(57)【要約】  本発明は、血中循環癌細胞を検出する方法であって、フィルター上に血液試料中の細胞を捕捉する工程と、細胞が捕捉されたフィルターに、第一の蛍光色素で標識された、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体を接触させる工程と、細胞が捕捉されたフィルターに、動物血清、界面活性剤、及び第二の蛍光色素で標識された、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体を接触させる工程と、細胞が捕捉されたフィルターに核酸を染色する第三の蛍光色素を接触させる工程と、フィルター上に捕捉された各細胞から発せられる蛍光を検出する工程と、を備える方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料中の血中循環癌細胞を検出する方法であって、
（ａ）血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉する工程と、
（ｂ）細胞が捕捉されたフィルターに、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程と、
（ｃ）細胞が捕捉されたフィルターに、
（ｃ１）動物血清、
（ｃ２）界面活性剤、及び
（ｃ３）上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体、
を同時に又は任意の順に接触させる工程と、
（ｄ）細胞が捕捉されたフィルターに、核酸を染色する第三の蛍光色素を接触させる工程と、
（ｅ）細胞が捕捉されたフィルターに、第一、第二及び第三の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、フィルター上に捕捉された各細胞から発せられる第一、第二及び第三の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出する工程と、を備え、
工程（ｄ）が、工程（ａ）と工程（ｅ）との間の任意の段階で行われる、
方法。
【請求項２】
血液試料中の血中循環癌細胞を検出する方法であって、
（ａ）血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉する工程と、
（ｂ）細胞が捕捉されたフィルターに、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、
（ｃ）細胞が捕捉されたフィルターに、
（ｃ１）動物血清、
（ｃ２）界面活性剤、及び
（ｃ３）上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体、
を同時に又は任意の順に接触させる工程と、
（ｄ）細胞が捕捉されたフィルターに、核酸を染色する第三の蛍光色素を接触させる工程と、
（ｅ）細胞が捕捉されたフィルターに、第一、第二及び第三の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、フィルター上に捕捉された各細胞から発せられる第一、第二及び第三の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出する工程と、を備え、
工程（ｄ）が、工程（ａ）と工程（ｅ）との間の任意の段階で行われる、
方法。
【請求項３】
工程（ｃ）及び工程（ｄ）を同時に行い、細胞が捕捉されたフィルターに、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｃ３）及び核酸を染色する第三の蛍光色素を同時に接触させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
界面活性剤がポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
界面活性剤の濃度が０．０５質量％〜０．２質量％である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
動物血清の由来となる動物、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体又は抗体の由来となる動物、及び上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体の由来となる動物が同じ動物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
由来動物がマウスである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
動物血清の濃度が２質量％〜１０質量％である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
白血球のマーカータンパク質がＣＤ４５である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
上皮細胞のマーカータンパク質がサイトケラチン又は腫瘍マーカーである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が捕捉されたフィルター上の血中循環癌細胞を検出するための前処理方法であって、細胞が捕捉されたフィルターに、動物血清及び界面活性剤を同時に又は任意の順に接触させる工程を含む、
方法。
【請求項１３】
動物血清及び界面活性剤を接触させる工程の前に、細胞が捕捉されたフィルターが、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体、及び一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体により処理されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
動物血清及び界面活性剤を接触させる工程の前に、細胞が捕捉されたフィルターが、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体により処理されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
細胞が捕捉されたフィルターに、動物血清、界面活性剤、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体、及び核酸を染色する第三の蛍光色素を同時に接触させる、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤を有する、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
界面活性剤がポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルを有する、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
界面活性剤の濃度が０．０５質量％〜０．２質量％である、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
動物血清の由来となる動物、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体又は抗体の由来となる動物、及び上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体の由来となる動物が同じ動物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
由来動物がマウスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
動物血清の濃度が２質量％〜１０質量％である、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
白血球のマーカータンパク質がＣＤ４５である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項２３】
上皮細胞のマーカータンパク質がサイトケラチン又は腫瘍マーカーである、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血中循環癌細胞の検出方法及び血中循環癌細胞を検出するための前処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の転移の有無を予測する方法として、血管及びリンパ管を通じて体内を循環する血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ、以下、「ＣＴＣ」ともいう。）を検出する方法がある。ＣＴＣの検出は、まず、フィルター（例えば、特許文献１）を用いて、細胞のサイズ及び変形能の違いによりＣＴＣをフィルター上に捕捉し、次いで、捕捉されたＣＴＣを染色することによって行うことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−４２６８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
フィルター上に捕捉された細胞の検出は、細胞の核を蛍光染色し、この蛍光を検出することによって行うことができるが、フィルター上には、ＣＴＣの他に、ＣＴＣと同程度の細胞直径を有する白血球も捕捉される。そこで、捕捉された細胞に対して、白血球とＣＴＣのそれぞれに特異的な蛍光標識抗体を反応させ、各細胞の発する蛍光を検出することで、捕捉された細胞が白血球又はＣＴＣのいずれであるかを同定することができる。しかしながら、従来のＣＴＣの検出方法では、捕捉された白血球において、細胞の核を示す蛍光とＣＴＣを示す蛍光とが観察される場合（偽陽性）、又は、捕捉された細胞において、細胞の核を示す蛍光と、白血球を示す蛍光と、ＣＴＣを示す蛍光とが観察される場合（トリプルポジティブ）があった。本発明者らによる検討の結果、血液中のＣＴＣを検出する場合は、採血から経過した時間によって、偽陽性の数及びトリプルポジティブの数が異なることを見出した。新鮮な血液、より具体的には、採血から経過した時間が８時間以内である血液を使用すると、トリプルポジティブが生じる場合はあっても、偽陽性は生じないか、生じても実用上問題のない程度であった。一方、新鮮でない血液、より具体的には、採血から８時間以上経過した血液を使用すると、トリプルポジティブ及び偽陽性の両方が、実用上問題となり得る程度で生じる場合があった。新鮮な血液を使用することで、偽陽性は抑えることができるものの、実際上、新鮮な血液を必ずしも用意することができるわけではない。したがって、使用する血液の採血からの経過時間に関わらず、偽陽性及びトリプルポジティブを低減することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
このような状況に鑑み、本発明者らは鋭意検討を行った結果、フィルター上に捕捉された細胞を、界面活性剤と動物血清とで処理することが、ＣＴＣの検出における偽陽性及びトリプルポジティブの低減に有効であることを見出し、本発明を完成させた。【０００６】
すなわち、本発明は、血液試料中の血中循環癌細胞を検出する方法であって、（ａ）血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉する工程と、（ｂ）細胞が捕捉されたフィルターに、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程と、（ｃ）細胞が捕捉されたフィルターに、（ｃ１）動物血清、（ｃ２）界面活性剤、及び（ｃ３）上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体、を同時に又は任意の順に接触させる工程と、（ｄ）細胞が捕捉されたフィルターに、核酸を染色する第三の蛍光色素を接触させる工程と、（ｅ）細胞が捕捉されたフィルターに、第一、第二及び第三の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、フィルター上に捕捉された各細胞から発せられる第一、第二及び第三の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出する工程と、を備え、工程（ｄ）が、工程（ａ）と工程（ｅ）との間の任意の段階で行われる方法を提供する。【０００７】
また、本発明は、上記方法における工程（ｂ）が、細胞が捕捉されたフィルターに、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程である方法を提供する。【０００８】
工程（ｃ）及び工程（ｄ）を同時に行い、細胞が捕捉されたフィルターに、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｃ３）及び核酸を染色する第三の蛍光色素を同時に接触させてもよい。【０００９】
界面活性剤は、非イオン性界面活性剤を有していてよく、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルを有していてよい。界面活性剤の濃度は、０．０５質量％〜０．２質量％であってよい。【００１０】
動物血清の由来となる動物、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体又は抗体の由来となる動物、及び上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体の由来となる動物は同じ動物であってよく、由来動物はマウスであってよい。動物血清の濃度は２質量％〜１０質量％であってよい。【００１１】
白血球のマーカータンパク質はＣＤ４５であってよい。また、上皮細胞のマーカータンパク質はサイトケラチン又は腫瘍マーカーであってよい。【００１２】
また、本発明は、細胞が捕捉されたフィルター上の血中循環癌細胞を検出するための前処理方法であって、細胞が捕捉されたフィルターに、動物血清及び界面活性剤を同時に又は任意の順に接触させる工程を含む方法を提供する。【００１３】
動物血清及び界面活性剤を接触させる工程の前に、細胞が捕捉されたフィルターは、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体、及び一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体により処理されていてもよく、又は、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体により処理されていてもよい。【００１４】
また、細胞が捕捉されたフィルターに、動物血清、界面活性剤、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体及び核酸を染色する第三の蛍光色素を同時に接触させてもよい。【００１５】
界面活性剤は、非イオン性界面活性剤を有していてよく、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルを有していてよい。界面活性剤の濃度は、０．０５質量％〜０．２質量％であってよい。【００１６】
動物血清の由来となる動物、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体又は抗体の由来となる動物、及び上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体の由来となる動物は同じ動物であってよく、由来動物はマウスであってよい。動物血清の濃度は２質量％〜１０質量％であってよい。【００１７】
白血球のマーカータンパク質はＣＤ４５であってよい。また、上皮細胞のマーカータンパク質はサイトケラチン又は腫瘍マーカーであってよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ＣＴＣの検出における偽陽性及びトリプルポジティブを低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】細胞捕捉カートリッジの一実施形態を示す斜視図である。
【図２】図１におけるＩＩ−ＩＩ線断面図である。
【図３】試験例１におけるトリプルポジティブの結果を示すグラフである。
【図４】試験例１における偽陽性の結果を示すグラフである。
【図５】試験例１におけるバックグラウンド染色の結果を示すグラフである。
【図６】試験例２におけるトリプルポジティブの結果を示すグラフである。
【図７】試験例２における偽陽性の結果を示すグラフである。
【図８】試験例２におけるバックグラウンド染色の結果を示すグラフである。
【図９】試験例３におけるトリプルポジティブの結果を示すグラフである。
【図１０】試験例３における偽陽性の結果を示すグラフである。
【図１１】試験例３におけるバックグラウンド染色の結果を示すグラフである。
【図１２】健常人血液を使用した場合の、偽陽性の数の経時変化を示すグラフである。
【図１３】健常人血液を使用した場合の、トリプルポジティブの数の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の一実施形態に係る、血液試料中の血中循環癌細胞を検出する方法は、（ａ）血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉する工程と、（ｂ）細胞が捕捉されたフィルターに、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程と、（ｃ）細胞が捕捉されたフィルターに、（ｃ１）動物血清、（ｃ２）界面活性剤、及び（ｃ３）上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体、を同時に又は任意の順に接触させる工程と、（ｄ）細胞が捕捉されたフィルターに、核酸を染色する第三の蛍光色素を接触させる工程と、（ｅ）細胞が捕捉されたフィルターに、第一、第二及び第三の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、フィルター上に捕捉された各細胞から発せられる第一、第二及び第三の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出する工程と、を備える。以下、これらの工程について詳細に説明していく。
【００２１】
はじめに、工程（ａ）において、血液試料がフィルターでろ過されて、血液試料中の細胞がフィルター上に捕捉される。本明細書において、「細胞」とは、特に明記しない限り、白血球又は血中循環癌細胞（ＣＴＣ）を意味する。健常者の血液にはＣＴＣが含まれないが、癌が転移した被験者の血液にはＣＴＣが含まれるため、癌が転移した被験者の血液をフィルターでろ過すると、ＣＴＣがフィルター上に捕捉される。また、白血球の直径はＣＴＣの直径と同程度であるため、フィルター上にはＣＴＣとともに白血球が捕捉される。
【００２２】
血液試料としては、被験者から採取した血液をそのまま使用することもできるし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液又はその他適当な媒体で希釈された血液を使用することもできる。血液試料には、抗凝固剤及び固定剤等、通常血液試料に添加される添加剤が添加されていてもよい。
【００２３】
フィルターは、血液試料中に存在する白血球及びＣＴＣを選択的に捕捉できるフィルターであれば特に限定されず、従来公知のフィルターを使用できる。フィルターは、例えば、金属製のフィルターであってよく、好ましくは５μｍ〜１５μｍ、より好ましくは６μｍ〜１２μｍ、さらに好ましくは７μｍ〜１０μｍの孔径の貫通孔を有する。なお、貫通孔の孔径は、貫通孔を通過できる球の直径の最大値をいう。
【００２４】
工程（ａ）の後、細胞が捕捉されたフィルターを洗浄してもよい（工程（ｘ））。工程（ｘ）は、例えば、ＰＢＳ等の既知の緩衝液を含む洗浄液を、フィルターに接触させることで行う。洗浄液には、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の添加物が含まれていてよい。工程（ｘ）は、工程（ａ）の後に限らず、各工程の後に適宜行われてよい。
【００２５】
なお、本明細書において、細胞が捕捉されたフィルターに物質を「接触させる」ことは、細胞が捕捉されたフィルターにその物質若しくはその物質の溶液を通液すること、又は細胞が捕捉されたフィルターをその物質若しくはその物質の溶液に浸すことにより行われてよいが、これらの方法に限定されない。
【００２６】
次に、工程（ｂ）において、細胞が捕捉されたフィルターに、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させることができる。この工程により、フィルター上に捕捉された白血球が蛍光標識される。細胞が捕捉されたフィルターに一次抗体を接触させた後、二次抗体を接触させる前に、細胞が捕捉されたフィルターを洗浄液で洗浄してもよい（工程（ｘ））。
【００２７】
フィルター上に捕捉された白血球の蛍光標識は、上記のように二段階で行うことができるが、一段階で行ってもよい。すなわち、工程（ｂ）において、細胞が捕捉されたフィルターに、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体を接触させることによって、フィルター上に捕捉された白血球を一段階で蛍光標識してもよい。
【００２８】
白血球のマーカータンパク質としては、例えば、全造血幹細胞に発現するＣＤ４５が挙げられる。
【００２９】
白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体、第一の蛍光色素で標識されている二次抗体、及び白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体は、特に限定されず、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってよい。抗体が由来する動物は、一次抗体が由来する動物と二次抗体が由来する動物とが異なる動物である限り、特に限定されない。
【００３０】
第一の蛍光色素は、抗体の蛍光標識に通常使用される蛍光色素であれば特に限定されない。第一の蛍光色素は、第二及び第三の蛍光色素とは別の蛍光色素である。各蛍光色素は異なる蛍光波長を有するため、識別可能である。第一の蛍光色素としては、例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）を使用できる。
【００３１】
工程（ｂ）の後、フィルター上に捕捉された細胞を固定化してもよい（工程（ｙ１））。ホルムアルデヒド等の公知の固定剤を、細胞が捕捉されたフィルターに接触させることで、細胞を固定化できる。細胞を固定化することにより、細胞の腐敗又は凝集をより軽減することができる。
【００３２】
また、工程（ｙ１）の後に、さらに、フィルター上に捕捉された細胞を透過処理してもよい（工程（ｙ２））。公知の透過処理剤を細胞が捕捉されたフィルターに接触させることで、細胞を透過処理することができる。透過処理剤としては、例えば、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルを使用することができる。
【００３３】
工程（ｙ１）及び（ｙ２）は、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に行うことが好ましい。
【００３４】
次に、工程（ｃ）において、細胞が捕捉されたフィルターに、（ｃ１）動物血清、（ｃ２）界面活性剤、及び（ｃ３）上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体を接触させることができる。
【００３５】
細胞が捕捉されたフィルターに動物血清（ｃ１）を接触させることは、ＣＴＣの検出における偽陽性及びトリプルポジティブを低減する方向に作用する。偽陽性及びトリプルポジティブが低減される機構は定かではないが、動物血清を細胞に接触させることで、抗体の非特異的結合を低減することができるためであると推測される。
【００３６】
動物血清（ｃ１）は、一般に使用される動物血清であれば特に限定されないが、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体の由来となる動物と同じ動物に由来する血清であってよく、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体の由来となる動物、及び白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体又は抗体の由来となる動物と、同じ動物に由来する血清であってよい。後者の場合、本発明の方法が、偽陽性及びトリプルポジティブの低減に、特に効果的である。例えば、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体又は抗体、及び上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体がマウス由来の抗体である場合、動物血清はマウス血清であることが好ましい。
【００３７】
動物血清（ｃ１）はＰＢＳ等の緩衝液又はその他適当な媒体で希釈されていてよい。動物血清（ｃ１）の濃度は、２質量％〜１０質量％が好ましく、４質量％〜６質量％がより好ましく、５質量％がさらに好ましい。動物血清の濃度が２質量％以上であると、後述する界面活性剤と併用した場合に、偽陽性及びトリプルポジティブがより一層低減される。動物血清の濃度が１０質量％以下であると、後述する界面活性剤と併用した場合に、動物血清によるフィルターの汚染が軽減される。
【００３８】
細胞が捕捉されたフィルターに界面活性剤（ｃ２）を接触させることは、ＣＴＣの検出における偽陽性及びトリプルポジティブを低減する方向に作用する。偽陽性及びトリプルポジティブが低減される機構は定かではないが、界面活性剤を細胞に接触させることで、抗体の非特異的結合を低減することができるためであると推定される。
【００３９】
また、動物血清（ｃ１）がフィルターに付着することでフィルターが汚染された場合であっても、界面活性剤（ｃ２）をフィルターに接触させることで、界面活性剤によりフィルターに付着した動物血清が除去される。
【００４０】
界面活性剤は、非イオン性界面活性剤を有することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウラート（ポリソルベート２０ともいう）、及びｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（オクチルグルコシドともいう）が挙げられ、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルが好ましい。
【００４１】
界面活性剤（ｃ２）はＰＢＳ等の緩衝液又はその他適当な媒体で希釈されていてよい。界面活性剤の濃度は、０．０５質量％〜０．２質量％が好ましく、０．０５質量％〜０．１質量％がより好ましく、０．０５質量％がさらに好ましい。界面活性剤の濃度が０．０５質量％以上であると、動物血清と併用した場合に、偽陽性及びトリプルポジティブがより一層低減される。界面活性剤の濃度が０．２質量％以下であると、細胞の物理的形態が良好に維持される。
【００４２】
上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体（ｃ３）の抗原である上皮細胞のマーカータンパク質としては、例えば、サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＣＤ１４６、ＣＤ１７６、及び、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ２等の腫瘍マーカーが挙げられ、サイトケラチン又は腫瘍マーカーが好ましい。ＣＴＣは上皮細胞に由来するため、これら上皮細胞のマーカータンパク質を有する。
第二の蛍光色素は、抗体の蛍光標識に通常使用される蛍光色素であれば特に限定されない。第二の蛍光色素としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のフルオレセインを使用できる。
【００４３】
抗体（ｃ３）は、特に限定されず、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってよい。抗体（ｃ３）の由来となる動物は限定されない。
【００４４】
工程（ｃ）において、（ｃ１）、（ｃ２）、及び（ｃ３）は、同時に又は任意の順で、細胞が捕捉されたフィルターに接触させることができるが、本発明の効果をより顕著に奏する観点から、（ｃ１）及び（ｃ２）を同時に接触させて、次いで（ｃ３）を接触させることが好ましく、（ｃ１）、（ｃ２）、及び（ｃ３）を同時に接触させることがより好ましい。工程（ｃ）において、適宜、洗浄工程（ｘ）を行ってよい。
【００４５】
次に、工程（ｄ）において、細胞が捕捉されたフィルターに、核酸を染色する第三の蛍光色素を接触させることができる。
【００４６】
核酸を染色する第三の蛍光色素は、核酸に結合することができる蛍光色素であれば特に限定されず、核酸を蛍光染色するのに通常用いられる蛍光色素を使用することができる。第三の蛍光色素としては、例えば、４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）及び２′−（４−エトキシフェニル）−５−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２，５′−ビ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール三塩酸塩（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）が挙げられる。
【００４７】
工程（ｄ）は、工程（ｃ）の次に行うことができるが、工程（ｃ）の次に行うことは必須ではなく、工程（ａ）と工程（ｅ）との間の任意の段階で行うことができる。本発明の効果をより顕著に奏する観点から、工程（ｃ）及び工程（ｄ）は同時に行うことが好ましい。より具体的には、細胞が捕捉されたフィルターに、（ｃ１）及び（ｃ２）を同時に接触させて、次いで（ｃ３）及び核酸を染色する第三の蛍光色素を同時に接触させることが好ましく、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｃ３）、及び核酸を染色する第三の蛍光色素を同時に接触させることがより好ましい。
【００４８】
細胞が捕捉されたフィルターに動物血清（ｃ１）及び界面活性剤（ｃ２）を同時に接触させる場合、動物血清及び界面活性剤をあらかじめ混合して混合液としたものを使用してもよい。混合液における、動物血清及び界面活性剤の濃度の組み合わせは、動物血清が２質量％〜１０質量％であり界面活性剤が０．０５質量％〜０．２質量％であることが好ましく、動物血清が４質量％〜６質量％であり界面活性剤が０．０５質量％〜０．１質量％であることがより好ましく、動物血清が５質量％であり界面活性剤が０．０５質量％〜０．１質量％であることがさらに好ましく、動物血清が５質量％であり界面活性剤が０．０５質量％であることが特に好ましい。動物血清及び界面活性剤の濃度の組み合わせが上記範囲にあると、本発明の効果をより顕著に奏することができる。また、フィルターの汚染によるバックグラウンド染色を軽減することができるとともに、細胞の物理的形態を維持することができる。
【００４９】
細胞が捕捉されたフィルターに、動物血清（ｃ１）と界面活性剤（ｃ２）のうち動物血清のみを接触させる場合、偽陽性及びトリプルポジティブを十分に低減することができないか、又は、フィルター上に動物血清が付着してしまう（フィルターが汚染される）。フィルター上に動物血清が付着すると、付着した動物血清に、フィルター上に存在する第一の蛍光色素で標識されている二次抗体又は抗体が結合する（バックグラウンド染色）ことで、工程（ｅ）において、フィルターの広範囲にわたり第一の蛍光色素による蛍光が検出されてしまい、ＣＴＣの検出が困難となる。細胞に、動物血清（ｃ１）と界面活性剤（ｃ２）のうち界面活性剤のみを接触させる場合、偽陽性及びトリプルポジティブを十分に低減することができないか、又は、捕捉された細胞の物理的形態が破壊されてしまい、ＣＴＣの検出が困難となる。本実施形態に係る発明によれば、細胞が捕捉されたフィルターに動物血清と界面活性剤との組み合わせを接触させることにより、偽陽性及びトリルポジティブが十分に低減されるとともに、フィルターの汚染によるバックグラウンド染色が軽減され、また、細胞の物理的形態が維持される。
【００５０】
最後に、工程（ｅ）において、細胞が捕捉されたフィルターに、第一、第二及び第三の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、フィルター上に捕捉された各細胞から発せられる第一、第二及び第三の蛍光色素の蛍光を検出する。
【００５１】
白血球は、第一及び第三の蛍光色素で標識されている。したがって、第一、第二及び第三の蛍光色素の蛍光を検出する際に、第二の蛍光色素による蛍光が検出されず（陰性）、第一及び第三の蛍光色素による蛍光が検出される（陽性）細胞が、白血球として同定される。一方、ＣＴＣは、第二及び第三の蛍光色素で標識されている。したがって、第一の蛍光色素による蛍光が検出されず（陰性）、第二及び第三の蛍光色素による蛍光が検出される（陽性）細胞が、ＣＴＣとして同定される。ここで、第一、第二及び第三の蛍光色素が検出される（陽性）場合、すなわちトリプルポジティブである場合、その細胞が白血球又はＣＴＣのどちらであるかを同定することができない。また、細胞が白血球であるにも関わらず、第一の蛍光色素による蛍光が検出されず（陰性）、第二及び第三の蛍光色素による蛍光が検出される（陽性）場合が偽陽性である。
【００５２】
次に、本発明の他の実施形態に係る、血液試料中のＣＴＣを検出する方法を、図１及び図２を参照しながら説明する。なお、本実施形態に係る方法における、フィルター、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体、第一の蛍光色素で標識されている二次抗体、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体、（ｃ１）動物血清、（ｃ２）界面活性剤、（ｃ３）第二の蛍光色素で標識されている抗体、核酸を染色する第三の蛍光色素、及びその他の反応液についての詳細は、上記実施形態で述べたとおりである。
【００５３】
図１及び図２に示すＣＴＣ捕捉カートリッジ（カートリッジ）１００は、液体が流入する流入管１２５が接続された流入口１３０と、液体が流出する流出管１３５が接続された流出口１４０とを有する筐体１２０と、フィルター１０５とを備える。フィルター１０５は、上部部材１１０及び下部部材１１５から構成される筐体１２０により固定されている。血液試料、洗浄液及びその他の反応液は、流入管１２５を通って筐体１２０の内部に導入され、フィルター１０５を通って、流出管１３５から外部に排出される。このような液体の流れは、例えば、流入管１２５の上流又は流出管１３５の下流にポンプを接続することにより作り出すことができる。また、流入管１２５の上流及び／又は流出管１３５の下流にコックを設け、液体の流れを制御してもよい。
【００５４】
はじめに、血液試料を流入管１２５からカートリッジ１００内に導入して、血液試料をフィルター１０５でろ過する（工程（ａ））。血液試料中の白血球及びＣＴＣはフィルター１０５の貫通孔１０６を通過できず、フィルター１０５表面に残留する。血液試料中のその他の成分は、貫通孔１０６を通過し、カートリッジ１００の外へと排出される。次いで、洗浄液をフィルター１０５に通液してフィルター１０５を洗浄してもよい（工程（ｘ））。なお、以下の各工程の後に、適宜、洗浄工程（ｘ）を行うことができる。
【００５５】
次に、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を含む溶液をカートリッジ１００内に導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、フィルター１０５上に捕捉された細胞と一次抗体とを反応させることができる。次いで、第一の蛍光色素で標識されている二次抗体を含む溶液をカートリッジ１００内に導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、上記一次抗体と二次抗体とを反応させることができる（工程（ｂ））。細胞と一次抗体とを反応させた後、かつ、一次抗体と二次抗体とを反応させる前に、洗浄液をフィルター１０５に通液してフィルター１０５を洗浄してもよい（工程（ｘ））。
【００５６】
工程（ｂ）は、上記のように、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体と第一の蛍光色素で標識されている二次抗体とを用いて二段階で行ってもよいが、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体を用いて一段階で行ってもよい。工程（ｂ）を一段階で行う場合、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体を含む溶液をカートリッジ１００内に導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、フィルター１０５上に捕捉された細胞と抗体とを反応させる。
【００５７】
ここで、固定剤を含む溶液をカートリッジ１００内に導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、フィルター１０５上に捕捉された細胞を固定化してもよい（工程（ｙ１））。次いで、透過処理剤を含む溶液をカートリッジ１００内に導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、フィルター１０５上に捕捉された細胞を透過処理してもよい（工程（ｙ２））。
【００５８】
次に、動物血清（ｃ１）を含む溶液、界面活性剤（ｃ２）を含む溶液、及び第二の蛍光色素で標識されている抗体（ｃ３）を含む溶液をカートリッジ１００内に導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、フィルター１０５上に捕捉された細胞と（ｃ１）〜（ｃ３）とを反応させることができる（工程（ｃ））。なお、各溶液は、それぞれ独立にカートリッジ１００に導入してもよいし、各溶液を任意の組み合わせで混合した混合溶液を任意の順でカートリッジ１００に導入してもよい。
【００５９】
次に、核酸を染色する第三の蛍光色素を含む溶液をカートリッジ１００内に導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、フィルター１０５上に捕捉された細胞と核酸を染色する第三の蛍光色素とを反応させることができる（工程（ｄ））。工程（ｄ）は、工程（ｃ）の次に行うことができるが、工程（ｃ）の次に行うことは必須ではなく、工程（ａ）と工程（ｅ）との間の任意の段階で行うことができる。なお、核酸を染色する第三の蛍光色素を含む溶液は、工程（ｃ）における各溶液と任意の組み合わせで混合して、混合溶液としてカートリッジ１００に導入してもよい。
【００６０】
最後に、蛍光顕微鏡を使用して、カートリッジ１００にそれぞれの蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、フィルター１０５上に捕捉された各細胞から発せられる蛍光を検出する（工程（ｅ））。蛍光の検出は、例えば、カートリッジ１００の垂直方向上面からカートリッジ１００を観察し、蛍光観察像を処理することにより行う。検出された蛍光の組み合わせに応じて、細胞がＣＴＣ又は白血球のどちらであるかが同定される。
【００６１】
本発明の一実施形態に係る、細胞が捕捉されたフィルター上の血中循環癌細胞を検出するための前処理方法は、細胞が捕捉されたフィルターに、動物血清及び界面活性剤を同時に又は任意の順に接触させる工程を含む。なお、本実施形態に係る方法における、フィルター、動物血清、界面活性剤、及びその他の反応液についての詳細は、血液試料中の血中循環癌細胞を検出する方法の実施形態で述べたとおりである。
【００６２】
細胞が捕捉されたフィルターは、例えば、血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉することで得ることができる。細胞が捕捉されたフィルターは、あらかじめ、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで、一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させたものであってもよく、又は、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体を接触させたものであってもよい。細胞が捕捉されたフィルターは、さらに核酸を染色する第三の蛍光色素を接触させたものであってもよい。
【００６３】
このようにして得られた、細胞が捕捉されたフィルターに、動物血清及び界面活性剤を接触させることで、細胞が捕捉されたフィルターを前処理することができる。動物血清及び界面活性剤は、同時に又は任意の順で、細胞が捕捉されたフィルターに接触させることができるが、本願発明の効果をより顕著に奏する観点から、同時に接触させることが好ましい。
【００６４】
細胞が捕捉されたフィルターには、本実施形態に係る方法の前処理が施された後、血中循環癌細胞の検出が行われる。血中循環癌細胞の検出は、例えば、次のように行うことができる。まず、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体、及び核酸を染色する第三の蛍光色素を同時に又は任意の順で、細胞が捕捉された前処理後のフィルターに接触させる。ただし、細胞が捕捉されたフィルターが、前処理の前に、あらかじめ核酸を染色する第三の蛍光色素を接触させたものである場合、この段階で再び核酸を染色する第三の蛍光色素をフィルターに接触させる必要はない。次いで、第一、第二及び第三の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、フィルター上に捕捉された各細胞から発せられる第一、第二及び第三の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出する。第一の蛍光色素に陰性であり、第二及び第三の蛍光色素に陽性である細胞が血中循環癌細胞として同定される。
【００６５】
ここで、前処理後に、細胞が捕捉されたフィルターに接触させる、第二の蛍光色素で標識されている抗体、及び核酸を染色する第三の蛍光色素を、あらかじめ前処理の段階で、細胞が捕捉されたフィルターに接触させておくこともできる。すなわち、本実施形態に係る前処理方法において、動物血清及び界面活性剤とともに、第二の蛍光色素で標識されている抗体、及び核酸を染色する第三の蛍光色素を、細胞が捕捉されたフィルターに同時に接触させることもできる。
【００６６】
本実施形態に係る前処理方法によれば、ＣＴＣの検出において、トリプルポジティブ及び偽陽性を低減することができる。
【実施例】
【００６７】
＜試験例１＞
（実施例１）
長径１００μｍ、短径８μｍの貫通孔を多数有する薄膜の金属フィルター（膜面積６ｍｍ×６ｍｍ、膜厚１８μｍ）をカートリッジに組み込んだＣＴＣ捕捉カートリッジ（カートリッジ）を用いて、血液試料中のＣＴＣを以下のように検出した。ＣＴＣ捕捉カートリッジは、上記実施形態で説明したカートリッジ１００に相当する。なお、工程（ａ）から工程（ｃ）までの工程は、ＣＴＣ捕捉装置を用いて行った。ＣＴＣ捕捉装置は、血液試料及びその他の反応液を導入するリザーバーを備える。【００６８】
まず、カートリッジを、０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有したＰＢＳ溶液（以下、「洗浄液」という。）で満たした。リザーバーに、洗浄液を７ｍＬ入れ、洗浄液の下に、Ｓｔｒｅｋ社のＣｅｌｌ  Ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅで採血した健常人の血液３ｍＬを、血液と洗浄液が層をなすように加えた。ＣＴＣ捕捉装置を作動させ、流速２００μＬ／分でリザーバー中の血液及び洗浄液をカートリッジに導入し、血液中の白血球をフィルター上に捕捉した。カートリッジに洗浄液を導入し、フィルターに残留した血液成分を洗い流した。【００６９】
１．２５ｍＬの抗ヒトＣＤ４５  マウスモノクロナール抗体  クローン：２Ｄ１を流速２００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。１．２５ｍＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識抗マウスＩｇＧヤギポリクロナール抗体を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。【００７０】
ホルムアルデヒドを０．５質量％〜４質量％含有するＰＢＳ溶液１．２５ｍＬを、流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて１０分反応させて、細胞を固定化した。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。【００７１】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を０．０５質量％〜０．１質量％含有するＰＢＳ溶液１．２５ｍＬを、流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて１０分反応させて、細胞を透過処理した。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。【００７２】
ＦＩＴＣ標識抗ヒトサイトケラチン  マウスモノクロナール抗体のクローン：ＣＫ３／６Ｈ５／ＡＥ１／ＡＥ３の混合物、ＤＡＰＩ、５質量％マウス血清、０．０５質量％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及び洗浄液を含む溶液（以下、「溶液Ｃ」ともいう。）１．２５ｍＬを、４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。３．００ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。次いで、カートリッジをＣＴＣ捕捉装置から外した。【００７３】
カートリッジを蛍光顕微鏡に設置した。蛍光ミラーユニットを使用して、細胞上の蛍光色素（ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、及びＤＡＰＩ）をそれぞれ励起させた。それぞれの蛍光色素から発せられた蛍光を撮影し、得られた画像を合成した。合成した画像から、トリプルポジティブを示す細胞及び偽陽性を示す細胞を、目視又は画像解析ソフトウェアを用いて抽出し、それぞれの細胞数を求めた。結果を表１に示す。ここで、トリプルポジティブを示す細胞とは、ＦＩＴＣ陽性、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４陽性かつＤＡＰＩ陽性の細胞のことである。また、偽陽性を示す細胞とは、ＦＩＴＣ陽性、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４陰性かつＤＡＰＩ陽性の細胞のことである。【００７４】
トリプルポジティブを示す細胞の数を、比較例１におけるトリプルポジティブを示す細胞の数を１００とした場合の相対値として表した。同様に、偽陽性を示す細胞の数を、比較例１における偽陽性を示す細胞の数を１００とした場合の相対値として表した。結果を表１、図３及び図４に示す。【００７５】
次のように、フィルターの染色（バックグラウンド染色）を評価した。フィルターの右上、右下、左上、左下、中央の細胞のない部分をスポットで蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度を、比較例１におけるバックグラウンド染色の蛍光強度を１００とした場合の相対値として表した。結果を表１及び図５に示す。【００７６】
また、次のように、細胞の物理的形態を評価した。フィルター上に捕捉されている複数の細胞をランダムに抽出し形態を目視で観察した。結果を表１に示す。表１において、Ａは細胞に変形が見られない場合を、Ｂはわずかに細胞の変形が見られたが細胞の観察には問題がない程度の場合を、それぞれ示す。【００７７】
（比較例１）
マウス血清及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含まない溶液Ｃを使用した以外は、実施例１と同様にして、トリプルポジティブを示す細胞の数、偽陽性を示す細胞の数、及びバックグラウンド染色の蛍光強度を求めるとともに、細胞の物理的形態を評価した。結果を表１に示す。【００７８】
（実施例２）
細胞の透過処理までは実施例１と同様に行った。その後、５質量％マウス血清、０．０５質量％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及び洗浄液を含む溶液１．２５ｍＬを、４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。１．５０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。Ａｎｔｉ−Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−ＦＩＴＣ及びＤＡＰＩを含むＰＢＳ溶液１．２５ｍＬを、４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。３．００ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。次いで、カートリッジをＣＴＣ捕捉装置から外した。その後、実施例１と同様にして、トリプルポジティブを示す細胞数の相対値、偽陽性を示す細胞数の相対値、及びバックグラウンド染色の蛍光強度の相対値を求めるとともに、細胞の物理的形態を評価した。結果を表１及び図３〜図５に示す。【００７９】
（比較例２）
マウス血清を含まない溶液Ｃを使用した以外は、実施例１と同様にして、トリプルポジティブを示す細胞数の相対値、偽陽性を示す細胞数の相対値、及びバックグラウンド染色の蛍光強度の相対値を求めるとともに、細胞の物理的形態を評価した。結果を表１及び図３〜図５に示す。【００８０】
（比較例３）
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含まない溶液Ｃを使用した以外は、実施例１と同様にして、トリプルポジティブを示す細胞数の相対値、偽陽性を示す細胞数の相対値、及びバックグラウンド染色の蛍光強度の相対値を求めるとともに、細胞の物理的形態を評価した。結果を表１及び図３〜図５に示す。【００８１】
【表１】
2018030547.tif 000002
【００８２】
細胞に、動物血清及び界面活性剤を反応させた場合（実施例１，２）、トリプルポジティブ及び偽陽性が比較例１と比べて低減された。また、バックグラウンド染色が軽減され、細胞の変形も見られなかった。一方、細胞に、動物血清又は界面活性剤の一方のみを反応させた場合（比較例２，３）、偽陽性が十分に低減されないか（比較例２）、バックグラウンド染色の染色強度が大きく上昇した（比較例３）。また、動物血清及び界面活性剤を、抗サイトケラチン抗体及び核酸染色剤と一緒に細胞に反応させた場合（実施例１）、動物血清及び界面活性剤を、抗サイトケラチン抗体及び核酸染色剤を反応させる前に、細胞に反応させた場合（実施例２）と比較して、トリプルポジティブ及び偽陽性がより低減された。【００８３】
＜試験例２＞
（実施例３、比較例４〜６）
試験例１とは別の健常者から採取した血液を使用した以外は、実施例１及び比較例１〜３と同様にして、それぞれ実施例３及び比較例４〜６の実験を行った。結果を表２及び図６〜８に示す。なお、トリプルポジティブを示す細胞数の相対値、偽陽性を示す細胞数の相対値、及びバックグラウンド染色の蛍光強度の相対値は、比較例１における対応する値を１００とした場合の相対値とした。【００８４】
（実施例４）
溶液ＣにおけるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度を０．１質量％とした以外は、実施例３と同様にして実験を行った。結果を表２及び図６〜８に示す。【００８５】
【表２】
2018030547.tif 000003
【００８６】
細胞に、動物血清及び界面活性剤を反応させた場合（実施例３，４）、トリプルポジティブ及び偽陽性が比較例４と比べて低減された。また、バックグラウンド染色が軽減され、細胞の変形も見られなかったか（実施例３）、変形が見られても、細胞の観察に支障のない範囲のわずかな変形であった（実施例４）。一方、動物血清又は界面活性剤の一方のみを反応させた場合（比較例５，６）、トリプルポジティブが十分に低減されないか（比較例５）、バックグラウンド染色の染色強度が大きく上昇した（比較例６）。【００８７】
＜試験例３＞
（実施例５〜７）
試験例１とは別の健常人から採取した血液を使用して、実施例１と同様の実験を行った。実施例５では、５質量％のマウス血清と、０、０．０５、０．１又は０．２質量％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含む溶液Ｃを使用した。実施例６及び実施例７では、溶液Ｃ中の界面活性剤として、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の代わりに、それぞれオクチルグルコシド及びＴｗｅｅｎ２０を用いて、実施例５と同様に実験をした。なお、トリプルポジティブを示す細胞数の相対値、偽陽性を示す細胞数の相対値、及びバックグラウンド染色の蛍光強度の相対値は、溶液Ｃにおける界面活性剤の濃度が０質量％の場合の実験結果を１００とした場合の相対値とした。【００８８】
結果を図９〜１１に示す。界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用した場合（実施例５）、他の界面活性剤を使用した場合（実施例６及び７）と比べて、トリプルポジティブ、偽陽性及びバックグラウンド染色がより低減された。【００８９】
＜試験例４＞
採血から０時間、２４時間又は４８時間経過した健常人の血液を用いて、比較例１と同様の流れで実験を行い、各蛍光色素から発せられた蛍光を観察し、トリプルポジティブの数及び偽陽性の数を求めた。その結果、図１２及び図１３に示すように、採血からの経過時間が長いほど、トリプルポジティブの数及び偽陽性の数が増加することが示された。
【符号の説明】
【００９０】
１００…ＣＴＣ捕捉カートリッジ、１０５…フィルター、１０６…貫通孔、１１０…上部部材、１１５…下部部材、１２０…筐体、１２５…流入管、１３０…流入口、１３５…流出管、１４０…流出口。
【図１】
2018030547.tif 000004
【図２】
2018030547.tif 000005
【図３】
2018030547.tif 000006
【図４】
2018030547.tif 000007
【図５】
2018030547.tif 000008
【図６】
2018030547.tif 000009
【図７】
2018030547.tif 000010
【図８】
2018030547.tif 000011
【図９】
2018030547.tif 000012
【図１０】
2018030547.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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