(57)【要約】  本発明は、２つ以上のＤＮＡ材料をアセンブルして、所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を製造する方法であって、（１）２つ以上のＤＮＡ材料を連結して、所望の塩基配列の一部と、連結用塩基配列とが交互に並んだ前駆ＤＮＡ断片を得る工程と、（２）前駆ＤＮＡ断片を制限酵素で処理し、連結用塩基配列を除去して所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を得る工程と、を備え、前駆ＤＮＡ断片には、制限酵素により認識される塩基配列が、制限酵素により処理して前駆ＤＮＡ断片を切断したときに、連結用塩基配列が除去され、かつ連結用塩基配列を介して隣接する所望の塩基配列の一部が、切断された部位同士で連結可能なように配置されている、方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上のＤＮＡ材料をアセンブルして、所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を製造する方法であって、
（１）２つ以上のＤＮＡ材料を連結して、所望の塩基配列の一部と、連結用塩基配列とが交互に並んだ前駆ＤＮＡ断片を得る工程と、
（２）前駆ＤＮＡ断片を制限酵素で処理し、連結用塩基配列を除去して所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を得る工程と、を備え、
前駆ＤＮＡ断片には、制限酵素により認識される塩基配列が、制限酵素により処理して前駆ＤＮＡ断片を切断したときに、連結用塩基配列が除去され、かつ連結用塩基配列を介して隣接する所望の塩基配列の一部が、切断された部位同士で連結可能なように配置されている、方法。
【請求項２】
前駆ＤＮＡ断片を得る工程が、
（１−１）以下の（ａ）〜（ｅ）を満たす、２つ以上のＤＮＡ材料を準備するステップと、
（ａ）ＤＮＡ材料は、それぞれ３’末端又は５’末端が突出した一本鎖オーバーハング領域を有する、
（ｂ）ＤＮＡ材料の一本鎖オーバーハング領域は、隣接して連結する他のＤＮＡ材料の一本鎖オーバーハング領域とハイブリダイズ可能な塩基配列を含む、
（ｃ）ＤＮＡ材料は、それぞれ所望の塩基配列の連続した一部の塩基配列と、連結用塩基配列とを含み、隣接して連結する２つのＤＮＡ材料に含まれる連結用塩基配列は、少なくとも一方の連結用塩基配列が、他方の連結用塩基配列の全ての塩基配列と重複している、
（ｄ）ＤＮＡ材料は、それぞれ連結用塩基配列に隣接した位置に制限酵素により切断される切断部位を有し、かつ当該制限酵素が認識する塩基配列を含む、
（ｅ）隣接して連結する２つのＤＮＡ材料は、切断部位が互いにハイブリダイズ可能な塩基配列を含む、
（１−２）ＤＮＡ材料の一本鎖オーバーハング領域と、隣接して連結する他のＤＮＡ材料の一本鎖オーバーハング領域とをハイブリダイズさせるステップと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（１−３）ステップ（１−２）の後に、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼの順で処理するステップを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を得る工程が、
制限酵素で処理した後、ＤＮＡリガーゼで処理することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩからなる群より選ばれる少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡリガーゼが、Ｔａｑリガーゼ及びＴｆｉＤＮＡリガーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種のＤＮＡリガーゼである、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ材料の一本鎖オーバーハング領域が、二本鎖ＤＮＡを５’エキソヌクレアーゼで処理することにより形成されたものである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
５’エキソヌクレアーゼが、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダ  エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＥ及びＴ５エキソヌクレアーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種の５’エキソヌクレアーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
制限酵素が、ＩＩ型制限酵素である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＩＩ型制限酵素が、ＩＩｓ型制限酵素である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＩＩｓ型制限酵素が、ＡａｒＩ、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＰＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｓｔＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏｐ１５Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＭｂｏＩＩ、ＭｍｅＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＳａｐＩ及びＳｆａＮＩからなる群より選ばれる少なくとも１種のＩＩｓ型制限酵素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
連結用塩基配列が、同一のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列が回文構造となるように２つ配置された塩基配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
２つ以上のＤＮＡ材料をアセンブルして、所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を製造する方法であって、
（１）以下の（ａ）〜（ｃ）を満たす二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ材料を準備する工程と、
（ａ）隣接して連結する２つのｄｓＤＮＡ材料は、それぞれ同一の連結用塩基配列を有する、
（ｂ）連結用塩基配列はいずれも、同一のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列が回文構造となるように２つ配置された塩基配列を有する、
（ｃ）ＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列は、ｄｓＤＮＡ材料の連結後にＩＩｓ型制限酵素で切断することにより、連結用塩基配列が除去される位置にある、
（２）ｄｓＤＮＡ材料を５’エキソヌクレアーゼ処理することにより、３’末端が突出した一本鎖オーバーハング領域を形成する工程と、
（３）ｄｓＤＮＡ材料の一本鎖オーバーハング領域と、他のｄｓＤＮＡ材料の一本鎖オーバーハング領域とをハイブリダイズする工程と、
（４）ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ハイブリダイズにより生じたギャップを埋める工程と、
（５）ＤＮＡリガーゼで処理し、ニックを繋ぎ合わせて前駆ＤＮＡ断片を得る工程と、
（６）前駆ＤＮＡ断片を、連結用塩基配列中に存在するＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を認識する１種又は２種以上のＩＩｓ型制限酵素で処理する工程と、
（７）ＩＩｓ型制限酵素による切断で生じた相補的な粘着末端をハイブリダイズし、ＤＮＡリガーゼで処理し、ニックを繋ぎ合わせる工程と、を備える、方法。
【請求項１４】
前駆ＤＮＡ断片中で、所望の塩基配列の一部を介して隣り合う連結用塩基配列に含まれるＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列が、それぞれ異なる塩基配列である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
２つ以上のオリゴＤＮＡを含む、所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を製造するためのキットであって、
オリゴＤＮＡは、それぞれ、所望の塩基配列の連続した一部の塩基配列と、他のＤＮＡ材料との連結に使用する連結用塩基配列とを含み、
オリゴＤＮＡには、制限酵素により認識される塩基配列が、オリゴＤＮＡの連結後に当該制限酵素で処理することにより、連結用塩基配列が除去され、かつ連結用塩基配列を介して隣接する所望の塩基配列の連続した一部の塩基配列が、制限酵素で切断された部位同士で連結可能なように配置されており、
オリゴＤＮＡは、全て連結したときに所望の塩基配列を網羅するものである、キット。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により得られる、ＤＮＡ断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を製造する方法として、ゴールデンゲート（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ）法、ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）法など、複数のＤＮＡ断片を連結する方法が知られている（非特許文献１）。【０００３】
Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法は、一方又は両方の末端にＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を含む複数のＤＮＡ断片を用意し、ＩＩｓ型制限酵素とＤＮＡリガーゼで処理する方法である。ＩＩｓ型制限酵素による切断で生じる粘着末端（スティッキー・エンド）により複数のＤＮＡ断片がハイブリダイズし、次いでＤＮＡリガーゼによりニックが繋ぎ合わされて、所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を製造することができる。ＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列の種類及び配置を設計することで、ＩＩｓ型制限酵素で切断された複数のＤＮＡ断片が、制限酵素の認識部位がなくなるように連結され、所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を製造することができる。Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法を利用し、所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片をクローニングベクターへ導入する方法等が報告されている（特許文献１及び非特許文献１）。【０００４】
Ｇｉｂｓｏｎ法は、隣接して連結するＤＮＡ断片のそれぞれの末端部の連結領域が１５〜８０塩基対（ｂｐ）程度重複するように（同一の塩基配列となるように）設計した複数のＤＮＡ断片を用意し、５’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼで処理する方法である。５’エキソヌクレアーゼによりＤＮＡ断片の末端から部分的に一本鎖ＤＮＡが生じる。生じた一本鎖ＤＮＡは、重複した塩基配列部分でハイブリダイズする。その後、ＤＮＡポリメラーゼによりギャップが埋められ、ＤＮＡリガーゼによりニックがつなぎ合わされて、所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を製造することができる。Ｇｉｂｓｏｎ法では、制限酵素により認識される塩基配列などを含ませる必要がないことから、塩基配列の制約がなく、長いＤＮＡ断片の構築にも適している（非特許文献２、特許文献２及び特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０２９１６３３号明細書
【特許文献２】米国特許第７７２３０７７号明細書
【特許文献３】特表２０１１−５１２１４０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９年，４（５），ｅ５５５３
【非特許文献２】化学と生物，２０１６年，Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ．１０，ｐｐ．７４０〜７４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法では、一度に連結可能なＤＮＡ断片の数は、最大でも１０程度と言われており、ＩＩｓ型制限酵素の種類もそれ程多くない。また、ＩＩｓ型制限酵素による切断で生じる粘着末端は４塩基前後と短いため、ミスライゲーションの頻度が高いと考えられる。特に、目的とする塩基配列（所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片）が、リピート配列、及びＧＣ含量の高い塩基配列の場合に、ミスライゲーションの頻度が高くなる傾向が強く、したがって一度に複数のＤＮＡ断片を正確に連結することは困難である。【０００８】
Ｇｉｂｓｏｎ法では、目的とする塩基配列が、リピート配列、又はＧＣ含量の高い塩基配列を含む場合、一本鎖ＤＮＡのハイブリダイズの正確性が低下するため、ミスライゲーションの頻度が極めて高くなると考えられる。【０００９】
ＣｐＧアイランド又はテロメア配列といったリピート配列からなるＤＮＡ断片は、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法においても、Ｇｉｂｓｏｎ法においても、正確に製造することは不可能である。【００１０】
本発明は、上述した問題に鑑み、リピート配列、ＧＣ含量の高い塩基配列を含むＤＮＡ断片であっても、正確に、かつ効率的に製造することができる、所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
２つ以上のＤＮＡ材料をアセンブルして、所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を製造する方法であって、
（１）２つ以上のＤＮＡ材料を連結して、所望の塩基配列の一部と、連結用塩基配列とが交互に並んだ前駆ＤＮＡ断片を得る工程と、
（２）前駆ＤＮＡ断片を制限酵素で処理し、連結用塩基配列を除去して所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を得る工程と、を備え、
前駆ＤＮＡ断片には、制限酵素により認識される塩基配列が、制限酵素により処理して前駆ＤＮＡ断片を切断したときに、連結用塩基配列が除去され、かつ連結用塩基配列を介して隣接する所望の塩基配列の一部が、切断された部位同士で連結可能なように配置されている、方法。
［２］
前駆ＤＮＡ断片を得る工程が、
（１−１）以下の（ａ）〜（ｅ）を満たす、２つ以上のＤＮＡ材料を準備するステップと、
（ａ）ＤＮＡ材料は、それぞれ３’末端又は５’末端が突出した一本鎖オーバーハング領域を有する、
（ｂ）ＤＮＡ材料の一本鎖オーバーハング領域は、隣接して連結する他のＤＮＡ材料の一本鎖オーバーハング領域とハイブリダイズ可能な塩基配列を含む、
（ｃ）ＤＮＡ材料は、それぞれ所望の塩基配列の連続した一部の塩基配列と、連結用塩基配列とを含み、隣接して連結する２つのＤＮＡ材料に含まれる連結用塩基配列は、少なくとも一方の連結用塩基配列が、他方の連結用塩基配列の全ての塩基配列と重複している、
（ｄ）ＤＮＡ材料は、それぞれ連結用塩基配列に隣接した位置に制限酵素により切断される切断部位を有し、かつ当該制限酵素が認識する塩基配列を含む、
（ｅ）隣接して連結する２つのＤＮＡ材料は、切断部位が互いにハイブリダイズ可能な塩基配列を含む、
（１−２）ＤＮＡ材料の一本鎖オーバーハング領域と、隣接して連結する他のＤＮＡ材料の一本鎖オーバーハング領域とをハイブリダイズさせるステップと、を含む、［１］に記載の方法。
［３］
（１−３）ステップ（１−２）の後に、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼの順で処理するステップを更に含む、［２］に記載の方法。
［４］
所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を得る工程が、
制限酵素で処理した後、ＤＮＡリガーゼで処理することを含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩからなる群より選ばれる少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼである、［３］に記載の方法。
［６］
ＤＮＡリガーゼが、Ｔａｑリガーゼ及びＴｆｉＤＮＡリガーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種のＤＮＡリガーゼである、［３］又は［４］に記載の方法。
［７］
ＤＮＡ材料の一本鎖オーバーハング領域が、二本鎖ＤＮＡを５’エキソヌクレアーゼで処理することにより形成されたものである、［２］に記載の方法。
［８］
５’エキソヌクレアーゼが、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダ  エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＥ及びＴ５エキソヌクレアーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種の５’エキソヌクレアーゼである、［７］に記載の方法。
［９］
制限酵素が、ＩＩ型制限酵素である、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］
ＩＩ型制限酵素が、ＩＩｓ型制限酵素である、［９］に記載の方法。
［１１］
ＩＩｓ型制限酵素が、ＡａｒＩ、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＰＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｓｔＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏｐ１５Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＭｂｏＩＩ、ＭｍｅＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＳａｐＩ及びＳｆａＮＩからなる群より選ばれる少なくとも１種のＩＩｓ型制限酵素である、［１０］に記載の方法。
［１２］
連結用塩基配列が、同一のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列が回文構造となるように２つ配置された塩基配列を有する、［１１］に記載の方法。
［１３］
２つ以上のＤＮＡ材料をアセンブルして、所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を製造する方法であって、
（１）以下の（ａ）〜（ｃ）を満たす二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ材料を準備する工程と、
（ａ）隣接して連結する２つのｄｓＤＮＡ材料は、それぞれ同一の連結用塩基配列を有する、
（ｂ）連結用塩基配列はいずれも、同一のＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列が回文構造となるように２つ配置された塩基配列を有する、
（ｃ）ＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列は、ｄｓＤＮＡ材料の連結後にＩＩｓ型制限酵素で切断することにより、連結用塩基配列が除去される位置にある、
（２）ｄｓＤＮＡ材料を５’エキソヌクレアーゼ処理することにより、３’末端が突出した一本鎖オーバーハング領域を形成する工程と、
（３）ｄｓＤＮＡ材料の一本鎖オーバーハング領域と、他のｄｓＤＮＡ材料の一本鎖オーバーハング領域とをハイブリダイズする工程と、
（４）ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ハイブリダイズにより生じたギャップを埋める工程と、
（５）ＤＮＡリガーゼで処理し、ニックを繋ぎ合わせて前駆ＤＮＡ断片を得る工程と、
（６）前駆ＤＮＡ断片を、連結用塩基配列中に存在するＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を認識する１種又は２種以上のＩＩｓ型制限酵素で処理する工程と、
（７）ＩＩｓ型制限酵素による切断で生じた相補的な粘着末端をハイブリダイズし、ＤＮＡリガーゼで処理し、ニックを繋ぎ合わせる工程と、を備える、方法。
［１４］
前駆ＤＮＡ断片中で、所望の塩基配列の一部を介して隣り合う連結用塩基配列に含まれるＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列が、それぞれ異なる塩基配列である、［１３］に記載の方法。
［１５］
２つ以上のオリゴＤＮＡを含む、所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を製造するためのキットであって、
オリゴＤＮＡは、それぞれ、所望の塩基配列の連続した一部の塩基配列と、他のＤＮＡ材料との連結に使用する連結用塩基配列とを含み、
オリゴＤＮＡには、制限酵素により認識される塩基配列が、オリゴＤＮＡの連結後に当該制限酵素で処理することにより、連結用塩基配列が除去され、かつ連結用塩基配列を介して隣接する所望の塩基配列の連続した一部の塩基配列が、制限酵素で切断された部位同士で連結可能なように配置されており、
オリゴＤＮＡは、全て連結したときに所望の塩基配列を網羅するものである、キット。
［１６］
［１］〜［１４］のいずれかに記載の方法により得られる、ＤＮＡ断片。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、リピート配列、ＧＣ含量の高い塩基配列を含む場合であっても、所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を正確に、かつ効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態に係る製造方法により、目的ＤＮＡ断片を得る原理を説明する図である。
【図２】ＤＮＡ材料の設計の一例を説明するための図である。
【図３】前駆ＤＮＡ断片を得る工程の一例を説明するための図である。
【図４】目的ＤＮＡ断片を得る工程の一例を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１５】
本実施形態に係る製造方法は、２つ以上のＤＮＡ材料をアセンブルして、所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片（目的ＤＮＡ断片）を製造する方法に関する。
【００１６】
本実施形態に係る製造方法は、（１）２つ以上のＤＮＡ材料を連結して、所望の塩基配列の一部と、連結用塩基配列とが交互に並んだ前駆ＤＮＡ断片を得る工程と、（２）前駆ＤＮＡ断片を制限酵素で処理し、連結用塩基配列を除去して所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を得る工程と、を備える。本実施形態に係る製造方法は、前駆ＤＮＡ断片を介して、目的ＤＮＡ断片を製造するものであるため、目的ＤＮＡ断片が、リピート配列、ＧＣ含量の高い塩基配列を含むＤＮＡ断片であっても、正確に、かつ効率的に製造することができる。
【００１７】
前駆ＤＮＡ断片は、２つ以上のＤＮＡ材料を連結することで得られ、所望の塩基配列の連続した一部と、連結用塩基配列とが交互に並んだ塩基配列を有する。連結用塩基配列は、目的ＤＮＡ断片には不要な塩基配列である。前駆ＤＮＡ断片には、制限酵素により認識される塩基配列が、制限酵素により処理して前駆ＤＮＡ断片を切断したときに、連結用塩基配列が除去され、かつ連結用塩基配列を介して隣接する所望の塩基配列の一部が、切断された部位同士で連結可能なように配置されている。
【００１８】
連結用塩基配列の長さは、例えば、２０〜１００塩基対（ｂｐ）であってよく、４０〜１００ｂｐであることが好ましく、６０〜１００ｂｐであることがより好ましい。
【００１９】
前駆ＤＮＡ断片が複数の連結用塩基配列を含む場合、複数の連結用塩基配列は、それぞれ異なる塩基配列を有することが好ましい。
【００２０】
図１は、本実施形態に係る製造方法により、目的ＤＮＡ断片を得る原理を説明する図である。図１中、「１２３４」及び「５６７８」は、制限酵素により認識される塩基配列（認識部位）を示す。また、図１中、「１２３４」は、制限酵素により切断される部位（切断部位）も示す。
【００２１】
図１（Ａ）は、隣接して連結する２つのＤＮＡ材料を模式的に示す図である。ＤＮＡ材料（１）は、目的ＤＮＡ断片の塩基配列の連続した一部の塩基配列（・・・・ｎｎｎｎ１２３４）と、ＤＮＡ材料（２）との連結に使用する連結用塩基配列（ＣＡ５６７８ＴＣＣ・・・８７６５ＴＣ）とを有する。ＤＮＡ材料（２）も同様に、目的ＤＮＡ断片の塩基配列の連続した一部の塩基配列（１２３４ｎｎｎｎ・・・・）と、ＤＮＡ材料（１）との連結に使用する連結用塩基配列（ＣＡ５６７８ＴＣＣ・・・８７６５ＴＣ）とを有する。ＤＮＡ材料（１）とＤＮＡ材料（２）の連結用塩基配列は、目的ＤＮＡ断片には不要な塩基配列であり、かつ互いに重複した同一の塩基配列である。
【００２２】
図１（Ｂ）は、図１（Ａ）に示すＤＮＡ材料（１）とＤＮＡ材料（２）とを５’エキソヌクレアーゼで処理した後の状態を模式的に示す図である。５’エキソヌクレアーゼ処理により、ＤＮＡ材料（１）及びＤＮＡ材料（２）のいずれにも３’末端が突出した一本鎖オーバーハング領域（３’オーバーハング領域）が形成される。ＤＮＡ材料（１）及びＤＮＡ材料（２）の３’オーバーハング領域の塩基配列は、互いに相補配列となっているため、ＤＮＡ材料（１）及びＤＮＡ材料（２）は、３’オーバーハング領域でハイブリダイズすることができる。
【００２３】
なお、図１には、５’エキソヌクレアーゼで処理する態様を記載しているが、ＤＮＡ材料（１）及びＤＮＡ材料（２）を予め３’オーバーハング領域を有するものとして調製することで、５’エキソヌクレアーゼ処理を省略して、図１（Ｂ）の状態から出発することもできる。
【００２４】
図１（Ｃ）は、一実施形態に係る前駆ＤＮＡ断片を示す図である。前駆ＤＮＡ断片は、図１（Ｂ）に示すＤＮＡ材料（１）とＤＮＡ材料（２）とを連結することで得ることができる。連結は、例えば、ＤＮＡ材料（１）及びＤＮＡ材料（２）を３’オーバーハング領域でハイブリダイズさせた後、必要に応じてＤＮＡポリメラーゼでギャップを埋め、ＤＮＡリガーゼでニックを繋ぎ合わせることにより行うことができる。
【００２５】
図１（Ｄ）は、前駆ＤＮＡ断片を制限酵素で処理した後の状態を示す図である。制限酵素で処理することにより、連結用塩基配列が除去され、「１２３４」（目的ＤＮＡ断片の塩基配列である。）の塩基配列を有する粘着末端が生成する。制限酵素は、例えば、「１２３４」の塩基配列を認識し、当該認識部位で前駆ＤＮＡ断片を切断するものであってもよく、「５６７８」の塩基配列を認識し、当該認識部位とは異なる「１２３４」の塩基配列の部位で前駆ＤＮＡ断片を切断するものであってもよい。また、相補的な粘着末端を生じるのであれば、連結用塩基配列の両端の切断に異なる制限酵素を使用してもよい。各種制限酵素の認識部位と切断部位は、本技術分野においてよく知られており、目的ＤＮＡ断片の塩基配列に応じて、使用する制限酵素の種類、及び連結用塩基配列を組み入れる位置等は、適宜設定することができる。
【００２６】
なお、図１（Ｄ）には、粘着末端を生成する態様を示したが、本発明の効果を損なわない限りにおいて、制限酵素は、平滑末端（ブラント・エンド）を生成するものであってもよい。
【００２７】
図１（Ｅ）は、一実施形態に係る目的ＤＮＡ断片を示す図である。目的ＤＮＡ断片は、図１（Ｄ）に示す制限酵素処理断片を連結することで得ることができる。連結は、例えば、両制限酵素処理断片を粘着末端でハイブリダイズさせた後、ＤＮＡリガーゼでニックを繋ぎ合わせることにより行うことができる。
【００２８】
ＤＮＡ材料は、ＤＮＡ材料を連結することにより得られる前駆ＤＮＡ断片が上述した特徴を有するように設計される。一実施形態において、ＤＮＡ材料は、それぞれ、所望の塩基配列の連続した一部の塩基配列（以下、「目的部分配列」ともいう。）と、他のＤＮＡ材料との連結に使用する連結用塩基配列とを含む。ＤＮＡ材料は、全て連結したときに所望の塩基配列を網羅できるように設計される。また、ＤＮＡ材料には、制限酵素により認識される塩基配列が、ＤＮＡ材料の連結後に当該制限酵素で処理することにより、連結用塩基配列が除去され、かつ連結用塩基配列を介して隣接する目的部分配列が、制限酵素で切断された部位同士で連結可能なように配置される。
【００２９】
連結用塩基配列は、ＤＮＡ材料の末端に配置されることが好ましい。ＤＮＡ材料に含まれる連結用塩基配列の長さは、前駆ＤＮＡ断片中の連結用塩基配列の長さと同様であり、例えば、２０〜１００塩基対（ｂｐ）であってよく、４０〜１００ｂｐであることが好ましく、６０〜１００ｂｐであることがより好ましい。隣接して連結する２つのＤＮＡ材料に含まれる連結用塩基配列は、少なくとも一方の連結用塩基配列が、他方の連結用塩基配列の全ての塩基配列と重複していればよく、両者の連結用塩基配列が全て重複していることが好ましい。
【００３０】
また、上述した連結用塩基配列の役割に鑑みて、連結用塩基配列は、ハイブリダイズの特異性が高くなるよう（例えば、適切なＧＣ含量、リピート配列の回避）設計されることが好ましく、また前駆ＤＮＡ断片中に連結用塩基配列が複数存在することになるときは、それぞれが異なる塩基配列を有することが好ましい。
【００３１】
ＤＮＡ材料は、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片である。ＤＮＡ材料となるｄｓＤＮＡ断片は、両端が平滑末端であるｄｓＤＮＡであってもよく、一端又は両端に一本鎖オーバーハング領域を有するｄｓＤＮＡであってもよい。ＤＮＡ材料として、両端が平滑末端であるｄｓＤＮＡを使用する場合は、エキソヌクレアーゼ（３’エキソヌクレアーゼ又は５’エキソヌクレアーゼ）で処理することにより、一本鎖オーバーハング領域を形成することができる。一本鎖オーバーハング領域は、３’末端が突出した一本鎖オーバーハング領域（３’オーバーハング領域）であってもよく、５’末端が突出した一本鎖オーバーハング領域（５’オーバーハング領域）であってもよい。
【００３２】
予め設計した一本鎖オーバーハング領域、及びエキソヌクレアーゼ処理で形成させる一本鎖オーバーハング領域は、連結用塩基配列の一部又は全部を含むものであってよい。隣接して連結する２つのＤＮＡ材料に含まれる連結用塩基配列は重複しているため、これにより、ＤＮＡ材料の一本鎖オーバーハング領域と、隣接して連結する他のＤＮＡ材料の一本鎖オーバーハング領域とがハイブリダイズ可能な塩基配列を含むものとなる。
【００３３】
ＤＮＡ材料は、それぞれ連結用塩基配列に隣接した位置に制限酵素により切断される切断部位を有し、かつ当該制限酵素が認識する塩基配列（認識部位）を含むものであってよい。ＤＮＡ材料に含まれる認識部位は、使用する制限酵素がＤＮＡ材料を切断する部位（切断部位）に応じて、目的部分配列中に含まれていてもよく、連結用塩基配列中に含まれていてもよく、目的部分配列と連結用塩基配列にまたがって含まれていてもよい。また、隣接して連結する２つのＤＮＡ材料は、切断部位が互いにハイブリダイズ可能な塩基配列を含むものであってもよい。
【００３４】
制限酵素は、二本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列を認識し、認識部位内部、又は認識部位とは異なる部位でＤＮＡを切断する酵素である。制限酵素としては、認識する塩基配列、及び切断する部位の特異性が高いことから、ＩＩ型制限酵素を使用することが好ましい。ＩＩ型制限酵素酵素としては、ＩＩＰ型、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、ＩＩＳ型等を挙げることができる。
【００３５】
認識部位内部でＤＮＡを切断する制限酵素としては、例えば、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｐａＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、Ｓａｕ３Ａ及びＴａｑＩを挙げることができる。
【００３６】
認識部位とは異なる部位を切断する制限酵素としては、例えば、表１に記載したＩＩｓ型制限酵素を挙げることができる。
【表１】
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【００３７】
上述のとおり設計されたＤＮＡ材料は、従来公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、設計されたＤＮＡ材料の塩基配列を有するオリゴＤＮＡ、及びその相補配列を有するオリゴＤＮＡを常法に従って合成し、これらをハイブリダイズさせてｄｓオリゴＤＮＡを調製することにより、ＤＮＡ材料を得ることができる。
【００３８】
図２〜図４を参照して、一実施形態に係る製造方法をより具体的に説明する。
【００３９】
図２は、ＤＮＡ材料の設計の一例を説明するための図である。図２中、「１」、「２」、「３」、「４」及び「５」で示す領域は、それぞれ目的ＤＮＡ断片の一部に相当する。目的ＤＮＡ断片は、「１」、「２」、「３」、「４」及び「５」がこの順に連結したＤＮＡ断片に該当する。図２では、それぞれ「１」、「２」、「３」、「４」及び「５」で示す領域に対応する塩基配列を含む、５つのＤＮＡ材料（ＤＮＡ材料（１）〜ＤＮＡ材料（５））を設計している。ＤＮＡ材料（１）は、連結用塩基配列（図２中、「ＢｂｓＩ」で示す領域）をその末端に含む。「ＢｂｓＩ」で示す領域には、ＩＩｓ型制限酵素ＢｂｓＩの認識部位（図２中、下線で示す）が含まれている。また、ＤＮＡ材料（２）には、ＤＮＡ材料（１）と連結する方の末端に「ＢｂｓＩ」で示す領域と同じ塩基配列を有する連結用塩基配列が含まれる。ＤＮＡ材料（１）とＤＮＡ材料（２）は、ＢｂｓＩにより切断される切断部位が、「ＢｂｓＩ」で示す領域（連結用塩基配列）に隣接した位置に存在するように設計されている（図２の塩基配列中、実線で示した部分で切断される）。また、ＢｂｓＩで切断した場合に、ＡＧＧＡからなる粘着末端、及びＴＣＣＴからなる粘着末端が生成するため、ＤＮＡ材料（１）及びＤＮＡ材料（２）は、切断部位が互いにハイブリダイズ可能な塩基配列を含むものである。以下、同様の条件を満たすようにして、連結用塩基配列として、「ＢｓｇＩ」で示す領域（ＩＩｓ型制限酵素ＢｓｇＩの認識部位を含む。）、「ＥａｒＩ」で示す領域（ＩＩｓ型制限酵素ＥａｒＩの認識部位を含む。）、「ＳａｐＩ」で示す領域（ＩＩｓ型制限酵素ＳａｐＩの認識部位を含む。）を設計することができる。
【００４０】
設計したＤＮＡ材料（１）〜ＤＮＡ材料（５）は、例えば、設計されたＤＮＡ材料の塩基配列を有するオリゴＤＮＡ、及びその相補配列を有するオリゴＤＮＡを常法に従って合成し、これらをハイブリダイズさせてｄｓオリゴＤＮＡを調製することにより得ることができる。
【００４１】
上記のように設計及び合成したＤＮＡ材料（１）〜ＤＮＡ材料（５）は、連結用塩基配列が、隣接して連結するＤＮＡ材料とそれぞれ同一の塩基配列を有する。この連結用塩基配列を利用し、例えば、特許文献３に記載のＧｉｂｓｏｎ法等の利用により連結して前駆ＤＮＡ断片を得ることができる。また、市販のＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使用して、ＤＮＡ材料（１）〜ＤＮＡ材料（５）を連結して前駆ＤＮＡ断片を得てもよい。
【００４２】
図３は、前駆ＤＮＡ断片を得る工程の一例を説明するための図である。図３に示すように、まずＤＮＡ材料（１）及びＤＮＡ材料（２）を５’エキソヌクレアーゼで処理する（ステップ１）。これにより、ＤＮＡ材料（１）及びＤＮＡ材料（２）に、互いに相補的な連結用塩基配列を含む、３’オーバーハング領域が形成される。なお、ステップ１は、次ステップで特異的なハイブリダイズを達成するために一本鎖オーバーハング領域を形成させることを目的としている。したがって、図３に示した例では、５’エキソヌクレアーゼで処理しているが、５’エキソヌクレアーゼに代えて３’エキソヌクレアーゼで処理することでも、ステップ１の目的を達成することができる。３’エキソヌクレアーゼで処理した場合は、互いに相補的な連結用塩基配列を含む、５’オーバーハング領域が形成される。
【００４３】
次いで、ＤＮＡ材料（１）及びＤＮＡ材料（２）の３’オーバーハング領域をハイブリダイズさせる（ステップ２）。なお、ステップ１で５’エキソヌクレアーゼに代えて３’エキソヌクレアーゼで処理した場合は、５’オーバーハング領域をハイブリダイズさせることになる。
【００４４】
ハイブリダイズ後、ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、ギャップ（すなわち、５’エキソヌクレアーゼにより消化された連結用塩基配列以外の塩基配列。なお、ステップ１で５’エキソヌクレアーゼに代えて３’エキソヌクレアーゼで処理した場合は、３’エキソヌクレアーゼにより消化された連結用塩基配列以外の塩基配列。）が埋められる（ステップ３）。
【００４５】
次いで、ＤＮＡリガーゼで処理することにより、ニック（すなわち、ホスホジエステル結合が欠如している部分）が繋ぎ合わされ（ステップ４）、前駆ＤＮＡ断片が得られる（ステップ５）。なお、図３には、簡略化のため、ＤＮＡ材料（１）とＤＮＡ材料（２）の連結部分のみを記載しているが、ＤＮＡ材料（１）〜ＤＮＡ材料（５）を全て混在させた状態で、図３に示す工程を実施することもできる。
【００４６】
また、ＤＮＡ材料（１）〜ＤＮＡ材料（５）を合成する際、図３のステップ４で示される状態となるように、一端又は両端に一本鎖オーバーハング領域を有するｄｓオリゴＤＮＡを設計及び合成することで、図３のステップ１〜ステップ３（すなわち、５’エキソヌクレアーゼ処理及びＤＮＡポリメラーゼ処理）を省略することもできる。
【００４７】
ステップ１の５’エキソヌクレアーゼ処理は、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダ  エキソヌクレアーゼ（ラムダファージのＲｅｄＡ）、ＲａｃプロファージのＲｅｃＥ、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く非耐熱性５’エキソヌクレアーゼ、ｄＮＴＰの非存在下でＴ５  ＤＮＡポリメラーゼ等の５’エキソヌクレアーゼにより行うことができる。３’エキソヌクレアーゼ処理は、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ等の３’エキソヌクレアーゼにより行うことができる。５’エキソヌクレアーゼ処理、又は３’エキソヌクレアーゼ処理等により形成される一本鎖オーバーハング領域は、ハイブリダイズのために充分な長さが確保されていることが好ましい。当業者であれば特異的なハイブリダイズを達成するために最適な長さを容易に設定することができる。具体的には、一本鎖オーバーハング領域の長さは、２０〜１００塩基長であってよく、好ましくは４０〜１００塩基長であってよく、更に好ましくは６０〜１００塩基長である。
【００４８】
ステップ２のハイブリダイズは、常法に従って行うことができる。また、ハイブリダイズ時に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、デキストラン等の密集剤を添加することにより、ハイブリダイズを促進することができる。
【００４９】
ステップ３のＤＮＡポリメラーゼ処理は、ハイブリダイズ後に残存する一本鎖ギャップ部分を、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応によって二本鎖化する処理である。使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ等のＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。ＤＮＡポリメラーゼのより具体的な例として、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭポリメラーゼ、ＶＥＮＴＲＴＭポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、９°Ｎｍポリメラーゼ等を挙げることができる。中でも、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭポリメラーゼは、高い正確性を示すので望ましい。
【００５０】
ステップ４のＤＮＡリガーゼ処理は、形成されたニックをＤＮＡリガーゼにより封着する処理である。ＤＮＡリガーゼとしては、例えば、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｔｆｉ  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，  Ｉｎｃ社製）等を挙げることができる。
【００５１】
上記のようにして得られた前駆ＤＮＡ断片は、適切な制限酵素（ここでは、ＩＩｓ型制限酵素ＢｂｓＩ、ＢｓｇＩ、ＥａｒＩ及びＳａｐＩ）で処理することにより、不要配列（連結用塩基配列）が除去され、所望の塩基配列を有する目的ＤＮＡ断片（ここでは、「１」、「２」、「３」、「４」及び「５」がこの順に連結したＤＮＡ断片）を得ることができる。
【００５２】
図４は、目的ＤＮＡ断片を得る工程の一例を説明するための図である。まず、前駆ＤＮＡ断片をＩＩｓ型制限酵素ＢｂｓＩで処理して切断する。ＢｂｓＩの切断部位（２カ所）が互いに相補的な塩基配列を有する粘着末端であるため、これらがハイブリダイズすることにより、前駆ＤＮＡ断片から連結用塩基配列（「ＢｂｓＩ」で示す領域）が除去されたものが得られる。図２及び図４に示した「ＢｂｓＩ」で示す領域の塩基配列からわかるように、ＤＮＡ材料（１）及びＤＮＡ材料（２）は、ＩＩｓ型制限酵素の認識部位を含む連結用塩基配列が回分構造となるように設計されており、かつ認識部位は当該ＩＩｓ型制限酵素で処理したときにＤＮＡ材料（１）及びＤＮＡ材料（２）の内側をそれぞれ切断する向きに配置されている。したがって、認識部位を認識するＩＩｓ型制限酵素で処理することにより、認識部位を含む連結用塩基配列（不要配列）を除去することができる。また、連結用塩基配列である、「ＢｓｇＩ」で示す領域、「ＥａｒＩ」で示す領域、及び「ＳａｐＩ」で示す領域も同様に設計されている（図示せず）。
【００５３】
使用するＩＩｓ型制限酵素種類及び認識部位を適切に設計することで、同一反応容器内で連続的に複数のＩＩｓ型制限酵素で処理して、複数の連結用塩基配列（不要配列）を除去することが可能である。例えば、前駆ＤＮＡ断片中で、目的部分配列を介して隣り合う連結用塩基配列に含まれるＩＩｓ型制限酵素により認識される塩基配列を、それぞれ異なる塩基配列とすること（すなわち、それぞれ異なるＩＩｓ型制限酵素で認識される塩基配列）ができる。
【００５４】
なお、制限酵素処理の最適条件は、制限酵素のメーカー推奨の条件、すなわちメーカー付属のバッファーを使用し、推奨の温度及び時間を挙げることができる。また制限酵素ＢｓｇＩのように必要に応じてＳＡＭを添加することが好ましい。
【００５５】
制限酵素処理により生じたニックは、前駆ＤＮＡ断片の製造の際と同様に、ＤＮＡリガーゼにより封着することができる。
【００５６】
本発明はまた、上述した方法により得られるＤＮＡ断片にも関する。
【００５７】
本発明はまた、上述したＤＮＡ材料をオリゴＤＮＡとして含む、所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を製造するためのキットにも関する。一実施形態に係るキットは、２つ以上のオリゴＤＮＡを含み、オリゴＤＮＡは、それぞれ、所望の塩基配列の連続した一部の塩基配列と、他のＤＮＡ材料との連結に使用する連結用塩基配列とを含み、オリゴＤＮＡには、制限酵素により認識される塩基配列が、オリゴＤＮＡの連結後に当該制限酵素で処理することにより、連結用塩基配列が除去され、かつ連結用塩基配列を介して隣接する所望の塩基配列の連続した一部の塩基配列が、制限酵素で切断された部位同士で連結可能なように配置されており、オリゴＤＮＡは、全て連結したときに所望の塩基配列を網羅するものである。
【００５８】
本実施形態に係るキットは、更に、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及び制限酵素からなる群より選択される少なくとも１種を含むものであってもよい。ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及び制限酵素の好ましい態様は、上述したとおりである。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６０】
〔実施例１：目的ＤＮＡ断片（高ＧＣ含量）の製造〕
クモ糸タンパク質由来の塩基配列を参考にして設計した、配列番号１１で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を以下の方法で製造した。【００６１】
（１）オリゴＤＮＡの設計及び合成
配列番号１〜１０で示される塩基配列を有する計１０種類のオリゴＤＮＡ（以下、単に配列番号１のオリゴＤＮＡ等ともいう。）を設計し、合成した（株式会社ファスマック委託合成）。【００６２】
配列番号１のオリゴＤＮＡ（Ｓｅｇ１  ｓｅａｌ３０  Ｆ）と配列番号２のオリゴＤＮＡ（Ｓｅｇ１  ｓｅａｌ３０  Ｒ）、配列番号３のオリゴＤＮＡ（Ｓｅｇ２  ｓｅａｌ３０  Ｆ）と配列番号４のオリゴＤＮＡ（Ｓｅｇ２  ｓｅａｌ３０  Ｒ）、配列番号５のオリゴＤＮＡ（Ｓｅｇ３  ｓｅａｌ３０  Ｆ）と配列番号６のオリゴＤＮＡ（Ｓｅｇ３  ｓｅａｌ３０  Ｒ）、配列番号７のオリゴＤＮＡ（Ｓｅｇ４  ｓｅａｌ３０  Ｆ）と配列番号８のオリゴＤＮＡ（Ｓｅｇ４  ｓｅａｌ３０  Ｒ）、及び配列番号９のオリゴＤＮＡ（Ｓｅｇ５  ｓｅａｌ３０  Ｆ）と配列番号１０のオリゴＤＮＡ（Ｓｅｇ５  ｓｅａｌ３０  Ｒ）は、それぞれが相補的な塩基配列を有している。【００６３】
配列番号１のオリゴＤＮＡの３’末端の３０塩基対の領域は、配列番号３のオリゴＤＮＡの５’末端の３０塩基対の領域と同一の塩基配列を有しており（連結用塩基配列）、当該連結用塩基配列中には、ＩＩｓ型制限酵素ＢｂｓＩにより認識される塩基配列（５’−ＧＡＡＧＡＣ−３’）が含まれる。
配列番号３のオリゴＤＮＡの３’末端の２８塩基対の領域は、配列番号５のオリゴＤＮＡの５’末端の２８塩基対の領域と同一の塩基配列を有しており（連結用塩基配列）、当該連結用塩基配列中には、ＩＩｓ型制限酵素ＢｓｇＩにより認識される塩基配列（５’−ＧＴＧＣＡＧ−３’）が含まれる。
配列番号５のオリゴＤＮＡの３’末端の３０塩基対の領域は、配列番号７のオリゴＤＮＡの５’末端の３０塩基対の領域と同一の塩基配列を有しており（連結用塩基配列）、当該連結用塩基配列中には、ＩＩｓ型制限酵素ＥａｒＩにより認識される塩基配列（５’−ＣＴＣＴＴＣ−３’）が含まれる。
配列番号７のオリゴＤＮＡの３’末端の３０塩基対の領域は、配列番号９のオリゴＤＮＡの５’末端の３０塩基対の領域と同一の塩基配列を有しており（連結用塩基配列）、当該連結用塩基配列中には、ＩＩｓ型制限酵素ＳａｐＩにより認識される塩基配列（５’−ＧＣＴＣＴＴＣ−３’）が含まれる。
また、ＩＩｓ型制限酵素で切断した後に生じる粘着末端（スティッキー・エンド）は、それぞれ相補的となるような塩基配列を有している。【００６４】
（２）ｄｓオリゴＤＮＡの連結（前駆ＤＮＡ断片の合成）
配列番号１のオリゴＤＮＡと配列番号２のオリゴＤＮＡをハイブリダイズさせ、ｄｓオリゴＤＮＡ（Ｓｅｇ１  ｓｅａｌ３０）を得た。配列番号３のオリゴＤＮＡと配列番号４のオリゴＤＮＡをハイブリダイズさせ、ｄｓオリゴＤＮＡ（Ｓｅｇ２  ｓｅａｌ３０）を得た。配列番号５のオリゴＤＮＡと配列番号６のオリゴＤＮＡをハイブリダイズさせ、ｄｓオリゴＤＮＡ（Ｓｅｇ３  ｓｅａｌ３０）を得た。配列番号７のオリゴＤＮＡと配列番号８のオリゴＤＮＡをハイブリダイズさせ、ｄｓオリゴＤＮＡ（Ｓｅｇ４  ｓｅａｌ３０）を得た。配列番号９のオリゴＤＮＡと配列番号１０のオリゴＤＮＡをハイブリダイズさせ、ｄｓオリゴＤＮＡ（Ｓｅｇ５  ｓｅａｌ３０）を得た。【００６５】
Ｓｅｇ１  ｓｅａｌ３０〜Ｓｅｇ５  ｓｅａｌ３０の５種類のｄｓオリゴＤＮＡをモル濃度｛濃度（ｎｇ／μＬ）／断片の長さ（ｂｐ）｝が当量になるようにそれぞれ混合した。混合液（１０μＬ）に等量のＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を添加し、５０℃で１時間反応させた。すなわち、５’エキソヌクレアーゼにより、各ｄｓオリゴＤＮＡの両端において、３’末端が突出した一本鎖のオーバーハング領域を生成させた。当該オーバーハング領域は、各ｄｓオリゴＤＮＡの連結用塩基配列部分の一部又は全部を含んでおり、相補的な塩基配列を有する他のｄｓオリゴＤＮＡの一本鎖オーバーハング領域とアニーリングする。次いで、ＤＮＡポリメラーゼにより、アニーリングしたｄｓオリゴＤＮＡ断片の間のギャップを埋め、更にＤＮＡリガーゼにより、ニックを繋ぎ合わせて連結し、前駆ＤＮＡ断片を得た。前駆ＤＮＡ断片は、配列番号１で示される塩基配列−配列番号３で示される塩基配列−配列番号５で示される塩基配列−配列番号７で示される塩基配列−配列番号９で示される塩基配列をこの順で繋ぎ、かつ各塩基配列の繋ぎ目において、連結用塩基配列を１つ除外した塩基配列を有する。【００６６】
なお、配列番号１〜１０のオリゴＤＮＡに代えて、配列番号１〜１０のオリゴＤＮＡにおいて、３’末端又は５’末端の約３０ｂｐの連結用塩基配列を欠失させた短いオリゴＤＮＡを使用することにより、ハイブリダイズさせた時点で一本鎖のオーバーハング領域を有するｄｓオリゴＤＮＡを調製することができる。この場合、上記５’エキソヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼでの処理を省くことができ、一本鎖オーバーハング領域のアニーリングに引き続き、ＤＮＡリガーゼで処理してニックを繋ぎ合わせて連結することで、前駆ＤＮＡ断片を得ることができる。【００６７】
得られた前駆ＤＮＡ断片は、ｐＵＣ１９を改良したクローニングベクター（ｌａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒからｌａｃＺの領域を削除し、配列内に含まれるＥａｒＩの認識サイトＣＴＣＴＴＣをＣＴＣＣＴＣに置換した配列を有する）にクローニングした。ＮＥＢ（登録商標）  Ｔｕｒｂｏ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．  ｃｏｌｉコンピテントセル（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製（品番：Ｃ２９８４Ｉ））１００μＬに当該クローニングベクター４μＬを添加し、穏やかに混和した。氷上に１５分間静置後、４２℃で３０秒間ヒートショックを行った。再び氷上に戻して２分間静置後、ＳＯＣ培地（塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ，トリプトン１０ｇ／Ｌ，酵母エキス５ｇ／Ｌ，グルコース４０ｍＭ，硫酸マグネシウム２０ｍＭ，塩化マグネシウム２０ｍＭ）を９００μＬ添加し、３７℃で約３０分間インキュベートした。インキュベート後、５０００ｒｐｍ、３分間の条件で遠心分離した。上清９００μＬを除去し、残液で沈澱画分を再懸濁し、ＬＢ＋ａｍｐプレートに塗布した。３７℃で１２時間培養し、形成されたコロニーについて、下記の方法でコロニーＰＣＲを行った。【００６８】
形成されたコロニーを爪楊枝でピックアップし、９．２μＬの滅菌水、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ（配列番号１２）０．４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ（配列番号１３）０．４μＬ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）１０μＬの入った１．５ｍｌチューブに無菌的に添加した。サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社  Ｖｅｒｉｔｉ）にチューブをセットして下記の条件でＰＣＲを行った。
（ｉ）９８℃で１分間
（ｉｉ）９８℃で１０秒間、５０℃で５秒間、７２℃で２０秒間を３０回繰り返す
（ｉｉｉ）７２℃で２分間【００６９】
ＰＣＲ後、当該増幅されたＤＮＡ断片を用い、下記の方法でシークエンス反応を行うまで、４℃で保存した。
上記増幅ＤＮＡ断片（２００〜６００ｎｇ／μＬ）３μＬに、滅菌水１１μＬ、５×Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ（１０ｐｍｏｌ）１μＬ（配列番号１３）及びＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．社製）１μＬを添加し、（１）９６℃で１分間、（２）９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で４分間を２５回繰り返し、１５℃で保存した。【００７０】
１５℃で保存していたシークエンス反応終了液２０μＬに、１２５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ５μＬ、１００％エタノール  ６０μＬを添加、混合し、暗所で１５分間静置した。静置後、１０，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清をピペットで除去した。沈殿画分に７０％エタノールを６０μＬ添加し、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し上清をピペットで除去した。６５℃インキュベーター中に１０分間静置して乾燥させた。乾燥後、Ｈｉｄｉ  ホルムアミドを２０μＬ添加し、十分に攪拌した。当該攪拌液をシークエンス用９６  ｗｅｌｌプレートに全量添加し、シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製，３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）にセットし、塩基配列を確認した。また、増幅ＤＮＡ断片のサイズをアガロースゲル電気泳動により確認した。その結果、理論サイズ（１９４８ｂｐ）付近にバンドが確認でき、塩基配列も理論配列と一致することが確認できた。【００７１】
（３）制限酵素処理による不要配列（連結用塩基配列）の除去
上記（２）で得た前駆ＤＮＡ断片を含むプラスミドＤＮＡより、不要配列（連結用塩基配列）を以下の方法で除去した。【００７２】
［ＢｂｓＩ処理］
上記（２）で得た前駆ＤＮＡ断片を含むプラスミドＤＮＡ５０μｇに、滅菌水８９０μＬ、Ｃｕｔｓｍａｒｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｊａｐａｎ  Ｉｎｃ．社製，品番：Ｂ７２０４Ｓ）１００μＬ、ＩＩｓ型制限酵素ＢｂｓＩ（５Ｕ／μＬ）を１０μＬ添加し、３７℃で６０分間反応後、６５℃で２０分間処理した。反応液を１５℃に冷却した後、当該反応液１０００μＬに対して１００ｍＭ  ＡＴＰを１０μＬ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（２０００Ｕ／μＬ）を１μＬとなるように添加し、１６℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間処理した。【００７３】
［ＢｓｇＩ処理］
ＢｂｓＩ処理後の処理液を１５℃に冷却した後、当該処理液にＢｓｇＩ（５Ｕ／μＬ）１０μＬ、ＳＡＭ（８０ｍＭ）２．５μＬを添加し、３７℃で６０分間反応後、６５℃で２０分間処理した。反応液を１５℃に冷却した後、当該反応液１０００μＬに対して１００ｍＭ  ＡＴＰを１０μＬ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（２０００Ｕ／μＬ）を１μＬとなるように添加し、１６℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間処理した。【００７４】
［ＥａｒＩ処理］
ＢｂｓＩ及びＢｓｇＩ処理後の処理液を１５℃に冷却した後、当該処理液にＥａｒＩ（２０Ｕ／μＬ）を２．５μＬ添加し、３７℃で６０分間反応後、６５℃で２０分間処理した。反応液を１５℃に冷却した後、当該反応液１０００μＬに対して１００ｍＭ  ＡＴＰを１０μＬ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（２０００Ｕ／μＬ）を１μＬとなるように添加し、１６℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間処理した。【００７５】
［ＳａｐＩ処理］
ＢｂｓＩ、ＢｓｇＩ及びＥａｒＩ処理後の処理液を１５℃に冷却した後、当該処理液にＳａｐＩ（１０Ｕ／μＬ）を５μＬ添加し、３７℃で６０分間反応後、６５℃で２０分間処理した。反応液を１５℃に冷却した後、当該反応液１０００μＬに対して１００ｍＭ  ＡＴＰを１０μＬ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（２０００Ｕ／μＬ）を１μＬとなるように添加し、１６℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間処理した。【００７６】
［精製］
ＢｂｓＩ、ＢｓｇＩ、ＥａｒＩ及びＳａｐＩ処理後の処理液から、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，製品番号Ａ９２８０）を用い、添付のカタログに従って処理し、プラスミドＤＮＡを精製した。【００７７】
［形質転換］
ＮＥＢ（登録商標）  Ｔｕｒｂｏ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．  ｃｏｌｉコンピテントセル（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製（品番：Ｃ２９８４Ｉ））１００μＬに上記回収プラスミドＤＮＡを４μＬ添加し、穏やかに混和した。氷上に１５分間静置後、４２℃で３０秒間ヒートショックを行った。再び氷上に戻して２分間静置後、ＳＯＣ培地を９００μＬ添加し、３７℃で約３０分間インキュベートした。インキュベート後、５０００ｒｐｍ、３分間の条件で遠心分離した。上清９００μＬを除去し、残液で沈澱画分を再懸濁し、ＬＢ＋ａｍｐプレートに塗布した。【００７８】
［プラスミドＤＮＡ抽出］
３７℃で１２時間培養し、形成されたコロニーを爪楊枝でピックアップし、１．５ｍｌのＬＢ＋ａｍｐ液の入ったカルチャーチューブに無菌的に添加した。蓋をして、３７℃、２００ｒｐｍの条件で一晩培養した。培養液を１．５ｍｌチューブに移し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、ＡｃｃｕＰｒｅｐ（登録商標）  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製，（品番：Ｋ３０３０））を用いて、キットに添付のマニュルアルに従ってプラスミドを抽出した。【００７９】
［シークエンス解析］
抽出したプラスミドＤＮＡ（２００〜６００ｎｇ／μＬ）１μＬに、滅菌水１１μＬ、５×Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ（１０ｐｍｏｌ）１μＬ（配列番号１３）及びＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．社製）１μＬを添加し、（１）９６℃で１分間、（２）９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で４分間を２５回繰り返し、１５℃で保存した。【００８０】
１５℃で保存していたシークエンス反応終了液２０μＬに、１２５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ５μＬ、１００％エタノール  ６０μＬを添加、混合し、暗所で１５分間静置した。静置後、１０，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清をピペットで除去した。沈殿画分に７０％エタノールを６０μＬ添加し、上清をピペットで除去した。６５℃インキュベーター中に１０分間静置して乾燥させた。乾燥後、Ｈｉ−ｄｉ  ホルムアミドを２０μＬ添加し、十分に攪拌した。当該攪拌液をシークエンス用９６ｗｅｌｌプレートに全量添加し、シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製，３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）にセットし、配列を確認した。【００８１】
その結果、制限酵素により認識される塩基配列等を含む連結用塩基配列（不要配列）が除去された理論配列（配列番号１１）と一致する塩基配列（所望の塩基配列）を有するＤＮＡ断片が得られたことが確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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