(57)【要約】  臨床検体から、ｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの新たな検出手段の提供。  被検体に対して次の工程（ａ）及び（ｂ）、又は工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を実施し、工程（ｂ）、又は工程（ｂ）及び（ｃ）で検出された被検体をｓｌｏｗ−ＶＩＳＡと判定することを特徴とするｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの検出法。  （ａ）被検体をＢＨＩ液体培地に接種し、３０±２℃で１８±２時間、次いで３７±２℃で１８±２時間培養する工程  （ｂ）工程（ａ）の培養液を、ムピロシン含有又はムピロシン非含有のＢＨＩ培地に接種して４８±２時間培養してＶＣＭのＭＩＣを測定し、ムピロシン含有培地のＶＣＭのＭＩＣがムピロシン非含有培地のＶＣＭのＭＩＣに比べて大きく、かつムピロシン含有培地のＶＣＭのＭＩＣが６μｇ／ｍＬより大きくなっている被検体を検出する工程  （ｃ）工程（ａ）で増殖した被検体をＢＨＩ液体培地に接種して３７±２℃で４８±２時間培養した後、ムピロシン非含有培地で培養してＶＣＭのＭＩＣを測定し、ＶＣＭのＭＩＣが、工程（ｂ）のムピロシン含有培地のＶＣＭのＭＩＣに比べて減少するとともにコロニーを形成する被検体を検出する工程【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体に対して次の工程（ａ）及び（ｂ）、又は工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を実施し、工程（ｂ）、又は工程（ｂ）及び（ｃ）で検出された被検体をｓｌｏｗ−ＶＩＳＡと判定することを特徴とするｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの検出法。
（ａ）被検体をＢＨＩ液体培地に接種し、３０±２℃で１８±２時間、次いで３７±２℃で１８±２時間培養する工程
（ｂ）工程（ａ）の培養液を、ムピロシン含有又はムピロシン非含有のＢＨＩ培地に接種して４８±２時間培養してＶＣＭのＭＩＣを測定し、ムピロシン含有培地のＶＣＭのＭＩＣがムピロシン非含有培地のＶＣＭのＭＩＣに比べて大きく、かつムピロシン含有培地のＶＣＭのＭＩＣが６μｇ／ｍＬより大きくなっている被検体を検出する工程
（ｃ）工程（ａ）で増殖した被検体をＢＨＩ液体培地に接種して３７±２℃で４８±２時間培養した後、ムピロシン非含有培地で培養してＶＣＭのＭＩＣを測定し、ＶＣＭのＭＩＣが、工程（ｂ）のムピロシン含有培地のＶＣＭのＭＩＣに比べて減少するとともにコロニーを形成する被検体を検出する工程
【請求項２】
工程（ｂ）において、被検体を含有するムピロシン非含有培地を、さらに７２±２時間培養し、４８±２時間の培養では見られなかったコロニー形成を確認する請求項１記載のｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの検出法。
【請求項３】
ＶＣＭのＭＩＣの測定が、培地上に配置したストリップの目盛を培養後の阻止円との交差点を判読してＶＣＭのＭＩＣを測定する手段である請求項１又は２記載のｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）薬であるバンコマイシン（ＶＣＭ）が有効でないＶＣＭ耐性菌のうちのｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌感染症に対する抗生物質の効力は確実であるが、薬剤耐性菌の出現が問題となっている。特にＭＲＳＡは院内感染の原因菌であったことから社会問題となった。これに対し、ＭＲＳＡの第一選択薬としてＶＣＭが開発され、耐性菌の問題は解決すると考えられた。【０００３】
しかし、近年、ＶＣＭに耐性のある腸球菌（ＶＲＥ）、ＶＣＭ中間耐性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）（非特許文献１）、ＶＣＭ耐性ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）が報告された。このうち、ＶＩＳＡは、耐性化機構が不明である。また、感染症の再燃が高い頻度が生じるものの、その原因が不明な症例も増加してきた。【０００４】
かかる状況において、本発明者らは、ＶＣＭ耐性菌について種々検討してきたところ、感染症再燃に関与する耐性菌であるｓｌｏｗ−ＶＩＳＡを見出し（非特許文献２）、さらにｓｌｏｗ−ＶＩＳＡ  のＳＮＰｓとトランスクリプトーム、メタボローム解析により、耐性化機序および抗菌剤暴露による変異遺伝子ネットワークを解明した。ｓｌｏｗ−ＶＩＳＡで見いだされた変異は、緊縮応答関連やプリン・ピリミジン合成経路、細胞壁合成系の代謝経路の遺伝子上にあった。特にｒｐｏＢ（ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）遺伝子の変異が、βラクタム系薬剤等の多剤耐性化を引き起こしていたことを証明した（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lancet 350: 1670-1673
【非特許文献２】Antimicrob. Agents Chemother. 58(9): 5024-5035
【非特許文献３】Antimicrob. Agents Chemother. 57(10): 4861-4871
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、感染症の再燃や菌血症に深く関与しているｓｌｏｗ−ＶＩＳＡは、未だ臨床検体から検出されておらず、検出手段の開発が望まれている。
従って、本発明の課題は、臨床検体から、ｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの新たな検出手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、ｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの検出手段について検討してきたところ、増殖の遅いｓｌｏｗ−ＶＩＳＡを、まず低温で培養し、次いで生理的高温で培養するという２段階培養によりｓｌｏｗ−ＶＩＳＡが母集団となる前培養液が得られること、さらにこの前培養液をムピロシン含有培地とムピロシン非含有培地で培養し、ＶＣＭのＭＩＣを測定し、このＭＩＣの変化を測定すれば、ｓｌｏｗ−ＶＩＳＡが短時間の操作で検出できることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔３〕を提供するものである。【０００９】
〔１〕被検体に対して次の工程（ａ）及び（ｂ）、又は工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を実施し、工程（ｂ）、又は工程（ｂ）及び（ｃ）で検出された被検体をｓｌｏｗ−ＶＩＳＡと判定することを特徴とするｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの検出法。
（ａ）被検体をＢＨＩ液体培地に接種し、３０±２℃で１８±２時間、次いで３７±２℃で１８±２時間培養する工程
（ｂ）工程（ａ）の培養液を、ムピロシン含有又はムピロシン非含有のＢＨＩ培地に接種して４８±２時間培養してＶＣＭのＭＩＣを測定し、ムピロシン含有培地のＶＣＭのＭＩＣがムピロシン非含有培地のＶＣＭのＭＩＣに比べて大きく、かつムピロシン含有培地のＶＣＭのＭＩＣが６μｇ／ｍＬより大きくなっている被検体を検出する工程
（ｃ）工程（ａ）で増殖した被検体をＢＨＩ液体培地に接種して３７±２℃で４８±２時間培養した後、ムピロシン非含有培地で培養してＶＣＭのＭＩＣを測定し、このＶＣＭのＭＩＣが、工程（ｂ）のムピロシン含有培地のＶＣＭのＭＩＣに比べて減少するとともにコロニーを形成する被検体を検出する工程
〔２〕工程（ｂ）において、被検体を含有するムピロシン非含有培地を、さらに７２±２時間培養し、４８±２時間の培養では見られなかったコロニー形成を確認する〔１〕記載のｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの検出法。
〔３〕ＶＣＭのＭＩＣの測定が、培地上に配置したストリップの目盛を培養後の阻止円との交差点を判読してＭＩＣを測定する手段である〔１〕又は〔２〕記載のｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの検出法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の検出法によれば、従来臨床検体から検出が不可能であったｓｌｏｗ−ＶＩＳＡが短時間の操作で確実に検出できる。ｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの迅速な診断ができれば、その結果、無駄な抗菌薬の使用が減り、よりよい抗菌薬化学療法と、耐性菌出現の予防と予測が可能になり、抗菌薬耐性菌の出現を制御することが実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ムピロシン０．０３２μｇ／ｍＬの添加によるｓｌｏｗ−ＶＩＳＡのＶＣＭ１６μｇ／ｍＬ含有培地の増殖速度の増加を示す。図中、ＭＵＰはムピロシンを示す。
【図２】ｓｌｏｗ−ＶＩＳＡのＢＨＩ寒天培地によるＶＣＭのＥ−ｔｅｓｔ（μｇ／ｍＬ）の結果を示す。左はムピロシン非含有、右はムピロシン含有の９６時間後の結果を示し、黒矢印は４８時間後を表す。
【図３】ｓｌｏｗ−ＶＩＳＡのＢＨＩ寒天培地によるＶＣＭの拡散ディスク法の結果。バンコマイシン３０μｇ／ｍＬディスク拡散法をムピロシン０．０３２μｇ／ｍＬ含有または薬剤非存在下のＢＨＩ寒天培地で各々実施した。４８時間培養後のｓｌｏｗ−ＶＩＳＡには、ムピロシン０．０３２μｇ／ｍＬ含有のＢＨＩ寒天培地上の阻止円の周りにのみ、小さい無数のコロニーが検出された。パネル上の値は、阻止円の直径の平均と標準偏差を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの検出法は、被検体に対して次の工程（ａ）及び（ｂ）、又は工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を実施し、工程（ｂ）、又は工程（ｂ）及び（ｃ）で検出された被検体をｓｌｏｗ−ＶＩＳＡと判定することを特徴とする。
（ａ）被検体をＢＨＩ液体培地に接種し、３０±２℃で１８±２時間、次いで３７±２℃で１８±２時間培養する工程
（ｂ）工程（ａ）の培養液を、ムピロシン含有又はムピロシン非含有のＢＨＩ培地に接種して４８±２時間培養してＭＩＣを測定し、ムピロシン含有培地のＶＣＭのＭＩＣがムピロシン非含有培地のＶＣＭのＭＩＣに比べて大きく、かつムピロシン含有培地のＶＣＭのＭＩＣが６μｇ／ｍＬより大きくなっている被検体を検出する工程
（ｃ）工程（ａ）で増殖した被検体をＢＨＩ液体培地に接種して３７±２℃で４８±２時間培養した後、ムピロシン非含有培地で培養してＶＣＭのＭＩＣを測定し、このＶＣＭのＭＩＣが、工程（ｂ）のムピロシン含有培地のＶＣＭのＭＩＣに比べて減少するとともにコロニーを形成する被検体を検出する工程
【００１３】
本発明において用いられる被検体は、例えば感染症患者由来の尿、血液、喀痰、膿瘍、鼻腔粘膜内であり、ＭＲＳＡの保菌者やＭＲＳＡの感染起因菌を含有することが疑われる臨床検体で、ＭＲＳＡと特定された検体であるのが好ましい。特に、ＶＣＭで奏功しなかった感染症患者由来の被検体が好ましい。
【００１４】
工程（ａ）に用いられる培地は、ＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン）液体培地であればよく、市販のＢＨＩ液体培地を用いることができる。工程（ａ）では、３０±２℃で１８±２時間、次いで３７±２℃で１８±２時間培養することが特徴である。３７±２℃で１８±２時間培養しても、ｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの増殖が遅く、十分に菌が生えて来ない。まず、３０±２℃で１８±２時間培養した後、さらに３７±２℃で１８±２時間培養してはじめて、ｓｌｏｗ−ＶＩＳＡが母集団を占める前培養液が得られる。被検体のＢＨＩ液体培地への接種量は、１×１０5ｃｅｌｌｓから１×１０6ｃｅｌｌｓが好ましい。
【００１５】
工程（ｂ）では、工程（ａ）の培養液を、ムピロシン含有又はムピロシン非含有のＢＨＩ培地に接種して４８±２時間培養してＶＣＭのＭＩＣ（最小発育濃度）を測定する。
工程（ｂ）で使用されるＢＨＩ培地の組成は、通常のＢＨＩ培地に、ＣＬＳＩ（http://clsi.org）に従って厚さ４ｍｍ±０．５ｍｍに菌の増殖が抑制されない濃度のムピロシンが含まれているのが好ましい。より詳細には、ＢＨＩ培地に、０．００５μｇ／ｍＬから０．０３μｇ／ｍＬのムピロシンが含まれているのが好ましい。また、ＢＨＩ培地としては、ＢＨＩ寒天培地が好ましい。
【００１６】
ＢＨＩ培地中のムピロシン含有量は、菌の増殖を妨げない濃度０．００５〜０．１μｇ／ｍＬが好ましく、０．００５〜０．０３μｇ／ｍＬがより好ましい。ＢＨＩ培地への工程（ａ）の培養液の接種は、約１×１０6ｃｅｌｌｓから１×１０7ｃｅｌｌｓが好ましい。培養は、３７±２℃で４８±２時間行う。
【００１７】
ＶＣＭのＭＩＣの測定は、通常の液体希釈法または寒天希釈法による方法でもよいが、培地上に配置したストリップの目盛を培養後の阻止円との交差点と判読してＭＩＣを測定する手段を採用するのが、ヘテロな集団を判定できるため好ましい。このＭＩＣ測定手段は、Ｅ−ｔｅｓｔ法（登録商標）として広く採用されており、市販のＥ−ｔｅｓｔ法（登録商標）を用いることができる。また、ＶＣＭのＭＩＣの測定は、ディスク拡散法を用いることもできる。また、ＶＣＭのＭＩＣに加えて、セフォキシチンのＭＩＣも測定してもよい。
【００１８】
ムピロシン含有培地のＶＣＭのＭＩＣがムピロシン非含有培地のＶＣＭのＭＩＣに比べて大きく、かつムピロシン含有培地のＶＣＭのＭＩＣが６μｇ／ｍＬより大きくなっている被検体を検出する。この検体は、ｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの疑いと判定できる。また、セフォキシチンのＭＩＣを測定した場合は、セフォキシチンのＭＩＣが８μｇ／ｍＬ以上になっている被検体（ＣＬＳＩでＭＲＳＡの定義に使用されている濃度）を検出する。
【００１９】
さらに、ムピロシン非含有培地をそのまま、７２±２時間培養し、４８±２時間では見られなかったコロニー形成があることを確認すれば、この検体がｓｌｏｗ−ＶＩＳＡであると確認できる。ｓｌｏｗ−ＶＩＳＡは、増殖が遅いため、この手法によりこの検体がｓｌｏｗ−ＶＩＳＡと確認できる。
【００２０】
工程（ｃ）は、工程（ａ）で増殖した被検体を再度新しいＢＨＩ液体培地に接種して３７±２℃で４８±２時間培養した後、ムピロシン非含有培地で培養してＶＣＭのＭＩＣを測定する。
工程（ｃ）で用いるＢＨＩ液体培地ヘ、工程（ａ）で増殖したＢＨＩ液体培地の１×１０5から１×１０6ｃｅｌｌｓを接種するのが好ましい。３７±２℃で４８±２時間培養することによりｓｌｏｗ−ＶＩＳＡが増殖するものと考えられる。この後、ムピロシン非含有ＢＨＩ培地で培養してＶＣＭのＭＩＣを測定する。ＭＩＣの測定は、工程（ｂ）と同様に、培地上に配置したストリップの目盛を培養後の阻止円との交差点を判読してＭＩＣを測定する手段が好ましい。ＭＩＣ測定の培養条件は、３７±２℃で、４８±２時間培養が好ましい。このＭＩＣ測定の培地もＢＨＩ寒天培地が好ましい。
【００２１】
工程（ｃ）では、ＶＣＭのＭＩＣが、工程（ｂ）のＶＣＭ含有培地のＶＣＭのＭＩＣに比べて減少するとともにコロニーを形成する被検体をｓｌｏｗ−ＶＩＳＡと判定する。
【００２２】
本発明方法では、工程（ｂ）単独、又は工程（ｂ）及び（ｃ）で検出された被検体をｓｌｏｗ−ＶＩＳＡと判定することができる。工程（ｂ）及び（ｃ）で検出された被検体をｓｌｏｗ−ＶＩＳＡと判定するのが好ましい。
【００２３】
本発明によれば、工程（ａ）を採用することにより短時間でｓｌｏｗ−ＶＩＳＡが母集団を占める前培養液を得ることができ、工程（ｂ）でムピロシン含有ＢＨＩ培地を用いた培養によりＶＣＭのＭＩＣを測定することにより、ｓｌｏｗ−ＶＩＳＡが選択的に検出できる。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。【００２５】
実施例１
（１）栄研化学のＢＨＩ液体培地４ｍＬに、単一コロニーを接種し、３０±２℃で１８±２時間の静置培養後、３７±２℃で１８±２時間振盪培養した。ここで、用いた単一コロニーは、ＶＣＭの治療が奏功しなかった菌血症患者由来の血液を培養し、市販のＭＲＳＡ選択培地で選択分離された菌株である。【００２６】
薬剤耐性度（ここでは、ＶＩＳＡを同定するＶＣＭと、ＭＲＳＡを同定するβラクタム系薬のセフォキシチン）をＥ−ｔｅｓｔで測定する前に、既存方法では、ＢＨＩ液体培地を用いて３７℃で１夜前培養していた。この方法では、ｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの増殖が遅いため、十分に菌が生えなかった。
また、３７℃で２日培養してみたが、母集団がｓｌｏｗ−ＶＩＳＡにならず、ＶＣＭの耐性度の落ちた増殖の早い菌のみが増え、本来の薬剤耐性度が見られなかった。【００２７】
（２）工程（ａ）で増殖した菌を、吸光度計測器（波長５７８ｎｍ）を使用してＯＤ＝０．３に合わせ、それを１×１０8ｃｅｌｌｓとする。その後、ＣＬＳIの記載どおりに、栄研化学のＢＨＩ寒天培地とムピロシン含有のＢＨＩ寒天培地に塗布し、ＶＣＭとセフォキシチンのＥ−ｔｅｓｔ（ビオメリュー）のストリップを置き、４８時間培養する。４８時間後、セフォキシチンのＭＩＣ≧８μｇ／ｍＬ、ＶＣＭのＭＩＣ＞６μｇ／ｍＬをｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの疑いとする。【００２８】
ｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの耐性化機構には、核酸代謝関連遺伝子の変異が関与していることが多いことを本発明者は見出した。そして、それらの変異遺伝子に関与する緊縮応答を起こすと、さらに耐性が上昇することが推測された。そこで、緊縮応答を起こす薬剤のムピロシンを使い、増殖が抑制されない濃度を添加したＢＨＩ培地でＥ−ｔｅｓｔを行うと、耐性度が上がったが、バンコマイシン感受性株の耐性度は上がらなかった（図１及び図２）。【００２９】
図１（ａ）に、ムピロシン０．０３２μｇ／ｍＬの添加によるｓｌｏｗ−ＶＩＳＡのＶＣＭ１６μｇ／ｍＬ含有培地の増殖速度の増加を示す。図１（ａ）より、ｓｌｏｗ−ＶＩＳＡの増殖を妨げない濃度のムピロシン（この場合０．０３２μｇ／ｍＬ）とＶＣＭ１６μｇ／ｍＬを混合して培養した方が、ムピロシン非含有またはムピロシンの増殖に影響を与える濃度とＶＣＭ８μｇ／ｍＬ両薬剤を加えた液体培地の増殖速度より早く、２４時間でＯＤ＝１以上示す。また、図１（ｂ）より、ＶＩＳＡではムピロシン添加による増殖速度の増加はみられなかった。【００３０】
図２にｓｌｏｗ−ＶＩＳＡ寒天培地によるＶＣＭのＥ−ｔｅｓｔ（μｇ／ｍＬ）の結果を示す。また、図３にｓｏｌｗ−ＶＩＳＡ寒天培地によるＶＣＭのディスク拡散法の結果を示す。【００３１】
（３）工程（ａ）で増殖した被検体を、さらに新しい４ｍＬのＢＨＩ液体培養液に接種して３７±２℃で４８±２時間振盪培養した後、ムピロシン非含有培地で培養し、工程（ｂ）と同様にしてＶＣＭのＭＩＣを測定した。２４時間から４８時間培養後にＭＩＣ≦３μｇ／ｍＬを示しコロニーを形成した場合、その菌はｓｌｏｗ−ＶＩＳＡと特定することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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