(57)【要約】  本発明の課題は、低温での輸送時に安定して細胞シートを輸送することができ、輸送後、簡便に細胞シート包埋剤から細胞シートを回収することができる細胞シート包埋剤、並びに細胞シート含有組成物およびキットを提供することである。本発明によれば、下記式１で示され、かつ分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上であるポリペプチドを含む、細胞シート包埋剤が提供される。式１：  Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ式中、ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸を示し、ｍは２〜１０の整数であり、ｎは３〜１００の整数であり、ＡおよびＢは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
2017170342.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１で示され、かつ分子量分布が下記条件Ｘを満たすポリペプチドを含む、細胞シート包埋剤。
式１：  Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
式中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２〜１０の整数であり、ｎは３〜１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件Ｘ：ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上である。
【請求項２】
ポリペプチドがリコンビナントゼラチンである、請求項１に記載の細胞シート包埋剤。
【請求項３】
ポリペプチドが、下記式２で示されるポリペプチドである、請求項１または２に記載の細胞シート包埋剤。
式２：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）６３］３−Ｇｌｙ
式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【請求項４】
ポリペプチドが、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞シート包埋剤。
【請求項５】
ポリペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞シート包埋剤。
【請求項６】
細胞シートと、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞シート包埋剤とを含み、前記細胞シートが前記細胞シート包埋剤により包埋されている、細胞シート含有組成物。
【請求項７】
細胞シートと、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞シート包埋剤とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子量分布が所定の条件を満たすポリペプチドを含む細胞シート包埋剤に関する。本発明はさらに、上記細胞シート包埋剤を含む細胞シート含有組成物およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多くの再生医療および細胞移植治療が実施されている。特に、細胞を細胞シートとして、細胞のみをシート状にして移植する治療が多く検討されている。個々の細胞を懸濁液として投与することに比べて、細胞シートは構造物として維持されることから、体内での生着が良く有効性が向上するとされている。特許文献１には、臨床への適用に障害となる製造工程由来不純物成分を含まない細胞培養液を用いた製造方法を提供することを目的として、実質的に増殖することなく細胞シートを形成し得る密度の細胞を、有効量の成長因子を含まない細胞培養液中で培養することを含む、細胞シートの製造方法が記載されている。【０００３】
一方、シート状でない個々の細胞については、細胞の支持体となる足場材料と細胞を組み合わせて移植することが検討されている。細胞の支持体となる足場材料としては、遺伝子組換えゼラチンが知られている。特許文献２には、細胞付着を伴う幾つかの用途、例えば、細胞培養作業、および足場依存性細胞の細胞培養を伴う用途、ならびに多様な医療用途にも特に有用な、遺伝子組換えゼラチンが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−８１８２９号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞シートは非常にもろく、輸送時に壊れやすいという問題があり、病院施設等に輸送する際の問題になる。また、病院施設等では、細胞シートの輸送後に、簡便に細胞シートを移植できることが望ましい。細胞シートの移植においては上記の問題を解決することが望まれている。本発明は、低温での輸送時に安定して細胞シートを輸送することができ、輸送後、簡便に細胞シート包埋剤から細胞シートを回収することができる細胞シート包埋剤を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記細胞シート包埋剤を含む細胞シート含有組成物、および上記細胞シート包埋剤を含むキットを提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定の配列を有するポリペプチドであって、分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上であるポリペプチドを含む細胞シート包埋剤によれば、低温での輸送時に安定して細胞シートを輸送することができ、さらに輸送後の細胞シート移植時に、室温において簡便に細胞シート包埋剤から細胞シートを回収することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。本発明によれば以下の発明が提供される。【０００７】
［１］  下記式１で示され、かつ分子量分布が下記条件Ｘを満たすポリペプチドを含む、細胞シート包埋剤。
式１：  Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
式中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２〜１０の整数であり、ｎは３〜１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件Ｘ：ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上である。
［２］  ポリペプチドがリコンビナントゼラチンである、［１］に記載の細胞シート包埋剤。
［３］  ポリペプチドが、下記式２で示されるポリペプチドである、［１］または［２］に記載の細胞シート包埋剤。
式２：  Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）６３］３−Ｇｌｙ
式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
［４］  ポリペプチドが、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列を有する、［１］〜［３］のいずれか一に記載の細胞シート包埋剤。
［５］  ポリペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、［１］〜［４］のいずれか一に記載の細胞シート包埋剤。
［６］  細胞シートと、［１］〜［５］のいずれか一に記載の細胞シート包埋剤とを含み、上記細胞シートが上記細胞シート包埋剤により包埋されている、細胞シート含有組成物。
［７］  細胞シートと、［１］〜［５］のいずれか一に記載の細胞シート包埋剤とを含む、キット。【０００８】
［８］  細胞シートの包埋において使用するための、下記式１で示され、かつ分子量分布が下記条件Ｘを満たすポリペプチド。
式１：  Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
式中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２〜１０の整数であり、ｎは３〜１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件Ｘ：ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上である。
［９］  細胞シート包埋剤の製造のための、下記式１で示され、かつ分子量分布が下記条件Ｘを満たすポリペプチドの使用。
式１：  Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
式中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２〜１０の整数であり、ｎは３〜１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件Ｘ：ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上である。
［１０］  細胞シートを、下記式１で示され、かつ分子量分布が下記条件Ｘを満たすポリペプチドで包埋することを含む、細胞シートの包埋方法。
式１：  Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
式中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２〜１０の整数であり、ｎは３〜１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件Ｘ：ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞シート包埋剤、細胞シート含有組成物およびキットによれば、低温での輸送時に安定して細胞シートを輸送することができ、輸送後、簡便に細胞シート包埋剤から細胞シートを回収することができる
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、リコンビナントゼラチンの分子量分布を示す。
【図２】図２は、天然動物ゼラチンの分子量分布を示す。
【図３】図３は、ＣＢＥ３包埋細胞シートとＣＢＥ３を含まない細胞シートの振とう前および振とう後の形状を示す。
【図４】図４は、振とう前および振とう後のＣＢＥ３包埋細胞シートの染色の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
＜細胞シート包埋剤＞
本発明の細胞シート包埋剤は、下記式１で示され、かつ分子量分布が下記条件Ｘを満たすポリペプチドを含む、細胞シート包埋剤である。
式１：  Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
式中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２〜１０の整数であり、ｎは３〜１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件Ｘ：ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上である。
【００１２】
本明細書で言う細胞シート包埋剤とは、細胞シートを包埋処理することができる物質である。包埋処理とは、細胞シートの表面の一部又は全部に、細胞シート包埋剤を浸漬等により接触させ、次いで細胞シートの表面の一部又は全部を細胞シート包埋剤で被覆する処理である。
【００１３】
［ポリペプチド］
上記式１で示されるポリペプチドは、溶液の状態で（低温度ではない条件）細胞シートを包埋し、温度を低下させることにより、ゲル化し、輸送に適した状態となる。なお、細胞の保存の観点でも、輸送の際には低温とする必要がある。また、本発明においては、ポリペプチドが、条件Ｘ（ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上である）を満たすことにより、低温（４℃）でのゲル化と室温（２５℃）での溶解とがシャープになり、細胞シート移植時に、室温において簡便に、細胞シート包埋剤から細胞シートを回収することが可能になる。
【００１４】
上記の通り、本発明において、ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積は、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上であるが、より好ましくは８５％以上であり、特に好ましくは９０％以上である。
【００１５】
ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Waters社製AQUITY UPLCシステムEmpower2）を使用し、緩衝液には１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ６．８）を用いて測定することができる。
【００１６】
上記式１において、ｍは２〜１０の整数であるが、好ましくは３〜５の整数を示す。
上記式１において、ｎは３〜１００の整数であり、好ましくは１５〜７０の整数であり、より好ましくは５０〜６５の整数である。
【００１７】
本発明で用いる式１で示されるポリペプチドは、分子量分布が上記条件Ｘを満たす限り、リコンビナントポリペプチド、化学合成ポリペプチド、または天然ポリペプチドの何れでもよい。
【００１８】
化学合成ポリペプチドとは、人工的に合成したポリペプチドを意味する。ポリペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ポリペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、並びにアミノ基の保護としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。
【００１９】
ポリペプチドは好ましくは、リコンビナントポリペプチドである。本明細書においては、式１で示されるリコンビナントポリペプチドのことを、リコンビナントゼラチンと称する。リコンビナントゼラチンについては本明細書中において後記する。
【００２０】
本発明で用いるポリペプチドの親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ４）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００２１】
本発明で用いるポリペプチドの「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ吸水性が高くなる。
【００２２】
本発明で用いるポリペプチドは、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標が、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（ＧＲＡＶＹ）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』および『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
本発明で用いるポリペプチドのＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなる。
【００２３】
［リコンビナントゼラチン］
本発明で用いるポリペプチドは、好ましくはリコンビナントゼラチンである。
リコンビナントゼラチンとしては、例えばＥＰ１０１４１７６、米国特許６９９２１７２号、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
【００２４】
リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。
【００２５】
リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ（キロダルトン）以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
【００２６】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、ＸおよびＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。ＸおよびＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。
【００２７】
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンおよびアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が好ましくは５％以上２０％未満であり、より好ましくは５％以上１０％未満である。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
【００２８】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有するものでもよい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列およびＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。
【００２９】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間、好ましくは２５〜６０の間で均一でないことが好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、タンパク質１分子中３〜５０個が好ましく、さらに好ましくは４〜３０個、特に好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。
【００３０】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、より好ましくは少なくとも０．６％であり、さらに好ましくは少なくとも０．８％であり、さらに一層好ましくは少なくとも１．０％であり、特に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、より好ましくは６、さらに好ましくは８、特に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００３１】
リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００３２】
より好ましくは、本発明で用いるポリペプチドは、下記式２で示される。
式２：  Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）６３］３−Ｇｌｙ
式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００３３】
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、またはV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、またはIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウスまたはラットであり、より好ましくはヒトである。
【００３４】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に記載されたように、１質量％ゼラチン溶液をカチオンおよびアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。
【００３５】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
【００３６】
リコンビナントゼラチンは、特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列；または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上）の配列同一性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列：
を有する。
なお、生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。
リコンビナントゼラチンは、最も好ましくは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
【００３７】
本発明における配列同一性は、以下の式で計算される値を指す。
％配列同一性＝［（同一残基数）／（アラインメント長）］×１００
２つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、ＢＬＡＳＴ（(Basic Local Alignment Search Tool)）プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）等を使用して決定することができる。
【００３８】
リコンビナントゼラチンは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するアミノ酸配列を有するものでもよい。
【００３９】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００４０】
リコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
【００４１】
［細胞シート包埋剤の形態］
本発明の細胞シート包埋剤の形態は特に限定されず、式１で示され、かつ分子量分布が条件Ｘを満たすポリペプチドを含む限り、任意の形態とすることができる。例えば、溶液（水溶液など）、懸濁液、粉末、またはゲルなどの何れでもよい。粉末、またはゲル等の場合には使用時に、水などの溶媒に溶解して使用することができる。
【００４２】
本発明の細胞シート包埋剤における上記ポリペプチドの含有量は特に限定されないが、一般的には０．１質量％から１００質量％であり、好ましくは０．５質量％から１００質量％である。
本発明の細胞シート包埋剤を適用する細胞シートについては、本明細書中後記する。
【００４３】
＜細胞シート含有組成物＞
本発明はさらに、細胞シートと、本発明の細胞シート包埋剤とを含み、上記細胞シートが上記細胞シート包埋剤により包埋されている、細胞シート含有組成物に関する。
［細胞シート］
本発明における細胞シートとは、細胞を主成分とするシートを意味する。細胞シートは、細胞が互いに連結してシート状になったものであり、シート形状である限り、その構成は特に限定されず、単層細胞シート、二層以上の細胞で形成されたシート、または三次元培養された細胞で形成されたシートの何れでもよい。
【００４４】
細胞同士は、直接および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも機械的に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞シートを構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも機械的に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。
【００４５】
本発明における細胞シートには、細胞シートを形成し得る任意の細胞が含まれる。細胞の例としては、特に限定されず、心筋細胞、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、線維芽細胞、滑膜細胞、上皮細胞、および内皮細胞などが含まれる。上記の中でも好ましくは、心筋細胞、および骨格筋芽細胞である。細胞としては、細胞シートによる治療が可能な任意の生物に由来する細胞を使用することができる。生物は、特に限定されず、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（サルなど）、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラット、マウスおよびハムスターなどが挙げられる。また、用いる細胞は１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。
【００４６】
細胞シートは、公知の細胞シートの製造方法またはそれに準ずる方法で製造することができる。例えば、細胞を培養皿で培養し、細胞がシート状になったら、シートを培養皿から回収すればよい。上記の通り、細胞シートの製造方法は特に限定されないが、一例としては、特開２０１０−８１８２９号公報に記載の方法により細胞シートを製造することができる。
【００４７】
細胞シートは、典型的には、細胞を培養液に播種する工程、および細胞を培養して細胞シートを形成させる工程により製造される。
【００４８】
細胞の培養は、本技術分野で通常なされている条件で行うことができる。例えば、典型的な培養条件としては、３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。
【００４９】
［細胞シート含有組成物の製造］
上記した細胞シートを本発明の細胞シート包埋剤により包埋することによって、細胞シート含有組成物を製造することができる。包埋の方法は特に限定されないが、細胞シートを含む容器に、本発明の包埋剤（好ましくは溶液）を添加して、低温（例えば、２〜１２℃）で冷却することによって、溶液をゲル化させることができる。上記により、細胞シートが細胞シート包埋剤により包埋されている細胞シート含有組成物を製造することができる。
【００５０】
＜キット＞
本発明によればさらに、上記した細胞シートと、本発明の細胞シート包埋剤とを含む、キットが提供される。細胞シートおよび細胞シート包埋剤の詳細、好ましい態様は本明細書中上記した通りである。キットにはさらに、包埋処理を行うための容器、および取扱説明書などが含まれていてもよい。
【００５１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
（１）リコンビナントゼラチン
リコンビナントゼラチンとして以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造：  ＧＡＰ［（ＧＸＹ）６３］３Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G【００５３】
（２）リコンビナントゼラチンの分子量分布の測定
上記（１）に記載のリコンビナントゼラチンＣＢＥ３（実施例１）について、ゲル浸透クロマトグラフ（ＧＰＣ）を用いて分子量分布の測定を実施した。分子量分布の測定はＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製ＡＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステムＥｍｐｏｗｅｒ２）を使用し、緩衝液には１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ６．８）を用いた。これらを用いてリコンビナントゼラチンの分子量分布の相対性を測定した。【００５４】
その結果を図１に示す。ＣＢＥ３の分子量ピークは２つ存在していた。それら２つのピークについて面積比から全ピーク中の占有率を計算したところ、１つ目のピークが９２．１％、２つ目のピークが７．９％となっていた。このことから、ＣＢＥ３は占有率の高いピークとして、９２％占有する分子量ピークを有することが分かった。【００５５】
（３）天然動物ゼラチンの分子量分布の測定
比較として、天然動物ゼラチン（比較例１）について、上記（２）と同様にＧＰＣを用いて分子量分布の測定を実施した。結果を図２に示す。天然動物ゼラチンの分子量ピークが２つ存在していた。それら２つのピークについて面積比から全ピーク中の占有率を計算したところ、１つ目のピークが４７．６％、２つ目のピークが５２．４％となっていた。このことから、天然動物ゼラチンは占有率の高いピークとして、５２％の分子量ピークを有することが分かった。【００５６】
（４）包埋剤性能試験（ゲル化速度）
細胞シートを輸送する際の包埋剤として使うためには、低温でのゲル化速度が速く、逆に可逆反応である常温下では素早く液体に戻る性能が重要となる。そこで１質量％濃度で、低温でのゲル化速度、常温での液体へ戻る速さを試験した。【００５７】
その結果、実施例１のＣＢＥ３では４℃に移すことで速やかにゲル化し、液の流動性が素早く低下し、完全にゲル化させた試料を２５℃の室温環境下へ移すと、早期に液体へと戻る現象が観察された。
具体的には、ＣＢＥ３では４℃に移すことで４０分後からゲル化が始まり５０分後にはほぼ安定なゲルになった。また、そのゲルは強度があり、手で押してもつぶれることのないゲルであった。そのゲルを２５℃の室温に戻すと、４０分で完全な液体に戻った。【００５８】
一方で、比較例１の天然動物ゼラチンは、４℃に移すことでゲル化は起こるものの、その速度がＣＢＥ３の時よりも緩やかであり遅かった。また、完全にゲル化させた試料を２５℃の室温環境下へ移して、再度液体へ戻る速さを試験した結果、実施例１のＣＢＥ３に比べて比較例１の天然動物ゼラチンは液体に戻るのが遅かった。
具体的には、天然動物ゼラチンでは、４℃に移すことで６０分後からゲル化が始まるが、９０分後でもゆるいゲル状にしかならなかった。その後も強度のあるゲルには移行せず、手で押すと簡単に潰れる程度のゆるいゲル状でとどまった。ゲル状のものを２５℃の室温に戻した場合、天然動物ゼラチンでは完全な液体に戻るまでに、７０分要した。【００５９】
（５）ＣＢＥ３包埋細胞シートの作製
ヒト骨格筋芽細胞６．０×１０７個を２０％（ｖ／ｖ）ヒト血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地  １０ｍＬに懸濁し、１０ｃｍ  ｄｉｓｈ温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）：株式会社セルシード）に播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養して細胞シート化し、室温で剥離させた。室温にて１質量％ＣＢＥ３を含むＨＢＳＳ＋（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１０ｍＬを温度応答性培養皿に添加し，２〜８℃で１時間冷却してゲル化させ、ＣＢＥ３包埋細胞シートを作製した。ＨＢＳＳは、Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの略称である。【００６０】
（６）振動評価
（６−１）
上記（５）で作製したＣＢＥ３包埋細胞シートを卓上シェイカー（ＮＲ−３，タイテック社製）に載せ、回転数１００ｒｐｍ（回転毎分：ｒｏｔａｔｉｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）に設定し２〜８℃で２日間振とうさせた。対照として、１０ｃｍｄｉｓｈ温度応答性培養皿で調製した細胞シートにＣＢＥ３を含まないＨＢＳＳ＋を添加して、同様に振とうさせた。振とう後，ＣＢＥ３包埋細胞シートを室温に静置し、ゲルを融解して細胞シートを回収した。振とう前および振とう後の形状を図３に示す。【００６１】
ＣＢＥ３を含まないＨＢＳＳ＋を添加した場合、振とう後の細胞シートが壊れたのに対し、１質量％ＣＢＥ３を含むＨＢＳＳ＋を用いて細胞シートを包埋した場合、振とう後でも細胞シートが壊れなかった。【００６２】
（６−２）
シート化直後の細胞シートおよび１質量％ＣＢＥ３を含むＨＢＳＳ＋を添加して、振とうさせた後に回収した細胞シートを１０質量％中性緩衝ホルマリンで一晩固定し，パラフィン包埋した。包埋サンプルは薄切して脱パラフィン後，カラッチのヘマトキシリンとエオジンで染色した。結果を図４に示す。【００６３】
１質量％ＣＢＥ３を含むＨＢＳＳ＋を添加して、細胞シートを包埋した場合、振とう後の細胞シートは、内部の細胞が作製時同様に生存しており、十分にその性能を発揮できる細胞シートであることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017170342.tif 000008
2017170342.tif 000009
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