fHを腹腔内に投与したマウスの血清を用いて行った。その結果、sMAP-fH投与前の血清と比較してsMAP-fH投与群ではザイモサンへのC3の沈着レベルの抑制効果が認められ、その効果はsMAP-fH腹腔内投与4時間後の血清において最大であった（図6）。【００９８】
以上の結果から、sMAP-fHはin vivoで補体レクチン経路と第二経路の阻害能を有することが示された。
＜実施例4：ヒトsMAPとヒトfactor Hの融合ポリペプチド(リンカー(GGGGS)×1)（ポリペプチド２）の作製＞
（材料と方法）
１）ヒトsMAP及びヒトfactor H SCR1-5ドメインのcDNAのクローニング
ヒト肝由来cDNAを鋳型にネステッドPCR法でヒトsMAPとN末端にリンカー配列を付加したヒトfactor H SCR1-5ドメインのcDNAを、下記表3のプライマーを用いてクローニングした。１回目のPCRは、98℃10秒、63℃15秒、72℃1分30秒のサイクルを35サイクルで行った。2回目のPCRは、98℃10秒、94.5℃〜75℃のgraduentで15秒、72℃１分30秒を35サイクルで行った。ネステッドPCR法におけるアウター・プライマー及びインナー・プライマーを表３に示す。【００９９】
【表３】
2018070521.tif 000005
【０１００】
２）ヒトsMAP-fH発現ベクターの構築
得られたヒトsMAPをコードするcDNAとN末端にリンカー配列を付加したヒトfactor H SCR1-5ドメインをコードするcDNAを、In-Fusion HD Cloning Kit（Clontech）を用いてPAタグ付加発現ベクターpCAG-Bsd PA tag-C（和光純薬工業）のマルチクローニングサイトに組み込んだ。ベクターを大腸菌DH5α株に42℃１分間のヒートショック法で形質転換し、アンピシリン添加LB寒天培地へ散布し37℃で培養した。大腸菌コロニーを30個拾い上げ、アンピシリン添加LB液体培地で培養した。NucleoBond（登録商標） Xtra Midi Olus EF(MACHEREY-NAGEL)を用いてベクターを精製し、塩基配列を解読して目的の塩基発列（ヒトsMAP、リンカー配列、ヒトfHのSCR1〜5ドメインをN末端からこの順番で含むポリペプチドをコードする塩基配列）を保持するベクターを選別した。
３）ヒトsMAP-fHの作製
上記２）で得られたsMAP-fHをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを、CHO細胞にFugene6トランスフェクション試薬（Promega）を用いてトランスフェクトし、無血清培地（SIGMA ALDRICH、Ex cell325）を用いて、37℃5%炭酸ガス環境下でsMAP-fHを産生させた。培養上清を回収し、抗PA抗体結合アフィ二ティーカラム（和光純薬工業）で添付の説明書に従ってsMAP-fHを精製した。
＜実施例5：ヒトsMAPとヒトfactor Hの融合ポリペプチド(リンカー(GGGGS)×4)（ポリペプチド３）の作製＞
実施例4と同様の手法で、ヒトsMAP、リンカー(GGGGS)×4、ヒトfHのSCR1〜5ドメインをN末端からこの順番で含むポリペプチドをコードする塩基配列を保持するベクターを構築し、CHO細胞にトランスフェクトして目的のポリペプチドを発現させ、培養上清を回収して精製した。アウター・プライマーは表３に記載のものを使用した。ネステッドPCR法におけるインナー・プライマーを表４に示す。【０１０１】
【表４】
2018070521.tif 000006
【０１０２】
＜実施例6：ヒトsMAPとヒトfactor Hの融合ポリペプチド(リンカー(GGGGS)×7)（ポリペプチド４）の作製＞
実施例4と同様の手法でヒトsMAP、リンカー(GGGGS)×7、ヒトfHのSCR1〜5ドメインをN末端からこの順番で含むポリペプチドをコードする塩基配列を保持する発現ベクターを構築し、CHO細胞にトランスフェクトし、ポリペプチドを発現させ、精製した。アウター・プライマーは表３に記載のものを使用した。ネステッドPCR法におけるインナー・プライマーを表５に示す。【０１０３】
【表５】
2018070521.tif 000007
【０１０４】
＜実施例7：ヒトsMAPとヒトfactor Hの融合ポリペプチド（ポリペプチド２、３、４）の確認＞
１）ウエスタンブロッティング
実施例4、5、及び6で得られた各ポリペプチド（ポリペプチド２、３及び４）を10%アクリルアミドゲルにてSDS-PAGEで展開し、PVDF膜に転写後Blocking one（ナカライ）でブロッキングを30分行った。PVDF膜に抗マウスsMAPポリクローナル抗体（ウサギにリコンビナントMASP-2を免疫し、その血清から精製して作製した）及びHRP標識抗ウサギ抗体（Dako）、又は抗ヒトfactor H抗体（abcam）及びHRP標識抗ヒツジ抗体（chemicon）を室温で30分ずつ反応させ、ECL prime kit(GE health)を添付の説明書に従って用いてsMAP-fHを検出した。
２）マススペクトロメトリー解析
実施例4、5、及び6で得られた各ポリペプチドを10%アクリルアミドゲルにてSDS-PAGEで展開し、CBBで染色した。sMAP-fHに相当するバンドを切り出し、50%アセトニトリル（Thermo Fisher Scientific）で脱染色し、遠心乾燥した。これにtrypsin/lysyl endopeptidase溶液（和光純薬）を加えてゲルを膨潤させ、37℃で消化した。この溶液に0.1%TFA/50%アセトニトリル溶液40μL（Thermo Fisher Scientific）を加えて15分間超音波処理後、約2μLになるまで遠心濃縮し、50μLの0.1%TFA（Thermo Fisher Scientific）を加えてC18カラムを用いて脱塩と不溶物の除去を行った。これに20μLの0.1%ギ酸/80%アセトニトリル（Thermo Fisher Scientific）を加えてsMAP-fHのペプチド断片を2回溶出し、約2μLになるまで遠心濃縮後、20μLの0.1%ギ酸/2%アセトニトリル溶液（Thermo Fisher Scientific）を加え、C18カラム（75μmｘ15cm,200nL/min）を用いてQSTAR XL Hybrid LC/MS/MS System (Thermo Fisher Scientific)で液体クロマトグラフィー質量分析を行い、PEAKS Studio（Bioinformatics Solutions）でdata base検索を行って目的のタンパク質を同定した。
（結果）
実施例4、5、及び6で得られた各ポリペプチドに対してウエスタンブロッティングを行ったところ、いずれのポリペプチドも抗マウスsMAPポリクローナル抗体、及び抗ヒトfactor H抗体の両方と反応したことから、sMAP及びfactor HのSCR1〜5ドメインを含む融合ポリペプチドが発現していることが確認された（データ示さず）。また、実施例5で調製したポリペプチド３について行ったマススペクトロメトリー解析では、得られたデータのdata base検索の結果、が、マウスsMAPに相当するドメインのペプチドと、マウスfactor H SCR1-5ドメインに相当するドメインのペプチドとを含むことが確認された（データ示さず）。
＜実施例8：ヒトsMAPとヒトfactor Hの融合ポリペプチド（ポリペプチド２、３、及び４の補体阻害作用＞
（材料と方法）
実施例4、5、及び6で作製した３つのポリペプチド（ポリペプチド２、３、及び４）のレクチン経路及び第二経路の阻害作用を、Wieslab（登録商標）Complement System Screen kit (Euro Diagnostica)を用いて評価した。 正常ヒト血清（N=3）と各ポリペプチドを混合し、37℃で1時間反応した後、各経路を評価するプレートに添加し37℃で60分インキュベートした。Wash bufferで3回洗浄後、conjugateを各ウェル100μLずつ加え室温30分反応させた。wash bufferで3回洗浄後、substrate solutionを各ウェル100μLずつ加え室温30分で反応させ、5 mM EDTAで反応を停止させた。吸光度（OD405nm）をVarioscan Lux（Thermo Fisher Scientific）で測定し、各経路のプレート上への補体活性化最終産物であるMAC（Membrane Attack Complex）の沈着度を測定した。【０１０５】
なお、レクチン経路の阻害作用の評価においては、レクチン経路の阻害作用を有しないと想定されるfHを併せて評価した。また、第二経路の阻害作用の評価においては第二経路の阻害作用を有しないと想定されるsMAPを併せて評価した。
（結果）
レクチン経路及び第二経路の阻害作用の評価結果を図7に示す。縦軸はポリペプチド非存在下の吸光度を100％、バックグラウンドの吸光度を0％とした場合の吸光度（％）を示す。図7に示した通り、レクチン経路と第二経路の両方において、ポリペプチド２、３、４の存在下で濃度依存的な吸光度の低下が観察され、ポリペプチド２、３、４は、いずれもレクチン経路と第二経路の両者を阻害することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明により、レクチン経路及び第二経路を阻害し得る融合ポリペプチド、該融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、及びこれらを含むレクチン経路及び第二経路の阻害剤又は医薬組成物等が提供される。本発明により、補体関連疾患を効果的に治療及び／又は予防することが可能になり得る。【０１０７】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2018070521.tif 000008
【図２】
2018070521.tif 000009
【図３】
2018070521.tif 000010
【図４】
2018070521.tif 000011
【図５】
2018070521.tif 000012
【図６】
2018070521.tif 000013
【図７】
2018070521.tif 000014
【配列表】
2018070521000001.app
【国際調査報告】
2018070521.tif 000015
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