(57)【要約】  本発明の目的はシゾフィラン等のβ-1,3グルカン骨格を有する多糖と複合化可能であり、しかも抗原提示細胞において抗原ペプチドを効率的に提示させ得る、核酸と抗原ペプチドの結合体を提供することである。  N末端にシステイン残基を有する８アミノ酸残基以上の抗原ペプチドのN末端システイン残基に、ポリデオキシアデニンに付加されているリンカーとジスルフィド結合にて結合させた結合体は、β-1,3グルカン骨格を有する多糖と複合化可能で、しかも抗原提示細胞において抗原ペプチドを効率的に提示し得る。
2017217531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
N末端にシステイン残基を有する８アミノ酸残基以上の抗原ペプチドのN末端システイン残基が、ポリデオキシアデニンに付加されているリンカーとジスルフィド結合で結合されている、核酸とペプチドの結合体。
【請求項２】
前記抗原ペプチドのC末端アミノ酸残基が疎水性アミノ酸残基である、請求項１に記載の核酸とペプチドの結合体。
【請求項３】
前記抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子で提示されるペプチドである、請求項１又は２に記載の核酸とペプチドの結合体。
【請求項４】
前記ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート化（S化）されている、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸とペプチドの結合体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸とペプチドの結合体と、β-1,3グルカン骨格を有する多糖との複合体。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸とペプチドの結合体、又は請求項５に記載の複合体を含む、ワクチン製剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸とペプチドの結合体、又は請求項５に記載の複合体を、免疫の付与又は増強が求められている者に投与する、免疫方法。
【請求項８】
ワクチン製剤を使用するための、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸とペプチドの結合体、又は請求項５に記載の複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸と抗原ペプチドの結合体に関する。より具体的には、本発明は、シゾフィラン等のβ-1,3グルカン骨格を有する多糖と複合化可能であり、しかも抗原提示細胞において抗原ペプチドを効率的に提示させ得る、核酸と抗原ペプチドの結合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンによる感染症や癌の予防の基本的原理は、人為的な疑似感染により、獲得免疫を誘導し、特定の病原体に対する抗体産生や細胞性免疫を誘導することにある。細胞性免疫では、先ず、抗原提示細胞が抗原タンパク質を貪食した後、抗原タンパク質を細胞内のプロテアーゼで分解して抗原ペプチドを生成し、当該抗原ペプチドがＭＨＣと結合し、抗原提示細胞の膜表面に露出し、異物情報としてＴ細胞に提示される。次いで、Ｔ細胞は、膜表面上のＴ細胞受容体でＭＨＣに結合した抗原ペプチドを認識して活性化され、癌細胞やウイルス感染細胞を特異的に傷害したり、各種サイトカインの産生を誘導したりすることにより、免疫を活性化する。【０００３】
ＭＨＣ分子には、クラスＩとクラスIIの２種類が存在するが、これらは細胞の異なる場所でペプチドを結合する。細胞質で生じたペプチドは小胞体へ移動し、ＭＨＣクラスＩ分子と結合し、細胞表面に移動し抗原ペプチドとして提示され、ＣＤ８Ｔ細胞に認識される。また、エンドサイトーシスにより取り込まれたタンパク質はリソソームで分解され小胞体でＭＨＣタイプII分子と結合し、細胞表面に移動し抗原ペプチドとして提示され、ＣＤ４Ｔ細胞に認識される。【０００４】
一方、従来、天然で３重螺旋構造を形成するβ-1,3グルカン（シゾフィラン等）を、非プロトン性非極性有機溶媒や0.1N以上のアルカリ溶液で溶解して１本鎖に解離させた後に１本鎖の核酸を加え、溶媒を水又は中性に戻すことによって、核酸１分子とβ-1,3グルカン２分子とならなる３重螺旋複合体を形成できることが知られている。また、このように核酸をβ-1,3グルカンによって複合化することにより、ヌクレアーゼによる核酸の加水分解や、血漿タンパク質と核酸との非特異的な結合等の、核酸と生体内タンパク質との望ましくない相互作用を抑制しつつ、核酸を細胞の内部に送達できることが明らかになっている。【０００５】
そこで、抗原ペプチドを投与するワクチン療法において、抗原提示細胞への抗原ペプチドのデリバリー効率の向上、免疫賦活活性の向上等の観点から、β-1,3グルカンの利用が種々試みられている。例えば、非特許文献１には、β-1,3グルカンと抗原ペプチドとを結合させ、更に当該β-1,3グルカンにCpG DNAを複合化させることにより得られたβ-1,3グルカン／抗原ペプチド／CpG DNAの三元複合体は、抗原ペプチドとアジュバントとして機能するCpG DNAを同時に効率的に抗原提示細胞に送達できることが開示されている。また、特許文献１には、抗原ペプチドがポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と共有結合を介して結合させたペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートを、β-1,3グルカンと複合化させることにより、生産性に優れ、高い免疫賦活活性を備えさせ得ることが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Synthsis and in Vitro Characterization of Antigen-Conjugated Polysaccharide as CpG DNA Carrier, N. Shimada, K. J. Ishii, Y. Takeda, C. Coban, Y. Torii, S. Shinkai, A. Akira and K. Sakurai, Bioconjugate Chem., 17, 1136-1140 (2006)
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2015/118789号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
マクロファージ、樹状細胞等の抗原提示細胞には、Dectin-1が発現しており、更に、シゾフィラン等のβ-1,3グルカンを含む核酸多糖複合体は、Dectin-1発現細胞に特異的に取り込まれる特性があることが明らかにされている。そのため、非特許文献１及び特許文献１のように、β-1,3グルカンと抗原ペプチドを含む複合体は、抗原提示細胞への送達効率に優れ、ワクチン療法への実用化に大きく期待されている。【０００９】
一方、抗原ペプチドに、多糖や核酸等の異分子を結合させると、抗原提示細胞内に取り込まれた後にＭＨＣと結合できなくなり、抗原提示細胞の膜表面に抗原ペプチドを提示できなくなったり、抗原ペプチドを提示する効率が低減されたりするおそれがあるところ、非特許文献１及び特許文献１では、どのような結合態様で抗原ペプチドを異分子と結合させると、抗原提示細胞において、抗原ペプチドを効率的に提示させ得るかについては十分な検討がなされていない。実際、本発明者等によって特許文献１の技術では、CTL（細胞障害性T細胞）反応の誘導に比較的多くのペプチドを要し、しかも抗原提示細胞を効果的に誘導できないことが確認されている（後述する実施例５及び６参照）。【００１０】
本発明の目的は、シゾフィラン等のβ-1,3グルカン骨格を有する多糖と複合化可能であり、しかも抗原提示細胞において抗原ペプチドを効率的に提示させ得る、核酸と抗原ペプチドの結合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、N末端にシステイン残基を有する８アミノ酸残基以上の抗原ペプチドのN末端システイン残基に、ポリデオキシアデニンに付加されているリンカーとジスルフィド結合にて結合させた結合体は、抗原提示細胞において抗原ペプチドを効率的に提示し得ることを見出した。また、このような結合体は、ポリデオキシアデニンが１本鎖で存在しているので、シゾフィラン等のβ-1,3グルカン骨格を有する多糖と複合化可能である。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。【００１２】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  N末端にシステイン残基を有する８アミノ酸残基以上の抗原ペプチドのN末端システイン残基が、ポリデオキシアデニンに付加されているリンカーとジスルフィド結合で結合されている、核酸とペプチドの結合体。
項２．  前記抗原ペプチドのC末端アミノ酸残基が疎水性アミノ酸残基である、項１に記載の核酸とペプチドの結合体。
項３．  前記抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子で提示されるペプチドである、項１又は２に記載の核酸とペプチドの結合体。
項４．  前記ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート化（S化）されている、項１〜３のいずれかに記載の核酸とペプチドの結合体。
項５．  項１〜４のいずれかに記載の核酸とペプチドの結合体と、β-1,3グルカン骨格を有する多糖との複合体。
項６．  項１〜４のいずれかに記載の核酸とペプチドの結合体、又は請求項５に記載の複合体を含む、ワクチン製剤。
項７．  項１〜４のいずれかに記載の核酸とペプチドの結合体、又は項５に記載の複合体を、免疫の付与又は増強が求められている者に投与する、免疫方法。
項８．  ワクチン製剤を使用するための、項１〜４のいずれかに記載の核酸とペプチドの結合体、又は項５に記載の複合体の使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の結合体は、N末端にシステイン残基を有する８アミノ酸残基以上の抗原ペプチドのN末端システイン残基に、リンカーを介してポリデオキシアデニンをジスルフィド結合にて結合していることにより、抗原提示細胞において抗原ペプチドを効率的に提示させることができる。【００１４】
また、本発明の結合体は、ポリデオキシアデニン部分に、シゾフィラン等のβ-1,3グルカン骨格を有する多糖を複合化することができる。本発明の結合体を当該多糖と複合化することによって、Dicten-1を発現している抗原提示細胞（マクロファージ、樹状細胞等）に効率的に送達することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１において、精製したdA40(S)−ペプチド結合体を電気泳動にて確認した結果である。
【図２】実施例２において、各種dA40(S)−ペプチド結合体に対するアミノペプチダーゼの反応性を確認した結果である。
【図３】実施例３において、各種dA40(S)−ペプチド結合体の抗原提示能を確認した結果である。
【図４】実施例５において、SPG/dA40(S)−OVA257-264、dA40(S)-OVA257-264、及びOVA257-264-click-dA40(S)/SPGの抗原提示能を確認した結果である。
【図５】実施例６において、SPG/dA40(S)−OVA257-264を用いてin vivo CTLアッセイを行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の結合体は、N末端にシステイン残基を有する８アミノ酸残基以上の抗原ペプチドのN末端システイン残基が、ポリデオキシアデニンに付加されているリンカーとジスルフィド結合で結合されていることを特徴とする。以下、本発明の結合体について詳述する。
【００１７】
［抗原ペプチド］
本発明で使用される抗原ペプチドを構成するアミノ酸残基の数については、８個以上であり、抗原性を有するもの（即ち、生体の免疫系において異物として認識されて免疫応答を引き起こすもの）であることを限度として特に制限されないが、通常８〜２０個、好ましくは８〜１２個、更に好ましくは８〜９個が挙げられる。
【００１８】
本発明で使用される抗原ペプチドのアミノ酸配列については、N末端がシステイン残基であり、且つ免疫応答を誘導できることを限度として特に制限されないが、例えば、食物アレルギー等のアレルゲンとなるタンパク質、病原体（細菌、ウイルス等）、腫瘍細胞等を期限とするタンパク質の内、エピトープとして作用し得る部分アミノ酸配列を有するものが挙げられる。好ましくは、ＭＨＣタイプＩ分子により提示される抗原ペプチドが挙げられる。より具体的には、本発明で使用される抗原ペプチドとして、表１に示す抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むものが挙げられる。なお、抗原ペプチドとして、表１に示す抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むものを使用する場合、表１に示す抗原ペプチドのアミノ酸配列のN末端にシステインを付加すればよい。
【００１９】
【表１】
2017217531.tif 000003
【００２０】
また、表１に示す抗原ペプチドのアミノ酸配列は、免疫応答を誘導可能であることを限度として、１又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、及び／又は挿入されたものであってもよい。表１に示す抗原ペプチドのアミノ酸配列に、アミノ酸の置換、欠失、挿入等の変異を施す場合、変異を導入するアミノ酸残基の数については、免疫応答を誘導可能である範囲内で適宜設定すればよいが、例えば１〜４個、好ましくは１〜３個、更に好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個が挙げられる。
【００２１】
更に、表１に示す抗原ペプチドのアミノ酸配列は、免疫応答を誘導可能であることを限度として、N末端及びC末端のいずれか少なくとも一方に、１又は複数のアミノ酸残基が付加されていてもよい。表１に示す抗原ペプチドのアミノ酸配列のN末端及び／又はC末端にアミノ酸残基を付加する場合、付加されるアミノ酸残基の数については、免疫応答を誘導可能である範囲内で適宜設定すればよいが、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜２個が挙げられ、抗原ペプチドの全長が９〜１６残基が好ましい。付加されるアミノ酸としては、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニンが好ましい。なお、抗原ペプチドのC末端側から抗原として認識されるため、表１に示す抗原ペプチドのアミノ酸配列のC末端側には、後述する疎水性アミノ酸残基を１つ付加する場合を除き、アミノ酸残基は付加されていないことが望ましい。
【００２２】
また、後述する実施例３に示すように、本発明の結合体は、抗原提示細胞に取り込まれた後に抗原ペプチドのC末端側が認識され、抗原ペプチドのC末端のアミノ酸残基が抗原提示能に大きく影響し、抗原ペプチドのC末端が疎水性アミノ酸残基である場合に、より一層効率的に抗原提示がなされることが確認されている。従って、本発明で使用される抗原ペプチドのアミノ酸配列のC末端は、疎水性アミノ酸残基であることが好ましい。当該疎水性アミノ酸残基としては、具体的には、ロイシン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンが挙げられる。これらの疎水性アミノ酸残基の中でも、好ましくはロイシンが挙げられる。
【００２３】
なお、抗原ペプチドとして、表１に示す抗原ペプチドのアミノ酸配列を含み、且つC末端が疎水性アミノ酸残基であるものを使用する場合、表１に示す抗原ペプチドのアミノ酸配列のC末端が疎水性アミノ酸残基でないものについては、C末端が疎水性アミノ酸残基となるように１又は複数のアミノ酸残基を付加したり、C末端が疎水性アミノ酸残基となるようにC末端側から１又は複数のアミノ酸残基を欠失させたりすればよい。
【００２４】
本発明で使用される抗原ペプチドは、起源となるタンパク質の加水分解、ペプチド合成等の任意の公知の方法を用いて得ることができる。
【００２５】
［ポリデオキシアデニン］
本発明で使用されるポリデオキシアデニンを構成するデオキシアデニンの数としては、後述するβ-1,3グルカン骨格を有する多糖との複合体形成が可能になる範囲で適宜設定すればよいが、例えば、10〜100個、好ましくは20〜100個、より好ましくは20〜80個、更に好ましくは30〜50個が挙げられる。
【００２６】
また、本発明で使用されるポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合は、少なくとも一部がホスホロチオエート化（S化）されていてもよい。このようにポリデオキシアデニンをS化することによって、ヌクレアーゼに対する耐性が付与され、生体内でより優れた安定性を備えることができる。ポリデオキシアデニンのS化は、従来公知の方法に従って行うことができる。
【００２７】
本発明で使用されるポリデオキシアデニンをS化する場合、そのS化率については、特に制限されないが、通常50%以上、好ましくは80%以上、更に好ましくは100%が挙げられる。本明細書において、ポリデオキシアデニンのS化率とは、ポリデオキシアデニン中のホスホジエステル結合の総数に対して、S化されているホスホジエステル結合の割合（%）を示す。また、S化されているホスホジエステル結合とは、ホスホジエステル結合部分のリン酸残基の酸素原子の一つが硫黄原子に置換されている結合構造を示す。
【００２８】
［抗原ペプチドとポリデオキシアデニンの結合］
本発明の結合体は、抗原ペプチドのN末端システイン残基のチオール基が、ポリデオキシアデニンに付加されているリンカー（スペーサー）とジスルフィド結合により結合している。
【００２９】
本発明の結合体において、ポリデオキシアデニンの5'末端側又は3'末端側のいずれが、リンカーを介して抗原ペプチドのN末端側に結合していてもよいが、ポリデオキシアデニンの5'末端側がリンカーを介して抗原ペプチドのN末端側に結合していることが好ましい。
【００３０】
本発明の結合体において、リンカー部分の分子量については、使用するリンカーの構造によって異なるが、例えば、100〜5000、好ましくは100〜2000、更に好ましくは100〜500が挙げられる。
【００３１】
本発明の結合体におけるリンカーについては、ポリデオキシアデニンの5'末端側又は3'末端側と共有結合し、且つ抗原ペプチドのN末端システイン残基のチオール基とジスルフィド結合している構造であればよく、公知の二官能性化合物を１個又は２個以上連結させたものが使用できる。
【００３２】
本発明の結合体において、リンカーを介したポリデオキシアデニンと抗原ペプチドとの連結は、例えば、ポリデオキシアデニンの5'末端側又は3'末端側に、チオール基とジスルフィド結合が可能な官能基を有するリンカーを結合させ、当該官能基と抗原ペプチドのN末端システイン残基のチオール基をジスルフィド結合させることによって行うことができる。
【００３３】
ポリデオキシアデニンの5'末端側又は3'末端側に、チオール基とジスルフィド結合が可能な官能基を有するリンカーを結合させるには、例えば、5'末端側又は3'末端側にアミノ基が付加されたポリデオキシアデニンに、アミノ基に共有結合可能な官能基と、チオール基にジスルフィド結合が可能な官能基を有する二官能性化合物を結合させればよい。
【００３４】
5'末端側又は3'末端側にアミノ基が付加されたポリデオキシアデニンとしては、例えば、下記一般式（１）〜（７）のいずれかの基がポリデオキシアデニンの5'末端のリン酸残基を構成する水素原子又はポリデオキシアデニンの3'末端のデオキシリボヌクレオチドの水酸基を構成する水素原子と置換しているものが挙げられる。
【００３５】
【化１】
2017217531.tif 000004
【００３６】
ここで、一般式（１）、（３）及び（４）において、n1は、1〜１８の整数、好ましくは１〜１２の整数、更に好ましくは１〜６の整数を示す。
【００３７】
一般式（２）において、n2は、1〜１８の整数、好ましくは１〜１２の整数、更に好ましくは１〜６の整数を示し、n3は、1〜１８の整数、好ましくは１〜１２の整数、更に好ましくは１〜６の整数を示す。
【００３８】
一般式（５）〜（７）において、n4は、1〜２０の整数、好ましくは１〜１０の整数、更に好ましくは１〜５の整数を示す。
【００３９】
一般式（１）〜（７）の基のポリデオキシアデニンへの付加は、公知の方法に従って行うことができる。
【００４０】
また、アミノ基に共有結合可能な官能基と、チオール基にジスルフィド結合が可能な官能基を有する二官能性化合物については、公知の二官能性架橋剤の中から適宜選択して使用すればよいが、具体的には、スクシンイミジル-6-[3'-(2-ピリジルジチオ)オプロピオネート]ヘキサノエート（LC-SPDP）、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）、N-スクシニミジル-S-アセチルチオアセテート（SATA）、N-スクシニミジル-S-アセチルチオプロピオネート(SATP)、イミノチオラン等が挙げられる。これらの二官能性リンカーの中でも、好ましくはスクシンイミジル-6-[3'-(2-ピリジルジチオ)オプロピオネート]ヘキサノエートが挙げられる。
【００４１】
アミノ基が付加されたポリデオキシアデニンと前記二官能性化合物との結合、及び前記二官能性リンカーとN末端システイン残基のチオール基とのジスルフィド結合は、公知の方法によって行うことができる。
【００４２】
［β-1,3グルカン骨格を有する多糖との複合化］
本発明の結合体は、そのままワクチンとして製剤化してもよいが、β-1,3グルカン骨格を有する多糖と複合化させて使用することが望ましい。このようにβ-1,3グルカン骨格を有する多糖と複合化させることにより、Dicten-1を発現している抗原提示細胞（マクロファージ、樹状細胞等）に効率的に送達され、より一層優れた免疫賦活効果を奏することが可能になる。
【００４３】
β-1,3-グルカンとは、グルコースがβ1→3グルコシド結合により結合された多糖であり、主鎖のグルコース残基数に対する側鎖のグルコース残基数の割合（以下、側鎖率と略記する）の異なる各種のものが知られている。β-1,3-グルカン骨格を有する多糖は、ｐｏｌｙ（Ｃ）等の核酸と近似するヘリックスパラメータを有しており（例えば、高橋、小畠、鈴木、Prog. Polym. Phys. Jpn. 27巻、767ページ、及び「Conformation of Carbohydrates」、Sharwood academic publisher、1998年等）、核酸塩基と水素結合可能な水酸基を有しているため、ポリデオキシアデニン１分子とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖２分子とで三重螺旋構造を有する安定な複合体を形成することが知られている。
【００４４】
本発明で使用されるβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖として、具体的には、シゾフィラン、カードラン、レンチナン、パーキマン、グリフォラン、スクレログルカン等が例示される。これらの中でも、シゾフィランは、抗原提示細胞への導入性及び酵素分解耐性の向上を一層顕著ならしめることができるので、本発明において好適な多糖である。また、前記多糖としてシゾフィランを用いる場合、シゾフィランの側鎖のグルコース残基を化学変換することにより、細胞のレセプターに親和性を有する官能基（アミノ基、アミノ酸基、ペプチド基、コレステロール基等）を導入することが可能である。
【００４５】
β-1,3-グルカン骨格を有する多糖の重量平均分子量については、特に制限されず、使用する多糖の種類、本発明の結合体におけるポリデオキシアデニンの鎖長等に応じて適宜設定すればよい。具体的には、β-1,3-グルカン骨格を有する多糖の重量平均分子量として、通常25,000〜2,500,000、好ましくは25,000〜150,000が挙げられる。
【００４６】
β-1,3-グルカン骨格を有する多糖は、公知の方法に従って得ることができる。例えば、シゾフィランの場合であれば、文献（A.C.S.38(1),253(1997);Carbohydrate Research,89,121-135(1981)）記載の定法に従って得ることができる。
【００４７】
本発明の結合体とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合化は、具体的には以下の方法に従って実施できる。β-1,3-グルカン骨格を有する多糖は、天然若しくは水中では、3重螺旋構造をとっている。当該多糖を、DMSO（ジメチルスルホオキシド）等の極性溶媒や水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ水溶液に溶解して1本鎖に変性させた後、本発明の結合体を加え、溶媒を水に戻すこと又はアルカリ水溶液を中和すること（再生過程）によって、本発明の結合体に連結しているポリデオキシアデニン1本鎖部分に、β-1,3-グルカン骨格を有する多糖２分子が結合して３重螺旋型に複合化された構造（会合構造）が形成される。このようなポリデオキシアデニンと多糖の複合化は、主に、水素結合と疎水性相互作用を介して形成されると考えられる。
【００４８】
本発明の結合体とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合化は、本発明の結合体：β-1,3-グルカン骨格を有する多糖のモル比として、20:1〜1:5、好ましくは10:1〜1:1で混合して行うことが望ましい。このようなモル比で、本発明の結合体とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖とを複合体形成条件下に晒すことにより、両者を効率的に相互作用させることが可能になり、本発明の結合体とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体の製造効率を向上させることができる。
【００４９】
[用途・剤型]
本発明の結合体、及び本発明の結合体とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体は、抗原提示細胞において抗原ペプチドを効率的に提示できるので、細菌、ウイルス等の病原体の感染に起因する感染症、ガン等の腫瘍の治療及び予防を目的としたワクチン製剤として製剤化して使用することができる。
【００５０】
当該ワクチン製剤は、本発明の結合体、又が本発明の結合体とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体と共に、薬学的に許容される担体や賦形剤を適宜組み合わせて配合し、公知の製剤化手法に従って製剤化することにより調製することができる。当該ワクチン製剤の剤型については、特に制限されないが、例えば、錠剤、座剤、カプセル剤、シロップ剤、マイクロカプセル剤、注射剤、エアゾール剤、スプレー剤等が挙げられる。
【００５１】
当該ワクチン製剤は、ヒト又は温血動物（マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、サル等）に対し、経口及び非経口経路のいずれによっても投与可能である。非経口投与経路としては、例えば、皮下注射、皮内注射、筋中注射、腹腔内投与、点滴、鼻粘膜や咽頭部への噴霧等が挙げられる。
【００５２】
当該ワクチン製剤の投与量については、活性、治療対象となる疾患、投与対象となる動物の種類、体重、性別、年齢、疾患の重篤度、投与方法等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、成人の場合であれば、１日当たりの用量が抗原ペプチドの重量換算で約１〜５００００μg、好ましくは約１０〜１００００μgとなるように設定すればよい。
【００５３】
当該ワクチン製剤は、必要に応じて、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、フロイント、水酸化アルミニウム（Alum）、ミョウバン等のアジュバントを含んでいてもよく、また、これらのアジュバントと共に投与されてもよい。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、以下、S化率が100％の40merのポリデオキシアデニンを「dA40(S)」と表記することがある。【００５５】
実施例１：dA40(S)とペプチドコンジュゲート体の作製
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に5'端にアミノ基を付加したdA40(S)（5'末端のリン酸残基を構成する水素原子が、基−(CH2)6−NH-CO-O−(CH2)2−NH2と置換しており、S化率が100％の40merのポリデオキシアデニン）1モルに対し、スクシンイミジル-6-[3'-(2-ピリジルジチオ)オプロピオネート]ヘキサノエート（LC-SPDP）を30モル当量混合させ、４０℃で３時間反応させた。【００５６】
次いで、陰イオン交換カラム（NAP-5 column）を用いて未反応のLC-SPDPを除去することで、dA40(S)の5'末端にLC-SPDPを結合させたdA40(S)-SPDPを得た。【００５７】
dA40(S)-LC-SPDP 1モルに対して、表２に示すペプチド１〜４（ペプチド１〜３は、卵白（OVE）抗原ペプチド）を25モル当量添加し、40℃で18時間反応させた。【００５８】
【表２】
2017217531.tif 000005
【００５９】
その後、反応溶液をHPLCに供し、dA40(S)とペプチドの結合体を分取した。HPLCの測定条件を以下のように設定した。
Ａ液：アセトニトリル
Ｂ液：0.1M TEAA(pH 7.0)
カラム：ZORBAX Eclipse Plus C18
溶離液
0 min          Ａ液：10%，Ｂ液：90%
〜  25 min           30%，      70%
〜  30 min          100%，       0%
〜  32 min          100%，       0%
〜  35 min           10%，      90%【００６０】
分取した溶液をAmicon Ultra Ultracel-3Kを用いて蒸留水に置換させ、凍結乾燥することにより、dA40(S)−ペプチド結合体を得た。得られたdA40(S)−ペプチド結合体の精製の確認をアクリルアミドゲル電気泳動で行った。【００６１】
ペプチド２を使用した場合について、電気泳動後、SYBR Goldで染色し蛍光画像を撮影した結果を図１に示す。図１において、左側のレーンはdA40(S)単独、中央のレーンはdA40(S)とペプチドの反応後の生成物、右側のレーンは精製後dA40(S)−ペプチド結合体の精製の結果である。図１から、dA40(S)とペプチドの反応後のレーン（中央）ではdA40(S)のバンドが高分子側に移動しており、dA40(S)とペプチドが結合しているのが分かる。しかし、まだ未反応のdA40(S)が見られるが、HPLC分取後では結合体のバンドのみが観察された。このことより、dA40(S)−ペプチド結合体の合成・精製が出来ていることが確認された。【００６２】
実施例２：小胞体アミノペプチダーゼによるdA40(S)−ペプチド結合体の切断
25mM Trisバッファー（pH8.0）中に各種dA40(S)−ペプチド結合体（1.5μM）とマウス小胞体アミノペプチダーゼ（0.5μｇ/ml）（R&D Systems catalog Number 2500-ZN）を添加し、37℃で18時間反応させた。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、dA40(S)−ペプチド結合体からの遊離の様子を観察した。【００６３】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図２に示す。図２において、pep(C)-dA40(S)はペプチド１を用いたdA40(S)−ペプチド結合体、dA40(S)-(C)pepはペプチド２を用いたdA40(S)−ペプチド結合体、dA40(S)-(C)pep longはペプチド３を用いたdA40(S)−ペプチド結合体、dA40(S)-(C)pep long miss(L→K)はペプチド４を用いたdA40(S)−ペプチド結合体を示す。C末端にシステイン残基を有するペプチド１のC末端のシステイン残基にジスルフィド結合を介してdA40(S)を結合させた結合体では酵素処理しても泳動距離に変化は見られなかった。つまり、この配向でのdA40(S)−ペプチド結合体は酵素認識されにくいことが分かった。逆に、N末端にシステイン残基を有するペプチド２のN末端のシステイン残基にジスルフィド結合を介してdA40(S)を結合させた結合体では酵素処理後にdA40(S)のバンドが少し見られた。更に、ペプチド２よりもアミノ酸数を増やしたペプチド３では、ほぼ完全にペプチドが遊離してdA40(S)のバンドが見られた。こうしたことより、抗原ペプチドのN末端のシステイン残基にジスルフィド結合を介してdA40(S)を結合させることでアミノペプチダーゼにより抗原ペプチドとdA40(S)を切断可能であることが分かった。また、ペプチド２のC末端をロイシンからリシンに置換させたペプチド４を使用したdA40(S)−ペプチド結合体では全く酵素に認識されなかった。アミノペプチダーゼは、抗原ペプチドをトリミングしてMHCに提示するのを助ける酵素の一つであるので、dA40(S)−ペプチド結合体を使用した抗原提示には、ポリデオキシアデニンをN末端システインに結合したペプチドであってもC末端側が疎水性アミノ酸残基で構成されていることが重要であることを確認した。【００６４】
実施例３：dA40(S)-ペプチド結合体を用いた抗原提示能の評価
C57BL/6Jマウスの腹腔にチオグリコレート培地３ｍｌを投与し、３日後に腹腔からマクロファージを回収した。得られたマクロファージを48ウェルに播種し（1.5×105 cells/well）、更に各種dA40(S)−ペプチド結合体10μMとなるように添加した。18時間CO2インキュベーターで培養後、4%パラホルムアルデヒドで細胞固定を行い、Anti-Mouse OVA257-264(SIINFEKL)peptide bound to H-2Kb PEで染色後、蛍光顕微鏡観察を行った。【００６５】
蛍光顕微鏡観察の結果を図３に示す。図３において、pep(C)-dA40(S)はペプチド１を用いたdA40(S)−ペプチド結合体、dA40(S)-(C)pepはペプチド２を用いたdA40(S)−ペプチド結合体、dA40(S)-(C)pep longはペプチド３を用いたdA40(S)−ペプチド結合体、dA40(S)-(C)pep long miss(L→K)はペプチド４を用いたdA40(S)−ペプチド結合体を示す。ペプチド１を使用したdA40(S)−ペプチド結合体は非常に弱い蛍光が観察された。また、ペプチド２及び３を使用したdA40(S)−ペプチド結合体はほぼ同程度に非常に強い蛍光が観察された。更に、ペプチド４を使用したdA40(S)−ペプチド結合体はほとんど抗原提示されなかった。これらの結果より、dA40(S)−抗原ペプチド結合体が抗原提示細胞へ取り込まれた後に、dA40(S)−抗原ペプチド結合体のC末端側が認識され、当該C末端が疎水性アミノ酸残基であることが抗原提示に重要であることがわかった。【００６６】
実施例４：dA40(S)-ペプチド結合体とシゾフィランとの複合体の作製
卵白（OVE）抗原ペプチド（OVA257-264；アミノ酸配列：SIINFEKL）を使用し、実施例１に記載の方法で、dA40(S)−OVA257-264結合体（dA40(S)−OVA257-264）を作成した。シゾフィラン(SPG)を0.25Nの水酸化ナトリウム水溶液中で２〜５日間溶解させ、三重螺旋構造を解離させたSPG溶液を得た。次いで、三重螺旋構造を解離させたSPG溶液、dA40(S)−OVA257-264結合体、及びリン酸緩衝液（330mM NaH2PO4, pH 4.7）を混合し、混合液を４℃で終夜静置した。なお、当該混合液において、dA40(S)−OVA257-264の濃度は60μM、[dA40(S)−OVA257-264]/[SPG]の比は4に設定した。斯くして、dA40(S)−OVA257-264とSPGとの複合体（SPG/dA40(S)−OVA257-264）を作製した。【００６７】
参考例１：CpG-dA40(S)とSPGとの複合体の作製
CpG（塩基配列：ATCGACTCTCGAGCGTTCTC）の3'末端にdA40(S)を連結させたCpG-dA40(S)を準備した。CpG-dA40(S)を用いて、前記実施例４と同様の方法で、CpG-dA40(S)とSPGとの複合体（CpG-dA40(S)/SPG）を作製した。【００６８】
参考例２：特許文献１（国際公開第2015/084374号）に示すdA40(S)とOVA257-264との結合体の作製、及び当該結合体とSPGとの複合体の作製
C末端にアジド基を導入した卵白（OVE）抗原ペプチド（OVA257-264；アミノ酸配列：SIINFEKL）（下記OVA(N3))と、5'末端にアルキンを導入したdA40(S)（下記dA40(S)(alkyne)を用いて、特許文献１（国際公開第2015/084374号）の実施例１に記載の方法に従って、アジド基とアルキンの付加環化反応によって、dA40(S)とOVA257-264との結合体（OVA257-264-click-dA40(S)）を作成した。
【化２】
2017217531.tif 000006
【００６９】
次いで、OVA257-264-click-dA40(S)を用いて、前記実施例４と同様の方法で、OVA257-264-click-dA40(S)とSPGとの複合体（OVA257-264-click-dA40(S)/SPG）を作製した。【００７０】
実施例５：SPG/dA40(S)−OVA257-264を用いた抗原提示能の評価
C57BL/6Jマウスの腹腔にチオグリコレート培地3mlを投与し、3日後に腹腔からマクロファージを回収した。得られたマクロファージを48ウェルに播種し（1.5×105 cells/well）、更にSPG/dA40(S)−OVA257-264、dA40(S)-OVA257-264、又はOVA257-264-click-dA40(S)/SPGをOVA257-264濃度で5μg/mlとなるように添加した。18時間CO2インキュベーターで培養後、4%パラホルムアルデヒドで細胞固定を行い、Anti-Mouse OVA257-264(SIINFEKL)peptide bound to H-2Kb PEで染色後、フローサイトメトリーにて分析を行った。【００７１】
結果を図４に示す。抗原（OVA257-264）提示レベルは、dA40(S)-OVA257-264とSPG/dA40(S)−OVA257-264では同程度であった。一方、OVA257-264-click-dA40(S)/SPGでは、抗原提示ができていなかった。これより、細胞内でペプチドが複合体から遊離されることにより（即ち、還元環境下でのジスルフィド結合の切断により）、その後の抗原提示が効率よく行われたことが示唆される。【００７２】
実施例６：In vivo CTLアッセイ
C57BL/6Jマウスに、SPG/dA40(S)−OVA257-264（OVA257-264量で20, 100, 500 ng）及びCpG-dA40(S)/SPG（CpG-dA量で30μg）を皮内へ投与した。【００７３】
投与７日目に、以下の手順で脾臓細胞を準備した。正常C57BL/6Jマウスから摘出された脾臓細胞を、10 μg/mlのOVA257-264 中で37℃、90分間処理した。その後、PBSで3回洗浄した後に、脾臓細胞を5μMのCFSE（carboxyfluorescein succinimidyl ester；Invitrogen, Carlsbad, CA)で標識した。また、OVA257-264で処理しなかった脾臓細胞についても、同様にCFSEで標識した（0.5μM）。標識後の細胞をPBSで3回洗浄し、OVA257-264で処理した脾臓細胞（CFSEhigh）とOVA257-264で処理しなかった脾臓細胞（CFSElow）とを同数になるように混合した。得られた脾臓細胞を、SPG/dA40(S)−OVA257-264及びCpG-dA40(S)/SPGの投与から7日目のマウスの静脈内に投与（4.0×106 cells/head）して、24時間飼育した。その後、マウスから、脾臓細胞を摘出し、フローサイトメトリーによってCFSE標識細胞を計測した。【００７４】
結果を図５に示す。SPG/dA40(S)−OVA257-264及びCpG-dA40(S)/SPGで免疫したマウスでは、OVA257-264の投与量に依存して、OVA257-264提示細胞(CFSEhighの脾臓細胞)の減少が認められ、OVA257-264の投与量が100ng/head以上の場合には、OVA257-264提示細胞は認められなかった。これより、免疫されたマウスは抗原を持った細胞のみ特異的に排除していることが分かった。OVA257-264-click-dA40(S)/SPGでは、少なくとも2μg/headのOVA257-264の投与が、CTL反応の誘導に必要と報告されている（Mochizuki, S., Morishita, H., Kobiyama, K., Aoshi, T., Ishii, K. J., and Sakurai, K. (2015) Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. J. Control. Release 220, 495-502）。即ち、SPG/dA40(S)−OVA257-264は、OVA257-264-click-dA40(S)/SPGに比べて、より少ないペプチドの投与量で高いCTL反応を誘導できることができることが明らかとなった。SPG/dA40(S)−OVA257-264とOVA257-264-click-dA40(S)/SPGとのCTL反応の誘導活性の相違は、抗原提示能を評価した前記実施例５の結果と一致していた。
【図１】
2017217531.tif 000007
【図２】
2017217531.tif 000008
【図３】
2017217531.tif 000009
【図４】
2017217531.tif 000010
【図５】
2017217531.tif 000011
【配列表】
2017217531000001.app
【国際調査報告】
2017217531.tif 000012
2017217531.tif 000013
2017217531.tif 000014
2017217531.tif 000015