(57)【要約】解決すべき課題は、体内での糖質の分解、吸収を抑えることにより、血糖値の上昇を抑制し、さらには高血糖症状および高血糖の慢性化に由来する糖尿病や肥満症の長期的な予防及び改善を行うことである。  この課題の解決手段として、琥珀抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、α−グルコシダーゼ活性抑制剤及びグルコース吸収抑制剤を発明した。
2018212362.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
琥珀抽出物を含有することを特徴とするα−グルコシダーゼ活性抑制剤。
【請求項２】
琥珀抽出物を含有することを特徴とするグルコース吸収抑制剤。
【請求項３】
前記琥珀抽出物を製造するための抽出溶媒が含水アルコール（含水率：１質量％〜６０質量％）である請求項１又は２に記載の剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤の１種又は２種以上を配合して成る経口投与組成物。
【請求項５】
態様が医薬品、医薬部外品、飲食品又は食品添加物である請求項４に記載の経口投与組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は琥珀抽出物を含むα−グルコシダーゼ活性抑制剤及び／又はグルコース吸収抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
琥珀とは、主にマツ属植物の樹脂が長期間地下に埋没し凝結してできた化石であり、中国では古くからその粉末が漢方薬として用いられている。主に樹脂、精油、コハク酸等を含み、エタノールやジエチルエーテルあるいはベンゼンに少量溶ける（例えば、非特許文献１を参照）。
日本では宝飾品としてよく知られているが、近年では、粉末や抽出物を化粧品や健康食品に用いる例が増えている。例えば、琥珀粉末を化粧品に配合し、肌感触を改善する技術（例えば、特許文献１を参照）、琥珀抽出物を皮膚外用剤に配合する技術（例えば、特許文献２、特許文献３を参照）、琥珀熱水抽出物の美白効果を利用する技術（例えば、特許文献４、特許文献５を参照）、琥珀抽出画分中の皮膚ターンオーバー促進因子を利用する技術（例えば、特許文献６を参照）、琥珀抽出物中の皮膚のスキンファーミング効果を利用する技術（例えば、特許文献７を参照）、琥珀抽出画分中のヒアルロン酸産生促進因子を利用する技術（例えば、特許文献８を参照）、琥珀抽出画分中の血管新生促進因子を利用する技術（例えば、特許文献９を参照）などが知られている。
このように、琥珀には様々な物理化学的、生物学的効果が知られており、非常に有用な素材として様々な分野で用いられてきており、無限の可能性を秘める素材として期待されている。
一方、近年急増している糖尿病は、慢性高血糖をはじめとする様々な代謝異常が現れる疾患である。糖尿病の９０％以上を占めるＩＩ型糖尿病は生活習慣と密接に関連しており、食事や運動等による予防・軽減が可能と言われている。従来、糖尿病治療薬としてインクレチン関連薬、ピグアナイド薬、スルホニルウレア薬、インスリン感受性増強薬、チアゾリジン薬、α−グルコシダーゼ阻害薬などが用いられてきたが、いずれも医師の管理下での使用が必須である上、副作用が心配されるものも多い。これらのことから、日常的な摂取が簡便である飲食品によって日ごろから血糖値を良好に調節し、糖尿病を予防及び改善することが望ましい。そこで、飲食品に添加可能な、食後の血糖値上昇を抑制する作用を有する食品素材の開発が強く望まれている。
食事から摂取した糖質は、小腸上皮上に局在するα−グルコシダーゼによってグルコースなどの単糖に分解され、その後小腸上皮細胞が単糖を取込むことで血液中に運ばれる。よって、α−グルコシダーゼの働きやグルコースの取込みを抑制することによって、食事に含まれる糖質の吸収を抑制又は遅らせることが可能であり、それによって食後の血糖値上昇を抑制することができる。
これまでにα−グルコシダーゼ活性抑制作用を有する食品素材としては、例えば、グアバ葉熱水抽出物（例えば、非特許文献２を参照）などが知られている。グルコース吸収抑制作用を有する食品素材としては、例えば、茶ポリフェノール（例えば、非特許文献３を参照）などが知られている。また、琥珀に含まれる成分として知られているコハク酸が、糖尿病モデルラットにおいて血糖値上昇抑制効果を示した報告があるが（例えば、特許文献１０を参照）、そのメカニズムは不明である。しかし、これまでに琥珀抽出物におけるα−グルコシダーゼ活性抑制作用及びグルコース吸収抑制作用などをメカニズムとした血糖値上昇抑制効果は報告がされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−８３４７８号公報
【特許文献２】特開Ｈ９−２２７３３４号公報
【特許文献３】特開２００１−１３１０４８号公報
【特許文献４】特開２０１０−２３５５５１号公報
【特許文献５】特開２０１２−２４０９６７号公報
【特許文献６】特開２００７−３１４５２２号公報
【特許文献７】特開２００８−１８９６６９号公報
【特許文献８】特開２００８−２６６２６０号公報
【特許文献９】特開２０１１−２５６１６４号公報
【特許文献１０】特開平６−６２７９８号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】中薬大辞典  第二巻  上海科学技術出版社（江蘇新医学院「中薬大辞典」編集部）小学館編）公知文献１参照
【非特許文献２】出口ヨリ子ら，日本農芸化学会誌，７２（８），９２３−９３１（１９８８）
【非特許文献３】Ｙ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．，４８，５６１８−５６２３（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、日常的な摂取が簡便である飲食品に組み込むことができる、α−グルコシダーゼ活性抑制剤及び／又はグルコース吸収抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような状況を鑑みて、本発明者らは鋭意研究をした結果、琥珀抽出物にα−グルコシダーゼ活性抑制効果及び／又はグルコース吸収抑制効果を見出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示すとおりである。
＜１＞琥珀抽出物を含有することを特徴とするα−グルコシダーゼ活性抑制剤。
＜２＞琥珀抽出物を含有することを特徴とするグルコース吸収抑制剤。
＜３＞前記琥珀抽出物を製造するための抽出溶媒が含水アルコール（含水率：１質量％〜６０質量％）である＜１＞又は＜２＞に記載の剤。
＜４＞＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の剤の１種又は２種以上を配合して成る経口投与組成物。
＜５＞態様が医薬品、医薬部外品、飲食品又は食品添加物である＜４＞に記載の経口投与組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、琥珀の抽出物を含むα−グルコシダーゼ活性抑制剤及び／又はグルコース吸収抑制剤である。これらのα−グルコシダーゼ活性抑制剤及び／又はグルコース吸収抑制剤は、小腸上皮上に局在するα−グルコシダーゼの活性を抑制し糖質の分解を抑えることにより、さらには／又は小腸上皮細胞からのグルコース吸収を抑制することにより、糖質の吸収を抑制及び／又は遅延させることができる。よって、これらのα−グルコシダーゼ活性抑制剤及び／又はグルコース吸収抑制剤を飲食品などに添加することで、食事由来の糖質の吸収を抑制及び／又は遅延させ、血糖値の上昇を抑制し、さらには高血糖症状および高血糖の慢性化に由来する糖尿病や肥満症の長期的な予防及び改善に有用な飲食物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図１はＣａｃｏ−２細胞における、琥珀抽出物によるスクラーゼ‐イソマルターゼ複合体のｍＲＮＡ発現抑制を示すグラフ（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、５０％エタノール抽出物とは製造例１の琥珀抽出物を指す）
図２はＣａｃｏ−２細胞における、琥珀抽出物によるスクラーゼ‐イソマルターゼ複合体のタンパク質発現抑制を示す図（ａ）及びグラフ（ｂ）（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、５０％エタノール抽出物とは製造例１の琥珀抽出物を指す）
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の琥珀抽出物
本発明のα−グルコシダーゼ活性抑制剤及び／又はグルコース吸収抑制剤は、有効成分として琥珀抽出物を含有することを特徴とする。ここで、本発明で言う琥珀抽出物とは、琥珀そのもの、琥珀を粉砕、細切等加工した加工物、琥珀又はその加工物に溶媒を加え抽出した抽出物、抽出物から溶媒を除去した抽出物の溶媒除去物、それらの精製物等が例示でき、これらの内では抽出物又はその溶媒除去物が特に好ましい。
抽出物の溶媒としては、例えば、水、メタノールやエタノール、１，３−ブタンジオール、プロピレングリコール、グリセリン等のアルコール類、酢酸エチルや蟻酸メチル等のエステル類、アセトニトリル等のニトリル類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、クロロホルムや塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素類、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類等が例示でき、これらの１種又は２種以上を単独あるいは混合して用いればよい。これらの内好ましいものは水又はアルコール類、より好ましいものは含水アルコールである。さらにアルコールとしてはエタノールが好ましい。含水率は１質量％〜６０質量％が好ましく、１０質量％〜５０質量％がさらに好ましい。これより高くても低くても、抽出効率が悪くなる場合が存する。
抽出の方法は、例えば琥珀の粉砕物に２〜２０倍量の溶媒を加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬すればよい。その後濾過等によって不溶物を除去し、減圧濃縮等すればよい。又、これをシリカゲル、オクタデシルシリル化シリカゲル、イオン交換樹脂等を充填したカラムでカラムクロマトグラフィーによって精製してもよい。
製造例１
琥珀の粉末１００ｇを５０％エタノールで抽出し、それを減圧濃縮、凍結乾燥し、５０％エタノール抽出物１０ｇを得た。
得られた抽出物を用いてα−グルコシダーゼ活性抑制作用を調べる方法としては、例えば、ヒト結腸癌由来細胞（以下、Ｃａｃｏ−２細胞とする）に抽出物を添加し培養した後、細胞を回収し、その粗酵素液に基質としてスクロース、マルトースを反応させ、生じたグルコース量を、グルコースオキシダーゼを用いた酵素法により定量する方法を用いることができる。グルコース取込み阻害作用を調べる方法としては、腸管上皮様に分化させたＣａｃｏ−２細胞にグルコースと抽出物を同時添加し、細胞に取込まれた、あるいは細胞を透過したグルコース量を、グルコースオキシダーゼを用いた酵素法により定量する方法を用いることができる。
本発明の抽出物を含む飲料の例としては、茶飲料、コーヒー飲料、清涼飲料、酒、乳飲料、炭酸飲料、健康飲料、栄養ドリンク、スポーツドリンク等とこれら飲料の濃縮原液及び調製粉末等であり、食品の例としては、ガム、キャンディー、ゼリー、錠菓、健康食品、栄養補給食品、サプリメント等である。
本発明の抽出物を糖尿病予防薬等の医薬として用いる場合には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤等の形態で提供される。本発明の抽出物をそのまま、あるいは水等で希釈して、経口的に投与できる。もしくはこれを公知の医薬用担体と共に製剤化することにより調製される。例えば、本発明の抽出物をシロップ剤などの経口液状製剤として、又はエキス、粉末などに加工して、薬学的に許容される担体と配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの経口固形製剤として投与できる。薬学的に許容できる担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、液状製剤における溶剤、賦形剤、懸濁化剤、結合剤などとして配合される。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色料、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
本発明の抽出物を含む飲食品又は医薬組成物には、本発明の抽出物を任意の濃度で含ませることができる。好ましくは、本発明の抽出物を１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で含み、より好ましくは５〜５０μｇ／ｍｌの濃度で含む。
また、有効な用量は、患者の年齢及び体重、疾病の種類及び重篤度並びに投与の経路により適宜決定することができる。
【実施例】
【００１０】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１：スクラーゼ、マルターゼ活性抑制試験
本試験はＯＧＡＷＡらの方法（Ｎ．Ｏｇａｗａら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１３０：５０７−５１３，２０００）を参考にした。
ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に１０％ウシ血清（ＦＥＴＡＬ  ＢＯＶＩＮＥ  ＳＥＲＵＭ、以下ＦＢＳとする）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と１％抗菌剤（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）（ｗａｋｏ社製）と１％非必須アミノ酸混合液（ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加した培養液（以下、ＤＭＥＭ培地とする）に、Ｃａｃｏ−２細胞を懸濁し、１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように２４ウェルプレート（ＴＰＰ社製）に播種した。９５％空気−５％炭酸ガスの下、３７℃で培養し、２〜３日おきに培地交換を行いコンフルエントになるまで８から１０日間培養した。培養上清を吸引除去後、製造例１の琥珀抽出物（５０％エタノール抽出物）を終濃度１００、２００μｇ／ｍＬになるようにジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯとする）に溶解させ、ＤＭＥＭ培地に混ぜたもの（ＤＭＳＯ終濃度：０．２５％）を５００μＬずつ添加した。また、ＤＭＥＭ培地にＤＭＳＯ終濃度０．２５％になるようＤＭＳＯを添加した培養液を処理したものをｃｏｎｔｒｏｌとし、アカルボース（以下、ＡＣＡとする）を終濃度１００μｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解させ、ＤＭＥＭ培地に混ぜた培養液（ＤＭＳＯ終濃度：０．２５％）を処理したものを陽性対照とした。さらに、琥珀抽出物に含有される相当量のコハク酸についてもスクラーゼ、マルターゼ活性抑制試験を実施した。具体的には、製造例１の琥珀抽出物のコハク酸含有量を分析／分取高速液体クロマトグラフィー装置及びフーリエ変換赤外分光光度計を用いて算出し、コハク酸含有率が２％以下であることを確認した。そこでコハク酸を終濃度２、５、２５μｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解させ、ＤＭＥＭ培地に混ぜたもの（ＤＭＳＯ終濃度：０．２５％）を処理した。これらのプレートを９５％空気−５％炭酸ガスの下、３７℃で７日間培養した。
溶解バッファー（０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．８）、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で細胞を回収し氷上で２０分間静置した後、４℃下で３０分間遠心分離（１０，０００ｘｇ）を行い、上清を採取した。上清と等量のスクロース液（スクロースを５６ｍＭの濃度でＰＢＳ（＋）に溶解したもの）又はマルトース液（マルトースを５６ｍＭの濃度でＰＢＳ（＋）に溶解したもの）を混合し、３７℃下で１時間反応させた後、生成したグルコースの量を、グルコースＣＩＩテストワコー（ｗａｋｏ社製）を用いて酵素法により定量した。グルコース生成量を基にスクラーゼ活性又はマルターゼ活性をそれぞれ算出した。そして、ｃｏｎｔｒｏｌサンプルの酵素活性を１００としたときの試料添加サンプルにおける相対的な変化を算出した。
表１にスクラーゼ、マルターゼ活性測定の結果を示す。本発明の琥珀抽出物はＣａｃｏ−２細胞におけるスクラーゼ活性およびマルターゼ活性に対し強い抑制作用を示した。一方で、琥珀抽出物に含有される相当量のコハク酸で処理したＣａｃｏ−２細胞においては、スクラーゼ活性、マルターゼ活性ともに抑制効果が確認されなかった。つまり、本発明の琥珀抽出物にはＣａｃｏ−２細胞のスクラーゼ活性、マルターゼ活性を抑制する成分が含まれるが、その成分はコハク酸以外の化合物もしくは混合物であることが分かった。
【表１】
2018212362.tif 000003
2018212362.tif 000004
実施例２：スクラーゼ‐イソマルターゼ複合体のｍＲＮＡ発現抑制試験
ＤＭＥＭ培地に、Ｃａｃｏ−２細胞を懸濁し、１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように直径４ｃｍのディッシュ（ＴＰＰ社製）に播種した。９５％空気−５％炭酸ガスの下、３７℃で培養し、２から３日おきに培地交換を行いコンフルエントになるまで１０日間培養した。培養上清を吸引除去後、製造例１の琥珀抽出物を終濃度１００、２００μｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解させ、ＤＭＥＭ培地に混ぜたもの（ＤＭＳＯ終濃度：０．２５％）を１ｍＬずつ添加した。また、ＤＭＥＭ培地にＤＭＳＯ終濃度０．２５％になるようＤＭＳＯを添加した培養液を処理したものをｃｏｎｔｒｏｌとした。これらのディッシュを９５％空気−５％炭酸ガスの下、３７℃で７日間培養した。
ＲＮＡ精製キットＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いて処理した細胞から総ＲＮＡを抽出した（産物を以下、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡとする）。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ量はナノスケール分光光度計（Ｎａｎｏ  ２００）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。次いでこのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを元に、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用い、添付文書に従ってＲＴ反応を行った。更にＳＹＢＲ（商標）Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  ＩＩ（タカラバイオ社製）を用い、添付文書に従って反応液を調製した。この反応液をｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法によりスクラーゼ−イソマルターゼ複合体（以下、ＳＩとする）及び内部標準であるＧＡＰＤＨの各プライマー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と反応させた。そして、ｃｏｎｔｒｏｌサンプルのＳＩ  ｍＲＮＡ発現量を１００としたときの試料添加サンプルにおける相対的な変化を算出した。その際、内部標準であるＧＡＰＤＨの値で補正した。
ＳＩ  ｍＲＮＡ発現の結果を図１に示す。本発明の琥珀抽出物はＳＩ  ｍＲＮＡ発現を抑制することが確認された。
実施例３：ＳＩタンパク発現抑制試験
ＤＭＥＭ培地に、Ｃａｃｏ−２細胞を懸濁し、１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように直径４ｃｍのディッシュ（ＴＰＰ社製）に播種した。９５％空気−５％炭酸ガスの下、３７℃で培養し、２〜３日おきに培地交換を行いコンフルエントになるまで１０日間培養した。培養上清を吸引除去後、製造例１の琥珀抽出物を終濃度１００、２００μｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解させ、ＤＭＥＭ培地に混ぜたもの（ＤＭＳＯ終濃度：０．２５％）を１ｍＬずつ添加した。また、ＤＭＥＭ培地にＤＭＳＯ終濃度０．２５％になるようＤＭＳＯを添加した培養液を処理したものをｃｏｎｔｒｏｌとした。これらのディッシュを９５％空気−５％炭酸ガスの下、３７℃で８日間培養した。
ＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＣＣ社製）で細胞を回収した後、４℃下で１５分間遠心分離（１０，０００ｘｇ）を行い、上清を採取した。総タンパク量はＢｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を用いて５９５ｎｍにおける吸光度により求めた。次いで、常法に従いポリアクリルアミド電気泳動を行い、ポリビニリデンジフルオリドメンブレン（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）にタンパク質を転写した。ＳＩタンパクの検出には、一次抗体としてマウス抗ヒトＳＩ（Ａ−１２）抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）、二次抗体としてヤギホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）を用いた。内部標準であるβ−ａｃｔｉｎタンパクの検出には、一次抗体としてウサギ抗ヒトβ−ａｃｔｉｎ抗体（ａｂｃａｍ社製）、二次抗体としてロバホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ラビット抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）を用いた。バンドの検出は、ＥＣＬ（ｂｉｏ−ｒａｄ社製）と二次抗体を反応させ、化学発光検出専用撮影装置を用いてシグナルを検出した。解析にはＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用い、ｃｏｎｔｒｏｌサンプルのＳＩタンパク発現量を１００としたときの試料添加サンプルにおける相対的な変化を算出した。その際、内部標準であるβ−ａｃｔｉｎの値で補正した。
ＳＩタンパク発現の結果を図２に示す。図２（ａ）はウエスタンブロットのバンドの代表例である。バンドのシグナル強度積算値（Ｖｏｌｕｍｅ）の平均値を算出したものを図２（ｂ）に示す。本発明の琥珀抽出物はＳＩタンパク発現を抑制することが確認された。
実施例４：腸管上皮様細胞によるグルコース取込みの抑制試験
本試験はＫｏｎｉｓｈｉらの方法（Ｋｏｎｉｓｈｉら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７（４），８５６−８６２，２００３）に従った。ＤＭＥＭ培地に、Ｃａｃｏ−２細胞を懸濁し、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるようにＴｒａｎｓｗｅｌｌ−ＣＯＬ  １２ｍｍ  Ｄｉａｍｅｔｅｒ  ０．４μｍ  Ｐｏｒｅ  Ｓｉｚｅ（ｃｏｒｎｉｎｇ社製）（以下、トランズウェルとする）に播種した。９５％空気−５％炭酸ガス、３７℃の下、２〜３日おきに培地交換を行い３週間培養した。
ミリセル（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ）ＥＲＳ−２抵抗値測定システム（メルクミリポア社製）を用いて細胞間電気抵抗値（ＴＥＲ値）が３５０Ω・ｃｍ２以上であることを確認した後、ａｐｉｃａｌ側に製造例１の琥珀抽出物を終濃度０．２、１、２ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解させ、ＰＢＳ（＋）に０．５％の濃度でＤ（＋）−グルコースを溶かしたもの（以下、０．５％グルコース溶液とする）に混ぜた溶液（ＤＭＳＯ終濃度：１％）を５００μＬずつ添加した。また、０．５％グルコース溶液にＤＭＳＯ終濃度１％になるようＤＭＳＯを添加した溶液を処理したものをｃｏｎｔｒｏｌとし、フロリジンｎ水和物，リンゴ由来（以下、フロリジンとする）を終濃度１ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解させ、０．５％グルコース溶液に混ぜた溶液（ＤＭＳＯ終濃度：１％）を処理したものを陽性対照とした。さらに、琥珀抽出物に含有される相当量のコハク酸についてもグルコース透過抑制試験を実施した。具体的には、製造例１の琥珀抽出物のコハク酸含有量を分析／分取高速液体クロマトグラフィー装置及びフーリエ変換赤外分光光度計を用いて算出し、コハク酸含有率が２％以下であることが確認できた。そこでコハク酸を終濃度０．０２、０．０５、０．１ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解させ、ＰＢＳ（＋）に混ぜた溶液（ＤＭＳＯ終濃度：１％）を処理した。また、それぞれのｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ側にはＰＢＳ（＋）を５００μＬずつ添加した。これらのトランズウェルを９５％空気−５％炭酸ガスの下、３７℃で２時間培養した後、ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ側に透過したグルコースの量を、グルコースＣＩＩテストワコーを用いて定量した。そして、ｃｏｎｔｒｏｌサンプルのグルコース透過量を１００としたときの試料添加サンプルにおける相対的な変化を算出した。また、試験後にはＴＥＲ値が３５０Ω・ｃｍ２以上であることを確認した。
グルコース透過率の結果を表２に示す。本発明の抽出物は腸管上皮様細胞によるグルコースの取込みを抑制することが確認された。一方で、琥珀抽出物に含有される相当量のコハク酸で処理したＣａｃｏ−２細胞においては、グルコース透過抑制効果が確認されなかった。つまり、本発明の琥珀抽出物にはＣａｃｏ−２細胞におけるグルコース透過を抑制する成分が含まれるが、その成分はコハク酸以外の化合物もしくは混合物であることが分かった。
【表２】
2018212362.tif 000005
【図１】
2018212362.tif 000006
【図２】
2018212362.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月9日(2019.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
琥珀抽出物を含有することを特徴とするα−グルコシダーゼ活性抑制剤。
【請求項２】
前記琥珀抽出物を製造するための抽出溶媒が含水アルコール（含水率：１質量％〜６０質量％）である請求項１に記載の剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の剤を配合してなるα−グルコシダーゼ活性抑制用経口投与組成物。
【請求項４】
態様が医薬品、医薬部外品、飲食品又は食品添加物である請求項３に記載のα−グルコシダーゼ活性抑制用経口投与組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、琥珀抽出物を含むα−グルコシダーゼ活性抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
琥珀とは、主にマツ属植物の樹脂が長期間地下に埋没し凝結してできた化石であり、中国では古くからその粉末が漢方薬として用いられている。主に樹脂、精油、コハク酸等を含み、エタノールやジエチルエーテルあるいはベンゼンに少量溶ける（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００３】
日本では宝飾品としてよく知られているが、近年では、粉末や抽出物を化粧品や健康食品に用いる例が増えている。例えば、琥珀粉末を化粧品に配合し、肌感触を改善する技術（例えば、特許文献１を参照）、琥珀抽出物を皮膚外用剤に配合する技術（例えば、特許文献２、特許文献３を参照）、琥珀熱水抽出物の美白効果を利用する技術（例えば、特許文献４、特許文献５を参照）、琥珀抽出画分中の皮膚ターンオーバー促進因子を利用する技術（例えば、特許文献６を参照）、琥珀抽出物中の皮膚のスキンファーミング効果を利用する技術（例えば、特許文献７を参照）、琥珀抽出画分中のヒアルロン酸産生促進因子を利用する技術（例えば、特許文献８を参照）、琥珀抽出画分中の血管新生促進因子を利用する技術（例えば、特許文献９を参照）などが知られている。
【０００４】
このように、琥珀には様々な物理化学的、生物学的効果が知られており、非常に有用な素材として様々な分野で用いられてきており、無限の可能性を秘める素材として期待されている。
【０００５】
一方、近年急増している糖尿病は、慢性高血糖をはじめとする様々な代謝異常が現れる疾患である。糖尿病の９０％以上を占めるＩＩ型糖尿病は生活習慣と密接に関連しており、食事や運動等による予防・軽減が可能と言われている。従来、糖尿病治療薬としてインクレチン関連薬、ピグアナイド薬、スルホニルウレア薬、インスリン感受性増強薬、チアゾリジン薬、α-グルコシダーゼ阻害薬などが用いられてきたが、いずれも医師の管理下での使用が必須である上、副作用が心配されるものも多い。これらのことから、日常的な摂取が簡便である飲食品によって日ごろから血糖値を良好に調節し、糖尿病を予防及び改善することが望ましい。そこで、飲食品に添加可能な、食後の血糖値上昇を抑制する作用を有する食品素材の開発が強く望まれている。
【０００６】
食事から摂取した糖質は、小腸上皮上に局在するα-グルコシダーゼによってグルコースなどの単糖に分解され、その後小腸上皮細胞が単糖を取込むことで血液中に運ばれる。よって、α-グルコシダーゼの働きを抑制することによって、食事に含まれる糖質の吸収を抑制又は遅らせることが可能であり、それによって食後の血糖値上昇を抑制することができる。
【０００７】
これまでにα-グルコシダーゼ活性抑制作用を有する食品素材としては、例えば、グアバ葉熱水抽出物（例えば、非特許文献２を参照）などが知られている。グルコース吸収抑制作用を有する食品素材としては、例えば、茶ポリフェノール（例えば、非特許文献３を参照）などが知られている。また、琥珀に含まれる成分として知られているコハク酸が、糖尿病モデルラットにおいて血糖値上昇抑制効果を示した報告があるが（例えば、特許文献１０を参照）、そのメカニズムは不明である。しかし、これまでに琥珀抽出物におけるα-グルコシダーゼ活性抑制作用をメカニズムとした血糖値上昇抑制効果は報告がされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−８３４７８号公報
【特許文献２】特開Ｈ９−２２７３３４号公報
【特許文献３】特開２００１−１３１０４８号公報
【特許文献４】特開２０１０−２３５５５１号公報
【特許文献５】特開２０１２−２４０９６７号公報
【特許文献６】特開２００７−３１４５２２号公報
【特許文献７】特開２００８−１８９６６９号公報
【特許文献８】特開２００８−２６６２６０号公報
【特許文献９】特開２０１１−２５６１６４号公報
【特許文献１０】特開平６−６２７９８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】中薬大辞典  第二巻  上海科学技術出版社（江蘇新医学院「中薬大辞典」編集部）小学館編）公知文献１参照
【非特許文献２】出口ヨリ子ら,  日本農芸化学会誌, ７２（８）, ９２３‐９３１（１９８８）
【非特許文献３】Ｙ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉら, Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．， ４８, ５６１８−５６２３（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、日常的な摂取が簡便である飲食品に組み込むことができる、α-グルコシダーゼ活性抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
このような状況を鑑みて、本発明者らは鋭意研究をした結果、琥珀抽出物にα-グルコシダーゼ活性抑制効果を見出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示すとおりである。
＜１＞琥珀抽出物を含有することを特徴とするα-グルコシダーゼ活性抑制剤。
＜２＞前記琥珀抽出物を製造するための抽出溶媒が含水アルコール（含水率：１質量％〜６０質量％）である＜１＞に記載の剤。
＜３＞＜１＞又は＜２＞に記載の剤の１種又は２種以上を配合して成るα-グルコシダーゼ活性抑制用経口投与組成物。
＜４＞態様が医薬品、医薬部外品、飲食品又は食品添加物である＜３＞に記載のα-グルコシダーゼ活性抑制用経口投与組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、琥珀の抽出物を含むα−グルコシダーゼ活性抑制剤である。このα-グルコシダーゼ活性抑制剤は、小腸上皮上に局在するα-グルコシダーゼの活性を抑制し糖質の分解を抑えることにより、糖質の吸収を抑制又は遅延させることができる。よって、これらのα-グルコシダーゼ活性抑制剤を飲食品などに添加することで、食事由来の糖質の吸収を抑制又は遅延させ、血糖値の上昇を抑制し、さらには高血糖症状および高血糖の慢性化に由来する糖尿病や肥満症の長期的な予防及び改善に有用な飲食物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｃａｃｏ−２細胞における、琥珀抽出物によるスクラーゼ‐イソマルターゼ複合体のｍＲＮＡ発現抑制を示すグラフ（ｎ＝３、*ｐ＜０．０５、５０％エタノール抽出物とは製造例１の琥珀抽出物を指す）。
【図２】Ｃａｃｏ−２細胞における、琥珀抽出物によるスクラーゼ‐イソマルターゼ複合体のタンパク質発現抑制を示す図（a）及びグラフ（ｂ）（ｎ＝３、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、５０％エタノール抽出物とは製造例１の琥珀抽出物を指す）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜本発明の琥珀抽出物＞
本発明のα-グルコシダーゼ活性抑制剤は、有効成分として琥珀抽出物を含有することを特徴とする。ここで、本発明で言う琥珀抽出物とは、琥珀そのもの、琥珀を粉砕、細切等加工した加工物、琥珀又はその加工物に溶媒を加え抽出した抽出物、抽出物から溶媒を除去した抽出物の溶媒除去物、それらの精製物等が例示でき、これらの内では抽出物又はその溶媒除去物が特に好ましい。
【００１５】
抽出物の溶媒としては、例えば、水、メタノールやエタノール、１，３−ブタンジオール、プロピレングリコール、グリセリン等のアルコール類、酢酸エチルや蟻酸メチル等のエステル類、アセトニトリル等のニトリル類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、クロロホルムや塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素類、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類等が例示でき、これらの１種又は２種以上を単独あるいは混合して用いればよい。これらの内好ましいものは水又はアルコール類、より好ましいものは含水アルコールである。さらにアルコールとしてはエタノールが好ましい。含水率は１質量％〜６０質量％が好ましく、１０質量％〜５０質量％がさらに好ましい。これより高くても低くても、抽出効率が悪くなる場合が存する。
【００１６】
抽出の方法は、例えば琥珀の粉砕物に２〜２０倍量の溶媒を加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬すればよい。その後濾過等によって不溶物を除去し、減圧濃縮等すればよい。又、これをシリカゲル、オクタデシルシリル化シリカゲル、イオン交換樹脂等を充填したカラムでカラムクロマトグラフィーによって精製してもよい。
＜製造例１＞
琥珀の粉末１００ｇを５０％エタノールで抽出し、それを減圧濃縮、凍結乾燥し、５０％エタノール抽出物１０ｇを得た。
【００１７】
得られた抽出物を用いてα−グルコシダーゼ活性抑制作用を調べる方法としては、例えば、ヒト結腸癌由来細胞（以下、Ｃａｃｏ−２細胞とする）に抽出物を添加し培養した後、細胞を回収し、その粗酵素液に基質としてスクロース、マルトースを反応させ、生じたグルコース量を、グルコースオキシダーゼを用いた酵素法により定量する方法を用いることができる。グルコース取込み阻害作用を調べる方法としては、腸管上皮様に分化させたＣａｃｏ−２細胞にグルコースと抽出物を同時添加し、細胞に取込まれた、あるいは細胞を透過したグルコース量を、グルコースオキシダーゼを用いた酵素法により定量する方法を用いることができる。
【００１８】
本発明の抽出物を含む飲料の例としては、茶飲料、コーヒー飲料、清涼飲料、酒、乳飲料、炭酸飲料、健康飲料、栄養ドリンク、スポーツドリンク等とこれら飲料の濃縮原液及び調製粉末等であり、食品の例としては、ガム、キャンディー、ゼリー、錠菓、健康食品、栄養補給食品、サプリメント等である。
【００１９】
本発明の抽出物を糖尿病予防薬等の医薬として用いる場合には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤等の形態で提供される。本発明の抽出物をそのまま、あるいは水等で希釈して、経口的に投与できる。もしくはこれを公知の医薬用担体と共に製剤化することにより調製される。例えば、本発明の抽出物をシロップ剤などの経口液状製剤として、又はエキス、粉末などに加工して、薬学的に許容される担体と配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの経口固形製剤として投与できる。薬学的に許容できる担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、液状製剤における溶剤、賦形剤、懸濁化剤、結合剤などとして配合される。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色料、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
【００２０】
本発明の抽出物を含む飲食品又は医薬組成物には、本発明の抽出物を任意の濃度で含ませることができる。好ましくは、本発明の抽出物を飲食品又は医薬組成物全量に対して、１０〜９０質量％の濃度で含み、より好ましくは３０〜６０質量％の濃度で含む。
【００２１】
また、有効な用量は、患者の年齢及び体重、疾病の種類及び重篤度並びに投与の経路により適宜決定することができる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞スクラーゼ、マルターゼ活性抑制試験
本試験はＯＧＡＷＡらの方法（Ｎ．Ｏｇａｗａら， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ, １３０：５０７−５１３, ２０００)を参考にした。
【００２３】
ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に１０％ウシ血清（ＦＥＴＡＬ ＢＯＶＩＮＥ ＳＥＲＵＭ、以下ＦＢＳとする）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と１％抗菌剤（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）（ｗａｋｏ社製）と１％非必須アミノ酸混合液（ＭＥＭ Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加した培養液（以下、ＤＭＥＭ培地とする）に、Ｃａｃｏ−２細胞を懸濁し、１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2となるように２４ウェルプレート（ＴＰＰ社製）に播種した。９５％空気−５％炭酸ガスの下、３７℃で培養し、２〜３日おきに培地交換を行いコンフルエントになるまで８から１０日間培養した。培養上清を吸引除去後、製造例１の琥珀抽出物（５０％エタノール抽出物）を終濃度１００、２００μｇ／ｍＬになるようにジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯとする）に溶解させ、ＤＭＥＭ培地に混ぜたもの（ＤＭＳＯ終濃度：０．２５％）を５００μＬずつ添加した。また、ＤＭＥＭ培地にＤＭＳＯ終濃度０．２５％になるようＤＭＳＯを添加した培養液を処理したものをｃｏｎｔｒｏｌとし、アカルボース（以下、ＡＣＡとする）を終濃度１００μｇ/ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解させ、ＤＭＥＭ培地に混ぜた培養液（ＤＭＳＯ終濃度：０．２５％）を処理したものを陽性対照とした。さらに、琥珀抽出物に含有される相当量のコハク酸についてもスクラーゼ、マルターゼ活性抑制試験を実施した。具体的には、製造例１の琥珀抽出物のコハク酸含有量を分析／分取高速液体クロマトグラフィー装置及びフーリエ変換赤外分光光度計を用いて算出し、コハク酸含有率が２％以下であることを確認した。そこでコハク酸を終濃度２、５、２５μｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解させ、ＤＭＥＭ培地に混ぜたもの（ＤＭＳＯ終濃度：０．２５％）を処理した。これらのプレートを９５％空気−５％炭酸ガスの下、３７℃で７日間培養した。
【００２４】
溶解バッファー（０．１Ｍリン酸バッファー(ｐＨ６．８)、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で細胞を回収し氷上で２０分間静置した後、４℃下で３０分間遠心分離（１０，０００xｇ）を行い、上清を採取した。上清と等量のスクロース液（スクロースを５６ｍＭの濃度でＰＢＳ(＋)に溶解したもの）又はマルトース液（マルトースを５６ｍＭの濃度でＰＢＳ(＋)に溶解したもの）を混合し、３７℃下で１時間反応させた後、生成したグルコースの量を、グルコースＣＩＩテストワコー（ｗａｋｏ社製）を用いて酵素法により定量した。グルコース生成量を基にスクラーゼ活性又はマルターゼ活性をそれぞれ算出した。そして、ｃｏｎｔｒｏｌサンプルの酵素活性を１００としたときの試料添加サンプルにおける相対的な変化を算出した。
【００２５】
表１にスクラーゼ、マルターゼ活性測定の結果を示す。本発明の琥珀抽出物はＣａｃｏ−２細胞におけるスクラーゼ活性およびマルターゼ活性に対し強い抑制作用を示した。一方で、琥珀抽出物に含有される相当量のコハク酸で処理したＣａｃｏ−２細胞においては、スクラーゼ活性、マルターゼ活性ともに抑制効果が確認されなかった。つまり、本発明の琥珀抽出物にはＣａｃｏ−２細胞のスクラーゼ活性、マルターゼ活性を抑制する成分が含まれるが、その成分はコハク酸以外の化合物もしくは混合物であることが分かった。
【００２６】
【表１】
2018212362.tif 000008
【００２７】
＜実施例２＞スクラーゼ‐イソマルターゼ複合体のｍＲＮＡ発現抑制試験
ＤＭＥＭ培地に、Ｃａｃｏ−２細胞を懸濁し、１．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2となるように直径４ｃｍのディッシュ（ＴＰＰ社製）に播種した。９５％空気−５％炭酸ガスの下、３７℃で培養し、２から３日おきに培地交換を行いコンフルエントになるまで１０日間培養した。培養上清を吸引除去後、製造例１の琥珀抽出物を終濃度１００、２００μｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解させ、ＤＭＥＭ培地に混ぜたもの（ＤＭＳＯ終濃度：０．２５％）を１ｍＬずつ添加した。また、ＤＭＥＭ培地にＤＭＳＯ終濃度０．２５％になるようＤＭＳＯを添加した培養液を処理したものをｃｏｎｔｒｏｌとした。これらのディッシュを９５％空気−５％炭酸ガスの下、３７℃で７日間培養した。
【００２８】
ＲＮＡ精製キットＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いて処理した細胞から総ＲＮＡを抽出した（産物を以下、total ＲＮＡとする）。total ＲＮＡ量はナノスケール分光光度計（Ｎａｎｏ ２００）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。次いでこのtotal ＲＮＡを元に、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉt（タカラバイオ社製）を用い、添付文書に従ってRT反応を行った。更にＳＹＢＲ（商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ ＩＩ（タカラバイオ社製）を用い、添付文書に従って反応液を調製した。この反応液をｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲ法によりスクラーゼ-イソマルターゼ複合体（以下、ＳＩとする）及び内部標準であるＧＡＰＤＨの各プライマー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と反応させた。そして、ｃｏｎｔｒｏｌサンプルのＳＩ ｍＲＮＡ発現量を１００としたときの試料添加サンプルにおける相対的な変化を算出した。その際、内部標準であるＧＡＰＤＨの値で補正した。
【００２９】
ＳＩ ｍＲＮＡ発現の結果を図１に示す。本発明の琥珀抽出物はＳＩ ｍＲＮＡ発現を抑制することが確認された。
＜実施例３＞ＳＩタンパク発現抑制試験
ＤＭＥＭ培地に、Ｃａｃｏ−２細胞を懸濁し、１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように直径４ｃｍのディッシュ（ＴＰＰ社製）に播種した。９５％空気−５％炭酸ガスの下、３７℃で培養し、２〜３日おきに培地交換を行いコンフルエントになるまで１０日間培養した。培養上清を吸引除去後、製造例１の琥珀抽出物を終濃度１００、２００μｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解させ、ＤＭＥＭ培地に混ぜたもの（ＤＭＳＯ終濃度：０．２５％）を１ｍＬずつ添加した。また、ＤＭＥＭ培地にＤＭＳＯ終濃度０．２５％になるようＤＭＳＯを添加した培養液を処理したものをｃｏｎｔｒｏｌとした。これらのディッシュを９５％空気−５％炭酸ガスの下、３７℃で８日間培養した。
【００３０】
ＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＣＣ社製）で細胞を回収した後、４℃下で１５分間遠心分離（１０，０００xｇ）を行い、上清を採取した。総タンパク量はＢｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を用いて５９５ｎｍにおける吸光度により求めた。次いで、常法に従いポリアクリルアミド電気泳動を行い、ポリビニリデンジフルオリドメンブレン（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）にタンパク質を転写した。ＳＩタンパクの検出には、一次抗体としてマウス抗ヒトＳＩ（Ａ−１２）抗体（ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ社製）、二次抗体としてヤギホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体（ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ社製）を用いた。内部標準であるβ−ａｃｔｉｎタンパクの検出には、一次抗体としてウサギ抗ヒトβ−ａｃｔｉｎ抗体（ａｂｃａｍ社製）、二次抗体としてロバホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ラビット抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）を用いた。バンドの検出は、ＥＣＬ（ｂｉｏ−ｒａｄ社製）と二次抗体を反応させ、化学発光検出専用撮影装置を用いてシグナルを検出した。解析にはＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用い、ｃｏｎｔｒｏｌサンプルのＳＩタンパク発現量を１００としたときの試料添加サンプルにおける相対的な変化を算出した。その際、内部標準であるβ−ａｃｔｉｎの値で補正した。
【００３１】
ＳＩタンパク発現の結果を図２に示す。図２（ａ）はウエスタンブロットのバンドの代表例である。バンドのシグナル強度積算値（Ｖｏｌｕｍｅ）の平均値を算出したものを図２（ｂ）に示す。本発明の琥珀抽出物はＳＩタンパク発現を抑制することが確認された。
【国際調査報告】
2018212362.tif 000009
2018212362.tif 000010
2018212362.tif 000011
2018212362.tif 000012