(57)【要約】  細胞傷害性Ｔ細胞療法に用いられる細胞傷害性Ｔ細胞の機能を高めるための手段を提供することを課題とする。CD3ζ細胞外ドメインと、膜貫通領域と、Ｔ細胞活性化のための細胞内シグナルドメインと、を含む、人工Ｔ細胞活性化分子及びそれを利用した治療法などが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD3ζ細胞外ドメインと、膜貫通領域と、Ｔ細胞活性化のための細胞内シグナルドメインと、を含む、人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項２】
膜貫通領域がCD3ζ膜貫通領域である、請求項１に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項３】
細胞内シグナルドメインが、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、請求項１又は２に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項４】
共刺激分子がCD28又は4-1BBである、請求項３に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項５】
共刺激分子の細胞内ドメインが、膜貫通領域の直下に配置される、請求項３又は４に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項６】
細胞内シグナルドメインが、共刺激分子の細胞内ドメインを複数個含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項７】
細胞内シグナルドメインが、共刺激分子の細胞内ドメインに加え、CD3ζの細胞内ドメインを含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子をコードする遺伝子。
【請求項９】
プロモーターと、該プロモーターの制御下にある、請求項８に記載の遺伝子と、を含む発現カセット。
【請求項１０】
検出用遺伝子を更に含む、請求項９に記載の発現カセット。
【請求項１１】
検出用遺伝子が、細胞内ドメインを欠く上皮成長因子受容体遺伝子である、請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の発現カセットを保持するベクター。
【請求項１３】
レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを標的細胞に導入するステップを含む、人工Ｔ細胞活性化分子を発現するＴ細胞の調製方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子を発現したＴ細胞。
【請求項１６】
標的特異性を獲得している、請求項１５に記載のＴ細胞。
【請求項１７】
標的特異性がウイルス特異性である、請求項１６に記載のＴ細胞。
【請求項１８】
標的特異性が腫瘍特異性である、請求項１６に記載のＴ細胞。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のＴ細胞を治療上有効量含む、細胞製剤。
【請求項２０】
請求項１７に記載のＴ細胞を、治療上有効量、ウイルス関連疾患患者に投与するステップを含む、ウイルス関連疾患の治療法。
【請求項２１】
請求項１８に記載のＴ細胞を、治療上有効量、がん患者に投与するステップを含む、がんの治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫療法（特に、細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）療法）に有用な技術に関する。本出願は、２０１６年６月２１日に出願された日本国特許出願第２０１６−１２２９５８号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
細胞傷害性細胞（CTL）表面に形成されるＴ細胞受容体（TCR）複合体はα鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖及びCD3などから構成され、抗原提示細胞（APC）のヒト白血球抗原（HLA）及び提示された標的抗原の複合体を認識する。標的を認識したCTLは活性化してサイトカインを放出し、直接標的を攻撃するとともに、分裂・増殖し、適応免疫の重要な役割を果たす。この免疫反応を応用した治療方法として、ウイルスや悪性腫瘍を標的とした特異的CTLによる免疫療法（CTL療法）の開発が進められている。標的特異性を獲得したCTL（特定のHLAと提示されたペプチドを認識するTCRを発現する）を利用する治療法として、養子免疫療法とＴ細胞受容体遺伝子導入CTL療法がある。前者はペプチドによる刺激により内因性CTLを増幅して利用するものであり、主にウイルス特異的CTL養子免疫療法に応用されている。後者はウイルスベクターなどを用いて特定の標的抗原を認識するＴ細胞受容体複合体のα鎖及びβ鎖を直接CTLに遺伝子導入するものであり、主に腫瘍特異的Ｔ細胞療法に応用されている。【０００３】
上記のウイルス特異的CTL養子免疫療法は実際に臨床応用されている。ベイラー医科大学（Baylor College of Medicine）では第三者ドナー由来のCTLを用いたウイルス特異的CTL養子免疫療法を実施し、サイトメガロウイルス（CMV）感染症、エプスタインバーウイルス（EBV）感染症、及びアデノウイルス（Adv）感染症に対して60%以上の有効率が得られたことを報告している（非特許文献１）。本邦においても、同種造血幹細胞移植後の難治性CMV感染症に対して移植ドナー由来CMV-CTL療法臨床試験が実施された。また、第三者ドナー由来のCTLを用いたCMV-CTL療法の臨床試験が開始された。このように、ウイルス特異的CTL養子免疫療法は臨床応用されつつあるが、その治療効果を高めるためには、ウイルスの種類などを考慮した改良が望まれる。例えば、EBV特異的CTLはその培養に１月半〜２月程度の時間を要すること、頭頚部腫瘍やリンパ腫などのEBV関連腫瘍に対しての有効性は報告されていないことなど、解決すべき課題は多い。【０００４】
Ｔ細胞受容体遺伝子導入CTLを用いた腫瘍特異的Ｔ細胞療法については、様々な腫瘍特異的抗原を標的として開発が進められているものの、有効性や安全性が十分とはいえず、臨床応用可能な治療方法として現在までに確立しているものはない。悪性黒色腫、大腸癌、滑膜平滑筋肉腫、食道癌などの治療を目指し、対応する腫瘍特異的抗原（MART-1、CEA、NY-ESO-1、MAGE-A3、MAGE-A4）を標的とした腫瘍特異的Ｔ細胞が作製され、臨床試験が施行されたが、その有効性は最大で30%程度の部分寛解にとどまっている。有効性を改善するためにTCRの親和性（アフィニティー）を強化したCTL療法（MAGE-A3を標的）も実施されたが、正常組織に発現する同一抗原を認識するOn-Target副反応による致死的な神経毒性や、正常組織の別抗原を認識してしまうOff-Target副反応による致死的心毒性が報告され、臨床試験は中止された（非特許文献２、３）。有効性の改善が必要であるが、標的認識に関わるアフィニティーの改変は安全性に大きな影響を及ぼすことから、別の対策が望まれる。【０００５】
一方、キメラ抗原受容体（Chimeric Antigen Receptor。以下、「CAR」とも呼ぶ）を用いた遺伝子改変Ｔ細胞療法（CAR-T療法）が近年、臨床応用され、華々しい成果を挙げている。例えば、ペンシルベニア大学のグループはマウス由来のCD19単鎖抗体と4-1BBの細胞内ドメインを連結したCARを作製し、化学療法抵抗性慢性リンパ性白血病の末梢血Ｔ細胞に遺伝子導入した。これを患者に投与するとほとんどの場合において寛解が得られるという驚異的な効果を報告している（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Leen AM, Bollard CM, Mendizabal AM, et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 2013;121(26):5113-5123.
【非特許文献２】Morgan RA, Chinnasamy N, Abate-Daga D, et al. Cancer regression and neurological toxicity following anti-MAGE-A3 TCR gene therapy. J Immunother. 2013;36(2):133-151.
【非特許文献３】Linette GP, Stadtmauer EA, Maus MV, et al. Cardiovascular toxicity and titin cross-reactivity of affinity-enhanced T cells in myeloma and melanoma. Blood. 2013;122(6):863-871.
【非特許文献４】Porter DL, Levine BL, Kalos M, Bagg A, June CH. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 2011;365:725-733.
【非特許文献５】Call ME, Wucherpfennig KW. Molecular mechanisms for the assembly of the T cell receptor-CD3 complex. Mol Immunol. 2004;40(18):1295-1305.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
CTL療法に用いる標的抗原特異的CTLには、(1)サイトカイン産生能、(2)細胞傷害活性、(3)細胞増殖能／効果の持続、が必要とされる。しかしながら、過度なサイトカイン産生はInfusion reactionを増加させ、高すぎる細胞傷害活性には正常組織に対する毒性が懸念される。一方、細胞増殖を改善することは、培養に難渋するCTL（EBV特異的CTLなど）の培養を容易にし、臨床上の有用性が高い。また、投与したCTLが生体内で良好に増殖するなどして長期に維持されれば、現在有効性が不十分な腫瘍を標的としたCTL療法（腫瘍特異的Ｔ細胞療法）についても、長期の有効性維持、寛解率改善を期待できる。【０００８】
本発明は、以上の背景の下、CTL療法に用いられるCTLの機能を高めるための手段を提供し、CTL療法の臨床応用及び更なる発展に資することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前述の通り、TCRのアフィニティーを改変することはヒト正常組織に発現する抗原を認識する可能性を高めることから、たとえin vitroの実験及び動物実験の段階で問題がないとしても、ヒトへの応用には適さない可能性が考えられる。この点を打開すべく検討を重ねた結果、本発明者らはTCRの構造及びシグナル伝達のメカニズムに着眼し、TCRのアフィニティーを改変せず、標的抗原特異的CTLの増殖能を改善し得る新たな分子、即ち、人工Ｔ細胞活性化分子（Artificial T cell activating adopter molecule; ATAM）を設計した。CTLは抗原刺激を受け、TCR複合体構成要素の一つである内在性CD3ζ分子が集合し、細胞内に刺激が伝わる（非特許文献５）。設計したATAMはCD3ζ分子の膜貫通領域直下にＴ細胞共刺激分子であるCD28又は4-1BBの細胞内ドメイン（Intracellular domain; ICD）を組込んでおり、TCRのα鎖、β鎖が標的を認識し細胞内にシグナルが伝わると、内在性CD3ζ分子とともにTCR複合体に集合すると考えられる。CTL内部には通常のTCR刺激に加えて、CD28や4-1BBを介した細胞増殖および維持を改善する刺激が伝わり、標的抗原特異的CTLの増殖が改善する。アフィニティーを改変していないため、抗原の認識は既存の標的抗原特異的CTLと変わらず、安全性が担保される。また、ATAMは既存の標的抗原特異的CTLに追加で導入できることから、これまで有効性が限定的であった各種標的抗原特異的CTLの改良に応用できる。TCRのアフィニティーを改変した標的抗原特異的CTLにATAMを導入し、細胞増殖及び維持の改善を図ることも可能である。このように様々な利点が想定されるATAMの有効性を検証すべく各種実験を行ったところ（後述の実施例を参照）、期待を超えるともいえる成果がもたらされた。
以下の発明は主として上記の成果及び考察に基づく。
［１］CD3ζ細胞外ドメインと、膜貫通領域と、Ｔ細胞活性化のための細胞内シグナルドメインと、を含む、人工Ｔ細胞活性化分子。
［２］膜貫通領域がCD3ζ膜貫通領域である、［１］に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
［３］細胞内シグナルドメインが、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、［１］又は［２］に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
［４］共刺激分子がCD28又は4-1BBである、［３］に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
［５］共刺激分子の細胞内ドメインが、膜貫通領域の直下に配置される、［３］又は［４］に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
［６］細胞内シグナルドメインが、共刺激分子の細胞内ドメインを複数個含む、［３］〜［５］のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
［７］細胞内シグナルドメインが、共刺激分子の細胞内ドメインに加え、CD3ζの細胞内ドメインを含む、［３］〜［６］のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
［８］［１］〜［７］のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子をコードする遺伝子。
［９］プロモーターと、該プロモーターの制御下にある、［８］に記載の遺伝子と、を含む発現カセット。
［１０］検出用遺伝子を更に含む、［９］に記載の発現カセット。
［１１］検出用遺伝子が、細胞内ドメインを欠く上皮成長因子受容体遺伝子である、［１０］に記載の発現カセット。
［１２］［９］〜［１１］のいずれか一項に記載の発現カセットを保持するベクター。
［１３］レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、［１２］に記載のベクター。
［１４］［１３］に記載のベクターを標的細胞に導入するステップを含む、人工Ｔ細胞活性化分子を発現するＴ細胞の調製方法。
［１５］［１］〜［７］のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子を発現したＴ細胞。
［１６］標的特異性を獲得している、［１５］に記載のＴ細胞。
［１７］標的特異性がウイルス特異性である、［１６］に記載のＴ細胞。
［１８］標的特異性が腫瘍特異性である、［１６］に記載のＴ細胞。
［１９］［１７］又は［１８］に記載のＴ細胞を治療上有効量含む、細胞製剤。
［２０］［１７］に記載のＴ細胞を、治療上有効量、ウイルス関連疾患患者に投与するステップを含む、ウイルス関連疾患の治療法。
［２１］［１８］に記載のＴ細胞を、治療上有効量、がん患者に投与するステップを含む、がんの治療法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ATAMを用いたCTLの改良。TCRのα鎖、β鎖が標的を認識し細胞内にシグナルが伝わると、内在性CD3ζ分子とともにATAMがTCR複合体に集合する（左）。３種類のATAMを設計した（右）。実施例ではレトロウイルスベクターを用いてATAMを導入した（下）。
【図２】各ATAMの発現用コンストラクトの構造。上段の発現コンストラクト（CD3ζ）は、CD3ζ（細胞外ドメイン（ECD）、膜貫通領域（TM）及び細胞内ドメイン（ICD）を含む）単独で構成されたATAMのコード領域と、GM-CSFレセプターのリーダー配列を付加したtEGFRのコード領域がT2A配列で連結された構造（Hind III配列、コザック（Kozak）配列、CD3ζ、T2A、GM-CSFレセプターのリーダー配列、tEGFR、NotI配列の順で配置されている）を備える。発現コンストラクト（CD3ζ）の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列を配列番号５及び配列番号６に示す。中段の発現コンストラクト（CD3ζ/CD28）は、CD3ζのTMとICDの間にCD28 ICDが組み込まれた構成のATAMのコード領域と、GM-CSFレセプターのリーダー配列を付加したtEGFRのコード領域がT2A配列で連結された構造（Hind III配列、コザック配列、CD3ζECD〜TM、グリシンリンカー配列、CD28 ICD、グリシンリンカー配列、CD3ζICD、T2A、GM-CSFレセプターのリーダー配列、tEGFR、NotI配列の順で配置されている）を備える。発現コンストラクト（CD3ζ/CD28）の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列を配列番号７及び配列番号８に示す。下段の発現コンストラクト（CD3ζ/4-1BB）は、CD3ζのTMとICDの間に4-1BB ICDが組み込まれた構成のATAMのコード領域と、GM-CSFレセプターのリーダー配列を付加したtEGFRのコード領域がT2A配列で連結された構造（Hind III配列、コザック配列、CD3ζECD〜TM、グリシンリンカー配列、4-1BB ICD、グリシンリンカー配列、CD3ζICD、T2A、GM-CSFレセプターのリーダー配列、tEGFR、NotI配列の順で配置されている）を備える。発現コンストラクト（CD3ζ/4-1BB）の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列を配列番号９及び配列番号１０に示す。CD3ζ TMとCD28 ICDの連結、CD28 ICDとCD3ζ ICDの連結、CD3ζ TMと4-1BB ICDの連結、4-1BB ICDDとCD3ζICDの連結にはグリシンリンカーを用いることにした。各発現コンストラクトをレトロウイルスベクターLZRS-pBMNzに組込み、レトロウイルスパッケージング用細胞であるPhoenix-Ampho細胞に導入した。尚、発現コンストラクトに使用した各ドメイン／領域のアミノ酸配列は次の通りである。  CD3ζ（ECD、TM、ICDを含む）：配列番号１２  CD3ζ ECD〜TM：配列番号１３  CD3ζ ICD：配列番号１４  CD28 ICD：配列番号１５  4-1BB ICD：配列番号１６  T2A：配列番号１７  GM-CSFレセプターのリーダー配列が付加されたtEGFR：配列番号１８
【図３】ATAMのCD8陽性Ｔ細胞への遺伝子導入。実験手順を示した（上）。tEGFR陽性画分を分取した（下）。
【図４】ATAMのCD8陽性Ｔ細胞への遺伝子導入。ウエスタンブロットの結果（上）とフローサイトメトリー（FCM）解析の結果（下）を示す。
【図５】CMV特異的CTL（CMV-CTL）へのATAM遺伝子の導入。実験手順を示した。
【図６】ATAM遺伝子導入後CMV-CTL（ATAM-CMV-CTL）のtEGFRを用いた純化。磁気ビーズ分取前後の細胞をFCMで解析した。代表的なドナーでの検出結果を示した。
【図７】ATAM-CMV-CTLの細胞内サイトカイン（IFNγ、IL2）染色。代表的なドナーでの検出結果を示した。No-Tdx：遺伝子導入なし。
【図８】ELISAによるIL-2の測定。3ドナーで測定した。stim：刺激あり、no stim：刺激なし。
【図９】細胞傷害活性（Cr放出試験）。E/T比率は10:1、3:1、1:1、0.3:1とした。標的細胞（K562細胞又はK562-HLA+ペプチド細胞）と4時間培養した。
【図１０】K562-ペプチド刺激によるATAM-CMV-CTLの増殖。実験手順を示した（上）。0日目、7日目及び14日目にK562-ペプチド細胞で刺激し、総細胞数、tetramer陽性細胞数をカウントした（下）。
【図１１】繰り返し刺激を受けたATAM-CMV-CTLのIL2産生能の変化。3ドナーで測定した。
【図１２】ATAM-EBV-CTLの作製とその増殖能の検討。実験手順を示した（上）。LCL-ペプチド細胞で繰り返し刺激し、総細胞数、tetramer陽性細胞数をカウントした（下）。
【図１３】in vivo実験（ATAM+NY-ESO-1 TCR-CTL in vivo治療モデル）の実験シェーマ。
【図１４】in vivo実験の結果。No Tdx：非遺伝子導入CD8陽性T細胞を単回投与（非遺伝子導入群）。tEGFR+NY-ESO-1 TCR：NY-ESO-1 TCR遺伝子と遺伝子導入マーカーtEGFRを遺伝子導入したCD8陽性T細胞を単回投与（tEGFR群）。CD3ζ/4-1BB+NY-ESO-1 TCR：NY-ESO-1 TCR遺伝子とCD3ζ/4-1BBを遺伝子導入したCD8陽性T細胞を単回投与（CD3ζ/4-1BB群）。
【図１５】in vivo実験の結果。３人のドナーから作成した各CTLを用いて３回の独立した実験を行った。n=7〜11（各群）。データは平均±SEMで示した。統計処理はTwo-way ANOVAによる。* p<0.05、** p<0.01、*** p<0.005、**** p<0.001
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．人工Ｔ細胞活性化分子
本発明の第１の局面は人工Ｔ細胞活性化分子（以下、「ATAM」と呼称することがある）に関する。用語「人工」は、Ｔ細胞の内在性分子（即ち、本来的に発現する分子）と本発明のＴ細胞活性化分子（ATAM）を区別する目的で使用される。ATAMはＴ細胞（典型的には細胞傷害性Ｔ細胞（CTL））の増殖能を高めるために用いられる。理論に拘泥する訳ではないが、遺伝子導入等によってATAMを発現することになったCTLでは、TCRが標的を認識して細胞内にシグナルが伝わる際、内在性CD3ζ分子とともにATAMがTCR複合体に集合する。CTL内部には通常のTCR刺激に加えて、ATAMを介したシグナルが伝わりCTLの増殖が改善する。その特有の機能を発揮するため、ATAMは特徴的な構造を備える。具体的には、CD3ζ細胞外ドメイン、膜貫通領域、Ｔ細胞活性化のための細胞内シグナルドメインを備える。
【００１２】
（１）CD3ζ細胞外ドメイン
CD3ζ細胞外ドメインのアミノ酸配列の具体例を配列番号２０に示す。
【００１３】
（２）膜貫通領域
膜貫通領域は、CD3ζ細胞外ドメインと細胞内シグナルドメインの間に介在する。膜貫通領域としては、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD8α、CD3、CD4又は4-1BBなどの膜貫通領域を用いることができる。膜貫通領域は当該分子の方向性を決定し、TCR刺激後の分子の集合の際にこの中のアミノ酸電荷を標的として集合するとされている。当該機能を発揮する限りにおいて、人工的に構築したポリペプチドからなる膜貫通領域を用いることにしてもよい。膜貫通領域の具体例として、CD3ζの膜貫通領域のアミノ酸配列を配列番号２１に示す。
【００１４】
（３）Ｔ細胞活性化のための細胞内シグナルドメイン
細胞内シグナルドメインは、TCR複合体が標的を認識した際にＴ細胞の活性化が生じるのに必要なシグナル（即ち、共刺激シグナル）を伝達する。当該シグナルが細胞増殖及び／又は細胞の維持を促す刺激となり、Ｔ細胞の増殖率／生存率が改善する。この効果が発揮されるように、典型的には、共刺激分子の細胞内ドメインが用いられる。共刺激分子としてCD28、4-1BB（CD137）、CD2、CD4、CD5、CD134、OX-40又はICOSを例示することができる。好ましくは、CD28又は4-1BBの細胞内ドメインを採用する。共刺激分子の細胞内ドメインは、好ましくは上記膜貫通領域の直下に配置される。このように構成すると、膜直下に存在するT細胞の活性化分子のリン酸化などのシグナル増幅効果を期待できる。「直下に配置される」とは、膜貫通領域と共刺激分子の細胞内ドメインとの間に機能的なドメイン（例えば、以下で言及するCD3ζの細胞内ドメイン）が介在しないことを意味する。従って、例えば、リンカーを介して当該二つのドメインが直接連結されている場合も、膜貫通領域の直下に共刺激分子の細胞内ドメインが配置されていることになる。リンカーとしては例えばペプチドリンカーを用いることができる。ペプチドリンカーとは、直鎖状にアミノ酸が連結したペプチドからなるリンカーである。ペプチドリンカーの代表例は、グリシンとセリンから構成されるリンカー（GGSリンカーやGSリンカー）、グリシンから構成されるリンカー（例えばGGGリンカー）である。これらのリンカーを構成するアミノ酸であるグリシンとセリンは、それ自体のサイズが小さく、リンカー内で高次構造が形成されにくい。リンカーの長さは特に限定されない。例えば、アミノ酸残基数が２〜１５個のリンカーを用いることができる。リンカーの長さは好ましくは２〜１０、更に好ましくは３〜５である。
【００１５】
共刺激分子の細胞内ドメインを２個以上（即ち複数個）、細胞内シグナルドメイン内に含めることにしてもよい。当該構成によれば、共刺激シグナルの増強や刺激後の細胞生存を高める効果等を期待できる。共刺激分子の細胞内ドメインの使用数は特に限定されないが、多すぎればATAMの分子サイズが過大となり、その導入及び／又は発現に影響する等の問題が生じ得ることから、例えば２〜５個、好ましくは２〜３個にするとよい。複数個の共刺激分子の細胞内ドメインは通常、直接又はリンカーを介してタンデム状に連結される。尚、２種類以上の共刺激分子の細胞内ドメインを組み合わせることも可能である。
【００１６】
共刺激分子の細胞内ドメインに加え、CD3ζの細胞内ドメインを細胞内シグナルドメイン内に含めることにしてもよい。当該構成によれば、細胞傷害活性の誘導・増強等を期待できる。共刺激分子の細胞内ドメインと、CD3ζの細胞内ドメインは、これらを直接連結しても、これらの間にリンカーを介在させてもよい。リンカーとしては例えばペプチドリンカーを用いることができる。ペプチドリンカーの構造、特徴等は前述の通りである。リンカーの長さは特に限定されない。例えば、アミノ酸残基数が２〜１５個のリンカーを用いることができる。
【００１７】
（４）その他の要素
ATAMの細胞表面への輸送、局在化のためにシグナルペプチドが用いられる。例えば、CD3ζのシグナルペプチド（具体例を配列番号１９示す）を用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
膜貫通領域と細胞内シグナルドメインの間にスペーサードメインを設けることもできる。例えば、前述のペプチドリンカーをスペーサードメインとして用いることができる。
【００１９】
本発明のATAMの構造の具体例を以下に示す。
(1) CD3ζ/CD28 ATAM
N末端側からC末端側に向かって、CD3ζ細胞外ドメイン、CD3ζ膜貫通領域、CD28細胞内ドメイン及びCD3ζ細胞内ドメインが直列的に並ぶ構造を備える。CD3ζ膜貫領域とCD28細胞内ドメイン、CD28細胞内ドメインとCD3ζ細胞内ドメインはグリシンリンカー（GGG）を介して連結されている。当該ATAMのアミノ酸配列（一例）を配列番号１に示す。
(2) CD3ζ/4-1BB ATAM
N末端側からC末端側に向かって、CD3ζ細胞外ドメイン、CD3ζ膜貫通領域、4-1BB細胞内ドメイン及びCD3ζ細胞内ドメインが直列的に並ぶ構造を備える。CD3ζ膜貫通領域と4-1BB細胞内ドメイン、4-1BB細胞内ドメインとCD3ζ細胞内ドメインはグリシンリンカー（GGG）を介して連結されている。当該ATAMのアミノ酸配列（一例）を配列番号３に示す。
【００２０】
尚、典型的な構造を備えるATAMについては、CD3ζに共刺激分子（CD28や4-1BB ICD等）の細胞内ドメインが挿入された構造体として捉えることができる。
【００２１】
２．人工Ｔ細胞活性化分子をコードする遺伝子及びその利用
本発明の第２の局面はATAMをコードする遺伝子（以下、「ATAM遺伝子」と呼称することがある）及びその利用（発現カセット、ベクター、ATAM発現Ｔ細胞の調製方法、ATAM発現Ｔ細胞及びその用途など）に関する。本発明のATAM遺伝子は上記構造のATAMをコードする。従って、それを標的細胞に導入し、発現させることにより、本発明のATAMを細胞表面に発現するＴ細胞が得られる。当該Ｔ細胞は、例えば、ウイルス特異的CTL養子免疫療法又は腫瘍特異的Ｔ細胞療法に用いられる（詳細は後述する）。
【００２２】
ATAM遺伝子は、通常、標的細胞内でのATAMの輸送、局在化のためにシグナルペプチドもコードする（即ち、リーダー配列を含む）。シグナルペプチドとして、例えば、CD3ζのシグナルペプチド（配列の具体例を配列番号１９に示す）、GM-CSFレセプターのシグナルペプチド（配列の具体例を配列番号１１に示す）を用いることができる。このように、典型的には、上記の各ドメイン（CD3ζ細胞外ドメイン、膜貫通領域、Ｔ細胞活性化のための細胞内シグナルドメイン）を含む構造体にシグナルペプチドが付加された前駆体をコードするようにATAM遺伝子を設計、構築する。
【００２３】
本発明のATAM遺伝子の構造の具体例を以下に示す。
(1) CD3ζ/CD28 ATAMをコードするATAM遺伝子
5'末端側から3'末端側に向かって、CD3ζ細胞外ドメインをコードする領域、CD3ζ膜貫通領域をコードする領域、CD28細胞内ドメインをコードする領域及びCD3ζ細胞内ドメインをコードする領域が直列的に並ぶ構造を備える。CD3ζ膜貫通領域をコードする領域とCD28細胞内ドメインをコードする領域の間、CD28細胞内ドメインをコードする領域とCD3ζ細胞内ドメインをコードする領域の間には、それぞれ、グリシンリンカー（GGG）をコードする配列が介在する。当該ATAM遺伝子のヌクレオチド配列（一例）を配列番号２に示す。
(2) CD3ζ/4-1BB ATAMをコードするATAM遺伝子
5'末端側から3'末端側に向かって、CD3ζ細胞外ドメインをコードする領域、CD3ζ膜貫通領域をコードする領域、4-1BB細胞内ドメインをコードする領域及びCD3ζ細胞内ドメインをコードする領域が直列的に並ぶ構造を備える。CD3ζ膜貫通領域をコードする領域と4-1BB細胞内ドメインをコードする領域の間、4-1BB細胞内ドメインをコードする領域とCD3ζ細胞内ドメインをコードする領域の間には、それぞれ、グリシンリンカー（GGG）をコードする配列が介在する。当該ATAM遺伝子のヌクレオチド配列（一例）を配列番号４に示す。
【００２４】
ATAM遺伝子を用い、ATAM発現用の発現カセット（以下、「ATAM発現カセット」とも呼称する）を構築することができる。ATAM発現カセットはプロモーターと、当該プロモーターの制御下にあるATAM遺伝子を含む。プロモーターの制御下となるように、通常、プロモーターの下流にATAM遺伝子を配置する。プロモーターとしては、標的細胞であるＴ細胞で機能するプロモーターが用いられる。構成的プロモーター、Ｔ細胞特異的プロモーター、最小プロモーター等を用いることができる。プロモーターの具体例を挙げると、ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）プロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、SV40ori、レトロウイルスLTP、SRα、EF1α、βアクチンプロモーター、nuclear factor of activated T cells (NFAT)-制御性プロモーターなどである。
【００２５】
ATAM遺伝子の下流には、通常、ポリA付加シグナル配列を配置する。ポリA付加シグナル配列の使用によって転写を終了させる。ポリA付加シグナル配列としては、SV40のポリA付加配列、ウシ由来成長ホルモン遺伝子のポリA付加配列等を用いることができる。
【００２６】
発現カセット内に検出用遺伝子（レポーター遺伝子、細胞又は組織特異的な遺伝子、選択マーカー遺伝子など）、エンハンサー配列、WRPE配列等を含めることにしてもよい。検出用遺伝子は、発現カセットの導入の成否や効率の判定、ATAM遺伝子の発現の検出又は発現効率の判定、ATAM遺伝子が発現した細胞の選択や分取等に利用される。一方、エンハンサー配列の使用によって発現効率の向上が図られる。検出用遺伝子としては、ネオマイシンに対する耐性を付与するneo遺伝子、カナマイシン等に対する耐性を付与するnpt遺伝子（Herrera Estrella、EMBO J. 2（1983）、987-995）やnptII遺伝子（Messing & Vierra．Gene 1 9:259-268(1982)）、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するhph遺伝子（Blochinger & Diggl mann，Mol Cell Bio 4:2929-2931）、メタトレキセートに対する耐性を付与するdhfr遺伝子（Bourouis et al.，EMBO J．2(7)）等（以上、マーカー遺伝子）、ルシフェラーゼ遺伝子（Giacomin、P1. Sci. 116（1996）、59〜72；Scikantha、J. Bact. 178（1996）、121）、β-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子、GFP（Gerdes、FEBS Lett. 389（1996）、44-47）やその改変体（EGFPやd2EGFPなど）等の蛍光タンパク質の遺伝子（以上、レポーター遺伝子）、細胞内ドメインを欠く上皮成長因子受容体（EGFR）遺伝子等の遺伝子を用いることができる。検出用遺伝子は、例えば、バイシストロニック性制御配列（例えば、リボソーム内部認識配列（IRES））や自己開裂ペプチドをコードする配列を介してATAM遺伝子に連結している。自己開裂ペプチドの例はThosea asigna virus由来の2Aペプチド（T2A）であるが、これに限定されるものではない。自己開裂ペプチドとして蹄疫ウイルス（FMDV）由来の2Aペプチド（F2A）、ウマ鼻炎Aウイルス（ERAV）由来の2Aペプチド（E2A）、porcine teschovirus（PTV-1）由来の2Aペプチド（P2A）等が知られている。
【００２７】
ATAM発現カセットは標的細胞への導入のためにベクターに搭載される。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸分子をターゲット（即ちＴ細胞又はその前駆細胞）内へと輸送することができる核酸性分子をいい、形態、由来などは特に限定されるものではない。様々な種類のベクターが利用可能である。好適なベクターの例はウイルスベクターであるが、非ウイルスベクターを用いることもできる。ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法は、ウイルスが細胞へと感染する現象を巧みに利用するものであり、高い遺伝子導入効率が得られる。ウイルスベクターとしてレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が開発されている。この中でレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターではベクターに組み込んだ目的遺伝子が宿主染色体へと組み込まれ、安定かつ長期的な発現が期待できる。各ウイルスベクターは既報の方法に従い又は市販される専用のキットを用いて作製することができる。非ウイルスベクターの例としては、プラスミドベクター、リポソームベクター、正電荷型リポソームベクター（Felgner, P.L., Gadek, T.R., Holm, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7413-7417, 1987）、YACベクター、BACベクターを挙げることができる。トランスポゾン法に利用されるベクターとして本発明のベクターを構築してもよい。
【００２８】
発現カセットを構成する要素の一部（但し、ATAM遺伝子は除く）が、ベクターから供給されてもよい。例えば、プロモーターの制御下にあるクローニングサイトを有するベクターを使用する場合、プロモーターを含まない核酸構築物（ATAM遺伝子と、必要に応じて他の要素を含む）をクローニングサイトに挿入することにより、プロモーターとその制御下にあるATAM遺伝子を含む発現カセットが構築されることになる。
【００２９】
本発明は更に、上記ベクターを利用した、人工Ｔ細胞活性化分子を発現するＴ細胞（ATAM発現Ｔ細胞）の調製方法、及びそれによって得られる細胞も提供する。本発明の調製方法では、上記ベクターを標的細胞に導入する。即ち、上記ベクターで標的細胞を形質転換し、ATAM遺伝子を標的細胞内で発現させる。標的細胞にはＴ細胞又はその前駆細胞（造血幹細胞、リンパ球前駆細胞等）を用いることができる。ここでのＴ細胞として、CD4陰性CD8陽性Ｔ細胞、CD4陽性CD8陰性T細胞、CD4陽性CD8陽性Ｔ細胞、γδT細胞、iPS細胞から調製されたＴ細胞を挙げることができる。上記の如きＴ細胞又は前駆細胞を含むものであれば、様々な細胞集団を用いることができる。末梢血から採取されるPBMC（末梢血単核細胞）は好ましい標的細胞の一つである。生体から採取された細胞集団を継代及び／又は純化することによって得られた細胞集団を標的細胞にすることもできる。尚、特に言及しない限り、本明細書における各種細胞（例えばＴ細胞）はヒト細胞である。
【００３０】
標的細胞の形質転換は常法で行えばよい。例えば、感染（ウイルスベクターを使用する場合）、エレクトロポレーション（Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984)）、リポフェクション（Felgner, P.L. et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1987)）等の方法により形質転換を行うことができる。尚、その操作から明らかな通り、本発明のATAM発現Ｔ細胞は生体外で（ex vivo）調製される。
【００３１】
本発明のATAM発現Ｔ細胞はウイルス特異的CTL養子免疫療法及び腫瘍特異的Ｔ細胞療法に利用され得る。治療効果の発揮に必要な特異的傷害活性を示すようにするため、ATAM遺伝子の導入前又は導入後の細胞に抗原特異性を獲得させる。典型的には、ATAM遺伝子が導入されることになる細胞（Ｔ細胞又はその前駆細胞）、又はATAM遺伝子が導入された細胞（Ｔ細胞又はその前駆細胞）と、抗原を取り込んだ抗原提示細胞とを生体外で接触させる（即ち共培養する）。例えば、PBMCを抗原の存在下で培養すれば、PBMC中に存在する、抗原提示細胞として機能する細胞（樹状細胞、単球、マクロファージ、B細胞）に抗原が取り込まれ、ATAM遺伝子が導入されることになる細胞に対して抗原提示が行われる。このように、抗原のパルス（ローディング）、抗原提示及びそれによる抗原特異性の獲得を実質的に一つ工程として実施することができる。抗原のパルス（ローディング）には、抗原ペプチド（天然型又は組換え型）又は抗原のHLA結合ペプチド（天然型又は組換え型）、或いは腫瘍細胞溶解液を用いることができる。
【００３２】
予め抗原をパルス（ローディング）した抗原提示細胞を用いて上記の接触操作を実施することにしてもよい。例えば、抗原提示細胞として機能する細胞の培養液中にパルス用物質（即ち、抗原ペプチドなど）を添加することなどによって、当該細胞と抗原ペプチド等とを接触させる。
【００３３】
以上の方法に限らず、特定の抗原又はそのHLA結合ペプチドをコードする核酸（mRNA、cDNA）、或いは腫瘍細胞から抽出・単離したtotal RNAパッシブパルス法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクターを利用する方法（Jonuleit H, Schmitt E, Schuler G, et al. J. Exp Med, 192, 1213-22(2000)）などによって細胞内に導入することによっても、抗原のパルス（ローディング）を行うことが可能である。抗原のパルス（ローディング）にmRNAを使用することについては、Saenz-Badillos J, Amin SP, Granstein RD, Exp Dermatol, 10, 143-54(2001）、Sullenger BA, Gilboa E, Nature, 418, 252-8(2002）、Ponsaerts P, Van Tendeloo VF, Berneman ZN, Clin Exp Immunol, 134, 378-84(2003)を参照することができる。尚、腫瘍細胞から抽出・単離したtotal RNAを使用した場合には、多種の腫瘍抗原（その中には未知のものが含まれると期待される）を取り込ませることが可能である（Nair SK, Morse M, Boczkowski D, et al. Ann Surg, 235, 540-9(2002)、Milazzo C, Reichardt VL, Muller MR, et al. Blood, 101, 977-82(2003)、Su Z, Dannull J, Heiser A, et al. Cancer Res, 63, 2127-33(2003)）。
【００３４】
ATAM遺伝子が導入されることになる細胞（Ｔ細胞又はその前駆細胞）、又はATAM遺伝子が導入された細胞（Ｔ細胞又はその前駆細胞）に、腫瘍抗原特異的Tリンパ球からクローニングした腫瘍抗原特異的T細胞受容体遺伝子、または当該遺伝子を改変した遺伝子をレトロウイルスベクター等で導入することにより、抗原特異性を獲得させることもできる。
【００３５】
本発明のATAM発現Ｔ細胞の標的となる抗原はウイルス抗原又は腫瘍抗原である。ウイルス抗原を標的抗原とすれば、ウイルス特異性を獲得した細胞が得られる。一方、腫瘍抗原を標的抗原とした場合には腫瘍特異性を獲得した細胞が得られる。標的特異性を獲得している、本発明のATAM発現Ｔ細胞は、標的抗原の種類に応じて、各種疾患（以下、「標的疾患」と呼ぶ）の治療、予防又は改善に利用され得る。各種ウイルス関連疾患及び各種悪性腫瘍／がんが好適な標的疾患となる。ウイルス関連疾患の例として、ウイルス感染症（CMV感染症、EBV感染症、Adv感染症など）、肝炎、麻疹、HTLV-1、HIVを挙げることができる。同様に、悪性腫瘍／がんの例として、各種B細胞リンパ腫（濾胞性悪性リンパ腫、びまん性悪性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、血管内B細胞性リンパ腫、CD20陽性ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫など）、骨髄増殖性腫瘍、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍（CMML,JMML,CML,MDS/MPN-UC）、骨髄異形成症候群、急性骨髄生白血病、神経芽腫、脳腫瘍、ユーイング肉腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、肺小細胞腫、メラノーマ、卵巣がん、横紋筋肉腫、腎臓がん、膵臓がん、悪性中皮腫、前立腺がん、食道がん、胃がん、大腸がん、ウイルス関連腫瘍（例えば、EBV関連腫瘍である節外性NK細胞リンパ腫（extranodal NK-cell lymphoma; ENKL）やバーキットリンパ腫など）を挙げることができる。「治療」とは、標的疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。「予防」とは、疾病（障害）又はその症状の発症／発現を防止又は遅延すること、或いは発症／発現の危険性を低下させることをいう。一方、「改善」とは、疾病（障害）又はその症状が緩和（軽症化）、好転、寛解、又は治癒（部分的な治癒を含む）することをいう。
【００３６】
「ウイルス抗原」とは、特定のウイルスに特異的なCTLを誘導しうるエピトープペプチドまたはエピトープを含むロングペプチドをいう。ウイルス抗原としては、これらに限定されるものではないが、例えばAdVの抗原ペプチド（例えば、WO 2007015540 A1を参照）、CMVの抗原ペプチド（例えば、特開2002-255997号公報、特開2004-242599号公報、特開2012-87126号公報を参照）、EBVの抗原ペプチド（例えば、WO 2007049737 A1、特願2011-177487号公報、特開2006-188513号公報を参照）、等を用いることができる。ウイルスペプチド抗原は配列情報に基づき常法（例えば液相合成法、固相合成法）で調製することができる。また、ウイルスペプチド抗原の中には市販されているものもある（例えば株式会社医学生物学研究所、タカラバイオ、ミルテニーバイオテックなどが提供する。）
【００３７】
２種類以上の抗原ペプチド（抗原ペプチド混合物）をウイルス抗原として使用することにしてもよい。例えば、AdV抗原ペプチド混合物、CMV抗原ペプチド混合物又はEBV抗原ペプチド混合物、或いはこれら抗原ペプチド混合物の中の二つ以上を組み合わせたもの（例えば、AdV抗原ペプチド混合物、CMV抗原ペプチド混合物及びEBV抗原ペプチド混合物を混合したもの）を用いる。２種類以上の抗原ペプチドを併用することにより、標的（抗原）が異なる複数の活性化Ｔ細胞を得ることができ、本発明のATAM発現Ｔ細胞が有効な治療対象（患者）の増大（カバー率の向上）を望める。尚、AdV抗原ペプチド混合物、CMV抗原ペプチド混合物、EBV抗原ペプチド混合物については市販もされており（例えば、ミルテニーバイオテク社が提供する、PepTivator（登録商標） AdV5 Hexon、PepTivator（登録商標） CMV pp65、PepTivator（登録商標） EBV EBNA-1、PepTivator（登録商標） EBV BZLF1、JPT Peptide Technologies社が提供するPepMixTM Collection HCMV、PepMixTM EBV (EBNA1)等）、容易に入手することができる。
【００３８】
「腫瘍抗原」とはがん化又はがん細胞を特徴付ける抗原である。腫瘍抗原を用いることにより、腫瘍特異的な活性化Ｔ細胞を得ることができる。腫瘍抗原の例を以下に示す。
（１）組織特異的タンパク質：メラノソームタンパク質であるgp100, MART1, TRP1, TRP2, チロシナーゼ（メラノーマ）、CEA（大腸癌）、PSA（前立腺癌）
（２）腫瘍特異的変異ペプチド：β−カテニン、CDK4、MUM-1（メラノーマ）、CASP8（扁平上皮癌）、KIAA0205（膀胱癌）
（３）C-T（Cancer-testis）抗原：MAGE-A1, -A2， -A3. -A4、BAGE、GAGE-1, -2、NY-ESO-1（メラノーマ、各種上皮性癌）
（４）癌遺伝子又は癌抑制遺伝子産物：Her2/neu（乳癌、卵巣癌、肺癌）、p53（扁平上皮癌）、ras（大腸癌、甲状腺癌）
（５）ウイルスタンパク質：HPV16-E7（子宮頸癌）、EBV-EBNA-2,-3,-4,-6、EBV-LMP2（B細胞リンパ腫）
（６）変異HLA：HLA-A2変異（腎臓癌）
（７）その他：GnT-V（メラノーマ）、PRAME（メラノーマ、各種癌、白血病）、SART-1（食道癌、肺腺癌）、ムチンMUC1（乳癌、卵巣癌、膵臓癌）、RAGE（腎臓癌）、WT1ペプチド（各種がん）
【００３９】
標的特異性を獲得しているATAM発現Ｔ細胞を抗原提示細胞と共培養し、更に活性化してもよい。この場合には、原則として、獲得された標的特異性に対応する抗原をパルス（ローディング）した抗原提示細胞を用いる。
【００４０】
また、標的特異性を獲得しているATAM発現Ｔ細胞をその増殖及び／又は活性化を促す条件下で培養することにしてもよい。例えば、IL-2、IL-15、IL-7、IL-21、IL-12、或いはこれらの中な二つ以上の存在下で培養する。IL-2、IL-15、IL-7、IL-21、IL-12等のＴ細胞増殖因子は常法に従って調製することができる。また、市販品を利用することもできる。ヒト以外の動物種のＴ細胞増殖因子の使用を排除するものではないが、通常、Ｔ細胞増殖因子はヒト由来のもの（組換え体であってもよい）を用いる。ヒトIL-2、IL-15、IL-7、IL-21、IL-12等のＴ細胞増殖因子は容易に入手することができる（例えばミルテニーバイオテク社、R＆Dシステムズ社等が提供する）。
【００４１】
血清（ヒト血清、ウシ胎仔血清など）を添加した培地を用いてもよいが、無血清培地を採用することにより、臨床応用する際の安全性が高く、且つ血清ロット間の差による培養効率の違いが出にくいという利点を有する細胞を調製することが可能になる。Ｔ細胞用の無血清培地の具体例はTexMACSTM（ミルテニーバイオテク社）、AIM V（登録商標）（Thermo Fisher Scientific社）である。血清を用いる場合には、自己血清、即ち、本発明のATAM発現Ｔ細胞の投与を受ける患者から採取した血清を用いるとよい。基本培地にはＴ細胞の培養に適したものを用いればよく、具体例を挙げれば、上掲のTexMACSTM、AIM V（登録症商標）である。その他の培養条件は、Ｔ細胞の生存、増殖に適したものであればよく、一般的なものを採用すればよい。例えば、37℃に設定したCO2インキュベーター（CO2濃度5%）内で培養すればよい。
【００４２】
本発明のATAM発現Ｔ細胞を細胞製剤の形態で提供することもできる。本発明の細胞製剤には、本発明のATAM発現Ｔ細胞が治療上有効量含有される。例えば１回の投与用として、104個〜1010個の細胞を含有させる。細胞の保護を目的としてジメチルスルフォキシド（DMSO）や血清アルブミン等、細菌の混入を阻止する目的で抗生物質等、細胞の活性化、増殖又は分化誘導などを目的とした各種の成分（ビタミン類、サイトカイン、成長因子、ステロイド等）等の成分を細胞製剤に含有させてもよい。
【００４３】
本発明のATAM発現Ｔ細胞又は細胞製剤の投与経路は特に限定されない。例えば、静脈内注射、動脈内注射、門脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、又は腹腔内注射によって投与する。全身投与によらず、局所投与することにしてもよい。局所投与として、目的の組織・臓器・器官への直接注入を例示することができる。投与スケジュールは、対象（患者）の性別、年齢、体重、病態などを考慮して作成すればよい。単回投与の他、連続的又は定期的に複数回投与することにしてもよい。尚、自家移植に限らず、同種移植に本発明のATAM発現Ｔ細胞又は細胞製剤を用いることにしてもよい。
【実施例】
【００４４】
１．ATAMの設計及び有効性の検討
CTL療法の改良に有望な分子としてATAM（Artificial T cell activating adopter molecule）を設計した。ATAMの有効性を検証すべく、レトロウイルスベクターを用いてATAMを遺伝子導入マーカーであるtruncated EGFR（tEGFR）とともにレトロウイルスにパッケージし、遺伝子導入を行った（ATAM-CTL）。CMV特異的CTL（CMV-CTL）を誘導する実験系、及びEBV特異的CTL（EBV-CTL）を誘導する実験系でATAM発現CTLの有効性を検討した。【００４５】
（１）ATAM-CTLの設計（図１）
TCRα鎖及びβ鎖が抗原刺激を受けるとATAMはTCR複合体に集合し細胞内にシグナルが伝わる。ATAMの候補として、CD3ζ単独の構造、CD3ζICDにCD28ICDを組み込んだ構造（CD3ζ/CD28）、及びCD3ζICDに4-1BBICDを組み込んだ構造（CD3ζ/4-1BB）を設計した。各々の構造体をコードする遺伝子を遺伝子導入マーカーtEGFRとともにレトロウイルスベクターLZRS-pBMNzに組込み、レトロウイルスパッケージング用細胞であるPhoenix-Ampho細胞に導入し、その後、培養上清を採取してレトロウイルスベクターを得た（図２）。【００４６】
（２）CD8陽性Ｔ細胞へのATAM遺伝子導入
作製したレトロウイルスベクターを用いて遺伝子導入が可能か、また遺伝子導入後にATAMが発現するかどうかを確認するため、健常ドナー末梢血単核球（PBMC）から分離したCD8陽性Ｔ細胞をCD3/CD28ビーズで非特異的に刺激をし、ATAM遺伝子を遺伝子導入した。陰性コントロールとして、遺伝子導入マーカーtEGFRのみを遺伝子導入したCD8陽性Ｔ細胞も作製した。培養開始後3日目に遺伝子導入し、10日目にtEGFRをマーカーに遺伝子発現を確認し、陽性分画を磁気ビーズにて分取した（図３）。各コンストラクトのATAM遺伝子導入細胞は85%〜90%以上の純度で分取された。それらのATAM-CTLの発現をウエスタンブロット及びFCMによる細胞内CD3ζ染色にて確認した。内在性CD3ζと比較し少量であるが、各ATAMはCD8Ｔ細胞において発現していることが確認された（図４）。【００４７】
（３）CMV-CTLへのATAM遺伝子導入
実験手順を図５に示す。PBMCをCMV特異的ペプチドにて刺激し、ATAM-tEGFRレトロウイルスを用いて培養4日目に遺伝子導入を行った。培養開始の翌日より72時間毎にIL2を50 U/ml培養液に加えた。【００４８】
（４）ATAM遺伝子導入後CMV-CTLのtEGFRを用いた純化
培養開始10日目にtEGFRを標的に磁気ビーズで細胞を分取し、ATAM-CMV-CTLを回収した。代表的ドナーにおいて、磁気ビーズ分取前後の細胞をCMV-TCRテトラマー及びtEGFRにて確認した。tEGFR純化後にはリンパ球分画の約90%の細胞がCMV-TCRテトラマー陽性かつATAM遺伝子導入マーカーtEGFR陽性となっている（図６）。【００４９】
（５）ATAM-CMV-CTLの細胞内サイトカイン（IFNγ、IL2）染色
tEGFRを用いた純化の直後、培養開始11日目で細胞機能を測定した。純化後のATAM-CMV-CTLを用いて、ドナーに対応するHLAを遺伝子導入したK562細胞、又は同細胞にCMVペプチド（TPRpeptide）をパルスした細胞（K562-ペプチド細胞）との6時間の共培養を行った後、細胞内サイトカイン（IFNγ及びIL2）染色を行った。代表的なドナーでの検出結果（フローサイトメトリーの結果）を図７に示す。K562-ペプチド細胞に対しては反応が見られたが、K562細胞に対しては、ATAMの遺伝子導入の有無にかかわらず反応は見られなかった。非遺伝子導入細胞（No-Tdx）はtEGFR純化していないためサイトカイン産生は低かったが、遺伝子導入細胞は導入遺伝子の種類（tEGFR又は各ATAM）に関わらず、同等のサイトカイン産生反応を示した。【００５０】
（６）ELISAによるIL2測定
tEGFR純化後のATAM-CMV-CTLを、培養開始12日目よりK562細胞又はK562-ペプチド細胞と共培養し（細胞数1×105。細胞の比率は1:1）、16時間後の培養上清中のIL2をELISA法で定量した。3人の異なるドナー由来細胞を用いて施行した。コントロール及び各ATAMについてK562-ペプチド細胞に対するIL2産生は同等であった（図８）。K562細胞に対しては全てのCTLでIL2の産生を認めなかった。【００５１】
（７）ATAM-CMV-CTLの細胞傷害活性
tEGFR純化後のATAM-CMV-CTLを用い、K562細胞又はK562-ペプチド細胞を標的として標準的クロム放出試験を行った。K562-ペプチド細胞に対する細胞傷害活性は各ATAM-CMV-CTLで同等であった（図９左）。K562細胞に対しては、全てのATAM-CMV-CTLで細胞傷害活性が有意に減弱した（図９右）。尚、各ATAM-CMV-CTL間で細胞傷害活性は同等であった。【００５２】
（８）K562-ペプチド細胞刺激によるATAM-CMV-CTLの増殖
tEGFR純化後のATAM-CMV-CTLをK562-ペプチド細胞で刺激した後（細胞数1×105。細胞比率は1:1）、全細胞数及びCMV tetramer陽性細胞数を測定することで細胞増殖効果を確認した。0日目、7日目及び14日目に上記刺激を繰り返した場合の結果を図１０に示す。CD3ζ/4-1BB-CMV-CTLは7日目以降良好な増殖を示し、細胞は最も長期に維持された。CD3ζ/CD28-CMV-CTLにも、細胞増殖能の向上が認められた。【００５３】
（９）繰り返し刺激を受けたATAM-CMV-CTLのIL2産生能の変化
K562-ペプチド細胞で刺激したATAM-CMV-CTL（0日目、7日目及び14日目）を用い、（６）の実験と同様の方法で各日にELISA法でIL2を測定した。7日目以降では各ATAM-CMV-CTLのIL2産生は同等に低値であった（図１１）。【００５４】
（１０）EBV-CTLへの導入
次に、ATAMの汎用性を検証するために、EBV特異的CTL（EBV-CTL）にATAM遺伝子を導入し、細胞の増殖能を確認した。実験方法はCMV-CTLにATAM遺伝子を導入する場合に準じた。但し、LCL細胞にEBVペプチドをパルスしたLCL-ペプチド細胞を用い、7日毎に繰り返し刺激した（図１２）。図１２に総細胞数（下段左）とtetramer陽性細胞数（下段右）の測定結果を示す。CD3ζ/4-1BBを遺伝子導入したEBV-CTLは良好な増殖を示した。【００５５】
＜まとめ＞
3種類のATAM（CD3ζ、CD3ζ/CD28、CD3ζ/4-1BB）を設計し、それらを発現する細胞（ATAM発現Ｔ細胞）の作製に成功した。また、CMV特異的CTLにATAMを発現させることにも成功した。4-1BB ICDを組み込んだATAMを導入したCMV-CTLは繰り返し刺激後の増殖が有意に良好であることを複数ドナーで確認した。CD28 ICDを組み込んだATAMにも細胞増殖能の向上が認められた。特筆すべきことは、ATAMの導入によってCTLの細胞傷害活性及びサイトカイン産生能が影響を受けなかったことである。また、非標的に細胞に対する細胞傷害活性とサイトカイン産生も認められず、ATAMの導入によってCTLの本来の機能が影響を受けないことが示された。一方、ATAMの導入によってEBV-CTLの増殖能も向上し、ATAMが汎用性に優れていることが裏づけられた。【００５６】
以上の実験結果が示すように、ATAMには従来の方法に比較して以下の利点がある。
(a) TCRのアフィニティーを改変することなく、TCR-CTLの機能を改善することができる。従って、正常組織にも微量に発現する標的や交叉抗原を認識してしまう危険性が低く、安全性が確保される。
(b) 細胞傷害活性やサイトカイン産生を変化させないため、生体内での急性期の副作用は増加しないと予想される。細胞増殖／細胞の維持を改善できることから、現在の方法では培養が困難、或いは培養に長時間を要するTCR-CTLを早期に調製可能となり、速やかに患者への投与が可能となる。また、細胞投与後、即ち、生体内でも増殖率の向上やより長期の細胞の維持を期待でき、現在有効性が極めて限定的な悪性腫瘍に対するTCR-CTLの効果を改善し得る。
(c) ウイルス特異的CTL養子免疫療法及び腫瘍特異的Ｔ細胞療法の両方に応用できる。即ち、汎用性に優れ、その利用価値は極めて高い。【００５７】
２．ATAMの有効性の検討（in vivo治療モデル）
（１）ATAM+NY-ESO-1 TCR-CTL in vivo治療モデルの作成（実験シェーマ、図１３）
ATAM遺伝子導入によるTCR-CTL療法に対する効果を確認するためin vivoモデルを作成した。CMV-CTLの実験で最も優れた結果を示したCD3ζ/4-1BBを用いた。NOD/Shi scid IL2Rγ knockout (NOG)マウスに、骨髄腫腫瘍細胞株U266を生着させ、in vivoの疾患モデルを作成した。U266にはレンチウイルスベクターにてルシフェリン発現遺伝子を導入しており、ルシフェリンをマウス腹腔内に注射することでU266細胞が発光する。0日目に1.5GyのX線を照射し、1日目にマウス尾静脈から2×106のU266細胞を静注した。21日目にルシフェリン発光を確認し、22日目に各マウスに2×106のCD8陽性T細胞を尾静脈より静脈注射にて投与した。投与したT細胞は、同一ドナー由来ヒトCD8陽性T細胞から調製した以下の３群である。
非遺伝子導入CD8陽性T細胞（No Tdx）：非遺伝子導入群
NY-ESO-1 TCR遺伝子と遺伝子導入マーカーtEGFRを遺伝子導入したCD8陽性T細胞（tEGFR+NY-ESO-1 TCR）：tEGFR群
NY-ESO-1 TCR遺伝子とCD3ζ/4-1BBを遺伝子導入したCD8陽性T細胞（CD3ζ/4-1BB+NY-ESO-1 TCR）：CD3ζ/4-1BB群
以降７日毎にルシフェリン腹腔内注射を行いU266細胞株の増殖を確認することでCD8T細胞による治療効果を評価した。【００５８】
（２）ATAM+NY-ESO-1 TCR-CTL in vivo治療モデルの実験結果（代表例、図１４）
前述のシェーマで示した実験結果の代表例を示す。ドナー２のCD3ζ/4-1BB群のうち１匹のマウスはT細胞静注直後に偶発的に死亡した。NY-ESO-1 TCR CTLを静注されたマウス（tEGFR群、CD3ζ/4-1BB群）のルシフェリン発光は低下した。特にCD3ζ/4-1BB+NY-ESO-1 TCR CTLを静注されたマウス（CD3ζ/4-1BB群）は比較的少量のCTL静注にもかかわらず、ルシフェリン発光が高度に低下し、経時的に発光の再燃が抑制された。NY-ESO-1 TCRを遺伝子導入されていないCD8陽性T細胞を静注されたマウス（非遺伝子導入群）のルシフェリン発光は抑制されず、一部のマウスはU266の増殖による衰弱で49日目の時点で死亡が確認された。【００５９】
（３）ATAM+NY-ESO-1 TCR-CTL in vivo 治療モデルの実験結果（腫瘍量変化、図１５）
前述の実験の複数ドナーからの結果を定量する。ルシフェリン発光を経時的に定量した。腫瘍量は、マウス全身のルシフェリン発光を合計し定量した。NY-ESO-1 TCR CTLを静注されたマウス（tEGFR群、CD3ζ/4-1BB群）は早期からルシフェリン発光が低下した。特にCD3ζ/4-1BB+NY-ESO-1 TCR CTLを静注されたマウス（CD3ζ/4-1BB群）では発光量は著明に低下し、49日目に及んでも有意に発光量の低下が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は標的特異的細胞傷害性Ｔ細胞の改善に有用である。本発明はウイルス特異的CTL養子免疫療法及び腫瘍特異的Ｔ細胞療法の両方に応用できるものであり、これらの免疫療法の臨床応用ないし発展に大きな貢献が期待できる。【００６１】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【配列表フリーテキスト】
【００６２】
配列番号１：人工配列の説明：CD3ζ/CD28 ATAM
配列番号２：人工配列の説明：CD3ζ/CD28 ATAM
配列番号３：人工配列の説明：CD3ζ/4-1BB ATAM
配列番号４：人工配列の説明：CD3ζ/4-1BB ATAM
配列番号５：人工配列の説明：CD3ζATAM発現コンストラクト
配列番号６：人工配列の説明：CD3ζATAM発現コンストラクト
配列番号７：人工配列の説明：CD3ζ/CD28 ATAM発現コンストラクト
配列番号８：人工配列の説明：CD3ζ/CD28 ATAM発現コンストラクト
配列番号９：人工配列の説明：CD3ζ/4-1BB ATAM発現コンストラクト
配列番号１０：人工配列の説明：CD3ζ/4-1BB ATAM発現コンストラクト
配列番号１８：人工配列の説明：GM-CSFレセプターのリーダー配列を付加したtEGFR
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年10月4日(2017.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３ζ細胞外ドメインと、膜貫通領域と、Ｔ細胞活性化のための細胞内シグナルドメインと、を含む、人工Ｔ細胞活性化分子であって、
細胞内シグナルドメインが、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項２】
膜貫通領域がＣＤ３ζ膜貫通領域である、請求項１に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
共刺激分子がＣＤ２８又は４−１ＢＢである、請求項１又は２に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項５】
共刺激分子の細胞内ドメインが、膜貫通領域の直下に配置される、請求項１、２、４のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項６】
細胞内シグナルドメインが、共刺激分子の細胞内ドメインを複数個含む、請求項１、２、４、５のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項７】
細胞内シグナルドメインが、共刺激分子の細胞内ドメインに加え、ＣＤ３ζの細胞内ドメインを含む、請求項１、２、４〜６のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項８】
請求項１、２、４〜７のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子をコードする遺伝子。
【請求項９】
プロモーターと、該プロモーターの制御下にある、請求項８に記載の遺伝子と、を含む発現カセット。
【請求項１０】
検出用遺伝子を更に含む、請求項９に記載の発現カセット。
【請求項１１】
検出用遺伝子が、細胞内ドメインを欠く上皮成長因子受容体遺伝子である、請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の発現カセットを保持するベクター。
【請求項１３】
レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを標的細胞に導入するステップを含む、人工Ｔ細胞活性化分子を発現するＴ細胞の調製方法。
【請求項１５】
請求項１、２、４〜７のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子を発現したＴ細胞。
【請求項１６】
標的特異性を獲得している、請求項１５に記載のＴ細胞。
【請求項１７】
標的特異性がウイルス特異性である、請求項１６に記載のＴ細胞。
【請求項１８】
標的特異性が腫瘍特異性である、請求項１６に記載のＴ細胞。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のＴ細胞を治療上有効量含む、細胞製剤。
【請求項２０】
請求項１７に記載のＴ細胞を、治療上有効量、ウイルス関連疾患患者に投与するステップを含む、ウイルス関連疾患の治療法。
【請求項２１】
請求項１８に記載のＴ細胞を、治療上有効量、がん患者に投与するステップを含む、がんの治療法。
【請求項２２】
細胞傷害性Ｔ細胞の増殖能を高めるために用いられる、請求項１、２、４〜７のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項２３】
Ｔ細胞受容体のアフィニティーを改変せずに、細胞傷害性Ｔ細胞の増殖能が高められる、請求項２２に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項２４】
標的の認識に必要な構造を有しない、請求項１、２、４〜７、２２、２３のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月20日(2017.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３ζ細胞外ドメインと、膜貫通領域と、Ｔ細胞活性化のための細胞内シグナルドメインと、を含み、且つ標的の認識に必要な構造を有しない、人工Ｔ細胞活性化分子であって、
細胞内シグナルドメインが、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項２】
膜貫通領域がＣＤ３ζ膜貫通領域である、請求項１に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
共刺激分子がＣＤ２８又は４−１ＢＢである、請求項１又は２に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項５】
共刺激分子の細胞内ドメインが、膜貫通領域の直下に配置される、請求項１、２、４のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項６】
細胞内シグナルドメインが、共刺激分子の細胞内ドメインを複数個含む、請求項１、２、４、５のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項７】
細胞内シグナルドメインが、共刺激分子の細胞内ドメインに加え、ＣＤ３ζの細胞内ドメインを含む、請求項１、２、４〜６のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項８】
請求項１、２、４〜７のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子をコードする遺伝子。
【請求項９】
プロモーターと、該プロモーターの制御下にある、請求項８に記載の遺伝子と、を含む発現カセット。
【請求項１０】
検出用遺伝子を更に含む、請求項９に記載の発現カセット。
【請求項１１】
検出用遺伝子が、細胞内ドメインを欠く上皮成長因子受容体遺伝子である、請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の発現カセットを保持するベクター。
【請求項１３】
レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを標的細胞に導入するステップを含む、人工Ｔ細胞活性化分子を発現するＴ細胞の調製方法。
【請求項１５】
請求項１、２、４〜７のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子を発現したＴ細胞。
【請求項１６】
標的特異性を獲得している、請求項１５に記載のＴ細胞。
【請求項１７】
標的特異性がウイルス特異性である、請求項１６に記載のＴ細胞。
【請求項１８】
標的特異性が腫瘍特異性である、請求項１６に記載のＴ細胞。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のＴ細胞を治療上有効量含む、細胞製剤。
【請求項２０】
請求項１７に記載のＴ細胞を、治療上有効量、ウイルス関連疾患患者に投与するステップを含む、ウイルス関連疾患の治療法。
【請求項２１】
請求項１８に記載のＴ細胞を、治療上有効量、がん患者に投与するステップを含む、がんの治療法。
【請求項２２】
細胞傷害性Ｔ細胞の増殖能を高めるために用いられる、請求項１、２、４〜７のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【請求項２３】
Ｔ細胞受容体のアフィニティーを改変せずに、細胞傷害性Ｔ細胞の増殖能が高められる、請求項２２に記載の人工Ｔ細胞活性化分子。
【国際調査報告】
2017221850.tif 000017
2017221850.tif 000018
2017221850.tif 000019
2017221850.tif 000020