(57)【要約】  この細胞培養装置は、１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備える。前記細胞培養ユニットは、液体が貯留される気密構造の第１液体貯留室と、前記液体が貯留される第２液体貯留室と、細胞の培養液が貯留される培養液貯留空間を有する培養液貯留室と、前記細胞が接着可能な一方の面が前記培養液貯留空間に臨む透過性の隔膜と、前記第１液体貯留室を供給源とする前記液体を、前記隔膜の他方の面側の空間から前記第２液体貯留室に導く液体導出流路と、を有する。前記貯留槽は、前記第１液体貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する。
2017154899.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、
前記細胞培養ユニットは、液体が貯留される気密構造の第１液体貯留室と、
前記液体が貯留される第２液体貯留室と、
細胞の培養液が貯留される培養液貯留空間を有する培養液貯留室と、
前記細胞が接着可能な一方の面が前記培養液貯留空間に臨む透過性の隔膜と、
前記第１液体貯留室を供給源とする前記液体を、前記隔膜の他方の面側の空間から前記第２液体貯留室に導く液体導出流路と、を有し、
前記貯留槽は、前記第１液体貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する、細胞培養装置。
【請求項２】
複数の前記細胞培養ユニットの前記第１液体貯留室のうち少なくとも２つは、気体が流通可能となるように互いに連通されている、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記液体を前記第２液体貯留室から第１液体貯留室に導く液体返送流路をさらに有し、
前記第２液体貯留室は、播種された細胞が保持される細胞保持部を有する、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
複数の前記細胞培養ユニットの前記第１液体貯留室のうち少なくとも２つは気体が流通可能となるように互いに連通され、かつ複数の前記細胞培養ユニットの前記第２液体貯留室のうち少なくとも２つは気体が流通可能となるように互いに連通されている、請求項３に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
前記細胞培養ユニットは、前記培養液が貯留される第２培養液貯留室と、
前記培養液を前記培養液貯留室から前記第２培養液貯留室に導く培養液導出流路と、
前記培養液を前記第２培養液貯留室から前記培養液貯留室に導く培養液導入流路と、をさらに備え、
前記貯留槽は、前記培養液貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する、請求項１〜４のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記複数の細胞培養ユニットの培養液貯留室のうち少なくとも２つは、気体が流通可能となるように互いに連通されている、請求項５に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記第１液体貯留室と、前記第２液体貯留室と、前記第２培養液貯留室とは、播種された細胞が保持される細胞保持部を有する、請求項５または６に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記液体導出流路から前記第２液体貯留室への前記液体の流れを制御する逆流防止機構をさらに備えている、請求項１〜７のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記逆流防止機構は、前記液体導出流路から前記第２液体貯留室へ向かう方向の前記液体の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁である、請求項８に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
前記液体を前記第１液体貯留室から前記隔膜の他方の面側の空間に導く液体導入流路と、
前記第１液体貯留室から前記液体導入流路への前記液体の流れを制御する逆流防止機構と、をさらに備えている、請求項１〜７のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
前記逆流防止機構は、前記第１液体貯留室から前記液体導入流路への前記液体の流れを許容し、かつ前記第１液体貯留室から前記液体導入流路への気体の流れを阻止するラプラス弁である、請求項１０に記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
前記液体導出流路は、流路断面積が他の部位に比べて１／１０以下である抵抗流路部位を有する、請求項１〜１１のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
前記貯留槽は、前記第１液体貯留室、前記第２液体貯留室および前記培養液貯留室が形成された容器状の槽本体と、前記第１液体貯留室、前記第２液体貯留室および前記培養液貯留室の開口を開閉自在かつ気密に閉止する蓋部とを有する、請求項１〜１２のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
前記蓋部を前記槽本体に向けて押さえつけて保持する蓋部押圧部をさらに備え、
前記蓋部押圧部は、前記槽本体に向けて前記蓋部を押圧する押圧部材を有する、請求項１３に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
前記槽本体は、前記液体導出流路を有する底部プレートと、前記底部プレートの一方の面に設けられた壁部とを備え、
前記第１液体貯留室、前記第２液体貯留室および前記培養液貯留室は、前記底部プレートと前記壁部とによって区画された空間である、請求項１３または１４に記載の細胞培養装置。
【請求項１６】
前記壁部を前記底部プレートに向けて押さえつけて保持する壁部押圧部をさらに備え、
前記壁部押圧部は、前記底部プレートに向けて前記壁部を押圧する押圧部材を有する、請求項１５に記載の細胞培養装置。
【請求項１７】
前記第１液体貯留室内を加圧可能な加圧手段をさらに備えている、請求項１〜１６のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１８】
１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、液体が貯留される気密構造の第１液体貯留室と、前記液体が貯留される第２液体貯留室と、細胞の培養液が貯留される培養液貯留空間を有する培養液貯留室と、前記細胞が接着可能な一方の面が前記培養液貯留空間に臨む透過性の隔膜と、前記第１液体貯留室を供給源とする前記液体を、前記隔膜の他方の面側の空間から前記第２液体貯留室に導く液体導出流路と、を有し、前記貯留槽は、前記第１液体貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する細胞培養装置を使用し、前記第１液体貯留室に前記通気孔を通して気体を供給して前記第１液体貯留室内を加圧し、前記第１液体貯留室内の圧力上昇によって、前記液体導出流路によって、前記液体を、前記隔膜の他方の面側の空間から前記第２液体貯留室に導く、細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養する装置およびこの装置を用いて細胞を培養する方法に関する。
本願は、２０１６年３月８日に日本に出願された特願２０１６−４５０２３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１，２に見られるように、近年の医薬品開発コストは指数関数的に増加しており、臨床試験の成功率も年々低下している。また、化粧品等の化成品開発においても同様に、開発コストの増加が起きている。かかる原因として、動物とヒトの種差のため、動物実験結果を臨床試験に直接的に外挿できないことが挙げられる。また、化粧品等の化成品開発では、欧州を中心に実験動物の使用が困難となってきていることもある。このような状況の中で、ヒト由来の培養細胞を用いた医薬品候補化合物や化成品のin vitro細胞アッセイに対する期待が高まっている。【０００３】
一方、従来の細胞アッセイで利用されてきた単層培養は、細胞を取り巻く環境が生体内と大きく異なり、培養細胞では体内で発現している機能の多くが失われている点がしばしば問題となる。近年の微細加工技術や三次元培養技術の進歩により、この問題が克服され、細胞アッセイのスループットと信頼性が同時に向上されると期待されている（例えば、非特許文献３，４）。特に、生理学的な三次元培養環境をin vitroで再現したマイクロ流体デバイスを１つの臓器のように取り扱うOrgan-on-a-chipという概念が広がり、医薬品開発への応用を意識した研究が世界的に広く展開されつつある（例えば、非特許文献５，６）。さらに、in vitroで再構成した複数の臓器モデルをマイクロ流路等で接続し、個体応答の再現を目指すBody-on-a-chipという概念も提唱され、急速な注目を集めている（例えば、非特許文献７）。【０００４】
以上の様に、ヒト由来の培養細胞によって構成される臓器モデルを生体外で再構成し、生理学的な機能を再現することで、細胞アッセイの信頼性が向上すると期待されている。
ここで、生体を構成する臓器の多くは隔膜型の構造をしている。例えば、小腸では腸間膜を隔てて栄養分が吸収され、腎臓では腎尿細管上皮細胞膜を介して代謝産物や老廃物を排泄している。また全身を巡る血管においても血管壁を介して周囲の組織に酸素や栄養素が供給され、老廃物が排泄されている。このような隔膜型の臓器機能を生体外で再構成するために、ボイデンチャンバーやトランズウェルといった隔膜型の培養容器が利用されてきた。しかしながら、これらの培養容器では、隔膜の一方の面側および他方の面側に液を流すことができないため、生理的な機能が発現しない、膜下部における細胞の状態の悪化、複数臓器を連結したBody-on-a-chipに適用できないといった問題がある。【０００５】
この問題を解決すべく、マイクロ流路の中に隔膜を配置した、Organ-on-a-chipが報告されている。例えば、腸（非特許文献８，９）、腎臓（非特許文献１０）、および脳内血管（非特許文献１１）に関する生体外モデルが報告されている。このような隔膜を内蔵したOrgan-on-a-chipを、動物実験の代替として創薬に利用していくためには、多種類の化合物を同時に評価できるシステムが必要である。一方で、上述の先行研究では送液のためにシリンジポンプやペリスタポンプを用いているために培養システムの並列化が困難である。【０００６】
本発明者等は、既に、これまでの研究で多数の薬剤溶液を簡便に取り扱える「圧力駆動型の灌流培養マイクロチャンバーアレイ」を開発し（非特許文献１２，１３）、その後、使い勝手の良いプラットフォームを備えた循環培養システムを開発して実用化のためのユーザー評価を実施するに至っている（非特許文献１４および特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１５−０７３４６８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Scannell, J. W. et al. Nat. Rev. Drug Discov., 11, 191 (2012)
【非特許文献２】Pammolli, F. et al. Nat. Rev. Drug Discov., 10, 428 (2011)
【非特許文献３】van Midwoud, P. M. et al. Integr. Biol., 3, 509 (2012)
【非特許文献４】Ghaemmaghami, A. M. et al. Drug Discov. Today, 17, 173 (2012)
【非特許文献５】Bhatia, S. N. et al. Nat. Biotechnol., 32, 760 (2014)
【非特許文献６】Baker, M. Nature, 471, 661 (2011)
【非特許文献７】Sung, J. H. et al. Lab Chip, 13, 1201 (2013)
【非特許文献８】H. J. Kim, D. Huh, G. Hamilton and D. E. Ingber,, Lab Chip,12, 2165-2174 (2012).
【非特許文献９】M. B. Esch, J. H. Sung, J. Yang, C. H. Yu, J. J. Yu, J. C. March and M. L. Shuler, Biomed. Microdevices, 14, 895-906 (2012).
【非特許文献１０】K.-J. Jang, A. P. Mehr, G. A. Hamilton, L. A. McPartlin, S. Chung, K.-Y. Suh and D. E. Ingber, Integr. Biol., 5, 1119-1129 (2013).
【非特許文献１１】R. Booth and H. Kim, Lab Chip, 12, 1784-1792 (2012).
【非特許文献１２】S.Sugiura, et al., Anal.Chem., 82, 8278 (2010)
【非特許文献１３】S.Sugiura, et al., Biotechnol.Bioeng., 100, 1156 (2008)
【非特許文献１４】K.Hattori, et al., J.Biosci.Bioeng., 118, 327 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来の細胞培養装置においては、配管等の構造が複雑であるため、装置が大型化し、また、操作が煩雑であるなどの多くの問題があった。【００１０】
本発明は、簡略な装置構造であって、操作の容易な細胞培養装置および細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（１）１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、液体が貯留される気密構造の第１液体貯留室と、前記液体が貯留される第２液体貯留室と、細胞の培養液が貯留される培養液貯留空間を有する培養液貯留室と、前記細胞が接着可能な一方の面が前記培養液貯留空間に臨む透過性の隔膜と、前記第１液体貯留室を供給源とする前記液体を、前記隔膜の他方の面側の空間から前記第２液体貯留室に導く液体導出流路と、を有し、前記貯留槽は、前記第１液体貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する、細胞培養装置。
（２）複数の前記細胞培養ユニットの前記第１液体貯留室のうち少なくとも２つは、気体が流通可能となるように互いに連通されている（１）に記載の細胞培養装置。
（３）前記液体を前記第２液体貯留室から第１液体貯留室に導く液体返送流路をさらに有し、前記第２液体貯留室は、播種された細胞が保持される細胞保持部を有する（１）に記載の細胞培養装置。
（４）複数の前記細胞培養ユニットの前記第１液体貯留室のうち少なくとも２つは気体が流通可能となるように互いに連通され、かつ複数の前記細胞培養ユニットの前記第２液体貯留室のうち少なくとも２つは気体が流通可能となるように互いに連通されている（３）に記載の細胞培養装置。
（５）前記細胞培養ユニットは、前記培養液が貯留される第２培養液貯留室と、前記培養液を前記培養液貯留室から前記第２培養液貯留室に導く培養液導出流路と、前記培養液を前記第２培養液貯留室から前記培養液貯留室に導く培養液導入流路と、をさらに備え、前記貯留槽は、前記培養液貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する（１）〜（４）のうちいずれか１つに記載の細胞培養装置。
（６）前記複数の細胞培養ユニットの培養液貯留室のうち少なくとも２つは、気体が流通可能となるように互いに連通されている（５）に記載の細胞培養装置。
（７）前記第１液体貯留室と、前記第２液体貯留室と、前記第２培養液貯留室とは、播種された細胞が保持される細胞保持部を有する（５）または（６）に記載の細胞培養装置。
（８）前記液体導出流路から前記第２液体貯留室への前記液体の流れを制御する逆流防止機構をさらに備えている（１）〜（７）のうちいずれか１つに記載の細胞培養装置。
（９）前記逆流防止機構は、前記液体導出流路から前記第２液体貯留室へ向かう方向の前記液体の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁である（８）に記載の細胞培養装置。
（１０）前記液体を前記第１液体貯留室から前記隔膜の他方の面側の空間に導く液体導入流路と、前記第１液体貯留室から前記液体導入流路への前記液体の流れを制御する逆流防止機構と、をさらに備えている（１）〜（７）のうちいずれか１つに記載の細胞培養装置。
（１１）前記逆流防止機構は、前記第１液体貯留室から前記液体導入流路への前記液体の流れを許容し、かつ前記第１液体貯留室から前記液体導入流路への気体の流れを阻止するラプラス弁である（１０）に記載の細胞培養装置。
（１２）前記液体導出流路は、流路断面積が他の部位に比べて１／１０以下である抵抗流路部位を有する（１）〜（１１）のうちいずれか１つに記載の細胞培養装置。
（１３）前記貯留槽は、前記第１液体貯留室、前記第２液体貯留室および前記培養液貯留室が形成された容器状の槽本体と、前記第１液体貯留室、前記第２液体貯留室および前記培養液貯留室の開口を開閉自在かつ気密に閉止する蓋部とを有する（１）〜（１２）のうちいずれか１つに記載の細胞培養装置。
（１４）前記蓋部を前記槽本体に向けて押さえつけて保持する蓋部押圧部をさらに備え、前記蓋部押圧部は、前記槽本体に向けて前記蓋部を押圧する押圧部材を有する（１３）に記載の細胞培養装置。
（１５）前記槽本体は、前記液体導出流路を有する底部プレートと、前記底部プレートの一方の面に設けられた壁部とを備え、前記第１液体貯留室、前記第２液体貯留室および前記培養液貯留室は、前記底部プレートと前記壁部とによって区画された空間である（１３）または（１４）に記載の細胞培養装置。
（１６）前記壁部を前記底部プレートに向けて押さえつけて保持する壁部押圧部をさらに備え、前記壁部押圧部は、前記底部プレートに向けて前記壁部を押圧する押圧部材を有する（１５）に記載の細胞培養装置。
（１７）前記第１液体貯留室内を加圧可能な加圧手段をさらに備えている（１）〜（１６）のうちいずれか１つに記載の細胞培養装置。
（１８）１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、液体が貯留される気密構造の第１液体貯留室と、前記液体が貯留される第２液体貯留室と、細胞の培養液が貯留される培養液貯留空間を有する培養液貯留室と、前記細胞が接着可能な一方の面が前記培養液貯留空間に臨む透過性の隔膜と、前記第１液体貯留室を供給源とする前記液体を、前記隔膜の他方の面側の空間から前記第２液体貯留室に導く液体導出流路と、を有し、前記貯留槽は、前記第１液体貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する細胞培養装置を使用し、前記第１液体貯留室に前記通気孔を通して気体を供給して前記第１液体貯留室内を加圧し、前記第１液体貯留室内の圧力上昇によって、前記液体導出流路によって、前記液体を、前記隔膜の他方の面側の空間から前記第２液体貯留室に導く細胞培養方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の一態様によれば、液体を、隔膜の他方の面側の空間から第２液体貯留室に導くことができるため、送液のための流路の構造を簡略にすることができる。そのため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、操作を容易にすることができる。
複数の細胞培養ユニットを有する細胞培養装置によれば、容易な操作で、複数の試験を並列的に行うことができる。そのため、多数の被検体（薬剤等）を効率よく評価できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】第１実施形態の細胞培養装置を模式的に示す断面図である。
【図２Ａ】図１の細胞培養装置を模式的に示す斜視図である。
【図２Ｂ】図１の細胞培養装置の一部を示す拡大図である。
【図３】第２実施形態の細胞培養装置を模式的に示す斜視図である。
【図４】第３実施形態の細胞培養装置を模式的に示す断面図である。
【図５】第４実施形態の細胞培養装置を模式的に示す断面図である。
【図６】図５の細胞培養装置を模式的に示す斜視図である。
【図７】図５の細胞培養装置を模式的に示す平面図である。
【図８Ａ】図５の細胞培養装置を用いた細胞培養方法の一例を説明するための図である。
【図８Ｂ】図５の細胞培養装置を用いた細胞培養方法の一例を説明するための図である。
【図８Ｃ】図５の細胞培養装置を用いた細胞培養方法の一例を説明するための図である。
【図８Ｄ】図５の細胞培養装置を用いた細胞培養方法の一例を説明するための図である。
【図９】第５実施形態の細胞培養装置を示す斜視図である。
【図１０】図９の細胞培養装置を示す分解斜視図である。
【図１１Ａ】図９の細胞培養装置の分解状態の正断面図である。
【図１１Ｂ】図９の細胞培養装置の正断面図である。
【図１２Ａ】図９の細胞培養装置の分解状態の側断面図である。
【図１２Ｂ】図９の細胞培養装置の側断面図である。
【図１３Ａ】ラプラス弁の説明図である。詳しくは、ラプラス弁が設けられた液体貯留室の部分拡大図である。
【図１３Ｂ】ラプラス弁の説明図である。詳しくは、ラプラス弁を介して下流口から連絡流路に培地が流入する場合の模式図である。
【図１３Ｃ】ラプラス弁の説明図である。詳しくは、下流口に空気が流入した際に、ラプラス弁が機能している際の模式図を示す。
【図１４】第６実施形態の細胞培養装置を模式的に示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（第１実施形態）
［細胞培養装置］
第１実施形態の細胞培養装置１０について、図面を参照して説明する。
図１は、細胞培養装置１０を模式的に示す断面図である。図２Ａは、細胞培養装置１０を模式的に示す斜視図である。図２Ｂは細胞培養装置１０の一部を示す拡大図である。
図１、図２Ａおよび図２Ｂに示すように、細胞培養装置１０は、貯留槽１１と、加圧ポンプ１４とを備えている。貯留槽１１は、１つの細胞培養ユニット９を備えている。貯留槽１１は、容器状の槽本体１２と、蓋部１３と、を備えている。
【００１５】
細胞培養ユニット９は、第１液体貯留室１と、第２液体貯留室２と、培養液貯留室３と、隔膜４と、液体導入流路５と、液体導出流路６とを有する。第１液体貯留室１および第２液体貯留室２は、貯留槽１１の槽本体１２の上面に形成された凹部によって形成された空間であり、液体培地Ｍ１（液体）を貯留可能である。
第２液体貯留室２は、主室２ｃと、主室２ｃの底面２ｅに形成された細胞保持凹部２ｄ（細胞保持部）とを有する。細胞保持凹部２ｄには細胞２０Ｂが保持される。第２液体貯留室２の内部空間は培養液貯留空間２ａである。
【００１６】
培養液貯留室３は、貯留槽１１の槽本体１２の上面に形成された凹部によって形成された空間であり、主室３ｃと、主室３ｃの底面３ｅに形成された凹部３ｄとを有する。主室３ｃの内部空間は培養液貯留空間３ａである。凹部３ｄの内面と隔膜４の外面４ｂとで区画される空間は外面側空間３ｂである。図１において、外面側空間３ｂは培養液貯留空間３ａの下方に位置している。培養液貯留室３は、培養液貯留空間３ａに培養液Ｃ１を貯留可能である。
【００１７】
隔膜４は、所定の大きさ以下の物質が厚さ方向に透過可能である。隔膜４を透過する物質移動は、例えば拡散により起きる。物質移動は、隔膜４に付着した細胞２０の作用により促進されることもある。隔膜４は例えば多孔質膜であってよい。隔膜４の平均細孔径は例えば０．１μｍ〜１０μｍである。隔膜４の材質は、ポリカーボネート、ポリエステル、シリコーン樹脂のいずれか１つであってよい。隔膜４は、例えば半透膜であってもよい。なお、細胞２０は隔膜４を透過できない。隔膜４は、内面４ａが細胞接着性材料でコーティングされていることが好ましい。細胞接着性材料は、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、マトリゲル、およびポリリジンのうち１または２以上が好ましい。
【００１８】
隔膜４は、培養液貯留室３内において、培養液貯留空間３ａと外面側空間３ｂとを隔てるように設置されている。隔膜４は、隔膜４は、凹部３ｄの底面より高い位置にあり、主室３ｃの底面３ｅに沿って、凹部３ｄの上部開口を塞ぐように設置することができる。隔膜４の内面４ａ（一方の面）は培養液貯留空間３ａに臨み、外面４ｂ（他方の面）は外面側空間３ｂに臨んでいる。
【００１９】
液体導入流路５は、一端が第１液体貯留室１の底部に接続され、他端が培養液貯留室３の凹部３ｄの底部３ｄ１に接続されている。液体導入流路５は、液体培地Ｍ１を第１液体貯留室１から培養液貯留室３の外面側空間３ｂに導くことができる。
【００２０】
液体導出流路６は、一端が培養液貯留室３の凹部３ｄの底部３ｄ１に接続され、他端が第２液体貯留室２の主室２ｃの底部に接続されている。液体導出流路６は、液体培地Ｍ１を培養液貯留室３の外面側空間３ｂから第２液体貯留室２に導くことができる。
【００２１】
蓋部１３は、槽本体１２の開口を開閉自在かつ気密に閉止する。詳しくは、蓋部１３は、第１液体貯留室１、第２液体貯留室２、および培養液貯留室３の上部開口１ｇ，２ｇ，３ｇをそれぞれ気密に閉止可能である。蓋部１３が上部開口１ｇ，２ｇ，３ｇを気密に閉止する構造としては、例えば、蓋部１３が、上部開口１ｂ，２ｂ，３ｇのそれぞれを包囲するように与えられたパッキン１５を介して槽本体１２の上面に当接する構造を例示できる。なお、図１では、蓋部１３は、槽本体１２から離間して示されている。
【００２２】
蓋部１３は、第１液体貯留室１、第２液体貯留室２および培養液貯留室３に相当する位置に、それぞれ通気孔１ｈ，２ｈ，３ｈを有する。通気孔１ｈ，２ｈ，３ｈは、それぞれ貯留室１，２，３に対して気体（例えば空気）を供給、および、貯留室１，２，３から気体（例えば空気）を排出することができる。通気孔１ｈ，２ｈ，３ｈにはそれぞれエアフィルタ１６が設けられることが好ましい。エアフィルタ１６によって、第１液体貯留室１、第２液体貯留室２および培養液貯留室３に異物が混入するのを防ぐことができる。
加圧ポンプ１４は、例えばコンプレッサである。
【００２３】
［細胞培養方法］
次に、細胞培養装置１０を用いて細胞を培養する方法の一例について説明する。
【００２４】
なお、本実施形態において培養する細胞は、特に限定されず、例えばヒトを含む動物由来の細胞、植物由来の細胞、微生物由来の細胞等を目的に応じて使用できる。
【００２５】
（１）工程１
図１、図２Ａおよび図２Ｂに示すように、細胞２０Ａを隔膜４の内面４ａに播種して接着させるとともに、培養液貯留室３の培養液貯留空間３ａに液体培地（培養液Ｃ１）を導入する。また、液体培地Ｍ１を第１液体貯留室１に導入する。ここで、液体培地Ｍ１は第２液体貯留室２にも導入し得る。また、第２液体貯留室２には、細胞２０Ａとは異なる細胞２０Ｂを播種することができる。その上で、蓋部１３をパッキン１５に押し当てるようにして閉じ、少なくとも第１液体貯留室１の上部開口１ｇを気密に閉止する。
【００２６】
（２）工程２
加圧ポンプ１４を稼働させ、通気孔１ｈを通して第１液体貯留室１に気体（例えば空気）を供給して第１液体貯留室１内を加圧する。この際、第２液体貯留室２は通気孔２ｈを通して大気に開放しておくことが好ましい。第１液体貯留室１内の圧力上昇によって、第１液体貯留室１（供給源）内の液体培地Ｍ１は、液体導入流路５を通って外面側空間３ｂに導入される。外面側空間３ｂ内の液体培地Ｍ１は、液体導出流路６を通って第２液体貯留室２に導入される。
【００２７】
ここで、外面側空間３ｂにおける液体培地Ｍ１の流れは、培養液貯留室３の培養液貯留空間３ａに導入された液体培地（培養液Ｃ１）と隔膜４を挟んで対向する。つまり、隔膜４の選択によって、液体培地（培養液Ｃ１）を外面側空間３ｂの液体培地Ｍ１に与えることができる。
【００２８】
本実施形態の細胞培養方法は、具体的には、例えば次のような試験への適用が考えられる。
【００２９】
培養液貯留室３内の隔膜４に播種する細胞２０Ａとして腸の細胞を用いる。隔膜４は、予めコラーゲンでコーティングしておくことで細胞２０Ａの接着性を向上させることができる。コラーゲンでコーティングした隔膜４で細胞２０Ａを数日間（例えば３日間）培養することで、細胞２０Ａ（腸の細胞）が隔膜４表面で膜状に増殖し、培養液Ｃ１側が頂側膜（ａｐｉｃａｌ） 側、コラーゲンコーティング側が基底膜（ｂａｓａｌ）側といったように、極性を有した形で細胞層が形成される。
第２液体貯留室２では、細胞２０Ｂとしてがん細胞を使用する。細胞保持凹部２ｄに細胞２０Ｂを播種し、培養する。
【００３０】
被検体となる物質を系内（例えば培養液貯留室３の培養液貯留空間３ａ）に添加することによって、この物質の、細胞２０Ａ，２０Ｂに対する影響を評価することができる。被検体となる物質としては医薬品候補化合物、食品添加物、化粧品原料、塗料、農薬といった、各種化成品に利用される化学物質が挙げられる。なお、被検体はこれらに限定されない。
ここでは、被検体として、抗がん剤を培養液貯留室３の培養液貯留空間３ａに添加する。
【００３１】
隔膜４上の腸の細胞２０Ａからなる層を通過した被検体の一部は、隔膜４を透過して、外面側空間３ｂ内の液体培地Ｍ１に混入する。第１液体貯留室１を加圧することによって、前記物質を含む液体培地Ｍ１は、液体導出流路６を通して第２液体貯留室２に流入し、第２液体貯留室２内の細胞２０Ｂ（がん細胞）と接する。
この試験では、抗がん剤の腸を介した吸収と、抗がん効果とを一度に評価することが可能となる。
【００３２】
培養ディッシュやマイクロプレートといった従来の培養容器を用いた試験では、腸を介して吸収された抗がん剤を回収し、別の培養容器を用いて培養したがん細胞に対して作用させることで抗がん効果を評価することが必要なため、二段階の培養操作が必要であった。
細胞培養装置１０を用いれば、一度の操作で被検体の評価が可能となる。また、腸（細胞２０Ａ）を介して吸収された抗がん剤をリアルタイムでがん細胞（細胞２０Ｂ）に作用させることが可能となるため、化学的に不安定な物質の吸収と抗がん効果を評価する際に特に有用である。
【００３３】
細胞培養装置１０は、第１液体貯留室１を加圧することによって、液体培地Ｍ１を、液体導入流路５を通して外面側空間３ｂを経て第２液体貯留室２に送ることができる。細胞培養装置１０では、送液のための流路の構造を簡略にすることができるため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
例えば、非特許文献８，１０，１１等に示す装置では、それぞれ、シリンジポンプ、カートリッジ式のペリスタポンプを用いて送液する構造が採用されており、送液のための配管接続が本実施形態よりも複雑となるとともに、装置が大型化し、試験の操作もより複雑である。
【００３４】
（第２実施形態）
［細胞培養装置］
第２実施形態の細胞培養装置１０Ａについて、図面を参照して説明する。以下、既出の構成と同じ構成については、同じ符号を付して説明を省略する。
図３に示すように、細胞培養装置１０Ａにおいて、貯留槽１１Ａは、複数の細胞培養ユニット９を有する。細胞培養ユニット９の数は、２以上の任意の数であってよい。
複数の細胞培養ユニット９のうち、隣り合う２つの細胞培養ユニット９，９の第１液体貯留室１，１は、気体流路１８によって互いに連通されている。気体流路１８の一端および他端は、第１液体貯留室１，１内の上部気相空間１ｆ，１ｆに接続されているため、気体流路１８は、気体が流通可能となるように第１液体貯留室１，１を接続している。細胞培養ユニット９の数が３以上である場合には、少なくとも２つの細胞培養ユニット９の第１液体貯留室１が気体流路１８によって互いに連通されていればよい。
【００３５】
細胞培養装置１０Ａでは、複数の第１液体貯留室１のうち一部の第１液体貯留室１を加圧することによって、気体流路１８を介して接続されたすべての第１液体貯留室１を一括的に加圧し、液体培地Ｍ１を培養液貯留室３の外面側空間３ｂを経て第２液体貯留室２に送ることができる。そのため、細胞培養装置１０Ａでは、容易な操作で、複数の試験を並列的に行うことができる。
また、少ない数の加圧ポンプ１４（図１参照）によって送液が可能となるため、装置の構造を簡略にすることができる。そのため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
上述の非特許文献８，１０，１１等に示す装置では、それぞれ、シリンジポンプ、カートリッジ式のペリスタポンプを用いて送液する構造が採用されており、１つの被検体を評価するために１台のポンプと１つのOrgan-on-a-chipを使用している。
この構造で複数の被検体を評価しようとすると、対象となる被検体の数だけポンプやペリスタポンプのカートリッジを増設する必要があるため、送液のための配管接続が増えてしまう。
図３に示す細胞培養装置１０Ａは、容易な操作で、多数の被検体（薬剤等）を一度に評価できる点で、非特許文献８，１０，１１等に示す装置より優れている。
【００３６】
（第３実施形態）
［細胞培養装置］
第３実施形態の細胞培養装置１０Ｅについて、図面を参照して説明する。
図４に示すように、細胞培養装置１０Ｅの貯留槽１１Ｅは、槽本体１２Ｅと、蓋部１３Ｅと、を備えている。貯留槽１１Ｅは、細胞培養ユニット９Ｅを備えている。細胞培養ユニット９Ｅは、第１液体貯留室１Ｅと、第２液体貯留室２Ｅと、培養液貯留室３Ｅと、隔膜４と、液体導出流路６Ｅと、液体返送流路７とを有する。
【００３７】
槽本体１２Ｅは、第１液体貯留室１Ｅおよび第２液体貯留室２Ｅが形成された主部１２Ｅ１と、培養液貯留槽３Ｅ１と、を備えている。培養液貯留室３Ｅは培養液貯留槽３Ｅ１の内部空間である。
第２液体貯留室２Ｅは、主室２Ｅｃと、主室２Ｅｃの底面２Ｅｅに形成された細胞保持凹部２Ｅｄ（細胞保持部）とを有する。細胞保持凹部２Ｅｄには細胞２０Ｅ２が保持される。
【００３８】
隔膜４は、培養液貯留室３Ｅの底部３Ｅａに設けられている。
培養液貯留槽３Ｅ１は、第１液体貯留室１Ｅに収容されている。培養液貯留槽３Ｅ１は、第１液体貯留室１Ｅの底面１Ｅｅから上方に離れた位置にある。そのため、第１液体貯留室１Ｅの底面１Ｅｅと隔膜４との間は、隔膜４の外面４ｂ側の空間となっている。
蓋部１３Ｅは、第１液体貯留室１Ｅ、第２液体貯留室２Ｅに相当する位置に、それぞれ通気孔１ｈ、２ｈを有する。
細胞培養装置１０Ｅは、第１液体貯留室１Ｅを加圧することで液体培地Ｍ１を第１液体貯留室１Ｅから第２液体貯留室２Ｅに導出することが可能である。つまり、蓋部１３Ｅの通気孔１ｈを通して、第１液体貯留室１Ｅに気体（例えば空気）を供給して第１液体貯留室１Ｅ内を加圧することによって、液体培地Ｍ１を、液体導出流路６Ｅを通して第１液体貯留室１Ｅから第２液体貯留室２Ｅに導出することができる。
同様に、第２液体貯留室２Ｅを加圧することで液体培地Ｍ１を第２液体貯留室２Ｅから第１液体貯留室１Ｅに送ることも可能である。つまり、蓋部１３Ｅの通気孔２ｈを通して、第２液体貯留室２Ｅに気体（例えば空気）を供給して第２液体貯留室２Ｅ内を加圧することによって、液体培地Ｍ１を、液体返送流路７を通して第２液体貯留室２から第１液体貯留室１Ｅに送ることができる。
【００３９】
［細胞培養方法］
次に、細胞培養装置１０Ｅを用いて細胞を培養する方法の一例について説明する。
（１）工程１
培養液貯留室３の隔膜４の内面４ａに細胞２０Ｅ１を播種する。第２液体貯留室２Ｅの細胞保持凹部２Ｅｄに細胞２０Ｅ２を播種する。
（２）工程２
第１液体貯留室１Ｅおよび第２液体貯留室２Ｅに液体培地Ｍ１を導入するとともに、培養液貯留室３Ｅに培養液Ｃ１を導入した後、蓋部１３Ｅを閉じる。
【００４０】
（３）工程３
蓋部１３Ｅの通気孔１ｈを通して、第１液体貯留室１Ｅに気体（例えば空気）を供給して第１液体貯留室１Ｅ内を加圧する。第２液体貯留室２Ｅは通気孔２ｈを通して大気に開放しておく。第１液体貯留室１Ｅ内の圧力上昇によって、第１液体貯留室１Ｅ内の液体培地Ｍ１は、液体導出流路６Ｅを通って第２液体貯留室２Ｅに導入される。
（４）工程４
蓋部１３Ｅの通気孔２ｈを通して、第２液体貯留室２Ｅに気体（例えば空気）を供給して第２液体貯留室２Ｅ内を加圧する。第１液体貯留室１Ｅは通気孔１ｈを通して大気に開放しておく。第２液体貯留室２Ｅ内の圧力上昇によって、第２液体貯留室２Ｅ内の液体培地Ｍ１は、液体返送流路７を通って第１液体貯留室１Ｅに返送される。
工程３，４を繰り返すことによって、液体培地Ｍ１を第１液体貯留室１Ｅと第２液体貯留室２Ｅの間で循環させることが可能となる。
【００４１】
細胞培養装置１０Ｅを用い、培養液貯留室３Ｅ内の隔膜４に播種する細胞２０Ｅ１として腸の細胞を用い、第２液体貯留室２で培養する細胞２０Ｅ２としてがん細胞を用い、被検体となる物質を系内（例えば培養液貯留室３Ｅ）に添加することによって、この物質の腸を介した吸収と、がん細胞に対する作用を一度に評価することが可能となる。
工程３，４を繰り返すことで、腸の細胞２０Ｅ１の膜を介して吸収された物質を連続的に液体培地Ｍ１に蓄積させつつ細胞２０Ｅ２（がん細胞）に作用させることができるため、図１の構成の細胞培養装置１０と比較して高い感度でがん細胞に対する被検体の作用を検出できる。
【００４２】
細胞培養装置１０Ｅでは、送液のための流路の構造を簡略にすることができるため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
【００４３】
第３実施形態の細胞培養装置１０Ｅは、第２実施形態の細胞培養装置１０Ａ（図３参照）と同様に、複数の細胞培養ユニット９Ｅを有する構成とすることができる。細胞培養ユニット９Ｅの数は、２以上の任意の数であってよい。
複数の細胞培養ユニット９Ｅのうち、少なくとも２つの細胞培養ユニット９Ｅ，９Ｅの第１液体貯留室１Ｅ，１Ｅは、気体が流通可能となるように気体流路（図示略）によって連通させることができる。
また、複数の細胞培養ユニット９Ｅのうち、少なくとも２つの細胞培養ユニット９Ｅ，９Ｅの第２液体貯留室２Ｅ，２Ｅは、気体が流通可能となるように気体流路（図示略）によって連通させることができる。
この構成によれば、工程３において、複数の第１液体貯留室１Ｅのうち一部の第１液体貯留室１Ｅを加圧することによって、気体流路を介して接続されたすべての第１液体貯留室１Ｅを一括的に加圧できる。また、工程４において、複数の第２液体貯留室２Ｅのうち一部の第２液体貯留室２Ｅを加圧することによって、気体流路を介して接続されたすべての第２液体貯留室２Ｅを一括的に加圧できる。
したがって、容易な操作で、複数の試験を並列的に行うことができる。
【００４４】
（第４実施形態）
［細胞培養装置］
第４実施形態の細胞培養装置１０Ｂについて、図面を参照して説明する。
図５は、細胞培養装置１０Ｂを模式的に示す断面図である。図６は、細胞培養装置１０Ｂを模式的に示す斜視図である。図７は、細胞培養装置１０Ｂを模式的に示す平面図である。
図５〜図７に示すように、細胞培養装置１０Ｂは、貯留槽１１Ｂと、加圧ポンプ（図示略）とを備えている。貯留槽１１Ｂは、１つの細胞培養ユニット９Ｂを備えている。貯留槽１１Ｂは、槽本体１２Ｂと、蓋部１３Ｂと、を備えている。
細胞培養ユニット９Ｂは、第１液体貯留室１Ｂと、第２液体貯留室２Ｂと、第１培養液貯留室３Ｂと、隔膜４と、液体導入流路５と、液体導出流路６と、第２培養液貯留室２１と、培養液導出流路２２と、培養液導入流路２３と、連絡流路２４と、を有する。
【００４５】
第１液体貯留室１Ｂは、主室１ｃと、主室１ｃの底面１ｅに形成された細胞保持凹部１ｄ（細胞保持部）とを有する。第１液体貯留室１Ｂには、培養液Ｃ２（液体）が貯留可能である。細胞保持凹部１ｄには細胞２０Ｄが保持される。
【００４６】
第２液体貯留室２Ｂは、主室２ｃと、主室２ｃの底面２ｅに形成された細胞保持凹部２ｄ（細胞保持部）とを有する。第１液体貯留室１Ｂには、培養液Ｃ２が貯留可能である。
細胞保持凹部２ｄには細胞２０Ｃが保持される。
【００４７】
第１培養液貯留室３Ｂでは、隔膜４は、凹部３ｄの内部（凹部３ｄの上部開口よりやや深い位置）に設けられている。凹部３ｄの上部と隔膜４とは、細胞２０Ｂが保持される細胞保持凹部３Ｂｄ（細胞保持部）を形成している。第１培養液貯留室３Ｂは、培養液貯留空間３ａに培養液Ｃ１を貯留可能である。
【００４８】
第２培養液貯留室２１は、主室２１ｃと、主室２１ｃの底面２１ｅに形成された細胞保持凹部２１ｄ（細胞保持部）とを有する。第２培養液貯留室２１の内部空間は、培養液貯留空間２１ａである。第２培養液貯留室２１は、培養液貯留空間２１ａに培養液Ｃ１を貯留可能である。細胞保持凹部２１ｄには細胞２０Ａが保持される。
【００４９】
連絡流路２４は、一端が第２液体貯留室２Ｂの主室２ｃの底部に接続され、他端が第１液体貯留室１Ｂの主室１ｃの底部に接続されている。連絡流路２４は、培養液Ｃ２を第２液体貯留室２Ｂから第１液体貯留室１Ｂに導くことができる。
【００５０】
培養液導出流路２２は、一端が第１培養液貯留室３Ｂの主室３ｃの底部に接続され、他端が第２培養液貯留室２１の主室２１ｃの底部に接続されている。培養液導出流路２２は、培養液Ｃ１を第１培養液貯留室３Ｂから第２培養液貯留室２１に導くことができる。
【００５１】
培養液導出流路２２は、一端が第２培養液貯留室２１の主室２１ｃの底部に接続され、他端が第１培養液貯留室３Ｂの主室３ｃの底部に接続されている。培養液導出流路２２は、培養液Ｃ１を第２培養液貯留室２１から第１培養液貯留室３Ｂに導くことができる。
【００５２】
蓋部１３Ｂは、槽本体１２Ｂの開口を開閉自在かつ密閉可能に閉止する。詳しくは、蓋部１３Ｂは、第１液体貯留室１Ｂ、第２液体貯留室２Ｂ、第１培養液貯留室３Ｂ、および第２培養液貯留室２１の上部開口１ｇ，２ｇ，３ｇ，２１ｇをそれぞれ気密に閉止可能である。蓋部１３Ｂが上部開口１ｇ，２ｇ，３ｇ，２１ｇを気密に閉止する構造としては、例えば、蓋部１３Ｂが、上部開口１ｇ，２ｇ，３ｇ，２１ｇのそれぞれを包囲するように与えられたパッキン１５を介して槽本体１２Ｂの上面に当接する構造を例示できる。なお、図５では、蓋部１３Ｂは、槽本体１２Ｂから離間して示されている。
【００５３】
蓋部１３Ｂは、第１液体貯留室１Ｂ、第２液体貯留室２Ｂ，第１培養液貯留室３Ｂおよび第２培養液貯留室２１に相当する位置に、それぞれ通気孔１ｈ，２ｈ，３ｈ，２１ｈを有する。通気孔１ｈ，２ｈ，３ｈ，２１ｈにはそれぞれエアフィルタ１６が設けられることが好ましい。
【００５４】
第１液体貯留室１Ｂには、液体導入流路５の一端に、第１液体貯留室１Ｂから液体導入流路５への液体の流れを許容し、かつ第１液体貯留室１Ｂから液体導入流路５への気体（例えば空気）の流入を阻止するラプラス弁３１が設けられている。
第１液体貯留室１Ｂには、連絡流路２４の他端に、連絡流路２４から第１液体貯留室１Ｂへ向かう方向の液体の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁３２が設けられている。
【００５５】
第２液体貯留室２Ｂには、連絡流路２４の一端に、第２液体貯留室２Ｂから連絡流路２４への液体の流れを許容し、かつ第２液体貯留室２Ｂから連絡流路２４への気体の流入を阻止するラプラス弁３３が設けられている。
第２液体貯留室２Ｂには、液体導出流路６の他端に、液体導出流路６から第２液体貯留室２Ｂへ向かう方向の液体の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁３４が設けられている。
【００５６】
第１培養液貯留室３Ｂには、培養液導出流路２２の一端に、第１培養液貯留室３Ｂから培養液導出流路２２への液体の流れを許容し、かつ第１培養液貯留室３Ｂから培養液導出流路２２への気体の流入を阻止するラプラス弁３５が設けられている。
第１培養液貯留室３Ｂには、培養液導入流路２３の他端に、培養液導入流路２３から第１培養液貯留室３Ｂへ向かう方向の液体の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁３６が設けられている。
【００５７】
第２培養液貯留室２１には、培養液導入流路２３の一端に、第２培養液貯留室２１から培養液導入流路２３への液体の流れを許容し、かつ第２培養液貯留室２１から培養液導入流路２３への気体の流入を阻止するラプラス弁３７が設けられている。
第２培養液貯留室２１には、培養液導出流路２２の他端に、培養液導出流路２２から第２培養液貯留室２１へ向かう方向の液体の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁３８が設けられている。
【００５８】
（逆止弁）
逆止弁３２，３４，３６，３８としては、例えば弁孔を有する弁座と、弁体とを備えた構造の逆止弁を例示できる。この逆止弁は、液が順方向に流れる際には、弁体が弁座から離れることにより弁孔が開かれるため、液は弁孔を通過して順方向に流れる。液が逆方向に流れる際には、弁体が弁座に当接して弁孔が閉止されるため、当該方向の液の流れは阻止される。
逆止弁３２，３４，３６，３８は、液体の流れを制御する逆流防止機構の例である。
【００５９】
（ラプラス弁）
ラプラス弁３１，３３，３５，３７の構造と機能を、図１３Ａ〜図１３Ｃを用いて説明する。図１３Ａは、ラプラス弁１１７が設けられた液体貯留室の部分拡大図を示す。図１３Ｂは、ラプラス弁１１７を介して下流口１１４から連絡流路１１５に培地１３１が流入する場合の模式図を示す。図１３Ｃは、下流口１１４に空気が流入した際に、ラプラス弁１１７が機能している際の模式図を示す。図１３Ｃに示すように、微細な流路内において、培地１３１と空気との間には界面張力による圧力差、すなわちラプラス圧が発生する。流路の表面が液体培地で濡れている場合は、ラプラス圧未満の空気圧条件下において液体が満たされた微細流路に空気は流入しえない。このような条件下で微細流路は受動的な空気流入防止機構として扱うことができる。
【００６０】
ラプラス弁の設計について、以下に説明する。
ラプラス弁に空気が流入してしまう圧力（ラプラス圧、限界圧力）（ΔＰＬａｐ）は界面張力（γ）およびラプラス弁を構成するマイクロ流路の幅（ｗＬ）および深さ（ｈＬ）によって以下の式（１）で計算できる。
【００６１】
【数１】
2017154899.tif 000003
【００６２】
細胞培養装置を駆動するための現実的な圧力範囲は市販の圧力制御装置で調整可能な圧力範囲および細胞の耐圧性によって決定されると考えられる。
仮に細胞の耐圧性を生体内の血圧の上限程度（３０ｋＰａ＝２２５ｍｍＨｇ）とすると、実施形態の細胞培養装置を駆動するために現実的な圧力範囲は１ｋＰａ〜３０ｋＰａ程度となる。培養液の界面張力は６０ｍＮ／ｍ程度であり、ラプラス弁を構成するマイクロ流路の断面が正方形の場合、つまりｗＬ＝ｈＬの場合、３０ｋＰａで空気が流入するマイクロ流路の寸法は上記式（１）よりｗＬ＝ｈＬ＝８μｍ程度、１ｋＰａで空気が流入するマイクロ流路の寸法はｗＬ＝ｈＬ＝２４０μｍ程度と推算される。
ラプラス弁を構成するマイクロ流路の寸法を上記寸法（３０ｋＰａのときのｗＬ＝ｈＬ＝８μｍ、１ｋＰａのときのｗＬ＝ｈＬ＝２４０μｍ）よりも小さくすることで、想定する圧力で運用した際にラプラス弁に空気が流入してしまうことを防ぐことができる。
すなわち、ラプラス弁が機能するための限界の圧力であるラプラス圧ΔＰＬａｐが、実施形態の細胞培養装置で使用する圧力範囲よりも大きくなるように、ラプラス弁を構成するマイクロ流路を形成すれば、ラプラス弁に空気が流入してしまうことを防ぐことができる。
なお、ｗＬとｈＬの比率が１：１でない場合も同様に式（１）に基づいて流路の寸法を設計することが可能である。
細胞培養装置１０Ｂでは、例えば、流路５、６、２２、２３、２４の幅および深さをそれぞれ２００μｍおよび２５μｍと設計し、ラプラス圧が５．４ｋＰａと推算して、圧力がこの値以下となるように液体を流路５、６、２２、２３、２４に流すことができる。
ラプラス弁３１，３３，３５，３７は、液体の流れを制御する逆流防止機構の例である。
【００６３】
（抵抗流路）
断面が矩形のマイクロ流路を流れる液体の流量（Ｑ）と圧力損失（ΔＰ）には以下の関係がある（F. M. White, Viscous Fluid Flow, McGraw-Hill Companies, Inc, Boston, 2006を参照）。
【００６４】
【数２】
2017154899.tif 000004
【００６５】
【数３】
2017154899.tif 000005
【００６６】
上記式（２）および式（３）において、ΔＰはマイクロ流路の入口と出口の圧力差、Ｒは流路抵抗、μは流体の粘度、ｌはマイクロ流路の長さ、ｗはマイクロ流路の幅、ｈはマイクロ流路の深さである。当該式（２）および式（３）はｗ＞ｈの条件で成立する。
【００６７】
例えば、細胞培養装置１０Ｂでは、液体導入流路５、液体導出流路６、培養液導出流路２２、培養液導入流路２３および連絡流路２４は、流量を調節するために流路断面積が１／１０以下となっている抵抗流路部位５ａ、６ａ、２２ａ、２３ａ、２４ａを備えていてもよい。
流路５、６、２２、２３、２４において、抵抗流路部位と、それ以外の部分の部位との長さが等しい場合を考える。抵抗流路の断面積が他の部位の断面積の１／１０となると、幅ｗ、深さｈが１／１００．５となり、式（３）の抵抗流路の流路抵抗Ｒが、抵抗流路以外の部位の流路抵抗Ｒの１００倍となる。
式（２）より、圧力損失についても抵抗流路の圧力損失が、抵抗流路以外の部位の圧力損失の１００倍となる。流路全体を流れる流量を推算する際に、抵抗流路の抵抗と流路全体にかかる圧力のみを考慮して流量を推算した場合の推算誤差が１／１００となり、これは許容できる誤差と言える。
すなわち、流路の一部に流量を調節するために流路断面積が１／１０以下となっている抵抗流路部位が設けられた場合には、抵抗流路の圧力損失のみを考慮して流路設計をすることで流路網の設計が容易になるという利点がある。
【００６８】
次に、細胞培養装置１０Ｂを用いて細胞を培養する方法の一例について説明する。
（１）工程１
図８Ａに示すように、細胞２０Ｂを第１培養液貯留室３Ｂ内の隔膜４の内面４ａに播種して接着させる。細胞２０Ａ，２０Ｃ，２０Ｄをそれぞれ第２培養液貯留室２１の細胞保持凹部２１ｄ、第２液体貯留室２Ｂの細胞保持凹部２ｄ、第１液体貯留室１Ｂの細胞保持凹部１ｄに播種する。
【００６９】
（２）工程２
図８Ｂに示すように、第１培養液貯留室３Ｂおよび第２液体貯留室２Ｂにそれぞれ培養液Ｃ１，Ｃ２を導入するとともに、蓋部１３を閉じる。
【００７０】
（３）工程３
図８Ｃに示すように、通気孔３ｈ，２ｈを通して第１培養液貯留室３Ｂおよび第２液体貯留室２Ｂに気体（例えば空気）を供給して各室内を加圧する。この際、第２培養液貯留室２１および第１液体貯留室１Ｂは大気に開放しておくことが好ましい。
第１培養液貯留室３Ｂ内の圧力上昇によって、第１培養液貯留室３Ｂの培養液貯留空間３ａ内の培養液Ｃ１は、培養液導出流路２２を通って第２培養液貯留室２１に導入される。
第２液体貯留室２Ｂ内の圧力上昇によって、第２液体貯留室２Ｂ内の培養液Ｃ２は、連絡流路２４を通って第１液体貯留室１Ｂに導入される。
【００７１】
（４）工程４
図８Ｄに示すように、通気孔２１ｈ，１ｈを通して第２培養液貯留室２１および第１液体貯留室１Ｂに気体（例えば空気）を供給して各室内を加圧する。この際、第１培養液貯留室３Ｂおよび第２液体貯留室２Ｂは大気に開放しておくことが好ましい。
第２培養液貯留室２１内の圧力上昇によって、第２培養液貯留室２１内の培養液Ｃ１は、培養液導入流路２３を通って第１培養液貯留室３Ｂの培養液貯留空間３ａに導入される。
第１液体貯留室１Ｂ内の圧力上昇によって、第１液体貯留室１Ｂ内の培養液Ｃ２は、液体導入流路５、外面側空間３ｂ、液体導出流路６を通って第２液体貯留室２Ｂに導入される。
工程３，４を繰り返すことによって、培養液Ｃ１，Ｃ２を細胞培養装置１０Ｂ内で循環させることができる。
【００７２】
細胞培養装置１０Ｂでは、４種類の細胞２０Ａ〜２０Ｄの評価を一括的に行うことができる。
例えば、細胞２０Ａ〜２０Ｄを、それぞれ消化管細胞、腸細胞、がん細胞、正常細胞とすれば、抗がん剤の消化、吸収、抗がん効果、および副作用を一度に評価できる。
【００７３】
細胞培養装置１０Ｂでは、培養液Ｃ１，Ｃ２を第１培養液貯留室３Ｂと第２培養液貯留室２１との間で循環させることができるため、せん断力が加えられる環境下で細胞２０Ａ〜２０Ｄの培養を行うことができる。
【００７４】
（第５実施形態）
［細胞培養装置］
第５実施形態の細胞培養装置１０Ｃについて、図面を参照して説明する。
図９は、細胞培養装置１０Ｃを示す斜視図である。図１０は、細胞培養装置１０Ｃの分解斜視図である。図１１Ａは細胞培養装置１０Ｃの分解状態の正断面図である。図１１Ｂは細胞培養装置１０Ｃの正断面図である。図１２Ａは細胞培養装置１０Ｃの分解状態の側断面図である。図１２Ｂは細胞培養装置１０Ｃの側断面図である。
【００７５】
図９〜図１２Ｂに示すように、細胞培養装置１０Ｃの貯留槽１１Ｃは、複数の細胞培養ユニット９Ｂ（図５および図６参照）を備えている。
貯留槽１１Ｃは、槽本体１２Ｃと、蓋部１３Ｃと、基体部４０と、蓋部押圧部４１と、壁部押圧部４７と、を備えている。
基体部４０は、底板５１と、底板５１の側縁から上方に突出して形成された厚肉部５２，５２と、底板５１の端縁から上方に突出して形成された端壁部５３，５３と、を備えている。底板５１と、厚肉部５２，５２と、端壁部５３，５３とは、底部プレート４５を収容する収容空間５４を画成している。厚肉部５２の両端面には、押圧バー４３の端部が挿入される挿入穴５２ａ、および押圧バー４８の端部が挿入される挿入穴５２ｂが形成されている。基体部４０は、底板５１上に置かれた槽本体１２Ｃを支持する。
【００７６】
蓋部押圧部４１は、槽本体１２Ｃに向けて蓋部１３を押圧する一対の押圧バー４３（押圧部材）を有する。押圧バー４３は、両端部を挿入穴５２ａに挿入した状態で、この挿入部分を支点として、厚肉部５２に沿う中心軸の軸周り方向に回動可能となっている。押圧バー４３は、蓋部１３Ｃの上面の両側部に形成された係止凹部５５に係止させることができる。これによって、蓋部１３Ｃを槽本体１２Ｃに対して押さえつけた状態で保持するとともに、槽本体１２Ｃの内部空間を密閉することができる。
【００７７】
槽本体１２Ｃは、底部プレート４５と、底部プレート４５の上面４５ａ（一方の面）に設けられたブロック状の壁部４６と、を備えている。
壁部４６は、厚さ方向に貫通して形成された複数の貫通孔部５０を有する。第１液体貯留室１Ｂ、第２液体貯留室２Ｂ、第１培養液貯留室３Ｂ、および第２培養液貯留室２１は、貫通孔部５０と、底部プレート４５とによって区画される空間であり、平面視形状はそれぞれ長円形である。
【００７８】
底部プレート４５には、液体導入流路５、液体導出流路６、培養液導出流路２２、培養液導入流路２３が形成されている（図７参照）。
壁部押圧部４７は、底部プレート４５に向けて壁部４６を押圧する押圧バー４８（押圧部材）を有する。押圧バー４８は、例えば金属などで構成されており、両端部を挿入穴５２ｂに挿入した状態で、この挿入部分を支点として、厚肉部５２に沿う中心軸の軸周り方向に回動可能となっている。押圧バー４８は、壁部４６の両側部に形成された係止凹部５６に係止させることができる。これによって、壁部４６を底部プレート４５に対して押圧し、底部プレート４５に隙間なく密着させることができる。壁部押圧部４７は、押圧バー４８によって、壁部４６を底部プレート４５に向けて押さえつけた状態で保持することができる。
【００７９】
図１１Ａおよび図１１Ｂに示すように、細胞培養装置１０Ｃでは、複数の細胞培養ユニット９Ｂの第１液体貯留室１のうち少なくとも２つは気体流路１８によって互いに連通されていることが好ましい。また、複数の細胞培養ユニット９Ｂの第２液体貯留室２のうち少なくとも２つは気体流路（図示略）によって互いに連通されていることが好ましい。また、複数の細胞培養ユニット９Ｂの第１培養液貯留室３Ｂのうち少なくとも２つは気体流路（図示略）によって互いに連通されていることが好ましい。また、複数の細胞培養ユニット９Ｂの第２培養液貯留室２１のうち少なくとも２つは気体流路（図示略）によって互いに連通されていることが好ましい。
【００８０】
細胞培養装置１０Ｃでは、複数の細胞培養ユニット９Ｂが、蓋部１３Ｃに形成された気体流路１８によって互いに連通されているため、複数の細胞培養ユニット９Ｂの貯留室を一括的に加圧することができる。例えば、複数の第１液体貯留室１を一括的に加圧することができる。同様に、第２液体貯留室２、第１培養液貯留室３Ｂ、および第２培養液貯留室２１についても一括的な加圧が可能である。そのため、細胞培養装置１０Ｃでは、容易な操作で、複数の細胞培養ユニット９Ｂにおける試験を並列的に行うことができる。
【００８１】
槽本体１２Ｃおよび蓋部１３Ｃは、例えば樹脂（プラスチック）、ガラス等が使用できる。細胞を光学的に観察することが容易であることから、前記材料は透明材料であることが好ましく、具体的には樹脂およびガラスが好ましい。
樹脂としては、シリコーン系樹脂（例えばポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ）)、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ））、スチレン系樹脂（例えばポリスチレン）、ポリビニルピリジン系樹脂（ポリ（４−ビニルピリジン）、４−ビニルピリジン−スチレン共重合体等）、ポリオレフィン系樹脂（例えばポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂）、ポリエステル樹脂（ポリエチレンテレフタレート樹脂（ＰＥＴ））、ポリカーボネート系樹脂、エポキシ系樹脂等がある。
なかでも、シリコーン系樹脂（例えばポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ）)、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ））、スチレン系樹脂（例えばポリスチレン）は、高い透明性を有するため好ましい。
【００８２】
細胞培養装置１０Ｃでは、複数の細胞培養ユニット９Ｂを有するため、複数の試験を並列的に行うことができる。また、装置の構造を簡略にすることができるため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
細胞培養装置１０Ｃは、容易な操作で、多数の被検体（薬剤等）を効率よく評価できる点で優れている。
【００８３】
（第６実施形態）
［細胞培養装置］
第６実施形態の細胞培養装置１０Ｄについて、図面を参照して説明する。
図１４に示すように、細胞培養装置１０Ｄの貯留槽１１Ｄは、槽本体１２Ｄと、蓋部１３Ｄと、を備えている。貯留槽１１Ｄは、細胞培養ユニット９Ｄを備えている。細胞培養ユニット９Ｄは、第１液体貯留室１Ｄと、第２液体貯留室２Ｄと、培養液貯留室３Ｄと、隔膜４と、液体導出流路６Ｄと、を有する。
【００８４】
槽本体１２Ｄは、第１液体貯留室１Ｄおよび第２液体貯留室２Ｄが形成された主部１２Ｄ１と、培養液貯留槽３Ｄ１と、を備えている。培養液貯留室３Ｄは培養液貯留槽３Ｄ１の内部空間である。
隔膜４は、培養液貯留槽３Ｄ１の底部３Ｄａに設けられている。隔膜４の内面４ａには細胞２０Ｄ１が播種される。
培養液貯留槽３Ｄ１は、第１液体貯留室１Ｄに収容されている。培養液貯留槽３Ｄ１は、第１液体貯留室１Ｄの底面１Ｄｅから上方に離れた位置にある。そのため、第１液体貯留室１Ｄの底面１Ｄｅと隔膜４との間は、隔膜４の外面４ｂ側の空間となっている。
蓋部１３Ｄは、第１液体貯留室１Ｄ、第２液体貯留室２Ｄに相当する位置に、それぞれ通気孔１ｈ、２ｈを有する。
【００８５】
蓋部１３Ｄの通気孔１ｈを通して、第１液体貯留室１Ｄに気体（例えば空気）を供給して第１液体貯留室１Ｄ内を加圧する。第２液体貯留室２Ｄは通気孔２ｈを通して大気に開放しておく。第１液体貯留室１Ｄ内の圧力上昇によって、第１液体貯留室１Ｄ内の液体培地Ｍ１は、液体導出流路６Ｄを通って第２液体貯留室２Ｄに導入される。
【００８６】
細胞培養装置１０Ｄでは、送液のための流路の構造を簡略にすることができるため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
【００８７】
上述の実施形態における各構成およびそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
例えば、図９等に示す細胞培養装置１０Ｃの貯留槽１１Ｃは、互いに別体である槽本体１２Ｃと蓋部１３Ｃとを有するが、これに限らず、一体型の貯留槽を採用してもよい。
本実施形態は、細胞工学分野、再生医療分野、バイオ関連工業分野、組織工学分野などにおいて有用である。特に、医薬品の開発、細胞生物学の基礎研究に有用である。
【符号の説明】
【００８８】
１，１Ｂ，１Ｄ，１Ｅ    第１液体貯留室
１ｄ，２ｄ，２Ｅｄ，２１ｄ，３Ｂｄ    細胞保持凹部（細胞保持部）
１ｈ，２ｈ，３ｈ，２１ｈ    通気孔
２，２Ｂ，２Ｄ，２Ｅ    第２液体貯留槽
３，３Ｂ，３Ｄ，３Ｅ    培養液貯留室
３ａ    培養液貯留空間
４    隔膜
４ａ    内面（一方の面）
５    液体導入流路
６，６Ｅ，６Ｄ    液体導出流路
６ａ    抵抗流路部位
７    液体返送流路
９，９Ｂ，９Ｄ，９Ｅ    細胞培養ユニット
１０，１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ，１０Ｄ，１０Ｅ    細胞培養装置
１１，１１Ａ，１１Ｂ，１１Ｃ，１１Ｄ，１１Ｅ    貯留槽
１２，１２Ｂ，１２Ｃ，１２Ｄ，１２Ｅ    槽本体
１３，１３Ｂ，１３Ｃ，１３Ｄ，１３Ｅ    蓋部
１４    加圧ポンプ（加圧手段）
２１    第２培養液貯留室
２２    培養液導出流路
２３    培養液導入流路
３４，３６，３８    逆止弁
３５    ラプラス弁
４１    蓋部押圧部
４３    押圧バー（押圧部材）
４５    底部プレート
４６    壁部
４７    壁部押圧部
４８    押圧バー（押圧部材）
Ｃ１，Ｃ２    培養液
Ｍ１    液体培地（液体）
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月7日(2018.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養装置であって、
複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、
前記複数の前記細胞培養ユニットの各々は、
液体が貯留される気密構造の第１液体貯留室と、
前記液体が貯留される第２液体貯留室と、
細胞の培養液が貯留される培養液貯留空間を有する培養液貯留室と、
前記細胞が接着可能な一方の面が前記培養液貯留空間に臨む透過性の隔膜と、
前記第１液体貯留室を供給源とする前記液体を、前記隔膜の他方の面側の空間から前記第２液体貯留室に導く液体導出流路と、を有し、
前記貯留槽は、前記第１液体貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有し、
前記複数の前記細胞培養ユニットにおける複数の前記第１液体貯留室のうち少なくとも２つには、気体が流通可能となるように互いに連通された気体流路が設けられており、
前記気体流路は、前記複数の前記細胞培養ユニットの間において、前記気体流路を用いて、前記液体を一括的に送ることが可能なように構成されている、
細胞培養装置。
【請求項２】
前記液体を前記第２液体貯留室から第１液体貯留室に導く液体返送流路をさらに有し、
前記第２液体貯留室は、播種された細胞が保持される細胞保持部を有する、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記複数の前記細胞培養ユニットにおける前記複数の前記第１液体貯留室のうち少なくとも２つは気体が流通可能となるように互いに連通され、かつ前記複数の前記細胞培養ユニットにおける前記複数の前記第２液体貯留室のうち少なくとも２つは気体が流通可能となるように互いに連通されている、請求項２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記複数の前記細胞培養ユニットの各々は、
前記培養液が貯留される第２培養液貯留室と、
前記培養液を前記培養液貯留室から前記第２培養液貯留室に導く培養液導出流路と、
前記培養液を前記第２培養液貯留室から前記培養液貯留室に導く培養液導入流路と、をさらに備え、
前記貯留槽は、前記培養液貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する、請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
前記複数の前記細胞培養ユニットにおける複数の前記培養液貯留室のうち少なくとも２つは、気体が流通可能となるように互いに連通されている、請求項４に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記第１液体貯留室と、前記第２液体貯留室と、前記第２培養液貯留室とは、播種された細胞が保持される細胞保持部を有する、請求項４または５に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記液体導出流路から前記第２液体貯留室への前記液体の流れを制御する逆流防止機構をさらに備えている、請求項１〜６のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記逆流防止機構は、前記液体導出流路から前記第２液体貯留室へ向かう方向の前記液体の流れを許容し、かつ前記流れの逆の方向の流れを阻止する逆止弁である、請求項７に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記液体を前記第１液体貯留室から前記隔膜の他方の面側の空間に導く液体導入流路と、
前記第１液体貯留室から前記液体導入流路への前記液体の流れを制御する逆流防止機構と、をさらに備えている、請求項１〜６のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
前記逆流防止機構は、前記第１液体貯留室から前記液体導入流路への前記液体の流れを許容し、かつ前記第１液体貯留室から前記液体導入流路への気体の流れを阻止するラプラス弁である、請求項９に記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
前記液体導出流路は、流路断面積が他の部位に比べて１／１０以下である抵抗流路部位を有する、請求項１〜１０のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
前記貯留槽は、前記第１液体貯留室、前記第２液体貯留室および前記培養液貯留室が形成された容器状の槽本体と、前記第１液体貯留室、前記第２液体貯留室および前記培養液貯留室の開口を開閉自在かつ気密に閉止する蓋部とを有する、請求項１〜１１のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
前記蓋部を前記槽本体に向けて押さえつけて保持する蓋部押圧部をさらに備え、
前記蓋部押圧部は、前記槽本体に向けて前記蓋部を押圧する押圧部材を有する、請求項１２に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
前記槽本体は、前記液体導出流路を有する底部プレートと、前記底部プレートの一方の面に設けられた壁部とを備え、
前記第１液体貯留室、前記第２液体貯留室および前記培養液貯留室は、前記底部プレートと前記壁部とによって区画された空間である、請求項１２または１３に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
前記壁部を前記底部プレートに向けて押さえつけて保持する壁部押圧部をさらに備え、
前記壁部押圧部は、前記底部プレートに向けて前記壁部を押圧する押圧部材を有する、請求項１４に記載の細胞培養装置。
【請求項１６】
前記第１液体貯留室内を加圧可能な加圧手段をさらに備えている、請求項１〜１５のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１７】
細胞培養方法であって、
複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記複数の前記細胞培養ユニットの各々は、液体が貯留される気密構造の第１液体貯留室と、前記液体が貯留される第２液体貯留室と、細胞の培養液が貯留される培養液貯留空間を有する培養液貯留室と、前記細胞が接着可能な一方の面が前記培養液貯留空間に臨む透過性の隔膜と、前記第１液体貯留室を供給源とする前記液体を、前記隔膜の他方の面側の空間から前記第２液体貯留室に導く液体導出流路と、を有し、前記貯留槽は、前記第１液体貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有し、前記複数の前記細胞培養ユニットにおける複数の前記第１液体貯留室のうち少なくとも２つには、気体が流通可能となるように互いに連通された気体流路が設けられており、前記気体流路は、前記複数の前記細胞培養ユニットの間において、前記気体流路を用いて、前記液体を一括的に送ることが可能なように構成されている細胞培養装置を使用し、
前記第１液体貯留室に前記通気孔を通して気体を供給して前記第１液体貯留室内を加圧し、前記第１液体貯留室内の圧力上昇によって、前記液体導出流路によって、前記液体を、前記隔膜の他方の面側の空間から前記第２液体貯留室に導く、細胞培養方法。
【国際調査報告】
2017154899.tif 000028
2017154899.tif 000029
2017154899.tif 000030
2017154899.tif 000031